(57)【要約】      （修正有）【課題】がんの進行を治療又は遅延するための方法の提供。【解決手段】有効量のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子及びＰＤ−１軸結合アンタゴニストを投与することを含む方法。Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、ＣＤ３と特異的に結合可能な第１の抗原結合部分及び葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）と特異的に結合可能な第２の抗原結合部分を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体においてがんの進行を治療又は遅延するための方法であって、個体に、有効量のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子及びＰＤ−１軸結合アンタゴニストを投与することを含む方法。
【請求項２】
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が、ＣＤ３と特異的に結合可能な第１の抗原結合部分及び葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）と特異的に結合可能な第２の抗原結合部分を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第１の抗原結合部分が、配列番号３７、配列番号３８及び配列番号３９からなる群から選択される少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列並びに配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４の群から選択される少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
第１の抗原結合部分が、配列番号３６のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が、ＦｏｌＲ１と特異的に結合可能な第３の抗原結合部分をさらに含む、請求項２から４の何れか一項に記載の方法。
【請求項６】
ＦｏｌＲ１と特異的に結合可能な第２及び第３の抗原結合部分が、同一の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）及び軽鎖ＣＤＲ配列を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
第３の抗原結合部分が、第２の抗原結合部分と同一である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
第１、第２及び第３の抗原結合部分のうちの少なくとも１つが、Ｆａｂ分子である、請求項５から７の何れか一項に記載の方法。
【請求項９】
葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）と特異的に結合可能な抗原結合部分が、配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１８からなる群から選択される少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列並びに配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４の群から選択される少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲを含む、請求項１から８の何れか一項に記載の方法。
【請求項１０】
葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）と特異的に結合可能な抗原結合部分が、配列番号１５のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）と特異的に結合可能な抗原結合部分が、配列番号８、配列番号５６及び配列番号５７からなる群から選択される少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列並びに配列番号５９、配列番号６０、配列番号６５の群から選択される少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲを含む、請求項１から８の何れか一項に記載の方法。
【請求項１２】
葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）と特異的に結合可能な抗原結合部分が、配列番号５５のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号６４のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）と特異的に結合可能な抗原結合部分が、配列番号１６、配列番号４０２及び配列番号４００からなる群から選択される少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列並びに配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４の群から選択される少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲを含む、請求項１から８の何れか一項に記載の方法。
【請求項１４】
ＦｏｌＲ１と特異的に結合可能な抗原結合部分が、
ａ）配列番号１６の相補性決定領域重鎖１（ＣＤＲ−Ｈ１）アミノ酸配列と、
（ｂ）配列番号４０２のＣＤＲ−Ｈ２アミノ酸配列と、
（ｃ）配列番号４００のＣＤＲ−Ｈ３アミノ酸配列と、
（ｄ）配列番号３２の相補性決定領域軽鎖１（ＣＤＲ−Ｌ１）アミノ酸配列と、
（ｅ）配列番号３３のＣＤＲ−Ｌ２アミノ酸配列と、
（ｆ）配列番号３４のＣＤＲ−Ｌ３アミノ酸配列と
を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ＦｏｌＲ１と特異的に結合可能な抗原結合部分が、配列番号４０１のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が、ヒトＦｏｌＲ１及びカニクイザルＦｏｌＲ１と結合し、マウスＦｏｌＲ１と結合しない、請求項１から１５の何れか一項に記載の方法。
【請求項１７】
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が、インビトロでヒトＣＤ３陽性Ｔ細胞の増殖を誘導する、請求項１から１６の何れか一項に記載の方法。
【請求項１８】
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が、インビトロでＦｏｌＲ１発現ヒト腫瘍細胞のヒト末梢血単核細胞媒介性死滅を誘導する、請求項１から１７の何れか一項に記載の方法。
【請求項１９】
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が、インビトロでＦｏｌＲ１発現ヒト腫瘍細胞のＴ細胞媒介性死滅を誘導する、請求項１から１８の何れか一項に記載の方法。
【請求項２０】
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が、２４時間後に、約３６ｐＭから約３９５７３ｐＭの間のＥＣ５０で、インビトロでＦｏｌＲ１発現ヒト腫瘍細胞のＴ細胞媒介性死滅を誘導する、請求項１から１９の何れか一項に記載の方法。
【請求項２１】
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が、フローサイトメトリーによって測定されるような、Ｔ細胞でのＣＤ２５及びＣＤ６９のうちの少なくとも一方の細胞表面発現の上方制御を誘導する、請求項１から２０の何れか一項に記載の方法。
【請求項２２】
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が、ヒトＦｏｌＲ１と、約１０ｎＭから約４０ｎＭの見かけのＫＤで結合する、請求項１から２１の何れか一項に記載の方法。
【請求項２３】
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が、ヒトＦｏｌＲ１と、約１０ｎＭの見かけのＫＤで結合し、カニクイザルＦｏｌＲ１と約４０ｎＭの見かけのＫＤで結合する、請求項１から２２の何れか一項に記載の方法。
【請求項２４】
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が、マウスＦｏｌＲ１と、約１．５ｎＭの見かけのＫＤで結合する、請求項１から２３の何れか一項に記載の方法。
【請求項２５】
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が、ヒトＦｏｌＲ１と、少なくとも約１０００ｎＭの一価の結合ＫＤで結合する、請求項１から２４の何れか一項に記載の方法。
【請求項２６】
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が、ヒト腫瘍細胞上に発現されるＦｏｌＲ１と結合する、請求項１から２５の何れか一項に記載の方法。
【請求項２７】
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が、ヒトＦｏｌＲ１上の立体構造エピトープと結合する、請求項１から２６の何れか一項に記載の方法。
【請求項２８】
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が、ヒト葉酸受容体２（ＦｏｌＲ２）又はヒト葉酸受容体３（ＦｏｌＲ３）と結合しない、請求項１から２７の何れか一項に記載の方法。
【請求項２９】
抗原結合部分が、ヒトＦｏｌＲ１（配列番号２２７）のアミノ酸２５−２３４を含むＦｏｌＲ１ポリペプチドと結合する、請求項１から２８の何れか一項に記載の方法。
【請求項３０】
ＦｏｌＲ１抗原結合部分が、配列番号２２７、２３０及び２３１のアミノ酸配列を含むＦｏｌＲ１ポリペプチドと結合し、ＦｏｌＲ１抗原結合部分が、配列番号２２８及び２２９のアミノ酸配列を含むＦｏｌＲポリペプチドと結合しない、請求項１から２９の何れか一項に記載の方法。
【請求項３１】
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が、ａ）ヒトＦｏｌＲ１との結合について、配列番号４０１の可変重鎖ドメイン（ＶＨ）及び配列番号３１の可変軽鎖ドメインを含む参照抗体と競合する第１の抗原結合部位と、ｂ）ヒトＣＤ３との結合について、配列番号３６の可変重鎖ドメイン（ＶＨ）及び配列番号３１の可変軽鎖ドメインを含む参照抗体と競合する第２の抗原結合部位とを含み、結合競合が、表面プラズモン共鳴アッセイを使用して測定される、請求項１から３０の何れか一項に記載の方法。
【請求項３２】
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が、第１、第２及び第３の抗原結合部分を形成する第１、第２、第３、第４及び第５のポリペプチド鎖を含み、第１の抗原結合部分が、ＣＤ３と結合可能であり、第２及び第３の抗原結合部分が各々、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）と結合可能であり、ａ）第１及び第２のポリペプチド鎖が、アミノ（Ｎ）末端からカルボキシル（Ｃ）末端の方向に、ＶＬＤ１及びＣＬＤ１を含み、ｂ）第３のポリペプチド鎖が、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ＶＬＤ２及びＣＨ１Ｄ２を含み、ｃ）第４のポリペプチド鎖が、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ＶＨＤ１、ＣＨ１Ｄ１、ＣＨ２Ｄ１及びＣＨ３Ｄ１を含み、ｄ）第５のポリペプチド鎖が、ＶＨＤ１、ＣＨ１Ｄ１、ＶＨＤ２、ＣＬＤ２、ＣＨ２Ｄ２及びＣＨ３Ｄ２を含み、
ＶＬＤ１が、第１の軽鎖可変ドメインであり、
ＶＬＤ２が、第２の軽鎖可変ドメインであり、
ＣＬＤ１が、第１の軽鎖定常ドメインであり、
ＣＬＤ２が、第２の軽鎖定常ドメインであり、
ＶＨＤ１が、第１の重鎖可変ドメインであり、
ＶＨＤ２が、第２の重鎖可変ドメインであり、
ＣＨ１Ｄ１が、第１の重鎖定常ドメイン１であり、
ＣＨ１Ｄ２が、第２の重鎖定常ドメイン１であり、
ＣＨ２Ｄ１が、第１の重鎖定常ドメイン２であり、
ＣＨ２Ｄ２が、第２の重鎖定常ドメイン２であり、
ＣＨ３Ｄ１が、第１の重鎖定常ドメイン３であり、
ＣＨ３Ｄ２が、第２の重鎖定常ドメイン３である、
請求項１から３１の何れか一項に記載の方法。
【請求項３３】
ａ．第３のポリペプチド鎖並びに第５のポリペプチド鎖のＶＨＤ２及びＣＬＤ２が、ＣＤ３と結合可能な第１の抗原結合部分を形成し、
ｂ．第１のポリペプチド鎖並びに第４のポリペプチド鎖のＶＨＤ１及びＣＨ１Ｄ１が、ＦｏｌＲ１と結合可能な第２の結合部分を形成し、
ｃ．第２のポリペプチド鎖並びに第５のポリペプチド鎖のＶＨＤ１及びＣＨ１Ｄ１が、ＦｏｌＲ１と結合可能な第３の結合部分を形成する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
第１の及び第２のポリペプチド鎖が、配列番号３９９のアミノ酸配列を含む、請求項３２又は３３の何れか一項に記載の方法。
【請求項３５】
第３のポリペプチド鎖が、配列番号８６のアミノ酸配列を含む、請求項３２又は３３の何れか一項に記載の方法。
【請求項３６】
第４のポリペプチド鎖が、配列番号３９４のアミノ酸配列を含む、請求項３２又は３３の何れか一項に記載の方法。
【請求項３７】
第５のポリペプチド鎖が、配列番号３９７のアミノ酸配列を含む、請求項３２又は３３の何れか一項に記載の方法。
【請求項３８】
ａ．第１及び第２のポリペプチド鎖が、配列番号３９９のアミノ酸配列を含み、
ｂ．第３のポリペプチド鎖が、配列番号８６のアミノ酸配列を含み、
ｃ．第４のポリペプチド鎖が、配列番号３９４のアミノ酸配列を含み、
ｄ．第５のポリペプチド鎖が、配列番号３９７のアミノ酸配列を含む、
請求項３２又は３３の何れか一項に記載の方法。
【請求項３９】
ＰＤ−１軸結合アンタゴニストが、ＰＤ−１結合アンタゴニスト、ＰＤ−Ｌ１結合アンタゴニスト及びＰＤ−Ｌ２結合アンタゴニストからなる群から選択される、請求項１から３８の何れか一項に記載の方法。
【請求項４０】
ＰＤ−１軸結合アンタゴニストが、ＰＤ−１結合アンタゴニストである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
ＰＤ−１結合アンタゴニストが、ＰＤ−１の、そのリガンドである結合パートナーとの結合を阻害する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
ＰＤ−１結合アンタゴニストが、ＰＤ−１のＰＤ−Ｌ１との結合を阻害する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
ＰＤ−１結合アンタゴニストが、ＰＤ−１のＰＤ−Ｌ２との結合を阻害する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
ＰＤ−１結合アンタゴニストが、ＰＤ−１の、ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２の両方との結合を阻害する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
ＰＤ−１結合アンタゴニストが、抗体である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４６】
ＰＤ−１結合アンタゴニストが、ニボルマブ、ペムブロリズマブ及びＣＴ−０１１からなる群から選択される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
ＰＤ−１結合アンタゴニストが、ＡＭＰ−２２４である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４８】
ＰＤ−１軸結合アンタゴニストが、ＰＤ−Ｌ１結合アンタゴニストである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４９】
ＰＤＬ１結合アンタゴニストが、ＰＤＬ１のＰＤ−１との結合を阻害する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
ＰＤ−Ｌ１結合アンタゴニストが、ＰＤ−Ｌ１のＢ７−１との結合を阻害する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
ＰＤ−Ｌ１結合アンタゴニストが、ＰＤ−Ｌ１の、ＰＤ−１及びＢ７−１両方との結合を阻害する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５２】
ＰＤ−Ｌ１結合アンタゴニストが、抗ＰＤＬ−１抗体である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５３】
抗ＰＤＬ−１抗体が、モノクローナル抗体である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
抗ＰＤＬ１抗体が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ及び（Ｆａｂ’）２断片からなる群から選択される抗体断片である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
抗ＰＤＬ１抗体が、ヒト化抗体又はヒト抗体である、請求項５２から５４の何れか一項に記載の方法。
【請求項５６】
ＰＤ−Ｌ１結合アンタゴニストが、ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＭＤＸ−１１０５及びＭＥＤＩ４７３６からなる群から選択される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５７】
抗ＰＤ−Ｌ１抗体が、配列番号２８９のＨＶＲ−Ｈｌ配列、配列番号２９０のＨＶＲ−Ｈ２配列及び配列番号２９１のＨＶＲ−Ｈ３配列を含む重鎖並びに配列番号２９２のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号２９３のＨＶＲ−Ｌ２配列及び配列番号２９４のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む軽鎖を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５８】
抗体が、配列番号２８０又は配列番号２８１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号３８３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５９】
ＰＤ−１軸結合アンタゴニストが、ＰＤ−Ｌ２結合アンタゴニストである、請求項３９に記載の方法。
【請求項６０】
ＰＤ−Ｌ２結合アンタゴニストが、抗体である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
ＰＤ−Ｌ２結合アンタゴニストが、イムノアドヘシンである、請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
個体に、Ｔ細胞免疫グロブリンムチン３（ＴＩＭ３）アンタゴニストを投与することをさらに含む、請求項１から６１の何れか一項に記載の方法。
【請求項６３】
ＴＩＭ３アンタゴニストが、抗ＴＩＭ３抗体である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
抗ＴＩＭ３抗体が、３７℃で１２０分後に少なくとも４５％の、ＴＩＭ３発現細胞でＴＩＭ３の内部移行を誘導し、内部移行が、ＦＡＣＳ解析によって測定される、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
抗ＴＩＭ３抗体が、以下の特性：
ａ）ＴＩＭ３との結合について、配列番号７のＶＨ及び配列番号８のＶＬを含む抗Ｔｉｍ３抗体と競合する、
ｂ）ヒト及びカニクイザルＴＩＭ３と結合する、
ｃ）イムノコンジュゲートとして、ＴＩＭ３発現細胞に対して細胞傷害活性を示す、
ｄ）インターフェロンガンマ放出を誘導する
のうちの少なくとも１つを有する、請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
抗ＴＩＭ３抗体が、
ａ）ＴＩＭ３との結合について、配列番号７のＶＨ及び配列番号８のＶＬを含む抗Ｔｉｍ３抗体と競合し、
ｂ）ヒト及びカニクイザルＴＩＭ３と結合し、
ｃ）イムノコンジュゲートとして、ＴＩＭ３発現細胞に対して細胞傷害活性を示し、
ｄ）インターフェロンガンマ放出を誘導する、
請求項６３に記載の方法。
【請求項６７】
抗ＴＩＭ３抗体が、モノクローナル抗体である、請求項６３から６６の何れか一項に記載の方法。
【請求項６８】
抗ＴＩＭ３抗体が、ヒト、ヒト化又はキメラ抗体である、請求項６３から６７の何れか一項に記載の方法。
【請求項６９】
抗ＴＩＭ３抗体が、ＴＩＭ３と結合する抗体断片である、請求項６３から６８の何れか一項に記載の方法。
【請求項７０】
抗ＴＩＭ３抗体が、Ｆａｂ断片である、請求項６３から６９の何れか一項に記載の方法。
【請求項７１】
Ａ）（ａ）（ｉ）配列番号３０４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３０５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２及び（ｉｉｉ）配列番号３０６から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン並びに（ｂ）（ｉ）配列番号３０７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号３０８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号３０９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｂ）（ａ）（ｉ）配列番号３０４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３０５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２及び（ｉｉｉ）配列番号３０６から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン並びに（ｂ）（ｉ）配列番号３１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号３０８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号３０９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｃ）（ａ）（ｉ）配列番号３０４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３０５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２及び（ｉｉｉ）配列番号３０６から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン並びに（ｂ）（ｉ）配列番号３１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号３０８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号３０９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｄ）（ａ）（ｉ）配列番号３１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２及び（ｉｉｉ）配列番号３１８から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン並びに（ｂ）（ｉ）配列番号３１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号３２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号３２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｅ）（ａ）（ｉ）配列番号３２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２及び（ｉｉｉ）配列番号３２６から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン並びに（ｂ）（ｉ）配列番号３２７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号３２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号３２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｆ）（ａ）（ｉ）配列番号３３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２及び（ｉｉｉ）配列番号３３４から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン並びに（ｂ）（ｉ）配列番号３３５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号３３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号３３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｇ）（ａ）（ｉ）配列番号３４０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３４１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２及び（ｉｉｉ）配列番号３４２から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン並びに（ｂ）（ｉ）配列番号３４３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号３４４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号３４５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｈ）（ａ）（ｉ）配列番号３４８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３４９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２及び（ｉｉｉ）配列番号３５０から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン並びに（ｂ）（ｉ）配列番号３５１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号３５２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号３５３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｉ）（ａ）（ｉ）配列番号３５６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３５７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２及び（ｉｉｉ）配列番号３５８から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン並びに（ｂ）（ｉ）配列番号３５９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号３６０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号３６１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｊ）（ａ）（ｉ）配列番号３６４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３６５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２及び（ｉｉｉ）配列番号３６６から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン並びに（ｂ）（ｉ）配列番号３６７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号３６８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号３６９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン
を含む、請求項６３から６７の何れか一項に記載の方法。
【請求項７２】
抗ＴＩＭ３抗体が、カバット番号付けのＥＵインデックスに従って突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ及びＰ３２９Ｇを有する全長ＩｇＧ１抗体である、請求項６３から６７の何れか一項に記載の方法。
【請求項７３】
抗ＴＩＭ３抗体が、国際公開第２０１１／１５５６０７号、国際公開第２０１３／００６４９０号、国際公開第０３／０６３７９２号、国際公開第２００９／０９７３９４号及び国際公開第２０１１／１５９８７７号に記載される抗体のうちいずれか１種である、請求項６３に記載の方法。
【請求項７４】
抗ＴＩＭ３抗体が、Ｆ３８−２Ｅ２である、請求項６３に記載の方法。
【請求項７５】
がんが、ＫＲＡＳ野生型を含有する、請求項１から７４の何れか一項に記載の方法。
【請求項７６】
がんが、活性化ＫＲＡＳ突然変異を含有する、請求項１から７４の何れか一項に記載の方法。
【請求項７７】
治療が、治療の休止後、個体における持続応答をもたらす、請求項１から７６の何れか一項に記載の方法。
【請求項７８】
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子及びＰＤ−１軸結合アンタゴニストの少なくとも一方が、継続的に投与される、請求項１から７７の何れか一項に記載の方法。
【請求項７９】
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子及びＰＤ−１軸結合アンタゴニストの少なくとも一方が、断続的に投与される、請求項１から７７の何れか一項に記載の方法。
【請求項８０】
ＰＤ−１軸結合アンタゴニストが、ＦｏｌＲ１  ＴＣＢの前に投与される、請求項１から７７の何れか一項に記載の方法。
【請求項８１】
ＰＤ−１軸結合アンタゴニストが、ＦｏｌＲ１  ＴＣＢと同時に投与される、請求項１から７７の何れか一項に記載の方法。
【請求項８２】
ＰＤ−１軸結合アンタゴニストが、ＦｏｌＲ１  ＴＣＢの後に投与される、請求項１から７７の何れか一項に記載の方法。
【請求項８３】
がんが、卵巣がん、肺がん、乳がん、腎がん、結腸直腸がん、子宮内膜がんからなる群から選択される、請求項１から８２の何れか一項に記載の方法。
【請求項８４】
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子及びＰＤ−１軸結合アンタゴニストの少なくとも一方が、静脈内に、筋肉内に、皮下に、局所に、経口的に、経皮的に、腹腔内に、眼窩内に、移植によって、吸入によって、髄腔内に、脳室内に又は鼻腔内に投与される、請求項１から８２の何れか一項に記載の方法。
【請求項８５】
個体中のＴ細胞が、組合せの投与の前に比べ、増強された活性化、増殖及び／又はエフェクター機能を有する、請求項１から８４の何れか一項に記載の方法。
【請求項８６】
個体中のＴ細胞が、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子単独の投与に比べ、増強された活性化、増殖及び／又はエフェクター機能を有する、請求項１から８２の何れか一項に記載の方法。
【請求項８７】
Ｔ細胞エフェクター機能が、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αのうちの少なくとも１種の分泌である、請求項８５又は８６に記載の方法。
【請求項８８】
個体が、約１５％未満のＰＤ−１ｈｉ発現腫瘍浸潤Ｔ細胞を含む、請求項１から８７の何れか一項に記載の方法。
【請求項８９】
ＦｏｌＲ１陽性がんを有する個体において免疫機能を増強する方法であって、個体に、有効量の、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）及びＣＤ３に特異的なＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子並びにＰＤ−１軸結合アンタゴニストの組合せを投与することを含む方法。
【請求項９０】
個体中のＴ細胞が、組合せの投与の前に比べ、増強された活性化、増殖及び／又はエフェクター機能を有する、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
個体中のＴ細胞が、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子単独の投与に比べ、増強された活性化、増殖及び／又はエフェクター機能を有する、請求項８９に記載の方法。
【請求項９２】
Ｔ細胞エフェクター機能が、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αのうちの少なくとも１種の分泌である、請求項９０又は９１に記載の方法。
【請求項９３】
個体が、約１５％未満のＰＤ−１ｈｉ発現腫瘍浸潤Ｔ細胞を含む、請求項８９から９２の何れか一項に記載の方法。
【請求項９４】
葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）及びＣＤ３に特異的なＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子並びにＰＤ−１軸結合アンタゴニストの組合せを用いる治療のために患者を選択するための方法であって、ＰＤ−１発現のレベルを測定することを含み、約１５％未満のＰＤ−１ｈｉ発現Ｔ細胞を有する患者が、組合せを用いる治療のために選択される、方法。
【請求項９５】
葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）及びＣＤ３に特異的なＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子と、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子をＰＤ−１軸結合アンタゴニストとともに使用して、個体においてがんの進行を治療又は遅延するための使用説明書を含む添付文書とを含むキット。
【請求項９６】
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子をＴＩＭ３アンタゴニストとともに使用するための使用説明書をさらに含む、請求項９５に記載のキット。
【請求項９７】
葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）及びＣＤ３に特異的なＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子並びにＰＤ−１軸結合アンタゴニストと、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子及びＰＤ−１軸結合アンタゴニストを使用して、個体においてがんの進行を治療又は遅延するための使用説明書を含む添付文書とを含むキット。
【請求項９８】
ＴＩＭ３アンタゴニストをさらに含む、請求項９７に記載のキット。
【請求項９９】
ＰＤ−１軸結合アンタゴニストが、抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤＬ−１抗体である、請求項９５から９８の何れか一項に記載のキット。
【請求項１００】
ＰＤ−１軸結合アンタゴニストが、抗ＰＤ−１イムノアドヘシンである、請求項９５から９８の何れか一項に記載のキット。
【請求項１０１】
葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）及びＣＤ３に特異的なＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子と、ＰＤ−１軸結合アンタゴニストと、薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物。
【請求項１０２】
ＴＩＭ３アンタゴニストをさらに含む、請求項１０１に記載の薬学的組成物。
【請求項１０３】
がんの治療のための医薬の製造における、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）及びＣＤ３に特異的なＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子並びにＰＤ−１軸結合アンタゴニストの組合せの使用。
【請求項１０４】
がんの治療のための医薬の製造における、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）及びＣＤ３に特異的なＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子並びにＰＤ−１軸結合アンタゴニスト並びにＴＩＭ３アンタゴニストの組合せの使用。
【請求項１０５】
医薬が、卵巣がん、肺がん、乳がん、腎がん、結腸直腸がん、子宮内膜がんの治療用である、請求項１０３又は１０４に記載の使用。
【請求項１０６】
本明細書において記載される本発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出されており、その全文が参照により本明細書に組み込まれる配列表を含有する。２０１５年１１月１１日に作製された前記ＡＳＣＩＩコピーは、３２４０１＿ＳＬ．ｔｘｔと名付けられ、５２７，１３７バイトの大きさである。
【０００２】
本発明は、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子及びＰＤ−１軸結合アンタゴニスト、及び任意選択的にＴＩＭ３アンタゴニストを使用する併用療法並びにがんの治療のためのこれらの併用療法の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
モノクローナル抗体は、がん細胞で差次的に発現される抗原を選択的に標的とするがんの治療のための強力な治療剤である。
【０００４】
１つの抗原結合部分を用いて、標的細胞上の表面抗原と、また第２の抗原結合部分を用いて、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体の活性化インバリアント成分と結合するように設計された二重特異性抗体は、近年、関心が持たれるようになった。このような抗体の、その標的の両方との同時結合は、標的細胞とＴ細胞の間の一過的な相互作用を強制し、任意の細胞傷害性Ｔ細胞の活性化及びその後の標的細胞の溶解を引き起こす。したがって、免疫応答は、標的細胞に対し再指向化され、ＣＴＬの正常なＭＨＣ拘束性活性化においては意味のある、標的細胞によるペプチド抗原提示又はＴ細胞の特異性とは独立している。これに関連して、ＣＴＬが、標的細胞がそれらに対する二重特異性抗体を提示している、すなわち、免疫学的シナプスが模倣される場合にのみ活性化されることは重大である。標的細胞の効率的溶解を誘発するためにリンパ球プレコンディショニング又は共刺激を必要としない二重特異性抗体は特に望ましい。ＴＣＢが、特定のエフェクター機能の活性化以外については、Ｔ細胞自体にどのように影響を及ぼすのかは十分に理解されていない。
【０００５】
抗原提示細胞（ＡＰＣ）による静止Ｔリンパ球又はＴ細胞の活性化は、２種のシグナル入力を必要とすると思われる。Ｌａｆｆｅｒｔｙ等、Ａｕｓｔ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．ＳｃＬ５３：２７−４２（１９７５）。一次又は抗原特異的シグナルは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と、それに続く主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）との関連で提示される外来抗原ペプチドの認識によって伝達される。二次又は共刺激シグナルは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上に発現される共刺激分子によってＴ細胞に送達され、Ｔ細胞クローン増殖、サイトカイン分泌及びエフェクター機能を促進する。Ｌｅｎｓｃｈｏｗ等、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４：２３３（１９９６）。共刺激の非存在下では、Ｔ細胞は、抗原刺激に対して不応性となり得、効果的な免疫応答を開始せず、外来抗原に対する消耗又は耐性をもたらし得る。
【０００６】
Ｔ細胞は、正及び負両方の二次的共刺激シグナルを受け取り得る。正及び負のシグナルのバランスは、免疫寛容を維持し、自己免疫を防ぎながら有効な免疫応答を誘発するために重要である。正のシグナルは、Ｔ細胞活性化を促進しながら、負の二次的シグナルは、Ｔ細胞寛容の誘導にとって必要と思われる。
【０００７】
最近、阻害性受容体、プログラム死１ポリペプチド（ＰＤ−１）の誘導され、持続された発現と同時に、Ｔ細胞機能障害又はアネルギーが起こることが発見された。そのリガンドの１種、ＰＤ−Ｌ１は、多数のがんにおいて過剰発現され、予後不良と関連していることが多い（Okazaki T等、Intern. Immun.2007 19（7）:813）（Thompson RH等、Cancer Res 2006、66（7）:3381）。興味深いことに、正常組織におけるＴリンパ球及び末梢血Ｔリンパ球と対照的に、腫瘍に浸潤しているＴリンパ球の大部分は、ＰＤ−１を主に発現し、これは、腫瘍反応性Ｔ細胞でのＰＤ−１の上方制御が、抗腫瘍免疫応答の障害に寄与し得ることを示す（Blood 2009 1 14（8）:1537）。
【０００８】
Ｔ細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン含有分子３（ＴＩＭ３）は、免疫調節において重要である。この細胞表面タンパク質は、１型ヘルパーＴ細胞によって優先的に発現され、マクロファージ活性化、炎症状態及びがんの調節に関与している（Majeti R等、PNAS、106（2009）3396-3401及び国際公開第２００９／０９１５４７号）。ＴＩＭ−３のそのリガンドの１種（例えば、ガレクチン−９）との結合は、プログラム細胞死を誘導し、それによって末梢の耐性を支持することによってＴｈ１応答を抑制し得る。ＴＩＭ−３  ｓｉＲＮＡを用いる、又は抗ＴＩＭ−３アンタゴニスト抗体を用いる治療は、ＣＤ４ポジティブＴ細胞からのインターフェロンαの分泌を増大し、ヒトＴ細胞におけるＴＩＭ−３の阻害的役割を支持する。抗ＴＩＭ−３モノクローナル抗体の例は、国際公開第２０１３／０６４９０号及び米国特許第２０１２／１８９６１７号（Ngiow等、Cancer Res7:6567（2011））に開示されている。
【０００９】
ＦＯＬＲ１は、種々の起源の腫瘍細胞、例えば、卵巣及び肺がん上で発現される。腫瘍をイメージングするための、ファーレツズマブなどの治療抗体、抗体薬物コンジュゲート又は養子Ｔ細胞療法を用いるＦＯＬＲ１を標的とするいくつかの手法が記載されている（Kandalaft等、J Transl Med.2012 Aug 3;10:157 doi:10.1186/1479-5876-10-157；van Dam等、Nat Med. 2011 Sep 18:17（10）:1315-9.doi:10.1038/nm.2472；Cliftonet等、Hum Vaccin.2011 Feb;7（2）:183-90. Epub 2011 Feb 1；Kelemen等、Int J Cancer. 2006 Jul 15;119（2）:243-50;Vaitilingam等 J Nucl Med.2012 Jul;53（7）；Teng等、2012 Aug;9（8）:901-8 doi:10.1517/17425247.2012.694863. Epub 2012 June 5。葉酸受容体及びＣＤ３を標的とするコンストラクトを用いて、葉酸受容体ポジティブ腫瘍を標的とするいくつかの試みが行われている（Kranz等、Proc Natl Acad Sci U S A. Sep 26,1995;92（20）:9057-9061；Roy等、Adv Drug Deliv Rev. 2004 Apr 29;56（8）:1219-31；Huiting Cui等Biol Chem.Aug 17,2012;287（34）:28206-28214；Lamers等、Int. J. Cancer.60（4）:450（1995）；Thompson等、MAbs.2009 Jul-Aug;1（4）:348-56.Epub 2009 Jul 19；Mezzanzanca等、Int. J. Cancer、41、609-615（1988））。
【００１０】
種々のがんの発達を治療し、安定化し、防止し、及び／又は遅延するためのこのような最適療法が依然として必要である。
【発明の概要】
【００１１】
広く、本発明は、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）標的化抗原結合部位と、ＣＤ３を標的とする第２の抗原結合部位とを組み合わせる二重特異性抗体、及び例えば、がんの治療のためのＰＤ−１軸結合アンタゴニストと組み合わせたその使用に関する。一実施態様では、組合せは、ＴＩＭ３アンタゴニストをさらに含む。本発明の方法及び組合せは、免疫療法の増強を可能にする。従来の治療を上回る利点は、ＦｏｌＲ１が発現される部位のみでＴ細胞活性化を誘導する特異性並びにＰＤ−１軸結合アンタゴニスト及び任意選択的にＴＩＭ３アンタゴニストとの組合せによる、Ｔ細胞消耗とも呼ばれる低いＴ細胞媒介性活性の低減及び／又は回復である。
【００１２】
したがって、一態様では、本発明は、個体に、有効量のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子及びＰＤ−１軸結合アンタゴニストを投与することを含む、個体においてがんの進行を治療又は遅延するための方法を提供する。一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、ＣＤ３と特異的に結合可能な第１の抗原結合部分及び葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）と特異的に結合可能な第２の抗原結合部分を含む。一実施態様では、第１の抗原結合部分は、配列番号３７、配列番号３８及び配列番号３９からなる群から選択される少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列並びに配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４の群から選択される少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲを含む。一実施態様では、第１の抗原結合部分は、配列番号３６のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む。一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、ＦｏｌＲ１と特異的に結合可能な第３の抗原結合部分をさらに含む。一実施態様では、ＦｏｌＲ１と特異的に結合可能な第２及び第３の抗原結合部分は、同一の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）及び軽鎖ＣＤＲ配列を含む。一実施態様では、第３の抗原結合部分は、第２の抗原結合部分と同一である。一実施態様では、第１、第２及び第３の抗原結合部分のうちの少なくとも１つは、Ｆａｂ分子である。
【００１３】
一実施態様では、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）と特異的に結合可能な抗原結合部分は、配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１８からなる群から選択される少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列並びに配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４の群から選択される少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲを含む。一実施態様では、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）と特異的に結合可能な抗原結合部分は、配列番号１５のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む。一実施態様では、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）と特異的に結合可能な抗原結合部分は、配列番号８、配列番号５６及び配列番号５７からなる群から選択される少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列並びに配列番号５９、配列番号６０、配列番号６５の群から選択される少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲを含む。一実施態様では、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）と特異的に結合可能な抗原結合部分は、配列番号５５のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号６４のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む。一実施態様では、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）と特異的に結合可能な抗原結合部分は、配列番号８、配列番号９及び配列番号５０からなる群から選択される少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列並びに配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４の群から選択される少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲを含む。一実施態様では、ＦｏｌＲ１と特異的に結合可能な抗原結合部分は、
ａ）配列番号８の相補性決定領域重鎖１（ＣＤＲ−Ｈ１）アミノ酸配列と、
（ｂ）配列番号９のＣＤＲ−Ｈ２アミノ酸配列と、
（ｃ）配列番号５０のＣＤＲ−Ｈ３アミノ酸配列と、
（ｄ）配列番号５２の相補性決定領域軽鎖１（ＣＤＲ−Ｌ１）アミノ酸配列と、
（ｅ）配列番号５３のＣＤＲ−Ｌ２アミノ酸配列と、
（ｆ）配列番号５４のＣＤＲ−Ｌ３アミノ酸配列と
を含む。
【００１４】
１つのこのような実施態様では、ＦｏｌＲ１と特異的に結合可能な抗原結合部分は、配列番号４９のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号５１のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む。
【００１５】
一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、ヒトＦｏｌＲ１、カニクイザルＦｏｌＲ１及びマウスＦｏｌＲ１と結合する。
【００１６】
一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、インビトロでヒトＣＤ３ポジティブＴ細胞の増殖を誘導する。
【００１７】
一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、インビトロでＦｏｌＲ１発現ヒト腫瘍細胞のヒト末梢血単核細胞媒介性死滅を誘導する。
【００１８】
一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、インビトロでＦｏｌＲ１発現ヒト腫瘍細胞のＴ細胞媒介性死滅を誘導する。一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、２４時間後に、約３６ｐＭから約３９５７３ｐＭの間のＥＣ５０で、インビトロでＦｏｌＲ１発現ヒト腫瘍細胞のＴ細胞媒介性死滅を誘導する。一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、フローサイトメトリーによって測定されるような、Ｔ細胞でのＣＤ２５及びＣＤ６９のうちの少なくとも一方の細胞表面発現の上方制御を誘導する。一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、ヒトＦｏｌＲ１と、約５．３６ｐＭ−約４ｎＭの見かけのＫＤで結合する。一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、ヒト及びカニクイザルＦｏｌＲ１と、約４ｎＭの見かけのＫＤで結合する。一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、マウスＦｏｌＲ１と、約１．５ｎＭの見かけのＫＤで結合する。一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、ヒトＦｏｌＲ１と、少なくとも約１０００ｎＭの一価の結合ＫＤで結合する。一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、ヒト腫瘍細胞上に発現されるＦｏｌＲ１と結合する。一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、ヒトＦｏｌＲ１上の立体構造エピトープと結合する。一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、ヒト葉酸受容体２（ＦｏｌＲ２）又はヒト葉酸受容体３（ＦｏｌＲ３）と結合しない。一実施態様では、抗原結合部分は、ヒトＦｏｌＲ１（配列番号２２７）のアミノ酸２５−２３４を含むＦｏｌＲ１ポリペプチドと結合する。一実施態様では、ＦｏｌＲ１抗原結合部分は、配列番号２２７、２３０及び２３１のアミノ酸配列を含むＦｏｌＲ１ポリペプチドと結合し、ＦｏｌＲ１抗原結合部分が、配列番号２２８及び２２９のアミノ酸配列を含むＦｏｌＲポリペプチドと結合しない。一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、ａ）ヒトＦｏｌＲ１との結合について、配列番号４９の可変重鎖ドメイン（ＶＨ）及び配列番号５１の可変軽鎖ドメインを含む参照抗体と競合する第１の抗原結合部位と、ｂ）ヒトＣＤ３との結合について、配列番号３６の可変重鎖ドメイン（ＶＨ）及び配列番号３１の可変軽鎖ドメインを含む参照抗体と競合する第２の抗原結合部位とを含み、結合競合が、表面プラズモン共鳴アッセイを使用して測定される。
【００１９】
一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第１、第２及び第３の抗原結合部分を形成する第１、第２、第３、第４及び第５のポリペプチド鎖を含み、第１の抗原結合部分は、ＣＤ３と結合可能であり、第２及び第３の抗原結合部分は各々、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）と結合可能であり、ａ）第１及び第２のポリペプチド鎖は、アミノ（Ｎ）末端からカルボキシル（Ｃ）末端の方向に、ＶＬＤ１及びＣＬＤ１を含み、ｂ）第３のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ＶＬＤ２及びＣＨ１Ｄ２を含み、ｃ）第４のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ＶＨＤ１、ＣＨ１Ｄ１、ＣＨ２Ｄ１及びＣＨ３Ｄ１を含み、ｄ）第５のポリペプチド鎖は、ＶＨＤ１、ＣＨ１Ｄ１、ＶＨＤ２、ＣＬＤ２、ＣＨ２Ｄ２及びＣＨ３Ｄ２を含み、
ＶＬＤ１は、第１の軽鎖可変ドメインであり、
ＶＬＤ２は、第２の軽鎖可変ドメインであり、
ＣＬＤ１は、第１の軽鎖定常ドメインであり、
ＣＬＤ２は、第２の軽鎖定常ドメインであり、
ＶＨＤ１は、第１の重鎖可変ドメインであり、
ＶＨＤ２は、第２の重鎖可変ドメインであり、
ＣＨ１Ｄ１は、第１の重鎖定常ドメイン１であり、
ＣＨ１Ｄ２は、第２の重鎖定常ドメイン１であり、
ＣＨ２Ｄ１は、第１の重鎖定常ドメイン２であり、
ＣＨ２Ｄ２は、第２の重鎖定常ドメイン２であり、
ＣＨ３Ｄ１は、第１の重鎖定常ドメイン３であり、
ＣＨ３Ｄ２は、第２の重鎖定常ドメイン３である。
【００２０】
１つのこのような実施態様では、
ａ．第３のポリペプチド鎖並びに第５のポリペプチド鎖のＶＨＤ２及びＣＬＤ２は、ＣＤ３と結合可能な第１の抗原結合部分を形成し、
ｂ．第１のポリペプチド鎖並びに第４のポリペプチド鎖のＶＨＤ１及びＣＨ１Ｄ１は、ＦｏｌＲ１と結合可能な第２の結合部分を形成し、
ｃ．第２のポリペプチド鎖並びに第５のポリペプチド鎖のＶＨＤ１及びＣＨ１Ｄ１は、ＦｏｌＲ１と結合可能な第３の結合部分を形成する。
【００２１】
１つのこのような実施態様では、第１の及び第２のポリペプチド鎖は、配列番号３９９のアミノ酸配列を含む。１つのこのような実施態様では、第３のポリペプチド鎖は、配列番号８６のアミノ酸配列を含む。１つのこのような実施態様では、第４のポリペプチド鎖は、配列番号３９４のアミノ酸配列を含む。１つのこのような実施態様では、第５のポリペプチド鎖は、配列番号３９７のアミノ酸配列を含む。一実施態様では、
ａ．第１及び第２のポリペプチド鎖は、配列番号３９９のアミノ酸配列を含み、
ｂ．第３のポリペプチド鎖は、配列番号８６のアミノ酸配列を含み、
ｃ．第４のポリペプチド鎖は、配列番号３９４のアミノ酸配列を含み、
ｄ．第５のポリペプチド鎖は、配列番号３９７のアミノ酸配列を含む。
【００２２】
いくつかの実施態様では、二重特異性抗体は、ＦｏｌＲ１及びＣＤ３の両方に対して二価である。
【００２３】
いくつかの実施態様では、二重特異性抗体は、ＣＤ３に特異的な抗原結合部位を含む１つ又は複数のＦａｂ断片を含み、重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域が交換されている。
【００２４】
いくつかの実施態様では、二重特異性抗体は、Ｆｃドメイン、ＦｏｌＲ１に特異的な抗原結合部位を含む少なくとも１つのＦａｂ断片及びＣＤ３に特異的な抗原結合部位を含む少なくとも１つのＦａｂ断片を含み、少なくとも１つのＦａｂ断片の重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のいずれかが交換されている。
【００２５】
いくつかの実施態様では、二重特異性抗体は、
ａ）Ｆｃドメインと、
ｂ）各々ＦｏｌＲ１に特異的な抗原結合部位を含む、第１及び第２のＦａｂ断片と、
ｃ）ＣＤ３に特異的な抗原結合部位を含む第３のＦａｂ断片と
を含み、第３のＦａｂ断片は、可変重鎖（ＶＨ）のＣ末端で、Ｆｃドメインの第２のサブユニットと接続しており、第３のＦａｂ断片は、可変重鎖のＮ末端で、第２のＦａｂ断片のＣ末端と接続している。
【００２６】
一実施態様では、前記Ｆａｂ断片の少なくとも１つは、ペプチドリンカーを介してＦｃドメインと接続している。
【００２７】
一実施態様では、前記二重特異性抗体は、Ｆｃ受容体との結合及び／又はエフェクター機能を低減する１つ又は複数のアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含む。一実施態様では、前記の１つ又は複数のアミノ酸置換は、Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＰ３２９の群から選択される１つ又は複数の位置でである。一実施態様では、Ｆｃドメインの各サブユニットは、活性化又は阻害性Ｆｃ受容体との結合及び／又はエフェクター機能を消失させる３つのアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸置換は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇである。
【００２８】
いくつかの実施態様では、ＰＤ−１軸結合アンタゴニストは、ＰＤ−１結合アンタゴニスト、ＰＤＬ１結合アンタゴニスト及びＰＤＬ２結合アンタゴニストからなる群から選択される。
【００２９】
いくつかの実施態様では、ＰＤ−１軸結合アンタゴニストは、ＰＤ−１結合アンタゴニストである。いくつかの実施態様では、ＰＤ−１結合アンタゴニストは、ＰＤ−１の、そのリガンドである結合パートナーとの結合を阻害する。いくつかの実施態様では、ＰＤ−１結合アンタゴニストは、ＰＤ−１のＰＤＬ１との結合を阻害する。いくつかの実施態様では、ＰＤ−１結合アンタゴニストは、ＰＤ−１のＰＤＬ２との結合を阻害する。いくつかの実施態様では、ＰＤ−１結合アンタゴニストは、ＰＤ−１のＰＤＬ１及びＰＤＬ２両方との結合を阻害する。いくつかの実施態様では、ＰＤ−１結合アンタゴニストは、抗体である。いくつかの実施態様では、抗ＰＤ−１抗体は、モノクローナル抗体である。いくつかの実施態様では、抗ＰＤ−１抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ及び（Ｆａｂ’）２断片からなる群から選択される抗体断片である。いくつかの実施態様では、ＰＤ−１結合アンタゴニストは、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、ＣＴ−０１１又はＡＭＰ−２２４である。
【００３０】
いくつかの実施態様では、ＰＤ−１軸結合アンタゴニストは、ＰＤＬ１結合アンタゴニストである。いくつかの実施態様ではＰＤ−Ｌ１結合アンタゴニストは、ＰＤＬ１のＰＤ−１との結合を阻害する。いくつかの実施態様では、ＰＤＬ１結合アンタゴニストは、ＰＤＬ１のＢ７−１との結合を阻害する。いくつかの実施態様では、ＰＤＬ１結合アンタゴニストは、ＰＤＬ１のＰＤ−１及びＢ７−１両方との結合を阻害する。いくつかの実施態様では、ＰＤＬ１結合アンタゴニストは、抗ＰＤＬ１抗体である。いくつかの実施態様では、抗ＰＤＬ１抗体は、モノクローナル抗体である。いくつかの実施態様では、抗ＰＤＬ１抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ及び（Ｆａｂ’）２断片からなる群から選択される抗体断片である。いくつかの実施態様では、抗ＰＤＬ１抗体は、ヒト化抗体又はヒト抗体である。いくつかの実施態様では、ＰＤＬ１結合アンタゴニストは、ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＭＤＸ−１１０５及びＭＥＤＩ４７３６からなる群から選択される。
【００３１】
いくつかの実施態様では、抗ＰＤＬ１抗体は、配列番号２８９のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号２９０のＨＶＲ−Ｈ２配列及び配列番号２９１のＨＶＲ−Ｈ３配列を含む重鎖並びに配列番号２９２のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号２９３のＨＶＲ−Ｌ２配列及び配列番号２９４のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施態様では、抗ＰＤＬ１抗体は、配列番号２８０又は配列番号２８１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号３８３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施態様では、抗ＰＤＬ１抗体は、配列番号２７８のアミノ酸配列を含む重鎖及び／又は配列番号２７９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【００３２】
いくつかの実施態様では、ＰＤ−１軸結合アンタゴニストは、ＰＤＬ２結合アンタゴニストである。いくつかの実施態様ではＰＤＬ２結合アンタゴニストは、抗体である。いくつかの実施態様では、抗ＰＤＬ２抗体は、モノクローナル抗体である。いくつかの実施態様では、抗ＰＤＬ２抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ及び（Ｆａｂ’）２断片からなる群から選択される抗体断片である。いくつかの実施態様では、ＰＤＬ２結合アンタゴニストは、イムノアドヘシンである。
【００３３】
一実施態様では、上記の実施態様のいずれかの方法は、個体に、Ｔ細胞免疫グロブリンムチン３（ＴＩＭ３）アンタゴニストを投与することをさらに含む。一実施態様では、ＴＩＭ３アンタゴニストは、抗ＴＩＭ３抗体である。一実施態様では、抗ＴＩＭ３抗体は、３７℃で１２０分後に少なくとも４５％のＴＩＭ３発現細胞でＴＩＭ３の内部移行を誘導し、内部移行は、ＦＡＣＳ解析によって測定される。一実施態様では、抗ＴＩＭ３抗体は、以下の特性：
ａ）ＴＩＭ３との結合について、配列番号７のＶＨ及び配列番号８のＶＬを含む抗Ｔｉｍ３抗体と競合する、
ｂ）ヒト及びカニクイザルＴＩＭ３と結合する、
ｃ）イムノコンジュゲートとして、ＴＩＭ３発現細胞に対して細胞傷害活性を示す、
ｄ）インターフェロンガンマ放出を誘導する
のうち１つ又は複数を有する。
【００３４】
一実施態様では、抗ＴＩＭ３抗体は、以下の特性：
ａ.ＴＩＭ３との結合について、配列番号７のＶＨ及び配列番号８のＶＬを含む抗Ｔｉｍ３抗体と競合する、
ｂ.ヒト及びカニクイザルＴＩＭ３と結合する、
ｃ.イムノコンジュゲートとして、ＴＩＭ３発現細胞に対して細胞傷害活性を示す、
ｄ.インターフェロンガンマ放出を誘導する、
のうち１つ又は複数を有する。
【００３５】
一実施態様では、抗ＴＩＭ３抗体は、モノクローナル抗体である。一実施態様では、抗ＴＩＭ３抗体は、ヒト、ヒト化又はキメラ抗体である。一実施態様では、抗ＴＩＭ３抗体は、ＴＩＭ３と結合する抗体断片である。一実施態様では、抗ＴＩＭ３抗体は、Ｆａｂ断片である。一実施態様では、抗ＴＩＭ３抗体は、
Ａ）（ａ）（ｉ）配列番号３０４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３０５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２及び（ｉｉｉ）配列番号３０６から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン並びに（ｂ）（ｉ）配列番号３０７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号３０８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号３０９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｂ）（ａ）（ｉ）配列番号３０４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３０５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２及び（ｉｉｉ）配列番号３０６から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン並びに（ｂ）（ｉ）配列番号３１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号３０８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号３０９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｃ）（ａ）（ｉ）配列番号３０４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３０５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２及び（ｉｉｉ）配列番号３０６から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン並びに（ｂ）（ｉ）配列番号３１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号３０８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号３０９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｄ）（ａ）（ｉ）配列番号３１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２及び（ｉｉｉ）配列番号３１８から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン並びに（ｂ）（ｉ）配列番号３１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号３２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号３２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｅ）（ａ）（ｉ）配列番号３２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２及び（ｉｉｉ）配列番号３２６から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン並びに（ｂ）（ｉ）配列番号３２７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号３２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号３２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｆ）（ａ）（ｉ）配列番号３３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２及び（ｉｉｉ）配列番号３３４から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン並びに（ｂ）（ｉ）配列番号３３５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号３３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号３３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｇ）（ａ）（ｉ）配列番号３４０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３４１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２及び（ｉｉｉ）配列番号３４２から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン並びに（ｂ）（ｉ）配列番号３４３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号３４４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号３４５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｈ）（ａ）（ｉ）配列番号３４８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３４９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２及び（ｉｉｉ）配列番号３５０から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン並びに（ｂ）（ｉ）配列番号３５１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号３５２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号３５３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｉ）（ａ）（ｉ）配列番号３５６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３５７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２及び（ｉｉｉ）配列番号３５８から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン並びに（ｂ）（ｉ）配列番号３５９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号３６０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号３６１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｊ）（ａ）（ｉ）配列番号３６４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３６５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２及び（ｉｉｉ）配列番号３６６から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン並びに（ｂ）（ｉ）配列番号３６７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号３６８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号３６９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン
を含む。
【００３６】
一実施態様では、抗ＴＩＭ３抗体は、カバット番号付けのＥＵインデックスに従って突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ及びＰ３２９Ｇを有する全長ＩｇＧ１抗体である。一実施態様では、抗ＴＩＭ３抗体は、国際公開第２０１１／１５５６０７号、国際公開第２０１３／００６４９０号、国際公開第０３／０６３７９２号、国際公開第２００９／０９７３９４号及び国際公開第２０１１／１５９８７７号に記載される抗体のうちいずれか１種である。一実施態様では、抗ＴＩＭ３抗体は、Ｆ３８−２Ｅ２である。一実施態様では、がんは、ＫＲＡＳ野生型を含有する。一実施態様では、がんは、活性化ＫＲＡＳ突然変異を含有する。
【００３７】
一実施態様では、治療は、治療の休止後、個体における持続応答をもたらす。一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子及びＰＤ−１軸結合アンタゴニストの少なくとも一方は、継続的に投与される。一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子及びＰＤ−１軸結合アンタゴニストの少なくとも一方は、断続的に投与される。一実施態様では、ＰＤ−１軸結合アンタゴニストは、ＦｏｌＲ１  ＴＣＢの前に投与される。一実施態様では、ＰＤ−１軸結合アンタゴニストは、ＦｏｌＲ１  ＴＣＢと同時に投与される。一実施態様では、ＰＤ−１軸結合アンタゴニストは、ＦｏｌＲ１  ＴＣＢの後に投与される。一実施態様では、がんは、卵巣がん、肺がん、乳がん、腎がん、結腸直腸がん、子宮内膜がんからなる群から選択される。一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子及びＰＤ−１軸結合アンタゴニストの少なくとも一方は、静脈内に、筋肉内に、皮下に、局所に、経口的に、経皮的に、腹腔内に、眼窩内に、移植によって、吸入によって、髄腔内に、脳室内に又は鼻腔内に投与される。
【００３８】
一実施態様では、個体中のＴ細胞は、組合せの投与の前に比べ、増強された活性化、増殖及び／又はエフェクター機能を有する。一実施態様では、個体中のＴ細胞は、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子単独の投与に比べ、増強された活性化、増殖及び／又はエフェクター機能を有する。一実施態様では、Ｔ細胞エフェクター機能は、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αのうちの少なくとも１種の分泌である。一実施態様では、個体は、約１５％未満のＰＤ−１ｈｉ発現腫瘍浸潤Ｔ細胞を含む。
【００３９】
一態様では、本発明は、ＦｏｌＲ１ポジティブがんを有する個体において免疫機能を増強する方法であって、個体に、有効量の、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）及びＣＤ３に特異的なＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子並びにＰＤ−１軸結合アンタゴニストの組合せを投与することを含む方法を提供する。一実施態様では、個体中のＴ細胞は、組合せの投与の前に比べ、増強された活性化、増殖及び／又はエフェクター機能を有する。一実施態様では、個体中のＴ細胞は、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子単独の投与に比べ、増強された活性化、増殖及び／又はエフェクター機能を有する。一実施態様では、Ｔ細胞エフェクター機能は、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αのうちの少なくとも１種の分泌である。
【００４０】
一実施態様では、個体は、約１５％未満のＰＤ−１ｈｉ発現腫瘍浸潤Ｔ細胞を含む。
【００４１】
別の態様では、本発明は、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）及びＣＤ３に特異的なＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子並びにＰＤ−１軸結合アンタゴニストの組合せを用いる治療のために患者を選択するための方法であって、ＰＤ−１発現のレベルを測定することを含み、約１５％未満のＰＤ−１ｈｉ発現Ｔ細胞を有する患者が、組合せを用いる治療のために選択される、方法を提供する。
【００４２】
別の態様では、本発明は、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）及びＣＤ３に特異的なＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子と、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子をＰＤ−１軸結合アンタゴニストとともに使用して、個体においてがんの進行を治療又は遅延するための使用説明書を含む添付文書とを含むキットを提供する。一実施態様では、キットは、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子をＴＩＭ３アンタゴニストとともに使用するための使用説明書をさらに含む。
【００４３】
別の態様では、本発明は、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）及びＣＤ３に特異的なＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子並びにＰＤ−１軸結合アンタゴニストと、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子及びＰＤ−１軸結合アンタゴニストを使用して、個体においてがんの進行を治療又は遅延するための使用説明書を含む添付文書とを含むキットを提供する。一実施態様では、キットは、ＴＩＭ３アンタゴニストをさらに含む。一実施態様では、ＰＤ−１軸結合アンタゴニストは、抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤＬ−１抗体である。一実施態様では、ＰＤ−１軸結合アンタゴニストは、抗ＰＤ−１イムノアドヘシンである。
【００４４】
別の態様では、本発明は、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）及びＣＤ３に特異的なＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子と、ＰＤ−１軸結合アンタゴニストと、薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物を提供する。一実施態様では、薬学的組成物は、ＴＩＭ３アンタゴニストをさらに含む。
【００４５】
別の態様では、本発明は、がんの治療のための医薬の製造における、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）及びＣＤ３に特異的なＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子及びＰＤ−１軸結合アンタゴニストの組合せの使用を提供する。一実施態様では、医薬は、卵巣がん、肺がん、乳がん、腎がん、結腸直腸がん、子宮内膜がんの治療用である。
【００４６】
本発明のすべての態様の特定の実施態様では、前記Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子及び／又はＰＤ−１軸結合アンタゴニストは、ヒト又はヒト化であることが有利である。
【００４７】
いくつかの実施態様では、二重特異性抗体は、Ｆｃドメインと、ＦｏｌＲ１に特異的な抗原結合部位を含む少なくとも１つのＦａｂ断片と、ＣＤ３に特異的な抗原結合部位を含む少なくとも１つのＦａｂ断片とを含む。
【００４８】
一態様では、本発明は、個体に、有効量のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子及びＴＩＭ３アンタゴニストを投与することを含む、個体においてがんの進行を治療又は遅延するための方法を提供する。いくつかの実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、Ｆｃドメインと、各々ＦｏｌＲ１に特異的な抗原結合部位を含む２種のＦａｂ断片と、ＣＤ３に特異的な抗原結合部位を含む１種のＦａｂ断片とを含む。
【００４９】
さらなる態様において、本発明は、がんの治療のための医薬の製造における、ＦｏｌＲ１及びＣＤ３と結合するＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子並びにＰＤ−１軸結合アンタゴニストの組合せの使用を提供する。
【００５０】
さらなる態様において、本発明は、がんの治療のための医薬の製造における、ＦｏｌＲ１及びＣＤ３と結合するＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子と、ＰＤ−１軸結合アンタゴニストと、ＴＩＭ３アンタゴニストとの組合せの使用を提供する。
【００５１】
本発明の実施態様をここで、添付の図を参照して、例として説明するが、制限ではない。しかし、本発明の種々のさらなる態様及び実施態様は、本開示を考慮して当業者に明らかとなる。
【００５２】
本明細書において使用される場合「及び／又は」とは、その他のものを伴う場合も伴わない場合も２種の特定の特徴又は成分の各々特定の開示ととられるべきである。例えば、「Ａ及び／又はＢ」は、各々が本明細書において個別に示されるかのような、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ及び（ｉｉｉ）Ａ及びＢの各々の特定の開示ととられるべきである。
【００５３】
文脈が別に示さない限り、上記で示される特徴の説明及び定義は、本発明の任意の特定の態様又は実施態様に制限されず、記載されるすべての態様及び実施態様に等しく当てはまる。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１Ａ】本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子（ＴＣＢ）の例示的立体配置を示す図である。これらのコンストラクトは、Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ突然変異を有し、ノブ・イントゥー・ホール修飾を有するノブ・イントゥー・ホールＦｃ断片を含む。「ＦｏｌＲ１  ＴＣＢ  ２＋１インバーテッド（共通軽鎖）」の例示。ＦｏｌＲ１バインダーは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、ノブ修飾を含むＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端と融合している。これらのコンストラクトは、交差しておらず、３回同一ＶＬＣＬ軽鎖を有する。
【図１Ｂ】本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子（ＴＣＢ）の例示的立体配置を示す図である。これらのコンストラクトは、Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ突然変異を有し、ノブ・イントゥー・ホール修飾を有するノブ・イントゥー・ホールＦｃ断片を含む。「ＦｏｌＲ１  ＴＣＢ  １＋１ヘッドトゥーテール（共通軽鎖）」の例示。これらのコンストラクトは、交差しておらず、２回同一ＶＬＣＬ軽鎖を有する。
【図１Ｃ】本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子（ＴＣＢ）の例示的立体配置を示す図である。これらのコンストラクトは、Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ突然変異を有し、ノブ・イントゥー・ホール修飾を有するノブ・イントゥー・ホールＦｃ断片を含む。「ＦｏｌＲ１  ＴＣＢ  １＋１古典的（共通軽鎖）」の例示。これらのコンストラクト交差しておらず、２回同一ＶＬＣＬ軽鎖を有する。
【図１Ｄ】本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子（ＴＣＢ）の例示的立体配置を示す図である。これらのコンストラクトは、Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ突然変異を有し、ノブ・イントゥー・ホール修飾を有するノブ・イントゥー・ホールＦｃ断片を含む。「ＦｏｌＲ１  ＴＣＢ  ２＋１古典的（共通軽鎖）」の例示。ＣＤ３バインダーは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、ノブ修飾を含むＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端と融合している。これらのコンストラクトは、交差しておらず、３回同一ＶＬＣＬ軽鎖を有する。
【図１Ｅ】本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子（ＴＣＢ）の例示的立体配置を示す図である。これらのコンストラクトは、Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ突然変異を有し、ノブ・イントゥー・ホール修飾を有するノブ・イントゥー・ホールＦｃ断片を含む。「ＦｏｌＲ１  ＴＣＢ  ２＋１  ｃｒｏｓｓｆａｂ  古典的」の例示。これらのコンストラクトは、従来のＣＨ１−ＶＨ鎖の代わりに、ＣＤ３バインダーのためのＣｋ−ＶＨ鎖を含む。ＣＤ３バインダーは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でノブ修飾を含むＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端と融合している。
【図１Ｆ】本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子（ＴＣＢ）の例示的立体配置を示す図である。これらのコンストラクトは、Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ突然変異を有し、ノブ・イントゥー・ホール修飾を有するノブ・イントゥー・ホールＦｃ断片を含む。「ＦｏｌＲ１  ＴＣＢ  ２＋１  ｃｒｏｓｓｆａｂインバーテッド」の例示。これらのコンストラクトは、従来のＣＨ１−ＶＨ鎖の代わりにＣＤ３バインダーのためのＣｋ−ＶＨ鎖を含む。ＦｏｌＲ１バインダーは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、ノブ修飾を含むＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端と融合している。
【図１Ｇ】本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子（ＴＣＢ）の例示的立体配置を示す図である。これらのコンストラクトは、Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ突然変異を有し、ノブ・イントゥー・ホール修飾を有するノブ・イントゥー・ホールＦｃ断片を含む。「ＦｏｌＲ１  ＴＣＢ  １＋１  ｃｒｏｓｓｆａｂヘッドトゥーテール」の例示。これらのコンストラクトは、従来のＣＨ１−ＶＨ鎖の代わりにＣＤ３バインダーのためのＣｋ−ＶＨ鎖を含む。
【図１Ｈ】本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子（ＴＣＢ）の例示的立体配置を示す図である。これらのコンストラクトは、Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ突然変異を有し、ノブ・イントゥー・ホール修飾を有するノブ・イントゥー・ホールＦｃ断片を含む。「ＦｏｌＲ１  ＴＣＢ  １＋１  ｃｒｏｓｓｆａｂ  古典的」の例示。これらのコンストラクトは、従来のＣＨ１−ＶＨ鎖の代わりにＣＤ３バインダーのためのＣｋ−ＶＨ鎖を含む。
【図１Ｉ】本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子（ＴＣＢ）の例示的立体配置を示す図である。ＣＤ３／ＦｏｌＲ１  κ−λ抗体形式を例示する。これらのコンストラクトは、交差された共通軽鎖ＶＬＣＨ１及びＣＤ３に特異的な１つの交差されたＶＨＣＬ鎖及びＦｏｌＲ１に特異的な１つの交差されたＶＨＣＬ鎖を含む。
【図２Ａ−Ｃ】ＦｏＬＲ１  ＩｇＧバインダーのＨｅＬａ細胞との結合をまとめるグラフを表す図である。新規に生じたＦｏｌＲ１バインダーの、ＨｅＬａ細胞上に発現されたＦｏｌＲ１との結合を、フローサイトメトリーによって調べた。結合している抗体は、蛍光標識された抗ヒト二次抗体を用いて検出した。
【図３Ａ−Ｂ】ＦｏｌＲ１バインダーのＦｏｌＲ１に対する特異性をまとめるグラフを表す図である。ＦｏｌＲ１  ＩｇＧの、ＦｏｌＲ１又はＦｏｌＲ２のいずれかで一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ細胞との結合を、フローサイトメトリーによって分析して、ＦｏｌＲ１と特異的に結合するが、ＦｏｌＲ２と特異的に結合しないクローンを同定した。抗体は、蛍光標識された抗ヒト二次抗体を用いて検出した。
【図４Ａ−Ｂ】ＦｏｌＲ１バインダーの、ｃｙＦｏＬＲ１との交差反応性をまとめるグラフを表す図である。ＦｏｌＲ１抗体のｃｙｎｏ  ＦｏｌＲ１との交差反応性については、フローサイトメトリーによって、ｃｙＦｏｌＲ１を一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ細胞で調べた。抗体は、蛍光標識された抗ヒト二次抗体を用いて検出した。
【図５】結合後のＦｏｌＲ１  ＴＣＢの内部移行を示すグラフを表す図である。ＦｏｌＲ１との結合後の４種のＦｏｌＲ１  ＴＣＢの内部移行を、ＨｅＬａ細胞で調べた。３７℃で示された時点のインキュベーション後に、表面上の残存するＦｏｌＲ１  ＴＣＢを蛍光標識された抗ヒト二次抗体を用いて検出した。内部移行のパーセンテージを算出した。
【図６Ａ−Ｅ】ＦｏｌＲ１  ＩｇＧの、異なるＦｏｌＲ１発現レベルを有する細胞との結合をまとめるグラフを表す図である。９Ｄ１１、１６Ｄ５及びＭｏｖ１９  ＩｇＧの、異なるＦｏｌＲ１発現レベルを有する腫瘍細胞との結合を、フローサイトメトリーによって分析した。アイソタイプコントロールとしてＤＰ４７  ＩｇＧを含め、ＭＫＮ−４５をＦｏｌＲ１ネガティブ細胞株として含めた。抗体を、蛍光標識された抗ヒト二次抗体を用いて検出した。
【図７Ａ−Ｄ】ＨＴ−２９及びＳＫＯＶ３細胞のＴ細胞媒介性死滅をまとめるグラフを表す図である。ＦｏｌＲ１  ＴＣＢを使用して、ＨＴ−２９及びＳＫＯＶ３腫瘍細胞のＴ細胞媒介性死滅並びに死滅の際のＴ細胞での活性化マーカーのアップレギュレーションを調べた。９Ｄ１１  ＦｏｌＲ１  ＴＣＢ及び１６Ｄ５  ＦｏｌＲ１  ＴＣＢの存在下でのＨＴ−２９及びＳＫＯＶ３細胞のＴ細胞媒介性死滅を、２４時間及び４８時間後にＬＤＨ放出によって測定した。ＤＰ４７  ＴＣＢをネガティブコントロールとして含めた。
【図７Ｅ−Ｈ】ＨＴ−２９及びＳＫＯＶ３細胞のＴ細胞媒介性死滅をまとめるグラフを表す図である。ＦｏｌＲ１  ＴＣＢを使用して、ＨＴ−２９及びＳＫＯＶ３腫瘍細胞のＴ細胞媒介性死滅並びに死滅の際のＴ細胞での活性化マーカーのアップレギュレーションを調べた。４８時間インキュベートした後、ＳＫＯＶ３腫瘍細胞の死滅の際のＣＤ８Ｔ細胞及びＣＤ４Ｔ細胞での活性化マーカーＣＤ２５及びＣＤ６９のアップレギュレーションをフローサイトメトリーによって評価した。
【図７Ｉ−Ｌ】ＨＴ−２９及びＳＫＯＶ３細胞のＴ細胞媒介性死滅をまとめるグラフを表す図である。ＦｏｌＲ１  ＴＣＢを使用して、ＨＴ−２９及びＳＫＯＶ３腫瘍細胞のＴ細胞媒介性死滅並びに死滅の際のＴ細胞での活性化マーカーのアップレギュレーションを調べた。４８時間インキュベートした後、ＨＴ−２９腫瘍細胞の死滅の際のＣＤ８Ｔ細胞及びＣＤ４Ｔ細胞での活性化マーカーＣＤ２５及びＣＤ６９のアップレギュレーションをフローサイトメトリーによって評価した。
【図８】赤血球との抗ＦｏｌＲ１結合がないことを示すグラフを表す図である。赤血球は、ＣＤ２３５ａポジティブ集団としてゲート開閉され、９Ｄ１１  ＩｇＧ、１６Ｄ５  ＩｇＧ、Ｍｏｖ１９  ＩｇＧ及びＤＰ４７  ＩｇＧのこの集団との結合を、フローサイトメトリーによって調べた。抗体を蛍光標識された抗ヒト二次抗体を用いて検出した。
【図９Ａ−Ｄ】全血における活性化マーカーアップレギュレーションをまとめるグラフを表す図である。９Ｄ１１  ＦｏｌＲ１  ＴＣＢ、１６Ｄ５  ＦｏｌＲ１  ＴＣＢ、Ｍｏｖ１９  ＦｏｌＲ１  ＴＣＢ及びＤＰ４７  ＴＣＢの添加後２４時間でのＣＤ４Ｔ細胞及びＣＤ８Ｔ細胞のＣＤ２５及びＣＤ６９活性化マーカーアップレギュレーションをフローサイトメトリーによって分析した。
【図１０Ａ−Ｃ】Ｈｅｌａ（高ＦｏｌＲ１）（図２４Ａ）、Ｓｋｏｖ−３（中程度ＦｏｌＲ１）（図２４Ｂ）及びＨＴ−２９（低ＦｏｌＲ１）（図２４Ｃ）ヒト腫瘍細胞の３６Ｆ２  ＴＣＢ、１６Ｄ５  ＴＣＢ、１６Ｄ５  ＴＣＢ古典的、１６Ｄ５  ＴＣＢ  １＋１及び１６Ｄ５  ＴＣＢ  ＨＴによって誘導されたＴ細胞死滅を表す図である（Ｅ：Ｔ＝１０：１、エフェクターヒトＰＢＭＣ、インキュベーション時間２４時間）。ＤＰ４７  ＴＣＢを非結合コントロールとして含めた。
【図１１Ａ−Ｂ】腫瘍浸潤Ｔ細胞での阻害性受容体の発現を示す図である。腫瘍試料中のＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞を、それらの阻害性受容体の発現についてフローサイトメトリーによって特性決定した。
【図１２Ａ−Ｉ】ＦｏｌＲ１−ＴＣＢへの曝露の際の腫瘍消化物及び悪性浸出液中のＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を示す図である。ＦｏｌＲ１−ＴＣＢ又はコントロールＴＣＢ  ＤＰ−４７の存在下又は非存在下で、腫瘍消化物又は悪性浸出液を２４時間培養した。ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＴ細胞機能の活性化マーカー又はマーカーの発現を、フローサイトメトリーによって調べた。
【図１２Ｊ−Ｋ】ＦｏｌＲ１−ＴＣＢへの曝露の際の腫瘍消化物及び悪性浸出液中のＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を示す図である。ＦｏｌＲ１−ＴＣＢ又はコントロールＴＣＢ  ＤＰ−４７の存在下又は非存在下で、腫瘍消化物又は悪性浸出液を２４時間培養した。ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＴ細胞機能の活性化マーカー又はマーカーの発現を、フローサイトメトリーによって調べた。高応答性（ＢＳ−２６９）又は低応答性患者（ＢＳ−２１２）におけるＦｏｌＲ１−ＴＣＢによって誘導されたＴ細胞活性化を示す代表的なＦＡＣＳプロットを示す。
【図１２Ｌ−Ｍ】ＦｏｌＲ１−ＴＣＢへの曝露の際の腫瘍消化物及び悪性浸出液中のＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を示す図である。ＦｏｌＲ１−ＴＣＢ又はコントロールＴＣＢ  ＤＰ−４７の存在下又は非存在下で、腫瘍消化物又は悪性浸出液を２４時間培養した。ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＴ細胞機能の活性化マーカー又はマーカーの発現を、フローサイトメトリーによって調べた。図１２Ｌは、代表的な患者から得たＴ細胞におけるＦｏｌＲ１−ＴＣＢによって誘導された活性化マーカー発現を示すＦＡＣＳプロットを表す。図１２Ｍ中のグラフは、ＦｏｌＲ１−ＴＣＢ処理後のマーカー発現の増大を表し、平均及び標準偏差を有する。比較として、健常なドナーから得たＰＢＭＣをＳｋｏｖ３腫瘍細胞株と同時培養し、ＦｏｌＲ１−ＴＣＢを用いて刺激した。
【図１２Ｎ】ＦｏｌＲ１−ＴＣＢへの曝露の際の腫瘍消化物及び悪性浸出液中のＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を示す図である。ＦｏｌＲ１−ＴＣＢ又はコントロールＴＣＢ  ＤＰ−４７の存在下又は非存在下で、腫瘍消化物又は悪性浸出液を２４時間培養した。細胞数測定ビーズアレイ又はＥＬＩＳＡによって決定され、培養物中の１×１０５個のＣＤ３＋Ｔ細胞（ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ、ＩＬ−２）又はＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞（パーフォリン）の量に対して正規化されたような、細胞培養物上清におけるＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＴＮＦ及びパーフォリンを表す。
【図１２Ｏ】ＦｏｌＲ１−ＴＣＢへの曝露の際の腫瘍消化物及び悪性浸出液中のＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を示す図である。ＦｏｌＲ１−ＴＣＢ又はコントロールＴＣＢ  ＤＰ−４７の存在下又は非存在下で、腫瘍消化物又は悪性浸出液を２４時間培養した。ＦｏｌＲ１−ＴＣＢによって誘導された腫瘍細胞死滅は、腫瘍消化物及び悪性浸出液において大幅に変わることを示す。健常なドナーから得たＦｏｌＲ１ポジティブ及びネガティブ腫瘍消化物、悪性浸出液又はＰＢＭＣを、１：１のＥ：Ｔ比で外因的に添加された蛍光標識されたＦｏｌＲ１＋Ｓｋｏｖ３細胞と、ＦｏｌＲ１−ＴＣＢの存在下又は非存在下で２４時間同時培養した。Ｓｋｏｖ３細胞のＦｏｌＲ１−ＴＣＢによって誘導された特異的死滅を、活性化されたカスパーゼ３及び生存／死滅マーカーＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）−ｎｅａｒ−ＩＲを測定することによってフローサイトメトリーによって調べた。ＦｏｌＲ１−ＴＣＢ媒介性死滅を以下のように算出した：特異的死滅％＝１００−［（ＦｏｌＲ１−ＴＣＢ処理試料中のＳｋｏｖ３生細胞の％／未処理試料中のＳｋｏｖ３生細胞の％）×１００］。ＦＡＣＳプロットは、代表的な患者におけるＦｏｌＲ１−ＴＣＢによって誘導された死滅を示す。ｐ値は、独立マンホイットニー検定を使用して算出した。
【図１３Ａ−Ｃ】ＦｏｌＲ１−ＴＣＢによって誘導されたＴ細胞活性化が、Ｅ：Ｔ比と（図１３Ａ）又はＦｏｌＲ１＋腫瘍細胞の量と（図１３Ｂ）相関を示さないことを示す図である。腫瘍消化物又は悪性浸出液を、ＦｏｌＲ１−ＴＣＢの存在下又は非存在下で２４時間培養した。ＣＤ２５のＦｏｌＲ１−ＴＣＢによって誘導された発現は、Ｅ：Ｔ比又は標的細胞の量と相関していた。ＭＦＩ：平均蛍光発光強度。
【図１４Ａ−Ｆ】ＦｏｌＲ１−ＴＣＢによって誘導されたＴ細胞活性化が、ＰＤ−１及びＴｉｍ−３の発現と逆相関することを示す図である。腫瘍消化物又は悪性浸出液を、ＦｏｌＲ１−ＴＣＢの存在下又は非存在下で２４時間培養した。ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＴ細胞機能の活性化マーカー又はマーカーの発現を、フローサイトメトリーによって調べた。ＣＤ２５（図４Ａ−Ｃ）及びＣＤ１３７（図１４Ｄ−Ｆ）のＦｏｌＲ１−ＴＣＢによって誘導された発現は、阻害性受容体ＰＤ−１及びＴｉｍ−３のベースライン単一又は共発現と相関していた。
【図１４Ｇ−Ｌ】ＦｏｌＲ１−ＴＣＢによって誘導されたＴ細胞活性化が、ＰＤ−１及びＴｉｍ−３の発現と逆相関することを示す図である。腫瘍消化物又は悪性浸出液を、ＦｏｌＲ１−ＴＣＢの存在下又は非存在下で２４時間培養した。ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＴ細胞機能の活性化マーカー又はマーカーの発現を、フローサイトメトリーによって調べた。ＩＣＯＳ（図１４Ｇ−Ｉ）及びグランザイムＢ（図１４Ｊ−Ｌ）のＦｏｌＲ１−ＴＣＢによって誘導された発現は、阻害性受容体ＰＤ−１及びＴｉｍ−３のベースライン単一又は共発現と相関していた。
【図１５Ａ−Ｃ】ＦｏｌＲ１−ＴＣＢによって誘導されたＩＬ−２分泌が、ＰＤ−１及びＴｉｍ−３の共発現と逆相関することを示す図である。腫瘍消化物又は悪性浸出液を、ＦｏｌＲ１−ＴＣＢの存在下又は非存在下で２４時間培養した。細胞培養物上清中のＩＬ−２をＥＬＩＳＡによって調べ、Ｔ細胞の量に対して正規化した。ＦｏｌＲ１  ＴＣＢによって誘導されたＩＬ−２分泌は、阻害性受容体ＰＤ−１及びＴｉｍ−３のベースライン単一又は共発現と相関していた。
