(57)【要約】      （修正有）【課題】抗体を選択する方法を提供する。【解決手段】ａ）第１の塩化ナトリウム濃度の存在下での正の線形ｐＨ勾配溶出によるＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体の保持時間を決定する工程と、ｂ）第２の塩化ナトリウム濃度の存在下での正の線形ｐＨ勾配溶出によるＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体の保持時間を決定する工程とを含み、これにより、工程ａ）で決定された保持時間と工程ｂ）で決定された保持時間とが実質的に異なる場合、ｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期に影響を及ぼす抗体−Ｆｃ−ＦｃＲｎ複合体における抗体−Ｆａｂ−ＦｃＲｎ相互作用の存在が決定される、ｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期に影響を及ぼす抗体−Ｆｃ−ＦｃＲｎ複合体における抗体−Ｆａｂ−ＦｃＲｎ相互作用の存在を決定する工程を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程：
ｉ）第１の塩濃度の存在下での正の線形ｐＨ勾配溶出によるＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体及び参照抗体の第１の保持時間を決定し、第２の塩濃度の存在下での正の線形ｐＨ勾配溶出によるＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体及び参照抗体の第２の保持時間を決定する工程、又は
ｉｉ）第１のｐＨ値での線形塩勾配溶出によるＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体及び参照抗体の第１の保持時間を決定し、第２のｐＨ値での線形塩勾配溶出によるＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体及び参照抗体の第２の保持時間を決定する工程、又は
ｉｉｉ）抗体及び参照抗体について、表面プラズモン共鳴を使用して、ｐＨ６におけるＫＤ値を決定し、高塩濃度の存在下での正の線形ｐＨ勾配溶出によるＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体及び参照抗体の保持時間を決定する工程、又は
ｉｖ）抗体及び参照抗体について、表面プラズモン共鳴を使用して、ｐＨ６におけるＫＤ値を決定し、線形塩勾配溶出によるＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体及び参照抗体の保持時間を決定する工程、又は
ｖ）正の線形ｐＨ勾配溶出によるＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体及びそのＦｃ領域の保持時間を決定する工程、又は
ｖｉ）高ｐＨ値での線形塩勾配溶出によるＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体及びそのＦｃ領域の保持時間を決定する工程、又は
ｖｉｉ）抗体及びそのＦｃ領域について、表面プラズモン共鳴を使用して、ｐＨ６におけるＫＤ値を決定し、高塩濃度の存在下での正の線形ｐＨ勾配溶出によるＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体及びそのＦｃ領域の保持時間を決定する工程、又は
ｖｉｉｉ）抗体及びそのＦｃ領域について、表面プラズモン共鳴を使用して、ｐＨ６におけるＫＤ値を決定し、高ｐＨ値での線形塩勾配溶出によるＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体及びそのＦｃ領域の保持時間を決定する工程
を含み、
ａ）第２の保持時間と実質的に同じ第１の保持時間を有する抗体、又は
ｂ）参照抗体のＫＤ値とは最大１０倍異なるＫＤ値を有し、参照抗体の保持時間と実質的に同じ保持時間を有する抗体、又は
ｃ）そのＦｃ領域の保持時間と実質的に同じ保持時間を有する抗体、又は
ｄ）そのＦｃ領域のＫＤ値とは最大１０倍異なるＫＤ値を有し、そのＦｃ領域の保持時間と実質的に同じ保持時間を有する抗体
を選択することによる、抗体を選択する方法。
【請求項２】
抗体のｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期に影響を及ぼす抗体−Ｆａｂ−ＦｃＲｎ相互作用を含まない抗体を選択するためのものである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ＩｇＧ１、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４サブクラスの抗体と比較して相対的に長いｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期を有する抗体を選択するためのものであり、
ｖ）、ｖｉ）、ｖｉｉ）、及びｖｉｉｉ）において、更に、参照抗体又は参照Ｆｃ領域の保持時間を決定し、
ａ）参照抗体の第１の保持時間より長い第１の保持時間を有し、第２の保持時間と実質的に同じ第１の保持時間を有する抗体、又は
ｂ）参照抗体のＫＤ値とは最大１０倍異なるＫＤ値を有し、参照抗体の保持時間より長い保持時間を有する抗体、又は
ｃ）そのＦｃ領域の保持時間と実質的に同じで、参照抗体の保持時間より長い保持時間を有する抗体、又は
ｄ）そのＦｃ領域のＫＤ値とは最大１０倍異なるＫＤ値を有し、そのＦｃ領域の保持時間と実質的に同じであり、参照抗体の保持時間より長い保持時間を有する抗体
を選択することによる、請求項１記載の方法。
【請求項４】
参照抗体に対して相対的に長い又は短い抗体のｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期を決定するためのものであり、
ｖ）、ｖｉ）、ｖｉｉ）、及びｖｉｉｉ）において、更に、参照抗体又は参照Ｆｃ領域の保持時間を決定し、
ｉ）〜ｖｉｉｉ）において、更に、突然変異Ｎ４３４Ａを有するＩｇＧ  Ｆｃ領域の保持時間を決定し、
ａ）参照の第１の保持時間より長い第１の保持時間を有し、実質的に同じであり第１の保持時間と第２の保持時間を有し、突然変異Ｎ４３４Ａを有するＦｃ領域の保持時間より短い第１の保持時間を有する抗体を選択することにより、相対的に長いｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期を有する抗体を選択し、又は
ｂ）参照抗体のＫＤ値とは最大１０倍異なるＫＤ値を有し、参照抗体の保持時間より長い保持時間を有し、突然変異Ｎ４３４Ａを有するＦｃ領域の保持時間より短い第１の保持時間を有する抗体を選択することにより、相対的に長いｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期を有する抗体を選択し、又は
ｃ）参照抗体の第１の保持時間より短い第１の保持時間を有し、実質的に同じ第１の保持時間と第２の保持時間を有する抗体を選択することにより、相対的に短いｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期を有する抗体を選択し、又は
ｄ）参照抗体のＫＤ値とは最大１０倍異なるＫＤ値を有し、参照抗体の保持時間より短い保持時間を有する抗体を選択することにより、相対的に長いｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期を有する抗体を選択することによる、請求項１記載の方法。
【請求項６】
正の線形ｐＨ勾配が、約ｐＨ５．５〜約ｐＨ８．８である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
塩が、塩化ナトリウムである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
第１の塩濃度が、約１４０mMである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
第２の塩濃度が、約４００mMである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
線形塩勾配が、０mMの塩〜２５０mMの塩である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
第１のｐＨ値が、約５．５である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
第２のｐＨ値が、約７．４である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
高塩濃度が、約４００mMである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
高ｐＨ値が、約ｐＨ７．４である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
実質的に異なる保持時間が、少なくとも５％異なる、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
実質的に同じ保持時間が、３．５％以下で異なる、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
保持時間が実質的に異なる場合、保持時間が、塩濃度の平方根の上の１（〜１／ＳＱＲＴ（ｃ（ｓａｌｔ）））に比例する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
抗体が、全長抗体である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リコンビナント抗体技術の分野、特に、テーラーメイド抗体の分野におけるものである。本明細書には、ＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーカラムで決定された保持時間に基づいて、抗体のｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期を予測する方法が報告されている。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
クラスＧのヒト免疫グロブリン（ＩｇＧ）は、ターゲット抗原に対する特異性を伝達する２つの抗原結合（Ｆａｂ）領域と、Ｆｃレセプターとの相互作用を担う定常領域（Ｆｃ領域）とを含有する（［１、２］）。ヒトＩｇＧのサブクラス１、２、及び４は、２１日の平均血清半減期を有する。この半減期は、他のどの公知の血清タンパク質の半減期よりも長い（［３］）。この長い半減期は、Ｆｃ領域と新生児Ｆｃレセプター（ＦｃＲｎ）との間の相互作用により、主に媒介される（［４、５］）。これは、ＩｇＧ又はＦｃ含有融合タンパク質が幅広いクラスの治療薬として使用される理由の１つである。
【０００３】
新生児ＦｃレセプターＦｃＲｎは、ＩｇＧ及びアルブミン両方のホメオスタシス胎盤を通過する母方のＩｇＧ輸送、及び、抗原−ＩｇＧ免疫複合体食作用において、関与する膜結合レセプターである（［６、９］）。ヒトＦｃＲｎは、グリコシル化クラスＩ主要組織適合複合体様タンパク質（α−ＦｃＲｎ）及びβ２ミクログロブリン（β２ｍ）サブユニットからなるヘテロ二量体である（［１０］）。ＦｃＲｎは、Ｆｃ領域のＣＨ２−ＣＨ３領域中の部位に結合し（［１１〜１４］）、２つのＦｃＲｎ分子は、Ｆｃ領域に同時に結合することができる（［１５、１６］）。ＦｃＲｎとＦｃ領域との間の親和性は、ｐＨ依存性である。このｐＨ依存性は、エンドソームのｐＨ５〜６において、ナノモル濃度の親和性を示し、生理学的ｐＨである７．４ではほとんど結合性を示さない（［１３、１７、１８］）。ＩｇＧに長い半減期を伝達する基礎となるメカニズムは、３つの根本的な工程により説明することができる。まず、ＩｇＧは、種々の細胞種による非特異的飲作用に供される（［１９、２０］）。第二に、ＩｇＧは、ｐＨ５〜６の酸性エンドソームにおいて、ＦｃＲｎと遭遇し、結合することにより、ＩｇＧをリソソーム分解から保護する（［１１、２１］）。最後に、ＩｇＧは、７．４の生理学的ｐＨにおいて、細胞外空間に放出される［４］。この厳密なｐＨ依存性の結合−放出メカニズムは、ＩｇＧリサイクリングに重要であり、異なるｐＨ値における結合特性の任意の偏りは、ＩｇＧの循環半減期に強く影響を及ぼす場合がある（［２２］）。
【０００４】
また、Ｆａｂ領域は、Ｆｃ領域とＦｃＲｎとの特異的相互作用に加えて、ＦｃＲｎ結合性に寄与することが示唆されている（［２３〜２５］）。例えば、中性ｐＨでのＦａｂ媒介性残存結合性は、一連の治療抗体の薬物動態特性と関連しており、この関連は、ｐＨ７．３においてＦｃＲｎに過剰な結合性を有するＩｇＧには、短い終末相半減期の問題があることを示している（［２４］）。近年、Schlothauer et al.（［２５］）は、ＦｃＲｎとＩｇＧとの間を解離させるための生理学的条件を厳密に模倣した、新規なｐＨ勾配ＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィー法を記載している。更に、彼らは、同一のＦｃ領域を有するＩｇＧが、ＦｃＲｎからのその解離において異なることを示し、このため、ＦｃＲｎ結合におけるＦａｂ領域の影響を示した。
【０００５】
しかしながら、Ｆａｂ領域がどのようにＦｃＲｎ結合に影響を及ぼすのかという基礎をなすメカニズムは、未だに解明されていない。
【０００６】
モノクローナル抗体の機能性を決定するための分析用ＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーが、Schlothauer, T., et al.（［２５］）に報告されている。Wang, W., et al.（［２４］）は、同一のＦｃ配列を有するモノクローナル抗体が、薬物動態事象を伴って、ＦｃＲｎに異なって結合し得ることを報告している。ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインを含有する治療タンパク質の血清半減期のレギュレーションにおける新生児ＦｃＲｎの重要性は、Suzuki, T., et al.（［２３］）に報告されている。Igawa, T., et al.（［３７］）は、可変領域を操作することにより、ＩｇＧ抗体の除去が低下することを報告している。免疫グロブリンＧのＦｃ領域を操作して、ｉｎ  ｖｉｖｏでの抗体レベルをモデュレーションすることが、Vaccaro, C., et al.（［２２］）に報告されている。Prabhat, P., et al.（［４０］）は、多焦点平面顕鏡法を使用することによる、ＦｃレセプターであるＦｃＲｎのエキソサイト―シスをもたらす細胞内リサイクリング経路の解明を報告している。モノクローナル抗体についての薬物動態、薬力学、及び免疫原性適合性評価戦略が、Putnam, W.S., et al.に報告されている（［３６］）。Boswell, C.A., et al.（［３８］）は、抗体組織分布及び薬物動態における電荷作用を報告している。ビオチンでの化学修飾後の放射性ヨウ化キメラＴＮＴ−１、−２、及び−３モノクローナル抗体の薬物動態特性及び生体分布が、Khawli, L.A., et al.に報告されている（［３５］）。
【０００７】
国際公開公報第２０１３／１２０９２９号には、Ｆｃレセプターベースの親和性クロマトグラフィーが報告されている。米国特許出願公開公報第２０１１／０１１１４０６号には、複数回抗原に抗原結合分子を結合させる方法が報告されている。米国特許出願公開公報第２０１４／００１３４５６号には、ヒスチジン操作軽鎖抗体及びこれを生成するための遺伝子操作された非ヒト動物が報告されている。
【０００８】
近年、ＦｃＲｎ相互作用におけるＦａｂ領域の影響が議論されている（［２３、２４、２５］）。
【０００９】
しかしながら、同じＦｃ領域を有する抗体は、単純に、同様のＰＫプロファイルを有するわけではない。ＦｃＲｎ結合に対するＦａｂ領域の更なる寄与が報告されているが、基礎となすメカニズムは、不明なままである（［４７］、［２４］、［２５］）。
【００１０】
Ｆｃ領域とＦｃＲｎとの特異的相互作用に加えて、Ｆａｂ領域も、ＦｃＲｎ−ＩｇＧ相互作用に寄与することが示唆されている（［３７、２４、２５］）。
【００１１】
後に公開されたLi, B., et al.（［４８］）は、フレームワークの選択が、分子電荷の差異により、ヒト化治療抗体の薬物動態に影響を及ぼす場合があることを報告している。
【００１２】
Sampei, Z., et al.（［４９］）は、因子ＶＩＩＩ補助因子活性の機能を模倣する、非対称二重特異性ＩｇＧ抗体の特定及び多次元最適化を報告している。
【００１３】
Wang et al.（［２４］）は、異なるターゲット特異性及びＦａｂ領域を有するが、同一のＦｃ配列を有するＩｇＧが、異なるＦｃＲｎ親和性を有する場合があることを報告している。生理学的ｐＨ近くでのＦａｂ媒介性残存結合性は、一連の治療抗体の薬物動態特性と関連しており、この関連は、ｐＨ７．３においてＦｃＲｎに過剰な結合性を有するＩｇＧには、短い終末相半減期の問題があることを示している。
【００１４】
近年、Schlothauer et al.（［２５］）は、ＦｃＲｎとＩｇＧとの間を解離させるための生理学的条件を厳密に模倣した、新規なｐＨ勾配ＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィー法を記載している。更に、彼らは、同一のＦｃ領域を有するＩｇＧが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＦｃＲｎからのその解離において異なることを示しており、このため、ＦｃＲｎ−ＩｇＧ相互作用におけるＦａｂ領域の影響を示した。
【００１５】
Benson, J.M., et al.（［５０］）は、ウステキヌマブ：インターロイキン−１２及びインターロイキン−２３をターゲットとする、免疫媒介性障害の処置のためのヒトモノクローナル抗体の発見及びメカニズムを報告している。
【００１６】
抗体ブリアキヌマブのアミノ酸配列は、国際公開公報第２０１３／０８７９１１号（配列番号３９及び配列番号４０）に報告されている。抗体ウステキヌマブのアミノ酸配列は、国際公開公報第２０１３／０８７９１１号（配列番号３７及び配列番号３８）に報告されている。抗体ベバシズマブのアミノ酸配列は、Drug Bank entry DB00112に報告されている。
【発明の概要】
【００１７】
Ｆｖドメイン中の電荷分布が、抗体−ＦｃＲｎ結合性に影響を及ぼし、抗体とＦｃＲｎとの間の更なる相互作用をもたらすことが見出された。これは、特にｐＨ７．４での抗体−ＦｃＲｎ複合体の解離に関するＦｃＲｎ結合特性を変化させることにより、抗体のＦｃＲｎ依存性終末相半減期を短縮する。
【００１８】
本明細書に報告された一態様は、下記工程：
ａ）第１の塩濃度の存在下での正の線形ｐＨ勾配溶出によるＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体の保持時間を決定する工程と、
ｂ）第２の塩濃度の存在下での正の線形ｐＨ勾配溶出によるＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体の保持時間を決定する工程とを含み、
これにより、工程ａ）で決定された保持時間と工程ｂ）で決定された保持時間とが実質的に異なる場合、抗体のｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期に影響を及ぼす抗体−Ｆａｂ−ＦｃＲｎ相互作用の存在が決定される、
抗体のｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期に影響を及ぼす抗体−Ｆａｂ−ＦｃＲｎ相互作用の存在を決定する方法である。
【００１９】
抗体−Ｆａｂ−ＦｃＲｎ相互作用は、抗体のＦａｂ領域とＦｃＲｎとの間の相互作用である。この相互作用は、少しでも存在する場合、抗体がＦｃＲｎと結合した後に生じる。このため、この相互作用の確立は、２工程プロセスである。第１工程において、抗体−ＦｃＲｎ複合体、より正確には、抗体−Ｆｃ−ＦｃＲｎ複合体が形成される。抗体−Ｆｃ−ＦｃＲｎ複合体が形成された後の第２の工程は、抗体−Ｆａｂ−ＦｃＲｎ相互作用の確立である。これから分かるように、全長抗体についてのみ、これらの２つの相互作用、すなわち、抗体−Ｆｃ−ＦｃＲｎ相互作用及び抗体−Ｆａｂ−ＦｃＲｎ相互作用を確立することができる。
【００２０】
本明細書に報告された一態様は、下記工程：
ａ）第１の塩濃度の存在下での正の線形ｐＨ勾配溶出によるＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体の保持時間を決定する工程と、
ｂ）第２の塩濃度の存在下での正の線形ｐＨ勾配溶出によるＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体の保持時間を決定する工程とを含み、
これにより、工程ａ）で決定された保持時間と工程ｂ）で決定された保持時間とが実質的に異なる場合、ｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期に影響を及ぼす抗体−ＦｃＲｎ複合体におけるＦａｂ−ＦｃＲｎ相互作用の存在が決定される、
ｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期に影響を及ぼす抗体−ＦｃＲｎ複合体におけるＦａｂ−ＦｃＲｎ相互作用の存在を決定する方法である。
【００２１】
本明細書に報告された別の態様は、下記工程：
ａ）第１の塩濃度の存在下での正の線形ｐＨ勾配溶出によるＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体の保持時間を決定する工程と、
ｂ）第２の塩濃度の存在下での正の線形ｐＨ勾配溶出によるＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体の保持時間を決定する工程とを含み、
これにより、工程ａ）で決定された保持時間と工程ｂ）で決定された保持時間とが実質的に異なる場合、抗体は、ＩｇＧクラスの標準的／天然の抗体と比較して相対的に短いｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期を有する、
抗体の相対的なｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期を決定する方法である。
【００２２】
一実施態様では、ＩｇＧクラスの抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４サブクラスの抗体である。一実施態様では、ＩｇＧクラスの抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４サブクラスの抗体である。一実施態様では、ＩｇＧクラスの抗体は、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４サブクラスの抗体である。一実施態様では、ＩｇＧクラスの抗体は、ＩｇＧ１サブクラスの抗体である。一実施態様では、ＩｇＧクラスの抗体は、ＩｇＧ４サブクラスの抗体である。
【００２３】
本明細書に報告された更なる態様は、下記工程：
ａ）第１の塩濃度の存在下での正の線形ｐＨ勾配溶出によるＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーカラムでの変異抗体及びその親抗体の保持時間を決定する工程と、
ｂ）第２の塩濃度の存在下での正の線形ｐＨ勾配溶出によるＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーカラムでの変異抗体及びその親抗体の保持時間を決定する工程とを含み、
これにより、ｉ）工程ａ）で決定された変異抗体の保持時間が、工程ａ）で決定されたその親抗体の保持時間より長く、ｉｉ）工程ａ）で決定された変異抗体の保持時間と工程ｂ）で決定された変異抗体の保持時間とが実質的に同じである場合、その親抗体に対して変異抗体のｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期が長くなり、また、これにより、ｉ）工程ａ）で決定された変異抗体の保持時間が、工程ａ）で決定されたその親抗体の保持時間より短く、ｉｉ）工程ａ）で決定された変異抗体の保持時間と工程ｂ）で決定された変異抗体の保持時間とが実質的に同じである場合、その親抗体に対して変異抗体のｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期が短くなる、
その親抗体に対する変異抗体のｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期の伸長又は短縮を決定する方法である。
【００２４】
本明細書に報告された別の態様は、下記工程：
ａ）第１の塩濃度の存在下での正の線形ｐＨ勾配溶出によるＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体及び参照抗体の保持時間を決定する工程と、
ｂ）第２の塩濃度の存在下での正の線形ｐＨ勾配溶出によるＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体及び参照抗体の保持時間を決定する工程とを含み、
これにより、参照抗体に対して長いｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期を有する抗体を選択する場合には、ｉ）工程ａ）で決定された参照抗体の保持時間より長い工程ａ）で決定された保持時間、及び、ｉｉ）工程ｂ）で決定された保持時間と実質的に同じ工程ａ）で決定された保持時間を有する抗体が選択され、また、これにより、参照抗体に対して短いｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期を有する抗体を選択する場合には、ｉ）工程ａ）で決定された参照抗体の保持時間より短い工程ａ）で決定された保持時間、及び、ｉｉ）工程ｂ）で決定された保持時間と実質的に同じ工程ａ）で決定された保持時間を有する抗体が選択される、
参照抗体に対して伸長又は短縮したｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期を有する抗体を選択する方法である。
【００２５】
本明細書に報告された別の態様は、
ａ）第１の塩濃度の存在下での正の線形ｐＨ勾配溶出によるＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体の保持時間を決定する工程と、
ｂ）第２の塩濃度の存在下での正の線形ｐＨ勾配溶出によるＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体の保持時間を決定する工程とを含み、
これにより、工程ｂ）で決定された保持時間と実質的に異ならない工程ａ）で決定された保持時間を有する抗体が選択され、また、これにより、抗体のｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期に影響を及ぼす抗体−Ｆａｂ−ＦｃＲｎ相互作用を有さない抗体を選択する、
抗体のｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期に影響を及ぼす抗体−Ｆａｂ−ＦｃＲｎ相互作用を有さない抗体を選択する方法である。
【００２６】
本明細書に報告された一態様は、下記工程：
ａ）本明細書に報告された方法により選択された、参照抗体に対して伸長又は短縮したｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期を有する抗体をコードする１つ以上の核酸を含む細胞を提供する工程と、
ｂ）該細胞を培養培地中で培養し、該細胞又は該培養培地から抗体を回収することにより、抗体を製造する工程とを含む、
抗体を製造する方法である。
【００２７】
本明細書に報告された一態様は、下記工程：
抗体軽鎖中の２７、５５、及び９４位（Ｋａｂａｔによるナンバリング）の荷電アミノ酸残基を、疎水性又は中性の親水性アミノ酸残基に変化させることにより、抗体のｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期を伸長する工程を含む、
抗体のｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期を伸長する方法である。
【００２８】
本明細書に報告された一態様は、下記工程：
ａ）塩勾配溶出による第１のｐＨ値におけるＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体及び参照抗体の保持時間を決定する工程と、
ｂ）塩勾配溶出による第２のｐＨ値におけるＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体及び参照抗体の保持時間を決定する工程とを含み、
これにより、工程ａ）で決定された抗体及び参照抗体の保持時間の比が、工程ｂ）で決定された抗体及び参照抗体の保持時間の比と実質的に異なる場合、抗体のｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期に影響を及ぼす抗体−Ｆａｂ−ＦｃＲｎ相互作用の存在が決定される、
抗体のｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期に影響を及ぼす抗体−Ｆａｂ−ＦｃＲｎ相互作用の存在を決定する方法である。
【００２９】
本明細書に報告された一態様は、下記工程：
ａ）変異抗体及びその親抗体について、表面プラズモン共鳴を使用して、ｐＨ６におけるＫＤ値を決定する工程と、
ｂ）高塩濃度の存在下での正の線形ｐＨ勾配溶出によるＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーカラムでの変異抗体及びその親抗体の保持時間を決定する工程とを含み、
これにより、ＫＤ値が、最大１０倍異なり、変異抗体とその親抗体との間で工程ｂ）で決定された保持時間が実質的に異なる場合、抗体のｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期に影響を及ぼす抗体−Ｆａｂ−ＦｃＲｎ相互作用の存在が決定される、
抗体のｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期に影響を及ぼす抗体−Ｆａｂ−ＦｃＲｎ相互作用の存在を決定する方法である。
【００３０】
本明細書に報告された一態様は、下記工程：
ａ）変異抗体及びその親抗体について、表面プラズモン共鳴を使用して、ｐＨ６におけるＫＤ値を決定する工程と、
ｂ）高塩濃度の存在下での正の線形ｐＨ勾配溶出によるＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーカラムでの変異抗体及びその親抗体の保持時間を決定する工程とを含み、
これにより、ＫＤ値が、最大１０倍異なり、変異抗体の工程ｂ）で決定された保持時間が、その親抗体の保持時間より短い／小さい場合、抗体は、その親抗体と比較して相対的に短いｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期を有し、また、これにより、ＫＤ値が、最大１０倍異なり、変異抗体の工程ｂ）で決定された保持時間が、その親抗体の保持時間より長い／大きい場合、抗体は、その親抗体と比較して相対的に長いｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期を有する、
抗体の相対的なｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期を決定する方法である。
【００３１】
本明細書に報告された一態様は、下記工程：
ａ）変異抗体及びその親抗体について、表面プラズモン共鳴を使用して、ｐＨ６におけるＫＤ値を決定する工程と、
