(57)【要約】      （修正有）【課題】心肥大の治療に用いられる、幹細胞と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。【解決手段】ｎ‐ブチリデンフタリドで前処理・反応により得られる幹細胞を含む医薬組成物を、高血圧患者の体内に遠位筋肉注射することによれば、心筋内のスーパーオキシドの含有量を減らしたり、ＳＴＡＴ３の活性を高めたり、炎症の消去を促進するマクロファージＭ２の含有量を増やしたりすることができると共に、高血圧による心肥大症状を効果的に治療することができる。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
心肥大の治療に用いられる幹細胞と、薬学的に許容される担体とを含む、心肥大の治療に用いられる医薬組成物において、
前記幹細胞は、ｎ‐ブチリデンフタリド(ＢＰ)で前処理・反応をすることにより得られたものであり、
前記医薬組成物は、遠位筋肉注射により、所望の治療の必要な対象に投与される、
ことを特徴とする心肥大の治療に用いられる医薬組成物。
【請求項２】
前記前処理・反応において、前記ｎ‐ブチリデンフタリドの濃度は、７μｇ／ｍＬ以上４０μｇ／ｍＬ未満の範囲である、
ことを特徴とする請求項１に記載の心肥大の治療に用いられる医薬組成物。
【請求項３】
前記前処理・反応には、２０℃〜４０℃にする温度範囲条件下で、幹細胞と前記ｎ‐ブチリデンフタリドとを６〜２４時間反応させることを含む、
ことを特徴とする請求項１又は２に記載の心肥大の治療に用いられる医薬組成物。
【請求項４】
前記幹細胞は、臍帯血幹細胞、末梢血幹細胞、神経幹細胞、脂肪幹細胞、及び骨髄幹細胞からなる群より選択した少なくとも１つである、
ことを特徴とする請求項１に記載の心肥大の治療に用いられる医薬組成物。
【請求項５】
心肥大治療用医薬組成物の調製に有効量の幹細胞を所望の治療の必要な対象に投与し、
前記幹細胞は、ｎ‐ブチリデンフタリドで前処理・反応することにより得られたものであり、
前記所望の治療の必要な対象は、心肥大を有するヒト又は哺乳類動物である、
ことを特徴とする心肥大治療用医薬組成物の調製に適用される幹細胞の用途。
【請求項６】
前記医薬組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む、
ことを特徴とする請求項５に記載の心肥大治療用医薬組成物の調製に適用される幹細胞の用途。
【請求項７】
前記有効量は、幹細胞が１×１０６個以上１×１０８個未満である範囲である、
ことを特徴とする請求項５に記載の心肥大治療用医薬組成物の調製に適用される幹細胞の用途。
【請求項８】
前記心肥大は、自然発症高血圧症により引き起こされる、
ことを特徴とする請求項５に記載の心肥大治療用医薬組成物の調製に適用される幹細胞の用途。
【請求項９】
前記幹細胞は、遠位筋肉注射により投与される、
ことを特徴とする請求項５に記載の心肥大治療用医薬組成物の調製に適用される幹細胞の用途。
【請求項１０】
前記遠位筋肉は、四肢筋肉又は臀部筋肉である、
ことを特徴とする請求項９に記載の心肥大治療用医薬組成物の調製に適用される幹細胞の用途。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬組成物に関し、特に、心肥大の治療に用いられる医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
左心室肥大(ＬＶＨ：Left ventricular hypertrophy)は、高血圧により招致された心臓への疾患・障害のうちに、最も見付けられた代表的疾患とは言わられる。本態性高血圧に続発する左心室肥大は、病理学では、心筋細胞が刺激を受けて増殖したり、線維芽細胞が活性化し、間質性線維化したりすることにより、心筋線維の太さが増大して心室壁が肥厚し，重量も増す心臓の変化をいう。臨床的医学上、心肥大によっては、脳卒中、慢性腎不全、心室機能障害、及び突然死などのリスクを発生させる可能性をさらに高めるおそれがある。
【０００３】
高血圧自然発症ラット(ＳＨＲ：Spontaneously Hypertensive Rat)は、ヒトの本態性高血圧症の研究において最も広く使用されている高血圧疾患モデル動物である。
研究により実証された結果から分かるように、スーパーオキシドアニオン(superoxide anion)を含む活性酸素種(ＲＯＳ：Reactive Oxygen Species)は、ＳＨＲ前肥大期の段階に属する心室肥大に対し初期作用を果たす役割として機能されている。一方、ミトコンドリア機能不全は、ＲＯＳを発生させる重要な原因である上に、高血圧による疾患障害のうちに常に発見された障害である。
研究報告によると、ＳＨＲの４０日目での収縮期血圧は、同齢の正常血圧ラットより顕著的に増加していると共に、形態学及び心室肥大のバイオマーカーを２ヶ月で評価したところ、左心室肥大の症状が顕著であることが確認された。
なお、心血管疾患の罹患率及び死亡率を予測には、左心室肥大が強力な予測因子として認められる。これにより、高血圧を下げるための降圧療法には、左心室肥大の症状を改善させることを目標とするのが一般的である。
【０００４】
現在、臨床的に心室肥大や線維症に対する主要な治療法には、β(ベータ)遮断薬及びアンジオテンシン変換酵素阻害剤(ＡＣＥＩ)の使用が含まれる。
【０００５】
β遮断薬は交感神経活動に拮抗し、心拍数を遅くし、そして心筋の酸素消費量を減らすことができるため、高血圧症患者は、β遮断薬を長期間服用すれば、心臓に係わる駆出率及び逆心室肥大を顕著的に改善することができる。
しかし、β遮断薬を長期間使用した後に突然薬物を中止するとしたら、元の症状が悪化し、血圧の上昇、頻脈性不整脈、狭心症の増加、さらには心筋梗塞までに引き起ってしまうこともある。また、インスリンで治療を受けている糖尿病患者に対しては、β遮断薬を使用すると、インスリンによる低血糖反応の後に血糖の回復を遅らせ、すなわち、低血糖反応を生じることがある。このため、糖尿病又は低血糖の患者は、これらの薬を注意払って使用すべきである。
【０００６】
ＡＣＥＩ薬は、主に、アンジオテンシン変換酵素(ＡＣＥ)の活性を抑制したり、アンジオテンシン(Ａｎｇ‐ＩＩ)の生成を減少させたり、ブラジキニン(Bradykinin)の加水分解を減少したりすることにより、血管拡張や、血液量の減少、血圧の下がりをさせることができ、並びに、左室肥大の軽減作用をもたらす役割として機能することが明らかに証明されている。
しかしながら、患者は、ブラジキニンの濃度が増加することに伴って、激しい刺激性の乾いた咳を発症することにより、不快感を引き起こす可能性がある。さらには、ＡＣＥＩを服用することに連れて、また味覚の異常、好中球減少症、発疹、発熱及び、血管浮腫等のような副作用を引き起こす可能性もあり得る。
【０００７】
従って、心肥大の治療に係わる既有技術の欠点を解消することができると共に、優れた医療効果を発揮し得る医薬組成物、特に異なる作用メカニズムの組合せを共に持つ心肥大治療剤を開発することが急務である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
そこで、本発明者らは、上記従来技術の問題点を解決するために種々の解決策を鋭意検討した結果、上記従来技術を改善するだけでなく、従来技術の欠点を解消することを課題とした心肥大の治療に用いられる医薬組成物を開発した。
