(57)【要約】      （修正有）【課題】十分な生物活性を保持しながら、インビボ半減期が増加した第ＶＩＩＩ因子を提供する。【解決手段】組換えＦＶＩＩＩと両性イオンポリマーとを含むコンジュゲートであって、ポリマーは１つまたは複数のモノマー単位を含み、少なくとも１つのモノマー単位は両性イオン基を含むコンジュゲートを開示する。場合により、両性イオン基がホスホリルコリン、モノマーが２−（アクリロイルオキシエチル）−２’−（トリメチルアンモニウムエチル）ホスフェートを含む。【選択図】図２
2020183404.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えＦＶＩＩＩ（ｒＦＶＩＩＩ）と両性イオンポリマーとを含むコンジュゲートであって、前記ポリマーは、１つまたは複数のモノマー単位を含み、そして、少なくとも１つのモノマー単位が、両性イオン基を含む、前記コンジュゲート。
【請求項２】
前記両性イオン基が、ホスホリルコリンを含む、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項３】
前記モノマーが、２−（アクリロイルオキシエチル）−２’−（トリメチルアンモニウムエチル）ホスフェートを含む、請求項２に記載のコンジュゲート。
【請求項４】
前記モノマーが、２−（メタクリロイルオキシエチル）−２’−（トリメチルアンモニウムエチル）ホスフェート（ＨＥＭＡ−ＰＣ）を含む、請求項２に記載のコンジュゲート。
【請求項５】
前記ｒＦＶＩＩＩが、Ｂドメインの一部または全部の欠失を有する、請求項４に記載のコンジュゲート。
【請求項６】
前記ポリマーが、３本以上のアームを有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項７】
前記ポリマーが、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２本のアームを有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項８】
前記ポリマーが、３、６または９本のアームを有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項９】
前記ポリマーが、９本のアームを有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項１０】
前記コンジュゲートの前記ポリマー部分が、３００，０００〜１，７５０，０００ダルトンの間のピーク分子量を有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項１１】
前記コンジュゲートの前記ポリマー部分が、５００，０００〜１，０００，０００ダルトンの間のピーク分子量を有する、請求項１０に記載のコンジュゲート。
【請求項１２】
前記コンジュゲートの前記ポリマー部分が、６００，０００〜８００，０００ダルトンの間のピーク分子量を有する、請求項１１に記載のコンジュゲート。
【請求項１３】
前記ポリマーが、９本のアームを有する、請求項１２に記載のコンジュゲート。
【請求項１４】
前記ｒＦＶＩＩＩが、前記ポリマーと共有結合している、請求項４に記載のコンジュゲート。
【請求項１５】
前記ポリマーが、ｒＦＶＩＩＩのアミノ基、ヒドロキシル基、スルフヒドリル基およびカルボキシル基の少なくとも１つと共有結合している、請求項１４に記載のコンジュゲート。
【請求項１６】
前記スルフヒドリル基が、ｒＦＶＩＩＩ中のシステイン残基からのものである、請求項１５に記載のコンジュゲート。
【請求項１７】
前記システイン残基が、組換えシステイン残基である、請求項１６に記載のコンジュゲート。
【請求項１８】
前記組換えシステイン残基が、Ｙ８１Ｃ、Ｆ１２９Ｃ、Ｋ３７７Ｃ、Ｈ３７８Ｃ、Ｋ４２２Ｃ、Ｑ４６８Ｃ、Ｌ４９１Ｃ、Ｌ５０４Ｃ、Ｋ５５６Ｃ、Ｋ５７０Ｃ、Ｄ１７９５Ｃ、Ｑ１７９６Ｃ、Ｒ１８０３Ｃ、Ｋ１８０４Ｃ、Ｋ１８０８Ｃ、Ｋ１８１０Ｃ、Ｔ１８２１Ｃ、Ｋ１８１３Ｃ、Ｎ１８６４Ｃ、Ｔ１９１１Ｃ、Ｎ２１１８Ｃ、Ｑ２０９１Ｃ、Ｆ２０９３ＣおよびＱ２２８４Ｃからなる群から選択され、前記残基が、前記組換え第ＶＩＩＩ因子を配列番号１と最大限に整列させた場合の、配列番号１中の対応する残基から番号付けされる、請求項１７に記載のコンジュゲート。
【請求項１９】
前記システイン残基が、ｒＦＶＩＩＩ中に自然に存在する、請求項１６に記載のコンジュゲート。
【請求項２０】
前記システイン残基が、Ｂドメイン中にある、請求項１９に記載のコンジュゲート。
【請求項２１】
前記システイン残基が、１２９３Ｃ、１３７３Ｃ、１６０４Ｃおよび１６３６Ｃからなる群から選択される、請求項２０に記載のコンジュゲート。
【請求項２２】
前記システイン残基が、１６０４Ｃおよび１６３６Ｃからなる群から選択される、請求項２１に記載のコンジュゲート。
【請求項２３】
前記ポリマーが、３、６または９本のアームを有する、請求項２２に記載のコンジュゲート。
【請求項２４】
前記ポリマーが、９本のアームを有する、請求項２３に記載のコンジュゲート。
【請求項２５】
前記コンジュゲートの前記ポリマー部分が、１００，０００〜１，５００，０００ダルトンの間のピーク分子量を有する、請求項２４に記載のコンジュゲート。
【請求項２６】
前記コンジュゲートの前記ポリマー部分が、５００，０００〜１，０００，０００ダルトンの間のピーク分子量を有する、請求項２５に記載のコンジュゲート。
【請求項２７】
前記コンジュゲートの前記ポリマー部分が、６００，０００〜８５０，０００ダルトンの間のピーク分子量を有する、請求項２６に記載のコンジュゲート。
【請求項２８】
Ｂドメインの少なくとも一部を含む組換えＦＶＩＩＩ（ｒＦＶＩＩＩ）と、両性イオンポリマーとを含むコンジュゲートであって、前記ポリマーは１つまたは複数のモノマー単位を含み、少なくとも１つのモノマー単位は両性イオン基を含み、そして前記ポリマーは前記Ｂドメイン中のシステイン残基を介して前記ｒＦＶＩＩＩとコンジュゲーションしており、ｒＦＶＩＩＩの分子１個当たり１個の分岐ポリマーがコンジュゲーションしている前記コンジュゲート。
【請求項２９】
前記ポリマーが、場合により９個の分岐を有する、分岐ポリマーである、請求項２９に記載のコンジュゲート。
【請求項３０】
前記ポリマーが、前記Ｂドメインの一部の中の２個の最もＣ末端のシステイン残基の１個であるシステイン残基を介してコンジュゲーションしている、請求項２８または２９に記載のコンジュゲート。
【請求項３１】
少なくとも２０時間のヒト中でのインビボ半減期を有する、請求項２８に記載のコンジュゲート。
【請求項３２】
Ｂドメインの少なくとも一部を含む軽鎖および重鎖を含む組換えＦＶＩＩＩ（ｒＦＶＩＩＩ）と、両性イオンポリマーとを含むコンジュゲートの分子を含む組成物であって、前記ポリマーは１つまたは複数のモノマー単位を含み、少なくとも１つのモノマー単位は両性イオン基を含み、前記ポリマーは前記Ｂドメイン中のシステイン残基を介して前記ｒＦＶＩＩＩとコンジュゲーションしており、そして組成物中の前記コンジュゲートの分子の少なくとも８０、９０、９５または９９％は前記Ｂドメインの同じ部分を有し、ｒＦＶＩＩＩの分子１個当たり１個のポリマーがコンジュゲーションしている、前記組成物。
【請求項３３】
前記ポリマーが、場合により９個の分岐を有して分岐している、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３４】
前記重鎖が、配列番号１の少なくとも残基１〜１６０４を含む、請求項３２または３３に記載の組成物。
【請求項３５】
前記重鎖が、配列番号１の少なくとも残基１〜１６３６を含む、請求項３２または３３に記載の組成物。
【請求項３６】
前記重鎖が、配列番号１の少なくとも残基１〜１６４８を含む、請求項３２または３３に記載の組成物。
【請求項３７】
前記重鎖が、配列番号１の残基１〜１６４８からなる、請求項３２または３３に記載の組成物。
【請求項３８】
前記Ｂドメインの少なくとも一部が、無傷Ｂドメインである、請求項３２または３３に記載の組成物。
【請求項３９】
前記分岐ポリマーが、前記Ｂドメイン中の２個の最もＣ末端のシステインの１個であるシステインを介してコンジュゲーションしている、請求項３１〜３８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４０】
請求項１〜３９のいずれか一項に記載のコンジュゲートを含む医薬組成物。
【請求項４１】
治療上有効量の請求項１〜４０のいずれか一項に記載のコンジュゲートまたは組成物を血友病を患っている対象に投与するステップを含む、血友病を治療する方法。
【請求項４２】
治療上有効量の請求項１〜４１のいずれか一項に記載のコンジュゲートまたは組成物を、血友病の対象に、前記対象が外部または内部出血していることを分かっていない時に投与するステップを含む血友病の対象の予防方法であって、ここで、前記コンジュゲートが、その後の出血後の凝固を促進するために血液中で持続するものとする、前記方法。
【請求項４３】
前記コンジュゲートまたは組成物が、１週間に１回以下の頻度で投与される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記コンジュゲートまたは組成物が、毎週〜毎月の間で投与される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記対象が、血友病を有さない対照の対象における平均ＦＶＩＩＩ活性の１％、３％または５％超のＦＶＩＩＩ活性のトラフレベルを有する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４６】
前記対象が、前記ポリマーとコンジュゲーションしていないＦＶＩＩＩの以前の投与からＦＶＩＩＩに対する抗体を発達させている、請求項４１〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
ポリマー−機能的物質コンジュゲートを合成する方法であって、前記コンジュゲートは１種または複数の機能的物質と、１本または複数のポリマーアームとを有し、各前記ポリマーアームは、１つまたは複数のモノマー型を有し、前記型の少なくとも１つは、両性イオンを含み、そして、前記方法が、
ａ．１つまたは複数のポリマー合成開始剤部分と第１の反応基とを含む開始剤を、重合に適した１つまたは複数のモノマー型と組み合わせるステップであって、前記モノマー型の少なくとも１つは両性イオンを含み；前記モノマー型はポリマー合成開始剤部分で反応してポリマーを形成して重合開始剤を得るステップと；
ｂ．第２および第３の反応基を含むリンカー部分を前記重合開始剤とカップリングして未反応反応基を有するリンカー重合開始剤を得るステップと；
ｃ．１種または複数の機能的物質を前記リンカー重合開始剤の前記未反応反応基とカップリングして前記ポリマー−機能的物質コンジュゲートを得るステップと
を含む、前記方法。
【請求項４８】
前記開始剤が、構造：
【化１】
2020183404.tif 000052
（式中、Ｒ１は求核性反応基を有し、Ｒ２はリンカーを含み、Ｒ３はポリマー合成開始剤部分を含み、ｓは１〜２０の間の整数である）
を有する、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
Ｒ１が、ＮＨ２−、ＯＨ−およびＳＨからなる群から選択される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
Ｒ１が、ＮＨ２−である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
Ｒ２が、アルキル、置換アルキル、アルキレン、アルコキシ、カルボキシアルキル、ハロアルキル、シクロアルキル、環状アルキルエーテル、アルケニル、アルケニレン、アルキニル、アルキニレン、シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルキレン、アリール、アリーレン、アリーレン−オキシ、ヘテロアリール、アミノ、アミドまたはこれらの任意の組み合わせである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５２】
Ｒ２が、式：
【化２】
2020183404.tif 000053
（式中、ｍは１〜２０である）
を有する構造を含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
ｍが、４である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
Ｒ３が、以下の式
【化３】
2020183404.tif 000054
｛式中、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、同じまたは異なり、
【化４】
2020183404.tif 000055
（式中、ＸはＮＣＳ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩである）
からなる群から選択される｝
を有する、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
ＸがＢｒである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
Ｒ４、Ｒ５およびＲ６が、それぞれ
【化５】
2020183404.tif 000056
である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
Ｒ４、Ｒ５およびＲ６がそれぞれ
【化６】
2020183404.tif 000057
である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５８】
Ｒ４、Ｒ５およびＲ６がそれぞれ
【化７】
2020183404.tif 000058
である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５９】
前記モノマーが、
【化８】
2020183404.tif 000059
（式中、Ｒ７はＨまたはＣ１〜６アルキルであり、ＺＷは両性イオンであり、そしてｔは１〜６である）
からなる群から選択される、請求項４７に記載の方法。
【請求項６０】
前記モノマーが、２−（メタクリロイルオキシエチル）−２’−（トリメチルアンモニウムエチル）ホスフェート（ＨＥＭＡ−ＰＣ）および２−（アクリロイルオキシエチル）−２’−（トリメチルアンモニウムエチル）ホスフェートからなる群から選択される、請求項４７に記載の方法。
【請求項６１】
前記モノマーが、２−（メタクリロイルオキシエチル）−２’−（トリメチルアンモニウムエチル）ホスフェートである、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
ステップｄの前記リンカー部分が構造
【化９】
2020183404.tif 000060
｛式中、Ｒ８は
【化１０】
2020183404.tif 000061
からなる群から選択され、
Ｒ９は
【化１１】
2020183404.tif 000062
（式中、ｐは１〜１２である）
からなる群から選択される｝
を有する活性化エステルを含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項６３】
前記リンカー部分が、
【化１２】
2020183404.tif 000063
である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
ステップａ．の前記開始剤が以下の構造：
【化１３】
2020183404.tif 000064
（式中、ｙは１〜５０の整数であり、Ｘは０〜５０の整数であり、そしてＺはＮＣＳ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩである）
を有する、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
Ｚが、Ｂｒである、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
Ｘが４、８または１２であり、そしてＹが１〜１０である、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
Ｙが４である、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記機能的物質が、タンパク質である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６９】
前記タンパク質が、ヒトＦＶＩＩＩを含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記ＦＶＩＩＩが、組換えＦＶＩＩＩ（ｒＦＶＩＩＩ）である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記ｒＦＶＩＩＩが、哺乳動物宿主細胞から精製される、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記ＦＶＩＩＩが、前記Ｂドメインの一部または全部の欠失を含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項７３】
ステップｆの前記リンカー−重合開始剤が式：
【化１４】
2020183404.tif 000065
（式中、Ｘは１〜５０の整数であり、Ｙは１〜５０の整数であり、そしてポリマーは本明細書に定義されるモノマーで合成される任意のポリマーである）
を有する、請求項４４に記載の方法。
【請求項７４】
Ｙが４であり、Ｘが４、８または１２であり、そして前記モノマーがＨＥＭＡ−ｐｃである、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
式：
【化１５】
2020183404.tif 000066
（式中、ｙは１〜５０の整数であり、Ｘは０〜５０の整数であり、そしてＺはＮＣＳ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩである）
を有する化合物。
【請求項７６】
ＺがＢｒである、請求項７５に記載の化合物。
【請求項７７】
Ｘが４、８または１２であり、Ｙが１〜１０である、請求項７５に記載の化合物。
【請求項７８】
Ｙが４である、請求項７７に記載の化合物。
【請求項７９】
式：
【化１６】
2020183404.tif 000067
（式中、ｙは１〜５０の整数であり、Ｘは０〜５０の整数であり、そしてＭＰＣはポリＭＰＣアームである）
を有するポリマー。
【請求項８０】
総分子量が約５００，０００〜約１，０００，０００ダルトンである、請求項７９に記載のポリマー。
【請求項８１】
総分子量が約６５０，０００〜約８５０，０００ダルトンである、請求項８０に記載のポリマー。
【請求項８２】
総分子量が約７５０，０００ダルトンである、請求項８１に記載のポリマー。
【請求項８３】
Ｘが４、８または１２であり、Ｙが１〜１０である、請求項８２に記載のポリマー。
【請求項８４】
Ｙが４である、請求項８３に記載のポリマー。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、非仮出願であり、全ての目的のためにその全体が参照により組み込まれる、２０１４年９月８日出願の米国特許出願第６１／８７５，０９９号の利益を主張するものである。
【背景技術】
【０００２】
血友病Ａは、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）の欠損または突然変異によって引き起こされる遺伝性血液凝固障害である。第ＶＩＩＩ因子は、内因性血液凝固経路の重要な構成要素である。第ＶＩＩＩ因子の欠損は出血増加を引き起こす。血友病Ａは、Ｘ連鎖性であり、男性の約５０００人に１人に観察される。
【０００３】
血友病Ａ患者は、現在、完全長組換えヒトＦＶＩＩＩの静脈内投与によって治療されている。治療は予防的であってもよいし、または出血を引き起こす傷害を受けて必要に応じてでもよい。ヒトにおける第ＶＩＩＩ因子の半減期は比較的短く、典型的には１１時間程度である。したがって、有効な治療のためには、１週間に３回程度の頻繁な投与を要する。しかしながら、典型的には点滴を介した、このような頻繁な投与は、診療所または他の医療従事者の頻繁な来診を必要とするので望ましくない。さらに、このような頻繁な投与は、処方された投与体制への患者のコンプライアンスを低下させる可能性がある。
【０００４】
現在の第ＶＩＩＩ因子治療の別の欠点は、第ＶＩＩＩ因子で治療した患者の約２５〜３０％がＦＶＩＩＩに対する抗体を発達させることである。循環抗第ＶＩＩＩ因子抗体のレベルが高い患者は、現在の第ＶＩＩＩ因子治療薬でうまく治療することができない。このような患者は、第ＶＩＩａ因子を含むより高価な治療体制および免疫寛容療法を要する。
【０００５】
治療薬の有効性は、その生物学的利用能および薬物動態特性を改善することによって増強させることができる。生物学的利用能を改善するための１つの手法はペグ化であった。ペグ化は、薬物、典型的にはタンパク質へのポリエチレングリコール鎖の付加を伴う。免疫原性または抗原性の低下、半減期増加、溶解度増加、腎臓によるクリアランスの減少、および酵素分解の減少は、ＰＥＧコンジュゲート（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）に起因している。これらの属性の結果として、特定の生物活性剤のＰＥＧコンジュゲートがしばしばあまり頻繁な投与を要さず、治療エンドポイントを達成するために少ない活性剤を使用することが可能となる可能性がある。あまり頻繁でない投与は、痛く、医療従事者への不便な来診を要する注射の絶対数を減少させるので、一般的に望ましい。
【０００６】
ＰＥＧコンジュゲートによっていくらかの成功が達成されたが、生物活性剤の「ペグ化」は困難な課題のままである。薬物開発者がエリスロポエチンなどの極めて強力なアゴニストタンパク質および種々のインターフェロンを越えて進歩するので、増加した溶解度、安定性および生物学的利用能におけるＰＥＧ親水性ポリマーの潜在的な利益が増加した粘度および免疫原性を十分には補わない。
【０００７】
ＦＶＩＩＩのペグ化がインビボでコンジュゲートの半減期を有意に増加させることは認められていない。
【０００８】
