(57)【要約】【課題】  トータル・ジアセチルの産生量が低下した変異酵母を提供する。【解決手段】ジアセチル、２，３−ペンタンジオンなどの前駆体であるα−アセト乳酸を代謝するケト酸レダクトイソメラーゼの高発現能を有し、且つｍｔＤＮＡ転写阻害剤に対する耐性を有し、且つトータル・ジアセチル（ビシナルジケトン類及びその前駆物質であるα−アセトハイドロキシ酸類の総称）低蓄積性の清酒酵母、ビール酵母、ワイン酵母を含む新規変異酵母を取得する。さらに具体的には、醸造酵母を変異処理し、ＥｔＢｒを含む培地で培養し生育したｍｔＤＮＡ転写阻害剤耐性変異株を最小培地で培養して変異株を分離し、更にトータル・ジアセチル低生産酵母を分離する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的とする表現型を有する酵母のスクリーニング方法であって、被験酵母に変異を誘導する工程、及び前記変異誘導後の酵母を、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）転写阻害剤の存在下で培養する工程、及び最小培地で培養する工程を含む、前記スクリーニング方法。
【請求項２】
前記ｍｔＤＮＡ転写阻害剤が、エチジウムブロマイドである、特許請求項第１項記載の方法。
【請求項３】
前記目的とする表現型が、トータル・ジアセチル（ビシナルジケトン類及びその前駆物質であるα−アセトハイドロキシ酸類の総称）低生産型、トータル・ジアセチル高生産型、有機酸高生産型、有機酸低生産型、高級アルコール低生産型、及び、高級アルコール高生産型からなる群より選ばれる少なくとも１つである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記トータル・ジアセチルが、α−アセト乳酸及び／又はジアセチルである、請求項第３項に記載の方法。
【請求項５】
請求項第１項〜第４項のいずれか１項に記載の方法によって得られた酵母。
【請求項６】
請求項第５項に記載の酵母を用いた酒類の製造方法。
【請求項７】
醸造する酒類が清酒である請求項第６項に記載の酒類の製造方法。
【請求項８】
請求項第６項又は第７項に記載の方法で製造された酒類。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、新規変異酵母の新規育種方法に関する。さらに詳細には、本発明は、トータル・ジアセチルの蓄積を低減する酵母の育種方法に関する。
【背景技術】
【０００２】  酒類の香気成分の内、ジアセチル（以下ＤＡともいう）臭は清酒、ビール及びワイン等の醸造酒における代表的オフフレーバーのひとつである。ＤＡ臭（清酒の官能表現ではつわり香ともいう）はＤＡを主体としたビシナルジケトン類（以下ＶＤＫともいう）が製品中に閾値以上存在することによって発生し、清酒における閾値は０．４  ｐｐｍ（非特許文献１）と言われている。【０００３】  酒類中のＶＤＫはＤＡと２，３−ペンタンジオン（以下ＰＤともいう）に大別される。ＤＡとＰＤは、それぞれバリン及びイソロイシン生合成系中間産物のα−アセトハイドロキシ酸であるα−アセト乳酸及びα−アセトハイドロキシ酪酸を前駆体として、酵母の関与しない非酵素的反応によって生成される。この他に汚染微生物によってもＤＡは生成される。【０００４】  以上のことから、ＶＤＫ（ＤＡ及びＰＤ）及びその前駆体α−アセトハイドロキシ酸類（α−アセト乳酸及びα−アセトハイドロキシ酪酸）全体（以下トータル・ジアセチルともいう）が製品にＤＡ臭をもたらす可能性のあるものとしてとらえることができ、これらを安定的に低減させる酵母の育種は酒類の製造管理を容易にするばかりでなく、新商品開発の可能性を広げることができる。【０００５】  ＤＡ臭の発生を抑制する試みとして、ビール製造では例えば非特許文献２ではバリン・ロイシン・イソロイシン要求性酵母でＶＤＫ生成量が低減することが報告されているが、実用化には至っていない。非特許文献３では実験室酵母に由来するＩＬＶ５遺伝子の発現量を調節した遺伝子操作酵母が、また非特許文献４では同じくＩＬＶ３遺伝子の発現量を調節した遺伝子操作酵母がそれぞれ報告されているが、いずれも実用化には至っていない。非特許文献５ではα−アセト乳酸脱炭酸酵素を使用することでＤＡの前駆体となるα−アセト乳酸をアセトインに迅速に変換する方法が報告されたが、遺伝子組み換え技術によってのみ製造されている酵素であり、日本では消費者に対するマイナスイメージが強く、本酵素を使用することは困難である。これに対し、α−アセト乳酸脱炭酸酵素をコードするＤＮＡ鎖を用いた遺伝子操作酵母が報告されている（特許文献１、２、３）が、国内では実用化されていない。
