(57)【要約】      （修正有）【課題】抗原提示細胞、特に樹状細胞による取り込みにおいて、特に効果的な、免疫調節製剤での、特にワクチンとしての使用のための、抗原が結合したガス入りの微小胞、および、前記微小胞を含む水性懸濁液の提供。【解決手段】安定化膜を有するガス入りの微小胞の水性懸濁液を含む医薬製剤であって、前記安定化膜は、（ａ）前記膜を形成する両親媒性成分に共有結合された抗原、（ｂ）リン脂質、および、（ｃ）脂肪酸を含み、前記リン脂質と前記脂肪酸との間のモル比は、３０／７０よりも低い、医薬製剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
安定化膜を有するガス入りの微小胞の水性懸濁液を含む医薬製剤であって、
前記安定化膜は、（ａ）前記膜を形成する両親媒性成分に共有結合された抗原、（ｂ）リン脂質、および、（ｃ）脂肪酸を含み、
前記リン脂質と前記脂肪酸との間のモル比は、３０／７０よりも低い、
医薬製剤。
【請求項２】
請求項１に記載の製剤であって、
前記モル比が、２５／７５またはそれよりも低い、
製剤。
【請求項３】
請求項１に記載の製剤であって、
前記モル比が、２０／８０またはそれよりも低い、
製剤。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか一項に記載の製剤であって、
前記安定化膜におけるリン脂質の量は、前記膜を形成する成分の全体量に対して、５０重量％未満である、
製剤。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか一項に記載の製剤であって、
前記抗原は、前記膜において、０．１％〜１０％のモル量で存在する、
製剤。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか一項に記載の製剤であって、
前記微小胞内に含まれる前記ガスは、フッ素化ガスを含む、
製剤。
【請求項７】
請求項１０に記載の製剤であって、
前記ガスは、空気または窒素と混合される、
製剤。
【請求項８】
請求項１から７のいずれか一項に記載の製剤であって、
前記リン脂質は、ジラウロイル−ホスファチジル−コリン（ＤＬＰＣ）、ジミリストイル−ホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジパルミトイル−ホスファチジル−コリン（ＤＰＰＣ）、ジアラキドイル−ホスファチジルコリン（ＤＡＰＣ）、ジステアロイル−ホスファチジル−コリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイル−ホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、１，２ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（エチル−ＤＳＰＣ）、ジペンタデカノイル−ホスファチジルコリン（ＤＰＤＰＣ）、１−ミリストイル−２−パルミトイル−ホスファチジルコリン（ＭＰＰＣ）、１−パルミトイル−２−ミリストイル−ホスファチジルコリン（ＰＭＰＣ）、１−パルミトイル−２−ステアロイル−ホスファチジルコリン（ＰＳＰＣ）、１−ステアロイル−２−パルミトイル−ホスファチジルコリン（ＳＰＰＣ）、１−パルミトイル−２−オレイル−ホスファチジル−コリン（ＰＯＰＣ）、１−オレイル−２−パルミトイル−ホスファチジルコリン（ＯＰＰＣ）、ジラウロイル−ホスファチジルグリセロール（ＤＬＰＧ）およびそのアルカリ金属塩類、ジアラキドイルホスファチジル−グリセロール（ＤＡＰＧ）およびそのアルカリ金属塩類、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）およびそのアルカリ金属塩類、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）およびそのアルカリ金属塩類、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）およびそのアルカリ金属塩類、ジオレオイル−ホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）およびそのアルカリ金属塩類、ジラウロイルホスファチジン酸（ＤＬＰＡ）、ジミリストイルホスファチジン酸（ＤＭＰＡ）およびそのアルカリ金属塩類、ジパルミトイルホスファチジン酸（ＤＰＰＡ）およびそのアルカリ金属塩類、ジステアロイルホスファチジン酸（ＤＳＰＡ）、ジアラキドイルホスファチジン酸（ＤＡＰＡ）およびそのアルカリ金属塩類、ジラウロイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＬＰＥ）、ジミリストイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジステアロイルホスファチジル−エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジオレイルホスファチジル−エタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジアラキドイルホスファチジル−エタノールアミン（ＤＡＰＥ）、ジリノレイルホスファチジルエタノールアミン、ジラウロイル−ホスファチジル−セリン（ＤＬＰＳ）、ジミリストイルホスファチジルセリン（ＤＭＰＳ）、ジアラキドイル−ホスファチジル−セリン（ＤＡＰＳ）、ジパルミトイルホスファチジルセリン（ＤＰＰＳ）、ジステアロイルホスファチジルセリン（ＤＳＰＳ）、ジオレオイルホスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）、ジパルミトイルスフィンゴミエリン（ＤＰＳＰ）、ジステアロイルスフィンゴミエリン（ＤＳＳＰ）、ジラウロイル−ホスファチジルイノシトール（ＤＬＰＩ）、ジアラキドイルホスファチジルイノシトール（ＤＡＰＩ）、ジミリストイルホスファチジルイノシトール（ＤＭＰＩ）、ジパルミトイルホスファチジルイノシトール（ＤＰＰＩ）、ジステアロイルホスファチジルイノシトール（ＤＳＰＩ）、ジオレオイル−ホスファチジルイノシトール（ＤＯＰＩ）からなる群より選択される、
製剤。
【請求項９】
請求項８に記載の製剤であって、
ペグ化リン脂質をさらに含む、
製剤。
【請求項１０】
請求項８または９に記載の製剤であって、
前記脂肪酸は、カプリン（ｎ−デカン）酸、ラウリン（ｎ−ドデカノン）酸、ミリスチン（ｎ−テトラデカン）酸、パルミチン（ｎ−ヘキサデカン）酸、ステアリン（ｎ−オクタデカン）酸、アラキジン（ｎ−エイコサン）酸、ベヘン（ｎ−ドコサン）酸およびｎ−テトラコサン酸からなる群より選択される、
製剤。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれか一項に記載の製剤であって、
前記抗原に共有結合した前記両親媒性成分は、リン脂質である、
製剤。
【請求項１２】
請求項１から１１のいずれか一項に記載の製剤であって、
免疫調節治療での使用のための、
製剤。
【請求項１３】
請求項１２に記載の使用のための製剤であって、
前記治療は、ワクチン接種を含む、
製剤。
【請求項１４】
請求項１２に記載の使用のための製剤であって、
前記抗原は、ワクチン抗原である、
製剤。
【請求項１５】
請求項１２から１４のいずれか一項に記載の使用のための製剤であって、
前記治療は、寛容導入の治療を含む、
製剤。
【請求項１６】
請求項１２から１４のいずれか一項に記載の使用のための製剤であって、
前記治療は、免疫賦活の治療を含む、
製剤。
【請求項１７】
請求項１から１６のいずれか一項に記載のガス入りの微小胞の懸濁液の前駆体であって、
生理的に許容できるガスの存在下で、生理的に許容できる水性担体中で再構成可能な、凍結乾燥された製剤の形態である、
前駆体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般論として、特にワクチンおよび免疫調節製剤での使用のための、抗原が結合したガス入りの微小胞、および前記微小胞を含む水性懸濁液に関する。
【背景技術】
【０００２】
樹状細胞（ＤＣ）は、極性化サイトカインの放出を介した獲得免疫の開始と調節、および、特異的なＴ細胞応答を刺激または復活させるための捕捉抗原（Ａｇ）のプロセシングと提示において、極めて重要な役割を果たす。免疫応答の調節を目指す、ワクチン接種を含む免疫療法の戦略は、これらの専門的な抗原提示細胞（ＡＰＣ）へのＡｇの送達に重点を置いてきた。ワクチン接種は、通常、抗原性の実体物（ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｅｎｔｉｔｉｅｓ）（ＤＮＡ、ペプチドまたはタンパク質）のインビボ送達により達成され、それは、それらの低い免疫学的活性のため、一般的に、補強された（ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ）デリバリーシステムで処方される。
【０００３】
