(57)【要約】【課題】生体組織に非侵襲的に薬剤を送達するシステムおよび方法が開示される。【解決手段】組織への薬剤の送達は、１つまたは複数の様式によるものであり得る。いくつかの実施形態では、このシステムおよび方法は、治療中の組織を非侵襲的に咬持する組織接触表面を含む薬剤キャリア本体を用いるものである。組織接触表面は、少なくとも一部が、薬剤キャリア本体の一部を形成する１つまたは複数のリザーバと流体接続した複数の突起部によって画定されるものであり得る。突起部は、空隙の内側から外に向かって伸長し前記組織接触表面で終端になっているものであり得る。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織に薬剤を送達して対象に免疫応答を誘導するシステムであって、
該薬剤が、薬剤キャリア本体、薬剤キャリアまたは薬剤塗布具に収納されており、
前記薬剤キャリア本体が、前記組織を咬持する組織接触表面を含み、
前記薬剤キャリア本体は、組織表面を貫通せず、
該システムが、
超音波を輸送刺激とし、超音波シグナルを与える手段を含み、
組織の１つまたは複数の選択した層への前記薬剤の送達を促進するか、可能にするよう設計されており、
前記薬剤の送達が、前記対象に粘膜免疫応答を誘導する、
システム。
【請求項２】
少なくとも粘膜免疫応答を誘導する前記薬剤の送達が、粘膜の上皮層または上皮層と上皮下層の中に送達される薬剤の量を制御することによるものである、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
設定する操作パラメータが、
塗布圧力、
超音波周波数、
超音波出力レベル、
超音波の波形、
超音波適用の持続時間、
超音波適用の動作周期および
超音波の方向
のうちのいずれか１つまたは複数のものを含む、請求項１又は２に記載のシステム。
【請求項４】
前記薬剤を以下の組織または組織層
粘膜；
粘膜下組織；および
粘膜血管系
のうちのいずれか１つもしくは複数のものまで、またはそれを超えて送達することができる、請求項１〜３のいずれか1項に記載のシステム。
【請求項５】
前記薬剤キャリアまたは前記薬剤キャリア本体が、治療中の組織を咬持する組織接触表面を含み、前記組織接触表面が、少なくとも部分的に複数の突起部によって確定される、請求項１〜４のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項６】
前記薬剤キャリアが、前記薬剤を保持する１つまたは複数の薬剤リザーバを含み、前記突起部が、前記薬剤キャリアの一部を形成する１つまたは複数のリザーバと流体接続している、請求項５に記載のシステム。
【請求項７】
各薬剤リザーバが、前記薬剤キャリア本体内に形成されたリザーバ容積を含む、請求項６に記載のシステム。
【請求項８】
前記薬剤キャリア本体または前記薬剤キャリアが、さらに空隙を有し、
前記突起部が、該空隙の内側から外に向かって伸長し、前記組織接触表面で終端になっている、請求項５または６に記載のシステム。
【請求項９】
前記薬剤キャリア本体または前記薬剤キャリアが、前記突起部を取り囲む末端構造物を
さらに有し、
前記末端構造物は、薬剤を収容し、
前記空隙が末端構造物によって形成されており、前記末端構造物の少なくとも一部が、前記組織接触表面で終端になっている、請求項７または８のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１０】
前記薬剤キャリア本体が、
前記組織接触表面を含む組織接触層と、
少なくとも１つの他の層と
を含む積層物を含み、
少なくとも前記組織接触層の中を少なくとも１つの穴が伸長して、前記薬剤キャリア本体内のそれぞれのマイクロチャネルの少なくとも一部を画定している、請求項１〜９のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１１】
マイクロチャネルによって、薬剤を１つの層から隣接する層まで輸送することが可能である、請求項１０に記載のシステム。
【請求項１２】
前記薬剤キャリア本体が、少なくとも一部が前記薬剤キャリア本体の中を前記組織接触表面まで伸長し組織表面への前記薬剤の輸送を可能にする１つまたは複数のマイクロチャネルを含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１３】
前記マイクロチャネルが、前記薬剤キャリア本体の中を伸長して薬剤リザーバと流体接続している、請求項１２に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的部位への薬剤の塗布に関する。好ましい形態では、本発明は、超音波エネルギー用いて、内部に複数のマイクロスケール構造物を有する薬剤キャリア本体に含まれる薬剤を非侵襲的に標的部位へ輸送する。この好ましい形態では、標的部位において、超音波導入機序により標的部位への薬剤の浸透が可能になるか促進される。
【背景技術】
【０００２】
国際公開第２００７／１４３７９６号には、標的組織内への分子および／または粒子の浸透を促進するために超音波を発生させる装置を用いて、標的部位に分子および／または粒子を送達する方法が開示されている。
【０００３】
国際公開第２００７／１４３７９６号の装置は、医薬品またはインクなどの分子および／または粒子を装填した導電性ポリマーゲル材料を含むものである。導電性ポリマーゲルに電場をかけると、ポリマーゲルマトリックス内で実質的に結合した分子または粒子が放出され、これらの分子または粒子は最終的に、超音波によりそのポリマーゲルを通って標的組織表面まで輸送される。標的組織表面では、超音波導入機序によって分子および／または粒子の組織内への浸透が可能になるか促進される。
【０００４】
この送達機序に関連する問題点の１つに、例えば水分の喪失によって、ポリマーゲルの構造が時間の経過とともに分解し、それにより、超音波による分子および／または粒子の伝播が減少し得るという点がある。さらに、ゲルは超音波の伝達性に乏しく、超音波導入過程の効果を減少させる。さらに、少量の分子および／または粒子を装填したポリマーゲルを塗布具に適切に装填することは時間がかかり、簡単なことではない。
【０００５】
上に挙げた問題点を踏まえ、標的組織に薬剤を送達するための改善された装置および機序を追求する。
【０００６】
本明細書で任意の先行技術に言及する場合、それは、その先行技術が、オーストラリアをはじめとする管轄国に共通の一般的知識の一部をなすこと、またはその先行技術が、他の先行技術と関連性があるか組み合わさったものであると当業者により合理的に確認、理解および認識されることが予想され得ることを認めるものでも何らかの形でこれを示唆するものでもなく、またそのように解釈されるべきでもない。
【発明の概要】
【０００７】
本開示は、生体組織に薬剤を非侵襲的に送達する薬剤キャリアを提供する。組織への薬剤の送達は、１つまたは複数の様式によるものであり得る。送達の様式は、薬剤キャリアを通った薬剤の輸送を引き起こす輸送刺激（１つまたは複数）を特徴とするものであり得る。好ましい形態では、輸送刺激はほかにも、薬剤の組織内への浸透を促進するか、可能にする。好ましい実施形態は、輸送刺激として超音波のみを用いる。
【０００８】
刺激は、それがなければ低い速度または少ない深度（またはその両方）で組織内に拡散する薬剤の組織内への浸透を、とりわけ薬剤を組織内に移動させる速度または深度（またはその両方）を増大させることによって促進し得る。あるいは、刺激は、それがなければ組織内に移動することができないか、組織内にほとんど拡散しない薬剤の組織内への浸透を、とりわけ薬剤の組織内への移動を可能にすることによって可能にするか、実現し得る。
【０００９】
好ましい実施形態では、薬剤キャリアは、中に薬剤を保持するよう設計された薬剤キャリア本体を含む。薬剤キャリア本体は、治療中の組織を咬持する組織接触表面を有し、ここでは、輸送刺激を加えると、薬剤が薬剤キャリア本体を通って組織接触表面まで輸送される。
【００１０】
送達する薬剤は、１つもしくは複数の分子もしくは粒子または任意に組み合わせた１つもしくは複数の分子と粒子を含み得る。薬剤は流体であっても、または例えば水、油、エマルション、ゲルなどの液状媒体に溶解、懸濁もしくは分散させることによって液状媒体中に保持されてもよい。少数ではあるが例を挙げれば、薬剤は、タンパク質（アミノ酸、ペプチド、ポリペプチドを含む）、ワクチン、核酸、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ナノ粒子または分子機械を含み得る。好ましい実施形態では、薬剤は医薬品または医薬組成物である。医薬品または医薬組成物の１つもしくは複数の活性医薬成分は、特に限定されないが、合成化合物；天然化合物；または生物製剤のうちのいずれか１つであり得る。医薬品または医薬組成物を生体組織に送達する目的は、任意の所望の臨床的理由であり得、疾患、病態もしくは障害の治療、治癒もしくは緩和；特定の疾患、病態もしくは障害の１つもしくは複数の症状の軽減、改善もしくは解消；１つもしくは複数の疾患、病態もしくは障害またはその症状の発現の予防または遅延；疾患、病態もしくは障害または身体の構造もしくは任意の機能に影響を及ぼすことを目的とする薬剤の診断がこれに含まれる。他の実施形態では、薬剤は、洗浄、美化、魅力の増進または身体の外観の改変などの美容目的に使用する薬剤であり得る。薬剤はこのほか、ヒトまたは機械が認知可能な材料、例えばインクなどを作製するのに使用するマーカー物質であり得る。その他の種類の薬剤も使用し得る。
【００１１】
輸送刺激は、薬剤をキャリアを通って組織接触表面まで移動させる駆動力となるほか、組織接触表面から組織内への薬剤の浸透を促進し、かつ／または可能にし得る。
【００１２】
いくつかの実施形態では、組織は、粘膜、皮膚および歯を含めた任意のヒトまたは動物生体組織であり得る。好ましくは、組織は眼組織または口腔粘膜である。いくつかの実施形態では、組織は任意の植物組織である。
【００１３】
一態様では、治療中の組織を非侵襲的に咬持する組織接触表面を含む薬剤キャリア本体が提供され、組織接触表面は、少なくとも一部が複数の突起部によって画定される。突起部は、薬剤キャリア本体の一部を形成する１つまたは複数のリザーバと流体接続し得る。各薬剤リザーバは、薬剤キャリア本体内部に形成された空隙を含み得る。突起部は、空隙の内側から外に向かって伸長し、前記組織接触表面で終端になり得る。空隙は末端構造物によって形成されているものであり得、前記末端構造物の少なくとも一部は組織接触表面で終端になり得る。
【００１４】
いくつかの実施形態では、末端構造物は突起部と同じ表面で終端になる。他の実施形態では、組織接触表面を画定する前記突起部の少なくとも一部は、空隙から外に向かって末端構造物を超えて伸長している。いくつかの実施形態では、突起部は、ある平面で終端になり得、末端構造物は、突起部が末端構造物を超えて伸長するように、その平面に達する前で終端になり得る。
【００１５】
薬剤キャリア本体は、少なくとも一部が薬剤キャリア本体の中を組織接触表面まで伸長し組織表面への薬剤の輸送を可能にする１つまたは複数のマイクロチャネルを含み得る。マイクロチャネルは、薬剤キャリア本体の中を伸長して薬剤リザーバと流体接続し得る。
【００１６】
上記の態様の薬剤キャリア本体は、組織接触表面を含む組織接触層と、少なくとも１つのそれ以外の層とを含む、積層物を含み得る。組織接触層は、その中を伸長し本体の少な
くとも一部のマイクロチャネルを画定する穴を有するのが好ましい。いくつかの実施形態では、複数の層が、その内部に形成された穴を有し、ある層から隣の層への薬剤の輸送を可能にする。複数の層のうちの１つの層に形成された穴は、複数の層の複数の穴が協同してマイクロチャネルを形成するように、隣接する層の穴と一直線に配置されているのが好ましい。いくつかの実施形態では、最初の層から組織接触層まで穴の直径が減少し、穴の数が増大する。マイクロチャネルは、その長さに沿って変化する断面積を有し得る。
【００１７】
いくつかの実施形態では、薬剤を貯蔵するリザーバは、少なくとも一部が（任意選択で全部が）薬剤キャリア本体内に形成されている。
【００１８】
マイクロチャネルおよび／または薬剤リザーバ（１つまたは複数）および／または突起部は、薬剤キャリア本体内の内部露出表面によって画定される。これらの内部露出表面は、所定の親水性、疎水性および／または導電性を有するよう設計されているのが好ましい。この場合、少なくとも一部の内部露出表面を改変または処理して、その親水性、疎水性および／または導電性を設定し得る。
【００１９】
薬剤キャリア本体は、薬剤キャリア本体および／またはリザーバ（１つまたは複数）に薬剤を装填することを可能にする入口を含み得る。
【００２０】
薬剤キャリア本体は、輸送刺激を発生させるよう作動可能な刺激発生装置をさらに含み得る。刺激発生装置は、好ましくは超音波振動子を含む。
【００２１】
いくつかの実施形態では、薬剤キャリアは、本明細書に記載される任意の種類の薬剤キャリア本体を機械的に支持するよう設計された収納部を含むのが好ましい。収納部は、薬剤塗布装置に取り付けるよう設計された取付構造を含み得る。取付構造は、薬剤キャリアを取り換えることができるように、薬剤キャリアを選択的に薬剤塗布装置に取り付け、薬剤塗布装置から取り外すことを可能にするものが好ましい。
【００２２】
薬剤キャリア収納部はこのほか、薬剤キャリア本体を収容するためにその中に形成されたくぼみをはじめとする取付形状を含み得る。いくつかの実施形態では、薬剤キャリア本体を取り換えることができるように、薬剤キャリア本体を選択的にくぼみまたは取付形状に取り付けるか、取り外すことができる。
【００２３】
薬剤キャリアは、薬剤キャリア本体および／またはリザーバ（１つまたは複数）に薬剤を装填することを可能にする入口を含み得る。
【００２４】
薬剤キャリアは、輸送刺激を発生させるよう作動可能な刺激発生装置をさらに含み得る。刺激発生装置は、好ましくは超音波振動子を含む。刺激発生装置の少なくとも一部は、薬剤キャリア本体の一部として形成され得る。
【００２５】
好ましい実施形態では、薬剤キャリアまたは薬剤キャリア本体は、薬剤塗布装置の一部として１回使用するのに適合した消耗品塗布具チップである。
【００２６】
本開示の別の態様では、本明細書に記載される薬剤キャリアおよび／または薬剤キャリア本体を含む、非侵襲性の薬剤塗布装置が提供される。
【００２７】
薬剤キャリアまたは薬剤キャリア本体は、薬剤塗布装置の手持操作を容易にするハンドルユニットと直接的または間接的に連結し得る。ハンドルユニットは、薬剤キャリアおよび／または薬剤キャリア本体の相補的な取付構造と協同するよう設計された取付構造を含むのが好ましい。
【００２８】
ハンドルユニットは、取り付けられた薬剤キャリアおよび／または薬剤キャリア本体に伝達する超音波を発生させる超音波発振器を含み得る。
【００２９】
薬剤キャリアは、好ましくは、１回の使用に適合した消耗品塗布具チップである。
【００３０】
薬剤キャリアは、治療中の組織を非侵襲的に咬持する組織接触表面を含み、組織接触表面が少なくとも部分的に複数の突起部によって画定される、薬剤キャリア本体を含むのが好ましい。
【００３１】
薬剤キャリアは、前記薬剤を保持する１つまたは複数の薬剤リザーバを含み得るものであり、ここでは、前記突起部は、薬剤キャリアの一部を形成する１つまたは複数のリザーバと流体接続している。各薬剤リザーバは、一部（または全部が）が、薬剤キャリア本体内に形成された空隙を含み得る。
【００３２】
本明細書にはこのほか、本明細書に記載される薬剤キャリアから薬剤を投薬する方法が開示される。この方法は、薬剤キャリア内に薬剤を保持することを含み、前記薬剤キャリアは固い薬剤キャリア本体を含む。この方法は、薬剤キャリア本体の組織接触表面で生体組織の組織表面を咬持することをさらに含み得る。この方法は、少なくとも１つの輸送刺激を加えて、薬剤を薬剤キャリア本体を通って組織表面まで輸送することによって、薬剤キャリアから組織表面に薬剤を投薬することをさらに含み得る。
【００３３】
いくつかの形態では、この方法は、薬剤キャリアを介して組織に輸送刺激を加えて、生体組織への薬剤の浸透を促進するか、可能にすることをさらに含む。
【００３４】
薬剤キャリア内に薬剤を保持することは、少なくとも一部の薬剤をキャリア本体内に保持することを含み得る。
【００３５】
好ましい実施形態では、薬剤キャリア本体は、組織接触表面の複数の突起部を終端とする。この場合、薬剤キャリア本体の組織接触表面で生体組織の組織表面を咬持することは、生体組織の組織表面を薬剤キャリア本体の突起部で咬持することを含む。このような咬持操作は、突起部によって生体組織の層を機械的に貫通することを一切含まないのが好ましい。
【００３６】
本開示の別の態様では、既に記載した薬剤キャリア、薬剤キャリア本体または薬剤塗布装置から薬剤を投薬する方法が提供され、この方法は、薬剤キャリアの組織接触表面と組織表面とを接触させること；および薬剤キャリア本体から組織表面および標的組織内に薬剤を投薬することを含む。
【００３７】
上記のいずれかの方法のいくつかの実施形態では、薬剤を投薬する段階は、超音波を発生させて薬剤を組織接触表面まで輸送することを含む。この方法は、超音波を薬剤キャリアを通って組織に伝播させることを含むのがさらに好ましい。これにより、超音波導入法によって薬剤を組織を通過させて送達するのを容易にする。
【００３８】
上記のいずれかの方法のいくつかの実施形態では、薬剤を投薬する段階は、薬剤キャリア本体に電圧を加えて組織接触表面に薬剤を輸送することを含み得る。電圧はこのほか、イオン導入法による組織内へのおよび組織を通過する薬剤の輸送をもたらし得る。この方法は、電流を薬剤キャリアを通って組織に伝播させることを含むのがさらに好ましい。
【００３９】
本開示のさらに別の態様では、本明細書に記載される薬剤キャリア、薬剤キャリア本体
または薬剤塗布装置から薬剤を投薬する方法が提供される。この方法は、薬剤キャリア本体の組織接触表面と組織表面とを接触させること；および薬剤キャリアから組織表面に薬剤を投薬することを含む。薬剤を投薬する段階は、超音波を発生させて組織接触表面への薬剤の輸送を引き起こすか、容易にすることを含むのが好ましい。この方法は、超音波導入法により組織表面に超音波を当てて、非侵襲的に組織内へのおよび組織を通過する薬剤の浸透を引き起こすか、容易にすることを含み得る。
【００４０】
この方法は、超音波を薬剤キャリアまたは薬剤キャリア本体を通って組織に伝播させることをさらに含む。
【００４１】
別の態様では、本開示は、本明細書に記載される薬剤キャリア、薬剤キャリア本体または薬剤塗布装置のうちのいずれか１つの中に薬剤を装填する方法を提供する。この方法は、薬剤キャリア本体を薬剤に曝露して、リザーバまたは前記リザーバと流体接続したマイクロチャネルの両方のうちのいずれかに前記薬剤を充填することを可能にすること含む。
【００４２】
この方法は、薬剤キャリアまたは薬剤キャリア本体に陰圧を加えて、マイクロチャネルまたはマイクロチャネルと流体接続した薬剤リザーバの中に薬剤を吸い込むことを含み得る。この方法は、薬剤キャリアまたは薬剤キャリア本体に陽圧を加えて、マイクロチャネルまたはマイクロチャネルと流体接続した薬剤リザーバの中に薬剤を注入することを含み得る。
【００４３】
マイクロチャネルまたは薬剤リザーバに薬剤を充填する段階は、薬剤キャリアまたは薬剤キャリア本体に超音波エネルギーを加えて、薬剤キャリアまたは薬剤キャリア本体の中に薬剤を吸い込むことを含み得る。
【００４４】
いくつかの実施形態では、薬剤キャリアが薬剤と接触したときの毛管力によって、薬剤キャリア本体の空隙および／またはマイクロチャネルを装填する。
【００４５】
本発明の実施形態は、粘膜（結膜、頬粘膜および口唇粘膜を含む）、角膜および眼球の外膜などの繊細な組織に薬剤を非侵襲的に送達するのに用いるのが有利であり得る。
【００４６】
第一の態様では、本発明は、組織に薬剤を送達する方法であって、超音波を輸送刺激とし、本明細書に記載される態様または実施形態のうちのいずれか１つの薬剤キャリア、薬剤キャリア本体または薬剤塗布具を用いて前記薬剤を塗布すること；および上記の組織内の選択した深度への前記薬剤の送達を促進するか、引き起こす塗布の操作パラメータを設定することを含む、方法を提供する。設定する操作パラメータは（特に限定されないが）
塗布圧力；
超音波周波数；
超音波出力レベル；
超音波の波形；
超音波適用の持続時間；
超音波適用の動作周期；および
超音波の方向
のうちのいずれか１つまたは複数のものを含み得る。
【００４７】
操作パラメータは、選択した量の薬剤が組織内の選択した深度に送達されるよう選択するのが好ましい。当業者であれば、対象の臨床試験を含めた実験的試験によって、特定の種類の組織への薬剤塗布および特定の薬剤キャリア設計の使用によって所望の免疫応答をもたらすのに必要な至適操作パラメータを決定することが可能であることを理解するであろう。
【００４８】
この方法は、以下の組織または組織層のうちのいずれか１つもしくは複数のものまで、またはそれを超えて薬剤を送達することを含み得る：
粘膜；
上皮
上皮下組織
粘膜；
粘膜下組織
粘膜血管系
角膜；
角膜上皮
ボーマン膜
角膜実質
角膜内皮
結膜；
テノン膜；
上強膜：
強膜；
脈絡膜；
脈絡膜毛細血管板；
ブルッフ膜；
網膜色素上皮；
神経網膜；
網膜血管；
内境界膜；
硝子体；
表皮；および
真皮。
【００４９】
本発明の別の態様では、対象の組織内の選択した深度範囲に薬剤を送達する方法であって、
超音波を輸送刺激とし、薬剤キャリア本体、薬剤キャリアまたは薬剤塗布具を用いて前記薬剤に超音波を当てる段階であって；薬剤キャリア本体が、組織を咬持する組織接触表面を含む、段階；および
組織内の選択した深度への前記薬剤の送達を促進するか、可能にするように薬剤塗布具の操作パラメータを設定する段階
を含み、
薬剤の送達が対象に免疫応答を誘導する、
方法が提供される。
【００５０】
本発明の別の態様では、対象の組織の１つまたは複数の選択した層に薬剤を送達する方法であって、
超音波を輸送刺激とし、薬剤キャリア本体、薬剤キャリアまたは薬剤塗布具を用いて前記薬剤に超音波を当てる段階であって；薬剤キャリアが、組織を咬持する組織接触表面を含む、段階；および
組織の１つまたは複数の層への前記薬剤の送達を促進するか、可能にするように薬剤塗布具の操作パラメータを設定する段階
を含み、
薬剤の送達が対象に免疫応答を誘導する、
方法が提供される。
【００５１】
この方法は、本発明の以前の態様の実施形態による方法に従って実施するのが好ましい。
【００５２】
本発明のさらなる態様では、対象の組織内の選択した深度範囲に薬剤を送達するシステムであって、
薬剤キャリア本体、薬剤キャリアまた薬剤塗布具に収納されており、薬剤キャリア本体が、薬剤キャリア本体が、組織を咬持する組織接触表面を含む、薬剤；および
超音波を輸送刺激とし、薬剤に超音波シグナルを与える手段を含み；
上記の組織内の選択した深度範囲への前記薬剤の送達を促進するか、可能にするよう設計されており、
薬剤の送達が、対象に免疫応答を誘導する、
システムが提供される。
【００５３】
本発明のさらなる態様では、対象の組織の１つまたは複数の選択した層に薬剤を送達するシステムであって、
薬剤キャリア本体、薬剤キャリアまたは薬剤塗布具に収納されており、薬剤キャリア本体が、組織を咬持する組織接触表面を含む、薬剤；および
超音波を輸送刺激とし、超音波シグナルを与える手段を含み；
