(57)【要約】      （修正有）【課題】アルツハイマー病および他の神経変性障害のためのバイオマーカーならびに診断方法および予後判定方法を提供する。【解決手段】対象からの生体試料における１つ以上のバイオマーカーのレベルをアッセイすること、次いでバイオマーカーのレベルに基づいて、対象における神経変性障害を診断もしくは予後判定すること、神経変性障害のリスクのある対象を特定すること、または、神経変性障害を有する対象における治療レジメンを処方もしくは治療の利益を予測することを含み、少なくとも１つ以上のバイオマーカーが、タウ、リン酸化タウ、Ａβ１−４２、ＴＤＰ−４３、α−シヌクレイン、ＳＯＤ−１、ＦＵＳ、ＦＫＢＰ５１、ＩＲＳ−１、リン酸化ＩＲＳ−１、ＣＴＳＤ、ＬＡＭＰ１、ＵＢＰ、ＨＳＰ７０、ＮＳＥ、ＮＦＬ、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１およびＣＤ１７１からなる群から選択される、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における神経変性障害を診断もしくは予後判定する、神経変性障害のリスクのある対象を特定する、または、神経変性障害を有する対象における治療レジメンを処方もしくは治療の利益を予測する方法であって、前記対象からの生体試料における１つ以上のバイオマーカーのレベルをアッセイすること、次いで前記バイオマーカーのレベルに基づいて、対象における神経変性障害を診断もしくは予後判定すること、神経変性障害のリスクのある対象を特定すること、または、神経変性障害を有する対象における治療レジメンを処方もしくは治療の利益を予測することを含み、少なくとも１つ以上の前記バイオマーカーが、タウ、リン酸化タウ、Ａβ１−４２、ＴＤＰ−４３、α−シヌクレイン、ＳＯＤ−１、ＦＵＳ、ＦＫＢＰ５１、ＩＲＳ−１、リン酸化ＩＲＳ−１、ＣＴＳＤ、ＬＡＭＰ１、ＵＢＰ、ＨＳＰ７０、ＮＳＥ、ＮＦＬ、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１およびＣＤ１７１からなる群から選択される、方法。
【請求項２】
生体試料中の１つ以上のバイオマーカーのレベルが、対照試料中の１つ以上のバイオマーカーのレベルと比較され、生体試料の１つ以上のバイオマーカーのレベルが、対照試料と比較して上昇している、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
神経変性障害が、アルツハイマー病（ＡＤ）、血管疾患性認知症、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、レビー小体型認知症、神経原線維変化優位型老年期認知症、ピック病（ＰｉＤ）、嗜銀顆粒病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、他の運動ニューロン疾患、グアムパーキンソン認知症複合、ＦＴＤＰ−１７、リティコ−ボディグ病、多発性硬化症、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、およびパーキンソン病からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
生体試料が、全血、血清、血漿、尿、間質液、腹水、子宮頸部スワブ、涙、唾液、頬スワブ、皮膚、脳組織、および脳脊髄液からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
リン酸化タウが、１つ以上のセリン、スレオニンまたはチロシン残基上でリン酸化されている、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
リン酸化タウが、Ｔｈｒ−１５３、Ｔｈｒ−１８１、Ｔｈｒ−２０５、Ｔｈｒ−２３１、Ｓｅｒ−１９９、Ｓｅｒ−２０２、Ｓｅｒ−２１４、Ｓｅｒ−２３５、Ｓｅｒ−２６２、Ｓｅｒ−３５６、Ｓｅｒ−３９６、Ｓｅｒ−４２２、Ｔｙｒ１８、Ｔｙｒ２９、Ｔｙｒ１９７、Ｔｙｒ３１０、およびＴｙｒ３９４からなる群から選択される１つ以上の残基でリン酸化されている、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
リン酸化ＩＲＳ−１が、１つ以上のセリン、スレオニンまたはチロシン残基上でリン酸化されている、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
リン酸化ＩＲＳ−１が、Ｐ−Ｓ３１２−ＩＲＳ−１およびＰ−ｐａｎＹ−ＩＲＳ−１からなる群から選択される１つ以上の残基でリン酸化されている、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
リン酸化タウまたはＩＲＳ−１のレベルが、リン酸化タウもしくはＩＲＳ−１ポリヌクレオチド、リン酸化タウもしくはＩＲＳ−１ポリペプチド、またはリン酸化タウもしくはＩＲＳ−１活性のレベルをアッセイすることにより決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
生体試料から小胞を単離することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
小胞が、エキソソーム、微粒子、微小胞、ナノソーム、細胞外小胞、およびエクトソームからなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
単離されたエキソソームが、ニューロン由来のエキソソーム、アストロサイト由来のエキソソーム、オリゴデンドロサイト由来のエキソソーム、およびミクログリア由来のエキソソームからなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
１つ以上のバイオマーカーのレベルが、前記１つ以上のバイオマーカーのタンパク質、リン酸化タンパク質、ｍＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡレベルである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
対象における神経変性障害を診断もしくは予後判定する、神経変性障害のリスクのある対象を特定する、または、神経変性障害を有する対象における治療レジメンを処方もしくは治療の利益を予測する方法であって、前記対象から得られた生体試料から小胞を単離すること、次いで前記小胞中の１つ以上のバイオマーカーのレベルを決定することを含み、対照試料中の１つ以上のバイオマーカーのレベルと比較して上昇した前記試料中の１つ以上のバイオマーカーのレベルが神経変性障害の兆候であり、少なくとも１つ以上の前記バイオマーカーが、タウ、リン酸化タウ、Ａβ１−４２、ＴＤＰ−４３、α−シヌクレイン、ＳＯＤ−１、ＦＵＳ、ＦＫＢＰ５１、ＩＲＳ−１、リン酸化ＩＲＳ−１、ＣＴＳＤ、ＬＡＭＰ１、ＵＢＰ、ＨＳＰ７０、ＮＳＥ、ＮＦＬ、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１およびＣＤ１７１からなる群から選択される、方法。
【請求項１５】
神経変性障害が、アルツハイマー病（ＡＤ）、血管疾患性認知症、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、レビー小体型認知症、神経原線維変化優位型老年期認知症、ピック病（ＰｉＤ）、嗜銀顆粒病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、他の運動ニューロン疾患、グアムパーキンソン認知症複合、ＦＴＤＰ−１７、リティコ−ボディグ病、多発性硬化症、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、およびパーキンソン病からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
生体試料が、全血、血清、血漿、尿、間質液、腹水、子宮頸部スワブ、涙、唾液、頬スワブ、皮膚、脳組織、および脳脊髄液からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
リン酸化タウおよびリン酸化ＩＲＳ−１が、１つ以上のセリン、スレオニンまたはチロシン残基上でリン酸化されている、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
小胞が、エキソソーム、微粒子、微小胞、ナノソーム、細胞外小胞、およびエクトソームからなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
エキソソームが、ニューロン由来のエキソソーム、アストロサイト由来のエキソソーム、オリゴデンドロサイト由来のエキソソーム、およびミクログリア由来のエキソソームからなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
生体試料から小胞を単離することが、生体試料中に存在する小胞が薬剤に結合して小胞−薬剤複合体を形成する条件下で、生体試料を薬剤と接触させること、次いで小胞−薬剤複合体から小胞を単離して小胞を含有する試料を得ることを含み、ここで、試料中に存在する小胞の純度は生体試料中に存在する小胞の純度より高い、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
生体試料から小胞を単離することが、生体試料から小胞を単離して小胞試料を得ること、小胞試料中に存在する小胞が薬剤に結合して小胞−薬剤複合体を形成する条件下で、小胞試料を薬剤と接触させること、次いで小胞−薬剤複合体から小胞を単離して小胞を含有する試料を得ることを含み、ここで、試料中に存在する小胞の純度は生体試料中に存在する小胞の純度より高い、請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
小胞が、エキソソーム、微粒子、微小胞、ナノソーム、細胞外小胞、およびエクトソームからなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
薬剤が、抗体、レクチン、リガンド、可溶性受容体、結合タンパク質、またはオリゴヌクレオチドである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
抗体が、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
抗体が、モノクローナル抗ヒトＮＣＡＭ抗体、モノクローナル抗ヒトＣＤ１７１抗体、モノクローナルＣＤ９抗体、モノクローナルＣＤ６３抗体、またはモノクローナルＣＤ８１抗体である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
１つ以上のバイオマーカーのレベルが、前記１つ以上のバイオマーカーのタンパク質、リン酸化タンパク質、ｍＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡレベルである、請求項１４に記載の方法。
【請求項２７】
対象における神経変性障害を診断もしくは予後判定する、神経変性障害のリスクのある対象を特定する、または、神経変性障害を有する対象における治療レジメンを処方もしくは治療の利益を予測する方法であって、前記対象から生体試料を得ること、試料に小胞特異的な抗体を適用すること、ここで前記小胞の存在は抗体−小胞複合体を形成するものであり、抗体−小胞複合体を単離すること、抗体−小胞複合体における１つ以上のバイオマーカーのレベルをアッセイすること、および１つ以上のバイオマーカーのレベルに基づいて、対象における神経変性障害を診断もしくは予後判定すること、神経変性障害のリスクのある対象を特定すること、または、神経変性障害を有する対象における治療レジメンを処方もしくは治療の利益を予測することを含み、少なくとも１つ以上の前記バイオマーカーが、タウ、リン酸化タウ、Ａβ１−４２、ＴＤＰ−４３、α−シヌクレイン、ＳＯＤ−１、ＦＵＳ、ＦＫＢＰ５１、ＩＲＳ−１、リン酸化ＩＲＳ−１、ＣＴＳＤ、ＬＡＭＰ１、ＵＢＰ、ＨＳＰ７０、ＮＳＥ、ＮＦＬ、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１およびＣＤ１７１からなる群から選択される、方法。
【請求項２８】
抗体−小胞複合体が、固相上に作成される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
抗体−小胞複合体から小胞を放出することをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
固相が、非磁性ビーズ、磁性ビーズ、アガロース、またはセファロースである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
抗体−小胞複合体を低ｐＨ３．５−１．５にさらすことによって、小胞が放出される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
放出された小胞が、高ｐＨ溶液を加えることによって中和される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
放出された小胞が、放出された小胞を溶解溶液とインキュベートすることによって溶解される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
溶解溶液が、プロテアーゼおよびホスファターゼに対する阻害剤を含有する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
１つ以上のバイオマーカーのレベルが、小胞の数または小胞バイオマーカーの値によって正規化される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３６】
小胞が、エキソソーム、微粒子、微小胞、ナノソーム、細胞外小胞、およびエクトソームからなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３７】
抗体が、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３８】
抗体が、モノクローナル抗ヒトＮＣＡＭ抗体、モノクローナル抗ヒトＣＤ１７１抗体、モノクローナルＣＤ９抗体、モノクローナルＣＤ６３抗体、またはモノクローナルＣＤ８１抗体である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３９】
エキソソームが、ニューロン由来のエキソソーム、アストロサイト由来のエキソソーム、オリゴデンドロサイト由来のエキソソーム、およびミクログリア由来のエキソソームからなる群から選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
リン酸化タウおよびリン酸化ＩＲＳ−１が、１つ以上のセリン、スレオニンまたはチロシン残基上でリン酸化されている、請求項２７に記載の方法。
【請求項４１】
生体試料が、全血、血清、血漿、尿、間質液、腹水、子宮頸部スワブ、涙、唾液、頬スワブ、皮膚、脳組織、および脳脊髄液からなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項４２】
神経変性障害が、アルツハイマー病（ＡＤ）、血管疾患性認知症、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、レビー小体型認知症、神経原線維変化優位型老年期認知症、ピック病（ＰｉＤ）、嗜銀顆粒病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、他の運動ニューロン疾患、グアムパーキンソン認知症複合、ＦＴＤＰ−１７、リティコ−ボディグ病、多発性硬化症、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、およびパーキンソン病からなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項４３】
１つ以上のバイオマーカーのレベルが、前記１つ以上のバイオマーカーのタンパク質、リン酸化タンパク質、ｍＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡレベルである、請求項２７に記載の方法。
【請求項４４】
１つ以上のバイオマーカーを含む、対象の神経変性障害状態を評価するためのバイオマーカーのセットであって、セット中のバイオマーカーのレベルがアッセイされ、かつバイオマーカーレベルが少なくとも４０％の特異度で対象の神経変性障害状態を決定し、バイオマーカーのセットの少なくとも１つ以上が、タウ、リン酸化タウ、Ａβ１−４２、ＴＤＰ−４３、α−シヌクレイン、ＳＯＤ−１、ＦＵＳ、ＦＫＢＰ５１、ＩＲＳ−１、リン酸化ＩＲＳ−１、ＣＴＳＤ、ＬＡＭＰ１、ＵＢＰ、ＨＳＰ７０、ＮＳＥ、ＮＦＬ、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１およびＣＤ１７１からなる群から選択される、バイオマーカーのセット。
【請求項４５】
生体試料が、全血、血清、血漿、尿、間質液、腹水、子宮頸部スワブ、涙、唾液、頬スワブ、皮膚、脳組織、および脳脊髄液からなる群から選択される、請求項４４に記載のバイオマーカーのセット。
【請求項４６】
神経変性障害が、アルツハイマー病（ＡＤ）、血管疾患性認知症、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、レビー小体型認知症、神経原線維変化優位型老年期認知症、ピック病（ＰｉＤ）、嗜銀顆粒病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、他の運動ニューロン疾患、グアムパーキンソン認知症複合、ＦＴＤＰ−１７、リティコ−ボディグ病、多発性硬化症、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、およびパーキンソン病からなる群から選択される、請求項４４に記載のバイオマーカーのセット。
【請求項４７】
試料からの小胞中のバイオマーカーのレベルをアッセイすることをさらに含む、請求項４４に記載のバイオマーカーのセット。
【請求項４８】
小胞が、エキソソーム、微粒子、微小胞、ナノソーム、細胞外小胞、およびエクトソームからなる群から選択される、請求項４７に記載のバイオマーカーのセット。
【請求項４９】
対象における神経変性障害を診断もしくは予後判定する、神経変性障害のリスクのある対象を特定する、または、神経変性障害を有する対象における治療レジメンを処方もしくは治療の利益を予測するためのキットであって、小胞に特異的に結合する１つ以上の薬剤、バイオマーカーに特異的に結合する１つ以上の薬剤、生体試料を収集および／または保持するための１つ以上の容器、ならびに使用のための指示書を含み、前記神経変性障害が変化したバイオマーカーレベルに関連し、前記バイオマーカーが、タウ、リン酸化タウ、Ａβ１−４２、ＴＤＰ−４３、α−シヌクレイン、ＳＯＤ−１、ＦＵＳ、ＦＫＢＰ５１、ＩＲＳ−１、リン酸化ＩＲＳ−１、ＣＴＳＤ、ＬＡＭＰ１、ＵＢＰ、ＨＳＰ７０、ＮＳＥ、ＮＦＬ、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１およびＣＤ１７１からなる群から選択される、キット。
【請求項５０】
小胞が、エキソソーム、微粒子、微小胞、ナノソーム、細胞外小胞、およびエクトソームからなる群から選択される、請求項４９に記載のキット。
【請求項５１】
薬剤が、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体である、請求項４９に記載のキット。
【請求項５２】
薬剤が、モノクローナル抗ヒトＮＣＡＭ抗体、モノクローナル抗ヒトＣＤ１７１抗体、モノクローナルＣＤ９抗体、モノクローナルＣＤ６３抗体、またはモノクローナルＣＤ８１抗体である、請求項４９に記載のキット。
【請求項５３】
エキソソームが、ニューロン由来のエキソソーム、アストロサイト由来のエキソソーム、オリゴデンドロサイト由来のエキソソーム、およびミクログリア由来のエキソソームからなる群から選択される、請求項４９に記載のキット。
【請求項５４】
