(57)【要約】      （修正有）【課題】抗皮膚老化外用組成物の提供。【解決手段】γ−オリザノール内包リポソームを含む、ＭＭＰ−１の発現が上昇しているヒト用の自然老化によるシワ及び／又はたるみ抑制外用組成物であり、当該組成物中、γ−オリザノールの含有量が、０．００１〜１質量％である、組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
γ−オリザノール内包リポソームを含む、ＭＭＰ−１の発現が上昇しているヒト用の自然老化によるシワ及び／又はたるみ抑制外用組成物であり、
当該組成物中、γ−オリザノールの含有量が、０．００１〜１質量％である、組成物。
【請求項２】
化粧品組成物である、請求項１に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗皮膚老化外用組成物等に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、特に美容分野において、抗皮膚老化効果を奏する外用組成物の需要はますます高まってきている。中でも皮膚のシワ又はたるみの抑制への関心は非常に高い。
【０００３】
皮膚においてシワやたるみが形成される一因として、光（紫外線、特にＵＶＡ）の皮膚照射が挙げられる。光の中でも紫外線（特にＵＶＡ）は真皮まで到達し、活性酸素種（ＲＯＳ）の生成を介して組織を傷害し、皮膚老化（例えば、表皮の肥厚、深く大きなシワの形成やたるみ）を引き起こすと考えられている（非特許文献１）。そのため、皮膚において抗酸化効果を奏する成分は、ＲＯＳの生成を抑制することにより、皮膚老化を抑制することが期待される。
【０００４】
また、皮膚光老化には、真皮弾性繊維や膠原繊維の分解及び減少が関与している。そして、真皮構成成分の分解には、マトリックスメタロプロテアーゼ（Ｍａｔｒｉｘ  Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ：ＭＭＰ）が関与しており、特にＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、及びＭＭＰ−９等は、基底膜を構成するＩＶ型コラーゲンや、真皮を構成するエラスチン、Ｉ型コラーゲン、及びＩＩＩ型コラーゲンを分解することが知られている。ＭＭＰが真皮コラーゲンや基底膜を分解し、皮膚構造が保持できなくなることで皮膚は大きく陥没し、深いシワの形成に至る。特に、ＭＭＰ−２やＭＭＰ−９はＵＶ照射やＲＯＳ暴露によりケラチノサイトや線維芽細胞から誘導されるとも考えられている（非特許文献１）。また、ＭＭＰ−１は自然老化皮膚及び光老化皮膚のいずれでも活性が高く、特に光老化皮膚において活性がより高いという報告もある（非特許文献２）。よって、ＲＯＳの生成を抑制する成分のなかでも、ＭＭＰの誘導をも抑制できる成分が、特に抗皮膚老化に効果的であると期待される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００７−２４６４３６号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】四国医誌  ６３巻５，  ６号  ２１９〜２２３  Ｄｅｃｅｍｂｅｒ２０，２００７
【非特許文献２】Chung JH, Seo JY, Choi HR, et al: Modulation of skin collagen metabolism in aged and photoaged human skin in vivo. J Invest Dermatol 117; 1218-1224: 2001
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、効率的に抗皮膚老化効果を得るための手法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、γ−オリザノールが、ＲＯＳ生成抑制効果のみならずＭＭＰ誘導抑制効果をも奏し得る優れた抗皮膚老化素材であることを見出し、さらには、γ−オリザノールをリポソームに内包して用いることで、より優れた抗皮膚老化効果を得ることができる可能性を見出し、さらに改良を重ねて本発明を完成させるに至った。
【０００９】
本発明は例えば以下の項に記載の主題を包含する。
項１．
γ−オリザノールを含む、抗皮膚老化外用組成物。
項２．
活性酸素産生抑制用及び／又はマトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）産生抑制用である、項１に記載の組成物。
項３．
γ−オリザノール内包リポソームを含む、抗皮膚老化外用組成物。
項４．
マトリックスメタロプロテアーゼ−２（ＭＭＰ−２）産生抑制用及び／又はマトリックスメタロプロテアーゼ−９（ＭＭＰ−９）産生抑制用である、項３に記載の組成物。
項５．
皮膚老化が、シワ又はたるみである、項１又は３に記載の組成物。
項６．
皮膚老化が、光による皮膚老化である、項１〜５のいずれかに記載の組成物。
項７．
