(57)【要約】【課題】ＣＤ３イプシロンおよびＢＣＭＡに対する二特異性抗体の提供。【解決手段】ヒトＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）の細胞外ドメイン、およびヒトＣＤ３イプシロンである、２つの標的に特異的に結合する、二価または三価の二特異性抗体であって、軽鎖およびそれぞれの重鎖内の可変ドメインＶＬおよびＶＨが、互いに置きかえられており、定常ドメインＣＬを含むことを特徴とし、１２４位におけるアミノ酸が、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈ）により独立に置換されており（Ｋａｂａｔに従う番号付け）、それぞれの定常ドメインＣＨ１内で、１４７位におけるアミノ酸および２１３位におけるアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）、またはアスパラギン酸（Ｄ）により独立に置換されている（Ｋａｂａｔに従う番号付け）二特異性抗体。また、前記抗体の製造および使用。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＣＤ３εおよびＢＣＭＡに対する新規の二特異性抗体、それらの製造および使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
ＢＣＭＡ；ＴＲ１７＿ＨＵＭＡＮ、ＴＮＦＲＳＦ１７（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｑ０２２２３）としてもまた公知の、ヒトＢ細胞成熟抗原は、分化した形質細胞内で優先的に発現する、腫瘍壊死受容体スーパーファミリーのメンバーである（Ｌａａｂｉら、１９９２年、Ｍａｄｒｙら、１９９８年）。ＢＣＭＡは、Ｂ細胞の成熟、成長、および生存に関与する、非グリコシル化ＩＩＩ型膜貫通タンパク質である。ＢＣＭＡは、ＴＮＦスーパーファミリーの２つのリガンド：ＢＣＭＡに対する高アフィニティーリガンドであるＡＰＲＩＬ（増殖誘導性リガンド）と、ＢＣＭＡに対する低アフィニティーリガンドであるＢ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）（ＴＨＡＮＫ、ＢｌｙＳ、Ｂリンパ球刺激因子、ＴＡＬＬ−１、およびｚＴＮＦ４）とに対する受容体である。ＡＰＲＩＬとＢＡＦＦとは、構造的類似性および重複を示すが、顕著に異なる受容体結合特異性も示す。また、負の調節因子ＴＡＣＩも、ＢＡＦＦおよびＡＰＲＩＬの両方に結合する。ＡＰＲＩＬおよびＢＡＦＦの、ＢＣＭＡおよび／またはＴＡＣＩへの協調した結合は、転写因子ＮＦ−κＢを活性化させ、生存促進性Ｂｃｌ−２ファミリーメンバー（例えば、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｂｃｌ−ｗ、Ｍｃｌ−１、Ａ１）の発現およびアポトーシス促進性因子（例えば、Ｂｉｄ、Ｂａｄ、Ｂｉｋ、Ｂｉｍなど）の下方調節を増大させ、こうして、アポトーシスを阻害し、生存を促進する。この作用の組合せは、Ｂ細胞の分化、増殖、生存、および抗体産生を促進する（Ｒｉｃｋｅｒｔ  ＲＣら、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ（２０１１年）、２４４巻（１号）：１１５〜１３３頁において総説されている）。
【０００３】
Ｔリンパ球のＴＣＲ／ＣＤ３複合体は、ガンマ（γ）、デルタ（δ）、イプシロン（ε）、ゼータ（ζ）、およびイータ（η）と標識されるＣＤ３の不変サブユニットと共に、細胞表面において共発現する、ＴＣＲアルファ（α）／ベータ（β）ヘテロ二量体またはＴＣＲガンマ（γ）／デルタ（δ）ヘテロ二量体からなる。ヒトＣＤ３εは、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ０７７６６（ＣＤ３Ｅ＿ＨＵＭＡＮ）下に記載されている。最先端技術において記載されている抗ＣＤ３ε抗体は、ＳＰ３４（Ｙａｎｇ  ＳＪ、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９８６年）、１３７巻：１０９７〜１１００頁）である。ＳＰ３４は、霊長動物ＣＤ３およびヒトＣＤ３のいずれとも反応する。ＳＰ３４は、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎから入手可能である。最先端技術において記載されている、さらなる抗ＣＤ３抗体は、ＵＣＨＴ−１（ＷＯ２００００４１４７４を参照されたい）である。最先端技術において記載されている、さらなる抗ＣＤ３抗体は、ＢＣ−３（Ｆｒｅｄ  Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ；ＧｖＨＤについてのフェーズＩ／ＩＩ試験において使用された；Ａｎａｓｅｔｔｉら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、５４巻：８４４頁（１９９２年））である。
【０００４】
最近では、例えば、ＩｇＧ抗体フォーマットと単鎖ドメインとの、例えば、融合によって、多種多様な組換え二特異性抗体フォーマットが開発されている（Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ＲＥ、ｍＡｂｓ、４巻：２号（２０１２年）、１〜１６頁を参照されたい）。可変ドメインＶＬおよびＶＨまたは定常ドメインＣＬおよびＣＨ１を、互いに置きかえた二特異性抗体については、ＷＯ２００９０８０２５１およびＷＯ２００９０８０２５２において記載されている。
【０００５】
誤対合副生成物の問題を回避する手法であって、「ＫＩＨ（ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ）」として公知である手法は、接触界面を修飾するように、突然変異を、ＣＨ３ドメインへと導入することにより、２つの異なる抗体重鎖の対合を強いることを目的とする。１つの鎖上では、かさ高いアミノ酸を、短い側鎖を伴うアミノ酸で置きかえ、「ホール」を創出した。逆に、大型の側鎖を伴うアミノ酸を、他のＣＨ３ドメインへと導入して、「ノブ」を創出した。これらの２つの重鎖（および両方の重鎖に対して適切でなければならない２つの同一な軽鎖）を共発現させることにより、ホモ二量体の形成（「ホール−ホール」または「ノブ−ノブ」）と対比して高収率の、ヘテロ二量体の形成（「ノブ−ホール」）が観察された（Ｒｉｄｇｗａｙ  ＪＢ、Ｐｒｅｓｔａ  ＬＧ、Ｃａｒｔｅｒ  Ｐ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．、９巻、６１７〜６２１頁（１９９６年）；およびＷＯ１９９６０２７０１１）。ファージディスプレイ手法と、ヘテロ二量体を安定化させるジスルフィド架橋の導入とを使用して、２つのＣＨ３ドメインの相互作用表面をリモデリングすることにより、ヘテロ二量体の百分率を、さらに増大させうる（Ｍｅｒｃｈａｎｔ  Ａ．  Ｍら、Ｎａｔｕｒｅ、Ｂｉｏｔｅｃｈ、１６巻（１９９８年）、６７７〜６８１頁；Ａｔｗｅｌｌ  Ｓ、Ｒｉｄｇｗａｙ  ＪＢ、Ｗｅｌｌｓ  ＪＡ、Ｃａｒｔｅｒ  Ｐ．、Ｊ  ＭｏＩ  Ｂｉｏｌ、２７０巻（１９９７年）、２６〜３５頁）。ＫＩＨ（ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ）技術のための新たな手法については、例えば、ＥＰ１８７０４５９Ａ１において記載されている。このフォーマットは、非常に魅力的であると考えられるが、現在のところ、臨床に向けた進展について記載するデータは、入手可能でない。この戦略の１つの重大な制約は、誤対合および不活性分子の形成を防止するのに、２つの親抗体の軽鎖が、同一でなければならないことである。こうして、この技法は、これらの抗体の重鎖および／または同一な軽鎖を最適化しなければならないので、第１および第２の標的に対する２つの抗体から出発して、２つの標的に対する組換え二特異性抗体を容易に開発するのには適切でない。Ｘｉｅ，Ｚ.ら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２８６巻（２０
０５年）、９５〜１０１頁は、ｓｃＦｖを、ＫＩＨ（ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ）技術と組み合わせて、ＦＣパートに使用する、二特異性抗体のフォーマットに言及している。ＷＯ２０１２１１６９２７およびＷＯ２０１０１４５７９２は、ＣＨ１とＣＬドメインとを交換することについて言及している。ＷＯ２００９０８０２５４は、二特異性抗体を作製するためのＫＩＨ（ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ）構築物について言及している。ＷＯ２００６０９３７９４は、ヘテロ二量体のタンパク質結合性組成物に関する。ＷＯ１９９９３７７９１は、多目的の抗体誘導体について記載している。Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６０巻（１９９８年）、２８０２〜２８０８頁は、可変領域ドメイン交換の、ＩｇＧの機能的特性に対する影響に言及している。
【０００６】
ＷＯ２０１３０２３６２は、ヘテロ二量体化されたポリペプチドに関する。ＷＯ２０１３１２７３３は、ヘテロ二量体のＦｃ領域を含むポリペプチドに関する。ＷＯ２０１２１３１５５５は、操作されたヘテロ二量体の免疫グロブリンに関する。ＥＰ２６４７７０７は、操作されたヘテロ二量体の免疫グロブリンに関する。ＷＯ２００９０８０２５１、ＷＯ２００９０８０２５２、ＷＯ２００９０８０２５３、ＷＯ２００９０８０２５４、およびＳｃｈａｅｆｅｒ，Ｗ．ら、ＰＮＡＳ、１０８巻（２０１１年）、１１１８７〜１１９１頁は、ドメインのクロスオーバーを伴う、二特異性の二価ＩｇＧ抗体に関する。軽鎖の誤対合を防止するように、１つの結合内にＶＨ／ＶＬの置きかえ／交換を伴う多特異性抗体（ＣｒｏｓｓＭａｂＶＨ−ＶＬ）であって、ＷＯ２００９０８０２５２（Ｓｃｈａｅｆｅｒ，Ｗ．ら、ＰＮＡＳ、１０８巻（２０１１年）、１１１８７〜１１９１頁もまた参照されたい）において記載されている多特異性抗体は、第１の抗原に対する軽鎖の、第２の抗原に対する誤った重鎖とのミスマッチにより引き起こされる副生成物を明らかに低減する（このようなドメイン交換を伴わない手法と比較して）。しかし、それらの調製物は、完全に副産物非含有というわけではない。主要な副産物は、ベンス−ジョーンズ型相互作用に基づく（Ｓｃｈａｅｆｅｒ，Ｗ．ら、PNAS、１０８巻（２０１１年）、１１１８７〜１１９１頁）。
【０００７】
ＢＣＭＡに対する抗体については、例えば、Ｇｒａｓ  Ｍ−Ｐ．ら、Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ.、７巻（１９９５年）、１０９３〜１１０６頁、ＷＯ２００１２４８１１、ＷＯ
２００１２４８１２、ＷＯ２０１０１０４９４９およびＷＯ２０１２１６３８０５において記載されている。ＢＣＭＡに対する抗体、ならびにリンパ腫および多発性骨髄腫の処置のためのそれらの使用については、例えば、ＷＯ２００２０６６５１６およびＷＯ２０１０１０４９４９において言及されている。ＷＯ２０１３１５４７６０は、ＢＣＭＡ認識部分と、Ｔ細胞活性化部分とを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に関する。
【０００８】
Ｒｙａｎ，ＭＣら、Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ.、６巻（２００７年）、３００
９〜３０１８頁は、形質細胞悪性腫瘍のための、ＢＣＭＡのターゲティングに関する。リガンド遮断活性を伴う抗体ＳＧ１は、ネイキッド抗体として、または抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）として、多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞系に対する細胞傷害作用を促進しうる。阻害性ＢＣＭＡ抗体であるＳＧ１は、核因子κＢの、ＡＰＲＩＬ依存的な活性化を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、用量依存的に遮断する。ＳＧ１の細胞傷害作用は、ＦｃγＲＩＩＩＡへの結合を増強するＦｃ突然変異を伴うおよびこれを伴わないキメラ化の後で、ネイキッド抗体として評価された。Ｒｙａｎはまた、ＡＰＲＩＬの、ＢＣＭＡへの結合を有意には阻害しない抗体であるＳＧ２についても言及している。しかし、ＳＧ２は、ＢＣＭＡ陽性骨髄腫細胞系に対する薬物コンジュゲートの細胞傷害性活性として測定されるＳＧ１よりも２０倍高いＩＣ５０値を示した。Ｒｙａｎは、ＢＣＭＡ抗体が、ＡＰＲＩＬ依存的なＮＦ−κＢの活性化の阻害、ナチュラルキラー細胞媒介型ＡＤＣＣ活性による腫瘍細胞溶解の促進、およびＡＤＣによる細胞傷害作用の誘導を含む、複数の機構を介して、骨髄腫細胞系に作用しうると結論付けている。
【０００９】
ＣＤ３およびＢＣＭＡに対する二特異性抗体については、ＷＯ２００７１１７６００、ＷＯ２００９１３２０５８、ＷＯ２０１２０６６０５８、ＷＯ２０１２１４３４９８、およびＷＯ２０１３０７２４１５において言及されている。ＰＣＴ／ＥＰ２０１４／０５２１８９およびＰＣＴ／ＥＰ２０１４／０５２１９０は、本発明でもまた開示される、ある特定のＣＤＲおよび可変ドメインを含む、ＢＣＭＡに対する抗体、ならびにＣＤ３およびＢＣＭＡに対する二特異性抗体について記載している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第２００９／０８０２５１号
【特許文献２】国際公開第２００９／０８０２５２号
【特許文献３】国際公開第１９９６／０２７０１１号
【特許文献４】欧州特許出願公開第１８７０４５９号明細書
【特許文献５】国際公開第２０１２／１１６９２７号
【特許文献６】国際公開第２０１０／１４５７９２号
【特許文献７】国際公開第２００９／０８０２５４号
【特許文献８】国際公開第２００６／０９３７９４号
【特許文献９】国際公開第１９９９／３７７９１号
【特許文献１０】国際公開第２０１３／０２３６２号
【特許文献１１】国際公開第２０１３／１２７３３号
【特許文献１２】国際公開第２０１２／１３１５５５号
【特許文献１３】欧州特許出願公開第２６４７７０７号明細書
【特許文献１４】国際公開第２００９／０８０２５３号
【特許文献１５】国際公開第２００９／０８０２５２号
【特許文献１６】国際公開第２００１／２４８１１号
【特許文献１７】国際公開第２００１／２４８１２号
【特許文献１８】国際公開第２０１０／１０４９４９号
【特許文献１９】国際公開第２０１２／１６３８０５号
【特許文献２０】国際公開第２００２／０６６５１６号
【特許文献２１】国際公開第２０１３／１５４７６０号
【特許文献２２】国際公開第２００７／１１７６００号
【特許文献２３】国際公開第２００９／１３２０５８号
【特許文献２４】国際公開第２０１２／０６６０５８号
【特許文献２５】国際公開第２０１２／１４３４９８号
【特許文献２６】国際公開第２０１３／０７２４１５号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｒｉｃｋｅｒｔ  ＲＣら、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ（２０１１年）、２４４巻（１号）：１１５〜１３３頁
【非特許文献２】Ｙａｎｇ  ＳＪ、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９８６年）、１３７巻：１０９７〜１１００頁
【非特許文献３】Ａｎａｓｅｔｔｉら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、５４巻：８４４頁（１９９２年）
【非特許文献４】Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ＲＥ、ｍＡｂｓ、４巻：２号（２０１２年）、１〜１６頁
【非特許文献５】Ｒｉｄｇｗａｙ  ＪＢ、Ｐｒｅｓｔａ  ＬＧ、Ｃａｒｔｅｒ  Ｐ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．、９巻、６１７〜６２１頁（１９９６年）
【非特許文献６】Ｍｅｒｃｈａｎｔ  Ａ．  Ｍら、Ｎａｔｕｒｅ、Ｂｉｏｔｅｃｈ、１６巻（１９９８年）、６７７〜６８１頁
【非特許文献７】Ａｔｗｅｌｌ  Ｓ、Ｒｉｄｇｗａｙ  ＪＢ、Ｗｅｌｌｓ  ＪＡ、Ｃａｒｔｅｒ  Ｐ．、Ｊ  ＭｏＩ  Ｂｉｏｌ、２７０巻（１９９７年）、２６〜３５頁
【非特許文献８】Ｘｉｅ，Ｚ.ら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２８６巻（２００５年）、９５〜１０１頁
【非特許文献９】Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６０巻（１９９８年）、２８０２〜２８０８頁
【非特許文献１０】Ｓｃｈａｅｆｅｒ，Ｗ．ら、ＰＮＡＳ、１０８巻（２０１１年）、１１１８７〜１１９１頁
【非特許文献１１】Ｇｒａｓ  Ｍ−Ｐ．ら、Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ.、７巻（１９９５年）、１０９３〜１１０６頁
【非特許文献１２】Ｒｙａｎ，ＭＣら、Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ.、６巻（２００７年）、３００９〜３０１８頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
したがって、ＶＨ／ＶＬの交換を伴う、ＣＤ３εおよびＢＣＭＡに対する二特異性抗体であって、高収率で作製することが可能であり、容易に精製されうる抗体が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
（発明の要旨）
本発明は、ヒトＢＣＭＡ（さらにまた、「ＢＣＭＡ」とも称する）の細胞外ドメイン、およびヒトＣＤ３ε（さらにまた、「ＣＤ３」とも称する）である、２つの標的に特異的に結合する、二価または三価の二特異性抗体であって、軽鎖およびそれぞれの重鎖内の可変ドメインＶＬおよびＶＨが、互いに置きかえられており、定常ドメインＣＬを含むことを特徴とし、１２４位におけるアミノ酸が、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈ）により独立に置換されており（Ｋａｂａｔに従う番号付け）、それぞれの定常ドメインＣＨ１内で、１４７位におけるアミノ酸および２１３位におけるアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）、またはアスパラギン酸（Ｄ）により独立に置換されている（Ｋａｂａｔに従う番号付け）二特異性抗体に関する。抗体は、ＣＤ３への結合について一価であることが好ましい。定常ドメインＣＬ内の１２４位におけるアミノ酸の置きかえに加えて、１２３位におけるアミノ酸も、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈ）により独立に置換されていることが好ましい。抗体は、ＣＤ３への結合について一価であり、アミノ酸１２４がＫであり、アミノ酸１４７がＥであり、アミノ酸２１３がＥであり、アミノ酸１２３がＲであることが好ましい。
【００１４】
本発明は、ヒトＢＣＭＡ（さらにまた、「ＢＣＭＡ」とも称する）の細胞外ドメイン、およびヒトＣＤ３ε（さらにまた、「ＣＤ３」とも称する）である、２つの標的に特異的に結合する二特異性抗体であって、
ａ）ＢＣＭＡに特異的に結合する第１の抗体の第１の軽鎖および第１の重鎖と；
ｂ）ＣＤ３に特異的に結合する第２の抗体の第２の軽鎖および第２の重鎖であって、第２の抗体の第２の軽鎖および第２の重鎖内の可変ドメインＶＬおよびＶＨが、互いに置きかえられている、第２の軽鎖および第２の重鎖とを含み；
ｃ）ａ）第１の軽鎖の定常ドメインＣＬ内で、１２４位におけるアミノ酸が、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈ）により独立に置換されており（Ｋａｂａｔに従う番号付け）、ａ）第１の重鎖の定常ドメインＣＨ１内で、１４７位におけるアミノ酸および２１３位におけるアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）により独立に置換されている（Ｋａｂａｔに従う番号付け）（例えば、図１Ａ、２Ａ、２Ｃ、３Ａ、３Ｃを参照されたい）こと
を特徴とする二特異性抗体に関する。
【００１５】
前出の最後の段落で記載した、前記二特異性抗体は、前記二特異性抗体がさらに、前記第１の抗体のＦａｂ断片（さらにまた、「ＢＣＭＡ−Ｆａｂ」とも称する）も含み、前記ＢＣＭＡ−Ｆａｂの定常ドメインＣＬ内で、１２４位におけるアミノ酸が、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈ）により独立に置換されており（Ｋａｂａｔに従う番号付け）、前記ＢＣＭＡ−Ｆａｂの定常ドメインＣＨ１内で、１４７位におけるアミノ酸および２１３位におけるアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）により独立に置換されている（Ｋａｂａｔに従う番号付け）こと（例えば、図２Ａ、２Ｃを参照されたい）もさらに特徴とすることが好ましい。
【００１６】
本発明はさらに、ヒトＢＣＭＡ（さらにまた、「ＢＣＭＡ」とも称する）の細胞外ドメイン、およびヒトＣＤ３ε（さらにまた、「ＣＤ３」とも称する）である、２つの標的に特異的に結合する二特異性抗体であって、
ａ）ＢＣＭＡに特異的に結合する第１の抗体の第１の軽鎖および第１の重鎖と；
ｂ）ＣＤ３に特異的に結合する第２の抗体の第２の軽鎖および第２の重鎖であって、第２の抗体の第２の軽鎖および第２の重鎖内の可変ドメインＶＬおよびＶＨが、互いに置きかえられている、第２の軽鎖および第２の重鎖とを含み；
ｃ）ｂ）第２の軽鎖の定常ドメインＣＬ内で、１２４位におけるアミノ酸が、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈ）により独立に置換されており（Ｋａｂａｔに従う番号付け）、ｂ）第２の重鎖の定常ドメインＣＨ１内で、１４７位におけるアミノ酸および２１３位におけるアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）により独立に置換されている（Ｋａｂａｔに従う番号付け）（例えば、図１Ｂ、２Ｂ、２Ｄ、３Ｂ、３Ｄを参照されたい）こと
を特徴とする二特異性抗体にも関する。
【００１７】
前出の最後の段落で記載した、前記二特異性抗体は、前記二特異性抗体がさらに、前記第１の抗体の第２のＦａｂ断片（「ＢＣＭＡ−Ｆａｂ」）を含むこと（例えば、図２Ｂ、２Ｄを参照されたい）もさらに特徴とすることが好ましい。
【００１８】
アミノ酸の番号付けは、Ｋａｂａｔに従う（下記を参照されたい）。
【００１９】
第１または第２の軽鎖の定常ドメインＣＬ内の１２４位におけるアミノ酸の置きかえに加えて、１２３位におけるアミノ酸も、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈ）により独立に置換されていることが好ましい。
【００２０】
定常ドメインＣＬ内で、１２４位におけるアミノ酸は、リシン（Ｋ）置換されており、定常ドメインＣＨ１内で、１４７位におけるアミノ酸および２１３位におけるアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）により置換されていることが好ましい。さらに、定常ドメインＣＬ内で、１２３位におけるアミノ酸は、アルギニン（Ｒ）により置換されていることが好ましい。
【００２１】
本発明の好ましい実施形態では、本発明に従う抗体は、ＣＤ３に特異的に結合する抗体の１つのＦａｂ断片（さらにまた、「ＣＤ３−Ｆａｂ」とも称する）と、ＢＣＭＡに特異的に結合する抗体の１つのＦａｂ断片（さらにまた、「ＢＣＭＡ−Ｆａｂ」とも称する）と、Ｆｃパートとからなり、ＣＤ３−ＦａｂおよびＢＣＭＡ−Ｆａｂが、それらのＣ末端を介して、前記Ｆｃパートのヒンジ領域へと連結されている。ＣＤ３−ＦａｂまたはＢＣＭＡ−Ｆａｂのいずれかは、アミノ酸置換を含み、ＣＤ３−Ｆａｂは、クロスオーバーを含む（図１Ａおよび１Ｂ）。
【００２２】
本発明の好ましい実施形態では、本発明に従う抗体は、１つのＣＤ３−Ｆａｂと、１つのＢＣＭＡ−Ｆａｂと、Ｆｃパートとからなり、ＣＤ３−ＦａｂおよびＢＣＭＡ−Ｆａｂが、それらのＣ末端を介して、前記Ｆｃパートのヒンジ領域およびそのＣ末端によりＣＤ３−ＦａｂのＮ末端へと連結された第２のＢＣＭＡ−Ｆａｂへと連結されている。ＣＤ３−Ｆａｂは、クロスオーバーを含み、ＣＤ３−Ｆａｂまたは両方のＢＣＭＡ−Ｆａｂは、アミノ酸置換を含む（図２Ａおよび２Ｂ）。ＢＣＭＡ−Ｆａｂ−Ｆｃ−ＣＤ３−Ｆａｂ−ＢＣＭＡ−Ｆａｂを含む二特異性抗体であって、両方のＢＣＭＡ−Ｆａｂが、アミノ酸置換を含み、ＣＤ３−Ｆａｂが、ＶＬ／ＶＨクロスオーバーを含む（図２Ａ）二特異性抗体が、とりわけ好ましい。ＢＣＭＡ−Ｆａｂ−Ｆｃ−ＣＤ３−Ｆａｂ−ＢＣＭＡ−Ｆａｂからなる二特異性抗体であって、両方のＢＣＭＡ−Ｆａｂが、アミノ酸置換Ｑ１２４Ｋ、Ｅ１２３Ｒ、Ｋ１４７Ｅ、およびＫ２１３Ｅを含み、ＣＤ３−Ｆａｂが、ＶＬ／ＶＨクロスオーバーを含む二特異性抗体が、とりわけ好ましい。両方のＢＣＭＡ−Ｆａｂが、ＣＤＲとして、抗体８３Ａ１０のＣＤＲ、またはＶＨ／ＶＬとして、８３Ａ１０のＶＨ／ＶＬを含むことが、とりわけ好ましい。両方のＢＣＭＡ−Ｆａｂが、ＣＤＲとして、抗体１７Ａ５のＣＤＲ、またはＶＨ／ＶＬとして、１７Ａ５のＶＨ／ＶＬを含むことが、さらに好ましい。両方のＢＣＭＡ−Ｆａｂが、ＣＤＲとして、抗体１３Ａ４のＣＤＲ、またはＶＨ／ＶＬとして、１３Ａ４のＶＨ／ＶＬを含むことが、さらに好ましい。
【００２３】
本発明の好ましい実施形態では、本発明に従う抗体は、２つのＢＣＭＡ−Ｆａｂと、Ｆｃパートとからなり、ＢＣＭＡ−Ｆａｂが、それらのＣ末端を介して、前記Ｆｃパートのヒンジ領域およびそのＣ末端により１つのＢＣＭＡ−ＦａｂのＮ末端へと連結されたＣＤ３−Ｆａｂへと連結されている。ＣＤ３−Ｆａｂは、クロスオーバーを含み、ＣＤ３−Ｆａｂまたは両方のＢＣＭＡ−Ｆａｂは、アミノ酸置換を含む（図２Ｃおよび２Ｄ）。
【００２４】
本発明の好ましい実施形態では、本発明に従う抗体は、そのＣ末端を介して前記Ｆｃパートのヒンジ領域へと連結された１つのＣＤ３−Ｆａｂと、そのＣ末端によりＣＤ３−ＦａｂのＮ末端へと連結されたＢＣＭＡ−Ｆａｂとからなる。ＣＤ３−Ｆａｂは、クロスオーバーを含み、ＣＤ３−ＦａｂまたはＢＣＭＡ−Ｆａｂのいずれかは、アミノ酸置換を含む（図３Ａおよび３Ｂ）。
【００２５】
本発明の好ましい実施形態では、本発明に従う抗体は、そのＣ末端を介して前記Ｆｃパートのヒンジ領域へと連結された１つのＢＣＭＡ−Ｆａｂと、そのＣ末端によりＢＣＭＡ−ＦａｂのＮ末端へと連結されたＣＤ３−Ｆａｂとからなる。ＣＤ３−Ｆａｂは、クロスオーバーを含み、ＣＤ３−ＦａｂまたはＢＣＭＡ−Ｆａｂのいずれかは、アミノ酸置換を含む（図３Ｃおよび３Ｄ）。
【００２６】
Ｆａｂ断片は、最先端技術に従う、適切なリンカーの使用により、一緒に化学的に連結される。（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ１）３リンカーを使用することが好ましい（Ｄｅｓｐｌａｎｃｑ  ＤＫら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ.、１９９４年８月、７巻（８号）：１０２７〜
３３頁；およびMack  M.ら、PNAS、１９９５年７月１８日、９２巻、１５号、７０２１〜７０２５頁）。２つのＦａｂ断片の間の連結は、重鎖の間で実施する。したがって、第１のＦａｂ断片のＣＨ１のＣ末端を、第２のＦａｂ断片のＶＨのＮ末端（クロスオーバーなし）、またはＶＬ（クロスオーバー）へと連結する。Ｆａｂ断片とＦｃパートとの間の連結は、本発明に従い、ＣＨ１とＣＨ２との間の連結として実施する。
【００２７】
ＢＣＭＡに特異的に結合する、抗体の第１および第２のＦａｂ断片は、同じ抗体に由来することが好ましく、ＣＤＲ配列、可変ドメイン配列ＶＨおよびＶＬ、ならびに／または定常ドメイン配列ＣＨ１およびＣＬが同一であることが好ましい。ＢＣＭＡに特異的に結合する、抗体の第１および第２のＦａｂ断片のアミノ酸配列は、同一であることが好ましい。ＢＣＭＡ抗体は、抗体８３Ａ１０、１７Ａ５、または１３Ａ４のＣＤＲ配列を含む抗体、抗体８３Ａ１０、１７Ａ５、または１３Ａ４のＶＨおよびＶＬ配列を含む抗体、または抗体８３Ａ１０、１７Ａ５、または１３Ａ４のＶＨ、ＶＬ、ＣＨ１、およびＣＬ配列を含む抗体であることが好ましい。
【００２８】
二特異性抗体は、Ｆａｂ断片およびＦｃパートとして、抗ＣＤ３抗体の１つを超えないＦａｂ断片、抗ＢＣＭＡ抗体の２つを超えないＦａｂ断片、および１つを超えないＦｃパート、好ましくは、ヒトＦｃパートを含むことが好ましい。抗ＢＣＭＡ抗体の第２のＦａｂ断片は、そのＣ末端を介して、抗ＣＤ３抗体のＦａｂ断片のＮ末端、またはＦｃパートのヒンジ領域のいずれかへと連結されていることが好ましい。連結は、ＢＣＭＡ−ＦａｂのＣＨ１とＣＤ３−ＦａｂのＶＬとの間で実施する（ＶＬ／ＶＨクロスオーバー）ことが好ましい。
【００２９】
本発明に従う抗体は、カニクイザルＢＣＭＡにもまた特異的に結合することをさらに特徴とすることが好ましい。本発明に従う、このような好ましい抗体は、ポリペプチドの、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、および配列番号４６（セット１）の、重鎖および軽鎖のセットを含むことを特徴とする抗体である。
【００３０】
ヒトＣＤ３に特異的に結合する抗体部分、好ましくは、Ｆａｂ断片は、配列番号１、２、および３の重鎖ＣＤＲを、それぞれ、抗ＣＤ３ε抗体（ＣＤＲ  ＭＡＢ  ＣＤ３）の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３として含む可変ドメインＶＨと、配列番号４、５、および６の軽鎖ＣＤＲを、それぞれ、抗ＣＤ３ε抗体（ＣＤＲ  ＭＡＢ  ＣＤ３）の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３として含む可変ドメインＶＬとを含むことを特徴とすることが好ましい。ヒトＣＤ３に特異的に結合する抗体部分は、可変ドメインが、配列番号７および８（ＶＨＶＬ  ＭＡＢ  ＣＤ３）の可変ドメインであることを特徴とすることが好ましい。
【００３１】
ヒトＢＣＭＡに特異的に結合する抗体部分、好ましくは、Ｆａｂ断片は、重鎖ＣＤＲ、配列番号２１のＣＤＲ１Ｈ、配列番号２４のＣＤＲ２Ｈ、配列番号２７のＣＤＲ３Ｈを含む可変ドメインＶＨを含むことと、軽鎖ＣＤＲ、配列番号３０のＣＤＲ１Ｌ、配列番号３３のＣＤＲ２Ｌ、配列番号３６のＣＤＲ３Ｌを含む可変ドメインＶＬを含むこととを特徴とする（ＣＤＲ  ＭＡＢ  ８３Ａ１０）ことが好ましい。ヒトＢＣＭＡに特異的に結合する抗体部分、好ましくは、Ｆａｂ断片は、重鎖ＣＤＲ、配列番号２２のＣＤＲ１Ｈ、配列番号２５のＣＤＲ２Ｈ、配列番号２８のＣＤＲ３Ｈを含む可変ドメインＶＨと、軽鎖の配列番号３１のＣＤＲ１Ｌ、配列番号３４のＣＤＲ２Ｌ、配列番号３７のＣＤＲ３Ｌを含む可変ドメインＶＬとを含むことを特徴とする（ＣＤＲ  ＭＡＢ  １７Ａ５）ことが好ましい。ヒトＢＣＭＡに特異的に結合する抗体部分、好ましくは、Ｆａｂ断片は、重鎖ＣＤＲ、配列番号２３のＣＤＲ１Ｈ、配列番号２６のＣＤＲ２Ｈ、配列番号２９のＣＤＲ３Ｈを含む可変ドメインＶＨと、軽鎖の配列番号３２のＣＤＲ１Ｌ、配列番号３５のＣＤＲ２Ｌ、配列番号３８のＣＤＲ３Ｌを含む可変ドメインＶＬとを含むことを特徴とする（ＣＤＲ
ＭＡＢ  １３Ａ４）ことが好ましい。
【００３２】
ヒトＢＣＭＡに特異的に結合する抗体部分、好ましくは、Ｆａｂ断片は、配列番号１５のＶＨと、配列番号１８のＶＬとを含むことを特徴とする（ＶＨＶＬ  ＭＡＢ  ８３Ａ１０）ことが好ましい。ヒトＢＣＭＡに特異的に結合する抗体部分、好ましくは、Ｆａｂ断片は、配列番号１６のＶＨと、配列番号１９のＶＬとを含むことを特徴とする（ＶＨＶＬ
ＭＡＢ  １７Ａ５）ことが好ましい。ヒトＢＣＭＡに特異的に結合する抗体部分、好ましくは、Ｆａｂ断片は、配列番号１７のＶＨと、配列番号２０のＶＬとを含むことを特徴とする（ＶＨＶＬ  ＭＡＢ  １３Ａ４）ことが好ましい。
【００３３】
本発明は、ヒトＢＣＭＡの細胞外ドメインおよびヒトＣＤ３εに特異的に結合する二特異性抗体であって、ポリペプチド、
ｉ）配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、および配列番号４６（セット１）、
ｉｉ）配列番号４５、配列番号４７、配列番号４８、および配列番号４９（セット２）、ならびに
ｉｉｉ）配列番号４５、配列番号５０、配列番号５１、および配列番号５２（セット３）
からなる群から選択される、重鎖および軽鎖のセットを含むことを特徴とする二特異性抗体に関する。
【００３４】
本発明に従う抗体は、抗ＢＣＭＡ抗体として、ＢＣＭＡ抗体の変異体である、１３Ａ４および８３Ａ１０の群から選択される抗体を含むことが好ましい。１３Ａ４の配列を含む本発明に従う抗体は、配列番号２９のＣＤＲ３Ｈ内の、９５位（Ｎ９５）または９６位（Ｇ９６）のそれぞれにおける、９５位における単一のアミノ酸変化である、Ｎ９５Ｓ、Ｎ９５Ｔ、Ｎ９５Ｅ、Ｎ９５Ｑ、Ｎ９５Ａ、もしくはＮ９５Ｇのいずれかによる、または９６位における単一のアミノ酸変化である、Ｇ９６Ａ、Ｇ９６Ｅ、もしくはＧ９６Ｑのいずれかによるアミノ酸の置きかえを含むことが好ましい。
【００３５】
１３Ａ４の配列を含む本発明に従う抗体は、配列番号３２のＣＤＲ１Ｌ内の、２７位（Ｎ２７ｆ）および２８位（Ｇ２８）のそれぞれにおける、２７位における単一のアミノ酸変化である、Ｎ２７ｆＳ、Ｎ２７ｆＴ、Ｎ２７ｆＥ、Ｎ２７ｆＱ、Ｎ２７ｆＡ、もしくはＮ２７ｆＧのいずれかによる、または２８位における単一のアミノ酸変化である、Ｇ２８Ａ、Ｇ２８Ｅ、もしくはＧ２８Ｑのいずれかによるアミノ酸の置きかえからなる群より選択されるアミノ酸の置きかえを含むことが好ましい。
【００３６】
１３Ａ４の配列を含む本発明に従う抗体は、配列番号２６のＣＤＲ２Ｈ内の、５４位（Ｄ５４）および５５位（Ｓ５５）のそれぞれにおける、５４位における単一のアミノ酸変化である、Ｄ５４Ｓ、Ｄ５４Ｔ、Ｄ５４Ｅ、Ｄ５４Ｑ、Ｄ５４Ａ、もしくはＤ５４Ｇのいずれかによる、または５５位における単一のアミノ酸変化である、Ｓ５５Ａ、Ｓ５５Ｅ、もしくはＳ５５Ｑのいずれかによるアミノ酸の置きかえからなる群より選択されるアミノ酸の置きかえを含むことが好ましい。
【００３７】
１３Ａ４の配列を含む本発明に従う抗体は、配列番号２３のＣＤＲ１Ｈ内の、３３位（Ｗ３３）における、Ｗ３３Ｆ、Ｗ３３Ｙ、Ｗ３３Ｖ、Ｗ３３Ｉ、Ｗ３３Ｌ、またはＷ３３Ａのいずれかによるアミノ酸Ｗの置きかえからなる群より選択されるアミノ酸の置きかえを含むことが好ましい。
【００３８】
１３Ａ４の配列を含む本発明に従う抗体は、Ｎ９５および／もしくはＷ３３における最大２つのアミノ酸の置きかえ、またはＧ９６および／もしくはＷ３３における最大２つのアミノ酸の置きかえを含むことが好ましい。１３Ａ４の配列を含む本発明に従う抗体は、Ｎ９５またはＧ９６における、１つのアミノ酸の置きかえを含むことが好ましい。
【００３９】
１３Ａ４の配列を含む本発明に従う抗体は、Ｎ９５および／もしくはＷ３３および／もしくはＮ２７、またはＧ２８および／もしくはＤ５４、またはＳ５５における最大４つのアミノ酸の置きかえ、あるいはＧ９６および／もしくはＷ３３および／もしくはＮ２７、またはＧ２８および／もしくはＤ５４、またはＳ５５における最大４つのアミノ酸の置きかえを含むことが好ましい。１３Ａ４の配列を含む本発明に従う抗体は、Ｎ９５またはＧ９６における、１つのアミノ酸の置きかえを含むことが好ましい。
【００４０】
本発明に従う抗体は、ＢＣＭＡに特異的に結合する第１の抗体の第１の軽鎖および第１の重鎖であって、前記軽鎖が、ＣＤＲとして、配列番号３５のＣＤＲ２Ｌ、配列番号３８のＣＤＲ３Ｌ、ならびに配列番号３２、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、および８７からなる群から選択されるＣＤＲ１Ｌを含み、前記重鎖が、重鎖ＣＤＲとして、配列番号２３、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、および１１７からなる群から選択されるＣＤＲ１Ｈ、配列番号２６、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、および１０５からなる群から選択されるＣＤＲ２Ｈ、配列番号２９、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、および６９からなる群から選択されるＣＤＲ３Ｈを含む、第１の軽鎖および第１の重鎖を含むことが好ましい。
【００４１】
本発明に従う抗体は、ＢＣＭＡに特異的に結合する第１の抗体の第１の軽鎖内に、配列番号２０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、および８８からなる群から選択される可変軽鎖ドメインＶＬを、ＢＣＭＡに特異的に結合する第１の抗体の第１の重鎖内に、配列番号１７、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、および１１８からなる群から選択される可変重鎖ドメインＶＨを含むことが好ましい。
【００４２】
８３Ａ１０の配列を含む本発明に従う抗体は、配列番号２７のＣＤＲ３Ｈ内の、９８位（Ｗ９８）における、Ｗ９８Ｆ、Ｗ９８Ｙ、Ｗ９８Ｖ、Ｗ９８Ｉ、Ｗ９８Ｌ、またはＷ９８Ａのいずれかによるアミノ酸の置きかえからなる群より選択されるアミノ酸の置きかえを含むことが好ましい。
【００４３】
本発明に従う抗体は、ＢＣＭＡに特異的に結合する第１の抗体の第１の軽鎖および第１の重鎖であって、前記軽鎖が、ＣＤＲとして、配列番号３０のＣＤＲ１Ｌ、配列番号３３のＣＤＲ２Ｌ、配列番号３６のＣＤＲ３Ｌを、前記重鎖が、重鎖ＣＤＲとして、配列番号２１のＣＤＲ１Ｈ、配列番号２４のＣＤＲ２Ｈ、ならびに配列番号２７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、および１２９からなる群から選択されるＣＤＲ３Ｈを含む第１の軽鎖および第１の重鎖を含むことが好ましい。
【００４４】
本発明に従う抗体は、ＢＣＭＡに特異的に結合する第１の抗体の第１の軽鎖内に、配列番号１８の可変軽鎖ドメインＶＬを、ＢＣＭＡに特異的に結合する第１の抗体の第１の重鎖内に、配列番号１５、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、および１３０からなる群から選択される可変重鎖ドメインＶＨを含むことが好ましい。
【００４５】
本発明はさらに、ＢＣＭＡの細胞外ドメインおよびＣＤ３εに特異的に結合する二特異性抗体であって、重鎖および軽鎖として、配列番号４５、５０、５１、および５２のポリペプチドを含むことを特徴とし、１つまたは複数のＣＤＲが、「ＢＣＭＡ抗体の変異体」のそれぞれのＣＤＲで置きかえられている二特異性抗体にも関する。本発明はさらに、ＢＣＭＡの細胞外ドメインおよびＣＤ３εに特異的に結合する二特異性抗体であって、重鎖および軽鎖として、配列番号４５、５０、５１、および５２のポリペプチドを含むことを特徴とし、１つまたは複数のＶＨおよび／またはＶＬが、「ＢＣＭＡ抗体の変異体」のそれぞれのＶＨおよび／またはＶＬで置きかえられている二特異性抗体にも関する。本発明はさらに、ＢＣＭＡの細胞外ドメインおよびＣＤ３εに特異的に結合する二特異性抗体であって、重鎖および軽鎖として、配列番号４３、４４、４５、および４６のポリペプチドを含むことを特徴とし、１つまたは複数のＣＤＲが、「ＢＣＭＡ抗体の変異体」のそれぞれのＣＤＲで置きかえられている二特異性抗体にも関する。本発明はさらに、ＢＣＭＡの細胞外ドメインおよびＣＤ３εに特異的に結合する二特異性抗体であって、重鎖および軽鎖として、配列番号４３、４４、４５、および４６のポリペプチドを含むことを特徴とし、１つまたは複数のＶＨおよび／またはＶＬが、「ＢＣＭＡ抗体の変異体」のそれぞれのＶＨおよび／またはＶＬで置きかえられている二特異性抗体にも関する。本発明に従う抗体は、ＢＣＭＡに対する高アフィニティーと、小さな凝集とを示すことが好ましい。
【００４６】
本発明はさらに、それぞれの重鎖および軽鎖セットをコードする核酸セットにも関する。
【００４７】
ＩｇＧ１サブクラスの定常重領域ＣＨ２／ＣＨ３を含む本発明に従う二特異性抗体は、ＦｃＲおよびＣ１ｑへの結合を回避し、ＡＤＣＣ／ＣＤＣを最小化するように、突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＰ２３９Ｇ（Ｋａｂａｔに従う番号付け）を含むことを特徴とすることが好ましい。利点は、本発明のこのような抗体が、Ｔ細胞をリダイレクションし／活性化させる強力な機構により、その腫瘍細胞殺滅の有効性を純粋に媒介することである。補体系およびＦｃＲを発現するエフェクター細胞に対する効果などのさらなる作用機構は、回避され、副作用の危険性は、低下する。
【００４８】
本発明は、配列番号４３、４７、または５０の、（Ｎ末端からＣ末端へ）ＶＨ（ＢＣＭＡ）−ＣＨ１（ＢＣＭＡ）−ＶＬ（ＣＤ３）−ＣＨ１（ＣＤ３）−ＣＨ２−ＣＨ３からなる本発明に従う抗体の重鎖のほか、それぞれのコード核酸も含むことが好ましい。これらのポリペプチドおよびそれぞれの核酸は、本発明に従う二特異性抗体を作製するために有用である。
【００４９】
本発明に従う二特異性抗体のＣＤＲの外部におけるアミノ酸（ａａ）交換は、ＢＣＭＡへの結合などの生物学的特性を変化させずに、作製／精製の大幅な改善をもたらす。本発明に従うアミノ酸交換を導入することにより、軽鎖ＬＣの誤対合および作製時における副産物の形成が有意に低減され、したがって、精製が容易になる。
【００５０】
本発明に従う抗体は、１ｍｇ／ｋｇ体重（ＢＷ）の用量で、週２回または週１回、静脈内（ｉ．ｖ．）または皮下（ｓ．ｃ．）または腹腔内（ｉ．ｐ．）投与され、好ましくは０．５ｍｇ／ｋｇ  ＢＷで、週２回または週１回、ｉ．ｖ．またはｉ．ｐ．またはｓ．ｃ．投与され、好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ  ＢＷで、週２回または週１回、ｉ．ｖ．またはｉ．ｐ．またはｓ．ｃ．投与され、好ましくは０．０５ｍｇ／ｋｇ  ＢＷで、週２回または週１回、ｉ．ｖ．またはｉ．ｐ．またはｓ．ｃ．投与され、好ましくは０．０１ｍｇ／ｋｇ  ＢＷで、週２回または週１回、ｉ．ｖ．またはｉ．ｐ．またはｓ．ｃ．投与され、好ましくは５μｇ／ｋｇ  ＢＷで、週２回または週１回、ｉ．ｖ．またはｉ．ｐ．またはｓ．ｃ．投与される、多発性骨髄腫異種移植モデル（例えば、ＮＣＩ−Ｈ９２９細胞またはＲＰＭＩ８２２６細胞またはＵ２６６Ｂ１細胞またはＬ−３６３細胞による異種移植）において、７０％を超え、好ましくは８５％を超え、好ましくは１００％に近い腫瘍成長の阻害を示すことにより特徴付けられることが好ましい。
【００５１】
本発明に従う抗体は、マウス、好ましくは、カニクイザルにおける消失半減期であって、２４時間より長い、好ましくは、３日間またはそれより長い消失半減期により特徴付けられることが好ましく、半減期は、異種移植モデルにおける、週２回または１回の投与で有効である用量について測定されることが好ましい。
【００５２】
腫瘍細胞上の標的およびＣＤ３に結合し、分子フォーマット（ｓｃＦｖ）２を有する二特異性抗体は、消失半減期が、１〜４時間と非常に短い。（ｓｃＦｖ）２二特異性ＣＤ１９×ＣＤ３抗体ブリナツモマブを用いた臨床試験では、この化合物は、患者が携行するポンプを介して、数週間および数カ月間にわたり投与しなければならなかった（Ｔｏｐｐら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ、２０１１年、２９巻（１８号）：２４９３〜８頁）。週２回または週１回のｉｖまたはｓｃ投与と比較して、ポンプを介して投与される処置は、患者にとってはるかに不都合であり、また、はるかに危険でもある（例えば、ポンプの不具合、カテーテルに関する問題）。
【００５３】
本発明に従う抗体は、ＮＣＩ−Ｈ９２９細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−９０６８（商標））への結合についてのＥＣ５０値であって、３０ｎＭまたはそれを下回る、好ましくは、１５ｎＭおよびそれを下回るＥＣ５０値を示すことを特徴とすることが好ましい。
【００５４】
本発明に従う抗体は、ヒトＴ細胞の存在下における、ＮＣＩ−Ｈ９２９腫瘍細胞のリダイレクトされた殺滅を、０．１ｎＭ未満、好ましくは、０．０５ｎＭ、好ましくは、０．０２ｎＭ、好ましくは、０．００２ｎＭおよびそれを下回るＥＣ５０で誘導するその能力により特徴付けられることが好ましい。
【００５５】
本発明に従う二特異性抗体の腫瘍細胞殺滅の効力は、臨床的に関与性の濃度のＡＰＲＩＬにより低減されないか、または低減されても最小限に限られることが好ましく、具体的には、本発明の二特異性抗体は、リダイレクトされたＴ細胞による腫瘍細胞の殺滅についてのＥＣ５０の、１００ｎｇ／ｍｌのＡＰＲＩＬの添加による変化が、４分の１未満、好ましくは、２分の１未満、好ましくは、１．５分の１未満であることを特徴とし、好ましい一実施形態では、本発明の二特異性抗体は、腫瘍細胞の殺滅についてのＥＣ５０の、１０００ｎｇ／ｍｌのＡＰＲＩＬの添加による変化が、６．５分の１未満、好ましくは、５分の１未満、好ましくは、４分の１未満、好ましくは、３分の１未満、好ましくは、２分の１未満であることを特徴とする。
【００５６】
ＡＰＲＩＬおよびＢＡＦＦは、多発性骨髄腫の発症機序において重要であることが示されている。多発性骨髄腫を患う患者は、ＡＰＲＩＬおよびＢＡＦＦの血漿濃度のばらつきが大きい。健常対象では、ＡＰＲＩＬの血漿濃度は、通例、１０ｎｇ／ｍｌまたはそれ未満である。骨髄腫患者では、ＡＰＲＩＬおよび／またはＢＡＦＦの血漿濃度は、１０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌの範囲にわたり、小さな割合の患者ではなお、最大３００ｎｇ／ｍｌおよびそれも超える（Ｍｏｒｅａｕｘら、２００４年、Ｂｌｏｏｄ、１０３巻（８号）：３１４８〜３１５７頁）。より重要なことは、ＡＰＲＩＬが、悪性骨髄腫細胞にとって重要な生存因子である、骨髄微小環境内で構成的に発現し、また、骨髄の骨髄系前駆体細胞により、主に産生および分泌されてもいることである（Ｍａｔｔｈｅｓら、Ｂｌｏｏｄ、２０１１年、１１８巻（７号）：１８３８〜１８４４頁）。こうして、この文脈では、骨髄腫患者の骨髄中のＡＰＲＩＬの濃度であって、最大１０００ｎｇ／ｍＬまたはそれをさらに超える、より甚大な大きさであることが予測される濃度の関与性が大きい。二特異性抗体の所与の臨床用量／濃度において、ＢＣＭＡ×ＣＤ３二特異性抗体によりリダイレクトされたＴ細胞による腫瘍細胞の殺滅のための濃度が、例えば、１００ｎｇ／ｍｌおよび／または１０００ｎｇ／ｍＬのＡＰＲＩＬにより、有意な高濃度へとシフトする場合（すなわち、規定されたインキュベーション時間において、同じ値の腫瘍溶解（％）を達成するのに、より高濃度のＢＣＭＡ×ＣＤ３二特異性抗体を要する場合）、血液中および／または骨髄中のＡＰＲＩＬレベルが低い患者は、治療効果を有しうるが、例えば、血液中のＡＰＲＩＬが１００ｎｇ／ｍｌであり、かつ／または骨髄中のＡＰＲＩＬが１０００ｎｇ／ｍＬである患者の、二特異性抗体による処置に対する応答は、治療効果がかなり低い、または効果がないことすらありうる。代替法は、かなりの高治療用量を使用することでありうるが、このような場合、副作用の危険性が大幅に増大する（例えば、臨床フェーズ１および２試験において、ブリナツモマブについて報告されている通り、Ｔ細胞二特異性抗体は、用量依存性副作用と関連しうる）。ＢＣＭＡ×ＣＤ３抗体と、ＡＰＲＩＬリガンドとが、ＢＣＭＡ受容体上の同じ結合性部位について競合する場合、高レベルのＡＰＲＩＬによる、ＢＣＭＡ×ＣＤ３抗体のより高い有効濃度への、このようなシフトが引き起こされる可能性がより高い。この場合、ＢＣＭＡ受容体の占有度は、競合するＡＰＲＩＬにより低減されうる。ＢＣＭＡ×ＣＤ３二特異性抗体による受容体の占有度が低度であることは、有効性が小さいことを意味する。また、ＢＡＦＦも、このようなシフトを引き起こしうるが、ＢＡＦＦの、ＢＣＭＡに対する結合アフィニティーが、ＡＰＲＩＬの、ＢＣＭＡに対する結合アフィニティーよりはるかに小さいこと（すなわち、最大１０００分の１のアフィニティー）を踏まえると、この文脈では、ＡＰＲＩＬの血漿濃度の関与性が、ＢＡＦＦの血漿濃度より大きい。
【００５７】
本発明に従う抗体は、ＢＣＭＡの天然リガンド、好ましくは、ＡＰＲＩＬによる結合と競合しないことが好ましい。
【００５８】
本発明に従う抗体は、４５０ｎｍのＯＤでのＥＬＩＳＡアッセイにおいて測定される、濃度が１０００ｎＭの前記抗体のヒトＢＣＭＡへの結合が、１４０ｎｇ／ｍｌ（６．２５ｎＭ）のマウスΔＡＰＲＩＬにより、ＡＰＲＩＬを伴わない前記結合剤／抗体のヒトＢＣＭＡへの結合と比較して、１０％を超えて低減されないことを特徴とすることが好ましい。
【００５９】
本発明に従う抗体は、４５０ｎｍのＯＤでのＥＬＩＳＡアッセイにおいて測定される、濃度が５００ｎＭの前記抗体のヒトＢＣＭＡへの結合が、１１２０ｎｇ／ｍｌ（５０ｎＭ）のΔＡＰＲＩＬにより、ＡＰＲＩＬを伴わない前記結合剤／抗体のヒトＢＣＭＡへの結合と比較して、３５％を超えて低減されず、好ましくは、１５％を超えて低減されないことを特徴とすることが好ましい。本発明に従う抗体は、４５０ｎｍのＯＤでのＥＬＩＳＡアッセイにおいて測定される、濃度が１０００ｎＭの前記結合剤／抗体の結合が、１１２０ｎｇ／ｍｌ（５０ｎＭ）のΔＡＰＲＩＬにより、ＡＰＲＩＬを伴わない前記結合剤／抗体のヒトＢＣＭＡへの結合と比較して、３５％を超えて低減されず、好ましくは、１５％を超えて低減されないことを特徴とすることが好ましい。
【００６０】
本発明に従う抗体は、濃度を２．５μｇ／ｍｌとするＡＰＲＩＬの存在下における、濃度を２００ｎＭ、好ましくは、１００ｎＭ、好ましくは、５０ｎＭ、好ましくは、５ｎＭとする前記結合剤／抗体のＮＣＩ−Ｈ９２９細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−９０６８（商標））への結合として測定される、前記抗体の、多発性骨髄腫細胞系ＮＣＩ−Ｈ９２９の細胞上のＢＣＭＡへの結合が、ＡＰＲＩＬにより、ＡＰＲＩＬを伴わない前記抗体のＮＣＩ−Ｈ９２９細胞への結合と比較して、２５％を超えて、好ましくは、２０％を超えて、好ましくは、１０％を超えて低減されないことを特徴とすることが好ましい。
【００６１】
本発明に従う抗体は、濃度を１ｎＭ、好ましくは、１００ｎＭ、好ましくは、４００ｎＭとする前記抗体が、ＡＰＲＩＬにより誘導される（ＡＰＲＩＬの濃度を１０００ｎｇ／ｍＬとする）ＮＦ−κＢの活性化を、ＡＰＲＩＬ単独と比較して、３０％を超えて変更（誘導または低減）せず、好ましくは、２０％を超えて変更せず、好ましくは、１０％を超えて変更しないこと、および／または濃度を１ｎＭ、好ましくは、１００ｎＭ、好ましくは、４００ｎＭとする前記抗体が、ＡＰＲＩＬを伴わないＮＦ−κＢの活性化を、前記抗体を伴わない場合と比較して、２０％を超えて、好ましくは、１０％を超えて、好ましくは、５％を超えて誘導しないことを特徴とすることが好ましい。
【００６２】
二特異性抗体の安定性は、実際的な条件および臨床適用の影響を受ける可能性がある。近年における抗体操作の改善にも拘らず、一部の組換えタンパク質および分子フォーマット（例えば、ｓｃＦＶ断片）は、ストレス条件下で、他の組換えタンパク質および分子フォーマットより容易に変性し、凝集物を形成する傾向がある（ＷｏｒｎおよびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、２００１年、３０５巻、９８９〜１０１０頁）。本発明に従う抗体は、標準的な製剤緩衝液中、３７℃で、好ましくは、４０℃で、１０日間、好ましくは、最長２週間、好ましくは、最長４週間保存された前記抗体が、高分子量（ＨＭＷ）分子種および／または低分子量（ＬＭＷ）分子種および／または単量体含量の、同じ製剤緩衝液中、−８０℃で同じ保存期間保存された前記抗体と比較して、１０％を超える変化（Δ）、好ましくは、５％を超える変化（Δ）を結果としてもたらさないことを特徴とすることが好ましい。
【００６３】
本発明に従う二特異性抗体は、ヒトＴ細胞の存在下において、多発性骨髄腫患者の原発性骨髄腫細胞の、リダイレクトされた殺滅を誘導するその能力により特徴付けられることが好ましい。本発明に従う二特異性抗体は、一方の重鎖のＣＨ３ドメインおよび他方の重鎖のＣＨ３ドメインの各々が、抗体のＣＨ３ドメインの間の、元の界面を含む界面において向かい合い、前記界面が、二特異性抗体の形成を促進するように変更されていることを特徴とし、変更は、
ａ）二特異性抗体内の他方の重鎖のＣＨ３ドメインの元の界面と向かい合う、一方の重鎖のＣＨ３ドメインの元の界面内で、アミノ酸残基が、より大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置きかえられ、これにより、一方の重鎖のＣＨ３ドメインの界面内に、他方の重鎖のＣＨ３ドメインの界面内の空洞にはまる突起が作出されるように、一方の重鎖のＣＨ３ドメインが変更されていることと、
ｂ）二特異性抗体内の第１のＣＨ３ドメインの元の界面と向かい合う、第２のＣＨ３ドメインの元の界面内で、アミノ酸残基が、より小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置きかえられ、これにより、第２のＣＨ３ドメインの界面内に、第１のＣＨ３ドメインの界面内の突起がはまる空洞が作出されるように、他方の重鎖のＣＨ３ドメインが変更されていることと
を特徴とすることが好ましい。
【００６４】
本発明に従う抗体は、より大きい側鎖体積を有する前記アミノ酸残基が、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）からなる群から選択されることを特徴とすることが好ましい。本発明に従う抗体は、より小さい側鎖体積を有する前記アミノ酸残基が、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）からなる群から選択されることを特徴とすることが好ましい。本発明に従う抗体は、両方のＣＨ３ドメインが、各ＣＨ３ドメインの対応する位置におけるアミノ酸としてのシステイン（Ｃ）の導入により、さらに変更されていることを特徴とすることが好ましい。本発明に従う抗体は、両方の重鎖の定常重鎖ドメインＣＨ３のうちの１つが、定常重鎖ドメインＣＨ１で置きかえられており、他の定常重鎖ドメインＣＨ３が、定常軽鎖ドメインＣＬで置きかえられていることを特徴とすることが好ましい。
【００６５】
本発明に従う抗体は、カニクイザルＢＣＭＡにもまた特異的に結合することをさらに特徴とすることが好ましい。
【００６６】
本発明のさらなる実施形態は、本発明に従う抗体のアミノ酸配列をコードする、１つまたは複数の核酸である。
【００６７】
本発明のさらなる実施形態は、本発明に従う核酸を含む発現ベクターであって、宿主細胞内で前記核酸を発現させることが可能なベクターである。
【００６８】
本発明のさらなる実施形態は、本発明に従う二特異性抗体を調製するための方法であって、
ａ）宿主細胞を、本発明に従う抗体の軽鎖および重鎖をコードする核酸分子を含むベクターで形質転換するステップと、
ｂ）宿主細胞を、前記抗体分子の合成を可能とする条件下で培養するステップと、
ｃ）前記抗体分子を、前記培養物から回収するステップと
を含む方法である。
【００６９】
本発明のさらなる実施形態は、本発明に従う抗体の軽鎖および重鎖をコードする核酸分子を含むベクターを含む宿主細胞である。
【００７０】
本発明のさらなる好ましい実施形態は、本発明に従う抗体および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物である。
【００７１】
本発明のさらなる実施形態は、本発明に従う抗体を含む診断用組成物である。
【００７２】
本発明のさらなる実施形態は、治療を必要とする患者を処置するための方法であって、患者へ、治療有効量の、本発明に従う二特異性抗体を投与するステップにより特徴付けられる方法である。
【００７３】
本発明のさらなる好ましい実施形態は、本発明に従う抗体を含む、医薬としての使用のための医薬組成物である。本発明のさらなる好ましい実施形態は、本発明に従う抗体を含む、形質細胞障害の処置における医薬としての使用のための医薬組成物である。本発明のさらなる好ましい実施形態は、本発明に従う抗体を含む、多発性骨髄腫の処置における医薬としての使用のための医薬組成物である。本発明のさらなる実施形態は、多発性骨髄腫のような形質細胞障害、またはＢＣＭＡを発現する他のＢ細胞障害の処置のための本発明に従う抗体である。多発性骨髄腫とは、骨髄コンパートメント内の、異常な形質細胞の、単クローン性の拡大および蓄積により特徴付けられるＢ細胞悪性腫瘍である。多発性骨髄腫また、同じＩｇＧ遺伝子再配列および体細胞超変異を伴う、循環クローン性Ｂ細胞も伴う。多発性骨髄腫は、意義不明の単クローン性ガンマグロブリン血症（ＭＧＵＳ）と呼ばれる、無症状性の前悪性状態であって、骨髄形質細胞の低レベルおよび単クローン性タンパク質により特徴付けられる状態から起こる。多発性骨髄腫細胞は、低速度で増殖する。多発性骨髄腫は、複数の構造的染色体変化（例えば、不均衡型転座）の進行性の発生から生じる。多発性骨髄腫は、悪性形質細胞と、骨髄微小環境（例えば、正常な骨髄間質細胞）との交互的な相互作用を伴う。活動性の多発性骨髄腫の臨床徴候は、単クローン性の抗体スパイク、形質細胞の過密な骨髄、溶解性骨病変、および破骨細胞の過剰刺激から生じる骨破壊（ＤｉｍｏｐｕｌｏｓおよびＴｅｒｐｏｓ、Ａｎｎ  Ｏｎｃｏｌ、２０１０年、２１巻、増刊７号：ｖｉｉ１４３〜１５０頁）を含む。形質細胞を伴う別のＢ細胞障害、すなわち、ＢＣＭＡを発現する別のＢ細胞障害は、ループスとしてもまた公知の、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）である。ＳＬＥとは、体内の任意のパートに影響を及ぼす可能性があり、免疫系が身体自身の細胞および組織を攻撃することにより表され、その結果として、慢性炎症および組織損傷がもたらされる、全身性の自己免疫疾患である。ＳＬＥは、抗体−免疫複合体が、さらなる免疫応答を誘起し、これを引き起こす、ＩＩＩ型過敏反応である（ＩｎａｋｉおよびＬｅｅ、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ、２０１０年；６巻：３２６〜３３７頁）。本発明のさらなる好ましい実施形態は、本発明に従う抗体を含む、全身性エリテマトーデスの処置における医薬としての使用のための医薬組成物である。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
