(57)【要約】      （修正有）【課題】カテプシンＣ、ＣＥＬＡ１、ＣＥＬＡ３Ａ及び／又はそれらに構造的に関連する酵素のインヒビター化合物、及び細胞及び／又は組織壊死の処置のための前記化合物を含む組成物の提供。【解決手段】3,4-ビス（（2-（ピロリジン-1-イル）エチル）アミノ）-1,2,5-チアジアゾール1,1-ジオキシド、（2-（ピペリジン-1-イル）チアゾール-4-イル）（ピロリジン-1-イル）メタノン等に代表される特定の化学構造を有する化合物又はそれらの薬学的な塩で、細胞又は組織壊死、又はそれらに関連する疾患の処置又は防止における使用のためのものである化合物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式I：
【化１】
2020183405.tif 000057
式I
の構造によって特徴付けられ、
式中、G1は、置換または非置換ピロリジン、置換または非置換ピペリジン、置換または
非置換ピペラジン、置換または非置換イミダゾリジン、または置換または非置換ピラゾリ
ジンであり；および
G3は以下の構造：
【化２】
2020183405.tif 000058
によって特徴付けられるか；またはG3は、置換または非置換のアルキル、置換または非置
換のアリールまたは置換または非置換のシクロアルキルであり；
式中、G2は、置換または非置換のアルキル、置換または非置換のアリール、置換または
非置換のシクロアルキルまたは置換または非置換の複素環である、化合物；または
式II：
【化３】
2020183405.tif 000059
式II
の構造によって特徴付けられ、
式中、G1は、置換または非置換ピロリジン、置換または非置換ピリジン、置換または非
置換アリール、置換または非置換ピペリジン、置換または非置換ピペラジン、置換または
非置換イミダゾリジン、または置換または非置換ピラゾリジンであり；および
G3は以下の構造：
【化４】
2020183405.tif 000060
によって特徴付けられるか；またはG3は、置換または非置換のアルキル、置換または非置
換のアリールまたは置換または非置換のシクロアルキルであり；
式中、G2は、置換または非置換のアルキル、置換または非置換のアリール、置換または
非置換のシクロアルキルまたは置換または非置換の複素環である、化合物；または
式III：
【化５】
2020183405.tif 000061
式III
の構造によって特徴付けられ、
式中、G1は、置換または非置換ピロリジン、置換または非置換ピリジン、置換または非
置換アリール、置換または非置換ピペリジン、置換または非置換ピペラジン、置換または
非置換イミダゾリジン、または置換または非置換ピラゾリジンであり；および
G3は以下の構造：
【化６】
2020183405.tif 000062
によって特徴付けられ；またはG3は、置換または非置換のアルキル、置換または非置換の
アリールまたは置換または非置換のシクロアルキルであり；
式中、G2は、置換または非置換のアルキル、置換または非置換のアリール、置換または
非置換のシクロアルキルまたは置換または非置換の複素環である、化合物；または
次の：
3,4-ビス（（2-（ピロリジン-1-イル）エチル）アミノ）-1,2,5-チアジアゾール1,1-ジ
オキシド；
シクロプロピル（2-（5-イソプロピルイソキサゾール-3-イル）ピロリジン-1-イル）メ
タノン；
6-ブロモ-2-（3,5-ジメトキシフェニル）-4ベンゾ[d][1,3]オキサジン-4-オン
6-メチル-5 -（（2-メチルピペリジン-1-イル）スルホニル）ピリミジン-2,4（1H,3H）
-ジオン；
N-メチル-4,5,6,7,8,9-ヘキサヒドロ-1H-シクロオクタ[c]ピラゾール-3-カルボキサミ
ド；
2-（5-（ピリジン-4-イル）-2H-テトラゾール-2-イル）酢酸；
2-（フラン-2-イル）-5,6,7,8-テトラヒドロ-4H-ベンゾ[4,5]チエノ[2,3-d][1,3]オキ
サジン-4-オン；
3-（（5-アセトアミド-1H-1,2,4-トリアゾール-3-イル）チオ）プロパン酸；
N,N'-（オキシビス（4,1-フェニレン））ビス（2-メチルプロパンアミド）；
7-（4-エチルピペラジン-1-イル）-5,6-ジメチル-[1,2,4]トリアゾロ[1,5-a]ピリミジ
ン；
7-フルオロ-10-（2-（4-イソプロピルピペラジン-1-イル）-2-オキソエチル）-2,3-ジ
ヒドロ-1H-ベンゾ[e]ピロロ[1,2-a][1,4]ジアゼピン-5,11（10H,11aH）-ジオン；
2-（tert-ブチル）-3-（1-メチル-1H-ベンゾ[d]イミダゾール-2-イル）-4-オキソ-4H-
クロメン-7-イルピバラート；
3-メチル-8-（ピペリジン-1-イル）-1H-プリン-2,6（3H,7H）-ジオン；
2-（3-ブロモフェニル）-4-オキソ-4H-ベンゾ[d][1,3]オキサジン-6-イルアセタート；
N-（1-エチル-3,5-ジメチル-1H-ピラゾール-4-イル）-3,4,5-トリメトキシベンズアミ
ド；
5-エチル-N-（ピリジン-2-イルメチル）-5H-[1,2,4]トリアジノ[5,6-b]インドール-3-
アミン；
3-（（4-クロロ-1H-ピラゾール-1-イル）メチル）-N-（2-（3-フルオロベンズアミド）
エチル）-1,2,4-オキサジアゾール-5-カルボキサミド；
1-（4-（メチルチオ）ベンジル）-4-トシルピペラジン；
2-（2-エチルフェニルスルホンアミド）-5-（4-エチルピペラジン-1-イル）安息香酸；
4（（2-メチルインドリン-1-イル）スルホニル）安息香酸；
6-ブロモ-2-（3,5-ジメトキシフェニル）-4H-ベンゾ[d][1,3]オキサジン-4-オン；
2-アミノ-N-（2,4-ジフルオロフェニル）ピリミジン-5-スルホンアミド；
3-メチル-8-（ピペリジン-1-イル）-1H-プリン-2,6（3H,7H）-ジオン；
5-クロロ-N-（2-オキソ-1-フェニルピロリジン-3-イル）チオフェン-2-スルホンアミド
；
3-（ピロリジン-1-イルスルホニル）安息香酸；
（3,5-ジメチル-1H-ピラゾール-1-イル）（3,4,5-トリメトキシフェニル）メタノン；
N-（3,4-ジフルオロフェニル）-2-（8-フルオロ-5,11-ジオキソ-2,3,11,11a-テトラヒ
ドロ-1H-ベンゾ[e]ピロロ[1,2-a][1,4]ジアゼピン-10（5H）-イル）アセトアミド；
5-（シクロヘキシルメチル）-3-（ピリジン-2-イル）-1,2,4-オキサジアゾール；
エチル5-メチル-4-（2-（（4-メチルベンジル）アミノ）-2-オキソエチル）-7-フェニ
ル-4,7-ジヒドロ-[1,2,4]トリアゾロ[1,5-a]ピリミジン-6-カルボキシラート；
[1,2,4]トリアゾロ[1,5-a]ピリミジン-2-カルボン酸；
1-（2-（ピペリジン-1-イル）-4,5-ジヒドロ-1H-イミダゾール-1-イル）ブタン-1-オン
；
（4-（6-クロロ-[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピリジン-3-イル）ピペラジン-1-イル）（1
-フェニルシクロプロピル）メタノン；
N-（2,4-ジフルオロフェニル）-2-（5,11-ジオキソ-2,3,11,11a-テトラヒドロ-1H-ベン
ゾ[e]ピロロ[1,2-a][1,4]ジアゼピン-10（5H）-イル）アセトアミド；および
エチル-2,3-ジヒドロ-3-オキソ-1,2-ベンズイソチアゾール-2-アセタート-1,1-ジオキ
シド；またはそれらの薬学的な塩、またはそれらの任意の組合せからなる群より選ばれる
化合物で、細胞または組織壊死またはそれらに関連する疾患の処置または防止における使
用のためのものである、化合物。
【請求項２】
前記化合物は（2-（ピペリジン-1-イル）チアゾール-4-イル）（ピロリジン-1-イル）
メタノン；N-（4-メチルピリジン-2-イル）-4-（2,4,5-トリメチルフェニル）チアゾール
-2-アミン；4-（（2-メチルインドリン-1-イル）スルホニル）安息香酸；1-（2-（4-メチ
ルピペラジン-1-イル）-4,5-ジヒドロ-1H-イミダゾール-1-イル）プロパン-1-オン；シク
ロペンチル（2-（ピロリジン-1-イル）-4,5-ジヒドロ-1H-イミダゾール-1-イル）メタノ
ン；N1-（4-（4-クロロフェニル）チアゾール-2-イル）-N4,N4-ジメチルベンゼン-1,4-ジ
アミン；2-シクロペンチル-1-（2-（ピロリジン-1-イル）-4,5-ジヒドロ-1H-イミダゾー
ル-1-イル）エタノン；N1-（4-（4-クロロフェニル）チアゾール-2-イル）-N4,N4-ジメチ
ルベンゼン-1,4-ジアミン；シクロペンチル（2-（4-エチルピペラジン-1-イル）-4,5-ジ
ヒドロ-1H-イミダゾール-1-イル）メタノン；2-エチル-1-（2-（ピロリジン-1-イル）-4,
5-ジヒドロ-1H-イミダゾール-1-イル）ブタン-1-オン；フラン-2-イル（2-（ピロリジン-
1-イル）-4,5-ジヒドロ-1H-イミダゾール-1-イル）メタノン；（2-クロロフェニル）-[2-
（1-ピペリジル）-4,5-ジヒドロイミダゾール-1-イル]メタノンである、請求項1の化合物
。
【請求項３】
前記化合物は、CELA3Aまたはそれらに構造的に関連する酵素、CELA1またはカテプシンC
またはそれらの組合せにKd10-7Mまたはそれよりも少ない最小親和性を伴い選択的に結合
する、請求項1または2のいずれか一項の化合物。
【請求項４】
前記化合物は、CELA2A、CELA3B、またはカテプシンA、B、D、E、G、H、K、L1、L2、O、
S、WまたはZまたはそれらの組合せに最小親和性Kd10-6Mまたはそれよりも多くを伴い結合
する、請求項3の化合物。
【請求項５】
前記使用はエクスビボまたはインビトロである、請求項1または2のいずれか一項の化合
物。
【請求項６】
前記使用はインビボである、請求項1または2のいずれか一項の化合物。
【請求項７】
細胞または組織壊死を処置または防止することは、脳細胞、神経細胞、プルキンエ細胞
、海馬錐体細胞、グリア細胞、心筋細胞、筋細胞、ケラチノサイト、表皮細胞、骨または
軟骨細胞、膵臓細胞、肝細胞、腎臓細胞、消化管細胞、脾臓細胞、造血細胞、リンパ球、
マクロファージ胸腺細胞、線維芽細胞、上皮細胞、気管支上皮細胞、腎細胞（nephrocyte
）、糸球体細血管細胞、性腺細胞、精子、卵子、受精卵、胚細胞および肺上皮細胞からな
る群より選ばれる細胞に影響を及ぼす、請求項1または2のいずれか一項の化合物。
【請求項８】
細胞または組織壊死を処置または防止することは、徴候を処置、寛解、抑止し、または
次の：神経変性疾患、黄斑変性症、網膜壊死、筋ジストロフィー、白血病、リンパ腫、呼
吸窮迫、窒息、嵌頓ヘルニア、糖尿病、結核、子宮内膜症、脈管ジストロフィー、乾癬、
寒冷傷害、鉄負荷合併症、ステロイド処置の合併症、虚血性心疾患、心筋梗塞、再潅流傷
害、脳血管疾患または壊疽の損傷、褥瘡性潰瘍、膵炎、肝炎、硬変、ヘモグロビン尿、敗
血症、熱傷、高熱、クローン病、セリアック病、コンパートメント症候群、壊死性直腸炎
、スティーブンス・ジョンソン症候群（SJS）、中毒性表皮壊死（TEN）、嚢胞性線維症、
関節リウマチ、骨髄炎、壊死性筋膜炎、腎毒性、脊髄損傷、糸球体腎炎、急性尿細管壊死
、腎皮質壊死、変形性関節症、チロセミア、代謝性遺伝性疾患、細菌性、ウイルス性、真
菌性または寄生虫感染、アンダーソン病、先天性ミトコンドリア病、フェニルケトン尿、
胎盤梗塞、梅毒、梅毒、無菌壊死、虚血性壊死、アルコール依存、薬物による投与または
暴露に関連する壊死（necrosis associated with administration with  or exposure to
a drug）、化学的毒素、農薬、重金属、兵器有機リン酸エステル、クモまたはヘビ毒、
ダーマルフィラー施与に関係する壊死、異所的薬物施与に関係する壊死、化学療法誘発性
壊死、放射線誘発性壊死、移植組織の欠陥または低下した質（impairment of or reduced
quality of transplant tissue）、または加齢からなる群より選ばれる疾患または医学
的条件の発生率を減らす、請求項1または2のいずれか一項の化合物。
【請求項９】
式I：
【化７】
2020183405.tif 000063
式I
の構造によって特徴付けられ、
式中、G1は、置換または非置換ピロリジン、置換または非置換ピペリジン、置換または
非置換ピペラジン、置換または非置換イミダゾリジン、または置換または非置換ピラゾリ
ジンであり；および
G3は以下の構造：
【化８】
2020183405.tif 000064
によって特徴付けられるか；またはG3は、置換または非置換のアルキル、置換または非置
換のアリールまたは置換または非置換のシクロアルキルであり；
式中、G2は、置換または非置換のアルキル、置換または非置換のアリール、置換または
非置換のシクロアルキルまたは置換または非置換の複素環である、化合物；または
式II：
【化９】
2020183405.tif 000065
式II
の構造によって特徴付けられ、
式中、G1は、置換または非置換ピロリジン、置換または非置換ピリジン、置換または非
置換アリール、置換または非置換ピペリジン、置換または非置換ピペラジン、置換または
非置換イミダゾリジン、または置換または非置換ピラゾリジンであり；および
G3は以下の構造：
【化１０】
2020183405.tif 000066
によって特徴付けられるか；またはG3は、置換または非置換のアルキル、置換または非置
換のアリールまたは置換または非置換のシクロアルキルであり；
式中、G2は、置換または非置換のアルキル、置換または非置換のアリール、置換または
非置換のシクロアルキルまたは置換または非置換の複素環である、化合物；または
式III：
【化１１】
2020183405.tif 000067
式III
の構造によって特徴付けられ、
式中、G1は、置換または非置換ピロリジン、置換または非置換ピリジン、置換または非
置換アリール、置換または非置換ピペリジン、置換または非置換ピペラジン、置換または
非置換イミダゾリジン、または置換または非置換ピラゾリジンであり；および
G3は以下の構造：
【化１２】
2020183405.tif 000068
によって特徴付けられ；またはG3は、置換または非置換のアルキル、置換または非置換の
アリールまたは置換または非置換のシクロアルキルであり；
式中、G2は、置換または非置換のアルキル、置換または非置換のアリール、置換または
非置換のシクロアルキルまたは置換または非置換の複素環である、化合物；または
次の：
3,4-ビス（（2-（ピロリジン-1-イル）エチル）アミノ）-1,2,5-チアジアゾール1,1-ジ
オキシド；
シクロプロピル（2-（5-イソプロピルイソキサゾール-3-イル）ピロリジン-1-イル）メ
タノン；
6-ブロモ-2-（3,5-ジメトキシフェニル）-4ベンゾ[d][1,3]オキサジン-4-オン
6-メチル-5 -（（2-メチルピペリジン-1-イル）スルホニル）ピリミジン-2,4（1H,3H）
-ジオン；
N-メチル-4,5,6,7,8,9-ヘキサヒドロ-1H-シクロオクタ[c]ピラゾール-3-カルボキサミ
ド；
2-（5-（ピリジン-4-イル）-2H-テトラゾール-2-イル）酢酸；
2-（フラン-2-イル）-5,6,7,8-テトラヒドロ-4H-ベンゾ[4,5]チエノ[2,3-d][1,3]オキ
サジン-4-オン；
3-（（5-アセトアミド-1H-1,2,4-トリアゾール-3-イル）チオ）プロパン酸；
N,N'-（オキシビス（4,1-フェニレン））ビス（2-メチルプロパンアミド）；
7-（4-エチルピペラジン-1-イル）-5,6-ジメチル-[1,2,4]トリアゾロ[1,5-a]ピリミジ
ン；
7-フルオロ-10-（2-（4-イソプロピルピペラジン-1-イル）-2-オキソエチル）-2,3-ジ
ヒドロ-1H-ベンゾ[e]ピロロ[1,2-a][1,4]ジアゼピン-5,11（10H,11aH）-ジオン；
2-（tert-ブチル）-3-（1-メチル-1H-ベンゾ[d]イミダゾール-2-イル）-4-オキソ-4H-
クロメン-7-イルピバラート；
3-メチル-8-（ピペリジン-1-イル）-1H-プリン-2,6（3H,7H）-ジオン；
2-（3-ブロモフェニル）-4-オキソ-4H-ベンゾ[d][1,3]オキサジン-6-イルアセタート；
N-（1-エチル-3,5-ジメチル-1H-ピラゾール-4-イル）-3,4,5-トリメトキシベンズアミ
ド；
5-エチル-N-（ピリジン-2-イルメチル）-5H-[1,2,4]トリアジノ[5,6-b]インドール-3-
アミン；
3-（（4-クロロ-1H-ピラゾール-1-イル）メチル）-N-（2-（3-フルオロベンズアミド）
エチル）-1,2,4-オキサジアゾール-5-カルボキサミド；
1-（4-（メチルチオ）ベンジル）-4-トシルピペラジン；
2-（2-エチルフェニルスルホンアミド）-5-（4-エチルピペラジン-1-イル）安息香酸；
4（（2-メチルインドリン-1-イル）スルホニル）安息香酸；
6-ブロモ-2-（3,5-ジメトキシフェニル）-4H-ベンゾ[d][1,3]オキサジン-4-オン；
2-アミノ-N-（2,4-ジフルオロフェニル）ピリミジン-5-スルホンアミド；
3-メチル-8-（ピペリジン-1-イル）-1H-プリン-2,6（3H,7H）-ジオン；
5-クロロ-N-（2-オキソ-1-フェニルピロリジン-3-イル）チオフェン-2-スルホンアミド
；
3-（ピロリジン-1-イルスルホニル）安息香酸；
（3,5-ジメチル-1H-ピラゾール-1-イル）（3,4,5-トリメトキシフェニル）メタノン；
N-（3,4-ジフルオロフェニル）-2-（8-フルオロ-5,11-ジオキソ-2,3,11,11a-テトラヒ
ドロ-1H-ベンゾ[e]ピロロ[1,2-a][1,4]ジアゼピン-10（5H）-イル）アセトアミド；
5-（シクロヘキシルメチル）-3-（ピリジン-2-イル）-1,2,4-オキサジアゾール；
エチル5-メチル-4-（2-（（4-メチルベンジル）アミノ）-2-オキソエチル）-7-フェニ
ル-4,7-ジヒドロ-[1,2,4]トリアゾロ[1,5-a]ピリミジン-6-カルボキシラート；
[1,2,4]トリアゾロ[1,5-a]ピリミジン-2-カルボン酸；
1-（2-（ピペリジン-1-イル）-4,5-ジヒドロ-1H-イミダゾール-1-イル）ブタン-1-オン
；
（4-（6-クロロ-[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピリジン-3-イル）ピペラジン-1-イル）（1
-フェニルシクロプロピル）メタノン；
N-（2,4-ジフルオロフェニル）-2-（5,11-ジオキソ-2,3,11,11a-テトラヒドロ-1H-ベン
ゾ[e]ピロロ[1,2-a][1,4]ジアゼピン-10（5H）-イル）アセトアミド；および
エチル-2,3-ジヒドロ-3-オキソ-1,2-ベンズイソチアゾール-2-アセタート-1,1-ジオキ
シド；またはそれらの薬学的な塩、またはそれらの任意の組合せからなる群より選ばれる
化合物の有効量を含み、および随意に薬学的に許容可能な担体または賦形剤をさらに含む
、薬剤組成物。
【請求項１０】
抗アポトーシス剤または抗加齢剤がさらに含まれる、請求項9の組成物。
【請求項１１】
細胞または組織壊死の処置または防止における使用のためのものである、請求項9の組
成物。
【請求項１２】
前記使用はエクスビボまたはインビトロである、請求項11の組成物。
【請求項１３】
前記細胞または組織壊死を処置または防止することは、脳細胞、神経細胞、プルキンエ
細胞、海馬錐体細胞、グリア細胞、心筋細胞、筋細胞、ケラチノサイト、表皮細胞、骨ま
たは軟骨細胞、膵臓細胞、肝細胞、腎臓細胞、消化管細胞、脾臓細胞、造血細胞、リンパ
球、マクロファージ胸腺細胞、線維芽細胞、上皮細胞、気管支上皮細胞、腎細胞、糸球体
細血管細胞、性腺細胞、精子、卵子、受精卵、胚細胞および肺上皮細胞からなる群より選
ばれる細胞に影響を及ぼす、請求項11の組成物。
【請求項１４】
細胞または組織壊死を処置または防止することは、次の：神経変性疾患、黄斑変性症、
網膜壊死、筋ジストロフィー、白血病、リンパ腫、呼吸窮迫、窒息、嵌頓ヘルニア、糖尿
病、結核、子宮内膜症、脈管ジストロフィー、乾癬、寒冷傷害、鉄負荷合併症、ステロイ
ド処置の合併症、虚血性心疾患、心筋梗塞、再潅流傷害、脳血管疾患または壊疽の損傷、
褥瘡性潰瘍、膵炎、肝炎、硬変、ヘモグロビン尿、敗血症、熱傷、高熱、クローン病、セ
リアック病、コンパートメント症候群、壊死性直腸炎、スティーブンス・ジョンソン症候
群（SJS）、中毒性表皮壊死（TEN）、嚢胞性線維症、関節リウマチ、骨髄炎、壊死性筋膜
炎、腎毒性、脊髄損傷、糸球体腎炎、急性尿細管壊死、腎皮質壊死、変形性関節症、チロ
セミア、代謝性遺伝性疾患、細菌性、ウイルス性、真菌性または寄生虫感染、アンダーソ
ン病、先天性ミトコンドリア病、フェニルケトン尿、胎盤梗塞、梅毒、梅毒、無菌壊死、
虚血性壊死、アルコール依存、薬物による投与または暴露に関連する壊死、化学的毒素、
農薬、重金属、兵器有機リン酸エステル、クモまたはヘビ毒、ダーマルフィラー施与に関
係する壊死、異所的薬物施与に関係する壊死、化学療法誘発性壊死、放射線誘発性壊死、
移植組織の欠陥または低下した質、または加齢からなる群より選ばれる疾患または医学的
条件の徴候を処置し、寛解し、抑止し、または発生率を減らす、請求項11の組成物。
【請求項１５】
壊死に関係する疾患または条件の徴候を処置し、防止し、寛解し、抑止し、またはそれ
らの発生率を減らすにあたり、それを必要とする対象において、式I：
【化１３】
2020183405.tif 000069
式I
の構造によって特徴付けられ、
式中、G1は、置換または非置換ピロリジン、置換または非置換ピペリジン、置換または
非置換ピペラジン、置換または非置換イミダゾリジン、または置換または非置換ピラゾリ
ジンであり；および
G3は以下の構造：
【化１４】
2020183405.tif 000070
によって特徴付けられるか；またはG3は、置換または非置換のアルキル、置換または非置
換のアリールまたは置換または非置換のシクロアルキルであり；
式中、G2は、置換または非置換のアルキル、置換または非置換のアリール、置換または
非置換のシクロアルキルまたは置換または非置換の複素環である、化合物；または
式II：
【化１５】
2020183405.tif 000071
式II
の構造によって特徴付けられ、
式中、G1は、置換または非置換ピロリジン、置換または非置換ピリジン、置換または非
置換アリール、置換または非置換ピペリジン、置換または非置換ピペラジン、置換または
非置換イミダゾリジン、または置換または非置換ピラゾリジンであり；および
G3は以下の構造：
【化１６】
2020183405.tif 000072
によって特徴付けられるか；またはG3は、置換または非置換のアルキル、置換または非置
換のアリールまたは置換または非置換のシクロアルキルであり；
式中、G2は、置換または非置換のアルキル、置換または非置換のアリール、置換または
非置換のシクロアルキルまたは置換または非置換の複素環である、化合物；または
式III：
【化１７】
2020183405.tif 000073
式III
の構造によって特徴付けられ、
式中、G1は、置換または非置換ピロリジン、置換または非置換ピリジン、置換または非
置換アリール、置換または非置換ピペリジン、置換または非置換ピペラジン、置換または
非置換イミダゾリジン、または置換または非置換ピラゾリジンであり；および
G3は以下の構造：
【化１８】
2020183405.tif 000074
によって特徴付けられ；またはG3は、置換または非置換のアルキル、置換または非置換の
アリールまたは置換または非置換のシクロアルキルであり；
式中、G2は、置換または非置換のアルキル、置換または非置換のアリール、置換または
非置換のシクロアルキルまたは置換または非置換の複素環である、化合物；または
次の：
3,4-ビス（（2-（ピロリジン-1-イル）エチル）アミノ）-1,2,5-チアジアゾール1,1-ジ
オキシド；
シクロプロピル（2-（5-イソプロピルイソキサゾール-3-イル）ピロリジン-1-イル）メ
タノン；
6-ブロモ-2-（3,5-ジメトキシフェニル）-4ベンゾ[d][1,3]オキサジン-4-オン
6-メチル-5 -（（2-メチルピペリジン-1-イル）スルホニル）ピリミジン-2,4（1H,3H）
-ジオン；
N-メチル-4,5,6,7,8,9-ヘキサヒドロ-1H-シクロオクタ[c]ピラゾール-3-カルボキサミ
ド；
2-（5-（ピリジン-4-イル）-2H-テトラゾール-2-イル）酢酸；
2-（フラン-2-イル）-5,6,7,8-テトラヒドロ-4H-ベンゾ[4,5]チエノ[2,3-d][1,3]オキ
サジン-4-オン；
3-（（5-アセトアミド-1H-1,2,4-トリアゾール-3-イル）チオ）プロパン酸；
N,N'-（オキシビス（4,1-フェニレン））ビス（2-メチルプロパンアミド）；
7-（4-エチルピペラジン-1-イル）-5,6-ジメチル-[1,2,4]トリアゾロ[1,5-a]ピリミジ
ン；
7-フルオロ-10-（2-（4-イソプロピルピペラジン-1-イル）-2-オキソエチル）-2,3-ジ
ヒドロ-1H-ベンゾ[e]ピロロ[1,2-a][1,4]ジアゼピン-5,11（10H,11aH）-ジオン；
2-（tert-ブチル）-3-（1-メチル-1H-ベンゾ[d]イミダゾール-2-イル）-4-オキソ-4H-
クロメン-7-イルピバラート；
3-メチル-8-（ピペリジン-1-イル）-1H-プリン-2,6（3H,7H）-ジオン；
2-（3-ブロモフェニル）-4-オキソ-4H-ベンゾ[d][1,3]オキサジン-6-イルアセタート；
N-（1-エチル-3,5-ジメチル-1H-ピラゾール-4-イル）-3,4,5-トリメトキシベンズアミ
ド；
5-エチル-N-（ピリジン-2-イルメチル）-5H-[1,2,4]トリアジノ[5,6-b]インドール-3-
アミン；
3-（（4-クロロ-1H-ピラゾール-1-イル）メチル）-N-（2-（3-フルオロベンズアミド）
エチル）-1,2,4-オキサジアゾール-5-カルボキサミド；
1-（4-（メチルチオ）ベンジル）-4-トシルピペラジン；
2-（2-エチルフェニルスルホンアミド）-5-（4-エチルピペラジン-1-イル）安息香酸；
4（（2-メチルインドリン-1-イル）スルホニル）安息香酸；
6-ブロモ-2-（3,5-ジメトキシフェニル）-4H-ベンゾ[d][1,3]オキサジン-4-オン；
2-アミノ-N-（2,4-ジフルオロフェニル）ピリミジン-5-スルホンアミド；
3-メチル-8-（ピペリジン-1-イル）-1H-プリン-2,6（3H,7H）-ジオン；
5-クロロ-N-（2-オキソ-1-フェニルピロリジン-3-イル）チオフェン-2-スルホンアミド
；
3-（ピロリジン-1-イルスルホニル）安息香酸；
（3,5-ジメチル-1H-ピラゾール-1-イル）（3,4,5-トリメトキシフェニル）メタノン；
N-（3,4-ジフルオロフェニル）-2-（8-フルオロ-5,11-ジオキソ-2,3,11,11a-テトラヒ
ドロ-1H-ベンゾ[e]ピロロ[1,2-a][1,4]ジアゼピン-10（5H）-イル）アセトアミド；
5-（シクロヘキシルメチル）-3-（ピリジン-2-イル）-1,2,4-オキサジアゾール；
エチル5-メチル-4-（2-（（4-メチルベンジル）アミノ）-2-オキソエチル）-7-フェニ
ル-4,7-ジヒドロ-[1,2,4]トリアゾロ[1,5-a]ピリミジン-6-カルボキシラート；
[1,2,4]トリアゾロ[1,5-a]ピリミジン-2-カルボン酸；
1-（2-（ピペリジン-1-イル）-4,5-ジヒドロ-1H-イミダゾール-1-イル）ブタン-1-オン
；
（4-（6-クロロ-[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピリジン-3-イル）ピペラジン-1-イル）（1
-フェニルシクロプロピル）メタノン；
N-（2,4-ジフルオロフェニル）-2-（5,11-ジオキソ-2,3,11,11a-テトラヒドロ-1H-ベン
ゾ[e]ピロロ[1,2-a][1,4]ジアゼピン-10（5H）-イル）アセトアミド；および
エチル-2,3-ジヒドロ-3-オキソ-1,2-ベンズイソチアゾール-2-アセタート-1,1-ジオキ
シド；またはそれらの薬学的な塩、またはそれらの任意の組合せからなる群より選ばれる
化合物の治療上有効な量を前記対象に施与することを含み、それによって前記対象におい
て疾患または条件が処置される、方法。
【請求項１６】
前記化合物は、（2-（ピペリジン-1-イル）チアゾール-4-イル）（ピロリジン-1-イル
）メタノン；N-（4-メチルピリジン-2-イル）-4-（2,4,5-トリメチルフェニル）チアゾー
ル-2-アミン；4-（（2-メチルインドリン-1-イル）スルホニル）安息香酸；1-（2-（4-メ
チルピペラジン-1-イル）-4,5-ジヒドロ-1H-イミダゾール-1-イル）プロパン-1-オン；シ
クロペンチル（2-（ピロリジン-1-イル）-4,5-ジヒドロ-1H-イミダゾール-1-イル）メタ
ノン；N1-（4-（4-クロロフェニル）チアゾール-2-イル）-N4,N4-ジメチルベンゼン-1,4-
ジアミン；2-シクロペンチル-1-（2-（ピロリジン-1-イル）-4,5-ジヒドロ-1H-イミダゾ
ール-1-イル）エタノン；N1-（4-（4-クロロフェニル）チアゾール-2-イル）-N4,N4-ジメ
チルベンゼン-1,4-ジアミン；シクロペンチル（2-（4-エチルピペラジン-1-イル）-4,5-
ジヒドロ-1H-イミダゾール-1-イル）メタノン；2-エチル-1-（2-（ピロリジン-1-イル）-
4,5-ジヒドロ-1H-イミダゾール-1-イル）ブタン-1-オン；フラン-2-イル（2-（ピロリジ
ン-1-イル）-4,5-ジヒドロ-1H-イミダゾール-1-イル）メタノン；および（2-クロロフェ
ニル）-[2-（1-ピペリジル）-4,5-ジヒドロイミダゾール-1-イル]メタノンからなる群よ
り選ばれる、請求項15の方法。
【請求項１７】
前記疾患または条件は、神経変性疾患、黄斑変性症、網膜壊死、筋ジストロフィー、白
血病、リンパ腫、呼吸窮迫、窒息、嵌頓ヘルニア、糖尿病、結核、子宮内膜症、脈管ジス
トロフィー、乾癬、寒冷傷害、鉄負荷合併症、ステロイド処置の合併症、虚血性心疾患、
心筋梗塞、再潅流傷害、脳血管疾患または壊疽の損傷、褥瘡性潰瘍、膵炎、肝炎、硬変、
ヘモグロビン尿、敗血症、熱傷、高熱、クローン病、セリアック病、コンパートメント症
候群、壊死性直腸炎、スティーブンス・ジョンソン症候群（SJS）、中毒性表皮壊死（TEN
）、嚢胞性線維症、関節リウマチ、骨髄炎、壊死性筋膜炎、腎毒性、脊髄損傷、糸球体腎
炎、急性尿細管壊死、腎皮質壊死、変形性関節症、チロセミア、代謝性遺伝性疾患、細菌
性、ウイルス性、真菌性または寄生虫感染、アンダーソン病、先天性ミトコンドリア病、
フェニルケトン尿、胎盤梗塞、梅毒、梅毒、無菌壊死、虚血性壊死、アルコール依存、薬
物による投与または暴露に関連する壊死、化学的毒素、農薬、重金属、兵器有機リン酸エ
ステル、クモまたはヘビ毒、ダーマルフィラー施与に関係する壊死、異所的薬物施与に関
係する壊死、化学療法誘発性壊死、放射線誘発性壊死、移植組織の欠陥または低下した質
、または加齢からなる群より選ばれる、請求項15の方法。
【請求項１８】
抗アポトーシス剤を対象に施与することがさらに含まれる、請求項15の方法。
【請求項１９】
前記抗アポトーシス剤は、前記化合物の施与前、施与と同時に、または施与後に施与さ
れる、請求項18の方法。
【請求項２０】
前記抗アポトーシス剤は、-[R]-N-[2-ヘプチル]-メチルプロパルギルアミン（R-2HMP）
、ビタミンE、ビタミンD、カスパーゼインヒビターおよび親水性胆汁塩ウルソデオキシコ
ール酸からなる群より選ばれる、請求項18の方法。
【請求項２１】
抗加齢剤を対象に施与するステップがさらに含まれる、請求項15の方法。
【請求項２２】
前記抗加齢剤は、抗酸化剤、植物化学物質、ホルモン、メトホルミンおよび脂肪酸から
なる群より選ばれる、請求項21の方法。
【請求項２３】
細胞または組織壊死に関係する疾患または医学的条件の徴候の処置、防止、寛解、抑止
、発生率の減少のための薬の製造における、請求項1または2のいずれか一項の化合物また
は請求項9の組成物の使用。
【請求項２４】
CELA3A、CELA1、またはカテプシンCインヒビター剤であって、前記薬剤は、アンチセン
ス、siRNA、マイクロRNA、リボザイムおよびDNAザイムからなる群より選ばれるポリヌク
レオチドであり、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列
番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35お
よび配列番号36からなる群より選ばれる核酸領域に向けられる、CELA3A、CELA1、または
カテプシンCインヒビター剤。
【請求項２５】
CELA3A、CELA1、またはカテプシンCインヒビター剤であって、前記薬剤はポリヌクレオ
チドであり、ポリヌクレオチド剤は、配列番号1、配列番号2または配列番号3で表される
核酸配列のポリヌクレオチドと少なくとも95％の同一性を共有する、CELA3A、CELA1、ま
たはカテプシンCインヒビター剤。
【請求項２６】
前記インヒビター剤は、CELA1またはCELA3A配列またはそれらの組合せと特異的にハイ
ブリダイズし、およびモデレートないしストリンジェントなハイブリダイゼーション条件
下でCELA2AまたはCELA3B配列にハイブリダイズしない、請求項24または25のいずれか一項
のインヒビター剤。
【請求項２７】
前記インヒビター剤は、CELA1またはCELA3A配列またはその組合せと特異的にハイブリ
ダイズし、およびストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でCELA2AまたはCELA
3B配列にハイブリダイズしない、請求項24または25のいずれか一項のインヒビター剤。
【請求項２８】
前記インヒビター剤は、カテプシンCに特異的にハイブリダイズし、およびモデレート
ないしストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でカテプシンA、B、D、E、G、H
、K、L1、L2、O、S、WまたはZにハイブリダイズしない、請求項24または25のいずれか一
項のインヒビター剤。
【請求項２９】
前記インヒビター剤はポリヌクレオチドであり、ポリヌクレオチド剤は、配列番号1で
表される核酸配列のポリヌクレオチドと少なくとも95％の同一性を共有する、請求項24ま
たは25のいずれか一項のインヒビター剤。
【請求項３０】
前記インヒビター剤はポリヌクレオチドであり、ポリヌクレオチド剤は、配列番号2で
表される核酸配列のポリヌクレオチドと少なくとも95％の同一性を共有する、請求項24ま
たは25のいずれか一項のインヒビター剤。
【請求項３１】
前記インヒビター剤はポリヌクレオチドであり、ポリヌクレオチド剤は、配列番号3で
表される核酸配列のポリヌクレオチドと少なくとも95％の同一性を共有する、請求項24ま
たは25のいずれか一項のインヒビター剤。
【請求項３２】
請求項24-31のいずれか一項のインヒビター剤を含む核酸構築物。
【請求項３３】
CELA3A、CELA1またはカテプシンCインヒビター剤であって、前記薬剤は、配列番号11、
配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号
18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、および配列番号23からなる群よ
り選ばれる配列を含むポリペプチドに特異的に結合し、およびその機能を抑制または防止
する抗体である、CELA3A、CELA1またはカテプシンCインヒビター剤。
【請求項３４】
請求項24-33のいずれか一項のインヒビター剤および薬学的に許容される担体を含む薬
剤組成物。
【請求項３５】
細胞膜の浸透のために調剤される、請求項34の薬剤組成物。
【請求項３６】
脂質小胞が含まれる、請求項35の薬剤組成物。
【請求項３７】
抗アポトーシス剤がさらに含まれる、請求項34-36のいずれか一項の薬剤組成物。
【請求項３８】
前記抗アポトーシス剤は、-[R]-N-[2-ヘプチル]-メチルプロパルギルアミン（R-2HMP）
、ビタミンE、ビタミンD、カスパーゼインヒビターおよび親水性胆汁塩ウルソデオキシコ
ール酸からなる群より選ばれる、請求項37の薬剤組成物。
【請求項３９】
抗加齢剤がさらに含まれる、請求項34-36のいずれか一項の薬剤組成物。
【請求項４０】
前記抗加齢剤は、抗酸化剤、植物化学物質、ホルモン、メトホルミンおよび脂肪酸から
なる群より選ばれる、請求項39の薬剤組成物。
【請求項４１】
細胞または組織壊死に関係する疾患または条件の徴候の処置、防止、寛解、抑止または
発生率の減少のための薬の製造における、請求項24-33のいずれか一項のインヒビター剤
、または請求項37-34のいずれか一項の組成物の使用。
【請求項４２】
壊死に関係する疾患または条件の徴候を処置し、防止し、寛解し、抑止しまたは発生率
を減らすにあたり、それを必要とする対象において、請求項24-33のいずれか一項のイン
ヒビター剤、または請求項37-34のいずれか一項の組成物の治療上有効な量を前記対象に
施与することを含み、それによって前記対象において疾患または条件が処置される、方法
。
【請求項４３】
前記疾患または条件は、神経変性疾患、黄斑変性症、網膜壊死、筋ジストロフィー、白
血病、リンパ腫、呼吸窮迫、窒息、嵌頓ヘルニア、糖尿病、結核、子宮内膜症、脈管ジス
トロフィー、乾癬、寒冷傷害、鉄負荷合併症、ステロイド処置の合併症、虚血性心疾患、
心筋梗塞、再潅流傷害、脳血管疾患または壊疽の損傷、褥瘡性潰瘍、膵炎、肝炎、硬変、
ヘモグロビン尿、敗血症、熱傷、高熱、クローン病、セリアック病、コンパートメント症
候群、壊死性直腸炎、スティーブンス・ジョンソン症候群（SJS）、中毒性表皮壊死（TEN
）、嚢胞性線維症、関節リウマチ、骨髄炎、壊死性筋膜炎、腎毒性、脊髄損傷、糸球体腎
炎、急性尿細管壊死、腎皮質壊死、変形性関節症、チロセミア、代謝性遺伝性疾患、細菌
性、ウイルス性、真菌性または寄生虫感染、アンダーソン病、先天性ミトコンドリア病、
フェニルケトン尿、胎盤梗塞、梅毒、梅毒、無菌壊死、虚血性壊死、アルコール依存、薬
物による投与または暴露に関連する壊死、化学的毒素、農薬、重金属、兵器有機リン酸エ
ステル、クモまたはヘビ毒、ダーマルフィラー施与に関係する壊死、異所的薬物施与に関
係する壊死、化学療法誘発性壊死、放射線誘発性壊死、移植組織の欠陥または低下した質
、または加齢からなる群より選ばれる、請求項42の方法、または請求項41の使用。
【請求項４４】
抗アポトーシス剤を対象に施与することがさらに含まれる、請求項42の方法。
【請求項４５】
前記抗アポトーシス剤は、前記化合物の施与前、施与と同時に、または施与後に施与さ
れる、請求項44の方法。
【請求項４６】
前記抗アポトーシス剤は、-[R]-N-[2-ヘプチル]-メチルプロパルギルアミン（R-2HMP）
、ビタミンE、ビタミンD、カスパーゼインヒビターおよび親水性胆汁塩ウルソデオキシコ
ール酸からなる群より選ばれる、請求項44の方法。
【請求項４７】
抗加齢剤を対象に施与するステップがさらに含まれる、請求項42の方法。
【請求項４８】
前記抗加齢剤は、抗酸化剤、植物化学物質、ホルモンおよび脂肪酸からなる群より選ば
れる、請求項47の方法。
【請求項４９】
式VI
【化１９】
2020183405.tif 000075
式VI
の構造によって特徴付けられ、
式中：
G1は、随意に置換されるNH-ピロリジン、随意に置換されるNH-ピペリジン、随意に置換
されるNH-ピペラジン、随意に置換されるNH-イミダゾリジン、随意に置換されるNH-ピラ
ゾリジン、随意に置換されるNH-アリール、随意に置換されるNH-シクロアルキル、随意に
置換されるピロリジン、随意に置換されるピペリジン、随意に置換されるピペリディン、
随意に置換されるピペラジン、随意に置換されるイミダゾリジン、または随意に置換され
るピラゾリジンであり；
G2は、随意に置換されるアルキル、随意に置換されるアリール、随意に置換されるシク
ロアルキルまたは随意に置換される複素環であり；