つまり、ｎ‐ブチリデンフタリドで前処理した幹細胞を用いて遠位筋肉（四肢又は臀部）注射することで、心筋内のスーパーオキシド含有量を効果的に減らしたり、ＳＴＡＴ３の活性を高めたりすることができ、並びに、炎症の消去を促進するマクロファージＭ２の含有量を増やして、心肥大を逆転させることができる医薬組成物が発見され、本発明の完成に至った。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
すなわち、本発明は、幹細胞と薬学的に許容される担体とを含む、心肥大の治療に用いられる医薬組成物を提供している。上記幹細胞は、ｎ‐ブチリデンフタリドで前処理・反応することにより得られる。
【００１０】
本発明に係わる一つの実施形態によれば、上記前処理・反応において、上記ｎ‐ブチリデンフタリドの濃度は、７μｇ／ｍＬ以上４０μｇ／ｍＬ未満の範囲にする。
【００１１】
本発明に係わる一つの実施形態によれば、上記前処理・反応には、２０℃〜４０℃にする温度範囲条件の下で、幹細胞と上記ｎ‐ブチリデンフタリドとを反応させることを含む。さらに、上記反応時間は６〜２４時間であるのが好ましい。
【００１２】
本発明に係わる一つの実施形態によれば、上記幹細胞は、臍帯血幹細胞、末梢血幹細胞、神経幹細胞、脂肪幹細胞、及び骨髄幹細胞からなる群より選択された少なくとも１つである。
【００１３】
さらに、本発明は、心肥大を治療する医薬組成物を調製するために使用される幹細胞であって、所望の治療の必要な対象に、ｎ‐ブチリデンフタリドで前処理・反応して得られる幹細胞を有効量投与することを特徴とする心肥大治療用医薬組成物の調製に適用される幹細胞の使用を提供している。
【００１４】
本発明に係わる一つの実施形態によれば、上記幹細胞の有効量は、１×１０６個以上１×１０８個未満の範囲内にする。好ましくは、１×１０６個以上１×１０７個未満の範囲にする。
【００１５】
本発明に係わる一つの実施形態によれば、上記心肥大は自然発症高血圧症により引き起こされる。
【００１６】
本発明に係わる一つの実施形態によれば、上記幹細胞は遠位筋肉注射により投与される。
【００１７】
本発明に係わる一つの一実施形態によれば、上記所望の治療の必要な対象はヒト又は哺乳類動物である。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１Ａ】図１Ａから図１Ｆは、実施例１における急性期の解析結果を示す図である。ここで、図１Ａは、各ラット群における右脚筋のスーパーオキシド含有量の比較を示す図であり；図１Ｂは、各ラット群における右脚筋のＤＨＥ染色の蛍光量の比較を示す図であり；図１Ｃは、各ラット群における心筋スーパーオキシドの含有量の比較を示す図であり；図１Ｄは、各ラット群における心筋ＤＨＥ染色の蛍光量の比較を示す図であり；図１Ｅは、各ラット群の右脚筋における抗ヒトミトコンドリア抗体による免疫組織化学的染色後のＡＤＳＣｓの数の比較を示す図であり；及び、図１Ｆは、各ラット群における心筋のＲＴ−ＰＣＲによるＡｌｕ遺伝子発現の比較を示す図である。図中では、＊は、対照群（ＷＫＹ）との比較（ｐ＜０．０５）を示し；†は、担体により治療された担体群（Ｖｅｈ）との比較（ｐ＜０．５）を示し；‡は、ＡＤＳＣ群（ＡＤＳＣ）との比較（ｐ＜０．０５）を示す。（１群につきＮ＝５）
【図１Ｂ】同上
【図１Ｃ】同上
【図１Ｄ】同上
【図１Ｅ】同上
【図１Ｆ】同上
【図２Ａ】図２Ａ及び図２Ｂは、実施例１における慢性期の心臓ＲＯＳ及びＳＴＡＴ３活性化に対するヒトＡＤＳＣ遠隔移植の影響の解析結果を示す図である。ここで、図２Ａは、各ラット群における心筋スーパーオキシド含有量の比較を示す図であり；図２Ｂは、各ラット群における心筋ＤＨＥ染色の蛍光量の比較を示す図である。図中では、＊は、対照群（ＷＫＹ）との比較（ｐ＜０．０５）、†は、担体により治療された担体群（Ｖｅｈ）との比較（ｐ＜０．５）を示し；‡は、ＡＤＳＣ群（ＡＤＳＣ）との比較（ｐ＜０．０５）を示す。（１群につきＮ＝１０）
【図２Ｂ】同上
【図３Ａ】図３Ａから図３Ｃは、実施例１における慢性期のＳＴＡＴ３の解析結果を示す図である。ここで、図３Ａは、ウェスタンブロッティング法により解析されたｐ−ＳＴＡＴ３（ｐｈｏｓｐｈｏ−ＳＴＡＴ３）含有量の比較図を示すであり；図３Ｂは、ＥＬＩＳＡにより解析されたＳＴＡＴ３のＤＮＡ結合活性の比較を示す図であり；図３Ｃは、免疫組織化学的染色における抗ｐ（Ｔｙｒ７０５）‐ＳＴＡＴ３抗体により解析されたＳＴＡＴ３の核移行度合いを示す定量図である。図中では、＊は、対照群（ＷＫＹ）との比較（ｐ＜０．０５）を示し；†は、担体により治療された担体群（Ｖｅｈ）との比較（ｐ＜０．５）を示し；‡は、ＡＤＳＣ群（ＡＤＳＣ）との比較（ｐ＜０．０５）を示す。（１群につきＮ＝１０）
【図３Ｂ】同上
【図３Ｃ】同上
【図４Ａ】図４Ａ及び図４Ｂは、実施例１における慢性期の心臓マクロファージの表現型バイアスＭ２型に対するヒトＡＤＳＣ遠隔移植の影響の解析結果を示す図である。ここで、図４Ａは、担体群（Ｖｅｈ）及びＡＤＳＣ群（ＡＤＳＣ）における免疫組織化学染色により解析されたマクロファージ中のＭ１の発現を示す定量的比較図であり；図４Ｂは、担体群（Ｖｅｈ）及びＡＤＳＣ群（ＡＤＳＣ）における免疫組織化学染色により解析されたマクロファージ中のＭ１の発現を示す定量的比較図である。図中では、＊は、対照群（ＷＫＹ）との比較（ｐ＜０．００１）を示す。（１群につきＮ＝５）
【図４Ｂ】同上
【図５Ａ】図５Ａから図５Ｅは、実施例１において慢性期でのヒトＡＤＳＣ遠隔移植により解析された、心臓におけるマクロファージの表現型バイアスＭ２型への影響の結果を示す図である。ここで、図５Ａは、各ラット群の心筋におけるＩＬ−６発現量の比較を示す図であり；図５Ｂは、各ラット群の心筋におけるＩＬ−１β発現量の比較を示す図であり；図５Ｃは、各ラット群の心筋におけるｉＮＯＳの発現量の比較を示す図であり；図５Ｄは、各ラット群の心筋におけるＣＤ２０６発現量の比較を示す図であり；図５Ｅは、各ラット群の心筋におけるＩＬ−１０発現量の比較を示す図である。図中では、＊は、対照群（ＷＫＹ）との比較（ｐ＜０．０５）を示し；†は、担体で治療した担体群（Ｖｅｈ）との比較（ｐ＜０．５）を示し；‡は、ＡＤＳＣ群（ＡＤＳＣ）との比較（ｐ＜０．０５）を示す。（１群につきＮ＝１０）
【図５Ｂ】同上
【図５Ｃ】同上
【図５Ｄ】同上
【図５Ｅ】同上
【図６Ａ】図６Ａから図６Ｄは、実施例１において慢性期でのヒトＡＤＳＣ遠隔移植により解析された、心肥大及び線維症に対する影響の結果を示す図である。ここで、図６Ａは、各群の大型心筋細胞の断面積の比較を示す図であり；図６Ｂは、各ラット群の心筋におけるＢＮＰ遺伝子の発現量の比較を示す図であり；図６Ｃは、シリウスレッド染色後の線維症面積を示す定量的比較図であり；また、図６Ｄは、ヒドロキシプロリン量の解析結果を示す比較図である。図中では、＊は対照群（ＷＫＹ）との比較（ｐ＜０．０５）を示し；†は、担体により治療された担体群（Ｖｅｈ）との比較（ｐ＜０．５）を示し；‡は、ＡＤＳＣ群（ＡＤＳＣ）との比較（ｐ＜０．０５）を示す。（１群につきＮ＝５）
【図６Ｂ】同上
【図６Ｃ】同上
【図６Ｄ】同上
【図７Ａ】図７Ａから図７Ｃは、実施例２におけるインビトロ実験の解析結果を示す図である。ここで、図７Ａは、各群の心筋スーパーオキシド含有量を示す比較図であり；図７Ｂは、各群のＳＴＡＴ３の活性を示す比較図であり；図７Ｃは、各群のＩＬ−１０の発現量を示す比較図である。図中では、＊は、ＡＤＳＣ群との比較（ｐ＜０．０５）を示し；†は、ＢＰ／ＡＤＳＣ群との比較（ｐ＜０．５）を示し；‡は、ＢＰ／ＡＤＳＣ／ＳＩＮ群との比較（ｐ＜０．０５）を示す。（１群につきＮ＝５）
【図７Ｂ】同上
【図７Ｃ】同上
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明における精神と内容をより完全かつ理解し易くするために、異なる具体的な実施例を挙げて、本発明の実施形態をより詳細に説明する。なお、当業者にとっても理解すべきであるのは、本発明はこれらの実施例に限定されるものではなく、又、同一又は同等である他の機能及び工程を使用するとしても、本発明を達成することもできる。
