(57)【要約】      （修正有）【課題】中枢への移行性に優れる中枢作用性ペプチド誘導体及び当該中枢作用性ペプチド誘導体を含む医薬組成物の提供。【解決手段】ペプチドに由来するアミノ酸配列部分である中枢作用部分と、オリゴアルギニン（Ｒｎ、ｎはアルギニン残基の数であり６〜１２）である膜透過配列部分と、ＦＦＬＩＰＫＧ又はＦＦＦＦＧであるエンドソーム脱出部分と、をこの順に有する、中枢作用性ペプチド誘導体であって、前記中枢作用性ペプチド誘導体を脳内に移行させて中枢神経系に作用させるための、中枢作用性ペプチド誘導体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチドに由来するアミノ酸配列部分である中枢作用部分と、オリゴアルギニン（Ｒｎ、ｎはアルギニン残基の数であり６〜１２）である膜透過配列部分と、ＦＦＬＩＰＫＧ又はＦＦＦＦＧであるエンドソーム脱出部分と、をこの順に有する、中枢作用性ペプチド誘導体であって、前記中枢作用性ペプチド誘導体を脳内に移行させて中枢神経系に作用させるための、中枢作用性ペプチド誘導体。
【請求項２】
前記オリゴアルギニンがＲ８である、請求項１に記載の中枢作用性ペプチド誘導体。
【請求項３】
前記アミノ酸配列部分が、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−２、ニューロメジンＵ、オピオイドペプチド、オキシトシン、レプチン、オレキシン、ニューロペプチドＹ又はインスリンであるペプチドに由来するアミノ酸配列部分である、請求項１又は請求項２に記載の中枢作用性ペプチド誘導体。
【請求項４】
前記アミノ酸配列部分が、以下の（ａ１）〜（ａ３）又は（ｂ）であるペプチドに由来するアミノ酸配列部分である、請求項２又は請求項３に記載の中枢作用性ペプチド誘導体。
（ａ１）Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ、配列番号１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド
（ａ２）Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＮＨ２、配列番号２）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド
（ａ３）Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−ＮＨ２、配列番号３）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド
（ｂ）アミノ酸配列（ａ１）〜（ａ３）において１若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ中枢作用性を有するペプチド
【請求項５】
精神神経疾患の治療用である、請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の中枢作用性ペプチド誘導体。
【請求項６】
うつ病又は学習障害の治療用である、請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の中枢作用性ペプチド誘導体。
【請求項７】
請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載の中枢作用性ペプチド誘導体を有効成分として含む、医薬組成物。
【請求項８】
精神神経疾患の治療用である、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
うつ病又は学習障害の治療用である、請求項７又は請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載の中枢作用性ペプチド誘導体を有効成分として含む、経鼻・点鼻製剤。
【請求項１１】
精神神経疾患の治療用である、請求項１０に記載の経鼻・点鼻製剤。
【請求項１２】
うつ病又は学習障害の治療用である、請求項１０又は請求項１１に記載の経鼻・点鼻製剤。
【請求項１３】
請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載の中枢作用性ペプチド誘導体を有効成分として含む医薬組成物の、経鼻・点鼻投与への使用。
【請求項１４】
オリゴアルギニン（Ｒｎ、ｎはアルギニン残基の数であり６〜１２である）である膜透過配列部分と、ＦＦＬＩＰＫＧ又はＦＦＦＦＧであるエンドソーム脱出部分とを、前記膜透過配列部分及び前記エンドソーム脱出部分の順に中枢作用性ペプチドに付加することを含む、中枢作用性ペプチドの安定化方法であり、前記安定化は前記中枢作用性ペプチドを経鼻・点鼻投与により脳内へ移行させる際の分解酵素に対する安定性の向上である、中枢作用性ペプチドの安定化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、中枢作用性ペプチド誘導体及び医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ペプチド等の生体由来の物質が有する生理活性の薬理学的な利用の検討が盛んに行われている。例えば、プログルカゴン由来で３７個のアミノ酸残基から構成されるペプチドであるグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）及び３３個のアミノ酸残基から構成されるグルカゴン様ペプチド−２（ＧＬＰ−２）は、いずれもＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）に結合してシグナルを伝達する役割を果たすことが知られている。ＧＬＰ−１（活性体は７−３７と７−３６アミドがある）の脳内における薬理作用として、学習障害改善作用に関する報告がなされている（例えば、非特許文献１〜２）。また、ＧＬＰ−２の脳内における薬理作用としては、治療抵抗性うつ病モデル動物でも有効な抗うつ作用、血圧降下作用及び学習障害改善作用に関する報告がなされている（例えば、非特許文献３〜９）。さらに、２３個のアミノ酸残基からなるニューロメジンＵ（ＮｍＵ）も、脳内のＧＰＣＲに結合して学習障害改善作用を示すことが報告されている（例えば、非特許文献１０）。このほかにもオピオイドペプチド、オキシトシン、レプチン、ニューロペプチドY、オレキシン、インスリンなどの中枢作用を有するペプチド等や抗体医薬品が開発されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Neuroscience Research 64(2009)67-74
【非特許文献２】Journal of Neuroscience Research 92(2014)446-454
【非特許文献３】Behavioural Brain Research 204(2009)235-240
【非特許文献４】Neuroscience 212(2012)140-148
【非特許文献５】Life Sciences 93(2013)889-896
【非特許文献６】Neuroscience Letters 550(2013)104-108
