(57)【要約】【課題】検出の精度、効率性に優れ、かつ、小型で可搬性に優れた標的物質検出装置等を提供すること。【解決手段】標的物質検出装置１は、標的物質と前記標的物質と結合体を形成する荷電粒子を含む液体試料４が表面上に保持可能とされる液体試料保持部（液体試料導入板２）と、液体試料導入板２の表面に対して全反射条件で光を照射可能とされる光照射部６と、電圧の印加により検出板２の表面上に導入された液体試料４中の前記結合体を移動可能とされる移動電場印加部（表面電極３Ａ，３Ｂ）と、前記光の照射を受けて液体試料導入板２から生ずる近接場に基づく光信号の信号変化から前記結合体の移動を検出可能とされる光信号検出部７と、を有することを特徴とする。【選択図】図１
2020122728.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的物質と前記標的物質と結合体を形成する荷電粒子を含む液体試料が表面上に導入されるとともに光の照射を受けて伝搬光及び近接場光のいずれかの検出光を生じさせる液体試料導入板が配され、かつ、前記液体試料が前記液体試料導入板の前記表面上に保持可能とされる液体試料保持部と、
前記液体試料導入板に前記光を照射して前記検出光を生じさせる光照射部と、
前記液体試料導入板の表面側に配され、電圧の印加により前記液体試料中の前記結合体を電極間で移動させる一対の電極を備える移動電場印加部と、
前記検出光に基づく光信号の信号変化から前記結合体の移動を検出可能とされる光信号検出部と、
を有することを特徴とする標的物質検出装置。
【請求項２】
移動電場印加部が、液体試料導入板の表面に離間させて形成される一対の表面電極、及び、前記液体試料導入板の表面に形成される表面電極と透明電極材料で形成され前記表面と対向して前記液体試料導入板上に導入された液体試料を覆うように配されるカバー電極とで構成される一対の電極の少なくともいずれかで構成される請求項１に記載の標的物質検出装置。
【請求項３】
更に、液体試料導入板の表面側に配され、電圧の印加により液体試料中の結合体を電極間で移動させ、かつ、前記表面に引き寄せる一対の電極を備える引き寄せ電場印加部を有する請求項１から２のいずれかに記載の標的物質検出装置。
【請求項４】
引き寄せ電場印加部が、移動電場印加部を構成する液体試料導入板の表面に離間させて形成される一対の表面電極の間の位置で前記液体試料導入板の前記表面に形成される表面電極と、透明電極材料で形成され前記表面電極と鉛直方向で対向して前記液体試料導入板上に導入された液体試料を覆うように配されるカバー電極とを備える請求項３に記載の標的物質検出装置。
【請求項５】
複数の第１の官能基で表面修飾された粒子本体の一部の前記第１の官能基又はその誘導基に前記標的物質と結合可能な結合物質が結合され、かつ、前記結合物質と未結合の前記第１の官能基又はその誘導基に液中で陽イオン又は陰イオンにイオン化する第２の官能基を１分子中に複数有する荷電分子が結合されることを特徴とする荷電処理粒子。
【請求項６】
一対の電極間に１．３Ｖ〜３．０Ｖの範囲内の電圧を印加したときに、いずれかの電圧値で０．３μｍ／ｓ以上の液中移動速度を有する請求項５に記載の荷電処理粒子。
【請求項７】
荷電分子がグルタミン酸及びアスパラギン酸のいずれかである請求項５から６のいずれかに記載の荷電処理粒子。
【請求項８】
粒子本体が、ポリスチレン、シリカ、デキストラン、ポリビニルアルコール及びポリエステルのいずれかを主材として形成される球状粒子である請求項５から７のいずれかに記載の荷電処理粒子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体試料中に存在する標的物質を電場を利用して移動させたときの光信号の変化を利用して前記標的物質を検出する標的物質検出装置及び前記標的物質の検出に用いられる荷電処理粒子に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、溶液中に存在する微小物質、特にＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、ウイルス、細菌等の生体関連物質を検出・定量する方法が開発されている。該方法として、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）イムノアッセイ法、全反射照明蛍光顕微鏡（ＴＩＲＦＭ）、表面プラズモン共鳴励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ）などが挙げられる。
【０００３】
前記表面プラズモン共鳴イムノアッセイ法は、抗原抗体反応の特異的選択性と高感度な屈折率計である表面プラズモン共鳴センサを組み合わせた手法であり、全反射面の金薄膜表面に生じる増強電場内の抗原・抗体結合をリアルタイムに高精度で検出・定量することができる（非特許文献１参照）。
【０００４】
前記全反射照明蛍光顕微鏡は、試料とカバーガラス或いはスライドガラスとの界面で入射光を全反射させ、これによって生じるエバネッセント場を励起光として利用し、ノイズとなるバックグラウンド光が少ない蛍光観察を行う技術である（特許文献１参照）。該技術は、超解像を実現可能な技術であり、単分子観察を可能とする。
【０００５】
前記表面プラズモン共鳴励起増強蛍光分光法は、クレッチマン配置と呼ばれる光学配置を用いて、プリズムに接したガラス表面の金薄膜層と液体試料との界面での入射光の全反射によって、金薄膜上に表面プラズモン共鳴を励起し、金薄膜表面に増強電場を形成することを特徴とする。表面プラズモン共鳴によって金薄膜表面近傍において増強された光を励起光として、増強電場内に存在する蛍光分子を励起し、強い蛍光を生じさせ、バックグラウンド光が少ない蛍光観察を行う技術である（特許文献２参照）。
【０００６】
また、こうした光の全反射によって電場増強を生じさせ、増強電場を得る方法としては、例えば、非特許文献２乃至８に記載されているような公知のものがある。本発明者は、シリカガラス基板上にシリコン層とＳｉＯ２層をこの順で積層した検出板をシリカガラス製の台形プリズム上に設置して、プリズムを介して検出板表面における全反射条件で光を照射し、増強電場を得る方法を非特許文献２で報告した。
【０００７】
非特許文献３では、クレッチマン配置を用いて表面プラズモン共鳴を発生させ、増強電場を得る方法が開示されている。非特許文献４では、クレッチマン配置におけるプリズムにドーブプリズムを用いて光を入射して表面プラズモン共鳴を発生させ、増強電場を得る方法が開示されている。非特許文献５及び非特許文献６では、レゾナントミラーを用いた増強電場を得る方法が開示されている。非特許文献７では、プリズム上に金属層と透明な誘電体層をこの順で積層して、リーキーモードセンサと呼ばれる構造を形成し、プリズムを介して光を照射して、前記誘電体層表面で増強電場を得る方法が開示されている。非特許文献８では、プリズム上に金属層を形成し、その上に屈折率の異なる２種類の透明な誘電体層をそれぞれ１層ずつ積層して、リーキーモードセンサ構造よりもさらに強い増強電場を得る方法が開示されている。
【０００８】
更に、特許文献３、４では、流路に表面プラズモン共鳴を発生させるプリズム形状が付与され、流路の底面または側面に表面プラズモン共鳴を発生させ、増強電場を得る方法が開示されている。
【０００９】
また、標的物質の検出面への吸着または近接を促進し、短時間での測定を実現するために、磁性粒子を標識に用いた方法が知られている（特許文献５、６）。これらの方法では、磁性標識と光応答性標識物質と標的物質との結合体を、磁場を印加することにより局所領域に引き寄せ、この局所領域を含む所定領域にのみ励起光を照射することにより、標的物質と磁性標識との結合体を形成していない光応答性標識の信号を排除した検出を行う。
【００１０】