神経変性障害が、アルツハイマー病（ＡＤ）、血管疾患性認知症、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、レビー小体型認知症、神経原線維変化優位型老年期認知症、ピック病（ＰｉＤ）、嗜銀顆粒病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、他の運動ニューロン疾患、グアムパーキンソン認知症複合、ＦＴＤＰ−１７、リティコ−ボディグ病、多発性硬化症、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、およびパーキンソン病からなる群から選択される、請求項４９に記載のキット。
【請求項５５】
生体試料が、全血、血清、血漿、尿、間質液、腹水、子宮頸部スワブ、涙、唾液、頬スワブ、皮膚、脳組織、および脳脊髄液からなる群から選択される、請求項４９に記載のキット。
【請求項５６】
リン酸化タウが、１つ以上のセリン、スレオニンまたはチロシン残基上でリン酸化されている、請求項４９に記載のキット。
【請求項５７】
試料中のバイオマーカーのレベルを分析するためのコンピュータモデルまたはアルゴリズムをさらに含む、請求項４９に記載のキット。
【請求項５８】
対象における神経変性障害を診断もしくは予後判定する、神経変性障害のリスクのある対象を特定する、または神経変性障害を有する対象における治療レジメンを処方もしくは治療の利益を予測するためのキットであって、小胞に特異的に結合する１つ以上の薬剤、バイオマーカーｍＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡを検出するための１つ以上のプローブもしくはプライマー、生体試料を収集および／または保持するための１つ以上の容器、ならびに使用のための指示書を含み、前記神経変性障害が変化したバイオマーカーレベルに関連し、前記バイオマーカーが、タウ、Ａβ１−４２、ＴＤＰ−４３、α−シヌクレイン、ＳＯＤ−１、ＦＵＳ、ＦＫＢＰ５１、ＩＲＳ−１、ＣＴＳＤ、ＬＡＭＰ１、ＵＢＰ、ＨＳＰ７０、ＮＳＥ、ＮＦＬ、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１およびＣＤ１７１からなる群から選択される、キット。
【請求項５９】
小胞が、エキソソーム、微粒子、微小胞、ナノソーム、細胞外小胞、およびエクトソームからなる群から選択される、請求項５８に記載のキット。
【請求項６０】
薬剤が、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体である、請求項５８に記載のキット。
【請求項６１】
エキソソームが、ニューロン由来のエキソソーム、アストロサイト由来のエキソソーム、オリゴデンドロサイト由来のエキソソーム、およびミクログリア由来のエキソソームからなる群から選択される、請求項５８に記載のキット。
【請求項６２】
神経変性障害が、アルツハイマー病（ＡＤ）、血管疾患性認知症、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、レビー小体型認知症、神経原線維変化優位型老年期認知症、ピック病（ＰｉＤ）、嗜銀顆粒病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、他の運動ニューロン疾患、グアムパーキンソン認知症複合、ＦＴＤＰ−１７、リティコ−ボディグ病、多発性硬化症、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、およびパーキンソン病からなる群から選択される、請求項５８に記載のキット。
【請求項６３】
生体試料が、全血、血清、血漿、尿、間質液、腹水、子宮頸部スワブ、涙、唾液、頬スワブ、皮膚、脳組織、および脳脊髄液からなる群から選択される、請求項５８に記載のキット。
【請求項６４】
リン酸化タウおよびリン酸化ＩＲＳ−１が、１つ以上のセリン、スレオニンまたはチロシン残基上でリン酸化されている、請求項５８に記載のキット。
【請求項６５】
対象における神経変性障害を診断する方法であって、（ｉ）対象から小胞を含有する試験生体試料を得る段階、（ｉｉ）試験生体試料中の１つ以上のバイオマーカーのレベルを測定する段階、（ｉｉｉ）対照生体試料中の１つ以上のバイオマーカーの対照レベルと試験生体試料中の１つ以上のバイオマーカーのレベルを比較する段階、次いで（ｉｖ）対照生体試料と比較して、試験生体試料中の１つ以上のバイオマーカーのレベルの増加を検出することによって、対象が神経変性障害を有することを決定する段階を含み、前記１つ以上のバイオマーカーの少なくとも１つが、タウ、リン酸化タウ、Ａβ１−４２、ＴＤＰ−４３、α−シヌクレイン、ＳＯＤ−１、ＦＵＳ、ＦＫＢＰ５１、ＩＲＳ−１、リン酸化ＩＲＳ−１、ＣＴＳＤ、ＬＡＭＰ１、ＵＢＰ、ＨＳＰ７０、ＮＳＥ、ＮＦＬ、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、およびＣＤ１７１からなる群から選択される、方法。
【請求項６６】
小胞が、エキソソーム、微粒子、微小胞、ナノソーム、細胞外小胞、およびエクトソームからなる群から選択される、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
エキソソームが、ニューロン由来のエキソソーム、アストロサイト由来のエキソソーム、オリゴデンドロサイト由来のエキソソーム、およびミクログリア由来のエキソソームからなる群から選択される、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
対象からの試料を分析する方法であって、（ｉ）対象から小胞を含む生体試料を得る段階、（ｉｉ）生体試料中の１つ以上のバイオマーカーのレベルを測定する段階、次いで（ｉｉｉ）対照生体試料中の１つ以上のバイオマーカーの対照レベルと生体試料中の１つ以上のバイオマーカーのレベルを比較する段階を含み、前記１つ以上のバイオマーカーの少なくとも１つが、タウ、リン酸化タウ、Ａβ１−４２、ＴＤＰ−４３、α−シヌクレイン、ＳＯＤ−１、ＦＵＳ、ＦＫＢＰ５１、ＩＲＳ−１、リン酸化ＩＲＳ−１、ＣＴＳＤ、ＬＡＭＰ１、ＵＢＰ、ＨＳＰ７０、ＮＳＥ、ＮＦＬ、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、およびＣＤ１７１からなる群から選択される、方法。
【請求項６９】
小胞が、エキソソーム、微粒子、微小胞、ナノソーム、細胞外小胞、およびエクトソームからなる群から選択される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
エキソソームが、ニューロン由来のエキソソーム、アストロサイト由来のエキソソーム、オリゴデンドロサイト由来のエキソソーム、およびミクログリア由来のエキソソームからなる群から選択される、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
対象が神経変性障害を有すると診断されている、または疑われている、請求項６８に記載の方法。
【請求項７２】
神経変性障害が、アルツハイマー病（ＡＤ）、血管疾患性認知症、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、レビー小体型認知症、神経原線維変化優位型老年期認知症、ピック病（ＰｉＤ）、嗜銀顆粒病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、他の運動ニューロン疾患、グアムパーキンソン認知症複合、ＦＴＤＰ−１７、リティコ−ボディグ病、多発性硬化症、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、およびパーキンソン病からなる群から選択される、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
１つ以上のバイオマーカーのレベルが、前記１つ以上のバイオマーカーのタンパク質、リン酸化タンパク質、ｍＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡレベルである、請求項６８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、その全体が出典明示により本明細書に組み込まれる、２０１３年１０月２４日に出願された米国仮特許出願第６１／８９５，３７６号、２０１４年４月１４日に出願された米国仮特許出願第６１／９７８，９９４号、および２０１４年９月８日に出願された米国仮特許出願第６２／０４７，０６２号の優先権を主張する。
【０００２】
技術分野
本発明は、アルツハイマー病および他の神経変性障害のためのバイオマーカーならびに診断方法および予後判定（ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ）方法に関する。本発明はまた、当該バイオマーカーを検出するための組成物、ならびにアルツハイマー病および他の神経変性障害を治療するために有用な組成物および方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
５４０万人以上のアメリカ人および世界では３５００万人が、認知症の最も一般的な形態であるアルツハイマー病を有する。現在、アルツハイマー病を診断する唯一の確実な方法は、患者の死亡後の脳組織の直接検査によるものである。医師は、アルツハイマー病を有する疑いのある患者における疾患を診断するために、脳イメージング、行動評価、精神医学的検査および他の手段を使用するが、いずれも高い正確性を示さず、かつ多くはコストがかかるか、実用的ではない。
【０００４】
従って、アルツハイマー病および他の神経変性障害を診断するためのバイオマーカーおよび方法が当技術分野で必要とされている。さらに、当該バイオマーカーを検出するための組成物、ならびにアルツハイマー病および他の神経変性障害を治療するために有用な組成物および方法が、当技術分野で必要とされている。本発明は、アルツハイマー病および他の神経変性障害を診断するための、正確で、非侵襲的な方法を提供することによって、この必要性を満たす。本発明は、さらに、アルツハイマー病および他の神経変性障害を診断、予後判定（ｐｒｏｇｎｏｓｉｎｇ）、予測（ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ）、および治療するための新規な方法、アッセイ、キット、および組成物を提供する。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、対象における神経変性障害を診断もしくは予後判定する、神経変性障害のリスクのある対象を特定する、または、神経変性障害を有する対象における治療レジメンを処方もしくは治療の利益を予測する方法であって、当該対象からの生体試料における１つ以上のバイオマーカーのレベルをアッセイすること、次いで当該バイオマーカーのレベルに基づいて、対象における神経変性障害を診断もしくは予後判定すること、神経変性障害のリスクのある対象を特定すること、または、神経変性障害を有する対象における治療レジメンを処方もしくは治療の利益を予測することを含み、当該１つ以上のバイオマーカーの少なくとも１つが、タウ、リン酸化タウ、Ａβ１−４２、ＴＤＰ−４３、α−シヌクレイン、ＳＯＤ−１、ＦＵＳ、ＦＫＢＰ５１、ＩＲＳ−１、リン酸化ＩＲＳ−１、カテプシンＤ（ＣＴＳＤ）、１型リソソーム関連膜タンパク質（ＬＡＭＰ１）、ユビキチン化タンパク質（ＵＢＰ）、熱ショックタンパク質７０（ＨＳＰ７０）、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、ニューロフィラメント軽鎖（ＮＦＬ）、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１およびＣＤ１７１からなる群から選択される、方法を提供する。いくつかの実施形態では、生体試料中の１つ以上のバイオマーカーのレベルは、対照試料中の１つ以上のバイオマーカーのレベルと比較され、ここで生体試料の１つ以上のバイオマーカーのレベルは、対照試料と比較して上昇している。他の実施形態では、神経変性障害は、アルツハイマー病（ＡＤ）、血管疾患性認知症、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、レビー小体型認知症、神経原線維変化優位型老年期認知症（ｔａｎｇｌｅ−ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔ  ｓｅｎｉｌｅ  ｄｅｍｅｎｔｉａ）、ピック病（ＰｉＤ）、嗜銀顆粒病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、他の運動ニューロン疾患、グアムパーキンソン認知症複合、ＦＴＤＰ−１７、リティコ−ボディグ病、多発性硬化症、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、およびパーキンソン病からなる群から選択される。他の実施形態では、生体試料は、全血、血清、血漿、尿、間質液、腹水、子宮頸部スワブ、涙、唾液、頬スワブ、皮膚、脳組織、および脳脊髄液からなる群から選択される。さらに他の実施形態では、リン酸化タウは、１つ以上のセリン、スレオニンまたはチロシン残基上でリン酸化されている。さらに他の実施形態では、リン酸化タウは、Ｔｈｒ−１５３、Ｔｈｒ−１８１、Ｔｈｒ−２０５、Ｔｈｒ−２３１、Ｓｅｒ−１９９、Ｓｅｒ−２０２、Ｓｅｒ−２１４、Ｓｅｒ−２３５、Ｓｅｒ−２６２、Ｓｅｒ−３５６、Ｓｅｒ−３９６、Ｓｅｒ−４２２、Ｔｙｒ１８、Ｔｙｒ２９、Ｔｙｒ１９７、Ｔｙｒ３１０、およびＴｙｒ３９４からなる群から選択される１つ以上の残基でリン酸化されている。他の実施形態では、リン酸化タウのレベルは、リン酸化タウポリヌクレオチド、リン酸化タウポリペプチド、またはリン酸化タウ活性のレベルをアッセイすることにより決定される。さらに他の実施形態では、リン酸化ＩＲＳ−１は、１つ以上のセリン、スレオニンまたはチロシン残基上でリン酸化されている。さらに他の実施形態では、リン酸化ＩＲＳ−１は、Ｐ−Ｓ３１２−ＩＲＳ−���およびＰ−ｐａｎＹ−ＩＲＳ−１からなる群から選択される１つ以上の残基でリン酸化されている。他の実施形態では、リン酸化ＩＲＳ−１のレベルは、リン酸化ＩＲＳ−１ポリヌクレオチド、リン酸化ＩＲＳ−１ポリペプチド、またはリン酸化ＩＲＳ−１活性のレベルをアッセイすることにより決定される。他の実施形態では、当該方法は、生体試料から小胞を単離することをさらに含む。他の実施形態では、小胞は、エキソソーム、微粒子、微小胞、ナノソーム、細胞外小胞、およびエクトソームからなる群から選択される。他の実施形態では、当該方法は生体試料からエキソソームを単離することをさらに含む。特定の実施形態では、単離されたエキソソームは、ニューロン由来のエキソソーム、アストロサイト由来のエキソソーム、オリゴデンドロサイト由来のエキソソーム、およびミクログリア由来のエキソソームからなる群から選択される。他の実施形態では、１つ以上のバイオマーカーのレベルは、当該１つ以上のバイオマーカーのタンパク質、リン酸化タンパク質、ｍＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡレベルである。
【０００６】
本発明はまた、対象における神経変性障害を診断もしくは予後判定する、神経変性障害のリスクのある対象を特定する、または、神経変性障害を有する対象における治療レジメンを処方もしくは治療の利益を予測する方法であって、当該対象から得られた生体試料から小胞を単離すること、次いで当該小胞中の１つ以上のバイオマーカーのレベルを決定することを含み、対照試料中の１つ以上のバイオマーカーのレベルと比較して上昇した当該生体試料中の１つ以上のバイオマーカーのレベルが神経変性障害の兆候であり、当該１つ以上のバイオマーカーの少なくとも１つが、タウ、リン酸化タウ、Ａβ１−４２、ＴＤＰ−４３、α−シヌクレイン、ＳＯＤ−１、ＦＵＳ、ＦＫＢＰ５１、ＩＲＳ−１、リン酸化ＩＲＳ−１、ＣＴＳＤ、ＬＡＭＰ１、ＵＢＰ、ＨＳＰ７０、ＮＳＥ、ＮＦＬ、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１およびＣＤ１７１からなる群から選択される、方法を提供する。他の実施形態では、小胞は、エキソソーム、微粒子、微小胞、ナノソーム、細胞外小胞、およびエクトソームからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、前記神経変性障害は、アルツハイマー病（ＡＤ）、血管疾患性認知症、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、レビー小体型認知症、神経原線維変化優位型老年期認知症、ピック病（ＰｉＤ）、嗜銀顆粒病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、他の運動ニューロン疾患、グアムパーキンソン認知症複合、ＦＴＤＰ−１７、リティコ−ボディグ病、多発性硬化症、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、およびパーキンソン病からなる群から選択される。他の実施形態では、生体試料は、全血、血清、血漿、尿、間質液、腹水、子宮頸部スワブ、涙、唾液、頬スワブ、皮膚、脳組織、および脳脊髄液からなる群から選択される。さらに他の実施形態では、リン酸化タウは、１つ以上のセリン、スレオニンまたはチロシン残基上でリン酸化されている。他の実施形態では、リン酸化タウは、Ｔｈｒ−１５３、Ｔｈｒ−１８１、Ｔｈｒ−２０５、Ｔｈｒ−２３１、Ｓｅｒ−１９９、Ｓｅｒ−２０２、Ｓｅｒ−２１４、Ｓｅｒ−２３５、Ｓｅｒ−２６２、Ｓｅｒ−３５６、Ｓｅｒ−３９６、Ｓｅｒ−４２２、Ｔｙｒ１８、Ｔｙｒ２９、Ｔｙｒ１９７、Ｔｙｒ３１０、およびＴｙｒ３９４からなる群から選択される１つ以上の残基でリン酸化されている。さらに他の実施形態では、リン酸化ＩＲＳ−１は、１つ以上のセリン、スレオニンまたはチロシン残基上でリン酸化されている。他の実施形態では、リン酸化ＩＲＳ−１は、Ｐ−Ｓ３１２−ＩＲＳ−１およびＰ−ｐａｎＹ−ＩＲＳ−１からなる群から選択される１つ以上の残基でリン酸化されている。さらに他の実施形態では、単離されたエキソソームは、ニューロン由来のエキソソーム、アストロサイト由来のエキソソーム、オリゴデンドロサイト由来のエキソソーム、およびミクログリア由来のエキソソームからなる群から選択される。他の実施形態では、生体試料から小胞を単離することは、生体試料中に存在する小胞が薬剤に結合して小胞−薬剤複合体を形成する条件下で、生体試料を薬剤と接触させること、および小胞−薬剤複合体から小胞を単離して小胞を含有する試料を得ることを含み、こ��で、試料中に存在する小胞の純度は生体試料中に存在する小胞の純度より高い。他の実施形態では、生体試料から小胞を単離することは、生体試料から小胞を単離して小胞試料を得ること、小胞試料中に存在する小胞が薬剤に結合して小胞−薬剤複合体を形成する条件下で、小胞試料を薬剤と接触させること、および小胞−薬剤複合体から小胞を単離して小胞を含有する試料を得ることを含み、ここで、試料中に存在する小胞の純度は生体試料中に存在する小胞の純度より高い。特定の態様では、薬剤は、抗体、レクチン、リガンド、可溶性受容体、結合タンパク質、またはオリゴヌクレオチドである。他の態様では、抗体はポリクローナルまたはモノクローナル抗体である。さらに他の態様では、抗体はモノクローナルＮＣＡＭ抗体である。他の態様では、抗体はモノクローナル抗ヒトＮＣＡＭ抗体である。さらに他の態様では、抗体はモノクローナルＣＤ１７１抗体である。他の態様では、抗体はモノクローナル抗ヒトＣＤ１７１抗体である。さらに他の態様では、抗体はモノクローナルＣＤ９抗体である。他の態様では、抗体はモノクローナルＣＤ６３抗体である。他の態様では、抗体はモノクローナルＣＤ８１抗体である。他の実施形態では、小胞は、エキソソーム、微粒子、微小胞、ナノソーム、細胞外小胞、およびエクトソームからなる群から選択される。他の実施形態では、１つ以上のバイオマーカーのレベルは、当該１つ以上のバイオマーカーのタンパク質、リン酸化タンパク質、ｍＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡレベルである。
【０００７】