【非特許文献７】Behavioural Brain Research 243(2013)153-157
【非特許文献８】Neuropeptides 49(2015)7-14
【非特許文献９】Neuroscience 294(2015)156-165
【非特許文献１０】Neuroscience Research 61(2008)113-119
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ペプチド等の生体由来の物質は、既存の薬剤よりも副作用が少ない薬剤の有効成分としての利用が期待される。しかし、薬剤の種類によっては日常的に服用する必要があるため、その投与方法は侵襲性が低いことが望ましい。そこで、有効成分を効率的に脳に送達でき、かつ侵襲性が低い方法で投与可能な剤形として経鼻・点鼻製剤の開発が検討されている。しかし、経鼻・点鼻投与されたペプチドは効率良く血液脳関門を通過することが難しく、更には、生体内での酵素分解により短時間で効果が失われるなどの問題がある。本発明者らは上記状況に鑑み、投与方法として、主に非侵襲的で中枢移行性を期待できる経鼻投与に着目し、中枢作用のあるペプチドに特定の配列のペプチドを付加することにより、中枢作用のあるペプチドを効率的に脳内へ移行させることを可能とした。すなわち、本発明は中枢への移行性に優れる中枢作用性ペプチド誘導体及び当該中枢作用性ペプチド誘導体を含む医薬組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
前記課題を達成するための具体的手段には、以下の実施態様が含まれる。
＜１＞中枢作用部分と、膜透過配列部分と、エンドソーム脱出部分と、を有する、中枢作用性ペプチド誘導体。
＜２＞前記中枢作用部分がペプチドに由来するアミノ酸配列部分である、＜１＞に記載の中枢作用性ペプチド誘導体。
＜３＞前記アミノ酸配列部分が、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−２、ニューロメジンＵ、オピオイドペプチド、オキシトシン、レプチン、オレキシン、ニューロペプチドＹ又はインスリンであるペプチドに由来するアミノ酸配列部分である、＜１＞又は＜２＞に記載の中枢作用性ペプチド誘導体。
＜４＞前記アミノ酸配列部分が、以下の（ａ１）〜（ａ３）又は（ｂ）であるペプチドに由来するアミノ酸配列部分である、＜２＞又は＜３＞に記載の中枢作用性ペプチド誘導体。
（ａ１）Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ、配列番号１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド
（ａ２）Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＮＨ２、配列番号２）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド
（ａ３）Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−ＮＨ２、配列番号３）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド
（ｂ）アミノ酸配列（ａ１）〜（ａ３）において１若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ中枢作用性を有するペプチド
＜５＞精神神経疾患の治療用である、＜１＞〜＜４＞のいずれか１項に記載の中枢作用性ペプチド誘導体。
＜６＞うつ病又は学習障害の治療用である、＜１＞〜＜４＞のいずれか１項に記載の中枢作用性ペプチド誘導体。
＜７＞＜１＞〜＜６＞のいずれか１項に記載の中枢作用性ペプチド誘導体を有効成分として含む、医薬組成物。
＜８＞精神神経疾患の治療用である、＜７＞に記載の医薬組成物。
＜９＞うつ病又は学習障害の治療用である、＜７＞又は＜８＞に記載の医薬組成物。
＜１０＞＜１＞〜＜６＞のいずれか１項に記載の中枢作用性ペプチド誘導体を有効成分として含む、経鼻・点鼻製剤。
＜１１＞精神神経疾患の治療用である、＜１０＞に記載の経鼻・点鼻製剤。
＜１２＞うつ病又は学習障害の治療用である、＜１０＞又は＜１１＞に記載の経鼻・点鼻製剤。
＜１３＞＜１＞〜＜６＞のいずれか１項に記載の中枢作用性ペプチド誘導体を有効成分として含む医薬組成物の、経鼻・点鼻投与への使用。
＜１４＞膜透過配列部分と、エンドソーム脱出部分とを中枢作用性ペプチドに付加することを含む、中枢作用性ペプチドの安定化方法。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、中枢への移行性に優れる中枢作用性ペプチド誘導体及び当該中枢作用性ペプチド誘導体を含む医薬組成物が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】ＧＬＰ−２誘導体を投与したラットの強制水泳試験の結果である。
【図２】ＧＬＰ−２を単独で投与したラットの強制水泳試験の結果である。
【図３】ＧＬＰ−２誘導体のラットの脳内における分布の評価結果である。
【図４】ＧＬＰ−２誘導体を投与したマウスの強制水泳試験の結果である。
【図５】ＧＬＰ−２誘導体を投与したマウスの尾懸垂試験の結果である。
【図６】ＧＬＰ−２誘導体を投与した治療抵抗性うつ病発症モデルマウスの強制水泳試験の結果である。
【図７】ＧＬＰ−１誘導体を投与した学習障害モデルマウスのＹ字迷路試験の結果である。
【図８】ＮｍＵ誘導体を投与した学習障害モデルマウスのＹ字迷路試験の結果である。
【図９】ＧＬＰ−２誘導体の分解酵素ＤＰＰ−４に対する安定性試験の結果である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
以下、本発明の実施の形態について説明する。これらの説明及び実施例は本発明を例示するものであり、本発明の範囲を制限するものではない。
本明細書において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。アミノ酸配列の記載は左側がＮ末端側であり、アミノ酸残基は当該技術分野で周知の一文字表記（例えば、グリシン残基を「Ｇ」）または三文字表記（例えば、グリシン残基を「Ｇｌｙ」）で表記する場合がある。
本明細書において「治療」とは、症状を消失又は軽減させる作用又は効果のほか、当該症状の悪化を抑制する作用又は効果も意味する。「抗うつ作用」又は「抗うつ効果」は、うつ病の症状を消失又は軽減させる作用又は効果のほか、当該症状の悪化を抑制する作用又は効果も意味する。「学習障害改善作用」又は「学習障害改善効果」は、学習障害の症状を消失又は軽減させる作用又は効果のほか、当該症状の悪化を抑制する作用又は効果も意味する。
【０００９】
＜中枢作用性ペプチド誘導体＞
本発明の中枢作用性ペプチド誘導体は、中枢作用部分と、膜透過配列部分と、エンドソーム脱出部分と、を有する。本発明者らは、中枢作用性のペプチドが生体内で分解する前に脳に迅速に送達し、かつ脳内に効率よく移行させるための方法を検討した。その結果、中枢作用部分と膜透過配列部分と、エンドソーム脱出部分と、を有する中枢作用性ペプチド誘導体を経鼻・点鼻投与した場合は、中枢作用部分を単独で経鼻・点鼻投与した場合よりも、脳への移行性が顕著に向上することを見出した。