ｂ）高塩濃度の存在下での正の線形ｐＨ勾配溶出によるＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーカラムでの変異抗体及びその親抗体の保持時間を決定する工程とを含み、
これにより、ＫＤ値が、最大１０倍異なり、変異抗体の工程ｂ）で決定された保持時間が、その親抗体の保持時間より短い／小さい場合、抗体は、その親抗体と比較して短いｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期を有し、また、これにより、ＫＤ値が、最大１０倍異なり、変異抗体の工程ｂ）で決定された保持時間が、その親抗体の保持時間より長い／大きい場合、抗体は、その親抗体と比較して長いｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期を有する、
抗体のｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期の伸長又は短縮を決定する方法である。
【００３２】
一実施態様では、抗体は、全長抗体である。
【００３３】
全態様の一実施態様では、正の線形ｐＨ勾配は、約ｐＨ５．５〜約ｐＨ８．８である。
【００３４】
全態様の一実施態様では、塩は、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、塩化カリウム、硫酸カリウム、クエン酸ナトリウム、又はクエン酸カリウムから選択される。
【００３５】
全態様の一実施態様では、塩は、塩化ナトリウムである。
【００３６】
全態様の一実施態様では、第１の塩濃度は、５０mM〜２００mMである。
【００３７】
全態様の一実施態様では、第１の塩濃度は、約１４０mMである。
【００３８】
全態様の一実施態様では、第２の塩濃度は、３００mM〜６００mMである。
【００３９】
全態様の一実施態様では、第２の塩濃度は、約４００mMである。
【００４０】
全態様の一実施態様では、工程ａ）と工程ｂ）とで実質的に異なる保持時間は、少なくとも５％異なる。
【００４１】
全態様の一実施態様では、工程ａ）と工程ｂ）とで実質的に異なる保持時間は、少なくとも１０％異なる。
【００４２】
全態様の一実施態様では、工程ａ）と工程ｂ）とで実質的に異なる保持時間は、少なくとも１５％異なる。
【００４３】
全態様の一実施態様では、保持時間が工程ａ）と工程ｂ）とで実質的に異なる場合、工程ａ）における保持時間は、工程ｂ）におけるより大きい／長い。
【００４４】
全態様の一実施態様では、保持時間が工程ａ）と工程ｂ）とで実質的に異なる場合、工程ｂ）における保持時間は、工程ａ）におけるより小さい／短い。
【００４５】
全態様の一実施態様では、保持時間が工程ａ）と工程ｂ）とで実質的に異なる場合、保持時間は、塩濃度の平方根の上の１（〜１／ＳＱＲＴ（ｃ（ｓａｌｔ）））に比例する。
【００４６】
全態様の一実施態様では、親又は参照抗体は、サブクラスＩｇＧ１について、配列番号０１（重鎖）及び配列番号０２（軽鎖）を有する抗−ＩＬ−１Ｒ抗体、ならびに、サブクラスＩｇＧ４について、配列番号０３（重鎖）及び配列番号０４（軽鎖）を有する抗−ＩＬ−１Ｒ抗体である。
【００４７】
全態様の一実施態様では、親又は参照抗体は、サブクラスＩｇＧ１について、配列番号３６（重鎖）及び配列番号３７（軽鎖）を有する抗−ＨＥＲ２抗体、ならびに、サブクラスＩｇＧ４について、配列番号３８（重鎖）及び配列番号３９（軽鎖）を有する抗−ＨＥＲ２抗体である。
【００４８】
全態様の一実施態様では、親又は参照抗体は、図５に示された軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列を有するウステキヌマブである。
【００４９】
全態様の一実施態様では、ＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーカラムは、新生児Ｆｃレセプター（ＦｃＲｎ）とベータ−２−ミクログロブリン（ｂ２ｍ）との非共有複合体を含む。
【００５０】
全態様の一実施態様では、ＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーカラムは、新生児Ｆｃレセプター（ＦｃＲｎ）とベータ−２−ミクログロブリン（ｂ２ｍ）との共有複合体を含む。
【００５１】
全態様の一実施態様では、新生児Ｆｃレセプター（ＦｃＲｎ）とベータ−２−ミクログロブリン（ｂ２ｍ）との複合体は、固体相に結合している。
【００５２】
全態様の一実施態様では、固体相は、クロマトグラフィー材料である。
【００５３】
全態様の一実施態様では、新生児Ｆｃレセプター（ＦｃＲｎ）とベータ−２−ミクログロブリン（ｂ２ｍ）との複合体は、ビオチン化されており、固体相は、ストレプトアビジンで誘導体化されている。
【００５４】
全態様の一実施態様では、ベータ−２−ミクログロブリンは、新生児Ｆｃレセプター（ＦｃＲｎ）と同じ種由来である。
【００５５】
全態様の一実施態様では、ベータ−２−ミクログロブリンは、ＦｃＲｎとは異なる種由来である。
【００５６】
全態様の一実施態様では、ＦｃＲｎは、ヒトＦｃＲｎ、カニクイザルＦｃＲｎ、マウスＦｃＲｎ、ラットＦｃＲｎ、ヒツジＦｃＲｎ、イヌＦｃＲｎ、ブタＦｃＲｎ、ミニブタＦｃＲｎ、及びウサギＦｃＲｎから選択される。
【００５７】
全態様の一実施態様では、抗体は、単特異性抗体もしくは融合ポリペプチドの抗体フラグメント、又は、二重特異性抗体もしくは融合ポリペプチドの抗体フラグメント、又は、三重特異性抗体もしくは融合ポリペプチドの抗体フラグメント、又は、四重特異性抗体もしくは融合ポリペプチドの抗体フラグメントである。
【００５８】
一実施態様では、抗体は、クラスＩｇＧの抗体である。一実施態様では、抗体は、サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４の抗体である。一実施態様では、抗体は、サブクラスＩｇＧ１又はＩｇＧ４の抗体である。
【００５９】
発明の詳細な説明
ＦｃＲｎ−ｍＡｂ（ｍＡｂ＝モノクローナル抗体）相互作用の構造解析の結果を組み合わせることにより、Ｆｖドメイン及び特に軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が、ＦｃＲｎ−ｍＡｂ解離に主な影響を提供するという結論がもたらされる。この発見は、Ｆｖドメインが同じ抗体のＦｃＲｎ結合部位から離れているため、予測されなかった。
【００６０】
抗体は、ｐＨ６．０での親和性において、差異を示さなかったため、Ｆａｂ領域は、ｐＨ６．０での結合性に影響を有さないと考えられる。対照的に、ＦｃＲｎと抗体との間の解離は、Ｆａｂ領域により影響を受けた。
【００６１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＦｃＲｎ−ＩｇＧ解離ｐＨは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの終末相半減期と直線的に関係した。まとめると、これらの発見は、より高いｐＨ値においてより遅い解離を示す抗体は、細胞内に戻るように輸送され、その後、血液循環に戻って放出される代わりに分解されるとの仮定を支持している。
【００６２】
Ｆｖドメイン中の電荷分布は、抗体−ＦｃＲｎ結合性に影響を及ぼし、抗体とＦｃＲｎとの間の更なる相互作用をもたらすことが見出された。これは、特にｐＨ７．４での抗体−ＦｃＲｎ複合体の解離に関するＦｃＲｎ結合特性を変化させることにより、抗体のＦｃＲｎ依存性終末相半減期を短縮する。
【００６３】
Ｉ．定義
「ａ」及び「ａｎ」という用語は、１又は２又は３又は４又は５又は６、及び最大１０９を意味する。
【００６４】
「約」という用語は、その後に続く数値の＋／−２０％の範囲を意味する。一実施態様では、約という用語は、その後に続く数値の＋／−１０％の範囲を意味する。一実施態様では、約という用語は、その後に続く数値の＋／−５％の範囲を意味する。
【００６５】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」という用語も含む。
【００６６】
「変化」という用語は、改変抗体又は融合ポリペプチドを得るための、親抗体又は融合ポリペプチド、例えば、Ｆｃ領域の少なくともＦｃＲｎ結合部を含む融合ポリペプチド中の１つ以上のアミノ酸残基の突然変異（置換）、挿入（付加）、変化（誘導体化）、又は欠失を意味する。「突然変異」という用語は、指定されたアミノ酸残基が、異なるアミノ酸残基に置換されることを意味する。例えば、突然変異Ｌ２３４Ａは、抗体Ｆｃ領域（ポリペプチド）中の２３４位（ＥＵインデックスによるナンバリング）のアミノ酸残基リシンが、アミノ酸残基アラニンにより置換されること（アラニンによるリシンの置換）を意味する。
【００６７】
「アミノ酸突然変異」という用語は、少なくとも１つの既存のアミノ酸残基の別の異なるアミノ酸残基による置換（＝アミノ酸残基の置き換え）を意味する。置き換えるアミノ酸残基は、「天然のアミノ酸残基」であることができ、アラニン（三文字表記：ａｌａ、一文字表記：Ａ）、アルギニン（ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（ａｓｐ、Ｄ）、システイン（ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（ｌｅｕ、Ｌ）、リシン（ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（ｓｅｒ、Ｓ）、スレオニン（ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（ｔｙｒ、Ｙ）、及びバリン（ｖａｌ、Ｖ）からなる群より選択することができる。置き換えるアミノ酸残基は、「非天然のアミノ酸残基」でもよい。例えば、米国特許第６，５８６，２０７号、国際公開公報第９８／４８０３２号、同第０３／０７３２３８号、米国特許出願公開公報第２００４／０２１４９８８号、国際公開公報第２００５／３５７２７号、同第２００５／７４５２４号、Chin, J.W., et al., J. Am. Chem. Soc. 124 (2002) 9026-9027；Chin, J.W. and Schultz, P.G., ChemBioChem 11 (2002) 1135-1137；Chin, J.W., et al., PICAS United States of America 99 (2002) 11020-11024；及びWang, L. and Schultz, P.G., Chem. (2002) 1-10を参照のこと（全ての文献は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる）。
【００６８】
「アミノ酸挿入」という用語は、アミノ酸配列中の所定の位置における、少なくとも１つのアミノ酸残基の（付加的な）組み込みを意味する。一実施態様では、挿入は、１つ又は２つのアミノ酸残基の挿入であろう。挿入されたアミノ酸残基は、任意の天然又は非天然のアミノ酸残基であることができる。
【００６９】
「アミノ酸欠失」という用語は、アミノ酸配列中の所定の位置における、少なくとも１つのアミノ酸残基の除去を意味する。
【００７０】
本明細書において、「抗体」という用語は、広い意味で使用され、種々の抗体構造体を包含する。この抗体構造体は、それらが全長抗体であり、所望の抗原−及び／又はＦｃＲＮ−結合活性を示す限り、モノクローナル抗体及び多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体、三重特異性抗体）を含むが、これらに限定されない。
【００７１】
「（抗原に対する）結合性」という用語は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ法での抗体の結合性を意味する。一実施態様では、結合性は、抗体が抗原の表面に結合し、抗原の抗体に対する結合性が表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により測定される、結合アッセイ法において決定される。結合性は、例えば、１０−８M以下、一部の実施態様では、１０−１３〜１０−８M、一部の実施態様では、１０−１３〜１０−９Mの結合親和性（ＫＤ）を意味する。
【００７２】
結合性は、BIAcoreアッセイ法（GE Healthcare Biosensor AB, Uppsala, Sweden）により調査することができる。結合親和性は、ｋａ（抗体／抗原複合体からの抗体が会合する速度定数）、ｋｄ（解離定数）、及びＫＤ（ｋｄ／ｋａ）という用語により定義される。
【００７３】
「バッファー物質」という用語は、例えば、酸性又は塩基性物質の付加又は放出により、溶液中で、溶液のｐＨ値の変化を平らにすることができる物質を意味する。
【００７４】
「ＣＨ２−ドメイン」という用語は、ほぼＥＵ位置２３１からＥＵ位置３４０（ＫａｂａｔによるＥＵナンバリングシステム）に向かって伸びる抗体重鎖ポリペプチドの部分を意味する。一実施態様では、ＣＨ２ドメインは、配列番号０５：
【表１】
2020183967.tif 000002
のアミノ酸配列を有する。
【００７５】
「ＣＨ３−ドメイン」という用語は、ほぼＥＵ位置３４１からＥＵ位置４４６に向かって伸びる抗体重鎖ポリペプチドの部分を意味する。一実施態様では、ＣＨ３ドメインは、配列番号０６：
【表２】
2020183967.tif 000003
のアミノ酸配列を有する。
【００７６】
抗体の「クラス」は、その重鎖により保持されている定常ドメイン又は定常領域の種類を指す。抗体には、５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭが存在する。これらの幾つかは、更に、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２に分類することができる。種々のクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
【００７７】
作用剤、例えば、医薬製剤の「有効量」は、所望の治療的又は予防的結果を達成するのに必要な用量及び期間において有効な量を指す。
【００７８】
「Ｆｃ融合ポリペプチド」という用語は、結合ドメイン（例えば、抗原結合ドメイン、例えば、一本鎖抗体又はポリペプチド、例えば、レセプターのリガンド）と、所望のターゲット−及び／又はプロテインＡ及び／又はＦｃＲｎ結合活性を示す抗体Ｆｃ領域との融合物を意味する。
【００７９】
「ヒト起源のＦｃ領域」という用語は、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインの内の少なくとも一部を含有する、ヒト起源の免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を意味する。一実施態様では、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６又はＰｒｏ２３０から、重鎖のカルボキシル末端に向かって伸びる。一実施態様では、Ｆｃ領域は、配列番号０７のアミノ酸配列を有する。ただし、Ｆｃ領域のＣ末端リシン（Ｌｙｓ４４７）は、存在してもよいし、又は、存在しなくてもよい。本明細書において特に断らない限り、Ｆｃ領域又は定常領域中のアミノ酸残基のナンバリングは、Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91 3242に記載され、ＥＵインデックスとも呼ばれる、ＥＵナンバリングシステムに従う。Ｆｃ領域は、２つの重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドから構成される。このポリペプチドは、ポリペプチド間ジスルフィド結合を形成するヒンジ領域のシステイン残基を介して、互いに共有結合することができる。
【００８０】
「ＦｃＲｎ」という用語は、ヒト新生児Ｆｃレセプターを意味する。ＦｃＲｎは、リボソーム分解経路からＩｇＧを救助するのに機能し、低下したクリアランス及び伸長した半減期をもたらす。ＦｃＲｎは、２つのポリペプチド：５０kDa クラスＩ主要組織適合性複合体様タンパク質（α−ＦｃＲｎ）と、１５kDa β２−ミクログロブリン（β２ｍ）とからなるヘテロ二量体タンパク質である。ＦｃＲｎは、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２−ＣＨ３部分に、高い親和性で結合する。ＩｇＧとＦｃＲｎとの間の相互作用は、厳密にｐＨ依存性であり、１つのＩｇＧがその２つの重鎖を介して２つのＦｃＲｎ分子に結合する、１：２の化学量論で生じる（Huber, A.H., et al., J. Mol. Biol. 230 (1993) 1077-1083）。ＦｃＲｎ結合は、エンドソーム中において、酸性ｐＨ（ｐＨ＜６．５）で生じ、ＩｇＧが、中性の細胞表面（約７．４のｐＨ）で放出される。この相互作用のｐＨ感受性は、エンドソームの酸性環境内でレセプターに結合することにより、細胞中に飲作用されたＩｇＧを細胞内分解からＦｃＲｎ媒介性保護するのを促進する。ついで、ＦｃＲｎは、細胞表面へのＩｇＧのリサイクリングを促進し、その結果、細胞外の中性ｐＨ環境へのＦｃＲｎ−ＩｇＧ複合体の露出によって、血流に放出する。
【００８１】
「Ｆｃ領域のＦｃＲｎ結合部分」という用語は、ほぼＥＵ位置２４３からＥＵ位置２６１に向かって、ならびに、ほぼＥＵ位置２７５からＥＵ位置２９３に向かって、ならびに、ほぼＥＵ位置３０２からＥＵ位置３１９に向かって、ならびに、ほぼＥＵ位置３３６からＥＵ位置３４８に向かって、ならびに、ほぼＥＵ位置３６７からＥＵ位置３９３及びＥＵ位置４０８に向かって、ならびに、ほぼＥＵ位置４２４からＥＵ位置４４０に向かって伸びる抗体重鎖ポリペプチドの部分を意味する。一実施態様では、ＫａｂａｔのＥＵナンバリングによる１つ以上の下記アミノ酸残基が改変される。
【表３】
2020183967.tif 000004
【００８２】
「全長抗体」という用語は、ネイティブな抗体構造と実質的に同様の構造を有する抗体を意味する。全長抗体は、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含む２つの全長抗体軽鎖と、重鎖可変ドメイン、第１の定常ドメイン、ヒンジ領域、第２の定常ドメイン、及び第３の定常ドメインを含む２つの全長抗体重鎖とを含む。全長抗体は、更なるドメイン、例えば、全長抗体の１つ以上の鎖にコンジュゲーションした、更なるｓｃＦｖ又はｓｃＦａｂを含んでもよい。これらのコンジュゲートも、全長抗体という用語に包含される。
【００８３】
「ヒンジ領域」という用語は、例えば、ＫａｂａｔのＥＵナンバリングシステムによる約２１６位から約２３０位に向かう、ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとを結合する抗体重鎖ポリペプチドの部分を意味する。一実施態様では、ヒンジ領域は、ＫａｂａｔのＥＵナンバリングシステムによる残基２２１〜２３０を含む短縮化ヒンジ領域である。ヒンジ領域は、通常、同一のアミノ酸配列を有する２つのポリペプチドからなる二量体分子である。ヒンジ領域は、一般的には、約２５個のアミノ酸残基を含み、抗原結合領域を独立して動かせるようにフレキシブルである。ヒンジ領域は、３つのドメイン：上部、中央、及び下部ヒンジドメインに細分することができる（Roux, et al., J. Immunol. 161 (1998) 4083）。
【００８４】
「ホスト細胞」、「ホスト細胞株」、及び「ホスト細胞培養物」という用語は、互換的に使用され、外来性核酸が導入されている細胞を指し、このような細胞の子孫を含む。ホスト細胞は、「トランスフォーマント」及び「トランスフォーメーションされた細胞」を含む。「トランスフォーマント」及び「トランスフォーメーションされた細胞」は、初代のトランスフォーメーションされた細胞、及び継代回数に関わらずそれらから得られた子孫を含む。子孫は、親細胞に対して核酸含量が完全に同一でなくてもよく、突然変異を含有してもよい。元々トランスフォーメーションされた細胞についてスクリーニング又は選択されたのと同じ機能又は生物学的活性を有する突然変異子孫は、本明細書に含まれる。
【００８５】
「から得られた」という用語は、アミノ酸配列が、少なくとも１つの位置に改変を導入することにより、親アミノ酸配列から得られることを意味する。このため、得られたアミノ酸配列は、対応する親アミノ酸配列とは、少なくとも１つの対応する位置（抗体Ｆｃ領域についてのＫａｂａｔ  ＥＵインデックスによるナンバリング）において異なる。一実施態様では、親アミノ酸配列から得られたアミノ酸配列は、対応する位置において、１〜１５個のアミノ酸残基により異なる。一実施態様では、親アミノ酸配列から得られたアミノ酸配列は、対応する位置において、１〜１０個のアミノ酸残基により異なる。一実施態様では、親アミノ酸配列から得られたアミノ酸配列は、対応する位置において、１〜６個のアミノ酸残基により異なる。同様に、得られたアミノ酸配列は、その親アミノ酸配列に対して、高いアミノ酸配列同一性を有する。一実施態様では、親アミノ酸配列から得られたアミノ酸配列は、８０％以上のアミノ酸配列同一性を有する。一実施態様では、親アミノ酸配列から得られたアミノ酸配列は、９０％以上のアミノ酸配列同一性を有する。一実施態様では、親アミノ酸配列から得られたアミノ酸配列は、９５％以上のアミノ酸配列同一性を有する。
【００８６】
「ヒトＦｃ領域ポリペプチド」という用語は、「ネイティブ」又は「野生型」のヒトＦｃ領域ポリペプチドと同一のアミノ酸配列を意味する。「変異（ヒト）Ｆｃ領域ポリペプチド」という用語は、少なくとも１つの「アミノ酸改変」により、「ネイティブ」又は「野生型」のヒトＦｃ領域ポリペプチドから得られたアミノ酸配列を意味する。「ヒトＦｃ領域」は、２つのヒトＦｃ領域ポリペプチドからなる。「変異（ヒト）Ｆｃ領域」は、２つのＦｃ領域ポリペプチドからなり、両方とも、変異（ヒト）Ｆｃ領域ポリペプチドであることができ、又は、一方がヒトＦｃ領域ポリペプチドであり、他方が変異（ヒト）Ｆｃ領域ポリペプチドである。
【００８７】
一実施態様では、ヒトＦｃ領域ポリペプチドは、配列番号０７のヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域ポリペプチド、又は、配列番号０８のヒトＩｇＧ２Ｆｃ領域ポリペプチド、又は、配列番号０９のヒトＩｇＧ３Ｆｃ領域ポリペプチド、又は、配列番号１０のヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域ポリペプチドのアミノ酸配列を有する。一実施態様では、Ｆｃ領域ポリペプチドは、配列番号０７又は０８又は０９又は１０のＦｃ領域ポリペプチドから得られ、配列番号０７又は０８又は０９又は１０のＦｃ領域ポリペプチドと比較して、少なくとも１つのアミノ酸突然変異を有する。一実施態様では、Ｆｃ領域ポリペプチドは、約１〜約１０個のアミノ酸突然変異、及び一実施態様では、約１〜約５個のアミノ酸突然変異を含む／有する。一実施態様では、Ｆｃ領域ポリペプチドは、配列番号０７又は０８又は０９又は１０のヒトＦｃ領域ポリペプチドに対して、少なくとも約８０％の相同性を有する。一実施態様では、Ｆｃ領域ポリペプチドは、配列番号０７又は０８又は０９又は１０のヒトＦｃ領域ポリペプチドに対して、少なくとも約９０％の相同性を有する。一実施態様では、Ｆｃ領域ポリペプチドは、配列番号０７又は０８又は０９又は１０のヒトＦｃ領域ポリペプチドに対して、少なくとも約９５％の相同性を有する。
【００８８】
配列番号０７又は０８又は０９又は１０のヒトＦｃ領域ポリペプチドから得られたＦｃ領域ポリペプチドは、含有されるアミノ酸改変により定義される。このため、例えば、Ｐ３２９Ｇという用語は、配列番号０７又は０８又は０９又は１０のヒトＦｃ領域ポリペプチドに対して、アミノ酸位置３２９において、プロリンからグリシンへの突然変異を有する、Ｆｃ領域ポリペプチド由来ヒトＦｃ領域ポリペプチドを意味する。
【００８９】
本発明で検討された全ての重鎖位置について、ナンバリングは、ＥＵインデックスに従う。ＥＵインデックス又はＫａｂａｔにおけるＥＵインデックス又はＫａｂａｔ  ＥＵインデックス又はＥＵナンバリングスキームは、抗体のＥＵナンバリングを指す（Edelman, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63 (1969) 78-85、同文献は、その全体が参照により組み入れられる）。軽鎖残基のナンバリングは、Ｋａｂａｔ命名法に従う（Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91 3242）。
【００９０】
ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域ポリペプチドは、下記アミノ酸配列：
【表４】
2020183967.tif 000005
を有する。
【００９１】
突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域由来Ｆｃ領域ポリペプチドは、下記アミノ酸配列：
【表５】
2020183967.tif 000006
を有する。
【００９２】
Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ突然変異を有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域由来Ｆｃ領域ポリペプチドは、下記アミノ酸配列：
【表６】
2020183967.tif 000007
を有する。
【００９３】
Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ突然変異を有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域由来Ｆｃ領域ポリペプチドは、下記アミノ酸配列：
【表７】
2020183967.tif 000008
を有する。
【００９４】
Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ突然変異とＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ突然変異とを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域由来Ｆｃ領域ポリペプチドは、下記アミノ酸配列：
【表８】
2020183967.tif 000009
を有する。
【００９５】
Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡとＳ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ突然変異とを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域由来Ｆｃ領域ポリペプチドは、下記アミノ酸配列：
【表９】
2020183967.tif 000010
を有する。
【００９６】
Ｐ３２９Ｇ突然変異を有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域由来Ｆｃ領域ポリペプチドは、下記アミノ酸配列：
【表１０】
2020183967.tif 000011
を有する。
【００９７】
Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ突然変異とＰ３２９Ｇ突然変異とを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域由来Ｆｃ領域ポリペプチドは、下記アミノ酸配列：
【表１１】
2020183967.tif 000012
を有する。
【００９８】
Ｐ３２９Ｇ突然変異とＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ突然変異とを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域由来Ｆｃ領域ポリペプチドは、下記アミノ酸配列：
【表１２】
2020183967.tif 000013
を有する。
【００９９】
Ｐ３２９Ｇ突然変異とＳ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ突然変異とを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域由来Ｆｃ領域ポリペプチドは、下記アミノ酸配列：
【表１３】
2020183967.tif 000014
を有する。
【０１００】
Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９ＧとＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ突然変異とを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域由来Ｆｃ領域ポリペプチドは、下記アミノ酸配列：
【表１４】
2020183967.tif 000015
を有する。
【０１０１】
Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇ突然変異とＳ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ突然変異とを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域由来Ｆｃ領域ポリペプチドは、下記アミノ酸配列：
【表１５】
2020183967.tif 000016
を有する。
【０１０２】
ヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ポリペプチドは、下記アミノ酸配列：
【表１６】
2020183967.tif 000017
を有する。
【０１０３】
Ｓ２２８Ｐ及びＬ２３５Ｅ突然変異を有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域由来Ｆｃ領域ポリペプチドは、下記アミノ酸配列：
【表１７】
2020183967.tif 000018
を有する。
【０１０４】
Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ突然変異とＰ３２９Ｇ突然変異とを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域由来Ｆｃ領域ポリペプチドは、下記アミノ酸配列：
【表１８】
2020183967.tif 000019
を有する。
【０１０５】
Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ突然変異を有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域由来Ｆｃ領域ポリペプチドは、下記アミノ酸配列：
【表１９】
2020183967.tif 000020
を有する。
【０１０６】
Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ突然変異を有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域由来Ｆｃ領域ポリペプチドは、下記アミノ酸配列：
【表２０】
2020183967.tif 000021
を有する。
【０１０７】
Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５ＥとＳ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ突然変異とを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域由来Ｆｃ領域ポリペプチドは、下記アミノ酸配列：
【表２１】
2020183967.tif 000022
を有する。
【０１０８】
Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５ＥとＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ突然変異とを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域由来Ｆｃ領域ポリペプチドは、下記アミノ酸配列：