本発明は、対象における神経変性障害を診断もしくは予後判定する、神経変性障害のリスクのある対象を特定する、または、神経変性障害を有する対象における治療レジメンを処方もしくは治療の利益を予測する方法であって、当該対象から生体試料を得ること、試料に小胞特異的な抗体を適用すること、ここで当該小胞の存在は抗体−小胞複合体を形成するものであり、抗体−小胞複合体を単離すること、抗体−小胞複合体における１つ以上のバイオマーカーのレベルをアッセイすること、次いで１つ以上のバイオマーカーのレベルに基づいて、対象における神経変性障害を診断もしくは予後判定すること、神経変性障害のリスクのある対象を特定すること、または、神経変性障害を有する対象における治療レジメンを処方もしくは治療の利益を予測することを含み、少なくとも１つのバイオマーカーが、タウ、リン酸化タウ、Ａβ１−４２、ＴＤＰ−４３、α−シヌクレイン、ＳＯＤ−１、ＦＵＳ、ＦＫＢＰ５１、ＩＲＳ−１、リン酸化ＩＲＳ−１、ＣＴＳＤ、ＬＡＭＰ１、ＵＢＰ、ＨＳＰ７０、ＮＳＥ、ＮＦＬ、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１およびＣＤ１７１からなる群から選択される、方法を提供する。いくつかの実施形態では、抗体−小胞複合体は固相上に作成される。さらに他の実施形態では、当該方法は、抗体−小胞複合体から小胞を放出することをさらに含む。特定の実施形態では、固相は、非磁性ビーズ、磁性ビーズ、アガロース、またはセファロースである。他の実施形態では、抗体−小胞複合体を低ｐＨ３．５−１．５にさらすことによって、小胞が放出される。さらに他の実施形態では、放出された小胞は、高ｐＨ溶液を加えることによって中和される。他の実施形態では、放出された小胞は、放出された小胞を溶解溶液とインキュベートすることによって溶解される。さらに他の実施形態では、溶解溶液は、プロテアーゼおよびホスファターゼに対する阻害剤を含有する。他の実施形態では、１つ以上のバイオマーカーのレベルは、小胞の数または小胞バイオマーカーの値によって正規化される。他の実施形態では、小胞は、エキソソーム、微粒子、微小胞、ナノソーム、細胞外小胞、およびエクトソームからなる群から選択される。特定の実施形態では、抗体はポリクローナルまたはモノクローナル抗体である。他の実施形態では、抗体はモノクローナルＮＣＡＭ抗体である。他の実施形態では、抗体はモノクローナル抗ヒトＮＣＡＭ抗体である。さらに他の態様では、抗体はモノクローナルＣＤ１７１抗体である。他の態様では、抗体はモノクローナル抗ヒトＣＤ１７１抗体である。他の態様では、抗体はモノクローナルＣＤ９抗体である。他の態様では、抗体はモノクローナルＣＤ６３抗体である。他の態様では、抗体はモノクローナルＣＤ８１抗体である。いくつかの実施形態では、エキソソームは、ニューロン由来のエキソソーム、アストロサイト由来のエキソソーム、オリゴデンドロサイト由来のエキソソーム、およびミクログリア由来のエキソソームからなる群から選択される。他の実施形態では、リン酸化タウは、１つ以上のセリン、スレオニンまたはチロシン残基上でリン酸化されている。さらに他の実施形態では、リン酸化タウは、Ｔｈｒ−１５３、Ｔｈｒ−１８１、Ｔｈｒ−２０５��Ｔｈｒ−２３１、Ｓｅｒ−１９９、Ｓｅｒ−２０２、Ｓｅｒ−２１４、Ｓｅｒ−２３５、Ｓｅｒ−２６２、Ｓｅｒ−３５６、Ｓｅｒ−３９６、Ｓｅｒ−４２２、Ｔｙｒ１８、Ｔｙｒ２９、Ｔｙｒ１９７、Ｔｙｒ３１０、およびＴｙｒ３９４からなる群から選択される１つ以上の残基でリン酸化されている。他の実施形態では、リン酸化ＩＲＳ−１は、１つ以上のセリン、スレオニンまたはチロシン残基上でリン酸化されている。さらに他の実施形態では、リン酸化ＩＲＳ−１は、Ｐ−Ｓ３１２−ＩＲＳ−１およびＰ−ｐａｎＹ−ＩＲＳ−１からなる群から選択される１つ以上の残基でリン酸化されている。さらに他の実施形態では、生体試料は、全血、血清、血漿、尿、間質液、腹水、子宮頸部スワブ、涙、唾液、頬スワブ、皮膚、脳組織、および脳脊髄液からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、神経変性障害は、アルツハイマー病（ＡＤ）、血管疾患性認知症、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、レビー小体型認知症、神経原線維変化優位型老年期認知症、ピック病（ＰｉＤ）、嗜銀顆粒病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、他の運動ニューロン疾患、グアムパーキンソン認知症複合、ＦＴＤＰ−１７、リティコ−ボディグ病、多発性硬化症、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、およびパーキンソン病からなる群から選択される。他の実施形態では、１つ以上のバイオマーカーのレベルは、当該１つ以上のバイオマーカーのタンパク質、リン酸化タンパク質、ｍＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡレベルである。
【０００８】
本発明は、１つ以上のバイオマーカーを含む、対象の神経変性障害状態を評価するためのバイオマーカーのセットであって、セット中のバイオマーカーのレベルがアッセイされ、かつバイオマーカーレベルが少なくとも４０％の特異度で対象の神経変性障害状態を決定し、バイオマーカーのセットの少なくとも１つ以上が、タウ、リン酸化タウ、Ａβ１−４２、ＴＤＰ−４３、α−シヌクレイン、ＳＯＤ−１、ＦＵＳ、ＦＫＢＰ５１、ＩＲＳ−１、リン酸化ＩＲＳ−１、ＣＴＳＤ、ＬＡＭＰ１、ＵＢＰ、ＨＳＰ７０、ＮＳＥ、ＮＦＬ、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１およびＣＤ１７１からなる群から選択される、バイオマーカーのセットを提供する。いくつかの実施形態では、バイオマーカーレベルは、少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の特異度で、対象の神経変性障害の状態を決定する。いくつかの実施形態では、生体試料は、全血、血清、血漿、尿、間質液、腹水、子宮頸部スワブ、涙、唾液、頬スワブ、皮膚、脳脊髄液からなる群から選択される。他の実施形態では、神経変性障害は、アルツハイマー病（ＡＤ）、血管疾患性認知症、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、レビー小体型認知症、神経原線維変化優位型老年期認知症、ピック病（ＰｉＤ）、嗜銀顆粒病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、他の運動ニューロン疾患、グアムパーキンソン認知症複合、ＦＴＤＰ−１７、リティコ−ボディグ病、多発性硬化症、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、およびパーキンソン病からなる群から選択される。さらに他の実施形態では、当該方法は、試料からの小胞中のバイオマーカーのレベルをアッセイすることをさらに含む。他の実施形態では、小胞は、エキソソーム、微粒子、微小胞、ナノソーム、細胞外小胞、およびエクトソームからなる群から選択される。
【０００９】
本発明はまた、対象における神経変性障害を診断もしくは予後判定する、神経変性障害のリスクのある対象を特定する、または、神経変性障害を有する対象における治療レジメンを処方もしくは治療の利益を予測するためのキットであって、小胞に特異的に結合する１つ以上の薬剤、バイオマーカーに特異的に結合する１つ以上の薬剤、生体試料を収集および／または保持するための１つ以上の容器、ならびに使用のための指示書を含み、当該神経変性障害が変化したバイオマーカーレベルに関連し、当該バイオマーカーが、タウ、リン酸化タウ、Ａβ１−４２、ＴＤＰ−４３、α−シヌクレイン、ＳＯＤ−１、ＦＵＳ、ＦＫＢＰ５１、ＩＲＳ−１、リン酸化ＩＲＳ−１、ＣＴＳＤ、ＬＡＭＰ１、ＵＢＰ、ＨＳＰ７０、ＮＳＥ、ＮＦＬ、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１およびＣＤ１７１からなる群から選択される、キットを提供する。他の実施形態では、小胞は、エキソソーム、微粒子、微小胞、ナノソーム、細胞外小胞、およびエクトソームからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、薬剤はポリクローナルまたはモノクローナル抗体である。他の実施形態では、抗体はモノクローナルＮＣＡＭ抗体である。他の実施形態では、抗体はモノクローナル抗ヒトＮＣＡＭ抗体である。さらに他の態様では、抗体はモノクローナルＣＤ１７１抗体である。他の態様では、抗体はモノクローナル抗ヒトＣＤ１７１抗体である。他の態様では、抗体はモノクローナルＣＤ９抗体である。他の態様では、抗体はモノクローナルＣＤ６３抗体である。他の態様では、抗体はモノクローナルＣＤ８１抗体である。特定の実施形態では、エキソソームは、ニューロン由来のエキソソーム、アストロサイト由来のエキソソーム、オリゴデンドロサイト由来のエキソソーム、およびミクログリア由来のエキソソームからなる群から選択される。他の実施形態では、神経変性障害は、アルツハイマー病（ＡＤ）、血管疾患性認知症、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、レビー小体型認知症、神経原線維変化優位型老年期認知症、ピック病（ＰｉＤ）、嗜銀顆粒病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、他の運動ニューロン疾患、グアムパーキンソン認知症複合、ＦＴＤＰ−１７、リティコ−ボディグ病、多発性硬化症、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、およびパーキンソン病からなる群から選択される。さらに他の実施形態では、生体試料は、全血、血清、血漿、尿、間質液、腹水、子宮頸部スワブ、涙、唾液、頬スワブ、皮膚、脳脊髄液からなる群から選択される。さらに他の実施形態では、リン酸化タウは、１つ以上のセリン、スレオニンまたはチロシン残基上でリン酸化されている。他の実施形態では、リン酸化タウは、Ｔｈｒ−１５３、Ｔｈｒ−１８１、Ｔｈｒ−２０５、Ｔｈｒ−２３１、Ｓｅｒ−１９９、Ｓｅｒ−２０２、Ｓｅｒ−２１４、Ｓｅｒ−２３５、Ｓｅｒ−２６２、Ｓｅｒ−３５６、Ｓｅｒ−３９６、Ｓｅｒ−４２２、Ｔｙｒ１８、Ｔｙｒ２９、Ｔｙｒ１９７、Ｔｙｒ３１０、およびＴｙｒ３９４からなる群から選択される１つ以上の残基でリン酸化されている。他の実施形態では、リン酸化ＩＲＳ−１は、１つ以上のセリン、スレオニンまたはチロシン残基上でリン酸化され��いる。さらに他の実施形態では、リン酸化ＩＲＳ−１は、Ｐ−Ｓ３１２−ＩＲＳ−１およびＰ−ｐａｎＹ−ＩＲＳ−１からなる群から選択される１つ以上の残基でリン酸化されている。他の実施形態では、キットは、試料中のバイオマーカーのレベルを分析するためのコンピュータモデルまたはアルゴリズムをさらに含む。
【００１０】
本発明はまた、対象における神経変性障害を診断もしくは予後判定する、神経変性障害のリスクのある対象を特定する、または神経変性障害を有する対象における治療レジメンを処方もしくは治療の利益を予測するためのキットであって、小胞に特異的に結合する１つ以上の薬剤、バイオマーカーｍＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡを検出するための１つ以上のプローブもしくはプライマー、生体試料を収集および／または保持するための１つ以上の容器、ならびに使用のための指示書を含み、当該神経変性障害が変化したバイオマーカーレベルに関連し、当該バイオマーカーが、タウ、リン酸化タウ、Ａβ１−４２、ＴＤＰ−４３、α−シヌクレイン、ＳＯＤ−１、ＦＵＳ、ＦＫＢＰ５１、ＩＲＳ−１、リン酸化ＩＲＳ−１、ＣＴＳＤ、ＬＡＭＰ１、ＵＢＰ、ＨＳＰ７０、ＮＳＥ、ＮＦＬ、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１およびＣＤ１７１からなる群から選択されるキットを提供する。他の実施形態では、小胞は、エキソソーム、微粒子、微小胞、ナノソーム、細胞外小胞、およびエクトソームからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、薬剤はポリクローナルまたはモノクローナル抗体である。他の実施形態では、エキソソームは、ニューロン由来のエキソソーム、アストロサイト由来のエキソソーム、オリゴデンドロサイト由来のエキソソーム、およびミクログリア由来のエキソソームからなる群から選択される。さらに他の実施形態では、神経変性障害は、アルツハイマー病（ＡＤ）、血管疾患性認知症、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、レビー小体型認知症、神経原線維変化優位型老年期認知症、ピック病（ＰｉＤ）、嗜銀顆粒病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、他の運動ニューロン疾患、グアムパーキンソン認知症複合、ＦＴＤＰ−１７、リティコ−ボディグ病、多発性硬化症、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、およびパーキンソン病からなる群から選択される。さらに他の実施形態では、生体試料は、全血、血清、血漿、尿、間質液、腹水、子宮頸部スワブ、涙、唾液、頬スワブ、皮膚、脳脊髄液からなる群から選択される。他の実施形態では、リン酸化タウは、１つ以上のセリン、スレオニンまたはチロシン残基上でリン酸化されている。さらに他の実施形態では、リン酸化タウは、Ｔｈｒ−１５３、Ｔｈｒ−１８１、Ｔｈｒ−２０５、Ｔｈｒ−２３１、Ｓｅｒ−１９９、Ｓｅｒ−２０２、Ｓｅｒ−２１４、Ｓｅｒ−２３５、Ｓｅｒ−２６２、Ｓｅｒ−３５６、Ｓｅｒ−３９６、Ｓｅｒ−４２２、Ｔｙｒ１８、Ｔｙｒ２９、Ｔｙｒ１９７、Ｔｙｒ３１０、およびＴｙｒ３９４からなる群から選択される１つ以上の残基でリン酸化されている。他の実施形態では、リン酸化ＩＲＳ−１は、１つ以上のセリン、スレオニンまたはチロシン残基上でリン酸化されている。さらに他の実施形態では、リン酸化ＩＲＳ−１は、Ｐ−Ｓ３１２−ＩＲＳ−１およびＰ−ｐａｎＹ−ＩＲＳ−１からなる群から選択される１つ以上の残基でリン酸化されている。他の実施形態では、キットは、試料中のバイオマーカーのレベルを分析するためのコンピュータモデルまたはアルゴリズムをさらに含む。
【００１１】
他の実施形態では、本発明は、対象における神経変性障害を診断する方法であって、（ｉ）対象から小胞を含有する試験生体試料を得る段階、（ｉｉ）試験生体試料中の１つ以上のバイオマーカーのレベルを測定する段階、（ｉｉｉ）対照生体試料中の１つ以上のバイオマーカーの対照レベルと試験生体試料中の１つ以上のバイオマーカーのレベルを比較する段階、次いで（ｉｖ）対照生体試料と比較して、試験生体試料中の１つ以上のバイオマーカーのレベルの増加を検出することによって、対象が神経変性障害を有することを決定する段階を含み、当該１つ以上のバイオマーカーの少なくとも１つが、タウ、リン酸化タウ、Ａβ１−４２、ＴＤＰ−４３、α−シヌクレイン、ＳＯＤ−１、ＦＵＳ、ＦＫＢＰ５１、ＩＲＳ−１、リン酸化ＩＲＳ−１、ＣＴＳＤ、ＬＡＭＰ１、ＵＢＰ、ＨＳＰ７０、ＮＳＥ、ＮＦＬ、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、およびＣＤ１７１からなる群から選択される、方法を提供する。他の実施形態では、小胞は、エキソソーム、微粒子、微小胞、ナノソーム、細胞外小胞、およびエクトソームからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、エキソソームは、ニューロン由来のエキソソーム、アストロサイト由来のエキソソーム、オリゴデンドロサイト由来のエキソソーム、およびミクログリア由来のエキソソームからなる群から選択される。他の実施形態では、リン酸化タウは、１つ以上のセリン、スレオニンまたはチロシン残基上でリン酸化されている。さらに他の実施形態では、リン酸化タウは、Ｔｈｒ−１５３、Ｔｈｒ−１８１、Ｔｈｒ−２０５、Ｔｈｒ−２３１、Ｓｅｒ−１９９、Ｓｅｒ−２０２、Ｓｅｒ−２１４、Ｓｅｒ−２３５、Ｓｅｒ−２６２、Ｓｅｒ−３５６、Ｓｅｒ−３９６、Ｓｅｒ−４２２、Ｔｙｒ１８、Ｔｙｒ２９、Ｔｙｒ１９７、Ｔｙｒ３１０、およびＴｙｒ３９４からなる群から選択される１つ以上の残基でリン酸化されている。他の実施形態では、リン酸化ＩＲＳ−１は、１つ以上のセリン、スレオニンまたはチロシン残基上でリン酸化されている。さらに他の実施形態では、リン酸化ＩＲＳ−１は、Ｐ−Ｓ３１２−ＩＲＳ−１およびＰ−ｐａｎＹ−ＩＲＳ−１からなる群から選択される１つ以上の残基でリン酸化されている。さらに他の実施形態では、神経変性障害は、アルツハイマー病（ＡＤ）、血管疾患性認知症、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、レビー小体型認知症、神経原線維変化優位型老年期認知症、ピック病（ＰｉＤ）、嗜銀顆粒病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、他の運動ニューロン疾患、グアムパーキンソン認知症複合、ＦＴＤＰ−１７、リティコ−ボディグ病、多発性硬化症、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、およびパーキンソン病からなる群から選択される。さらに他の実施形態では、生体試料は、全血、血清、血漿、尿、間質液、腹水、子宮頸部スワブ、涙、唾液、頬スワブ、皮膚、脳脊髄液からなる群から選択される。他の実施形態では、リン酸化タウは、１つ以上のセリン、スレオニンまたはチロシン残基上でリン酸化されている。他の実施形態では、リン酸化ＩＲＳ−１は、１つ以上のセリン、スレオニンまたはチロシン残基上でリン酸化されている。他の実施形態では、��該方法は生体試料から小胞を単離することをさらに含む。他の実施形態では、小胞は、エキソソーム、微粒子、微小胞、ナノソーム、細胞外小胞、およびエクトソームからなる群から選択される。
【００１２】