【００２０】
まず、本明細書に使用される特定の用語又は名詞を描写的に説明する。
【００２１】
本明細書に特に他の定義をされない限り、本明細書に使用される科学的及び技術的用語は、本発明に属する分野の当業者により理解や慣用される意義と同じく意味する。
【００２２】
本明細書において、用語とされる「治療(treatment又はtreating)」とは、ある医療状況や、症状、疾患、病状、又は既存の状態を有する治療対象又は患者に対し、薬学的及び／又は生理学的効果を達成できる予防的、治療的又は緩和的治療措置を実施することにより、重症度、発生の遅延、及び／又は、病状の１つ以上の徴候、異常、及び／又は、病気発生の確率の抑制を部分的又は完全に軽減する行為を指す。前述の徴候、疾患、異常及び／又は医療状況は、坐骨神経損傷であり得る。
【００２３】
本明細書において、用語とされる「有効量(an effective amount)」とは、(administered、administering又はadministration)医療薬物が、患者に直接的又は間接的に投与されてから適切な期間を経過した後に、心室肥大を緩和するか、又は心室肥大を治療する効果や目的を完成し得るとき、その医療薬物が投与される特定な用量を指す。
【００２４】
本明細書において、述べられる「医学薬物」とは、局所的及び／又は全身的作用により、所望の医薬的及び／又は生理学的反応を誘起する可能な医薬的な活性を有する物質を指し、一般的には、医薬化合物(compound)、製剤(formulation)、組成物(composition)、薬剤(agent)、医薬品(medicine or medicament)、又は医薬活性化合物のプロドラッグ(prodrug)、誘導体(derivative)、又は類似体(analog)などを含む。
【００２５】
本明細書では、「治療の必要な対象(subject)」又は「患者(patient)」は互いに交替使用することができる。前記に用語とされる「治療対象」又は「患者」とは、化合物及び／又は方法による治療を受けられる動物、例えば、犬、猫、馬、羊、豚、牛などを含む哺乳動物のいずれか、及び、ヒト、人間以外の霊長類を指すが、これらに限定されるものではない。特に明記しない限り、「治療対象」又は「患者」は、雄性及び雌性である両方の性別を含む。さらに、好ましくは、本発明の医薬組成物及び／又は方法による治療に適用される治療の必要な対象又は患者は、ヒトである。
【００２６】
本明細書において、本発明の範囲を規定するために使用される数値及びパラメータには、個々の試験方法による標準偏差が含まれることが本質的に避けられないため、近似的な数値で表されるのが大半であるが、具体的実施例においては、関連する数値をできるだけ正確に表示するとされている。
本明細書において、「約」とは、普段、本発明に属する領域における当業者の考えによって決められるが、一般に、実際の値が平均値の許容可能な標準誤差内に入るべき、例えば、実際の値を、特定の数値又は範囲の±１０％、±５％、±１％、又は±０．５％以内にすることを意味する。
【００２７】
本発明の開示内容によれば、幹細胞と薬学的に許容される担体とを含む心肥大の治療に用いられる医薬組成物を提供することができる。ここで、前記幹細胞は、ｎ‐ブチリデンフタリドにより前処理・反応して得られる。
本発明の技術的思想によれば、前処理・反応において、ｎ‐ブチリデンフタリドの濃度（μｇ）は、一般的に７μｇ／ｍＬ〜４０μｇ／ｍＬにする範囲であるが、好ましくは、７μｇ／ｍＬ〜３５μｇ／ｍＬにする範囲であり；より好ましくは、７μｇ／ｍＬ〜３０μｇ／ｍＬにする範囲であり；最も好ましくは、７μｇ／ｍＬ〜２５μｇ／ｍＬにする範囲である。
前処理・反応は、２０〜４０℃の範囲とする条件の下で幹細胞をｎ‐ブチリデンフタリドと反応させることを含む。好ましくは２５〜４０℃の範囲であり；より好ましくは３０〜４０℃の範囲であり；最も好ましくは３５〜４０℃の範囲とする条件の下で幹細胞をｎ‐ブチリデンフタリドと反応させる。さらに、反応時間は、６〜２４時間とするが、好ましくは７〜２４時間とし；より好ましくは８〜２４時間とし；最も好ましくは１０〜２４時間にする範囲である。
【００２８】
また、本発明の技術的思想によれば、幹細胞は、臍帯血幹細胞、末梢血幹細胞、神経幹細胞、表皮幹細胞、筋肉幹細胞、脂肪幹細胞、骨髄幹細胞、角膜幹細胞、肝臓幹細胞、及び腸管上皮幹細胞からなる群から選択される少なくとも１つであり、好ましくは、臍帯血幹細胞、末梢血幹細胞、神経幹細胞、脂肪幹細胞、骨髄幹細胞、肝臓幹細胞、及び腸管上皮幹細胞からなる群から選択される少なくとも１つであり、より好ましくは、臍帯血幹細胞、末梢血幹細胞、神経幹細胞、脂肪幹細胞、及び骨髄幹細胞からなる群から選択される少なくとも１つであり、最も好ましくは、臍帯血幹細胞、脂肪幹細胞、及び骨髄幹細胞からなる群から選択される少なくとも１つである。
【００２９】
以下、実施例により本発明の具体的な実施形態を説明するが、本発明の範囲は、下記の実施例に限定されない。
【実施例】
【００３０】
なお、本発明の実施例で行った細胞培養実験及び動物実験は、中国医科大学の実験動物管理・使用ガイド（許可番号：２０１８‐０４３）に準拠して行われ、及び米国国立衛生研究所の実験動物管理・使用ガイド(１９９６年に改訂されたＮＩＨ Ｐｂｕｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．８５‐２３）によって確認された。
≪ヒトＡＤＳＣｓの分離≫
【００３１】
本発明に係わる実施例に使用されるヒト脂肪幹細胞（ＡＤＳＣｓ）は、市販されたキット（Ｓｔｅｍｐｒｏ  ｈｕｍａｎ  ＡＤＳＣ  ｋｉｔ、  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カリフォルニア州カールスバッド）をＧＷＯＸＩ幹細胞社により購入して供給された。前記ＡＤＳＣｓは、１０％のＦＢＳ(Ｓｅｒａｎａ)及び１％のペニシリン／ストレプトマイシン(Ｈｙｃｌｏｎｅ)低グルコースＤＭＥＭ培地(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)を使用して培養した後、さらにＴｒｙｐＬＥ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて継代培養を行った。このように継代培養により得られた幹細胞は、第一継代の幹細胞として呼ばれる。本発明に係わる実施形態で用いたＡＤＳＣｓは、第３〜５継代の幹細胞である。当該ＡＤＳＣｓはそれぞれ同一であり、いずれも内皮細胞又は造血系統(ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｌｉｎｅａｇｅｓ)を含まない幹細胞である。さらに、培養されたＡＤＳＣｓは、間葉系幹細胞表現型であって、間葉系幹細胞マーカーとしてのＣＤ９０（＞９５％）を示すが、造血マーカーとしてのＣＤ３１及びＣＤ４５（＜２％）を示さない幹細胞である。
≪ＢＰ前処理≫
【００３２】
まず、Ａｌｆａ Ａｅｓａｒから購入されたｎ‐ブチリデンフタリド(ＢＰ：n-butylidenephthalide)をジメチルヒドラジンに溶解し、濃度７μｇ／ｍｌのＢＰ溶液に調製した。その後、当該ＢＰ溶液に、１×１０６〜１×１０７個のＡＤＳＣｓを投入して前処理を１６時間に行った後、ＢＰにより前処理されたＡＤＳＣｓを得た。
【００３３】
直接的な薬物作用を除去するために、細胞を移植する前には当該細胞をＰＢＳで３回洗浄しておく。