【図１６Ａ−Ｅ】ＦｏｌＲ１−ＴＣＢによって誘導された腫瘍細胞死滅が、ＰＤ−１及びＴｉｍ−３の共発現と逆相関することを示す。腫瘍消化物又は悪性浸出液を、外因的に添加された蛍光標識されたＳｋｏｖ３細胞と、１：１のＴ細胞対標的細胞比で、ＦｏｌＲ１−ＴＣＢの存在下又は非存在下で２４時間同時培養した。Ｓｋｏｖ３細胞のＦｏｌＲ１−ＴＣＢ特異的死滅を、活性化されたカスパーゼ３及び生存／死滅マーカーＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ−ｎｅａｒ−ＩＲを測定することによってフローサイトメトリーによって調べた。特異的死滅は、阻害性受容体ＰＤ−１、Ｔｉｍ−３及びＣＴＬＡ−４のベースライン単一又は共発現と相関していた。
【図１６Ｆ】ＦｏｌＲ１−ＴＣＢによって誘導された腫瘍細胞死滅が、ＰＤ−１及びＴｉｍ−３の共発現と逆相関することを示す。腫瘍消化物又は悪性浸出液を、外因的に添加された蛍光標識されたＳｋｏｖ３細胞と、１：１のＴ細胞対標的細胞比で、ＦｏｌＲ１−ＴＣＢの存在下又は非存在下で２４時間同時培養した。Ｓｋｏｖ３細胞のＦｏｌＲ１−ＴＣＢ特異的死滅を、活性化されたカスパーゼ３及び生存／死滅マーカーＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ−ｎｅａｒ−ＩＲを測定することによってフローサイトメトリーによって調べた。特異的死滅は、阻害性受容体ＰＤ−１、Ｔｉｍ−３及びＣＴＬＡ−４のベースライン単一又は共発現と相関していた。
【図１７Ａ−Ｈ】カツマキソマブへの曝露の際の、腫瘍浸潤ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を示す図である。腫瘍消化物又は悪性浸出液を、カツマキソマブ存在下又は非存在下で２４時間培養した。（図１７Ａ−Ｄ）ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＴ細胞機能の活性化マーカー又はマーカーの発現を、フローサイトメトリーによって調べた。（図１７Ｅ−Ｈ）阻害性受容体のベースライン発現を示すグラフ。
【図１８Ａ−Ｆ】カツマキソマブによって誘導されたＴ細胞活性化が、阻害性受容体の共発現と逆相関することを示す図である。腫瘍消化物又は悪性浸出液を、カツマキソマブ存在下又は非存在下で２４時間培養した。Ｔ細胞活性化及びエフェクター機能は、ＰＤ−１の発現と相関していた。
【図１８Ｇ−Ｌ】カツマキソマブによって誘導されたＴ細胞活性化が、阻害性受容体の共発現と逆相関することを示す図である。腫瘍消化物又は悪性浸出液を、カツマキソマブ存在下又は非存在下で２４時間培養した。Ｔ細胞活性化及びエフェクター機能は、Ｔｉｍ−３の発現と相関していた。
【図１８Ｍ−Ｒ】カツマキソマブによって誘導されたＴ細胞活性化が、阻害性受容体の共発現と逆相関することを示す図である。腫瘍消化物又は悪性浸出液を、カツマキソマブ存在下又は非存在下で２４時間培養した。Ｔ細胞活性化及びエフェクター機能は、ＰＤ−１及びＴｉｍ−３の組合せの発現と相関していた。
【図１９Ａ−Ｂ】非小細胞肺がん患者における腫瘍浸潤Ｔ細胞での阻害性受容体の発現を示す図である。腫瘍試料中のＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞を、フローサイトメトリーによって、その阻害性受容体の発現について特性決定した。
【図１９Ｃ−Ｄ】非小細胞肺がん患者における腫瘍浸潤Ｔ細胞での阻害性受容体の発現を示す図である。腫瘍試料中のＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞を、フローサイトメトリーによって、その阻害性受容体の発現について特性決定した。
【図１９Ｅ−Ｆ】非小細胞肺がん患者における腫瘍浸潤Ｔ細胞での阻害性受容体の発現を示す図である。腫瘍試料中のＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞を、フローサイトメトリーによって、その阻害性受容体の発現について特性決定した。
【図１９Ｇ】非小細胞肺がん患者における腫瘍浸潤Ｔ細胞での阻害性受容体の発現を示す図である。ある代表的なドナーのゲートの開閉戦略を示す。
【図１９Ｈ】非小細胞肺がん患者における腫瘍浸潤Ｔ細胞での阻害性受容体の発現を示す図である。Ｅｘｃｅｌ条件付き書式プログラムを使用した、発現のパーセンテージに基づく示された細胞サブセットの分析の結果及び熱マッピングを示す。
【図２０Ａ−Ｅ】ＣＤ３／ＣＤ２８抗体によるポリクローナル刺激の際のＴ細胞活性化及びエフェクター機能を示す図である。アゴニストＣＤ３及びＣＤ２８抗体を用いる全腫瘍消化物の刺激後に消化された腫瘍試料から得られたＴ細胞において、それぞれ、Ｔ細胞活性化及びエフェクター機能のマーカーとして、ＣＤ２５及びグランザイムＢ（図２０Ａ−Ｂ）並びにＩＬ−２、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−α（図２０Ｃ−Ｅ）の発現を分析した。
【図２１Ａ−Ｅ】阻害性受容体の発現及びＴ細胞機能障害を示す図である。抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体によるポリクローナル刺激の際のＣＤ２５及びグランザイムＢ（図２１Ａ−Ｂ）並びにＩＬ−２、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−α（図２１Ｃ−Ｅ）の発現は、ｉＲスコアによって示される阻害性受容体の累積発現と相関する。
【図２１Ｆ】阻害性受容体の発現及びＴ細胞機能障害を示す図である。ｉＲスコアの例示的算出を示す。ＰＤ−１、Ｔｉｍ−３、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３及びＢＴＬＡの発現のパーセンテージを、すべてのＮＳＣＬＣ試料において分析し、中央値並びに四分位間範囲を決定した。ｉＲスコアの算出のために、各患者に、発現が一致した四分位に基づいて、決定された阻害性受容体の各々発現の点を与えた。最大１５点が到達され得、各試料の算出されたスコアを、この点の最大量に対して正規化した。
【図２１Ｇ−Ｊ】阻害性受容体の発現及びＴ細胞機能障害を示す図である。阻害性受容体の発現が腫瘍段階につれて増大することを示す。ＣＤ８＋腫瘍浸潤Ｔ細胞での阻害性受容体の発現は、ＴＮＭステージと相関していた。
【図２１Ｋ】阻害性受容体の発現及びＴ細胞機能障害を示す図である。阻害性受容体の発現が腫瘍段階につれて増大することを示す。ＣＤ８＋腫瘍浸潤Ｔ細胞での阻害性受容体の発現は、ＴＮＭステージと相関していた。
【図２１Ｌ−Ｍ】阻害性受容体の発現及びＴ細胞機能障害を示す図である。腫瘍進行に伴う阻害性受容体の累積発現の増大を示す図である。ｉＲスコアによって表されるような阻害性受容体ＰＤ−１、Ｔｉｍ−３、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３及びＢＴＬＡの累積発現は、結節状態及びＴＮＭステージと相関していた。
【図２１Ｎ】阻害性受容体の発現及びＴ細胞機能障害を示す図である。腫瘍進行に伴う阻害性受容体の累積発現の増大を示す図である。ｉＲスコアによって表されるような阻害性受容体ＰＤ−１、Ｔｉｍ−３、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３及びＢＴＬＡの累積発現は、結節状態及びＴＮＭステージと相関していた。
【図２２Ａ−Ｃ】ＰＤ−１及びＴｉｍ−３の発現が、Ｔ細胞機能障害と相関することを示す図である。ＣＤ３／ＣＤ２８によるポリクローナル刺激の際のＣＤ２５及びグランザイムＢの発現は、腫瘍浸潤Ｔ細胞でのＰＤ−１の発現と相関する。
【図２２Ｄ−Ｆ】ＰＤ−１及びＴｉｍ−３の発現が、Ｔ細胞機能障害と相関することを示す図である。ＣＤ３／ＣＤ２８によるポリクローナル刺激の際のＩＬ−２、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αの発現は、腫瘍浸潤Ｔ細胞でのＴｉｍ−３の発現と相関する。
【図２２Ｇ−Ｉ】ＰＤ−１及びＴｉｍ−３の発現が、Ｔ細胞機能障害と相関することを示す図である。ＣＤ３／ＣＤ２８によるポリクローナル刺激の際のＩＬ−２、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αの発現は、腫瘍浸潤Ｔ細胞でのＰＤ−１／Ｔｉｍ−３の発現と相関する。
【図２３Ａ−Ｃ】ＰＤ−１の又は混合ＰＤ−１／Ｔｉｍ−３ブロックの効果が患者間で変わることを示す図である。消化物を、ＰＤ−１単独又はＴｉｍ−３と組み合わせたＰＤ−１へのブロック抗体の添加を用いてアゴニスト抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体によって刺激した。ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α及びＩＬ−２の分泌を、ＥＬＩＳＡによって調べ、１×１０６Ｔ細胞に対して正規化した。Ｔ細胞機能が、ブロッキングＡｂ（ＢＳ−２６８）の添加によってレスキューされ得る患者から得たＴ細胞及びＰＤ−１又はＰＤ−１／Ｔｉｍ−３ブロックに対する応答がない患者から得たＴ細胞を示す。発現の相違（［Ａｂ処理発現％］−［未処理発現％］）が示されている。
【図２３Ｄ】ＰＤ−１の又は混合ＰＤ−１／Ｔｉｍ−３ブロックの効果が患者間で変わることを示す図である。消化物を、ＰＤ−１単独又はＴｉｍ−３と組み合わせたＰＤ−１へのブロック抗体の添加を用いてアゴニスト抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体によって刺激した。ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α及びＩＬ−２の分泌を、ＥＬＩＳＡによって調べ、１×１０６Ｔ細胞に対して正規化した。ＰＤ−１ｈｉ及びＰＤ−１ｉｎｔサブセットを有するそれぞれのフローサイトメトリープロットを示す。
【図２３Ｅ】ＰＤ−１の又は混合ＰＤ−１／Ｔｉｍ−３ブロックの効果が患者間で変わることを示す図である。消化物を、ＰＤ−１単独又はＴｉｍ−３と組み合わせたＰＤ−１へのブロック抗体の添加を用いてアゴニスト抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体によって刺激した。ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α及びＩＬ−２の分泌を、ＥＬＩＳＡによって調べ、１×１０６Ｔ細胞に対して正規化した。ＥＬＩＳＡによって決定され、１×１０６個のＣＤ３＋Ｔ細胞に対して正規化されたような、６人の患者から得られたＴ細胞によるＩＬ−２、ＴＮＦ−α及びＩＦＮ−γ分泌の概要を示す。
【図２４Ａ−Ｃ】ＰＤ−１又は混合ＰＤ−１／Ｔｉｍ−３ブロックの効果が、ＰＤ−１ｈｉ及びＰＤ−１ｉｎｔサブセットにおいて異なることを示す図である。ＰＤ−１又は混合ＰＤ−１／Ｔｉｍ−３ブロックによるサイトカイン産生の増大と、ＰＤ−１ｈｉ及びＰＤ−１ｉｎｔサブセットとの相関が、ＰＤ−１ｈｉ／ＰＤ−１ｉｎｔ比によって示される。
【図２４Ｄ−Ｆ】ＰＤ−１又は混合ＰＤ−１／Ｔｉｍ−３ブロックの効果が、ＰＤ−１ｈｉ及びＰＤ−１ｉｎｔサブセットにおいて異なることを示す図である。ＰＤ−１又は混合ＰＤ−１／Ｔｉｍ−３ブロックによるサイトカイン産生の増大と、ＰＤ−１ｈｉ及びＰＤ−１ｉｎｔサブセットとの相関が、ＰＤ−１ｈｉ／ＰＤ−１ｉｎｔ比によって示される。
【図２５Ａ−Ｉ】ＦｏｌＲ１−ＴＣＢへの曝露の際の腫瘍消化物及び悪性浸出液におけるＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化を示す図である。腫瘍消化物又は悪性浸出液を、ＦｏｌＲ１−ＴＣＢ又はコントロールＴＣＢ  ＤＰ−４７の存在下又は非存在下で２４時間培養した。ＣＤ８＋Ｔ細胞でのＴ細胞機能の活性化マーカー又はマーカーの発現を、フローサイトメトリーによって調べた。
【図２６Ａ−Ｃ】ＦｏｌＲ１−ＴＣＢ誘導されたＴ細胞活性化が、ＣＴＬＡ−４、Ｌａｇ−３及びＢＴＬＡ発現に依存しないことを示す図である。腫瘍消化又は悪性浸出液を、ＦｏｌＲ１−ＴＣＢの存在下又は非存在下で２４時間培養した。ＣＤ８＋Ｔ細胞でのＣＤ２５の発現を、フローサイトメトリーによって調べた。ＣＤ２５のＦｏｌＲ１−ＴＣＢによって誘導された発現は、ＣＴＬＡ−４、Ｌａｇ−３及びＢＴＬＡのベースライン発現と相関していた。
【図２７Ａ−Ｃ】ＦｏｌＲ１−ＴＣＢが、低パーセンテージのＰＤ−１ｈｉ発現ＣＤ８＋Ｔ細胞を有する患者においてのみ、サイトカイン分泌を誘導することを示す図である。腫瘍消化物又は悪性浸出液を、ＦｏｌＲ１−ＴＣＢの存在下又は非存在下で２４時間培養した。細胞培養物上清中のＩＦＮ−γ、ＴＮＦ及びＩＬ−２を調べ、培養物中の１×１０５個のＴ細胞の量に対して正規化した。ＦｏｌＲ１−ＴＣＢによって誘導されたサイトカイン分泌は、ベースラインＰＤ−１ｈｉ発現と相関していた。
【図２８Ａ−Ｃ】ＰＤ−１ブロック抗体を用いる処理は、低パーセンテージのＰＤ−１ｈｉ発現細胞を有する、肺及び卵巣がんの患者から得た腫瘍消化物又は悪性浸出液においてサイトカイン分泌を誘導できないことを示す図である。腫瘍消化物又は悪性浸出液を、ＰＤ−１ブロック抗体の存在下又は非存在下でＦｏｌＲ１−ＴＣＢとともに２４時間培養した。細胞培養上清中のＩＦＮ−γ、ＴＮＦ及びＩＬ−２を調べ、培養物中の１×１０５個のＴ細胞の量に対して正規化した。ＦｏｌＲ１−ＴＣＢ処理単独と比べ、ブロック抗体によって誘導されたサイトカイン分泌は、ベースラインＰＤ−１ｈｉ発現と相関していた。
【図２８Ｄ−Ｆ】ＰＤ−１ブロック抗体を用いる処理は、低パーセンテージのＰＤ−１ｈｉ発現細胞を有する、肺及び卵巣がんの患者から得た腫瘍消化物又は悪性浸出液においてサイトカイン分泌を誘導できないことを示す図である。腫瘍消化物又は悪性浸出液を、ＰＤ−１及びＴｉｍ−３ブロック抗体の組合せの存在下又は非存在下でＦｏｌＲ１−ＴＣＢとともに２４時間培養した。細胞培養上清中のＩＦＮ−γ、ＴＮＦ及びＩＬ−２を調べ、培養物中の１×１０５個のＴ細胞の量に対して正規化した。ＦｏｌＲ１−ＴＣＢ処理単独と比べ、ブロック抗体によって誘導されたサイトカイン分泌は、ベースラインＰＤ−１ｈｉ発現と相関していた。
【図２９Ａ】ＦＡＣＳベースの内部移行アッセイから得た結果を示す図である。データは、抗ＴＩＭ３抗体Ｔｉｍ３＿００２２（＜ＴＩＭ−３＞Ａｂ（０２２）として略される）のＦａｂ断片（＜ＴＩＭ−３＞Ｆａｂ）が、３７℃でのインキュベーション後に、全ＩｇＧ形式の抗体と同様の動力学で、ｈｕＴＩＭ−３を発現するｒｅｃ  ＣＨＯＫ１細胞中に内部移行したことを示す。
【図２９Ｂ】ＦＡＣＳベースの内部移行アッセイから得た結果を示す図である。データは、抗ＴＩＭ３抗体Ｔｉｍ３＿００２２（＜ＴＩＭ−３＞Ａｂ（０２２）として略される）のＦａｂ断片（＜ＴＩＭ−３＞Ｆａｂ）が、３７℃でのインキュベーション後に、全ＩｇＧ形式の抗体と同様の動力学で、ｈｕＴＩＭ−３を発現するｒｅｃ  ＣＨＯＫ１細胞中に内部移行したことを示す。
【図３０Ａ】抗ＴＩＭ３抗体のＲＰＭＩ−８２２６細胞との結合を示す（抗体指定（ｄｅｓｉｇａｎｔｉｏｎ）クローン００１６とは、抗体Ｔｉｍ３＿００１６を指し、クローン００１６とは、抗体Ｔｉｍ３＿００１６変異体（抗体Ｔｉｍ３＿００１８）を指し、クローン００２２とは、抗体Ｔｉｍ３＿００１２２を指すなど）。
【図３０Ｂ】抗ＴＩＭ３抗体のＰｆｅｉｆｆｅｒ細胞との結合を示す（抗体指定クローン００１６とは、抗体Ｔｉｍ３＿００１６を指し、クローン００１６とは、抗体Ｔｉｍ３＿００１６変異体（抗体Ｔｉｍ３＿００１８）を指し、クローン００２２とは、抗体Ｔｉｍ３＿００１２２を指すなど）。
【図３１】抗ＴＩＭ−３  ｍＡｂを使用するＦＡＣＳによる種々の患者ＡＭＬ細胞試料でのＴＩＭ−３の発現レベルを示す図である。
【図３２】ＮＳＣＬＣ関連ＴＩＬでの阻害性受容体の発現のヒートマップを示す図である。示された免疫チェックポイントについてポジティブの腫瘍浸潤ＣＤ８＋Ｔ細胞での阻害性受容体の共発現が、さらなる受容体の発現のパーセンテージを示すヒートマップとして示されている。
【図３３】ＮＳＣＬＣ関連ＴＩＬでの阻害性受容体の発現のレーダープロットを示す図である。示された免疫チェックポイントについてポジティブの腫瘍浸潤ＣＤ８＋Ｔ細胞での阻害性受容体の共発現が、４種のその他の受容体の平均発現及び標準偏差を示すレーダープロットとして示されている。
【図３４Ａ−Ｄ】さらなる免疫チェックポイントを発現するＰＤ−１ｈｉ又はＰＤ−１ｉｎｔＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを示す図である。各ドットは、１つの患者の試料を表す。ｐ値は、ウィルコクソン順位和検定を使用して算出した。
【図３５Ａ】瘍内Ｔ細胞阻害性受容体発現及びＴ細胞機能を示す図である。２人の代表的な患者から得られたＴ細胞のＰＤ−１ｈｉ、ＰＤ−１ｉｎｔ及びＰＤ−１ｎｅｇＣＤ８＋サブセットの同定のためのゲートの開閉戦略を示す。
【図３５Ｂ】瘍内Ｔ細胞阻害性受容体発現及びＴ細胞機能を示す図である。分析された腫瘍試料における示されたＴ細胞サブセットの分布を示す。
【図３５Ｃ】瘍内Ｔ細胞阻害性受容体発現及びＴ細胞機能を示す図である。抗ＣＤ３／−ＣＤ２８刺激によって誘導されたＴ細胞機能が、ＣＤ８＋Ｔ細胞のＰＤ−１発現レベルに応じて変わることを示す。腫瘍消化及び悪性浸出液を、アゴニスト抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体の存在下又は非存在下で２４時間培養した。ＰＤ−１ｈｉが稀な及び豊富な腫瘍において、ＣＤ８＋Ｔ細胞でのＣＤ２５の発現の増大を調べた。ｐ値は、独立マン・ホイットニー検定を使用して算出した。
【図３５Ｄ】瘍内Ｔ細胞阻害性受容体発現及びＴ細胞機能を示す図である。腫瘍消化及び悪性浸出液を、アゴニスト抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体の存在下又は非存在下で２４時間培養した。ＰＤ−１ｈｉが稀な及び豊富な腫瘍において、エフェクターサイトカインＩＦＮ−γ、ＩＬ−２及びＴＮＦの増大を調べた。ｐ値は、独立マン・ホイットニー検定を使用して算出した。
【図３５Ｅ】瘍内Ｔ細胞阻害性受容体発現及びＴ細胞機能を示す図である。ＰＤ−１ｈｉ発現ＣＤ８＋細胞のパーセンテージに従って、腫瘍試料を、それぞれ、ＰＤ−１ｈｉが稀な及び豊富な発現を有する２群にわけた。
【図３５Ｆ】瘍内Ｔ細胞阻害性受容体発現及びＴ細胞機能を示す図である。阻害性受容体ＰＤ−１、Ｔｉｍ−３、ＣＴＬＡ−４、Ｌａｇ−３及びＢＴＬＡの発現レベルを、腫瘍消化物又は悪性浸出液から得たＣＤ８＋Ｔ細胞でフローサイトメトリーによって調べた。
【図３６Ａ】阻害性受容体発現のパターン、並びが稀な及び豊富なＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを示す図である。ＰＤ−１ｈｉ、ＰＤ−１ｉｎｔ及びＰＤ−１ｎｅｇＣＤ８＋Ｔ細胞でのＴｉｍ−３の共発現を示す。ｐ値は、ボンフェローニポストホック試験を用いる一方向ＡＮＯＶＡを使用して算出した。
【図３６Ｂ】阻害性受容体発現のパターン、並びが稀な及び豊富なＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを示す図である。ＰＤ−１ｈｉ、ＰＤ−１ｉｎｔ及びＰＤ−１ｎｅｇＣＤ８＋Ｔ細胞でのＣＴＬＡ−４の共発現を示す。ｐ値は、ボンフェローニポストホック試験を用いる一方向ＡＮＯＶＡを使用して算出した。
【図３６Ｃ】阻害性受容体発現のパターン、並びが稀な及び豊富なＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを示す図である。ＰＤ−１ｈｉ、ＰＤ−１ｉｎｔ及びＰＤ−１ｎｅｇＣＤ８＋Ｔ細胞でのＬａｇ−３の共発現を示す。ｐ値は、ボンフェローニポストホック試験を用いる一方向ＡＮＯＶＡを使用して算出した。
【図３６Ｄ】阻害性受容体発現のパターン、並びが稀な及び豊富なＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを示す図である。ＰＤ−１ｈｉ、ＰＤ−１ｉｎｔ及びＰＤ−１ｎｅｇＣＤ８＋Ｔ細胞でのＢＴＬＡの共発現を示す。ｐ値は、ボンフェローニポストホック試験を用いる一方向ＡＮＯＶＡを使用して算出した。
【図３６Ｅ】阻害性受容体発現のパターン、並びが稀な及び豊富なＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを示す図である。ＦｏｌＲ１＋腫瘍試料を、ＰＤ−１ｈｉ発現ＣＤ８＋細胞のパーセンテージに従って、それぞれ、ＰＤ−１ｈｉが稀な及び豊富な発現を有する２群にわけた。
【図３７Ａ−Ｇ】ＦｏｌＲ１−ＴＣＢ誘導されたＴ細胞機能が、ＣＤ８＋Ｔ細胞のＰＤ−１発現レベルに応じて変わることを示す図である。ＦｏｌＲ１＋腫瘍消化物及び悪性浸出液を、ＦｏｌＲ１−ＴＣＢの存在下又は非存在下で２４時間培養した。ＰＤ−１ｈｉが稀な及び豊富な腫瘍において、ＣＤ８＋Ｔ細胞での活性化マーカーの発現の増大（図３７Ａ−Ｃ）並びにエフェクターサイトカインＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＴＮＦ及びパーフォリンの増大（図３７Ｄ−Ｇ）を調べた。
【図３７Ｈ】ＦｏｌＲ１−ＴＣＢ誘導されたＴ細胞機能が、ＣＤ８＋Ｔ細胞のＰＤ−１発現レベルに応じて変わることを示す図である。ＦｏｌＲ１＋腫瘍消化物及び悪性浸出液を、ＦｏｌＲ１−ＴＣＢの存在下又は非存在下で２４時間培養した。標的細胞死滅を示す。ＦｏｌＲ１ポジティブ及びネガティブ腫瘍試料の両方を、１：１のＥ：Ｔ比へのＦｏｌＲ１＋  Ｓｋｏｖ３細胞株の添加によって調整し、ＰＤ−１ｈｉが稀な及び豊富な腫瘍において死滅を比較した。ｐ値は、独立マンホイットニー検定を使用して算出した。
【図３８Ａ−Ｅ】ＰＤ−１ブロックは、ＰＤ−１ｈｉが稀な腫瘍から得たＴ細胞においてのみ、サイトカイン産生を増大するが、その細胞溶解機能は増大しないことを示す図である。図３８Ａ−Ｄ：ＦｏｌＲ１＋腫瘍消化物又は悪性浸出液を、ＰＤ−１ブロック抗体の存在下又は非存在下でＦｏｌＲ１−ＴＣＢとともに２４時間培養した。細胞培養物上清中のＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＴＮＦ及びパーフォリンを、細胞数測定ビーズアレイ又はＥＬＩＳＡによって調べ、１×１０５個のＣＤ３＋Ｔ細胞（ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＴＮＦ、図３８Ａ−Ｃ）又はＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞（パーフォリン、図３８Ｄ）の量に対して正規化した。ＰＤ−１ｈｉが稀な及び豊富な腫瘍において、ＦｏｌＲ１−ＴＣＢ単独と比べた、混合ＦｏｌＲ１−ＴＣＢ及び抗ＰＤ−１処理の際のサイトカイン分泌の増大を調べた。図３８Ｅ：腫瘍消化物又は悪性浸出液を、ＰＤ−１ブロック抗体及びＦｏｌＲ１−ＴＣＢの存在下又は非存在下で、１：１のＥ：Ｔ比で外因的に添加された蛍光標識されたＳｋｏｖ３細胞とともに２４時間同時培養した。ＰＤ−１ｈｉが稀な及び豊富な腫瘍において、抗ＰＤ−１抗体による比死滅の増大を比較した。ｐ値は、独立マンホイットニー検定を使用して算出した。
【図３９】詳細な患者特性を示す図である。
【図４０Ａ−Ｃ】漸増濃度のＦｏｌＲ１−ＴＣＢへの曝露の際のＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を示す図である。ＰＢＭＣを、ＦｏｌＲ１−ＴＣＢ又は非特異的コントロールＤＰ−４７−ＴＣＢの存在下又は非存在下でＳｋｏｖ３細胞とともに２４時間同時培養した。図４０Ａは、Ｓｋｏｖ３でのＦｏｌＲ１の発現を示す。影付きのヒストグラム：アイソタイプコントロール；中白のヒストグラム：抗ＦｏｌＲ１抗体。図４０Ｂ：ＣＤ８＋Ｔ細胞での活性化マーカーＣＤ２５、ＣＤ１３７及びＩＣＯＳの発現を、フローサイトメトリーによって調べた。図４０Ｃ：細胞培養物上清中のＩＦＮ−γ、ＩＬ−２及びＴＮＦを、ＥＬＩＳＡによって調べ、１×１０５個のＣＤ３＋Ｔ細胞の量に対して正規化した。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
Ｉ．定義
本明細書における目的上、「アクセプターヒトフレームワーク」とは、以下に定義されるような、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークに由来する、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワーク又は重鎖可変ドメイン（VH）フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク「に由来する」アクセプターヒトフレームワークは、その同一アミノ酸配列を含み得るか、又はアミノ酸配列変更を含有し得る。いくつかの実施態様では、アミノ酸変化の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下又は２以下である。いくつかの実施態様では、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、ＶＬヒト免疫グロブリンフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列と配列において同一である。
【００５６】
「親和性」とは、分子（例えば、抗体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）間の非共有結合相互作用の総計の強度を指す。特に断りのない限り、本明細書において、「結合親和性」とは、結合対のメンバー（例えば、抗体及び抗原）間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、一般に、解離定数（Ｋｄ）によって表され得る。親和性は、本明細書において記載されるものを含む、当該技術分野で公知の一般的な方法によって測定され得る。結合親和性を測定するための特定の説明的及び例示的実施態様を以下に記載する。
【００５７】
「親和性成熟した」抗体とは、このような変更を有さない親抗体と比べて、１つ又は複数の超可変領域（ＨＶＲ）において１つ又は複数の変更を有する抗体を指し、このような変更は、抗原に対する抗体の親和性の改善をもたらす。
【００５８】
用語「葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）及びＣＤ３と特異的に結合する二重特異性抗体」、「ＦｏｌＲ１及びＣＤ３に対して特異的な、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子」及び「ＦｏｌＲ１  ＴＣＢ」は、本明細書において同義的に使用され、抗体がＣＤ３＋Ｔ細胞のＦｏｌＲ２＋標的細胞への標的化において診断剤及び／又は治療剤として有用であるような十分な親和性で、ＦｏｌＲ１及びＣＤ３と結合可能である二重特異性抗体を指す。
【００５９】
用語「抗ＴＩＭ３抗体」及び「ＴＩＭ３抗体」は、ＴＩＭ３と特異的に結合する抗体を指すように本明細書において同義的に使用される。本明細書において記載される抗ＴＩＭ３抗体とは、抗体が、診断剤及び／又は治療剤として有用であるような十分な親和性で、細胞表面上に発現されるＴＩＭ３と、特に、ＴＩＭ３ポリペプチドと結合可能である抗体を指す。一実施態様では、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）又はフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって測定されるように、無関係の非ＴＩＭ３タンパク質との、ＴＩＭ３と特異的に結合する抗体の結合の程度は、抗体のＴＩＭ３との結合の約１０％未満である。特定の実施態様では、ＴＩＭ３と特異的に結合する抗体は、解離定数（Ｋｄ）が≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０−８Ｍ以下、例えば、１０−８Ｍ−１０−１３Ｍ、例えば、１０−９Ｍ−１０−１３Ｍ）である。特定の実施態様では、ＴＩＭ３と特異的に結合する抗体は、種々の種から得たＤＲ５の間で保存されるＴＩＭ３のエピトープと結合する。好ましくは、前記抗体は、ヒト及びカニクイザルＴＩＭ３と結合する。用語「ＴＩＭ３と特異的に結合する抗体」はまた、ＴＩＭ３及び第２の抗原と結合可能である二重特異性抗体も包含する。
【００６０】
本明細書において用語「抗体」は、広い意味で使用され、それだけには限らないがモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）及び所望の抗原結合活性を示す限り抗体断片を含む種々の抗体構造を包含する。
【００６１】
「抗体断片」とは、インタクトな抗体が結合する抗原と結合するインタクトな抗体の部分を含むインタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例として、それだけには限らないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディー、ｃｒｏｓｓ−Ｆａｂ断片、直鎖状抗体、単鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられる。ｓｃＦｖ抗体は、例えば、Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０３（１９９１）４６−９６に記載されている。さらに、抗体断片は、ＶＨドメインの特性を有する、すなわち、機能的抗原結合部位に、ＶＬドメインと一緒に組み立てられ得る、又はＶＬドメインの特性を有する、すなわち、ＶＨドメインと一緒に組み立てられ得、それによって、全長抗体の抗原結合特性を提供する一本鎖ポリペプチドを含む。
【００６２】
本明細書において、「Ｆａｂ断片」とは、ＶＬドメイン及び軽鎖の定常ドメイン（ＣＬ）を含む軽鎖断片並びにＶＨドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む抗体断片を指す。一実施態様では、本発明の二重特異性抗体は、重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のいずれかが交換されている少なくとも１種のＦａｂ断片を含む。可変領域又は定常領域のいずれかの交換のために、前記Ｆａｂ断片はまた、「ｃｒｏｓｓ−Ｆａｂ断片」又は「ｘＦａｂ断片」又は「クロスオーバーＦａｂ断片」とも呼ばれる。クロスオーバーＦａｂ分子の２種の異なる鎖組成物があり得、本発明の二重特異性抗体中に含まれる：一方では、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変領域は交換される、すなわち、クロスオーバーＦａｂ分子は、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び重鎖定常領域（ＣＨ１）から構成されるペプチド鎖及び重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）から構成されるペプチド鎖を含む。このクロスオーバーＦａｂ分子はまた、ＣｒｏｓｓＦａｂ（ＶＬＶＨ）とも呼ばれる。他方では、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の定常領域が交換される場合には、クロスオーバーＦａｂ分子は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）から構成されたペプチド鎖及び軽鎖可変領域（ＶＬ）及び重鎖定常領域（ＣＨ１）から構成されるペプチド鎖を含む。このクロスオーバーＦａｂ分子はまた、ＣｒｏｓｓＦａｂ（ＣＬＣＨ１）とも呼ばれる。クロスオーバーＦａｂ断片を含む二重特異性抗体形式は、例えば、国際公開第２００９／０８０２５２号、国際公開第２００９／０８０２５３号、国際公開第２００９／０８０２５１号、国際公開第２００９／０８０２５４号、国際公開第２０１０／１３６１７２号、国際公開第２０１０／１４５７９２号及び国際公開第２０１３／０２６８３１号に記載されている。
【００６３】
「一本鎖Ｆａｂ断片」又は「ｓｃＦａｂ」は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及びリンカーからなるポリペプチドであり、前記抗体ドメイン及び前記リンカーは、Ｎ末端からＣ末端方向に以下の順序のうち１種を有する：
ａ）ＶＨ−ＣＨ１−リンカー−ＶＬ−ＣＬ、ｂ）ＶＬ−ＣＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＨ１、ｃ）ＶＨ−ＣＬ−リンカー−ＶＬ−ＣＨ１又はｄ）ＶＬ−ＣＨ１−リンカー−ＶＨ−ＣＬ；前記リンカーは、少なくとも３０個のアミノ酸、好ましくは、３２から５０個の間のアミノ酸のポリペプチドである。前記一本鎖Ｆａｂ断片ａ）ＶＨ−ＣＨ１−リンカー−ＶＬ−ＣＬ、ｂ）ＶＬ−ＣＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＨ１、ｃ）ＶＨ−ＣＬ−リンカー−ＶＬ−ＣＨ１及びｄ）ＶＬ−ＣＨ１−リンカー−ＶＨ−ＣＬは、ＣＬドメインとＣＨ１ドメイン間の天然ジスルフィド結合によって安定化される。さらに、これらの一本鎖Ｆａｂ分子は、システイン残基の挿入（例えば、カバット番号付けに従う可変重鎖中の位置４４及び可変軽鎖中の位置１００）による鎖間ジスルフィド結合の生成によってさらに安定化され得る。用語「Ｎ末端は、Ｎ末端の最後のアミノ酸を意味する。用語「C末端は、C末端の最後のアミノ酸を意味する。「融合している」又は「接続している」とは、成分（例えば、Ｆａｂ分子及びＦｃドメインサブユニット）が、直接的に又は１つ又は複数のペプチドリンカーを介してペプチド結合によって連結していることを意味する。
【００６４】
用語「リンカー」とは、本明細書において、ペプチドリンカーを指し、好ましくは、少なくとも５個のアミノ酸の長さを有する、好ましくは、５−１００、より好ましくは、１０−５０個のアミノ酸の長さを有するアミノ酸配列を有するペプチドである。一実施態様では、前記ペプチドリンカーは、（ＧｘＳ）ｎ（配列番号３８４及び３８５）又は（ＧｘＳ）ｎＧｍ（配列番号４２９及び４３０）であり、Ｇ＝グリシン、Ｓ＝セリン及び（ｘ＝３、ｎ＝３、４、５又は６、及びｍ＝０、１、２又は３）又は（ｘ＝４、ｎ＝２、３、４又は５及びｍ＝０、１、２又は３）、好ましくは、ｘ＝４及びｎ＝２又は３、より好ましくは、ｘ＝４、ｎ＝２である。一実施態様では、前記ペプチドリンカーは、（Ｇ４Ｓ）２（配列番号３８６）である。
用語「免疫グロブリン分子」とは、天然に存在する抗体の構造を有するタンパク質を指す。例えば、ＩｇＧクラスの免疫グロブリンは、ジスルフィド結合している２つの軽鎖及び２つの重鎖から構成される、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各重鎖は、ＮからＣ末端に、可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）と、それに続いて、重鎖定常領域とも呼ばれる３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）を有する。同様に、各軽鎖は、ＮからＣ末端に、可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）と、それに続いて、軽鎖定常領域とも呼ばれる定常軽鎖（ＣＬ）ドメインを有する。免疫グロブリンの重鎖は、α（ＩｇＡ）、δ（ＩｇＤ）、ε（ＩｇＥ）、γ（ＩｇＧ）又はμ（ＩｇＭ）と呼ばれる５つの種類のうち１つに割り当てることができ、これらのうちいくつかは、さらにサブタイプ、例えば、γ１（ＩｇＧ１）、γ２（ＩｇＧ２）、γ３（ＩｇＧ３）、γ４（ＩｇＧ４）、α１（ＩｇＡ１）及びα２（ＩｇＡ２）に分けることができる。免疫グロブリンの軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２つの種類に割り当てることができる。免疫グロブリンは、本質的に、免疫グロブリンヒンジ領域を介して連結している２つのＦａｂ分子及びＦｃドメインからなる。
【００６５】
参照抗体と「同一エピトープと結合する抗体」とは、競合アッセイにおいて、参照抗体のその抗原との結合を５０％以上ブロックする抗体を指し、逆に、参照抗体は、競合アッセイにおいて、その抗体のその抗原との結合を５０％以上ブロックする。例示的競合アッセイは、本明細書においてに提供されている。
【００６６】
用語「抗原結合ドメイン」とは、抗原と特異的に結合する領域を含み、抗原の一部又はすべてに対して相補的である抗原結合分子の一部を指す。抗原が大きい場合には、抗原結合分子は、抗原の特定の部分とのみ結合し得、この部分はエピトープと呼ばれる。抗原結合ドメインは、例えば、１つ又は複数の抗体可変ドメイン（抗体可変領域とも呼ばれる）によって提供され得る。好ましくは、抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）及び抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。
【００６７】
用語「キメラ」抗体とは、普通、組換えＤＮＡ技術によって調製される、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の供給源又は種に由来し、重鎖及び／又は軽鎖の残部が異なる供給源又は種に由来する抗体を指す。ウサギ可変領域及びヒト定常領域を含むキメラ抗体が好ましい。本発明によって包含される「キメラ抗体」のその他の好ましい形態は、定常領域が、特に、Ｃ１ｑ結合及び／又はＦｃ受容体（ＦｃＲ）結合に関して本発明に従う特性をもたらすように、元の抗体のものから修飾されているか、又は変更されているものがある。このようなキメラ抗体はまた、「クラススイッチ抗体」とも呼ばれる。キメラ抗体は、免疫グロブリン可変領域をコードするＤＮＡセグメント及び免疫グロブリン定常領域をコードするＤＮＡセグメントを含む発現された免疫グロブリン遺伝子の産物である。キメラ抗体を製造する方法は、従来の組換えＤＮＡを含み、遺伝子トランスフェクション技術は、当該技術分野で周知である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｓ．Ｌ．等、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１（１９８４）６８５１−６８５５；米国特許第５２０２２３８号及び米国特許第５２０４２４４号を参照のこと。
【００６８】
本明細書において用語「細胞傷害性剤」とは、細胞機能を阻害又は阻止する、及び／又は細胞死若しくは破壊を引き起こす物質を指す。細胞傷害性剤として、それだけには限らないが、放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体）；化学療法剤又は薬物（例えば、メトトレキサート、アドリアマイシン（adriamicin）、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシン又はその他の挿入剤）；成長阻害性薬剤；核酸分解酵素などの酵素及びその断片；抗生物質；その断片及び／又は変異体を含む、細菌、真菌、植物又は動物起源の低分子毒素又は酵素的に活性な毒素などの毒素；並びに以下に開示される種々の抗腫瘍又は抗がん剤が挙げられる。
【００６９】
「エフェクター機能」とは、抗体アイソタイプに応じて変わる抗体のＦｃ領域に起因する生物活性を指す。抗体エフェクター機能の例として、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）、サイトカイン分泌、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性抗原取り込み、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方制御及びＢ細胞活性化が挙げられる。
【００７０】
本明細書において、用語「工学的に操作する（engineer）」、「工学的に操作された（engineered）」「工学的操作（engineering）」は、天然に存在するポリペプチド又は組換えポリペプチド又はその断片のペプチド骨格の任意の操作又は翻訳後修飾を含むと考えられる。工学的操作は、アミノ酸配列の、グリコシル化パターンの、又は個々のアミノ酸の側鎖基の修飾並びにこれらの手法の組合せを含む。
【００７１】
本明細書において、用語「アミノ酸突然変異」とは、アミノ酸置換、欠失、挿入及び修飾を包含することを意味する。最終コンストラクトが、所望の特性、例えば、Ｆｃ受容体との結合の低減、又は別のペプチドとの会合の増大を有する限り、最終コンストラクトに達するように、置換、欠失、挿入及び修飾の任意の組合せが行われ得る。アミノ酸配列欠失及び挿入は、アミノ酸のアミノ及び／又はカルボキシ末端欠失及び挿入を含む。特定のアミノ酸突然変異は、アミノ酸置換である。例えば、Ｆｃ領域の結合特性を変更する目的で、非保存的アミノ酸置換、すなわち、あるアミノ酸を、異なる構造及び／又は化学特性を有する別のアミノ酸と置き換えることは、特に好ましい。アミノ酸置換は、天然に存在しないアミノ酸による、又は２０種の標準アミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン、３−メチルヒスチジン、オルニチン、ホモセリン、５−ヒドロキシリジン）の天然に存在するアミノ酸誘導体による置換を含む。アミノ酸突然変異は、当該技術分野で周知の遺伝的又は化学的方法を使用して作製できる。遺伝的方法は、部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲ、遺伝子合成などを含み得る。化学修飾などの遺伝子工学的操作以外の方法によってアミノ酸の側鎖基を変更する方法も有用であり得ると考えられる。同一アミノ酸突然変異を示すために、種々の記号表示を使用できる。例えば、Ｆｃドメインの位置３２９のプロリンからグリシンへの置換は、３２９Ｇ、Ｇ３２９、Ｇ３２９、Ｐ３２９Ｇ又はＰｒｏ３２９Ｇｌｙと示され得る。
【００７２】
薬剤、例えば、薬学的製剤の「有効量」とは、所望の治療的又は予防的結果を達成するのに必要な投与量での及び必要な期間の有効な量を指す。
【００７３】
本明細書において、用語「Ｆｃドメイン」又は「Ｆｃ領域」は、定常領域の少なくとも一部を含有する免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。この用語は、天然配列Ｆｃ領域及び変異Ｆｃ領域を含む。ＩｇＧ重鎖のＦｃ領域の境界は、わずかに変わり得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、普通、Ｃｙｓ２２６から、又はＰｒｏ２３０から、重鎖のカルボキシル末端に伸長するように定義される。しかし、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在する場合も存在しない場合もある。本明細書において特に断りのない限り、Ｆｃ領域又は定常領域におけるアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔ等、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、１９９１に記載されるような、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従う。本明細書において、Ｆｃドメインの「サブユニット」は、二量体Ｆｃドメインを形成する２種のポリペプチドのうち１種、すなわち、安定な自己会合が可能な、免疫グロブリン重鎖のＣ末端定常領域を含むポリペプチドを指す。例えば、ＩｇＧ  Ｆｃドメインのサブユニットは、ＩｇＧ  ＣＨ２及びＩｇＧ  ＣＨ３定常ドメインを含む。
【００７４】
「Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促進する修飾」は、Ｆｃドメインサブユニットを含むポリペプチドが、同一ポリペプチドと会合して、ホモダイマーを形成するのを低減又は阻止するＦｃドメインサブユニットのペプチド骨格の操作又は翻訳後修飾である。本明細書において、会合を促進する修飾は、特に、会合するよう望まれる２種のＦｃドメインサブユニット（すなわち、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニット）の各々に行われる別個の修飾を含み、修飾は、２種のＦｃドメインサブユニットの会合を促進するように互いに相補的である。例えば、会合を促進する修飾は、それぞれ、それらの会合を立体的に又は静電気的に都合のよいものにするように、Ｆｃドメインサブユニットの一方又は両方の構造又は電荷を変更し得る。したがって、（ヘテロ）二量体化は、サブユニットの各々に融合されたさらなる成分（例えば、抗原結合部分）が同一ではないという意味で同一ではない場合がある、第１のＦｃドメインサブユニットを含むポリペプチドと、第２のＦｃドメインサブユニットを含むポリペプチドの間で起こる。いくつかの実施態様では、会合を促進する修飾は、Ｆｃドメイン中のアミノ酸突然変異、具体的には、アミノ酸置換を含む。特定の実施態様では、会合を促進する修飾は、別個のアミノ酸突然変異、具体的には、Ｆｃドメインの２種のサブユニットの各々におけるアミノ酸置換を含む。
【００７５】
「フレームワーク」又は「ＦＲ」とは、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般に、４種のＦＲドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４からなる。したがって、ＨＶＲ及びＦＲ配列は、一般に、ＶＨ（又はＶＬ）中に以下の配列で現れる：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４。
【００７６】
用語「全長抗体」、「インタクトな抗体」及び「全抗体」は、天然抗体構造と実質的に同様の構造を有するか、又は本明細書において定義されるようなＦｃ領域を含有する重鎖を有する抗体を指すように、本明細書において同義的に使用される。
【００７７】
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養物」は、同義的に使用され、外因性核酸が導入されている細胞を指し、このような細胞の子孫を含む。宿主細胞として、初代形質転換細胞及び継代数にかかわらずそれに由来する子孫を含む「形質転換体」及び「形質転換細胞」が挙げられる。子孫は、親細胞と核酸含有量において完全に同一ではない場合もあり、突然変異を含有し得る。本明細書では、元の形質転換細胞においてスクリーニング又は選択されるような同一の機能又は生物活性を有する突然変異体子孫が含まれる。
【００７８】
「ヒト抗体」は、ヒト若しくはヒト細胞によって産生されるか、又はヒト抗体レパートリー若しくはその他のヒト抗体をコードする配列を利用する非ヒト供給源に由来する抗体のものに対応するアミノ酸配列を有するものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を具体的に排除する。また、本発明のキメラ及びヒト化抗体についても記載されるように、本明細書において、用語「ヒト抗体」はまた、例えば、「クラススイッチ」、すなわち、Ｆｃ部分の変更又は突然変異（例えば、ＩｇＧ１からＩｇＧ４へ、及び／又はＩｇＧ１／ＩｇＧ４突然変異）によって、特に、Ｃ１ｑ結合及び／又はＦｃＲ結合に関して本発明の特性をもたらすように定常領域において修飾されているような抗体も含む。
【００７９】
本明細書において、用語「組換えヒト抗体」は、ＮＳ０若しくはＣＨＯ細胞などの宿主細胞から、若しくはヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックである動物（例えば、マウス）から単離された抗体又は宿主細胞中にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現された抗体などの組換え手段によって調製、発現、作製又は単離されたすべてのヒト抗体を含むよう企図される。このような組換えヒト抗体は、再配列された形態で可変及び定常領域を有する。本発明の組換えヒト抗体は、インビボ体細胞超変異に付されている。したがって、組換え抗体のＶＨ及びＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶＨ及びＶＬ配列に由来し、それと関連しながら、インビボでヒト抗体生殖系列レパートリー内に天然に存在しない可能性がある配列である。
【００８０】
「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨフレームワーク配列の選択において最もよく生じるアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般に、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループからである。一般に、配列のサブグループは、Ｋａｂａｔ等、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ９１−３２４２、Ｂｅｔｈｅｓｄａ  ＭＤ（１９９１）第１−３巻におけるようなサブグループである。一実施態様では、ＶＬについては、サブグループは、Ｋａｂａｔ等、前掲におけるようなサブグループκＩである。一実施態様では、ＶＨについては、サブグループは、Ｋａｂａｔ等、前掲におけるようなサブグループＩＩＩである。
【００８１】
「ヒト化」抗体とは、非ヒトＨＶＲに由来するアミノ酸残基及びヒトＦＲに由来するアミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。特定の実施態様では、ヒト化抗体は、ＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）のすべて又は実質的にすべてが、非ヒト抗体のものに対応し、ＦＲのすべて又は実質的にすべてが、ヒト抗体のものに対応する、少なくとも１つの、通常２つの可変ドメインの実質的にすべて含む。ヒト化抗体は、任意選択的に、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含み得る。抗体、例えば、非ヒト抗体の「ヒト化形態」とは、ヒト化を受けた抗体を指す。本発明によって包含される「ヒト化抗体」のその他の形態は、特に、Ｃ１ｑ結合及び／又はＦｃ受容体（ＦｃＲ）結合に関して、本発明の特性をもたらすように、定常領域が、元の抗体のものからさらに修飾又は変更されているものである。
【００８２】
本明細書において、用語「超可変領域」又は「ＨＶＲ」とは、配列及び／又はループと構造的に定義される形態（「超可変ループ」）において超可変である抗体可変ドメインの領域の各々を指す。一般に、天然の４鎖抗体は、６つのＨＶＲ；ＶＨ中の３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）及びＶＬ中の３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）を含む。ＨＶＲは、一般に、超可変ループに由来する及び／又は「相補性決定領域」（ＣＤＲ）に由来するアミノ酸残基を含み、後者は、最高の配列可変性のものであり、及び／又は抗原認識に関与している。例示的超可変ループは、アミノ酸残基２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）、９１−９６（Ｌ３）、２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）及び９６−１０１（Ｈ３）に生じる（Chothia及びLesk、J. Mol. Biol. 196:901-917（1987年））。例示的ＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２及びＣＤＲ−Ｈ３）は、Ｌ１のアミノ酸残基２４−３４、Ｌ２の５０−５６、Ｌ３の８９−９７、Ｈ１の３１−３５Ｂ、Ｈ２の５０−６５及びＨ３の９５−１０２に生じる（Kabat等、Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版Public Health Service、National Institutes of Health、Bethesda、MD（1991））。超可変領域（ＨＶＲ）はまた、相補性決定領域（ＣＤＲ）とも呼ばれ、これらの用語は、本明細書において、抗原結合領域を形成する可変領域の部分に関して同義的に使用される。この特定の領域は、Ｋａｂａｔ等、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」（１９８３）によって、及びにＣｈｏｔｈｉａ等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）によって記載されており、これでは、定義は、互いに比較した場合にアミノ酸残基の重複又はサブセットを含む。それにもかかわらず、抗体のＣＤＲ又はその変異体を指すためのいずれかの定義の適用は、本明細書において定義され、使用されるような用語の範囲内にあると意図される。上記で引用された参考文献の各々によって定義されるようなＣＤＲを包含する適当なアミノ酸残基は、比較として、表Ａにおいて以下に示されている。特定のＣＤＲを包含する正確な残基数は、ＣＤＲの配列及び大きさに応じて変わる。当業者ならば、抗体の可変領域アミノ酸配列を考えると、どの残基が特定のＣＤＲを含むかを常套的に決定できる。
2020183403.tif 000002
1表A中のすべてCDR定義の番号付けは、Kabat等によって示される番号付け慣習に従う(以下を参照のこと)。
2表Aにおいて使用されるような小文字「b」を用いる「AbM」とは、Oxford Molecularの「AbM」抗体モデル化ソフトウェアによって定義されるようなCDRを指す。
【００８３】
Ｋａｂａｔ等はまた、任意の抗体に適用可能である可変領域配列の番号付けシステムも定義した。当業者ならば、配列自体を超える任意の実験データに頼ることなく、この「カバット番号付け」のシステムを任意の可変領域配列に明確に割り当てることができる。本明細書において、「カバット番号付け」とは、Ｋａｂａｔ等、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」（１９８３）によって示される番号付けシステムを指す。特に断りのない限り、抗体可変領域中の特定のアミノ酸残基位置の番号付けへの言及は、カバット番号付けシステムに従う。
【００８４】
ＶＨ中のＣＤＲ１を除いて、ＣＤＲは、一般に、超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。ＣＤＲはまた、抗原と接触する残基である「特異性決定残基」又は「ＳＤＲ」も含む。ＳＤＲは、省略されたＣＤＲ、又はａ−ＣＤＲと呼ばれるＣＤＲの領域内に含有される。例示的ａ−ＣＤＲ（ａ−ＣＤＲ−Ｌ１、ａ−ＣＤＲ−Ｌ２、ａ−ＣＤＲ−Ｌ３、ａ−ＣＤＲ−Ｈ１、ａ−ＣＤＲ−Ｈ２及びａ−ＣＤＲ−Ｈ３）は、Ｌ１のアミノ酸残基３１−３４、Ｌ２の５０−５５、Ｌ３の８９−９６、Ｈ１の３１−３５Ｂ、Ｈ２の５０−５８及びＨ３の９５−１０２で生じる（Almagro及びFransson、Front. Biosci. 13:1619-1633（2008）を参照のこと）。別途指示がない限り、可変ドメイン中のＨＶＲ残基及びその他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、本明細書においてＫａｂａｔ等、前掲に従って番号付けされる。
【００８５】
「イムノコンジュゲート」は、それだけには限らないが、細胞傷害性剤を含む、１種又は複数の異種分子にコンジュゲートされている抗体である。
【００８６】
「個体」又は「対象」は、哺乳動物である。哺乳動物として、それだけには限らないが、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト及びサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）が挙げられる。特定の実施態様では、個体又は対象は、ヒトである。
【００８７】
「単離された」抗体とは、その天然環境の成分から分離されているものである。いくつかの実施態様では、抗体は、例えば、電気泳動的なもの（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動法（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフィー的なもの（例えば、イオン交換又は逆相ＨＰＬＣ）によって決定されるような９５％又は９９％を超える純度に精製される。抗体純度の評価のための方法の概説については、例えば、Ｆｌａｔｍａｎ等、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ  ８４８：７９−８７（２００７）を参照のこと。
【００８８】
「単離された」核酸とは、その天然環境の成分から分離されている核酸分子を指す。単離された核酸は、通常、その核酸分子を含有するが、核酸分子が染色体外に存在するか、その天然染色体位置とは異なる染色体位置に存在する細胞中に含有される核酸分子を含む。
【００８９】
「ＤＲ５及びＦＡＰ抗体と特異的に結合する二重特異性抗体をコードする単離された核酸」とは、単一ベクター又は別個のベクター中にあるような核酸分子及び宿主細胞中の１つ又は複数の位置に存在するような核酸分子を含む、抗体重鎖及び軽鎖（又はその断片）をコードする１種又は複数の核酸分子を指す。
【００９０】
本明細書において、用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体、すなわち、集団を含む個々の抗体は、例えば、天然に存在する突然変異を含有する、又はモノクローナル抗体調製の製造の際に生じる可能性ある変異体抗体を除いて、同一であり、及び／又は同一エピトープと結合し、このような変異体は、一般に、少量で存在する。通常、異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。したがって、修飾語句「モノクローナル」は、抗体の実質的に均一な集団から得られているような抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の製造を必要とすると解釈されてはならない。例えば、本発明に従って使用されるべきモノクローナル抗体は、それだけには限らないが、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法及びヒト免疫グロブリン遺伝子座のすべて又は一部を含有するトランスジェニック動物を利用する方法を含む種々の技術によって作製され得、モノクローナル抗体を作製するためのこのような方法及びその他の例示的方法は、本明細書において記載されている。
【００９１】
「ネイキッド抗体」とは、異種部分（例えば、細胞傷害性部分）又は放射標識とコンジュゲートしていない抗体を指す。ネイキッド抗体は、薬学的製剤中に存在し得る。
【００９２】
「天然抗体」とは、種々の構造を有する天然に存在する免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然ＩｇＧ抗体は、約１５０，０００ダルトンの、ジスルフィド結合している２つの同一の軽鎖及び２つの同一の重鎖から構成されるヘテロ四量体糖タンパク質である。各重鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）、続いて、３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）を有する。同様に、各軽鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）と、それに続く、定常軽鎖（ＣＬ）ドメインを有する。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２種のうち１種に割り当てることができる。
【００９３】
「ブロック」抗体又は「アンタゴニスト」抗体とは、結合する抗原の生物活性を阻害又は低減するものである。いくつかの実施態様では、ブロック抗体又はアンタゴニスト抗体は、抗原の生物活性を実質的に又は完全に阻害する。例えば、本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＰＤ−１によるシグナル伝達をブロックして、抗原刺激に対する機能障害状態からＴ細胞による機能的応答（例えば、増殖、サイトカイン産生、標的細胞死滅）を回復させる。
【００９４】
「アゴニスト」又は活性化抗体とは、結合する抗原によるシグナル伝達を増強又は開始するものである。いくつかの実施態様では、アゴニスト抗体は、天然リガンドが存在しなくてもシグナル伝達を引き起こす又は活性化する。
【００９５】
用語「添付文書」は、このような治療製品の使用に関する適応症、用法、投与量、投与、併用療法、禁忌症及び／又は警告についての情報を含有する、治療製品の市販のパッケージ中に通例含まれる使用説明書を指すように使用される。
【００９６】
「実質的な交差反応性がない」とは、分子（例えば、抗体）が、特に、その標的抗原と比べた場合に、分子の実際の標的抗原とは異なる抗原（例えば、標的抗原と密接に関連する抗原）を認識又は特異的に結合しないことを意味する。例えば、抗体は、約１０％未満から約５％未満で、実際の標的抗原とは異なる抗原と結合し得る、又は実際の標的抗原とは異なる前記抗原と、約１０％、９％、８％  ７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．２％若しくは０．１％未満の、好ましくは、約２％、１％若しくは０．５％未満の、最も好ましくは、約０．２％若しくは０．１％未満の、実際の標的抗原とは異なる抗原からなる量で結合し得る。
【００９７】
参照ポリペプチド配列に関して「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、配列をアラインし、必要に応じてギャップを導入して、最大配列同一性パーセントを達成した後の、任意の保存的置換を配列同一性の一部と考えない、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である、候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージと定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを調べる目的のアラインメントは、当該技術分野の技術内にある種々の方法で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成できる。当業者ならば、比較されている配列の全長にわたる最大アラインメントを達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含む、配列をアラインするための適当なパラメータを決定できる。しかし、本明細書における目的上、アミノ酸配列同一性％の値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を使用して作製される。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、Ｉｎｃ．によって生み出され、ソースコードは、米国著作権局、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．、２０５５９においてユーザー文書とともにファイルされており、米国著作権登録番号第ＴＸＵ５１００８７号のもとで登録されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、Ｉｎｃ．、Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから公的に入手可能であり、ソースコードからコンパイルされ得る。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ  Ｖ４．０Ｄを含むＵＮＩＸオペレーティングシステムで使用するにはコンパイルされなければならない。すべての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され、変動しない。
【００９８】
ＡＬＩＧＮ−２が、アミノ酸配列比較のために使用される状況では、所与のアミノ酸配列Ｂに対する、それとの、又はそれに対する所与のアミノ酸配列Ａのアミノ酸配列同一性％（あるいは、所与のアミノ酸配列Ｂに対して、それと、又はそれに対して特定のアミノ酸配列同一性％を有するか、又は含む所与のアミノ酸配列Ａと言い表すことができる）は、以下のように算出される：
１００×割合Ｘ／Ｙ
［式中、Ｘは、配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２によって、Ａ及びＢのそのプログラムのアラインメントにおいて同一マッチとスコアされたアミノ酸残基数であり、Ｙは、Ｂ中のアミノ酸残基の総数である］。ということが認められよう。アミノ酸配列Ａの長さが、アミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合には、Ｂに対するＡのアミノ酸配列同一性％は、Ａに対するＢのアミノ酸配列同一性％と等しくならない。別に具体的に記載されない限り、本明細書において使用されるすべてのアミノ酸配列同一性％の値は、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを使用して直前の段落に記載されるように得られる。
【００９９】
用語「薬学的製剤」とは、中に含有される有効成分の生物活性が有効であることを可能にするような形態であり、製剤が投与される対象にとって容認しがたく毒性であるさらなる成分を含有しない調製物を指す。
【０１００】
「薬学的に許容される担体」とは、対象にとって非毒性である、薬学的製剤中の有効成分以外の成分を指す。薬学的に許容される担体として、それだけには限らないが、バッファー、賦形剤、安定剤又は防腐剤が挙げられる。
【０１０１】
用語「ＰＤ−１軸結合アンタゴニスト」は、ＰＤ−１軸結合パートナーの、その結合パートナーのいずれか１種又は複数との相互作用を阻害して、ＰＤ−１シグナル伝達軸でのシグナル伝達に起因するＴ細胞機能障害を除去する分子であり−結果は、Ｔ細胞機能（例えば、増殖、サイトカイン産生、標的細胞死滅）を回復させるか、又は増強する。本明細書において、ＰＤ−１軸結合アンタゴニストは、ＰＤ−１結合アンタゴニスト、ＰＤ−Ｌ１結合アンタゴニスト及びＰＤ−Ｌ２結合アンタゴニストを含む。
【０１０２】
用語「ＰＤ−１」結合アンタゴニストとは、ＰＤ−１の、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２などの、１種又は複数のその結合パートナーとの相互作用に起因するシグナル伝達を低減する、ブロックする、阻害する、無効にする又は干渉する分子である。いくつかの実施態様では、ＰＤ−１結合アンタゴニストは、ＰＤ−１のその結合パートナーとの結合を阻害する分子である。特定の態様では、ＰＤ−１結合アンタゴニストは、ＰＤ−１のＰＤ−Ｌ１及び／又はＰＤ−Ｌ２との結合を阻害する。例えば、ＰＤ−１結合アンタゴニストは、ＰＤ−１のＰＤ−Ｌ１及び／又はＰＤ−Ｌ２との相互作用に起因するシグナル伝達を低減する、ブロックする、阻害する、無効にする又は干渉する、抗ＰＤ−１抗体、その抗原結合断片、イムノアドヘシン、融合タンパク質、オリゴペプチド及びその他の分子が挙げられる。一実施態様では、ＰＤ−１結合アンタゴニストは、ＰＤ−１を介した、Ｔリンパ球上で発現される細胞表面タンパク質媒介性シグナル伝達によって媒介される、又はそれによる負の共刺激シグナルを低減し、機能障害性Ｔ細胞をあまり機能障害性ではないようにする（例えば、抗原認識に対するエフェクター応答を増強する）。いくつかの実施態様では、ＰＤ−１結合アンタゴニストは、抗ＰＤ−１抗体である。特定の態様では、ＰＤ−１結合アンタゴニストは、本明細書において記載されるＭＤＸ−１１０６である。別の特定の態様では、ＰＤ−１結合アンタゴニストは、本明細書において記載されるＭｅｒｃｋ３７４５である。別の特定の態様では、ＰＤ−１結合アンタゴニストは、本明細書において記載されるＣＴ−０１１である。
【０１０３】
用語「ＰＤ−Ｌ１結合アンタゴニスト」とは、ＰＤ−Ｌ１の、ＰＤ−１、Ｂ７−１などのその結合パートナーのいずれか１種又は複数との相互作用に起因するシグナル伝達を低減する、ブロックする、阻害する、無効にする又は干渉する分子である。いくつかの実施態様では、ＰＤ−Ｌ１結合アンタゴニストは、ＰＤ−Ｌ１の、その結合パートナーとの結合を阻害する分子である。特定の態様では、ＰＤ−Ｌ１結合アンタゴニストは、ＰＤ−Ｌ１の、ＰＤ−１及び／又はＢ７−１との結合を阻害する。いくつかの実施態様では、ＰＤ−Ｌ１結合アンタゴニストは、ＰＤ−Ｌ１の、ＰＤ−１、Ｂ７−１などの１種又は複数のその結合パートナーとの相互作用に起因するシグナル伝達を低減する、ブロックする、阻害する、無効にする又は干渉する、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、その抗原結合断片、イムノアドヘシン、融合タンパク質、オリゴペプチド及びその他の分子を含む。一実施態様では、ＰＤ−Ｌ１結合アンタゴニストは、ＰＤ−Ｌ１を介した、Ｔリンパ球上で発現される細胞表面タンパク質媒介性シグナル伝達によって媒介される、又はそれによる負の共刺激シグナルを低減して、機能障害性Ｔ細胞を、あまり機能障害性ではないようにする（例えば、抗原認識に対するエフェクター応答を増強する）。いくつかの実施態様では、ＰＤ−Ｌ１結合アンタゴニストは、抗ＰＤ−Ｌ１抗体であり。特定の態様では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、本明細書において記載されるＹＷ２４３．５５．Ｓ７０である。別の特定の態様では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、本明細書において記載されるＭＤＸ−１１０５である。さらに別の特定の態様では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、本明細書において記載されるＭＰＤＬ３２８０Ａである。
【０１０４】
用語「ＰＤ−Ｌ２結合アンタゴニスト」は、ＰＤ−Ｌ２の、ＰＤ−１などのその結合パートナーのいずれか１種又は複数との相互作用に起因するシグナル伝達を低減する、ブロックする、阻害する、無効にする又は干渉する分子である。いくつかの実施態様では、ＰＤ−Ｌ２結合アンタゴニストは、ＰＤ−Ｌ２の、その結合パートナーとの結合を阻害する分子である。特定の態様では、ＰＤ−Ｌ２結合アンタゴニストは、ＰＤ−Ｌ２のＰＤ−１との結合を阻害する。いくつかの実施態様では、ＰＤ−Ｌ２アンタゴニストは、ＰＤ−Ｌ２の、ＰＤ−１などのその結合パートナーのいずれか１種又は複数との相互作用に起因するシグナル伝達を低減する、ブロックする、阻害する、無効にする又は干渉する、抗ＰＤ−Ｌ２抗体、その抗原結合断片、イムノアドヘシン、融合タンパク質、オリゴペプチド及びその他の分子を含む。一実施態様では、ＰＤ−Ｌ２結合アンタゴニストは、ＰＤ−Ｌ２を介した、Ｔリンパ球上で発現される細胞表面タンパク質媒介性シグナル伝達によって媒介される、又はそれによる負の共刺激シグナルを低減して、機能障害性Ｔ細胞を、あまり機能障害性ではないようにする（例えば、抗原認識に対するエフェクター応答を増強する）。いくつかの実施態様では、ＰＤ−Ｌ２結合アンタゴニストは、イムノアドヘシンである。
【０１０５】
「ＰＤ−１オリゴペプチド」「ＰＤ−Ｌ１オリゴペプチド」又は「ＰＤ−Ｌ２オリゴペプチド」は、本明細書において記載されるような、それぞれ、受容体、リガンド又はシグナル伝達成分を含む、それぞれ、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１又はＰＤ−Ｌ２負の共刺激ポリペプチドと、好ましくは、特異的に結合するオリゴペプチドである。このようなオリゴペプチドは、既知オリゴペプチド合成方法を使用して化学的に合成され得、又は組換え技術を使用して調製及び精製され得る。このようなオリゴペプチドは、普通、少なくとも約５個のアミノ酸長、あるいは、少なくとも約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００個のアミノ酸長又はそれ超である。このようなオリゴペプチドは、周知の技術を使用して同定され得る。この関連で、ポリペプチド標的と特異的に結合可能なオリゴペプチドについてオリゴペプチドライブラリーをスクリーニングするための技術は、当該技術分野で周知であるということは知られている（例えば、米国特許第５５５６７６２号、同５７５０３７３号、同４７０８８７１号、同４８３３０９２号、同５２２３４０９号、同５４０３４８４号、同５５７１６８９号、同５６６３１４３号；ＰＣＴ公開番号国際公開第８４／０３５０６号及び国際公開第８４／０３５６４号；Geysen等、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、81:3998-4002（1984）；Geysen等、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、82:178-182（1985）；Geysen等、in Synthetic Peptides as Anrigens、130-149（1986）；Geysen等、J. Immunol. Metk、102:259-274（1987）;Schoofs等、J. Immunol.、140:611-616（1988）、Cwirla,S. E.等、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、87:6378（1990）；Lowman,H.B.等、Biochemistry、30:10832（1991）;Clackson,T.等 Nature、352:624（1991）；Marks,J. D.等、J. Mol. Biol.、222:581（1991）；Kang,A.S.等 Proc. Natl. Acad. Sci. USA、88:8363（1991）、及びSmith,G. P.、Current Opin. Biotechnol、2:668（1991）を参照のこと）。
【０１０６】
用語「アネルギー」とは、Ｔ細胞受容体を介して送達される不完全な又は不十分なシグナルに起因する抗原刺激に対して不応答の状態を指す（例えば、ｒａｓ−活性化の非存在下での細胞内Ｃａ＋２の増大）。Ｔ細胞アネルギーはまた、抗原での刺激の際に、共刺激の不在をもたらし得、その結果、細胞が、共刺激との関連においてでさえ、抗原によるその後の活性化に対して不応性になった。不応答状態は、インターロイキン−２の存在によって乗り越えられ得ることが多い。アネルギー性Ｔ細胞は、クローン増殖を起こさない、及び／又はエフェクター機能を獲得しない。
【０１０７】
用語「消耗」とは、多数の慢性感染症及びがんの際に起こる持続性ＴＣＲシグナル伝達から生じるＴ細胞機能障害の状態としてのＴ細胞消耗を指す。不完全な又は欠損したシグナル伝達によってではなく、持続したシグナル伝達によって起こるという点でアネルギーとは区別される。不十分なエフェクター機能、阻害性受容体の持続した発現及び機能的エフェクター又は記憶Ｔ細胞のものとは異なる転写状態によって定義される。消耗は、感染及び腫瘍の最適制御を阻止する。消耗は、外因性の負の調節経路（例えば、免疫調節サイトカイン）並びに細胞固有の負の調節（共刺激）経路（ＰＤ−１、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４など）の両方に起因し得る。
【０１０８】
「Ｔ細胞機能の増強」とは、持続した、若しくは増幅した生物学的機能を有するようにＴ細胞を誘導する、引き起こす、若しくは刺激すること、又は消耗した、若しくは不活性のＴ細胞を再生若しくは再活性化することを意味する。Ｔ細胞機能の増強の例として、介入前のこのようなレベルと比べた、ＣＤ８＋Ｔ細胞からのγ−インターフェロンの分泌の増大、増殖の増大、抗原応答性（例えば、ウイルス、病原体又は腫瘍クリアランス）の増大が挙げられる。一実施態様では、増強のレベルは、少なくとも５０％、あるいは、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２０％、１５０％、２００％である。この増強を測定する方法は、当業者に公知である。
【０１０９】
「腫瘍免疫」とは、腫瘍が、免疫認識及びクリアランスを逃れるプロセスを指す。したがって、治療概念として、腫瘍免疫は、このような回避が減弱され、腫瘍が、免疫系によって認識され、攻撃される場合に「治療される」。腫瘍認識の例として、腫瘍結合、腫瘍縮小及び腫瘍クリアランスが挙げられる。［００４６］「免疫原性」とは、特定の物質の免疫応答を誘発する能力を指す。腫瘍は、免疫原性であり、腫瘍免疫原性の増強は、免疫応答による腫瘍細胞のクリアランスに役立つ。腫瘍免疫原性の増強の例として、抗ＰＤＬ抗体及びＭＥ阻害剤を用いる治療が挙げられる。
【０１１０】
「持続した応答」とは、治療の休止後の、腫瘍増殖の低減に対する持続した効果を指す。例えば、腫瘍の大きさは、投与相の開始時の大きさと比べて、同一又は同様のままであり得る。いくつかの実施態様では、持続した応答は、治療期間と少なくとも同一の期間、治療期間の少なくとも１．５Ｘ、２．０Ｘ、２．５Ｘ又は３．０Ｘの長さを有する。
【０１１１】
本明細書において、用語「線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）」とは、別途指示がない限り、霊長類（例えば、ヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含む、任意の脊椎動物供給源に由来する任意の天然ＦＡＰを指す。この用語は、「全長の」、プロセシングされていないＦＡＰ並びに細胞におけるプロセシングに起因するＦＡＰの任意の形態を包含する。この用語はまた、ＦＡＰの天然に存在する変異体、例えば、スプライスバリアント又は対立遺伝子変異体も包含する。好ましくは、本発明の抗ＦＡＰ抗体は、ＦＡＰの細胞外ドメインと結合する。ヒトＦＡＰの配列を含む、例示的ＦＡＰポリペプチド配列のアミノ酸配列は、国際公開第２０１２／０２０００６号に開示されている。
【０１１２】
本明細書において、「治療」（及び「治療する」又は「治療している」などのその文法的変異）とは、治療されている個体の自然経過を変更しようとする臨床的介入を指し、予防のために、又は臨床病理の経過の間に実施され得る。治療の望ましい効果として、それだけには限らないが、疾患の発生又は再発を阻止すること、症候の緩和、疾患の直接的又は間接的病理学的帰結の減少、転移の阻止、疾患進行の速度の減少、病態の改善又は緩和及び寛解又は予後の改善が挙げられる。いくつかの実施態様では、本発明の抗体は、疾患の発生を遅延するために、又は疾患の進行を減速するために使用される。
【０１１３】
本明細書において、用語がんとは、がんなどの増殖性疾患を指し、結腸直腸がん、肉腫、頭頸部がん、扁平上皮癌、乳がん、膵臓がん、胃がん、非小細胞肺癌、小細胞肺がん及び中皮腫があり、上記のがんのいずれかの難治性型又は上記のがんのうち１種若しくは複数の組合せを含む。一実施態様では、がんは、結腸直腸がんであり、任意選択的に、化学療法剤は、イリノテカンである。がんが肉腫である実施態様では、任意選択的に、肉腫は、軟骨肉腫、平滑筋肉腫、消化管間質性腫瘍、線維肉腫、骨肉腫、脂肪肉腫又は悪性線維性組織球腫である。
【０１１４】
用語「可変領域」又は「可変ドメイン」とは、抗体の抗原との結合に関与している抗体重鎖又は軽鎖のドメインを指す。天然抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれ、ＶＨ及びＶＬ）は、一般に、同様の構造を有し、各ドメインは、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）及び３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む（例えば、Kindt等、Kuby Immunology、第6版、W.H. Freeman and Co.、p.91（2007）を参照のこと）。単一のＶＨ又はＶＬドメインは、抗原結合特異性を付与するのに十分であり得る。さらに、特定の抗原と結合する抗体を、抗原と結合する抗体に由来するＶＨ又はＶＬドメインを使用して単離して、それぞれ、相補的ＶＬ又はＶＨドメインのライブラリーをスクリーニングすることができる。例えば、Ｐｏｒｔｏｌａｎｏ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：８８０−８８７（１９９３）；Ｃｌａｒｋｓｏｎ等、Ｎａｔｕｒｅ３５２：６２４−６２８（１９９１）を参照のこと。
【０１１５】
本明細書において、用語「抗原結合分子」とは、広い意味で、抗原決定基と特異的に結合する分子を指す。抗原結合分子の例として、免疫グロブリン及びその誘導体、例えば、断片がある。
【０１１６】
本明細書において使用される場合、用語「抗体の抗原結合部位」とは、抗原結合に関与している抗体のアミノ酸残基を指す。抗体の抗原結合部分は、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」に由来するアミノ酸残基を含む。「フレームワーク」又は「ＦＲ」領域は、本明細書において定義されるような超可変領域残基以外の可変ドメイン領域である。したがって、抗体の軽鎖及び重鎖可変ドメインは、Ｎ末端からＣ末端に、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４を含む。特に、重鎖のＣＤＲ３は、抗原結合に最も寄与し、抗体の特性を規定する領域である。ＣＤＲ及びＦＲ領域は、Ｋａｂａｔ等、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１）の標準定義及び／又は「超可変ループ」に由来する残基に従って決定される。
【０１１７】
抗体特異性とは、抗原の特定のエピトープに対する抗体の選択的認識を指す。自然抗体、例えば、単一特異性である。本発明の「二重特異性抗体」は、２種の異なる抗原結合特異性を有する抗体である。本発明の抗体は、２種の異なる抗原、すなわち、第１の抗原としてのＤＲ５及び第２の抗原としてのＦＡＰに対して特異的である。
【０１１８】
本明細書において、用語「単一特異性」抗体は、各々が、同一抗原の同一エピトープと結合する１つ又は複数の結合部位を有する抗体を意味する。
【０１１９】
用語「二重特異性」とは、抗原結合分子が、少なくとも２種の異なる抗原決定基と特異的に結合できることを意味する。通常、二重特異性抗原結合分子は、各々が、異なる抗原決定基に対して特異的である、少なくとも２種の抗原結合部位を含む。特定の実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、２種の抗原決定基と、特に、２種の異なる細胞上に発現された２種の抗原決定基と同時に結合可能である。
【０１２０】
本明細書において提供される抗体は、多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも２種の異なる部位に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。ＦＡＰ及びＤＲ５に対して結合特異性を有する二重特異性抗体が、本明細書において提供される。特定の実施態様では、二重特異性抗体は、ＤＲ５の２種の異なるエピトープと結合し得る。二重特異性抗体を使用して、細胞傷害性剤を、ＤＲ５を発現する細胞に局在化させることもできる。二重特異性抗体は、全長抗体又は抗体断片として調製され得る。
【０１２１】
多重特異性抗体を作製するための技術として、それだけには限らないが、異なる特異性を有する２種の免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の組換え共発現（Milstein及びCuello、Nature305: 537（1983）、国際公開第９３／０８８２９号及びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ等、ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：３６５５（１９９１））及び「ノブ−イン−ホール（knob-in-hole）」工学的操作（例えば、米国特許第５７３１１６８号を参照のこと）が挙げられる。多重特異性抗体はまた、抗体Ｆｃ−ヘテロ二量体分子を作製するために静電ステアリング効果を工学的に操作すること（国際公開第２００９／０８９００４号）；２種以上の抗体又は断片を架橋すること（例えば、米国特許第４６７６９８０号及びBrennan等、Science、229:81（1985））；二重特異性抗体を製造するためにロイシンジッパーを使用すること（例えば、Kostelny等、J. Immunol.、148（5）:1547-1553（1992））；二重特異性抗体断片を作製するために「ダイアボディー」技術を使用すること（例えば、Hollinger等、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、90:6444-6448（1993）を参照のこと）；及び単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーを使用すること（例えば、Gruber等、J. Immunol.、152:5368（1994）を参照のこと）；及び例えば、Ｔｕｔｔ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）に記載されるような三重特異性抗体を調製することによって作製できる。
【０１２２】
「オクトパス抗体」を含む、３つ以上の機能的抗原結合部位を有する工学的に操作された抗体も、本明細書に含まれる（例えば、米国特許出願公開第２００６／００２５５７６Ａ１号を参照のこと）。
【０１２３】
本明細書における抗体又は断片はまた、ＦＡＰ又はＤＲ５並びに別の異なる抗原と結合する少なくとも１つの抗原結合部位を含む「二重作用性ＦＡｂ」又は「ＤＡＦ」を含む（例えば、米国特許第２００８／００６９８２０号を参照のこと）。
【０１２４】
本出願内で使用されるような用語「結合価」とは、抗体分子中の特定の数の結合部位の存在を意味する。そのようなものとして、用語「二価」、「四価」及び「六価」とは、抗体分子中の、それぞれ、２つの結合部位、４つの結合部位及び６つの結合部位の存在を意味する。本発明の二重特異性抗体は、少なくとも「二価」であり、「三価」又は「多価」（例えば、「四価」又は「六価」）である場合もある。
【０１２５】
本発明の抗体は、２つ以上の結合部位を有し、二重特異性である、すなわち、抗体は、３つ以上の結合部位がある（すなわち、抗体は、三価又は多価である）場合でさえ、二重特異性であり得る。本発明の二重特異性抗体として、例えば、多価一本鎖抗体、ダイアボディー及びトリアボディー並びにさらなる抗原結合部位（例えば、一本鎖Ｆｖ、ＶＨドメイン及び／又はＶＬドメイン、Ｆａｂ又は（Ｆａｂ）２）が、１つ又は複数のペプチドリンカーを介して連結している全長抗体の定常ドメイン構造を有する抗体が挙げられる。抗体は、単一種に由来する全長得あり得るか、又はキメラ化若しくはヒト化され得る。
【０１２６】
本明細書において、用語「ベクター」とは、連結している別の核酸を増殖可能である核酸分子を指す。この用語は、自己複製性核酸構造としてのベクター並びに導入されている宿主細胞のゲノム中に組み込まれたベクターを含む。特定のベクターは、作動可能に連結されている核酸の発現を指示可能である。このようなベクターは、本明細書において、「発現ベクター」と呼ばれる。
【０１２７】
本出願内で使用される、用語「アミノ酸」とは、アラニン（三文字コード：ａｌａ、一文字コード：Ａ）、アルギニン（ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（ａｓｐ、Ｄ）、システイン（ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（ｌｅｕ、Ｌ）、リジン（ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（ｓｅｒ、Ｓ）、スレオニン（ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（ｔｙｒ、Ｙ）及びバリン（ｖａｌ、Ｖ）を含む天然に存在するカルボキシα−アミノ酸の群を意味する。
【０１２８】
本明細書において、表現「細胞」、「細胞株」及び「細胞培養物」は、同義的に使用され、すべてのこのような指定は、子孫を含む。したがって、単語「トランスフェクタント」及び「トランスフェクトされた細胞」は、一次対象細胞及び移動数に関わらず、それに由来する培養物を含む。すべての子孫が、計画的な又は偶発性の突然変異のためにＤＮＡコンテントにおいて正確に同一ではない場合もあるということも理解される。元の形質転換細胞においてスクリーニングされたものと同一の機能又は生物活性を有する変異体子孫が含まれる。
【０１２９】
「親和性」とは、分子（例えば、抗体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）間の非共有結合相互作用の総計の強度を指す。特に断りのない限り、本明細書において、「結合親和性」とは、結合対のメンバー（例えば、抗体及び抗原）間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、一般に、解離定数（Ｋｄ）によって表され得る。親和性は、本明細書において記載されるものを含む、当該技術分野で公知の一般的な方法によって測定され得る。結合親和性を測定するための特定の説明的及び例示的実施態様を以下に記載する。
【０１３０】
本明細書において、用語「結合」又は「特異的結合とは、ｉｎ−ｖｉｔｒｏアッセイにおける、好ましくは、表面プラズモン共鳴アッセイ（ＳＰＲ、ＢＩＡｃｏｒｅ、ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）における抗体の抗原のエピトープとの結合を指す。結合の親和性は、用語ｋａ（抗体／抗原複合体に由来する抗体の会合の速度定数）、ｋＤ（解離定数）及びＫＤ（ｋＤ／ｋａ）によって定義される。結合又は特異的結合は、１０−８ｍｏｌ／ｌ以下、好ましくは、１０−９Ｍ−１０−１３ｍｏｌ／ｌの結合親和性（ＫＤ）を意味する。
【０１３１】
デスレセプターに対する抗体の結合は、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイ（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）によって調べることができる。結合の親和性は、用語ｋａ（抗体／抗原複合体に由来する抗体の会合の速度定数）、ｋＤ（解離定数）及びＫＤ（ｋＤ／ｋａ）によって定義される。
【０１３２】
「結合の低減」、例えば、Ｆｃ受容体との結合の低減とは、例えば、ＳＰＲによって測定されるようなそれぞれの相互作用の親和性の減少を指す。明確にするために、この用語は、親和性のゼロ（又は分析法の検出限界未満）への低減、すなわち、相互作用の完全な消失を含む。逆に、「結合の増大」とは、それぞれの相互作用の結合親和性の増大を指す。
【０１３３】
「Ｔ細胞活性化」とは、本明細書において、増殖、分化、サイトカイン分泌、細胞傷害性エフェクター分子放出、細胞傷害活性及び活性化マーカーの発現から選択される、Ｔリンパ球、特に、細胞傷害性Ｔリンパ球の１種又は複数の細胞応答を指す。本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、Ｔ細胞活性化を誘導可能である。Ｔ細胞活性化を測定するための適したアッセイは、本明細書において記載される当該技術分野で公知である。
【０１３４】
「標的細胞抗原」とは、本明細書において、標的細胞、例えば、がん細胞などの腫瘍中の細胞又は細胞間質の細胞の表面に提示される抗原決定基を指す。特に、「標的細胞抗原」とは、葉酸受容体１を指す。
【０１３５】
本明細書において、抗原結合部分などに関して用語「第１の」及び「第２の」とは、２以上の各種類の部分がある場合に区別するのに都合がよいために使用される。これらの用語の使用は、明確にそのように示されない限り、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の特定の順序又は配向を付与することを意図しない。
【０１３６】
用語「エピトープ」は、抗体と特異的に結合可能な任意のポリペプチド決定基を含む。特定の実施態様では、エピトープ決定基は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル又はスルホニルなどの分子の化学的に活性な表面基（surface grouping）を含み、特定の実施態様では、特定の３次元構造特徴及び又は特定の荷電特徴を有し得る。エピトープは、抗体が結合する抗原の領域である。
【０１３７】
本明細書において、用語「抗原決定基」は、「抗原」及び「エピトープ」と同義であり、抗原結合部分が結合し、抗原結合部分−抗原複合体を形成する、ポリペプチド高分子上の部位（例えば、アミノ酸の近接するストレッチ又は近接していないアミノ酸の異なる領域で構成されているコンホメーション立体配置）を指す。有用な抗原決定基は、例えば、腫瘍細胞の表面上に、ウイルス感染細胞の表面上に、その他の罹患細胞の表面上に、免疫細胞の表面上に見出すことができ、血液血清中、及び／又は細胞外マトリックス（ＥＣＭ）中には含まれない。本明細書において抗原と呼ばれるタンパク質、例えば、ＦｏｌＲ１及びＣＤ３は、別途指示がない限り、霊長類（例えば、ヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含む、任意の脊椎動物供給源に由来するタンパク質の任意の天然形態であり得る。特定の実施態様では、抗原は、ヒトタンパク質である。本明細書において特定のタンパク質が言及される場合には、この用語は、「全長」、プロセシングされていないタンパク質並びに細胞におけるプロセシングに由来するタンパク質の任意の形態を包含する。この用語はまた、タンパク質の天然に存在する変異体、例えば、スプライスバリアント又は対立遺伝子変異体も包含する。抗原として有用である例示的ヒトタンパク質として、それだけには限らないが、ＦｏｌＲ１（葉酸受容体アルファ（ＦＲＡ）；葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）；ヒトＦｏｌＲ１  ＵｎｉＰｒｏｔ番号：Ｐ１５３２８；マウスＦｏｌＲ１  ＵｎｉＰｒｏｔ番号：Ｐ３５８４６；カニクイザルＦｏｌＲ１  ＵｎｉＰｒｏｔ番号：Ｇ７ＰＲ１４）及びＣＤ３、特に、ＣＤ３のエプシロンサブユニット（ヒト配列の、ＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｐ０７７６６（バージョン１３０）、ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ番号ＮＰ＿０００７２４．１、配列番号１５０；又はカニクイザル［カニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）］配列の、ＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｑ９５ＬＩ５（バージョン４９）、ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋ番号ＢＡＢ７１８４９．１を参照のこと）が挙げられる。本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、ＣＤ３のエピトープ又はＣＤ３の間で保存されている標的細胞抗原又は異なる種に由来する標的抗原と結合する。特定の実施態様では、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、ＣＤ３及びＦｏｌＲ１と結合するが、ＦｏｌＲ２（葉酸受容体ベータ；ＦＲＢ；ヒトＦｏｌＲ２  ＵｎｉＰｒｏｔ番号：Ｐ１４２０７）又はＦｏｌＲ３（葉酸受容体ガンマ；ヒトＦｏｌＲ３  ＵｎｉＰｒｏｔ番号：Ｐ４１４３９）とは結合しない。
【０１３８】
本明細書において、用語「工学的に操作する（engineer）」、「工学的に操作された（engineered）」「工学的操作（engineering）」は、特に、接頭辞「グリコ」とともに、並びに用語「グリコシル化の工学的操作」は、天然に存在するポリペプチド又は組換えポリペプチド又はその断片のグリコシル化パターンの任意の操作を含むと考えられる。グリコシル化の工学的操作は、細胞において発現される糖タンパク質のグリコシル化の変更を達成するオリゴ糖合成経路の遺伝的操作を含む、細胞のグリコシル化機構の代謝工学的操作を含む。さらに、グリコシル化の工学的操作は、グリコシル化に対する突然変異及び細胞環境の効果を含む。一実施態様では、グリコシル化の工学的操作は、グリコシルトランスフェラーゼ活性の改変である。特定の実施態様では、工学的操作は、グルコサミニルトランスフェラーゼ活性及び／又はフコシルトランスフェラーゼ活性の変更をもたらす。
【０１３９】
ＩＩ．組成物及び方法
一態様では、本発明は、例えば、がんの治療のための、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子、例えば、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）に特異的な第１の抗原結合部位と、ＣＤ３に特異的な第２の抗原結合部位を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子及びＰＤ−１軸結合アンタゴニストの治療的組合せの使用に基づいている。いくつかの実施態様では、治療的組合せは、ＴＩＭ３アンタゴニストをさらに含む。
【０１４０】
Ａ．Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子及びＰＤ−１軸結合アンタゴニストの併用療法
広く、本発明は、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子及びＰＤ−１軸結合アンタゴニストと組み合わせたその使用に関する。単剤療法を上回る組合せの利点は、本発明において使用されるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、Ｔ細胞を、標的とされる細胞へ再指向させ、活性化することが可能であり、一方で、ＰＤ−１軸結合アンタゴニストは、Ｔ細胞消耗の低減によってＴ細胞機能を増強するということである。
【０１４１】
一態様では、個体に、有効量のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子、例えば、ＦｏｌＲ１−ＴＣＢ及びＰＤ−１軸結合アンタゴニストを投与することを含む、個体においてがんの進行を治療及び遅延するための方法が、本明細書において提供される。いくつかの実施態様では、治療は、治療の休止後に、個体において持続した応答をもたらす。本発明の方法は、がんの治療のために、腫瘍免疫原性を増大することなどの免疫原性の増強が望まれる治療状態において使用できる。それだけには限らないがＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異を含有し得るがん、ＢＲＡＦ野生型を含有し得るがん、ＫＲＡＳ野生型を含有し得るがん又は活性化ＫＲＡＳ突然変異を含有し得るがんを含む種々のがんが、治療され得るか、又はその進行が遅延され得る。
【０１４２】
いくつかの実施態様では、個体は、子宮内膜がんを有する。子宮内膜がんは、早期段階である場合も、後期状態である場合もある。いくつかの実施態様では、個体は、メラノーマを有する。メラノーマは、早期段階である場合も後期段階である場合もある。いくつかの実施態様では、個体は、結腸直腸がんを有する。結腸直腸がんは、早期段階である場合も後期段階である場合もある。いくつかの実施態様では、個体は、肺がん、例えば、非小細胞肺がんを有する。非小細胞肺がんは、早期段階である場合も後期段階である場合もある。いくつかの実施態様では、個体は、膵臓がんを有する。膵臓がんは、早期段階である場合も、後期状態である場合もある。いくつかの実施態様では、個体は、血液悪性腫瘍を有する。血液悪性腫瘍は、早期段階である場合も後期段階である場合もある。いくつかの実施態様では、個体は、卵巣がんを有する。卵巣がんは、早期段階である場合も後期段階である場合もある。いくつかの実施態様では、個体は、乳がんを有する。乳がんは、早期段階である場合も後期段階である場合もある。いくつかの実施態様では、個体は、腎細胞癌を有する。腎細胞癌は、早期段階である場合も後期段階である場合もある。
【０１４３】
いくつかの実施態様では、個体は、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト及びサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物である。いくつかの実施態様では、治療される個体は、ヒトである。
【０１４４】
別の態様では、有効量のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子、具体的には、ＦｏｌＲ１−ＴＣＢ及びＰＤ−１軸結合アンタゴニストを投与することを含む、がんを有する個体において免疫機能を増強する方法が本明細書において提供される。
【０１４５】
いくつかの実施態様では、個体においてＴ細胞は、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子及びＰＤ−１経路アンタゴニストの投与の前と比べて、プライミング、活性化、増殖及び／又はエフェクター機能を増強した。いくつかの実施態様では、Ｔ細胞エフェクター機能は、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αのうち少なくとも１種の分泌である。一実施態様では、ＦｏｌＲ１−ＴＣＢ及び抗ＰＤＬ−１抗体の投与は、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αのＴ細胞分泌の増大をもたらす。いくつかの実施態様では、Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞である。いくつかの実施態様では、Ｔ細胞プライミングは、ＣＤ８Ｔ細胞におけるＣＤ４４発現の上昇及び／又は細胞溶解活性の増強によって特徴を明らかにする。いくつかの実施態様では、ＣＤ８Ｔ細胞活性化は、γ−ＩＦＴ＾Ｔ  ＣＤ８Ｔ細胞の頻度の上昇によって特徴を明らかにする。いくつかの実施態様では、ＣＤ８Ｔ細胞は、抗原特異的Ｔ細胞である。いくつかの実施態様では、ＰＤ−Ｌ１表面発現を介したシグナル伝達による免疫回避は、阻害される。いくつかの実施態様では、がんは、Ｔ細胞浸潤レベルが上昇した。
【０１４６】
いくつかの実施態様では、本発明の併用療法は、ＦｏｌＲ１−ＴＣＢ及びＰＤ−１軸結合アンタゴニストの投与を含む。ＦｏｌＲ１−ＴＣＢ及びＰＤ−１軸結合アンタゴニストは、当該技術分野で公知の任意の適した方法で投与され得る。例えば、ＦｏｌＲ１−ＴＣＢ及びＰＤ−１軸結合アンタゴニストは、逐次（異なる時間で）又は同時に（同一の時間で）投与され得る。いくつかの実施態様では、ＦｏｌＲ１−ＴＣＢは、連続的に投与される。いくつかの実施態様では、ＦｏｌＲ１−ＴＣＢは、断続的に投与される。いくつかの実施態様では、ＦｏｌＲ１−ＴＣＢは、ＰＤ−１軸結合アンタゴニストの投与の前に投与される。いくつかの実施態様では、ＦｏｌＲ１−ＴＣＢは、ＰＤ−１軸結合アンタゴニストの投与と同時に投与される。いくつかの実施態様では、ＦｏｌＲ１−ＴＣＢは、ＰＤ−１軸結合アンタゴニストの投与後に投与される。
【０１４７】