したがって、十分な生物活性を保持しながら、インビボ半減期が増加したＦＶＩＩＩ薬物が依然として必要とされている。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、組換えＦＶＩＩＩ（ｒＦＶＩＩＩ）と両性イオンポリマーとを含むコンジュゲートであって、ポリマーは１つまたは複数のモノマー単位を含み、少なくとも１つのモノマー単位は両性イオン基を含むコンジュゲートを提供する。場合により、両性イオン基がホスホリルコリンを含む。場合により、モノマーが２−（アクリロイルオキシエチル）−２’−（トリメチルアンモニウムエチル）ホスフェートを含む。場合により、モノマーが２−（メタクリロイルオキシエチル）−２’−（トリメチルアンモニウムエチル）ホスフェート（ＨＥＭＡ−ＰＣ）を含む。ｒＦＶＩＩＩがＢドメインの一部もしくは全部の欠失を有してもよいし、または無傷Ｂドメイン（intact B-domain）を有してもよい。場合
により、ポリマーが３本以上のアームを有する。場合により、ポリマーが３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２本のアームを有する。場合により、ポリマーが３、６または９本のアームを有し、好ましくはポリマーが９本のアームを有する。
【００１０】
いくつかのコンジュゲートは、ｒＦＶＩＩＩを含む、ポリマー部分が３００，０００〜１，７５０，０００ダルトンの間のピーク分子量を有するようなものである。いくつかのコンジュゲートは、５００，０００〜１，０００，０００ダルトンの間のピーク分子量を有するポリマー部分を有する。いくつかのコンジュゲートは、６００，０００〜８００，０００ダルトンの間のピーク分子量を有するポリマー部分を有する。
【００１１】
いくつかのコンジュゲートでは、ｒＦＶＩＩＩがポリマーと共有結合している。いくつかのコンジュゲートでは、ポリマーが、ｒＦＶＩＩＩのアミノ基、ヒドロキシル基、スルフヒドリル基およびカルボキシル基の少なくとも１つと共有結合している。いくつかのコンジュゲートでは、スルフヒドリル基がｒＦＶＩＩＩ中のシステイン残基からのものである。いくつかのコンジュゲートでは、システイン残基が組換えシステイン残基である。いくつかのコンジュゲートでは、組換えシステイン残基がＹ８１Ｃ、Ｆ１２９Ｃ、Ｋ３７７Ｃ、Ｈ３７８Ｃ、Ｋ４２２Ｃ、Ｑ４６８Ｃ、Ｌ４９１Ｃ、Ｌ５０４Ｃ、Ｋ５５６Ｃ、Ｋ５７０Ｃ、Ｄ１７９５Ｃ、Ｑ１７９６Ｃ、Ｒ１８０３Ｃ、Ｋ１８０４Ｃ、Ｋ１８０８Ｃ、Ｋ１８１０Ｃ、Ｔ１８２１Ｃ、Ｋ１８１３Ｃ、Ｎ１８６４Ｃ、Ｔ１９１１Ｃ、Ｎ２１１８Ｃ、Ｑ２０９１Ｃ、Ｆ２０９３ＣおよびＱ２２８４Ｃからなる群から選択され、残基は、組換え第ＶＩＩＩ因子を配列番号１と最大限に整列させた場合の、配列番号１（図１）中の対応する残基から番号付けされる。いくつかのコンジュゲートでは、システイン残基がｒＦＶＩＩＩ中に自然に存在する。いくつかのコンジュゲートでは、システイン残基がＢドメイン中にある。いくつかのコンジュゲートでは、システイン残基が１２９３Ｃ、１３７３Ｃ、１６０４Ｃおよび１６３６Ｃからなる群、好ましくは１６０４Ｃまたは１６３６Ｃから選択される。
【００１２】
好ましいコンジュゲートは、ｒＦＶＩＩＩと３、６または９本のアーム、好ましくは９本のアームとを含む１００，０００〜１，５００，０００、より好ましくは５００，０００〜１，０００，０００ダルトンまたは６００，０００〜８５０，０００ダルトンの間のピーク分子量を有するポリマー部分を有する。
【００１３】
本発明はさらに、Ｂドメインの少なくとも一部を含む組換えＦＶＩＩＩ（ｒＦＶＩＩＩ）と、両性イオンポリマーとを含むコンジュゲートであって、ポリマーは１つまたは複数のモノマー単位を含み、少なくとも１つのモノマー単位は両性イオン基を含み、ポリマーはＢドメイン中のシステイン残基を介してｒＦＶＩＩＩとコンジュゲーションしており、ｒＦＶＩＩＩの分子１個当たり１個の分岐ポリマーがコンジュゲーションしているコンジュゲートを提供する。場合により、ポリマーが、場合により９個の分岐を有する、分岐ポリマーである。場合により、ポリマーが、Ｂドメインの一部の中の２個の最もＣ末端のシステイン残基の１個であるシステイン残基を介してコンジュゲーションしている。場合により、コンジュゲートが少なくとも２０時間のヒト中でのインビボ半減期を有する。
【００１４】
本発明はさらに、Ｂドメインの少なくとも一部を含む軽鎖および重鎖を含む組換えＦＶＩＩＩ（ｒＦＶＩＩＩ）と、両性イオンポリマーとを含むコンジュゲートの分子を含む組成物であって、ポリマーは１つまたは複数のモノマー単位を含み、少なくとも１つのモノマー単位は両性イオン基を含み、ポリマーはＢドメイン中のシステイン残基を介してｒＦＶＩＩＩとコンジュゲートしており、組成物中のコンジュゲートの分子の少なくとも８０、９０、９５または９９％はＢドメインの同じ部分を有し、ｒＦＶＩＩＩの分子１個当たり１個のポリマーがコンジュゲートしている組成物を提供する。場合により、ポリマーが、場合により９個の分岐を有して分岐している。場合により、重鎖が配列番号１の少なくとも残基１〜１６０４または配列番号１の少なくとも残基１〜１６３６、または配列番号１の少なくとも残基１〜１６４８を含む。場合により、重鎖が配列番号１の残基１〜１６４８からなる。場合により、Ｂドメインの少なくとも一部が無傷Ｂドメインである。場合により、ポリマーが、Ｂドメイン中の２個の最もＣ末端のシステインの１個であるシステインを介してコンジュゲートしている。
【００１５】
本発明はさらに、上記のコンジュゲートを含む医薬組成物を提供する。
【００１６】
本発明はさらに、治療上有効量の上記のコンジュゲートを血友病を患っている対象に投与するステップを含む、血友病を治療する方法を提供する。
【００１７】
本発明はさらに、血友病の対象の予防方法であって、治療上有効量の前記主張のいずれかのコンジュゲートまたは組成物を、血友病の対象に、対象が外部または内部出血していることを分かっていない時に投与するステップを含み、前記コンジュゲートが、その後の出血後の凝固を促進するために血液中で持続する（persists）ものとする方法を提供する。場合により、コンジュゲートまたは組成物が１週間に１回以下の頻度で投与される。場合により、コンジュゲートまたは組成物が毎週〜毎月の間で投与される。場合により、対象が、血友病を有さない対照の対象における平均ＦＶＩＩＩ活性の１％、３％または５％超のＦＶＩＩＩ活性のトラフレベルを有する。場合により、対象が、ポリマーとコンジュゲートしていないＦＶＩＩＩの以前の投与からＦＶＩＩＩに対する抗体を発達させている。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】成熟ヒト第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸配列（配列番号１）を示す図である。
【００１９】
【図２】ヒト第ＶＩＩＩ因子のドメインおよびシステイン残基の位置を示す図である（Ｌｅｎｔｉｎｇら、Ｂｌｏｏｄ  １９９８；９２：３９８３〜３９９６から転載）。
【発明の詳細な説明】
【００２０】
Ｉ．概要
本発明は、ホスホリルコリンなどの、親水基または両性イオンを有する高分子量（ＭＷ）ポリマーを提供する。本発明によると、高ＭＷポリマーを作製するための方法および新規な出発材料も提供される。本発明によると、高ＭＷポリマーと、機能的物質（本明細書で定義される）とのコンジュゲートも提供される。国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３２７６８号パンフレットおよびＰＣＴ／ＵＳ２００７／００５３７２号パンフレットが、全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
【００２１】
ＩＩ．定義
「ポリマー」は、結びついている一連のモノマー群を指す。高ＭＷポリマーは、それだけに限らないが、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、メタクリルアミド、スチレン、ビニル−ピリジン、ビニル−ピロリドンおよびビニルエステル（酢酸ビニルなど）を含むモノマーから調製される。さらなるモノマーが本発明の高ＭＷポリマーに有用である。２つの異なるモノマーを使用する場合、２つのモノマーを「コモノマー」と呼び、異なるモノマーを共重合して単一ポリマーを形成することを意味する。ポリマーは直鎖であっても分岐であってもよい。ポリマーが分岐である場合、各ポリマー鎖を「ポリマーアーム」と呼ぶ。開始剤部分と連結したポリマーアームの末端が近位端であり、ポリマーアームの成長鎖末端が遠心端である。ポリマーアームの成長鎖末端上では、ポリマーアーム末端基がラジカルスカベンジャーであっても別の基であってもよい。
【００２２】
「開始剤」は、本発明のモノマーまたはコモノマーを用いて重合を開始することができる化合物を指す。重合は従来のフリーラジカル重合であっても、好ましくは制御／「リビング」ラジカル重合、例えば、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）、可逆的付加−開裂−停止（Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ａｄｄｉｔｉｏｎ−Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ−Ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）（ＲＡＦＴ）重合またはニトロキシド媒介重合（ｎｉｔｒｏｘｉｄｅ
ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）（ＮＭＰ）であってもよい。重合は、退行移動などの、「偽」制御重合であってもよい。開始剤がＡＴＲＰに適している場合、これはホモリシス開裂して、ラジカル重合を開始することができるラジカルである開始剤断片、Ｉ、および成長ポリマー鎖のラジカルと反応して重合を可逆的に停止するラジカルスカベンジャー、Ｉ’を形成することができる不安定な結合を含む。ラジカルスカベンジャーＩ’は、典型的にはハロゲンであるが、ニトリルなどの有機部分であってもよい。
【００２３】
「リンカー」は２つの基を結びつける化学的部分を指す。リンカーは切断可能であっても切断不可能であってもよい。切断可能なリンカーは、加水分解可能、酵素的切断可能、ｐＨ感受性、感光性またはジスルフィドリンカーなどであることができる。他のリンカーにはホモ二官能性（ｈｏｍｏｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）およびヘテロ二官能性（ｈｅｔｅｒｏｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）リンカーが含まれる。「結合基」は、生理活性剤との１つまたは複数の結合からなる共有結合を形成することができる官能基である。非限定的な例としては、表１に示されるものが挙げられる。
【００２４】
本明細書で使用される「反応基」という用語は、別の化学基と反応して共有結合を形成することができる、すなわち、適当な反応条件下で共有結合的に反応性であり、一般的に別の物質のための結合点を表す基を指す。反応基は、異なる化合物上の官能基と化学反応して共有結合を形成することができる本発明の化合物上の、マレイミドまたはスクシンイミジルエステルなどの部分である。反応基には一般的に、求核剤、求電子剤および光励起性基が含まれる。
【００２５】
「機能的物質」は、生理活性剤または診断薬を含むと定義される。「生理活性剤」は、特異的な生物学的位置を標的化する（標的薬）ならびに／あるいはインビボまたはインビトロで証明することができるある局所的または全身的な生理学的または薬理学的効果を提供する任意の物質、薬物、化合物またはこれらの混合物を含むと定義される。非限定的な例としては、薬物、ワクチン、抗体、抗体断片、ｓｃＦｖ、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、アビマー（ａｖｉｍｅｒ）、ビタミンおよび補因子、多糖、炭水化物、ステロイド、脂質、脂肪、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、および核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、アンチセンス構築物、リボザイム等）が挙げられる。「診断薬」は、組織または疾患の検出または画像化を可能にする任意の物質を含むと定義される。診断薬の例としては、それだけに限らないが、放射標識、発蛍光団および色素が挙げられる。
【００２６】
「治療用タンパク質」は、全体でまたは部分的に薬物を構成するアミノ酸配列を含み、ヒトまたは動物医薬用途に使用することができるペプチドまたはタンパク質を指す。限定されないが、本明細書に開示されるものを含む多数の治療用タンパク質が知られている。
【００２７】
「ＰＣ」とも示される「ホスホリルコリン」は、以下：
【化１】
2020183404.tif 000003
（＊は付着点を示す）
を指す。ホスホリルコリンは、両性イオン基であり、塩（分子内塩など）ならびにそのプロトン化および脱プロトン化型を含む。
【００２８】
「ホスホリルコリン含有ポリマー」は、ホスホリルコリンを含むポリマーである。「両性イオン含有ポリマー」は、両性イオンを含むポリマーを指す。
【００２９】
ポリ（アクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）含有ポリマーは、モノマーとして２−（アクリロイルオキシ）エチル−２−（トリメチルアンモニウム）エチルホスフェートを含むポリマーを指す。
【００３０】
ポリ（メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）含有ポリマーは、モノマーとして２−（メタクリロイルオキシ）エチル−２−（トリメチルアンモニウム）エチルホスフェートを含むポリマーを指す。
【００３１】
ポリマーの文脈における「分子量」は、数平均分子量、または重量平均分子量、またはピーク分子量のいずれかとして表されることができる。特に指示しない限り、本明細書における分子量への全ての言及は、ピーク分子量を指す。これらの分子量測定、数平均（Ｍｎ）、重量平均（Ｍｗ）およびピーク（Ｍｐ）は、サイズ排除クロマトグラフィーまたは他の液体クロマトグラフィー技術を用いて測定することができる。数平均分子量を測定するための末端基分析または束一的性質（例えば、凝固点降下、沸点上昇もしくは浸透圧）の測定、あるいは重量平均分子量を測定するための光散乱技術、超遠心分離または粘度測定の使用などの分子量値を測定するための他の方法を使用することもできる。本発明の好ましい実施形態では、分子量をＳＥＣ−ＭＡＬＳ（サイズ排除クロマトグラフィー−多角度光散乱）によって測定する。本発明のポリマー試薬は、典型的には多分散系であり（すなわち、ポリマーの数平均分子量と重量平均分子量が等しくない）、好ましくは例えば、ゲル浸透クロマトグラフィーによって判断される約１．５未満の低い多分散度値を有している。他の実施形態では、多分散度（ＰＤＩ）がより好ましくは約１．４〜約１．２の範囲にあり、さらにより好ましくは約１．１５未満、さらにより好ましくは約１．１０未満、なおさらにより好ましくは約１．０５未満、最も好ましくは約１．０３未満である。
【００３２】
本明細書で使用される「ａ」または「ａｎ」実体という句は、その実体の１つまたは複数を指す；例えば、化合物は１つもしくは複数の化合物または少なくとも１つの化合物を指す。よって、「ａ」（または「ａｎ」）、「１つまたは複数」および「少なくとも１つの」という用語は、本明細書において互換的に使用されることができる。
【００３３】
本明細書で使用される「約」は、異なる機器、試料および試料調製間で行われた測定で見られるような変動を意味する。
【００３４】
「保護された」、「保護型」、「保護基（ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  ｇｒｏｕｐ）」および「保護基（ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｇｒｏｕｐ）」は、ある反応条件下で、分子中の特定の化学反応性官能基の反応を防ぐまたは遮断する基（すなわち、保護基）の存在を指す。保護基は、保護されている化学反応基の種類ならびに使用される反応条件およびもしあれば、分子中の追加の反応基または保護基の存在によって変化する。適当な保護基には、Ｇｒｅｅｎｅら、「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  Ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、第３版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．ニューヨーク、１９９９による論文中に見出されるものが含まれる。
【００３５】
「アルキル」は、指示される炭素原子の数を有する直鎖または分岐の、飽和、脂肪族基を指す。例えば、Ｃ１〜Ｃ６−アルキルには、それだけに限らないが、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ヘキシル等が含まれる。他のアルキル基には、それだけに限らないが、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル等が含まれる。アルキルは、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、２〜３、２〜４、２〜５、２〜６、３〜４、３〜５、３〜６、４〜５、４〜６および５〜６個などの任意の数の炭素を含むことができる。アルキル基は典型的には一価であるが、アルキル基が２つの部分を結びつける場合などは、二価であってもよい。
【００３６】
それぞれ有機基または化合物に関連して上記および下記で言及される「低級」という用語は、７個以下、好ましくは４個以下の炭素原子を有する分岐または非分岐であることができ、および（非分岐として）１個または２個の炭素原子を有することができる化合物または基を定義する。
【００３７】
「アルキレン」は、少なくとも２個の他の基を連結する、上に定義されるアルキル基、すなわち、二価炭化水素基を指す。アルキレンと連結した２つの部分は、アルキレンの同じ原子と連結していても異なる原子と連結していてもよい。例えば、直鎖アルキレンは、−（ＣＨ２）ｎ（ｎは１、２、３、４、５または６である）の二価基であることができる。アルキレン基には、それだけに限らないが、メチレン、エチレン、プロピレン、イソプロピレン、ブチレン、イソブチレン、ｓｅｃ−ブチレン、ペンチレンおよびヘキシレンが含まれる。
【００３８】
（アルキレン、アルケニル、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニルおよびヘテロシクロアルケニルとしばしば呼ばれる基を含む）アルキルおよびヘテロアルキル基の置換基は、０〜（２ｍ’＋１）（ｍ’は前記基中の炭素原子の総数である）に及ぶ数の、−ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、−ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ’’Ｒ’’’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ２）＝ＮＨ、−ＮＲ’Ｃ（ＮＨ２）＝ＮＨ、−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ２）＝ＮＲ’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、−ＣＮおよび−ＮＯ２から選択される種々の基であることができる。Ｒ’、Ｒ’’およびＲ’’’はそれぞれ独立に、水素、未置換（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルおよびヘテロアルキル、未置換アリール、１〜３個のハロゲンで置換されたアリール、未置換アルキル、アルコキシもしくはチオアルコキシ基、またはアリール−（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル基を指す。Ｒ’およびＲ’’が同じ窒素原子に結合している場合、これらは窒素原子と結合して５、６または７員環を形成することができる。例えば、−ＮＲ’Ｒ’’は１−ピロリジニルおよび４−モルホリニルを含むことを意図している。置換基の上記議論から、当業者であれば、「アルキル」という用語がハロアルキル（例えば、−ＣＦ３および−ＣＨ２ＣＦ３）およびアシル（例えば、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＦ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＯＣＨ３など）などの基を含むことを意図していることを理解するだろう。好ましくは、置換アルキルおよびヘテロアルキル基は、１〜４個の置換基、より好ましくは１、２または３個の置換基を有する。例外には、同様に好ましく、本発明により熟慮されるペルハロアルキル基（例えば、ペンタフルオロエチルなど）がある。  
【００３９】
（アルキレン、アルケニル、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニルおよびヘテロシクロアルケニルとしばしば呼ばれる基を含む）アルキルおよびヘテロアルキル基の置換基は、それだけに限らないが、０〜（２ｍ’＋１）（ｍ’は前記基中の炭素原子の総数である）に及ぶ数の、−ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、−ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ’’Ｒ’’’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’Ｒ’’’）＝ＮＲ’’’’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’）＝ＮＲ’’’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲＳＯ２Ｒ’、−ＣＮおよび−ＮＯ２から選択される種々の基の１つまたは複数であることができる。Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’およびＲ’’’’はそれぞれ好ましくは独立に、水素、置換または未置換ヘテロアルキル、置換または未置換アリール、例えば、１〜３個のハロゲンで置換されたアリール、置換または未置換アルキル、アルコキシまたはチオアルコキシ基、またはアリールアルキル基を指す。本発明の化合物が２個以上のＲ基を含む場合、例えば、Ｒ基の各々が独立に、Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’およびＲ’’’’基の各々が２個以上が存在する場合のこれらの基のように選択される。Ｒ’およびＲ’’が同じ窒素原子に結合している場合、これらは窒素原子と結合して５、６または７員環を形成することができる。例えば、−ＮＲ’Ｒ’’はそれだけに限らないが、１−ピロリジニルおよび４−モルホリニルを含むことを意図している。置換基の上記議論から、当業者であれば、「アルキル」という用語がハロアルキル（例えば、−ＣＦ３および−ＣＨ２ＣＦ３）およびアシル（例えば、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＦ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＯＣＨ３など）などの水素原子以外の基と結合した炭素原子を含む基を含むことを意図していることを理解するだろう。