また、前記生体関連物質を検出・定量する方法として、伝搬光を検出光とする方法も提案されている。例えば、このような方法として、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ法）、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ法）などを挙げることができる。
前記ＦＩＡ法は、特定の細菌やウイルスなどの標的物質に特異的に結合する抗体を用いて蛍光色素を結合させ、蛍光顕微鏡等で蛍光色素の発光を観測することで標的物質を検出・定量する手法である。
また、前記ＥＬＩＳＡ法は、検出プレート上に抗原−抗体反応を用いて前記標的物質を固定させた後、酵素標識抗体を結合させ、前記酵素により発色する基質を添加しその色の変化から標的物質を検出・定量する。
いずれの方法も確立された生体関連物質検出法として広く用いられているが、これらの方法は、多段の反応工程や繰り返しの洗浄工程を要し、測定結果を得るまでに多くの時間と手間が必要となる問題がある。また、検出感度の一層の向上が求められている。
【００１１】
前記生体関連物質検出法を用いた前記標的物質の検出における検出感度を向上させる方法として、磁性粒子を用いた測定法が提案されている。例えば、前記標的物質と前記磁性粒子とを含む結合体を液体試料容器底面側に集約し、前記容器底面に配された抗体と前記結合体との抗原−抗体反応により容器底面に固定する検出方法が開示されている（特許文献７参照）。
しかしながら、こうした磁性粒子を用いた測定法では、前記結合体を磁場によって検出位置に集める濃縮効果によって、検出感度を向上させることができるものの、濃縮先の前記検出位置で浮遊する夾雑物、前記液体試料容器底面上に吸着する前記夾雑物、前記液体試料容器底面上のキズ、更には、検出に用いる検出光の光源出力の揺らぎなどを原因とするノイズ信号と、前記結合体に基づく光信号とを区別できないことから、検出の精度が低い問題がある。このような問題は、前記微小物質の検出を行う場合に、より一層顕在化する。
また、前記液体試料容器底面上に吸着する前記夾雑物に基づく前記ノイズ信号を排除するためには、検出ごとにいちいち前記夾雑物を取り除く洗浄処理が必要となり、依然として検出の効率性が低い問題がある。
【００１２】
こうした問題を解決するため、本発明者は、磁場印加部を配した標的物質検出装置である外力支援型センサを提案している（特許文献８〜１０参照）。この提案では、前記磁場印加部からの磁場の印加に伴って移動する前記磁性粒子と前記標的物質との前記結合体に基づく光信号を光検出器で観察することで、前記検出位置で浮遊する夾雑物、前記液体試料容器底面上に吸着する前記夾雑物、前記液体試料容器底面上のキズ、更には、検出に用いる検出光の光源出力の揺らぎなどを原因とするノイズ信号と、前記結合体に基づく光信号とを区別する。
つまり、磁場の印加により前記結合体が移動する一方で、前記ノイズ信号等は移動しないことから、検出される光信号の移動の様子を観察することで、この光信号が前記結合体に起因するものであるか、前記ノイズ信号等に起因するものかを区別することができ、延いては、検出の精度、効率性を向上させる。
【００１３】
しかしながら、前記外力支援型センサにおける前記磁場印加部では、永久磁石で構成する場合及び電磁石で構成する場合のいずれの場合であっても、前記結合体を移動させるだけの磁場を発生させるためには、一定の大きさが必要となる。また、前記光検出器を構成する電子部品は、前記磁場印加部からの強力な磁場により悪影響を受ける可能性があるため、前記磁場印加部と前記光検出器との間の距離を一定以上狭めることができない。
したがって、前記磁場印加部を配する前記外力支援型センサでは、装置の小型化が困難であり、延いては、可搬性に乏しいため、室外の検出現場に赴いて検出を行う用途など持ち運びを要する用途に適さない問題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】特開２００２−２３６２５８号公報
【特許文献２】国際公開２０１５／１９４６６３号
【特許文献３】特開２０１３−２４６０６号公報
【特許文献４】特開２０１０−１４５４０８号公報
【特許文献５】特開２０１１−３３４５４号公報
【特許文献６】特開２００５−７７３３８号公報
【特許文献７】特開平４−１０２０６２号公報
【特許文献８】国際公開第２０１７／１８７７４４号公報
【特許文献９】国際公開第２０１８／１００７７９号公報
【特許文献１０】国際公開第２０１８／１００７８０号公報
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】D. R. Shankaran et al. Sensors and Actuators B, Vol. 121 (2007) 158-177
【非特許文献２】M. Fujimaki et al. Optics Express, Vol. 23 (2015) pp.10925 -10937
【非特許文献３】C. Nylander et al. Sensors and Actuators, Vol. 3 (1982/83) pp. 79 - 88
【非特許文献４】O.R.Bolduc et al. Talanta, Vol. 77 (2009) pp. 1680 - 1687
【非特許文献５】R. Cush et al. Biosensors and Bioelectronics, Vol. 8 (1993)pp. 347 - 353
【非特許文献６】P.E. Buckle et al. Biosensors and Bioelectronics, Vol. 8 (1993) pp. 355 - 363
【非特許文献７】R.P. Podgorsek et al. Sensors and Actuators B, Vol. 38 - 39 (1997) pp. 349 - 352
【非特許文献８】S. Hayashi et al. Applied Physics Express, Vol. 8, 022201 (2015)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明は、従来技術における前記諸問題を解決し、検出の精度、効率性に優れ、かつ、小型で可搬性に優れた標的物質検出装置及び前記標的物質検出装置に用いられる荷電処理粒子を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
前記課題を解決するための手段としては、次の通りである。即ち、
＜１＞  標的物質と前記標的物質と結合体を形成する荷電粒子を含む液体試料が表面上に導入されるとともに光の照射を受けて伝搬光及び近接場光のいずれかの検出光を生じさせる液体試料導入板が配され、かつ、前記液体試料が前記液体試料導入板の前記表面上に保持可能とされる液体試料保持部と、前記液体試料導入板に前記光を照射して前記検出光を生じさせる光照射部と、前記液体試料導入板の表面側に配され、電圧の印加により前記液体試料中の前記結合体を電極間で移動させる一対の電極を備える移動電場印加部と、前記検出光に基づく光信号の信号変化から前記結合体の移動を検出可能とされる光信号検出部と、を有することを特徴とする標的物質検出装置。
＜２＞  移動電場印加部が、液体試料導入板の表面に離間させて形成される一対の表面電極、及び、前記液体試料導入板の表面に形成される表面電極と透明電極材料で形成され前記表面と対向して前記液体試料導入板上に導入された液体試料を覆うように配されるカバー電極とで構成される一対の電極の少なくともいずれかで構成される前記＜１＞に記載の標的物質検出装置。
＜３＞  更に、液体試料導入板の表面側に配され、電圧の印加により液体試料中の結合体を電極間で移動させ、かつ、前記表面に引き寄せる一対の電極を備える引き寄せ電場印加部を有する前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の標的物質検出装置。