ヒトＢ細胞成熟抗原（さらにまた、「ＢＣＭＡ」とも称する）の細胞外ドメイン、およびヒトＣＤ３ε（さらにまた、「ＣＤ３」とも称する）である、２つの標的に特異的に結合する、二価または三価の二特異性抗体であって、軽鎖およびそれぞれの重鎖内の可変ドメインＶＬおよびＶＨが、互いに置きかえられており、定常ドメインＣＬを含むことを特徴とし、１２４位におけるアミノ酸が、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈ）により独立に置換されており（Ｋａｂａｔに従う番号付け）、それぞれの定常ドメインＣＨ１内で、１４７位におけるアミノ酸および２１３位におけるアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）、またはアスパラギン酸（Ｄ）により独立に置換されている（Ｋａｂａｔに従う番号付け）二特異性抗体。
（項目２）
ヒトＢＣＭＡの細胞外ドメイン、およびヒトＣＤ３である、２つの標的に特異的に結合する二特異性抗体であって、
ａ）ＢＣＭＡに特異的に結合する第１の抗体の第１の軽鎖および第１の重鎖と；
ｂ）ＣＤ３に特異的に結合する第２の抗体の第２の軽鎖および第２の重鎖であって、前記第２の抗体の前記第２の軽鎖および第２の重鎖内の可変ドメインＶＬおよびＶＨが、互いに置きかえられている、第２の軽鎖および第２の重鎖とを含み；
ｃ）ａ）前記第１の軽鎖の定常ドメインＣＬ内で、１２４位におけるアミノ酸が、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈ）により独立に置換されており（Ｋａｂａｔに従う番号付け）、ａ）前記第１の重鎖の定常ドメインＣＨ１内で、１４７位におけるアミノ酸および２１３位におけるアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）により独立に置換されている（Ｋａｂａｔに従う番号付け）こと
を特徴とする二特異性抗体。
（項目３）
ヒトＢＣＭＡの細胞外ドメイン、およびヒトＣＤ３である、２つの標的に特異的に結合する二特異性抗体であって、
ａ）ＢＣＭＡに特異的に結合する第１の抗体の第１の軽鎖および第１の重鎖と；
ｂ）ＣＤ３に特異的に結合する第２の抗体の第２の軽鎖および第２の重鎖であって、前記第２の抗体の前記第２の軽鎖および第２の重鎖内の可変ドメインＶＬおよびＶＨが、互いに置きかえられている、第２の軽鎖および第２の重鎖とを含み；
ｃ）ｂ）下にある前記第２の軽鎖の定常ドメインＣＬ内で、１２４位におけるアミノ酸が、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈ）により独立に置換されており（Ｋａｂａｔに従う番号付け）、ｂ）下にある前記第２の重鎖の定常ドメインＣＨ１内で、１４７位におけるアミノ酸および２１３位におけるアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）により独立に置換されている（Ｋａｂａｔに従う番号付け）こと
を特徴とする二特異性抗体。
（項目４）
さらに、前記第１の抗体のＦａｂ断片（さらにまた、「ＢＣＭＡ−Ｆａｂ」とも称する）も含み、前記ＢＣＭＡ−Ｆａｂの定常ドメインＣＬ内で、１２４位におけるアミノ酸が、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈ）により独立に置換されており（Ｋａｂａｔに従う番号付け）、前記ＢＣＭＡ−Ｆａｂの定常ドメインＣＨ１内で、１４７位におけるアミノ酸および２１３位におけるアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）により独立に置換されている（Ｋａｂａｔに従う番号付け）こと
を特徴とする、項目２に記載の二特異性抗体。
（項目５）
さらに、前記第１の抗体の第２のＦａｂ断片（「ＢＣＭＡ−Ｆａｂ」）を含むことを特徴とする、項目３に記載の二特異性抗体。
（項目６）
前記定常ドメインＣＬ内の１２４位におけるアミノ酸の置きかえに加えて、１２３位におけるアミノ酸も、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈ）により独立に置換されていることを特徴とする、項目１から５のいずれか一項に記載の二特異性抗体。
（項目７）
アミノ酸１２４がＫであり、アミノ酸１４７がＥであり、アミノ酸２１３がＥであり、アミノ酸１２３がＲであることを特徴とする、項目１から６のいずれか一項に記載の二特異性抗体。
（項目８）
ヒトＢＣＭＡの細胞外ドメインおよびヒトＣＤ３に特異的に結合する二特異性抗体であって、ポリペプチド、
ｉ）配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、および配列番号４６（セット１）、
ｉｉ）配列番号４５、配列番号４７、配列番号４８、および配列番号４９（セット２）、ならびに
ｉｉｉ）配列番号４５、配列番号５０、配列番号５１、および配列番号５２（セット３）
からなる群から選択される、重鎖および軽鎖のセットを含むことを特徴とする二特異性抗体。
（項目９）
ヒトＣＤ３に特異的に結合する抗体部分内で、配列番号１、２、および３の重鎖ＣＤＲを、それぞれ、抗ＣＤ３ε抗体の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３として含む可変ドメインＶＨにより、可変ドメインＶＨが置きかえられ、配列番号４、５、および６の軽鎖ＣＤＲを、それぞれ、抗ＣＤ３ε抗体の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３として含む可変ドメインＶＬにより、可変ドメインＶＬが置きかえられることを特徴とする、項目８に記載の抗体。
（項目１０）
一方の重鎖のＣＨ３ドメインおよび他方の重鎖のＣＨ３ドメインの各々が、抗体のＣＨ３ドメインの間の、元の界面を含む界面において向かい合い、前記界面が、前記二特異性抗体の形成を促進するように変更されていることを特徴とし、前記変更が、
ａ）前記二特異性抗体内の前記他方の重鎖のＣＨ３ドメインの前記元の界面と向かい合う、一方の重鎖のＣＨ３ドメインの前記元の界面内で、アミノ酸残基が、より大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置きかえられ、これにより、一方の重鎖のＣＨ３ドメインの前記界面内に、前記他方の重鎖のＣＨ３ドメインの前記界面内の空洞にはまる突起が作出されるように、一方の重鎖のＣＨ３ドメインが変更されていることと、
ｂ）前記二特異性抗体内の前記第１のＣＨ３ドメインの前記元の界面と向かい合う、前記第２のＣＨ３ドメインの前記元の界面内で、アミノ酸残基が、より小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置きかえられ、これにより、前記第２のＣＨ３ドメインの前記界面内に、前記第１のＣＨ３ドメインの前記界面内の突起がはまる空洞が作出されるように、前記他方の重鎖のＣＨ３ドメインが変更されていることと
を特徴とする、項目１から７のいずれか一項に記載の抗体。
（項目１１）
項目１から１０のいずれか一項に記載の二特異性抗体を調製するための方法であって、
ａ）宿主細胞を、項目１から１０のいずれか一項に記載の抗体の軽鎖および重鎖をコードする核酸分子を含むベクターで形質転換するステップと、
ｂ）前記宿主細胞を、前記抗体分子の合成を可能とする条件下で培養するステップと、
ｃ）前記抗体分子を、前記培養物から回収するステップと
を含む方法。
（項目１２）
項目１から１０のいずれか一項に記載の抗体の軽鎖および重鎖をコードする核酸分子
を含むベクターを含む宿主細胞。
（項目１３）
項目１から１０のいずれか一項に記載の抗体および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
（項目１４）
医薬としての使用のための、項目１から１０のいずれか一項に記載の抗体、または項目１３に記載の医薬組成物。
（項目１５）
多発性骨髄腫のような形質細胞障害の処置における医薬としての使用のための、項目１から１０のいずれか一項に記載の抗体、または項目１３に記載の医薬組成物。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】図１は、Ｆａｂ断片（ＣＤ３およびＢＣＭＡに対して特異的である）およびＦｃパートだけを含む、（Ａ）Ｆａｂ  ＢＣＭＡ（ＲＫ／ＥＥ）−Ｆｃ−Ｆａｂ  ＣＤ３；（Ｂ）Ｆａｂ  ＢＣＭＡ−Ｆｃ−Ｆａｂ  ＣＤ３（ＲＫ／ＥＥ）として明記される二特異性二価抗体を示す図である。ＲＫ／ＥＥに対するアミノ酸置換は、作製におけるＬＣ誤対合／副産物を低減するように、ＣＬ−ＣＨ１に導入される。Ｆａｂ  ＣＤ３は、ＬＣ誤対合および副産物を低減するように、ＶＬ−ＶＨクロスオーバーを含む。
【図２】図２は、Ｆａｂ断片（ＣＤ３およびＢＣＭＡに対して特異的である）およびＦｃパートだけを含む、（Ａ）Ｆａｂ  ＢＣＭＡ（ＲＫ／ＥＥ）−Ｆｃ−Ｆａｂ  ＣＤ３−Ｆａｂ  ＢＣＭＡ（ＲＫ／ＥＥ）；（Ｂ）Ｆａｂ  ＢＣＭＡ−Ｆｃ−Ｆａｂ  ＣＤ３（ＲＫ／ＥＥ）−Ｆａｂ  ＢＣＭＡ；（Ｃ）Ｆａｂ  ＢＣＭＡ（ＲＫ／ＥＥ）−Ｆｃ−Ｆａｂ  ＢＣＭＡ（ＲＫ／ＥＥ）−Ｆａｂ  ＣＤ３；（Ｄ）Ｆａｂ  ＢＣＭＡ−Ｆｃ−Ｆａｂ  ＢＣＭＡ−Ｆａｂ  ＣＤ３（ＲＫ／ＥＥ）として明記される好ましい二特異性三価抗体を示す図である。ＲＫ／ＥＥに対するアミノ酸置換は、作製におけるＬＣ誤対合／副産物を低減するように、ＣＬ−ＣＨ１に導入される。Ｆａｂ  ＣＤ３は、ＬＣ誤対合および副産物を低減するように、ＶＬ−ＶＨクロスオーバーを含むことが好ましい。Ｆａｂ  ＣＤ３と、Ｆａｂ  ＢＣＭＡとは、可撓性のリンカーにより、互いに連結されることが好ましい。
【図３】図３は、Ｆａｂ断片（ＣＤ３およびＢＣＭＡに対して特異的である）およびＦｃパートだけを含む、（Ａ）Ｆｃ−Ｆａｂ  ＣＤ３−Ｆａｂ  ＢＣＭＡ（ＲＫ／ＥＥ）；（Ｂ）Ｆｃ−Ｆａｂ  ＣＤ３（ＲＫ／ＥＥ）−Ｆａｂ  ＢＣＭＡ；（Ｃ）Ｆｃ−Ｆａｂ  ＢＣＭＡ（ＲＫ／ＥＥ）−Ｆａｂ  ＣＤ３；（Ｄ）Ｆｃ−Ｆａｂ  ＢＣＭＡ−Ｆａｂ  ＣＤ３（ＲＫ／ＥＥ）として明記される二特異性二価抗体を示す図である。Ｆａｂ  ＣＤ３は、ＬＣ誤対合および副産物を低減するように、ＶＬ−ＶＨクロスオーバーを含むことが好ましい。Ｆａｂ  ＣＤ３と、Ｆａｂ  ＢＣＭＡとは、可撓性のリンカーにより、互いに連結されることが好ましい。
【図４】図４は、ＢＣＭＡ陽性多発性骨髄腫細胞上の、抗ＢＣＭＡ抗体の結合を示す図である。抗ＢＣＭＡ抗体濃度（０．２〜４０μｇ／ｍＬ）の関数としてプロットされた、抗ＢＣＭＡ  ＩｇＧクローンについての平均蛍光強度、（Ａ）Ｈ９２９細胞上のクローン１７Ａ５および８３Ａ１０、（Ｂ）ＭＫＮ４５細胞上のクローン１７Ａ５、８３Ａ１０、（Ｃ）Ｈ９２９細胞上のクローン１３Ａ４、（Ｄ）ＭＫＮ４５細胞上のクローン１３Ａ４（実施例４を参照されたい）。
【図５】図５は、競合ＥＬＩＳＡを示す図である。ある濃度範囲のマウスＡＰＲＩＬ（１．５６〜１００ｎＭ）の存在下における、５００または１０００ｎＭの飽和濃度の、選択された抗ＢＣＭＡ  Ｆａｂクローン（１７Ａ５、８３Ａ１０、および１３Ａ４）の、固定化されたヒトＢＣＭＡへの結合についてのＥＬＩＳＡ結果を示す。非競合の場合、濃度範囲にわたるアッセイのばらつきの中で、シグナルは、一定を保ち、マウスＡＰＲＩＬの存在下におけるシグナルは、マウスＡＰＲＩＬを添加していない対照ウェルからのシグナルと同等であった。競合の場合、濃度依存的なシグナルの低減が測定された（実施例５ａを参照されたい）。
【図６】図６は、ＦＡＣＳにより、Ｈ９２９細胞内の結合の競合を示す図である。フローサイトメトリーにより検出される、マウスΔ−ＡＰＲＩＬの、抗ＢＣＭＡ抗体との競合。１０００ｎｇ／ｍＬの濃度で使用され、Ｈ９２９細胞上の抗ＢＣＭＡ抗体クローン８３Ａ１０、１７Ａ５、および１３Ａ４の濃度（１および１６μｇ／ｍＬ）の関数として検出されるΔ−ＡＰＲＩＬの相対蛍光強度中央値（ＦＩＴＣシグナル）。アイソタイプ対照の存在下における、Δ−ＡＰＲＩＬの結合時における蛍光強度中央値を１とし、他のシグナルは、これに対して標準化した。抗ＢＣＭＡ抗体の存在下における、ＡＰＲＩＬの、ＢＣＭＡ陽性Ｈ９２９細胞への結合の検出は、抗ＨＡ蛍光色素コンジュゲート抗体を介して測定した（実施例５ｂを参照されたい）。
【図７】図７は、ＦＡＣＳにより、ＲＰＭＩ−８２２６細胞上の結合の競合を示す図である。フローサイトメトリーにより検出される、抗ＢＣＭＡ抗体の、Δ−ＡＰＲＩＬとの競合。１０００ｎｇ／ｍＬのΔ−ＡＰＲＩＬの非存在下または存在下において、ＲＰＭＩ−８２２６細胞上で検出される抗ＢＣＭＡ抗体のクローン１３Ａ４、１７Ａ５、８３Ａ１０に対して４０μｇ／ｍＬの濃度で使用される、抗ＢＣＭＡ抗体の相対蛍光強度中央値（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７シグナル）である。Δ−ＡＰＲＩＬの非存在下における、抗ＢＣＭＡ抗体の結合時における蛍光強度中央値を１とし、Δ−ＡＰＲＩＬの存在下における、抗ＢＣＭＡ抗体のそれぞれに対する他のシグナルは、これに対して標準化した。Δ−ＡＰＲＩＬの存在下における、抗ＢＣＭＡ抗体の、ＢＣＭＡ陽性ＲＰＭＩ−８２２６細胞への結合の検出は、抗ヒトＦｃ蛍光色素コンジュゲート抗体を介して測定した（実施例５ｃを参照されたい）。
【図８】図８は、フローサイトメトリーにより検出される、同時的なインキュベーションの後における、Ｈ９２９細胞内の、抗ＢＣＭＡ抗体の、Δ−ＡＰＲＩＬとの競合を示す図である。（Ａ）２．５μｇ／ｍＬのΔ−ＡＰＲＩＬの存在下または非存在下における、２０μｇ／ｍＬの濃度の抗ＢＣＭＡ抗体クローン１３Ａ４、１７Ａ５、８３Ａ１０についての、蛍光強度中央値および相対蛍光シグナル（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７シグナル）、または（Ｂ）濃度を、２．５μｇ／ｍＬのΔ−ＡＰＲＩＬおよび抗ＢＣＭＡ抗体クローン８３Ａ１０（２０μｇ／ｍＬ）とするときの、Δ−ＡＰＲＩＬについての、平均蛍光強度および相対蛍光シグナル（ＦＩＴＣシグナル）（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７シグナル）を測定した。Δ−ＡＰＲＩＬの存在下における抗ＢＣＭＡ抗体の、ＦＩＴＣコンジュゲート抗ヒトＦｃ抗体による検出は、Δ−ＡＰＲＩＬの非存在下における、抗ＢＣＭＡ抗体クローンのシグナルに対して標準化した。抗ＢＣＭＡ抗体クローンの存在下におけるΔ−ＡＰＲＩＬの、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７コンジュゲート抗ＨＡ抗体による検出は、アイソタイプ対照の存在下における、Δ−ＡＰＲＩＬシグナルに対して標準化した（実施例５ｄを参照されたい）。
【図９】図９は、化学発光ＥＬＩＳＡベースのアッセイにより検出された、ＡＰＲＩＬの非存在下の、Ｈ９２９細胞への結合時における、抗ＢＣＭＡ抗体の、ＮＦ−κＢの活性化に対する効果を示す図である。化学発光ＥＬＩＳＡベースのアッセイを使用して、抗ＢＣＭＡ抗体（１７Ａ５、８３Ａ１０）およびアイソタイプ対照抗体の、ＢＣＭＡを発現するＨ９２９細胞への結合時における、ＮＦ−κＢの活性化の検出を測定した（実施例６を参照されたい）。
【図１０】図１０は、電荷変異体を伴わない８３Ａ１０−ＴＣＢの作製および精製を、電荷変異体を伴う８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖと対比して示す図である。８３Ａ１０−ＴＣＢ抗体および８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ抗体のための、異なる精製法の後における、ＣＥ−ＳＤＳ（非還元）による、最終タンパク質調製物についてのグラフ。８３Ａ１０−ＴＣＢ抗体へと適用された、プロテインＡ（ＰＡ）アフィニティークロマトグラフィーおよびサイズ除外クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による精製ステップ（Ａ）。（Ｂ）（Ａ）における最終タンパク質調製物へと適用された、さらなる精製ステップ：カチオン交換クロマトグラフィー（ｃＩＥＸ）ステップおよび最終的なサイズ除外クロマトグラフィー（ｒｅ−ＳＥＣ）ステップ。（Ｃ）ＰＡ＋ｃＩＥＸ＋ＳＥＣ精製ステップの後における、８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ抗体。８３Ａ１０−ＴＣＢ分子および８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ分子のいずれも、図２ａに記載されている分子フォーマットの分子である（実施例８を参照されたい）。
【図１１Ａ−Ｂ】図１１は、一対一の比較研究：電荷変異体を伴わない８３Ａ１０−ＴＣＢの作製を、電荷変異体を伴う８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖと対比して示す図である。８３Ａ１０−ＴＣＢ抗体および８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ抗体の特性（例えば、純度、収率、単量体含量）を、並行して測定し、各精製ステップ：１）ＰＡアフィニティークロマトグラフィーだけ（Ａ、Ｂ）、２）ＰＡアフィニティークロマトグラフィー、次いで、ＳＥＣ（Ｃ、Ｄ）、ならびに３）ＰＡアフィニティークロマトグラフィー、次いで、ＳＥＣ、次いで、ｃＩＥＸおよびｒｅ−ＳＥＣ（Ｅ、Ｆ）の後で比較した。８３Ａ１０−ＴＣＢ抗体および８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ抗体のための、それぞれの精製法の後における、ＣＥ−ＳＤＳ（非還元）による、最終タンパク質溶液についてのグラフ。（Ａ）８３Ａ１０−ＴＣＢ抗体へと適用されたＰＡアフィニティークロマトグラフィーによる精製ステップ。（Ｂ）８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ抗体へと適用されたＰＡアフィニティークロマトグラフィーによる精製ステップ。（Ｃ）８３Ａ１０−ＴＣＢ抗体へと適用された、ＰＡアフィニティークロマトグラフィー＋ＳＥＣ精製ステップ。（Ｄ）８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ抗体へと適用された、ＰＡアフィニティークロマトグラフィー＋ＳＥＣ精製ステップ。（Ｅ）８３Ａ１０−ＴＣＢ抗体へと適用された、ＰＡアフィニティークロマトグラフィー±ＳＥＣ＋ｃＩＥＸ＋ＳＥＣ精製ステップ。（Ｆ）８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ抗体へと適用された、ＰＡアフィニティークロマトグラフィー±ＳＥＣ＋ｃＩＥＸ＋ＳＥＣ精製ステップ。純度、収率、単量体含量を測定した。液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）により検出された、適正な分子の百分率（実施例８を参照されたい）。
【図１１Ｃ−Ｄ】図１１は、一対一の比較研究：電荷変異体を伴わない８３Ａ１０−ＴＣＢの作製を、電荷変異体を伴う８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖと対比して示す図である。８３Ａ１０−ＴＣＢ抗体および８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ抗体の特性（例えば、純度、収率、単量体含量）を、並行して測定し、各精製ステップ：１）ＰＡアフィニティークロマトグラフィーだけ（Ａ、Ｂ）、２）ＰＡアフィニティークロマトグラフィー、次いで、ＳＥＣ（Ｃ、Ｄ）、ならびに３）ＰＡアフィニティークロマトグラフィー、次いで、ＳＥＣ、次いで、ｃＩＥＸおよびｒｅ−ＳＥＣ（Ｅ、Ｆ）の後で比較した。８３Ａ１０−ＴＣＢ抗体および８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ抗体のための、それぞれの精製法の後における、ＣＥ−ＳＤＳ（非還元）による、最終タンパク質溶液についてのグラフ。（Ａ）８３Ａ１０−ＴＣＢ抗体へと適用されたＰＡアフィニティークロマトグラフィーによる精製ステップ。（Ｂ）８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ抗体へと適用されたＰＡアフィニティークロマトグラフィーによる精製ステップ。（Ｃ）８３Ａ１０−ＴＣＢ抗体へと適用された、ＰＡアフィニティークロマトグラフィー＋ＳＥＣ精製ステップ。（Ｄ）８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ抗体へと適用された、ＰＡアフィニティークロマトグラフィー＋ＳＥＣ精製ステップ。（Ｅ）８３Ａ１０−ＴＣＢ抗体へと適用された、ＰＡアフィニティークロマトグラフィー±ＳＥＣ＋ｃＩＥＸ＋ＳＥＣ精製ステップ。（Ｆ）８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ抗体へと適用された、ＰＡアフィニティークロマトグラフィー±ＳＥＣ＋ｃＩＥＸ＋ＳＥＣ精製ステップ。純度、収率、単量体含量を測定した。液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）により検出された、適正な分子の百分率（実施例８を参照されたい）。
【図１１Ｅ−Ｆ】図１１は、一対一の比較研究：電荷変異体を伴わない８３Ａ１０−ＴＣＢの作製を、電荷変異体を伴う８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖと対比して示す図である。８３Ａ１０−ＴＣＢ抗体および８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ抗体の特性（例えば、純度、収率、単量体含量）を、並行して測定し、各精製ステップ：１）ＰＡアフィニティークロマトグラフィーだけ（Ａ、Ｂ）、２）ＰＡアフィニティークロマトグラフィー、次いで、ＳＥＣ（Ｃ、Ｄ）、ならびに３）ＰＡアフィニティークロマトグラフィー、次いで、ＳＥＣ、次いで、ｃＩＥＸおよびｒｅ−ＳＥＣ（Ｅ、Ｆ）の後で比較した。８３Ａ１０−ＴＣＢ抗体および８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ抗体のための、それぞれの精製法の後における、ＣＥ−ＳＤＳ（非還元）による、最終タンパク質溶液についてのグラフ。（Ａ）８３Ａ１０−ＴＣＢ抗体へと適用されたＰＡアフィニティークロマトグラフィーによる精製ステップ。（Ｂ）８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ抗体へと適用されたＰＡアフィニティークロマトグラフィーによる精製ステップ。（Ｃ）８３Ａ１０−ＴＣＢ抗体へと適用された、ＰＡアフィニティークロマトグラフィー＋ＳＥＣ精製ステップ。（Ｄ）８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ抗体へと適用された、ＰＡアフィニティークロマトグラフィー＋ＳＥＣ精製ステップ。（Ｅ）８３Ａ１０−ＴＣＢ抗体へと適用された、ＰＡアフィニティークロマトグラフィー±ＳＥＣ＋ｃＩＥＸ＋ＳＥＣ精製ステップ。（Ｆ）８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ抗体へと適用された、ＰＡアフィニティークロマトグラフィー±ＳＥＣ＋ｃＩＥＸ＋ＳＥＣ精製ステップ。純度、収率、単量体含量を測定した。液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）により検出された、適正な分子の百分率（実施例８を参照されたい）。
【図１２】図１２は、フローサイトメトリーにより検出された、マウスＢＣＭＡを発現するＨＥＫ細胞（Ａ）およびカニクイザルＢＣＭＡを発現するＨＥＫ細胞（Ｂ）上の抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３−ＴＣＢ抗体の結合を示す図である（実施例１０を参照されたい）。
【図１３Ａ】図１３は、ＢＣＭＡ陽性Ｈ９２９細胞上の、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３−ＴＣＢｃｖ抗体の結合を、フローサイトメトリーにより示す図である。抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体についての平均蛍光強度を、抗体濃度の関数としてプロットした、（Ａ）Ｈ９２９細胞およびＭＫＮ４５細胞上の８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ、（Ｂ）Ｈ９２９細胞およびＭＫＮ４５細胞上の１７Ａ５−ＴＣＢｃｖ（実施例１１を参照されたい）。
【図１３Ｂ】図１３は、ＢＣＭＡ陽性Ｈ９２９細胞上の、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３−ＴＣＢｃｖ抗体の結合を、フローサイトメトリーにより示す図である。抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体についての平均蛍光強度を、抗体濃度の関数としてプロットした、（Ａ）Ｈ９２９細胞およびＭＫＮ４５細胞上の８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ、（Ｂ）Ｈ９２９細胞およびＭＫＮ４５細胞上の１７Ａ５−ＴＣＢｃｖ（実施例１１を参照されたい）。
【図１４Ａ】図１４は、フローサイトメトリーにより測定された、ＣＤ３陽性Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞上の、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３−ＴＣＢｃｖ抗体の結合を示す図である。抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体（８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ（Ａ）；１７Ａ５−ＴＣＢｃｖ（Ｂ））の、Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞への結合についての蛍光強度中央値であり、抗体の濃度の関数としてプロットした。ＢＣＭＡ陰性およびＣＤ３陰性ＭＫＮ４５細胞への結合なし（実施例１２を参照されたい）。
【図１４Ｂ】図１４は、フローサイトメトリーにより測定された、ＣＤ３陽性Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞上の、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３−ＴＣＢｃｖ抗体の結合を示す図である。抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体（８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ（Ａ）；１７Ａ５−ＴＣＢｃｖ（Ｂ））の、Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞への結合についての蛍光強度中央値であり、抗体の濃度の関数としてプロットした。ＢＣＭＡ陰性およびＣＤ３陰性ＭＫＮ４５細胞への結合なし（実施例１２を参照されたい）。
【図１５】図１５は、ホスホフローサイトメトリーにより検出された、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３−ＴＣＢｃｖ抗体の、ＡＰＲＩＬにより誘導されるＮＦ−κＢの活性化に対する効果を示す図である。（Ａ）Ｈ９２９細胞内の、ＡＰＲＩＬと競合しない８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖの、ＡＰＲＩＬ（１０００ｎｇ／ｍＬ）に媒介されるＮＦ−κＢの活性化に対する、ＡＰＲＩＬと競合するＪ６Ｍ０−ＴＣＢと比較した効果。（Ｂ）Ｈ９２９細胞内の、ＡＰＲＩＬと競合しない８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖの、ＡＰＲＩＬ（５０００ｎｇ／ｍＬの飽和濃度）に媒介されるＮＦ−κＢの活性化に対する、ＡＰＲＩＬと競合するＪ６Ｍ０−ＴＣＢと比較した効果。ホスホフローサイトメトリーによる、細胞内リン酸化ＮＦ−κＢの検出（実施例１３を参照されたい）。
【図１６】図１６は、ホスホフローサイトメトリーにより検出された、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３−ＴＣＢｃｖ抗体の、ＡＰＲＩＬの非存在下における、Ｈ９２９細胞内の、ＮＦ−κＢの活性化に対する効果を示す図である。（Ａ）ＡＰＲＩＬの非存在下における、Ｈ９２９細胞内の、ＡＰＲＩＬと競合しない８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖの、ＮＦ−κＢの活性化に対する効果（実験１）。（Ｂ）ＡＰＲＩＬの非存在下における、Ｈ９２９細胞内の、ＡＰＲＩＬと競合しない８３Ａ１０−ＴＣＢの、ＮＦ−κＢの活性化に対する効果（実験２）。ホスホフローサイトメトリーによる、細胞内リン酸化ＮＦ−κＢの検出（実施例１４を参照されたい）。
【図１７】図１７は、フローサイトメトリーにより検出された、Ｈ９２９細胞の存在下において、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  ＴＣＢｃｖ抗体に媒介される、Ｔ細胞の活性化を示す図である。４８時間のインキュベーション後における、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞上の、早期活性化マーカーＣＤ６９（Ｃ、Ｄ）、および後期活性化マーカーＣＤ２５（Ａ、Ｂ）の発現レベル。８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ抗体は、ＢＣＭＡ陽性標的細胞の存在下で、ＣＤ６９およびＣＤ２５活性化マーカーの上方調節を、濃度依存的かつ特異的に誘導した。使用したＥ：Ｔ比は、ＰＢＭＣ：Ｈ９２９細胞＝１０：１であり、細胞は、ＣＤ６９およびＣＤ２５の上方調節を測定する前に、４８時間インキュベートした。２つの独立の実験からの代表的な結果（実施例１５を参照されたい）。
【図１８】図１８は、比色ＬＤＨ放出アッセイにより検出された、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  ＴＣＢｃｖ抗体が、ＢＣＭＡ陽性Ｈ９２９骨髄腫細胞の、Ｔ細胞をリダイレクトした殺滅を誘導することを示す図である。ＬＤＨの放出により測定されたように、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体（（Ａ）８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ、（Ｂ）１７Ａ５−ＴＣＢｃｖ）が、ＢＣＭＡ陽性Ｈ９２９骨髄腫細胞の、濃度依存的な殺滅を誘導した。使用したＥ：Ｔ比は、ＰＢＭＣ：Ｈ９２９細胞＝１０：１であり、細胞は、ＬＤＨの放出を測定する前に、２４時間インキュベートした（実施例１８を参照されたい）。
【図１８−１Ａ−Ｂ】図１８−１は、ＬＤＨの放出により測定された、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体により誘導される、リダイレクトされたＴ細胞によるＨ９２９  ＭＭ細胞の溶解を示す図である。８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖにより誘導される、Ｈ９２９  ＭＭ細胞の溶解についての濃度応答曲線（白丸、点線）。８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ抗体については、Ｈ９２９細胞の濃度依存的な殺滅が見られたのに対し、対照ＴＣＢでは、殺滅が観察されなかった。実験は、ＰＢＭＣ対ＭＭ細胞を１０対１とする、エフェクター細胞対腫瘍標的細胞（Ｅ：Ｔ）比を使用して、ＰＢＭＣドナー１（Ａ）、ドナー３（Ｂ）、ドナー４（Ｃ）、ドナー５（Ｄ）に対して実施した（実施例１８を参照されたい）。
【図１８−１Ｃ−Ｄ】図１８−１は、ＬＤＨの放出により測定された、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体により誘導される、リダイレクトされたＴ細胞によるＨ９２９  ＭＭ細胞の溶解を示す図である。８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖにより誘導される、Ｈ９２９  ＭＭ細胞の溶解についての濃度応答曲線（白丸、点線）。８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ抗体については、Ｈ９２９細胞の濃度依存的な殺滅が見られたのに対し、対照ＴＣＢでは、殺滅が観察されなかった。実験は、ＰＢＭＣ対ＭＭ細胞を１０対１とする、エフェクター細胞対腫瘍標的細胞（Ｅ：Ｔ）比を使用して、ＰＢＭＣドナー１（Ａ）、ドナー３（Ｂ）、ドナー４（Ｃ）、ドナー５（Ｄ）に対して実施した（実施例１８を参照されたい）。
【図１８−２Ａ−Ｂ】図１８−２は、ＬＤＨの放出により測定された、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体により誘導される、リダイレクトされたＴ細胞によるＬ３６３  ＭＭ細胞の溶解を示す図である。８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖにより誘導される、Ｌ３６３  ＭＭ細胞の溶解についての濃度応答曲線（白丸、点線）。８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ抗体については、Ｌ３６３細胞の濃度依存的な殺滅が観察されたのに対し、対照ＴＣＢでは、殺滅が観察されなかった。実験は、ＰＢＭＣ対ＭＭ細胞を１０対１とするＥ：Ｔ比を使用して、ＰＢＭＣドナー１（Ａ）、ドナー２（Ｂ）、ドナー３（Ｃ）、ドナー４（Ｄ）、ドナー５（Ｅ）に対して実施した（実施例１９を参照されたい）。
【図１８−２Ｃ−Ｄ】図１８−２は、ＬＤＨの放出により測定された、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体により誘導される、リダイレクトされたＴ細胞によるＬ３６３  ＭＭ細胞の溶解を示す図である。８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖにより誘導される、Ｌ３６３  ＭＭ細胞の溶解についての濃度応答曲線（白丸、点線）。８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ抗体については、Ｌ３６３細胞の濃度依存的な殺滅が観察されたのに対し、対照ＴＣＢでは、殺滅が観察されなかった。実験は、ＰＢＭＣ対ＭＭ細胞を１０対１とするＥ：Ｔ比を使用して、ＰＢＭＣドナー１（Ａ）、ドナー２（Ｂ）、ドナー３（Ｃ）、ドナー４（Ｄ）、ドナー５（Ｅ）に対して実施した（実施例１９を参照されたい）。
【図１８−２Ｅ】図１８−２は、ＬＤＨの放出により測定された、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体により誘導される、リダイレクトされたＴ細胞によるＬ３６３  ＭＭ細胞の溶解を示す図である。８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖにより誘導される、Ｌ３６３  ＭＭ細胞の溶解についての濃度応答曲線（白丸、点線）。８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ抗体については、Ｌ３６３細胞の濃度依存的な殺滅が観察されたのに対し、対照ＴＣＢでは、殺滅が観察されなかった。実験は、ＰＢＭＣ対ＭＭ細胞を１０対１とするＥ：Ｔ比を使用して、ＰＢＭＣドナー１（Ａ）、ドナー２（Ｂ）、ドナー３（Ｃ）、ドナー４（Ｄ）、ドナー５（Ｅ）に対して実施した（実施例１９を参照されたい）。
【図１８−３Ａ−Ｂ】図１８−３は、ＬＤＨの放出により測定された、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体により誘導される、リダイレクトされたＴ細胞によるＲＰＭＩ−８２２６  ＭＭ細胞の溶解を示す図である。８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖにより誘導される、ＲＰＭＩ−８２２６  ＭＭ細胞の溶解についての濃度応答曲線（白丸、点線）。８３Ａ１０−ＴＣＢ抗体については、ＲＰＭＩ−８２２６細胞の濃度依存的な殺滅が観察されたのに対し、対照ＴＣＢでは、殺滅が観察されなかった。実験は、ＰＢＭＣ対ＭＭ細胞を１０対１とするＥ：Ｔ比を使用して、ＰＢＭＣドナー２（Ａ）、ドナー３（Ｂ）、ドナー４（Ｃ）、ドナー５（Ｄ）に対して実施した（実施例１９Ａを参照されたい）。
【図１８−３Ｃ−Ｄ】図１８−３は、ＬＤＨの放出により測定された、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体により誘導される、リダイレクトされたＴ細胞によるＲＰＭＩ−８２２６  ＭＭ細胞の溶解を示す図である。８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖにより誘導される、ＲＰＭＩ−８２２６  ＭＭ細胞の溶解についての濃度応答曲線（白丸、点線）。８３Ａ１０−ＴＣＢ抗体については、ＲＰＭＩ−８２２６細胞の濃度依存的な殺滅が観察されたのに対し、対照ＴＣＢでは、殺滅が観察されなかった。実験は、ＰＢＭＣ対ＭＭ細胞を１０対１とするＥ：Ｔ比を使用して、ＰＢＭＣドナー２（Ａ）、ドナー３（Ｂ）、ドナー４（Ｃ）、ドナー５（Ｄ）に対して実施した（実施例１９Ａを参照されたい）。
【図１８−４Ａ−Ｂ】図１８−４は、フローサイトメトリーにより測定された、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体により誘導される、リダイレクトされたＴ細胞によるＪＪＮ−３  ＭＭ細胞の溶解を示す図である。８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖによる、ＪＪＮ−３  ＭＭ細胞の濃度依存的な殺滅（白丸、点線）。アネキシンＶ陽性ＪＪＮ−３細胞（Ａ、Ｃ）および腫瘍細胞溶解（Ｂ、Ｄ）の百分率を決定し、プロットした。具体的濃度の抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体により誘導される、ＪＪＮ−３細胞の溶解の百分率は、以下の通りに決定した：所与のＴＣＢ濃度のアネキシンＶ陰性ＪＪＮ−３細胞の絶対カウントを測定し、これを、ＴＣＢを伴わないアネキシンＶ陰性ＪＪＮ−３細胞の絶対カウントから減じ、これを、ＴＣＢを伴わないアネキシンＶ陰性ＪＪＮ−３細胞の絶対カウントで除した。実験は、ＰＢＭＣ対ＭＭ細胞を１０対１とするＥ：Ｔ比を使用して、二人のＰＢＭＣドナー：ドナー１（Ａ、Ｂ）およびドナー２（Ｃ、Ｄ）に対して実施した（実施例１９Ｂを参照されたい）。
【図１８−４Ｃ−Ｄ】図１８−４は、フローサイトメトリーにより測定された、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体により誘導される、リダイレクトされたＴ細胞によるＪＪＮ−３  ＭＭ細胞の溶解を示す図である。８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖによる、ＪＪＮ−３  ＭＭ細胞の濃度依存的な殺滅（白丸、点線）。アネキシンＶ陽性ＪＪＮ−３細胞（Ａ、Ｃ）および腫瘍細胞溶解（Ｂ、Ｄ）の百分率を決定し、プロットした。具体的濃度の抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体により誘導される、ＪＪＮ−３細胞の溶解の百分率は、以下の通りに決定した：所与のＴＣＢ濃度のアネキシンＶ陰性ＪＪＮ−３細胞の絶対カウントを測定し、これを、ＴＣＢを伴わないアネキシンＶ陰性ＪＪＮ−３細胞の絶対カウントから減じ、これを、ＴＣＢを伴わないアネキシンＶ陰性ＪＪＮ−３細胞の絶対カウントで除した。実験は、ＰＢＭＣ対ＭＭ細胞を１０対１とするＥ：Ｔ比を使用して、二人のＰＢＭＣドナー：ドナー１（Ａ、Ｂ）およびドナー２（Ｃ、Ｄ）に対して実施した（実施例１９Ｂを参照されたい）。
【図１９】図１９は、比色ＬＤＨ放出アッセイにより検出された、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体が、ＡＰＲＩＬの存在下における、ＢＣＭＡ陽性Ｈ９２９骨髄腫細胞の、Ｔ細胞をリダイレクトした殺滅を誘導することを示す図である。（Ａ）外因性ＡＰＲＩＬの非存在下、および１００ｎｇ／ｍＬまたは１０００ｎｇ／ｍＬの外因性ＡＰＲＩＬの存在下における、ＡＰＲＩＬを遮断しない／ＡＰＲＩＬと競合しない８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ。（Ｂ）外因性ＡＰＲＩＬの非存在下、および１００ｎｇ／ｍＬまたは１０００ｎｇ／ｍＬの外因性ＡＰＲＩＬの存在下における、ＡＰＲＩＬを遮断する／ＡＰＲＩＬと競合するＪ６Ｍ０−ＴＣＢ。使用したＥ：Ｔ比は、ＰＢＭＣ：Ｈ９２９細胞＝１０：１であり、細胞は、ＬＤＨの放出を測定する前に、２４時間インキュベートした（実施例２０を参照されたい）。
【図２０Ａ】図２０は、電荷変異体を伴わない８３Ａ１０−ＴＣＢと、電荷変異体を伴う８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖとの、生物学的特性についての比較を示す図である。（Ａ）一対一の比較：フローサイトメトリーにより検出された、８３Ａ１０−ＴＣＢ抗体および８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ抗体の、Ｈ９２９細胞への結合（実験１）；（Ｂ）一対一の比較：フローサイトメトリーにより検出された、８３Ａ１０−ＴＣＢ抗体および８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ抗体の、Ｈ９２９細胞およびＭＫＮ４５細胞への結合（実験２）；（Ｃ〜Ｆ）ＢＣＭＡ陽性Ｈ９２９骨髄腫細胞の、Ｔ細胞をリダイレクトした殺滅を誘導する、８３Ａ１０−ＴＣＢ抗体（Ｃ、Ｄ）と、８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ抗体（Ｅ、Ｆ）との比較。使用したＥ：Ｔ比は、ＰＢＭＣ：Ｈ９２９細胞＝１０：１であり、細胞は、ＬＤＨの放出を測定する前に、２４時間インキュベートした（実施例２１を参照されたい）。
【図２０Ｂ】図２０は、電荷変異体を伴わない８３Ａ１０−ＴＣＢと、電荷変異体を伴う８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖとの、生物学的特性についての比較を示す図である。（Ａ）一対一の比較：フローサイトメトリーにより検出された、８３Ａ１０−ＴＣＢ抗体および８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ抗体の、Ｈ９２９細胞への結合（実験１）；（Ｂ）一対一の比較：フローサイトメトリーにより検出された、８３Ａ１０−ＴＣＢ抗体および８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ抗体の、Ｈ９２９細胞およびＭＫＮ４５細胞への結合（実験２）；（Ｃ〜Ｆ）ＢＣＭＡ陽性Ｈ９２９骨髄腫細胞の、Ｔ細胞をリダイレクトした殺滅を誘導する、８３Ａ１０−ＴＣＢ抗体（Ｃ、Ｄ）と、８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ抗体（Ｅ、Ｆ）との比較。使用したＥ：Ｔ比は、ＰＢＭＣ：Ｈ９２９細胞＝１０：１であり、細胞は、ＬＤＨの放出を測定する前に、２４時間インキュベートした（実施例２１を参照されたい）。
【図２０Ｃ−Ｄ】図２０は、電荷変異体を伴わない８３Ａ１０−ＴＣＢと、電荷変異体を伴う８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖとの、生物学的特性についての比較を示す図である。（Ａ）一対一の比較：フローサイトメトリーにより検出された、８３Ａ１０−ＴＣＢ抗体および８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ抗体の、Ｈ９２９細胞への結合（実験１）；（Ｂ）一対一の比較：フローサイトメトリーにより検出された、８３Ａ１０−ＴＣＢ抗体および８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ抗体の、Ｈ９２９細胞およびＭＫＮ４５細胞への結合（実験２）；（Ｃ〜Ｆ）ＢＣＭＡ陽性Ｈ９２９骨髄腫細胞の、Ｔ細胞をリダイレクトした殺滅を誘導する、８３Ａ１０−ＴＣＢ抗体（Ｃ、Ｄ）と、８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ抗体（Ｅ、Ｆ）との比較。使用したＥ：Ｔ比は、ＰＢＭＣ：Ｈ９２９細胞＝１０：１であり、細胞は、ＬＤＨの放出を測定する前に、２４時間インキュベートした（実施例２１を参照されたい）。
【図２０Ｅ−Ｆ】図２０は、電荷変異体を伴わない８３Ａ１０−ＴＣＢと、電荷変異体を伴う８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖとの、生物学的特性についての比較を示す図である。（Ａ）一対一の比較：フローサイトメトリーにより検出された、８３Ａ１０−ＴＣＢ抗体および８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ抗体の、Ｈ９２９細胞への結合（実験１）；（Ｂ）一対一の比較：フローサイトメトリーにより検出された、８３Ａ１０−ＴＣＢ抗体および８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ抗体の、Ｈ９２９細胞およびＭＫＮ４５細胞への結合（実験２）；（Ｃ〜Ｆ）ＢＣＭＡ陽性Ｈ９２９骨髄腫細胞の、Ｔ細胞をリダイレクトした殺滅を誘導する、８３Ａ１０−ＴＣＢ抗体（Ｃ、Ｄ）と、８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ抗体（Ｅ、Ｆ）との比較。使用したＥ：Ｔ比は、ＰＢＭＣ：Ｈ９２９細胞＝１０：１であり、細胞は、ＬＤＨの放出を測定する前に、２４時間インキュベートした（実施例２１を参照されたい）。
【図２１】図２１は、マルチパラメータフローサイトメトリーにより測定された、自家骨髄に浸潤するＴ細胞（患者の全骨髄吸引物）の存在下における、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体により誘導される、リダイレクトされたＴ細胞による多発性骨髄腫患者骨髄の骨髄腫形質細胞の溶解を示す図である。アネキシンＶ陽性骨髄腫形質細胞の百分率を決定し、ＴＣＢ濃度に対してプロットした。８色型マルチパラメータパネルに基づき、８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖによる、患者骨髄腫形質細胞の、濃度依存的で特異的な溶解が観察されたのに対し、Ｔ細胞、Ｂ細胞、およびＮＫ細胞の溶解は、観察されなかった。被験ＴＣＢ抗体の最高濃度において、対照ＴＣＢによる、骨髄腫形質細胞の細胞死の誘導なし（実施例２３を参照されたい）。
【図２２】図２２は、フローサイトメトリーにより測定された、自家骨髄に浸潤するＴ細胞の存在下における、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体により誘導される、リダイレクトされたＴ細胞による多発性骨髄腫患者骨髄の骨髄腫形質細胞の溶解を示す図である。生存骨髄腫形質細胞の百分率は、患者００１（Ａ）、患者００２（Ｂ）および患者００３（Ｃ）について、アネキシンＶ陰性細胞集団をゲーティングすることにより決定し、８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体の濃度に対してプロットした。８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖは、骨髄腫患者の骨髄吸引物試料中の骨髄腫形質細胞の溶解を誘導した。８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖで処置された患者試料３例中３例において、生存骨髄腫細胞の濃度依存的な低減が観察された。８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖの、Ｊ６Ｍ０−ＴＣＢｃｖとの比較（ＢＣＭＡへの結合時に、ＡＰＲＩＬと競合することが報告されている抗体（Taiら、Blood、２０１４年））：患者試料３例中３例において、８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖは、３０ｎＭの等モル最大用量で、Ｊ６Ｍ０−ＴＣＢによるより多くの、患者骨髄吸引物に由来する骨髄腫形質細胞の溶解を誘導した（実施例２３を参照されたい）。
【図２３Ａ−Ｂ】図２３は、フローサイトメトリーにより測定された、自家骨髄に浸潤するＴ細胞の存在下における、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体により誘導される、リダイレクトされたＴ細胞による多発性骨髄腫患者骨髄の骨髄腫形質細胞の溶解を示す図である。ヨウ化プロピジウム陰性骨髄腫形質細胞の百分率を決定し、培地対照（ＭＣ）と比べた、生存骨髄形質細胞の百分率を、ＴＣＢ濃度に対してプロットした。８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖによる、患者骨髄腫形質細胞の、濃度依存的で特異的な溶解が観察された（Ａ〜Ｇ）のに対し、骨髄微小環境（ＢＭＭＥ）の溶解は、観察されなかった（Ｈ）。被験ＴＣＢ抗体の最高濃度において、対照ＴＣＢによる、骨髄腫形質細胞の細胞死の誘導は観察されなかった。８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖは、生存（ヨウ化プロピジウム陰性）骨髄腫形質細胞の濃度依存的な低減により反映されたように、患者骨髄の骨髄腫形質細胞の強力な殺滅を誘導した。効果は、その対応する統計学的検定のＰ値が、＜５％（＊）、＜  １％（＊＊）、または＜０．１％（＊＊＊）である場合に、統計学的に有意であると考えられた。実験は、患者１（Ａ）、患者２（Ｂ）、患者３（Ｃ）、患者４（Ｄ）、患者５（Ｅ）、患者６（Ｆ）、および患者７（Ｇ、Ｈ）から収集された骨髄吸引物試料を使用して実施した（実施例２３を参照されたい）。
【図２３Ｃ−Ｄ】図２３は、フローサイトメトリーにより測定された、自家骨髄に浸潤するＴ細胞の存在下における、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体により誘導される、リダイレクトされたＴ細胞による多発性骨髄腫患者骨髄の骨髄腫形質細胞の溶解を示す図である。ヨウ化プロピジウム陰性骨髄腫形質細胞の百分率を決定し、培地対照（ＭＣ）と比べた、生存骨髄形質細胞の百分率を、ＴＣＢ濃度に対してプロットした。８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖによる、患者骨髄腫形質細胞の、濃度依存的で特異的な溶解が観察された（Ａ〜Ｇ）のに対し、骨髄微小環境（ＢＭＭＥ）の溶解は、観察されなかった（Ｈ）。被験ＴＣＢ抗体の最高濃度において、対照ＴＣＢによる、骨髄腫形質細胞の細胞死の誘導は観察されなかった。８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖは、生存（ヨウ化プロピジウム陰性）骨髄腫形質細胞の濃度依存的な低減により反映されたように、患者骨髄の骨髄腫形質細胞の強力な殺滅を誘導した。効果は、その対応する統計学的検定のＰ値が、＜５％（＊）、＜  １％（＊＊）、または＜０．１％（＊＊＊）である場合に、統計学的に有意であると考えられた。実験は、患者１（Ａ）、患者２（Ｂ）、患者３（Ｃ）、患者４（Ｄ）、患者５（Ｅ）、患者６（Ｆ）、および患者７（Ｇ、Ｈ）から収集された骨髄吸引物試料を使用して実施した（実施例２３を参照されたい）。
【図２３Ｅ−Ｆ】図２３は、フローサイトメトリーにより測定された、自家骨髄に浸潤するＴ細胞の存在下における、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体により誘導される、リダイレクトされたＴ細胞による多発性骨髄腫患者骨髄の骨髄腫形質細胞の溶解を示す図である。ヨウ化プロピジウム陰性骨髄腫形質細胞の百分率を決定し、培地対照（ＭＣ）と比べた、生存骨髄形質細胞の百分率を、ＴＣＢ濃度に対してプロットした。８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖによる、患者骨髄腫形質細胞の、濃度依存的で特異的な溶解が観察された（Ａ〜Ｇ）のに対し、骨髄微小環境（ＢＭＭＥ）の溶解は、観察されなかった（Ｈ）。被験ＴＣＢ抗体の最高濃度において、対照ＴＣＢによる、骨髄腫形質細胞の細胞死の誘導は観察されなかった。８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖは、生存（ヨウ化プロピジウム陰性）骨髄腫形質細胞の濃度依存的な低減により反映されたように、患者骨髄の骨髄腫形質細胞の強力な殺滅を誘導した。効果は、その対応する統計学的検定のＰ値が、＜５％（＊）、＜  １％（＊＊）、または＜０．１％（＊＊＊）である場合に、統計学的に有意であると考えられた。実験は、患者１（Ａ）、患者２（Ｂ）、患者３（Ｃ）、患者４（Ｄ）、患者５（Ｅ）、患者６（Ｆ）、および患者７（Ｇ、Ｈ）から収集された骨髄吸引物試料を使用して実施した（実施例２３を参照されたい）。
【図２３Ｇ−Ｈ】図２３は、フローサイトメトリーにより測定された、自家骨髄に浸潤するＴ細胞の存在下における、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体により誘導される、リダイレクトされたＴ細胞による多発性骨髄腫患者骨髄の骨髄腫形質細胞の溶解を示す図である。ヨウ化プロピジウム陰性骨髄腫形質細胞の百分率を決定し、培地対照（ＭＣ）と比べた、生存骨髄形質細胞の百分率を、ＴＣＢ濃度に対してプロットした。８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖによる、患者骨髄腫形質細胞の、濃度依存的で特異的な溶解が観察された（Ａ〜Ｇ）のに対し、骨髄微小環境（ＢＭＭＥ）の溶解は、観察されなかった（Ｈ）。被験ＴＣＢ抗体の最高濃度において、対照ＴＣＢによる、骨髄腫形質細胞の細胞死の誘導は観察されなかった。８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖは、生存（ヨウ化プロピジウム陰性）骨髄腫形質細胞の濃度依存的な低減により反映されたように、患者骨髄の骨髄腫形質細胞の強力な殺滅を誘導した。効果は、その対応する統計学的検定のＰ値が、＜５％（＊）、＜  １％（＊＊）、または＜０．１％（＊＊＊）である場合に、統計学的に有意であると考えられた。実験は、患者１（Ａ）、患者２（Ｂ）、患者３（Ｃ）、患者４（Ｄ）、患者５（Ｅ）、患者６（Ｆ）、および患者７（Ｇ、Ｈ）から収集された骨髄吸引物試料を使用して実施した（実施例２３を参照されたい）。
【図２４】図２４は、マルチパラメータフローサイトメトリー（８色型染色パネル）により測定された、８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体により誘導される、骨髄形質細胞（患者の全骨髄吸引物）の存在下における、骨髄腫患者の骨髄Ｔ細胞の活性化を示す図である。ＣＤ４Ｔ細胞の活性化（上）およびＣＤ８Ｔ細胞の活性化（下）（実施例２３Ａを参照されたい）。
【図２５】図２５は、免疫不全ＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄ  ＩＬ２ｒガンマ（ヌル）（ＮＯＧ）マウスにおける、０．００８２、０．０８２、および０．８２ｍｇ／ｋｇの８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖの、単回静脈内（ＩＶ）注射後に、血清試料から測定される、８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖの濃度を示す図である。血清試料の収集は、投与前、および投与の０．２５、０．５、１、３、７、２４、４８、９６、１６８、２４０時間後において実施した（実施例２４を参照されたい）。
【図２６】図２６は、カニクイザルにおける、０．００３、０．０３、および０．１ｍｇ／ｋｇの８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖの、単回静脈内（ＩＶ）注射後に、血清試料（実線を伴う塗りつぶし記号）および骨髄試料（点線を伴う白抜き記号）から測定される、８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖの濃度を示す図である。血清試料の収集は、投与前、および投与の３０、９０、１８０分後、７、２４、４８、９６、１６８、３３６、５０４時間後において実施した。骨髄試料は、投与前、ならびに投与の９６、および３３６時間後において収集した（実施例２４Ａを参照されたい）。