【表２２】
2020183967.tif 000023
を有する。
【０１０９】
Ｐ３２９Ｇ突然変異を有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域由来Ｆｃ領域ポリペプチドは、下記アミノ酸配列：
【表２３】
2020183967.tif 000024
を有する。
【０１１０】
Ｐ３２９ＧとＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ突然変異とを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域由来Ｆｃ領域ポリペプチドは、下記アミノ酸配列：
【表２４】
2020183967.tif 000025
を有する。
【０１１１】
Ｐ３２９ＧとＳ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ突然変異とを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域由来Ｆｃ領域ポリペプチドは、下記アミノ酸配列：
【表２５】
2020183967.tif 000026
を有する。
【０１１２】
Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｐ３２９ＧとＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ突然変異とを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域由来Ｆｃ領域ポリペプチドは、下記アミノ酸配列：
【表２６】
2020183967.tif 000027
を有する。
【０１１３】
Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｐ３２９ＧとＳ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ突然変異とを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域由来Ｆｃ領域ポリペプチドは、下記アミノ酸配列：
【表２７】
2020183967.tif 000028
を有する。
【０１１４】
種々のヒトＦｃ領域のアライメントを、以下に示す（ＥＵナンバリング）。
【表２８】
2020183967.tif 000029
【０１１５】
「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲ由来のアミノ酸残基とヒトＦＲ由来のアミノ酸残基とを含むキメラ抗体を指す。特定の実施態様では、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むであろうし、この場合、全て又は実質的に全てのＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）は、非ヒト抗体のＨＶＲに対応し、全て又は実質的に全てのＦＲは、ヒト抗体のＦＲに対応する。ヒト化抗体は、場合により、ヒト抗体から得られた抗体定常領域の少なくとも一部を含んでもよい。抗体、例えば、非ヒト抗体の「ヒト化型」は、ヒト化を受けている抗体を指す。
【０１１６】
「個体」又は「対象」は、哺乳類である。哺乳類は、飼育動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト及び非ヒト霊長類、例えば、サル）、ウサギ、ならびにげっ歯類（例えば、マウス及びラット）を含むが、これらに限定されない。特定の実施態様では、個体又は対象は、ヒトである。
【０１１７】
「単離された」抗体は、その天然の環境中での成分から分離されている抗体である。一部の実施態様では、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフィー（例えば、サイズ排除クロマトグラフィー又はイオン交換もしくは逆相ＨＰＬＣ）により決定された場合、９５％又は９９％超の純度に精製される。抗体純度を評価する方法のレビューについては、例えば、Flatman, S. et al., J. Chrom. B 848 (2007) 79-87を参照のこと。
【０１１８】
「単離された」核酸は、その天然の環境中での成分から分離されている核酸分子を指す。単離された核酸は、通常核酸分子を含有するが、核酸分子が、染色体外又はその天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する、細胞に含有される核酸分子を含む。
【０１１９】
本明細書で使用する場合、「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体集団から得られた抗体を指す。すなわち、該集団を含む個々の抗体は、例えば、自然発生的突然変異を含有し、又は、モノクローナル抗体調製物の生成中に生じる、可能性のある変異抗体を除いて、同一であり、及び／又は、同じエピトープに結合する。このような変異体は、一般的には、少量存在する。ポリクローナル抗体調製物が、典型的には、種々の決定因子（エピトープ）に対する種々の抗体を含むのとは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の１つの決定因子に対する。このため、「モノクローナル」という修飾語は、抗体の実質的に均一な集団から得られた抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の生成を必要とすると解釈されるべきではない。例えば、本発明に使用されるモノクローナル抗体は、各種の技術により調製することができる。同技術は、ハイブリドーマ法、リコンビナントＤＮＡ法、ファージ−ディスプレイ法、及びヒト免疫グロブリンローカスの全部又は一部を含有するトランスジェニック動物を利用する方法を含むが、これらに限定されない。このような方法及びモノクローナル抗体を調製する他の例示的な方法は、本明細書に記載されている。
【０１２０】
「ネイティブな抗体」は、可変性の構造を有する天然の免疫グロブリン分子を指す。例えば、ネイティブなＩｇＧ抗体は、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質であり、２つの同一の軽鎖と２つの同一の重鎖から構成される。同重鎖は、ジスルフィド結合している。Ｎ末端からＣ末端に向かって、各重鎖は、可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）、続けて、３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）を有する。同様に、Ｎ末端からＣ末端に向かって、各軽鎖は、可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）、続けて、定常軽鎖（ＣＬ）ドメインを有する。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２種類の内の一方に割り当てることができる。
【０１２１】
「負の線形ｐＨ勾配」という用語は、高い（すなわち、中性又はアルカリ性）ｐＨ値から開始して、より低い（すなわち、中性又は酸性）ｐＨ値で終了するｐＨ勾配を意味する。一実施態様では、負の線形ｐＨ勾配は、約８．８のｐＨ値で開始し、約５．５のｐＨ値で終了する。
【０１２２】
「非天然アミノ酸残基」という用語は、上記列記された天然アミノ酸残基以外のアミノ酸残基を意味し、ポリペプチド鎖中で、隣接するアミノ酸残基に共有結合することができる。非天然アミノ酸残基の例は、ノルロイシン、オルニチン、ノルバリン、ホモセリンである。更なる例は、Ellman, et al., Meth. Enzym. 202 (1991) 301-336に列記されている。非天然アミノ酸残基を合成する例示的な方法は、例えば、Noren, et al., Science 244 (1989) 182及び上記Ellman et al.に報告されている。
【０１２３】
「医薬製剤」という用語は、活性成分の生物学的活性が有効であるように含有されており、該製剤が投与されるであろう対象に対して許容できない毒性を示す更なる成分を含有していない形態にある調製物を指す。
【０１２４】
「薬学的に許容し得る担体」は、対象に対して非毒性である活性成分以外の医薬製剤中の成分を指す。薬学的に許容し得る担体は、バッファー、賦形剤、安定剤、又は保存剤を含むが、これらに限定されない。
【０１２５】
本明細書で使用する場合、「プラスミド」という用語は、連結される別の核酸を伝播可能な核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造体としてのプラスミドと、導入されているホスト細胞のゲノム内に組み込まれているプラスミドとを含む。特定のプラスミドは、操作可能に連結している核酸の発現を指示することができる。本明細書において、このようなプラスミドは、「発現プラスミド」と呼ばれる。
【０１２６】
「正の線形ｐＨ勾配」という用語は、低い（すなわち、より酸性）ｐＨ値で開始して、より高い（すなわち、ほぼ酸性でない、中性、又はアルカリ性）ｐＨ値で終了するｐＨ勾配を意味する。一実施態様では、正の線形ｐＨ勾配は、約５．５のｐＨ値で開始し、約８．８のｐＨ値で終了する。
【０１２７】
本明細書で使用する場合、「リコンビナント抗体」という用語は、リコンビナント手段により、調製、発現、作製、又は単離される全ての抗体（キメラ、ヒト化、及びヒト）を意味する。リコンビナント抗体は、ホスト細胞、例えば、ＮＳ０もしくはＣＨＯ細胞、又は、ホスト細胞内にトランスフェクションされたリコンビナント発現プラスミドを使用して発現されるヒト免疫グロブリン遺伝子又は抗体についてトランスジェニックな動物（例えば、マウス）から単離された抗体を含む。このようなリコンビナント抗体は、再配置された状態で、可変領域及び定常領域を有する。本明細書で報告されたリコンビナント抗体は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの体細胞超突然変異に供することができる。このため、リコンビナント抗体のＶＨ及びＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系ＶＨ及びＶＬ配列から得られ、同配列に関するが、ｉｎ  ｖｉｖｏでのヒト抗体生殖系レパートリー内には天然に存在しない場合がある配列である。
【０１２８】
「固体相」は、非流体物質を意味し、ポリマー、金属（常磁性、強磁性粒子）、ガラス、及びセラミック等の材料から形成された粒子（微小粒子及びビーズを含む）；ゲル状物質、例えば、シリカ、アルミナ、及びポリマーゲル；キャピラリー（ポリマー、金属、ガラス、及び／又はセラミックで形成することができる）；ゼオライト及び他の多孔性物質；電極；マイクロタイタープレート；固体ストリップ；ならびにキュベット、チューブ、又は他の分光計サンプル容器を含む。アッセイ法における固体相成分は、不活性な固体表面とは区別される。その場合、「固体支持体」は、その表面の少なくとも１つの部分を含有する。同部分は、分子と化学的に相互作用することを意図している。固体相は、定常部品、例えば、チップ、チューブ、ストリップ、キュベット、もしくはマイクロタイタープレートでもよく、又は、非定常部品、例えば、ビーズもしくは微小粒子でもよい。微小粒子は、均一なアッセイフォーマットのための固体支持体としても使用することができる。タンパク質及び他の物質の非共有又は共有付着の両方を可能にする各種の微小粒子を使用することができる。このような粒子は、ポリマー粒子、例えば、ポリスチレン及びポリ（メチルメタクリラート）；金粒子、例えば、金ナノ粒子及び金コロイド；ならびにセラミック粒子、例えば、シリカ、ガラス；ならびに金属酸化物粒子を含む。例えば、Martin, C.R., et al., Analytical Chemistry-News & Features, May 1 (1998) 322A-327Aを参照のこと。同文献は、参照により本明細書に組み入れられる。一実施態様では、固体支持体は、セファロースである。
【０１２９】
「実質的に同じ」という用語は、２つの値、例えば、２種類の異なる抗体のＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーカラムでの保持時間が、互いに５％以内であること、すなわち、５％未満で異なることを意味する。例えば、８０分の第１の保持時間と８４分の第２の保持時間とは、実質的に同じである。一方、８０分の保持時間と８５分の保持時間とは、実質的に同じではなく、これらの保持時間は異なる。一実施態様では、実質的に同じは、２つの値が、互いに３．５％以内であること、すなわち、３．５％以下で異なることを意味する。一実施態様では、実質的に同じは、２つの値が、互いに２．５％以内であること、すなわち、２．５％以下で異なることを意味する。２つの値の内の小さい方は、この計算の基礎となる。
【０１３０】
本明細書で使用する場合、「処置」（及び、その文法上の変形、例えば、「処置する」又は「処置すること」）は、処置される個体の自然経過を変える試みにおける臨床的介在を指し、予防のため、又は、臨床病理の進行中のいずれかで行うことができる。処置の望ましい効果は、疾患の発生又は再発を予防すること、兆候の緩和、疾患の直接又は間接的の病理進行のいずれかの除去、転移の予防、疾患進行速度の減速、疾患状態の緩和又は軽減、ならびに寛解又は改善された予後を含む。一部の実施態様では、本明細書で報告された抗体又はＦｃ領域融合ポリペプチドは、疾患の発生を遅延させ、又は、疾患の進行を遅らせるのに使用される。
【０１３１】
本願内で使用する場合、「価」という用語は、（抗体）分子中の特定数の結合部位の存在を意味する。なお、「二価」、「四価」、及び「六価」という用語はそれぞれ、（抗体）分子中の、２つの結合部位、４つの結合部位、及び６つの結合部位の存在を意味する。好ましい一実施態様において、本明細書で報告される二重特異性抗体は、「二価」である。
【０１３２】
「可変領域」又は「可変ドメイン」という用語は、抗体のその抗原への結合に関与する抗体重鎖又は軽鎖のドメインを指す。抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれ、ＶＨ及びＶＬ）は、概ね同様の構造を有する。各ドメインは、４つのフレームワーク領域（ＦＲ）と、３つの超可変領域（ＨＶＲ）とを含む（例えば、Kindt, T.J. et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., N.Y. (2007), page 91を参照のこと）。抗原結合特異性を付与するには、１つのＶＨ又はＶＬドメインで十分であることができる。更に、特定の抗原に結合する抗体は、抗原に結合する抗体由来のＶＨ又はＶＬドメインを使用し、相補なＶＬ又はＶＨドメインそれぞれのライブラリをスクリーニングして、単離することができる。例えば、Portolano, S. et al., J. Immunol. 150 (1993) 880-887; Clackson, T. et al., Nature 352 (1991) 624-628を参照のこと。
【０１３３】
「変異体」、「改変抗体」、及び「改変融合ポリペプチド」という用語は、親分子のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有する分子を意味する。典型的には、このような分子は、１つ以上の変化、挿入、又は欠失を有する。一実施態様では、改変抗体又は改変融合ポリペプチドは、天然由来でないＦｃ領域の少なくとも一部を含むアミノ酸配列を含む。このような分子は、親抗体又は親融合ポリペプチドに対して、１００％未満の配列同一性を有する。一実施態様では、変異抗体又は変異融合ポリペプチドは、親抗体又は親融合ポリペプチドのアミノ酸配列に対して、約７５％〜１００％未満、特に、約８０％〜１００％未満、特に、約８５％〜１００％未満、特に、約９０％〜１００％未満、及び特に、約９５％〜１００％未満のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。一実施態様では、親抗体又は親融合ポリペプチドと、変異抗体又は変異融合ポリペプチドとは、１つ（単独）、２つ、又は３つのアミノ酸残基で異なる。
【０１３４】
ＩＩ．本明細書に報告された方法
本発明は、少なくとも一部において、Ｆｖドメイン中の電荷分布が抗体−ＦｃＲｎ結合性に影響を及ぼし、抗体とＦｃＲｎとの間の更なる相互作用をもたらすという発見に基づいている。これは、特にｐＨ７．４での抗体−ＦｃＲｎ複合体の解離に関するＦｃＲｎ結合特性を変化させることにより、抗体のＦｃＲｎ依存性終末相半減期を短縮する。
【０１３５】
ａ）新生児Ｆｃレセプター（ＦｃＲｎ）
新生児Ｆｃレセプター（ＦｃＲｎ）は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＩｇＧクラスの抗体の代謝運命に重要である。ＦｃＲｎは、リボソーム分解経路から野生型ＩｇＧを救助するのに機能し、低下したクリアランス及び伸長した半減期をもたらす。ＦｃＲｎは、２つのポリペプチド：５０kDa クラスＩ主要組織適合性複合体様タンパク質（α−ＦｃＲｎ）と、１５kDa β２−ミクログロブリン（β２ｍ）とからなるヘテロ二量体タンパク質である。ＦｃＲｎは、クラスＩｇＧの抗体の、Ｆｃ領域のＣＨ２−ＣＨ３部分に、高い親和性で結合する。クラスＩｇＧの抗体とＦｃＲｎとの間の相互作用は、ｐＨ依存性であり、１：２の化学量論で生じる。すなわち、１つのＩｇＧ抗体分子が、その２つの重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドを介して、２つのＦｃＲｎ分子に相互作用することができる（例えば、［１６］を参照のこと）。
【０１３６】
このため、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＩｇＧ  ＦｃＲｎ結合特性／特徴は、血液循環中でのそのｉｎ  ｖｉｖｏ薬物動態特性を示している。
【０１３７】
ＦｃＲｎとＩｇＧクラスの抗体の、Ｆｃ領域との間の相互作用には、重鎖ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインの種々のアミノ酸残基が関与している。ＦｃＲｎと相互作用するアミノ酸残基は、ほぼＥＵ位置２４３とＥＵ位置２６１との間、ほぼＥＵ位置２７５とＥＵ位置２９３との間、ほぼＥＵ位置３０２とＥＵ位置３１９との間、ほぼＥＵ位置３３６とＥＵ位置３４８との間、ほぼＥＵ位置３６７とＥＵ位置３９３との間、ＥＵ位置４０８及び、ほぼＥＵ位置４２４とＥＵ位置４４０との間に位置している。より具体的には、ＫａｂａｔのＥＵナンバリングによる下記アミノ酸残基が、Ｆｃ領域とＦｃＲｎとの間の相互作用に関与している。
【表２９】
2020183967.tif 000030
【０１３８】
部位特異的突然変異誘発研究から、ＦｃＲｎに対するＩｇＧのＦｃ領域中の重要な結合部位は、ヒスチジン３１０、ヒスチジン４３５、及びイソロイシン２５３であり、より少ない程度で、ヒスチジン４３３及びチロシン４３６であることが証明されている（例えば、Kim, J.K., et al., Eur. J. Immunol. 29 (1999) 2819-2825；Raghavan, M., et al., Biochem. 34 (1995) 14649-146579；Medesan, C., et al., J Immunol. 158 (1997) 2211-2217を参照のこと）。
【０１３９】
ＦｃＲｎに対するＩｇＧ結合性を向上させる方法は、ＩｇＧを種々のアミノ酸残基：スレオニン２５０、メチオニン２５２、セリン２５４、スレオニン２５６、スレオニン３０７、グルタミン酸３８０、メチオニン４２８、ヒスチジン４３３、及びアスパラギン４３４で突然変異させることにより行われてきた（Kuo, T.T., et al., J. Clin. Immunol. 30 (2010) 777-789を参照のこと）。
【０１４０】
一部の場合では、血液循環中での短い半減期を有する抗体が望ましい。例えば、硝子体内適用の薬剤は、眼における長い半減期と、患者の循環における短い半減期を有するべきである。このような抗体は、疾患部位、例えば、眼における向上した曝露の利点も有する。
【０１４１】
ＦｃＲｎ結合性とそれに関する血液循環中での半減期に影響を及ぼす種々の突然変異が公知である。マウスＦｃ−マウスＦｃＲｎ相互作用に重要なＦｃ領域残基は、部位特異的突然変異誘発により特定されている（例えば、Dall’Acqua, W.F., et al. J. Immunol 169 (2002) 5171-5180を参照のこと）。残基Ｉ２５３、Ｈ３１０、Ｈ４３３、Ｎ４３４、及びＨ４３５（ＫａｂａｔによるＥＵナンバリング）は、この相互作用に関与している（Medesan, C., et al., Eur. J. Immunol. 26 (1996) 2533-2536；Firan, M., et al., Int. Immunol. 13 (2001) 993-1002；Kim, J.K., et al., Eur. J. Immunol. 24 (1994) 542-548）。残基Ｉ２５３、Ｈ３１０、及びＨ４３５は、ヒトＦｃとマウスＦｃＲｎとの相互作用に重要であることが見出された（Kim, J.K., et al., Eur. J. Immunol. 29 (1999) 2819-2825）。残基Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅは、タンパク質−タンパク質相互作用研究により、ＦｃＲｎ結合性を改善させることが、Dall‘Acqua et al.により記載されている（Dall'Acqua, W.F., et al. J. Biol. Chem. 281(2006) 23514-23524）。ヒトＦｃ−ヒトＦｃＲｎ複合体の研究から、残基Ｉ２５３、Ｓ２５４、Ｈ４３５、及びＹ４３６は、この相互作用に重要であることが示されている（Firan, M., et al., Int. Immunol. 13 (2001) 993-1002；Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604）。Yeung, Y.A., et al.（J. Immunol. 182 (2009) 7667-7671）には、残基２４８〜２５９及び３０１〜３１７及び３７６〜３８２及び４２４〜４３７の種々の突然変異体が報告され、試験されている。例示的な突然変異体及びＦｃＲｎ結合性におけるその効果を、下記表１に列記する。
【０１４２】
【表３０】
2020183967.tif 000031
2020183967.tif 000032
2020183967.tif 000033
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【０１４３】
Ｆｖドメイン中の電荷分布が、抗体−ＦｃＲｎ結合性に影響を及ぼし、抗体とＦｃＲｎとの間の更なる相互作用をもたらすことができることが見出された。これは、特にｐＨ７．４での抗体−ＦｃＲｎ複合体の解離に関するＦｃＲｎ結合特性を変化させることにより、抗体のＦｃＲｎ依存性終末相半減期に影響を及ぼす（短縮する）。
【０１４４】
ヒト新生児Ｆｃレセプター（ＦｃＲｎ）は、ＩｇＧ異化に重要な役割を果たす。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＩｇＧ  ＦｃＲｎ結合特性／特徴は、そのｉｎ  ｖｉｖｏ薬物動態特性を示している。このようなｉｎ  ｖｉｔｒｏ法は、繰り返しのｉｎ  ｖｉｖｏ研究を避けること（動物実験、時間、及び費用の削減）ができるため、抗体開発において非常に価値があるであろう。
【０１４５】
ＩｇＧ−ＦｃＲｎ相互作用は、プラズモン表面共鳴（ＳＰＲ）アッセイ法を使用して分析することができる（Wang, W., et al., Drug Metab. Disp. 39 (2011) 1469-1477；Datta-Mannan, A., et al., Drug Metab. Disp. 40 (2012) 1545-1555；Vaughn, D.E. and Bjorkman, P.J., Biochemistry 36 (1997) 9374-9380；Raghavan, M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 11200-11204；Martin, W.L. and Bjorkman, P.J., Biochemistry 38 (1999) 12639-12647）。
【０１４６】
熱量及び非対称流れ場流動分別法も、ＦｃＲｎに対するＩｇＧ結合親和性を評価するのに記載されている（Huber, A.H., et al., J. Mol. Biol. 230 (1993) 1077-1083；Pollastrini, J., et al., Anal. Biochem. 414 (2011) 88-98）。
【０１４７】
複合体アッセイ法に加えて、ＳＰＲにより決定されるｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＦｃＲｎ結合パラメータとｉｎ  ｖｉｖｏでの抗体の血清半減期との間の相関を調査する幾つかの研究は、これまで、改善された結合反応条件及び適切なモデリングにも関わらず、このような相関を説明できていない（Gurbaxani, B., et al., Mol. Immunol. 43 (2006) 1462-1473；Gurbaxani, B.M. and Morrison, S.L., Mol. Immunol. 43 (2006) 1379-1389；Gurbaxani, B., Clin. Immunol. 122 (2007) 121-124）。
【０１４８】
ＳＰＲ技術により測定された、ｐＨ６及び中性ｐＨでのＩｇＧ１のＦｃＲｎに対する親和性を改善するためのＩｇＧ１のＦｃ領域の操作は、カニクイザルにおいて改善された薬物動態をもたらさなかった（Yeung, Y.A., et al., J. Immunol. 182 (2009) 7663-7671）。ただし、ｐＨ７．４でのＦｃＲｎに対する同時の顕著な結合性を伴わずに、ｐＨ６において、Ｎ４３４Ａ  ＩｇＧ１変異体におけるＦｃＲｎ親和性がわずかにのみ向上したことは、霊長類において改善された薬物動態をもたらし、これは、ｐＨ７．４でのＦｃＲｎ放出の重要性を説明している（上記Yeung, Y.A.,を参照のこと）。
【０１４９】
例えば、ＩｇＧ−ＦｃＲｎ相互作用のＳＰＲ分析は、サンプルの予測又は予想外の結合特性を示す定性的結果を提供するが、予想外の結合性の原因のヒントも、予想外の結合性を有する抗体量の定量的推測も提供しない。
【０１５０】
正の線形勾配溶出を使用するＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィー法は、国際公開公報第２０１３／１２０９２９号に報告されている。
【０１５１】
ｂ）ＦｃＲｎ−Ｆａｂ電荷媒介性相互作用
Ｆｃ領域の特定の操作は、Ｆｃ領域とＦｃＲｎとの間の相互作用を変化させることにより、ＰＫパラメータに影響を及ぼすことが公知であり、特定のＰＫ特性を有する治療抗体を設計するのに使用されてきた［３３、３４］。
【０１５２】
近年、ＦｃＲｎ相互作用におけるＦａｂ領域の影響が議論されてきたが、同じ野生型ヒトＦｃ領域配列であるが、Ｆａｂ領域が異なる抗体の場合に、ＦｃＲｎ親和性において差異を示し、ＰＫが変化した。この相互作用のメカニズムは、不明なままである［２３、２４］。
【０１５３】
ＦｃＲｎ媒介性ＩｇＧホメオスタシスに対するＦａｂ領域の影響因子を示すために、抗体ペアであるブリアキヌマブ（Ozespa（商標））とウステキヌマブ（Stelara（商標））とを、モデル系として使用した。ブリアキヌマブ及びウステキヌマブは両方とも、完全なヒトモノクローナルＩｇＧ１抗体である。ブリアキヌマブ及びウステキヌマブは、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）及びインターロイキン２３（ＩＬ−２３）の同じヒトｐ４０−サブユニットに結合し［２６］、対応するマウスＩＬ−１２及びＩＬ−２３に対して交差反応性でない［２７、２８］。ブリアキヌマブ及びウステキヌマブはそれぞれ、ＶＨ５のＶκ１Ｄ生殖系ファミリーである可変重鎖及び軽鎖ドメインを有し、ＩｇＧ１κ抗体、ならびに、ＶＨ３のＶλ１生殖系ファミリーである可変重鎖及び軽鎖ドメインを有し、ＩｇＧ１λ抗体である。異なる可変ドメインに加えて、ブリアキヌマブ及びウステキヌマブは、定常ドメイン中の幾つかのアロタイプ特異的アミノ酸において差異を示す（図５を参照のこと）。ただし、これらのアミノ酸残基は、（同じ抗体の）ＦｃＲｎ結合領域の外側であるため、ＦｃＲｎ依存性ＰＫにおいて役割を果たさないと考えることができる［１１］。興味深いことに、ウステキヌマブは、２２日の（報告された）中央終末相半減期を有する［２９］が、一方で、ブリアキヌマブは、８〜９日のみの終末相半減期を有する［２６、３０、３１］。
【０１５４】
ｃ）電荷分布及びｐＨ依存性の正味電荷
ブリアキヌマブは、７．４の生理学的ｐＨにおいて不均一な電荷分布を示す（例えば、ウステキヌマブの公開されている結晶構造［２７］及びブリアキヌマブの相同性モデルを参照のこと）。ブリアキヌマブは、Ｆｖドメイン上に大きな正に電荷した領域を示す（図１ａを参照のこと）。この領域は、ウステキヌマブには存在しない（図１ｂを参照のこと）。更に、ＦｃＲｎは、強力で、広い負に電荷した領域を有する（図１ｃを参照のこと）。ただし、この領域は、同じ抗体のＦｃ領域結合性に関与しない。ブリアキヌマブ及びウステキヌマブはそれぞれ、９．７及び９．４の算出等電点を有する。更に、ブリアキヌマブの正味電荷は、ｐＨ範囲全体にわたって、わずかにより正である（図１ｄを参照のこと）。
【０１５５】
ｐＨ６．０でのブリアキヌマブ及びウステキヌマブのＦｃＲｎ結合親和性は同等である。すなわち、両方の値は、最大で１桁又は規模、一実施態様では、最大５倍異なる。一方、ＦｃＲｎからの解離は、非常に異なる。ブリアキヌマブ及びウステキヌマブの変異体を使用して、相互作用は、主に静電的であり、正に荷電した領域（以下を参照のこと）の範囲に相関することを示すことができる。
【０１５６】
ｄ）ｐＨ依存性ＦｃＲｎ−ＩｇＧ相互作用
ブリアキヌマブ及びウステキヌマブの１０個の変異体が合成され、ＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーにより、そのＦｃＲｎ結合特性に関して特徴決定されている（表２を参照のこと）。変異体において、可変領域が改変されており、ｐＨ６でのＦｃＲｎ結合親和性及びＦｃＲｎ解離について、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）及びＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーをそれぞれ使用して試験されている（表３を参照のこと）。
【０１５７】
表２：ブリアキヌマブ及びウステキヌマブの体系的に操作された変異体。Ｆｖ、ＬＣ、及びＣＤＲ等の構造部分を、ブリアキヌマブ（明部）とウステキヌマブ（暗部）との間で交換した：ｍＡｂ１〜６。ブリアキヌマブのＨＣ中の３つ及び５つの塩基性アミノ酸をそれぞれ、ｍＡｂ７及びｍＡｂ８のために、（部位特異的突然変異誘発により）アラニン残基に交換した。ｍＡｂ９は、軽鎖ＣＤＲ中の３つの塩基性アミノ酸がアラニン残基に交換されたブリアキヌマブである。ｍＡｂ１０は、ＨＣ中の５つの塩基性アミノ酸の更なる交換を有するｍＡｂ９を表す。１つの塩基性アミノ酸の交換を、円で示し、交換された３つのアミノ酸を、１つの円として描画し、交換された５つのアミノ酸を、２つの円として描画する。
【表３１】
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【０１５８】