ここで：
G1が非置換ピロリジンである場合、そのときG2は、アルキル、シクロペンチル、アルキ
ルシクロペンチルまたはフランではなく；または
G1がピペリジンである場合、そのときG2はアルキルではなく；および
G1がピペラジンである場合、そのときG2はアルキルまたはフランではない、
化合物。
【請求項５０】
G1はピロリジンであり、およびG2はエチルまたはフランである、請求項49の化合物。
【請求項５１】
G1は置換ピペラジンであり、およびG2はフランまたはフェニルである、請求項49の化合
物。
【請求項５２】
G1はピペリジンであり、およびG2は、シクロペンチル、フランまたはフェニルである、
請求項49の化合物。
【請求項５３】
G1は随意に置換されるイミダゾリジンまたは随意に置換されるピラゾリジンである、請
求項49の化合物。
【請求項５４】
式VII：
【化２０】
2020183405.tif 000076
式VII
の構造によって特徴付けられ、
式中：
G1は、随意に置換されるNH-ピロリジン、随意に置換されるNH-ピペリジン、随意に置換
されるNH-ピペラジン、随意に置換されるNH-イミダゾリジン、随意に置換されるNH-ピラ
ゾリジン、随意に置換されるNH-ピリジン、随意に置換されるNH-アリール、随意に置換さ
れるNH-シクロアルキル、随意に置換されるピロリジン、随意に置換されるピペリジン、
随意に置換されるピペリディン、随意に置換されるピペラジン、随意に置換されるイミダ
ゾリジン、随意に置換されるピラゾリジンまたは随意に置換されるアリールであり；
G2は、
【化２１】
2020183405.tif 000077
または随意に置換されるアルキル、随意に置換されるアリールまたは随意に置換されるシ
クロアルキルであり；および
G4は、随意に置換されるピロリジン、随意に置換されるピペリジン、随意に置換される
ピペラジン、随意に置換されるイミダゾリジンまたは随意に置換されるピラゾリジンであ
り；
ここで：
G1がピペリジンである場合、そのときG4はピロリジンではなく、またはG2は随意に置換
されるアリールではなく；または
G1がイミダゾリジンである場合、そのときG2は随意に置換されるアリールではなく；ま
たは
G1が随意に置換されるNH-ピリジンである場合、そのときG2は随意に置換されるアリー
ルではなく；または
G1が随意に置換されるNH-アリールである場合、そのときG2は随意に置換されるアリー
ルではなく；または
G1が随意に置換されるピリジンである場合、そのときG2は随意に置換されるアリールで
はない、
化合物。
【請求項５５】
G1は随意に置換されるNH-ピリジンであり、G2は、
【化２２】
2020183405.tif 000078
であり、式中、G4はピロリジンであり、またはG2はハロアリールである、請求項54の化合
物。
【請求項５６】
G1は随意に置換されるNH-アリールであり、およびG2は、
【化２３】
2020183405.tif 000079
であり、式中、G4はピロリジンである、請求項54の化合物。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
この出願は、2015年4月7日付け米国仮特許出願第62/143,821号および2015年6月4日付け
米国仮特許出願第62/170,717号の利益を請求し、参照することによりそれらの双方を全体
としてここに組み込む。
【０００２】
本発明の分野
本発明は、そのいくらかの実施態様において、細胞壊死の処置および/または防止のた
めの組成物および方法に、およびさらに具体的には、細胞内カテプシンCおよび/またはCE
LA1および/またはCELA3Aおよび/またはそれらに構造的に関連する標的の発現の下方制御
および/または活性の抑制によって細胞壊死を防止し、または処置することに関する。
【背景技術】
【０００３】
壊死（ネクローシス）は、細胞および生存組織の死滅の独特なプロセスであると考えら
れ、アポトーシスのプログラム細胞死とは区別される。壊死は、細胞の腫脹、クロマチン
消化ならびに血しょうおよびオルガネラ膜の破壊によって特徴付けられる。壊死の最終段
階は、広範なDNA加水分解、小胞体の空胞化、細胞小器官の崩壊および細胞溶解によって
特徴付けられる。細胞膜破裂後の細胞内内容物の放出は、壊死で見られる炎症の原因であ
る。壊死は長い間、細胞死の偶発的な病理学的様式とみなされてきており；しかしながら
、最近の研究では、壊死が調節されたプロセスであることを指し示すいくつかの証拠が示
された。
【０００４】
アポトーシスは、壊死とは異なって、エネルギー依存性である。アポトーシスは、カス
パーゼ活性化およびDNA開裂の特異的様式を特徴とするが、しかしながら、双方のプロセ
スは壊死には存在しない。
【０００５】
細胞死は戻ってこない点につながるプロセスである。たとえば、総虚血に供された肝細
胞について、細胞死はおよそ150分であり、その時間は組織学的切片ではほとんど変化が
見られない。壊死は12ないし24時間後だけで十分に発達する。言い換えれば、細胞は、光
学顕微鏡検査によって何らかの壊死変化を見ることができるよりもずっと前に死滅する。
【０００６】
多くの壊死の原因があり、それには、たとえば、傷害、虚血、無酸素症、梗塞、感染、
ガン、毒、毒液および炎症への長期曝露が含まれる。例として、壊死は、創傷部位への適
切なケアの欠如から生じることがある。
【０００７】
壊死はまた、心筋梗塞、脳卒中、肝硬変および他の潜在的に致命的な疾患を含むいくつ
かの重篤な疾患の病理に関与する。心不全は、西洋での最大の死因の1つであり、心臓筋
肉細胞（心筋細胞）の喪失によって特徴付けられる。心不全に伴う心筋細胞の喪失におい
て、壊死による細胞死が重要な役割を果たすことは十分に確立された。
【０００８】
壊死組織の早期の、および積極的な外科的創面切除および試験切開、高圧酸素療法、高
圧力酸素治療法、抗生物質の施与、抗炎症薬の施与および静脈内免疫グロブリンの施与を
含む壊死のためのいくつかの既存の治療法が現在存在する。しかしながら、これらはすべ
て、部分的には成功だが部分的には失敗して使用され、著しい疾病率および死亡率は、壊
死の合併症に起因する。
【０００９】
多くの壊死の原因があり、それには、たとえば、傷害、虚血、無酸素症、梗塞、感染、
ガン、毒、毒液および炎症への長期曝露が含まれる。例として、壊死は、創傷部位への適
切なケアの欠如から生じ得る。壊死はまた、心筋梗塞、脳卒中、肝硬変および他の潜在的
に致死的な疾患を含むいくつかの重度の病気の病理に関与する。西洋での最大の死因の1
つである心不全は、心臓筋肉細胞（心筋細胞）の喪失を特徴とする。心不全に伴う心筋細
胞の喪失において、壊死による細胞死が重要な役割を果たすことは十分に確立された。
【００１０】
さらに、壊死プロセスは、移植前に採取された器官および組織を保存することに関連す
る問題に寄与する。特に、このプロセスは、ドナー心臓の貯蔵中の心臓組織の劣化に関与
し、その結果、そのものの品質が低下する。他の例は、皮弁、腎臓、肝臓および他の組織
の保存および移植である。壊死はまた、化学療法中の健康な組織に対する細胞傷害性にも
関与する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
目下、壊死についての唯一の処置は、高圧酸素療法である。しかしながら、これらは壊
死そのものに対する薬物処置ではない。そのことは、壊死の合併症に起因する著しい疾病
率および死亡率をもたらす理由である。
【００１２】
タンパク質の分解を触媒する一定のエラスターゼは、壊死細胞死に関与することが予備
的に示されたが、一定の（好中球エラスターゼ）インヒビター化合物による罹患細胞の処
置は、インビトロ（in vitro、試験管内）においてそのようなインヒビターが数百マイク
ロモル濃度で用いられるとき細胞壊死を防止し/治療した（国際公開WO2003079969）。
【００１３】
これらの初期の知見は、ファミリーメンバーの広さを考慮すると、望みを与えるが、壊
死を予防/治療するのに有効な高親和性インヒビターを事前に定義することでの難しさ、
およびエラスターゼファミリーメンバーが壊死の処置および防止のための有効な標的であ
るとの理解の欠如およびそのものの理想的な療法は今日まで依然として分かりにくいまま
である。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の概略
この発明は、一定のエラスターゼ様タンパク質分解酵素の発現および/または活性の抑
制が、細胞および組織壊死の非常に有効な防止および処置をもたらすという驚くべき知見
を提供する。意外にも、カテプシンC、CELA1、CELA3Aまたは他のそれらに構造的に関連す
る分子の特異的抑制は、細胞および/または組織壊死を予防および/または処置する。
【００１５】
特に、本発明は、とりわけ、非常に特異的な一連の標的の識別同定のためのものを提供
し、それらは、いくつかの態様においてタンパク質分解酵素であり、およびいくつかの態
様において、エラスターゼ活性も見せてよく、ここに説明されるように、化合物、薬剤お
よび組成物によりそれらの抑制が達成されることができた。いくらかの態様では、ここに
記載の化合物を用いる特異的インビトロ抑制は、以前のエラスターゼインヒビターよりも
数桁少ない濃度で提供され、壊死の防止および/または処置および/または停止/排除にお
いて驚くほど有効であった。
【００１６】
いくらかの態様では、そのような増強された親和性は、ここに記載されるように、組成
物、方法、使用、薬剤および化合物における適用のためにより一層特異的な標的の識別に
関連する。
【００１７】
いくらかの態様では、そのような増強された親和性は、いくらかの実施態様において、
高度に有効な治療上の標的としての役割を果たす壊死経路における活性酵素の異なるサブ
セットの識別を反映する。
【００１８】
いくらかの態様では、そのような増強された親和性は、細胞および組織の壊死を減少さ
せることでの適用について以前に識別された標的とは異なる活性を有する標的のクラスの
識別に関連する。
【００１９】
したがって、本発明は、とりわけ、細胞および組織壊死およびそれに関連する疾患を処
置および防止するための方法を提供し、それは、それを必要とする対象に、カテプシンC
、CELA1、CELA3Aまたはそれらに構造的に関連する酵素の発現および/または活性を特異的
に抑制する薬剤の有効な量を施与することによる。
【００２０】
そのような薬剤は、カテプシンC、CELA1、CELA3Aまたはそれに構造的に関連する酵素の
発現および/または活性を特異的に抑制し、ここにさらに記載されるように、ポリヌクレ
オチドまたはポリペプチドインヒビター、ならびにここにさらに記載されるように、規定
される化学的化合物であってよい。
【００２１】
この発明は、いくつかの実施態様において、式I：
【化１】
2020183405.tif 000002
式I
の構造によって特徴付けられ、
式中、G1は、置換または非置換ピロリジン、置換または非置換ピペリジン、置換または
非置換ピペラジン、置換または非置換イミダゾリジン、または置換または非置換ピラゾリ
ジンであり；および
G3は以下の構造：
【化２】
2020183405.tif 000003
によって特徴付けられるか；またはG3は、置換または非置換のアルキル、置換または非置
換のアリールまたは置換または非置換のシクロアルキルであり；
式中、G2は、置換または非置換のアルキル、置換または非置換のアリール、置換または
非置換のシクロアルキルまたは置換または非置換の複素環である、化合物；または
式II：
【化３】
2020183405.tif 000004
式II
の構造によって特徴付けられ、
式中、G1は、置換または非置換ピロリジン、置換または非置換ピリジン、置換または非
置換アリール、置換または非置換ピペリジン、置換または非置換ピペラジン、置換または
非置換イミダゾリジン、または置換または非置換ピラゾリジンであり；および
G3は以下の構造：
【化４】
2020183405.tif 000005
によって特徴付けられるか；またはG3は、置換または非置換のアルキル、置換または非置
換のアリールまたは置換または非置換のシクロアルキルであり；
式中、G2は、置換または非置換のアルキル、置換または非置換のアリール、置換または
非置換のシクロアルキルまたは置換または非置換の複素環である、化合物；または
式III：
【化５】
2020183405.tif 000006
式III
の構造によって特徴付けられ、
式中、G1は、置換または非置換ピロリジン、置換または非置換ピリジン、置換または非
置換アリール、置換または非置換ピペリジン、置換または非置換ピペラジン、置換または
非置換イミダゾリジン、または置換または非置換ピラゾリジンであり；および
G3は以下の構造：
【化６】
2020183405.tif 000007
によって特徴付けられ；またはG3は、置換または非置換のアルキル、置換または非置換の
アリールまたは置換または非置換のシクロアルキルであり；
式中、G2は、置換または非置換のアルキル、置換または非置換のアリール、置換または
非置換のシクロアルキルまたは置換または非置換の複素環である、化合物；または
次の：
3,4-ビス（（2-（ピロリジン-1-イル）エチル）アミノ）-1,2,5-チアジアゾール1,1-ジ
オキシド；
シクロプロピル（2-（5-イソプロピルイソキサゾール-3-イル）ピロリジン-1-イル）メ
タノン；
6-ブロモ-2-（3,5-ジメトキシフェニル）-4ベンゾ[d][1,3]オキサジン-4-オン
6-メチル-5 -（（2-メチルピペリジン-1-イル）スルホニル）ピリミジン-2,4（1H,3H）
-ジオン；
N-メチル-4,5,6,7,8,9-ヘキサヒドロ-1H-シクロオクタ[c]ピラゾール-3-カルボキサミ
ド；
2-（5-（ピリジン-4-イル）-2H-テトラゾール-2-イル）酢酸；
2-（フラン-2-イル）-5,6,7,8-テトラヒドロ-4H-ベンゾ[4,5]チエノ[2,3-d][1,3]オキ
サジン-4-オン；
3-（（5-アセトアミド-1H-1,2,4-トリアゾール-3-イル）チオ）プロパン酸；
N,N'-（オキシビス（4,1-フェニレン））ビス（2-メチルプロパンアミド）；
7-（4-エチルピペラジン-1-イル）-5,6-ジメチル-[1,2,4]トリアゾロ[1,5-a]ピリミジ
ン；
7-フルオロ-10-（2-（4-イソプロピルピペラジン-1-イル）-2-オキソエチル）-2,3-ジ
ヒドロ-1H-ベンゾ[e]ピロロ[1,2-a][1,4]ジアゼピン-5,11（10H,11aH）-ジオン；
2-（tert-ブチル）-3-（1-メチル-1H-ベンゾ[d]イミダゾール-2-イル）-4-オキソ-4H-
クロメン-7-イルピバラート；
3-メチル-8-（ピペリジン-1-イル）-1H-プリン-2,6（3H,7H）-ジオン；
2-（3-ブロモフェニル）-4-オキソ-4H-ベンゾ[d][1,3]オキサジン-6-イルアセタート；
N-（1-エチル-3,5-ジメチル-1H-ピラゾール-4-イル）-3,4,5-トリメトキシベンズアミ
ド；
5-エチル-N-（ピリジン-2-イルメチル）-5H-[1,2,4]トリアジノ[5,6-b]インドール-3-
アミン；
3-（（4-クロロ-1H-ピラゾール-1-イル）メチル）-N-（2-（3-フルオロベンズアミド）
エチル）-1,2,4-オキサジアゾール-5-カルボキサミド；
1-（4-（メチルチオ）ベンジル）-4-トシルピペラジン；
2-（2-エチルフェニルスルホンアミド）-5-（4-エチルピペラジン-1-イル）安息香酸；
4（（2-メチルインドリン-1-イル）スルホニル）安息香酸；
6-ブロモ-2-（3,5-ジメトキシフェニル）-4H-ベンゾ[d][1,3]オキサジン-4-オン；
2-アミノ-N-（2,4-ジフルオロフェニル）ピリミジン-5-スルホンアミド；
3-メチル-8-（ピペリジン-1-イル）-1H-プリン-2,6（3H,7H）-ジオン；
5-クロロ-N-（2-オキソ-1-フェニルピロリジン-3-イル）チオフェン-2-スルホンアミド
；
3-（ピロリジン-1-イルスルホニル）安息香酸；
（3,5-ジメチル-1H-ピラゾール-1-イル）（3,4,5-トリメトキシフェニル）メタノン；
N-（3,4-ジフルオロフェニル）-2-（8-フルオロ-5,11-ジオキソ-2,3,11,11a-テトラヒ
ドロ-1H-ベンゾ[e]ピロロ[1,2-a][1,4]ジアゼピン-10（5H）-イル）アセトアミド；
5-（シクロヘキシルメチル）-3-（ピリジン-2-イル）-1,2,4-オキサジアゾール；
エチル5-メチル-4-（2-（（4-メチルベンジル）アミノ）-2-オキソエチル）-7-フェニ
ル-4,7-ジヒドロ-[1,2,4]トリアゾロ[1,5-a]ピリミジン-6-カルボキシラート；
[1,2,4]トリアゾロ[1,5-a]ピリミジン-2-カルボン酸；
1-（2-（ピペリジン-1-イル）-4,5-ジヒドロ-1H-イミダゾール-1-イル）ブタン-1-オン
；
（4-（6-クロロ-[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピリジン-3-イル）ピペラジン-1-イル）（1
-フェニルシクロプロピル）メタノン；
N-（2,4-ジフルオロフェニル）-2-（5,11-ジオキソ-2,3,11,11a-テトラヒドロ-1H-ベン
ゾ[e]ピロロ[1,2-a][1,4]ジアゼピン-10（5H）-イル）アセトアミド；および
エチル-2,3-ジヒドロ-3-オキソ-1,2-ベンズイソチアゾール-2-アセタート-1,1-ジオキ
シド；またはそれらの薬学的な塩、またはそれらの任意の組合せからなる群より選ばれる
化合物で、細胞または組織壊死またはそれらに関連する疾患の処置または防止における使
用のためのものである、化合物を提供する。
【００２２】
直上に規定されるように、化合物を含む薬剤組成物は、同様にこの発明の実施態様を構
成すると理解されるべきである。
【００２３】
この発明は、直上に規定されるように、化合物の第1の医学的使用を記載し、この使用
は同様に本発明の実施態様を構成すると理解されるべきである。
【００２４】
この発明はさらに、細胞または組織壊死またはそれらに関連する疾患もしくは条件の処
置の方法を提供し、直上に規定されるように、化合物の有効量またはそれを含む薬剤組成
物を、それを必要とする対象に施与すること、または罹患した細胞または組織をそれに接
触させることを含み、それによって細胞または組織壊死またはそれらに関連する条件が処
置される方法を提供する。
【００２５】
この発明はまた、直上に規定されるように、化合物の有効量またはそれを含む薬剤組成
物の、対象において起こる細胞または組織壊死に関連する疾患または条件を処置すること
での使用のための薬の製造における使用を提供する。
【００２６】
いくらかの態様において、このことは、ここに記載されるように、具体化された化合物
の最初の実証された医学的使用であり、および本発明により同じことを企図される。いく
らかの態様において、ここに記載されるように、化合物またはそれに構造的に関連する化
合物は、カテプシンC、CELA1、CELA3Aまたはそれらに構造的に関連する酵素の活性を特異
的に抑制する規定された活性を所有し、この発明の構想される態様である。
【００２７】
いくらかの実施態様において、この発明の化合物は、カテプシンC、CELA1、CELA3Aまた
はそれらに構造的に関連する酵素、またはKd 10-7Mまたはそれよりも低い（以下の）最小
親和性を有するそれらの組み合わせに対するその選択的結合によって規定される。いくら
かの実施態様では、この発明の化合物は、CELA2A、CELA3B、またはカテプシンA、B、D、E
、G、H、K、L1、L2、O、S、WまたはZまたはそれらの組合せで、それらは、いくらかの実
施態様では、Kd 10-6M以上の最小親和性を示すものに対するその少ない選択的結合性によ
って規定される。
【００２８】
いくらかの実施態様において、この発明は、ここに記載のように、化合物の任意の組合
せを含む組成物を提供する。いくらかの実施態様では、本組成物は、ここに記載の化合物
の任意の組合せまたはここに記載の任意の単一化合物の有効量を含む。いくらかの実施態
様では、本組成物は、薬学的に許容可能な担体または賦形剤をさらに含む。
【００２９】
本発明のいくらかの実施態様によれば、薬剤組成物は細胞膜を浸透することについて調
剤される。
【００３０】
本発明のいくらかの実施態様によれば、薬剤組成物は脂質小胞を含む。
【００３１】
いくらかの実施態様では、本組成物は、抗アポトーシス剤または抗加齢剤をさらに含む
。本発明のいくらかの実施態様によれば、抗加齢剤は、抗酸化剤、植物化学物質、ホルモ
ン、メトホルミンおよび脂肪酸からなる群より選ばれる。
【００３２】
いくらかの実施態様では、本発明は、カテプシンC、CELA1、CELA3A、またはそれに構造
的に関連する酵素のインヒビター剤を提供し、そこでは、前記薬剤は、アンチセンス、si
RNA、マイクロRNA、Ribozyme（リボザイム）およびDNAzyme（DNAザイム）からなる群より
選ばれるポリヌクレオチドであり、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、
配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号
34、配列番号35および配列番号36からなる群より選ばれる核酸領域に向けられる。
【００３３】
いくらかの実施態様では、CELA3A、CELA1、またはカテプシンCインヒビター剤は、ポリ
ヌクレオチドであり、そのポリヌクレオチド剤は、配列番号1、配列番号2または配列番号
3で表される核酸配列のポリヌクレオチドと少なくとも95％の同一性を共有する。
【００３４】
いくらかの実施態様では、CELA3A、CELA1、またはカテプシンCインヒビター剤は、ポリ
ヌクレオチドであり、そのポリヌクレオチド剤は、CELA1またはCELA3A配列またはそれら
の組合せと特異的にハイブリダイズし、およびモデレート（中程度）ないしストリンジェ
ント（厳格）なハイブリダイゼーション条件下でCELA2AまたはCELA3B配列にハイブリダイ
ズしない。
【００３５】
いくらかの実施態様では、CELA3A、CELA1、またはカテプシンCインヒビター剤は、ポリ
ヌクレオチドであり、そのポリヌクレオチド剤は、カテプシンCに特異的にハイブリダイ
ズし、およびモデレートないしストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でカテ
プシンA、B、D、E、G、H、K、L1、L2、O、S、WまたはZにハイブリダイズしない。
【００３６】
いくらかの実施態様では、CELA3A、CELA1、またはカテプシンCインヒビター剤は、ポリ
ヌクレオチドであり、そのポリヌクレオチド剤は、配列番号1で表される核酸配列のポリ
ヌクレオチドと少なくとも95％の同一性を共有する。いくらかの実施態様では、CELA3A、
CELA1、またはカテプシンCインヒビター剤は、ポリヌクレオチドであり、そのポリヌクレ
オチド剤は、配列番号2で表される核酸配列のポリヌクレオチドと少なくとも95％の同一
性を共有する。いくらかの実施態様では、CELA3A、CELA1、またはカテプシンCインヒビタ
ー剤は、ポリヌクレオチドであり、そのポリヌクレオチド剤は、配列番号3で表される核
酸配列のポリヌクレオチドと少なくとも95％の同一性を共有する。
【００３７】
いくらかの実施態様では、この発明はここに記載されるように、任意のポリヌクレオチ
ドインヒビター剤を含む核酸構築物を提供する。
【００３８】
いくらかの実施態様では、この発明はCELA3A、CELA1、またはカテプシンCインヒビター
剤を提供し、そこでは、前記薬剤は、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14
、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番
号21、配列番号22および配列番号23からなる群より選ばれる配列を含むポリペプチドに特
異的に結合し、およびその機能を抑制または防止する抗体である。
【００３９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、高親和性結合分子は、抗体またはその抗原結合
フラグメントで、FabまたはscFvフラグメントを含むものであり、これは熟練技術者（当
業者とも言う）には理解されるであろう。
【００４０】
本発明は、細胞の壊死およびそれに関連する疾患を処置および予防するための組成物お
よび方法を提供する。
【００４１】
追加の実施態様では、本発明は、壊死の防止および処置のための、特に低濃度で細胞壊
死を抑制することが判明した特異的な小抑制性分子の使用に関する。分子のリストには、
様々な化学的ファミリーに属する小さな抑制性化合物、たとえば、2-アミノイミダゾリン
、2-アミノチアゾリンおよびイソオキサゾールが含まれる。本発明はまた、細胞壊死に関
係する疾患または医学的条件の処置および/または防止に用いるための様々な小分子イン
ヒビターも提供する。またさらに別の実施形態では、細胞壊死に関係する疾患または医学
的条件の処置および/または防止のための薬の製造における小分子インヒビターの使用が
提供される。
【００４２】
いくらかの実施態様では、本発明は、細胞性壊死の処置、抑止、抑制または防止のため
に、ここに記載の任意の化合物の使用、または任意のカテプシンC、CELA1、CELA3Aまたは
その構造的に関連する酵素の使用を企図する。いくつかの実施形態では、壊死を受けてい
る細胞は、脳細胞、神経細胞、プルキンエ細胞、海馬錐体細胞（hypocampal pyramidal c
ell、低錐体錐体細胞）、グリア細胞、心筋細胞、筋細胞、ケラチノサイト（角化細胞）
、表皮細胞、骨または軟骨細胞、膵臓細胞、心臓細胞、筋肉細胞、肝臓細胞（liver cell
）、呼吸器細胞（respiratory cell）または肺細胞肝細胞、腎臓細胞、肝細胞、消化管細
胞（胃腸細胞）、脾臓細胞、造血細胞（hematopoetic cell）、リンパ球、マクロファー
ジ（大食細胞）、胸腺細胞、線維芽細胞、上皮細胞、実質細胞、気管支上皮細胞、ネフロ
ーゼ尿細管細胞（nephrotic tubular cell、ネフローゼ管状細胞）、糸球体細血管細胞（
glomerulus capillary cell）、および肺上皮細胞、および幹細胞、性腺細胞、精子、卵
子、受精卵、胚細胞、ステムセル（幹細胞）および網膜細胞からなる群より選ばれる。
【００４３】
いくつかの実施形態では、本発明は、細胞または組織壊死に関係する疾患または条件の
処置、抑止、抑制または防止のために、ここに記載のような任意の化合物の使用、または
任意のCELA3A、CELA1、またはカテプシンCインヒビター剤の使用を企図する。いくらかの
実施形態では、疾患または医学的条件は、神経変性疾患、例は、認知症、パーキンソン病
（Parkinson’s disease）、アルツハイマー病、ハンチントン病、多発性硬化筋萎縮性側
索硬化（multiple sclerosis Amyotrophic lateral sclerosis）（ALS）、黄斑変性症、
加齢黄斑変性（加齢性黄斑変性症）（AMD）、急性網膜壊死（ARN）、進行性網膜外層壊死
（進行性外側網膜壊死）、筋ジストロフィー、白血病、リンパ腫、呼吸窮迫（新生児呼吸
窮迫症）、窒息、嵌頓ヘルニア（収縮ヘルニア）、糖尿病、結核、子宮内膜症、脈管ジス
トロフィー（vascular dystrophy）、乾癬、寒冷傷害、鉄負荷合併症（iron-load compli
cation）、ステロイド処置の合併症、虚血性心疾患、心筋梗塞、再潅流傷害、脳血管疾患
または損傷、例は、脳卒中または外傷性脳損傷、壊疽、褥瘡性潰瘍（pressure sore、圧
痛）、膵炎、重症急性膵炎、肝炎、慢性肝炎、硬変（肝硬変）、ヘモグロビン尿、細菌性
敗血症、ウイルス性敗血症、熱傷（火傷）、高熱（体温上昇）、クローン病、セリアック
病、コンパートメント症候群、壊死性直腸炎（壊死性結腸炎）、スティーブンス・ジョン
ソン症候群（SJS）、中毒性表皮壊死（毒性表皮壊死）（TEN）、嚢胞性線維症、関節リウ
マチ、骨髄炎、壊死性筋膜炎、腎毒性、脊髄損傷、糸球体腎炎、急性尿細管壊死、腎皮質
壊死、変形性関節症（変性関節炎）、チロセミア（チロシン血症、甲状腺機能低下症）、
多発性硬化症、先天性ミトコンドリア病（congenital mitochondrial disease）、代謝性
遺伝性疾患（metabolic inherited disease）、マイコプラズマ病、炭疽感染、細菌感染
、ウイルス感染、エボラ感染、アンダーソン病（Anderson’s disease）、先天性ミトコ
ンドリア病、フェニルケトン尿、胎盤梗塞、梅毒、梅毒、無菌壊死、虚血性壊死、アルコ
ール依存、投与および/または自己投与、および/または暴露に関連する壊死（necrosis a
ssociated with administration and/or self-administration with, and/or exposure t
o）で、コカイン、薬物、例は、パラセタモールまたはドキソルビシンによるもの；化学
的毒素、農薬、重金属、兵器有機リン酸エステル（warfare organophosphate）、クモま
たはヘビ毒（spider or snake venoms）、ダーマルフィラー（皮膚充填剤）施与に関係す
る壊死；異所的薬物施与に関係する壊死で、たとえば、デキストロース溶液、化学療法薬
の溢出などのようなもの；化学療法誘発性壊死、放射線誘発性壊死、移植組織および加齢
の保守管理からなる群より選ばれる。
【００４４】
いくらかの実施態様において、本発明は、ここに記載のような任意の化合物の使用、ま
たはカテプシンC、CELA1、CELA3A、またはそれと構造的に関連する酵素の任意のインヒビ
ター剤の使用を、皮膚の概観または質の改善のために企図し、およびいくらかの実施態様
では、ここに記載するように、化合物および薬剤の美容的使用を企図する。
【００４５】
また、少なくとも一の薬学的に許容可能な担体およびここに記載のように化合物または
ここに記載のようにカテプシンC、CELA1、CELA3A、またはそれと構造的に関連する酵素の
任意のインヒビター剤の治療上有効な量を含む、薬剤組成物も提供する。
【００４６】
いくらかの実施態様では、本発明でのカテプシンC、CELA1、CELA3A、またはそれと構造
的に関連する酵素の任意のインヒビター剤は、CELA3A、CELA1、またはカテプシンCまたは
それらの組合せに、Kd 10-7M以下の最小親和性を伴って結合し、およびCELA2A、および/
またはCELA3B、および/またはカテプシンA、B、D、E、G、H、K、L1、L2、O、S、WまたはZ
に、CELA3A、CELA1、またはカテプシンCについての最小結合親和性のものに比べて少なく
とも10倍高いKdの最小親和性伴って結合する。
【００４７】
いくらかの実施態様において、そのようなインヒビター剤は、CELA3Bおよび/またはOCI
AD1にKd 10-7M以下の最小親和性を伴って結合してよい。いくらかの実施態様では、この
態様に従い、インヒビター剤は、配列番号3で説明される配列と少なくとも95％の同一性
を共有する配列をもつ。
【００４８】
いくらかの実施態様において、そのようなインヒビター剤は、CELA3Bおよび/またはOCI
AD1に、CELA2Aおよび/またはカテプシンA、B、D、E、G、H、K、L1、L2、O、S、WまたはZ
に対する結合よりも高い親和性を伴って結合してよく、上文に説明するように最小親和性
をもつ。いくらかの実施態様では、インヒビター剤は、この態様に従い、配列番号3で説
明される配列と少なくとも95％の同一性を共有する配列をもつ。
【００４９】
いくらかの態様では、本発明は、当業者によって理解されるように、ここに記載のポリ
ヌクレオチドの保存的置換を企図する。
【００５０】
いくらかのさらなる実施形態では、細胞壊死に関係する医学的疾患または条件の処置で
、それを必要とする対象における方法が提供される。本方法は、治療上有効な量のここに
記載の任意の薬剤または化合物を、必要に応じてそれらの類似体、誘導体、フラグメント
（断片とも言う）、異性体または塩を含めて対象に施与することを含む。さらに好ましい
実施態様において、対象は、ヒトまたは非ヒト哺乳動物である。
【００５１】
いくらかの実施態様では、ここに記載のような薬剤または化合物は、細胞が壊死の初期
段階にあるとき有効である。いくらかのさらなる実施態様では、ここに記載のような薬剤
または化合物は、細胞が壊死シグナルに供されたとき活性である。
【００５２】
さらなる実施態様によれば、この発明は、加齢の処置および/または防止で、それを必
要とする対象における方法を提供し、本方法には：（a）ここに記載のような任意の薬剤
または化合物またはそのものの組合せを対象に施与すること；および（b）抗加齢剤を対
象に施与することであり、それにより加齢が処置および/または防止されることが含まれ
る。
【００５３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞は壊死性細胞である。
【００５４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、本方法は、抗アポトーシス剤、たとえば、カス
パーゼインヒビターのようなものを対象に施与することを含む。
【００５５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、抗アポトーシス剤は、ここに記載のような薬剤
または化合物の施与に先立ち、それと同時に、または施与後に施与される。本発明のいく
つかの実施形態によれば、本方法はインビボで行われる。
【００５６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、薬剤組成物は、細胞膜を浸透するために調剤さ
れる。本発明のいくつかの実施形態によれば、薬剤組成物には、脂質小胞が含まれる。
【００５７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、抗加齢剤は、抗酸化剤、植物化学物質、ホルモ
ン、メトホルミンおよび脂肪酸からなる群より選ばれる。
【００５８】
本発明のさらなる態様によれば、臓器、組織および細胞の機能的完全性を、ここでの壊
死の誘発の防止および/または抑制によって保管および保存するための方法および組成物
が提供される。
【００５９】
いくつかの態様では、本発明は、心臓、腎臓、肝臓、皮膚、肺および他の器官および組
織の移植または再移植を含む、移植前の保存を必要とするヒト、ヒト適合性または非ヒト
収集器官、組織または細胞を保存する方法を提供する。さらに、本発明は、蘇生後に収集
された器官の改善された保存のための方法を提供する。本発明はさらに、保存期間中に交
替する地理的場所へのそのもののより一層効率的な輸送をに可能にする。さらに、本発明
は、さらに保存に付け加え、細胞の回復プロセス中の細胞生存度の改善、例として、解凍
後のもの、および移植前の期間の評価のための方法を提供する。さらに加えて、本発明は
、それらの維持、保存および移植の間に、再生関連細胞、即ち、生殖腺細胞、精子、卵、
受精卵、および/または胚細胞の保存および保守管理のための方法を提供する。
【００６０】
一実施形態では、生物学的組織を保存するための組成物は、生理学的塩溶液、ATPの生
成のための基質およびここに開示されるように、インヒビターの1つを含み、それによっ
て細胞の壊死を防止または抑制する。随意に、ATP産生のための基質は、リン酸クレアチ
ン、クレアチンエチルエステル、リンゴ酸ジクレアチン（dicreatine malate）、グルコ
ン酸クレアチン、フルクトース、スクロース、リボース、ヘキソースまたはペントースで
ある。あるいはまた、ATPの生成のための基質は、オレイン酸クレアチン、クレアチン一
水和物、アデノシン、またはデキストロース/グルコースである。
【００６１】
いくつかの実施形態では、ここに記載のような薬剤または化合物は、当分野で理解され
るように、小分子である。
【００６２】
いくつかの実施形態では、ここに記載のような薬剤または化合物は、ポリヌクレオチド
剤であり、アンチセンス、siRNA、マイクロRNA、リボザイムおよびDNAザイムからなる群
より選ばれる。ときには、ポリヌクレオチド剤は、本発明の一実施形態によれば、細胞の
壊死を防止または抑制する方法がここに提供され、本方法には、壊死シグナルに供される
細胞に、細胞内CELA3、CELA1、および/またはカテプシンCの少なくとも1つの活性の発現
を特異的に下方制御し、および/またはそれを抑制する薬剤の治療上有効な量を施与する
ことを含み、それにより細胞の壊死を防止または抑制する。
【００６３】
いくつかの実施形態において、ここに記載のような薬剤または化合物は、CELA3Aに対し
てCELA3Bよりも高い特異性を有するが、いずれかまたは双方の標的の抑制が本発明の一部
を包含するものと考えられ、そのものおよび/またはそのものの活性を特異的に抑制する
規定されるような薬剤と特異的に相互作用する薬剤が含まれる。
【００６４】
特に好ましい実施形態では、細胞の壊死を防止たは抑制する方法が提供され、本方法に
は、壊死シグナルに供される細胞に、CELA3AおよびCELA3Bを含むCELA3の活性の発現を特
異的に下方制御（ダウンレギュレート）するか、または追加的に、それを抑制する治療上
有効な量の薬剤を施与することが含まれる。
【００６５】
本発明のさらなる実施形態によれば、細胞壊死に関係する医学的疾患または条件の処置
で、それを必要とする対象における方法を提供し、本方法には、細胞内カテプシンC、CEL
A1、CELA3Aまたはそれに、および/または対象の細胞において構造的に関連する酵素の少
なくとも1つの活性の発現を特異的に下方制御し、およびあるいはまた、追加的にそれを
抑制する治療上有効な量の薬剤を対象に施与することを含み、それはいくつかの実施形態
では、CELA3Aの抑制よりも最適ではない活性を提供し得るが、それは、それにもかかわら
ず、発現および/または活性への影響は、たとえば、いくつかの実施形態では、CELA3Bで
有用であり、それによって、細胞壊死に関係する条件が処置される。
【００６６】
別の好ましい実施形態では、本発明はまた、モデレートないしストリンジェントなハイ
ブリダイゼーション条件下で、CELA3Aおよび/またはCELA1に特異的にハイブリダイズする
が、CELA2Aには最適ではなく、またはCELA3Bにあまり最適ではない分離されるポリヌクレ
オチドの使用にも向けられる。
【００６７】
特に好ましい実施形態において、分離されたポリヌクレオチドは、CELA3Aに特異的にハ
イブリダイズする。
【００６８】
特に好ましい実施形態では、本発明は、細胞内カテプシンC、CELA1、CELA3Aまたはそれ
らに構造的に関連する酵素の少なくとも1つを特異的に抑制する小分子の使用に向けられ
る。
【００６９】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、小分子は、Kd 10-7M以下の最小親和性
を伴って、細胞内カテプシンC、CELA1、CELA3Aまたはそれらに構造的に関連する酵素の少
なくとも1つに特異的に結合し、および少なくとも10倍高いKdの最小親和性を伴って、CEL
A2Aおよび/またはCELA3Bに、および/またはカテプシンA、B、D、E、G、H、K、L1、L2、O
、S、WまたはZに結合する。
【００７０】
いくつかの実施形態において、ここに記載のような薬剤または化合物は、CELA3Aよりも
低いCELA3Bに対する親和性を伴って結合するが、ここに記載のような薬剤または化合物は
、CELA2Aおよび/またはカテプシンA、B、 E、G、H、K、L1、L2、O、S、WまたはZに対する
よりも高い親和性を伴ってCELA3Bに、モデレートないしストリンジェントのハイブリダイ
ゼーション条件下で結合する。
【００７１】
本発明の別の実施形態によれば、高親和性分子がここにおいて提供され、それは細胞内
カテプシンC、CELA1、CELA3Aまたはそれに構造的に関連する酵素の少なくとも1つの折り
たたまれたアミノ酸配列から構成される少なくとも1つのドメインに結合する。
【００７２】
本発明のいくつかの実施形態のある態様によれば、抗体が提供され、それは、Kd 10-7M