化粧品組成物である、項１〜６のいずれかに記載の組成物。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、優れた抗皮膚老化効果が奏される外用組成物が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】γ−オリザノールについて、線維芽細胞に紫外線（ＵＶＡ）を照射した際に発生する活性酸素種（ＲＯＳ）の産生に対する効果を評価した結果を示す。
【図２】γ−オリザノールについて、線維芽細胞に紫外線（ＵＶＡ）を照射した際のＭＭＰ−１の産生に対する効果を評価した結果を示す。
【図３】γ−オリザノールにより、抗酸化遺伝子（Ｎｒｆ２、Ｎｑｏ１、ＨＯ−１、及びＳＯＤ１）の発現量がどのように変化するかをリアルタイムＰＣＲで解析した結果を示す。
【図４】γ−オリザノール内包リポソームにより、抗酸化遺伝子（Ｎｒｆ２及びＮｑｏ１）の発現量がどのように変化するかをリアルタイムＰＣＲで解析した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明の各実施形態について、さらに詳細に説明する。
【００１３】
本発明に包含される抗皮膚老化組成物は、γ−オリザノールを含む外用組成物（好ましくはγ−オリザノール内包リポソームを含む外用組成物）である。以下当該組成物を、本発明の抗皮膚老化外用組成物と呼ぶことがある。
【００１４】
リポソームは、リン脂質を主体とした脂質を十分量の水で水和することにより形成される二分子膜を有する脂質小胞体である。リポソームは脂質分子膜層の数に基づいて分類され、具体的には、多重膜リポソーム（ＭＬＶ）と一枚膜リポソーム（ＵＬＶ）に分類される。また、一枚膜リポソームは、脂質小胞体の大きさに応じて更に分類されることがあり、具体的には、大きさの小さいほうから順に、ＳＵＶ（ｓｍａｌｌ  ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅ）、ＬＵＶ（ｌａｒｇｅ  ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅ）、ＧＵＶ（ｇｉａｎｔ  ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅ）に分類される。本発明において、リポソームは、これらのいずれであってもよい。好ましいのはＭＬＶである。本発明では、リポソームの大きさは、特に制限はされないが、平均粒子径として、例えば、３０〜１０００ｎｍが好ましく、３０〜６００ｎｍがより好ましく、５０〜３０
０ｎｍがさらに好ましい。
【００１５】
γ−オリザノール内包リポソームを含む外用組成物において、リポソームに内包されるγ−オリザノール量も特に制限はされないが、例えばリポソーム膜成分（好ましくはリポソームに含まれるリン脂質）１０質量部に対して、０．２〜３質量部程度、０．５〜２質量部、又は１〜１．５質量部程度が例示される。
【００１６】
また、本発明の抗皮膚老化外用組成物において、γ−オリザノールは、当該組成物中に、例えば０．００１〜５質量％程度、０．００５〜４．５質量％程度、０．０１〜４質量％程度、０．０２〜２．５質量％程度、０．０５〜１質量％程度、又は０．０５〜０．５質量％程度含まれることが好ましい。また例えば、γ−オリザノールが、０．００１〜０．０１質量％程度含まれることも好ましく、特に、γ−オリザノールがリポソームに内包されていない状態で含まれる場合には、０．００１〜０．０１質量％程度含まれることが好ましい。
【００１７】
また、当該組成物がγ−オリザノール内包リポソームを含む外用組成物である場合には、リポソームに内包されるγ−オリザノールの、当該組成物に対する含有量が、例えば０．０１〜５質量％程度、０．０２〜２．５質量％程度、０．０５〜１質量％程度、又は０．０５〜０．５質量％程度であることが好ましい。また、当該組成物に含まれるγ−オリザノールのうち、例えば、８０質量％〜１００質量％、９０質量％〜１００質量％、又は実質的に１００質量％が、γ−オリザノール内包リポソームに含まれることが好ましい。なお当該組成物に含まれるγ−オリザノールのうち、実質的に１００質量％が、γ−オリザノール内包リポソームに含まれるとは、リポソームに全てのγ−オリザノールを内包させるよう組成物を製造した場合において、不可避的にリポソーム外にもγ−オリザノールが存在する場合をも包含することを意味する。
【００１８】
γ−オリザノールをリポソームに包含させる方法としては、公知の方法又は公知の方法から容易に想到できる方法を用いることができ、通常は水溶液中にリポソームが分散している状態、すなわちリポソーム懸濁液として得ることができる。リポソーム懸濁液の製造方法は特に限定されないが、例えば、次の方法が挙げられる。（１）リン脂質、リポソームに内包する成分（オリザノールを含む；以下同じ）、及び必要に応じてその他酸化防止剤などを均質に混合した後、水和し、リポソームを形成させる方法（当該水和は、好ましくはｐＨ調整剤、多価アルコール、糖類などを含む水溶液で行う）。（２）リン脂質、リポソームに内包する成分、及び必要に応じてその他酸化防止剤などをアルコール、多価アルコールなどに溶解し、ｐＨ調整剤、多価アルコール、糖類などを含む水溶液で水和し、リポソームを調製する方法。（３）超音波、フレンチプレスやホモジナイザーを用いて、リン脂質、リポソームに内包する成分、及び必要に応じてその他酸化防止剤などを水中で複合化させ、リポソームを調製する方法。（４）エタノールにリン脂質、リポソームに内包する成分、及び必要に応じてその他酸化防止剤などを混合溶解し、このエタノール溶液を塩化カリウム水溶液に添加した後にエタノールを除去しリポソームを調製する方法。γ−オリザノールは、そのまま使用してもよいし、少量の溶媒（例えば水又は水系溶媒）に予め溶解させた後に使用することができる。