【図２７】図２７は、８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ（０．００３、０．０３、および０．３ｍｇ／ｋｇ）の単回ＩＶ注射に続き、カニクイザルにおいて観察される末梢Ｔ細胞の再分布を示す図である。動物ＡおよびＢ、ＣおよびＤ、ならびにＥおよびＦには、それぞれ、０．００３、０．０３、および０．３ｍｇ／ｋｇの８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖによるＩＶ注射を施した。絶対血中Ｔ細胞カウント（血液１μＬ当たりのＣＤ２＋細胞）は、処置後の時間に対してプロットした（実施例２４Ａを参照されたい）。
【図２８Ａ】図２８は、マルチパラメータフローサイトメトリーにより測定された、８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ（０．３ｍｇ／ｋｇ）の単回ＩＶ注射に続き、カニクイザルにおいて観察される血中形質細胞の低減を示す図である。形質細胞（ＰＣ）は、６色型染色パネルに基づき同定し、リンパ球に対するＰＣの百分率を測定し、コンタープロットにプロットした（Ａ）。カニクイザルにおける、０．３ｍｇ／ｋｇの８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖによる処置の後における、血中形質細胞の枯渇の動態をプロットした（Ｂ）（実施例２４Ａを参照されたい）。
【図２８Ｂ】図２８は、マルチパラメータフローサイトメトリーにより測定された、８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ（０．３ｍｇ／ｋｇ）の単回ＩＶ注射に続き、カニクイザルにおいて観察される血中形質細胞の低減を示す図である。形質細胞（ＰＣ）は、６色型染色パネルに基づき同定し、リンパ球に対するＰＣの百分率を測定し、コンタープロットにプロットした（Ａ）。カニクイザルにおける、０．３ｍｇ／ｋｇの８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖによる処置の後における、血中形質細胞の枯渇の動態をプロットした（Ｂ）（実施例２４Ａを参照されたい）。
【図２９】図２９は、ＰＢＭＣヒト化ＮＯＧマウスを使用するＨ９２９ヒト骨髄腫異種移植モデルにおいて、８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体により誘導される抗腫瘍活性を示す図である。０日目（ｄ０）に、免疫不全ＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄ  ＩＬ２ｒガンマ（ヌル）（ＮＯＧ）に、ヒト多発性骨髄腫Ｈ９２９細胞を、右脇腹の背側への皮下（ＳＣ）注射として施した。１５日目（ｄ１５）に、ＮＯＧマウスに、ヒトＰＢＭＣの単回腹腔内（ＩＰ）注射を施した。次いで、マウスを、異なる処置群および対照群（ｎ＝９／群）へと注意深く無作為化し、統計学的検定を実施して、群間の均質性について調べた。実験群は、対照非処置群、対照ＴＣＢ処置群、２．６ｎＭ／ｋｇの８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ処置群、および２．６ｎＭ／ｋｇのＢＣＭＡ５０−ＢｉＴＥ（登録商標）（ＢＣＭＡ×ＣＤ３（ｓｃＦｖ）２）処置群であった。尾静脈注射により施される抗体処置は、１９日目（ｄ１９）、すなわち、Ｈ９２９腫瘍細胞のＳＣ注射の１９日後に開始した。ＴＣＢ抗体による処置スケジュールは、週１回、最長３週間のＩＶ投与（すなわち、合計３回のＴＣＢ抗体の注射）からなった。研究中に、腫瘍容量（ＴＶ）を、キャリパーにより測定し、進行を、ＴＶの群間比較により査定した。ＴＶ（ｍｍ３）は、腫瘍注射後の日数に対してプロットした。処置の１日目であるｄ１９において、平均腫瘍容量は、媒体で処置された対照群で３００±１６１ｍｍ３（Ａ）、２．６ｎＭ／ｋｇの対照ＴＣＢ処置群で３１５±１４８ｍｍ３（Ａ）、２．６ｎＭ／ｋｇの８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ群で２９３±１３５ｍｍ３（Ｂ）、および２．６ｎＭ／ｋｇのＢＣＭＡ５０−ＢｉＴＥ（登録商標）群で３０７±１３８ｍｍ３（Ｃ）に達した。実験群：（Ａ）媒体対照（実線）および対照ＴＣＢ（点線）を含む対照群、（Ｂ）８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ（２．６ｎＭ／ｋｇ）群、ならびに（Ｃ）ＢＣＭＡ５０−ＢｉＴＥ（登録商標）（２．６ｎＭ／ｋｇ）ごとの各個別のマウスのＴＶを、腫瘍注射後の日数に対してプロットした。黒矢印は、ＩＶ注射により施されたＴＣＢ処置を示す。８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ（２．６ｎＭ／ｋｇ）群では、マウス９匹中６匹（６７％）は、それらの腫瘍を、ｄ１９、すなわち、第１のＴＣＢ処置において記録されたＴＶをなおも下回って退縮させ、腫瘍の退縮は、研究の終了まで維持された。腫瘍の退縮を示さなかった８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ（２．６ｎＭ／ｋｇ）処置群内の３匹のマウスのＴＶは、ｄ１９において、それぞれ、３７６、４０２、および５２２ｍｍ３と等しかった。これに対し、等モル用量のＢＣＭＡ５０−ＢｉＴＥ（登録商標）（２．６ｎＭ／ｋｇ）により、週１回のスケジュールで３週間処置された９匹のマウス（０％）はどれも、いずれの時点においても、それらの腫瘍を退縮させなかった（実施例２５を参照されたい）。
【図３０】図３０は、ｄ１９〜ｄ４３に計算し、８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ（２．６ｎＭ／ｋｇ）群と、ＢＣＭＡ５０−ＢｉＴＥ（登録商標）（２．６ｎＭ／ｋｇ）群との間で比較した腫瘍成長の百分率（ＴＧ）を示す図である。ＴＧ（％）として規定される腫瘍成長の百分率は、ＴＧ（％）＝１００×（解析群のＴＶ中央値）／（対照媒体処置群のＴＶ中央値）を計算することにより決定した。倫理的な理由で、マウスは、ＴＶが、少なくとも２０００ｍｍ３に達したら、安楽死させた。８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ（２．６ｎＭ／ｋｇ）群では、ＴＧ（％）が、一貫して、かつ、有意に低減されたほか、ＴＧ（％）は、ＢＣＭＡ５０−ＢｉＴＥ（登録商標）（２．６ｎＭ／ｋｇ）と比較した場合、常に低かった（実施例２５を参照されたい）。
【発明を実施するための形態】
【００７５】
（発明の詳細な説明）
本発明者らは、ＶＨ／ＶＬの交換を伴う、ＣＤ３εおよびＢＣＭＡに対する二特異性抗体は、ＣＤ３εまたはＢＣＭＡに対する抗体部分の軽鎖ＣＬ内で、１２４位におけるアミノ酸が、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈ）により独立に置換されており（Ｋａｂａｔに従う番号付け）、それぞれの定常ドメインＣＨ１内で、１４７位におけるアミノ酸および２１３位におけるアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）、またはアスパラギン酸（Ｄ）により独立に置換されている（Ｋａｂａｔに従う番号付け）場合、高収率で作製され、容易に精製されうることを見出した。
【００７６】
ＶＨ／ＶＬの交換は、ＣＤ３結合性部分内でなされることが好ましい。二特異性抗体は、ＣＤ３への結合について一価であることが好ましい。上で記載したアミノ酸置換は、ＢＣＭＡ結合性部分内またはＣＤ３結合性部分内のいずれかでなされうる。したがって、本発明のある特定の実施形態では、ＣＤ３結合性部分は、ＶＨ／ＶＬの交換およびアミノ酸置換を含みうる。この場合、ＢＣＭＡ結合性部分は、アミノ酸１２４、１４７、２１３、または１２３において、ＶＨ／ＶＬの交換も、アミノ酸置換も含まない。二特異性抗体は、ＣＤ３への結合について一価であり、ＢＣＭＡへの結合について二価であることが好ましい。したがって、記載される通り、二特異性抗体は、第１のＢＣＭＡ結合性部分と同一である、第２のＢＣＭＡ結合性部分を含みうる。したがって、第１のＢＣＭＡ結合性部分が、アミノ酸置換を含めば、第２のＢＣＭＡ結合性部分も、同じ置換を含み、第１のＢＣＭＡ結合性部分が、アミノ酸置換を含まなければ、第２のＢＣＭＡ結合性部分もまた、置換を含まない。アミノ酸１２４は、Ｋであり、アミノ酸１４７は、Ｅであり、アミノ酸２１３は、Ｅであり、アミノ酸１２３は、Ｒであることことが好ましい。ＣＤ３結合性部分およびＢＣＭＡ結合性部分（または、そうである場合、ＢＣＭＡ結合性部分の両方）は、Ｆａｂ断片であり、それによって、２つのＢＣＭＡ結合性部分が存在する場合、１つのＢＣＭＡ部分は、ＣＨ１／ＶＬ（ＢＣＭＡ結合性部分のＣ末端（ＣＨ１）からクロスオーバーのＣＤ３結合性部分のＮ末端（ＶＬ）へ）、またはＣＨ１／ＶＨ（クロスオーバーのＣＤ３結合性部分のＣ末端（ＣＨ１）からＢＣＭＡ結合性部分のＮ末端（ＶＨ）へ）を介して、ＣＤ３結合性部分へと化学的に連結されることが好ましい。二特異性抗体は、Ｆｃパートを含む場合も、Ｆｃパートを含まない場合もある。
【００７７】
本明細書で使用される「標的」という用語は、ＢＣＭＡまたはＣＤ３のいずれかを意味する。「第１の標的および第２の標的」という用語は、第１の標的としてのＣＤ３、および第２の標的としてのＢＣＭＡを意味するか、または、第１の標的としてのＢＣＭＡ、および第２の標的としてのＣＤ３を意味する。
【００７８】
本明細書で使用される「ＢＣＭＡ」という用語は、分化した形質細胞内で優先的に発現する、腫瘍壊死受容体スーパーファミリーのメンバーである、ＢＣＭＡとしてもまた公知の、ヒトＢ細胞成熟抗原（ＴＮＦＲＳＦ１７であるＴＲ１７＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｑ０２２２３））に関する。ＢＣＭＡの細胞外ドメインは、ＵｎｉＰｒｏｔに従い、アミノ酸１〜５４（または５〜５１）からなる。本明細書で使用される「ＢＣＭＡに対する抗体、抗ＢＣＭＡ抗体」という用語は、ＢＣＭＡに特異的に結合する抗体に関する。
【００７９】
本明細書で使用される「ＣＤ３εまたはＣＤ３」という用語は、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ０７７６６（ＣＤ３Ｅ＿ＨＵＭＡＮ）下に記載されているヒトＣＤ３εに関する。「ＣＤ３に対する抗体、抗ＣＤ３抗体」という用語は、ＣＤ３εに結合する抗体に関する。抗体は、配列番号１、２、および３の重鎖ＣＤＲを、それぞれ、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３として含む可変ドメインＶＨと、配列番号４、５、および６の軽鎖ＣＤＲを、それぞれ、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３として含む可変ドメインＶＬとを含むことが好ましい。抗体は、配列番号７（ＶＨ）および配列番号８（ＶＬ）の可変ドメインを含むことが好ましい。本明細書で使用される「ＣＤ３に対する抗体、抗ＣＤ３抗体」という用語は、ＣＤ３に特異的に結合する抗体に関する。
【００８０】
「ＣＤ３またはＢＣＭＡに特異的に結合すること」とは、抗体が、ＣＤ３またはＢＣＭＡのターゲティングにおいて、治療剤として有用であるように、ＣＤ３またはＢＣＭＡ（標的）に、十分なアフィニティーで結合することが可能な抗体を指す。一部の実施形態では、抗ＣＤ３抗体または抗ＢＣＭＡ抗体が、無関係なＣＤ３以外またはＢＣＭＡ以外のタンパク質に結合する程度は、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、またはフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により測定される通り、抗体の、ＣＤ３またはＢＣＭＡへの結合の、約１０分の１、好ましくは、１００分の１未満である。ＣＤ３またはＢＣＭＡに結合する抗体の解離定数（Ｋｄ）は、１０−８Ｍまたはそれ未満、好ましくは、１０−８Ｍ〜１０−１３Ｍ、好ましくは、１０−９Ｍ〜１０−１３Ｍであることが好ましい。抗ＣＤ３および／または抗ＢＣＭＡ抗体は、異なる種に由来するＣＤ３および／またはＢＣＭＡの間、好ましくは、ヒトおよびカニクイザルの間で保存されているＣＤ３および／またはＢＣＭＡのエピトープに結合することが好ましい。「ＣＤ３およびＢＣＭＡに特異的に結合する二特異性抗体」または「本発明に従う抗体」または「ＣＤ３およびＢＣＭＡに対する二特異性抗体」とは、両方の標的への結合についてのそれぞれの規定を指す。ＢＣＭＡ（またはＢＣＭＡおよびＣＤ３）に特異的に結合する抗体は、他のヒト抗原に結合しない。したがって、ＥＬＩＳＡでは、このような無関係な標的についてのＯＤ値は、特殊なアッセイの検出限界のＯＤ値と等しいかもしくはそれ未満、好ましくは、０．３ｎｇ／ｍＬ超、またはＢＣＭＡをプレートに結合させていないか、もしくはＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトしていない対照試料のＯＤ値と等しいかもしくはそれ未満である。
【００８１】
本明細書で使用される「ＢＣＭＡ抗体の変異体」という用語は、配列番号２９のＣＤＲ３Ｈ内の、９５位（Ｎ９５）または９６位（Ｇ９６）のそれぞれにおける、９５位における単一のアミノ酸変化である、Ｎ９５Ｓ、Ｎ９５Ｔ、Ｎ９５Ｅ、Ｎ９５Ｑ、Ｎ９５Ａ、もしくはＮ９５Ｇのいずれかによる、または９６位における単一のアミノ酸変化である、Ｇ９６Ａ、Ｇ９６Ｅ、もしくはＧ９６Ｑのいずれかによるアミノ酸の置きかえからなる群から選択されるアミノ酸の置きかえを伴う抗体１３Ａ４の配列を含む抗ＢＣＭＡ抗体に関する。この用語はまた、配列番号３２のＣＤＲ１Ｌ内の、２７位（Ｎ２７ｆ）および２８位（Ｇ２８）のそれぞれにおける、２７位における単一のアミノ酸変化である、Ｎ２７ｆＳ、Ｎ２７ｆＴ、Ｎ２７ｆＥ、Ｎ２７ｆＱ、Ｎ２７ｆＡ、もしくはＮ２７ｆＧのいずれかによる、または２８位における単一のアミノ酸変化である、Ｇ２８Ａ、Ｇ２８Ｅ、もしくはＧ２８Ｑのいずれかによるアミノ酸の置きかえからなる群から選択されるアミノ酸の置きかえを伴う、抗体１３Ａ４の配列を含む本発明の抗体にも関する。この用語はまた、配列番号２６のＣＤＲ２Ｈ内の、５４位（Ｄ５４）および５５位（Ｓ５５）のそれぞれにおける、５４位における単一のアミノ酸変化である、Ｄ５４Ｓ、Ｄ５４Ｔ、Ｄ５４Ｅ、Ｄ５４Ｑ、Ｄ５４Ａ、もしくはＤ５４Ｇのいずれかによる、または５５位における単一のアミノ酸変化である、Ｓ５５Ａ、Ｓ５５Ｅ、もしくはＳ５５Ｑのいずれかによるアミノ酸の置きかえからなる群から選択されるアミノ酸の置きかえを伴う、抗体１３Ａ４の配列を含む本発明の抗体にも関する。この用語はまた、配列番号２３のＣＤＲ１Ｈ内の、３３位（Ｗ３３）における、Ｗ３３Ｆ、Ｗ３３Ｙ、Ｗ３３Ｖ、Ｗ３３Ｉ、Ｗ３３Ｌ、またはＷ３３Ａのいずれかによるアミノ酸Ｗの置きかえからなる群から選択されるアミノ酸の置きかえを伴う、抗体１３Ａ４の配列を含む本発明の抗体にも関する。
【００８２】
本明細書で使用される「ＢＣＭＡ抗体の変異体」という用語はまた、配列番号２７のＣＤＲ３Ｈ内の、９８位（Ｗ９８）における、Ｗ９８Ｆ、Ｗ９８Ｙ、Ｗ９８Ｖ、Ｗ９８Ｉ、Ｗ９８Ｌ、またはＷ９８Ａのいずれかによるアミノ酸の置きかえからなる群から選択されるアミノ酸の置きかえを伴う、抗体８３Ａ１０の配列を含む本発明の抗体にも関する。
【００８３】
本明細書で使用される「ＡＰＲＩＬ」という用語は、組換え切断型マウスＡＰＲＩＬ（Δ−ＡＰＲＩＬ）（アミノ酸１０６〜２４１；ＮＰ＿０７６００６）に関する。ＡＰＲＩＬは、Ｒｙａｎ、２００７年（Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ、６巻（１１号）：３００９〜１８頁）において記載されている通りに作製することができ、また、市販されてもいる（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｅｕｒｏｐｅ）。
【００８４】
抗ＢＣＭＡ抗体は、ＡＰＲＩＬの存在下および非存在下において、プレートに結合させたＢＣＭＡを使用する、ヒトＢＣＭＡへの結合についてのＥＬＩＳＡにより解析する。このアッセイでは、好ましくは、１．５μｇ／ｍＬの、プレートに結合させたＢＣＭＡの量と、好ましくは、１ｐＭ〜２００ｎＭの範囲の濃度の抗ＢＣＭＡ抗体を使用する。本発明に従う、ＡＰＲＩＬの、ＢＣＭＡへの結合を阻害しないＢＣＭＡ抗体とは、「ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、ＡＰＲＩＬの、ヒトＢＣＭＡへの結合を阻害しない」抗ＢＣＭＡ抗体である。
【００８５】
本明細書で使用される「ＮＦ−κＢ」という用語は、組換えＮＦ−κＢ  ｐ５０（受託番号（Ｐ１９８３８）に関する。
【００８６】
ＮＦ−κＢ活性は、ＮＣＩ−Ｈ９２９  ＭＭ細胞（ＣＲＬ−９０６８（商標））の抽出物についてのＤＮＡ結合ＥＬＩＳＡにより測定する。ＮＣＩ−Ｈ９２９  ＭＭ細胞は、非処置とするか、または０．１ｐＭ〜２００ｎＭのアイソタイプ対照もしくは０．１ｐＭ〜２００ｎＭの抗ＢＣＭＡ抗体で処置し、ＡＰＲＩＬの非存在下で、２０分間インキュベートする。ＮＦ−κＢ活性は、ＮＦ−κＢコンセンサス配列に結合したｐ６５からの化学発光シグナルを検出する、機能的ＥＬＩＳＡを使用してアッセイする（ＵＳ６１５００９０）。
【００８７】
ＮＦ−κＢ活性は、ＮＣＩ−Ｈ９２９  ＭＭ細胞（ＣＲＬ−９０６８（商標））内の、細胞内リン酸化ＮＦ−κＢ  ｐ６５（ｐＳ５２９）を測定するホスホフローサイトメトリーにより測定することが好ましい。ＮＣＩ−Ｈ９２９  ＭＭ細胞は、非処置とするか、または１０００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは、３０００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは、５０００ｎｇ／ｍＬのＡＰＲＩＬで、１分間〜３０分間、好ましくは、１５分間処置するが、ＡＰＲＩＬを伴わずに、またはＡＰＲＩＬと同時に、０．１ｐＭ〜２００ｎＭの抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体またはアイソタイプ対照抗体と共に、２０分間、あらかじめインキュベートされている。ＮＦ−κＢ活性は、ＮＦ−κＢコンセンサス配列に結合したｐ６５のリン酸化Ｓ５２９からの細胞内シグナルを検出する機能的ホスホフローアッセイ（ＵＳ６１５００９０）を使用してアッセイする。
【００８８】
また、本発明に従う抗体を、過剰に、好ましくは、最大５００ｎＭまたは１０００ｎＭ使用する場合、前記抗体の、ＢＣＭＡへの結合は、１４０ｎｇ／ｍｌのＡＰＲＩＬにより、１０％を超えて、好ましくは、６％を超えて、好ましくは、１％を超えて低減されない。
【００８９】
本発明に従う抗体を、過剰に、好ましくは、最大１０７ｎＭ使用する場合、１０００ｎｇ／ｍｌのＡＰＲＩＬの、ＮＣＩ−Ｈ９２９細胞（ＣＲＬ−９０６８（商標））への結合は、前記抗体の存在下において、１０％を超えて、好ましくは、５％を超えて、好ましくは、１％を超えて低減されないことが好ましい。
【００９０】
本発明に従う抗体を、過剰に、好ましくは、最大２６７ｎＭ使用する場合、前記抗体の、ＲＰＭＩ８２２６（ＣＣＬ−１５５（商標））への結合は、１０００ｎｇ／ｍｌのＡＰＲＩＬにより、１０％を超えて、好ましくは、５％を超えて、好ましくは、１％を超えて低減されないことが好ましい。
【００９１】
好ましい実施形態では、本発明に従う抗体を、過剰に、好ましくは、最大１３３ｎＭ使用する場合、前記抗体の、ＮＣＩ−Ｈ９２９細胞（ＣＲＬ−９０６８（商標））への結合は、２５００ｎｇ／ｍｌのＡＰＲＩＬにより、２５％を超えて、好ましくは、２０％を超えて、好ましくは、１０％を超えて低減されない。
【００９２】
本発明に従う抗体を、過剰に、好ましくは、最大４００ｎＭ使用する場合、前記抗体は、１０００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは、３０００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは、５０００ｎｇ／ｍＬのＡＰＲＩＬの存在下において、ＮＣＩ−Ｈ９２９細胞（ＣＲＬ−９０６８（商標））内のＡＰＲＩＬにより誘導されるＮＦ−κＢの活性化を、３０％を超えて変更しないことが好ましい。
【００９３】
好ましい一実施形態では、本発明に従う抗体を、過剰に、好ましくは、最大４００ｎＭ使用する場合、前記抗体は、ＡＰＲＩＬの非存在下において、ＮＣＩ−Ｈ９２９細胞（ＣＲＬ−９０６８（商標））内のＮＦ−κＢの活性化を、５％を超えて誘導しない。
【００９４】
本発明に従う抗体は、ＮＣＩ−Ｈ９２９細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−９０６８（商標））への結合についてのＥＣ５０値であって、３０ｎＭまたはそれを下回る、好ましくは、１５ｎＭおよびそれを下回るＥＣ５０値を示すことを特徴とすることが好ましい。
【００９５】
本発明に従う抗体は、ＲＰＭＩ８２２６（ＣＣＬ−１５５（商標））細胞に結合するその能力により特徴付けられることが好ましい。
【００９６】
好ましい一実施形態では、本発明に従う抗体は、ヒトＴ細胞に結合するその能力により特徴付けられる。本明細書で使用される「ＴＣＢ」という用語は、ＢＣＭＡおよびＣＤ３に特異的に結合する二特異性抗体を指す。
【００９７】
本発明に従う抗体は、ＨＥＫ細胞上で一過性に発現させたカニクイザルＢＣＭＡに結合するその能力により特徴付けられることが好ましい。
【００９８】
好ましい実施形態では、本発明に従う抗体は、ＢＣＭＡを発現する腫瘍細胞の存在下において、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を誘導するその能力により特徴付けられる。
【００９９】
本発明に従う抗体は、ヒトＴ細胞の存在下における、ＮＣＩ−Ｈ９２９腫瘍細胞のリダイレクトされた殺滅を、０．１ｎＭ未満、好ましくは、０．０５ｎＭ、好ましくは、０．０２ｎＭ、好ましくは、０．００２ｎＭおよびこれを下回るＥＣ５０で誘導するその能力により特徴付けられることが好ましい。
【０１００】
本発明に従う抗体の、リダイレクトされたＴ細胞による、ＮＣＩ−Ｈ９２９細胞の殺滅を誘導する効力（例えば、ＥＣ５０）は、臨床的に関与性の濃度のＡＰＲＩＬにより低減されないか、または低減されても最小限に限られることにより規定され；１００ｎｇ／ｍｌのＡＰＲＩＬの添加による、ＮＣＩ−Ｈ９２９細胞の殺滅についてのＥＣ５０の変化が、４分の１未満、好ましくは、２分の１未満、好ましくは、１．５分の１未満であり；より好ましくは、１０００ｎｇ／ｍＬのＡＰＲＩＬの添加による、ＮＣＩ−Ｈ９２９細胞の殺滅についてのＥＣ５０の変化が、６．５分の１未満、好ましくは、５分の１未満、好ましくは、４分の１未満、好ましくは、３分の１未満、好ましくは、２分の１未満、好ましくは、１．５分の１未満であることを特徴とすることが好ましい。
【０１０１】
本明細書で使用される「抗体」という用語は、モノクローナル抗体を指す。抗体は、「軽鎖」（ＬＣ）および「重鎖」（ＨＣ）の２つの対（本明細書では、このような軽鎖（ＬＣ）／重鎖対を、ＬＣ／ＨＣと略記する）からなる。このような抗体の軽鎖および重鎖は、いくつかのドメインからなるポリペプチドである。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書では、ＨＣＶＲまたはＶＨと略記する）および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、重鎖定常ドメインＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３（抗体クラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＧ）、任意選択で重鎖定常ドメインＣＨ４（抗体クラス：ＩｇＥおよびＩｇＭ）を含む。各軽鎖は、軽鎖可変ドメインＶＬおよび軽鎖定常ドメインＣＬを含む。可変ドメインＶＨおよびＶＬは、相補性決定領域（ＣＤＲ）と名付けられる超可変領域であって、フレームワーク領域（ＦＲ）と名付けられる、より保存的な領域を散在させた、超可変領域へとさらに細分することができる。各ＶＨおよびＶＬは、アミノ末端から、カルボキシ末端へと、以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で並べられる、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成される。重鎖および軽鎖の「定常ドメイン」は、抗体の、標的への結合に直接は関与しないが、多様なエフェクター機能を呈示する。
【０１０２】
本明細書で使用される「抗体の軽鎖」とは、Ｎ末端からＣ末端の方向で、ＶＬ−ＣＬと略記される、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）および軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）を含むポリペプチドである。本明細書で使用される「クロスオーバー軽鎖（ＶＨ−ＣＬ）」とは、ＶＬドメインを、それぞれのＶＨドメインで置きかえた軽鎖である。本明細書で使用される「抗体の重鎖」とは、Ｎ末端からＣ末端の方向で、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および定常重鎖ドメイン１（ＣＨ１）を含むポリペプチドである。本明細書で使用される「クロスオーバー重鎖（ＶＬ−ＣＨ１）」とは、ＶＨドメインを、それぞれのＶＬドメインで置きかえた重鎖である。
【０１０３】
ヘテロ二量体化を強化する、ＣＨ３修飾のためのいくつかの手法であって、例えば、ＷＯ９６／２７０１１、ＷＯ９８／０５０４３１、ＥＰ１８７０４５９、ＷＯ２００７／１１０２０５、ＷＯ２００７／１４７９０１、ＷＯ２００９／０８９００４、ＷＯ２０１０／１２９３０４、ＷＯ２０１１／９０７５４、ＷＯ２０１１／１４３５４５、ＷＯ２０１２０５８７６８、ＷＯ２０１３１５７９５４、ＷＯ２０１３０９６２９１において十分に記載されている手法が存在する。このような手法のいずれにおいても、第１のＣＨ３ドメインおよび第２のＣＨ３ドメインの両方を、各ＣＨ３ドメイン（またはそれを含む重鎖）がもはや、それ自身とホモ二量体化することができず、操作された相補的な他のＣＨ３ドメインとヘテロ二量体化することを強いられるように（第１のＣＨ３ドメインと、第２のＣＨ３ドメインとが、ヘテロ二量体化し、２つの第１のＣＨ３ドメインまたは２つの第２のＣＨ３ドメインの間でホモ二量体が形成されないように）相補的な形で操作することが典型的である。重鎖のヘテロ二量体化を改善するためのこれらの異なる手法は、本発明に従う抗体内で、重鎖−軽鎖修飾（１つの結合性アーム内のＶＨおよびＶＬの交換／置きかえ、ならびにＣＨ１／ＣＬ界面内の、逆の電荷を伴う帯電アミノ酸による置換の導入）と組み合わせた異なる代替法であって、軽鎖の誤対合、例えば、ベンス−ジョーンズ型副産物を低減する代替法として想定されている。
【０１０４】
本発明の好ましい一実施形態では（本発明に従う抗体が、重鎖内にＣＨ３ドメインを含む場合には）、本発明に従う前記多特異性抗体のＣＨ３ドメインは、例えば、ＷＯ９６／０２７０１１、Ｒｉｄｇｗａｙ，Ｊ．Ｂ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．、９巻（１９９６年）、６１７〜６２１頁；およびＭｅｒｃｈａｎｔ，Ａ．Ｍ．ら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１６巻（１９９８年）、６７７〜６８１頁；ＷＯ９８／０５０４３１において、いくつかの例と共に、詳細に記載されている、「ＫＩＨ（ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ）」技術により変更することができる。この方法では、これらの２つのＣＨ３ドメインを含有する両方の重鎖のヘテロ二量体化を増大させるように、２つのＣＨ３ドメインの相互作用表面を変更する。２つのＣＨ３ドメイン（２つの重鎖の）の各々を「ノブ」としうる一方で、他は「ホール」となる。
【０１０５】
こうして、本発明の一実施形態では、本発明に従う前記抗体は（各重鎖内にＣＨ３ドメインを含み）、ａ）抗体の第１の重鎖の第１のＣＨ３ドメインおよびｂ）抗体の第２の重鎖の第２のＣＨ３ドメインの各々が、抗体のＣＨ３ドメインの間の、元の界面を含む界面において向かい合い、前記界面が、本発明に従う抗体の形成を促進するように変更されていることもさらに特徴とし、前記変更は、
ｉ）本発明に従う抗体内の他方の重鎖のＣＨ３ドメインの元の界面と向かい合う、一方の重鎖のＣＨ３ドメインの元の界面内で、アミノ酸残基が、より大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置きかえられ、これにより、一方の重鎖のＣＨ３ドメインの界面内に、他方の重鎖のＣＨ３ドメインの界面内の空洞にはまる突起が作出されるように、一方の重鎖のＣＨ３ドメインが変更されていることと、
ｉｉ）本発明に従う抗体内の第１のＣＨ３ドメインの元の界面と向かい合う、第２のＣＨ３ドメインの元の界面内で、アミノ酸残基が、より小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置きかえられ、これにより、第２のＣＨ３ドメインの界面内に、第１のＣＨ３ドメインの界面内の突起がはまる空洞が作出されるように、他方の重鎖のＣＨ３ドメインが変更されていることと
を特徴とする。
【０１０６】
より大きい側鎖体積を有する前記アミノ酸残基は、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）からなる群から選択されることが好ましい。
【０１０７】
本発明の一態様では、両方のＣＨ３ドメインは、両方のＣＨ３ドメインの間でジスルフィド架橋が形成されうるように、各ＣＨ３ドメインの対応する位置におけるアミノ酸としてのシステイン（Ｃ）の導入により、さらに変更されている。
【０１０８】
ヘテロ二量体化を強化する、ＣＨ３修飾のための他の技法も、本発明の代替法として想定されており、例えば、ＷＯ９６／２７０１１、ＷＯ９８／０５０４３１、ＥＰ１８７０４５９、ＷＯ２００７／１１０２０５、ＷＯ２００７／１４７９０１、ＷＯ２００９／０８９００４、ＷＯ２０１０／１２９３０４、ＷＯ２０１１／９０７５４、ＷＯ２０１１／１４３５４５、ＷＯ２０１２／０５８７６８、ＷＯ２０１３／１５７９５４、ＷＯ２０１３／１５７９５３、ＷＯ２０１３／０９６２９１において記載されている。
【０１０９】
一実施形態では、本発明に従う抗体は、ＩｇＧ２アイソタイプの抗体であり、ＷＯ２０１０／１２９３０４において記載されているヘテロ二量体化法を、代替的に使用することができる。
【０１１０】
「抗体」という用語は、例えば、それらの特徴的な特性が保持されている限りにおいて、マウス抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、および遺伝子操作抗体（変異体または突然変異体の抗体）を含む。とりわけ、組換えヒト抗体またはヒト化抗体としての、ヒト抗体またはヒト化抗体が、とりわけ、好ましい。本明細書で使用される「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、単一のアミノ酸組成を有する抗体分子の調製物を指す。
【０１１１】
本明細書で使用される「二特異性抗体」および「本発明に従う抗体」という用語は、重鎖および軽鎖の２つの対（ＨＣ／ＬＣ）のうちの一方が、ＢＣＭＡに特異的に結合しており、他の一方が、ＣＤ３に、または好ましくは、ＣＤ３およびＢＣＭＡに特異的に結合している抗体を指す。本出願中で使用される「〜価の」という用語は、抗体分子内の、明記された数の結合性部位の存在を示す。本発明に従う二価抗体は、一方が、ＣＤ３のための、他方が、ＢＣＭＡのための、２つの結合性部位を有する。それ自体、「三価」という用語は、本発明に従う抗体内の３つの結合性部位であって、２つの結合性部位が、ＢＣＭＡのためであり、１つの結合性部位が、ＣＤ３のためである、結合性部位の存在を示す。
【０１１２】
ギリシャ文字：α、δ、ε、γ、およびμで示される、５種類の哺乳動物抗体重鎖が存在する（Ｊａｎｅｗａｙ  ＣＡ，Ｊｒら（２００１年）、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ、５版、Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ）。存在する重鎖の種類は、抗体のクラスを規定し、これらの鎖は、それぞれ、ＩｇＡ抗体、ＩｇＤ抗体、ＩｇＥ抗体、ＩｇＧ抗体、およびＩｇＭ抗体において見出される（Ｒｈｏａｄｅｓ  ＲＡ、Ｐｆｌａｎｚｅｒ  ＲＧ（２００２年）、Ｈｕｍａｎ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、４版、Ｔｈｏｍｓｏｎ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ）。別個の重鎖は、サイズおよび組成が異なり、αおよびγが、約４５０アミノ酸を含有するのに対し、μおよびεは、約５５０アミノ酸を有する。各重鎖は、２つの領域である、定常領域および可変領域を有する。定常領域は、同じアイソタイプの全ての抗体では、同一であるが、異なるアイソタイプの抗体では異なる。重鎖γ、α、およびδは、３つの定常ドメインＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３（一列の）と、可撓性を付加するためのヒンジ領域とから構成される定常領域を有し（Ｗｏｏｆ  Ｊ、Ｂｕｒｔｏｎ  Ｄ、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、４巻（２００４年）、８９〜９９頁）、重鎖μおよびεは、４つの定常ドメインＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４から構成される定常領域を有する（Ｊａｎｅｗａｙ  ＣＡ，Ｊｒら（２００１年）、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ、５版、Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ）。重鎖の可変領域は、異なるＢ細胞により産生される抗体内では異なるが、単一のＢ細胞またはＢ細胞クローンにより産生される全ての抗体では同じである。各重鎖の可変領域は、約１１０アミノ酸の長さであり、単一の抗体ドメインから構成される。
【０１１３】
哺乳動物では、ラムダ（λ）およびカッパ（κ）と呼ばれる、２種類の軽鎖が存在する。軽鎖は、２つの連続ドメイン：１つの定常ドメインＣＬと、１つの可変ドメインＶＬとを有する。軽鎖のおおよその長さは、２１１〜２１７アミノ酸である。軽鎖は、カッパ（κ）軽鎖であることが好ましく、定常ドメインＣＬは、カッパ（κ）軽鎖（定常ドメインＣＫ）に由来することが好ましい。本発明に従う抗体の重鎖定常ドメインおよび軽鎖定常ドメインは、ヒトドメインであることが好ましい。
【０１１４】
本発明に従う「抗体」は、任意のクラス（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ、好ましくは、ＩｇＧまたはＩｇＥ）、またはサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２、好ましくは、ＩｇＧ１）の抗体であることが可能であり、これによって、本発明に従う二特異性二価抗体が由来する両方の抗体は、同じサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４など、好ましくは、ＩｇＧ１）、好ましくは、同じアロタイプ（例えば、白色人種）のＦｃパートを有する。
【０１１５】
本明細書で使用される「抗体のＦａｂ断片」とは、抗原に結合する抗体の断片である。抗体のＦａｂ断片は、２つのドメイン対からなる。野生型抗体では、抗体のＦａｂ断片は、重鎖（ＣＨ１、およびＶＨ）および軽鎖（ＣＬおよびＶＬ）の各々の１つの定常ドメインおよび１つの可変ドメインから構成される。本発明に従えば、このようなドメイン対はまた、クロスオーバーのために、ＶＨ−ＣＬおよびＶＬ−ＣＨ１でもありうる。野生型抗体では、かつ、本発明に従えば、Ｆａｂ断片の重鎖および軽鎖のドメイン対のドメインは、化学的に一緒に連結されてはおらず、したがって、ｓｃＦｖ（単鎖可変断片）ではない。本発明に従う「クロスオーバー」とは、好ましくは、１つのＦａｂドメイン内で、ＶＬとＶＨとが、互いに置きかえられていることを意味する。
【０１１６】
本明細書で使用される「アミノ酸置換または電荷変異体」という用語は、定常ドメインＣＬ内で、１２４位におけるアミノ酸が、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈ）により独立に置換されており（Ｋａｂａｔに従う番号付け）、それぞれの定常ドメインＣＨ１内で、１４７位におけるアミノ酸および２１３位におけるアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）、またはアスパラギン酸（Ｄ）により独立に置換されており、好ましくは、さらに、定常ドメインＣＬ内で、１２３位におけるアミノ酸も、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈ）により、好ましくは、アルギニン（Ｒ）により独立に置換されているという点で、本発明に従うアミノ酸置換を意味する。
【０１１７】
アミノ酸置換の好ましい組合せは、Ｑ１２４Ｋ、Ｅ１２３Ｒ、Ｋ１４７Ｅ、およびＫ２１３Ｅ（例えば、Ｅ１２３Ｒとは、１２３位におけるグルタミン酸（Ｅ）が、アルギニン（Ｒ）で置きかえられていることを意味する）である。
【０１１８】
「抗体のＦｃパート」とは、当業者に周知であり、パパインによる抗体の切断に基づき規定される用語である。本発明に従う抗体は、Ｆｃパートとして、好ましくは、ヒト由来のＦｃパート、好ましくは、ヒト定常領域の他の全てのパートも含有する。抗体のＦｃパートは、補体の活性化、Ｃ１ｑへの結合、Ｃ３の活性化、およびＦｃ受容体への結合に直接関与する。抗体の、補体系に対する影響は、ある特定の条件に依存するが、Ｃ１ｑへの結合は、Ｆｃパート内の、規定された結合性部位により引き起こされる。このような結合性部位は、最先端技術において公知であり、例えば、Ｌｕｋａｓ，ＴＪ．ら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ.、１２７巻（１９８１年）、２５５５〜２５６０頁；Ｂｒｕｎｈｏｕｓｅ，
Ｒ．、およびＣｅｂｒａ，Ｊ．Ｊ．、ＭｏＩ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６巻（１９７９年）、９０７〜９１７頁；Ｂｕｒｔｏｎ，Ｄ．Ｒ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、２８８巻（１９８０年）、３３８〜３４４頁；Ｔｈｏｍｍｅｓｅｎ，Ｊ．Ｅ．ら、ＭｏＩ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３７巻（２０００年）、９９５〜１００４頁；Ｉｄｕｓｏｇｉｅ，Ｅ．Ｅ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６４巻（２０００年）、４１７８〜４１８４頁；Ｈｅｚａｒｅｈ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７５巻（２００１年）、１２１６１〜１２１６８頁；Ｍｏｒｇａｎ，Ａ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、８６巻（１９９５年）、３１９〜３２４頁；ならびにＥＰ０３０７４３４により記載されている。このような結合性部位は、例えば、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ｐ３３１、およびＰ３２９（ＫａｂａｔによるＥＵインデックスに従う番号付け（下記を参照されたい））である。サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ３の抗体が通例、補体の活性化、Ｃ１ｑへの結合、Ｃ３の活性化を示すのに対し、ＩｇＧ４は、補体系を活性化させず、Ｃ１ｑに結合せず、Ｃ３を活性化させない。Ｆｃパートは、ヒトＦｃパートであることが好ましい。Ｆｃパートは、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃパートであることが好ましい。本発明に従う抗体は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃパート内に、Ｐｒｏ３２９の、グリシンもしくはアルギニンによるアミノ酸置換、ならびに／または置換Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ、好ましくは、Ｐｒｏ３２９のグリシンによる置換、ならびに置換Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａを含むことが好ましい。
【０１１９】
本発明に従う抗体は、Ｆｃパートとして、野生型ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域のＦｃ変異体であって、位置Ｐｒｏ３２９におけるアミノ酸置換と、少なくとも１つのさらなるアミノ酸置換とを含み、残基が、ＫａｂａｔによるＥＵインデックスに従い、番号付けされ、前記抗体が、野生型ＩｇＧ  Ｆｃ領域を含む抗体と比較して、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡおよび／またはＦｃγＲＩＩＡおよび／またはＦｃγＲＩに対するアフィニティーの低減を呈示し、前記抗体により誘導されるＡＤＣＣが、野生型ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域を含む抗体により誘導されるＡＤＣＣの少なくとも２０％まで低減されるＦｃ変異体を含むことが好ましい。具体的な実施形態では、本発明に従う抗体内の野生型ヒトＦｃ領域のＰｒｏ３２９を、グリシンもしくはアルギニン、またはＦｃのプロリン３２９と、ＦｃγＲＩＩＩのトリプトファン（ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎｅ）残基Ｔｒｐ８７およびＴｉｐ１１０との間で形成される、Ｆｃ／Ｆｃγ受容体界面内のプロリンサンドイッチ（Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、４０６巻、２６７〜２７３頁（２０００年７月２０日））を破壊するのに十分な程度に大型のアミノ酸残基で置換する。本発明のさらなる態様では、Ｆｃ変異体内の、少なくとも１つのさらなるアミノ酸置換は、Ｓ２２８Ｐ、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｄ、またはＰ３３１Ｓであり、さらに別の実施形態では、前記少なくとも１つのさらなるアミノ酸置換は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域のＬ２３４Ａ（ロイシン２３４が、アラニンにより置換されていることを示す）およびＬ２３５Ａ、またはヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域のＳ２２８ＰおよびＬ２３５Ｅである。このようなＦｃ変異体については、ＷＯ２０１２１３０８３１において、詳細に記載されている。
【０１２０】
「キメラ抗体」という用語は、１つの供給源または種に由来する可変領域、すなわち、結合性領域と、異なる供給源または種に由来する定常領域の少なくとも一部とを含む抗体であって、通例、組換えＤＮＡ技法により調製される抗体を指す。マウス可変領域と、ヒト定常領域とを含むキメラ抗体が好ましい。本発明により包含される、「キメラ抗体」の他の好ましい形態は、本発明に従う特性であって、とりわけ、Ｃ１ｑへの結合および／またはＦｃ受容体（ＦｃＲ）への結合に関する特性を作出するように、定常領域を、元の抗体の定常領域から修飾するか、または変化させた形態である。このようなキメラ抗体はまた、「クラススイッチ抗体」とも称する。キメラ抗体とは、免疫グロブリンの可変領域をコードするＤＮＡセグメントと免疫グロブリンの定常領域をコードするＤＮＡセグメントとを含む、発現した免疫グロブリン遺伝子の産物である。キメラ抗体を作製するための方法は、当技術分野で周知の従来の組換えＤＮＡおよび遺伝子トランスフェクション技法を伴う。例えばＭｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１巻（１９８４年）、６８５１〜６８５５頁；米国特許第５，２０２，２３８号、および同第５，２０４，２４４号を参照されたい。
【０１２１】
「ヒト化抗体」という用語は、フレームワークまたは「相補性決定領域」（ＣＤＲ）が、親免疫グロブリンのＣＤＲと比較して特異性が異なる、免疫グロブリンのＣＤＲを含むように修飾された抗体を指す。好ましい実施形態では、マウスＣＤＲを、ヒト抗体のフレームワーク領域へとグラフトして、「ヒト化抗体」を調製する。例えばＲｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、３３２巻（１９８８年）、３２３〜３２７頁；およびＮｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、３１４巻（１９８５年）、２６８〜２７０頁を参照されたい。特に好ましいＣＤＲは、キメラ抗体について上で言及した標的を認識する配列を表すＣＤＲに対応する。本発明により包含される「ヒト化抗体」の他の形態は、本発明に従う特性であって、とりわけ、Ｃ１ｑへの結合および／またはＦｃ受容体（ＦｃＲ）への結合に関する特性を作出するように、定常領域を、元の抗体の定常領域から、さらに修飾するか、または変化させた形態である。
【０１２２】
本明細書で使用される「ヒト抗体」という用語は、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する抗体を含むことを意図する。最先端技術では、ヒト抗体が周知である（ｖａｎ  Ｄｉｊｋ，Ｍ．Ａ．およびｖａｎ  ｄｅ  Ｗｉｎｋｅｌ，Ｊ．Ｇ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、５巻（２００１年）、３６８〜３７４頁）。ヒト抗体はまた、免疫化すると、内因性免疫グロブリン産生の非存在下において、ヒト抗体の完全なレパートリーまたはセレクションを産生することが可能な、トランスジェニック動物（例えば、マウス）によって作製することもできる。ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン遺伝子アレイの、このような生殖細胞系列突然変異マウスへの移入は、標的による感作時における、ヒト抗体の産生を結果としてもたらす（例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ，Ａ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０巻（１９９３年）、２５５１〜２５５５頁；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ，Ａ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、３６２巻（１９９３年）、２５５〜２５８頁；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，Ｍ．ら、Ｙｅａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ.、７巻（１９９３年）、３３〜４０頁を参照されたい）。ヒト抗
体はまた、ファージディスプレイライブラリー（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｈ．Ｒ．およびＷｉｎｔｅｒ，Ｇ．、Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ.、２２７巻（１９９２年）、３８１〜３８
８頁；Ｍａｒｋｓ，Ｊ．Ｄ．ら、Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ.、２２２巻（１９９１年）、５
８１〜５９７頁）で作製することもできる。ＣｏｌｅらおよびＢｏｅｒｎｅｒらによる技法はまた、ヒトモノクローナル抗体の調製にも利用可能である（Coleら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ、７７頁（１９８５年）；およびＢｏｅｒｎｅｒ，Ｐ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７巻（１９９１年）、８６〜９５頁）。本発明に従うキメラ抗体およびヒト化抗体について既に言及した通り、本明細書で使用される「ヒト抗体」という用語はまた、本発明に従う特性であって、とりわけ、Ｃ１ｑへの結合および／またはＦｃＲへの結合に関する特性を作出するように、例えば、「クラススイッチング」、すなわち、Ｆｃパートの変化または突然変異（例えば、ＩｇＧ１からＩｇＧ４への突然変異、および／またはＩｇＧ１／ＩｇＧ４突然変異）により、定常領域において修飾される抗体も含む。
【０１２３】
本明細書で使用される「組換えヒト抗体」という用語は、ＮＳＯ細胞もしくはＣＨＯ細胞などの宿主細胞、またはヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックである動物（例えば、マウス）から単離された抗体、あるいは宿主細胞へとトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現させた抗体など、組換え手段により調製するか、発現させるか、創出するか、または単離した、全てのヒト抗体を含むことを意図する。このような組換えヒト抗体は、可変領域および定常領域を、再配列された形態で有する。本発明に従う組換えヒト抗体は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける体細胞超変異に供されている。こうして、組換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系列のＶＨおよびＶＬ配列に由来し、これらと類縁であるが、ｉｎ  ｖｉｖｏのヒト抗体生殖細胞系列レパートリー内で、天然には存在しえない配列である。
【０１２４】
本明細書で使用される「可変ドメイン」（軽鎖（ＶＬ）の可変ドメイン、重鎖（ＶＨ）の可変領域）は、抗体の、標的への結合に直接関与する、軽鎖および重鎖の対の各々を示す。可変ヒト軽鎖および重鎖のドメインは、同じ一般的構造を有し、各ドメインは、その配列が、広く保存され、３つの「超可変領域」（または相補性決定領域、ＣＤＲ）により接続されている、４つのフレームワーク（ＦＲ）領域を含む。フレームワーク領域は、βシートコンフォメーションを取り、ＣＤＲは、βシート構造を接続するループを形成しうる。各鎖内のＣＤＲは、フレームワーク領域により、それらの三次元構造に保たれ、他の鎖に由来するＣＤＲと一緒に、標的結合性部位を形成する。抗体の重鎖および軽鎖ＣＤＲ３領域は、本発明に従う抗体の結合特異性／アフィニティーにおいて、特に重要な役割を果たし、したがって、本発明のさらなる目的を提供する。
【０１２５】
本明細書で使用される場合の「超可変領域」または「抗体の標的結合性部分」という用語は、標的への結合の一因となる、抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」に由来するアミノ酸残基を含む。「フレームワーク」領域または「ＦＲ」領域とは、本明細書で規定される超可変領域残基以外の可変ドメイン領域である。したがって、抗体の軽鎖および重鎖は、Ｎ末端からＣ末端へと、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４を含む。各鎖上のＣＤＲは、このようなフレームワークアミノ酸により隔てられている。とりわけ、重鎖のＣＤＲ３は、標的への結合に最も寄与する領域である。ＣＤＲ領域およびＦＲ領域は、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１年）による標準的な規定に従い、決定する。
【０１２６】
「エピトープ」という用語は、抗体への特異的結合が可能な、任意のポリペプチド決定基を含む。ある特定の実施形態では、エピトープ決定基は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル、またはスルホニルなど、化学的に活性な表面分子の群を含み、ある特定の実施形態では、特異的な三次元構造特徴および／または特異的な電荷特徴を有しうる。エピトープとは、抗体が結合する、標的の領域である。
【０１２７】
本発明に従う二特異性抗体を調製するためには、各軽鎖および重鎖をコードする、別々のベクターまたは、別の適切な量のベクターを使用することができる。このようなベクターは、宿主細胞の形質転換に使用することができる。
【０１２８】
本明細書で使用される「核酸または核酸分子」という用語は、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子を含むことを意図する。核酸分子は、一本鎖でも二本鎖でもよいが、二本鎖ＤＮＡであることが好ましい。
【０１２９】
本明細書で使用される「細胞」、「細胞系」、および「細胞培養物」という表現は、互換的に使用され、全てのこのような呼称は、子孫細胞を含む。こうして、「形質転換体」および「形質転換細胞」という語は、初代対象細胞、およびこれに由来する培養物であって、継代数に関わらない培養物を含む。また、全ての子孫細胞は、意図的なまたは偶発的な突然変異のために、ＤＮＡ含量が正確に同一でない可能性があることも理解される。元の形質転換細胞内でスクリーニングされたのと同じ機能または生物学的活性を有する、変異体の子孫細胞も含まれる。顕著に異なる呼称が意図される場合、文脈から明らかであろう。
【０１３０】
本明細書で使用される「形質転換」という用語は、ベクター／核酸の、宿主細胞への移入のプロセスを指す。透過しにくい細胞壁バリアを伴わない細胞を宿主細胞として使用する場合、トランスフェクションは、例えば、ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ  ｄｅｒ  Ｅｈ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５２巻（１９７８年）、５４６頁以降により記載されている、リン酸カルシウム沈殿法により実行する。しかし、また、核注射によるまたはプロトプラスト融合によるなど、ＤＮＡを細胞へと導入するための他の方法も使用することができる。原核細胞または実質的な細胞壁の構築を含有する細胞を使用する場合、例えば、トランスフェクションの１つの方法は、Ｃｏｈｅｎ  ＳＮら、ＰＮＡＳ、１９７２年、６９巻（８号）：２１１０〜２１１４頁により記載されている通り、塩化カルシウムを使用するカルシウム処理である。
【０１３１】
最先端技術では、形質転換を使用する、抗体の組換え産生が周知であり、例えば、Ｍａｋｒｉｄｅｓ，Ｓ．Ｃ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ.、１７巻（１９９９年
）、１８３〜２０２頁；Ｇｅｉｓｓｅ，Ｓ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ.、８巻（１９９６年）、２７１〜２８２頁；Ｋａｕｆｍａｎ，ＲＪ．、ＭｏＩ．Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌ.、１６巻（２０００年）、１５１〜１６１頁；Ｗｅｒｎｅｒ，Ｒ．Ｇ．
ら、Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌｆｏｒｓｃｈｕｎｇ、４８巻（１９９８年）、８７０〜８８０頁による総説論文；ならびにＵＳ６３３１４１５およびＵＳ４８１６５６７において記載されている。
【０１３２】
本明細書で使用される「発現」とは、核酸をｍＲＮＡへと転写するプロセス、および／または転写されたｍＲＮＡ（転写物ともまた称する）を、その後、ペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質へと翻訳するプロセスを指す。転写物と、コードされたポリペプチドとを、遺伝子産物と総称する。ポリヌクレオチドが、ゲノムＤＮＡに由来する場合、真核細胞内の発現は、ｍＲＮＡのスプライシングを含みうる。
【０１３３】
「ベクター」とは、核酸分子、特に、自己複製型核酸分子であって、挿入された核酸分子を、宿主細胞内および／または宿主細胞間に移入する核酸分子である。用語は、主にＤＮＡまたはＲＮＡの、細胞への挿入（例えば、染色体の組込み）のために機能するベクター、主にＤＮＡまたはＲＮＡの複製のために機能するベクターの複製、ならびにＤＮＡまたはＲＮＡの転写および／または翻訳のために機能する発現ベクターを含む。また、記載される機能のうちの１つを超える機能を提供するベクターも含まれる。
【０１３４】
「発現ベクター」とは、適切な宿主細胞へと導入されると、ポリペプチドへと転写および翻訳されるポリヌクレオチドである。「発現系」とは通例、所望の発現産物をもたらすように機能しうる発現ベクターを含む、適切な宿主細胞を指す。
【０１３５】