組織の１つまたは複数の層への前記薬剤の送達を促進するか、可能にするよう設計されており、
薬剤の送達が、対象に免疫応答を誘導する、
システムが提供される。
【００５４】
本発明の別の態様では、対象に免疫応答を誘導する方法であって、
超音波を輸送刺激とし、薬剤キャリア本体、薬剤キャリアまたは薬剤塗布具に収納された薬剤に超音波を当てる段階であって；薬剤キャリア本体が、組織を咬持する組織接触表面を含む、段階；および
組織内の選択した深度範囲への前記薬剤の送達を促進するか、可能にするように薬剤塗布具の操作パラメータを設定する段階
を含み、
薬剤の送達が、対象に免疫応答を誘導する、
方法が提供される。
【００５５】
本発明の別の態様では、対象に免疫応答を誘導する方法であって、
超音波を輸送刺激とし、薬剤キャリア本体、薬剤キャリアまたは薬剤塗布具に収納された薬剤に超音波を当てる段階であって；薬剤キャリアが、組織を咬持する組織接触表面を含む、段階；および
組織の１つまたは複数の選択した層への前記薬剤の送達を促進するか、可能にするように薬剤塗布具の操作パラメータを設定する段階
を含み、
薬剤の送達が、対象に免疫応答を誘導する、
方法が提供される。
【００５６】
本発明の別の態様では、対象に免疫応答を誘導するのに使用する薬剤が提供され、ここでは、薬剤が薬剤キャリア本体、薬剤キャリアまたは薬剤塗布具に収納されており、薬剤キャリア本体が組織を咬持する組織接触表面を含み；薬剤が組織内の選択した深度範囲に送達される。
【００５７】
本発明の別の態様では、対象に免疫応答を誘導するのに使用する薬剤が提供され、ここ
では、薬剤が薬剤キャリア本体、薬剤キャリアまたは薬剤塗布具に収納されており、薬剤キャリアが組織を咬持する組織接触表面を含み；薬剤が組織の１つまたは複数の選択した層に送達される。
【００５８】
本発明のさらに別の態様では、対象に免疫応答を誘導する薬物の調製への薬剤の使用が提供され、ここでは、薬剤が薬剤キャリア本体、薬剤キャリアまたは薬剤塗布具に収納されており、薬剤キャリアが組織を咬持する組織接触表面を含み；薬剤が組織内の選択した深度範囲に送達される。
【００５９】
本発明のさらに別の態様では、対象に免疫応答を誘導する薬剤の調製への薬剤の使用が提供され、ここでは、薬剤が薬剤キャリア、薬剤キャリア本体または薬剤塗布具に収納されており、薬剤キャリアが組織を咬持する組織接触表面を含み；薬剤が組織の１つまたは複数の選択した層に送達される。
【００６０】
本発明の上記の態様の薬剤は、本明細書に記載される方法に従い、薬剤塗布具の操作パラメータを設定することによって、選択した深度範囲または組織の１つまたは複数の選択した層に送達される。
【００６１】
本発明のさらなる態様では、組織に薬剤を送達して対象に免疫応答を誘導するシステムであって、
薬剤キャリア本体、薬剤キャリアまたは薬剤塗布具に収納されており、薬剤キャリア本体が、組織を咬持する組織接触表面を含む、薬剤；および
超音波を輸送刺激とし、超音波シグナルを与える手段を含み；
組織内の選択した深度範囲への前記薬剤の送達を促進するか、可能にするよう設定されており、
薬剤の送達が、対象に免疫応答を誘導する、
システムが提供される。
【００６２】
本発明のさらなる態様では、組織に薬剤を送達して、対象に免疫応答を誘導するシステムであって、
薬剤キャリア本体、薬剤キャリアまたは薬剤塗布具に収納されており、薬剤キャリア本体が、組織を咬持する組織接触表面を含む、薬剤；および
超音波を輸送刺激とし、超音波シグナルを与える手段を含み；
組織の１つまたは複数の選択した層への前記薬剤の送達を促進するか、可能にするよう設計されており、
薬剤の送達が、対象に免疫応答を誘導する、
システムが提供される。
【００６３】
本発明の上記の態様で誘導する免疫応答は、粘膜免疫応答、全身免疫応答またはその両方であり得る。好ましくは、少なくとも粘膜免疫応答を誘導し、任意選択で全身免疫応答も誘導する。
【００６４】
本明細書に記載される本発明の各態様および各実施形態からわかるように、組織の標的送達部位は、組織の特定の層（１つまたは複数）であると定義されるか、あるいは深度範囲で定義されるものであり得る。例えば、薬剤の送達は、角膜のボーマン膜（すなわち、層）に送達されるという観点から定義され得るか、約５〜１５μＭの深度（すなわち、深度範囲）に送達されるという観点から定義され得る。当業者であれば、所与の標的層が所与の組織のどの深度にあるかがわかるであろう。本発明の上記の態様で誘導する免疫応答は、粘膜免疫応答、全身免疫応答またはその両方であり得る。好ましくは、少なくとも粘膜免疫応答を誘導し、任意選択で全身免疫応答も誘導する。本明細書に記載される薬剤塗
布具の操作パラメータを選択的に設定することによって、組織の選択した深度または１つまたは複数の層に送達される薬剤の量を制御し得ることが考慮される。例えば、本発明の本明細書の態様および以前の態様のいくつかの実施形態では、薬剤の大部分が粘膜の上皮層および上皮下層内に送達されるよう薬剤の送達を制御することによって少なくとも粘膜免疫応答を誘導する薬剤の送達が提供される。
【００６５】
したがって、本発明の本明細書の態様および以前の態様のいくつかの実施形態では、薬剤の送達が少なくとも粘膜免疫応答を誘導する。薬剤は、本明細書に記載される操作パラメータを用いて塗布してよく、粘膜に免疫応答を誘導するため、十分な用量の薬剤が少なくとも一時的に粘膜に留まり続けるのが好ましい。より具体的には、十分な用量の薬剤が、少なくとも一時的に粘膜の上皮層または上皮下層のうちの１つまたは複数のものに留まり続ける。
【００６６】
したがって、対象に少なくとも粘膜免疫応答を誘導する方法であって、
超音波を輸送刺激とし、薬剤キャリア本体、薬剤キャリアまたは薬剤塗布具内の薬剤に超音波を当てる段階であって；薬剤キャリア本体が、組織を咬持する組織接触表面を含む、段階；および
粘膜の上皮層または上皮層と上皮下層の両方への前記薬剤の送達を促進するか、可能にするように薬剤塗布具の操作パラメータを設定する段階
を含み、
薬剤の送達が、少なくとも粘膜免疫応答を誘導する、
方法が提供される。
【００６７】
本発明の別の態様では、対象に少なくとも粘膜免疫応答を誘導するのに使用する薬剤が提供され、ここでは、薬剤が薬剤キャリア本体、薬剤キャリアまたは薬剤塗布具に収納されており、薬剤キャリア本体が組織を咬持する組織接触表面を含み；薬剤が組織の上皮層内または上皮層内と上皮下層内に送達され、薬剤の送達が少なくとも粘膜免疫応答を誘導する。
【００６８】
本発明の別の態様では、対象に少なくとも粘膜免疫応答を誘導する薬物の調製への薬剤の使用が提供され、ここでは、薬剤が薬剤キャリア本体、薬剤キャリアまたは薬剤塗布具に収納されており、薬剤キャリア本体が組織を咬持する組織接触表面を含み；薬剤が組織の上皮層内または上皮層内と上皮下層内に送達され、薬剤の送達が少なくとも粘膜免疫応答を誘導する。
【００６９】
本発明の上記の態様の薬剤は、本明細書に記載される方法に従い、薬剤塗布具の操作パラメータを設定することによって、上皮組織および上皮下組織に送達される。
【００７０】
本発明のさらなる態様では、組織に薬剤を送達して対象に少なくとも粘膜免疫応答を誘導するシステムであって、
薬剤キャリア本体、薬剤キャリアまたは薬剤塗布具に収納されており、薬剤キャリア本体が、組織を咬持する組織接触表面を含む、薬剤；および
超音波を輸送刺激とし、超音波シグナルを与える手段を含み；
組織の上皮層内または上皮層内と上皮下層内への前記薬剤の送達を促進するか、可能にするよう設計されており、
薬剤の送達が、対象に少なくとも粘膜免疫応答を誘導する、
システムが提供される。
【００７１】
上皮層または上皮層と上皮下層への薬剤の送達は、少なくとも粘膜免疫応答のほか、可能性として全身免疫応答を誘導し得るのに対し、薬剤がこれらの層を通過して上皮下層の
下の層まで送達されるよう制御すれば、より確実に全身免疫応答を誘導することができる。例えば、本発明の本明細書の態様および以前の態様のいくつかの実施形態では、組織の上皮層および上皮下層内ならびにそこを通過して下層組織に送達される薬剤の量を制御することにより薬剤を送達して、全身免疫応答を誘導することが提供される。
【００７２】
したがって、対象に全身免疫応答を誘導する方法であって、
超音波を輸送刺激とし、薬剤キャリア本体、薬剤キャリアまたは薬剤塗布具内の薬剤に超音波を当てる段階であって；薬剤キャリア本体が、組織を咬持する組織接触表面を含む、段階；および
組織の上皮層および上皮下層内ならびにそこを通過して下層組織への前記薬剤の送達を促進するか、可能にするように薬剤塗布具の操作パラメータを設定する段階
を含み、
薬剤の送達が、対象に全身免疫応答を誘導する、
方法が提供される。
【００７３】
本発明の別の態様では、対象に全身免疫応答を誘導するのに使用する薬剤が提供され、ここでは、薬剤が薬剤キャリア本体、薬剤キャリアまたは薬剤塗布具に収納されており、薬剤キャリア本体が組織を咬持する組織接触表面を含み；薬剤が組織の上皮層および上皮下層内ならびにそこを通過して下層組織に送達され、薬剤の送達が、対象に全身免疫応答を誘導する。
【００７４】
本発明の別の態様では、対象に全身免疫応答を誘導する薬物の調製への薬物の使用が提供され、ここでは、薬剤が薬剤キャリア本体、薬剤キャリアまたは薬剤塗布具に収納されており、薬剤キャリア本体が組織を咬持する組織接触表面を含み；薬剤が組織の上皮層および上皮下層内ならびにそこを通過して下層組織に送達され、薬剤の送達が、対象に全身免疫応答を誘導する。
【００７５】
本発明の上記の態様の薬剤は、本明細書に記載される方法に従い、薬剤塗布具の操作パラメータを設定することによって、組織の上皮層および上皮下層内ならびにそこを通過して下層組織に送達される。
【００７６】
本発明のさらなる態様では、組織に薬剤を送達して対象に全身免疫応答を誘導するシステムであって
薬剤キャリア本体、薬剤キャリアまたは薬剤塗布具に収納されており、薬剤キャリア本体が、組織を咬持する組織接触表面を含む、薬剤；および
超音波を輸送刺激とし、超音波シグナルを与える手段を含み；
組織の上皮層および上皮下層内ならびにそこを通過して下層組織への前記薬剤の送達を促進するか、可能にするよう設計されており、
薬剤の送達が、対象に免疫応答を誘導する、
システムが提供される。
【００７７】
本発明の本明細書の態様および以前の態様のいくつかの実施形態では、薬剤は粘膜免疫応答および全身免疫応答をともに誘導する。
【００７８】
本明細書に記載される本発明の方法はほかにも、
・薬剤キャリア本体および／または薬剤キャリアに薬剤を装填する段階；
・薬剤を保持している薬剤キャリア本体または薬剤キャリアを提供する段階；
・薬剤キャリア本体または薬剤キャリアの組織接触表面を前記組織と直接的または間接的に接触させる段階；ならび
・薬剤キャリア本体または薬剤キャリアから組織表面に薬剤を投薬する段階
のうちの１つまたは複数のものを含み得るものであり、ここでは、薬剤を投薬する段階は、超音波シグナルを発生させて、組織接触表面への薬剤の輸送を引き起こすか、促進することを含むのが好ましい。
【００７９】
間接的に接触させることによって、薬剤キャリア本体と組織との間にゲルなどの物質を設置し得ることが理解されよう。
【００８０】
当業者には理解されるように、１つの選択した層への薬剤の送達が絶対的なものであるとは限らない。例えば、十分な量の薬剤（「十分な量」は、免疫応答を誘導するのに十分な量を意味することが理解されよう）が例えば上皮に送達されるよう薬剤塗布具の操作パラメータを設定し得る。ただし、最終的に上皮下組織にも少量の薬剤が入ることがある。本発明では、この少量の「溢流」が上皮組織および上皮下組織の両方に送達されることは考慮されない。むしろ、上皮組織および上皮下組織の両方に十分な量の薬剤を送達することを意図する場合、十分な量の薬剤を上記の組織に特異的に送達するため、特定の薬剤塗布具の操作パラメータを設定することが必要となる。同様に、薬剤を、例えば組織の上皮層および上皮下層組織内に送達することならびにそこを通過させて送達することによって、薬剤の一部が上記の層の一方または両方に留まり得るが、本発明の目的には、十分な量の薬剤が下層組織に送達されることになる。
【００８１】
本発明の本明細書の態様および以前の態様のいくつかの実施形態では、薬剤の送達は、粘膜から身体に入る感染症および感染病原体に対する免疫を誘導する。
【００８２】
本発明の上記の各態様および各実施形態に記載される薬剤キャリア、薬剤キャリア本体または薬剤塗布具は、本明細書に記載される態様または実施形態のうちのいずれか１つに記載されるものである。例えば、本明細書に記載されるように、薬剤キャリア本体の組織接触表面は、少なくとも一部が複数の突起部によって画定される。薬剤キャリア本体はこのほか、組織接触層と少なくとも１つの他の層とを含む積層物を含み得る。また、本発明の各態様または各実施形態の操作パラメータは、好ましくは、第一の態様に挙げたものから選択されるものであり、より好ましくは、選択した量の薬剤が組織内の選択した深度範囲または組織の１つまたは複数の選択した層に送達されるよう選択されるものである。
【００８３】
本発明の上記の各態様および各実施形態に記載される組織および組織層は、第一の態様で上に挙げたものである。薬剤を送達する組織およびその特定の層の選択は、生じさせる免疫応答に基づくものであり得る。
【００８４】
本発明の各態様および各実施形態の薬剤の送達または使用は、非侵襲性であるのが好ましい。
【００８５】
本明細書で使用される用語「ｃｏｍｐｒｉｓｅ（含む）」およびその変化形、例えば「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」、「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」および「ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ」などは、文脈上他の意味に解釈する必要がある場合を除き、さらなる事柄、添加物、成分、整数または段階を除外しないものとする。このほか、本明細書で使用される場合、単語「ｉｎｃｌｕｄｅ（含む）」、「ｆｏｒ  ｅｘａｍｐｌｅ（例えば）」またはそれと同様の表現の後に何かを明記することは、それと反対の表現が存在する場合を除き、ほかに含まれるものを限定するものではない。
【００８６】
上の段落に記載される本発明のさらなる態様および諸態様のさらなる実施形態は、例を挙げ、添付図面を参照した以下の説明から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１Ａ】組織表面に当てた一実施形態による薬剤塗布装置の模式的断面ブロック図であり、１つの例示的な薬剤塗布装置の構成要素全体を示している。
【図１Ｂ】図１Ａに示され本出願者のオーストラリア特許出願第２０１３９０１６０６号に既に記載されている実施形態の薬剤キャリア本体のさらに詳細な断面図である。
【図１Ｃ】図１Ｂのものと同じ薬剤キャリア本体で、超音波振動子を含むものを示す図である。
【図２】薬剤塗布装置のハンドルアセンブリの一実施形態およびその基本的な構成部品の断面ブロック図である。
【図３】本出願者のオーストラリア特許出願第２０１３９０１６０６号に既に記載されている種類の薬剤キャリア本体を含み、使い捨て塗布具チップの形態をとる薬剤キャリアの断面図である。理解されるように、本明細書に概略的に記載され、図８Ａ〜１０または図２３〜３０Ａのいずれか１つに例示される任意の薬剤キャリア本体を代替手段として使用し得る。
【図４Ａ】本出願者のオーストラリア特許出願第２０１３９０１６０６号に既に記載されている様々なマイクロチャネルおよび／またはリザーバ配置を有する単層薬剤キャリア本体の様々な実施形態を示す図である。
【図４Ｂ】本出願者のオーストラリア特許出願第２０１３９０１６０６号に既に記載されている様々なマイクロチャネルおよび／またはリザーバ配置を有する単層薬剤キャリア本体の様々な実施形態を示す図である。
【図４Ｃ】本出願者のオーストラリア特許出願第２０１３９０１６０６号に既に記載されている様々なマイクロチャネルおよび／またはリザーバ配置を有する単層薬剤キャリア本体の様々な実施形態を示す図である。
【図４Ｄ】単層薬剤キャリア本体の第一の表面および組織接触表面の実施形態を示す図である。
【図４Ｅ】様々なマイクチャネルおよびリザーバ配置を有する多層薬剤キャリア本体の様々な実施形態を示す図である。
【図４Ｆ】様々なマイクチャネルおよびリザーバ配置を有する多層薬剤キャリア本体の様々な実施形態を示す図である。
【図４Ｇ】様々なマイクチャネルおよびリザーバ配置を有する多層薬剤キャリア本体の様々な実施形態を示す図である。
【図４Ｈ】様々なマイクチャネルおよびリザーバ配置を有する多層薬剤キャリア本体の様々な実施形態を示す図である。
【図４Ｉ】薬剤キャリア本体の第一の層の第一の表面および第二の表面ならびに薬剤キャリア本体の第二の層の第一の表面および組織接触表面の図４Ｈに示される実施形態を示す図である。
【図４Ｊ】追加の薬剤を貯蔵し、使用過程でマイクロチャネルの薬剤が枯渇したときにこれを補充することが可能な薬剤キャリア本体の薬剤リザーバ接触層のさらなる実施形態の例を示す図である。
【図５Ａ】それぞれが様々な設計の表面接触層を有する薬剤キャリア本体の様々な実施形態を示す図である。
【図５Ｂ】それぞれが様々な設計の表面接触層を有する薬剤キャリア本体の様々な実施形態を示す図である。
【図５Ｃ】それぞれが様々な設計の表面接触層を有する薬剤キャリア本体の様々な実施形態を示す図である。
【図５Ｄ】図５Ｂおよび５Ｃに示される薬剤キャリアから伸長する２種類の例示的な種類の微小突起部を示す図である。
【図６】積層配置および薬剤充填口を有する薬剤キャリア本体の実施形態を示す図である。
【図７Ａ】積層構造を有する薬剤キャリア本体の穴およびその穴によって画定されるチャネルの実施形態を示す図である。
【図７Ｂ】積層構造を有する薬剤キャリア本体の穴およびその穴によって画定されるチャネルの実施形態を示す図である。
【図７Ｃ】微小製造工程によって作製した穴およびマイクロチャネルの拡大像である。
【図７Ｄ】微小製造工程によって作製した穴およびマイクロチャネルの拡大像である。
【図７Ｅ】微小製造工程によって作製した穴およびマイクロチャネルの拡大像である。
【図８Ａ】本発明の一態様による薬剤キャリア本体の代替的実施形態の模式図であり、それぞれその平面図および斜視図を示している。
【図８Ｂ】本発明の一態様による薬剤キャリア本体の代替的実施形態の模式図であり、それぞれその平面図および斜視図を示している。
【図８Ｃ】中に形成されたマイクロチャネルを有する薬剤キャリア本体層の代替的実施形態の模式図であり、それぞれその平面図および斜視図を示している。
【図８Ｄ】中に形成されたマイクロチャネルを有する薬剤キャリア本体層の代替的実施形態の模式図であり、それぞれその平面図および斜視図を示している。
【図８Ｅ】中に形成されたリザーバを有する薬剤キャリア本体層の代替的実施形態の模式図であり、それぞれその平面図および斜視図を示している。
【図８Ｆ】中に形成されたリザーバを有する薬剤キャリア本体層の代替的実施形態の模式図であり、それぞれその平面図および斜視図を示している。
【図８Ｇ】図８Ｅおよび８Ｆの薬剤キャリア本体層と図８Ｃおよび８Ｄの薬剤キャリア本体層とが積み重なって形成された薬剤キャリア本体の模式図であり、それぞれ未充填形態および充填形態の薬剤キャリア本体を示している。
【図８Ｈ】図８Ｅおよび８Ｆの薬剤キャリア本体層と図８Ｃおよび８Ｄの薬剤キャリア本体層とが積み重なって形成された薬剤キャリア本体の模式図であり、それぞれ未充填形態および充填形態の薬剤キャリア本体を示している。
【図９Ａ】図８Ａ〜８Ｈのいずれか１つの薬剤キャリア本体の一部の電子顕微鏡像である。
【図９Ｂ】図８Ａ〜８Ｈのいずれか１つの薬剤キャリア本体の単一の突起部の電子顕微鏡像である。
【図１０】本発明の実施形態のそれぞれの薬剤キャリア本体（またはその層）を形成するのに適した一連の４つのマスクデザインを示す図である。
【図１１Ａ】薬剤キャリア内の薬剤キャリア本体の外部の位置に薬剤リザーバを備えた様々な実施形態を示す図である。理解されるように、本明細書に概略的に記載され、図８Ａ〜１０または図２３〜３０Ａのいずれか１つに例示される任意の薬剤キャリア本体をこのような実施形態とともに使用し得る。
【図１１Ｂ】薬剤キャリア内の薬剤キャリア本体の外部の位置に薬剤リザーバを備えた様々な実施形態を示す図である。理解されるように、本明細書に概略的に記載され、図８Ａ〜１０または図２３〜３０Ａのいずれか１つに例示される任意の薬剤キャリア本体をこのような実施形態とともに使用し得る。
【図１１Ｃ】薬剤キャリア内の薬剤キャリア本体の外部の位置に薬剤リザーバを備えた様々な実施形態を示す図である。理解されるように、本明細書に概略的に記載され、図８Ａ〜１０または図２３〜３０Ａのいずれか１つに例示される任意の薬剤キャリア本体をこのような実施形態とともに使用し得る。
【図１２Ａ】本発明の実施形態に用い得る充填方法または再充填方法の様々な実施形態の諸段階を示す図である。理解されるように、本明細書に概略的に記載され、図８Ａ〜１０または図２３〜３０Ａのいずれか１つに例示される任意の薬剤キャリア本体をこのような実施形態とともに使用し得る。
【図１２Ｂ】本発明の実施形態に用い得る充填方法または再充填方法の様々な実施形態の諸段階を示す図である。理解されるように、本明細書に概略的に記載され、図８Ａ〜１０または図２３〜３０Ａのいずれか１つに例示される任意の薬剤キャリア本体をこのような実施形態とともに使用し得る。
【図１２Ｃ】本発明の実施形態に用い得る充填方法または再充填方法の様々な実施形態の諸段階を示す図である。理解されるように、本明細書に概略的に記載され、図８Ａ〜１０または図２３〜３０Ａのいずれか１つに例示される任意の薬剤キャリア本体をこのような実施形態とともに使用し得る。
【図１２Ｄ】本発明の実施形態に用い得る充填方法または再充填方法の様々な実施形態の諸段階を示す図である。理解されるように、本明細書に概略的に記載され、図８Ａ〜１０または図２３〜３０Ａのいずれか１つに例示される任意の薬剤キャリア本体をこのような実施形態とともに使用し得る。
【図１２Ｅ】本発明の実施形態に用い得る充填方法または再充填方法の様々な実施形態の諸段階を示す図である。理解されるように、本明細書に概略的に記載され、図８Ａ〜１０または図２３〜３０Ａのいずれか１つに例示される任意の薬剤キャリア本体をこのような実施形態とともに使用し得る。
【図１３Ａ】一実施形態による薬剤キャリアの分解図および断面図を示す図である。薬剤キャリアは、本明細書に概略的に記載され、図８Ａ〜１０または図２３〜３０Ａのいずれか１つに例示される任意の薬剤キャリア本体を保持するのに用いることができる。
【図１３Ｂ】一実施形態による薬剤キャリアの分解図および断面図を示す図である。薬剤キャリアは、本明細書に概略的に記載され、図８Ａ〜１０または図２３〜３０Ａのいずれか１つに例示される任意の薬剤キャリア本体を保持するのに用いることができる。
【図１４】口唇送達から２４時間後のＦＰＶ−ＨＩＶ−ＧＦＰワクチンの取込みを評価したプロットであり、矢印で示される右上４分の１の区分に、検出されたワクチンの蛍光ＧＦＰ抗原を含むＩ−Ａｄ  ＡＰＣ  ＭＨＣ−ＩＩ細胞が示されている。各点は単一の細胞を表す。
【図１５】口唇送達から２４時間後の様々な樹状細胞サブセットによるそれぞれの流入領域リンパ節への抗原取込みの動員を評価したプロットである。ＭＨＣ−１１＋およびＣＤ１１ｂ＋（左側の２つの欄）またはＣＤ１１ｃ＋（右側の２つの欄）であると同定された樹状細胞の割合が右上４分の１の区分に示されている（矢印を参照されたい）。