【００１９】
使用するリン脂質としては、特に制限されないが、大豆レシチン、ナタネレシチン、コーンレシチン、綿実油レシチン、ひまわりレシチン、卵黄レシチン、卵白レシチン、ピーナッツレシチンなどが例示される。レシチンはホスファチジルコリン又は１，２−ジアシルグリセロール ３−ホスホコリンとも称され、一般的に、グリセロールの１位及び２位
に脂肪酸が結合している。本発明では、例えば、１位及び２位の両方又は片方に炭素数１２〜２４の不飽和脂肪酸が結合しているレシチンを使用することが好ましく、１位に炭素数１２〜２４の飽和脂肪酸、２位に炭素数１２〜２４の不飽和脂肪酸が結合しているレシ
チンを使用することがより好ましい。ここで、飽和脂肪酸及び不飽和脂肪酸は直鎖状及び分枝状のいずれでもよい。また、レシチンに代えて又は加えて、レシチン誘導体を用いることもできる。レシチン誘導体としては、水素添加レシチンや、前記例示のレシチン中のリン脂質にポリエチレングリコール、アミノグリカン類等を導入した化合物が例示できる。このうち、大豆レシチン、卵黄レシチン、水素添加大豆レシチン、水素添加卵黄レシチンが好ましく、特に大豆レシチン、卵黄レシチンが好ましい。また、レシチン中に存在するリン脂質（例えばホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、スフィンゴミエリン等）の純度を高めた精製レシチンも好ましく使用することができる。これらレシチン又はレシチン誘導体は１種または２種以上を組み合わせて使用することができる。本発明で使用するレシチンは、例えばＳＬＰ−ＰＣ３５（ホスファチジルコリン（以下ＰＣと略することがある）含量３５％）、ＳＬＰ−ＰＣ７０（ＰＣ含量７０％）、（ＳＬＰ−ホワイトリゾ（リゾレシチン）（以上、辻製油（株）社製）；卵黄レシチンＬＰＬ−２０Ｓ、２０Ｗ（リゾリン脂質含量約２０％）、卵黄レシチンＰＬ−３０Ｓ（ホスファチジルコリン含量約３０％）（以上、キューピー（株）社製）；大豆レシチン、卵黄レシチン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、グリセロホスホコリン（以上、Ｈホススタイン社製）；Ｌｅｃｉｇｒａｎ（粉末レシチン）、Ｍｅｔａｒｉｎ（分画レシチン）、Ｌｅｃｉｍｕｌｔｈｉｎ（粉末リゾレシチン）（以上、Ｃａｒｇｉｌｌ社製）；レシオンＰ（リン脂質含量９０％以上）、レシオンＬＰ−１（レシチン含量約７０％）、レシマール（酵素分解レシチン、リン脂質含量５０％）（以上、理研ビタミン社製）；ニチユＰＳ２５（ホスファチジルセリン含量約２５％）、ニチユＰＳ５０（ホスファチジルセリン含量約５０％）；、サンレシチンＡ−１（酵素分解大豆レシチン、レシチン含量約３０％）などから商業的に入手することもできる。
【００２０】
本発明の抗皮膚老化外用組成物は、皮膚老化の中でも、特に皮膚のシワ又はたるみに効果的であり、これらの抑制のために好ましく用いることができる。また、加齢による皮膚老化抑制のためにも用いることもできるが、特に光による皮膚老化抑制のために好ましく用いることができる。光の中でも、紫外線（特にＵＶＡ）の照射による皮膚老化を抑制するために好ましく用いることができる。
【００２１】
また、本発明の抗皮膚老化外用組成物は、活性酸素（ＲＯＳ）産生抑制用及び／又はマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）産生抑制用として好ましく用いることができる。ＭＭＰ産生抑制効果は、ＭＭＰの中でもＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９に対して好ましく発揮され得る。
【００２２】
本発明の抗皮膚老化外用組成物が、γ−オリザノール内包リポソームを含む外用組成物である場合には、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９に対して特に好ましく発揮され得る。また、本発明の抗皮膚老化外用組成物が、リポソーム非内包γ−オリザノールを含む外用組成物である場合には、ＭＭＰ−１に対して特に好ましく発揮され得る。
【００２３】
例えば、γ−オリザノールに他成分を加えて本発明の抗皮膚老化外用組成物として用いることができる。また例えば、本発明の抗皮膚老化外用組成物として、上記リポソーム懸濁液をそのまま用いることもできるし、これに他成分をさらに加えて用いることもできる。
【００２４】
他成分として、例えば、高分子、蛋白質及びその加水分解物、ムコ多糖類などを配合す
ることができる。高分子としては、例えばカルボキシビニルポリマー、キサンタンガム、アルギン酸ナトリウムなどが例示できるが、これらに限定されるものでもない。カルボキシビニルポリマー、キサンタンガムが好ましく、特にカルボキシビニルポリマーが好ましい。これら高分子等は１種または２種以上を組み合わせて使用できる。高分子の配合量は