いくつかの実施態様では、個体に、有効量のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子、例えば、ＦｏｌＲ１−ＴＣＢ及びＰＤ−１軸結合アンタゴニストを投与することを含み、さらなる療法を投与することをさらに含む、個体においてがんの進行を治療又は遅延するための方法が提供される。具体的には、さらなる療法が、ＴＩＭ−３アンタゴニストを含む実施態様が考慮される。したがって、一態様では、個体に、有効量のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子、具体的には、ＦｏｌＲ１−ＴＣＢ、ＰＤ−１軸結合アンタゴニスト及びＴＩＭ−３アンタゴニストを投与することを含む、個体においてがんの進行を治療又は遅延するための方法が本明細書において提供される。任意のＴＩＭ３アンタゴニスト、例えば、本明細書において記載されるものが使用され得る。さらなる療法はまた、放射線療法、手術（例えば、腫瘍摘出手術及び乳房切除術）、化学療法、遺伝子療法、ＤＮＡ療法、ウイルス療法、ＲＡ療法、免疫療法、骨髄移植、ナノ治療、モノクローナル抗体療法又は前記のものの組合せであり得る。さらなる療法は、アジュバント又はネオアジュバント療法の形態であり得る。いくつかの実施態様では、さらなる療法は、小分子酵素阻害剤又は抗転移剤の投与である。いくつかの実施態様では、さらなる療法は、副作用制限剤（例えば、嘔吐抑制剤などといった、治療の副作用の出現及び／又は重症度を和らげるように意図される薬剤）の投与である。いくつかの実施態様では、さらなる療法は、放射線療法である。いくつかの実施態様では、さらなる療法は、手術である。いくつかの実施態様では、さらなる療法は、放射線療法及び手術の組合せである。いくつかの実施態様では、さらなる療法は、ガンマ照射である。いくつかの実施態様では、さらなる療法は、Ｐ１３Ｋ／Ａ  Ｔ／ｍＴＯＲ経路を標的とする療法、ＨＳＰ９０阻害剤、チュブリン阻害剤、アポトーシス阻害剤及び／又は化学防御剤である。さらなる療法は、本明細書において先に記載された化学療法剤のうち１種又は複数であり得る。
【０１４８】
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子、例えば、ＦｏｌＲ１−ＴＣＢ及びＰＤ−１軸結合アンタゴニストは、同一投与経路によって投与されても、異なる投与経路によって投与されてもよい。いくつかの実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子、例えば、ＦｏｌＲ１−ＴＣＢは、静脈内に、筋肉内に、皮下に、局所的に、経口的に、経皮的に、腹腔内に、眼窩内に、移植によって、吸入によって、髄腔内に、脳室内に又は鼻腔内に投与される。いくつかの実施態様では、ＰＤ−１軸結合アンタゴニストは、静脈内に、筋肉内に、皮下に、局所的に、経口的に、経皮的に、腹腔内に、眼窩内に、移植によって、吸入によって、髄腔内に、脳室内に又は鼻腔内に投与される。有効量のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子及びＰＤ−１軸結合アンタゴニストは、疾患の阻止又は治療のために投与され得る。Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子及び／又はＰＤ−１軸結合アンタゴニストの適当な投与量は、治療されるべき疾患の種類、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子及びＰＤ−１軸結合アンタゴニストの種類、疾患の重症度及び経過、個体の臨床状態、個体の病歴及び治療に対する応答並びに主治医の裁量に基づいて決定され得る。
【０１４９】
当該技術分野で公知であるか、又は以下に記載されるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子、ＰＤ−１軸結合アンタゴニスト及びＴＩＭ−３アンタゴニストのいずれも、本方法において使用され得る。
【０１５０】
さらなる態様において、本発明は、本明細書において記載されるようなＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子、本明細書において記載されるようなＰＤ−１軸結合アンタゴニスト及び薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物を提供する。いくつかの実施態様では、薬学的組成物は、ＴＩＭ３アンタゴニストをさらに含む。
【０１５１】
さらなる態様において、本発明は、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）及びＣＤ３に特異的なＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子並びにＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子をＰＤ−１軸結合アンタゴニストとともに使用して、個体においてがんの進行を治療又は遅延するための使用説明書を含む添付文書を含むキットを提供する。いくつかの実施態様では、キットは、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を、ＴＩＭ３アンタゴニストとともに使用するための使用説明書をさらに含む。
【０１５２】
さらなる態様において、本発明は、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）及びＣＤ３に特異的なＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子並びにＰＤ−１軸結合アンタゴニストと、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子及びＰＤ−１軸結合アンタゴニストを使用して、個体においてがんの進行を治療又は遅延するための使用説明書を含む添付文書とを含むキットを提供する。一実施態様では、キットは、ＴＩＭ３アンタゴニストをさらに含む。実施態様の１つでは、ＰＤ−１軸結合アンタゴニストは、抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤＬ−１抗体である。一実施態様では、ＰＤ−１軸結合アンタゴニストは、抗ＰＤ−１イムノアドヘシンである。
【０１５３】
さらなる態様において、本発明は、
（ｉ）本明細書において記載されるような葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）及びＣＤ３に特異的なＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を含む組成物を含む第１の容器と、
（ｉｉ）ＰＤ−１軸結合アンタゴニストを含む組成物を含む第２の容器と
を含むキットを提供する。
【０１５４】
さらなる態様において、本発明は、
（ｉ）本明細書において記載されるような葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）及びＣＤ３に特異的なＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を含む組成物を含む第１の容器と、
（ｉｉ）ＰＤ−１軸結合アンタゴニストを含む組成物を含む第２の容器と、
（ｉｉｉ）ＴＩＭ３アンタゴニストを含む組成物を含む第３の容器と
を含むキットを提供する。
【０１５５】
Ｂ．本発明において使用するための例示的Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子
本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、二重特異性である、すなわち、２種の異なる抗原決定基と、すなわち、ＣＤ３及びＦｏｌＲ１と特異的に結合可能な少なくとも２種の抗原結合部分を含む。本発明によれば、抗原結合部分は、Ｆａｂ分子（すなわち、重鎖及び軽鎖からなり、各々、可変領域及び定常領域を含む抗原結合ドメイン）である。一実施態様では、前記Ｆａｂ分子は、ヒトである。別の実施態様では、前記Ｆａｂ分子は、ヒト化である。さらに別の実施態様では、前記Ｆａｂ分子は、ヒト重鎖及び軽鎖定常領域を含む。
【０１５６】
本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、標的細胞抗原ＦｏｌＲ１及びＣＤ３と同時結合可能である。一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、標的細胞抗原ＦｏｌＲ１及びＣＤ３との同時結合によってＴ細胞及びＦｏｌＲ１発現標的細胞を架橋可能である。なおより特定の実施態様では、このような同時結合は、ＦｏｌＲ１発現標的細胞、特に、ＦｏｌＲ１発現腫瘍細胞の溶解をもたらす。一実施態様では、このような同時結合は、Ｔ細胞の活性化をもたらす。その他の実施態様では、このような同時結合は、増殖、分化、サイトカイン分泌、細胞傷害性エフェクター分子放出、細胞傷害活性及び活性化マーカーの発現の群から選択される、Ｔリンパ球、特に、細胞傷害性Ｔリンパ球の細胞応答をもたらす。一実施態様では、標的細胞抗原ＦｏｌＲ１との同時結合を伴わない、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＣＤ３との結合は、Ｔ細胞活性化をもたらさない。
【０１５７】
一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、Ｔ細胞の細胞傷害活性を、ＦｏｌＲ１発現標的細胞へ再指向させることが可能である。特定の実施態様では、前記の再指向は、標的細胞によるＭＨＣ媒介性ペプチド抗原提示及び／又はＴ細胞の特異性に依存しない。
【０１５８】
特に、本発明のいくつかの実施態様のＴ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞である。いくつかの実施態様では、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞、特に、ＣＤ８＋Ｔ細胞である。
【０１５９】
本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、ＣＤ３と結合可能な少なくとも１種の抗原結合部分（本明細書において「ＣＤ３抗原結合部分」又は「第１の抗原結合部分」とも呼ばれる）を含む。特定の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、ＣＤ３と特異的に結合可能な２つ以上の抗原結合部分を含む。一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、ＣＤ３との一価の結合を提供する。特定の実施態様では、ＣＤ３は、ヒトＣＤ３又はカニクイザルＣＤ３、最も特には、ヒトＣＤ３である。特定の実施態様では、ＣＤ３抗原結合部分は、ヒト及びカニクイザルＣＤ３に対して交差反応性である（すなわち、特異的に結合する）。いくつかの実施態様では、第１の抗原結合部分は、ＣＤ３のエプシロンサブユニットと特異的に結合可能である（ヒト配列の、ＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｐ０７７６６（バージョン１３０）、ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ番号ＮＰ＿０００７２４．１、配列番号１５０；カニクイザル［カニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）］配列の、ＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｑ９５ＬＩ５（バージョン４９）、ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋ番号ＢＡＢ７１８４９．１を参照のこと）。
【０１６０】
いくつかの実施態様では、ＣＤ３抗原結合部分は、配列番号３７、配列番号３８及び配列番号３９からなる群から選択される少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）並びに配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４の群から選択される少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲを含む。
【０１６１】
一実施態様では、ＣＤ３抗原結合部分は、配列番号３７の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３８の重鎖ＣＤＲ２、配列番号３９の重鎖ＣＤＲ３、配列番号３２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３３の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号３４の軽鎖ＣＤＲ３を含む。
【０１６２】
一実施態様では、ＣＤ３抗原結合部分は、配列番号３６のアミノ酸配列を含む可変重鎖と、配列番号３１のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む。
【０１６３】
一実施態様では、ＣＤ３抗原結合部分は、配列番号３６と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列及び配列番号３１と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列を含む。
【０１６４】
本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、標的細胞抗原ＦｏｌＲ１と結合可能な少なくとも１つの抗原結合部分（本明細書において、「ＦｏｌＲ１結合部分」又は「第２の」又は「第３の」抗原結合部分とも呼ばれる）を含む。一実施態様では、標的細胞抗原ＦｏｌＲ１と結合可能な抗原結合部分は、ＦｏｌＲ２又はＦｏｌＲ３と結合しない。特定の実施態様では、ＦｏｌＲ１抗原結合部分は、ヒト及びカニクイザルＦｏｌＲ１に対して交差反応性である（すなわち、特異的に結合する）。特定の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、標的細胞抗原ＦｏｌＲ１と結合可能な２つの抗原結合部分を含む。特定のこのような実施態様では、これらの抗原結合部分の各々は、同一抗原決定基と特異的に結合する。さらにより特定の実施態様では、これらの抗原結合部分のすべては同一である。一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、ＦｏｌＲ１と結合可能な３つ以上の抗原結合部分を含む。
【０１６５】
ＦｏｌＲ１結合部分は、一般に、ＦｏｌＲ１と特異的に結合するＦａｂ分子であり、標的部位、例えば、ＦｏｌＲ１を発現する特定の種類の腫瘍細胞と接続しているＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を指向できる。
【０１６６】
一態様では、本発明は、
（ｉ）ＣＤ３と特異的に結合可能なＦａｂ分子であり、配列番号３７、配列番号３８及び配列番号３９からなる群から選択される少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）並びに配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４の群から選択される少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲを含む第１の抗原結合部分と、
（ｉｉ）葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）と特異的に結合可能なＦａｂ分子である第２の抗原結合部分
を含む、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。
【０１６７】
一実施態様では、ＣＤ３と特異的に結合可能なＦａｂ分子である第１の抗原結合部分は、配列番号３６のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む。
【０１６８】
一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、
（ｉｉｉ）ＦｏｌＲ１と特異的に結合可能なＦａｂ分子である第３の抗原結合部分
をさらに含む。
【０１６９】
１つのこのような実施態様では、ＦｏｌＲ１と特異的に結合可能な第２及び第３の抗原結合部分は、同一の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）及び軽鎖ＣＤＲ配列を含む。１つのこのような実施態様では、第３の抗原結合部分は、第２の抗原結合部分と同一である。
【０１７０】
一実施態様では、上記の実施態様のいずれかのＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、安定に会合可能な第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む。
【０１７１】
一実施態様では、第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分は、各々、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端と融合している。
【０１７２】
一実施態様では、第３の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端と、任意選択的に、ペプチドリンカーを介して融合している。
【０１７３】
さらなる特定の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子中に、ＣＤ３と特異的に結合可能な１つ以下の抗原結合部分が存在する（すなわち、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、ＣＤ３に対して一価の結合を提供する）。
【０１７４】
共通軽鎖を有するＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子
本発明の発明者らは、結合部分が、親の、ＣＤ３に対する単一特異性抗体の特異性及び有効性を保持し、同一軽鎖を使用して第２の抗原（例えば、ＦｏｌＲ１）と結合し得る共通軽鎖を共有する二重特異性抗体を作製した。親抗体の結合特性を保持する共通軽鎖を有する二重特異性分子の作製は、ハイブリッド軽鎖の共通ＣＤＲが、両標的に対する結合特異性を実現しなくてはならないので容易なものではない。一態様では、本発明は、第１及び第２の抗原結合部分を含み、そのうち一方が、ＣＤ３と特異的に結合可能なＦａｂ分子であり、そのうち一方が、ＦｏｌＲ１と特異的に結合可能なＦａｂ分子であり、第１及び第２のＦａｂ分子が同一のＶＬＣＬ軽鎖を有する、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。一実施態様では、前記同一軽鎖（ＶＬＣＬ）は、配列番号３２、配列番号３３及び配列番号３４の軽鎖ＣＤＲを含む。一実施態様では、前記同一軽鎖（ＶＬＣＬ）は、配列番号３５を含む。
【０１７５】
一実施態様では、本発明は、
（ｉ）ＣＤ３と特異的に結合可能なＦａｂ分子であり、配列番号３７、配列番号３８及び配列番号３９からなる群から選択される少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）並びに配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４の群から選択される少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲを含む、第１の抗原結合部分と、
（ｉｉ）葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）と特異的に結合可能なＦａｂ分子であり、配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１８からなる群から選択される少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）並びに配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４の群から選択される少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲを含む、第２の抗原結合部分と
を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。
【０１７６】
１つのこのような実施態様では、ＣＤ３抗原結合部分は、配列番号３７の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３８の重鎖ＣＤＲ２、配列番号３９の重鎖ＣＤＲ３、配列番号３２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３３の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号３４の軽鎖ＣＤＲ３を含み、ＦｏｌＲ１抗原結合部分は、配列番号１６の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１７の重鎖ＣＤＲ２、配列番号１８の重鎖ＣＤＲ３、配列番号３２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３３の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号３４の軽鎖ＣＤＲ３を含む。
【０１７７】
一実施態様では、本発明は、
（ｉ）配列番号３６のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、ＣＤ３と特異的に結合可能なＦａｂ分子である第１の抗原結合部分と
（ｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）と特異的に結合可能なＦａｂ分子である第２の抗原結合部分と
を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。
【０１７８】
さらなる実施態様では、ＦｏｌＲ１に対して特異的である抗原結合部分は、配列番号１５に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列及び配列番号３１に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列又は機能性を保持するそれらの変異体を含む。
【０１７９】
一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号３６に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、配列番号１５に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列及び配列番号３１に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列を含む。
【０１８０】
一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、
（ｉｉｉ）ＦｏｌＲ１と特異的に結合可能な第３の抗原結合部分（Ｆａｂ分子である）を
さらに含む。
【０１８１】
１つのこのような実施態様では、ＦｏｌＲ１と特異的に結合可能な第２及び第３の抗原結合部分は、同一重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）及び軽鎖ＣＤＲ配列を含む。１つのこのような実施態様では、第３の抗原結合部分は、第２の抗原結合部分と同一である。
【０１８２】
したがって、一実施態様では、本発明は、
（ｉ）ＣＤ３と特異的に結合可能なＦａｂ分子であり、配列番号３７、配列番号３８及び配列番号３９からなる群から選択される少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）並びに配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４の群から選択される少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲを含む、第１の抗原結合部分と、
（ｉｉ）葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）と特異的に結合可能なＦａｂ分子であり、配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１８からなる群から選択される少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）並びに配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４の群から選択される少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲを含む、第２の抗原結合部分と、
（ｉｉｉ）葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）と特異的に結合可能なＦａｂ分子であり、配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１８からなる群から選択される少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）並びに配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４の群から選択される少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲを含む、第３の抗原結合部分と
を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。
【０１８３】
１つのこのような実施態様では、ＣＤ３抗原結合部分は、配列番号３７の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３８の重鎖ＣＤＲ２、配列番号３９の重鎖ＣＤＲ３、配列番号３２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３３の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号３４の軽鎖ＣＤＲ３を含み、ＦｏｌＲ１抗原結合部分は、配列番号１６の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１７の重鎖ＣＤＲ２、配列番号１８の重鎖ＣＤＲ３、配列番号３２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３３の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号３４の軽鎖ＣＤＲ３を含む。
【０１８４】
一実施態様では、本発明は、
（ｉ）配列番号３６のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、ＣＤ３と特異的に結合可能なＦａｂ分子である第１の抗原結合部分と、
（ｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）と特異的に結合可能なＦａｂ分子である第２の抗原結合部分と、
（ｉｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）と特異的に結合可能なＦａｂ分子である第３の抗原結合部分と
を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。
【０１８５】
一実施態様では、本発明は、
（ｉ）ＣＤ３と特異的に結合可能なＦａｂ分子であり、配列番号３７、配列番号３８及び配列番号３９からなる群から選択される少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）並びに配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４の群から選択される少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲを含む、第１の抗原結合部分と、
（ｉｉ）葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）と特異的に結合可能なＦａｂ分子であり、配列番号１６、配列番号４０２及び配列番号４００からなる群から選択される少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）並びに配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４の群から選択される少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲを含む、第２の抗原結合部分と
を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。
【０１８６】
１つのこのような実施態様では、ＣＤ３抗原結合部分は、配列番号３７の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３８の重鎖ＣＤＲ２、配列番号３９の重鎖ＣＤＲ３、配列番号３２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３３の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号３４の軽鎖ＣＤＲ３を含み、ＦｏｌＲ１抗原結合部分は、配列番号１６の重鎖ＣＤＲ１、配列番号４０２の重鎖ＣＤＲ２、配列番号４００の重鎖ＣＤＲ３、配列番号３２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３３の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号３４の軽鎖ＣＤＲ３を含む。
【０１８７】
一実施態様では、本発明は、
（ｉ）配列番号３６のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、ＣＤ３と特異的に結合可能なＦａｂ分子である第１の抗原結合部分と
（ｉｉ）配列番号４０１のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）と特異的に結合可能なＦａｂ分子である第２の抗原結合部分と
を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。
【０１８８】
さらなる実施態様では、ＦｏｌＲ１に対して特異的である抗原結合部分は、配列番号４０１に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列及び配列番号３１に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列又は機能性を保持するそれらの変異体を含む。
【０１８９】
一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号３６に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、配列番号４０１に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列及び配列番号３１に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列を含む。
【０１９０】
一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、
（ｉｉｉ）ＦｏｌＲ１と特異的に結合可能な第３の抗原結合部分（Ｆａｂ分子である）を
さらに含む。
【０１９１】
１つのこのような実施態様では、ＦｏｌＲ１と特異的に結合可能な第２及び第３の抗原結合部分は、同一重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）及び軽鎖ＣＤＲ配列を含む。１つのこのような実施態様では、第３の抗原結合部分は、第２の抗原結合部分と同一である。
【０１９２】
したがって、一実施態様では、本発明は、
（ｉ）ＣＤ３と特異的に結合可能なＦａｂ分子であり、配列番号３７、配列番号３８及び配列番号３９からなる群から選択される少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）並びに配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４の群から選択される少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲを含む、第１の抗原結合部分と、
（ｉｉ）葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）と特異的に結合可能なＦａｂ分子であり、配列番号１６、配列番号４０２及び配列番号４００からなる群から選択される少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）並びに配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４の群から選択される少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲを含む、第２の抗原結合部分と、
（ｉｉｉ）葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）と特異的に結合可能なＦａｂ分子であり、配列番号１６、配列番号４０２及び配列番号４００からなる群から選択される少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）並びに配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４の群から選択される少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲを含む、第３の抗原結合部分と
を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。
【０１９３】
１つのこのような実施態様では、ＣＤ３抗原結合部分は、配列番号３７の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３８の重鎖ＣＤＲ２、配列番号３９の重鎖ＣＤＲ３、配列番号３２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３３の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号３４の軽鎖ＣＤＲ３を含み、ＦｏｌＲ１抗原結合部分は、配列番号１６の重鎖ＣＤＲ１、配列番号４０２の重鎖ＣＤＲ２、配列番号４００の重鎖ＣＤＲ３、配列番号３２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３３の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号３４の軽鎖ＣＤＲ３を含む。
【０１９４】
一実施態様では、本発明は、
（ｉ）配列番号３６のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、ＣＤ３と特異的に結合可能なＦａｂ分子である第１の抗原結合部分と、
（ｉｉ）配列番号４０１のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）と特異的に結合可能なＦａｂ分子である第２の抗原結合部分と、
（ｉｉｉ）配列番号４０１のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）と特異的に結合可能なＦａｂ分子である第３の抗原結合部分と
を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。
【０１９５】
したがって、一実施態様では、本発明は、それぞれ、Ｔ細胞活性化抗原ＣＤ３及び標的細胞抗原ＦｏｌＲ１との特異的結合を付与する少なくとも２つの結合部分が、同一軽鎖及び対応する再構築された重鎖を有する二重特異性分子に関する。このいわゆる「共通軽鎖」原理、すなわち、１つの軽鎖を共有するが、別個の特性を依然として有する２種のバインダーを組み合わせることの使用は、軽鎖ミスペアリングを阻止する。したがって、製造の際により少ない副生成物しかなく、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の均一な調製を容易にする。
【０１９６】
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の成分は、種々の立体配置で互いに融合され得る。例示的立体配置は、図１Ａ−Ｉに表され、以下にさらに記載される。
【０１９７】
いくつかの実施態様では、前記のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、安定に会合可能な第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインをさらに含む。Ｆｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の以下の例示的実施態様が記載されている。
【０１９８】
クロスオーバーＦａｂ断片を有するＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子
本発明の発明者らは、結合部分の１つが、クロスオーバーＦａｂ断片である第２の二重特異性抗体形式を作製した。本発明の一態様では、ＩｇＧ分子のＦａｂ断片の１つが、クロスオーバーＦａｂ断片によって置換されている一価の二重特異性抗体が提供される。クロスオーバーＦａｂ断片は、重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のいずれかが交換されているＦａｂ断片である。クロスオーバーＦａｂ断片を含む二重特異性抗体形式は、例えば、国際公開第２００９０８０２５２号、国際公開第２００９０８０２５３号、国際公開第２００９０８０２５１号、国際公開第２００９０８０２５４号、国際公開第２０１０／１３６１７２号、国際公開第２０１０／１４５７９２号及び国際公開第２０１３／０２６８３１号に記載されている。特定の実施態様では、第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変又は定常領域のいずれかが交換されているクロスオーバーＦａｂ分子である。このような修飾は、異なるＦａｂ分子に由来する重鎖及び軽鎖のミスペアリングを阻止し、それによって、組換え製造において本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の収率及び純度を改善する。本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子にとって有用な特定のクロスオーバーＦａｂ分子では、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変領域が交換される。本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子にとって有用な別のクロスオーバーＦａｂ分子では、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の定常領域が交換される。
【０１９９】
一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、
（ｉ）配列番号３７、配列番号３８及び配列番号３９からなる群から選択される少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）並びに配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４の群から選択される少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲを含む、ＣＤ３と特異的に結合可能なクロスオーバーＦａｂ分子である第１の抗原結合部分と、
（ｉｉ）配列番号８、配列番号５６及び配列番号５７からなる群から選択される少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）並びに配列番号５９、配列番号６０、配列番号６５の群から選択される少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲを含む、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）と特異的に結合可能な第２の抗原結合部分と
を含む。
【０２００】
１つのこのような実施態様では、ＣＤ３抗原結合部分は、配列番号３７の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３８の重鎖ＣＤＲ２、配列番号３９の重鎖ＣＤＲ３、配列番号３２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３３の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号３４の軽鎖ＣＤＲ３を含み、ＦｏｌＲ１抗原結合部分は、配列番号８の重鎖ＣＤＲ１、配列番号５６の重鎖ＣＤＲ２、配列番号５７の重鎖ＣＤＲ３、配列番号５９の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号６０の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号６５の軽鎖ＣＤＲ３を含む。
【０２０１】
一実施態様では、第２の抗原結合部分は、従来のＦａｂ分子である。
【０２０２】
一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、
（ｉ）配列番号３６のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、ＣＤ３と特異的に結合可能なクロスオーバーＦａｂ分子である第１の抗原結合部分と、
（ｉｉ）配列番号５５のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号６４のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）と特異的に結合可能なＦａｂ分子である第２の抗原結合部分と
を含む。
【０２０３】
一実施態様では、第２の抗原結合部分は、従来のＦａｂ分子である。
【０２０４】
さらなる実施態様では、ＦｏｌＲ１に特異的である抗原結合部分は、配列番号５５と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列及び配列番号６４と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列又は機能性を保持するその変異体を含む。
【０２０５】
一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号３６と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、配列番号３１と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、配列番号５５と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列及び配列番号６４と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列を含む。
【０２０６】
一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、
（ｉｉｉ）ＦｏｌＲ１と特異的に結合可能な第３の抗原結合部分
をさらに含む。
【０２０７】
一実施態様では、第３の抗原結合部分は、従来のＦａｂ分子である。一実施態様では、第３の抗原結合部分は、クロスオーバーＦａｂ分子である。
【０２０８】
１つのこのような実施態様では、ＦｏｌＲ１と特異的に結合可能な第２及び第３の抗原結合部分は、同一の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）及び軽鎖ＣＤＲ配列を含む。１つのこのような実施態様では、第３の抗原結合部分は、第２の抗原結合部分と同一である。
【０２０９】
一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、
（ｉ）配列番号３７、配列番号３８及び配列番号３９からなる群から選択される少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）並びに配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４の群から選択される少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲを含む、ＣＤ３と特異的に結合可能なクロスオーバーＦａｂ分子である第１の抗原結合部分と、
（ｉｉ）配列番号８、配列番号５６及び配列番号５７からなる群から選択される少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）並びに配列番号５９、配列番号６０、配列番号６５の群から選択される少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲを含む、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）と特異的に結合可能な第２の抗原結合部分と、
（ｉｉｉ）配列番号８、配列番号５６及び配列番号５７からなる群から選択される少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）並びに配列番号５９、配列番号６０、配列番号６５の群から選択される少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲを含む、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）と特異的に結合可能な第３の抗原結合部分と
を含む。
【０２１０】
１つのこのような実施態様では、ＣＤ３抗原結合部分は、配列番号３７の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３８の重鎖ＣＤＲ２、配列番号３９の重鎖ＣＤＲ３、配列番号３２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３３の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号３４の軽鎖ＣＤＲ３を含み、ＦｏｌＲ１抗原結合部分は、配列番号８の重鎖ＣＤＲ１、配列番号５６の重鎖ＣＤＲ２、配列番号５７の重鎖ＣＤＲ３、配列番号５９の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号６０の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号６５の軽鎖ＣＤＲ３を含む。
【０２１１】
一実施態様では、第２の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分は、両方とも従来のＦａｂ分子である。
【０２１２】
一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、
（ｉ）配列番号３６のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、ＣＤ３と特異的に結合可能なクロスオーバーＦａｂ分子である第１の抗原結合部分と、
（ｉｉ）配列番号５５のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号６４のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）と特異的に結合可能なＦａｂ分子である第２の抗原結合部分と、
（ｉｉｉ）配列番号５５のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号６４のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）と特異的に結合可能なＦａｂ分子である第３の抗原結合部分と
を含む。
【０２１３】
一実施態様では、第２の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分は、両方とも従来のＦａｂ分子である。
【０２１４】
一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、
（ｉ）配列番号３７、配列番号３８及び配列番号３９からなる群から選択される少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）並びに配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４の群から選択される少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲを含む、ＣＤ３と特異的に結合可能なクロスオーバーＦａｂ分子である第１の抗原結合部分と、
（ｉｉ）配列番号８、配列番号９及び配列番号５０からなる群から選択される少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）並びに配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４の群から選択される少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲを含む、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）と特異的に結合可能な第２の抗原結合部分と
を含む。
【０２１５】
１つのこのような実施態様では、ＣＤ３抗原結合部分は、配列番号３７の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３８の重鎖ＣＤＲ２、配列番号３９の重鎖ＣＤＲ３、配列番号３２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３３の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号３４の軽鎖ＣＤＲ３を含み、ＦｏｌＲ１抗原結合部分は、配列番号８の重鎖ＣＤＲ１、配列番号９の重鎖ＣＤＲ２、配列番号５０の重鎖ＣＤＲ３、配列番号５２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５３の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号５４の軽鎖ＣＤＲ３を含む。
【０２１６】
一実施態様では、第２の抗原結合部分は、従来のＦａｂ分子である。一実施態様では、第２の抗原結合部分は、クロスオーバーＦａｂ分子である。
【０２１７】
一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、
（ｉ）配列番号３６のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、ＣＤ３と特異的に結合可能なクロスオーバーＦａｂ分子である第１の抗原結合部分と、
（ｉｉ）配列番号４９のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号５１のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）と特異的に結合可能なＦａｂ分子である第２の抗原結合部分と
を含む。
【０２１８】
一実施態様では、第２の抗原結合部分は、従来のＦａｂ分子である。一実施態様では、第２の抗原結合部分は、クロスオーバーＦａｂ分子である。
【０２１９】
さらなる実施態様では、ＦｏｌＲ１に特異的である抗原結合部分は、配列番号４９と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列及び配列番号５１と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列又は機能性を保持するその変異体を含む。
【０２２０】
一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号３６と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、配列番号３１と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、配列番号４９と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列及び配列番号５１と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列を含む。
【０２２１】
一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、
（ｉｉｉ）ＦｏｌＲ１と特異的に結合可能な第３の抗原結合部分
をさらに含む。
【０２２２】
一実施態様では、第３の抗原結合部分は、従来のＦａｂ分子である。一実施態様では、第２の抗原結合部分は、クロスオーバーＦａｂ分子である。
【０２２３】
１つのこのような実施態様では、ＦｏｌＲ１と特異的に結合可能な第２及び第３の抗原結合部分は、同一の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）及び軽鎖ＣＤＲ配列を含む。１つのこのような実施態様では、第３の抗原結合部分は、第２の抗原結合部分と同一である。
【０２２４】
一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、
（ｉ）配列番号３７、配列番号３８及び配列番号３９からなる群から選択される少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）並びに配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４の群から選択される少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲを含む、ＣＤ３と特異的に結合可能なクロスオーバーＦａｂ分子である第１の抗原結合部分と、
（ｉｉ）配列番号８、配列番号９及び配列番号４９からなる群から選択される少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）並びに配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４の群から選択される少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲを含む、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）と特異的に結合可能な第２の抗原結合部分と、
（ｉｉｉ）配列番号８、配列番号９及び配列番号５０からなる群から選択される少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）並びに配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４の群から選択される少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲを含む、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）と特異的に結合可能な第３の抗原結合部分と
を含む。
【０２２５】
１つのこのような実施態様では、ＣＤ３抗原結合部分は、配列番号３７の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３８の重鎖ＣＤＲ２、配列番号３９の重鎖ＣＤＲ３、配列番号３２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３３の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号３４の軽鎖ＣＤＲ３を含み、ＦｏｌＲ１抗原結合部分は、配列番号８の重鎖ＣＤＲ１、配列番号９の重鎖ＣＤＲ２、配列番号５０の重鎖ＣＤＲ３、配列番号５２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５３の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号５４の軽鎖ＣＤＲ３を含む。
【０２２６】
一実施態様では、第２の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分は、両方とも従来のＦａｂ分子である。
【０２２７】
一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、
（ｉ）配列番号３６のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、ＣＤ３と特異的に結合可能なクロスオーバーＦａｂ分子である第１の抗原結合部分と、
（ｉｉ）配列番号４９のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号５１のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）と特異的に結合可能なＦａｂ分子である第２の抗原結合部分と、
（ｉｉｉ）配列番号４９のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号５１のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）と特異的に結合可能なＦａｂ分子である第３の抗原結合部分と
を含む。
【０２２８】
一実施態様では、第２の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分は、両方とも従来のＦａｂ分子である。
【０２２９】
したがって、一実施態様では、本発明は、２つの結合部分が、ＦｏｌＲ１に対する特異的結合を付与し、１つの結合部分が、Ｔ細胞活性化抗原ＣＤ３に対する特異性を付与する二重特異性分子に関する。重鎖の１つは、重鎖及び軽鎖の適切なペアリングを確実にし、従って、共通軽鎖手法の必要性を排除するように修飾される。２つのＦｏｌＲ１結合部位の存在によって、標的抗原ＦｏｌＲ１との適当な結合及びＴ細胞の活性化が可能になる。
【０２３０】
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の成分は、種々の立体配置で互いに融合され得る。例示的立体配置は、図１Ａ−Ｉに表され、以下にさらに記載される。
【０２３１】
いくつかの実施態様では、前記のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、安定に会合可能な第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインをさらに含む。Ｆｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の以下の例示的実施態様が記載されている。
【０２３２】
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子形式
上記で、及び図１Ａ−Ｉにおいて表されるように、一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、２種の異なる抗原に対する特異性を付与する、同一軽鎖（ＶＬＣＬ）を有し、異なる重鎖（ＶＨＣＬ）を有する少なくとも２つのＦａｂ断片を含む、すなわち、一方のＦａｂ断片は、Ｔ細胞活性化抗原ＣＤ３に対して特異的に結合可能であり、もう一方のＦａｂ断片は、標的細胞抗原ＦｏｌＲ１と特異的に結合可能である。
【０２３３】
別の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、少なくとも２つの抗原結合部分（Ｆａｂ分子）を含み、そのうち一方は、クロスオーバーＦａｂ分子であり、そのうち一方は、従来のＦａｂ分子である。１つのこのような実施態様では、ＣＤ３と特異的に結合可能な第１の抗原結合部分は、クロスオーバーＦａｂ分子であり、ＦｏｌＲと特異的に結合可能な第２の抗原結合部分は、従来のＦａｂ分子である。
【０２３４】
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のこれらの成分は、種々の立体配置で互いに融合され得る。例示的立体配置は、図１Ａ−Ｉに表されている。
【０２３５】
いくつかの実施態様では、第１及び第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端と各々融合されている。特定のこのような実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、本質的に、第１及び第２の抗原結合部分、第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン、及び任意選択的に１つ又は複数のペプチドリンカーからなり、第１及び第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端と各々融合している。１つのこのような実施態様では、第１及び第２の抗原結合部分は両方とも、Ｆａｂ断片であり、同一軽鎖（ＶＬＣＬ）を有する。別のこのような実施態様では、ＣＤ３と特異的に結合可能な第１の抗原結合部分は、クロスオーバーＦａｂ分子であり、ＦｏｌＲと特異的に結合可能な第２の抗原結合部分は、従来のＦａｂ分子である。
【０２３６】
一実施態様では、第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端と融合しており、第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端と融合している。特定のこのような実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は本質的に、第１及び第２の抗原結合部分、第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン、及び任意選択的に１つ又は複数のペプチドリンカーからなり、第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端と融合しており、第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端と融合している。１つのこのような実施態様では、第１及び第２の抗原結合部分は両方とも、Ｆａｂ断片であり、同一軽鎖（ＶＬＣＬ）を有する。別のこのような実施態様では、ＣＤ３と特異的に結合可能な第１の抗原結合部分は、クロスオーバーＦａｂ分子であり、ＦｏｌＲと特異的に結合可能な第２の抗原結合部分は、従来のＦａｂ分子である。任意選択的に、第１の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖及び第２の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖は、互いにさらに融合され得る。
【０２３７】
その他の実施態様では、第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端と融合している。特定のこのような実施態様では、第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端と融合している。特定のこのような実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は本質的に、第１及び第２の抗原結合部分、第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン、及び任意選択的に１つ又は複数のペプチドリンカーからなり、第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端と融合しており、第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端と融合している。１つのこのような実施態様では、第１及び第２の抗原結合部分は両方とも、Ｆａｂ断片であり、同一軽鎖（ＶＬＣＬ）を有する。別のこのような実施態様では、ＣＤ３と特異的に結合可能な第１の抗原結合部分は、クロスオーバーＦａｂ分子であり、ＦｏｌＲと特異的に結合可能な第２の抗原結合部分は、従来のＦａｂ分子である。任意選択的に、第１の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖及び第２の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖は、互いにさらに融合され得る。
【０２３８】
抗原結合部分は、Ｆｃドメインと、又は互いに直接又は１個若しくは複数のアミノ酸、通常、約２−２０個のアミノ酸を含むペプチドリンカーを介して融合され得る。ペプチドリンカーは、当該技術分野で公知であり、本明細書において記載されている。適した非免疫原性ペプチドリンカーとして、例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎ（配列番号３８７）、（ＳＧ４）ｎ（配列番号３８８）、（Ｇ４Ｓ）ｎ（配列番号３８７）又はＧ４（ＳＧ４）ｎ（配列番号３８９）ペプチドリンカーが挙げられる。「ｎ」は、一般に、１から１０の間、通常、２から４の間の数字である。第１及び第２の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖を互いに融合するのに特に適したペプチドリンカーとして、（Ｇ４Ｓ）２（配列番号３８６）がある。第１及び第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖を接続するのに適した例示的ペプチドリンカーとして、ＥＰＫＳＣ（Ｄ）−（Ｇ４Ｓ）２（配列番号３９０及び３９１）がある。さらに、リンカーは、免疫グロブリンヒンジ領域（の部分）を含み得る。特に、抗原結合部分が、ＦｃドメインサブユニットのＮ末端と融合している場合には、さらなるペプチドリンカーを伴って、又は伴わずに、免疫グロブリンヒンジ領域又はその一部を介して融合され得る。
【０２３９】
本発明の発明者らによって、標的細胞抗原ＦｏｌＲに特異的な２つの結合部分を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、標的細胞抗原ＦｏｌＲに対して特異的な１つのみの結合部分を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子と比べて優れた特性を有するということがわかった。
【０２４０】
したがって、特定の実施態様では、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、ＦｏｌＲに対して特異的に結合可能であるＦａｂ分子である第３の抗原結合部分をさらに含む。１つのこのような実施態様では、ＦｏｌＲ１と特異的に結合可能な第２及び第３の抗原結合部分は、同一重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）及び軽鎖ＣＤＲ配列を含む、すなわち、第２の抗原結合部分の重鎖ＣＤＲ配列は、第３の抗原結合部分の重鎖ＣＤＲ配列と同一であり、第２の抗原結合部分の軽鎖ＣＤＲ配列は、第３の抗原結合部分の軽鎖ＣＤＲ配列と同一である。１つのこのような実施態様では、第３の抗原結合部分は、第２の抗原結合部分と同一である（すなわち、それらは、同一アミノ酸配列を含む）。
【０２４１】
一実施態様では、第１及び第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端と各々融合しており、第３の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端と融合している。特定のこのような実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は本質的に、第１、第２及び第３の抗原結合部分、第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン、及び任意選択的に１つ又は複数のペプチドリンカーからなり、第１及び第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端と各々融合しており、第３の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端と融合している。１つのこのような実施態様では、第１、第２及び第３の抗原結合部分は、従来のＦａｂ断片であり、同一軽鎖（ＶＬＣＬ）を有する。別のこのような実施態様では、ＣＤ３と特異的に結合可能な第１の抗原結合部分は、クロスオーバーＦａｂ分子であり、ＦｏｌＲと特異的に結合可能な第２及び第３の抗原結合部分は、従来のＦａｂ分子である。任意選択的に、第１の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖及び第３の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖は、互いにさらに融合され得る。
【０２４２】
別の態様では、本発明は、ａ）ヒトＦｏｌＲ１との結合について、配列番号４９の可変重鎖ドメイン（ＶＨ）及び配列番号５１の可変軽鎖ドメインを含む参照抗体と競合する第１の抗原結合部位並びにｂ）ヒトＣＤ３との結合について、配列番号３６の可変重鎖ドメイン（ＶＨ）及び配列番号３１の可変軽鎖ドメインを含む参照抗体と競合する第２の抗原結合部位を含む二重特異性抗体を提供し、結合競合は、表面プラズモン共鳴アッセイを使用して測定される。
【０２４３】
別の態様では、本発明は、ＣＤ３と特異的に結合可能な第１の抗原結合部分及び葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）と特異的に結合可能な第２の抗原結合部分を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供し、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、ヒトＦｏｌＲ１上の、配列番号４９の可変重鎖ドメイン（ＶＨ）及び配列番号５１の可変軽鎖ドメインを含む第１の参照抗体と同一エピトープと結合し、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、ヒトＣＤ３上の、配列番号３６の可変重鎖ドメイン（ＶＨ）及び配列番号３１の可変軽鎖ドメインを含む第２の参照抗体と同一エピトープと結合する。
【０２４４】
別の態様では、本発明は、第１、第２及び第３の抗原結合部分を形成する第１、第２、第３、第４及び第５のポリペプチド鎖を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供し、第１の抗原結合部分は、ＣＤ３と結合可能であり、第２及び第３の抗原結合部分は各々、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）と結合可能である。第１及び第２のポリペプチド鎖は、アミノ（Ｎ）末端からカルボキシル（Ｃ）末端方向に、第１の軽鎖可変ドメイン（ＶＬＤ１）及び第１の軽鎖定常ドメイン（ＣＬＤ１）を含む。第３のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端方向に、第２の軽鎖可変ドメイン（ＶＬＤ２）及び第２の重鎖定常ドメイン１（ＣＨ１Ｄ２）を含む。第４のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端方向に、第１の重鎖可変ドメイン（ＶＨＤ１）、第１の重鎖定常ドメイン１（ＣＨ１Ｄ１）、第１の重鎖定常ドメイン２（ＣＨ２Ｄ１）及び第１の重鎖定常ドメイン３（ＣＨ３Ｄ１）を含む。第５のポリペプチド鎖は、ＶＨＤ１、ＣＨ１Ｄ１、第２の重鎖可変ドメイン（ＶＨＤ２）、第２の軽鎖定常ドメイン（ＣＬＤ２）、第２の重鎖定常ドメイン２（ＣＨ２Ｄ２）及び第２の重鎖定常ドメイン３（ＣＨ３Ｄ２）を含む。第３のポリペプチド鎖並びに第５のポリペプチド鎖のＶＨＤ２及びＣＬＤ２は、ＣＤ３と結合可能である第１の抗原結合部分を形成する。第２のポリペプチド鎖並びに第５のポリペプチド鎖のＶＨＤ１及びＣＨ１Ｄ１は、ＦｏｌＲ１と結合可能な第３の結合部分を形成する。第１のポリペプチド鎖並びに第４のポリペプチド鎖のＶＨＤ１及びＣＨ１Ｄ１は、ＦｏｌＲ１と結合可能な第２の結合部分を形成する。
【０２４５】
別の実施態様では、第２及び第３の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端と各々融合しており、第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端と融合している。特定のこのような実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は本質的に、第１、第２及び第３の抗原結合部分、第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン、及び任意選択的に１つ又は複数のペプチドリンカーからなり、第２及び第３の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端と各々融合しており、第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第３の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端と融合している。１つのこのような実施態様では、第１、第２及び第３の抗原結合部分は、従来のＦａｂ断片であり、同一軽鎖（ＶＬＣＬ）を有する。別のこのような実施態様では、ＣＤ３と特異的に結合可能な第１の抗原結合部分は、クロスオーバーＦａｂ分子であり、ＦｏｌＲと特異的に結合可能な第２及び第３の抗原結合部分は、従来のＦａｂ分子である。任意選択的に、第１の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖及び第２の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖は、互いにさらに融合され得る。
【０２４６】
抗原結合部分は、Ｆｃドメインと直接的に、又はペプチドリンカーを介して融合され得る。特定の実施態様では、抗原結合部分は、免疫グロブリンヒンジ領域を介してＦｃドメインと各々融合している。特定の実施態様では、免疫グロブリンヒンジ領域は、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域である。
【０２４７】
一実施態様では、第１及び第２の抗原結合部分並びにＦｃドメインは、免疫グロブリン分子の一部である。特定の実施態様では、免疫グロブリン分子は、ＩｇＧクラス免疫グロブリンである。さらにより特定の実施態様では、免疫グロブリンは、ＩｇＧ１サブクラス免疫グロブリンである。別の実施態様では、免疫グロブリンは、ＩｇＧ４サブクラス免疫グロブリンである。さらに特定の実施態様では、免疫グロブリンは、ヒト免疫グロブリンである。その他の実施態様では、免疫グロブリンは、キメラ免疫グロブリン又はヒト化免疫グロブリンである。
【０２４８】
特定の実施態様では、前記Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子第１及び第２の抗原結合部分並びにＦｃドメインは、免疫グロブリン分子の一部であり、第３の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端と融合しており、第１、第２及び第３の抗原結合部分は、従来のＦａｂ断片であり、同一軽鎖（ＶＬＣＬ）を有し、ＣＤ３と特異的に結合可能な第１の抗原結合部分は、配列番号３７、配列番号３８及び配列番号３９からなる群から選択される少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）並びに配列番号３２、配列番号３３及び配列番号３４の群から選択される少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲを含み、ＦｏｌＲ１と特異的に結合可能な第２及び第３の抗原結合部分は、配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１８からなる群から選択される少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）並びに配列番号３２、配列番号３３及び配列番号３４の群から選択される少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲを含む。
【０２４９】
特定の実施態様では、前記Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子第１及び第２の抗原結合部分並びにＦｃドメインは、免疫グロブリン分子の一部であり、第３の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端と融合しており、第１、第２及び第３の抗原結合部分は、従来のＦａｂ断片であり、同一軽鎖（ＶＬＣＬ）を有し、ＣＤ３と特異的に結合可能な第１の抗原結合部分は、配列番号３６の配列を含む可変重鎖、配列番号３１の配列を含む可変軽鎖を含み、ＦｏｌＲ１と特異的に結合可能な第２及び第３の抗原結合部分は、配列番号１５の配列を含む可変重鎖、配列番号３１の配列を含む可変軽鎖を含む。
【０２５０】
特定の実施態様では、前記Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子第１及び第２の抗原結合部分並びにＦｃドメインは、免疫グロブリン分子の一部であり、第３の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端と融合しており、ＣＤ３と特異的に結合可能な第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変又は定常領域のいずれかが交換されており、配列番号３７、配列番号３８及び配列番号３９からなる群から選択される少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）並びに配列番号３２、配列番号３３及び配列番号３４の群から選択される少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲを含むクロスオーバーＦａｂ分子であり、ＦｏｌＲ１と特異的に結合可能な第２及び第３の抗原結合部分は、配列番号８、配列番号５６及び配列番号５７からなる群から選択される少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）並びに配列番号５９、配列番号６０及び配列番号６５の群から選択される少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲを含む。
【０２５１】
特定の実施態様では、前記Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子第１及び第２の抗原結合部分並びにＦｃドメインは、免疫グロブリン分子の一部であり、第３の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端と融合しており、ＣＤ３と特異的に結合可能な第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変又は定常領域のいずれかが交換されており、ＣＤ３と特異的に結合可能な第１の抗原結合部分が、配列番号３６の配列を含む可変重鎖、配列番号３１の配列を含む可変軽鎖を含むクロスオーバーＦａｂ分子であり、ＦｏｌＲ１と特異的に結合可能な第２及び第３の抗原結合部分は、配列番号５５の配列を含む可変重鎖、配列番号６５の配列を含む可変軽鎖を含む。
【０２５２】
一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、各抗原について一価である。特定の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、ヒトＣＤ３及びヒト葉酸受容体アルファ（ＦｏｌＲ１）と結合し得、例えば、ノブ・イントゥー・ホール技術などのヘテロ二量体化手法を使用することなく作製された。例えば、分子は、共通軽鎖ライブラリー及びＣｒｏｓｓＭａｂ技術を使用することによって製造され得る。特定の実施態様では、ＣＤ３バインダーの可変領域は、両特異性について共通しているＶＬＶＨ交差分子（Ｆｃと融合している）を形成するように、標準ヒトＩｇＧ１抗体のＣＨ１ドメインと融合している。交差した対応物（ＶＨＣＬ）を作製するために、ＣＤ３に特異的な可変重鎖ドメインは、定常ヒトλ軽鎖と融合しているのに対し、ヒトＦｏｌＲ１に対して特異的な可変重鎖ドメイン（例えば、共通軽鎖ライブラリーから単離された）は、定常ヒトκ軽鎖と融合している。正しく対形成された鎖を有する得られた所望の分子は、κ及びλ軽鎖又はその断片の両方を含む。結果として、この所望の二重特異性分子種は、いずれかの配列中のκ及びλ軽鎖を選択するその後の精製ステップを用いて、誤って対形成された、又はホモダイマー種から精製され得る。１つの特定の実施態様では、所望の二重特異性抗体の精製は、ΚａｐｐａＳｅｌｅｃｔ及びＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いるその後の精製ステップを使用して、望まれていないホモダイマー抗体を除去する。
【０２５３】
Ｆｃドメイン
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、免疫グロブリン分子の重鎖ドメインを含むポリペプチド鎖の対からなる。例えば、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子のＦｃドメインは、ダイマーであり、その各サブユニットは、ＣＨ２及びＣＨ３  ＩｇＧ重鎖定常ドメインを含む。Ｆｃドメインの２つのサブユニットは、互いに安定に会合可能である。一実施態様では、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、１つ以下のＦｃドメインを含む。
【０２５４】
本発明の一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、ＩｇＧ  Ｆｃドメインである。特定の実施態様では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１  Ｆｃドメインである。別の実施態様では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ４  Ｆｃドメインである。より特定の実施態様では、Ｆｃドメインは、位置Ｓ２２８（カバット番号付け）にアミノ酸置換、特に、アミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含むＩｇＧ４  Ｆｃドメインである。このアミノ酸置換は、ＩｇＧ４抗体のインビボＦａｂアーム交換を低減する（Stubenrauch等、Drug Metabolism and Disposition38、84-91（2010）を参照のこと）。さらに特定の実施態様では、Ｆｃドメインは、ヒトである。
【０２５５】
ヘテロ二量体化を促進するＦｃドメイン修飾
本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットのうち一方又はもう一方と融合している異なる抗原結合部分を含み、したがって、Ｆｃドメインの２つのサブユニットは、通常、２つの非同一ポリペプチド鎖中に含まれる。これらのポリペプチドの組換え共発現及びその後の二量体化は、２種のポリペプチドのいくつかの可能性ある組合せにつながる。したがって、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃドメイン中に、所望のポリペプチドの会合を促進する修飾を導入することは、組換え製造におけるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の収率及び純度を改善するために有利となろう。
【０２５６】
したがって、特定の実施態様では、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促進する修飾を含む。ヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインの２つのサブユニット間の最も広範なタンパク質間相互作用の部位は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメイン中にある。したがって、一実施態様では、前記修飾は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメイン中にある。
【０２５７】
特定の実施態様では、前記修飾は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの一方に「ノブ」修飾を、Ｆｃドメインの２つのサブユニットのもう一方に「ホール」修飾を含む、いわゆる「ノブ・イントゥー・ホール」修飾である。
【０２５８】
ノブ・イントゥー・ホール技術は、例えば、米国特許第５７３１１６８号、米国特許第７６９５９３６号；Ｒｉｄｇｗａｙ等、Ｐｒｏｔ  Ｅｎｇ９、６１７−６２１（１９９６）及びＣａｒｔｅｒ、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈ２４８、７−１５（２００１）に記載されている。一般に、方法は、隆起が空洞中に配置され、ヘテロ二量体形成を促進し、ホモ二量体形成を邪魔し得るように、第１のポリペプチドの接触面に隆起（「ノブ」）を、及び第２のポリペプチドの接触面中に対応する空洞（「ホール」）を導入することを含む。隆起は、第１のポリペプチドの接触面に由来する小さいアミノ酸側鎖を、大きな側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）と交換することによって構築される。隆起と同一か又はより小さい大きさの代償性の空洞が、大きなアミノ酸側鎖をより小さいもの（例えば、アラニン又はスレオニン）と置換することによって第２のポリペプチドの接触面中に作製される。
【０２５９】
したがって、特定の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基が、より大きな側鎖容積を有するアミノ酸残基で置換され、それによって、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の空洞中に配置可能である第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の隆起が生じ、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインでは、アミノ酸残基は、より小さい側鎖容積を有するアミノ酸残基で置換され、それによって、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に空洞が生じ、その中に、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の隆起が配置可能である。
【０２６０】
隆起及び空洞は、例えば、部位特異的突然変異誘発によって、又はペプチド合成によってポリペプチドをコードする核酸を変更することによって作製できる。
【０２６１】
特定の実施態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインでは、位置３６６のスレオニン残基が、トリプトファン残基（Ｔ３６６Ｗ）で置換され、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインでは、位置４０７のチロシン残基が、バリン残基（Ｙ４０７Ｖ）で置換される。一実施態様では、Ｆｃドメインの第２のサブユニットでは、さらに、位置３６６のスレオニン残基が、セリン残基（Ｔ３６６Ｓ）で置換され、位置３６８のロイシン残基が、アラニン残基（Ｌ３６８Ａ）で置換される。
【０２６２】
なおさらなる実施態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいて、さらに、位置３５４のセリン残基が、システイン残基（Ｓ３５４Ｃ）で置換され、Ｆｃドメインの第２のサブユニットでは、さらに、位置３４９のチロシン残基が、システイン残基（Ｙ３４９Ｃ）によって置換される。これら２個のシステイン残基の導入は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの間のジスルフィド架橋の形成をもたらし、したがって、ダイマーをさらに安定化する（Carter, J Immunol Methods 248、7-15（2001））。
【０２６３】
特定の実施態様では、ＣＤ３と結合可能な抗原結合部分は、Ｆｃドメインの第１のサブユニット（「ノブ」修飾を含む）と融合している（任意選択的に、標的細胞抗原と結合可能な抗原結合部分を介して）。理論に捉われようとは思わないが、ＣＤ３と結合可能な抗原結合部分の、Ｆｃドメインのノブ含有サブユニットとの融合は、ＣＤ３と結合可能な２つの抗原結合部分を含む抗原結合分子の生成を（さらに）最小化する（２つのノブ含有ポリペプチドの立体的衝突）。
【０２６４】
代替実施態様では、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促進する修飾は、例えば、ＰＣＴ公開国際公開第２００９／０８９００４号に記載されるような静電ステアリング効果を媒介する修飾を含む。一般に、この方法は、２つのＦｃドメインサブユニットの接触面での、荷電アミノ酸残基による１個又は複数アミノ酸残基の置換を含み、その結果、ホモダイマー形成は、静電気的に好ましくないものになるが、ヘテロ二量体化は、静電気的に好ましい。
【０２６５】
Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクター機能を消失させるＦｃドメイン修飾
Ｆｃドメインは、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子に、標識組織における良好な蓄積に寄与する長い血清半減期及び好ましい組織−血液分布比を含む、好ましい薬物動態特性を付与する。しかし、同時に、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の、好ましい抗原を有する細胞よりもＦｃ受容体を発現する細胞への望ましくない標的化につながり得る。さらに、Ｆｃ受容体シグナル伝達経路の同時活性化は、サイトカイン放出につながり得、これは、抗原結合分子のＴ細胞活性化特性及び長い半減期と組み合わせて、全身投与の際にサイトカイン受容体の過剰な活性化及び重度の副作用をもたらす。Ｔ細胞以外の（Ｆｃ受容体を有する）免疫細胞の活性化は、例えば、ＮＫ細胞によるＴ細胞の可能性ある破壊のためにＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の有効性をさらに低減し得る。
【０２６６】
したがって、特定の実施態様では、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、天然ＩｇＧ１  Ｆｃドメインと比べて、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の低減及び／又はエフェクター機能の低減を示す。１つのこのような実施態様では、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子）は、天然ＩｇＧ１  Ｆｃドメイン（又は天然ＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子）と比べて、５０％未満、好ましくは、２０％未満、より好ましくは、１０％未満、最も好ましくは、５％未満のＦｃ受容体に対する結合親和性及び／又は天然ＩｇＧ１  Ｆｃドメインドメイン（又は天然ＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子）と比べて、５０％未満、好ましくは、２０％未満、より好ましくは、１０％未満、及び最も好ましくは、５％未満のエフェクター機能を示す。一実施態様では、Ｆｃドメインドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子）は、Ｆｃ受容体と実質的に結合せず、及び／又はエフェクター機能を誘導しない。特定の実施態様では、Ｆｃ受容体は、Ｆｃγ受容体である。一実施態様では、Ｆｃ受容体は、ヒトＦｃ受容体である。一実施態様では、Ｆｃ受容体は、活性化Ｆｃ受容体である。特定の実施態様では、Ｆｃ受容体は、活性化ヒトＦｃγ受容体、より詳しくは、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａ、最も詳しくは、ヒトＦｃγＲＩＩＩａである。一実施態様では、エフェクター機能は、ＣＤＣ、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ及びサイトカイン分泌の群から選択される１つ又は複数である。特定の実施態様では、エフェクター機能は、ＡＤＣＣである。一実施態様では、Ｆｃドメインドメインは、天然ＩｇＧ１  Ｆｃドメインドメインと比べて、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対して実質的に同様の結合親和性を示す。ＦｃＲｎに対する実質的に同様の結合は、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子）が、ＦｃＲｎに対する天然ＩｇＧ１  Ｆｃドメイン（又は天然ＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子）の結合親和性の約７０％超、特に、約８０％超、より詳しくは、約９０％超示す場合に達成される。
【０２６７】
特定の実施態様では、Ｆｃドメインは、工学的に操作されていないＦｃドメインと比べて、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の低減及び／又はエフェクター機能の低減を有するように工学的に操作される。特定の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、Ｆｃ受容体に対するＦｃドメインの結合親和性及び／又はエフェクター機能を低減する１個又は複数のアミノ酸突然変異を含む。通常、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの各々に、同一の１個又は複数のアミノ酸突然変異が存在する。一実施態様では、アミノ酸突然変異は、Ｆｃ受容体に対するＦｃドメインの結合親和性を低減する。一実施態様では、アミノ酸突然変異は、Ｆｃ受容体に対するＦｃドメインの結合親和性を、少なくとも２倍、少なくとも５倍又は少なくとも１０倍低減する。Ｆｃ受容体に対するＦｃドメインの結合親和性を低減する２以上のアミノ酸突然変異がある実施態様では、これらのアミノ酸突然変異の組合せが、Ｆｃ受容体に対するＦｃドメインの結合親和性を、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍又はさらには少なくとも５０倍低減し得る。一実施態様では、工学的に操作されたＦｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、工学的に操作されていないＦｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子と比べて、２０％未満、特に、１０％未満、より詳しくは、５％未満の、Ｆｃ受容体に対する結合親和性を示す。特定の実施態様では、Ｆｃ受容体は、Ｆｃγ受容体である。いくつかの実施態様では、Ｆｃ受容体は、ヒトＦｃ受容体である。いくつかの実施態様では、Ｆｃ受容体は、活性Ｆｃ受容体である。特定の実施態様では、Ｆｃ受容体は、活性化ヒトＦｃγ受容体、より詳しくは、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａ、最も詳しくは、ヒトＦｃγＲＩＩＩａである。好ましくは、これらの受容体の各々に対する結合が低減される。いくつかの実施態様では、補体成分に対する結合親和性、詳しくは、Ｃ１ｑに対する結合親和性も低減される。一実施態様では、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する結合親和性は、低減されない。ＦｃＲｎに対する実質的に同様の結合、すなわち、前記受容体に対するＦｃドメインの結合親和性の保存は、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子）が、ＦｃＲｎに対する、Ｆｃドメインの工学的に操作されていない形態（又は前記のＦｃドメインの工学的に操作されていない形態を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子）の結合親和性の約７０％超を示す場合に達成される。Ｆｃドメイン又は前記Ｆｃドメインを含む本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、このような親和性の約８０％超及びさらには約９０％超を示し得る。特定の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、工学的に操作されていないＦｃドメインと比べて、エフェクター機能の低減を有するように工学的に操作される。低減されたエフェクター機能として、それだけには限らないが、以下のうち１つ又は複数を挙げることができる：補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の低減、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の低減、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）の低減、サイトカイン分泌の低減、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性抗原取り込みの低減、ＮＫ細胞との結合の低減、マクロファージとの結合の低減、単球との結合の低減、多形核細胞との結合の低減、アポトーシスを誘導する直接シグナル伝達の低減、標的が結合している抗体の架橋の低減、樹状細胞成熟の低減又はＴ細胞プライミングの低減。一実施態様では、エフェクター機能の低減は、ＣＤＣの低減、ＡＤＣＣの低減、ＡＤＣＰの低減及びサイトカイン分泌の低減の群から選択される１つ又は複数である。特定の実施態様では、エフェクター機能の低減は、ＡＤＣＣの低減である。一実施態様では、ＡＤＣＣの低減は、工学的に操作されていないＦｃドメイン（又は工学的に操作されていないＦｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子）によって誘導されるＡＤＣＣの２０％未満である。
【０２６８】
一実施態様では、Ｆｃ受容体に対するＦｃドメインの結合親和性及び／又はエフェクター機能を低減するアミノ酸突然変異は、アミノ酸置換である。一実施態様では、Ｆｃドメインは、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７、Ｐ３３１及びＰ３２９の群から選択される位置にアミノ酸置換を含む。より特定の実施態様では、Ｆｃドメインは、Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＰ３２９の群から選択される位置にアミノ酸置換を含む。いくつかの実施態様では、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを含む。１つのこのような実施態様では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１  Ｆｃドメイン、特に、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインである。一実施態様では、Ｆｃドメインは、位置Ｐ３２９にアミノ酸置換を含む。より特定の実施態様では、アミノ酸置換は、Ｐ３２９Ａ又はＰ３２９Ｇ、特に、Ｐ３２９Ｇである。一実施態様では、Ｆｃドメインは、位置Ｐ３２９にアミノ酸置換並びにＥ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７及びＰ３３１から選択される位置にさらなるアミノ酸置換を含む。より特定の実施態様では、さらなるアミノ酸置換は、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｄ又はＰ３３１Ｓである。特定の実施態様では、Ｆｃドメインは、位置Ｐ３２９、Ｌ２３４及びＬ２３５にアミノ酸置換を含む。より特定の実施態様では、Ｆｃドメインは、アミノ酸突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（「Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ」）を含む。１つのこのような実施態様では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１  Ｆｃドメイン、特に、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインである。アミノ酸置換の「Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ」組合せは、その全文が参照により本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ公開番号国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載されるように、ヒトＩｇＧ１  ＦｃドメインのＦｃγ受容体結合をほぼ完全に消失させる。国際公開第２０１２／１３０８３１号はまた、このような突然変異体Ｆｃドメインを調製する方法及びＦｃ受容体結合又はエフェクター機能などのその特性を決定するための方法を記載する。
【０２６９】
ＩｇＧ４抗体は、ＩｇＧ１抗体と比べて、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の低減及びエフェクター機能の低減を示す。したがって、いくつかの実施態様では、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、ＩｇＧ４  Ｆｃドメイン、特に、ヒトＩｇＧ４  Ｆｃドメインである。一実施態様では、ＩｇＧ４  Ｆｃドメインは、位置Ｓ２２８にアミノ酸置換、具体的には、アミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含む。一実施態様では、ＩｇＧ４  Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体に対するその結合親和性及び／又はそのエフェクター機能をさらに低減するために、位置Ｌ２３５にアミノ酸置換、具体的には、アミノ酸置換Ｌ２３５Ｅを含む。別の実施態様では、ＩｇＧ４  Ｆｃドメインは、位置Ｐ３２９にアミノ酸置換、具体的には、アミノ酸置換Ｐ３２９Ｇを含む。特定の実施態様では、ＩｇＧ４  Ｆｃドメインは、位置Ｓ２２８、Ｌ２３５及びＰ３２９にアミノ酸置換、具体的には、アミノ酸置換Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ及びＰ３２９Ｇを含む。このようなＩｇＧ４  Ｆｃドメイン突然変異体及びそのＦｃγ受容体結合特性は、参照によりその全文が本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開番号国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載されている。