【図１６】口唇送達から２４時間後の頸部リンパ節、縦隔リンパ節および腸間膜リンパ節でのＦＰＶ−ＨＩＶ−ＧＦＰワクチン取込みを評価したプロットである。ワクチンの蛍光ＧＦＰ抗原を含むＩ−Ａｄ  ＡＰＣ  ＭＨＣ−ＩＩ細胞が、矢印で示される右上４分の１の区分に検出されている。
【図１７】実施した実験の以下の段階を示す写真である。示される段階には、投与する薬剤のマイクロチップへの装填（左上）、超音波システムの設定（右上）およびマウスへの口唇送達（下２つ）が含まれる。
【図１８】ＩＦＮ−γ細胞内染色を用いてＨＩＶ特異的脾臓ＣＤ８  Ｔ細胞の程度の評価を可能にしたプロットである。Ｃｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔ  ＰｒｏまたはＦｌｏｗＪｏ解析を用いてＦＡＣＳデータを解析した。四角の囲みは、口唇／ｉ．ｍ．（上段のマウス３匹）、ｉ．ｎ．／ｉ．ｍ．（中段のマウス２匹）およびブースター単独（下段のマウス３匹）でワクチン接種した後のＩＦＮ−γを発現するＨＩＶ特異的脾臓ＣＤ８  Ｔ細胞の割合を示している。
【図１９】四量体染色を用いてＨＩＶ特異的脾臓ＣＤ８  Ｔ細胞の評価を可能にしたプロットである。Ｃｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔ  ＰｒｏまたはＦｌｏｗＪｏ解析を用いてＦＡＣＳデータを解析した。四角の囲みは、様々な経路、すなわち、口唇／ｉ．ｍ．（上段のマウス３匹）、ｉ．ｎ．／ｉ．ｍ．（中段のマウス２匹）およびブースター単独（下段のマウス２匹）でワクチンを送達した後のＨＩＶ特異的脾臓ＣＤ８  Ｔ細胞の割合を示している。
【図２０】図１０の４種類の異なるマイクロチップで観察されたＨＩＶ特異的脾臓ＣＤ８  Ｔ細胞応答を示すプロットである。データは、四量体染色によって測定したＨＩＶ特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の数を表す（データは、各グループのマウス１匹を表す）。
【図２１】四量体染色を用いてＨＩＶ特異的脾臓ＣＤ８  Ｔ細胞応答の評価を可能にしたプロットである。Ｃｅｌｌ  ｑｕｅｓｔ  Ｐｒｏソフトウェアを用いてＦＡＣＳデータを解析した。プロットは、１グループ当たり３匹のマウスについて、マイクロチップ１（上段）および２（中段）によるプライムブースト感作のデータと経口送達（下段）のデータとを比較して表したものである。右上４分の１の区分（矢印）は、各ワクチン戦略の後に観察されたＨＩＶ特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の％を示している。
【図２２】ＩＦＮ−γ細胞内サイトカイン染色を用いてＨＩＶ特異的ＣＤ８  Ｔ細胞応答の程度の評価を可能にしたプロットである。Ｃｅｌｌ  ｑｕｅｓｔ  Ｐｒｏソフトウェアを用いてＦＡＣＳデータを解析した。プロットは、１グループ当たり３匹のマウスについて、マイクロチップ１（上段）および２（中段）によるプライムブースト感作のデータと経口送達（下段）のデータとを比較して示したものである。右上４分の１の区分（赤い矢印）は、ＩＦＮ−γを発現するＨＩＶ特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の％を示している。
【図２３】様々な薬剤キャリア本体（またはその層）を作製するための一連のマスクデザインを示す図である。
【図２４】様々な実施形態の薬剤キャリア本体およびその諸領域の一連の電子顕微鏡像である。
【図２５】様々な実施形態の薬剤キャリア本体およびその諸領域の一連の電子顕微鏡像である。
【図２６】様々な実施形態の薬剤キャリア本体およびその諸領域の一連の電子顕微鏡像である。
【図２７】様々な実施形態の薬剤キャリア本体およびその諸領域の一連の電子顕微鏡像である。
【図２８】様々な実施形態の薬剤キャリア本体およびその諸領域の一連の電子顕微鏡像である。
【図２９】本発明の一実施形態による２つの混合型薬剤キャリア本体を示す図である。
【図３０】本発明の一実施形態による２つの混合型薬剤キャリア本体を示す図である。
【図３０Ａ】本発明の一実施形態による２つの混合型薬剤キャリア本体を示す図である。
【図３１Ａ】様々なチップを有する本発明の実施形態とともに使用可能な５種類の薬剤塗布具を作動させたときの変位（ｎｍ）および速度（ｍ／ｓ）のプロットである。
【図３１Ｂ】様々なチップを有する本発明の実施形態とともに使用可能な５種類の薬剤塗布具を作動させたときの変位（ｎｍ）および速度（ｍ／ｓ）のプロットである。
【図３１Ｃ】様々なチップを有する本発明の実施形態とともに使用可能な５種類の薬剤塗布具を作動させたときの変位（ｎｍ）および速度（ｍ／ｓ）のプロットである。
【図３１Ｄ】様々なチップを有する本発明の実施形態とともに使用可能な５種類の薬剤塗布具を作動させたときの変位（ｎｍ）および速度（ｍ／ｓ）のプロットである。
【図３２】薬剤塗布具ＭＰ４およびＡＭＯ１を選択した周波数で様々な駆動電圧にわたって駆動させたときのチップの変位を示す図である。
【図３３】実験５の結果を示す図であり、対照マウス（左の画像）ならびにワクチン接種から３時間後、６時間後および９時間後にｍＣｈｅｒｒｙ蛍光抗原の発現を評価した別のマウスの画像を示している。
【図３４】実験５の結果を示す図であり、対照マウス（左の画像）ならびにワクチン接種から３時間後、６時間後、９時間後および２４時間後にｍＣｈｅｒｒｙ蛍光抗原の発現を評価した別のマウスの画像を示している。
【図３５】実験６の結果を示す図であり、具体的には、図３５および３６はＨＩＶ特異的四量体の実験結果を示し、図３７および３８はＩＦＮ−γ染色の実験結果を示している。
【図３６】実験６の結果を示す図であり、具体的には、図３５および３６はＨＩＶ特異的四量体の実験結果を示し、図３７および３８はＩＦＮ−γ染色の実験結果を示している。
【図３７】実験６の結果を示す図であり、具体的には、図３５および３６はＨＩＶ特異的四量体の実験結果を示し、図３７および３８はＩＦＮ−γ染色の実験結果を示している。
【図３８】実験６の結果を示す図であり、具体的には、図３５および３６はＨＩＶ特異的四量体の実験結果を示し、図３７および３８はＩＦＮ−γ染色の実験結果を示している。
【発明を実施するための形態】
【００８８】
（実施形態の詳細な説明）
説明を目的として、本発明を十全に理解できるよう多数の具体的な詳細を以下に記載する。しかし、本発明は、これらの具体的な詳細がなくても実施し得るものであることが明らかになるであろう。その他の例では、不必要に不明瞭になるのを避けるため、周知の構造物および装置をブロック図の形態で示す。
【００８９】
この説明は以下のアウトラインに従って記載される：
１．概要
２．一般的原則およびマイクロチャネルの実施形態
３．突起部をベースとする実施形態
４．混合型代替的実施形態
５．装填および使用の例
６．試験の結果
７．参考文献
【００９０】
１．概要
本発明の実施形態の背景
医学の分野では、皮下注射も経口摂取も外科手術も用いずに約５００ダルトンを超える高分子を含めた薬物および親水性薬物を身体に送達することが長年、望ましい目標の１つとされてきた。
【００９１】
これ（「薬物送達装置」）を達成するべく、これまでに様々な技術を用いた薬物送達装置が多数開発されてきたが、いずれも多岐にわたる薬物を安全で実用的、かつ予測可能で効果的な方法で非侵襲的に身体に送達することはできていない。歴史的にみれば、経皮経路が非侵襲性の薬物送達適用の主要な焦点であった。
【００９２】
経口摂取することなく薬物を身体に送達することの利点としては、消化管の酸性またはアルカリ性の領域および消化管内の酵素による薬物の分解が迂回されること、肝臓酵素による薬物代謝が回避されることのほか、薬物による消化不良性の副作用が解消されることが挙げられる。皮下注射を用いずに高分子または親水性薬物を身体に送達することの利点としては、痛み、局所的外傷および副作用の軽減または解消、患者コンプライアンスの向上のほか、針による汚染、疾患の伝播および針の誤用の発生率の低下が挙げられる。埋込装置を用いて身体に薬物を送達するには外科手術が必要であり、外科手術には、その処置自体による合併症のリスク（麻酔によるリスクを含む）の可能性および異物の導入による合併症のリスクの可能性がある。
【００９３】
薬物送達装置は、標的を定めた塗布に用いられ得るほか、全身薬物送達の入口としても用いられ得る。親水性分子および／または約５００ダルトンを超える分子を経皮輸送するに際に主な障壁となるのが、表皮の最外層である角質層であり、その厚さは通常、１０〜２０μｍである。角質層は生育不能細胞の層であり、皮脂脂質の連続する基質の中に高度
に架橋されたケラチノサイトが埋め込まれたものからなる。この天然の半透性バリアを克服して薬物を送達するには薬物送達装置を必要とする。皮膚用の薬物送達装置には、そのような組織に薬物を送達する主な手段としてマイクロニードルおよび／またはイオン導入法を用いることが多い。
【００９４】
頻度は低いものの全身薬物送達の入り口として用いられる薬物送達装置のまた別の適用部位に粘膜がある。親水性分子および高分子の経粘膜輸送の主な障壁となるのが上皮層である。経粘膜送達用の薬物送達装置には通常、主な薬物送達手段として鼻噴霧剤、吸入剤および／またはイオン導入法を用いる。
【００９５】
薬物送達装置には現時点で、以下に挙げる技術が（単独で、または任意に組み合わせて）用いられている。
【００９６】
イオン導入法
イオン導入として知られる過程を用いて身体に薬剤を送達する薬物送達装置は、電極を当てることによって生じる電流を発生させ、装置と標的組織との間に電位差を生じさせて維持することによって作動する。送達するイオン形態の薬物は電流の中を輸送され、それにより標的組織に達する。イオン導入法を用いて身体に薬剤を送達する装置は通常、薬物含有液の連続する層を有し、その中に装置内の電極が浸されている。適用時間は長い傾向にあり、多くの場合、数時間に及ぶ。
【００９７】
イオン導入法を用いて身体に送達することができる薬剤は、親水性であると同時に電荷を有するものでなければならない。イオン導入法では、中性分子ならびに／あるいは大きいタンパク質およびワクチンを含む粒子を送達することはできない。
【００９８】
マイクロニードル
マイクロニードルは、組織の１つまたは複数の層を貫通するよう機能する分離した複数の突起部である。マイクロニードルはその用途に応じて、一部分または全体が中空であったり、中空でなかったりする。薬物送達装置に用いられるマイクロニードルは通常、１）特定の外部刺激と組み合わせて組織内の透過性を増大させることができる構造物；２）組織中に溶解する薬剤を組み込む構造物；３）薬剤を組織中に注入する中空の導管；および／または４）表面組織を掻爬するもしくは内部組織を露出させるよう設計された構造物として機能する。マイクロニードルは通常、粘着剤で皮膚に貼付するか、機械的に皮膚に貼り付かせるパッチに組み込まれる。マイクロニードルはほかにも、薬剤の組織を通過する浸透を促進する化合物を含有し得るか、組織を透過促進化合物で前処理した後、その組織に適用され得る。
【００９９】
超音波導入法
超音波導入として知られる過程を用いて薬剤を送達する薬物送達装置は、組織に超音波を当て、組織の透過性を増大させるとともに薬剤に運動エネルギーを加えることによって作動する。超音波による組織の透過性の増大は、以下に挙げる現象のうちいずれか１つまたは複数のもの含めたいくつかの現象に起因する：１）気泡の発生および振動による空洞現象；２）温度上昇による熱効果が引き起こす対流輸送の誘導；または３）超音波が引き起こす圧力変動に起因するストレス発生による機械的効果。超音波導入法には、一般に２０〜２００ｋＨｚの範囲、好ましくは１００ｋＨｚ未満の低周波数超音波の方が、これより周波数の高い超音波よりも効果が高いことがわかっている。超音波導入により皮膚を通過させて輸送する主要な方法は、空洞現象を生じさせるのに十分な出力を必要とする。
【０１００】
超音波導入法を用いて身体に薬剤を送達する薬物送達装置は通常、薬剤を含有する流体の層を有し、その中に超音波発生源が浸されているか、そのすぐ近くに超音波発生源が設
置されている。このような装置はほかにも、様々な種類のマイクロニードルを含むことがあり、その場合、マイクロニードルは上記の流体の中に浸されている。上記の各装置では、流体は固体よりも超音波の出力を低下させ、超音波が作用する流体の体積は、その内部または周囲の固体構造物に対して大きいという理由で、波面が組織表面に近づくまでに相当量の超音波エネルギーが低下する。この超音波波面は、一部が組織表面に反射して流体層に戻り、これが超音波の効率をさらに低下させるため、流体に加える出力を大きくする必要が生じる。これらの技術にはいくつかの欠点が考えられ、例えば、組織に超音波を当てると、その出力の大きさに応じて、空洞現象および熱効果による局所的損傷を引き起こし得る。超音波出力による組織損傷の閾値は、組織の種類、組織の厚さ、組織の健康状態および組織損傷の有無を含めた様々な因子に左右される。例えば、皮膚は、粘膜および眼組織よりも高い超音波出力を加えても、それに耐えることが可能である。さらに、薬剤に超音波を当てると、その出力の大きさに応じて、薬剤またはその中の分子に空洞現象、熱効果または機械的効果による切断、変性または別の形の損傷を引き起こし得る。超音波空洞現象、機械力または摂氏４０℃超の温度に対する耐性が低いことが知られている薬剤としては、ワクチン、タンパク質をはじめとする生物製剤が挙げられる。
【０１０１】
実施形態の概要
本発明の好ましい実施形態は、概略的には、薬剤を非侵襲的に組織に送達するために、低周波の超音波を低出力で用いて、内部にマイクロスケール構造物を有する薬剤キャリア本体の中に収納された薬剤を輸送するものである。
【０１０２】
理解されるように、１つもしくは複数の周波数帯域にわたる超音波または複数の帯域を有する周波数スペクトルにわたる超音波を適用する。帯域（１つまたは複数）は、薬剤キャリア本体を含む薬剤塗布装置の共鳴周波数のほか、任意選択でその共鳴周波数の１つまたは複数の高調波に対応しているのが好ましい。本発明のいくつかの形態では、用いる超音波は、２０ｋＨｚ〜１００ｋＨｚの低周波のものであり、最も好ましくは、超音波エネルギーの周波数が２０ｋＨｚ〜４０ｋＨｚである。この周波数は、粘膜、眼球をはじめとする繊細な組織での使用に特に好ましい。しかし、他の実施形態では、薬剤塗布装置の共鳴周波数がこれよりも低い場合もあり、本明細書に記載される装置を薬剤キャリア本体チップの一次共鳴周波数である約１０ｋＨｚで作動させ得る。試験を実施する際には、本発明の実施形態で使用するのに適した薬剤塗布具を、１０ｋＨｚ；２０ｋＨｚ、２２ｋＨｚ、２８ｋＨｚ、２８．１９ｋＨｚおよび３８ｋＨｚを中心とするか、その前後にある帯域ならびに／あるいは２０〜２５ｋＨｚ、２５〜３０ｋＨｚ、３８〜４０ｋＨｚ、４０〜４５ｋＨｚ、４０〜６０ｋＨｚ、４０〜８０ｋＨｚ、１４０〜１６０ｋＨｚの周波数帯域のうちのいずれか１つあるいは複数の周波数で作動させている。
【０１０３】
皮膚などのその他の組織には、超音波周波数は上記の範囲外のものであり得る。
【０１０４】
本発明の好ましい形態では、用いる超音波出力は比較的小さく、通常、０．０５〜３．５Ｗｃｍ−２の範囲内にある。用途によっては、これよりも強度の高い超音波出力を必要とし得る。このような場合、組織損傷（例えば、熱効果によるもの）および／または薬剤への損傷を防ぐため、超音波エネルギーの動作周期を瞬間適用などにより制御することが必要であり得る。
【０１０５】
薬剤塗布具から超音波エネルギーを加えると、薬剤キャリア本体の組織接触表面の往復運動が起こる。典型的な実施形態では、組織接触表面の平均位置からの変位は約１００ｎｍ〜２２００ｎｍであり得る。諸実施形態は、２００ｎｍ超の変位で作動し得る。諸実施形態は、２１００ｎｍ未満の変位で作動し得る。諸実施形態は、４００ｎｍ超の変位で作動し得る。実験に用いた実施形態は、５００ｎｍ未満、より具体的には４００ｎｍ未満の変位で作動した。
【０１０６】
２種類のチップアセンブリ、例えば薬剤キャリア、「チップアセンブリ１」および「チップアセンブリ２」を有する２種類の薬剤塗布具、ＭＰ１およびＭＰ４を０〜２００ｋＨｚの範囲の周波数で作動させたときの変位（ｎｍ）および速度（ｍ／ｓ）のプロットを図３１Ａに示す。
【０１０７】
チップアセンブリ、例えば薬剤キャリアを有さず、ある実施形態による薬剤塗布具に使用可能な３種類のハンドルユニット、ＡＭＯ１（モデル番号Ｓｏｖ３７７０６）；ＡＭＯ２（モデル番号Ｓｏｖ３９３０２）およびＡＬＣＯＮ１（モデル番号Ｔｕｒｂｏ  Ｓｏｎｉｃ−３７５）を０〜２００ｋＨｚの範囲の周波数で作動させたときの変位（ｎｍ）および速度（ｍ／ｓ）のプロットを図３１Ｂに示す。
【０１０８】
第二の種類のチップアセンブリ、例えば薬剤キャリアを有する３種類のハンドルユニット、ＡＭＯ１；ＡＭＯ２およびＡＬＣＯＮ１を０〜２００ｋＨｚの範囲の周波数で作動させたときの変位（ｎｍ）および速度（ｍ／ｓ）のプロットを図３１Ｃに示す。
【０１０９】
第三の種類のチップアセンブリ、例えば薬剤キャリアを有する３種類の薬剤塗布具、ＡＭＯ１；ＡＭＯ２およびＡＬＣＯＮ１を０〜２００ｋＨｚの範囲の周波数で作動させたときの変位（ｎｍ）および速度（ｍ／ｓ）のプロットを図３１Ｄに示す。
【０１１０】
薬剤塗布具ＭＰ４およびＡＭＯ１を選択した周波数で一定範囲の駆動電圧にわたって駆動させたときのチップの変位を図３２に示す。ＭＰ４システムは、ＲＦ増幅器を介し、２２ｋＨｚでピークトゥピーク値５０〜４００Ｖの範囲の入力電圧にわたって駆動させた。ＡＭＯ１は、２８．１９ｋＨｚで同じ電圧範囲にわたって駆動させた。
【０１１１】
装置の試験は、ドイツのＰｏｌｙｔｅｃ社製の機器のうちレーザードップラー振動計モデルＭＳＡ４００を用いて実施した。
【０１１２】
図からわかるように、作動させる周波数（または周波数帯域）を選択することによって、所望の振動パラメータを選択することができる。これらのパラメータは、使用する特定の薬剤キャリアに応じて異なるものとなる。好ましい実施形態では、これらの装置は、プロットに示される運動のピークのうち１つまたは複数のものに対応する周波数帯域で作動させる。
【０１１３】
典型的な実施形態では、組織接触表面の運動速度は約０．０１ｍ／ｓ〜０．４ｍ／ｓであり得る。諸実施形態は０．０３ｍ／ｓ超の速度で作動し得る。諸実施形態は０．３６ｍ／ｓ未満の速度で作動し得る。諸実施形態は０．０６ｍ／ｓ超の速度で作動し得る。実験に用いた実施形態は０．０５ｍ／ｓ未満の変位で作動した。
【０１１４】
本発明の諸実施形態は、粘膜（結膜、頬粘膜および口唇粘膜を含む）、眼組織などの繊細な組織への薬剤の送達に使用し得るという点で有利である。
【０１１５】
諸実施形態の超音波出力および／または周波数パラメータは、組織内への薬剤の浸透深度を制御するためなどの様々な理由で増大または減少させ得る。１つの例として、粘膜の上皮表面細胞に薬剤を送達するのに用いる超音波出力および／または周波数パラメータは、上皮表面よりも下にある血管に富む毛細血管床および深部結合組織に用いる出力および／または周波数パラメータよりも小さい値となり得る。
【０１１６】
好ましい実施形態では、薬剤キャリア本体は組織表面のいずれの層も貫通しないことが意図される。本発明の好ましい実施形態を用いる際にある程度の表層細胞の損傷が起こり
得るが、薬剤を標的組織に送達するためにそれを意図することも、それに依存することもない。可能な限り無傷な組織表面を維持することは、薬剤が組織層内に浸透する深度をより精密に制御するのに役立ち得る。
【０１１７】
本明細書に記載される薬剤キャリア本体内の様々なマイクロスケール構造物はとりわけ、薬剤キャリア本体と組織表面とを直接接触させて超音波エネルギーを伝播し、それにより薬剤キャリア本体内および薬剤キャリア本体と標的組織との間の連続する層の流体（超音波を減衰させる傾向がある）の程度を最小限に抑えるという目的にかなうものである。
【０１１８】
本発明者の国際出願ＰＣＴ／ＡＵ２０１４／０５００２７号（その内容全体はあらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる）に最初に記載した一群の実施形態は、強固な壁に取り囲まれた複数のマイクロチャネルを形成する微細構造物を有する、様々な薬剤を送達するための薬剤キャリア本体を含むものである。このマイクロチャネルは通常、送達方向を横断する形で測定したとき約２５〜１００μｍの範囲内にあり、長さが約０．５ｍｍ〜２ｍｍであり得る。任意の適切な断面の形状および／または縦断面の形状を用いることができる。
【０１１９】
使用時、各チャネルには薬剤が流体柱の形で収納されており、各流体柱およびそれを取り囲む壁に超音波エネルギーを直接加える。実際には、超音波は本来、縦方向に発生する、すなわち、チャネルに沿って伝播する。いくつかの実施形態では、微細構造物のミクロンスケールの構造を用いることによって、流体柱に衝突する波面を各マイクロチャネル内に集中させ、超音波の減衰を抑える。装置と組織表面、最も好ましくは薬剤キャリア本体と組織表面とを直接接触させて、両者の間に流体空間を存在させないようにすることによって、超音波が組織表面で反射するのを最小限に抑える。このことはさらに、分子が超音波波面の経路に沿って超音波の影響を受けながら、標的組織に向かって効率的に移動するのを助ける。超音波は薬剤キャリア本体、特にマイクロチャネルを画定する壁にも伝わる。これらは流体ほど超音波エネルギーを低下させることがないため、超音波導入出力を効率的に標的組織に直接伝える。
【０１２０】
好ましい実施形態では、装置の組織接触表面は、連続する流体層によって組織から分離することはない。薬剤キャリア本体の組織接触表面は、固体の本体および液体の薬剤の領域（すなわち、マイクロチャネルの開口部）を有する表面となり、いくつかの実施形態では、固体−液体がほぼ「千鳥格子」様の配列となる。この配置では、固い壁面が直接組織と接触するため、装置の超音波導入能が増大し得る。このような実施形態では、装置の構造は、多数の個々のマイクロスケールの超音波導入式送達装置が密に詰め込まれて一緒になったものと考えることができる。
【０１２１】
新たな実施形態のまた別のグループは、一緒に薬剤キャリア本体の組織接触表面を画定するマイクロスケールの突起部によって形成される複数のマイクロスケール構造物を含むものである。これらの突起部が標的組織と接触し、送達する薬剤がそれを取り囲む。好ましい形態では、薬剤キャリア本体は、突起部を取り囲み、使用時に薬剤を収納する末端構造物、通常は壁を有する。この実施形態は、薬剤キャリア本体内の流体に対する微細構造物の比が、マイクロチャネルからなる薬剤キャリア本体よりも小さい。これらの実施形態は、突起部やほか可能性としては末端構造物を介して、超音波発生源と標的組織との間の直接的接触を維持するのが好ましい。突起部およびその間の流体によって縦方向の超音波が伝導される。突起部は、標的組織の方向への薬物の輸送を促進することによって作用する。突起部が存在することによって、突起部間の隣接する空間内の流体による波形干渉が最小限に抑えられ、このことは、少なくとも波形の伝播を遮断するのに役立つ。
【０１２２】
新たな実施形態のまた別のグループは、複数のマイクロスケールの突起部を有する少な
