(57)【要約】【課題】本発明の目的は、既存の方法よりも信頼性が高く、より高感度な分析方法を提供することである。【解決手段】本発明は、以下の工程：キャリア流体に含有される複数の液滴を提供する工程であって、液滴のうち少なくとも１個は、主軸に沿って延長する物体を画定する、粒子の少なくとも１個のクラスターを含み、液滴のうち少なくともいくつかは、クラスターに付着できる少なくとも１個の標的要素を含有する、工程を含む、液滴の内容物を分析する方法に関する。本方法は、クラスターに対する前記標的要素の付着に特有の物理的パラメータが測定される工程を含む。【選択図】図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程：
−  キャリア流体（８）に含有される複数の液滴（６）を提供する工程であって、液滴（６）のうち少なくとも１個が、主軸（Ｘ）に沿って長尺物を画定する、粒子（１２）の少なくとも１個の凝集体（１０）を含み、少なくとも特定の液滴（６）が、凝集体（１０）に結合できる少なくとも１個の標的要素（３７）を含有する、工程を含む、液滴の内容物を分析するための方法において、
凝集体（１０）上への標的要素（３７）の付着に特有の物理的パラメータを測定する測定工程を含むことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、以下の工程：
−  キャリア流体（ｃａｒｒｉｅｒ  ｆｌｕｉｄ）に含有される複数の液滴を提供する工程であって、液滴のうち少なくとも１個が、主軸に沿って長尺物（ｅｌｏｎｇａｔｅｄ  ｏｂｊｅｃｔ）を画定する、粒子の少なくとも１個の凝集体を含み、少なくとも特定の液滴が、凝集体に結合できる少なくとも１個の標的要素（ｔａｒｇｅｔ  ｅｌｅｍｅｎｔ）を含有する、工程
を含む、液滴の含有物を分析するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
このような方法は、例えば、液滴中に分散した目的分子のスクリーニングを行うためのものである。特に、本方法は、特定の標的要素を含む液滴を決定し、更には選択するためのものであり、この標的要素は化学反応又は生物学的反応から生じうる。
【０００３】
特に、液滴の測定及びその後の選択は、生成物の濃度又は結合活性度（ｃｏｎｎｅｃｔｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）に基づいてもよい。
【０００４】
文献ＷＯ２００９／０１１８０８Ａ１は、液滴中のタンパク質を付着させる活性度を決定するための方法を記載している。
【０００５】
Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ誌に２０１３年４月４日にオンライン発表されたＭａｚｕｔｉｓらの刊行物「Ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｓｏｒｔｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｄｒｏｐｌｅｔ−ｂａｓｅｄ  ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ」は、この原理を例示している。
【０００６】
マウスハイブリドーマは、抗マウス抗体で覆われたビーズを含む液滴内にカプセル化される。ハイブリドーマは抗体を分泌する。フルオロフォアとカップリングした二次抗体により、分泌抗体の存在を明らかにすることが可能になる。二次抗体の分布は、分泌抗体が存在しない場合、液滴中で均質であるが、抗体が存在する場合、ビーズ上に再局在化する。
【０００７】
したがって、本方法は、特定の細胞の活性度を決定する上で非常に選択性が高い。
【０００８】
一方で、このような方法には様々な欠点がある。細胞及びビーズを区画化するための方法は無作為である。液滴中のビーズの数は、ポアソン分布法則により推定されることがある。また、液滴内の細胞の数も、独立のポアソン分布法則によって推定されることがある。ビーズ及び液滴の初期濃度は、液滴１個当たり平均して１個の細胞及び１個のビーズを有するように調整される。したがって、液滴の一部のみが、実施される分析の目的となる。
【０００９】
更に、相当なサイズを有する、液滴１個当たり単一のビーズの存在は、本方法の分解能にとって好ましくない。実際、二次抗体はビーズの表面全体に分布する。したがって、本方法のダイナミックレンジは、ビーズ１個当たりの利用可能な外部表面積によって制限される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】ＷＯ２００９／０１１８０８Ａ１
【特許文献２】米国特許第２０１０／０１０５１１２号
【特許文献３】ＰＣＴ／ＦＲ２００９／０５１３９６
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｍａｚｕｔｉｓら、「Ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｓｏｒｔｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｄｒｏｐｌｅｔ−ｂａｓｅｄ  ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ」、Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、２０１３年４月４日オンライン発表
【非特許文献２】Ｂｒａｎｄｏｎ  Ｊ  ＤｅＫｏｓｋｙら、「Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐａｉｒｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｈｅａｖｙ  ａｎｄ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ」、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３１巻、１６６〜１６９頁、２０１３年発行
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、既存の方法よりも信頼性が高く、より高感度な分析方法を提供することである。
【００１３】
このために、本発明の目的は、凝集体上への標的要素の付着に特有の物理的パラメータを測定するための測定工程を含むことを特徴とする、前述の種類の方法である。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明による方法は、個別に又は技術的に可能なすべての組合せに従って選択される、以下の特徴のうち１つ又は複数を含んでもよい。
−  粒子が磁性粒子であり、有利には常磁性粒子であり、好ましくは超常磁性粒子である；
−  液滴を提供する工程が、
−  液滴を形成するための流体塊（ｍａｓｓ  ｏｆ  ｆｌｕｉｄ）中での粒子の分散、次いで
−  液滴の形態の流体塊の分散、
−  主軸に沿って長尺物を画定する、粒子の少なくとも１個の凝集体の各液滴中での形成
を含み、粒子の凝集体が分散後に各液滴中で形成される；
−  標的要素が、タンパク質、抗体、ペプチド、ＤＮＡ又はＲＮＡ断片、代謝産物、鉄イオン、脂質、及び細胞によって産生されうる生体分子によって形成される群から選択される要素である；
−  少なくとも１個の液滴が、標的要素を産生しうる産生実体（ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ｅｎｔｉｔｙ）を含み、産生実体が、好ましくは細胞又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現系によって形成される群から選択される；
−  測定工程が、液滴内に位置する複数の点における局所的な物理的パラメータの測定を含み、液滴内部で測定された値の積分値の決定を好ましくは含む；
−  方法が、測定工程の前に、凝集体の主軸を検出軸に沿って配向させる工程を含む；
−  方法が、各測定において異なる検出軸に沿って凝集体の主軸を配向させる工程を有する、複数の測定工程を含む；
−  測定工程が、液滴の循環を伴わずに、マイクロ流体チャンバー内で実施される；
−  方法が、
−  液滴を循環させるためのアセンブリ及び検出領域を含むデバイスの提供、
−  検出領域に向けた液滴の輸送
を含み、液滴内部の測定が検出領域において実行される；
−  方法が、
−  液滴を循環させるためのアセンブリ及び複数の分類領域を含むデバイス、並びに液滴又は液滴の一部分を分類領域に向けて選択的に誘導するための手段の提供、
−  液滴又は液滴の一部分に対する分類決定であって、複数の分類領域から１つの分類領域を選択的に選び出すことからなる決定、
−  決定工程中に選択された液滴の分類領域に向けた、液滴、特に液滴の一部分の輸送
を含む；
−  少なくとも１個の液滴が、少なくとも１個の標的要素、標的要素との複合体を形成することができる少なくとも１個の第１のシグナリング実体（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｅｎｔｉｔｙ）、及び標的要素との複合体を形成することができる少なくとも１個の別個の第２のシグナリング実体を含み、方法が、凝集体上に再局在化したシグナリング実体のそれぞれの濃度を示す信号の測定を含む；
−  少なくとも１個の液滴が、少なくとも１個の標的要素、標的要素との複合体を形成することができる少なくとも１個のシグナリング実体が、及び標的要素との複合体を形成することができる少なくとも１個の定量化実体（ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｅｎｔｉｔｙ）を含み、方法が、
−  凝集体上に再局在化したシグナリング実体の濃度を表す信号の測定、
−  凝集体上に再局在化した定量化実体の濃度を表す信号の測定、
−  再局在化したシグナリング実体の信号の、再局在化した定量化実体の信号に対する比率からの、標的要素とシグナリング実体との解離定数の決定
を含む；
−  少なくとも特定の液滴が産生実体を含み、産生実体が、標的要素となる少なくとも１個の抗体を産生しうる細胞であり、方法が、少なくとも１種の抗原に対する産生実体により産生される抗体の親和度を決定する工程を含み、好ましくは、決定工程後に液滴を選別する工程を含む；
−  少なくとも１個の液滴が少なくとも２個の別個のシグナリング実体を含み、２個のシグナリング実体のそれぞれが、凝集体上で別個の標的要素との複合体を形成することができ、方法が、再局在化したシグナリング実体のそれぞれの濃度を示す信号の測定を含む；
−  少なくとも特定の液滴が産生実体を含み、産生実体が、１種又は複数の種類のタンパク質を産生しうる細胞であり、各タンパク質が別個の標的要素であり、再局在化したシグナリング実体のそれぞれの濃度を示す信号の測定が、前記種類のタンパク質の定量化を可能にする；
−  物理的パラメータの測定が蛍光測定である；
−  液滴のうち少なくとも１個が、標的要素を分泌できる細胞を含み、方法が、標的要素が細胞によって液滴中に分泌されるインキュベーション工程を含む；
−  液滴のうち少なくとも１個が細胞を含み、方法が細胞溶解のための工程を含む；
−  液滴のうち少なくとも１個が、標的要素を発現できるｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系を含む；
−  方法が、液滴のうち少なくとも１個における凝集体から離れて位置する第１の点において局所的に、物理的パラメータを測定し、同じ液滴内の凝集体の近傍にある第２の点において局所的に、同じ物理的パラメータを測定する工程を含む；
−  粒子の最大寸法が、液滴の直径の５０％未満である；
−  液滴が、少なくとも１個のシグナリング実体を含有し、物理的パラメータの測定が、液滴内での、又は凝集体に対するシグナリング実体の位置に依存する；
−  産生実体が、タンパク質、ペプチド、ＤＮＡ又はＲＮＡ断片、代謝産物、イオン、脂質及び細胞によって産生されうる生体分子により形成される群から選択される複数の標的要素を産生する；
−  方法が、産生実体の少なくとも１個の特性を決定する工程を含む；
−  分類を決定する工程が、測定工程の後に行われる；
−  液滴が超常磁性粒子を含有し、液滴又は液滴の一部分が、磁力、電界、誘電泳動、電気合体（ｅｌｅｃｔｒｏｃｏａｌｅｓｃｅｎｃｅ）、又は表面弾性波の中から選択された誘導手段により、分類領域に向けて誘導される；
−  液滴の一部分が磁力によって抽出され、抽出部分が、副液滴を形成し、凝集体を含有する。
【００１５】
本発明の目的はまた、
−  キャリア流体に含有される複数の液滴を提供するためのアセンブリであって、液滴のうち少なくとも一個が、主軸に沿って長尺物を画定する、粒子の少なくとも１個の凝集体を含むアセンブリ
を備える、液滴の内容物を分析するための装置において、凝集体上への標的要素の付着に特有の物理的パラメータを測定するためのアセンブリを備え、好ましくは、
−  液滴を循環させるためのアセンブリ、
−  液滴の分類を決定するためのアセンブリ、
−  分類決定に従って液滴を選別するためのアセンブリ
を更に備えることを特徴とする装置である。
【００１６】
単に一例として示された以下の説明を読み、添付図面を参照することで、本発明をよりよく理解することができるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明による第１の分析装置の標的要素の略図である。