過去の年月の間に様々なデリバリーシステムが研究されており、特にＡｇ微粒子（ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｉｏｎ）に基づく、異なるアジュバントが、抗原の送達を強化して、したがって免疫系を活性化する、それらの有効性に関して試験されている。例えば、抗原−リポソーム製剤でのリポソームのアジュバント効果が研究されている（例えば、Ｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ，「Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｌｉｐｉｄ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  Ｅｘｅｒｔ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ａｄｊｕｖａｎｔｉｃｉｔｙ  ｉｎ  Ａｎｔｉｇｅｎ−Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｖｉａ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ」Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．１５（１），２００４，ｐｐ．３５〜４０を参照）。より最近では、中国特許ＣＮ１００５４６６４に開示されるように、ガス入りの微小胞も免疫アジュバントおよびワクチン担体として提案されている。ガス入りの微小胞は、一般に、とりわけ超音波イメージングのための、造影剤としてのそれらの使用で知られている。それらは典型的に、水性媒体中に分散された数ミクロンの直径を有する気泡の懸濁液を含み、ガスを含むための安定化膜を形成する適切な材料を含む。
【０００４】
ＣＮ１００５４６６４は、特に、抗原が微小胞の内側に封入されているか、あるいはその表面に付着している（静電気的吸着により）かのいずれかのガス入りの微小胞の調製を開示する。そして微小胞は局所的に投与されて、微小胞を破壊して抗原を放出するために超音波が局所的に加えられる。前記特許によれば、ガス入りの微小胞と超音波照射を組み合わせた使用で観察されるプラス効果に反して、付着した抗原を有する微小胞の単独の投与は、実質的に効果がない（ブランクコントロールに匹敵する）。
【０００５】
国際特許出願ＷＯ２０１２／０８５０７２は、ガス入りの微小胞を開示し、抗原は、微小胞膜の成分、具体的にはリン脂質に共有結合していて、これらの微小胞は、いかなる超音波照射も実質的に不存在下で、顕著なアジュバント効果を与える。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本出願人は、ここで、ガス入りの微小胞の安定化膜の処方を適切に改変することにより、微小胞のアジュバント効果がさらに増大され得ることを見いだした。具体的には、出願人は、免疫調節治療における有利な結果は、微小胞の安定化膜における脂肪酸のモル量がリン脂質のモル量よりも高い場合に達成することができ；さらなる有利性は、抗原がリン脂質に直接結合される場合に達成することができることを観察した。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の一態様は、安定化膜を有するガス入りの微小胞の水性懸濁液を含む医薬製剤に関し、前記安定化膜は、（ａ）前記膜を形成する両親媒性成分に共有結合された抗原、（ｂ）リン脂質および（ｃ）脂肪酸を含み、リン脂質と脂肪酸の間のモル比は、少なくとも４０／６０またはそれよりも低い。
【０００８】
好ましくは、前記モル比は、３０／７０またはそれよりも低く、より好ましくは、少なくとも２５／７５またはそれよりも低く、さらにより好ましくは、２２／７８またはそれよりも低い。
【０００９】
好ましい実施態様によれば、安定化膜におけるリン脂質の量は、膜を形成する成分の全体量に対して、５０重量％未満である。
【００１０】
好ましい態様によれば、前記製剤は、免疫調節治療、好ましくは、抗原特異的な抗体応答および／またはＴ細胞応答を促進するための治療での使用のための製剤である。
【００１１】
さらに好ましい態様によれば、前記免疫調節治療は、ワクチン接種を含む。
【００１２】
さらに好ましい実施態様によれば、前記抗原は、ワクチン抗原である。
【００１３】
別の態様によれば、本発明は、ワクチンまたは免疫調節剤を調製するための、前記微小胞の成分に共有結合された抗原を含む、ガス入りの微小胞の水性懸濁液の使用に関する。
【００１４】
本発明の別の態様は、それぞれの抗原を含むガス入りの微小胞によって抗原提示細胞の活性化を増大させる方法、および／または、前記のそれぞれの抗原提示細胞によって前記抗原の取り込みを増大させる方法に関し、前記のガス入りの微小胞を前記細胞と接触させるステップを含み、ここで、前記のガス入りの微小胞は、（ａ）前記膜を形成する両親媒性成分に共有結合された前記抗原、（ｂ）リン脂質、および（ｃ）脂肪酸を含む、安定化膜を含み、ここで、リン脂質と脂肪酸の間のモル比は、少なくとも４０／６０またはそれよりも低い。好ましい実施態様によれば、前記抗原提示細胞は、樹状細胞である。
【００１５】
本発明のさらなる態様は、それを必要とする患者での免疫系の調節を誘導する方法に関し、前記微小胞の成分に共有結合された抗原を含むガス入りの微小胞の水性懸濁液を有効量で前記患者に投与するステップを含む。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
用語「ガス入りの微小胞」は、安定化材料の膜または層（フィルム形成層を含む）で囲まれた、ミクロンまたはナノメートルのサイズの気泡を含む、任意の構造を含む。当該用語は、ガス入りのリポソーム、マイクロバブル、マイクロスフェア、マイクロバルーンまたはマイクロカプセルとして当技術分野で知られているものを含む。安定化材料は、例えば、界面活性剤、脂質、スフィンゴ脂質、オリゴ脂質、糖脂質、リン脂質、タンパク質、ポリペプチド、炭水化物、および、合成または天然のポリマー材料を含む、当技術分野で典型的に知られている任意の材料であってよい。
【００１７】
用語、ガス入りの微小胞の「前駆体」は、ガスの存在下で水性担体を用いて再構成するとガス入りの微小胞の水性懸濁液を産生する、任意の組成物を含む。前記組成物は、典型的に、ガスの存在下でその水性懸濁液を振るとガス入りの微小胞を形成することが可能な、任意の上記の安定化材料を、乾燥粉末の（例えば、凍結−乾燥された、凍結乾燥された、または噴霧乾燥された）形態で含む。
【００１８】
用語「マイクロバブル」は、ガスと液体の界面（ときには、当技術分野で「エバネセント（ｅｖａｎｅｓｃｅｎｔ）」膜と呼ばれる）に配置された安定化両親媒性材料を含む非常に薄い膜（フィルム）によって、ガスの気泡がガス／液体界面で結合している、水性懸濁液を含み；好ましくは、両親媒性材料は、リン脂質および脂肪酸の混合物を含む。マイクロバブル懸濁液は、粉末の両親媒性材料（例えば凍結乾燥された、予め形成されたリポソーム、または、凍結乾燥または噴霧乾燥されたリン脂質溶液）のような適切なその前駆体を、空気またはその他のガスに接触させて、それから、マイクロバブル懸濁液を産生するためにかき混ぜながら水性担体と接触させることにより調製することができ、それから、好ましくはその調製の直後に、投与することができる。ガスマイクロバブルの水性懸濁液、前駆体、およびその調製の例は、例えば、参照により本明細書に援用される、ＵＳ５，２７１，９２８、ＵＳ５，４４５，８１３、ＵＳ５，４１３，７７４、ＵＳ５，５５６，６１０、ＵＳ５，５９７，５４９、ＵＳ５，８２７，５０４およびＷＯ０４／０６９２８４に開示されている。
【００１９】
表現「膜形成化合物」は、ガス入りの微小胞の安定化膜の形成に関与することが可能な任意の化合物を含む。前記化合物は、好ましくは、両親媒性材料であり、好ましくは、リン脂質を含む。
【００２０】
用語「免疫調節」または「免疫応答の調節」は、それを必要としている患者での免疫賦活および／または寛容に向けたまたは導入が可能な、任意の医学的な治療（「免疫調節治療」）を、その意味の中に含む。同様に、用語「免疫調節剤」、または、「免疫調節」化合物または製剤は、患者における免疫応答の所望の調節を誘導することが可能な、免疫賦活および／または寛容原性化合物または製剤を含むことを意図する。
【００２１】
用語「免疫賦活」は、患者における改善された応答を誘導する抗原の免疫原性の任意の増加を含む。同様に、「免疫賦活」化合物または製剤は、前記免疫応答を増加させることが可能な化合物または製剤を含む（例えば、感染、癌、および／または免疫不全症の治療において有用である）。
【００２２】
用語「寛容」は、抗原に対する、患者の免疫系の実質的な非反応性の任意の状態を、その意味の中に含む。「寛容原」は、患者において抗原に対して寛容導入することが可能な化合物または製剤を含む（例えば、環境−例えば花粉アレルギー、または栄養学的アレルギーのようなアレルギーの治療において有用である）。
【００２３】
用語「ワクチン接種」は、抗原化合物または製剤、典型的にはワクチン抗原の患者への投与を含む、任意の免疫調節治療を含む。同様に、用語「ワクチン」は、ワクチン抗原を含む任意の化合物または製剤を、その意味の中に含む。
【００２４】
用語「（医学的な）治療」は、予防的な治療および／または治療的な治療のいずれかを、その意味の中に含む。
【００２５】
本発明に係るガス入りの微小胞は、当技術分野で知られている任意のガス入りの微小胞、具体的には、ガス入りのマイクロバブルであってよい。
【００２６】