くとも１つの領域と、強固な壁に取り囲まれたマイクロチャネルを有する少なくとも１つの他の領域とを有する、混合型装置を提供する。強固な壁に取り囲まれたマイクロチャネルを有する領域（１つまたは複数）は通常、マイクロスケールの突起部を有する領域を画定する末端構造物の一部を形成する。
【０１２３】
本発明の方法およびシステムでは、上記のいずれかのグループに分類される薬剤キャリア本体を有する薬剤キャリアを用い得ることが理解されるべきである。
【０１２４】
超音波導入法を用いて身体に送達される可能性があることが本発明者らにわかっている分子としては、１）任意の種類の電荷を有するか、中性の電荷（全体として中性のものを含む）を有する分子、２）小さい分子または大きい分子（約１５０，０００ダルトンのモノクローナル抗体を含む）および３）親水性、疎水性または親油性の分子が挙げられる。
【０１２５】
本発明者らはさらに、本発明を用いてワクチンを主として粘膜上皮に送達することにより、粘膜免疫を誘導し、粘膜での特に限定されないがインフルエンザ、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、ヒトパピローマウイルス、結核をはじめとする病原体を含めた初期感染によって生じる疾患または病態を予防または治療する新たな機会が生まれることを明らかにした。粘膜免疫はほかにも、自己免疫疾患、癌、アレルギーなどを治療または軽減する機会をもたらす。いくつかの試験では、粘膜免疫応答を刺激することによって、粘膜および全身の両方の環境で防御Ｂ細胞およびＴ細胞の産生が起こり、感染が侵入領域に限定され、身体の他の組織に達するのを防ぎ得ることが明らかになった。特に、粘膜は分泌型ＩｇＡまたはｓＩｇＡという特殊な種類の抗体を産生する。さらに、粘膜免疫によって生じた抗体および細胞傷害性Ｔ細胞は、全身免疫によって生じた抗体および細胞傷害性Ｔ細胞よりも粘膜から身体に侵入する病原体に対する効果が高いと考えられる。
【０１２６】
好ましくは超音波のみを用いる輸送様式で薬剤を非侵襲的に標的組織表面部位に送達する例示的薬剤塗布装置に関して、本発明の様々な態様の例示的実施形態をいくつか記載する。これらの例示的実施形態では、標的組織表面部位において、超音波導入機序により同部位への薬剤の浸透を可能にするか、促進する。標的組織表面部位は、特に限定されないが、結膜、膣、尿道、内耳、気管および気管支、肛門、口腔および鼻の組織を含めた粘膜であるのが好ましい。標的組織表面はこのほか、角膜を含み得る。
【０１２７】
２．一般的原則およびマイクロチャネルの実施形態
このシステムは、好ましくは手持式で標的組織への薬剤の送達に使用する薬剤塗布装置を含む。薬剤塗布装置の好ましい形態は、塗布具チップと連結されたハンドルを含む。塗布具チップは薬剤キャリア本体を含み、薬剤キャリア本体の中にはマイクロチャネルが形成されており、薬剤は、そのマイクロチャネルを通って塗布具チップ内から標的組織表面に送達される。薬剤キャリア本体は、塗布具チップの中に組み込まれていても、塗布具チップに装着可能な別個の構成要素（カートリッジなど）であってもよい。
【０１２８】
塗布具チップは、薬剤を保持するリザーバを含み得る。リザーバは、薬剤キャリア本体の一部を形成していても、薬剤キャリア本体と流体接続した別個の構成要素であってもよい。
【０１２９】
ハンドルまたは塗布具チップの一部を形成する超音波振動子から超音波エネルギー（波）が発生し、これにより薬剤が薬剤キャリア本体のマイクロチャネルの中を移動し、薬剤キャリア本体の組織接触表面でマイクロチャネルの末端孔から標的組織表面に出る。超音波はこのほか、超音波導入によって標的組織内への薬剤の取込みを促進し、かつ／または可能にする。
【０１３０】
図１Ａは、本明細書に記載される任意の薬剤キャリアまたは薬剤キャリア本体とともに使用可能な本発明による薬剤塗布装置の第一の実施形態を極めて模式的に示した図である。この例では、薬剤塗布装置１００は、塗布具ハンドル１０３と連結した塗布具チップ１０２を含む（装置全体は示していない）。塗布具ハンドル１０３は超音波発振器１０１を含む。塗布具チップ１０２はハンドル１０３と接続されているため、超音波エネルギーがトランスデューサー１０１から連結棒１０６を介してそれに伝わる。理解されるように、超音波の適用は一般に、上の概要に記載したパラメータに従うものとなる。塗布具チップ１０２の組織接触表面を標的組織表面１０８に接触させる。次いで、超音波発振器が作動し、それにより超音波１１０が連結棒１０６を通って塗布具チップ１０２および薬剤キャリア本体１０４を通過し、標的組織１０８内に伝播する。この実施形態では、薬剤は薬剤キャリア本体１０４内に貯蔵され、薬剤キャリア本体１０４内に形成されたたマイクロチャネル１１２を介して標的組織表面１０８まで輸送される。超音波は、薬剤が薬剤キャリア本体１０４からマイクロチャネル１１２を介して標的組織表面１０８まで輸送されるのを助ける。超音波はこのほか、組織超微細構造に対する超音波導入作用によって、標的組織１０８内への薬剤の浸透を促進し、かつ／または可能にする。
【０１３１】
この例では、薬剤キャリア本体１０４は、本明細書に一般に記載されている任意の種類のものおよび図８Ａ〜１０または図２３〜３０Ａのいずれか１つに例示されているものであり得る。しかし、薬剤キャリア本体が作動する原理を説明するため、本出願者のオーストラリア特許出願第２０１３９０１６０６号に既に記載されている種類の薬剤キャリア本体１０４のより詳細な図を、１Ａを組織表面１０８に当てた状態で図１Ｂに示す。薬剤キャリア本体１０４は組織接触表面１１４を有する。この例では、薬剤キャリア本体１０４内に形成され、薬剤キャリア本体１０４の内部から組織接触表面１１４に及ぶマイクロチャネル１１２が含まれている。マイクロチャネル１１２は組織接触表面１１４で細孔１１６として終わっている。薬剤は、薬剤キャリア本体１０４から供給され、チャネル１１２を通り、組織接触表面１１４で細孔１１６から組織表面１０８上に出る。別の方法として、薬剤キャリア本体１０４は、本明細書に一般に記載されている任意の種類のものおよび図８Ａ〜１０または図２３〜３０Ａのいずれか１つに例示されているものであり得る。
【０１３２】
この例では、超音波１１０が発生し、薬剤キャリア本体１０４内を伝導する。これにより、チャネル１１２内に貯蔵されている薬剤１１８がチャネル１１２から組織表面１０８上に放出される。組織に対して超音波導入作用を発揮する超音波の使用によって、組織１０８内への薬剤の浸透が促進され、かつ／または可能になる。
【０１３３】
図１Ａの実施形態では、塗布具ハンドル１０３は超音波１１０を発生する超音波振動子１０１を有し、発生した超音波は連結棒１０６を通って塗布具チップ１０２から薬剤キャリア本体１０４に伝わる。しかし、代替的実施形態では、塗布具チップ１０２はその構造内に、外部の超音波振動子を必要とせずにそのものが超音波を発生することができるシステムを含むよう形成されていてもよい。図１Ｃに、薬剤キャリア本体１０４が超音波振動子１２４をさらに含む代替的実施形態を示す。
【０１３４】
チャネル１１２の内表面（１つまたは複数）は官能化されているのが好ましい。チャネル１１２の内表面１１３は、疎水特性もしくは親水特性またはその両部分の組合せを有する化合物または分子で官能化し得る。あるいは、チャネルの表面に小分子を接触させてチャネルの表面に吸着させ、所望の物理的および／または化学的特性を有する特定の官能基を露出させることによって、チャネル１１２の表面１１３を官能化し得る。小分子は、化学吸着または物理吸着によりチャネルの内部表面に吸着させ得る。水／油親和性を変化させることに代えて、またはこれに加えて、マイクロチャネルおよび／または薬剤リザーバの内表面を導電性にすることによって、これを官能化し得る。
【０１３５】
図２は、本明細書に一般に記載されている任意の種類の薬剤キャリア本体および図８Ａ〜１０または図２３〜３０Ａのいずれか１つに例示されている薬剤キャリア本体とともに使用可能な薬剤塗布装置のハンドルアセンブリ２００の一実施形態の図を示している。ハンドルアセンブリ２００は、超音波振動子２０４を収納する主要収納部２０２を含む。トランスデューサーはバッテリ２０６（あるいは外部の電源）を動力源とし、超音波を発生して、コネクタ２１０を終端とする連結棒２０８にこれを伝えるよう設計されている。コネクタ２１０は、例えばねじ山またはバヨネット式取付具など、ハンドルアセンブリ２００と薬剤キャリアとを（直接的なかみ合せ、または間接的なかみ合せのいずれかにより）かみ合わせることが可能な任意の種類のものであり得る。
【０１３６】
図３は、図２のハンドルアセンブリ２００とともに使用し得る塗布具チップ３００の形態の薬剤キャリアの模式的断面図である。塗布具チップ３００は、第一の末端３０２と第二の末端３０３とを有する収納部３０１を含む。第一の末端３０２は、ハンドルアセンブリ２００のコネクタ２１０と機械的に接続させるバヨネット式取付具またはねじ山などの取付機構３０５を含む。塗布具チップ３００は、その第二の末端３０３に、薬剤キャリア本体１０４または本明細書に一般に記載されている任意の種類の薬剤キャリア本体および図８Ａ〜１０もしくは図２３〜３０Ａのいずれか１つに例示されている薬剤キャリア本体を受け止めるよう配置されたくぼみ３０４をさらに含む。塗布具チップ３００は、使用時に、薬剤を薬剤キャリア本体１０４の組織接触表面３０６まで運び、必要に応じて、超音波の適用によって治療する組織に薬剤を送達するよう設計されている。いくつかの実施形態では、塗布具チップ３００は、薬剤キャリア本体１０４内に形成されたマイクロチャネルと流体接続した薬剤リザーバを含み得る。
【０１３７】
図４Ａ、４Ｂ、４Ｃおよび４Ｄに単層薬剤キャリア本体の様々な実施形態を示し、図４Ｅ、４Ｆ、４Ｇ、４Ｈに、積み重なった薬剤キャリア層から薬剤キャリア本体が形成される様々な実施形態を示す。
【０１３８】
薬剤キャリア本体４００は、固体材料の層（１つまたは複数）で形成され、様々な幾何学的形状および大きさであり得る複数のマイクロチャネルまたは網状のマイクロチャネルを有する。これらのマイクロチャネルは、薬剤の貯蔵または保持のほか、薬剤キャリア本体４００内から薬剤キャリア本体４００の組織接触表面４０６への薬剤の送達にも用いることができる。マイクロチャネルは、微細加工技術によって作製することができる。例えば、薬剤キャリア本体４００がケイ素から形成されている実施形態では、リソグラフィー、エッチングおよび／またはその他の工程によってマイクロチャネルを形成することができる。金属、プラスチックまたはポリマーから作製する実施形態では、様々な種類および波長のレーザーの使用ならびに成形および押出技術を含めた他の技術によってマイクロチャネルを作製することができる。これらの微細加工技術を用いると、薬剤量の精度が保持されるという利点、マイクロ流体力学が予測可能になるという便益がもたらされ、さらには、薬剤キャリア本体４００の露出した組織接触表面およびミクロンスケールの空洞４０２を裏打ちする内壁の一方または両方に特殊な表面化学処理などの改良が可能になるため、特に望ましい。これらの便益性を用いて、例えば、薬剤の装填、保持および標的組織への送達をさらに促進することができる。
【０１３９】
組織接触表面４０６は、一連の開口部、窓または細孔４０４を有する。細孔の多種多様な形状および大きさは約１０〜１００μｍであり得るが、他の実施形態は最大１０００μｍの孔径を有し得る。マイクロチャネル４０２は、組織接触表面４０６の細孔４０４から少なくとも一部が薬剤キャリア本体４００の中を伸長している。マイクロチャネル４０２は、薬剤の保持および組織表面への薬剤輸送の両方に用いることができる。
【０１４０】
細孔４０４は、パターン化された外観を呈し、様々な幾何学的形状、例えば最密六方構
造、様々な密度で配列された四角形、多角形が入り混じったモザイク、らせん、直線などを示し得る。薬剤の保持および／または輸送のためのマイクロチャネル４０２の配列が形成されるよう薬剤キャリア本体４００に所望の幾何学的形状が物理的にエッチングされている。マイクロチャネルは、様々な形状、例えば円柱状、円錐状などであり得る。
【０１４１】
薬剤キャリア本体４００内のマイクロチャネル４０２の壁および／またはその他の内部表面が、互いにかつ／または組織接触表面４０６の細孔４０４の間の領域と性質が同じまたは逆であり得る親水特性または疎水特性を有するように、これを処理し得る。薬剤キャリア本体４００内のマイクロチャネル４０２の壁および／またはその他の内部表面が、互いにかつ／または組織接触表面４０６の細孔４０４の間の領域と同じまたは逆の極性を有し得る電荷を伝導するか、局所電場を生じ得るように、これを処理し得る。
【０１４２】
薬剤キャリア本体４００は、単一の材料片から形成されたものであり得る。しかし、別の実施形態では、薬剤キャリア本体は、積み重なった複数の層を含み得る。微細加工した固体材料を単一または複数の層として用いて薬剤キャリア本体を作製することにより、音波透過性が向上し、ひいては超音波による標的組織への薬剤の送達が向上する。
【０１４３】
薬剤キャリア本体４０４内のマイクロチャネル４０２および／またはその他の内部表面の寸法および内層の特徴ならびに薬剤キャリアを含む層の数は、薬剤および標的組織に合わせて調節され、薬剤の特性、用量および製剤の必要性、超音波出力および熱発生ならびに使用時間の結果として異なるものとなる。
【０１４４】
マイクロチャネル４０２’が内部連結チャネル４０８によって相互に連結されていることを除き、図４Ａの実施形態とほぼ同じ別の実施形態を図４Ｂに示す。このような構造によって、チャネル４０２’単独の場合のものに加えてある程度のレベルの薬剤貯蔵が可能になる。
【０１４５】
単層の薬剤キャリア本体４００’’がマイクロチャネル４０２’’を有し、マイクロチャネル４０２’’の一端が組織接触表面４０６’’で細孔４０４’’として終わっており、他方の端が薬剤リザーバ４１０と接続している、さらなる実施形態を図４Ｃに示す。
【０１４６】
図４Ｄは、図４Ａ〜４Ｃのいずれか１つに示される単層の薬剤キャリア本体の表面の図を示している。薬剤キャリア本体４００’’は、第一の表面４１１と、組織接触表面である第二の表面４１２とを有する。既に記載した通り、マイクロチャネルは、薬剤キャリア本体４００内から（リザーバ４１０または連結チャネル４０８が存在する場合はそこから）伸長し、組織接触表面４１２の細孔４０４として終わっている。
【０１４７】
別の実施形態では、薬剤キャリア本体は積層構造を有し、少なくとも２つの層を含む。より好ましくは、１つまたは複数の層は、その中に形成され、治療する組織に塗布する前に薬剤を保持するためのマイクロチャネルと流体接続している追加のマイクロリザーバ容積を有する。マイクロリザーバ容積は、単一の容積であっても、あるいは、例えばそれぞれが１つまたは１群のマイクロチャネルと連続した複数の小さい容積であってもよい。組織接触層から最も離れた層に、チャネルと流体接続した単一の大きいリザーバ容積が存在してもよい。あるいは、複数のマイクロリザーバ容積が存在し、それぞれのマイクロリザーバ容積が流体接続していてもよい。
【０１４８】
図４Ｅ、４Ｆおよび４Ｇはそれぞれ、薬剤キャリア本体４１３が第一の層４１４、４１４’、４１４’’および第二の層４１６、４１６’、４１６’’を含むことを除き、図４Ａ、４Ｂおよび４Ｃに対応している。第一の層４１４、４１４’、４１４’’は、図４Ａ、４Ｂおよび４Ｃの単層の実施形態に関して一般に記載される通りのものであるが、層が
一緒に積み重なっている場合、組織接触表面４２２を有する代わりに、第一および第二の層の中を伸長するマイクロチャネルの一部を画定する細孔または止まり穴を含む接合面４１５を有する。第二の層４１６、４１６’、４１６’’は、第一の層４１４、４１４’、４１４’’の接合面４１５と接する第一の表面４２０と、マイクロチャネル４２４によって形成される細孔４２６を有する組織接触表面４２２とを含む。図からわかるように、マイクロチャネル４２４は、第一の層の内部から第二の層４１６、４１６’、４１６’’の中を伸長し、第二の層４１６、４１６’、４１６’’の組織接触表面４２２で細孔４２６として終わっている。このように、第一の層４１４、４１４’、４１４’’および第二の層４１６、４１６’、４１６’’の穴が整列してマイクロチャネル４２４を形成し、それにより、第一の層４１４、４１４’、４１４’’と第二の層４１６、４１６’、４１６’’が接続されてシステム内の流体の連続性が可能になる。
【０１４９】
第一の層４１４’’’が、第二の層４１６’’’のマイクロチャネル内に薬剤を直接供給する開口型の薬剤リザーバ４２５を含む、二重積層の薬剤キャリア本体４１３のさらなる代替的実施形態を図４Ｈに示す。
【０１５０】
図４Ｉは、図４Ｈに示される二重層の薬剤４１３’’キャリアの様々な層の表面の図を示している。第一の層４１４’’は、第一の表面４３０と第二の表面４３２とを有する。第二の層４１６’’は第一の表面と第二の表面（４３４で一般に示されるものと同じである）とを有する。薬剤リザーバ４２５は、第一の層４１４’’に形成され一部が同リザーバ内まで伸長しているくぼみによって形成されている。第一の層４１４’’の第二の表面４３２は、第二の層４１６’’の接合面の上方に整列して配置されているため、第二の層内に形成されている実質的に全部のマイクロチャネル４２４が、第一の層４１４’’の薬剤リザーバ４２５と流体接続している。
【０１５１】
薬剤キャリア本体内に形成され、追加の薬剤を貯蔵し、使用過程でマイクロチャネルの薬剤が枯渇したときにこれを補充することが可能な薬剤リザーバのさらなる実施形態を図４Ｊに示す。リザーバは、例えば図４Ｇに示されるものと同じ薬剤キャリア本体層のマイクロチャネルと接続しているか、例えば図４Ｈに示される薬剤キャリア本体の連続する層のマイクロチャネルと接続し得る。薬剤キャリア本体４３８は、２つの環状輪型リザーバ容積４４０および４４２によって形成されるリザーバを含み、入口４４６を通って伸長している導管４４４を含む。入口４４６に真空をかけるか、入口４４６に薬剤を注入すると、それぞれ陰圧または陽圧がリザーバ４４０、４４２にかかる。この種類の層は、積層になるよう配置されて薬剤キャリア本体を形成し、第一の層がその隣接する層に重なっているため、その隣接する層の穴がいずれもリザーバ容積と流体接続しており、薬剤は、層の中を通るマイクロチャネルを通って組織接触表面まで移動することが可能である。
【０１５２】
薬剤キャリア本体４４８は、リザーバが、それぞれが互いに流体接続した複数の同心円状の環からなる、また別の実施形態である。これ以外にも、本発明を逸脱することなく層内の薬剤リザーバ容積の配置が可能であることが理解されよう。
【０１５３】
薬剤キャリア本体の低層ないし中間層の穴は一般に、その層の厚さ全体にわたって伸長し、それに続く流体接続した他の層の穴とともに、薬剤キャリアの表面接触層の組織接触表面から伸長するマイクロチャネルを形成する。ある特定の場合には、穴は特定の層の途中まで伸長するにとどまり、このことは、例えば図４Ｅ〜４Ｇに示される第一の層の場合に当てはまり得ることが理解されよう。
【０１５４】
既に記載したように、マイクロチャネルの内表面（１つまたは複数）をはじめとする薬剤キャリアの内部表面、例えば薬剤リザーバの内部表面は、官能化されているのが好ましい。
【０１５５】
図５Ａ、５Ｂおよび５Ｃに示される実施形態では、薬剤キャリア本体は、１つの表面組織接触層と、その表面接触層の上に次々に積み重なった５つの層とを含む、６つの層を含む。
【０１５６】
６つの層５０１．１、５０１．２、５０１．３、５０１．４、５０１．５、５０１．６が積み重なった薬剤キャリア本体５００の実施形態を図５Ａに示す。薬剤キャリア本体の第一の端部は、治療する組織と接触する層５０１．６の表面組織接触表面５０２である。この層の上には複数のほかの層と、最上層５０１．１がある。この実施形態では、薬剤を保持および送達する薬剤リザーバおよびマイクロチャネル（不掲載）は、薬剤キャリア５００の層５０１．１〜５０１．６のうちの一部または全部の中を伸長し得る。いくつかの実施形態では、チャネルは、層５０１．６の組織接触表面５０２から中間層５０１．５〜５０１．２の中を伸長し、最上層５０１．１で終端となる。
【０１５７】
図５Ａに示されるものに代わる６層が積み重なった薬剤キャリア本体５０５の実施形態を図５Ｂに示す。この実施形態では、表面組織接触層５０１．６は複数の微小突起部５０６を含み、この例では同突起部は微小チューブである。全体的な配置はこれとほぼ同じであるが、微小突起部５０６’が微小針であるさらなる代替的薬剤キャリア本体５１０を図５Ｃに示す。微小突起部は中空であり、その中にはチャネルが形成されており、薬剤を送達する微小チャネルのシステムの一部を形成している。以下に記載するように、可能な限り無傷な状態の組織表面を維持するため、微小針の使用は好ましくない。
【０１５８】
微小針および微小チューブなどの微小突起部は、細孔間の領域がほとんど取り除かれるように、組織接触層５０１．６の組織接触表面５０２のエッチングからなる二次加工によって作製することができる。これにより、各細孔を取り囲むのに必要な突起部の各細孔周囲の壁が残る。微小針および微小チューブは、任意の所望の形状であり得る。例えば、図５Ｄに、円柱の形状を有する微小突起部（微小チューブ５１０）および円錐台状の形状を有する別の微小突起部（微小針５０８）を示す。他の実施形態では、図示はしないが、表面５０２組織接触層５０１．６は、薬剤キャリア本体が標的組織と接合しやすくなるよう、他の表面処理が施されているか、組織を咬持する表面構造、例えば鋸歯構造、リップル、環などを備えていてよい。
【０１５９】
好ましい実施形態では、各層が円盤状または円柱状である。好ましくは、各層は厚さが約０．３ｍｍ〜約１．０ｍｍであり、さらにより好ましくは、各層は厚さが約０．５ｍｍである。各層は、好ましくは直径が約３ｍｍ〜約１０ｍｍ、さらにより好ましくは直径が約５ｍｍである。厚さ寸法および直径寸法は層の間で異なっていてよい。薬剤キャリア本体の層および全体的形状は、図３のように断面形状が円盤状または円柱状であると記載しているが、本発明の範囲を逸脱することなく、例えば長方形、正方形をはじめとする多角形、卵円形など、これ以外の形状を用いることも可能である。さらに、薬剤キャリア本体の全体的形状は断面が一定であるのが好ましいが、その長さに沿って変化するものであってもよく、例えば、薬剤キャリア本体は、錐台（円錐台、角錐台を問わない）または角柱の形状であってもよい。用いる輸送様式または輸送様式の組合せに依存する装置の効率を最大限にするため、薬剤キャリアおよび薬剤キャリア本体の全体の形状および／または構成要素の形状を改変することができる。
【０１６０】
図６は、積層配置の薬剤キャリア本体６０１を有する薬剤キャリア６００を図示したものである。積層は、１つの最下層６０２、４つの中間層６０４、最上層６０６を含む。最下層６０２は微小チューブ６０８を有し、これが伸長して組織接触表面６１０を形成する。薬剤キャリア６００は、入口６１２をさらに含む。この実施形態では、入口６１２は第一の層６０６の一部になっている。入口６１２は、好ましくは間を流体が流れることがで
きるように第一の層６０６の薬剤リザーバ容積を介して、薬剤キャリア本体６０１内に形成されているマイクロチャネルと接続している。入口６１２は、これに陰圧または陽圧をかけることができるように、真空ラインまたは高圧注入器に接続するよう設計されている。これにより、薬剤を外部の供給源から薬剤キャリア内に装填することが可能になる。入口６１２に真空をかけると、組織接触表面６１０の微小チューブの細孔から薬剤が吸い込まれ、マイクロチャネルを通って薬剤キャリア本体６０１の積層物の中に入り、マイクロチャネルおよびリザーバ容積を満たす。あるいは、入口６１２から薬剤キャリア内に薬剤を注入してもよい。いずれかの方法を用いて、薬剤キャリアに薬剤を充填することができる。