以下、前記ＢＰにより前処理されたＡＤＳＣｓに対しＰＢＳで３回洗浄されて得たものを「ＢＰ−ＡＤＳＣｓ」として略称する場合もある。
≪実施例１≫
【００３４】
心肥大症状を有する１２週齢の雄性の高血圧自然発症ラット（ＳＨＲ）をランダムに担体群、ＡＤＳＣ群、及びＢＰ／ＡＤＳＣ群という３つの群に分けた。そして、前記担体群に属するＳＨＲの右脚筋に対し、被験物質としてＰＢＳを３０μｌ注射し；前記ＡＤＳＣ群に属するＳＨＲの右脚筋に対し、被験物質として１×１０６個のＡＤＳＣｓ（ＡＤＳＣｓを３０μｌのＰＢＳに混合したもの）を注射し；ＢＰ／ＡＤＳＣ群に属するＳＨＲの右脚筋に対し、被験物質として１×１０６個のＢＰにより前処理されたＡＤＳＣｓ（ＢＰ−ＡＤＳＣｓを３０μｌのＰＢＳに混合したもの）を注射した。また、対照群としては、同齢かつ正常血圧である雄性のＷｉｓｔａｒ‐Ｋｙｏｔｏ（ＷＫＹ）ラットを選択して採用された。
【００３５】
そして、各群のラットに対し、続いて、個別飼育する。飼育期間は、被験物質の注射した後から３日までの急性段階と、被験物質の注射した後から５６日までの慢性段階という２つの段階に分けられた。各段階終了直後に、各群のラットに対し、後述の急性段階試験と、慢性段階試験とを行った結果をそれぞれ分析評価した。
ここで、急性段階試験は、被験物質の注射した後から３日まで飼育したラットをそれぞれ殺して、各群のラットの右脚筋（すなわち注射部位）及び摘出された心臓に対し、解析を行った。急性段階試験は、被験物質の注射した後から５６日まで飼育したラットをそれぞれ殺して、各群のラットから摘出した心臓に対し、解析を行った。
【００３６】
次に、本発明に係わる実施例における各試験の標準的な操作方法について説明する。
（血行動態測定）
【００３７】
８週間の飼育をした後の目覚めているラットの動脈血圧を、朝の環境温度が２２℃である暗室にて、テールカフシステム（ＢＰ‐９８Ａ、中国北京ソフトトロン北京）を用いて測定した。結果を表１に示す。
【００３８】
次に、ゾレチル（５０ｍｇ／ｋｇ）を用いて腹腔内注射を行うことにより軽く麻酔されたラットに対し、１４ＭＨｚプローブを備えたＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｖｉｖｉｄ  ７  Ｕｌｔｒａ−ｓｏｕｎｄ  Ｓｙｓｔｅｍ（ウィスコンシン州ミルウォーキー）を用いて心エコー検査を行うことにより、左心室（ＬＶ）のＭモード心エコー図を傍胸骨長軸断面像から得ると共に、中隔サイズ、左心室拡張末期径（ＬＶＥＤＤ）、左心室収縮末期径(ＬＶＥＳＤ)、及び左心室後壁のサイズを得て、左室内径短縮率(Ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ  Ｓｈｏｒｔｅｎｉｎｇ)を換算した。
【００３９】
その後、ラットを殺し、心臓を摘出し、心房と右心室を剪断し、左心室筋を冷たい生理食塩水内で洗浄してから秤量した直後、直ちに液体窒素で凍結して使用に備える。
（ウェスタンブロッティング法によるＳＴＡＴ３の解析）
【００４０】
液体窒素中に保存した前述の左心室自由壁（ｆｒｅｅ  ｗａｌｌ）から試料を採取した。ｐ−ＳＴＡＴ３（Ｔｙｒ７０５）（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国・マサチューセッツ州ダンバーズ）、全ＳＴＡＴ３（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、及びβ‐アクチン（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カリフォルニア州サンタクルーズ）に対する抗体を使用した。
試料をホモジナイズした後、ＢＣＡタンパク質試薬セット（Ｐｉｅｒｃｅ、イリノイ州ロックフォード）を使用してタンパク質濃度を測定した。
タンパク質２０μｇの試料を８％のＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した後、ニトロセルロース膜に移行して前記抗体とを更にインキュベートした。その後、5‐bromo‐4‐chloro‐3‐indolyl‐phosphate and nitroblue tetrazolium chloride（Ｓｉｇｍａ）を用いて抗原‐抗体複合体を検出すると共に、リニア範囲の露光レベルを密度スキャナーで検出した。
このような試験を３回繰り返し、平均値を以って試験結果を表す。
（リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによるヒトＡｌｕ、ＩＬ−６、ＩＬ−１β、ｉＮＯＳ、ＣＤ２０６、ＩＬ−１０、及びＢＮＰの解析）
【００４１】
本実施例では、左心室筋から得られた試料をＴａｑＭａｎシステム（Ｐｒｉｓｍ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ、ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）でＲＴ−ＰＣＲ試験を行うことにより、試料中のＭ１マクロファージ（ＩＬ−６、ＩＬ−１β、ｉＮＯＳ）及びＭ２マクロファージにおけるマーカー遺伝子（ＣＤ２０６、ＩＬ−１０）の発現を測定した。
また、心肥大に係わる分子的特徴としては、成人の心臓におけるＢ型ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）の先天性心疾患遺伝子の再活性化を含むことを踏まえて、心肥大のことを確認するために、遺伝子の発現を測定すると共に、ＢＮＰをもＲＴ−ＰＣＲで測定した。
【００４２】
ＲＴ−ＰＣＲを実施する際には、下記の表１に示すプライマー配列を用いて、４５回のサイクル（９５℃（１０秒）→６０℃（５秒）→７５℃（１０秒））の増幅をＴａｑＭａｎシステムにて実施した。そして、ターゲットテンプレートに対する閾値サイクルの対数的検量線を作成し、ハウスキーピング遺伝子(ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ  ｇｅｎｅ)としてのシクロフィリン（Ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ）の発現に基づいて各遺伝子の発現量を換算して算出した。
【００４３】
【表１】
2020183369.tif 000003
（ヒトミトコンドリア、ニトロチロシン、ＣＤ６８、ｉＮＯＳ、及びＩＬ−１０の免疫組織化学的染色解析、並びにスーパーオキシドの検出）
【００４４】
注射からの３日になったときに得られた大腿後筋及び心筋試料を用いて、ＡＤＳＣｓが各群のラットの組織にうまく移植されたかどうかを確認した。
その後、組織試料を２‐メチルブタンで凍結させてから凍結組織切片作製用包埋剤（ティシュー・テック、トーランス）に包埋し、ミクロトームで５μｍの切片を得た。
切片をＰＢＴｘ（トリトンＸ−１００を０．１％含有するＰＢＳ）で洗浄した後、ＢＳＡ（Ａｍｒｅｓｃｏ）１％及び正常ヤギ血清（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）１．５％を含有するＰＢＴｘを用いて、反応を３７℃で１時間行った。次に、切片を一次抗体、抗ヒトミトコンドリア（１：１００、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）及び抗肉腫性アルファアクチニン抗体（１：１００、アブカム、イギリスケンブリッジ）と４℃で一晩反応させた。
【００４５】