以下の最小親和性を伴いCELA3AおよびCELA1に結合するが、少なくとも10倍高いKdの最小
親和性を伴ってCELA2AまたはCELA3Bに結合する。
【００７３】
本発明のいくつかの実施形態のある態様によれば、抗体が提供され、それは、Kd 10-7M
の最小親和性を伴ってカテプシンCに結合するが、少なくとも10倍高いKdの親和性を伴っ
てカテプシンA、B、D、E、G、H、K、L1、L2、O、S、WまたはZに結合する。
【００７４】
本発明のいくつかの実施形態のある態様によれば、本発明での分離されたポリヌクレオ
チド、本発明での高親和性分子、または本発明での抗体、および薬学的に許容可能な担体
を含む薬剤組成物が提供される。
【００７５】
本発明のいくつかの実施形態のある態様によれば、本発明での分離されたポリヌクレオ
チド、抗アポトーシス剤および薬学的に許容可能な担体を含む薬剤組成物が提供される。
【００７６】
いくつかの実施形態では、本発明は、ここに記載のようなポリヌクレオチドまたはポリ
ペプチドを含むベクター、コンジュゲート（結合体とも言う）、リポソームまたは担体、
およびそれらを含む組成物を提供する。
【００７７】
本発明のいくつかの実施形態のある態様によれば、加齢の処置および/または防止で、
それを必要とする対象における方法が提供され、本方法には、（a）対象の細胞において
細胞内カテプシンC、CELA1、CELA3Aまたはそれに構造的に関連する酵素の少なくとも1つ
の活性の発現を下方制御し、およびあるいはまたは追加的に抑制する薬剤を対象に施与す
ること、および（b）抗加齢剤を対象に施与することで、それにより加齢を処置および/ま
たは防止することが含まれる。
【００７８】
本発明のいくつかの実施形態のある態様によれば、本発明での分離されたポリヌクレオ
チド、抗加齢剤および薬学的に許容可能な担体を含む薬剤組成物が提供される。
【００７９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、本発明の化合物、薬剤、組成物、使用および方
法は、壊死シグナルを受けた任意の細胞に適用することができる。
【００８０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、薬剤の量は、細胞壊死の細胞アポトーシスへの
変換を引き起こすように選定される。
【００８１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、この方法は、抗アポトーシス剤を対象に施与す
ることをさらに含む。
【００８２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、抗アポトーシス剤は、-[R]-N-[2-ヘプチル]-メ
チルプロパルギルアミン（R-2HMP）、ビタミンE、ビタミンD、カスパーゼインヒビター、
薬剤で抗アポトーシスタンパク質および親水性胆汁塩、ウルソデオキシコール酸をダウン
レギュレートするものからなる群より選ばれる。
【００８３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、抗アポトーシス剤は、カテプシンC、CELA1、CE
LA3Aまたはそれに構造的に関連する酵素の発現を特異的にダウンレギュレートし、および
あるいはまたは追加的に抑制する薬剤の施与の前に、同時にまたは施与後に施与され、そ
こではいくらかの実施態様において、活性はCELA3AについてCELA3Bよりもより優先的であ
り得る。
【００８４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、本方法はインビボで行われる。
【００８５】
本発明はまた、インビトロでの壊死に対する保護を提供するために、細胞内CELA3Aまた
は構造的に類似の酵素、CELA1、および/またはカテプシンCの少なくとも1つの抑制のため
の方法にも向けられる。
【００８６】
いくらかの実施態様では、この発明は、式VI：
【化７】
2020183405.tif 000008
式VI
の構造によって特徴付けられ、
式中：
G1は、随意に置換されるNH-ピロリジン、随意に置換されるNH-ピペリジン、随意に置換
されるNH-ピペラジン、随意に置換されるNH-イミダゾリジン、随意に置換されるNH-ピラ
ゾリジン、随意に置換されるNH-アリール、随意に置換されるNH-シクロアルキル、随意に
置換されるピロリジン、随意に置換されるピペリジン（piperidine）、随意に置換される
ピペリディン（piperidin）、随意に置換されるピペラジン、随意に置換されるイミダゾ
リジン、または随意に置換されるピラゾリジンであり；
G2は、随意に置換されるアルキル、随意に置換されるアリール、随意に置換されるシク
ロアルキルまたは随意に置換される複素環であり；
ここで：
G1が非置換ピロリジンである場合、そのときG2は、アルキル、シクロペンチル、アルキ
ルシクロペンチルまたはフランではなく；または
G1がピペリジンである場合、そのときG2はアルキルではなく；および
G1がピペラジンである場合、そのときG2はアルキルまたはフランではない、
化合物を提供する。
【００８７】
いくらかの実施態様では、G1はピロリジンであり、およびG2はエチルまたはフランであ
る。いくらかの実施態様では、G1は置換ピペラジンであり、およびG2はフランまたはフェ
ニルである。いくらかの実施態様では、G1はピペリジンであり、およびG2は、シクロペン
チル、フランまたはフェニルである。いくらかの実施態様では、G1は随意に置換されるイ
ミダゾリジンまたは随意に置換されるピラゾリジンである。
【００８８】
いくらかの実施態様では、この発明は、式VII：
【化８】
2020183405.tif 000009
式VII
の構造によって特徴付けられ、
式中：
G1は、随意に置換されるNH-ピロリジン、随意に置換されるNH-ピペリジン、随意に置換
されるNH-ピペラジン、随意に置換されるNH-イミダゾリジン、随意に置換されるNH-ピラ
ゾリジン、随意に置換されるNH-ピリジン、随意に置換されるNH-アリール、随意に置換さ
れるNH-シクロアルキル、随意に置換されるピロリジン、随意に置換されるピペリジン、
随意に置換されるピペリジン、随意に置換されるピペラジン、随意に置換されるイミダゾ
リジン、随意に置換されるピラゾリジンまたは随意に置換されるアリールであり；
G2は、
【化９】
2020183405.tif 000010
または随意に置換されるアルキル、随意に置換されるアリールまたは随意に置換されるシ
クロアルキルであり；および
G4は、随意に置換されるピロリジン、随意に置換されるピペリジン、随意に置換される
ピペラジン、随意に置換されるイミダゾリジンまたは随意に置換されるピラゾリジンであ
り；
ここで：
G1がピペリジンである場合、そのときG4はピロリジンではなく、またはG2は随意に置換
されるアリールではなく；または
G1がイミダゾリジンである場合、そのときG2は随意に置換されるアリールではなく；ま
たは
G1が随意に置換されるNH-ピリジンである場合、そのときG2は随意に置換されるアリー
ルではなく；または
G1が随意に置換されるNH-アリールである場合、そのときG2は随意に置換されるアリー
ルではなく；または
G1が随意に置換されるピリジンである場合、そのときG2は随意に置換されるアリールで
はない、
化合物を提供する。
【００８９】
いくらかの実施態様では、この態様に従い、G1は随意に置換されるNH-ピリジンであり
、G2は、
【化１０】
2020183405.tif 000011
であり、式中、G4はピロリジンであり、またはG2はハロアリールであり、およびいくらか
の実施態様では、この態様に従い、G1は随意に置換されるNH-アリールであり、およびG2
は、
【化１１】
2020183405.tif 000012
であり、式中、G4はピロリジンである。
【００９０】
他に定義されない限り、ここに使用されるすべての技術および/または科学用語は、本
発明が属する技術分野の通常の技量の者（当業者とも言う）によって普通に理解されるの
と同じ意味をもつ。ここに記載される方法および物質と類似または等価の方法および物質
を本発明の実施態様の実践または試験に使用することができるが、模範的な方法および/
または物質を以下に説明する。対立する場合、定義を含めて特許明細書が支配する。さら
に、物質、方法、および例は例示に過ぎず、および必ずしも制限的なものではない。
【００９１】
本発明のいくらかの実施態様は、添付の図面を参照して、単に一例として、ここで説明
される。今回、特に図面に関連して、示された詳細は、例としてであり、本発明の実施態
様の説明のためであることが強調される。この点に関して、図面を用いた説明は、本発明
の実施態様がどのように実践され得るかを当業者に明らかにする。
図面において、次に示すとおりである。
【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１】U-937細胞におけるKCN誘発細胞死の動態を示す折れ線グラフである。図1は、KCN誘発壊死の時間および用量応答を例示する。アクリジンオレンジおよび臭化エチジウムによる二重染色によって核形態を決定した。
【図２】酵素アッセイによって評価されるような10mM KCN処理によるタンパク質分解活性の誘導を示す折れ線グラフである。U-937細胞を異なる時間間隔についてKCNにより処理した。細胞溶解物中のカテプシンC活性およびエラスターゼ様活性は、特定の基質を用いて測定した（ここでの以下の例のセクションに詳細に示すようなもの）。
【図３】エラスターゼインヒビターIIIによる細胞におけるKCN誘発エラスターゼ様活性の用量依存的抑制を例示する。10mM KCNで30分間処理した後、細胞溶解物を調製した。エラスターゼ様活性は基質MAAPVを用いて測定した。カテプシンLインヒビターおよびE-64dは、エラスターゼ様タンパク質分解活性に影響を及ぼさなかった。データは示されていない。
【図４Ａ】図4A-Bは、異なる濃度のKCNによって誘発された壊死を受けるU-937細胞からのLDH放出に対するCELA1およびCELA3AについてのsiRNAによるサイレンシングの効果を例示する。図4Aは、コントロールsiRNAまたは特異的酵素についてのsiRNAによりトランスフェクトし、KCNを含むか、または含まないで7時間処理した細胞を示す棒グラフであり、および次いで細胞からのLDH放出を測定した。コントロールsiRNAを用いたトランスフェクションはそれ自体では効果がなかった。*P<0.001。図4Bは、適切なsiRNAsでの処理に起因する特定タンパク質のダウンレギュレーションを証明するウエスタンブロットを例示する写真を描く。
【図４Ｂ】図4Aと同様である。
【図４Ｃ】KCNによって誘導された壊死を受けるPC12細胞からのLDH放出に対するカテプシンC、CELA1およびCELA3AについてのsiRNAによるサイレンシングの効果を示す。コントロールsiRNAまたは特異的酵素についてのsiRNAによりトランスフェクトされたPC12細胞を、グルコースを含まない培地中で1時間プレインキュベートし、およびKCNを用いてか、または用いずに5時間処理した。その後、細胞からのLDH放出を測定した。*P<0.001。
【図５】図5A-Bは、エラスターゼ活性（図5A）およびカテプシンC活性（図5B）に対するsiRNAの効果を示す棒グラフである。コントロールsiRNAまたはカテプシンC、CELA1またはCELA3AについてのsiRNAによって処理した細胞を、KCN10mMに30分間曝露した。次いで、細胞を溶解し、および溶解物中のカテプシンCまたはエラスターゼ様活性を特異的比色基質により測定した。
【図６】KCNによって誘発された壊死を受けるPC12細胞からのLDH放出に対する特異的カテプシンCインヒビターの効果を示す。異なる濃度のカテプシンCインヒビターの存在下または不存在下で、異なる濃度のKCNを用いてか、または用いずに細胞を5時間処理し、および次いで細胞からのLDH放出を測定した。エラスターゼインヒビターを陽性コントロールとして用いた。*P<0.01。
【図７】図7A-Bは、壊死を受けているPC12細胞に及ぼす種々のエラスターゼインヒビターの保護効果を示す棒グラフである。図7A-Bは、それぞれ異なる濃度のエラスターゼインヒビターIIまたはIIIの存在下または不存在下で5時間、KCNを用いてか、または用いずに処理したPC12細胞を示す。次いで、細胞からのLDH放出を測定した。*P<0.05。図7Cは、最大48時間までのKCN処理細胞のレスキューにおけるエラスターゼインヒビターIIの保護効果を示す棒グラフである。グルコース欠乏培地中に維持された細胞を、エラスターゼインヒビターIIを伴ってか、または伴わずに30分間インキュベートした。その後、細胞を、KCNを用いてか、または用いずに5時間処理した。しかる後、培地を完全DMEMに変更し、およびインキュベーションを24または48時間進行させた。エラスターゼインヒビター自体はコントロール細胞の生存に影響を及ぼさなかった。XTT法を使用して、指定された時間ごとに細胞生存能力を測定し、およびそれらの結果をそれらのそれぞれのコントロールと比較した。
【図８】図8A-Bは、エラスターゼインヒビターIIおよびIIIがインビボで閉鎖性頭部損傷からマウスの脳を保護することを示す棒グラフである。エラスターゼインヒビターIIおよびIII（図8A）の神経学的重症度スコア（NSS）に対する効果の定量化および図8Bでの、外傷を負ったマウスの脳における壊死領域の発生を示す。*P<0.01。
【図９】化合物Z601-4253（2-（ピペリジン-1-イル）チアゾール-4-イル）（ピロリジン-1-イル）メタノンの保護インビボ効果を示し、それは、アセトアミノフェン（APAP）投与によって引き起こされる肝臓毒性に対する活性化合物の2-アミノチアゾール基に属する。化合物は、3D構造類似性およびCELA3A酵素の位相的類似体に基づいてCELA3Aインヒビターのライブラリーをスクリーニングすることによって見出された。注目すべきは、化合物が、APAP投与の後4時間に投与されたとき、活性であることである。
【図１０】化合物1-（2-（4-メチルピペラジン-1-イル）-4,5-ジヒドロ-1H-イミダゾール-1-イル）プロパン-1-オン（M059-0891）の保護効果を示す図であり、それは、上記のようなCELA3インヒビターのライブラリーのスクリーニングによって活性が見出された2-アミノイミダゾリンシリーズに属する。これらの結果は、マウスにおける心筋梗塞/再灌流のモデルにおいてこのインヒビターによる壊死および梗塞サイズの有意な減少を示す。
【図１１】エラスターゼタンパク質CELA1（配列番号8）、CELA2A（配列番号27）、CELA3A（配列番号10）およびCELA3B（配列番号25）のアミノ酸配列の配列アラインメントを示す。European Bioinformatics Institute（EBI）（欧州バイオインフォマティクス研究所）からのclustalW2（クラスタルW2）ソフトウェアによって決定されるようにアミノ酸標的部位を指し示す（CELA1については黄色、CELA3Aについては緑色で示されている）。
【発明を実施するための形態】
【００９３】
以下は本発明の詳細な記載である。
本発明は、いくつかの実施形態では、細胞または組織の壊死および/またはそれに関連
する疾患および状態を処置および/または防止するための組成物および方法に関し、およ
びより一層詳細にであるが、排他的ではなく、細胞または組織の壊死を、細胞内CELA3、
それはいくつかの実施形態では、優先的にCELA3Aまたは構造的に関連する酵素、またはい
くつかの実施形態では、CELA1、またはいくつかの実施形態では、カテプシンC、またはい
くつかの実施形態では、それらの任意の組合せの活性の発現をダウンレギュレートし、お
よび/または抑制することによって防止または処置することに関する。
【００９４】
驚くべきことに、一定のタンパク質分解酵素が壊死の初期段階に特異的に関与し、およ
び化合物または薬剤を規定する標的として働き、そのものまたは双方の活性の発現をダウ
ンレギュレートするか、またはそれらを抑制し、壊死の防止、壊死の処置、またはそれら
の組合せをもたらす。
【００９５】
カテプシンC（CTSC）は、ジペプチジルペプチダーゼI（DPP-1）としても知られ、リソ
ソームエキソシステインプロテアーゼである。ヒトでは、それはCTSC遺伝子によってコー
ドされる。カテプシンCは、タンパク質のN末端からジペプチドの切除を触媒する。カテプ
シンCは、エラスターゼの活性化因子であることが知られる（Turk（ターク）D.ら、The E
MBO Journal（ジ・EMBOジャーナル）(2001)20(23)：6570-6582）。
【００９６】
CELA1は、キモトリプシン様エラスターゼファミリー、メンバー1である。その遺伝子は
、12番染色体上の12q13位に位置する。それは、たとえば、膵臓、胃、腸、腎臓、肺、胚
組織、肝臓、筋肉、関節、脳、乳腺、脾臓、血液、舌、骨および膀胱において発現される
。CELA3Aはキモトリプシン様エラスターゼファミリー、メンバー3Aである。その遺伝子は
、1番染色体、1p36.12位に位置する。それは、たとえば、膵臓、膀胱、肝臓、前立腺、皮
膚、胸腺、結合組織、脳および血液において発現される。
【００９７】
驚くべきことに、ここでは、カテプシンC、またはCELA1もしくはCELA3、特にCELA3A、
またはそれに構造的に関連する酵素の活性の発現をダウンレギュレートするか、またはそ
れを抑制する化合物または薬剤の定義の点で、壊死の防止、壊死の処置またはそれらの組
合せをもたらすことが示された。驚くべきことに、本発明の組成物および使用/方法にお
いて有用な新規の薬剤および新規な化合物がここに記載された。
【００９８】
また、驚くべきことに、ここに、薬剤および化合物のクラスが規定され、それはそのも
のまたは双方の活性の発現をダウンレギュレートするか、またはそれを抑制し、壊死の防
止、壊死の処置またはそれらの組合せをもたらし、それによって、化合物の存在は、以前
に既知であるがしかし、治療上の使用は説明されていない。
【００９９】
また、驚くべきことに、ここに、薬剤または化合物のクラスが規定され、それは、その
ものまたは双方の活性の発現をダウンレギュレーションし、またはそれを抑制することが
でき、壊死の防止、壊死の処置またはそれらの組合せをもたらし、それによって、それら
の化合物の存在は以前に既知であったかもしれず、またはそれ自体治療上の使用は以前に
既知であったかもしれないが、そのものの、細胞または組織壊死またはそれらに関する疾
患の防止、抑止、発生率の減少または処置における特定の使用は説明されていない。
【０１００】
本発明の原理および操作は、図面および付随の説明を参照することにより、より一層良
好に理解され得る。
【０１０１】
本発明の少なくとも1つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、その適用が、必
ずしも、以下の説明に記載され、または例によって例示される詳細に制限されないことを
理解されたい。本発明は、他の実施形態が可能であるか、または様々な方法で実践または
遂行されることが可能である。また、ここに採用される表現および用語が説明のためのも
のであり、制限的であると見なされるべきではないことを理解されたい。
【０１０２】
心筋梗塞、脳損傷、脳卒中、肝硬変および他の多くの疾患および条件は、壊死形態の細
胞死に関係する。
【０１０３】
本発明を実践するために単純化しながら、本発明者らは、カテプシンC、CELA1、特にCE
LA3Aまたはそれに構造的に関連する酵素または酵素群が、壊死性細胞応答を調節する細胞
標的であり、およびそのものの下方制御または抑制が壊死誘導細胞死から細胞を保護する
ために使用することができることを明らかにした。
【０１０４】
ここで下記および続く例のセクションに示されるように、本発明者らは、細胞壊死が細
胞内エラスターゼの活性化を誘導することを明らかにした（図2A-Bおよび3参照）。さら
に、細胞内CELA3A、CELA1、および/またはカテプシンCの少なくとも1つの発現を特異的に
下方制御するRNAサイレンシング剤は、壊死形態の細胞死を防止する（図4A-B参照）。ま
た、特定のsiRNA（それぞれ配列番号1-3）によるこれらの標的の抑制は、標的細胞におけ
るカテプシンC酵素活性またはCELA1/CELA3Aエラスターゼ様活性に特異的な様式で抑制を
もたらした（図5A-B参照）。さらに、マウスおよびラット（図8A-B参照）、マウスにおけ
るAPAP誘発性肝毒性モデル（図9）、およびマウスでの心筋虚血/再灌流モデル（図10）に
おいて、閉鎖性頭部損傷（外傷）モデルを用いてエラスターゼインヒビターが脳細胞壊死
損傷をインビボで防止する能力を示した。まとめると、これらの結果は、壊死誘発細胞死
の処置または防止のために、細胞内CELA3Aまたは構造的に関連する酵素、CELA1、および/
またはカテプシンCの少なくとも1つについてのダウンレギュレーション剤またはインヒビ
ターの使用を実証する。さらに、CELA3Aまたは構造的に関連する酵素および随意にCELA1
の識別は、壊死プロセスの主要な標的として、他のエラスターゼの酵素活性を妨害しない
特異的なエラスターゼインヒビターの設計を可能にする。
【０１０５】
したがって、本発明の一態様によれば、細胞の壊死を防止または抑制する方法が提供さ
れ、本方法には、壊死シグナルに供される細胞に、細胞内CELA3Aまたは構造的に関連する
酵素、CELA1、および/またはカテプシンCの少なくとも1つの活性の発現を特異的にダウン
レギュレーションし、およびあるいはまたは追加的に抑制する薬剤の治療上有効な量を施
与することが含まれる。
【０１０６】
ここで使用されるように語句「壊死」は、生きた組織における細胞の時期尚早の死に言
及する。壊死は、典型的には、細胞膜および細胞小器官の破壊、細胞の腫脹、ミトコンド
リアの障害、続いて細胞の溶解および最終的には細胞死によって特徴付けられる病理学的
プロセスである。また、細胞溶解は、典型的には、炎症反応を伴い、および炎症は壊死を
増加させる可能性がある。
【０１０７】
壊死誘発細胞死は、たとえば、CytoTox 96(R)（サイトトックス96商標）Non-Radioacti
ve Cytotoxicity Assay（非放射性細胞傷害アッセイ）（Promega（プロメガ社）、WI（ウ
ィスコンシン州）、USA）による、LDH Cytotoxicity Assay Kit（LDH細胞傷害性アッセイ
キット）（Cayman（カイマン社）、MI（ミシガン州）、米国）による、アクリジン・オレ
ンジ/臭化エチジウムによるStaining（ステイニング）、および蛍光顕微鏡によるか、ま
たはFACS（例は、生体染料HO342を用いる）による分析を含め、当業者に知られる任意の
方法によってアッセイすることができ、ここで以下の例のセクションのさらなる詳細を参
照。
【０１０８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、壊死は、様々な医学的条件/疾患と関係するこ
とがあり、それらのそれぞれが本発明のいくつかの実施形態に従って企図される治療上の
標的である。そのような医学的条件/疾患の例には、制限されないが、感染、毒、毒液、
放射線、物理的外傷、炎症、栄養素または酸素供給の欠如、化学的不均衡、血液供給の中
断、細胞または組織の死をもたらす他の状態、または上記の2以上の組合せを含む。特定
の実施形態では、組織壊死は、移植中の組織の移植および/または保存不良に関連するこ
とがある。たとえば、細胞または組織の壊死は、以下の条件（病態とも言う）のいずれか
1以上に関連し得る：膿瘍、悪寒（マラリア熱）、貧血、強直症、無酸素症、無呼吸、関
節炎、窒息、喘息、失調、萎縮、背痛（backache、腰痛）、出血、膿漏眼（blennorrhea
）、悪液質、カリエス（骨瘍）、疝痛、便秘、痙攣（convulsion、発作）、咳そう、チア
ノーゼ、下痢、めまい、水腫（水疱）、乾性壊疽（乾燥壊疽）、赤痢、消化不良、呼吸困
難、浮腫（水腫）、るいそう（痩せ）、失神、疲労、発熱、細動（細線維化、フィブリン
化）、ガス壊疽、遺伝性疾患、高血圧（high blood pressure）、水症、高血圧症（hyper
tension）、低血圧症（hypotension）、黄疸（icterus）、消化障害（不消化）、炎症、
不眠、そう痒（かゆみ）、黄疸（jaundice）、低血圧（low blood pressure）、腰痛（lu
mbago）、消耗、湿性壊疽、水がん（noma、壊疽性口内炎）、痛み、麻痺、痒疹（pruritu
s、そう痒症）、発疹、ルーム（カタル）、硬化、発作、ショック、皮膚発疹、傷（びら
ん）、攣縮（spasm、痙攣）、脱疽（sphacelation）、癆症（tabes、消耗）、頻脈、う歯
、腫瘍、胃のむかつき（upset stomach）、めまいまたは嘔吐が含まれる。
【０１０９】
壊死は、生きている細胞のグループに局在化することができ、または1以上の組織領域
（例は、壊死組織）にわたって広がることがあることは理解されよう。
【０１１０】
用語「組織」は、機能または機能群を実行するように設計された細胞からなる有機体（
生物）の一部分に言及する。典型的には、固形組織は血管新生される。例には、脳組織、
網膜、皮膚組織、肝臓組織、膵臓組織、骨組織、軟骨組織、結合組織、血液組織、筋組織
、心臓組織脳組織、脈管（血管）組織、腎臓組織、肺組織、性腺組織、造血組織が含まれ
る。
【０１１１】
典型的には、細胞は、その細胞外環境からの壊死シグナルを受けた後に壊死されるが、
それらに限られない。任意の上記条件、例は、酸素の欠乏、毒、毒素、等があり、および
細胞の壊死に至るプロセスを開始する可能性がある。
【０１１２】
ここに使用される用語「壊死細胞」または「壊死性細胞」は、壊死シグナルを受け、お
よび壊死に関係する少なくとも1つの表現型を示す任意のタイプの細胞を包含する（上記
のようになもの）。
【０１１３】
本教示による細胞は、たとえば、脳細胞、ニューロン、心臓細胞、筋肉細胞、皮膚細胞
、骨細胞、膵臓細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、腸細胞、脾臓細胞、呼吸器細胞、肺細胞、リ
ンパ球または単球またはここに記載の任意の罹患細胞を含む。
【０１１４】
ここで使用される「壊死細胞」という用語は、壊死の任意の段階の細胞にさらに関連す
る。したがって、細胞は、壊死の初期段階（例は、細胞の腫脹またはミトコンドリアの障
害を受けている）であってもよく、または細胞死の最終段階（例は、細胞溶解中）であっ
てもよい。
【０１１５】
ここに使用されるように、「抑制する」または「処置する」という語句は、壊死の有害
な影響を軽減、治癒、逆進（逆転）、弱化（減弱）、緩和、最小化、抑止または停止する
ことに言及する。
【０１１６】
いくつかの態様において、細胞または組織壊死に関係する疾患の防止に言及するとき、
そのような言及は、集団レベルでの疾患の発生率の減少に関する。いくつかの態様では、
そのような言及は、再発または再発性疾患に罹患しているペイシェントに関するものであ
り得、そこでは、以前にそのようなペイシェントで起こったような十分な症候、病因また
は疾患の重篤度を発症しないことが真の防止の指標として役立ち得る。
【０１１７】
いくらかの態様では、細胞または組織レベルでの壊死の防止に言及するとき、そのもの
は古典的マーカーまたは組織病理学的証拠または典型的には壊死に関連する分泌シグナル
の明白な減少に言及することもできる。
【０１１８】
一実施形態によれば、細胞または組織の壊死を処置または抑制することは、壊死を、本
発明の薬剤では処理されていないが処置された細胞/組織と同じ壊死シグナルを受けた同
じタイプのものであるコントロール壊死細胞/組織と比較して、少なくとも約10％だけ、
少なくとも約20％だけ、少なくとも約30％だけ、少なくとも約40％だけ、少なくとも約50
％だけ、少なくとも約60％だけ、少なくとも約70％だけ、少なくとも約80％だけ、少なく
とも約90％だけ、または少なくとも約100％だけ減少させ得る。
【０１１９】
上述のように、本発明のこの態様の方法は、壊死シグナルに供される細胞に、細胞内CE
LA3A、または構造的に関連する酵素、CELA1、および/またはカテプシンCの少なくとも一
の発現を特異的にダウンレギュレートし、およびあるいは、またはそれに加えてその活性
を抑制する薬剤を施与することによって影響を及ぼす。
【０１２０】
ここに使用されるように、「特異的に」は、細胞内CELA3Aまたは構造的に類似の酵素、
CELA1、および/またはカテプシンCの少なくとも1つの発現をダウンレギュレートし、およ
び/またはその活性を抑制するが、細胞において任意の他のタンパク質の活性または発現
を実質的に干渉しない（すなわち、細胞内CELA3A、CELA1、および/またはカテプシンCの
少なくとも1種ではない細胞成分の活性または発現において10％、15％、20％、25％、30
％未満である。）ことに言及する。具体的には、本教示はまた、細胞内CELA3A、CELA1お
よび/またはカテプシンCの少なくとも一、それらの二（例は、CELA3AおよびCELA1C）また
はそれらのすべての活性の発現をダウンレギュレートし、および/または抑制するための
単一の薬剤の能力に言及する。
【０１２１】
ここに使用されるように、「ダウンレギュレートする」または「抑制する」は、細胞内
カテプシンC、CELA1、CELA3Aまたはそれに構造的に関連する酵素であるタンパク質の少な
くとも1つの発現または活性の減少、低下、弱化、軽減、最小化、抑止または停止に言及
する。1つの実施形態によれば、細胞内カテプシンC、CELA1、CELA3Aまたはその構造的に
関連する酵素であるタンパク質の少なくとも1つの発現のダウンレギュレーションおよび/
またはその活性の抑制は、本発明での薬剤により処理されてない細胞内CELA3A、CELA1、
および/またはカテプシンCタンパク質の少なくとも一であるが、その他では同じ条件に供
したコントロールと比べて、少なくとも約5％だけ、少なくとも約10％だけ、少なくとも
約20％だけ、少なくとも約30％だけ、少なくとも約40％だけ、少なくとも約50％だけ、少
なくとも約60％だけ、少なくとも約70％だけ、少なくとも約80％だけ、少なくとも約90％
または少なくとも約100％だけである。
【０１２２】
ここに使用されるように、用語「発現」はタンパク質発現またはmRNA発現に言及する。
【０１２３】
ここに使用されるように、「細胞内カテプシンC、CELA1、CELA3Aまたはそれに構造的に
関連する酵素の少なくとも1つの活性」という語句は、生物学的活性、例は、その酵素活
性に言及する。一実施態様によれば、CELA3Aおよび/またはCELA1は、そのセリンプロテア
ーゼ活性に言及する（例は、タンパク質、たとえば、エラスチンなどのようなものを加水
分解するエラスターゼ活性）。別の実施形態によれば、カテプシンCの活性は、そのリソ
ソームシステインプロテイナーゼ活性に言及する（例は、セリンプロテイナーゼの活性化
でのもの）。
【０１２４】
カテプシンC、CELA1、CELA3Aまたはそれに構造的に関連する酵素の発現または活性のレ
ベル（例は、そのダウンレギュレーション）を評価することは、当業者に知られる任意の
方法によって遂行することができる。したがって、たとえば、酵素結合免疫吸着（ELISA
）アッセイ、免疫蛍光（IF）アッセイまたはChemiluminescent Immunoassay（CLIA）アッ
セイで、Uscn、OriGene（オリジーン）またはSigma-Aldrich（シグマ-アルドリッチ）か
ら入手可能であるものを用いて、細胞内カテプシンC、CELA1、CELA3Aまたはそれに構造的
に関連する酵素の少なくとも1つのタンパク質レベルを決定することができる。それは酵
素アッセイと組み合わせることができた。mRNA発現レベルは、例は、ノーザンブロット分
析またはRT-qPCRを用いて遂行することができる。本教示に従って使用され得るCELA1およ
び/またはCELA3A活性アッセイには、例は、Ellman Esterase Assay（エルマン・エステラ
ーゼ・アッセイ）（Ellman, G. L.ら、Biochem. Pharmacol.（バイオケミカル・ファーマ
コロジー）7、88-95、1961参照）またはフローインジェクション分析（FIA）によるエス
テラーゼ活性アッセイ[Joga（ジョガ）ら、Biotechnology Letters（バイオテクノロジー
・レターズ）（2201）23（12 ）：943-948]が含まれる。本教示に従って使用され得るカ
テプシンC活性アッセイには、例はUscn Life Science Inc.（Uscnライフ・サイエンス社
）からの、入手可能なCTSCアッセイキットが含まれる。
【０１２５】
したがって、たとえば、および以下の例3にさらに詳細に記載されるように、エラスタ
ーゼ様活性は、基質として使用されるN-メトキシスクシニル-Ala-Ala-Pro-Valp-ニトロア
ニリド（MAAPV）（Sigma）を用いるELISAによって測定することができ、その一方、カテ
プシンC様活性は、基質として使用されるGly-Phe p-ニトロアニリド（Sigma）を用いるEL
ISAによって測定することができる。
【０１２６】
ここに使用されるように、用語「カテプシンC」は、ジペプチジルペプチダーゼI（DPP-
1）またはカテプシンC（CTSC）とも呼ばれ、例は、NP_001107645.1（配列番号6）に記載
されるもので、ペプチダーゼC1ファミリーに属するリソソームエキソシステインプロテア
ーゼに関する。
【０１２７】
ここに使用されるように、用語「CELA1」は、エラスターゼ-1（ELA1）としても知られ
、例は、NP_001962.3（配列番号8）に記載されるようなもので、キモトリプシン様エラス
ターゼファミリーメンバー1（CELA1）に関連する。
【０１２８】
ここに使用されるように、用語「CELA3A」は、エラスターゼファミリーメンバー3Aとし
ても知られ、例は、NP_005738.4（配列番号10）に記載されるようなもので、酵素キモト
リプシン様エラスターゼファミリーメンバー3Aに関連する。
【０１２９】
カテプシンC、CELA1およびCELA3A発現のダウンレギュレーションは、転写および/また
は翻訳を妨害する種々の分子[例は、RNAサイレンシング剤（例は、アンチセンス、siRNA
、shRNA、マイクロRNA）、リボザイムおよびDNAザイム]を用いるゲノムおよび/または転
写レベルに影響を及ぼすことができる。細胞内CELA3A、CELA1、および/またはカテプシン
C活性の少なくとも1つの抑制は、タンパク質レベルに影響を及ぼし、即ち、タンパク質の
活性を抑制するか、または例は、抗体、アンタゴニスト、ポリペプチドを開裂する酵素、
小分子、自然インヒビターおよびその他同種類のものなどを用いてその分解を引き起こす
。
【０１３０】
一実施形態によれば、細胞内CELA3A、CELA1および/またはカテプシンCの少なくとも1つ
を抑制することが可能な薬剤は、カテプシンC、CELA3AおよびCELA1の折りたたまれたアミ
ノ酸配列から構成される少なくとも1つのドメインに結合する高親和性結合分子である。
【０１３１】
たとえば、高親和性結合分子は、カテプシンC、CELA3AおよびCELA1に特異的に結合する
ことが可能なアプタマー、抗体または抗体フラグメントであり得る。特定の実施形態によ
れば、高親和性分子は、抗原認識ドメイン、例は、カテプシンC、CELA3AおよびCELA1の少
なくとも1つのエピトープに特異的に結合する抗体を含む。ここに使用されるように、「
エピトープ」という用語は、抗体のパラトープが結合する抗原上の任意の抗原決定基に言
及する。
【０１３２】
エピトープ決定基は大抵、分子、たとえば、アミノ酸または炭水化物側鎖などのような
ものの化学的に活性な表面グルーピングからなり、および特異的な三次元構造特性ならび
に特異的な電荷特性を普通に有する。
【０１３３】
本教示に従って標的とされ得るCELA1およびCELA3Aの模範的なエピトープは、配列番号1
1、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列
番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22配列番号23および配列番号23
で表されるアミノ酸配列を含む。これらの模範的なアミノ酸配列は、CELA1およびCELA3A
のエピトープ領域として企図され、これらは、そのもののダウンレギュレーションを標的
とすることができる。当技術でよく知られる方法、例は、ELISAまたはウエスタンブロッ
トアッセイを用いて生成される抗体のそれぞれについて、抗体特異性および酵素抑制のさ
らなる修飾が行われる必要があることは理解されよう。
【０１３４】
本発明において使用されるように、「抗体」という用語には、インタクト（無傷とも言
う）な分子ならびにその機能的断片（フラグメント）で、たとえば、マクロファージに結
合することが可能なFab、F（ab'）2、およびFvなどのようなものを含む。これらの機能的
抗体断片は、以下のように規定される：（1）Fabは、抗体分子の一価抗原結合断片を含む
断片であり、抗体全体を酵素パパインで消化してインタクトな軽鎖および1つの重鎖の部
分を生じさせる；（2）Fab'は、抗体全体をペプシンで処理し、次いで還元してインタク
トな軽鎖および重鎖の一部分を生じさせることによって得ることができる抗体分子のフラ
グメントであり；抗体分子当たり2つのFab'断片が得られ；（3）（Fab'）2は、抗体全体
を酵素ペプシンで処理することで、その後の還元は行わないことによって得ることができ
る抗体の断片であり；F（ab'）2は、2つのジスルフィド結合によって一緒に保持された2
つのFab'断片の二量体であり；（4）Fvは、軽鎖の可変領域および2本鎖として発現される
重鎖の可変領域を含む遺伝子操作された断片として規定され；および（5）一本鎖抗体（
「SCA」）は、遺伝的に融合される単鎖分子として適切なポリペプチドリンカーによって
連結される軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含む遺伝子操作された分子である。
【０１３５】
ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体ならびにそのフラグメントを産生する方
法は、当技術においてよく知られる（たとえば、Harlow（ハーロー）およびLane（レーン
）、Antibodies（アンティボディズ）：A Laboratory Manual（ラボラトリー・マニュア
ル）、Cold Spring Harbor Laboratory（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリ
ー）、New York（ニューヨーク）、1988を参照し、参照によってそれをここに組み込む。
）。
【０１３６】
本発明のいくつかの実施形態による抗体フラグメントは、抗体のタンパク質加水分解に
よって、またはフラグメントをコードするDNAの大腸菌または哺乳動物細胞（例は、チャ
イニーズハムスター卵巣細胞培養物または他のタンパク質発現系）での発現によって調製
することができる。抗体フラグメントは、慣習的な方法による全抗体のペプシン消化また
はパパイン消化によって得ることができる。たとえば、抗体フラグメントは、ペプシンに
よる抗体の酵素的開裂によって産生され、F（ab'）2と表される5Sフラグメントを提供す
ることができる。このフラグメントは、ジスルフィド連結の開裂から生じるスルフヒドリ
ル基のためのチオール還元剤、および随意にブロッキング基を用いて3.5S Fab'一価フラ
グメントを生成するためにさらに開裂することができる。あるいは、ペプシンを用いる酵
素的切断は、2つの一価Fab'フラグメントおよびFcフラグメントを直接産生する。これら
の方法は、たとえば、Goldenberg（ゴールデンバーグ）、米国特許第4,036,945号および
同第4,331,647号ならびにそれらに含まれる参考文献によって記載されており、これらの
特許はその全体が参照によりここに組み込まれる。Porter（ポーター）、R.R.[Biochem. 