【０１６１】
図６にはほかにも、入口６１２に取り付ける栓またはシール６１４および表面接触層６１０に被せる栓またはシール６１６が示されている。シール６１６は、表面接触層６１０の表面を密封して、無菌性を維持するほか、マイクロチャネル内で生じた真空を維持する。これと同様に、シール６１４も同じ目的で入口６１２を密封する。この密封層はプラスチックフィルムであるのが好ましい。
【０１６２】
図６の実施形態はほかにも、追加の層６１８と超音波振動子６２０とを含む。層６１８は、最上層の窓を覆って（マイクロチャネルが最上層を貫通して伸長している場合）、流体の放出および／または真空の解除を防ぐ役割を果たす単純な分離層であり得る。
【０１６３】
輸送様式は、電場を用いて、帯電した薬剤を輸送するものであり得る。電場は、薬剤塗布装置内部のバッテリを用いて、または外部電源によって、薬剤キャリア内の電極に電圧をかけることにより生じさせることができる。好ましい形態では、薬剤塗布装置内に電極を設置し、第二の外部電極を同じく薬剤塗布装置の電源に接続し、標的組織を効率的にその極性が内部電極と逆の電極になるよう設置し得る。電極の極性は、内部電極が薬剤の電荷と同じ極性になるよう選択し得る。２つの電極間で確立した電圧は、帯電した薬剤を薬剤キャリアを通って組織接触表面まで輸送するほか、イオン導入法によって、帯電した薬剤の組織内への輸送を促進し、かつ／または可能にし得る。本発明の実施形態では、超音波および電流を交互にまたは同時に組み合わせて使用する複数の送達様式を用い得る。したがって、層６１８が、電極としての役割を果たす材料を含むか、あるいはそのような材料となるよう、これをさらに改変することができる。電極は、正に帯電していても負に帯電していてもよく、これを用いて静的電場または動的電場を発生させる。隣接する薬剤キャリア層の上面に細孔がなく、隣接する薬剤キャリア層が導電性でない材料でできている場合、電極と、マイクロチャネルまたはリザーバ内に収納されているイオンまたは帯電した薬剤とが接触することはないが、電極上に存在する極性と同じ極性のイオンおよび帯電した薬剤であれば反発する。隣接する薬剤キャリア層が導電性の材料でできており、隣接する薬剤キャリア層に穴がない場合、マイクロチャネルまたはリザーバ内に収納されているイオンまたは帯電した薬剤によって確立された導電性が存在する。この状況は、隣接する薬剤キャリア層の表面が細孔を有し（かつ隣接する薬剤キャリア層の導電性に依存しない）、電極がマイクロチャネルまたはリザーバ内に収納されているイオンまたは帯電した薬剤と直接接触している場合と機能的に同等であり、この場合、層６１８と逆の極性のさらなる電極を標的組織上にまたはこれに隣接させて設置することができる。電気回路を完成させるため、標的組織上にまたはこれに隣接させて設置した電極を、塗布装置の薬剤キャリア、塗布具ハンドルをはじめとする構成要素に接続し得る（不掲載）。電圧を加えると、層６１８の電極と同じ極性の帯電した薬剤が、薬剤キャリア本体６０１のマイクロチャネル内に収納されている流体に流れ込み、薬剤キャリアから細孔を出て組織表面まで移動し、イオン導入によって組織内に送達されるのに必要なエネルギーが供給され得る。
【０１６４】
これは、薬剤キャリアが電圧を発生させて、電流の流れが帯電した薬剤を薬剤キャリアから細孔を出て組織まで輸送するのを促進することが可能な代替的実施形態となる。
【０１６５】
いくつかの実施形態では、薬剤キャリア本体は、帯電した薬剤を薬剤キャリアを通り細孔を出て標的組織まで輸送するのを促進する電極を含む（層６１８と同様に）か、それ自体がそのような電極となる。電極は、積層物に隣接して設置されていても、積層物の中に組み込まれた電極層であっても（層６１８と同様に）よい。
【０１６６】
上記の実施形態では、超音波エネルギーおよび／または電圧によって、薬剤が薬剤キャリアの中をその組織接触表面まで移動するのに必要なエネルギーが供給され、この場合、超音波導入法および／またはイオン導入法によって薬剤を標的組織内に送達することが可能である。
【０１６７】
上記の実施形態で理解されるように、組織接触表面、例えば４２２、４２２’、４２２’’、５０２、６１０を含む層は、図８Ａ〜１０および図２３〜２８のいずれか１つに記載されているもののように、少なくとも一部が複数の突起部によって画定される組織接触表面を含む層であり得る。
【０１６８】
図７Ａおよび７Ｂは、本発明の一実施形態による薬剤キャリア本体を形成する積層物の穴およびその穴によって画定されるチャネルの実施形態を図示したものである。図７Ａは、２つの層７０２および７０４を含む積層物７００を図示したものである。層７０２は、組織接触表面から層７０４よりも遠い位置にある層である。層７０２は複数の穴７０６を含み、層７０４は、穴の集合体７０８として配置された複数の穴を含む。これらの層７０４、７０２は、積層物７００で互いに隣接して配置されている。層７０４の穴の集合体７０８はそれぞれ層７０２の穴７０６と一直線に整列している。層７０４の穴は、層７０２の穴よりも数が多く、小さい。装置を組み立てるときに層の整列を容易にするため、層７０２、７０４はそれぞれ、層の配列を明確に示す基準点または基準構造７０７、７０７’を備え得る。このため、所定の方法で配列されたそれぞれの基準点７０７、７０７’に合わせて層を整列させて（例えば、互いに一直線に整列させて）層７０２、７０４それぞれの穴を正確に整列させ、それにより、積層物７００の複数の層の中を伸長するマイクロチャネルを形成することができる。
【０１６９】
図７Ｂは、薬剤キャリア本体の変形形態および異なる積層の様々な大きさの穴の間での整列をさらに図示したものである。穴７０６’は穴７０６を拡大したものである。穴７０６’は、隣接する次の積層の第一の穴の集合体７０８（点線で示す）に重なる。穴７０８’は穴７０８を拡大したものである。穴７０８’は、隣接する次の積層の対応する穴の集合体７１０（点線で示す）に重なる。同様に、７１０’は穴７１０を拡大したものである。穴７１０’は、隣接する次の積層の対応する穴の集合体７１２（点線で示す）に重なる。穴７１２’は穴７１２を拡大したものであるなど、最後の層までこれが続く。
【０１７０】
最上層から中間層を通って表面接触層まで進むに従って、穴の直径が小さくなり、穴の数が多くなるように複数の層を配置することができる。次の層はそれぞれ、隣接する次の層の穴と一直線に整列する穴の集合体を含む。例えば、第一の層（最上層であっても、中間層の上方の層であってもよい）は複数の穴を有する。この第一の層は第二の層に重なり、ここでは、第二の層は第一の層の穴の下に配置される穴の集合体を有する。この第二の層は第三の層に重なってよく、第二の層の穴の集合体それぞれの各穴は、第三の層のより小さな穴のさらなる集合体に重なる（このようにして、さらに層を追加してもよい）。
【０１７１】
チャネルは、薬剤キャリア本体を通って組織表面までの薬剤の流路を画定するものである。チャネルはまず、最初の有穴層の穴の直径によって画定される。これに続く層は、この最初の有穴層の穴と一直線に整列している穴の集合体を有する。したがって、最初の有穴層からそれに続く層に進むに従って、チャネルが多数の枝管に分岐する。これらの多数
の枝管はいずれもチャネルの一部を形成することが理解されよう。
【０１７２】
微小製造工程によって作製したマイクロチャネルの例を詳細に示す拡大像を図７Ｃ、７Ｄおよび７Ｅに示す。図７Ｃおよび７Ｄ（７Ｄは７Ｃの倍率を高めたものを示している）は、穴の断面が正方形である層を示している。図７Ｅは、断面が正方形および六角形である穴を含む層を示している。
【０１７３】
３．突起部をベースとする実施形態
以下の一連の実施形態は、一緒に薬剤キャリア本体の組織接触表面を画定するミクロンスケールの突起部から形成される複数の微細構造物を含むものである。これらのマイクロスケール構造物は標的組織と接触し、送達する薬剤に取り囲まれている。好ましい形態では、薬剤キャリア本体は、末端構造物、通常は突起部を取り囲む壁を有し、使用する薬剤を収納する。この実施形態は、マイクロチャネルからなる薬剤キャリア本体よりも薬剤キャリア本体内の流体に対する微細構造物の比が小さい。これらの実施形態は、突起部のほかにも、可能性として末端構造物を介して、超音波発生源と標的組織との間の直接的接触を維持するのが好ましい。理解されるように、超音波の適用は一般に、上の概要に記載したパラメータに従うものとなる。
【０１７４】
より具体的には、治療中の組織を咬持する組織接触表面を含み、組織接触表面の少なくとも一部が複数の突起部によって画定される薬剤キャリア本体を用いる実施形態を図８Ａ〜１０および図２３〜３０Ａにいくつか示す。突起部は、空隙の内側から外に向かって伸長し、前記組織接触表面で終端になるのが好ましい。空隙は末端構造物によって形成されているものであり得、前記末端構造物の少なくとも一部は組織接触表面で終端になり得る。
【０１７５】
いくつかの実施形態では、末端構造物は突起部と同じ表面で終端になる。他の実施形態では、組織接触表面を画定する前記突起部の少なくとも一部は、空隙から外に向かって末端構造物を超えて伸長している。いくつかの実施形態では、突起部は、ある平面で終端になり得、末端構造物は、突起部が末端構造物を超えて伸長するように、その平面に達する前で終端になり得る。
【０１７６】
このような実施形態では、好ましい実施形態の突起部が微小針としての役割を果たすことはないことに留意するべきである。好ましい実施形態の突起部は、微小針とは異なり、組織のいかなる層も貫通することを目的とするものではない。突起部の機能としては、圧力を加えて表面に摩擦力を生じさせることによって標的組織を咬持することが挙げられる。これにより、（例えば、滑りやすい粘膜表面での）装置の位置決めが容易になり、超音波導入作用が促進される。
【０１７７】
理解されるように、これらの図面に例示される薬剤キャリア本体は、本明細書に図示される任意の薬剤キャリア本体、例えば、薬剤キャリア本体１０４、８１０、９０２、９０３、９０３’、９０３’’、９０３’’’、９０３’’’’および１３０２の代わりに、あるいは本明細書に記載されるいずれかの薬剤キャリア、例えば、薬剤キャリア３００、８００、８００’および９００、９００’、９００’’、９００’’’、９００’’’’とともに使用することができる。
【０１７８】
好ましい実施形態では、突起部は以下の特性を有する：
先端が針様ではない、すなわち、先端の幅がほぼ０になるまで減少しないよう、ある点までは細くならない。
少なくとも先端付近では、最も好ましくはその長さ全体にわたって、断面が比較的一定である。ほとんどの場合、幅は、その先端に向かって狭くなる割合は２０％以下、好まし
くは１０％未満である。
通常、先端の幅が１０μｍよりも大きい。したがって、突起部のスケールも一般に微小針のものとは異なる。
標的組織の無傷の上皮表面に侵入することはない。
装置を組織に接触させて置くときに加わる摩擦力によって、装置を安定させるのに役立る。このことは、局所的な粘液分泌により表面の摩擦力が小さくなる傾向にある粘膜に対して特に有利である。
一般に、縦横アスペクト比（最短の断面幅のもの）が１：１〜１０：１である。これよりも大きいアスペクト比を用いてもよいが、操作、装填および損傷を与えない超音波エネルギー適用に耐え得る許容される強度を得るのが難しくなる。理解されるように、断面の形状は突起部の強度に大きな影響を及ぼすものであり、しかるべく選択される。
【０１７９】
好ましい実施形態では、突起部は、薬剤を保持して突起部を取り囲む体積の５％超を占める。この割合は、毛管力をはじめとする力によって、通常の操作によって生じる重力をはじめとする力に逆らって薬剤を薬剤キャリア本体内に保持できるよう十分に高くする必要がある。水様薬剤とともに用いる実施形態では通常、突起の密度は５％超、最も好ましくは１０％超である。このほか、薬剤が粘度の高いもの（例えば、タンパク質含有量の多い薬剤）になるにつれて、突起部の密度あるいはその大きさおよび／または壁表面積を小さくし得ることが理解されるべきである。
【０１８０】
薬剤キャリア本体および一緒に薬剤キャリア本体の組織接触表面を画定する複数の突起部を含む薬剤キャリア本体の層の代替的実施形態の模式図を図８Ａ〜８Ｇに示す。
【０１８１】
この実施形態では、輸送刺激を介した組織への薬剤送達に薬剤キャリア本体７５０を用いることができる。薬剤キャリア本体７５０は、治療中の組織を咬持する組織接触表面７５２を含む。この例では、組織接触表面は、少なくとも一部が複数の突起部７５４によって画定される。
【０１８２】
突起部７５４は任意の形状のものであってよいが、この例では一般に円柱状である。突起部は、その長さに沿って一定の断面形状を有するのが好ましい。突起部７５４は、薬剤キャリア本体７５０内に形成された空隙７５６の内側から外に向かって伸長している。外側端部７５８は、薬剤キャリア本体７５０の組織接触表面の少なくとも一部を画定している。
【０１８３】
空隙７５６は末端構造物７６０によって形成され、同構造物はこの場合、周壁または枠の形態をとる。枠７６０も組織接触表面７５２の一部を画定している。
【０１８４】
この実施形態の末端構造物７６０は、突起部と同じ平面で終端となって、平面状の組織接触表面７５２を画定している。しかし、他の実施形態では、前記突起部７５４の少なくとも一部が末端構造物を超えて伸長し、かつ／または末端構造物に達する前に終わっているため、組織接触表面７５２は平面状ではない。いくつかの実施形態では、いずれの突起部７５４も末端構造物７６０を超えて伸長している。
【０１８５】
空隙７５４は、薬剤キャリア本体７５０内に薬剤を保持するリザーバとしての役割を果たす。しかし、このリザーバは、前の実施形態とは異なり、薬剤キャリア本体の組織接触表面側に位置している。
【０１８６】
突起部７５４は、リザーバ内の薬剤と流体接続するようにリザーバ内に位置している。これにより、突起部７５４が薬剤キャリア本体７５０内の薬剤に作用し、薬剤中に輸送刺激を伝えることが可能になるのに対し、上記の実施形態では、マイクロチャネルの壁が薬
剤キャリア本体内の薬剤に作用する。
【０１８７】
この種類の実施形態は一般に、薬剤を保持する容積が上記の実施形態よりも大きい。充填容積が大きくなることにより、空気が閉じ込められる可能性も低くなる。このように充填特性が改善されることにより、特定の実施形態では充填の精度および再現性が改善され、医療用途に重要となり得る用量の精度の向上に寄与し得る。さらに、充填が改善されると、空気間隙の保持による減衰が抑えられるため、超音波エネルギーの伝播が向上し得る。
【０１８８】
空隙７５４の内表面（１つまたは複数）は官能化されているのが好ましい。空隙７５４および突起部７５２の内表面は、疎水特性もしくは親水特性またはその両部分の組合せを有する化合物または分子で官能化し得る。あるいは、チャネルの表面に小分子を接触させてチャネルの表面に吸着させ、所望の物理的および／または化学的特性を有する特定の官能基を露出させることによって、空隙７５４および突起部７５２の表面を官能化し得る。小分子は、化学吸着または物理吸着によりチャネルの内部表面に吸着させ得る。水／油親和性を変化させることに代えて、またはこれに加えて、マイクロチャネルおよび／または薬剤リザーバの内表面を導電性にすることによって、これを官能化し得る。好ましい形態では、薬剤キャリアが薬剤と接触したときの毛管力によって、薬剤キャリア本体の装填を実施する。
【０１８９】
図８Ｃおよび８Ｄに薬剤キャリア本体の層７５０’を示す。薬剤キャリア本体の層７５０’は一般に、薬剤キャリア本体７５０と同じものであり、同じ特徴には同じ番号が付してある。しかし、薬剤キャリア本体の層７５０’は、その中を伸長する１つまたは複数のマイクロチャネル７６２をさらに含む。マイクロチャネル７６２は、前の実施形態のように、リザーバ７５６が隣接する薬剤キャリア本体の層と流体接続し得るように薬剤キャリア本体の層の中を伸長している。この例では、４つのマイクロチャネルを用いている。
【０１９０】
図８Ｅおよび８Ｆは、中に形成されたリザーバを有する薬剤キャリア本体の層の略図である。薬剤キャリア本体の層７６４は一般に、形態が円柱状であり、内部のリザーバ容積７７０を画定する周壁７６６を含む。使用時、薬剤キャリア本体の層７６４が薬剤キャリア本体の層７５０’の上に積み重なることにより、壁７６６の外枠７６８が薬剤キャリア本体の層７５０’の背面と接触してリザーバ容積７７０が閉じられる。薬剤キャリア本体の層７５０’のマイクロチャネル７６２は、リザーバ容積７７０内の薬剤を通過させて、投薬用のリザーバ７５６内に入れる。
【０１９１】
図８Ｇおよび８Ｈは、図８Ｅおよび８Ｆの薬剤キャリア本体の層に図８Ｃおよび８Ｄの薬剤キャリア本体の層を積み重ねて薬剤キャリア本体７８０を形成することによって形成した薬剤キャリア本体の略図である。薬剤キャリア本体７８０は、組織接触表面７５２を含む組織接触層７５０’と、もう１つの層７６４とを含む、積層物を含む。さらに多くの層を積み重ねて薬剤キャリア本体を形成することも可能である。
【０１９２】
図８Ｈでは、薬剤キャリア本体７８０に薬剤を充填した状態で示している。この形態では、薬剤が組織接触表面７５２まで充填される。
【０１９３】
図９Ａは、図８Ａ〜８Ｈに模式的に示した種類の薬剤キャリア本体（またはその層）の一部を示す電子顕微鏡像である。図９Ａは、突起部７５４として働く３つの柱状物７８２の一部を示している。表面７８４は、柱状物７８２が伸長する空隙７５６の土台となっている。図９Ｂは、また別の柱状物７８６の一部分を接写したものを示す電子顕微鏡像である。これらの実施形態のそれぞれのスケールからわかるように、柱状物７８２および７８６は幅が約２００マイクロメートルであり、高さもこれとほぼ同じである。しかし、他の
実施形態では、異なる高さおよび幅を用い得る。
【０１９４】
図１０は一連の４つのマスクデザインを示しており、それぞれがその薬剤キャリア本体（またはその層）を形成するのに適している。これらのマスクは、薬剤キャリアの組織接触表面の突起部および末端構造物を形成するマイクロマシニング工程に使用するものである。突起部は、あるパターン、この例では規則的な配列で配置されている。
【０１９５】
図１０では、各装置（装置１〜４）のマスクは、正方形の周壁を画定する第一のマスク区画７９２を含む。装置１は、５×５の配列で配置された２５個のマスクが配列した区画７９４を含み、突起部の５×５の配列を形成している。装置２は、４×４の配列で配置された１６個のマスクが配列した区画７９４を含み、突起部の４×４の配列を形成している。装置３は、３×３の配列で配置された９個のマスクが配列した区画７９４を含み、突起部の３×３の配列を形成している。装置４も、４×４の配列で配置された１６個のマスクが配列した区画７９４を含み、突起部の４×４の配列を形成している。図からわかるように、装置４の突起部は、装置２のものよりも間隔が広くなっている。本発明の諸実施形態の突起部の高さは、所望の容積を有する空隙が形成されるよう選択することができる。いくつかの実施形態では、突起部は高さが２００μｍ超であり得る。いくつかの形態では、それらは高さが１ｍｍ未満であり得る。いくつかの実施形態では、突起部は高さが３００μｍ超であり得る。いくつかの形態では、それらは高さが８００μｍ未満であり得る。いくつかの実施形態では、突起部は高さが４００μｍ超であり得る。いくつかの形態では、それらは高さが７００μｍ未満であり得る。いくつかの実施形態では、突起部は高さが５００μ超であり得る。いくつかの形態では、それらは高さが６００μｍ未満であり得る。いくつかの実施形態では、１ｍｍ超または２００μｍ未満の高さを用い得る。
【０１９６】
図２３に、様々な薬剤キャリア本体（またはその層）を作製するための（ａ）〜（ｇ）の一連のマスクデザインを示す。図（ａ）〜（ｅ）は円形の突起部７９４を有する実施形態であるのに対し、図（ｆ）および（ｇ）は平面図で十字形の突起部７９４を有する実施形態である。これらの実施形態を以下の表にまとめる。
【０１９７】
【表１】
2020195881.tif 000002
【０１９８】
これらの実施形態は決して網羅的なものではなく、突起部の寸法、間隔、断面形状が異なる代替的実施形態が多数案出され得ることが理解されよう。このほか、これらの実施形態は、参照番号７９２と命名される正方形の枠に含まれるが、これ以外の形状も用いるこ
とができることも留意するべきである。さらに、突起部の配列は、規則的な配列である必要も、チップ全体で均一な密度または分布を有する必要もない。ある実施形態に用いる突起部７９４は、すべてが同じ断面形状を有する必要がない。
【０１９９】
例（ｆ）および（ｇ）は十字形の突起部７９４を有する。十字形の突起部には、円形の突起部に比して壁の表面積が大きいが、断面積は小さく、このため薬剤貯蔵容積が最大限になるという利点がある。十字形の突起部の表面形状はほかにも、各アームが横方向に伸長するアームを支える支持物として働く限り、比較的優れた機械的特性を有する。
【０２００】
図２４〜２８に、薬剤キャリア本体およびその諸領域の一連の電子顕微鏡像を示す。図２４（ａ）〜（ｃ）は第一の実施形態を示している。この実施形態は、空隙７８４から上に向かって伸長している４×４の配列の十字形の突起部７８２を有する。空隙７８４は、前の実施形態のように、周壁７８５によって取り囲まれている。使用時、空隙７８４をリザーバとして用いることにより、送達する薬剤を薬剤キャリア本体内に保持する。図からわかるように、突起部７８２は、その高さ全体にわたって断面形状が十字形であるが、その幅は変化している。この変化は、特にその先端付近で比較的小さいため、薬剤キャリア本体の組織接触表面を形成する最上部面は実質的に平坦である。この実施形態では、周壁７８５は高さが約０．５ｍｍであり、極めて厳密に言えば４８４．８９μｍである。各突起部は実質的に同じ長さである。この実施形態の断面形状の幅は３１．１１μｍである。これは、５０μｍのマスクによって画定される名目上の断面と比較したものであり、突起部がほぼ４０％先細であることを表す。しかし、図からわかるように、突起部は先端に向かって少し細くなっているものの、微小針のように鋭いものではない。この平坦な表面および複数の密に詰まった突起部が、上記の実施形態による表面の機械的損傷または貫通を防ぐ。
【０２０１】
図２４（ｄ）は、同じくほぼ正方形の周囲枠７８５によって取り囲まれた十字形の突起部７８２を有するさらなる実施形態である。この例では、突起部は３×３のパターンで配置されている。
【０２０２】
図２５（ａ）〜（ｅ）は、円形の断面を有するいくつかの実施形態の電子顕微鏡像である。同じ特徴には同じ番号が付してあり、詳細には記載しない。しかし、図からわかるように、突起部７８２がその先端に向かって細くなっているものの、その先端は平坦であり、微小針のように尖ってはいない。この実施形態でも同じく、突起部は高さが約０．５ｍｍ（写真（ｂ）に示されるように、５２５．２５μｍ）である。図２５に示されるように、突起部の先端の直径は１８４．０２μｍである。
【０２０３】
図２６（ａ）〜（ｄ）は、十字形の断面（ａ）および円形の断面（ｂ）〜（ｄ）を有するいくつかのさらなる実施形態の電子顕微鏡像である。この例では、突起部７８２の側面が前の実施形態よりも垂直である。つまり、その側面は前の実施形態よりも先細りの程度が少ない。このことは写真（ａ）〜（ｃ）で最も顕著である。
【０２０４】