他の実施形態では、本発明は、対象からの試料を分析する方法であって、（ｉ）対象から小胞を含む生体試料を得る段階、（ｉｉ）生体試料中の１つ以上のバイオマーカーのレベルを測定する段階、次いで（ｉｉｉ）対照生体試料中の１つ以上のバイオマーカーの対照レベルと生体試料中の１つ以上のバイオマーカーのレベルを比較する段階を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、対象は、神経変性障害を有すると診断されている、または疑われている。他の実施形態では、当該方法は、対象における神経変性障害を診断もしくは予後判定する、対象における神経変性障害のリスクを特定する、または、神経変性障害を有する、もしくは有する疑いのある対象について治療レジメンを処方もしくは治療の利益を予測することをさらに含む。特定の実施形態では、当該１つ以上のバイオマーカーの少なくとも１つは、タウ、リン酸化タウ、Ａβ１−４２、ＴＤＰ−４３、α−シヌクレイン、ＳＯＤ−１、ＦＵＳ、ＦＫＢＰ５１、ＩＲＳ−１、リン酸化ＩＲＳ−１、ＣＴＳＤ、ＬＡＭＰ１、ＵＢＰ、ＨＳＰ７０、ＮＳＥ、ＮＦＬ、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、およびＣＤ１７１からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、生体試料中の１つ以上のバイオマーカーのレベルは、対照試料中の１つ以上のバイオマーカーのレベルと比較され、生体試料の１つ以上のバイオマーカーのレベルは、対照試料と比較して上昇している。他の実施形態では、神経変性障害は、アルツハイマー病（ＡＤ）、血管疾患性認知症、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、レビー小体型認知症、神経原線維変化優位型老年期認知症、ピック病（ＰｉＤ）、嗜銀顆粒病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、他の運動ニューロン疾患、グアムパーキンソン認知症複合、ＦＴＤＰ−１７、リティコ−ボディグ病、多発性硬化症、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、およびパーキンソン病からなる群から選択される。他の実施形態では、生体試料は、全血、血清、血漿、尿、間質液、腹水、子宮頸部スワブ、涙、唾液、頬スワブ、皮膚、脳組織、および脳脊髄液からなる群から選択される。さらに他の実施形態では、リン酸化タウは、１つ以上のセリン、スレオニンまたはチロシン残基上でリン酸化されている。さらに他の実施形態では、リン酸化タウは、Ｔｈｒ−１５３、Ｔｈｒ−１８１、Ｔｈｒ−２０５、Ｔｈｒ−２３１、Ｓｅｒ−１９９、Ｓｅｒ−２０２、Ｓｅｒ−２１４、Ｓｅｒ−２３５、Ｓｅｒ−２６２、Ｓｅｒ−３５６、Ｓｅｒ−３９６、Ｓｅｒ−４２２、Ｔｙｒ１８、Ｔｙｒ２９、Ｔｙｒ１９７、Ｔｙｒ３１０、およびＴｙｒ３９４からなる群から選択される１つ以上の残基でリン酸化されている。他の実施形態では、リン酸化タウのレベルは、リン酸化タウポリヌクレオチド、リン酸化タウポリペプチド、またはリン酸化タウ活性のレベルをアッセイすることにより決定される。さらに他の実施形態では、リン酸化ＩＲＳ−１は、１つ以上のセリン、スレオニンまたはチロシン残基上でリン酸化されている。さらに他の実施形態では、リン酸化ＩＲＳ−１は、Ｐ−Ｓ３１２−ＩＲＳ−１およびＰ−ｐａｎＹ−ＩＲＳ−１からなる群から選択される１つ以上の残基でリン酸化されて��る。他の実施形態では、リン酸化ＩＲＳ−１のレベルは、リン酸化ＩＲＳ−１ポリヌクレオチド、リン酸化ＩＲＳ−１ポリペプチド、またはリン酸化ＩＲＳ−１活性のレベルをアッセイすることにより決定される。他の実施形態では、当該方法は生体試料から小胞を単離することをさらに含む。他の実施形態では、小胞は、エキソソーム、微粒子、微小胞、ナノソーム、細胞外小胞、およびエクトソームからなる群から選択される。他の実施形態では、当該方法は生体試料からエキソソームを単離することをさらに含む。特定の実施形態では、単離されたエキソソームは、ニューロン由来のエキソソーム、アストロサイト由来のエキソソーム、オリゴデンドロサイト由来のエキソソーム、およびミクログリア由来のエキソソームからなる群から選択される。他の実施形態では、当該方法は、Ｐ−Ｓ３１２−ＩＲＳ−１およびＰ−ｐａｎＹ−ＩＲＳ−１の比（Ｒまたはインスリン抵抗性指数）を決定することをさらに含む。他の実施形態では、本発明の方法はさらに、試料中の１つ以上のバイオマーカーのレベルを分析するためのコンピュータモデルまたはアルゴリズムをさらに含む。他の実施形態では、１つ以上のバイオマーカーのレベルは、当該１つ以上のバイオマーカーのタンパク質、リン酸化タンパク質、ｍＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡレベルである。
【００１３】
本発明のこれらの、および他の実施形態は、容易に、本明細書の開示に照らして当業者に想起され、全てのそのような実施形態が具体的に企図されている。
【００１４】
本発明の各々の限定は、本発明の様々な実施形態を包含しうる。従って、任意の１つの要素または要素の組み合わせを伴う本発明の各々の限定は、本発明の各態様に含まれうると考えられる。本発明は、その適用にあたり、以下詳述される構造の詳細および構成要素の配置に限られない。本発明は他の実施形態が可能であり、様々な方法で実施または具体化することができる。また、本明細書で使用される表現および用語は説明の目的のためであり、限定とみなされるべきではない。本明細書における「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「伴う（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」、およびそれらの活用形の使用は、その後に列挙される項目およびその同等物ならびに追加項目を包含することを意味する。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに指示しない限り、複数の言及を含むことに注意しなければならない。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、本明細書中に記載された、変化しうるような特定の方法論、プロトコール、細胞株、アッセイ、および薬剤に限られないということが理解されるべきである。また、本明細書で使用される用語は、本発明の特定の実施形態を説明することを意図し、添付の特許請求の範囲に記載の本発明の範囲を限定することを意図するものではないことが理解されるべきである。
【００１６】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上明らかに指示しない限り、複数への言及を含むことに注意しなければならない。従って、例えば「断片」への言及は、そのような断片の複数を含み、「抗体」への言及は、１つ以上の抗体および当業者に知られたその同等物などへの言及である。
【００１７】
特に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと、類似もしくは同等の任意の方法および材料を、本発明の実施または試験に使用することができるが、好ましい方法、装置、および材料が以下に記載されている。本明細書に引用される全ての刊行物は、本発明に関連して使用されてもよい、刊行物で報告された方法論、薬剤、およびツールを説明および開示する目的で、その全体が出典明示により本明細書に組み込まれる。本明細書において、本発明が、先行発明により上述の開示に先行する権利がないと認めるものとして解釈されるべきものはない。
【００１８】
特に指示しない限り、本発明の実施は、当技術分野の技術の範囲内で、化学、生化学、分子生物学、細胞生物学、遺伝学、免疫学および薬理学の従来の方法を採用するだろう。このような技術は、文献に十分に説明されている。例えば、Ｇｅｎｎａｒｏ，  Ａ．Ｒ．，  ｅｄ．  （１９９０）  Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  １８ｔｈ  ｅｄ．，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．；  Ｃｏｌｏｗｉｃｋ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．；  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌｓ．  Ｉ−ＩＶ  （Ｄ．Ｍ．  Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  Ｃ．Ｃ．  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，  ｅｄｓ．，  １９８６，  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）；  Ｍａｎｉａｔｉｓ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．  （１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｖｏｌｓ．  Ｉ−ＩＩＩ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；  Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｆ．  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．  （１９９９）  Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ；  Ｒｅａｍ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．  （１９９８）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：  Ａｎ  Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）；  ＰＣＲ  （Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｓｅｒｉｅｓ），  ２ｎｄ  ｅｄ．  （Ｎｅｗｔｏｎ  ＆  Ｇｒａｈａｍ  ｅｄｓ．，  １９９７，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ）を参照のこと。
【００１９】
本発明は、部分的には、エキソソームのバイオマーカーをアッセイして、例えばアルツハイマー病（ＡＤ）、多発性硬化症（ＭＳ）、および前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）を含む神経変性障害を有する、または発症する可能性のある対象を特定できるという発見に関する。
【００２０】
本発明は、部分的には、神経変性疾患（例えばアルツハイマー病）を有する対象の血液循環中に存在するニューロン由来のエキソソーム中の特定のバイオマーカーの予想外の増加の発見に基づく。本発明は、これらのバイオマーカーのエキソソームのレベルをアッセイして、神経変性疾患を有する対象における神経変性障害を診断しうることを実証する。本発明は、さらに、対象からのニューロン由来のエキソソーム中の特定のバイオマーカーの測定を用いて、神経変性疾患のその後の発症を予測しうる（例えば、神経変性障害を発症するリスクのある対象を特定しうる）ということを示す。
【００２１】
本発明は、対象の神経変性状態を評価するためのバイオマーカーのセットを提供する。本実施形態では、バイオマーカーレベルがアッセイされ、当該バイオマーカーレベルは少なくとも４０％の特異度で対象の神経変性障害状態を決定する。
【００２２】
また、本発明は、本明細書中に記載の方法における使用のための組成物を提供する。かかる組成物は、低分子化合物、抗体もしくはそれらの機能的に活性な断片を含む、ペプチドおよびタンパク質；ならびに低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、およびアンチセンス配列を含む、ポリヌクレオチドを含んでもよい。（Ｚｅｎｇ  （２００３）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １００：９７７９−９７８４；  ａｎｄ  Ｋｕｒｒｅｃｋ  （２００３）  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２７０：１６２８−１６４４を参照のこと。）
【００２３】
本発明は、さらに、対象における神経変性障害を診断もしくは予後判定する、神経変性障害のリスクのある対象を特定する、または、神経変性障害を有する対象における治療レジメンを処方もしくは治療の利益を予測するためのキットを提供する。これらの実施形態では、キットは、エキソソームに特異的に結合する１つ以上の抗体、バイオマーカーに特異的に結合する１つ以上の抗体、生体試料を収集および／または保持するための１つ以上の容器、およびキットの使用のための指示書を含む。
【００２４】
セクションの見出しは、構成上の目的のためのみに本明細書中で使用され、本明細書に記載の主題を限定するものとして決して解釈されるべきではない。
【００２５】
生体試料
本発明は、アルツハイマー病および他の神経変性障害のための、バイオマーカーならびに診断方法および予後判定方法を提供する。バイオマーカーレベルは対象から得られた生体試料において決定される。いくつかの実施形態では、本発明の生体試料は、血液から得ることができる。いくつかの実施形態では、約１−１０ｍｌの血液が対象から採血される。他の実施形態では、約１０−５０ｍｌの血液が対象から採血される。血液は、腕、脚、または中心静脈カテーテルを介してアクセス可能な血液を含む、身体の任意の適切な領域から採血できる。いくつかの実施形態では、血液は、処置または活動の後に収集される。例えば、血液は、健康診断の後に収集できる。また、収集のタイミングは、試料中に存在するエキソソームの数および／または組成を増加するように調整することができる。例えば、血液は、血管拡張を誘導する運動または処置の後に収集できる。
【００２６】
血液は、その後の技術のために、試料を保存または準備するための収集の後に、様々な成分と組み合わせることができる。例えば、いくつかの実施形態では、血液は、収集後に、抗凝固剤、細胞固定剤、プロテアーゼ阻害剤、ホスファターゼ阻害剤、タンパク質、ＤＮＡ、もしくはＲＮＡ保存剤で処理される。いくつかの実施形態では、血液は、ＥＤＴＡまたはヘパリンなどの抗凝固剤を含有する真空採取チューブを用いて静脈穿刺によって収集される。また、血液は、ヘパリンコーティングされた注射器および皮下注射針を用いて収集できる。血液はまた、細胞培養のために有用であろう成分と組み合わせることができる。例えば、いくつかの実施形態では、血液は、細胞培養培地または補充した細胞培養培地（例えば、サイトカイン）と組み合わせられる。
【００２７】
生体試料はまた、全血、血清、血漿、尿、間質液、腹水、子宮頸部スワブ、涙、唾液、頬スワブ、皮膚、脳脊髄液、または、例えば脳組織を含む他の組織を含む、当技術分野で知られた他の供給源から得ることができる。
【００２８】
小胞（エキソソーム、微粒子、微小胞、ナノソーム、細胞外小胞、およびエクトソーム）の濃縮または単離
試料は、ポジティブセレクション、ネガティブセレクション、またはポジティブセレクションおよびネガティブセレクションの組み合わせを通して、小胞について濃縮されうる。いくつかの実施形態では、小胞は直接捕捉される。他の実施形態では、血液細胞が捕捉され、小胞は残りの生体試料から収集される。いくつかの実施形態では、生体試料中で濃縮された小胞は、エキソソーム、微粒子、微小胞、ナノソーム、細胞外小胞、またはエクトソームである。いくつかの実施形態では、生体試料中で濃縮された小胞は、ニューロン由来のエキソソーム、アストロサイト由来のエキソソーム、オリゴデンドロサイト由来のエキソソーム、およびミクログリア由来のエキソソームである。
【００２９】
試料はまた、小胞の生化学的特性の差異に基づいて、小胞について濃縮されうる。例えば、試料は、抗原、核酸、代謝、遺伝子発現、またはエピジェネティックな差異に基づいて、小胞について濃縮されうる。抗原の差異に基づくいくつかの実施形態では、磁場勾配における抗体結合磁性もしくは常磁性ビーズまたはフローサイトメトリーと蛍光標識された抗体が使用される。核酸の差異に基づくいくつかの実施形態では、フローサイトメトリーが使用される。代謝の差異に基づくいくつかの実施形態では、フローサイトメトリーにより測定される色素の取り込み／排出または他のソーティング技術が使用される。遺伝子発現に基づく実施形態のいくつかでは、サイトカインとの細胞培養が使用される。試料はまた、当技術分野で知られた他の生化学的特性に基づいて、小胞について濃縮されうる。例えば、試料は、ｐＨおよび運動性に基づいて、小胞について濃縮されうる。さらに、いくつかの実施形態では、１より多くの方法が小胞についての濃縮のために使用される。他の実施形態では、試料は、抗体、リガンド、または可溶性受容体を使用して小胞について濃縮される。
【００３０】
他の実施形態では、表面マーカーが、試料中の小胞を正に濃縮するために使用される。いくつかの実施形態では、小胞は、エキソソーム、微粒子、微小胞、ナノソーム、細胞外小胞、またはエクトソームである。他の実施形態では、ＮＣＡＭ、ＣＤ１７１、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、多様なニューロンもしくはアストロサイト接着タンパク質、ミクログリアＣＤ１８／１１、またはＣＤ３  Ｔ細胞膜の細胞表面マーカーが、エキソソームについての濃縮に使用される。いくつかの実施形態では、小胞集団上で見られない細胞表面マーカーが、細胞集団を枯渇させることにより、小胞を負に濃縮するために使用される。また、フローサイトメトリーソーティングが、蛍光標識にコンジュゲートした細胞表面マーカーまたは細胞内もしくは細胞外マーカーを用いて、エキソソームについてさらに濃縮するために使用されてもよい。細胞内および細胞外のマーカーは、核染色、または小胞中に優先的に発現する細胞内もしくは細胞外タンパク質に対する抗体を含んでもよい。細胞表面マーカーは、エキソソーム上に優先的に発現される細胞表面抗原に対する抗体を含んでいてもよい（例えばＮＣＡＭ）。いくつかの実施形態では、細胞表面マーカーは、例えばＮＣＡＭまたはＣＤ１７１を含む、ニューロン由来のエキソソーム表面マーカーである。いくつかの実施形態では、モノクローナルＮＣＡＭ、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１またはＣＤ１７１抗体が、試料からエキソソームを濃縮または単離するために使用される。ある特定の態様において、ＮＣＡＭ、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１またはＣＤ１７１抗体は、ビオチン化されている。この実施形態では、ビオチン化されたＮＣＡＭまたはＣＤ１７１抗体は、ストレプトアビジン−アガロース樹脂またはビーズを用いて、その後に単離されうる抗体−エキソソーム複合体を形成しうる。他の実施形態では、ＮＣＡＭ、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１またはＣＤ１７１抗体は、モノクローナル抗ヒトＮＣＡＭ、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１またはＣＤ１７１抗体である。
【００３１】
いくつかの実施形態では、生体試料から濃縮された小胞は、その後、小胞の特定のタイプについて濃縮される。例えば、生体試料は、エキソソームについて濃縮され、次いで、濃縮されたエキソソームは、その後、ニューロン由来のエキソソームについて濃縮される。いくつかの実施形態では、生体試料は、小胞の個々の神経細胞供給源について濃縮される。ある特定の態様では、小胞の神経細胞供給源は、ミクログリア、ニューロン、またはアストロサイトである。
【００３２】
他の実施形態では、小胞は生体試料から単離または濃縮され、生体試料中に存在する小胞が薬剤に結合して小胞−薬剤複合体を形成する条件下で、生体試料を薬剤と接触させること、および小胞−薬剤複合体から小胞を単離して小胞を含有する試料を得ることを含み、ここで、試料中に存在する小胞の純度は生体試料中に存在する小胞の純度より高い。特定の実施形態では、薬剤は抗体またはレクチンである。小胞−レクチン複合体を形成するのに有用なレクチンは、米国特許出願公開第２０１２／００７７２６３号に記載されている。いくつかの実施形態では、小胞は、エキソソーム、微粒子、微小胞、ナノソーム、細胞外小胞、またはエクトソームである。いくつかの実施形態では、エキソソームは、ニューロン由来のエキソソーム、アストロサイト由来のエキソソーム、オリゴデンドロサイト由来のエキソソーム、またはミクログリア由来のエキソソームである。いくつかの実施形態では、複数の単離または濃縮段階が実施される。本実施形態の特定の態様において、第一の単離段階は血液試料からエキソソームを単離するために実施され、第二の単離段階は他のエキソソームからニューロン由来のエキソソームを単離するために実施される。他の実施形態では、小胞−薬剤複合体の小胞部分は、溶解薬剤を用いて溶解され、溶解された小胞のタンパク質レベルが分析される。いくつかの実施形態では、抗体−小胞複合体が固相上に作成される。さらに他の実施形態では、当該方法は、抗体−小胞複合体から小胞を放出することをさらに含む。特定の実施形態では、固相は非磁性ビーズ、磁性ビーズ、アガロースまたはセファロースである。他の実施形態では、抗体−小胞複合体を低ｐＨ３．５−１．５にさらすことによって、小胞が放出される。さらに他の実施形態では、放出された小胞は、高ｐＨ溶液を加えることによって中和される。他の実施形態では、放出された小胞は、放出された小胞を溶解溶液とインキュベートすることによって溶解される。さらに他の実施形態では、溶解溶液は、プロテアーゼおよびホスファターゼに対する阻害剤を含有する。
【００３３】
神経変性障害  本発明は、対象における神経変性障害を診断もしくは予後判定する、神経変性障害のリスクのある対象を特定する、または、神経変性障害を有する対象における治療レジメンを処方もしくは治療の利益を予測するための方法を提供する。
【００３４】