J.（ザ・バイオケミカル・ジャーナル）73：119-126（1959）]。フラグメントが抗原に結
合インタクトな抗体によって認識される限り、抗体を切断する他の方法、たとえば、一価
の軽鎖-重鎖フラグメントを形成するための重鎖の分離、フラグメントのさらなる切断、
または他の酵素的、化学的、または遺伝子技術などのようなものも使用され得る。
【０１３７】
Fvフラグメントは、VHおよびVL鎖の会合を含む。この会合は、Inbar（インバー）らに
記載されるように、一価でありうる[Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 69:2659-62 (19720]。
代わりに、可変鎖は分子内ジスルフィド結合または化学物質、たとえば、グルタルアルデ
ヒドなどのようなものによる架橋によって連結することができる。好適には、Fvフラグメ
ントはペプチドリンカーによって接続されるVHおよびVL鎖を含む。これらの単鎖抗原結合
タンパク質（sFv）は、オリゴヌクレオチドによって接続されたVHドメインおよびVLドメ
インをコードするDNA配列を含む構造遺伝子を構築することにより調製される。構造遺伝
子を発現ベクターに挿入し、続いてそれを宿主細胞、たとえば、E. coli（大腸菌）など
のようなものに導入する。組換え宿主細胞は、2つのVドメインを架橋するリンカーペプチ
ドを有する単一のポリペプチド鎖を合成する。sFvを生成するための方法は、例えば、[Wh
itlow（ホイットロー）およびFilpula（フィルプラ）、Methods（メソッヅ）2：97-105（
1991）；Bird（バード）ら、Science（サイエンス）242：423-426（1988）；Pack（パッ
ク）ら、Bio/Technology（バイオ／テクノロジー）11：1271-77（1993）；および米国特
許第4,946,778号によって記載され、それらの全体が参照によりここに組み込まれる。
【０１３８】
抗体フラグメントの別の形態は、単一の相補性決定領域（CDR）をコードするペプチド
である。CDRペプチド（「最小認識単位」）は、目的の抗体のCDRをコードする遺伝子を構
築することによって得ることができる。そのような遺伝子は、たとえば、ポリメラーゼ連
鎖反応を用いて、抗体産生細胞のRNAから可変領域を合成することによって調製される。
たとえば、Larrick（ラリック）およびFry（フライ）参照[Methods、2：106-10（1991）]
。
【０１３９】
非ヒト（例は、ネズミ）抗体のヒト化形態は、免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖また
はその断片（Fv、Fab、Fab'、F（ab'）.sub.2または抗体の他の抗原結合サブ配列）のキ
メラ分子であり、それは非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含む。ヒト化抗体に
は、レシピエントの相補性決定領域（CDR）を形成する残基が、非ヒト種、たとえば、所
望される特異性、親和性および能力をもつマウス、ラットまたはウサギなどのようなもの
のCDR由来の残基（ドナー抗体）によって置換されるヒト免疫グロブリンが含まれる。例
として、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置
換される。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体にも、移入されたCDRまたはフレームワ
ーク配列にも見出されない残基を含み得る。概して、ヒト化抗体は、少なくとも1つの、
および典型的には2つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、そこでは、CDR領域のすべ
てまたは実質的にすべてが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、およびFR領域のすべて
または実質的にすべてがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである。ヒト化抗体
はまた、最適には、免疫グロブリン定常領域（Fc）の少なくとも一部分、典型的にはヒト
免疫グロブリンのそのものを含む［Jones（ジョーンズ）ら、Nature（ネイチャー）、321
：522-525（1986）；Riechmann（リーチマン）ら、Nature、332：323-329（1988）；およ
びPresta（プレスタ）、Curr. Op. Struct. Biol.（カレント・オピニオン・イン・スト
ラクチュラル・バイオロジー）、2：593-596（1992）］。
【０１４０】
非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当技術でよく知られる。概して、ヒト化抗体は
、非ヒトである供給源からそれに導入された1つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの
非ヒトアミノ酸残基は、多くの場合、インポート残基と呼ばれ、それらは、通常はインポ
ート可変ドメインから取られる。ヒト化は、Winter（ウィンター）および共同研究者の方
法に従い[Jonesら、Nature、321：522-525（1986）；Riechmannら、Nature 332：323-327
（1988）；Verhoeyen（フェルホアイアン）ら、Science、239：1534-1536（1988）]、げ
っ歯類のCDRsまたはCDR配列をヒト抗体の対応する配列に置換することによって、本質的
に実行することができる。したがって、そのようなヒト化抗体は、キメラ抗体（米国特許
第4,816,567号）であり、そこでは、実質的に無傷のヒト可変ドメインが非ヒト種由来の
対応する配列によって置換されている。実際には、ヒト化抗体は、典型的にはヒト抗体で
あり、そこで、いくつかのCDR残基および場合によってはいくつかのFR残基が、げっ歯類
抗体の類似部位由来の残基によって置換されている。
【０１４１】
ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリー[Hoogenboom（フーゲンブーム）
およびWinter、J. Mol. Biol.（ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー）、227
：381（1991）；Marks（マークス）ら、J. Mol. Biol.、222：581（1991）]を含め、当技
術において知られる種々の技術を用いて生成することができる。Cole（コール）ら、およ
びBoerner（ボェルナー）らの技術はまた、ヒトモノクローナル抗体の調製のためにも利
用可能である（Coleら、Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R.Liss、p.7
7（1985）およびBoernerら、J. Immunol.（ジャーナル・オブ・イムノロジー）、147（1
）：86-95（1991））。同様に、ヒト抗体は、トランスジェニック動物、例は、内因性免
疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活性化されたマウスに、ヒト免疫グロブリン
遺伝子座を導入することによって作製することができる。チャレンジにより、ヒト抗体生
成が観察され、それは、すべての観点、遺伝子再構成、アセンブリー、および抗体レパー
トリーを含め、ヒトにおいてみられるものによく似ている。このアプローチは、たとえば
、米国特許第5,545,807号、第5,545,806号、第5,569,825号、第5,625,126号、第5,633,42
5号、第5,661,016号、および以下の科学刊行物に記載されている：Marksら、Bio/Technol
ogy 10,：779-783（1992）；Lonberg（ロンベルグ）ら、Nature 368：856-859（1994）；
Morrison（モリスン）、Nature 368 812-13（1994）；Fishwild（フィッシュワイルド）
ら、Nature Biotechnology（ネイチャー・バイオテクノロジー）14、845-51（1996）；Ne
uberger、（ノイバーガー）、Nature Biotechnology 14：826（1996）；LonbergおよびHu
szar（フサール）、Intern. Rev. Immunol.（インターナショナル・レビューズ・オブ・
イムノロジー）13、65-93（1995）に記載されている。
【０１４２】
したがって、細胞内CELA3A、CELA1、および/またはカテプシンC酵素活性の少なくとも1
つの抑制は、たとえば、酵素の立体配座変化の認識によって活性酵素に特異的に結合する
抗体を用いて影響され得る。あるいは、抗体は、酵素の基質に結合することによって酵素
活性を抑制し得る。
【０１４３】
本発明の一実施形態によれば、Kd 10-7M以下のCELA3AおよびCELA1に対する最小親和性
で結合するが、少なくとも10倍より低い（例は、10-6M）最小親和性でCELA2AまたはCELA3
Bに結合する抗体が提供される。特定の実施形態によれば、抗体は、（10-8-10-10Mまたは
10-9-10-10M）の範囲のKdで標的に結合する。
【０１４４】
本発明の1つの実施形態によれば、カテプシンCに対して10-7M以下のKdの最小親和性で
結合するが、、カテプシンA、B、D、E、G、H、K、L1、L2、O、S、WまたはZに少なくとも1
0倍低い（例は、10-6M）最小親和性で結合する抗体が提供される。特定の実施形態によれ
ば、抗体は、（10-8-10-10Mまたは10-9-10-10M）の範囲のKdで標的に結合する。
【０１４５】
本教示に従って使用され得る模範的な抗体には、制限されないが、例は、EMD Millipor
e（EMDミリポア社）、Sigma-AldrichおよびSanta Cruz Biotechnology（サンタ・クルズ
・バイオテクノロジー社）から入手可能なCELA1抗体；例は、Abcam（アブカム社）、Sigm
a-Aldrich、およびSanta Cruz Biotechnologyからが入手可能な抗CELA3A抗体；例は、Sig
ma-AldrichおよびR＆D Systems（R&Dシステムズ社）から入手可能な抗カテプシンC / CTS
C抗体が含まれる。そのような抗体は、以下にさらに記載されるように、その特異性につ
いて認定され得る。
【０１４６】
カテプシンC、CELA1、CELA3Aまたはそれに構造的に関連する酵素を抑制することが可能
な別の薬剤は、カテプシンC、CELA1、CELA3Aまたはそれに構造的に関連する酵素に結合お
よび/または開裂する任意の分子である。そのような分子は、カテプシンC、CELA1、CELA3
Aまたはそれに構造的に関連する酵素のアンタゴニスト、またはカテプシンC、CELA1、CEL
A3A、またはそれに構造的に関連する酵素の抑制ペプチドであり得る。
【０１４７】
カテプシンC、CELA1、CELA3Aまたはそれに構造的に関連する酵素の少なくとも触媒また
は結合部分の非機能的類似体は、カテプシンC、CELA1、CELA3Aまたは構造的に関連する酵
素を抑制する薬剤としても使用できることが理解されよう。
【０１４８】
カテプシンC、CELA1、CELA3Aまたはそれに構造的に関連する酵素を抑制するために本発
明のいくつかの実施形態とともに使用することができる別の薬剤は、カテプシンC、CELA1
、CELA3Aまたはそれに構造的に関連する酵素の活性化または基質結合性を防止する分子で
ある。
【０１４９】
カテプシンC、CELA1、CELA3Aまたはそれに構造的に関連する酵素を抑制するために本発
明のいくつかの実施形態とともに使用することができる別の薬剤は、ドミナントネガティ
ブ分子、すなわち、そのペプチドの一部またはその変形体で、カテプシンC、CELA1、CELA
3Aまたはそれに構造的に関連する酵素のエフェクター（作動体とも言う）と競合する。
【０１５０】
細胞内カテプシンC、CELA1、CELA3Aまたはそれに構造的に関連する酵素の少なくとも1
つを抑制するために本発明のいくつかの実施形態とともに使用することができる別の薬剤
は、その活性化経路において自然なインヒビターである。本発明の教示に従って用い得る
カテプシンCの模範的な自然なインヒビターには、制限されないが、シスタチンF、ヒトプ
ロテイナーゼインヒビター9（PI-9/セルピンB9）、シスタチンCおよびステフィンAおよび
Bが含まれる。
【０１５１】
したがって、細胞膜を透過するか、または透過するように改変されてもよく（以下に詳
述するように）、および細胞内カテプシンC、CELA1、CELA3Aまたは構造的に関連する酵素
の少なくとも1つの触媒活性を本教示に従って使用してもよい。特に好ましい実施態様に
おいて、本発明は、細胞内CELA3Aまたは構造的に類似の酵素のCELA1、および/またはカテ
プシンCの少なくとも1つを特異的に抑制する小分子の使用に向けられる。本発明のいくつ
かの実施形態の一態様によれば、小分子は、細胞内CELA3A、CELA1、および/またはカテプ
シンCの少なくとも1つに特異的にKd 10-7Mおよびそれよりも低い（以下とも言う）の最小
親和性を伴い結合し、およびCELA2AまたはCELA3B、またはカテプシンA、B、D、E、G、 H
、K、L1、L2、O、S、WまたはZに少なくとも10倍より高いKdの最小親和性を伴って結合す
る。
【０１５２】
他の態様では、本発明は、特定のエラスターゼインヒビター、たとえば、エラスターゼ
インヒビターII（MeOSuc-AAPA-CMK）などのようなもので、Calbiochem-Novabiochem（カ
ルバイオケム-ノババイオケム）、USAから入手可能であるものの使用を意図する。
【０１５３】
本発明に従って使用することができる模範的なエラスターゼインヒビターにはまた、非
ペプチド小分子も含まれる。
【０１５４】
いくつかの態様では、そのようなエラスターゼインヒビターはまた、CELA1、CELA3、お
よび特にCELA3Aおよび/またはカテプシンCの発現を下方制御し、および/または活性を抑
制するこの発明の化合物/薬剤を表すこともできる。CELA3または構造的に関連するインヒ
ビターは、3D構造類似性およびトポロジー（位相的）アナログに基づいて、CELA3Aに対し
て特異的に設計され得る。いくつかの小分子は、様々な化学ファミリーに属することがあ
る。選択的および特異的にCELA 3Aまたは構造的に類似の酵素を抑制することができる模
範的な化合物には、ここでのテーブル1に列挙されたものが含まれる。
【０１５５】
本発明はまた、以下のテーブル1に列挙される薬剤、またはその誘導体、異性体、塩、
酸化物、多形体もしくはそのものの他の既知の形態の任意のサブグルーピングを包含する
ものと理解される。
【０１５６】
壊死を抑制することができる薬剤には、とりわけ、様々な化学的ファミリーに属する他
の小さな抑制性化合物、たとえば、2-アミノイミダゾリン、2-アミノチアゾールおよびイ
ソオキサゾールが含まれる。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、薬剤は、以下のテーブルIによって記載される任意の化合物
であり、またはいくつかの実施形態では、薬剤は、その誘導体、類似体、または薬学的塩
または異性体である。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、テーブル1において記載される薬剤の任意の組合せまたはサ
ブグルーピングが、この発明の一部として企図され、およびその実施形態を表す。
【表１−１】
2020183405.tif 000013
【表１−２】
2020183405.tif 000014
【表１−３】
2020183405.tif 000015
【表１−４】
2020183405.tif 000016
【表１−５】
2020183405.tif 000017
【表１−６】
2020183405.tif 000018
【０１５９】
CELA 1を選択的かつ特異的に抑制することができる模範的な化合物には、制限されない
が、N-[4-[4-（イソブチリルアミノ）フェノキシ]フェニル]-2-メチル-プロピオンアミド
、エチル-2,3-ジヒドロ-3-オキソ-1,2-ベンズイソチアゾール-2-アセタート-1,1-ジオキ
シドが含まれる。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、この発明の化合物および/またはこの発明の組成物が含まれ
、および/またはこの発明の方法は使用を提供し、および/またはこの発明の第1の医学的
使用は次の式：
【化１２】
2020183405.tif 000019
によって特徴付けられる薬剤またはそれらの任意の組合せが含まれる。いくつかの態様に
おいて、この発明の化合物および/またはこの発明の組成物は含まれ、および/またはこの
発明の方法は使用を提供し、および/またはこの発明の第1の医学的使用には、M059-0032
；M059-0055；M059-0082；M059-0053；M059-0335；M059-0891；M059-0891；M059-1012、M
008-0111；4112-3656；Z632-2266；またはZ601-4253の構造またはそのものの任意のサブ
セットによって特徴付けられる薬剤が含まれうる。いくつかの態様では、この発明の化合
物および/またはこの発明の組成物は含まれ、および/またはこの発明の方法は使用を提供
し、および/またはこの発明の第1の医学的使用には、M059-0032；M059-0055；M059-0082
；M059-0053；M059-0335；M059-0891；M059-0891；M059-1012の構造、または中央の2-ア
ミノイミダゾリンが、それらのいずれかの2-アミノ位置で、置換または非置換ピロリジン
、置換または非置換ピペリジン、置換または非置換ピペラジン、置換または非置換イミダ
ゾリジン、置換または非置換ピラゾリジン、置換または非置換アリール、置換または非置
換5または6員複素環式環、または置換または非置換5または6員シクロアルキルを伴って置
換を含む同様の構造を有する化合物によって特徴付けられる薬剤が含まれる。いくつかの
態様において、本発明の化合物および/または本発明の組成物は含まれ、および/または本
発明の方法は使用を提供し、および/または本発明の第1の医学的使用は、M059-0032；M05
9-0055；M059-0082；M059-0053；M059-0335；M059-0891；M059-0891；M059-1012の構造、
または中央の2-アミノイミダゾリンによって非置換ピロリジン、非置換ピペリジン、非置
換ピペラジン、非置換イミダゾリジン、非置換ピラゾリジン、非置換アリール、非置換5
または6員複素環式環、または非置換5または6員シクロアルキルを伴うそのものの任意の2
-アミノ位置での置換を含む類似の構造を有する化合物により特徴付けられる薬剤を含み
うる。いくつかの態様では、本発明の化合物および/または本発明の組成物は含まれ、お
よび/または本発明の方法は使用を提供し、および/または本発明の第1の医学的使用は、M
059-0032；M059-0055；M059-0082；M059-0053；M059-0335；M059-0891；M059-0891；M059
-1012の構造、または中央の2-アミノイミダゾリンによって置換ピロリジン、置換ピペリ
ジン、置換ピペラジン、置換イミダゾリジン、置換ピラゾリジン、置換アリール、置換5
または6員複素環式環、置換5または6員シクロアルキルを伴い同様の任意の2-アミノ位置
での置換を含む類似の構造を有する化合物により特徴付けられる薬剤を含みうる。いくつ
かの態様において、本発明の化合物および/または本発明の組成物は含まれ、および/また
は本発明の方法は使用を提供し、および/または本発明の第1の医学的使用は、M059-0032
；M059-0055；M059-0082；M059-0053；M059-0335；M059-0891；M059-0891；M059-1012の
構造、または中央の2-アミノイミダゾリンによって、それらのいずれかの2-アミノ位置で
、置換または非置換ピロリジン、置換または非置換ピペリジン、置換または非置換ピペラ
ジン、置換または非置換イミダゾリジン、置換または非置換ピラゾリジンを伴う置換を含
む同様の構造を有する化合物により特徴付けられる薬剤を含みうる。
【０１６１】
いくつかの態様において、本発明の化合物および/または本発明の組成物は含まれ、お
よび/または本発明の方法は使用を提供し、および/または本発明の第1の医学的使用は、M
008-0111；4112-3656；またはZ632-2266の構造またはそのものの任意のサブセットにより
特徴付けられる薬剤を含みうる。
【０１６２】
いくつかの態様では、本発明の化合物および/または本発明の組成物は含まれ、および/
または本発明の方法は使用を提供し、および/または本発明の第1の医学的使用は、M008-0
111；4112-3656またはZ632-2266の構造、または中央の2-アミノイミダゾリンによって、
置換または非置換ピロリジン、置換または非置換ピペリジン、置換または非置換ピペラジ
ン、置換または非置換イミダゾリジン、置換または非置換ピラゾリジン、置換または非置
換アリール、置換または非置換5または6員複素環式環、または置換または非置換5または6
員シクロアルキルを伴い、2-アミノ位置で置換を含む同様の構造を有する化合物により特
徴付けられる薬剤を含みうる。いくつかの態様では、本発明の化合物および/または本発
明の組成物は含まれ、および/または本発明の方法は使用を提供し、および/または本発明
の第1の医学的使用は、M008-0111；4112-3656またはZ632-2266の構造、または中央の2-ア
ミノチアゾリンまたはイソキサゾールによって、非置換ピロリジン、非置換ピペリジン、
非置換ピペラジン、非置換イミダゾリジン、非置換ピラゾリジン、非置換アリール、非置
換5または6員複素環式環、または非置換5または6員シクロアルキルを伴って、2-アミノ位
置での置換を含む類似の構造を有する化合物によって特徴付けられる薬剤を含みうる。い
くつかの態様では、本発明の化合物および/または本発明の組成物は含まれ、本発明の方
法は使用を提供し、および/または本発明の第1の医学的使用は、M008-0111；4112-3656ま
たはZ632-2266の構造、または中央の2-アミノチアゾリンによって、置換ピロリジン、置
換ピペリジン、置換ピペラジン、置換イミダゾリジン、置換ピラゾリジン、置換アリール
、置換5または6員複素環式環、置換5または6員シクロアルキルを伴って、2-アミノ位置で
の置換を含む類似の構造を有する化合物によって特徴付けられる薬剤を含みうる。
【０１６３】
いくらかの態様において、この発明の化合物および/またはこの発明の組成物は含まれ
、および/またはこの発明の方法は使用を提供し、および/またはこの発明の第一の医学的
使用は、式I：
【化１３】
2020183405.tif 000020
式I
の構造によって特徴付けられ、
式中、G1は、置換または非置換ピロリジン、置換または非置換ピペリジン、置換または
非置換ピペラジン、置換または非置換イミダゾリジン、または置換または非置換ピラゾリ
ジンであり；および
G3は以下の構造：
【化１４】
2020183405.tif 000021
によって特徴付けられるか；またはG3は、置換または非置換のアルキル、置換または非置
換のアリールまたは置換または非置換のシクロアルキルであり；
式中、G2は、置換または非置換のアルキル、置換または非置換のアリール、置換または
非置換のシクロアルキルまたは置換または非置換の複素環である、薬剤；または
式II：
【化１５】
2020183405.tif 000022
式II
の構造によって特徴付けられ、
式中、G1は、置換または非置換ピロリジン、置換または非置換ピリジン、置換または非
置換アリール、置換または非置換ピペリジン、置換または非置換ピペラジン、置換または
非置換イミダゾリジン、または置換または非置換ピラゾリジンであり；および
G3は以下の構造：
【化１６】
2020183405.tif 000023
によって特徴付けられるか；またはG3は、置換または非置換のアルキル、置換または非置
換のアリールまたは置換または非置換のシクロアルキルであり；
式中、G2は、置換または非置換のアルキル、置換または非置換のアリール、置換または
非置換のシクロアルキルまたは置換または非置換の複素環である、化合物；または
式III：
【化１７】
2020183405.tif 000024
式III
の構造によって特徴付けられ、
式中、G1は、置換または非置換ピロリジン、置換または非置換ピリジン、置換または非
置換アリール、置換または非置換ピペリジン、置換または非置換ピペラジン、置換または
非置換イミダゾリジン、または置換または非置換ピラゾリジンであり；および
G3は以下の構造：
【化１８】
2020183405.tif 000025
によって特徴付けられ；またはG3は、置換または非置換のアルキル、置換または非置換の
アリールまたは置換または非置換のシクロアルキルであり；
式中、G2は、置換または非置換のアルキル、置換または非置換のアリール、置換または
非置換のシクロアルキルまたは置換または非置換の複素環である、化合物を含みうる。
【０１６４】
いくつかの態様において、本発明は、ここに記載のような式I、II、III、IV、VまたはV
Iの化合物、またはそれを含む組成物を企図し、およびそのものの第一の医学的使用が含
まれ、それによって、式において描かれる環構造は、さらに追加のヘテロ原子、たとえば
、追加の窒素または酸素が組み込まれてもよい。
【０１６５】
基：
【化１９】
2020183405.tif 000026
を参照するとき、アスタリスクは、述べられる基のためのアタッチメント（付着）の点を
示すことが理解される。たとえば、G3が基
【化２０】
2020183405.tif 000027
によって式I、
【化２１】
2020183405.tif 000028
に関して特徴付けられるとき、これは今度は次の構造：
【化２２】
2020183405.tif 000029
によって特徴付けることができる。熟練者は、アスタリスクが、ここに記載のように、式
I-VIによって特徴付けられる化合物のいずれかにおいて適切な対応する構造についての指
示された位置の付着点を同様に指し示す（inidicate）ことを理解するであろう。
【０１６６】
いくつかの実施形態では、G1、G2またはG3に関し、ピロリジン、ピリジン、ピペリジン
、ピペラジン、イミダゾリジン、ピラゾリジンまたは複素環として定義されるが、いくつ
かの実施形態では、指示された原子に対するそのような記述された基のための付着点は、
必要に応じて、窒素またはヘテロ原子を介し、または同じ基の炭素原子を介してよい。
【０１６７】
いくつかの実施形態では、式Iの化合物に関して、G1がピロリジンであるとき、付着の
点はピロリジン基の窒素原子を介しており、およびいくつかの実施形態では、G1がピペラ
ジンであるとき、付着の点はピペラジン基の窒素原子を介し、およびいくつかの実施形態
では、G1がピペリジンであるとき、付着の点はピペラジン基の窒素原子を介する。
【０１６８】
いくつかの実施形態では、式IIの化合物に関して、G1がピペリジンであるとき、付着の
点はピペラジン基の窒素原子を介し、およびいくつかの実施形態では、G1がピペリジンで
あるとき、付着の点はピペリジン基の炭素原子を介し、そこでは、窒素原子が付着の点に
関してオルト位置にある。
【０１６９】
いくらかの実施態様において、この発明は、式VI：
【化２３】
2020183405.tif 000030
式VI
の構造によって特徴付けられ、
式中：
G1は、随意に置換されるNH-ピロリジン、随意に置換されるNH-ピペリジン、随意に置換
されるNH-ピペラジン、随意に置換されるNH-イミダゾリジン、随意に置換されるNH-ピラ
ゾリジン、随意に置換されるNH-アリール、随意に置換されるNH-シクロアルキル、随意に
置換されるピロリジン、随意に置換されるピペリジン（piperidine）、随意に置換される
ピペリディン（piperidin）、随意に置換されるピペラジン、随意に置換されるイミダゾ
リジン、または随意に置換されるピラゾリジンであり；
G2は、随意に置換されるアルキル、随意に置換されるアルケニル、随意に置換されるア
リール、随意に置換されるヘテロアリール、随意に置換されるシクロアルキルまたは随意
に置換される複素環であり；
ここで：
G1が非置換ピロリジンである場合、そのときG2は、アルキル、シクロペンチル、アルキ
ルシクロペンチルまたはフランではなく；または
G1がピペリジンである場合、そのときG2はアルキルではなく；および
G1がピペラジンである場合、そのときG2はアルキルまたはフランではない、
化合物を提供する。
【０１７０】
いくらかの実施態様では、G1はピロリジンであり、およびG2はエチルまたはフランであ
る。いくらかの実施態様では、G1は置換ピペラジンであり、およびG2はフランまたはフェ
ニルであり、およびいくらかの実施態様では、G1はピペリジンであり、およびG2は、シク
ロペンチル、フランまたはフェニルである。いくらかの実施態様では、G1は随意に置換さ
れるイミダゾリジンまたは随意に置換されるピラゾリジンである。
【０１７１】
いくらかの態様において、この発明の化合物および/またはこの発明の組成物は含まれ
、および/またはこの発明の方法は使用を提供し、および/またはこの発明の第一の医学的
使用は、式V：
【化２４】
2020183405.tif 000031
式V
の構造によって特徴付けられ、
式中、XはNまたはSであり；
G1は、置換または非置換ピロリジン、置換または非置換ピリジン、置換または非置換ア
リール、置換または非置換ピペリジン、置換または非置換ピペラジン、置換または非置換
イミダゾリジン、または置換または非置換ピラゾリジンであり；
G3は
【化２５】
2020183405.tif 000032
であるか；またはG3は、置換または非置換のアルキル、置換または非置換のアリールまた
は置換または非置換のシクロアルキルであり、それはXがNである場合であり；
G3はなく、それはXがSである場合であり；
G4またはG5は各々、無関係に、
【化２６】
2020183405.tif 000033
；置換または非置換のアルキル、置換または非置換のアルコキシ、アシル、置換または非
置換のアリールまたは置換または非置換のシクロアルキルであり、それはXがSである場合
であり；
G4またはG5は各々無関係にH、OH、ハロゲンであり、それはXがNである場合であり；お
よび
G2は、置換または非置換のアルキル、アルコキシ、アシル、置換または非置換のアリー
ル、置換または非置換のシクロアルキルまたは置換または非置換の複素環である、薬剤を
含みうる。
【０１７２】
いくらかの実施態様において、この発明は、式VI：
【化２７】
2020183405.tif 000034
式VI
の構造によって特徴付けられ、
式中：
G1は、随意に置換されるNH-ピロリジン、随意に置換されるNH-ピペリジン、随意に置換
されるNH-ピペラジン、随意に置換されるNH-イミダゾリジン、随意に置換されるNH-ピラ
ゾリジン、随意に置換されるNH-アリール、随意に置換されるNH-シクロアルキル、随意に
置換されるピロリジン、随意に置換されるピペリジン、随意に置換されるピペリディン、
随意に置換されるピペラジン、随意に置換されるイミダゾリジン、または随意に置換され
るピラゾリジンであり；
G2は、随意に置換されるアルキル、随意に置換されるアリール、随意に置換されるシク
ロアルキルまたは随意に置換される複素環であり；
ここで：
G1が非置換ピロリジンである場合、そのときG2は、アルキル、シクロペンチル、アルキ
ルシクロペンチルまたはフランではなく；または
G1がピペリジンである場合、そのときG2はアルキルではなく；および
G1がピペラジンである場合、そのときG2はアルキルまたはフランではない、
化合物を提供する。
【０１７３】
いくらかの態様では、G1はピロリジンであり、およびG2はエチルまたはフランである。
いくらかの態様では、G1は置換ピペラジンであり、およびG2はフランまたはフェニルであ
り、いくらかの態様では、G1はピペリジンであり、およびG2は、シクロペンチル、フラン
またはフェニルである。いくらかの態様では、G1は随意に置換されるイミダゾリジンまた
は随意に置換されるピラゾリジンである。
【０１７４】
いくらかの実施態様では、G1は、随意に置換されるNH-ピロリジン、随意に置換されるN
H-ピペリジン、随意に置換されるNH-ピペラジン、およびG2は随意に置換されるアルキル
であり；またはいくらかの実施態様では、G1は、随意に置換されるNH-ピロリジン、随意
に置換されるNH-ピペリジン、随意に置換されるNH-ピペラジン、およびG2は随意に置換さ
れるアルケニルであり；またはいくらかの実施態様では、G1は、随意に置換されるNH-ピ
ロリジン、随意に置換されるNH-ピペリジン、随意に置換されるNH-ピペラジン、およびG2
は随意に置換されるアリールであり；またはいくらかの実施態様では、G1は、随意に置換
されるNH-ピロリジン、随意に置換されるNH-ピペリジン、随意に置換されるNH-ピペラジ
ン、およびG2は随意に置換されるヘテロアリールであり；またはいくらかの実施態様では
、G2は随意に置換されるシクロアルキルであり；またはいくらかの実施態様では、G1は、
随意に置換されるNH-ピロリジン、随意に置換されるNH-ピペリジン、随意に置換されるNH
-ピペラジン、およびG2は随意に置換される複素環である。
【０１７５】
いくらかの実施態様では、G1は、随意に置換されるNH-イミダゾリジンまたは随意に置
換されるNH-ピラゾリジンであり、およびG2は随意に置換されるアルキルであり；または
いくらかの実施態様では、G1は、随意に置換されるNH-イミダゾリジンまたは随意に置換
されるNH-ピラゾリジンであり、およびG2は随意に置換されるアルキルであり；またはい
くらかの実施態様では、G1は、NH-イミダゾリジンまたは随意に置換されるNH-ピラゾリジ
ンであり、およびG2は随意に置換されるアリールであり；またはいくらかの実施態様では
、G1は、NH-イミダゾリジンまたは随意に置換されるNH-ピラゾリジンであり、およびG2は
随意に置換されるヘテロアリールであり；またはいくらかの実施態様では、G2は随意に置
換されるシクロアルキルであり；またはいくらかの実施態様では、G1は、NH-イミダゾリ
ジンまたは随意に置換されるNH-ピラゾリジンであり、およびG2は随意に置換される複素
環である。
【０１７６】
いくらかの実施態様では、G1は、随意に置換されるNH-アリール、随意に置換されるNH-
シクロアルキルであり、およびG2は随意に置換されるアルキルであり；またはいくらかの
実施態様では、G1は、随意に置換されるNH-アリール、随意に置換されるNH-シクロアルキ
ルであり、およびG2は随意に置換されるアルケニルであり；またはいくらかの実施態様で
は、G1は、随意に置換されるNH-アリール、随意に置換されるNH-シクロアルキルであり、
およびG2は随意に置換されるアリールであり；またはいくらかの実施態様では、G1は、随
意に置換されるNH-アリール、随意に置換されるNH-シクロアルキルであり、およびG2は随
意に置換されるヘテロアリールであり；またはいくらかの実施態様では、G2は随意に置換
されるシクロアルキルであり；またはいくらかの実施態様では、G1は、随意に置換される
NH-アリール、随意に置換されるNH-シクロアルキルであり、およびG2は随意に置換される
複素環である。
【０１７７】
いくらかの実施態様では、G1は、随意に置換されるピロリジン、随意に置換されるピペ
リジン、随意に置換されるピペリディンであり、およびG2は随意に置換されるアルキルで
あり；またはいくらかの実施態様では、G1は、随意に置換されるピロリジン、随意に置換
されるピペリジン（piperidine）、随意に置換されるピペリディンであり、およびG2は随
意に置換されるアルケニルであり；またはいくらかの実施態様では、G1は、随意に置換さ
れるピロリジン、随意に置換されるピペリジン、随意に置換されるピペリディンであり、
およびG2は随意に置換されるアリールであり；またはいくらかの実施態様では、G1は、随
意に置換されるピロリジン、随意に置換されるピペリジン、随意に置換されるピペリディ
ンであり、およびG2は随意に置換されるヘテロアリールであり；またはいくらかの実施態