＜４＞  引き寄せ電場印加部が、移動電場印加部を構成する液体試料導入板の表面に離間させて形成される一対の表面電極の間の位置で前記液体試料導入板の前記表面に形成される表面電極と、透明電極材料で形成され前記表面電極と鉛直方向で対向して前記液体試料導入板上に導入された液体試料を覆うように配されるカバー電極とを備える前記＜３＞に記載の標的物質検出装置。
＜５＞  複数の第１の官能基で表面修飾された粒子本体の一部の前記第１の官能基又はその誘導基に前記標的物質と結合可能な結合物質が結合され、かつ、前記結合物質と未結合の前記第１の官能基又はその誘導基に液中で陽イオン又は陰イオンにイオン化する第２の官能基を１分子中に複数有する荷電分子が結合されることを特徴とする荷電処理粒子。
＜６＞  一対の電極間に１．３Ｖ〜３．０Ｖの範囲内の電圧を印加したときに、いずれかの電圧値で０．３μｍ／ｓ以上の液中移動速度を有する前記＜５＞に記載の荷電処理粒子。
＜７＞  荷電分子がグルタミン酸、アスパラギン酸及びアルギニンのいずれかである前記＜５＞から＜６＞のいずれかに記載の荷電処理粒子。
＜８＞  粒子本体が、ポリスチレン、シリカ、デキストラン、ポリビニルアルコール及びポリエステルのいずれかを主材として形成される球状粒子である前記＜５＞から＜７＞のいずれかに記載の荷電処理粒子。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、従来技術における前記諸問題を解決でき、検出の精度、効率性に優れ、かつ、小型で可搬性に優れた標的物質検出装置及び前記標的物質検出装置に用いられる荷電処理粒子を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明の実施形態に係る標的物質検出装置の概要を示す説明図である。
【図２（ａ）】液体試料４の調製方法の概要を示す説明図（１）である。
【図２（ｂ）】液体試料４の調製方法の概要を示す説明図（２）である。
【図２（ｃ）】液体試料４の調製方法の概要を示す説明図（３）である。
【図２（ｄ）】液体試料４の調製方法の概要を示す説明図（４）である。
【図２（ｅ）】液体試料４の調製方法の概要を示す説明図（５）である。
【図３】標的物質検出装置１の変形例の要部を示す説明図である。
【図４】表面電極３Ａ、３Ｂへの電圧印加前、並びに、表面電極３Ａ，３Ｂに２．８Ｖの直流電圧を印加してから３０秒後、６０秒後、９０秒後、１２０秒後、１５０秒後及び１８０秒後に、それぞれ露光時間１０秒で取得された画像を重ね合わせて表示した画像である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
（標的物質検出装置）
本発明の標的物質検出装置は、液体試料保持部と、光照射部と、移動電場印加部と、光信号検出部とを有し、必要に応じて、その他の部を有する。
【００２１】
＜液体試料保持部＞
前記液体試料保持部は、液体試料導入板が配され、かつ、液体試料が前記液体試料導入板の表面上に保持される部である。
【００２２】
−液体試料−
前記液体試料は、標的物質と、前記標的物質と結合体を形成する荷電粒子とを含む。
【００２３】
−−標的物質−−
前記標的物質としては、特に制限はなく、目的に応じて選択することができ、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、ウイルス、菌、汚染物質などが挙げられる。
前記標的物質の検出対象となる具体的な被検体液としては、例えば、血液、唾液、尿、液体薬品、環境水、上下水、飲料、食品のホモジナイズ溶液、ぬぐい液、粉末等の固体試料を水等の溶媒に溶解させた溶液、気相中のガスや微粒子などを捕集した気相濃縮液などが挙げられる。
したがって、具体的な前記液体試料としては、前記被検体液に前記荷電粒子などを加えたものが挙げられる。
【００２４】
−−荷電粒子−−
前記荷電粒子は、前記標的物質と結合して前記結合体を形成するとともに、前記移動電場印加部から印加される電場に基づき、前記標的物質を引き連れて移動する作用を持つ。
前記荷電粒子としては、このような作用を有するものであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択できるが、前記標的物質と安定的に結合させる観点及び電場の印加に伴う移動を生じ易くさせる観点から、次の荷電処理粒子が好ましい。
加えて、前記荷電処理粒子は、液中に分散させて保管することが可能であり、前記荷電処理粒子を調製、保管しておけば、前記標的物質の検出を行う際の前記液体試料の調製を効率的に行うことができる。
【００２５】
−−−荷電処理粒子−−−
前記荷電処理粒子は、複数の第１の官能基で表面修飾された粒子本体の一部の前記第１の官能基又はその誘導基に前記標的物質と結合可能な結合物質が結合され、かつ、前記結合物質と未結合の前記第１の官能基又はその誘導基に液中で陽イオン又は陰イオンにイオン化する第２の官能基を１分子中に複数有する荷電分子が結合される粒子である。
【００２６】
前記粒子本体としては、特に制限はなく、公知の粒子を挙げることができるが、電場印加に伴う移動性の観点から、ポリスチレン、シリカ、デキストラン、ポリビニルアルコール及びポリエステルのいずれかを主材として形成される球状粒子であることが好ましい。
前記球状粒子の直径としては、特に制限はないが、伝搬光による検出を行う場合、５０ｎｍ〜１０μｍが好ましく、近接場光による検出を行う場合、５０ｎｍ〜２μｍが好ましい。
また、複数の前記第１の官能基で表面修飾された前記粒子本体としては、種々の用途で用いられており、公知のものから適宜選択して用いることができる。
【００２７】
前記第１の官能基としては、特に制限はないが、前記結合物質及び前記荷電分子と安定的に結合させる観点から、カルボキシ基（ＣＯＯＨ）、アミノ基（ＮＨ２）、スルフヒドリル基（ＳＨ）が好ましい。
前記第１の官能基の誘導基としては、前記第１の官能基に対し前記結合物質及び前記荷電分子を結合させるために誘導される基が挙げられる。
例えば、前記第１の官能基がカルボキシ基（ＣＯＯＨ）であるときに、前記カルボキシ基にカルボン酸活性試薬としてのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を結合させた後、形成された活性エステル（ＮＨＳエステル体）にアミノ基を有する前記結合物質及び前記荷電分子を脱水縮合させて形成されたアミド結合（ＣＯＮＨ）中の前記カルボキシ基残基（ＣＯ）や、カルボキシ基（ＣＯＯＨ）に前記結合物質及び前記荷電分子をエステル結合（ＣＯＯＲ）させたときの前記カルボキシ基残基（ＣＯＯ）などが前記誘導基に該当する。
【００２８】
前記結合物質としては、一の部で前記第１の官能基又はその誘導基と結合し、かつ、他の部で前記標的物質と結合する物質であれば、特に制限はなく、例えば、前記標的物質との間で、公知の抗原−抗体反応、アプタマーによる結合、ＤＮＡハイブリダイゼーション、ビオチン−アビジン結合、キレート結合などによる結合を与える諸物質を用いることができる。具体的には、抗体、アプタマー、ＤＮＡプローブ、ＲＮＡプローブ、ペプチド、糖鎖、プロテインＡ、プロテインＧ、アビジン及びその誘導体（ニュートラアビジン等）、ストレプトアビジン、ビオチン及びその誘導体などが挙げられる。
【００２９】
前記荷電分子としては、前記第１の官能基又はその誘導基と結合し、かつ、液中で陽イオン又は陰イオンにイオン化する第２の官能基を１分子中に複数有する分子であることが必要である。前記第２の官能基を１分子中に複数有することで、電荷が大きくなり、電場印加に伴う移動性が向上する。
今、前記第１の官能基としてカルボキシ基を選択した場合の前記カルボキシ基で表面修飾されたポリスチレンビーズを例に挙げて説明をすると、このポリスチレンビーズは、中性の液中に分散させた状態で、前記カルボキシ基の陰イオン化によって負に帯電するが、アミンカップリング反応などにより前記カルボキシ基の一部を前記結合物質と結合させると、前記ポリスチレンビーズの表面における前記結合物質と未結合の陰イオン化された前記カルボキシ基の数が減少し、電荷が小さくなる。その結果、電場印加に伴って移動を行うのに必要な電荷が得られにくい。