表３：全ての試験した抗体のＦｃＲｎ結合親和性及び電荷分布。抗体を、ＦｃＲｎカラムの保持時間に従って分取する。平衡解離定数ＫＤを、定常状態の親和性として算出し、ウステキヌマブのＫＤに対して正規化した。相対ＫＤ値（ウステキヌマブ＝１）の比較を、平均（ｎ＝３）±標準偏差（ＳＤ）として表す。ｐＨ６．０及びｐＨ７．４でのＦｖドメインの等電点及び正味電荷を算出した（SaWI-Tools）。ＦｃＲｎカラムの保持時間は、ｐＨ６．０又はｐＨ７．４でのＦｖドメインの等電点又は正味電荷とは相関しない。
【表３２】
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【０１５９】
ｐＨ６でのＦｃＲｎ結合親和性は、１１個全ての抗体について狭い範囲にある（表３を参照のこと）。平衡解離定数（ＫＤ）を、ウステキヌマブに対して算出した（ウステキヌマブ＝１．０）。ブリアキヌマブは、０．２の相対ＫＤを有した。９つの変異体は、ブリアキヌマブとウステキヌマブとの間の範囲にあった。このため、異なるｉｎ  ｖｉｖｏでの終末相半減期は、ｐＨ６．０での異なるＦｃＲｎ結合性によるものではないということを結論付けることができる。
【０１６０】
本明細書で報告された一態様は、下記工程：
ａ）変異抗体及びその親抗体について、表面プラズモン共鳴を使用して、ｐＨ６におけるＫＤ値を決定する工程と、
ｂ）高塩濃度の存在下での正の線形ｐＨ勾配溶出によるＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーカラムでの変異抗体及びその親抗体の保持時間を決定する工程とを含み、
これにより、ＫＤ値が、最大１０倍異なり、変異抗体とその親抗体との間の工程ｂ）で決定された保持時間が、実質的に異なる場合、ｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期に影響を及ぼす抗体−Ｆｃ−ＦｃＲｎ複合体における抗体−Ｆａｂ−ＦｃＲｎ相互作用の存在が決定される、
抗体のｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期に影響を及ぼす抗体−Ｆｃ−ＦｃＲｎ複合体における抗体−Ｆａｂ−ＦｃＲｎ相互作用の存在を決定する方法である。
【０１６１】
本明細書に報告された一態様は、下記工程：
ａ）変異抗体及びその親抗体について、表面プラズモン共鳴を使用して、ｐＨ６におけるＫＤ値を決定する工程と、
ｂ）高塩濃度の存在下での正の線形ｐＨ勾配溶出によるＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーカラムでの変異抗体及びその親抗体の保持時間を決定する工程とを含み、
これにより、ＫＤ値が、最大１０倍異なり、変異抗体の工程ｂ）で決定された保持時間が、その親抗体の保持時間より短い／小さい場合、抗体は、その親抗体と比較して相対的に短いｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期を有し、また、これにより、ＫＤ値が、最大１０倍異なり、変異抗体の工程ｂ）で決定された保持時間が、その親抗体の保持時間より長い／大きい場合、抗体は、その親抗体と比較して相対的に長いｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期を有する、
抗体の相対的なｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期を決定する方法である。
【０１６２】
本明細書に報告された一態様は、下記工程：
ａ）変異抗体及びその親抗体について、表面プラズモン共鳴を使用して、ｐＨ６におけるＫＤ値を決定する工程と、
ｂ）高塩濃度の存在下での正の線形ｐＨ勾配溶出によるＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーカラムでの変異抗体及びその親抗体の保持時間を決定する工程とを含み、
これにより、ＫＤ値が、最大１０倍異なり、変異抗体の工程ｂ）で決定された保持時間が、その親抗体の保持時間より短い／小さい場合、抗体は、その親抗体と比較して短いｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期を有し、また、これにより、ＫＤ値が、最大１０倍異なり、変異抗体の工程ｂ）で決定された保持時間が、その親抗体の保持時間より長い／大きい場合、抗体は、その親抗体と比較して長いｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期を有する、
抗体のｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期の伸長又は短縮を決定する方法である。
【０１６３】
１２個の抗体の溶出プロファイルを、正の線形ｐＨ勾配溶出によるＦｃＲｎ親和性カラムを使用して分析した（図２を参照のこと）。ウステキヌマブ、及びブリアキヌマブの定常部上にウステキヌマブのＦｖドメインを有するｍＡｂ１は、８４分付近の区別できない保持時間を示した。このことは、ＦｖドメインがＦｃＲｎとの相互作用に影響を及ぼすことを示している。一方、ブリアキヌマブは、９４分の保持時間で溶出したため、ウステキヌマブと比較して明らかに異なる保持時間を有した。ブリアキヌマブのＩｄｅＳ開裂Ｆｃ領域（８５．７分）とウステキヌマブ（８５．２分）の区別できない保持時間は、Ｆｃ領域の役割を無視できることを示した。ウステキヌマブＬＣ（ＬＣ＝軽鎖、ＨＣ＝重鎖）及びブリアキヌマブＨＣを含有するｍＡｂ４は、ウステキヌマブに近い保持時間を有した。このことは、ＦｃＲｎ結合におけるＬＣの影響を示す。
【０１６４】
変異抗体ｍＡｂ５及びｍＡｂ６は、ブリアキヌマブのフレームワーク上にウステキヌマブＣＤＲ（重鎖及び軽鎖の部分）を有し、及びその逆を有する。ブリアキヌマブ上にウステキヌマブＣＤＲをグラフト化すること（ｍＡｂ５）により、ｍＡｂ５の保持時間は、ウステキヌマブの保持時間に近づくようにシフトした。ウステキヌマブ上にブリアキヌマブＣＤＲをグラフト化すること（ｍＡｂ６）により、ウステキヌマブにもっと近づいた溶出プロファイルが説明／表示された。
【０１６５】
ブリアキヌマブからウステキヌマブの方向への強力な保持時間シフトが、軽鎖ＣＤＲ中の３つの正に電荷した残基をアラニン残基に突然変異させたブリアキヌマブ変異体であるｍＡｂ９について観察された。
【０１６６】
ブリアキヌマブの重鎖中の３つ及び５つの正に電荷した残基をそれぞれ、ｍＡｂ７及びｍＡｂ８において突然変異させた。これらの変異体では、保持時間は、ブリアキヌマブに対してシフトした。
【０１６７】
ウステキヌマブのＨＣ及びブリアキヌマブのＬＣを含むｍＡｂ３と、ウステキヌマブの定常ドメイン上にブリアキヌマブのＦｖドメインを含有するｍＡｂ２とは両方とも、ブリアキヌマブの近くで溶出した。
【０１６８】
まとめると、データから、Ｆｖドメインは、ＦｃＲｎ解離に影響を及ぼし、（ｐＨ６．０での）ＦｃＲｎ結合に影響を及ぼさないことが示される。
【０１６９】
ＦｃＲｎカラム保持時間を、抗体の等電点及び正味電荷と整列させた。リソソームのｐＨ６．０又は生理学的ｐＨ７．４において、ＦｃＲｎカラム保持時間と、Ｆｖドメインの等電点又は正味電荷との間には、相間を見ることができない（表３を参照のこと）。ただし、測定したＦｃＲｎカラム保持時間は、特に、軽鎖可変ドメイン周囲の正に電荷した領域の程度を共に伸長した（図２を参照のこと）。
【０１７０】
本明細書で報告された一態様は、
抗体軽鎖中の２７、５５、及び９４位（Ｋａｂａｔによるナンバリング）の荷電アミノ酸残基を、疎水性又は中性の親水性アミノ酸残基に変化させることにより、抗体のｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期を伸長する工程を含む、
抗体のｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期を伸長する方法である。
【０１７１】
アミノ酸は、共通する側鎖特性に従って分類することができる：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性で親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向性に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族性：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【０１７２】
酸性及び塩基性アミノ酸残基は、荷電したアミノ酸残基のグループにまとめられる。
【０１７３】
また、ＦｃＲｎカラム保持時間を、移動相中の増大したイオン強度での種々の設定において、すなわち、増大した塩濃度の存在下において決定した。電荷媒介性相互作用は、高イオン強度条件下において、弱められるのが公知である。一方、疎水性相互作用は、典型的には、塩により強められる。ブリアキヌマブのＦｃＲｎカラム保持時間が塩の存在下で短縮され、電荷スクリーニングのデバイ−ヒュッケル法に示唆されたように、イオン強度の逆平方根に比例したことが見出された［３２］。ウステキヌマブの保持時間は、基本的に影響を受けないままであった（図６を参照のこと）。このため、過剰なＦｃＲｎ−ブリアキヌマブ相互作用の相当な部分が、荷電媒介性である。
【０１７４】
上記をまとめると、操作された変異体のＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーは、同じＦｖドメインを有する抗体（ｍＡｂ１及びｍＡｂ２）と、同じＬＣを有する抗体（ｍＡｂ３及びｍＡｂ４）とは、ほぼ同一のＦｃＲｎカラム保持時間で溶出することを示した。更に、ブリアキヌマブ上にウステキヌマブＣＤＲをグラフト化すること（ｍＡｂ５）により、溶出ｐＨは、ウステキヌマブの溶出ｐＨに近づくようにシフトする。このため、軽鎖ＣＤＲは、ブリアキヌマブのＦｃＲｎ結合性に主な影響を提供する。
【０１７５】
ウステキヌマブ上にブリアキヌマブＣＤＲをグラフト化すること（ｍＡｂ６）により、ウステキヌマブにもっと近づいた溶出プロファイルが示された。このため、理論に拘束されるものではないが、抗体−ＦｃＲｎ相互作用は、より小さく正に電荷した領域を形成することによるより、ブリアキヌマブの大きな正に電荷した領域を破壊することにより影響を受ける可能性がある。ＭＤシミュレーション（以下を参照のこと）により示唆されるように、正に電荷したＦｖドメインとＦｃＲｎ中の負に電荷した領域との間を直接安定化する相互作用は、容易に実行できる。このため、ＦｃＲｎ−Ｆｖ相互作用は、生理学的条件下での、ＦｃＲｎ−ＩｇＧ複合体の通常より遅い解離をもたらすことができる。
【０１７６】
ｅ）ヒトＦｃＲｎトランスジェニックマウスにおける薬物動態のＦｃＲｎ溶出ｐＨとの相関
以前の研究において、抗体と内皮細胞表面上の負に電荷した基との間での静電相互作用に影響を及ぼすことにより、正味電荷が、変化した薬物動態特性のための駆動力となることが議論されてきた［３５、３６］。例えば、Igawa et al,［３７］は、可変領域中の操作によるより低い等電点（ｐＩ）を有するＩｇＧ４抗体が、より遅い速度の流動相飲作用、続けて、低下した除去速度を有することを観察した。更に、Boswell et al.［３８］は、ｐＩの差異が、ＰＫに影響を及ぼす少なくとも１つのユニットに必要であったと提案した。
【０１７７】
ブリアキヌマブ、ウステキヌマブ、ｍＡｂ８、及びｍＡｂ９のｐＩは、９．３〜９．７で変動する。したがって、流動相飲作用におけるｐＩの差異による影響は最小であると仮定することができる。ただし、高イオン強度条件下でのブリアキヌマブのより短いＦｃＲｎカラム保持時間（上記を参照のこと）と、ＭＤシミュレーションにおけるウステキヌマブと比較したＦｃＲｎ−Ｆｖ相互作用に対するより高い静電的寄与（以下を参照のこと）とから、特異的に位置した電荷が、ＦｃＲｎ−ＩｇＧ相互作用における主な影響因子であることができることが示される。Ｆｖドメイン中における電荷の影響を、突然変異させたブリアキヌマブＨＣ中の３つ（ｍＡｂ７）及び５つ（ｍＡｂ８）の正に電荷した残基を有する突然変異体と、軽鎖ＣＤＲ中に突然変異させた３つの正に電荷した残基を有するブリアキヌマブ（ｍＡｂ９）とを使用して分析した。ｍＡｂ７及びｍＡｂ８は、保持時間が、ウステキヌマブの方向に小さくシフトすることを示す。このことから、電荷媒介性相互作用が確認される。一方、ｍＡｂ９は、保持時間が、ウステキヌマブの方向に大きくシフトすることを示す。このため、軽鎖ＣＤＲ中に特異的に位置する電荷は、ＦｃＲｎ解離に強力に影響を及ぼす。
【０１７８】
ブリアキヌマブの可変ドメイン中の突然変異させた荷電残基のＦｃＲｎ結合性における影響がモデュレーションされたｉｎ  ｖｉｖｏでのＰＫ特性に変換されるかどうかを評価するために、ヒトＦｃＲｎトランスジェニックマウスにおけるＰＫ研究を行った。ブリアキヌマブ及びウステキヌマブと共に、ブリアキヌマブとウステキヌマブとの間のＦｃＲｎカラム保持時間を有したブリアキヌマブの２つの変異体（ｍＡｂ８及びｍＡｂ９）を試験した。４つの抗体の分布及び除去プロセスは、他のＩｇＧ  ＰＫ研究と一致する（図３ａを参照のこと）。ブリアキヌマブは、α−期において、他の抗体より速い減少を示した。興味深いことに、ブリアキヌマブ及びウステキヌマブはそれぞれ、４８時間及び１３７時間の終末相半減期を示した（図３ｂを参照のこと）。Ｆｖドメイン中により小さい正に電荷した領域を有する変異体ｍＡｂ８及びｍＡｂ９はそれぞれ、７８時間及び１０９時間の終末相半減期を有した。統計学的有意差を、ブリアキヌマブ及びウステキヌマブ、ブリアキヌマブ及びｍＡｂ９、ならびにウステキヌマブ及びｍＡｂ８の終末相半減期間で検出することができた。ウステキヌマブ、ｍＡｂ９、ｍＡｂ８、及びブリアキヌマブはそれぞれ、７．４、７．５、７．７、及び７．９の溶出ｐＨに対応して、８４．３、８６．２、９０．１、及び９３．７分で溶出した。このため、４つのＩｇＧの終末相半減期は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＦｃＲｎカラム溶出ｐＨ値と直線的に相関することが見出された（図３ｂを参照のこと）。
【０１７９】
ＰＫ実験において、終末相半減期を試験した。この試験は、ＦｃＲｎリサイクリングが優勢である排出相において排他的に算出される［３９］。４つの抗体の終末相半減期は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＦｃＲｎカラム溶出ｐＨと直線的に相関する。ＦｃＲｎカラム溶出ｐＨが高いほど、終末相半減期がより短いため、このことはＦｃＲｎカラムが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＦｃＲｎ解離のための予測／知覚ツールであることを実証する。終末相半減期とＦｃＲｎカラム溶出ｐＨとの間の相関から、生理学的ｐＨでの速いＦｃＲｎ−ＩｇＧ解離の重要性が確認される。
【０１８０】
理論に拘束されるものではないが、ＦｃＲｎ−ＩｇＧ複合体は、ｐＨ６．０のエンドソーム中で構築されるため、ほとんど結合しない場合には、ＩｇＧリサイクリングがほとんどなく、より速いクリアランスがもたらされる。エキソサイト−シスにより、ＦｃＲｎ−ＩｇＧ複合体は、細胞膜に放出される。この場合、ＩｇＧとＦｃＲｎとの解離は、７．４の生理学的ｐＨにおいて、短時間に行われる必要がある［４０］。その結果、生理学的ｐＨでの解離は、伸長した半減期にも重要である［２２、４０］。
【０１８１】
このため、より高いｐＨ値での解離が、ＦｃＲｎからのより遅い解離を示すことが見出された。理論に拘束されるものではないが、このことは、血液循環に戻るように抗体を放出する代わりに、リソソーム中での抗体の分解をもたらす。
【０１８２】
このため、ＩｇＧのＦｖドメイン中の電荷は、ＩｇＧとＦｃＲｎとの間の相互作用を変化させることにより、終末相半減期に影響を及ぼすことが見出された。ＦｃＲｎと相互作用するＦａｂの構造部分が位置しており、相互作用は、荷電媒介性であることが実証された。ＰＫ研究から、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＦｃＲｎ−ＩｇＧ解離とｉｎ  ｖｉｖｏでの終末相半減期との間の直線的相関が証明された。
【０１８３】
ｆ）ＦｃＲｎ−ＩｇＧモデルの分子動力学（ＭＤ）シミュレーション
ヒトＦｃＲｎ−Ｆｃ複合体の相同性モデルを、公開されているラットＦｃＲｎ構造をテンプレートとして使用して生成した。ブリアキヌマブ及びウステキヌマブのＦｖドメインの位置を、完全なＩｇＧ１（ＰＤＢコード  １ＨＺＨ）の結晶構造に基づいてモデル化した。これらの相同性モデルは、１つの完全なＩｇＧ分子上にＦｃＲｎ（β２ｍを含むα−ＦｃＲｎ）の２つのコピーを含有する（図４ａを参照のこと）。ＦｃＲｎとＦｖドメインとの間の距離は、開始構造において４０Å超であり、生理学的条件下において、約８Åのデイビー長を超える［３２］。ＦｃＲｎ−ＩｇＧ複合体の動力学を、分子動力学シミュレーションにより、１００nsの期間にわたって、顕在する水及び生理学的イオン強度においてシミュレーションした。シミュレーションの経過中に、２つのＦａｂ領域の一方が、ＦｃＲｎの先端に近づき、シミュレーション時間の残りの間この配置で持続した（図４ｂ、ｃ、ｄを参照のこと）。Ｆｖドメインと相互作用することが見出されたＦｃＲｎ上の領域は、今までは、ＩｇＧ結合性に関与するとは説明されていなかった。驚くべきことに、ＭＤシミュレーションにおいて、ブリアキヌマブだけでなくウステキヌマブも、ＦｖとＦｃＲｎとが互いに相互作用するコンホーメーションが仮定された（図４ｂ、ｃを参照のこと）。両複合体において、非対称な開始構造中の２種類の異なるペアのＦｖ及びＦｃＲｎドメインが互いに接近したことが見出された。ＦｃＲｎ−Ｆｖ相互作用に対する静電的寄与は、ブリアキヌマブにおいて、ウステキヌマブの程度より約２倍高いことが見出された（図４ｅを参照のこと）。
【０１８４】
まとめると、ＦｃＲｎ−ＩｇＧ複合体のＦａｂアームの固有のフレキシビリティが構造的に、ＦｖドメインとＦｃＲｎの先端との直接的な安定化相互作用を可能にすることが見出された。
【０１８５】
ｇ）本発明の方法
ｇ．ｉ）種々の塩濃度での正の線形ｐＨ勾配による溶出
本明細書において、下記２つの工程：
ａ）第１の塩濃度の存在下での正の線形ｐＨ勾配溶出によるＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体の保持時間を決定する工程と、
ｂ）第２の塩濃度の存在下での正の線形ｐＨ勾配溶出によるＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体の保持時間を決定する工程とを含む、方法が報告されている。
【０１８６】
第２の塩濃度は、一般的には、第１の塩濃度より高い／大きい。このため、これらの塩濃度は、ほぼ同一でない。すなわち、これらの濃度は、少なくとも１０％、一実施態様では、少なくとも２０％異なる。
【０１８７】
この方法について、単純なクロマトグラフィー法において、種々の塩濃度の存在下で得られた保持時間を比較することにより（図１３を参照のこと）、又は、全長抗体及びそのＦｃ領域の保持時間を比較することにより、抗体−Ｆｃ−ＦｃＲｎ複合体における抗体−Ｆａｂ−ＦｃＲｎ相互作用の存在を決定することができる。これは、抗体−Ｆａｂ−ＦｃＲｎ相互作用が抗体のｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期に影響を及ぼすため重要である。
【０１８８】
抗体／参照抗体ペアについて、ＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーカラムでのその保持時間に関する種々の関係と、そのＦｃＲｎ相互作用に関する種々の関係とが存在する。
１）抗体及び参照抗体は、工程ａ）及び工程ｂ）において実質的に同じ保持時間を有する。この場合、両抗体のｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期は、実質的に同じであるべきである。すなわち、ｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期は、抗体−Ｆａｂ−ＦｃＲｎ相互作用により影響を受けない。又は
２）抗体及び参照抗体は、工程ａ）において実質的に同じ保持時間を有するが、工程ｂ）において異なる保持時間を有する。この場合、抗体のｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期は、参照抗体のｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期より短い。すなわち、ｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期は、抗体−Ｆａｂ−ＦｃＲｎ相互作用により影響を受ける。
【０１８９】
本抗体は、親抗体の変異抗体であることができる。この場合、参照抗体は、親抗体である。
【０１９０】
一事例では、参照抗体は、ＩｄｅＳ開裂又はパパイン開裂後のそのＦｃ領域と実質的に同じ保持時間を有する抗体である。
【０１９１】
今日知られている多様な疾患及び将来証明されるであろう疾患をも処置する治療法を提供するために、テーラーメイド抗体及びＦｃ領域含有ポリペプチドの必要性が存在する。
【０１９２】
抗体のＦｃＲｎ結合特性をテーラーメイドするために、ＦｃＲｎ相互作用に関与する残基を改変し、得られた改変抗体を試験しなければならない。要求される特徴に合致しなければ、同じプロセスを再度行う。
【０１９３】
このため、改変抗体における特徴の変化を分析するためのｉｎ  ｖｉｖｏでの研究を必要としない単純なクロマトグラフィー法に基づいて、改変抗体の特徴的特性の変化を予測する方法を提供するのは有益であろう。
【０１９４】
一部の事例では、伸長した半減期を有する抗体が望ましい。例えば、処置を必要とする患者の循環中で伸長した半減期を有する薬剤は、用量を減らす、又は、投与間隔を広げる必要がある。このような抗体は、疾患部位、例えば、腫瘍に対する向上した曝露の利点も有する。
【０１９５】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期は、ＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーカラムでの保持時間と相関する。これは、特に、抗体とＦｃＲｎとの間の相互作用がほぼ、抗体Ｆｃ領域中の残基によってのみ媒介される場合に当てはまる。ただし、抗体Ｆｃ領域の外側、例えば、抗体−Ｆａｂ中の残基も、ＦｃＲｎと相互作用する場合でも、この相関を、更に確認する必要がある。これは、低塩濃度及び高塩濃度又はインタクトな抗体及びＦｖ領域開裂抗体（＝Ｆｃ領域）の存在下での正の線形ｐＨ勾配溶出によるＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィー法における保持時間の変化を利用する、本明細書で報告された方法により行うことができる。保持時間が、低から高に向かう塩濃度の変化、又は、Ｆｃ領域の開裂により実質的に影響を受けない場合、抗体−Ｆａｂ−ＦｃＲｎ相互作用は存在せず、ＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーカラムでのより長い保持時間は、伸長したｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期と相関する。ただし、低から高に向かう塩濃度の変化、又は、Ｆｃ領域の開裂により、保持時間が影響を受ける場合、特に、保持時間が短縮される場合、ｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期は、ＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーカラムにおける保持時間とは異なって相関する。すなわち、ＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーカラムにおけるより長い保持時間は、生理学的ｐＨでの低下した抗体−ＦｃＲｎ解離、及び、理論に拘束されるものではないが、抗体の向上したリソソーム分解のために、より短いｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期に相関する。
【０１９６】
本明細書で使用されるＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーカラムは、マトリックスと、マトリックス結合クロマトグラフ官能基とを含む。この場合、このマトリックス結合クロマトグラフ官能基は、新生児Ｆｃレセプター（ＦｃＲｎ）とベータ−２−ミクログロブリンとの非共有複合体を含む。
【０１９７】
一般的には、本明細書に報告された方法のための開始点は、ＦｃＲｎに対するその結合性により特徴付けられた、親又は参照抗体である。
【０１９８】
本明細書に報告された一態様は、下記工程：
ａ）第１の塩濃度の存在下での正の線形ｐＨ勾配溶出によるＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体の保持時間を決定する工程と、
ｂ）第２の塩濃度の存在下での正の線形ｐＨ勾配溶出によるＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体の保持時間を決定する工程とを含み、
これにより、工程ａ）で決定された保持時間と工程ｂ）で決定された保持時間とが実質的に異なる場合、ｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期に影響を及ぼす抗体−Ｆｃ−ＦｃＲｎ複合体における抗体−Ｆａｂ−ＦｃＲｎ相互作用の存在が決定される、
ｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期に影響を及ぼす抗体−Ｆｃ−ＦｃＲｎ複合体における抗体−Ｆａｂ−ＦｃＲｎ相互作用の存在を決定するための本明細書に報告された方法の使用である。
【０１９９】
本明細書に報告された一態様は、下記工程：
ａ）第１の塩濃度の存在下での正の線形ｐＨ勾配溶出によるＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体の保持時間を決定する工程と、
ｂ）第２の塩濃度の存在下での正の線形ｐＨ勾配溶出によるＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体の保持時間を決定する工程とを含み、
これにより、工程ａ）で決定された保持時間と工程ｂ）で決定された保持時間とが実質的に異なる場合、ｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期に影響を及ぼす抗体−Ｆｃ−ＦｃＲｎ複合体における抗体−Ｆａｂ−ＦｃＲｎ相互作用の存在が決定される、
ｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期に影響を及ぼす抗体−Ｆｃ−ＦｃＲｎ複合体における抗体−Ｆａｂ−ＦｃＲｎ相互作用の存在を決定する方法である。
【０２００】
変異抗体は、親抗体ポリペプチドと比較した場合、又は、参照抗体と比較した場合、ＦｃＲｎに対する向上又は低下した結合性のいずれかを示すため、親／参照抗体と比較して、血清中での変化した半減期を有する。
【０２０１】
一般的には、ＦｃＲｎに対する向上した親和性（すなわち、親抗体又は参照抗体と比較して、ＦｃＲｎカラムにおける伸長した保持時間）を有するＦｃ領域変異体は、まず、ＦｃＲｎに対する低下した親和性（すなわち、親抗体又は参照抗体と比較して、ＦｃＲｎカラムにおける短縮した保持時間）を有するものと比較して、より長い血清半減期を有することが予測される。
【０２０２】
この予測されたｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期を、その後確認する必要がある。この確認のために、本明細書に報告された方法を使用することができる。
【０２０３】
伸長したｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期を有する抗体変異体は、哺乳類、特にヒトを処置する方法における適用を有する。この場合、例えば、慢性疾患又は障害の処置において、投与された抗体の半減期は、長いのが望ましい。
【０２０４】
ＦｃＲｎに対して低下した親和性を有する抗体変異体は、哺乳類、特にヒトを処置する方法における適用を有する。この場合、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏでの画像診断において、投与された抗体又は融合ポリペプチドの半減期は、短いのが望ましい。
【０２０５】
低下したＦｃＲｎ結合親和性を有する抗体変異体は、おそらく胎盤を通過できる可能性が高いため、妊婦における、特に、胎児の疾患又は障害の処置に使用することができる。加えて、低下したＦｃＲｎ結合親和性は、脳、腎臓、及び／又は肝臓への適用／輸送を意図した薬剤に望ましい場合がある。
【０２０６】
本明細書に報告された一態様は、血管系から腎臓の糸球体の上皮を通過する低下した輸送を示す抗体を特定するための、本明細書に報告された方法の使用である。
【０２０７】
本明細書に報告された一態様は、脳から血管空間内への血液脳関門を通過する低下した輸送を示す抗体を特定するための、本明細書に報告された方法の使用である。
【０２０８】
本明細書に報告された全態様の一実施態様では、ＦｃＲｎは、ヒトＦｃＲｎ、カニクイザルＦｃＲｎ、マウスＦｃＲｎ、ラットＦｃＲｎ、ヒツジＦｃＲｎ、イヌＦｃＲｎ、ブタＦｃＲｎ、ミニブタＦｃＲｎ、及びウサギＦｃＲｎから選択される。
【０２０９】
本明細書に報告された全態様の一実施態様では、ベータ−２−ミクログロブリンは、ＦｃＲｎと同じ種由来である。
【０２１０】
本明細書に報告された全態様の一実施態様では、ベータ−２−ミクログロブリンは、ＦｃＲｎとは異なる種由来である。
【０２１１】
一実施態様では、親抗体は、少なくとも１つの結合ドメインと、少なくとも１つのＦｃ領域とを含む。一実施態様では、親抗体は、２つの結合ドメインと、２つのＦｃ領域とを含む。
【０２１２】
一実施態様では、親抗体は、生物学的作用を媒介し、細胞に対するネガティブ又はポジティブシグナルの伝達を媒介するターゲット（一実施態様では、細胞表面レセプターに結合可能なリガンド又はリガンドに結合可能な細胞表面レセプター）に特異的に結合する少なくとも１つの結合ドメインを含む。一実施態様では、親抗体は、減少又は除去のためにターゲッティングされる抗原（一実施態様では、細胞表面抗原又は可溶性抗原）に特異的な少なくとも１つの結合ドメインと、少なくとも１つのＦｃ領域とを含む。
【０２１３】
ターゲットに特異的に結合する抗体は、関連する抗原（例えば、精製抗原、このような抗原を含む細胞もしくは細胞抽出物、又はこのような抗原をコードするＤＮＡ）と、場合により、補助剤との複数回の皮下又は腹腔内注入により、哺乳類中に生じさせることができる。
【０２１４】
一実施態様では、抗体は、全長抗体である。
【０２１５】
一実施態様では、抗体は、モノクローナル抗体である。
【０２１６】
一実施態様では、親抗体は、二重特異性抗体である。
【０２１７】
一実施態様では、親抗体は、キメラ抗体である。
【０２１８】
先の全態様の一実施態様では、ｐＨは、約ｐＨ５．５から約ｐＨ８．８に向かう勾配である。
【０２１９】
一般的には、ＦｃＲｎの可溶性細胞外ドメイン（ヒトＦｃＲｎについて、配列番号３３）と、Ｃ末端Ｈｉｓ−Ａｖｉタグ（配列番号３４）とを、哺乳類の細胞中において、β２−ミクログロブリン（ヒトベータ−２−ミクログロブリンについて、配列番号３５）と共に共発現させた。非共有ＦｃＲｎ−ミクログロブリン複合体をビオチン化し、ストレプトアビジン誘導体化セファロースにロードした。
【０２２０】
本明細書に報告された全態様の一実施態様では、新生児Ｆｃレセプター（ＦｃＲｎ）とベータ−２−ミクログロブリンとの非共有複合体は、固体相に結合している。
【０２２１】
一実施態様では、固体相に対する非共有複合体のコンジュゲーションは、Ｎ末端及び／又はε−アミノ基（リシン）、種々のリシンのε−アミノ基、カルボキシ−、スルフヒドリル−、ヒドロキシル−、及び／又は抗体のアミノ酸骨格のフェノール性官能基、ならびに／又は、抗体の炭水化物構造の糖アルコール基を介した化学結合により行われる。