ガス入りのマイクロバブルは、一般に、１つまたは複数の両親媒性の成分により、安定化される。マイクロバブルの安定化膜を形成するために適切な両親媒性の成分は、例えば、リン脂質；リゾリン脂質；パルミチン酸、ステアリン酸、アラキドン酸またはオレイン酸のような脂肪酸；キチン、ヒアルロン酸、ポリビニルピロリドンまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のようなポリマーを有する、「ペグ化脂質」とも呼ばれる脂質；スルホン化単糖類、ニ糖類、オリゴ糖類または多糖類を有する脂質；コレステロール、硫酸コレステロールまたはヘミコハク酸コレステロール；ヘミコハク酸トコフェロール；エーテルまたはエステル結合脂肪酸を有する脂質；重合脂質；ジアセチルホスフェート；ジセチルホスフェート；セラミド；ポリオキシエチレン脂肪酸エステル（例えばポリオキシエチレン脂肪酸ステアリン酸）、ポリオキシエチレン脂肪アルコール、ポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテル、ポリオキシエチル化ソルビタン脂肪酸エステル、グリセロールポリエチレングリコールリシノール酸、エトキシ化ダイズステロール、エトキシ化ヒマシ油またはエチレンオキシド（ＥＯ）とプロピレンオキシド（ＰＯ）のブロック共重合体；酪酸コレステロール、イソ酪酸コレステロール、パルミチン酸コレステロール、ステアリン酸コレステロール、酢酸ラノステロール、パルミチン酸エルゴステロール、またはｎ−酪酸植物ステロールを含む、ステロール脂肪酸エステル；コレステロールグルクロニド、ラノステロールグルクロニド、７−デヒドロコレステロールグルクロニド、エルゴステロールグルクロニド、グルコン酸コレステロール、グルコン酸ラノステロールまたはグルコン酸エルゴステロールを含む、糖酸のステロールエステル；ラウリルグルクロニド、ステアロイルグルクロニド、ミリストイルグルクロニド、ラウリルグルコン酸、ミリストイルグルコン酸、またはステアロイルグルコン酸を含む、糖酸とアルコール類のエステル；ラウリン酸スクロース、ラウリン酸フルクトース、パルミチン酸スクロース、ステアリン酸スクロース、グルクロン酸、グルコン酸またはポリウロン酸を含む、糖類と脂肪酸のエステル；サルササポゲニン、スミラゲニン、ヘデラゲニン、オレアノール酸、またはジギトキシゲニンを含む、サポニン；トリパルミチン酸グリセロール、ジステアリン酸グリセロール、トリステアリン酸グリセロール、ジミリスチン酸グリセロール、トリミリスチン酸グリセロール、ジラウリン酸グリセロール、トリラウリン酸グリセロール、ジパルミチン酸グリセロールを含む、グリセロールエステルまたはグリセロール；ｎ−デシルアルコール、ラウリルアルコール、ミリスチルアルコール、セチルアルコール、またはｎ−オクタデシルアルコールを含む、長鎖アルコール；６−（５−コレステン−３β−イルオキシ）−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド；ジガラクトシルジグリセリド；６−（５−コレステン−３β−イルオキシ）ヘキシル−６−アミノ−６−デオキシ−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド；６−（５−コレステン−３β−イルオキシ）ヘキシル−６−アミノ−６−デオキシル−１−チオ−β−Ｄ−マンノピラノシド；１２−（（（７’−ジエチルアミノクマリン−３−イル）カルボニル）メチルアミノ）オクタデカン酸；Ｎ−［１２−（（（７’−ジエチルアミノクマリン−３−イル）カルボニル）メチルアミノ）オクタデカノイル］−２−アミノパルミチン酸；Ｎ−スクシニルジオレイルホスファチジルエタノールアミン；１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロール；１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−３−スクシニルグリセロール；１，３−ジパルミトイル−２−スクシニルグリセロール；１−ヘキサデシル−２−パルミトイルグリセロホスホエタノールアミンまたはパルミトイルホモシステイン；例えば、Ｎ−ステアリルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジステアリルアミン、Ｎ−ヘキサデシルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジヘキサデシルアミン、Ｎ−ステアリルアンモニウム塩化物、Ｎ，Ｎ’−ジステアリルアンモニウム塩化物、Ｎ−ヘキサデシルアンモニウム塩化物、Ｎ，Ｎ’−ジヘキサデシルアンモニウム塩化物、ジメチルジオクタデシルアンモニウム臭化物（ＤＤＡＢ）、ヘキサデシルトリメチルアンモニウム臭化物（ＣＴＡＢ）のような、少なくとも１つの（Ｃ１０−Ｃ２０）、好ましくは（Ｃ１４−Ｃ１８）アルキル鎖を含む、アルキルアミンまたはアルキルアンモニウム塩；例えば、１，２−ジステアロイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＳＴＡＰ）、１，２−ジパルミトイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＰＴＡＰ）、１，２−オレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）、１，２−ジステアロイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＳＤＡＰ）のような、（Ｃ３−Ｃ６）アルキレン架橋を介してＮ原子に結合した１つまたは好ましくは２つの（Ｃ１０−Ｃ２０）、好ましくは（Ｃ１４−Ｃ１８）アシル鎖を含む、第３級または第４級アンモニウム塩；およびそれらの混合物または組み合わせを含む。
【００２７】
本発明によれば、安定化層の組成内の脂肪酸のモル量がリン脂質のモル量よりも多い場合に、微小胞の有効性が増大し得ることが観察されている。具体的には、微小胞の膜における脂肪酸の量が多いことは、インビボでの抗原特異的な抗体および／またはＴ細胞応答を著しく促進し得ることが観察されている。
【００２８】
適切な脂肪酸の例は、相対的に長鎖脂肪族、例えば、１０〜２８個の炭素原子（Ｃ１０−Ｃ２８）を含むカルボン酸である。脂肪族鎖は、好ましくは線形（直線）の鎖である。本発明に係る組成において有用な脂肪酸は、好ましくは、Ｃ１０−Ｃ２４脂肪族鎖、より好ましくはＣ１４−Ｃ２２、さらにより好ましくは、Ｃ１６−Ｃ２０脂肪族鎖を有し、カルボン酸基で終わる。
【００２９】
脂肪酸は、飽和または不飽和のいずれかであってよい（すなわち、１つまたは複数の不飽和、典型的に二重結合を含む）。
【００３０】
飽和脂肪酸は、例えば：カプリン酸（ｎ−デカン酸）、ラウリン酸（ｎ−ドデカノン酸）、ミリスチン酸（ｎ−テトラデカン酸）、パルミチン酸（ｎ−ヘキサデカン酸）、ステアリン酸（ｎ−オクタデカン酸）、アラキジン酸（ｎ−エイコサン酸）、ベヘン酸（ｎ−ドコサン酸）およびｎ−テトラコサン酸のような、脂肪族鎖内に不飽和を有さない脂肪酸を含む。好ましい飽和脂肪酸は、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸およびアラキジン酸であり、パルミチン酸が特に好ましい。
【００３１】
不飽和脂肪酸は、少なくとも１個、および５個までの不飽和（具体的には二重結合）を脂肪族鎖内に含んでよい。好ましくは、不飽和は、ｃｉｓ−立体配置である。好ましくは、不飽和脂肪酸は、３個以下の不飽和、より好ましくは２個以下の不飽和を含み；単一の不飽和を脂肪族鎖内に含む不飽和脂肪酸が特に好ましい。不飽和脂肪酸の例は、例えば、デセン酸、ドデセン酸、テトラデセン酸、ヘキサデセン酸、ヘキサデセン二酸、オクタデセン酸、オクタデカジエン酸、オクタデカトリエン酸、オクタデカテトラエン酸、エイコセン酸、エイコサジエン酸、エイコサトリエン酸、エイコサテトラエン酸、エイコサペンタエン酸、ドコセン酸、ドコサトリエン酸、ドコサテトラエン酸、ドコサペンタエン酸、およびテトラコセン酸を含む。好ましい不飽和脂肪酸は、ミリストレイン酸（シス−９−テトラデセン酸）、パルミトレイン酸（シス−９−ヘキサデセン酸）、サピエン酸（シス−６−ヘキサデセン酸）、オレイン（シス−９−オクタデセン酸）、リノール酸（シス−９，１２−オクタデカジエン酸）、リノレン（シス−９，１２，１５−オクタデカトリエン酸）、ゴンドン酸（シス−１１−エイコセン酸）、シス−１１，１４−エイコサジエン酸、シス−５，８，１１−エイコサトリエン酸、シス−８，１１，１４−エイコサトリエン酸、シス−１１，１４，１７−エイコサトリエン酸、アラキドン酸（シス−８，１１，１４，１７−エイコサテトラエン酸）、およびエルカ（シス−１３−ドコセン酸を含み、パルミトレイン酸、オレイン酸およびゴンドン酸が特に好ましい。
【００３２】
微小胞の安定化膜を形成する脂肪酸（単数または複数）とリン脂質（単数または複数）との間のモル比は、少なくとも６０／４０またはそれよりも高く、好ましくは７０／３０またはそれよりも高く、より好ましくは７５／２５またはそれよりも高く、さらにより好ましくは７８／２２またはそれよりも高い。好ましくは、モル比は、９５／５、より好ましくは９０／１０よりも高くない。
【００３３】
本発明によれば、微小胞の膜は、リン脂質をさらに含む。用語「リン脂質」は、任意の両親媒性リン脂質化合物を包含することが意図されて、その分子は、最終微小気泡懸濁液中のガス−水の境界界面において、材料の安定化フィルムを、（典型的には、モノ分子層の形態で）形成することが可能である。
【００３４】
両親媒性リン脂質化合物は、典型的に、少なくとも１つのリン酸基、および、少なくとも１つ、好ましくは２つの脂溶性長鎖炭化水素基を含む。
【００３５】
適切なリン脂質の例は、１つまたは好ましくは２つの（同じか異なる）脂肪酸残基およびリン酸と、グリセロールとのエステルを含み、ここでリン酸基は、例えば、コリン（ホスファチジルコリン−ＰＣ）、セリン（ホスファチジルセリン−ＰＳ）、グリセロール（ホスファチジルグリセロール−ＰＧ）、エタノールアミン（ホスファチジルエタノールアミン−ＰＥ）、イノシトール（ホスファチジルイノシトール）のような親水性基に次々に結合される。ただ１つの脂肪酸残基を有するリン脂質のエステルは、一般に、当技術分野において、リン脂質の「リゾ」形態または「リゾリン脂質」と呼ばれる。リン脂質中に存在する脂肪酸残基は、一般に、長鎖脂肪酸であり、典型的に、１２〜２４個、好ましくは１４〜２２個の炭素原子を含み；脂肪族鎖は１つか複数の不飽和を含んでよく、または好ましくは完全に飽和である。リン脂質中に含まれる適切な脂肪酸の例は、例えば、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、オレイン酸、リノール酸、およびリノレン酸である。好ましくは、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸およびアラキジン酸のような飽和脂肪酸が用いられる。