実際、前記カルボキシ基で表面修飾された前記ポリスチレンビーズを用いた実験では、前記結合体としてＩｇＧ抗体分子だけを結合させると、前記ポリスチレンビーズの電場中での移動を確認できないケースがある一方で、前記ＩｇＧ抗体分子に加えて前記荷電分子としてのグルタミン酸を結合させたこと以外は、同一条件下で行ったケースでは、前記ポリスチレンビーズの電場中での移動が確認されている。
【００３０】
前記第２の官能基としては、特に制限はなく、液中で陽イオンにイオン化させる場合には、例えば、アミノ基、イミノ基、イミダゾール基などが挙げられ、液中で陰イオンにイオン化させる場合には、例えば、カルボキシ基、スルホ基、リン酸基、チオール基、ヒドロキシ基などが挙げられる。
【００３１】
前記荷電分子の条件を満たす好適な化合物としては、１分子中にカルボキシ基を２つ有するグルタミン酸及びアスパラギン酸、並びに、１分子中にアミノ基を２つ有するアルギニンなどが挙げられる。
【００３２】
また、前記第１の官能基又はその誘導基に対する前記結合物質及び前記荷電分子の結合は、直接結合であっても間接的な結合であってもよく、前記間接的な結合とする場合、前記第１の官能基又はその誘導基と、前記結合物質及び前記荷電分子との間にこれらの結合を仲介する接合分子を挟むことができる。
前記接合分子としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、アビジン及びその誘導体（ニュートラアビジン等）、ストレプトアビジン、ビオチン及びその誘導体などが挙げられる。
【００３３】
前記荷電処理粒子を含む前記荷電粒子としては、電場印加に応じて移動したことが前記光信号検出部による信号検出において判別可能な液中移動速度を持つことが必要である。
前記液中移動速度としては、前記光信号検出部による前記液体試料導入板表面の観察において、実用的な観察時間内で前記荷電粒子を含む前記結合体の光点の１ピクセル以上の移動が連続して確認できる速度、あるいは、ブラウン運動によるランダム移動の平均移動量を上回る速度のいずれか大きい方が好適に該当する。
ここで、前記実用的な観察時間とは、オンサイト測定で２０分以内であり、好適には５分以内である。
また、電場印加前と電場印加後とにおける２枚の観察画像だけでは、電場印加による光点移動とブラウン運動によるランダムな光点移動とが判別できない場合があることから、電場印加前後の観察画像は、少なくとも３枚以上連続して取得する必要がある。したがって、１枚の画像取得にかけられる時間としては、４００秒以内、好適には１００秒以内である。
観察画像の１ピクセルの大きさは、イメージセンサの素子によって様々であるが、一般に１μｍ〜１０μｍの範囲の大きさを持つ。そのため、前記結合体の液中移動量としては、１０μｍ以上であることが好適である。
したがって、前記実用的な観察時間内で、前記結合体の光点の１ピクセル以上の移動が連続して確認できる速度は、０．０２５μｍ／ｓ以上、好適には０．１μｍ／ｓ以上である。
一方、ブラウン運動によるランダム移動の平均移動量Δｘは、球形粒子について下記式（１）で求められる。
【００３４】
【数１】
2020122728.tif 000003
ただし、前記式（１）中、ｔは、観察時間を示し、ｋＢは、ボルツマン定数を示し、Ｔは、絶対温度を示し、ηは、溶媒の粘度を示し、ｄは、粒子径を示す。
前記式（１）に示されるように平均移動量Δｘは、前記荷電粒子の粒子径が小さくなるほど大きくなる。ここでは、直径１００ｎｍの前記荷電粒子を基準粒子として考え、温度を２０℃、溶媒を水として計算を行うと、観察時間１００秒において、平均移動量Δｘが２９μｍとなり、観察時間４００秒において平均移動量Δｘが５８μｍとなる。
したがって、ブラウン運動によるランダム移動の平均移動量を上回る速度は、０．３μｍ／ｓ以上となる。
よって、前記実用的な観察時間内で前記荷電粒子を含む前記結合体の光点の１ピクセル以上の移動が連続して確認できる速度、あるいは、ブラウン運動によるランダム移動の平均移動量を上回る速度のいずれか大きい方とする前記移動速度は、０．３μｍ／ｓ以上である。
【００３５】
ところで、前記荷電粒子の前記液中移動速度は、電場の強さを大きくするほど大きくなる。一方、前記移動電場印加部の構成電極に印加する電圧を大きくしすぎると、前記液体試料中の液体の電気分解が進み、気泡が発生して前記結合体の移動観察の妨げとなることがある。また、高い印加電圧は、電源部を大きくする必要が生じることから不適であり、小型で可搬性に優れた前記標的物質検出装置を提供する観点からは、電池で駆動可能であることが好ましい。
携帯電話やノートパソコン等で広く用いられるリチウムイオンポリマー二次電池の電圧は、３．７Ｖであり、小型機器で広く用いられるコイン型リチウム電池の電圧は、３．０Ｖである。
よって、前記移動電場印加部の駆動源から選択される、前記移動電場印加部に対する好適な印加電圧としては、３．０Ｖ以下である。
一方、前記印加電圧の下限としては、電気泳動を生じるためには電極で電解反応が生じる必要があることから、電解反応を起こすために必要な電圧を超える電圧を印加する必要がある。生じる電解反応の種類は、前記液体試料の構成成分に応じて様々であるが、代表的な被電解反応物質として水を考えると、電解反応を起こすためには１．２３Ｖを超える電圧を印加する必要がある（下記参考文献１参照）。したがって、前記印加電圧の下限は１．３Ｖ程度である。
以上から、前記荷電粒子としては、前記移動電場印加部を構成する一対の電極に対し、１．３Ｖ〜３．０Ｖの範囲内の電圧を印加したときに、いずれかの電圧値で０．３μｍ／ｓ以上の液中移動速度を有することが好ましい。
なお、前記粒子本体の表面に前記荷電分子を結合させた前記荷電処理粒子として、後述の実施例で用いたポリスチレンビーズは、前記結合体の移動光点観察の結果より、２．８Ｖの電圧印加によって、１８０秒間に２８０μｍの距離を移動することが確認され、その液中移動速度は、０．３μｍ／ｓを大幅に超える１．６μｍ／ｓである。
なお、本明細書において、「液中移動速度」とは、水を９０体積％以上含む溶液を液体としたときに前記液体中で一対の電極間を電気泳動により移動する速度を示す。
参考文献１：渡辺他、基礎科学コース  電気化学、丸善（２００１）
【００３６】
−−標識物質−−
前記標的物質は、前記結合体から発せられる光信号の移動を通じて前記光信号検出部により検出される。
前記標的物質が蛍光等の光信号を発しない場合には、前記光信号検出部による光信号検出のため、前記標的物質に光応答性の標識物質を結合させて前記結合体の移動に基づく前記光信号の信号変化を検出する。
【００３７】
前記標識物質は、前記標的物質を介して前記結合体と結合し、前記光照射部からの光照射に起因する光を受けて光信号を発する物質である。
前記標識物質としては、このような性質を有する物質であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、蛍光色素、量子ドット等の公知の蛍光物質を挙げることができる。
【００３８】
前記標的物質と前記標識物質とを結合させる方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、物理吸着、抗原−抗体反応、アプタマーによる結合、ＤＮＡハイブリダイゼーション、ビオチン−アビジン結合、キレート結合、アミド結合などの公知の結合方法を用いることができる。
また、前記標識物質に色素を用いる場合、前記標的物質の前記色素による染色も、前記標的物質と前記標識物質との結合方法として有効である。