【図２】第１の装置を用いた方法工程（ｍｅｔｈｏｄ  ｓｔｅｐ）の略図である。
【図３】本発明による方法工程中の、本発明による第２の装置の一部分の写真である。
【図４】本発明による方法工程中の、本発明による第２の装置の一部分の写真である。
【図５】本発明による方法工程中の、本発明による第２の装置の一部分の写真である。
【図６】本発明による方法工程中の、本発明による第２の装置の一部分の写真である。
【図７】本発明による第３の装置の略図である。
【図８】本発明による第４の装置の略図である。
【図９】第１の装置を用いた方法工程の略図である。
【図１０】本方法による解離定数（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）Ｋｄの決定を示す図である。
【図１１】液滴を生成するためのデバイスを示す図である。
【図１２】液滴を生成するためのデバイスを示す図である。
【図１３】液滴を離隔（ｓｐａｃｉｎｇ  ａｐａｒｔ）し測定を行うためのアセンブリを示す図である。
【図１４】液滴を離隔し測定を行うためのアセンブリを示す図である。
【図１５】二次元の読み取りを行うためのアセンブリを示す図である。
【図１６】二次元の読み取りを行うためのセンブリを示す図である。
【図１７】実施例３を示す図である。
【図１８】実施例３を示す図である。
【図１９】実施例３を示す図である。
【図２０】実施例４を示す図である。
【図２１】実施例４を示す図である。
【図２２】実施例５を示す図である。
【図２３】実施例５を示す図である。
【図２４】一方法を適用する工程中の液滴の略図である。
【図２５】実施例６を示す図である。
【図２６】実施例７を示す図である。
【図２７】実施例７を示す図である。
【図２８】実施例７を示す図である。
【図２９】実施例８を示す図である。
【図３０】実施例８を示す図である。
【図３１】実施例９を示す図である。
【図３２】実施例９を示す図である。
【図３３】実施例１０を示す図である。
【図３４】実施例１０を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明による液滴の内容物を分析するための第１の装置を図１に示す。
【００１９】
装置１は、キャリア流体８に含有される複数の液滴６を提供するためのアセンブリ４を含み、液滴６の少なくとも一部は、主軸Ｘに従って長尺物を画定する、粒子１２の少なくとも１個の凝集体１０含む。
【００２０】
装置１は、液滴中の物理的パラメータの測定するためのアセンブリ１４を更に含む。
【００２１】
測定アセンブリ１４は、例えば、液滴のうち少なくとも１個における凝集体１０から離れて位置する第１の点１６における局所的な、物理的パラメータの測定、及び同じ液滴内の凝集体１０の近傍にある第２の点１８における局所的な、同じ物理的パラメータの測定を実施することができる。
【００２２】
装置１はまた、循環アセンブリ２２、循環導管２４及び検出領域２６を含むデバイス２０を備える。
【００２３】
循環アセンブリ２２は、導管２４内のキャリア液８において各液滴６を連続的な液滴の列として循環させることができる。
【００２４】
供給アセンブリ４は、装填アセンブリ２８及び凝集アセンブリ３０を備える。供給アセンブリ４は、離隔アセンブリ３１を更に備える。
【００２５】
装填アセンブリ２８は、粒子１２の分散体を含む複数の初期液滴３２を提供することができ、初期液滴３２の少なくとも１個は少なくとも１個の標的要素３７を更に含む。
【００２６】
離隔アセンブリ３１は、液滴の列から２個の連続する液滴６を離間すること、即ち、２個の連続する液滴の間の距離を大きくすることができる。例えば、離隔アセンブリ３１は、キャリア流体入口８を備える。離隔アセンブリの例は図１３及び図１４に示される。
【００２７】
キャリア流体８は、２個の連続する液滴６を液滴の列から分離して、それら液滴の接触を防ぐことができる。或いは、液滴６の分離は、機械デバイスによって実行される。
【００２８】
液滴６及びキャリア流体８の内相を形成する流体は、実質的に非混和性である。例えば、液滴６は水性内相を含み、キャリア流体８は有機相又は油相である。
【００２９】
キャリア流体８は有利にはフッ素化オイルである。
【００３０】
キャリア流体８又は液滴の内相を形成する流体は、例えば米国特許第２０１０／０１０５１１２号に記載されているような、接触した２個の液滴６の融合を防ぐことができる界面活性剤、又は更にＲａｉｎＤａｎｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製界面活性剤ＥＡを有利には含む。
【００３１】
「実質的に非混和性である」とは、一般に、２５℃及び周囲圧力にて測定された、キャリア流体８中で液滴を形成する流体の溶解度が、１％未満であることを意味する。
【００３２】
液滴６のサイズは、例えば１μｍ〜１０００μｍの間に含まれる。
【００３３】
液滴６の容積は、有利には０．１ピコリットル〜１マイクロリットルの間に含まれる。
【００３４】
提供された液滴６は実質的に単分散する。実質的に単分散するとは、液滴６の多分散度が５％未満であることを意味する。
【００３５】
図示された例では、液滴６は球形である。或いは、液滴６は、導管２４の循環軸Ｙに沿って細長い形状になる。或いは、液滴６は、循環軸Ｙに垂直な軸に沿って平らにされた円盤（ｐｕｃｋ）の形状である。
【００３６】
各初期液滴３２は、ベース流体（ｂａｓｅ  ｆｌｕｉｄ）、ベース流体中の固体粒子１２の分散体、及び複数のシグナリング実体３４を含む。更に、少なくとも１個の初期液滴３２は、少なくとも１個の標的要素３７を含む。
【００３７】
粒子１２は、細長い形状の凝集体１０を形成するためのものである。例えば、粒子１２は、磁場を印加すると磁気モーメントを獲得する超常磁性粒子である。超常磁性は、強磁性又はフェリ磁性材料が小粒子又はナノ粒子の形態にあるとき、それらの材料に現れる挙動である。十分に小さいサイズの粒子では、温度の影響下で磁化の向きが自然に反転することがある。本明細書における「磁性粒子」という用語は、超常磁性粒子を指す。
【００３８】
磁性粒子１２は、例えば、Ｄｙｎａｌ社（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、Ａｄｅｍｔｅｃｈ社又はＭｉｌｔｅｎｙｉ社によって提供される粒子の中から選択される。
【００３９】
粒子１２は例えばナノメートル単位である。したがって、粒子１２の最大寸法は１μｍ未満であり、例えば、５０〜１，０００ｎｍの間に含まれる。粒子１２は有利には実質的に単分散する。例えば、粒子１２の最大寸法間の変動は厳密に１０％未満である。液滴６中の粒子１２のサイズ及び数は、所望の数の凝集体を形成するように選択される。粒子１２の最大寸法サイズは、液滴６の直径の５０％未満である。
【００４０】
粒子１２の濃度によって、コロイド安定性が得られる。
【００４１】
液滴６中の粒子１２の濃度は、粒子１２が液滴６の容積の０．１〜５％の間、例えば１．７％となるものである。
【００４２】
一例において、３３ピコリットルの各液滴６は、平均して、３００ｎｍの直径を有する粒子１２を５００個含有する。
【００４３】
粒子１２は最初に、初期液滴３２中で均質な分散体を形成する。これらは、初期液滴３２の容積中に実質的に均一に分布している。したがって、粒子１２の濃度は、初期液滴３２の全体にわたって均質になる。
【００４４】
粒子１２は、表面材料からなる生体分子の結合を可能にする表面を有利には有する。例えば、粒子１２は、ＣＯＯＨ又はＮＨ２官能基を有するポリマーで覆われる。
【００４５】
有利には、この表面材料はまた、液滴中での粒子１２の自然凝集を制限できる。
【００４６】
更に、前記表面材料は、例えば、凝集体における１個のビーズの材料とその隣接ビーズの材料との間の非特異的結合により、凝集体１０の安定性を有利には促進できる。
【００４７】
粒子１２は有利には官能化される。このことは、粒子１２の表面材料が官能性要素を含むことを特に意味する。
【００４８】
図示された例では、官能性要素として、捕捉要素３６を含む。捕捉要素３６は、例えば、標的要素３７を捕捉することができる。捕捉要素３６は、標的要素３７を介してシグナリング実体３４に間接的に結合することができる。或いは、捕捉要素は、シグナリング実体３４に直接結合することができる。
【００４９】
例えば、粒子１２上の捕捉要素３６はプロテインＧであり、標的要素３７はプロテインＧに結合できる抗体であり、シグナリング実体（ｓｉｇｎａｌ  ｅｎｔｉｔｙ）３４は抗体によって認識される抗原であり、抗原は抗体に結合することができる。
【００５０】
凝集アセンブリ３０は、主軸Ｘに沿った粒子１２の凝集体を生成することができる。
【００５１】
凝集アセンブリ３０は、例えば、導管２４の両側に位置する２個の磁石３８を含む。磁場の向きは循環軸Ｙに対して平行ではなく、有利には循環軸Ｙに対して垂直である。凝集アセンブリ３０は、各液滴６内に細長い凝集体を形成することを可能にする。
【００５２】
一実施形態において、磁石３８は永久磁石である。
【００５３】
或いは、凝集アセンブリ３０は非永久磁石を備える。
【００５４】
或いは、凝集アセンブリ３０は、特定の液滴においてのみ細長い凝集体１０を生成するために、活性モードから非活性モードに切り替えることができる。
【００５５】
例えば、粒子１２の各凝集体１０は、主軸Ｘに沿って配向された柱（ｃｏｌｕｍｎ）を含む。柱の高さは、液滴６の直径の５０％〜１００％の間に有利には含まれる。柱の幅は、例えば柱の高さの６０％未満である。
【００５６】
更に、凝集アセンブリ３０は、例えば、凝集体を優先軸（ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ａｘｉｓ）に沿って配向させることができる。図示された例では、凝集体１２の軸Ｘは、循環導管２４内の液滴６の循環軸Ｙに対して垂直になっている。
【００５７】
測定アセンブリ１４は、例えば、循環軸Ｙに対して垂直の又は傾斜した軸Ｘ’に沿って延びる線に沿って、蛍光強度を光学的に測定することができるレーザー線を含む。
【００５８】
測定アセンブリ１４は、検出領域２６において液滴内の測定を実施することができる。
【００５９】
レーザー線の軸Ｘ’は、検出領域２６内の凝集体Ｘの軸に対して有利には平行である。
【００６０】
キャリア流体８の流量が一定である場合、レーザー線によって得られる信号の経時的測定値（ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｖｅｒｔｉｍｅ）は、レーザー線の前を通過する液滴６の空間走査に対応する。これにより、連続的に複数の測定点、特に、凝集体１０から離れて位置する少なくとも１個の第１の測定点１６、及び凝集体１０の近傍において凝集体１０のより近くに位置する第２の測定点１８を得ることが可能になる。
【００６１】
実際には、測定アセンブリ１４に面した漸進的通過の間に、液滴６の長手方向寸法にわたって、複数の連続的測定点が取られる。
【００６２】
図１及び図２に示される例では、シグナリング実体３４は蛍光性である。
【００６３】
循環導管２４は、供給アセンブリ４から測定アセンブリ１４への循環方向において循環軸Ｙに沿った液滴６、３２の循環を可能にするためのものである。
【００６４】
循環導管２４は１ｍｍ以下の内径を有利には有する。
【００６５】
循環導管２４は、循環軸Ｙに沿って細長くなっている。循環導管２４は、円形又は楕円形のような丸い輪郭を有する交差断面、長方形の輪郭などの多角形の導管による交差断面を有する。
【００６６】
循環導管２４は、例えば、測定アセンブリ１４による光学パラメータの測定を可能にする半透明材料で画定される。或いは、循環導管２４は、検出領域２６内に少なくとも１つの透明測定窓を画定する。
【００６７】
循環導管２４の壁は、キャリア流体８に対して不浸透性である。
【００６８】
例えば、循環導管２４は、有利には１ｍｍ未満の内部寸法を有する毛管内に画定される。或いは、循環導管２４は、マイクロ流体チップ内に画定される。
【００６９】
液滴を循環させるためのアセンブリ２２は、導管２４内で液滴６、３２を循環方向に１個ずつ移動させるためのものである。
【００７０】
循環アセンブリ２２は、例えば、キャリア流体８に制御流量を適用することが可能なシリンジポンプを備える。或いは、循環アセンブリ２２は、圧力制御器を備える。
【００７１】
次に、第１の装置１に適用される本発明による第１の分析方法について説明する。
【００７２】
前述した装置１が提供される。前述のような初期液滴３２は、キャリア流体８中に調製される。
【００７３】
好ましくは、粒子１２は各初期液滴３２中で均質に分散される。初期液滴３２に対する個々の粒子１２の小さなサイズを考慮すると、各初期液滴３２は、例えば１０個を超える多数の個々の粒子１２を含有する。粒子１２を１個も含まない初期液滴３２を得る確率は、非常に低いか、又は０である。
【００７４】
好ましくは、標的要素３７及びシグナリング実体３４は、各初期液滴３２内に均質に分散する。
【００７５】
初期液滴３２内には、特定の親和性を有する要素間に結合が形成される。
【００７６】
一例において、各標的要素３７は、シグナリング実体３４及び捕捉要素３６に結合される。シグナリング実体３４は、このようにして粒子１２上に再局在化する。
【００７７】
以下において、「再局在化した」実体とは、凝集体１０に結合する実体を意味する。
【００７８】
初期液滴３２は、循環アセンブリ２２によって導管２４内でキャリア流体８と一緒に循環する。
【００７９】