特に限定しないが、０．００１〜２０％、好ましくは ０．００５〜１０％、特に好まし
くは ０．０１〜５％である。蛋白質及びその加水分解物としては、コラーゲン、エラス
チン、ケラチン、カゼイン、それらの加水分解物、加水分解物の塩、加水分解物のエステル、あるいは酵素処理されたものが挙げられるが、特にコラーゲンが好ましい。蛋白質及びその加水分解物の配合量は特に限定しないが、０．００１〜５％、好ましくは０．０１〜１％である。ムコ多糖としては、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸、ムコイチン硫酸、ヘパリンとその誘導体、及びそれらの塩類などが挙げられるが、特にコンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸及びこれらのナトリウム塩が好ましい。ムコ多糖の配合量は特に限定しないが、 ０．０００５〜５％、好ましくは０．００１
〜１％である。
【００２５】
また、この他にも、本発明の効果を損なわない範囲において、通常外用組成物に用いられる公知の成分を配合する（リポソーム分散液の連続相に含ませる）こともできる。このような成分としては、保湿剤、水溶性高分子、油成分、着色剤、酸化防止剤、金属封鎖剤、防腐剤、ｐＨ調整剤、清涼剤、香料、紫外線吸収・散乱剤、抗酸化剤、薬効成分などが例示できる。  
【００２６】
また、本発明の抗皮膚老化外用組成物がγ−オリザノール内包リポソームを含む場合、リポソームの調製において、本発明の効果を損なわない範囲で、通常リポソームに含ませ得る成分を用いることもできる。例えば、アスコルビン酸などの抗酸化剤、乳酸、クエン酸などの有機酸、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルエタノールアミンなどの脂質、キトサン、フコイダン、ヒアルロン酸などの天然高分子、ポリエチレングリコール、カルボキシビニルポリマーなどの合成高分子、トレハロース、ラクチュロース、マルチトールなどの糖質、グリセリンなどのポリオール等が例示される。
【００２７】
本発明の外用組成物は、特に皮膚に適用する組成物として用いることが好ましい。外用組成物としては、例えば医薬組成物、医薬部外品組成物、及び化粧品組成物が例示される。剤形としては、特に限定するものではないが、フェイスパック、ペースト、軟膏、クリーム、ジェル、ローション、乳液、美容液、化粧水、スプレー剤などが挙げられる。
【００２８】
本発明の抗皮膚老化外用組成物の適用対象は特に限定されないが、好ましくは抗皮膚老化（特にシワ又はたるみの抑制）を望むヒトである。
【００２９】
本発明の抗皮膚老化外用組成物は、上記の通り、抗酸化遺伝子発現亢進により活性酸素（ＲＯＳ）を抑制（特に減少）する効果、及び／又は、ＭＭＰ（Ｍａｔｒｉｘ  Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）を抑制する効果、を奏することにより、抗皮膚老化を発揮する。よって、本発明は、γ−オリザノール（好ましくはγ−オリザノール内包リポソーム）を含む抗酸化遺伝子発現亢進用外用組成物、及び、γ−オリザノール（好ましくはγ−オリザノール内包リポソーム）を含むＭＭＰ抑制用外用組成物、をも包含する。
【００３０】
抗酸化遺伝子としては、例えばＮｒｆ２（ＮＦＥ２  ｒｅｌａｔｅｄ  ｆａｃｔｏｒ  ２）、Ｎｑｏ１（ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ  ｑｕｉｎｏｎｅ  ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ  １）、ＨＯ−１（ｈｅｍｅ  ｏｘｙｇｅｎａｓｅ−１）、及びＳＯＤ１（Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｄｉｓｍｕｔａｓｅ  １）等が挙げられる。Ｎｒｆ２、Ｎｑｏ１、ＨＯ−１、及びＳＯＤ１からなる群より選択される少なくとも１種の抗酸化遺伝子であることが好ましく、特にＮｒｆ２遺伝子及び／又はＮｑｏ１遺伝子であることが好ましい。
【００３１】
また、抑制されるＭＭＰとしては、特にＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、及びＭＭＰ−９が好ましく挙げられる。
【００３２】
なお、Ｎｒｆ２は、活性酸素等よって活性化され、高等動物における酸化ストレス適応反応を統一的に制御する転写因子である。Ｎｒｆ２は、親電子性物質の解毒化酵素であるＧＳＴやＮｑｏ１などの異物代謝酵素、グルタチオン合成酵素などの遺伝子発現を増強して、親電子性物質を解毒化する。ヘムオキシゲナーゼ１（ＨＯ−１）は酸化ストレスを始めとする種々の急性ストレスにより誘導されることが知られており、Ｎｒｆ２標的遺伝子の１つでもある。スーパーオキシドディスムターゼ（Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｄｉｓｍｕｔａｓｅ，ＳＯＤ）は、細胞内に発生した活性酸素を分解する酵素であって、哺乳動物には３種のＳＯＤが存在しており、ＳＯＤ１は細胞質に存在する。