なお、前記物理吸着による結合方法としては、例えば、水素結合等の静電的な結合力を利用して、前記標的物質と前記標識物質とを結合させる方法を挙げることができる。
これらの結合方法の中でも、前記標識物質が前記夾雑物と結合することを避けるため、前記抗原−抗体反応、前記アプタマーによる結合、前記ＤＮＡハイブリダイゼーション、前記ビオチン−アビジン結合、前記キレート結合などの結合方法により、前記標的物質と前記標識物質とを特異的に結合させることが好ましい。
【００３９】
−液体試料導入板−
前記液体試料導入板は、前記液体試料が表面上に導入されるとともに光の照射を受けて前記伝搬光及び前記近接場光のいずれかの検出光を生じさせる部材である。
前記液体試料導入板としては、前記液体試料が表面上に導入されるとともに裏面側又は前記表面側から照射される光の透過光を前記伝搬光として前記光が照射される側と反対の面側に伝搬可能とされる透光板、前記液体試料が前記表面上に導入されるとともに前記表面側から照射される光の反射光を前記伝搬光として前記表面上方に伝搬可能な反射板、前記液体試料が前記表面上に導入される導入板、及び、前記液体試料が前記表面上に導入されるとともに前記表面に対して全反射条件で照射される光により前記表面上に前記近接場光を発生可能な検出板のいずれかで形成される。
なお、前記伝搬光とは、一般に発生源から数百ｎｍ〜数μｍ以内の距離だけ離れた位置で急激な減衰を示す近接場光を含まない光とされるが、本明細書においても、前記近接場光を含まないことを意味し、前記液体試料導入板の前記表面から数百ｎｍ〜数μｍ以内の距離だけ離れた位置で急激な減衰を示すことのない光を意味する。また、前記近接場光とは、前記液体試料導入板の前記表面から数百ｎｍ〜数μｍ以内の距離だけ離れた位置で急激な減衰を示す光を意味する。
【００４０】
前記透光板としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、公知の透過型顕微鏡の観察用ステージに用いられるガラス板、プラスチック板などの公知の透光板を用いることができる。
また、前記反射板としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、公知の落射型顕微鏡の観察用ステージに用いられるガラス板、プラスチック板、金属板などの公知の反射板を用いることができる。
また、前記導入板としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記透光板、前記反射板を含み、この他の液体試料を導入するための公知の板状部材を用いることができる。
また、前記検出板としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、公知の表面プラズモン共鳴センサや公知の光導波モードセンサに用いられる検出板などの公知の検出板を用いることができる。
【００４１】
前記液体試料導入板としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記表面が前記結合体の吸着を抑制する吸着抑制剤で表面処理されていることが好ましい。このような表面処理が施されていると、前記結合体が前記液体試料導入板の前記表面に吸着されることが抑制され、前記結合体の電場による移動を補助することができる。
前記吸着抑制剤としては、特に制限はなく、前記結合体を構成する物質の種類に応じて、公知の吸着抑制剤から適宜選択することができる。
例えば、前記表面処理の手法として、前記標的物質が前記タンパク質である場合には、前記タンパク質の吸着を抑制する公知のブロッキング法を選択することができる。前記ブロッキング法としては、特に制限はなく、例えば、ポリエチレングリコールを用いる手法、エタノールアミンを用いる方法、スキムミルクを用いる方法などが挙げられる。
【００４２】
前記液体試料保持部の構成としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記液体試料導入板そのもので構成されてもよく、また、前記液体試料をカバーガラス等の板状透光部材と前記液体試料導入板とで挟み、前記液体試料の液層を前記液体試料導入板の前記表面上に保持する構成でもよい。
また、前記液体試料保持部の構成としては、底面が前記液体試料導入板で構成される枡状の液体セルで構成することもできる。
なお、前記液体試料保持部としては、１つの前記液体試料導入板の前記表面上の領域を複数に分画してマルチチャンネル化させてもよい。
【００４３】
＜光照射部＞
前記光照射部は、前記液体試料導入板に前記光を照射して前記検出光を生じさせる部である。
前記光照射部としては、裏面側光照射部、表面側光照射部、側面側光照射部及び全反射光照射部のいずれかで形成される。
【００４４】
前記裏面側光照射部は、前記液体試料導入板が前記透光板で形成されるときに前記液体試料導入板の前記裏面から前記光を照射可能とされる。
前記裏面側光照射部の構成としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、公知の透過型顕微鏡に用いられる公知の光照射部と同様に構成することができる。
【００４５】
前記表面側光照射部は、前記液体試料導入板が前記透光板及び前記反射板のいずれかで形成されるときに前記液体試料導入板の前記表面側から前記光を照射可能とされる。
前記表面側光照射部の構成としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記反射板で形成される場合、公知の落射型顕微鏡に用いられる公知の光照射部と同様に構成することができ、また、前記透光板で形成される場合、公知の透過型顕微鏡に用いられる公知の光照射部と同様に構成することができる。
【００４６】
前記側面側光照射部は、前記液体試料導入板が前記導入板で形成されるときに前記液体試料導入板上に保持される前記液体試料に対して前記液体試料導入板の側面側から前記液体試料導入板の前記表面の面内方向と平行な方向で前記光を照射可能とされる。
前記側面側光照射部の構成としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、公知の光照射部と同様に構成することができる。
【００４７】
前記全反射光照射部は、前記液体試料導入板が前記検出板で形成されるときに前記表面に対して全反射条件で前記光を照射可能とされる。前記表面における全反射は、前記検出板の前記表面において全反射条件を満たすことが可能であれば、前記光の入射方向に特に制限はない。例えば、前記検出板表面を導波路構造にすることで、前記検出板の前記表面側又は前記裏面側又は前記側面側に形成したグレーティング、若しくは、前記表面側又は前記裏面側又は前記側面側に配したプリズムを介して前記導波路構造に前記光を前記表面側から導入し、前記導波路構造内での全反射を利用して前記検出板表面での全反射条件を満たすことができる。また、前記プリズムは前記検出板の一部構造として形成されてもよい。
前記全反射光照射部の構成としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、公知の表面プラズモン共鳴センサや公知の光導波モードセンサに用いられる公知の光照射部と同様に構成することができる。
【００４８】
なお、前記裏面側光照射部、前記表面側光照射部、前記側面側光照射部及び前記全反射光照射部における光源としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、公知のランプ、ＬＥＤ装置、レーザ光照射装置などの発光装置を用いることができる。
また、前記裏面側光照射部、前記表面側光照射部及び前記全反射光照射部としては、前記光源以外の光学要素についても特に制限はなく、公知の光学顕微鏡、公知の表面プラズモン共鳴センサや公知の光導波モードセンサに用いられる公知の光学要素を目的に応じて適宜採用して構成することができる。
【００４９】
＜移動電場印加部＞