少なくとも１個の初期液滴３２は、凝集アセンブリ３０に導かれる。主軸Ｘに沿って長尺物を画定する、粒子１２の凝集体１０は、凝集アセンブリ３０によって初期液滴３２内で形成される。
【００８０】
好ましくは、粒子１２が磁性粒子である場合、粒子１２は凝集アセンブリ３０の各磁石３８の前を通過する間に主軸Ｘに沿って整列する。
【００８１】
長尺物を含む液滴６は、検出領域２６へと運ばれる。物理的パラメータは、測定アセンブリ１４によって、液滴６のうち少なくとも１個における少なくとも１個の第１の点１６にて局所的に測定される。
【００８２】
特定の用途では、物理的パラメータは、測定アセンブリ１４によって、液滴６のうち少なくとも１個における少なくとも１個の第１の点１６において局所的に測定され、同じ物理的パラメータが、測定アセンブリ１４によって、同じ液滴６における凝集体１０近傍の少なくとも１個の第２の点１８において局所的に測定される。
【００８３】
図２は、例として、異なる液滴６について得られた異なる測定値を示している。グラフは、レーザー線によって経時的に測定された蛍光強度を示している。
【００８４】
蛍光強度は、シグナリング実体３４の波長特性の範囲内で測定されている。この例では、蛍光強度は、粒子１２の波長特性の範囲内で更に測定されており、粒子１２は蛍光性である。したがって、凝集体１０をより容易に位置づけることができる。
【００８５】
レーザー線上で測定されたシグナリング実体３４の蛍光に対応する蛍光強度４０は、図２において、異なる液滴６ごとに点線で示されている。
【００８６】
粒子１２の蛍光に対応する蛍光強度４１は、図２において、異なる液滴６ごとに実線で示されている。
【００８７】
測定工程は、液滴内に位置する複数の点において局所的に物理的パラメータを決定することを含む。測定工程は、複数の点における測定値の累積、例えば液滴６内での測定値の積分の決定を更に有利には含む。
【００８８】
図示された第１の液滴４２は、異なるシグナリング実体３４が粒子１２上に再局在化していない液滴６である。シグナリング実体３４の分布は、液滴６内で均質になっている。蛍光強度信号は、プラトー４４として測定される。
【００８９】
図示された第２の液滴４８は、シグナリング実体３４の一部が粒子１２上に再局在化した液滴６である。実際には、これらのシグナリング実体３４は、捕捉要素３６によって捕捉された標的要素３７に結合している。この場合、凝集体１０の近傍での蛍光強度は、液滴６の残り部分よりも顕著である。プラトー５２に加えてピーク５０を有する蛍光強度信号が測定されている。
【００９０】
凝集体１０から遊離しているシグナリング実体３４が少ないため、第２の液滴４８のプラトー５２の高さは、第１の液滴４２のプラトー４４の高さよりも低くなっている。
【００９１】
図示された第３の液滴５６は、シグナリング実体３４の大部分が凝集体上に再局在化した液滴である。蛍光強度信号は、ピーク５８及びプラトー５９を有する。より多くのシグナリング実体３４が粒子１２によって捕捉され、したがって、凝集体１０の近傍に位置しているため、測定されたピーク５８の高さは、第２の液滴４８において測定されたピーク５０の高さよりも高くなっている。
【００９２】
図９は、再局在化したシグナリング実体３４の濃度を推定する上で有用なパラメータの選択を示している。
【００９３】
時間ｔに対する信号Ｓを示す図９には、より高い信号ピークを有する、（左側及び右側の）１つのピーク又は２つのピーク（凝集体）を含有する、３個の液滴が示されている。有用なパラメータは、所定の閾値を基準とする信号の積分値（Ｉｎｔ）が計算される、信号の極大値（Ｍａｘとして示す）でありうる。
【００９４】
第１の方法は、各液滴６における信号の極大値（Ｍａｘ）、即ち凝集体上に再局在化した信号ピークの高さによって、この濃度を推定することからなる。
【００９５】
より精密な第２の方法は、例えば図９に示すように、各液滴６について、ユーザーによって設定された閾値を超えた信号の積分値（Ｉｎｔ）を計算することからなる。この方法は、実施例３で説明するように、信号の分散を制限する上でより興味深いことが明らかになりうる。
【００９６】
これらの信号処理方法はともに、リアルタイムで実行することができる。
【００９７】
他の方法、例えばこれらのアプローチの組合せは、例えば再局在化したシグナリング実体３４及び再局在化していないシグナリング実体３４両方の測定に適用することができる。
【００９８】
本発明は、液滴６中の標的要素３７の濃度の測定を更に可能にする。
【００９９】
これを行うための単純なケースは、以下の条件：
−  捕捉要素３６が、標的要素の少なくとも９０％超、有利には全体を凝集体上に捕捉するのに十分な量存在し、標的要素３７に対する十分な親和性を有し；
−  シグナリング実体３４の濃度が標的要素３７の濃度よりも大きく、シグナリング実体３４と標的要素３７との間の解離定数Ｋｄが標的要素３７の濃度よりも小さく、有利には１０倍超である、という条件に当てはまる場合である。これは、典型的には、サブナノモルのＫｄを有するモノクローナル抗体のような最適な用量の試薬が使用されるケース、及び実施例５に示されるように、１ナノモル濃度超の標的要素３７の濃度を検出することが意図されるケースである。
【０１００】
「ナノモル濃度」は、１ナノモル／Ｌに等しいという意味である。
【０１０１】
これらの特定の条件下において、各標的要素３７の存在により、捕捉要素３６−標的要素３７−シグナリング実体３４複合体の形成がもたらされる。したがって、標的要素３７の濃度は、凝集体１０に再局在化したシグナリング実体３４の信号に比例する。その他の条件は、定量化の達成を可能にし、捕捉要素３６、又は標的要素３７に対するシグナリング実体３４の濃度及び親和性を変更することにより当業者には明らかであろう。
【０１０２】
図３〜図６は、本発明による第２の装置６０の一部分を示す。
【０１０３】
この第２の装置６０は、デバイス２０がチャンバー６２を備える点で第１の装置１と異なる。チャンバー６２は、複数の循環路６４及び複数の分離パッド６６を含む。
【０１０４】
その他のチャンバーもありうる。一代替例において、チャンバーは、文献ＰＣＴ／ＦＲ２００９／０５１３９６に記載され、図１５及び図１６に示される、分離パッドを含まない。
【０１０５】
チャンバー６２は、凝集工程又は配向工程中、及び測定工程中に、キャリア流体８中の複数の液滴６を貯蔵するためのものである。
【０１０６】
第２の装置６０の測定アセンブリは、チャンバー６２内に存在する複数の液滴６の物理的パラメータを同時に測定できる点で、第１の装置１の測定アセンブリ１４と異なる。
【０１０７】
図３は、キャリア流体８中の初期液滴３２を含有するチャンバー６２を示す。磁性粒子１２の分散体を目視できる。
【０１０８】
図４は、液滴中で凝集体１０が形成された後の同じチャンバー６２を示す。複数の細長い凝集体が各液滴６内に形成されている。
【０１０９】
図５は、同じデバイス６０内の、細長い凝集体１０を有する複数の液滴６を示す。液滴６の性質及び量は、液滴１個当たり単一の細長い凝集体１０のみが存在するように調整されている。液滴６当たり単一の凝集体１０が存在することにより測定が容易になる。
【０１１０】
図６は、同じ検出軸Ｄに沿って凝集体を配向させる工程の後の同じチャンバー６２を示す。
【０１１１】
この第２の装置６０からの本発明による分析方法は、例えば、液滴６が検出器の前を循環することによってではなく、チャンバー６２全体を同時に測定することによって、測定が複数の液滴６に対して同時に行われるという点で、前述の方法と異なる。
【０１１２】
この方法はまた、測定工程の前に、検出軸Ｄに沿って凝集体１０の主軸Ｘを配向させる工程を含むという点でも異なる。
【０１１３】
有利には、可変方位（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）の磁場を印加することにより、検出軸を増加することができる。このアプローチは、液滴中の他の非磁性物体からの凝集体１０の識別、又は渦流信号の低減が可能であるという利点を有する。例えば、バックグラウンド蛍光ノイズを低減することができる。例えば、異なる軸に沿った検出は、凝集体１０上でのシグナリング実体３４の再局在化を、液滴６内の別の物体、例えば細胞上でのシグナリング実体３４の再局在化から区別することを可能にする。
【０１１４】
この概念の実現は、第１の方位Ｄ１に沿って凝集体１０の主軸Ｘを整列させるために磁場Ｂ１を印加し、次いで、Ｄ１に対して垂直な第２の方位Ｄ２に沿って凝集体１０の主軸Ｘを整列させるために、Ｂ１に対して垂直な磁場Ｂ２を印加することからなる。
【０１１５】
本発明による第３の装置７０を図７に示す。
【０１１６】
この第３の装置７０は、分類アセンブリ７２を更に備える点で第１の装置１と異なる。
【０１１７】
更に、第３の装置７０は、装填アセンブリ２８が、内相入口領域７４並びにキャリア流体入口領域７６及び連結領域（ｊｕｎｃｔｉｏｎ  ａｒｅａ）７８を含むという点で、第１の装置１と異なる。装填アセンブリ２８は、インキュベーション領域７９を更に含む。
【０１１８】
内相入口領域７４は、第１の入口導管８０、第２の入口導管８２、及び合流導管（ｊｏｉｎｔ  ｆｌｏｗ  ｃｏｎｄｕｉｔ）８４を備える。
【０１１９】
第１の入口導管８０は、液滴の内相の一部分を形成することを意図とした第１の流体塊８６を導入することを意図するものである。この例では、第１の内部流体塊は、粒子１２及び複数のシグナリング実体３４を含んでいる。
【０１２０】
第２の入口導管８２は、液滴内相の一部分を形成するための第２の流体塊８８の入口となるためのものである。この例では、第２の内部流体塊は、標的要素３７の産生実体９０の懸濁液を含む。産生実体９０は、例えば細胞９０である。
【０１２１】
細胞９０は、有利には、標的要素３７を分泌できる細胞である。特に、特定の細胞９０は、ハイブリドーマ又は形質細胞のような、抗体分泌細胞である。分泌抗体は、粒子１２の捕捉要素３６とシグナリング実体３４両方によって認識される。
【０１２２】
液滴６内でのこれらの標的要素３７の存在により、凝集体１０上でのシグナリング実体３４の再局在化が可能になる。
【０１２３】
第２の流体塊中の細胞９０の濃度は、有利には液滴の相当な部分が１個の細胞９０のみを含有する、例えば液滴の１０％超が１個の細胞９０を含有することになる。
【０１２４】
合流導管８４は、内相を形成するための流体塊８６、８８両方の配給を可能にする。
【０１２５】
キャリア流体入口領域７６は、キャリア流体８の入口となるためのものである。図示された例では、キャリア流体８は、２つの入口導管９２を通って流入する。
【０１２６】
連結領域７８は、キャリア流体入口領域７６と内相入口領域７４とを連結する。特に、連結領域は、合流導管８４をキャリア流体入口導管９２に連結する。
【０１２７】
連結領域７８は、初期液滴３２を形成することができる。本明細書に図示された連結領域７８は、流体力学的集束連結部（ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ  ｆｏｃｕｓｉｎｇ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ）である。流体力学的集束連結部の例は、図１１及び図１２に示される。或いは、初期液滴３２は、Ｔ形連結部において形成される。
【０１２８】
流体塊８６と流体塊８８との混合物を含む初期液滴３２が形成される。初期液滴３２は、粒子１２及びシグナリング実体３４の分散体を含む。
【０１２９】
少なくとも特定の初期液滴３２は、細胞９０を更に含む。
【０１３０】
インキュベーション領域７９は、連結領域７８の下流に位置する。インキュベーション領域は、細胞９０による標的要素３７の分泌を可能にするためのものである。或いは、細胞９０は、インキュベーション領域７９内で溶解され、標的要素３７が放出されるためのものである。
【０１３１】
或いは、インキュベーションは、デバイス２０の外部で実行される。
【０１３２】
第３の装置７０はまた、デバイス２０が、複数の分類領域９４、９６、及び液滴又は液滴の一部分を分類領域９４、９６に向けて選択的に誘導するための手段９８を更に含むという点でも異なる。
【０１３３】
分類領域９４、９６は、検出領域２６の下流に位置する。導管２４は、２つの出口導管１０２、１０４においてフォーク１００を備える。第１の分類領域９４は、第１の液滴群１０６を受け取るための第１の出口導管１０２を備える。第２の分類領域９６は、第２の液滴群１０８を受け取るための第２の出口導管１０４を備える。或いは、デバイス２０は、選別基準の数に応じて、より多くの分類領域９４、９６を備える。
【０１３４】
選択的に液滴を誘導するための手段９８は、例えば、磁力によって１個の液滴６を分類領域９４、９６へと誘導することができる。
【０１３５】
或いは、液滴６は電極によって誘導される。
【０１３６】
例えば、液滴は、誘電泳動によって、流れによる電気合体によって、又は弾性表面波（ＳＡＷ）によって、分類領域へと誘導される。
【０１３７】
次に、本発明による第３の装置７０による分析方法について説明する。
【０１３８】
前述の装置７０が提供される。磁性粒子１２及びシグナリング実体３４の懸濁液が調製され、第１の入口導管８０に注入される。
【０１３９】
細胞９０の懸濁液が調製され、第２の入口導管８２に注入される。
【０１４０】
キャリア流体８が提供され、キャリア流体入口導管９２に注入される。
【０１４１】
流体８６、８８は、循環アセンブリ２２によって動き始める。初期液滴３２は、連結領域７８において形成される。
【０１４２】
この方法は、区画化された細胞９０が、標的要素３７、例えば分析されるタンパク質が分泌されるインキュベーション工程を更に含む。