【０２２２】
一実施態様では、非共有複合体は、特異的結合対を介して、固体相にコンジュゲートする。一実施態様では、非共有複合体は、ビオチンにコンジュゲートし、固体相への固定化は、固体支持体固定化アビジン又はストレプトアビジンを介して行われる。
【０２２３】
特異的結合対（第１の成分／第２の成分）は、一実施態様では、ストレプトアビジン又はアビジン／ビオチン、抗体／抗原（例えば、Hermanson, G.T., et al., Bioconjugate Techniques, Academic Press (1996)を参照のこと）、レクチン／多糖類、ステロイド／ステロイド結合タンパク質、ホルモン／ホルモンレセプター、酵素／基質、ＩｇＧ／プロテインＡ及び／又はＧ等から選択される。
【０２２４】
原理的に、任意のバッファー物質を、本明細書に報告された方法に使用することができる。
【０２２５】
マウスＦｃ−マウスＦｃＲｎ相互作用に重要なＦｃ残基は、部位特異的突然変異誘発により特定されている（例えば、Dall’Acqua, W.F., et al. J. Immunol 169 (2002) 5171-5180を参照のこと）。残基Ｉ２５３、Ｈ３１０、Ｈ４３３、Ｎ４３４、及びＨ４３５（ＫａｂａｔによるＥＵナンバリング）は、この相互作用に関与する（Medesan, C., et al., Eur. J. Immunol. 26 (1996) 2533；Firan, M., et al., Int. Immunol. 13 (2001) 993；Kim, J.K., et al., Eur. J. Immunol. 24 (1994) 542）。残基Ｉ２５３、Ｈ３１０、及びＨ４３５は、ヒトＦｃとマウスＦｃＲｎとの相互作用に重要であることが見出された（Kim, J.K., et al., Eur. J. Immunol. 29 (1999) 2819）。残基Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅは、タンパク質−タンパク質相互作用研究により、ＦｃＲｎ結合が改善されることが、Dall’Acqua et al.により説明されている（Dall'Acqua, W.F., et al. J. Biol. Chem. 281(2006) 23514-23524）。ヒトＦｃ−ヒトＦｃＲｎ複合体の研究から、残基Ｉ２５３、Ｓ２５４、Ｈ４３５、及びＹ４３６が、この相互作用に重要であることが示されている（Firan, M., et al., Int. Immunol. 13 (2001) 993；Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604）。Yeung, Y.A., et al.（J. Immunol. 182 (2009) 7667-7671）には、残基２４８〜２５９及び３０１〜３１７及び３７６〜３８２及び４２４〜４３７の種々の突然変異体が報告され、試験されている。
【０２２６】
【表３３】
2020183967.tif 000039
【０２２７】
一実施態様では、薬学的に許容し得るバッファー物質、例えば、リン酸又はその塩、酢酸又はその塩、クエン酸又はその塩、モルホリン又はその塩、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）又はその塩、ヒスチジン又はその塩、グリシン又はその塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）又はその塩、（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）又はその塩が使用される。
【０２２８】
一実施態様では、バッファー物質は、リン酸もしくはその塩、又は、酢酸もしくはその塩、又は、クエン酸もしくはその塩、又は、ヒスチジンもしくはその塩から選択される。
【０２２９】
一実施態様では、バッファー物質は、１０mM〜５００mMの濃度を有する。一実施態様では、バッファー物質は、１０mM〜３００mMの濃度を有する。一実施態様では、バッファー物質は、１０mM〜２５０mMの濃度を有する。一実施態様では、バッファー物質は、１０mM〜１００mMの濃度を有する。一実施態様では、バッファー物質は、１５mM〜５０mMの濃度を有する。一実施態様では、バッファー物質は、約２０mMの濃度を有する。
【０２３０】
正の線形ｐＨ勾配のための例示的な開始溶液は、一実施態様では、ｐＨ５．５に調整された、２０mM ＭＥＳ及び１４０mM ＮａＣｌを含む。
【０２３１】
正の線形ｐＨ勾配のための例示的な終了溶液は、一実施態様では、ｐＨ８．８に調整された、２０mM ＴＲＩＳ及び１４０mM ＮａＣｌを含む。
【０２３２】
勾配中に、開始溶液と終了溶液との混合物が、ＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーカラムにアプライされる。これにより、正の線形勾配は、１００％ 開始溶液（すなわち、純粋な開始溶液）で開始して、その後、開始溶液の割合が、１００％から０％に減少し、終了溶液の割合が、０％から１００％に増加する。これにより、正の線形ｐＨ勾配後に、１００％ 終了溶液を、カラムにアプライする。
【０２３３】
一実施態様では、開始溶液と終了溶液は、更なる塩を含む。一実施態様では、更なる塩は、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、塩化カリウム、硫酸カリウム、クエン酸ナトリウム、又はクエン酸カリウムから選択される。一実施態様では、該溶液は、５０mM〜１０００mM 更なる塩を含む。一実施態様では、該溶液は、５０mM〜７５０mM 更なる塩を含む。一実施態様では、該溶液は、５０mM〜５００mM 更なる塩を含む。一実施態様では、該溶液は、５０mM〜７５０mM 更なる塩を含む。一実施態様では、該溶液は、約１４０mM〜約４００mM 更なる塩を含む。
【０２３４】
一実施態様では、開始溶液と終了溶液は、塩化ナトリウムを含む。一実施態様では、開始溶液と終了溶液は、約１４０mM〜約４００mM 塩化ナトリウムを含む。
【０２３５】
ある種の塩及びバッファー物質が、保持時間及び分解能に影響を及ぼすことが見出された。抗体をＦｃＲｎに結合させるのに最適な塩濃度を決定することができる（１４０mM ＮａＣｌ）。塩濃度がより高い（４００mM）場合、ＦｃＲｎに対する結合性は、溶液のイオン強度の増大による、電荷相互作用による干渉のために低下し、より短い保持時間が得られる。
【０２３６】
このため、本明細書に報告された方法において、工程ａ）及び工程ｂ）に使用される溶液と、工程ａ）及び工程ｂ）に適用される勾配と、工程ａ）及び工程ｂ）におけるカラムのローディングと、工程ａ）及び工程ｂ）におけるカラム寸法及びＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィー材料の量と、工程ａ）及び工程ｂ）におけるＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィー材料中のＦｃＲｎ親和性リガンド密度と、工程ａ）及び工程ｂ）における固体相へのＦｃＲｎのコンジュゲーションと、工程ａ）及び工程ｂ）におけるｂ２ｍ及びＦｃＲｎの性質は、同じであるか又は同一である。このため、本明細書に報告された方法において、工程ａ）及び工程ｂ）におけるＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーは、塩濃度を除いて、同一の条件下において行われる。同塩濃度は、工程ａ）と工程ｂ）との間で異なる。一実施態様では、第２の塩濃度は、第１の塩濃度より大きい。一実施態様では、第２の塩濃度は、第１の塩濃度の少なくとも２倍である。
【０２３７】
図７から分かるように、アプライされる抗体量は、溶出ピークの曲線下面積に対して直線的な相関を示す。
【０２３８】
８つの抗体を、完全な抗体として、かつ、酵素ＩｄｅＳによる開裂後として分析した。開裂を、ＳＤＳｐａｇｅ及び分析用ＳＥＣにより制御した。Ｆｃ領域及び抗体−Ｆａｂを、調製用ＳＥＣにより分離した。
【０２３９】
【表３４】
2020183967.tif 000040
【０２４０】
一般的には、野生型Ｆｃ領域を有する抗体（ＩｇＧ１又はＩｇＧ２又はＩｇＧ４）の保持時間は、実施例５の条件下において、４５〜４９分で変動する（３６個の抗原に対して３５個の治療抗体について試験、データを示さず）。実施例２の条件を使用する場合、保持時間は、勾配がより長いため、約８５分に伸長する。
【０２４１】
【表３５】
2020183967.tif 000041
【０２４２】
一般的には、本明細書に報告された方法及び使用における保持時間は、ｐＨ勾配の傾き及び利用される塩濃度に依存する。野生型抗体が参照として使用される場合、より弱い結合性は、より短い保持時間（＝より早い溶出）により示される。一方、より強い結合性は、より長い保持時間（＝より遅い溶出）により示される。
【０２４３】
ＩｇＧのＦｃ領域における種々の突然変異体は、ＦｃＲｎカラムにおいて異なって挙動し、改変された保持時間を示す。
【０２４４】
例えば、抗体−ＩＧＦ−１Ｒ抗体突然変異体ＹＴＥは、伸長した保持時間を示す（図８を参照のこと）。
【０２４５】
【表３６】
2020183967.tif 000042
【０２４６】
本明細書に報告された一態様は、下記工程：
ａ）第１の塩濃度の存在下での正の線形ｐＨ勾配溶出によるＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体の保持時間を決定する工程と、
ｂ）第２の塩濃度の存在下での正の線形ｐＨ勾配溶出によるＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体の保持時間を決定する工程とを含み、
これにより、工程ａ）で決定された保持時間と工程ｂ）で決定された保持時間とが実質的に異なる場合、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４のサブクラスの標準的／天然の抗体と比較して相対的に短いｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期を有する、
抗体の相対的なｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期を決定する方法である。
【０２４７】
本明細書に報告された一態様は、下記工程：
ａ）第１の塩濃度の存在下での正の線形ｐＨ勾配溶出によるＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体の保持時間を決定する工程と、
ｂ）第２の塩濃度の存在下での正の線形ｐＨ勾配溶出によるＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体の保持時間を決定する工程とを含み、
これにより、工程ａ）で決定された保持時間と工程ｂ）で決定された保持時間とが実質的に異なる場合、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４のサブクラスの標準的／天然の抗体と比較して相対的に短いｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期を有する、
抗体の相対的なｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期を決定するための本明細書に報告された方法の使用である。
【０２４８】
本明細書に報告された一態様は、下記工程：
ａ）第１の塩濃度の存在下での正の線形ｐＨ勾配溶出によるＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーカラムでの変異抗体及びその親抗体の保持時間を決定する工程と、
ｂ）第２の塩濃度の存在下での正の線形ｐＨ勾配溶出によるＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーカラムでの変異抗体及びその親抗体の保持時間を決定する工程とを含み、
これにより、ｉ）工程ａ）で決定された変異抗体の保持時間が、工程ａ）で決定されたその親抗体の保持時間より大きく／長く、ｉｉ）工程ａ）で決定された変異抗体の保持時間と工程ｂ）で決定された変異抗体の保持時間とが実質的に同じである場合、その親抗体に対する変異抗体のｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期が伸長され、また、これにより、ｉ）工程ａ）で決定された変異抗体の保持時間が、工程ａ）で決定されたその親抗体の保持時間より小さく／短く、ｉｉ）工程ａ）で決定された変異抗体の保持時間と工程ｂ）で決定された変異抗体の保持時間とが実質的に同じである場合、その親抗体に対する変異抗体のｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期が短縮される、
その親抗体に対する変異抗体のｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期の伸長又は短縮を決定する方法である。
【０２４９】
本明細書に報告された一態様は、下記工程：
ａ）第１の塩濃度の存在下での正の線形ｐＨ勾配溶出によるＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーカラムでの変異抗体及びその親抗体の保持時間を決定する工程と、
ｂ）第２の塩濃度の存在下での正の線形ｐＨ勾配溶出によるＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーカラムでの変異抗体及びその親抗体の保持時間を決定する工程とを含み、
これにより、ｉ）工程ａ）で決定された変異抗体の保持時間が、工程ａ）で決定されたその親抗体の保持時間より大きく／長く、ｉｉ）工程ａ）で決定された変異抗体の保持時間と工程ｂ）で決定された変異抗体の保持時間とが実質的に同じである場合、その親抗体に対する変異抗体のｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期が伸長され、また、これにより、ｉ）工程ａ）で決定された変異抗体の保持時間が、工程ａ）で決定されたその親抗体の保持時間より小さく／短く、ｉｉ）工程ａ）で決定された変異抗体の保持時間と工程ｂ）で決定された変異抗体の保持時間とが実質的に同じである場合、その親抗体に対する変異抗体のｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期が短縮される、
その親抗体に対する変異抗体のｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期の伸長又は短縮を決定するための本明細書に報告された方法の使用である。
【０２５０】
ＦｃＲｎカラムからの遅い溶出を示した抗体、すなわち、ＦｃＲｎカラムでのより長い保持を有し、抗体―Ｆａｂ−ＦｃＲｎ相互作用を示さない抗体が、より長いｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期を有したことが見出された（実施例６を参照のこと）。
【０２５１】
【表３７】
2020183967.tif 000043
【０２５２】
本明細書に報告された一態様は、抗体のｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期を決定するための本明細書に報告された方法の使用である。
【０２５３】
野生型ＩｇＧ及びＦｃ領域中にＹＴＥ−突然変異を有するＩｇＧ変異体について行われたｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでの実験のセットは、ヒトＦｃＲｎにトラスジェニックなマウスによるｉｎ  ｖｉｖｏでの薬物動態研究の相関と共に、ＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーにおける半定量的相関の知見を示した（Spiekerman, G.M., et al. J. Exp. Med. 196 (2002) 303-310；Dall’Acqua, W.F., et al., J. Biol. Chem. 281 (2006) 23514-23524）。ＹＴＥ−突然変異は、顕著に伸長した半減期及びより遅い血漿クリアランスをもたらす。より長いｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期は、ＦｃＲｎクロマトグラフィーにおけるより長い保持時間に対応した。近年、Ｆｃ操作トラスシズマブ変異体の伸長した半減期が、フローサイトメトリーにより測定された場合、ＦｃＲｎに対するｉｎ  ｖｉｔｒｏでの結合性を向上させたことが示された（Petkova, S.B., et al., Int. Immunol. 18 (2006) 1759-1769）。１１倍の改善されたＦｃＲｎ親和性を有する抗−ＶＥＧＦ  ＩｇＧ１抗体であるベバシズマブの変異体は、ヒトＦｃＲｎトランスジェニックマウスにおいて５倍の伸長した半減期を有し、カニクイザルにおいて３倍長い半減期を有することが示された（Zalevsky, J., et al., Nat. Biotechnol. 28 (2010) 157-159）。
【０２５４】
抗体フォーマットは、ＦｃＲｎカラムに対する結合性に影響を有さないことが示された。このことは、ノブ−ｉｎｔｏ−ホールフォーマット及び幾つかの二重特異性抗体フォーマットについて示された。このため、本明細書に報告された方法は、新規な抗体フォーマットの評価に使用することができる。
【０２５５】
一実施態様では、複合体は、モノビオチン化されている。
【０２５６】
一実施態様では、リガンドとして新生児Ｆｃレセプター（ＦｃＲｎ）とベータ−２−ミクログロブリンとの非共有複合体を含むクロマトグラフィー材料は、本明細書に報告された方法及び使用において、少なくとも１００サイクルの安定性を有する。サイクルは、各方法又は使用における第１のｐＨ値から第２のｐＨ値に向かうｐＨ勾配である。これにより、材料の再生のために、条件の更なる変更を、本方法又は使用の終了条件以外に必要としない。このため、一実施態様では、サイクルは、約ｐＨ５．５のｐＨ値から約ｐＨ８．８のｐＨ値に向かうｐＨ勾配である。
【０２５７】
ｇ．ｉｉ）抗体及びそのＦｃ領域の同じ塩濃度での正の線形ｐＨ勾配による溶出
本明細書において、下記２つの工程：
ａ）第１の塩濃度の存在下での正の線形ｐＨ勾配溶出によるＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体の保持時間を決定する工程と、
ｂ）第１の塩濃度の存在下での正の線形ｐＨ勾配溶出によるＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体のＦｃ領域の保持時間を決定する工程とを含む、方法が報告されている。
【０２５８】
この方法について、抗体及びそのＦｃ領域の保持時間を比較することにより、単純なクロマトグラフィー法において、抗体−Ｆｃ−ＦｃＲｎ複合体における抗体−Ｆａｂ−ＦｃＲｎ相互作用の存在を決定することができる。Ｆｃ領域は、例えば、酵素ＩｄｅＳ又はパパインによる酵素的開裂により得ることができ、又は、リコンビナントに生成することができる。このことは、抗体−Ｆａｂ−ＦｃＲｎ相互作用が、抗体のｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期に影響を及ぼすため重要である。
【０２５９】
抗体／抗体−Ｆｃ領域ペアについて、ＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーカラムでのその保持時間に関する種々の関係と、同様に、そのＦｃＲｎ相互作用に関する種々の関係とが存在する。
１）抗体及びそのＦｃ領域は、実質的に同じ保持時間を有する。この場合、抗体のｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期は、抗体−Ｆａｂ−ＦｃＲｎ相互作用により影響を受けない。
２）抗体及びそのＦｃ領域は、異なる保持時間を有し、Ｆｃ領域の保持時間は、抗体の保持時間より短い。この場合、抗体のｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期は、抗体−Ｆａｂ−ＦｃＲｎ相互作用により影響を受ける。
【０２６０】
当該抗体が変異抗体である場合、更なる態様を考慮する必要がある。変異抗体では、抗体−Ｆｃ−ＦｃＲｎ相互作用と、抗体−Ｆａｂ−ＦｃＲｎ相互作用とは、親抗体に対して導入された改変により変化する場合がある。
【０２６１】
このため、親抗体、変異抗体、及びそれらの各Ｆｃ領域間に、下記の可能性のある関係が存在する（図１０を参照のこと）。
１）親抗体（１）、変異抗体（３）、及びそれらのＦｃ領域（２、４）は、実質的に同じ保持時間を有する。この場合、変異抗体のｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期は、ｉ）抗体−Ｆａｂ−ＦｃＲｎ相互作用により影響を受けず、ｉｉ）親抗体のｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期に対応する（図１０Ａを参照のこと）。
２）変異抗体（３）及びそのＦｃ領域（４）は、異なる保持時間を有し、変異抗体のＦｃ領域の保持時間は、変異抗体の保持時間より短く、親抗体（１）、親抗体のＦｃ領域（２）、及び変異抗体のＦｃ領域（４）は、実質的に同じ保持時間を有する。この場合、変異抗体のｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期は、ｉ）抗体−Ｆａｂ−ＦｃＲｎ相互作用により影響を受け、ｉｉ）親抗体のｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期より短い（図１０Ｂを参照のこと）。
３）親抗体（１）及び変異抗体（３）は、異なる保持時間を有し、変異抗体のＦｃ領域（４）の保持時間は、変異抗体（３）の保持時間と実質的に同じであり、変異抗体の保持時間は、親抗体（１）の保持時間より長い。この場合、変異抗体のｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期は、ｉ）抗体−Ｆａｂ−ＦｃＲｎ相互作用により影響を受けず、ｉｉ）親抗体のｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期より長い（図１０Ｃを参照のこと）。
４）親抗体（１）及び変異抗体（３）は、異なる保持時間を有し、変異抗体のＦｃ領域（４）の保持時間は、変異抗体（３）の保持時間と実質的に同じであり、変異抗体（３）の保持時間は、親抗体（１）の保持時間より短い。この場合、変異抗体のｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期は、ｉ）抗体−Ｆａｂ−ＦｃＲｎ相互作用により影響を受けず、ｉｉ）親抗体のｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期より短い。
５）親抗体（１）及び変異抗体（３）は、異なる保持時間を有し、変異抗体のＦｃ領域（４）の保持時間は、変異抗体（３）の保持時間とは異なり、親抗体（１）及びそのＦｃ領域（２）の保持時間とも異なり、変異抗体のＦｃ領域（４）の保持時間は、変異抗体（３）の保持時間と親抗体（４）の保持時間との間である。この場合、変異抗体のｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期は、ｉ）抗体−Ｆａｂ−ＦｃＲｎ相互作用により影響を受け、ｉｉ）親抗体のｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期とは異なる（図１０Ｄを参照のこと）。
【０２６２】
一事例では、参照抗体は、ＩｄｅＳ開裂又はパパイン開裂後のそのＦｃ領域と実質的に同じ保持時間を有する抗体である。
【０２６３】
上記概説されたように、抗体−Ｆａｂ−ＦｃＲｎ相互作用は、抗体のｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期に影響を有する場合がある。また、上記概説されたように、抗体−Ｆｃ−ＦｃＲｎ相互作用は、抗体のｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期に影響を有する場合がある。このため、両相互作用を考慮する必要がある。
【０２６４】
例えば、Ropeenian及びAkilesh（Nat. Rev. Immunol. 7 (2007) 715-725）は、例えば、ヒト化ＩｇＧ１抗体であるｈｕ４Ｄ５（ハーセプチン；Genentech；ＥＲＢＢ２特異的モノクローナル抗体）変異体Ａｓｎ４３４Ａｌａ（Ｎ４３４Ａ）及び三重置換変異体Ｔｈｒ３０７Ａｌａ／Ａｓｎ４３４Ａｌａ／Ｇｌｕ３８０Ａｌａ（Ｔ３０７Ａ／Ｎ４３４Ａ／Ｑ３８０Ａ）がそれぞれ、ｐＨ６．０において、野生型ｈｕ４Ｄ５抗体より、３倍及び１２倍高い親和性でヒトＦｃＲｎに結合することを報告している。予期しなかったことに、ＦｃＲｎトランスジェニックヒト化マウスにおいて、これら２つの変異抗体の半減期は、基本的に同等であった。この矛盾は、Ropeenian及びAkileshによれば、ｐＨ７．４でのＦｃＲｎに対する三重置換変異体の向上した親和性により説明することができる。ｐＨ７．４及びｐＨ６．０における結合親和性が改善するＦｃ領域突然変異は、その半減期を伸長するよりもむしろ、実際には、ｉｎ  ｖｉｖｏでの抗体のクリアランスを加速させている可能性がある。
【０２６５】
このため、変異抗体のＦｃ領域の保持時間が、境界保持時間より長いかどうかを、更に考慮する必要がある。理論に拘束されるものではないが、この境界保持時間は、ｐＨ７．４での相互作用がｐＨ７．４での抗体−ＦｃＲｎ複合体の解離が減少するほど向上し、抗体の向上した分解をもたらす作用をもたらす（図１１を参照のこと）。
【０２６６】
本発明の一態様は、下記工程（図１２を参照のこと）：
ａ）同じ溶出条件を使用するＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーカラムでの、ｉ）抗体（３）、ｉｉ）該抗体のＦｃ領域（４）、ｉｉｉ）参照抗体（１）、ｉｖ）参照抗体のＦｃ領域（２）、及びｖ）Ｆｃ領域中に突然変異Ｎ４３４Ａを有する参照抗体（５）の保持時間を決定する工程と、
ｂ）抗体を選択する工程であって、
ｂ−ｉ）参照抗体（１）、変異抗体（３）、及びそれらのＦｃ領域（２、４）が、実質的に同じ保持時間を有し、抗体の保持時間が、Ｆｃ領域中に突然変異Ｎ４３４Ａを有する参照抗体（５）の保持時間より短い抗体を選択することにより、ｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期が、ｉ）抗体−Ｆａｂ−ＦｃＲｎ相互作用により影響を受けず、ｉｉ）親抗体のｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期に対応する（図１２Ａを参照のこと）抗体を選択し、
ｂ−ｉｉ）抗体（３）及びそのＦｃ領域（４）が、異なる保持時間を有し、該抗体のＦｃ領域（４）の保持時間が、抗体（３）の保持時間より短く、参照抗体（１）又はそのＦｃ領域（２）の保持時間と同じ、又は、参照抗体（１）又はそのＦｃ領域（２）の保持時間より長く、参照抗体（１）、参照抗体のＦｃ領域（２）、及び抗体（３）の保持時間が、Ｆｃ領域中に突然変異Ｎ４３４Ａを有する参照抗体（５）の保持時間より短い抗体を選択することにより、ｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期が、ｉ）抗体−Ｆａｂ−ＦｃＲｎ相互作用により影響を受け、ｉｉ）参照抗体のｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期より短い（図１２Ｂを参照のこと）抗体を選択し、
ｂ−ｉｉｉ）参照抗体（１）及び抗体（３）が、異なる保持時間を有し、抗体のＦｃ領域（４）の保持時間が、抗体（３）の保持時間と実質的に同じであり、抗体（３）の保持時間が、参照抗体（１）の保持時間より長く、抗体（３）の保持時間が、Ｆｃ領域中に突然変異Ｎ４３４Ａを有する参照抗体（５）の保持時間より短い抗体を選択することにより、ｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期が、ｉ）抗体−Ｆａｂ−ＦｃＲｎ相互作用により影響を受けず、ｉｉ）参照抗体のｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期より長い（図１２Ｃを参照のこと）抗体を選択し、
ｂ−ｉｖ）参照抗体（１）及び抗体（３）が、異なる保持時間を有し、抗体のＦｃ領域（４）の保持時間が、抗体（３）の保持時間と実質的に同じであり、抗体（３）の保持時間が、参照抗体（１）の保持時間より短く、抗体（３）の保持時間が、Ｆｃ領域中に突然変異Ｎ４３４Ａを有する参照抗体（５）の保持時間より短い抗体を選択することにより、ｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期が、ｉ）抗体−Ｆａｂ−ＦｃＲｎ相互作用により影響を受けず、ｉｉ）参照抗体のｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期より短い（図１２Ｄを参照のこと）抗体を選択し、
ｂ−ｖ）参照抗体（１）及び抗体（３）が、異なる保持時間を有し、抗体のＦｃ領域（４）の保持時間が、抗体（３）の保持時間とは異なり、参照抗体（１）及びそのＦｃ領域（２）の保持時間とも異なり、抗体のＦｃ領域（３）の保持時間が、抗体（３）の保持時間と参照抗体（１）の保持時間との間であり、抗体（３）の保持時間が、Ｆｃ領域中に突然変異Ｎ４３４Ａを有する参照抗体（５）の保持時間より短い抗体を選択することにより、ｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期が、ｉ）抗体−Ｆａｂ−ＦｃＲｎ相互作用により影響を受け、ｉｉ）参照抗体のｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期とは異なる（図１２Ｅを参照のこと）抗体を選択する工程、とを含む、
抗体を選択する方法である。
【０２６７】
一実施態様では、溶出は、一定の塩濃度での正の線形ｐＨ勾配によるか、又は、一定のｐＨ値での線形塩勾配を使用することによる。
【０２６８】
一実施態様では、抗体は、親抗体の変異抗体であり、参照抗体は、親抗体である。一実施態様では、変異抗体は、抗体−Ｆａｂ又は／及び抗体−Ｆｃ領域中のアミノ酸変化を有する。
【０２６９】
ｇ．ｉｉｉ）塩勾配による溶出
本明細書において、下記工程：
ａ）塩勾配溶出による第１のｐＨ値におけるＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体及び参照抗体の保持時間を決定する工程と、
ｂ）塩勾配溶出による第２のｐＨ値におけるＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体及び参照抗体の保持時間を決定する工程とを含む、方法が報告される。
【０２７０】
一定塩濃度でのｐＨ勾配による溶出に加えて、一定ｐＨ値での塩勾配による溶出も、抗体−Ｆｃ−ＦｃＲｎ複合体における抗体−Ｆａｂ−ＦｃＲｎ相互作用が存在するか否かを決定するのに使用することができることが見出された。
【０２７１】
既に上記概説されたように、抗体−Ｆａｂ−ＦｃＲｎ相互作用は、抗体−Ｆｃ−ＦｃＲｎ複合体が形成された後に、少しでも存在する場合、確立される二次的相互作用である。
【０２７２】
両相互作用、すなわち、抗体−Ｆｃ−ＦｃＲｎ相互作用及び抗体−Ｆａｂ−ＦｃＲｎ相互作用は、電荷媒介性非共有相互作用である。
【０２７３】
本明細書に報告された一態様は、下記工程：
ａ）塩勾配溶出による第１のｐＨ値におけるＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体及び参照抗体の保持時間を決定する工程と、