移動電場印加部は、前記液体試料導入板の表面側に配され、電圧の印加により前記液体試料中の前記結合体を電極間で移動させる一対の電極を備える。つまり、前記移動電場印加部は、電圧印加に伴って発生する電場により前記一対の電極間で前記結合体を電気泳動させる作用を有する。
このような移動電場印加部を配することで、前記結合体を移動させる外力として磁場を利用する従来例と比較して、装置の小型化及び可搬性を向上させることができる。
【００５０】
前記移動電場印加部としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、公知の電極及び前記電極に電圧を印加する電源が挙げられる。
具体的には、前記荷電粒子における正又は負の帯電状況に応じて、前記一対の電極に電圧を印加して前記荷電粒子と結合する前記標的物質を電気泳動により負極方向又は正極方向に移動させる。
前記結合体を移動させる方向としては、前記液体試料導入板の前記表面の面内方向と平行な方向のベクトル成分を持つ方向及び前記液体試料導入板から遠ざかる方向のベクトル成分を持つ方向のいずれかの方向が挙げられる。
前記液体試料導入板の前記表面の面内方向と平行な方向に前記結合体を移動させると、例えば、前記結合体の移動前後の過程における２次元画像における光点の経時的なズレや光点の消失（観察視野外まで移動）として、前記標的物質を検出することができる。また、前記液体試料導入板から遠ざかる方向に前記結合体を移動させると、例えば、前記結合体の移動前後の過程における２次元画像における光点の経時的な大きさの変化や光点の消失（観察視野外まで移動）として、前記標的物質を検出することができる。
【００５１】
また、前記移動電場印加部としては、特に制限はないが、装置の小型化及び可搬性を向上させる観点から、前記液体試料導入板の表面に離間させて形成される一対の表面電極、及び、前記液体試料導入板の表面に形成される表面電極と透明電極材料で形成され前記表面と対向して前記液体試料導入板上に導入された前記液体試料を覆うように配されるカバー電極とで構成される一対の電極の少なくともいずれかで構成されることが好ましい。
前記表面電極として構成すると、前記液体試料導入板と前記移動電場印加部とを一体化させることができ、装置の大型化を抑制することができる。また、前記カバー電極として構成すると、前記カバーガラスに置き換えて配することができ、装置の大型化を抑制することができる。
前記各表面電極の形成材料としては、特に制限はなく、公知の電極材料を用いることができる。また、前記各表面電極の前記液体試料導入板への形成方法としては、スパッタリング法、真空蒸着法、化学気相成長法、ゾルゲル法、塗布法などが挙げられる。
前記透明電極材料としては、特に制限はなく、公知の酸化インジウムスズ（ＩＴＯ）、二酸化スズ、ＩＧＺＯ等を挙げることができる。
なお、前記カバー電極としては、前記透明電極材料自身で形成されるものに加え、前記カバーガラスの一の面に前記透明電極材料による電極層を形成したものも含まれる。
【００５２】
＜光信号検出部＞
前記光信号検出部は、前記検出光に基づく光信号の信号変化から前記結合体の移動を検出可能とされる。
【００５３】
前記光信号検出部としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、フォトダイオード、光電子増倍管などの公知の光検出器や対物レンズ等の公知の光学要素を用いて構成することができる。
また、前記光信号検出部としては、特に制限はないが、前記液体試料導入板の前記表面上の検出領域の様子を２次元画像として取得可能とされることが好ましい。前記２次元画像を取得できると、光点や暗点として現れる前記２次元画像中の前記光信号の位置情報やサイズ情報を容易に取得することができ、前記結合体の移動前後の前記２次元画像同士を比較して、前記光信号が前記結合体に関与する情報であるのか、或いは、前記液体試料導入板の前記表面上のキズ、前記夾雑物、光源出力の揺らぎ等の前記結合体に関与しない情報であるのかを明確に区別することが可能となる。このような２次元画像の取得を可能とするには、前記光信号検出部として撮像デバイスを選択すればよい。
前記撮像デバイスとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＣＣＤイメージセンサ、ＣＭＯＳイメージセンサなどの公知のイメージセンサを用いることができる。
なお、前記光信号検出部により前記光信号を検出する方法としては、前記光信号検出部の結像可能範囲外及び前記近接場光の発生領域（前記液体試料導入板の前記表面から数百ｎｍ〜数μｍ上方の領域）外に存在する前記結合体の検出漏れを防ぐため、一旦、前記液体試料導入板の前記表面上ないし前記表面近傍に前記結合体を配した後に検出を実施する方法が好ましい。
また、前記標的物質を検出することとしては、前記標的物質の有無の検出、前記標的物質の存在量の検出（定量測定）、前記標的物質の存在状況のリアルタイム観察等が挙げられる。
【００５４】
また、前記光信号検出部としては、特に制限はないが、前記液体試料中に帯電した夾雑物が含まれる場合に、前記夾雑物由来の光信号と前記結合体由来の光信号を区別するため、前記夾雑物由来の光信号を除去する光学フィルタを好適に採用することができる。
【００５５】
＜その他の部＞
前記その他の部としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、引き寄せ電場印加部、公知の透過型顕微鏡、公知の落射型顕微鏡、公知の表面プラズモン共鳴センサ、公知の光導波モードセンサ等に用いられる任意の部が挙げられる。
【００５６】
−引き寄せ電場印加部−
前記引き寄せ電場印加部は、前記液体試料導入板の表面側に配され、電圧の印加により前記液体試料中の前記結合体を電極間で移動させ、かつ、前記表面に引き寄せる一対の電極を備える。つまり、前記引き寄せ電場印加部は、電圧印加に伴って発生する電場により前記一対の電極間で前記結合体を電気泳動させて前記表面に引き寄せる作用を有する。
前記光信号検出部では、前記液体試料導入板の前記表面近傍を検出領域とすることから、前記引き寄せ電場印加部を持たない場合、前記液体試料中の前記結合体が前記液体試料導入板の前記表面近傍まで重力沈降するまで検出操作の実行を待つ必要があるが、前記引き寄せ電場印加部を配する場合、前記重力沈降を待つ必要がなく、効率的に検出操作を実行することができる。
【００５７】
前記引き寄せ電場印加部としては、特に制限はなく、前記移動電場印加部と同様に構成することができ、装置の小型化及び可搬性を向上させる観点から、前記移動電場印加部を構成する前記液体試料導入板の前記表面に離間させて形成される前記一対の表面電極の間の位置で前記液体試料導入板の前記表面に形成される表面電極と、透明電極材料で形成され前記表面電極と鉛直方向で対向して前記液体試料導入板上に導入された液体試料を覆うように配されるカバー電極とを備えることが好ましい。
なお、前記カバー電極としては、前記一対の電極間で電位の高低をスイッチさせることにより、前記結合体を前記液体試料導入板の前記表面側に引き寄せる作用と前記表面側から遠ざける作用との２つの作用を持たせることができ、延いては、前記移動電場印加部及び前記引き寄せ電場印加部を構成する前記一対の電極における対極として、これらの部が持つ双方の機能を与えることができる。
【００５８】
なお、前記標的物質検出装置における前記液体試料保持部、前記光照射部、前記光信号検出部等の各部の構成としては、外力（磁場）を利用した外力支援型センサに関する国際公開第２０１７／１８７７４４号公報、国際公開第２０１８／１００７７９号公報、国際公開第２０１８／１００７８０号公報に記載の事項を参酌して構成することができる。
【００５９】
（荷電処理粒子）