【０１４３】
或いは、この方法は、標的要素３７、例えば細胞質外で分析されるタンパク質の放出を可能にする細胞溶解工程を含む。
【０１４４】
これらの溶解又はインキュベーション工程は、デバイス２０のインキュベーション領域７９内で実行される。
【０１４５】
或いは、これらの工程は、デバイス２０の外部で実行される。
【０１４６】
凝集体１０の形成工程及び測定工程は、第１の装置１による分析方法と同様である。
【０１４７】
この方法は、測定工程の後に分析工程が続くという点で異なっている。分析工程は、所定の基準に従って液滴６が群１０６、１０８のいずれに属するかを決定し、測定工程の後に液滴６ごとに分類決定を行うことを可能にする。
【０１４８】
分類決定に従い、液滴６は、誘導手段９８により分類領域９４、９６のいずれかに誘導される。
【０１４９】
図７に示される例では、強い蛍光強度信号の大部分が凝集体１０の近傍に局在化した液滴１０６が、第１の分類領域９４に誘導される。第１の群１０６の液滴は、例えば図２における第３の液滴５６に対応する。
【０１５０】
これらの液滴１０６は、例えば目的のタンパク質を生成できる細胞９０を含有する。液滴１０６は任意に回収され、その内容物が他の技術により分析されるか、又は細胞９０が再び培養にかけられる。
【０１５１】
異なる信号、特に液滴１０８における実質的に均質な信号が測定された液滴１０８は、別の分類領域９６へと誘導される。第２の群の液滴１０８は、例えば、細胞９０を含有しない液滴、及び十分な量及び質でタンパク質を産生しない細胞９０を含有する液滴を含む。
【０１５２】
本発明による第４の装置１２０を図８に示す。この装置１２０は、抽出アセンブリ１２２を更に備えるという点で第１の装置１と異なる。
【０１５３】
抽出アセンブリ１２２は、液滴６を、２種の抽出液滴１２４、１２６、即ち主液滴１２４と副液滴１２６に分離することができ、副液滴１２６は凝集体１０を含む。
【０１５４】
有利には、粒子１２は磁性であり、抽出アセンブリ１２２は抽出を行うために磁力を印加することができる。
【０１５５】
更に、第４の装置１２０は、抽出アセンブリ１２２の下流に、本発明による第３の装置７０と同様の分類アセンブリ７２を備え、副液滴１２６を主液滴１２４から分離することを可能にしている。
【０１５６】
一代替例において、分類アセンブリ及び抽出アセンブリは同じものである。
【０１５７】
このような装置１２０は、細長い凝集体１０による選択的捕捉を実現する上で特に有用である。粒子１２によって捕捉される標的要素３７は、選択された液滴の回収後に溶離されるためのものである。
【０１５８】
本発明による第５の装置は、追加の注入デバイス及び第２の検出領域を備える点で、第１の装置と異なる。追加の注入デバイスは、検出後に、液滴に要素を添加することができる。
【０１５９】
追加の注入デバイスは、例えば、液滴を融合させるためのデバイス、又はピコ注射（ｐｉｃｏ−ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）のためのデバイスである。
【０１６０】
この第５の装置からの本発明による分析方法は、測定工程後の注入工程、及び注入工程後の測定工程を含む。
【０１６１】
例えば、シグナリング実体３４は蛍光性であり、追加の注入工程中に、非蛍光性の追加の実体が添加される。追加の実体は、その蛍光性を除き、シグナリング実体３４と同じ特性を有する。例えば、追加の実体は、標的要素３７に対して、シグナリング実体３４と同じ親和性を有する。第１の測定工程中に、蛍光性シグナリング実体３４の捕捉レベルが決定される。注入後、追加の実体及びシグナリング実体３４は、凝集体１０近傍での標的要素３７への結合について競合する。
【０１６２】
第２の測定は、特定の時間後に実行され、蛍光性シグナリング実体３４の放出率を決定し、したがって、シグナリング実体３４と標的要素３７との間の結合の解離定数Ｋｏｆｆを決定することを可能にする。
【０１６３】
液滴のサイズに比べて小さいサイズの粒子１２の分散体を使用することにより、液滴６中の粒子１２の均質分布が確保され、したがって各液滴６中に相当なサイズの凝集体１０が形成されることがほぼ確実になる。
【０１６４】
全体として、この方法は、液滴中の検体を定量化し、用量決定（ｄｏｓｉｎｇ）を可能にする。細長い凝集体１０の形成は、単一のビーズをカプセル化するＭａｚｕｔｉｓら（Ｎａｔ  ｐｒｏｔ  ２０１３）に記載の試験と比較して、より良好な信号対ノイズ比及びより大きな動的間隔を得ることを可能にする。実際に、シグナリング実体３４により生成される信号は、表面積が等しい球体の幅よりも小さい幅に集中する。したがって、図２に示されるピークの高さは、再局在化した同数のシグナリング実体３４では、単一のビーズの場合よりも高くなる。
【０１６５】
この方法は、多くの生物学的分析方法で使用することができる。
【０１６６】
本発明による方法は、多くの種類の検体、生体分子、ポリペプチド、タンパク質、代謝産物、核酸、細胞、細胞小器官、微小粒子及びナノ粒子、ポリマー、コロイド、病原体、食品化合物、環境試料に適用することができる。
【０１６７】
本発明による装置は、１つの技術要素（ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｂｒｉｃｋ）として、より複雑なデバイス、特に高流量スクリーニングデバイス、オンチップ実験具（ｏｎ−ｃｈｉｐ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、実験室用計器、ロボット又はその他のデバイス内の「ポイントオブケア（ｐｏｉｎｔ  ｏｆ  ｃａｒｅ）」デバイスに組み込むことができる。
【０１６８】
更に、本発明による方法は、診断、薬物の発見、標的の発見、薬物の鑑定を可能にする複雑な手順に組み込むことができる。
【０１６９】
更に、本発明によるマイクロ流体システム及び本発明による方法は、他の種類のマイクロ流体部品に組み合わせるか含めてもよく、最先端技術において公知となっている他のマイクロ流体機能と組み合わせるか含めてもよい。
【０１７０】
更に、使用される試料のサイズが小さいため、本発明は、細胞試験、特に単一細胞のスクリーニング、及びデジタル生物学での用途において特に注目される。
【０１７１】
デジタルとは、化学的又は生物学的対象物の単一コピーに対して生物学的操作が実行され、そのような生物学的対象物のセットに対して実行された操作との対照として、各単一コピーに対する操作の結果を独立させることができることを意味する。
【０１７２】
生物学的又は化学的対象物とは、任意の分子状、超分子結晶性（ｓｕｐｒａ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ）、コロイド状、細胞状、細胞下（ｓｕｂｃｅｌｌ）の対象物、例えば、限定されるものではないが、細胞、細胞小器官、ウイルス、変性天然ＤＮＡ（ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｎａｔｕｒａｌ  ＤＮＡ）又は人工ＤＮＡ、ＲＮＡ又はその他の核酸、タンパク質、糖タンパク質、強力なタンパク質（ｆｏｒｃｅｆｕｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、人工又は天然タンパク質、脂質、リン脂質、有機分子、有機金属分子、高分子、単離結晶、量子ドット又は量子点、ナノ粒子、小胞、マイクロカプセル及びその他の実体を意味する。
【０１７３】
本発明は、各種光学的方法、特に光学検出方法と組み合わせたとき、更に特に有用になりうる。
【０１７４】
本方法は、例えば、溶液中に存在する標的要素３７を決定すること、即ち、溶液中の標的要素３７の濃度を決定し、粒子１２上又は液滴６内に存在する別の種に対する標的要素３７の親和性特性を確立することを可能にする。
【０１７５】
本発明はまた、標的要素３７とシグナリング実体３４との間の解離定数Ｋｄの測定も可能にする。
【０１７６】
この場合、液滴６は、シグナリング実体３４とは異なる蛍光性を有する定量化実体を更に含む。
【０１７７】
より具体的には、要素Ａ（標的要素３７）と要素Ｂ（シグナリング実体３４）との間における対Ａ：Ｂの解離定数Ｋｄの定義は、
Ｋｄ＝［Ａｆｒｅｅ］［Ｂｆｒｅｅ］／［Ａ：Ｂ］
式中、
［Ａｆｒｅｅ］は、溶液中でＢに結合していないＡの濃度であり、
［Ｂｆｒｅｅ］は、溶液中でＡに結合していないＢの濃度であり、
［Ａ：Ｂ］は、溶液中の複合体Ａ：Ｂの濃度であり、ＡはＢに結合している。
種Ａの全濃度は、
［Ａｔｏｔａｌ］＝［Ａｆｒｅｅ］  ＋  ［Ａ：Ｂ］
である。
種Ｂの全濃度は、
［Ｂｔｏｔａｌ］＝［Ｂｆｒｅｅ］  ＋  ［Ａ：Ｂ］
である。
【０１７８】
液滴６内のシグナリング実体３４の濃度［Ｂｔｏｔａｌ］は、ユーザーによって選択され、既知である。
【０１７９】
濃度［Ａｔｏｔａｌ］は、例えば、Ａが、液滴６内にカプセル化された細胞９０により分泌される標的要素３７である場合、先験的に既知ではない場合がある。
【０１８０】
本発明は、シグナリング実体３４に対する、凝集体上に再局在化された複合体［Ａ：Ｂ］の濃度を測定すること可能にする。
【０１８１】
この測定により、別のシグナリング実体３４である定量化実体を介してＡの定量化が達成される、制御濃度条件下でのＡとＢとの間の解離定数Ｋｄを推定することができる。
【０１８２】
これを行うための単純なケースは、以下の条件：
−  捕捉要素３６が、標的要素３７の９０％超、凝集体１０上のＡ、有利には全体を捕捉するのに十分な量存在し、標的要素３７に対する十分な親和性を有し、
−  シグナリング実体３４の濃度が標的要素３７の濃度よりも大きく、
−  Ａを定量化するために使用される定量化実体の濃度が標的要素３７の濃度よりも大きく、定量化実体と標的要素３７との間の解離定数が標的要素３７の濃度よりも小さく、有利には１０倍超である、
という条件に当てはまる場合である。
【０１８３】
特定の条件、即ち各標的要素３７の存在は、捕捉要素３６−標的要素３７−定量化実体複合体の形成、及び／又は捕捉要素３６−標的要素３７−シグナリング実体３４により形成される複合体の形成をもたらす。
【０１８４】
捕捉要素３６−標的要素３７−シグナリング実体３４複合体の数は、以下の式：
【０１８５】
【数１】
2020183966.tif 000003
【０１８６】
即ち、
【０１８７】
【数２】
2020183966.tif 000004
【０１８８】
を通して、標的要素３７のシグナリング実体３４に対するＫｄに直接関連する。
【０１８９】
Ｂｔｏｔａｌが設定され、Ａｔｏｔａｌの変動性は無視することができ、［Ａ：Ｂ］／Ａｔｏｔａｌ比の単独の測定値からＫｄを推定することができるという条件が存在する。したがって、Ａｔｏｔａｌ＜Ｂｔｏｔａｌである場合、［Ａ：Ｂ］／Ａｔｏｔａｌは、
【０１９０】
【数３】
2020183966.tif 000005
【０１９１】
の優れた近似となる。
【０１９２】
図１０は、Ａｔｏｔａｌ／Ｂｔｏｔａｌ比の異なる値に対するｌｏｇ  Ｋｄの関数として、［Ａ：Ｂ］／Ａｔｏｔａｌ比のシミュレーションを表している。
【０１９３】
前述の特定のケースにおいて、Ａ：Ｂ複合体に対応するシグナリング実体３４の信号の、Ａｔｏｔａｌに対応する定量化実体の信号に対する比率により、［Ａ：Ｂ］／Ａｔｏｔａｌ比を評価することが可能であるため、［Ａ：Ｂ］／Ａｔｏｔａｌ比を介してＫｄを扱えることは、高流速測定の明白な利点を表している。
【０１９４】
この比率は、液滴に関して実時間で取得することができ、Ｋｄに従って液滴を選別する基準となる。
【０１９５】
この方法は、各種シグナリング実体３４に対する標的要素３７の特異性、又は各種シグナリング実体３４に対する捕捉要素３６によって設定される分子又は分子会合体の特異性を決定するために適用可能である。この場合、Ｓｏｕｔｈａｌｌのシグナリング実体３４として、例えば、異なる色のフルオロフォアにより標識された分子が、液滴６に注入される。例えば異なる波長の蛍光を取得することによって、各シグナリング実体３４に対して生成された信号を同時に記録することが可能である。したがって、どのシグナリング実体３４が凝集体１０上に局在化しているかを決定し、それらを定量化することが可能となる。
【０１９６】
例えば、捕捉要素３６は、細胞９０によって分泌された抗体３７を捕捉するプロテインＧであり、シグナリング実体３４は、異なる色のフルオロフォアでそれぞれ標識される、異なる動物種の同種抗原である。この例では、各シグナリング実体３４に対する信号の同時測定は、抗体である標的要素３７が、ある動物種に対して特異的である（単一色で観察されるピーク）か、特異的でない（複数の色で観察されるピーク）かを決定することを可能にする。
【０１９７】
別の例では、粒子１２は、相補的ヌクレオチド配列を捕捉できるヌクレオチド配列で覆われている。
【０１９８】
或いは、標的要素３７は、細胞を含まないがｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系を含む液滴６内で産生されるタンパク質である。
【０１９９】
この方法は、親和性分析及び標識生成物の定量化を行うのに有用である。例えば、標的要素がＧＦＰのような蛍光タンパク質を含む融合タンパク質である場合がある。
【０２００】
この方法は、目的の特性を有する液滴の選別、捕捉及び抽出を更に可能にする。
【０２０１】
一例において、この方法はサンドイッチの形成を含み、標的要素３７は、一方では粒子１２の捕捉要素３６に結合し、他方ではシグナリング実体３４に結合し、シグナリング実体３４は蛍光性である。