【００４０】
「アルコキシ」は、アルコキシを付着点と接続する、またはアルコキシ基の２個の炭素と結合している酸素原子を有するアルキル基を指す。アルコキシ基には、例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソープロポキシ、ブトキシ、２−ブトキシ、イソ−ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ペントキシ、ヘキソキシ等が含まれる。アルコキシ基が本明細書中に記載される種々の置換基でさらに置換されていてもよい。例えば、アルコキシ基がハロゲンで置換されて「ハロ−アルコキシ」基を形成してもよい。
【００４１】
「カルボキシアルキル」は、カルボキシ基で置換された（本明細書に定義される）アルキル基を意味する。「カルボキシシクロアルキル」という用語は、カルボキシ基で置換された（本明細書に定義される）シクロアルキル基を意味する。アルコキシアルキルという用語は、アルコキシ基で置換された（本明細書に定義される）アルキル基を意味する。本明細書で使用される「カルボキシ」という用語は、カルボン酸およびそのエステルを指す。
【００４２】
「ハロアルキル」は、水素原子のいくつかまたは全てがハロゲン原子で置換されている上に定義されるアルキルを指す。ハロゲン（ハロ）は、好ましくはクロロまたはフルオロを表すが、ブロモまたはヨードであってもよい。例えば、ハロアルキルには、トリフルオロメチル、フルオロメチル、１，２，３，４，５−ペンタフルオロ−フェニル等が含まれる。「ペルフルオロ」という用語は、フッ素で置き換えられた全ての利用可能な水素を有する化合物または基を定義する。例えば、ペルフルオロフェニルは１，２，３，４，５−ペンタフルオロフェニルを指し、ペルフルオロメチルは１，１，１−トリフルオロメチルを指し、ペルフルオロメトキシは１，１，１−トリフルオロメトキシを指す。
【００４３】
「フルオロ置換アルキル」は、１個、いくつかまたは全ての水素原子がフッ素によって置き換えられたアルキル基を指す。  
【００４４】
本発明の文脈における「サイトカイン」は、免疫および炎症反応において細胞間情報伝達に参加することができるタンパク質シグナル伝達分子のグループのメンバーである。サイトカインは、典型的には約８〜３５ｋＤａの質量を有する小型の水溶性糖タンパク質である。
【００４５】
「シクロアルキル」は、約３〜１２、３〜１０または３〜７個の環内炭素原子を含む環状炭化水素基を指す。シクロアルキル基は、縮合、架橋およびスピロ環構造を含む。
【００４６】
「環内」は、環状環構造の一部を構成する原子または原子のグループを指す。
【００４７】
「環外」は、環状環構造に結合しているがこれを定義しない原子または原子のグループを指す。
【００４８】
「環状アルキルエーテル」は、３または４個の環内炭素原子と、１個の環外酸素または硫黄原子とを有する４または５員環状アルキル基（例えば、オキセタン、チエタン、テトラヒドロフラン、テトラヒドロチオフェン）；あるいは１または２個の環内酸素または硫黄原子を有する６〜７員環状アルキル基（例えば、テトラヒドロピラン、１，３−ジオキサン、１，４−ジオキサン、テトラヒドロチオピラン、１，３−ジチアン、１，４−ジチアン、１，４−オキサチアン）を指す。
【００４９】
「アルケニル」は、少なくとも１個の二重結合を有する、２〜６個の炭素原子の直鎖または分岐炭化水素のいずれかを指す。アルケニル基の例としては、それだけに限らないが、ビニル、プロペニル、イソプロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル、イソブテニル、ブタジエニル、１−ペンテニル、２−ペンテニル、イソペンテニル、１，３−ペンタジエニル、１，４−ペンタジエニル、１−ヘキセニル、２−ヘキセニル、３−ヘキセニル、１，３−ヘキサジエニル、１，４−ヘキサジエニル、１，５−ヘキサジエニル、２，４−ヘキサジエニルまたは１，３，５−ヘキサトリエニルが挙げられる。アルケニル基はまた、２〜３、２〜４、２〜５、３〜４、３〜５、３〜６、４〜５、４〜６および５〜６個の炭素を有することもできる。アルケニル基は典型的には一価であるが、アルケニル基が２つの部分を結びつける場合などは、二価であってもよい。
【００５０】
「アルケニレン」は、少なくとも２個の他の基を連結する、上に定義されるアルケニル基、すなわち、二価炭化水素基を指す。アルケニレンと連結した２つの部分は、アルケニレンの同じ原子と連結していても異なる原子と連結していてもよい。アルケニレン基には、それだけに限らないが、エテニレン、プロペニレン、イソプロペニレン、ブテニレン、イソブテニレン、ｓｅｃ−ブテニレン、ペンテニレンおよびヘキセニレンが含まれる。
【００５１】
「アルキニル」は、少なくとも１個の三重結合を有する、２〜６個の炭素原子の直鎖または分岐炭化水素のいずれかを指す。アルキニル基の例としては、それだけに限らないが、アセチレニル、プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、イソブチニル、ｓｅｃ−ブチニル、ブタジイニル、１−ペンチニル、２−ペンチニル、イソペンチニル、１，３−ペンタジイニル、１，４−ペンタジイニル、１−ヘキシニル、２−ヘキシニル、３−ヘキシニル、１，３−ヘキサジイニル、１，４−ヘキサジイニル、１，５−ヘキサジイニル、２，４−ヘキサジイニルまたは１，３，５−ヘキサトリイニルが挙げられる。アルキニル基はまた、２〜３、２〜４、２〜５、３〜４、３〜５、３〜６、４〜５、４〜６および５〜６個の炭素を有することもできる。アルキニル基は典型的には一価であるが、アルキニル基が２つの部分を結びつける場合などは、二価であってもよい。
【００５２】
「アルキニレン」は、少なくとも２個の他の基を連結する、上に定義されるアルキニル基、すなわち、二価炭化水素基を指す。アルキニレンと連結した２つの部分は、アルキニレンの同じ原子と連結していても異なる原子と連結していてもよい。アルキニレン基には、それだけに限らないが、エチニレン、プロピニレン、ブチニレン、ｓｅｃ−ブチニレン、ペンチニレンおよびヘキシニレンが含まれる。
【００５３】
「シクロアルキル」は、３〜１２個の環原子または指示される原子の数を含む飽和または部分不飽和の、単環式、縮合二環式または架橋多環式環集合体を指す。単環式環には、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルおよびシクロオクチルが含まれる。二環式および多環式環には、例えば、ノルボルナン、デカヒドロナフタレンおよびアダマンタンが含まれる。例えば、Ｃ３〜８シクロアルキルには、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロオクチルおよびノルボルナンが含まれる。
【００５４】
「シクロアルキレン」は、少なくとも２個の他の基を連結する、上に定義されるシクロアルキル基、すなわち、二価炭化水素基を指す。シクロアルキレンと連結した２つの部分は、シクロアルキレンの同じ原子と連結していても異なる原子と連結していてもよい。シクロアルキレン基には、それだけに限らないが、シクロプロピレン、シクロブチレン、シクロペンチレン、シクロヘキシレンおよびシクロオクチレンが含まれる。
【００５５】
「ヘテロシクロアルキル」は、３個の環メンバー〜約２０個の環メンバーと、１〜約５個のヘテロ原子（Ｎ、ＯおよびＳなど）とを有する環系を指す。それだけに限らないが、Ｂ、Ａｌ、ＳｉおよびＰを含むさらなるヘテロ原子も有用となることができる。それだけに限らないが、−Ｓ（Ｏ）−および−Ｓ（Ｏ）２−など、ヘテロ原子が酸化されていてもよい。例えば、複素環には、それだけに限らないが、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチオフェニル、モルホリノ、ピロリジニル、ピロリニル、イミダゾリジニル、イミダゾリニル、ピラゾリジニル、ピラゾリニル、ピペラジニル、ピペリジニル、インドリニル、キヌクリジニルおよび１，４−ジオキサ−８−アザ−スピロ［４．５］デカ−８−イルが含まれる。
【００５６】
「ヘテロシクロアルキレン」は、少なくとも２個の他の基を連結する、上に定義されるヘテロシクロアルキル基を指す。ヘテロシクロアルキレンと連結した２つの部分は、ヘテロシクロアルキレンの同じ原子と連結していても異なる原子と連結していてもよい。
【００５７】
「アリール」は、６〜１６個の環炭素原子を含む単環式または縮合二環式、三環式またはそれ以上の芳香環集合体を指す。例えば、アリールはフェニル、ベンジルまたはナフチル、好ましくはフェニルであることができる。「アリーレン」は、アリール基に由来する二価基を意味する。アリール基は、例えば、上に定義されるように、その全てが場合によりさらに置換されている、アルキル、アルコキシ、アリール、ヒドロキシ、ハロゲン、シアノ、アミノ、アミノ−アルキル、トリフルオロメチル、アルキレンジオキシおよびオキシ−Ｃ２〜Ｃ３−アルキレンから選択される１、２または３個の基で一、二または三置換されていてもよい；あるいは１−または２−ナフチル；あるいは１−または２−フェナントレニルであることができる。アルキレンジオキシは、フェニルの２個の隣接炭素原子と結合した二価置換基、例えば、メチレンジオキシまたはエチレンジオキシである。オキシ−Ｃ２〜Ｃ３−アルキレンはまた、フェニルの２個の隣接炭素原子と結合した二価置換基、例えば、オキシエチレンまたはオキシプロピレンである。オキシ−Ｃ２〜Ｃ３−アルキレン−フェニルの例には２，３−ジヒドロベンゾフラン−５−イルがある。
【００５８】
アリールとして好ましいのは、ナフチル、フェニルまたはアルコキシ、フェニル、ハロゲン、アルキルもしくはトリフルオロメチルによって一もしくは二置換されたフェニル、特にフェニルまたはアルコキシ、ハロゲンもしくはトリフルオロメチルによって一もしくは二置換されたフェニル、特にフェニルである。
【００５９】
Ｒとしての置換フェニル基の例には、例えば、４−クロロフェン−１−イル、３，４−ジクロロフェン−１−イル、４−メトキシフェン−１−イル、４−メチルフェン−１−イル、４−アミノメチルフェン−１−イル、４−メトキシエチルアミノメチルフェン−１−イル、４−ヒドロキシエチルアミノメチルフェン−１−イル、４−ヒドロキシエチル−（メチル）−アミノメチルフェン−１−イル、３−アミノメチルフェン−１−イル、４−Ｎ−アセチルアミノメチルフェン−１−イル、４−アミノフェン−１−イル、３−アミノフェン−１−イル、２−アミノフェン−１−イル、４−フェニル−フェン−１−イル、４−（イミダゾール−１−イル）−フェニル、４−（イミダゾール−１−イルメチル）−フェン−１−イル、４−（モルホリン−１−イル）−フェン−１−イル、４−（モルホリン−１−イルメチル）−フェン−１−イル、４−（２−メトキシエチルアミノメチル）−フェン−１−イルおよび４−（ピロリジン−１−イルメチル）−フェン−１−イル、４−（チオフェニル）−フェン−１−イル、４−（３−チオフェニル）−フェン−１−イル、４−（４−メチルピペラジン−１−イル）−フェン−１−イル、ならびに複素環式環で場合により置換されていてもよい４−（ピペリジニル）−フェニルおよび４−（ピリジニル）フェニルがある。
【００６０】
「アリーレン」は、少なくとも２個の他の基を連結する、上に定義されるアリール基を指す。アリーレンと連結した２つの部分は、アリーレンの異なる原子と連結している。アリーレン基には、それだけに限らないが、フェニレンが含まれる。
【００６１】
「アリーレン−オキシ」は、アリーレンと連結した部分の１つが酸素原子を通して連結している、上に定義されるアリーレン基を指す。アリーレン−オキシ基には、それだけに限らないが、フェニレン−オキシが含まれる。
【００６２】
同様に、アリールおよびヘテロアリール基の置換基は変化し、０〜芳香環系の開いた原子価の総数に及ぶ数の、−ハロゲン、−ＯＲ’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、−Ｒ’、ＣＮ、−ＮＯ２、−ＣＯ２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ２）＝ＮＨ、−ＮＲ’Ｃ（ＮＨ２）＝ＮＨ、−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ２）＝ＮＲ’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、−Ｎ３、−ＣＨ（Ｐｈ）２、ペルフルオロ（Ｃ１〜Ｃ４）アルコキシおよびペルフルオロ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルから選択され、Ｒ’、Ｒ’’およびＲ’’’は独立に、水素、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルおよびヘテロアルキル、未置換アリールおよびヘテロアリール、（未置換アリール）−（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、ならびに（未置換アリール）オキシ−（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルから選択される。
【００６３】
アリールまたはヘテロアリール環の隣接原子上の置換基の２つが場合により式−Ｔ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｑ−Ｕ−（式中、ＴおよびＵは独立に、−ＮＨ−、−Ｏ−、−ＣＨ２−または単結合であり、ｑは０〜２の整数である）の置換基で置き換えられていてもよい。あるいは、アリールまたはヘテロアリール環の隣接原子上の置換基の２つが場合により式−Ａ−（ＣＨ２）ｒ−Ｂ−（式中、ＡおよびＢは独立に、−ＣＨ２−、−Ｏ−、−ＮＨ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’−または単結合であり、ｒは１〜３の整数である）の置換基で置き換えられていてもよい。こうして形成した新しい環の単結合の１つが、場合により二重結合で置き換えられていてもよい。あるいは、アリールまたはヘテロアリール環の隣接原子上の置換基の２つが場合により式−（ＣＨ２）ｓ−Ｘ−（ＣＨ２）ｔ−（式中、ｓおよびｔは独立に、０〜３の整数であり、Ｘは−Ｏ−、−ＮＲ’、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−または−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’−である）の置換基で置き換えられていてもよい。−ＮＲ’−および−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’−中の置換基Ｒ’は、水素または未置換（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルから選択される。
【００６４】
「ヘテロアリール」は、環原子の１〜４個がヘテロ原子、それぞれＮ、ＯまたはＳである、５〜１６個の環原子を含む単環式または縮合二環式または三環式芳香環集合体を指す。例えば、ヘテロアリールには、ピリジル、インドリル、インダゾリル、キノキサリニル、キノリニル、イソキノリニル、ベンゾチエニル、ベンゾフラニル、フラニル、ピロリル、チアゾリル、ベンゾチアゾリル、オキサゾリル、イソキサゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ピラゾリル、イミダゾリル、チエニル、または例えば、アルキル、ニトロもしくはハロゲンによって置換、特に一もしくは二置換された任意の他の基が含まれる。ピリジルは２−、３−または４−ピリジル、有利には２−または３−ピリジルを表す。チエニルは２−または３−チエニルを表す。キノリニルは、好ましくは２−、３−または４−キノリニルを表す。イソキノリニルは、好ましくは１−、３−または４−イソキノリニルを表す。ベンゾピラニル、ベンゾチオピラニルは、好ましくはそれぞれ３−ベンゾピラニルまたは３−ベンゾチオピラニルを表す。チアゾリルは、好ましくは２−または４−チアゾリル、最も好ましくは４−チアゾリルを表す。トリアゾリルは、好ましくは１−、２−または５−（１，２，４−トリアゾリル）である。テトラゾリルは、好ましくは５−テトラゾリルである。
【００６５】
好ましくは、ヘテロアリールは、ピリジル、インドリル、キノリニル、ピロリル、チアゾリル、イソキサゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ピラゾリル、イミダゾリル、チエニル、フラニル、ベンゾチアゾリル、ベンゾフラニル、イソキノリニル、ベンゾチエニル、オキサゾリル、インダゾリルまたは置換、特に一もしくは二置換された基のいずれかである。
【００６６】
本明細書で使用される場合、「ヘテロアルキル」という用語は、１〜３個のヘテロ原子（Ｎ、ＯおよびＳなど）を有するアルキル基を指す。それだけに限らないが、Ｂ、Ａｌ、ＳｉおよびＰを含むさらなるヘテロ原子も有用となることができる。それだけに限らないが、−Ｓ（Ｏ）−および−Ｓ（Ｏ）２−など、ヘテロ原子が酸化されていてもよい。例えば、ヘテロアルキルには、エーテル、チオエーテル、アルキル−アミンおよびアルキル−チオールが含まれることができる。
【００６７】
本明細書で使用される場合、「ヘテロアルキレン」という用語は、少なくとも２個の他の基を連結する、上に定義されるヘテロアルキル基を指す。ヘテロアルキレンと連結した２つの部分は、ヘテロアルキレンの同じ原子と連結していても異なる原子と連結していてもよい。
【００６８】
「求電子剤」は、求電子中心、すなわち、電子を求めており、求核剤と反応することができる中心を有する、イオン性であることができるイオンまたは原子または原子の集合体を指す。求電子剤（または求電子試薬）は、その反応パートナー（求核剤）からの両方の結合電子を受容することによって、その反応パートナーとの結合を形成する試薬である。
【００６９】
「求核剤」は、求核中心、すなわち、求電子中心を求めている、または求電子剤と反応することができる中心を有する、イオン性であることができるイオンまたは原子または原子の集合体を指す。求核剤（または求核試薬）は、両方の結合電子を供与することによって、その反応パートナー（求電子剤）との結合を形成する試薬である。「求核基」は、反応基と反応した後の求核剤を指す。非限定的な例としては、アミノ、ヒドロキシル、アルコキシ、ハロアルコキシなどが挙げられる。
【００７０】
「マレイミド」は、スルフヒドリル（例えば、チオアルキル）と反応して、構造    
【化２】
2020183404.tif 000004
（「●」はマレイミド基の付着点を示し、「
2020183404.tif 000005
」は元のスルフヒドリル保有基の残りとチオールの硫黄原子の付着点を示す）
を有する−Ｓ−マレイミド基を形成する構造：
【化３】
2020183404.tif 000006
を有するピロール−２，５−ジオン−１−イル基を指す。
【００７１】
本開示の目的のために、タンパク質およびポリペプチド中に見られる「天然アミノ酸」は、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシンおよび／またはＬ−バリンである。タンパク質中に見られる「非天然アミノ酸」は、天然アミノ酸として列挙されているもの以外の任意のアミノ酸である。非天然アミノ酸には、限定されないが、天然アミノ酸のＤ異性体、および天然アミノ酸のＤ異性体とＬ異性体の混合物が含まれる。４−ヒドロキシプリン、デスモシン、イソデスモシン、５−ヒドロキシリジン、ε−Ｎ−メチルリジン、３−メチルヒスチジンなどの他のアミノ酸は、天然タンパク質中に見られるが、一般的にはｍＲＮＡのリボソーム翻訳以外の手段によって導入されるので、本開示の目的のために、タンパク質中に見られる非天然アミノ酸とみなす。
【００７２】
ポリマーの幾何学、構築または全体構造に関連した「直鎖」は、単一ポリマーアームを有するポリマーを指す。
【００７３】
ポリマーの幾何学、構築または全体構造に関連した「分岐」は、開始剤に含まれるコア構造から伸びる２本以上のポリマー「アーム」を有するポリマーを指す。開始剤を原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）反応に使用してもよい。分岐ポリマーは、２本のポリマー鎖（アーム）、３本のポリマーアーム、４本のポリマーアーム、５本のポリマーアーム、６本のポリマーアーム、７本のポリマーアーム、８本のポリマーアーム、９本のポリマーアームまたはそれ以上を有してもよい。各ポリマーアームは、ポリマー開始部位から伸びている。各ポリマー開始部位は、モノマーの付加によるポリマー鎖の成長のための部位となることができる。例えば、限定としてではなく、ＡＴＲＰを用いる場合、開始剤上のポリマー開始の部位は、典型的にはハロゲン化第一銅などの遷移金属化合物によって触媒される可逆的酸化還元過程を受ける有機ハロゲン化物である。好ましくは、ハロゲン化物が臭素である。
【００７４】
「薬学的に許容される」組成物または「医薬組成物」は、本発明の化合物と、薬学的に許容される賦形剤（複数可）とを含む組成物を指す。
【００７５】
「薬学的に許容される賦形剤」および「薬学的に許容される担体」は、本発明の組成物に含めることができ、患者に有意な有害毒物学的効果を引き起こさず、特にヒトにおける治療的使用についてＦＤＡによって承認されているまたは承認可能である賦形剤を指す。薬学的に許容される賦形剤の非限定的な例としては、水、ＮａＣｌ、生理食塩水、乳酸リンゲル液、規定ショ糖、規定ブドウ糖などが挙げられる。
【００７６】