本発明に従う二特異性抗体は、組換え手段により作製することが好ましい。このような方法は、最先端技術において広く公知であり、原核細胞内および真核細胞内のタンパク質の発現であって、その後における抗体ポリペプチドの単離と、通例、薬学的に許容される純度までの精製とを伴う発現を含む。タンパク質を発現させるためには、標準的な方法により、軽鎖および重鎖またはこれらの断片をコードする核酸を、発現ベクターへと挿入する。発現は、ＣＨＯ細胞、ＮＳＯ細胞、ＳＰ２／０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、酵母、またはＥ．ｃｏｌｉ細胞のような適切な原核または真核宿主細胞内で実施し、抗体は、細胞（上清または溶解の後における細胞）から回収する。二特異性抗体は、全細胞で、細胞溶解物中、または部分的に精製もしくは実質的に純粋形態で存在しうる。精製は、アルカリ／ＳＤＳ処理、カラムクロマトグラフィー、および当技術分野で周知の他の技法を含む標準的な技法により、他の細胞構成要素または他の夾雑物、例えば、他の細胞核酸またはタンパク質、を消失させるために実施する。Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．ら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ（１９８７年）を参照されたい。
【０１３６】
ＮＳ０細胞内の発現は、例えば、Ｂａｒｎｅｓ，Ｌ．Ｍ．ら、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３２巻（２０００年）、１０９〜１２３頁；およびＢａｒｎｅｓ，Ｌ．Ｍ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ.、７３巻（２００１年）、２６１〜２７０頁により記載
されている。一過性発現は、例えば、Ｄｕｒｏｃｈｅｒ，Ｙ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．、３０巻（２００２年）、Ｅ９頁により記載されている。可変ドメインのクローニングは、Ｏｒｌａｎｄｉ，Ｒ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６巻（１９８９年）、３８３３〜３８３７頁；Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９巻（１９９２年）、４２８５〜４２８９頁；およびＮｏｒｄｅｒｈａｕｇ，Ｌ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、２０４巻（１９９７年）、７７〜８７頁により記載されている。好ましい一過性発現系（ＨＥＫ２９３）は、Ｓｃｈｌａｅｇｅｒ，Ｅ．−Ｊ．およびＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｋ．、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３０巻（１９９９年）、７１〜８３頁；ならびにＳｃｈｌａｅｇｅｒ，Ｅ．−Ｊ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９４巻（１９９６年）、１９１〜１９９頁により記載されている。
【０１３７】
原核細胞に適する制御配列は、例えば、プロモーター、任意選択で、オペレーター配列およびリボソーム結合性部位を含む。真核細胞は、プロモーター、エンハンサー、およびポリアデニル化シグナルを活用することが公知である。
【０１３８】
核酸は、別の核酸配列との機能的関係に置かれた場合、「作動可能に連結」されている。例えば、プレ配列もしくは分泌リーダーのためのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に参与するプレタンパク質として発現する場合、ポリペプチドのためのＤＮＡに作動可能に連結されているか；プロモーターもしくはエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結されているか；またはリボソーム結合性部位は、翻訳を容易とするように位置づけられている場合、コード配列に作動可能に連結されている。
【０１３９】
一般に、「作動可能に連結された」とは、連結されているＤＮＡ配列が連続であり、分泌リーダーの場合、リーディングフレーム内で連続であることを意味する。しかし、エンハンサーは、連続でなくともよい。連結は、好都合な制限部位におけるライゲーションにより達成される。このような部位が存在しない場合は、従来の慣行に従い、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを使用する。
【０１４０】
二特異性抗体は、例えば、プロテインＡ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーなど、従来の免疫グロブリン精製手順により、培養培地から適切に分離される。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡまたはＲＮＡは、従来の手順を使用して、たやすく単離され、シークエンシングされる。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡおよびＲＮＡの供給源として用いることができる。単離されたら、ＤＮＡを、発現ベクターへと挿入することができ、次いで、宿主細胞内で組換えモノクローナル抗体の合成を得るように、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、または骨髄腫細胞などの宿主細胞であって、トランスフェクトしなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない宿主細胞へとトランスフェクトする。
【０１４１】
二特異性抗体のアミノ酸配列の変異体（または突然変異体）は、適切なヌクレオチド変化を、抗体ＤＮＡへと導入することにより、またはヌクレオチドの合成により調製する。このような修飾は、実施しうるが、例えば、上で記載した通り、非常に限定的な範囲内に限られる。例えば、修飾は、ＩｇＧアイソタイプおよび標的への結合など、上述の抗体特徴を変更しないが、組換え作製の収率、タンパク質の安定性を改善する、または精製を容易とすることが可能である。
【０１４２】
Ｔ細胞二特異性（ＴＣＢ）結合剤は、細胞の殺滅（例えば、ピコモル未満の範囲または低ピコモル範囲の、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞殺滅アッセイにおけるＥＣ５０；Dreierら、Int  J  Cancer、２００２年）において、非常に高度な、濃度／腫瘍細胞受容体占有度依存的効力を有するが、Ｔ細胞二特異性結合剤（ＴＣＢ）は、従来の単一特異性抗体よりはるかに低用量で施されている。例えば、ブリナツモマブ（ＣＤ１９×ＣＤ３）は、急性リンパ性白血病の処置のための、５〜１５μｇ／ｍ２／日（すなわち、わずか、０．０３５〜０．１０５ｍｇ／ｍ２／週）、または非ホジキンリンパ腫の処置のための、６０μｇ／ｍ２／日の連続静脈内投与で施され、これらの投与時における血清濃度は、０．５〜４ｎｇ／ｍｌの範囲である（Klingerら、Blood、２０１２年、Toppら、J  Clin  Oncol、２０１１年、Goebelerら、Ann  Oncol、２０１１年）。低用量のＴＣＢで、患者において高度な有効性を発揮しうるため、本発明に従う抗体では、皮下投与が可能であり、臨床状況において好ましいことが想定される（０．２５〜２．５ｍｇ／ｍ２／週の用量範囲が好ましい）。これらの低濃度／用量／受容体占有度であってもなお、ＴＣＢは、無視できない有害事象を引き起こしうる（Klingerら、Blood、２０１２年）。したがって、腫瘍細胞占有度／カバレッジを制御することが極めて重要である。高レベルおよび可変レベルの血清ＡＰＲＩＬおよびＢＡＦＦを伴う患者（例えば、多発性骨髄腫患者、Moreauxら、２００４年、Blood、１０３巻（８号）：３１４８〜３１５７頁）では、腫瘍細胞に結合するＴＣＢ
の数および腫瘍細胞の占有度のそれぞれは、ＡＰＲＩＬ（ヒトＢＣＭＡに、ＢＡＦＦの１０００倍のアフィニティーで結合する、高アフィニティーリガンド）の大幅な影響を受ける可能性がある。しかし、本発明の前記抗体を使用することにより、腫瘍細胞の占有度および有効性／安全性のそれぞれに関して、本発明に従う抗体では、ＡＰＲＩＬリガンドとの競合の影響を受けない可能性があるので、用量の増大は要請されないことがある。本発明に従う抗体の別の利点は、Ｆｃ部分の組入れに基づき、これは、Ｆｃ部分を伴わないＴＣＢ（例えば、ブリナツモマブ）であって、患者が携行するポンプで、静脈内において連続的に施すことを要請するＴＣＢと比較して、消失半減期を、最大約１２日間またはさらにそれ超まで延長し、週１回または２回の投与の機会をもたらす。
【０１４３】
ＣＤ１９×ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性（ＴＣＢ）抗体ブリナツモマブについては、再発性／不応性の急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）を伴う患者において、最大８０％の奏効率が示されている。ＡＬＬと同様、多発性骨髄腫および他の形質細胞疾患にも、依然として高い医療的必要が存在する。今日利用可能な全ての処置にも拘らず、初回の診断の５年後に、多発性骨髄腫患者のうちの約６０％が、既に死亡している。多発性骨髄腫を伴う患者のための有効な処置が、依然として必要とされている。
【０１４４】
本発明に従う抗体は、例えば、ブリナツモマブおよび公表されているＢＣＭＡ×ＣＤ３
ＴＣＢ抗体に対して、固有の特徴および利点：
・長い消失半減期（数時間ではなく、数日間）
・簡便な週２回または１回の投与（患者が数週間／数カ月間携行するポンプによる投与ではない）
・ＢＣＭＡ−ＴＣＢにより誘導される腫瘍細胞殺滅に対する、ＢＣＭＡの天然リガンドであるＡＰＲＩＬの血中濃度および骨髄濃度の最小限の影響（多発性骨髄腫を伴う患者は、ＡＰＲＩＬ濃度の極めて大きなばらつきを示し、有効性が、ＡＰＲＩＬレベルに強く依存する場合、ＡＰＲＩＬレベルの高い患者では、薬物の有効性が低減されるか、または薬物の有効性がみられないことすらありうる）
・ＢＣＭＡ×ＣＤ３  ＴＣＢ抗体の高度の安定性および低度の凝集をもたらす、分子フォーマットおよび構造
・以下の措置によって高品質の製造を可能とし、精製を容易とする、分子構造の最適化：
軽鎖の誤対合を低減する、ＣＬおよびＣＨ１内のアミノ酸置換
軽鎖の誤対合を低減する、ＶＬ−ＶＨクロスオーバー
好ましくは、適正な重鎖対合を改善するＫＩＨ（ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ）技術
・好ましくは、補体系および／またはＦｃＲを保有するエフェクター細胞との相互作用に由来する潜在的な副作用を回避する、ＦｃのＣＨ３内のＰｒｏ３２９およびＬ２３４ＡおよびＬ２３５Ａのアミノ酸置換
を有する。
【０１４５】
【表１】
2020122013.tif 000002
【０１４６】
【表２】
2020122013.tif 000003
【０１４７】
以下の（２＋１）Ｆｃ含有抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  ＴＣＢを制作するためには、上記の表２で言及した、それぞれの「構成ブロック」／配列番号：
８３Ａ１０−ＴＣＢ：３９、４０、４１、４２（比較）
８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ：４３、４４、４５、４６（図２Ａ）
１７Ａ５−ＴＣＢｃｖ：４５、４７、４８、４９（図２Ａ）
１３Ａ４−ＴＣＢｃｖ：４５、５０、５１、５２（図２Ａ）
が必要とされる。
【０１４８】
【表３−１】
2020122013.tif 000004
【表３−２】
2020122013.tif 000005
【０１４９】
以下では、本発明の具体的な実施形態を列挙する。
【０１５０】
１．ヒトＢＣＭＡ（さらにまた、「ＢＣＭＡ」とも称する）の細胞外ドメイン、およびヒトＣＤ３ε（さらにまた、「ＣＤ３」とも称する）である、２つの標的に特異的に結合する、二価または三価の二特異性抗体であって、軽鎖およびそれぞれの重鎖内の可変ドメインＶＬおよびＶＨが、互いに置きかえられており、定常ドメインＣＬを含むことを特徴とし、１２４位におけるアミノ酸が、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈ）により独立に置換されており（Ｋａｂａｔに従う番号付け）、それぞれの定常ドメインＣＨ１内で、１４７位におけるアミノ酸および２１３位におけるアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）、またはアスパラギン酸（Ｄ）により独立に置換されている（Ｋａｂａｔに従う番号付け）二特異性抗体。
【０１５１】
２．ヒトＢＣＭＡの細胞外ドメイン、およびヒトＣＤ３である、２つの標的に特異的に結合する二特異性抗体であって、
ａ）ＢＣＭＡに特異的に結合する第１の抗体の第１の軽鎖および第１の重鎖と；
ｂ）ＣＤ３に特異的に結合する第２の抗体の第２の軽鎖および第２の重鎖であって、第２の抗体の第２の軽鎖および第２の重鎖内の可変ドメインＶＬおよびＶＨが、互いに置きかえられている、第２の軽鎖および第２の重鎖とを含み；
ｃ）ａ）下にある第１の軽鎖の定常ドメインＣＬ内で、１２４位におけるアミノ酸が、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈ）により独立に置換されており（Ｋａｂａｔに従う番号付け）、ａ）下にある第１の重鎖の定常ドメインＣＨ１内で、１４７位におけるアミノ酸および２１３位におけるアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）により独立に置換されている（Ｋａｂａｔに従う番号付け）こと
を特徴とする二特異性抗体。
【０１５２】
３．ヒトＢＣＭＡの細胞外ドメイン、およびヒトＣＤ３である、２つの標的に特異的に結合する二特異性抗体であって、
ａ）ＢＣＭＡに特異的に結合する第１の抗体の第１の軽鎖および第１の重鎖と；
ｂ）ＣＤ３に特異的に結合する第２の抗体の第２の軽鎖および第２の重鎖であって、第２の抗体の第２の軽鎖および第２の重鎖内の可変ドメインＶＬおよびＶＨが、互いに置きかえられている、第２の軽鎖および第２の重鎖とを含み；
ｃ）ｂ）下にある第２の軽鎖の定常ドメインＣＬ内で、１２４位におけるアミノ酸が、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈ）により独立に置換されており（Ｋａｂａｔに従う番号付け）、ｂ）下にある第２の重鎖の定常ドメインＣＨ１内で、１４７位におけるアミノ酸および２１３位におけるアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）により独立に置換されている（Ｋａｂａｔに従う番号付け）こと
を特徴とする二特異性抗体。
【０１５３】
４．さらに、前記第１の抗体のＦａｂ断片（さらにまた、「ＢＣＭＡ−Ｆａｂ」とも称する）も含み、前記ＢＣＭＡ−Ｆａｂの定常ドメインＣＬ内で、１２４位におけるアミノ酸が、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈ）により独立に置換されており（Ｋａｂａｔに従う番号付け）、前記ＢＣＭＡ−Ｆａｂの定常ドメインＣＨ１内で、１４７位におけるアミノ酸および２１３位におけるアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）により独立に置換されている（Ｋａｂａｔに従う番号付け）ことを特徴とする、上記の実施形態２に従う二特異性抗体。
【０１５４】
５．さらに、前記第１の抗体の第２のＦａｂ断片（「ＢＣＭＡ−Ｆａｂ」）を含むこと
を特徴とする、上記の実施形態３に従う二特異性抗体。
【０１５５】
６．ＣＤ３に特異的に結合する抗体の１つのＦａｂ断片（さらにまた、「ＣＤ３−Ｆａｂ」とも称する）と、ＢＣＭＡに特異的に結合する抗体の１つのＦａｂ断片（さらにまた、「ＢＣＭＡ−Ｆａｂ」とも称する）と、Ｆｃパートとからなり、ＣＤ３−ＦａｂおよびＢＣＭＡ−Ｆａｂが、それらのＣ末端を介して、前記Ｆｃパートのヒンジ領域へと連結されており、ＣＤ３−ＦａｂまたはＢＣＭＡ−Ｆａｂが、アミノ酸置換を含み、ＣＤ３−Ｆａｂが、クロスオーバーを含むことを特徴とする、実施形態１から５のいずれか１つに従う二特異性抗体。
【０１５６】
７．ＣＤ３−ＦａｂおよびＢＣＭＡ−Ｆａｂが、それらのＣ末端を介してＦｃパートのヒンジ領域へと連結されている１つのＣＤ３−Ｆａｂと、１つのＢＣＭＡ−Ｆａｂと、前記Ｆｃパートと、Ｃ末端によりＣＤ３−ＦａｂのＮ末端へと連結された第２のＢＣＭＡ−Ｆａｂとからなり、ＣＤ３−Ｆａｂが、クロスオーバーを含み、ＣＤ３−Ｆａｂまたは両方のＢＣＭＡ−Ｆａｂが、アミノ酸置換を含む（図２Ａおよび２Ｂ）ことを特徴とする、実施形態６に従う二特異性抗体。
【０１５７】
８．ＢＣＭＡ−Ｆａｂ−Ｆｃ−ＣＤ３−Ｆａｂ−ＢＣＭＡ−Ｆａｂからなり、両方のＢＣＭＡ−Ｆａｂが、アミノ酸置換を含み、ＣＤ３−Ｆａｂが、ＶＬ／ＶＨクロスオーバーを含むことを特徴とする、実施形態７に従う二特異性抗体。
【０１５８】
９．それらのＣ末端を介してＦｃパートのヒンジ領域へと連結されている２つのＢＣＭＡ−Ｆａｂと、前記Ｆｃパートと、ＢＣＭＡ−Ｆａｂが、Ｃ末端により１つのＢＣＭＡ−ＦａｂのＮ末端へと連結されているＣＤ３−Ｆａｂとからなり、ＣＤ３−Ｆａｂが、クロスオーバーを含み、ＣＤ３−Ｆａｂまたは両方のＢＣＭＡ−Ｆａｂが、アミノ酸置換を含む（図２Ｃおよび２Ｄ）ことを特徴とする、実施形態１に従う二特異性抗体。
【０１５９】
１０．そのＣ末端を介して、前記Ｆｃパートのヒンジ領域へと連結された、１つのＣＤ３−Ｆａｂと、そのＣ末端により、ＣＤ３−ＦａｂのＮ末端へと連結されたＢＣＭＡ−Ｆａｂとからなり、ＣＤ３−ＦａｂまたはＢＣＭＡ−Ｆａｂのいずれかが、アミノ酸置換を含む（図３Ａおよび３Ｂ）ことを特徴とする、実施形態１から５のいずれか１つに従う二特異性抗体。
【０１６０】
１１．そのＣ末端を介して、前記Ｆｃパートのヒンジ領域へと連結された、１つのＢＣＭＡ−Ｆａｂと、そのＣ末端により、ＢＣＭＡ−ＦａｂのＮ末端へと連結されたＣＤ３−Ｆａｂとからなり、ＣＤ３−ＦａｂまたはＢＣＭＡ−Ｆａｂのいずれかが、アミノ酸置換を含む（図３Ｃおよび３Ｄ）ことを特徴とする、実施形態１から６のいずれか１つに従う二特異性抗体。
【０１６１】
１２．抗ＢＣＭＡ抗体８３Ａ１０、１７Ａ５、または１３Ａ４のＣＤＲ配列を含むことを特徴とする、実施形態１から６のいずれか１つに従う二特異性抗体。
【０１６２】
１３．抗ＢＣＭＡ抗体８３Ａ１０、１７Ａ５、もしくは１３Ａ４のＶＨおよびＶＬ配列を含むことを特徴とする、実施形態１から６のいずれか１つに従う二特異性抗体、または抗ＢＣＭＡ抗体８３Ａ１０、１７Ａ５、または１３Ａ４のＶＨ、ＶＬ、ＣＨ１、およびＣＬ配列を含む抗体。
【０１６３】
１４．ヒトＣＤ３に特異的に結合する抗体部分、好ましくは、Ｆａｂ断片が、配列番号１、２、および３の重鎖ＣＤＲを、それぞれ、抗ＣＤ３ε抗体（ＣＤＲ  ＭＡＢ  ＣＤ３）の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３として含む可変ドメインＶＨと、配列番号４、５、および６の軽鎖ＣＤＲを、それぞれ、抗ＣＤ３ε抗体（ＣＤＲ  ＭＡＢ  ＣＤ３）の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３として含む可変ドメインＶＬとを含むことを特徴とすることを特徴とする、実施形態１から６のいずれか１つに従う二特異性抗体。
【０１６４】
１５．ヒトＣＤ３に特異的に結合する抗体部分が、可変ドメインが、配列番号７および８（ＶＨＶＬ  ＭＡＢ  ＣＤ３）の可変ドメインであることを特徴とすることを特徴とする、実施形態１から６のいずれか１つに従う二特異性抗体。
【０１６５】
１６．ヒトＢＣＭＡに特異的に結合するＦａｂ断片が、重鎖ＣＤＲ、配列番号２１のＣＤＲ１Ｈ、配列番号２４のＣＤＲ２Ｈ、配列番号２７のＣＤＲ３Ｈを含む可変ドメインＶＨを含むことと、軽鎖ＣＤＲ、配列番号３０のＣＤＲ１Ｌ、配列番号３３のＣＤＲ２Ｌ、配列番号３６のＣＤＲ３Ｌを含む可変ドメインＶＬを含むこととを特徴とする（ＣＤＲ  ＭＡＢ  ８３Ａ１０）ことを特徴とする、実施形態１から６のいずれか１つに従う二特異性抗体。
【０１６６】
１７．ヒトＢＣＭＡに特異的に結合するＦａｂ断片が、重鎖ＣＤＲ、配列番号２２のＣＤＲ１Ｈ、配列番号２５のＣＤＲ２Ｈ、配列番号２８のＣＤＲ３Ｈを含む可変ドメインＶＨと、軽鎖の配列番号３１のＣＤＲ１Ｌ、配列番号３４のＣＤＲ２Ｌ、配列番号３７のＣＤＲ３Ｌを含む可変ドメインＶＬとを含むことを特徴とする（ＣＤＲ  ＭＡＢ  １７Ａ５）ことを特徴とする、実施形態１から６のいずれか１つに従う二特異性抗体。
【０１６７】
１８．ヒトＢＣＭＡに特異的に結合するＦａｂ断片が、重鎖ＣＤＲ、配列番号２３のＣＤＲ１Ｈ、配列番号２６のＣＤＲ２Ｈ、配列番号２９のＣＤＲ３Ｈを含む可変ドメインＶＨと、軽鎖の配列番号３２のＣＤＲ１Ｌ、配列番号３５のＣＤＲ２Ｌ、配列番号３８のＣＤＲ３Ｌを含む可変ドメインＶＬとを含むことを特徴とする（ＣＤＲ  ＭＡＢ  １３Ａ４）ことを特徴とする、実施形態１から６のいずれか１つに従う二特異性抗体。
【０１６８】
１９．ヒトＢＣＭＡに特異的に結合するＦａｂ断片が、配列番号１５のＶＨと、配列番号１８のＶＬとを含むことを特徴とする（ＶＨＶＬ  ＭＡＢ  ８３Ａ１０）ことを特徴とする、実施形態１から６のいずれか１つに従う二特異性抗体。
【０１６９】
２０．ヒトＢＣＭＡに特異的に結合するＦａｂ断片が、配列番号１６のＶＨと、配列番号１９のＶＬとを含むことを特徴とする（ＶＨＶＬ  ＭＡＢ  １７Ａ５）ことを特徴とする、実施形態１から６のいずれか１つに従う二特異性抗体。
【０１７０】
２１．ヒトＢＣＭＡに特異的に結合するＦａｂ断片が、配列番号１７のＶＨと、配列番号２０のＶＬとを含むことを特徴とする（ＶＨＶＬ  ＭＡＢ  １３Ａ４）ことを特徴とする、実施形態１から６のいずれか１つに従う二特異性抗体。
【０１７１】
２２．定常ドメインＣＬ内の１２４位におけるアミノ酸の置きかえに加えて、１２３位におけるアミノ酸も、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈ）により独立に置換されていることを特徴とする、実施形態１から２１のいずれか１つに従う二特異性抗体。
【０１７２】
２３．アミノ酸１２４がＫであり、アミノ酸１４７がＥであり、アミノ酸２１３がＥであり、アミノ酸１２３がＲであることを特徴とする、実施形態１から２２のいずれか１つに従う二特異性抗体。
【０１７３】
２４．ヒトＢＣＭＡの細胞外ドメインおよびヒトＣＤ３εに特異的に結合する二特異性抗体であって、ポリペプチド、
ｉ）配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、および配列番号４６（セット１）、
ｉｉ）配列番号４５、配列番号４７、配列番号４８、および配列番号４９（セット２）、ならびに
ｉｉｉ）配列番号４５、配列番号５０、配列番号５１、および配列番号５２（セット３）
からなる群から選択される、重鎖および軽鎖のセットを含むことを特徴とする二特異性抗体。
【０１７４】
２５．ヒトＣＤ３εに特異的に結合する抗体部分内で、配列番号１、２、および３の重鎖ＣＤＲを、それぞれ、抗ＣＤ３ε抗体の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３として含む可変ドメインＶＨにより、可変ドメインＶＨが置きかえられ、配列番号４、５、および６の軽鎖ＣＤＲを、それぞれ、抗ＣＤ３ε抗体の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３として含む可変ドメインＶＬにより、可変ドメインＶＬが置きかえられることを特徴とする、実施形態２４に従う抗体。
【０１７５】
２６．一方の重鎖のＣＨ３ドメインおよび他方の重鎖のＣＨ３ドメインの各々が、抗体のＣＨ３ドメインの間の、元の界面を含む界面において向かい合い、前記界面が、二特異性抗体の形成を促進するように変更されていることを特徴とし、変更が、
ａ）二特異性抗体内の他方の重鎖のＣＨ３ドメインの元の界面と向かい合う、一方の重鎖のＣＨ３ドメインの元の界面で、アミノ酸残基が、より大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置きかえられ、これにより、一方の重鎖のＣＨ３ドメインの界面内に、他方の重鎖のＣＨ３ドメインの界面内の空洞にはまる突起が作出されるように、一方の重鎖のＣＨ３ドメインが変更されていることと、
ｂ）二特異性抗体内の第１のＣＨ３ドメインの元の界面と向かい合う、第２のＣＨ３ドメインの元の界面内で、アミノ酸残基が、より小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置きかえられ、これにより、第２のＣＨ３ドメインの界面内に、第１のＣＨ３ドメインの界面内の突起がはまる空洞が作出されるように、他方の重鎖のＣＨ３ドメインが変更されていることと
を特徴とする、実施形態１から２５のいずれか１つに従う抗体。
【０１７６】
２７．実施形態１から２６のいずれか１つに従う二特異性抗体を調製するための方法であって、
ａ）宿主細胞を、実施形態１から２６のいずれか１つに従う抗体の軽鎖および重鎖をコードする核酸分子を含むベクターで形質転換するステップと、
ｂ）宿主細胞を、前記抗体分子の合成を可能とする条件下で培養するステップと、
ｃ）前記抗体分子を、前記培養物から回収するステップと
を含む方法。
【０１７７】
２８．実施形態１から２６のいずれか１つに従う抗体の軽鎖および重鎖をコードする核酸分子を含むベクターを含む宿主細胞。
【０１７８】
２９．実施形態１から２６のいずれか１つに従う抗体および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
【０１７９】
３０．医薬としての使用のための、実施形態１から２６のいずれか１つに従う抗体、または実施形態２９に従う医薬組成物。
【０１８０】
３１．形質細胞障害の処置における医薬としての使用のための、実施形態１から２６のいずれか１つに従う抗体、または実施形態２９の医薬組成物。
【０１８１】
３２．多発性骨髄腫の処置における医薬としての使用のための、実施形態１から２６のいずれか１つに従う抗体、または実施形態２９の医薬組成物。
【０１８２】
３３．多発性骨髄腫のような形質細胞障害、またはＢＣＭＡを発現する他のＢ細胞障害の処置のための、実施形態１から２６のいずれか１つに従う抗体、または実施形態２９の医薬組成物。
【０１８３】
３４．ヒトＩｇＧ１  Ｆｃパート内に、Ｐｒｏ３２９の、グリシンもしくはアルギニンによるアミノ酸置換、ならびに／または置換Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａを含むことを特徴とする、実施形態１から２５のいずれか１つに従う抗体。
【０１８４】
以下の例、配列表、および図は、本発明の理解の一助とするために提示するものであり、本発明の真の範囲は、付属の特許請求の範囲で記される。本発明の精神から逸脱することなく、記される手順に改変を施しうることが理解される。
【０１８５】
材料および一般的方法
【０１８６】
組換えＤＮＡ技法
Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８９年において記載されている、標準的方法を使用して、ＤＮＡを取り扱った。分子生物学的試薬は、製造元の指示書に従い使用した。ヒト免疫グロブリンの軽鎖および重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的な情報は、Ｋａｂａｔ，  Ｅ．Ａ．ら、（１９９１年）、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５版、ＮＩＨ刊行物番号９１−３２４２において与えられている。抗体鎖のアミノ酸は、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、（１９９１年）に従い番号付けされ、言及された。
【０１８７】
遺伝子の合成
ａ）所望の遺伝子セグメントは、化学合成により制作されたオリゴヌクレオチドから調製した。単一の制限エンドヌクレアーゼ切断部位に挟まれた、６００〜１８００ｂｐ長の遺伝子セグメントを、ＰＣＲ増幅を含む、オリゴヌクレオチドのアニーリングおよびライゲーションによりアセンブルし、その後、指し示される制限部位、例えば、Ｋｐｎｌ／ＳａｄまたはＡｓｃｌ／Ｐａｃｌを介して、ｐＰＣＲＳｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ベースのｐＧＡ４クローニングベクターへとクローニングした。サブクローニングされた遺伝子断片のＤＮＡ配列は、ＤＮＡシークエンシングにより確認した。遺伝子合成断片は、Ｇｅｎｅａｒｔ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で提供されている仕様に従い、注文した。
【０１８８】
ｂ）要請される場合、所望の遺伝子セグメントは、適切な鋳型を使用するＰＣＲにより作出するか、またはＧｅｎｅａｒｔ  ＡＧ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって、自動式遺伝子合成により、合成オリゴヌクレオチドおよびＰＣＲ産物から合成した。単一の制限エンドヌクレアーゼ切断部位に挟まれた遺伝子セグメントは、標準的な発現ベクターまたはさらなる解析のためのシークエンシングベクターへとクローニングした。プラスミドＤＮＡは、市販されているプラスミド精製キットを使用して、形質転換された細菌から精製した。プラスミド濃度は、ＵＶ分光法により決定した。サブクローニングされた遺伝子断片のＤＮＡ配列は、ＤＮＡシークエンシングにより確認した。遺伝子セグメントは、それぞれの発現ベクターへのサブクローニングを可能とする、適切な制限部位によりデザインした。要請される場合、タンパク質コード遺伝子は、タンパク質を、真核細胞内の分泌へとターゲティングする、リーダーペプチドをコードする５’末端のＤＮＡ配列によりデザインした。
【０１８９】
ＤＮＡの配列決定
ＤＮＡ配列は、二本鎖シークエンシングにより決定した。
【０１９０】
ＤＮＡおよびタンパク質の配列解析ならびに配列データの管理
Ｃｌｏｎｅ  Ｍａｎａｇｅｒ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＆  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）ソフトウェアパッケージバーション９．２を、配列のマッピング、解析、注釈づけ、および例示のために使用した。
【０１９１】
発現ベクター
ａ）下で記載される抗体鎖を含む融合遺伝子は、ＰＣＲおよび／または遺伝子合成により作出し、対応する核酸セグメントの接続であって、例えば、それぞれのベクター内で固有の制限部位を使用する接続によって、公知の組換え方法および技法によりアセンブルした。サブクローニングされた核酸配列は、ＤＮＡシークエンシングにより検証した。一過性トランスフェクションのためには、形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ培養物（Ｎｕｃｌｅｏｂｏｎｄ  ＡＸ、Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）からのプラスミド調製により、より大量のプラスミドを調製する。
【０１９２】
ｂ）抗ＢＣＭＡ抗体の発現ベクターを作出するために、重鎖および軽鎖ＤＮＡ配列の可変領域を、哺乳動物細胞系内の発現に最適化された、それぞれの汎用レシピエント発現ベクターへとあらかじめ挿入された、ヒトＩｇＧ１定常重鎖またはｈｕｍ  ＩｇＧ１定常軽鎖のいずれかとインフレームでサブクローニングした。抗体の発現は、ＣＭＶエンハンサーおよびＭＰＳＶプロモーターに続いて、５’ＵＴＲ、イントロン、およびＩｇカッパＭＡＲエレメントを含むキメラＭＰＳＶプロモーターにより駆動する。転写は、ＣＤＳの３’末端における合成ポリＡシグナル配列により終結させる。全てのベクターは、タンパク質を、真核細胞内の分泌へとターゲティングする、リーダーペプチドをコードする５’末端のＤＮＡ配列を保有する。加えて、各ベクターは、ＥＢＶ  ＥＢＮＡ発現細胞内のエピソームのプラスミド複製のためのＥＢＶ  ＯｒｉＰ配列も含有する。
【０１９３】
ｃ）ＢＣＭＡ×ＣＤ３二特異性抗体ベクターを作出するために、ＩｇＧ１由来の二特異性分子は、少なくとも、２つの顕著に異なる抗原性決定基ＣＤ３およびＢＣＭＡに特異的に結合することが可能な、２つの抗原結合性部分からなる。抗原結合性部分とは、各々が、可変領域および定常領域を含む、重鎖および軽鎖から構成されるＦａｂ断片である。Ｆａｂ断片のうちの少なくとも１つは、ＶＨとＶＬとを交換した、「Ｃｒｏｓｓｆａｂ」断片であった。Ｆａｂ断片内のＶＨとＶＬとの交換により、特異性の異なるＦａｂ断片が、同一のドメインの並びを有さないことを確保する。二特異性分子のデザインは、ＣＤ３について一価であり、ＢＣＭＡについて二価であり、この場合、１つのＦａｂ断片を、内側のＣｒｏｓｓＦａｂ（２＋１）のＮ末端へと融合させた。二特異性分子は、分子の半減期が長くなるように、Ｆｃパートを含有した。構築物の概略表示を、図２に与え、構築物の好ましい配列を、配列番号３９〜５２に示す。分子は、ポリマーベースのトランスフェクションを使用して、懸濁液中で成長するＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞に、哺乳動物用発現ベクターを共トランスフェクトすることにより作製した。２＋１  ＣｒｏｓｓＦａｂ−ＩｇＧ構築物を調製するために、細胞に、対応する発現ベクターを、１：２：１：１の比（「Ｆｃ（ノブ）ベクター」：「軽鎖ベクター」：「軽鎖  ＣｒｏｓｓＦａｂベクター」：「重鎖−ＣｒｏｓｓＦａｂベクター」）でトランスフェクトした。
【０１９４】
細胞培養技法
Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０００年）、Ｂｏｎｉｆａｃｉｎｏ，Ｊ．Ｓ．、Ｄａｓｓｏ，Ｍ．、Ｈａｒｆｏｒｄ，Ｊ．Ｂ．、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｊ．、およびＹａｍａｄａ，Ｋ．Ｍ．（編）、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．において記載されている、標準的な細胞培養技法を使用する。
【０１９５】
ＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ系）内の一過性発現
二特異性抗体は、ポリマーベースのトランスフェクションを使用して、懸濁液中で培養される、ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞内の、それぞれの哺乳動物用発現ベクターの一過性共トランスフェクションにより発現させた。トランスフェクションの１日前に、ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を、６ｍＭのＬ−グルタミンを補充した、Ｅｘ−Ｃｅｌｌ培地中に、生細胞１５０万個／ｍＬで播種した。最終的な産生容量１ｍＬ当たり、生細胞２００万個を遠心分離した（２１０×ｇで５分間）。上清を吸引し、細胞を、１００μＬのＣＤ  ＣＨＯ培地中に再懸濁させた。最終的な産生容量１ｍＬ当たりのＤＮＡは、１μｇのＤＮＡ（重鎖：修飾重鎖：軽鎖：修飾軽鎖の比＝１：１：２：１）を、１００μＬのＣＤ  ＣＨＯ培地中で混合することにより調製した。０．２７μＬのポリマーベースの溶液（１ｍｇ／ｍＬ）を添加した後で、混合物を、１５秒間ボルテックスし、室温で１０分間放置した。１０分後、再懸濁させた細胞およびＤＮＡ／ポリマーベースの溶液混合物をまとめ、次いで、適切な容器へと移し、これを、振とうデバイス（３７℃、５％のＣＯ２）内に置いた。３時間のインキュベーション時間後に、６ｍＭのＬ−グルタミン、１．２５ｍＭのバルプロ酸、および１２．５％のＰｅｐｓｏｙ（５０ｇ／Ｌ）を補充した、８００μＬのＥｘ−Ｃｅｌｌ  Ｍｅｄｉｕｍを、最終的な産生容量１ｍＬ当たり添加した。２４時間後、７０μＬのフィード溶液を、最終的な産生容量１ｍＬ当たり添加した。７日後、または細胞の生存率が、７０％と等しいかまたはそれ未満となったところで、遠心分離および滅菌濾過により、細胞を、上清から分離した。抗体は、アフィニティーステップ、ならびにカチオン交換クロマトグラフィーおよびサイズ除外クロマトグラフィーである、１つまたは２つの仕上げステップにより精製した。要請される場合は、さらなる仕上げステップも使用した。組換え抗ＢＣＭＡヒト抗体および二特異性抗体は、ポリマーベースのトランスフェクションを使用して、懸濁液中で、ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞に、哺乳動物用発現ベクターを共トランスフェクトすることにより作製した。細胞には、フォーマットに応じて、２つまたは４つのベクターをトランスフェクトした。ヒトＩｇＧ１では、一方のプラスミドにより、重鎖をコードし、他方のプラスミドにより、軽鎖をコードした。二特異性抗体では、４つのプラスミドを共トランスフェクトした。これらのうちの２つにより、２つの異なる重鎖をコードし、他の２つにより、２つの異なる軽鎖をコードした。トランスフェクションの１日前に、ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を、６ｍＭのＬ−グルタミンを補充した、Ｆ１７  Ｍｅｄｉｕｍ中に、生細胞１５０万個／ｍＬで播種した。
【０１９６】
タンパク質の決定
抗体濃度の決定は、０．１％の抗体溶液の吸光度についての理論値を使用する、２８０ｎｍにおける吸光度の測定により行った。この値は、アミノ酸配列に基づくものであり、ＧＰＭＡＷソフトウェア（Ｌｉｇｈｔｈｏｕｓｅ  ｄａｔａ）により計算した。
【０１９７】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｐｒｅ−Ｃａｓｔゲルシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、製造元の指示書に従い使用する。特に、１０％または４〜１２％のＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）Ｂｉｓ−ＴＲＩＳ  Ｐｒｅ−Ｃａｓｔゲル（ｐＨ６．４）およびＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＭＥＳ（還元ゲル、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔランニングバッファー添加剤を伴う）、またはＭＯＰＳ（非還元ゲル）ランニングバッファーを使用する。
【０１９８】
タンパク質の精製
プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによる精製
アフィニティーステップのために、上清を、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．５  ６ＣＶで平衡化させたプロテインＡカラム（ＨｉＴｒａｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＦＦ、５ｍＬ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にロードした。同じ緩衝液による洗浄ステップの後で、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、１００ｍＭの塩化ナトリウム、１００ｍＭのグリシン、ｐＨ３．０による段階的溶出によって、抗体を、カラムから溶出させた。所望の抗体を伴う画分を、０．５Ｍのリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０（１：１０）で速やかに中和し、プールし、遠心分離により濃縮した。濃縮物は、滅菌濾過し、さらにカチオン交換クロマトグラフィーおよび／またはサイズ除外クロマトグラフィーに掛けた。
【０１９９】
カチオン交換クロマトグラフィーによる精製
カチオン交換クロマトグラフィーステップのために、濃縮されたタンパク質を、アフィニティーステップのために使用した溶出緩衝液で、１：１０に希釈し、カチオン交換カラム（Ｐｏｒｏｓ  ５０  ＨＳ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）へとロードした。それぞれ、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、２０ｍＭのトリス、ｐＨ５．０、および２０ｍＭのリン酸ナトリウム、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、２０ｍＭのトリス、１００ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ５．０である、平衡緩衝液および洗浄緩衝液による、２回の洗浄ステップの後で、タンパク質を、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、２０ｍＭのトリス、１００ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ８．５を使用する勾配により溶出させた。所望の抗体を含有する画分は、プールし、遠心分離により濃縮し、滅菌濾過し、さらにサイズ除外ステップに掛けた。
【０２００】
解析用サイズ除外クロマトグラフィーによる精製
サイズ除外ステップのために、濃縮されたタンパク質を、製剤緩衝液としての、Ｔｗｅｅｎ２０を伴うかまたは伴わない、２０ｍＭのヒスチジン、１４０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ６．０と共に、ＸＫ１６／６０  ＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に注入した。単量体を含有する画分は、プールし、遠心分離により濃縮し、滅菌バイアルへと滅菌濾過した。
【０２０１】
純度および単量体含量の測定
最終タンパク質調製物の純度および単量体含量は、２５ｍＭのリン酸カリウム、１２５ｍＭの塩化ナトリウム、２００ｍＭのＬ−アルギニン一塩酸塩、０．０２％（ｗ／ｖ）のアジ化ナトリウム、ｐＨ６．７による緩衝液中で、ＣＥ−ＳＤＳ（Ｃａｌｉｐｅｒ  ＬａｂＣｈｉｐ  ＧＸＩＩシステム（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ））およびＨＰＬＣ（ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００  ＳＷ  ＸＬ解析用サイズ除外カラム（Ｔｏｓｏｈ））のそれぞれにより決定した。
【０２０２】
ＬＣ−ＭＳ解析による分子量の確認
脱グリコシル化
分子の均質の調製を確認するために、最終タンパク質溶液を、ＬＣ−ＭＳ解析により解析した。炭水化物により導入される異質性を除去するために、構築物を、ＰＮＧａｓｅＦ（ＰｒｏＺｙｍｅ）で処理する。したがって、２Ｍのトリス２μを、濃度を０．５ｍｇ／ｍｌとする２０μｇのタンパク質へと添加することにより、タンパク質溶液のｐＨを、ｐＨ７．０へと調整した。０．８μｇのＰＮＧａｓｅＦを、添加し、３７℃で１２時間インキュベートした。
【０２０３】
ＬＣ−ＭＳ解析−オンライン検出
ＬＣ−ＭＳ法は、ＴＯＦ  ６４４１質量分析計（Ａｇｉｌｅｎｔ）へとカップリングさせた、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＨＰＬＣ  １２００上で実施した。クロマトグラフィーによる分離は、Ｍａｃｈｅｒｅｙ  Ｎａｇｅｌ  Ｐｏｌｙｓｔｅｒｅｎｅカラム；ＲＰ１０００−８（粒子サイズを８μｍとする、４．６×２５０ｍｍ；カタログ番号７１９５１０）上で実施した。溶離液Ａは、水中に５％のアセトニトリル、および０．０５％（ｖ／ｖ）のギ酸であり、溶離液Ｂは、９５％のアセトニトリル、５％の水、および０．０５％のギ酸であった。流量は、１ｍｌ／分であり、分離は、４０℃で実施し、前に記載した処理により、６μｇ（１５μｌ）のタンパク質試料を得た。
【表３２】
2020122013.tif 000006
【０２０４】
最初の４分間の間、質量分析計を塩汚染から保護するように、溶出液を、廃棄物へと方向づけた。ＥＳＩ源は、乾燥ガス流量を１２ｌ／分とし、温度を３５０℃とし、噴霧器圧力を６０ｐｓｉとして動作させた。ＭＳスペクトルは、陽イオンモードにおいて、３８０Ｖのフラグメンター電圧および７００〜３２００ｍ／ｚの質量範囲を使用して取得した。ＭＳデータは、計器ソフトウェアにより、４〜１７分間にわたり取得した。
【０２０５】
ＰＢＭＣからの初代ヒト汎Ｔ細胞の単離
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ密度遠心分離により、地域の血液バンク、または健常ヒトドナーに由来する採取したての血液から得られる、富化されたリンパ球調製物（軟膜）から調製した。略述すると、血液を、滅菌ＰＢＳで希釈し、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ勾配（Ｓｉｇｍａ、Ｈ８８８９）にわたり、注意深く層化させた。４５０×ｇ、室温で３０分間遠心分離の後（ブレーキをオフに切り替える）、ＰＢＭＣを含有する相間部の上方の血漿部分を廃棄した。ＰＢＭＣを、新しい５０ｍｌ  Ｆａｌｃｏｎチューブへと移し、チューブを、ＰＢＳで、５０ｍｌの総容量まで満たした。混合物を、４００×ｇ、室温で１０分間遠心分離した（ブレーキをオンに切り替える）。上清を廃棄し、ＰＢＭＣペレットを、滅菌ＰＢＳで２回洗浄した（３５０×ｇ、４℃で１０分間の遠心分離ステップ）。結果として得られるＰＢＭＣ集団を、自動的にカウントし（ＶｉＣｅｌｌ）、アッセイ開始まで、インキュベーター内、３７℃、５％のＣＯ２、１０％のＦＣＳ、および１％のＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ、Ｋ０３０２）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地中で保存した。
【０２０６】
ＰＢＭＣからのＴ細胞の富化は、製造元の指示書に従い、Ｐａｎ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ＩＩ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ型番１３０−０９１−１５６）を使用して実施した。略述すると、細胞ペレットを、細胞１０００万個当たり４０μｌの低温緩衝液（滅菌濾過された、０．５％のＢＳＡ、２ｍＭのＥＤＴＡを伴うＰＢＳ）中で希釈し、細胞１０００万個当たり１０μｌのビオチン−抗体カクテルと共に、４℃で１０分間インキュベートした。細胞１０００万個当たり３０μｌの低温緩衝液および２０μｌの抗ビオチン磁気ビーズを添加し、混合物を、４℃でさらに１５分間インキュベートした。現行容量の１０〜２０倍容量を添加することにより、細胞を洗浄し、その後、３００×ｇで１０分間遠心分離ステップにかけた。最大１億個の細胞を、５００μｌの緩衝液中に再懸濁させた。標識されていないヒト汎Ｔ細胞の磁気による分離は、製造元の指示書に従い、ＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ型番１３０−０４２−４０１）を使用して実施した。結果として得られるＴ細胞集団を、自動的にカウントし（ＶｉＣｅｌｌ）、アッセイ開始まで、インキュベーター内、３７℃、５％のＣＯ２、ＡＩＭ−Ｖ培地中で保存した（２４時間より長くない）。
【０２０７】
ＰＢＭＣからの初代ヒトナイーブＴ細胞の単離
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ密度遠心分離により、地域の血液バンク、または健常ヒトドナーに由来する採取したての血液から得られる、富化されたリンパ球調製物（軟膜）から調製した。ＰＢＭＣからのＴ細胞の富化は、製造元の指示書に従い、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ（型番１３０−０９３−２４４）製のＮａｉｖｅ  ＣＤ８＋  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを使用して実施したが、ＣＤ８＋Ｔ細胞の最後の単離ステップは省略した（初代ヒト汎Ｔ細胞の単離についての記載もまた参照されたい）。
【０２０８】
ヘパリン処理された血液からの初代カニクイザルＰＢＭＣの単離
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、密度遠心分離により、健常カニクイザルドナーに由来する採取したての血液から、以下の通りに調製した：ヘパリン処理された血液を、滅菌ＰＢＳで１：３に希釈し、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ培地（Ａｘｏｎ  Ｌａｂ型番１１１４５４５）を、滅菌ＰＢＳで９０％まで希釈した。２倍容量の希釈された血液を、１倍容量の、希釈された密度勾配にわたり層化させ、ＰＢＭＣ画分を、５２０×ｇ、室温で、ブレーキを伴わない、３０分間の遠心分離により分離した。ＰＢＭＣバンドを、新しい５０ｍｌ  Ｆａｌｃｏｎチューブへと移し、滅菌ＰＢＳで、４００×ｇ、４℃で１０分間の遠心分離によって洗浄した。１回の低速遠心分離（１５０×ｇ、４℃で１５分間）を実施して、血小板を除去し、結果として得られるＰＢＭＣ集団を、自動的にカウントし（ＶｉＣｅｌｌ）、さらなるアッセイのために速やかに使用した。
【実施例】
【０２０９】
（実施例１）
抗ＢＣＭＡ抗体の作出
（実施例１．１）
抗原およびツール試薬の作製
（実施例１．１．１）
可溶性の組換えヒトＢＣＭＡ細胞外ドメイン
【０２１０】
ファージディスプレイ選択のための抗原として使用される、ヒトＢＣＭＡ、カニクイザルＢＣＭＡ、およびマウスＢＣＭＡの細胞外ドメインを、ＨＥＫ  ＥＢＮＡ細胞内で、Ｎ末端単量体のＦｃ融合体として一過性に発現させ、受容体鎖（Ｆｃノブ鎖）を保有するＦｃ部分のＣ末端に配置されたａｖｉタグ認識配列における、ＢｉｒＡビオチンリガーゼの共発現を介して、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、部位特異的にビオチニル化させた。ヒトＢＣＭＡ、カニクイザルＢＣＭＡ、およびマウスＢＣＭＡの細胞外ドメインは、それぞれ、メチオニン４〜アスパラギン５３、メチオニン４〜アスパラギン５２、およびアラニン２〜トレオニン４９を含んだ。これらを、Ｎ末端において、ヒトＩｇＧ１のヒンジへと融合させ、ＫＩＨ（ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ）技術による、非融合ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ部分（ホール鎖）とのヘテロ二量体化を可能とした。
【０２１１】
ＢＣＭＡの細胞外ドメインを回収するために、以下のプライマー：
ＢａｍＨ１部位（太字、下線を付す）を組み込む、ＡＡＧＣＴＴＧＧＡＴＣＣＡＴＧＴＴＧＣＡＧＡＴＧＧＣＴＧＧＧＣＡＧＴＧＣＴＣＣ−３（配列番号９）、および
リバースプライマー：５−ＧＡＡＴＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＴＣＣＴＴＴＣＡＣＴＧＡＡＴＴＧＧＴＣＡＣＡＣＴＴＧＣＡＴＴＡＣ−３（配列番号１０）；プライマー：５−ＡＣＧＴＴＡＧＡＴＣＴＣＣＡＣＴＣＡＧＴＣＣＴＧＣＡＴＣＴＴＧＴＴＣＣＡＧＴＴＡＡＣ−３（配列番号１１）、および
リバースプライマー：５−ＡＡＣＧＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＡＧＴＴＴＣＡＣＡＡＡＣＣＣＣＡＧＧ−３（配列番号１２）；
ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位（太字、下線を付す）およびＫｏｚａｋコンセンサス配列を含む、ＧＡＡＴＴＣＡＡＧＣＴＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＴＴＧＣＡＧＡＴＧＧＣＴＧＧＧＣＡＧＴＧＣＴＣＣ−３（配列番号１３）、ならびに
リバースプライマー：５−ＧＡＡＴＴＣＴＣＴＡＧＡＴＴＡＣＣＴＡＧＣＡＧＡＡＡＴＴＧＡＴＴＴＣＴＣＴＡＴＣＴＣＣＧＴＡＧＣ−３（配列番号１４）
を使用した。
【０２１２】
（実施例１．１．２）
組換え切断型マウスＡＰＲＩＬ
ファージディスプレイ選択およびＥＬＩＳＡのためのツール（競合物質）として使用される、組換え切断型マウスＡＰＲＩＬを、ＨＥＫ  ＥＢＮＡ細胞内で、Ｎ末端単量体のＦｃ融合体として一過性に発現させた。マウスＡＰＲＩＬは、ヒスチジン１０６〜ロイシン２４１を含んだ。マウスＡＰＲＩＬを、Ｎ末端において、ヒトＩｇＧ１のヒンジへと融合させ、ＫＩＨ（ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ）技術による、非融合ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ部分（ホール鎖）とのヘテロ二量体化を可能とした。
【０２１３】
（実施例１．２）
ツールとしてのＢＣＭＡ発現細胞
【０２１４】
（実施例１．２．１）
ヒトＢＣＭＡ、カニクイザルＢＣＭＡ、またはマウスＢＣＭＡをそれらの表面において発現する組換え細胞
ａ）全長ＢＣＭＡを一過性に発現させるＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞の作製
ＢＣＭＡを一過性に発現させるＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞は、ポリマーベースのトランスフェクションを使用して、懸濁液中で、ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞に、哺乳動物用発現ベクターをトランスフェクトすることにより作製した。細胞に、全長ヒトＢＣＭＡ、全長マウスＢＣＭＡ、または全長カニクイザルＢＣＭＡをコードする遺伝子を含有するベクターをトランスフェクトした。トランスフェクションの１日前に、ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を、６ｍＭのＬ−グルタミンを補充した、Ｅｘ−Ｃｅｌｌ（登録商標）ＧＴＭ−３培地中に、生細胞１５０万個／ｍＬで播種した。
【０２１５】
最終的な産生容量１ｍＬ当たり、生細胞２００万個を遠心分離した（２１０×ｇで５分間）。上清を吸引し、細胞を、１００ｕＬのＣＤ  ＣＨＯ培地中に再懸濁させた。最終的な産生容量１ｍＬ当たりのＤＮＡは、１ｕｇのＤＮＡを、１００ｕＬのＣＤ  ＣＨＯ培地中で混合することにより調製した。０．２７ｕＬのポリマーベースの溶液（１ｍｇ／ｍＬ）を添加した後で、混合物を、１５秒間にわたりボルテックスし、室温で１０分間放置した。１０分後、再懸濁させた細胞およびＤＮＡ／ポリマーベースの溶液混合物をまとめた。これを、適切な容器へと移し、これを、振とうデバイス（３７℃、５％のＣＯ２）内に置いた。３時間のインキュベーション時間後に、６ｍＭのＬ−グルタミン、１．２５ｍＭのバルプロ酸、および１２．５％のＰｅｐｓｏｙ（５０ｇ／Ｌ）を補充した、８００ｕＬのＦ１７  Ｍｅｄｉｕｍを、最終的な産生容量１ｍＬ当たり添加した。
【０２１６】
インキュベーションの２日後、一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を、遠心分離（２００×ｇ；１０分間）により採取した。上清の吸引の後、細胞ペレットを、Ｅｘ−ｃｅｌｌ（登録商標）ＧＴＭ−３培地と共に、要請される密度（細胞３０００万個／ｍＬ）で、静かに再懸濁させた。細胞を、クライオバイアル（１ｍＬ／バイアル）へと移し、低温保存ボックスに入れ、これを、摂氏４度で少なくとも１２時間、あらかじめ冷却し、摂氏−８０度で保存した。摂氏−８０度における７２時間後、細胞を、液体窒素中へと移した。
【０２１７】
ｂ）ＢＣＭＡを発現するＣＨＯ細胞系の作出
ヒトＢＣＭＡ、カニクイザルＢＣＭＡ、またはマウスＢＣＭＡを過剰発現するＣＨＯ細胞系は、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）の形質導入により作出した。レンチウイルスベースのウイルス様粒子は、ＨＥＫ２９３Ｔ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１１２６８）細胞への、ＶｉｒａＳａｆｅ（商標）Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇプラスミド（Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ、ＵＳＡ）と、ヒトＢＣＭＡ、マウスＢＣＭＡ、またはカニクイザルＢＣＭＡをコードするレンチウイルス発現ベクターとの共トランスフェクションにより作製した。プラスミドの、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞へのトランスフェクションは、製造元の指示書に従い、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＬＴＸ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＳＡ）により実施した。トランスフェクションは、２．５μｇのプラスミドＤＮＡを使用して、トランスフェクションの前日に、細胞６×１０５個／ウェルを播種された６ウェルプレート内で行った。各トランスフェクションは、０．４μｇのｐＲＳＶ−Ｒｅｖパッケージングベクター、０．４μｇのｐＣｇｐＶパッケージングベクター、０．４μｇのｐＣＭＶ−ＶＳＶ−Ｇエンベロープベクター、および１．３μｇのヒトＢ（ｐＥＴＲ１４３０５）、マウス（ｐＥＴＲ１４３０４）、またはカニクイザル（ｐＥＴＲ１４３０６）ＢＣＭＡの発現ベクターを含有した。ＶＬＰを含有する上清は、４８時間後に収集し、小孔サイズを０．４５μｍとするポリエーテルスルホン膜を介して濾過した。安定的なＢＣＭＡ発現細胞系を作出するために、ＣＨＯ細胞を、細胞１．０×１０６個／ウェルで、６ウェルプレート内に播種し、２ｍＬのＶＬＰを含有する上清を重層させた。形質導入は、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ  ５８１０  ｔａｂｌｅ−ｔｏｐ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、Ｇｅｒｍａｎｙ）内で、８００×ｇおよび３２℃で３０分間スピノキュレーションにより実行した。ウイルス上清は、スピノキュレーションの１２時間後に、未使用の培地と交換した。形質導入の３日後に、ピューロマイシンを、６μｇ／ｍＬまで添加し、細胞を、何代かの継代にわたり培養した。ＢＣＭＡ陽性細胞のプールは、交差反応性のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４４８で標識された抗ＢＣＭＡ抗体を使用する、ＦＡＣＳ分取（ＦＡＣＳ  ＡＲＩＡ、Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、ＵＳＡ）により得た。