いくつかの実施形態では、前記神経変性障害は、アルツハイマー病（ＡＤ）、血管疾患性認知症、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、レビー小体型認知症、神経原線維変化優位型老年期認知症、ピック病（ＰｉＤ）、嗜銀顆粒病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、他の運動ニューロン疾患、グアムパーキンソン認知症複合、ＦＴＤＰ−１７、リティコ−ボディグ病、多発性硬化症、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、およびパーキンソン病からなる群から選択される。
【００３５】
いくつかの実施形態では、本発明は、医師が対象における１つ以上の神経変性障害を診断または予後判定することを可能にする。他の実施形態では、本発明は、医師が診断可能性としての１つ以上の神経変性疾患を除外または排除することを可能にする。さらに他の実施形態では、本発明は、医師が神経変性障害を発症するリスクのある対象を特定することを可能にする。他の実施形態では、本発明は、医師が、対象が後に神経変性障害を発症するかどうかを予測することを可能にする。さらなる実施形態では、本発明は、医師が、神経変性障害を有する対象における治療レジメンを処方もしくは治療の利益を予測することを可能にする。
【００３６】
バイオマーカー  バイオマーカーレベルは、神経変性障害（例えばアルツハイマー病）を有する、または有するリスクのある対象から得られた生体試料中においてアッセイされる。いくつかの実施形態では、バイオマーカーは、リン酸化タウ、Ａβ１−４２、ＴＤＰ−４３、α−シヌクレイン、ＳＯＤ−１、ＦＵＳ、ＦＫＢＰ５１、ＩＲＳ−１、リン酸化ＩＲＳ−１、ＣＴＳＤ、ＬＡＭＰ１、ＵＢＰ、ＨＳＰ７０、ＮＳＥ、ＮＦＬ、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１およびＣＤ１７１である。他の実施形態では、リン酸化タウは、１つ以上のセリン残基でリン酸化されている。本実施形態の特定の態様では、リン酸化タウは、Ｓｅｒ−１９９、Ｓｅｒ−２０２、Ｓｅｒ−２１４、Ｓｅｒ−２３５、Ｓｅｒ−２６２、Ｓｅｒ−３５６、Ｓｅｒ−３９６、およびＳｅｒ−４２２からなる群から選択される、少なくとも１つのセリン残基でリン酸化されている。他の実施形態では、リン酸化タウは、１つ以上のスレオニン残基上でリン酸化されている。本実施形態の特定の態様では、リン酸化タウは、Ｔｈｒ−１５３、Ｔｈｒ−１８１、Ｔｈｒ−２０５、およびＴｈｒ−２３１からなる群から選択される、少なくとも１つのスレオニン残基上でリン酸化されている。さらに他の実施形態では、リン酸化タウは、１つ以上のチロシン残基上でリン酸化されている。本実施形態の特定の態様では、リン酸化タウは、Ｔｙｒ１８、Ｔｙｒ２９、Ｔｙｒ１９７、Ｔｙｒ３１０およびＴｙｒ３９４からなる群から選択される、少なくとも１つのチロシン残基上でリン酸化されている。他の実施形態では、リン酸化タウレベルは、１つ以上のリン酸化部位に対する抗体を使用して決定またはアッセイされる。本実施形態の特定の態様では、本発明において使用される抗体は、好ましくは、以下のリン酸化部位：Ｔｈｒ−１５３、Ｔｈｒ−１８１、Ｔｈｒ−２０５、Ｔｈｒ−２３１、Ｓｅｒ−１９９、Ｓｅｒ−２０２、Ｓｅｒ−２１４、Ｓｅｒ−２３５、Ｓｅｒ−２６２、Ｓｅｒ−３５６、Ｓｅｒ−３９６、Ｓｅｒ−４２２、Ｔｙｒ１８、Ｔｙｒ２９、Ｔｙｒ１９７、Ｔｙｒ３１０およびＴｙｒ３９４の１つ以上でリン酸化されたリン酸タウに結合する。他の実施形態では、リン酸化ＩＲＳ−１はＰ−Ｓ３１２−ＩＲＳ−１またはＰ−ｐａｎＹ−ＩＲＳ−１である。
【００３７】
いくつかの実施形態では、本発明のバイオマーカーレベルは、バイオマーカーの遺伝子発現を決定することにより測定される。特定の実施形態では、表１に示される１つ以上の遺伝子の発現レベルを決定することにより、遺伝子発現の変化が測定される。特定の態様では、バイオマーカーの遺伝子発現は、ＰＣＲ、マイクロアレイまたはシーケンシングを使用して決定される。いくつかの実施形態では、バイオマーカーの発現レベルは、バイオマーカーのｍＲＮＡまたはｍｉＲＮＡのレベルを測定することによって決定される。
【００３８】
当業者は、本発明のマーカーの検出および分析のために利用可能ないくつかの方法および装置を有する。患者試験試料中のポリペプチドまたはタンパク質に関して、多くの場合イムノアッセイ装置および方法が利用される。これらの装置および方法は、目的の分析物の存在または量に関するシグナルを生成するために、様々なサンドイッチ（ｓａｎｄｗｉｃｈ）、競合、または非競合アッセイ形式で標識分子を利用することができる。さらに、バイオセンサーおよび光学的イムノアッセイなどの特定の方法および装置が、標識分子を必要とすることなく、分析物の存在および量を決定するために使用されてもよい。
【００３９】
他の方法（例えば、マーカーＲＮＡレベルの測定）は、当業者に良く知られているが、好ましくは、マーカーはイムノアッセイを使用して分析される。マーカーの存在または量は、一般的に、各マーカーに特異的な抗体を使用して、かつ特異的な結合を検出して、決定される。任意の適切なイムノアッセイ、例えば、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、競合結合アッセイ、プレーナーウェイブガイド技術などが利用されてもよい。マーカーに対する特異的な抗体の免疫学的結合は、直接的にまたは間接的に決定されうる。直接標識は、抗体に結合した蛍光もしくは発光タグ、金属、色素または放射性核種などを含む。間接標識は、アルカリホスファターゼ、西洋わさびペルオキシダーゼなどの当技術分野でよく知られた種々の酵素を含む。
【００４０】
マーカーに特異的な固定化抗体の使用も、本発明によって企図される。抗体は、磁気もしくはクロマトグラフィーマトリックス粒子、アッセイ場所（マイクロタイターウェルなど）の表面、固体基板材料片（プラスチック、ナイロン、紙など）等などの、種々の固体支持体上に固定化されうる。アッセイストリップは固体支持体上のアレイに抗体または複数の抗体をコーティングすることによって調製できる。このストリップを、試験試料中に浸漬し、次いで、洗浄および検出段階を経て迅速に処理して、着色されたスポットなどの測定可能なシグナルを生成できる。
【００４１】
複数のマーカーの分析は１つの試験試料と別々にまたは同時に行ってもよい。複数の試料の効率的な処理のために、いくつかのマーカーは１つの試験に組み合わされてもよい。さらに、当業者は、同じ個体からの複数の試料（例えば、連続した時点）を試験する価値を認識するだろう。そのような連続した試料を試験することは、経時的なマーカーレベルの変化の同定を可能にするだろう。マーカーレベルの増加または減少だけでなく、マーカーレベルの変化の非存在は、事象の開始からのおおよその時間を同定すること、救助可能な組織（ｓａｌｖａｇｅａｂｌｅ  ｔｉｓｓｕｅ）の存在および量、薬物療法の妥当性、様々な治療法の有効性、事象の重症度の同定、疾患の重症度の同定、ならびに将来の事象のリスクを含む患者の治療結果（ｏｕｔｃｏｍｅ）の同定に限定されるものではないが、これらを含む、疾患状態についての有用な情報を提供するだろう。
【００４２】
本発明で参照されるマーカーの組み合わせからなるアッセイを構築し、鑑別診断に関する関連情報を提供してもよい。そのようなパネルは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０もしくはそれ以上、または個別のマーカーを使用して構築されてもよい。単一のマーカー、またはより大きなマーカーのパネルを含むマーカーのサブセットの分析を本発明内に記載された方法において実施し、種々の臨床状況における臨床的感度または特異度を最適化することができる。Ｐ−Ｓ３１２−ＩＲＳ−１およびＰ−ｐａｎＹ−ＩＲＳ−１の比（Ｒまたはインスリン抵抗性指数）は神経変性障害のリスクまたは診断に使用されてもよい。
【００４３】
マーカーの分析は、同様に種々の物理的形式において実施されうる。例えば、マイクロタイタープレートの使用または自動化を用いて、多数の試験試料の処理を容易にすることができる。あるいは、単一試料形式を開発し、例えば、外来輸送（ａｍｂｕｌａｔｏｒｙ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ）または緊急治療室の状況において、時機を逸せずに迅速な処置および診断を容易にすることができる。特に、有用な物理形式は、複数の異なる検体の検出のための、複数の不連続な、アドレス可能な位置を有する表面を含む。かかる形式はプロテインマイクロアレイもしくは「プロテインチップ」およびキャピラリー装置を含む。
【００４４】
本発明のバイオマーカーは、神経変性障害（例えばアルツハイマー病）早期検出およびモニタリングにおいて、重要な役割を果たす。かかる障害のマーカーは典型的に、測定することができる身体試料中に見られる物質である。測定された量は、基礎障害もしくは疾患の病態生理、神経変性障害の存在もしくは非存在、または将来の神経変性障害の可能性に相関しうる。患者の状態の治療を患者が受ける際に、測定された量はまた、治療の反応性に相関するだろう。
【００４５】
いくつかの実施形態では、バイオマーカーは、免疫組織化学、免疫細胞化学、免疫蛍光、免疫沈降、ウェスタンブロッティング、およびＥＬＩＳＡをからなる群から選択される方法で測定される。
【００４６】
臨床アッセイ性能  本発明の方法は、対象における神経変性障害を診断もしくは予後判定する、神経変性障害のリスクのある対象を特定する、および／または、神経変性障害を有する対象における治療レジメンを処方もしくは治療の利益を予測するために、臨床アッセイにおいて用いられてもよい。臨床アッセイ性能は、アッセイの感度、特異度、ＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）、精度、陽性適中率（ＰＰＶ）、および陰性適中率（ＮＰＶ）を決定することによって評価できる。本明細書中に開示されているものは、対象における神経変性障害を診断もしくは予後判定する、神経変性障害のリスクのある対象を特定する、または、神経変性障害を有する対象における治療レジメンを処方もしくは治療の利益を予測するためのアッセイである。
【００４７】
アッセイの臨床性能は感度に基づいてもよい。本発明のアッセイの感度は、少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％であってもよい。アッセイの臨床性能は特異度に基づいてもよい。本発明のアッセイの特異度は、少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％であってもよい。アッセイの臨床性能はＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）に基づいてもよい。本発明のアッセイのＡＵＣは、少なくとも約０．５、０．５５、０．６、０．６５、０．７、０．７５、０．８、０．８５、０．９または０．９５であってもよい。アッセイの臨床性能は精度に基づいてもよい。本発明のアッセイの精度は、少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％であってもよい。
【００４８】
組成物  本発明の方法において有用な組成物は、神経変性障害に関連するバイオマーカーを特に認識する組成物であり、当該バイオマーカーは、リン酸化タウ、Ａβ１−４２、リン酸化ＩＲＳ、ＣＴＳＤ、ＬＡＭＰ１、ＵＢＰ、ＨＳＰ７０、ＮＳＥ、ＮＦＬ、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１およびＣＤ１７１である。いくつかの実施形態では、組成物が、少なくとも１つのタウまたはＩＲＳ−１ホスファターゼの活性を強化する。他の実施形態では、組成物が、少なくとも１つのタウまたはＩＲＳ−１キナーゼの活性を減少させる。さらに他の実施形態では、組成物は、ペプチド、核酸、抗体および低分子からなる群から選択される。
【００４９】
特定の実施形態では、本発明は、神経変性障害に関連するバイオマーカーを特に検出する組成物に関する。本明細書の他の場所で詳述されるように、本発明は、リン酸化タウ、リン酸化ＩＲＳ−１、ＣＴＳＤ、ＬＡＭＰ１、ＵＢＰ、ＨＳＰ７０、ＮＳＥ、ＮＦＬが、ＡＤおよび他の神経変性障害のための特異的バイオマーカーであるとの知見に基づく。一実施形態では、本発明の組成物は、リン酸化タウと特異的に結合し、検出する。一実施形態では、本発明の組成物は、タウ上の１つ以上のセリン、スレオニンまたはチロシン残基でリン酸化されたタウと特異的に結合し、検出する。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、Ｓ３９６でリン酸化されたタウ（Ｓ３９６タウリン酸化）と特異的に結合する。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、Ｔ１８１でリン酸化されたタウ（Ｔ１８１タウリン酸化）と特異的に結合する。さらに他の実施形態では、本発明の組成物は、Ｔｈｒ−１５３、Ｔｈｒ−１８１、Ｔｈｒ−２０５、Ｔｈｒ−２３１、Ｓｅｒ−１９９、Ｓｅｒ−２０２、Ｓｅｒ−２１４、Ｓｅｒ−２３５、Ｓｅｒ−２６２、Ｓｅｒ−３５６、Ｓｅｒ−３９６、Ｓｅｒ−４２２、Ｔｙｒ１８、Ｔｙｒ２９、Ｔｙｒ１９７、Ｔｙｒ３１０およびＴｙｒ３９４からなる群から選択される１つ以上の残基でリン酸化されたタウと特異的に結合する。本発明の組成物は、抗体、ペプチド、低分子、核酸等を含むことができる。他の実施形態では、本発明の組成物は、リン酸化ＩＲＳ−１と特異的に結合し、検出する。一実施形態では、本発明の組成物はＰ−Ｓ３１２−ＩＲＳまたはＰ−ｐａｎＹ−ＩＲＳ−１と特異的に結合し、検出する。他の実施形態では、本発明の組成物は、ＣＴＳＤ、ＬＡＭＰ１、ＵＢＰ、ＨＳＰ７０、ＮＳＥ、ＮＦＬ、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１およびＣＤ１７１と特異的に結合し、検出する。
【００５０】
いくつかの実施形態では、組成物は抗体を含み、前記抗体は本発明のバイオマーカーまたは小胞と特異的に結合する。本明細書中で使用され、さらに以下に説明される「抗体」なる用語は、バイオマーカーまたは小胞（例えばエキソソーム）と特異的に反応する、それらの断片を含むことを意図している。抗体は従来の技術を用いて断片化することができ、全長抗体（ｗｈｏｌｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）に関して上記に記載したものと同じ方法で、フラグメントは有用性についてスクリーニングできる。例えば、Ｆ（ａｂ）２フラグメントは、ペプシンで抗体を処理することによって生成されうる。得られたＦ（ａｂ）２フラグメントをジスルフィド架橋を還元するように処理して、Ｆａｂフラグメントを産生することができる。抗原結合部位はまた、組換えＤＮＡ技術により、または無傷の（ｉｎｔａｃｔ）抗体の酵素的もしくは化学的切断により、産生されてもよい。抗原結合部位は、とりわけ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｄＡｂ、および相補性決定領域（ＣＤＲ）フラグメント、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体、二重特異性抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ダイアボディ、および、ポリペプチドに特異的抗原結合を付与するために十分な、少なくとも免疫グロブリンの部分を含有するポリペプチドを含む。特定の実施形態では、抗体は、抗体に結合し、かつ検出されうる、標識をさらに含む（例えば、標識は放射性同位体、蛍光物質、酵素または酵素の補酵素とすることができる）。
【００５１】
特定の実施形態では、本発明の抗体はモノクローナル抗体であり、かつ特定の実施形態では、本発明は、本発明のバイオマーカーまたはエキソソームに特異的に結合する新規抗体を生成するための方法を利用可能にする。例えば、バイオマーカーまたはエキソソームに特異的に結合するモノクローナル抗体を生成するための方法は、検出可能な免疫応答を刺激するのに有効な、バイオマーカーもしくはエキソソーム、またはそれらのフラグメントを含む免疫原性組成物の量をマウスへ投与すること、マウスから抗体産生細胞（例えば、脾臓由来の細胞）を得て、抗体産生ハイブリドーマを得るために、骨髄腫細胞と抗体産生細胞を融合すること、および、バイオマーカーまたはエキソソームに特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを特定するために抗体産生ハイブリドーマを試験することを含んでもよい。いったん得られると、ハイブリドーマは細胞培養で、任意に、ハイブリドーマ由来の細胞がバイオマーカーまたはエキソソームに特異的に結合するモノクローナル抗体を生成する培養条件で、増殖されうる。モノクローナル抗体は、細胞培養物から精製されてもよい。
【００５２】
抗体に関して使用される「と特異的に反応する」という用語は、当技術分野において一般に理解されるように、抗体が目的の抗原（例えばバイオマーカーまたはエキソソーム）と目的でない他の抗原の間で、十分に選択的であることを意味することを意図している。治療応用などの抗体を使用する特定の方法では、結合におけるより高い程度の特異性が望まれてもよい。モノクローナル抗体は、一般に、所望の抗原と、交差反応するポリペプチドとの間で効果的に識別する、より大きな傾向（ポリクローナル抗体と比較して）を有する。抗体：抗原相互作用の特異性に影響する１つの特徴は、抗原に対する抗体のアフィニティーである。所望の特異性は異なるアフィニティーの範囲に到達してもよいが、一般に、好ましい抗体は、約１０−６、１０−７、１０−８、１０−９またはそれ以下のアフィニティー（解離定数）を有するだろう。
【００５３】
抗体は、例えば、ニューロン由来のエキソソーム、リン酸化タウ、Ａβ１−４２、リン酸化ＩＲＳ−１、ＣＴＳＤ、ＬＡＭＰ１、ＵＢＰ、ＨＳＰ７０、ＮＳＥ、ＮＦＬ、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１およびＣＤ１７１を含む、本発明のエキソソームまたはバイオマーカーのエピトープに特異的に結合するように生成されうる。
【００５４】
また、所望の抗体を同定する目的で抗体をスクリーニングするために用いられる技術は、得られる抗体の性質に影響してもよい。種々の異なる技術は、特に望ましい抗体を同定するために、抗体抗原間の相互作用を試験するために利用できる。このような技術は、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴結合アッセイ（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ結合アッセイ、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）、サンドイッチアッセイ（例えば、常磁性ビーズシステム、ＩＧＥＮ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，  Ｉｎｃ．，  Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，  Ｍｄ．）、ウェスタンブロット、免疫沈降アッセイ、免疫細胞化学、および免疫組織化学を含む。
【００５５】
いくつかの実施形態では、本発明は、神経変性障害を治療または予防するために用いられる組成物に関する。本明細書の他の場所で詳述されるように、本発明は、タウのリン酸化は、例えばアルツハイマー病などの様々な神経変性障害の病態に関与しているという知見に基づく。従って、一実施形態では、本発明は、タウのリン酸化を防ぐ組成物を提供する。一実施形態では、前記組成物は、タウ上の１つ以上のセリン残基でのタウのリン酸化を防ぐ。他の実施形態では、前記組成物は、タウ上の１つ以上のスレオニン残基でのタウのリン酸化を防ぐ。他の実施形態では、前記組成物は、タウ上の１つ以上のチロシン残基でのタウのリン酸化を防ぐ。別の実施形態では、本発明は、タウのリン酸化を減少させる組成物を提供する。一実施形態では、前記組成物はタウ上の１つ以上のセリン、スレオニン、およびまたはチロシン残基でのタウのリン酸化を減少させる。さらに他の実施形態では、前記組成物は、Ｔｈｒ−１５３、Ｔｈｒ−１８１、Ｔｈｒ−２０５、Ｔｈｒ−２３１、Ｓｅｒ−１９９、Ｓｅｒ−２０２、Ｓｅｒ−２１４、Ｓｅｒ−２３５、Ｓｅｒ−２６２、Ｓｅｒ−３５６、Ｓｅｒ−３９６、Ｓｅｒ−４２２、Ｔｙｒ１８、Ｔｙｒ２９、Ｔｙｒ１９７、Ｔｙｒ３１０およびＴｙｒ３９４からなる群から選択される１つ以上の残基でのタウのリン酸化を減少させる。