様では、G2は随意に置換されるシクロアルキルであり；またはいくらかの実施態様では、
G1は、随意に置換されるピロリジン、随意に置換されるピペリジン、随意に置換されるピ
ペリディンであり、およびG2は随意に置換される複素環である。
【０１７８】
いくらかの実施態様では、G1は、随意に置換されるピペラジン、随意に置換されるイミ
ダゾリジン、または随意に置換されるピラゾリジンであり、およびG2は随意に置換される
アルキルであり；またはいくらかの実施態様では、G1は、随意に置換されるピロリジン、
随意に置換されるピペリジン、随意に置換されるピペリディンであり、およびG2は随意に
置換されるアルケニルであり；またはいくらかの実施態様では、G1は、随意に置換される
ピペラジン、随意に置換されるイミダゾリジン、または随意に置換されるピラゾリジンで
あり、およびG2は随意に置換されるアリールであり；またはいくらかの実施態様では、G1
は、随意に置換されるピペラジン、随意に置換されるイミダゾリジン、または随意に置換
されるピラゾリジンであり、およびG2は随意に置換されるヘテロアリールであり；または
いくらかの実施態様では、G2は随意に置換されるシクロアルキルであり；またはいくらか
の実施態様では、G1は、随意に置換されるピペラジン、随意に置換されるイミダゾリジン
、または随意に置換されるピラゾリジンであり、およびG2は随意に置換される複素環であ
る。
【０１７９】
いくらかの実施態様では、この発明は、式VII：
【化２８】
2020183405.tif 000035
式VII
の構造によって特徴付けられ、
式中：
G1は、随意に置換されるNH-ピロリジン、随意に置換されるNH-ピペリジン、随意に置換
されるNH-ピペラジン、随意に置換されるNH-イミダゾリジン、随意に置換されるNH-ピラ
ゾリジン、随意に置換されるNH-ピリジン、随意に置換されるNH-アリール、随意に置換さ
れるNH-シクロアルキル、随意に置換されるピロリジン、随意に置換されるピペリジン、
随意に置換されるピペリジン、随意に置換されるピペラジン、随意に置換されるイミダゾ
リジン、随意に置換されるピラゾリジンまたは随意に置換されるアリールであり；
G2は、
【化２９】
2020183405.tif 000036
または随意に置換されるアルキル、随意に置換されるアリールまたは随意に置換されるシ
クロアルキルであり；および
G4は、随意に置換されるピロリジン、随意に置換されるピペリジン、随意に置換される
ピペラジン、随意に置換されるイミダゾリジンまたは随意に置換されるピラゾリジンであ
り；
ここで：
G1がピペリジンである場合、そのときG4はピロリジンではなく、またはG2は随意に置換
されるアリールではなく；または
G1がイミダゾリジンである場合、そのときG2は随意に置換されるアリールではなく；ま
たは
G1が随意に置換されるNH-ピリジンである場合、そのときG2は随意に置換されるアリー
ルではなく；または
G1が随意に置換されるNH-アリールである場合、そのときG2は随意に置換されるアリー
ルではなく；または
G1が随意に置換されるピリジンである場合、そのときG2は随意に置換されるアリールで
はない、
化合物を提供する。
【０１８０】
いくらかの実施態様では、この態様に従い、G1は随意に置換されるNH-ピリジンであり
、G2は、
【化３０】
2020183405.tif 000037
であり、式中、G4はピロリジンであり、またはG2はハロアリールであり、およびいくらか
の実施態様では、この態様に従う。
【０１８１】
G1は随意に置換されるNH-アリールであり、およびG2は、
【化３１】
2020183405.tif 000038
であり、式中、G4はピロリジンである。
【０１８２】
いくらかの態様では、アルキル、アルケニル、ピロリジン、ピペリジン、ピペラジン、
イミダゾリジンピラゾリジン、アリール、ヘテロアリール、複素環式環、またはシクロア
ルキル基に関する用語「置換」への言及は、ハロゲン、ヒドロキシル、C1-C6直鎖または
分枝鎖アルキル、ニトロ、CN、ニトリルアミド、アミドスルフィド、アミノ、アルデヒド
、置換ケトン、-COOH、エステル、トリフルオロメチル、アミド、アルコキシまたはハロ
アルキル基またはそれらの任意のサブコンビネーションが含まれてよい。
【０１８３】
いくつかの態様では、アルキル、アルケニル、ピロリジン、ピペリジン、ピペラジン、
イミダゾリジンピラゾリジン、アリール、ヘテロアリール、複素環式環、またはシクロア
ルキル基に関する用語「置換」への言及は、ハロゲン、ヒドロキシル、C1-C6直鎖または
分枝鎖アルキル、ニトロ、CN、ニトリルアミド、アミドスルフィド、アミノ、アルデヒド
、またはそれらの任意のサブコンビネーションが、またはいくらかの実施態様では、置換
ケトン、-COOH、エステル、トリフルオロメチル、アミド、アルコキシまたはハロアルキ
ル基またはそれらの任意のサブコンビネーションが、またはいくらかの実施態様では、ハ
ロゲン、ヒドロキシル、C1-C6直鎖または分枝鎖アルキル、またはそれらの任意のサブコ
ンビネーションが、またはいくらかの実施態様では、ニトロ、CN、ニトリルアミド、アミ
ドスルフィド、アミノ、アルデヒド、またはそれらの任意のサブコンビネーションが含ま
れてよい。
【０１８４】
いくらかの態様では、用語「アルキル」は、直鎖または分枝鎖C1-C6アルキルを含むと
理解されるべきである。いくらかの態様では、「シクロアルキル」という用語は、3-、4-
、5-または6-員の不飽和環を含むと理解されるべきである。
【０１８５】
いくらかの態様では、用語「アルキル」は、線状、分枝状、または環状炭化水素構造お
よびそれらの組合せを含むことを意図する。アルキル基の例には、メチル、エチル、プロ
ピル、イソプロピル、ブチル、s-およびt-ブチルおよびその他同種類のものなどが含まれ
る。いくらかの実施態様では、アルキル基はC20以下のものである。いくらかの実施態様
では、アルキル基はC7以下のものである。いくらかの実施態様では、アルキル基はC6以下
のものである。シクロアルキルは、アルキルのサブセットであり、および3から13個まで
の炭素原子の環状炭化水素基を含む。シクロアルキル基の例には、c-プロピル、c-ブチル
、c-ペンチル、ノルボルニル、アダマンチルおよびその他同種類のものなどが含まれる。
この出願では、アルキルは、アルカニル、アルケニルおよびアルキニル残基に言及する。
シクロヘキシルメチル、ビニル、アリル、イソプレニルおよびその他同種類のものなどを
含むことも意図する。アルキレンはアルキルの別のサブセットであり、アルキルと同じ残
基に言及するが、2つの付着の点を有する。アルキレンの例には、エチレン（-CH2CH2-）
、プロピレン（-CH2CH2CH2-）、ジメチルプロピレン（-CH2C（CH3）2CH2-）およびシクロ
ヘキシルプロピレン（-CH2CH2CH（C6H13）-）が含まれる。特定の数の炭素を有するアル
キル残基が指定されるとき、その炭素数を有するすべての幾何異性体が包含されることを
意図され；したがって、たとえば、「ブチル」は、n-ブチル、sec-ブチル、イソブチルお
よびt-ブチルを含むことを意味し；「プロピル」には、n-プロピルおよびイソプロピルが
含まれる。
【０１８６】
ここでの用語「アルコキシ」または「アルコキシル」は、基-O-アルキル、好ましくは
、酸素を通して親構造に付着する直鎖、分枝鎖、環状立体配置およびそれらの組合せの1
から8個までの炭素原子を含めて言及しうる。例には、メトキシ、エトキシ、プロポキシ
、イソプロポキシ、シクロプロピルオキシ、シクロヘキシルオキシおよびその他同種類の
ものなどが含まれる。
【０１８７】
「置換アルコキシ」という用語は、ここにおいて基-O-（置換アルキル）に言及するこ
とができる。
【０１８８】
「アシル」という用語は、ここでは、カルボニル官能基を通して親構造に付着する直鎖
、分枝鎖、環状立体配置、飽和、不飽和および芳香族およびそれらの組合せの1から10個
までの炭素原子の基に言及しうる。親への付着の点がカルボニルに残っている限り、アシ
ル残基中の1以上の炭素は窒素、酸素または硫黄で置き換えられていてもよい。例には、
アセチル、ベンゾイル、プロピオニル、イソブチリル、t-ブトキシカルボニル、ベンジル
オキシカルボニルおよびその他同種類のものなどが含まれる。
【０１８９】
用語「アリール」は、ここでは、5-または6-員芳香環、二環式9-または10-員芳香族環
系、または三環式12-ないし14-員芳香族環系に言及しうる。例には、シクロペンタ-1,3-
ジエン、フェニル、ナフチル、インダン、テトラリン、フルオレン、シクロペンタ[b]ナ
フタレンおよびアントラセンが含まれる。
【０１９０】
「ヘテロ環」または「ヘテロシクリル」という用語は、ここでは、1ないし4個の炭素が
、たとえば、酸素、窒素または硫黄のようなヘテロ原子によって置換されるシクロアルキ
ル残基に言及しうる。1-4個（またはそれよりも多く）のヘテロ原子を含む4-、5-、6-ま
たは7-員の非芳香族環、1-4個（またはそれよりも多く）のヘテロ原子を含む二環式8-、9
-または10-員の非芳香族環系、または1-4個（またはそれよりも多く）のヘテロ原子を含
む三環式11-ないし14-員の非芳香族環系であり；ヘテロ原子は、O、NまたはSから選ばれ
る。例には、ピロリジン、テトラヒドロフラン、テトラヒドロ-チオフェン、チアゾリジ
ン、ピペリジン、テトラヒドロ-ピラン、テトラヒドロ-チオピラン、ピペラジン、モルホ
リン、チオモルホリンおよびジオキサンが含まれる。
【０１９１】
「ヘテロ環」または「ヘテロシクリル」という用語は、ここでは、不飽和の数および配
置が基を芳香族にしないという条件で、不飽和結合を含む環系に言及しうる。例には、イ
ミダゾリン、オキサゾリン、テトラヒドロイソキノリン、ベンゾジオキサン、ベンゾジオ
キソールおよび3,5-ジヒドロベンゾオキサジニルが含まれる。置換ヘテロシクリルの例に
は、4-メチル-1-ピペラジニルおよび4-ベンジル-1-ピペリジニルが含まれる。
【０１９２】
いくつかの態様における用語「アリールアルキル」は、アリールおよびアルキル基の両
方に関してここに提供される規定を提供すると理解され、および同様に、任意の組み合わ
せられた官能基の用語は、各基の説明を無関係に包含すると、同じように理解される。
【０１９３】
「随意の」または「随意に」という用語は、後に記載される事象または状況が起こって
も起こらなくてもよいことを意味し、および本記載は、前記事象または状況が起こる場合
および起こらない場合の例を含む。
【０１９４】
たとえば、「随意に置換されるアルキル」は、以下に規定するように、「アルキル」ま
たは「置換アルキル」のいずれをも意味する。そのような基は、任意の置換または置換パ
ターンを導入することを意図しておらず（例は、置換アルキルは、随意に置換されるシク
ロアルキル基を含み、それは次に、随意に置換されるアルキル基を、潜在的に無限に含み
）、それは立体的に実現困難であり、合成的に実行可能ではなく、および/または本質的
に不安定である。用語「置換または非置換」は、示された基が1以上の置換基を含むか否
かに関して同じ選択を包含するものと理解される。
【０１９５】
「置換され」という用語は、指定された原子上の1個以上の水素が、示された基からの
選定で置き換えられることを意味し、但し、それは現存する状況下での指定された原子の
通常の原子価は超えられず、および置換は安定な化合物をもたらす。置換基および/また
は変数の組合せは、そのような組合せが安定な化合物をもたらす場合にのみ許容される。
「安定な化合物」または「安定な構造」は、反応混合物からの有用な純度までの分離、お
よび有効な治療上の薬剤への調剤に残存するのに十分にローバスト（頑強）な化合物を意
味する。特定の基、ラジカルまたは部分である。用語「随意に置換され」は、特定の基、
ラジカルまたはモイエティ（一部分）による随意の置換を意味する。
【０１９６】
ここでの本文、スキーム、例およびテーブル中の不十分な価数を有する任意の炭素およ
びヘテロ原子は、原子価を満たすのに十分な数の水素原子（群、複数もありうることを示
す）を有すると仮定されることにも留意すべきである。
【０１９７】
ここに記載のように、本発明は、ここに記載のような化合物の任意の異性体または薬学
的に許容可能な塩、N-オキシド、水和物、プロドラッグ、溶媒和物、または誘導体、ここ
に記載のような化合物の任意の異性体または薬学的に許容可能な塩、N-オキシド、溶媒和
物または誘導体を含む組成物、およびここに記載のような化合物の任意の異性体または薬
学的に許容される塩、N-オキシド、溶媒和物、水和物または誘導体を採用する第1の医学
的用途および/または処置の方法を提供する。
【０１９８】
「薬学的に許容可能な塩」という用語は、ここでは、本発明の化合物の生物学的有効性
および性質を保持する塩に言及することができ、およびそれらは、生物学的でないもの、
またはその他の点で望ましくないものではない。多くの場合、本発明の化合物は、アミノ
および/またはカルボキシル基またはそれに類似の基の存在により、酸および/または塩基
の塩を形成することが可能である。薬学的に許容可能な酸付加塩は、無機酸および有機酸
により形成することができる。塩を誘導することができる無機酸には、例えば、塩酸、臭
化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、およびその他同種類のものなどが含まれる。塩を誘導す
ることができる有機酸には、例えば、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、
シュウ酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、
桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、サ
リチル酸、およびその他同種類のものなどが含まれる。
【０１９９】
薬学的に許容可能な塩基付加塩は、無機および有機塩基により形成することができる。
塩を誘導することができる無機塩基には、たとえば、ナトリウム、カリウム、リチウム、
アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、亜鉛、銅、マンガン、アルミニウム、お
よびその他同種類のものなどが含まれ；特に、アンモニウム塩、カリウム塩、ナトリウム
塩、カルシウム塩およびマグネシウム塩が好ましい。塩が誘導され得る有機塩基には、例
えば、第一級、第二級、および第三級アミン、自然に存在する置換アミンを含めて置換ア
ミン、環状アミン、塩基性イオン交換樹脂、およびその他同種類のものなどが含まれ、具
体的には、たとえば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエ
チルアミン、トリプロピルアミン、およびエタノールアミンなどのようなものである。
【０２００】
ここにおける用語「溶媒和物」は、薬学的に許容可能な溶媒の1つ以上の分子と物理的
に会合した化合物に言及しうる。用語「溶媒和物」は、述べられる化合物、その化合物の
薬学的に許容可能な塩、その化合物の溶媒和物、およびその化合物の薬学的に許容可能な
塩の溶媒和物を包含するものと理解される。
【０２０１】
たとえば、「ここに記載のような化合物」または「記載のような使用のための化合物」
などのような句は、式I-VIIの化合物またはその任意の薬学的に許容可能な塩、異性体、N
-オキシド、異性体または溶媒和物を包含すると考えられる。
【０２０２】
本発明の化合物のプロドラッグおよび溶媒和物もまた、ここにおいて企図される。プロ
ドラッグの議論は、T. Higuchi（ヒグチ）およびV. Stella（ステラ）、Pro-drugs as No
vel Delivery Systems（新規デリバリー・システムとしてのプロ-ドラッグ）(1987) 14 o
f the A. C. S. Symposium Series（A. C. S. シンポジウム・シリーズの14）において、
およびBioreversible Carriers in Drug Design（ドラッグ・デザインにおける生物可逆
的担体）、(1987) Edward B. Roche（エドワードBロッシェ）編、American Pharmaceutic
al Association and Pergamon Press（アメリカン・ファーマシューティカル・アソシエ
ーション・アンド・ペルガモン・プレス）において記載される。「プロドラッグ」という
用語は、インビボで変換され、式（I）-（IV）の化合物またはその化合物の薬学的に許容
可能な塩、水和物または溶媒和物を生成する化合物（例は、薬物前駆体）を意味する。変
換は、様々なメカニズム（例は、代謝プロセスまたは化学プロセスにより）、たとえば、
血液における加水分解などのようなものを通して起こり得る。プロドラッグの使用につい
ての議論は、T. HiguchiおよびW. Stella、「Pro-drugs as Novel Delivery Systems」、
Vol. 14 of the A. C. S. Symposium Series （A.C. S.シンポジウムシリーズのVol. 14
）によって、およびBioreversible Carriers in Drug Design、ed.（編者）Edward B. Ro
che、American Pharmaceutical Association and Pergamon Press、1987において提供さ
れる。
【０２０３】
本発明に従って使用することができる例示的なカテプシンCインヒビターには、例は、M
P Biomedicals, USA（MPバイオメディカル、USA）より入手可能なGly-Phe-ジアゾメチル
ケトン（Gly-Phe-DMK）が含まれる。
【０２０４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、任意のバイオインフォマティクス方法は、少な
くとも一つの細胞内CELA3Aまたは構造的に関連する酵素、CELA1、および/またはカテプシ
ンCの特異的インヒビターを設計および合成するために使用することができる（例は、バ
イオインフォマティクス技術、たとえば、Vigyaan、DNALinux仮想デスクトップ（VD）ま
たはBioclipse）。
【０２０５】
上記のように、カテプシンC、CELA3AおよびCELA1の活性または発現をダウンレギュレー
ションすることが可能な別の薬剤は、標的化された様式で発現をサイレンシングするのに
適するポリヌクレオチド剤である。そのような薬剤の例は以下に列挙される。
【０２０６】
細胞内CELA3A、CELA1、および/またはカテプシンCの少なくとも1つのダウンレギュレー
ションは、RNAサイレンシングによって達成することができる。ここで使用する「RNAサイ
レンシング」という語句は、RNA分子によって媒介される調節メカニズムの一群に言及さ
れる［例は、RNA干渉（RNAi）、転写遺伝子サイレンシング（TGS）、転写後遺伝子サイレ
ンシング（PTGS）、クウェリング（quelling）、共抑制、および翻訳抑制］で、それらは
対応するタンパク質コード遺伝子の発現の抑制すなわち「サイレンシング」をもたらす。
RNAサイレンシングは、植物、動物および真菌を含む多くのタイプの有機体において観察
された。
【０２０７】
ここで使用されるように、用語「RNAサイレンシング剤」は、標的遺伝子の発現を特異
的に抑制または「サイレンシング」することが可能なRNAに言及する。一定の実施形態で
は、RNAサイレンシング剤は、転写後サイレンシングメカニズムを通してmRNA分子の十分
なプロセシング（例は、十分な翻訳および/または発現）を防止することが可能である。R
NAサイレンシング剤には、非コードRNA分子、たとえば、対形成したストランド（鎖）を
含むRNA二重鎖、ならびにそのような小さな非コードRNAがそこから生成され得る前駆体RN
Aが含まれる。例示的なRNAサイレンシング剤には、dsRNAs、たとえば、siRNAs、miRNAsお
よびshRNAsのようなものなどが含まれる。一実施形態では、RNAサイレンシング剤はRNA干
渉を誘導することが可能である。別の実施形態では、RNAサイレンシング剤は翻訳抑止を
媒介することが可能である。
【０２０８】
本発明の一実施形態によれば、RNAサイレンシング剤は標的RNA（例は、カテプシンC、C
ELA3AおよびCELA1）に特異的であり、および99％以下の標的遺伝子に対するグローバルホ
モロジー、例は、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％
、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％より少ない標的遺伝子に対するグローバル
ホモロジーを見せる遺伝子またはスプライス変異体を交差抑制またはサイレンシングしな
い。
【０２０９】
RNA干渉は、短い干渉RNA（siRNA）によって媒介される動物における配列特異的転写後
遺伝子サイレンシングのプロセスに言及される。植物における対応するプロセスは、普通
に、転写後遺伝子サイレンシングまたはRNAサイレンシングとして言及され、および真菌
におけるクウェリングとしても言及される。転写後遺伝子サイレンシングのプロセスは、
進化的に保存された外来遺伝子の発現を防止するために用いられる細胞防御機構であると
考えられており、および普通は多様な動植物（flora and phyla）によって共有される。
そのような外来遺伝子発現からの保護は、ウイルス感染から、または相同一本鎖RNAまた
はウイルスゲノムRNAを特異的に破壊する細胞応答を介した宿主ゲノムへのトランスポゾ
ンエレメントのランダム組込みから由来する二本鎖RNA（dsRNA）の産生に応じて進化した
かもしれない。
【０２１０】
細胞において長いdsRNAsの存在は、ダイサーと称されるリボヌクレアーゼIII酵素の活
性を刺激する。ダイサーはdsRNAを短い干渉RNAs（siRNAs）として知られるdsRNAの短いピ
ースに加工することに関与する。ダイサー活性から由来する短い干渉RNAsは、典型的には
、長さが約21ないし約23のヌクレオチドであり、および約19塩基対の二本鎖を含む。RNAi
応答はまた、エンドヌクレアーゼ複合体を特徴とし、一般にRNA誘発サイレンシング複合
体（RISC）とも呼ばれ、それはiRNA二本鎖のアンチセンス鎖に相補的な配列を有する一本
鎖RNAの切断を媒介する。標的RNAの切断は、siRNA二本鎖のアンチセンス鎖に相補的な領
域の中央で起こる。
【０２１１】
したがって、本発明のいくつかの実施形態は、mRNAからのタンパク質発現をダウンレギ
ュレートするためにdsRNAの使用を企図する。
【０２１２】
一実施形態によれば、dsRNAは30bpより大きい。長いdsRNAs（すなわち、30bpより大き
いdsRNA）の使用は、二本鎖RNAのこれらのより一層長い領域がインターフェロンおよびPK
R応答の誘導をもたらすであろうという考えのために、きわめて制限される。しかしなが
ら、長いdsRNAsの使用は、細胞が膨大な数のsiRNAsを試験する必要性を緩和する最適なサ
イレンシング配列を選定することができるという点で多くの利点を提供することができ；
長いdsRNAsは、サイレンシングライブラリーがsiRNAsに必要とされるよりも少ない複雑さ
を有することを可能にし；およびおそらく最も重要なことに、長いdsRNAは、治療薬とし
て使用するとき、ウイルスエスケープ変異を防止することができた。
【０２１３】
種々の研究は、長いdsRNAsが、ストレス応答を誘導することなく、または有意なオフタ
ーゲット効果を引き起こさずに、遺伝子発現をサイレンシングするために使用され得るこ
とを実証する‐たとえば、以下参照［Strat（ストラット）ら、Nucleic Acids Research
（ヌクレイック・アシッヅ・リサーチ）、2006、第34巻、第13号、3803-3810；Bhargava
（バールガバ）Aら、Brain Res. Protoc.（ブレイン・リサーチ・プロトコルズ）2004、1
3：115-125；Diallo（ディアロ）M.ら、Oligonucleotides（オリゴヌクレオチズ）、2003
；13：381-392；Paddison（パディソン）P. J.ら、Proc. Natl Acad. Sci. USA.（プロシ
ーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・
ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ）、2002；99：1443-1448；Tran（チャン）N.
ら、FEBS Lett.（FEBSレターズ）、2004；573：127-134]。
【０２１４】
特に、いくつかの実施形態による本発明は、インターフェロン経路が活性化されていな
い細胞（例は、胚細胞および卵母細胞）における遺伝子サイレンシングのための長いdsRN
A（30塩基を超える転写物）の導入を企図し、例は、Billy（ビリー）ら、PNAS 2001、Vol
98、第14428-14433頁。およびDialloら、Oligonucleotides、2003年10月1日、13（5）：
381-392。doi：10.1089/154545703322617069参照。
【０２１５】
いくつかの実施形態による本発明はまた、遺伝子発現を下方制御するためのインターフ
ェロンおよびPKR経路を誘導しないように特異的に設計された長いdsRNAの導入を企図する
。例えば、Shinagwa（シナガワ）およびIshii（イシイ）[Genes＆Dev.（ジーンズ・アン
ド・デベロップメント）17（11）：1340-1345、2003]は、RNAポリメラーゼII（Pol II）
プロモーターから長い二本鎖RNAを発現させるために、pDECAPと名付けられたベクターを
開発した。pDECAP由来の転写物は、細胞質へのds-RNAの輸送を促進する5'-キャップ構造
および3'-ポリ（A）テールの両方を欠くので、pDECAP由来の長いds-RNAはインターフェロ
ン応答を誘導しない。
【０２１６】
哺乳動物系におけるインターフェロンおよびPKR経路を回避する別の方法は、トランス
フェクションまたは内因性発現のいずれかを介して小抑制（small inhibitory）RNA（siR
NA）を導入することによる。
【０２１７】
「siRNA」という用語は、RNA干渉（RNAi）経路を誘導する小抑制RNA二本鎖（概して18-
30塩基対の間）に言及する。典型的には、siRNAsは、中央の19bpの二本鎖領域および対称
な2塩基3'-オーバーハングを終端上で有する21mers（21マー）として化学的に合成される
が、25-30塩基長の化学的に合成されたRNA二本鎖が同じロケーションでの21mersと比較し
て100倍ほどの効力での増加をもつことができることが最近説明された。RNAiを誘発する
際により一層長いRNAを用いて得られる観察され増加した効力は、生成物（21mer）の代わ
りに基質（27mer）をダイサーに与えることから理論化され、およびこれはRISCへのsiRNA
二本鎖の侵入速度または効率を改善する。
【０２１８】
3'-オーバーハングの位置がsiRNAの効力に影響を及ぼし、およびアンチセンス鎖での3'
-オーバーハングを有する非対称二重鎖は概して、センス鎖での3'-オーバーハングを有す
るものよりも強力であることが見出された（Rose（ローズ）ら、2005）。このことは、ア
ンチセンス転写産物を標的とするときに反対の有効性パターンが観察されるため、RISCへ
の非対称鎖負荷に起因する可能性がある。
【０２１９】
二本鎖干渉RNA（例は、siRNA）の鎖は、ヘアピンまたはステムループ構造（例は、shRN
A）を形成するように連結され得る。したがって、述べられたように、本発明のいくつか
の実施形態のRNAサイレンシング剤は、ショートヘアピンRNA（shRNA）であってもよい。
【０２２０】
ここで使用される「shRNA」という用語は、ステム-ループ構造を有するRNA剤に言及さ
れ、それには、相補的配列の第1および第2の領域が含まれ、本領域の相補性および配向の
程度は、塩基対形成がこれらの領域の間で起こるように十分であり、第1および第2の領域
はループ領域によって結合され、本ループは、ループ領域内のヌクレオチド（またはヌク
レオチド類似体）の間の塩基対形成の欠如に起因する。ループでのヌクレオチドの数は、
3ないし23、または5ないし15、または7ないし13、または4ないし9、または9ないし11の間
またはそれらを含む数である。ループでのヌクレオチドのいくつかは、ループでの他のヌ
クレオチドとの対の相互作用である。ループを形成するために使用することができるオリ
ゴヌクレオチド配列の例には、5'-UUCAAGAGA-3'（Brummelkamp（ブランメルカンプ）TRら
、（2002）Science（サイエンス）296：550）および5'-UUUGUGUAG-3'（Castanotto（カス
タノト）D.ら、（2002）RNA 8：1454）。得られる一本鎖オリゴヌクレオチドが、RNAi機
構と相互作用することが可能な二本鎖領域を含むステム-ループまたはヘアピン構造を形
成することは、この技術での熟練者によって認識されるであろう。
【０２２１】
本発明のいくつかの実施形態による使用に適するRNAサイレンシング剤の合成は、以下
のようにして行うことができる。最初に、カテプシンC、CELA3AおよびCELA1 mRNA配列を
、AAジヌクレオチド配列のAUG開始コドンの下流でスキャンする。潜在的siRNA標的部位と
して各AAおよび3 '隣接19ヌクレオチドの発生が記録される。好ましくは、非翻訳領域（U
TRs）は調節タンパク質結合部位が豊富であるため、siRNA標的部位はオープンリーディン
グフレームから選定される。UTR結合タンパク質および/または翻訳開始複合体は、siRNA
エンドヌクレアーゼ複合体の結合を妨害し得る[Tuschl（ツシュラ）、ChemBiochem.（ケ
ムバイオケム）2：239-245]。しかし、5'UTRに向けられたsiRNAが細胞GAPDH mRNA、およ
び十分に破壊されたタンパク質レベルにおいて約90％の減少を媒介するGAPDHについて実
証されるように、非翻訳領域を指向するsiRNAもまた有効であり得ることが理解されるで
あろう（www.ambion.com/ techlib/tn/91/912.html）。
【０２２２】
第2に、任意の配列アラインメントソフトウェア、たとえば、NCBIサーバ（www.ncbi.nl
m.nih.gov/BLAST/）から入手可能なBLASTソフトウェアなどのようなものを使用して、潜
在的な標的部位を適切なゲノムデータベース（例は、ヒト、マウス、ラット、など）と比
較する。他のコード配列と有意な相同性を示す推定標的部位は除外される。
【０２２３】
適格（Qualifying）標的配列は、siRNA合成のための鋳型として選定される。好ましい
配列は、低いG/C含量を含むものであり、それは、55％より高いG/C含量を有するものと比
較して、遺伝子サイレンシングを媒介する上でより有効であることが証明されているから
である。いくつかの標的部位は、好ましくは、評価のために標的遺伝子の長さに沿って選
定される。選定されたsiRNAのより一層良好な評価のために、ネガティブコントロール（
陰性対照とも言う）を併用することが好ましい。ナガティブコントロールsiRNAは、好ま
しくはsiRNAと同じヌクレオチド組成を含むが、ゲノムとの有意な相同性を欠く。したが
って、siRNAのスクランブルされたヌクレオチド配列は、他の遺伝子と何らかの有意な相
同性を示さない限り、使用されるのが好ましい。
【０２２４】
たとえば、カテプシンCのための適切なsiRNA分子は、配列番号1に記載のような核酸配
列を含むことができる。
【０２２５】
カテプシンCサイレンシングのための模範的なsiRNA分子、miRNA分子またはshRNA分子は
、例は、Sigma-Aldrich、QIAGENまたはOriGeneから商業上購入することができる。
【０２２６】
たとえば、CELA1に適するsiRNA分子は、配列番号2に記載されるような核酸配列を含む
ことができる。
【０２２７】
CELA1サイレンシングのための模範的なsiRNA分子、miRNA分子またはshRNA分子は、例は
、Sigma-Aldrich、QIAGENまたはOriGeneから商業上購入することができる。
【０２２８】
たとえば、CELA3Aに適するsiRNA分子は、配列番号3に記載のような核酸配列を含むこと
ができる。
【０２２９】
CELA3Aサイレンシングのための模範的なsiRNA分子、miRNA分子またはshRNA分子は、例
は、Sigma-Aldrich、QIAGENまたはOriGeneから商業上購入することができる。
【０２３０】
本発明はさらに、配列番号1と少なくとも95％から99％までの同一性を共有するか、ま
たは配列番号1に記載されるような核酸配列を含む分離されたポリヌクレオチドを提供す
る。
【０２３１】
本発明はさらに、配列番号2と少なくとも95％から99％までの同一性を共有するか、ま
たは配列番号2に記載されるような核酸配列を含む分離されたポリヌクレオチドを提供す
る。
【０２３２】
本発明はさらに、配列番号3と少なくとも95％から99％までの同一性を共有するか、ま
たは配列番号3に示される核酸配列を含む分離されたポリヌクレオチドを提供する。
【０２３３】
本発明のいくつかの実施形態のRNAサイレンシング剤は、RNAのみを含むそれらの分子に
制限される必要はないが、しかし、化学的に修飾されたヌクレオチドおよび非ヌクレオチ
ドをさらに包含することが理解されよう。
【０２３４】
RNAサイレンシング剤を用いて標的とされるmRNAsには、制限されないが、それらの発現
が望ましくない表現型形質と相関するものが含まれる。標的化され得る模範的なmRNAsは
、切断タンパク質をコードするmRNA、すなわち欠失を含むものである。したがって、本発
明のいくつかの実施形態のRNAサイレンシング剤は、欠失のいずれかの側の架橋領域を標
的とすることができる。そのようなRNAサイレンシング剤の細胞への導入は、突然変異し
ていないタンパク質を影響を受けずに、突然変異したタンパク質のダウンレギュレーショ
ンを引き起こす。
【０２３５】
別の実施形態によれば、RNAサイレンシング剤はmiRNAであってもよい。
【０２３６】
用語「マイクロRNA」、「miRNA」、および「miR」は同義語であり、および約19-28ヌク
レオチド長の非コード一本鎖RNA分子のコレクションに言及し、それらは遺伝子発現を調
節する。miRNAsは広範囲の有機体（ウイルス、ヒト）に見出され、および発達、恒常性、
および病気の原因において役割を演ずることが示された。
【０２３７】
miRNAおよびmiRNA*の任意の対の5'および3'端において可変性が存在し得ることに注目
すべきである。この変動性は、切断部位に関してドローシャ（Drosha）およびダイサー（
Dicer）の酵素処理における変動性に起因し得る。miRNAおよびmiRNA*の5'および3'端での
可変性はまた、pri-miRNAおよびpre-miRNAのステム構造におけるミスマッチに起因し得る
。ステム鎖（幹鎖とも言う）のミスマッチは、異なるヘアピン構造の集団をもたらす可能
性がある。ステム構造における変動はまた、ドローシャおよびダイサーによる開裂の生成
物において変動をもたらし得る。
【０２３８】
カテプシンC、CELA3AおよびCELA1をダウンレギュレーションすることが可能な別の薬剤
は、カテプシンC、CELA3AおよびCELA1のmRNA転写物またはDNA配列を特異的に開裂するこ
とが可能なDNAザイム（DNAzyme）分子である。DNAザイムは、一本鎖および二本鎖標的配
列の両方を開裂することが可能な一本鎖ポリヌクレオチドである（Breaker（ブレーカー
）R. R.およびJoyce（ジョイス）G.のChemistry and Biology（ケミストリー・アンド・
バイオロジー）1995；2：655；Santoro（サントロ）S. W. ＆ Joyce、G. F. Proc. Natl,
Acad. Sci. USA、1997；943：4262。DNAザイムのための一般的なモデル（「10-23」モデ
ル）が提案された。「10-23」DNAザイムは15のデオキシリボヌクレオチドの触媒ドメイン
を有し、7ないし9のデオキシリボヌクレオチドのそれぞれの基質認識ドメインの2つに隣
接する。このタイプのDNAザイムは、プリン：ピリミジンジャンクション（接合部とも言
う）でその基質RNAを効果的に開裂することができる（Santoro, S. W. ＆ Joyce, G. F.