【０２０２】
一例において、捕捉要素３６は抗体である。
【０２０３】
一例において、シグナリング実体３４は抗体である。
【０２０４】
一例において、標的要素３７はタンパク質である。
【０２０５】
或いは、標的要素３７は抗体又は抗体断片である。
【０２０６】
特定の例において、標的要素３７は抗体であり、捕捉要素３６は、プロテインＧ、若しくはプロテインＡ又は抗体と結合する別のタンパク質、例えばプロテインＡ／Ｇ若しくはプロテインＬである。
【０２０７】
特定の例において、標的要素３７は抗体であり、捕捉要素３６は抗体である。
【０２０８】
一例において、標的要素３７は抗体であり、捕捉要素３６は抗体によって認識される抗原である。
【０２０９】
別の例において、標的要素３７は抗体であり、シグナリング実体３４は抗原である。
【０２１０】
別の例において、捕捉要素３６は互いに同一ではない複数の捕捉分子からなり、標的実体３７は互いに同一ではない複数の分子からなる。
【０２１１】
別の例では、分子的性質の異なるいくつかの標的要素３７の存在を検出するために、又は同じ標的要素３７上の異なる結合部位の存在を検出し、特徴付けるために、捕捉要素３６−標的要素３７対又は捕捉要素３６−標的要素３７−シグナリング実体３４トリプレット（ｔｒｉｐｌｅｔ）を、同時に分析してもよい。
【０２１２】
例えば、図２４における液滴に示されているように、液滴は、性質の異なる複数の標的要素３７ａ、３７ｂ、及びそれぞれ標的要素３７ａ、３７ｂのいずれかと複合体を形成することができる複数のシグナリング実体３４ａ、３４ｂを含む。凝集体１０の特定の粒子１２は、第１の標的要素３７ａの捕捉に適合した捕捉素子３６ａを含み、他の粒子は、第２の標的要素３７ｂの捕捉に適合した別の捕捉要素３６ｂを含む。
【０２１３】
一例において、この方法は、測定された親和性に従って、抗体を分泌する不死化細胞を選択することを可能にする。次いで、選別された細胞は再び培養にかけられる。
【０２１４】
別の例において、この方法は、抗体の遺伝子配列を検索する前に、測定された親和性に従って、抗体を分泌する非不死化細胞を選択することを可能にする。
【０２１５】
別の例において、この方法は、血液中に存在する異なる種類の細胞によって分泌されたサイトカインを定量化することを可能にする。
【０２１６】
特定の用途において、粒子１２の凝集は可逆的である。
【０２１７】
特定の場合において、標的要素３７の存在は、凝集を不可逆にし、凝集アセンブリ３０における形成時に凝集体１０を固化させる。したがって、凝集体１０は、標的要素３７を含有する液滴６中にのみ、安定的に先在する。標的要素３７を含有しない液滴では、凝集体１０が読み取り領域２６に入っていない限り、粒子１２凝集の可逆性により、凝集体１０は溶解する。選択された磁化及びフルイディクスの条件において、凝集体１０は、この前凝集（ｐｒｅ−ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）が存在する場合にのみ、自身を形成し配向させることが可能になる。前凝集は、シグナリング実体３４を介さない方法により、閾値要素（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｅｌｅｍｅｎｔ）３７を含有する液滴に、図２に従うピークの取得を限定する。
【０２１８】
この方法は、産生された抗体の親和性の測定を実施することにより、抗体産生細胞をスクリーニングすることに特に適用可能である。例えば、細胞が、抗体を産生できる細胞Ｂである場合、少なくとも１種の抗原に対するこの抗体の親和度は、本発明の方法によって決定される。また、液滴は、決定された親和度に従って、本発明の方法により選別される。
【０２１９】
別の用途において、この方法は、白血球の異種集団による１種又は複数のサイトカインの分泌を分析することを可能にする。例えば、細胞が１種又は複数の種類のサイトカインを産生し得る細胞である場合、サイトカインは、本発明の方法によって定量化される。分析の結果は、潜在的な診断上の価値を有する、細胞の状態に関する一片の情報である。
【０２２０】
この方法の適用例を以下に説明する。
【０２２１】
以下の実施例の手順は、
−  粒子１２、シグナリング実体３４及び標的要素又は有利には液滴中で標的要素を生成しうる系を含有する、複数の水溶液の調製、液滴生成チップの入口での水溶液の注入、
−  試験の全試薬を含む液滴の生成、
−  液滴を含有する溶液のインキュベーション、
−  本発明によるデバイス（２種類のデバイスが以下の実施例１及び２に記載されている）への液滴の注入、
−  試験の結果の測定、
−  任意に測定値に応じた液滴の選別
を含む。
【０２２２】
［実施例１］
タイプ１の液滴生成及び液滴測定用デバイス
区画化とも呼ばれる、液滴の生成は、試薬溶液及び試料溶液をチップ上で混合した後に行う。
【０２２３】
試薬及び試料の変質を避けるために、区画化まで溶液を氷中に保存する。
【０２２４】
区画化を開始する直前に、鉱油（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社、＃３３０７６０）を満たした１ｍＬのＨａｍｉｌｔｏｎ社製シリンジに接続したタンクへと、試薬溶液を吸引する。
【０２２５】
スクリーニング対象試料を、区画化の直前に希釈標準溶液（ｗｏｒｋ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）と混合し、次に、予めフッ素化オイル（３Ｍ社、ＮＯＶＥＣ  ＨＦＥ−７５００）を満たしたガラスバイアルに移し、バイアルを氷上で４℃に維持する。
【０２２６】
有利にはＰＴＦＥ製の内径０．３ｍｍキャピラリー（Ｆｉｓｃｈｅｒ社販売、＃１１９１９４４５）により、バイアル及び試薬溶液のタンクを液滴形成用デバイスに接続することを可能にする。
【０２２７】
これらの溶液の両方を、液滴形成用チップに注入し、両溶液のそれぞれの等容積を含む液滴の生成を可能にする。
【０２２８】
液滴の容積は、フッ素化オイルの流量に基づいてユーザーが選択する。有利には、液滴の容積は３３ピコリットルである。フッ素化オイルはキャリア流体８となる。キャリア流体８は液滴を含むエマルションの連続相を形成する。
【０２２９】
試験試薬の溶液とスクリーニング対象試験試料の溶液とを、同じ流速で、有利には各溶液について２００マイクロリットル／時間で、チップに注入する。流速は、標準シリンジポンプシステム、例えばＣｅｔｏｎｉ社製ｎｅＭＥＳＹＳポンプによって、又は圧力制御ポンプ、例えばＦｌｕｉｇｅｎｔ社によって市販されているシステムによって、向上する。
【０２３０】
液滴は、図１１及び図１２に示される流体力学的集束連結部において生成される。ここで、外相は、２質量％／容積の界面活性剤（例えば、２つのペルフルオロポリエーテル（ＰＦＰＥ）尾部（分子量約６，０００ｇ／ｍｏｌ）及び１つのＰＥＧ頭部（約６００ｇ／ｍｏｌ）を含むトリブロックコポリマー（ｔｈｒｅｅ−ｂｌｏｃｋ  ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ））を添加した、フッ素化オイル（３Ｍ社、ＮＯＶＥＣ  ＨＦＥ−７５００）である。
【０２３１】
図１１及び図１２は、他の試薬と混合された磁性ビーズを含有する流れと、右側に位置する流体力学的集束連結部における液滴形成前の試料を含有する流れとを混合することを可能にする流れ集束デバイス（ｆｌｏｗ  ｆｏｃｕｓｉｎｇ  ｄｅｖｉｃｅ）を表している。図１１において、磁性粒子の直径は５００ｎｍであり、図１２において、磁性粒子の直径は２００ｎｍである。
【０２３２】
第２の工程は収集工程である。有利にはリング形磁石（Ａｍａｚｉｎｇ  ｍａｇｎｅｔｓ社製Ｈ２５０Ｈ−ＤＭ）により発生させた磁場の下で４℃に維持したバイアルにより、液滴の収集を可能にする。短いキャピラリーにより、バイアルをチップに接続することを可能にする。理想的には、出力キャピラリーは２０ｃｍ未満であり、有利には１０ｃｍである。
【０２３３】
有利には３７℃にて２０〜９０分間、磁場下で、液滴がインキュベートされるように設定するが、時間及びインキュベーション温度は、実施される分析、並びに産生実体９０の種類及び調査される標的要素３７の種類に依存する。
【０２３４】
インキュベーションの後に、エマルションを含有するバイアルを移し、常に磁場下で４℃に維持する。
【０２３５】
第１のタイプのデバイスは、図１に記載された本発明によるデバイスである。
【０２３６】
液滴を含有するバイアルは再注入のためにチップに接続され、バイアルは、一方ではチップに接続され、他方では、圧力システム、加圧ポンプ又はシリンジ及びそのポンプに接続されて、循環アセンブリ２２を形成する。
【０２３７】
離隔アセンブリ３１は、チップに接続された２つのオイル入口を含む。これらの入口は、図１３に示すように、エマルションの液滴を離隔することを可能にするオイル、有利にはフッ素化オイルを注入するためのものである。
【０２３８】
離隔オイルの流速は、有利にはそれぞれ３００マイクロリットル／時間に設定し、循環アセンブリの流速は、有利には５０マイクロリットル／時間に設定し、流速及び液滴の再注入周波数を調整して２５０〜１，０００Ｈｚの間に含まれる周波数が得られるようにする。
【０２３９】
一対の永久磁石３８、有利にはＫ＆Ｊ  Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ社提供の＃ＢＣ  １４−Ｎ５２を、主チャネル２４周囲のチップの両側に配置した。これらの磁石３８は、液滴再注入の際にビーズ凝集体を発生させ配向させるためのものである。
【０２４０】
液滴の分析及び選別のために、設備、例えばレーザー又は光電子増倍管を制御するためのソフトウェアを作製した。選別システムは、実時間で信号の分析を実施するためにＦＰＧＡカードを必要とする。
【０２４１】
離隔アセンブリ通過後、滴下１個ごとに測定を行い、図１４に示された読み取り領域の後で、これらの液滴を選別して所望の出口に向けることができる。
【０２４２】
選別及び回収が所望される場合、選別液滴及び非選別エマルションを氷上に収集し、標準的手順により液滴の内容物を回収する。
【０２４３】
［実施例２］
タイプ２の液滴測定用デバイス
第２タイプの測定デバイスは、二次元平面内で生成された液滴を貯蔵するためのチャンバーである。この例には、そのようなチャンバーを作製するための２つの可能な選択肢がある。
【０２４４】
第１の選択肢は、ＰＤＭＳにおける従来の微細製造によって作製されたチャンバーであり、図３〜図６に示されるような、チャンバーの崩壊を避けるために規則的に配置されたピラーを有利には含む。
【０２４５】
第２の選択肢は、図１４及び図１６に示されるような、発明ＰＣＴ／ＦＲ２００９／０５１３９６によるガラスチャンバーである。有利には、このアプローチは、液滴を変形させることなく長期間（１時間超）にわたって液滴のインキュベーションを行うことを可能性にする。したがって、液滴形成後、そのようなチャンバー内に液滴を直接収集してもよい。
【０２４６】
図１５及び図１６は、本発明による二次元の読み出しデバイスの例を示しており、ここでは、ガラスチャンバー内で、チャンバーの一方の側に位置する永久磁石によって磁場が処理される。
【０２４７】
以下の実施例に関する一般事項
以下の実施例では、液滴の調製は、
−  以下の実施例において、粒子１２、シグナリング実体３４を含有する「試薬溶液」、及び標的要素を含有する「スクリーニング対象試料溶液」と称される、２種の水溶液を調製すること、
−  液滴を生成するためにチップ入口に両方の水溶液を注入すること、
−  両方の溶液のそれぞれの等容積を含む液滴を生成すること、
−  タイプ１のデバイス内で液滴を測定すること、
−  任意に液滴を選別すること（実施例４）
を含む。
【０２４８】
両方の水溶液の調製について一般的に説明し、この標準的手順との相違点について必要に応じて実施例の中で言及する。
【０２４９】
ａ）試薬溶液の調製
この溶液に含まれる要素は、液滴生成前における試薬の凝集を避けるために、有利には互いに不活性である。
【０２５０】
この第１の水溶液は、
−  ここでは捕捉要素３６、ここではプロテインＧにより官能化されたコロイド状磁性粒子である粒子１２、及び
−  ここでは蛍光で標識された抗原、例えばフルオロフォアＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８で標識された抗原であるシグナリング実体３４、
−  液滴６の検出を可能性にする着色剤、例えばスルホローダミンＢ、
−  ここでは蛍光性である抗体、例えばフルオロフォアＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ６４７で標識された抗マウスモノクローナル抗体の断片を定量化するための実体、
−  希釈標準溶液
を含有する。
【０２５１】
各試薬の濃度については、各実施例に関して詳述する。
【０２５２】
これらの試薬は、希釈標準溶液と称する溶液で希釈する。希釈標準溶液は、例えば、
−  Ｐｅｒｃｏｌｌ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社により提供）３０ｖ／ｖ％、
−  ＮａＣｌ  ５０ｍＭ、
−  ｐＨ７．４のＨＥＰＥＳ緩衝液２５ｍＭ、
−  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社により提供されるＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８  ０．１ｖ／ｖ％、