清酒製造では、例えば、アルコール１５％以上でかつα−アセト乳酸の前駆体となるピルビン酸濃度の低い酒母に四段添加をして直ちに上槽することでＤＡの生成を抑制した低アルコール清酒を製造する方法が報告されている（特許文献４）。また、バリン・ロイシン・イソロイシンのアナログに対して感受性となる変異株を取得し、それらの中からＤＡ低蓄積株を選抜するという方法が開示されている（特許文献５）。しかしながら、この方法は分枝アミノ酸のアナログを含む培地で増殖が遅い株を取得しなければならないので、変異株の取得効率が良くないという問題があった。【０００６】  ＶＤＫの前駆体であるα−アセト乳酸はケト酸レダクトイソメラーゼ（以下ＫＡＲＩともいう）によりα，β−ジヒドロキシバレレートへと変換され、バリン、ロイシンの生合成に用いられる。ＫＡＲＩの活性部位をコードするＩＬＶ５遺伝子を高発現した酵母はｍｔＤＮＡ転写活性阻害剤に対して抵抗性を持つことが知られている（非特許文献６）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開昭６２−２２８２８２号公報
【特許文献２】特開平０２−２６５４８８号公報
【特許文献３】特開平０７−０００１７１号公報
【特許文献４】特開２００１−２０４４５７号公報
【特許文献５】特開２００２−２９１４６５号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】清酒製造技術  ｐ．３９１（２００９）
【非特許文献２】ジャーナル・オブ・アメリカン・ソサイエティ・オブ・ブリューイング・ケミスツ，プロシーディング（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｂｒｅｗｉｎｇ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ），ｐ．９４−９９（１９７３）
【非特許文献３】ジャーナル・オブ・アメリカン・ソサイエティ・オブ・ブリューリング・ケミスツ，プロシーディング（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｂｒｅｗｉｎｇ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ），ｐ．８１−８４（１９８７）
【非特許文献４】ヨーロピアン・ブリュワリー・コンベンション，プロシーディングス・オブ・第２１回ＥＢＣコングレス，マドリッド（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｒｅｗｅｒｙ  Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ２１ｓｔ  ＥＢＣ  ｃｏｎｇｒｅｓｓ，Ｍａｄｒｉｄ），ｐ．５５３−５６０（１９８７）
【非特許文献５】ヨーロピアン・ブリュワリー・コンベンション，プロシーディングス・オブ・第２６回ＥＢＣコングレス，マーストリヒト（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｒｅｗｅｒｙ  Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ２６ｔｈ  ＥＢＣ  ｃｏｎｇｒｅｓｓ，Ｍａａｓｔｒｉｃｈｔ），ｐ．４５５−４６０（１９９７）