、Proc. Natl, Acad. Sci. USA 199；DNAザイムのrevについてはKhachigian（ハチギアン
）LM[Curr Opin Mol Ther（カレント・オピニオン・イン・モレキュラー・セラピューテ
ィクス）4：119-21（2002）]。
【０２３９】
一本鎖および二本鎖の標的開裂部位を認識する合成の、操作されたDNAザイムの構築お
よび増幅の例は、Joyceらへの米国特許第6,326,174号に開示された。ヒトウロキナーゼレ
セプターに対する類似のデザインのDNAザイムは、ウロキナーゼレセプター発現を抑制し
、およびインビボで大腸ガン細胞転移を首尾よく抑制することが最近観察された（Itoh（
イトウ）ら、2002、Abstract（アブストラクト）409、Ann Meeting Am Soc Gen Ther www
dotasgtdotorg）。別の適用において、bcr-ab1ガン遺伝子に相補的なDNAザイムは、白血
病細胞におけるガン遺伝子発現の抑制に成功し、およびCMLおよびALLの場合での自己骨髄
移植における再発率の低下を成功させた。
【０２４０】
カテプシンC、CELA3aおよびCELA1のダウンレギュレーションはまた、カテプシンC、CEL
A3AおよびCELA1をコードするmRNA転写物と特異的にハイブリダイズすることが可能なアン
チセンスポリヌクレオチドを用いることによって行うことができる。
【０２４１】
細胞内CELA3A、CELA1、および/またはカテプシンCの少なくとも1つを効率的にダウンレ
ギュレートするために用いることができるアンチセンス分子の設計は、アンチセンスアプ
ローチにとって重要な2つの態様を考慮しつつ行われなければならない。第1の態様は、適
切な細胞の細胞質へのオリゴヌクレオチドの配送であり、その一方で、第2の態様は、そ
の翻訳を抑制するように細胞内の指定されたmRNAに特異的に結合するオリゴヌクレオチド
の設計である。
【０２４２】
先行技術は、オリゴヌクレオチドを多種多様な細胞型に効率的に配送するために使用さ
れ得る多数の配送戦略を教示する[例えば、Luft（ルフト）J Mol Med（ジャーナル・オブ
・モレキュラー・メディシン）76：75-6（1998）；Kronenwett（クローネンウエット）ら
、Blood（ブラッド）91：852-62（1998）；Rajur（ラジュル）らBioconjug Chem（バイオ
コンジュゲート・ケミストリー）8：935-40（1997）；Lavigne（ラヴィーン）ら、Bioche
m Biophys Res Commun（バイオケミカル・アンド・バイフィジカル・リサーチ・コミュニ
ケーションズ）237：566-71（1997）およびAoki（アオキ）ら（1997）Biochem Biophys R
es Commun 231：540-5（1997）参照]。
【０２４３】
さらに、それらの配列を、標的mRNAおよびオリゴヌクレオチドの両方での構造変化のエ
ネルギー論を説明する熱力学的サイクルに基づいて、それらの標的mRNAに対する最も高い
予測結合親和性により同定するためのアルゴリズムも利用可能である[例えば、ウォルト
ン（Walton）ら、Biotechnol Bioeng（バイオテクノロジー・アンド・バイオエンジニア
リング）65：1-9（1999）参照]。
【０２４４】
そのようなアルゴリズムは、細胞においてアンチセンスアプローチを実践するために首
尾よく使用される。例えば、Waltonらによって開発されたアルゴリズムは、 ラビットベ
ータグロビン（RBG）およびマウス腫瘍壊死因子-アルファ（TNFアルファ）転写産物につ
いて科学者がアンチセンスオリゴヌクレオチドを首尾よく設計することを可能にした。同
じ研究グループは、もっと最近では、kinetic PCR（動力学PCR）技術によって評価したよ
うに細胞培養において3つのモデル標的mRNAs（ヒト乳酸デヒドロゲナーゼAおよびBおよび
ラットgp130）に対する合理的に選択されたオリゴヌクレオチドのアンチセンス活性が、
ほとんどすべてのケースにおいて、ホスホジエステルおよびホスホロチオアートオリゴヌ
クレオチド化学を用いた2つの細胞型における3つの異なる標的に対する試験が含まれ、効
率的であると証明されることを報告した。
【０２４５】
さらに加え、インビトロ系を用いる特異的オリゴヌクレオチドの効率を設計および予測
するためのいくつかのアプローチも発表された（Matveeva（マトベーエワ）ら、Nature B
iotechnology（ネイチャー・バイオテクノロジー）16：1374-1375（1998））。
【０２４６】
カテプシンC、CELA3AおよびCELA1をダウンレギュレーションすることができる別の薬剤
は、カテプシンC、CELA3AおよびCELA1をコードするmRNA転写物を特異的に切断することが
できるリボザイム分子である。リボザイムは、関心があるタンパク質をコードするmRNAの
切断による遺伝子発現の配列特異的抑制にますます使用される[Welch（ウェルチ）ら、Cu
rr Opin Biotechnol.（カレント・オピニオン・イン・バイオテクノロジー）9：486-96（
1998）]。任意の特定の標的RNAを切断するようにリボザイムを設計する可能性は、それら
を基礎研究および治療用途の両方において貴重なツールにした。治療領域において、リボ
ザイムは、感染症、ガンにおける優勢なガン遺伝子および遺伝的障害における特定の体細
胞変異でのウイルスRNAsを標的にするために利用された（Welchら、Clin Diagn Virol.（
クリニカル・アンド・ダイアグノスティック・バイロロジー）10：163-71（1998）]。最
も注目すべきことに、HIV患者のためのいくつかのリボザイム遺伝子治療プロトコールは
すでに第1相試験中である。より最近になって、リボザイムは、トランスジェニック動物
研究、遺伝子標的の検証および経路解明に用いられた。いくつかのリボザイムは臨床試験
の様々な段階にある。ANGIOZYME（アンジオザイム）はヒト臨床試験で研究される最初の
化学合成リボザイムであった。ANGIOZYMEは、血管形成経路における重要な成分であるVEG
F-r（血管内皮増殖因子受容体）の形成を特異的に抑制する。Ribozyme Pharmaceuticals,
Inc.（リボザイム・ファーマシューティカルズ社）ならびに他の企業は、動物モデルに
おいて抗血管新生治療薬の重要性を実証した。HEPTAZYMEは、C型肝炎ウイルス（HCV）RNA
を選択的に破壊するように設計されたリボザイムであり、細胞培養アッセイでC型肝炎ウ
イルスRNAを減少させるのに有効であることが見出された（Ribozyme Pharmaceuticals, I
ncorporated-WEBホームページ）。
【０２４７】
したがって、カテプシンC、CELA3AおよびCELA1調節領域における任意の所定の配列につ
いて、三重鎖形成配列を考案することができる。三重鎖形成オリゴヌクレオチドは、好ま
しくは少なくとも15、より一層好ましくは25、さらにより一層好ましくは30またはそれよ
りも多くのヌクレオチド長、最大で50または100bpまでである。
【０２４８】
TFOsによる細胞のトランスフェクション（例えば、カチオン性リポソームによる）、お
よび標的DNAによる三重らせん構造の形成は、立体的および機能的変化を誘導し、転写開
始および伸長がブロックされ、内因性DNAでの望ましい配列変化の導入が可能にされ、お
よび遺伝子発現の特異的ダウンレギュレーションがもたらされる。TFOsにより処理された
細胞における遺伝子発現のそのような抑止の例には、TFOで処置した細胞における遺伝子
発現のこのような抑制の例には、哺乳動物細胞におけるエピソームsupFG1および内因性HP
RT遺伝子のノックアウトが含まれる（Vasquez（バスケス）ら、Nucl Acids Res.（ヌクレ
イック・アシッズ・リサーチ）1999；27：1176-81およびPuri（プリ）ら、J Biol Chem（
ジャーナル・オブ・ケミカル・バイオロジー）、2001；276：28991-98）、および前立腺
ガン病因において重要なEts2転写因子の発現の配列-および標的特異的ダウンレギュレー
ション（Carbone（カルボーネ）ら、Nucl Acid Res. 2003；31：833-43）、および炎症誘
発性ICAM-1遺伝子（Besch（ベシュ）ら、J Biol Chem、2002；277：32473-79）が含まれ
る。さらに、Vuyisich（ブイッジヒ）およびBeal（ビール）は最近、配列特異的TFOsがds
RNAに結合することができ、dsRNA依存性酵素、たとえば、RNA依存性キナーゼなどのよう
なものの活性が抑制されることを示した（VuyisichおよびBeal、Nuc. Acids Res 2000；2
8：2369-74）。
【０２４９】
さらに追加的に、上記の原理に従って設計されたTFOsは、DNA修復を行うことができる
定方向（有向とも言う）変異誘発を誘導することができ、従って内因性遺伝子の発現のダ
ウンレギュレーションおよびアップレギュレーションの両方が提供される（Seidman（セ
イデマン）およびGlazer（グレーザー）、J Clin Invest（ザ・ジャーナル・オブ・クリ
ニカル・インベスティゲーション）2003；112：487-94）。有効なTFOsの設計、合成およ
び管理の詳細な説明は、Froehler（フレーリラー）らへの米国特許出願第2003 017068号
および第2003 0096980号、ならびにEmanuele（エマニュエル）らへの2002 0128218および
2002 0123476、ならびに、Lawn（ローン）への米国特許第5,721,138号において見出すこ
とができる。
【０２５０】
本教示のポリヌクレオチド剤によって標的とされ得るCELA1およびCELA3Aの模範的な核
酸領域は、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29
、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35に記載さ
れるような核酸配列が含まれる。しかし、カテプシンC、CELA1および/またはCELA3Aの任
意の核酸領域が、標的の様式でその発現をサイレンシングし、本発明の教示に従って使用
され得ることは理解されるであろう。
【０２５１】
本発明はさらに、モデレート（中程度）からストリンジェント（厳格）なハイブリダイ
ゼーション条件下で、CELA1および/またはCELA3Aに特異的にハイブリダイズするが、CELA
2AまたはCELA3Bに対してはハイブリダイズしない分離されたポリヌクレオチドを提供する
。本発明でのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、例えば、10％デキスト
ラン硫酸、1M NaCl、1％SDSおよび5×106cpm 32p標識プローブを含むハイブリダイゼーシ
ョン溶液によって65℃で、0.2×SSCおよび0.1％SDSの洗浄溶液で、および65℃での最終洗
浄で；その一方、モデレートなハイブリダイゼーション条件は、例えば、10％デキストラ
ン硫酸、1M NaCl、1％SDSおよび5×106cpm 32p標識プローブを含むハイブリダイゼーショ
ン溶液によって65℃で、1×SSCおよび0.1％SDSの最終洗浄溶液により、および50℃での最
終洗浄で作用され得る。
【０２５２】
本発明はさらに、カテプシンCに特異的にハイブリダイズするが、モデレートないしス
トリンジェントなハイブリダイゼーション条件でカテプシンA、B、D、E、G、H、K、L1、L
2、O、S、WまたはZにはそうしない分離されたポリヌクレオチドを提供する。
【０２５３】
壊死性細胞におけるカテプシンC、CELA1および/またはCELA3A発現をダウンレギュレー
トするための分離されたポリヌクレオチド剤は、それ自体が細胞に提供され得る。そのよ
うなポリヌクレオチド剤は、典型的には、発現構築物の一部分として細胞に施与される。
この場合、ポリヌクレオチド剤は、細胞においてポリヌクレオチド剤の発現を構成的また
は誘導的様式で指示することができるシス作用調節エレメント（例は、プロモーター）の
制御下で核酸構築物において連結される。
【０２５４】
本発明での発現構築物はまた、それを、真核生物における複製および組込みに適するよ
うにするさらなる配列（例は、シャトルベクター）を含み得る。典型的なクローニングベ
クターは、転写および翻訳開始配列（例えば、プロモーター、エンハンス）および転写お
よび翻訳ターミネーター（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含む。本発明での発現構
築物は、プロモーター配列に隣接し、または離れてもよく、そこから転写を上方制御する
ことができるエンハンサーをさらに含むことができる。
【０２５５】
既に記載された実施形態に加えて、本発明での発現構築物は、典型的には、クローニン
グされた核酸の発現レベルを増加させるか、または組換えDNAを所有する細胞の識別を容
易にするために、他の特殊な要素を含み得る。例えば、多数の動物ウイルスは、許容細胞
型においてウイルスゲノムの染色体外複製を促進するDNA配列を含む。これらのウイルス
レプリコンを保有するプラスミドは、プラスミド上または宿主細胞のゲノム上に伴われる
いずれかの遺伝子によって適切な因子が提供される限り、エピソーム的に複製される。
【０２５６】
本発明での発現構築物は真核生物のレプリコンを含んでも含まなくてもよい。真核生物
のレプリコンが存在する場合、ベクターは適切な選択マーカーを用いて真核細胞において
増幅することができる。構築物が真核生物レプリコンを含まない場合、エピソーム増幅は
不可能である。代わりに、組換えDNAは、操作された細胞のゲノムに組み込まれ、そこで
は、プロモーターは望ましい核酸の発現を指示する。
【０２５７】
適切な遺伝子配送ビヒクル/方法（トランスフェクション、形質導入、など）および適
切な発現系を用いて、核酸構築物を本発明での壊死性細胞に導入することができる。
【０２５８】
哺乳動物発現ベクターの例には、制限されないが、pcDNA3、pcDNA3.1（+/-）、pGL3、p
ZeoSV2（+/-）、pSecTag2、pDisplay、pEF/myc/cyto、pCMV/myc/cyto、pCR3.1、pSinRep5
、DH26S、DHBB、pNMT1、pNMT41およびpNMT81で、それらは、Invitrogen（インビトロゲン
社）から入手可能でり、pCIで、それは、Promega（プロメガ社）から入手可能であり、pM
bac、pPbac、pBK-RSVおよびpBK-CMVで、それらは、Strategene（ストラテジーン社）から
入手可能であり、pTRESで、それは、Clontech（クロンテク社）から入手可能であり、お
よびそれらの派生物が含まれる。
【０２５９】
様々な方法を用いて、本発明の発現ベクターをヒト細胞に導入することができる。その
ような方法は、包括的に、例えば：Sambrook（サムブルック）J.およびRussell（ラッセ
ル）D. W.（1989、1992、2001）、Molecular Cloning：A Laboratory Manual（分子クロ
ーニング：ラボラトリー・マニュアル）、Cold Springs Harbor Laboratory（コールド・
スプリング・ハーバー・ラボラトリー）、New York（ニューヨーク）；Ausubel（オーズ
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ゲティング）、CRC Press、Boca Raton、FL（フロリダ州）。Rodriguez（ロドリゲス）R.
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Molecular Cloning Vectors and Their Uses（分子クローニングベクターおよびその使
用の調査）、Butterworth-Heinemann（バターワース-ハイネマン）、Boston（ボストン）
、Mass（マサチューセッツ州）；およびGilboa（ギルボア）E.ら（1986）。Transfer and
expression of cloned genes using retro-viral vectors（レトロ-ウイルスベクターを
用いるクローン化遺伝子の導入および発現Biotechniques（バイオテクニックズ）4（6）
、504-512において説明され；および例えば、安定または一過性トランスフェクション、
リポフェクション、エレクトロポレーション、および組換えウイルスベクターによる感染
が含まれる。さらに、ポジティブ-ネガティブ選定法のための米国特許第5,464,764号およ
び第5,487,992号を参照。
【０２６０】
細胞内CELA3A、CELA1、および/またはカテプシンCの少なくとも1つのそれぞれが細胞内
標的であるので、本発明の薬剤は細胞内配送のために調剤され得る。例えば、本発明での
高親和性結合分子（例えば、抗体）は細胞内送達のためにさらに設計され得る。
【０２６１】
いくらかの実施態様において、ここに提供されるRNAサイレンシング剤は、細胞浸透性
ペプチドと機能的に会合することができる。ここに使用されるように、「細胞浸透性ペプ
チド」は、短い（約12-30残基）アミノ酸配列または機能的モチーフを含むペプチドであ
り、それはエネルギー非依存性（すなわち、非エンドサイトーシス）転座特性を、膜透過
性複合体の細胞の血漿および/または核膜を通過する輸送に関連して付与する。本発明の
いくつかの実施態様の膜透過性複合体は、少なくとも1つの非機能性システイン残基を好
ましくは含み、それは遊離または誘導体化されるかのいずれかで、そのような連結のため
に修飾された二本鎖リボ核酸とジスルフィド結合を形成する。そのような特性を付与する
代表的アミノ酸モチーフは、米国特許第6,348,185号に列挙され、その内容は、参照によ
りここに明示的に組み込まれる。本発明のいくらかの実施態様の細胞透過性ペプチドは、
制限されないが好ましくは、ペネトラチン、トランスポータン、pIsl、TAT（48-60）、pV
EC、MTS、およびMAPが含まれる。
【０２６２】
したがって、例えば、本発明での標的細胞（例えば、壊死性細胞）へのこれらの抗体の
配送のために、脂質系システムを使用することができる。
【０２６３】
リポソームには、容量を囲む脂質二重層からなる任意の合成（すなわち、天然に存在し
ない）構造のものが含まれる。リポソームには、エマルジョン、フォーム、ミセル、不溶
性単層、液晶、リン脂質分散物、ラメラ（積層状）層およびその他同種類のものなどが含
まれる。リポソームは、本技術で知られる方法のいずれかによって調製することができる
[Monkkonen（モンコネン）J.ら、1994、J. Drug Target（ジャーナル・オブ・ドラッグ・
ターゲティング）、2：299-308；Monkkonen, J.ら、1993、Calcif. Tissue Int.（カルシ
フィード・ティッシュ・インターナショナル）、53：139-145；Lasic（レーシック）D D.
、Liposomes Technology Inc.（リポソームズ・テクノロジー社）、Elsevier（エルセビ
ア）、1993、63-105。（第3章）；Winterhalter（ウィンターハルター）M、Lasic D D、C
hem Phys Lipids（ケミストリー・アンド・フィジックス・オブ・リピッズ）、1993年9月
；64（1-3）：35-43]。リポソームは、正に帯電していてもよく、中性であってもよいし
、負に帯電していてもよい。単核貪食システム（MPS）取り込みについて、リポソーム膜
の親水性マスキング（例えば、ポリエチレングリコール結合脂質および親水性粒子の使用
による）がMPS取り込みを起こし難いことがあるので、リポソームは疎水性であることが
できる。リポソームはまた、立体的に遮蔽された脂質、たとえば、ガングリオシドGM1お
よびホスファチジルイノシトールなどのようなものは、これらの脂質がMPS摂取を妨げる
ので、含まないことが好ましい。
【０２６４】
リポソームは、単一の脂質層であってもよく、または多層であってもよい。治療上の薬
剤が親水性である場合、それらのより一層大きな内部容量のために大きな単層ベシクル（
小胞とも言う）を使用してその配送をさらに改善することができる。逆に、治療上の薬剤
が疎水性である場合、その配送は多層小胞を使用してさらに改善され得る。あるいはまた
、治療剤（例えば、抗体）は、脂質二重層に浸透することができないかもしれず、および
その結果、リポソーム表面に吸着したままであろう。この場合、リポソームの表面積を増
加させることにより、治療剤の配送をさらに改善することができる。本発明による適切な
リポソームは、非毒性リポソーム、例えば、ホスファチジルコリンホスホグリセロール、
およびコレステロールから調製されるリポソームなどのようなものである。使用されるリ
ポソームの直径は、0.1-1.0ミクロン（マイクロメートル）の範囲であり得る。しかしな
がら、貪食細胞による食作用に適した他のサイズ範囲も使用することができる。リポソー
ムをサイジングするために、ホモジナイゼーションを使用することができ、それは、大き
なリポソームをより小さなものにフラグメント化するための剪断エネルギーに依存する。
好都合に使用できるホモジナイザーには、Boston、MA所在のMicrofluidics（マイクロフ
ルイディクス社）によって製造されるmicrofluidizers（マイクロフルイダイザー）が含
まれる。典型的なホモジナイゼーション手順では、選定されたリポソームの大きさが観察
されるまで、標準的なエマルションホモジナイザーを通して、リポソームを再循環させる
。粒度分布は、慣習的なレーザービーム粒径の弁別によってモニターすることができる。
小孔ポリカーボネート膜または非対称セラミック膜を通じたリポソームの押し出しは、リ
ポソームのサイズを比較的よく規定されたサイズ分布に減少させる有効な方法である。典
型的には、懸濁物は、望ましいリポソームサイズ分布が達成されるまで膜を1回以上循環
させる。リポソームは、徐々に小さい細孔膜を通して押し出して、リポソームのサイズを
徐々に減少させることができる。
【０２６５】
当技術において知られる任意の方法を用いて、本発明のいくつかの実施形態の治療剤を
リポソームに組み込むことができる。例えば、高親和性分子（例えば、抗体）をリポソー
ム内に封入してもよい。あるいは、それはリポソームの表面に吸着されていてもよい。本
発明でのリポソームに製薬上の薬剤を組み込むために使用され得る他の方法は、Alfonso
（アルフォンソ）らによって説明されるもの[The science and practice of pharmacy（
薬学のサイエンスおよび実践）、Mack Publishing（マック・パブリッシング）、Easton
（イーストン）Pa（ペンシルベニア州）19th ed.（19版）、（1995）]およびKulkarni（
クルカルニ）らによって説明されるもの[J. Microencapsul.（ジャーナル・オブ・マイク
ロエンカプスレーション）1995、12（3）229-46]である。
【０２６６】
本発明の方法において使用されるリポソームは、好ましくは血液バリア（血液関門）を
横切る。したがって、本発明でのリポソームは、好ましくは、それらの膜部分に多糖類（
例えば、マンノース）を標的とする血液バリアを含まない。好ましくは、本発明のリポソ
ームは、血液バリア上のレセプターを標的とする膜部分にペプチドを含まない。このよう
なペプチドの例には、制限されないが、トランスフェリン、インスリン、IGF-1、IGF-2抗
トランスフェリンレセプター抗体、抗インスリンレセプター抗体、抗IGF-1レセプター抗
体および抗IGF-2レセプター抗体が含まれる。
【０２６７】
本発明に従って特に好適なリポソームを決定するために、スクリーニングアッセイを実
行することができ、たとえば、米国特許出願第20040266734号明細書および米国特許出願
第20040266734号明細書；およびDanenberg（ダネンバーグ）ら、Journal of cardiovascu
lar pharmacology（ジャーナル・オブ・カルジオバスキュラー・ファーマコロジー）2003
、42：671-9；Circulation（サーキュレーション）2002、106：599-605；Circulation 20
03、108：2798-804に記載されるアッセイなどのようなものである。
【０２６８】
一実施形態によれば、細胞性壊死を予防または抑制する方法は、インビトロ、インビボ
またはエクスビボ（ex vivo、生体外とも言う）で行われる。
【０２６９】
細胞内CELA3A、CELA1、および/またはカテプシンCの少なくとも1つを調節する能力は、
壊死誘発性細胞死の処置のための新規な治療上の様式（therapeutic modality）として使
用することができる。
【０２７０】
したがって、本発明の別の態様によれば、細胞性壊死に関連する医学的疾患または状態
の処置で、それを必要とする対象における方法であって、治療上有効な量の薬剤を対象に
施与することを含む方法が提供され、それは、対象の細胞においてカテプシンC、CELA3A
およびCELA1の発現を特異的にダウンレギュレーションし、およびあるいは、またはそれ
に加えて、それらの活性を抑制する。
【０２７１】
「処置する」という用語は、疾患、障害または条件の発症を抑制または阻止すること、
および/または疾患、障害もしくは条件の軽減、寛解または退行を引き起こすこと、また
は疾患、障害もしくは医学的条件を、疾患の障害または状態に罹患している可能性がある
が、まだ疾患の障害または状態を有すると診断されていない対象において起こることから
避けることに言及する。当業者は、疾患、障害または条件の発症を評価するために様々な
方法論およびアッセイを使用することができ、および同様に、疾患、障害または条件の軽
減、寛解または退行を評価するために様々な方法論およびアッセイを使用することができ
ることを理解するであろう。
【０２７２】
ここに使用されるように、「対象」という用語は、動物、好ましくは哺乳動物、最も好
ましくは人間に言及し、壊死関連障害または条件に罹患しているか、または罹患しやすい
両方の性別の若者および老人の双方を含む。
【０２７３】
細胞性壊死に関連する疾患または条件には、神経変性疾患、認知症、パーキンソン病（
Parkinson disease）、アルツハイマー病、筋ジストロフィー、白血病、リンパ腫、呼吸
窮迫（新生児呼吸窮迫症）、窒息、嵌頓ヘルニア（収縮ヘルニア）、糖尿病、結核、子宮
内膜症、脈管ジストロフィー（vascular dystrophy）、乾癬、寒冷傷害、鉄負荷合併症（
iron-load complication）、ステロイド処置の合併症、虚血性心疾患、再潅流傷害、脳血
管疾患または損傷、壊疽（gangrene）、褥瘡性潰瘍（pressure sore、圧痛）、膵炎、肝
炎、ヘモグロビン尿、髄膜炎、壊疽組織（sphacelus）、虚血性壊死、無血管壊死（avasc
ular necrosis）（例えば、骨のもの）、細菌性敗血症、ウイルス性敗血症、熱傷（火傷
）、高熱（体温上昇）、クローン病、セリアック病、コンパートメント症候群、壊死性直
腸炎（壊死性結腸炎）、嚢胞性線維症、関節リウマチ、腎毒性、多発性硬化症、脊髄損傷
、糸球体腎炎、変形性関節症（変性関節炎）、チロセミア（チロシン血症、甲状腺機能低
下症）、代謝性遺伝性疾患（metabolic inherited disease）、マイコプラズマ病、炭疽
感染、細菌感染、ウイルス感染、アンダーソン病（Anderson disease）、先天性ミトコン
ドリア病、フェニルケトン尿、胎盤梗塞、梅毒、梅毒、無菌壊死、虚血性壊死、アルコー
ル依存、および投与および/または自己投与、および/または暴露に関連する壊死（necros
is associated with administration and/or self-administration with, and/or exposu
re to）で、コカイン、薬物、化学的毒素、農薬および重金属、ダーマルフィラー（皮膚
充填剤）施与に関係する壊死；異所的薬物施与に関係する壊死で、たとえば、デキストロ
ース溶液、化学療法薬の溢出などのようなもの；化学療法誘発性壊死、放射線誘発性壊死
、移植組織および加齢の保守管理が含まれる。
【０２７４】
一実施形態によれば、細胞壊死に関連する疾患または条件は脳損傷（例えば、外傷性脳
損傷）である。
【０２７５】
したがって、本方法は、任意の急性または慢性中枢神経系（CNS）傷害に関連する壊死
の処置において有用である。そのような疾患または条件には、制限されないが、卒中（血
栓症、塞栓症または血管収縮によって引き起こされるもの）、閉鎖頭部損傷、全脳虚血（
例えば、心筋梗塞、不整脈、出血性ショック、および冠状動脈バイパス移植後脳傷害を含
む任意の原因の全身性低血圧による虚血）、局所虚血および頭蓋内出血が含まれうる。CN
S（中枢神経系）への虚血性損傷は、全虚血または局所虚血条件のいずれかでも起因し得
る。全虚血は、たとえば、心停止の間などのようなものの一定の時間の期間、脳全体への
血流が止まるところで起こる。局所虚血は、脳の一部が正常な血流を奪われたとき、たと
えば、脳血管の血栓塞栓性の閉塞（thromboembolytic occlusion）、外傷性頭部外傷、浮
腫および脳腫瘍の間などのようなときに生じる。脳虚血に起因するCNS損傷の多くは、虚
血状態に続いて数時間または数日後でさえも起こり、および損傷組織による細胞傷害性生
成物の放出に続発する。
【０２７６】
いくつかの態様では、本発明は、任意の既知の原因、たとえば、感染に基づく、または
毒性物質への暴露、または当業者により理解されるような他のものから生じる肝臓の毒性
の処置または防止を特に考慮する。
【０２７７】
いくつかの態様では、本発明は、当業者によって理解されるように、いくつかの態様に
おいて、心筋梗塞、心不全、心臓病、およびその他を含め、心疾患の処置または防止を特
別に企図する。
【０２７８】
本教示によれば、細胞壊死に関連する医学的疾患または条件を処置するために、対象は
、カテプシンC、CELA1および/またはCELA3Aまたは構造的に関連する酵素の発現を特異的
にダウンレギュレートし、および代替的または追加的にそれらの活性を抑制する薬剤によ
り、さらに上文に詳述されるように管理される。
【０２７９】
各々の上述のダウンレギュレーション剤またはダウンレギュレーション剤をコードする
発現ベクターは、個体に、それ自体でか、または生理学的に許容可能な担体をも含む薬剤
組成物の一部としてか、またはいくつかの態様では、コンジュゲート、荷電粒子、リポソ
ーム、または当技術分野における任意の既知の担体の一部として施与できることが理解さ
れ、次にそれは、いくつかの態様では、薬剤組成物の一部としてさらに調剤されてもよい
。薬剤組成物の目的は、有機体への活性成分の管理を容易にすることである。
【０２８０】
ここに使用されるように、「薬剤組成物」は、ここに記載される1以上の活性成分の、
他の化学成分、たとえば、生理学的に適切な担体および賦形剤などのようなものとの調製
物に言及する。薬剤組成物の目的は有機体への化合物の管理を容易にすることである。
【０２８１】
ここにおいて、用語「活性成分」は、細胞内CELA3A、CELA1、および/またはカテプシン
C、生物学的効果について説明可能な下方制御性または抑制性の薬剤の少なくとも1つに言
及する。
【０２８２】
以下において、「生理学的に許容可能な担体」および「薬学的に許容可能な担体」とい
う語句は、交換可能に使用されてよく、有機体に対して有意な刺激を引き起こさず、かつ
、生物学的活性および特性を無効にしない担体または希釈剤に言及される。アジュバント
はこれらの語句の下に含まれる。
【０２８３】
ここにおいて、用語「賦形剤」は、活性成分の管理をさらに容易にするために薬剤組成
物に添加される不活性物質に言及する。賦形剤の例には、制限なく、炭酸カルシウム、リ
ン酸カルシウム、様々な糖およびでんぷんのタイプ、セルロース誘導体、ゼラチン、植物
油およびポリエチレングリコールが含まれる。
【０２８４】
薬物の調剤および施与のための技術は、参照によりここに組み込まれる、Remington's 
Pharmaceutical Sciences、Mack Publishing Co.、Easton、PA、最新版に見出すことがで
きる。
【０２８５】
適切な投与経路には、例えば、経口、直腸、経粘膜、特に経鼻、腸または非経口配送が
含まれ、筋肉内、皮下および髄腔内注入ならびに髄腔内、直接的な心室内、心臓内、例え
ば、右または左心室腔への、共通冠動脈への、静脈内、腹腔内、鼻腔内、または眼（球）
内注入が含まれうる。
【０２８６】
中枢神経系（CNS）への薬物配送のための慣習的なアプローチには、次の：（脳）神経
外科的戦略（例えば、脳内注射または脳室内注入）；薬剤の分子操作（例えば、それ自体
BBBを横切ることができない薬剤と組み合わせた内皮細胞表面分子に対する親和性を有す
る輸送ペプチドを含むキメラ融合タンパク質の産生）で、BBBの内因性輸送経路の1つを利
用する試みにおけるもの；薬剤の脂質溶解性を高めるために設計された薬理学的戦略（例
えば、脂質またはコレステロール担体への水溶性薬剤のコンジュゲート）；および高浸透
圧性破壊によるBBBの完全性の一時的な破壊（頸動脈へのマンニトール溶液の注入または
生物学的に活性な薬剤、たとえば、アンジオテンシンペプチドなどのようなものの使用に
起因する）が含まれる。
【０２８７】
本発明の一実施形態によれば、薬剤組成物は、細胞膜に侵入性のために調剤される。し
たがって、例えば、薬剤組成物は脂質小胞を含み得る。
【０２８８】
あるいはまた、あるものは、例えば、薬剤組成物をペイシェント（主として患者を意味
する）の組織領域（例えば、壊死性組織）に直接注入することによって、全身的よりはむ
しろ局所的に薬剤組成物を施与することができる。
【０２８９】
本発明のいくつかの実施形態の薬剤組成物は、例えば、慣習的な混合、溶解、造粒（顆
粒化とも言う）、ドラジェ-メーキング（糖衣錠作成）、粉（ゲル状）にする（levigatin
g）、乳化、封入、捕捉または凍結乾燥プロセスによって、当技術でよく知られるプロセ
スによって製造することができる。
【０２９０】
したがって、本発明のいくつかの実施形態に従って使用するための薬剤組成物は、調剤
上で使用することができる調製物への活性成分の処理を容易にする賦形剤および補助剤を
含む1以上の生理学的に許容可能な担体を用いて慣習的な様式において調剤することがで
きる。適切な調剤物は選定される施与の経路に依存する。
【０２９１】
注入のために、薬剤組成物の活性成分は、水溶液、好ましくは生理学的に適合する緩衝
剤、たとえば、ハンクス液、リンガー液、または生理的塩緩衝剤などのようなものにおい
て調剤され得る。経粘膜投与のために、浸透すべき障壁に適切な浸透剤が製剤中に使用さ
れる。そのような浸透剤は、本技術において包括的に知られている。
【０２９２】
経口投与の場合、薬剤組成物は、活性化合物を当該技術でよく知られる薬学的に許容可
能な担体と組み合わせることによって容易に製剤化することができる。そのような担体は
、ペイシェントによる経口摂取のために、薬剤組成物を錠剤、丸薬、糖衣錠、カプセル、
液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁物、およびその他同種類のものなどとして処方す
ることを可能にする。経口使用のための薬理学的調製物は、必要に応じて適切な補助剤を
添加した後、錠剤または糖衣錠コアを得るために、固形賦形剤を使用して、随意に得られ
る混合物を粉砕し、および顆粒の混合物を加工することができる。適切な賦形剤は、特に
、充填剤で、たとえば、糖などのようなもので、ラクトース、スクロース、マンニトール
、またはソルビトールを；セルロース調製物で、たとえば、トウモロコシデンプン、小麦
デンプン、米デンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセル
ロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボメチルセルロースナトリウムなど
のようなものを；および/または生理学的に許容されるポリマーで、たとえば、ポリビニ
ルピロリドン（PVP）が含まれるものである。必要に応じて、架橋ポリビニルピロリドン
、寒天、またはアルギン酸またはたとえば、アルギン酸ナトリウムなどのようなその塩な
どの崩壊剤を添加してもよい。
【０２９３】
糖衣錠コアには、適切なコーティングが施される。この目的のために、濃縮糖溶液を使
用することができ、それには、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポ
ールゲル、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、ラッカー溶液および適切な有機溶媒
または溶媒混合物が随意に含まれることができる。識別のために、または活性化合物用量
の異なる組合せを特徴付けるために、染料または顔料を錠剤または糖衣錠コーティングに
添加してもよい。
【０２９４】
経口で使用することができる薬剤組成物には、ゼラチン製のプッシュフィットカプセル
、ならびにゼラチンおよび可塑剤で、たとえば、グリセロールまたはソルビトールなどの
ようなものでできた軟質の、密封カプセルが含まれる。プッシュフィットカプセルは、活
性成分を、充填剤で、たとえば、ラクトースなどのようなもの、結合剤で、たとえば、デ
ンプンなどのようなもの、潤滑剤で、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなどのよう
なもの、および随意に安定剤と混合して含むことができる。ソフトカプセルにおいて、活
性成分は、適切な液体で、たとえば、脂肪油、流動パラフィン、または液体ポリエチレン
グリコールなどのようなものに溶解または懸濁されてもよい。さらに、安定剤を添加して
もよい。経口投与のためのすべての製剤は、選択された施与の経路に適した投与量でなけ
ればならない。
【０２９５】
頬側（口腔とも言う）投与の場合、組成物は、慣習的な様式で製剤化された錠剤または
ロゼンジ剤（トローチ剤とも言う）の形態を取ることができる。
【０２９６】
鼻吸入による投与のために、本発明のいくつかの実施形態による使用のための活性成分
は、適切な噴射剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジ
クロロ-テトラフルオロエタンまたは二酸化炭素の使用を伴う加圧パックまたは噴霧器か
らのエアロゾルスプレープレゼンテーションの形態で慣習的に配送される。加圧エアロゾ
ルの場合、投与量単位は、計量された量を配送するための弁を提供することによって決定
され得る。ディスペンサーにおいて使用するための、例えば、ゼラチンのカプセルおよび
カートリッジは、化合物および適切な粉末基剤で、例えば、ラクトースまたはデンプンな
どのようなものの粉体混合物を含むように製剤化することができる。
【０２９７】
ここに記載の薬剤組成物は、例えば、ボーラス注入または連続注入などによる非経口施
与のために製剤化することができる。注入用調剤物は、単位剤形、例えば、アンプルにお
いて、または多回投与容器において、随意に保存剤を加えて提示することができる。組成
物は、油性または水性ビヒクルにおける懸濁物、溶液または乳濁物であってもよく、およ
び処方剤（formulatory agents）で、例えば、懸濁剤、安定化剤および/または分散剤な
どのようなものを含有してもよい。
【０２９８】
非経口施与のための薬剤組成物は水溶性形態での活性調製物の水性溶液を含む。さらに
、活性成分の懸濁物は適切な油性または水ベースの注入懸濁物として調製することができ
る。適切な親油性溶媒またはビヒクルには、脂肪油で、たとえば、ゴマ油などのようなも
の、または合成脂肪酸エステルで、たとえば、オレイン酸エチル、トリグリセリドまたは
リポソームなどのようなものが含まれる。水性注入懸濁物は、懸濁液の粘度を増加させる
物質で、たとえば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキス
トランなどのようなものを含み得る。随意に、懸濁物はまた、高濃度の溶液の調製を可能
にするために、活性成分の溶解性を高める適切な安定剤または薬剤を含有してもよい。
【０２９９】
あるいはまた、活性成分は、使用前に適切なビヒクルで、例えば、滅菌した、発熱物質
を含まない水ベースの溶液により構成するための粉体の形態であってもよい。
【０３００】
本発明のいくつかの実施形態の薬剤組成物は、直腸組成物、例えば、坐剤または停留浣
腸などのようなものにおいて、例えば、慣習的な坐薬基剤で、例えば、カカオバターまた
は他のグリセリドなどのようなものを使用して、調剤することもできる。
【０３０１】
本発明のいくつかの実施形態に関連して使用するのに適した薬剤組成物は、活性成分が
意図された目的を達成するのに有効な量で含まれる組成物を含む。より一層具体的には、
治療上有効な量は、障害（例えば、細胞壊死）の症状を防止、緩和または改善するのに有
効な、または処置される対象の生存を延長する量の活性成分（例えば、細胞内CELA3A、CE
LA1、および/またはカテプシンCのダウンレギュレーション性または抑制性の薬剤の少な
くとも1つ）を意味する。
【０３０２】
本発明のある実施形態によれば、本発明の薬剤の効果的な量は、細胞壊死の細胞アポト
ーシスへの変換を引き起こすように選定される量である。
【０３０３】
ここに使用するように、「細胞アポトーシス」という用語は、プログラムされた細胞死
の細胞プロセスに言及する。アポトーシスは、細胞質および核における明確な形態変化、
規則的に離れた部位でのクロマチン切断、およびヌクレオソーム部位でのゲノムDNAのエ
ンドヌクレアーゼ切断によって特徴付けられる。これらの変化には、小疱形成（ブレブ形
成）、細胞収縮、核断片化、染色体凝縮、および染色体DNA断片化が含まれる。しかし、
壊死とは異なり、アポトーシスは、アポトーシス小体と呼ばれる細胞断片を産生し、それ
は細胞の内容物が周囲の細胞にあふれ出し、および損傷を受ける前に、食細胞が貪食して
迅速に除去することができる。
【０３０４】
治療上有効量の決定は、特にここに提供される詳細な開示を考慮すると、十分に当業者
の能力の範囲内である。
【０３０５】
本発明の方法において使用される任意の調製物について、治療上有効な量または用量は
、初期にインビトロおよび細胞培養アッセイから推定することができる（例えば、以下の
例のセクションでの例1-3参照）。さらに、用量は望ましい濃度または力価を達成するた
めに、動物モデルで処方することができる。そのような情報は、ヒトにおいて有用な用量
をより正確に決定するために使用され得る。
【０３０６】
ここに記載の活性成分の毒性および治療上の効力は、インビトロ、細胞培養または実験
動物における標準的な薬学的手順によって決定することができる。これらのインビトロお
よび細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトでの使用のための投与
量の範囲を定式化する際に使用することができる。投与量は、採用される剤形および利用
される施与経路に依存して変動し得る。正確な製剤、施与経路および投与量は、ペイシェ
ントの条件を考慮して個々の医師によって選定することができる。（例えば、Fingl（フ
ィングル）ら、1975、The Pharmacological Basis of Therapeutics（治療の薬理学的基
礎）、Ch.1（第一章）p.1（第1頁）参照）。
【０３０７】
壊死性疾患および条件のための動物モデルには、無菌壊死についてのブタモデル[例え
ば、Muller-Vahl（ミューラー-バール）HおよびPabst（パブスト）R.、Int J Tissue Rea
ct.（インターナショナル・ジャーナル・オブ・ティッシュ・リアクションズ）（1984）6
（3）：251-4]、大腿骨頭壊死についてのヒツジモデル[J. Manggold（マンゴールド）ら
、Laboratory Animals（ラボラトリー・アニマルズ）（2002）36、173-180]が含まれる。
【０３０８】
投薬量および間隔は、生物学的効果（最小有効濃度、MEC）を誘導または抑制するのに
十分な量で活性成分を提供するために、個別に調節されてもよい。MECは各調製物につい
て変動するが、インビトロデータから推定することができる。MECを達成するために必要
な投与量は、個々の特徴および施与の経路に依存する。検出アッセイを使用して、血漿濃
度を決定することができる。
【０３０９】
処置される条件の重篤度および応答性に依存して、投薬は、数日間から数週間までの持
続する処置過程または治癒がもたらされ、または疾患状態の減少が達成されるまで、単回
または複数回の施与であり得る。
【０３１０】
施与される組成物の量は、もちろん、治療される対象、悩みの重症度、施与の様式、処
方する医師の判断、などに依存するであろう。
【０３１１】
本発明のいくつかの実施形態の組成物は、必要に応じて、パックまたはディスペンサー
装置で、例えば、FDA承認キットなどのようなものにおいて提供することができ、それら
は活性成分を含有する1以上の単位剤形を含むことができる。パックは、例えば、金属ま
たはプラスチックホイルで、例えば、ブリスターパックなどのようなものを含むことがで
きる。パックまたはディスペンサー装置は、施与のための指示書を伴ってもよい。パック
またはディスペンサーはまた、調合薬の製造、使用または販売を規制する政府機関によっ
て規定された形態で、容器に付随する通知によって収容されてもよく、その通知は、組成
物の形態またはヒトまたは獣医学的投与の当局による承認を反映する。そのような通知は
、例えば、処方薬について米国食品医薬品局によって承認を受けたラベルまたは承認され
た製品挿入物のものであってもよい。適合性のある薬学的担体において調剤される本発明
の調製物を含む組成物は、上記でさらに詳述したように、調製され、適切な容器に入れら
れ、および指示された条件の処置のために標識されてもよい。
【０３１２】
本発明の薬剤は、製造物の物品として適切に包装することができる薬剤組成物として適
切に調剤することができる。そのような製造物の物品は、壊死関連疾患の処置において使
用するためのラベルを含み、パッケージング材料は薬学的に有効な量のダウンレギュレー
ション剤を包装する。
【０３１３】
本発明の薬剤または組成物の各々は、他の既知の処置で、制限されないが、抗アポトー
シス剤または抗炎症剤を含めて組み合わせて施与され得ることが理解されるであろう。
【０３１４】
本発明の薬剤または組成物は、後者の施与の前に、それと同時に、または後に施与され
得る。
【０３１５】
本教示に従って使用することができる抗アポトーシス剤には、制限されないが、-[R]-N
-[2-ヘプチル]-メチルプロパルギルアミン（R-2HMP）、ビタミンE、ビタミンD、カスパー
ゼインヒビターおよび親水性胆汁酸塩ウルソデオキシコール酸が含まれる。
【０３１６】
本発明の教示に従って使用することができる抗炎症剤には、制限されないが、アクロフ
ェナク；ジプロプタン酸アルクロメタゾン；アルゲストンアセトニド；アルファアミラー
ゼ；アムシナファル；アムシナフィド；アムフェナックナトリウム；アミプリロース塩酸
塩；アナキンラ；アニロラック；アニトラザフェン；アパゾン；バルサラジド二ナトリウ
ム；ベンダザック；ベノキサプロフェン；ベンジダミン塩酸塩；ブロメライン；ブロペラ
モール；ブデソニド；カルプロフェン；シクロプロフェン；シンタゾン；クリップロフェ
ン；プロピオン酸クロベタゾール；クロベタゾンブチラート；クロピラク；プロピオナー
トクロチカゾン；酢酸コルメタゾン；コルトドキソン；デフラザコート；デソニド；デソ
キシメタゾン；デプロメタゾンジプロピオナート；ジクロフェナクカリウム；ジクロフェ
ナクナトリウム；ジフルラゾンジアセタート；ジフルミドンナトリウム；ジフルニサル；
ジフルプレドナート；ジフタロン（Diftalone）；ジメチルスルホキシド；ドロシノニド
；エンドリソン；エンリモマブ；エノリラムナトリウム；エピリゾール；エトドラク；エ
トフェナマート；フェルビナク；フェナモール；フェンブフェン；フェンクロフェナック
；フェンクロラック；フェンドサル；フェンピパロン（Fenpipalone）；フェンチアザッ
ク；フラザロン；フルアザコート；フルフェナミン酸；フルミゾール；フルニソリドアセ
タート；フルニキシン；フルニキシンメグルミン；フルオルコルチンブチル；フルオロメ
トロンアセタート；フルクアゾン（Fluquazone）；フルルビプロフェン；フルレトフェン
（Fluretofen）；プロピオン酸フルチカゾン；フラプロフェン；フロブフェン；ハルシノ
ニド；プロピオン酸ハロベタゾール；ハロプロドンアセタート；イブフェナク；イブプロ
フェン；イブプロフェンアルミニウム；イブプロフェンピコノール；イロニダップ（Ilon
idap）；インドメタシン；インドメタシンナトリウム；インドプロフェン；インドキソー
ル；イントラゾール；イソフルプレドンアセタート；イソキセパク（Isoxepac）；イソキ
シカム（Isoxicam）；ケトプロフェン；ロフェミゾール塩酸塩；ロモキシカム（Lomoxica
m）；ロテプレドノールエタボナート；メクロフェナマートナトリウム；メクロフェナム
酸；メクロリソンジブチラート；メフェナム酸；メサラミン；メセクラゾン；メチルプレ
ドニソロンスレプタナート；モミフルマート；ナブメトン；ナプロキセン；ナプロキセン
ナトリウム；ナプロキソール；ニマゾン；オルサラジンナトリウム；オルゴテイン；オル
パノキシン；オキサプロジン；オキシフェンブタゾン；塩酸パラニリン；ペントサン多硫
酸ナトリウム（Pentosan Polysulfate Sodium）；フェンブタゾンナトリウムグリセラー
ト；ピルフェニドン；ピロキシカム；ピロキシカムシンナマート；ピロキシカムオラミン
；ピルプロフェン；プレドナザート；プリフェロン；プロドール酸；プロクアゾン；プロ
キサゾール；くえん酸プロキサゾール；リメキソロン；ロマザリット；サルコレクス（Sa
lcolex）；サルナセジン（Salnacedin）；サルサラート；サンギナリンクロリド（Sangui
narium Chloride）；セクラゾン；セルメタシン；スドキシカム；スリンダク；スプロフ
ェン；タルメタシン；タルニフルマート；タロサラート；テブフェロン；テニダップ；テ
ニダップナトリウム；テノキシカム；テシカム；テシミド；テトリダミン；チオピナック
；チキソコルトールピバラート；トルメチン；トルメチンナトリウム；トリクロニド；ト
リフルミダート；ジドメタシン；ゾメピラックナトリウムが含まれる。
【０３１７】
治療効率を試験するために、対象体は、物理的検査ならびに細胞壊死を評価するための
本技術で知られる任意の方法を用いて評価され得る。したがって、例えば、壊死性細胞ま
たは組織サンプルを（例えば、対象体から）得ることができ、および光、蛍光または電子
顕微鏡技術によって、またはトリパンブルー染色を介して、それによって壊死性細胞が色
素を取り込み、および従って青色で染色され、壊死性細胞を識別することができる。壊死
細胞は、膜の完全性の喪失、オルガネラの崩壊および/またはクロマチンの凝集を含む形
態学的変化によって健常細胞と区別することができる。
【０３１８】
本発明の別の態様によれば、加齢を処置および/または防止の、それを必要とする対象
における方法が提供され、その方法には、次の：（a）対象の細胞において、カテプシンC
、CELA3Aまたは構造的に類似の酵素およびCELA1の発現を、特異的にダウンレギュレート
し、およびあるいはまたは追加的に、それらの活性を抑制する薬剤を対象に施与すること
；および（b）抗加齢薬剤を対象に施与することであり、それによって加齢を処置および/
または防止することが含まれる。
【０３１９】
本教示によれば、任意の抗加齢剤、たとえば、抗酸化剤、植物化学物質、ホルモンおよ
び脂肪酸などのようなものを使用することができる。
【０３２０】
本教示に従って用いることができる模範的な抗加齢剤には、制限されないが、ビタミン
E、ビタミンC、コエンザイムQ10、リポ酸、葉酸、セレン、フラボノイド、カロテン、ビ
タミンBおよびカルニチンが含まれる。
【０３２１】
本教示と併せて使用することができる分子は、以下のようにそれらの特異性について認
定することができる。
【０３２２】
したがって、本発明の別の態様によれば、細胞の壊死を抑制することができる薬剤を識
別する方法が提供され、その方法には、壊死シグナルに供された細胞に試験薬剤を導入す
ること、および試験薬剤が、細胞内CELA3A、CELA1、および/またはカテプシンCの少なく
とも1つの発現を特異的にダウンレギュレートし、およびあるいはまたは付加的にそれら
の活性を抑制し、それによって細胞の壊死を抑制することができる薬剤を識別することが
含まれる。試験薬剤は、他の細胞タンパク質、たとえば、他のCELAタンパク質またはタン
パク質群などのようなものに対するその効果を経路おいて試験することによって特異性に
ついて試験される（上文に、「特異性」の下でさらに詳述されるようなもの）。
【０３２３】
さらなる好ましい実施形態では、本発明は、壊死および関連する疾患および条件の防止
および処置用に使用するために特異的な小抑制分子を提供する。分子のリストには、様々
な化学的ファミリーに属する小さな抑制性化合物、例えば、2-アミノイミダゾリン、アミ
ノチアゾールおよびイソオキサゾールが含まれる。本発明はまた、細胞壊死に関係する疾
患または医学的条件の処置および/または防止における使用のための種々の小分子インヒ
ビターをも提供する。さらにまた別の実施形態では、細胞壊死に関係する疾患または医学
的条件の処置および/または防止のための薬の製造における小分子インヒビターの使用が
提供される。
【０３２４】
したがって、一実施形態によれば、試験薬剤は、小分子またはエラスターゼの自然なイ
ンヒビター（例えば、インドール-3-カルビノールまたはフラバノール（-）エピガロカテ
キン-3-ガレート）であってよく、およびCELA1またはCELA3のその特異的抑制は本教示を
用いて評価することができる。試験薬剤が特定のCELA1/CELA3Aインヒビターとして検証さ
れた後、それは、細胞壊死の抑制についてさらに分析される。そのような分子のリストを
テーブル1に示す。
【０３２５】
例えば、本発明での小分子は、遷移状態類似体（すなわち、酵素触媒化学反応において
基質分子の遷移状態に類似する化学構造を有する化学的化合物を含むことができるが、そ
れらは典型的には化学反応を受けず、および酵素インヒビターとして作用し）、可逆的イ
ンヒビター（すなわち、典型的に、酵素、酵素-基質複合体、またはその両方に非共有結
合するインヒビター）および不可逆的インヒビター（すなわち、典型的には酵素と反応し
、およびそれを化学的に、例えば、共有結合形成を介して変化させ、および酵素活性に必
要とされる重要なアミノ酸残基を修飾するインヒビター）を含む。
【０３２６】
ここに記載の化合物のいずれかに関して、本発明はまた、任意の異性体、薬学的に許容
可能な塩、薬剤生成物、水和物、N-オキシド、結晶またはそれらの任意の組合せを企図し
、および同じものが本発明の一部とみなされる。
【０３２７】
一実施形態によれば、試験薬剤は、高親和性結合分子またはポリヌクレオチドであって
もよく、およびカテプシンC、CELA1、CELA3Aまたはそれに構造的に関連する酵素のその特
異的抑制は、本教示を用いて評価することができる。試験薬剤が特異的インヒビターとし
て検証された後、細胞壊死の抑制についてさらに分析される。
【０３２８】
したがって、本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞壊死に関連する疾患または医
学的条件の処置および/または防止における使用のための細胞透過性プロテアーゼインヒ
ビターが提供される。プロテアーゼインヒビターは、壊死を受けている細胞における壊死
性細胞死に関与する少なくとも1つの細胞内プロテアーゼの酵素活性を抑制する。細胞内
プロテアーゼは、CELA3A、CELA1、およびカテプシンCからなる群より選ばれる。好ましい
実施形態では、プロテアーゼはCELA3Aである。
【０３２９】
ここに使用されるように、用語「約」は±10％に言及する。
【０３３０】
用語「comprises」、「comprising」、「includes」、「including」、「having」およ
びそれらのコンジュゲート（同語源の語）は、「制限されないが、含まれる」ことを意味
する。
【０３３１】
「からなる」という用語は、「含み、および制限される」ことを意味する。
【０３３２】
用語「から本質的になる」は、追加の成分、ステップおよび/または部分が、請求され
る組成物、方法または構造の基本的および新規な特性を実質的に変えない場合にのみ、組
成物、方法または構造が追加の成分、工程および/または部分を含み得ることを意味する
。
【０３３３】
ここに使用されるように、単数形「a」、「an」および「the」は、文脈上他に明確に指
示されない限り、複数の参照を含む。例えば、「ある化合物」または「少なくとも1つの
化合物」という用語は、その混合物を含め、複数の化合物を含み得る。
【０３３４】
この出願を通して、本発明の様々な実施形態を範囲形式で提示することができる。範囲
の形式の記載は、便宜上のものであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない制限として解
釈されるべきではないことを理解されたい。したがって、範囲の記載は、その範囲内のす
べての可能な部分範囲および個々の数値を具体的に開示したものとみなされるべきである
。例えば、1から6までなどのような範囲の記述は、1から3まで、1から4まで、1から5まで
、2から4まで、2から6まで、3から6までなどの下位範囲、ならびにその範囲内の個々の数
字、例えば1、2、3、4、5および6などのようなものを具体的に開示したものと考えるべき
である。これは、範囲の幅に関係なく適用される。
【０３３５】
数値範囲がここに示される場合はいつでも、示された範囲内に任意の引用数字（分数ま
たは整数）を含むことを意味する。語句、第1の指示番号および第2の指示番号の「範囲内
/間の範囲」および第1の指示番号から第2の指示番号までの「範囲内/それからの範囲」は
、ここでは交換可能に使用され、および第1および第2の指示番号およびそれらの間のすべ
ての分数および整数の数字が含まれることを意味する。
【０３３６】
ここに使用するように、「方法」という用語は、所与のタスクを達成するための様式、
手段、技術および手順に言及し、制限されないが、化学的、薬理学的、生物学的、生化学
的および医学的技術の実践者によって、既知の様式で知られるか、または容易に開発され
る様式、手段、技術および手順が含まれる。
【０３３７】
明瞭にするために、別個の実施形態の文脈で記載される本発明の一定の特長は、単一の
実施形態において組み合わせて提供されてもよいことが理解される。逆に、簡潔にするた
めに、単一の実施形態の文脈で記載される本発明の様々な特長は、別々に、または任意の
適切なサブコンビネーションで、または本発明の任意の他の記載された実施形態に適する
ものとして提供されてよい。様々な実施形態の文脈で説明される一定の特長は、実施形態
がそれらの要素なしで動作不能でない限り、それらの実施形態の本質的な特長と見なすべ
きではない。
【０３３８】
上記に詳細に描写され、次の請求の範囲の項で請求される本発明の様々な実施形態およ
び態様は、以下の実施例において実験的支持を見出せる。
【実施例】
【０３３９】
上記の記載と共に、次に本発明を非制限的に説明する以下の例を参照する。
【０３４０】
包括的に、ここに使用される命名法および本発明で利用される実験手順には、分子的、
生化学的、微生物学的および組換えDNA技術が含まれる。そのような技術は文献で十分に
説明されている。例えば、「Molecular Cloning：A laboratory Manual」Sambrookら、（
1989）；「Current Protocols in Molecular Biology」、Volumes I-III Ausubel, R. M.
ら（1994）；Ausubelら、「Current Protocols in Molecular Biology」、John Wiley an
d Sons、Baltimore、Maryland（1989）；Perbal、「A Practical Guide to Molecular Cl
oning（分子クローニングの実践ガイド）」、John Wiley＆Sons、New York（1988）； Wa
tson（ワトソン）ら、「Recombinant DNA（組換えDNA）」、Scientific American Books
（シエンティフィック・アメリカン・ブックス）、New York；Birrenら、（eds）「Genom
e Analysis：A Laboratory Manual Series（ゲノム分析：実験マニュアルシリーズ）」、
Vols. 1-4、Cold Spring Harbor Laboratory Press、New York（1998）；米国特許第4,66
6,828号；第4,683,202号；第4,801,531号；第5,192,659号および第5,272,057号に記載の
ような方法論；「Cell Biology：A Laboratory Handbook（細胞生物学：実験ハンドブッ
ク）」、Volumes I-III、Cellis, J. E.（1994）；「Current Protocols in Immunology
（免疫学での最新のプロトコル）」Volumes I-III Coligan J. E. ed.（1994）；Stites
ら（eds）、「Basic and Clinical Immunology（基礎的および臨床的免疫学）」（第8版
）、Appleton＆Lange、Norwalk、CT（1994）；MishellおよびShiigi（eds）、「Selected
Methods in Cellular Immunology（細胞免疫学における選択方法）」、W.H. Freeman an
d Co.、New York（1980）；利用可能なイムノアッセイは、特許および科学文献に広範に
記載されており、たとえば、米国特許第3,791,932号；第3,839,153号；第3,850,752号；
第3,850,578号；第3,853,987号；第3,867,517号；第3,879,262号；第3,901,654号；第3,9
35,074号；第3,984,533号；第3,996,345号；第4,034,074号；第4,098,876号；第4,879,21
9号；第5,011,771号および第5,281,521号；「Oligonucleotide Synthesis（オリゴヌクレ
オチド合成）」Gait, M. J.、ed.（1984）；「Nucleic Acid Hybridization（拡散ハイブ
リダイゼーション）」Hames, B. D.、およびHiggins S. J.、eds.（1985）；「Transcrip
tion and Translation（転写および翻訳）」Hames, B. D.およびHiggins S. J., Eds.（1
984）；「Animal Cell Culture（動物細胞培養）」Freshney, R. I., ed.（1986）；「Im
mobilized Cells and Enzymes（固定化細胞および酵素）」IRL Press、（1986）；「A Pr
actical Guide to Molecular Cloning（分子クローニングに対する実践ガイド）」Perbal
, B.（1984）および「Methods in Enzymology（酵素学での方法）」Vol. 1-317、Academi
c Press；「PCR Protocols：A Guide To Methods And Applications（PCRプロトコル：方
法および適用への指針）」、Academic Press、San Diego、CA（1990）；Marshakら、「St
rategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Man
ual（タンパク質精製および特徴付けのための戦略-実験コースマニュアル」CSHL Press（
1996）を参照し；これらすべては参照によりここにあたかも説明されるかのように組み込
む。他の包括的な参考文献は、この文書を通して提供される。ここでの手法は、この技術
においてよく知られるものと考えられ、および読者の便宜のため提供される。ここに含ま
れるすべての情報は、参照によりここに組み込まれる。
包括的な材料および実験手順
インビトロ壊死のモデル
KCN誘発壊死
【０３４１】
10％熱不活性化ウシ胎仔血清、2mMグルタミン、100U/mlペニシリンおよび100μg/mlペ
ニシリンおよび100μg/mlストレプトマイシンを補充したRPMI-1640培地での懸濁物中で、
ヒトプロモノサイトU-937細胞（p53-陰性前単球細胞株）を増殖させた。対数期での細胞
を4×10 5/mlの濃度で播種した（Tsesin Nら、Chemistry and Physics of Lipids、2014
、183：159-168）。
【０３４２】
ラット褐色細胞腫PC12細胞株（細胞系とも言う）を、5％熱不活化仔ウシ血清、10％熱
不活性化ウマ血清、2mMのL-グルタミン、100U/mlペニシリンおよび100μg/ mlのストレプ
トマイシンで補充したDMEM培地（Beit Haemek、Israel）において増殖させた。対数期で
のPC12細胞を、96ウェルプレートに1.2×10 5/ウェルの濃度で播種し、および一晩インキ
ュベートした。
【０３４３】
その後、細胞を2回洗浄し、および2mMピルビン酸および10％透析FCSを補充したRPMI-16
40（U-937細胞）およびDMEM（PC-12細胞）グルコースフリー培地中に1時間維持した。次
いで、示された濃度で7時間（U-937細胞）、または5時間（PC12細胞）、KCN（Merck、Ger
many）の存在下または非存在下で細胞を処理した。
インヒビターの試験
【０３４４】
エラスターゼインヒビターII（MeOSuc-AAPA-CMK）およびエラスターゼインヒビターIII
（MeOSuc-AAPV-CMK）は、Calbiochem-Novabiochem、USAから購入した。化合物Gly-Pheジ
アゾメチルケトンは、MP Biomedicals、USAから購入した。上記のテーブル1に開示される
すべての化合物は、ChemDiv、San Diego、CAから購入した。化合物をDMSOに溶解し、およ
び細胞死誘導剤を添加する30分前に投与した。すべてのサンプルに添加されたDMSOの最終
濃度は0.1％であり、これはそれ自体では効果がなかった。
siRNAおよび細胞トランスフェクション
【０３４５】
細胞を、HiPerFect Transfection Reagent（トランスフェクション試薬）と特異的プロ
テアーゼを抑制することを目的とするsiRNAとの複合体により、または以下のような適切
なコントロールにより48時間処理した。HiPerFectトランスフェクション試薬は、有効なs
iRNAの取り込みと細胞内でのsiRNAの効率的な放出を可能にし、完全な遺伝子ノックダウ
ンをもたらす、カチオン性脂質と中性脂質のブレンドである。陰性および陽性の死のコン
トロールは製造者の指示に従って使用した。カテプシンCサイレンシングについてのsiRNA
配列は、ATGATCTGCATCAGTTGTAAA（配列番号1）であった。CELA1についてのsiRNA配列はCG
GCAACATGCTGGTCCTTTA（配列番号2）であり、およびCELA3AについてのsiRNA配列はCTGCCTT
TGGCTGCAACTTCA（配列番号3）であった。コントロールに用いたsiRNA配列はAATTCTCCGAAC
GTGTCACGT（配列番号4）であった。すべてのsiRNAsとHiPerFectTMトランスフェクション
試薬はQiagenから購入した。
【０３４６】
その後、正常細胞またはサイレンシングされた細胞を2回洗浄し、およびグルコースを
含まない培地に1時間移し、および次いで上記のようにシアン化カリウムで壊死を誘発し
た。細胞死亡率は、溶解細胞からの安定した細胞質ゾル酵素である乳酸デヒドロゲナーゼ
（LDH）の放出を定量することにより、細胞死を正確かつ迅速に測定するPromegaのCytoTo
x96(R) Non-Radioactive Cytotoxicity Assay（非放射性細胞毒性アッセイ）によって評
価した。
【０３４７】
CELA1のsiRNA配列は、CELA1転写産物と完全に一致するが、それはまたCELA3AおよびCEL
A3Bには不完全にしか一致しない。CELA3AのsiRNAはCELA3Aと完全に一致する。
壊死およびアポトーシスの形態学的定量
【０３４８】
アポトーシスまたは壊死性細胞死に関係する形態学的変化を受ける細胞を、以前に記載
されるようにモニターした[McGahon AJら、Methods Cell Biol（1995）46：153-184]およ
び[Zelig Uら、Biophys J. 2009年10月7日；97（7）：2107-14]。処理後の与えられる時
点で、1mlの細胞懸濁物を収集し、遠心分離し、およびペレットを色素混合物（100μg/ml
アクリジンオレンジおよび100μg/ml臭化エチジウムから構成される）のPBSでの20倍希釈
物に再懸濁し、およびガラススライド上に置き、蛍光顕微鏡で観察する。核が正常な形態
を示し、および緑色であれば、細胞は生きていると評価された。正常な形態およびオレン
ジ色を呈する細胞を壊死として評価した。それらの核がクロマチン凝縮および/または核
断片化を示した場合、細胞をアポトーシスとして評価した。各サンプルについて最低100
個の細胞を採点した。
乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）放出を用いた壊死のアッセイ
【０３４９】
溶解した細胞から放出されるLDHの量は細胞死の敏感な尺度である。96ウェルプレート
においてPromega CytoTox 96 LDHアッセイキットを用いて壊死性細胞死を測定した。0.1
％Triton X-100中で10分間溶解した細胞からのLDH含量を全LDHの指標として使用した。培
地中に放出されたLDHを壊死細胞死の指標として使用し、および合計のLDHからのパーセン
テージを算出した。インヒビターによる保護は、インヒビターの存在下および不存在下に
おけるLDH放出のパーセンテージを比較することに基づいて算出した。インヒビターはま
た、合計、ブランクおよびコントロールに加えた。490nmでの吸光度をELISAリーダー（Bi
oTec）で測定した。
エラスターゼおよびカテプシンC活性のアッセイ
【０３５０】
細胞を収集し、氷冷PBSで2回洗浄し、および氷冷溶解緩衝剤（50mMトリス-HClのpH7.5
、0.1％NP-40、1mMのDTT）中に2×108/mlで再懸濁させた。ポリトロン（各7秒の3サイク
ル）により細胞を破壊し、および13,000g、30分間、4℃での遠心分離によって破片をペレ
ット化した。上清を直ちに使用した。標準としてウシ血清アルブミン（BSA）を用いたBra
dford Protein Assay（ブラッドフォードタンパク質アッセイ）（Bio-Rad）を用いて、各
試料のタンパク質含有量を測定した。すべてのアッセイは、合計容量100μlで行い、およ
びエラスターゼ基質としてN-メトキシスクシニル-Ala-Ala-Pro-Valp-ニトロアニリド（MA
APV）（Sigma）を最終濃度5mM、40μgサンプルタンパク質を、特定の濃度のプロテアーゼ
インヒビターまたはコントロールのための溶媒の存在下または非存在下で、平底マイクロ
タイタープレートにおいて3連で含んだ。37℃で1.5時間インキュベートした後、405nmで
のODをプレートELISAリーダー（Molecular Devices）で測定した。プロテアーゼ活性はp-
ニトロアニリンの較正曲線に従って算出した。カテプシンC様活性を同様にGly-Phe p-ニ
トロアニリド（Sigma）で測定した。
外傷性脳損傷インビボモデル
【０３５１】
クローズドヘッド損傷（閉鎖性頭部外傷）法を使用して、脳壊死の発症に対する、およ
び神経学的重症度スコア（NSS）を用いて評価された神経学的状態に対するエラスターゼ
インヒビターの効果を定めた。外傷の1時間後にNSS検査を行った。 NSSテストの間、様々
な反射、移動能力、ビームバランス、ビームウォーク、およびサイクルの探索および終了
などの他の行動パラメータが監視された。壊死の発生は、2,3,5-トリフェニル-2H-テトラ
ゾリウムクロライド（TTC）で染色された脳スライスでの壊死空間を評価することによっ
て測定した。
【０３５２】
体重40±4g（平均±SD）のC57BL/6Jマウスを本研究で使用した。体重減少装置を用いて
、頭蓋骨にショックを与え、制御された脳損傷を生じさせた。インパクトは、フレームに
降ろされたプラットフォームから押し出されるシリコーンコーティングされた5mmの金属
先端によってもたらされた。この頭蓋損傷モデルは以前の研究で用いられた[Feldman Zら
、J Neurosurg（1995）83：1060-1066；Shapira Yら、J Neurosurg Anesthesiol（1995）
7：17-25]。）。すべての動物の手技とケア技術は、the Ben-Gurion University of the 
Negev Committee for the Ethical Care and Use of Animals in Research（ベングリオ
ン大学の研究での動物の倫理学的ケアおよび使用のためのネゲブ委員会）によって承認を
受けた。
【０３５３】
マウスを、イソフルランでの麻酔により手術用に調製し、自発的に呼吸させた。実験手
順に対する適切な麻酔の維持は角膜反射の喪失によって確認した。角膜反射がなくなれば
、中線の頭皮切開を行い、頭皮および下にある筋肉を横方向に動かした。閉鎖性頭部外傷
（CHT）は左大脳半球の前頭部分にわたり頭蓋骨に送られた。外傷の1分後、エラスターゼ
インヒビターIIまたはIIIの100μgをそのビヒクル（DMSO溶液）において、大槽内に直接
送ることにより脳室内注入した。ビヒクル自体は以前は効果がないことが判明した。外傷
を受けていないマウスのNSSは0ないし1であり、および染色された脳スライスには壊死ス
ペースはなかった。
【０３５４】
注射麻酔を中止した後、動物をケージに戻し、そして食物および水を自由に与えた。
【０３５５】
野生型C57BL/6Jマウスに加えて、好中球エラスターゼノックアウトマウス株B6.129X1-E
laneもまた試験した。すべての手続はネゲブのベングリオン大学倫理委員会によって承認
された。
肝臓毒性インビボモデル
【０３５６】
体重23±3グラムの野生型C57BL/6Jマウスを、処置当たり6匹のマウスで使用した。マウ
スはHarlan（ハーラン）（イスラエル）から得た。すべての動物の手技とケア技術は、ベ
ングリオン大学の研究での動物の倫理学的ケアおよび使用のためのネゲブ委員会により承
認を受けた。マウスは、アセトアミノフェン（N-アセチル-p-アミノフェノール）APAP（3
00mg/kg）の単回腹腔（i.p.）用量の投与の前に16時間断食した。APAP注射の4時間後、マ
ウスにビヒクル（PBS中20％DMSO）に溶解した試験化合物によりi.p.注入した。コントロ
ールマウスにはビヒクルのみを注射した。APAP注射の24時間後、マウスを犠牲にし、およ
び心臓から採血した。ヘパリンを血漿採取のための抗凝固添加剤として使用した。血漿サ
ンプルを4000gで室温にて10分間遠心分離した。ALTおよびASTレベルの測定のために上清
を回収した。酵素レベルは、Soroka's Biochemistry Medical Center（ソロカのバイオケ
ミストリー・メディカル・センター）の自動分析装置で測定した。
心臓壊死インビボモデル
【０３５７】
雄のBalb/cマウス（20-25g；Charles River（チャールズ・リバー）；Milan（ミラノ）
；イタリア）を制御された環境に収容し、および標準的なげっ歯類の餌および水を与えた
。
【０３５８】
公表された方法論（Yetら、2001）を用いて、マウスに30分間の心筋虚血および6時間の
再灌流を施した。調査群は、偽物、ビヒクルコントロール、およびインヒビター（n=8/群
、下記参照）からなった。簡潔には、ペントバルビタールナトリウム（60mg/kg体重）で
マウスを麻酔し、麻酔を維持するために必要に応じて追加用量を与えた。マウスに挿管し
、および100％酸素で機械的に換気した。マウスは、活性インヒビターの1-（2-（4-メチ
ルピペラジン-1-イル）-4,5-ジヒドロ-1H-イミダゾール-1-イル）プロパン-1-オン（M059
-0891）（30mg/kg）の最初のIV投与を受けて、およびその胸を開けた。インヒビターのIV
投与後20分に、冠動脈左前下行枝（LAD）を、LADにわたり通常位置付け左心房の先端から
1mmに配置したPE-10チュービングのセクションで8-0絹縫合糸を用いて結紮することによ
って虚血を開始した。30分間の閉塞の後、結紮を解放し、およびPE-10チュービングを取
り除くことによって再灌流を開始した。動物は、再灌流の開始時に2回目のIV用量のイン
ヒビター（30mg/kg）を受けた。次いで、胸壁を閉じ、動物を抜管し、および体温を37℃
の温かいプレートの使用により維持した。6時間の再灌流後、動物を形態損傷の決定のた
めに心臓の収集用に安楽死させた。AARの％である壊死領域を定量化した。
【０３５９】
実験群：合計で24匹のマウスを以下の群に割り当てた：
-虚血/再灌流+ビヒクル：LAD閉塞（30分）に続いて再灌流（6時間）に供したマウス（n
=8）。
-虚血/再灌流+化合物：上記のように説明の外科的処置を施し、およびマウス虚血開始
の前、および再灌流の開始時20分およびエラスターゼインヒビターで処置したマウス（IV
ボーラスを介して投与量を30mg/kg）（n=8）。
-偽物+賦形剤：LAD閉塞を除いて同一の外科的方法に供し、および実験期間中、麻酔下
に保たれたマウス（n=8）。
【０３６０】
すべての実験の終わりに、梗塞領域の評価のために動物を下記のように処理した。
梗塞サイズの決定。
【０３６１】
再灌流期間の後、1mL/kgの4％チオフラビンS溶液をIV注入して、非リフロー領域を描写
する。チオフラビンS溶液は、灌流された領域を蛍光として染色する蛍光黄緑色色素であ
り、非リフロー領域は暗く見える。5分後、LADを再閉塞し、およびAAR（青色色素を欠く
組織）を描写するために、IV注入によって0.6mLの50％Unisperse blue（ユニスパルス・
ブルー）（Ciba Geigy（チバ・ガイギー）、Hawthorne（ホーソーン）、NY）を与え、お
よび深部麻酔下で1mLのKCl（150mg/mL IV）で処置しマウスを安楽死させた。その後、心
臓を切除し、LVを4つの等しい厚さの横断切片に切断する。これらのスライスは、非リフ
ロー領域（暗領域）を決定するために紫外光（λ=254nm）および黄色フィルタを使用して
写真撮影し、および次いでハロゲン照明下でAARを識別する（染色されていない青色）。
次いで、梗塞領域を描写するために、スライスを1％トリフェニルテトラゾリウムクロラ
イド（TTC）中で37℃にて15分間インキュベートする。TTCは生存可能な心筋組織をブリッ
ク赤に染色し、および梗塞組織は白く見える。その後、心室スライスを再撮影する。非リ
フロー領域、AARおよび壊死領域を示す心臓スライスのデジタル写真を追跡し、および次
いでコンピュータ化された面積測定（planimetric）システムを用いてデジタル化する。
虚血領域および非虚血領域の面積が計算され、スライスのパーセンテージとして壊死およ
び非壊死組織の％と同様に表される。各スライスにおいての％にスライスの重みが乗算さ
れる。重量は各心臓について合計される。AAR（染色されてない青色領域）は、LV質量の
パーセンテージとして表される。壊死の程度は、LV質量のパーセンテージとして計算され
、および梗塞サイズは、AAR（梗塞サイズ=壊死の程度/AARの程度）のパーセンテージとし