ｂ）塩勾配溶出による第２のｐＨ値におけるＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体及び参照抗体の保持時間を決定する工程とを含み、
これにより、工程ａ）で決定された抗体及び参照抗体の保持時間の比が、工程ｂ）で決定された抗体及び参照抗体の保持時間の比と実質的に異なる場合、抗体のｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期に影響を及ぼす抗体−Ｆａｂ−ＦｃＲｎ相互作用の存在が決定される、
抗体のｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期に影響を及ぼす抗体−Ｆａｂ−ＦｃＲｎ相互作用の存在を決定する方法である。
【０２７４】
一実施態様では、第１のｐＨ値は、５．５である。一実施態様では、第２のｐＨ値は、８．８である。
【０２７５】
一実施態様では、工程ａ）及び工程ｂ）における塩勾配は同一である。
【０２７６】
一実施態様では、塩勾配は、塩化ナトリウム勾配である。
【０２７７】
一実施態様では、塩勾配は、０mM〜２５０mM 塩である。
【０２７８】
ｈ）ベバシズマブ及びベバシズマブ突然変異体
ＣＤＲ中に電荷パッチを有さない別の分子は、ＬＣ−ＣＤＲ中に正の電荷パッチを形成して、この位置での正の電荷が一般的に抗体のＦｃＲｎ結合親和性に影響を及ぼすという上記で報告された知見を実証するのに選択される。
【０２７９】
ベバシズマブは、ＬＣ−ＣＤＲ中にわずかな電荷のみを有しているため、選択された。ブリアキヌマブを使用して特定された３つの塩基性アミノ酸残基は、アルギニン残基Ｒ２７、Ｒ５５、及びＲ９４である。ベバシズマブのアミノ酸配列において、アスパラギン酸Ｄ２７、ロイシンＬ５４、及びスレオニンＴ９３は、リシン残基に交換され、正の電荷パッチを形成する（図１４を参照のこと）。
【０２８０】
ベバシズマブ−野生型及びベバシズマブ−突然変異体のＦｃＲｎ親和性クロマトグラムは、表９に示される。各保持時間は、下記表９に列記される。
【０２８１】
【表３８】
2020183967.tif 000044
【０２８２】
ベバシズマブ−野生型は、８４．７分の保持時間を有する。一方、ベバシズマブ−突然変異体は、８６．９分後に溶出する。このため、ベバシズマブのＦｖ中の正の電荷パッチは、保持時間を２．２分シフトさせる。この結果から、ＩｇＧ１のＦｖ中の電荷は、一般的にＦｃＲｎ結合親和性に影響を及ぼすこと、特に、ＦｃＲｎからの解離が影響を受けることが示される。
【図面の簡単な説明】
【０２８３】
【図１】電荷分布及びｐＨ依存性正味電荷。ｐＨ７．４においてプロトン化され、２ｋＢＴ／ｅで描かれたタンパク質の等ポテンシャル表面。黒：正／負。（ａ）ブリアキヌマブ。軽鎖を、薄い灰色で示す。重鎖を、濃い灰色で示す。中央及び右側の画像の視野はそれぞれ、垂直及び水平軸についての回転による、左側のパネル中の視野に関する。（ｂ）ウステキヌマブ。軽鎖及び重鎖はそれぞれ、薄い及び濃い灰色で着色されている。視野は、（ａ）と同一である。（ｃ）ヒトβ２ミクログロブリン（β２ｍ）を含む複合体におけるヒトＦｃＲｎ相同性モデルの２ｋＢＴ／ｅで描かれた等ポテンシャル表面。Ｆｃドメインを、明確性のために示す。（ｄ）配列をベースに算出した正味電荷  ｖｓ  ブリアキヌマブ及びウステキヌマブのｐＨ。タンパク質構造を、DiscoveryStudio Proで作製した。
【図２】ｐＨ依存性ＦｃＲｎ−ＩｇＧ相互作用。１１個のＩｇＧ変異体のＦｃＲｎ親和性クロマトグラムを、明確性のために、強度正規化した。ｐＨ７．４でプロトン化された構造モデルの分子表面提示を、２ｋＢＴ／ｅで描かれた等ポテンシャル表面と重ねた。視野は、図１ａの右側パネルと同一であり、ＣＤＲ領域に焦点を当てる。第２の水平軸は、オフラインｐＨ測定から内挿した溶出ｐＨを示す。
【図３】ヒトＦｃＲｎトランスジェニックマウスでの薬物動態におけるＦｃＲｎ溶出ｐＨの効果。抗体を、１群当たり６匹の動物に対して、一回のｉ．ｖ．ボーラス注射（１０mg/kg）として投与した。データ点は、平均±標準偏差を表す。（ａ）ブリアキヌマブ（オレンジ色）、ウステキヌマブ（緑色）、ｍＡｂ８（紫色）、及びｍＡｂ９（青色）の血液レベル曲線。（ｂ）終末相半減期とＦｃＲｎカラム溶出ｐＨとの間の相関。
【図４】ＦｃＲｎ−ＩｇＧモデルの分子動力学シミュレーション。  （ａ）シミュレーション開始時のコンホーメーション。破線は、Ｆｖ領域とＦｃＲｎ中の２つの例となるアミノ酸間の距離を示す。この距離は、パネル（ｃ）中で示されるように、ＭＤシミュレーション中に近づく。色は、図１と同一である。（ｂ）シミュレーション終了時のコンホーメーション（ｔ＝１００ns）。ボックスは、（ｃ）に示される分子の部分を示す。（ｃ）ＦｃＲｎとＦｖドメインとの間の相互作用の詳細図。フレームワーク、ＣＤＲ、及びＦｃＲｎ残基の相互作用は、ブリアキヌマブとウステキヌマブとにおいて異なることに留意されたい。（ｄ）シミュレーションの経過中での残基２４５（ＦｃＲｎ）と１００（ウステキヌマブＬＣ）及び２９（ブリアキブマブＬＣ）との間の距離。（ｅ）シミュレーション終了時の相互作用エネルギー（９６、９７、９８、９９、及び１００nsでのコンホーメーションの平均及び標準偏差）。「ＶＤＷ」及び「静電」はそれぞれ、ＦｃＲｎ−Ｆａｂ相互作用に対するファンデルワールス及び静電的寄与を意味する。タンパク質構造を、PyMol（商標）（Schrodinger LLC）により作製した。
【図５】ブリアキヌマブ及びウステキヌマブの軽鎖及び重鎖の配列アライメント。ＶＨ及びＶＬ領域を、イタリック体で示す。ＣＤＲを、アスタリスク（＊）でマークする。ハッシュ（＃）は、開始構造におけるＦｃＲｎに近接した（＜４Å）アミノ酸を意味する。記号
【化１】
2020183967.tif 000045
は、ＭＤ目的でＦｃＲｎに対するジスルフィド架橋を確立するために、Ｃｙｓに突然変異させた残基をマークする。
【図６】ブリアキヌマブ及びウステキヌマブのＦｃＲｎ親和性カラム保持時間の塩依存性。ブリアキヌマブ及びウステキヌマブを、増加するＮａＣｌ量の存在下でのｐＨ勾配溶出によるＦｃＲｎ親和性カラムクロマトグラフィーに供した。データを、溶解した塩による電荷遮蔽効果を説明する逆平方根関数に当てはめる。ブリアキヌマブの保持時間は、
【数１】
2020183967.tif 000046
で短縮する。一方、ウステキヌマブの保持時間は、基本的に影響を受けないままである。
【図７】本明細書に報告された、アプライした抗体とＦｃＲｎカラムを使用するクロマトグラフィーの曲線下面積との直線性。
【図８】本明細書に報告されたＦｃＲｎカラムにおける、抗−ＩＧＦ−１Ｒ抗体野生型及びＹＴＥ−突然変異体のクロマトグラム。
【図９】アバスチン−野生型及びアバスチン−突然変異体のＦｃＲｎ親和性クロマトグラム。
【図１０Ａ】Ｆｃ領域と抗体−Ｆａｂとの抗体−ＦｃＲｎ相互作用に依存する、ＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーカラムでの保持時間変化のスキーム。１：親抗体、２：親抗体のＦｃ領域、３：変異抗体、４：変異抗体のＦｃ領域；実線：完全な抗体（抗体−Ｆａｂ＋Ｆｃ領域）、破線：Ｆｃ領域のみ；Ａ：野生型様Ｆｃ領域、抗体−Ｆａｂ−ＦｃＲｎ相互作用なし；Ｂ：野生型様Ｆｃ領域、抗体−Ｆａｂ−ＦｃＲｎ相互作用あり；Ｃ：改善されたＦｃＲｎ結合性を有する操作されたＦｃ領域、抗体−Ｆａｂ−ＦｃＲｎ相互作用なし；Ｄ：改善されたＦｃＲｎ結合性を有する操作されたＦｃ領域、抗体−Ｆａｂ−ＦｃＲｎ相互作用あり。
【図１０Ｂ】Ｆｃ領域と抗体−Ｆａｂとの抗体−ＦｃＲｎ相互作用に依存する、ＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーカラムでの保持時間変化のスキーム。１：親抗体、２：親抗体のＦｃ領域、３：変異抗体、４：変異抗体のＦｃ領域；実線：完全な抗体（抗体−Ｆａｂ＋Ｆｃ領域）、破線：Ｆｃ領域のみ；Ａ：野生型様Ｆｃ領域、抗体−Ｆａｂ−ＦｃＲｎ相互作用なし；Ｂ：野生型様Ｆｃ領域、抗体−Ｆａｂ−ＦｃＲｎ相互作用あり；Ｃ：改善されたＦｃＲｎ結合性を有する操作されたＦｃ領域、抗体−Ｆａｂ−ＦｃＲｎ相互作用なし；Ｄ：改善されたＦｃＲｎ結合性を有する操作されたＦｃ領域、抗体−Ｆａｂ−ＦｃＲｎ相互作用あり。
【図１０Ｃ】Ｆｃ領域と抗体−Ｆａｂとの抗体−ＦｃＲｎ相互作用に依存する、ＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーカラムでの保持時間変化のスキーム。１：親抗体、２：親抗体のＦｃ領域、３：変異抗体、４：変異抗体のＦｃ領域；実線：完全な抗体（抗体−Ｆａｂ＋Ｆｃ領域）、破線：Ｆｃ領域のみ；Ａ：野生型様Ｆｃ領域、抗体−Ｆａｂ−ＦｃＲｎ相互作用なし；Ｂ：野生型様Ｆｃ領域、抗体−Ｆａｂ−ＦｃＲｎ相互作用あり；Ｃ：改善されたＦｃＲｎ結合性を有する操作されたＦｃ領域、抗体−Ｆａｂ−ＦｃＲｎ相互作用なし；Ｄ：改善されたＦｃＲｎ結合性を有する操作されたＦｃ領域、抗体−Ｆａｂ−ＦｃＲｎ相互作用あり。
【図１０Ｄ】Ｆｃ領域と抗体−Ｆａｂとの抗体−ＦｃＲｎ相互作用に依存する、ＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーカラムでの保持時間変化のスキーム。１：親抗体、２：親抗体のＦｃ領域、３：変異抗体、４：変異抗体のＦｃ領域；実線：完全な抗体（抗体−Ｆａｂ＋Ｆｃ領域）、破線：Ｆｃ領域のみ；Ａ：野生型様Ｆｃ領域、抗体−Ｆａｂ−ＦｃＲｎ相互作用なし；Ｂ：野生型様Ｆｃ領域、抗体−Ｆａｂ−ＦｃＲｎ相互作用あり；Ｃ：改善されたＦｃＲｎ結合性を有する操作されたＦｃ領域、抗体−Ｆａｂ−ＦｃＲｎ相互作用なし；Ｄ：改善されたＦｃＲｎ結合性を有する操作されたＦｃ領域、抗体−Ｆａｂ−ＦｃＲｎ相互作用あり。
【図１１】改善されたＦｃＲｎ結合性を有し、抗体−Ｆａｂ−ＦｃＲｎ相互作用を有するが、抗体−ＦｃＲｎ相互作用が改善されたクリアランスをもたらすため、ｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期（境界保持時間を超える保持時間）が短縮している、操作された抗体を示すスキーム。
【図１２Ａ】Ｆｃ領域と抗体−Ｆａｂとの抗体−ＦｃＲｎ相互作用に依存する、ＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーカラムでの保持時間変化のスキーム。１：参照抗体、２：参照抗体のＦｃ領域、３：抗体、４：抗体のＦｃ領域；実線：完全な抗体（抗体−Ｆａｂ＋Ｆｃ領域）、破線：Ｆｃ領域のみ。
【図１２Ｂ】Ｆｃ領域と抗体−Ｆａｂとの抗体−ＦｃＲｎ相互作用に依存する、ＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーカラムでの保持時間変化のスキーム。１：参照抗体、２：参照抗体のＦｃ領域、３：抗体、４：抗体のＦｃ領域；実線：完全な抗体（抗体−Ｆａｂ＋Ｆｃ領域）、破線：Ｆｃ領域のみ。
【図１２Ｃ】Ｆｃ領域と抗体−Ｆａｂとの抗体−ＦｃＲｎ相互作用に依存する、ＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーカラムでの保持時間変化のスキーム。１：参照抗体、２：参照抗体のＦｃ領域、３：抗体、４：抗体のＦｃ領域；実線：完全な抗体（抗体−Ｆａｂ＋Ｆｃ領域）、破線：Ｆｃ領域のみ。
【図１２Ｄ】Ｆｃ領域と抗体−Ｆａｂとの抗体−ＦｃＲｎ相互作用に依存する、ＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーカラムでの保持時間変化のスキーム。１：参照抗体、２：参照抗体のＦｃ領域、３：抗体、４：抗体のＦｃ領域；実線：完全な抗体（抗体−Ｆａｂ＋Ｆｃ領域）、破線：Ｆｃ領域のみ。
【図１２Ｅ】Ｆｃ領域と抗体−Ｆａｂとの抗体−ＦｃＲｎ相互作用に依存する、ＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーカラムでの保持時間変化のスキーム。１：参照抗体、２：参照抗体のＦｃ領域、３：抗体、４：抗体のＦｃ領域；実線：完全な抗体（抗体−Ｆａｂ＋Ｆｃ領域）、破線：Ｆｃ領域のみ。
【図１３】ＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーの保持時間の塩濃度への依存性と、抗体−Ｆａｂ−ＦｃＲｎ相互作用。
【図１４】ベバシズマブ及びベバシズマブ変異体の軽鎖可変ドメインの配列アライメント。同一及び類似するアミノ酸を、灰色で示す。ＣＤＲを、アスタリスク（＊）でマークする。
【図１５】ブリアキヌマブ、ウステキヌマブ、及びｍＡｂ１〜６のＩＬ−１２相互作用。１：ブリアキヌマブ、２：ウステキヌマブ、３：ｍＡｂ１、４：ｍＡｂ２、５：ｍＡｂ３、６：ｍＡｂ４、７：ｍＡｂ５、８：ｍＡｂ６。
【図１６】ブリアキヌマブ、ウステキヌマブ、及びｍＡｂ７〜１０のＩＬ−１２相互作用。１：ブリアキヌマブ、２：ウステキヌマブ、３：ｍＡｂ７、４：ｍＡｂ８、５：ｍＡｂ９、６：ｍＡｂ１０。
【０２８４】
具体的な実施態様
１．下記工程：
ｉ）第１の塩濃度の存在下での正の線形ｐＨ勾配溶出によるＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体及び参照抗体の第１の保持時間を決定し、第２の塩濃度の存在下での正の線形ｐＨ勾配溶出によるＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体及び参照抗体の第２の保持時間を決定する工程、又は
ｉｉ）第１のｐＨ値での線形塩勾配溶出によるＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体及び参照抗体の第１の保持時間を決定し、第２のｐＨ値での線形塩勾配溶出によるＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体及び参照抗体の第２の保持時間を決定する工程、又は
ｉｉｉ）抗体及び参照抗体について、表面プラズモン共鳴を使用して、ｐＨ６におけるＫＤ値を決定し、高塩濃度の存在下での正の線形ｐＨ勾配溶出によるＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体及び参照抗体の保持時間を決定する工程、又は
ｉｖ）抗体及び参照抗体について、表面プラズモン共鳴を使用して、ｐＨ６におけるＫＤ値を決定し、線形塩勾配溶出によるＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体及び参照抗体の保持時間を決定する工程、又は
ｖ）正の線形ｐＨ勾配溶出によるＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体及びそのＦｃ領域の保持時間を決定する工程、又は
ｖｉ）高ｐＨ値での線形塩勾配溶出によるＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体及びそのＦｃ領域の保持時間を決定する工程、又は
ｖｉｉ）抗体及びそのＦｃ領域について、表面プラズモン共鳴を使用して、ｐＨ６におけるＫＤ値を決定し、高塩濃度の存在下での正の線形ｐＨ勾配溶出によるＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体及びそのＦｃ領域の保持時間を決定する工程、又は
ｖｉｉｉ）抗体及びそのＦｃ領域について、表面プラズモン共鳴を使用して、ｐＨ６におけるＫＤ値を決定し、高ｐＨ値での線形塩勾配溶出によるＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体及びそのＦｃ領域の保持時間を決定する工程
を含み、
ａ）第２の保持時間と実質的に同じ第１の保持時間を有する抗体、又は
ｂ）参照抗体のＫＤ値とは最大１０倍異なるＫＤ値を有し、参照抗体の保持時間と実質的に同じ保持時間を有する抗体、又は
ｃ）そのＦｃ領域の保持時間と実質的に同じ保持時間を有する抗体、又は
ｄ）そのＦｃ領域のＫＤ値とは最大１０倍異なるＫＤ値を有し、そのＦｃ領域の保持時間と実質的に同じ保持時間を有する抗体
を選択することによる、抗体を選択する方法。
【０２８５】
２．下記工程：
第１の塩濃度の存在下での正の線形ｐＨ勾配溶出によるＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体及び参照抗体の第１の保持時間を決定し、第２の塩濃度の存在下での正の線形ｐＨ勾配溶出によるＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体及び参照抗体の第２の保持時間を決定する工程と、
ａ）第２の保持時間と実質的に同じ第１の保持時間を有する抗体、又は
ｂ）参照抗体のＫＤ値とは最大１０倍異なるＫＤ値を有し、参照抗体の保持時間と実質的に同じ保持時間を有する抗体、又は
ｃ）そのＦｃ領域の保持時間と実質的に同じ保持時間を有する抗体、又は
ｄ）そのＦｃ領域のＫＤ値とは最大１０倍異なるＫＤ値を有し、そのＦｃ領域の保持時間と実質的に同じ保持時間を有する抗体
を選択する工程とを含む、抗体を選択する方法。
【０２８６】
３．下記工程：
第１のｐＨ値での線形塩勾配溶出によるＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体及び参照抗体の第１の保持時間を決定し、第２のｐＨ値での線形塩勾配溶出によるＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体及び参照抗体の第２の保持時間を決定する工程と、
ａ）第２の保持時間と実質的に同じ第１の保持時間を有する抗体、又は
ｂ）参照抗体のＫＤ値とは最大１０倍異なるＫＤ値を有し、参照抗体の保持時間と実質的に同じ保持時間を有する抗体、又は
ｃ）そのＦｃ領域の保持時間と実質的に同じ保持時間を有する抗体、又は
ｄ）そのＦｃ領域のＫＤ値とは最大１０倍異なるＫＤ値を有し、そのＦｃ領域の保持時間と実質的に同じ保持時間を有する抗体
を選択する工程とを含む、抗体を選択する方法。
【０２８７】
４．下記工程：
抗体及び参照抗体について、表面プラズモン共鳴を使用して、ｐＨ６におけるＫＤ値を決定し、高塩濃度の存在下での正の線形ｐＨ勾配溶出によるＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体及び参照抗体の保持時間を決定する工程と、
ａ）第２の保持時間と実質的に同じ第１の保持時間を有する抗体、又は
ｂ）参照抗体のＫＤ値とは最大１０倍異なるＫＤ値を有し、参照抗体の保持時間と実質的に同じ保持時間を有する抗体、又は
ｃ）そのＦｃ領域の保持時間と実質的に同じ保持時間を有する抗体、又は
ｄ）そのＦｃ領域のＫＤ値とは最大１０倍異なるＫＤ値を有し、そのＦｃ領域の保持時間と実質的に同じ保持時間を有する抗体
を選択する工程とを含む、抗体を選択する方法。
【０２８８】
５．下記工程：
抗体及び参照抗体について、表面プラズモン共鳴を使用して、ｐＨ６におけるＫＤ値を決定し、線形塩勾配溶出によるＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体及び参照抗体の保持時間を決定する工程と、
ａ）第２の保持時間と実質的に同じ第１の保持時間を有する抗体、又は
ｂ）参照抗体のＫＤ値とは最大１０倍異なるＫＤ値を有し、参照抗体の保持時間と実質的に同じ保持時間を有する抗体、又は
ｃ）そのＦｃ領域の保持時間と実質的に同じ保持時間を有する抗体、又は
ｄ）そのＦｃ領域のＫＤ値とは最大１０倍異なるＫＤ値を有し、そのＦｃ領域の保持時間と実質的に同じ保持時間を有する抗体
を選択する工程とを含む、抗体を選択する方法。
【０２８９】
６．下記工程：
正の線形ｐＨ勾配溶出によるＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体及びそのＦｃ領域の保持時間を決定する工程と、
ａ）第２の保持時間と実質的に同じ第１の保持時間を有する抗体、又は
ｂ）参照抗体のＫＤ値とは最大１０倍異なるＫＤ値を有し、参照抗体の保持時間と実質的に同じ保持時間を有する抗体、又は
ｃ）そのＦｃ領域の保持時間と実質的に同じ保持時間を有する抗体、又は
ｄ）そのＦｃ領域のＫＤ値とは最大１０倍異なるＫＤ値を有し、そのＦｃ領域の保持時間と実質的に同じ保持時間を有する抗体
を選択する工程とを含む、抗体を選択する方法。
【０２９０】
７．下記工程：
高ｐＨ値での線形塩勾配溶出によるＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体及びそのＦｃ領域の保持時間を決定する工程と、
ａ）第２の保持時間と実質的に同じ第１の保持時間を有する抗体、又は
ｂ）参照抗体のＫＤ値とは最大１０倍異なるＫＤ値を有し、参照抗体の保持時間と実質的に同じ保持時間を有する抗体、又は
ｃ）そのＦｃ領域の保持時間と実質的に同じ保持時間を有する抗体、又は
ｄ）そのＦｃ領域のＫＤ値とは最大１０倍異なるＫＤ値を有し、そのＦｃ領域の保持時間と実質的に同じ保持時間を有する抗体
を選択する工程とを含む、抗体を選択する方法。
【０２９１】
８．下記工程：
抗体及びそのＦｃ領域について、表面プラズモン共鳴を使用して、ｐＨ６におけるＫＤ値を決定し、高塩濃度の存在下での正の線形ｐＨ勾配溶出によるＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体及びそのＦｃ領域の保持時間を決定する工程と、
ａ）第２の保持時間と実質的に同じ第１の保持時間を有する抗体、又は
ｂ）参照抗体のＫＤ値とは最大１０倍異なるＫＤ値を有し、参照抗体の保持時間と実質的に同じ保持時間を有する抗体、又は
ｃ）そのＦｃ領域の保持時間と実質的に同じ保持時間を有する抗体、又は
ｄ）そのＦｃ領域のＫＤ値とは最大１０倍異なるＫＤ値を有し、そのＦｃ領域の保持時間と実質的に同じ保持時間を有する抗体
を選択する工程とを含む、抗体を選択する方法。
【０２９２】
９．下記工程：
抗体及びそのＦｃ領域について、表面プラズモン共鳴を使用して、ｐＨ６におけるＫＤ値を決定し、高ｐＨ値での線形塩勾配溶出によるＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体及びそのＦｃ領域の保持時間を決定する工程と、
ａ）第２の保持時間と実質的に同じ第１の保持時間を有する抗体、又は
ｂ）参照抗体のＫＤ値とは最大１０倍異なるＫＤ値を有し、参照抗体の保持時間と実質的に同じ保持時間を有する抗体、又は
ｃ）そのＦｃ領域の保持時間と実質的に同じ保持時間を有する抗体、又は
ｄ）そのＦｃ領域のＫＤ値とは最大１０倍異なるＫＤ値を有し、そのＦｃ領域の保持時間と実質的に同じ保持時間を有する抗体
を選択する工程とを含む、抗体を選択する方法。
【０２９３】
１０．抗体のｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期に影響を及ぼす抗体−Ｆａｂ−ＦｃＲｎ相互作用を含まない抗体を選択するためのものである、実施態様１〜１０のいずれか１つに記載の方法。
【０２９４】
１１．ＩｇＧ１、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４サブクラスの抗体と比較して相対的に長いｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期を有する抗体を選択するためのものであり、
更に、参照抗体又は参照Ｆｃ領域の保持時間を決定し、
ａ）参照抗体の第１の保持時間より長い第１の保持時間を有し、第２の保持時間と実質的に同じである第１の保持時間を有する抗体、又は
ｂ）参照抗体のＫＤ値とは最大１０倍異なるＫＤ値を有し、参照抗体の保持時間より長い保持時間を有する抗体、又は
ｃ）そのＦｃ領域の保持時間と実質的に同じであり、参照抗体の保持時間より長い保持時間を有する抗体、又は
ｄ）そのＦｃ領域のＫＤ値とは最大１０倍異なるＫＤ値を有し、そのＦｃ領域の保持時間と実質的に同じであり、参照抗体の保持時間より長い保持時間を有する抗体
を選択することによる、実施態様１、６、７、８、及び９のいずれか１つに記載の方法。
【０２９５】
１２．参照抗体に対して相対的に伸長又は短縮した抗体のｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期を決定するためのものであり、
更に、参照抗体又は参照Ｆｃ領域の保持時間を決定し、
更に、突然変異Ｎ４３４Ａを有するＩｇＧ  Ｆｃ領域の保持時間を決定し、
ａ）参照抗体の第１の保持時間より長い第１の保持時間を有し、実質的に同じであり第１の保持時間と第２の保持時間を有し、突然変異Ｎ４３４Ａを有するＦｃ領域の保持時間より短い第１の保持時間を有する抗体を選択することにより、相対的に長いｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期を有する抗体を選択し、又は
ｂ）参照抗体のＫＤ値とは最大１０倍異なるＫＤ値を有し、参照抗体の保持時間より長い保持時間を有し、突然変異Ｎ４３４Ａを有するＦｃ領域の保持時間より短い第１の保持時間を有する抗体を選択することにより、相対的に長いｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期を有する抗体を選択し、又は
ｃ）参照抗体の第１の保持時間より短い第１の保持時間を有し、実質的に同じである第１の保持時間と第２の保持時間を有する抗体を選択することにより、相対的に短いｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期を有する抗体を選択し、又は
ｄ）参照抗体のＫＤ値とは最大１０倍異なるＫＤ値を有し、参照抗体の保持時間より短い保持時間を有する抗体を選択することにより、相対的に長いｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期を有する抗体を選択することによる、実施態様１、６、７、８、及び９のいずれか１つに記載の方法。
【０２９６】
１３．（正の）線形ｐＨ勾配が、約ｐＨ５．５〜約ｐＨ８．８である、実施態様１、２、４、６、８、及び１０〜１２のいずれか１つに記載の方法。
【０２９７】
１４．塩が、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、塩化カリウム、硫酸カリウム、クエン酸ナトリウム、又はクエン酸カリウムから選択される、実施態様１〜１３のいずれか１つに記載の方法。
【０２９８】
１５．塩が、塩化ナトリウムである、実施態様１〜１４のいずれか１つに記載の方法。
【０２９９】
１６．第１の塩濃度が、５０mM〜２００mMである、実施態様１、２、及び１０〜１５のいずれか１つに記載の方法。
【０３００】
１７．第１の塩濃度が、約１４０mMである、実施態様１、２、及び１０〜１６のいずれか１つに記載の方法。
【０３０１】
１８．第２の塩濃度が、３００mM〜６００mMである、実施態様１、２、及び１０〜１７のいずれか１つに記載の方法。
【０３０２】
１９．第２の塩濃度が、約４００mMである、実施態様１、２、及び１０〜１８のいずれか１つに記載の方法。
【０３０３】
２０．線形塩勾配が、０mM 塩から５００mM 塩に向かう、実施態様１、３、５、７、及び９〜１９のいずれか１つに記載の方法。
【０３０４】
２１．線形塩勾配が、０mM 塩から２５０mM 塩に向かう、実施態様１、３、５、７、及び９〜２０のいずれか１つに記載の方法。
【０３０５】
２２．第１のｐＨ値が、約５．５である、実施態様１、３、及び１０〜２１のいずれか１つに記載の方法。
【０３０６】
２３．第２のｐＨ値が、約７．４である、実施態様１、３、及び１０〜２２のいずれか１つに記載の方法。
【０３０７】
２４．高塩濃度が、２５０mM〜６００mMである、実施態様１、４、８、及び１０〜２３のいずれか１つに記載の方法。
【０３０８】
２５．高塩濃度が、約４００mMである、実施態様１、４、８、及び１０〜２４のいずれか１つに記載の方法。
【０３０９】
２６．高ｐＨ値が、ｐＨ６．５〜ｐＨ８．８である、実施態様１、７、及び９〜２５のいずれか１つに記載の方法。
【０３１０】
２７．高ｐＨ値が、約ｐＨ７．４である、実施態様１、７、及び９〜２６のいずれか１つに記載の方法。
【０３１１】
２８．実質的に異なる保持時間が、少なくとも５％異なる、実施態様１〜２７のいずれか１つに記載の方法。
【０３１２】
２９．実質的に異なる保持時間が、少なくとも１０％異なる、実施態様１〜２８のいずれか１つに記載の方法。
【０３１３】
３０．実質的に異なる保持時間が、少なくとも１５％異なる、実施態様１〜２９のいずれか１つに記載の方法。
【０３１４】
３１．実質的に同じ保持時間が、５％未満で異なる、実施態様１〜３０のいずれか１つに記載の方法。
【０３１５】
３２．実質的に同じ保持時間が、３．５％以下で異なる、実施態様１〜３１のいずれか１つに記載の方法。
【０３１６】
３３．実質的に同じ保持時間が、２．５％以下で異なる、実施態様１〜３２のいずれか１つに記載の方法。
【０３１７】
３４．保持時間が実質的に異なる場合、保持時間が、塩濃度の平方根の上の１（〜１／ＳＱＲＴ（ｃ（ｓａｌｔ）））に比例する、実施態様１〜３３のいずれか１つに記載の方法。
【０３１８】
３５．参照抗体が、サブクラスＩｇＧ１について、配列番号０１（重鎖）及び配列番号０２（軽鎖）を有する抗−ＩＬ−１Ｒ抗体、ならびに、サブクラスＩｇＧ４について、配列番号０３（重鎖）及び配列番号０４（軽鎖）を有する抗−ＩＬ−１Ｒ抗体、又は、サブクラスＩｇＧ１について、配列番号３６（重鎖）及び配列番号３７（軽鎖）を有する抗−ＨＥＲ２抗体、ならびに、サブクラスＩｇＧ４について、配列番号３８（重鎖）及び配列番号３９（軽鎖）を有する抗−ＨＥＲ２抗体のいずれかである、実施態様１〜３４のいずれか１つに記載の方法。
【０３１９】
３６．ＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーカラムが、新生児Ｆｃレセプター（ＦｃＲｎ）とベータ−２−ミクログロブリン（ｂ２ｍ）との非共有複合体を含む、実施態様１〜３５のいずれか１つに記載の方法。
【０３２０】
３７．ＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーカラムが、新生児Ｆｃレセプター（ＦｃＲｎ）とベータ−２−ミクログロブリン（ｂ２ｍ）との共有複合体を含む、実施態様１〜３６のいずれか１つに記載の方法。
【０３２１】
３８．新生児Ｆｃレセプター（ＦｃＲｎ）とベータ−２−ミクログロブリン（ｂ２ｍ）との複合体が、固体相に結合している、実施態様３６又は３７のいずれか１つに記載の方法。
【０３２２】
３９．固体相が、クロマトグラフィー材料である、実施態様３８記載の方法。
【０３２３】
４０．新生児Ｆｃレセプター（ＦｃＲｎ）とベータ−２−ミクログロブリン（ｂ２ｍ）との複合体が、ビオチン化されており、固体相が、ストレプトアビジンで誘導体化されている、実施態様３６〜３９のいずれか１つに記載の方法。
【０３２４】
４１．ベータ−２−ミクログロブリンが、新生児Ｆｃレセプター（ＦｃＲｎ）と同じ種由来である、実施態様３６〜４０のいずれか１つに記載の方法。
【０３２５】
４２．ベータ−２−ミクログロブリンが、ＦｃＲｎとは異なる種由来である、実施態様３６〜４０のいずれか１つに記載の方法。
【０３２６】
４３．ＦｃＲｎが、ヒトＦｃＲｎ、カニクイザルＦｃＲｎ、マウスＦｃＲｎ、ラットＦｃＲｎ、ヒツジＦｃＲｎ、イヌＦｃＲｎ、ブタＦｃＲｎ、ミニブタＦｃＲｎ、及びウサギＦｃＲｎから選択される、実施態様１〜４２のいずれか１つに記載の方法。
【０３２７】
４４．抗体が、単特異性抗体もしくは融合ポリペプチドの抗体フラグメント、又は、二重特異性抗体もしくは融合ポリペプチドの抗体フラグメント、又は、三重特異性抗体もしくは融合ポリペプチドの抗体フラグメント、又は、四重特異性抗体もしくは融合ポリペプチドの抗体フラグメントである、実施態様１〜４３のいずれか１つに記載の方法。
【０３２８】
４５．抗体が、全長抗体である、実施態様１〜４４のいずれか１つに記載の方法。
【０３２９】
４６．モノクローナル抗体である、実施態様１〜４５のいずれか１つに記載の抗体。
【０３３０】
４７．下記工程：
ａ）実施態様１〜４６のいずれか1つに記載の方法により選択された抗体をコードする１つ以上の核酸を含む細胞を提供する工程と、
ｂ）該細胞を培養培地中で培養する工程と、
ｃ）該細胞又は該培養培地から抗体を回収することにより、抗体を製造する工程とを含む、