【００１０】
中枢作用性ペプチド誘導体の用途は、中枢作用部分が中枢神経に作用して発揮する薬理効果を利用するものであれば特に制限されない。このような薬理効果としては、抗うつ作用、学習障害改善作用、抗不安作用、摂食抑制作用、認知障害改善作用、血圧降下作用、鎮痛作用、睡眠作用、抗てんかん作用等を挙げることができる。従って、本発明の中枢作用性ペプチド誘導体は抗うつ剤、学習障害改善剤、抗不安剤、食欲抑制剤、認知障害改善剤、血圧降下剤、鎮痛剤、睡眠導入剤、抗てんかん剤等の精神神経疾患の治療用に好適に使用することができる。
【００１１】
（中枢作用部分）
中枢作用性ペプチド誘導体における中枢作用部分は、中枢神経に作用して薬理効果を発揮する物質に由来するものであれば特に制限されない。中枢作用性ペプチド誘導体において、中枢作用部分に膜透過配列部分及びエンドソーム脱出部分を付加する方法は特に制限されず、公知の方法により行うことができる。
【００１２】
中枢作用性ペプチド誘導体のある実施態様では、中枢作用部分は、中枢作用性ペプチドに由来するアミノ酸配列部分（以下、中枢作用性ペプチド部分とも称する）である。中枢作用性ペプチドとしては、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−２、ニューロメジンＵ、オピオイドペプチド（エンケファリン、ダイノルフィンなど）、オキシトシン、レプチン、オレキシン、ニューロペプチドＹ、インスリンなどが挙げられる。
【００１３】
中枢作用性ペプチド誘導体のある実施態様では、中枢作用部分が以下の（ａ１）〜（ａ３）又は（ｂ）であるペプチドに由来するペプチド部分である。
【００１４】
（ａ１）ＨＡＤＧＳＦＳＤＥＭＮＴＩＬＤＮＬＡＡＲＤＦＩＮＷＬＩＱＴＫＩＴＤで表されるアミノ酸配列からなるペプチド（ＧＬＰ−２、配列番号１）
（ａ２）ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲ−ＮＨ２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（ＧＬＰ−１：活性体７−３６アミド、配列番号２）
（ａ３）ＹＫＶＮＥＹＱＧＰＶＡＰＳＧＧＦＦＬＦＲＰＲＮ−ＮＨ２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（ニューロメジンＵ、配列番号３）
（ｂ）アミノ酸配列（ａ１）〜（ａ３）において１若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ中枢作用性を有するペプチド
【００１５】
上記ペプチドのうち、ＧＬＰ−２は抗うつ作用及び血圧降下作用を示し、ＧＬＰ−１は学習障害改善作用を示し、ニューロメジンＵは学習障害改善作用を示すことが知られている。このため、これらのペプチドは中枢作用性ペプチド誘導体の中枢作用部分としての有用性が大きい。なお、「ペプチドに由来するアミノ酸配列」とは、あるペプチドのアミノ酸配列が他のアミノ酸配列と結合して一つのペプチドを構成している場合において、当該ペプチドのアミノ酸配列に相当する部分を意味する。
【００１６】
中枢作用性ペプチド部分が「（ｂ）アミノ酸配列（ａ１）〜（ａ３）において１若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されてなるアミノ酸配列からなるペプチド」に由来する場合、欠失、置換若しくは付加されるアミノ酸残基の数は、中枢作用性ペプチド部分が本発明の効果を達成できる範囲であれば特に制限されない。例えば、１〜１０個であり、１〜５個であることが好ましく、１〜３個であることがより好ましい。合成の効率、取扱性、安定性等の観点からは、（ｂ）のペプチドのアミノ酸残基の総数は４０以下であることが好ましく、３５以下であることがより好ましく、３３以下であることがさらに好ましい。
【００１７】
（膜透過配列部分）
中枢作用性ペプチド誘導体は、膜透過配列部分を有する。膜透過配列部分は、膜透過性ペプチド（Ｃｅｌｌ  ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ、以下ＣＰＰとも称する）に由来するアミノ酸配列からなる。「膜透過性ペプチド」とは、細胞膜を通過する作用を有するペプチドを意味する。中枢作用性ペプチド誘導体が膜透過配列部分を有することにより、中枢作用性ペプチド誘導体が膜透過配列部分の膜透過作用によって細胞内へと導入される。細胞内に導入された中枢作用性ペプチド誘導体は、主に軸索輸送等により鼻粘膜および嗅上皮等を介して脳に移行して脳内に分布すると考えられる。
【００１８】
膜透過配列部分を構成する膜透過性ペプチドは、中枢作用性ペプチド誘導体を細胞内に導入する作用を有するものであればよく、その構造や原理は特に制限されない。膜透過性ペプチドの例としてはオリゴアルギニン（Ｒｎ、ｎはアルギニン残基の数であり６〜１２）、Ａｎｇｉｏｐｅｐ−５（ＲＦＦＹＧＧＳＲＧＫＲＮＮＦＲＴＥＥＹ、配列番号４）、Ａｎｔｐ（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ、配列番号５）、Ｂａｃ（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ、配列番号６）、ＢＲ１（ＲＡＧＬＱＦＰＶＧＲＬＬＲ、配列番号７）、ＢＲ２（ＲＡＧＬＱＦＰＶＧＲＬＬＲＲＬＬＲ、配列番号８）、Ｂｕｆ  ＩＩｂ［ＢＲ３］（ＲＡＧＬＱＦＰＶＧＲＬＬＲＲＬＬＲＲＬＬＲ、配列番号９）、ＳＨ−ＣＰＰＰ−２（ＫＬＰＶＭ、配列番号１０）、ＣｙＬｏＰ−１（ＣＲＷＲＷＫＣＣＫＫ、配列番号１１）、Ｃｙｓ−Ａｎｔｐ（ＣＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ、配列番号１２）、Ｃｙｓ−ｐＶＥＣ（ＣＬＬＩＩＬＲＲＲＩＲＫＱＡＨＡＨＫＳ、配列番号１３）Ｃｙｓ−ＳＡＰ（ＣＶＲＬＰＰＰＶＲＬＰＰＰＶＲＬＰＰＰ、配列番号１４）、Ｃｙｓ−ＳＡＰｒ（ＣＰＰＰＬＲＶＰＰＰＬＲＶＰＰＰＬＲＶ、配列番号１５）、Ｃｙｓ−ＴＡＴ（ＣＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ、配列番号１６）、Ｃｙｓ−ＴＰ１０（ＣＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ、配列番号１７）、Ｃｙｓ−ＴＰ１０Ｋ（ＣＡＧＹＬＬＧＫＩＮＫＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ、配列番号１８）、ＦＡＫ（ＦＡＫＬＡＡＲＬＹＲＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ、配列番号１９）、Ｈ９（ＨＨＨＨＨＨＨＨＨ、配列番号２０）、ＨＣ−［ｐｏｌｙ（Ｋ）］（ＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥＬ−ｐｏｌｙ（Ｋ）、配列番号２１）、ｈＬＦ（ＫＣＦＱＷＱＲＮＭＲＫＶＲＧＰＰＶＳＣＩＫＲ、配列番号２２）、ＨＲ９（ＣＨＨＨＨＨＨＲＲＲＲＲＲＲＲＲＨＨＨＨＨＣ、配列番号２３）、ＩＲ９（ＧＬＦＥＡＩＥＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧＷＹＧＲＲＲＲＲＲＲＲＲ、配列番号２４）、ＪＮＫＩ−１Ｄ−ＴＡＴ（ＴＤＱＳＲＰＶＱＰＦＬＮＬＴＴＰＲＫＰＲＲＰＰＲＲＲＱＲＲＫＫＲＧ、配列番号２５）、Ｋ９（ＫＫＫＫＫＫＫＫＫ、配列番号２６）、Ｌｏｗ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ｐｒｏｔａｍｉｎｅ（ＬＭＷＰ）（ＶＳＲＲＲＲＲＲＧＧＲＲＲＲ、配列番号２７）、ＭＡＰ（ＫＬＡＬＫＬＡＬＫＡＬＫＡＡＬＫＬＡ、配列番号２８）、Ｍｉｔｏｐａｒａｎ（ＩＮＬＫＫＬＡＫＬ（Ａｉｂ）ＫＫＩＬ、配列番号２９）、ｍ−Ｎ２−１０−１（ＭＴＳ−Ｃ）（ＨＹＳＲＬＥＩＣＮＬ−ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＰ、配列番号３０）、ｍ−Ｎ２−１０−１（ＭＴＳ−Ｎ）（ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＰ−ＨＹＳＲＬＥＩＣＮＬ、配列番号３１）、ｍ−Ｎ２−１０−１（ＮＩＶ−Ｃ）（ＨＹＳＲＬＥＩＣＮＬ−ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ、配列番号３２）、ｍ−Ｎ２−１０−１（ＮＩＶ−Ｎ）（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ−ＨＹＳＲＬＥＩＣＮＬ、配列番号３３）、ｍ−Ｎ２−１０−１（ＯＲ−Ｃ）（ＲＲＲＲＲＲＲＲ−ＨＹＳＲＬＥＩＣＮＬ、配列番号３４）、ｍ−Ｎ２−１０−１（ＯＲ−Ｎ）（ＨＹＳＲＬＥＩＣＮＬ−ＲＲＲＲＲＲＲＲ、配列番号３５）、ＭＰＧ−８（ＡＦＬＧＷＬＧＡＷＧＴＭＧＷＳＰＫＫＫＲＫ−Ｃｙｓｔｅａｍｉｄｅ、配列番号���６）、ＭＰＧα（ＧＡＬＦＬＡＡＡＬＳＬＭＧＬＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＳＨ、配列番号３７）、ＭＰＧβ（ＧＡＬＦＬＧＡＡＬＳＬＭＧＬＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＳＨ、配列番号３８）、ＮｒＴＰ１（ＹＫＱＣＨＫＫＧＧＫＫＧＳＧ、配列番号３９）、ＮｒＴＰ２（ＹＫＱＣＨＫＫＧＧ−Ａｈｘ−ＫＫＧＳＧ、配列番号４０）、ＮｒＴＰ５（ＹＫＧＣＨＫＫＧＧＫＫＧＳＧ、配列番号４１）、ＮｒＴＰ６（ＹＫＱＳＨＫＫＧＧＫＫＧＳＧ、配列番号４２）、ＮｒＴＰ７（ＹＲＱＳＨＲＲＧＧＲＲＧＳＧ、配列番号４３）、ＭＰＧ  ＨＩＶ−ｇｐ４１／ＳＶ４０  Ｔ−ａｎｔｉｇｅｎ（ＧＡＬＦＬＧＦＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ、配列番号４４）、ＮｒＴＰ８（ＷＫＱＳＨＫＫＧＧＫＫＧＳＧ、配列番号４５）、ＰＡＭＡＭ−ＰＥＧ−Ａｎｇｉｏｐｅｐ−２（ＰＦＦＹＧＧＳＧＧＮＲＮＮＹＬＲＥＥＹ、配列番号４６）、ＰＥＩ−ＴＡＴ（ＴＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−ＰＥＩ、配列番号４７）、Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ（４３−５８）（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ、配列番号４８）、ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫ、配列番号４９）、Ｐｅｐ−１  ＨＩＶ−ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ／ＳＶ４０  Ｔ−ａｎｔｉｇｅｎ（ＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ、配列番号５０）、Ｐｅｐ１（ＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ、配列番号５１）、ｐｅｐＭ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ４５−７２  ｏｆ  ＤＥＮＶ−２  Ｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＫＬＦＭＡＬＶＡＦＬＲＦＬＴＩＰＰＴＡＧＩＬＫＲＷＧＴＩ、配列番号５２）、ｐｅｐＲ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ６７−１００  ｏｆ  ＤＥＮＶ−２  Ｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＬＫＲＷＧＴＩＫＫＳＫＡＩＮＶＬＲＧＦＲＫＥＩＧＲＭＬＮＩＬＮＲＲＲＲ、配列番号５３）、ｐｅｐｔｉｄｅ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｐｒｏｔａｍｉｎｅ（ＲＲＲＲＲＲＧＧＲＲＲＲＧ、配列番号５４）、Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃａｄｈｅｒｉｎ（ｐＶＥＣ）（ＬＬＩＩＬＲＲＲＩＲＫＱＡＨＡＨＳＫ、配列番号５５）、ＰＦ１４（ＡＧＹＬＬＧＫＬＬＯＯＬＡＡＡＡＬＯＯＬＬ、「Ｏ」は任意のアミノ酸残基、配列番号５６）、ＰＲ９（ＦＦＬＩＰＫＧＲＲＲＲＲＲＲＲＲ、配列番号５７）、ｐｒｏｔａｍｉｎｅ（ＶＳＲＲＲＲＲＲＧＧＲＲＲＲＫ、配列番号５８）、ＰＹＣ３６Ｌ−ＴＡＴ（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧＧＬＱＧＲＲＲＱＧＹＱＳＩＫＰ、配列番号５９）、Ｒ６Ｗ３  Ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ（ＲＲＷＷＲＲＷＲＲ、配列番号６０）、Ｒ９−ｈＬＦ（ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＫＣＦＱＷＱＲＮＭＲＫＶＲＧＰＰＶＳＣＩＫＲ、配列番号６１）、ＲＡ９（ＲＲＡＡＲＲＡＲＲ、配列番号６２）、ＲＨ９（ＲＲＨＨＲＲＨＲＲ、配列番号６３）、ＲＬ９（ＲＲＬＬＲＲＬＲＲ、配列番号６４）、ＲＶＧ−９Ｒ（ＹＴＩＷＭＰＥＮＰＲＰＧＴＰＣＤＩＦＴＮＳＲＧＫＲＡＳＮＧ−９Ｒ、配列番号６５）、ＲＷ９（ＲＲＷＷＲＲＷＲＲ、配列番号６６）、Ｓ８（ＳＳＳＳＳＳＳＳＫ、配列番号６７）、ＳＡＰ（ＶＲＬＰＰＰＶＲＬＰＰＰＶＲＬＰＰＰ、配列番号６８）、ＳＡＰｒ（ＰＰＰＬＲＶＰＰＰＬＲＶＰＰＰＬＲＶ、配列番号��９）、ＳｙｎＢ１（ＲＧＧＲＬＳＹＳＲＲＲＦＳＴＳＴＧＲ、配列番号７０）、ＳｙｎＢ３（ＲＲＬＳＹＳＲＲＲＦ、配列番号７１）、Ｘｅｎｔｒｙ（ＬＣＬＲＰＶＧ、配列番号７２）、ＹＡＲＡ（ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ、配列番号７３）、ＴＡＴ（４７−５７）（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰ、配列番号７４）、ＴＡＴ（４８−６０）（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ、配列番号７５）、ＴＡＴ（４９−５７）（ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ、配列番号７６）、ＴＡＴ−Ｄ（ＧＲＲＲＱＲＲＫＫＲＧ、配列番号７７）、ＴＡＴ−Ｌ（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧ、配列番号７８）、ＴＡＴ−ＰＥＧ−Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−ＰＥＧ−ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ、配列番号７９）、ＴＰ−１０（ＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ、配列番号８０）、ＴＰ−１０Ｋ（ＡＧＹＬＬＧＫＩＮＫＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ、配列番号８１）、Ｔｒａｎｓｐｏｒｔａｎ（ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ、配列番号８２）、ＣＡＤ−２（ＧＬＷＲＡＬＷＲＬＬＲＳＬＷＲＬＬＷＫＡ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＳＨ、配列番号８３）、ＰＦ６（ＡＧＹＬＬＧＫ（Ｋ（Ｋ２（ＴＦＱ４）））ＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ、配列番号８４）、ｐｏｌｙａｒｇｉｎｉｎｅ誘導体（ＲＲＲＱＲＲＫＲＲＲＱ、配列番号８５）等を挙げることができる。
【００１９】
上記の膜透過性ペプチドの中でも、細胞膜との親和性および合成の容易さの点から、アルギニン、リシン、ヒスチジン、トリプトファン等の塩基性のアミノ酸残基に富む（例えば、アミノ酸残基総数の半数以上が塩基性のアミノ酸残基である）アミノ酸配列からなる膜透過性ペプチドが好ましい。このような膜透過性ペプチドとしては、オリゴアルギニン（Ｒｎ、ｎはアルギニン残基の数であり６〜１２）、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）のＴａｔタンパク質に由来するＴＡＴ等が挙げられる。塩基性のアミノ酸残基に富むアミノ酸配列からなる膜透過性ペプチドは、細胞が細胞外の物質を取り込む過程であるエンドサイトーシスの一種であるマクロピノサイトーシスを誘発すると考えられる。これにより、中枢作用性ペプチド誘導体をより効率的に細胞内に導入することができると考えられる。
【００２０】
中枢作用性ペプチド誘導体の膜透過効率の観点からは、膜透過性ペプチドはアミノ酸残基総数の半数以上がアルギニン残基であるペプチドであることが好ましく、６〜１２個のアルギニン残基からなるオリゴアルギニンであることがより好ましく、７〜９個のアルギニン残基からなるオリゴアルギニンであることがさらに好ましく、８個のアルギニン残基からなるオリゴアルギニンであることがさらにより好ましい。
【００２１】
（エンドソーム脱出部分）
中枢作用性ペプチド誘導体は、エンドソーム脱出部分を有する。中枢作用性ペプチド誘導体がエンドソーム脱出部分を有することにより、細胞内に導入された中枢作用性ペプチド誘導体がエンドソームに留まる時間が短縮され、より短時間でのエンドソーム脱出が可能になると考えられる。その結果、中枢作用性ペプチド誘導体の脳への移行及び分布がより短い時間で達成されると考えられる。
【００２２】
エンドソーム脱出部分は、中枢作用性ペプチド誘導体のエンドソーム脱出を促進する作用を有するものであればよく、その構造や原理は特に制限されない。例えば、アセチル基（ＣｎＨ２ｎ＋１ＣＯ−、ｎ＝３〜９）や、ＦＦＬＩＰＫＧ（配列番号８６）、ＬＩＬＩＧ（配列番号８７）、ＦＦＧ（配列番号８８）、ＦＦＦＦＧ（配列番号８９）、ＦＦＦＦＦＦＧ（配列番号９０）等のエンドソーム脱出促進配列（Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ  ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ、以下ＰＡＳとも称する）として知られるアミノ酸配列等を挙げることができる。エンドソーム脱出機能の観点からは、エンドソーム脱出部分はＰＡＳであることが好ましい。
【００２３】
中枢作用性ペプチド誘導体における膜透過配列部分及びエンドソーム脱出部分の位置は特に制限されない。例えば、膜透過配列部分が中枢作用部分に近い側に位置していても、エンドソーム脱出部分が中枢作用部分に近い側に位置していてもよい。本発明の効果をより効果的に達成する観点からは、膜透過配列部分が中枢作用部分に近い側に位置していることがより好ましく、膜透過配列部分が中枢作用部分に近い側に位置し、かつ膜透過配列部分のＮ末端側にエンドソーム脱出部分としてＰＡＳが存在していることがさらに好ましい。
【００２４】
（スペーサー）
中枢作用性ペプチド誘導体において、中枢作用部分と膜透過配列部分又はエンドソーム脱出部分とは直接結合していても、これらの間にスペーサーが存在していてもよい。中枢作用部分と膜透過配列部分との間にスペーサーが存在している場合のスペーサーのアミノ酸配列は、中枢作用部分の活性が低下又は損なわれることを防ぐ機能を有するものであれば特に制限されない。一般に、膜透過配列部分は塩基性アミノ酸から構成される。従って、中枢作用部分が酸性アミノ酸残基を含む場合、グリシン等の中性アミノ酸残基が複数（例えば１〜１０個、好ましくは２〜６個）連続したスペーサーを存在させ、膜透過配列部分と中枢作用部分とが相互作用して中枢作用部分の活性が低下又は損なわれるのを防ぐことが好ましい。
【００２５】
中枢作用性ペプチド誘導体は、用途に応じて種々の改変を施してもよい。例えば、アミノ基修飾（ビオチン化、ミリストイル化、パルミトイル化、アセチル化、マレイミド化等）、カルボキシル基修飾（アミド化、エステル化等）、チオール基修飾（ファルネシル化、ゲラニル化、メチル化、パルミトイル化等）、水酸基修飾（リン酸化、硫酸化、オクタノイル化、パルミトイル化、パルミトレオイル化等）、各種蛍光標識（ＦＩＴＣ、ＦＡＭ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ、ＢＯＤＩＰＹ、ＮＢＤ、ＭＣＡ等）、ＰＥＧ化、非天然アミノ酸、Ｄ−アミノ酸等の導入などの改変を施してもよい。改変は、中枢作用性ペプチド誘導体の中枢作用部分、膜透過配列部分、エンドソーム脱出部分、スペーサーのいずれにおいて施されていてもよい。
【００２６】
中枢作用性ペプチド誘導体を構成するアミノ酸残基のそれぞれは、本発明の効果が達成される限りＬ体又はＤ体のいずれであってもよい。中枢作用性ペプチド誘導体の作製方法は特に制限されず、生体や天然物からの採取、遺伝子工学的方法、有機合成化学的方法等のいずれであってもよい。
【００２７】
ある実施態様では、中枢作用性ペプチド誘導体はＮ末端側からＰＡＳ、ＣＰＰ、必要に応じて配置されるスペーサー、及び中枢作用部分としてのアミノ酸配列がこの順に位置するアミノ酸配列からなり、ＰＡＳはＦＦＬＩＰＫＧ、ＬＩＬＩＧ、ＦＦＧ、ＦＦＦＦＧ、又はＦＦＦＦＦＦＧから選択され、ＣＰＰはオリゴアルギニン（Ｒｎ、ｎ＝６〜１２）から選択され、必要に応じて配置されるスペーサーはグリシン残基（Ｇｎ、ｎ＝２〜６）から選択される。