て表される。
データ分析
【０３６２】
図およびテキストにおけるすべての値は、N回の観察の平均（SEM）の平均標準誤差とし
て表された。データは、一元配置ANOVA、続いて多重比較のためのBonferroni（ボンフェ
ローニ）post-hoc（事後）検定によって分析した。ノンパラメトリックデータはFisher's
exact（フィッシャー直接）検定を用いて分析した。0.05未満のp値は有意であるとみな
される。*p<0.05対偽物。*p<0.05対I/R
統計分析
【０３６３】
特に明記しない限り、各実験は3回実施し；各試料を少なくとも二連で試験した。結果
は平均±SEを示す。統計分析はStudent’s T-test（スチューデントのT検定）を用いて行
った。NSSの値は、Microsoft Windows(R)（マイクロソフト・ウインドウズ（商標））ソ
フトウェア用のSPSSを使用したノンパラメトリックマンホイットニー検定で解析される。
有意性はP<0.05に設定した。
例1
壊死は細胞内エラスターゼ様タンパク質分解活性の誘導を伴う
【０３６４】
壊死が細胞内タンパク質分解活性の誘導を伴うか否かを決定するために、第1の実験を
行った。U-937細胞における壊死は、KCNによる処理によって誘導され、それは化学的低酸
素症（chemohypoxia）を引き起こして細胞を死滅させる。U-937細胞におけるKCN誘発壊死
の用量および時間依存動力学を図1に示す。
【０３６５】
エラスターゼ様タンパク質分解活性の活性化が壊死細胞死プロセスの間に起こることを
さらに確証するために、KCN処理U-937細胞から調製した細胞抽出物において、コントロー
ルと比較してMAAPV、エラスターゼ特異的基質を用いてその活性を定めた。壊死のどの段
階でエラスターゼ様酵素が活性化されたかを見るために、KCNで異なる時間間隔で処理し
たU937細胞から調製した溶解液中で酵素アッセイを行った。図2は、10mMのKCNによる処理
によって誘導されたタンパク質分解活性の時間依存誘導を示す。見られるように、エラス
ターゼ様活性も10分以内に劇的に上昇し、およびその活性が7倍上昇したとき15分以内に
最大に達した。エラスターゼ活性の増加は細胞死の形態学的徴候が観察される前に検出さ
れた。
【０３６６】
エラスターゼ様誘導活性は、異なるプロテアーゼインヒビターを用いてさらに特徴付け
られた。100μM濃度でのEIIIIはコントロール細胞のエラスターゼ活性にわずかな効果を
有した；しかし、それは壊死誘導活性を十分に抑制した。抑制は用量依存的であり、IC50
は2.735μMを有した（図3）。これらの結果は、U-937細胞における壊死に関連する誘導タ
ンパク質分解活性がセリンプロテアーゼ活性と適合性であることを示した。
【０３６７】
本発明者らはまた、どの壊死段階において、カテプシンCのエラスターゼの活性化酵素
が活性化されたかを知りたかった。この目的のために、酵素アッセイを、異なる時間間隔
で10mMのKCNで処理した細胞の溶解物において行った。図2は、10mMのKCNによる処理によ
って誘導されたタンパク質分解活性の時間依存的誘導を示す。見られるように、すでに10
分の処置後、カテプシンC様活性は4倍だけ上昇し、およびその最大に達した。
【０３６８】
エラスターゼ様タンパク質分解活性の誘導（分、図2）および壊死過程の進行（時間、
図1）の時間スケールにおける非常に大きな差異は、タンパク質分解活性が壊死経路の初
期分子ステップの一部分であるという仮説を導いた。この仮説を試験するために、エラス
ターゼ様酵素の発現の抑制および下方制御のために、および壊死過程に対するそれらの効
果を調べるために、異なる方法を利用した（以下の例2および3参照）。
例2
カテプシンC、CELA3AおよびCELA1のためのsiRNAによるトランスフェクションは、壊死
誘導細胞死に対して保護する
【０３６９】
壊死プロセスの初期段階で活性化される酵素（群）を特徴付ける試みにおいて、本発明
者らは、異なるプロテアーゼに対するsiRNAのライブラリーを利用した。トランスフェク
ションは合計93のプロテアーゼに対するsiRNAを用いて実行した。
【０３７０】
図4A~Bは、CELA1またはCELA3AのsiRNAでのU-937細胞のトランスフェクションが、KCNと
の7時間のインキュベーション後のLDH放出での安定で、および有意な減少をもたらしたこ
とを示す。CELA1またはCELA3Aのいずれか単独によるトランスフェクションは部分的な保
護を引き起こしたが、その一方、CELA1およびCELA3Aの両方に対するsiRNAの組合せによる
トランスフェクションは壊死に対して十分な保護を提供した。
【０３７１】
CELA1およびCELA3AのsiRNAに加えて、他のプロテアーゼのsiRNAsも試験した。中でもカ
テプシンA、B、C、D、E、G、H、K、L1、L2、O、S、WおよびZ、セリンプロテアーゼHNE、H
trA、キモトリプシンC、CELA 2AおよびCELA 3B、マトリクスメタロペプチダーゼ7、11、1
2、21および25がある。結果は、カテプシンCに対するsiRNAも、壊死に対して保護効果を
示したことを示す（図4A）。合計で90個のプロテアーゼに対するsiRNAsを用いたトランス
フェクションは、KCN誘導性細胞死に対するいかなる防御も与えることができなかった。
【０３７２】
特定のsiRNAsの効果がU-937細胞に特異的でないことを確かめるために、これらの実験
をPC12細胞で繰り返した（図4C）。
【０３７３】
PC12細胞による比較実験は、カテプシンC、CELA3AおよびCELA1についてのsiRNAが各々
、シアン化物誘導細胞死に対してU-937およびPC12細胞での有意な保護効果を有すること
を示した。また、siRNAおよびHiPerFectのトランスフェクション試薬（コントロール処理
）の混合物は、細胞にとって毒性でないことも見ることができた。さらに、壊死の間の初
期のカテプシンCの活性化は、小分子カテプシンCインヒビターによる壊死の抑制と同様に
示された。結果はまた、上記の酵素の活性の抑制が細胞死での減少に関係することを示し
た。結果は、これらの酵素が、壊死性細胞死を制御/調節するための標的として役立つ可
能性があることを示した。
例3
カテプシンC、CELA1および/またはCELA3AについてsiRNAによるトランスフェクションは
特異的抑制を導く
【０３７４】
特定のsiRNAsの保護効果が標的酵素の転写の停止に起因するものであり、および何らか
のオフターゲット効果によるものではないことを確実にするために、本発明者らは、カテ
プシンCおよびエラスターゼ様活性が特異的siRNAsによりトランスフェクトされた細胞に
おいて抑制されたことを示すために酵素的なアッセイを実行した。効果的なサイレンシン
グの追加的な支持のために、指定されたタンパク質についてウエスタンブロット分析を行
い、およびサイレンシングされた酵素の発現が実際に抑制されたことを示した。
【０３７５】
図5A-Bは、カテプシンC、CELA1およびCELA3AについてのsiRNAsが、細胞溶解物の適切な
酵素活性の安定した、および有意な低下を引き起こすことを示す。さらに、エラスターゼ
CELA1およびCELA3Aに対するsiRNAによるトランスフェクションは、カテプシンC活性に影
響を及ぼさず、効果の特異性がさらに支持された。この実験は、特定のsiRNAsでの処置の
保護効果が、酵素のダウンレギュレーションに起因し、および他の非標的効果に起因しな
いことを示した。これらの結果は、カテプシンCがプログラムされた壊死性細胞死に必須
であることをさらに示した。
【０３７６】
さらに、図4Aおよび図5A-Bの両方の組み合わされた結果は、これらの特異的酵素（CELA
3AおよびCELA1）の活性が抑制される条件下では（図5A-B）、壊死のプロセスは抑制され
（図4A）、これらの酵素の活性をブロックすることは細胞死の抑制を引き起こすことを意
味する。
【０３７７】
したがって、これらの研究は酵素が壊死の抑制のための有効な標的であるという基礎を
提供する。まとめると、特異的CELA3AおよびCELA1インヒビターは他のエラスターゼのイ
ンヒビターではなく、壊死性細胞死を抑制することができることが示唆される。
例4
カテプシンC、CELA3AおよびCELA1インヒビターは壊死性細胞死の抑制をもたらす
【０３７８】
図6は、カテプシンCインヒビター（Gly-Phe-DMK、MP Biomedicals、USA）がPC12中のKC
Nによって誘発された壊死を抑制することができたことを示す。インヒビターの添加は、L
DH放出の用量依存的な減少によって明らかにされるように、細胞壊死を抑制した。再度、
図5A-Bおよび図6の結果は、カテプシンCが抗壊死性薬剤についての標的を提供することが
できたことを意味した。
【０３７９】
エラスターゼ様活性を壊死性の死経路と関連付ける本仮説の直接の結果は、このタンパ
ク質分解活性の抑制が壊死性細胞死プログラムの実行を遅延または防止することである。
この仮説を試験するために、壊死性細胞死に対する透過性エラスターゼインヒビターの効
果を研究した。EI IIおよびIIIは、LDH放出によって評価されるように、PC12細胞におけ
るKCN誘発細胞死を用量依存的様式において抑制した（図7AおよびB）。非細胞透過性エラ
スターゼインヒビターのエラスタチナール（elastatinal）は、KCN誘発性壊死を受ける細
胞に対して保護効果を有さなかった（データ示さず）。
【０３８０】
CELA3Aインヒビターは3D構造類似性およびトポロジカルな類似性に基づいて合成した。
これらは抗壊死性防御を与える能力について試験された。いくつかの結果の代表例をテー
ブル2に示す。KCN誘発壊死に対する保護は、最大0.1nMまでの様々な濃度で観察された（
テーブル2）。CELA1の2つの小分子インヒビターは同様に壊死を抑制することができ、そ
の上、ある種の化合物、たとえば、テーブルに挙げられた最後の3つの化合物は、著しく
高い濃度で保護を与えた。
【０３８１】
【表２−１】
2020183405.tif 000039
【表２−２】
2020183405.tif 000040
【表２−３】
2020183405.tif 000041
【０３８２】
それら自体で不活性であった高濃度（最大300μM）の非特異的エラスターゼインヒビタ
ーEI IIおよびIIIへのPC-12細胞の曝露は、KCNによって誘発された壊死を有意に抑制する
ことを観察することができる。しかし、小分子CELA3Aインヒビターが数桁低い濃度で有効
であったことも同様に容易に見ることができる。壊死の防止/処置におけるCELA1-およびC
ELA3A-特異的抑制の予想外の増強された活性は、これらの2つの独特の標的、およびそれ
によってそれらと構造的に関連する標的の重要性を強調する。
例5
エラスターゼインヒビターの保護効果は、膜破壊を防止するよりも、KCN処理細胞の救
済に現れる。
【０３８３】
エラスターゼインヒビターの細胞への保護効果が、虚血後の長期間にわたって維持され
ているかどうかを調べるために、本発明者らは動態学試験を行った。5時間のKCNインキュ
ベーション後、培地をKCNまたはエラスターゼインヒビターを含まない通常のDMEMに交換
し、およびインキュベーションを48時間まで進行させた。細胞の生存は、膜の完全性より
は細胞代謝活性を測定するXTT法によって評価した。この結果は、細胞が不可逆的な損傷
なしに5時間のKCN処理で生存したことを示す。それらは、KCN処置の48時間後に十分な回
復を示す（図7C）。これらの結果は、エラスターゼインヒビターが長期間にわたる保護効
果を提供することを実証するので、臨床的意義がある。例えば、MIまたは脳卒中のような
虚血性ストレス後の治療域（therapeutic window）中にエラスターゼインヒビターで処置
された組織を保存することができた。
例6
エラスターゼインヒビターがインビボでの壊死に及ぼす影響
【０３８４】
上記有望な結果を考慮して、インビボでの壊死プロセスに対するエラスターゼインヒビ
ターの効果の評価を試験した。研究された最初のインビボモデルは、外傷性脳損傷であっ
た（図8）。まず、エラスターゼインヒビターIIおよびIIIならびにビヒクルのコントロー
ルマウスに対する効果を調べた。マウスはNSS 0ないし1および壊死性脳組織なしで健康で
あることが判明した。図8A-Bは、エラスターゼインヒビターIIまたはIII処置マウスにお
ける、未処理の外傷を受けた動物と比較したニューロン損傷の減少および壊死空間の減少
を示す。神経学的状態を、神経学的重症度スコアを用いて評価した。EIs IIおよびIIIは
、損傷後1時間で測定したとき神経学的損傷を有意に減少させる。図8Bは、TTC染色によっ
て測定したとき外傷を負ったマウスにおける壊死空間の量を示し；エラスターゼインヒビ
ターによる処置は、損傷した半球の50から25％までに壊死組織の空間を明らかに縮小させ
た。好中球エラスターゼノックアウトマウスでインヒビターの効果を試験した場合、実質
的に同じ結果が得られた（図8B）。図8A-Bに示すデータに加え、野生型Sprague Dawley（
スプラーグドーリー）ラットについても同じ実験を行い、同様の結果が得られた（データ
は示していない）。
【０３８５】
まとめると、図4A-C、7A-Bおよび8A-Bに提示される結果は、壊死性傷害を減弱させるエ
ラスターゼインヒビターの使用を支持する。興味深いことに、壊死の発生および正常とノ
ックアウトのマウスの間の処置に対する反応に差異はなく、好中球エラスターゼがこれら
の2つの過程において何らの役割も果たさないことを示す。
【０３８６】
さらに、CELA3Aまたは構造的に関連する酵素の選択された特異的に強力なインヒビター
を、壊死の追加のモデルにおいてインビボで試験した。以前に記載されたそのような活性
小分子インヒビターは、3D構造類似性およびCELA3A酵素のトポロジカルな類似体に基づく
CELA3Aインヒビターのライブラリーをスクリーニングすることによって見出された。これ
らの化合物のインビトロ活性を以下に示し、例7参照。化合物Z601-4253（2-（ピペリジン
-1-イル）チアゾール-4-イル）（ピロリジン-1-イル）メタノネン、それは活性化合物の2
-アミノチアゾールグループに属し、それを肝臓毒性に対する保護について試験した。
【０３８７】
本発明者らは、APAP肝毒性に対する抗壊死剤としてのこの化合物の可能性を評価した。
この目的のために、本発明者らは、肝細胞死に関する血清生化学マーカーのレベルでの変
化、すなわちALTおよびASTの変化を調べた。
【０３８８】
図9に示すように、300mg/kgのAPAPによるマウスの処置は、酵素レベルにおいて有意な
増加を生じさせ、パラセタモール投与の24時間後に血液中の肝酵素レベルが測定された。
APAPのみで処置したマウスのALTレベルは8220±413U/Lであり、およびそれらのASTレベル
は3553±290U/Lであった。偽物、コントロールおよび化合物単独では、ALTは2％未満であ
り、およびASTは4％未満であった。パラレルコントロールは、対応するAPAP処理から減少
させた。APAPの投与の4時間後にIP注射した化合物Z601-4253は、血液中の両肝酵素のレベ
ルを用量依存的様式で有意に低下させ、パラセタモール誘発毒性に対して保護する。
【０３８９】
研究された別のモデルは、心筋虚血/再灌流傷害のネズミインビボモデルであった（図1
0）。2-（4-（4-メチルピペラジン-1-イル）-4,5-ジヒドロ-1H-イミダゾール-1-イル）プ
ロパン-1-オン（M059-0891）の活性化合物、1-アミノイミダゾリンシリーズに属するもの
を研究した。結果は、インヒビターによる壊死および梗塞サイズの著しい減少を示す。
例7
本発明に従い使用するための具体的化合物のための包括的合成方法
【０３９０】
以下に提供するスキーム1は、2-アミノイミダゾリン化合物の調製のための一般的な合
成方法を記載しており、テーブル3は、指示された変数のための具体的な置換基を提供す
る。
【０３９１】
【化３２】
2020183405.tif 000042
【表３】
2020183405.tif 000043
【０３９２】
一定の2-アミノイミダゾリン化合物の調製を、塩化メチレン中、2-チオメチルジヒドロ
イミダゾールヨウ化水素酸塩（ヒドロヨージド）（1.550gm（グラム）、0.0063モル）お
よびジイソプロピルエチルアミン（2.2当量）の混合物（15ml）に、室温で攪拌し、およ
びプロピオン酸無水物で処理し調製することによって達成された。混合物を室温で一晩撹
拌した。反応混合物を濃縮し、および塩化メチレンおよび水（それぞれ20ml）で希釈した
。塩化メチレン層を分離し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、および濃縮してN-プロパノイル
-2-チオメチルジヒドロイミダゾール（1.2gm）を得た。t-ブタノール（12ml）中のN-プロ
パノイル-2-チオメチルジヒドロイミダゾール（400mg）および1-メチルピペラジン（3当
量）の混合物を3日間還流し、次いで濃縮し、シリカゲルカラム上で20-30％メタノール-
塩化メチレンを用いて溶出し、出発物質（210mg）と共に化合物1（50mg）を与えた。1HNM
R（DMSo-D6）：0.99（t、J=8Hz、3H）、2.16（s、3H）、2.32（q、J=8Hz、2H）、2.49（m
、4H）、3.04）、3.39（t、J=8Hz、2H）、3.81（t、J=8Hz、2H）。LCMS m/z 225.0[M+1]
。この合成手順は、上に概略的に示された方法Aに従う。
【０３９３】
一定の2-アミノイミダゾリン化合物の調製は、メタノール（15ml）中の2-チオメチルジ
ヒドロイミダゾールヨウ化水素酸塩（1.1gm）および1-メチルピペラジン（1.5当量）の混
合物を、反応が完了するまで還流し（6-18時間）、次いで濃縮し、および塩化メチレン（
20ml）に溶解し、およびトリエチルアミン（2当量）および無水プロピオン酸（1.25当量
）で処理し、調製することによって達成した。混合物を室温で1時間撹拌した。次いで、
反応混合物を濃縮し、および10-30％メタノール-塩化メチレンを用いてシリカゲルカラム
上で精製して化合物1（780mg）を与えた。0.1％TFA-水を用いて化合物1（0.5gm）をC-18
カラム上でさらに精製して化合物1のTFA塩（280mg）を与えた。1HNMR（CDCl3）：1.17（t
、J=8Hz、3H）、2.38（s、3H）、2.49（q、J=8Hz、2H）、2.54(m、4H)、3.32(m、4H)、3.
61(t、J=8Hz、2H)、3.93(t、J=8Hz、2H)；LCMS m/z 225.0[M+1]。この合成手順は、上に
概略的に示された方法Bに従う。
【０３９４】
方法Aの合成手順に従い、以下の特性を有する化合物2（M059-0851）をまた合成した：1
HNMR(DMSO-d6):0.98(t、J=8Hz、3H)、1.50-1.83(m、8H)、2.30(q、J=8Hz、2H)、2.34-2.3
7(m、4H)、3.03-3.05(m、4H)、3.12-3.16(m、1H)、3.39(t、J=8Hz、2H)、3.84(t、J=8Hz
、2H)；LCMS m/z 279.1[M+1]。
【０３９５】
方法Aの合成手順に次いで、化合物3のTFA塩（M059-0032）を合成し、続いてC-18カラム
精製を行い、以下の特性を生成した：1HNMR(DMSO-d6):1.82-1.90(m、2H)、1.96-2.03(m、
2H)、3.33-3.37(m、2H)、3.50-3.54(m、2H)、3.71(t、J=8Hz、2H)、4.39(t、J=8Hz、2H)
、6.81-6.82(m、1H)、7.50(d、J=Hz、1H)、8.11(m、1H)、9.84(s、1H)；LCMS m/z 234.0[
M+1]。
【０３９６】
方法Aの合成手順に続いて、化合物4のTFA塩（M059-0055）を合成し、以下の特性を生成
した：1HNMR(DMSO-d6):1.08-1.83(m、8H)、1.81-1.85(m、4H)、2.15-2.22(m、1H)、2.59(
d、J=8Z、2H)、3.38-3.41(m、4H)、3.36(t、J=8Hz、2H)、4.17(t、J=8Hz、2H)、9.47(s、
1H)；LCMS m/z 250.1[M+1]。
【０３９７】
方法Aの合成手順に続いて、化合物5（M059-0082）を合成した。方法Aの合成手順に続い
て、1HNMR(DMSO-d6):1.48-1.74(m、8H)、1.85-1.90(m、4H)、2.49-2.56(m、1H)、3.18-3.
23(m、2H)、3.34-3.40(m、6H)；LCMS m/z 236.1[M+1]である。
【０３９８】
化合物6（M059-0053）および化合物7（M059-0335）は、方法Aに従って、化合物4と同様
のプロトコールで調製した。
【０３９９】
化合物8（Z601-4253）は、2-ピペリジノ-1,3-チアゾール-4-カルボン酸およびピロリジ
ンから、塩化メチレン中、DCC、トリエチルアミンおよびDMAPの存在下で調製した。
【０４００】
以下に示すスキーム2は、2-アミノイミダゾリン化合物の調製のための包括的な合成方
法を記載しており、テーブル3は、指示された変数のための具体的な置換基を提供する。
【０４０１】
【化３３】
2020183405.tif 000044
【０４０２】
化合物9（M008-0111）および10（4112-3656）を、対応するブロモアセトフェノンおよ
びアミンから、スキーム2に記載の方法に従って調製した。
【０４０３】
以下に示すスキーム3は、2-アミノイミダゾリン化合物の調製のための包括的な合成方
法を記載する。
【０４０４】
【化３４】
2020183405.tif 000045
【０４０５】
スキーム3に従い、商業上入手可能な5-イソプロピル-3-ピロリジン-2-イルイソオキサ
ゾールおよびシクロプロパンカルボン酸から塩化メチレン中、DCC、トリエチルアミンお
よびDMAPの存在下で化合物11（Z632-2266）を調製した。
【０４０６】
以下に提供されるスキーム4は、ここに記載されるように使用する具体化化合物/化合物
群のための追加の包括的合成手順を記載する：
【０４０７】
スキーム4：
【化３５】
2020183405.tif 000046
【０４０８】
以下に提供されるスキーム5は、ここに記載の使用のための具体化化合物/化合物群のた
めの追加の包括的合成手順を記載する：
【０４０９】
【化３６】
2020183405.tif 000047
【０４１０】
以下に提供されるスキーム6は、ここに記載の使用のための具体化化合物/化合物群のた
めの追加の包括的合成手順を記載する：
【０４１１】
【化３７】
2020183405.tif 000048
【０４１２】
以下に提供されるスキーム7は、ここに記載の使用のための具体化化合物/化合物群のた
めの追加の包括的合成手順を記載する：
【０４１３】
【化３８】
2020183405.tif 000049
【０４１４】
以下に提供されるスキーム8は、ここに記載されるような使用のための具体化された化
合物/化合物群のための追加の包括的合成手順を記載する。提供される参考文献はまた、
その全体が参照によりここに十分に組み込まれる。
【０４１５】
【化３９】
2020183405.tif 000050
【０４１６】
以下に提供されるスキーム9は、ここに記載されるような使用のための具体化された化
合物/化合物群のための追加の包括的合成手順を記載する：
【０４１７】
【化４０】
2020183405.tif 000051
【０４１８】
簡潔には、PMRスペクトルを300MHz Bruker DPXに登録し、およびBruker XWinNMRソフト
ウェアを用いて処理した。すべての商業的に入手した試薬をさらに精製することなく使用
した。
【０４１９】
化合物3。化合物1（0.1モル）を、化合物1（0.1モル）とエーテル（100ml）の混合物に
加えた。混合物を28-30℃で12時間撹拌し、および次いで5℃に冷却した。形成された沈殿
物をろ過によって集収し、水で洗浄し、乾燥させ、およびエタノールから結晶化して純粋
な反応生成物3を70-75％の収率で与えた。
【０４２０】
化合物4。化合物3（0.1モル）を、水（200ml）でのNaOH（0.25モル）およびエタノール
（5ml）の溶液に懸濁させた。固体が完全に溶解するまで混合物を90℃で撹拌した。得ら
れた溶液を室温まで冷却し、および酢酸で注意深く酸性化した。生成した沈殿物をろ過に
より集収し、水で洗浄し、乾燥させ、およびジオキサンから結晶化させて純粋な反応生成
物4を75-80％の収率で与えた。
【０４２１】
化合物5。1mmolの酸4を、5mlの乾燥DMF中のCDI（0.95mmol）の溶液に添加した。混合物
をガスが形成されている間に80℃で2時間撹拌した。次いで、1mmolのアミンHNR2aR2bを反
応混合物に加え、3-4時間還流し、および室温で一晩放置した。次いで、混合物を水（10m
l）に注ぎ、形成された沈殿物をろ過により集収し、プロパノール-2からの結晶化により
精製して、純粋な反応生成物5を40-85％の収率で与えた。
【０４２２】
また、スキーム10を参照する：
【化４１】
2020183405.tif 000052
【０４２３】
提供される参考文献は、その全体がここに十分に組み込まれる。
【０４２４】
当業者は、上記の合成方法が、テーブル1に記載されるような化合物を調製するために
、またはここに提供される任意の式によって規定されるようにどのように修飾されること
ができるかを理解するであろう。
例8
3D構造の類似性およびトポロジカルな類似性に基づいてCELA3AおよびCELA1インヒビタ
ーのライブラリーをスクリーニングすることによって見出された活性小分子インヒビター
のリスト
【０４２５】
以下の化合物をベンダーChemDiv Inc.（San Diego、USA）によって調製し、およびそれ
らのそれぞれのChemDiv I.D.ナンバーを以下のテーブル4に示す。
【０４２６】
【表４−１】
2020183405.tif 000053
【表４−２】
2020183405.tif 000054
【表４−３】
2020183405.tif 000055
壊死性細胞死のインヒビター
【０４２７】
これらの化合物を、PC12細胞においてKCNによって誘導された壊死を抑制するそれらの
能力について試験した。この系における細胞死の壊死モードは、以前に記載されたように
検証された。結果を以下のテーブルに示す。PC12細胞に上記のようにKCNをチャレンジし
た。LDH放出法を用いて評価したKCN誘発性壊死に対する化合物の保護効果を以下のテーブ
ル5に示す。これらのインヒビターのIC50値は、数十から単一ナノモルの範囲にある。
【表５】
2020183405.tif 000056
考察
【０４２８】
壊死性細胞死を防止または処置することができないことは未解決の問題である。本発明
者らは、siRNAによって、または特異的エラスターゼ低分子インヒビターによるエラスタ
ーゼ様活性の低下が、壊死性細胞死を受けた細胞に対する保護を与えることを示した。保
護効果は異なる方法によって検証された。エラスターゼインヒビターが細胞を死から保護
する能力は、オリゴマイシンAの存在下で、KCNでのか、または以前は抗Fasおよびスタウ
ロスポリンによる処置後に観察されたように、細胞死誘発とは無関係であるように思われ
る。異なるクラスのペプチドおよび複素環式エラスターゼインヒビターは、保護を付与す
ることができ、その効果は化合物に特異的でないことが示された。この死のプロセスにお
ける細胞内エラスターゼの役割に対するさらなる支持は、壊死細胞の細胞抽出物における
エラスターゼ様活性の早期増加によってもたらされ、明らかな壊死性細胞死の兆候の前に
起こる。活性における増加は、特定の基質を用いたエラスターゼ様活性の測定によって確
認された。また、透過性エラスターゼインヒビター（EI IIおよびEI III）によるインタ
クトな細胞の処理は、細胞における酵素活性の誘導を無効にした。壊死中のエラスターゼ
様活性の誘導に必要な短い時間は、酵素が壊死プロセスの初期段階、おそらく最終的に細
胞死に至る分子事象のカスケードにおける初期段階のタンパク質分解活性化因子として作
用することを示す。壊死におけるエラスターゼのこの役割は、細胞死プロセスにおけるタ
ンパク質分解カスケードの既知の関与と一致する。したがって、エラスターゼ様活性の早
期の顕著な誘導および細胞死を防止するエラスターゼインヒビターの能力は、壊死プロセ
スにおけるエラスターゼ様酵素の重要な役割を支持する。
【０４２９】
マウスおよびラットにおける閉鎖頭部損傷（外傷）モデルを用いて、インビボでの脳細
胞壊死損傷を防止するエラスターゼインヒビターの能力が示された。エラスターゼインヒ
ビターの投与後の神経機能の改善（NSSでの減少）は、神経機能の低下が最も顕著であっ
たとき、外傷後1時間に主に観察された。TTC染色によって明らかにされるような壊死領域
の発生に対する保護効果は、外傷後24時間でさえ顕著であった。脳薄片のTTC染色は印象
的な画像を明らかにし：エラスターゼインヒビターは脳組織の最大60％までを保護し、そ
れはそうでなければ壊死を発症すると思われた。
【０４３０】
罹患組織、たとえば、心筋梗塞からなどのようなものは、事象後4-12時間以内に壊死を
生じる。同様に、脳卒中の場合、梗塞後数時間最大で24時間以内に壊死が発生し、脳組織
に修復不能な損傷を引き起こす。事象直後のエラスターゼインヒビターによる処置は壊死
の発生を防止する。したがって、本研究は明らかに治療的処置を表す。
【０４３１】
本研究では、エラスターゼインヒビターが免疫細胞の活性または寄与とは無関係に壊死
性細胞死を抑えることが明らかに示された。この実験系では、HNEを放出することができ
る好中球またはグリア細胞を欠く細胞モノカルチャーを利用した。注目すべきは、本研究
で使用されるPC12細胞系はニューロン起源であり、および好中球エラスターゼを欠く。さ
らに、累積的にこれらの結果は、遍在性エラスターゼ様酵素が壊死性細胞死の開始に関与
していることを示す。したがって、インビボでのエラスターゼインヒビター施与後のNSS
での改善は、ニューロン細胞に存在する細胞内エラスターゼ様酵素の抑制の結果である可
能性が高い。このことは、免疫優先的部位（immune preferred site）における外傷後の
回復の初期段階中に、有意な好中球浸潤はなく、およびそれによって好中球エラスターゼ
の抑制による混乱効果が最も起こりにくいという事実に起因する。この概念は、NEノック
アウトマウスが壊死に対するエラスターゼインヒビターの保護効果に応答することを示す
結果によって裏付けられる。
【０４３２】
結論として、特定の細胞透過性エラスターゼインヒビターが壊死性細胞死を防止するこ
とが初めて示された。これらのインヒビターは、壊死性傷害の発症前の細胞死の予防に使
用することができ、驚くべきことにここで行われた研究から生じる保護作用である。この
治療上のアプローチは、脳卒中または心筋梗塞のリスクが高い患者の処置に特に有用であ
ることができる。
【０４３３】
エラスターゼインヒビターが細胞を死から保護する能力は、細胞死の引き金とは無関係
であるようであり、およびインビトロおよびインビボで記録された。さらに、siRNAサイ
レンシングにより、標的のより一層特異的な識別が可能にされた。
【０４３４】
提示された模範的な活性化合物のリストは、CELA3Aまたは同様の酵素との構造的類似性
およびトポロジカルな類似性を有する分子を有する。これらの化合物はすべて、アッセイ
において壊死を抑制することが見出された。すべての化合物は、著しい保護を1μM以下の
濃度で与えることができた。
【０４３５】
高濃度（最大300μM）の非特異的エラスターゼインヒビターEI IIおよびIIIは、それら
自体で不活性であり、それらへのPC-12細胞の曝露は、KCNによって誘発された壊死を著し
く抑制することが既に観察された。しかしながら、開示された小分子インヒビターが数桁
低い濃度で有効であったことも同様に容易にわかる。非特異的なインヒビターに対する特
異的なインヒビターの優越性のこの予期しない表示は、特異的な標的化の重要性を裏付け
る。
【０４３６】
罹患組織、たとえば、心筋梗塞からなどのようなものは、事象後4-12時間以内に壊死す
る。同様に、脳卒中の場合、梗塞後数時間以内最大で24時間で壊死が発生し、脳組織に修
復不能な損傷を引き起こす。事象直後のエラスターゼインヒビターによる処置は壊死の発
生を防止する。これは、3D構造類似性およびトポロジカルな類似性に基づいたCELA3Aイン
ヒビターのライブラリーをスクリーニングすることによって発見された特異的小分子イン
ヒビターの注入がAPAP投与の4時間後に投与されたときでも肝臓毒性に対して保護するこ
とを示す結果によってさらに裏付けられる。MIの処置は、スクリーニングによって発見さ
れた別の小さなインヒビターによる梗塞サイズでの約30％の減少を示すことによっても支
持される。したがって、本研究は明らかに治療的処置の可能性を示す。
【０４３７】
本発明をその特定の実施形態と共に説明したが、当業者には多くの代替物、修飾および
変形が容易に見えることは明らかである。したがって、添付の請求の範囲の精神および広
い範囲内に入るそのような代替、修飾および変形のなどのようなもののすべてを包含する
ことが意図される。
【０４３８】
ここに言及されるすべての刊行物、特許および特許出願は、個々の刊行物、特許または
特許出願のそれぞれが、ここに参考として組み込まれることが具体的に、および個別に示
されているのと同程度に、本明細書中に、同じ範囲にまで受け継がれ、ここにそれらの全
体が組み込まれる。さらに、本出願における任意の参考文献の引用または識別は、そのよ
うな参照が本発明の先行技術として利用可能であることを認めるものと解釈されてはなら
ない。セクション見出しが使用される限り、それらは必ずしも制限的であると解釈される
べきではない。
【図１】
2020183405.tif 000080
【図２】
2020183405.tif 000081
【図３】
2020183405.tif 000082
【図４Ａ】
2020183405.tif 000083
【図４Ｂ】
2020183405.tif 000084
【図４Ｃ】
2020183405.tif 000085
【図５Ａ】
2020183405.tif 000086
【図５Ｂ】
2020183405.tif 000087
【図６】
2020183405.tif 000088
【図７】
2020183405.tif 000089
【図８】
2020183405.tif 000090
【図９】
2020183405.tif 000091
【図１０】
2020183405.tif 000092
【図１１】
2020183405.tif 000093
【配列表】
2020183405000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年8月5日(2020.8.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式II：
【化１】
2020183405.tif 000094
式II
の構造によって特徴付けられ、
式中、G1は、置換または非置換ピロリジン、置換または非置換ピリジン、置換または非置換アリール、置換または非置換ピペリジン、置換または非置換ピペラジン、置換または非置換イミダゾリジン、または置換または非置換ピラゾリジンであり；および
G3は以下の構造：
【化２】
2020183405.tif 000095
によって特徴付けられるか；またはG3は、置換または非置換のアルキル、置換または非置換のアリールまたは置換または非置換のシクロアルキルであり；
式中、G2は、置換または非置換のアルキル、置換または非置換のアリール、置換または非置換のシクロアルキルまたは置換または非置換の複素環である、化合物；またはその薬学的な塩であり、
前記化合物は、CELA3Aまたはそれらに構造的に関連する酵素、CELA1またはカテプシンCまたはそれらの組合せにKd10-7Mまたはそれよりも少ない最小親和性を伴い選択的に結合する、化合物。
【請求項２】
前記化合物は、（2-（ピペリジン-1-イル）チアゾール-4-イル）（ピロリジン-1-イル）メタノン；N-（4-メチルピリジン-2-イル）-4-（2,4,5-トリメチルフェニル）チアゾール-2-アミン；またはそれらの薬学的な塩である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記化合物は、CELA2A、CELA3B、またはカテプシンA、B、D、E、G、H、K、L1、L2、O、S、WまたはZまたはそれらの組合せに最小親和性Kd10-6Mまたはそれよりも多くを伴い結合する、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
式II：
【化３】
2020183405.tif 000096
式II
の構造によって特徴付けられ、
式中、G1は、置換または非置換ピロリジン、置換または非置換ピリジン、置換または非置換アリール、置換または非置換ピペリジン、置換または非置換ピペラジン、置換または非置換イミダゾリジン、または置換または非置換ピラゾリジンであり；および
G3は以下の構造：
【化４】
2020183405.tif 000097
によって特徴付けられるか；またはG3は、置換または非置換のアルキル、置換または非置換のアリールまたは置換または非置換のシクロアルキルであり；
式中、G2は、置換または非置換のアルキル、置換または非置換のアリール、置換または非置換のシクロアルキルまたは置換または非置換の複素環である、化合物；またはその薬学的な塩の有効量を含み、および随意に薬学的に許容可能な担体または賦形剤をさらに含む、薬剤組成物。
【請求項５】
抗アポトーシス剤または抗加齢剤がさらに含まれる、請求項４の組成物。
【請求項６】
細胞または組織壊死の処置または防止における使用のためのものである、請求項４の組成物。
【請求項７】
前記使用はエクスビボまたはインビトロである、請求項６の組成物。
【請求項８】
前記細胞または組織壊死を処置または防止することは、脳細胞、神経細胞、プルキンエ細胞、海馬錐体細胞、グリア細胞、心筋細胞、筋細胞、ケラチノサイト、表皮細胞、骨または軟骨細胞、膵臓細胞、肝細胞、腎臓細胞、消化管細胞、脾臓細胞、造血細胞、リンパ球、マクロファージ胸腺細胞、線維芽細胞、上皮細胞、気管支上皮細胞、腎細胞、糸球体細血管細胞、性腺細胞、精子、卵子、受精卵、胚細胞および肺上皮細胞からなる群より選ばれる細胞に影響を及ぼす、請求項６に記載の使用のための組成物。
【請求項９】
細胞または組織壊死を処置または防止することは、次の：神経変性疾患、黄斑変性症、網膜壊死、筋ジストロフィー、白血病、リンパ腫、呼吸窮迫、窒息、嵌頓ヘルニア、糖尿病、結核、子宮内膜症、脈管ジストロフィー、乾癬、寒冷傷害、鉄負荷合併症、ステロイド処置の合併症、虚血性心疾患、心筋梗塞、再潅流傷害、脳血管疾患または壊疽の損傷、褥瘡性潰瘍、膵炎、肝炎、硬変、ヘモグロビン尿、敗血症、熱傷、高熱、クローン病、セリアック病、コンパートメント症候群、壊死性直腸炎、スティーブンス・ジョンソン症候群（SJS）、中毒性表皮壊死（TEN）、嚢胞性線維症、関節リウマチ、骨髄炎、壊死性筋膜炎、腎毒性、脊髄損傷、糸球体腎炎、急性尿細管壊死、腎皮質壊死、変形性関節症、チロセミア、代謝性遺伝性疾患、細菌性、ウイルス性、真菌性または寄生虫感染、アンダーソン病、先天性ミトコンドリア病、フェニルケトン尿、胎盤梗塞、梅毒、梅毒、無菌壊死、虚血性壊死、アルコール依存、薬物による投与または暴露に関連する壊死、化学的毒素、農薬、重金属、兵器有機リン酸エステル、クモまたはヘビ毒、ダーマルフィラー施与に関係する壊死、異所的薬物施与に関係する壊死、化学療法誘発性壊死、放射線誘発性壊死、移植組織の欠陥または低下した質、または加齢からなる群より選ばれる疾患または医学的条件の徴候を処置し、寛解し、抑止し、または発生率を減らす、請求項６に記載の使用のための組成物。
【請求項１０】
細胞または組織壊死に関係する疾患または医学的条件の徴候の処置、防止、寛解、抑止、発生率の減少における使用のためのものである、請求項４の組成物。
【外国語明細書】
2020183405000001.pdf