図２７（ａ）〜（ｄ）は、円形の断面を有する突起部を有するいくつかのさらなる実施形態の電子顕微鏡像である。これらの実施形態でも同じく、突出部７８２の側面が前の実施形態よりも垂直である。周壁および突起部の高さも同じく約０．５ｍｍである。最後の２つの実施形態を図２８（ａ）および（ｂ）に示す。これらの例は、それぞれ４×４の配列および５×５の配列である。
【０２０５】
この顕微鏡像では、突起部が底部でも先細りになっている。この先細りは、製造時に用いたエッチング工程の結果であり、ほとんど意図的なものではない。しかし、いくつかの実施形態では、この先細りによって、薬剤を保持する空隙の容積が増大するため、これを
活用することができる。
【０２０６】
４．混合型代替的実施形態
図２９および３０に、薬剤キャリア本体の２つの混合型実施形態を示す。図２９では、薬剤キャリア本体１０４は、その周縁部を取り囲んで配置された複数のマイクロチャネル１１２を枠７８５内に含む。同薬剤キャリア本体はほかにも、中央の空隙７８４の中に形成された突起部７８２の配列を有する。
【０２０７】
図３０および３０Ａに、突起部をベースとする実施形態であると見なすことができるが、凹凸のある枠または特定の輪郭を有する枠を有する代替的実施形態を示す。この場合、薬剤キャリア本体はスプライン加工されている周囲枠７８５を有する。枠７８５は、周縁部から空隙７８４まで枠７８５の中を伸長する一連のチャネルまたは窓７８５Ａを有する。空隙７８４にはほかにも、３×３の配列の突起部７８２が含まれている。配置をさらによく示すため、線３０Ａ−３０Ａに沿った断面を図３０Ａに示す。
【０２０８】
このほか、可能性としては配列などのパターンで配置された複数の薬剤キャリア本体を有する薬剤キャリアが提供され得る。
【０２０９】
５．装填および使用の例
図１１Ａ、１１Ｂおよび１１Ｃに、薬剤キャリア内に薬剤リザーバを薬剤キャリア本体とは別個の構成要素として備えた実施形態を示す。
【０２１０】
図１１Ａは、本発明のさらなる実施形態による薬剤塗布具の一部分を示している。この図には、塗布具チップ８００と手持式薬剤塗布装置のハンドル部分とを連結する連結棒８０２に装着された塗布具チップ８００の実施形態が示されている。塗布具チップ８００は、チップの収納部８０３内に形成された薬剤リザーバ８０４を含む。収納部８０３はほかにも、薬剤キャリア本体を収容するくぼみ領域８０６を含む。薬剤リザーバ８０４は入口８０８を含む。入口８０８は、複数の異なる用途のために設計され得る。ある特定の実施形態では、薬剤リザーバ８０４に薬剤を注入するのに入口８０８を用い得る。他の実施形態では、薬剤リザーバ８０４に真空をかけてリザーバ８０４内に薬剤を吸い込むのに入口８０８を用い得る。
【０２１１】
図１１Ｂは、薬剤キャリア本体８１０がくぼみ領域８０６（薬剤キャリア本体８１０の存在によって見えない）に挿入された塗布具チップ８００’を示している。図１１Ａの説明から理解されるように、入口８０８’に吸引をかけ、薬剤キャリア本体８１０の中のマイクロチャネルを介して薬剤を吸い込むことによって、薬剤リザーバ８０４’に薬剤を充填し、リザーバ８０４に保管／保持し得る。あるいは、入口８０８’を用いて薬剤リザーバ８０４’に薬剤を直接注入した後、リザーバ８０４’および薬剤キャリア８１０のマイクロチャネルを薬剤で満たし得る。
【０２１２】
図１１Ｃは、塗布具チップ８００’’のさらなる実施形態を示しており、この実施形態は上記のものとほぼ同じであるため、対応する特徴には同じ番号を付し、実施形態から変更したことを示すため、その番号に二重プライム記号を付してある。塗布具チップ８００’’は連結棒８０２’’と接続されている。同塗布具チップは、薬剤リザーバ８０４’’と、積み重なった薬剤キャリア本体８１０’’とを含む。その他の箇所については前の例と同じである。
【０２１３】
薬剤キャリアに薬剤および／またはその他の物質を充填する機序、改変および方法であって、システムによる薬剤の装填、保持および送達に役立つものを図１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ、１２Ｄおよび１２Ｅに示す。
【０２１４】
図１２Ａ〜１２Ｅに概略的に示した装填機序はこのほか、薬剤を装填する前に薬剤キャリアまたはその空洞の表面を親水性または疎水性の部分で裏打ちするか、電荷を伝導することができ、かつ／または薬剤を装填する前に電場の発生もしくは伝播に関与することができる部分で裏打ちする方法として、単独で、または組み合わせて用い得る。
【０２１５】
図１２Ａは、薬剤キャリアに薬剤を充填する方法の実施形態を示している。この実施形態では、薬剤キャリア本体９０２を含む塗布具チップ９００が、その連結棒９０８を介して手持式薬剤塗布装置（不掲載）と接続されている。薬剤キャリア本体９０２は、少なくとも一部が薬剤９０６を含む容器９０４に浸かっている。薬剤塗布装置の超音波振動子によって発生した超音波振動が、連結棒９０８を介して塗布具チップ９００を通り、薬剤キャリア本体９０２に伝わる。この振動はマイクロチャネルから空気を排出し、薬剤キャリア本体９０２内のマイクロチャネルおよび／または薬剤リザーバの少なくとも一部に薬剤９０６を充填する。
【０２１６】
図１２Ｂは、薬剤キャリアに薬剤を充填する方法の別の実施形態を示している。この実施形態では、薬剤キャリアは取外し可能な塗布具チップ９００’になっている。塗布具チップ９００’および／または別個の薬剤キャリア本体９０３は、少なくとも一部が薬剤９０６’を含む容器９０４’に浸かっている。外部の発生源９１０によって発生した超音波振動が容器９０４’に加わり、これにより、塗布具チップ９００’に含まれる薬剤キャリアのマイクロチャネルおよび／または薬剤リザーバ（不掲載）ならびに／あるいは別個の薬剤キャリア本体９０３から空気が排出され、塗布具チップ９００’内の薬剤キャリアのマイクロチャネルおよび／または薬剤リザーバならびに／あるいは別個の薬剤キャリア本体９０３の少なくとも一部に薬剤９０６’を充填する。他の実施形態では、超音波振動を加えず、単に薬剤キャリアまたは薬剤キャリア本体を浸漬することによって装填を実施し得る。
【０２１７】
図１２Ｃは真空チャンバ９１２を示している。入口９１４に真空をかけて、チャンバ９１２の空気のほか、塗布具チップ９００’’内に保持されている薬剤キャリアのマイクロチャネルおよび／または薬剤リザーバあるいは別個の薬剤キャリア本体９０３’の中の空気を除去する。真空をかけ終えると、薬剤入口９１６を制御するバルブが開き、チャンバ９１７内に保管されていた薬剤が、薬剤入口９１６を通ってチャンバ９１２内に吸い込まれ、塗布具チップ９００’’内の薬剤キャリア本体９０２’’のマイクロチャネルおよび／または薬剤リザーバならびに／あるいは別個の薬剤キャリア本体９０３’の中に吸い込まれる。薬剤は、薬剤キャリア（１つまたは複数）の組織接触表面の細孔を通って進入する。薬剤が充填された後、薬剤を含有する流体から塗布具チップ９００’’および／または別個の薬剤キャリア本体９０３’を取り出し、露出した表面に密封層を被せ得る。
【０２１８】
図１２Ｄは、真空を用いて薬剤キャリア本体９０３’’’に薬剤９０６’’’を充填する方法の別の実施形態を示している。薬剤９０６’’’は容器９０４’’’内に保持されている。薬剤キャリア９０３’’’は容器９０４’’’内にあり、薬剤キャリア本体９０３’’’の組織接触表面９２０の細孔が薬剤溶液９０６’’’中にあるように、同薬剤キャリア本体の少なくとも一部が浸かっている。入口９１８に真空をかけて、薬剤キャリア９０３’’’のマイクロチャネルから薬剤溶液を吸い上げ、マイクロチャネルおよび／または薬剤リザーバの少なくとも一部に薬剤溶液９０６’’’を充填する。
【０２１９】
薬剤キャリア本体に薬剤を充填する方法のまた別の実施形態では、薬剤を直接入口に注入し、薬剤キャリア（すなわち、マイクロチャネルおよび／または薬剤リザーバ）の中の空気を排出して薬剤と入れ替えることができる。
【０２２０】
図１２Ｅは、図１２Ｄのものとほぼ同じ方法を示しているが、薬剤キャリア本体９０２’’’を有する塗布具チップ９００’’’’に薬剤を充填するようになっている。塗布具チップ９００’’’’は、塗布具チップが、薬剤キャリア本体９０２’’’内に形成された任意のリザーバとは別個の収納部内にリザーバ９２１を含むことがわかるように、断面で示されている。塗布具チップ９００’’’’はリザーバ９２１につながる真空入口９２２を含む。上記のように、真空入口９２２に真空を加えると、薬剤キャリア本体９０２’’’のマイクロチャネルを通って薬剤溶液が吸い上げられ、薬剤キャリア本体９０２’’’または塗布具チップ９００’’’’の収納部のいずれかのマイクロチャネルおよび／または薬剤リザーバの少なくとも一部に薬剤溶液９０６’’’’が充填される。
【０２２１】
薬剤キャリアまたは薬剤キャリアを有する塗布具チップに薬剤を充填する方法のまた別の実施形態では、薬剤を直接入口に注入し、薬剤キャリア（例えば、マイクロチャネルおよび／または薬剤リザーバ）の中の空気を排出して薬剤と入れ替えることができる。
【０２２２】
理解されるように、上記の装填技術は、本明細書に記載されているか、考案される、適切なマイクロチャネル、混合型または突起部をベースとする薬剤キャリア本体とともに用いることができる。しかし、薬剤リザーバに直接つながることが可能な薬剤キャリア本体または薬剤キャリアは、薬剤を直接リザーバに入れる、例えば薬剤をピペットでリザーバに入れることによって装填し得る。下に記載する実験では、このような機序の１つの例を用いた。この例では、突起部をベースとする薬剤キャリア本体の薬剤キャリア本体の組織接触表面の空隙に薬剤をピペットで入れる。同様にして、薬剤キャリア本体の背面のリザーバに薬剤をピペットで入れ、マイクロチャネルを通して組織接触表面に送達する。
【０２２３】
薬剤キャリアは、空の薬剤キャリアまたは薬剤の入った充填済みの薬剤キャリアのいずれかで提供され得る。空の薬剤キャリアが提供される場合、末端使用者が使用前に薬剤を薬剤キャリアに充填する必要がある。
【０２２４】
本発明はこのほか、薬剤キャリアに薬剤を充填し、薬剤キャリアから薬剤を放出する方法に関する。
【０２２５】
薬剤キャリアから薬剤を放出する、または組織表面に薬剤を投薬する方法は、薬剤キャリアを組織表面に当てることと、薬剤キャリアから組織表面に薬剤を投薬することとを含む。薬剤を投薬する過程は、組織表面に超音波を当てて、超音波導入により組織内への薬剤の浸透を促進することを含むのが好ましい。
【０２２６】
上記のことから理解されるように、薬剤キャリアまたは薬剤キャリア本体そのものは、薬剤塗布装置から分離可能なアイテムである。好ましい形態では、薬剤キャリアまたは薬剤キャリア本体は、取外し可能または交換可能な使い捨てアイテムである。このことは、医療に使用するのに必要な滅菌に役立ち、とりわけ、患者間で用いる手持式薬剤塗布装置の清浄化および滅菌を容易にする。好ましい実施形態の固い物理的性質により、取替え可能な状況下での薬剤キャリアの取付けおよび操作が容易になる。さらに、薬剤を入れる薬剤キャリア本体に固い材料を使用することにより、薬剤キャリアへの薬剤の装填、予め薬剤を装填した薬剤キャリア本体の包装、操作が容易になる。重要なのは、薬剤キャリア本体に固い材料を使用することにより、薬剤を薬剤キャリアの中を移動させるのに用いる超音波が伝播しやすくなるほか、超音波導入による標的組織内への薬剤の浸入が促進され、かつ／または可能になる。
【０２２７】
図１３Ａおよび１３Ｂに、塗布具チップ形態の薬剤キャリアの一実施形態を示す。塗布具チップ１３００は概略的には、図１に示される塗布具チップ１０２と同じものである。この例では、薬剤キャリア１３００は、取外し可能で交換可能な薬剤キャリア本体を有す
る塗布具チップの形態をとる。
【０２２８】
薬剤キャリア１３００は、以下の主な構成要素、つまり、薬剤キャリア本体１３０２と、チップ本体１３０４および薬剤キャリア本体保持キャップ１３０６を含むチップ収納部１３０３とを含む。
【０２２９】
薬剤キャリア本体１３０２は一般に、平面図では直線で囲まれており、この例では正方形である。薬剤キャリア本体１３０２は、上記の例または本明細書に記載される態様のうちのいずれか１つに従って作製され得る。薬剤キャリア本体１３０２は組織接触表面１３０４を有する。
【０２３０】
チップ本体１３０４には、薬剤キャリア１３００と薬剤塗布装置とを接続することと、超音波エネルギーの形態の伝導刺激を薬剤キャリア本体１３０２に伝えることの両方の役割がある。これを達成するため、チップ本体１３０４は、その第一の端部にねじ山の形態の取付機構１３０５を備えている。取付機構１３０５は、対応するハンドルアセンブリのコネクタと機械的に接続するのに用いられる。チップ本体１３０４の第二の端部は、合せ面１３０７を介して超音波エネルギーを薬剤キャリア本体１３０２に伝える角として働く。
【０２３１】
薬剤キャリア本体保持キャップ１３０６には、薬剤キャリア本体１３０２を保持し、それを合せ面１３０７と接触させておく役割がある。薬剤キャリア本体保持キャップ１３０６には、その中に形成された開口部１３１０があり、使用時にそこから薬剤キャリア本体１３０２の組織接触表面１３０８が露出する。薬剤キャリア本体保持キャップ１３０６は、ねじ山を用いてチップ本体１３０４に取り付けられる。
【０２３２】
理解されるように、このようなシステムには、作製することが可能な形態的変形形態および機械的変形形態が多数存在する。例えば、薬剤キャリア本体およびそれに付随する組織接触表面を含めた構成要素の形状を変化させ得る。この正方形の実施形態は、半導体材料から薬剤キャリア本体を作製し、その製造工程が正方形の構成要素を生産するのに最も都合がよい場合に特に好都合である。輸送刺激として超音波エネルギーを用いる場合、超音波エネルギーの伝導が最大限に高められるようチップ本体の形状を変化させ得る。薬剤キャリア本体の組織接触表面を露出させる開口部の形状を変化させてもよい。いくつかの場合には、それは薬剤キャリア本体の組織接触表面の形状と異なるものであり得る。
【０２３３】
薬剤キャリア保持キャップをチップ本体に咬持させる方法を様々に変化させて、任意の好都合な種類の機序を用いることができる。この例では、咬持はねじ山によるものであるが、非網羅的なリストまたは代替法を挙げると、薬剤キャリア保持キャップをチップ本体に圧入するか、留め金またはバヨネット式取付具で咬持させることも可能である。同様に、薬剤キャリア本体の取付機構を変化させて、任意の既知の連結機序を用いることができる。
【０２３４】
このほか、可能性としては配列などのパターンで配置された複数の薬剤キャリア本体を有する薬剤キャリアが提供され得る。
【０２３５】
６．試験の結果および治療の方法論
本発明のさらなる態様では、薬剤を生体組織、例えば動物、植物またはヒトに送達する方法が提供される。本明細書に記載される非侵襲性の薬剤塗布具の操作パラメータを選択的に選択することによって、組織内の選択した深度に送達される薬剤の量を制御し得るものと考えられる。
【０２３６】
制御する操作パラメータは、
塗布圧力；
超音波周波数；
超音波の波形；
超音波の方向；
超音波出力レベル；
超音波適用の持続時間；および
超音波動作周期．
のうちの１つまたは複数のものを含み得る。
【０２３７】
当業者には、特定の種類の組織への薬剤の塗布および特定の薬剤キャリア設計の使用によって所望の免疫応答を得るのに必要な最適な操作パラメータは、対象での臨床試験を含めた実験的試験によって決定することが可能であることが理解されよう。特に好ましい形態では、標的組織の所望の深度への薬剤の送達が制御されるよう操作パラメータを選択することができる。その１つの例として、薬剤の経上皮送達が主として角膜の実質内に起こるようシステムパラメータを設定することが考えられる。このことは、組織の中で最も有効であることがわかっている深度を選択して、薬物、ワクチンをはじめとする薬剤を送達する機会が得られるという点で有利である。
【０２３８】
この点に関して、本発明は一形態では、本明細書に記載される態様または実施形態のうちのいずれか１つの薬剤キャリア、薬剤キャリア本体または薬剤塗布具を用いて、組織内の選択した深度範囲または組織の１つもしくは複数の選択した層に送達される薬剤の量を制御する方法を提供する。
【０２３９】
好ましい形態では、この方法を用いて粘膜の免疫応答、好ましくは少なくとも粘膜免疫応答を優先的に誘導する。さらに、全身免疫応答も誘導され得る。この方法は、免疫応答、好ましくは粘膜免疫応答を誘導するため、粘膜内のある深度範囲に送達される薬剤の量を制御して、そのような組織のある深度に十分な用量の薬剤を（少なくとも一時的に）留まらせることを含む。さらに、超音波を（低出力レベルで）当てる時間を長くすると、より表層の組織層に選択的に送達される用量が増大することによって、粘膜免疫応答を誘導する能力が増強され得ると考えられる。
【０２４０】
また別の形態では、この方法を用い、上皮組織および上皮下組織層内およびその下層まで送達される薬剤の量を制御することによって、全身免疫応答を誘導する。前記薬剤は、前記応答を引き起こすのに十分な用量で投与する。本明細書に既に詳述したように、一部の薬剤は表皮および／または上皮下組織層に留まり得るが、全身免疫応答を誘導するのに十分な量がこれらの組織を通過する。
【０２４１】
組織深度範囲または組織の１つもしくは複数の選択した層に送達される薬剤の量を選択的に制御して粘膜免疫を誘導する実施形態は、単なる例としてインフルエンザ、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、ヒトパピローマウイルス、結核、麻疹、流行性耳下腺炎および百日咳を含めた粘膜から身体に入る感染症の治療または予防に用い得る。
【０２４２】
全身免疫は血液媒介感染症に有益である。全身免疫が好ましいものであり得る例には、Ｃ型肝炎ウイルス、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、マラリアおよび破傷風がある。
【０２４３】
薬剤を組織の複数の深度に同時にまたは逐次的に送達する有用な組合せ法を用いることができる。この方法はとりわけ、全身免疫および粘膜免疫の両方を誘導しようとするのに用い得る。
【０２４４】
実験的試験
本発明の実施形態を用いて組織に薬剤を良好に送達することができるかどうかを明らかにするため、マウスを用いて一連の実験を実施した。各場合の輸送刺激は超音波エネルギーのみとした。本実験では、薬剤が免疫系に提示され、免疫応答を誘導し得るかどうかを明らかにするため、本発明の実施形態を用い、超音波エネルギーのみを口唇の内側に当てて、ウイルスワクチンを投与した。研究者らは、全身免疫応答を引き起こすのに必要な時間の間装置を適用することによって口唇の粘膜が損傷を受けることはないことを実験２で明らかにした。
【０２４５】
以下の実施例に記載する方法論に加えて、特異的分泌型ＩｇＡ抗体が粘膜免疫系の優勢な抗体アイソタイプであることから、その抗体を検出することによって粘膜免疫をモニターまたは確認することができる。このクラスの抗体は、ヒトの粘膜分泌物に２つのアイソタイプ型、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２として存在し、二量体形態で産生される。このことにより、同抗体は安定性が高く、粘膜免疫の優れたマーカーとなる。
【０２４６】
６．１．実験の概要
実験１
図７ｃに示される本発明の実施形態に２つの薬剤キャリア本体（実験の考察では「マイクロチップ」と呼ぶ）を用いて、マウスに１匹当たり計約２〜５×１０６プラーク形成単位（ｐｆｕ）の蛍光標識組換えポックスウイルスベクター系ＨＩＶワクチンを接種した。
【０２４７】
ワクチン抗原を取り込んだ抗原提示細胞の割合（０．０２５〜０．０６８対０．０２５〜０．０２２）および流入領域リンパ節に動員された樹状細胞の割合（０．２５〜０．５４対０．２２〜０．４９）は、接種マウス、未接種マウスでそれぞれ同程度であった（図１および２）。重要な結論は、２つのマイクロチップのみを用いても免疫応答は誘導されなかったということである。
【０２４８】
実験２
マウスのプライミング１回当たり３つのマイクロチップを用い、ＨＩＶ抗原を発現する組換えポックスウイルスを用いた完全異種プライムブーストワクチン接種を実施し、鼻腔内（ｉ．ｎ．）投与でプライミングしたマウス（陽性対照）およびワクチンでプライミングしていないマウス（陰性対照）と応答を比較した。プライミングワクチン接種から２週間後、全マウスに筋肉内（ｉ．ｍ．）ブースターワクチン接種を実施した。
【０２４９】
脾臓のＨＩＶ特異的ＣＤ８  Ｔ細胞のパーセントを求めることにより、様々なワクチン接種経路によって誘導された全身免疫応答（血液区画の応答）の程度を評価した。本発明の実施形態を用いてワクチン接種したマウスのうち、１匹に陽性対照を上回る免疫応答がみられ、概念実証が示された。
【０２５０】
実験３
さらなる実験では、図１０に示される本発明の実施形態を用いて予備的プライムブーストワクチン接種実験を実施した。各実施形態によるマイクロチップを３つ用いた口唇送達システムでマウスを１匹当たり約２〜５×１０６ｐｆｕのＦＰＶ−ＨＩＶでプライミングした後、筋肉内ブースターワクチン接種を実施した。ＨＩＶ特異的ＣＤ８  Ｔ細胞のパーセントを用いて、誘導された免疫応答の程度を評価した。データから、マイクロチップ１（細胞１％）および２（０．６％）の方がマイクロチップ３および４（０．５％）よりも若干性能が優れていることがわかった。このほか、マイクロチップ１および２の方がマイクロチップ３および４よりも装填および送達時の性能が優れていることがわかった。
【０２５１】
実験４
図１０のマイクロチップ１および２を用いて完全プライムブーストワクチン接種実験を実施した。この実験では、ワクチン接種したグループそれぞれのマウスのうち１匹に鼻腔内陽性対照を上回る免疫応答が生じたのに対し、各グループのほかの２匹のマウスには経口ワクチン陰性対照群と同程度の応答がみられた。
【０２５２】
表１に実験１〜４それぞれの実験のパラメータおよび結果をまとめる。
【０２５３】
【表２】
2020195881.tif 000003
【０２５４】
実験５
この実験は、本発明の実施形態を用いて対象に送達したワクチンの取込みを明らかにしようとするものである。この実施例では、口唇に送達した。このほか、皮内（ｉ．ｄ．）取込みを評価するため、追加の実験を実施した。図１０のマイクロチップ１の設計を有する３×マイクロチップを用いてヌードマウスにワクチン接種した。マイクロチップには、
ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光抗原を発現する蛍光標識組換えポックスウイルスベクター系ＨＩＶワクチンを収納した。ワクチン接種から３時間後、６時間後、９時間後および２４時間後に生体イメージングを実施し、蛍光ワクチンの取込みおよび発現を経時的に評価した。データから、口唇送達が効果的であったほか、ｉ．ｄ．送達も効率的に機能することがわかった。マイクロチップ装置＃１はワクチン取込みに優れ、送達から３時間後に早くも抗原発現プロファイルが検出された。
【０２５５】
実験６
図１０のマイクロチップ装置＃１にＨＩＶ抗原を発現する組換えポックスウイルスを用いた異種プライムブーストワクチン接種を実施することにより、本発明の一実施形態を試験した。プライミングにＢＡＬＢ／ｃマウス１匹当たり３マイクロチップ用量（マウス１匹当たり約２〜５×１０６のＦＰＶ−ＨＩＶ）を用い、次いでプライミングワクチン接種から２週間後、１×１０７ＶＶ−ＨＩＶブースターの筋肉内（ｉ．ｍ．）ワクチン接種を実施した。応答をいずれのワクチンでもプライミング−ブーストを実施していないマウス（未感作対照）と比較した（表３）。脾臓およびパイエル板それぞれのＨＩＶ特異的ＣＤ８  Ｔ細胞のパーセントを求めることのほか、細胞内サイトカイン染色および抗ウイルスサイトカインＩＦＮ−γの測定によって、全身免疫応答の程度（血液区画の応答）および消化管粘膜（パイエル板）の粘膜応答を評価した。