【００５６】
いくつかの実施形態では、本発明は神経変性障害の治療または予防のために使用される組成物に関する。本明細書中の他の場所で詳述されるように、本発明は、ＩＲＳ−１のリン酸化は、例えばアルツハイマー病のような様々な神経変性障害の病態に関与しているという知見に基づく。従って、一実施形態では、本発明は、ＩＲＳ−１のリン酸化を防ぐ組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、ＩＲＳ−１のリン酸化を減少させる組成物を提供する。
【００５７】
タウまたはＩＲＳ−１のリン酸化を予防および／または減少させるために有用な組成物は、タンパク質、ペプチド、核酸、低分子等を含む。
治療方法
本発明は、対象における神経変性障害を治療する方法であって、有効量の組成物を対象に投与することを含み、当該組成物がタウおよび／またはＩＲＳ−１のリン酸化のレベルを減少させる、方法を提供する。他の実施形態では、組成物は、少なくとも１つのタウまたはＩＲＳ−１ホスファターゼの活性を高める。さらに他の実施形態では、組成物は、少なくとも１つのタウもしくはＩＲＳ−１キナーゼの活性を減少させる。他の実施形態では、組成物は、ペプチド、核酸、抗体、および低分子からなる群から選択される。他の実施形態では、本発明は、対象における神経変性障害を治療する方法であって、有効量の組成物を対象に投与することを含み、当該組成物がＣＴＳＤ、ＬＡＭＰ１またはＵＢＰのレベルを減少させる、方法を提供する。さらに他の実施形態では、本発明は、対象における神経変性障害を治療する方法であって、有効量の組成物を対象に投与することを含み、当該組成物がＨＳＰ７０のレベルを増加させる方法を提供する。他の実施形態では、本発明は、対象における神経変性障害を治療する方法であって、有効量の組成物を対象に投与することを含み、当該組成物が、リン酸化タウ、Ａβ１−４２、リン酸化ＩＲＳ−１、ＣＴＳＤ、ＬＡＭＰ１、ＵＢＰ、ＨＳＰ７０、ＮＳＥ、ＮＦＬ、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１およびＣＤ１７１を参照レベル（ｒｅｆｅｒｒｅｎｃｅ  ｌｅｖｅｌ）に正規化する、方法を提供する。
【００５８】
キット
本発明の別の態様は、対象における神経変性障害を検出またはモニタリングするためのキットを包含する。様々な構成要素を有する種々のキットが、本発明により企図されている。一般的に言うと、キットは対象における１つ以上のバイオマーカーを定量するための手段を含む。別の実施形態では、キットは生体試料を収集するための手段、生体試料中の１つ以上のバイオマーカーを定量する手段、およびキットの内容物の使用のための説明書を含む。特定の実施形態では、キットは生体試料中のエキソソームを濃縮または単離するための手段を含む。さらなる態様では、エキソソームを濃縮または単離するための手段は、生体試料からエキソソームを濃縮または単離するために必要な試薬を含む。特定の態様では、キットは、バイオマーカーの量を定量するための手段を含む。さらなる態様では、バイオマーカーの量を定量するための手段は、バイオマーカーの量を検出するために必要な試薬を含む。
【表１−１】
2020144147.tif 000002
【表１−２】
2020144147.tif 000003
【００５９】
本発明のこれら、および他の実施形態は、容易に、本明細書の開示に鑑みて当業者に想起されるだろう。
【実施例】
【００６０】
本発明は、本発明の単なる例示であるよう意図された、以下の実施例を参照することによってさらに理解されるだろう。これらの実施例は、本発明を例示するためにのみ提供される。本発明は、本発明の単一の態様の例示としてのみ意図されている例示の実施形態によって範囲は限定されない。機能的に同等である任意の方法は、本発明の範囲内である。本明細書に記載したものに加えて、本発明の種々の改変は、前述の説明から当業者に明らかになるだろう。このような改変は、添付の特許請求の範囲内に入ることが意図される。
【実施例１】
【００６１】
実施例１：アルツハイマー病を有するヒト対象におけるニューロン由来血清エキソソームのリン酸化タウおよびＡβ１−４２レベル
リン酸化タウおよびＡβ１−４２タンパク質のレベルを、以下のようにアルツハイマー病（ＡＤ）を有するヒト対象においてアッセイした。１０ミリリットルの静脈血を対照対象（ｎ＝２０）およびＡＤ対象（ｎ＝２０）から採取した。ＡＤ対象が認識力が保たれていた（ｃｏｇｎｉｔｉｖｅｌｙ  ｉｎｔａｃｔ）時点で、第一の血液試料が採取された。ＡＤ対象がおそらくＡＤが発症した後に、第二の血液試料が採取された。ＡＤの診断は標準的な臨床および検査基準によって確立された。
【００６２】
血液採取のために、１０ｍｌの静脈血を各対象から採取し、４５分間３７℃で保持し、４℃で２０分間１０００×ｇで遠心分離して、−８０℃で０．５ｍｌのアリコートでの貯蔵のための血清を得た。次に、０．５ｍｌの各血清試料を、推奨濃度の２倍のプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，  ＩＮ）ホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｈａｌｔ，  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｉｎｃ．，  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，  ＩＬ）を含有する、０．５ｍｌのカルシウムおよびマグネシウムフリーのダルベッコ平衡塩類溶液（ＤＢＳ）と混合し、室温で１５分間インキュベートした。
【００６３】
血漿のために、０．５ｍｌに０．１ｍｌのトロンボプラスチン−Ｄ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｉｎｃ．，  Ｈａｎｏｖｅｒ  Ｐａｒｋ，  ＩＬ）を加え、続いて３０分間室温でインキュベートし、５分間１５００×ｇで遠心分離を行った。次いで、推奨濃度の２．５倍のプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテルを含有する０．４ｍｌのＤＢＳを各上清に加えた。
【００６４】
これらの血清および血漿上清を２５２μｌのＥｘｏＱｕｉｃｋエキソソーム沈殿溶液（ＥＸＯＱ；Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｍｏｕｎｔａｉｎｖｉｅｗ，  ＣＡ）に完全に混合し、混合物を４℃で１時間インキュベートした。得られたエキソソーム懸濁液を４℃で３０分間１５００×ｇで遠心分離し、上清を取り除き、エキソソームの各ペレットを、神経供給源（ｎｅｕｒａｌ  ｓｏｕｒｃｅ）からのエキソソームの免疫化学的濃縮のため、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテルを含む２５０μｌのＤＢＳに再懸濁した。次に、各試料に、あらかじめＥＺ−Ｌｉｎｋ  ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ｂｉｏｔｉｎ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｉｎｃ．）でビオチン化された、２μｇのマウス抗ヒトＮＣＡＭ抗体（ＥＲＩＣ  １，  ｓｃ−１０６，  Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，  ＣＡ）を加えた。４℃で２時間後、２０μｌのストレプトアビジン−アガロース樹脂（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｉｎｃ．）を各試料に加え、続いて震盪しながら４℃で１時間インキュベートした。次いで、試料を４℃で１０分間２００ｇで遠心分離し、上清を取り除き、各ペレットをプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテルを含む２５０μｌのＥＬＩＳＡ結合バッファー（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｉｎｃ．）に再懸濁した。
【００６５】
ニューロン由来エキソソームタンパク質は、製造業者の指示書に従って、ヒト精製組換えＣＤ８１抗原（Ｏｒｉｇｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，  ＭＤ）と抗原性の検証を有するヒトＣＤ８１（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｉｎｃ．  ａｎｄ  Ｈｏｅｌｚｅｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｋａ，  Ｃｏｌｏｇｎｅ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）、ヒトＡβ１−４２、総ヒトタウおよびヒトリン酸化タウ［ｐＳ３９６］（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，  ＣＡ）、ならびにヒトリン酸化タウ［ｐＴ１８１］（Ｉｎｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，  Ｉｎｃ．，  Ａｌｐｈａｒｅｔｔａ，  ＧＡ）のためのＥＬＩＳＡキットによって定量された。
【００６６】
下記の表２に示すように、ニューロン由来血清エキソソームのリン酸化タウ（ｐＳ３９６）のレベルは、対照対象の血清エキソソームレベルと比較して、ＡＤを有する対象において有意に増加した。同様に、ＡＤを有する対象では、対照対象のレベルと比較して、血清エキソソームＡβ１−４２のレベルが有意に増加した。血清エキソソーム総タウレベルはＡＤと対照対象との間で大幅な違いはなかった。
【表２】
2020144147.tif 000004
平均値±標準偏差；＊コントロールと比較してｐ＜０．０００１、＋対応のない両側ｔ検定によるｐ＝０．０００５。
【００６７】
これらの結果は、Ａβ１−４２およびリン酸化タウのニューロン由来血清エキソソームレベルが、ＡＤを有する対象を特定するために有用であることを示した。これらの結果は、本発明の方法および組成物が、アルツハイマー病および他の神経変性障害を診断するために有用であることをさらに示した。
【００６８】
第二の一連の実験を実施して、初期アルツハイマー病（すなわち、最小認知障害、ＭＣＩ）および後期アルツハイマー病を有するヒト対象におけるリン酸化タウおよびＡβ１−４２タンパク質のレベルを決定した。１０ミリリットルの静脈血を、初期ＡＤを有する対象（ｎ＝１０）および後期ＡＤを有する対象（ｎ＝８）から採取した。血液試料は上述のように処理し、Ａβ１−４２、タウ、およびリン酸化タウに関するニューロン由来エキソソームタンパク質レベルは上述のＥＬＩＳＡキットを用いて定量した。
【００６９】
下記の表３に示すように、ニューロン由来血清エキソソームのリン酸化タウ（ｐＳ３９６）レベルは、初期ＡＤおよび後期ＡＤにおいて同様であった。血清エキソソームＡβ１−４２レベルも、初期ＡＤおよび後期ＡＤにおいては同様であった。
【表３】
2020144147.tif 000005
値は平均値±標準偏差
【００７０】
これらの結果は、Ａβ１−４２およびリン酸化タウのニューロン由来血清エキソソームレベルが、初期ＡＤまたは後期ＡＤを有する対象を特定するために有用であることをと示した。これらの結果は、本発明の方法および組成物が、アルツハイマー病および他の神経変性障害を診断するために有用であることをさらに示した。
【実施例２】
【００７１】
実施例２：アルツハイマー病を有するヒト対象におけるニューロン由来血清エキソソームのリン酸化タウレベル
リン酸化タウタンパク質のニューロン由来のエキソソームレベルを、以下のようにアルツハイマー病（ＡＤ）を有するヒト対象においてアッセイした。血液試料をＡＤを有するヒト対象から採取し、ニューロン由来のエキソソームの濃縮後、以下のリン酸化タウタンパク質：ｐＳｅｒ−１９９タウ、ｐＳｅｒ−２０２タウ、ｐＳｅｒ−２１４タウ、ｐＳｅｒ−２３５タウ、ｐＳｅｒ−２６２タウ、ｐＳｅｒ−３５６タウ、ｐＳｅｒ−４２２タウ、ｐＴｈｒ−１５３タウ、ｐＴｈｒ−１８１タウ、ｐＴｈｒ−２０５タウ、またはｐＴｈｒ−２３１タウについて試料をアッセイすることを除き、上記実施例１に記載のように処理した。
【００７２】
ニューロン由来のエキソソームのリン酸化タウレベルは、対照レベルと比較して有意に増加した。これらの結果は、リン酸化タウのニューロン由来血清エキソソームレベルが、ＡＤを有する対象を特定するために有用であることを示す。これらの結果は、本発明の方法および組成物が、アルツハイマー病および他の神経変性障害を診断するために有用であることをさらに示す。
【実施例３】
【００７３】
実施例３：多発性硬化症を有するヒト対象におけるニューロン由来血清エキソソームのタンパク質レベル
リン酸化タウタンパク質のレベルを、以下のように多発性硬化症（ＭＳ）を有するヒト対象においてアッセイした。血液試料をＭＳを有するヒト対象から採取し、ニューロン由来のエキソソームの濃縮後、以下のエキソソームタンパク質：ｐＳｅｒ−１９９タウ、ｐＳｅｒ−２０２タウ、ｐＳｅｒ−２１４タウ、ｐＳｅｒ−２３５タウ、ｐＳｅｒ−２６２タウ、ｐＳｅｒ−３５６タウ、ｐＳｅｒ−３９６タウ、ｐＳｅｒ−４２２タウ、ｐＴｈｒ−１５３タウ、ｐＴｈｒ−１８１タウ、ｐＴｈｒ−２０５タウ、またはｐＴｈｒ−２３１タウについて試料をアッセイすることを除き、上記実施例１に記載のように処理した。
【００７４】
ニューロン由来のエキソソームのリン酸化タウレベルは、対照レベルと比較して有意に増加した。これらの結果は、リン酸化タウのニューロン由来血清エキソソームレベルが、ＭＳを有する対象を特定するために有用であることを示す。これらの結果は、本発明の方法および組成物が、多発硬化症および他の神経変性障害を診断するために有用であることをさらに示す。
【実施例４】
【００７５】
実施例４：前頭側頭型認知症を有するヒト対象におけるニューロン由来血清エキソソームタンパク質レベル
リン酸化タウタンパク質のレベルを、以下のように前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）を有するヒト対象においてアッセイした。血液試料をＦＴＤを有するヒト対象から採取し、ニューロン由来のエキソソーム濃縮後、以下のエキソソームタンパク質：ｐＳｅｒ−１９９タウ、ｐＳｅｒ−２０２タウ、ｐＳｅｒ−２１４タウ、ｐＳｅｒ−２３５タウ、ｐＳｅｒ−２６２タウ、ｐＳｅｒ−３５６タウ、ｐＳｅｒ−３９６タウ、ｐＳｅｒ−４２２タウ、ｐＴｈｒ−１５３タウ、ｐＴｈｒ−１８１タウ、ｐＴｈｒ−２０５タウ、またはｐＴｈｒ−２３１タウについて試料をアッセイすることを除き、上記実施例１に記載のように処理した。
【００７６】
ニューロン由来のエキソソームリン酸化タウレベルは、対照レベルと比較して有意に増加した。これらの結果は、リン酸化タウのニューロン由来血清エキソソームレベルが、ＦＴＤを有する対象を特定するために有用であることを示す。これらの結果は、本発明の方法および組成物が、前頭側頭型認知症および他の神経変性障害を診断するために有用であることをさらに示す。
【実施例５】
【００７７】
実施例５：ニューロン由来血清エキソソームのタンパク質レベルはヒト対象におけるアルツハイマー病を予測する
リン酸化タウタンパク質のニューロン由来エキソソームレベルを、アルツハイマー病（ＡＤ）を予測する（例えば、アルツハイマー病を発症するリスクのある対象を特定する）ために、以下のようにヒト対象においてアッセイした。血液試料を、ＡＤの診断前（例えばＡＤの発症前）のヒト対象、およびアルツハイマー病の診断後（例えば、顕性認知症を発症した後）のヒト対象から採取した。血液試料を、ニューロン由来のエキソソームの濃縮後、以下のエキソソームタンパク質：ｐＳｅｒ−１９９タウ、ｐＳｅｒ−２０２タウ、ｐＳｅｒ−２１４タウ、ｐＳｅｒ−２３５タウ、ｐＳｅｒ−２６２タウ、ｐＳｅｒ−３５６タウ、ｐＳｅｒ−３９６タウ、ｐＳｅｒ−４２２タウ、ｐＴｈｒ−１５３タウ、ｐＴｈｒ−１８１タウ、ｐＴｈｒ−２０５タウ、またはｐＴｈｒ−２３１タウについて試料をアッセイすることを除き、上記実施例１に記載のように処理した。
【００７８】
ニューロン由来のエキソソームリン酸化タウレベルは、ＡＤ診断の前後に採取された血液試料において、対照レベルと比較して有意に増加した（すなわち、ＡＤ発症前と顕性認知症を発症した後の、増加したニューロン由来のエキソソームリン酸化タウレベル）。これらの結果は、リン酸化タウのニューロン由来血清エキソソームレベルが、対象がＡＤを発症するかどうかを予測するために有用であることを示す。これらの結果は、本発明の方法および組成物が、アルツハイマー病および他の神経変性障害を予後判定および診断するために有用であることをさらに示す。
【実施例６】
【００７９】
実施例６：ニューロン由来血清エキソソームのリン酸化タウ、総タウおよびＡβ１−４２レベルはアルツハイマー病を有するヒト対象において増加する
総タウ、リン酸化タウ（Ｐ−Ｔ１８１およびＰ−Ｓ３９６）、およびＡβ１−４２タンパク質レベルのエキソソームレベルを、アルツハイマー病を有するヒト対象において以下のようにアッセイした。１０ミリリットルの静脈血を、ＡＤを有する対象（ｎ＝５７）および対照対象（ｎ＝５７）から採取した。上記実施例１に記載したように、血液試料を処理し、エキソソームを単離した。
【００８０】
エキソソームタンパク質は、製造業者の指示書に従って、ヒトＡβ１−４２、ヒト総タウ、およびヒトＰ−Ｓ３９６−タウ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，  ＣＡ）、ヒトＰ−Ｔ１８１（Ｉｎｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｕｊｉｒｅｂｉｏ  ＵＳ，  Ｉｎｃ．，  Ａｌｐｈａｒｅｔｔａ，  ＧＡ）、ならびにヒト精製組換えＣＤ８１抗原（Ｏｒｉｇｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，  ＭＤ）を用いたＣＤ８１抗原標準曲線の検証を有するヒトＣＤ８１（Ｈｏｅｌｚｅｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｋａ−Ｃｕｓａｂｉｏ，  Ｃｏｌｏｇｎｅ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）について、ＥＬＩＳＡキットによって定量された。
【００８１】
個別の判別分類分析（ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｎｔ  ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒ  ａｎａｌｙｓｅｓ）を実施して、対照対象とＡＤ対象を比較するために、最良単純線形モデルを定義した。２判別分析は、すべての変数を考慮し、段階的に行われた。最終的なモデルは、エンターのための３．８４およびリムーブのための２．７１の最小部分Ｆの変数のみ保持した。事前確率は、すべての群について等しいと考えられた。フィッシャー関数係数および群内の分散が計算された。受信者動作特性（ＲＯＣ）解析をエリアの標準誤差のためのノンパラメトリックな分布の仮定の下に行い、対照対象からＡＤ対象を識別するためのモデルの性能を決定した。識別およびＲＯＣ解析はＳＰＳＳ  ｖ２１．０  （ＩＢＭ）で行われた。
【００８２】
下記の表４に示すように、ニューロン由来血清エキソソームの総タウ、Ｐ−Ｔ１８１−タウ、Ｐ−Ｓ３９６−タウ、およびＡβ１−４２レベルは、対照対象の血清エキソソームレベルと比較して、ＡＤを有する対象において有意に増加した。
【表４】
2020144147.tif 000006
平均値±標準偏差；＊コントロールと比較してｐ＜０．０００１、＋対応のないｔ検定によるｐ＝０．０００５。
【００８３】