【０２７０】
特定の実施態様では、天然ＩｇＧ１  Ｆｃドメインと比べて、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の低減及び／又はエフェクター機能の低減を示すＦｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及び任意選択的にＰ３２９Ｇを含むヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメイン又はアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、及び任意選択的にＰ３２９Ｇを含むヒトＩｇＧ４  Ｆｃドメインである。
【０２７１】
特定の実施態様では、ＦｃドメインのＮ−グリコシル化は、排除されている。１つのこのような実施態様では、Ｆｃドメインは、位置Ｎ２９７にアミノ酸突然変異、特に、アスパラギンをアラニン（Ｎ２９７Ａ）又はアスパラギン酸（Ｎ２９７Ｄ）によって置き換えるアミノ酸置換を含む。
【０２７２】
本明細書において上記で、及びＰＣＴ公開番号国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載されるＦｃドメインに加えて、Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクター機能が低減したＦｃドメインはまた、Ｆｃドメイン残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７及び３２９のうち１つ又は複数の置換を有するものを含む（米国特許第６７３７０５６号）。このようなＦｃ突然変異として、残基２６５及び２９７のアラニンへの置換を有するいわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ突然変異体を含む、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７のうち２つ以上に置換を有するＦｃ突然変異体が挙げられる（米国特許第７３３２５８１号）。
【０２７３】
突然変異体Ｆｃドメインは、当該技術分野で周知の遺伝的又は化学的方法を使用するアミノ酸欠失、置換、挿入又は修飾によって調製され得る。遺伝的方法として、コーディングＤＮＡ配列の部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲ、遺伝子合成などを挙げることができる。正しいヌクレオチド変更は、例えば、配列決定によって検証できる。
【０２７４】
Ｆｃ受容体に対する結合は、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）などの標準機器使用及び組換え発現によって得ることができるようなＦｃ受容体を使用して、ＥＬＩＳＡによって、又は表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって容易に調べることができる。適したこのような結合アッセイは、本明細書において記載されている。あるいは、Ｆｃ受容体に対する、Ｆｃドメイン又はＦｃドメインを含む細胞活性化二重特異性抗原結合分子の結合親和性は、ＦｃγＩＩＩａ受容体を発現するヒトＮＫ細胞などの特定のＦｃ受容体を発現すると知られている細胞株を使用して評価され得る。
【０２７５】
Ｆｃドメイン又はＦｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のエフェクター機能は、当該技術分野で公知の方法によって測定できる。ＡＤＣＣを測定するための適したアッセイが、本明細書に記載されている。対象の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイのその他の例は、米国特許第５５００３６２号；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ等  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ８３、７０５９−７０６３（１９８６）及びＨｅｌｌｓｔｒｏｍ等、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ８２、１４９９−１５０２（１９８５）；米国特許第５８２１３３７号；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ等、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ１６６、１３５１−１３６１（１９８７）に記載されている。あるいは、非放射活性アッセイ法が使用され得る（例えば、ＡＣＴＩ（商標）フローサイトメトリーのための非放射活性細胞傷害性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）；及びＣｙｔｏＴｏｘ  ９６（登録商標）非放射活性細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を参照のこと）。このようなアッセイのための有用なエフェクター細胞として、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。あるいは、又はさらに、対象の分子のＡＤＣＣ活性は、インビボで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ等、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ９５、６５２−６５６（１９９８）に開示されるものなど動物モデルにおいて評価され得る。
【０２７６】
いくつかの実施態様では、補体成分に対する、具体的には、Ｃ１ｑに対するＦｃドメインの結合が低減される。したがって、Ｆｃドメインが、低減したエフェクター機能を有するように工学的に操作されているいくつかの実施態様では、前記の低減されたエフェクター機能は、低減されたＣＤＣを含む。Ｃ１ｑ結合アッセイは、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が、Ｃ１ｑと結合でき、ひいては、ＣＤＣ活性を有するか否かを調べるために実施され得る。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び国際公開第２００５／１００４０２号におけるＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照のこと。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを実施してもよい（例えば、Gazzano-Santoro等、J Immunol Methods 202、163（1996）；Cragg等、Blood101、1045-1052（2003）；及びCragg and Glennie、Blood103、2738-2743（2004）を参照のこと）。
【０２７７】
ヘテロ二量体化を促進するＦｃドメイン修飾
本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、異なる抗原結合部分を含み、その一部は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの一方又はもう一方と融合しており、したがって、Ｆｃドメインの２つのサブユニットは、通常、２つの非同一ポリペプチド鎖中に含まれる。これらのポリペプチドの組換え共発現及びその後の二量体化は、２種のポリペプチドのいくつかの可能性ある組合せにつながる。したがって、組換え製造における本発明の二重特異性抗体の収率及び純度を改善するために、本発明の二重特異性抗体のＦｃドメイン中に、所望のポリペプチドの会合を促進する修飾を導入することが有利となる。
【０２７８】
したがって、特定の実施態様では、本発明の二重特異性抗体のＦｃドメインは、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促進する修飾を含む。ヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインの２つのサブユニット間の最も広範なタンパク質間相互作用の部位は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメイン中にある。したがって、一実施態様では、前記修飾は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメイン中にある。
【０２７９】
特定の実施態様では、前記修飾は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの一方に「ノブ」修飾を、Ｆｃドメインの２つのサブユニットのもう一方に「ホール」修飾を含む、いわゆる「ノブ・イントゥー・ホール」修飾である。ノブ・イントゥー・ホール技術は、例えば、米国特許第５７３１１６８号、米国特許第７６９５９３６号；Ｒｉｄｇｗａｙ等、Ｐｒｏｔ  Ｅｎｇ９、６１７−６２１（１９９６）及びＣａｒｔｅｒ、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈ２４８、７−１５（２００１）に記載されている。
【０２８０】
一般に、方法は、隆起が空洞中に配置され、ヘテロ二量体形成を促進し、ホモ二量体形成を邪魔し得るように、第１のポリペプチドの接触面に隆起（「ノブ」）を、及び第２のポリペプチドの接触面中に対応する空洞（「ホール」）を導入することを含む。隆起は、第１のポリペプチドの接触面に由来する小さいアミノ酸側鎖を、大きな側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）と交換することによって構築される。隆起と同一か又はより小さい大きさの代償性の空洞が、大きなアミノ酸側鎖をより小さいもの（例えば、アラニン又はスレオニン）と置換することによって第２のポリペプチドの接触面中に作製される。
【０２８１】
したがって、特定の実施態様では、本発明の二重特異性抗体のＦｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基が、より大きな側鎖容積を有するアミノ酸残基で置換され、それによって、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の空洞中に配置可能である第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の隆起が生じ、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインでは、アミノ酸残基は、より小さい側鎖容積を有するアミノ酸残基で置換され、それによって、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に空洞が生じ、その中に、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の隆起が配置可能である。
【０２８２】
隆起及び空洞は、例えば、部位特異的突然変異誘発によって、又はペプチド合成によってポリペプチドをコードする核酸を変更することによって作製できる。
【０２８３】
特定の実施態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインでは、位置３６６のスレオニン残基が、トリプトファン残基（Ｔ３６６Ｗ）で置換され、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインでは、位置４０７のチロシン残基が、バリン残基（Ｙ４０７Ｖ）で置換される。一実施態様では、Ｆｃドメインの第２のサブユニットでは、さらに、位置３６６のスレオニン残基が、セリン残基（Ｔ３６６Ｓ）で置換され、位置３６８のロイシン残基が、アラニン残基（Ｌ３６８Ａ）で置換される。
【０２８４】
なおさらなる実施態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいて、さらに、位置３５４のセリン残基が、システイン残基（Ｓ３５４Ｃ）で置換され、Ｆｃドメインの第２のサブユニットでは、さらに、位置３４９のチロシン残基が、システイン残基（Ｙ３４９Ｃ）によって置換される。これら２個のシステイン残基の導入は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの間のジスルフィド架橋の形成をもたらし、したがって、ダイマーを安定化する（Carter, J Immunol Methods 248、7-15（2001））。
【０２８５】
代替実施態様では、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促進する修飾は、例えば、国際公開第２００９／０８９００４号に記載されるような静電ステアリング効果を媒介する修飾を含む。一般に、この方法は、２つのＦｃドメインサブユニットの接触面での、荷電アミノ酸残基による１個又は複数アミノ酸残基の置換を含み、その結果、ホモダイマー形成は、静電気的に好ましくないものになるが、ヘテロ二量体化は、静電気的に好ましい。
【０２８６】
一実施態様では、上記の実施態様のいずれかに従うＦｏｌＲ１及びＣＤ３と結合するＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、ＦｏｌＲ１に特異的な２つの結合部位を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子を含み、これでは、第１の重鎖のＦｃ部分は、第１の二量体化モジュールを含み、第２の重鎖のＦｃ部分は、第２の二量体化モジュールを含み、これが、ＩｇＧ分子の２つの重鎖のヘテロ二量体化を可能にする。
【０２８７】
さらに好ましい実施態様では、ノブ・イントゥー・ホール戦略に従って、第１の二量体化モジュールは、ノブを含み、第２の二量体化モジュールは、ホールを含む（Carter P.;Ridgway J.B.B.;Presta L.G.: Immunotechnology、第2巻、第1号、February 1996、p.73-73（1）を参照のこと）。
【０２８８】
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の生物学的特性及び機能的特性
当業者ならば、がん性及び非がん性の健常細胞間を選択的に区別する分子の有利な効率を理解できる。この目的を達成するための１つの方法は、適当な標的選択によってである。もっぱら腫瘍細胞で発現されるマーカーを使用して、このようなマーカーを発現しない正常細胞を残しながら、エフェクター分子又は細胞を腫瘍細胞に選択的に標的化できる。しかし、いくつかの例では、正常組織においても、いわゆる腫瘍細胞マーカーが、より低いレベルではあるが発現される。正常組織におけるこの発現は、毒性の可能性を高める。したがって、当該技術分野では、腫瘍細胞をより選択的に標的化できる分子が必要であった。本明細書において記載される本発明は、ＦｏｌＲ１ポジティブ腫瘍細胞を選択的に標的化し、ＦｏｌＲ１を低レベルで発現するか、又は全く発現しない正常な非がん性細胞を標的化しないＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、高及び低ＦｏｌＲ１発現細胞間の区別を可能にする結合活性効果を付与する、比較的低い親和性の、少なくとも２つの、好ましくは２つのＦｏｌＲ１結合部分を含む。腫瘍細胞は、ＦｏｌＲ１を高又は中程度のレベルで発現するので、本発明のこの実施態様は、腫瘍細胞と選択的に結合し、及び／又はその死滅を誘導し、ＦｏｌＲ１を低レベルで発現するか、又は全く発現しない正常な非がん性細胞とは選択的に結合せず、及び／又はその死滅を誘導しない。一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、２＋１インバーテッド形式である。一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、ＦｏｌＲ１ポジティブ腫瘍細胞のＴ細胞媒介性死滅を誘導するが、非腫瘍細胞のＴ細胞媒介性死滅を誘導せず、配列番号３７の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３８の重鎖ＣＤＲ２、配列番号３９の重鎖ＣＤＲ３、配列番号３２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３３の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号３４の軽鎖ＣＤＲ３を含むＣＤ３抗原結合部分並びに各々、配列番号８の重鎖ＣＤＲ１、配列番号９の重鎖ＣＤＲ２、配列番号５０の重鎖ＣＤＲ３、配列番号５２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５３の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号５４の軽鎖ＣＤＲ３を含む２つのＦｏｌＲ１抗原結合部分を含む。
【０２８９】
１つの特定の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、その表面に約１０００コピー未満のＦｏｌＲ１を有する正常細胞の死滅を誘導しない。
【０２９０】
上記の有利な特性に加えて、本発明の一実施態様は、化学的架橋又はハイブリッド手法がもたらされることを必要としない。したがって、一実施態様では、本発明は、ＣＨＯ細胞において製造可能なＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、ヒト化及びヒトポリペプチドを含む。一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、ＦｃｇＲ架橋を引き起こさない。１つのこのような実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、ＣＨＯ細胞において製造可能であり、配列番号３７の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３８の重鎖ＣＤＲ２、配列番号３９の重鎖ＣＤＲ３、配列番号３２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３３の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号３４の軽鎖ＣＤＲ３を含むＣＤ３抗原結合部分並びに各々、配列番号８の重鎖ＣＤＲ１、配列番号９の重鎖ＣＤＲ２、配列番号５０の重鎖ＣＤＲ３、配列番号５２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５３の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号５４の軽鎖ＣＤＲ３を含む２つのＦｏｌＲ１抗原結合部分を含む。
【０２９１】
上記のように、本明細書において考慮されるいくつかの実施態様は、ＦｏｌＲ１に対する特異的結合を付与する２つの結合部分及びＴ細胞活性化抗原ＣＤ３に対する特異性を付与する１つの結合部分を有するＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を含み、個々のＦｏｌＲ１結合部分は各々、抗原と低親和性で会合する。それにもかかわらず、分子は、ＦｏｌＲ１との結合を付与する２つの抗原結合部分を含むので、分子の全体的な結合活性は、ＦｏｌＲ１発現標的細胞との有効な結合及びＴ細胞エフェクター機能を誘導するためのＴ細胞の活性化を提供する。ＦｏｌＲ１は、腫瘍細胞で種々のレベルで発現され、特定の正常細胞でもまた、極めて低いレベルで発現される（例えば、細胞表面上に約１０００コピー未満）ことを考慮すると、当業者ならば、治療剤として使用するためのこのような分子の有利な効率を容易に認識できる。このような分子は、正常細胞を上回って腫瘍細胞を選択的に標的化する。したがって、このような分子は、高親和性でＦｏｌＲ１と結合して、エフェクター機能を誘導する分子と比べて、ＦｏｌＲ１ポジティブ正常細胞に起因する毒性についての大幅に少ない懸念しか伴わずに、それを必要とする個体に投与できる。
【０２９２】
一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、約５．３６ｐＭ−約４ｎＭの見かけのＫＤでヒトＦｏｌＲ１と結合する。一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、ヒト及びカニクイザルＦｏｌＲ１と、約４ｎＭの見かけのＫＤで結合する。一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、マウスＦｏｌＲ１と約１．５ｎＭの見かけのＫＤで結合する。一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、ヒトＦｏｌＲ１と少なくとも約１０００ｎＭの一価の結合ＫＤで結合する。特定の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、ヒト及びカニクイザルＦｏｌＲ１と約４ｎＭの見かけのＫＤで結合し、マウスＦｏｌＲ１と約１．５ｎＭの見かけのＫＤで結合し、配列番号３７の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３８の重鎖ＣＤＲ２、配列番号３９の重鎖ＣＤＲ３、配列番号３２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３３の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号３４の軽鎖ＣＤＲ３を含むＣＤ３抗原結合部分並びに各々、配列番号８の重鎖ＣＤＲ１、配列番号９の重鎖ＣＤＲ２、配列番号５０の重鎖ＣＤＲ３、配列番号５２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５３の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号５４軽鎖ＣＤＲ３を含む２つのＦｏｌＲ１抗原結合部分を含む。一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、ヒトＦｏｌＲ１と少なくとも約１０００ｎＭの一価の結合ＫＤで結合し、配列番号３７の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３８の重鎖ＣＤＲ２、配列番号３９の重鎖ＣＤＲ３、配列番号３２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３３の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号３４の軽鎖ＣＤＲ３を含むＣＤ３抗原結合部分並びに各々、配列番号８の重鎖ＣＤＲ１、配列番号９の重鎖ＣＤＲ２、配列番号５０の重鎖ＣＤＲ３、配列番号５２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５３の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号５４の軽鎖ＣＤＲ３を含む２つのＦｏｌＲ１抗原結合部分を含む。
【０２９３】
上記のように、本明細書において考慮されるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、Ｔ細胞エフェクター機能、例えば、細胞表面マーカー発現、サイトカイン産生、Ｔ細胞媒介性死滅を誘導し得る。一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、インビトロでヒト腫瘍細胞などのＦｏｌＲ１発現標的細胞のＴ細胞媒介性死滅を誘導する。一実施態様では、Ｔ細胞は、ＣＤ８ポジティブＴ細胞である。ＦｏｌＲ１発現ヒト腫瘍細胞の例として、それだけには限らないが、Ｈｅｌａ、Ｓｋｏｖ−３、ＨＴ−２９及びＨＲＣＥｐｉＣ細胞が挙げられる。インビトロ試験に使用できるその他のＦｏｌＲ１ポジティブヒトがん細胞は、当業者には容易に入手可能である。一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、２４時間後に、約３６ｐＭから約３９５７３ｐＭの間のＥＣ５０で、インビトロでＦｏｌＲ１発現ヒト腫瘍細胞のＴ細胞媒介性死滅を誘導する。具体的には、２４時間後に、約３６ｐＭのＥＣ５０で、インビトロでＦｏｌＲ１発現腫瘍細胞のＴ細胞媒介性死滅を誘導するＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が考慮される。一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、２４時間後に、約１７８．４ｐＭのＥＣ５０で、インビトロでＦｏｌＲ１発現腫瘍細胞のＴ細胞媒介性死滅を誘導する。一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、４８時間後に、約１３４．５ｐＭ以上のＥＣ５０で、インビトロでＦｏｌＲ１発現腫瘍細胞のＴ細胞媒介性死滅を誘導する。ＥＣ５０は、当該技術分野で公知の方法によって、例えば、実施例によって本明細書において開示される方法によって測定できる。
【０２９４】
一実施態様では、上記の実施態様のいずれかのＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、フローサイトメトリーによって測定されるように、Ｔ細胞上でのＣＤ２５及びＣＤ６９のうち少なくとも一方の細胞表面発現の上方制御を誘導する。一実施態様では、Ｔ細胞は、ＣＤ４ポジティブＴ細胞又はＣＤ８ポジティブＴ細胞である。
【０２９５】
一実施態様では、上記の実施態様のいずれかのＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、ヒト腫瘍細胞上に発現されたＦｏｌＲ１と結合する。一実施態様では、上記の実施態様のいずれかのＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、ヒトＦｏｌＲ１上の立体構造エピトープと結合する。一実施態様では、上記の実施態様のいずれかのＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、ヒト葉酸受容体２（ＦｏｌＲ２）と、又はヒト葉酸受容体３（ＦｏｌＲ３）と結合しない。上記の実施態様のいずれかのＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の一実施態様では、抗原結合部分は、ヒトＦｏｌＲ１のアミノ酸２５−２３４（配列番号２２７）を含むＦｏｌＲ１ポリペプチドと結合する。上記の実施態様のいずれかのＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の一実施態様では、ＦｏｌＲ１抗原結合部分は、配列番号２２７、２３０及び２３１のアミノ酸配列を含むＦｏｌＲ１ポリペプチドと結合し、ＦｏｌＲ１抗原結合部分は、配列番号２２８及び２２９のアミノ酸配列を含むＦｏｌＲポリペプチドと結合しない。１つの特定の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号２２７、２３０及び２３１のアミノ酸配列を含むＦｏｌＲ１ポリペプチドと結合するＦｏｌＲ１抗原結合部分を含み、ここで、ＦｏｌＲ１抗原結合部分は、配列番号２２８及び２２９のアミノ酸配列を含むＦｏｌＲポリペプチドと結合せず、配列番号３７の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３８の重鎖ＣＤＲ２、配列番号３９の重鎖ＣＤＲ３、配列番号３２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３３の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号３４の軽鎖ＣＤＲ３を含むＣＤ３抗原結合部分並びに各々、配列番号８の重鎖ＣＤＲ１、配列番号９の重鎖ＣＤＲ２、配列番号５０の重鎖ＣＤＲ３、配列番号５２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５３の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号５４の軽鎖ＣＤＲ３を含む２つのＦｏｌＲ１抗原結合部分を含む。
【０２９６】
ＦｏｌＲ１に関して、本明細書において考慮されるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、アゴニスト、アンタゴニスト又は中立効果を有し得る。アゴニスト効果の例として、ＦｏｌＲ１結合部分による標的細胞上のＦｏｌＲ１受容体との会合の際の、ＦｏｌＲ１を介したシグナル伝達の誘導又は増強が挙げられる。アンタゴニスト活性の例として、ＦｏｌＲ１結合部分による標的細胞上のＦｏｌＲ１受容体との会合の際のＦｏｌＲ１を介したシグナル伝達の抑止又は低減が挙げられる。これは、例えば、葉酸とＦｏｌＲ１間の相互作用をブロックすること又は低減することによって起こり得る。
【０２９７】
本発明において使用するための例示的ＰＤ−１軸結合アンタゴニスト
個体に、有効量のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子及びＰＤ−１軸結合アンタゴニストを投与することを含む、個体においてがんの進行を治療又は遅延するための方法が、本明細書において提供される。例えば、ＰＤ−１軸結合アンタゴニストは、ＰＤ−１結合アンタゴニスト、ＰＤＬ１結合アンタゴニスト及びＰＤＬ２結合アンタゴニストを含む。「ＰＤ−１」の別名として、ＣＤ２７９及びＳＬＥＢ２が挙げられる。「ＰＤＬ１」の別名として、Ｂ７−Ｈ１、Ｂ７−４、ＣＤ２７４及びＢ７−Ｈが挙げられる。「ＰＤＬ２」の別名として、Ｂ７−ＤＣ、Ｂｔｄｃ及びＣＤ２７３が挙げられる。いくつかの実施態様では、ＰＤ−１、ＰＤＬ１及びＰＤＬ２は、ヒトＰＤ−１、ＰＤＬ１及びＰＤＬ２である。
【０２９８】
いくつかの実施態様では、ＰＤ−１結合アンタゴニストは、ＰＤ−１の、そのリガンドである結合パートナーとの結合を阻害する分子である。特定の態様では、ＰＤ−１リガンド結合パートナーは、ＰＤＬ１及び／又はＰＤＬ２である。別の実施態様では、ＰＤＬ１結合アンタゴニストは、ＰＤＬ１のその結合パートナーとの結合を阻害する分子である。特定の態様では、ＰＤＬ１結合パートナーは、ＰＤ−１及び／又はＢ７−１である。別の実施態様では、ＰＤＬ２結合アンタゴニストは、ＰＤＬ２のその結合パートナーとの結合を阻害する分子である。特定の態様では、ＰＤＬ２結合パートナーは、ＰＤ−１である。アンタゴニストは、抗体、その抗原結合断片、イムノアドヘシン、融合タンパク質又はオリゴペプチドであり得る。
【０２９９】
いくつかの実施態様では、ＰＤ−１結合アンタゴニストは、抗ＰＤ−１抗体（例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体又はキメラ抗体）である。いくつかの実施態様では、抗ＰＤ−１抗体は、ニボルマブ、ペムブロリズマブ及びＣＴ−０１１からなる群から選択される。いくつかの実施態様では、ＰＤ−１結合アンタゴニストは、イムノアドヘシン（例えば、定常領域（例えば、免疫グロブリン配列のＦｃ領域）と融合しているＰＤＬ１又はＰＤＬ２の細胞外又はＰＤ−１結合部分を含むイムノアドヘシン）である。いくつかの実施態様では、ＰＤ−１結合アンタゴニストは、ＡＭＰ−２２４である。ＭＤＸ−１１０６−０４、ＭＤＸ−１１０６、ＯＮＯ−４５３８、ＢＭＳ−９３６５５８及びＯＰＤＩＶＯ（登録商標）としても知られるニボルマブは、国際公開第２００６／１２１１６８号に記載される抗ＰＤ−１抗体である。ＭＫ−３４７５、Ｍｅｒｃｋ３４７５、ランブロリズマブ、ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）及びＳＣＨ−９００４７５としても知られるペムブロリズマブは、国際公開第２００９／１１４３３５号に記載される抗ＰＤ−１抗体である。ｈＢＡＴ又はｈＢＡＴ−１としても知られるＣＴ−０１１は、国際公開第２００９／１０１６１１号に記載された抗ＰＤ−１抗体である。Ｂ７−ＤＣＩｇとしても知られるＡＭＰ−２２４は、国際公開第２０１０／０２７８２７号及び国際公開第２０１１／０６６３４２号に記載されたＰＤＬ２−Ｆｃ融合可溶型受容体である。
【０３００】
いくつかの実施態様では、抗ＰＤ−１抗体は、ニボルマブ（ＣＡＳ登録番号：９４６４１４−９４−４）である。一層さらなる実施態様では、配列番号２７４に由来する重鎖可変領域アミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び／又は配列番号２７５に由来する軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む単離された抗ＰＤ−１抗体が提供される。一層さらなる実施態様では、重鎖及び／又は軽鎖配列を含む単離された抗ＰＤ−１抗体が提供され、ここで、
（ａ）重鎖配列は、
重鎖配列：
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＤＣＫＡＳＧＩＴＦＳＮＳＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＩＷＹＤＧＳＫＲＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＦＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＴＮＤＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ（配列番号２７４）
に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％配列同一性を有するか、又は
（ｂ）軽鎖配列は、
軽鎖配列：
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤＡＳＮＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＳＳＮＷＰＲＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号２７５）
に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有する。
【０３０１】
いくつかの実施態様では、抗ＰＤ−１抗体は、ペムブロリズマブ（ＣＡＳ登録番号：１３７４８５３−９１−４）である。一層さらなる実施態様では、配列番号２７６に由来する重鎖可変領域アミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び／又は配列番号２７７に由来する軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む単離された抗ＰＤ−１抗体が提供される。一層さらなる実施態様では、重鎖及び／又は軽鎖配列を含む単離された抗ＰＤ−１抗体が提供され、ここで、
（ａ）重鎖配列は、
重鎖配列：ＱＶＱＬＶＱＳＧＶＥ  ＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴ  ＮＹＹＭＹＷＶＲＱＡ  ＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧ  ＩＮＰＳＮＧＧＴＮＦ  ＮＥＫＦＫＮＲＶＴＬＴＴＤＳＳＴＴＴＡＹ  ＭＥＬＫＳＬＱＦＤＤ  ＴＡＶＹＹＣＡＲＲＤＹＲＦＤＭＧＦＤＹＷ  ＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰ  ＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥ  ＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳ  ＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳ  ＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴ  ＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳ  ＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰ  ＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶ  ＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴ  ＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤ  ＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫ  ＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨ  ＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳ  ＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫ  ＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫ  ＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥ  ＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮ  ＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬ  ＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥ  ＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳ  ＬＳＬＳＬＧＫ（配列番号２７６）
に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％配列同一性を有するか、又は
（ｂ）軽鎖配列は、
軽鎖配列：
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＫＧＶＳＴＳＧＹＳＹＬＨＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＬＡＳＹＬＥＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＨＳＲＤＬＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴ  ＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号２７７）
に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有する。
【０３０２】
いくつかの実施態様では、ＰＤＬ１結合アンタゴニストは、抗ＰＤＬ１抗体である。いくつかの実施態様では、抗ＰＤＬ１結合アンタゴニストは、ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＭＤＸ−１１０５及びＭＥＤＩ４７３６からなる群から選択される。ＢＭＳ−９３６５５９としても知られるＭＤＸ−１１０５は、国際公開第２００７／００５８７４号に記載された抗ＰＤＬ１抗体である。抗体ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０（それぞれ配列番号２０及び２１に示される重鎖及び軽鎖可変領域配列）は、国際公開第２０１０／０７７６３４Ａ１号に記載された抗ＰＤＬ１である。ＭＥＤＩ４７３６は、各々、その全文が記載されるかのように参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１１／０６６３８９号及び米国特許第２０１３／０３４５５９号に記載された抗ＰＤＬ１抗体である。
【０３０３】
本発明の方法にとって有用な抗ＰＤＬ１抗体の例及びそれを作製するための方法は、各々、その全文が記載されるかのように参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ特許出願国際公開第２０１０／０７７６３４Ａ１号及び米国特許第８２１７１４９号に記載されている。
【０３０４】
いくつかの実施態様では、ＰＤ−１軸結合アンタゴニストは、抗ＰＤＬ１抗体である。いくつかの実施態様では、抗ＰＤＬ１抗体は、ＰＤＬ１とＰＤ−１の間及び／又はＰＤＬ１とＢ７−１の間の結合を阻害可能である。いくつかの実施態様では、抗ＰＤＬ１抗体は、モノクローナル抗体である。いくつかの実施態様では、抗ＰＤＬ１抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ及び（Ｆａｂ’）２断片からなる群から選択される抗体断片である。いくつかの実施態様では、抗ＰＤＬ１抗体は、ヒト化抗体である。いくつかの実施態様では、抗ＰＤＬ１抗体は、ヒト抗体である。
【０３０５】
国際公開第２０１０／０７７６３４Ａ１号に記載されるものなど、このような抗体を含有する組成物を含む、本発明において有用な抗ＰＤＬ１抗体は、がんを治療するために、Ｔ細胞活性化抗原結合分子と、及び任意選択的に抗ＴＩＭ３アンタゴニスト抗体と組み合わせて使用できる。いくつかの実施態様では、抗ＰＤＬ１抗体は、配列番号３８２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号３８３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【０３０６】
一実施態様では、抗ＰＤＬ１抗体は、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変領域ポリペプチド含有し、ここで、
（ａ）ＨＶＲ−Ｈ１配列は、ＧＦＴＦＳＸ１ＳＷＩＨ（配列番号２８３）であり、
（ｂ）ＨＶＲ−Ｈ２配列は、ＡＷＩＸ２ＰＹＧＧＳＸ３ＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２８４）であり、
（ｃ）ＨＶＲ−Ｈ３配列は、ＲＨＷＰＧＧＦＤＹ（配列番号２８５）であり、
さらに、ここで、Ｘ１は、Ｄ又はＧであり、Ｘ２は、Ｓ又はＬであり、Ｘ３は、Ｔ又はＳである。
【０３０７】
１つの特定の態様では、Ｘ１は、Ｄであり、Ｘ２は、Ｓであり、Ｘ３は、Ｔである。別の態様では、ポリペプチドは、式：（ＨＣ−ＦＲ１）−（ＨＶＲ−Ｈ１）−（ＨＣ−ＦＲ２）−（ＨＶＲ−Ｈ２）−（ＨＣ−ＦＲ３）−（ＨＶＲＨ３）−（ＨＣ−ＦＲ４）に従うＨＶＲの間に並置された可変領域重鎖フレームワーク配列をさらに含む。さらに別の態様では、フレームワーク配列は、ヒトコンセンサスフレームワーク配列に由来する。さらなる態様において、フレームワーク配列は、ＶＨサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワークである。一層さらなる態様では、フレームワーク配列のうち少なくとも１つは、以下であり、
ＨＣ−ＦＲ１は、ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳ（配列番号２９５）であり、
ＨＣ−ＦＲ２は、ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶ（配列番号２９６）であり、
ＨＣ−ＦＲ３は、ＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号２９７）であり、
ＨＣ−ＦＲ４は、ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ（配列番号２９８）である。
【０３０８】
一層さらなる態様では、重鎖ポリペプチドは、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３を含む可変領域軽鎖とさらに組み合され、ここで、
（ａ）ＨＶＲ−Ｌ１配列は、ＲＡＳＱＸ４Ｘ５Ｘ６ＴＸ７Ｘ８Ａ（配列番号２８６）であり、
（ｂ）ＨＶＲ−Ｌ２配列は、ＳＡＳＸ９ＬＸ１０Ｓ（配列番号２８７）であり、
（ｃ）ＨＶＲ−Ｌ３配列は、ＱＱＸ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４ＰＸ１５Ｔ（配列番号２８８）であり、
さらにここで、Ｘ４は、Ｄ又はＶであり、Ｘ５は、Ｖ又はＩであり、Ｘ６は、Ｓ又はＮであり、Ｘ７は、Ａ又はＦであり、Ｘ８は、Ｖ又はＬであり、Ｘ９は、Ｆ又はＴであり、Ｘ１０は、Ｙ又はＡであり、Ｘ１１は、Ｙ、Ｇ、Ｆ又はＳであり、Ｘ１２は、Ｌ、Ｙ、Ｆ又はＷであり、Ｘ１３は、Ｙ、Ｎ、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｆ又はＩであり、Ｘ１４は、Ｈ、Ｖ、Ｐ、Ｔ又はＩであり、Ｘ１５は、Ａ、Ｗ、Ｒ、Ｐ又はＴである。
【０３０９】
一層さらなる態様では、Ｘ４は、Ｄであり、Ｘ５は、Ｖであり、Ｘ６は、Ｓであり、Ｘ７は、Ａであり、Ｘ８は、Ｖであり、Ｘ９は、Ｆであり、Ｘ１０は、Ｙであり、Ｘ１１は、Ｙであり、Ｘ１２は、Ｌであり、Ｘ１３は、Ｙであり、Ｘ１４は、Ｈであり、Ｘ１５は、Ａである。一層さらなる態様では、軽鎖は、式：（ＬＣ−ＦＲ１）−（ＨＶＲ−Ｌ１）−（ＬＣ−ＦＲ２）−（ＨＶＲ−Ｌ２）−（ＬＣ−ＦＲ３）−（ＨＶＲ−Ｌ３）−（ＬＣＦＲ４）に従うＨＶＲの間に並置された可変領域軽鎖フレームワーク配列をさらに含む。
【０３１０】
一層さらなる態様では、フレームワーク配列は、ヒトコンセンサスフレームワーク配列に由来する。一層さらなる態様では、フレームワーク配列は、ＶＬκＩコンセンサスフレームワークである。一層さらなる態様では、フレームワーク配列のうち少なくとも１つは、以下であり、
ＬＣ−ＦＲ１は、ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（配列番号３００）であり、
ＬＣ−ＦＲ２は、ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号３０１）であり、
ＬＣ−ＦＲ３は、ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣ（配列番号３０２）であり、
ＬＣ−ＦＲ４は、ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲ（配列番号３０３）である。
【０３１１】
別の実施態様では、重鎖及び軽鎖可変領域配列を含む単離された抗ＰＤＬ１抗体又は抗原結合断片が提供され、ここで、
（ａ）重鎖は、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含み、ここで、さらに
（ｉ）ＨＶＲ−Ｈ１配列は、ＧＦＴＦＳＸ１ＳＷＩＨ（配列番号２８３）であり、
（ｉｉ）ＨＶＲ−Ｈ２配列は、ＡＷＩＸ２ＰＹＧＧＳＸ３ＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２８４）であり、
（ｉｉｉ）ＨＶＲ−Ｈ３配列は、ＲＨＷＰＧＧＦＤＹ（配列番号２８５）であり、
（ｂ）軽鎖は、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３を含み、ここで、さらに、
（ｉ）ＨＶＲ−Ｌ１配列は、ＲＡＳＱＸ４Ｘ５Ｘ６ＴＸ７Ｘ８Ａ（配列番号２８６）であり、
（ｉｉ）ＨＶＲ−Ｌ２配列は、ＳＡＳＸ９ＬＸ１０Ｓ（配列番号２８７）であり、
（ｉｉｉ）ＨＶＲ−Ｌ３配列は、ＱＱＸ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４ＰＸ１５Ｔ（配列番号２８８）であり、
さらにここで、Ｘ１は、Ｄ又はＧであり、Ｘ２は、Ｓ又はＬであり、Ｘ３は、Ｔ又はＳであり、Ｘ４は、Ｄ又はＶであり、Ｘ５は、Ｖ又はＩであり、Ｘ６は、Ｓ又はＮであり、Ｘ７は、Ａ又はＦであり、Ｘ８は、Ｖ又はＬであり、Ｘ９は、Ｆ又はＴであり、Ｘ１０は、Ｙ又はＡであり、Ｘ１１は、Ｙ、Ｇ、Ｆ又はＳであり、Ｘ１２は、Ｌ、Ｙ、Ｆ又はＷであり、Ｘ１３は、Ｙ、Ｎ、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｆ又はＩであり、Ｘ１４は、Ｈ、Ｖ、Ｐ、Ｔ又はＩであり、Ｘ１５は、Ａ、Ｗ、Ｒ、Ｐ又はＴである。
【０３１２】
特定の態様では、Ｘ１は、Ｄであり、Ｘ２は、Ｓであり、Ｘ３は、Ｔである。別の態様では、Ｘ４は、Ｄであり、Ｘ５は、Ｖであり、Ｘ６は、Ｓであり、Ｘ７は、Ａであり、Ｘ８は、Ｖであり、Ｘ９は、Ｆであり、Ｘ１０は、Ｙであり、Ｘ１１は、Ｙであり、Ｘ１２は、Ｌであり、Ｘ１３は、Ｙであり、Ｘ１４は、Ｈであり、Ｘ１５は、Ａである。さらに別の態様では、Ｘ１は、Ｄであり、Ｘ２は、Ｓであり、Ｘ３は、Ｔであり、Ｘ４は、Ｄであり、Ｘ５は、Ｖであり、Ｘ６は、Ｓであり、Ｘ７は、Ａであり、Ｘ８は、Ｖであり、Ｘ９は、Ｆであり、Ｘ１０は、Ｙであり、Ｘ１１は、Ｙであり、Ｘ１２は、Ｌであり、Ｘ１３は、Ｙであり、Ｘ１４は、Ｈであり、Ｘ１５は、Ａである。
【０３１３】
さらなる態様において、重鎖可変領域は、（ＨＣ−ＦＲ１）−（ＨＶＲ−Ｈ１）−（ＨＣ−ＦＲ２）−（ＨＶＲ−Ｈ２）−（ＨＣＦＲ３）−（ＨＶＲ−Ｈ３）−（ＨＣ−ＦＲ４）としてＨＶＲの間に並置された１つ又は複数のフレームワーク配列を含み、軽鎖可変領域は、（ＬＣ−ＦＲ１）−（ＨＶＲ−Ｌ１）−（ＬＣ−ＦＲ２）−（ＨＶＲＬ２）−（ＬＣ−ＦＲ３）−（ＨＶＲ−Ｌ３）−（ＬＣ−ＦＲ４）としてＨＶＲの間に並置された１つ又は複数のフレームワーク配列を含む。一層さらなる態様では、フレームワーク配列は、ヒトコンセンサスフレームワーク配列に由来する。一層さらなる態様では、重鎖フレームワーク配列は、カバットサブグループＩ、ＩＩ又はＩＩＩ配列に由来する。一層さらなる態様では、重鎖フレームワーク配列は、ＶＨサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワークである。一層さらなる態様では、重鎖フレームワーク配列のうち１つ又は複数は、以下である：
ＨＣ−ＦＲ１  ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳ（配列番号２９５）
ＨＣ−ＦＲ２  ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶ（配列番号２９６）
ＨＣ−ＦＲ３  ＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号２９７）
ＨＣ−ＦＲ４  ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ（配列番号２９８）。
【０３１４】
一層さらなる態様では、軽鎖フレームワーク配列は、カバットκＩ、ＩＩ、ＩＩ又はＩＶサブグループ配列に由来する。一層さらなる態様では、軽鎖フレームワーク配列は、ＶＬκＩコンセンサスフレームワークである。一層さらなる態様では、軽鎖フレームワーク配列のうち１つ又は複数は、以下である：
ＬＣ−ＦＲ１  ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（配列番号３００）
ＬＣ−ＦＲ２  ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号３０１）
ＬＣ−ＦＲ３  ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣ（配列番号３０２）
ＬＣ−ＦＲ４  ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲ（配列番号３０３）。
【０３１５】
一層さらなる特定の態様では、抗体は、ヒト又はマウス定常領域をさらに含む。一層さらなる態様では、ヒト定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４からなる群から選択される。一層さらなる特定の態様では、ヒト定常領域は、ＩｇＧ１である。一層さらなる態様では、マウス定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ、ＩｇＧ３からなる群から選択される。一層さらなる態様では、マウス定常領域は、ＩｇＧ２Ａである。一層さらなる特定の態様では、抗体は、低減した又は最小のエフェクター機能を有する。一層さらなる特定の態様では、最小のエフェクター機能は、「エフェクターのないＦｃ突然変異」又は非グリコシル化に起因する。一層さらなる実施態様では、エフェクターのないＦｃ突然変異は、定常領域におけるＮ２９７Ａ又はＤ２６５Ａ／Ｎ２９７Ａ置換である。
【０３１６】
なお別の実施態様では、重鎖及び軽鎖可変領域配列を含む抗ＰＤＬ１抗体が提供され、ここで、
（ａ）重鎖は、それぞれＧＦＴＦＳＤＳＷＩＨ（配列番号２８９）、ＡＷＩＳＰＹＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２９０）、およびＲＨＷＰＧＧＦＤＹ（配列番号２９１）に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲＨ３配列をさらに含むか、又は
（ｂ）軽鎖は、それぞれ、ＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号２９２）、ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号２９３）およびＱＱＹＬＹＨＰＡＴ（配列番号２９４）に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３配列をさらに含み。
【０３１７】
特定の態様では、配列同一性は、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％である。別の態様では、重鎖可変領域は、（ＨＣＦＲ１）−（ＨＶＲ−Ｈ１）−（ＨＣ−ＦＲ２）−（ＨＶＲ−Ｈ２）−（ＨＣ−ＦＲ３）−（ＨＶＲ−Ｈ３）−（ＨＣ−ＦＲ４）としてＨＶＲの間に並置された１つ又は複数のフレームワーク配列を含み、軽鎖可変領域は、（ＬＣ−ＦＲ１）−（ＨＶＲ−Ｌ１）−（ＬＣ−ＦＲ２）−（ＨＶＲ−Ｌ２）−（ＬＣ−ＦＲ３）−（ＨＶＲ−Ｌ３）−（ＬＣ−ＦＲ４）としてＨＶＲの間に並置された１つ又は複数のフレームワーク配列を含む。さらに別の態様では、フレームワーク配列は、ヒトコンセンサスフレームワーク配列に由来する。一層さらなる態様では、重鎖フレームワーク配列は、カバットサブグループＩ、ＩＩ又はＩＩＩ配列に由来する。一層さらなる態様では、重鎖フレームワーク配列は、ＶＨサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワークである。一層さらなる態様では、重鎖フレームワーク配列のうちの１つ又は複数は、以下である：
ＨＣ−ＦＲ１  ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳ（配列番号２９５）
ＨＣ−ＦＲ２  ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶ（配列番号２９６）
ＨＣ−ＦＲ３  ＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号２９７）
ＨＣ−ＦＲ４  ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ（配列番号２９８）。
【０３１８】
一層さらなる態様では、軽鎖フレームワーク配列は、カバットκＩ、ＩＩ、ＩＩ又はＩＶサブグループ配列に由来する。一層さらなる態様では、軽鎖フレームワーク配列は、ＶＬκＩコンセンサスフレームワークである。一層さらなる態様では、軽鎖フレームワーク配列のうち１つ又は複数は、以下である：
ＬＣ−ＦＲ１  ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（配列番号３００）
ＬＣ−ＦＲ２  ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号３０１）
ＬＣ−ＦＲ３  ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣ（配列番号３０２）
ＬＣ−ＦＲ４  ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲ（配列番号３０３）。
【０３１９】
一層さらなる特定の態様では、抗体は、ヒト又はマウス定常領域をさらに含む。一層さらなる態様では、ヒト定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４からなる群から選択される。一層さらなる特定の態様では、ヒト定常領域は、ＩｇＧ１である。一層さらなる態様では、マウス定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ、ＩｇＧ３からなる群から選択される。一層さらなる態様では、マウス定常領域は、ＩｇＧ２Ａである。一層さらなる特定の態様では、抗体は、低減した又は最小のエフェクター機能を有する。一層さらなる特定の態様では、最小のエフェクター機能は、「エフェクターのないＦｃ突然変異」又は非グリコシル化に起因する。一層さらなる実施態様では、エフェクターのないＦｃ突然変異は、定常領域におけるＮ２９７Ａ又はＤ２６５Ａ／Ｎ２９７Ａ置換である。
【０３２０】
一層さらなる実施態様では、重鎖及び軽鎖可変領域配列を含む単離された抗ＰＤＬ１抗体が提供され、ここで、
（ａ）重鎖配列は、重鎖配列：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＳＷＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＷＩＳＰＹＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＨＷＰＧＧＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ（配列番号３８２）
に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するか、又は
（ｂ）軽鎖配列は、軽鎖配列：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ  ＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＬＹＨＰＡＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲ（配列番号３８３）
に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する。
【０３２１】
特定の態様では、配列同一性は、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％である。別の態様では、重鎖可変領域は、（ＨＣＦＲ１）−（ＨＶＲ−Ｈ１）−（ＨＣ−ＦＲ２）−（ＨＶＲ−Ｈ２）−（ＨＣ−ＦＲ３）−（ＨＶＲ−Ｈ３）−（ＨＣ−ＦＲ４）としてＨＶＲの間に並置された１つ又は複数のフレームワーク配列を含み、軽鎖可変領域は、（ＬＣ−ＦＲ１）−（ＨＶＲ−Ｌ１）−（ＬＣ−ＦＲ２）−（ＨＶＲ−Ｌ２）−（ＬＣ−ＦＲ３）−（ＨＶＲ−Ｌ３）−（ＬＣ−ＦＲ４）としてＨＶＲの間に並置された１つ又は複数のフレームワーク配列を含む。さらに別の態様では、フレームワーク配列は、ヒトコンセンサスフレームワーク配列に由来する。さらなる態様では、重鎖フレームワーク配列は、カバットサブグループＩ、ＩＩ又はＩＩＩ配列に由来する。一層さらなる態様では、重鎖フレームワーク配列は、ＶＨサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワークである。一層さらなる態様では、重鎖フレームワーク配列のうちの１つ又は複数は、以下である：
ＨＣ−ＦＲ１  ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳ（配列番号２９５）
ＨＣ−ＦＲ２  ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶ（配列番号２９６）
ＨＣ−ＦＲ３  ＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号２９７）
ＨＣ−ＦＲ４  ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ（配列番号２９８）。
【０３２２】
一層さらなる態様では、軽鎖フレームワーク配列は、カバットκＩ、ＩＩ、ＩＩ又はＩＶサブグループ配列に由来する。一層さらなる態様では、軽鎖フレームワーク配列は、ＶＬκＩコンセンサスフレームワークである。一層さらなる態様では、軽鎖フレームワーク配列のうち１つ又は複数は、以下である：
ＬＣ−ＦＲ１  ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（配列番号３００）
ＬＣ−ＦＲ２  ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号３０１）
ＬＣ−ＦＲ３  ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣ（配列番号３０２）
ＬＣ−ＦＲ４  ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲ（配列番号３０３）。
【０３２３】
一層さらなる特定の態様では、抗体は、ヒト又はマウス定常領域をさらに含む。一層さらなる態様では、ヒト定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４からなる群から選択される。一層さらなる特定の態様では、ヒト定常領域は、ＩｇＧ１である。一層さらなる態様では、マウス定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ、ＩｇＧ３からなる群から選択される。一層さらなる態様では、マウス定常領域は、ＩｇＧ２Ａである。一層さらなる特定の態様では、抗体は、低減された又は最小のエフェクター機能を有する。一層さらなる特定の態様では、最小のエフェクター機能は、原核細胞における製造に起因する。一層さらなる特定の態様では、最小のエフェクター機能は、「エフェクターのないＦｃ突然変異」又は非グリコシル化に起因する。一層さらなる実施態様では、エフェクターのないＦｃ突然変異は、定常領域におけるＮ２９７Ａ又はＤ２６５Ａ／Ｎ２９７Ａ置換である。
【０３２４】
別のさらなる実施態様では、重鎖及び軽鎖可変領域配列を含む単離された抗ＰＤＬ１抗体が提供され、ここで、
（ａ）重鎖配列は、重鎖配列：ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＳＷＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＷＩＳＰＹＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＨＷＰＧＧＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号２８０）に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するか、又は
（ｂ）軽鎖配列は、軽鎖配列：ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ  ＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＬＹＨＰＡＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲ（配列番号３８３）に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する。
【０３２５】
一層さらなる実施態様では、重鎖及び軽鎖可変領域配列を含む単離された抗ＰＤＬ１抗体が提供され、ここで、
（ａ）重鎖配列は、重鎖配列：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＳＷＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＷＩＳＰＹＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＨＷＰＧＧＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫ（配列番号２８１）
に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するか、又は
（ｂ）軽鎖配列は、軽鎖配列：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦ
ＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＬＹＨＰＡＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲ（配列番号２８２）
に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する。
【０３２６】
特定の態様では、配列同一性は、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％である。別の態様では、重鎖可変領域は、（ＨＣＦＲ１）−（ＨＶＲ−Ｈ１）−（ＨＣ−ＦＲ２）−（ＨＶＲ−Ｈ２）−（ＨＣ−ＦＲ３）−（ＨＶＲ−Ｈ３）−（ＨＣ−ＦＲ４）としてＨＶＲの間に並置された１つ又は複数のフレームワーク配列を含み、軽鎖可変領域は、（ＬＣ−ＦＲ１）−（ＨＶＲ−Ｌ１）−（ＬＣ−ＦＲ２）−（ＨＶＲ−Ｌ２）−（ＬＣ−ＦＲ３）−（ＨＶＲ−Ｌ３）−（ＬＣ−ＦＲ４）としてＨＶＲの間に並置された１つ又は複数のフレームワーク配列を含む。さらに別の態様では、フレームワーク配列は、ヒトコンセンサスフレームワーク配列に由来する。さらなる態様では、重鎖フレームワーク配列は、カバットサブグループＩ、ＩＩ又はＩＩＩ配列に由来する。一層さらなる態様では、重鎖フレームワーク配列は、ＶＨサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワークである。一層さらなる態様では、重鎖フレームワーク配列のうちの１つ又は複数は、以下である：
ＨＣ−ＦＲ１  ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳ（配列番号２９５）
ＨＣ−ＦＲ２  ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶ（配列番号２９６）
ＨＣ−ＦＲ３  ＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号２９７）
ＨＣ−ＦＲ４  ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号２９９）。
【０３２７】
一層さらなる態様では、軽鎖フレームワーク配列は、カバットκＩ、ＩＩ、ＩＩ又はＩＶサブグループ配列に由来する。一層さらなる態様では、軽鎖フレームワーク配列は、ＶＬκＩコンセンサスフレームワークである。一層さらなる態様では、軽鎖フレームワーク配列のうち１つ又は複数は、以下である：
ＬＣ−ＦＲ１  ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（配列番号３００）
ＬＣ−ＦＲ２  ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号３０１）
ＬＣ−ＦＲ３  ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣ（配列番号３０２）
ＬＣ−ＦＲ４  ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲ（配列番号３０３）。
【０３２８】
一層さらなる特定の態様では、抗体は、ヒト又はマウス定常領域をさらに含む。一層さらなる態様では、ヒト定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４からなる群から選択される。一層さらなる特定の態様では、ヒト定常領域は、ＩｇＧ１である。一層さらなる態様では、マウス定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ、ＩｇＧ３からなる群から選択される。一層さらなる態様では、マウス定常領域は、ＩｇＧ２Ａである。一層さらなる特定の態様では、抗体は、低減された又は最小のエフェクター機能を有する。一層さらなる特定の態様では、最小のエフェクター機能は、原核細胞における製造に起因する。一層さらなる特定の態様では、最小のエフェクター機能は、「エフェクターのないＦｃ突然変異」又は非グリコシル化に起因する。一層さらなる実施態様では、エフェクターのないＦｃ突然変異は、定常領域におけるＮ２９７Ａ又はＤ２６５Ａ／Ｎ２９７Ａ置換である。
【０３２９】
なお別の実施態様では、抗ＰＤＬ１抗体は、ＭＰＤＬ３２８０Ａ（ＣＡＳ登録番号：１４２２１８５−０６−５）である。一層さらなる実施態様では、配列番号２４又は配列番号２８に由来する重鎖可変領域アミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び／又は配列番号２１に由来する軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む単離された抗ＰＤＬ１抗体が、提供される。一層さらなる実施態様では、重鎖及び／又は軽鎖配列を含む単離された抗ＰＤＬ１抗体が提供され、ここで
（ａ）重鎖配列は、重鎖配列：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＳＷＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＷＩＳＰＹＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＨＷＰＧＧＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＡＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号２７８）
に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するか、又は
（ｂ）軽鎖配列は、軽鎖配列：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＬＹＨＰＡＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号２７９）
に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有する。
【０３３０】
一層さらなる実施態様では、本発明は、少なくとも１種の薬学的に許容される担体と組み合わせて上記の抗ＰＤＬ１抗体のいずれかを含む組成物を提供する。
【０３３１】
一層さらなる実施態様では、抗ＰＤＬ１抗体の軽鎖又は重鎖可変領域配列をコードする単離された核酸が提供され、ここで
（ａ）重鎖は、それぞれ、ＧＦＴＦＳＤＳＷＩＨ（配列番号２８９）、ＡＷＩＳＰＹＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２９０）およびＲＨＷＰＧＧＦＤＹ（配列番号２９１）に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲＨ３配列をさらに含み、
（ｂ）軽鎖は、それぞれ、
ＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号２９２）、ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号２９３）およびＱＱＹＬＹＨＰＡＴ（配列番号２９４）に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３配列をさらに含む。
【０３３２】
特定の態様では、配列同一性は、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％である。態様では、重鎖可変領域は、（ＨＣ−ＦＲ１）−（ＨＶＲ−Ｈ１）−（ＨＣ−ＦＲ２）−（ＨＶＲ−Ｈ２）−（ＨＣ−ＦＲ３）−（ＨＶＲ−Ｈ３）−（ＨＣ−ＦＲ４）としてＨＶＲの間に並置された１つ又は複数のフレームワーク配列を含み、軽鎖可変領域は、（ＬＣＦＲ１）−（ＨＶＲ−Ｌ１）−（ＬＣ−ＦＲ２）−（ＨＶＲ−Ｌ２）−（ＬＣ−ＦＲ３）−（ＨＶＲ−Ｌ３）−（ＬＣ−ＦＲ４）としてＨＶＲの間に並置された１つ又は複数のフレームワーク配列を含む。さらに別の態様では、フレームワーク配列は、ヒトコンセンサスフレームワーク配列に由来する。さらなる態様において、重鎖フレームワーク配列は、カバットサブグループＩ、ＩＩ又はＩＩＩ配列に由来する。一層さらなる態様では、重鎖フレームワーク配列は、ＶＨサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワークである。一層さらなる態様では、重鎖フレームワーク配列のうち１つ又は複数は以下である：
ＨＣ−ＦＲ１  ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳ（配列番号２９５）
ＨＣ−ＦＲ２  ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶ（配列番号２９６）
ＨＣ−ＦＲ３  ＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号２９７）
ＨＣ−ＦＲ４  ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ（配列番号２９８）。
【０３３３】
一層さらなる態様では、軽鎖フレームワーク配列は、カバットκＩ、ＩＩ、ＩＩ又はＩＶサブグループ配列に由来する。一層さらなる態様では、軽鎖フレームワーク配列は、ＶＬκＩコンセンサスフレームワークである。一層さらなる態様では、軽鎖フレームワーク配列のうち１つ又は複数は以下である：
ＬＣ−ＦＲ１  ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（配列番号３００）
ＬＣ−ＦＲ２  ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号３０１）
ＬＣ−ＦＲ３  ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣ（配列番号３０２）
ＬＣ−ＦＲ４  ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲ（配列番号３０３）。
【０３３４】
一層さらなる特定の態様では、本明細書において記載される抗体（抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤＬ１抗体又は抗ＰＤＬ２抗体など）は、ヒト又はマウス定常領域をさらに含む。一層さらなる態様では、ヒト定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４からなる群から選択される。一層さらなる特定の態様では、ヒト定常領域は、ＩｇＧ１である。一層さらなる態様では、マウス定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ、ＩｇＧ３からなる群から選択される。一層さらなる態様では、マウス定常領域は、ＩｇＧ２Ａである。一層さらなる特定の態様では、抗体は、低減された又は最小のエフェクター機能を有する。一層さらなる特定の態様では、最小のエフェクター機能は、原核細胞における製造に起因する。一層さらなる特定の態様では、最小のエフェクター機能は、「エフェクターのないＦｃ突然変異」又は非グリコシル化に起因する。一層さらなる態様では、エフェクターのないＦｃ突然変異は、定常領域におけるＮ２９７Ａ又はＤ２６５Ａ／Ｎ２９７Ａ置換である。
【０３３５】
一層さらなる態様では、本明細書において記載される抗体のいずれかをコードする核酸が提供される。いくつかの実施態様では、核酸は、これまでに記載された抗ＰＤＬ１、抗ＰＤ−１又は抗ＰＤＬ２抗体のいずれかをコードする核酸の発現に適したベクターをさらに含む。一層さらなる特定の態様では、ベクターは、核酸の発現に適した宿主細胞をさらに含む。一層さらなる特定の態様では、宿主細胞は、真核細胞又は原核細胞である。一層さらなる特定の態様では、真核細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）などの哺乳動物細胞である。
【０３３６】
抗体又はその抗原結合断片は、当該技術分野で公知の方法を使用して、例えば、発現に適した形態の、これまでに記載された抗ＰＤＬ１、抗ＰＤ−１又は抗ＰＤＬ２抗体又は抗原結合断片のいずれかをコードする核酸を含有する宿主細胞を、このような抗体又は断片を製造するのに適した条件下で培養すること及び抗体又は断片を回収することを含むプロセスによって製造できる。
【０３３７】
いくつかの実施態様では、単離された抗ＰＤＬ１抗体は、グリコシル化されていない（aglycosylated）。
【０３３８】
抗体のグリコシル化は、通常、Ｎ結合型又はＯ結合型の何れかである。Ｎ結合型とは、アスパラギン残基の側鎖との炭水化物部分の結合を指す。トリペプチド配列アスパラギン−Ｘ−セリン及びアスパラギン−Ｘ−スレオニン（式中、Ｘは、プロリンを除く任意のアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖との炭水化物部分の酵素的結合のための認識配列である。したがって、これらのトリペプチド配列のいずれかが存在すると、潜在的グリコシル化部位が生じる。Ｏ結合型グリコシル化とは、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリン又はスレオニンとの糖類Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース又はキシロースのうち１種との結合をさすが、５−ヒドロキシプロリン又は５−ヒドロキシリジンも使用され得る。抗体からのグリコシル化部位の除去は、簡便には、上記のトリペプチド配列（Ｎ結合グリコシル化部位の）が除去されるようにアミノ酸配列を変更することによって達成される。変更は、グリコシル化部位内のアスパラギン、セリン又はスレオニン残基の別のアミノ酸残基（例えば、グリシン、アラニン又は保存的置換）との置換によって行うことができる。
【０３３９】
本明細書における実施態様のいずれかにおいて、単離された抗ＰＤＬ１抗体は、ヒトＰＤＬ１、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ寄託番号Ｑ９ＮＺＱ７．１において示されるようなヒトＰＤＬ１又はその変異体と結合できる。
【０３４０】
一層さらなる実施態様では、本発明は、本明細書において提供されるような抗ＰＤＬ１、抗ＰＤ−１又は抗ＰＤＬ２抗体又はその抗原結合断片及び少なくとも１種の薬学的に許容される担体を含む組成物を提供する。いくつかの実施態様では、個体に投与される抗ＰＤＬ１、抗ＰＤ−１又は抗ＰＤＬ２抗体又はその抗原結合断片は、１種又は複数の薬学的に許容される担体を含む組成物である。
【０３４１】
本明細書において記載される、又は当該技術分野で公知の薬学的に許容される担体のいずれも、使用できる。
【０３４２】
いくつかの実施態様では、本明細書において記載される抗ＰＤＬ１抗体は、約６０ｍｇ／ｍＬの量の抗体、約２０ｍＭの濃度のヒスチジンアセテート、約１２０ｍＭの濃度のスクロース及び０．０４％（ｗ／ｖ）の濃度のポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０）を含む製剤中にあり、製剤は、約５．８のｐＨを有する。いくつかの実施態様では、本明細書において記載される抗ＰＤＬ１抗体は、約１２５ｍｇ／ｍＬの量の抗体、約２０ｍＭの濃度のヒスチジンアセテート、約２４０ｍＭの濃度のスクロース及び０．０２％（ｗ／ｖ）の濃度のポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０）を含む製剤中にあり、製剤は、約５．５のｐＨを有する。
【０３４３】
本発明において使用するための例示的ＴＩＭ３アンタゴニスト
個体に有効量のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子、ＰＤ−１軸結合アンタゴニスト及びＴＩＭ−３アンタゴニストを投与することを含む、個体においてがんの進行を治療又は遅延するための方法が、本明細書において提供される。一実施態様では、ＴＩＭ−３アンタゴニストは、抗ＴＩＭ−３抗体である。いくつかの実施態様では、抗ＴＩＭ３は、ＦＡＣＳ解析によって調べられるように、３７℃で１２０分後に、少なくとも４５％の細胞上で発現されたＴＩＭ３の内部移行を誘導する。細胞は、例えば、ＲＰＭＩ８２２６細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ−１５５（商標））である。一実施態様では、抗体は、ＦＡＣＳ解析によって調べられるように、３７℃で１２０分後に、少なくとも５５％のＴＩＭ３を発現するＲＰＭＩ８２２６細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ−１５５（商標））上でＴＩＭ３の内部移行を誘導する。一実施態様では、抗体は、ＦＡＣＳ解析によって調べられるように、３７℃で２４０分後に、少なくとも６０％のＴＩＭ３を発現するＲＰＭＩ８２２６細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ−１５５（商標））上でＴＩＭ３の内部移行を誘導する。一実施態様では、抗体は、ＦＡＣＳ解析によって調べられるように、３７℃で２４０分後に、少なくとも６５％のＴＩＭ３を発現するＲＰＭＩ８２２６細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ−１５５（商標））上でＴＩＭ３の内部移行を誘導する。
【０３４４】
いくつかの実施態様では、抗ＴＩＭ３抗体は、ＴＩＭ３との結合について、Ｔｉｍ３＿００１６のＶＨ及びＶＬを含む抗Ｔｉｍ３抗体と競合する。いくつかの実施態様では、抗ＴＩＭ３抗体は、ヒト及びカニクイザルＴＩＭ３と結合する。いくつかの実施態様では、抗ＴＩＭ３抗体は、イムノコンジュゲートとして、ＴＩＭ３発現細胞に対して細胞傷害活性を示す。１つのこのような実施態様では、イムノコンジュゲートは、０．１以下のシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素Ａコンジュゲートとして、ＲＰＭＩ−８２２６細胞に対する細胞傷害活性の比ＩＣ５０値を有する。一実施態様では、抗ＴＩＭ３抗体は、ＭＬＲアッセイによって調べられるように、インターフェロンガンマ放出を誘導する。
【０３４５】
特定の実施態様では、抗ＴＩＭ３抗体は、ヒト及びカニクイザルＴＩＭ３と結合し、ＭＬＲアッセイによって調べられるように、インターフェロンガンマ放出を誘導する。
【０３４６】
一実施態様では、抗ＴＩＭ３抗体は、（ａ）配列番号３０４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号３０５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）配列番号３０６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）配列番号３０７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１又は配列番号３１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号３１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号３０８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｆ）配列番号３０９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つのＨＶＲを含む。
【０３４７】
一実施態様では、抗ＴＩＭ３抗体は、（ａ）配列番号３０４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号３０５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）配列番号３０６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）配列番号３０７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１又は配列番号３１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１又は配列番号３１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号３０８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｆ）配列番号３０９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【０３４８】
一実施態様では、抗ＴＩＭ３抗体は、（ａ）配列番号３０４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号３０５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）配列番号３０６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）配列番号３０７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号３０８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｆ）配列番号３０９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【０３４９】
一実施態様では、抗ＴＩＭ３抗体は、（ａ）配列番号３０４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号３０５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）配列番号３０６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）配列番号３１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号３０８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｆ）配列番号３０９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【０３５０】
一実施態様では、抗ＴＩＭ３抗体は、（ａ）配列番号３０４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号３０５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）配列番号３０６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）配列番号３１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号３０８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｆ）配列番号３０９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【０３５１】
一実施態様では、抗ＴＩＭ３抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号３０４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３０５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２及び（ｉｉｉ）配列番号３０６から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ又は３つのＶＨ  ＨＶＲ配列すべてを含むＶＨドメイン及び（ｂ）（ｉ）配列番号３０７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１又は配列番号３１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１又は配列番号３１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号３０８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｃ）配列番号３０９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ又は３つのＶＬ  ＨＶＲ配列すべてを含むＶＬドメインを含む。
【０３５２】
一実施態様では、抗ＴＩＭ３抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号３０４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３０５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２及び（ｉｉｉ）配列番号３０６から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン並びに（ｂ）（ｉ）配列番号３０７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１又は配列番号３１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１又は配列番号３１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号３０８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号３０９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含む。
【０３５３】
一実施態様では、抗ＴＩＭ３抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号３０４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３０５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２及び（ｉｉｉ）配列番号３０６から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン並びに（ｂ）（ｉ）配列番号３０７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号３０８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号３０９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含む。
【０３５４】
一実施態様では、抗ＴＩＭ３抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号３０４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３０５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２及び（ｉｉｉ）配列番号３０６から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン並びに（ｂ）（ｉ）配列番号３１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号３０８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号３０９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含む。
【０３５５】
一実施態様では、抗ＴＩＭ３抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号３０４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３０５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２及び（ｉｉｉ）配列番号３０６から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン並びに（ｂ）（ｉ）配列番号３１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号３０８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号３０９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含む。
【０３５６】
一実施態様では、このような抗ＴＩＭ３抗体は、
ｉ）配列番号３１０のＶＨ配列及び配列番号３１１のＶＬ配列を含み、
ｉｉ）配列番号３１２のＶＨ配列及び配列番号３１３のＶＬ配列を含み、
ｉｉｉ）又はｉ）若しくはｉｉ）の下で抗体のＶＨ及びＶＬのヒト化変異体を含む。
【０３５７】
一実施態様では、抗ＴＩＭ３抗体は、（ａ）配列番号３１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号３１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）配列番号３１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）配列番号３１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号３２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｆ）配列番号３２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つのＨＶＲを含む。
【０３５８】
一実施態様では、抗ＴＩＭ３抗体は、（ａ）配列番号３１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号３１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）配列番号３１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）配列番号３１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号３２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｆ）配列番号３２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【０３５９】
一実施態様では、抗ＴＩＭ３抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号３１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２及び（ｉｉｉ）配列番号３１８から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ又は３つのＶＨ  ＨＶＲ配列すべてを含むＶＨドメイン並びに（ｂ）（ｉ）配列番号３１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号３２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｃ）配列番号３２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ又は３つのＶＬ  ＨＶＲ配列すべてを含むＶＬドメインを含む。
【０３６０】
一実施態様では、抗ＴＩＭ３抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号３１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２及び（ｉｉｉ）配列番号３１８から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン並びに（ｂ）（ｉ）配列番号３１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号３２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号３２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含む。
【０３６１】
一実施態様では、このような抗ＴＩＭ３抗体は、
ｉ）配列番号３２２のＶＨ配列及び配列番号３２３のＶＬ配列を含み、
ｉｉ）ｉ）の下で抗体のＶＨ及びＶＬのヒト化変異体を含む。
【０３６２】
一実施態様では、抗ＴＩＭ３抗体は、（ａ）配列番号３２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号３２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）配列番号３２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）配列番号３２７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号３２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｆ）配列番号３２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つのＨＶＲを含む。
【０３６３】
一実施態様では、抗ＴＩＭ３抗体は、（ａ）配列番号３２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号３２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）配列番号３２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）配列番号３２７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号３２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｆ）配列番号３２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【０３６４】
一実施態様では、抗ＴＩＭ３抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号３２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２及び（ｉｉｉ）配列番号３２６から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ又は３つのＶＨ  ＨＶＲ配列すべてを含むＶＨドメイン並びに（ｂ）（ｉ）配列番号３２７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号３２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｃ）配列番号３２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ又は３つのＶＬ  ＨＶＲ配列すべてを含むＶＬドメインを含む。
【０３６５】
一実施態様では、抗ＴＩＭ３抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号３２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２及び（ｉｉｉ）配列番号３２６から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン並びに（ｂ）（ｉ）配列番号３２７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号３２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号３２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含む。
【０３６６】
一実施態様では、このような抗ＴＩＭ３抗体は、
ｉ）配列番号３３０のＶＨ配列及び配列番号３３１のＶＬ配列を含み、
ｉｉ）ｉ）の下で抗体のＶＨ及びＶＬのヒト化変異体を含む。
【０３６７】
一実施態様では、抗ＴＩＭ３抗体は、（ａ）配列番号３３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号３３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）配列番号３３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）配列番号３３５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号３３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｆ）配列番号３３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つのＨＶＲを含む。
【０３６８】
一実施態様では、抗ＴＩＭ３抗体は、（ａ）配列番号３３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号３３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）配列番号３３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）配列番号３３５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号３３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｆ）配列番号３３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【０３６９】