また、スーパーオキシドが心筋細胞内に生成されるか否かを評価するためには、ＯＣＴで包埋した組織を用いてＤＨＥと反応させてから、イン・サイチュ（Ｉｎ  ｓｉｔｕ）ジヒドロエチジウム（ＤＨＥ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、米国オレゴン州ユージーン）蛍光により、心筋細胞におけるスーパーオキシドの生成があるか否かを評価する。つまり、パラフィンを用いて包埋した組織（５μｍ）をＤＨＥ含有ＰＢＳ（１０ｍＭ）に浸し、そして加湿容器に入れ、暗所内でかつ室温で３０分間インキュベートした後、組織でのスーパーオキシドラジカルが生成するかとの証明としての赤色蛍光信号を画像測定で検出すると共に、レポートを、ランダム画像の密度が平方ミリメートルあたりにするように出力する。
なお、赤色蛍光による検出は、非特異的DHE酸化生成物からの干渉を最小限にするために、４８０ｎｍから４０５ｎｍの波長範囲で励起して行われた。
【００４６】
一方、試料の移植からの５６日になった後に、マクロファージの分極の変位があるか否かを確認するためには、各群におけるラットの左心室筋をそれぞれ免疫組織化学的染色してマクロファージＭ１及びＭ２を分析した。
【００４７】
組織を凍結包埋剤（ＯＣＴ）に入れて、組織形態を維持するように冷却降温させた。そして、凍結切片化した後、ＣＤ６８に対する抗体（全てのマクロファージのマーカー；アブカム、マサチューセッツ州ケンブリッジ）、ｉＮＯＳ（Ｍ１のマーカー；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国マサチューセッツ州ダンバーズ）及びＩＬ−１０（Ｍ２ｃのマーカー；  Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、英国アビングドン）とを併せて反応させた一方、同型かつ同じ直接コンジュゲートした抗体をネガティブ対照群とした。軌道上の標的密度は、コンピュータ化平面法（Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓ、Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ、メリーランド州シルバースプリング）により計算した。４００倍の倍率下で、１０個の視野をランダムに選択し、標的密度を定性的に評価する上に、総面積に対するマーカー面積の比率で表示する。
（心筋細胞サイズ及び心筋線維症の形態解析）
【００４８】
心肥大は反応性線維症と心筋細胞肥大を組み合わせる病変であることを踏まえて、この実施例では、他の非心筋細胞からの干渉の発生可能性を避けるために、心筋重量のみを測定するだけでなく、併せて心筋細胞のサイズをも測定した。
【００４９】
試料の移植からの５６日になった直後のラットの左心室筋切片を１０％ホルマリンで固定すると共にパラフィン内に包埋した。各切片をヘマトキシリン(ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ)及びエオシン(ｅｏｓｉｎ)で染色処理した。左心室筋の異なる領域における心筋細胞の大きさの差がなくなるためには、切片のサンプリング位置を、左心室筋の中央部とした。次に、解析結果の一貫性を維持するためには、観察により、スライス面に垂直したと共に、明瞭に見られる細胞核及び細胞膜を有し、かつ明瞭で切れ目のない細胞輪郭を有する心筋細胞を選択してから、心筋細胞の横断面積を測定する。
【００５０】
測定方法は、コンピュータ化平面法（Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓ、Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ、メリーランド州シルバースプリング）を用い、実験プロセスを知らないオペレータにより、画像解析システムの４００倍の倍率でのデジタル画像から心筋細胞を１００個選択して解析を行った。
【００５１】
さらに、心臓線維症の形態解析は、アニリンブルー及びコラーゲン特異的染色剤シリウスレッド（Ｓｉｒｉｕｓ  Ｒｅｄ  Ｆ３ＢＡ）（Ｐｆａｌｔｚ＆Ｂａｕｅｒ、コネチカット州スタンフォード）を用いて、左心室冠状動脈部位のパラフィン包埋切片（厚さは５μｍ）を染色した。自動画像解析器（Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓ、カリフォルニア）により、シリウスレッドで染色した切片を定量的形態計測し、間質コラーゲン部分を確定した。
これらの数値は、少なくとも２人の研究者により一重盲検法で評価された。４００倍の倍率下で、ランダムに選択した１０個の視野に対し、マーカー領域の密度を定性的に評価した。この数値は、総面積に対するマーカー面積の比率で表示した。
（実験室の測定）
【００５２】
組織コラーゲンの結果は、Ｓｔｅｇｅｍａｎｎ及びＳｔａｌｌｅｒ修飾ヒドロキシプロリンアッセイを用いて確認した。左心筋の自由壁から採取した試料を取り出した直後、直ちに液体窒素に入れ、ヒドロキシプロリン含有量を測定するまで引き続いて‐８０℃で保存した。さらに、組織重量あたりのヒドロキシプロリン含有量を結果として算出した。
【００５３】
ＳＴＡＴ３のＤＮＡ結合活性を評価するためには、心筋ホモジネートを調製した上に、市販のキットであるＴｒａｎｓＡＭ  ＳＴＡＴ３転写因子アッセイキット(Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ) 及びその解析方法を使用することによりＥＬＩＳＡ解析を行った。
【００５４】
Ｍ２ｃマクロファージに対し、心筋におけるＩＬ−１０の活性を測定した。左心室自由壁から採取した心筋組織を、抽出緩衝液（リン酸カリウム緩衝液５０ｍＭ、ｐＨ７．０、ＥＤＴＡ１ｍＭ、エチレングリコールテトラ酢酸１ｍＭ、フェニルメタンスルホニルフルオリド０．２ｍＭ、ペプスタチン１μｇ／ｍＬ、ロイペプチン０．５μｇ／ｍＬ、ＮａＦ１０ｍＭ、Ｎａ３ＶＯ４２ｍＭ、及びβ‐メルカプトエタノール１０ｍＭ）の中にホモジナイズした後、４℃の温度条件下で、３０分間、１４，０００ｇの回転数で遠心分離した。その後、市販のＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、心筋における膜結合型ＩＬ−１０の分数を測定した。
【００５５】
ルシグニン（５μＭのビス‐Ｎ‐メチルアクリジニウムニトレート、Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）により増強された化学発光を用いて、上記のように心筋からのスーパーオキシドの生成があるか否かを検出した。バックグラウンド活性を差し引いたにより、特異的化学発光信号を計算し、毎分ミリグラム（ｃｐｍ／ｍｇ）で表した。
（統計解析）
【００５６】
解析結果は、平均値±ＳＤとして表される。ＳＰＳＳ統計解析ソフトウェア（ＳＰＳＳ、バージョン１９．０、イリノイ州シカゴ）を用いて統計解析を行った。各群のラット同士間の差異は、ＡＮＯＶＡによりテストした。顕著的な効果の場合に、各群の間の測定値をBonferroni'sの校正と比較した。０．０５未満であるＰ値は、統計が有効であることを表す。
【００５７】
次に、様々な解析の試験結果について説明する。
（ヒトＡＤＳＣsの特徴）
【００５８】
フローサイトメトリーによる解析した後、ＡＤＳＣｓはＣＤ７３、ＣＤ９０、及びＣＤ１０５に対して高度に陽性であったが、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５、及びＨＬＡ−ＤＲに対しては陽性ではなかったことが分かった。従って、本発明の実施例において培養されたヒトＡＤＳＣｓの表現型は、ＣＤ７３ｐｏｓ／ＣＤ９０ｐｏｓ／ＣＤ１０５ｐｏｓ／ＣＤ１４ｎｅｇ／ＣＤ１９ｎｅｇ／ＣＤ３４ｎｅｇ／ＣＤ４５ｎｅｇ／ＨＬＡ−ＤＲｎｅｇである。