【００３３】
なお、本明細書において「含む」とは、「本質的にからなる」と、「からなる」をも包含する（The term "comprising" includes "consisting essentially of” and "consisting of."）。
【実施例】
【００３４】
以下、本発明をより具体的に説明するが、本発明は下記の例に限定されるものではない。なお、以下、特に断らない限り、各種組成物における成分含有割合を示す％は質量％（ｗ／ｗ％）を表す。ＣＯ２濃度の％はｖ／ｖ％である。また、細胞、培地及び培地関連試薬については、全て市販品を購入して用いた。
【００３５】
紫外線照射による活性酸素産生に対する効果の検討
γ−オリザノールについて、線維芽細胞に紫外線（ＵＶＡ）を照射した際に発生する活性酸素種（以下ＲＯＳ）の産生に対する効果を評価した。
【００３６】
＜使用材料＞
・５３歳女性由来ヒト皮膚線維芽細胞（以下ＨＤＦ５３）
・ＨＤＦ５３用培地：Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｅａｇｌｅ
（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｍ４６５５）に１０％ＦＢＳおよび１％抗生物質（ＧｉｂｃｏＴＭ，  １５２４００６２）を添加して調製した。以下ＭＥＭ（＋）とする。・ＰＢＳ  （Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｄ８５３７）
・ＤＣＦＨ−ＤＡ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）
なお、ＤＣＦＨ−ＤＡプローブは細胞内に散在して、細胞内エステラーゼにより脱アセチル化し、非蛍光型  ２’，７’−Ｄｉｃｈｌｏｒｏｄｉｈｙｄｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  （ＤＣＦＨ）になり、更にＲＯＳにより素早く酸化され、強く蛍光する２’，７’−Ｄｉｃｈｌｏｒｏｄｉｈｙｄｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  （ＤＣＦ）に変化する。これにより、細胞内のＲＯＳ量を蛍光強度により測定することができる。
・Ｐｒｅｍｉｘ  ＷＳＴ−１  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ  （ＴａＫａＲａ  Ｂｉｏ，  ＭＫ４００）（以下ＷＳＴ−１）
なお、ＷＳＴ−１は、細胞生存能力を発色測定により定量するための試薬である。生細胞中のミトコンドリア脱水素酵素によるテトラゾリウム塩（ＷＳＴ−１）のホルマザン色素への変換を基本としており、生細胞数が増加すれば、サンプル中のミトコンドリア脱水素酵素の全体の活性が増加することになり、この酵素活性の増加が、ホルマザン色素の生成増加を導くため、ホルマザン色素と培地中の代謝活性のある細胞の数とは直線的な相関を示すことになる。
【００３７】
＜実験操作＞
４８穴ウェルプレートにＨＤＦ５３を１．２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、コンフルエントになるまで３７℃  ＣＯ２５％インキュベーター内で３日間培養（使用培地：ＭＥＭ（＋））した。３日後、ＭＥＭ（＋）を除去してＰＢＳで１回洗浄し、新しいＰＢＳを各ウェルに２００μｌずつ添加した。上記のＨＤＦ５３に、ＵＶＡを６０００ｍＪ／ｃｍ２  照射した。ＰＢＳを吸引除去し、新しいＰＢＳで１回洗浄した。γ−オリザ
ノールを５０μｇ／ｍｌ含むＭＥＭ（＋）を各ウェルに５００μｌずつ添加した。各ウェルに  ５ｍＭ  ＤＣＦＨ−ＤＡ  （Ｄｉ（Ａｃｅｔｏｘｙｍｅｔｈｙｌ  Ｅｓｔｅｒ）  （６−Ｃａｒｂｏｘｙ−２’，７’−Ｄｉｃｈｌｏｒｏｄｉｈｙｄｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  Ｄｉａｃｅｔａｔｅ））を３μｌずつ添加した（最終濃度３０μＭ）。３７℃、ＣＯ２５％インキュベーター内で３０分間培養した。培地を吸引除去し、ＰＢＳで１回洗浄した。新しいＰＢＳを各ウェルに３００μｌずつ添加した。ＧＥＭＩＮＩ  ＸＰＳ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で、Ｅｘ  ４８８ｎｍ／Ｅｍ  ５３０ｎｍの波長で蛍光強度を測定した。その後、ＰＢＳを吸引除去して１０倍希釈したＷＳＴ−１を含むＭＥＭ（＋）を各ウェルに５００μｌずつ添加し、３７℃、ＣＯ２５％インキュベーター内で２時間培養した。ｘＭａｒｋ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（ＢＩＯ  ＲＡＤ）で４５０ｎｍの吸光度を測定した。当該実験は、Ｎ＝３で実施した。また、γ−オリザノールを含まないＭＥＭ（＋）をコントロールとした。
【００３８】