【００３６】
リン脂質のさらなる例は、ホスファチジン酸、すなわち、グリセロール−リン酸と脂肪酸のジエステル；スフィンゴミエリンのようなスフィンゴ脂質、すなわち、脂肪酸とのグリセロールジエステルの残基がセラミド鎖で置換されている、これらのホスファチジルコリンアナログ；カルジオリピン、すなわち、１，３−ジホスファチジルグリセロールと脂肪酸のエステル；ガングリオシドＧＭ１（またはＧＭ２）またはセレブロシドのようなグリコリピド；グルコリピド；スルファチドおよびグリコスフィンゴ脂質である。
【００３７】
本明細書において用いられる、用語「リン脂質」は、単独で、または混合物としてのいずれかで用いることができる、天然起源、半合成または合成的に調製される生成物のいずれかを含む。
【００３８】
天然起源のリン脂質の例は、典型的には、大豆または卵黄レシチンのような、天然のレシチン（ホスファチジルコリン（ＰＣ）誘導体）である。
【００３９】
半合成のリン脂質の例は、天然起源のレシチンの部分的または完全な水素化誘導体である。好ましいリン脂質は、ホスファチジルコリン、エチルホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトールまたはスフィンゴミエリンの脂肪酸ジエステルである。
【００４０】
好ましいリン脂質の例は、例えば、ジラウロイル−ホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）、ジミリストイル−ホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジパルミトイル−ホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジアラキドイル−ホスファチジルコリン（ＤＡＰＣ）、ジステアロイル−ホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイル−ホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、１，２ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（エチル−ＤＳＰＣ）、ジペンタデカノイル−ホスファチジルコリン（ＤＰＤＰＣ）、１−ミリストイル−２−パルミトイル−ホスファチジルコリン（ＭＰＰＣ）、１−パルミトイル−２−ミリストイル−ホスファチジルコリン（ＰＭＰＣ）、１−パルミトイル−２−ステアロイル−ホスファチジルコリン（ＰＳＰＣ）、１−ステアロイル−２−パルミトイル−ホスファチジルコリン（ＳＰＰＣ）、１−パルミトイル−２−オレイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、１−オレイル−２−パルミトイル−ホスファチジルコリン（ＯＰＰＣ）、ジラウロイル−ホスファチジルグリセロール（ＤＬＰＧ）およびそのアルカリ金属塩、ジアラキドイルホスファチジル−グリセロール（ＤＡＰＧ）およびそのアルカリ金属塩、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）およびそのアルカリ金属塩、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）およびそのアルカリ金属塩、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）およびそのアルカリ金属塩、ジオレオイル−ホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）およびそのアルカリ金属塩、ジミリストイルホスファチジン酸（ＤＭＰＡ）およびそのアルカリ金属塩、ジパルミトイルホスファチジン酸（ＤＰＰＡ）およびそのアルカリ金属塩、ジステアロイルホスファチジン酸（ＤＳＰＡ）、ジアラキドイルホスファチジン酸（ＤＡＰＡ）およびそのアルカリ金属塩、ジミリストイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジステアロイルホスファチジル−エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジオレイルホスファチジル−エタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジアラキドイルホスファチジル−エタノールアミン（ＤＡＰＥ）、ジリノレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＬＰＥ）、ジミリストイルホスファチジルセリン（ＤＭＰＳ）、ジアラキドイルホスファチジルセリン（ＤＡＰＳ）、ジパルミトイルホスファチジルセリン（ＤＰＰＳ）、ジステアロイルホスファチジルセリン（ＤＳＰＳ）、ジオレオイルホスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）、ジパルミトイルスフィンゴミエリン（ＤＰＳＰ）、およびジステアロイルスフィンゴミエリン（ＤＳＳＰ）、ジラウロイル−ホスファチジルイノシトール（ＤＬＰＩ）、ジアラキドイルホスファチジルイノシトール（ＤＡＰＩ）、ジミリストイルホスファチジルイノシトール（ＤＭＰＩ）、ジパルミトイルホスファチジルイノシトール（ＤＰＰＩ）、ジステアロイルホスファチジルイノシトール（ＤＳＰＩ）、ジオレオイル−ホスファチジルイノシトール（ＤＯＰＩ）である。
【００４１】
また、リン脂質は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）のような親水性ポリマーをそれに結合させることにより修飾されたリン脂質であってもよい。ポリマー修飾されたリン脂質は、例えば、「ペグ化リン脂質」、すなわち、ＰＥＧポリマーに結合したリン脂質を含む。ペグ化リン脂質の例は、ペグ化ホスファチジルエタノールアミン（手短に「ＰＥ−ＰＥＧ」）、すなわち、ＤＰＰＥ−ＰＥＧ（または、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ、ＤＭＰＥ−ＰＥＧ、ＤＡＰＥ−ＰＥＧまたはＤＯＰＥ−ＰＥＧ）のような、親水性エタノールアミンの部分が可変の分子量（例えば３００〜２００００ダルトン、好ましくは５００〜５０００ダルトン）のＰＥＧ分子に結合しているホスファチジルエタノールアミンである。例えば、ＤＰＰＥ−ＰＥＧ２０００は、約２０００の中間平均分子量（ｍｅａｎ  ａｖｅｒａｇｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ）を有するＰＥＧポリマーがそれに結合したＤＰＰＥを指す。
【００４２】
特に好ましいリン脂質は、ＤＡＰＣ、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＭＰＡ、ＤＰＰＡ、ＤＳＰＡ、ＤＭＰＧ、ＤＰＰＧ、ＤＳＰＧ、ＤＭＰＳ、ＤＰＰＳ、ＤＳＰＳ、および、エチル−ＤＳＰＣである。最も好ましいのは、ＤＰＰＧ、ＤＰＰＳおよびＤＳＰＣである。
【００４３】
また、リン脂質の混合物は、例えば、ＤＰＰＥおよび／またはＤＳＰＥ（ペグ化誘導体を含む）、ＤＰＰＣ、ＤＳＰＣおよび／またはＤＡＰＣと、ＤＳＰＳ、ＤＰＰＳ、ＤＳＰＡ、ＤＰＰＡ、ＤＳＰＧ、ＤＰＰＧ、エチル−ＤＳＰＣおよび／またはエチル−ＤＰＰＣとの混合物のようにして用いることもできる。
【００４４】
本発明によれば、安定化膜におけるリン脂質の量は、膜を形成する成分の全重量の５０重量％未満、好ましくは４０％未満である。
【００４５】
抗原は、従来型の方法に従って、具体的には、抗原をマイクロバブルの安定化膜を形成している両親媒性成分（手短に「膜形成成分」）に共有結合させることにより、マイクロバブルの安定化膜の成分に共有結合している。前記成分は、前に説明したものの中から選択することができ、リン脂質であることが特に好ましく、特にホスファチジルエタノールアミン（例えばＤＳＰＥまたはＤＰＰＥ）である。抗原は、好ましくは、例えばそれぞれの成分に含まれる反応基が関与する共有結合を用いて膜形成成分に直接結合されて、このようにして、膜形成に結合した抗原を含む構築物を得る。実際のところ、抗原をリン脂質に結合させるためにＰＥＧリンカーの使用を避けることによって、（より一般には、それらの安定化膜においてペグ化リン脂質を実質的に欠いている微小胞を用いることによって）、より顕著な免疫応答を得ることができることが観察されている。
【００４６】
反応性成分は、所望の反応基を含むか、または、成分中に所望の反応基を含むように従来型の技術によって修飾（「官能化」）することができるかの、いずれかでよい。
【００４７】
例えば、２つの反応性成分の１つが反応性アミノ基を含む場合は、イソチオシアネート基（チオカルバミド結合を形成する）、反応性エステル（アミド結合を形成する）、またはアルデヒド基（アルキルアミン結合に還元され得るイミン結合を形成する）のような適切な対応する反応性部分を含む他の成分と反応され得る。あるいは、２つの反応性成分の１つが反応性チオール基を含む場合は、他の成分上の適切な補完の反応性部分は、ハロアセチル誘導体、マレイミド（チオエーテル結合を形成する）、または、チオールを有する成分に由来するチオールとの反応の際に２つの成分の間に安定なジスルフィド結合の形成をもたらす、２−ピリジルチオ基の形態での硫化物を含む混合ジスルフィドを含んでよい。さらに、２つの反応性成分の１つが反応性カルボン酸基を含む場合は、他の成分上の適切な反応性部分は、アミンおよびヒドラジド（アミドまたはＮ−アシル、Ｎ’−アルキルヒドラジド機能を形成する）であってよい。例えば、マレイミド誘導体化リン脂質（例えばホスファチジルエタノールアミン）を調製することができ、それから、脱アセチル化溶液中で事前にインキュベートされたメルカプトアセチル化抗原（例えばタンパク質）と反応させる。