【０２１８】
ｃ）カニクイザルＢＣＭＡを、それらの表面上で安定的に発現する組換え細胞
ｉ．ＢＣＭＡを安定的に発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞系の作出
ヒトＢＣＭＡまたはカニクイザルＢＣＭＡを過剰発現させるＨＥＫ２９３Ｔ（ＡＴＣＣ
ＣＲＬ１１２６８）細胞系は、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）の形質導入により作出した。レンチウイルスベースのウイルス様粒子は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞への、ＶｉｒａＳａｆｅ（商標）Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇプラスミド（Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ）と、ヒトＢＣＭＡまたはカニクイザルＢＣＭＡをコードするレンチウイルス発現ベクターとの共トランスフェクションにより作製した。プラスミドの、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞へのトランスフェクションは、製造元の指示書に従い、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＬＴＸ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により実施した。トランスフェクションは、２．５μｇのプラスミドＤＮＡを使用して、トランスフェクションの前日に、細胞６×１０５個／ウェルを播種された６ウェルプレート内で行った。各トランスフェクションは、０．４μｇのｐＲＳＶ−Ｒｅｖパッケージングベクター、０．４μｇのｐＣｇｐＶパッケージングベクター、０．４μｇのｐＣＭＶ−ＶＳＶ−Ｇエンベロープベクター、および１．３μｇのヒト（ｐＥＴＲ１４３０５）またはカニクイザル（ｐＥＴＲ１４３０６）ＢＣＭＡ発現ベクターを含有した。ＶＬＰを含有する上清は、４８時間後に収集し、小孔サイズを０．４５μｍとするポリエーテルスルホン膜を介して濾過した。安定的なＢＣＭＡ発現細胞系を作出するために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、細胞１．０×１０６個／ウェルで、６ウェルプレート内に播種し、１ｍＬのＶＬＰを含有する上清を重層させた。形質導入は、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ  ５８１０  ｔａｂｌｅ−ｔｏｐ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）内で、８００×ｇおよび３２℃で３０分間スピノキュレーションにより実行した。ウイルス上清は、スピノキュレーションの１２時間後に、未使用の培地と交換した。形質導入の３日後に、ピューロマイシンを、１μｇ／ｍＬまで添加し、細胞を、何代かの継代にわたり培養した。ＢＣＭＡ陽性細胞のクローンは、ヒト／カニクイザル交差反応性抗ＢＣＭＡ抗体（ＭＡＢ  ８３Ａ１０）と、二次抗体として、ＦＩＴＣコンジュゲートＦｃガンマ特異的ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、型番１０９−０９５−０９８）を使用する、ＦＡＣＳ分取（ＦＡＣＳ  ＡＲＩＡ、Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ）により得た。
【０２１９】
ｉｉ．ヒトＢＣＭＡおよびカニクイザルＢＣＭＡの発現の正常化
抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、型番Ｆ３１６５）を使用するフローサイトメトリー解析を、形質導入されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞内の、ＦＬＡＧでタグ付けされたカニクイザルＢＣＭＡとヒトＢＣＭＡとの同等な発現レベルを確認するのに使用した。細胞内ＦＬＡＧタグを、ヒトＢＣＭＡおよびカニクイザルＢＣＭＡのＣ末端へと融合させた。細胞内染色のために、細胞１０６個を洗浄し、パラホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳ中に１％のサポニンを使用して透過処理し、次いで、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体と共に、４℃で３０分間インキュベートした。細胞を、ＰＢＳですすぎ、ＲＰＥコンジュゲートヤギ抗マウス抗体（ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ、型番１０３００１）と共に、３０分間インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄し、フローサイトメトリー解析のために、１ｍＬのＰＢＳ／５％のＦＣＳ中で再懸濁させた。
【０２２０】
（実施例１．２．２）
それらの表面上でＢＣＭＡを発現するヒト骨髄腫細胞系
ＢＣＭＡの発現を、フローサイトメトリーにより、５つのヒト骨髄腫細胞系（ＮＣＩ−Ｈ９２９、ＲＰＭＩ−８２２６、Ｕ２６６Ｂ１、Ｌ−３６３およびＪＪＮ−３）上で評価した。ＮＣＩ−Ｈ９２９細胞（（Ｈ９２９）ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−９０６８（商標））を、１０〜２０％の熱不活化ＦＣＳを伴い、２ｍＭのＬ−グルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、および５０μＭのメルカプトエタノールを含有する場合もある、８０〜９０％のＲＰＭＩ  １６４０中で培養した。ＲＰＭＩ−８２２６細胞（（ＲＰＭＩ）ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ−１５５（商標））を、９０％のＲＰＭＩ  １６４０、および１０％の熱不活化ＦＣＳを含有する培地中で培養した。Ｕ２６６Ｂ１（（Ｕ２６６）ＡＴＣＣ（登録商標）ＴＩＢ−１９６（商標））細胞を、２ｍＭのＬ−グルタミン、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、４５００ｍｇ／Ｌのグルコース、および１５００ｍｇ／Ｌの炭酸水素ナトリウム、および１５％の熱不活化ＦＣＳを含有するように改変されたＲＰＭＩ−１６４０培地中で培養した。Ｌ−３６３細胞系（Ｌｅｉｂｎｉｚ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＤＳＭＺ（Ｇｅｒｍａｎ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ）；ＤＳＭＺ受託番号ＡＣＣ  ４９）を、８５％のＲＰＭＩ  １６４０、および１５％の熱不活化ＦＣＳ中で培養した。ＪＪＮ−３細胞系（ＤＳＭＺ受託番号ＡＣＣ  ５４１）を、４０％のダルベッコＭＥＭ＋４０％のイスコフＭＤＭ＋２０％の熱不活化ＦＢＳ中で培養した。略述すると、細胞を採取し、洗浄し、生存率についてカウントし、９６ウェル丸底プレートの細胞５０，０００個／ウェルで再懸濁させ、１０μｇ／ｍｌの抗ヒトＢＣＭＡ抗体（Ａｂｃａｍ、型番ａｂ５４８３４、マウスＩｇＧ１）と共に、４℃で３０分間インキュベートした（内部化を防止するように）。マウスＩｇＧ１を、アイソタイプ対照として使用した（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、型番５５４１２１）。次いで、細胞を遠心分離し（３５０×ｇで５分間）、２回洗浄し、ＦＩＴＣコンジュゲート抗マウス二次抗体と共に、４℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション時間の終了時に、細胞を遠心分離し（３５０×ｇで５分間）、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、１００ｕｌのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁させ、ＦＡＣＳ  Ｄｉｖａソフトウェアを作動させるＣａｎｔｏＩＩデバイス上で解析した。Ｈ９２９骨髄腫細胞系、ＲＰＭＩ−８２２６骨髄腫細胞系、およびＵ２６６Ｂ１骨髄腫細胞系の表面膜上のＢＣＭＡ受容体数の相対定量化は、ＱＩＦＩＫＩＴ解析（Ｄａｋｏ、型番Ｋ００７８、製造元の指示書に従う）により評価した。Ｈ９２９細胞は、ヒトＢＣＭＡを、他の骨髄腫細胞系の最大５〜６倍の最高密度で発現させた。Ｈ９２９は、ＢＣＭＡの発現が低度な骨髄腫細胞である、ＲＰＭＩ−８２２６、Ｕ２６６、およびＬ３６３と比較して、ＢＣＭＡの発現が高度な骨髄腫細胞系であると考えられる。表４および４Ａは、ヒト多発性骨髄腫細胞系の細胞表面上の相対ＢＣＭＡ受容体数についてまとめる。
【０２２１】
【表４】
2020122013.tif 000007
【０２２２】
【表４Ａ】
2020122013.tif 000008
【０２２３】
（実施例１．３）
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける組換えライブラリーからＢＣＭＡ結合剤を得ること
（実施例１．３．１）
汎用Ｆａｂライブラリーの構築
Ｆａｂフォーマットの汎用抗体ライブラリーは、ヒト生殖細胞系列遺伝子に基づき、以下のＶドメイン対合：ＤＰ４７−３ライブラリーのための、Ｖｋ３＿２０カッパ軽鎖の、ＶＨ３＿２３重鎖との対合、およびＤＰ８８−３ライブラリーのための、Ｖｋ１＿１７カッパ軽鎖の、ＶＨ１＿６９重鎖との対合を使用して構築する。いずれのライブラリーも、軽鎖のＣＤＲ３（Ｌ３）内および重鎖のＣＤＲ３（Ｈ３）内で無作為化し、ＳＯＥ（ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｂｙ  ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）−ＰＣＲにより、１つのライブラリー当たり３つの断片からアセンブルする。断片１が、無作為化されたＬ３を含む抗体遺伝子の５’末端を含み、断片２が、Ｌ３〜Ｈ３にわたる、中央の定常断片であるのに対し、断片３は、抗体遺伝子の無作為化されたＨ３および３’部分を含む。以下のプライマーの組合せを使用して、ＤＰ４７−３ライブラリーのためのライブラリー断片：断片１（ＬＭＢ３−ＬｉｂＬ１ｂ＿ｎｅｗ）、断片２（ＭＳ６３〜ＭＳ６４）、断片３（Ｌｉｂ２Ｈ−ｆｄｓｅｑｌｏｎｇ）を作出する。ＷＯ２０１２０２００３８の表１を参照されたい。以下のプライマーの組合せを使用して、ＤＰ８８−３ライブラリーのためのライブラリー断片：断片１（ＬＭＢ３−ＲＪＨ＿ＬＩＢ３）、断片２（ＲＪＨ３１〜ＲＪＨ３２）および断片３（ＬＩＢ８８＿２−ｆｄｓｅｑｌｏｎｇ）を作出する。ＷＯ２０１２０２００３８の表３および４を参照されたい。
【０２２４】
ライブラリー断片を作製するためのＰＣＲプロトコールは、９４℃で５分間の初期の変性；９４℃で１分間、５８℃で１分間、および７２℃で１分間による２５サイクル；ならびに７２℃で１０分間の終期の伸長を含む。アセンブリーＰＣＲのためには、等モル比の３つの断片を、鋳型として使用する。アセンブリーＰＣＲプロトコールは、９４℃で３分間の初期の変性；ならびに９４℃で３０秒間、５８℃で１分間、および７２℃で２分間による５サイクルを含む。この段階で、断片１〜３の外側の配列と相補的なプライマーを添加し、さらなる２０サイクルを実施してから、７２℃で１０分間終期の伸長を施す。十分な量の全長無作為化Ｆａｂ構築物のアセンブリーの後で、Ｆａｂ構築物を、同様に処理されるアクセプターファージミドベクターと共に、ＤＰ４７−３ライブラリーのためには、ＮｃｏＩ／ＮｏｔＩで消化し、ＤＰ８８−３ライブラリーのためには、ＮｃｏＩ／ＮｈｅＩで消化した。ＤＰ４７−３ライブラリーのためには、２２．８μｇのＦａｂライブラリーを、１６．２μｇのファージミドベクターとライゲーションする。ＤＰ８８−３ライブラリーのためには、３０．６μｇのＦａｂライブラリーを、３０．６μｇのファージミドベクターとライゲーションする。
【０２２５】
精製されたライゲーション物を、ＤＰ４７−３ライブラリーのための６８の形質転換、およびＤＰ８８−３ライブラリーのための６４の形質転換のそれぞれに使用して、最終的なＤＰ４７−３ライブラリーおよびＤＰ８８−３ライブラリーを得る。Ｆａｂライブラリーを提示するファージミド粒子をレスキューし、ＰＥＧ／ＮａＣｌ精製により精製して、抗ＢＣＭＡ  Ｆａｂクローンを選択するために使用する。
【０２２６】
（実施例１．３．２）
抗ＢＣＭＡ  Ｆａｂクローンの選択
抗ＢＣＭＡ  Ｆａｂは、ファージディスプレイにより、異なるＶドメインファミリーに由来するＶＬとＶＨとの対合からなる合成Ｆａｂライブラリーから確立した。クローン１７Ａ５および８３Ａ１０は、Ｖｋ３＿２０／ＶＨ３＿２３サブライブラリーから、クローン１３Ａ４は、Ｖｋ２Ｄ＿２８／ＶＨ５＿１サブライブラリーから、それぞれ、作出した（表５）。これらのライブラリーは、ＶＬドメインのＣＤＲ３（３つの異なる長さ）内およびＶＨドメインのＣＤＲ３（６つの異なる長さ）内の配列多様性を伴う完全ヒトフレームワークに基づく。
【０２２７】
【表５】
2020122013.tif 000009
【０２２８】
選択ラウンド（バイオパニング）は、以下のパターンに従い溶液中で実施した：１）抗原のＦｃ部分を認識する抗体のライブラリーを枯渇するための、１０ｕｇ／ｍｌの無関係なヒトＩｇＧでコーティングされたイムノチューブ内、ライブラリープール１つ当たり約１０１２個のファージミド粒子のプレクリアリング；２）Ｆｃ結合剤をさらに枯渇させるための、総容量２ｍｌ中、１００ｎＭの無関係な非ビオチニル化Ｆｃ  ＫＩＨ（ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ）構築物の存在下における、非Ｆｃ結合性ファージミド粒子の、１００ｎＭのビオチニル化ＢＣＭＡとの０．５時間のインキュベーション；３）パニング反応物を、ニュートラアビジンまたはストレプトアビジンあらかじめコーティングされたマイクロタイタープレート上の１６のウェルへと分配し、移すことによる、シェーカー上２０分間にわたる、ビオチニル化ＢＣＭＡおよび特異的結合性ファージの捕捉；４）プレート洗浄機を使用する、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０により１０〜３０回、およびＰＢＳにより１０〜３０回のそれぞれのウェルの洗浄；５）２３０ｎＭのマウスＡＰＲＩＬを添加することによって、天然リガンドの結合性部位を認識するＦａｂクローンを変位させ、こうして、ＡＰＲＩＬと競合しないファージ抗体について選択する、任意選択の競合的洗浄ステップ；６）１００ｍＭのＴＥＡ（トリエチルアミン）、ウェル１つ当たり１２５ｕｌの添加による、５〜１０分間のファージ粒子の溶出と、１Ｍのトリス／ＨＣｌ  ｐＨ７．４、等容量の添加による中和；７）対数期のＥ．ｃｏｌｉ  ＴＧ１細胞への、溶出させたファージ粒子の再感染、ヘルパーファージＶＣＳＭ１３の感染、シェーカー上、３０℃で一晩にわたるインキュベーション、および、その後における、次の選択ラウンドで使用されるファージミド粒子の、ＰＥＧ／ＮａＣｌ沈殿。
【０２２９】
選択は、一定の抗原濃度である１００ｎＭを使用して、３〜５ラウンドにわたり実行した。ヒトＢＣＭＡだけを抗原として使用する選択方策とは別に、交差反応性抗体について選択するために、カニクイザルＢＣＭＡまたはマウスＢＣＭＡもまた、ヒトＢＣＭＡと交互に使用する、さらなる選択方策も実行した。なおさらに、ストレプトアビジンプレートベースの捕捉に対する代替法として、ストレプトアビジンでコーティングされた磁気ビーズ５．４×１０７個の、パニング反応物への添加に続き、上で記載した条件下で、それぞれの磁石を使用する洗浄ステップによって、抗原：ファージ複合体の捕捉も実施した。
【０２３０】
特異的結合剤は、ＢｉｏＲａｄ製のＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６バイオセンサーを使用する、Ｆａｂを含有する細菌培養物上清の、表面プラズモン共鳴によるスクリーニングにより同定した。略述すると、対数期のＥ．ｃｏｌｉ  ＴＧ１細胞に、溶出させたファージ粒子を感染させた後、単一のコロニー形成単位（ｃｆｕ）をプレーティングし、１ｍｌの発現培養物の、９６ディープウェルプレートへの接種のために取り集めた。Ｆａｂは、８．０００〜１０．０００ＲＵのヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２断片特異的ポリクローナル抗体で誘導体化されたＰｒｏｔｅＯｎ  ＧＬＭチップ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、型番１０９−００５−００６）上で、上清から、垂直方向に捕捉した。その後、ヒトＢＣＭＡ、カニクイザルＢＣＭＡ、およびマウスＢＣＭＡ、ならびに無関係なＦｃ  ＫＩＨ（ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ）構築物を、解析物として水平方向に注入した。ＢＣＭＡへの有意な結合応答を呈示し、抗原のＦｃ部分に結合しなかったクローンを、０．５リットルの培養物容量中で細菌により発現させ、アフィニティー精製し、ＢｉｏＲａｄ製のＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６バイオセンサー上で、ワンショット反応速度プロトコールを使用する、ＳＰＲ解析により反応速度的に特徴付けた。
【０２３１】
（実施例２）
ＢＣＭＡ結合アッセイ：表面プラズモン共鳴
ａ）抗ＢＣＭＡ  Ｆａｂクローンのアフィニティー（ＫＤ）は、ニュートラアビジン捕捉により、ビオチニル化ヒトＢＣＭＡ、ビオチニル化カニクイザルＢＣＭＡ、およびビオチニル化マウスＢＣＭＡをＮＬＣチップ上に固定化して、２５℃でＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６計器（Ｂｉｏｒａｄ）を使用する、表面プラズモン共鳴により測定した（表６）。無関係なビオチニル化Ｆｃ  ＫＩＨ（ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ）構築物も同様に、陰性対照として固定化した。抗原（リガンド）の固定化：組換え抗原を、ＰＢＳＴ（１０ｍＭのリン酸塩、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．４、０．００５％のＴｗｅｅｎ
２０）で、１０ｕｇ／ｍｌへと希釈し、次いで、４０ｕｌ／分で３００秒間、垂直方向に注入した。解析物の注入：ワンショット反応速度測定のために、注入方向を、水平方向へと変化させ、会合時間を２００または３００秒間とし、解離時間を３００秒間として、精製Ｆａｂの２倍の希釈系列（濃度範囲を変化させる）を、チャネル１〜５に沿って、４０ｕｌ／分で、同時に注入した。基準化のための「インラインの」ブランクをもたらすように、６番目のチャネルに沿って、緩衝液（ＰＢＳＴ）を注入した。会合速度定数（ｋｏｎ）および解離速度定数（ｋｏｆｆ）は、ＰｒｏｔｅＯｎ  Ｍａｎａｇｅｒ  ｖ３．１ソフトウェアにおいて、単純な一対一ラングミュア結合モデルを使用して、会合センサーグラムと解離センサーグラムとを同時に当てはめることにより計算した。平衡解離定数（ＫＤ）は、ｋｏｆｆ／ｋｏｎの比として計算した。再生は、１０ｍＭのグリシン−ＨＣｌ  ｐＨ  １．５を、１００ｕｌ／分の流量で、１８秒間の接触時間使用して、水平方向で実施した。
【０２３２】
【表６】
2020122013.tif 000010
【０２３３】
ｂ）抗ＢＣＭＡ抗体の、組換えＢＣＭＡへの結合についての、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による評価は、以下の通りに行った。全てのＳＰＲ実験は、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００上、２５℃で、ＨＢＳ−ＥＰ（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％のＳｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｐ２０、Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）をランニングバッファーとして実施した。抗ＢＣＭＡ抗体と、組換えＢＣＭＡ  Ｆｃ（ｋｉｈ）（ヒト、カニクイザル、およびマウス）との相互作用のアビディティーを決定した。指示書（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）に従い、ビオチニル化組換えヒトＢＣＭＡ  Ｆｃ（ｋｉｈ）、ビオチニル化組換えカニクイザルＢＣＭＡ  Ｆｃ（ｋｉｈ）、およびビオチニル化組換えマウスＢＣＭＡ  Ｆｃ（ｋｉｈ）を、ＳＡチップ上に、直接カップリングさせた。固定化レベルは、２００〜７００ＲＵの範囲であった。抗ＢＣＭＡ抗体は、フローセルを介して、２倍の濃度範囲（１．９５〜５００ｎＭ）、３０μＬ／分の流量で、１２０秒間にわたり流過させた。解離は、１８０秒間モニタリングした。バルク屈折率の差違は、基準フローセル上で得られる応答を控除することにより補正した。ここで、抗ＢＣＭＡ抗体を、標準的なアミンカップリングキットにおいて記載されている通りに、あらかじめ活性化させ、脱活性化させた、空の表面上に流動させた。見かけの反応速度定数は、比較を目的とする、相互作用の二価性にも拘らず、数値積分により、１：１のラングミュア結合についての速度式を当てはめる、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖＡＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ／Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して導出した。
【０２３４】
また、抗ＢＣＭＡ抗体と、組換えヒトＢＣＭＡ  Ｆｃ（ｋｉｈ）との相互作用のアフィニティーも決定した。標準的なアミンカップリングキット（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、抗ヒトＦａｂ抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、ｐＨ５．０で、ＣＭ５チップ上に、直接カップリングさせた。固定化レベルは、約６５００ＲＵであった。抗ＢＣＭＡ抗体は、２５ｎＭで９０秒間捕捉した。組換えヒトＢＣＭＡ  Ｆｃ（ｋｉｈ）は、フローセルを介して、４倍の濃度範囲（１．９５〜５００ｎＭ）、３０μＬ／分の流量で、１２０秒間流過させた。解離は、１２０秒間にわたりモニタリングした。バルク屈折率の差違は、基準フローセル上で得られる応答を控除することにより補正した。ここで、組換えＢＣＭＡを、抗ヒトＦａｂ抗体が固定化されているが、その上に、抗ＢＣＭＡ抗体ではなくて、ＨＢＳ−ＥＰを注入された表面上に流動させた。反応速度定数は、数値積分により、１：１のラングミュア結合についての速度式を当てはめる、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖＡＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ／Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して導出した（表７）。また、８３Ａ１０抗ＢＣＭＡ抗体の、組換えカニクイザルＢＣＭＡ  Ｆｃ（ｋｉｈ）およびマウスＢＣＭＡ  Ｆｃ（ｋｉｈ）への結合も測定した（表８）。
【０２３５】
【表７】
2020122013.tif 000011
【０２３６】
【表８】
2020122013.tif 000012
【０２３７】
（実施例３）
抗ＢＣＭＡ  ＩｇＧ抗体の、ｈｕＴＡＣＩ−ＲおよびｈｕＢＡＦＦ−Ｒに対する特異性についての試験
ＴＮＦ−ＴＮＦ−Ｒスーパーファミリーのメンバーとして、ＴＡＣＩ受容体およびＢＡＦＦ受容体は、細胞外ドメイン内の相同性を、それぞれ、２２％、および１８．５％として、ＢＣＭＡ受容体と類縁である。したがって、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による結合実験を実施して、抗ＢＣＭＡ  ＩｇＧ抗体の特異性について検討する。全てのＳＰＲ実験は、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上、２５℃で、ＨＢＳ−ＥＰ（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％のＳｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｐ２０）をランニングバッファーとして実施する。標準的なアミンカップリングキット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、Ｆｃを融合させた、ｈｕＢＣＭＡ、ｈｕＢＡＦＦ−Ｒ、およびｈｕＴＡＣＩ−Ｒを、ｐＨ５．０で、高固定化レベル（約５０００ＲＵ）により、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＣＭ５センサーチップの異なるフローチャネル上に、化学的に固定化する。まず、抗ＢＣＭＡ  ＩｇＧ  ８３Ａ１０ならびに陽性対照としての抗ｈｕＴＡＣＩ−Ｒ  ＩｇＧおよび抗ｈｕＢＡＦＦ−Ｒ  ＩｇＧの高濃縮溶液（１．５μＭ、ＨＢＳ−ＥＰ中に溶解させた）を注入（会合時間：８０秒間、解離時間：６００秒間、流量：３０μｌ／分）して、結合が生じるのかどうかを点検する。抗ｈｕＴＡＣＩ−Ｒ  ＩｇＧの、ｈｕＴＡＣＩ−Ｒへの正の結合イベントのほか、抗ｈｕＢＡＦＦ−Ｒ  ＩｇＧの、ｈｕＢＡＦＦ−Ｒへの正の結合イベント、および抗ＢＣＭＡ  ＩｇＧ抗体の、ｈｕＢＣＭＡへの正の結合イベントは、全ての受容体が、固定化の後でもやはり認識されることを指し示す。抗ＢＣＭＡ  ＩｇＧ抗体の、ｈｕＢＡＦＦ−Ｒおよび／またはｈｕＴＡＣＩ−Ｒへの、大きな反応速度定数による結合については、固定化レベルを小さくした（３００ＲＵ）場合の反応速度パラメータについての注意深い検討を、新しいＣＭ５センサーチップ上で実施する。濃度を７００、３５０、１７５、８７．５、４３．７５、２１．８８ｎＭ（ＨＢＳ−ＥＰ中に溶解させた）とする抗ＢＣＭＡ  ＩｇＧ抗体希釈液を、注入（会合時間：８０秒間、解離時間：３００秒間、流量：３０μｌ／分）し、試料を、二連で調べる。また、可能な場合、すなわち、解離が高速で完了してしまわない場合は、再生も実施する。抗ＢＣＭＡ  ＩｇＧ抗体と、ｈｕＢＡＦＦ−ＲまたはｈｕＴＡＣＩ−Ｒとの相互作用についての反応速度による査定は、物質移動についての項（Ｂｉａｃｏｒｅ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０）を含む、１：１相互作用モデルへのデータのグローバルフィッティングにより実施する。また、抗ＢＣＭＡ  ＩｇＧ抗体の濃度がより高い定常状態解析も実施する。
【０２３８】
（実施例４）
ＢＣＭＡ抗体の、ＢＣＭＡ陽性多発性骨髄腫細胞系への結合（フローサイトメトリー）
フローサイトメトリーにより、抗ＢＣＭＡ  ＩｇＧ抗体（クローン１７Ａ５、８３Ａ１０、１３Ａ４）を、ＢＣＭＡを発現するＨ９２９細胞上の、ヒトＢＣＭＡへの結合について解析した。ＭＫＮ４５（ＢＣＭＡを発現させない、ヒト胃腺癌細胞系）を、陰性対照として使用した。略述すると、培養された細胞を、採取し、カウントし、ＶｉＣｅｌｌを使用して、細胞生存率を査定した。次いで、生細胞を、ＢＳＡを含有するＦＡＣＳ  Ｓｔａｉｎ緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中、１ｍｌ当たりの細胞２×１０６個へと調整する。この細胞懸濁液１００μｌを、丸底９６ウェルプレートへと、ウェルごとに、さらにアリコート分割し、３０μｌの抗ＢＣＭＡ抗体または対応するＩｇＧ対照と共に、４℃で３０分間インキュベートした。全ての抗ＢＣＭＡ抗体（およびアイソタイプ対照）を滴定し、０．１〜４０ｕｇ／ｍｌの間の最終濃度範囲で解析した。次いで、細胞を遠心分離し（３５０×ｇで５分間）、１２０μｌ／ウェルのＦＡＣＳ  Ｓｔａｉｎ緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で洗浄し、再懸濁させ、蛍光色素コンジュゲートＰＥコンジュゲートＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）２  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ  Ｆｃ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂ；１０９−１１６−１７０）と共に、４℃で、さらに３０分間インキュベートした。次いで、細胞を、Ｓｔａｉｎ緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で２回洗浄し、ウェル１つ当たり１００ｕｌのＢＤ  Ｆｉｘａｔｉｏｎ緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、型番５５４６５５）を使用して、４℃で２０分間固定し、１２０μｌのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁させ、ＢＤ  ＦＡＣＳ  ＣａｎｔｏＩＩを使用して解析した。図４は、抗ＢＣＭＡ抗体の濃度の関数としてプロットされた、抗ＢＣＭＡ  ＩｇＧクローンについての平均蛍光強度、（Ａ）Ｈ９２９細胞上のクローン１７Ａ５、８３Ａ１０、（Ｂ）ＭＫＮ４５細胞上のクローン１７Ａ５、８３Ａ１０、（Ｃ）Ｈ９２９細胞上のクローン１３Ａ４、（Ｄ）ＭＫＮ４５細胞上のクローン１３Ａ４を示す。クローン１７Ａ５、８３Ａ１０の、Ｈ９２９細胞への結合についてのＥＣ５０値（最大結合の５０％に達するのに要請される抗体の濃度を示す）を、表９にまとめる。
【０２３９】
【表９】
2020122013.tif 000013
【０２４０】
（実施例５）
１００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは、１０００ｎｇ／ｍＬのＡＰＲＩＬは、ＢＣＭＡ抗体の、ヒトＢＣＭＡへの結合を変更しない（フローサイトメトリーおよびＥＬＩＳＡ）
ａ）非ＡＰＲＩＬ競合抗ＢＣＭＡ  Ｆａｂまたは抗体の、ＥＬＩＳＡによる同定。Ｆａｂの、固定化されたヒトＢＣＭＡへの結合は、増大する濃度のマウスＡＰＲＩＬの存在下で評価した。ニュートラアビジンプレートに、２５ｎＭのビオチニル化ヒトＢＣＭＡ（１００μｌ／ウェル）をコーティングし、シェーカー上、室温で１時間インキュベートした。５００ｎＭまたは１０００ｎＭの精製Ｆａｂを添加して、コーティングしたヒトＢＣＭＡを、室温で１時間飽和させた。プレートを、ＰＢＳで３回洗浄し、０〜１００ｎＭの範囲にわたる、ＰＢＳ緩衝液中の２倍の希釈系列を使用して、マウスＡＰＲＩＬを、８つの異なる濃度で添加し、シェーカー上で３０分間インキュベートした。プレートを、ＰＢＳで３回洗浄し、抗ＦＬＡＧ−ＨＲＰ二次抗体（１：４０００）を、１時間添加した。ここでもまた、プレートを、ＰＢＳで３回洗浄し、１００ｕｌ／ウェルのＢＭ  Ｂｌｕｅ  ＰＯＤ（Ｒｏｃｈｅ）を添加することにより現像した。反応は、１ＭのＨ２ＳＯ４  ５０ｕｌ／ウェルを添加することにより停止させ、ＯＤは、最終的なリードアウトであるＯＤ４５０−６５０のために、４５０ｎｍで（６５０ｎｍを基準とする）読み取った。選択されたＦａｂについての結果を、図５に示す。５０ｎＭ（１２００ｎｇ／ｍＬ）または６．２５ｎＭ（１４０ｎｇ／ｍＬ）のｍｕＡＰＲＩＬ（マウスΔ−ＡＰＲＩＬ）の非存在下で抗ＢＣＭＡクローンに関して測定されたＯＤ値の、これらの存在下で測定されたＯＤ値と対比した低減を表１０にまとめる。
【０２４１】
【表１０】
2020122013.tif 000014
【０２４２】
ｂ）フローサイトメトリーにより検出される、Δ−ＡＰＲＩＬの、抗ＢＣＭＡ抗体との競合。Δ−ＡＰＲＩＬと抗ＢＣＭＡ抗体との終局における競合についての評価は、Ｈ９２９細胞上で、増大する濃度の抗ＢＣＭＡ抗体（クローン１７Ａ５、８３Ａ１０、１３Ａ４）の存在下における、Δ−ＡＰＲＩＬの結合を定量化することにより実施した。略述すると、培養された細胞を採取し、カウントし、ＶｉＣｅｌｌを使用して、細胞生存率を査定した。生細胞は、ＢＳＡを含有するＦＡＣＳ  Ｓｔａｉｎ緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中、１ｍｌ当たりの細胞１×１０６個へと調整した。この細胞懸濁液１００μｌを、丸底９６ウェルプレートへと、ウェルごとに、さらにアリコート分割し、３０μｌの抗ＢＣＭＡ抗体または対応するＩｇＧ対照と共に、４℃で３０分間インキュベートする。全ての抗ＢＣＭＡ抗体（およびアイソタイプ対照）を滴定し、１、１６、および４０μｇ／ｍｌの最終濃度で解析した。次いで、細胞を遠心分離し（３５０×ｇで５分間）、１２０μｌ／ウェルのＦＡＣＳ  Ｓｔａｉｎ緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で洗浄し、再懸濁させ、ヘマグルチニン（ＨＡ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｅｕｒｏｐｅ、型番７９０７−ＡＰ−０１０）でタグ付けされた、１ｕｇ／ｍｌ組換えマウスΔ−ＡＰＲＩＬと共に、４℃でさらに３０分間インキュベートする。次いで、細胞を、１２０μｌ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄し、ＦＩＴＣコンジュゲート抗ＨＡ抗体（Ｓｉｇｍａ
Ａｌｄｒｉｃｈ、型番Ｈ７４１１）と共に、４℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション時間の終了時に、細胞を、１２０μｌ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、ウェル１つ当たり１００ｕｌのＢＤ  Ｆｉｘａｔｉｏｎ緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、型番５５４６５５）を使用して、４℃で２０分間固定し、８０μｌのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁させ、ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｆｏｒｔｅｓｓａを使用して解析した。図６は、Ｈ９２９細胞上で、増大する濃度の抗ＢＣＭＡ抗体クローン１３Ａ４の関数として検出される、Δ−ＡＰＲＩＬ（ＦＩＴＣシグナル）の相対蛍光強度中央値を示す。アイソタイプ対照の存在下における、Δ−ＡＰＲＩＬの結合時における蛍光強度中央値を１とし、他のシグナルは、これに対して標準化した。
【０２４３】
ｃ）フローサイトメトリーにより検出される、抗ＢＣＭＡ抗体の、Δ−ＡＰＲＩＬとの競合。Δ−ＡＰＲＩＬと抗ＢＣＭＡ抗体との終局における競合についての評価は、ＲＰＭＩ細胞上で、Δ−ＡＰＲＩＬの存在下または非存在下における、抗ＢＣＭＡ抗体（クローン１３Ａ４、１７Ａ５、８３Ａ１０）の結合を定量化することにより実施した。略述すると、培養された細胞を採取し、カウントし、ＶｉＣｅｌｌを使用して、細胞生存率を査定した。生細胞は、ＢＳＡを含有するＦＡＣＳ  Ｓｔａｉｎ緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中、１ｍｌ当たりの細胞１×１０６個へと調整した。この細胞懸濁液１００μｌを、丸底９６ウェルプレートへと、ウェルごとに、さらにアリコート分割し、３０μｌの抗ＢＣＭＡ抗体または対応するＩｇＧ対照と共に、４℃で２０分間インキュベートした。全ての抗ＢＣＭＡ抗体およびアイソタイプ対照は、最終濃度４０ｕｇ／ｍｌで解析した。次いで、細胞を遠心分離し（３５０×ｇで５分間）、１２０μｌ／ウェルのＦＡＣＳ  Ｓｔａｉｎ緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で洗浄し、再懸濁させ、ヘマグルチニン（ＨＡ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｅｕｒｏｐｅ、型番７９０７−ＡＰ−０１０）でタグ付けされた、１μｇ／ｍｌの組換えマウスΔ−ＡＰＲＩＬと共に、４℃でさらに４０分間インキュベートした。次いで、細胞を、１２０μｌ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄し、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７コンジュゲート抗ヒトＦｃ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂ、型番１０９−６０６−００８）と共に、４℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション時間の終了時に、細胞を、１２０μｌ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、ウェル１つ当たり１００ｕｌのＢＤ  Ｆｉｘａｔｉｏｎ緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、型番５５４６５５）を使用して、４℃で２０分間固定し、８０μｌのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁させ、ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｆｏｒｔｅｓｓａを使用して解析した。図７は、１０００ｎｇ／ｍＬのΔ−ＡＰＲＩＬの非存在下または存在下において検出される、ＲＰＭＩ８２２６細胞上の抗ＢＣＭＡ抗体（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７シグナル）クローン１３Ａ４、１７Ａ５、８３Ａ１０の相対蛍光強度中央値を示す。Δ−ＡＰＲＩＬの非存在下における、抗ＢＣＭＡ抗体の結合時における蛍光強度中央値を１とし、Δ−ＡＰＲＩＬの存在下における、抗ＢＣＭＡ抗体のそれぞれに対する他のシグナルは、これに対して標準化した。
【０２４４】
ｄ）同時的なインキュベーションの後において、フローサイトメトリーにより検出される、抗ＢＣＭＡ抗体の、Δ−ＡＰＲＩＬとの競合。Δ−ＡＰＲＩＬと抗ＢＣＭＡ抗体との終局における競合についての評価は、Ｈ９２９細胞（ＮＣＩ−Ｈ９２９、ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−９０６８（商標））上で、Δ−ＡＰＲＩＬの存在下または非存在下における、抗ＢＣＭＡ抗体（クローン１３Ａ４、１７Ａ５、８３Ａ１０）の結合を定量化することにより実施した。略述すると、培養された細胞を採取し、カウントし、ＶｉＣｅｌｌを使用して、細胞生存率を査定した。生細胞は、ＢＳＡを含有するＦＡＣＳ  Ｓｔａｉｎ緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中、１ｍｌ当たりの細胞１×１０６個へと調整した。この細胞懸濁液１００μｌを、丸底９６ウェルプレートへと、ウェルごとに、さらにアリコート分割し、３０μｌの抗ＢＣＭＡ抗体または対応するＩｇＧ対照、およびヘマグルチニン（ＨＡ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｅｕｒｏｐｅ、型番７９０７−ＡＰ−０１０）でタグ付けされた、３０μｌのΔ−ＡＰＲＩＬと共に、４℃で４０分間インキュベートした。全ての抗ＢＣＭＡ抗体およびアイソタイプ対照は、最終濃度２０ｕｇ／ｍｌで、Δ−ＡＰＲＩＬは最終濃度２．５ｕｇ／ｍｌで解析した。次いで、細胞を遠心分離し（３５０×ｇで５分間）、１２０μｌ／ウェルのＦＡＣＳ  Ｓｔａｉｎ緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で洗浄した。その後、細胞を、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７コンジュゲート抗ヒトＦｃ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂ、型番１０９−６０６−００８）およびＦＩＴＣコンジュゲート抗ＨＡ抗体（Ｓｉｇｍａ
Ａｌｄｒｉｃｈ、型番Ｈ７４１１）と共に、４℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション時間の終了時に、細胞を、１２０μｌ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、ウェル１つ当たり１００ｕｌのＢＤ  Ｆｉｘａｔｉｏｎ緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、型番５５４６５５）を使用して、４℃で２０分間固定し、８０μｌのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁させ、ＢＤ  ＦＡＣＳ  ＣａｎｔｏＩＩを使用して解析した。図８Ａは、抗ＢＣＭＡ抗体クローン（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７シグナル）の平均蛍光強度および相対蛍光シグナルを示し、図８Ｂは、Δ−ＡＰＲＩＬ（ＦＩＴＣシグナル）および抗ＢＣＭＡ抗体クローン（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７シグナル）の平均蛍光強度および相対蛍光シグナルを示す。Δ−ＡＰＲＩＬの存在下における抗ＢＣＭＡ抗体の、ＦＩＴＣコンジュゲート抗ヒトＦｃ抗体による検出は、Δ−ＡＰＲＩＬの非存在下における、抗ＢＣＭＡ抗体クローンのシグナルに対して標準化した。抗ＢＣＭＡ抗体クローンの存在下におけるΔ−ＡＰＲＩＬの、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７コンジュゲート抗ＨＡ抗体による検出は、アイソタイプ対照の存在下における、Δ−ＡＰＲＩＬシグナルに対して標準化した。蛍光色素コンジュゲート抗ヒトＦｃ抗体により検出された、Δ−ＡＰＲＩＬ（２．５μｇ／ｍＬ）の存在下における、抗ＢＣＭＡ抗体（２０μｇ／ｍＬ）クローン１３Ａ４、１７Ａ５、および８３Ａ１０の結合の低減を、表１１にまとめる。
【０２４５】
【表１１】
2020122013.tif 000015
【０２４６】
（実施例６）
抗ＢＣＭＡ抗体は、ＮＦ−κＢの活性化を単独では誘導しない（発光アッセイ）
抗ＢＣＭＡ抗体の、ＢＣＭＡを発現するＨ９２９細胞への結合が、ＢＣＭＡの下流における、公知のシグナル伝達経路である、ＮＦ−κＢの活性化を誘導するのかどうかを評価した。略述すると、Ｈ９２９細胞を、細胞インキュベーター内の、０．２５％のＦＣＳを伴うＲＰＭＩ１６４０中、３７℃で２４時間飢餓させた。飢餓時間の終了時に、細胞を採取し、カウントし、ＶｉＣｅｌｌを使用して、細胞生存率を査定した。生細胞は、ＢＳＡを含有するＦＡＣＳ  Ｓｔａｉｎ緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中、１ｍｌ当たりの細胞４×１０６個へと調整した。この細胞懸濁液３０μｌを、丸底９６ウェルプレートへと、ウェルごとに、さらにアリコート分割し、１００または３５０ｎＭ（１４または５０ｕｇ／ｍｌ）の抗ＢＣＭＡ抗体３０μｌと共に、３７℃で２０分間インキュベートした。陰性対照としては、細胞を、非処置のまま放置するか、または対応するＩｇＧアイソタイプ対照抗体１００ｎＭ（１４μｇ／ｍｌ）と共に、３７℃で２０分間インキュベートした。陽性対照としては、細胞を、ヘマグルチニン（ＨＡ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ
Ｅｕｒｏｐｅ、型番７９０７−ＡＰ−０１０）でタグ付けされた、１μｇ／ｍｌの組換えマウスΔ−ＡＰＲＩＬと共に、３７℃で２０分間インキュベートした。インキュベーション時間の終了時に、Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｅｘｔｒａｃｔ  Ｋｉｔ（Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ、型番４０４１０）の製造元のプロトコールに従い、細胞を採取し、洗浄し、溶解させ、操作した。製造元の指示書に従い、ＴｒａｎｓＡｍ（登録商標）ＮＦ−κＢ  ｐ６５
Ｃｈｅｍｉ  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ、型番４００９７）を使用して、タンパク質抽出物を、ＮＦ−κＢ活性について解析した。発光シグナルは、Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｍａｘ  Ｍ５  ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して読み取った。図９に描示される通り、Ｈ９２９細胞を、１μｇ／ｍｌのＡＰＲＩＬへと曝露したところ、Ｈ９２９細胞単独と比較して、４．２倍の発光シグナルの増大が達せられた。最小限のバックグラウンドの発光シグナルは、Ｈ９２９細胞単独に関して、またはアイソタイプ対照抗体の存在下において観察され、前に報告されている（Demchenkoら、Blood、２０１０年、１１５巻（１７号）：３５４１〜３５５２頁）通り、多発性骨髄腫細胞系内で観察される、基礎的なＮＦ−κＢの活性化により説明されうる。抗ＢＣＭＡ抗体（１７Ａ５、８３Ａ１０）単独の添加により、ＮＦ−κＢの活性化が、それぞれの対照アイソタイプ抗体と比較して、さらに誘導されることはなかった。結果は、抗ＢＣＭＡ抗体が、ＢＣＭＡ陽性細胞への結合時に、ＮＦ−κＢの活性化を誘導しないことを示唆する。
【０２４７】
（実施例７）
抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体の作出
（実施例７．１）
抗ＣＤ３抗体
本明細書で使用される「ＣＤ３εまたはＣＤ３」という用語は、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ０７７６６（ＣＤ３Ｅ＿ＨＵＭＡＮ）下に記載されているヒトＣＤ３εに関する。「ＣＤ３に対する抗体、抗ＣＤ３抗体」という用語は、ＣＤ３εに結合する抗体に関する。抗体は、配列番号１、２、および３の重鎖ＣＤＲを、それぞれ、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３として含む、可変ドメインＶＨと、配列番号４、５、および６の軽鎖ＣＤＲを、それぞれ、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３として含む、可変ドメインＶＬとを含むことが好ましい。抗体は、配列番号７（ＶＨ）および配列番号８（ＶＬ）の可変ドメインを含むことが好ましい。
【０２４８】
上で記載した抗ＣＤ３抗体を使用して、以下の実施例で使用されるＴ細胞二特異性抗体を作出した。
【０２４９】
（実施例７．２）
Ｆｃ含有２＋１フォーマットの抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体の作出
対応する抗ＢＣＭＡ  ＩｇＧ１抗体の完全重鎖および完全軽鎖をコードするｃＤＮＡ、ならびに抗ＣＤ３  ＶＨおよび抗ＣＤ３  ＶＬのｃＤＮＡを、出発材料として使用した。各二特異性抗体には、対応する抗ＢＣＭＡ抗体の重鎖および軽鎖、ならびに上で記載した抗ＣＤ３抗体の重鎖および軽鎖のそれぞれを含む、４つのタンパク質鎖が関与した。誤対合重鎖を伴う、例えば、抗ＣＤ３抗体の２つの重鎖を伴う、副産物の形成を最小化するために、ＷＯ２００９０８０２５１およびＷＯ２００９０８０２５２において記載されている通り、「ＫＩＨ（ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ）突然変異」および操作されたジスルフィド結合を保有する、突然変異させたヘテロ二量体のＦｃ領域を使用する。誤対合軽鎖、例えば、抗ＢＣＭＡ抗体の２つの軽鎖を伴う、副産物の形成を最小化するために、ＷＯ２００９０８０２５１およびＷＯ２００９０８０２５２に記載されている方法論を使用して、ＣＨ１×定常カッパクロスオーバーを、抗ＣＤ３抗体の重鎖および軽鎖へと適用する。
【０２５０】
ａ）２＋１フォーマットを伴う抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体、すなわち、ＢＣＭＡに対して二価であり、ＣＤ３に対して一価である、二特異性（Ｆａｂ）２×（Ｆａｂ）抗体は、腫瘍標的ＢＣＭＡに優先的に結合し、ＣＤ３抗体シンクを回避し、こうして、腫瘍へと焦点を当てた薬物曝露の確率がより高いため、効力に対する利点、有効性および安全性に対する予測可能性を有する。
【０２５１】
２＋１フォーマットによる抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体、すなわち、ＢＣＭＡに対して二価であり、ＣＤ３に対して一価である、二特異性（Ｆａｂ）２×ａＦａｂ）抗体であって、Ｆｃを伴う抗体を、以前に選択されたヒトＢＣＭＡ抗体のために作製した。対応する抗ＢＣＭＡ  ＩｇＧ１抗体の完全Ｆａｂ（重鎖ＶＨドメインおよび重鎖ＣＨ１ドメインに加えた、軽鎖ＶＬドメインおよび軽鎖ＣＬドメイン）をコードするｃＤＮＡ、ならびに抗ＣＤ３  ＶＨおよび抗ＣＤ３  ＶＬのｃＤＮＡを、出発材料として使用した。各二特異性抗体には、Ｆｃ領域を伴う、対応する抗ＢＣＭＡ抗体の重鎖および軽鎖、ならびに上で記載した抗ＣＤ３抗体の重鎖および軽鎖のそれぞれを含む、４つのタンパク質鎖が関与した。
【０２５２】
略述すると、各二特異性抗体は、それぞれが、ａ）対応するＢＣＭＡ抗体の完全軽鎖のｃＤＮＡ、ｂ）スプライス−オーバーラップ−エクステンションＰＣＲなど、標準的な分子生物学法により作出される、融合体のｃＤＮＡであって、（Ｎ末端からＣ末端の順序で）分泌リーダー配列、上で記載した、対応する抗ＢＣＭＡ抗体のＦａｂ（ＶＨドメインに続くＣＨ１ドメイン）、配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒを伴う、可撓性のグリシン（Ｇｌｙ）−セリン（Ｓｅｒ）リンカー、上で記載した、対応する抗ＢＣＭＡ抗体のＦａｂ（ＶＨドメインに続くＣＨ１ドメイン）、配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒを伴う、可撓性のグリシン（Ｇｌｙ）−セリン（Ｓｅｒ）リンカー、上で記載した抗ＣＤ３抗体のＶＨ、およびヒト軽鎖ｃＤＮＡの定常カッパドメインから制作される融合タンパク質をコードするｃＤＮＡ、ｃ）スプライス−オーバーラップ−エクステンションＰＣＲなど、標準的な分子生物学法により作出される、融合体のｃＤＮＡであって、（Ｎ末端からＣ末端の順序で）分泌リーダー配列、上で記載した抗ＣＤ３抗体のＶＬ、ヒトＩｇＧ１  ｃＤＮＡの定常ＣＨ１ドメインから制作される融合タンパク質をコードするｃＤＮＡをコードする、４つの哺乳動物用発現ベクターの同時的な共トランスフェクションにより作製する。ヒトＩｇＧ１抗体またはヒト化ＩｇＧ１抗体の産生のための、上で記載した方法であって、１つの改変：抗体の精製のために、プロテインＡを使用して第１の捕捉ステップを行わず、代わりに、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）など、ヒトカッパ軽鎖定常領域に結合する樹脂を充填したアフィニティークロマトグラフィーカラムを使用して行うことを伴う方法を使用する、哺乳動物細胞の共トランスフェクション、ならびに抗体の作製および精製。加えて、安定性および収率を増大させるように、ジスルフィドのほか、イオン性架橋を形成し、ヘテロ二量体化収率を増大させる、さらなる残基も、含むことができる（ＥＰ１８７０４５９Ａ１）。
【０２５３】
ｂ）ＢＣＭＡ×ＣＤ３二特異性抗体ベクターを作出するために、ＩｇＧ１由来の二特異性分子は、少なくとも、２つの顕著に異なる抗原性決定基ＣＤ３およびＢＣＭＡに特異的に結合することが可能な、２つの抗原結合性部分からなる。抗原結合性部分は、各々が、可変領域および定常領域を含む、重鎖および軽鎖から構成されるＦａｂ断片であった。Ｆａｂ断片のうちの少なくとも１つは、Ｆａｂ重鎖と、Ｆａｂ軽鎖の定常ドメインを交換した、「Ｃｒｏｓｓｆａｂ」断片であった。Ｆａｂ断片内の重鎖定常ドメインと軽鎖定常ドメインとの交換により、特異性の異なるＦａｂ断片が、同一のドメインの並びを有さず、結果として、軽鎖を相互交換しないことを確保する。二特異性分子のデザインは、ＣＤ３について一価であり、ＢＣＭＡについて二価であり、この場合、１つのＦａｂ断片を、内側のＣｒｏｓｓＦａｂ（２＋１）のＮ末端へと融合させる。二特異性分子は、半減期が長くなるように、Ｆｃパートを含有した。構築物の概略表示を、図２に与え、好ましい構築物の配列を、配列番号４１および４３〜５２に示す。分子は、ポリマーベースのトランスフェクションを使用して、懸濁液中で成長するＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞に、哺乳動物用発現ベクターを共トランスフェクトすることにより作製した。２＋１  ＣｒｏｓｓＦａｂ−ＩｇＧ構築物を調製するために、細胞に、対応する発現ベクターを、１：２：１：１の比（「Ｆｃ（ノブ）ベクター」：「軽鎖ベクター」：「軽鎖  ＣｒｏｓｓＦａｂベクター」：「重鎖−ＣｒｏｓｓＦａｂベクター」）でトランスフェクトした。
【０２５４】
（実施例７．３）
比較のための、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体の作出
ＡＰＲＩＬおよびＢＡＦＦを遮断するＪ６Ｍ０−ＴＣＢｃｖおよびＢＣＭＡ５０−ｓｃ（Ｆｖ）２（ＢＣＭＡ５０−ＢｉＴＥ（登録商標）としてもまた公知である）抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体の作出、ならびに使用されるアミノ酸配列は、それぞれ、ＷＯ２０１２１６３８０５およびＷＯ２０１３０７２４０６／ＷＯ２０１３０７２４１５に従った。
【０２５５】
（実施例８）
電荷変異体を伴うかまたは伴わない、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｆｃ含有（２＋１）Ｔ細胞二特異性抗体の作製および精製
二特異性抗体を作製するために、二特異性抗体を、ポリマーベースのトランスフェクションを使用して、懸濁液中で培養される、ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞内の、それぞれの哺乳動物用発現ベクターの一過性共トランスフェクションにより発現させた。トランスフェクションの１日前に、ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を、６ｍＭのＬ−グルタミンを補充した、Ｅｘ−Ｃｅｌｌ培地中に、生細胞１５０万個で／ｍＬで播種した。最終的な産生容量１ｍＬ当たり、生細胞２００万個を遠心分離した（２１０×ｇで５分間）。上清を吸引し、細胞を、１００μＬのＣＤ  ＣＨＯ培地中に再懸濁させた。最終的な産生容量１ｍＬ当たりのＤＮＡは、１μｇのＤＮＡ（重鎖：修飾重鎖：軽鎖：修飾軽鎖の比＝１：１：２：１）を、１００μＬのＣＤ  ＣＨＯ培地中で混合することにより調製した。０．２７μＬのポリマーベースの溶液（１ｍｇ／ｍＬ）を添加した後で、混合物を、１５秒間ボルテックスし、室温で１０分間放置した。１０分後、再懸濁させた細胞およびＤＮＡ／ポリマーベースの溶液混合物をまとめ、次いで、適切な容器へと移し、これを、振とうデバイス（３７℃、５％のＣＯ２）内に置いた。３時間のインキュベーション時間後に、６ｍＭのＬ−グルタミン、１．２５ｍＭのバルプロ酸、および１２．５％のＰｅｐｓｏｙ（５０ｇ／Ｌ）を補充した、８００μＬのＥｘ−Ｃｅｌｌ  Ｍｅｄｉｕｍを、最終的な産生容量１ｍＬ当たり添加した。２４時間後、７０μＬのフィード溶液を、最終的な産生容量１ｍＬ当たり添加した。７日後、または細胞の生存率が、７０％と等しいかまたはそれ未満となったところで、遠心分離および滅菌濾過により、細胞を、上清から分離した。抗体は、アフィニティーステップ、ならびにカチオン交換クロマトグラフィーおよびサイズ除外クロマトグラフィーである、１つまたは２つの仕上げステップにより精製した。要請される場合は、さらなる仕上げステップも使用した。
【０２５６】