測定した蛍光強度を図１に示す。ただし、図１に示す蛍光強度は、ＧＥＭＩＮＩ  ＸＰＳで測定した蛍光強度を、細胞生存率で割り補正した値である。細胞生存率は、ＷＳＴ−１を用いた検討において、ｘＭａｒｋで測定した各ウェルの吸光度を、ＵＶＡ未照射コントロールの吸光度の平均値で割ることにより、算出した。なお、ＵＶＡ未照射コントロールでの生存率を「１」とした。なお、図１において、＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１（いずれもＴ−ｔｅｓｔによる）を示す。
【００３９】
紫外線照射によるＭＭＰ−１産生に対する効果の検討
γ−オリザノールについて、線維芽細胞に紫外線（ＵＶＡ）を照射した際のＭＭＰ−１の産生に対する効果を評価した。
【００４０】
＜使用材料＞
・５３歳女性由来ヒト皮膚線維芽細胞（以下ＨＤＦ５３）
・ＨＤＦ５３用培地：Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｅａｇｌｅ
（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｍ４６５５）に１０％ＦＢＳおよび１％抗生物質（ＧｉｂｃｏＴＭ，  １５２４００６２）を添加して調製した。以下ＭＥＭ（＋）ともいう。
・ＰＢＳ  （Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｄ８５３７）
・ＨＢＳＳ  （Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｈ８２６４）
・Ｐｒｅｍｉｘ  ＷＳＴ−１  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ  （ＴａＫａＲａ  Ｂｉｏ，  ＭＫ４００）（以下ＷＳＴ−１）
・Ｈｕｍａｎ  Ｔｏｔａｌ  ＭＭＰ−１    （Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ，  ＤＹ９０１Ｂ）＊ＭＭＰ−１検出用ＥＬＩＳＡキット
・ＤｕｏＳｅｔ  Ａｎｃｉｌｌａｒｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ２    （Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ，  ＤＹ００８）
【００４１】
＜実験操作＞
４８穴ウェルプレートにＨＤＦ５３を１．２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、コンフルエントになるまで３７℃  ＣＯ２５％インキュベーター内で３日間培養（使用培地：ＭＥＭ（＋））した。３日後、ＭＥＭ（＋）を除去してＨＢＳＳで１回洗浄し、新しいＨＢＳＳを各ウェルに２００μｌずつ添加した。上記のＨＤＦ５３に、ＵＶＡを８０００ｍＪ／ｃｍ２  照射した。ＨＢＳＳを吸引除去し、ＰＢＳで１回洗浄した。γ−オリザノールを５０μｇ／ｍｌ含むＭＥＭ（＋）を各ウェルに５００μｌずつ添加し、３７℃  ＣＯ２５％インキュベーター内で７２時間培養した。７２時間後、培地を回収して１２０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、上清を回収して使用するまで−３０℃で保管した。また、各ウェルの残った培地を吸引除去し、新しいＰＢＳで１回洗浄した。１０倍希釈したＷＳＴ−１を含むＭＥＭ（＋）を、各ウェルに３００μｌずつ添加し、３７℃  ＣＯ２５％
インキュベーター内で２時間培養した。培養後、ｘＭａｒｋ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（ＢＩＯ  ＲＡＤ）で４５０ｎｍの吸光度を測定した。また、遠心分離して得た培地上清中のＭＭＰ−１の濃度測定を、ＥＬＩＳＡキット付属のプロトコールに従って行った。ＥＬＩＳＡの測定において、吸光度はｘＭａｒｋ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（ＢＩＯ  ＲＡＤ）で４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【００４２】
当該実験は、Ｎ＝３で実施した。また、γ−オリザノールを含まないＭＥＭ（＋）をコントロールとした。
【００４３】
測定したＭＭＰ−１の濃度を図２に示す。ただし、図２に示す濃度は、ＥＬＩＳＡの測定において、ｘＭａｒｋで測定した吸光度を、細胞生存率で割り補正した値である。細胞生存率は、ＷＳＴ−１を用いた検討において、ｘＭａｒｋで測定した各ウェルの吸光度を、ＵＶＡ未照射コントロールの吸光度の平均値で割ることにより、算出した。なお、ＵＶＡ未照射コントロールでの生存率を「１」とした。なお、図２において、＊＊はｐ＜０．０１（Ｔ−ｔｅｓｔによる）を示す。
【００４４】
抗酸化遺伝子発現の検討
ＮＨＥＫ細胞（正常ヒト表皮角化細胞；新生児由来）を用いて、γ−オリザノールを含む組成物又はγ−オリザノール内包リポソームを含む組成物により抗酸化遺伝子の発現が変化するかを検討した。
【００４５】
＜増殖培地調製方法＞
３７℃に恒温化したＨｕｍｅｄｉａ−ＫＢ２培地  ５００ｍＬに同じく恒温化したインスリン  ０．５ｍｌ、ｈＥＧＦ  ０．５ｍｌ、ハイドロコ−チゾル  ０．５ｍｌ、ＢＰＥ（ウシ脳下垂体抽出液）２ｍｌ、ゲンタマイシン／アンフォテリシンＢ  ０．５ｍｌ（抗菌剤）を加えた。これを緩やかに混合した後、４℃に保存した。