【００４８】
本発明によるシステムにおけるガス入りの微小胞に共有結合されることができる抗原、具体的にはワクチン抗原は、限定されないが、天然、組み換えまたは合成の生成物、およびそれらのフラグメントを含む。適切な抗原、具体的にはワクチン抗原は、例えば：植物花粉、昆虫毒（例えば、セイヨウミツバチ由来のホスホリパーゼＡ２）、食品、動物の鱗屑、チリダニなどに由来するか関連するアレルギー性抗原；アデノウイルス、アルファウイルス、コロナウイルス、サイトメガロウイルス、ジステンパー、エンテロウイルス種、エプスタイン・バー・ウイルス、フラビウイルス、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｅ型肝炎、ヘルペス種、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＨＴＬＶ１、ヒトレトロウイルス種、インフルエンザ、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、麻疹、乳頭腫ウイルス、パラインフルエンザウイルス、パラミクソウイルス、パロウイルス（ｐａｒｏｖｉｒｕｓ）、ポリオ、ポリオーマ腫瘍ウイルス、狂犬病、レオウイルス、トガウイルス、水痘帯状疱疹ウイルスなどに由来するか関連するウイルス抗原；百日咳菌、ライム病ボレリア菌（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｉｒｆｅｒｉ）、ブルセラ属、クラミジア、アナプラズマ科エンテロバクター属（ａｎａｐｌａｓｍａｔａｃｅａｅ  ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、大腸菌、ヘモフィルス属、ピロリ菌、肺炎桿菌、レジオネラ菌、髄膜炎菌（ｍｅｎｉｇｏｃｏｃｃｕｓ）、マイコバクテリウム属、淋菌、パスツレラ（ｐａｓｔｕｒｅｌｌａ）属、肺炎球菌、シュードモナス、リケッチア（ｒｉｃｋｓｅｔｔｉａ）、サルモネラ属、ブドウ球菌、連鎖球菌、梅毒トレポネーマ、ビブリオ、腸炎エルシニアなどに由来するか関連する、細菌性抗原；コクシジオイデス・イミティス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｉ）、ヒストプラスミン、トリコフィチン、デルマトフィチン、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、カンジダ・アルビカンス、クラドスポリウム・ハーバルム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｈｅｒｂａｒｕｍ）、ニューモシスチス・イロヴェチ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｊｉｒｏｖｅｃｉｉ）などに由来するか関連する、真菌抗原；百日咳菌、ボツリヌス菌、破傷風菌、破傷風菌などに由来するか関連する、毒素由来抗原；コクシジウム、フィラリア性線虫類、リーシュマニア、マラリア原虫、肉胞子虫、住血吸虫、条虫類、トキソプラズマ原虫、旋毛虫、膣トリコモナス、トリパノソーマなどに由来するか関連する寄生虫抗原；例えば、１型糖尿病、セリアック病、全身性エリテマトーデス（ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｌｕｐｕｓ  ｅｒｙｔｈｅｒｍａｔｏｓｉｓ）、関節リウマチ、グレーブス病、特発性血小板減少性紫斑病、シェーグレン症候群、慢性のリンパ球性甲状腺炎の原因となるもののような、自己抗原；または、例えば、チロシナーゼ、メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１または他のメラノーマ関連の抗原、癌／精巣抗原、発癌性胚抗原、多形性上皮性ムチン、上皮細胞の接着分子、ヒト乳頭腫ウイルス、前立腺に特異的な因子またはα−フェトプロテインのような、腫瘍抗原を含んでよい。
【００４９】
微小胞の膜に結合される抗原の量は、抗原のタイプおよび患者において誘導しなければならない免疫調節のタイプに依存して変化し得る。例えば、抗原は、微小胞の膜を形成する成分の全量に対して、約０．１モル％〜約１０モル％に変化し得る。好ましくは、前記量は、約０．２モル％〜約５モル％、さらにより好ましくは、約０．５モル％〜約２モル％に変化し得る。
【００５０】
ガス入りの微小胞は、微小胞のアジュバント効果を増大／改変するために、免疫調節化合物（アジュバント）、好ましくは両親媒性を場合により含んでよい。アジュバントの例は、例えば、Ｒｅｅｄ  ＳＧ，Ｂｅｒｔｈｏｌｅｔ  Ｓ，Ｃｏｌｅｒ  ＲＮらによる、「Ｎｅｗ  ｈｏｒｉｚｏｎｓ  ｉｎ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ  ｆｏｒ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２００８」、３０（１）：２３−３２；または、Ｗｉｌｓｏｎ−Ｗｅｌｄｅｒ  ＪＨ、Ｔｏｒｒｅｓ  Ｍ，Ｋｉｐｐｅｒ  ＭＪらによる、「Ｖａｃｃｉｎｅ  Ａｄｊｕｖａｎｔｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ  ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ」，Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  ２００９；９８（４）：１２７８−１３１６に開示される。
【００５１】
安定化膜における免疫調節のアジュバントの量は、（安定化膜を形成している材料の全モル量に対して）約０．１モル％〜約２０モル％、好ましくは約０．５モル％〜約１５モル％、さらにより好ましくは約１モル％〜約１０モル％に変化し得る。
【００５２】
他の賦形剤または添加剤は、マイクロバブルの安定化膜の形成に必ずしも関与することなく（または部分的にのみ関与して）、マイクロバブルの乾燥製剤中に存在してよいか、それの再構成のために用いられる水性担体とともに加えられてよいかのいずれかである。これらはｐＨ調節剤、浸透圧調整剤、粘度増強剤、乳化剤、充填剤などを含み、そして従来の量で使用されてよい。例えば、ポリオキシプロピレングリコールおよびポリオキシエチレングリコールならびにそれらの共重合体のような化合物を用いることができる。粘度増強剤または安定剤の例は、直鎖および架橋した多糖類、オリゴ糖類、糖類およびポリエチレングリコールのような親水性ポリマーから選択される化合物である。
【００５３】
ガス入りのマイクロバブルの調製は凍結乾燥または噴霧乾燥のステップを含んでよいので、凍結保護および／またはリオプロテクティブ（ｌｙｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ）効果を有する薬剤および／または増量剤、例えばグリシンのようなアミノ酸；炭水化物、例えばスクロース、マンニトール、マルトース、トレハロース、グルコース、ラクトースまたはシクロデキストリンのような糖、またはデキストラン、キトサンおよびその誘導体（例えば：カルボキシメチルキトサン、トリメチルキトサン）のような多糖；またはポリエチレングリコールのようなポリオキシアルキレングリコール、などの凍結乾燥添加剤を製剤中に含むことが好都合であり得る。
【００５４】
本発明による組成物のマイクロバブルは、当技術分野における任意の公知の方法によって生産することができる。典型的に、製造方法は、前記材料を含む水性または有機懸濁液の好ましくは凍結乾燥（フリーズドライ）による、上記の両親媒性材料を含む乾燥粉末材料の調製を含む。
【００５５】
例えば、ＷＯ９１／１５２４４に記載されるように、フィルム形成両親媒性化合物は、最初に、リポソームの形成のために用いられる任意の方法により、層状の形態に変換することができる。そのために、フィルム形成脂質および場合により他の添加剤（例えば粘度増強剤、非−フィルム形成の界面活性剤、電解質など）を含む水溶液を高スピードの機械的ホモジナイズまたは音響周波数または超音波周波数の下での超音波処理に供することができ、そしてそれから、流動性粉末を形成するために凍結乾燥されて、それからガスの存在下で保存される。例えばＵＳ５，５９７，５４９に記載されるような任意選択の洗浄ステップは、凍結乾燥の前に行なうことができる。
【００５６】
別の実施態様（例えばＵＳ５，５９７，５４９に記載される）によれば、フィルム形成化合物および親水性安定剤（例えばポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、グリコール酸、リンゴ酸またはマルトール）は、有機溶媒（例えば第３級ブタノール、２−メチル−２−ブタノールまたはＣ２Ｃｌ４Ｆ２）に溶解することができ、そして溶液を凍結乾燥して乾燥粉末を形成することができる。
【００５７】