「患者」または「それを必要とする対象」は、本明細書で提供される医薬組成物の投与によって予防または治療することができる状態を患っているまたは状態になりやすい生物を指す。非限定的な例としては、ヒト、他の哺乳動物および他の哺乳動物以外の動物が挙げられる。
【００７７】
コンジュゲートは、好ましくは単離型で提供される。単離されたとは、目的の種が、それが自然に会合しているまたはその製造で使用されるが、単離された種と組み合わせて作用することを意図した他の成分、例えば、医薬賦形剤の存在を必ずしも排除しない汚染物質から少なくとも部分的に分離されていることを意味する。好ましくは、コンジュゲートが、試料中に存在する主な巨大分子種である（すなわち、組成物中のモル基準でおよび典型的には、存在する全ての巨大分子種の（モル基準で）少なくとも約５０％を構成する）。一般的に、単離されたコンジュゲートは、組成物中に存在する全ての巨大分子種の８０、９０、９５または９９％超を構成する。最も好ましくは、組成物が単一巨大分子種から本質的になるように、コンジュゲートが本質的な均質性まで（すなわち、汚染物質種を従来の検出法によって組成物中に検出することができない）精製される。コンジュゲートが同じ種であると考えられる同じ重鎖および軽鎖を有するにもかかわらず、タンパク質部分のグリコシル化の変異およびコンジュゲートの異なる分子と結合しているポリマー部分の多数のモノマーの変異が存在することができる。
【００７８】
「治療上有効量」は、同定された疾患または状態を治療、改善または予防する、あるいは検出可能な治療または阻害効果を示すのに有用な結合した機能的物質または医薬組成物の量を指す。効果は、治療前のベースライン測定値に対する個々の患者で、または治療集団と対照集団との間の成績の統計学的に有意な差異を決定することによって検出することができる。
【００７９】
物質の「生物学的半減期」は、物質を生物に導入した後に物質の２分の１を生物から除去するのに要する時間を指定する薬物動態パラメータである。
【００８０】
配列同一性は、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ７．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩのＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡなどのアルゴリズムを用いて、デフォルトギャップパラメータを用いて配列を整列させることによって、または検査およびベストアラインメント（すなわち、比較窓に対する最高百分率の配列類似性をもたらす）によって決定することができる。配列同一性の百分率は、比較窓に対して２つの最適に整列させた配列を比較し、同一残基が両配列中に生じる位置の数を決定して一致した位置の数を得て、一致した位置の数を比較窓中の位置の総数（すなわち、窓サイズ）で割り、結果に１００を掛けて配列同一性の百分率を得ることによって計算される。
【００８１】
ＩＩＩ．第ＶＩＩＩ因子
凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）は、極めて低濃度で血漿中を循環しており、フォン・ヴィルブランド因子（ＶＷＦ）と非共有結合的に結合している。止血中、ＦＶＩＩＩはＶＷＦから分離し、カルシウムおよびリン脂質または細胞膜の存在下で活性化の速度を増強することによって活性化第ＩＸ因子（ＦＩＸａ）媒介第Ｘ因子（ＦＸ）活性化の補因子として作用する。
【００８２】
ＦＶＩＩＩは、ドメイン構造Ａ１−Ａ２−Ｂ−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２（図２）を有する約２７０〜３３０ｋＤａの単鎖前駆体として合成される。血漿から精製される場合（例えば、「血漿由来」または「血漿性」）、ＦＶＩＩＩは重鎖（Ａ１−Ａ２−Ｂ）および軽鎖（Ａ３−Ｃ１−Ｃ２）で構成される。軽鎖の分子質量は８０ｋＤａであるが、Ｂドメイン内のタンパク質分解のために、重鎖は９０〜２２０ｋＤａの範囲にある。ドメインは配列番号１中以下の通り描写されるＡ１、残基Ａｌａ１〜Ａｒｇ３７２；Ａ２、残基Ｓｅｒ３７３〜Ａｒｇ７４０；Ｂ、残基Ｓｅｒ７４１〜Ａｒｇ１６４８；Ａ３、残基Ｓｅｒ１６９０〜Ｉｌｅ２０３２；Ｃ１、残基Ａｒｇ２０３３〜Ａｓｎ２１７２；およびＣ２、残基Ｓｅｒ２１７３〜Ｔｙｒ２３３２。残りの配列、残基Ｇｌｕ１６４９〜Ａｒｇ１６８９は通常、第ＶＩＩＩ因子軽鎖活性化ペプチドと呼ばれる。第ＶＩＩＩ因子は、フォン・ヴィルブランド因子からこれを解離し、凝血原機能を有する第ＶＩＩＩａ因子を形成するトロンビンまたは第Ｘａ因子によってタンパク質分解的に活性化される。第ＶＩＩＩａ因子の生物学的機能は、第Ｘ因子活性化に対して第ＩＸａ因子の触媒効率を数桁増加させることである。トロンビン活性化第ＶＩＩＩａ因子は１６０ｋＤａ  Ａ１／Ａ２／Ａ３−Ｃ１−Ｃ２である。
【００８３】
成熟第ＶＩＩＩ因子は重度にグリコシル化およびタンパク質分解されており、金属イオンによって結合された重鎖と軽鎖を有するヘテロ二量体として循環している。重鎖は、配列関連領域Ａ１およびＡ２ドメインならびに重度にグリコシル化された結合Ｂ領域からなる。軽鎖はＡ３、Ｃ１およびＣ２ドメインからなる。血漿中で、第ＶＩＩＩ因子はフォン・ヴィルブランド因子との非共有結合複合体として循環している。第ＶＩＩＩ因子凝固活性にＢドメインが不要であることが分かった。
【００８４】
治療薬としての組換えＦＶＩＩＩ（ｒＦＶＩＩＩ）の潜在的有効性を決定するための種々のインビトロアッセイが考案されている。これらのアッセイは、内因性ＦＶＩＩＩのインビボ効果を模倣する。ＦＶＩＩＩのインビトロトロンビン処理は、インビトロアッセイによって測定されるように、凝血原活性の急速な増加およびその後の低下をもたらす。この活性化および不活性化は、重鎖と軽鎖の両方において特異的な限定されたタンパク質分解と同時に起こり、ＦＶＩＩＩの異なる結合エピトープの利用性を変化させる、例えば、ＦＶＩＩＩがＶＷＦから解離し、リン脂質表面に結合することを可能にする、またはあるモノクローナル抗体との結合能力を変化させる。
【００８５】
組換え工学技術による組換え第ＶＩＩＩ因子の産生が記載されている。例えば、米国特許第４７５７００６号明細書、第５７３３８７３号明細書、第５１９８３４９号明細書、第５２５０４２１号明細書、第５９１９７６６号明細書および欧州特許第３０６９６８号明細書を参照されたい。第ＶＩＩＩ因子の遺伝子は、Ｘ染色体の長腕の先端に位置する。ヒト第ＶＩＩＩ因子遺伝子は、ゲノムＤＮＡの１８６，０００ｂｐにわたって広がる２６個のエキソンを含み、１９個のアミノ酸リーダー配列を含む２３５１個のアミノ酸のタンパク質をコードする。第ＶＩＩＩ因子は最大の既知遺伝子の１つである。成熟第ＶＩＩＩ因子タンパク質は、２３３２個のアミノ酸である（Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ  Ｐ００４５１）。第ＶＩＩＩ因子のタンパク質配列を図１に示す。ＦＶＩＩＩを、ヒト血漿などの天然源から単離するのとは異なる遺伝子技術の結果として合成する場合、組換えとみなす。組換えＦＶＩＩＩは、（例えば、切断または突然変異により）血漿由来ＦＶＩＩＩと他の点で変わっていても変わっていなくてもよい。
【００８６】
ＦＶＩＩＩは、Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔデータベースに記載されている多数の既知の多型性の対象となる。したがって、例えば、５６位のアスパラギン酸残基が、場合により本発明によりバリンであってもよい。同様に、１１４１位のアスパラギン酸も、本発明によりグルタミン酸であってもよい。ＦＶＩＩＩの全ての既知のまたは発見された対立遺伝子および多型変異が本発明の範囲に含まれる。
【００８７】
本明細書では、「第ＶＩＩＩ因子」または「ＦＶＩＩＩ」という用語は、野生型ＦＶＩＩＩと関連した生物活性、特に血液凝固の促進を示す任意のＦＶＩＩＩ分子を指す。ＦＶＩＩＩ活性についてのいくつかのアッセイが商業的に入手可能である（Ｃｈａｎｄｌｅｒら、Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ  ２００３；１２０：３４〜３９参照）。本発明の好ましい実施形態では、ＦＶＩＩＩがＢドメインの少なくとも一部または全部（例えば、ポリマーとコンジュゲート可能な少なくとも１個のシステインを含む少なくとも１００、２００、５００または９００個の残基）を有する。好ましくは、一部が無傷Ｂドメインの２個の最もＣ末端のシステイン（１６０４位および１６３６位）を含む。本発明の一実施形態では、ＦＶＩＩＩ分子が完全長第ＶＩＩＩ因子（シグナルペプチドが欠失していてもよいことを除く）である。ＦＶＩＩＩ分子は、ストリンジェントな条件（例えば、５２℃、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ）下で、第ＶＩＩＩ：Ｃ因子をコードするＤＮＡとハイブリダイズすることができるＤＮＡ配列によってコードされるタンパク質である。このようなタンパク質は、ドメインＡ１−Ａ２−Ｂ−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２の間または中の種々の部位のアミノ酸欠失を含んでもよい（例えば、米国特許第４８６８１１２号明細書参照）。ＦＶＩＩＩ分子はまた、１個または複数のアミノ酸残基が部位特異的変異誘発によって置き換えられた野生型ＦＶＩＩＩの類似体であってもよい。
【００８８】
本発明に有用なＦＶＩＩＩ分子には、本明細書で以下に記載される完全長タンパク質、タンパク質の前駆体、タンパク質の生物活性もしくは機能的サブユニットまたはフラグメント、およびこれらの機能的誘導体が含まれる。ＦＶＩＩＩへの言及は、このようなタンパク質の全ての考えられる形態を含み、無傷野生型Ｂドメイン配列の少なくとも一部または全部を有するＦＶＩＩＩの形態およびＢドメインが存在しない形態を含むことを意図している。
【００８９】
本発明の別の態様では、種々の欠失を有するＦＶＩＩＩ部分を本発明のポリマーとコンジュゲートしてもよい。本発明のこの態様による第ＶＩＩＩ因子分子は、残りのドメインが配列番号１のアミノ酸１〜７４０および１６４９〜２３３２を有さない示される配列を有するＢドメイン切断第ＦＶＩＩＩ因子である。好ましくは、本発明による第ＶＩＩＩ因子分子は、好ましくは哺乳動物起源の、形質転換宿主細胞で産生された組換え分子である。
【００９０】
しかしながら、残りのドメイン（すなわち、３個のＡドメインおよび２個のＣドメイン）が配列番号１に示されるアミノ酸配列（アミノ酸１〜７４０および１６４９〜２３３２）とわずかに、例えば、約１％、２％、３％、４％または５％異なっていてもよい。特に、例えば、第ＶＩＩＩ因子の、例えば、ｖＷ因子、ＬＰＲ、種々の受容体、他の凝固因子、細胞表面等などの種々の他の成分との結合能力を修正するために、アミノ酸改変（置換、欠失または挿入）を残りのドメインに導入することができる。さらに、本発明による第ＶＩＩＩ因子分子は、例えば、切断Ｂドメインおよび／または分子の他のドメインの１つもしくは複数の中の他の翻訳後修飾を含むことができる。これらの他の翻訳後修飾は、例えば、ポリマー化合物、ペプチド化合物、脂肪酸由来化合物などの本発明による第ＶＩＩＩ因子分子とコンジュゲートした種々の分子の形態であってもよい。
【００９１】
本発明による第ＶＩＩＩ因子分子は、Ｂドメインの外側で修飾されているか否か、他の翻訳後修飾を有するか否かにかかわらず、全て第ＶＩＩＩ因子活性（ＦＶＩＩＩと類似または等しい機能的様式で凝固カスケードにおいて機能し、活性化血小板上のＦＩＸａとの相互作用を介してＦＸａの形成を誘導し、血餅の形成を支持する能力を意味する）を有する。活性は、例えば、血塊分析、内因性トロンビンポテンシャル（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ
ｔｈｒｏｍｂｉｎ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）分析等などの当技術分野で周知の技術（例えば、Ｃｈａｎｄｌｅｒら、上記）によってインビトロで評価することができる。本発明による第ＶＩＩＩ因子分子は、野生型ヒトＦＶＩＩＩの活性の少なくとも約１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％および１００％または１００％超のＦＶＩＩＩ活性さえ有する。
【００９２】
第ＶＩＩＩ因子のＢドメインは配列番号１のアミノ酸７４１〜１６４８に及ぶ。Ｂドメインはいくつかの異なる部位で切断されて、循環血漿ＦＶＩＩＩ分子における大きな異種性をもたらす。重度にグリコシル化されたＢドメインの正確な機能は未知である。しかし、ドメインは凝固カスケードのＦＶＩＩＩ活性にとって不要である。機能のこの明らかな欠如は、Ｂドメイン欠失／切断ＦＶＩＩＩが、完全長野生型ＦＶＩＩＩに見られるのと同一のインビボ特性を有するように見えるという事実によって裏付けられる。そうは言っても、Ｂドメインが、少なくとも無血清条件下で、細胞膜との会合を減少させる可能性がある兆候がある。
【００９３】
Ｂドメイン切断／欠失第ＶＩＩＩ因子分子：内因性完全長ＦＶＩＩＩは、単鎖前駆体分子として合成される。分泌の前に、前駆体は重鎖と軽鎖に切断される。組換えＢドメイン欠失ＦＶＩＩＩを、２つの異なる戦略から作製することができる。Ｂドメインを含まない重鎖および軽鎖を２つの異なるポリペプチド鎖として個別に合成する（２本鎖戦略）、またはＢドメイン欠失ＦＶＩＩＩを、完全長ＦＶＩＩＩ前駆体と同様に重鎖と軽鎖に切断される単一前駆体ポリペプチド鎖として合成する（単鎖戦略）。
【００９４】
Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩ前駆体ポリペプチドでは、重鎖および軽鎖部分が通常はリンカーによって分離されている。免疫原性エピトープをＢドメイン欠失ＦＶＩＩＩに導入するリスクを最小限にするために、リンカーの配列は、好ましくはＦＶＩＩＩ  Ｂドメイン由来とする。リンカーは、Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩ前駆体ポリペプチドを重鎖と軽鎖に分離するプロテアーゼのための認識部位を含まなければならない。完全長ＦＶＩＩＩのＢドメインでは、アミノ酸１６４４〜１６４８がこの認識部位を構成する。Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩの活性化でリンカーの除去をもたらすトロンビン部位は、重鎖に位置する。したがって、リンカーのサイズおよびアミノ酸配列は、トロンビン活性化による残りのＦＶＩＩＩ分子からのその除去に影響を及ぼしそうにない。Ｂドメインの欠失はＦＶＩＩＩの産生にとって有利なことである。それにもかかわらず、生産性を低下させることなく、Ｂドメインの一部をリンカーに含めることができる。Ｂドメインの生産性に対する負の効果は、Ｂドメインのいかなる特異的サイズまたは配列にも起因しなかった。
【００９５】
本発明によると、「組換え第ＶＩＩＩ因子」（ｒＦＶＩＩＩ）という用語は、ＤＮＡ技術を介して得られる任意のｒＦＶＩＩＩ（異種性もしくは天然）、またはその生物活性誘導体を含む。特定の実施形態では、この用語は、上記のタンパク質および本発明のｒＦＶＩＩＩをコードする核酸を包含する。このような核酸には、例えば、限定されないが、遺伝子、プレｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ、多型変異体、対立遺伝子、合成および天然変異体が含まれる。ｒＦＶＩＩＩという用語に包含されるタンパク質には、例えば、限定されないが、上記タンパク質およびポリペプチド、上記核酸によってコードされるタンパク質、種間相同体、および参照核酸によってコードされるポリペプチドまたは本明細書に記載されるアミノ酸と少なくとも約１００、約２００、約３００、約４００個またはそれ以上のアミノの領域にわたって、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％もしくは約９９％超またはそれ以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する他のポリペプチドが含まれる。好ましくは、第ＶＩＩＩ因子が、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ｃ１およびＣ２ドメインの全配列と少なくとも９０、９５、９６、９７、９８または９９％配列同一性を示す。
【００９６】
本発明の特定の態様によると、ｒＦＶＩＩＩの作製は、（ｉ）遺伝子工学による組換えＤＮＡの作製、（ｉｉ）例えば、限定されないが、トランスフェクション、電気穿孔または微量注入による組換えＤＮＡの原核または真核細胞への導入、（ｉｉｉ）前記形質転換細胞の培養、（ｉｖ）例えば、構成的または誘導でのｒＦＶＩＩＩの発現、および（ｖｉ）精製ｒＦＶＩＩＩを得るための、（ｖ）例えば、培養培地から、または形質転換細胞を回収することによる、前記ｒＦＶＩＩＩの単離のための当技術分野で既知の任意の方法を含む。
【００９７】
本発明の好ましい態様では、ｒＦＶＩＩＩを、薬学的に許容されるｒＦＶＩＩＩ分子を産生することを特徴とする適当な原核または真核宿主系での発現によって作製する。真核細胞の例には、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ、ＳＫ−ＨｉｐおよびＨｅｐＧ２などの哺乳動物細胞がある。
【００９８】
さらに他の態様では、多種多様なベクターがｒＦＶＩＩＩの調製に使用され、真核および原核発現ベクターから選択される。原核発現用のベクターの例としては、プラスミド、例えば、限定されないが、ｐｒｅｓｅｔ、ｐｅｔおよびｐａｄが挙げられ、原核発現ベクターに使用されるプロモーターには、限定されないが、ｌａｃ、ｔｒｃ、ｔｒｐ、ｒｅｃＡまたはａｒａＢＡＤの１つまたは複数が含まれる。真核発現用のベクターの例としては、（ｉ）プロモーター、例えば、限定されないが、ＡＯＸ１、ＧＡＰ、ＧＡＬ１またはＡＵＧ１を用いる、酵母での発現用のベクター、例えば、限定されないが、ｐＡＯ、ｐＰＩＣ、ｐＹＥＳまたはｐＭＥＴ；（ｉｉ）プロモーター、例えば、限定されないが、ＰＨ、ｐ１０、ＭＴ、Ａｃ５、ＯｐＩＥ２、ｇｐ６４またはｐｏｌｈを用いる、昆虫細胞での発現用のベクター、例えば、限定されないが、ｐＭＴ、ｐＡｃ５、ｐＩＢ、ｐＭＩＢまたはｐＢＡＣ、および（ｉｉｉ）哺乳動物細胞での発現用のベクター、例えば、限定されないが、ｐＳＶＬ、ｐＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡ３またはｐＢＰＶが挙げられ、一態様では、プロモーター、例えば、限定されないが、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＥＦ−１、ＵｂＣ、ＲＳＶ、ＡＤＶ、ＢＰＶおよびβ−アクチンを用いる、ウイルス系、例えば、限定されないが、ワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスまたはレトロウイルスが挙げられる。
【００９９】
ＦＶＩＩＩ分子を、タンパク質を含む他の機能的物質のために本明細書に記載される本発明のポリマーと結合させてもよい。例えば、一実施形態では、ポリマーを、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルを用いてタンパク質の遊離アミノ基を介してＦＶＩＩＩとコンジュゲートする。アミノ基とのコンジュゲーションを標的化する試薬は、リジンのε−アミン基、Ｎ−末端アミノ酸のα−アミン基、およびヒスチジンのδ−アミン基にランダムに反応することができる。完全長ＦＶＩＩＩは、１５８個のリジン、２個のＮ末端および７５個のヒスチジンを有する。本発明の態様によると、これらの部位の１つまたは複数を用いてコンジュゲートを形成することができる。しかしながら、完全な活性のために、ＦＶＩＩＩがフォン・ヴィルブランド因子（ＶＷＦ）、凝固第Ｘ因子（ＦＸ）および活性化第ＩＸ因子（ＦＩＸａ）などの複数のパートナーと相互作用することを要することが知られている。したがって、ポリマーと遊離アミノ基のコンジュゲーションは、コンジュゲートしたＦＶＩＩＩが凝固に影響を及ぼす能力に悪影響を及ぼす可能性がある。
【０１００】
別の実施形態では、本発明のポリマーを、限定されないが、マレイミド化学を含む任意の適当なチオール反応性化学を用いて遊離ＳＨ基とカップリングすることができる、または先の酸化の後ポリマーヒドラジドもしくはポリマーアミンとＦＶＩＩＩの炭水化物部分をカップリングすることができる。マレイミドカップリングの使用が、本発明の特に好ましい実施形態である。
【０１０１】
本発明の好ましい実施形態によると、十分な生物活性が保持される限り、マレイミドカップリングを用いて、ポリマーをＦＶＩＩＩのいずれのシステイン残基とカップリングしてもよい。あるいは、十分な活性が保持される限り、本発明のポリマーとＦＶＩＩＩのカップリングのために、ＦＶＩＩＩのいずれの適当なアミンまたは炭水化物部分を使用してもよい。
【０１０２】
ＦＶＩＩＩは、Ｂドメイン中に４個のシステインおよび他のドメイン中に１９個のシステインを有する。Ｂドメイン欠失（ＢＤＤ）ＦＶＩＩＩ中の１９個のシステインのうち、１６個がジスルフィドを形成し、他３個が遊離システインとなる。ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩの構造モデルは、全３個の遊離システインが埋め込まれ、ポリマーとの反応に利用できないことを示唆している（Ｂａｉｓａｎら  １１６  Ｂｌｏｏｄ  ２７０〜２７９（２０１０））。したがって、本発明の態様によると、ポリマーを、好ましくは部位特異的変異誘発によってＦＶＩＩＩに導入されたシステイン残基と共有結合する（考えられる部位については、以下の表１参照）。例えば、欧州特許第２３６３４１４号明細書を参照されたい。
【表１】
2020183404.tif 000007
例えば、Ｍｅｉ，Ｂ．ら、（２０１２）Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ  １１６、２７０〜２７９参照。
【０１０３】