【００４６】
＜凍結ＮＨＥＫ細胞の解凍及び培地交換方法＞
凍結ＮＨＥＫ細胞の入ったアンプル２本を３７℃の恒温槽で解凍した。解凍後、予め１５ｍｌチューブに分注した４℃のＨｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２培地  ６ｍｌに細胞溶液を混合した。予め３７℃に恒温化したＨｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２培地  ３９ｍｌを１３ｍｌずつ３つのフラスコに移した。混合した細胞溶液を接着細胞培養フラスコ（ＳＵＭＩＬＯＮ  ２５０ｍＬ）に２ｍｌずつ移し、細胞が均一になるように混合させてから、しばらく静置した。３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで培養した。翌日以降、細胞密度が８０％コンフルエントになるまで１日１回培地交換を行なった。
【００４７】
＜ＮＨＥＫ細胞の継代培養方法＞
増殖培地を吸引し、３７℃に恒温化したＨＥＰＥＳ緩衝液を５ｍＬ加え、軽く細胞層を洗浄した。ＨＥＰＥＳ緩衝液を吸引し、０．２５％トリプシン溶液を２ｍＬ加え、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで３分静置した。その後、フラスコ底面に接着している細胞をはがした（フラスコの縁を軽く叩き、細胞をはがす）。そこに３７℃に恒温化したトリプシン中和液を４ｍＬ加えてトリプシン酵素の反応を停止させた。細胞懸濁液を５０ｍｌファルコンに回収し、遠心した（ＲＴ、１，０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ）。上清を吸引し、Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２培地１０ｍｌに混合した後、血球計算盤で細胞数を計測した。その後、接着細胞２４ｗｅｌｌプレートに培地量９５０μＬ、細胞数が１．３３×１０５個になるよう蒔いた。翌日、培地交換を行なった。
【００４８】
＜試料添加方法＞
増殖培地を吸引し、ＰＢＳ  １ｍｌで洗浄した後、Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＢ２培地  １ｍｌ
に混合した試料（γ−オリザノール又はＢＳＡ）を添加し、２４時間培養した。なお、γ−オリザノールは、培地中のγ−オリザノール終濃度が１０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、又は１００μｇ／ｍｌ、となるように添加した。ＢＳＡは、終濃度約０．１４％となるように添加した。γ−オリザノールは、オリザ油化株式会社から購入して用いた。
【００４９】
＜細胞回収方法＞
Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＢ２培地を吸引し、ＰＢＳ  １ｍｌで洗浄した。ＰＢＳを吸引し、ＲＬＴ（細胞溶解液）  ３５０μｌを加え、プレートシェイカーで３ｍｉｎ振盪した。２４ｗｅｌｌプレートの周りをビニールテープで覆い、−８０℃へ保存した。
【００５０】
＜ｃＤＮＡの作製＞
−８０℃から２４ｗｅｌｌプレートを取り出し、恒温槽で解凍した。７０％  ＥｔＯＨ  ３５０μｌを加え、プレートシェイカーで３分振盪した。Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡサンプルはＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて抽出した。ＮＡＮＯＤＲＯＰ  ２０００  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）でＲＮＡ濃度を測定し、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社）を用いて、約５００ｎｇのＴｏｔａｌ  ＲＮＡからｃＤＮＡを作製した。
【００５１】
＜リアルタイムＰＣＲ＞
Ｐｒｉｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ（タカラバイオ社）１０μｌにプライマー、ＲＯＸ  ＤｙｅＩＩとＲＮＡ  Ｆｒｅｅ水を加え、１８μｌの混液を調製し、２μｌ（約５０ｎｇ）のｃＤＮＡサンプルを加えて、Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ測定サンプルを各プライマーごとに調製した。内在性コントロールとしてβ−ａｃｔｉｎ、又はＧＡＰＤＨ、ターゲット抗酸化遺伝子としてＮｒｆ２、Ｎｑｏ１、ＨＯ−１、及びＳＯＤ１を選択した。Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｔａｎｄａｒｄ７５００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により、ターゲット遺伝子の発現解析（相対定量）を行なった。検量線法による解析結果を図３に示す。また、図３の結果は内在性コントロールとしてβ−ａｃｔｉｎを用いて解析した結果である。なお、図３は、ＢＳＡ添加培地での遺伝子発現量を１としたときの各培地における遺伝子発現量比を示す。また、図３において、＋、＊、＊＊、＊＊＊は、それぞれ、コントロール（ＢＳＡ添加）と比較して有意差が有ることを示す（＋：Ｐ＜０．１、＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．０１、＊＊＊：Ｐ＜０．００１）