好ましくは、例えば国際特許出願ＷＯ２００４／０６９２８４に記載されるように、リン脂質（上記のものの中から選択され、そして上記で特定された荷電リン脂質の少なくとも１つを含む）およびリオプロテクティング（ｌｙｏｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ）剤（前に記載したもののような、特に炭水化物、糖アルコール、ポリグリコール、ポリオキシアルキレングリコールおよびそれらの混合物）は、撹拌下で、水に不混和の有機溶媒（例えば分岐または直鎖のアルカン、アルケン、シクロアルカン、芳香族炭化水素、アルキルエステル、ケトン、ハロゲン化炭化水素、全フッ素置換された炭化水素またはそれらの混合物）を用いて水のエマルションに分散することができる。エマルションは、少なくとも１つのリン脂質の存在下で、水性の媒体および溶媒を、例えば、超音波処理、振とう、高圧ホモジナイズ、マイクロミキシング、膜乳化、高スピード撹拌または高せん断混合のような、当技術分野で知られている任意の適切なエマルション生成技術に供することにより、得ることができる。例えば、Ｐｏｌｙｔｒｏｎ（登録商標）ＰＴ３０００のようなローター・ステーターホモジナイザーを用いることができる。ローター・ステーターホモジナイザーの撹拌スピードは、エマルションの成分、エマルションの量、有機溶媒の相対容量、エマルションを含んでいる容器の直径およびエマルション中の溶媒の微小滴の所望の最終直径に依存して選択することができる。あるいは、例えば、第一注入口を通じて（例えば０．０５〜５ｍＬ／分の流速で）有機溶媒をミキサーの中に、そして第二注入口を通じて（例えば２〜１００ｍＬ／分の流速で）水相を導入することによって、混合物を乳化するためにマイクロミキシング技術を用いることができる。エマルション法によっては、乳化ステップの間または乳化ステップを始める直前に、有機溶媒を徐々に導入することができる。あるいは、乳化ステップの間または乳化ステップを始める直前に、水性媒体を、水に不混和の溶媒に徐々に加えることができる。好ましくは、この後者が有機溶媒と混合する前に、リン脂質は水性媒体中に分散される。あるいは、リン脂質は、有機溶媒中に分散することができ、または、乳化ステップの前または間に、水性−有機物混合物に、別に加えられてよい。こうして得られた、リン脂質材料によって（および場合により、他の両親媒性のフィルム形成化合物および／または添加剤によって）包囲されて安定化された溶媒の微小滴を含むマイクロエマルションは、それから、凍結乾燥された材料を得るために従来技術により凍結乾燥されて、（例えば適切なガスの存在下でバイアル中に）保存されて、マイクロバブルの寸法とサイズの分布が実質的に微小滴の懸濁液の寸法とサイズの分布と同程度であるガス入りのマイクロバブル懸濁液を最終的に与えるために水性担体を用いて再構成することができる。
【００５８】
ガス入りのマイクロバブルを調製するためのさらなる方法は、所望のガスの存在下で、リン脂質（および場合により、他の両親媒性のフィルム形成化合物および／または添加剤）を含む水性媒体を、制御された高い撹拌エネルギー（例えばローター・ステーターミキサーを用いて）に供して、そして得られた分散物を凍結乾燥に供して、乾燥した再構成可能な生成物を生産することにより、ガスマイクロバブルの分散物を生成するステップを含む。この方法の例は、例えば、参照により本明細書に援用されるＷＯ９７／２９７８２に与えられている。
【００５９】
噴霧乾燥技術（例えばＵＳ５，６０５，６７３に開示される）もまた、ガス入りのマイクロバブルを得るために生理学的水性担体と接触させると再構成可能な乾燥粉末を得るために、用いることができる。
【００６０】
任意の上記の技術により得られる乾燥または凍結乾燥された生成物は、一般に、粉末またはケークの形態であり、所望のガスと接触して保存（例えばバイアル中に）することができる。生成物は、適切な生理的に許容できる水性液体担体（典型的には注入可能）中で容易に再構成可能であり、バイアルを穏やかに撹拌するとガス入りのマイクロバブルの懸濁液を形成する。適切な生理的に許容できる液体担体は、滅菌水、生理食塩水（注入用の最終生成物が低張でないように有利に平衡化されてよい）のような水溶液、または、塩類か糖類、糖アルコール、グリコールまたは他の非イオン性ポリオール材料（例えばグルコース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、グリセロール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなど）のような１つか複数の浸透圧調節物質、カルボキシメチルキトサン、トリメチルキトサンのようなキトサン誘導体、または、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルスターチまたはデキストランのようなゲル化（ｇｅｌｉｆｙｉｎｇ）化合物の溶液である。
【００６１】
本発明の一実施態様によれば、抗原を含む構築物（すなわち抗原／膜形成成分構築物または抗原／スペーサー／膜形成成分構築物）は、任意の上記の調製方法により得られる凍結乾燥された材料の再構成のときに安定化膜の中に取り込まれるように、それ自体として製剤の他の成分と混合することができる。
【００６２】
あるいは、構築物は、適切に機能化された中間体（例えばマレイミド含有ホスファチジルエタノールアミンのような機能化膜形成成分）として最初の製剤に混合して、前記中間体を含む凍結乾燥された材料を生産することができ；それから、適切な補完の反応性部分（例えばチオール）を含む抗原は、それぞれの反応性部分を反応させることにより、再構成されたマイクロバブルの膜中に既に取り込まれた中間体化合物に結合することができる。
【００６３】
ＷＯ２００４／０６９２８４に開示される方法の場合、抗原を含む構築物は、乳化と凍結乾燥のステップを行なおうとしている最初の混合物の成分と混合することもできる。あるいは、構築物を含むミセル懸濁液を別々に調製して、そしてその後に、好ましくは加熱して、既に形成されたエマルション（他のフィルム形成成分を含む）に加えることができる。上述のように、形成された構築物の代わりに、機能化された中間体を代替的に用いることができ、それから、方法の任意のステップにおいて（例えば、乳化の段階に、または凍結乾燥された化合物の再構成のときに）、補完の反応性部分を含む抗原と反応させることができる。一実施態様によれば、機能化された膜形成成分（または膜形成／スペーサー中間体構築物）は、ミセル懸濁液として、形成されたエマルションに撹拌下で加えられる。抗原（補完の反応性部分を含む）を含む化合物は、それから、得られたエマルションに加えられる。
【００６４】
例えば、膜形成成分のマレイミド誘導体のミセル懸濁液を、形成されたフィルム形成成分のエマルションに加えることができる。それから、エマルションの凍結乾燥前に、メルカプトアセチル化抗原の溶液を、穏やかな撹拌下でエマルションに加える。あるいは、膜形成成分のマレイミド誘導体を含むエマルションは凍結乾燥されて、そしてそれから、その後に、無保護の抗原が、ガス入りの微小胞の再構成された懸濁液に加えられる。
【００６５】
任意の生体適合性ガス、ガス前駆体、またはそれらの混合物が、上記の微小胞を充填するために用いられてよい（以降、「微小胞形成ガス」とも特定される）。
【００６６】
ガスは、例えば、空気；窒素；酸素；二酸化炭素；水素；亜酸化窒素；ヘリウム、アルゴン、キセノンまたはクリプトンのような希ガスまたは不活性ガス；低分子量の炭化水素（例えば、最大で７炭素原子までを含む）、例えばメタン、エタン、プロパン、ブタン、イソブタン、ペンタンまたはイソペンタンのようなアルカン、シクロブタンまたはシクロペンタンのようなシクロアルカン、プロペン、ブテンまたはイソブテンのようなアルケン、またはアセチレンのようなアルキン；エーテル；ケトン；エステル；ハロゲン化、フッ素化または全フッ素置換された低分子量の炭化水素（例えば、最大で７炭素原子までを含む）のような、ハロゲン化ガス、好ましくはフッ素化ガス；または前述のいずれかの混合物を含んでよい。ハロゲン化炭化水素が用いられる場合は、前記化合物中のハロゲン原子の好ましくは少なくともいくつか、さらに好ましくは全てがフッ素原子である。
【００６７】
フッ素化ガス、特に、全フッ素置換されたガスが好ましい。フッ素化ガスは、例えば、フッ素化炭化水素（１つか複数の炭素原子とフッ素を含む有機化合物）；六フッ化硫黄；フッ素化、好ましくは全フッ素置換された、ペルフルオロアセトンのようなケトン類；およびフッ素化、好ましくは全フッ素置換された、ペルフルオロジエチルエーテルのようなエーテル類のような、少なくとも１つのフッ素原子を含む材料を含む。好ましい化合物は、例えば、ＥＰ０５５４２１３に開示されるような、特に安定したマイクロバブル懸濁液を形成することが知られている、ＳＦ６またはペルフルオロカーボン（全フッ素置換された炭化水素）のような全フッ素置換されたガス、すなわち全ての水素原子がフッ素原子により置換されている炭化水素である。
【００６８】
用語「ペルフルオロカーボン」は、飽和、不飽和、および環状ペルフルオロカーボンを含む。生体適合性で生理的に許容できるペルフルオロカーボンの例は：ペルフルオロメタン、ペルフルオロエタン、ペルフルオロプロパン、ペルフルオロブタンのようなペルフルオロアルカン（例えば、場合によりペルフルオロ−イソブタンのような他の異性体との混合で、ペルフルオロ−ｎ−ブタン）、ペルフルオロペンタン、ペルフルオロヘキサンまたはペルフルオロヘプタン；ペルフルオロプロペン、ペルフルオロブテン（例えばペルフルオロブト−２−エン）またはペルフルオロブタジエンのようなペルフルオロアルケン；ペルフルオロアルキン（例えばペルフルオロブト−２−イン）；およびペルフルオロシクロアルカン（例えばペルフルオロシクロブタン、ペルフルオロメチルシクロブタン、ペルフルオロジメチルシクロブタン、ペルフルオロトリメチルシクロブタン、ペルフルオロシクロペンタン、ペルフルオロメチルシクロペンタン、ペルフルオロジメチルシクロペンタン、ペルフルオロシクロヘキサン、ペルフルオロメチルシクロヘキサンおよびペルフルオロシクロヘプタン）である。好ましい飽和ペルフルオロカーボンは、例えば、ＣＦ４、Ｃ２Ｆ６、Ｃ３Ｆ８、Ｃ４Ｆ８、Ｃ４Ｆ１０、Ｃ５Ｆ１２およびＣ６Ｆ１２を含む。