【００２８】
中枢作用性ペプチド誘導体の中枢作用部分がアミノ酸配列である場合、中枢作用性ペプチド誘導体全体のアミノ酸残基数は本発明の効果が得られる限り特に制限されず、用途等に応じて選択できる。中枢作用性ペプチド誘導体全体のアミノ酸残基数は、例えば８０以下であってよく、７０以下であることが好ましく、６０以下であることがより好ましい。中枢作用性ペプチド誘導体全体のアミノ酸残基数は、例えば３５以上であってよく、４０以上であることが好ましく、４５以上であることがより好ましい。
【００２９】
＜医薬組成物＞
本発明の医薬組成物は、中枢作用部分と、膜透過配列部分と、エンドソーム脱出部分と、を有する中枢作用性ペプチド誘導体を有効成分として含む。本発明の医薬組成物は、中枢作用性ペプチド誘導体を有効成分として含むことにより、脳への移行性に優れ、効率的に薬理効果を発揮することができる。また、投与形態の侵襲性が低いため、例えば、在宅で連日投与する必要のある疾患の治療に有用である。従って、医薬組成物の好適な剤形としては経鼻・点鼻製剤が挙げられる。
【００３０】
医薬組成物の治療対象である精神神経疾患は、中枢作用性ペプチド誘導体の中枢作用部分が中枢神経に作用することで治療効果が発揮されるものであれば特に制限されない。治療対象である精神神経疾患としては、うつ病、学習障害、不安、摂食障害、認知障害、高血圧、睡眠障害、てんかん等が挙げられる。
【００３１】
医薬組成物として具体的には、抗うつ剤、学習障害改善剤、抗不安剤、食欲抑制剤、認知障害改善剤、血圧降下剤、鎮痛剤、睡眠導入剤、抗てんかん剤等が挙げられ、治療対象に応じて中枢作用性ペプチド誘導体の中枢作用部分、膜透過配列部分及びエンドソーム脱出部分の種類を選択できる。例えば、有効成分としてＧＬＰ−２に由来するペプチド部分を有する中枢作用性ペプチド誘導体を含む医薬組成物は、抗うつ剤として有用である。また、ＧＬＰ−２は血圧降下作用を示すことから、強いストレスによるうつ病に高血圧を併発している患者に投与した場合の有効性が特に高いと考えられる。ＧＬＰ−１又はＮｍＵに由来するペプチド部分を有する中枢作用性ペプチド誘導体を含む医薬組成物は、学習障害改善剤として有用である。
【００３２】
医薬組成物に含まれる中枢作用性ペプチド誘導体の詳細及び好ましい態様は、上述したとおりである。医薬組成物の使用方法は、本発明の効果が得られる限り特に制限されず、経鼻・点鼻投与、経口投与、静脈内投与等のいずれであってもよい。日常的に服用しやすいという観点からは経鼻・点鼻投与又は経口投与が好ましく、脳への送達性の観点からは経鼻・点鼻投与がより好ましい。医薬組成物は、中枢作用性ペプチド誘導体以外の成分を含んでいてもよい。医薬組成物以外に含まれてもよい成分の具体例としては、医薬組成物の調製に用いられる媒質及び製剤用添加物を挙げることができる。製剤用添加物としては、賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、界面活性剤、緩衝剤、溶解補助剤、安定化剤、等張化剤、懸濁化剤、乳化剤、溶剤、増粘剤、粘液溶解剤、湿潤剤、防腐剤などが挙げられる。医薬組成物の投与量は、疾患の種類、患者の症状、体重、年齢等、投与態様などに応じて選択される。
【００３３】
＜経鼻・点鼻製剤＞
本発明の経鼻・点鼻製剤は、中枢作用部分と、膜透過配列部分と、エンドソーム脱出部分と、を有する中枢作用性ペプチド誘導体を有効成分として含む。本発明の経鼻・点鼻製剤は、中枢作用性ペプチド誘導体を有効成分として含むことにより、脳への移行性に優れ、効果的に薬理作用を発揮することができる。また、投与形態の侵襲性が低いため、在宅で連日投与する必要のある疾患の症状改善に好適である。
【００３４】
本発明の経鼻・点鼻製剤に含まれる中枢作用性ペプチド誘導体の詳細及び好ましい態様は、上述したとおりである。本発明の経鼻・点鼻製剤は、中枢作用性ペプチド誘導体以外の成分を含んでいてもよい。中枢作用性ペプチド誘導体以外の成分としては、医薬組成物調製に用いられる媒質及び製剤用添加物として上述したものを挙げることができる。
【００３５】
本発明の実施態様には、上述した中枢作用性ペプチド誘導体を有効成分として含む医薬組成物の、経鼻・点鼻投与への使用が含まれる。当該使用における中枢作用性ペプチド誘導体及び医薬組成物の詳細及び好ましい態様は、上記したとおりである。
【００３６】
本発明の実施態様には、膜透過配列部分と、エンドソーム脱出部分とを中枢作用性ペプチドに付加することを含む、中枢作用性ペプチドの安定化方法が含まれる。当該方法における膜透過配列部分、エンドソーム脱出部分及び中枢作用性ペプチドの詳細及び好ましい態様は、上記したとおりである。
【実施例】
【００３７】
以下に実施例を挙げて、本発明をさらに具体的に説明する。以下の実施例に示す材料、使用量、割合、処理手順等は、本発明の趣旨を逸脱しない限り適宜変更することができる。従って、本発明の範囲は以下に示す具体例により限定的に解釈されるべきものではない。
【００３８】
［中枢作用性ペプチド誘導体の抗うつ効果の評価］
＜実施例１＞
中枢作用性ペプチド誘導体として、ＦＩＴＣ−ＦＦＬＩＰＫＧ−（Ｒ）８−（Ｇ）２−ＨＡＤＧＳＦＳＤＥＭＮＴＩＬＤＮＬＡＡＲＤＦＩＮＷＬＩＱＴＫＩＴＤのアミノ酸配列からなるＧＬＰ−２の誘導体を定法により作製した。次いで、ＧＬＰ−２誘導体をＤＭＳＯに一次溶解してからＤＭＳＯの最終濃度が１６％になるようにリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で希釈し、ＧＬＰ−２誘導体のＤＭＳＯ溶液を調製した。
【００３９】
調製したＧＬＰ−２誘導体のＤＭＳＯ溶液を用いてラットの強制水泳試験を行い、ＧＬＰ−２誘導体の抗うつ効果を評価した。強制水泳試験は、以下のようにして行った。強制水泳試験日は、試験開始１時間前からラット（８〜１０週齢、オス、個体数６）を実験室に置いて馴化させた。ＧＬＰ−２誘導体のＤＭＳＯ溶液をラットに１８μｇ／日、強制水泳試験の３０分前に２日間経鼻・点鼻投与した。水温２５±１℃の水が高さ３０ｃｍまで入った、直径１８ｃｍ、高さ５０ｃｍの透明なプラスチック製の円筒形シリンダー中で、ラットを１匹ずつ１５分間泳がせ、無動時間（秒）を測定した。強制水泳後のラットは体をキムタオルで拭き、ケージに戻した。１日目を予備試験、２日目を本試験とし、この試験を２日間連続で行った。コントロールとして、ＧＬＰ−２誘導体を含まない溶媒のみ１０μＬを経鼻・点鼻投与したラット（８〜１０週齢、オス、個体数６）の強制水泳試験も同様にして行った。結果を表１及び図１に示す。図中のエラーバーは中央値±標準誤差（ｎ＝６）を表し、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定により統計処理を行った（＊Ｐ＜０．０５）。
【００４０】
＜比較例１＞