一実施態様では、抗ＴＩＭ３抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号３３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２及び（ｉｉｉ）配列番号３３４から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ又は３つのＶＨ  ＨＶＲ配列すべてを含むＶＨドメイン並びに（ｂ）（ｉ）配列番号３３５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号３３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｃ）配列番号３３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ又は３つのＶＬ  ＨＶＲ配列すべてを含むＶＬドメインを含む。
【０３７０】
一実施態様では、抗ＴＩＭ３抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号３３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２及び（ｉｉｉ）配列番号３３４から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン並びに（ｂ）（ｉ）配列番号３３５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号３３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号３３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含む。
【０３７１】
一実施態様では、このような抗ＴＩＭ３抗体は、
ｉ）配列番号３３８のＶＨ配列及び配列番号３３９のＶＬ配列を含み、
ｉｉ）ｉ）の下で抗体のＶＨ及びＶＬのヒト化変異体を含む。
【０３７２】
一態様では、本発明は、（ａ）配列番号３４０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号３４１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）配列番号３４２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）配列番号３４３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号３４４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｆ）配列番号３４５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つのＨＶＲを含む抗ＴＩＭ３抗体を提供する。
【０３７３】
一実施態様では、抗ＴＩＭ３抗体は、（ａ）配列番号３４０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号３４１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）配列番号３４２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）配列番号３４３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号３４４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｆ）配列番号３４５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【０３７４】
一実施態様では、抗ＴＩＭ３抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号３４０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３４１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２及び（ｉｉｉ）配列番号３４２から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ又は３つのＶＨ  ＨＶＲ配列すべてを含むＶＨドメイン並びに（ｂ）（ｉ）配列番号３４３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号３４４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｃ）配列番号３４５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ又は３つのＶＬ  ＨＶＲ配列すべてを含むＶＬドメインを含む。
【０３７５】
一実施態様では、抗ＴＩＭ３抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号３４０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３４１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２及び（ｉｉｉ）配列番号３４２から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン並びに（ｂ）（ｉ）配列番号３４３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号３４４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号３４５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含む。
【０３７６】
一実施態様では、このような抗ＴＩＭ３抗体は、
ｉ）配列番号３４６のＶＨ配列及び配列番号３４７のＶＬ配列を含み、
ｉｉ）ｉ）の下で抗体のＶＨ及びＶＬのヒト化変異体を含む。
【０３７７】
一実施態様では、抗ＴＩＭ３抗体は、（ａ）配列番号３４８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号３４９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）配列番号３５０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）配列番号３５１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号３５２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｆ）配列番号３５３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つのＨＶＲを含む。
【０３７８】
一態様では、本発明は、（ａ）配列番号３４８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号３４９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）配列番号３５０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）配列番号３５１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号３５２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｆ）配列番号３５３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む抗ＴＩＭ３抗体を提供する。
【０３７９】
一実施態様では、抗ＴＩＭ３抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号３４８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３４９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２及び（ｉｉｉ）配列番号３５０から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ又は３つのＶＨ  ＨＶＲ配列すべてを含むＶＨドメイン並びに（ｂ）（ｉ）配列番号３５１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号３５２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｃ）配列番号３５３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ又は３つのＶＬ  ＨＶＲ配列すべてを含むＶＬドメインを含む。
【０３８０】
一実施態様では、抗ＴＩＭ３抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号３４８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３４９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２及び（ｉｉｉ）配列番号３５０から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン並びに（ｂ）（ｉ）配列番号３５１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号３５２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号３５３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含む。
【０３８１】
一実施態様では、このような抗ＴＩＭ３抗体は、
ｉ）配列番号３５４のＶＨ配列及び配列番号３５５のＶＬ配列を含み、
ｉｉ）ｉ）の下で抗体のＶＨ及びＶＬのヒト化変異体を含む。
【０３８２】
一実施態様では、抗ＴＩＭ３抗体は、（ａ）配列番号３５６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号３５７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）配列番号３５８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）配列番号３５９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号３６０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｆ）配列番号３６１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つのＨＶＲを含む。
【０３８３】
一実施態様では、抗ＴＩＭ３抗体は、（ａ）配列番号３５６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号３５７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）配列番号３５８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）配列番号３５９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号３６０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｆ）配列番号３６１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【０３８４】
一実施態様では、抗ＴＩＭ３抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号３５６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３５７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２及び（ｉｉｉ）配列番号３５８から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ又は３つのＶＨ  ＨＶＲ配列すべてを含むＶＨドメイン並びに（ｂ）（ｉ）配列番号３５９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号３６０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｃ）配列番号３６１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ又は３つのＶＬ  ＨＶＲ配列すべてを含むＶＬドメインを含む。
【０３８５】
一実施態様では、抗ＴＩＭ３抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号３５６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３５７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２及び（ｉｉｉ）配列番号３５８から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン並びに（ｂ）（ｉ）配列番号３５９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号３６０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号３６１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含む。
【０３８６】
一実施態様では、このような抗ＴＩＭ３抗体は、
ｉ）配列番号３６２のＶＨ配列及び配列番号３６３のＶＬ配列を含み、
ｉｉ）ｉ）の下で抗体のＶＨ及びＶＬのヒト化変異体を含む。
【０３８７】
一実施態様では、抗ＴＩＭ３抗体は、（ａ）配列番号３６４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号３６５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）配列番号３６６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）配列番号３６７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号３６８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｆ）配列番号３６９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つのＨＶＲを含む。
【０３８８】
一実施態様では、抗ＴＩＭ３抗体は、（ａ）配列番号３６４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号３６５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）配列番号３６６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）配列番号３６７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号３６８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｆ）配列番号３６９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【０３８９】
一実施態様では、抗ＴＩＭ３抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号３６４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３６５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２及び（ｉｉｉ）配列番号３６６から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ又は３つのＶＨ  ＨＶＲ配列すべてを含むＶＨドメイン並びに（ｂ）（ｉ）配列番号３６７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号３６８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｃ）配列番号３６９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ又は３つのＶＬ  ＨＶＲ配列すべてを含むＶＬドメインを含む。
【０３９０】
一実施態様では、抗ＴＩＭ３抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号３６４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３６５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２及び（ｉｉｉ）配列番号３６６から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン並びに（ｂ）（ｉ）配列番号３６７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号３６８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号３６９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含む。
【０３９１】
一実施態様では、このような抗ＴＩＭ３抗体は、
ｉ）配列番号３７０のＶＨ配列及び配列番号３７１のＶＬ配列を含み、
ｉｉ）ｉ）の下で抗体のＶＨ及びＶＬのヒト化変異体を含む。
【０３９２】
上記の実施態様のいずれかでは、抗ＴＩＭ３抗体は、ヒト化である。一実施態様では、抗ＴＩＭ３抗体は、上記の実施態様のいずれかにおけるようにＨＶＲを含み、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークをさらに含む。別の実施態様では、抗ＴＩＭ３抗体は、上記の実施態様のいずれかにおけるようにＨＶＲを含み、このようなＨＶＲを含むＶＨ及びＶＬをさらに含む。さらなる態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、本明細書において提供される抗ＴＩＭ３抗体と同一のエピトープと結合する。例えば、特定の実施態様では、抗ＴＩＭ３抗体は、配列番号３１０のＶＨ配列及び配列番号３１１のＶＬ配列を含む抗ＴＩＭ３抗体と同一のエピトープと結合する、又は抗ＴＩＭ３抗体は、配列番号３１２のＶＨ配列及び配列番号３１３のＶＬ配列を含む抗ＴＩＭ３抗体と同一のエピトープと結合する、又は配列番号３２２のＶＨ配列及び配列番号３２３のＶＬ配列を含む抗ＴＩＭ３抗体と同一のエピトープと結合する抗体が提供される、又は配列番号３３０のＶＨ配列及び配列番号３３１のＶＬ配列を含む抗ＴＩＭ３抗体と同一のエピトープと結合する抗体が提供される、又は配列番号３３８のＶＨ配列及び配列番号３３９のＶＬ配列を含む抗ＴＩＭ３抗体と同一のエピトープと結合する抗体が提供される、又は配列番号３４６のＶＨ配列及び配列番号３４７のＶＬ配列を含む抗ＴＩＭ３抗体と同一のエピトープと結合する抗体が提供される、又は配列番号３５４のＶＨ配列及び配列番号３５５のＶＬ配列を含む抗ＴＩＭ３抗体と同一のエピトープと結合する抗体が提供される、又は配列番号３６２のＶＨ配列及び配列番号３６３のＶＬ配列を含む抗ＴＩＭ３抗体と同一のエピトープと結合する抗体が提供される、又は配列番号３７０のＶＨ配列及び配列番号３７１のＶＬ配列を含むを含む抗ＴＩＭ３抗体と同一のエピトープと結合する抗体が提供される。１つの好ましい実施態様では、配列番号３１０のＶＨ配列及び配列番号３１１のＶＬ配列を含む抗ＴＩＭ３抗体と同一のエピトープと結合する抗体が提供される。
【０３９３】
一実施態様では、抗ＴＩＭ３は、ＴＩＭ３を発現するＲＰＭＩ−８２２６細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ−１５５（商標））を使用する競合アッセイにおいて調べられるように、ヒトＴＩＭ３との結合について、配列番号３１０のＶＨ配列及び配列番号３１１のＶＬ配列を含む抗ＴＩＭ３抗体と競合する。
【０３９４】
一実施態様では、上記の実施態様のいずれかの抗ＴＩＭ３抗体は、キメラ、ヒト化又はヒト抗体を含む、モノクローナル抗体である。一実施態様では、抗ＴＩＭ３抗体は、抗体断片、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ダイアボディー又はＦ（ａｂ’）２断片である。別の実施態様では、抗体は、全長抗体、例えば、インタクトなＩｇＧ１又はＩｇＧ４抗体又は本明細書において定義されるようなその他の抗体クラス若しくはアイソタイプである。
【０３９５】
さらなる態様において、上記の実施態様のいずれかの抗ＴＩＭ３抗体は、本明細書において記載されるように、特徴のいずれかを単一で又は組み合わせて組み込み得る。
【０３９６】
一実施態様では、抗ＴＩＭ３抗体は、国際公開第２０１１／１５５６０７号、国際公開第２０１３／００６４９０号、国際公開第０３／０６３７９２号、国際公開第２００９／０９７３９４号又は国際公開第２０１１／１５９８７７号に記載される抗体のいずれかである。一実施態様では、抗ＴＩＭ３抗体は、Ｆ３８−２Ｅ２である。いくつかの実施態様では、抗ＴＩＭ−３抗体は、ハイブリドーマ８Ｂ．２Ｃ１２及び２５Ｆ．１Ｄ６に由来する抗体であり、米国特許出願番号第２００４／０００５３２２号及び同２００５／０１９１７２１号、Ｓａｂａｔｏｓ，Ｃ．Ａ．等、Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．４：１１０２−１１１０、２００３及びＳａｎｃｈｅｚ−Ｆｕｅｙｏ，Ａ．等、Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．４：１０９３−１０１  ２００３に開示されるように調製され、それらのすべては、その全文が記載されるかのように参照により本明細書に組み込まれる。ＴＩＭ−３に対するその他の抗体は、具体的に考慮され、例えば、本明細書において開示される方法を用いて製造され得る。ＴＩＭ３ヒト配列のヌクレオチド及びタンパク質配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号ＡＦ２５１７０７．１及びＵｎｉｐｒｏｔ寄託番号Ｑ８ＴＤＱ０で見出すことができる。例示的ヒトＴＩＭ３アミノ酸配列は、配列番号３８０で記載され、例示的ヒトＴＩＭ３細胞外ドメインアミノ酸配列は、配列番号３８１で記載される。
【０３９７】
抗体調製物
上記のように、いくつかの実施態様では、ＰＤ−１結合アンタゴニストは、抗体（例えば、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤＬ１抗体又は抗ＰＤＬ２抗体）である。いくつかの実施態様では、ＴＩＭ３アンタゴニストは、抗体（例えば、抗ＴＩＭ３アンタゴニスト抗体）である。本明細書において記載された抗体は、抗体を作製するための当該技術分野で入手可能な技術を使用して調製でき、その例示的方法は、以下の節により詳細に記載されている。
【０３９８】
抗体は、対象の抗原に対するものである。例えば、抗体は、ＰＤ−１（ヒトＰＤ−１など）、ＰＤＬ１（ヒトＰＤＬ１など）、ＰＤＬ２（ヒトＰＤＬ２など）、ＴＩＭ３（ヒトＴＩＭ３など）に対するものであってよい。好ましくは、抗原は、生物学的に重要なポリペプチドであり、障害を患っている哺乳動物への抗体の投与は、その哺乳動物において治療的利益をもたらし得る。
【０３９９】
特定の実施態様では、本明細書において記載される抗体は、解離定数（Ｋｄ）が１μＭ、１５０ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、０．１ｎＭ、０．０１ｎＭ又は０．００１ｎＭ（例えば、１０−８Ｍ以下、例えば、１０−８Ｍ−１０−１３Ｍ、例えば、１０−９Ｍ−１０−１３Ｍ）である。
【０４００】
一実施態様では、Ｋｄは、以下のアッセイによって記載されるように、対象の抗体のＦａｂ型及びその抗原を用いて実施される放射標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）によって測定される。Ｆａｂの抗原に対する溶液結合親和性は、標識されていない抗原の滴定系列の存在下で、最小濃度の（１２５Ｉ）標識された抗原を用いてＦａｂを平衡化すること、次いで、抗Ｆａｂ抗体でコートされたプレートを用いて結合している抗原を捕捉することによって測定される（例えば、Chen等、J. Mol. Biol. 293:865-881（1999）を参照のこと）。アッセイの条件を確立するために、ＭＩＣＲＯＴＩＴＥＲ（登録商標）マルチウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、５０ｍＭの炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）中、５μｇ／ｍｌの捕捉抗Ｆａｂ抗体（Ｃａｐｐｅｌ  Ｌａｂｓ）を用いて一晩コーティングし、続いて、ＰＢＳ中、２％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンを用いて、室温（およそ２３℃）で２−５時間ブロッキングする。非吸着プレート（Ｎｕｎｃ番号２６９６２０）において、１００ｐＭ又は２６ｐＭの［１２５Ｉ］抗原を、対象のＦａｂの段階希釈と混合する。次いで、対象のＦａｂを一晩インキュベートする。しかし、平衡が達せられることを確実にするために、インキュベーションがより長い期間（例えば、約６５時間）継続することもある。その後、室温でのインキュベーションのために混合物を捕捉プレートに移す（例えば、１時間）。次いで、溶液を除去し、ＰＢＳ中、０．１％のポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標））を用いてプレートを８回洗浄する。プレートが乾燥した時点で、１５０μｌ／ウェルの閃光物質（ＭＩＣＲＯＳＣＩＮＴ−２０ＴＭ；Ｐａｃｋａｒｄ）を添加し、プレートをＴＯＰＣＯＵＮＴ  ＴＭγカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ）で１０分間カウントする。競合結合アッセイにおいて使用するために、２０％以下の最大結合をもたらす各Ｆａｂの濃度が選択される。
【０４０１】
別の実施態様によれば、Ｋｄは、２５℃で〜１０反応単位（ＲＵ）で固定化されている抗原ＣＭ５チップを用い、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−２０００又はＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ、Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を使用する表面プラズモン共鳴アッセイを使用して測定される。手短には、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ＢＩＡＣＯＲＥ、Ｉｎｃ．）を、供給業者の指示書に従ってＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を用いて活性化する。抗原を、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８を用いて、５μｇ／ｍｌ（〜０．２μＭ）に希釈し、その後、およそ１０反応単位（ＲＵ）のカップリングされたタンパク質を達成するように５μｌ／分の流速で注射する。抗原の注射後、１Ｍのエタノールアミンを注射して未反応基をブロックする。反応速度論測定のために、０．０５％ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ−２０ＴＭ）界面活性剤（ＰＢＳＴ）を有するＰＢＳ中のＦａｂの２倍段階希釈（０．７８ｎＭ−５００ｎＭ）を、２５℃でおよそ２５μｌ／分の流速で注射する。会合速度（ｋｏｎ）及び解離速度（ｋｏｆｆ）は、会合及び解離センサーグラムを同時にフィッティングすることによって、単純な１対１ラングミュア結合モデル（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）評価ソフトウェアバージョン３．２）を使用して算出する。平衡解離定数（Ｋｄ）は、比ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして算出する。例えば、Ｃｈｅｎ等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５−８８１（１９９９）を参照のこと。会合速度が、上記の表面プラズモン共鳴アッセイによって１０６Ｍ−１  ｓ−１を超える場合には、会合速度は、流動停止を備えた分光光度計（Ａｖｉｖ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）又は撹拌キュベットを備えた８０００シリーズＳＬＭ−ＡＭＩＮＣＯ  ＴＭ分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）などの分光計において測定されるように、漸増濃度の抗原の存在下で、ＰＢＳ、ｐＨ７．２中、２０ｎＭの抗抗原抗体（Ｆａｂ形態）の２５℃の蛍光放出強度（励起＝２９５ｎｍ；放出＝３４０ｎｍ、１６ｎｍ帯域通過）の増大又は減少を測定する蛍光消光技術を使用して決定できる。
【０４０２】
いくつかの実施態様では、本明細書において記載されるような抗ＴＩＭ３抗体は、ヒトＴＩＭ３に対して少なくとも１００ｐＭ以下の結合親和性、ヒトＴＩＭ３に対して少なくとも３００ｐＭ以下の結合親和性、ヒトＴＩＭ３に対して少なくとも４００ｐＭ以下の結合親和性、ヒトＴＩＭ３に対して少なくとも４０ｎＭ以下の中和能力、ヒトＴＩＭ３に対して少なくとも１２０ｎＭ以下の中和能力及びヒトＴＩＭ３に対して少なくとも３１ｎＭ以下の中和能力を示す。これらの実施態様では、結合親和性は、米国特許第８，７７１，６９７号に記載されるような表面プラズモン共鳴によって測定され得る。
【０４０３】
抗体断片
特定の実施態様では、本明細書において記載される抗体は、抗体断片である。抗体断片として、それだけには限らないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ及びｓｃＦｖ断片及び以下に記載されるその他の断片が挙げられる。特定の抗体断片の概説については、Ｈｕｄｓｏｎ等  Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）を参照のこと。ｓｃＦｖ断片の概説については、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ、ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、第１１３巻、Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ及びＭｏｏｒｅ編、（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、ｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照のこと;国際公開第９３／１６１８５号及び米国特許第５５７１８９４号及び同５５８７４５８号も参照のこと。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、インビボ半減期が増大したＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片の考察については、米国特許第５８６９０４６号を参照のこと。
【０４０４】
ダイアボディーは、二価又は二重特異性であり得る、２つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、欧州特許第４０４０９７号；国際公開第１９９３／０１１６１号；Ｈｕｄｓｏｎ等、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）；及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：６４４４−６４４８（１９９３）を参照のこと。トリアボディー及びテトラボディーはまた、Ｈｕｄｓｏｎ等、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）に記載されている。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインのすべて若しくは一部又は軽鎖可変ドメインのすべて若しくは一部を含む抗体断片である。特定の実施態様では、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ、Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ；例えば、米国特許第６２４８５１６Ｂ１号を参照のこと）。本明細書において記載されるような、抗体断片は、それだけには限らないが、インタクトな抗体のタンパク質分解消化並びに組換え宿主細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）又はファージ）による製造を含めた種々の技術によって作製できる。
【０４０５】
キメラ及びヒト化抗体
特定の実施態様では、本明細書において記載される抗体は、キメラ抗体である。特定のキメラ抗体は、例えば、米国特許第４８１６５６７号；及びＭｏｒｒｉｓｏｎ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：６８５１−６８５５（１９８４）に記載されている。一例では、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ又はサルなどの非ヒト霊長類に由来する可変領域）及びヒト定常領域を含む。さらなる実施例において、キメラ抗体は、クラス又はサブクラスが、親抗体のものから変更されている「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体は、その抗原結合断片を含む。特定の実施態様では、キメラ抗体は、ヒト化抗体である。通常、非ヒト抗体は、親の非ヒト抗体の特異性及び親和性を維持しながら、ヒトに対する免疫原性を低下させるようにヒト化される。一般に、ヒト化抗体は、１つ又は複数の可変ドメインを含み、これでは、ＨＶＲ、例えば、ＣＤＲ、（又はその一部）は、非ヒト抗体に由来し、ＦＲ（又はその一部）は、ヒト抗体配列に由来する。ヒト化抗体はまた、任意選択的に、ヒト定常領域の少なくとも一部を含む。いくつかの実施態様では、例えば、抗体特異性又は親和性を回復させる又は改善するように、ヒト化抗体中のいくつかのＦＲ残基が、非ヒト抗体（例えば、ＨＶＲ残基が由来する抗体）に由来する対応する残基で置換されている。
【０４０６】
ヒト化抗体及びそれらを作製する方法は、例えば、Ａｌｍａｇｒｏ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｓｓｏｎ、Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９−１６３３（２００８）に概説されており、例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ等、Ｎａｔｕｒｅ３３２：３２３−３２９（１９８８）；Ｑｕｅｅｎ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１００２９−１００３３（１９８９）；米国特許第５８２１３３７号、同７５２７７９１号、同６９８２３２１号及び同７０８７４０９号；Ｋａｓｈｍｉｒｉ等、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６：２５−３４（２００５）（ＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）グラフティングを記載する）；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：４８９−４９８（１９９１）（「リサーフェイシング」を記載する）；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ等、Ｍｅｔｈｏｄｓ３６：４３−６０（２００５）（「ＦＲシャッフリング」を記載する）；及びＯｓｂｏｕｒｎ等、Ｍｅｔｈｏｄｓ３６：６１−６８（２００５）及びＫｌｉｍｋａ等、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、８３：２５２−２６０（２０００）（ＦＲシャッフリングのための「誘導選択」手法を記載する）にさらに記載されている。
【０４０７】
ヒト化に使用できるヒトフレームワーク領域として、それだけには限らないが、「ベストフィット（ｂｅｓｔ−ｆｉｔ）」法を使用して選択されるフレームワーク領域（例えば、Sims等、J. Immunol. 151:2296（1993））；軽鎖又は重鎖可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワーク領域（例えば、Carter等 Proc. Natl. Acad. Sci. USA、89:4285（1992）；及びPresta等 J. Immunol.、151:2623（1993）を参照のこと）；ヒト成熟（体細胞性に成熟した）フレームワーク領域又はヒト生殖系列フレームワーク領域（例えば、Almagro and Fransson、Front. Biosci. 13:1619-1633（2008）を参照のこと）；及びＦＲライブラリーのスクリーニングに由来するフレームワーク領域（例えば、Baca等、J. Biol. Chem. 272:10678-10684（1997）及びRosok等、J. Biol. Chem. 271:22611-22618（1996）を参照のこと）が挙げられる。
【０４０８】
ヒト抗体
特定の実施態様では、本明細書において記載される抗体は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当該技術分野で公知の種々の技術を使用して製造できる。ヒト抗体は、全般的に、ｖａｎ  Ｄｉｊｋ及びｖａｎ  ｄｅ  Ｗｉｎｋｅｌ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５：３６８−７４（２００１）及びＬｏｎｂｅｒｇ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：４５０−４５９（２００８）に記載されている。
【０４０９】
ヒト抗体は、抗原投与に応じて、ヒト可変領域を有するインタクトなヒト抗体又はインタクトな抗体を産生するように修飾されているトランスジェニック動物に免疫原を投与することによって調製できる。このような動物は、通常、内因性免疫グロブリン遺伝子座と置き換わる、又は染色体外に存在する若しくは動物の染色体中に無作為に組み込まれる、ヒト免疫グロブリン遺伝子座のすべて又は一部を含有する。このようなトランスジェニックマウスでは、内因性免疫グロブリン遺伝子座は、一般に、不活性化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法の概説については、Ｌｏｎｂｅｒｇ、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３：１１１７−１１２５（２００５）を参照のこと。また、例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥＴＭ技術を記載する米国特許第６０７５１８１号及び同６１５０５８４号；ＨＵＭＡＢ（登録商標）技術を記載する米国特許第５７７０４２９号；Ｋ−Ｍマウス（登録商標）技術を記載する米国特許第７０４１８７０号及びＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を記載する米国特許出願公開番号第２００７／００６１９００号も参照のこと。このような動物によって作製されたインタクトな抗体に由来するヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることによってさらに修飾され得る。
【０４１０】
ヒト抗体はまた、ハイブリドーマに基づく方法によって作製できる。ヒトモノクローナル抗体の製造のためのヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株が記載されている。（例えば、Kozbor J. Immunol.133:3001（1984）;Brodeur等、Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications、p.51-63（Marcel Dekker、Inc.、New York、1987）；及びBoerner等、J. Immunol.147:86（1991）を参照のこと）。ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術によって作製されたヒト抗体もまた、Ｌｉ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０３：３５５７−３５６２（２００６）に記載されている。さらなる方法として、例えば、米国特許第７１８９８２６号（ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の製造を記載する）及びＮｉ、Ｘｉａｎｄａｉ  Ｍｉａｎｙｉｘｕｅ、２６（４）：２６５−２６８（２００６）（ヒトヒトハイブリドーマを記載する）に記載されたものが挙げられる。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）もまた、Ｖｏｌｌｍｅｒｓ及びＢｒａｎｄｌｅｉｎ、Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ、２０（３）：９２７−９３７（２００５）及びＶｏｌｌｍｅｒｓ及びＢｒａｎｄｌｅｉｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｆｉｎｄｉｎｇｓ  ｉｎ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、２７（３）：１８５−９１（２００５）に記載されている。
【０４１１】
ヒト抗体はまた、ヒト由来ファージディスプレイライブラリーから選択されるＦｖクローン可変ドメイン配列を単離することによって作製され得る。このような可変ドメイン配列は、次いで、所望のヒト定常ドメインと組み合され得る。抗体ライブラリーからヒト抗体を選択するための技術は、以下に記載されている。
【０４１２】
ライブラリー由来抗体
抗体は、所望の活性（単数又は複数）を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって単離できる。例えば、ファージディスプレイライブラリーを作製し、所望の結合特性を有する抗体についてこのようなライブラリーをスクリーニングするための種々の方法が、当該技術分野で公知である。このような方法は、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ１７８：１−３７中のＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍ等（O’Brien等、編、Human Press、Totowa、NJ、2001）に概説されており、例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ等、Ｎａｔｕｒｅ３４８：５５２−５５４；Ｃｌａｃｋｓｏｎ等、Ｎａｔｕｒｅ３５２：６２４−６２８（１９９１）；Ｍａｒｋｓ等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９２）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ２４８：１６１−１７５中のＭａｒｋｓ及びＢｒａｄｂｕｒｙ（Lo編、Human Press、Totowa、NJ、2003）；Ｓｉｄｈｕ等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３８（２）：２９９−３１０（２００４）；Ｌｅｅ等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０（５）：１０７３−１０９３（２００４）；Ｆｅｌｌｏｕｓｅ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０１（３４）：１２４６７−１２４７２（２００４）；及びＬｅｅ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ２８４（１−２）：１１９−１３２（２００４）にさらに記載されている。
【０４１３】
特定のファージディスプレイ法では、Ｗｉｎｔｅｒ等、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１２：４３３−４５５（１９９４）に記載されるように、ＶＨ及びＶＬ遺伝子のレパートリーを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって別個にクローニングし、ファージライブラリーにおいてランダムに組み換え、次いで、これを、抗原結合ファージについてスクリーニングすることができる。ファージは、通常、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片として、又はＦａｂ断片のいずれかとして、抗体断片をディスプレイする。免疫処置された供給源から得たライブラリーは、ハイブリドーマを構築する必要性を伴わずに免疫原に対する高親和性抗体を提供する。あるいは、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ等、ＥＭＢＯ  Ｊ、１２：７２５−７３４（１９９３）によって記載されるように、任意の免疫処置を伴わずに、広範な非自己及び自己抗原に対する抗体の単一供給源を提供するために、未処置のレパートリーをクローニングできる（例えば、ヒトから）。最後に、未処置のライブラリーはまた、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ及びＷｉｎｔｅｒ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７：３８１−３８８（１９９２）によって記載されるように、幹細胞から再編成されていないＶ遺伝子セグメントをクローニングすること及び高度に可変性のＣＤＲ３領域をコードし、インビトロで再配列を達成するためにランダム配列を含有するＰＣＲプライマーを使用することによって合成的に製造できる。ヒト抗体ファージライブラリーを記載する特許公開として、例えば、米国特許第５７５０３７３号及び米国特許出願第２００５／００７９５７４号、同２００５／０１１９４５５号、同２００５／０２６６０００号、同２００７／０１１７１２６号、同２００７／０１６０５９８号、同２００７／０２３７７６４号、同２００７／０２９２９３６号及び同２００９／０００２３６０号が挙げられる。ヒト抗体ライブラリーから単離された抗体又は抗体断片は、本明細書においてヒト抗体又はヒト抗体断片と考えられる。
【０４１４】
多重特異性抗体
特定の実施態様では、本明細書において記載される抗体は、多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる部位に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。ＦｏｌＲ１及びＣＤ３に対して特異的なＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の例が、本明細書において記載されている。いくつかの実施態様では、ＰＤ１軸成分アンタゴニストは、多重特異性である。結合特異性の一方では、ＰＤ−１軸成分（例えば、ＰＤ−１、ＰＤＬ１又はＰＤＬ２）に対してであり、もう一方は、任意のその他の抗原に対してである。いくつかの実施態様では、結合特異性の一方は、ＩＬ−１７又はＩＬ−１７Ｒに対してであり、もう一方は、任意のその他の抗原に対してである。特定の実施態様では、二重特異性抗体は、ＰＤ−１軸成分（例えば、ＰＤ−１、ＰＤＬ１又はＰＤＬ２）、ＩＬ−１７又はＩＬ−１７Ｒの２つの異なるエピトープと結合し得る。二重特異性抗体は、全長抗体又は抗体断片として調製できる。
【０４１５】
いくつかの実施態様では、結合特異性の一方は、ＰＤ−１軸成分（例えば、ＰＤ−１、ＰＤＬ１又はＰＤＬ２）に対してであり、もう一方は、ＩＬ−１７又はＩＬ−１７Ｒに対してである。個体に、有効量の多重特異性抗体を投与することを含む、個体においてがんの進行を治療又は遅延するための方法が、本明細書において提供され、多重特異性抗体は、ＰＤ−１軸成分（例えば、ＰＤ−１、ＰＤＬ１又はＰＤＬ２）に対する第１の結合特異性及びＩＬ−１７又はＩＬ−１７Ｒに対する第２の結合特異性を含む。いくつかの実施態様では、多重特異性抗体は、本明細書において及び以下に記載される技術のいずれかによって作製され得る。
【０４１６】
多重特異性抗体を作製するための技術として、それだけには限らないが、異なる特異性を有する２種の免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の組換え共発現（Milstein及びCuello、Nature 305:537（1983）、国際公開第９３／０８８２９号及びTraunecker等、EMBO J. 10:3655（1991）を参照のこと）及び「ノブ−イン−ホール」工学的操作（例えば、米国特許第５７３１１６８号を参照のこと）が挙げられる。多重特異性抗体はまた、抗体Ｆｃ−ヘテロダイマー分子を作製するために静電ステアリング効果を工学的操作すること（国際公開第２００９／０８９００４Ａ１号）；２種以上の抗体又は断片を架橋すること（例えば、米国特許第４６７６９８０号及びBrennan等、Science、229:81（1985））；二重特異性抗体を製造するためにロイシンジッパーを使用すること（例えば、Kostelny等、J. Immunol.、148（5）:1547-1553（1992）を参照のこと）；二重特異性抗体断片を作製するための「ダイアボディー」技術を使用すること（例えば、Hollinger等、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、90:6444-6448（1993）を参照のこと）；及び単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーを使用すること（例えば、Gruber等、J. Immunol.、152:5368（1994）を参照のこと）；及び例えば、Ｔｕｔｔ等  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）に記載されるように三重特異性抗体を調製することによって作製され得る。
【０４１７】
「オクトパス抗体」を含む、３つ以上の機能的抗原結合部位を有する工学的に操作された抗体もまた、本明細書において含まれる（例えば、米国特許出願第２００６／００２５５７６Ａ１号を参照のこと）。
【０４１８】
本明細書において、抗体又は断片はまた、ＰＤ−１軸成分（例えば、ＰＤ−１、ＰＤＬ１又はＰＤＬ２）、ＩＬ−１７又はＩＬ−１７Ｒ並びに別の異なる抗原（例えば、米国特許第２００８／００６９８２０号）と結合する抗原結合部位を含む「二重作用性ＦＡｂ」又は「ＤＡＦ」を含む。
【０４１９】
Ｃ．核酸配列、ベクター及び製造の方法
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子、例えば、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）に特異的な第１の抗原結合部位及びＣＤ３に特異的な第２の抗原結合部位を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子並びに抗体をコードするポリヌクレオチドが、本明細書において記載されるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子及び抗体の製造のために使用され得る。本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子及び抗体は、全二重特異性抗原結合分子をコードする単一ポリヌクレオチドとして、又は共発現される複数の（例えば、２つ以上の）ポリヌクレオチドとして発現され得る。共発現されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、例えば、ジスルフィド結合又はその他の手段によって会合して、機能的Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子及び抗体を形成し得る。例えば、Ｆａｂ断片の軽鎖部分は、Ｆａｂ断片の重鎖部分、Ｆｃドメインサブユニット及び任意選択的に別のＦａｂ断片（の一部）を含む、二重特異性抗体又はＦｏｌＲ１と結合する抗体の部分とは別個のポリヌクレオチドによってコードされ得る。共発現されると、重鎖ポリペプチドは、軽鎖ポリペプチドと会合して、Ｆａｂ断片を形成する。別の例では、２つのＦｃドメインサブユニットのうちの１つ及び任意選択的に１つ又は複数のＦａｂ断片（の一部）を含む、本明細書において提供されるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の部分又はＦｏｌＲ１抗原結合部分は、２つのＦｃドメインサブユニットのうちのもう一方及び任意選択的にＦａｂ断片（の一部）を含む、本明細書において提供される二重特異性抗体又はＦｏｌＲ１と結合する抗体の部分とは別個のポリヌクレオチドによってコードされ得る。共発現されると、Ｆｃドメインサブユニットは会合して、Ｆｃドメインを形成する。
【０４２０】
特定の実施態様では、ポリヌクレオチド又は核酸は、ＤＮＡである。その他の実施態様では、本発明のポリヌクレオチドは、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態のＲＮＡである。本発明のＲＮＡは、一本鎖である場合も、二本鎖である場合もある。
【０４２１】
Ｄ．抗体変異体
特定の実施態様では、上記のものに加えて、本明細書において提供されるＦｏｌＲ１及びＣＤ３に特異的なＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のアミノ酸配列変異体並びに抗体が考慮される。例えば、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の結合親和性及び／又はその他の生物学的特性を改善することが望ましいことであり得る。Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子及び抗体のアミノ酸配列変異体は、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子又は抗体をコードするヌクレオチド配列中に適当な修飾を導入することによって、又はペプチド合成によって調製できる。このような修飾として、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失及び／又はそれへの挿入及び／又はその置換が挙げられる。最終コンストラクトが、所望の特性、例えば、抗原結合性を有する限り、欠失、挿入及び置換の任意の組合せを行って、最終コンストラクトに到達できる。
【０４２２】
１．置換、挿入及び欠失変異体
特定の実施態様では、１つ又は複数のアミノ酸置換を有する変異体が提供される。置換突然変異誘発のための対象の部位として、ＨＶＲ及びＦＲが挙げられる。保存的置換は、「保存的置換」の表題のもと表Ｂに示されている。「例示的置換」の表題のもと表Ｂにおいて、アミノ酸側鎖クラスに関して以下にさらに記載されるように、より実質的な変更が提供されている。アミノ酸置換は、対象の抗体中に導入され得、生成物は、所望の活性、例えば、抗原結合の保持／改善、免疫原性の低減又はＡＤＣＣ若しくはＣＤＣの改善ついてスクリーニングされる。
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【０４２３】
アミノ酸は、共通の側鎖特性に従ってグループ化され得る：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【０４２４】
非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーの別のクラスとの交換を必要とする。
【０４２５】
置換変異体の１種は、親抗体（例えば、ヒト化又はヒト抗体）の１個又は複数の超可変領域残基を置換することを含む。一般に、さらなる研究のために選択された得られた変異体（単数又は複数）は、親抗体に対して、特定の生物学的特性における修飾（例えば、改善）（例えば、親和性の増大、免疫原性の低減）を含む、及び／又は親抗体の実質的に保持された特定の生物学的特性を有する。例示的置換変異体として、親和性成熟した抗体があり、これは、簡便には、例えば、本明細書において記載されるものなどのファージディスプレイベースの親和性成熟技術を使用して作製できる。手短には、１個又は複数のＨＶＲ残基を突然変異し、変異体抗体をファージ上にディスプレイし、特定の生物活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングする。
【０４２６】
例えば、抗体親和性を改善するために、ＨＶＲにおいて変更（例えば、置換）を行うことができる。このような変更は、ＨＶＲ「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟プロセスの際に高頻度で突然変異を受けるコドンによってコードされる残基（例えば、Chowdhury、Methods Mol. Biol. 207:179-196（2008）を参照のこと）、及び／又はＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）において行うことができ、得られた変異体ＶＨ又はＶＬは、結合親和性について試験される。構築すること及び二次的ライブラリーから再選択することによる親和性成熟は、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ１７８：１−３７（O’Brien等編、Human Press、Totowa、NJ、（2001））中のＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍ等に記載されている。親和性成熟のいくつかの実施態様では、多様性を、種々の方法（例えば、エラー−プローンＰＣＲ、鎖シャッフリング又はオリゴヌクレオチド指定突然変異）のいずれかによって成熟について選択される可変遺伝子中に導入する。次いで、二次的ライブラリーが作製される。次いで、所望の親和性を有する任意の抗体変異体を同定するためにライブラリーをスクリーニングする。多様性を導入するための別の方法は、いくつかのＨＶＲ残基（例えば、一度に４−６個の残基）が無作為化されるＨＶＲによって指示される手法を含む。抗原結合に関与するＨＶＲ残基は、例えば、アラニンスキャニング突然変異誘発又はモデル化を使用して具体的に同定され得る。特に、ＣＤＲ−Ｈ３及びＣＤＲ−Ｌ３が標的化されることが多い。
【０４２７】
特定の実施態様では、１つ又は複数のＨＶＲ内に置換、挿入又は欠失が、このような変更が、抗体の抗原と結合する能力を実質的に低減しない限り起こり得る。例えば、ＨＶＲにおいて、結合親和性を実質的に低減しない保存的変更（例えば、本明細書において提供されるような保存的置換）を行うことができる。このような変更は、ＨＶＲ「ホットスポット」又はＳＤＲの外側であり得る。上記で提供される変異体ＶＨ及びＶＬ配列の特定の実施態様では、各ＨＶＲのいずれかは変更されず、１つ、２つ又は３つ以下のアミノ酸置換を含有する。
【０４２８】
突然変異誘発のために標的とされ得る抗体の残基又は領域の同定のための有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ及びＷｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４：１０８１−１０８５によって記載されるような「アラニンスキャニング突然変異誘発」と呼ばれる。この方法では、標的残基（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ及びｇｌｕなどの荷電残基）の残基又は群が同定され、抗体の抗原との相互作用が影響を受けるか否かを調べるために、中性又は負に荷電したアミノ酸（例えば、アラニン又はポリアラニン）によって置換される。さらなる置換は、最初の置換に対して機能的感受性を実証するアミノ酸位置に導入され得る。あるいは、又はさらに、抗体及び抗原間の接触点を同定するための抗原−抗体複合体の結晶構造。このような接触残基及び隣接残基が、置換の候補として標的化されるか、又は排除され得る。変異体は、それらが、所望の特性を含有するか否かを調べるためにスクリーニングされ得る。
【０４２９】
アミノ酸配列挿入は、１個の残基から１００個以上の残基を含有するポリペプチドの長さの範囲のアミノ及び／又はカルボキシル末端融合物並びに単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例として、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体が挙げられる。抗体分子のその他の挿入変異体として、抗体の血清半減期を増大する酵素（例えば、ＡＤＥＰＴのための）又はポリペプチドとの抗体のＮ又はＣ末端との融合が挙げられる。
【０４３０】
２．グリコシル化変異体
特定の実施態様では、本明細書において提供されたＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子又は抗体は、抗体がグリコシル化される程度を増大又は低減するように変更される。抗体へのグリコシル化部位の付加又は欠失は、簡便には、１つ又は複数のグリコシル化部位が作製又は除去されるようにアミノ酸配列を変更することによって達成され得る。
【０４３１】
本発明とともに使用されるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子又は抗体が、Ｆｃ領域を含む場合には、結合している炭水化物が変更され得る。哺乳動物細胞によって製造される天然抗体は、通常、一般に、Ｎ結合によってＦｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７と結合している分岐した、二分岐オリゴ糖を含む。例えば、Ｗｒｉｇｈｔ等  ＴＩＢＴＥＣＨ１５：２６−３２（１９９７）を参照のこと。オリゴ糖は、種々の炭水化物、例えば、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース及びシアル酸並びに二分岐オリゴ糖構造の「ステム」においてＧｌｃＮＡｃと結合しているフコースを含み得る。いくつかの実施態様では、特定の改善された特性を有する抗体変異体を作製するために、本発明の二重特異性抗体又はＤＲ５と結合する抗体においてオリゴ糖の修飾を行うことができる。
【０４３２】
一実施態様では、Ｆｃ領域に（直接的又は間接的に）結合しているフコースを欠く炭水化物構造を有する、二重特異性抗体変異体又は抗体の変異体が提供される。例えば、このような抗体中のフコースの量は、１％−８０％、１％−６５％、５％−６５％又は２０％−４０％であり得る。フコースの量は、例えば、国際公開第２００８／０７７５４６号に記載されるようなＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって測定されるように、Ａｓｎ２９７と結合しているすべての糖構造体（例えば、複合体、ハイブリッド及び高マンノース構造）の合計に対して、Ａｓｎ２９７での糖鎖内のフコースの平均量を算出することによって決定される。Ａｓｎ２９７とは、Ｆｃ領域中の約２９７位（Ｆｃ領域残基のＥｕ番号付け）に位置するアスパラギン残基を指す。しかし、Ａｓｎ２９７はまた、抗体中の小さい配列差異のために、２９７位の約±３個のアミノ酸上流又は下流に、すなわち、位置２９４から３００の間に位置し得る。このようなフコシル化変異体は、改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。例えば、米国特許出願第２００３／０１５７１０８号（Ｐｒｅｓｔａ、Ｌ．）；米国特許出願第２００４／００９３６２１号（Ｋｙｏｗａ  Ｈａｋｋｏ  Ｋｏｇｙｏ  Ｃｏ．、Ｌｔｄ）を参照のこと。「脱フコシル化」又は「フコース欠損」抗体変異体と関連する刊行物の例として、米国特許出願第２００３／０１５７１０８号、国際公開第２０００／６１７３９号、国際公開第２００１／２９２４６号、米国特許出願第２００３／０１１５６１４号、米国特許出願第２００２／０１６４３２８号、米国特許出願第２００４／００９３６２１号、米国特許出願第２００４／０１３２１４０号、米国特許出願第２００４／０１１０７０４号、米国特許出願第２００４／０１１０２８２号、米国特許出願第２００４／０１０９８６５号、国際公開第２００３／０８５１１９号、国際公開第２００３／０８４５７０号、国際公開第２００５／０３５５８６号、国際公開第２００５／０３５７７８号、国際公開第２００５／０５３７４２号、国際公開第２００２／０３１１４０号、Ｏｋａｚａｋｉ等  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３６：１２３９−１２４９（２００４）；Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ等  Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）が挙げられる。脱フコシル化抗体を製造可能な細胞株の例として、タンパク質フコシル化が欠損しているＬｅｃ１３  ＣＨＯ細胞（Ripka等 Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545（1986）；米国特許出願第２００３／０１５７１０８Ａ１号、Presta, L；及び国際公開第２００４／０５６３１２Ａ１号、Ａｄａｍｓ等、特に、実施例１１）及びアルファ−１，６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞（例えば、Yamane-Ohnuki等 Biotech. Bioeng. 87:614（2004）；Kanda, Y.等、Biotechnol. Bioeng.、94（4）:680-688（2006）及び国際公開第２００３／０８５１０７号を参照のこと）などのノックアウト細胞株が挙げられる。
【０４３３】
二分されたオリゴ糖を有するＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子変異体及び抗体変異体が、さらに提供され、これでは、ＦｏｌＲ１と結合するＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃ領域と結合している二分岐オリゴ糖は、ＧｌｃＮＡｃによって二分されている。このようなＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子変異体は、フコシル化の低減及び／又はＡＤＣＣ機能の改善を有し得る。このような抗体変異体の例は、例えば、国際公開第２００３／０１１８７８号（Jean-Mairet等）、米国特許第６６０２６８４号（Umana等）及び米国特許出願第２００５／０１２３５４６号（Umana等）に記載されている。Ｆｃ領域と結合しているオリゴ糖中に少なくとも１個のガラクトース残基を有する抗体変異体も提供される。このような抗体変異体は、改善されたＣＤＣ機能を有し得る。このような抗体変異体は、例えば、国際公開第１９９７／３００８７号（Patel等）、国際公開第１９９８／５８９６４号（Raju、S.）及び国際公開第１９９９／２２７６４号（Raju、S.）に記載されている。
【０４３４】
３．システイン操作抗体変異体
特定の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の１個又は複数の残基が、システイン残基で置換されているシステイン操作されたＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子及び抗体、例えば、ＴＩＯＭＡＢＳを作製することが望ましいものであり得る。特定の実施態様では、置換された残基は、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の到達可能な部位で起こる。それらの残基をシステインで置換することによって、それによって反応性チオール基が、抗体の到達可能な部位に位置付けられ、抗体を、薬物部分又はリンカー−薬物部分などのその他の部分にコンジュゲートして、イムノコンジュゲートを作製するために使用され得る。特定の実施態様では、以下の残基のうち任意の１個又は複数が、システインで置換され得る：軽鎖のＶ２０５（カバット番号付け）；重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号付け）及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ番号付け）。システイン操作抗体は、例えば、米国特許第７５２１５４１号に記載されるように作製できる。
【０４３５】
Ｅ．組換え法及び組成物
本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子及び抗体は、例えば、固体状態ペプチド合成（例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相合成）又は組換え製造によって得ることができる。組換え製造のために、例えば、上記のような、１種又は複数の、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子又は抗体（又は断片）をコードするポリヌクレオチドを単離し、さらなるクローニング及び／又は宿主細胞における発現のために、１種又は複数のベクター中に挿入する。このようなポリヌクレオチドは、従来手順を使用して容易に単離でき、配列決定できる。一実施態様では、１種又は複数の本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、好ましくは、発現ベクターが提供される。当業者に周知である方法を使用して、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子又は抗体のコード配列を、適当な転写／翻訳制御シグナルとともに含有する発現ベクターを構築できる。これらの方法として、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術及びインビボ組換え／遺伝子組換えが挙げられる。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ等、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）；及びＡｕｓｕｂｅｌ等、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎ．Ｙ（１９８９）に記載される技術を参照のこと。発現ベクターは、プラスミド、ウイルスの一部であり得るか、又は核酸断片であり得る。発現ベクターは、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子（断片）又は抗体（断片）をコードするポリヌクレオチド（すなわち、コード領域）が、プロモーター及び／又はその他の転写若しくは翻訳制御エレメントと作動可能に関連してクローニングされる発現カセットを含む。本明細書において、「コード領域」とは、アミノ酸に翻訳されるコドンから核酸の部分である。「停止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ又はＴＡＡ）は、アミノ酸に翻訳されないが、存在する場合にはコード領域の一部であると考えられ得、しかし、任意のフランキング配列、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、５’及び３’非翻訳領域などは、コード領域の一部ではない。単一ポリヌクレオチドコンストラクト中に、例えば、単一ベクター上に、又は別個のポリヌクレオチドコンストラクト中に、例えば、別個の（異なる）ベクター上に２種以上のコード領域が存在し得る。さらに、任意のベクターが、単一のコード領域を含有し得るか、又は２種以上のコード領域を含み得る、例えば、本発明のベクターは、タンパク質分解による切断によって最終タンパク質に翻訳後に又は同時翻訳的に分離される、１種又は複数のポリペプチドをコードし得る。さらに、本発明のベクター、ポリヌクレオチド又は核酸は、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子（断片）若しくは抗体又はその変異体又は誘導体をコードするポリヌクレオチドと融合しているか、又は融合していない、異種コード領域をコードし得る。異種コード領域は、制限なく、分泌シグナルペプチド又は異種機能的ドメインなどの特定のエレメント又はモチーフを含む。作動可能な関連は、遺伝子産物、例えば、ポリペプチドのコード領域が、遺伝子産物の発現を調節配列（単数又は複数）の影響又は制御下に置くような方法で、１種又は複数の調節配列と関連している場合である。２種のＤＮＡ断片（ポリペプチドコード領域及びそれと関連しているプロモーターなど）は、プロモーター機能の誘導が、所望の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写をもたらす場合に、及び２種のＤＮＡ断片間の連結の性質が、発現調節配列の遺伝子産物の発現を指示する能力に干渉しない、若しくはＤＮＡ鋳型が転写される能力に干渉しない場合に、「作動可能に関連している」。したがって、プロモーター領域は、プロモーターが、その核酸の転写を達成可能であった場合に、ポリペプチドをコードする核酸と作動可能に関連する。プロモーターは、所定の細胞においてのみＤＮＡの実質的な転写を指示する細胞特異的プロモーターであり得る。
【０４３６】
プロモーターに加えて、その他の転写制御エレメント、例えば、エンハンサー、オペレーター、リプレッサー及び転写ターミネーターシグナルが、ポリヌクレオチドと細胞特異的転写を指示するように作動可能に関連され得る。適したプロモーター及びその他の転写制御領域は、本明細書において開示されている。種々の転写制御領域が、当業者に公知である。これらとして、制限するものではないが、それだけには限らないが、サイトメガロウイルスに由来するプロモーター及びエンハンサーセグメント（例えば、イントロン−Ａとともの最早期プロモーター）、シミアンウイルス４０に由来するプロモーター及びエンハンサーセグメント（例えば、早期プロモーター）及びレトロウイルス（例えば、ラウス肉腫ウイルスなど）に由来するプロモーター及びエンハンサーセグメントなどの脊椎動物細胞において機能する転写制御領域が挙げられる。その他の転写制御領域として、アクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモン及びウサギａ−グロビンなどの脊椎動物遺伝子に由来するもの並びに真核細胞において遺伝子発現を制御可能なその他の配列が挙げられる。さらに適した転写制御領域として、組織特異的プロモーター及びエンハンサー並びに誘導性プロモーター（例えば、プロモーター誘導性テトラサイクリン）が挙げられる。同様に、種々の翻訳制御エレメントが当業者に公知である。これらとして、それだけには限らないが、リボソーム結合部位、翻訳開始及び終結コドン並びにウイルス系に由来するエレメント（特に、ＣＩＴＥ配列とも呼ばれる、配列内リボソーム進入部位又はＩＲＥＳ）が挙げられる。発現カセットはまた、複製開始点及び／又はレトロウイルス長末端反復（ＬＴＲ）若しくはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆方向末端反復（ＩＴＲ）などの染色体組込みエレメントなどのその他の特徴を含み得る。
【０４３７】
本発明のポリヌクレオチド及び核酸コード領域は、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの分泌を指示する分泌又はシグナルペプチドをコードするさらなるコード領域を伴ってもよい。例えば、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子又は抗体の分泌が望まれる場合には、シグナル配列をコードするＤＮＡが、本発明の二重特異性抗体又は本発明のＤＲ５と結合する抗体又はその断片をコードする核酸の上流に配置され得る。シグナル仮説によれば、哺乳動物細胞によって分泌されるタンパク質は、粗面小胞体を越える成長するタンパク質鎖の輸送が開始されると、成熟したタンパク質から切断される、シグナルペプチド又は分泌リーダー配列を有する。当業者ならば、脊椎動物細胞によって分泌されるポリペプチドは、一般に、ポリペプチドのＮ末端に融合されたシグナルペプチドを有し、これが、翻訳されたポリペプチドから切断されて、ポリペプチドの分泌された又は「成熟した」形態が生じることは承知している。特定の実施態様では、天然シグナルペプチド、例えば、免疫グロブリン重鎖又は軽鎖シグナルペプチド又はそれと作動可能に関連しているポリペプチドの分泌を指示する能力を保持するその配列の機能的誘導体が使用される。あるいは、異種哺乳動物シグナルペプチド又はその機能的誘導体が使用され得る。例えば、野生型リーダー配列は、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）又はマウスβ−グルクロニダーゼのリーダー配列で置換され得る。
【０４３８】
後の精製を容易にする、又はＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の標識を補助するために使用され得る短いタンパク質配列をコードするＤＮＡ（例えば、ヒスチジンタグ）は、ポリヌクレオチドをコードするＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子（断片）又は抗体（断片）内に、又はその末端に含まれ得る。
【０４３９】
さらなる実施態様では、１種又は複数の、本発明のポリヌクレオチドを含む宿主細胞が提供される。特定の実施態様では、１種又は複数の本発明のベクターを含む宿主細胞が提供される。ポリヌクレオチド及びベクターは、それぞれ、ポリヌクレオチド及びベクターに関して、本明細書において記載される特徴のいずれかを単一で又は組み合わせて組み込み得る。１つのこのような実施態様では、宿主細胞は、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子又は抗体又はその一部をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む（例えば、それで形質転換されている又はトランスフェクトされている）。本明細書において、用語「宿主細胞」とは、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子、例えば、本明細書において開示されるＦｏｌＲ１Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子又は本発明の抗体、例えば、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体及び抗ＴＩＭ３抗体若しくはその断片を作製するように工学的に操作され得る任意の種類の細胞系を指す。本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子及び抗体を複製及びその発現を支持するために適した宿主細胞は、当該技術分野で周知である。このような細胞は、必要に応じて特定の発現ベクターをトランスフェクト又は形質導入され得、多量のベクターを含有する細胞は、臨床適用のために十分な量のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子及び抗体を得るために、大規模発酵槽に播種するために増殖され得る。適した宿主細胞として、大腸菌などの原核生物の微生物又はチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、昆虫細胞などといった真核細胞が挙げられる。例えば、ポリペプチドは、特にグリコシル化が必要ではない場合には、細菌において製造され得る。発現後、ポリペプチドは、細菌細胞ペーストから可溶画分中に単離され得、さらに精製され得る。原核生物に加えて、そのグリコシル化経路が、「ヒト化」されており、部分的又は完全にヒトグリコシル化パターンを有するポリペプチドの製造をもたらす真菌及び酵母株を含む、糸状菌又は酵母などの真核微生物が、ポリペプチドをコードするベクターの適したクローニング又は発現宿主である。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ２２、１４０９−１４１４（２００４）及びＬｉ等、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ２４、２１０−２１５（２００６）を参照のこと。（グリコシル化された）ポリペプチドの発現に適した宿主細胞はまた、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）に由来する。無脊椎動物細胞の例として、植物及び昆虫細胞が挙げられる。昆虫細胞とともに使用できる、特に、ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞のトランスフェクションのための多数のバキュロウイルス株が同定されている。植物細胞培養物も宿主として利用できる。例えば、米国特許第５９５９１７７号、同６０４０４９８号、同６４２０５４８号、同７１２５９７８号及び同６４１７４２９号（トランスジェニック植物において抗体を製造するためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（商標）技術を記載する）を参照のこと。脊椎動物細胞も宿主として使用できる。例えば、懸濁液中で増殖するよう適合されている哺乳動物細胞株も有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株のその他の例として、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７）によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株、ヒト胎児性／胚性腎臓株（例えば、Graham等、J Gen Virol 36、59（1977）に記載されるような２９３又は２９３Ｔ細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスセルトリ細胞（例えば、Mather、Biol Reprod 23、243-251（1980）において記載されるようなＴＭ４細胞）、サル腎臓細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６）、ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２）、マウス乳房腫瘍細胞（ＭＭＴ  ０６０５６２）、ＴＲＩ細胞（例えば、Mather等、Annals N.Y. Acad Sci 383、44-68（1982）に記載されるような）、ＭＲＣ５細胞及びＦＳ４細胞がある。その他の有用な哺乳動物宿主細胞株として、ｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞（Urlaub等、Proc Natl Acad Sci USA 77、4216（1980））を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞及びＹＯ、ＮＳ０、Ｐ３Ｘ６３及びＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株が挙げられる。タンパク質製造に適した特定の哺乳動物宿主細胞株の概説については、例えば、Ｙａｚａｋｉ及びＷｕ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２４８（B.K.C. Lo編、Humana Press、Totowa、NJ）、p.２５５−２６８（２００３）を参照のこと。宿主細胞は、培養細胞、例えば、２、３例を挙げると、哺乳動物培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、細菌細胞及び植物細胞を、またトランスジェニック動物、トランスジェニック植物又は培養植物又は動物組織内に含まれる細胞も含む。
【０４４０】
一実施態様では、宿主細胞は、真核細胞、好ましくは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児性／胚性腎臓（ＨＥＫ）細胞又はリンパ球系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）などの哺乳動物細胞である。
【０４４１】
これらの系において外来遺伝子を発現させるための標準技術は、当該技術分野で公知である。抗体などの抗原結合ドメインの重鎖又は軽鎖のいずれかを含むポリペプチドを発現する細胞は、発現された生成物が、重鎖及び軽鎖の両方を有する抗体であるように、抗体鎖のもう一方も発現するように工学的に操作され得る。
【０４４２】
本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子において、任意の動物種の抗体、抗体断片、抗原結合ドメイン又は可変領域を使用できる。本発明において有用な制限するものではない抗体、抗体断片、抗原結合ドメイン又は可変領域は、マウス、霊長類又はヒト起源であり得る。Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が、ヒト使用のために意図される場合には、抗体の定常領域がヒトに由来するキメラ形態の抗体を使用してもよい。ヒト化又は完全ヒト形態の抗体は、当該技術分野で周知の方法に従って調製できる（例えば、Ｗｉｎｔｅｒの米国特許第５５６５３３２号を参照のこと）。ヒト化は、それだけには限らないが、（ａ）重要なフレームワーク残基（例えば、良好な抗原結合親和性又は抗体機能を保持するために重要であるもの）を保持して、又は保持せずに、非ヒト（例えば、ドナー抗体）ＣＤＲをヒト（例えば、レシピエント抗体）フレームワーク及び定常領域にグラフトすること、（ｂ）非ヒト特異性決定領域（ＳＤＲ又はａ−ＣＤＲ；抗体抗原相互作用にとって重要な残基）のみをヒトフレームワーク及び定常領域にグラフトすること、又は（ｃ）全非ヒト可変ドメインを移植するが、表面残基の置換によってヒト様切片を用いてそれらを「覆うこと（cloaking）」ことを含む、種々の方法によって達成され得る。ヒト化抗体及びそれらを作製する方法は、例えば、Ａｌｍａｇｒｏ及びＦｒａｎｓｓｏｎ、Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ１３、１６１９−１６３３（２００８）に概説されており、例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ等、Ｎａｔｕｒｅ３３２、３２３−３２９（１９８８）；Ｑｕｅｅｎ等、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ８６、１００２９−１００３３（１９８９）；米国特許第５８２１３３７号、同７５２７７９１号、同６９８２３２１号及び同７０８７４０９号；Ｊｏｎｅｓ等、Ｎａｔｕｒｅ３２１、５２２−５２５（１９８６）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ等、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ８１、６８５１−６８５５（１９８４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ及びＯｉ、Ａｄｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ４４、６５−９２（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ２３９、１５３４−１５３６（１９８８）；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌｅｃ  Ｉｍｍｕｎ３１（３）、１６９−２１７（１９９４）；Ｋａｓｈｍｉｒｉ等、Ｍｅｔｈｏｄｓ３６、２５−３４（２００５）（ＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）グラフティングを記載する）；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ２８、４８９−４９８（１９９１）（「リサーフェイシング」を記載する）；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ等、Ｍｅｔｈｏｄｓ３６、４３−６０（２００５）（「ＦＲシャッフリング」を記載する）；及びＯｓｂｏｕｒｎ等、Ｍｅｔｈｏｄｓ３６、６１−６８（２００５）及びＫｌｉｍｋａ等、Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ８３、２５２−２６０（２０００）（ＦＲシャッフリングのための「誘導選択」手法を記載する）にさらに記載されている。ヒト抗体及びヒト可変領域は、当該技術分野で公知の種々の技術を使用して製造できる。ヒト抗体は、全般的に、ｖａｎ  Ｄｉｊｋ及びｖａｎ  ｄｅ  Ｗｉｎｋｅｌ、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ５、３６８−７４（２００１）並びにＬｏｎｂｅｒｇ、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ２０、４５０−４５９（２００８）に記載されている。ヒト可変領域は、ハイブリドーマ法によって作製されたヒトモノクローナル抗体の一部を形成し得、それに由来し得る（例えば、Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications、p.51-63（Marcel Dekker、Inc.、New York、1987）を参照のこと）。ヒト抗体及びヒト可変領域はまた、免疫原を、抗原投与に応じて、ヒト可変領域を有するインタクトなヒト抗体又はインタクトな抗体を産生するように修飾されているトランスジェニック動物に投与することによって調製できる（例えば、Lonberg、Nat Biotech 23、1117-1125（2005）を参照のこと。ヒト抗体及びヒト可変領域はまた、ヒト由来ファージディスプレイライブラリーから選択されるＦｖクローン可変領域配列を単離することによって作製できる（例えば、Methods in Molecular Biology 178:1-37中のHoogenboom等（O’Brien等編、Human Press、Totowa、NJ、2001）及びMcCafferty等、Nature 348:552-554;Clackson等、Nature 352:624-628（1991）を参照のこと）。ファージは、通常、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片として、又はＦａｂ断片のいずれかとして、抗体断片をディスプレイする。
【０４４３】
特定の実施態様では、本発明において有用な抗原結合部分は、例えば、その全開示内容が参照により組み込まれる米国特許出願第２００４／０１３２０６６号において開示される方法に従って、増強された結合親和性を有するように工学的に操作される。本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の、特異的抗原決定基と結合する能力は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）又は当業者が精通するその他の技術、例えば、表面プラズモン共鳴法（ＢＩＡＣＯＲＥ  Ｔ１００システムで分析される）（Liljeblad等、Glyco J 17、323-329（2000））及び伝統的な結合アッセイ（Heeley、Endocr Res 28、217-229（2002））のいずれかによって測定され得る。競合アッセイを使用して、特異的抗原との結合について参照抗体と競合する抗体、抗体断片、抗原結合ドメイン又は可変ドメイン、例えば、ＣＤ３との結合についてＶ９抗体と競合する抗体を同定できる。特定の実施態様では、このような競合抗体は、参照抗体が結合する同一エピトープ（例えば、線形又は立体構造エピトープ）と結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングするための詳細な例示的方法は、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ６６巻（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ）中の、Ｍｏｒｒｉｓ（１９９６）「Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」に提供されている。例示的競合アッセイでは、固定化されている抗原（例えば、ＣＤ３）を、抗原と結合する第１の標識化抗体（例えば、米国特許第６０５４２９７号に記載されるＶ９抗体）及び抗原との結合について第１の抗体と競合するその能力について試験されている第２の非標識化抗体を含む溶液中でインキュベートする。第２の抗体は、ハイブリドーマ上清中に存在し得る。コントロールとして、固定化されている抗原を、第１の標識化抗体を含むが、第２の非標識化抗体を含まない溶液中でインキュベートする。第１の抗体の抗原との結合に許容的な条件下でインキュベートした後、過剰の結合していない抗体を除去し、固定化されている抗原と会合している標識の量を測定する。コントロール試料と比べて、試験試料において固定化されている抗原と会合している標識の量が、実質的に低減される場合には、第２の抗体が、抗原との結合について第１の抗体と競合していることを示す。Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ１４章（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）を参照のこと。
【０４４４】
特定の実施態様では、本発明において有用な抗原結合部分は、例えば、その開示内容が参照により組み込まれる米国特許出願第２００４／０１３２０６６号において開示される方法に従って、増強された結合親和性を有するように工学的に操作される。本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子又は抗体の、特異的抗原決定基と結合する能力は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）又は当業者が精通するその他の技術、例えば、表面プラズモン共鳴法（ＢＩＡＣＯＲＥ  Ｔ１００システムで分析される）（Liljeblad等、Glyco J 17、323-329（2000））及び伝統的な結合アッセイ（Heeley、Endocr Res 28、217-229（2002））のいずれかによって測定され得る。競合アッセイを使用して、特定の抗原との結合について参照抗体と競合する抗体、抗体断片、抗原結合ドメイン又は可変ドメインを同定できる。特定の実施態様では、このような競合抗体は、参照抗体が結合する同一エピトープ（例えば、線形又は立体構造エピトープ）と結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングするための詳細な例示的方法は、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ第６６巻（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ）中の、Ｍｏｒｒｉｓ（１９９６）「Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」に提供されている。例示的競合アッセイでは、固定化されている抗原を、抗原と結合する第１の標識化抗体及び抗原との結合について第１の抗体と競合するその能力について試験されている第２の非標識化抗体を含む溶液中でインキュベートする。第２の抗体は、ハイブリドーマ上清中に存在し得る。コントロールとして、固定化されている抗原を、第１の標識化抗体を含むが、第２の非標識化抗体を含まない溶液中でインキュベートする。
【０４４５】
第１の抗体の抗原との結合に許容的な条件下でインキュベートした後、過剰の結合していない抗体を除去し、固定化されている抗原と会合している標識の量を測定する。コントロール試料と比べて、試験試料において固定化されている抗原と会合している標識の量が、実質的に低減される場合には、第２の抗体が、抗原との結合について第１の抗体と競合していることを示す。Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  第１４章（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）を参照のこと。
【０４４６】
本明細書において記載されるように調製されたＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子及び抗体は、高性能液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーなどといった当該技術分野で公知の技術によって精製してもよい。特定のタンパク質を精製するために使用される実際の条件は、幾分かは、正味電荷、疎水性、親水性などといった因子に応じて変わり、当業者には明らかとなろう。アフィニティークロマトグラフィー精製のために、二重特異性抗体又はＤＲ５と結合する抗体が結合する抗体、リガンド、受容体又は抗原を使用できる。例えば、本発明の二重特異性抗体のアフィニティークロマトグラフィー精製のために、プロテインＡ又はプロテインＧを有するマトリックスが使用され得る。本質的に、実施例に記載されるように、連続的プロテインＡ又はＧアフィニティークロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーを使用して二重特異性抗体を単離できる。二重特異性抗体又はＤＲ５と結合する抗体の純度は、ゲル電気泳動、高圧液体クロマトグラフィーなどを含む、種々の周知の分析法のいずれかによって決定できる。
【０４４７】
Ｆ．アッセイ
本明細書において提供されるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子、例えば、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）に特異的な第１の抗原結合部位及びＣＤ３に特異的な第２の抗原結合部位を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子並びに抗体、例えば、抗ＰＤ−１軸結合アンタゴニスト抗体及び抗ＴＩＭ３アンタゴニスト抗体は、当該技術分野で公知の種々のアッセイによって、その物理的／化学的特性及び／又は生物活性について同定、スクリーニングされ、又は特徴を明らかにされ得る。
【０４４８】
１．親和性アッセイ
そのそれぞれの抗原、例えば、ＦｏｌＲ１、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＴＩＭ３に対する、本明細書において提供されるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子、例えば、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）に特異的な第１の抗原結合部位及びＣＤ３に特異的な第２の抗原結合部位を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子並びに抗体、例えば、抗ＰＤ−１軸結合アンタゴニスト抗体及び抗ＴＩＭ３アンタゴニスト抗体の親和性は、ＢＩＡｃｏｒｅ機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）などの標準機器使用及び組換え発現によって得ることができるような受容体又は標的タンパク質を使用して、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって実施例に示される方法に従って決定できる。あるいは、本明細書において提供されるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子及び抗体の、そのそれぞれの抗原との結合は、特定の受容体又は標的抗原を発現する細胞株を使用して、例えば、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって評価できる。
【０４４９】
ＫＤは、２５℃でＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ１００機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して表面プラズモン共鳴によって測定され得る。Ｆｃ部分及びＦｃ受容体の間の相互作用を分析するために、Ｈｉｓタグをつけた組換えＦｃ受容体を、ＣＭ５チップ上に固定化された抗ペンタＨｉｓ抗体（Ｑｉａｇｅｎ）（配列番号３９２として開示される「ペンタＨｉｓ」）によって捕捉し、二重特異性コンストラクトを被分析物として使用する。手短には、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を用い、供給業者の指示書に従って活性化する。抗ペンタＨｉｓ抗体（配列番号３９２として開示される「ペンタＨｉｓ」）を、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０を用いて、４０μｇ／ｍｌに希釈し、その後、およそ６５００反応単位（ＲＵ）のカップリングされたタンパク質を達成するように５μｌ／分の流速で注射する。リガンドの注射後、１Ｍのエタノールアミンを注射して、未反応基をブロックする。その後、４又は１０ｎＭでＦｃ−受容体を６０秒間捕捉する。反応速度論測定のために、二重特異性コンストラクトの４倍段階希釈（５００ｎＭから４０００ｎＭの間の範囲）を、ＨＢＳ−ＥＰ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％界面活性剤Ｐ２０、ｐＨ７．４）に２５℃で３０μｌ／分の流速で１２０秒間注射する。
【０４５０】
標的抗原に対する親和性を調べるために、抗ペンタＨｉｓ抗体（配列番号３９２として開示される「ペンタＨｉｓ」）について記載されたように、二重特異性コンストラクトを、活性化されたＣＭ５センサーチップ表面上に固定化されている抗ヒトＦａｂ特異的抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって捕捉する。カップリングされたタンパク質の最終量は、およそ１２０００ＲＵである。二重特異性コンストラクトを、３００ｎＭで９０秒間捕捉する。標的抗原を、２５０−１０００ｎＭの濃度範囲で、３０μｌ／分の流速を用いてフローセルに１８０秒間通す。解離を１８０秒間モニタリングする。