アフィニティーステップのために、上清を、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．５  ６ＣＶで平衡化させたプロテインＡカラム（ＨｉＴｒａｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＦＦ、５ｍＬ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にロードした。同じ緩衝液による洗浄ステップの後で、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、１００ｍＭの塩化ナトリウム、１００ｍＭのグリシン、ｐＨ３．０による段階的溶出によって、抗体を、カラムから溶出させた。所望の抗体を伴う画分を、０．５Ｍのリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０（１：１０）で速やかに中和し、プールし、遠心分離により濃縮した。濃縮物は、滅菌濾過し、さらにカチオン交換クロマトグラフィーおよび／またはサイズ除外クロマトグラフィーに掛けた。
【０２５７】
カチオン交換クロマトグラフィーステップのために、濃縮されたタンパク質を、アフィニティーステップのために使用した溶出緩衝液で、１：１０に希釈し、カチオン交換カラム（Ｐｏｒｏｓ  ５０  ＨＳ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）へとロードした。それぞれ、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、２０ｍＭのトリス、ｐＨ５．０、および２０ｍＭのリン酸ナトリウム、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、２０ｍＭのトリス、１００ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ５．０である、平衡緩衝液および洗浄緩衝液による、２回の洗浄ステップの後で、タンパク質を、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、２０ｍＭのトリス、１００ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ８．５を使用する勾配により溶出させた。所望の抗体を含有する画分は、プールし、遠心分離により濃縮し、滅菌濾過し、さらにサイズ除外ステップに掛けた。
【０２５８】
サイズ除外ステップのために、濃縮されたタンパク質を、製剤緩衝液としての、Ｔｗｅｅｎ２０を伴うかまたは伴わない、２０ｍＭのヒスチジン、１４０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ６．０と共に、ＸＫ１６／６０  ＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に注入した。単量体を含有する画分は、プールし、遠心分離により濃縮し、滅菌バイアルへと滅菌濾過した。
【０２５９】
抗体濃度の決定は、０．１％の抗体溶液の吸光度についての理論値を使用する、２８０ｎｍにおける吸光度の測定により行った。この値は、アミノ酸配列に基づくものであり、ＧＰＭＡＷソフトウェア（Ｌｉｇｈｔｈｏｕｓｅ  ｄａｔａ）により計算した。
【０２６０】
最終タンパク質調製物の純度および単量体含量は、２５ｍＭのリン酸カリウム、１２５ｍＭの塩化ナトリウム、２００ｍＭのＬ−アルギニン一塩酸塩、０．０２％（ｗ／ｖ）のアジ化ナトリウム、ｐＨ６．７による緩衝液中で、ＣＥ−ＳＤＳ（Ｃａｌｉｐｅｒ  ＬａｂＣｈｉｐ  ＧＸＩＩシステム（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ））およびＨＰＬＣ（ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００  ＳＷ  ＸＬ解析用サイズ除外カラム（Ｔｏｓｏｈ））のそれぞれにより決定した。
【０２６１】
最終タンパク質調製物の分子量を検証し、最終タンパク質溶液中の分子が均質になるように調製されたことを確認するために、液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）を使用した。脱グリコシル化ステップをまず実施した。炭水化物により導入される異質性を除去するために、構築物を、ＰＮＧａｓｅＦ（ＰｒｏＺｙｍｅ）で処理した。したがって、２Ｍのトリス２μｌを、濃度を０．５ｍｇ／ｍｌとする２０μｇのタンパク質へと添加することにより、タンパク質溶液のｐＨを、ｐＨ７．０へと調整した。０．８μｇのＰＮＧａｓｅＦを、添加し、３７℃で１２時間インキュベートした。次いで、ＬＣ−ＭＳオンライン検出を実施した。ＬＣ−ＭＳ法は、ＴＯＦ  ６４４１質量分析計（Ａｇｉｌｅｎｔ）へとカップリングさせた、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＨＰＬＣ  １２００上で実施した。クロマトグラフィーによる分離は、Ｍａｃｈｅｒｅｙ  Ｎａｇｅｌ  Ｐｏｌｙｓｔｅｒｅｎｅカラム；ＲＰ１０００−８（粒子サイズを８μｍとする、４．６×２５０ｍｍ；カタログ番号７１９５１０）上で実施した。溶離液Ａは、水中に５％のアセトニトリル、および０．０５％（ｖ／ｖ）のギ酸であり、溶離液Ｂは、９５％のアセトニトリル、５％の水、および０．０５％のギ酸であった。流量は、１ｍｌ／分であり、分離は、４０℃で実施し、前に記載した処理により、６μｇ（１５μｌ）のタンパク質試料を得た。
【表３３】
2020122013.tif 000016
【０２６２】
最初の４分間の間、質量分析計を塩汚染から保護するように、溶出液を、廃棄物へと方向づけた。ＥＳＩ源は、乾燥ガス流量を１２ｌ／分とし、温度を３５０℃とし、噴霧器圧力を６０ｐｓｉとして動作させた。ＭＳスペクトルは、陽イオンモードにおいて、３８０Ｖのフラグメンター電圧および７００〜３２００ｍ／ｚの質量範囲を使用して取得した。ＭＳデータは、計器ソフトウェアにより、４〜１７分間にわたり取得した。
【０２６３】
図１０は、８３Ａ１０−ＴＣＢ抗体および８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ抗体のための、異なる精製法の後における、ＣＥ−ＳＤＳ（非還元）による、最終タンパク質調製物についてのグラフを描示する。８３Ａ１０−ＴＣＢ抗体へと適用された、プロテインＡ（ＰＡ）アフィニティークロマトグラフィーおよびサイズ除外クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による精製ステップが結果としてもたらす単量体含量（Ａ）の純度は、３０％未満および８２．８％であった。カチオン交換クロマトグラフィー（ｃＩＥＸ）ステップおよび最終的なサイズ除外クロマトグラフィー（ｒｅ−ＳＥＣ）ステップを含むさらなる精製ステップを、（Ａ）における最終タンパク質調製物へと適用したところ、純度は、９３．４％へと増大したが、単量体含量は同じにとどまり、収率は、０．４２ｍｇ／Ｌへと有意に低減された。しかし、特異的電荷修飾を、８３Ａ１０抗ＢＣＭＡ  Ｆａｂ  ＣＬ−ＣＨ１へと適用したところ、つまり、８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ抗体では、ＰＡ＋ｃＩＥＸ＋ＳＥＣ精製ステップを適用した場合であってもなお、９５．３％の純度、１００％の単量体含量、および最大３．３ｍｇ／Ｌの収率により実証される通り、さらなるｒｅ−ＳＥＣ精製ステップを含むにも拘らず、作製／精製プロファイルが、７．９分の１の収率および１７．２％低量の単量体含量を示す（Ｂ）と比較して、ＴＣＢ分子の優れた作製／精製プロファイルを既に観察することができた（Ｃ）。
【０２６４】
次いで、８３Ａ１０−ＴＣＢの作製／精製プロファイルを、８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ抗体と対比して比較する、一対一の作製試行を行って、抗体へと適用されるＣＬ−ＣＨ１電荷修飾の利点をさらに査定した。８３Ａ１０−ＴＣＢ分子および８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ分子のいずれも、図２ａに記載されている分子フォーマットの分子である。図１１に描示される通り、８３Ａ１０−ＴＣＢ抗体および８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ抗体の特性を、並行して測定し、各精製ステップ：１）ＰＡアフィニティークロマトグラフィーだけ（Ａ、Ｂ）、２）ＰＡアフィニティークロマトグラフィー、次いで、ＳＥＣ（Ｃ、Ｄ）、ならびに３）ＰＡアフィニティークロマトグラフィー、次いで、ＳＥＣ、次いで、ｃＩＥＸおよびｒｅ−ＳＥＣ（Ｅ、Ｆ）の後で比較した。８３Ａ１０−ＴＣＢ抗体および８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ抗体のための、それぞれの精製法の後における、ＣＥ−ＳＤＳ（非還元）による、最終タンパク質溶液についてのグラフを、図１１に顕示する。図１１Ａおよび１１Ｂにおいて示される通り、電荷変異体をＴＣＢ抗体へと適用することによる改善は、ＰＡアフィニティークロマトグラフィーだけによる精製の後で既に観察された。この一対一研究では、８３Ａ１０−ＴＣＢ抗体へと適用した、ＰＡアフィニティークロマトグラフィーによる精製ステップは、６１．３％の純度、２６．２ｍｇ／Ｌの収率、および６３．７％の単量体含量を結果としてもたらした（１１Ａ）。比較として、８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ抗体を、ＰＡアフィニティークロマトグラフィーで精製したところ、より良好な８１．０％の純度、より良好な５１．５ｍｇ／Ｌの収率、および６８．２％の単量体含量により、全ての特性が改善された（１１Ｂ）。さらなるＳＥＣ精製ステップを、図１２Ａおよび１２Ｂで見られるように最終タンパク質調製物へと適用したところ、純度および単量体含量が、それぞれ、最大９１．０％および８３．９％と改善されたが、収率は１０．３ｍｇ／Ｌであった８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ（Ｄ）と比較して、８３Ａ１０−ＴＣＢは、６９．５％の純度、１４．１ｍｇ／Ｌの収率、および７４．７％の単量体含量（Ｃ）と向上した。この特定の実験では、収率こそ、８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖが、８３Ａ１０−ＴＣＢよりわずかに少なかった（すなわち、２７％少なかった）ものの、適正な分子の百分率では、８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖが、８３Ａ１０−ＴＣＢよりはるかに良好であり、ＬＣ−ＭＳにより測定される通り、それぞれ、４０〜６０％と対比した９０％であった。第３の一対一比較では、図１１Ｃおよび１１Ｄからの、８３Ａ１０−ＴＣＢおよび８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖの最終タンパク質調製物を、ＰＡアフィニティークロマトグラフィーによる精製ステップだけの後における、別の精製バッチ（同じ作製）からの最終タンパク質調製物、それぞれ約１Ｌ（等容量）と共にプールした。次いで、プールされたタンパク質調製物を、ｃＩＥＸおよびＳＥＣによる精製法により、さらに精製した。図１１Ｅおよび１１Ｆに描示される通り、電荷変異体を伴わないＴＣＢ抗体と比較した場合の、電荷変異体を伴うＴＣＢ抗体の作製／精製プロファイルの改善が一貫して観察された。いくつかのステップによる精製法（すなわち、ＰＡ±ＳＥＣ＋ｃＩＥＸ＋ＳＥＣ）を使用して、８３Ａ１０−ＴＣＢ抗体を精製した後において、達せられた純度は、４３．１％に過ぎず、９８．３％の単量体含量は達成されたが、収率は損なわれ、０．４３ｍｇ／Ｌへと低減された。ＬＣ−ＭＳにより測定される適正な分子の百分率は、やはり低値であり、６０〜７０％であった。最後に、最終タンパク質調製物の品質は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける使用に許容可能なものではなかった。これとは全く対照的に、同じ複数の精製ステップを、同順で８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ抗体へと適用したところ、９６．２％の純度および９８．９％の単量体含量が達せられたほか、ＬＣ−ＭＳにより測定される適正な分子も９５％であった。しかし、ここでもまた、収率は、ｃＩＥＸ精製ステップの後で、０．６４ｍｇ／Ｌへと大幅に低減された。結果は、８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ抗体に関して、より良好な純度、より高い単量体含量、より高い百分率の適正な分子、およびより良好な収率は、２つの標準的な精製ステップ、すなわち、ＰＡアフィニティークロマトグラフィーおよびＳＥＣの後で初めて達成されうるが（図１１Ｄ）、８３Ａ１０−ＴＣＢでは、さらなる精製ステップを適用してもなお、このような特性を達成することができなかった（図１１Ｅ）ことを示す。
【０２６５】
表１２は、ＰＡ精製ステップの後における、８３Ａ１０−ＴＣＢの、８３Ａ１０−ＴＣＶｃｖと比較した特性についてまとめる。表１３は、ＰＡ精製ステップおよびＳＥＣ精製ステップの後における、８３Ａ１０−ＴＣＢの、８３Ａ１０−ＴＣＶｃｖと比較した特性についてまとめる。表１４は、ＰＡおよびＳＥＣに加え、ＰＡ単独、次いで、ｃＩＥＸおよびｒｅ−ＳＥＣの精製ステップの後における、８３Ａ１０−ＴＣＢの、８３Ａ１０−ＴＣＶｃｖと比較した特性についてまとめる。表１２〜１４では、太字の値は、８３Ａ１０−ＴＣＢと、８３Ａ１０−ＴＣＶｃｖとの間で比較した場合の優れた特性を強調する。代表的ではい可能性がある１つ（すなわち、収率および量のそれぞれ；表１３を参照されたい）を例外として、３つの一対一比較実験から得られる全ての作製／精製パラメータおよび値は、８３Ａ１０−ＴＣＢと比較して、８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖが優れていた。全体的な結果により、作製／精製特徴における利点は、ＣＬ−ＣＨ１電荷修飾を、ＴＣＢ抗体へと適用することにより達成できたこと、および開発可能特性が非常に良好な、既に高品質のタンパク質調製物を達成するのに要請される精製ステップは、２つ（すなわち、ＰＡアフィニティークロマトグラフィーおよびＳＥＣ）だけであったことが明らかに実証される。
【０２６６】
【表１２】
2020122013.tif 000017
【０２６７】
【表１３】
2020122013.tif 000018
【０２６８】
【表１４】
2020122013.tif 000019
【０２６９】
（実施例９）
製剤緩衝液中の、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体の安定性（凝集／断片化）
抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  ＴＣＢｃｖ抗体を、凝集／断片化に関するそれらの安定性について評価し、ＢＣＭＡ×ＣＤ３（ｓｃＦＶ）２二特異性抗体フォーマットと比較するために、試料を、標準的な製剤緩衝液（例えば、２０ｍＭのクエン酸塩、１８０ｍＭのスクロース、２０ｍＭのアルギニン、０．０２％のポリソルベート２０、または例えば、２０ｍＭのヒスチジン、１４０ｍＭのＮａＣｌ、０．０１％のＴｗｅｅｎ２０、ｐＨ６．０）中、タンパク質濃度約１ｍｇ／ｍＬで、３７〜４０℃で１０日間、好ましくは、２〜４週間インキュベートする。それぞれの対照試料は、−８０℃で２〜４週間保存する。
【０２７０】
凝集物および低分子量（ＬＭＷ）分子種を定量化するために、ＨＰＬＣにより、サイズ除外クロマトグラフィーを実施する。２５μｇの量のタンパク質を、Ａｇｉｌｅｎｔ  １２００  ＨＰＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ）上、５ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、１２５ｍＭのＮａＣｌ、２００ｍＭのＬ−アルギニン一塩酸塩、０．０２％（ｗ／ｖ）のＮａＮ３、ｐＨ６．７中で、Ｔｏｓｏｈ  ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷＸＬカラムへと適用する。溶出したタンパク質は、２８０ｎｍのＵＶ吸光度により定量化する。
【０２７１】
（実施例１０）
それらの表面上で、ヒトＢＣＭＡ、カニクイザルＢＣＭＡ、またはマウスＢＣＭＡを発現する組換え細胞への抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体の結合（フローサイトメトリー）
ａ）抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体の結合は、マウスＢＣＭＡ（ｍｕＢＣＭＡ−ＨＥＫ）、またはカニクイザルＢＣＭＡ（ｃｙＢＣＭＡ−ＨＥＫ）を一過性に発現するＨＥＫ細胞上で、フローサイトメトリーにより実証した。略述すると、ＢＣＭＡを発現するＨＥＫ細胞を採取し、カウントし、ＶｉＣｅｌｌを使用して、細胞生存率を査定した。次いで、生細胞を、ＢＳＡを含有するＦＡＣＳ  Ｓｔａｉｎ緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中、１ｍｌ当たりの細胞２×１０６個へと調整した。この細胞懸濁液１００μｌを、丸底９６ウェルプレートへと、ウェルごとに、さらにアリコート分割し、３０μｌの抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体または対応するＴＣＢ対照抗体と共に、４℃で３０分間インキュベートした。全ての抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体およびＴＣＢ対照抗体を滴定し、２〜３００ｎＭの間の最終濃度範囲で解析した。次いで、細胞を遠心分離し（３５０×ｇで５分間）、１２０μｌ／ウェルのＦＡＣＳ  Ｓｔａｉｎ緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で洗浄し、再懸濁させ、蛍光色素コンジュゲートＰＥコンジュゲートＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）２  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ  Ｆｃ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂ；１０９−１１６−１７０）と共に、４℃で、さらに３０分間インキュベートした。次いで、細胞を、Ｓｔａｉｎ緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で２回洗浄し、ウェル１つ当たり１００μｌのＢＤ  Ｆｉｘａｔｉｏｎ緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、型番５５４６５５）を使用して、４℃で２０分間固定し、１２０μｌのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁させ、ＢＤ  ＦＡＣＳ  ＣａｎｔｏＩＩを使用して解析した。図１２に描示されるように、蛍光強度中央値の増大により測定される通り、８３Ａ１０−ＴＣＢは、マウスＢＣＭＡ（Ａ）およびカニクイザルＢＣＭＡ（Ｂ）を一過性に発現するＨＥＫ細胞に、特異的、かつ、濃度依存的に結合する。陰性対照のＴＣＢ抗体として、ＤＰ４７−ＴＣＢは、ｍｕＢＣＭＡ−ＨＥＫ細胞およびｃｙＢＣＭＡ−ＨＥＫ細胞に結合しなかった。２つの分子の間では、ＶＬ  ＣＤＲおよびＶＨ  ＣＤＲが同一であるので、８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖにも、８３Ａ１０−ＴＣＢに関して観察されるのと同じ結合特性が予測される（実施例１９を参照されたい）。
【０２７２】
ｂ）抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体の結合はまた、マウスＢＣＭＡ、カニクイザルＢＣＭＡまたはＢＣＭＡを安定的に発現するＣＨＯ細胞上でも、フローサイトメトリーにより実施する。略述すると、ＢＣＭＡを発現するＨＥＫ細胞を、採取し、カウントし、ＶｉＣｅｌｌを使用して、細胞生存率を査定する。次いで、生細胞を、ＢＳＡを含有するＦＡＣＳ  Ｓｔａｉｎ緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中、１ｍｌ当たりの細胞２×１０６個へと調整する。この細胞懸濁液１００μｌを、丸底９６ウェルプレートへと、ウェルごとに、さらにアリコート分割し、３０μｌの抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体または対応するＴＣＢ対照抗体と共に、４℃で３０分間インキュベートする。全ての抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体およびＴＣＢ対照抗体を滴定し、２〜３００ｎＭの間の最終濃度範囲で解析する。次いで、細胞を遠心分離し（３５０×ｇで５分間）、１２０μｌ／ウェルのＦＡＣＳ  Ｓｔａｉｎ緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で洗浄し、再懸濁させ、蛍光色素コンジュゲートＰＥコンジュゲートＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）２  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ  Ｆｃ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂ；１０９−１１６−１７０）と共に、４℃で、さらに３０分間インキュベートする。次いで、細胞を、Ｓｔａｉｎ緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で２回洗浄し、ウェル１つ当たり１００μｌのＢＤ  Ｆｉｘａｔｉｏｎ緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、型番５５４６５５）を使用して、４℃で２０分間固定し、１２０μｌのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁させ、ＢＤ  ＦＡＣＳ  ＣａｎｔｏＩＩを使用して解析する。
【０２７３】
ｃ）フローサイトメトリーにより測定された、それらの表面上で、ヒトＢＣＭＡまたはカニクイザルＢＣＭＡを安定的に発現する組換え細胞への、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体の結合。抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体の結合は、ヒトＢＣＭＡ（ｈｕＢＣＭＡ−ＨＥＫ２９３Ｔ）、またはカニクイザルＢＣＭＡ（ｃｙｎｏＢＣＭＡ−ＨＥＫ２９３Ｔ）を安定的に発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞系上で、フローサイトメトリーにより実証した。ヒトＢＣＭＡおよびカニクイザルＢＣＭＡの、細胞表面における発現レベルは、細胞内ＦＬＡＧ発現により確認される通り、同様であった。略述すると、ＢＣＭＡを発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を採取し、カウントし、ＶｉＣｅｌｌを使用して、細胞生存率を査定した。次いで、生細胞を、ＢＳＡを含有するＦＡＣＳ  Ｓｔａｉｎ緩衝液（ＢＤ
Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中、１ｍｌ当たりの細胞２×１０６個へと調整した。この細胞懸濁液１００μｌを、丸底９６ウェルプレートへと、ウェルごとに、さらにアリコート分割し、３０μｌの抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体または対応するＴＣＢ対照抗体と共に、４℃で３０分間インキュベートした。全ての抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体およびＴＣＢ対照抗体を滴定し、２〜３００ｎＭの間の最終濃度範囲で解析した。次いで、細胞を遠心分離し（３５０×ｇで５分間）、１２０μｌ／ウェルのＦＡＣＳ  Ｓｔａｉｎ緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で洗浄し、再懸濁させ、蛍光色素コンジュゲートＰＥコンジュゲートＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）２  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ  Ｆｃ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂ；１０９−１１６−１７０）と共に、４℃で、さらに３０分間インキュベートした。次いで、細胞を、Ｓｔａｉｎ緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で２回洗浄し、ウェル１つ当たり１００μｌのＢＤ  Ｆｉｘａｔｉｏｎ緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、型番５５４６５５）を使用して、４℃で２０分間固定し、１２０μｌのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁させ、ＢＤ  ＦＡＣＳ  ＣａｎｔｏＩＩを使用して解析した。８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖの、ｈｕＢＣＭＡ−ＨＥＫ２９３Ｔ細胞およびｃｙｎｏＢＣＭＡ−ＨＥＫ２９３Ｔ細胞への結合についてのＥＣ５０値を測定した（表１４Ａ）。
【０２７４】
【表１４Ａ】
2020122013.tif 000020
【０２７５】
（実施例１１）
抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体の、ＢＣＭＡ陽性多発性骨髄腫細胞系への結合（フローサイトメトリー）
抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体（１３Ａ４−ＴＣＢｃｖ、１７Ａ５−ＴＣＢｃｖ、８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ）を、フローサイトメトリーにより、ＢＣＭＡを発現するＨ９２９細胞およびＬ３６３細胞上における、ヒトＢＣＭＡへの結合について解析した。ＭＫＮ４５（ＢＣＭＡを発現させない、ヒト胃腺癌細胞系）を、陰性対照として使用した。略述すると、培養された細胞を、採取し、カウントし、ＶｉＣｅｌｌを使用して、細胞生存率を査定する。次いで、生細胞を、ＢＳＡを含有するＦＡＣＳ  Ｓｔａｉｎ緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中、１ｍｌ当たりの細胞２×１０６個へと調整する。この細胞懸濁液１００μｌを、丸底９６ウェルプレートへと、ウェルごとに、さらにアリコート分割し、３０μｌの抗ＢＣＭＡ抗体または対応するＩｇＧ対照と共に、４℃で３０分間インキュベートした。全ての抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体（およびＴＣＢ対照）を滴定し、１〜３００ｎＭの間の最終濃度範囲で解析した。次いで、細胞を遠心分離し（３５０×ｇで５分間）、１２０μｌ／ウェルのＦＡＣＳ  Ｓｔａｉｎ緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で洗浄し、再懸濁させ、蛍光色素コンジュゲートＰＥコンジュゲートＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）２  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ  Ｆｃ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂ；１０９−１１６−１７０）と共に、４℃で、さらに３０分間インキュベートした。次いで、細胞を、Ｓｔａｉｎ緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で２回洗浄し、ウェル１つ当たり１００ｕｌのＢＤ  Ｆｉｘａｔｉｏｎ緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、型番５５４６５５）を使用して、４℃で２０分間固定し、１２０μｌのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁させ、ＢＤ  ＦＡＣＳ  ＣａｎｔｏＩＩを使用して解析した。図１３に描示される通り、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体についての平均蛍光強度を、抗体濃度の関数としてプロットした；（Ａ）Ｈ９２９細胞およびＭＫＮ４５細胞上の８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ、（Ｂ）Ｈ９２９細胞およびＭＫＮ４５細胞上の１７Ａ５−ＴＣＢｃｖ、（Ｃ）Ｈ９２９細胞およびＭＫＮ４５細胞上の１３Ａ４−ＴＣＢｃｖの結合。該当する場合、Ｐｒｉｓｍ  ＧｒａｐｈＰａｄ（ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して、ＥＣ５０を計算し、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体の、Ｈ９２９細胞への結合について最大結合の５０％を達成するのに要請される抗体の濃度を示すＥＣ５０値を、表１５にまとめる。表１５Ａは、８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖの、Ｌ３６３  ＭＭ細胞への結合についてのＥＣ５０値を示す。
【０２７６】
【表１５】
2020122013.tif 000021
【０２７７】
【表１５Ａ】
2020122013.tif 000022
【０２７８】
（実施例１２）
抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体の、ＣＤ３陽性Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞系への結合（フローサイトメトリー）
抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体（１３Ａ４−ＴＣＢｃｖ、１７Ａ５−ＴＣＢｃｖ、８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ）はまた、フローサイトメトリーにより、ヒト白血病性Ｔ細胞Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ  ＴＩＢ−１５２）上で発現する、ヒトＣＤ３へのそれらの結合特性についても解析した。Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞を、１０％の熱不活化ＦＣＳを補充したＲＰＭＩ中で培養した。略述すると、培養された細胞を採取し、カウントし、ＶｉＣｅｌｌを使用して、細胞生存率を査定した。次いで、生細胞を、０．１％のＢＳＡを含有するＦＡＣＳ  Ｓｔａｉｎ緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中、１ｍｌ当たりの細胞２×１０６個へと調整した。この細胞懸濁液１００μｌを、丸底９６ウェルプレートへと、ウェルごとに、さらにアリコート分割した。細胞を含有するウェルへと、３０μｌの抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体または対応するＩｇＧ対照を添加して、３ｎＭ〜５００ｎＭまたは０．１ｐＭ〜２００ｎＭの最終濃度を得た。抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体と、対照ＩｇＧとは、同じモル濃度で使用した。４℃で３０分間のインキュベーションの後、細胞を遠心分離し（３５０×ｇで５分間）、１５０μｌ／ウェルの、ＢＳＡを含有するＦＡＣＳ  Ｓｔａｉｎ緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で２回洗浄し、次いで、ウェル１つ当たり１００ｕｌのＢＤ  Ｆｉｘａｔｉｏｎ緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、型番５５４６５５）を使用して、４℃で２０分間細胞を固定し、１２０μｌのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁させ、ＢＤ  ＦＡＣＳ  ＣａｎｔｏＩＩを使用して解析した。抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体の、Ｔ細胞への結合を査定し、蛍光強度中央値を、ＣＤ３を発現するＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞にゲーティングして決定し、ヒストグラムまたはドットプロットにプロットした。図１４は、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体（８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ（Ａ）；１７Ａ５−ＴＣＢｃｖ（Ｂ））の、Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞への結合についての蛍光強度中央値であり、抗体の濃度の関数としてプロットされた蛍光強度中央値を示す。ＥＣ５０値、および抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体の、ＣＤ３陽性Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞への最大の結合には達しなかった。アイソタイプ対照抗体は、Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞に結合せず、ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体（（Ａ）８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ；（Ｂ）１７Ａ５−ＴＣＢｃｖ）は、ＢＣＭＡ陰性ＭＫＮ４５細胞およびＣＤ３陰性ＭＫＮ４５細胞に結合しなかった。
【０２７９】
（実施例１３）
抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体は、細胞内リン酸化ＮＦ−κＢにより検出される、ＡＰＲＩＬ依存性のＮＦ−κＢの活性化を遮断しない（フローサイトメトリー）
抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体が、ＡＰＲＩＬ依存性のＮＦ−κＢの活性化を遮断するのか、さらに誘導するのかについて調べるために、細胞内リン酸化ＮＦ−κＢの検出を、Lafargeら、BMC  Molecular  Biol、２００７年、８巻：６４頁において記載されて
いる通り、フローサイトメトリーにより測定した。ホスホフローサイトメトリー法とは、十分に好感度でなく、面倒なステップを含有する場合がある、ＥＬＩＳＡベースの発光アッセイによるＮＦ−κＢの活性化の検出に対する代替法である（PerezおよびNolan、Nat
Biotechnol、２００２年、２０巻（２号）：１５５〜６２頁）。抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３
ＴＣＢ抗体の、ＢＣＭＡ陽性Ｈ９２９骨髄腫細胞への結合が、ＢＣＭＡ受容体の下流における、公知の核因子によるシグナル伝達経路である、ＡＰＲＩＬ依存性のＮＦ−κＢの活性化を遮断するのか、さらに誘導するのかを評価した。略述すると、Ｈ９２９細胞を、細胞インキュベーター内の、ＦＣＳを伴わないＲＰＭＩ１６４０中、３７℃で２４時間飢餓させた。飢餓時間の終了時に、細胞を採取し、カウントし、ＶｉＣｅｌｌを使用して、細胞生存率を査定した。生細胞は、ＢＳＡを含有するＦＡＣＳ  Ｓｔａｉｎ緩衝液（ＢＤ
Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中、１ｍｌ当たりの細胞１×１０６個へと調整した。この細胞懸濁液１００μｌを、丸底９６ウェルプレートへと、ウェルごとに、さらにアリコート分割し、飽和濃度４００ｎＭ（７７μｇ／ｍｌ）の抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体またはアイソタイプ対照抗体２５μｌと共に、３７℃で２０分間インキュベートするのに続いて、１００ｎｇ／ｍＬもしくは１μｇ／ｍＬの組換えマウスΔ−ＡＰＲＩＬ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｅｕｒｏｐｅ）を伴う、３７℃でさらに１５分間直接的インキュベーションにかけた。陰性対照としては、細胞を、非処置のまま放置するか、または対応するＩｇＧアイソタイプ対照抗体４００ｎＭ（７７μｇ／ｍｌ）と共に、３７℃で、合計４５分間インキュベートした。陽性対照としては、細胞を、１００ｎｇ／ｍＬまたは１μｇ／ｍｌの組換えマウスΔ−ＡＰＲＩＬ単独（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｅｕｒｏｐｅ）と共に、３７℃で１５分間インキュベートした。刺激の終了時に、細胞を遠心分離し（３６０×ｇで４分間）、細胞ペレットを、あらかじめ加温したＣｙｔｏｆｉｘ緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、型番５５４６５５）中で速やかに固定し、３７℃で１０分間インキュベートした。次いで、細胞を遠心分離し、上清を除去し、ボルテックスにより細胞ペレットを破壊した。次いで、細胞を、氷上の氷冷Ｐｈｏｓｆｌｏｗ  Ｐｅｒｍ  Ｂｕｆｆｅｒ  ＩＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、型番５５８０５０）中で３０分間透過処理した。次いで、細胞を遠心分離し、上清を除去し、ボルテックスにより細胞ペレットを破壊した。細胞を、１００μＬのＰｈｏｓｆｌｏｗ  Ｐｅｒｍ  Ｂｕｆｆｅｒ  ＩＩＩ中に再懸濁させ、透過処理された細胞を、光から保護して、抗ＮＦ−κＢ  ｐ６５（ｐＳ５２９）抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、型番５５８４２３）、またはアイソタイプ対照抗体（Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ２ｂ  κ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ型番５５５０５８）により、室温で６０分間染色した。染色期間の後、細胞を、ＰＢＳ＋０．１％のＢＳＡで洗浄してから、フローサイトメトリー解析にかけた。上で記載した通りに処置されたＨ９２９細胞から得られる、相対蛍光強度中央値を測定した。アイソタイプ対照の存在下において、Δ−ＡＰＲＩＬの結合時に得られる蛍光強度中央値（ＭＦＩ）シグナルを１とし、他のシグナルは、これに対して標準化した。図１５に描示される通り、ＡＰＲＩＬと競合するＢＣＭＡ結合性アーム（Ｊ６Ｍ０−ＴＣＢ）と比較して、ＡＰＲＩＬと競合しないＢＣＭＡ結合性アーム（８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ）を伴う抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体の、Ｈ９２９細胞内の、１０００ｎｇ／ｍＬのＡＰＲＩＬに媒介されるＮＦ−κＢの活性化に対する効果について調べた（Ａ）。１０００ｎｇ／ｍＬのＡＰＲＩＬの存在下におけるＨ９２９細胞と比較して、非ＡＰＲＩＬ競合８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖは、ＡＰＲＩＬにより誘導されるＮＦ−κＢの活性化シグナルを２９．９％低減した（Ａ）。実験によるばらつきが約２０％存在しうることを考慮すると、８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖが示す、ＡＰＲＩＬに媒介されるＮＦ−κＢのリン酸化の低減は、最小限であった。これに対し、ＡＰＲＩＬと競合するＢＣＭＡ結合性アームＪ６Ｍ０−ＴＣＢを、１０００ｎｇ／ｍＬのＡＰＲＩＬの存在下におけるＨ９２９細胞と比較したところ、ホスホフローサイトメトリーにより測定されるＮＦ−κＢの活性化シグナルの、少なくとも７９．３％の減少が見られた。Ｊ６Ｍ０抗ＢＣＭＡ抗体（ＷＯ２０１２１６３８０５）は、ＡＰＲＩＬにより誘導されるＮＦ−κＢの活性化を遮断することが報告されている。Ｊ６Ｍ０−ＴＣＢは、８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖと正確に同じＴＣＢフォーマットを使用して作出した。
【０２８０】
実験の第２のセットでは、ホスホフローサイトメトリー技法を使用して、ＡＰＲＩＬと競合しない８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ、およびＡＰＲＩＬと競合するＪ６Ｍ０−ＴＣＢの効果を、飽和濃度のＡＰＲＩＬ、すなわち、Ｈ９２９細胞内のＮＦ−κＢの活性化のためのより強力なシグナルを誘導する５０００ｎｇ／ｍＬのＡＰＲＩＬの存在下において検証し、第１の観察を確認した。５０００ｎｇ／ｍＬのＡＰＲＩＬの存在下におけるＨ９２９細胞と比較して、非ＡＰＲＩＬ競合８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖについては、ＮＦ−κＢの活性化の、３０％の増大が観察された（図１５Ｂ）。しかし、アッセイによるばらつきが依然として２０〜３０％であることを考慮すると、８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖについては、活性化シグナルの増大も低減も結論付けることができない。他方、ＡＰＲＩＬと競合するＪ６Ｍ０−ＴＣＢを、５０００ｎｇ／ｍＬのＡＰＲＩＬの存在下におけるＨ９２９細胞と比較したところ、ホスホフローサイトメトリーにより測定されるＮＦ−κＢの活性化シグナルの、６９％の減少が見られた。アッセイによるばらつきを考慮しても、これは、活性化シグナルの低減である。
【０２８１】
全体的な結果は、ＢＣＭＡおよびＢＣＭＡ陽性細胞への結合についての、ＡＰＲＩＬ競合研究のデータセットを補強し（図５〜８）、８３Ａ１０抗ＢＣＭＡ  ＩｇＧ抗体および８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖによる、ＡＰＲＩＬとの競合が最小限であり、ＡＰＲＩＬの、細胞上のＢＣＭＡへの結合を遮断しないか、またはこれを遮断しても最小限であるほか、ＡＰＲＩＬの、細胞上のＢＣＭＡへの結合時の、下流における、ＮＦ−κＢによるシグナル伝達／シグナル変換への影響も最小限に限られることを確認する。この結果はまた、Ｊ６Ｍ０が、ＢＣＭＡへの結合についてＡＰＲＩＬと競合し、ＡＰＲＩＬの下流におけるシグナル伝達を遮断する抗ＢＣＭＡ抗体であることも確認する。
【０２８２】
（実施例１４）
抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体は、外因性ＡＰＲＩＬの非存在下において、リン酸化ＮＦ−κＢにより測定されるＮＦ−κＢの活性化を直接誘導しない（フローサイトメトリー）
抗ＢＣＭＡ抗体／抗ＣＤ３  ＴＣＢの、ＢＣＭＡ陽性Ｈ９２９骨髄腫細胞への結合が、ＢＣＭＡ受容体の下流における、公知の核因子によるシグナル伝達経路である、ＮＦ−κＢの活性化を誘導するのかどうかを評価した。略述すると、Ｈ９２９細胞を、細胞インキュベーター内の、ＦＣＳを伴わないＲＰＭＩ１６４０中、３７℃で２４時間飢餓させた。飢餓時間の終了時に、細胞を採取し、カウントし、ＶｉＣｅｌｌを使用して、細胞生存率を査定した。生細胞は、ＢＳＡを含有するＦＡＣＳ  Ｓｔａｉｎ緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中、１ｍｌ当たりの細胞１×１０６個へと調整した。この細胞懸濁液１００μｌを、丸底９６ウェルプレートへと、ウェルごとに、さらにアリコート分割し、飽和濃度４００ｎＭ（７７μｇ／ｍｌ）の抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体またはアイソタイプ対照抗体２５μｌと共に、３７℃で２０分間インキュベートするのに続いて、１００ｎｇ／ｍＬもしくは１μｇ／ｍＬ、または飽和濃度３μｇ／ｍＬ〜最大５μｇ／ｍＬの組換えマウスΔ−ＡＰＲＩＬ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｅｕｒｏｐｅ）を伴う、３７℃でさらに１５分間直接的インキュベーションにかけた。陰性対照としては、細胞を、非処置のまま放置するか、または対応するＩｇＧアイソタイプ対照抗体４００ｎＭ（７７μｇ／ｍｌ）と共に、３７℃で、合計４５分間インキュベートした。陽性対照としては、細胞を、１００ｎｇ／ｍＬまたは１μｇ／ｍｌの組換えマウスΔ−ＡＰＲＩＬ単独（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｅｕｒｏｐｅ）と共に、３７℃で１５分間インキュベートしたところ、陽性シグナルが検出可能なことが示され、シグナルの欠如／最小限のシグナルが、技術的誤差に起因するものではないことを示した。刺激の終了時に、細胞を遠心分離し（３６０×ｇで４分間）、細胞ペレットを、あらかじめ加温したＣｙｔｏｆｉｘ緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、型番５５４６５５）中で速やかに固定し、３７℃で１０分間インキュベートした。次いで、細胞を遠心分離し、上清を除去し、ボルテックスにより細胞ペレットを破壊した。次いで、細胞を、氷上の氷冷Ｐｈｏｓｆｌｏｗ  Ｐｅｒｍ  Ｂｕｆｆｅｒ  ＩＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、型番５５８０５０）中で３０分間透過処理した。次いで、細胞を遠心分離し、上清を除去し、ボルテックスにより細胞ペレットを破壊した。細胞を、１００μＬのＰｈｏｓｆｌｏｗ  Ｐｅｒｍ  Ｂｕｆｆｅｒ  ＩＩＩ中に再懸濁させ、透過処理された細胞を、光から保護して、抗ＮＦ−κＢ  ｐ６５（ｐＳ５２９）抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、型番５５８４２３）、またはアイソタイプ対照抗体（マウスＩｇＧ２ｂ  κ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ型番５５５０５８）により、室温で６０分間染色した。染色期間の後、細胞を、ＰＢＳ＋０．１％のＢＳＡで洗浄してから、フローサイトメトリー解析にかけた。上で記載した通りに処置されたＨ９２９細胞から得られる、相対蛍光強度中央値を測定した。アイソタイプ対照の存在下において、Δ−ＡＰＲＩＬの結合時に得られる蛍光強度中央値シグナルを１とし、他のシグナルは、これに対して標準化した。外因性ＡＰＲＩＬの非存在下における、Ｈ９２９細胞への結合時のＮＦ−κＢシグナル伝達に対す��、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体（８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ）の効果を、図１６に示す。図１６Ａは、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  ８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖの、Ｈ９２９細胞への結合は、ＡＰＲＩＬの非存在下において、ＮＦ−κＢの活性化の増大を引き起こさず、わずかに１８．１％の基礎シグナルの減少が観察されたが、これは、Ｈ９２９細胞単独と比較して、かつ、ホスホフローサイトメトリーによる細胞内ＮＦ−κＢ  ｐ６５（ｐＳ５２９）の検出により測定される通り、実験によるばらつきの範囲内であることを示す。この観察は、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  ８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖが、ＢＣＭＡ陽性Ｈ９２９細胞への結合により、ＮＦ−κＢの活性化を阻害も誘導もしないことを示す第２の実験において確認された（図１６Ｂ）。過去の刊行物において前に報告されている通り、Ｈ９２９骨髄腫細胞は、多発性骨髄腫細胞系の、公知の病理学的特徴である、ＮＦ−κＢ経路における基礎レベルの活性化を示した（Demchenkoら
、Blood、２０１０年、１１５巻（１７号）：３５４１〜３５５２頁）。とりわけ、抗Ｂ
ＣＭＡ／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体の、ＢＣＭＡ腫瘍標的に対する結合アフィニティーが、Ｔ細胞上のＣＤ３に対する結合アフィニティーと対比して大きいことに起因して、ＮＦ−ＦＢ経路をさらに活性化させないことが好ましく、かつ、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体が、いまだＴ細胞に結合しないうちに、ＢＣＭＡ陽性骨髄腫細胞に一時的に結合すれば、骨髄腫細胞の生存が延長されることを踏まえると、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体の、ＢＣＭＡ陽性細胞への結合時における、ＮＦ−ＦＢ経路の活性化の欠如は有利でありうる。
【０２８３】
（実施例１５）
抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体の、ＣＤ３陽性Ｔ細胞、およびＢＣＭＡ陽性多発性骨髄腫細胞系への結合時における、ヒトＴ細胞の活性化（フローサイトメトリー）
ヒトＢＣＭＡを発現するＭＭ細胞の存在下または非存在下における、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞上の、早期活性化マーカーＣＤ６９、または後期活性化マーカーＣＤ２５の表面発現を査定することにより、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体を、フローサイトメトリーにより、Ｔ細胞の活性化を誘導するそれらの能力について解析した。略述すると、ＢＣＭＡ陽性Ｈ９２９細胞を、Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ緩衝液により採取し、カウントし、生存率について点検した。細胞を、改変ＲＰＭＩ−１６４０培地中、１ｍｌ当たりの（生）細胞０．３×１０６個へと調整し、この細胞懸濁液１００μｌを、丸底９６ウェルプレートへと、ウェルごとに、ピペッティングした（指し示される通りに）。５０μｌの（希釈された）抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体を、細胞を含有するウェルへと添加して、０．３ｐＭ〜３０ｎＭの最終濃度を得た。ヒトＰＢＭＣエフェクター細胞を、健常ドナーの採取したての血液から単離し、改変ＲＰＭＩ−１６４０培地中、１ｍｌ当たりの（生）細胞６×１０６個へと調整した。この細胞懸濁液５０μｌを、アッセイプレートのウェルごとに添加して、ＰＢＭＣと骨髄腫腫瘍細胞との最終Ｅ：Ｔ比、１０：１を得た。抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体が、ヒトＢＣＭＡを発現する標的細胞の存在下で、Ｔ細胞を特異的に活性化させることが可能であるのかどうかについて解析するために、それぞれの抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  ＴＣＢ分子３ｎＭを含有するウェルのほか、ＰＢＭＣを含有するが、標的細胞は含有しないウェルも含めた。５％のＣＯ２、３７℃で、１５〜２８時間（ＣＤ６９）または２４〜４８時間（ＣＤ２５）インキュベーションの後で、細胞を遠心分離し（３５０×ｇで５分間）、０．１％のＢＳＡを含有する、１５０μｌ／ウェルのＰＢＳで、２回洗浄した。ＣＤ４（マウスＩｇＧ１  Ｋ；クローンＲＰＡ−Ｔ４）、ＣＤ８（マウスＩｇＧ１  Ｋ；クローンＨＩＴ８ａ；ＢＤ型番５５５６３５）、ＣＤ６９（マウスＩｇＧ１；クローンＬ７８；ＢＤ型番３４０５６０）、およびＣＤ２５（マウスＩｇＧ１  Ｋ；クローンＭ−Ａ２５１；ＢＤ型番５５５４３４）についての表面染色は、供給元の示唆に従い、４℃で３０分間実施した。０．１％のＢＳＡを含有する、１５０μｌ／ウェルのＰＢＳで、細胞を２回洗浄し、１００μｌ／ウェルの固定緩衝液（ＢＤ型番５５４６５５）を使用して、４℃で１５分間固定した。遠心分離の後、試料を、０．１％のＢＳＡを伴う、２００μｌ／ウェルのＰＢＳ中に再懸濁させ、ＦＡＣＳ  ＣａｎｔｏＩＩ装置（Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ＦＡＣＳ  Ｄｉｖａ）を使用して解析した。図１７は、４８時間のインキュベーションの後における、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞上の早期活性化マーカーＣＤ６９（Ｃ、Ｄ）、および後期活性化マーカーＣＤ２５（Ａ、Ｂ）の発現レベル（２つの独立の実験からの代表的な結果）を描示する。８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ抗体は、ＢＣＭＡ陽性標的細胞の存在下で、ＣＤ６９活性化マーカーおよびＣＤ２５活性化マーカーの上方調節を、濃度依存的かつ特異的に誘導した。ヒトＰＢＭＣを、ＤＰ４７−ＴＣＢ対照抗体で処置しても、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化は観察されなかったことから、Ｔ細胞上のＣＤ３への結合にも拘らず、ＴＣＢ抗体が、ＢＣＭＡ陽性標的細胞に結合しない場合、Ｔ細胞の活性化は生じないことが示唆される（データは示さない）。
【０２８４】
（実施例１６）
抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体の、ＣＤ３陽性Ｔ細胞、およびＢＣＭＡ陽性多発性骨髄腫細胞系への結合時における、活性化Ｔ細胞からのサイトカインの産生（サイトカイン放出アッセイにおけるＣＢＡ解析）
抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体を、ヒトＢＣＭＡを発現するＭＭ細胞の存在下または非存在下において、Ｔ細胞に媒介されるサイトカインの産生を、デノボで誘導するそれらの能力について解析する。略述すると、ヒトＰＢＭＣを、軟膜から単離し、ウェル１つ当たり３０万個の細胞を、丸底９６ウェルプレートへとプレーティングする。代替的に、健常ドナーに由来する２８０μｌの全血液を、ディープウェル９６ウェルプレートのウェルごとにプレーティングする。腫瘍標的細胞（例えば、Ｈ９２９骨髄腫細胞、ＲＰＭＩ−８２２６骨髄腫細胞、Ｕ２６６骨髄腫細胞、またはＬ３６３骨髄腫細胞）を添加して、１０：１の最終Ｅ：Ｔ比を得る。抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体および対照を、０．３ｐＭ〜３０ｎＭの最終濃度で添加する。５％のＣＯ２、３７℃で最長２４時間のインキュベーションの後、アッセイプレートを、３５０×ｇで５分間遠心分離し、その後における解析のために、上清を、新しいディープウェル９６ウェルプレートへと移す。ＣＢＡ解析は、製造元の指示書に従い、ＦＡＣＳ  ＣａｎｔｏＩＩ上で、Ｈｕｍａｎ  Ｔｈ１／Ｔｈ２  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｋｉｔ  ＩＩ（ＢＤ型番５５１８０９）、または以下のＣＢＡ  Ｆｌｅｘ  Ｓｅｔ：ヒトグランザイムＢ（ＢＤ型番５６０３０４）、ヒトＩＦＮ−γ  Ｆｌｅｘ  Ｓｅｔ（ＢＤ型番５５８２６９）、ヒトＴＮＦ  Ｆｌｅｘ  Ｓｅｔ（ＢＤ型番５５８２７３）、ヒトＩＬ−１０  Ｆｌｅｘ  Ｓｅｔ（ＢＤ型番５５８２７４）、ヒトＩＬ−６  Ｆｌｅｘ  Ｓｅｔ（ＢＤ型番５５８２７６）、ヒトＩＬ−４  Ｆｌｅｘ  Ｓｅｔ（ＢＤ型番５５８２７２）、ヒトＩＬ−２  Ｆｌｅｘ  Ｓｅｔ（ＢＤ型番５５８２７０）の組合せを使用して実施する。表１５Ｃおよび１５Ｄは、Ｈ９２９細胞およびＲＰＭＩ−８２２６細胞を、それぞれ、腫瘍標的細胞として使用する場合の、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体の濃度当たりに分泌される、サイトカイン／プロテアーゼのＥＣ５０値および量を示す。
【０２８５】
【表１５Ｃ】
2020122013.tif 000023
【０２８６】
【表１５Ｄ】
2020122013.tif 000024
【０２８７】
（実施例１７）
抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体により誘導される、リダイレクトされたＴ細胞による、カニクイザルＢＣＭＡトランスフェクト細胞に対する細胞傷害作用（ＬＤＨ放出アッセイ）