段階的判別分析は、０．２２９のＷｉｌｋｓのラムダおよび１１９の正確なＦ（ｐ＜０．００１）を生成する、総タウではなく、ＰＴ１８１−タウ、ＰＳ３９６−タウおよびＡβ１−４２を徐々に組み込むモデルをもたらした。最終的なモデルは正しく９６．４％のＡＤ患者を分類した。ＲＯＣ解析からの最終的なモデルの曲線下面積（ＡＵＣ）は、０．９９９であり、個々のタンパク質についての個々のＡＵＣ値は、Ｐ−Ｔ１８１−タウ、ＰＳ３９６−タウ、Ａβ１−４２、総タウについて、それぞれ、０．９９１、０．９８８、０．９８７および０．７３１であった。
【００８４】
これらの結果は、総タウ、Ｐ−Ｔ１８１−タウ、Ｐ−Ｓ３９６−タウおよびＡβ１−４２のニューロン由来血清エキソソームレベルが、アルツハイマー病を有する対象において増加し、アルツハイマー病を有する対象を特定するために有用であることを示した。これらの結果は、さらに、本発明のアッセイおよび方法が、アルツハイマー病を有する対象を正しく分類することを示した。これらの結果は、さらに、本発明の方法および組成物が、アルツハイマー病および他の神経変性障害を診断するために有用であることを示した。
【実施例７】
【００８５】
実施例７：ニューロン由来血清エキソソームのリン酸化タウ、総タウおよびＡβ１−４２タンパク質は、前頭側頭型疾患を有するヒト対象において増加する
総タウ、リン酸化タウ（Ｐ−Ｔ１８１およびＰ−Ｓ３９６）、およびＡβ１−４２タンパク質レベルのエキソソームレベルを、前頭側頭型疾患（ＦＴＤ）を有するヒト対象において、以下のようにアッセイした。１０ミリリットルの静脈血を、ＦＴＤを有する対象（ｎ＝１６）および対照対象（ｎ＝１６）から採取した。上記実施例１に記載したように、血液試料を処理し、エキソソームを単離した。
【００８６】
エキソソームタンパク質は、製造業者の指示書に従って、ヒトＡβ１−４２、ヒト総タウ、およびヒトＰ−Ｓ３９６−タウ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，  ＣＡ）、ヒトＰ−Ｔ１８１（Ｉｎｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｕｊｉｒｅｂｉｏ  ＵＳ，  Ｉｎｃ．，  Ａｌｐｈａｒｅｔｔａ，  ＧＡ）、ならびにヒト精製組換えＣＤ８１抗原（Ｏｒｉｇｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，  ＭＤ）を用いたＣＤ８１抗原標準曲線の検証を有するヒトＣＤ８１（Ｈｏｅｌｚｅｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｋａ−Ｃｕｓａｂｉｏ，  Ｃｏｌｏｇｎｅ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）について、ＥＬＩＳＡキットによって定量された。
【００８７】
個別の判別分類分析を実施して、対照対象とＦＴＤ対象を比較するために、最良単純線形モデルを定義した。２判別分析は、すべての変数を考慮し、段階的に行われた。最終的なモデルは、エンターのための３．８４およびリムーブのための２．７１の最小部分Ｆの変数のみ保持した。事前確率は、すべての群について等しいと考えられた。フィッシャー関数係数および群内の分散が計算された。受信者動作特性（ＲＯＣ）解析をエリアの標準誤差のためのノンパラメトリックな分布の仮定の下に行い、対照対象からＦＴＤ対象を識別するためのモデルの性能を決定した。識別およびＲＯＣ解析はＳＰＳＳ  ｖ２１．０  （ＩＢＭ）で行われた。
【００８８】
下記の表５に示すように、ニューロン由来血清エキソソームＰ−Ｔ１８１−タウ、およびＡβ１−４２レベルは、対照対象の血清エキソソームレベルと比較して、ＦＴＤを有する対象において有意に増加した。
【表５】
2020144147.tif 000007
平均値±標準偏差；＊コントロールと比較して対応のないｔ検定によるｐ＜０．０００１。
【００８９】
段階的判別分析において、ＰＴ１８１−タウは、０．３２４のＷｉｌｋｓのラムダ値および６２．５の正確なＦ（ｐ＜０．００１）を達成した。最終的なモデルでは、エキソソームＰ−Ｔ１８１−タウは対照対象と比較して８７．５％のＦＴＤ患者を正しく分類した（７５％のＦＴＤおよび１００％の対照）。ＲＯＣ解析からの最終的なモデルでは、ＡＵＣは、Ｐ−Ｔ１８１−タウについて０．９９２およびＡβ１−４２について０．９６９であった。
【００９０】
これらの結果は、Ｐ−Ｔ１８１−タウ、およびＡβ１−４２のニューロン由来血清エキソソームレベルが前頭側頭型疾患を有する対象において増加し、前頭側頭型疾患を有する対象を特定するために有用であることを示した。これらの結果は、本発明のアッセイおよび方法が、前頭側頭型疾患を有する対象を正しく分類することをさらに示した。これらの結果は、本発明の方法および組成物が、前頭側頭型疾患および他の神経変性障害を診断するために有用であることをさらに示した。
【実施例８】
【００９１】
実施例８：ニューロン由来血清エキソソームのリン酸化タウおよびＡβ１−４２レベルはヒト対象におけるアルツハイマー病の発症を予測する
総タウ、リン酸化タウ（Ｐ−Ｔ１８１およびＰ−Ｓ３９６）、およびＡβ１−４２タンパク質レベルのエキソソームレベルを、以下のようにヒト対象においてアッセイした。１０ミリリットルの静脈血を、対象（ｎ＝２４）から、２時点：一点目は、対象のアルツハイマー病の診断前の１年から１０年（アルツハイマー前臨床期、ＡＰ）、二点目はアルツハイマー病（ＡＤ）の最初の診断の時に採取した。静脈血試料は対照対象（ｎ＝２４）からも採取された。上記実施例１に記載したように、血液試料を処理し、エキソソームを単離した。
【００９２】
エキソソームタンパク質は、製造業者の指示書に従って、ヒトＡβ１−４２、ヒト総タウ、およびヒトＰ−Ｓ３９６−タウ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，  ＣＡ）、ヒトＰ−Ｔ１８１（Ｉｎｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｕｊｉｒｅｂｉｏ  ＵＳ，  Ｉｎｃ．，  Ａｌｐｈａｒｅｔｔａ，  ＧＡ）、ならびにヒト精製組換えＣＤ８１抗原（Ｏｒｉｇｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，  ＭＤ）を用いたＣＤ８１抗原標準曲線の検証を有するヒトＣＤ８１（Ｈｏｅｌｚｅｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｋａ−Ｃｕｓａｂｉｏ，  Ｃｏｌｏｇｎｅ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）について、ＥＬＩＳＡキットによって定量された。
【００９３】
下記の表６に示すように、ニューロン由来血清エキソソームのＰ−Ｔ１８１−タウ、Ｐ−Ｓ３９６−タウ、およびＡβ１−４２レベルは、対照対象の血清エキソソームレベルと比較して、ＡＤを有する対象において有意に増加した。さらに、ニューロン由来血清エキソソームのＰ−Ｔ１８１−タウ、およびＰ−Ｓ３９６−タウレベルは、早ければＡＤの臨床診断の１０年前に、対象において有意に増加した（表６参照）。Ａβ１−４２にとって、ＡＤとＡＰの両群の平均レベルは対照対象レベルよりも有意に高く、平均ＡＤレベルも平均ＡＰ群のレベルより有意に高かった（表６参照）。
【表６】
2020144147.tif 000008
平均値±標準誤差；＊コントロールと比較して対応のあるｔ検定によるｐ＜０．０００１；＃ＡＤと比較して対応のあるｔ検定によるｐ＜０．０００１。
【００９４】
これらの結果は、Ｐ−Ｔ１８１−タウ、Ｐ−Ｓ３９６−タウ、およびＡβ１−４２のニューロン由来血清エキソソームレベルが、アルツハイマー病を有する対象において増加し、アルツハイマー病を有する対象を特定するために有用であることを示した。これらの結果はまた、Ｐ−Ｔ１８１−タウ、Ｐ−Ｓ３９６−タウ、およびＡβ１−４２のニューロン由来血清エキソソームレベルが、早ければアルツハイマー病の臨床診断の１０年前に対象において増加することを示した。これらの結果は、さらに、本発明のアッセイおよび方法が、神経変性障害（例えば、アルツハイマー病）のリスクのある対象を特定するために有用であることを示した。さらに、これらの結果は、本発明のアッセイおよび方法が、アルツハイマー病の進行を早期に検出および決定するために有用でありうることを示した。これらの結果は、さらに、本発明の方法および組成物が、アルツハイマー病および他の神経変性障害を診断するために有用であることを示した。
【実施例９】
【００９５】
実施例９：神経変性障害または糖尿病を有するヒト対象におけるニューロン由来血漿エキソソームの総ＩＲＳ−１およびリン酸化ＩＲＳ−１レベル
総ＩＲＳ−１およびリン酸化ＩＲＳ−１（Ｐ−Ｓ３１２−ＩＲＳ−１およびＰ−ｐａｎＹ−ＩＲＳ−１）タンパク質レベルのエキソソームレベルを、以下のようにヒト対象においてアッセイした。３０ミリリットルの静脈血を、ＡＤを有する２６対象、２型糖尿病（ＤＭ２）を有する２０対象、ＦＴＤを有する１６対象、および適合対照対象から採取した。血液試料を室温で１０分間インキュベートし、１５００ｇで１５分間遠心分離した。血漿を吸引し、アリコートで−８０℃で保存した。
【００９６】
０．５ｍｌの血漿を０．１５ｍｌのトロンボプラスチン−Ｄ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｉｎｃ．，  Ｈａｎｏｖｅｒ  Ｐａｒｋ，  ＩＬ）と１時間室温でインキュベートし、続いて、提案された終濃度の３倍のプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，  ＩＮ）およびホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｈａｌｔ，  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｉｎｃ．，  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，  ＩＬ）を含む０．３５ｍｌのカルシウムおよびマグネシウムフリーのダルベッコ平衡塩類溶液（ＤＢＳ−２）を加えた。１５００ｇで２０分間遠心分離した後、上清を２５２μｌのＥｘｏＱｕｉｃｋエキソソーム沈殿溶液（ＥＸＯＱ；Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｍｏｕｎｔａｉｎｖｉｅｗ，  ＣＡ）と混合し、４℃で１時間インキュベートした。得られたエキソソームの懸濁液を１５００ｇで３０分間、４℃で遠心分離し、各ペレットを、神経供給源からのエキソソームの免疫化学的濃縮の前に、−８０℃の凍結融解後のボルテックス混合によって、阻害剤カクテルを含む２５０μｌの蒸留水に再懸濁した。
【００９７】
各試料を、５０μｌの３％ＢＳＡ（ＰＢＳ中ブロッカーＢＳＡ１０％溶液の１：３．３３希釈，  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｉｎｃ．）中の１μｇのマウス抗ヒトＣＤ１７１（Ｌ１ＣＡＭ神経結合タンパク質）ビオチン化抗体（ｃｌｏｎｅ  ５Ｇ３，  ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）と４℃で１時間インキュベートし、５０μｌの３％ＢＳＡと４℃で３０分間インキュベートした。２００ｇで１０分間、４℃で遠心分離し、上清を除去した後に、各ペレットを、１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ  ８．６）でｐＨ８．０に調整し、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤のカクテルを含有する、０．５ｍｌのＭ−ＰＥＲ哺乳類タンパク質抽出試薬（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｉｎｃ．）に再懸濁した。これらの懸濁液を３７℃で２０分間インキュベートし、ＥＬＩＳＡでの使用まで−８０℃で保存する前に１５秒間ボルテックスで懸濁した。
【００９８】
エキソソームタンパク質は、製造業者の指示書に従って、ヒトＰ−Ｓ３１２−ＩＲＳ−１（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ．，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）、ヒトＰ−ｐａｎＹ−ＩＲＳ−１（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｄａｎｖｅｒｓ，  ＭＡ）、ヒト総ＩＲＳ−１（ＡＭＳＢＩＯ，  ＬＬＣ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  ＭＡ）、ならびにヒト精製組換えＣＤ８１抗原（Ｏｒｉｇｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，  ＭＤ）を用いたＣＤ８１抗原標準曲線の検証を有するテトラスパニンエキソソームマーカーＣＤ８１（Ｈｏｅｌｚｅｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｋａ−Ｃｕｓａｂｉｏ，  Ｃｏｌｏｇｎｅ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）について、ＥＬＩＳＡキットによって定量された。各アッセイ群内のＣＤ８１のすべての測定値の平均値は１．００に設定し、各試料の相対値を使用して、回復を正規化した。Ｒ、インスリン抵抗性指数はＰ−Ｓ３１２−ＩＲＳ−１およびＰ−ｐａｎＹ−ＩＲＳ−１の比として定義された。
【００９９】
ＡＤまたはＦＴＤまたはＤＭ２を有する患者の群の平均間、およびそれぞれの患者群とそれぞれに適合対照群間の差異の統計的有意性は、解釈において、ボーンフェローニ補正（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  ＣＡ）を含む、対応のないｔ検定により決定された。個別の判別分類器分析を実施して、ＡＤ群とその対照群（ＡＣ）、ＦＴＤ群とその対照群（ＦＴＣ）、およびＤＭ２群とその対照群（ＤＣ）を比較するために、最良単純線形モデルを定義した。判別分析は、Ｗｉｌｋｓラムダ法で、段階的に行われた。各段階で、エンターのための３．８４およびリムーブのための２．７１の最小部分Ｆの変数のみ保持した。事前確率は、すべての群について等しいと考えられた。フィッシャー関数係数および群内の分散が計算された。受信者動作特性（ＲＯＣ）解析をエリアの標準誤差のためのノンパラメトリックな分布の仮定の下に行い、ＡＣからＡＤ、ＦＴＣからＦＴＤ、ＤＣからＤＭ２、ならびにＤＭ２およびＦＴＤからＡＤを識別するためのモデルの性能を決定した。識別およびＲＯＣ解析はＳＰＳＳ  ｖ２１．０  （ＩＢＭ）で行われた。ＡＤ患者におけるＣＳＦバイオマーカーと神経濃縮エキソソーム中のＩＲＳ−１タンパク質間の関係の意義を評価するために、０次ピアソンの相関と偏相関（年齢および性別の制御）を計算した。縦断的解析のために、ａＭＣＩまたは認知症の発症前後にとられたＡＤ患者のための連続値間の差異の有意性が、対応のあるｔ検定（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いて計算された。
【０１００】
下記の表７に示すように、ニューロン由来血清エキソソームのＰ−Ｓ３１２−ＩＲＳ−１レベルは、それぞれの対照の血清エキソソームレベルと比較して、ＡＤ、ＤＭ２およびＦＴＤを有する対象において有意に増加した。インスリン抵抗性指数（Ｒ）の比は、それぞれの対照と比較して、ＡＤ、ＤＭ２およびＦＴＤを有する対象において有意に増加した（表７参照）。Ｐ−ｐａｎＹ−ＩＲＳ−１について、ＡＤおよびＤＭ２群両方についての平均レベルは、対照対象よりも有意に高かった（表７参照）。
【表７】
2020144147.tif 000009
平均値±標準誤差；＊コントロールと比較して対応のあるｔ検定によるｐ＜０．０００１。
【０１０１】
ＡＤとＡＣのデータの段階的判別分析は、最初のＰ−ｐａｎＹ−ＩＲＳ−１および２つめのＰ−Ｓ３１２−ＩＲＳ−１を組み込むモデルをもたらした。最終的なモデルは、０．１０５のＷｉｌｋｓのラムダおよび２０７．９の正確なＦ（ｐ＜０．００１）を達成し、ＡＤ患者とＡＣ対照の１００％を正しく分類した。ＡＤおよびＡＣ群の分類のＲＯＣ解析では、最終的なモデルからの個々の対象スコアは、１の曲線下面積（ＡＵＣ）を達成した（漸近的な有意性（ａｓｙｍｐｔｏｔｉｃ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ）＜０．００１）。ＡＵＣ値は、総ＩＲＳ−１、Ｐ−Ｓ３１２−ＩＲＳ−１、およびＰ−ｐａｎＹ−ＩＲＳ−１について、それぞれ、０．７２２、０．８６２、０．９９９であった。ＤＣからＤＭ２を判別したデータの段階的判別分析は、第一のＰ−ｐａｎＹ−ＩＲＳ−１および第二のＰ−Ｓ３１２−ＩＲＳ−１を組み込むモデルをもたらした。最終的なモデルは、０．１６８のＷｉｌｋｓのラムダおよび９１．８の正確なＦ（ｐ＜０．００１）を達成し、ＤＭ２患者とＤＣ対象の９７．５％を正しく分類した。ＤＭ２およびＤＣ群の分類のＲＯＣ解析では、最終的なモデルからの個々の対象スコアは、１のＡＵＣを達成した。ＡＵＣ値は、Ｐ−ｐａｎＹ−ＩＲＳ−１およびＰ−Ｓ３１２−ＩＲＳ−１について、それぞれ、０．７４１（漸近的な有意性＝０．００９）、０．９９９（漸近的な有意性＜０．００１）であった。ＦＴＣからＦＴＤを判別したデータの段階的判別分析は、Ｐ−Ｓ３１２−ＩＲＳ−１を組み込むモデルをもたらした。最終的なモデルは、０．５７６のＷｉｌｋｓのラムダおよび２２．１の正確なＦ（ｐ＜０．００１）を達成し、ＦＴＤ患者とＦＴＣ対象の８４％を正しく分類した。ＦＴＤおよびＦＴＣ群の分類のＲＯＣ解析では、Ｐ−Ｓ３１２−ＩＲＳ−１は０．９２８のＡＵＣ（漸近的な有意性＜０．００１）を達成した。
【０１０２】
これらの結果は、Ｐ−Ｓ３１２−ＩＲＳ−１、Ｐ−ｐａｎＹ−ＩＲＳ−１のニューロン由来血清エキソソームレベル、およびインスリン抵抗性指数（Ｒ）の比が、ＡＤ、ＤＭ２およびＦＴＤを有する対象において増加し、ＡＤ、ＤＭ２およびＦＴＤを有する対象を特定するために有用であることを示した。さらに、これらの結果は、本発明の方法および組成物が、アルツハイマー病、糖尿病、前頭側頭型認知症および他の神経変性障害を診断するために有用であることを示した。
【実施例１０】
【０１０３】
実施例１０：ニューロン由来血清エキソソームのリン酸化ＩＲＳ−１レベルおよびインスリン抵抗性指数は、ヒト対象におけるアルツハイマー病の発症を予測する
総ＩＲＳ−１およびリン酸化ＩＲＳ−１タンパク質レベルのエキソソームレベルを、以下のようにヒト対象においてアッセイした。１０ミリリットルの静脈血を、対象（Ｎ＝２２）から、２時点：一点目は、対象のアルツハイマー病の診断前の１年から１０年（アルツハイマー前臨床期、ＡＰ）、二点目はアルツハイマー病（ＡＤ）の最初の診断の時に採取した。静脈血試料は対照対象（ｎ＝２２）からも採取された。上記実施例９に記載したように、血液試料を処理し、エキソソームを単離した。
【０１０４】
下記の表８に示すように、ニューロン由来血清エキソソームのＰ−Ｓ３１２−ＩＲＳ−１、Ｐ−ｐａｎＹ−ＩＲＳ−１およびＲは、対照対象の血清エキソソームレベルと比較して、ＡＤを有する対象において有意に増加した。さらに、ニューロン由来血清エキソソームのＰ−Ｓ３１２−ＩＲＳ−１、Ｐ−ｐａｎＹ−ＩＲＳ−１およびＲは、早ければＡＤの臨床診断の１０年前に対象において有意に増加した（表８参照）。
【表８】
2020144147.tif 000010
平均値±標準誤差；＊コントロールと比較して対応のあるｔ検定によるｐ＜０．０００１。
【０１０５】
これらの結果は、Ｐ−Ｓ３１２−ＩＲＳ−１、Ｐ−ｐａｎＹ−ＩＲＳ−１のニューロン由来血清エキソソームレベルおよびＲが、アルツハイマー病を有する対象において増加し、アルツハイマー病を有する対象を特定するために有用であることを示した。これらの結果はまた、Ｐ−Ｓ３１２−ＩＲＳ−１、Ｐ−ｐａｎＹ−ＩＲＳ−１のニューロン由来血清エキソソームレベルおよびＲが、早ければアルツハイマー病の臨床診断の１０年前に対象において増加していることを示した。これらの結果は、さらに、本発明のアッセイおよび方法が、神経変性障害（例えば、アルツハイマー病）のリスクのある対象を特定するために有用であることを示した。さらに、これらの結果は、本発明のアッセイおよび方法が、アルツハイマー病の進行を早期に検出および決定するために有用でありうることを示した。これらの結果は、さらに、本発明の方法および組成物が、アルツハイマー病および他の神経変性障害を診断するために有用であることを示した。