【０４５１】
参照フローセルで得られた反応を差し引くことによって、バルク屈折率の相違を補正する。定常状態反応を使用して、ラングミュアの結合等温式の非線形曲線フィッティングによって解離定数ＫＤを導いた。会合速度（ｋｏｎ）及び解離速度（ｋｏｆｆ）は、会合及び解離センサーグラムを同時にフィッティングすることによって、単純な１対１ラングミュア結合モデル（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ１００評価ソフトウェアバージョン１．１．１）を使用して算出する。平衡解離定数（ＫＤ）は、比ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして算出する。例えば、Ｃｈｅｎ等、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ２９３、８６５−８８１（１９９９）を参照のこと。
【０４５２】
２．結合アッセイ及びその他のアッセイ
一態様では、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子、例えば、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）に特異的な第１の抗原結合部位及びＣＤ３に特異的な第２の抗原結合部位を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子並びに抗体、例えば、抗ＰＤ−１軸結合アンタゴニスト抗体及び抗ＴＩＭ３アンタゴニスト抗体は、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロットなどといった公知の方法によって、その抗原結合活性について試験される。
【０４５３】
別の態様では、競合アッセイを使用して、それぞれの抗原との結合について特異的参照抗体と競合する抗体又は断片を同定できる。特定の実施態様では、このような競合抗体は、特異的参照抗体が結合する同一エピトープ（例えば、線形又は立体構造エピトープ）と結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングするための詳細な例示的方法は、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ第６６巻（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ）中の、Ｍｏｒｒｉｓ（１９９６）「Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」に提供されている。さらなる方法は、実施例の節に記載されている。
【０４５４】
３．活性アッセイ
一態様では、生物活性を有する、本明細書において提供されるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子、例えば、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）に特異的な第１の抗原結合部位及びＣＤ３に特異的な第２の抗原結合部位を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子並びに抗体、例えば、抗ＰＤ−１軸結合アンタゴニスト抗体及び抗ＴＩＭ３アンタゴニスト抗体を同定するためのアッセイが、提供される。生物活性は、例えば、ＤＮＡ断片化の誘導、標的化された細胞のアポトーシス及び溶解の誘導を含み得る。インビボ及び／又はインビトロでこのような生物活性を有する抗体も提供される。
【０４５５】
特定の実施態様では、本発明のＴ細胞活性化抗原結合分子及び抗体は、このような生物活性について試験される。細胞溶解（例えば、ＬＤＨ放出の測定による）又はアポトーシス（例えば、ＴＵＮＥＬアッセイを使用する）を検出するためのアッセイは、当該技術分野で周知である。ＡＤＣＣ又はＣＤＣを測定するためのアッセイはまた、その全開示内容が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２００４／０６５５４０号（その中の実施例１を参照のこと）に記載されている。
【０４５６】
Ｇ．薬学的製剤
本明細書において記載されるような、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子、例えば、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）に特異的な第１の抗原結合部位及びＣＤ３に特異的な第２の抗原結合部位を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子並びに抗体、例えば、抗ＰＤ−１軸結合アンタゴニスト抗体及び抗ＴＩＭ３アンタゴニスト抗体の薬学的製剤を、所望の程度の純度を有するこのようなＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子又は抗体を、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態の、１種又は複数の任意選択の薬学的に許容される担体（Remington's Pharmaceutical Sciences 第16版、Osol、A.編（1980））と混合することによって調製する。薬学的に許容される担体は、一般に、使用される投与量及び濃度でレシピエントにとって非毒性であり、それだけには限らないが、リン酸、クエン酸及びその他の有機酸などのバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロライド；ベンザルコニウムクロライド；ベンゼトニウムクロライド；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０個未満の残基）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジンなどのアミノ酸；単糖類、二糖類及びグルコース、マンノース又はデキストリンを含むその他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなどの糖類；ナトリウムなどの塩形成性対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）；及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が挙げられる。本明細書における例示的な薬学的に許容される担体は、可溶性中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｉｎｃ．）などのヒト可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質などの間質薬物分散剤をさらに含む。ｒＨｕＰＨ２０を含む特定の例示的ｓＨＡＳＥＧＰ及び使用方法は、米国特許公開第２００５／０２６０１８６号及び同２００６／０１０４９６８号に記載されている。一態様では、ｓＨＡＳＥＧＰを、コンドロイチナーゼなどの１種又は複数のさらなるグリコサミノグリカナーゼと混合する。
【０４５７】
例示的凍結乾燥抗体製剤は、米国特許第６２６７９５８号に記載されている。水性抗体製剤として、米国特許第６１７１５８６号及び国際公開第２００６／０４４９０８号に記載されたものが挙げられ、後者の製剤は、酢酸ヒスチジンバッファーを含む。
【０４５８】
本明細書において製剤はまた、治療されている特定の適応症のために必要に応じて２種以上の有効成分、好ましくは、互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有するものを含有し得る。このような有効成分は、意図される目的のために有効である量で組み合わせて適宜存在する。
【０４５９】
有効成分は、コアセルベーション技術によって、又は界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えば、コロイド薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）において、又はマクロエマルジョンにおいて、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ（メチルメタアシレート）マイクロカプセル中に封入してもよい。このような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  第１６版、Ｏｓｏｌ、Ａ．編（１９８０）に開示されている。
【０４６０】
徐放性調製物を調製できる。徐放性調製物の適した例として、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられ、このマトリックスは、成形品、例えば、フィルム又はマイクロカプセルの形態である。
【０４６１】
インビボ投与に使用されるべき製剤は、一般に、無菌である。無菌状態は、例えば、滅菌濾過膜を通す濾過によって容易に達成され得る。
【０４６２】
Ｈ．治療方法及び組成物
本明細書において提供される１種又は複数のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子及び抗ＰＤ−１軸結合アンタゴニスト抗体、及び任意選択的にＴＩＭ３アンタゴニストを含む治療的組合せが治療方法において使用され得る。
【０４６３】
一態様では、医薬として使用するための葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）及びＣＤ３と結合するＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が、抗ＰＤ−１軸結合アンタゴニスト抗体と組み合わせて使用するために提供される。特定の実施態様では、抗ＰＤ−１軸結合アンタゴニスト抗体と組み合わせて使用するための、ＦｏｌＲ１及びＣＤ３と結合するＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が、治療方法において使用するために提供される。特定の実施態様では、組合せは、ＴＩＭ３アンタゴニスト、例えば、抗ＴＩＭ３アンタゴニスト抗体をさらに含む。特定の実施態様では、本発明は、個体に、有効量の、ＦｏｌＲ１及びＣＤ３と結合するＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子並びに抗ＰＤ−１軸結合アンタゴニスト抗体を投与することを含むがんを有する個体において治療する方法において使用するための、ＦｏｌＲ１及びＣＤ３と結合するＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子並びに抗ＰＤ−１軸結合アンタゴニスト抗体を提供する。１つのこのような実施態様では、方法は、個体に、有効量の、例えば、以下に記載されるような少なくとも１種のＴＩＭ３アンタゴニストを投与することをさらに含む。上記の実施態様のいずれかによる「個体」は、好ましくは、ヒトである。１つの好ましい実施態様では、前記がんは、膵臓がん、肉腫又は結腸直腸癌である。その他の実施態様では、がんは、結腸直腸がん、肉腫、頭頸部がん、扁平上皮癌、乳がん、膵臓がん、胃がん、非小細胞肺癌、小細胞肺がん又は中皮腫である。がんが乳がんである実施態様では、乳がんは、トリプルネガティブ乳がんであり得る。
【０４６４】
さらなる態様において、本発明は、医薬の製造又は調製における、ＦｏｌＲ１及びＣＤ３と結合するＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子並びに抗ＰＤ−１軸結合アンタゴニスト抗体を含む治療的組合せの使用を提供する。一実施態様では、組合せは、ＴＩＭ３アンタゴニストをさらに含む。一実施態様では、医薬は、がんの治療のためである。さらなる実施態様では、医薬は、がんを有する個体に、有効量の医薬を投与することを含む、がんを治療する方法において使用するためである。１つのこのような実施態様では、方法は、個体に、有効量の、例えば、以下に記載されるような少なくとも１種のさらなる治療剤を投与することをさらに含む。上記の実施態様のいずれかによる「個体」は、ヒトであり得る。
【０４６５】
さらなる態様において、本発明は、がんを治療するための方法を提供する。一実施態様では、方法は、がんを有する個体に、有効量の、ＦｏｌＲ１及びＣＤ３と結合するＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子並びに抗ＰＤ−１軸結合アンタゴニスト抗体を含む治療的組合せを投与することを含む。１つのこのような実施態様では、方法は、個体に、有効量の、以下に記載されるような少なくとも１種のさらなる治療剤を投与することをさらに含む。１つのこのような実施態様では、少なくとも１種のさらなる治療剤は、抗ＴＩＭ３アンタゴニスト抗体である。上記の実施態様のいずれかによる「個体」は、ヒトであり得る。１つの好ましい実施態様では、前記がんは、膵臓がん、肉腫又は結腸直腸癌である。その他の実施態様では、がんは、結腸直腸がん、肉腫、頭頸部がん、扁平上皮癌、乳がん、膵臓がん、胃がん、非小細胞肺癌、小細胞肺がん又は中皮腫である。
【０４６６】
さらなる態様において、本発明は、例えば、上記の治療方法のいずれかにおいて使用するための、本明細書において提供されるＦｏｌＲ１及びＣＤ３と結合するＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のいずれか、並びに抗ＰＤ−１軸結合アンタゴニスト抗体を含む薬学的製剤を提供する。一実施態様では、薬学的製剤は、本明細書において提供されるＦｏｌＲ１と結合するＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のいずれか及び薬学的に許容される担体を含む。別の実施態様では、薬学的製剤は、本明細書において提供されるＦｏｌＲ１及びＣＤ３と結合するＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のいずれか並びに抗ＰＤ−１軸結合アンタゴニスト抗体並びに例えば、以下に記載されるような少なくとも１種のさらなる治療剤を含む。
【０４６７】
二重特異性抗体は、非経口的に、肺内に及び鼻腔内に並びに必要に応じて、局所治療のために病巣内投与を含む、任意の適した手段によって投与され得る。非経口注射は、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内又は皮下投与を含む。投薬は、幾分かは、投与が短時間であるか、又は慢性であるか否かに応じて、任意の適した経路によって、例えば、静脈内又は皮下注射などの注射によってであり得る。それだけには限らないが、単回又は種々の時点にわたる複数回投与、ボーラス投与及びパルス点滴を含む種々の投薬スケジュールが、本明細書において考慮される。
【０４６８】
二重特異性抗体は、医学行動規範と一致した様式で製剤化、投薬及び投与され得る。これに関連して考慮する因子として、治療されている特定の障害、治療されている特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤送達部位、投与方法、投与のスケジュール調整及び医師に公知のその他の因子が挙げられる。二重特異性抗体は、問題の障害を阻止又は治療するために現在使用されている１種又は複数の薬剤とともに製剤化されなくてもよいが、任意選択的に、製剤化される。有効量のこのようなその他の薬剤は、製剤中に存在する抗体の量、障害又は治療の種類及び上記で論じられたその他の因子に応じて変わる。これらは、一般に、本明細書において記載されたような同一投与量で、投与経路を用いて、又は本明細書において記載された投与量の約１−９９％で、又は適当であると経験的に／臨床的に決定される任意の投与量で、任意の経路によって使用される。
【０４６９】
疾患を阻止又は治療するために、二重特異性抗体の適当な投与量は、治療されるべき疾患の種類、抗体の種類、疾患の重症度及び経過、二重特異性抗体が、阻止目的で又は治療目的で投与されるか否か、これまでの療法、患者の病歴及び二重特異性抗体に対する応答及び主治医の裁量に応じて変わる。二重特異性抗体は、患者に、単回、又は一連の治療にわたって適宜投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、約１μｇ／ｋｇ−１５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ−１０ｍｇ／ｋｇ）の二重特異性抗体又はＤＲ５と結合する新規抗体が、例えば、１回又は複数回の別個の投与によってか、又は連続的注入によってかにかかわらず、患者への投与の最初の候補投与量であり得る。１つの通常の１日投与量は、上記の因子に応じて、約１μｇ／ｋｇ−１００ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上の範囲であり得る。数日又はそれより長くにわたっての反復投与のために、状態に応じて、治療は、一般に、病徴の所望の抑制が起こるまで持続される。二重特異性の１つの例示的投与量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇ−約１０ｍｇ／ｋｇの範囲となる。したがって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇの１回又は複数回の用量が、患者に投与され得る。このような容量は、断続的に、例えば、毎週又は３週間毎に（例えば、患者が、約２−約１２、又は例えば、約６容量の二重特異性抗体を受け取るように）投与され得る。最初のより高い負荷用量と、それに続く１回又は複数回のより低い用量が投与され得る。しかし、その他の投与計画も有用であり得る。この療法の進行は、従来技術及びアッセイによって容易にモニタリングされる。
【０４７０】
上記の製剤又は治療方法のいずれかは、ＦｏｌＲ１及びＣＤ３と結合するＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子及び抗ＰＤ−１軸結合アンタゴニスト抗体、並びに任意選択的に抗ＴＩＭ３アンタゴニスト抗体のかわりに、又はそれらに加えて本発明のイムノコンジュゲートを使用して実施され得るということは理解される。
【０４７１】
Ｉ．製造品
本発明の別の態様では、上記の障害の治療、阻止及び／又は診断にとって有用な材料を含有する製造品が提供される。製造品は、容器及び容器上の、又は容器と関連している表示又は添付文書を含む。適した容器として、例えば、瓶、バイアル、シリンジ、ＩＶ溶液バッグなどが挙げられる。容器は、ガラス又はプラスチックなどの種々の材料から形成され得る。容器は、それだけであるか、又は状態の治療、阻止及び／又は診断に有効な別の組成物と混合された組成物を保持し、滅菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、皮下注射ニードルによって穿刺可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであり得る）。組成物中の少なくとも１種の活性薬剤は、二重特異性抗体であり、さらなる活性薬剤は、本明細書において記載されたようなさらなる化学療法剤である。表示又は添付文書は、組成物が、選択した状態を治療するために使用されることを示す。さらに、製造品は、（ａ）二重特異性抗体を含む組成物が中に含有された第１の容器と、（ｂ）さらなる細胞傷害性又はそうでなければ治療剤を含む組成物が中に含有された第２の容器を含み得る。本発明のこの実施態様における製造品は、組成物が、特定の状態を治療するために使用され得ることを示す添付文書をさらに含み得る。あるいは、又はさらに、製造品は、静菌性の注射用水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液及びデキストローズ溶液などの薬学的に許容されるバッファーを含む第２の（又は第３の）容器をさらに含み得る。その他のバッファー、希釈剤、フィルター、ニードル及びシリンジを含む、商業的及びユーザーの観点から望ましいその他の材料をさらに含み得る。
【０４７２】
上記の製造品のいずれかは、ＦｏｌＲ１及びＣＤ３と結合するＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子及び抗ＰＤ−１軸結合アンタゴニスト抗体、並びに任意選択的に抗ＴＩＭ３アンタゴニスト抗体に代わって、又はそれらに加えて、本発明のイムノコンジュゲートを含み得るということは理解される。
【実施例】
【０４７３】
ＩＩＩ．  実施例
以下は、本発明の方法及び組成物の例である。上記に示されている一般的な説明を考慮して、多様な他の実施態様が実施され得ることが理解される。
【０４７４】
以下は、本発明の方法及び組成物の例である。上記に示されている一般的な説明を考慮して、多様な他の実施態様が実施され得ることが理解される。
【０４７５】
一般的な方法
組換えＤＮＡ技術
ＤＮＡを操作するために、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８９に記載のような標準的な方法が使用された。分子生物学的試薬は、製造業者の説明書によって使用された。ヒト免疫グロブリン軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的な情報は、以下に示されている：Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．．等、（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２。
【０４７６】
ＤＮＡ配列決定
ＤＮＡ配列は、二本鎖配列決定によって決定された。
【０４７７】
遺伝子合成
必要とされる場合、望ましい遺伝子セグメントは、適切な鋳型を使用するＰＣＲによって作製されたもの又は自動化された遺伝子合成による合成オリゴヌクレオチド及びＰＣＲ産物からＧｅｎｅａｒｔ  ＡＧ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって合成されたものの何れかである。正確な遺伝子配列が得られない場合には、オリゴヌクレオチドプライマーは、最も近いホモログからの配列に基づいて設計され、遺伝子は、適切な組織に由来するＲＮＡからのＲＴ−ＰＣＲによって単離された。単一の制限エンドヌクレアーゼ切断部位が側面に位置した遺伝子セグメントは、標準的なクローニング／配列決定ベクター内にクローニングされた。プラスミドＤＮＡは、形質転換された細菌から精製され、濃度は、ＵＶ分光法によって決定された。サブクローニングされた遺伝子断片のＤＮＡ配列は、ＤＮＡ配列決定によって確認された。遺伝子セグメントは、それぞれの発現ベクター内にサブクローニングすることを可能にするための好適な制限部位で設計された。全てのコンストラクトは、真核細胞における分泌のためにタンパク質を標的とするリーダーペプチドをコードしている５’末端ＤＮＡ配列付きで設計された。
【０４７８】
ＰＢＭＣからの初代ヒトｐａｎ  Ｔ細胞の単離
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、地域血液銀行から又は健常なヒトのドナーからの新しい血液から得られた濃縮リンパ球調製物（バフィーコート）からのＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ密度遠心分離によって調製された。簡単に説明すると、血液は、滅菌ＰＢＳで希釈され、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ勾配（Ｓｉｇｍａ、Ｈ８８８９）の上に注意深く層にされた。（ブレーキスイッチオフで）室温で３０分間の４５０×ｇでの遠心分離後、ＰＢＭＣを含む中間相より上の血漿の部分は捨てられた。ＰＢＭＣは、新しい５０ｍｌのＦａｌｃｏｎチューブ内に移され、チューブは、ＰＢＳで５０ｍｌの総容量までフィルアップされた。混合物は、（ブレーキスイッチオンで）室温で１０分間、４００×ｇで遠心分離された。上清は捨てられ、ＰＢＭＣペレットは滅菌ＰＢＳで２回洗浄された（４℃で１０分間の３５０×ｇでの遠心分離ステップ）。得られたＰＢＭＣ集団は、自動的に計数され（ＶｉＣｅｌｌ）、１０％のＦＣＳ及び１％のＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ、Ｋ０３０２）を含む、ＲＰＭＩ１６４０培地中、インキュベーター内で３７℃、５％のＣＯ２でアッセイ開始まで保存された。
【０４７９】
ＰＢＭＣからのＴ細胞濃縮は、製造業者の説明書に従って、Ｐａｎ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ＩＩ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ＃１３０−０９１−１５６）を使用して行われた。簡単に説明すると、細胞ペレットは、１千万個の細胞あたり４０μｌの冷却されたバッファー（滅菌濾過された、０．５％のＢＳＡ、２ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳ）中に希釈され、１千万個の細胞あたり１０μｌのビオチン−抗体カクテルと共に４℃で１０分間インキュベートされた。１千万個の細胞あたり３０μｌの冷却されたバッファー及び２０μｌの抗ビオチン磁気ビーズが添加され、混合物は、４℃で更に１５分間インキュベートされた。細胞は、１０−２０×その時の容量を添加すること及びその後の３００×ｇで１０分間の遠心分離ステップによって洗浄された。多くとも１億個の細胞が、５００μｌのバッファー中に再懸濁された。標識されていないヒトｐａｎ  Ｔ細胞の磁気的分離は、製造業者の説明書に従って、ＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＃１３０−０４２−４０１）を使用して行われた。得られたＴ細胞集団は、自動的に計数され（ＶｉＣｅｌｌ）、ＡＩＭ−Ｖ培地中、インキュベーター内で３７℃、５％のＣＯ２でアッセイ開始（２４時間以内）まで保存された。
【０４８０】
ＰＢＭＣからの初代ヒト未処理Ｔ細胞の単離
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、地域血液銀行から又は健常なヒトのドナーからの新しい血液から得られた濃縮リンパ球調製物（バフィーコート）からのＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ密度遠心分離によって調製された。ＰＢＭＣからのＴ細胞濃縮は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ＢｉｏｔｅｃからのＮａｉｖｅ  ＣＤ８＋  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（＃１３０−０９３−２４４）を使用して、製造業者の説明書に従ってではあるが、ＣＤ８＋  Ｔ細胞の最後の単離ステップを省いて行われた（初代ヒトｐａｎ  Ｔ細胞の単離についての説明も参照されたい）。
【０４８１】
脾細胞からのマウスｐａｎ  Ｔ細胞の単離
脾臓は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスから単離されて、ＭＡＣＳバッファー（ＰＢＳ＋０．５％  ＢＳＡ＋２ｍＭ  ＥＤＴＡ）を含むＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳ  Ｃチューブ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＃１３０−０９３−２３７）内に移され、単一細胞浮遊液を得るために製造業者の説明書に従ってＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒで解離された。細胞浮遊液は、プリセパレーションフィルターに通され、残りの非解離組織粒子が除去された。４℃で４分間の４００×ｇでの遠心分離後、ＡＣＫ溶解バッファーが添加され、赤血球が溶解された（室温で５分間のインキュベーション）。残りの細胞は、ＭＡＣＳバッファーで２回洗浄され、計数されてマウスのｐａｎ  Ｔ細胞の単離に使用された。（磁気的な）ネガティブ選択は、製造業者の説明書に従って、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ＢｉｏｔｅｃからのＰａｎ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（＃１３０−０９０−８６１）を使用して行われた。得られたＴ細胞集団は、自動的に計数され（ＶｉＣｅｌｌ）、更なるアッセイに直ちに使用された。
【０４８２】
ヘパリン添加血液からの初代カニクイザルＰＢＭＣの単離
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、以下のように、健常なカニクイザルドナーからの新しい血液から密度遠心分離によって調製された：ヘパリン添加血液は、滅菌ＰＢＳで１：３希釈され、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ培地（Ａｘｏｎ  Ｌａｂ  ＃１１１４５４５）は、滅菌ＰＢＳで９０％に希釈された。２倍量の希釈された血液は、１倍量の希釈された密度勾配の上に層にされ、ＰＢＭＣ画分は、ブレーキなしで、室温で３０分間の５２０×ｇでの遠心分離によって分離された。ＰＢＭＣバンドは、新しい５０ｍｌのＦａｌｃｏｎチューブ内に移され、４℃で１０分間の４００×ｇでの遠心分離によって滅菌ＰＢＳで洗浄された。血小板を除去するために、１回の低速遠心分離が行われ（１５０×ｇ、４℃で１５分）、得られたＰＢＭＣ集団は、自動的に計数され（ＶｉＣｅｌｌ）、更なるアッセイに直ちに使用された。
【０４８３】
実施例１
ビオチン化された葉酸受容体−Ｆｃ融合体の精製
ヒトＦｏｌＲ１に対する新しい抗体を作製するために、以下の抗原及びスクリーニングツールが、一価のＦｃ融合タンパク質として作製された（抗原の細胞外ドメインが、Ｆｃ−ホール分子と共発現されるＦｃ−ノブのヒンジ領域に連結される）。抗原遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋ又はＳｗｉｓｓＰｒｏｔから得られた配列に基づいて合成され（Ｇｅｎｅａｒｔ、Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、インビボ又はインビトロでのビオチン化のためのＣ末端Ａｖｉタグ付きのＦｃ−ノブとの融合タンパク質を作製するために発現ベクター内に挿入された。インビボでのビオチン化は、産生中に細菌ビオチンリガーゼをコードしている細菌ｂｉｒＡ遺伝子を共発現させることによって達成された。全ての遺伝子の発現は、ＥＢＮＡを含む細胞株におけるプラスミドの安定な維持のためのｏｒｉＰ要素を含むプラスミド上のキメラＭＰＳＶプロモーターの制御下にあった。
【０４８４】
ビオチン化されたモノマー抗原／Ｆｃ融合分子の調製のために、指数関数的に増殖中の浮遊ＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞は、融合タンパク質の２つの成分（ノブ及びホール鎖）並びに、ビオチン化反応のために必要な酵素である、ＢｉｒＡをコードしている３つのベクターでコトランスフェクトされた。該当するベクターは、９．５：９．５：１の比（「抗原ＥＣＤ−Ｆｃノブ−ａｖｉタグ」：「Ｆｃホール」：「ＢｉｒＡ」）で使用された。
【０４８５】
５００ｍｌの振盪フラスコ内でのタンパク質産生のために、トランスフェクション２４時間前に４億個のＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞が播種された。トランスフェクションのために、細胞は、２１０ｇで５分間遠心分離され、上清は、予め温められたＣＤ  ＣＨＯ培地に置き換えられた。発現ベクターは、２００μｇのベクターＤＮＡを含む２０ｍＬのＣＤ  ＣＨＯ培地中に再懸濁された。５４０μＬのポリエチレンイミン（ＰＥＩ）の添加後、溶液は、１５秒間混合され、室温で１０分間インキュベートされた。その後、細胞は、ＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合され、５００ｍＬの振盪フラスコに移されて、５％のＣＯ２雰囲気を有するインキュベーター内で３７℃で３時間インキュベートされた。インキュベーション後、１６０ｍＬのＦ１７培地が添加され、細胞は、２４時間培養された。トランスフェクションの１日後、１ｍＭのバルプロ酸及び７％のＦｅｅｄ  １（Ｌｏｎｚａ）が培養物に添加された。産生培地は、１００μＭのビオチンで更に補われた。７日間の培養後、細胞上清は、細胞を２１０ｇで１５分間スピンダウンすることによって収集された。溶液は、滅菌濾過され（０．２２μｍフィルター）、アジ化ナトリウムで０．０１％（ｗ／ｖ）の最終濃度まで補われ、４℃で維持された。
【０４８６】
分泌タンパク質は、プロテインＡを使用したアフィニティークロマトグラフィー、及びその後のサイズ排除クロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製された。アフィニティークロマトグラフィーのために、上清は、４０ｍＬの２０ｍＭ  リン酸ナトリウム、２０ｍＭ  クエン酸ナトリウム  ｐＨ７．５で平衡化されたＨｉＴｒａｐ  ＰｒｏｔｅｉｎＡ  ＨＰカラム（ＣＶ＝５ｍＬ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にロードされた。結合していないタンパク質は、少なくとも１０カラム容積の２０ｍＭ  リン酸ナトリウム、２０ｍＭ  クエン酸ナトリウム  ｐＨ７．５で洗浄することによって除去された。結合したタンパク質は、２０カラム容積を超える２０ｍＭ  クエン酸ナトリウム、１００ｍＭ  塩化ナトリウム、１００ｍＭ  グリシン、ｐＨ３．０の作製された直線ｐＨ勾配を使用して溶出された。カラムは、次いで、１０カラム容積の２０ｍＭ  クエン酸ナトリウム、１００ｍＭ  塩化ナトリウム、１００ｍＭ  グリシン、ｐＨ３．０で洗浄された。収集された画分のｐＨは、１／１０（ｖ／ｖ）の０．５Ｍのリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０の添加によって調整された。タンパク質は、２０ｍＭ  ヒスチジン、１４０ｍＭ  塩化ナトリウム、ｐＨ６．０で平衡化されたＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にロードする前に濃縮及び濾過された。
【０４８７】
タンパク質濃度は、アミノ酸配列に基づいて算出されたモル吸光係数を使用して、２８０ｎｍで光学濃度（ＯＤ）を測定することによって決定された。ＦｏｌＲ１−Ｆｃ−融合体の純度及び分子量は、還元剤の存在下及び非存在下でＳＤＳキャピラリー電気泳動によって製造業者の説明書（機器Ｃａｌｉｐｅｒ  ＬａｂＣｈｉｐＧＸ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）に従って解析された。試料の凝集体含有量は、２５ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４、１２５ｍＭ  ＮａＣｌ、２００ｍＭ  Ｌ−アルギニン一塩酸塩、０．０２％（ｗ／ｖ）  ＮａＮ３、ｐＨ６．７の２５℃のランニングバッファー中で平衡化されたＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００  ＳＷ  ＸＬ分析的サイズ排除カラム（Ｔｏｓｏｈ）を使用して解析された。
【０４８８】
精製された抗原−Ｆｃ−融合タンパク質は、抗原の正確な且つ天然の高次構造を確認するために、市販の抗体を使用して表面プラズモン共鳴アッセイによって解析された（データは示されていない）。
表1:ヒトFolR1抗体の単離、選択及び対抗選択のために作製された抗原
2020183403.tif 000004
表2:FolR-Fc-融合体の収量及び最終モノマー含有量のまとめ。
2020183403.tif 000005
【０４８９】
実施例２
ＣＤ３ε特異性を有する共通軽鎖の作製
本明細書に記載のＴ細胞活性化二重特異性分子は、少なくとも１つのＣＤ３結合部分を含む。この部分は、実験動物を免疫化すること、ファージライブラリーをスクリーニングすること又は既知の抗ＣＤ３抗体を使用することによって作製され得る。ＣＤ３ε特異性を有する共通軽鎖は、マウス親抗ＣＤ３ε抗体（ＣＨ２５２７）の軽鎖をヒト化することによって作製された。ヒト以外の起源の抗体のヒト化のために、ヒト以外の抗体（ドナー）からのＣＤＲ残基は、ヒト（アクセプター）抗体のフレームワーク上に移植されなければならない。一般に、アクセプターフレームワーク配列は、ドナーの配列を一まとまりの潜在的なアクセプター配列に対してアラインメントすること、並びにドナーに対する合理的な相同性を有するもの、又は構造及び活性にきわめて重要ないくつかの部位において類似したアミノ酸を示すものの何れかを選択することによって選択される。本場合において、抗体アクセプターフレームワークの探索は、親抗体のマウスＶＬドメイン配列を一まとまりのヒト生殖系列配列に対してアラインメントすること、及び高い配列同一性を示したヒト配列を選択することによって行われた。驚くべきことに、フレームワーク配列相同性に関する良好な一致は、ラムダ型のＶドメインファミリー７に属している比較的稀なヒト軽鎖、より正確には、ｈＶＬ＿７＿４６（ＩＭＧＴ命名法、ＧｅｎＢａｎｋ  寄託番号Ｚ７３６７４）において見出された。この稀なヒト軽鎖は、次いで、ＣＨ２５２７の軽鎖のヒト化のためのアクセプターフレームワークとして選択された。マウス軽鎖可変ドメインの３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）は、このアクセプターフレームワーク上にグラフトされた。フレームワーク４領域は生殖系列Ｖ遺伝子の可変領域の部分ではないので、この領域（Ｊエレメント）についてのアライメントは、個別に行われた。それ故に、この軽鎖のヒト化のためにＩＧＬＪ３−０２配列が選択された。
【０４９０】
１３種のヒト化変異体が作製された（ＣＨ２５２７−ＶＬ７＿４６−１からＶＬ７＿４６−１０、ＶＬ７＿４６−１２からＶＬ７＿４６−１４）。これらは、マウスＶドメイン配列に、又はヒト生殖系列配列と同一に維持され得るＣＤＲ残基（カバット定義）中に、復帰突然変異したフレームワーク残基（及びそれらの組合せ）において異なる。ＣＤＲの外側の以下のフレームワーク残基は、最終ヒト化ＶＬドメイン変異体ＶＬ７＿４６−１３においてマウス残基に復帰突然変異した（マウス残基が挙げられている）：それぞれ、Ｖ３６、Ｅ３８、Ｆ４４、Ｇ４６、Ｇ４９、及びＧ５７。ヒトＪエレメントＩＧＬＪ３−０２は、マウス親抗体のＪエレメントと１００％同一であった。
【０４９１】
実施例３
ＣＤ３ε特異性を有するヒト化変異体のＳＰＲ評価
ヒト化ＶＬ変異体は、２＋１  ＴＣＢ形式の、すなわち、ヒト化軽鎖Ｖドメインがマウス重鎖Ｖドメインと対にされた、キメラとして評価された。ＳＰＲ評価は、ＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６機器（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上で行われた。より正確には、変異体は、抗Ｆａｂ誘導体化ＧＬＭセンサーチップ（ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）２断片特異的、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）上で垂直方向で培養液上清から直接に捕捉された。以下の被分析物は、次いで、ヒト及びカニクイザルのＣＤ３εに対する結合を評価するために単一濃度として水平方向に注入された：それぞれ、３μＭ  ｈｕ  ＣＤ３ε（−１−２６）−Ｆｃ（ノブ）−ａｖｉ（ＩＤ８０７）及び２．５μＭ  ｃｙ  ＣＤ３ε−（−１−２６）−Ｆｃ（ノブ）−Ａｖｉ−Ｆｃ（ホール）（ＩＤ８７３）。結合応答は、マウスコントロールコンストラクトの結合と質的に比較され、＋（比較可能な結合が観察される）、＋／−（低減された結合が観察される）及び−（結合が観察されない）に分類された。捕捉抗体は、リガンド捕捉及び被分析物結合の各サイクルの後に再生され、マウスコンストラクトは、捕捉表面の活性を確認するために試験の終了時に再注入された。結果は、表３にまとめられている。
2020183403.tif 000006
表3 CH2527のマウス重鎖と組み合わされたヒト化軽鎖変異体についてのSPRに基づいた定性的結合評価。太字で強調されている、最終的に選択されたヒト化軽鎖変異体、CH2527-VL7_46-13のみが、ヒト及びカニクイザルのCD3εに対する比較可能な結合を示した。
【０４９２】
実施例４
ＣＤ３ε特異性を有するヒト化共通軽鎖の特性
ヒト化鉛分子のために選択された軽鎖Ｖドメイン変異体は、ＶＬ７＿４６−１３である。ヒト化の程度、すなわち、ヒト生殖系列Ｖドメイン配列に対するヒト化Ｖドメインの配列相同性が決定された。ＶＬ７＿４６−１３については、最も近いヒト生殖系列ホモログとの全体の配列同一性は、ヒト化前に６５％であり、ヒト化後に８０％である。ＣＤＲ領域を除き、配列同一性は、最も近いヒト生殖系列ホモログに対して９２％である。表３から理解され得るように、ＶＬ７＿４６−１３は、一区画の１３種の変異体のうち、親マウス抗体に対する比較可能な結合を示し、且つ更にカニクイザルＣＤ３εに対するその交差反応性を保持した唯一のヒト化ＶＬ変異体である。この結果は、ＣＤ３εに対する結合親和性を失うことなくマウスＶＬドメインをヒト化することは簡単ではなく、これには、ＣＤＲ１内にＧ２４を保持しつつ同時にマウスフレームワーク残基（特にＧ４６）にいくつかの復帰突然変異が必要とされたことを示している。加えて、この結果は、ＶＬドメインが、標的認識において重要な役割を果たすことを示している。重要なことに、ラムダ型のＶドメインファミリー７に属しており且つＣＤ３εに対する親和性及び特異性を保持している稀なヒト生殖系列に基づくヒト化ＶＬドメインＶＬ７＿４６−１３は、Ｆａｂ形式のファージディスプレイされた抗体ライブラリーにおける共通軽鎖としての使用にも好適であり、ＣＤ３ε及び、例えば、腫瘍標的に結合し且つ同じ「共通」軽鎖を共有する二重特異性分子の作製及び産生を大いに促進する新規特異性のための選択の成功を可能にする。
【０４９３】
実施例５
ＨＶＫ１−３９に由来するヒト生殖系列共通軽鎖を使用してファージディスプレイされた抗体ライブラリーの作製
全長ヒトＩｇＧに類似した二重特異性抗体を作製するためのいくつかの手法は、異なる２つの重鎖のヘテロ二量体化を誘導するＦｃ領域内の修飾を利用するものである。このような例には、ノブ・イントゥー・ホール（Merchant等、Nat Biotechnol. 1998 Jul;16(7):677-81）、ＳＥＥＤ（Davis等、Protein Eng Des Sel. 2010 Apr;23(4):195-202）及び静電気的操縦技術（Gunasekaran等、J Biol Chem. 2010 Jun 18;285(25):19637-46）が含まれる。これらの手法は異なる２つの重鎖の有効なヘテロ二量体化を可能にするが、同起源の軽鎖及び重鎖の適切な対形成には問題が残される。共通軽鎖（ＬＣ）の使用により、この問題を解決することができる（Merchant等 Nat Biotech 16, 677-681 (1998)）。
【０４９４】
ここでは、本発明者らは、Ｍ１３ファージ上でのディスプレイのための抗体ライブラリーの作製について記載する。基本的には、本発明者らは、１つの一定の（又は「共通の」）軽鎖を有する重鎖のためのマルチフレームワークライブラリーを設計した。このライブラリーは、軽鎖誤対合を回避するために精巧な技術を使用する必要なく多重特異性抗体を作製するために設計されている。
【０４９５】
共通軽鎖を使用することにより、もはや誤対合が生じないので、これらの分子の産生を促進することができ、きわめて純粋な二重特異性抗体の単離が促進される。他の形式と比較されるとき、ビルディングブロックとしてのＦａｂ断片の使用は、例えば、ｓｃＦｖ断片の使用とは、反対に、より高い熱安定性をもたらし、ｓｃＦｖ凝集及び分子間ｓｃＦｖ形成をなくす。
【０４９６】
ライブラリー作製
以下では、Ｍ１３ファージ上でのディスプレイのための抗体ライブラリーの作製が記載されている。基本的には、本発明者らは、１つの一定の（又は「共通の」）軽鎖を有する重鎖のためのマルチフレームワークライブラリーを設計した。
【０４９７】
本発明者らは、ライブラリー中のこれらの重鎖を使用した（括弧内にＧｅｎＢａｎｋ寄託番号）：
ＩＧＨＶ１−４６＊０１（Ｘ９２３４３）（配列番号１０４）、
ＩＧＨＶ１−６９＊０６（Ｌ２２５８３）、（配列番号１０５）
ＩＧＨＶ３−１５＊０１（Ｘ９２２１６）、（配列番号１０６）
ＩＧＨＶ３−２３＊０１（Ｍ９９６６０）、（配列番号１０７）
ＩＧＨＶ４−５９＊０１（ＡＢ０１９４３８）、（配列番号１０８）
ＩＧＨＶ５−５１＊０１（Ｍ９９６８６）、（配列番号１０９）
【０４９８】
ＩＧＨＪ６配列を使用するＩＧＨＶ１−６９＊０６を除き、全ての重鎖は、ＪエレメントとしてＩＧＨＪ２を使用する。無作為化の設計には、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３が含まれていた。ＣＤＲ−Ｈ１及びＣＤＲ−Ｈ２については、「ソフトな」無作為化戦略が選択され、無作為化オリゴヌクレオチドは、生殖系列配列のアミノ酸のためのコドンが５０％で存在したものであった。システインを除き、他の全てのアミノ酸は、残りの５０％に合計された。遺伝的Ｄエレメントの存在が原因で生殖系列アミノ酸が存在しないＣＤＲ−Ｈ３では、オリゴヌクレオチドは、長さが４から９アミノ酸のＶエレメントとＪエレメントとの間の無作為化されたインサートの使用を可能にするように設計された。それらのオリゴヌクレオチドは、それらの無作為化された部分内に含まれ、例えば、３つのアミノ酸Ｇ／Ｙ／Ｓはそれぞれ１５％存在し、アミノ酸Ａ／Ｄ／Ｔ／Ｒ／Ｐ／Ｌ／Ｖ／Ｎ／Ｗ／Ｆ／Ｉ／Ｅはそれぞれ４，６％存在する。
【０４９９】
抗体ライブラリーの作製のための例示的な方法は、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９１、１９、４１３３−４１３；Ｌｅｅ等  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２００４）３４０、１０７３−１０９３に記載されている。
【０５００】
軽鎖は、ヒト配列ｈＶＫ１−３９由来であり、非修飾及び非無作為化様式で使用される。これは、同じ軽鎖が追加の修飾なしで他のプロジェクトに使用され得ることを確実にすることになる。
【０５０１】
例示的なライブラリー選択：
全ての親和性成熟ライブラリーでの選択は、標的抗原Ｘのモノマーの且つビオチン化された細胞外ドメインを使用して溶液中で以下の手順に従って行われる。
【０５０２】
１．各ライブラリーの１０＾１２個のファージミド粒子を、１００ｎＭのビオチン化された可溶性抗原に１ｍｌの総容量で０．５時間結合させる。２．ビオチン化された抗原が捕捉され、特異的に結合させたファージ粒子が〜５×１０＾７ストレプトアビジン被覆磁気ビーズの１０分間の添加によって単離される。３．ビーズは、５−１０×の１ｍｌのＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０及び５−１０×の１ｍｌのＰＢＳを使用して洗浄される。４．ファージ粒子の溶出は、１ｍｌの１００ｍＭのＴＥＡ（トリエチルアミン）の１０分間の添加及び５００ｕｌの１ＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ７．４の添加による中和によって行われ、且つ５．指数関数的に増殖中の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＧ１細菌の再感染、ヘルパーファージＶＣＳＭ１３での感染、及びその後のファージミド粒子のＰＥＧ／ＮａＣｌ沈澱がその後の選択回において適用される。選択は、一定の抗原濃度又は漸減（１０＾−７Ｍから２×１０＾−９Ｍまで）抗原濃度の何れかを使用して３−５回にわたって行われる。２回目では、抗原／ファージ複合体の捕捉は、ストレプトアビジンビーズの代わりにニュートラアビジンプレートを使用して行われる。全ての結合反応は、プラスチック支持材に対する抗体の単なる粘着性の結合から生じる望ましくないクローンについて競合するために、１００ｎＭのウシ血清アルブミン、又は脱脂粉乳の何れかで補われる。
【０５０３】
選択は、抗原が１００ｎＭから開始して最終選択回には５ｎＭまで低下していく漸減抗原濃度を使用して３回又は４回にわたって行われている。特異的なバインダーは、バックグラウンドよりも約５×高いシグナルとして定義され、ＥＬＩＳＡによって同定される。特異的なバインダーは、ＥＬＩＳＡによって以下のように同定される：１ウェルあたり１００μｌの１０ｎＭのビオチン化抗原が、ニュートラアビジンプレート上に被覆される。Ｆａｂを含む細菌上清が添加され、結合しているＦａｂは、そのＦｌａｇタグを介して、抗Ｆｌａｇ／ＨＲＰ二次抗体を使用することによって検出される。ＥＬＩＳＡポジティブクローンは、９６ウェル形式で可溶性Ｆａｂ断片として細菌に発現され、上清で、ＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６（ＢｉｏＲａｄ）を使用したＳＰＲ解析による動態スクリーニング実験が行われる。最も大きな親和定数を有するＦａｂを発現しているクローンが同定され、対応するファージミドが配列決定される。更なる特徴づけのために、Ｆａｂ配列は、ＰＣＲを介してファージミドから増幅され、適切な制限部位を介して哺乳動物の産生のためのヒトＩｇＧ１発現ベクター内にクローニングされる。
【０５０４】
ヒト化ＣＤ３ε特異的共通軽鎖を使用してファージディスプレイされた抗体ライブラリーの作製
ここでは、Ｍ１３ファージ上でのディスプレイのための抗体ライブラリーの作製が記載されている。基本的には、本発明者らは、１つの一定の（又は「共通の」）軽鎖を有する重鎖のためのマルチフレームワークライブラリーを設計した。このライブラリーは、１つ又は２つのＦａｂが、腫瘍細胞上で発現される腫瘍表面抗原を認識するのに対して、抗体の残りのＦａｂアームが、Ｔ細胞上のＣＤ３ｅを認識する、Ｆｃを含むがＦｃｇＲ結合不活性な、ＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ又はＩｇＧ４  ＳＰＬＥ  ＰＧアイソタイプのＴ細胞二重特異性抗体の作製のために設計された。
【０５０５】
ライブラリー作製
以下では、Ｍ１３ファージ上でのディスプレイのための抗体ライブラリーの作製が記載されている。基本的には、本発明者らは、１つの一定の（又は「共通の」）軽鎖を有する重鎖のためのマルチフレームワークライブラリーを設計した。このライブラリーは、Ｆｃを含むがＦｃｇＲ結合不活性な、ＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ又はＩｇＧ４  ＳＰＬＥ  ＰＧアイソタイプのＴ細胞二重特異性抗体の作製のためだけに設計されている。
【０５０６】
多様性は、無作為化オリゴヌクレオチドを介して異なる重鎖のＣＤＲ３内のみに導入された。抗体ライブラリーの作製のための方法は、当技術分野においてよく知られており、（Hoogenboom等、Nucleic Acids Res. 1991, 19, 4133-413;又は:Lee等 J. Mol. Biol. (2004) 340, 1073-1093）に記載されている。
【０５０７】
本発明者らは、ライブラリー中のこれらの重鎖を使用した：
ＩＧＨＶ１−４６＊０１（Ｘ９２３４３）、（配列番号１０４）
ＩＧＨＶ１−６９＊０６（Ｌ２２５８３）、（配列番号１０５）
ＩＧＨＶ３−１５＊０１（Ｘ９２２１６）、（配列番号１０６）
ＩＧＨＶ３−２３＊０１（Ｍ９９６６０）、（配列番号１０７）
ＩＧＨＶ４−５９＊０１（ＡＢ０１９４３８）、（配列番号１０８）
ＩＧＨＶ５−５１＊０１（Ｍ９９６８６）、（配列番号１０９）
【０５０８】
本発明者らは、ライブラリー中のヒト化されたヒト及びカニクイザルのＣＤ３ε特異抗体ＣＨ２５２７に由来する軽鎖を使用した：（ＶＬ７＿４６−１３；配列番号１１２）。この軽鎖は、無作為化されておらず、異なる二重特異性バインダーとの適合性を確実にするためにいかなる更なる修飾もなく使用された。
【０５０９】
ＩＧＨＪ６配列を使用するＩＧＨＶ１−６９＊０６を除き、全ての重鎖は、ＪエレメントとしてＩＧＨＪ２を使用する。無作為化の設計は、ＣＤＲ−Ｈ３のみに焦点が定められ、ＰＣＲオリゴヌクレオチドは、長さが４から９アミノ酸のＶエレメントとＪエレメントとの間の無作為化されたインサートの使用を可能にするように設計された。
【０５１０】
実施例６
ＦｏｌＲ１に対する（ＣＤ３ε特異性を有する軽鎖を含む）共通軽鎖ライブラリーからの抗体断片の選択
ＣＤ３ε特異性を有する共通軽鎖ＶＬ７＿４６−１３を含む抗体１６Ａ３、１５Ａ１、１８Ｄ３、１９Ｅ５、１９Ａ４、１５Ｈ７、１５Ｂ６、１６Ｄ５、１５Ｅ１２、２１Ｄ１、１６Ｆ１２、２１Ａ５、２１Ｇ８、１９Ｈ３、２０Ｇ６、及び２０Ｈ７は、異なる種（ヒト、カニクイザル及びマウス）のＦｏｌＲ１に対するファージディスプレイ選択によって得られた。クローン１６Ａ３、１５Ａ１、１８Ｄ３、１９Ｅ５、１９Ａ４、１５Ｈ７、１５Ｂ６、２１Ｄ１、１６Ｆ１２、１９Ｈ３、２０Ｇ６、及び２０Ｈ７は、共通軽鎖がヒト生殖系列ＶＨ１＿４６に基づいた重鎖レパートリーと対にされたサブライブラリーから選択された。このサブライブラリーにおいて、ＶＨ１＿４６のＣＤＲ３は、異なる６つのＣＤＲ３長に基づいて無作為化されている。クローン１６Ｄ５、１５Ｅ１２、２１Ａ５、及び２１Ｇ８は、共通軽鎖がヒト生殖系列ＶＨ３＿１５に基づいた重鎖レパートリーと対にされたサブライブラリーから選択された。このサブライブラリーにおいて、ＶＨ３＿１５のＣＤＲ３は、異なる６つのＣＤＲ３長に基づいて無作為化されている。種交差反応性（又はマウスＦｏｌＲ１反応性）抗体を得るために、異なる種のＦｏｌＲ１は、以下の３回のバイオパニングにわたる異なる方法で交替された（又は一定に維持された）：１６Ａ３及び１５Ａ１（ヒト−カニクイザル−ヒトＦｏｌＲ１）；１８Ｄ３（カニクイザル−ヒト−マウスＦｏｌＲ１）；１９Ｅ５及び１９Ａ４（マウスＦｏｌＲ１に対して３回）；１５Ｈ７、１５Ｂ６、１６Ｄ５、１５Ｅ１２、２１Ｄ１、１６Ｆ１２、２１Ａ５、２１Ｇ８（ヒト−カニクイザル−ヒトＦｏｌＲ１）；１９Ｈ３、２０Ｇ６、及び２０Ｈ７（マウスＦｏｌＲ１に対して３回）。
【０５１１】
ファージディスプレイ選択並びにＥＬＩＳＡに基づくスクリーニング及びＳＰＲに基づくスクリーニングのための抗原としてのヒト、マウス及びカニクイザルのＦｏｌＲ１は、ＨＥＫ  ＥＢＮＡ細胞においてＮ末端モノマーＦｃ融合体として一過的に発現され、受容体鎖（Ｆｃノブ鎖）を有するＦｃ部分のＣ末端に位置するａｖｉタグ認識配列においてＢｉｒＡビオチンリガーゼの共発現を介してインビボで部位特異的にビオチン化された。ＦｏｌＲ１に対する特異性を評価するために、２つの関連した受容体、ヒトＦｏｌＲ２及びＦｏｌＲ３が同様の方法で作製された。
【０５１２】
各選択回（バイオパニング）は、以下のパターンに従って溶液中で行われた：
１．抗原のＦｃ部分を認識する抗体のライブラリーを枯渇させるために１０ｕｇ／ｍｌの無関係なヒトＩｇＧで被覆されたマキシソーププレート上の〜１０１２個のファージミド粒子のプレクリアリング。
２．非Ｆｃ結合ファージミド粒子を、１００ｎＭのビオチン化されたヒト、カニクイザル、又はマウスのＦｏｌＲ１と共に、Ｆｃバインダーの更なる枯渇のための１００ｎＭの無関係な非ビオチン化Ｆｃノブ・イントゥ・ホールコンストラクトの存在下で１ｍｌの総容量で０．５時間インキュベートすること。
３．ニュートラアビジンで予め被覆されたマイクロタイタープレートの４つのウェルに（１回目及び３回目に）１０分間移すことにより、ビオチン化されたＦｏｌＲ１及び結合させた、特異的に結合するファージを捕捉すること。
４．５×のＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０及び５×のＰＢＳを使用してそれぞれのウェルを洗浄すること。
５．１ウェルあたり２５０ｕｌの１００ｍＭのＴＥＡ（トリエチルアミン）の１０分間の添加及び４つのウェルからのプールされた溶出液への５００ｕｌの１ＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ７．４の添加による中和によってファージ粒子を溶出すること。
６．Ｆｃバインダー及び非特異的バインダーの最終除去のために、ニュートラアビジンで予め被覆されたマイクロタイタープレート上で、１００ｎＭのビオチン捕捉されたＦｏｌＲ２又はＦｏｌＲ３と共にインキュベートすることによる、中和された溶出液のポストクリアリング。
７．溶出されたファージ粒子の上清での対数増殖期大腸菌ＴＧ１細胞の再感染、ヘルパーファージＶＣＳＭ１３での感染、振盪機上での３０℃で一晩のインキュベーション及びその後の次の選択回において使用されるファージミド粒子のＰＥＧ／ＮａＣｌ沈澱。
【０５１３】
選択は、１００ｎＭの一定の抗原濃度を使用して３回を超えて行われた。２回目では、ニュートラアビジンに対するバインダーの濃縮を回避するために、抗原の捕捉：ファージ複合体は、５．４×１０７ストレプトアビジン被覆磁気ビーズの添加によって成し遂げられた。特異的なバインダーは、ＥＬＩＳＡによって以下のように同定された：１００ｕｌの２５ｎＭのビオチン化されたヒト、カニクイザル、又はマウスのＦｏｌＲ１、及び１０ｕｇ／ｍｌのヒトＩｇＧが、それぞれニュートラアビジンプレート及びマキシソーププレート上に被覆された。Ｆａｂを含む細菌上清が添加され、結合しているＦａｂは、そのＦｌａｇタグを介して、抗Ｆｌａｇ／ＨＲＰ二次抗体を使用して検出された。ヒトＦｏｌＲ１におけるシグナルを示し且つヒトＩｇＧにおいてネガティブであるクローンは、更なる解析のために選抜候補リストに入れられ、類似した様式で残りの２つの種のＦｏｌＲ１に対しても試験された。これらは、０．５リットルの培養容量で細菌に発現され、アフィニティー精製されて、ＢｉｏＲａｄのＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６バイオセンサーを使用したＳＰＲ解析によって更に特徴づけされた。
【０５１４】
選択されたクローンの親和性（ＫＤ）は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により、ＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６機器（Ｂｉｏｒａｄ）を使用して、ニュートラアビジン捕捉によってＮＬＣチップ上に固定化されたビオチン化されたヒト、カニクイザル、及びマウスのＦｏｌＲ１、並びにヒトＦｏｌＲ２及びＦｏｌＲ３（ネガティブコントロール）と共に２５℃で測定された。抗原（リガンド）の固定化：組換え抗原は、ＰＢＳＴ（１０ｍＭ  リン酸塩、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム  ｐＨ７．４、０．００５％  Ｔｗｅｅｎ２０）で１０μｇ／ｍｌに希釈され、次いで、３０μｌ／分で垂直方向で注入された。被分析物の注入：「ワンショット動態」測定のために、注入方向は水平方向に変更され、精製されたＦａｂの２倍希釈系列（異なる濃度範囲）が、２００秒の結合時間、及び６００秒の解離時間で、別々のチャネル１−５に沿って同時に注入された。参照のために「ラインに入っている」ブランクを得るために、第６のチャネルに沿ってバッファー（ＰＢＳＴ）が注入された。結合速度定数（ｋｏｎ）及び解離速度定数（ｋｏｆｆ）は、ＰｒｏｔｅＯｎ  Ｍａｎａｇｅｒ  ｖ３．１ソフトウェアにおいて単純な１対１のラングミュア結合モデルを使用して結合及び解離のセンサーグラムを同時にフィッティングすることによって算出された。平衡解離定数（ＫＤ）は、比ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして算出された。表４は、ＦｏｌＲ１に特異的な選択されたクローンの平衡解離定数（ＫＤ）を一覧にしたものである。
表4:VL7_46-13、CD3εに特異的なヒト化軽鎖を含む共通軽鎖サブライブラリーからファージディスプレイによって選択された抗FolR1抗体(Fab形式)についての平衡解離定数(KD)。nMでのKD。
2020183403.tif 000007
【０５１５】
実施例７
ＦｏｌＲ１に対する一般的なマルチフレームワークライブラリーからの抗体断片の選択
抗体１１Ｆ８、３６Ｆ２、９Ｄ１１、５Ｄ９、６Ｂ６、及び１４Ｅ４は、異なる種（ヒト、カニクイザル及びマウス）のＦｏｌＲ１に対する一般的なマルチフレームワークサブライブラリーに基づいたファージディスプレイ選択によって得られた。これらのマルチフレームワークサブライブラリーにおいて、無作為化されたＣＤＲ３（異なる３つの長さ）を有する異なるＶＬドメインは、無作為化されたＣＤＲ３（異なる６つの長さ）を有する異なるＶＨドメインと対にされる。選択されたクローンは、以下のＶＬ／ＶＨペアリングのものである：１１Ｆ８（Ｖｋ＿１＿５／ＶＨ＿１＿６９）、３６Ｆ２（Ｖｋ＿３＿２０／ＶＨ＿１＿４６）、９Ｄ１１（Ｖｋ２Ｄ＿２８／ＶＨ１＿４６）、５Ｄ９（Ｖｋ３＿２０／ＶＨ１＿４６）、６Ｂ６（Ｖｋ３＿２０／ＶＨ１＿４６）、及び１４Ｅ４（Ｖｋ３＿２０／ＶＨ３＿２３）。種交差反応性（又はマウスＦｏｌＲ１反応性）抗体を得るために、異なる種のＦｏｌＲ１は、以下の３回又は４回のバイオパニングにわたる異なる方法で交替された（又は一定に維持された）：１１Ｆ８（カニクイザル−マウス−ヒトＦｏｌＲ１）；３６Ｆ２（ヒト−マウス−カニクイザル−マウスＦｏｌＲ１）；９Ｄ１１（カニクイザル−ヒト−カニクイザルＦｏｌＲ１）；５Ｄ９（ヒト−カニクイザル−ヒトＦｏｌＲ１）；６Ｂ６（ヒト−カニクイザル−ヒトＦｏｌＲ１）及び１４Ｅ４（マウスＦｏｌＲ１に対して３回）。
【０５１６】
ファージディスプレイ選択並びにＥＬＩＳＡに基づくスクリーニング及びＳＰＲに基づくスクリーニングのための抗原としてのヒト、マウス及びカニクイザルのＦｏｌＲ１は、ＨＥＫ  ＥＢＮＡ細胞においてＮ末端モノマーＦｃ融合体として一過的に発現され、受容体鎖（Ｆｃノブ鎖）を有するＦｃ部分のＣ末端に位置するａｖｉタグ認識配列においてＢｉｒＡビオチンリガーゼの共発現を介してインビボで部位特異的にビオチン化された。ＦｏｌＲ１に対する特異性を評価するために、２つの関連した受容体、ヒトＦｏｌＲ２及びＦｏｌＲ３が同様の方法で作製された。
【０５１７】
各選択回（バイオパニング）は、以下のパターンに従って溶液中で行われた：
１．抗原のＦｃ部分を認識する抗体のライブラリーを枯渇させるために１０ｕｇ／ｍｌの無関係なヒトＩｇＧで被覆されたマキシソーププレート上の〜１０１２個のファージミド粒子のプレクリアリング。
２．非Ｆｃ結合ファージミド粒子を、１００ｎＭのビオチン化されたヒト、カニクイザル、又はマウスのＦｏｌＲ１と共に、Ｆｃバインダーの更なる枯渇のための１００ｎＭの無関係な非ビオチン化Ｆｃノブ・イントゥ・ホールコンストラクトの存在下で１ｍｌの総容量で０．５時間インキュベートすること。
３．ニュートラアビジンで予め被覆されたマイクロタイタープレートの４つのウェルに（１回目及び３回目に）１０分間移すことにより、ビオチン化されたＦｏｌＲ１及び結合させた、特異的に結合するファージを捕捉すること。
４．５×のＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０及び５×のＰＢＳを使用してそれぞれのウェルを洗浄すること。
５．１ウェルあたり２５０ｕｌの１００ｍＭのＴＥＡ（トリエチルアミン）の１０分間の添加及び４つのウェルからのプールされた溶出液への５００ｕｌの１ＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ７．４の添加による中和によってファージ粒子を溶出すること。
６．Ｆｃバインダー及び非特異的バインダーの最終除去のために、ニュートラアビジンで予め被覆されたマイクロタイタープレート上で、１００ｎＭのビオチン捕捉されたＦｏｌＲ２又はＦｏｌＲ３と共にインキュベートすることによる、中和された溶出液のポストクリアリング。
７．溶出されたファージ粒子の上清での対数増殖期大腸菌ＴＧ１細胞の再感染、ヘルパーファージＶＣＳＭ１３での感染、振盪機上での３０℃で一晩のインキュベーション及びその後の次の選択回において使用されるファージミド粒子のＰＥＧ／ＮａＣｌ沈澱。
【０５１８】
選択は、１００ｎＭの一定の抗原濃度を使用して３回を超えて行われた。２回目及び４回目では、ニュートラアビジンに対するバインダーの濃縮を回避するために、抗原の捕捉：ファージ複合体は、５．４×１０７ストレプトアビジン被覆磁気ビーズの添加によって成し遂げられた。特異的なバインダーは、ＥＬＩＳＡによって以下のように同定された：１００ｕｌの２５ｎＭのビオチン化されたヒト、カニクイザル、又はマウスのＦｏｌＲ１、及び１０ｕｇ／ｍｌのヒトＩｇＧが、それぞれニュートラアビジンプレート及びマキシソーププレート上に被覆された。Ｆａｂを含む細菌上清が添加され、結合しているＦａｂは、そのＦｌａｇタグを介して、抗Ｆｌａｇ／ＨＲＰ二次抗体を使用して検出された。ヒトＦｏｌＲ１におけるシグナルを示し且つヒトＩｇＧにおいて陰性であるクローンは、更なる解析のために選抜候補リストに入れられ、類似した様式で残りの２つの種のＦｏｌＲ１に対しても試験された。これらは、０．５リットルの培養容量で細菌に発現され、アフィニティー精製されて、ＢｉｏＲａｄのＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６バイオセンサーを使用したＳＰＲ解析によって更に特徴づけされた。
【０５１９】
選択されたクローンの親和性（ＫＤ）は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により、ＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６機器（Ｂｉｏｒａｄ）を使用して、ニュートラアビジン捕捉によってＮＬＣチップ上に固定化されたビオチン化されたヒト、カニクイザル、及びマウスのＦｏｌＲ１、並びにヒトＦｏｌＲ２及びＦｏｌＲ３（ネガティブコントロール）と共に２５℃で測定された。抗原（リガンド）の固定化：組換え抗原は、ＰＢＳＴ（１０ｍＭ  リン酸塩、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム  ｐＨ７．４、０．００５％  Ｔｗｅｅｎ２０）で１０μｇ／ｍｌに希釈され、次いで、３０μｌ／分で垂直方向で注入された。被分析物の注入：「ワンショット動態」測定のために、注入方向は水平方向に変更され、精製されたＦａｂの２倍希釈系列（異なる濃度範囲）が、それぞれ、１５０又は２００秒の結合時間、及び２００又は６００秒の解離時間で、別々のチャネル１−５に沿って同時に注入された。参照のために「ラインに入っている」ブランクを得るために、第６のチャネルに沿ってバッファー（ＰＢＳＴ）が注入された。結合速度定数（ｋｏｎ）及び解離速度定数（ｋｏｆｆ）は、ＰｒｏｔｅＯｎ  Ｍａｎａｇｅｒ  ｖ３．１ソフトウェアにおいて単純な１対１のラングミュア結合モデルを使用して結合及び解離のセンサーグラムを同時にフィッティングすることによって算出された。平衡解離定数（ＫＤ）は、比ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして算出された。表５は、ＦｏｌＲ１に特異的な選択されたクローンの平衡解離定数（ＫＤ）を一覧にしたものである。
表5:一般的なマルチフレームワークサブライブラリーからファージディスプレイによって選択された抗FolR1抗体(Fab形式)についての平衡解離定数(KD)。nMでのKD。
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【０５２０】
実施例８
ＩｇＧ及びＴ細胞二重特異性形式の新規ＦｏｌＲ１バインダーの産生及び精製
選択された標的細胞のＴ細胞依存的な死滅を誘導することが可能なＦｏｌＲ１バインダーを同定するために、共通軽鎖ライブラリー又はＦａｂライブラリーから単離された抗体は、対応するヒトＩｇＧ１形式に変換された。簡単に説明すると、ファージディスプレイからの固有のＦｏｌＲ１バインダーの可変重鎖及び可変軽鎖は、標準的なＰＣＲ反応によって鋳型としてＦａｂクローンを使用して増幅された。ＰＣＲ産物は、精製され、それらが適切なヒト定常重鎖又はヒト定常軽鎖に融合される好適な発現ベクター内に（制限エンドヌクレアーゼ及びリガーゼに基づくクローニングによって、又はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのＩｎＦｕｓｉｏｎキットを使用する「リコンビニーリング」によっての何れかで）挿入された。これらのベクター内の発現カセットは、キメラＭＰＳＶプロモーター及び合成ポリアデニル化部位からなる。更に、これらのプラスミドは、ＥＢＶ核抗原（ＥＢＮＡ）を有するＨＥＫ２９３細胞内でのプラスミドの安定な維持のためのＥｐｓｔｅｉｎ  ＢａｒｒウイルスからのｏｒｉＰ領域を含む。ＰＥＩ媒介性トランスフェクション後、抗体は、ＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞において一過的に産生され、標準的なＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマトグラフィー及びその後のサイズ排除クロマトグラフィーによって以下に記載のように精製された：
【０５２１】
一過的トランスフェクション及び産生
本明細書中で使用される全ての（二重特異性）抗体は（商業的な供給源から得られたのではない場合）、下記のような、必要とされるベクターのための、ＰＥＩ媒介性トランスフェクション手順を使用して、ＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞において一過的に産生された。ＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞は、ＣＤ  ＣＨＯ培養培地中で無血清懸濁培養される。５００ｍｌの振盪フラスコ内での産生のために、トランスフェクション２４時間前に４億個のＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞が播種される（代替の規模では、全ての量がそれに応じて調整された）。トランスフェクションのために、細胞は、２１０×ｇによって５分間遠心分離され、上清は、予め温められた２０ｍｌのＣＤ  ＣＨＯ培地に置き換えられる。発現ベクターは、２００μｇのＤＮＡの最終量になるように、２０ｍｌのＣＤ  ＣＨＯ培地中に混合される。５４０μｌのＰＥＩの添加後、溶液は、１５秒間ボルテックス処理され、次いで、室温で１０分間インキュベートされる。その後、細胞は、ＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合され、５００ｍｌの振盪フラスコに移されて、５％のＣＯ２雰囲気を有するインキュベーター内で３７℃によって３時間インキュベートされる。インキュベーション時間後、１６０ｍｌのＦ１７培地が添加され、細胞は、２４時間培養される。トランスフェクションの１日後、１ｍＭのバルプロ酸及び７％のＦｅｅｄ１が添加される。７日間の培養後、上清は、２１０×ｇで１５分間の遠心分離によって精製のために収集され、その溶液は、滅菌濾過され（０．２２μｍフィルター）、０．０１％ｗ／ｖの最終濃度のアジ化ナトリウムが添加されて、４℃で維持される。産生後、上清は収集され、抗体を含む上清は０．２２μｍの滅菌フィルターに通して濾過されて、精製まで４℃で保存された。
【０５２２】
抗体精製
全ての分子は、プロテインＡアフィニティー精製（Ａｋｔａ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ）及びサイズ排除クロマトグラフィー等の、標準的な手順を使用して２ステップで精製された。一過性の産生から得られた上清は、（２ＭのＴＲＩＳ  ｐＨ８．０を使用して）ｐＨ８．０に調整され、８カラム容積（ｃｖ）のバッファーＡ（２０ｍＭ  リン酸ナトリウム、２０ｍＭ  クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．５）で平衡化されたＨｉＴｒａｐ  ＰＡ  ＦＦ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カラム容積（ｃｖ）＝５ｍｌ）にアプライされた。１０ｃｖのバッファーＡでの洗浄後、タンパク質は、１２ｃｖを超えるバッファーＢ（２０ｍＭ  クエン酸ナトリウム  ｐＨ３、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１００ｍＭ  グリシン）へのｐＨ勾配を使用して溶出された。目的のタンパク質を含む画分がプールされ、溶液のｐＨは、（０．５ＭのＮａ２ＨＰＯ４  ｐＨ８．０を使用して）穏やかにｐＨ６．０に調整された。試料は、超濃縮装置（Ｖｉｖａｓｐｉｎ  １５Ｒ  ３０．０００  ＭＷＣＯ  ＨＹ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を使用して２ｍｌに濃縮され、次いで、２０ｍＭ  ヒスチジン、ｐＨ６．０、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ−２０で平衡化されたＨｉＬｏａｄ（商標）１６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）２００調製用グレード（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にアプライされた。溶出された画分の凝集体含有量は、分析用サイズ排除クロマトグラフィーによって解析された。そのため、３０μｌの各画分が、２５ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４、１２５ｍＭ  ＮａＣｌ、２００ｍＭ  Ｌ−アルギニン一塩酸塩、０．０２％（ｗ／ｖ）  ＮａＮ３、ｐＨ６．７のランニングバッファー中で２５℃で平衡化されたＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００  ＳＷ  ＸＬ分析用サイズ排除カラム（Ｔｏｓｏｈ）にアプライされた。２％未満のオリゴマーを含む画分がプールされ、超濃縮装置（Ｖｉｖａｓｐｉｎ  １５Ｒ  ３０．０００  ＭＷＣＯ  ＨＹ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を使用して１−１．５ｍｇ／ｍｌの最終濃度に濃縮された。タンパク質濃度は、アミノ酸配列に基づいて算出されたモル吸光係数を使用して、２８０ｎｍで光学濃度（ＯＤ）を測定することによって決定された。コンストラクトの純度及び分子量は、還元剤の存在下及び非存在下でＳＤＳキャピラリー電気泳動によって製造業者の説明書（機器Ｃａｌｉｐｅｒ  ＬａｂＣｈｉｐＧＸ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）に従って解析された。精製されたタンパク質は、液体Ｎ２中で凍結され、−８０℃で保存された。
【０５２３】
インビトロでの特徴づけの結果に基づき、選択されたバインダーは、Ｔ細胞二重特異性形式に変換された。これらの分子では、ＦｏｌＲ１：ＣＤ３結合部分が２：１のオーダーで配置され、ＦｏｌＲ１  ＦａｂがＮ末端に位置される。標準的なＦａｂライブラリーから単離されたクローンでは、ＣＤ３結合部分は、ＣｒｏｓｓＦａｂ（ＣＨ１Ｃκ交差）として作製されたのに対し、共通軽鎖ライブラリーからのクローンでは、交差は必要ではなかった。これらの二重特異性分子は、ＩｇＧと類似に産生及び精製された。
表6: IgG及びTCBそれぞれの形式の新規FolR1バインダーの収量及びモノマー含有量。
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【０５２４】
実施例９
２＋１及び１＋１  Ｔ細胞二重特異性形式
１つの共通軽鎖バインダー（１６Ｄ５）については異なる４つのＴ細胞二重特異性形式が、Ｆａｂライブラリーからの１つのバインダー（９Ｄ１１）については３つの形式が調製され、それらのインビトロでの死滅特性が比較された。
【０５２５】
標準的な形式は、すでに記載されているような２＋１インバーテッド形式である（ＦｏｌＲ１：ＣＤ３結合部分が２：１のオーダーで配置され、ＦｏｌＲ１  ＦａｂがＮ末端に位置される）。２＋１古典的形式では、ＦｏｌＲ１：ＣＤ３結合部分が２：１のオーダーで配置され、ＣＤ３  ＦａｂがＮ末端に位置される。２種の一価の形式も調製された。１＋１ヘッド・トゥ・テールは、Ｎ末端に位置されるＦｏｌＲ１  Ｆａｂを有する分子の同じアーム上に１：１のオーダーで配置されたＦｏｌＲ１：ＣＤ３結合部分を有する。１＋１古典的形式では、ＦｏｌＲ１：ＣＤ３結合部分は、分子の１つのアーム上にそれぞれ１回存在する。標準的なＦａｂライブラリーから単離された９Ｄ１１クローンでは、ＣＤ３結合部分は、ＣｒｏｓｓＦａｂ（ＣＨ１Ｃκ交差）として作製されたのに対し、共通軽鎖ライブラリーからの１６Ｄ５では、交差は必要ではなかった。これらの二重特異性分子は、標準的なインバーテッドＴ細胞二重特異性形式と類似に産生及び精製された。
表7: 異なるT細胞二重特異性形式の収量及び最終モノマー含有量のまとめ。
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【０５２６】
実施例１０
表面プラズモン共鳴によるＦｏｌＲ１バインダーの生化学的特徴づけ
ＩｇＧとしての、又は異なる組換え葉酸受容体（ヒトＦｏｌＲ１、２、及び３、マウスＦｏｌＲ１並びにカニクイザルＦｏｌＲ１；全てＦｃ融合体として）に対するＴ細胞二重特異性形式の、ＦｏｌＲ１バインダーの結合は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって評価された。全てのＳＰＲ実験は、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００上で２５℃でランニングバッファーとしてＨＢＳ−ＥＰ（０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．００５％  Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｐ２０、Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて行われた。
【０５２７】
単独注入
最初に、抗ＦｏｌＲ１  ＩｇＧは、それらの（ヒト、マウス及びカニクイザルのＦｏｌＲ１に対する）交差反応性及び（ヒトＦｏｌＲ１、ヒトＦｏｌＲ２、ヒトＦｏｌＲ３に対する）特異性を特徴づけするために、単独注入によって解析された（表１）。ヒト、カニクイザル及びマウスの葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１−Ｆｃ）又はヒトの葉酸受容体２及び３（ＦｏｌＲ２−Ｆｃ、ＦｏｌＲ３−Ｆｃ）の組換えビオチン化モノマーＦｃ融合体は、標準的なカップリング説明書（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してＳＡチップ上に直接にカップリングされた。固定化レベルは、約３００−４００ＲＵであった。ＩｇＧは、５００ｎＭの濃度で６０秒間注入された。ｈｕＦｏｌＲ２及びｈｕＦｏｌＲ３に対するＩｇＧ結合性は、特異性がないために否認された。大部分のバインダーは、ヒト及びカニクイザルのＦｏｌＲ１間のみで交差反応性であり、マウスのＦｏｌＲ１に対する更なる交差反応性は、特異性の喪失とほとんどいつも密接に関連した。
表8: (IgGとしての)25種の新しい葉酸受容体1バインダー並びに2種のコントロールIgG(Mov19及びファルレツズマブ)の交差反応性及び特異性。+は結合を意味し、-は結合なしを意味し、+/-は弱い結合を意味する。
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【０５２８】
葉酸受容体１に対する結合力
抗ＦｏｌＲ１  ＩｇＧ又はＴ細胞二重特異性抗体と組換え葉酸受容体との間の相互作用の結合力は、下記のように決定された（表９）。
【０５２９】
ヒト、カニクイザル及びマウスの葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１−Ｆｃ）の組換えビオチン化モノマーＦｃ融合体は、標準的なカップリング説明書（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してＳＡチップ上に直接にカップリングされた。固定化レベルは、約３００−４００ＲＵであった。抗ＦｏｌＲ１  ＩｇＧ又はＴ細胞二重特異性抗体は、２．１から５００ｎＭまでの濃度範囲で３０μＬ／分の流速でフローセルを通して１８０秒間にわたって通過された。解離は、６００秒間モニターされた。バルクの屈折率差は、組換えビオチン化ＩＬ２受容体Ｆｃ融合体が固定化された参照フローセル上で得られた反応を減算することによって補正された。１９Ｈ３  ＩｇＧ及びマウス葉酸受容体１の相互作用の解析のために、葉酸（Ｓｉｇｍａ  Ｆ７８７６）は、ＨＢＳ−ＥＰランニングバッファー中に２．３μＭの濃度で添加された。ＩｇＧ又はＴ細胞二重特異性抗体の二価の結合から得られた結合曲線は、１：１のラングミュア結合に近似され、そのモデルとフィッティングされた（これは正確ではないが、結合力についての見当がつく）。相互作用についての見かけ上の結合力定数は、Ｂｉａ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してフィッティングの速度定数から導かれた。
表9: ヒト及びカニクイザルのFolR1上での、IgGとしての又はT細胞二重特異性抗体(TCB)としての選択されたFolR1バインダーの二価の結合(見かけ上のKDでの結合力)。
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【０５３０】
１．  葉酸受容体１に対する親和性
抗ＦｏｌＲ１  ＩｇＧ又はＴ細胞二重特異性抗体と組換え葉酸受容体との間の相互作用の親和性は、下記のように決定された（表１０）。
【０５３１】
親和性測定のために、約６０００−７０００共鳴単位（ＲＵ）の抗ヒトＦａｂ特異抗体（Ｆａｂ捕捉キット、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の直接的なカップリングは、標準的なアミンカップリングキット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してＣＭ５チップ上でｐＨ５．０で行われた。抗ＦｏｌＲ１  ＩｇＧ又はＴ細胞二重特異性抗体は、２０ｎＭで１０μｌ／分の流速で２０又は４０秒間捕捉され、参照フローセルは、捕捉なしで残された。ヒト又はカニクイザルの葉酸受容体１  Ｆｃ融合体の希釈系列（６．１７から５００ｎＭ又は１２．３５から３０００ｎＭ）は、結合状態を記録するために、全てのフローセル上を３０μｌ／分で１２０又は２４０秒間通過された。解離状態は、２４０秒間モニターされ、試料溶液からＨＢＳ−ＥＰに切り換えることによってトリガーされた。チップ表面は、各サイクル後に１０ｍＭのグリシン−ＨＣｌ  ｐＨ２．１又はｐＨ１．５の６０秒間の２回の注入を使用して再生された。バルクの屈折率差は、参照フローセル１上で得られた反応を減算することによって補正された。相互作用についての親和定数は、Ｂｉａ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して１：１のラングミュア結合にフィッティングすることによって速度定数から導かれた。
表10: ヒト及びカニクイザルのFolR1上での、IgGとしての又はT細胞二重特異性抗体(TCB)としての選択されたFolR1バインダーの一価の結合(親和性)。
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【０５３２】
２．  ＣＤ３に対する親和性
抗ＦｏｌＲ１  Ｔ細胞二重特異性抗体と組換えヒトＣＤ３εδ−Ｆｃとの間の相互作用の親和性は、下記のように決定された（表１１）。
【０５３３】
親和性測定のために、約９０００共鳴単位（ＲＵ）の抗ヒトＦａｂ特異抗体（Ｆａｂ捕捉キット、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の直接的なカップリングは、標準的なアミンカップリングキット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してＣＭ５チップ上でｐＨ５．０で行われた。抗ＦｏｌＲ１  Ｔ細胞二重特異性抗体は、２０ｎＭで１０μｌ／分の流速で４０秒間捕捉され、参照フローセルは、捕捉なしで残された。ヒトＣＤ３εδ−Ｆｃ融合体の希釈系列（６．１７から５００ｎＭ）は、結合状態を記録するために、全てのフローセル上を３０μｌ／分で２４０秒間通過された。解離状態は、２４０秒間モニターされ、試料溶液からＨＢＳ−ＥＰに切り換えることによってトリガーされた。チップ表面は、各サイクル後に１０ｍＭのグリシン−ＨＣｌ  ｐＨ２．１の６０秒間の２回の注入を使用して再生された。バルクの屈折率差は、参照フローセル１上で得られた反応を減算することによって補正された。相互作用についての親和定数は、Ｂｉａ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して１：１のラングミュア結合にフィッティングすることによって速度定数から導かれた。
表11: ヒトCD3-Fc上での、選択されたFolR1 T細胞二重特異性抗体(TCB)の一価の結合(親和性)。
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【０５３４】
ＣＤ３結合部分は、全てのコンストラクトについて同一であり、親和性は、測定されたＴ細胞二重特異性抗体について類似している（６０及び９０ｎＭの間のＫＤ範囲）。
【０５３５】
実施例１１
葉酸受容体１及びＣＤ３上の同時結合性Ｔ細胞二重特異性抗体
組換え葉酸受容体１及び組換えヒトＣＤ３εδ−Ｆｃ上での抗ＦｏｌＲ１  Ｔ細胞二重特異性抗体の同時結合は、下記のように決定された。
【０５３６】
ヒト、カニクイザル及びマウスの葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１−Ｆｃ）の組換えビオチン化モノマーＦｃ融合体は、標準的なカップリング説明書（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してＳＡチップ上に直接にカップリングされた。固定化レベルは、約３００−４００ＲＵであった。抗ＦｏｌＲ１  Ｔ細胞二重特異性抗体は、５００ｎＭで３０μＬ／分の流速でフローセルを通して６０秒間注入され、次いで、ｈｕ  ＣＤεδ−Ｆｃが５００ｎＭで６０秒間注入された。バルクの屈折率差は、組換えビオチン化ＩＬ２受容体Ｆｃ融合体が固定化された参照フローセル上で得られた反応を減算することによって補正された。試験された４種のＴ細胞二重特異性抗体（１６Ｄ５  ＴＣＢ、２１Ａ５  ＴＣＢ、５１Ｃ７  ＴＣＢ及び４５Ｄ２  ＴＣＢ）は、予想通り、葉酸受容体１及びヒトＣＤ３に同時に結合することができた。
【０５３７】
実施例１２
エピトープビニング
エピトープビニングのために、抗ＦｏｌＲ１  ＩｇＧ又はＴ細胞二重特異性抗体は、標準的なアミンカップリングキット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、約７００ＲＵの最終レスポンスで、ＣＭ５チップ上にｐＨ５．０で直接に固定化された。５００ｎＭのｈｕＦｏｌＲ１−Ｆｃは、次いで、６０秒間捕捉され、その後、５００ｎＭの異なるバインダーが３０秒間捕捉された。表面は、１０ｍＭのグリシン  ｐＨ２の３０秒間ずつの２回の注入で再生された。固定化されたバインダー上に捕捉されたｈｕＦｏｌＲ１に異なるバインダーが結合できるかどうかが評価される（表１２）。
表12: ヒトFolR1上のIgGとしての又はT細胞二重特異性抗体(TCB)としての選択されたFolR1バインダーのエピトープの特徴づけ。+は結合を意味し、-は結合なしを意味し、+/-は弱い結合を意味する
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【０５３８】
これらの結果及び固定化されたｈｕＦｏｌＲ１上での同時結合に関する更なるデータに基づき、バインダーは、３つのグループに分けられた。９Ｄ１１は、他の全てのバインダーを移動させるので、別のエピトープを有するかどうかは明らかではない。１６Ｄ５及び２１Ａ５は同じグループに、Ｍｏｖ１９、ファルレツズマブ（Coney等、Cancer Res. 1991 Nov 15;51(22):6125-32; Kalli等、Curr Opin Investig Drugs. 2007 Dec;8(12):1067-73）及び３６Ｆ２は別のグループに入るようである（表１３）。しかし、３６Ｆ２は、ヒト、カニクイザル及びマウスのＦｏｌＲ１に結合するので、Ｍｏｖ  １９及びファルレツズマブとは異なるエピトープに結合する。
表13: ヒトFolR1上のIgGとしての又はT細胞二重特異性抗体(TCB)としての選択されたFolR1バインダーのエピトープのグループ分け
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【０５３９】
実施例１３
バインダーの選択
ＩｇＧ形式のＦｏｌＲ１バインダーは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって及び最良の候補を選択するための細胞上でのインビトロアッセイによってスクリーニングされた。
【０５４０】
抗ＦｏｌＲ１  ＩｇＧは、それらの（ヒト、マウス及びカニクイザルのＦｏｌＲ１に対する）交差反応性及び（ヒトＦｏｌＲ１、ヒトＦｏｌＲ２、ヒトＦｏｌＲ３に対する）特異性を特徴づけするために、ＳＰＲによって解析された。ヒトＦｏｌＲ２及び３に対する非特異的な結合は、除外要因とみなされた。ヒトＦｏｌＲ１に対する結合及び特異性は、細胞上で確認された。一部のバインダーは、ＳＰＲにおいて組換えヒトＦｏｌＲ１を認識したにもかかわらず、ＦｏｌＲ１を発現している細胞上に結合しなかった。凝集温度は、決定されたが、選択されたバインダーが全て安定であったので、除外要因ではなかった。選択されたバインダーは、非特異的な結合についてチェックするためにポリ反応性ＥＬＩＳＡにおいて試験され、これにより、４種のバインダーが除外された。このプロセスにより、以下の３種のバインダーが最初に選択される結果になった：３６Ｆ２（Ｆａｂライブラリー）、９Ｄ１１（Ｆａｂライブラリー）及び１６Ｄ５（共通軽鎖）。３６Ｆ２は、ｈｕＦｏｌＲ１から急速に解離し、したがって、最初は好ましくなかった。
【０５４１】
実施例１４
ヒトＦｏｌＲ１ポジティブ腫瘍細胞に対する、新たに作製されたＦｏｌＲ１バインダーの特異的な結合
新しいＦｏｌＲ１バインダーは、Ｆａｂライブラリー又はＣＤ３軽鎖を使用した共通軽鎖ライブラリーの何れかを使用してファージディスプレイを介して作製された。同定されたバインダーはヒトＩｇＧ１形式に変換され、ＦｏｌＲ１高発現ＨｅＬａ細胞に対する結合について取り組まれた。参照分子としてヒトＦｏｌＲ１バインダーＭｏｖ１９が含まれていた。このアッセイにおいて試験された大部分のバインダーは、ＦｏｌＲ１に対する中程度から良好な結合を示し、一部のクローンは、Ｍｏｖ１９と同程度に良く結合した（図２を参照されたい）。クローン１６Ａ３、１８Ｄ３、１５Ｈ７、１５Ｂ６、２１Ｄ１、１４Ｅ４及び１６Ｆ１２は、細胞上でのＦｏｌＲ１に対する結合をフローサイトメトリーによって確認することができなかったので除外された。次のステップでは、選択されたクローンは、密接に関連したヒトＦｏｌＲ２に対する結合を除外することによってヒトＦｏｌＲ１に対する特異性について試験された。ＨＥＫ細胞は、特異性に対処するために、ヒトＦｏｌＲ１又はヒトＦｏｌＲ２の何れかで一過的にトランスフェクトされた。Ｆａｂライブラリーに由来するクローン３６Ｆ２及び９Ｄ１１並びにＣＬＣライブラリーに由来するクローン１６Ｄ５及び２１Ａ５は、ヒトＦｏｌＲ１に特異的に結合するがヒトＦｏｌＲ２には結合しない（図３Ａ−Ｂを参照されたい）。試験された他の全てのクローンは、ヒトＦｏｌＲ２に対する少なくともいくらかの結合を示した（図３Ａ−Ｂを参照されたい）。したがって、これらのクローンは、更なる特徴づけから除外された。並行して、カニクイザルＦｏｌＲ１に対するＦｏｌＲ１クローンの交差反応性については、カニクイザルＦｏｌＲ１で一過的にトランスフェクトされたＨＥＫ細胞に対する結合試験を行うことによって取り組まれた。試験された全てのクローンは、カニクイザルＦｏｌＲ１に結合することができていて、４種の選択されたヒトＦｏＬＲ１特異的クローン３６Ｆ２、９Ｄ１１、１６Ｄ５及び２１Ａ５は、比較的良くヒト及びカニクイザルのＦｏＬＲ１に結合する（図４）。次いで、３種のヒトＦｏｌＲ１特異的カニクイザル交差反応性バインダーが、ＴＣＢ形式に変換され、Ｔ細胞死滅及びＴ細胞活性化の誘導について試験された。これらのクローンは、Ｆａｂライブラリーからの９Ｄ１１、並びにＣＬＣライブラリーからの１６Ｄ５及び２１Ａ５であった。参照分子としてＭｏｖ１９  ＦｏｌＲ１  ＴＣＢが全ての試験において含まれていた。これらのＦｏｌＲ１  ＴＣＢは、次いで、ＨｅＬａ細胞上でのＦｏｌＲ１に対する結合後の内部移行の誘導を比較するために使用された。試験された３種全てのクローンは、Ｍｏｖ１９  ＦｏＬＲ１  ＴＣＢの結合の際の内部移行と同等にＦｏｌＲ１に対する結合の際に内部移行される（図５）。２１Ａ５  ＦｏｌＲ１  ＴＣＢは、ポリ反応性の徴候が原因で中断された。
【０５４２】
実施例１５
ＦｏｌＲ１  ＴＣＢ抗体によって誘導されるＦｏｌＲ１発現腫瘍標的細胞のＴ細胞媒介性死滅
ＦｏｌＲ１  ＴＣＢを使用して、ＦｏＬＲ１を発現している腫瘍細胞のＴ細胞媒介性死滅が決定された。一区画の潜在的な標的細胞株を使用して、Ｑｉｆｉｋｉｔ解析によってＦｏＬＲ１結合部位が決定された。
【０５４３】
使用された区画の腫瘍細胞には、ＦｏｌＲ１を高、中及び低発現している腫瘍細胞並びにＦｏｌＲ１陰性細胞株が含まれる。
表14: 腫瘍細胞上のFolR1結合部位
2020183403.tif 000017
【０５４４】
この区画の腫瘍細胞株に対する、異なる３種のＦｏＬＲ１  ＴＣＢ（９Ｄ１１、１６Ｄ５及びＭｏｖ１９バインダーを含む）の結合が決定され、ＦｏＬＲ１  ＴＣＢがＦｏｌＲ１発現腫瘍細胞に特異的に結合し、ＦｏＬＲ１陰性腫瘍細胞株には結合しないことが示された。結合したコンストラクトの量はＦｏｌＲ１発現レベルに比例し、検出可能なＦｏｌＲ１低細胞株ＨＴ−２９に対してコンストラクトの依然として良好な結合がある。加えて、使用された何れの細胞株に対してもネガティブコントロールＤＰ４７  ＴＣＢの結合はない（図６Ａ−Ｅ）。ＤＰ４７  ＴＣＢは、標的化されていないＴＣＢであり、国際公開第２０１４／１３１７１２号に記載のように調製された。
【０５４５】
中発現細胞株ＳＫＯＶ３及び低発現細胞株ＨＴ−２９は、１６Ｄ５  ＴＣＢ及び９Ｄ１１  ＴＣＢを使用してＴ細胞媒介性死滅及びＴ細胞活性化を試験するために更に使用された；ＤＰ４７  ＴＣＢは、ネガティブコントロールとして含まれていた。両方の細胞株は、すでにきわめて低レベルの１６Ｄ５  ＴＣＢ及び９Ｄ１１  ＴＣＢの存在下で死滅させられ、１６Ｄ５  ＴＣＢよりも９Ｄ１１  ＴＣＢのほうがＦｏｌＲ１により強く結合するにもかかわらず、両方のＴＣＢの間に活性における差はなかった。ＳＫＯＶ３細胞の全体的な死滅は、ＨＴ−２９と比較してより高かったが、これは、ＳＫＯＶ３細胞におけるＦｏｌＲ１のより高い発現レベルを反映している（図７Ａ−Ｄ）。これに合致して、ＣＤ４＋  Ｔ細胞及びＣＤ８＋  Ｔ細胞における活性化マーカーＣＤ２５及びＣＤ６９の強い上方制御が検出された。Ｔ細胞の活性化は、ＳＫＯＶ３細胞及びＨＴ−２９細胞の存在下においてきわめて類似していた。ネガティブコントロールＤＰ４７  ＴＣＢは、使用された濃度においていかなる死滅も誘導せず、Ｔ細胞におけるＣＤ２５及びＣＤ６９の有意な上方制御はなかった。
表15: SKOV3細胞での腫瘍細胞死滅及びT細胞活性化のEC50値
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表16: HT-29細胞での腫瘍細胞死滅及びT細胞活性化のEC50値
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【０５４６】
実施例１６
赤血球に対するＦｏｌＲ１  ＴＣＢ抗体の結合及び全血におけるＴ細胞活性化
ＦｏＬＲ１を発現している腫瘍細胞の非存在下で自発的な活性化がないことを証明するために、本発明者らは、潜在的にＦｏｌＲ１を発現する可能性がある赤血球に対するＦｏｌＲ１クローンの結合があるかどうかを試験した。ネガティブコントロールＤＰ４７  ＩｇＧを含めたところ、本発明者らは、赤血球に対する、９Ｄ１１  ＩｇＧ、１６Ｄ５  ＩｇＧ及びＭｏｖ１９  ＩｇＧのいかなる特異的結合も観察できなかった（図８）。
【０５４７】
いかなる更なる血球に対する非特異的結合をも又はＦｏＬＲ１  ＴＣＢを介した非特異的活性化をも除外するために、９Ｄ１１  ＴＣＢ、１６Ｄ５  ＴＣＢ及びＭｏｖ１９  ＴＣＢが全血中に添加され、ＣＤ４＋  Ｔ細胞及びＣＤ８＋  Ｔ細胞におけるＣＤ２５及びＣＤ６９の上方制御がフローサイトメトリーによって解析された。ＤＰ４７  ＴＣＢは、ネガティブコントロールとして含まれていた。試験された何れのコンストラクトでのＴ細胞の活性化も、ＣＤ４＋  Ｔ細胞及びＣＤ８＋  Ｔ細胞におけるＣＤ２５及びＣＤ６９の上方制御を解析することによって観察することはできなかった（図９）。
【０５４８】
実施例１７
異なる一価及び二価のＴ細胞二重特異性形式の３６Ｆ２  ＴＣＢ及び１６Ｄ５  ＴＣＢによって誘導されるＴ細胞死滅
Ｈｅｌａ、Ｓｋｏｖ−３（中ＦｏｌＲ１、約７００００−９００００コピー）及びＨＴ−２９（低ＦｏｌＲ１、約１００００）ヒト腫瘍細胞の３６Ｆ２  ＴＣＢ、１６Ｄ５  ＴＣＢ、古典的１６Ｄ５  ＴＣＢ、１６Ｄ５  ＴＣＢ  １＋１及び１６Ｄ５  ＴＣＢ  ＨＴ抗体によって媒介されるＴ細胞死滅が評価された。ＤＰ４７  ＴＣＢ抗体は、ネガティブコントロールとして含まれていた。ヒトＰＢＭＣがエフェクターとして使用され、二重特異性抗体と共に２４時間のインキュベーションでの死滅が検出された。簡単に説明すると、標的細胞は、トリプシン／ＥＤＴＡで収集されて、洗浄され、平底９６ウェルプレートを使用して２５  ０００細胞／ウェルの密度で播種された。細胞は、接着するように一晩放置された。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、健常なヒトのドナーから得られた濃縮リンパ球調製物（バフィーコート）のＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ密度遠心分離によって調製された。新鮮な血液は、滅菌ＰＢＳで希釈され、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ勾配（Ｓｉｇｍａ、＃Ｈ８８８９）の上に層にされた。遠心分離（４５０×ｇ、３０分、室温）後、ＰＢＭＣを含む中間相より上の血漿は捨てられ、ＰＢＭＣは新しいファルコンチューブ内に移され、次いで、５０ｍｌのＰＢＳで満たされた。混合物は遠心分離（４００×ｇ、１０分、室温）され、上清は捨てられ、ＰＢＭＣペレットは滅菌ＰＢＳで２回洗浄された（遠心分離ステップ３５０×ｇ、１０分）。得られたＰＢＭＣ集団は、自動的に計数され（ＶｉＣｅｌｌ）、１０％のＦＣＳ及び１％のＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ、Ｋ０３０２）を含むＲＰＭＩ１６４０培地中、細胞インキュベーター内で３７℃、５％のＣＯ２で更なる使用（２４時間以内）まで保存された。死滅アッセイのために、抗体が、指示された濃度（３重で０．０１ｐＭ−１００ｎＭの範囲）で添加された。ＰＢＭＣは、１０：１の最終Ｅ：Ｔ比で標的細胞に添加された。標的細胞死滅は、３７℃、５％のＣＯ２で２４時間のインキュベーション後に、プログラム死／壊死の細胞によって細胞上清中に放出されたＬＤＨの定量化（ＬＤＨ検出キット、Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、＃１１  ６４４  ７９３  ００１）によって評価された。標的細胞の最大溶解（＝１００％）は、標的細胞を１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００と共にインキュベートすることによって達成された。最小溶解（＝０％）とは、二重特異性コンストラクトなしでエフェクター細胞と共インキュベートされた標的細胞を指す。これらの結果は、３６Ｆ２  ＴＣＢ及び１６Ｄ５  ＴＣＢによって誘導される３種全てのＦｏｌＲ１＋標的細胞株の標的特異的な死滅を示している（図１０）。
【０５４９】
実施例１８
抗ＴＩＭ３抗体の作製
マウスの免疫化  ＮＭＲＩマウスは、全長ヒトＴｉｍ−３をコードしているプラスミド発現ベクターを使用して１００ｕｇのベクターＤＮＡ（プラスミド１５３０４＿ｈＴＩＭ３−ｆｌ）の皮内適用によって、遺伝的に免疫化され、次いで、エレクトロポレーションが行われた（１０００Ｖ／ｃｍの２スクエアパルス、時間０．１ミリ秒、間隔０．１２５秒；その後、２８７．５Ｖ／ｃｍの４スクエアパルス、時間１０ミリ秒、間隔０．１２５秒）。マウスは、０、１４、２８、４２、５６、７０、及び８４日目において、いずれか６回の連続的な免疫化を受けた。血液は、３６、７８及び９２日目に採取されて、血清が調製され、これは、ＥＬＩＳＡによる力価決定に使用された（以下を参照されたい）。５０ｕｇの組換えヒトＴｉｍ−３ヒトＦｃキメラの静脈内注射により、最も高い力価を有する動物が９６日目にブースティングのために選択され、モノクローナル抗体は、ブースト３日後に骨髄腫細胞株への脾細胞の融合により、ハイブリドーマ技術によって単離された。
【０５５０】
血清力価の決定（ＥＬＩＳＡ）  ヒト組換えＴｉｍ−３ヒトＦｃキメラは、９６ウェルＮＵＮＣ  Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート上に、ＰＢＳ中に、０．３ｕｇ／ｍｌ、１００ｕｌ／ウェルで固定化され、次いで、以下が行われた：ＰＢＳ中に２％のＣｒｏｔｅｉｎ  Ｃ、２００ｕｌ／ウェルでのプレートのブロッキング；ＰＢＳ中に０．５％のＣｒｏｔｅｉｎ  Ｃ、１００ｕｌ／ウェル中での、２重での、抗血清の段階希釈の適用；ＨＲＰがコンジュゲートされたヤギ抗マウス抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ／Ｄｉａｎｏｖａ  １１５−０３６−０７１；１／１６  ０００）での検出。全てのステップについて、プレートは、３７℃で１時間インキュベートされた。全てのステップ間に、プレートは、ＰＢＳ中に０．０５％のＴｗｅｅｎ２０で３回洗浄された。シグナルは、ＢＭ  Ｂｌｕｅ  ＰＯＤ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｓｏｌｕｂｌｅ（Ｒｏｃｈｅ）、１００ｕｌ／ウェルの添加によって発色され、１ＭのＨＣｌ、１００ｕｌ／ウェルの添加によって停止された。吸光度は、参照としての６９０ｎｍに対して、４５０ｎｍで読み取られた。力価は、最大半量のシグナルをもたらす抗血清の希釈率として定義された。
【０５５１】
実施例１９
抗Ｔｉｍ３抗体特徴づけ
Ｔｉｍ３についてのＥＬＩＳＡ  Ｎｕｎｃ−Ｍａｘｉ  Ｓｏｒｐ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎｅプレート（ＭｉｃｒｏＣｏａｔ  ＃１１９７４９９８／ＭＣ１０９９）は、（ＢｉｒＡリガーゼでビオチン化された）Ｔｉｍ３−ＥＣＤ−Ｈｉｓ−ビオチンで２５μｌ／ウェルによって被覆され、４００ｒｐｍ回転で振盪しながら室温で１時間インキュベートされた。洗浄後（ＰＢＳＴバッファーで３×９０μｌ／ウェル）、２５μｌのａＴｉｍ３試料又は（１：２段階）希釈された参照抗体ａＴｉｍ３  Ｆ３８−２Ｅ２（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）が添加され、室温で１時間インキュベートされた。洗浄後（ＰＢＳＴバッファーで３×９０μｌ／ウェル）、２５μｌ／ウェルのヒツジ抗マウスＰＯＤ（ＧＥ  ＮＡ９３１０Ｖ）が１：９０００の希釈で添加され、４００ｒｐｍ回転で振盪しながら室温で１時間インキュベートされた。洗浄後（ＰＢＳＴバッファーで４×９０μｌ／ウェル）、２５μｌ／ウェルのＴＭＢ基質（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、＃ＣＬ０７）が添加され、ＯＤ１．５−２．５までインキュベートされた。次いで、反応は、２５μｌ／ウェルの１ＮのＨＣＬ溶液の添加によって停止された。測定は、３７０／４９２ｎｍで行われた。ＥＬＩＳＡ結果は、ＥＣ５０値［ｎｇ／ｍｌ］として下記のまとめの表１７に一覧にされている。