【０２５６】
この実験から、本発明の実施形態を口唇組織に用いることにより、全身応答のほかにも粘膜免疫を誘導することが可能であることがわかる。プライムブーストワクチン接種後に一貫した（有効性８０％）ＣＤ８  Ｔ細胞免疫応答がみられた。以上のデータをまとめると、この方法を口唇／ｉ．ｄ．プライムブースト無針送達戦略として良好に用いることが可能であることが示唆される。
【０２５７】
【表３】
2020195881.tif 000004
【０２５８】
６．２．実験の詳細
実験１
目的：図７ｃの実施形態を用いた口唇送達システムが流入領域リンパ節（ＬＮ）への抗原取込みを誘導するかどうかを明らかにするため、ワクチン接種から２４時間後、抗原提示および免疫細胞の動員を以下に通りにモニターした：
１．ＨＩＶ抗原とともに緑色蛍光タンパク質を発現する蛍光標識ワクチンである組換え鶏痘ウイルス（ＦＰＶ−ＨＩＶ−ＧＦＰ）を一定数のマイクロチップの分だけ投与した後、頸部リンパ節、縦隔リンパ節および／または腸間膜リンパ節でのワクチン抗原の取込みをモニターした；
２．抗原提示細胞（ＡＰＣ）がこれらのＬＮに動員されるかどうかを評価するため、特有の細胞表面マーカーを染色することによって、これらの部位の樹状細胞（ＤＣ）およびマクロファージの相対数を明らかにした。
【０２５９】
方法：
１．マウスをＦＰＶ−ＨＩＶ−ＧＦＰで感作し、ワクチン接種から２４時間後に応答を評価した。これらの実験ではほかにも、以下のマウス：
ａ）未感作対照（図１４および１５）または
ｂ）ＦＰＶ−ＨＩＶのみをワクチン接種した対照（すなわち、ＧＦＰ蛍光抗原無し、図１６）
を飼育した。
マウスには２つのマイクロチップを用いてワクチン接種を実施し、一方は左側の口唇、もう一方は右側の口唇に実施した（マウス１匹当たり約５×１０６ｐｆｕ）。
２．２４時間後、様々な流入領域ＬＮを回収してプールし、完全培地で単細胞懸濁液を調製した（Ｒａｎａｓｉｎｇｈｅら，２０１１、Ｒａｎａｓｉｎｇｈｅら，２００６、Ｒａｎａｓｉｎｇｈｅら，２００７、Ｒａｎａｓｉｎｇｈｅら，２０１３）
３．１×１０６個の細胞を等分し、様々な細胞表面マーカーで染色した。［抗原提示ＭＨＣ−ＩＩ細胞をＩ−ＡｄＡＰＣ細胞表面マーカーに対する抗体で染色した。ＤＣの同定には細胞表面マーカーのＣＤ１１ｂ−ＰＥおよびＣＤ１１ｃ−ＰｅｒＣＰに対する抗体を用い（図１５）、マクロファージの同定には細胞表面マーカーのＦ４／８０−ＰＥ  Ｃｙ７に対する抗体を用いた（データ不掲載）］（Ｒａｎａｓｉｎｇｈｅら，２０１３）。
４．フローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ）を用いて、細胞表面に発現した蛍光標識細胞表面マーカーに基づき様々な細胞サブセットを分析した。これらの実験を３回反復し、その結果を合わせて図１４〜１６に示す。
５．これらの実験ではほかにも、単色対照（ＳＳ）および１項目除外蛍光（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｍｉｎｕｓ  ｏｎｅ）（ＦＭＯ）対照を用いて、ゲーティングを設定し、様々な細胞サブセットの分析を正確に実施した。
【０２６０】
結果および結論：
図１４〜１６に実験の結果をグラフで示す。これに関して、図１４は、口唇送達から２４時間後のＦＰＶ−ＨＩＶ−ＧＦＰワクチン取込みの評価をプロットしたものであり、矢印で示される右上４分の１の区分に、検出されたワクチンの蛍光ＧＦＰ抗原を含むＩ−ＡｄＡＰＣ  ＭＨＣ−ＩＩ細胞が示されている。このプロットをはじめとするＦＡＣＳプロットでは、各点が単一の細胞を表すことに留意されたい。
【０２６１】
図１５は、口唇送達から２４時間後の様々な樹状細胞サブセットによるそれぞれの流入領域リンパ節への抗原取込みの動員を評価したプロットを示している。ＭＨＣ−１１＋およびＣＤ１１ｂ＋（左側の２つの欄）またはＣＤ１１ｃ＋（右側の２つの欄）であると同定された樹状細胞の割合が右上４分の１の区分に示されている（矢印を参照されたい）。
【０２６２】
図１６は、口唇送達から２４時間後の頸部リンパ節、縦隔リンパ節および腸間膜リンパ節（実験３を反復）でのＦＰＶ−ＨＩＶ−ＧＦＰワクチン取込みを評価したプロットを示している。ワクチンの蛍光ＧＦＰ抗原を含むＩ−Ａｄ  ＡＰＣ  ＭＨＣ−ＩＩ細胞が、矢印で示された右上４分の１の区分に検出されている。（上の３つのグラフはゲーティング戦略を示していることに留意されたい）。
【０２６３】
図からわかるように、ＦＰＶ−ＨＩＶ−ＧＦＰワクチンを投与したマウスと対照との間に抗原の取込みおよび提示（図１４および１６）の差も、流入領域リンパ節に動員されたＤＣサブセット（図１５）の差も検出されなかった。データから以下のことがわかった；
ｉ）マウス１匹当たりマイクロチップ２つ分の用量（用量約２〜５×１０６ｐｆｕ）でワクチン送達を実施しても効果はみられなかった。
ｉｉ）このため、のちのプライムブーストワクチン接種の実験では、免疫に何らかの結果をもたらすため、マウス１匹当たり最低３つ以上のチップを用いた。
【０２６４】
実験２
次のこの実験では、プライムブーストワクチン接種を用いて、実験１と同じマイクロチップでの口唇送達の効果の評価を実施した。
【０２６５】
目的：
１．ＨＩＶ  ｇａｇ特異的四量体染色および
２．ＨＩＶ特異的ＣＤ８  Ｔ細胞内のＩＦＮ−γの細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）を用いて、口唇プライミングの後に筋肉内（ｉ．ｍ．）ブースターワクチン接種を実施することによって、鼻腔内プライミング（ｉ．ｎ．）／ｉ．ｍ．ブースターワクチン接種戦略と比較して効果的なＨＩＶ特異的ＣＤ８  Ｔ細胞免疫を誘導することができるかどうかを試験すること。
【０２６６】
方法：
図１７は、実施した実験の以下の段階を示す写真である。示される段階には、マイクロチップの装填（左上）、超音波システムの設定（右上）およびマウスへの口唇送達（下２つ）が含まれる。実験方法は以下の通りに実施した。
【０２６７】
１）ＦＰＶ−ＨＩＶによるプライミングワクチン接種
ａ．ルーチンのｉ．ｎ．送達には、ワクチン（約６００〜８００μｌのストック）を超音波処理（すなわち、出力：３０％；１サイクル当たり１０秒間で３サイクル）した。超音波処理したウイルスを４８ウェルプレートの２つのウェルに３００〜４００μｌ／ウェルで加えた。
ｂ．４８ウェルプレートのＦＰＶ−ＨＩＶ（５×１０８ＰＦＵ／ｍｌ）にマイクロチップを浸漬した（図１７左上）。各マイクロチップは５μｌを吸収し排出し得ると推定されたため、マイクロチップ１つ当たりの用量は２．５×１０６ｐｆｕと算出された。
ｃ．１ウェル当たり６つのマイクロチップを重ならないように流体中に浸漬し、氷上で３０分間インキュベートした（図１７左上）。
ｄ．マイクロチップ１つを取り出し、装填済みマイクロチップをＰＢＳの入ったウェルに入れることにより、チップにウイルスが装填されたかどうかを試験した。マイクロチップが浮かべば、チップは装填されていないことを表し、マイクロチップが沈めば、装填されているものと見なした。
ｅ．対照：陽性対照のマウスのうち、２匹はｉ．ｎ．（２０μｌ／マウス、１×１０７ｐｆｕ）で感作し、２匹にはｉ．ｍ．ブースター（１×１０７ｐｆｕ）をワクチン接種してその効果のみを試験した。
ｆ．試験群：口唇／ｉ．ｍ．群にはマウス３匹を以下の通りに感作した。図１に示されるものと同じ薬剤塗布具にマイクロチップを取り付け、電源に接続した。アームとマイクロチップとの接触を良くするため、両者の間に超音波ゲルを用いた。電源を入れた。
ｇ．麻酔をかけたマウスの口唇内部の領域にマイクロチップをしっかり押し当てた（図１７下）。
ｈ．出力スイッチを入れて超音波エネルギーを３０秒間当て、口唇領域内にウイルスを送達した。この時点の機器の設定は、トランスデューサー駆動電圧Ｖ＝９５〜１６０；Ｐ＝２８００〜３２００ｍＷであった。
ｉ．マイクロチップからウイルスが送達されたかどうかを確認するため、チップを上の場合と同様に、ＰＢＳの中に入れた。チップが浮かべば、ウイルスがチップから良好に排出されたことがわかった。チップは８０％の時間浮かんでいたことから、ワクチンが排出されたことがわかった。２つのマイクロチップがワクチンを正しく送達できなかった場合、そのマウスは除外し、新たなマウスを感作した。
ｊ．毎回新たなチップを用いて、この操作をマウス１匹当たり３つのマイクロチップで繰り返した。
【０２６８】
２）１０７ＰＦＵのＶＶ−ＨＩＶを用いた筋肉内ブースターワクチン接種
ａ．ＦＰＶ−ＨＩＶプライミングワクチン接種から２週間後、ブースターワクチン接種を実施した。
ｂ．ブースターワクチンは、マウス９匹に対しＰＢＳ  ９００μｌで計９×１０７ＰＦＵ調製した。
ｃ．ＦＰＶ−ＨＩＶの場合と全く同じようにウイルスを超音波処理した。
ｄ．マウスにノーズコーンを用いてイソフルランで麻酔をかけ、ＶＶ−ＨＩＶ  ５０μｌを四頭筋からｉ．ｍ．送達した。
【０２６９】
３）分析用の脾臓試料の調製
ブースターワクチン接種から７〜１４日後、各マウスから脾臓を採取し、Ｒａｎａｓｉｎｇｈｅら（２００６）に記載されている通りに単細胞懸濁液を調製した。
【０２７０】
以下にように、プレートスキームに従い各マウスの脾臓細胞４×１０６個を用いて、四量体染色および細胞内サイトカイン染色によりＨＩＶ特異的ＣＤ８  Ｔ細胞応答の程度を評価した：
ａ．（Ｒａｎａｓｉｎｇｈｅら，２０１１、Ｒａｎａｓｉｎｇｈｅら，２００６、Ｒａｎａｓｉｎｇｈｅら，２００７、Ｒａｎａｓｉｎｇｈｅら，２０１３に）記載されている通りに四量体染色を実施した。
・細胞をＦＡＣＳ緩衝液中、室温で４５分間、ＫｄＧａｇ１９７−２０５−ＡＰＣ四量体および抗ＣＤ８α  ＦＩＴＣで染色した。
・細胞を洗浄し、０．５％ＰＦＡで固定した後、ＦＡＣＳを用いて分析した。
ｂ．このほか、ＩＦＮ−γに対する細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）を記載されている通り（Ｒａｎａｓｉｎｇｈｅら，２０１１、Ｒａｎａｓｉｎｇｈｅら，２００６、Ｒａｎａｓｉｎｇｈｅら，２００７、Ｒａｎａｓｉｎｇｈｅら，２０１３）に実施した。
・細胞を３７℃および５％ＣＯ２で１時間、ＫｄＧａｇ１９７−２０５ペプチドで一晩刺激した。
・各ウェルにブレフェルジンＡを加え、３７℃でさらに５時間インキュベートした。
・細胞をＦＡＣＳ緩衝液中、４℃で２５分間、抗ＣＤ８α  ＦＩＴＣで表面染色した。
・ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社のＩＣ／ｆｉｘおよびＩＣ／ｐｅｒｍを用いて細胞を固定／透過処理した。
・次いで、細胞に抗ＩＦＮ−γを用いて４℃で２５分間、細胞内染色を実施した（表２）。
○陽性染色−ＩＣ  Ｐｅｒｍに溶かした抗ＩＦＮ−γＡＰＣ
○単色対照およびＦＭＯ。
【０２７１】
【表４】
2020195881.tif 000005
【０２７２】
【表５】
2020195881.tif 000006
【０２７３】
結果および結論：
ＩＦＮ−γ細胞内染色を用いてＨＩＶ特異的脾臓ＣＤ８  Ｔ細胞の程度の評価を示したプロットを図１８に示す。Ｃｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔ  ＰｒｏまたはＦｌｏｗＪｏ解析を用いてＦＡＣＳデータを解析した。四角の囲みは、口唇／ｉ．ｍ．（上段のマウス３匹）、ｉ．ｎ．／ｉ．ｍ．（中段のマウス２匹）およびブースター単独（下段のマウス３匹）でワクチン接種した後のＩＦＮ−γを発現するＨＩＶ特異的脾臓ＣＤ８  Ｔ細胞の割合を表す。四量体染色を用いてＨＩＶ特異的脾臓ＣＤ８  Ｔ細胞の評価を可能にしたプロットを図１９に示す。材料および方法に記載通りに細胞を染色した。Ｃｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔ  ＰｒｏまたはＦｌｏｗＪｏ解析を用いてＦＡＣＳデータを解析した。四角の囲みは、様々な経路、すなわち、口唇／ｉ．ｍ．（上段のマウス３匹）、ｉ．ｎ．／ｉ．ｍ．（中段のマウス２匹）およびブースター単独（下段のマウス２匹）でワクチンを送達した後のＨＩＶ特異的脾臓ＣＤ８  Ｔ細胞の割合を表す。
【０２７４】
ＨＩＶ特異的四量体（図１８）およびＩＦＮ−γ染色（図１９）のデータから、極めて一貫性のある結果が得られたｉ．ｎ．／ｉ．ｍ．送達戦略（図１８−範囲８．９４〜９．３３％）とは異なり、口唇／ｉ．ｍ．送達戦略では一貫した結果が得られない（図１９−範囲１．０３〜１５．１％）ことがわかった。これは、口唇送達の際にマウスのプライミングに一貫性がなかった（注：ｉ．ｍ．ブースター単独と比較して口唇／ｉ．ｍ．も参照されたい）ことに起因するものと思われるが、１匹のマウス（マウス１）にはｉ．ｎ．／ｉ．ｍ．送達戦略を上回る免疫応答がみられ、本発明の実施形態を用いて応答が可能であることが示された。
【０２７５】
データからほかにも、３×口唇または４×口唇マイクロチップ送達の方が５×口唇マイクロチップ送達よりも効果的であることがわかった（データ不掲載）。これらの実験をは２回実施したものであり、データは実験間（実験４および５）でほぼ同じであることがわかった。データは１つの実験の代表的なものである。
【０２７６】
実験３：
プライムブーストワクチン接種戦略を試験する実験をなおも実施して、図１０に示される本発明の突起部をベースとする実施形態をそれぞれ用いた口唇送達の効果を評価した。
【０２７７】
目的：ＨＩＶ  ｇａｇ特異的四量体染色を用いて、これらのマイクロチップに図７ｃのマイクロチップよりも効率的にワクチンを装填し口唇に送達することができるかどうかを
試験すること（図２０）。
【０２７８】
１）ＦＰＶ−ＨＩＶによるプライミングワクチン接種
ａ．上の場合と同様に、ワクチンを超音波処理し、４８ウェルプレートに１ウェル当たり３００〜４００ｍｌ加えた。
ｂ．マイクロチップを装置に接続した後、ピペットを用いてマイクロチップの組織接触表面にワクチン５〜７μｌを装填し、直ちにマウスの口唇に送達した。図７ｃのマイクロチップとは異なり、これらの改良マイクロチップはＦＰＶ−ＨＩＶに３０分間浸漬しなかった。
ｃ．対照：陽性対照にはマウス２匹をｉ．ｎ．で感作し（２０ｍｌ／マウス）；陰性対照にはマウス２匹を経口的に感作し、ワクチン接種単独の効果を試験するため、ｉ．ｍ．ブースト単独の対照としてマウス２匹を飼育した（図５と同じ）。
【０２７９】
２）ｉ．ｍ．ブースターワクチン接種および四量体染色を用いた免疫応答の評価
ａ）実験２に記載した通りに実施した。
【０２８０】
結果および結論：
１）図７ｃのマイクロチップとは異なり、ワクチンをピペットで直接チップに装填したため、新規なマイクロチップが適切に装填されたかどうかを判定するのが極めて容易であった。同様に、ワクチン接種を実施した後、マイクロチップを組織片の上において、ワクチンが適切に排出されたかどうかを判定した。マイクロチップが乾いていれば、ワクチンが送達されたことを表した。このほか、空のマイクロチップ、装填済みのマイクロチップおよび使用済みのマイクロチップを顕微鏡下で可視化することによって上記の装填を検査した。
２）マイクロチップ１および２（図１０上段）は、マイクロチップ３および４（図１０下段）よりもはるかに効率的に（漏出せずに）ワクチンが装填および排出されるのが観察された。装填ははるかに効率的であったが、装置を口唇に当てると、出力スイッチを入れる間もなく直ちにマイクロチップ３および４（特に前者）からワクチンが漏出し、むしろ経口送達になった。
３）さらに、ＨＩＶ特異的四量体に関する予備データから、マイクロチップ１の方がマイクロチップ３および４よりも性能が優れていることが確認された。このため、以下の実験４では、対照である経口プライム／ｉ．ｍ．ブースター感作戦略を含めたプライムブーストワクチン接種実験を図１０のマイクロチップ１および２で再び実施してデータを検証することにした。
【０２８１】
実験４
この実験では、３×口唇ｐ／ｉ．ｍ．ワクチン接種戦略に図１０のマイクロチップ１および２を用いたワクチン接種をこれまでの実験と同様に試験した。
【０２８２】
目的：
ａ）ＨＩＶ  ｇａｇ−特異的四量体染色（図２１）および
ｂ）ＩＦＮ−γの細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）（図２２）
を用いて、３×口唇／ｉ．ｍ．ワクチン接種戦略の効果を１×経口／ｉ．ｍ．プライム−ブースターワクチン接種と比較して試験する。
【０２８３】
方法：
１グループ当たり３匹のマウスを用いて、実験３の通りにワクチン接種および解析を実施した。このほか、追加の対照として１×経口プライム／ｉ．ｍ．ブースターワクチン接種を実施して、プライミングが経口送達または口唇送達（経口用量＝５×１０６ＦＰＶ−ＨＩＶ）と関係があるかどうかを評価した。ブースターワクチン接種から１４日後、四量
体染色および細胞内ＩＦＮ−γ染色を用いて脾臓のＨＩＶ特異的ＣＤ８  Ｔ細胞応答を測定した。実験は２回実施した。
【０２８４】
結果および結論：
四量体染色を用いてＨＩＶ特異的脾臓ＣＤ８  Ｔ細胞応答の評価を可能にしたプロットを図２１に示す。Ｃｅｌｌ  ｑｕｅｓｔ  Ｐｒｏソフトウェアを用いてＦＡＣＳデータを解析した。プロットは、１グループ当たり３匹のマウスについて、マイクロチップ１（上段）および２（中段）によるプライムブースト感作のデータと経口送達（下段）のデータとを比較して表したものである。右上４分の１の区分（赤い矢印）は、各ワクチン戦略の後に観察されたＨＩＶ特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の％を示している。
【０２８５】
ＩＦＮ−γ細胞内サイトカイン染色を用いてＨＩＶ特異的ＣＤ８  Ｔ細胞応答の程度の評価を可能にしたプロットを図２２に示す。Ｃｅｌｌ  ｑｕｅｓｔ  Ｐｒｏソフトウェアを用いてＦＡＣＳデータを解析した。プロットは、１グループ当たり３匹のマウスについて、マイクロチップ１（上段）および２（中段）によるプライムブースト感作のデータと経口送達（下段）のデータとを比較して示したものである。右上４分の１の区分（赤い矢印）は、ＩＦＮ−γを発現するＨＩＶ特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の％を示している。
【０２８６】
図からわかるように、マイクロチップ１−マウス２およびマイクロチップ２−マウス３（赤い矢印）で観察されたＨＩＶ特異的脾臓ＣＤ８  Ｔ細胞応答は、経口送達（図２１および２２のマウス３匹）と比較して大幅に上昇しており、これらの結果は、観察された応答が口腔内での取込みではなく口唇での取込みであることを明確に示していた。
【０２８７】
データから、送達に均一性／一貫性があれば、マイクロチップ１および２によって血液区画に良好なＨＩＶ特異的ＣＤ８  Ｔ細胞免疫が誘導され得ることがわかった。
【０２８８】
図１０に従って作製したマイクロチップで検出された陽性応答は、実験１および２で用いた図７ｃのマイクロチップで検出された陽性応答と極めて類似していた。しかし、前者のマイクロチップの方が装填が容易であった。
【０２８９】
実験データから、均一性／一貫性が得られれば、口唇送達の方が経口送達または鼻腔内送達よりも効果的であり得ることが示唆される。
【０２９０】
考察
超音波導入法を用いて身体に送達される可能性があることが本発明者らにわかっている分子としては、１）任意の種類の電荷を有するか、中性の電荷（全体として中性のものを含む）を有する分子、２）小さい分子または大きい分子（約１４９，０００ダルトンのモノクローナル抗体を含む）および３）親水性、疎水性または親油性の分子が挙げられる。
【０２９１】
さらに、本発明を用いてワクチンを粘膜上皮に送達すると、全身免疫に加えて粘膜免疫が誘導されるにより、特に限定されないがインフルエンザ、ＨＩＶ／ＡＩＤＳおよび結核を含めた疾患を予防または治療する新たな機会が生まれることがわかった。粘膜抗体は、粘膜から感染する病原体に対する免疫を生じさせるうえで全身抗体よりも効果的であると考えられる。全身免疫は一般に、ワクチンを注射により身体に送達することによって誘導されるが、粘膜免疫応答の刺激によって防御Ｂ細胞およびＴ細胞が産生され、粘膜免疫および全身免疫の両方が生じ得ることを示唆する証拠が存在する。
【０２９２】
実験５
この実験は、本発明の実施形態を用いて口唇および／または真皮内（ｉ．ｄ．）への送達を実施した後のウイルスベクター系ワクチンの取込みを評価するものである。
【０２９３】
６インチ（約１５ｃｍ）のシリコンウエハからマイクロチップを切り取り、図１０のマイクロチップ１のマスクの特徴を用いて作製した。完成したチップは、大きさ３ｍｍ、厚さ１ｍｍであり、既に記載したように、エッチングを施した開口領域と独立して立っている支柱（ヘアブラシの毛のような配置）とを有する。マイクロチップは、深さが５００〜６００μｍであり、側壁のばらつきは最大でエッチングの深さの±１０％である。
【０２９４】
目的：本発明の実施形態用いて口唇および／またはｉ．ｄの抗原取込みが効果的であるかどうかを明らかにすること。Ｔｏｗｎｓｅｎｄら（出版準備中）に記載されている通りに、ヌードマウスに蛍光タグタンパク質（ｍＣｈｅｒｒｙ）を発現する組換えＦＰＶ−ＨＩＶをワクチン接種し、ワクチン接種後から２４時間、タンパク質の取込みおよび発現をモニターした。
【０２９５】
方法：ヌードマウス３匹（ｎ＝３）をＦＰＶ−ＨＩＶ−ｍＣｈｅｒｒｙで感作し、ワクチン接種後から最大２４時間、抗原の取込み／発現を評価した。これらの実験ではほかにも、マウス１匹をａ）未感作対照またはｂ）ＦＰＶ−ＨＩＶのみ（すなわち、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光抗原を有さない）でワクチン接種した対照のいずれかとして飼育した。図３３および３４に、ｍＣｈｅｒｒｙ抗原を発現するＦＰＶ−ＨＩＶを用いた生きた個体の画像を示す。両図とも、左端の個体が、ワクチンを一切投与しなかった未感作マウスである。図３３では、右端から３枚の画像は、口唇送達によるワクチン接種から３時間後、６時間後および９時間後のｍＣｈｅｒｒｙ抗原の取込みおよび発現を単一の個体について示している。同様に図３４では、右端から４枚の画像は、ＦＰＶ−ＨＩＶ−ｍＣｈｅｒｒｙをｉ．ｄ．で耳内に投与し、ワクチン接種から３時間後、６時間後、９時間後および２４時間後にｍＣｈｅｒｒｙの発現を評価した１匹のマウスを示している。これらの図は、経時的に追跡したマウス１匹の代表的なものであるが、実験は、マウス３匹（ｎ＝３）を用いて実施し、２回反復した。上記の通り、マウスのワクチン接種は、３×マイクロチップを用いて口唇に実施するか、ｉ．ｄ．送達で耳に実施した（マウス１匹当たり約２〜５×１０６ｐｆｕ）。
【０２９６】
結論：データから以下のことがわかった：
マウス１匹当たり３×マイクロチップ（用量約２〜５×１０６ｐｆｕ）を用いて口唇からワクチンを取り込ませるのが効果的である。図３３および３４の左から２枚目の画像からわかるように、抗原の取込みおよび発現ピークは、早くも３時間後に検出することができる。これは、送達から６〜１２時間後に発現ピークが検出され得るいくつかの別のワクチン接種戦略（（Ｔｒｉｖｅｄｉら，２０１４）、Ｔｏｗｎｓｅｎｄら（出版準備中））とよりも好ましいことである。