本発明の別の態様によると、ポリマーを好ましくはＢドメイン中の天然システイン残基とカップリングさせる。あるいは、本発明の態様によると、システイン残基を、組換えＤＮＡ技術を介してＢドメインに付加してもよい。ポリマーを、１個のおよびただ１個のシステイン残基、または複数のシステインを介してｒＦＶＩＩＩとコンジュゲートすることができる。好ましくは、システイン（複数可）が、Ｂドメイン中、好ましくは配列番号１の１６０４位および１６３６位のＢドメイン中２個の最もＣ末端のシステインのいずれかである。（Ｂドメインの一部のみを使用する場合、２個の最もＣ末端のシステインは、無傷Ｂドメインの２個の最もＣ末端のシステインに整列させた部分のＣ末端システインである）。ｒＦＶＩＩＩの任意の所与の分子中の単一システインを介した分岐ポリマーの結合が、ｒＦＶＩＩＩ活性のいずれかがある場合に、実質的な減損なしに、ｒＦＶＩＩＩをポリマーと両性イオン電荷で囲むのに有利である。ポリマーをコンジュゲートする単一システインは、ｒＦＶＩＩＩの異なる分子で同じであっても異なっていてもよい。機構の理解は本発明の実施に要求されないが、ｒＦＶＩＩＩを囲むポリマー上の両性イオン電荷が、結果としてｒＦＶＩＩＩとタンデムに移動してｒＦＶＩＩＩをインビボでの分解過程から保護する水分子の層を実質的に固定すると考えられる。
【０１０４】
ｒＦＶＩＩＩの製剤は、ゲル上の重鎖からのいくつかのバンドをもたらすＢドメイン内の異なる部位でのタンパク質プロセシングにより典型的には均質である。２個のＣ末端システインの１つを介した重合をもたらすｒＦＶＩＩＩのこのような製剤と本発明のポリマーのコンジュゲーションは、これらの２個の末端システインが存在するｒＦＶＩＩＩの分子についてのみコンジュゲートを形成する。Ｂドメインがより切断されているｒＦＶＩＩＩの分子は、有意な程度にはコンジュゲートを形成しない。Ｂドメインの単一形態とのコンジュゲーションの特異性は、コンジュゲーション前後のゲル上のバンドを比較し、コンジュゲーション前のバンドのただ１つの損失または実質的減少を観察することによって示される。コンジュゲートしたｒＦＶＩＩＩは、分子量の大きな差異のためにｒＦＶＩＩＩのコンジュゲートしていない分子から容易に分離することができる。結果として、コンジュゲートしたｒＦＶＩＩＩの製剤は、ｒＦＶＩＩＩの典型的な製剤よりもずっと大きな均質性を有することができる。例えば、製剤中の分子の少なくとも８０、９０、９５または９９％が、Ｂドメイン、例えば、無傷Ｂドメインの同じ部分と、１分子当たり１個およびただ１個の結合したポリマー（好ましくは分岐）とを有することができる（異なるタンパク質間のグリコシル化の差および異なるポリマー間の長さの差があってもよいが）。いくつかの製剤では、部分が少なくとも配列番号１の残基配列番号１〜１６０４または１〜１６３６または１〜１６４８である。いくつかの製剤では、部分が配列番号１の残基１〜１６４８からなる。
【０１０５】
結合したポリマーを含むコンジュゲートのＢドメインが、内因性ＦＶＩＩＩ活性化過程によって対象への投与後に切除されてもよい。しかしながら、コンジュゲートしたポリマーは、活性の必要性が生じるまで、結合したＦＶＩＩＩの半減期を延長する役割をまだ果たす。さらに、活性化の過程でのポリマーの損失は、活性化が起こった後に、ＦＶＩＩＩが（Ｂドメインを介する以外でコンジュゲートしたＦＶＩＩＩと比較して）速く分解されることができるという利点を有する。この理由のために、Ｂドメインを介してコンジュゲートしたｒＦＶＩＩＩは、血友病を有しているが、投与時には出血（内部または外部）を経験していることが分かっていない対象の予防にとって有利である。ポリマーとのコンジュゲーションが、対象が出血エピソードを経験していると決定される可能性がある時まで、コンジュゲートの持続性を促進する。
【０１０６】
この時、Ｂドメインと会合したポリマーがｒＦＶＩＩＩからプロセシングされ、残りのｒＦＶＩＩＩが凝固を促進し、その後、不活性化されることができる。
【０１０７】
本方法によるｒＦＶＩＩＩとポリマーのコンジュゲーションは、ヒトにおけるｒＦＶＩＩＩのインビボ半減期を１１時間超増加させる。例えば、半減期が１２〜５０時間となることができる。好ましくは、半減期が２０時間以上である。半減期は、ヒトＦＶＩＩＩに対する前の抗体応答がないヒト対象の集団における平均値として測定される。このようなヒトは、半減期を測定する目的のために血友病を有していてもよいが、有する必要はない。
【０１０８】
その長い半減期のために、コンジュゲートを現在のレジメンよりも予防において少ない頻度で、例えば、毎週間隔以下での投与で投与することができる。いくつかの予防体制では、コンジュゲートを毎週〜毎月の間、例えば、毎週、隔週または毎月の頻度で投与する。減少した投与頻度にもかかわらず、コンジュゲートを受けている対象は、現在の方法と比べて増加したＦＶＩＩＩのトラフレベルを有することができる。現在の方法では、予防体制の対象は、血友病でない対照の対象における平均レベルの１％未満のレベルのＦＶＩＩＩ活性のトラフレベルで、約１８時間／週を過ごす。１％未満のレベルは、対象を急性出血の高いリスクにさらす。本方法を用いると、対象を、少なくとも１週間、１か月、１年または無期限の期間、血友病でない対照の対象におけるＦＶＩＩＩ活性の平均レベルの約１％、３％または５％超のトラフレベルで維持することができる。活性は、Ｂドメインの処理によるＦＶＩＩＩの活性化を含むインビトロ発色アッセイで評価することができる。
【０１０９】
予防的治療または他の治療において、本発明のコンジュゲートは、（本明細書に記載されるようにコンジュゲートしていない）ＦＶＩＩＩで以前治療され、これに対するヒト抗体応答を発達させた対象への投与に適している。本コンジュゲートのポリマー部分は、本コンジュゲートのＦＶＩＩＩをこのような抗体から保護して、ＦＶＩＩＩが、コンジュゲートしていないＦＶＩＩＩの場合よりも長く、好ましくは、ＦＶＩＩＩに対する抗体のない対象と本質的に同じ半減期を有して血液中で持続することを可能にする。
【０１１０】
Ｂドメイン中に天然システインに関して、無傷ＢドメインはＦＶＩＩＩ活性に必須ではない。ＦＶＩＩＩのＢドメインはアミノ酸７４５で始まり、アミノ酸１６４８まで続く。Ｂドメインは、４個の天然システイン残基：１２９３、１３７３、１６０４および１６３６を有する。本発明によると、これらの残基の１つまたは複数でのカップリングが好ましい。本発明のポリマーと残基１６０４および１６３６のカップリングが特に好ましい。
【０１１１】
本発明によると、本発明の高ＭＷポリマーとＦＶＩＩＩのコンジュゲートが提供される。本発明の一態様によると、ＦＶＩＩＩが両性イオンポリマーと結合しており、ポリマーが１つまたは複数のモノマー単位で構成され、少なくとも１つのモノマー単位は両性イオン基を含む好ましいコンジュゲートが提供される。好ましくは、両性イオン基がホスホリルコリンである。
【０１１２】
本発明の好ましい態様では、モノマー単位の１つが２−（アクリロイルオキシエチル）−２’−（トリメチルアンモニウムエチル）ホスフェートまたは２−（メタクリロイルオキシエチル）−２’−（トリメチルアンモニウムエチル）ホスフェート（ＨＥＭＡ−ＰＣ）である。他の好ましい実施形態では、ポリマーが、好ましくは２−（アクリロイルオキシエチル）−２’−（トリメチルアンモニウムエチル）ホスフェートまたは２−（メタクリロイルオキシエチル）−２’−（トリメチルアンモニウムエチル）ホスフェートである単一モノマーから合成される。
【０１１３】
本発明の好ましい実施形態では、ＦＶＩＩＩまたはコンジュゲートが組換えＦＶＩＩＩ（ｒＦＶＩＩＩ）である。本発明の好ましい実施形態では、ｒＦＶＩＩＩが完全長である。本発明の他の好ましい実施形態では、ｒＦＶＩＩＩが哺乳動物宿主細胞から精製される。本発明のさらに別の態様では、ＦＶＩＩＩがＢドメインの一部または全部の欠失を含む。
【０１１４】
本発明のさらに他の態様では、ＦＶＩＩＩコンジュゲートが２本以上、好ましくは３本以上のポリマーアームを有し、モノマーがＨＥＭＡ−ＰＣであることが好ましい。本発明の別の態様では、コンジュゲートが２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２本以上のポリマーアームを有し、モノマーがＨＥＭＡ−ＰＣであることが好ましい。より好ましくは、コンジュゲートが３、６または９本のアームを有する。最も好ましくは、コンジュゲートが９本のアームを有する。
【０１１５】
本発明の一態様では、ポリマー−ＦＶＩＩＩコンジュゲートが、１００，０００〜１，５００，０００ダルトンの間の分子量を有するポリマー部分を有することが好ましい。より好ましくは、コンジュゲートが、５００，０００〜１，０００，０００ダルトンの間の分子量を有するポリマー部分を有する。さらにより好ましくは、コンジュゲートが、６００，０００〜８００，０００ダルトンの間の分子量を有するポリマー部分を有する。最も好ましくは、ＦＶＩＩＩコンジュゲートが、６００，０００〜８５０，０００ダルトンの間の分子量を有するポリマー部分を有し、９本のアームを有する。ここでおよび本出願の他で、ＦＶＩＩＩを含むポリマーについての総分子量は、ポリマー部分について示されるものよりも約３００，０００ダルトン高い範囲にある。
【０１１６】
本発明の態様によると、両性イオンポリマー−機能的物質コンジュゲートを合成する方法であって、コンジュゲートが１種または複数の機能的物質と、１本または複数のポリマーアームとを有し、ポリマーアームの各々は１つまたは複数のモノマー型を有し、型の少なくとも１つは両性イオンである方法が提供される。本発明の態様によると、本方法は、ａ．１つまたは複数のポリマー合成開始剤部分と第１の反応基とを含む開始剤を、重合に適した１つまたは複数のモノマー型と組み合わせるステップであって、前記モノマー型の少なくとも１つは両性イオンを含み；前記モノマー型はポリマー合成開始剤部分（複数可）で反応してポリマー（複数可）を形成して重合開始剤を得るステップと；ｂ．第２および第３の反応基を含むリンカー部分を重合開始剤とカップリングして未反応反応基を有するリンカー重合開始剤を得るステップと；ｃ．１種または複数の機能的物質をリンカー重合開始剤の未反応反応基とカップリングしてポリマー−機能的物質コンジュゲートを得るステップとを有する。
【０１１７】
本発明の前に、開始剤分子または実体が、機能的物質のカップリングを可能にする脱保護可能な官能基を含まなければならなかった。保護されたマレイミドを有するこのような開始剤の例を以下に示す。
【化４】
2020183404.tif 000008
ポリマー合成後、保護されたマレイミドを熱により脱保護して、機能的物質をカップリングするために使用することができるマレイミドの作製を可能にする。マレイミドとポリマー開始部位との間の化学実体の性質を変えることを望む場合、完全に新しい開始剤を合成しなければならないだろう。
【０１１８】
ポリマー合成プロセスの可能なスケールアップを検討する場合、開始剤を多少なりとも変更または変化させる度に、新たなスケールアップ合成手順を開発しなければならない。開始剤分子の性質の各変化は、ポリマー合成に対する広範な効果を有する。しかしながら、本発明によると、単一開始剤部分を大規模ポリマー調製に使用することができる。したがって、スケールアップした最適なポリマー合成のための条件を開発することができる。本請求の発明を用いると、このようなポリマーを、種々の型のリンカーに「スナッピング（ｓｎａｐｐｉｎｇ−ｏｎ）」することによって種々の型の機能的物質に適合させることができる。
【０１１９】
例えば、より大きな機能的物質をＦａｂフラグメントの抗体などの本発明のポリマーとコンジュゲートすることが望まれる場合、より長いリンカー配列をポリマーにスナッピングすることができる。対照的に、より小さな機能的物質は比較的短いリンカー配列を必要とする可能性がある。
【０１２０】
本方法の好ましい実施形態では、開始剤がポリマー開始のための１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２個の部位を有する。好ましくは、開始剤がポリマー開始のための３、６または９個の部位を有する。
【０１２１】
本発明のこの態様によると、ポリマー合成イミテーター部分が、好ましくは以下の構造：
【化５】
2020183404.tif 000009
（Ｘは、ＡＴＲＰまたは関連するポリマー合成スキームの開始を可能にするＮＣＳまたはハロゲンであり、Ｒはイミテーターの残りである）
を有する。
【０１２２】
本発明によると、開始剤が、好ましくは構造：
【化６】
2020183404.tif 000010
（式中、Ｒ１は求核性反応基を有し、Ｒ２はリンカーを含み、Ｒ３はポリマー合成開始剤部分であり、ｓは１〜２０の間の整数である）
を有する。Ｒ１は、好ましくはＮＨ２−、ＯＨ−およびＳＨからなる群から選択される。より好ましくは、Ｒ１がＮＨ２−である。
【０１２３】
本発明のこの態様によると、Ｒ２は好ましくはアルキル、置換アルキル、アルキレン、アルコキシ、カルボキシアルキル、ハロアルキル、シクロアルキル、環状アルキルエーテル、アルケニル、アルケニレン、アルキニル、アルキニレン、シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルキレン、アリール、アリーレン、アリーレン−オキシ、ヘテロアリール、アミノ、アミドまたはこれらの任意の組み合わせである。
【０１２４】
より好ましくは、Ｒ２は式：
【化７】
2020183404.tif 000011
（式中、ｍは１〜２０であり、ｍは好ましくは４である）
を有する構造を含む。
【０１２５】
本発明によると、Ｒ３は以下の式
【化８】
2020183404.tif 000012
｛式中、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は同じまたは異なり、
【化９】
2020183404.tif 000013
（式中、ＸはＮＣＳ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩである）
からなる群から選択される｝
を有する。好ましくは、ＸがＢｒである。
【０１２６】
本発明のより好ましい態様では、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６がそれぞれ
【化１０】
2020183404.tif 000014
である。
あるいは、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６はそれぞれ
【化１１】
2020183404.tif 000015
である。
さらに他の好ましい実施形態では、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６がそれぞれ
【化１２】
2020183404.tif 000016
である。
【０１２７】
本発明のこの態様によると、モノマーが好ましくは
【化１３】
2020183404.tif 000017
（式中、Ｒ７はＨまたはＣ１〜６アルキルであり、ＺＷは両性イオンであり、ｔは１〜６である）
からなる群から選択される。好ましくは、両性イオンがホスホリルコリンである。
【０１２８】
さらにより好ましくは、モノマーが２−（メタクリロイルオキシエチル）−２’−（トリメチルアンモニウムエチル）ホスフェート（ＨＥＭＡ−ＰＣ）および２−（アクリロイルオキシエチル）−２’−（トリメチルアンモニウムエチル）ホスフェートからなる群から選択される。最も好ましくは、モノマーが２−（メタクリロイルオキシエチル）−２’−（トリメチルアンモニウムエチル）ホスフェートである。
【０１２９】
本発明の態様によると、ステップｄのリンカー部分が好ましくは構造
【化１４】
2020183404.tif 000018
｛式中、Ｒ８は
【化１５】
2020183404.tif 000019
からなる群から選択され、
Ｒ９は
【化１６】
2020183404.tif 000020
（式中、ｐは１〜１２である）
からなる群から選択される｝
を有する活性化エステルである。
【０１３０】
好ましくは、リンカー部分が
【化１７】
2020183404.tif 000021
である。
【０１３１】
本発明の態様によると、ステップａ．の開始剤が好ましくは以下の構造：
【化１８】
2020183404.tif 000022
（式中、ｙは１〜５０の整数であり、Ｘは０〜５０の整数であり、ＺはＮＣＳ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩである）
を有する。好ましくは、ＺがＢｒであり、Ｘが４、８または１２であり、Ｙが１〜１０である。より好ましくは、Ｙが４である。
【０１３２】
本発明のこの態様によると、ステップｆのリンカー−重合開始剤が好ましくは式：    
【化１９】
2020183404.tif 000023
（式中、Ｘは１〜５０の整数であり、Ｙは１〜５０の整数であり、ポリマーは本明細書に定義されるモノマーで合成される任意のポリマーである）
を有する。
より好ましくは、Ｙが４であり、Ｘが４、８または１２であり、モノマーがＨＥＭＡ−ｐｃである。
【０１３３】
好ましくは、機能的物質がタンパク質である。より好ましくは、タンパク質がヒトＦＶＩＩＩを含む。さらにより好ましくは、ＦＶＩＩＩが、好ましくはヒト宿主細胞から精製された組換えＦＶＩＩＩ（ｒＦＶＩＩＩ）である。最も好ましくは、ＦＶＩＩＩがＢドメインの一部または全部の欠失を有する。
【０１３４】
本発明の態様によると、式：
【化２０】
2020183404.tif 000024
（式中、ｙは１〜５０の整数であり、Ｘは０〜５０の整数であり、ＺはＮＣＳ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩである）
を有する化合物が提供される。好ましくは、ＺがＢｒであり、Ｘが４、８または１２であり、Ｙが１〜１０である。より好ましくは、Ｙが４である。
【０１３５】
本発明の別の態様によると、式：
【化２１】
2020183404.tif 000025
（式中、ｙは１〜５０の整数であり、Ｘは０〜５０の整数であり、ＭＰＣはポリＭＰＣアームである）
を有するポリマーが提供される。ポリＭＰＣは、重合反応、例えば、ＡＴＲＰで、２−（メタクリロイルオキシエチル）−２’−（トリメチルアンモニウムエチル）ホスフェートを用いて調製される。好ましくは、ポリマーの総分子量が約５００，０００〜約１，０００，０００ダルトンである。より好ましくは、ポリマーの総分子量が約６５０，０００〜約８５０，０００ダルトンである。さらにより好ましくは、ポリマーの総分子量が約７５０，０００ダルトンである。
【０１３６】
本発明のこの態様によると、Ｘが好ましくは４、８または１２であり、Ｙが１〜１０である。さらにより好ましくは、Ｙが４である。
【０１３７】
このような開始剤を、ポリマー合成のための基質として本発明により使用することができる。好ましくは、ポリマー合成をＡＴＲＰまたは同様の方法を用いて行う、例えば、ＡＧＥＴ（Ｗｏｏｄｗｏｒｔｈら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、第３１巻、第２３号、１９９８）またはＡＲＧＥＴ（Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、２０１２、４５（１６）、６３７１〜６３７９頁（Ｓｉｍａｋｏｖａ，Ａ．ら））によって作製する。本明細書に記載されるモノマーのいずれをポリマー合成に使用してもよい。
【０１３８】
経口投与に適した医薬組成物は、個別の単位、例えば、カプセル剤、液剤、シロップ剤または懸濁剤として（水性もしくは非水性液体中；または可食泡もしくはホイップとして；または乳剤として）提供することができる。錠剤または硬ゼラチンカプセルに適した賦形剤には、乳糖、トウモロコシデンプンまたはその誘導体、ステアリン酸またはその塩が含まれる。軟ゼラチンカプセルに使用するのに適した賦形剤には、例えば、植物油、ワックス、脂肪、半個体または液体ポリオール等が含まれる。液剤およびシロップ剤を調製するために、使用することができる賦形剤には、例えば、水、ポリオールおよび糖が含まれる。懸濁剤を調製するために、油（例えば、植物油）を使用して水中油型または油中水型懸濁剤を得ることができる。
【０１３９】
担体が固体である経鼻投与に適した医薬組成物には、嗅ぎたばこを嗅ぐように、すなわち、鼻の近くに保持した粉末の容器から鼻腔を通して迅速な吸入によって投与される、例えば、２０〜５００ミクロンの範囲の粒径を有する粗粉が含まれる。鼻噴霧薬または点鼻薬として投与するのに適した、担体が液体である組成物には、有効成分の水性または油性溶液が含まれる。吸入により投与するのに適した医薬組成物には、種々の型の定量加圧エアゾール、ネブライザーまたは吸入器によって生成されることができる微粒子粉塵または霧が含まれる。
【０１４０】
非経口投与に適した医薬組成物には、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤および製剤を意図したレシピエントの血液と実質的に等張性にする溶質を含んでもよい水性および非水性滅菌注射液；ならびに懸濁剤および増粘剤を含んでもよい水性および非水性滅菌懸濁液が含まれる。注射液に使用されることができる賦形剤には、例えば、水、アルコール、ポリオール、グリセリンおよび植物油が含まれる。組成物を、単位用量または多回投与容器、例えば、密閉アンプルおよびバイアルで提供することができ、使用直前に、滅菌液体担体、例えば、注射用の水を添加することのみを要するフリーズドライ（凍結乾燥）条件で保存することができる。即時注射液および懸濁液を、滅菌散剤、粒剤および錠剤から調製してもよい。医薬組成物は実質的に等張性であってもよい（約２５０〜３５０ｍＯｓｍ／ｋｇ水の重量オスモル濃度を意味する）。
【０１４１】
一般に、医薬組成物は、保存剤、可溶化剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、甘味剤、着色剤、着臭剤、塩（本発明の物質自体が薬学的に許容される塩の形態で提供されてもよい）、緩衝剤、コーティング剤または抗酸化剤を含んでもよい。医薬組成物は、本発明の物質に加えて、治療活性剤を含んでもよい。本発明の医薬組成物を、薬学的に許容される希釈剤、補助剤または担体と組み合わせて使用してもよい。このような賦形剤には、それだけに限らないが、生理食塩水、緩衝生理食塩水（リン酸緩衝生理食塩水）、ブドウ糖、リポソーム、水、グリセロール、エタノールおよびこれらの組み合わせが含まれることができる。
【０１４２】
医薬組成物を、例えば、経口、静脈内、皮下、筋肉内、骨内、鼻腔内経路などによる投与を含む、患者の疾患を治療するのに有効な、任意の有効で簡便な様式で投与することができる。療法でまたは予防として、活性剤を注射用組成物、例えば、好ましくは等張性の滅菌水性分散液として個体に投与することができる。
【０１４３】
哺乳動物、特にヒトに投与するために、活性剤の１日投与量は０．０１ｍｇ／ｋｇ体重、典型的には約１ｍｇ／ｋｇとなる。いずれにしても、医師が、個体の年齢、体重、性別および反応を含む因子に依存する個体に最も適した実際の投与量を決定することができる。上記投与量は、平均的なケースを代表するものである。当然、高いまたは低い投与量に値する例も存在し、このような例も本発明の範囲内にある。