膜透過配列部分とエンドソーム脱出部分を有しない、ＨＡＤＧＳＦＳＤＥＭＮＴＩＬＤＮＬＡＡＲＤＦＩＮＷＬＩＱＴＫＩＴＤのアミノ酸配列からなるＧＬＰ−２を定法により作製し、実施例１と同様にしてＤＭＳＯ溶液（１６％）を作製した。このＤＭＳＯ溶液を用いてＧＬＰ−２（１８μｇ）をラット（８〜１０週齢、オス、個体数６）に経鼻・点鼻投与した以外は実施例１と同様にしてラットの強制水泳試験を行った。結果を表１及び図２に示す。図中のエラーバーは中央値±標準誤差（ｎ＝６）を表し、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定により統計処理を行った（ｎｓ＝非有意）。
【００４１】
【表１】
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【００４２】
＜実施例２＞
実施例１と同様にして調製したＧＬＰ−２誘導体のＤＭＳＯ溶液（１６％）を用いてＧＬＰ−２誘導体（１８μｇ）を経鼻・点鼻投与したラットの嗅球（Ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｂｕｌｂ）、下辺縁皮質（Ｉｎｆｒａｌｉｍｂｉｃ  ｃｏｒｔｅｘ）、扁桃体基底外側部（Ｂａｓｏｌａｔｅｒａｌ  ａｍｙｇｄａｌａ）、扁桃体中心核（Ｃｅｎｔｒａｌ  ａｍｙｇｄａｌａ）、扁桃体内側核（Ｍｅｄｉａｌ  ａｍｙｇｄａｌａ）、視床下部室傍核（Ｐａｒａｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｉｃ  ｎｕｃｌｅｕｓ）、視床下部背内側核（Ｄｏｒｓｏｍｅｄｉａｌ  ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｉｃ  ｎｕｃｌｅｕｓ）、海馬（Ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ）及び傍小脳脚核（Ｐａｒａｂｒａｃｈｉａｌ  ｎｕｃｌｅｕｓ）におけるＧＬＰ−２誘導体の分布の状態を、以下のようにして調べた。
【００４３】
実施例１と同様にして調製したＧＬＰ−２誘導体のＤＭＳＯ溶液（１６％）を用いてＧＬＰ−２誘導体（１８μｇ）をラットに経鼻・点鼻投与して３０分後にラットをホルマリン固定し、脳標本を作製した。脳標本からクライオスタット（ライカマイクロシステムズ：ＣＭ１５６０Ｓ）で薄切片（３０μｍ）を作製し、蛍光顕微鏡（キーエンス：ＢＺ−９０００）で観察した。コントロールとして、ＧＬＰ−２誘導体を含まない溶媒のみを経鼻投与したラットの脳標本も作製し、同様にして観察した。結果を図１に示す。図中のエラーバーは中央値±標準誤差（ｎ＝６）を表し、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定により統計処理を行った（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）。
【００４４】
＜実施例３＞
中枢作用性ペプチド誘導体として、ＦＦＬＩＰＫＧ−（Ｒ）８−（Ｇ）２−ＨＡＤＧＳＦＳＤＥＭＮＴＩＬＤＮＬＡＡＲＤＦＩＮＷＬＩＱＴＫＩＴＤのアミノ酸配列からなるＧＬＰ−２誘導体を定法により作製した。すなわち、作製したＧＬＰ−２誘導体は、蛍光標識（ＦＩＴＣ）を付加していない点において実施例１で作製したＧＬＰ−２誘導体と異なっている。次いで、ＧＬＰ−２誘導体をＤＭＳＯに一次溶解してからＤＭＳＯの最終濃度が１６％になるようにＰＢＳで希釈し、ＧＬＰ−２誘導体のＤＭＳＯ溶液を調製した。
【００４５】
マウスの強制水泳試験を行い、ＧＬＰ−２誘導体の抗うつ効果を評価した。強制水性試験は、以下のようにして行った。強制水泳試験を実施する２４時間前に、ｄｄＹマウス（５〜７週齢、オス、個体数１２）に対して１５分間の予備水泳を行った。なお、試験の前日と当日にＧＬＰ−２誘導体のＤＭＳＯ溶液を用いてＧＬＰ−２誘導体を３．６μｇずつ投与した。その後、実施例１と同様にして強制水泳試験を行い、無動時間（秒）を測定した。コントロールとして、ＧＬＰ−２誘導体を含まない溶媒のみを経鼻・点鼻投与したマウス（５〜７週齢、オス、個体数１２）の強制水泳試験も同様にして行った。結果を表２及び図４に示す。図中のエラーバーは中央値±標準誤差（ｎ＝１２）を表し、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定により統計処理を行った（＊Ｐ＜０．０５）。
【００４６】
【表２】
2020183423.tif 000003
【００４７】
＜実施例４＞
実施例３で作製したＧＬＰ−２誘導体のＤＭＳＯ溶液を用いてマウスの尾懸垂試験を行い、ＧＬＰ−２誘導体の抗うつ効果を評価した。尾懸垂試験は、以下のようにして行った。ｄｄＹマウス（５〜７週齢、オス、個体数９）に対し、試験の前日と当日にＧＬＰ−２誘導体のＤＭＳＯ溶液を用いてＧＬＰ−２誘導体を３．６μｇずつ投与した。その後、マウスを尻尾から逆さに吊るし、無動時間（秒）を測定した。コントロールとして、ＧＬＰ−２誘導体を含まない溶媒のみを経鼻・点鼻投与したマウス（５〜７週齢、オス、個体数９）の尾懸垂試験も同様にして行った。結果を表３及び図５に示す。図中のエラーバーは中央値±標準誤差（ｎ＝９）を表し、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定により統計処理を行った（＊Ｐ＜０．０５）。
【００４８】
【表３】
2020183423.tif 000004
【００４９】
＜実施例５＞
実施例３で作製したＧＬＰ−２誘導体のＤＭＳＯ溶液を用いてうつ病発症モデルマウスの強制水泳試験を行い、ＧＬＰ−２誘導体の抗うつ効果を評価した。うつ病発症モデルマウスとしては、視床下部−下垂体−副腎皮質系（ＨＰＡ系）の亢進状態を副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）により誘導したｄｄＹマウス（５〜７週齢、オス、個体数１１）を使用した。ＡＣＴＨの投与は、０．４５ｍｇ／ｋｇ重／日となる量で１４日間連続して行った。強制水泳試験は実施例３と同様にして行い、無動時間（秒）を測定した。なお、試験の当日まで、６日間連続してＧＬＰ−２誘導体のＤＭＳＯ溶液を用いてＧＬＰ−２誘導体を３．６μｇずつ経鼻・点鼻投与した。コントロールとして、ＧＬＰ−２誘導体を含まない溶媒のみ４μＬを６日間連続して経鼻投与したマウス（５〜７週齢、オス、個体数１１）の強制水泳試験も同様にして行った。結果を表４及び図６に示す。図中のエラーバーは中央値±標準誤差（ｎ＝１１）を表し、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定により統計処理を行った（＊＊Ｐ＜０．０１）。
【００５０】
【表４】
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【００５１】
［中枢作用性ペプチド誘導体の学習障害改善効果の評価］
＜実施例６＞
中枢作用性ペプチド誘導体として、ＦＦＬＩＰＫＧ−（Ｒ）８−（Ｇ）２−ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲ−ＮＨ２のアミノ酸配列からなるＧＬＰ−１（７−３６アミド）の誘導体を定法により作製した。次いで、ＧＬＰ−１誘導体をＦＯＳ１２（ｎ−ｄｏｄｅｃｙｌｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ）に一次溶解してからＦＯＳ１２の最終濃度が１％になるようにＰＢＳで希釈し、ＧＬＰ−１誘導体のＦＯＳ１２溶液を調製した。