【００５９】
これらのＡＤＳＣｓは同一で、内皮細胞又は造血系統を含まないものであると共に、移植前の１６時間のＢＰによるＡＤＳＣの前処理を行っても、細胞マーカーは顕著的に変化されない。
（急性段階（３日間）の解析結果）
【００６０】
急性段階解析用試料としては、移植からの３日後の各群におけるラットから採取した右脚筋（移植帯）及び左心室筋を使用した。
【００６１】
（右脚筋及び心筋のスーパーオキシドに対するＡＤＳＣ移植の影響）
【００６２】
各群におけるラットの右脚筋及び左心室筋の試料をルシグニンで化学発光増強し、スーパーオキシドからの特異的化学発光信号を検出してから、得られた結果を表２に記録すると共に、図１Ａ及び図１Ｃにてそれぞれプロットした。
【００６３】
また、各群におけるラットの右脚筋及び左心室筋の試料に対し、それぞれＤＨＥ蛍光染色を行ってから、その試料の赤色蛍光量を蛍光顕微鏡で撮影し、その結果を表２に記録すると共に、図１Ｂ及び図１Ｄにて、それぞれプロットした。
【００６４】
また、ラットに移植されたヒトＡＤＳＣｓの生存率を定量化するためには、各群におけるラットの右脚筋試料をそれぞれ抗ヒトミトコンドリア抗体(ａｎｔｉ‐ｈｕｍａｎ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ  ａｎｔｉｂｏｄｙ)で染色してから、試料中のミトコンドリア陽性細胞の割合を解析した後、表２に記録すると共に、図１Ｅにプロットした。
【００６５】
試料移植からの３日になった後の各群におけるラットの左心室筋試料は、抗ヒトミトコンドリア抗体の染色により幹細胞の存在を検出することができなかった。よって、体内の免疫組織化学が少数の細胞の検出に十分に敏感でないという問題を避けるためには、心室筋試料中のＡｌｕ遺伝子の発現（使用したプライマー配列を表３に示す）をＰＴ−ＰＣＲにより解析した。そして、解析結果を表２に記録すると共に、図１Ｆにプロットした。
【００６６】
【表２】
2020183369.tif 000004
【００６７】
図１Ａに示される右脚筋試料の特異的化学発光信号の結果から分かったように、担体群のスーパーオキシド含有量は、対照群のスーパーオキシド含有量（Ｐ＜０．０１）より顕著に高いが、ＡＤＳＣ群とＢＰ／ＡＤＳＣ群のスーパーオキシド含有量は担体群と比べて顕著に減少し、そのうち、ＢＰ／ＡＤＳＣ群の減少幅が最も大きかった。
また、図１Ｂに示されるＤＨＥ蛍光染色解析結果図からも、相応の結果を観察することができる。
【００６８】
同様に、図１Ｃに示される左心室筋試料の特異的化学発光信号の結果から分かったように、担体群のスーパーオキシド含有量は、対照群のスーパーオキシド含有量（Ｐ＜０．０１）より顕著に高いが、ＡＤＳＣ群とＢＰ／ＡＤＳＣ群のスーパーオキシド含有量は、担体群と比べて顕著に減少し、そのうち、ＢＰ／ＡＤＳＣ群の減少幅が最も大きかった。
また、図１Ｄに示されるＤＨＥ蛍光染色解析結果図からも、相応の結果を観察することができる。
【００６９】
具体的に、右脚筋のスーパーオキシドの低減効果に関しては、担体群よりも、ＡＤＳＣ群は約２１．６８％減少し、ＢＰ／ＡＤＳＣ群は約４５．４５％減少し、ＢＰ／ＡＤＳＣはＡＤＳＣの最大２．１倍程度の低減効果を有することを示している。
次に、左心室筋におけるスーパーオキシドの減少効果に関して、担体群よりも、ＡＤＳＣ群は１７．２８％減少し、ＢＰ／ＡＤＳＣ群は約２３．０５％減少し、ＢＰ／ＤＳＣがＡＤＳＣの最大１．３３倍程度の低減効果を有することを示している。
従って、上記の結果から分かるように、ＡＤＳＣ又はＢＰ／ＡＤＳＣを体内に移植すると、いずれも、高血圧によって増加したスーパーオキシド含有量を効果的に減少させることができるが、ＢＰ／ＡＤＳＣの低減効果はＡＤＳＣの効果よりはるかに高い。
また、投与に関しては、ＢＰ／ＡＤＳＣは、心臓から移植される必要はなく、遠位端（例えば右脚筋）から移植されればよいので、患者の危険性を減らすという優れた効果を有する。
【００７０】
図１Ｅに示す抗ヒトミトコンドリア抗体の染色解析の結果から分かるように、試料が移植された領域（右脚筋）から観察すると、ＡＤＳＣ群におけるミトコンドリア陽性細胞（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｃｅｌｌ）の割合は、７．６±１．３％であるが、ＢＰ／ＡＤＳＣ群におけるミトコンドリア陽性細胞の割合は、１５．４±５．６％までに増加され、顕著な増加があった（Ｐ＜０．０５）から、ＡＤＳＣがＢＰによって前処理されてから移植すると、筋肉内のＡＤＳＣｓの生存率を効果的に上昇させることができることを示している。
【００７１】
また、図１Ｆに示した左心室筋試料におけるＡｌｕ遺伝子発現量の結果から分かるように、対照群、担体群、ＡＤＳＣ群、及びＢＰ／ＡＤＳＣ群の各左心室筋試料において、Ａｌｕ遺伝子発現量は顕著的差なしにほぼ等しいことから、遠隔移植（例えば、右脚筋）のＡＤＳＣは、注射部位から心臓へ顕著に移行しなかったことを示している。
（慢性段階（５６日間）の解析）
【００７２】
慢性段階解析用試料は、５６日の移植の後各ラット群の左心室筋から採取した。各群の血行動態データが表３に示される。
【００７３】
【表３】
2020183369.tif 000005
【００７４】
細胞移植の前に、ＳＨＲ群は、同様の体重基準を有し、表１に示した結果から分かるように、担体群、ＡＤＳＣ群、及びＢＰ／ＡＤＳＣ群の体重が細胞移植して５６日後にほぼ同様になったから、被験者の体重は細胞移植によって顕著に変化することはないことを示している。
【００７５】
また、脛骨の長さに対する左心室の重さの比に関しては、対照群より担体群が６９％増加し、担体群は心肥大の症状を有することが示されている。担体群と比べて、ＡＤＳＣ群及びＢＰ／ＡＤＳＣ群は、それぞれ１１．６％及び１６．７％減少し、ＡＤＳＣ及びＢＰ／ＡＤＳＣは高血圧による心肥大を効果的に低減させ、しかも、ＢＰ／ＡＤＳＣは、ＡＤＳＣの最大１．４４倍の減少効果を有することを示している。
【００７６】
さらに、例えば、血圧及び心拍の統計データなどの他の血行動態パラメータを比較したところ、担体群、ＡＤＳＣ群、及びＢＰ／ＡＤＳＣ組織の間に顕著的な差はないことが発見された。また、ＡＤＳＣによる心肥大の治療は、非血行作用（non‐hemodynamic）によるものであることが示されている。さらに、各ラット群は、注射部位の周囲に局所感染又は炎症を有さなかった。
【００７７】
（心臓ＲＯＳ及びＳＴＡＴ３の活性化に対するヒトＡＤＳＣ遠隔移植の影響）
【００７８】
各ラット群の左心室筋試料は、化学発光がルシグニンにより増強され、スーパーオキシドからの特異的化学発光信号を検出し、その結果を表４に記録すると共に、図２Ａにプロットした。
【００７９】
また、各ラット群の右脚筋及び左心室筋試料をＤＨＥ蛍光染色し、蛍光顕微鏡で撮影して試料の赤色蛍光量を解析し、その結果を表４に記録すると共に、図２Ｂにプロットした。
【００８０】
【表４】
2020183369.tif 000006
【００８１】
図２Ａに示す左心室筋試料の特異的化学発光信号の結果から分かるように、担体群よりＡＤＳＣ群及びＢＰ／ＡＤＳＣ群のスーパーオキシド含有量は、いずれも顕著に低減した（Ｐ＜０．００１）。そのうち、ＢＰ／ＡＤＳＣ群のスーパーオキシド含有量は、ＡＤＳＣ群に比べて低減した幅は最も大きかった。
具体的には、慢性期解析において、左心室筋におけるスーパーオキシドの減少効果に関しては、担体群よりＡＤＳＣ群は約２４．４２％減少し、ＢＰ／ＡＤＳＣ群は約３５．９４％減少し、ＢＰ／ＡＤＳＣはＡＤＳＣの最大約１．５倍の低減効果を有することが示されている。