【０２９７】
マウス１匹当たり３×マイクロチップを用いてワクチンが皮内（ｉ．ｄ．）に送達されることが示された。
【０２９８】
実験６
この実験は、実験５の場合と同じマイクロチップを用いて口唇送達する本発明の実施形態の使用の効果を評価するものである。
【０２９９】
目的：口唇プライミングの後に筋肉内（ｉ．ｍ．）ブースターワクチン接種を実施することによって、効果的なＨＩＶ特異的粘膜免疫および全身ＣＤ８Ｔ細胞免疫を誘導することが可能であるかどうかを、ＨＩＶ  ｇａｇ特異的四量体染色およびＩＦＮ−γの細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）を用いて試験すること。
【０３００】
方法：
１）ＦＰＶ−ＨＩＶによるプライミングワクチン接種
ａ．ワクチン（約６００〜８００μｌのストック）を超音波処理（すなわち、出力：３０％；１サイクル当たり１０秒間で３サイクル）した。
ｂ．口唇／ｉ．ｍ．群にはマウス５匹を以下の通りに感作した。各マイクロチップを薬剤塗布装置に取り付けた。超音波と薬剤キャリアとの連結を良くするため、塗布具のアクチュエータロッドとマイクロチップとの間に超音波ゲルを用いてもよい。
ｃ．マイクロチップにワクチン約３μｌを装填し、対象（各場合とも、麻酔をかけたＢＡＬＢ／ｃマウス）の口唇領域にしっかり押し当てた。
ｄ．超音波を３０秒間当てて口唇領域内にウイルスを送達した。トランスデューサー出力を１０、Ｖ＝１．５２に設定した。
ｅ．この操作をマウス１匹当たり３つのマイクロチップで繰り返した。
【０３０１】
２）１０７ＰＦＵのＶＶ−ＨＩＶを用いた筋肉内ブースターワクチン接種
ａ．ＦＰＶ−ＨＩＶプライミングワクチン接種から２週間後、ブースターワクチン接種を実施した。
ｂ．ウイルスをＦＰＶ−ＨＩＶの場合と全く同じように超音波処理した。
ｃ．マウスにノーズコーンを用いてイソフルランで麻酔をかけ、ＶＶ−ＨＩＶ  ５０μｌを四頭筋からｉ．ｍ．送達した（計１０７ｐｆｕ）。
【０３０２】
３）分析用の脾臓試料およびパイエル板試料の調製
ブースターワクチン接種から１４日後、各マウスから脾臓およびパイエル板（ＰＰ）を採取し、（Ｒａｎａｓｉｎｇｈｅら，２００６；Ｒａｎａｓｉｎｇｈｅら，２０１３、Ｘｉら，２０１２）に記載されている通りに単細胞懸濁液を調製した。
【０３０３】
以下のように、各マウスの脾臓細胞４×１０６個を用いて、四量体染色および細胞内サイトカイン染色によりＨＩＶ特異的ＣＤ８  Ｔ細胞応答の程度を評価した：
ａ．（Ｒａｎａｓｉｎｇｈｅら，２０１１、Ｒａｎａｓｉｎｇｈｅら，２００６、Ｒａｎａｓｉｎｇｈｅら，２００７、Ｒａｎａｓｉｎｇｈｅら，２０１３に）記載されている通りに四量体染色を実施した。
・細胞をＦＡＣＳ緩衝液中、室温で４５分間、ＫｄＧａｇ１９７−２０５−ＡＰＣ四量体および抗ＣＤ８α  ＦＩＴＣで染色した。
・細胞を洗浄し、０．５％ＰＦＡで固定した後、ＦＡＣＳを用いて分析した。
ｂ．このほか、ＩＦＮ−γに対する細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）を記載されている通り（Ｒａｎａｓｉｎｇｈｅら，２０１１、Ｒａｎａｓｉｎｇｈｅら，２００６、Ｒａｎａｓｉｎｇｈｅら，２００７、Ｒａｎａｓｉｎｇｈｅら，２０１３）に実施した。
・細胞を３７℃および５％ＣＯ２で１時間、ＫｄＧａｇ１９７−２０５ペプチドで一晩刺激した。
・各ウェルにブレフェルジンＡを加え、３７℃でさらに５時間インキュベートした。
・細胞をＦＡＣＳ緩衝液中、４℃で２５分間、抗ＣＤ８α  ＦＩＴＣで表面染色した。
・ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社のＩＣ／ｆｉｘおよびＩＣ／ｐｅｒｍを用いて細胞を固定／透過処理した。
・次いで、細胞に抗ＩＦＮ−γを用いて４℃で２５分間、細胞内染色を実施した。
【０３０４】
結果および結論：
各実験は２回実施し、図３５〜３７に示されるデータは１つの実験の代表的なものである。図３５および３６は、ＨＩＶ特異的四量体の実験結果を示し、図３７および３８はＩＦＮ−γ染色の実験結果を示している。
【０３０５】
より具体的には、図３５は、四量体染色を用いたＨＩＶ特異的脾臓ＣＤ８  Ｔ細胞を示
している。上に記載した通りに脾臓細胞を染色した。ＦｌｏｗＪｏ解析を用いてＦＡＣＳデータを解析した。四角の囲みは、ワクチン接種後のＨＩＶ特異的脾臓ＣＤ８  Ｔ細胞の割合を示している。上段の５つのプロットは口唇／ｉ．ｍ．感作マウスを示し、下段のプロットは２匹の未感作対照マウスを示している。
【０３０６】
図３６は、四量体染色を用いたＨＩＶ特異的消化管（粘膜）ＣＤ８  Ｔ細胞を示している。上記の通りにパイエル板の細胞を染色した。ＦｌｏｗＪｏ解析を用いてＦＡＣＳデータを解析した。四角の囲みは、ワクチン接種後のＨＩＶ特異的脾臓ＣＤ８  Ｔ細胞の割合を示している。プロットのうち、上段は１グループ当たり２匹のマウス、全体で計５匹のマウスについてプールした口唇／ｉ．ｍ．感作マウスの結果を示している。下段は、２匹の未感作対照マウスについてプールしたデータである。
【０３０７】
図３７は、ＩＦＮ−γ細胞内染色を用いたＨＩＶ特異的脾臓ＣＤ８  Ｔ細胞の程度を示している。上記の通りに染色を実施し、ＦｌｏｗＪｏ解析によりＦＡＣＳデータを解析した。上段のプロットはそれぞれ口唇／ｉ．ｍ．感作マウスの結果を示している。四角の囲みは、ＩＦＮ−γを発現するＨＩＶ特異的脾臓ＣＤ８  Ｔ細胞の割合を示している。下段のプロットは、２匹の未感作対照マウスのデータを表している。
【０３０８】
図３８は、ＩＦＮ−γ細胞内染色を用いたＨＩＶ特異的消化管（粘膜）ＣＤ８  Ｔ細胞の程度を示している。上記の通りにパイエル板の細胞を染色した。ＦｌｏｗＪｏ解析によりＦＡＣＳデータを解析した。各プロットは、計５匹のマウスを用い、２匹のプールしたマウスのデータを表している。四角の囲みは、口唇／ｉ．ｍ感作後のＩＦＮ−γを発現するＨＩＶ特異的脾臓ＣＤ８  Ｔ細胞の割合を示している。下段のプロットは２匹の未感作対照マウスを表している。
【０３０９】
結果
１．ライブイメージングのデータから、本発明の実施形態を用いた口唇送達およびｉ．ｄ．送達後の組換えベクター系ワクチンの取込みおよび発現の均一性が良好であることがわかる。
２．プライムブースト実験のデータから、口唇プライミングによって効果的な粘膜（消化管特異的）免疫および全身ＨＩＶ特異的ＣＤ８  Ｔ細胞免疫を誘導することが可能であることがわかる。
３．デーからほかにも、本発明の装置を口唇／ｉ．ｄ．無針プライムブースト戦略に使用できる可能性が示唆される。このほか、（ヒトに関しては皮膚内への）ｉ．ｄ．送達によって粘膜免疫が改善される可能性がある。（例えば、ｉ．ｍ．ブースターをｉ．ｄ．ブースターに置き換える）。
【０３１０】
以上の結果から、ＢＡＬＢ／ｃマウスでは、実施した方法によって一貫性のある免疫的結果を誘導することが可能である（表３および図３５〜３８）ことがわかる。マウス５匹のうち４匹に口唇プライミングに対する効果的な応答がみられたことから、データは、プライミングの効力に一貫性があることを示している。
【０３１１】
７．参考文献：
ＲＡＮＡＳＩＮＧＨＥ，Ｃ．，ＥＹＥＲＳ，Ｆ．，ＳＴＡＭＢＡＳ，Ｊ．，ＢＯＹＬＥ，Ｄ．Ｂ．，ＲＡＭＳＨＡＷ，Ｉ．Ａ．＆  ＲＡＭＳＡＹ，Ａ．Ｊ，２０１１．Ａ  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＨＩＶ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｕｃｏｓａｌ／ｓｙｓｔｅｍｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ａｎｄ  ａｖｉｄｉｔｙ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｒＤＮＡ／ｒＦＰＶ  ａｎｄ  ｐｏｘｖｉｒｕｓ−ｐｏｘｖｉｒｕｓ
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ＲＡＮＡＳＩＮＧＨＥ，Ｃ．，ＴＵＲＮＥＲ，Ｓ．Ｊ．，ＭＣＡＲＴＨＵＲ，Ｃ．，ＳＵＴＨＥＲＬＡＮＤ，Ｄ．Ｂ．，ＫＩＭ，Ｊ．Ｈ．，ＤＯＨＥＲＴＹ，Ｐ．Ｃ．＆  ＲＡＭＳＨＡＷ，Ｉ．Ａ．２００７．Ｍｕｃｏｓａｌ  ＨＩＶ−１  ｐｏｘ  ｖｉｒｕｓ  ｐｒｉｍｅ−ｂｏｏｓｔ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｉｎｄｕｃｅｓ  ｈｉｇｈ−ａｖｉｄｉｔｙ  ＣＤ８＋Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ｒｅｇｉｍｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ／ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７８，２３７０−９
ＴＲＩＶＥＤＩ，Ｓ．，ＪＡＣＫＳＯＮ，Ｒ．Ｊ．＆  ＲＡＮＡＳＩＮＧＨＥ，Ｃ．２０１４．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ＨＩＶ  ｐｏｘ  ｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ−ｂａｓｅｄ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ａｎｄ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ  ｃａｎ  ｉｎｄｕｃｅ  ｕｎｉｑｕｅ
ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ｔｈａｔ  ｍｏｄｕｌａｔｅ  ＣＤ８  Ｔ  ｃｅｌｌ  ａｖｉｄｉｔｙ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，４６８−４７０，４７９−８９．
ＸＩ，Ｙ．，ＤＡＹ，Ｓ．Ｌ．，ＪＡＣＫＳＯＮ，Ｒ．Ｊ．＆  ＲＡＮＡＳＩＮＧＨＥ，Ｃ．２０１２．Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｔｙｐｅ  Ｉ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｅｐｓｉｌｏｎ  ｉｎ  ｖｉｒａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｕｃｏｓａｌ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｍｕｃｏｓａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，５（６），６１０−６２２．
【０３１２】
本明細書に開示および明記される本発明は、本文または図面に記載されているか、これより明らかである個々の特徴をまた別に２つ以上組み合わせたものすべてに及ぶことが理解されよう。これらの様々な組合せはいずれも、本発明の様々な代替的態様を構成するものである。
本発明の態様は、例えば以下のようなものとすることができる。
＜１＞
対象の組織の１つまたは複数の選択した層に薬剤を送達する方法であって、
超音波を輸送刺激とし、薬剤キャリア本体、薬剤キャリアまたは薬剤塗布具の中の前記薬剤に超音波を当てる段階であって、前記薬剤キャリアが、前記組織を咬持する組織接触表面を含む段階と、
前記組織の前記１つまたは複数の層への前記薬剤の送達を促進するか、可能にするように、前記薬剤塗布具の操作パラメータを設定する段階と
を含み、
前記薬剤の送達が、前記対象に免疫応答を誘導する、
方法。
＜２＞
対象に免疫応答を誘導する方法であって、
超音波を輸送刺激とし、薬剤キャリア本体、薬剤キャリアまたは薬剤塗布具の中の薬剤に超音波を当てる段階であって、前記薬剤キャリア本体が、前記組織を咬持する組織接触
表面を含む段階と、
１つまたは複数の選択した層への前記薬剤の送達を促進するか、可能にするように、前記薬剤塗布具の操作パラメータを設定する段階と
を含み、
前記薬剤の送達が、前記対象に免疫応答を誘導する、
方法。
＜３＞
前記免疫応答が少なくとも粘膜免疫応答である、＜１＞または＜２＞に記載の方法。
＜４＞
少なくとも粘膜免疫応答を誘導する前記薬剤の送達が、粘膜の上皮層または上皮層と上皮下層の中に送達される薬剤の量を制御することによるものである、＜３＞に記載の方法。
＜５＞
前記免疫応答が全身免疫応答である、＜１＞または＜２＞に記載の方法。
＜６＞
全身免疫応答を誘導する前記薬剤の送達が、上皮組織および上皮下組織の中におよびそこを通過して送達される薬剤の量を制御することによるものである、＜５＞に記載の方法。
＜７＞
前記薬剤キャリア本体および／または前記薬剤キャリアに薬剤を装填する段階、
前記薬剤を保持する前記薬剤キャリア本体または前記薬剤キャリアを提供する段階、
前記薬剤キャリア本体または前記薬剤キャリアの組織接触表面を前記組織に直接接触させるか、間接的に接触させる段階ならびに
前記薬剤キャリア本体または前記薬剤キャリアから前記薬剤を投薬する段階
のうちの１つまたは複数の段階をさらに含み、
前記薬剤を投薬する段階が、超音波シグナルを発生させて、前記組織接触表面への前記薬剤の輸送を可能にするか、促進することを含む、
＜１＞〜＜６＞のいずれか１に記載の方法。
＜８＞
対象の組織の１つまたは複数の選択した層に薬剤を送達するシステムであって、
薬剤キャリア本体、薬剤キャリアまたは薬剤塗布具に収納されており、前記薬剤キャリア本体が、前記組織を咬持する組織接触表面を含む、薬剤と、
超音波を輸送刺激とし、超音波シグナルを与える手段と
を含み、
前記組織の前記１つまたは複数の層への前記薬剤の送達を促進するか、可能にするよう設計されており、
前記薬剤の送達が、前記対象に免疫応答を誘導する、
システム。
＜９＞
組織に薬剤を送達して対象に免疫応答を誘導するシステムであって、
薬剤キャリア本体、薬剤キャリアまたは薬剤塗布具に収納されており、前記薬剤キャリア本体が、前記組織を咬持する組織接触表面を含む、薬剤と、
超音波を輸送刺激とし、超音波シグナルを与える手段と
を含み、
組織の１つまたは複数の選択した層への前記薬剤の送達を促進するか、可能にするよう設計されており、
前記薬剤の送達が、前記対象に免疫応答を誘導する、
システム。
＜１０＞
前記免疫応答が粘膜免疫応答である、＜８＞または＜９＞に記載のシステム。
＜１１＞
少なくとも粘膜免疫応答を誘導する前記薬剤の送達が、粘膜の上皮層または上皮層と上皮下層の中に送達される薬剤の量を制御することによるものである、＜１０＞に記載のシステム。
＜１２＞
前記免疫応答が全身免疫応答である、＜８＞または＜９＞に記載のシステム。
＜１３＞
全身免疫応答を誘導する前記薬剤の送達が、粘膜の上皮層または上皮下層の中におよびそこを通過して送達される薬剤の量を制御することによるものである、＜１２＞に記載のシステム。
＜１４＞
設定する前記操作パラメータが、
塗布圧力、
超音波周波数、
超音波出力レベル、
超音波の波形、
超音波適用の持続時間、
超音波適用の動作周期および
超音波の方向
のうちのいずれか１つまたは複数のものを含む、＜１＞〜＜１３＞のいずれか１に記載の方法またはシステム。
＜１５＞
前記薬剤を以下の組織または組織層
粘膜；
上皮
上皮下組織
粘膜；
粘膜下組織
粘膜血管系
角膜；
角膜上皮
ボーマン膜
角膜実質
角膜内皮
結膜；
テノン膜；
上強膜：
強膜；
脈絡膜；
脈絡膜毛細血管板；
ブルッフ膜；
網膜色素上皮；
神経網膜；
網膜血管；
内境界膜；
硝子体；
表皮；および
真皮
のうちのいずれか１つもしくは複数のものまで、またはそれを超えて送達することを含む、＜１＞もしくは＜２＞に記載の方法または＜８＞もしくは＜９＞に記載のシステム。
＜１６＞
前記薬剤キャリアまたは前記薬剤キャリア本体が、治療中の組織を咬持する組織接触表面を含み、前記組織接触表面が、少なくとも部分的に複数の突起部によって確定される、＜１＞〜＜１５＞のいずれか１に記載の方法またはシステム。
＜１７＞
前記薬剤キャリアが、前記薬剤を保持する１つまたは複数の薬剤リザーバを含み、前記突起部が、前記薬剤キャリアの一部を形成する１つまたは複数のリザーバと流体接続している、＜１６＞に記載の方法またはシステム。
＜１８＞
各薬剤リザーバが、前記薬剤キャリア本体内に形成された空隙を含む、＜１７＞に記載の方法またはシステム。
＜１９＞
前記突起部が、空隙の内側から外に向かって伸長し、前記組織接触表面で終端になっている、＜１６＞または＜１７＞に記載の方法またはシステム。
＜２０＞
前記空隙が末端構造物によって形成されており、前記末端構造物の少なくとも一部が、前記組織接触表面で終端になっている、＜１８＞または＜１９＞のいずれか１に記載の方法またはシステム。
＜２１＞
前記末端構造物が、前記突起部と同じ平面で終端になっている、＜２０＞に記載の方法またはシステム。
＜２２＞
前記組織接触表面を画定する前記突起部の少なくとも一部が、前記空隙から外に向かって前記末端構造物を超えて伸長している、＜２０＞に記載の方法またはシステム。
＜２３＞
前記突起部が平面で終端になっており、前記末端構造物が、前記突起部が前記末端構造物を超えて伸長するように前記平面に達する前で終端になっている、＜２２＞に記載の方法またはシステム。
＜２４＞
前記薬剤キャリア本体が、
前記組織接触表面を含む組織接触層と、
少なくとも１つの他の層と
を含む積層物を含む、
＜１＞〜＜２３＞のいずれか１に記載の方法またはシステム。
＜２５＞
少なくとも前記組織接触層の中を少なくとも１つの穴が伸長して、前記薬剤キャリア本体内のそれぞれのマイクロチャネルの少なくとも一部を画定している、＜２４＞に記載の方法またはシステム。
＜２６＞
マイクロチャネルによって、薬剤を１つの層から隣接する層まで輸送することが可能である、＜２５＞に記載の方法またはシステム。
＜２７＞
前記薬剤キャリアが伝導刺激を伝える、＜１＞〜＜２６＞のいずれか１に記載の方法またはシステム。
＜２８＞
前記薬剤キャリア本体が前記伝導刺激を伝える、＜２７＞に記載の方法またはシステム。
＜２９＞
前記薬剤キャリア本体が、少なくとも一部が前記薬剤キャリア本体の中を前記組織接触表面まで伸長し組織表面への前記薬剤の輸送を可能にする１つまたは複数のマイクロチャ
ネルを含む、＜１＞〜＜２８＞のいずれか１に記載の方法またはシステム。
＜３０＞
前記マイクロチャネルが、前記薬剤キャリア本体の中を伸長して薬剤リザーバと流体接続している、＜２９＞に記載の方法またはシステム。
【図１Ａ】
2020195881.tif 000007
【図１Ｂ】
2020195881.tif 000008
【図１Ｃ】
2020195881.tif 000009
【図２】
2020195881.tif 000010
【図３】
2020195881.tif 000011
【図４Ａ】
2020195881.tif 000012
【図４Ｂ】
2020195881.tif 000013
【図４Ｃ】
2020195881.tif 000014
【図４Ｄ】
2020195881.tif 000015
【図４Ｅ】
2020195881.tif 000016
【図４Ｆ】
2020195881.tif 000017
【図４Ｇ】
2020195881.tif 000018
【図４Ｈ】
2020195881.tif 000019
【図４Ｉ】
2020195881.tif 000020
【図４Ｊ】
2020195881.tif 000021
【図５Ａ】
2020195881.tif 000022
【図５Ｂ】
2020195881.tif 000023
【図５Ｃ】
2020195881.tif 000024
【図５Ｄ】
2020195881.tif 000025
【図６】
2020195881.tif 000026
【図７Ａ】
2020195881.tif 000027
【図７Ｂ】
2020195881.tif 000028
【図７Ｃ】
2020195881.tif 000029
【図７Ｄ】
2020195881.tif 000030
【図７Ｅ】
2020195881.tif 000031
【図８Ａ】
2020195881.tif 000032
【図８Ｂ】
2020195881.tif 000033
【図８Ｃ】
2020195881.tif 000034
【図８Ｄ】
2020195881.tif 000035
【図８Ｅ】
2020195881.tif 000036
【図８Ｆ】
2020195881.tif 000037
【図８Ｇ】
2020195881.tif 000038
【図８Ｈ】
2020195881.tif 000039
【図９Ａ】
2020195881.tif 000040
【図９Ｂ】
2020195881.tif 000041
【図１０】
2020195881.tif 000042
【図１１Ａ】
2020195881.tif 000043
【図１１Ｂ】
2020195881.tif 000044
【図１１Ｃ】
2020195881.tif 000045
【図１２Ａ】
2020195881.tif 000046
【図１２Ｂ】
2020195881.tif 000047
【図１２Ｃ】
2020195881.tif 000048
【図１２Ｄ】
2020195881.tif 000049
【図１２Ｅ】
2020195881.tif 000050
【図１３Ａ】
2020195881.tif 000051
【図１３Ｂ】
2020195881.tif 000052
【図１４】
2020195881.tif 000053
【図１５】
2020195881.tif 000054
【図１６】
2020195881.tif 000055
【図１７】
2020195881.tif 000056
【図１８】
2020195881.tif 000057
【図１９】
2020195881.tif 000058
【図２０】
2020195881.tif 000059
【図２１】
2020195881.tif 000060
【図２２】
2020195881.tif 000061
【図２３】
2020195881.tif 000062
【図２４】
2020195881.tif 000063
【図２５】
2020195881.tif 000064
【図２６】
2020195881.tif 000065
【図２７】
2020195881.tif 000066
【図２８】
2020195881.tif 000067
【図２９】
2020195881.tif 000068
【図３０】
2020195881.tif 000069
【図３０Ａ】
2020195881.tif 000070
【図３１Ａ】
2020195881.tif 000071
【図３１Ｂ】
2020195881.tif 000072
【図３１Ｃ】
2020195881.tif 000073
【図３１Ｄ】
2020195881.tif 000074
【図３２】
2020195881.tif 000075
【図３３】
2020195881.tif 000076
【図３４】
2020195881.tif 000077
【図３５】
2020195881.tif 000078
【図３６】
2020195881.tif 000079
【図３７】
2020195881.tif 000080
【図３８】
2020195881.tif 000081