【００５２】
なお、ＰＣＲに用いた各プライマーの塩基配列は次の通りである。（Ｆ：はフォワードプライマーを、Ｒ：はリバースプライマーを示す。）
β−ａｃｔｉｎ
Ｆ：ＴＴＧＴＴＡＣＡＧＧＡＡＧＴＣＣＣＴＴＧＣＣ
Ｒ：ＡＴＧＣＴＡＴＣＡＣＣＴＣＣＣＣＴＧＴＧＴＧ
ＧＡＰＤＨ
Ｆ：ＧＣＡＣＣＧＴＣＡＡＧＧＣＴＧＡＧＡＡＣ
Ｒ：ＴＧＧＴＧＡＡＧＡＣＧＣＣＡＧＴＧＧＡ
Ｎｒｆ２
Ｆ：ＣＴＴＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＴＴＣＴＧＡＡＧＴＧ
Ｒ：ＣＣＴＧＡＧＡＴＧＧＴＧＡＣＡＡＧＧＧＴＴＧＴＡ
Ｎｑｏ１
Ｆ：ＧＧＡＴＴＧＧＡＣＣＧＡＧＣＴＧＧＡＡ
Ｒ：ＡＡＴＴＧＣＡＧＴＧＡＡＧＡＴＧＡＡＧＧＣＡＡＣ
ＨＯ−１
Ｆ：ＡＡＧＡＣＴＧＣＧＴＴＣＣＴＧＣＴＣＡＡＣ
Ｒ：ＡＡＡＧＣＣＣＴＡＣＡＧＣＡＡＣＴＧＴＣＧ
ＳＯＤ１
Ｆ：ＡＧＴＧＣＡＧＧＧＣＡＴＣＡＴＣＡＡＴＴＴＣ
Ｒ：ＣＣＡＴＧＣＡＧＧＣＣＴＴＣＡＧＴＣＡＧ
【００５３】
＜リポソームの調製＞
表１に示す組成（合計１００％）となるよう原料を混合し、これを高圧乳化機（スターバーストミニＨＪＰ−２５００１：（株）スギノマシン社製）で２００Ｍｐａ、５パスの条件で処理し、リポソーム懸濁液（γ−オリザノール内包リポソームを含有する）を調製した。また、γ−オリザノールはオリザ油化株式会社から購入して用いた。レシチンは大豆レシチンを日油株式会社から購入して用いた。また作成したリポソームは透過型電子顕微鏡  ＨＴ７７００（ＨＩＴＡＣＨＩ）にて存在を確認した。
【００５４】
【表１】
2020183443.tif 000002
【００５５】
以下の検討には、得られたリポソーム懸濁液（０．５％γオリザノール内包リポソーム懸濁液、及び空リポソーム懸濁液）を用いた。
【００５６】
＜細胞の３次元培養＞
３次元（３Ｄ）皮膚モデル作製用ツールであるＥｐｉｄｅｒｍ  ２００Ｘキット及びＥＰＩ−１００ＭＭ培地（いずれもクラボウ社）を用いて、３次元皮膚モデルを培養した。具体的には、Ｅｐｉｄｅｒｍ  ２００Ｘキットを用いて、次の手順で作製した。接着細胞２４ｗｅｌｌプレートに予め３７℃に恒温化したＥＰＩ−１００ＭＭ培地  ５００μｌを加えた。３次元皮膚モデルの入ったインサートカップを接着細胞２４ｗｅｌｌ  プレートに泡が入らないよう移した。３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで２〜３時間培養して、３Ｄ皮膚モデルを作製した。
【００５７】
＜遺伝子発現検討＞
３Ｄ皮膚モデル上部に試料（０．５％γオリザノール内包リポソーム懸濁液、又は空リポソーム懸濁液）を４０μｌ添加し、２４時間培養した。その後、培地を吸引し、３Ｄ皮膚モデル上部を組織が崩れないよう注意しながらＰＢＳで３回洗浄した。メスでインサートカップから３Ｄ皮膚モデルとメンブレンを切り出し、その後３Ｄ皮膚モデルからメンブレンを剥がした。細胞ストック用チューブに３Ｄ皮膚モデルを入れ、液体窒素で凍結し−８０℃で保存した。その後、上述した方法と同様にしてＲＮＡを抽出してｃＤＮＡを作製しリアルタイムＰＣＲを行って遺伝子（Ｎｒｆ２及びＮｑｏ１）発現を解析した。Ｃｔ法による解析結果を図４に示す。また、図４の結果は内在性コントロールとしてＧＡＰＤＨを用いて解析した結果である。なお、図４において、＋、＊は、それぞれ、コントロール（空リポソーム）と比較して有意差が有ることを示す（＋：Ｐ＜０．１、＊：Ｐ＜０．０５）。
【００５８】
＜マイクロアレイ解析＞
上記のようにして調製した３Ｄ皮膚モデル細胞のＲＮＡを用いて、ＤＮＡマイクロアレイ解析を行い、ＭＭＰ−２遺伝子及びＭＭＰ−９遺伝子の発現を検討した。ＤＮＡマイクロアレイとしてはＤＮＡチップジェノパール皮膚チップ（三菱ケミカル株式会社）を用い
た。基準サンプル（すなわち、空リポソームを添加して培養した３Ｄ皮膚モデル細胞のＲＮＡ）の補正値を１としたときの、γ−オリザノール内包リポソームを添加して培養した３Ｄ皮膚モデル細胞のＲＮＡの発現量は、ＭＭＰ−２遺伝子が０．６８、ＭＭＰ−９遺伝子が０．７８であった。このことから、γ−オリザノール内包リポソームには、ＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９遺伝子の発現を抑制する傾向があることも分かった。
【図１】
2020183443.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
2020183443.tif 000006
【配列表】
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