ａ）抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体を、抗原結合性部分の、細胞上のＢＣＭＡへの結合を介する、ＴＣＢ構築物の架橋時に、カニクイザルＢＣＭＡを発現するＣＨＯ細胞内でＴ細胞媒介型アポトーシスを誘導するそれらの能力について解析する。略述すると、カニクイザルＢＣＭＡを発現するＣＨＯ標的細胞を、Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ
Ｂｕｆｆｅｒにより採取し、洗浄し、１０％のウシ胎仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したＲＰＭＩ中に再懸濁させる。ウェル１つ当たりの細胞約３０，０００個を、丸底９６ウェルプレート内にプレーティングし、構築物のそれぞれの希釈液を、所望の最終濃度、０．１ｐＭ〜１０ｎＭの範囲の最終濃度となるように添加する（三連で）。適切な比較のために、全てのＴＣＢ構築物および対照を、同じモル濃度へと調整する。カニクイザルＰＢＭＣを、エフェクター細胞として使用し、１０：１の最終Ｅ：Ｔ比を使用する。陰性対照群は、エフェクター細胞だけ、または標的細胞だけで表す。カニクイザルＴ細胞を活性化させるための陽性対照として、１μｇ／ｍｌのＰＨＡ−Ｍ（Ｓｉｇｍａ型番Ｌ８９０２）を使用する。標準化のために、カニクイザルＢＣＭＡを発現するＣＨＯ標的細胞の最大溶解（＝１００％）を、最終濃度１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を伴い、細胞死を誘導する、標的細胞のインキュベーションにより決定する。最小の溶解（＝０％）は、エフェクター細胞だけを伴い、すなわち、Ｔ細胞二特異性抗体を伴わずに共インキュベートされた標的細胞により表した。次いで、５％のＣＯ２、３７℃で２０〜２４時間のインキュベーションの後、製造元の指示書に従い、ＬＤＨ検出キット（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）により、アポトーシス性／壊死性カニクイザルＢＣＭＡを発現するＣＨＯ標的細胞から上清へのＬＤＨの放出を測定した。ＬＤＨ放出の百分率を、濃度応答曲線において、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体の濃度に対してプロットする。ＥＣ５０値は、Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用して測定し、最大ＬＤＨ放出の５０％を結果としてもたらすＴＣＢ抗体の濃度として決定する。
【０２８８】
ｂ）抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体を、抗原結合性部分の、細胞上のＢＣＭＡへの結合を介する、ＴＣＢ構築物の架橋時に、カニクイザルＢＣＭＡを発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞内でＴ細胞媒介型アポトーシスを誘導するそれらの能力について解析する。略述すると、カニクイザルＢＣＭＡを発現するＨＥＫ２９３Ｔ標的細胞を、Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒにより採取し、洗浄し、１０％のウシ胎仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したＲＰＭＩ  １６４０培地中に再懸濁させる。ウェル１つ当たりの細胞約３０，０００個を、丸底９６ウェルプレート内にプレーティングし、構築物のそれぞれの希釈液を、所望の最終濃度、０．１ｐＭ〜１０ｎＭの範囲の最終濃度となるように添加する（三連で）。適切な比較のために、全てのＴＣＢ構築物および対照を、同じモル濃度へと調整する。カニクイザルＰＢＭＣを、エフェクター細胞として使用し、１０：１の最終Ｅ：Ｔ比を使用する。陰性対照群は、エフェクター細胞だけ、または標的細胞だけで表す。標準化のために、カニクイザルＢＣＭＡを発現するＨＥＫ標的細胞の最大溶解（＝１００％）を、最終濃度１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を伴い、細胞死を誘導する、標的細胞のインキュベーションにより決定する。最小の溶解（＝０％）は、エフェクター細胞だけを伴い、すなわち、Ｔ細胞二特異性抗体を伴わずに共インキュベートされた標的細胞により表した。次いで、５％のＣＯ２、３７℃で２０〜２４時間のインキュベーションの後、製造元の指示書に従い、ＬＤＨ検出キット（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）により、アポトーシス性／壊死性カニクイザルＢＣＭＡを発現するＨＥＫ標的細胞から上清へのＬＤＨの放出を測定した。ＬＤＨ放出の百分率を、濃度応答曲線において、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体の濃度に対してプロットする。ＥＣ５０値は、Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用して測定し、最大ＬＤＨ放出の５０％を結果としてもたらすＴＣＢ抗体の濃度として決定する。表１５Ｅは、８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖによる、標的細胞であるｃｙｎｏＢＣＭＡ−ＨＥＫ細胞の溶解についてのＥＣ５０値を示す。
【０２８９】
【表１５Ｅ】
2020122013.tif 000025
【０２９０】
（実施例１８）
抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体により誘導される、リダイレクトされたＴ細胞による、ＢＣＭＡの発現が高度なＨ９２９骨髄腫細胞に対する細胞傷害作用（比色ＬＤＨ放出アッセイ）
また、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体を、抗原結合性部分の、細胞上のＢＣＭＡへの結合を介する、構築物の架橋時に、ＢＣＭＡの発現が高度なＭＭ細胞内でＴ細胞媒介型アポトーシスを誘導するそれらの潜在能力についても解析した。略述すると、ヒトＢＣＭＡを発現させるＨ９２９多発性骨髄腫標的細胞を、Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ
Ｂｕｆｆｅｒにより採取し、洗浄し、１０％のウシ胎仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したＲＰＭＩ中に再懸濁させた。ウェル１つ当たりの細胞約３０，０００個を、丸底９６ウェルプレート内にプレーティングし、構築物のそれぞれの希釈液を、所望の最終濃度、０．１ｐＭ〜１０ｎＭの範囲の最終濃度となるように添加した（三連で）。適切な比較のために、全てのＴＣＢ構築物および対照を、同じモル濃度へと調整した。ヒト全Ｔ細胞（エフェクター）を、ウェルへと添加して、５：１の最終Ｅ：Ｔ比を得た。ヒトＰＢＭＣを、エフェクター細胞として使用する場合、１０：１の最終Ｅ：Ｔ比を使用した。陰性対照群は、エフェクター細胞だけ、または標的細胞だけで表した。ヒト汎Ｔ細胞を活性化させるための陽性対照として、１μｇ／ｍｌのＰＨＡ−Ｍ（Ｓｉｇｍａ型番Ｌ８９０２）を使用した。標準化のために、Ｈ９２９  ＭＭ標的細胞の最大溶解（＝１００％）を、最終濃度１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を伴い、細胞死を誘導する、標的細胞のインキュベーションにより決定した。最小の溶解（＝０％）は、エフェクター細胞だけを伴い、すなわち、Ｔ細胞二特異性抗体を伴わずに共インキュベートされた標的細胞により表した。次いで、５％のＣＯ２、３７℃で２０〜２４時間または４８時間のインキュベーションの後、製造元の指示書に従い、ＬＤＨ検出キット（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）により、アポトーシス性／壊死性ＭＭ標的細胞から上清へのＬＤＨの放出を測定した。ＬＤＨ放出の百分率を、濃度応答曲線において、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体の濃度に対してプロットした。ＥＣ５０値は、Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用して測定し、最大ＬＤＨ放出の５０％を結果としてもたらすＴＣＢ抗体の濃度として決定した。図１８に示される通り、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体（（Ａ）８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ、（Ｂ）１７Ａ５−ＴＣＢｃｖ）は、ＬＤＨの放出により測定されるＢＣＭＡ陽性Ｈ９２９骨髄腫細胞の、濃度依存的な殺滅を誘導した。ＢＣＭＡ陽性標的細胞に結合しないＤＰ４７−ＴＣＢ対照抗体は、被験最高濃度であってもなお、ＬＤＨの放出を誘導しなかったので、Ｈ９２９細胞の殺滅は特異的であった（データは示さない）。表１６および１６Ａは、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体により誘導される、リダイレクトされたＴ細胞による、ＢＣＭＡ陽性Ｈ９２９細胞の殺滅についてのＥＣ５０値についてまとめる。一部の実験では、８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖを、Ｈ９２９細胞の殺滅の誘導において、ＡＰＲＩＬ／ＢＡＦＦリガンド競合Ｊ６Ｍ０−ＴＣＢと比較した（表１６Ａ）。図１８−１は、８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖが、ＬＤＨの放出により測定されるＢＣＭＡ陽性Ｈ９２９骨髄腫細胞の、濃度依存的な殺滅を誘導したことを示す。ＢＣＭＡ陽性標的細胞に結合せず、Ｔ細胞上のＣＤ３だけに結合する対照ＴＣＢ抗体は、被験最高濃度であってもなお、ＬＤＨの放出を誘導しなかったので、Ｈ９２９細胞の溶解は特異的であった。
【０２９１】
【表１６】
2020122013.tif 000026
【０２９２】
【表１６Ａ】
2020122013.tif 000027
【０２９３】
（実施例１９）
抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体により誘導される、リダイレクトされたＴ細胞による、ＢＣＭＡの発現が低度なＵ２６６ＢＩ骨髄腫細胞および／またはＬ３６３骨髄腫細胞に対する細胞傷害作用（ＬＤＨ放出アッセイ）
抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体を、抗原結合性部分の、細胞上のＢＣＭＡへの結合を介する、構築物の架橋時に、ＢＣＭＡの発現が低度なＭＭ細胞内でＴ細胞媒介型アポトーシスを誘導するそれらの能力について解析する。略述すると、ＢＣＭＡの発現が低度なヒトＵ２６６多発性骨髄腫標的細胞および／またはヒトＬ３６３多発性骨髄腫標的細胞を、Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒにより採取し、洗浄し、１０％のウシ胎仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したＲＰＭＩ中に再懸濁させる。ウェル１つ当たりの細胞約３０，０００個を、丸底９６ウェルプレート内にプレーティングし、構築物のそれぞれの希釈液を、所望の最終濃度、０．１ｐＭ〜１０ｎＭの範囲の最終濃度となるように添加する（三連で）。適切な比較のために、全てのＴＣＢ構築物および対照を、同じモル濃度へと調整する。ヒト全Ｔ細胞（エフェクター）を、ウェルへと添加して、５：１の最終Ｅ：Ｔ比を得る。ヒトＰＢＭＣを、エフェクター細胞として使用する場合、１０：１の最終Ｅ：Ｔ比を使用する。陰性対照群は、エフェクター細胞だけ、または標的細胞だけで表す。ヒトＴ細胞を活性化させるための陽性対照として、１μｇ／ｍｌのＰＨＡ−Ｍ（Ｓｉｇｍａ型番Ｌ８９０２）を使用する。標準化のために、ＭＭ標的細胞の最大溶解（＝１００％）を、最終濃度１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を伴い、細胞死を誘導する、標的細胞のインキュベーションにより決定する。最小の溶解（＝０％）は、エフェクター細胞だけを伴い、すなわち、Ｔ細胞二特異性抗体を伴わずに共インキュベートされた標的細胞により表す。次いで、５％のＣＯ２、３７℃で２０〜２４時間のインキュベーションの後、製造元の指示書に従い、ＬＤＨ検出キット（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）により、アポトーシス性／壊死性ＭＭ標的細胞から上清へのＬＤＨの放出を測定する。ＬＤＨ放出の百分率を、濃度応答曲線において、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体の濃度に対してプロットする。ＥＣ５０値は、Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用して測定し、最大ＬＤＨ放出の５０％を結果としてもたらすＴＣＢ抗体の濃度として決定する。図１８−２に示される通り、８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体は、ＬＤＨの放出により測定されるＢＣＭＡ陽性Ｌ３６３骨髄腫細胞の、濃度依存的な殺滅を誘導した。ＢＣＭＡ陽性標的細胞に結合せず、Ｔ細胞上のＣＤ３だけに結合する対照ＴＣＢ抗体は、被験最高濃度であってもなお、ＬＤＨの放出を誘導しなかったので、Ｌ３６３細胞の溶解は特異的であった。表１６Ｂは、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体により誘導される、リダイレクトされたＴ細胞による、ＢＣＭＡの発現が中程度／低度なＬ３６３細胞の殺滅についてのＥＣ５０値についてまとめる。
【０２９４】
【表１６Ｂ】
2020122013.tif 000028
【０２９５】
（実施例１９Ａ）
抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体により誘導される、リダイレクトされたＴ細胞による、ＢＣＭＡの発現が中程度／低度なＲＰＭＩ−８２２６骨髄腫細胞に対する細胞傷害作用（ＬＤＨ放出アッセイ）
抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体を、抗原結合性部分の、細胞上のＢＣＭＡへの結合を介する、構築物の架橋時に、ＢＣＭＡの発現が中程度／低度なＭＭ細胞内でＴ細胞媒介型アポトーシスを誘導するそれらの能力について解析した。略述すると、ＢＣＭＡの発現が中程度／低度なヒトＬ３６３多発性骨髄腫標的細胞を、Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒにより採取し、洗浄し、１０％のウシ胎仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したＲＰＭＩ中に再懸濁させる。ウェル１つ当たりの細胞約３０，０００個を、丸底９６ウェルプレート内にプレーティングし、構築物のそれぞれの希釈液を、所望の最終濃度、０．１ｐＭ〜１０ｎＭの範囲の最終濃度となるように添加する（三連で）。適切な比較のために、全てのＴＣＢ構築物および対照を、同じモル濃度へと調整する。ヒトＰＢＭＣ（エフェクター細胞）を、ウェルへと添加して、腫瘍標的細胞１に対して、Ｔ細胞約３〜５のＥ：Ｔ比に対応する、１０：１の最終Ｅ：Ｔ比を得た。陰性対照群は、エフェクター細胞だけ、または標的細胞だけで表した。標準化のために、ＭＭ標的細胞の最大溶解（＝１００％）を、最終濃度１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を伴い、細胞死を誘導する、標的細胞のインキュベーションにより決定した。最小の溶解（＝０％）は、エフェクター細胞だけを伴い、すなわち、Ｔ細胞二特異性抗体を伴わずに共インキュベートされた標的細胞により表した。次いで、５％のＣＯ２、３７℃で２０〜２４時間のインキュベーションの後、製造元の指示書に従い、ＬＤＨ検出キット（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）により、アポトーシス性／壊死性ＭＭ標的細胞から上清へのＬＤＨの放出を測定した。ＬＤＨ放出の百分率を、濃度応答曲線において、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体の濃度に対してプロットした。ＥＣ５０値は、Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用して測定し、最大ＬＤＨ放出の５０％を結果としてもたらすＴＣＢ抗体の濃度として決定した。図１８−３に示される通り、８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体は、ＬＤＨの放出により測定されるＢＣＭＡ陽性ＲＰＭＩ−８２２６骨髄腫細胞の、濃度依存的な殺滅を誘導した。ＢＣＭＡ陽性標的細胞に結合せず、Ｔ細胞上のＣＤ３だけに結合する対照ＴＣＢ抗体は、被験最高濃度であってもなお、ＬＤＨの放出を誘導しなかったので、ＲＰＭＩ−８２２６細胞の溶解は特異的であった。表１６Ｃは、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体により誘導される、リダイレクトされたＴ細胞による、ＢＣＭＡの発現が中程度／低度なＲＰＭＩ−８２２６細胞の殺滅についてのＥＣ５０値についてまとめる。
【０２９６】
【表１６Ｃ】
2020122013.tif 000029
【０２９７】
（実施例１９Ｂ）
抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体により誘導される、リダイレクトされたＴ細胞による、ＢＣＭＡの発現が低度なＪＪＮ−３骨髄腫細胞に対する細胞傷害作用（フローサイトメトリーおよびＬＤＨの放出）
抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体を、抗原結合性部分の、細胞上のＢＣＭＡへの結合を介する、構築物の架橋時に、ＢＣＭＡの発現が低度なＭＭ細胞内でＴ細胞媒介型アポトーシスを誘導するそれらの能力について解析した。略述すると、ＢＣＭＡの発現が低度なヒトＪＪＮ−３多発性骨髄腫標的細胞を、Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒにより採取し、洗浄し、１０％のウシ胎仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したＲＰＭＩ中に再懸濁させる。ウェル１つ当たりの細胞約３０，０００個を、丸底９６ウェルプレート内にプレーティングし、構築物のそれぞれの希釈液を、所望の最終濃度、０．１ｐＭ〜１０ｎＭの範囲の最終濃度となるように添加する（三連で）。適切な比較のために、全てのＴＣＢ構築物および対照を、同じモル濃度へと調整する。ヒトＰＢＭＣ（エフェクター細胞）を、ウェルへと添加して、腫瘍標的細胞１に対して、Ｔ細胞約３〜５のＥ：Ｔ比に対応する、１０：１の最終Ｅ：Ｔ比を得た。陰性対照群は、エフェクター細胞だけ、または標的細胞だけで表した。標準化のために、ＭＭ標的細胞の最大溶解（＝１００％）を、最終濃度１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を伴い、細胞死を誘導する、標的細胞のインキュベーションにより決定した。最小の溶解（＝０％）は、エフェクター細胞だけを伴い、すなわち、Ｔ細胞二特異性抗体を伴わずに共インキュベートされた標的細胞により表した。ｉ）５％のＣＯ２、３７℃で４８時間のインキュベーションの後、培養された骨髄腫細胞を収集し、洗浄し、アポトーシス性骨髄腫細胞を決定するために、蛍光色素コンジュゲート抗体およびアネキシンＶで染色した。染色パネルには、ＣＤ１３８−ＡＰＣＣ７５０／ＣＤ３８−ＦＩＴＣ／ＣＤ５−ＢＶ５１０／ＣＤ５６−ＰＥ／ＣＤ１９−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ７／ＣＤ４５−Ｖ４５０／アネキシンＶ−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５を含めた。使用される蛍光色素で標識された抗体は、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）およびＣａｌｔａｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ  ＣＡ）から購入した。取得は、マルチカラーフローサイトメーターおよびインストールされたソフトウェア（例えば、ＦＡＣＳ  Ｄｉｖａソフトウェアを作動させるＣａｎｔｏＩＩデバイスまたはＣｅｌｌＱＵＥＳＴソフトウェアを使用するＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター）を使用して実施した。データ解析のためには、Ｐａｉｎｔ−Ａ−Ｇａｔｅ  ＰＲＯプログラム（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用した。アネキシンＶを、ＪＪＮ−３細胞上で測定し、アネキシンｖ陽性ＪＪＮ−３細胞の百分率を、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体の濃度に対してプロットした。具体的濃度の抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体により誘導される、ＪＪＮ−３細胞の溶解の百分率はまた、所与のＴＣＢ濃度で、アネキシンＶ陰性ＪＪＮ−３細胞の絶対カウントを測定し、これを、ＴＣＢを伴わないアネキシンＶ陰性ＪＪＮ−３細胞の絶対カウントから減じ、これを、ＴＣＢを伴わないアネキシンＶ陰性ＪＪＮ−３細胞の絶対カウントで除することによっても決定した。図１８−４は、８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体が、フローサイトメトリーにより測定される、ＢＣＭＡの発現が低度なＪＪＮ−３骨髄腫細胞の、濃度依存的な殺滅を誘導したことを示す。ＢＣＭＡ陽性標的細胞に結合せず、Ｔ細胞上のＣＤ３だけに結合する対照ＴＣＢ抗体は、被験最高濃度であってもなお、アネキシンＶ陽性ＪＪＮ−３細胞またはＪＪＮ−３細胞の溶解の増大を誘導しなかったので、ＪＪＮ−３細胞の溶解は特異的であった。表１６Ｄおよび１６Ｅは、それぞれ、アネキシンｖ陽性ＪＪＮ−３細胞の百分率と、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体により誘導されたＪＪＮ−３細胞の溶解の百分率とについてまとめる。
【０２９８】
【表１６Ｄ】
2020122013.tif 000030
【０２９９】
【表１６Ｅ】
2020122013.tif 000031
【０３００】
（実施例２０）
高濃度のリガンドの存在下における、リダイレクトされたＴ細胞による、ＢＣＭＡ陽性多発性骨髄腫細胞系の殺滅について、ＡＰＲＩＬを遮断しない／ＡＰＲＩＬと競合しない抗ＢＣＭＡ抗体を含有する抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体の、ＡＰＲＩＬを遮断する／ＡＰＲＩＬと競合する抗ＢＣＭＡ抗体を含有する抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体と対比した比較で
多発性骨髄腫など、ある特定の造血器悪性腫瘍では、循環ＢＣＭＡリガンドである、ＡＰＲＩＬおよびＢＡＦＦのレベルが上昇しうる（Moreauxら、２００４年、Blood、１０３巻（８号）：３１４８〜３１５７頁）。こうして、本発明者らは、血清中高レベルのリガンドが、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体の、腫瘍細胞上のＢＣＭＡ受容体への結合に干渉しうることを認識する。健常ドナーと比較して、多発性骨髄腫患者の血液中の循環ＡＰＲＩＬ（ＢＣＭＡに対する高アフィニティーリガンド）のレベルは、約１０ｎｇ／ｍＬと対比した、約１００ｎｇ／ｍＬである。ＢＡＦＦ（ＢＣＭＡに対する低アフィニティーリガンド）では、レベルは、健常ドナーにおける約３ｎｇ／ｍＬと比較して、１〜１０００ｎｇ／ｍＬで変動しうる。腫瘍細胞の近傍、すなわち、多発性骨髄腫患者の骨髄微小環境（骨髄は、構成的にＡＰＲＩＬに富む臓器である）内では、ＡＰＲＩＬ／ＢＡＦＦ濃度は、血清中で測定されるレベルより高い公算が大きいであろう。より重要なことは、ＡＰＲＩＬが、悪性骨髄腫細胞にとって重要な生存因子である、骨髄微小環境内で構成的に発現し、また、骨髄の骨髄系前駆体細胞により、主に産生および分泌されてもいることである（Matthesら、Blood、２０１１年、１１８巻（７号）：１８３８〜１８４４頁）。こうして、この文脈では、骨髄腫患者の骨髄中のＡＰＲＩＬの濃度であって、最大１０００ｎｇ／ｍＬまたはそれをさらに超える、より甚大な大きさであることが予測される濃度の関与性が大きい。全身性エリテマトーデスなど、ある特定の自己免疫疾患でもまた、循環ＡＰＲＩＬのレベルは、約８５ｎｇ／ｍＬと上昇する（Koyamaら、２００５年、Ann  Rheum
Dis、６４巻：１０６５〜１０６７頁）。
【０３０１】
ＡＰＲＩＬを遮断しない／ＡＰＲＩＬと競合しない抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体が、ＡＰＲＩＬを遮断する／ＡＰＲＩＬと競合する抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体と比べて有利であるのかどうかを検証するため、ＡＰＲＩＬを遮断しない／ＡＰＲＩＬと競合しない抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体を、多発性骨髄腫患者において見出される、高ＡＰＲＩＬ濃度（すなわち、１００ｎｇ／ｍＬ〜１０００ｎｇ／ｍＬ）の存在下で、抗原結合性部分の、細胞上のＢＣＭＡへの結合を介する、構築物の架橋時に、ＢＣＭＡを発現する骨髄腫細胞の、Ｔ細胞媒介型殺滅を誘導するそれらの潜在能力について解析した。ＡＰＲＩＬは、ヒトＢＣＭＡに、ＢＡＦＦが、受容体に結合するアフィニティーの、最大１０００倍のアフィニティーで結合するので、この文脈では、高濃度のＡＰＲＩＬの関与性が、高濃度のＢＡＦＦより大きい。高レベルのＡＰＲＩＬは、とりわけ、患者において、非常に低用量で治療剤を施す場合、ＴＣＢ抗体の有効性に影響を及ぼす可能性が極めて高い（Bargouら、Science、２００８年、３２１巻（５８９１号）：９７４〜７頁）。こ
うして、ＡＰＲＩＬの存在下において、以下の実験を実施した。
【０３０２】
略述すると、ヒトＢＣＭＡ陽性Ｈ９２９多発性骨髄腫標的細胞を、Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒにより採取し、洗浄し、１０％のウシ胎仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したＲＰＭＩ中に再懸濁させた。ウェル１つ当たりの細胞約３０，０００個を、丸底９６ウェルプレート内にプレーティングし、ＴＣＢ構築物のそれぞれの希釈液を、最終濃度を１００ｎｇ／ｍＬまたは１０００ｎｇ／ｍＬとするＡＰＲＩＬの存在下または非存在下における、所望の最終濃度、０．１ｐＭ〜１０ｎＭの範囲の抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  ＴＣＢの最終濃度となるように添加した（三連で）。適切な比較のために、全てのＴＣＢ構築物および対照を、同じモル濃度へと調整した。ヒトＰＢＭＣ（エフェクター）を、ウェルへと添加して、１０：１の最終Ｅ：Ｔ比を得た。陰性対照群は、エフェクター細胞だけ、または標的細胞だけで表した。ヒト汎Ｔ細胞を活性化させるための陽性対照として、１μｇ／ｍｌのＰＨＡ（Ｓｉｇｍａ型番Ｌ８９０２）を使用した。標準化のために、Ｈ９２９  ＭＭ標的細胞の最大溶解（＝１００％）を、最終濃度１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を伴い、細胞死を誘導する、標的細胞のインキュベーションにより決定した。最小の溶解（＝０％）は、エフェクター細胞だけを伴い、すなわち、Ｔ細胞二特異性抗体を伴わずに共インキュベートされた標的細胞により表した。次いで、５％のＣＯ２、３７℃で２４時間のインキュベーションの後、製造元の指示書に従い、ＬＤＨ検出キット（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）により、アポトーシス性／壊死性Ｈ９２９骨髄腫標的細胞から上清へのＬＤＨの放出を測定した。ＬＤＨ放出の百分率を、濃度応答曲線において、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体の濃度に対してプロットした。ＥＣ５０値は、Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用して測定し、最大ＬＤＨ放出の５０％を結果としてもたらすＴＣＢ抗体の濃度として決定した。図１９に示される通り、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体は、外因性ＡＰＲＩＬの存在下または非存在下におけるＢＣＭＡ陽性Ｈ９２９骨髄腫細胞の殺滅を誘導した。図１９Ａに描示される通り、ＡＰＲＩＬを遮断しない／ＡＰＲＩＬと競合しない８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖは、外因性ＡＰＲＩＬの非存在下において、低ピコモル効力（ＥＣ５０ＡＰＲＩＬ０＝１．５ｐＭ）で、ＢＣＭＡ陽性Ｈ９２９骨髄腫の濃度依存的な殺滅を誘導した。多発性骨髄腫患者の血液中で見出されうるＡＰＲＩＬの濃度である、１００ｎｇ／ｍＬのＡＰＲＩＬを、培養物へと添加したところ、このような濃度のリガンドが、８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖに媒介される殺滅効力に与える影響は、ＥＣ５０（ＥＣ５０ＡＰＲＩＬ１００＝４．３ｐＭ）の２．９倍の増大により反映される通り、最小限に限られた。多発性骨髄腫患者の骨髄中で見出されうる、１０倍の高濃度のＡＰＲＩＬ（すなわち、１０００ｎｇ／ｍＬ）を、培養物へと添加したところ、８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖに媒介される殺滅効力の低減は、ＥＣ５０の６倍の増大（ＥＣ５０ＡＰＲＩＬ１０００＝９．０ｐＭ）により反映される通り、わずかであった。１０００ｎｇ／ｍＬのＡＰＲＩＬの存在下における、殺滅効力のこの小さな低減���も拘らず、ＡＰＲＩＬを遮断しない／ＡＰＲＩＬと競合しない８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖは、ＢＣＭＡ陽性Ｈ９２９骨髄腫細胞を、低ピコモル範囲の効力で、やはり効率的に死滅させうる。表１７は、外因性ＡＰＲＩＬの非存在下および存在下における、ＡＰＲＩＬを遮断しない／ＡＰＲＩＬと競合しない８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖのＥＣ５０値についてまとめる。
【０３０３】
【表１７】
2020122013.tif 000032
【０３０４】
図１９Ｂに描示される通り、ＡＰＲＩＬを遮断する／ＡＰＲＩＬと競合するＪ６Ｍ０−ＴＣＢは、外因性ＡＰＲＩＬの非存在下において、低ピコモル効力（ＥＣ５０ＡＰＲＩＬ０＝５．８ｐＭ）で、ＢＣＭＡ陽性Ｈ９２９骨髄腫の濃度依存的な殺滅を誘導した。１００ｎｇ／ｍＬのＡＰＲＩＬを、培養物へと添加したところ、このような濃度のリガンドが、Ｊ６Ｍ０−ＴＣＢに媒介される殺滅効力に与える影響は、ＥＣ５０（ＥＣ５０ＡＰＲＩＬ１００＝１４．２ｐＭ）の２．４倍の増大により示される通り、最小限に限られた。しかし、１０００ｎｇ／ｍＬのＡＰＲＩＬを、培養物へと添加したところ、Ｊ６Ｍ０−ＴＣＢに媒介される殺滅効力は、ＥＣ５０の８４．３倍の増大（ＥＣ５０ＡＰＲＩＬ１０００＝４８８．９ｐＭ）により反映される通り、大幅に低減された。表１８は、外因性ＡＰＲＩＬの非存在下および存在下における、ＡＰＲＩＬを遮断する／ＡＰＲＩＬと競合するＪ６Ｍ０−ＴＣＢのＥＣ５０値についてまとめる。
【０３０５】
全体的な結果は、ＡＰＲＩＬを遮断しない／ＡＰＲＩＬと競合しない抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体は、多発性骨髄腫患者の骨髄微小環境内に存在する公算が大きい、高濃度のＡＰＲＩＬの影響を受けず、かつ／または影響を受けても小さな影響であることにより、ＡＰＲＩＬを遮断する／ＡＰＲＩＬと競合する抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体に比べて、明らかな利点を有しうることを示唆する。１０００ｎｇ／ｍＬのＡＰＲＩＬの存在下における、殺滅効力のこの小さな低減にも拘らず、ＡＰＲＩＬを遮断しない／ＡＰＲＩＬと競合しない８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖは、ＢＣＭＡ陽性Ｈ９２９骨髄腫細胞を、低ピコモル範囲の効力で、やはり効率的に死滅させうる。これらの観察を臨床状況へと置き直すと、骨髄中のＡＰＲＩＬレベルが高い患者において、８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖなどのＴＣＢの、所与の治療用量が低量であっても、やはり骨髄腫細胞を死滅させうることを意味する。Ｊ６Ｍ０−ＴＣＢなどのＴＣＢを使用する場合は、状況は異なる可能性があり、ＡＰＲＩＬレベルが高い患者における抗腫瘍効果は、失われる公算が大きい。代替法は、はるかな高治療用量を使用することであるが、これは、副作用の危険性を増大させる（ＴＣＢであるブリナツモマブについて、用量依存的な副作用が報告されている）。
【０３０６】
【表１８】
2020122013.tif 000033
【０３０７】
（実施例２１）
電荷変異体を伴わない８３Ａ１０−ＴＣＢと、電荷変異体を伴う８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖとは、同様の生物学的特性を示す
いずれの分子においても、ＶＬ  ＣＤＲと、ＶＨ  ＣＤＲとは、同一のままであるので、ＣＬ−ＣＨ１において電荷修飾を伴うＴＣＢ抗体は、細胞ベースのアッセイにおいて、電荷修飾を伴わない、それらの野生型ＴＣＢ対応物と同様に挙動し、同様の生物学的特性を提示することが予測される。
【０３０８】
電荷変異体を伴うＴＣＢを、電荷変異体を伴わないＴＣＢと対比して比較するのに最適な生物学的特性のうちの１つは、ＴＣＢ抗体が細胞に結合する能力であろう。図２０Ａは、濃度依存的で、それぞれＥＣ５０＝９．８ｎＭ対ＥＣ５０＝１４．５ｎＭである、同様の効力を伴う、８３Ａ１０−ＴＣＢおよび８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖの、ＢＣＭＡ陽性Ｈ９２９細胞への結合を描示する。ＤＰ４７−ＴＣＢ対照抗体は、蛍光強度中央値の増大の欠如により測定される通り、ＢＣＭＡ陽性Ｈ９２９骨髄腫細胞に結合しなかった。第２の一対一比較実験では、８３Ａ１０−ＴＣＢおよび８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖを、ＢＣＭＡ陽性Ｈ９２９細胞への結合、およびＢＣＭＡ／ＣＤ３陰性ＭＫＮ４５細胞への結合の欠如について査定した。図２０Ｂに描示される通り、８３Ａ１０−ＴＣＢおよび８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖは、ＢＣＭＡ陽性Ｈ９２９細胞に、濃度依存的に、かつ、それぞれ、ＥＣ５０＝１６．９ｎＭおよびＥＣ５０＝１４．５ｎＭである、同様の効力で結合する。８３Ａ１０−ＴＣＢおよび８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖの、Ｈ９２９細胞への結合についてのＥＣ５０値を、両方の実験について、表１９にまとめる。
【０３０９】
【表１９】
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【０３１０】
電荷変異体を伴うＴＣＢ抗体を、電荷変異体を伴わないＴＣＢ抗体と対比して比較するのに適切な別の生物学的特性は、リダイレクトされたＴ細胞による標的細胞の殺滅を誘導するそれらの能力であろう。図２０Ｃ〜Ｆに示される通り、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体（（Ｃ、Ｄ）８３Ａ１０−ＴＣＢ、（Ｅ、Ｆ）８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ）は、ＬＤＨの放出により測定される、ＢＣＭＡ陽性Ｈ９２９骨髄腫細胞の、濃度依存的な殺滅を誘導した。ＢＣＭＡ陽性標的細胞に結合しないＤＰ４７−ＴＣＢ対照抗体は、１ｎＭの最高濃度であってもなお、ＬＤＨの放出を誘導しなかったので、Ｈ９２９細胞の殺滅は特異的であった（Ｃ）。８３Ａ１０−ＴＣＢ（Ｃ、Ｄ）および８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ（Ｅ、実験１）についてのＥＣ５０値は、Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ）統計学ソフトウェアにより測定可能ではなかったが、ＥＣ５０値の大きさは、非帯電ＴＣＢ分子および帯電ＴＣＢ分子の両方について、ほぼ、低ピコモル範囲の効力であると推定しうる。第２の実験では、リダイレクトＴ細胞殺滅アッセイにおいて、８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖの効果を査定し、ＥＣ５０値を、１．５ｐＭと測定することができた（Ｆ）。著者らは、わずかに低値のＥＣ５０値（わずかにより良好な効力）が、血液ドナーのばらつきに起因する可能性を除外することができなかった。しかし、Ｈ９２９細胞を死滅させる効力の大きさが、低ピコモル範囲にあることは、疑いなかった。全体的な結果は、８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ（電荷変異体を伴う）と対比した、８３Ａ１０−ＴＣＢ（電荷変異体を伴わない）が、細胞ベースのアッセイにおいて、同様の生物学的特性を示すことを示唆する。８３Ａ１０−ＴＣＢおよび８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖにより誘導される、リダイレクトされたＴ細胞による、Ｈ９２９細胞の殺滅についてのＥＣ５０値を、表２０にまとめる。
【０３１１】
【表２０】
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【０３１２】
（実施例２２）
多発性骨髄腫患者に由来する骨髄中の骨髄腫細胞上のＢＣＭＡの発現
目的の腫瘍標的を発現するヒト細胞系は、Ｔ細胞の存在下において腫瘍細胞細胞傷害作用を誘導する、ＴＣＢ抗体の効力を測定し、ＥＣ５０値を決定するのために、またＴＣＢ分子をランク付けするために、非常に有用で実際的なツールである。しかし、たやすく入手可能であり、実際的であるにも拘らず、ヒト骨髄腫細胞系には、分子レベルにおける著明な異質性により特徴付けられる、非常に複雑な疾患である、多発性骨髄腫の異質性を表さない点には注意すべきである。加えて、骨髄腫細胞系は、一部の細胞は、ＢＣＭＡを、他の細胞より強力に発現させる（例えば、Ｕ２６６細胞またはＲＰＭＩ−８２２６細胞と対比したＨ９２９細胞）ので、ＢＣＭＡ受容体を、同じ強度および密度では発現させないことから、細胞レベルにおけるこのような異質性はまた、異なる患者間でも観察されうることが示唆される。多発性骨髄腫における、重要な研究主導者による共同研究を通して、患者試料中のＢＣＭＡの発現および密度の決定、ならびに臨床患者試料による、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体の査定が探索されている。地域の倫理審査委員会によるガイドラインおよびヘルシンキ宣言に従い、説明同意文書の署名を得た後で、多発性骨髄腫患者から、血液および骨髄吸引物を収集する。
【０３１３】
ａ）フローサイトメトリーにより検出される、ＢＣＭＡの発現（蛍光強度中央値）
骨髄中の骨髄腫細胞上のＢＣＭＡ受容体の発現を決定するために、単離されたばかりの骨髄吸引物を使用して、免疫表現型解析を実施する。赤血球溶解Ｋ３−ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）で抗凝集処理された全骨髄試料を、免疫表現型解析に使用する。ＣＤ１３８＋  ＣＤ３８＋  ＣＤ４５＋  ＣＤ１９−  ＣＤ５６＋として同定される悪性形質細胞の特異的同定および免疫表現型による特徴付けを目的とする、直接免疫蛍光技法およびマルチカラー染色を使用して、チューブ１本当たりの総細胞２×１０６個を染色し、溶解させ、次いで、洗浄する。次いで、蛍光色素コンジュゲート抗体のパネルであって、少なくともＣＤ３８−ＦＩＴＣ／ＣＤ５６−ＰＥ／ＣＤ１９−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ７／ＣＤ４５−Ｖ４５０／ＢＣＭＡ−ＡＰＣを含むパネルを使用して、細胞を染色する。使用される蛍光色素で標識された抗体は、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）およびＣａｌｔａｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ  ＣＡ）から購入する。自家製のＡＰＣコンジュゲート抗ヒトＢＣＭＡ抗体は、免疫表現型解析において使用する。取得は、マルチカラーフローサイトメーターおよびインストールされたソフトウェア（例えば、ＦＡＣＳ  Ｄｉｖａソフトウェアを作動させるＣａｎｔｏＩＩデバイスまたはＣｅｌｌＱＵＥＳＴソフトウェアを使用するＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター）を使用して実施する。データ解析には、Ｐａｉｎｔ−Ａ−Ｇａｔｅ  ＰＲＯプログラム（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用する。ＢＣＭＡの発現は、悪性形質細胞集団にゲーティングして測定し、蛍光強度中央値を決定し、骨髄腫患者間で比較する。
【０３１４】
【表２１】
2020122013.tif 000036
【０３１５】
ｂ）ＢＣＭＡ抗原のコピー数の決定（定量的フローサイトメトリー解析）
（ｉ）Ｑｉｆｉｋｉｔ（Ｄａｋｏ）法を使用して、Ｈ９２９細胞の細胞表面上の、ＢＣＭＡ抗原のコピー数を定量化する。Ｈ９２９細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄し（１００μｌ／ウェル；３５０×ｇで５分間）、細胞１００万個／ｍｌへと調整する。５０μｌ（＝細胞５０万個）の細胞懸濁液を、指し示される通りに、９６丸底ウェルプレートの各ウェルへと移す。次いで、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、０．１％のＢＳＡ）中で、２５μｇ／ｍｌの最終濃度まで（または飽和濃度に）希釈された、５０μｌのマウス抗ヒトＢＣＭＡ  ＩｇＧ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ型番３５７５０２）、またはマウスＩｇＧ２ａアイソタイプ対照（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ型番４０１５０１）を添加し、暗所内、４℃で３０分間、染色を実施する。次に、１００μｌのＳｅｔ−ｕｐ  ＢｅａｄｓまたはＣａｌｉｂｒａｔｉｏｎ  Ｂｅａｄｓを、別々のウェルに添加し、細胞ならびにビーズを、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄する。細胞およびビーズを、Ｑｉｆｉｋｉｔにより提供されている、フルオレセインコンジュゲート抗マウス二次抗体（飽和濃度の）を含有する、２５μｌのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁させる。細胞およびビーズを、暗所内、４℃で４５分間染色する。細胞を１回洗浄し、全ての試料を、１００μｌのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁させる。試料を、マルチカラーフローサイトメーターおよびインストールされたソフトウェア（例えば、ＦＡＣＳ  Ｄｉｖａソフトウェアを作動させるＣａｎｔｏＩＩデバイスまたはＣｅｌｌＱＵＥＳＴソフトウェアを使用するＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター）上で解析する。代替的に、一部の研究では、市販のマウス抗ヒトＢＣＭＡ  ＩｇＧを一次抗体として使用する代わりに、結合特性が最適な、自家製の抗ヒトＢＣＭＡ  ＩｇＧ抗体（例えば、８３Ａ１０  ＩｇＧ、１７Ａ５−ＩｇＧまたは１３Ａ４）ＩｇＧを使用するのに続いて、ヒトＩｇＧ−Ｆｃに対する市販の第１の非コンジュゲート二次抗体（Ａｂｃａｍ、型番ＡＢＭ１２１）を伴う、さらなるインキュベーションステップにかけてから、第２のフルオレセインコンジュゲート抗マウス二次抗体を含有するＦＡＣＳ緩衝液の存在下において、キャリブレーションビーズを、細胞と共にインキュベートする。一次抗体および二次抗体を、飽和濃度で使用する場合、結合した一次抗体分子の数は、細胞表面上に存在する抗原性部位の数に対応し、蛍光は、細胞上およびビーズ上の、結合した一次抗体分子の数と相関する。
【０３１６】
（ｉｉ）Ｑｉｆｉｋｉｔ（Ｄａｋｏ）法を使用して、患者骨髄の骨髄腫形質細胞上の細胞表面における、ＢＣＭＡ特異的抗原結合能（ＳＡＢＣ）を定量化した。全骨髄吸引物から単離された骨髄腫形質細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、０．１％のＢＳＡ）中で、２５μｇ／ｍｌの最終濃度まで（または飽和濃度に）希釈された、５０μｌのマウス抗ヒトＢＣＭＡ  ＩｇＧ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ型番３５７５０２）、またはマウスＩｇＧ２ａアイソタイプ対照（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ型番４０１５０１）で染色し、染色は、暗所内、４℃で３０分間実施した。次に、１００μｌのＳｅｔ−ｕｐ  ＢｅａｄｓまたはＣａｌｉｂｒａｔｉｏｎ  Ｂｅａｄｓを、別々のウェルに添加し、細胞ならびにビーズを、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。細胞およびビーズを、Ｑｉｆｉｋｉｔにより提供されている、フルオレセインコンジュゲート抗マウス二次抗体（飽和濃度の）を含有する、２５μｌのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁させた。細胞およびビーズを、暗所内、４℃で４５分間染色した。細胞を１回洗浄し、全ての試料を、１００μｌのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁させた。試料を、マルチカラーフローサイトメーターおよびインストールされたソフトウェア（例えば、ＦＡＣＳ  Ｄｉｖａソフトウェアを作動させるＣａｎｔｏＩＩデバイスまたはＣｅｌｌＱＵＥＳＴソフトウェアを使用するＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター）上で速やかに解析した。
【０３１７】
【表２２】
2020122013.tif 000037
【０３１８】
（実施例２３）
抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体により誘導される、リダイレクトされたＴ細胞による、骨髄中の患者骨髄腫細胞に対する細胞傷害作用（フローサイトメトリー）
ａ）多発性骨髄腫のためのＴＣＢ抗体候補物質の前臨床査定時において、最も有意義であり、かつ、極めて重要なｉｎ  ｖｉｔｒｏの特徴付けのうちの１つは、ＴＣＢ分子が、患者のＴ細胞を活性化させ、患者の骨髄に由来する原発性骨髄腫細胞の、リダイレクトされたＴ細胞による殺滅を誘導しうるかどうかである。リダイレクトされたＴ細胞による、骨髄中の骨髄腫細胞の殺滅を誘導する抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体の効果を査定するため、全血液および赤血球溶解全骨髄試料から単離された、自家血液Ｔ細胞を収集し、調製する。第１の実験設定では、自家骨髄浸潤Ｔ細胞を、エフェクター細胞として使用し、ＴＣＢ抗体を、赤血球溶解全骨髄試料中に直接スパイクする。全骨髄試料中に存在する、エフェクター細胞と腫瘍細胞との比（Ｅ：Ｔ比）を、決定し、フローサイトメトリーにより測定する。骨髄腫細胞１に対する、ＣＤ３＋細胞を１〜３とするＥ：Ｔ比を使用することが好ましい。第２の実験設定では、患者全血液から単離された自家血液Ｔ細胞を、全骨髄試料へと添加して、骨髄腫細胞１に対する、ＣＤ３＋細胞を１〜３とするＥ：Ｔ比を得る。略述すると、２００μｌの、調製された赤血球溶解全骨髄試料を、９６ディープウェルプレートへと移す。抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体および対照抗体希釈液を、滅菌ＰＢＳ中で調製し、１０μｌの調製物を、それぞれのウェルへと、０．１ｐＭ〜１００ｎＭの範囲の最終濃度となるように添加する。全骨髄−抗体懸濁液を、静かな振とうにより混合し、次いで、５％のＣＯ２、３７℃で２４時間〜４８時間インキュベートし、パラフィンフィルムで密封する。インキュベーション期間の後、ＣＤ１３８−ＡＰＣＣ７５０／ＣＤ３８−ＦＩＴＣ／ＣＤ５−ＢＶ５１０／ＣＤ５６−ＰＥ／ＣＤ１９−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ７／ＣＤ４５−Ｖ４５０／ＢＣＭＡ−ＡＰＣ／アネキシンＶ−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５を含む抗体パネルに基づき調製された、２０μｌの対応するＦＡＣＳ抗体溶液を、９６Ｕ字型底プレートへと添加する。蛍光色素で標識された抗体は、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）およびＣａｌｔａｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ  ＣＡ）から購入し、自家製のＡＰＣコンジュゲート抗ヒトＢＣＭＡ抗体を使用する。次いで、試料を、暗所内、室温で１５分間インキュベートし、取得し、マルチカラーフローサイトメーターを使用して解析する。骨髄腫細胞の細胞死は、骨髄腫細胞集団ＣＤ１３８＋  ＣＤ３８＋  ＣＤ４５＋  ＣＤ１９−、およびＣＤ１３８＋  ＣＤ３８＋  ＣＤ４５＋  ＣＤ１９−  ＢＣＭＡ＋にゲーティングして、アネキシンＶ陽性発現を査定することにより決定する。次いで、骨髄腫細胞死の百分率を決定する。
【０３１９】
抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体が、骨髄腫患者のＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞（例えば、骨髄浸潤Ｔ細胞（ＭＩＬ）および血中Ｔ細胞）の活性化を誘導するのかどうかを査定するため、処置群、非処置群、および対照群のそれぞれに由来する試料もまた、ＣＤ８−ＡＰＣＨ７／ＣＤ６９−ＦＩＴＣ／ＣＤ１０７−ＢＶ５１０／ＣＤ１６−ＰＥ／ＣＤ２５−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ７／ＣＤ４−ＰａｃＢ／ＨＬＤ−ＤＲ−ＡＰＣ／ＣＤ３−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５を含む抗体パネルに基づき調製された、ＦＡＣＳ抗体溶液で染色する。次いで、試料を、暗所内、室温で１５分間インキュベートし、取得し、マルチカラーフローサイトメーターを使用して解析する。Ｔ細胞の活性化は、ＣＤ４＋Ｔ細胞集団およびＣＤ８＋Ｔ細胞集団にゲーティングして、ＣＤ２５陽性発現および／またはＣＤ６９陽性発現を査定することにより決定する。次いで、Ｔ細胞の活性化の百分率を、測定する。
【０３２０】
ｂ）リダイレクトされたＴ細胞による、骨髄中の骨髄腫形質細胞の殺滅を誘導する抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体の効果を査定するため、全骨髄吸引物を、多発性骨髄腫患者から、ＥＤＴＡでコーティングされたチューブに収集し、細胞培養物アッセイのために速やかに使用した。全骨髄試料中に存在する、エフェクター細胞と腫瘍細胞との比（Ｅ：Ｔ比）を、決定し、フローサイトメトリーにより測定した。略述すると、２００μｌの骨髄試料を、９６ディープウェルプレートへと移した。抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体および対照抗体希釈液を、滅菌培地中で調製し、１０μｌの調製物を、それぞれのウェルへと、０．１ｐＭ〜３０ｎＭの範囲の最終濃度となるように添加した。骨髄−抗体懸濁液を、静かな振とうにより混合し、次いで、５％のＣＯ２、３７℃で４８時間インキュベートし、パラフィンフィルムで密封する。インキュベーション期間の後、ＣＤ１３８−ＡＰＣＣ７５０／ＣＤ３８−ＦＩＴＣ／ＣＤ５−ＢＶ５１０／ＣＤ５６−ＰＥ／ＣＤ１９−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ７／ＣＤ４５−Ｖ４５０／ＢＣＭＡ−ＡＰＣ／アネキシンＶ−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５を含む抗体パネルに基づき調製された、２０μｌの対応するＦＡＣＳ抗体溶液を、９６Ｕ字型底プレートへと添加した。蛍光色素で標識された抗体は、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）およびＣａｌｔａｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ  ＣＡ）から購入し、自家製のＡＰＣコンジュゲート抗ヒトＢＣＭＡ抗体を使用した。次いで、試料を、暗所内、室温で１５分間インキュベートし、取得し、マルチカラーフローサイトメーターを使用して解析した。骨髄腫細胞の細胞死は、骨髄腫細胞集団ＣＤ１３８＋  ＣＤ３８＋  ＣＤ４５＋  ＣＤ１９−  ＣＤ５６＋にゲーティングして、アネキシンＶ陽性発現を査定することにより決定した。次いで、骨髄腫細胞死の百分率を決定した。具体的濃度の抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体により誘導される、患者骨髄の骨髄腫形質細胞の溶解の百分率はまた、所与のＴＣＢ濃度で、アネキシンＶ陰性骨髄腫形質細胞の絶対カウントを測定し、これを、ＴＣＢを伴わないアネキシンＶ陰性骨髄腫形質細胞の絶対カウントから減じ、これを、ＴＣＢを伴わないアネキシンＶ陰性骨髄腫形質細胞の絶対カウントで除することによっても決定した。抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体の特異性を検証するために、アネキシンＶ発現はまた、Ｔ細胞、Ｂ細胞、およびＮＫ細胞など、他の骨髄細胞型内でも測定した。図２１に示される通り、患者骨髄腫形質細胞の、濃度依存的で特異的な溶解が見られたのに対し、Ｔ細胞、Ｂ細胞、およびＮＫ細胞の溶解は、観察されなかった。加えて、ＣＤ３だけに結合し、ＢＣＭＡに結合しない対照ＴＣＢは、ＴＣＢ抗体の最高濃度でも、骨髄腫形質細胞の細胞死を誘導しなかった。表２３に示される通り、患者骨髄中のアネキシンＶ陽性骨髄腫細胞の百分率は、８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖについて、最高濃度（３０ｎＭ）のときに、最大の２９．３１％に達したことから、８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖは、患者骨髄の骨髄腫形質細胞の殺滅を誘導するのに強力であることが示唆される。
【０３２１】
【表２３】
2020122013.tif 000038
【０３２２】
ｃ）別の研究では、３例のＭＭ患者に由来する骨髄吸引物中で、生存骨髄腫形質細胞の百分率を、アネキシンＶ陰性細胞集団にゲーティングすることにより決定し、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体の濃度に対してプロットした。ＥＣ５０値は、最大生存骨髄腫形質細胞の５０％を結果としてもたらすＴＣＢ抗体の濃度として、測定および決定した。ＥＭＡＸ（％）は、それぞれの抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体の存在下における、生存骨髄腫形質細胞の最大値として決定した。８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖは、骨髄腫患者の骨髄吸引物試料中の骨髄腫形質細胞の溶解の誘導において強力であった（表２４；図２２）。８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖで処置された患者試料３例中３例において、生存骨髄腫細胞の濃度依存的な低減が観察された。図２２および表２４はまた、その後の研究において実施された、ＥＣ５０値およびＥＭＡＸ（％）値に関する８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖの、Ｊ６Ｍ０−ＴＣＢｃｖとの比較（Ｊ６Ｍ０とは、ＢＣＭＡへの結合時に、ＡＰＲＩＬと競合することが報告されている抗体である（Taiら、Blood、２０１４年））も示す。患者試料３例中３例において、８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖは、３０ｎＭの等モル最大用量で、Ｊ６Ｍ０−ＴＣＢｃｖでより、患者骨髄吸引物に由来する骨髄腫形質細胞のより大きな溶解であって、生存骨髄腫形質細胞の百分率（この百分率が小さいほど、溶解細胞の百分率は大きい）を表すＥＭＡＸ値により反映される溶解を誘導した。ＥＣ５０値はまた、８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖがまた、患者試料３例中２例において、Ｊ６Ｍ０−ＴＣＢｃｖより強力であったことも示した。