本発明の荷電処理粒子は、複数の第１の官能基で表面修飾された粒子本体の一部の前記第１の官能基又はその誘導基に前記標的物質と結合可能な結合物質が結合され、かつ、前記結合物質と未結合の前記第１の官能基又はその誘導基に液中で陽イオン又は陰イオンにイオン化する第２の官能基を１分子中に複数有する荷電分子が結合されることを特徴とする。
前記荷電処理粒子は、本発明の前記標的物質検出装置に対し前記荷電粒子として用いられ、前記標的物質検出装置についての説明文中で前記荷電処理粒子として説明した事項を適用することができ、ここでは、重複した説明を省略する。
【００６０】
以下では、図面を参照しつつ、本発明の実施形態をより具体的に説明する。
【００６１】
図１に、本発明の実施形態に係る標的物質検出装置の概要を示す。なお、図１は、本発明の実施形態に係る標的物質検出装置の概要を示す説明図である。
図１に示すように標的物質検出装置１は、液体試料導入板２と、光源６及び光学プリズム８で構成される光照射部と、前記移動電場印加部の構成電極としての一対の表面電極３Ａ，３Ｂと、光信号検出部７（撮像デバイス）とで構成される。なお、前記撮像デバイスは、例えば、公知のＣＣＤイメージセンサ等で構成され、２次元画像の取得が可能とされる。
【００６２】
液体試料導入板２は、液体試料４が前記表面上に導入されるとともに前記表面に対して全反射条件で照射される光Ｌの照射を受け、前記表面上方に近接場光を発生可能な検出板で形成される。また、液体試料導入板２は、自身で前記液体試料保持部を構成し、前記表面上に液体試料４が導入された後、液体試料４を覆うようにカバーガラス５を配することで液体試料４を保持する。
前記光照射部は、光源６から照射される光Ｌを光学プリズム８を介して液体試料導入板２の前記表面に対して全反射条件で照射可能とされる全反射光照射部として構成される。
表面電極３Ａ，３Ｂは、液体試料導入板２表面の側面側の位置に離間させて形成され、光信号検出部７では、これら表面電極３Ａ，３Ｂ間の光照射領域を含んで検出領域が設定される。
【００６３】
標的物質検出装置１を用いた標的物質検出方法について説明する。
先ず、標的物質検出装置１に用いられる前記荷電粒子として前記荷電処理粒子を含む液体試料４の調製方法について、図２（ａ）〜（ｅ）を参照しつつ説明する。なお、図２（ａ）は、液体試料４の調製方法の概要を示す説明図（１）〜（５）である。
【００６４】
先ず、図２（ａ）に示すように、ポリスチレンビーズ等の粒子本体Ｐの表面が複数の第１の官能基Ｒ１で表面修飾された表面修飾粒子を用意する。本例で第１の官能基Ｒ１は、液中でイオン化（陰イオン化）されるものを想定する。
次に、図２（ｂ）に示すように、前記表面修飾粒子に対し、前記結合物質として抗原（前記標的物質）と特異的に結合する抗体Ｉｇとを液中で反応させ、前記表面修飾粒子の一方の第１の官能基Ｒ１の前記誘導基に抗体Ｉｇを結合させる。
次に、図２（ｃ）に示すように、液中でイオン化（陰イオン化）する第２の官能基Ｒ２を１分子中に２つ有する前記荷電分子を加え、前記表面修飾粒子の他方の第１の官能基Ｒ１の前記誘導基に前記荷電分子を結合させ、前記荷電処理粒子を得る。この時、前記荷電処理粒子では、図２（ｂ）に示す前記表面修飾粒子に比べてイオン化する官能基が増え、電荷が大きくなることで電場印加に伴う移動が生じ易くなる。
次に、図２（ｄ）に示すように、抗原Ａｇ（前記標的物質）を含む前記被検体液を加え、抗体Ｉｇと抗原Ａｇとの抗原抗体反応により、抗原Ａｇ（前記標的物質）と前記荷電処理粒子とを結合させた前記結合体を得る。
ここで、抗原Ａｇ（前記標的物質）が前記近接場光を受けて蛍光等の光信号を発しない場合には、図２（ｅ）に示すように、更に抗体Ｉｇ付きの標識物質Ｏを加えて、前記荷電処理粒子と抗原Ａｇ（前記標的物質）と標識物質Ｏとを結合させた前記結合体を得る。
以上により、液体試料４が調製される。
【００６５】
再び図１を参照しつつ、標的物質検出装置１による前記標的物質の検出方法を説明する。
先ず、調製した液体試料４を液体試料導入板２の前記表面上に導入し、保持させる。
液体試料４の液層中を浮遊する前記結合体が液体試料導入板２の前記表面近傍に重力沈降するのを待ち、光源６から照射される光Ｌを光学プリズム８を介して液体試料導入板２の前記表面に対して全反射条件で照射し、光信号検出部７で前記表面上の前記近接場光に基づく光信号Ｓを取得する。
【００６６】
次に、表面電極３Ａ，３Ｂに電圧を印加し、前記結合体を移動させる。本例では、表面電極３Ａを負極、表面電極３Ｂを正極として、負に帯電する前記帯電処理粒子を表面電極３Ａ側から表面電極３Ｂ側に電気泳動させて移動させる。
次に、検出領域（観察視野）を維持したまま前記結合体を移動させた後の液体試料導入板２の前記表面上の光信号を光信号検出部７で取得する。なお、前記結合体の移動状態は、一連の移動を経時的に区切り、複数の状態として把握することが好ましい。つまり、移動開始から移動完了までの前記結合体の一連の移動を複数に分けて捉え、各時点での光信号として複数取得することが好ましい。このような光信号の取得方法により、ブラウン運動によるランダムな移動と、電場による移動とを区別し易くすることができる。
【００６７】
このように構成される標的物質検出装置１では、前記結合体の移動に基づく光信号を、液体試料導入板２の前記表面上のキズ、前記表面に吸着ないし前記表面上に存在する夾雑物、光源出力の揺らぎなどの移動が生じないノイズ信号と明確に区別して検出することができるため、前記標的物質を高精度に検出することができる。また、液体試料導入板２の前記表面上に前記夾雑物が吸着している場合でも、その存在を無視した検出を行うことができるため、必ずしも検出ごとに液体試料導入板２に対する洗浄を行う必要がなく、効率的な検出を行うことができる。
更に、外力として磁場を利用する目的で磁場印加部が配される従来の外力支援型センサに比べ、外力として電場を利用する表面電極３Ａ，３Ｂが配される標的物質検出装置１の方が、装置の大型化を抑制することができ、小型で可搬性に優れた装置を提供することができる。
【００６８】
次に、標的物質検出装置１の変形例について図３を参照しつつ説明する。なお、図３は、標的物質検出装置１の変形例の要部を示す説明図である。
図３に示すように、この変形例では、液体試料導入板２の表面上に表面電極３Ａ，３Ｂに代えて、表面電極１３Ａ，１３Ｂ，１３Ｃが配されるとともに、カバーガラス５に代えてカバー電極１９が配されて構成される。
この変形例では、表面電極１３Ａと表面電極１３Ｃとの間の領域又は表面電極１３Ｃと表面電極１３Ｂとの間の領域を光信号検出部７による光信号の検出領域として、表面電極１３Ａ，１３Ｂが表面電極３Ａ，３Ｂと同様に前記移動電場印加部として作用する。
また、表面電極１３Ｃとカバー電極１９とは、電圧の印加により液体試料４の液層中を浮遊する前記結合体を液体試料導入板２の前記表面側に引き寄せる前記引き寄せ電場印加部として作用する。
なお、カバー電極１９は、印加する電圧の極性をスイッチさせることにより、前記移動電場印加部及び前記引き寄せ電場印加部を構成する前記一対の電極における対極として、これらの部が持つ双方の機能を発揮させることができる。即ち、カバー電極１９と表面電極Ａ（又は表面電極Ｂ）とで前記移動電場印加部における前記一対の電極を構成することができ、また、カバー電極１９と表面電極１３Ｃとで前記引き寄せ電場印加部における一対の電極を構成することができる。
このような前記引き寄せ電場印加部を有する変形例によれば、液体試料４の液層中を浮遊する前記結合体が液体試料導入板２の前記表面近傍に重力沈降するのを待つ必要がなく、効率的に前記標的物質の検出を行うことができる。
【実施例】
【００６９】
図１に示す標的物質検出装置１の構成に準じて実施例に係る標的物質検出装置を作製した。以下では、説明の便宜上、標的物質検出装置１の説明に用いた符号と同一の符号で実施例１に係る標的物質検出装置の各構成部を説明する。