【００６９】
任意の比率で上記のガスのいずれかの混合物を用いることも好都合であり得る。例えば、混合物は、窒素、空気または二酸化炭素のような従来型のガス、および、六フッ化硫黄または前述したペルフルオロカーボンのような、安定したマイクロバブル懸濁液を形成するガスを含んでよい。適切なガス混合物の例は、例えば、参照により本明細書中に援用されるＷＯ９４／０９８２９に見られることができる。以下の組み合わせが特に好ましい：ガス（Ａ）と（Ｂ）の混合物であって、ガス（Ｂ）は前述したものの中から選択されるフッ素化ガスであり、それらの混合物を含み、そして（Ａ）は空気、酸素、窒素、二酸化炭素またはそれらの混合物から選択される。ガス（Ｂ）の量は、混合物全体の約０．５％〜約９５％（ｖ／ｖ）、好ましくは約５％〜８０％を示すことができる。
【００７０】
特に好ましいガスは、ＳＦ６、Ｃ３Ｆ８、Ｃ４Ｆ１０またはそれらの混合物であり、場合により、空気、酸素、窒素、二酸化炭素またはそれらの混合物との混合である。
【００７１】
特定の状況では、ガス状の材料の前駆体（すなわち、インビボでガスに変換されることが可能な材料）を含むことが望ましくあり得る。好ましくは、ガス状の前駆体およびそれから得られるガスは、生理的に許容できる。ガス状の前駆体は、ｐＨ活性化、光活性化、温度活性化などであってよい。例えば、特定のペルフルオロカーボンは、温度活性化のガス状の前駆体として用いてよい。ペルフルオロペンタンまたはペルフルオロヘキサンのような、これらのペルフルオロカーボンは、室温（または薬剤が生産および／または保管される温度）よりも高いが体温よりも低い液体／ガス相転移温度を有し；したがって、それらは、液体／ガス相転移を受けて、ヒト体内でガスに転換される。
【００７２】
上述したとおり、本発明の微小胞は、特にワクチンおよび／または免疫調節製剤として有用である。
【００７３】
本出願人は、本発明の微小胞は、抗原がそれに共有結合されていない（例えば封入または吸着されている）微小胞と比較して、抗原提示細胞、具体的には樹状細胞（以下では「ＤＣ」）による取り込みに、特に効果的であることを観察した。本出願人により観察されたとおり、前記の増加した取り込みは、共有結合した抗原に対する特異的抗体のより高い産生、および抗原特異的なＴ細胞応答の増加をもたらす。
【００７４】
免疫応答の促進／調節に対するそれらの有利なアジュバント効果を考慮すると、本発明の微小胞は、それに共有結合した前述の（ワクチン）抗原のいずれかを効果的に投与するために用いることができる。微小胞の投与は、例えば、皮下、皮内、経皮、筋肉内または静脈内注入により、または経口、舌下、経鼻、膀胱内、膣または直腸送達のような粘膜経路により行なうことができる。例えば合計５回までの投与を、例えば１週間〜６か月の間を含む間隔で行うことができる。組成物は、好ましくはガス入りの微小胞の水性懸濁液の形態で投与される。あるいは、組成物は、凍結乾燥物として、またはゲル溶液として投与することができる。
【００７５】
注入／免疫付与のプロトコルの例は、本明細書中の実施例に示されている。
【００７６】
本発明の微小胞は、このように、それを必要とする患者における免疫応答の調節を含む、または誘導する、任意の医学的な治療、特に、それを必要とする患者における免疫応答を調節するための治療で使用することができる。典型的に、治療は、患者のワクチン接種を含む。
【００７７】
例えば、免疫調節治療は、感染（例えば、マラリア、髄膜炎、麻疹、エイズ、流感（インフルエンザ）、コレラ、リステリア症またはサルモネラ症のような、典型的に、細菌性、ウイルス性、寄生性および／または真菌性の感染）の治療、腫瘍（例えば、乳癌、前立腺癌、肺癌、卵巣癌、膀胱癌、または食道癌、肉腫、またはメラノーマなど）の治療、および、例えば環境または栄養学的アレルギー（例えば、花粉、ハチ毒、チリダニ、ラテックス、ミルク（ラクトース）、ピーナッツおよび／または卵（アルブミン）アレルギーなど）を含むアレルギーの治療を含んでよい。
【００７８】
以下の例は、本発明をさらに説明するのに役立つ。
【実施例】
【００７９】
以下の材料および略称は、後に続く実施例で用いられる：
【表１】
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2020183435.tif 000003
【００８０】
［実施例１］
共有結合した抗原（ＯＶＡ）を含むガス入りの微小胞の調製
ａ）ＯＶＡのチオール化
ＯＶＡ（６ｍｇ−１３３ｎｍｏｌｅｓ）を、ＰＢＥ（リン酸バッファー２５ｍＭ、１５０ｍＭ生理食塩水、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８）に溶解させて、２０ｍｇ／ｍＬの溶液を得た。Ｔｒａｕｔ試薬の溶液（２ｍｇ／ｍＬ−１４．５ｍＭ）をＰＢＥ中に調製して、９２μＬのこの溶液（１０ｅｑｕ．）をＯＶＡ溶液に添加した。生じた混合物を、撹拌しながら室温で１時間インキュベートした。この溶液を、ＰＢＥ中で平衡化されたスピンカラム（Ｚｅｂａスピンカラム２ｍＬ、Ｐｉｅｒｃｅ，＃８９８９０）を通してスピンした。溶液の最終容量は約３９０μＬであった。
【００８１】
最終ＯＶＡ濃度（２８０ｎｍのＵＶにより測定）は、約３００ｎｍｏｌ．／ｍＬであった。
【００８２】
チオールの酸化の可能性を制限するために、チオール化ＯＶＡ溶液を精製直後に用いた。
【００８３】
ｂ）共有結合したＯＶＡを含む微小胞の製剤：
ガス入りの微小胞の４つの製剤、すなわち、本発明に係る製剤Ａ１およびＡ２および比較製剤Ｂ１およびＢ２を、以下の方法論を用いて調製した。それぞれの製剤における成分のタイプおよび量は、以下の表１に特定される。
【００８４】
ｂ１）製剤Ａ１およびＢ１について：
ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−マレイミド（２．２ｍｇ−７．４７μｍｏｌｅｓ）を、撹拌（ボルテックス）によって４５℃でリン酸バッファー１００ｍＭ  ｐＨ６（０．２ｍＬ）に溶解させて、透明な溶液を得た。
【００８５】
ＤＳＰＣ／パルミチン酸の混合物２０ｍｇ（表１に示されるモル比）を、シクロオクタン（１．６ｍＬ）に７０℃で溶解させた。別個に、上記で調製された水溶液（０．２ｍＬ）を、１９．８ｍＬのＰＥＧ４０００  １０％溶液に添加した。それから、リン脂質を含む有機相を水相に添加して、高速ホモジナイザー（Ｐｏｌｙｔｒｏｎ  ＰＴ３１００、１１’０００ｒｐｍで１分）を使用することにより乳化した。ＰＰチューブ（Ｆａｌｃｏｎ−１５ｍＬ）中に、エマルションを１０ｍＬ画分に分けた。
【００８６】
ｂ２）製剤Ａ２およびＢ２について：
ＤＰＰＥ−ＭＰＢ（４．２ｍｇ−４．３９μｍｏｌｅｓ）を、ＤＳＰＣ／パルミチン酸の混合物２０ｍｇ（表１に示されるモル比）と混合して、撹拌（ボルテックス）によって６０℃でエタノール中に溶解させて、透明な溶液を得た。溶媒を窒素下で蒸発させて、残渣を真空下で一晩乾燥させた。
【００８７】
乾燥した残渣を、シクロオクタン（１．６ｍＬ）中に７０℃で溶解させて、２０ｍｌのＰＥＧ４０００  １０％を有機相に添加して、高速ホモジナイザー（Ｐｏｌｙｔｒｏｎ  ＰＴ３１００、１１’０００ｒｐｍで１分）を用いることにより混合物を乳化した。ＰＰチューブ（Ｆａｌｃｏｎ−１５ｍＬ）中に、エマルションを１０ｍＬ画分に分けた。
【００８８】
チオール化ＯＶＡ（７８ｎｍｏｌｅｓ）を、上記のステップｂ１またはｂ２に従って得られた１０ｍＬのエマルションに添加して、生じた混合物を２２℃で２時間３０分撹拌した。得られたエマルションを、最終的に、１０％  ＰＥＧ４０００溶液を用いて２回希釈して、ＤＩＮ４Ｒバイアル中にサンプリングした（５００μＬ／バイアル）。−５０℃で２時間、バイアルを凍結させて（Ｃｈｒｉｓｔ  Ｅｐｓｉｌｏｎ凍結乾燥機）、それから、−２５℃および０．２ｍＢａｒで１２時間、凍結乾燥させた。それから、凍結乾燥された生成物を、３５％のペルフルオロ−ｎ−ブタンおよび６５％の空気を含む雰囲気に曝した。
【００８９】
凍結乾燥した前駆体の分散および微小胞懸濁液の再構成のために、手による穏やかな振とうによって、１ｍＬの生理食塩水（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）をバイアルに添加した。あとに続く実施例では、再構成のための生理食塩水の容量は、特定の実験により必要とされる所望の濃度の抗原を得るように適応される。
【００９０】
４つの製剤の組成および特性を以下の表１に示す。具体的には、上記で引用されたＷＯ２０１２／０８５０７２の実施例と同様に、本発明に係る製剤Ａ１およびＡ２における微小胞は、安定化膜内に脂肪酸とリン脂質を８０／２０モル比で含み、一方で、比較製剤Ｂ１およびＢ２における微小胞は、安定化膜内に脂肪酸とリン脂質を２０／８０モル比で含み；さらに、製剤Ａ１およびその比較製剤Ｂ１では、抗原はペグ化リンカーを介してリン脂質に結合され、一方で、製剤Ａ２およびその比較製剤Ｂ２では、抗原はリン脂質に直接結合される。
【００９１】
【表２】
2020183435.tif 000004
【００９２】
［実施例２］
ミューリンＤＣのインビトロ活性化：微小胞の製剤Ａ１と比較Ｂ１との間の比較