【０３２３】
【表２４】
2020122013.tif 000039
【０３２４】
ｄ）本発明の新たな抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体についての、８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖと比較したさらなる探索において、７例の採取したての患者全骨髄試料／吸引物を、ＣＤ１３８磁気マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で染色し、ａｕｔｏＭＡＣＳ細胞分離カラム内に流過させ、ＭＭ形質細胞が十分な数残存し、通例、骨髄腫形質細胞が＞４％である収集された画分を、さらなる実験のために使用した。２４ウェルプレート内で、細胞５００，０００個／ウェルをインキュベートし、４８時間培養した。抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体および対照抗体希釈液を、それぞれのウェルへと、０．１ｐＭ〜１０ｎＭの最終ＴＣＢ濃度となるように添加した。各投与点は、三連で行った。形質細胞および骨髄微小環境細胞の生存率は、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ；Ｂｅｃｔｏｎ
Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用する、ヨウ化プロピジウム／ＣＤ１３８−ＦＩＴＣ二重染色により探索した。データ解析は、ＦＡＣＳＤｉｖａ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｅｃｔｏｎ
Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して実施した。図２３に描示される通り、バープロットは、それぞれの培地対照（ＭＣ）の三連にわたる平均値に対して標準化された平均値を示す。統計学的解析のためには、片側ｔ検定を使用した。濃度１０ｎＭにおけるＭＭ形質細胞成長の最大阻害（ＩＭＡＸ１０）および１ｎＭにおいて測定される阻害（ＩＭＡＸ１）は、それぞれ、培地対照に照らしたパーセントで与えた。対照ＴＣＢ抗体（１０ｎＭ）による、培地対照と比較した最大阻害もまた描示した。演算は、ＩＭＡＸ値の計算（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ（登録商標）；Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｏｆｆｉｃｅ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ  ２０１３）を除き、Ｒ  ３．１．１９およびＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ
２．１３１０を使用して実施した。効果は、その対応する統計学的検定のＰ値が、＜５％（＊）、＜１％（＊＊）、または＜０．１％（＊＊＊）である場合に、統計学的に有意であると考えられた。図２３Ａ〜２３Ｇに示される通り、結果は明らかに、患者試料７例中７例において、８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖを伴う骨髄中の生存骨髄腫形質細胞は、培地対照と比較して少ないこと（すなわち、骨髄中の骨髄腫形質細胞のより大きな溶解）を示す。図２５は、培地対照と比べて、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体によって誘導される患者骨髄吸引物に由来する生存骨髄腫形質細胞の百分率を実証する。表２６は、ＩＭＡＸ１０値およびＩＭＡＸ１値を示す。結果は、８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖが、患者骨髄の骨髄腫形質細胞の殺滅を誘導するのに強力であることを実証する。抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体により誘導され、全ての骨髄患者試料中で観察された骨髄形質細胞（ＢＭＰＣ）の特異的溶解にも拘らず、骨髄微小環境（ＢＭＭＥ）は、それぞれの試料中で影響を受けなかった（図２３Ｈ、７例の患者試料を表す）。
【０３２５】
【表２５】
2020122013.tif 000040
【０３２６】
【表２６】
2020122013.tif 000041
【０３２７】
（実施例２３Ａ）
抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体により誘導される、患者骨髄Ｔ細胞の活性化（マルチパラメータフローサイトメトリー）
抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体が、骨髄腫患者のＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞（すなわち、骨髄浸潤Ｔ細胞（ＭＩＬ））の活性化を誘導するのかどうかを査定するため、インキュベーションの４８時間後における、処置群、非処置群、および対照群のそれぞれに由来する試料もまた、８つのマーカー：ＣＤ８／ＣＤ６９／ＴＩＭ−３／ＣＤ１６／ＣＤ２５／ＣＤ４／ＨＬＡ−ＤＲ／ＰＤ−１を含む抗体パネルに基づき調製された、ＦＡＣＳ抗体溶液で染色した。次いで、試料を、暗所内、室温で１５分間インキュベートし、取得し、マルチカラーフローサイトメーターを使用して解析した。Ｔ細胞の活性化は、ＣＤ４＋Ｔ細胞集団およびＣＤ８＋Ｔ細胞集団にゲーティングして、ＣＤ２５陽性発現、ＣＤ６９陽性発現、および／またはＨＬＡ−ＤＲ陽性発現を査定することにより決定した。次いで、Ｔ細胞の活性化の百分率を、測定した。図２４は、多発性骨髄腫患者に由来する、骨髄浸潤ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞における、ＣＤ６９およびＣＤ２５の濃度依存的な上方調節を示す。表２６Ａは、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体により誘導される、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞における、ＣＤ６９発現およびＣＤ２５発現の増大（１例の患者に由来するデータ）についてまとめる。
【０３２８】
【表２６Ａ】
2020122013.tif 000042
【０３２９】
（実施例２４）
マウスにおける薬物動態研究
抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  ＴＣＢｃｖ抗体が、（ｓｃＦＶ）２（例えば、ＷＯ２０１３／０７２４１５およびＷＯ２０１３／０７２４０６において記載されている、ＢＣＭＡ×ＣＤ３二特異性Ｔ細胞エンゲージャーＢｉＴＥ）などの他の二特異性抗体に比べて有しうる、明らかな利点は、患者が携行するポンプを介して、数週間〜数カ月間投与される処置を要請する（ｓｃＦＶ）２の非常に短い消失半減期（例えば、１〜４時間の）と比較した、週２回または１回のｉ．ｖ．投与またはｓ．ｃ．投与を可能としうるｉｎ  ｖｉｖｏにおける、はるかに長い消失半減期／小さなクリアランスである（Toppら、J  Clin  Oncol、２０１１年、２９巻（１８号）：２４９３〜８頁）。週２回または１回の投与は、患者にとってはるかに好都合であり、また、はるかに危険（例えば、ポンプの不具合、カテーテルに関する問題）が小さい。
【０３３０】
抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  ＴＣＢｃｖ抗体の、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける消失半減期／クリアランスを検証するために、免疫不全雄マウスおよび／または免疫不全雌マウス（例えば、６〜１０週齢で、体重１８〜２５ｇの、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスまたはＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄ  ＩＬ２ｒガンマ（ヌル）（ＮＯＧ）マウスを、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ、Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙおよび／またはＴａｃｏｎｉｃなど、認識された販売元から得、適切な条件下で、少なくとも１週間馴致する。馴致期間および実験期間を通して、動物には、標準的なペレットによる食餌および水が不断に供給された。動物の飼育および全ての手順は、連邦政府によるガイドラインおよび適切な動物福利に関する関連法規に従い、実績のあるＣＲＯおよび／または認可された実験室において行う。
【０３３１】
ａ）薬物動態研究を行うために、動物を、ｎ＝１〜ｎ＝６、好ましくは、ｎ＝２〜ｎ＝４の群へと無作為化し、選択された処置および／または用量および／または血液収集の時点へと割り当てる。群は、別々のケージに保ち、個々の動物は、適切な方法でマークする。動物には、１μｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは、５μｇ／ｋｇ〜０．５ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  ＴＣＢｃｖ抗体の、単回ｉ．ｖ．用量を投与する。投与容量は、５〜１０ｍＬ／ｋｇの範囲にわたる。一部の群では、比較のために、マウスに、ＢＣＭＡ×ＣＤ３（ｓｃＦＶ）２のｉ．ｖ．投与を施す。採血は、実験プロトコールに従い、投与前、および被験薬をｉ．ｖ．注射した１０分後〜１４日間後、好ましくは、１５分後〜１６８時間後の範囲で、投与後の複数の時点にスケジューリングする。約２００μｌの血液試料は、ヘマトクリット毛細管を使用して、球後静脈叢の穿刺により、または安楽死の時点では、心穿刺により、ｍｉｃｒｏｖｅｔｔｅｓ（登録商標）へと収集する。血液試料は、４℃で速やかに保存し、最大９０００×ｇで２〜５分間遠心分離する。少なくとも８０μｌの血清または血漿上清を分離し、解析まで、−２０℃〜−８０℃で保存する。ヒトＩｇＧを検出する標準的なＥＬＩＳＡアッセイ（ａｂｃａｍ；カタログ番号ａｂ１０００５４７）を使用して、探索下の抗体の血清濃度または血漿濃度を測定する。血清濃度および／または血漿濃度から、薬物動態パラメータ、例えば、最大血清濃度／最大血漿濃度、分布容量、濃度時間曲線下面積、クリアランス、平均滞留時間、および／または半減期時間を計算する。ヒトＩｇＧ  Ｆｃを欠くＢＣＭＡ×ＣＤ３（ｓｃＦＶ）２の血清濃度を検出するために、処置されたマウスに由来する血清試料中の、ＢＣＭＡ×ＣＤ３（ｓｃＦＶ）２の、ｎｇ／ｍｌ未満の濃度を定量化するための、生物学的アッセイを使用する。生物学的アッセイの基礎は、前に報告されている（Schlerethら、Cancer
Immunol  Immunother、２００６年、５５巻：５０３〜５１４頁）通り、ＢＣＭＡ×Ｃ
Ｄ３（ｓｃＦＶ）２が、Ｔ細胞の活性化表面マーカー（ＣＤ６９および／またはＣＤ２５）の上方調節を、濃度依存的に誘導することの観察である。ＢＣＭＡ陽性Ｈ９２９細胞に結合したＢＣＭＡ×ＣＤ３（ｓｃＦＶ）２の存在下における、ＣＤ３陽性Ｔ細胞の免疫学的応答を測定する検量線を作成するために、３ｎｇ／ｍｌ〜２００ｐｇ／ｍｌの範囲のＢＣＭＡ×ＣＤ３（ｓｃＦＶ）２濃度を使用する。細胞は、５％のＣＯ２、３７℃、１０：１のＥ：Ｔ比で、一晩にわたりインキュベートする。ブランク試料（ＢＣＭＡ×ＣＤ３（ｓｃＦＶ）２を伴わない）を使用して、バックグラウンドのマーカー発現を測定する。被験試料は、標準物質のための手順なものと同等に、そのままで扱うほか、プールされたヒト血清中１：２、および１：４に希釈する。免疫学的表面マーカーの発現レベルは、抗ＣＤ２５および／または抗ＣＤ６９  ＦＩＴＣまたはＰＥ標識検出抗体（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用するＦＡＣＳ解析により決定する。未知の被験試料のＢＣＭＡ×ＣＤ３（ｓｃＦＶ）２濃度は、Ｐｒｉｓｍ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧｒａｐｈＰａｄ）の「内挿Ｘ値」関数を使用して、公知のＢＣＭＡ×ＣＤ３（ｓｃＦＶ）２濃度に対する検量線から、それぞれのマーカーの量をプロットすることにより決定する。皮下投与が、最終的に好ましい臨床投与経路でありうるので、マウスにおける皮下薬物動態研究に取り組むことができる。
【０３３２】
ｂ）単回投与の薬物動態研究では、動物を、群１つ当たりのマウスをｎ＝９とする３つの処置群へと無作為化し、次いで、選択された血液収集の時点（処置群１つ当たり、１時点当たりのｎ＝３）へとさらに割り当てた。動物には、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  ８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ抗体の単回ＩＶ用量を、０．００８２ｍｇ／ｋｇ〜０．８２ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で実施した。投与容量は、５ｍＬ／ｋｇで投与した。採血は、実験プロトコールに従い、複数の時点：被験薬８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖのｉ．ｖ．注射の、０．２５、０．５、１、３、７、２４、４８、９６、１６８、２４０時間後においてスケジューリングした。動物１匹当たり約１００μｌの血液試料は、ヘマトクリット毛細管を使用して、球後静脈叢の穿刺（球後静脈叢に由来する個々のマウスの血液は、注射後、２つまたは最大３つの時点において採取するにとどめた）により、または、安楽死の時点では、心穿刺により、Ｍｉｃｒｏｖｅｔｔｅｓ（登録商標）へと収集した。血液試料は、９３００ｇで２．５分間の遠心分離まで、約６０分間、凝固させるように、室温で保った。少なくとも５０μｌの血清上清を収集し、清浄な２００μｌのＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブへと移し、解析まで、−８５℃〜−７０℃の間で保存した。探索下にある８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖの血清濃度は、ヒトＦｃまたはＣＨ１／カッパを検出する、標準的な生化学アッセイであって、Ｓｔｕｂｅｎｒａｕｃｈら、Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ａｎａｌ、２００９年、およびＳｔｕｂｅｎｒａｕｃｈら、Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ａｎａｌ、２０１３年において記載されているアッセイを使用して測定した。表２７および図２５に報告される血清濃度は、ヒトＦｃを検出するＥＬＩＳＡを使用することにより測定した。表２７および図２５は、ＥＬＩＳＡにより、３つの用量で測定された血清濃度を示す。図２５は、探索される用量範囲における用量直線性を示唆する。濃度時間曲線は、注射後最初の数時間で、注射後２４〜２４０時間の期間において観察される濃度の減衰より、比較的迅速な減衰を示すと考えられる。中用量（０．０８２ｍｇ／ｋｇ）では、２４〜２４０時間後の間の減衰はむしろ、直線的挙動を反映し、直線的減衰の傾きから、約６〜７日間の消失半減期を取り出すことができる。高用量（０．８２ｍｇ／ｋｇ）における濃度時間曲線の減衰は、なお緩徐であると考えられる、すなわち、消失半減期は、少なくとも６〜７日間であるが、なお長い可能性もある。低用量（０．００８２ｍｇ／ｋｇ）における、２４〜２４０時間後の間の消失半減期は、２４０時間後における血清レベルが検出限界を下回るため、完全には査定することができない。しかし、図２５は、２４〜９６時間後の間の消失半減期が、６〜７日間より短く、おそらく、３〜５日間に近い可能性があることを示唆する。８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖについて観察される濃度時間曲線は、薬物の、好都合な、週１回または２回の投与の可能性を裏付ける。
【０３３３】
【表２７】
2020122013.tif 000043
【０３３４】
（実施例２４Ａ）
カニクイザルにおける薬物動態／薬力学（ＰＫ／ＰＤ）研究
抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体（８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ）の単回用量による薬物動態（ＰＫ）薬力学（ＰＤ）研究は、ＡＡＡＬＡＣにより認証された、実績のあるＣＲＯにおいて行った。約２歳で体重約３ｋｇの、生物学的にナイーブな成体カニクイザルを、少なくとも４０日間馴致し、体重、臨床観察、および臨床病態検討に基づき選択した。動物は、個々のタトゥーおよびカラーコード式ケージカードにより同定した。全ての動物手順（飼育、健康状態のモニタリング、拘束、投与などを含む）および倫理条項の改正は、「生物医学研究に使用される動物の保護に関する指令」を強化する現行の国内法令に従い実施した。動物は、直近の試験前体重に基づき、処置群へと無作為に割り当てた。許容不可能な試験前所見を伴う動物を除外した後で、試験前体重に関して均衡を達成するようにデザインされた、Ｐｒｉｓｔｉｍａ（登録商標）システム内に含まれるコンピュータプログラムを使用して、体重に関して両極値を示す動物を除外し、残りの動物を処置群へと無作為化した。動物を、８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖによる３つの処置群（群１つ当たりの動物のｎ＝２、すなわち、雌１匹および雄１匹）であって、０．００３；０．０３；および０．３ｍｇ／ｋｇの処置群へと割り当てた。動物に、８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖの単回ｉ．ｖ．注射を施し、ＰＫ査定のために、以下の収集スケジュールおよび手順：投与前、投与の３０、９０、１８０分後、７、２４、４８、９６、１６８、３３６、５０４時間後に従い、１時点当たり、少なくとも０．８ｍＬの血液試料を、末梢血管を介して収集した。血液試料は、血清分離のために、チューブ内、室温で６０分間凝固させた。凝固物は、遠心分離（１２００ｇ、＋４℃で少なくとも１０分間）によりスピンダウンした。結果として得られる血清（約３００μＬ）は、さらなる解析まで、−８０℃で、直接保存した。また、ＰＫ査定のための骨髄試料も、大腿骨において、麻酔／鎮痛処置下、以下の収集スケジュール：投与前、投与の９６および３３６時間後に従い、収集した。骨髄試料は、血清分離のために、チューブ内、室温で６０分間凝固させた。凝固物は、遠心分離（１２００ｇ、＋４℃で少なくとも１０分間）によりスピンダウンした。結果として得られる骨髄（約１ｍＬ）は、さらなる解析まで、−８０℃で、直接保存した。ＰＫデータの解析および査定を実施する。標準的なノンコンパートメント解析は、Ｗａｔｓｏｎパッケージ（ｖ  ７．４、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｗａｌｔｍａｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）、またはＰｈｏｅｎｉｘ  ＷｉｎＮｏｎｌｉｎシステム（ｖ．  ６．３、Ｃｅｒｔａｒａ  Ｃｏｍｐａｎｙ、ＵＳＡ）を使用して実施する。図２６、表２８に示される通り、８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖの血清濃度は、ＥＬＩＳＡにより測定する。表２９は、各処置群についてのＥＬＩＳＡ（ＢＬＱとは、定量化レベルを下回ることを意味する）により測定される、骨髄中の８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖの濃度を示す。
【０３３５】
８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖの潜在的な臨床使用に適したいくつかの情報を、図２６、表２８、および表２９から抜き出すことができる。
・ＭＭ患者に由来する骨髄吸引物中では、１ｎＭまたは１０ｎＭの濃度の８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖは、ＭＭ形質細胞の著明な殺滅、またはさらに全面的な殺滅を誘導し、０．０３ｍｇ／ｋｇの用量では、注射〜１６８時間後（７日後）の区間において、約１ｎＭ〜４ｎＭの間の血漿濃度が達成されたことから、用量を約０．０３ｍｇ／ｋｇ（２００ｎｇ／ｍｌは、約１ｎＭに対応する）とする、週１回の治療が実施可能である公算が大きいことが示される。
・図２６は、探索される用量範囲内で、ＰＫは、ほぼ用量に対して直線的であることを示すが、これは、臨床治療に有用な特性である、濃度が用量に比例することを意味する。
・ＭＭとは、主に骨髄中に局在化する疾患であり、骨髄中で検出される８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖの濃度は、血清濃度に近接し（表２９）、例えば、注射の９６時間後において、約１および２ｎＭの骨髄濃度が測定されているが、これらは、ＭＭ形質細胞の著明な殺滅が、ＭＭ患者から採取したて骨髄吸引物中で観察される本発明のＴＣＢの濃度である（表２５および２６を参照されたい）ことから、ここでもまた、週１回などの好都合の投与間隔の可能性が実証される。
・注射後２４〜５０４時間の間、消失は、ほぼ、半減期を約６〜８日間とする一次消失であることから、ここでもまた、例えば、週１回投与の可能性が確認される。
【０３３６】
【表２８】
2020122013.tif 000044
【０３３７】
【表２９】
2020122013.tif 000045
【０３３８】
薬力学（ＰＤ）測定：血液試料（時点：投与前、投与の２４、４８、９６、１６８、３３６、５０４時間後）および骨髄試料（時点：投与前、投与の９６および３３６時間後）を、ｉ．ｖ．で単回用量として施される８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖの、血中および骨髄中の形質細胞、Ｂ細胞、およびＴ細胞に対する効果をフローサイトメトリーによって査定するＰＤ査定のために、７．５％のＫ３  ＥＤＴＡを含有するチューブ内に収集した。表面マーカーの「溶解洗浄式」直接免疫蛍光染色法を適用した。略述すると、１００μＬの血液または骨髄を、ＣＤ４５／ＣＤ２／ＣＤ１６／ＣＤ２０／ＣＤ２７／ＣＤ３８またはＣＤ４５／ＣＤ２／ＣＤ１６／ＣＤ４／ＣＤ２５／ＣＤ８を含む２つの抗体混合物と共に、暗所内、＋４℃で３０分間インキュベートした。赤血球を溶解させるために、２ｍＬの溶解緩衝溶液を、試料へと添加し、暗所内、室温で１５分間インキュベートした。遠心分離により細胞を収集し、染色緩衝液（ＰＢＳ２％のウシ胎仔血清）で洗浄した。染色された試料は、同日における、血球計算器による取得まで、冷凍し、光から保護して保った。ＦＡＣＳデータ取得は、４８８および６３５のレーザーラインを装備した、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎのフローサイトメーターである、ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩで実施した。データの収集および解析には、ＢＤ  ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェアを使用した。絶対細胞数の数え上げは、血液学解析器（ＡＤＶＩＡＴＭ  １２０、Ｓｉｅｍｅｎｓ）により得られるＷＢＣカウントに基づく複式プラットフォームにより実施した。図２７に示される通り、循環Ｔ細胞カウントの減少により示されるように末梢Ｔ細胞再分布再分布が、８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖの単回用量ＩＶ処置を施される全ての動物において観察された。図２８Ａに示される通り、０．３ｍｇ／ｋｇの８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖによる処置の２４時間後において既に、血中形質細胞（ＢＣＭＡ陽性細胞）の減少が、処置された動物において観察される一方、総Ｂ細胞（ＢＣＭＡ陰性細胞）の減少は見られなかった。図２８Ｂは、カニクイザルにおける、０．３ｍｇ／ｋｇの８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖによる処置の後における、血中の形質細胞の低減の動態を示す。
【０３３９】
血液試料はまた、以下の収集スケジュール：投与前、投与の３０、９０、１８０分後、７、２４、４８、９６、１６８時間後に従い、サイトカイン解析（ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＴＮＦ−α、およびＩＦＮ−γ）のための血漿収集のためにも操作した。血液試料は、氷冷水浴中に保たれたプラスチック製チューブに入れ、次いで、遠心分離（１２００ｇ、＋４℃で少なくとも１０分間）した。結果として得られる血漿は、解析まで、−８０℃で、直接保存した。サイトカイン解析は、Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｂｅａｄ−ｂａｓｅｄ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）により実施する。データは、Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ  Ｍａｎａｇｅｒ  ４．１ソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）（５パラメータロジスティック回帰モデル（５ＰＬ）を使用する）を使用して解析する。
【０３４０】
（実施例２５）
ヒト骨髄腫異種移植マウスモデルにおける、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体の治療有効性
ａ）抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  ＴＣＢｃｖ抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ効果を、ヒト骨髄腫異種移植マウスモデルにおいて査定する。略述すると、研究の０日目（ｄ０）に、ヒト骨髄腫細胞系ＮＣＩ−Ｈ９２９（ＮＣＩ−Ｈ９２９、ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−９０６８（商標））の細胞５×１０６〜１００×１０６個を、免疫不全ＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄ  ＩＬ２ｒガンマ（ヌル）（ＮＯＧ）成体マウス（Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙおよび／またはＴａｃｏｎｉｃ）の右脇腹の背側へと皮下注入し、７〜２１日間、または腫瘍サイズが、５０〜３００ｃｍ３、好ましくは１００〜２００ｃｍ３に達するまで、放置して生着させる。移植されたマウスを、異なる処置群（ｎ＝５〜１２）へと無作為に割り当てる。ＮＯＧマウスは、刺激されていないＳＣＩＤ免疫不全マウスまたはＲＡＧ免疫不全マウスにおいて観察される可能性があり、ヒト異種細胞による腫瘍生着に影響を及ぼしうる常在のＮＫ細胞集団を含む免疫細胞の完全な欠如により反映される通り、ヒト化マウスモデルに最も適切な株のうちの１つである（Itoら、Curr  Top  Microbiol
Immunol、２００８年、３２４巻：５３〜７６頁）。腫瘍移植片が、約５０〜３００ｃ
ｍ３、好ましくは１００〜２００ｃｍ３の容量に達する、７日目〜２１日目（ｄ７〜ｄ２１）において、軟膜から単離されたヒトＰＢＭＣ  ５×１０６〜１００×１０６個を、宿主マウスの腹腔へと注入する。対照群からのマウスには、ヒトＰＢＭＣを施さず、ヒトＰＢＭＣを施される対照媒体で処置されるマウスとの比較のための非移植対照マウスとして使用して、Ｔ細胞の、腫瘍成長に対する影響をモニタリングする。ＴＣＢによる処置スケジュールは、あらかじめ得られた薬物動態データに基づき、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  ＴＣＢｃｖ抗体の最大３〜６回の注射のための、週１回のｉ．ｖ．投与、ｓ．ｃ．投与、またはｉ．ｐ．投与からなる。ヒトＰＢＭＣによるレシピエントの再構成（ｄ９〜ｄ２３）の２日後、１μｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは、５μｇ／ｋｇ〜０．５ｍｇ／ｋｇの範囲の抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  ２ＴＣＢｃｖ抗体の初回投与を、尾静脈注射を介して、またはｓ．ｃ．注射もしくはｉ．ｐ．注射により施す。サテライト群の一部のマウスでは、採血時点を、薬物動態解析のために、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  ２＋１  Ｆｃ含有ＴＣＢ抗体の注射の５分後、１時間後、８時間後、および２４時間後において実施する。初回のＴＣＢ処置の３〜７日後、レシピエントマウスを、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  ＴＣＢｃｖ抗体の２回目の投与で処置する。２回目のＴＣＢ注射の１時間前に、血液を収集して、処置抗体のトラフレベルを得る。２回目のＴＣＢ処置の３〜７日後、レシピエントマウスを、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  ＴＣＢｃｖ抗体の３回目の投与で処置するなどである。処置は、３週間にわたり継続するように、すなわち、週２回のスケジュールでは６回の投与、週１回のスケジュールでは３回の投与のそれぞれとなるように計画する。２回目のＴＣＢ注射（週１回の投与スケジュールにおいて）および４回目のＴＣＢ注射のそれぞれの１時間前に、薬物動態解析のために、血液を収集する。２回目のＴＣＢ処置と３回目のＴＣＢ処置との間、および４回目のＴＣＢ処置と５回目のＴＣＢ処置との間のそれぞれにおいて、サテライト群の一部のマウスを安楽死させ、薬力学効果の実証、ならびに処置されたマウスにおけるＴ細胞の活性化およびＴ細胞機能など、副次的評価項目の測定のために使用する。主要評価項目は、腫瘍容量により測定する。研究中に、腫瘍を、キャリパーにより測定し、進行を、腫瘍容量（ＴＶ）の群間比較により査定する。腫瘍成長阻害Ｔ／Ｃ（％）は、Ｔ／Ｃ（％）＝１００×（解析群のＴＶ中央値）／（対照媒体処置群のＴＶ中央値）としてのＴＣを計算することにより決定する。一部の研究では、宿主マウスの生存を、主要評価項目または副次的評価項目として使用する。Ｈ９２９細胞系の代替物として、ヒト骨髄腫細胞系ＲＰＭＩ−８２２６（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ−１５５（商標））、Ｕ２６６Ｂ１（ＡＴＣＣ（登録商標）ＴＩＢ−１９６（商標））、またはＬ−３６３細胞系（Ｌｅｉｂｎｉｚ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＤＳＭＺ（Ｇｅｒｍａｎ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ
ｏｆ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ）；ＤＳＭＺ受託番号ＡＣＣ  ４９）を、異種移植片として使用することもできる。一部の研究では、ＮＯＤ−Ｒａｇ１（ヌル）−γ鎖（ヌル）（ＮＲＧ）成体マウス（Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を、移植レシピエントとして使用することもできる。一部の研究では、レシピエントマウスを、週２回および／または１回の処置スケジュールのために、同等用量のＢＣＭＡ×ＣＤ３（ｓｃＦＶ）２（例えば、ＷＯ２０１３／０７２４１５およびＷＯ２０１３／０７２４０６において記載されている、ＢＣＭＡ×ＣＤ３二特異性Ｔ細胞エンゲージャーＢｉＴＥ）で処置する。
【０３４１】
ｂ）ＰＢＭＣヒト化ＮＯＧマウスによる、Ｈ９２９ヒト骨髄腫異種移植モデルにおいて、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体により誘導される、抗腫瘍活性。消失半減期が長いために、Ｆｃ含有抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  ＴＣＢｃｖ抗体は、週１回のスケジュールにより、等モル用量で施される、ＢＣＭＡ５０−ＢｉＴＥ（登録商標）など、（ｓｃＦｖ）２ベースの二特異性抗体より有効でありうる。８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ、およびＢＣＭＡ５０−ＢｉＴＥ（登録商標）（ＷＯ２０１３０７２４１５およびＷＯ２０１３０７２４０６において記載されている）の、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける効果を比較し、ＰＢＭＣヒト化ＮＯＧマウスによる、Ｈ９２９ヒト骨髄腫異種移植モデルにおいて査定した。ＮＯＧマウスは、常在のＮＫ細胞集団を含む免疫細胞を完全に欠いているので、ヒト化マウスモデルに適し、したがって、ヒト異種細胞による腫瘍生着に対する許容性が大きい（Ito
ら、Curr  Top  Microbiol  Immunol、２００８年、３２４巻：５３〜７６頁）。略述す
ると、研究の０日目（ｄ０）に、５０：５０でマトリゲル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆｒａｎｃｅ）を含有する１００μＬのＲＰＭＩ  １６４０培地中に５×１０６個の、ヒト骨髄腫細胞系ＮＣＩ−Ｈ９２９（ＮＣＩ−Ｈ９２９、ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−９０６８（商標））を、８〜１０週齢の免疫不全ＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄ  ＩＬ２ｒガンマ（ヌル）（ＮＯＧ）雌マウス（Ｔａｃｏｎｉｃ、Ｒｙ、Ｄａｎｅｍａｒｋ）の右脇腹の背側へと、皮下（ＳＣ）注入した。Ｈ９２９腫瘍細胞のＳＣ植込みの２４〜７２時間前に、全てのマウスに、線源（１．４４Ｇｙ、６０Ｃｏ、ＢｉｏＭｅｐ、Ｂｒｅｔｅｎｉｅｒｅｓ、Ｆｒａｎｃｅ）による全身照射を施した。１５日目（ｄ１５）に、ＮＯＧマウスに、ヒトＰＢＭＣ（ＰＢＳ  １×、５００μＬ、ｐＨ７．４中）２×１０７個の単回腹腔内（ＩＰ）注射を施した。ヒトＰＢＭＣの特徴付けは、免疫表現型決定（フローサイトメトリー）により実施した。次いで、Ｖｉｖｏ  ｍａｎａｇｅｒ（登録商標）ソフトウェア（Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｅｓ、Ｃｏｕｔｅｒｎｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ）を使用して、マウスを、異なる処置群および対照群（ｎ＝９／群）へと、注意深く無作為化し、統計学的検定（分散分析）を実施して、群間の均質性について調べた。抗体処置は、腫瘍容量が、全てのマウスにおいて、少なくとも１００〜１５０ｍｍ３に達し、媒体で処置された対照群では、平均腫瘍容量が、３００±１６１ｍｍ３に達し、２．６ｎＭ／ｋｇの対照ＴＣＢ処置群では、３１５±１４８ｍｍ３、２．６ｎＭ／ｋｇの８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ群では、２９３±１３５ｍｍ３、および２．６ｎＭ／ｋｇのＢＣＭＡ５０−（ｓｃＦｖ）２（ＢＣＭＡ５０−ＢｉＴＥ（登録商標））群では、３０７±１３８ｍｍ３に達した、１９日目（ｄ１９）に、すなわち、Ｈ９２９腫瘍細胞のＳＣ注射の１９日後に開始した。ＴＣＢ抗体による処置スケジュールは、８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖによりあらかじめ得られた薬物動態結果に基づき、週１回、最長３週間のＩＶ投与（すなわち、合計３回のＴＣＢ抗体の注射）からなった。ヒトＰＢＭＣによる宿主マウスの再構成（ｄ１９）の４日後、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  ８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ抗体（２．６ｎＭ／ｋｇのそれぞれ、０．５ｍｇ／ｋｇ）の初回投与を、尾静脈注射を介して施した。血液試料は、頸部／下顎部における静脈穿刺（麻酔下で）により、各処置の１時間前、２回目の処置の２時間前、および終了時に、８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖおよび対照ＴＣＢｃｖで処置された全ての群のマウスから収集した。血液試料は、凝固活性化因子を含有するチューブ（Ｔ  ＭＧチューブ、ｃｈｅｒｒｙ  ｒｅｄ  ｔｏｐ、Ｃａｐｉｊｅｃｔ（登録商標）、Ｔｅｒｕｍｏ（登録商標））へと速やかに移した。チューブを、室温で３０分間放置して、凝固させた。次いで、凝固物／血清の分離のために、チューブを、１，３００ｇで５分間遠心分離した。血清アリコートを調製し、液体窒素中で瞬時凍結させ、さらなる解析まで、−８０℃で保存した。研究中に、腫瘍容量（ＴＶ）を、キャリパーにより測定し、進行を、ＴＶの群間比較により査定した。ＴＧ（％）として規定される腫瘍成長の百分率は、ＴＧ（％）＝１００×（解析群のＴＶ中央値）／（対照���体処置群のＴＶ中央値）を計算することにより決定した。倫理的な理由で、マウスは、ＴＶが、少なくとも２０００ｍｍ３に達したら、安楽死させた。図２９は、実験群ごとの各個々のマウスのＴＶ：（Ａ）媒体対照（実線）および対照ＴＣＢ（点線）を含む対照群、（Ｂ）８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ（２．６ｎＭ／ｋｇ）群、ならびに（Ｃ）ＢＣＭＡ５０−ＢｉＴＥ（登録商標）（２．６ｎＭ／ｋｇ）を示す。８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ（２．６ｎＭ／ｋｇ）群では、マウス９匹中６匹（６７％）は、それらの腫瘍を、ｄ１９、すなわち、初回のＴＣＢ処置において記録されたＴＶをなおも下回って退縮させ、腫瘍の退縮は、研究の終了まで維持された。８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ（２．６ｎＭ／ｋｇ）処置群内の３匹のマウスであって、腫瘍の退縮を示さなかったマウスのＴＶは、ｄ１９において、それぞれ、３７６、４０２、および５２２ｍｍ３と等しかった。これに対し、等モル用量のＢＣＭＡ５０−ＢｉＴＥ（登録商標）（２．６ｎＭ／ｋｇ）により、週１回のスケジュールで３週間処置された９匹のマウス（０％）はいずれも、いずれの時点においても、それらの腫瘍を退縮させなかった。表３０は、全ての実験群における、時間経過にわたる、腫瘍容量の推移を示す。腫瘍成長の百分率は、ｄ１９〜ｄ４３にわたり計算し、８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ（２．６ｎＭ／ｋｇ）群と、ＢＣＭＡ５０−ＢｉＴＥ（登録商標）（２．６ｎＭ／ｋｇ）群との間で比較した（図３０）。結果は、８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ（２．６ｎＭ／ｋｇ）群では、ＴＧ（％）が、一貫して、かつ、有意に低減されるほか、ＴＧ（％）は、ＢＣＭＡ５０−ＢｉＴＥ（登録商標）（２．６ｎＭ／ｋｇ）と比較した場合、常に低値であることを実証する。表３１は、１９〜４３日目における、腫瘍容量（ＴＶ）中央値および腫瘍成長の百分率（ＴＧ（％））を示す。全体的な結果は、処置を、週１回３週間のスケジュールにおいて、等モル用量で施す場合、８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて抗腫瘍活性を誘導するのに、ＢＣＭＡ５０−ＢｉＴＥ（登録商標）より優れていることを明らかに実証した。
【０３４２】
【表３０−１】
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【表３０−２】
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【表３０−３】
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【表３０−４】
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【０３４３】
【表３１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2020122013.tif 000059
【図１０】
2020122013.tif 000060
【図１１Ａ−Ｂ】
2020122013.tif 000061
【図１１Ｃ−Ｄ】
2020122013.tif 000062
【図１１Ｅ−Ｆ】
2020122013.tif 000063
【図１２】
2020122013.tif 000064
【図１３Ａ】
2020122013.tif 000065
【図１３Ｂ】
2020122013.tif 000066
【図１４Ａ】
2020122013.tif 000067
【図１４Ｂ】
2020122013.tif 000068
【図１５】
2020122013.tif 000069
【図１６】
2020122013.tif 000070
【図１７】
2020122013.tif 000071
【図１８】
2020122013.tif 000072
【図１８−１Ａ−Ｂ】
2020122013.tif 000073
【図１８−１Ｃ−Ｄ】
2020122013.tif 000074
【図１８−２Ａ−Ｂ】
2020122013.tif 000075
【図１８−２Ｃ−Ｄ】
2020122013.tif 000076
【図１８−２Ｅ】
2020122013.tif 000077
【図１８−３Ａ−Ｂ】
2020122013.tif 000078
【図１８−３Ｃ−Ｄ】
2020122013.tif 000079
【図１８−４Ａ−Ｂ】
2020122013.tif 000080
【図１８−４Ｃ−Ｄ】
2020122013.tif 000081
【図１９】
2020122013.tif 000082
【図２０Ａ】
2020122013.tif 000083
【図２０Ｂ】
2020122013.tif 000084
【図２０Ｃ−Ｄ】
2020122013.tif 000085
【図２０Ｅ−Ｆ】
2020122013.tif 000086
【図２１】
2020122013.tif 000087
【図２２】
2020122013.tif 000088
【図２３Ａ−Ｂ】
2020122013.tif 000089
【図２３Ｃ−Ｄ】
2020122013.tif 000090
【図２３Ｅ−Ｆ】
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【図２３Ｇ−Ｈ】
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【図２４】
2020122013.tif 000093
【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
2020122013.tif 000096
【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２９】
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【図３０】
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【配列表】
2020122013000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年5月8日(2020.5.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
（発明の要旨）
本発明は、ヒトＢＣＭＡ（さらにまた、「ＢＣＭＡ」とも称する）の細胞外ドメイン、およびヒトＣＤ３ε（さらにまた、「ＣＤ３」とも称する）である、２つの標的に特異的に結合する、二価または三価の二特異性抗体であって、軽鎖およびそれぞれの重鎖内の可変ドメインＶＬおよびＶＨが、互いに置きかえられており、定常ドメインＣＬを含むことを特徴とし、１２４位におけるアミノ酸が、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈ）により独立に置換されており（ＫａｂａｔによるＥＵインデックスに従う番号付け）、それぞれの定常ドメインＣＨ１内で、１４７位におけるアミノ酸および２１３位におけるアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）、またはアスパラギン酸（Ｄ）により独立に置換されている（ＫａｂａｔによるＥＵインデックスに従う番号付け）二特異性抗体に関する。抗体は、ＣＤ３への結合について一価であることが好ましい。定常ドメインＣＬ内の１２４位におけるアミノ酸の置きかえに加えて、１２３位におけるアミノ酸も、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈ）により独立に置換されていることが好ましい。抗体は、ＣＤ３への結合について一価であり、アミノ酸１２４がＫであり、アミノ酸１４７がＥであり、アミノ酸２１３がＥであり、アミノ酸１２３がＲであることが好ましい。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
本発明は、ヒトＢＣＭＡ（さらにまた、「ＢＣＭＡ」とも称する）の細胞外ドメイン、およびヒトＣＤ３ε（さらにまた、「ＣＤ３」とも称する）である、２つの標的に特異的に結合する二特異性抗体であって、
ａ）ＢＣＭＡに特異的に結合する第１の抗体の第１の軽鎖および第１の重鎖と；
ｂ）ＣＤ３に特異的に結合する第２の抗体の第２の軽鎖および第２の重鎖であって、第２の抗体の第２の軽鎖および第２の重鎖内の可変ドメインＶＬおよびＶＨが、互いに置きかえられている、第２の軽鎖および第２の重鎖とを含み；
ｃ）ａ）第１の軽鎖の定常ドメインＣＬ内で、１２４位におけるアミノ酸が、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈ）により独立に置換されており（ＫａｂａｔによるＥＵインデックスに従う番号付け）、ａ）第１の重鎖の定常ドメインＣＨ１内で、１４７位におけるアミノ酸および２１３位におけるアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）により独立に置換されている（ＫａｂａｔによるＥＵインデックスに従う番号付け）（例えば、図１Ａ、２Ａ、２Ｃ、３Ａ、３Ｃを参照されたい）こと
を特徴とする二特異性抗体に関する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
前出の最後の段落で記載した、前記二特異性抗体は、前記二特異性抗体がさらに、前記第１の抗体のＦａｂ断片（さらにまた、「ＢＣＭＡ−Ｆａｂ」とも称する）も含み、前記ＢＣＭＡ−Ｆａｂの定常ドメインＣＬ内で、１２４位におけるアミノ酸が、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈ）により独立に置換されており（ＫａｂａｔによるＥＵインデックスに従う番号付け）、前記ＢＣＭＡ−Ｆａｂの定常ドメインＣＨ１内で、１４７位におけるアミノ酸および２１３位におけるアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）により独立に置換されている（ＫａｂａｔによるＥＵインデックスに従う番号付け）こと（例えば、図２Ａ、２Ｃを参照されたい）もさらに特徴とすることが好ましい。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
本発明はさらに、ヒトＢＣＭＡ（さらにまた、「ＢＣＭＡ」とも称する）の細胞外ドメイン、およびヒトＣＤ３ε（さらにまた、「ＣＤ３」とも称する）である、２つの標的に特異的に結合する二特異性抗体であって、
ａ）ＢＣＭＡに特異的に結合する第１の抗体の第１の軽鎖および第１の重鎖と；
ｂ）ＣＤ３に特異的に結合する第２の抗体の第２の軽鎖および第２の重鎖であって、第２の抗体の第２の軽鎖および第２の重鎖内の可変ドメインＶＬおよびＶＨが、互いに置きかえられている、第２の軽鎖および第２の重鎖とを含み；
ｃ）ｂ）第２の軽鎖の定常ドメインＣＬ内で、１２４位におけるアミノ酸が、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈ）により独立に置換されており（ＫａｂａｔによるＥＵインデックスに従う番号付け）、ｂ）第２の重鎖の定常ドメインＣＨ１内で、１４７位におけるアミノ酸および２１３位におけるアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）により独立に置換されている（ＫａｂａｔによるＥＵインデックスに従う番号付け）（例えば、図１Ｂ、２Ｂ、２Ｄ、３Ｂ、３Ｄを参照されたい）こと
を特徴とする二特異性抗体にも関する。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
アミノ酸の番号付けは、定常ドメインＣＬおよびＣＨについてはＫａｂａｔによるＥＵインデックスに従い、その他についてはＫａｂａｔに従う（下記を参照されたい）。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４７】
ＩｇＧ１サブクラスの定常重領域ＣＨ２／ＣＨ３を含む本発明に従う二特異性抗体は、ＦｃＲおよびＣ１ｑへの結合を回避し、ＡＤＣＣ／ＣＤＣを最小化するように、突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＰ３２９Ｇ（ＫａｂａｔによるＥＵインデックスに従う番号付け）を含むことを特徴とすることが好ましい。利点は、本発明のこのような抗体が、Ｔ細胞をリダイレクションし／活性化させる強力な機構により、その腫瘍細胞殺滅の有効性を純粋に媒介することである。補体系およびＦｃＲを発現するエフェクター細胞に対する効果などのさらなる作用機構は、回避され、副作用の危険性は、低下する。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７５】
（発明の詳細な説明）
本発明者らは、ＶＨ／ＶＬの交換を伴う、ＣＤ３εおよびＢＣＭＡに対する二特異性抗体は、ＣＤ３εまたはＢＣＭＡに対する抗体部分の軽鎖ＣＬ内で、１２４位におけるアミノ酸が、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈ）により独立に置換されており（ＫａｂａｔによるＥＵインデックスに従う番号付け）、それぞれの定常ドメインＣＨ１内で、１４７位におけるアミノ酸および２１３位におけるアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）、またはアスパラギン酸（Ｄ）により独立に置換されている（ＫａｂａｔによるＥＵインデックスに従う番号付け）場合、高収率で作製され、容易に精製されうることを見出した。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１６】
本明細書で使用される「アミノ酸置換または電荷変異体」という用語は、定常ドメインＣＬ内で、１２４位におけるアミノ酸が、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈ）により独立に置換されており（ＫａｂａｔによるＥＵインデックスに従う番号付け）、それぞれの定常ドメインＣＨ１内で、１４７位におけるアミノ酸および２１３位におけるアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）、またはアスパラギン酸（Ｄ）により独立に置換されており、好ましくは、さらに、定常ドメインＣＬ内で、１２３位におけるアミノ酸も、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈ）により、好ましくは、アルギニン（Ｒ）により独立に置換されているという点で、本発明に従うアミノ酸置換を意味する。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５０】
１．ヒトＢＣＭＡ（さらにまた、「ＢＣＭＡ」とも称する）の細胞外ドメイン、およびヒトＣＤ３ε（さらにまた、「ＣＤ３」とも称する）である、２つの標的に特異的に結合する、二価または三価の二特異性抗体であって、軽鎖およびそれぞれの重鎖内の可変ドメインＶＬおよびＶＨが、互いに置きかえられており、定常ドメインＣＬを含むことを特徴とし、１２４位におけるアミノ酸が、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈ）により独立に置換されており（ＫａｂａｔによるＥＵインデックスに従う番号付け）、それぞれの定常ドメインＣＨ１内で、１４７位におけるアミノ酸および２１３位におけるアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）、またはアスパラギン酸（Ｄ）により独立に置換されている（ＫａｂａｔによるＥＵインデックスに従う番号付け）二特異性抗体。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５１】
２．ヒトＢＣＭＡの細胞外ドメイン、およびヒトＣＤ３である、２つの標的に特異的に結合する二特異性抗体であって、
ａ）ＢＣＭＡに特異的に結合する第１の抗体の第１の軽鎖および第１の重鎖と；
ｂ）ＣＤ３に特異的に結合する第２の抗体の第２の軽鎖および第２の重鎖であって、第２の抗体の第２の軽鎖および第２の重鎖内の可変ドメインＶＬおよびＶＨが、互いに置きかえられている、第２の軽鎖および第２の重鎖とを含み；
ｃ）ａ）下にある第１の軽鎖の定常ドメインＣＬ内で、１２４位におけるアミノ酸が、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈ）により独立に置換されており（ＫａｂａｔによるＥＵインデックスに従う番号付け）、ａ）下にある第１の重鎖の定常ドメインＣＨ１内で、１４７位におけるアミノ酸および２１３位におけるアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）により独立に置換されている（ＫａｂａｔによるＥＵインデックスに従う番号付け）こと
を特徴とする二特異性抗体。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５２】
３．ヒトＢＣＭＡの細胞外ドメイン、およびヒトＣＤ３である、２つの標的に特異的に結合する二特異性抗体であって、
ａ）ＢＣＭＡに特異的に結合する第１の抗体の第１の軽鎖および第１の重鎖と；
ｂ）ＣＤ３に特異的に結合する第２の抗体の第２の軽鎖および第２の重鎖であって、第２の抗体の第２の軽鎖および第２の重鎖内の可変ドメインＶＬおよびＶＨが、互いに置きかえられている、第２の軽鎖および第２の重鎖とを含み；
ｃ）ｂ）下にある第２の軽鎖の定常ドメインＣＬ内で、１２４位におけるアミノ酸が、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈ）により独立に置換されており（ＫａｂａｔによるＥＵインデックスに従う番号付け）、ｂ）下にある第２の重鎖の定常ドメインＣＨ１内で、１４７位におけるアミノ酸および２１３位におけるアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）により独立に置換されている（ＫａｂａｔによるＥＵインデックスに従う番号付け）こと
を特徴とする二特異性抗体。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５３】
４．さらに、前記第１の抗体のＦａｂ断片（さらにまた、「ＢＣＭＡ−Ｆａｂ」とも称する）も含み、前記ＢＣＭＡ−Ｆａｂの定常ドメインＣＬ内で、１２４位におけるアミノ酸が、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈ）により独立に置換されており（ＫａｂａｔによるＥＵインデックスに従う番号付け）、前記ＢＣＭＡ−Ｆａｂの定常ドメインＣＨ１内で、１４７位におけるアミノ酸および２１３位におけるアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）により独立に置換されている（ＫａｂａｔによるＥＵインデックスに従う番号付け）ことを特徴とする、上記の実施形態２に従う二特異性抗体。