また、図２Ｂに示したＤＨＥ蛍光染色の解析結果から分かるように、担体群の蛍光強度は対照群より遥かにに高いが、ＡＤＳＣ群及びＢＰ／ＡＤＳＣ群の蛍光強度は、いずれも担体群より顕著に低減し、そのうち、ＡＤＳＣ群と比べてＢＰ／ＡＤＳＣ群の蛍光強度の低減した幅は最大であることから、その結果は特異的化学発光信号の結果と一致した。
【００８２】
また、ウェスタンブロッティング法による解析の結果が以下の表５及び図３Ａに示される。図３Ａの結果から分かるように、担体群における全ＳＴＡＴ３に対するｐ−ＳＴＡＴ３（ｐｈｏｓｐｈｏ−ＳＴＡＴ３）の割合（ｐ−ＳＴＡＴ３／全ＳＴＡＴ３）は、対照群より遥かに低減し（Ｐ＜０．０５）、ＡＤＳＣは、ｐ−ＳＴＡＴ３の割合を１５６±２１％に増加することができるから（Ｐ＜０．０１）、ＡＤＳＣの使用が活性化を効果的に促進できることを示している。さらに、ｐ−ＳＴＡＴ３活性化の効果に関して、ＢＰ／ＡＤＳＣ群（２．４５±０．１４％）は、ＡＤＳＣ群（２．１９±０．１９％）の約１．１２倍の高さを有する。
【００８３】
また、ＥＬＩＳＡ法によるＳＴＡＴ３のＤＮＡ結合活性への検出の結果は、下記の表５及び図３Ｂに示される。図３Ｂの結果から分かるように、ＡＤＳＣ群（１．４５±０．１９）は担体群（１．０５±０．１２）より約１．３８倍増加し、ＢＰ／ＡＤＳＣ群（１．７６±０．１４）は担体群（１．０５±０．１２）より約１．６８倍増加したことから、ＢＰ／ＡＤＳＣ群のＳＴＡＴ３のＤＮＡ結合活性は、ＡＤＳＣ群よりも顕著に高くなり、ＡＤＳＣ群の約１．２２倍であることを示している。その結果は、ウェスタンブロッティング法により解析して得られた結果と一致した。
【００８４】
また、各群におけるラットの左室筋のＳＴＡＴ３活性化の程度を評価するために、抗ｐ（Ｔｙｒ７０５）‐ＳＴＡＴ３抗体を用いて免疫組織化学的染色を行い、蛍光顕微鏡写真からＳＴＡＴ３核移行度合いを解析した。得られた定量化データは表５に記録すると共に、図３Ｃにプロットした。
【００８５】
図３Ｃの結果から分かるように、ＢＰ／ＡＤＳＣ群におけるＳＴＡＴ３の核移行度合いは、担体群及びＡＤＳＣ群より遥かに高く、その解析結果は、上記のウェスタンブロッティング法及びＥＬＩＳＡ法の解析結果と一致した。
【００８６】
【表５】
2020183369.tif 000007
【００８７】
（心臓マクロファージの表現型バイアスＭ２型に対するヒトＡＤＳＣ遠隔移植の影響）
【００８８】
心筋におけるヒトＡＤＳＣｓと宿主マクロファージとの相互作用を検討するために、免疫組織化学的染色を用いて異なる表現型についての特異的マーカーを鑑定して解析した。マクロファージ極性化表現型は、主に、Ｍ１とＭ２に分類することができ、ここでマクロファージＭ１は炎症誘発性であり、マクロファージＭ２は炎症消去を促進し炎症の過程を軽減することができる。
【００８９】
免疫組織化学的染色による結果は、ＣＤ６８＋マクロファージ（ＣＤ６８＋マクロファージ）が浸潤していることが示される。
担体群と比較して、表６及び図４Ａに示されるように、ＡＤＳＣ群におけるｉＮＯＳ発現のＣＤ６８＋マクロファージ（ｉＮＯＳ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ＣＤ６８＋  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）の割合は、顕著に減少した（担体群で１２±４％、ＡＤＳＣ群で４±２％、Ｐ＜０．０５）。
また、担体群と比較して、表６及び図４Ｂに示すように、ＡＤＳＣ群におけるＩＬ−１０発現を有するＣＤ６８＋マクロファージ（ＩＬ−１０−ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ＣＤ６８＋  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）の割合は、顕著に増加した（担体群で５±３％、ＡＤＳＣ群で１６±５％、Ｐ＜０．０５）。
【００９０】
【表６】
2020183369.tif 000008
【００９１】
また、マクロファージの表現型の変化をさらに確認するために、各ラット群の左心房筋におけるマクロファージＭ１型ｍＲＮＡ（ＩＬ−６、ＩＬ−１β、及びｉＮＯＳ）及びマクロファージＭ２型ｍＲＮＡ（ＣＤ２０６、及びＩＬ−１０）の発現量をＲＴ−ＰＣＲによって解析した。その結果は表７に示され、図５Ａ〜５Ｅにプロットする。
【００９２】
【表７】
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【００９３】
表７及び図５Ａ〜図５Ｅの結果から分かるように、マクロファージＭ１型のｍＲＮＡ（ＩＬ−６、ＩＬ−１β、及びｉＮＯＳ）の解析結果に関して、ＡＤＳＣ群におけるＩＬ−６の発現量は１．５２±０．１９でり、担体群（１．７７±０．１２）よりも約１４．１２％減少し、ＩＬ−１βの発現量は１．６８±０．１であり、担体群（１．８９±０．１２）よりも約１１．１１％減少し、ｉＮＯＳの発現量は１．５±０．１１であり、担体群（１．６９±０．０９）よりも約１１．２４％減少し、さらに、ＢＰ／ＡＤＳＣ群におけるＩＬ−６の発現量は１．３９±０．１２であり、担体群（１．７７±０．１２）よりも約２１．４７％減少し、ＩＬ−１βの発現量は１．５２±０．１２であり、担体群（１．８９±０．１２）よりも約２０．５８％減少し、そしてｉＮＯＳの発現量は１．３８±０．０８であり、担体群（１．６９±０．０９）よりも約１８．３４％減少した。
【００９４】
さらに、ＩＬ−６の発現量の比較では、ＢＰ／ＡＤＳＣ群の減少度合いはＡＤＳＣ群の約１．５２倍であり、ＩＬ−１βの発現量の比較では、ＢＰ／ＡＤＳＣ群の減少度合いはＡＤＳＣ群の約１．８５倍であり、並びに、ｉＮＯＳ発現量の比較では、ＢＰ／ＡＤＳＣ群の減少度合いはＡＤＳＣ群の１．６３倍であり、ＡＤＳＣ群よりもＢＰ／ＡＤＳＣ群がマクロファージのＭ１含有量を効果的に減少することができ、炎症の発症率を減少させることを示している。
【００９５】
また、マクロファージＭ２のｍＲＮＡ（ＣＤ２０６、ＩＬ−１０）の解析結果に関して、ＡＤＳＣ群におけるＣＤ２０６の発現量は１．９８±０．１８であり、担体群（１．１８±０．１２）よりも約１．６８倍増加し、ＩＬ−１０の発現量は１．８８±０．１９であり、担体群（１．２６±０．２２）よりも約１．４９倍増加し、さらにＢＰ／ＡＤＳＣ群のＣＤ２０６の発現量は２．１６±０．１６であり、担体群（１．１８±０．１２）よりも約１．８３倍増加し、ＩＬ−１０の発現量は２．３８±０．１５であり、担体群（１．２６±０．２２）よりも約１．８９倍増加した。
【００９６】
なお、ＣＤ２０６の発現量の比較において、ＢＰ／ＡＤＳＣ群の上昇はＡＤＳＣ群の約１．１倍であり、ＩＬ−１０の発現量の比較において、ＢＰ／ＡＤＳＣ群の上昇はＡＤＳＣ群の約１．２７であり、ＢＰ／ＡＤＳＣ群がＡＤＳＣ群よりマクロファージのＭ２の含有量を効果的に増やすことができ、炎症の消去を促進し、炎症過程を減らすことを示している。
【００９７】
（心肥大及び線維症に対するヒトＡＤＳＣ遠隔移植の影響）
【００９８】
対照群の心筋細胞断面積に対する担体群、ＡＤＳＣ群、及びＢＰ／ＡＤＳＣ群の割合が表８及び図６Ａに示される。図６Ａの結果から分かるように、担体群の心筋細胞は対照群の心筋細胞より顕著に大きく、ＡＤＳＣ群及びＢＰ／ＡＤＳＣ群の心筋細胞の断面積は担体群よりも小さい。より具体的には、ＡＤＳＣ群の心筋細胞断面積の割合は１．３８倍であり、担体群より約１３％減少した。
一方、ＢＰ／ＡＤＳＣ群の心筋細胞断面積の割合は１．２４倍であり、担体群より約２２％減少した。また、この結果から、ＢＰ／ＡＤＳＣ群における心筋細胞の断面積減少の効果はＡＤＳＣ群よりも優れており、ＡＤＳＣ群の約１．６９倍であったことが分かった。