抗体を製造する方法。
【０３３１】
参考文献リスト
【表３９】
2020183967.tif 000047
2020183967.tif 000048
【実施例】
【０３３２】
下記実施例、図面、及び配列を、本発明の理解を手助けするのに提供する。その真の範囲は、添付の特許請求の範囲に説明されている。変更は、本発明の本質を逸脱することなく、説明された手法においてなされ得ることが理解される。
【０３３３】
材料及び方法
抗体
実験に使用した抗体は、ウステキヌマブ（CNTO 1275, Stelara（商標）、ＣＡＳ登録番号815610-63-0、配列番号４２及び４３の可変ドメイン）と、ブリアキヌマブ（ABT 874, J 695, Ozespa（商標）、配列番号４０及び４１の可変ドメイン）と、ウステキヌマブ及びブリアキヌマブの１０個の変異体及び突然変異体（以下、それぞれｍＡｂ１〜ｍＡｂ１０と呼ぶ）とした。合計１２個のＩｇＧを調査した（表２を参照のこと）。
【０３３４】
合成遺伝子を、ウステキヌマブ、ブリアキヌマブ、ｍＡｂ５、及びｍＡｂ６について、Geneart（Life technologies GmbH, Carlsbad, CA, USA）において生成した。部位特異的突然変異誘発を、特定のアミノ酸を交換し、ｍＡｂ１、ｍＡｂ２、ｍＡｂ７、ｍＡｂ８、及びｍＡｂ９を生成するのに使用した。ｍＡｂ３を、ウステキヌマブ重鎖とブリアキヌマブ軽鎖とをコードするプラスミドによりトランスフェクションした。ｍＡｂ４はその逆とした。
【０３３５】
本明細書で使用したモノクローナル抗体を、HEK293細胞中で一過性に発現した（以下を参照のこと）。精製を、プロテインＡクロマトグラフィーにより、標準的な手法を使用して行った（以下を参照のこと）。
【０３３６】
生化学的特性決定には、サイズ排除クロマトグラフィー(Waters BioSuit（商標） 250  ７．８×３００mm、溶出液：２００mM ＫＨ２ＰＯ４、２５０mM ＫＣｌ、ｐＨ７．０）及びBioAnalyzer 2100（Agilent technologies, Santa Clara, CA, USA）を使用する分子量分布分析が含まれる。
【０３３７】
Ｆｃフラグメントを、FabRICATOR−キット（GENOVIS, Lund, Sweden）を使用して、３７℃で３０分以内の抗体のＩｄｅＳ消化により得た。
【０３３８】
発現プラスミド
上記された抗体の発現のために、一過性発現（例えば、HEK293-F）細胞のための変異体の発現プラスミドを、ＣＭＶ−イントロンＡプロモーターによるもしくはよらないｃＤＭＡ構築、又は、ＣＭＶプロモーターによるゲノム構築のいずれかに基づいて適用した。
【０３３９】
抗体発現カセットに加えて、プラスミドは、
E.coli中でのこのプラスミドの複製を可能にする複製起点、
E.coliにアンピシリン抵抗性を付与するβ−ラクタマーゼ遺伝子、及び
真核細胞における選択マーカーとしてのMus musculus由来のジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子
を含んだ。
【０３４０】
抗体遺伝子の転写ユニットを、下記エレメントで構成した。
５’端における固有の制限部位、
ヒトサイトメガロウイルス由来の前初期エンハンサー及びプロモーター、
続けて、ｃＤＮＡ構築の場合には、イントロンＡ配列、
ヒト抗体遺伝子の５’−非翻訳領域、
免疫グロブリン重鎖のシグナル配列、
免疫グロブリンエクソン―イントロン構築を伴うｃＤＮＡ又はゲノム構築のいずれかとしてのヒト抗体鎖、
ポリアデニル化シグナル配列を伴う３’非翻訳領域、及び
３’端における固有の制限部位
【０３４１】
抗体鎖を含む融合遺伝子を、ＰＣＲ及び／又は遺伝子合成により生成し、公知のリコンビナント法及び技術、例えば、各プラスミド中の固有の制限部位を使用する核酸セグメントによる連結により構築した。サブクローニングした核酸配列を、ＤＮＡシークエンシングにより検証した。一過性トランスフェクションのために、大量のプラスミドを、トランスフォーメンションされたE. coli培養物からのプラスミド調製により調製した（Nucleobond AX, Macherey-Nagel）。
【０３４２】
細胞培養技術
標準的な細胞培養技術を、Current Protocols in Cell Biology (2000), Bonifacino, J.S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J. and Yamada, K.M. (eds.), John Wiley & Sons, Incに記載されているように使用した。
【０３４３】
HEK293-F系における一過性トランスフェクション
抗体を、（例えば、重鎖と、対応する軽鎖とをコードする）各プラスミドによる一過性トランスフェクションにより、HEK293-F細胞（Invitrogen）を使用して、製造メーカーの説明書に従って生成した。簡潔に述べると、振とうフラスコ又は撹拌発酵槽のいずれかにおいて、血清を含まないFreeStyle（商標）293発現培地（Invitrogen）中で懸濁状に増殖させたHEK293-F細胞（Invitrogen）を、各発現プラスミドと、293 fectin(商標)又はフェクチン（Invitrogen）との混合物によりトランスフェクションした。２Ｌ振とうフラスコ（Corning）に対して、HEK293-F細胞を、６００mL中に１×１０６個/mLの密度で播種し、１２０rpm、８％ＣＯ２でインキュベーションした。その翌日、細胞を、約１．５×１０６個/mLの細胞密度で、Ａ）Opti-MEM（Invitrogen）２０mL（各重鎖及び等モル比で対応する軽鎖をコードする、６００μg トータルプラスミドＤＮＡ（１μg/mL）を含む）と、Ｂ）Opti-MEM ２０mL＋293 fectin又はフェクチン １．２mL（２μL/mL）との混合物 約４２mLによりトランスフェクションした。グルコース消費に従って、グルコース溶液を、発酵の経過中に加えた。分泌された抗体を含有する上清を、５〜１０日後に収集した。抗体を、上清から直接精製するか、又は、上清を、凍結及び保存するかのいずれかをした。
【０３４４】
精製
抗体を、細胞培養上清から、MabSelectSure-Sepharose（商標）（GE Healthcare, Sweden）を使用する親和性クロマトグラフィー、ブチル−セファロース（GE Healthcare, Sweden）を使用する疎水性相互作用クロマトグラフィー、及びSuperdex 200サイズ排除（GE Healthcare, Sweden）クロマトグラフィーにより精製した。
【０３４５】
簡潔に述べると、無菌ろ過細胞培養上清を、ＰＢＳバッファー（１０mM Ｎａ２ＨＰＯ４、１mM ＫＨ２ＰＯ４、１３７mM ＮａＣｌ、及び２．７mM ＫＣｌ、ｐＨ７．４）で平衡化したMabSelectSuRe樹脂上に捕捉し、平衡化バッファーで洗浄し、２５mM クエン酸ナトリウム（ｐＨ３．０）で溶出した。溶出した抗体画分をプールし、２M Ｔｒｉｓ（ｐＨ９．０）で中和した。抗体プールを、疎水性相互作用クロマトグラフィーのために、１．６M 硫酸アンモニウム溶液を加えて、０．８M 硫酸アンモニウムの最終濃度にし、酢酸を使用してｐＨを５．０に調整することにより調製した。３５mM 酢酸ナトリウム、０．８M 硫酸アンモニウム（ｐＨ５．０）によりブチル−セファロース樹脂を平衡化した後、抗体を、該樹脂にアプライし、平衡化バッファーで洗浄し、３５mM 酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）に向かう線形勾配により溶出した。抗体含有画分をプールし、サイズ排除クロマトグラフィーにより、２０mM ヒスチジン、１４０mM ＮａＣｌ（ｐＨ６．０）により平衡化したSuperdex 200 26/60 GL（GE Healthcare, Sweden）カラムを使用して、更に精製した。抗体含有画分をプールし、Vivaspin限外ろ過装置（Sartorius Stedim Biotech S.A., France）を使用して、必要とされる濃度に濃縮し、−８０℃で保存した。
【０３４６】
【表４０】
2020183967.tif 000049
【０３４７】
純度及び抗体の完全性を、マイクロ流体Labchip技術（Caliper Life Science, USA）を使用するＣＥ−ＳＤＳにより、各精製工程後に分析した。タンパク質溶液 ５μLを、ＨＴタンパク質発現試薬キットを使用し、製造メーカーの説明書に従って、ＣＥ−ＳＤＳ分析用に調製し、LabChip GXIIシステムにおいて、ＨＴタンパク質発現チップを使用して分析した。データを、LabChip GXソフトウェアを使用して分析した。
【０３４８】
表１１：全てのｍＡｂの生化学的特性決定の概観
濃度を、３回の測定の平均として提供する。単量体含量を、ＳＥＣクロマトグラムの積分により決定する。抗体種の純度を、インタクトなｍＡｂのＣＥ−ＳＤＳにより、ＤＴＴ還元後に決定する。疎水性を、低及び高疎水性ＲＳに対して表す。
【表４１】
2020183967.tif 000050
【０３４９】
機能性特定決定
機能性特定決定には、ブリアキヌマブ及びウステキヌマブが正しく生成され、ターゲットへの結合性も機能しているかを試験するための、ターゲット（ヒトＩＬ−１２）との相互作用分析が含まれる。ｍＡｂ変異体を、Ｆａｂ領域において改変し、これらの改変がターゲット結合性を変化させるかを試験する。更に、マウスＩＬ−１２／−２３とのマウスＰＫ研究に使用される抗体の相互作用を、マウス研究におけるターゲット媒介性クリアランス効果を除外するのに分析する。加えて、マウスＦｃγレセプターＩ（ｍｕＦｃγＲＩ）に対する結合レベルを測定する。マウスＦｃγＲＩに対するより強い結合性は、抗原提示細胞へのより速い取込みによるＰＫ研究におけるより速い減少をもたらす場合があるためである。
【０３５０】
ヒトＩＬ−１２との相互作用
ブリアキヌマブ、ウステキヌマブ、及び変異体は、ＩＬ−１２結合性に影響を及ぼす場合があるＦａｂ領域において構造的差異を有するため、全てのｍＡｂの結果を、詳細に提供する。
【０３５１】
ＥＬＩＳＡ
交差交換を有する変異体（ｍＡｂ１〜６）及び改変された電荷分布を有する変異体（ｍＡｂ７〜１０）の吸光度−濃度曲線を、図１５及び１６それぞれに示す。各ｍＡｂの濃度を、ブリアキヌマブ検量線の当てはめを使用して算出し、ブリアキヌマブに対するＩＬ−１２結合性（ブリアキヌマブ＝１００％）を得た。３０％以下の結合性の差異を、ブリアキヌマブと同様のＩＬ−１２に対する結合性を示すと評価した。３０％以上の差異は、ＩＬ−１２に対する結合性が低下したことを示す。ブリアキヌマブ、ウステキヌマブ、及び交換されたＦｖドメインを有するｍＡｂ（ｍＡｂ１及びｍＡｂ２）は、同様のＩＬ−１２結合プロファイルを示す。ブリアキヌマブ、ウステキヌマブ、及びｍＡｂ２の結合性は、２０％ウインドウの範囲であり、ｍＡｂ３の結合性は、３０％ウインドウの範囲である。交換されたＬＣを有するｍＡｂ（ｍＡｂ３及びｍＡｂ４）と、交換されたＣＤＲを有するｍＡｂ（ｍＡｂ５及びｍＡｂ６）は、ＩＬ−１２に結合しない。
【０３５２】
改変された電荷分布を有するブリアキヌマブ変異体（ｍＡｂ７〜９）は、ブリアキヌマブに対して３０％の範囲で、ＩＬ−１２に結合する。これは、同様のＩＬ−１２結合性を示す。ｍＡｂ１０のみが、ブリアキヌマブと比較して６３％の結合性で、低下したＩＬ−１２結合性を示す。
【０３５３】
表面プラズモン共鳴
ＳＰＲを、ターゲット特異的ＥＬＩＳＡの結果を確認するのに使用した。ウステキヌマブ及びブリアキヌマブは、ほぼ同一の会合速度定数（ｋａ）（ｋａ（ブリアキヌマブ）８×１０５l/Ms  ｖｓ．ｋａ（ウステキヌマブ）９×１０５l/Ms）を有する。ＩＬ−１２とｍＡｂとの解離は、非常に遅いため、解離速度定数（ｋｄ）、及びその後の、平行解離定数（ＫＤ）の算出は、実際の値とは異なる場合がある。この設定における方法の限界に関わらず、算出値は、一般的な評価を提供することができ、ＥＬＩＳＡでの結果を確認するのに使用することができる。ブリアキヌマブ及びウステキヌマブは、高い親和性でＩＬ−１２に結合し、ＫＤは、低いnM範囲（ＫＤ（ブリアキヌマブ）＝０．２nM  ｖｓ．  ＫＤ（ウステキヌマブ）＝０．０７nM）にある。それぞれ８×１０５l/Ms、６×１０−５l/s、及び７０pMのｋａ、ｋｄ、及びＫＤ値を有するブリアキヌマブの測定された親和性は、文献データ（ｋａ  ５×１０５l/Ms、ｋｄ  ５．１×１０−５l/s、ＫＤ＝１００pM）と一致している（［５１］）。ＩＬ−１２に対するウステキヌマブの高い親和性も、文献に記載されている（［５２］）。
【０３５４】
表１２に、ターゲット相互作用の算出された反応速度パラメータをまとめる。交換されたＦｖドメインを有するモノクローナル抗体（ｍＡｂ１及びｍＡｂ２）と、改変された電荷分布を有するｍＡｂ（ｍＡｂ７〜１０）は、ブリアキヌマブ及びウステキヌマブと同様のＩＬ−１２に対する親和性を有する。ｍＡｂ３及びｍＡｂ５は、ＩＬ−１２に結合せず、ｍＡｂ４及びｍＡｂ６は、ＩＬ−１２に対して非常に弱い結合性を示す。データは、ＥＬＩＳＡでの結果と一致している。
【０３５５】
【表４２】
2020183967.tif 000051
【０３５６】
ｐＨ６．０でのＦｃＲｎ−ｍＡｂ親和性
ＫＤを、ウステキヌマブに対して算出した（ウステキヌマブ＝１．０）。ＫＤ値の評価のために、差異が、ウステキヌマブ−ＦｃＲｎ  ＫＤに対して小数第一位より小さかった場合、ｍＡｂとＦｃＲｎとの親和性を、ウステキヌマブ−ＦｃＲｎ親和性と同様であると評価した。ＫＤの差異が、ウステキヌマブ−ＦｃＲｎ  ＫＤに対して小数第一位より大きかった場合、ＫＤを、異なると評価した。ｐＨ６．０でのＦｃＲｎ親和性は、全てのｍＡｂについて狭い範囲にあった。ブリアキヌマブは、０．２の相対的なＫＤを有した。変異体は、１．１の相対的なＫＤを有したｍＡｂ１０を除いて、ブリアキヌマブとウステキヌマブとの間の範囲にあった。
【０３５７】
【表４３】
2020183967.tif 000052
【０３５８】
ＦｃＲｎ−ｍＡｂ解離
ＦｃＲｎとｍＡｂとの解離を、ＳＰＲ及びＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィーにより分析した。
【０３５９】
ＳＰＲを使用するＦｃＲｎ−ｍＡｂ解離
ＫＤ値の評価について、１μMを下回るＫＤを、中程度の親和性を示すと評価し、１〜５μMのＫＤを、弱い親和性を示すと評価し、５μM超のＫＤを、ＦｃＲｎに対する結合性を示さないと評価した。ブリアキヌマブ及びウステキヌマブは、ｐＨ６．０において同様の親和性を示した。ウステキヌマブは、ｐＨ６．６において非常に弱い親和性を示し、ｐＨ６．８において親和性を示さなかった。対照的に、ブリアキヌマブは、ｐＨ６．８まで中程度の親和性を示し、ｐＨ７．０において弱い親和性を示し、ｐＨ７．２において結合性を示さなかった。
【０３６０】
【表４４】
2020183967.tif 000053
【０３６１】
抗体の生化学的特性決定は、ブリアキヌマブ、ウステキヌマブ、及び変異体間で、目立った差異を示さなかった。
【０３６２】
抗体フラグメントの生成
Ｆ（ａｂ’）２フラグメント及びＦｃ領域フラグメントを、FabRICATOR−キット（GENOVIS, Lund, Sweden）を使用して、３７℃で３０分間インキュベーションすることにより調製した。得られた開裂生成物であるＦ（ａｂ’）２及びＦｃ領域を、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）カラム（Superdex 200, GE Healthcare, Zurich, Switzerland）において、AKTA Explorerクロマトグラフィーシステム（GE Healthcare, Uppsala, Sweden）を使用して分離し、ピーク画分をプールした。分子量標準を、２つの開裂生成物をその保持時間に基づいて特定するのに、同じカラムに供給した。
【０３６３】
ＦｃＲｎ表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析
抗体のＦｃＲｎに対する結合特性を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術により、BIAcore T100機器（BIAcore AB, Uppsala, Sweden）を使用して分析した。このシステムは、分子間相互作用の研究に十分確立されている。それは、リガンド／検体結合の連続的なリアルタイムモニタリングが可能であり、このため、種々のアッセイ設定における反応速度パラメータの決定が可能である。ＳＰＲ技術は、金でコートしたバイオセンサチップの表面近くでの屈折率の測定に基づいている。屈折率の変化は、固定されたリガンドと溶液中の注入された検体との相互作用による表面での質量変化を示す。分子が表面に固定されたリガンドに結合すると、質量は増大する。解離した場合、質量は減少する。本アッセイ法では、ＦｃＲｎレセプターを、BIAcore CM5-バイオセンサチップ（GE Healthcare Bioscience, Uppsala, Sweden）上に、アミンカップリングを介して、４００応答単位（RU）のレベルで固定化した。このアッセイ法を、ランニング及び希釈バッファーとして、ＰＢＳ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ６．０(GE Healthcare Bioscience)を使用して、室温で行った。２００nM ネイティブ又は酸化抗体サンプルを、５０μL/分の流速で室温において注入した。会合時間を、１８０秒とし、解離相を、３６０秒とった。チップ表面の再生を、ＨＢＳ−Ｐ（ｐＨ８．０）の短い注入により達成した。ＳＰＲデータの評価を、注入後１８０秒と注入後３００秒での生物学的応答シグナルの高さの比較により行った。対応するパラメータを、ＲＵ最大レベル（注入後１８０秒）及び後期安定性（注入終了後３００秒）とする。
【０３６４】
ｈｕＦｃＲｎとＩｇＧとについての定常状態結合レベル及び平衡解離定数（ＫＤ）を、ｐＨ６．０において、BIAcore T100 SPR機器（GE Healthcare, Little Chalfont, United Kingdom）を使用して決定した。ヒトＦｃＲｎを、BIAcore CM5−バイオセンサチップ（GE Healthcare Bioscience）上に、アミンカップリングを介して、５０応答単位（RU）のレベルで固定化した。ｍＡｂ５及びｍＡｂ６について、CM4−バイオセンサチップを使用した。このアッセイ法を、ランニング及び希釈バッファーとして、ｐＨ６．０に調整した０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（両方とも、Roche Diagnostics, Mannheim, Germanyから入手）を使用して、室温で行った。サンプルの濃度系列を、１５００nM〜２３nMの範囲で調製した。各サンプルを、５μL/分の流速で注入した。６００及び３６０秒の会合及び解離時間を、それぞれ使用した。該チップを、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ｐＨ７．５）の注入により再生した。平衡解離定数ＫＤを、定常状態親和性として算出し、ウステキヌマブのＫＤに対して正規化した。
【０３６５】
マウス
マウスＦｃＲｎ  α−鎖遺伝子を欠損しているが、ヒトＦｃＲｎ  α−鎖遺伝子について半接合トランスジェニックなB6.Cg-Fcgrttm1DcrTg(FCGRT)276Dcrマウス（ｍｕＦｃＲｎ−／−  ｈｕＦｃＲｎ  ｔｇ＋／−、系統２７６）を、薬物動態研究に使用した［３９］。マウスの管理を、特定病原体不在条件下において行った。マウスを、Jackson Laboratory（Bar Harbor, ME, USA）から得た（メス、４〜１０週齢、投与時体重１７〜２２ｇ）。全ての動物実験について、Government of Upper Bavaria, Germanyにより承認を受け（許可番号５５．２−１−５４−２５３２．２−２８−１０）、ＡＡＡＬＡＣ認定動物施設において、実験動物の管理及び利用に関する欧州連合基準に従って行った。動物を、標準的なケージに収容し、研究期間全体を通して、食餌及び水を自由に摂取できるようにした。
【０３６６】
薬物動態研究
単回用量の抗体を、外側尾静脈を介して、１０mg/kgの用量レベルでｉ．ｖ．注射した。マウスを、３つの群に６匹のマウスずつに分け、合計９回の血清収集時点（投与後０．０８、２、８、２４、４８、１６８、３３６、５０４、及び６７２時間）をカバーした。各マウスを、Isoflurane（商標）（CP-Pharma GmbH, Burgdorf, Germany）による浅麻酔下において行う後眼窩出血に２回供した。三回目の血液サンプルを、安楽死の時点で収集した。血液を、血清チューブ（Microvette 500Z-Gel, Sarstedt, Numbrecht, Germany）中に収集した。２時間のインキュベーション後、サンプルを、９，３００ｇで３分間遠心分離し、血清を得た。遠心分離後、血清サンプルを、分析まで−２０℃で凍結保存した。
【０３６７】
ヒト抗体の血清濃度の決定
マウス血清中のウステキヌマブ、ブリアキヌマブ、ｍＡｂ８、及びｍＡｂ９の濃度を、特異的酵素結合免疫アッセイ法により決定した。抗体に特異的なビオチン化インターロイキン１２及びジゴキシゲニン−標識抗−ヒト−Ｆｃマウスモノクローナル抗体（Roche Diagnostics, Penzberg, Germany）をそれぞれ、捕捉及び検出に使用した。ストレプトアビジンコートしたマイクロタイタープレート（Roche Diagnostics, Penzberg, Germany）を、アッセイバッファー（Roche Diagnostics, Penzberg, Germany）で希釈したビオチン化捕捉抗体で、１時間コートした。洗浄後、血清サンプルを、種々の希釈で加え、続けて、更に１時間インキュベーションした。繰返し洗浄した後、結合したヒト抗体を、検出抗体、続けて、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ：Roche Diagnostics, Penzberg, Germany）にコンジュゲートさせた抗−ジゴキシゲニン抗体とのその後のインキュベーションにより検出した。ＡＢＴＳ（２，２’−アジノ−ジ［３−エチルベンズチアゾリンスルホナート］；Roche Diagnostics, Germany）を、ＨＲＰ基質として使用し、着色反応生成物を形成した。得られた反応生成物の吸光度を、４９０nmでの参照波長と共に４０５nmで、Tecan sunriseプレートリーダー（Mannedorf, Switzerland)を使用して読み取った。
【０３６８】
全ての血清サンプル、陽性及び陰性の対照サンプルを、２連分析し、参照標準に対して較正した。
【０３６９】
ＰＫ分析
薬物動態パラメータを、WinNonlin（商標）1.1.1（Pharsight, CA, USA）を使用する非コンパートメント分析により算出した。
【０３７０】
簡潔に述べると、曲線下面積（ＡＵＣ０−ｉｎｆ）値を、抗体の非線形減少による対数台形法により算出し、最後の時点で観察された濃度からの外挿と共に、見かけの終末相速度定数λｚを使用して、無限大に外挿した。
【０３７１】
血漿クリアランスを、ＡＵＣ０−ｉｎｆで割った線量率（Ｄ）として算出した。見かけの終末相半減期（Ｔ１／２）を、等式Ｔ１／２＝ｌｎ２／λｚから導いた。
【０３７２】
統計学的分析
中心を外れた血清濃度を、Nalimov outlier検定を使用して検出し、更なる分析から除外した。
【０３７３】
テューキーの真の有意差検定（テューキーのＨＳＤ検定）を、終末相半減期において、統計学的な有意差の分析のための統計学的検定として使用した。
【０３７４】
ｐＨ依存性正味電荷の算出
ｐＨ依存性正味電荷（「滴定曲線」）を、オープンソースプログラムEMBOSS iepにより、全てのシステインがジスルフィド架橋に関与すると仮定して算出した。
【０３７５】
ブリアキヌマブ相同性モデルの生成及び等ポテンシャル表面の算出
ブリアキヌマブＦａｂフラグメントについての相同性モデルを、テンプレートとしてＰＤＢ構造１ＡＱＫ［４１］を使用するモデラー９ｖ７を使用して生成した。ブリアキヌマブ及びウステキヌマブＦａｂについての等ポテンシャル表面を、このモデル（ブリアキヌマブ）又はウステキヌマブの結晶構造（ＰＤＢ  ＩＤ  ３ＨＭＸ）からそれぞれ算出した。構造を、DiscoveryStudio Pro, Version 3.5（Accelrys Inc., San Diego, USA）におけるCHARMm force fieldによる「prepare protein」プロトコールを使用して、ｐＨ７．４及び０．１４５M イオン強度においてプロトン化した。静電ポテンシャルを、DiscoveryStudio Proにおける「electrostatic potential」プロトコールを使用して算出した。このプロトコールは、DelPhiプログラムを呼び出す［４２］。
【０３７６】
ブリアキヌマブ及びウステキヌマブ−ＦｃＲｎ複合体の分子動力学シミュレーション
完全なＩｇＧとしてのブリアキヌマブ及びウステキヌマブの相同性モデルを、完全なＩｇＧ１の結晶構造（ＰＤＢ  ＩＤ  １ＨＺＨ）により、テンプレートとしてグリカンを使用することなく、DiscoveryStudio Pro, Version 3.5を使用して構築した。この簡易化は、適切であったと考えられる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるグリコシル化は、ＦｃＲｎ結合性に顕著な影響を有さないためである［４３］。このテンプレート中のＦａｂドメインを、そのＣＨ１及びＣＬドメインのアライメント後に、上記されたＦａｂ構造により置き換えた。ヒトＦｃＲｎの相同性モデルを、テンプレートとしてラットＦｃＲｎ−Ｆｃ複合体（ＰＤＢ  ＩＤ  １Ｉ１Ａ）を使用して、DiscoveryStudio Proにより構築した。欠けている残基を、DiscoveryStudio Proの「prepare protein」スクリプトにより構築した。ヒトＦｃＲｎの相同性モデルを、ブリアキヌマブ及びウステキヌマブＩｇＧモデルの両重鎖に対して、ＦｃＲｎ周囲５Å内にあるラットＦｃドメインのＣ−アルファ原子と、ヒトＦｃ領域におけるその相同的な対応物とを重ねることにより、モデル化した。ＭＤシミュレーションについて、ＦｃＲｎ：Ｆｃ界面（ＦｃＲｎ中の残基１０８とＦｃ中の残基２５５との間、図Ｓ１）におけるジスルフィド結合を、シミュレーション中に複合体が解離するのを妨げるために導入した。得られた構造は、ＦｃＲｎ／β２ｍｇヘテロ二量体の２つのコピーを有する完全なＩｇＧを表す。
【０３７７】
ＩｇＧ−ＦｃＲｎ複合体の分子動力学（ＭＤ）シミュレーションを、GROMACS 4.6.2シミュレーションソフトウェアパッケージ（www.gromacs.orgから入手）［４４］により、基本的にKortkhonjia et al.［４５］に記載されているように行った。シミュレーションを、Linuxオペレーティングシステムで動作するコンピュータクラスターの１６０個のプロセッサのにおいて、平行して行った。OPLSAA force field［４６］を使用し、構造を、約１２８’０００  ＴＩＰ３の水分子により完全に溶媒和した。塩化物又はナトリウム原子を加えて、系全体の電荷を中和した。周期的な境界条件による切頂八面体を、タンパク質周囲の７．５オングストローム境界と共に使用した。静電相互作用を、ＰＭＥ積算を使用して、１．０nmの実空間静電カットオフにより算出した。レナード−ジョーンズポテンシャルを、１．０nmでカットオフした。LINCSを使用して、全てのタンパク質結合長を制限し、２fsのタイムステップを可能にした。温度を、V-rescaleアルゴリズムを使用して、３００Ｋで一定に保った。エネルギー最少化（ターゲット：最大力＜１０００kJ/mol/nm）に従って、３０psでの平衡化を行った。その後、１００nsの長さにわたって軌跡をシミュレーションした。
【０３７８】
ＩｇＧ−ＦｃＲｎ相互作用エネルギーの算出
ＭＤ軌跡中にＦｃＲｎに近づく、ＦｃＲｎとＦａｂドメインとの間の非結合相互作用に対する静電的寄与を、DiscoveryStudio Proにより算出した。エネルギー算出について、タンパク質を、上記されたのと同じ設定で、ｐＨ７．４、１４５mM イオン強度、及び３７℃の温度でプロトン化した。構造を、最大１０００ステップの「smart minimizer」プロトコールにより最小化した。その後、相互作用エネルギーを、「calculate interaction energy」プロトコールを使用して、DiscoveryStudio ProにおけるCHARMm force fieldにより算出した。顕在する水及びＧＢＭＶ静電モデルを使用した。この計算を、軌跡（０ns）の開始時と、１ns間隔で９６〜１００nsとで行った。
【０３７９】
実施例１
ＦｃＲｎ親和性カラムの準備
HEK293細胞中でのＦｃＲｎの発現
ＦｃＲｎを、ＦｃＲｎとベータ−２−ミクログロブリンとのコード配列を含有する２つのプラスミドによるHEK293細胞のトランスフェクションにより、一過性に発現させた。トランスフェクションされた細胞を、振とうフラスコ中において、３６．５℃、１２０rpm（振とう器振幅５cm）、湿度８０％、及び７％ ＣＯ２で培養した。該細胞を、２〜３日毎に、３〜４×１０５個／mLの密度に希釈した。
【０３８０】
一過性発現のために、１４Ｌのステンレス鋼製バイオリアクタを、培養容積 ８Ｌで、３６．５℃、ｐＨ７．０±０．２、ｐＯ２ ３５％（Ｎ２及び空気でガス補給、合計ガス流量 ２００ml・分−１）、及び１００〜４００rpm 撹拌速度で開始した。細胞密度が２０×１０５個／mLに達した時点で、１０mg プラスミドＤＮＡ（両プラスミドの等モル量）を、Opti-MEM（Invitrogen）の４００mL中で希釈した。293fectin（Invitrogen）の２０mLを、この混合物に加えた。ついで、混合物を、室温で１５分間インキュベーションし、その後、発酵槽に移した。翌日から、細胞に、連続モードで栄養を供給した。フィード溶液を、１日当たりに５００mLの速度で加え、２g/lを上回るレベルを維持するのに必要なグルコースを加えた。上清を、トランスフェクション後７日で、１１個のバケットを有するスイングヘッド遠心分離：４０００rpmで９０分間を使用して収集した。上清（１３Ｌ）を、Sartobran Pフィルタ（０．４５μm＋０．２μm、Sartorius）により浄化し、ＦｃＲｎ  ベータ−２−ミクログロブリン複合体を、それから精製した。
【０３８１】
新生児Ｆｃレセプターのビオチン化
３mg ＦｃＲｎを、１５０mM 塩化ナトリウムを含有する２０mM リン酸二水素ナトリウムバッファー ５．３mL中に溶解／希釈し、ＰＢＳ ２５０μL及びcomplete protease inhibitor（complete ULTRA Tablets, Roche Diagnostics GmbH) １錠を加えた。ＦｃＲｎを、Avidityから入手したビオチン化キットを使用して、製造メーカーの説明書に従って、ビオチン化した（Bulk BIRA, Avidity LLC）。ビオチン化反応を、室温で一晩行った。
【０３８２】
ビオチン化ＦｃＲｎを、１５０mM ＮａＣｌを含む２０mM リン酸二水素ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）に対して、４℃で一晩透析して、過剰なビオチンを除去した。
【０３８３】
ストレプトアビジンセファロースへの結合
ストレプトアビジンセファロースに結合させるために、１グラム ストレプトアビジンセファロース（GE Healthcare, United Kingdom）を、ビオチン化し、透析したＦｃＲｎに加え、４℃で一晩インキュベーションした。ＦｃＲｎ誘導体化セファロースを、ＸＫカラム（GE Healthcare, United Kingdom） １mLに充填した。ついで、ＦｃＲｎカラムを、１４０mM 塩化ナトリウムを含有する２０mM ２−（Ｎ−モルホリン）−エタンスルホン酸（ＭＥＳ）ナトリウム塩バッファー（ｐＨ５．５）で平衡化した。
【０３８４】
実施例２
ＦｃＲｎ親和性カラム及びｐＨ勾配を使用するクロマトグラフィー