【非特許文献６】ザ・エンボ・ジャーナル（Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ），Ｖｏｌ．１４，Ｎｏ．１３，ｐ．３２６８−３２７６（１９９５）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】  本発明の課題は、トータル・ジアセチル、特にＤＡの発生を制御することのできる変異酵母を得ることである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】  本発明者は、上記課題を解決するべく鋭意検討を行った。その結果、被験酵母に変異導入をした上で、特定の選択条件下で培養することによるスクリーニングを行えば、トータル・ジアセチルの蓄積が安定して低減される変異酵母を分離できることを見出し、本発明を完成した。【００１１】  すなわち本発明は、上記課題を解決するための酵母のスクリーニング方法などに関する。本発明は、具体的には、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に属する醸造酵母を変異処理し、一次スクリーニングとしてｍｔＤＮＡ転写阻害剤を含む培地で培養した変異酵母を最小培地で培養し、生育した株の中から二次スクリーニングとしてトータル・ジアセチル低生産酵母を分離することによるスクリーニング方法などを提供する。
【発明の効果】
【００１２】  本発明によれば、酒類等の製品中でオフフレーバーとなるＶＤＫ（例えばＤＡ、ＰＤなど）又はその前駆体（例えば、α−アセトヒドロキシ酸類など）、特にＤＡまたはその前駆体であるα−アセト乳酸の低蓄積酵母を効率的にスクリーニングし得る方法を提供することができる。本発明のスクリーニング方法は、例えば、酒類等の製品及び製造方法の改良のために用いる有用酵母を提供することができる点で、極めて実用的かつ有用なものである。また、本発明のスクリーニング方法によって取得した酵母を使用すれば、例えば、酒類製造においてＤＡ臭の発生を容易に抑えることができる。
【発明を実施するための形態】
【００１３】  本発明は、変異処理した酵母を培養する際に選択培地としてｍｔＤＮＡ転写阻害剤を含む培地と、最小培地を用い、有用な変異株の取得効率の向上を達成し得るものである。すなわち本発明は、ＤＡ臭の原因物質であるＶＤＫ類が主に酵母のバリン・ロイシン・イソロイシンのいわゆる分岐鎖アミノ酸の生合成経路の中間産物であるα−アセトヒドロキシ酸類に由来すること、及びｍｔＤＮＡ転写阻害剤に抵抗性を示す酵母ではＩＬＶ５が高発現していることに着目し、ｍｔＤＮＡ転写阻害剤耐性酵母変異株の中にはＩＬＶ５が高発現するような何らかの変異を生じている株が存在する可能性があると考えられることから、ｍｔＤＮＡ転写阻害に耐性をもつ酵母の中からトータル・ジアセチル低生産株を分離するというスクリーニング方法を新規に開発し、目的とする変異酵母を効率的に分離することに成功した。
【００１４】  以下、本発明を詳細に説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。
【００１５】  被験酵母への変異誘導の方法は限定されず、薬剤処理、紫外線（ＵＶ）照射、放射線照射、遺伝子組換え及び自然変異等による公知の種々の方法が適用され得る。
【００１６】  変異処理をする場合に親株として用いる酵母は、酒類製造用酵母であればよく、清酒酵母、ビール酵母、ワイン酵母などいずれの酵母でもトータル・ジアセチルの蓄積が安定して低減される変異酵母を取得できる。
【００１７】  スクリーニング工程で用いるｍｔＤＮＡ転写阻害剤としては、例えば、エチジウムブロマイド（以下ＥｔＢｒともいう）が好ましいが、その他のｍｔＤＮＡ転写阻害剤でも、親株として用いる酵母の増殖を抑制或いは阻害するものであれば適宜利用可能である。培地中の上記ｍｔＤＮＡ転写阻害剤の濃度は、各々のｍｔＤＮＡ転写阻害剤が少なからず酵母の増殖を抑制或いは阻害し得る範囲で設定すればよく、限定はされないが、例えばＥｔＢｒを用いる場合は、０．０５〜０．５  ｍＭであることが好ましい。
【００１８】  スクリーニング工程としてはｍｔＤＮＡ転写阻害剤を用いて培養した酵母を最小培地で選抜する工程を一次スクリーニング、変異酵母が目的とする表現型を有するか判断する工程を二次スクリーニングとすることが好ましい。
【００１９】  一次スクリーニングにおいて変異処理後酵母を培養する培地の組成は、限定はされないが、例えばＥｔＢｒを含む液体培地の場合、ＹＰＤ培地にＥｔＢｒ  ０．５  ｍＭを含むよう調整することが好ましい。
【００２０】  二次スクリーニングはトータル・ジアセチル濃度が親株として用いる酵母を用いた場合に比べて低い変異酵母を選択する工程であるが、目的とする表現型を有するかどうかの判断手法は、限定はされず、例えば、親株として用いる酵母及び変異酵母を用いて少量の清酒を製造し、上槽後のＤＡを測定する方法や、親株として用いる酵母及び変異酵母を液体培地に接種し、適宜培養した後、培養液上清中のトータル・ジアセチルを定量する方法があげられる。