【０５５２】
Ｔｉｍ３についての細胞ＥＬＩＳＡ  全長ヒトＴｉｍ３及びＧ４１８での選択（プラスミド上にネオマイシン耐性マーカー）をコードしているプラスミド１５３１２＿ｈＴＩＭ３−ｆｌ＿ｐＵＣ＿Ｎｅｏで安定にトランスフェクトされた接着性ＣＨＯ−Ｋ１細胞株が、１．２×１０Ｅ６細胞／ｍｌの濃度で３８４ウェル平底プレート内に播種され、一晩培養された。
【０５５３】
翌日、２５μｌ／ウェルのＴｉｍ３試料又はａＴｉｍ３参照抗体Ｆ３８−２Ｅ２  Ａｚｉｄｅ  ｆｒｅｅ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３５４００４）が添加され、（内部移行を回避するために）４℃で２時間インキュベートされた。洗浄後（３×９０μｌ／ウェルのＰＢＳＴ（ＢＩＯＴＥＫ  Ｗａｓｈｅｒ：プログラム２９、１×９０）、細胞は、残りのバッファーを振り落とすこと、及び１×ＰＢＳバッファー中に２５％のグルタルアルデヒド（Ｓｉｇｍａ  カタログ番号：Ｇ５８８２）の１：５００希釈である５０μｌ／ウェルの０．０５％のグルタルアルデヒドの添加によって固定され、室温で１時間インキュベートされた。洗浄後（３×９０μｌ／ウェルＰＢＳＴ（ＢＩＯＴＥＫ  Ｗａｓｈｅｒ：プログラム２１、３×９０  ＧｒｅｉｎＬｙｓｉｎ）、２５μｌ／ウェルの二次抗体が検出のために添加され（ヒツジ抗マウスＰＯＤ；ホースラディッシュＰＯＤ結合型Ｆ（ａｂ’）２断片；ＧＥ  ＮＡ９３１０）、次いで、４００ｒｐｍで振盪しながら室温で２時間インキュベーションされた。洗浄後（３×９０μｌ／ウェルのＰＢＳＴ（ＢＩＯＴＥＫ  Ｗａｓｈｅｒ：プログラム２１、３×９０  ＧｒｅｉｎＬｙｓｉｎ）、２５μｌ／ウェルのＴＭＢ基質溶液（Ｒｏｃｈｅ  １１８３５０３３００１）が添加され、ＯＤ１．５−２．５までインキュベートされた。次いで、反応は、２５μｌ／ウェルの１ＮのＨＣＬ溶液の添加によって停止された。測定は、３７０／４９２ｎｍで行われた。細胞ＥＬＩＳＡ結果は、「ＥＣ５０  ＣＨＯ−Ｔｉｍ３」値［ｎｇ／ｍｌ］として下記のまとめの表、表１７に一覧にされている。
表17: 例示的な抗体の結合親和性(ELISA及びBIACORE)
2020183403.tif 000020
【０５５４】
Ｔｉｍ３抗体のＢｉａｃｏｒｅ特徴づけ  表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）に基づくアッセイが、数種のマウスＴｉｍ３バインダー並びに市販のヒトＴｉｍ３結合参照の間の結合の動態パラメーターを決定するために使用された。したがって、抗マウスＩｇＧは、アミンカップリングによって（Ｂｉａｃｏｒｅ）ＣＭ５センサーチップの表面に固定化された。試料は、次いで、捕捉され、ｈｕ／ｃｙ  Ｔｉｍ３−ＥＣＤをそれらに結合させた。センサーチップ表面は、各解析サイクルの後に再生された。平衡定数ＫＤは、データを１：１のラングミュア相互作用モデルにフィッティングすることによって最終的に得られた。約１２０００レスポンスユニット（ＲＵ）の３０μｇ／ｍｌの抗マウスＩｇＧ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＃ＢＲ−１００８−３８）は、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅによって供給されるアミンカップリングキットを使用することによってＢｉａｃｏｒｅ  Ｂ４０００内でｐＨ５．０でＣＭ５センサーチップのフローセル１−４のスポット１、２、４及び５上にカップリングされた（スポット１、５は活性であり、スポット２、４は参照スポットである）。
【０５５５】
試料及びランニングバッファーは、ＨＢＳ−ＥＰ＋（０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％ｖ／ｖ  Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｐ２０、ｐＨ７．４）であった。フローセル温度は２５℃に且つ試料区画温度は１２℃に設定された。システムは、ランニングバッファーで準備刺激された。試料は、２００μｇ／ｍｌの濃度で３０秒間注入され、それぞれのフローセルのスポット１及び５に結合し、８つの試料を並行して測定することが可能にされた。次いで、異なる（モノマーカニクイザル、モノマーヒト及びｈｕＦｃ融合ダイマーのヒトＴｉｍ３−ＥＣＤ）濃度の全セット（表Ｘ参照）が、各試料上を通して２４０秒間注入され、その後、３０／１８００秒の解離時間が続いた（表１参照）。各解析サイクル（試料捕捉、スポット１及び５−Ｔｉｍ３  ＥＣＤ注入）は、次いで、グリシン−ＨＣｌ  ｐＨ１．７の３０秒間の長さの注入で再生された。流速は、全てのランについて３０μｌ／分に設定された。最終的に、二重の参照されたデータが、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｂ４０００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅで１：１のラングミュア相互作用モデルにフィッティングされた。得られたＫＤ値は、表１７及び１８に示されている。
表18: 動態SPR測定によって得られるBiacore-KD値によって決定される結合親和性。-n.f.とは、可能な適合がないことを意味し、ない又は弱い結合に起因する可能性が最も高い。
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【０５５６】
実施例２０
抗Ｔｉｍ３抗体誘導体の作製
キメラ抗体誘導体  キメラＴｉｍ３抗体は、抗ＴＩＭ３マウス抗体Ｔｉｍ３−００１６、Ｔｉｍ３−００１６変異体（００１８）、Ｔｉｍ３−００２１、Ｔｉｍ３−００２２、Ｔｉｍ３−００２６、Ｔｉｍ３−００２８、Ｔｉｍ３−００３０、及びＴｉｍ３−００３３、Ｔｉｍ３−００３８の可変重鎖及び軽鎖領域をＰＣＲを介してから増幅すること、並びにそれらをエフェクター機能をなくすＬＡＬＡ及びＰＧ変異（ロイシン２３４がアラニンに、ロイシン２３５がアラニンに、プロリン３２９がグリシンに）を有するヒトＩｇＧ１主鎖／ヒトＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３との融合タンパク質として重鎖発現ベクター内に及びヒトＣ−カッパへの融合タンパク質として軽鎖発現ベクター内にクローニングすることによって作製された。ＬＣ及びＨＣプラスミドは、次いで、ＨＥＫ２９３内にコトランスフェクトされ、７日後に抗体精製のための標準的な方法によって上清から精製された。
【０５５７】
グリコシル化部位ＮＹＴの除去：Ｔｉｍ３−００１６内の１つのＨＶＲ−Ｌ１部位を改変して、Ｔｉｍ３＿００１６及びＴｉｍ３＿００１６変異体（００１８）の可変軽鎖領域内でのＱ又はＳ変異によるＮの置換によるＴｉｍ３＿００１６変異体（００１８又はＴｉｍ３＿００１８と呼ばれる）は、Ａｇｉｌｅｎｔ「Ｑｕｉｃｋ  Ｃｈａｎｇｅ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ  Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ」を製造業者の説明書に従って使用してインビトロでの突然変異誘発によって作製された。この方法により、軽鎖ＨＶＲ−Ｌ１（配列番号４）内のグリコシル化部位モチーフＮＹＴのアスパラギン（Ｎ）は、グルタミン（Ｑ）に置き換えられた（結果として配列番号１１＝Ｔｉｍ３＿００１６＿ＨＶＲ−Ｌ１変異体１＿ＮＱをもたらした）又は、代替的に、アスパラギン（Ｎ）は、セリン（Ｓ）に置き換えられた（結果として配列番号１２＝Ｔｉｍ３＿００１６＿ＨＶＲ−Ｌ１変異体２＿ＮＳをもたらした）。両方のグリコシル化部位においてモチーフＮＹＴは、改変に成功した。変異体をコードしているＬＣ及びＨＣプラスミドは、次いで、ＨＥＫ２９３内にコトランスフェクトされ、７日後に抗体精製のための標準的な方法によって上清から精製された。作製された変異体は、ヒトＴｉｍ３におけるＥＬＩＳＡ、カニクイザルＴｉｍ３におけるＥＬＩＳＡ及び全長ヒトＴｉｍ３を発現している接着ＣＨＯ−Ｋ１細胞における細胞ＥＬＩＳＡによって試験された。作製された全ての変異体は、ＣＨＯ細胞において、ヒトＴＩＭ３（ヒト）、カニクイザルＴＩＭ３（ｃｙｎｏ）又はヒトＴＩＭＲに対しそれぞれ親抗体Ｔｉｍ３＿００１６又はＴｉｍ３＿００１６抗体変異体Ｔｉｍ３＿００１８よりも更に機能的な結合を示すことが見出された。
表19:
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【０５５８】
実施例２１
精製されたモノクローナル抗体の蛍光標識
ハイブリドーマに由来するモノクローナル抗体の蛍光標識は、（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎによって製造された）Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔを製造業者の説明書に従って使用することによって行われた。標識後、それぞれの抗体は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８（以下、「Ａｌｅｘａ−４８８」と呼ばれる）でポジティブに標識されることが、ＴＩＭ−３を発現しているＲＰＭＩ−８２２６及びＰｆｅｉｆｆｅｒ細胞についての（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによって製造された）ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ解析によって確認された。
【０５５９】
実施例２２
ＦＡＣＳに基づく競合アッセイを使用した結合エピトープグループの分類
作製された抗ＴＩＭ３抗体と６種の抗ＴＩＭ３参照抗体との間のエピトープの関係は、ＦＡＣＳに基づく結合競合アッセイによって解析された。ＴＩＭ３参照抗体は、以下のものであった：米国特許第２０１２／１８９６１７号に記載のような抗体４１７７及び８２１３、国際公開第２０１３／０６４９０号に記載のような抗体１．７Ｅ１０及び２７．１２Ｅ１２；抗体３４４８２３（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓによって製造された、クローン３４４８２３）及び抗体Ｆ３８−２Ｅ２（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ及びＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓによって製造された、クローンＦ３８−２Ｅ２）。簡単に説明すると、試験抗体は、ＴＩＭ−３を発現しているＲＰＭＩ−８２２６細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ−１５５（商標））と相互作用及び結合することができるようにされ、次いで、別の抗ＴＩＭ−３抗体もＴＩＭ−３発現細胞に結合することができるかどうかがフローサイトメトリー法によって評価された。
【０５６０】
手短に言えば、ヒトＴＩＭ３を発現しているＲＰＭＩ−８２２６細胞は、ＢＤヒトＦｃ  Ｂｌｏｃｋと共に室温で１０分間インキュベートされ、試験された抗体の親和性における差が結合に与える影響を排除するために異なる２つの実験的なセットアップにおいて以下で染色された：
１）製造業者の説明書（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ａ−２０１８１）に従って１個の抗体あたり平均２．７個のフルオロフォアでＡｌｅｘａ＊４８８とコンジュゲートされた、開示の精製抗ＴＩＭ３（ＢＤ染色バッファー中に１０μｇ／ｍｌ、４℃で０．５時間）。次いで、ａ）標識されていない（１−４）参照組換え抗ＴＩＭ３抗体又はアイソタイプコントロールがＢＤ  ＳＢ中に４℃で０．５時間添加され（１０μｇ／ｍｌ）、ＢＤ  ＳＢでの洗浄後、ＰＥ標識された抗ｈｕＦｃγ抗体で染色された（ＪＩＲ、１０９−１１６−０９８、１：２００、ＢＤ  ＳＢ中、４℃で０．５時間）又はｂ）ＰＥ標識された（５−６）利用可能な参照抗ＴＩＭ３抗体又は適切なアイソタイプコントロールがＢＤ  ＳＢ中に４℃で０．５時間添加された（１０μｇ／ｍｌ）。洗浄及び遠心分離後、染色されたＲＰＭＩ−８２２６細胞のＭＦＩシグナルが、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏフローサイトメーターによって解析された。
表20: エピトープ特徴づけのまとめ。
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【０５６１】
ＦＡＣＳに基づいたエピトープグループマッピングからの結果は、Ｔｉｍ３＿００１６及びＴｉｍ３＿００１６変異体Ｔｉｍ３＿００１８が、試験された何れの抗ＴＩＭ−３参照抗体とも結合競合を示さないことを示していて、これらの抗体が、以前に記載されている全てのＴＩＭ３参照抗体が認識したエピトープとは異なる新しいエピトープを認識したことが示唆されたのに対して、Ｔｉｍ３＿００２２、Ｔｉｍ３＿００２６、Ｔｉｍ３＿００２８及びＴｉｍ３＿００３８は、様々な程度に、ＪＲＰＭＩ−８２２６細胞において表面発現されるＴＩＭ３に対する結合について多様な競合相手と競合する。
【０５６２】
実施例２３
混合リンパ球反応（ＭＬＲ）におけるサイトカイン産生に対する、ヒト抗ＴＩＭ−３抗体の効果
混合リンパ球反応を使用して、ＴＩＭ−３経路をブロックすることによるリンパ球エフェクター細胞に対する効果が実証された。Ｔ細胞は、アッセイにおいて、抗ＴＩＭ−３モノクローナル抗体の存在下又は非存在下での活性化及びそれらのＩＦＮ−ガンマ分泌について試験された。
【０５６３】
ヒトリンパ球は、健常ドナーの末梢血からＬｅｕｋｏｓｅｐ（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ  Ｏｎｅ、２２７  ２８８）を使用した密度勾配遠心分離法によって単離された。簡単に説明すると、ヘパリン添加血液は、３倍量のＰＢＳで希釈され、希釈された血液の２５ｍｌのアリコートは、５０ｍｌのＬｅｕｋｏｓｅｐチューブ内で層にされた。室温で１５分間の８００×ｇ（ブレーキなし）での遠心分離後、リンパ球を含む画分が収集され、ＰＢＳ中で洗浄されて、機能アッセイにおいて直接に使用された又は凍結培地（１０％ＤＭＳＯ、９０％ＦＣＳ）中に１．０Ｅ＋０７細胞／ｍｌで再懸濁されて液体窒素中で保存された。１：１の標的／応答細胞比が、ＭＬＲアッセイにおいて使用された（すなわち、各ＭＬＲ培養物は、２００μｌの総容量中に各ドナーからの  −  ２．０Ｅ＋０５のＰＢＭＣを含んでいた）。抗ＴＩＭ３モノクローナル抗体Ｔｉｍ３＿００１６、Ｔｉｍ３＿００１６変異体（Ｔｉｍ３＿００１８）、Ｔｉｍ３＿００２１、Ｔｉｍ３＿００２２、Ｔｉｍ３＿００２６、Ｔｉｍ３＿００２８、Ｔｉｍ３＿００３０、Ｔｉｍ３＿００３３、Ｔｉｍ３＿００３８及びＦ３８−２Ｅ２（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）は、各培養物に異なる抗体濃度で添加された。抗体なし又はアイソタイプコントロール抗体は何れもネガティブコントロールとして使用され、ｒｅｃ  ｈｕ  ＩＬ−２（２０ＥＵ／ｍｌ）はポジティブコントロールとして使用された。細胞は、３７℃で６日間培養された。６日目後、サイトカイン測定のために各培養物から１００μｌの培地が採取された。ＩＦＮ−ガンマのレベルは、ＯｐｔＥＩＡ  ＥＬＩＳＡキット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して測定された。
【０５６４】
結果は、表２１（ＩＦＮ−ｇ分泌／放出）に示されている。抗ＴＩＭ−３モノクローナル抗体は、濃度依存的な様式でＴ細胞活性化及びＩＦＮ−ガンマ分泌を促進した。抗ＴＩＭ３抗体Ｔｉｍ３＿００２１、Ｔｉｍ３＿００２２、Ｔｉｍ３＿００２８、及びＴｉｍ３＿００３８は、炎症性サイトカインＩＦＮ−ガンマの放出をＦ３８−２Ｅ２抗体よりも減少させる。Ｔｉｍ３＿００１６、Ｔｉｍ３＿００１６変異体（Ｔｉｍ３＿００１８）、Ｔｉｍ３＿００３３及びＴｉｍ３＿００３８は、Ｆ３８−２Ｅ２抗体と比較されたときに、類似した放出を示した。対照的に、アイソタイプコントロール抗体を含む培養物は、ＩＦＮ−ガンマ分泌における増加を示さなかった。
表21: ポジティブコントロールとしてのrec hu IL-2(20EU/ml)(=100%)及びネガティブコントロールとしての抗体なしと比較した、抗Tim3抗体に誘導されるIFNガンマ放出の百分率(ドナー)
2020183403.tif 000024
【０５６５】
実施例２４
ＴＩＭ−３を発現している細胞内への抗ＴＩＭ−３抗体の内部移行
本明細書に記載のＴＩＭ−３特異抗体は、ＴＩＭ−３を発現しているリンパ腫、多発性骨髄腫及びＡＭＬ細胞を含む、ＴＩＭ−３を発現している細胞内に内部移行され得る。例えば、開示のＴＩＭ−３特異抗体及びそれらの断片は、細胞に基づくＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）及び共焦点顕微鏡法によって評価されるように、ヒトＴＩＭ−３を安定に発現しているｒｅｃ  ＴＩＭ３  ＣＨＯ細胞内に内部移行されることが示されている。
【０５６６】
安定なＴｉｍ３トランスフェクトＣＨＯ−Ｋ１細胞（クローン８）（４×１０４細胞／ウェル／１００μｌ）は、新しい培養培地を使用して９８ウェルのＭＴＰ内に播種された。一晩の細胞接着後、細胞培養培地が除去されて、試験抗体が細胞に添加され（細胞培養培地中に１０μｇ／ｍｌ）、４℃で０．５時間インキュベートされた。参照として、市販のマウス抗ヒト抗体（ＴＩＭ３  ＭＡＢ  １１Ｅ３６５（ＵＳ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、Ｔ５４６９−９２Ｐ）が使用された。洗浄（細胞培養培地で２回）及び遠心分離の後に、細胞は、２００μｌの細胞培養培地中でａ）４℃又はｂ）３７℃で３時間インキュベートされた。内部移行は、典型的には、４℃ではなく、３７℃で生じ、これは、反応についての別のコントロールを提供する。次いで、細胞は、１×ＰＢＳ中の１００μｌ／ウェルの０．０５％グルタルアルデヒド（Ｓｉｇｍａ  カタログ番号：Ｇ５８８２）で室温（ＲＴ）で１０分間固定された。この後、２００μｌのＰＢＳ−Ｔでの３回の洗浄ステップが行われ、二次抗体のヒツジ抗マウスＰＯＤ（ホースラディッシュＰＯＤ結合型Ｆ（ａｂ’）２断片；ＧＥ  ＮＡ９３１０））が室温で１時間添加された。最終洗浄ステップ（３×ＰＢＳ−Ｔ）後、ＴＭＢ基質が１５分間添加され（Ｒｏｃｈｅ  注文番号１１８３５０３３００１）、発色は、１ＮのＨＣｌを使用して停止された。最終ＯＤは、ＥＬＩＳＡ読取り装置内での４５０／６２０ｎｍにおける測定によって決定された。この細胞ＥＬＩＳＡ手順は、ハイブリドーマ上清から精製された試験抗体の内部移行能力の培地スループット評価に使用された。
【０５６７】
内部移行の百分率は、以下のように算出された：
内部移行［％］＝（１−ＯＤ試料＿３７℃／ＯＤ試料＿４℃）＊１００
【０５６８】
結果は、図２９Ａ及びＢ（内部移行）に示されている。試験されたほぼ全ての抗ＴＩＭ−３モノクローナル抗体は、３７℃で３時間のインキュベーション後、安定なＴｉｍ３トランスフェクトＣＨＯ−Ｋ１細胞内に同様に良く内部移行された（必ずしも全てのデータが示されているわけではない）。
【０５６９】
ＥＣ５０内部移行値（時間依存性）の決定、並びに一価対二価性に依存した内部移行の動態の比較は、選択された候補についてのＦＡＣＳによって推定された。
【０５７０】
手短に言えば、ヒトＴＩＭ３を安定に発現しているＣＨＯ−Ｋ１細胞は、新しい培養培地を使用して９８ウェルのｖ底ＭＴＰ内に播種され（４×１０５細胞／ウェル／５０μｌ）、非特異的な結合をブロックするためにＲｅｄｉｍｕｎｅ（登録商標）ＮＦ  Ｌｉｑｕｉｄと共に室温で１０分間インキュベートされた。次いで、５０μｌ／ウェルの選択された精製抗ＴＩＭ３（細胞培養培地中に１０μｇ／ｍｌ）が添加され、４℃で１時間インキュベートされた。（細胞培養培地での）洗浄及び遠心分離後、細胞は、２００μｌの細胞培養培地中でａ）４℃又はｂ）３７℃で０．２５、０．５、１、２、３、４、６及び２４時間インキュベートされた。次いで、細胞は、ＰＢＳ／１％  ＢＳＡで洗浄され、二次抗体Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８ヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｆ（ａｂ）２が４℃で１時間添加された。洗浄及び遠心分離後、１２５μｌのＣｅｌｌＦｉｘ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、１：１０００）が添加され、染色された細胞のＭＦＩシグナルは、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏフローサイトメーターによって解析された。
【０５７１】
内部移行の百分率は、以下のように算出された：
内部移行［％］＝（１−ＭＦＩ試料＿３７℃／ＭＦＩ試料＿４℃）＊１００
【０５７２】
ＲＰＭＩ−８２２６細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ−１５５（商標））における抗ＴＩＭ３抗体Ｔｉｍ３＿００１６、Ｔｉｍ３＿００１６変異体（Ｔｉｍ３＿００１８）、Ｔｉｍ３＿００２１、Ｔｉｍ３＿００２８、Ｔｉｍ３＿００３０、Ｔｉｍ３＿００３３、Ｔｉｍ３＿００３８の時間依存的な内部移行の評価についての例：
本開示の抗ＴＩＭ３抗体は、ＴＩＭ３を発現しているＲＰＭＩ−８２２６細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ−１５５（商標））内に高レベルで急速に内部移行される。実験は、ｈｕＴＩＭ−３を発現しているｒｅｃ  ＣＨＯＫ１細胞の代わりにＴＩＭ３を発現しているＲＰＭＩ−８２２６細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ−１５５（商標））を用いて上記のように行われた。結果は、表２２に示されている。以下の抗体がＴＩＭ３参照抗体として使用された：米国特許出願第２０１２／１８９６１７号に記載のような抗体８２１３、国際公開第２０１３／０６４９０号に記載のような抗体２７．１２Ｅ１２。ヒトＩｇＧ１キメラバージョンとしてＴｉｍ３＿００１６、Ｔｉｍ３＿００１６変異体（Ｔｉｍ３＿００１８）、Ｔｉｍ３＿００３８が使用された。
表22: 表示の時点における内部移行の百分率(0分を0パーセントとして設定)。
2020183403.tif 000025
【０５７３】
これらの結果は、試験された抗体がＲＰＭＩ−８２２６細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ−１５５（商標））において参照抗体と比較して高い百分率で急速に内部移行されることを示している。
【０５７４】
実施例２５
ＴＩＭ−３を発現している単離されたヒト単球に対する抗ＴＩＭ−３抗体の結合
ＣＤ１４＋単球は、健常ドナーの血液凝固を阻止した末梢血からＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）（利用者マニュアル内の一般的なプロトコールを参照又はｗｗｗ．ｍｉｌｔｅｎｙｉｂｉｏｔｅｃ．ｃｏｍ／ｐｒｏｔｏｃｏｌｓを閲覧されたい）を使用した密度勾配遠心分離法及びその後のＣＤ１４  ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓを介したポジティブ選択によって単離された。最初に、ＣＤ１４＋細胞は、ＣＤ１４  ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓで磁気標識された。次いで、細胞浮遊液は、ＭＡＣＳ  Ｓｅｐａｒａｔｏｒの磁場内に配置されたＭＡＣＳ（登録商標）Ｃｏｌｕｍｎ上へロードされる。磁気標識されたＣＤ１４＋細胞は、カラム内に保持される。標識されていない細胞は通り抜け、この細胞画分はＣＤ１４＋細胞が枯渇されている。磁場からのカラムの除去後、磁気的に保持されたＣＤ１４＋細胞は、ポジティブ選択された細胞画分として溶出させることができる。室温で１０分間の２００×ｇでの遠心分離後、単球が収集され、結合アッセイにおいて直接に使用された又は凍結培地（１０％ＤＭＳＯ、９０％ＦＣＳ）中に１．０Ｅ＋０７細胞／ｍｌで再懸濁されて液体窒素中で保存された。
【０５７５】
文献中に示されているように、単球は、その表面上でＴＩＭ３を構成的に発現する。１×１０５個の単離されたＣＤ１４＋ヒト単球（５０μｌ／ウェル）は、新しい培養培地中で９８ウェルのｖ底ＭＴＰ内に入れられ、非特異的な結合をブロックするためにＲｅｄｉｍｕｎｅ（登録商標）ＮＦ  Ｌｉｑｕｉｄと共に室温で１５分間インキュベートされた。次いで、５０μｌ／ウェルの開示の抗ＴＩＭ３モノクローナル抗体又は参照抗ＴＩＭ−３モノクローナル抗体３４４８２３（Ｒ＆Ｄ）及びＦ３８−２Ｅ２（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）（細胞培養培地中に１０μｇ／ｍｌ）が添加され、４℃で１時間インキュベートされた。次いで、細胞は、ＰＢＳ／１％  ＢＳＡで洗浄され、二次抗体ＰＥ標識ヤギ抗マウスＦ（ａｂ’）２（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂ  １１５−００６−０７２）が４℃で１時間添加された。洗浄及び遠心分離後、染色された細胞のＭＦＩシグナルは、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏフローサイトメーターによって解析された。
【０５７６】
特異的な結合は、以下のように算出された：
特異的な結合［ＭＦＩ］＝幾何平均ＭＦＩ試料−幾何平均ＭＦＩアイソタイプコントロール
【０５７７】
結果は、表８：（ヒト単球に対する結合）に示されている。ＴＩＭ３クローンＴｉｍ３＿００１６、Ｔｉｍ３＿００１８、Ｔｉｍ３＿００２０、Ｔｉｍ３＿００２８及びＴｉｍ３＿００３８は、参照抗ＴＩＭ−３抗体よりも更に良好に異なるドナーのヒト単球に結合する。
表23: ヒト単球に対する結合。
2020183403.tif 000026
【０５７８】
実施例２６
ＴＩＭ−３を発現している単離されたカニクイザル単球に対する抗ＴＩＭ−３抗体の結合
ＣＤ１４＋単球は、カニクイザルの血液凝固を阻止した末梢血（Ｃｏｖａｎｃｅ）からＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）（利用者マニュアル内の一般的なプロトコールを参照又はｗｗｗ．ｍｉｌｔｅｎｙｉｂｉｏｔｅｃ．ｃｏｍ／ｐｒｏｔｏｃｏｌｓを閲覧されたい）を使用した密度勾配遠心分離法及びその後のＮＨＰ  ＣＤ１４  ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓを介したポジティブ選択によって単離された。最初に、ＣＤ１４＋細胞は、ＣＤ１４  ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓで磁気標識された。次いで、細胞浮遊液は、ＭＡＣＳ  Ｓｅｐａｒａｔｏｒの磁場内に配置されたＭＡＣＳ（登録商標）Ｃｏｌｕｍｎ上へロードされる。磁気標識されたＣＤ１４＋細胞は、カラム内に保持される。標識されていない細胞は通り抜け、この細胞画分はＣＤ１４＋細胞が枯渇されている。磁場からのカラムの除去後、磁気的に保持されたＣＤ１４＋細胞は、ポジティブ選択された細胞画分として溶出させることができる。室温で１０分間の２００×ｇでの遠心分離後、単球が収集され、結合アッセイにおいて直接に使用された又は凍結培地（１０％ＤＭＳＯ、９０％ＦＣＳ）中に１．０Ｅ＋０７細胞／ｍｌで再懸濁されて液体窒素中で保存された。
【０５７９】
文献中に示されているように、単球は、その表面上でＴＩＭ３を構成的に発現する。１×１０５個の単離されたＣＤ１４＋カニクイザル単球（５０μｌ／ウェル）は、新しい培養培地中で９８ウェルのｖ底ＭＴＰ内に入れられ、非特異的な結合をブロックするためにＲｅｄｉｍｕｎｅ（登録商標）ＮＦ  Ｌｉｑｕｉｄと共に室温で１５分間インキュベートされた。次いで、５０μｌ／ウェルのＡｌｅｘａ４８８標識抗ＴＩＭ３（細胞培養培地中に１０μｇ／ｍｌ）が添加され、４℃で１時間インキュベートされた。洗浄及び遠心分離後、染色された細胞のＭＦＩシグナルは、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏフローサイトメーターによって解析された。
【０５８０】
特異的な結合は、以下のように算出された：
特異的な結合［ＭＦＩ］＝幾何平均ＭＦＩ試料−幾何平均ＭＦＩアイソタイプコントロール
【０５８１】
結果は、表９（カニクイザル単球に対する結合）に示されている。ＴＩＭ３クローンＴｉｍ３＿００１６、Ｔｉｍ３＿００１８、Ｔｉｍ３＿００２６、Ｔｉｍ３＿００２８及び、Ｔｉｍ３＿００３０は、異なるカニクイザルドナーのカニクイザル単球に結合する。
表24: カニクイザル単球に対する結合。
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【０５８２】
実施例２７
ＴＩＭ−３を発現しているＮＨＬ及びＭＭ細胞株に対する抗ＴＩＭ−３抗体の結合
開示の抗ＴＩＭ３抗体並びに２つの抗ＴＩＭ３参照抗体クローン（１）４１７７及び（２）８２１３（Ｋｙｏｗａ）の結合能力は、ＦＡＣＳによって解析された。手短に言えば、ヒトＴＩＭ３発現Ｂ細胞リンパ腫細胞（Ｐｆｅｉｆｆｅｒ細胞として例示される）及び多発性骨髄腫細胞（ＲＰＭＩ−８２２６細胞として例示される）は、非特異的な結合をブロックするためにＢＤヒトＦｃ  Ｂｌｏｃｋと共に室温で１０分間インキュベートされた。次いで、２×１０５細胞（５０μｌ／ウェル）は、９８ウェルのｖ底ＭＴＰ内に入れられ、５０μｌ／ウェルのＡｌｅｘａ４８８標識抗ＴＩＭ３（ＢＤ  Ｓｔａｉｎｉｎｇバッファー中に１０μｇ／ｍｌ）が添加され、４℃で１時間インキュベートされた。洗浄及び遠心分離後、染色された細胞のＭＦＩシグナルは、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏフローサイトメーターによって解析された。
【０５８３】
特異的な結合は、以下のように算出された：
特異的な結合［ＭＦＩ］＝幾何平均ＭＦＩ試料−幾何平均ＭＦＩアイソタイプコントロール
【０５８４】
結果は、図２Ａ及び２Ｂ（ＲＰＭＩ−８２２６及びＰｆｅｉｆｆｅｒ細胞に対する結合）に示されている。
【０５８５】
実施例１０：  ＴＩＭ−３を発現しているＮＨＬ及びＭＭ細胞における抗ＴＩＭ３抗体の細胞傷害活性
シュードモナス外毒素（ＰＥ２４）とコンジュゲートされたＴＩＭ３特異抗体は、ＴＩＭ３を発現している細胞を効果的に死滅させる。開示の抗ＴＩＭ３抗体及び市販の入手可能な１種の抗ＴＩＭ３参照抗体クローン１１Ｅ３６５（ＵＳ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌから入手可能）の細胞傷害活性は、Ｐｒｏｍｅｇａ  ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙを用いて解析された。手短に言えば、５×１０３個（９８ウェルＭＴＰ中に５０μｌ／ウェル、３重で）のヒトＴＩＭ−３安定発現組換えＣＨＯ  Ｋ１に、又は２×１０４細胞（９８ウェルＭＴＰ中に５０μｌ／ウェル、３重で）のヒトＴＩＭ３発現Ｂ細胞リンパ腫細胞（Ｐｆｅｉｆｆｅｒ細胞として例示される）に、又は多発性骨髄腫細胞（ＲＰＭＩ−８２２６細胞として例示される）に、１０μｇ／ｍｌの最高濃度を有する１：５段階希釈の２５μｌ／ウェルの開示の抗ＴＩＭ−３抗体が、又は処理なしの細胞には適切な培地が、又は標的化されない処理細胞にはアイソタイプコントロールが添加された。処理は、３重で１０μｇ／ｍｌから１ｎｇ／ｍｌまでの範囲に及ぶ。全ての抗体は、全長マウスＦｃγバージョンとして使用された。シュードモナス外毒素のコンジュゲーションのコンジュゲーションのために、ＰＥ２４とコンジュゲートされた１０μｇ／ｍｌのマウスＦｃγ断片特異的Ｆａｂが添加され、３７℃で３日間インキュベートされた。真核生物における既知のタンパク質合成阻害剤としてのシクロヘキシミドは、ポジティブコントロールとして使用された。処理された細胞の生存率は、Ｐｒｏｍｅｇａ  ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙで測定された。
【０５８６】
細胞傷害活性は、以下のように算出された：
相対阻害［％］＝（１−（Ｅ試料−Ｅネガティブコントロール）／（Ｅポジティブコントロール−Ｅネガティブコントロール））＊１００
【０５８７】
結果は、表２５に示されている。
表25: TIM-3を発現している、サンドイッチ形式の組換えNHL及びMM細胞株における抗TIM3モノクローナル抗体の細胞傷害活性。
2020183403.tif 000028
【０５８８】
試験された全てのＴＩＭ３クローンは、ヒトＴＩＭ−３を安定に発現している組換えＣＨＯ  Ｋ１並びに高レベル及び中レベルのＴＩＭ−３を発現しているＰｆｅｉｆｆｅｒ細胞においてきわめて強力であり（ＩＣ５０範囲０，０１−０，２ｎＭ）、且つそれらの細胞傷害活性において、強く内部移行している参照抗ＴＩＭ−３抗体クローン１１Ｅ３６５、ＵＳ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌよりも更に強力である。ＴＩＭ３クローン００１６、００１８、００２１、００２２、００３３及び００３８は、組換えＣＨＯ  ＴＩＭ−３細胞と比較して５分の１のＴＩＭ−３レベルを発現しているＲＰＭＩ−８２２６細胞においても強力である。
【０５８９】
実施例２８：開示の抗ＴＩＭ３抗体対２種の抗ＴＩＭ３参照抗体（国際公開第２０１３／０６４９０号に記載のような）１．７．Ｅ１０及び２７−１２Ｅ１２の細胞傷害活性の比較。
開示の抗ＴＩＭ３抗体及び国際公開第２０１３／０６４９０号に記載のようなＴＩＭ３参照抗体１．７．Ｅ１０及び２７−１２Ｅ１２の２種の抗ＴＩＭ３参照抗体の細胞傷害活性は、Ｐｒｏｍｅｇａ  ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙを用いて上記のように解析された。全ての抗体は、ヒトＦｃガンマ部分を含む全長ヒトＩｇＧ１形式として使用された。この実験において、シュードモナス外毒素のコンジュゲーションは、ＰＥ２４とコンジュゲートされたヒトＦｃγ断片特異的Ｆａｂ（１０μｇ／ｍｌ）を介して達成され、これは、添加されて３７℃で５日間インキュベートされた。
【０５９０】
結果は、表２６に示されている。
表26: TIM-3を発現しているNHL及びMM細胞株における抗TIM3モノクローナル抗体の細胞傷害活性の比較。
2020183403.tif 000029
【０５９１】
開示の全てのＴＩＭ３クローンは、ＴＩＭ−３を発現しているＰｆｅｉｆｆｅｒ及びＲＰＭＩ−８２２６細胞においてきわめて活性であり（ＩＣ５０範囲０，０２−０，０８ｎＭ）、且つそれらの細胞傷害活性において、強く内部移行している参照抗ＴＩＭ−３抗体クローン２７−１２Ｅ１２よりも更に強力である。全ての抗体は、同じシュードモナス外毒素を同じ条件下で使用したシュードモナス外毒素（ＰＥ２４）コンジュゲートとして比較された。
【０５９２】
実施例２８
（ＴＩＭ３を発現しているが、ＰＳＭＡは発現していない）ＭＭ、ＮＨＬ及びＡＭＬ細胞株における、開示の抗ＴＩＭ３抗体のＦａｂ−ＰＥ２４コンストラクトの細胞傷害活性。
細胞傷害活性は、Ｐｒｏｍｅｇａ  ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙを用いて上記のように解析された。５０μｇ／ｍｌの最高濃度を有する１：５段階希釈の、ＰＥ２４に直接にコンジュゲートされた開示の抗ＴＩＭ３抗体のＦａｂ断片、又は処理なしの細胞には適切な培地、又は標的化されない処理細胞には非結合性抗ＰＳＭＡ  Ｆａｂ−ＰＥ２４コントロールが、７，５×１０３個のＰｆｅｉｆｆｅｒ細胞又は２×１０３個のＲＰＭＩ−８２２６細胞（９８ウェルＭＴＰ中に５０μｌ／ウェル）と共に４日間３７℃でインキュベートされた。処理は、３重で５０μｇ／ｍｌから８ｎｇ／ｍｌまでの範囲に及ぶ。シクロヘキシミドは、ポジティブコントロールとして使用された。
【０５９３】
結果は、表２７に示されている。
表27: MM、NHL及びAML細胞株における、開示の抗TIM3抗体のFab-PE24コンストラクトの細胞傷害活性。
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【０５９４】
開示の抗ＴＩＭ３抗体の試験された全てのＦａｂ−ＰＥ２４コンストラクトは、中レベルのＴＩＭ−３を発現しているＭＭ（ＲＰＭＩ−８２２６）及びＮＨＬ（Ｋａｒｐａｓ−２９９）細胞においてきわめて強力であり（ＩＣ５０範囲１−１０ｎＭ）、きわめて低レベルのＴＩＭ−３を発現しているＡＭＬ細胞株（ＣＭＫ、ＴＦ−１、ＭＯＬＭ−１３）において有意な細胞傷害活性を示す。
【０５９５】
実施例２９
再発／難治性患者からの初代白血病幹細胞／始原ＡＭＬ細胞における、開示の抗ＴＩＭ３のイムノコンジュゲート（シュードモナス外毒素Ａコンジュゲート（Ｆａｂ−ＰＥ２４コンストラクト））の細胞傷害活性
再発／難治性患者の末梢血からのＣＤ３４＋細胞は、ＡｌｌＣｅｌｌｓ、ＬＬＣ、Ａｌａｍｅｄａ、ＣＡから得られた。全ての試料の純度及び生存率の確認後（純度範囲８４−９４％及び生存率範囲９５−９９％）、抗ＴＩＭ−３モノクローナル抗体３４４８２３（Ｒ＆Ｄ）を使用して実施例７に記載のようなＦＡＣＳによってＴＩＭ−３の発現レベルが評価された。（図３１を参照されたい）。再発／難治性患者からの試験された全て（４／４）の初代白血病幹細胞／始原（ＣＤ３４＋）ＡＭＬ試料は、異なるレベルでＴＩＭ−３の均一な発現を示す。
【０５９６】
初代ＣＤ３４＋  ＡＭＬ細胞における、開示の抗ＴＩＭ３クローン００１６及び００２２のＦａｂ−ＰＥ２４コンストラクトの細胞傷害活性の評価のために、１×１０４細胞（９８ウェルＭＴＰ中に５０μｌ／ウェル、３重で）は、５０μｇ／ｍｌの最高濃度を有する１：５段階希釈のＦａｂ断片と共に、又は処理なしの細胞には適切な培地と共に、又は標的化されない処理細胞には非結合性抗ＰＳＭＡ  Ｆａｂ−ＰＥ２４コントロールと共に、３７℃で３日間インキュベートされた。シクロヘキシミドは、ポジティブコントロールとして使用された。細胞傷害活性は、Ｐｒｏｍｅｇａ  ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙを用いて実施例２８において上述されているように解析された。
【０５９７】
結果は、表２８．（初代ＣＤ３４＋  ＡＭＬ細胞における、開示の抗ＴＩＭ３抗体のＦａｂ−ＰＥ２４コンストラクトの細胞傷害活性）に示されている。
表28: 初代CD34+ AML細胞における、開示の抗TIM3抗体のFab-PE24コンストラクトの細胞傷害活性。
2020183403.tif 000031
【０５９８】
抗ＴＩＭ３抗体Ｔｉｍ３＿００１６及びＴｉｍ３＿００２２のＦａｂ−ＰＥ２４コンストラクトは、（２／４の）初代ＡＭＬ試料（ＰＢ０１４２及びＰＢ０１３５）においてきわめて強力であり（ＩＣ５０範囲３０−１１６ｎＭ）、異なるレベルのＴＩＭ−３を発現している、全て（４／４）の初代白血病幹細胞／始原（ＣＤ３４＋）ＡＭＬ細胞において顕著な細胞傷害活性を示す。
【０５９９】
実施例３０
ＮＨＬ及びＭＭ細胞株における、選択された抗ＴＩＭ３抗体のＦａｂ−ＰＥ２４コンストラクトの効力の比較
選択された開示の抗ＴＩＭ３抗体の、ソルターゼがカップリングされたＦａｂ−ＰＥ２４コンストラクトの細胞傷害活性の評価は、Ｐｒｏｍｅｇａ  ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙを用いて実施例２８において上述されているように解析された。
【０６００】
結果は、表２９に示されている。
表29: NHL及びMM細胞における、選択された抗TIM3抗体のFab-PE24コンストラクトの細胞傷害活性。
2020183403.tif 000032
【０６０１】
中レベルのＴＩＭ−３を発現しているＮＨＬ（Ｐｆｅｉｆｆｅｒ）及びＭＭ（ＲＰＭＩ−８２２６）細胞において、全ての選択された開示の抗ＴＩＭ３抗体のＦａｂ−ＰＥ２４コンストラクトで高い細胞傷害効力が実証された（ＩＣ５０範囲０，３−５ｎＭ）。
【０６０２】
最も高い細胞傷害活性は、開示の抗ＴＩＭ３抗体Ｔｉｍ３＿００１６及びＴｉｍ３＿００３８のＦａｂ−ＰＥ２４コンストラクトで観察された。
【０６０３】
実施例３１
Ｐｆｅｉｆｆｅｒ細胞における、開示の抗ＴＩＭ−３抗体の同じクローンのＦａｂ−ＰＥ２４コンストラクト対全ＩｇＧ−アマトキシンコンジュゲートの細胞傷害活性の比較
開示の抗ＴＩＭ３クローン００１６のコンジュゲート化Ｆａｂ−ＰＥ２４コンストラクト対（国際公開第２０１２／０４１５０４号に記載されている手順による（アマトキシンアミノ酸４の６’Ｃ原子を介して、特に、アマトキシンアミノ酸の６’Ｃ原子に結合した酸素原子を介してコンジュゲートされていて、ＴＩＭ３抗体が尿素部分を介してリンカーによって連結される）アマトキシンとコンジュゲートされた同じクローンの全ＩｇＧの細胞傷害活性の評価は、Ｐｒｏｍｅｇａ  ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙを用いて実施例１２において上述されているように解析された。結果は、表３０に示されている。
表30: NHL細胞における、抗TIM3クローン0016のFab-PE24コンストラクト対全IgG-アマトキシンコンジュゲートの細胞傷害活性
2020183403.tif 000033
【０６０４】
アマトキシンがコンジュゲートされた抗ＴＩＭ−３クローン００１６の細胞傷害活性（ＩＣ５０  ０，８ｎＭ）は、中レベルのＴＩＭ−３を発現しているＮＨＬ（Ｐｆｅｉｆｆｅｒ）細胞において、同じクローンのＦａｂ−ＰＥ２４コンストラクトの細胞傷害活性（ＩＣ５０  ０，３ｎＭ）と比較可能である。
【０６０５】
実施例３２
患者及び腫瘍の試料の加工
新たに切除された固形腫瘍病変及び悪性浸出液は、非小細胞肺がんを有する３４名の患者、卵巣がんを有する７名の患者及び腎細胞癌（ＲＣＣ）を有する１名の患者間から収集された。固形腫瘍病変は、アキュターゼ（ＰＡＡ）、コラゲナーゼＩＶ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）、ヒアルロニダーゼ（Ｓｉｇｍａ）、及びＤＮＡｓｅ  ＩＶ型（Ｓｉｇｍａ）を使用して切除後すぐに機械的に解離及び消化された。単一細胞浮遊液が調製された。悪性浸出液の細胞画分は、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１１１９（Ｓｉｇｍａ）を使用して密度勾配遠心分離法によって単離された。全ての試料は、更なる使用まで液体窒素中で保存された。この試験は、地域の倫理審査委員会（Ｅｔｈｉｋｋｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  Ｎｏｒｄｗｅｓｔｓｃｈｗｅｉｚ）によって承認された。
【０６０６】
実施例３３
腫瘍試料の特徴づけ
全ての腫瘍試料は、マルチカラーフローサイトメトリーによって包括的に特徴づけされた。以下の抗体が、フローサイトメトリー解析に使用された：α−ＣＤ４−ＰＥ、α−ＣＤ８−ＰＥ−Ｃｙ７、α−ＣＤ１１ｂ−ＰｅｒＣＰ−ｅＦｌｕｏｒ７１０、α−ＣＤ４５−ＰＥ−Ｃｙ７、α−ＣＤ４５−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５、α−ＣＤ１３７−ＦＩＴＣ、α−ＢＴＬＡ−ビオチン、α−ＣＴＬＡ−４−ＰＥ、α−ＩＣＯＳ−ＦＩＴＣ、α−ＩＦＮ−γ−ＦＩＴＣ、α−Ｌａｇ−３−ＡＰＣ（全てｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、α−ＣＤ３−ＰＥＣＦ５９４、α−ＣＤ２５−ＢＶ６０５、α−ＣＤ６９−ＦＩＴＣ、α−Ｅｐｃａｍ−ＦＩＴＣ、α−グランザイムＢ−ＰＥ、α−活性カスパーゼ３−ＰＥ、α−ＰＤ−１−ＢＶ６０５、ストレプトアビジン−ＢＶ７１１（全てＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、α−ＣＤ４５ＲＡ−ＢＶ４２１、α−ＣＣＲ７−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７、α−ＦｏｘＰ３−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７、α−Ｔｉｍ−３−ＢＶ４２１、α−Ｔｉｍ−３−ＢＶ６０５（全てＢｉｏｌｅｇｅｎｄ）。死滅した細胞は、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｎｅａｒ−ＩＲ  Ｄｅａｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｉｎ  Ｋｉｔ又はＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｂｌｕｅ  Ｄｅａｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｉｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色された。細胞内染色のために、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅからのＦｉｘａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｍａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒｓが使用された。試料は、フローサイトメトリー解析のためにＢＤ  ＬＳＲ  Ｆｏｒｔｅｓｓａ上で取得された。ヒトＩＬ−２、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ  ＥＬＩＳＡセットは、全てＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから得られた。
【０６０７】
ＣＤ８＋及びＣＤ４＋  Ｔ細胞（ＣＤ４５＋ＣＤ３＋）は、表面マーカーＰＤ−１、Ｔｉｍ−３、ＣＴＬＡ−４、Ｌａｇ−３、ＢＴＬＡ、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ１３７、ＩＣＯＳ、ＣＤ４５ＲＡ及びＣＣＲ７の発現について特徴づけされた。腫瘍細胞（ＣＤ４５−Ｅｐｃａｍ＋）は、ＦｏｌＲ１特異抗体の結合をその適合したアイソタイプコントロールと比較して、ＦｏｌＲ１の発現について特徴づけされた。ＦｏｌＲ１発現についてポジティブであった試料のみがＦｏｌＲ１−ＴＣＢでの処理に、ＥｐＣＡＭを発現している試料がカツマキソマブでの処理に、それぞれ使用された。
【０６０８】
実施例３４
エクスビボでの腫瘍試料のＦｏｌＲ１−ＴＣＢでの処理
ＦｏｌＲ１ポジティブ腫瘍消化物又は悪性浸出液は、解凍され、洗浄されて、完全培地（ＤＭＥＭ＋ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）＋ＭＥＭ非必須アミノ酸（１×）＋Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）＋ペニシリン／ストレプトマイシン（１００ｎｇ／ｍｌ）＋２−メルカプトエタノール（５０ｎＭ）＋シプロキシン（１ｍｇ／ｍｌ）＋１０％ヒト血清）中に３×１０５細胞／２００μｌ／ウェルの密度で９６ウェル平底細胞培養プレート（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ）内に播種された。試料は、２ｎＭの濃度のＦｏｌＲ１−ＴＣＢ又はＤＰ４７  ＴＣＢの存在下又は非存在下で２４時間培養された。ＦｏｌＲ１−ＴＣＢ処理によるＣＤ８＋及びＣＤ４＋  Ｔ細胞（ＣＤ４５＋ＣＤ３＋）の活性化は、マルチカラーフローサイトメトリーによって細胞表面マーカーＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ１３７、ＩＣＯＳ、ＰＤ−１及びＴｉｍ−３の発現を測定することによって決定された。更に、グランザイムＢ及びＩＦＮ−γの発現は、細胞内染色によって決定された。細胞培養上清中のＩＬ−２の濃度は、ＥＬＩＳＡ（ヒトＩＬ−２  ＥＬＩＳＡセット、ＢＤ  ＯｐｔＥＩＡ）によって製造業者の説明書に従って測定された。
【０６０９】
実施例３５
エクスビボでの腫瘍試料のカツマキソマブでの処理
三機能性ＴＣＢカツマキソマブ（Ｒｅｍｏｖａｂ（登録商標））は、Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓから得られた。実験条件は、ＦｏｌＲ１−ＴＣＢについて上記に示されているものと同様であった。簡単に説明すると、ＥｐＣＡＭポジティブ腫瘍消化物又は悪性浸出液は、１０ｎｇ／ｍｌの濃度のカツマキソマブの存在下又は非存在下で２４時間培養された。ＣＤ８＋及びＣＤ４＋ポジティブＴ細胞（ＣＤ４５＋ＣＤ３＋）の解析は、上記のように行われた。
【０６１０】
実施例３６
死滅アッセイ
ＦｏｌＲ１−ＴＣＢにより誘導される腫瘍細胞死滅を決定するために、３×１０４個のＣＦＳＥ標識Ｓｋｏｖ３細胞が、９６ウェル平底細胞培養プレート内で２ｎＭの濃度のＦｏｌＲ１−ＴＣＢの存在下又は非存在下で腫瘍試料と２４時間共培養された。Ｅ：Ｔ比（Ｅ：エフェクターＣＤ４５＋ＣＤ３＋細胞；Ｔ：腫瘍及び添加されたＳｋｏｖ３細胞からの標的ＦｏｌＲ１＋細胞）は、各ウェル内で１：１に調整され、添加された腫瘍試料の細胞数は、各試料について、フローサイトメトリーによる事前の特徴づけによって算出された。Ｓｋｏｖ３細胞の細胞死は、活性化されたカスパーゼ３を測定すること及び生／死マーカーＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ−ｎｅａｒ−ＩＲによってフローサイトメトリーによって決定された。アッセイは、３重で行われた。ＦｏｌＲ１−ＴＣＢ媒介性死滅は、以下の方程式によって算出された：特異的な死滅の％＝１００−［（ＦｏｌＲ１−ＴＣＢ処理された試料中のＳｋｏｖ３生細胞の％／未処理の試料中のＳｋｏｖ３生細胞の％）×１００］。
【０６１１】
腫瘍試料間でＴ細胞のＦｏｌＲ１−ＴＣＢ誘導性の死滅させる能力を比較するために、且つ、腫瘍細胞におけるＰＤ−Ｌ１の発現のように、Ｔ細胞機能性を抑制している更なる要因を排除するために、本発明者らは、基本的には上記のように、腫瘍消化物にＣＦＳＥ標識ＦｏｌＲ１＋  Ｓｋｏｖ３細胞を外因的に添加してＥ：Ｔ比を１：１に調整した。本発明者らは、次いで、ＦｏｌＲ１−ＴＣＢにより誘導される、ＣＦＳＥ標識Ｓｋｏｖ３細胞の死滅を測定し、これにより、ＦｏｌＲ１−腫瘍試料も解析に含めることが可能となった。エフェクター細胞の量がきわめて少ないのが原因で、ＴＣＢ媒介性腫瘍細胞死滅の特徴を明らかにするために最初のコホートからのいくつかの腫瘍を使用することはできないので、１５名の非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）患者及び２名の上皮卵巣癌（ＥＯＣ）患者からの別のコホートの１２種の腫瘍消化物及び５種の悪性浸出液が解析された。全ての試料は、これらのＣＤ３＋エフェクター細胞及びＦｏｌＲ１＋標的細胞の含有量について特徴づけされた（図３９）。患者からのＣＤ３＋  Ｔ細胞の腫瘍細胞死滅は、健常ドナーからのＰＢＭＣ由来Ｔ細胞と比較された。個々の患者間で腫瘍細胞死滅における実質的な不均一性が２４時間後に観察された（２６±１１．８％）（図１２Ｏ）。重要なことに、健常ドナーからのＣＤ３＋  Ｔ細胞は、ＴＩＬよりも有意に良好な死滅を誘導した（４２．８±９．７％、ｐ＝０．０１３）。腫瘍抗原（ＤＰ４７−ＴＣＢ）に結合しないコントロールＴＣＢへの曝露は、いかなる腫瘍細胞死滅も誘導しなかった。
【０６１２】
実施例３７
抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体でのポリクローナル刺激
９６ウェル平底プレートは、０．５ｕｇ／ｍｌの抗ＣＤ３ε（クローンＯＫＴ３、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で３７℃で２時間予め被覆された。その後、抗体溶液は除去され、プレートは広く洗浄された。凍結された腫瘍浮遊液は、解凍され、洗浄されて、２μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８抗体（クローン２８．２、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を含む完全培地中に３×１０５細胞／２００μＬ／ウェルで２４時間培養された。インキュベーションの２４時間後、細胞は、収集され、洗浄されて、活性化マーカー、例えば、ＣＤ２５及びＴ細胞エフェクター機能、例えば、ＣＤ８＋  Ｔ細胞におけるグランザイムＢ及びＩＦＮ−γ等の発現についてフローサイトメトリーによって解析された。上清は、製造業者の説明書に従って行われたＩＬ−２、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αのＥＬＩＳＡのために収集された。
【０６１３】
実施例３８
ＰＤ−１ブロックによるＴ細胞機能の回復
腫瘍消化物は、１ウェルあたり１０μｇ／ｍｌの抗ＰＤ−１抗体（ＭＤＸ５Ｃ４）の存在下又は非存在下で上記のようにアゴニストの抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体によって刺激され、２４時間インキュベートされた。２４時間後、細胞は、収集され、洗浄されて、フローサイトメトリーによって解析された。上清は、製造業者の説明書に従って行われたＩＬ−２、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αのＥＬＩＳＡのために収集された。
【０６１４】
実施例３９
腫瘍消化物及び悪性浸出液における、ＦｏｌＲ１  ＴＣＢによるＴ細胞の活性化
ＣＤ３及び葉酸受容体１に結合しているＴ細胞二重特異性抗体（Ｍｏｖ１９に基づくＦｏｌＲ１−ＴＣＢ及びコントロール抗体ＤＰ４７−ＴＣＢは、Ｒｏｃｈｅ  Ｇｌｙｃａｒｔによって提供された。抗ＰＤ−１抗体５Ｃ４は、米国特許第８００８４４９号に記載されている。抗Ｔｉｍ３抗体Ｆ３８−２ＥＬが使用された。ＦｏｌＲ１発現のフローサイトメトリーによる特徴づけのために、ＬｉｆｅＳｐａｎＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓからの抗ＦｏｌＲ１−ＡＰＣ抗体（ａａ２５−２３３）及びその適合したアイソタイプコントロール（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）が使用された。ＦｏｌＲ１＋腫瘍を有する１５名の患者からの腫瘍病変は、ＦｏｌＲ１  ＴＣＢによって誘導されるＴ細胞活性化について特徴づけされた。試料は、ＮＳＣＬＣ（ｎ＝７）、卵巣がん（ｎ＝７）、及び腎細胞がんを有する患者（ｎ＝１）に由来する９種の単一細胞浮遊液及び６種の悪性浸出液からなっていた。ＣＤ３＋  Ｔ細胞及びＦｏｌＲ１＋腫瘍細胞の量は、患者間で変動性が高かった（ＣＤ３＋：平均３３．９％±１６．６％の標準偏差、ＦｏｌＲ１＋：１７．１％±１６．８％）。Ｔ細胞における阻害性受容体ＰＤ−１、Ｔｉｍ−３、ＣＴＬＡ−４、Ｌａｇ−及びＢＴＬＡの発現の特徴づけにより、患者間での大きな不均一性が明らかにされた（図１１Ａ−Ｂ）。腫瘍浸潤性のＣＤ８＋  Ｔ細胞が高レベルのＰＤ−１、Ｔｉｍ−３及びＣＴＬＡ−４を示した（それぞれ、３１．６％±２５％；２２．２％±２０．８％及び１８．７％±１４．４％）のに対して、Ｌａｇ−３及びＢＴＬＡは、このコホートの全ての患者において少数の細胞において発現されただけであった（それぞれ、３．５％±４．９％及び２．３％±１．７％）。ＣＤ４＋  Ｔ細胞上の阻害性受容体は、同様に分布し、ＣＴＬＡ−４の発現がわずかにより顕著であった。
【０６１５】
ＦｏｌＲ１−ＴＣＢにより誘導されるＴ細胞活性化を決定するために、腫瘍試料は、ＦｏｌＲ１−ＴＣＢ又はコントロールＴＣＢ  ＤＰ−４７の存在下又は非存在下で培養された。次いで、Ｔ細胞は、上記のように、活性化マーカーの発現及びＴ細胞エフェクター機能についてマルチカラーフローサイトメトリーによって特徴づけされた。図１２Ａ−Ｏにより、ＦｏｌＲ１−ＴＣＢにより誘導されるＴ細胞活性化における患者間での大きな不均一性が認められる。特に、大多数の患者がベースラインにおいてすでにＣＤ６９を発現していたのに対して、ＣＤ２５、ＣＤ１３７、及びＩＣＯＳの上方制御は、それぞれ、９−８０％、２．５−５０％及び３．５−７１％まで変化するのが観察された。ＩＦＮ−γ分泌、ＣＤ１０７脱顆粒及びグランザイムＢの発現等のエフェクター機能の獲得が観察され、それぞれ、３．７−５９％の範囲、１−７又は１．３−６４の倍率変化に及んだ（図１２Ａ−Ｉ）。阻害性受容体ＰＤ−１及びＴｉｍ−３は、それらのベースラインの発現に関係なく、ＦｏｌＲ１−ＴＣＢ処理による活性化のマーカーとして更に上方制御された。ＴＣＢ  ＤＰ−４７への曝露は、いかなるＴ細胞活性化も誘導しなかった。ＦｏｌＲ１−ＴＣＢ刺激によって誘導されるＣＤ２５及びＩＣＯＳの上方制御は、健常ドナーからの末梢ＣＤ８＋  Ｔ細胞において、腫瘍由来ＣＤ８＋  細胞についてよりも著しく強かった（それぞれ、ｐ＝０．００２及びｐ＜０．００１；図１２Ｊ、図１２Ｌ、図１２Ｍ）。ＦｏｌＲ１−ＴＣＢ刺激の際のＴ細胞エフェクターサイトカインＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、及びＴＮＦの分泌は、健常ドナーからのＰＢＭＣと比較して、大多数の腫瘍においてＴＩＬ間で大きく低減された（それぞれ、ｐ＝０．００４７、ｐ＜０．００１、及びｐ＝０．００６；図１２Ｎ）。ＦｏｌＲ１−ＴＣＢにより誘導されるパーフォリン分泌は、ＴＩＬにおいて変動性が高く、患者のサブセットにおいて激しく損なわれていた（図１２Ｎ）。
【０６１６】
同様に、グランザイムＢのより低い上方制御にもかかわらず、ＦｏｌＲ１−ＴＣＢは、ＣＤ４＋  Ｔ細胞のエフェクター機能の活性化及び獲得を誘導した（図２５Ａ−Ｉ）。腫瘍内Ｔ細胞の存在量又はＦｏｌＲ１発現がＴＣＢ曝露の際のＴ細胞活性化に対して影響を与えるかどうかを評価するために、活性化マーカーの上方制御は、Ｅ：Ｔ比（Ｅ：エフェクターＣＤ４５＋ＣＤ３＋  Ｔ細胞；Ｔ：ＦｏｌＲ１＋細胞）並びにＦｏｌＲ１＋細胞の腫瘍抗原発現の百分率及びレベルに関連づけされた（図１３Ａ−Ｃ）。後者は、フローサイトメトリーを使用して、腫瘍細胞（ＣＤ４５−ＥｐＣＡＭ＋）におけるＦｏｌＲ１の平均蛍光強度によって決定された（図１３Ｃ）。しかし、これらのパラメーターの何れもＴ細胞活性化に影響しなかった、すなわち、少量のＦｏｌＲ１＋細胞、高いＥ：Ｔ比、又は弱いＴ細胞浸潤でも、活性化及び機能のマーカーの効率的な上方制御のために十分であった。加えて、調節性Ｔ細胞又は未成熟骨髄細胞等の潜在的に免疫抑制性の細胞集団の存在は、Ｔ細胞活性化又はＴ細胞機能に影響しなかった。
【０６１７】
実施例４０
ＦｏｌＲ１−ＴＣＢにより誘導されるＴ細胞活性化は、ＰＤ−１及びＴｉｍ−３の発現と逆相関する
阻害性受容体の高い発現は、消耗Ｔ細胞の特徴として記載されている。したがって、腫瘍浸潤Ｔ細胞の機能不全状態は、ＦｏｌＲ１  ＴＣＢの有効性に影響を与える可能性もあり、少なくとも部分的に、ＴＣＢ曝露による不均一なＴ細胞活性化の原因となり得る。この目的のために、阻害性受容体の共発現は、ベースラインにおいて決定されたように、活性化マーカー及びＴ細胞エフェクター機能のＦｏｌＲ１  ＴＣＢ誘導性上方制御と関連づけされた。ＣＤ８＋  Ｔ細胞におけるＰＤ−１及びＴｉｍ−３の両方の発現は、それによって、ＣＤ２５、ＣＤ１３７及びＩＣＯＳの発現によって決定されたＴ細胞活性化と負に相関した。高発現のＰＤ−１又はＴｉｍ−３を有するＣＤ８＋  Ｔ細胞は、ＦｏｌＲ１−ＴＣＢ処理の際、不十分な効果を示したのに対して、低発現のこれらの阻害性受容体を有するＴ細胞は、ＦｏｌＲ１−ＴＣＢでの処理の際、強く活性化されることが可能であった（図１４Ａ−Ｉ）。試料中のＴ細胞の含有量に対して標準化された、ＦｏｌＲ１−ＴＣＢにより誘導されたＩＬ−２分泌の測定により、ＰＤ−１及びＴｉｍ−３発現への同じ依存性が明らかにされた（図１５Ａ−Ｃ）のに対して、ＦｏｌＲ１−ＴＣＢにより誘導されたグランザイムＢの上方制御は、これらの阻害性受容体の事前の発現への依存性が低かった（図１４Ｊ−Ｌ）。興味深いことに、ＣＤ８＋  Ｔ細胞におけるＣＴＬＡ−４、Ｌａｇ−３及びＢＴＬＡのベースラインの発現は、ＦｏｌＲ１−ＴＣＢにより誘導されるＴ細胞活性化と相関していなかった（図２６Ａ−Ｃ）。ＣＤ４＋  Ｔ細胞における阻害性受容体の発現は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞における同受容体の発現と比較して、ＦｏｌＲ１−ＴＣＢにより誘導されるＣＤ４＋  Ｔ細胞活性化について、はるかに予測性が低かった。
【０６１８】
実施例４１
ＦｏｌＲ１−ＴＣＢにより誘導される腫瘍細胞死滅は、ＰＤ−１及びＴｉｍ−３の発現と逆相関する
調整された１：１のＥ：Ｔ比の腫瘍細胞のＦｏｌＲ１−ＴＣＢ誘導性死滅を調査するために、マルチカラーフローサイトメトリーを使用して予め決定された量のＣＤ３＋  Ｔ細胞を含む腫瘍消化物にＣＦＳＥ標識Ｓｋｏｖ３細胞が外因的に添加された。Ｓｋｏｖ３細胞のＦｏｌＲ１−ＴＣＢ誘導性死滅は、活性化されたカスパーゼ３を測定すること及び生／死マーカーによって決定された。ＣＤ２５上方制御によって測定されるような、ＦｏｌＲ１−ＴＣＢにより誘導されるＴ細胞活性化と一致して、ＦｏｌＲ１−ＴＣＢ曝露の際の特異的な死滅は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞におけるＰＤ−１及びＴｉｍ−３の単一発現又は共発現と負に相関した。更に、ＦｏｌＲ１−ＴＣＢにより誘導される死滅は、ＣＴＬＡ−４のベースラインの発現並びにＰＤ−１及びＣＴＬＡ−４の共発現によっても影響された。しかし、ＦｏｌＲ１−ＴＣＢにより誘導される腫瘍細胞死滅に対するＣＴＬＡ−４発現の影響は、ＰＤ−１及びＴｉｍ−３の発現と比較して顕著ではなかった。
【０６１９】
実施例４２
カツマキソマブを用いた新しい腫瘍病変の治療  −
カツマキソマブを使用した腫瘍浸潤Ｔ細胞の活性化、及び阻害性受容体の発現との相関
カツマキソマブがＴ細胞活性化をどの程度まで誘導するかを決定し、且つ第２の独立のＴ細胞二重特異性分子を使用して上記の発見を確認するために、Ｔ細胞におけるＣＤ３及び腫瘍細胞におけるＥｐＣＡＭを認識する三機能性二重特異性抗体である、カツマキソマブに、ＮＳＣＬＣを有する患者からの４種の腫瘍消化物が曝露された。次いで、Ｔ細胞は、活性化マーカー及びＴ細胞エフェクター機能の発現についてフローサイトメトリーによって特徴づけされた（図１７Ａ−Ｄ）。ＦｏｌＲ１−ＴＣＢについての上記の本発明者らのデータを検証して、本発明者らは、カツマキソマブにより誘導されるＴ細胞活性化における顕著な不均一性を観察した。したがって、阻害性受容体のベースラインの発現は、患者間で異なっていた（図１７Ｅ−Ｈ）。
【０６２０】
カツマキソマブでの処理した際のＴ細胞活性化及びエフェクター機能の解析により、ＣＤ８＋  Ｔ細胞におけるＰＤ−１及び／又はＴｉｍ−３の発現による患者の２つのグループが、ＦｏｌＲ１−ＴＣＢでの本発明者らの発見を確認していることが明らかにされた（図１８Ａ−Ｒ）。ＰＤ−１ｌｏｗ、Ｔｉｍ−３ｌｏｗ、及び、更により顕著に、ＰＤ−１ｌｏｗ／Ｔｉｍ−３ｌｏｗの両方を発現している細胞は、カツマキソマブによって活性化させることができなかったのに対して、ＰＤ−１ｈｉｇｈ、Ｔｉｍ−３ｈｉｇｈ、及びＰＤ−１ｈｉｇｈ／Ｔｉｍ−３ｈｉｇｈ  Ｔ細胞は、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ１３７、ＩＣＯＳ、グランザイムＢ及びＩＦＮ−γを実質的に上方制御した。
【０６２１】
実施例４３
ＣＤ３／ＣＤ２８による腫瘍浸潤Ｔ細胞のポリクローナル刺激  −
非小細胞肺がん試料中の腫瘍浸潤Ｔ細胞サブセットの免疫表現型分類
本発明者らは、マルチカラーフローサイトメトリーを使用した、３４名のＮＳＣＬＣ患者からの腫瘍浸潤性のＣＤ３＋ＣＤ８＋及びＣＤ３＋ＣＤ４＋のＴ細胞サブセットにおける共阻害性Ｔ細胞受容体及び分化マーカーの発現を調査した。大多数の腫瘍は、Ｔ細胞消耗の主要な制御因子である、阻害性受容体ＰＤ−１の高い発現を示した（図１９Ａ−Ｂ）。重要なことに、Ｔｉｍ−３、ＣＴＬＡ−４、Ｌａｇ−３又はＢＴＬＡ等の他のチェックポイント阻害因子の発現は、異なる腫瘍から得られたＴ細胞間で実質的なバリエーションを示した（図１９ＡーＢ）。
【０６２２】
実施例４４
阻害性受容体の累積の発現は、Ｔ細胞機能障害を明らかにする
この実施例では、ポリクローナル刺激は、Ｔ細胞機能における阻害性受容体の影響を評価するために、最適より低い用量で使用された。ＣＤ２５発現によって例示されるような、アゴニストの抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体での刺激による、Ｔ細胞活性化に対する効果、並びに、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α及びＩＬ−２の産生、並びにグランザイムＢの発現によって解析されるような、Ｔ細胞エフェクター機能に対する効果は、フローサイトメトリー（図２０Ａ−Ｂ）及びＥＬＩＳＡ（図２０Ｃ−Ｅ）によって決定されたように、患者間で実質的に変化した。重要なことに、本発明者らは、異なるレベルのＴ細胞機能を観察し、ほぼ保存されたＴ細胞機能（すなわち、維持されたＣＤ２５及びグランザイムＢの発現、並びにＩＬ−２、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αの産生）を示すＴ細胞集団から、排除されたＴ細胞機能（ＣＤ２５及びグランザイムＢの発現の損失並びにサイトカイン産生の損失）を有するものまで多様であった。
【０６２３】
Ｔ細胞機能性における複数の阻害性受容体の影響を解析するために、本発明者らは、Ｔ細胞における阻害性受容体の累積発現についてのマーカーとして阻害性受容体（ｉＲ）スコアを定めた。この目的のために、全てのＮＳＣＬＣ試料において、ＰＤ−１、Ｔｉｍ−３、ＣＴＬＡ−４、Ｌａｇ−３及びＢＴＬＡの発現の百分率が解析され、発現された各受容体の中央値及び四分位数間範囲に基づいたスコアが各試料について定義及び算出された（例えば、図２１Ｆ）。複数の阻害性受容体の発現を示す高いｉＲスコアを発現している腫瘍浸潤性のＣＤ８＋  Ｔ細胞は、それらのきわめて機能不全の状態と相関して、ポリクローナル刺激の際、不十分な効果を示したのに対して、低ｉＲスコアを有するＴ細胞は、ポリクローナル刺激の際、強く活性化されることが可能であった（図２１Ａ−Ｅ）。ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αの産生によって示される、Ｔ細胞エフェクター機能の上方制御は、阻害性受容体の累積の発現と相関しただけではなく、同様にＰＤ−１及びＴｉｍ−３の発現並びに両方の受容体の共発現とも相関しており（図２２Ａ−Ｉ）、Ｔ細胞機能障害へのＰＤ−１及びＴｉｍ−３の重要な寄与を示した。
【０６２４】
実施例４５
阻害性受容体発現
阻害性受容体の単一及び累積の発現は、腫瘍進行と共に上昇する。阻害性受容体の発現は、腫瘍ステージ及び腫瘍進行と相関した。ＰＤ−１、Ｔｉｍ−３及びＬａｇ−３ポジティブ細胞の数は、進行した腫瘍ステージにおいて明白に増加していた（図２１Ｇ−Ｋ）。ＣＴＬＡ−４の発現について明らかな相関は観察されなかった。これは、この受容体が、異なる阻害機構を介して働くことを示し得る。ＢＴＬＡは、低レベルで全体的に発現され、進行した腫瘍ステージにおいてわずかな増加だけが見出された（図２１Ｋ）。ｉＲスコアによって反映されるような、阻害性受容体の累積の発現における顕著な増加は、結節節ポジティブがん及び進行した腫瘍ステージを有する患者において観察されたのに対して、初期の腫瘍サイズは、ｉＲスコアと有意には相関しなかった（図２１Ｌ−Ｍ）。これらのデータは、腫瘍進行中の、阻害性受容体の緩やか且つ持続的な上方制御を示唆し、これは、ＮＳＣＬＣにおけるＴ細胞消耗に関与する可能性がきわめて高い。
【０６２５】
阻害性受容体は、腫瘍浸潤Ｔ細胞において徐々に発現される。単一Ｔ細胞における異なる阻害性受容体の同時発現の役割を探究するために、解析された５種の受容体の何れかの発現に対して相対的な、ＣＤ８＋  Ｔ細胞におけるこれらの受容体の同時の発現（図３２、３３）が解析された。発現は、個々の患者についての発現の百分率を示している、ヒートマップとして（図３２）、又は、表示の５種目の免疫チェックポイントについて予めゲートがかけられた、ＣＤ８＋  Ｔ細胞における４種の各受容体の平均及び標準偏差として発現を示す、レーダープロットとして（図３３）示されている。ＣＤ８＋ＰＤ−１＋  Ｔ細胞は、平均して、最も低い百分率の他の阻害性受容体を発現したのに対して、ＣＤ８＋ＢＴＬＡ＋  Ｔ細胞は、他の４種の阻害性受容体の全てを高レベルで発現しており、これにより、ＢＴＬＡは、特に、消耗Ｔ細胞サブセットをマークすることが示された（図３２、３３）。共発現された阻害性受容体の数における増加は、ＣＤ８＋Ｔｉｍ−３＋  Ｔ細胞からＣＤ８＋ＣＴＬＡ−４＋  Ｔ細胞を経てＣＤ８＋ＬＡＧ−３＋  Ｔ細胞まで観察された（図３２、３３）。これらの発見は、広く発現される早期マーカーとしてのＰＤ−１では阻害性受容体が緩やかに獲得されることを示唆するのに対して、ＢＴＬＡは、Ｔ細胞消耗の間に比較的遅く上方制御される。
【０６２６】
実施例４６
ＰＤ−１のブロックは、Ｔ細胞機能を部分的に回復させることができる
ＰＤ−１ブロック抗体によるＴ細胞機能のレスキューは、ＰＤ−１発現のレベルに依存する。本発明者らは、阻害性受容体、特に、ＰＤ−１及びＴｉｍ−３の発現と、ポリクローナル刺激の際のＴ細胞活性化との間の明らかな相関を見出したので、ＰＤ−１又はＰＤ−１／Ｔｉｍ−３経路のブロックは、Ｔ細胞機能を回復させる可能性があった。しかし、アゴニスト抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体での刺激の際、ＰＤ−１に対するブロック抗体（５Ｃ４）の添加、又はＰＤ−１及びＴｉｍ−３の組み合わされたブロックは、一部の患者のみにおいてＩＬ−２、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αの産生及び分泌等のＴ細胞エフェクター機能を回復させることができたのに対して、他の患者では、不十分な効果しか認められなかった（図２３Ａ−Ｄ）。慢性マウスＬＣＭＶ感染モデルにおいて観察されたように（Blackburn等、PNAS 105(39):15016 (2008)）、本発明者らは、ＮＳＣＬＣ患者からの腫瘍浸潤性のＣＤ８＋  Ｔ細胞においてＰＤ−１ｈｉ及びＰＤ−１ｉｎｔサブセットを同定した。簡単に説明すると、ＰＤ−１ｈｉ、ＰＤ−１ｉｎｔ、及びＰＤ−１ｎｅｇサブセットは、それらの測定された蛍光強度に基づいて同定が可能であった。３種のサブセットの再現可能な識別のための均一なパラメーターを規定するために、３３名の患者からの細胞がＰＤ−１発現について解析された。解析は、ＰＤ−１発現レベルの全スペクトルをカバーしており、明らかに顕著なＰＤ−１ｎｅｇ又はＰＤ−１ｈｉ集団を有する腫瘍試料を含んでいた。これにより、この解析のためのゲートを設定することが可能にされ、これは、次いで、全ての試料に適用された。
【０６２７】
ＰＤ−１ｉｎｔを発現しているＴ細胞サブセットだけが、ＰＤ−１又は組み合わされたＰＤ−１／Ｔｉｍ−３ブロックの際、活性化がレスキューされるようであったのに対して、Ｔ細胞活性化における効果は、ＰＤ−１ｈｉ細胞におけるブロックの際に観察されなかった（図２４）。後者は、ＰＤ−１ブロック単独には耐性となるようである、より消耗された表現型を示し得る。
【０６２８】
この発見は、ＦｏｌＲ１  ＴＣＢによって活性化されたＴ細胞において確認された。Ｔ細胞は、ＦｏｌＲ１で上記のように刺激された。ＰＤ−１のブロックは、患者のサブセットからのＴ細胞のＦｏｌＲ１−ＴＣＢ誘導性Ｔ細胞活性化を更に強化した。
【０６２９】
試料中のＴ細胞の含有量に対して標準化された、ＦｏｌＲ１−ＴＣＢにより誘導されたＩＦＮ−γ、ＴＮＦ及びＩＬ−２の分泌の測定により、実質的な量のＰＤ−１ｈｉ（約＞１５％）を発現している細胞を有する患者細胞集団は、これらのサイトカインを分泌できなかったことが明らかにされた。対照的に、サイトカイン分泌は、より少量のＰＤ−１ｈｉ（約＜１５％）を発現している細胞を有する大部分の患者細胞集団において誘導可能であった（図２７Ａ−Ｃ）。後者のグループにおいて、ＦｏｌＲ１−ＴＣＢ刺激による刺激の際、ＰＤ−１に対するブロック抗体の添加、又はＰＤ−１及びＴｉｍ−３の組み合わされたブロックは、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αの産生を増加させた（図２８Ａ−Ｆ）。ＰＤ−１ｈｉを発現しているサブセットは、したがって、ＰＤ−１ブロック単独には耐性となるようである、より消耗された表現型を示し得る。
【０６３０】
したがって、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αの産生等のＴ細胞エフェクター機能は、一部のＮＳＣＬＣ患者からのＴＩＬにおいて回復が可能であったのに対して、他の患者では、Ｔ細胞機能の不十分な回復だけが達成され得た。ＰＤ−１ブロック抗体と組み合わせての抗ＣＤ３／ＣＤ２８刺激への曝露の際のサイトカイン産生における増加は、患者毎のＰＤ−１ポジティブ集団からのＰＤ−１ｈｉ  ＣＤ８＋  Ｔ細胞の百分率と比較された。ＰＤ−１ブロックの際のサイトカイン発現における増加は、ＰＤ−１ｈｉ  Ｔ細胞の百分率と逆相関し、これにより、より多数のＰＤ−１ｈｉ  Ｔ細胞を発現している患者は、ＰＤ−１ブロック単独には十分に応答しないことが示された（図２４Ａ−Ｃ）。Ｔ細胞機能障害が、複数の阻害性受容体の発現（すなわち、高いｉＲスコアを有する患者）と相関し、且つＰＤ−１指向療法に対する応答が、ＣＤ８＋  Ｔ細胞におけるＰＤ−１の発現レベルと相関するので、本発明者らは、ＰＤ−１ｈｉ及びＰＤ−１ｉｎｔ  ＣＤ８＋  Ｔ細胞におけるＴｉｍ−３、ＣＴＬＡ−４、Ｌａｇ−３及びＢＴＬＡの発現を更に解析した。意外なことに、ＰＤ−１ｈｉ  Ｔ細胞は、ＰＤ−１ｉｎｔサブセットと比較して有意に高いレベルの更なる受容体を発現した（図３４）。したがって、ＰＤ−１ｈｉ及びＰＤ−１ｉｎｔは、ＰＤ−１ｈｉ  Ｔ細胞が、ＰＤ−１ブロック単独によって回復不能な、より消耗された表現型を示し得る、異なる２種のＴ細胞集団を同定し得る。
【０６３１】
本明細書において提示されているデータは、ＮＳＣＬＣを有する患者からの腫瘍浸潤性ＣＤ８＋  Ｔ細胞の包括的な表現型及び機能の解析を初めて提供する。このデータにより、これらの細胞が、主にエフェクター記憶表現型を有し（ＣＣＲ７−ＣＤ４５ＲＡｌｏｗ）、ＰＤ−１、Ｔｉｍ−３、ＣＴＬＡ−４、Ｌａｇ−３及びＢＴＬＡ等の阻害性受容体の発現において大きな不均一性を示すことが示される。それにもかかわらず、末期ステージの腫瘍からの腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）において発現される受容体の数における明らかな増加が観察されており、これは、腫瘍増殖中のＴ細胞機能障害の進行を反映している。本明細書において提示されているデータにより、大多数の患者においてＴＩＬのエフェクター機能が損なわれたことが示され、その機能障害は、阻害性受容体の発現と相関していた。臨床的に関連した設定においてＴ細胞機能を回復させるために、本発明者らは、ポリクローナルＴ細胞刺激をＰＤ−１の抗体媒介性阻害と組み合わせた。Ｔ細胞機能性に対するＰＤ−１ブロックの効果は、異なる患者からのＴＩＬ間で変化したが、高レベルでＰＤ−１を発現しているＣＤ８＋  Ｔ細胞の百分率を評価することによって予測することができた。
【０６３２】
ここで、本発明者らは、ＴＩＬの機能性が、阻害性受容体の数及び発現レベルと相関し得ること及びそれらによって大きく影響されることを実証することができた。重要なことに、ＩＬ−２の分泌が大多数の患者において損なわれていたので、低レベルの阻害性受容体を発現しているＴ細胞でも、いくらかの程度の損なわれた機能性を示した。ＣＤ８＋  Ｔ細胞の全体的な活性化及びエフェクター機能は、阻害性受容体の累積の発現と逆相関し、異なる阻害性経路が、ＮＳＣＬＣにおけるＴ細胞機能障害に直接的に寄与することが示された。
【０６３３】
腫瘍浸潤性のＣＤ８＋  Ｔ細胞における５種の阻害性受容体の本発明者らの解析により、腫瘍ポジティブリンパ節及び進行した腫瘍ステージを示しているＮＳＣＬＣ患者からの腫瘍組織におけるこれらの阻害性受容体の単一及び累積の発現の明らかな上昇が示された。ＣＴＬＡ−４の発現は、他の４種の受容体とは異なり、早期ステージにあるポジティブ細胞の百分率が最も高かった。これは、Ｔ細胞免疫の調節におけるＣＴＬＡ−４の異なる役割を示し得る（Topalian等、Safety, activity, and immune correlates of anti-PD-1 antibody in cancer. N. Engl. J. Med. 366, 2443 (Jun 28, 2012)）。所与の１種の受容体の発現に対して相対的な、単一細胞における更なる阻害性受容体の共発現解析により、それぞれ早期及び後期のＰＤ−１及びＢＴＬＡの上方制御を伴う、緩やかな発現が示された。これは、Ｔ細胞消耗の動的なプロセスを反映し得る。
【０６３４】
本明細書において提示されている発見は、腫瘍増殖の免疫調節の進行性の欠損を伴う、ＮＳＣＬＣ腫瘍進行中の阻害性受容体発現の臨床的な関連性を強調するものである。本発明者らは、異なるレベルのＰＤ−１発現（ＰＤ−１ｈｉ及びＰＤ−１ｉｎｔサブセット）によって特徴を明らかにされたＣＤ８＋腫瘍浸潤Ｔ細胞の２種の集団をここに報告している。ＰＤ−１ｈｉ  Ｔ細胞の出現は、ＰＤ−１発現の百分率と相関していなかった。興味深いことに、本発明者らは、ＰＤ−１ブロックの効果がＰＤ−１発現のレベルと相関し、高い割合のＰＤ−１ｈｉ部分母集団を有するＴＩＬの応答性に対する効果は限定的であったことを観察した。これらの発見は、ＰＤ−１ｉｎｔ  ＤｂＧＰ３３特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞のサブセットがＰＤ−１ブロックによって回復可能であった、マウスの慢性ＬＣＭＶ感染モデルにおける実験と合致している。対照的に、ＰＤ−１ｈｉサブセットは、より「消耗された」ように見え、すなわち、機能的消耗の徴候を示し、ＰＤ−１ブロックに十分に応答しなかった。したがって、ＰＤ−１発現のレベルは、ヒトがんにおける異なるＴ細胞サブセットを規定するための新規なマーカーを代表する可能性があり且つ、ＰＤ−１ブロック抗体での処理に対する応答の予測因子として役立ち得る。
【０６３５】
実施例４７
ＦｏｌＲ１−ＴＣＢによる、健常ドナー及びがん患者からのＴ細胞の活性化
Ｔ細胞活性化におけるＦｏｌＲ１−ＴＣＢの効果を評価するために、健常ドナーからの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）が、ＦｏｌＲ１＋卵巣がん細胞株Ｓｋｏｖ３と共培養された（図４０Ａ）。０．６ｐＭから２ｎＭまでの範囲に及ぶ漸増濃度のＦｏｌＲ１−ＴＣＢへの２４時間の曝露の際、本発明者らは、ＣＤ２５、ＣＤ１３７、及びＩＣＯＳの上方制御を伴うＣＤ８＋  Ｔ細胞の強い活性化を観察した。加えて、Ｔ細胞は、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、及びＴＮＦを分泌していた。無関係な抗原に対して指向されるＴＣＢである、ＤＰ４７−ＴＣＢへの曝露は、いかなるＴ細胞活性化も誘導しなかった（図４０Ｂ及びＣ）。
【０６３６】
実施例４８
阻害性受容体発現は、腫瘍浸潤性ＣＤ８＋  Ｔ細胞においてきわめて多様である
腫瘍内在Ｔ細胞はきわめて機能不全の表現型を示すことが多いので、ＦｏｌＲ１−ＴＣＢ刺激後の異なる患者間のＴ細胞活性化において観察された不均一性は、損なわれたＴＩＬ機能性が原因であり得る。慢性ウイルス感染及び腫瘍の両方における機能不全のＴ細胞の特徴は、阻害性受容体の過剰発現である。この目的のために、本発明者らは、全ての腫瘍試料において腫瘍浸潤性ＣＤ８＋  Ｔ細胞における免疫チェックポイントＰＤ−１、Ｔｉｍ−３、ＣＴＬＡ−４、Ｌａｇ−３、及びＢＴＬＡの発現を決定した。本発明者らは、異なる腫瘍間のこれらの受容体の頻度及び組み合わされた発現における高い多様性を観察した；ＰＤ−１は、最も高い百分率の発現（６０．２±３０％）を有する最も顕著な阻害性受容体であり、その後にＴｉｍ−３（２９．５±２４．４％）、ＣＴＬＡ−４（２４．６±１７．６％）、Ｌａｇ−３（７．０±５．９％）、及びＢＴＬＡ（３．９±２．６％）が続くことが見出された（図３５Ｆ）。マウス慢性ウイルス感染モデルにおいて以前に記載されているように（Blackburn等、Proc Natl Acad Sci U S A 2008;105(39):15016-21）且つ、本明細書に示されているように、ヒト腫瘍において、ＰＤ−１＋集団は、ＰＤ−１ｈｉ及びＰＤ−１ｉｎｔを発現している部分母集団に分けられた（図３５Ａ）。これらの特定のサブセットにおいて発現される更なる阻害性受容体の解析により、ＰＤ−１ｈｉ部分母集団では、Ｔｉｍ−３、ＣＴＬＡ−４、Ｌａｇ−３、及びＢＴＬＡを含む、他の全ての阻害性受容体が、ＰＤ−１ｉｎｔ及びＰＤ−１ｎｅｇサブセットにおけるこれらの受容体の発現と比較して有意に高く発現されることが示された（図３６Ａ−Ｄ）。したがって、本発明者らは、阻害性受容体の累積の発現についての代替マーカーとして、ＣＤ８＋サブセットにおけるＰＤ−１ｈｉ  Ｔ細胞の百分率を使用した。腫瘍試料は、ＰＤ−１ｈｉ細胞の頻度によって、ＰＤ−１ｈｉを発現しているＴ細胞がそれぞれ高頻度（ＰＤ−１ｈｉが豊富な腫瘍）及び低頻度（ＰＤ−１ｈｉが稀な腫瘍）の２つのグループに分けられた。２つのグループを分けるために、３０％のＰＤ−１ｈｉ発現のカットオフ値が選択された。ＰＤ−１ｈｉ細胞の百分率は、ＰＤ−１ｈｉが豊富なグループでは３９．１−６０．５％（４９．５±７．９％）、ＰＤ−１ｈｉが稀なグループでは２．６５−１９．５％の範囲に及んだ（８．４±５．７％；図３６Ｅ）。カットオフ値は、ＰＤ−１ｈｉ細胞の頻度において同様の分布を有する１４名のＮＳＣＬＣ患者及び２名の卵巣がん患者の第２のコホートにおいて検証され、ここで、本発明者らは、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体によるポリクローナル刺激の際に比較可能な結果を観察した（図３９）。
【０６３７】
実施例４９
ＦｏｌＲ１−ＴＣＢにより誘導されるＴ細胞活性化は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞においてＰＤ−１発現のレベルに大きく依存する
本発明者らは、阻害性受容体の発現が、ＦｏｌＲ１−ＴＣＢ処理の際に低下されたＴ細胞機能性と相関し得るかどうかを解析した。上記の実施例４１に記載の結果と一致して、ＣＤ２５、ＣＤ１３７、及びＩＣＯＳの発現（それぞれ、ｐ＝０．０２８；ｐ＜０．００１、及びｐ＝０．００８）によって例示されたように、ＦｏｌＲ１−ＴＣＢにより誘導されるＴ細胞活性化、並びに、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＴＮＦ、及びパーフォリン分泌によって示された、Ｔ細胞エフェクター機能は、ＰＤ−１ｈｉが豊富な腫瘍において、ＰＤ−１ｈｉが稀な腫瘍と比較して有意に損なわれていた（それぞれ、ｐ＝０．０１９；ｐ＝０．００７；ｐ＝０．０２８、及びｐ＝０．０２９；図３７Ａ−Ｇ）。同様に、ＰＤ−１ｈｉが豊富な腫瘍は、ＦｏｌＲ１−ＴＣＢ刺激の際に有意に低下された細胞傷害性を示したのに対して、ＰＤ−１ｈｉが稀な腫瘍の大多数において、強い腫瘍細胞死滅が観察可能であった（ｐ＝０．０２１；図３７Ｈ）。
【０６３８】
実施例５０
ＰＤ−１ブロックは、ＰＤ−１ｈｉが稀な腫瘍のみにおいて、ＦｏｌＲ１−ＴＣＢにより誘導されるＴ細胞機能を回復させる
ＴＩＬにおけるＰＤ−１発現のレベルがＦｏｌＲ１−ＴＣＢの有効性と相関するので、本発明者らは、ＦｏｌＲ１−ＴＣＢ処理と組み合わされたＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１軸のブロックがＴ細胞機能を回復させることができる可能性があるかどうかを解析した。本発明者らは、ＦｏｌＲ１−ＴＣＢ及びＰＤ−１ブロック抗体ニボルマブ（ＭＤＸ５Ｃ４）での組み合わされた処理の際、エフェクターサイトカインＩＦＮ−γ、ＴＮＦ、及びＩＬ−２並びにパーフォリンの分泌が、ＰＤ−１ｈｉが稀な腫瘍の一部のみにおいて増加され得たことを見出した。対照的に、ＰＤ−１ｈｉが豊富な腫瘍では、ＰＤ−１ブロックは、いかなる応答も誘発することができなかった（図３８Ａ−Ｄ）。重要なことに、細胞傷害性腫瘍細胞死滅は、Ｔ細胞において、ＰＤ−１ｈｉが稀な腫瘍からもＰＤ−１ｈｉが豊富な腫瘍からも、更なるＰＤ−１ブロックによって改良することができなかった（図３８Ｅ）。
【０６３９】
本明細書に記載の実施例には、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、上皮卵巣癌（ＥＯＣ）及び腎細胞癌（ＲＣＣ）を有する患者からの原発性がん病変におけるＣＤ３×ＦｏｌＲ１特異的ＴＣＢの免疫調節能力が記載されている。健常ドナーからの完全に機能的な末梢Ｔ細胞と比較して、本発明者らは、大多数の患者においてＴ細胞機能の部分的又は完全な障害をもたらしている、ＦｏｌＲ１−ＴＣＢにより誘導される腫瘍細胞死滅及びＴ細胞活性化における異なるヒト腫瘍試料間の実質的な不均一性を観察した。腫瘍内Ｔ細胞の細胞表面における阻害性受容体発現の包括的な解析により、ＦｏｌＲ１−ＴＣＢによるＴ細胞活性化の有効性がＰＤ−１の発現レベルと逆相関したことが明らかにされた。ＰＤ−１ｈｉが豊富な腫瘍を有する患者は、ＦｏｌＲ１−ＴＣＢ処理の際、損なわれたＴ細胞活性化及びエフェクター機能を示した。更に、これらの患者は、そのＰＤ−１ｈｉが稀にしか発現していない対応物とは対照的に、ＰＤ−１ブロックに応答しなかった。したがって、二重特異性抗体の生理活性は、Ｔ細胞機能障害によって著しく阻止され、これは、少なくとも部分的に、阻害性受容体の持続的且つきわめて多様な発現が合わさることによって起きる。
【０６４０】
本発明者らは、健常ドナーからのＰＢＭＣにおいて、ＦｏｌＲ１−ＴＣＢ刺激の際、Ｔ細胞活性化マーカーの強い上方制御、エフェクターサイトカイン分泌及び腫瘍細胞死滅を観察した（図４０）。しかし、全く対照的に、Ｔ細胞エフェクター機能は、腫瘍内Ｔ細胞において大きく変化し且つ全体的に低下された。特に、死滅させる能力及びエフェクターサイトカイン産生は、大多数の腫瘍において、ＩＬ−２産生の完全な損失及び激しく損なわれたＴＮＦ及びＩＦＮ−γの分泌を有するＴＩＬにおいて著しく低かった。
【０６４１】
本発明者らは、腫瘍内ＣＤ８＋  Ｔ細胞における阻害性受容体ＰＤ−１、Ｔｉｍ−３、ＣＴＬＡ−４、Ｌａｇ−３、及びＢＴＬＡの発現を報告した。ＰＤ−１は、解析された全ての阻害性受容体のうち最も広範な発現を示した。Ｂｌａｃｋｂｕｒｎによる慢性マウスＬＣＭＶ感染からの知見により、フローサイトメトリーを使用して、ＭＦＩレベルに基づいて分離され得る、機能的に異なるＰＤ−１ポジティブＴ細胞サブセットの存在が示唆される（Blackburn等、PNAS 105(39):15016 (2008)）。重要なことに、ＰＤ−１ｈｉ  Ｔ細胞サブセットは、Ｔｉｍ−３及びＣＴＬＡ−４の高い共発現並びにより少ない程度のＬａｇ−３及びＢＴＬＡを示したのに対して、それらのＰＤ−１ｉｎｔ対応物は、ＰＤ−１ｎｅｇ  Ｔ細胞と同等の、低レベルのみの他の阻害性受容体を発現した。ＰＤ−１ｈｉ  ＣＤ８＋  Ｔ細胞の頻度は、患者間で大きく異なり、本発明者らがＰＤ−１ｈｉが豊富な腫瘍と稀な腫瘍とを区別するのを可能にした。ＰＤ−１ｈｉが稀な表現型を有する患者とは対照的に、ＦｏｌＲ１−ＴＣＢ媒介性のＴ細胞活性化及び腫瘍細胞死滅は、ＰＤ−１ｈｉが豊富な表現型を示している腫瘍において著しく損なわれた。これらのデータは、ＣＤ８＋  Ｔ細胞の活性化及びエフェクター機能が、複数の免疫チェックポイントの共発現と相関するという以前の知見を拡張及び確認するものである（Sakuishi等、J Exp Med 2010;207(10):2187-94; Fourcade等、J Exp Med 2010;207(10):2175-86; Grosso等、J Immunol 2009;182(11):6659-69; Matsuzaki等、Proc Natl Acad Sci U S A 2010;107(17):7875-80; Fourcade等、Cancer Res 2012;72(4):887-96）。ＰＤ−１ｈｉ  Ｔ細胞の頻度は、したがって、ＴＣＢ活性化の際のＴＩＬの機能性についての代替マーカーとして有用となり得るだけでなく、ＴＣＢ治療に対する治療応答についての予測的マーカーとして役立ち得る。この免疫プロファイルは、ＴＣＢ等の免疫療法に応答する可能性が高い患者の選択を導くことができた。臨床的有用性とのその相関は、前向き臨床的介入により決定される必要がある。
【０６４２】
ＴＣＢの治療有効性を改良するための有望な手段は、Ｔ細胞における阻害性シグナルのブロックにある。ＰＤ−１は解析された全ての腫瘍において最も顕著に発現された阻害性受容体であったので、本発明者らは、ＰＤ−１ブロックが、ＴＣＢ活性化の際、Ｔ細胞エフェクター機能を促進することができるかどうかを評価した。重要なことに、本発明者らは、ＰＤ−１ｈｉが稀な腫瘍のみにおいてではあるが、組み合わされたＦｏｌＲ１−ＴＣＢ及び抗ＰＤ−１処理の際、エフェクターサイトカインの増加された分泌を観察した。したがって、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１ブロックに対する感受性を高めるために、ＰＤ−１ｉｎｔ  Ｔ細胞内へのＰＤ−１ｈｉの形質転換を探究する、新規治療戦略が明らかに必要とされている。
【０６４３】
意外なことに、本発明者らにより、腫瘍試料の全てにおいて、同時のＰＤ−１ブロックの際、腫瘍細胞死滅における改良は観察されなかった。したがって、単一の免疫チェックポイントのブロックは、ＴＩＬの細胞溶解能力を回復させるのに十分ではない場合もある。しかし、マウス腫瘍モデルにおいて、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１軸のブロックは、腫瘍内へのＴ細胞浸潤を増加させることが示されており（Curran等、Proc Natl Acad Sci U S A 2010;107(9):4275-80）、この処理の特性、これは、本発明者らのインビトロでの手法によって対処することはできなかった。したがって、インビボでのＰＤ−１ブロックの治療効果は、残りの腫瘍内Ｔ細胞のＴ細胞細胞傷害性を改良することによってだけではなく、新たに浸潤したＴ細胞の持続した機能性によっても生じた可能性があった。ＴＣＢにより誘導されるＴ細胞活性化は、ＰＤ−１発現を上方制御することが示されており、これは、Ｈｅｒ２特異的ＴＣＢ及びがん胎児性抗原（ＣＥＡ）特異的ＴＣＢの両方で近年実証されたように、腫瘍細胞及び浸潤性免疫細胞の両方において発現されたＰＤ−Ｌ１の存在下で二次耐性に導き得る（Junttila等、Cancer Res 2014;74(19):5561-71; Osada等、Cancer Immunol Immunother 2015）。重要なことに、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１軸のブロックは、インビトロ及びマウス腫瘍モデルの両方において、ＴＣＢにより誘導されたＴ細胞機能を完全に回復させることができた。これらの知見により、チェックポイント阻害剤の共投与は、ＴＩＬの機能不全状態を増進させる可能性があり且つＴＣＢの治療有効性を制限し得る二次耐性を防ぐ能力があることが示される。チェックポイント阻害剤及びＴＣＢの最適な組合せレジメンを決定するために、更なる研究が明らかに必要とされている。潜在的な治療標的としての重複しない機能を有する阻害性及び活性化Ｔ細胞受容体を同定することもきわめて重要になる。
【０６４４】
本発明者らの発見により、ＦｏｌＲ１−ＴＣＢ等の二重特異性抗体は、Ｔ細胞が共刺激分子を上方制御して、炎症性サイトカインを産生し、細胞溶解性機能を獲得するのを引き起こす能力があることが明らかに示される。本発明者らは、少なくとも部分的に、阻害性受容体の発現によって統制され且つ、一部の例において、ＴＣＢの効率を低下させる、異なる状態のＴ細胞機能障害を観察した。ＦｏｌＲ１−ＴＣＢにより誘導されるエフェクター機能がＰＤ−１ブロックによって部分的にのみ回復可能であったので、本発明者らの結果により、腫瘍環境内でのＴ細胞機能障害を維持するために複数の且つ最終的に重複しない経路を利用する、比較的複雑な免疫調節が示唆される。
【０６４５】
配列
例示的実施態様のアミノ酸配列
1)共通軽鎖形式、可変重鎖において有用なFolRバインダー
2020183403.tif 000034
2020183403.tif 000035
2)CD3バインダー共通軽鎖(CLC)
2020183403.tif 000036
3)CD3バインダー、重鎖
2020183403.tif 000037
4)crossfab形式にとって有用なFolRバインダー
2020183403.tif 000038
2020183403.tif 000039
5)crossfab形式において有用なCD3バインダー
2020183403.tif 000040
6)CD3-FolR二重特異性抗体2+1インバーテッドcrossmab形式の例示的アミノ酸配列
2020183403.tif 000041
2020183403.tif 000042
7)共通軽鎖を有するCD3-FolR二重特異性抗体の例示的アミノ酸配列
2020183403.tif 000043
2020183403.tif 000044
2020183403.tif 000045
2020183403.tif 000046
8)  親和性が低減した例示的16D5変異体
a.親和性が低減した例示的軽鎖変異体
2020183403.tif 000047
b.親和性が低減した例示的重鎖変異体
2020183403.tif 000048
9)ファージディスプレイライブラリーから作製されたさらなる例示的実施態様(CDRに下線が引かれている)
2020183403.tif 000049
2020183403.tif 000050
2020183403.tif 000051
10)例示的実施態様の9D11グリコシド変異体:可変軽鎖(CDRに下線が引かれている)
2020183403.tif 000052
11)脱アミノ化変異体
2020183403.tif 000053
2020183403.tif 000054
12)例示示的実施態様のMov19ベースのFolR1 TCB(CDRに下線が引かれている)
2020183403.tif 000055
13)中間親和性のバインダーを有するさらなるFolR1 TCB(カバットに従うCDRに下線が引かれている)
2020183403.tif 000056
2020183403.tif 000057
14)抗原配列
2020183403.tif 000058
2020183403.tif 000059
2)例示的実施態様のヌクレオチド配列
2020183403.tif 000060
2020183403.tif 000061
2020183403.tif 000062
2020183403.tif 000063
2020183403.tif 000064
2020183403.tif 000065
2020183403.tif 000066
2020183403.tif 000067
2020183403.tif 000068
2020183403.tif 000069
2020183403.tif 000070
2020183403.tif 000071
2020183403.tif 000072
2020183403.tif 000073
2020183403.tif 000074
2020183403.tif 000075
2020183403.tif 000076
2020183403.tif 000077
2020183403.tif 000078
2020183403.tif 000079
2020183403.tif 000080
2020183403.tif 000081
2020183403.tif 000082
2020183403.tif 000083
2020183403.tif 000084
2020183403.tif 000085
2020183403.tif 000086
2020183403.tif 000087
2020183403.tif 000088
2020183403.tif 000089
2020183403.tif 000090
2020183403.tif 000091
2020183403.tif 000092
2020183403.tif 000093
2020183403.tif 000094
2020183403.tif 000095
【０６４６】
例示的抗ＰＤ１アンタゴニスト配列
2020183403.tif 000096
2020183403.tif 000097
【０６４７】
例示的抗ＴＩＭ３抗体配列
例示的抗ＴＩＭ３抗体アミノ酸配列及び例示的ＴＩＭ３配列の配列が、以下のように以下の配列表中に示されている：
配列番号３０４    重鎖ＨＶＲ−Ｈ１、Ｔｉｍ３＿００１６
配列番号３０５    重鎖ＨＶＲ−Ｈ２、Ｔｉｍ３＿００１６
配列番号３０６    重鎖ＨＶＲ−Ｈ３、Ｔｉｍ３＿００１６
配列番号３０７    軽鎖ＨＶＲ−Ｌ１、Ｔｉｍ３＿００１６
配列番号３０８    軽鎖ＨＶＲ−Ｌ２、Ｔｉｍ３＿００１６
配列番号３０９    軽鎖ＨＶＲ−Ｌ３、Ｔｉｍ３＿００１６
配列番号３１０    重鎖可変ドメインＶＨ、Ｔｉｍ３＿００１６
配列番号３１１    軽鎖可変ドメインＶＬ、Ｔｉｍ３＿００１６
配列番号３１２    重鎖可変ドメインＶＨ、Ｔｉｍ３＿００１６変異体（００１８）
配列番号３１３    軽鎖可変ドメインＶＬ、Ｔｉｍ３＿００１６変異体（００１８）
配列番号３１４    軽鎖ＨＶＲ−Ｌ１、Ｔｉｍ３＿００１６＿ＨＶＲ−Ｌ１変異体１＿ＮＱ
（ＮからＱへの突然変異によるグリコシル化部位の除去）
配列番号３１５    軽鎖ＨＶＲ−Ｌ１、Ｔｉｍ３＿００１６＿ＨＶＲ−Ｌ１変異体２＿ＮＳ
（ＮからＳへの突然変異によるグリコシル化部位の除去）
配列番号３１６    重鎖ＨＶＲ−Ｈ１、Ｔｉｍ３＿００２１
配列番号３１７    重鎖ＨＶＲ−Ｈ２、Ｔｉｍ３＿００２１
配列番号３１８    重鎖ＨＶＲ−Ｈ３、Ｔｉｍ３＿００２１
配列番号３１９    軽鎖ＨＶＲ−Ｌ１、Ｔｉｍ３＿００２１
配列番号３２０    軽鎖ＨＶＲ−Ｌ２、Ｔｉｍ３＿００２１
配列番号３２１    軽鎖ＨＶＲ−Ｌ３、Ｔｉｍ３＿００２１
配列番号３２２    重鎖可変ドメインＶＨ、Ｔｉｍ３＿００２１
配列番号３２３    軽鎖可変ドメインＶＬ、Ｔｉｍ３＿００２１
配列番号３２４    重鎖ＨＶＲ−Ｈ１、Ｔｉｍ３＿００２２
配列番号３２５    重鎖ＨＶＲ−Ｈ２、Ｔｉｍ３＿００２２
配列番号３２６    重鎖ＨＶＲ−Ｈ３、Ｔｉｍ３＿００２２
配列番号３２７    軽鎖ＨＶＲ−Ｌ１、Ｔｉｍ３＿００２２
配列番号３２８    軽鎖ＨＶＲ−Ｌ２、Ｔｉｍ３＿００２２
配列番号３２９    軽鎖ＨＶＲ−Ｌ３、Ｔｉｍ３＿００２２
配列番号３３０    重鎖可変ドメインＶＨ、Ｔｉｍ３＿００２２
配列番号３３１    軽鎖可変ドメインＶＬ、Ｔｉｍ３＿００２２
配列番号３３２    重鎖ＨＶＲ−Ｈ１、Ｔｉｍ３＿００２６
配列番号３３３    重鎖ＨＶＲ−Ｈ２、Ｔｉｍ３＿００２６
配列番号３３４    重鎖ＨＶＲ−Ｈ３、Ｔｉｍ３＿００２６
配列番号３３５    軽鎖ＨＶＲ−Ｌ１、Ｔｉｍ３＿００２６
配列番号３３６    軽鎖ＨＶＲ−Ｌ２、Ｔｉｍ３＿００２６
配列番号３３７    軽鎖ＨＶＲ−Ｌ３、Ｔｉｍ３＿００２６
配列番号３３８    重鎖可変ドメインＶＨ、Ｔｉｍ３＿００２６
配列番号３３９    軽鎖可変ドメインＶＬ、Ｔｉｍ３＿００２６
配列番号３４０    重鎖ＨＶＲ−Ｈ１、Ｔｉｍ３＿００２８
配列番号３４１    重鎖ＨＶＲ−Ｈ２、Ｔｉｍ３＿００２８
配列番号３４２    重鎖ＨＶＲ−Ｈ３、Ｔｉｍ３＿００２８
配列番号３４３    軽鎖ＨＶＲ−Ｌ１、Ｔｉｍ３＿００２８
配列番号３４４    軽鎖ＨＶＲ−Ｌ２、Ｔｉｍ３＿００２８
配列番号３４５    軽鎖ＨＶＲ−Ｌ３、Ｔｉｍ３＿００２８
配列番号３４６    重鎖可変ドメインＶＨ、Ｔｉｍ３＿００２８
配列番号３４７    軽鎖可変ドメインＶＬ、Ｔｉｍ３＿００２８
配列番号３４８    重鎖ＨＶＲ−Ｈ１、Ｔｉｍ３＿００３０
配列番号３４９    重鎖ＨＶＲ−Ｈ２、Ｔｉｍ３＿００３０
配列番号３５０    重鎖ＨＶＲ−Ｈ３、Ｔｉｍ３＿００３０
配列番号３５１    軽鎖ＨＶＲ−Ｌ１、Ｔｉｍ３＿００３０
配列番号３５２    軽鎖ＨＶＲ−Ｌ２、Ｔｉｍ３＿００３０
配列番号３５３    軽鎖ＨＶＲ−Ｌ３、Ｔｉｍ３＿００３０
配列番号３５４    重鎖可変ドメインＶＨ、Ｔｉｍ３＿００３０
配列番号３５５    軽鎖可変ドメインＶＬ、Ｔｉｍ３＿００３０
配列番号３５６    重鎖ＨＶＲ−Ｈ１、Ｔｉｍ３＿００３３
配列番号３５７    重鎖ＨＶＲ−Ｈ２、Ｔｉｍ３＿００３３
配列番号３５８    重鎖ＨＶＲ−Ｈ３、Ｔｉｍ３＿００３３
配列番号３５９    軽鎖ＨＶＲ−Ｌ１、Ｔｉｍ３＿００３３
配列番号３６０    軽鎖ＨＶＲ−Ｌ２、Ｔｉｍ３＿００３３
配列番号３６１    軽鎖ＨＶＲ−Ｌ３、Ｔｉｍ３＿００３３
配列番号３６２    重鎖可変ドメインＶＨ、Ｔｉｍ３＿００３３
配列番号３６３    軽鎖可変ドメインＶＬ、Ｔｉｍ３＿００３３
配列番号３６４    重鎖ＨＶＲ−Ｈ１、Ｔｉｍ３＿００３８
配列番号３６５    重鎖ＨＶＲ−Ｈ２、Ｔｉｍ３＿００３８
配列番号３６６    重鎖ＨＶＲ−Ｈ３、Ｔｉｍ３＿００３８
配列番号３６７    軽鎖ＨＶＲ−Ｌ１、Ｔｉｍ３＿００３８
配列番号３６８    軽鎖ＨＶＲ−Ｌ２、Ｔｉｍ３＿００３８
配列番号３６９    軽鎖ＨＶＲ−Ｌ３、Ｔｉｍ３＿００３８
配列番号３７０    重鎖可変ドメインＶＨ、Ｔｉｍ３＿００３８
配列番号３７１    軽鎖可変ドメインＶＬ、Ｔｉｍ３＿００３８
配列番号３７２    例示的シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素Ａ変異体１（脱免疫化ＰＥ２４実施例）
配列番号３７３    例示的シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素Ａ変異体２（脱免疫化ＰＥ２４実施例）
配列番号３７４    ヒトκ軽鎖定常領域
配列番号３７５    ヒトλ軽鎖定常領域
配列番号３７６    ＩｇＧ１に由来するヒト重鎖定常領域
配列番号３７７    突然変異Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを有するＩｇＧ１に由来するヒト重鎖定常領域
配列番号３７８    突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを有するＩｇＧ１に由来するヒト重鎖定常領域
配列番号３７９    ＩｇＧ４に由来するヒト重鎖定常領域
配列番号３８０    例示的ヒトＴＩＭ３  配列
配列番号３８１    ヒトＴＩＭ３細胞外ドメイン（ＥＣＤ）
<210> 304
<211> 9
<212> PRT
<213> マウス(Mus musculus)
<400> 304
Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser Gly Met 
1 5 
<210> 305
<211> 3
<212> PRT