【０１４４】
本発明の物質の投与量は、治療する疾患または障害、治療する個体の年齢および状態等に応じて広い限度間で変化し、最終的には医師が使用する適当な投与量を決定する。
【０１４５】
この投与量を、適宜繰り返してもよい。副作用が生じた場合、投与の量および／または頻度を、通常の診療にしたがって減らすことができる。一実施形態では、医薬組成物が１日〜３０日おきに１回投与されることができる。
【０１４６】
本発明の第３の態様によると、第２の態様の医薬組成物および別の医薬活性剤が提供される。他の医薬活性剤、例えば、別の血液凝固因子は、ＦＶＩＩＩの活性を促進または増強することができる。
【０１４７】
本発明の医薬組成物を、単独で使用しても、治療化合物もしくは分子、例えば、抗炎症薬、鎮痛薬もしくは抗生物質などの他の化合物と合わせて使用してもよい。他の化合物とのこのような投与は同時であっても、個別であっても、または逐次であってもよい。成分は、適宜説明書を含んでもよいキットの形態で調製されることができる。
【０１４８】
好ましくは、本発明の医薬組成物および他の治療化合物を、これを必要とする患者に直接投与する。
【０１４９】
本発明はまた、本発明の医薬組成物と、それだけに限らないが、経口投与用のカプセル、肺投与用の吸入器および静脈内投与用の注射液を含む投与ビヒクルとを含むパーツキットも提供する。
【０１５０】
本発明の第４の態様によると、血液凝固疾患を治療する方法であって、本発明の組成物を、これを必要とする患者に投与するステップを含む方法が提供される。そのため、本発明のこの態様は、前記方法におけるこのような組成物の使用も含む。
【０１５１】
血液凝固疾患は、血液凝固因子の機能の損失、または自己抗体の産生によって特徴付けられることができる。血液凝固疾患の例としては、血友病Ａおよび後天性血友病Ａが挙げられる。
【０１５２】
本明細書で使用される場合、「治療」という用語は、ヒトまたはヒト以外の動物に役立つことができる任意の体制を含む。「ヒト以外の動物」の治療は、飼育動物（ウマを含む）、およびコンパニオンアニマル（例えば、ネコおよびイヌ）、および家畜／農業用動物（ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシおよびウマ科の構成員を含む）の治療に及ぶ。治療は、任意の既存の状態もしくは疾患に関するものであってもよいし、または予防的（予防的治療）であってもよい。治療は、遺伝疾患のものであっても、後天性疾患のものであってもよい。治療は、急性状態のものであっても、慢性状態のものであってもよい。
【０１５３】
本発明の態様によるポリマーとコンジュゲートするために使用することができる、抗体を含むタンパク質上の求核基には、それだけに限らないが、（ｉ）Ｎ−末端アミン基、（ｉｉ）側鎖アミン基、例えば、リジン、（ｉｉｉ）側鎖チオール基、例えば、システイン、および（ｉｖ）タンパク質がグリコシル化されている糖ヒドロキシルまたはアミノ基が含まれる。アミン、チオールおよびヒドロキシル基は求核性であり、（ｉ）活性エステル（ＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロホルメートおよび酸ハロゲン化物など；（ｉｉ）ハロゲン化アルキルおよびベンジル（ハロアセトアミドなど）；（ｉｉｉ）アルデヒド、ケトン、カルボキシルおよびマレイミド基を含むポリマーと結合したリンカー部分およびリンカー試薬上の求電子基と反応して共有結合を形成することができる。抗体を含む多くのタンパク質が、コンジュゲーションに潜在的に使用することができるシステインチオール基を有する。多くのシステイン残基は、還元性鎖間ジスルフィド、すなわち、システイン架橋の形態である。ジスルフィドの形態のシステイン残基は、一般的にマレイミドなどの試薬と反応するために利用可能でない。システイン残基は遊離であっても不対であってもよい。しかしながら、遊離残基はしばしば、種々の媒体中で１種または複数の試薬によって「キャップ化」されていることが分かり、同様にコンジュゲーションに利用可能でない。タンパク質が完全にまたは部分的に還元されるように、ＤＴＴ（ジチオトレイトール）またはトリカルボニルエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）などの還元剤で処理することによって、システイン残基をマレイミドなどのリンカー試薬とのコンジュゲーションのために反応性にしてもよい。したがって、各システイン架橋は、理論的には、２個の反応性チオール求核剤を形成する。遊離システインの場合、１個のチオール求核剤が還元によって形成される。使用する条件に応じて、ＴＣＥＰまたはＤＴＴによる還元は、付随する活性の損失を伴う適当なタンパク質の折り畳みの損失をもたらす可能性がある。しかしながら、適当な条件下でタンパク質の再折り畳みを可能にすることによって、活性を回復させることができる。
【０１５４】
例えば、リジン残基を２−イミノチオラン（トラウト試薬）と反応させ、アミンのチオールへの変換を得ることによる、リジン残基の修飾を通して、追加の求核基を抗体に導入することができる。（例えば、１個または複数の非野生型システインアミノ酸残基を含む変異体を調製することにより）１、２、３、４個またはそれ以上のシステイン残基を導入することによって、反応性チオール基をタンパク質に導入してもよい。
【実施例】
【０１５５】
開始剤の合成
実施例１  ３−アーム「スナッピング」開始剤の調製
以下の構造を有するＴＦＡ／アミン塩開始剤（化合物Ｂ）を以下の通り合成した。
【化２２】
2020183404.tif 000026
【０１５６】
最初に、以下の構造：
【化２３】
2020183404.tif 000027
を有するＢＯＣ保護した３アーム開始剤、化合物Ａを以下の通り調製した：２５ｍＬ丸底フラスコに、窒素下で、ｔｅｒｔ−ブチル２−［２−（２−アミノエトキシ）エトキシ］エチルカルバメート（６６ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ、１．２当量）および（２，２，２−トリ（２−ブロモ−２−メチル−プロピオニルオキシメチル）エトキシ）酢酸（参照により本明細書に組み込まれる、生成物４．５についてＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０６０３０１に記載されているように調製される）（１４２ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ、１．０当量）、引き続いてＮ，Ｎ−ジメチルホルミアミド（２ｍＬ）、次いで、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．１９ｍＬ、１．１ｍｍｏｌ、５．０当量）を入れた。氷浴を用いてフラスコを０℃に冷却した。これに、プロピルホスホン酸無水物溶液（酢酸エチル中５０重量％、０．１６ｍＬ、０．２６ｍｍｏｌ、１．２当量）を１分間にわたって添加した。反応物を室温に加温し、１．５時間攪拌した。反応物を、水を添加してクエンチし、次いで、水と酢酸エチルを用いて分配した。有機層を分離し、水層を酢酸エチルで抽出した。合わせた有機層を水、飽和重炭酸ナトリウム水溶液、水、０．５Ｍクエン酸水溶液、水で洗浄し、次いで、乾燥させ（硫酸ナトリウム）、濾過し、真空下で濃縮した。残渣をシリカゲルカラム（６０ｍＬ）に加え、７０％酢酸エチルと３０％ヘキサンで溶出した。生成物を含む管をプールし、真空下で濃縮すると、化合物Ａ１５０ｍｇ（０．１７ｍｍｏｌ、７７％）が得られた。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ  ＣＤＣｌ３）：δ＝Ｎｅｅｄ  ｔｏ  ｐｕｔ  ｉｎ  ｄａｔａ  １．４４（ｓ，９Ｈ，ＯＣＣＨ３），１．９６（ｓ，１８Ｈ，ＣＣ（ＣＨ３）２Ｂｒ），３．３１  （ｑ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，２Ｈ，ＯＣＮＨＣＨ２ＣＨ２Ｏ），３．５−３．６（ｍ，１２Ｈ），３．９９（ｓ，２Ｈ，ＯＣＨ２Ｃ），４．３２（ｓ，６Ｈ，ＣＣＨ２ＯＣ＝Ｏ），５．０（ｂｒ  ｓ，１Ｈ，ＣＨ２ＮＨＣ＝ＯＯ），６．８（ｂｒ  ｓ，１Ｈ，ＣＨ２ＮＨＣ＝ＯＣ），ＬＣ−ＭＳ（ＥＳ，ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］＋  計算値  Ｃ３０Ｈ５１Ｂｒ３Ｎ２Ｏ１２＋Ｈ＝８７１．１；実測値  ８７１．８．
【０１５７】
化合物Ａを以下の通り脱保護して化合物Ｂを得た：２０ｍＬ丸底に、窒素下で、化合物Ａ（１２０ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ、１当量）、ジクロロメタン（２ｍＬ）、引き続いてトリフルオロ酢酸（２ｍＬ、２６．９ｍｍｏｌ、１９２当量）を添加した。反応物を、室温で３０分間攪拌した。反応物を、ヘキサンジクロロメタン（２０ｍＬ）を用いて希釈し、真空下で濃縮した。反応物を、ヘキサン（５０ｍＬ）を用いて希釈し、真空下で濃縮すると（２回）、化合物Ｂ２．２ｇ（２．７３ｍｍｏｌ、（残留ジクロロメタンを含む））が得られた。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ  ＣＤＣｌ３）：δ＝１．９４（ｓ，１８Ｈ，ＣＣ（ＣＨ３）２Ｂｒ），３．２（ｂｒ，２Ｈ，ＯＣＮＨＣＨ２ＣＨ２Ｏ），３．５−３．８（ｍ，１２Ｈ），３．９９（ｓ，２Ｈ，ＯＣＨ２Ｃ），４．３４（ｓ，６Ｈ，ＣＣＨ２ＯＣ＝Ｏ），７．１１（ｂｒ  ｔ，１Ｈ，ＣＨ２ＮＨＣ＝Ｏ），７．９９（ｂｒ，３Ｈ，ＮＨ３＋）．
ＬＣ−ＭＳ（ＥＳ，ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］＋  計算値  Ｃ２５Ｈ４３Ｂｒ３Ｎ２Ｏ１０＋Ｈ＝７７１．１；実測値  ７７１．６．
【０１５８】
実施例２  ６−アーム「スナッピング」開始剤の調製
以下の構造を有するＴＦＡ／アミン塩開始剤（化合物Ｆ１）を合成した。
【化２４】
2020183404.tif 000028
【０１５９】
Ｆ１を調製する第１のステップとして、以下の構造を有する化合物Ｃを合成した：    
【化２５】
2020183404.tif 000029
１００ｍＬ丸底に、窒素下で、還流冷却器を用いて、１−トシル−１１−（３，４，７−トリアザ−４，６，１０−トリフェニル−アダマンタン−１−イルメトキシ）−３，６，９−トリオキサウンデカン（生成物２．２についてＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０６０３０１に記載されているように調製される）（４．０ｇ、５．５ｍｍｏｌ、１．０当量）、ジ（ｔｅｒｔ−ブチル）イミドジカルボネート（１．４３ｇ、６．６ｍｍｏｌ、１．２当量）、炭酸カリウム（１．９ｇ、１３．７ｍｍｏｌ、２．５当量）、ヨウ化カリウム（０．１３７ｇ、０．８２ｍｍｏｌ、０．１５当量）、引き続いてアセトニトリル（２５ｍＬ）を添加した。反応物を室温で５分間攪拌し、引き続いて６０℃で３０時間攪拌した。反応物を、水（２５ｍＬ）およびｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル（１２５ｍＬ）を添加してクエンチした。有機層を分離し、水層をｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル（７５ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を飽和塩化ナトリウム水溶液（２０ｍＬ）で洗浄し、次いで、乾燥させ（硫酸ナトリウム）、濾過し、真空下で濃縮した。残渣をシリカゲルカラム（１９５ｇ、６．５ｃｍ×１２ｃｍ）に加え、８０％ヘキサン中２０％ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルから最大１００％ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルで溶出した。生成物を含む管をプールし、真空下で濃縮すると、化合物Ｃ３．７ｇ（４．７９ｍｍｏｌ、８７％）が得られた。
【０１６０】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ  ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝１．４２（ｓ，１８Ｈ，Ｃ［Ｃ（ＣＨ３）３］２），２．７２（ｓ，２Ｈ，ＣＣＨ２Ｎ，アイソマー），２．８８（ｓ，２Ｈ，ＣＣＨ２Ｎ，アイソマー），３．２−３．６（ｍ，２０Ｈ），５．２５（ｓ，２Ｈ，ＮＣＨＰｈ，アイソマー），５．７０（ｓ，１Ｈ，ＮＣＨＰｈ，アイソマー），７．３−７．８（ｍ，１５Ｈ，フェニル）．
【０１６１】
次に、以下の構造を有する化合物Ｄを合成した：
【化２６】
2020183404.tif 000030
５００ｍＬ丸底に、窒素下で、還流冷却器を用いて、化合物Ｃ（２．７ｇ、３．４９ｍｍｏｌ、１．０当量）、水酸化リチウム一水和物（０．７３ｇ、１７．５ｍｍｏｌ、５当量）、テトラヒドロフラン（２０ｍＬ）、メタノール（８ｍＬ）、引き続いて水（８ｍＬ）を添加した。反応物を６０℃で６時間攪拌した。反応物を真空下で濃縮し、次いで、水（７５ｍＬ）および酢酸エチル（１００ｍＬ）を添加することによって分配した。有機層を分離し、水層を酢酸エチル（５０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を飽和塩化ナトリウム水溶液（３０ｍＬ）で洗浄し、次いで、乾燥させ（硫酸ナトリウム）、濾過し、真空下で濃縮した。残渣をシリカゲルカラム（１１０ｇ、５．５ｃｍ×１０．５ｃｍ）に加え、５０％ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル中５０％ヘキサンから最大１００％ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルで溶出した。生成物を含む管をプールし、真空下で濃縮すると、化合物Ｄ１．３８ｇ（２．０５ｍｍｏｌ、５９％）が得られた。
【０１６２】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ  ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝１．３６（ｓ，９Ｈ，Ｃ［Ｃ（ＣＨ３）３］２），２．７２（ｓ，２Ｈ，ＣＣＨ２Ｎ，アイソマー），２．８８（ｓ，２Ｈ，ＣＣＨ２Ｎ，アイソマー），３．１−３．４（ｍ，２０Ｈ），５．２５（ｓ，２Ｈ，ＮＣＨＰｈ（アイソマー）），５．７０（ｓ，１Ｈ，ＮＣＨＰｈ（アイソマー）），６．７３（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，１Ｈ，Ｏ＝ＣＮＨＣＨ２），７．３−７．７（ｍ，１５Ｈ，フェニル）．
【０１６３】
Ｆ１の調製における次のステップは、以下の構造：
【化２７】
2020183404.tif 000031
を有する化合物Ｅの合成であった。
１００ｍＬ丸底に、化合物Ｄ（２．９６ｇ、４．４ｍｍｏｌ、１．０当量）、ジエチルエーテル（２０ｍＬ）、引き続いて水（１６ｍＬ）を添加した。氷浴を用いてフラスコを０℃に冷却した。これに、臭化水素酸溶液（水中４８重量％）（１．６４ｍＬ、１４．５ｍｍｏｌ、３．３当量）を添加した。反応物を０℃で１時間迅速に攪拌した。有機層を分離し、水層を０℃の反応フラスコに戻し、ここにジエチルエーテル（２０ｍＬ）を添加し、攪拌を１５分間続けた。有機層を再度分離し、水層を０℃の反応フラスコに戻し、ここにジエチルエーテル（２０ｍＬ）を添加し、攪拌を１０分間続けた。有機層を分離し、１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を添加して水層をｐＨ４．５に調整した。真空下でのアセトニトリルとの共沸によって水を除去すると、化合物Ｅ２．５ｇ（３．８５ｍｍｏｌ、８７％）が白色固体として得られた。
【０１６４】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ  ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝１．３６（ｓ，９Ｈ，ＯＣ（ＣＨ３）３），３．０５−３．５８（ｍ，２４Ｈ，ＣＨ２），６．８（ｔ，１Ｈ，Ｏ＝ＣＮＨＣＨ２），８．０（ｂｒ  ｓ，９Ｈ，ＣＨ２ＮＨ２＊ＨＢｒ）．
【０１６５】
ＬＣ−ＭＳ（ＥＳ，ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］＋Ｃ１８Ｈ４０Ｎ４Ｏ６＋Ｈについての計算値＝４０９．３；実測値４０９．６。
【０１６６】
化合物Ｆ１の調製における次のステップは、以下の構造：
【化２８】
2020183404.tif 000032
を有する化合物Ｆの合成であった。
２００ｍＬ丸底フラスコに、窒素下で、ビス２，２−［（２−ブロモイソブチリル）ヒドロキシメチル］プロピオン酸（参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願第１３／６４１，３４２号明細書の実施例７に記載されるように調製される）（２．３２ｇ、５．３７ｍｍｏｌ、３．３当量）および化合物Ｅ（１．０６ｇ、１．６３ｍｍｏｌ、１．０当量）、引き続いてジメチルホルムアミド（１５ｍＬ）、次いで、ジイソプロピルエチルアミン（３．４ｍＬ、１９．５ｍｍｏｌ、１２当量）を入れた。これに、プロピルホスホン酸無水物溶液（酢酸エチル中５０重量％、３．７ｍＬ、５．８７ｍｍｏｌ、３．５当量）を添加した。反応物を６０分間攪拌した。反応物を、水（１ｍＬ）を添加してクエンチし、予備的ＨＰＬＣカラムにロードし、水中５０％アセトニトリル（０．１％トリフルオロ酢酸を含む）から９５％アセトニトリル（０．１％トリフルオロ酢酸を含む）で溶出した。生成物を含む管をプールし、真空下で濃縮し、凍結し、凍結乾燥機に入れた。これにより、化合物Ｆ６４０ｍｇ（０．３９ｍｍｏｌ、２４％）が得られた。
【０１６７】
最後に、ｔＢＯＣ保護基を除去して、上に示される構造を有する最終的な開始剤、Ｆ１を得た。５０ｍＬ丸底に、生成物１７４−４４（６００ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ）およびジクロロメタン（３．６ｍＬ）を添加した。氷浴を用いてフラスコを０℃に冷却した。これに、トリフルオロ酢酸（３．６ｍＬ）を添加した。反応物を、室温で４５分間攪拌した。反応物をヘキサンで希釈し、次いで、真空下で濃縮した。反応物をヘキサンで希釈し、真空下で濃縮した。残渣を、アセトニトリル（３ｍＬ）を用いて溶解し、水（１．５ｍＬ）で希釈し、凍結し、凍結乾燥機に入れた。これにより、化合物Ｆ１  ５３７ｍｇ（０．３２ｍｍｏｌ、８９％）が油として得られた。
【０１６８】
実施例３  ９−アーム「スナッピング」開始剤化合物Ｌの調製
以下の構造を有するＴＦＡ／アミン塩開始剤（化合物Ｌ）を以下の通り合成した。
【化２９】
2020183404.tif 000033
【０１６９】
最初に、以下の構造を有する化合物Ｋを合成した：
【化３０】
2020183404.tif 000034
２００ｍＬ丸底フラスコに、窒素下で、化合物Ｊ（１．９ｇ、２．６７ｍｍｏｌ、３．３当量）
【化３１】
2020183404.tif 000035
および化合物Ｅ（０．５２５ｇ、０．８１ｍｍｏｌ、１．０当量）（上記参照）、引き続いてジメチルホルムアミド（１０ｍＬ）、次いで、ジイソプロピルエチルアミン（２．５ｍＬ、１４．６ｍｍｏｌ、１８当量）を入れた。
氷浴を用いてフラスコを０℃に冷却した。これに、プロピルホスホン酸無水物溶液（酢酸エチル中５０重量％、２．５ｍＬ、４．０４ｍｍｏｌ、５当量）を約６分間にわたって添加した。
【０１７０】
反応物を室温に加温し、１５分間攪拌した。反応物を、水（２０ｍＬ）、飽和重炭酸ナトリウム水溶液（２０ｍＬ）および酢酸エチル（１００ｍＬ）を添加してクエンチした。有機層を分離し、水層を酢酸エチル（７５ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を飽和重炭酸ナトリウム水溶液（３０ｍＬ）、０．５Ｍクエン酸水溶液（４０ｍＬ）、水（２５ｍＬ）および飽和塩化ナトリウム水溶液（４０ｍＬ）で洗浄し、次いで、乾燥させ（硫酸ナトリウム）、濾過し、真空下で濃縮した。さらに精製することなく使用した残渣により化合物Ｋ２．０ｇ（０．８０ｍｍｏｌ、９９％）が得られた。
【０１７１】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ  ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝１．３６（ｓ，９Ｈ，ＯＣＣＨ３），１．９０（ｓ，５４Ｈ，ＣＣ（ＣＨ３）２Ｂｒ），２．３１（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，６Ｈ，ＣＣＨ２ＣＨ２ＮＨ），２．９８（ｄ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，６Ｈ，ＣＣＨ２ＮＨ），３．０４（ｑ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ，ＯＣＨ２ＣＨ２ＮＨ），３．１８（ｓ，２Ｈ，ＯＣＨ２Ｃ），３．３−３．３７（ｍ，８Ｈ，ＣＨ２），３．４７−３．５５（ｍ，１２Ｈ，ＣＨ２），３．５８（ｓ，６Ｈ，ＯＣＨ２Ｃ），３．８７（ｓ，６Ｈ，Ｏ＝ＣＣＨ２Ｏ），４．２７（ｓ，１８Ｈ，ＣＣＨ２ＯＣ＝Ｏ），６．７４（ｂｒ  ｔ，１Ｈ，ＣＨ２ＮＨＣ＝Ｏ），７．６９（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ，ＣＨ２ＮＨＣ＝Ｏ），７．８４（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，３Ｈ，ＣＨ２ＮＨＣ＝Ｏ）．
【０１７２】
ＬＣ−ＭＳ（ＥＳ，ｍ／ｚ）：［（Ｍ＋２Ｈ−ｂｏｃ）／２］＋（Ｃ８４Ｈ１３６Ｂｒ９Ｎ７Ｏ３３＋２Ｈ−Ｂｏｃ）についての計算値／２＝１１９６．６；実測値１１９６．６。
【０１７３】
次に、化合物Ｌを以下の通り合成した：１００ｍＬ丸底に、窒素下で、化合物Ｋ（２．０ｇ、０．８ｍｍｏｌ）、ジクロロメタン（１０ｍＬ）、引き続いてトリフルオロ酢酸（５ｍＬ）を添加した。反応物を、室温で３０分間攪拌した。反応物を真空下で濃縮した。反応物を、ジクロロメタン（１０ｍＬ）を用いて希釈し、真空下で濃縮した。残渣を、アセトニトリル（１０ｍＬ）を用いて溶解し、シリンジフィルタ（Ａｃｒｏｄｉｓｃ  ＣＲ２５、ＰＮ  ４２２５Ｔ）を通して濾過し、予備的ＨＰＬＣカラムにロードし、水中６０％アセトニトリル（０．１％トリフルオロ酢酸を含む）から最大９８％アセトニトリル（０．１％トリフルオロ酢酸を含む）で溶出した。生成物を含む管をプールし、真空下で濃縮し、凍結し、凍結乾燥機に入れた。これにより、化合物Ｌ９９０ｍｇ（０．４ｍｍｏｌ、２ステップにわたって５０％）が白色粉末として得られた。