【実施例１１】
【０１０６】
実施例１１：神経変性障害を有するヒト対象におけるニューロン由来血漿エキソソームタンパク質レベル
カテプシンＤ（ＣＴＳＤ）、１型リソソーム関連膜タンパク質（ＬＡＭＰ１）、ユビキチン化タンパク質（ＵＢＰ）、および熱ショックタンパク質７０（ＨＳＰ７０）レベルのエキソソームレベルを、以下のようにヒト対象においてアッセイした。３０ミリリットルの静脈血を、アルツハイマー病（ＡＤ）を有する２６対象、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）を有する１６対象、および適合対照対象（アルツハイマー対照−ＡＣおよび前頭側頭型認知症対照−ＦＴＣ）から採取した。血液試料を室温で１０分間インキュベートし、１５００ｇで１５分間遠心分離した。血漿を吸引し、アリコートで−８０℃で保存した。
【０１０７】
０．５ｍｌの血漿を０．１５ｍｌのトロンボプラスチン−Ｄ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｉｎｃ．，  Ｈａｎｏｖｅｒ  Ｐａｒｋ，  ＩＬ）と１時間室温でインキュベートし、続いて、提案された終濃度の３倍のプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，  ＩＮ）ホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｈａｌｔ，  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｉｎｃ．，  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，  ＩＬ）を含む０．３５ｍｌのカルシウムおよびマグネシウムフリーのダルベッコ平衡塩類溶液（ＤＢＳ−２）を加えた。１５００ｇで２０分間遠心分離した後、上清を２５２μｌのＥｘｏＱｕｉｃｋエキソソーム沈殿溶液（ＥＸＯＱ；Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｍｏｕｎｔａｉｎｖｉｅｗ，  ＣＡ）と混合し、４℃で１時間インキュベートした。得られたエキソソームの懸濁液を１５００ｇで３０分間、４℃で遠心分離し、各ペレットを、神経源からのエキソソームの免疫化学的濃縮の前に、−８０℃の凍結融解後のボルテックス混合によって、阻害剤カクテルを含む２５０μｌの蒸留水で再懸濁した。
【０１０８】
各試料を、５０μｌの３％ＢＳＡ（ＰＢＳ中ブロッカーＢＳＡ１０％溶液の１：３．３３希釈，  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｉｎｃ．）中の１μｇのマウス抗ヒトＣＤ１７１（Ｌ１ＣＡＭ  神経結合タンパク質）ビオチン化抗体（ｃｌｏｎｅ  ５Ｇ３，  ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）と４℃で１時間インキュベートし、５０μｌの３％ＢＳＡと４℃で３０分間インキュベートした。２００ｇで１０分間、４℃で遠心分離し、上清を除去した後に、各ペレットを、１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ  ８．６）でｐＨ８．０に調製され、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤のカクテルを含有する、０．５ｍｌのＭ−ＰＥＲ哺乳類タンパク質抽出試薬（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｉｎｃ．）に再懸濁した。これら懸濁液を３７℃で２０分間インキュベートし、ＥＬＩＳＡｓでの使用まで−８０℃で保存する前に１５秒間ボルテックスで懸濁した。
【０１０９】
エキソソームタンパク質は、製造業者の指示書に従って、総ユビキチン（ＦＩＶＥｐｈｏｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）、１型リソソーム関連膜タンパク質（ＬＡＭＰ１）（ＵＳＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｓａｌｅｍ，  ＭＡ）、熱ショックタンパク質７０（ＨＳＰ７０）（Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，  ＮＹ）、カテプシンＤ（ＥＭＤ  Ｍｉｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．，  Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，  ＭＡ）、ならびにヒト精製組換えＣＤ８１抗原（Ｏｒｉｇｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，  ＭＤ）を用いたＣＤ８１抗原標準曲線の検証を有するテトラスパニンエキソソームマーカーＣＤ８１（Ｈｏｅｌｚｅｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｋａ−Ｃｕｓａｂｉｏ，  Ｃｏｌｏｇｎｅ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）について、ＥＬＩＳＡキットによって定量された。各アッセイ群内のＣＤ８１のすべての測定値の平均値は１．００に設定し、各試料の相対値を使用して、回復を正規化した。
【０１１０】
横断的患者群の群平均間と、各々の患者群とそれぞれの適合対照群間との差異の統計的有意性は、解釈において、ボーンフェローニ補正（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  ＣＡ）を含む、対応のないｔ検定により決定された。個別の判別分類器分析を実施して、ＡＤ群とその対照群（ＡＣ）、ＦＴＤ群とその対照群（ＦＴＣ）を比較するために、最良単純線形モデルを定義した。判別分析は、Ｗｉｌｋｓラムダ法で、段階的に行われた。各段階で、エンターのための３．８４およびリムーブのための２．７１の最小部分Ｆの変数のみ保持した。事前確率は、すべての群について等しいと考えられた。フィッシャー関数係数および群内の分散が計算された。受信者動作特性（ＲＯＣ）解析をエリアの標準誤差のためのノンパラメトリックな分布の仮定の下に行い、性能を決定した。縦断的解析のために、ａＭＣＩまたは認知症の発症前後にとられたＡＤ患者のための連続値間の差異の有意性が、対応のあるｔ検定（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いて計算された。
【０１１１】
下記の表９に示すように、それぞれの対照対象の血清エキソソームレベルと比較して、ＡＤを有する対象においては、ニューロン由来血清エキソソームのＣＴＳＤ、ＬＡＭＰ１およびＵＢＰタンパク質レベルは有意に増加し、ＨＳＰ７０タンパク質レベルは有意に減少した。それぞれの対照対象の血清エキソソームレベルと比較して、ＦＴＤを有する対象においては、ニューロン由来血清エキソソームのＣＴＳＤタンパク質は有意に増加し、ＨＳＰ７０タンパク質レベルは有意に減少した（表９参照）。
【表９】
2020144147.tif 000011
平均値±標準誤差；＊コントロールと比較して対応のあるｔ検定によるｐ＜０．０００５。
【０１１２】
ＡＤとＡＣのデータの段階的判別分析は、ＬＡＭＰ−１ではなく、ＣＴＳＤ、次にＵＢＰ、最終的にＨＳＰ−７０を組み込むモデルをもたらした。ＡＤ対ＡＣのＲＯＣ曲線は、ＡＤ患者の１００％の正しい分類をする最終的なモデルから、ＣＴＳＤおよび複合スコア両方について、１．０の曲線下面積を示した。同様のＲＯＣ解析はＦＴＤ対ＦＴＣ対照の１００％、ＡＤ対ＦＴＤの９５．８％を正しく分類した。
【０１１３】
これらの結果は、ＡＤを有する対象において、ＣＴＳＤ、ＬＡＭＰ１、およびＵＢＰタンパク質レベルのニューロン由来血清エキソソームレベルが増加し、ＨＳＰ７０タンパク質レベルが減少し、かつＡＤを有する対象を特定するために有用であることを示した。また、これらの結果は、ＦＴＤを有する対象において、ＣＴＳＤのニューロン由来血清エキソソームレベルが増加し、ＨＳＰ７０タンパク質レベルが減少し、かつＦＴＤを有する対象を特定するために有用であることを実証した。これらの結果は、さらに、本発明の方法および組成物が、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症、および他の神経変性障害を診断するために有用であることを示した。
【実施例１２】
【０１１４】
実施例１２：ニューロン由来血清エキソソームタンパク質レベルはヒト対象におけるアルツハイマー病の発症を予測する
カテプシンＤ（ＣＴＳＤ）、１型リソソーム関連膜タンパク質（ＬＡＭＰ１）、ユビキチン化タンパク質（ＵＢＰ）および熱ショックタンパク質（ＨＳＰ７０）レベルのエキソソームレベルを、以下のようにヒト対象においてアッセイした。１０ミリリットルの静脈血を、対象（ｎ＝２０）から、２時点：一点目は、対象のアルツハイマー病の診断前の１年から１０年（アルツハイマー前臨床期、ＡＰ）、二点目はアルツハイマー病（ＡＤ）の最初の診断の時に採取した。静脈血試料は対照対象（ｎ＝２０）からも採取された。上記実施例１１に記載したように、血液試料を処理し、エキソソームを単離した。
【０１１５】
下記の表１０に示すように、対照対象の血清エキソソームレベルと比較して、ＡＤを有する対象においては、ニューロン由来血清エキソソームのＣＴＳＤ、ＬＡＭＰ１、およびＵＢＰは有意に増加し、ＨＳＰ７０タンパク質レベルは有意に減少した。さらに、早ければＡＤの臨床診断の１０年前に、対象において、ニューロン由来血清エキソソームのＣＴＳＤ、ＬＡＭＰ１、およびＵＢＰは有意に増加し、ＨＳＰ７０タンパク質レベルは有意に減少した（表１０参照）。
【表１０】
2020144147.tif 000012
平均値±標準誤差；＊コントロールと比較して対応のあるｔ検定によるｐ＜０．０００３。
【０１１６】
これらの結果は、アルツハイマー病を有する対象において、ＣＴＳＤ、ＬＡＭＰ−１、およびＵＢＰのニューロン由来血清エキソソームタンパク質レベルが増加し、ＨＳＰ７０が減少し、かつアルツハイマー病を有する対象を特定するために有用であることを示した。これらの結果はまた、早ければアルツハイマー病の臨床診断前１０年に、対象において、ＣＴＳＤ、ＬＡＭＰ−１、およびＵＢＰのニューロン由来血清エキソソームレベルが増加し、ＨＳＰ７０が減少することを示した。これらの結果は、さらに、本発明のアッセイおよび方法が、神経変性障害（例えば、アルツハイマー病）のリスクのある対象を特定するために有用であることを示した。さらに、これらの結果は、本発明のアッセイおよび方法が、アルツハイマー病の進行を早期に検出および決定するために有用でありうることを示した。これらの結果は、さらに、本発明の方法および組成物が、アルツハイマー病および他の神経変性障害を診断するために有用であることを示した。
【実施例１３】
【０１１７】
実施例１３：神経変性障害を有するヒト対象におけるニューロン由来血漿エキソソームタンパク質レベル
ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）およびニューロフィラメント軽鎖（ＮＦＬ）レベルのエキソソームレベルを、以下のようにヒト対象においてアッセイした。３０ミリリットルの静脈血を、アルツハイマー病（ＡＤ）を有する２０対象、および適合対照対象（アルツハイマー対照−ＡＣ）から採取した。血液試料を室温で１０分間インキュベートし、１５００ｇで１５分間遠心分離した。血漿を吸引し、アリコートで−８０℃で保存した。
【０１１８】
０．５ｍｌの血漿を０．１５ｍｌのトロンボプラスチン−Ｄ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｉｎｃ．，  Ｈａｎｏｖｅｒ  Ｐａｒｋ，  ＩＬ）と１時間室温でインキュベートし、続いて、提案された終濃度の３倍のプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，  ＩＮ）およびホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｈａｌｔ，  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｉｎｃ．，  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，  ＩＬ）を含む０．３５ｍｌのカルシウムおよびマグネシウムフリーのダルベッコ平衡塩類溶液（ＤＢＳ−２）を加えた。１５００ｇで２０分間遠心分離した後、上清を２５２μｌのＥｘｏＱｕｉｃｋエキソソーム沈殿溶液（ＥＸＯＱ；Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｍｏｕｎｔａｉｎｖｉｅｗ，  ＣＡ）と混合し、４℃で１時間インキュベートした。得られたエキソソームの懸濁液を１５００ｇで３０分間、４℃で遠心分離し、各ペレットを、神経供給源からのエキソソームの免疫化学的濃縮の前に、−８０℃の凍結融解後のボルテックス混合によって、阻害剤カクテルを含む２５０μｌの蒸留水で再懸濁した。
【０１１９】
各試料を、５０μｌの３％ＢＳＡ（ＰＢＳ中ブロッカーＢＳＡ１０％溶液の１：３．３３希釈，  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｉｎｃ．）中の１μｇのマウス抗ヒトＣＤ１７１（Ｌ１ＣＡＭ  神経結合タンパク質）ビオチン化抗体（ｃｌｏｎｅ  ５Ｇ３，  ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）と４℃で１時間インキュベートし、５０μｌの３％ＢＳＡと４℃で３０分間インキュベートした。２００ｇで１０分間、４℃で遠心分離し、上清を除去した後に、各ペレットを、１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ  ８．６）でｐＨ８．０に調整し、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテルを含有する、０．５ｍｌのＭ−ＰＥＲ哺乳類タンパク質抽出リージェント（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｉｎｃ．）に再懸濁した。これら懸濁液を３７℃で２０分間インキュベートし、ＥＬＩＳＡでの使用まで−８０℃で保存する前に１５秒間ボルテックスで懸濁した。
【０１２０】
エキソソームタンパク質は、製造業者の指示書に従って、総ニューロン特異的エノラーゼ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｓｔ．  Ｐａｕｌ，  ＭＮ）、ニューロフィラメント軽鎖タンパク質（ＮＦＬ）（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，  Ｗａｌｔｈａｍ，  ＭＡ）、ならびにヒト精製組換えＣＤ８１抗原（Ｏｒｉｇｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，  ＭＤ）を用いたＣＤ８１抗原標準曲線の検証を有するテトラスパニンエキソソームマーカーＣＤ８１（Ｈｏｅｌｚｅｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｋａ−Ｃｕｓａｂｉｏ，  Ｃｏｌｏｇｎｅ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）について、ＥＬＩＳＡキットによって定量された。各アッセイ群内のＣＤ８１のすべての測定値の平均値は１．００に設定し、各試料の相対値を使用して、回復を正規化した。
【０１２１】
横断的患者群の群平均間と、各々の患者群とそれぞれの適合対照群間との差異の統計的有意性は、解釈において、ボーンフェローニ補正（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  ＣＡ）を含む、対応のないｔ検定により決定された。個別の判別分類器分析を実施して、ＡＤ群とその対照群（ＡＣ）を比較するために、最良単純線形モデルを定義した。判別分析は、Ｗｉｌｋｓラムダ法で、段階的に行われた。各段階で、エンターのための３．８４およびリムーブのための２．７１の最小部分Ｆの変数のみ保持した。事前確率は、すべての群について等しいと考えられた。フィッシャー関数係数および群内の分散が計算された。受信者動作特性（ＲＯＣ）解析をエリアの標準誤差のためのノンパラメトリックな分布の仮定の下に行い、性能を決定した。
【０１２２】
下記の表１１に示すように、それぞれの対照対象の血清エキソソームレベルと比較して、ＡＤを有する対象において、ニューロン由来血清エキソソームのＮＳＥおよびＮＦＬタンパク質レベルが有意に増加した（表１１参照）。
【表１１】
2020144147.tif 000013
平均値±標準誤差；＊コントロールと比較して対応のあるｔ検定によるｐ＜０．０００１。
【０１２３】
これらの結果は、ＮＳＥおよびＮＦＬタンパク質レベルのニューロン由来血清エキソソームレベルがＡＤを有する対象において増加し、ＡＤを有する対象を特定するために有用であることを示した。これらの結果は、さらに、本発明の方法および組成物が、アルツハイマー病および他の神経変性障害を診断するために有用であることを示した。
【０１２４】
本明細書に示され記載されたものに加え、本発明の種々の改変が、前述の説明から当業者に明らかになるであろう。このような改変は、添付の特許請求の範囲内に入ることが意図される。
【０１２５】
本明細書に引用された全ての参考文献は、その全体が出典明示により本明細書に組み込まれる。
【手続補正書】
【提出日】令和2年6月24日(2020.6.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）対象からエキソソームを含む生体試料を得る段階、（ｉｉ）生体試料からエキソソームを単離する段階、および（ｉｉｉ）単離されたエキソソームから１つ以上のバイオマーカーを検出する段階、を含む対象からの試料を分析する方法であって、ここで１つ以上のバイオマーカーがタンパク質、リン酸化タンパク質、ｍＲＮＡ、および／またはｍｉＲＮＡであり、生体試料が全血、血清、または血漿である、方法。
【請求項２】
生体試料からエキソソームを単離する段階が：生体試料中に存在するエキソソームが薬剤に結合してエキソソーム−薬剤複合体を形成する条件下で、生体試料を薬剤と接触させる段階；およびエキソソーム−薬剤複合体からエキソソームを単離してエキソソームを含有する試料を得る段階、を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
検出が、シーケンシング技術、核酸ハイブリダイゼーション技術、核酸増幅技術、およびイムノアッセイからなる群から選択される方法を使用して実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
単離されたエキソソームが、ニューロン由来のエキソソーム、アストロサイト由来のエキソソーム、オリゴデンドロサイト由来のエキソソーム、およびミクログリア由来のエキソソームからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
薬剤が、抗体、レクチン、リガンド、可溶性受容体、結合タンパク質、またはオリゴヌクレオチドである、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
抗体が、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
抗体が、モノクローナル抗ヒトＮＣＡＭ抗体、モノクローナル抗ヒトＣＤ１７１抗体、モノクローナルＣＤ９抗体、モノクローナルＣＤ６３抗体、またはモノクローナルＣＤ８１抗体である、請求項６に記載の方法。