【００２１】  上述した本発明のスクリーニング方法により得られる酵母を用いることによって、例えば、所望の酒類でＶＤＫ、特にＤＡの濃度を低く抑えることが可能となり、香味に優れた酒類を製造することができる。対象となる酒類としては、例えば、清酒、清酒テイストドリンク、麦芽飲料（ビール等）、ビールテイストドリンク、ワイン、蒸留酒（ウイスキー及び焼酎等）等があげられる。とりわけ、上述した本発明のスクリーニング方法により得られる酵母を、ＤＡ臭の発生が散見される低アルコール濃度清酒の製造に用いることで、ＤＡ臭の発生を容易に防ぐことが可能になるばかりでなく、低アルコール濃度清酒の品質を容易に多様化することができる。すなわち、上述した本発明のスクリーニング方法によって選抜された酵母を用いて酒類製造のための発酵・醸造を行い、トータル・ジアセチルの生産量を低減することにより、所望の酒類において、トータル・ジアセチルの濃度が低減された酒類を製造することができる。これらの酒類を製造する場合は、親株の代わりに本発明のスクリーニング方法により得られる酵母を用いる以外は公知の手法を利用することができる。従って、原料、製造設備及び製造管理等は、従来法と同様でよく、トータル・ジアセチル濃度、特にＤＡ濃度を低く抑えた酒類を製造するためのコストを増加させる必要はない。すなわち、本発明によれば、香味安定性等に優れた酒類を、既存の施設を用い、コストを増加させることなく製造することができる。なお、本発明は、上述した酒類の製造方法により得られる酒類も含むものである。
【００２２】  上述した本発明のスクリーニング方法により得られる酵母の中には、ＤＡを多量に生産する変異株が存在する可能性がある。ＤＡ高生産性変異株を取得するには、本発明のスクリーニング方法に則り一次スクリーニングを行った後、二次スクリーニングでＤＡ生成量の多い変異株を選択すれば良い。このＤＡ高生産性酵母を用いることによって、例えば、所望の酒類でＶＤＫ、特にＤＡの濃度を高めることが可能となり、香味に特徴のある酒類を製造することができる。対象となる酒類としては、例えば、清酒、清酒テイストドリンク、麦芽飲料（ビール等）、ビールテイストドリンク、ワイン、蒸留酒（ウイスキー及び焼酎等）等があげられる。すなわち、上述した本発明のスクリーニング方法によって選抜された酵母を用いて酒類製造のための発酵・醸造を行い、トータル・ジアセチルの生産量を増加させることにより、所望の酒類において、トータル・ジアセチルの濃度が増加した酒類を製造することができる。これらの酒類を製造する場合は、親株の代わりに本発明のスクリーニング方法により得られる酵母を用いる以外は公知の手法を利用することができる。従って、原料、製造設備及び製造管理等は、従来法と同様でよく、トータル・ジアセチル濃度、特にＤＡ濃度が増加した酒類を製造するためのコストを増加させる必要はない。なお、本発明は、上述した酒類の製造方法により得られる酒類も含むものである。
【００２３】  以下に、実施例をあげて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００２４】  清酒酵母ｈｉａ１株（菊正宗酒造総合研究所で分離された酢酸イソアミル高産生清酒酵母）をＹＰＤ培地５ｍｌに植菌し、３０℃で一晩振とう培養した後、無菌的に集菌及び滅菌水洗浄した。この変異処理前洗浄菌体を０．１  Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１  ｍｌに再懸濁し、エチルメタンスルフォネート（以下ＥＭＳともいう）３％を加えて激しくボルテックスし、３０℃で１時間振とうしながら変異処理を行った。変異処理後の菌体を５％チオ硫酸ナトリウム水溶液と滅菌水で２回洗浄した後、一次スクリーニングを行った。【００２５】  一次スクリーニングとして、菌体懸濁滅菌水０．１  ｍｌを、０．５  ｍＭＥｔＢｒを含むＹＰＤ培地に添加し、遮光しながら３０℃で約２４時間培養した。この菌液を１０＾−５〜１０＾−２に希釈したのち、菌液０．１  ｍｌを最小培地に播種し、３０℃で約３日間培養した。【００２６】  一次スクリーニングで生育が確認できた株のうち１０株を二次スクリーニング対象株とした。