−  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製Ｓｕｐｅｒ  Ｌｏｗ  ＩｇＧ血清５ｖ／ｖ％
を含む。
【０２５３】
この容量の希釈標準溶液に対し、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社により提供されるＧｌｕｔａＭＡＸ（登録商標）を補充したＲＰＭＩ−１６４０を最後に添加し、最終容量を得る。
【０２５４】
使用前に磁性コロイド状粒子１２を処理する。粒子１２は、貯蔵溶液中のＣｈｅｍｉｃｅｌｌ社により提供される粒子（ＳｃｒｅｅｎＭＡＧ）又はＡｄｅｍｔｅｃｈ社により提供される粒子（Ｂｉｏ−Ａｄｅｍｂｅａｄｓ）である。これらの粒子を、貯蔵溶液を抑制するために磁性担体（ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｓｕｐｐｏｒｔ）上に保持するが、１０ｗ／ｗ％、有利には粒子の初期容積の１０倍にて、過量のＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）中に懸濁させ、室温で３０分間インキュベートする。
【０２５５】
この処理の後、磁性コロイド状粒子１２をＰＢＳで２回洗浄し、希釈標準溶液中に懸濁させる。
【０２５６】
有利には、希釈標準溶液中に懸濁した粒子１２は、試験試薬を添加する前に１０分間超音波処理に供する。
【０２５７】
蛍光試薬を使用前に処理する。蛍光試薬は、例えば、シグナリング要素３４、液滴の検出着色剤及び定量化試薬である。少なくとも１２，０００Ｇ、４℃にて５分間、蛍光試薬を遠心分離した後、試薬の凝集体の痕跡を抑制する。
【０２５８】
ｂ）スクリーニング対象試料溶液の調製
スクリーニング対象試料溶液は、
−  捕捉要素３６によって捕捉可能な標的要素３７、
−  又はインキュベーション段階において液滴中でこの標的要素３７を合成できる産生実体９０（この系は、例えば、細胞、又はＤＮＡ若しくはｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現系であってもよい。この場合、標的要素３７は、スクリーニング対象試料溶液中に予め存在してはいない。）
−  希釈標準溶液
を含む。
【０２５９】
使用される細胞の濃度は、所望される液滴の大きさに依存する。有利には、液滴１個当たりの細胞の濃度は、液滴１個当たり細胞０．３個である。液滴３３ピコリットルを含むエマルションは、１ミリリットル当たり３０×１０６個超の液滴を含有する。３３ピコリットルの液滴の場合、液滴１個当たり０．３個の細胞を有するためには、概算して、スクリーニング対象試料溶液中で１ミリリットル当たり１８×１０６個の細胞という濃度（液滴に対して２倍の濃度）が必要となる。
【０２６０】
両方の水溶液は５０／５０の比で１個の液滴中に混合されるため、スクリーニング試料溶液中の細胞濃度は最終濃度の２倍になることに留意すべきである。
【０２６１】
細胞調製手順は、細胞の種類及び実験の目的に依存する。
【０２６２】
［実施例３］
抗原に対するモノクローナル抗体の親和度の定量化及び測定。
この実施例では、標的要素３７は、スクリーニング対象溶液に既に含有されている抗体であり、この実施例は細胞には当てはまらない。
【０２６３】
この実施例の目的は、複数の色を用いた結合試験の可能性を実証することである。別の目的は、別の信号により再局在化信号を正規化する可能性を実証することである。これにより、再局在化抗体（定量化実体）に対する軽鎖結合のためのタンパク質の信号による正規化を可能にすることで、抗原（シグナリング実体）の局在化信号からＫｄを評価することが可能になる。
【０２６４】
この実験において、液滴の容量は３３ピコリットルである。
【０２６５】
スクリーニング対象試料溶液は、３０ｖ／ｖ％のＰｅｒｃｏｌｌ、０．１ｖ／ｖ％のＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８ＨＥＰＥＳ  １８ｍＭを補充した２ｍＭ  ＧｌｕｔａＭＡＸ添加ＲＰＭＩ−１６４０中に希釈した、異なる濃度の抗ｈＴＮＦαモノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社により提供されるＴ６８１７）を含有する。
【０２６６】
スクリーニング対象試料溶液中の抗ｈＴＮＦαモノクローナル抗体の濃度は、０ｎＭ、１０ｎＭ、２５ｎＭ又は５０ｎＭである。
【０２６７】
試薬溶液は以下の試薬：
−  磁性粒子８．３３ｖ／ｖ％（Ａｄｅｍｔｅｃｈ社＃０４３３）、
−  Ｆａｂ−ＤＬ６５０抗マウスＦａｂ’２（定量化実体）２００ｎＭ、
−  ｈＴＮＦα−ＡＦ４８８（シグナリング実体）１００ｎＭ、
−  スルホローダミンＢ（液滴標識用）１μｍ
を含有する。
【０２６８】
抗体Ｆａｂ−ＤＬ６５０断片を、ＤｙＬｉｇｈｔ−６５０（Ａｂｃａｍ社により市販される、ａｂ９８７６０）と接合したヤギＦ（ａｂ’）２抗マウスＩｇＧ（Ｆａｂ’）２から調製し、パパインで分解し、プロテインＧのカラムで精製する。
【０２６９】
この溶液に対し、３０ｖ／ｖ％のＰｅｒｃｏｌｌ、０．１ｖ／ｖ％のＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８及びＨＥＰＥＳ  １８ｍＭを補充したＲＰＭＩ−１６４０及び２ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸを最後に添加した。
【０２７０】
この溶液により、抗原−ＡＦ４８８  ５０ｎＭ、Ｆａｂ−ＤＬ６５０  １００ｎＭ、及び抗原に対するモノクローナル抗体それぞれ０ｎＭ、５ｎＭ、１２．５ｎＭ又は２５ｎＭを含有する、４つの異なるエマルションを得ることが可能になる。
【０２７１】
次いで、タイプ１のデバイスにより液滴を分析する。
【０２７２】
この実験により、図１７に示されるように、二次試薬の２つの蛍光読取り値を用いて液滴中の柱における磁性粒子に対する結合試験を実施することの可能性を示すことが可能になる。更に、このアプローチは、抗原の結合信号と抗原捕捉に関与する抗体の量とを相関させることによって、結合親和性を特徴づけることを可能にする。実際に、抗体の濃度とは独立のパラメータを分析から抽出してもよい。
【０２７３】
図１７は、２つの色により液滴の軌跡（ｔｒａｉｌ）を表した実時間蛍光測定値を示し、一方がシグナリング実体３４（複合体ＡＢ、図１７の薄い灰色）に対応し、一方が定量化実体（化合物Ａ、濃い灰色）に対応し、Ａの量を０ｎＭから２５ｎＭに増加させた場合を示している。図１８は、この実験に対応する二次元グラフであり、ここで、各点は、横座標に定量化実体の色についての液滴の蛍光極大値、縦座標にシグナリング実体３４についての蛍光極大値を示している。図１９は、同じ液滴のセットについて二次元グラフを表し、ここで、各点は、横座標に定量化実体の色についての積分値、縦座標にシグナリング実体３４についての積分値を示している。
【０２７４】
「極大」信号間の関係は、（Ｒ２＝０．７９の線形回帰によって示唆される）データ点の分散にもかかわらず、とりわけ液滴全体にわたる凝集体の形状及び位置の変動により、全体として線形となることがわかる。「積分」信号間の関係は、より良好なＲ２（Ｒ２＝０．９０）を有する線形回帰によって特徴づけられ、点の分散ははるかに小さく、上述のようにＡＢ／Ａ比からＫｄを推定することを可能にすることがわかる。
【０２７５】
［実施例４］
ハイブリドーマが分泌する抗体の親和度に従った、単一細胞の尺度におけるハイブリドーマの選別。
この実験の目的は、実施例３と同様の試薬及びアプローチを使用することにより、分泌されるモノクローナル抗体の結合親和度に従う抗体産生細胞のスクリーニングを実証することである。特に、２種類のハイブリドーマ：抗ＴＮＦアルファ（２５Ｈ１２株）抗体を分泌するハイブリドーマと抗ｃ−Ｍｙｃ抗体（９Ｅ１０株）とを区別し選別することが可能であることがわかっている。
【０２７６】
この実施例では、親和度を推定するだけでなく、更にその親和度に従って細胞を選別する。
【０２７７】
この実験において、液滴の容積は３３ピコリットルである。
【０２７８】
スクリーニング対象試料溶液は、実施例１に記載の希釈標準溶液中に懸濁された、１３．５×１０６個のハイブリドーマ９Ｅ１０細胞及び４．５×１０６個のハイブリドーマ２５Ｈ１２細胞を含有する。
【０２７９】
試薬溶液は、希釈標準溶液中に懸濁した以下の試薬：
−  磁性粒子（Ａｄｅｍｔｅｃｈ社＃０４３３）８．３３ｖ／ｖ％、
−  抗体−ＤＬ６５０抗マウスＦａｂ’２断片（定量化実体）１００ｎＭ、
−  ｈＴＮＦα−ＡＦ４８８（シグナリング実体）１００ｎＭ、
−  スルホローダミンＢ  ２μｍ
を含有する。
【０２８０】
これにより、５０ｎＭのｈＴＮＦα−ＡＦ４８８、５０ｎＭのＦａｂ−ＤＬ６５０、及び２５Ｈ１２ハイブリドーマのＨＴＮＦαに対して又は９Ｅ１０ハイブリドーマのｃ−Ｍｙｃに対して抗体を分泌するハイブリドーマ単一細胞を含むエマルションを得る。２５Ｈ１２細胞は細胞の２５％を占め、９Ｅ１０細胞は細胞の７５％を占める。
【０２８１】
抗原を緑、定量化実体を赤として、異なる蛍光チャネルについて、蛍光を測定する。この実施例において関係する信号は、蛍光極大値である。有意な緑色及び赤色の蛍光信号を示す液滴を選別し、収集する。
【０２８２】
Ｍａｚｕｔｉｓら（Ｎａｔ  ｐｒｏｔ  ２０１３）に記載されるように、選別し収集した液滴を破壊し、細胞を回収する。
【０２８３】
次いで、選別液滴から又は非選別エマルションから抽出された細胞の溶液に対して実時間ＰＣＲを実行し、２種類の制限酵素を使用してＰＣＲ産物を分解する。ＢａｍＨＩ酵素は、９Ｅ１０細胞由来のＤＮＡｃ上に制限部位を有し、ＫｐｎＩ酵素は、２５Ｈ１２由来のＤＮＡｃ上に制限部位を有する。分解産物を電気泳動によって分析する。図２０及び図２１を参照すると、本方法は、デバイスによるスクリーニング後に２５Ｈ１２細胞の濃縮を可能にすることがわかる。
【０２８４】
したがって、本発明は、シグナリング実体を認識する抗体を分泌する単一細胞を高流速で特異的に選択することを可能にする。
【０２８５】
図２０及び図２１は、本発明によるハイブリドーマの選別を示している。図２０は、二次元のグラフを表し、ここで、各点は、横座標にシグナリング実体の色についての液滴の蛍光極大値、縦座標に定量化実体についての蛍光極大値を示している。黒い枠は、選別を実行するために選択された値の範囲を示す。
【０２８６】
図２１は、実時間ＰＣＲによる分析及びＢａｍＨ１による酵素分解（左側の４列の組）又はＫｐｎ１（右側の４列の組）による酵素分解を示したものであり、純粋なハイブリドーマ２５Ｈ１２（抗ＴＮＦアルファ）及び９Ｅ１０（抗ｃＭｙｃ）のＤＮＡから（各組の最初の２列）、２５／７５混合物において（各組の３番目の列）、並びに最後にＴＮＦアルファを認識するためのバイオテストを用いて、本発明によりこの混合物を濃縮した後（各組の４番目の列）である。選別後の２５Ｈ１２細胞において約２０倍の濃縮が存在する。
【０２８７】
［実施例５］
単一細胞の尺度において分泌されたサイトカインの定量化。
この実施例の目的は、サンドイッチ免疫学的試験の包括的アプローチを用いて、単一細胞の尺度において分泌されたサイトカインを検出及び定量する可能性を実証することである。この実施例では、捕捉要素３６はストレプトアビジンに結合したビオチン化抗体であり、シグナリング実体３４は蛍光検出抗体である。
【０２８８】
粒子をストレプトアビジンで官能化し、捕捉抗体をビオチン化する。捕捉抗体を粒子上にカップリングさせるために別の方法を使用することも可能である。
【０２８９】
カップリング方法は共有結合又は非共有結合である。重要な基準は、シグナリング実体が粒子の表面に直接捕捉されないことである。
【０２９０】
ここでは、本発明により、及びタイプ１の測定デバイスを用いて、単一細胞の尺度において、炎症又は感染の多くの場合におけるバイオマーカーサイトカインであるガンマ−インターフェロン（ＩＦＮγ）の分泌を定量化するための方法を示す。このような生物学的アッセイは、機能的免疫学的試験の範囲内で、患者の免疫系の操作を試験するために使用されることがある。そのような試験では、免疫細胞が刺激され、そのサイトカイン分泌が測定される。
【０２９１】
この実施例では、２５〜４０ｐＬの容量で、液的中の組換えＩＦＮγをアッセイする可能性を実証した。
【０２９２】
ただし、このアッセイは、個々にカプセル化された細胞に使用するという目的を有しており、これを行うための一般的手順を以下で説明する。
【０２９３】
各液滴は、免疫サンドイッチ系に必要な全ての要素を含有し、サンドイッチは、例えば、ストレプトアビジンで覆われた磁性蛍光ビーズ、ビオチン化抗体及び蛍光抗体からなる。両方の種類の抗体が、ＩＦＮγの２つの異なるエピトープに向けられる。
【０２９４】
希釈標準溶液は、ある培養培地及び細胞活性体（ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ）（例えば、マイトジェン、抗原）を含有する。
【０２９５】
細胞及び免疫試験サンドイッチ系を液滴内にカプセル化した後に、エマルションをインキュベートする。磁場の作用下において、液滴内で粒子を配向させ、柱を形成する。ストレプトアビジン−ビオチン系による捕捉抗体の非共有結合の場合、捕捉抗体上に位置する複数のビオチンを介してビーズを架橋することによって、柱へのビーズの凝集を不可逆にする。
【０２９６】
インキュベーションにより分泌を可能にし、任意に分子同士の結合を可能にする。インキュベーション後、本発明によるタイプ１のデバイスにより液滴を分析する。