具体的に、液体試料導入板２としては、厚さ０．７５ｍｍのＳｉＯ２基板を用いた。光源６としては、中心波長６３５ｎｍの半導体レーザ（Ｔｈｏｒｌａｂｓ社、型番ＣＰＳ６３５）を用いた。液体試料導入板の裏面には、ＳｉＯ２ガラス製の光学プリズム８を光学的に密着させて配し、液体試料導入板２の表面に対して入射角６７°で光源６からの光を入射させる構成とした。
また、前記移動電場印加部としては、表面電極３Ａ，３Ｂとして厚さ３００ｎｍの酸化インジウムスズ電極を５ｍｍの距離を置いて形成し、各電極上に固定した銅細線を介して表面電極３Ａ，３Ｂをファンクションジェネレーター（エヌエフ回路設計ブロック社、型番ＷＦ１９７４）に接続し、直流電圧を印加する構成とした。
また、液体試料導入板２及び表面電極３Ａ，３Ｂに対する前記結合体の吸着を防止するため、吸着防止層として、これら部材の表面にメトキシトリエチレングリコール−トリエトキシシランの単分子膜を形成した。
また、光信号検出部７としては、５倍の対物レンズを備えた光学顕微鏡に冷却ＣＣＤカメラ（ビットラン社、型番ＢＵ−５９ＬＩＲ）を組み込んだものを用い、前記光信号を光点とする２次元画像を取得する構成とした。また、前記荷電処理粒子や液体試料導入板２の表面に付着した夾雑物等が前記近接場による光を散乱することで生じる散乱光の光信号を除外し、前記標識物質中の蛍光色素からの光信号だけを取得するため、前記対物レンズと前記ＣＣＤカメラとの間の光路中に透過波長６８０ｎｍのバンドパスフィルタ（Ｔｈｏｒｌａｂｓ社、型番ＦＢ６８０−１０）を配する構成とした。つまり、光信号検出部７としては、５倍の前記対物レンズ及び透過波長６８０ｎｍの前記バンドパスフィルタを備えたＣＣＤカメラを用いたこととなる。
【００７０】
前記標的物質としては、正常マウスＩｇＧを選択した。
また、前記荷電処理粒子（前記荷電粒子）としては、前記第１の官能基としてのカルボキシ基で表面修飾された直径１００ｎｍのポリスチレンビーズに対し、前記結合物質としての抗マウスＩｇＧ−ロバ抗体と、前記荷電分子として１分子中にカルボキシ基を２つ有するグルタミン酸とを結合させたものを用いた。
この荷電処理粒子は、次のように調製した。
調製試薬として、Ｐｏｌｙｌｉｎｋ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ社製、バッファー液としてのＰｏｌｙｌｉｎｋ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒと、活性化剤としての１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ）とを含む）を用いる。
先ず、前記ポリスチレンビーズ１２．５ｍｇを前記バッファー液１７０μＬに分散させた分散液を、前記バッファー液に前記ＥＤＡＣを加えて調製した濃度が２００ｍｇ／ｍＬのＥＤＡＣ溶液１０μＬと混合して混合液を調製し、前記混合液を１５分間反応させ、前記ポリスチレンビーズ表面の前記カルボキシ基を活性誘導基に変換した。
次に、遠心分離で上清を除去して行うビーズ洗浄により、前記混合液から得られた前記ポリスチレンビーズの濃縮液を別の前記バッファー液１７０μＬに再分散させて再分散液を調製した。
次に、前記再分散液に対し、前記バッファー液に前記抗マウスＩｇＧ分散液（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を加えて調製した濃度が５μｇ／ｍＬの前記抗マウスＩｇＧ溶液１０μＬを混合し、３０分間室温で反応させて前記活性誘導基に前記抗マウスＩｇＧを結合させ、前記ポリスチレンビーズの１次処理液を調製した。
次に、前記ポリスチレンビーズの１次処理液に対し、リン酸緩衝生理食塩水（富士フィルム和光純薬社製）にグルタミン酸（富士フィルム和光純薬社製）を加えて調製した濃度が５００ｎｇ／ｍＬのグルタミン酸溶液１０μＬを混合し、２４時間室温で反応させ、前記抗マウスＩｇＧと未結合の前記活性誘導基に前記グルタミン酸を結合させ、前記ポリスチレンビーズの２次処理液を調製した。
その後、前記ポリスチレンビーズの２次処理液に対し、前記ビーズ洗浄を３回行い、前記ポリスチレンビーズ表面の前記カルボキシ基のグループのうち、一のグループが前記抗マウスＩｇＧと結合し、他の一のグループが前記グルタミン酸と結合した状態の前記ポリスチレンビーズの表面処理粒子として、前記荷電処理粒子を調製した。
また、前記標識物質としては、直径４００ｎｍの蛍光色素Ｃｙａｎｉｎｅ５を含有したポリマービーズ（多摩川精機社製）に抗マウスＩｇＧ−ウサギ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を結合させた粒子を用いた。
前記標的物質、前記荷電処理粒子及び前記標識物質としては、いずれもリン酸緩衝生理食塩水に分散させ、分散液のｐＨは６．７とした。
液体試料４としては、前記標的物質の分散液に前記荷電処理粒子の分散液及び前記標識物質の分散液を混合させて調製した。
【００７１】
前記標的物質の検出としては、次のように行った。
先ず、１００μＬの液体試料４を液体試料導入板２上に導入後、カバーガラス５を配して液体試料４を液体試料導入板２上に保持させた。
次に、光源６から光Ｌを照射し、液体試料導入板２の表面に近接場を形成させた。
次に、表面電極３Ａ，３Ｂに対して電圧を印加し、前記結合体の移動の様子を光信号検出部７で検出した。
【００７２】
検出結果を図４に示す。なお、図４は、表面電極３Ａ、３Ｂへの電圧印加前、並びに、表面電極３Ａ，３Ｂに２．８Ｖの直流電圧を印加してから３０秒後、６０秒後、９０秒後、１２０秒後、１５０秒後及び１８０秒後に、それぞれ露光時間１０秒で取得された画像を重ね合わせて表示した画像である。
また、図４の視野は、０．９ｍｍ×０．９ｍｍであり、図中の「１」は、電圧印加前の光点、「２」は、直流電圧を印加してから３０秒後の光点、「３」は、直流電圧を印加してから６０秒後の光点、「４」は、直流電圧を印加してから９０秒後の光点、「５」は、直流電圧を印加してから１２０秒後の光点、「６」は、直流電圧を印加してから１５０秒後の光点、「７」は、直流電圧を印加してから１８０秒後の光点を示している。
また、図４に示す画像の検出領域は、液体試料導入板２の表面近傍における表面電極３Ａと表面電極３Ｂとの間の領域であり、図中、左方向に負極として表面電極３Ａが配され、右方向に正極として表面電極３Ｂが配されている。
【００７３】
図４中の光点「１」〜「７」に示すように、視野中の光点が時間の経過と共に表面電極３Ｂ（正極）に向けて移動していることが確認される。
ここで、移動する光点は、前記標的物質、前記荷電処理粒子及び前記標識物質からなる前記結合体が、表面電極３Ａ，３Ｂに印加した電圧によって液体試料導入板２の表面上を移動したことにより検出されたものである。
このように、表面電極３Ａ，３Ｂへの電圧印加による光信号の移動を観測することで、前記結合体の移動に基づく光信号を、液体試料導入板２の前記表面上のキズ、前記表面に吸着ないし前記表面上に存在する夾雑物、光源出力の揺らぎなどのノイズ信号（図４中の移動しない光点）と明確に区別して検出することができる。
【符号の説明】
【００７４】
１    標的物質検出装置
２    液体試料導入板
３Ａ，３Ｂ，１３Ａ，１３Ｂ，１３Ｃ    表面電極
４    液体試料
５    カバーガラス
６    光源
７    光信号検出部
８    光学プリズム
１９    カバー電極
Ｐ    粒子本体
Ｒ１    第１の官能基
Ｒ２    第２の官能基
Ｉｇ    抗体
Ａｇ    抗原
【図１】
2020122728.tif 000004
【図２（ａ）】
2020122728.tif 000005
【図２（ｂ）】
2020122728.tif 000006
【図２（ｃ）】
2020122728.tif 000007
【図２（ｄ）】
2020122728.tif 000008
【図２（ｅ）】
2020122728.tif 000009
【図３】
2020122728.tif 000010
【図４】
2020122728.tif 000011