【０１７４】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ  ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝１．９０（ｓ，５４Ｈ，ＣＣ（ＣＨ３）２Ｂｒ），２．３１（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，６Ｈ，ＣＣＨ２ＣＨ２ＮＨ），２．９７−３．０（ｍ，８Ｈ，ＣＣＨ２ＮＨ  ａｎｄ  ＯＣＨ２ＣＨ２ＮＨ），３．１７（ｓ，２Ｈ，ＯＣＨ２Ｃ），３．３（ｑ，６Ｈ，ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ＝Ｏ），３．４−３．５９（ｍ，２０Ｈ，ＣＨ２），３．８７（ｓ，６Ｈ，Ｏ＝ＣＣＨ２Ｏ），４．２７（ｓ，１８Ｈ，ＣＣＨ２ＯＣ＝Ｏ），７．６９−７．８４（ｍ，９Ｈ，ｂｏｔｈ  ＣＨ２ＮＨＣ＝Ｏ  ａｎｄ  ＮＨ３＋）．
【０１７５】
ＬＣ−ＭＳ（ＥＳ，ｍ／ｚ）：［（Ｍ＋２Ｈ）／２］＋（Ｃ８４Ｈ１３６Ｂｒ９Ｎ７Ｏ３３＋２Ｈ）についての計算値／２＝１１９６．６；実測値１１９７．４。
【０１７６】
実施例４  より長いスペーサー９−アーム開始剤  スナッピング開始剤化合物Ｏの調製
以下の構造を有するＴＦＡ／アミン塩開始剤（化合物Ｏ）を以下の通り合成した。    
【化３２】
2020183404.tif 000036
【０１７７】
最初に、以下の構造を有する化合物Ｍを合成した：
【化３３】
2020183404.tif 000037
２０ｍＬバイアルに、化合物Ｌ（４１０ｍｇ、０．１６４ｍｍｏｌ、１．０当量）（上記参照）およびα−ｔ−ブチルオキシカルボニルアミノ−ω−カルボキシオクタ（エチレングリコール）（９７．５ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ、１．１当量）、引き続いてＮ，Ｎ−ジメチルホルミアミド（２ｍＬ）、次いで、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．１７１ｍＬ、０．９８２ｍｍｏｌ、６当量）を入れた。氷浴を用いてフラスコを０℃に冷却した。これに、プロピルホスホン酸無水物溶液（酢酸エチル中５０重量％、０．２０５ｍＬ、０．３２７ｍｍｏｌ、２当量）を約１分間にわたって添加した。反応物を室温に加温し、３０分間攪拌した。反応物を、水（１０ｍＬ）、飽和重炭酸ナトリウム水溶液（１０ｍＬ）および酢酸エチル（４０ｍＬ）を添加してクエンチした。有機層を分離し、水層を酢酸エチル（２５ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を飽和重炭酸ナトリウム水溶液（１０ｍＬ）、０．５Ｍクエン酸水溶液（１０ｍＬ）、水（１０ｍＬ）および飽和塩化ナトリウム水溶液（１０ｍＬ）で洗浄し、次いで、乾燥させ（硫酸ナトリウム）、濾過し、真空下で濃縮した。さらに精製することなく使用した残渣により化合物Ｍ０．５ｇ（０．１７２ｍｍｏｌ、１０５％）が得られた。
【０１７８】
ＬＣ−ＭＳ（ＥＳ，ｍ／ｚ）：［（Ｍ＋２Ｈ−ｂｏｃ）／２］＋（Ｃ１０３Ｈ１７３Ｂｒ９Ｎ８Ｏ４２＋２Ｈ−Ｂｏｃ）についての計算値／２＝１４０８．２；実測値１４０８．９。
【０１７９】
１００ｍＬ丸底に、窒素下で、化合物Ｍ（０．５ｇ）、ジクロロメタン（４ｍＬ）、引き続いてトリフルオロ酢酸（３ｍＬ）を添加した。反応物を、室温で１５分間攪拌した。反応物を真空下で濃縮した。残渣を、アセトニトリル（３ｍＬ）を用いて溶解し、シリンジフィルタ（Ａｃｒｏｄｉｓｃ  ＣＲ２５、ＰＮ  ４２２５Ｔ）を通して濾過し、予備的ＨＰＬＣカラムにロードし、５０％水（０．１％トリフルオロ酢酸を含む）中５０％アセトニトリル（０．１％トリフルオロ酢酸を含む）から最大９０％アセトニトリル（０．１％トリフルオロ酢酸を含む）で溶出した。生成物を含む管をプールし、真空下で濃縮し、凍結し、凍結乾燥機に入れた。これにより、化合物Ｏ１０１ｍｇ（２ステップにわたって２１％）が得られた。
【０１８０】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ  ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝１．９０（ｓ，５４Ｈ，ＣＣ（ＣＨ３）２Ｂｒ），２．３（  ｂｒ  ｔ，８Ｈ，ＣＣＨ２ＣＨ２ＮＨ  ａｎｄ  ＣＨ２ＣＨ２Ｃ＝Ｏ），３．０（ｍ，８Ｈ，ＣＣＨ２ＮＨ  ａｎｄ  ＯＣＨ２ＣＨ２ＮＨ），３．１−３．６（ｍ，６４Ｈ，ＯＣＨ２Ｃ），３．８７（ｓ，６Ｈ，Ｏ＝ＣＣＨ２Ｏ），４．２７（ｓ，１８Ｈ，ＣＣＨ２ＯＣ＝Ｏ），７．６−７．８（ｍ，１０Ｈ，ｂｏｔｈ  ＣＨ２ＮＨＣ＝Ｏ  ａｎｄ  ＮＨ３＋）．
【０１８１】
ＬＣ−ＭＳ（ＥＳ，ｍ／ｚ）：［（Ｍ＋２Ｈ）／２］＋（Ｃ９８Ｈ１６５Ｂｒ９Ｎ８Ｏ４０＋２Ｈ）についての計算値／２＝１４０８．２；実測値１４０８．３。
【０１８２】
実施例５  より長いスペーサー９−アーム「スナッピング」開始剤化合物Ｐの調製
以下の構造を有するＴＦＡ／アミン塩開始剤（化合物Ｐ）を以下の通り合成した：    
【化３４】
2020183404.tif 000038
２０ｍＬバイアルに、化合物Ｌ（４３０ｍｇ、０．１７２ｍｍｏｌ、１．０当量）（上記参照）およびα−ｔ−ブチルオキシカルボニルアミノ−ω−カルボキシオクタ（エチレングリコール）（１５４ｍｇ、０．２１５ｍｍｏｌ、１．２５当量）、引き続いてＮ，Ｎ−ジメチルホルミアミド（２ｍＬ）、次いで、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．１８ｍＬ、１．０３ｍｍｏｌ、６当量）を入れた。氷浴を用いてフラスコを０℃に冷却した。これに、プロピルホスホン酸無水物溶液（酢酸エチル中５０重量％、０．２１５ｍＬ、０．３４３ｍｍｏｌ、２当量）を１分間にわたって添加した。反応物を室温に加温し、３０分間攪拌した。反応物を、水、飽和重炭酸ナトリウム水溶液および酢酸エチルを添加してクエンチした。有機層を分離し、水層を酢酸エチルで抽出した。合わせた有機層を飽和重炭酸ナトリウム水溶液、０．５Ｍクエン酸水溶液、水および飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、次いで、乾燥させ（硫酸ナトリウム）、濾過し、真空下で濃縮した。さらに精製することなく使用した残渣により、以下に示される化合物Ｎ０．６ｇ（０．１９４ｍｍｏｌ）が得られた。
【０１８３】
ＬＣ−ＭＳ（ＥＳ，ｍ／ｚ）：［（Ｍ＋２Ｈ−ｂｏｃ）／２］＋（Ｃ１１１Ｈ１８９Ｂｒ９Ｎ８Ｏ４６＋２Ｈ−Ｂｏｃ）についての計算値／２＝１４９６．３；実測値１４９７．２。    
【化３５】
2020183404.tif 000039
１００ｍＬ丸底に、窒素下で、化合物Ｎ（０．６ｇ）、ジクロロメタン（４ｍＬ）、引き続いてトリフルオロ酢酸（３ｍＬ）を添加した。反応物を、室温で１５分間攪拌した。反応物を真空下で濃縮した。残渣を、アセトニトリル（３ｍＬ）を用いて溶解し、シリンジフィルタ（Ａｃｒｏｄｉｓｃ  ＣＲ２５、ＰＮ  ４２２５Ｔ）を通して濾過し、予備的ＨＰＬＣカラムにロードし、５０％水（０．１％トリフルオロ酢酸を含む）中５０％アセトニトリル（０．１％トリフルオロ酢酸を含む）から最大９０％アセトニトリル（０．１％トリフルオロ酢酸を含む）で溶出した。生成物を含む管をプールし、真空下で濃縮し、凍結し、凍結乾燥機に入れた。これにより、化合物Ｐ２００ｍｇ（０．０６４ｍｍｏｌ、２ステップにわたって３７％）が得られた。
【０１８４】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ  ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝１．９０（ｓ，５４Ｈ，ＣＣ（ＣＨ３）２Ｂｒ），２．３（ｂｒ  ｔ，８Ｈ，ＣＣＨ２ＣＨ２ＮＨ  ａｎｄ  ＣＨ２ＣＨ２Ｃ＝Ｏ），３．０（ｍ，８Ｈ，ＣＣＨ２ＮＨ  ａｎｄ  ＯＣＨ２ＣＨ２ＮＨ），３．１−３．６（ｍ，８４Ｈ，ＯＣＨ２Ｃ），３．８７（ｓ，６Ｈ，Ｏ＝ＣＣＨ２Ｏ），４．２７（ｓ，１８Ｈ，ＣＣＨ２ＯＣ＝Ｏ），７．６−７．８（ｍ，１０Ｈ，ｂｏｔｈ  ＣＨ２ＮＨＣ＝Ｏ  ａｎｄ  ＮＨ３＋）．
【０１８５】
ＬＣ−ＭＳ（ＥＳ，ｍ／ｚ）：［（Ｍ＋２Ｈ）／２］＋（Ｃ１０６Ｈ１８１Ｂｒ９Ｎ８Ｏ４４＋２Ｈ）についての計算値／２＝１４９６．３；実測値１４９６．６。
【０１８６】
ポリマーの合成
実施例６  両性イオンポリマーの調製
開始剤を、典型的には約１００ｍｇ／ｍＬのＤＭＦ中ストック溶液として調製する。開始剤およびリガンド（２，２’−ビピリジル）をシュレンク管に導入した。得られた溶液を、ドライアイス／アセトン混合物を用いて−７８℃に冷却し、真空下で１０分間脱気した。管にアルゴンを充填し、触媒（特に指示しない限り、ＣｕＢｒ）を、アルゴン下で維持して、シュレンク管に導入した（開始剤上の原子臭素／触媒（ＣｕＢｒ）／リガンドのモル比を１／１／２に維持した）。溶液が直ちに濃褐色になった。シュレンク管を密閉し、短サイクルの真空／アルゴンを印加することによって直ちにパージした。窒素下で維持したグローブボックス中で調製した規定量のモノマーと２００標準強度の脱気エタノールを混合することによって、ＨＥＭＡ−ＰＣの溶液を調製した。モノマー溶液をシュレンク管に（カニューレを介して）滴加した（および光によって均質化した  攪拌：不要）。温度を−７８℃で維持した。溶液からの起泡が止むまで、完全な真空を反応混合物に少なくとも１０〜１５分間印加した。次いで、管にアルゴンを充填し、室温に加温した。溶液を攪拌し、重合が進行するにつれて、溶液が粘性になった。３〜８時間またはちょうど一晩静置した後、Ｃｕ（Ｉ）をＣｕ（ＩＩ）に酸化するために、反応物を空気への直接暴露によってクエンチすると、混合物が青緑色になり、銅触媒を除去するためにこれをシリカカラムに通過させた。回収した溶液を回転蒸発によって濃縮し、得られた混合物をテトラヒドロフランを用いて沈殿させるかまたは水に対して透析し、引き続いて凍結乾燥させると自由流動性白色粉末が得られた。表２は本発明により作製した代表的なポリマーを示している。
【表２】
2020183404.tif 000040
【表３】
2020183404.tif 000041
2020183404.tif 000042
2020183404.tif 000043
【０１８７】
実施例７  保護されたマレイミドの脱保護
バイオポリマー粉末を１２０℃で９０分間加熱した場合、熱脱保護後に、保護されたマレイミドバイオポリマーがＭｐをより高い値にシフトする傾向があることが認められた。これにより、Ｍｐのアップシフトの量がバイオポリマー（Ｍｐ、構造等）に依存するので、バイオポリマー製造がより困難になる。脱保護の代替法が必要とされる。
【０１８８】
最初の実験を、密閉キャピラリーループ内の水中で行った。１２０℃のオーブンでバイオポリマー水溶液の熱脱保護中に、フランが放出されることが証明された。水溶液中での熱脱保護後に、Ｍｐのアップシフトは認められなかった。  
【０１８９】
エタノールに溶解したバイオポリマーについても、この手順を繰り返した。エタノール溶液中で熱脱保護を行うと、Ｍｐのアップシフトが完全に排除されることが確認された。オーブンまたは油浴などの異なる加熱方法を試験したところ、加熱時間および温度を同じに維持する限り、わずかな差しか見られなかった。加熱の持続時間を最適化してバイオポリマー分解を回避しなければならないが、同時に、フラン保護マレイミドバイポリマーのほとんどの脱保護を確保する。手順を終了させて、圧力反応器（７０ＰＳＩ圧力を保持することができる）中でバイオポリマーのエタノール溶液を使用した。
【０１９０】
典型的な操作は、清潔で乾燥したガラス反応器で開始する。バイオポリマーをエタノールに溶解して澄んだ透明の溶液を形成する。バイオポリマーの濃度は、典型的には５０ｍｇ／ｍＬ〜１５０ｍｇ／ｍＬの間であり、通常は約１００ｍｇ／ｍＬである。これが消費されるエタノールの最小化と、高粘度のポリマー溶液の回避との間の良好なバランスである。
【０１９１】
澄んだバイオポリマー溶液を清潔な圧力反応器に移し、Ｎ２で３〜５分間パージし、次いで、密栓すべきである。いかなる漏出も発見することができるように、熱脱保護前後で反応器＋バイポリマー溶液の質量を記録すべきである。
【０１９２】
（脱保護すべき）バイオポリマー溶液を含む圧力反応器を、１２０℃に設定したオーブンに２時間入れる。脱保護後、圧力反応器をオーブンから取り出し、冷却させる。脱保護したバイオポリマー溶液を、溶媒沈殿、噴霧乾燥または凍結乾燥によって精製することができる。
【０１９３】
コンジュゲーション可能ポリマーの調製
実施例８  マレイミドコンジュゲーション可能３−アームポリマーの調製
以下の構造を有するマレイミドコンジュゲーション可能ポリマー（Ｂ３）を以下の通り調製した：
【化３６】
2020183404.tif 000044
２０ｍＬバイアルに、ポリマー識別番号１００（表２）（２８０ｍｇ、０．００１２３ｍｍｏｌ、１．０当量）を入れ、水（２ｍＬ）を用いて溶解した。これに、０．５Ｍ第二リン酸ナトリウム水溶液（０．２ｍＬ）を添加した。別のバイアルで、３−マレイミドプロピオン酸、ＮＨＳ−エステル（１．５ｍｇ、０．００５４８ｍｍｏｌ、４．５当量）をテトラヒドロフラン（０．６ｍＬ）に溶解した。ＮＨＳエステル溶液をポリマー溶液に室温で約２分間にわたって添加し、得られた溶液を７５分間攪拌した。反応物を４：１水：テトラヒドロフラン（４ｍＬ）で希釈し、Ａｍｉｃｏｎ遠心分離膜透析管（３０，０００ｍｗｃｏ）に入れ、管を遠心分離機（ｒｐｍ３０００）に３０分間入れた。濾液を分析のために除去する一方、保持液（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）を４：１水：テトラヒドロフラン（６ｍＬ）で希釈および混合し、管を遠心分離機（ｒｐｍ３０００）に３０分間入れる。濾液を分析のために除去する一方、保持液を水（８ｍＬ）で希釈および混合し、遠心分離機（ｒｐｍ３０００）に３０分間入れる。濾液を分析のための除去する一方、保持液を水（８ｍＬ）で希釈および混合する。遠心分離機手順をさらに３回繰り返し、その後、保持液を取り出し、バイアルに入れる。Ａｍｉｃｏｎ膜管を水（２×約２ｍＬ）ですすぎ、これを保持液と合わせ、これを凍結し、凍結乾燥機に入れた。これにより、Ｂ３  ２６２ｍｇ（９３％）が白色粉末として得られた。
【０１９４】
実施例９  マレイミド６−アームコンジュゲーション可能ポリマーの調製
以下の構造を有するマレイミドコンジュゲーション可能６−アームポリマー（Ｆ４）を以下の通り合成した：
【化３７】
2020183404.tif 000045
２０ｍＬバイアルに、ポリマー識別番号１１０（表２）（５０２ｍｇ、０．００２０５ｍｍｏｌ、１．０当量）を入れ、水（４ｍＬ）を用いて溶解した。これに、０．５Ｍ第二リン酸ナトリウム水溶液（０．４ｍＬ）を添加した。別のバイアルで、３−マレイミドプロピオン酸、ＮＨＳ−エステル（２．４５ｍｇ、０．００９２ｍｍｏｌ、４．５当量）をテトラヒドロフラン（１ｍＬ）に溶解した。ＮＨＳエステル溶液をポリマー溶液に室温で２分間にわたって添加し、得られた溶液を１００分間攪拌した。反応物を４：１水：テトラヒドロフラン（４ｍＬ）で希釈し、２本のＡｍｉｃｏｎ遠心分離膜透析管（３０，０００ｍｗｃｏ）に均等に入れ、管を遠心分離機（ｒｐｍ３０００）に３０分間入れた。濾液を分析のために除去する一方、保持液を４：１水：テトラヒドロフラン（６ｍＬ）で希釈および混合し、管を遠心分離機（ｒｐｍ３０００）に３０分間入れる。濾液を分析のために除去する一方、保持液を水（それぞれ８ｍＬ）で希釈および混合し、遠心分離機（ｒｐｍ３０００）に３０分間入れる。濾液を分析のための除去する一方、保持液を水（８ｍＬ／管）で希釈および混合する。遠心分離機手順をさらに３回繰り返し、その後、保持液を取り出し、バイアルに入れる。Ａｍｉｃｏｎ膜管を水（各管２×約２ｍＬ）ですすぎ、保持液と合わせたこれを凍結し、凍結乾燥機に入れた。これにより、ポリマーＦ４  ４５９ｍｇ（９１％）が白色粉末として得られた。
【０１９５】
実施例１０  ６−アームコンジュゲーション可能ポリマーの調製
以下の構造を有するマレイミドコンジュゲーション可能６−アームポリマー（Ｓ）を以下の通り合成した：
【化３８】
2020183404.tif 000046
２０ｍＬバイアルに、ポリマー識別番号１２０（表２）（５００ｍｇ、０．０００９１ｍｍｏｌ、１．０当量）を入れ、１０分間攪拌した後、エタノール（４ｍＬ）を用いて溶解した。これに、４−メチルモルホリンのアセトニトリル中１％溶液（０．０３０ｍＬ、０．００２７３ｍｍｏｌ、３当量）を添加した。別のバイアルで、生成物１７６−５５（２．６５ｍｇ、０．００４５５ｍｍｏｌ、５当量）をアセトニトリル（１ｍＬ）に溶解し、この溶液をポリマー溶液に室温で約１分間にわたって添加した。追加のアリコートのアセトニトリル（１ｍＬ）を添加し、得られた溶液を１８時間攪拌した。反応物を０．１％トリフルオロ酢酸水溶液（２ｍＬ）（約ｐＨ６）、引き続いて水（約１４ｍＬ）で希釈し、シリンジフィルタ（Ａｃｒｏｄｉｓｃ  Ｓｕｐｏｒ、ＰＮ４６１２）を通して濾過し、３本のＡｍｉｃｏｎ遠心分離膜透析管（３０，０００ｍｗｃｏ）に均等に入れた。管を水（それぞれ約５ｍＬ）で希釈および混合し、遠心分離機（ｒｐｍ３０００）に３０分間入れた。濾液を分析のために除去する一方、保持液を水（約１０ｍＬ／管）で希釈および混合する。遠心分離機手順をさらに５回繰り返し、その後、保持液を取り出し、バイアルに入れる。Ａｍｉｃｏｎ膜管を水（各管２×約２ｍＬ）ですすぎ、これを保持液と合わせた。保持液溶液をシリンジフィルタ（Ａｃｒｏｄｉｓｃ  Ｓｕｐｏｒ、ＰＮ４６１２）を通して濾過し、凍結し、凍結乾燥機に入れた。これにより、ポリマーＳ４６９ｍｇ（０．０００８５ｍｍｏｌ、９３％）が白色粉末として得られた。
【０１９６】
実施例１１  マレイミド９−アームコンジュゲーション可能ポリマーの調製
以下の構造を有するマレイミドコンジュゲーション可能９−アームポリマー（Ｑ）を以下の通り合成した：
【化３９】
2020183404.tif 000047
コンジュゲーション可能ポリマーＱを以下の通り調製した：２０ｍＬバイアルに、ポリマー識別番号１６０（表２）（５４０ｍｇ、０．０００７ｍｍｏｌ、１．０当量）を入れ、水（４ｍＬ）を用いて溶解した。これに、０．５Ｍ第二リン酸ナトリウム水溶液（０．４ｍＬ）を添加した。別のバイアルで、３−マレイミドプロピオン酸、ＮＨＳ−エステル（０．９３ｍｇ、０．００３５ｍｍｏｌ、５当量）をテトラヒドロフラン（１ｍＬ）に溶解した。ＮＨＳエステル溶液をポリマー溶液に室温で約２分間にわたって添加し、得られた溶液を３０分間攪拌した。反応物を水（約１５ｍＬ）で希釈し、シリンジフィルタ（Ａｃｒｏｄｉｓｃ  Ｓｕｐｏｒ、ＰＮ４６１２）を通して濾過し、３本のＡｍｉｃｏｎ遠心分離膜透析管（３０，０００ｍｗｃｏ）に均等に入れた。管を水（それぞれ約５ｍＬ）で希釈および混合し、遠心分離機（ｒｐｍ３０００）に３０分間入れた。濾液を分析のために除去する一方、保持液を水（約１０ｍＬ／管）で希釈および混合する。遠心分離機手順をさらに５回繰り返し、その後、保持液を取り出し、バイアルに入れる。Ａｍｉｃｏｎ膜管を水（各管２×約２ｍＬ）ですすぎ、これを保持液と合わせた。保持液溶液をシリンジフィルタ（Ａｃｒｏｄｉｓｃ  Ｓｕｐｏｒ、ＰＮ４６１２）を通して濾過し、凍結し、凍結乾燥機に入れた。これにより、ポリマーＱ５０８ｍｇ（９４％）が白色粉末として得られた。
【０１９７】
実施例１２  マレイミド９−アームコンジュゲーション可能ポリマーの調製
以下の構造を有するマレイミドコンジュゲーション可能９−アームポリマー（Ｒ）を以下の通り合成した。
【化４０】
2020183404.tif 000048
【０１９８】
これを、コンジュゲーション可能ポリマーＱについて記載されるのと同じ技術を用いて調製した。
【０１９９】
実施例１３  コンジュゲーションのための野生型第ＶＩＩＩ因子の調製
哺乳動物発現野生型（ＦＶＩＩＩ−ＷＴ）は、マレイミドまたはヨードアセトアミドなどの反応基を含むチオール反応性ポリマーを用いて、酸化してジスルフィド架橋を形成する、またはＢドメイン中に存在する遊離システインの場合には、不対遊離システインがコンジュゲーションのために利用可能となるのを防ぐ媒体からの代謝産物によって遮断（キャップ化）される全てのシステイン残基を有することが知られている。これらのキャップ化部分をＴＣＥＰまたはＤＴＴなどの還元剤を用いて除去し、引き続いて還元剤を除去し、タンパク質を再折り畳みすることができる。
【０２００】
ＦＶＩＩＩ−ＷＴを、０．５ｍｇ／ｍＬの濃度で５０ｍＭ  ＭＯＰＳ  ｐＨ７、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、１％ショ糖および０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０に配合した。１５０×モル過剰当量のＴＣＥＰ溶液を添加し、４℃で１時間インキュベートした。Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５の脱塩カラムをＴＣＥＰ除去に使用した。Ｇ２５カラムを配合緩衝液により平衡化し、ＴＣＥＰ還元試料をロードし、回収した分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。タンパク質を含む分画をプールし、４℃で一晩インキュベートしてタンパク質再折り畳み（酸化によるジスルフィド対の再生）を可能にした一方、不対システインは遊離スルフヒドリル型（脱キャップ化）のままであった。あるいは、ＴＣＥＰ除去を、陰イオン交換（例えば、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ）カラムを用いて達成し、ここではＴＣＥＰ還元試料を希釈して塩濃度を低下させ、次いで、ＱＦＦカラムにロードし、これに低塩ＭＯＰＳ緩衝液を用いた洗浄ステップおよび段階勾配のＮａＣｌによる溶出が続いた。これらの条件下で、タンパク質は約３００ｍＭ  ＮａＣｌで溶出した。タンパク質分画を、下記のコンジュゲーションのためにプールした。ＴＣＥＰ除去のためのイオン交換法は、スケールアップをより受け入れられるので、脱塩カラム手法よりも好ましい。  