【０２９７】
細胞を含む液滴は、活性化信号に応答せず、ガンマインターフェロンを一切分泌せず、液滴全体内に蛍光抗体を含む。ガンマインターフェロンを分泌する液滴は、ビーズのストレプトアビジン表面上に再局在化したビオチン化捕捉抗体−ＩＦＮγ−蛍光検出抗体サンドイッチを有する。したがって、これらの液滴内で、凝集体における再局在化蛍光を測定する。
【０２９８】
ガンマインターフェロンがより多く分泌されるほど、粒子ライン上の蛍光はより多くなり、蛍光ピーク及び／又は蛍光信号の積分値はより大きくなる。したがって、これにより、刺激された細胞によって分泌されたガンマインターフェロンの定量化が可能になる。
【０２９９】
この実施例では、以下の試薬を使用することにより、本発明によるガンマインターフェロンの検出及び定量化のための試験を実施することが可能であることを示した。
【０３００】
試薬溶液：
−  ビオチン化捕捉抗体（Ｍａｂｔｅｃｈ社７−Ｂ６−１）２００ｎＭ
−  フィコエリトリン（ＰＥ）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社４５−１５）で標識した検出抗体（シグナリング実体）２００ｎＭ
−  希釈標準溶液：Ｐｅｒｃｏｌｌ（Ｓｉｇｍａ社）３０％／Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８（ＬｉｆｅＴｅｃｈ社）１％／ＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ社）６９％。
【０３０１】
スクリーニング対象溶液：
−  組換えＩＦＮγ１Ｂ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社）０又は２０又は２００ｎＭ
−  磁性ビーズｓｃｒｅｅｎＭＡＧ／Ｒストレプトアビジン０．５μｍ（Ｃｈｅｍｉｃｅｌｌ社）（エマルション１２０μｌで２０μｌ）。
【０３０２】
実施例１及び３のいずれかと同様のデバイスを使用して、流れに作用させることにより、３種のスクリーニング対象溶液から液滴を生成し、ＩＦＮγ濃度ごとに異なるサイズが得られるようにする（ただし、所望の最終濃度を得るために、水溶液の２つの注入流を常に等しく保つ）。液滴は、０ｎＭのＩＦＮγでは約２５ｐＬ、最終１０ｎＭでは３１ｐＬ、及び最終１００ｎＭでは３８ｐＬである。オレンジ色の検出抗体の再局在化を測定するために、液滴のこれら３つの集団を混合し、インキュベートし、分析する。この手順は実施例３のものと同一である。２個の蛍光チャネル：検出抗体（ＰＭＴ３）のオレンジ色、ビーズ（ＰＭＴ４）の赤色について蛍光を測定する。この実施例において考慮する信号は、蛍光極大値である。
【０３０３】
磁性ビーズのラインの形成又は配向が不十分な場合に対応する、ＰＭＴ４（ビーズ）上の値が低い（ＰＭＴ４＜０．３４）液滴は分析から除外した。
【０３０４】
残りの液滴の分析は、液滴の３つの集団をサイズ及び検出抗体信号（ＰＭＴ３）により区別することが可能であることを示しており、このことは、図２２及び図２３に示すように、液滴中のＩＦＮγを定量化する可能性を実証している。
【０３０５】
分析は、ＰＭＴ３及びＰＭＴ４の信号間に直線関係があることも示しており、このことは、磁性ビーズ当たりの検出抗体の量が一定であること、及びシグナリング実体信号（ＰＭＴ３）の変動は凝集体の形状の変動に直接相関することを示唆している。
【０３０６】
図２２及び図２３は、本発明によるマイクロ流体液滴中のサイトカイン（ガンマインターフェロン、ＩＦＮγ）の検出及び定量化を示す。図２２では、０、１０又は１００ｎＭのＩＦＮγを含有する液滴の３つの集団が、そのサイズ（幅）に対して、検出抗体に対応するオレンジ色の極大蛍光（ＰＭＴ３）に従って表されている。液滴の３つの集団は、ビーズに対応する赤色の極大蛍光（ＰＭＴ４）に対して、オレンジ色の極大蛍光（ＰＭＴ３）に従って、図２３に示されている。
【０３０７】
［実施例６］
一次細胞が分泌する抗体の結合活性に従った、単一細胞の尺度における、一次細胞、より具体的にはＢリンパ球（形質細胞）の選別。
この実験の目的は、実施例３と同様の試薬及びアプローチを使用することにより、分泌されるモノクローナル抗体の結合活性に従う、抗体を産生する一次細胞のスクリーニングを実証することである。特に、Ｂリンパ球が分泌するモノクローナル抗体の結合活性に従って、Ｂリンパ球を区別し選別することが可能であることを示す。
【０３０８】
Ｂリンパ球をマウスの脾臓から予め抽出し、標準手順（Ｐａｎ  Ｂ  ｋｉｔ  ＩＩ＃１３０−１０４−４４３、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社）に従って精製する。この実施例において、捕捉要素３６は、ビオチン化抗原、より具体的には「ＴＴビオチン」であり、例えばＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社から提供される標準キットの標識手順により、予めビオチンで官能化された、破傷風トキソイドタンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｔａｎｕｓ  Ｔｏｘｏｉｄ）である。この実施例では、標的抗原に対する抗体の結合活性のみが観察されるが、加えて、それらの抗体の結合活性に従って細胞が選別される。
【０３０９】
この実験において、液滴の容積は４０ピコリットルである。
【０３１０】
この実験において、希釈標準溶液は、
−  Ｓｕｐｅｒ  Ｌｏｗ  ＩｇＧ血清（＃ＳＨ３０８９８．０３、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）５ｖ／ｖ％、
−  ｐＨ７．４のＨＥＰＥＳ緩衝液２５ｍＭ、
−  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社により提供されるＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８  ０．１ｖ／ｖ％、
−  抗生物質−抗真菌剤（＃１５２４０、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）１ｖ／ｖ％
を含む。
【０３１１】
この容量の希釈標準溶液に対し、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社により提供されるＤＭＥＭ−Ｆ１２を最後に添加し、最終容量を得る。
【０３１２】
生成後、分析及びスクリーニングの前に、２種のエマルションを生成し、共通化した。大部分のエマルション（約１０百万個の液滴）は、スクリーニング対象細胞及び検出試薬からなる。約１００万個の液滴を含む、いわゆる陰性対照エマルションである第２のエマルションは、検出試薬のみからなる。２種のエマルションは、２種の異なる濃度のオレンジ色フルオロフォア、スルホローダミンＢの使用によって区別可能である。
【０３１３】
スクリーニング対象試料溶液は、実施例１に記載されているように、希釈標準溶液中に懸濁された６．６×１０６個の精製一次細胞を含有する。
【０３１４】
試薬溶液は、希釈標準溶液中に懸濁した以下の試薬：
−  ストレプトアビジン磁性粒子（Ａｄｅｍｔｅｃｈ社＃０４３３）３３．３３ｖ／ｖ％、
−  ウサギＦａｂ’２抗ＦＣマウス（ａｎｔｉ−ＦＣｍｏｕｓｅ）ＡＦ６４７、ＪａｃｋｓｏｎＩＲ社＃３１５−６０６−１４６（定量化実体）２００ｎＭ、
−  ＴＴビオチン（捕捉要素３６）１００ｎＭ、
−  スルホローダミンＢ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社＃Ｓ１４０２）０．８又は１．６又は２．４μＭ
を含有する。
【０３１５】
これにより、５０ｎＭのビオチン化抗原（ＴＴビオチン）、１００ｎＭのウサギＦａｂ’２抗ＦｃマウスＡＦ６４７、及び抗原（破傷風トキソイド）に向けられる抗体を分泌する又は分泌しない独自の一次細胞を含むエマルションを得る。
【０３１６】
定量化実体について赤色の蛍光を測定した。この実施例において考慮する信号は、蛍光極大値である。強い赤色蛍光信号を有し、適当なサイズを有し、一次細胞のエマルション（スルホローダミンＢの弱いオレンジ色蛍光）に由来する液滴を選別し、収集し、破壊し、次いで実施例４のように細胞を回収する。
【０３１７】
図２５は、定量化実体のチャネル上で測定された蛍光信号についてカウントされた液滴数のヒストグラムを表す。横座標は、定量化実体の色の蛍光極大値を表し、縦座標は、この蛍光値において測定された液滴数に対する底１０の対数を表す。スクリーニング対象一次細胞のエマルションについて得られた値を黒い実線でプロットしている。陰性対照エマルションについて得られた値を灰色の点線でプロットしている。黒丸の点の垂直線は、それを超える液滴が選別で選択される閾値を示す。
【０３１８】
次に、選別液滴又は非選別細胞から抽出された細胞の溶液に対して、即ち、精製（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社製キット）の後、マイクロ流体スクリーニングの前に、ＥＬＩＳｐｏｔを実施した。ＥＬＩＳｐｏｔによって分析された細胞を、抗体の分泌及び抗ＴＴ抗体の分泌について試験する。
【０３１９】
選別された一次細胞及び精製されているが選別されていない一次細胞のＥＬＩＳｐｏｔによる分析を実施する。マウスＩｇＧ  ＥＬＩＳｐｏｔＢＡＳＩＣキット（Ｍａｂｔｅｃｈ社＃３８２５−２Ａ）に記載の手順を使用して、２種の標識について分析を実施した。第１の抗体、いわゆるＩｇＧについては、「トータルＩｇ  ＥＬＩＳｐｏｔ（Ｔｏｔａｌ  Ｉｇ  ＥＬＩＳｐｏｔ）」手順を使用し、抗体分泌細胞の数を検出することを可能にする。第２の抗体、いわゆるＴＴについては、「抗原特異的Ｉｇ  ＥＬＩＳｐｏｔ、プロトコールＩＩ」手順を使用し、抗原ＴＴに対する結合活性を有する抗体分泌細胞の数を検出することを可能にする。
【０３２０】
下記の式に従って濃縮係数ηを計算した。式中、Ｎ＋，０は選別前の陽性細胞の数、Ｎ＋，１は選別後の陽性細胞の数、Ｎ−，０及びＮ−，１はそれぞれ選別前及び選別後の陰性細胞の値である。
【０３２１】
【数４】
2020183966.tif 000006
【０３２２】
実験では、５，０００個の非選別細胞について、ＴＴに対する５１個の陽性細胞及び４，９４９個の陰性細胞が得られ、１，０００個の選別細胞について、ＴＴに対する１３２個の陽性細胞及び８６８個の陰性細胞が得られる。
【０３２３】
本実験は、選別後にＴＴに対する結合活性を有する細胞の分泌において、約１５倍という濃縮係数ηを示し、これらの細胞は、検出された抗体分泌細胞の９３％に相当する。
【０３２４】
ＥＬＩＳｐｏｔ試験は、本方法により、デバイスを用いたスクリーニングの前に一次細胞の濃縮が可能であることを示すことを可能にしている。
【０３２５】
したがって、本発明は、捕捉要素を認識する抗体を分泌する単一一次細胞の高流速での特異的選択を可能にする。
【０３２６】
［実施例７］
モノクローナル抗体の定量化及び２Ｄチャンバーにおけるその抗原との結合の検出。
この実施例では、標的要素３７は、スクリーニング対象溶液に既に含有されている抗体であり、この実施例は細胞には当てはまらない。
【０３２７】
この実施例の目的は、タイプ６０のデバイス、即ち、液滴が単一の層に二次元的に分布するチャンバーにおいて、所与の抗原に対するモノクローナル抗体の濃度に従って計量的反応を測定する可能性を実証することである。この実施例において、シグナリング実体は、蛍光抗原、より具体的には「ＴＴ−ＡＦ４８８」であり、例えばＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社により提供される標準キットの標識手順により、ＡｌｅｘａＦｌｏｕｒ−４８８フルオロフォアを用いて予めビオチンで官能化された、破傷風トキソイドタンパク質である。この実施例において、液滴の柱を形成するために使用される磁性粒子は、捕捉実体、ここでは、「ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ビオチン抗ＬＣカッパー（マウス）コンジュゲート（Ｂｉｏｔｉｎ  Ａｎｔｉ−ＬＣ−ｋａｐｐａ  （ｍｕｒｉｎｅ）  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）」（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社＃７１０３１５２５００）の飽和度により標識される。
【０３２８】
この実験において、液滴の容量は４０ピコリットルである。
【０３２９】
この実験において、希釈標準溶液は、
−  Ｓｕｐｅｒ  Ｌｏｗ  ＩｇＧ血清（＃ＳＨ３０８９８．０３、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）５ｖ／ｖ％、
−  ｐＨ７．４のＨＥＰＥＳ緩衝液２５ｍＭ、
−  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社により提供されるＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８  ０．１ｖ／ｖ％、
を含む。
【０３３０】
この容量の希釈標準溶液に対し、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社により提供されるフェノールレッドなしのＤＭＥＭ−Ｆ１２を最後に添加し、最終容量を得る。
【０３３１】
試薬溶液は、希釈標準溶液中に懸濁した以下の試薬：