【００２７】  二次スクリーニング対象株をＬｏｗ  Ｄｉａｃｅｔｙｌ（ＬＤ）株と名付け、親株であるｈｉａ１株及びＬＤ株をＹＰＤ培地にて３０℃で一晩振とう培養した後、無菌的に集菌及び滅菌水洗浄した菌体を滅菌水でＯＤ６６０＝１５．２になるよう調整し、酵母液として第２表に示す仕込配合で一段小仕込み醪を製造した。品温は１５℃一定とし、留６日目に上槽した。上槽酒のＤＡの定量は、サンプルに１０％トリクロロ酢酸及び酢酸エチルを等量添加し、酢酸エチル層に転送させた後、ＤＡをＧＣ／ＭＳにより分析することによって行った（ジャーナル・オブ・バイオサイエンス・アンド・バイオエンジニアリング（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ），Ｖｏｌ．９９，ｐ．５０２−５０７，２００５）。測定結果を第３表に示す。第３表から、ｈｉａ１株では０．７３６  ｐｐｍのＤＡが検出されたが、ＬＤ株では０．５０１  ｐｐｍにまでＤＡ生成が抑えられており、本発明のスクリーニング方法を用いて取得した酵母のＤＡ低生産性が認められた。【００２８】
【表１】
2020137508.tif 000002
【００２９】
【表２】
2020137508.tif 000003
【実施例２】
【００３０】  実施例１で本発明のスクリーニング方法により得られた低ＤＡ生産性変異株ＬＤ１及び親株であるｈｉａ１株を用いて、仕込配合を変えて低アルコール清酒を製造した。
ｈｉａ１株及びＬＤ１株をＹＰＤ培地にて３０℃で一晩振とう培養した後、無菌的に集菌及び滅菌水洗浄した菌体を滅菌水でＯＤ６６０＝１５．２になるよう調整し、酵母液として第３表に示す仕込配合で清酒を製造した。品温は１５℃一定とし、発酵途中でサンプリングを行いながらアルコール度数が１５％を越えたことを確認して上槽した。上槽酒のＤＡの定量は、サンプルを４０℃２４時間加温し、酢酸エチルによって抽出されたＤＡをＧＣ／ＭＳにより分析することによって行った。この際、前駆体であるα−アセト乳酸は加温処理によってＤＡに変換されているため、ＤＡの測定値にはα−アセト乳酸も含まれている。発酵経過に伴うＤＡ量の測定結果を図２に示す。「低アルコール酒用酵母の開発」（宮城県工業技術センター研究報告，２８，ｐ．７４−７７（１９９６））によるアルコール濃度１０％以下の低アルコール清酒の分類では、アルコール濃度の低い段階で強制的に醪の発酵を停止し、上槽し、低アルコールとする清酒を「発酵停止タイプ」の低アルコール清酒としている。この製造法における問題は、「発酵停止タイプ」の清酒の多くでＤＡ臭（つわり香）が認められることである。図２から、ｈｉａ１株を用いた低アルコール清酒では最大で０．５９１  ｐｐｍのＤＡが検出されたが、ＬＤ１株を用いた低アルコール清酒では同じ時期のＤＡ量が０．２８１  ｐｐｍにまで抑えられており、本発明のスクリーニング方法によって取得した酵母を用いて製造した低アルコール清酒におけるＤＡ量の低減が認められた。このことから、従来は困難であった、ＤＡ臭発生の危険性を抑えて発酵中醪の上槽を行うことが可能になり、ＤＡ臭発生の危険性の低い低アルコール清酒を従来の一般的な製造方法からも得られるようになった。【００３１】
【表３】
2020137508.tif 000004
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】  ｈｉａ１株及びＬＤ１株の発酵経過に伴うＤＡ量の推移を表した図である（実施例２）
【００３３】  以上の結果から、本発明のスクリーニング方法によってＤＡ低生産性酵母が取得できることが示された。また、得られた変異株を用いて製造した清酒ではＤＡ量が低減していることが示された。従って、本発明のスクリーニング方法によって取得した酵母が清酒製造におけるＤＡ臭の発生防止に役立つのみでなく、低アルコール濃度清酒の製造管理を容易なものとし、また低アルコール濃度清酒の品質の多様化に貢献しうることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００３４】  本発明の変異酵母を使用すれば、製品中でオフフレーバーとなるトータル・ジアセチル、特にＤＡ生産量が低減され、香味に優れた酒類を容易に製造することが可能となる。
【図１】
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