【００９９】
また、各ラット群の左心房筋におけるＢＮＰ遺伝子ｍＲＮＡ（病理性心肥大のマーカー）の発現をＲＴ−ＰＣＲにより解析した結果が表８及び図６Ｂに示される。図６Ｂの結果から分かるように、担体群のＢＮＰ遺伝子発現は対照群の約２．７３倍であり（Ｐ  ＜０．０００１）、ＡＤＳＣ群及びＢＰ／ＡＤＳＣ群のＢＮＰ遺伝子発現は担体群より低減した。
より具体的には、ＡＤＳＣ群のＢＮＰ遺伝子発現は０．９８±０．１１であり、担体群より約３１％低減したが、ＢＰ／ＡＤＳＣ群のＢＮＰ遺伝子発現は０．７６±０．０８倍であり、担体群より約４６％低減した。さらに、その結果から分かるように、ＢＰ／ＡＤＳＣ群は、ＢＮＰ遺伝子発現を抑制する効果がＡＤＳＣ群よりも優れてＡＤＳＣ群の約１．４８倍であり、その結果は前述の組織学的結果と一致した。
【０１００】
ピクロシリウス（シリウスレッド）染色によるコラーゲン面積率解析及びヒドロキシプロリン含有量解析（コラーゲン面積率及びヒドロキシプロリン含有量）の結果が表８に示され、図６Ｃ及び図６Ｄにそれぞれプロットする。
【０１０１】
コラーゲン面積率の解析結果から、ＡＤＳＣ群のコラーゲン面積率は０．５３±０．０８％であり、担体群よりも約３０％低減し、ＢＰ／ＡＤＳＣコラーゲン面積率は０．２６±０．０８％であり、担体群よりも約６６％低減し、かつ、ＢＰ／ＡＤＳＣ群における減少の程度はＡＤＳＣ群の２．２倍であった。
【０１０２】
また、ヒドロキシプロリン含有量の解析結果から、ＡＤＳＣ群のヒドロキシプロリン含有量が１．６７±０．１１％であり、担体群よりも約１６％低減し、ＢＰ／ＡＤＳＣ群のヒドロキシプロリン含有量は１．４２±０．１％であり、担体群よりも約２８％低減し、かつ、ＢＰ／ＡＤＳＣ群の減少度はＡＤＳＣ群の約１．７５倍であり、この結果の傾向もコラーゲン面積率解析の傾向と一致しており、ＢＰ／ＡＤＳＣ群はＡＤＳＣ群よりも心臓線維症を顕著に減少させることができた。
【０１０３】
【表８】
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【０１０４】
（心エコー図の結果解析）
【０１０５】
心エコーの検出結果が表９に示され、表９に示す結果から分かるように、担体群の心臓は、対照群と比較して、例えば、中隔及び左心室の後壁の大きさが増加したような構造的変化が示され、それも心肥大の結果と一致ことを示している。
【０１０６】
さらに、心エコー検査によって、ＡＤＳＣによる心肥大の治療が壁応力増加及び心機能不全をもたらすかどうかを確認した。表９に示される左心室拡張期サイズ（ＬＶＥＤＤ）、左心室収縮期（ＬＶＥＳＤ）サイズ及び短縮率から分かるように、担体群、ＡＤＳＣ群、及びＢＰ／ＡＤＳＣ群の統計的結果は、いずれも顕著的差がなく、ＡＤＳＣによる心肥大の治療は、壁応力増加及び心機能不全を引き起こさなかったことを示している。
【０１０７】
【表９】
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≪実施例２≫
【０１０８】
実施例１の結果から分かるように、ＢＰによって前処理されたＡＤＳＣは、心筋におけるマクロファージＭ２表現型を顕著に増加させることができるが、関与するメカニズムは不明である。マクロファージの極性化中のＲＯＳ／ＳＴＡＴ３信号伝達に対するＢＰの介入の重要性を確認するために、３‐モルホリノシドノニミン（ＳＩＮ−１、ペルオキシ亜硝酸発生剤）又はＳ３Ｉ−２０１（ａＳＴＡＴ３阻害剤、３‐（２，４‐ジクロロフェニル）‐４‐（１‐メチルー１Ｈ‐インドールー３‐イル）‐１Ｈピロールー２，５‐ジオン、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社、カリフォルニア州ラホヤ米国）を用いてインビトロ試験を実施した。
【０１０９】
同様に、心肥大のある１２週齢の雄性の高血圧自然発症ラット（ＳＨＲ）をＡＤＳＣ群、ＢＰ／ＡＤＳＣ群、ＢＰ／ＡＤＳＣ／ＳＩＮ群、及びＢＰ／ＡＤＳＣ／Ｓ３Ｉ群にランダムに分けた。
ここで、ＡＤＳＣ群では、１×１０６個のＡＤＳＣｓ（３０μｌのＰＢＳに混合された）をＳＨＲの右脚筋に注射し、ＢＰ／ＡＤＳＣ群、ＢＰ／ＡＤＳＣ／ＳＩＮ群、及びＢＰ／ＡＤＳＣ／Ｓ３Ｉ群に、１×１０６個のＢＰで前処理されたＡＤＳＣｓ（３０μｌのＰＢＳに混合された）をＳＨＲの右脚筋に注射した。
【０１１０】
移植３日間後にラットを殺して心臓を摘出し、１１７．０ｍＭのＮａＣｌ、２３．０ｍＭのＮａＨＣＯ３、４．６ｍＭのＫＣｌ、０．８ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１．０ｍＭのＭｇＣｌ２、２．０ｍＭのＣａＣｌ２、及び５．５ｍＭのグルコースを含有する非循環修飾タイロード溶液で各心臓を灌流し、３７℃で平衡化し、Ｏ２９５％及びＣＯ２５％を含有するガス混合物で酸化反応した。
また、ＢＰ／ＡＤＳＣ／ＳＩＮ群が使用した非循環式修飾タイロード溶液は、３７μＭのＳＩＮ−１をさらに含み、ＢＰ／ＡＤＳＣ／Ｓ３Ｉ群が使用した非循環式修飾タイロード溶液は、２５μＭのＳ３Ｉ−２０１をさらに含む。灌流時間は３０分であった。
【０１１１】
実験終了後、各群の心臓における左心室のＲＯＳ発現量、ｐ−ＳＴＡＴ３の割合、及びＩＬ−１０含有量を測定し、試験方法は実施例１と同じである。
【０１１２】
得られた結果を表１０に記録し、それぞれ図７Ａから図７Ｃにプロットする。
【０１１３】
【表１０】
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【０１１４】
図７Ａ〜図７Ｃの結果から分かるように、ＢＰ／ＡＤＳＣ／ＳＩＮ群におけるｐ−ＳＴＡＴ３／全ＳＴＡＴ３は、０．８７±０．１９であり、ＢＰ／ＡＤＳＣ群より約４５％低減し、ＢＰ／ＡＤＳＣ／ＳＩＮ群におけるＩＬ−１０含有量は、５６３±９８ｐｇ／ｍｇであり、ＢＰ／ＡＤＳＣ群より約７７％低減した。ＳＩＮ−１はペルオキシナイトライト発生剤であるので、この結果は、ｐ−ＳＴＡＴ３及びＩＬ−１０のレベルに対するスーパーオキシドの介入の効果を示す。
【０１１５】
さらに、ＳＴＡＴ３信号伝達経路がマクロファージＭ２ｃの極性化にとって重要であるかどうかを評価するために、マクロファージのＭ２ｃへの変換に対するＳ３Ｉ−２０１の影響を解析した。図７Ａ〜図７Ｃの結果から分かるように、ＢＰ／ＡＤＳＣ／Ｓ３Ｉ群のＩＬ−１０含有量は４９３±１０４ｐｇ／ｍｇであり、ＢＰ／ＡＤＳＣ群よりも約８０％低減した（Ｐ＜０．０５）。Ｓ３Ｉ−２０１はＳＴＡＴ３の阻害剤であるので、ＩＬ−１０のレベルに対するＳＴＡＴ３活性の効果を示している。
さらに、ＢＰ／ＡＤＳＣ群とＢＰ／ＡＤＳＣ／Ｓ３Ｉ群とのパーオキシドレベルを比較すると顕著的差はないことが発見されており、スーパーオキシドのレベルがＳ３Ｉ−２０１の作用によって影響されなかったことを示し、ＲＯＳは、ＳＴＡＴ３活性の調節の上流にあることが分かる。
【０１１６】
以上、上記実施形態において本発明の内容を具体的に例示したが、本発明はこれらの実施形態に限定されるものではない。本発明の要旨を逸脱しない範囲で種々変形して実施することができることは当業者にとって明らかである。例えば、上記実施形態に例示した技術内容を組み合わせたり変更したりして、新たな実施形態とすることができ、これらの実施形態はもちろん本発明の一部であると考えられる。したがって、本願が保護しようとする範囲は、以下に記載される特許請求の範囲及びそれによって定義される範囲も含む。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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