−  捕捉実体の飽和度により予め標識された、ストレプトアビジン磁性粒子（Ａｄｅｍｔｅｃｈ社＃０４３３）３３．３３ｖ／ｖ％、
−  ウサギＦａｂ’２抗ＦＣマウスＡＦ６４７、ＪａｃｋｓｏｎＩＲ社＃３１５−６０６−１４６（定量化実体）１５０ｎＭ、
−  ＴＴ−ＡＦ４８８（捕捉実体）５０ｎＭ、
−  スルホローダミンＢ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社＃Ｓ１４０２）０．８又は１．６又は２．４μＭ
を含有する。
【０３３２】
これにより、蛍光抗原（ＴＴ−ＡＦ４８８）２５ｎＭ、定量化実体（ウサギＦａｂ’２抗ＦＣマウスＡＦ６４７）７５ｎＭ、及び以下の値：０、４．２、１２．５、２０．８、４２（図Ｓ７ｂのみ）、６２．５、８３．３、１２５、２０８、２５０（図Ｓ７ｂのみ）を含む濃度域における、抗原（ＴＴ７）に対する結合活性を有する、モノクローナル抗体を含むエマルションを得る。抗ＴＴ抗体、いわゆるＴＴ７は、Ｂｒａｎｄｏｎ  Ｊ  ＤｅＫｏｓｋｙらの論文、表題「Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐａｉｒｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｈｅａｖｙ  ａｎｄ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ」、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３１巻、１６６〜１６９頁、２０１３年発行において発表された配列からの組換えタンパク質の発現により得た。
【０３３３】
測定された複数のエマルションは、一定範囲の濃度のオレンジフルオロフォア、スルホローダミンＢを使用することによって区別できる。収集された測定値は同時に得られたものではなかった。
【０３３４】
図２６は、この実施例で使用した第２の装置６０のタイプの測定デバイスを表す。２枚のガラススライド間に高さ４０μｍのチャンバーが作製されている。入口及び出口は上部ガラススライド上に作製され、それぞれに接続キャピラリーに接続するための標準コネクタが設けられている。
【０３３５】
この実験により、図２７に示されるように、二次試薬の２つの蛍光読取り値を用いて液滴中の柱における磁性粒子に対する結合試験を行うことの可能性を示すことが可能になる。モノクローナル抗体が存在しない場合、シグナリング実体（図２７Ａ）及び定量化実体（図２７Ｂ）の分散蛍光が観察される。逆に、抗原（ＴＴ７）に対する結合活性を有するモノクローナル抗体５０ｎＭが存在する場合、シグナリング実体（図２７Ｃ）及び定量化実体（図２７Ｄ）の蛍光の再局在化が観察される。
【０３３６】
図２８は、標的要素（抗体ＴＴ７）の濃度（単位：ナノモル濃度）に従った、定量化実体の再局在化信号と分散化信号との比（図２８Ａ）、及びシグナリング実体の再局在化信号と分散化信号との比（図２８Ｂ）を表す滴定曲線である。
【０３３７】
［実施例８］
２Ｄチャンバーにおける抗原に対するモノクローナル抗体の親和度の測定。
この実施例は、抗原の親和度範囲を表す複数の別個の標的要素３７が測定されることを除き、すべての点において実施例７と同様である。
【０３３８】
この実施例の目的は、タイプ６０のデバイス、即ち、液滴が単一の層に二次元的に分布するチャンバー内で、所与の抗原に対するモノクローナル抗体の親和度を測定する可能性を実証することである。
【０３３９】
ビーズの柱上に固定された抗体に結合した蛍光抗原の濃度測定、及びビーズ柱上に捕捉された抗体の濃度の同時測定から、解離定数Ｋｄを評価した。
【０３４０】
この実験に使用された抗ＴＴ抗体、いわゆるＴＴ４、ＴＴ７及びＴＴ１０は、Ｂｒａｎｄｏｎ  Ｊ  ＤｅＫｏｓｋｙらの論文、表題「Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐａｉｒｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｈｅａｖｙ  ａｎｄ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ」、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３１巻、１６６〜１６９頁、２０１３年発行において発表された配列からの組換えタンパク質の発現により得た。
【０３４１】
線形回帰により、３種の抗体のそれぞれについて、定量化実体の信号に対するシグナリング実体信号の比を得るために、複数の別個のエマルションにおいて３種の抗体ごとに異なる濃度を使用した。より具体的にはＴＴ１０抗体については０ｎＭ、５ｎＭ及び１０ｎＭ、ＴＴ４抗体については０ｎＭ、２．５ｎＭ及び１０ｎＭ、並びにＴＴ７抗体については０ｎＭ、５ｎＭ、１０ｎＭ、１５ｎＭ及び２５ｎＭであった。
【０３４２】
この実験により、図２９及び図３０に示されているように、定量化実体の信号に対するシグナリング実体信号の比と、選択された標的要素の解離定数とを相関させることの可能性を示すことが可能になる。
【０３４３】
図２９は、この実験において試験した３種のモノクローナル抗体、ＴＴ４、ＴＴ７及びＴＴ１０について、定量化実体の再局在化信号と分散信号との比を横座標に表し、シグナリング実体の再局在化信号と分散信号との比を縦座標に表したグラフである。
【０３４４】
図３０は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって得られた３種のモノクローナル抗体の解離定数を横座標に表し、定量化実体信号に対するシグナリング実体信号の比を縦座標に表したグラフである。
【０３４５】
［実施例９］
２Ｄチャンバー内での一次細胞によるモノクローナル抗体の分泌の動態的及び定量的測定。
この実施例は、標的要素３７が一次細胞によって分泌されるモノクローナル抗体であること及びこの分泌が動態的に測定されることを除き、すべての点において実施例８と同様である。
【０３４６】
この実施例の目的は、所与の抗原について、タイプ６０のデバイスにおいて液滴内に単離される単一一次細胞によって生成されるモノクローナル抗体の分泌動態及び親和性を同時測定する可能性を実証することである。
【０３４７】
実施例６と同様に、Ｂリンパ球をマウスの脾臓から予め抽出し、標準手順（Ｐａｎ  Ｂ  ｋｉｔ  ＩＩ＃１３０−１０４−４４３、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社）に従って精製した。
【０３４８】
図３１は、単一細胞の尺度における、液滴の分散信号に対する磁性ビーズラインの再局在化信号の比対時間（分）の時間依存性変化を表すグラフである。更に、滴定曲線（実施例７の図２８ａ）により、測定された信号とモノクローナル抗体濃度とを相関させることが可能である。この濃度を図３０に示す。
【０３４９】
図３２は、ｎ＝２５の別個の一次細胞について、単一細胞の尺度における、液滴の分散信号に対する磁性ビーズラインの再局在化信号の比対時間（分）の時間依存性変化を表すグラフである。図３２は、一次細胞の不均質性を示している。
【０３５０】
［実施例１０］
液滴内の磁性ビーズの凝集体の数、形状及び安定性。
この実施例において、標的要素３７は、ビオチン化蛍光分子、例えばシグナリング実体の役割をも有しスクリーニング対象溶液に既に含有されている、ＡＦ５４６−ビオチン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社＃Ｓ１１２２５）である。この実施例は細胞には一切当てはまらない。
【０３５１】
この実施例の目的は、横断的に結合する分子（ｔｒａｎｓｖｅｒｓｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）の使用により、磁性ビーズの凝集体のラインを安定させ、液滴内の単一性（ｓｉｎｇｕｌａｒｉｔｙ）を確保することの可能性を実証することである。この実験の場合、横断的に結合する分子として、異なる濃度の多重ビオチン化（ｍｕｌｔｉｐｌｙ  ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ）タンパク質である、ビオチンＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社＃Ａ８５４９）を使用することを示す。使用するビオチンＢＳＡは、アルブミン１モル当たり８〜１６モルのビオチンを有する。
【０３５２】
この実験において、液滴の容量は４０ピコリットルである。
【０３５３】
この実験において、希釈標準溶液は、
−  Ｓｕｐｅｒ  Ｌｏｗ  ＩｇＧ血清（＃ＳＨ３０８９８．０３、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）５０ｖ／ｖ％、
−  ｐＨ７．４のＨＥＰＥＳ緩衝液２５ｍＭ、
−  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社より提供されるＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８  ０．１ｖ／ｖ％、
−  抗生物質−抗真菌剤（＃１５２４０、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）１ｖ／ｖ％
を含む。
【０３５４】
この容量の希釈標準溶液に対し、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社により提供されるＤＭＥＭ−Ｆ１２を最後に添加し、最終容量を得る。
【０３５５】
この実験のために生成した７種のエマルションは、希釈標準溶液中に懸濁させた以下の試薬：
−  最終濃度１００ｎＭのＡＦ５４６−ビオチン（シグナリング実体）、
−  標準量の１倍、２倍又は３倍の３３．３３ｖ／ｖ％の磁性粒子ストレプトアビジン（Ａｄｅｍｔｅｃｈ社＃０４３３）、
−  Ｄｙ−６４９（Ｄｙｏｍｉｃｓ社）５０、１００、２００、４００、８００又は１，６００ｎＭ、
−  ０対１、５若しくは１．２５対１、又は１００対１の可変比のビオチンＢＳＡと磁性ビーズ、即ち０、０．５、２．５、５又は１５ｎＭの濃度のビオチンＢＳＡ
を含有する。
【０３５６】
実施例「Ｃ」に記載されているように、基準エマルション、いわゆる「ＶＨＨライン」を生成する。「ＶＨＨライン」エマルションの場合、磁性ビーズラインの安定性は、標的要素（抗体）と捕捉実体（「ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ビオチン抗ＬＣカッパー（マウス）コンジュゲート」ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社＃７１０３１５２５００）との間の横断的結合によって得られる。なぜなら、同じ標的要素（抗体）が２個の捕捉実体に結合できるためである。
【０３５７】
図３３は、異なる実験条件に従った、磁性ビーズラインの形状比（ｆｏｒｍａｔ  ｒａｔｉｏ）を表すグラフであり、各場合が顕微鏡画像によって示されている。
【０３５８】
図３４は、異なる実験条件に従った、磁性ビーズラインの単一性又は複数性を表すグラフである。
【０３５９】
この実験により、図３３及び図３４に示されているように、液滴ごとの磁性ビーズラインの数及び幾何学的形状を安定させることの可能性を示すことが可能になる。
【符号の説明】
【０３６０】
１  装置
４  供給アセンブリ
６  液滴
８  キャリア流体
１０  凝集物
１０  凝集体
１２  粒子
１４  測定アセンブリ
１６  測定点
１８  測定点
２０  デバイス
２２  循環アセンブリ
２４  循環導管
２４  導管
２６  検出領域
２８  装填アセンブリ
３０  凝集アセンブリ
３１  離隔アセンブリ
３２  初期液滴
３４  シグナリング実体
３４ａ  シグナリング実体
３４ｂ  シグナリング実体
３６  捕捉要素
３６ａ  捕捉要素
３６ｂ  捕捉要素
３７  標的要素
３７ａ  標的要素
３７ｂ  標的要素
３８  永久磁石
４０  蛍光強度
４１  蛍光強度
４２  液滴
４４  プラトー
４８  液滴
５０  ピーク
５２  プラトー
５６  液滴
５８  ピーク
５９  プラトー
６０  装置
６０  デバイス
６２  チャンバー
６４  循環路
６６  分離パッド
７０  装置
７２  分類アセンブリ
７４  内相入口領域
７６  キャリア流体入口領域
７８  連結領域
７９  インキュベーション領域
８０  入口導管
８２  入口導管
８４  合流導管
８６  流体塊
８８  流体
８８  流体塊
９０  細胞
９０  産生実体
９２  キャリア流体入口導管
９４  分類領域
９６  分類領域
９８  誘導手段
１００  フォーク
１０２  出口導管
１０４  出口導管
１０６  第１の液滴群
１０８  第２の液滴群
１２０  装置
１２２  抽出アセンブリ
１２４  主液滴
１２６  副液滴
【図１】
2020183966.tif 000007
【図２】
2020183966.tif 000008
【図３】
2020183966.tif 000009
【図４】
2020183966.tif 000010
【図５】
2020183966.tif 000011
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【外国語明細書】
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