脾臓由来マウスＤＣ２．４細胞を、完全ＲＰＭＩ培地中で維持した。それらを、完全ＲＰＭＩ培地中で、ポリ−Ｌ−リジンによりコーティングされたミニトレイ培養プレートでインキュベートした。それから、５μｌの微小胞製剤Ａ１またはＢ１（１０００微小胞：１ＤＣの比を得るような希釈で再構成した）をウェルに添加して、培養プレートを転倒させて、３７℃で２４時間、上下逆にしてインキュベートした。培養上清中のＴＮＦ−αを、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によって定量した。ＣＤ１６／３２に対するｍＡｂを用いて細胞をブロッキングして、ＣＤ４０に対するモノクローナル抗体を用いて染色して、ＧａｌｌｉｏｓフローサイトメーターおよびＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ  Ｉｎｃ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）を用いて解析した。
【００９３】
表２の結果は、本発明による製剤（Ａ１）は、膜内の脂肪酸含有量が低い比較製剤（Ｂ１）と比べて、細胞活性化を誘導する優れた能力を有することを示す。具体的には、製剤Ａ１の微小胞とのインキュベーション後に得られたＤＣのＴＮＦ−α産生は、製剤Ｂ１の微小胞とのインキュベーションと比べて２倍であることが観察され得る。同様に、ＤＣによるＣＤ４０発現は、比較製剤Ｂ１とのインキュベーション後よりも、製剤Ａ１とのインキュベーション後の方が高い。
【００９４】
【表３】
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【００９５】
［実施例３］
製剤Ａ１およびＡ２とそれぞれの比較製剤Ｂ１およびＢ２との間の短期免疫応答の比較
１００μｌの異なる微小胞製剤（Ａ１、Ａ２、Ｂ１またはＢ２；１００μｌの懸濁液あたり４．５μｇのＯＶＡの濃度を与えるような生理食塩水の容量で再構成された、実施例１のバイアル中の前駆体）を用いて、尾の付け根に皮下でマウスを免疫化した。Ｌｉｍｕｌｕｓ  Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ  Ｌｙｓａｔｅアッセイによってエンドトキシンレベルを測定して、ＯＶＡのμｇあたり１エンドトキシン単位（ＥＵ）よりも低いことが分かった。２週間隔で３回の投与を行なって、最後の注入の１４日後に脾臓を集めた。血清中のＯＶＡ特異的抗体の存在および力価を、以下のプロトコルに従ってＥＬＩＳＡによって決定した。手短には、Ｍａｘｉｓｏｒｂプレート（Ｎｕｎｃ）を１０μｇ／ｍＬ  ＯＶＡでコーティングして、ＰＢＳ−０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０−１％  ＢＳＡでブロッキングして、滴定された投与量の血清の添加前に洗浄した。４℃での一晩のインキュベーションの後に、プレートを洗浄して、ＯＶＡ特異的なＩｇＧの存在を、ＨＲＰが結合した抗ＩｇＧ抗体を用いたインキュベーションにより評価した。洗浄の後に、ＨＲＰ基質を添加して、１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を用いて数分後に反応を止めて、ＯＤ  ４５０ｎｍを測定した。得られた滴定曲線に基づいて（血清希釈（アゴニスト）ｖｓ．ＯＤ  ４５０ｎｍ（応答））、シグモイドフィッティング曲線を作成した。それから、試験されたそれぞれの条件の比較を可能にする、それぞれの曲線に関して最大半量ＯＤ  ４５０ｎｍを与える血清希釈（力価）を計算した（ＥＣ５０）。脾細胞を丸底９６ウェルプレートに４・１０５細胞／ウェルで蒔いて、培地のみ、ＯＶＡ（１００μｇ／ｍＬ）、または、ポジティブコントロールとしてコンカナバリンＡ（１．５μｇ／ｍＬ）のいずれかとともにインキュベートして、インキュベートした。７２時間のインキュベーションの後に細胞培養上清を集めて、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によってＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１０、ＩＬ−４の存在について分析した。
【００９６】
表３は、特異的な抗−ＯＶＡ  ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａの両方とも、微小胞製剤Ａ１を用いた短期免疫化の後に、製剤Ｂ１およびＢ２と比較して非常に増大したことを示す。製剤Ａ２を用いた免疫化は、製剤Ｂ１またはＡ２と比較した場合、より高レベルのＯＶＡ特異的ＩｇＧ１を産生した。
【００９７】
【表４】
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【００９８】
表４は、ワクチン接種したＢａｌｂ／ｃマウス由来のＯＶＡによって刺激された脾臓の細胞懸濁液からの培養上清中のサイトカイン測定を示す。微小胞製剤Ａ１およびＡ２の存在は、それぞれの比較製剤Ｂ１およびＢ２に対して、より顕著なＴｈ１型の免疫応答が生じるのを可能にした（免疫化されたマウスの脾細胞におけるＩＦＮ−γおよびＩＬ−２の重要な産生によって反映される）；表４の結果から観察されるように、Ｔｈ１型の免疫応答は、抗原がＰＥＧリンカーを介してリン脂質に結合される製剤（Ａ１）に対して、抗原が直接リン脂質に結合される製剤（Ａ２）によってさらに増大される。ＩＬ−１０およびＩＬ−４の産生は、本発明のＡ１およびＡ２の製剤の存在によって同様に増大した。
【００９９】
【表５】
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【０１００】
［実施例４］
Ｔ細胞応答の長期持続性の比較
１００μｌの微小胞製剤Ａ２またはＢ１（１００μｌの懸濁液あたり４．５μｇのＯＶＡの濃度を与えるような生理食塩水の容量を用いて再構成された、実施例１のバイアル）を用いて、尾の付け根に皮下でマウスを免疫化した。２週間隔で３回の投与を行なって、最後の注入の１４日後、２ヶ月後および６ヶ月後に血液および脾臓を集めた。脾臓の細胞懸濁液を、サイトカイン産生について、実施例３に説明したとおりに分析した。加えて、３７℃で、ＰＢＳ  ０．１％  ＢＳＡ中でＣＦＳＥにより脾細胞をラベルして、それから、９６ウェルプレート中に蒔く前に、冷却ＰＢＳ  ５％ウシ胎仔血清を用いて洗浄した。
【０１０１】
表５は、本発明に係る製剤（Ａ２）または比較製剤（Ｂ１）の最後の注入の１４日後、２ヶ月後および６ヶ月後に分析された、ワクチン接種したＢＡＬＢ／ｃマウス由来の脾臓のＴ細胞の抗原特異的な増殖を示す。ＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞は、両方とも、ワクチン接種後、早期（１４日後）および６ヶ月後の両方で、重要な増殖性能力を示す。ＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞の増殖はどちらも、本発明に係る製剤Ａ２をマウスに投与した場合に優れていた。
【０１０２】
表６の結果は、製剤Ａ２またはＢ１によって以前にワクチン接種されたＢＡＬＢ／ｃマウス由来のＯＶＡにより刺激された脾臓の細胞懸濁液からの培養上清中のサイトカイン定量を示す。サイトカインの持続的な産生は、ＩＬ−４を除き、免疫化後最初の２ヶ月観察される。すべての条件において、サイトカインのレベルは、製剤Ｂ１と比較して製剤Ａ２を用いたワクチン接種後に、より高くなる傾向がある。時において（Ｕｐｏｎ  ｔｉｍｅ）、製剤Ａ２を用いてワクチン接種されたマウスは、製剤Ｂ１と比較して、著しくより多くのＩＬ−２およびＩＦＮ−γを産生した。
【０１０３】
【表６】
2020183435.tif 000008
【０１０４】
【表７】
2020183435.tif 000009
【０１０５】
［実施例５］
ＯＶＡ−Ｌｍ感染に対する、ワクチンにより誘導される長期の保護
１００μｌの微小胞製剤Ａ２またはＢ１（１００μｌの懸濁液あたり４．５μｇのＯＶＡの濃度を与えるような生理食塩水の容量を用いて再構成された、実施例１のバイアル）を用いて、尾の付け根に皮下でマウスを免疫化した。２週間隔で３回の投与を行なった。最後の免疫化の６ヶ月後に、ＯＶＡ（ＯＶＡ−Ｌｍ）を安定的に発現する組み換えリステリア菌の５０’０００コロニー形成単位（ＣＦＵ）のＰＢＳ溶液を静脈内注入した。脾臓および肝臓におけるＯＶＡ−Ｌｍ負荷を感染の４日後に分析した。ＰＢＳ−０．１％  ＮＰ４０バッファー中の脾臓および肝臓を、７０−μｍ細胞ストレーナーを用いてすり潰して、２００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＢＨＩアガロースプレート上に段階希釈を蒔いて、３７℃で２４時間インキュベートした。細菌数を、脾臓または肝臓のＣＦＵ／ｍｇとして表わす。脾臓の細胞懸濁液によって産生されたＩＦＮ−γを、実施例２に説明したとおりに定量化した。
【０１０６】
表７のデータから推論できるように、比較製剤Ｂ１を用いてワクチン接種されたマウスは、コントロール群（抗原なし）のものと比べて、感染に対抗する高い能力を示したが、本発明の製剤Ａ２によるマウスのワクチン接種は、ＯＶＡ−Ｌｍによるチャレンジの４日後に試験された肝臓および脾臓における細菌負荷の著しい減少をもたらした。細菌負荷の減少を示すマウス（製剤Ａ２によりワクチン接種された）は全て感染を耐え抜いたが、一方で、製剤Ｂ１ワクチンでは４匹のうち２匹が４日以内に死亡し、抗原の無いコントロールを投与された４匹のうち３匹が４日以内に死亡した。部分保護は、最適化された製剤Ａ２によってワクチン接種されたマウスから得られた脾細胞による相当なレベルのＩＦＮ−γの産生と相関した（表７）。
【０１０７】
【表８】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年8月13日(2020.8.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【外国語明細書】
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2020183435000002.pdf
2020183435000003.pdf