【００５２】
作製したＧＬＰ−１誘導体のＦＯＳ１２溶液を用いて、学習障害誘導マウスのＹ字迷路試験を行い、ＧＬＰ−１誘導体の学習障害改善効果を評価した。学習障害誘導マウスとしては、試験の３日前にＬＰＳ（リポ多糖）１０μｇを投与したｄｄＹマウス（５〜７週齢、オス、個体数５）を使用した。なお、ＬＰＳの投与の１５分前に、ＧＬＰ−１誘導体のＦＯＳ１２溶液を用いてＧＬＰ−１誘導体（３μｇ）を経鼻・点鼻投与した。Ｙ字迷路試験は、３本の同じ大きさのアームを有する装置を使用し、３回連続して異なるアームに進入した回数をアームへの総進入回数から２を引いた値で除した後、１００を乗じて得た値を自発的交代行動（％）として求めた。
【００５３】
コントロールとして、ＬＰＳの投与の１５分前に、ＧＬＰ−１誘導体を含まない溶媒のみ（４μＬ）を経鼻・点鼻投与したマウス（５〜７週齢、オス、個体数５又は７）についても上記と同様の試験を行った。さらに、ＬＰＳを投与していないマウス（Ｖｅｈｉｃｌｅ）についても上記と同様の試験を行った。結果を表５及び図７に示す。図中のエラーバーは中央値±標準誤差（ｎ＝５又は７）を表し、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定により統計処理を行った（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）。
【００５４】
【表５】
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【００５５】
［中枢作用性ペプチド誘導体の学習障害改善効果の評価］
＜実施例７＞
中枢作用性ペプチド誘導体として、ＦＦＦＦＧ−（Ｒ）８−（Ｇ）２−ＹＫＶＮＥＹＱＧＰＶＡＰＳＧＧＦＦＬＦＲＰＲＮ−ＮＨ２のアミノ酸配列からなるＮｍＵ（ニューロメジンＵ）の誘導体を定法により作製した。次いで、ＮｍＵ誘導体をＦＯＳ１２に一次溶解してからＦＯＳ１２の最終濃度が５％になるようにＰＢＳで希釈し、ＮｍＵ誘導体のＦＯＳ１２溶液を調製した。学習障害誘導マウスとしては、試験の３日前にＬＰＳ（リポ多糖）１０μｇを投与したｄｄＹマウス（５〜７週齢、オス、個体数６）を使用した。なお、ＬＰＳの投与の１５分前にＮｍＵ誘導体のＦＯＳ１２溶液を用いてＮｍＵ誘導体（５．６μｇ）を経鼻・点鼻投与した。実施例６と同様にしてＹ字迷路試験を行い、測定値から自発的交代行動（％）を求めた。
【００５６】
コントロールとして、ＬＰＳの投与の１５分前にＮｍＵ誘導体を含まない溶媒のみ４μＬを経鼻・点鼻投与したマウス（５〜７週齢、オス、個体数６）についても上記と同様の試験を行った。さらに、ＬＰＳを投与していないマウス（Ｖｅｈｉｃｌｅ）についても上記と同様の試験を行った。結果を表６及び図８に示す。図中のエラーバーは中央値±標準誤差（ｎ＝６）を表し、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定により統計処理を行った（＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。
【００５７】
【表６】
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【００５８】
［中枢作用性ペプチド誘導体の安定性の評価］
＜実施例８＞
ＧＬＰ−２及び実施例３で作製したＧＬＰ−２誘導体を、それぞれＤＭＳＯに一次溶解してからＤＭＳＯの最終濃度が１％になるようにリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で希釈してサンプルを調製した。サンプル中のＧＬＰ−２及びＧＬＰ−２誘導体の含有量は、それぞれ１２ｎｇ／μＬとした。また、ＤＰＰ−４（ジペプチジルペプチダーゼ−４）０．１２５ユニットも各サンプルに添加した。
【００５９】
評価用サンプルを３７℃で保管し、調製から１時間及び６時間後のＧＬＰ−２及びＧＬＰ−２誘導体の含有量をＨＰＬＣにより測定した。測定した値を、ＤＰＰ−４を添加していないサンプルの調製直後のＧＬＰ−２及びＧＬＰ−２誘導体の含有量を１００％として相対値化し、残存率（％）として算出した。結果を図９に示す。図中の値は中央値±標準誤差（ｎ＝３）を表し、ｔ検定により統計処理を行った（＊＊Ｐ＜０．００１）。
【００６０】
［評価結果の考察］
実施例１及び比較例１の結果に示すように、膜透過配列部分及びエンドソーム脱出部分をＧＬＰ−２に付加して作製したＧＬＰ−２誘導体を投与した群では強制水泳試験における無動時間がコントロール群に比べて有意に短く、抗うつ効果に有意な差がみられた。これに対して、膜透過配列部分とエンドソーム脱出部分を付加していないＧＬＰ−２を投与した群ではコントロール群との間で抗うつ効果に有意な差がみられなかった。これらの結果から、ＧＬＰ−２の抗うつ効果はＧＬＰ−２に膜透過配列部分及びエンドソーム脱出部分を付加することによって向上することがわかった。
【００６１】
実施例２の結果より、膜透過配列部分及びエンドソーム脱出部分を有するＧＬＰ−２誘導体は脳内に広く分布していることがわかった。このことから、ＧＬＰ−２に膜透過性ペプチド及びエンドソーム脱出部分を付加することにより達成される抗うつ作用の向上効果は、膜透過配列部分及びエンドソーム脱出部分の付加によってＧＬＰ−２の脳内における分布が促進された結果としてもたらされたものと考えられる。
【００６２】
試験対象動物及び試験方法を変更して行った実施例３及び実施例４、並びに治療抵抗性うつ病発症モデルを用いた実施例５の評価結果より、ＧＬＰ−２の投与により抗うつ効果が得られることがわかった。
【００６３】
中枢作用性ペプチドをＧＬＰ−１又はＮｍＵに変更してＹ字迷路試験を行った実施例６及び実施例７の評価結果より、ＬＰＳ投与群はＬＰＳ非投与群（Ｖｅｈｉｃｌｅ）に比べて学習能力が低下していたが、ＧＬＰ−１又はＮｍＵの投与により学習能力が有意に改善されることがわかった。
【００６４】
中枢作用性ペプチド誘導体の安定性試験を行った実施例８では、膜透過配列部分及びエンドソーム脱出部分をＧＬＰ−２に付加したＧＬＰ−２誘導体の方が、分解酵素であるＤＰＰ−４に対する安定性が誘導体化する前のＧＬＰ−２よりも高かった。このことから、中枢作用部分に膜透過配列部分及びエンドソーム脱出部分を付加することでＤＰＰ−４による分解が進みにくくなり、ペプチドの安定性が向上し、中枢への移行性がいっそう向上するという副次的な効果が得られると考えられる。
【００６５】
日本国特許出願２０１４−１７７９７４号及び日本国特許出願２０１４−１８４４３６号の開示は、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。本明細書に記載された全ての文献、特許出願、及び技術規格は、個々の文献、特許出願、及び技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書に参照により取り込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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