<213> マウス
<400> 305
Leu Asn Asp 
1 
<210> 306
<211> 8
<212> PRT
<213> マウス
<400> 306
Asn Gly Tyr Leu Tyr Ala Leu Asp 
1 5 
<210> 307
<211> 6
<212> PRT
<213> マウス
<400> 307
Ser Ser Ser Val Asn Tyr 
1 5 
<210> 308
<211> 3
<212> PRT
<213> マウス
<400> 308
Asp Ala Phe 
1 
<210> 309
<211> 7
<212> PRT
<213> マウス
<400> 309
Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr 
1 5 
<210> 310
<211> 120
<212> PRT
<213> マウス
<400> 310
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln 
1 5 10 15 
Thr Leu Arg Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 
20 25 30 
Gly Met Ser Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu 
35 40 45 
Trp Leu Ala His Ile Trp Leu Asn Asp Asp Val Phe Phe Asn Pro Ala 
50 55 60 
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Asn Asn Gln Val 
65 70 75 80 
Phe Leu Gln Ile Ala Ser Val Val Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 
85 90 95 
Cys Val Arg Ala Asn Gly Tyr Leu Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln 
100 105 110 
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 
115 120 
<210> 311
<211> 106
<212> PRT
<213> マウス
<400> 311
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 
1 5 10 15 
Gln Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Thr 
20 25 30 
Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr 
35 40 45 
Asp Ala Phe Lys Leu Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 
50 55 60 
Gly Thr Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 
65 70 75 80 
Asp Ala Ala Ser Tyr Phe Cys His Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr 
85 90 95 
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 
100 105 
<210> 312
<211> 120
<212> PRT
<213> マウス
<400> 312
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln 
1 5 10 15 
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 
20 25 30 
Gly Met Ser Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu 
35 40 45 
Trp Leu Ala His Ile Trp Leu Asn Asp Asp Val Phe Phe Asn Pro Ala 
50 55 60 
Leu Lys Arg Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Asn Asn Gln Val 
65 70 75 80 
Phe Leu Gln Ile Ala Ser Val Val Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 
85 90 95 
Cys Val Arg Ala Asn Gly Tyr Leu Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln 
100 105 110 
Gly Ile Ser Val Thr Val Ser Ser 
115 120 
<210> 313
<211> 106
<212> PRT
<213> マウス
<400> 313
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 
1 5 10 15 
Gln Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Thr 
20 25 30 
Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr 
35 40 45 
Asp Ala Phe Lys Leu Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 
50 55 60 
Gly Thr Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 
65 70 75 80 
Asp Ala Ala Ser Tyr Phe Cys His Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr 
85 90 95 
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 
100 105 
<210> 314
<211> 6
<212> PRT
<213> マウス
<400> 314
Ser Ser Ser Val Gln Tyr 
1 5 
<210> 315
<211> 6
<212> PRT
<213> マウス
<400> 315
Ser Ser Ser Val Ser Tyr 
1 5 
<210> 316
<211> 7
<212> PRT
<213> マウス
<400> 316
Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 
1 5 
<210> 317
<211> 3
<212> PRT
<213> マウス
<400> 317
Ser Asp Ser 
1 
<210> 318
<211> 9
<212> PRT
<213> マウス
<400> 318
Gly Tyr Tyr Ala Trp Tyr Tyr Phe Asp 
1 5 
<210> 319
<211> 7
<212> PRT
<213> マウス
<400> 319
Ser Gln Ser Ile Gly Asn Asn 
1 5 
<210> 320
<211> 3
<212> PRT
<213> マウス
<400> 320
Tyr Ala Ser 
1 
<210> 321
<211> 6
<212> PRT
<213> マウス
<400> 321
Ser Asn Ser Trp Pro Leu 
1 5 
<210> 322
<211> 120
<212> PRT
<213> マウス
<400> 322
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gln Leu Val Arg Pro Gly Ala 
1 5 10 15 
Ser Val Gln Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 
20 25 30 
Leu Leu His Trp Leu Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 
35 40 45 
Gly Met Ile Asp Pro Ser Asp Ser Glu Thr Arg Leu Asn Gln Lys Phe 
50 55 60 
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 
65 70 75 80 
Met Gln Leu Ser Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 
85 90 95 
Ala Arg Asp Gly Tyr Tyr Ala Trp Tyr Tyr Phe Asp Cys Trp Gly Gln 
100 105 110 
Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 
115 120 
<210> 323
<211> 107
<212> PRT
<213> マウス
<400> 323
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly 
1 5 10 15 
Asp Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Asn Asn 
20 25 30 
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile 
35 40 45 
Lys Tyr Ala Ser His Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Lys Phe Ser Gly 
50 55 60 
Thr Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Phe Asn Ser Val Glu Thr 
65 70 75 80 
Glu Asp Phe Gly Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Leu 
85 90 95 
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 
100 105 
<210> 324
<211> 5
<212> PRT
<213> マウス
<400> 324
Gly Asp Ser Ile Ala 
1 5 
<210> 325
<211> 3
<212> PRT
<213> マウス
<400> 325
Tyr Ser Gly 
1 
<210> 326
<211> 4
<212> PRT
<213> マウス
<400> 326
Asp Tyr Phe Asp 
1 
<210> 327
<211> 7
<212> PRT
<213> マウス
<400> 327
Arg Gln Asp Val Arg Lys Asn 
1 5 
<210> 328
<211> 3
<212> PRT
<213> マウス
<400> 328
Tyr Thr Ser 
1 
<210> 329
<211> 6
<212> PRT
<213> マウス
<400> 329
Tyr Asp Asn Leu Pro Phe 
1 5 
<210> 330
<211> 114
<212> PRT
<213> マウス
<400> 330
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro Ser Gln 
1 5 10 15 
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Asp Ser Ile Ala Ser Ala 
20 25 30 
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Tyr Met 
35 40 45 
Gly Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 
50 55 60 
Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Gln Asn Gln Tyr Tyr Leu 
65 70 75 80 
Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Val 
85 90 95 
Thr Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Thr Leu Thr Val 
100 105 110 
Ser Ser 
<210> 331
<211> 107
<212> PRT
<213> マウス
<400> 331
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Tyr Leu Gly 
1 5 10 15 
Gly Lys Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Arg Gln Asp Val Arg Lys Asn 
20 25 30 
Ile Gly Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro Arg Leu Leu Ile 
35 40 45 
Trp Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 
50 55 60 
Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Asn Ile Asn Asn Leu Glu Pro 
65 70 75 80 
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Asn Leu Pro Phe 
85 90 95 
Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu Ile Arg 
100 105 
<210> 332
<211> 5
<212> PRT
<213> マウス
<400> 332
Gly Tyr Thr Phe Thr 
1 5 
<210> 333
<211> 3
<212> PRT
<213> マウス
<400> 333
Glu Thr Tyr 
1 
<210> 334
<211> 4
<212> PRT
<213> マウス
<400> 334
Gly Tyr Pro Ala 
1 
<210> 335
<211> 12
<212> PRT
<213> マウス
<400> 335
Ser Arg Thr Ile Leu His Ser Ser Gly Asn Thr Tyr 
1 5 10 
<210> 336
<211> 3
<212> PRT
<213> マウス
<400> 336
Lys Val Ser 
1 
<210> 337
<211> 6
<212> PRT
<213> マウス
<400> 337
Asp Ser His Val Pro Phe 
1 5 
<210> 338
<211> 115
<212> PRT
<213> マウス
<400> 338
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 
1 5 10 15 
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 
20 25 30 
Ser Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Arg Gly Leu Lys Trp Met 
35 40 45 
Gly Tyr Ile Asn Thr Glu Thr Tyr Glu Pro Thr Phe Gly Ala Asp Phe 
50 55 60 
Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Asp Thr Ser Ala Thr Thr Ala Tyr 
65 70 75 80 
Leu Gln Ile Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Thr Phe Phe Cys 
85 90 95 
Gly Gly Gly Gly Tyr Pro Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Val Val Ile 
100 105 110 
Val Ser Ala 
115 
<210> 339
<211> 112
<212> PRT
<213> マウス
<400> 339
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 
1 5 10 15 
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Arg Thr Ile Leu His Ser 
20 25 30 
Ser Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 
35 40 45 
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 
50 55 60 
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile 
65 70 75 80 
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Asp 
85 90 95 
Ser His Val Pro Phe Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 
100 105 110 
<210> 340
<211> 7
<212> PRT
<213> マウス
<400> 340
Gly Phe Asn Ile Lys Thr Thr 
1 5 
<210> 341
<211> 3
<212> PRT
<213> マウス
<400> 341
Ala Asp Asp 
1 
<210> 342
<211> 8
<212> PRT
<213> マウス
<400> 342
Phe Gly Tyr Val Ala Trp Phe Ala 
1 5 
<210> 343
<211> 7
<212> PRT
<213> マウス
<400> 343
Ser Gln Ser Val Asp Asn Tyr 
1 5 
<210> 344
<211> 3
<212> PRT
<213> マウス
<400> 344
Tyr Ala Ser 
1 
<210> 345
<211> 6
<212> PRT
<213> マウス
<400> 345
His Tyr Ser Ser Pro Tyr 
1 5 
<210> 346
<211> 119
<212> PRT
<213> マウス
<400> 346
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Val Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 
1 5 10 15 
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Thr Thr 
20 25 30 
Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile 
35 40 45 
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asp Asp Asn Thr Lys Tyr Ala Pro Lys Phe 
50 55 60 
Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 
65 70 75 80 
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ala Ala Ile Tyr Tyr Cys 
85 90 95 
Val Arg Asp Phe Gly Tyr Val Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 
100 105 110 
Thr Leu Val Thr Phe Ser Ala 
115 
<210> 347
<211> 107
<212> PRT
<213> マウス
<400> 347
Asn Ile Val Met Thr Pro Thr Pro Lys Phe Leu Pro Val Ser Ser Gly 
1 5 10 15 
Asp Arg Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp Asn Tyr 
20 25 30 
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 
35 40 45 
Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Ile Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 
50 55 60 
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Val 
65 70 75 80 
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln His Tyr Ser Ser Pro Tyr 
85 90 95 
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 
100 105 
<210> 348
<211> 7
<212> PRT
<213> マウス
<400> 348
Gly Tyr Pro Phe Ser Glu Tyr 
1 5 
<210> 349
<211> 3
<212> PRT
<213> マウス
<400> 349
Glu Thr Gly 
1 
<210> 350
<211> 4
<212> PRT
<213> マウス
<400> 350
Gly Tyr Pro Ala 
1 
<210> 351
<211> 12
<212> PRT
<213> マウス
<400> 351
Ser Arg Ser Ile Val His Ser Ser Gly Asn Thr Tyr 
1 5 10 
<210> 352
<211> 3
<212> PRT
<213> マウス
<400> 352
Lys Val Ser 
1 
<210> 353
<211> 5
<212> PRT
<213> マウス
<400> 353
Asp Ser His Val Pro 
1 5 
<210> 354
<211> 115
<212> PRT
<213> マウス
<400> 354
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 
1 5 10 15 
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Pro Phe Ser Glu Tyr 
20 25 30 
Ser Ile His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 
35 40 45 
Val Tyr Val Asn Thr Glu Thr Gly Gln Pro Ile Val Gly Asp Asp Phe 
50 55 60 
Arg Gly Arg Phe Val Leu Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 
65 70 75 80 
Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 
85 90 95 
Gly Gly Gly Gly Tyr Pro Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 
100 105 110 
Val Ser Ala 
115 
<210> 355
<211> 112
<212> PRT
<213> マウス
<400> 355
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 
1 5 10 15 
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Arg Ser Ile Val His Ser 
20 25 30 
Ser Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 
35 40 45 
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 
50 55 60 
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile 
65 70 75 80 
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Asp 
85 90 95 
Ser His Val Pro Phe Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 
100 105 110 
<210> 356
<211> 7
<212> PRT
<213> マウス
<400> 356
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Ser 
1 5 
<210> 357
<211> 3
<212> PRT
<213> マウス
<400> 357
Ala Thr Gly 
1 
<210> 358
<211> 8
<212> PRT
<213> マウス
<400> 358
Tyr Pro His Tyr Tyr Ala Met Asp 
1 5 
<210> 359
<211> 7
<212> PRT
<213> マウス
<400> 359
Ser Glu Asn Ile Phe Ser Asn 
1 5 
<210> 360
<211> 3
<212> PRT
<213> マウス
<400> 360
Ser Ala Thr 
1 
<210> 361
<211> 6
<212> PRT
<213> マウス
<400> 361
Phe Tyr Lys Ile Pro Phe 
1 5 
<210> 362
<211> 121
<212> PRT
<213> マウス
<400> 362
Gln Gly Gln Met His Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ser 
1 5 10 15 
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Ser 
20 25 30 
Phe Ile Ser Trp Leu Lys Gln Lys Pro Gly Gln Ser Leu Glu Trp Ile 
35 40 45 
Ala Trp Ile Tyr Ala Ala Thr Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 
50 55 60 
Thr Asn Lys Ala Gln Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Ala Ala Tyr 
65 70 75 80 
Met Gln Phe Ser Ser Leu Thr Thr Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys 
85 90 95 
Ala Arg His Ala Gly Tyr Pro His Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly 
100 105 110 
Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 
115 120 
<210> 363
<211> 107
<212> PRT
<213> マウス
<400> 363
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 
1 5 10 15 
Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Phe Ser Asn 
20 25 30 
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val 
35 40 45 
Tyr Ser Ala Thr Asn Leu Gly Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 
50 55 60 
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro 
65 70 75 80 
Glu Asp Phe Gly Asn Tyr Tyr Cys Gln His Phe Tyr Lys Ile Pro Phe 
85 90 95 
Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 
100 105 
<210> 364
<211> 7
<212> PRT
<213> マウス
<400> 364
Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr 
1 5 
<210> 365
<211> 3
<212> PRT
<213> マウス
<400> 365
Glu Asp Gly 
1 
<210> 366
<211> 8
<212> PRT
<213> マウス
<400> 366
His Gly Tyr Val Gly Trp Phe Ala 
1 5 
<210> 367
<211> 8
<212> PRT
<213> マウス
<400> 367
Ala Ser Glu Asn Val Asp Thr Tyr 
1 5 
<210> 368
<211> 3
<212> PRT
<213> マウス
<400> 368
Gly Ala Ser 
1 
<210> 369
<211> 6
<212> PRT
<213> マウス
<400> 369
Ser Tyr Ser Tyr Pro Trp 
1 5 
<210> 370
<211> 119
<212> PRT
<213> マウス
<400> 370
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Pro Leu Lys Pro Gly Ala 
1 5 10 15 
Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Thr Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr 
20 25 30 
Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Ser Asp Gln Gly Leu Glu Trp Ile 
35 40 45 
Gly Arg Ile Asp Pro Glu Asp Gly Glu Leu Ile Tyr Ala Pro Lys Phe 
50 55 60 
Gln Asp Lys Ala Thr Ile Thr Val Asp Thr Ser Ser Asn Ile Ala Tyr 
65 70 75 80 
Leu Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
85 90 95 
Ser Arg Asp His Gly Tyr Val Gly Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 
100 105 110 
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 
115 
<210> 371
<211> 107
<212> PRT
<213> マウス
<400> 371
Asn Val Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Ser Met Ile Met Ser Val Gly 
1 5 10 15 
Gln Arg Val Thr Leu Asn Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Asp Thr Tyr 
20 25 30 
Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 
35 40 45 
Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 
50 55 60 
Ser Arg Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala 
65 70 75 80 
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gly Gln Ser Tyr Ser Tyr Pro Trp 
85 90 95 
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Phe Arg 
100 105 
<210> 372
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 例示的シュードモナス属（Pseudomonas）外毒素A変異体1（脱免疫化PE24実施例）
<400> 372
Pro Thr Gly Ala Glu Phe Leu Gly Asp Gly Gly Asp Val Ser Phe Ser 
1 5 10 15 
Thr Arg Gly Thr Gln Asn Trp Thr Val Glu Arg Leu Leu Gln Ala His 
20 25 30 
Ala Gln Leu Glu Glu Arg Gly Tyr Val Phe Val Gly Tyr His Gly Thr 
35 40 45 
Phe Leu Glu Ala Ala Gln Ser Ile Val Phe Gly Gly Val Ala Ala Arg 
50 55 60 
Ser Gln Asp Leu Ala Ala Ile Trp Ala Gly Phe Tyr Ile Ala Gly Asp 
65 70 75 80 
Pro Ala Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala Gln Asp Gln Glu Pro Asp Ala Ala 
85 90 95 
Gly Arg Ile Arg Asn Gly Ala Leu Leu Arg Val Tyr Val Pro Ala Ser 
100 105 110 
Ser Leu Pro Gly Phe Tyr Arg Thr Ser Leu Thr Leu Ala Ala Pro Glu 
115 120 125 
Ala Ala Gly Glu Val Glu Arg Leu Ile Gly His Pro Leu Pro Leu Ala 
130 135 140 
Leu Asp Ala Ile Thr Gly Pro Glu Glu Glu Gly Gly Arg Leu Glu Thr 
145 150 155 160 
Ile Leu Gly Trp Pro Leu Ala Glu Arg Thr Val Val Ile Pro Ser Ala 
165 170 175 
Ile Pro Thr Asp Pro Arg Asn Val Gly Gly Asp Leu Asp Pro Ser Ser 
180 185 190 
Ile Pro Asp Lys Glu Gln Ala Ile Ser Ala Leu Pro Asp Tyr Ala Ser 
195 200 205 
Gln Pro Gly Lys Pro Pro Arg Glu Asp Leu Lys 
210 215 
<210> 373
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 例示的シュードモナス属（Pseudomonas）外毒素A変異体2（脱免疫化PE24実施例）
<400> 373
Pro Thr Gly Ala Glu Phe Leu Gly Asp Gly Gly Asp Val Ser Phe Ser 
1 5 10 15 
Thr Arg Gly Thr Gln Asn Trp Thr Val Glu Arg Leu Leu Gln Ala His 
20 25 30 
Ala Gln Leu Glu Glu Arg Gly Tyr Val Phe Val Gly Tyr His Gly Thr 
35 40 45 
Ala Leu Glu Ala Ala Gln Ser Ile Val Phe Gly Gly Val Arg Ala Arg 
50 55 60 
Ser Gln Asp Leu Arg Ala Ile Trp Arg Gly Phe Tyr Ile Ala Gly Asp 
65 70 75 80 
Pro Ala His Ala Tyr Gly Tyr Ala Gln Asp Gln Glu Pro Asp Ala Arg 
85 90 95 
Gly Arg Ile Ala Asn Gly Ala Leu Leu Arg Val Tyr Val Pro Ala Ser 
100 105 110 
Ser Leu Pro Gly Phe Tyr Arg Thr Ser Leu Thr Leu Ala Ala Pro Glu 
115 120 125 
Ala Ala Gly Glu Val Glu Arg Leu Ile Gly His Pro Leu Pro Leu Arg 
130 135 140 
Leu Asp Ala Ile Thr Gly Pro Glu Glu Glu Gly Gly Arg Glu Glu Thr 
145 150 155 160 
Ile Leu Gly Trp Pro Leu Ala Glu Arg Thr Val Val Ile Pro Ser Ala 
165 170 175 
Ile Pro Thr Asp Pro Arg Asn Val Gly Gly Asp Leu Asp Pro Ser Ser 
180 185 190 
Ile Pro Asp Lys Glu Gln Ala Ile Ser Ala Leu Pro Asp Tyr Ala Ser 
195 200 205 
Gln Pro Gly Lys Pro Pro Arg Glu Asp Leu Lys 
210 215 
<210> 374
<211> 107
<212> PRT
<213> ヒト（Homo Sapiens）
<400> 374
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 
1 5 10 15 
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 
20 25 30 
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 
35 40 45 
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 
50 55 60 
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 
65 70 75 80 
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 
85 90 95 
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 
100 105 
<210> 375
<211> 105
<212> PRT
<213> ヒト
<400> 375
Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu 
1 5 10 15 
Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe 
20 25 30 
Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val 
35 40 45 
Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys 
50 55 60 
Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser 
65 70 75 80 
His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu 
85 90 95 
Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 
100 105 
<210> 376
<211> 330
<212> PRT
<213> ヒト
<400> 376
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 
1 5 10 15 
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 
20 25 30 
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 
35 40 45 
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 
50 55 60 
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 
65 70 75 80 
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 
85 90 95 
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 
100 105 110 
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 
115 120 125 
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 
130 135 140 
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 
145 150 155 160 
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 
165 170 175 
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 
180 185 190 
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 
195 200 205 
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 
210 215 220 
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 
225 230 235 240 
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 
245 250 255 
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 
260 265 270 
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 
275 280 285 
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 
290 295 300 
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 
305 310 315 320 
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 
325 330 
<210> 377
<211> 330
<212> PRT
<213> ヒト
<400> 377
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 
1 5 10 15 
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 
20 25 30 
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 
35 40 45 
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 
50 55 60 
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 
65 70 75 80 
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 
85 90 95 
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 
100 105 110 
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 
115 120 125 
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 
130 135 140 
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 
145 150 155 160 
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 
165 170 175 
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 
180 185 190 
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 
195 200 205 
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 
210 215 220 
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 
225 230 235 240 
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 
245 250 255 
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 
260 265 270 
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 
275 280 285 
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 
290 295 300 
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 
305 310 315 320 
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 
325 330 
<210> 378
<211> 330
<212> PRT
<213> ヒト
<400> 378
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 
1 5 10 15 
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 
20 25 30 
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 
35 40 45 
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 
50 55 60 
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 
65 70 75 80 
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 
85 90 95 
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 
100 105 110 
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 
115 120 125 
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 
130 135 140 
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 
145 150 155 160 
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 
165 170 175 
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 
180 185 190 
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 
195 200 205 
Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 
210 215 220 
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 
225 230 235 240 
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 
245 250 255 
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 
260 265 270 
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 
275 280 285 
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 
290 295 300 
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 
305 310 315 320 
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 
325 330 
<210> 379
<211> 327
<212> PRT
<213> ヒト
<400> 379
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 
1 5 10 15 
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 
20 25 30 
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 
35 40 45 
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 
50 55 60 
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 
65 70 75 80 
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 
85 90 95 
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro 
100 105 110 
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 
115 120 125 
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 
130 135 140 
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 
145 150 155 160 
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 
165 170 175 
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 
180 185 190 
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 
195 200 205 
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 
210 215 220 
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 
225 230 235 240 
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 
245 250 255 
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 
260 265 270 
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 
275 280 285 
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 
290 295 300 
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 
305 310 315 320 
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 
325 
<210> 380
<211> 280
<212> PRT
<213> ヒト
<400> 380
Ser Glu Val Glu Tyr Arg Ala Glu Val Gly Gln Asn Ala Tyr Leu Pro 
1 5 10 15 
Cys Phe Tyr Thr Pro Ala Ala Pro Gly Asn Leu Val Pro Val Cys Trp 
20 25 30 
Gly Lys Gly Ala Cys Pro Val Phe Glu Cys Gly Asn Val Val Leu Arg 
35 40 45 
Thr Asp Glu Arg Asp Val Asn Tyr Trp Thr Ser Arg Tyr Trp Leu Asn 
50 55 60 
Gly Asp Phe Arg Lys Gly Asp Val Ser Leu Thr Ile Glu Asn Val Thr 
65 70 75 80 
Leu Ala Asp Ser Gly Ile Tyr Cys Cys Arg Ile Gln Ile Pro Gly Ile 
85 90 95 
Met Asn Asp Glu Lys Phe Asn Leu Lys Leu Val Ile Lys Pro Ala Lys 
100 105 110 
Val Thr Pro Ala Pro Thr Arg Gln Arg Asp Phe Thr Ala Ala Phe Pro 
115 120 125 
Arg Met Leu Thr Thr Arg Gly His Gly Pro Ala Glu Thr Gln Thr Leu 
130 135 140 
Gly Ser Leu Pro Asp Ile Asn Leu Thr Gln Ile Ser Thr Leu Ala Asn 
145 150 155 160 
Glu Leu Arg Asp Ser Arg Leu Ala Asn Asp Leu Arg Asp Ser Gly Ala 
165 170 175 
Thr Ile Arg Ile Gly Ile Tyr Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala Gly Leu 
180 185 190 
Ala Leu Ala Leu Ile Phe Gly Ala Leu Ile Phe Lys Trp Tyr Ser His 
195 200 205 
Ser Lys Glu Lys Ile Gln Asn Leu Ser Leu Ile Ser Leu Ala Asn Leu 
210 215 220 
Pro Pro Ser Gly Leu Ala Asn Ala Val Ala Glu Gly Ile Arg Ser Glu 
225 230 235 240 
Glu Asn Ile Tyr Thr Ile Glu Glu Asn Val Tyr Glu Val Glu Glu Pro 
245 250 255 
Asn Glu Tyr Tyr Cys Tyr Val Ser Ser Arg Gln Gln Pro Ser Gln Pro 
260 265 270 
Leu Gly Cys Arg Phe Ala Met Pro 
275 280 
<210> 381
<211> 181
<212> PRT
<213> ヒト
<400> 381
Ser Glu Val Glu Tyr Arg Ala Glu Val Gly Gln Asn Ala Tyr Leu Pro 
1 5 10 15 
Cys Phe Tyr Thr Pro Ala Ala Pro Gly Asn Leu Val Pro Val Cys Trp 
20 25 30 
Gly Lys Gly Ala Cys Pro Val Phe Glu Cys Gly Asn Val Val Leu Arg 
35 40 45 
Thr Asp Glu Arg Asp Val Asn Tyr Trp Thr Ser Arg Tyr Trp Leu Asn 
50 55 60 
Gly Asp Phe Arg Lys Gly Asp Val Ser Leu Thr Ile Glu Asn Val Thr 
65 70 75 80 
Leu Ala Asp Ser Gly Ile Tyr Cys Cys Arg Ile Gln Ile Pro Gly Ile 
85 90 95 
Met Asn Asp Glu Lys Phe Asn Leu Lys Leu Val Ile Lys Pro Ala Lys 
100 105 110 
Val Thr Pro Ala Pro Thr Arg Gln Arg Asp Phe Thr Ala Ala Phe Pro 
115 120 125 
Arg Met Leu Thr Thr Arg Gly His Gly Pro Ala Glu Thr Gln Thr Leu 
130 135 140 
Gly Ser Leu Pro Asp Ile Asn Leu Thr Gln Ile Ser Thr Leu Ala Asn 
145 150 155 160 
Glu Leu Arg Asp Ser Arg Leu Ala Asn Asp Leu Arg Asp Ser Gly Ala 
165 170 175 
Thr Ile Arg Ile Gly 
180 
【０６４８】
前記の発明を、理解の明確さを目的として例示及び実施例によって幾分か詳細に記載したが、説明及び実施例は、本発明の範囲を制限すると解釈されてはならない。本明細書において引用されたすべての特許及び科学文献の開示内容は、参照によってその全文が明確に組み込まれる。
【図１Ａ】
2020183403.tif 000098
【図１Ｂ】
2020183403.tif 000099
【図１Ｃ】
2020183403.tif 000100
【図１Ｄ】
2020183403.tif 000101
【図１Ｅ】
2020183403.tif 000102
【図１Ｆ】
2020183403.tif 000103
【図１Ｇ】
2020183403.tif 000104
【図１Ｈ】
2020183403.tif 000105
【図１Ｉ】
2020183403.tif 000106
【図２Ａ−Ｃ】
2020183403.tif 000107
【図３Ａ−Ｂ】
2020183403.tif 000108
【図４Ａ−Ｂ】
2020183403.tif 000109
【図５】
2020183403.tif 000110
【図６Ａ−Ｅ】
2020183403.tif 000111
【図７Ａ−Ｄ】
2020183403.tif 000112
【図７Ｅ−Ｈ】
2020183403.tif 000113
【図７Ｉ−Ｌ】
2020183403.tif 000114
【図８】
2020183403.tif 000115
【図９Ａ−Ｄ】
2020183403.tif 000116
【図１０Ａ−Ｃ】
2020183403.tif 000117
【図１１Ａ−Ｂ】
2020183403.tif 000118
【図１２Ａ−Ｉ】
2020183403.tif 000119
【図１２Ｊ−Ｋ】
2020183403.tif 000120
【図１２Ｌ−Ｍ】
2020183403.tif 000121
【図１２Ｎ】
2020183403.tif 000122
【図１２Ｏ】
2020183403.tif 000123
【図１３Ａ−Ｃ】
2020183403.tif 000124
【図１４Ａ−Ｆ】
2020183403.tif 000125
【図１４Ｇ−Ｌ】
2020183403.tif 000126
【図１５Ａ−Ｃ】
2020183403.tif 000127
【図１６Ａ−Ｅ】
2020183403.tif 000128
【図１６Ｆ】
2020183403.tif 000129
【図１７Ａ−Ｈ】
2020183403.tif 000130
【図１８Ａ−Ｆ】
2020183403.tif 000131
【図１８Ｇ−Ｌ】
2020183403.tif 000132
【図１８Ｍ−Ｒ】
2020183403.tif 000133
【図１９Ａ−Ｂ】
2020183403.tif 000134
【図１９Ｃ−Ｄ】
2020183403.tif 000135
【図１９Ｅ−Ｆ】
2020183403.tif 000136
【図１９Ｇ】
2020183403.tif 000137
【図１９Ｈ】
2020183403.tif 000138
【図２０Ａ−Ｅ】
2020183403.tif 000139
【図２１Ａ−Ｅ】
2020183403.tif 000140
【図２１Ｆ】
2020183403.tif 000141
【図２１Ｇ−Ｊ】
2020183403.tif 000142
【図２１Ｋ】
2020183403.tif 000143
【図２１Ｌ−Ｍ】
2020183403.tif 000144
【図２１Ｎ】
2020183403.tif 000145
【図２２Ａ−Ｃ】
2020183403.tif 000146
【図２２Ｄ−Ｆ】
2020183403.tif 000147
【図２２Ｇ−Ｉ】
2020183403.tif 000148
【図２３Ａ−Ｃ】
2020183403.tif 000149
【図２３Ｄ】
2020183403.tif 000150
【図２３Ｅ】
2020183403.tif 000151
【図２４Ａ−Ｃ】
2020183403.tif 000152
【図２４Ｄ−Ｆ】
2020183403.tif 000153
【図２５Ａ−Ｉ】
2020183403.tif 000154
【図２６Ａ−Ｃ】
2020183403.tif 000155
【図２７Ａ−Ｃ】
2020183403.tif 000156
【図２８Ａ−Ｃ】
2020183403.tif 000157
【図２８Ｄ−Ｆ】
2020183403.tif 000158
【図２９Ａ】
2020183403.tif 000159
【図２９Ｂ】
2020183403.tif 000160
【図３０Ａ】
2020183403.tif 000161
【図３０Ｂ】
2020183403.tif 000162
【図３１】
2020183403.tif 000163
【図３２】
2020183403.tif 000164
【図３３】
2020183403.tif 000165
【図３４Ａ−Ｄ】
2020183403.tif 000166
【図３５Ａ】
2020183403.tif 000167
【図３５Ｂ】
2020183403.tif 000168
【図３５Ｃ】
2020183403.tif 000169
【図３５Ｄ】
2020183403.tif 000170
【図３５Ｅ】
2020183403.tif 000171
【図３５Ｆ】
2020183403.tif 000172
【図３６Ａ】
2020183403.tif 000173
【図３６Ｂ】
2020183403.tif 000174
【図３６Ｃ】
2020183403.tif 000175
【図３６Ｄ】
2020183403.tif 000176
【図３６Ｅ】
2020183403.tif 000177
【図３７Ａ−Ｇ】
2020183403.tif 000178
【図３７Ｈ】
2020183403.tif 000179
【図３８Ａ−Ｅ】
2020183403.tif 000180
【図３９】
2020183403.tif 000181
【図４０Ａ−Ｃ】
2020183403.tif 000182
【配列表】
2020183403000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年8月4日(2020.8.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０６４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０６４８】
前記の発明を、理解の明確さを目的として例示及び実施例によって幾分か詳細に記載したが、説明及び実施例は、本発明の範囲を制限すると解釈されてはならない。本明細書において引用されたすべての特許及び科学文献の開示内容は、参照によってその全文が明確に組み込まれる。
＜本発明の更なる実施態様＞
［実施態様１］ 
個体においてがんの進行を治療又は遅延するための方法であって、個体に、有効量のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子及びＰＤ−１軸結合アンタゴニストを投与することを含む方法。 
［実施態様２］ 
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が、ＣＤ３と特異的に結合可能な第１の抗原結合部分及び葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）と特異的に結合可能な第２の抗原結合部分を含む、実施態様１に記載の方法。 
［実施態様３］ 
第１の抗原結合部分が、配列番号３７、配列番号３８及び配列番号３９からなる群から選択される少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列並びに配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４の群から選択される少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲを含む、実施態様１に記載の方法。 
［実施態様４］ 
第１の抗原結合部分が、配列番号３６のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、実施態様１に記載の方法。 
［実施態様５］ 
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が、ＦｏｌＲ１と特異的に結合可能な第３の抗原結合部分をさらに含む、実施態様２から４の何れか一に記載の方法。 
［実施態様６］ 
ＦｏｌＲ１と特異的に結合可能な第２及び第３の抗原結合部分が、同一の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）及び軽鎖ＣＤＲ配列を含む、実施態様５に記載の方法。 
［実施態様７］ 
第３の抗原結合部分が、第２の抗原結合部分と同一である、実施態様６に記載の方法。 
［実施態様８］ 
第１、第２及び第３の抗原結合部分のうちの少なくとも１つが、Ｆａｂ分子である、実施態様５から７の何れか一に記載の方法。 
［実施態様９］ 
葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）と特異的に結合可能な抗原結合部分が、配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１８からなる群から選択される少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列並びに配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４の群から選択される少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲを含む、実施態様１から８の何れか一に記載の方法。 
［実施態様１０］ 
葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）と特異的に結合可能な抗原結合部分が、配列番号１５のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、実施態様９に記載の方法。 
［実施態様１１］ 
葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）と特異的に結合可能な抗原結合部分が、配列番号８、配列番号５６及び配列番号５７からなる群から選択される少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列並びに配列番号５９、配列番号６０、配列番号６５の群から選択される少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲを含む、実施態様１から８の何れか一に記載の方法。 
［実施態様１２］ 
葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）と特異的に結合可能な抗原結合部分が、配列番号５５のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号６４のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、実施態様１１に記載の方法。 
［実施態様１３］ 
葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）と特異的に結合可能な抗原結合部分が、配列番号１６、配列番号４０２及び配列番号４００からなる群から選択される少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列並びに配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４の群から選択される少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲを含む、実施態様１から８の何れか一に記載の方法。 
［実施態様１４］ 
ＦｏｌＲ１と特異的に結合可能な抗原結合部分が、 
ａ）配列番号１６の相補性決定領域重鎖１（ＣＤＲ−Ｈ１）アミノ酸配列と、 
（ｂ）配列番号４０２のＣＤＲ−Ｈ２アミノ酸配列と、 
（ｃ）配列番号４００のＣＤＲ−Ｈ３アミノ酸配列と、 
（ｄ）配列番号３２の相補性決定領域軽鎖１（ＣＤＲ−Ｌ１）アミノ酸配列と、 
（ｅ）配列番号３３のＣＤＲ−Ｌ２アミノ酸配列と、 
（ｆ）配列番号３４のＣＤＲ−Ｌ３アミノ酸配列と 
を含む、実施態様１３に記載の方法。 
［実施態様１５］ 
ＦｏｌＲ１と特異的に結合可能な抗原結合部分が、配列番号４０１のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、実施態様１４に記載の方法。 
［実施態様１６］ 
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が、ヒトＦｏｌＲ１及びカニクイザルＦｏｌＲ１と結合し、マウスＦｏｌＲ１と結合しない、実施態様１から１５の何れか一に記載の方法。 
［実施態様１７］ 
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が、インビトロでヒトＣＤ３陽性Ｔ細胞の増殖を誘導する、実施態様１から１６の何れか一に記載の方法。 
［実施態様１８］ 
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が、インビトロでＦｏｌＲ１発現ヒト腫瘍細胞のヒト末梢血単核細胞媒介性死滅を誘導する、実施態様１から１７の何れか一に記載の方法。 
［実施態様１９］ 
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が、インビトロでＦｏｌＲ１発現ヒト腫瘍細胞のＴ細胞媒介性死滅を誘導する、実施態様１から１８の何れか一に記載の方法。 
［実施態様２０］ 
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が、２４時間後に、約３６ｐＭから約３９５７３ｐＭの間のＥＣ５０で、インビトロでＦｏｌＲ１発現ヒト腫瘍細胞のＴ細胞媒介性死滅を誘導する、実施態様１から１９の何れか一に記載の方法。 
［実施態様２１］ 
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が、フローサイトメトリーによって測定されるような、Ｔ細胞でのＣＤ２５及びＣＤ６９のうちの少なくとも一方の細胞表面発現の上方制御を誘導する、実施態様１から２０の何れか一に記載の方法。 
［実施態様２２］ 
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が、ヒトＦｏｌＲ１と、約１０ｎＭから約４０ｎＭの見かけのＫＤで結合する、実施態様１から２１の何れか一に記載の方法。 
［実施態様２３］ 
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が、ヒトＦｏｌＲ１と、約１０ｎＭの見かけのＫＤで結合し、カニクイザルＦｏｌＲ１と約４０ｎＭの見かけのＫＤで結合する、実施態様１から２２の何れか一に記載の方法。 
［実施態様２４］ 
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が、マウスＦｏｌＲ１と、約１．５ｎＭの見かけのＫＤで結合する、実施態様１から２３の何れか一に記載の方法。 
［実施態様２５］ 
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が、ヒトＦｏｌＲ１と、少なくとも約１０００ｎＭの一価の結合ＫＤで結合する、実施態様１から２４の何れか一に記載の方法。 
［実施態様２６］ 
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が、ヒト腫瘍細胞上に発現されるＦｏｌＲ１と結合する、実施態様１から２５の何れか一に記載の方法。 
［実施態様２７］ 
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が、ヒトＦｏｌＲ１上の立体構造エピトープと結合する、実施態様１から２６の何れか一に記載の方法。 
［実施態様２８］ 
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が、ヒト葉酸受容体２（ＦｏｌＲ２）又はヒト葉酸受容体３（ＦｏｌＲ３）と結合しない、実施態様１から２７の何れか一に記載の方法。 
［実施態様２９］ 
抗原結合部分が、ヒトＦｏｌＲ１（配列番号２２７）のアミノ酸２５−２３４を含むＦｏｌＲ１ポリペプチドと結合する、実施態様１から２８の何れか一に記載の方法。 
［実施態様３０］ 
ＦｏｌＲ１抗原結合部分が、配列番号２２７、２３０及び２３１のアミノ酸配列を含むＦｏｌＲ１ポリペプチドと結合し、ＦｏｌＲ１抗原結合部分が、配列番号２２８及び２２９のアミノ酸配列を含むＦｏｌＲポリペプチドと結合しない、実施態様１から２９の何れか一に記載の方法。 
［実施態様３１］ 
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が、ａ）ヒトＦｏｌＲ１との結合について、配列番号４０１の可変重鎖ドメイン（ＶＨ）及び配列番号３１の可変軽鎖ドメインを含む参照抗体と競合する第１の抗原結合部位と、ｂ）ヒトＣＤ３との結合について、配列番号３６の可変重鎖ドメイン（ＶＨ）及び配列番号３１の可変軽鎖ドメインを含む参照抗体と競合する第２の抗原結合部位とを含み、結合競合が、表面プラズモン共鳴アッセイを使用して測定される、実施態様１から３０の何れか一に記載の方法。 
［実施態様３２］ 
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が、第１、第２及び第３の抗原結合部分を形成する第１、第２、第３、第４及び第５のポリペプチド鎖を含み、第１の抗原結合部分が、ＣＤ３と結合可能であり、第２及び第３の抗原結合部分が各々、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）と結合可能であり、ａ）第１及び第２のポリペプチド鎖が、アミノ（Ｎ）末端からカルボキシル（Ｃ）末端の方向に、ＶＬＤ１及びＣＬＤ１を含み、ｂ）第３のポリペプチド鎖が、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ＶＬＤ２及びＣＨ１Ｄ２を含み、ｃ）第４のポリペプチド鎖が、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ＶＨＤ１、ＣＨ１Ｄ１、ＣＨ２Ｄ１及びＣＨ３Ｄ１を含み、ｄ）第５のポリペプチド鎖が、ＶＨＤ１、ＣＨ１Ｄ１、ＶＨＤ２、ＣＬＤ２、ＣＨ２Ｄ２及びＣＨ３Ｄ２を含み、 
ＶＬＤ１が、第１の軽鎖可変ドメインであり、 
ＶＬＤ２が、第２の軽鎖可変ドメインであり、 
ＣＬＤ１が、第１の軽鎖定常ドメインであり、 
ＣＬＤ２が、第２の軽鎖定常ドメインであり、 
ＶＨＤ１が、第１の重鎖可変ドメインであり、 
ＶＨＤ２が、第２の重鎖可変ドメインであり、 
ＣＨ１Ｄ１が、第１の重鎖定常ドメイン１であり、 
ＣＨ１Ｄ２が、第２の重鎖定常ドメイン１であり、 
ＣＨ２Ｄ１が、第１の重鎖定常ドメイン２であり、 
ＣＨ２Ｄ２が、第２の重鎖定常ドメイン２であり、 
ＣＨ３Ｄ１が、第１の重鎖定常ドメイン３であり、 
ＣＨ３Ｄ２が、第２の重鎖定常ドメイン３である、 
実施態様１から３１の何れか一に記載の方法。 
［実施態様３３］ 
ａ．第３のポリペプチド鎖並びに第５のポリペプチド鎖のＶＨＤ２及びＣＬＤ２が、ＣＤ３と結合可能な第１の抗原結合部分を形成し、 
ｂ．第１のポリペプチド鎖並びに第４のポリペプチド鎖のＶＨＤ１及びＣＨ１Ｄ１が、ＦｏｌＲ１と結合可能な第２の結合部分を形成し、 
ｃ．第２のポリペプチド鎖並びに第５のポリペプチド鎖のＶＨＤ１及びＣＨ１Ｄ１が、ＦｏｌＲ１と結合可能な第３の結合部分を形成する、実施態様３２に記載の方法。 
［実施態様３４］ 
第１の及び第２のポリペプチド鎖が、配列番号３９９のアミノ酸配列を含む、実施態様３２又は３３の何れか一に記載の方法。 
［実施態様３５］ 
第３のポリペプチド鎖が、配列番号８６のアミノ酸配列を含む、実施態様３２又は３３の何れか一に記載の方法。 
［実施態様３６］ 
第４のポリペプチド鎖が、配列番号３９４のアミノ酸配列を含む、実施態様３２又は３３の何れか一に記載の方法。 
［実施態様３７］ 
第５のポリペプチド鎖が、配列番号３９７のアミノ酸配列を含む、実施態様３２又は３３の何れか一に記載の方法。 
［実施態様３８］ 
ａ．第１及び第２のポリペプチド鎖が、配列番号３９９のアミノ酸配列を含み、 
ｂ．第３のポリペプチド鎖が、配列番号８６のアミノ酸配列を含み、 
ｃ．第４のポリペプチド鎖が、配列番号３９４のアミノ酸配列を含み、 
ｄ．第５のポリペプチド鎖が、配列番号３９７のアミノ酸配列を含む、 
実施態様３２又は３３の何れか一に記載の方法。 
［実施態様３９］ 
ＰＤ−１軸結合アンタゴニストが、ＰＤ−１結合アンタゴニスト、ＰＤ−Ｌ１結合アンタゴニスト及びＰＤ−Ｌ２結合アンタゴニストからなる群から選択される、実施態様１から３８の何れか一に記載の方法。 
［実施態様４０］ 
ＰＤ−１軸結合アンタゴニストが、ＰＤ−１結合アンタゴニストである、実施態様３９に記載の方法。 
［実施態様４１］ 
ＰＤ−１結合アンタゴニストが、ＰＤ−１の、そのリガンドである結合パートナーとの結合を阻害する、実施態様４０に記載の方法。 
［実施態様４２］ 
ＰＤ−１結合アンタゴニストが、ＰＤ−１のＰＤ−Ｌ１との結合を阻害する、実施態様４１に記載の方法。 
［実施態様４３］ 
ＰＤ−１結合アンタゴニストが、ＰＤ−１のＰＤ−Ｌ２との結合を阻害する、実施態様４１に記載の方法。 
［実施態様４４］ 
ＰＤ−１結合アンタゴニストが、ＰＤ−１の、ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２の両方との結合を阻害する、実施態様４１に記載の方法。 
［実施態様４５］ 
ＰＤ−１結合アンタゴニストが、抗体である、実施態様４０に記載の方法。 
［実施態様４６］ 
ＰＤ−１結合アンタゴニストが、ニボルマブ、ペムブロリズマブ及びＣＴ−０１１からなる群から選択される、実施態様４５に記載の方法。 
［実施態様４７］ 
ＰＤ−１結合アンタゴニストが、ＡＭＰ−２２４である、実施態様４１に記載の方法。 
［実施態様４８］ 
ＰＤ−１軸結合アンタゴニストが、ＰＤ−Ｌ１結合アンタゴニストである、実施態様３９に記載の方法。 
［実施態様４９］ 
ＰＤＬ１結合アンタゴニストが、ＰＤＬ１のＰＤ−１との結合を阻害する、実施態様４８に記載の方法。 
［実施態様５０］ 
ＰＤ−Ｌ１結合アンタゴニストが、ＰＤ−Ｌ１のＢ７−１との結合を阻害する、実施態様４８に記載の方法。 
［実施態様５１］ 
ＰＤ−Ｌ１結合アンタゴニストが、ＰＤ−Ｌ１の、ＰＤ−１及びＢ７−１両方との結合を阻害する、実施態様４８に記載の方法。 
［実施態様５２］ 
ＰＤ−Ｌ１結合アンタゴニストが、抗ＰＤＬ−１抗体である、実施態様４８に記載の方法。 
［実施態様５３］ 
抗ＰＤＬ−１抗体が、モノクローナル抗体である、実施態様５２に記載の方法。 
［実施態様５４］ 
抗ＰＤＬ１抗体が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ及び（Ｆａｂ’）２断片からなる群から選択される抗体断片である、実施態様５２に記載の方法。 
［実施態様５５］ 
抗ＰＤＬ１抗体が、ヒト化抗体又はヒト抗体である、実施態様５２から５４の何れか一に記載の方法。 
［実施態様５６］ 
ＰＤ−Ｌ１結合アンタゴニストが、ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＭＤＸ−１１０５及びＭＥＤＩ４７３６からなる群から選択される、実施態様４８に記載の方法。 
［実施態様５７］ 
抗ＰＤ−Ｌ１抗体が、配列番号２８９のＨＶＲ−Ｈｌ配列、配列番号２９０のＨＶＲ−Ｈ２配列及び配列番号２９１のＨＶＲ−Ｈ３配列を含む重鎖並びに配列番号２９２のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号２９３のＨＶＲ−Ｌ２配列及び配列番号２９４のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む軽鎖を含む、実施態様５２に記載の方法。 
［実施態様５８］ 
抗体が、配列番号２８０又は配列番号２８１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号３８３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、実施態様５２に記載の方法。 
［実施態様５９］ 
ＰＤ−１軸結合アンタゴニストが、ＰＤ−Ｌ２結合アンタゴニストである、実施態様３９に記載の方法。 
［実施態様６０］ 
ＰＤ−Ｌ２結合アンタゴニストが、抗体である、実施態様５９に記載の方法。 
［実施態様６１］ 
ＰＤ−Ｌ２結合アンタゴニストが、イムノアドヘシンである、実施態様５９に記載の方法。 
［実施態様６２］ 
個体に、Ｔ細胞免疫グロブリンムチン３（ＴＩＭ３）アンタゴニストを投与することをさらに含む、実施態様１から６１の何れか一に記載の方法。 
［実施態様６３］ 
ＴＩＭ３アンタゴニストが、抗ＴＩＭ３抗体である、実施態様６２に記載の方法。 
［実施態様６４］ 
抗ＴＩＭ３抗体が、３７℃で１２０分後に少なくとも４５％の、ＴＩＭ３発現細胞でＴＩＭ３の内部移行を誘導し、内部移行が、ＦＡＣＳ解析によって測定される、実施態様６３に記載の方法。 
［実施態様６５］ 
抗ＴＩＭ３抗体が、以下の特性： 
ａ）ＴＩＭ３との結合について、配列番号７のＶＨ及び配列番号８のＶＬを含む抗Ｔｉｍ３抗体と競合する、 
ｂ）ヒト及びカニクイザルＴＩＭ３と結合する、 
ｃ）イムノコンジュゲートとして、ＴＩＭ３発現細胞に対して細胞傷害活性を示す、 
ｄ）インターフェロンガンマ放出を誘導する 
のうちの少なくとも１つを有する、実施態様６３に記載の方法。 
［実施態様６６］ 
抗ＴＩＭ３抗体が、 
ａ）ＴＩＭ３との結合について、配列番号７のＶＨ及び配列番号８のＶＬを含む抗Ｔｉｍ３抗体と競合し、 
ｂ）ヒト及びカニクイザルＴＩＭ３と結合し、 
ｃ）イムノコンジュゲートとして、ＴＩＭ３発現細胞に対して細胞傷害活性を示し、 
ｄ）インターフェロンガンマ放出を誘導する、 
実施態様６３に記載の方法。 
［実施態様６７］ 
抗ＴＩＭ３抗体が、モノクローナル抗体である、実施態様６３から６６の何れか一に記載の方法。 
［実施態様６８］ 
抗ＴＩＭ３抗体が、ヒト、ヒト化又はキメラ抗体である、実施態様６３から６７の何れか一に記載の方法。 
［実施態様６９］ 
抗ＴＩＭ３抗体が、ＴＩＭ３と結合する抗体断片である、実施態様６３から６８の何れか一に記載の方法。 
［実施態様７０］ 
抗ＴＩＭ３抗体が、Ｆａｂ断片である、実施態様６３から６９の何れか一に記載の方法。 
［実施態様７１］ 
Ａ）（ａ）（ｉ）配列番号３０４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３０５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２及び（ｉｉｉ）配列番号３０６から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン並びに（ｂ）（ｉ）配列番号３０７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号３０８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号３０９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は 
Ｂ）（ａ）（ｉ）配列番号３０４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３０５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２及び（ｉｉｉ）配列番号３０６から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン並びに（ｂ）（ｉ）配列番号３１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号３０８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号３０９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は 
Ｃ）（ａ）（ｉ）配列番号３０４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３０５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２及び（ｉｉｉ）配列番号３０６から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン並びに（ｂ）（ｉ）配列番号３１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号３０８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号３０９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は 
Ｄ）（ａ）（ｉ）配列番号３１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２及び（ｉｉｉ）配列番号３１８から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン並びに（ｂ）（ｉ）配列番号３１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号３２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号３２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は 
Ｅ）（ａ）（ｉ）配列番号３２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２及び（ｉｉｉ）配列番号３２６から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン並びに（ｂ）（ｉ）配列番号３２７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号３２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号３２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は 
Ｆ）（ａ）（ｉ）配列番号３３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２及び（ｉｉｉ）配列番号３３４から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン並びに（ｂ）（ｉ）配列番号３３５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号３３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号３３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は 
Ｇ）（ａ）（ｉ）配列番号３４０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３４１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２及び（ｉｉｉ）配列番号３４２から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン並びに（ｂ）（ｉ）配列番号３４３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号３４４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号３４５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は 
Ｈ）（ａ）（ｉ）配列番号３４８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３４９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２及び（ｉｉｉ）配列番号３５０から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン並びに（ｂ）（ｉ）配列番号３５１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号３５２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号３５３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は 
Ｉ）（ａ）（ｉ）配列番号３５６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３５７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２及び（ｉｉｉ）配列番号３５８から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン並びに（ｂ）（ｉ）配列番号３５９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号３６０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号３６１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は 
Ｊ）（ａ）（ｉ）配列番号３６４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３６５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２及び（ｉｉｉ）配列番号３６６から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン並びに（ｂ）（ｉ）配列番号３６７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号３６８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号３６９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン 
を含む、実施態様６３から６７の何れか一に記載の方法。 
［実施態様７２］ 
抗ＴＩＭ３抗体が、カバット番号付けのＥＵインデックスに従って突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ及びＰ３２９Ｇを有する全長ＩｇＧ１抗体である、実施態様６３から６７の何れか一に記載の方法。 
［実施態様７３］ 
抗ＴＩＭ３抗体が、国際公開第２０１１／１５５６０７号、国際公開第２０１３／００６４９０号、国際公開第０３／０６３７９２号、国際公開第２００９／０９７３９４号及び国際公開第２０１１／１５９８７７号に記載される抗体のうちいずれか１種である、実施態様６３に記載の方法。 
［実施態様７４］ 
抗ＴＩＭ３抗体が、Ｆ３８−２Ｅ２である、実施態様６３に記載の方法。 
［実施態様７５］ 
がんが、ＫＲＡＳ野生型を含有する、実施態様１から７４の何れか一に記載の方法。 
［実施態様７６］ 
がんが、活性化ＫＲＡＳ突然変異を含有する、実施態様１から７４の何れか一に記載の方法。 
［実施態様７７］ 
治療が、治療の休止後、個体における持続応答をもたらす、実施態様１から７６の何れか一に記載の方法。 
［実施態様７８］ 
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子及びＰＤ−１軸結合アンタゴニストの少なくとも一方が、継続的に投与される、実施態様１から７７の何れか一に記載の方法。 
［実施態様７９］ 
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子及びＰＤ−１軸結合アンタゴニストの少なくとも一方が、断続的に投与される、実施態様１から７７の何れか一に記載の方法。 
［実施態様８０］ 
ＰＤ−１軸結合アンタゴニストが、ＦｏｌＲ１  ＴＣＢの前に投与される、実施態様１から７７の何れか一に記載の方法。 
［実施態様８１］ 
ＰＤ−１軸結合アンタゴニストが、ＦｏｌＲ１  ＴＣＢと同時に投与される、実施態様１から７７の何れか一に記載の方法。 
［実施態様８２］ 
ＰＤ−１軸結合アンタゴニストが、ＦｏｌＲ１  ＴＣＢの後に投与される、実施態様１から７７の何れか一に記載の方法。 
［実施態様８３］ 
がんが、卵巣がん、肺がん、乳がん、腎がん、結腸直腸がん、子宮内膜がんからなる群から選択される、実施態様１から８２の何れか一に記載の方法。 
［実施態様８４］ 
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子及びＰＤ−１軸結合アンタゴニストの少なくとも一方が、静脈内に、筋肉内に、皮下に、局所に、経口的に、経皮的に、腹腔内に、眼窩内に、移植によって、吸入によって、髄腔内に、脳室内に又は鼻腔内に投与される、実施態様１から８２の何れか一に記載の方法。 
［実施態様８５］ 
個体中のＴ細胞が、組合せの投与の前に比べ、増強された活性化、増殖及び／又はエフェクター機能を有する、実施態様１から８４の何れか一に記載の方法。 
［実施態様８６］ 
個体中のＴ細胞が、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子単独の投与に比べ、増強された活性化、増殖及び／又はエフェクター機能を有する、実施態様１から８２の何れか一に記載の方法。 
［実施態様８７］ 
Ｔ細胞エフェクター機能が、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αのうちの少なくとも１種の分泌である、実施態様８５又は８６に記載の方法。 
［実施態様８８］ 
個体が、約１５％未満のＰＤ−１ｈｉ発現腫瘍浸潤Ｔ細胞を含む、実施態様１から８７の何れか一に記載の方法。 
［実施態様８９］ 
ＦｏｌＲ１陽性がんを有する個体において免疫機能を増強する方法であって、個体に、有効量の、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）及びＣＤ３に特異的なＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子並びにＰＤ−１軸結合アンタゴニストの組合せを投与することを含む方法。 
［実施態様９０］ 
個体中のＴ細胞が、組合せの投与の前に比べ、増強された活性化、増殖及び／又はエフェクター機能を有する、実施態様８９に記載の方法。 
［実施態様９１］ 
個体中のＴ細胞が、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子単独の投与に比べ、増強された活性化、増殖及び／又はエフェクター機能を有する、実施態様８９に記載の方法。 
［実施態様９２］ 
Ｔ細胞エフェクター機能が、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αのうちの少なくとも１種の分泌である、実施態様９０又は９１に記載の方法。 
［実施態様９３］ 
個体が、約１５％未満のＰＤ−１ｈｉ発現腫瘍浸潤Ｔ細胞を含む、実施態様８９から９２の何れか一に記載の方法。 
［実施態様９４］ 
葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）及びＣＤ３に特異的なＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子並びにＰＤ−１軸結合アンタゴニストの組合せを用いる治療のために患者を選択するための方法であって、ＰＤ−１発現のレベルを測定することを含み、約１５％未満のＰＤ−１ｈｉ発現Ｔ細胞を有する患者が、組合せを用いる治療のために選択される、方法。 
［実施態様９５］ 
葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）及びＣＤ３に特異的なＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子と、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子をＰＤ−１軸結合アンタゴニストとともに使用して、個体においてがんの進行を治療又は遅延するための使用説明書を含む添付文書とを含むキット。 
［実施態様９６］ 
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子をＴＩＭ３アンタゴニストとともに使用するための使用説明書をさらに含む、実施態様９５に記載のキット。 
［実施態様９７］ 
葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）及びＣＤ３に特異的なＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子並びにＰＤ−１軸結合アンタゴニストと、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子及びＰＤ−１軸結合アンタゴニストを使用して、個体においてがんの進行を治療又は遅延するための使用説明書を含む添付文書とを含むキット。 
［実施態様９８］ 
ＴＩＭ３アンタゴニストをさらに含む、実施態様９７に記載のキット。 
［実施態様９９］ 
ＰＤ−１軸結合アンタゴニストが、抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤＬ−１抗体である、実施態様９５から９８の何れか一に記載のキット。 
［実施態様１００］ 
ＰＤ−１軸結合アンタゴニストが、抗ＰＤ−１イムノアドヘシンである、実施態様９５から９８の何れか一に記載のキット。 
［実施態様１０１］ 
葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）及びＣＤ３に特異的なＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子と、ＰＤ−１軸結合アンタゴニストと、薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物。 
［実施態様１０２］ 
ＴＩＭ３アンタゴニストをさらに含む、実施態様１０１に記載の薬学的組成物。 
［実施態様１０３］ 
がんの治療のための医薬の製造における、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）及びＣＤ３に特異的なＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子並びにＰＤ−１軸結合アンタゴニストの組合せの使用。 
［実施態様１０４］ 
がんの治療のための医薬の製造における、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）及びＣＤ３に特異的なＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子並びにＰＤ−１軸結合アンタゴニスト並びにＴＩＭ３アンタゴニストの組合せの使用。 
［実施態様１０５］ 
医薬が、卵巣がん、肺がん、乳がん、腎がん、結腸直腸がん、子宮内膜がんの治療用である、実施態様１０３又は１０４に記載の使用。 
［実施態様１０６］ 
本明細書において記載される本発明。 
【外国語明細書】
2020183403000001.pdf