【０２０１】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によるＴＣＥＰ処理型の分析は、主に２本のバンドを示した：（１）重鎖＋Ｂドメイン（ＨＣ−ＢＤ）を表す約１８０ｋＤａで移動する高ＭＷバンド；および（２）軽鎖（ＬＣ）を表す約８０ｋＤａで移動する低ＭＷバンド。試料をＳｕｐｅｒｏｓｅ  ６カラムを用いたゲル濾過によっても分析した。カラムを２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％エタノール、１％ショ糖および０．００１％Ｔｗｅｅｎ８０で平衡化し、引き続いて比較のために（１）ＴＣＥＰ処理し、再折り畳みしたＦＶＩＩＩ−ＷＴ；および（２）元のＦＶＩＩＩ−ＷＴを含む異なるＦＶＩＩＩ試料を注入した。２８０ｎｍでの両試料の溶出プロファイルはそれぞれ、予想された保持時間で優勢な単一ピークを示した。
【０２０２】
実施例１４  ＦＶＩＩＩ−ＷＴと高分子量両性イオンポリマーのコンジュゲーション
ＦＶＩＩＩ−ＷＴのＴＣＥＰ処理型中の明らかにされた遊離システインチオールを、種々のマレイミドと表４に示されるように分子量、構造およびリンカー長が異なる上記のヨード−アセトアミド官能化ポリマーとのコンジュゲーションに使用した。コンジュゲーション反応混合物は、５０ｍＭ  ＭＯＰＳ  ｐＨ７、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０ならびに２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８、２００ｍＭ
ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２および０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０に溶解した５〜１００×モル過剰量のマレイミドポリマー中、約０．５ｍｇ／ｍＬのＦＶＩＩＩ−ＷＴタンパク質を含んでいた。反応を４℃で一晩進行させ、引き続いて非還元条件と還元条件の両方の下で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりコンジュゲーション効率を分析した。結果は、単一重鎖−Ｂドメイン（ＨＣ−ＢＤ）バンドの消失を示したが、ドメインの切断型およびゲル上部の高分子量バンドの同時出現は示さず、新たに形成したコンジュゲートの存在を示した。各反応のコンジュゲーション効率（ポリマーを含まない対照と比べた、残りのＨＣ−Ｂドメインバンドの百分率として計算）を表４に示す。
【表４】
2020183404.tif 000049
2020183404.tif 000050
以下の表５は、表３の開始剤ＯまたはＰからの９−分岐ヘマ−ＰＣポリマーから形成したコンジュゲートの活性を示している。
【表５】
2020183404.tif 000051
【０２０３】
ＴＣＥＰ処理ＦＶＩＩＩ−ＷＴ１ｍｇおよび５０×モル過剰量の１７番に使用したコンジュゲーション可能ポリマー（表４）および前記プロトコルを用いて、コンジュゲーション反応を行った。前の通りＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて、９０％超のコンジュゲーション効率が決定された。還元条件下でコンジュゲートバンドが維持された。
【０２０４】
ＭａｃｒｏＣａｐ  ＳＰ樹脂を用いる陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて、コンジュゲートを精製した。コンジュゲーション反応物を５０ｍＭ  ＭＯＰＳ、ｐＨ７、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０に１０倍希釈し、５ｍＬドリップカラムに充填した３ｍＬ樹脂にロードした。カラム流は、重力によって達成し、未結合分画を回収した。カラムを、合わせた２１カラム体積（ＣＶ）の２０ｍＭ  ＮａＣｌを含む洗浄緩衝液で追い出し、洗浄した。次いで、結合したタンパク質を、１００、１５０、２００、２５０および５００ｍＭ  ＮａＣｌを含む異なるＮａＣｌ濃度を含む洗浄緩衝液で溶出した。各ＮａＣｌ濃度について、少なくとも５ＣＶの溶出液を回収した。分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に供してタンパク質が溶出したＮａＣｌ濃度を決定した。予備的分析は、遊離タンパク質が１５０ｍＭ塩で溶出し、コンジュゲートが１００ｍＭ塩で溶出することを示した。このことは、コンジュゲートおよび遊離タンパク質について単一ピークを与えたＳｕｐｅｒｏｓｅ  ６カラムでの分析的ゲル濾過によって確認された。コンジュゲートプールを濃縮し、０．２μｍ  ＳｐｉｎＸ遠心分離フィルタを用いて滅菌濾過して、最終プロセス収率４０％で２．１６ｍｇ／ｍＬの最終濃度（タンパク質に関するように）を得た。
【０２０５】
ＣＯＡＭＡＴＩＣ第ＦＶＩＩＩ因子アッセイキットを用いて測定したコンジュゲートの活性は、ＦＶＩＩＩ−ＷＴと等しかった。
【０２０６】
前記発明を、理解を明確にする目的で実例および例としていくらか詳細に記載してきたが、添付の特許請求の範囲の範囲内で一定の変更および修正を行うことができる。さらに、本明細書に提供される各参考文献は、あたかも各参考文献が参照により個別に組み込まれるのと同程度に全ての目的のために全体が参照により組み込まれる。ウェブサイトまたは受入番号を含む任意の引用文献の内容が時とともに変化することができる程度に、本出願の出願日の効果の説明が意図される。文脈から明らかでない限り、実施形態のいずれのステップ、要素、態様、特徴も他のものと組み合わせて使用することができる。
【図１】
2020183404.tif 000068
【図２】
2020183404.tif 000069
【配列表】
2020183404000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年7月17日(2020.7.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
機能的物質及び両性イオンポリマーを含む、下記式を有するコンジュゲート：
【化１】
2020183404.tif 000070
（式中、ｓは、１〜２０であり、
Ｒ１は、
【化２】
2020183404.tif 000071
であり、
Ｒ２は、アルキル、置換アルキル、アルキレン、アルコキシ、カルボキシアルキル、ハロアルキル、シクロアルキル、環状アルキルエーテル、アルケニル、アルケニレン、アルキニル、アルキニレン、シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルキレン、アリール、アリーレン、アリーレン−オキシ、ヘテロアリール、アミノ、アミド及びこれらの組み合わせからなる群から選択され、そして
Ｒ３は、
【化３】
2020183404.tif 000072
（式中、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６は、同じであるか又は異なるものであり、そして、
【化４】
2020183404.tif 000073
（式中、Ｚは、ポリマーであり、前記ポリマーは
【化５】
2020183404.tif 000074
（式中、Ｒ７はＨまたはＣ１〜６アルキルであり、ＺＷは両性イオンであり、そしてｔは１〜６である）
からなる群から選択されるモノマーで合成される）
からなる群から選択される））。
【請求項２】
前記Ｒ２が、下記式の構造を含む、請求項１に記載のコンジュゲート：
【化６】
2020183404.tif 000075
（式中、ｍは１〜２０の整数である）。
【請求項３】
前記Ｒ２が、
【化７】
2020183404.tif 000076
（式中、Ｘは０〜５０の整数であり、Ｙは１〜５０の整数であり、そしてｍは１〜２０の整数である）
である、請求項２に記載のコンジュゲート。
【請求項４】
両性イオンがホスホリルコリンである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項５】
前記モノマーが、２−（メタクリロイルオキシエチル）−２’−（トリメチルアンモニウムエチル）ホスフェート（ＭＰＣ）又は２−（アクリロイルオキシエチル）−２’−（トリメチルアンモニウムエチル）ホスフェートである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項６】
前記モノマーが、２−（メタクリロイルオキシエチル）−２’−（トリメチルアンモニウムエチル）ホスフェート（ＭＰＣ）である、請求項５に記載のコンジュゲート。
【請求項７】
前記Ｒ２が、
【化８】
2020183404.tif 000077
（式中、Ｙは１〜１０の整数であり；そしてＸは４、８、又は１２である）
である、請求項６に記載のコンジュゲート。
【請求項８】
前記Ｙが４である、請求項７に記載のコンジュゲート。
【請求項９】
前記Ｚが、−Ｂｒである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項１０】
前記ポリマーが約５００，０００〜約１，０００，０００ダルトンの分子量を有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項１１】
前記ポリマーが約６５０，０００〜約８５０，０００ダルトンの分子量を有する、請求項１０に記載のコンジュゲート。
【請求項１２】
前記ポリマーが約８００，０００ダルトンの分子量を有する、請求項１０に記載のコンジュゲート。
【請求項１３】
前記ポリマーが約７５０，０００ダルトンの分子量を有する、請求項１０に記載のコンジュゲート。
【請求項１４】
前記ポリマーが下記式を有するコンジュゲート：
【化９】
2020183404.tif 000078
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
本発明はさらに、血友病の対象の予防方法であって、治療上有効量のいずれかのコンジュゲートまたは組成物を、血友病の対象に、対象が外部または内部出血していることを分かっていない時に投与するステップを含み、前記コンジュゲートが、その後の出血後の凝固を促進するために血液中で持続する（persists）ものとする方法を提供する。場合により、コンジュゲートまたは組成物が１週間に１回以下の頻度で投与される。場合により、コンジュゲートまたは組成物が毎週〜毎月の間で投与される。場合により、対象が、血友病を有さない対照の対象における平均ＦＶＩＩＩ活性の１％、３％または５％超のＦＶＩＩＩ活性のトラフレベルを有する。場合により、対象が、ポリマーとコンジュゲートしていないＦＶＩＩＩの以前の投与からＦＶＩＩＩに対する抗体を発達させている。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２１】
本発明のこの態様によると、ポリマー合成イニシエーター部分が、好ましくは以下の構造：
【化５】
2020183404.tif 000079
（Ｘは、ＡＴＲＰまたは関連するポリマー合成スキームの開始を可能にするＮＣＳまたはハロゲンであり、Ｒはイニシエーターの残りである）
を有する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２９】
本発明の態様によると、ステップｂのリンカー部分が好ましくは構造
【化１４】
2020183404.tif 000080
｛式中、Ｒ８は
【化１５】
2020183404.tif 000081
からなる群から選択され、
Ｒ９は
【化１６】
2020183404.tif 000082
（式中、ｐは１〜１２である）
からなる群から選択される｝
を有する活性化エステルである。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３２】
本発明のこの態様によると、ステップｂのリンカー−重合開始剤が好ましくは式：
【化１９】
2020183404.tif 000083
（式中、Ｘは１〜５０の整数であり、Ｙは１〜５０の整数であり、ポリマーは本明細書に定義されるモノマーで合成される任意のポリマーである）
を有する。
より好ましくは、Ｙが４であり、Ｘが４、８または１２であり、モノマーがＨＥＭＡ−ｐｃである。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５７】
化合物Ａを以下の通り脱保護して化合物Ｂを得た：２０ｍＬ丸底フラスコに、窒素下で、化合物Ａ（１２０ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ、１当量）、ジクロロメタン（２ｍＬ）、引き続いてトリフルオロ酢酸（２ｍＬ、２６．９ｍｍｏｌ、１９２当量）を添加した。反応物を、室温で３０分間攪拌した。反応物を、ヘキサンジクロロメタン（２０ｍＬ）を用いて希釈し、真空下で濃縮した。反応物を、ヘキサン（５０ｍＬ）を用いて希釈し、真空下で濃縮すると（２回）、化合物Ｂ２．２ｇ（２．７３ｍｍｏｌ、（残留ジクロロメタンを含む））が得られた。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ  ＣＤＣｌ３）：δ＝１．９４（ｓ，１８Ｈ，ＣＣ（ＣＨ３）２Ｂｒ），３．２（ｂｒ，２Ｈ，ＯＣＮＨＣＨ２ＣＨ２Ｏ），３．５−３．８（ｍ，１２Ｈ），３．９９（ｓ，２Ｈ，ＯＣＨ２Ｃ），４．３４（ｓ，６Ｈ，ＣＣＨ２ＯＣ＝Ｏ），７．１１（ｂｒ  ｔ，１Ｈ，ＣＨ２ＮＨＣ＝Ｏ），７．９９（ｂｒ，３Ｈ，ＮＨ３＋）．
ＬＣ−ＭＳ（ＥＳ，ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］＋  計算値  Ｃ２５Ｈ４３Ｂｒ３Ｎ２Ｏ１０＋Ｈ＝７７１．１；実測値  ７７１．６．
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５９】
Ｆ１を調製する第１のステップとして、以下の構造を有する化合物Ｃを合成した：
【化２５】
2020183404.tif 000084
１００ｍＬ丸底フラスコに、窒素下で、還流冷却器を用いて、１−トシル−１１−（３，４，７−トリアザ−４，６，１０−トリフェニル−アダマンタン−１−イルメトキシ）−３，６，９−トリオキサウンデカン（生成物２．２についてＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０６０３０１に記載されているように調製される）（４．０ｇ、５．５ｍｍｏｌ、１．０当量）、ジ（ｔｅｒｔ−ブチル）イミドジカルボネート（１．４３ｇ、６．６ｍｍｏｌ、１．２当量）、炭酸カリウム（１．９ｇ、１３．７ｍｍｏｌ、２．５当量）、ヨウ化カリウム（０．１３７ｇ、０．８２ｍｍｏｌ、０．１５当量）、引き続いてアセトニトリル（２５ｍＬ）を添加した。反応物を室温で５分間攪拌し、引き続いて６０℃で３０時間攪拌した。反応物を、水（２５ｍＬ）およびｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル（１２５ｍＬ）を添加してクエンチした。有機層を分離し、水層をｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル（７５ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を飽和塩化ナトリウム水溶液（２０ｍＬ）で洗浄し、次いで、乾燥させ（硫酸ナトリウム）、濾過し、真空下で濃縮した。残渣をシリカゲルカラム（１９５ｇ、６．５ｃｍ×１２ｃｍ）に加え、８０％ヘキサン中２０％ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルから最大１００％ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルで溶出した。生成物を含む管をプールし、真空下で濃縮すると、化合物Ｃ３．７ｇ（４．７９ｍｍｏｌ、８７％）が得られた。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６１】
次に、以下の構造を有する化合物Ｄを合成した：
【化２６】
2020183404.tif 000085
５００ｍＬ丸底フラスコに、窒素下で、還流冷却器を用いて、化合物Ｃ（２．７ｇ、３．４９ｍｍｏｌ、１．０当量）、水酸化リチウム一水和物（０．７３ｇ、１７．５ｍｍｏｌ、５当量）、テトラヒドロフラン（２０ｍＬ）、メタノール（８ｍＬ）、引き続いて水（８ｍＬ）を添加した。反応物を６０℃で６時間攪拌した。反応物を真空下で濃縮し、次いで、水（７５ｍＬ）および酢酸エチル（１００ｍＬ）を添加することによって分配した。有機層を分離し、水層を酢酸エチル（５０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を飽和塩化ナトリウム水溶液（３０ｍＬ）で洗浄し、次いで、乾燥させ（硫酸ナトリウム）、濾過し、真空下で濃縮した。残渣をシリカゲルカラム（１１０ｇ、５．５ｃｍ×１０．５ｃｍ）に加え、５０％ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル中５０％ヘキサンから最大１００％ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルで溶出した。生成物を含む管をプールし、真空下で濃縮すると、化合物Ｄ１．３８ｇ（２．０５ｍｍｏｌ、５９％）が得られた。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６３】
Ｆ１の調製における次のステップは、以下の構造：
【化２７】
2020183404.tif 000086
を有する化合物Ｅの合成であった。
１００ｍＬ丸底フラスコに、化合物Ｄ（２．９６ｇ、４．４ｍｍｏｌ、１．０当量）、ジエチルエーテル（２０ｍＬ）、引き続いて水（１６ｍＬ）を添加した。氷浴を用いてフラスコを０℃に冷却した。これに、臭化水素酸溶液（水中４８重量％）（１．６４ｍＬ、１４．５ｍｍｏｌ、３．３当量）を添加した。反応物を０℃で１時間迅速に攪拌した。有機層を分離し、水層を０℃の反応フラスコに戻し、ここにジエチルエーテル（２０ｍＬ）を添加し、攪拌を１５分間続けた。有機層を再度分離し、水層を０℃の反応フラスコに戻し、ここにジエチルエーテル（２０ｍＬ）を添加し、攪拌を１０分間続けた。有機層を分離し、１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を添加して水層をｐＨ４．５に調整した。真空下でのアセトニトリルとの共沸によって水を除去すると、化合物Ｅ２．５ｇ（３．８５ｍｍｏｌ、８７％）が白色固体として得られた。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６７】
最後に、ｔＢＯＣ保護基を除去して、上に示される構造を有する最終的な開始剤、Ｆ１を得た。５０ｍＬ丸底フラスコに、生成物１７４−４４（６００ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ）およびジクロロメタン（３．６ｍＬ）を添加した。氷浴を用いてフラスコを０℃に冷却した。これに、トリフルオロ酢酸（３．６ｍＬ）を添加した。反応物を、室温で４５分間攪拌した。反応物をヘキサンで希釈し、次いで、真空下で濃縮した。反応物をヘキサンで希釈し、真空下で濃縮した。残渣を、アセトニトリル（３ｍＬ）を用いて溶解し、水（１．５ｍＬ）で希釈し、凍結し、凍結乾燥機に入れた。これにより、化合物Ｆ１  ５３７ｍｇ（０．３２ｍｍｏｌ、８９％）が油として得られた。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７３】
次に、化合物Ｌを以下の通り合成した：１００ｍＬ丸底フラスコに、窒素下で、化合物Ｋ（２．０ｇ、０．８ｍｍｏｌ）、ジクロロメタン（１０ｍＬ）、引き続いてトリフルオロ酢酸（５ｍＬ）を添加した。反応物を、室温で３０分間攪拌した。反応物を真空下で濃縮した。反応物を、ジクロロメタン（１０ｍＬ）を用いて希釈し、真空下で濃縮した。残渣を、アセトニトリル（１０ｍＬ）を用いて溶解し、シリンジフィルタ（Ａｃｒｏｄｉｓｃ  ＣＲ２５、ＰＮ  ４２２５Ｔ）を通して濾過し、予備的ＨＰＬＣカラムにロードし、水中６０％アセトニトリル（０．１％トリフルオロ酢酸を含む）から最大９８％アセトニトリル（０．１％トリフルオロ酢酸を含む）で溶出した。生成物を含む管をプールし、真空下で濃縮し、凍結し、凍結乾燥機に入れた。これにより、化合物Ｌ９９０ｍｇ（０．４ｍｍｏｌ、２ステップにわたって５０％）が白色粉末として得られた。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７９】
１００ｍＬ丸底フラスコに、窒素下で、化合物Ｍ（０．５ｇ）、ジクロロメタン（４ｍＬ）、引き続いてトリフルオロ酢酸（３ｍＬ）を添加した。反応物を、室温で１５分間攪拌した。反応物を真空下で濃縮した。残渣を、アセトニトリル（３ｍＬ）を用いて溶解し、シリンジフィルタ（Ａｃｒｏｄｉｓｃ  ＣＲ２５、ＰＮ  ４２２５Ｔ）を通して濾過し、予備的ＨＰＬＣカラムにロードし、５０％水（０．１％トリフルオロ酢酸を含む）中５０％アセトニトリル（０．１％トリフルオロ酢酸を含む）から最大９０％アセトニトリル（０．１％トリフルオロ酢酸を含む）で溶出した。生成物を含む管をプールし、真空下で濃縮し、凍結し、凍結乾燥機に入れた。これにより、化合物Ｏ１０１ｍｇ（２ステップにわたって２１％）が得られた。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８３】
ＬＣ−ＭＳ（ＥＳ，ｍ／ｚ）：［（Ｍ＋２Ｈ−ｂｏｃ）／２］＋（Ｃ１１１Ｈ１８９Ｂｒ９Ｎ８Ｏ４６＋２Ｈ−Ｂｏｃ）についての計算値／２＝１４９６．３；実測値１４９７．２。
【化３５】
2020183404.tif 000087
１００ｍＬ丸底フラスコに、窒素下で、化合物Ｎ（０．６ｇ）、ジクロロメタン（４ｍＬ）、引き続いてトリフルオロ酢酸（３ｍＬ）を添加した。反応物を、室温で１５分間攪拌した。反応物を真空下で濃縮した。残渣を、アセトニトリル（３ｍＬ）を用いて溶解し、シリンジフィルタ（Ａｃｒｏｄｉｓｃ  ＣＲ２５、ＰＮ  ４２２５Ｔ）を通して濾過し、予備的ＨＰＬＣカラムにロードし、５０％水（０．１％トリフルオロ酢酸を含む）中５０％アセトニトリル（０．１％トリフルオロ酢酸を含む）から最大９０％アセトニトリル（０．１％トリフルオロ酢酸を含む）で溶出した。生成物を含む管をプールし、真空下で濃縮し、凍結し、凍結乾燥機に入れた。これにより、化合物Ｐ２００ｍｇ（０．０６４ｍｍｏｌ、２ステップにわたって３７％）が得られた。
【外国語明細書】
2020183404000001.pdf