レセプター誘導体化セファロースを、ＸＫカラム（GE Healthcare） １mLに充填し、ついで、ＦｃＲｎカラムを、１４０mM ＮａＣｌを含有する２０mM ２−（Ｎ−モルホリン）−エタンスルホン酸（ＭＥＳ）バッファー（ｐＨ５．５）で平衡化した。
【０３８５】
条件
カラム寸法：        ５０mm×５mm
ベッド高さ：        ５cm
ローディング：      ３０μg サンプル
平衡化バッファー：  １４０mM ＮａＣｌを含む２０mM ＭＥＳ、ｐＨ５．５に調整
溶出バッファー：    １４０mM ＮａＣｌを含む２０mM Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８．８に調整
溶出：              ７．５ＣＶ 平衡化バッファー、１２０分間に１００％ 溶出バッファー、１０ＣＶ 溶出バッファー
【０３８６】
サンプルを、２０mM ２−（Ｎ−モルホリン）−エタンスルホン酸（ＭＥＳ）ナトリウム塩、１４０mM 塩化ナトリウム（ｐＨ５．５）中で調製した。各サンプルは、１注入当たりに３０μg ｍＡｂを含んだ。抗体を、ｐＨ５．５から８．８に向かう線形ｐＨ勾配により、２０mM ２−（Ｎ−モルホリン）−エタンスルホン酸（ＭＥＳ）ナトリウム塩、１４０mM 塩化ナトリウム（ｐＨ５．５）及び２０mM トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンＴＲＩＳ、１４０mM 塩化ナトリウム（ｐＨ８．８）を溶出液として使用し、０．５mL/分の流速で、１２０分以内に溶出した。ＦｃＲｎカラムクロマトグラフィーは、酸性ｐＨ（ｐＨ５．５〜６．０）において結合性を示し、より高いｐＨ値において放出を示す。抗体の完全な溶出のために、ｐＨを、勾配においてｐＨ８．８まで上昇させる。クロマトグラムを、Chromeleonソフトウェア（Dionex, Germany）を使用することにより、手作業で積分した。実験を、室温で行った。溶出プロファイルを、２８０nmでの吸光度の連続的な測定により得た。特定の保持時間での溶出ｐＨを決定するために、サンプルを、５分毎に回収し、ｐＨを、オフラインで測定した。
【０３８７】
実施例３
ＦｃＲｎ親和性カラム、ｐＨ勾配、及び高塩条件を使用するクロマトグラフィー
レセプター誘導体化セファロースを、ＸＫカラム（GE Healthcare） １mLに充填し、ついで、ＦｃＲｎカラムを、４００mM ＮａＣｌを含有する２０mM ２−（Ｎ−モルホリン）−エタンスルホン酸（ＭＥＳ）バッファー（ｐＨ５．５）で平衡化した。
【０３８８】
条件
カラム寸法：        ５０mm×５mm
ベッド高さ：        ５cm
ローディング：      ３０μg サンプル
平衡化バッファー：  ４００mM ＮａＣｌを含む２０mM ＭＥＳ、ｐＨ５．５に調整
溶出バッファー：    ４００mM ＮａＣｌを含む２０mM Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８．８に調整
溶出：              ７．５ＣＶ 平衡化バッファー、１２０分間に１００％ 溶出バッファー、１０ＣＶ 溶出バッファー
【０３８９】
サンプルを、２０mM ２−（Ｎ−モルホリン）−エタンスルホン酸（ＭＥＳ）ナトリウム塩、４００mM 塩化ナトリウム（ｐＨ５．５）中で調製した。各サンプルは、１注入当たりに３０μg ｍＡｂを含んだ。抗体を、ｐＨ５．５から８．８に向かう線形ｐＨ勾配により、２０mM ２−（Ｎ−モルホリン）−エタンスルホン酸（ＭＥＳ）ナトリウム塩、４００mM 塩化ナトリウム（ｐＨ５．５）及び２０mM トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンＴＲＩＳ、４００mM 塩化ナトリウム（ｐＨ８．８）を溶出液として使用し、０．５mL/分の流速で、１２０分以内に溶出した。ＦｃＲｎカラムクロマトグラフィーは、酸性ｐＨ（ｐＨ５．５〜６．０）において結合性を示し、より高いｐＨ値において放出を示す。抗体の完全な溶出のために、ｐＨを、勾配においてｐＨ８．８まで向上させる。クロマトグラムを、Chromeleonソフトウェア（Dionex, Germany）を使用することにより、手作業で積分した。実験を、室温で行った。溶出プロファイルを、２８０nmでの吸光度の連続的な測定により得た。特定の保持時間での溶出ｐＨを決定するために、サンプルを、５分毎に回収し、ｐＨを、オフラインで測定した。
【０３９０】
実施例４
ＦｃＲｎ親和性カラム及び塩勾配を使用するクロマトグラフィー
レセプター誘導体化セファロースを、ＸＫカラム（GE Healthcare） １mLに充填し、ついで、ＦｃＲｎカラムを、１０mM ２−（Ｎ−モルホリン）−エタンスルホン酸（ＭＥＳ）バッファー（ｐＨ７．８）で平衡化した。
【０３９１】
条件
カラム寸法：        ５０mm×５mm
ベッド高さ：        ５cm
ローディング：      ３０μg サンプル
平衡化バッファー：  １０mM ＭＥＳ、ｐＨ７．８に調整
溶出バッファー：    ２５０mM ＮａＣｌを含む１０mM ＭＥＳ、ｐＨ７．８に調整
溶出：              ７．５ＣＶ 平衡化バッファー、６０分間に１００％ 溶出バッファー、１０ＣＶ 溶出バッファー
【０３９２】
サンプルを、１０mM ２−（Ｎ−モルホリン）−エタンスルホン酸（ＭＥＳ）ナトリウム塩（ｐＨ７．８）中で調製した。各サンプルは、１注入当たりに３０μg ｍＡｂを含んだ。抗体を、０nMから２５０nMに向かう塩化ナトリウムの線形塩濃度により、１０mM ２−（Ｎ−モルホリン）−エタンスルホン酸（ＭＥＳ）ナトリウム塩（ｐＨ７．８）及び１０mM ２−（Ｎ−モルホリン）−エタンスルホン酸（ＭＥＳ）ナトリウム塩、２５０mM 塩化ナトリウム（ｐＨ７．８）を溶出液として使用し、０．５mL/分の流速で、６０分以内に溶出した。実験を、室温で行った。溶出プロファイルを、２８０nmでの吸光度の連続的な測定により得た。クロマトグラムを、Chromeleonソフトウェア（Dionex, Germany）を使用することにより、手作業で積分した。
【０３９３】
実施例５
ＦｃＲｎ親和性カラムを使用するクロマトグラフィー
レセプター誘導体化セファロースを、ＸＫカラム（GE Healthcare） １mLに充填し、ついで、ＦｃＲｎカラムを、１５０mM ＮａＣｌを含有する２０mM ２−（Ｎ−モルホリン）−エタンスルホン酸（ＭＥＳ）バッファー（ｐＨ５．５）で平衡化した。
【０３９４】
条件
カラム寸法：        ５０mm×５mm
ベッド高さ：        ５cm
ローディング：      ５０μg サンプル
平衡化バッファー：  １５０mM ＮａＣｌを含む２０mM ＭＥＳ、ｐＨ５．５に調整
溶出バッファー：    １５０mM ＮａＣｌを含む２０mM Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８．８に調整
溶出：              ７．５ＣＶ 平衡化バッファー、３０ＣＶの間に１００％ 溶出バッファー、１０ＣＶ 溶出バッファー
【０３９５】
５０〜１００μg タンパク質を含有する抗体又は融合タンパク質サンプルを、ｐＨ５．５に調整し、AKTA explorer 10 XT又はDionex Summit（Dionex, Idstein, Germany）を使用するＦｃＲｎカラムにアプライした。ついで、５cmのベッド高さを有するカラムを、２０mM ＭＥＳ、１５０mM ＮａＣｌ（ｐＨ５．５）の平衡化バッファー ５〜１０カラム量で洗浄した。親和性結合したＦｃ含有タンパク質を、２０mM Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、１５０mM ＮａＣｌ（ｐＨ８．８）へのｐＨ勾配により、３０カラム量で溶出した。改変抗体の完全な溶出のために、ｐＨを、勾配において、ｐＨ８．８まで上昇させた。実験を、室温で行った。溶出プロファイルを、２８０nmでの吸光度の連続的な測定により得た。サンプル注入後、検体ピークＸが検出器に達するのに掛かった時間を、保持時間と呼んだ。
【０３９６】
実施例６
ＦｃＲｎカラムにおける保持時間とｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期との相関
ｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期を、１０mg/kg（ｎ＝８）の単回ｉ．ｖ．投与後に、ヒトＦｃＲｎトランスジェニックC57BL/6Jマウスにおいて測定し、ＦｃＲｎカラムにおける保持時間と比較した（表１５を参照のこと）。ＦｃＲｎカラムから遅い溶出を示した抗体は、ＦｃＲｎトランスジェニックマウスにおいて、より長い半減期を有したことが見出された。
【０３９７】
【表４５】
2020183967.tif 000054
【０３９８】
実施例７
ヒトＦｃＲｎ、マウスＦｃＲｎ、及びカニクイザルＦｃＲｎの精製
ヘキサヒスタグ付きタンパク質を含有する澄んだ上清を、Ｎｉ−ＮＴＡ親和性クロマトグラフィー樹脂（Qiagen, Hanbrechtikon, Switzerland）に、４℃でロードした。５００mM ＮａＣｌを含む２０mM リン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ７．４と、１００mM イミダゾールを含有する２０mM リン酸ナトリウムバッファーとのそれぞれによる洗浄工程後、タンパク質を、２mL/分の流速において、３００mM イミダゾールを含有する同じバッファーによるバッチ溶出を使用して、AKTA Primクロマトグラフィーシステム（Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden）で溶出した。画分をプールし、５００mM ＮａＣｌを含有するリン酸ナトリウムバッファー中において、サイズ排除クロマトグラフィー（Superdex（商標） 200, GE Healthcare, Zurich, Switzerland）で更に精製した。精製タンパク質を、Nanodrop分光計（Nanodrop Technologies, Wilmington, DE）を使用して定量し、ＳＤＳ  ＰＡＧＥにより、ＭＥＳバッファー中でのＮｕＰＡＧＥ ４〜１２％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲルにおいて、変性及び還元条件下で分析した。
【０３９９】
実施例８
マウス及びカニクイザルＦｃＲｎ親和性カラムクロマトグラフィー
下記表１６に、カニクイザル由来のＦｃＲｎを含む親和性カラムでの例示的なヒト抗体の保持時間を提供する。データを、下記条件を使用して得た。溶出バッファー：２０mM ＴＲＩＳ／ＨＣｌ、１５０mM ＮａＣｌ、ｐＨ８．５。更なる説明は、実施例２を参照のこと。ＹＴＥ−突然変異体という用語は、三重突然変異体Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅを意味する。
【０４００】
【表４６】
2020183967.tif 000055
【０４０１】
下記表１７に、マウスＦｃＲｎでの例示的なヒト抗体の保持時間を提供する。データを、下記条件を使用して得た。セファロース 1mLに結合させた１．２mg レセプター。溶出バッファー：２０mM ＴＲＩＳ／ＨＣｌ、１５０mM ＮａＣｌ、ｐＨ８．５。更なる説明は、実施例２を参照のこと。溶出バッファーのｐＨが９．５に調整されない限り、ＹＴＥ−突然変異体を溶出することができなかったため、ＹＴＥ−突然変異体は、この表には含まれていない。
【０４０２】
【表４７】
2020183967.tif 000056
【０４０３】
カニクイザルＦｃＲｎ親和性カラムは、ヒト化抗体の結合性に関してヒトＦｃＲｎ親和性カラムと同様に挙動した。一方、マウスＦｃＲｎカラムに対するヒト化抗体の結合性は、より遅い保持から分かるように、ヒトＦｃＲｎ親和性カラムに対するより強い。
【０４０４】
実施例９
抗体フラグメントの生成
Ｆ（ａｂ’）２フラグメント及びＦｃ領域フラグメントを、抗体５０μg当たりに１μg ＩｄｅＳシステインプロテアーゼを加え、３７℃で２時間インキュベーションすることにより、１００mM Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）で１：１希釈した全長抗体を開裂させて調製した。得られた開裂生成物であるＦ（ａｂ’）２及びＦｃを、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）カラム（Superdex 200, GE Healthcare, Zurich, Switzerland）において、AKTA Explorerクロマトグラフィーシステム（GE Healthcare, Uppsala, Sweden）で分離し、ピーク画分をプールした。２つ開裂生成物をその保持時間に基づいて特定するのに、分子量標準を同じカラムに供給した。
【０４０５】
全長抗体の保持時間は、顕著に変動した。対照的に、全ての試験抗体の各Ｆｃ部分の保持時間は、実際には、互いに異ならなかった（１％未満）。
【０４０６】
プラスミンを、全長抗体の開裂に使用した場合、同じ知見が得られた（データを示さず）。
【０４０７】
実施例１０
ヒトＦｃＲｎマウスにおける薬物動態研究
全ての手法を、実験動物ケア評価認証協会（www.aaalac.org）のガイドラインに従って行った。この研究は、Regional Council of Oberbayern, Germanyにより承認された。
【０４０８】
マウスＦｃＲｎを欠損しているが、ヒトＦｃＲｎについて半接合トランスジェニックな（ｈｕＦｃＲｎ（２７６）−／ｔｇ（３０、３１））、オス及びメスのC57BL/6Jマウス（バックグラウンド）を、薬物動態研究全体を通して使用した。
【０４０９】
投与の時点で、動物は、体重１７〜２５ｇであった。各抗体を、尾静脈を介して、単回静脈内ボーラス注射として与えた。マウスの限られた血液量のために、４匹のオス及び４匹のメスの各動物の３つの群は、９回のサンプリング時点、すなわち、１動物当たりに３回のサンプリング時点をカバーするのに必要であった。血液サンプルを、群１において、投与後５分、２４時間、及び３３６時間、群２において、投与後２時間、１６８時間、及び５０４時間、ならびに、群３において、投与後８時間、４８時間、６７２時間で採取した。血液サンプル 約１００μLを、眼球後ろの穿孔により取得し、室温で６０分間保存して、凝固させた。血清サンプル 少なくとも４０μLを、９，３００×ｇ、４℃で３分間の遠心分離により取得し、直ちに凍結させ、アッセイするまで−２０℃で保存した。
【０４１０】
マウス血清中のヒト治療抗体の血清濃度を、投与された抗体及びその変異体の抗原結合領域（Ｆａｂ）に特異的な抗原捕捉酵素結合免疫吸着アッセイ法（ＥＬＩＳＡ）により決定した。全ての試薬又はサンプルを、室温において、４００rpmでの振とう器上でインキュベーションした。各洗浄工程は、三回のサイクルを含んだ。簡潔に述べると、ストレプトアビジンコートマイクロタイタープレートを、アッセイバッファーで希釈したビオチン化抗体でコートした。リン酸緩衝生理食塩水−ポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ２０）での洗浄後、種々の希釈での血清サンプルを加え、１時間インキュベーションした。洗浄後、結合したヒト治療抗体を、マウスＩｇＧと交差反応しない、ジゴキシゲニンとコンジュゲートさせたヒトＦｃγ特異的モノクローナル抗体Ｆａｂフラグメントとの、その後のインキュベーションにより検出した。洗浄後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とコンジュゲートさせた抗−ジゴキシゲニン抗体を加え、１時間インキュベーションした。洗浄後、ＡＢＴＳ（２，２’−アジノ−ジ［３−エチルベンズチアゾリンスルホナート］；Roche Diagnostics, Germany）を、ＨＲＰ基質として加え、着色反応生成物を形成した。得られた反応生成物の吸光度を、４９０nmでの参照波長と共に４０５nmで読み取った。全ての血清サンプル及び陽性又は陰性の対照サンプルを、繰返しで分析し、参照標準に対して較正した。
【０４１１】
薬物動態パラメータを、薬物動態評価プログラムであるWinNonlin（商標）（Pharsight, St. Louis, MO, USA）version 5.2.1を使用する非コンパートメント分析により算出した。簡潔に述べると、濃度／時間曲線下面積ＡＵＣ（０−６７２）を、時間０〜無限大に向かって、線形台形則（線形内挿法）により算出した。見かけの終末相半減期（Ｔ１／２）を、等式Ｔ１／２＝ｌｎ２／λｚから導いた。全身クリアランス（ＣＬ）を、用量／ＡＵＣとして算出した。野生型抗体とその変異体との間での薬物動態パラメータにおける統計学的な有意差を、ＡＮＯＶＡ分析により決定した。
【０４１２】
マウスＦｃＲｎを欠損しているが、ヒトＦｃＲｎについて半接合トランスジェニックな（ｈｕＦｃＲｎ（２７６）−／ｔｇ）C57BL/6Jマウスにおける薬物動態研究から、ＹＴＥ突然変異が、抗体の薬物動態を向上させることが示された。統計学的有意性のレベルにおいて、ＹＴＥ突然変異は、野生型抗体との比較において、１．７４倍高いＡＵＣ（０−６７２）、１．９５倍遅いクリアランス、及び２．２倍長い終末相半減期を有した（表１４）。
【０４１３】
表１８：野生型抗体及びその三重突然変異体ＹＴＥについての薬物動態パラメータを、ヒトＦｃＲｎトランスジェニックマウスに対する１０mg/kgの単回ｉ．ｖ．ボーラス注射後に、ＥＬＩＳＡにより測定された血清濃度の非コンパートメント分析により得た。平均±ＳＤ、１群当たりにｎ＝８。野生型抗体との比較における有意性のＡＮＯＶＡ分析（＋＋＋、ｐ＜０．００１）。ＡＵＣ（０−６７２）は、０〜６７２時間の血清濃度−時間曲線下面積である。
【表４８】
2020183967.tif 000057
【０４１４】
実施例１１
ヒトＦｃＲｎマウスにおける薬物動態研究
全ての手法を、実験動物ケア評価認証協会（www.aaalac.org）のガイドラインに従って行った。この研究は、Regional Council of Oberbayern, Germanyにより承認された。
【０４１５】
マウスＦｃＲｎを欠損しているが、ヒトＦｃＲｎについて半接合トランスジェニックな（ｈｕＦｃＲｎ（２７６）−／ｔｇ（３０、３１））、オス及びメスのC57BL/6Jマウス（バックグラウンド）を、薬物動態研究全体を通して使用した。
【０４１６】
４つの抗体：ブリアキヌマブ、ウステキヌマブ、ｍＡｂ８、及びｍＡｂ９を、ｉｎ  ｖｉｖｏ研究に使用した。
【０４１７】
各抗体を、単回静脈内ボーラス注射（１０mg/kg）として与えた。マウスの限られた血液量のために、各６匹の動物の３つの群が、９回のサンプリング時点をカバーするのに必要であった。最後のサンプリング時点を、投与後４週間とした。
【０４１８】
結果を、図３に示す。
【０４１９】
【表４９】
2020183967.tif 000058
【０４２０】
ヒトＦｃＲｎトランスジェニックマウスにおける終末相半減期の差異が異なるＦｃＲｎ−ｍＡｂ相互作用により生じたことを確認するために、ＦｃＲｎノックアウトマウスにおける第２のｉｎ  ｖｉｖｏ研究を行った。この研究に使用したマウス数を減らすために、３つの抗体：ブリアキヌマブ、ウステキヌマブ、及びｍＡｂ９のみを使用した。
【０４２１】
１０mg/kg 抗体のｉ．ｖ．投与後に、全ての抗体のクリアランスは、ＦｃＲｎ媒介性ＩｇＧリサイクリングが行われないため、ヒトＦｃＲｎトランスジェニックマウスにおけるより、ＦｃＲｎノックアウトマウスにおいて非常に速い。アルファ及びベータ相における分割を、明確に定義できない。抗体が非常に速く除去されるためである。ブリアキヌマブは、ウステキヌマブ及びｍＡｂ９と比較して、投与後最初の数時間において、より速い分布を伴って、異なる薬物動態挙動を有することを実証することができる。これらの知見は、ヒトＦｃＲｎトランスジェニックマウスでも観察された。このことは、投与後の最初の数時間における分布プロセスが、ＦｃＲｎ媒介性でないことを示している。
【０４２２】
下記ＰＫパラメータ：ＡＵＣ０−ｉｎｆ、Ｃｌ、ＶＳＳ、及びＴ１／２を算出し、まとめた。
【０４２３】
【表５０】
2020183967.tif 000059
【０４２４】
ウステキヌマブ及びｍＡｂ９は、ＡＵＣ０−ｉｎｆ、Ｃｌ、ＶＳＳ、及びＴ１／２に関して同等である。ブリアキヌマブは、ウステキヌマブ及びｍＡｂ９より、小さいＡＵＣ０−ｉｎｆ、速いＣｌ、及び短いＴ１／２を有する。Ｔ１／２の算出は、実際の値とは異なる場合がある。終末相半減期をより正確に算出するのには、３及び４日後の時点が必要であったであろうためである。
【０４２５】
終末相半減期の統計学的分析を、テューキーのＨＳＤ検定を使用して算出した。統計学的な有意性を、ブリアキヌマブとウステキヌマブ間、及び、ブリアキヌマブとｍＡｂ９間の終末相半減期で検出することができた。
【０４２６】
ＡＤＡの形成を、薬剤／ＡＤＡ免疫複合体の検出により試験した。ＦｃＲｎノックアウトマウスにおいて、１０mg/kg ブリアキヌマブの投与は、約１６８〜１９２時間（７〜８日）後に、ブリアキヌマブ／ＡＤＡ免疫複合体の形成をもたらした。
【０４２７】
表２１：ＦｃＲｎノックアウトマウスにおけるブリアキヌマブ投与後のＡＤＡ−陽性サンプル
ＦｃＲｎノックアウトマウスにおける１０mg/kg ブリアキヌマブのｉ．ｖ．投与後の各サンプリング時点の血清濃度。ＡＤＡ−陽性サンプルを、中程度及び高度な薬剤／ＡＤＡ免疫複合体の形成について、それぞれ＊及び＊＊として示す。
【表５１】
2020183967.tif 000060
【０４２８】
ｍＡｂ９の投与後に、薬剤／ＡＤＡ免疫複合体も、約１６８時間（７日、表２８）後に最初に検出された。ウステキヌマブの投与後には、ウステキヌマブ／ＡＤＡ複合体は、ＦｃＲｎノックアウトマウスにおいて検出されなかった（表２７）。ブリアキヌマブ及びｍＡｂ９の濃度−時間曲線は、ＡＤＡ形成による速い減少を示していない。ウステキヌマブ及びｍＡｂ９は、非常に類似する濃度−時間曲線を有する。このことは、ｍＡｂ９投与後のＡＤＡ形成がＰＫに影響を及ぼさないことを示している。
【０４２９】
表２２：ヒトＦｃＲｎトランスジェニックマウスにおけるブリアキヌマブの血清濃度
血清濃度を、１群当たりに６匹の動物に対する、１０mg/kgの単回用量ｉ．ｖ．注射の投与後に決定する。ＡＤＡ−陽性サンプルを、中程度及び高度な薬剤／ＡＤＡ免疫複合体の形成について、それぞれ＊及び＊＊として示す。
【表５２】
2020183967.tif 000061
【０４３０】
表２３：ヒトＦｃＲｎトランスジェニックマウスにおけるウステキヌマブの血清濃度
血清濃度を、１群当たりに６匹の動物に対する、１０mg/kgの単回用量ｉ．ｖ．注射の投与後に決定する。ＡＤＡ−陽性サンプルを、中程度及び高度な薬剤／ＡＤＡ免疫複合体の形成について、それぞれ＊及び＊＊として示す。
【表５３】
2020183967.tif 000062
【０４３１】
表２４：ヒトＦｃＲｎトランスジェニックマウスにおけるｍＡｂ８の血清濃度
血清濃度を、１群当たりに６匹の動物に対する、１０mg/kgの単回用量ｉ．ｖ．注射の投与後に決定する。ＡＤＡ−陽性サンプルを、中程度及び高度な薬剤／ＡＤＡ免疫複合体の形成について、それぞれ＊及び＊＊として示す。
【表５４】
2020183967.tif 000063
【０４３２】
表２５：ヒトＦｃＲｎトランスジェニックマウスにおけるｍＡｂ９の血清濃度
血清濃度を、１群当たりに６匹の動物に対する、１０mg/kgの単回用量ｉ．ｖ．注射の投与後に決定する。ＡＤＡ−陽性サンプルを、中程度及び高度な薬剤／ＡＤＡ免疫複合体の形成について、それぞれ＊及び＊＊として示す。
【表５５】
2020183967.tif 000064
【０４３３】
表２６：ＦｃＲｎノックアウトマウスにおけるブリアキヌマブの血清濃度
血清濃度を、１群当たりに６匹の動物に対する、１０mg/kgの単回用量ｉ．ｖ．注射の投与後に決定する。ＡＤＡ−陽性サンプルを、中程度及び高度な薬剤／ＡＤＡ免疫複合体の形成について、それぞれ＊及び＊＊として示す。
【表５６】
2020183967.tif 000065
【０４３４】
表２７：ＦｃＲｎノックアウトマウスにおけるウステキヌマブの血清濃度
血清濃度を、１群当たりに６匹の動物に対する、１０mg/kgの単回用量ｉ．ｖ．注射の投与後に決定する。
【表５７】
2020183967.tif 000066
【０４３５】
表２８：ＦｃＲｎノックアウトマウスにおけるｍＡｂ９の血清濃度
血清濃度を、１群当たりに６匹の動物に対する、１０mg/kgの単回用量ｉ．ｖ．注射の投与後に決定する。ＡＤＡ−陽性サンプルを、中程度及び高度な薬剤／ＡＤＡ免疫複合体の形成について、それぞれ＊及び＊＊として示す。
【表５８】
2020183967.tif 000067
【図１】
2020183967.tif 000068
【図２】
2020183967.tif 000069
【図３】
2020183967.tif 000070
【図４】
2020183967.tif 000071
【図５】
2020183967.tif 000072
【図６】
2020183967.tif 000073
【図７】
2020183967.tif 000074
【図８】
2020183967.tif 000075
【図９】
2020183967.tif 000076
【図１０Ａ】
2020183967.tif 000077
【図１０Ｂ】
2020183967.tif 000078
【図１０Ｃ】
2020183967.tif 000079
【図１０Ｄ】
2020183967.tif 000080
【図１１】
2020183967.tif 000081
【図１２Ａ】
2020183967.tif 000082
【図１２Ｂ】
2020183967.tif 000083
【図１２Ｃ】
2020183967.tif 000084
【図１２Ｄ】
2020183967.tif 000085
【図１２Ｅ】
2020183967.tif 000086
【図１３】
2020183967.tif 000087
【図１４】
2020183967.tif 000088
【図１５】
2020183967.tif 000089
【図１６】
2020183967.tif 000090
【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年8月27日(2020.8.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程：
ｉｉ）第１のｐＨ値での線形塩勾配溶出によるＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーカラムでの抗体及び参照抗体の第１の保持時間を決定し、第２のｐＨ値での線形塩勾配溶出によるＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーカラムでの抗体及び参照抗体の第２の保持時間を決定する工程、又は
ｖ）正の線形ｐＨ勾配溶出によるＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーカラムでの抗体及びそのＦｃ領域の保持時間を決定する工程、又は
ｖｉ）高ｐＨ値での線形塩勾配溶出によるＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーカラムでの抗体及びそのＦｃ領域の保持時間を決定する工程
を含み、
ａ）第２の保持時間と実質的に同じ第１の保持時間を有する抗体、又は
ｃ）そのＦｃ領域の保持時間と実質的に同じ保持時間を有する抗体
を選択することによる、
抗体を選択する方法。
【請求項２】
抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期に影響を及ぼす抗体−Ｆａｂ−ＦｃＲｎ相互作用を含まない抗体を選択するためのものである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ＩｇＧ１、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４サブクラスの抗体と比較して増大している相対的ｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を有する抗体を選択するためのものであり、
ｖ）及びｖｉ）において、更に、参照抗体又は参照Ｆｃ領域の保持時間を決定し、
ａ）参照抗体の第１の保持時間より長い第１の保持時間を有し、第２の保持時間と実質的に同じ第１の保持時間を有する抗体、又は
ｃ）そのＦｃ領域の保持時間と実質的に同じで、参照抗体の保持時間より長い保持時間を有する抗体
を選択することによる、
請求項１記載の方法。
【請求項４】
参照抗体に対する抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期の相対的増大又は減少を決定するためのものであり、
ｖ）及びｖｉ）において、更に、参照抗体又は参照Ｆｃ領域の保持時間を決定し、
ｉｉ）、ｖ）、及びｖｉ）において、更に、突然変異Ｎ４３４Ａを有するＩｇＧ  Ｆｃ領域の保持時間を決定し、
ａ）参照の第１の保持時間より長い第１の保持時間を有し、実質的に同じである第１の保持時間と第２の保持時間を有し、突然変異Ｎ４３４Ａを有するＦｃ領域の保持時間より短い第１の保持時間を有する抗体を選択することにより、相対的に増大したｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を有する抗体を選択することによるか、又は
ｃ）参照抗体の第１の保持時間より短い第１の保持時間を有し、実質的に同じである第１の保持時間と第２の保持時間を有する抗体を選択することにより、相対的に減少したｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を有する抗体を選択することによる、
請求項１記載の方法。
【請求項５】
正の線形ｐＨ勾配が、約ｐＨ５．５〜約ｐＨ８．８である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
塩が、塩化ナトリウムである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
第１の塩濃度が、約１４０mMである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
第２の塩濃度が、約４００mMである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
線形塩勾配が、０mMの塩〜２５０mMの塩である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
第１のｐＨ値が、約５．５である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
第２のｐＨ値が、約７．４である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
高塩濃度が、約４００mMである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
高ｐＨ値が、約ｐＨ７．４である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
実質的に異なる保持時間が、少なくとも５％異なる、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
実質的に同じ保持時間が、３．５％以下で異なる、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
保持時間が実質的に異なる場合、保持時間が、塩濃度の平方根上の１に比例する（〜１／ＳＱＲＴ（ｃ（ｓａｌｔ）））、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
抗体が、全長抗体である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【外国語明細書】
2020183967000001.pdf