(57)【要約】【課題】  ラクトバチルス属菌とストレプトコッカス・サーモフィラスとを用いる発酵食品の製造方法において、乳糖資化性のないラクトバチルス・デルブルッキーを用いても発酵食品を製造することが可能であり、かつ、酸味、旨味、発酵香気、及び濃厚感の全てにおいてバランスのとれた穏やか（マイルド）な風味を有する発酵食品を得ることができる発酵食品の製造方法を提供すること。【解決手段】  原料乳を含有する調乳液に、ラクトバチルス・デルブルッキー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）及びｐｒｔＳ遺伝子を保有するストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）を添加して発酵させる発酵工程を含むことを特徴とする、発酵食品の製造方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
原料乳を含有する調乳液に、ラクトバチルス・デルブルッキー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）及びｐｒｔＳ遺伝子を保有するストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）を添加して発酵させる発酵工程を含むことを特徴とする、発酵食品の製造方法。
【請求項２】
前記ラクトバチルス・デルブルッキーが、
ｆｕｓＡ遺伝子、ｇｙｒＢ遺伝子、ｈｓｐ６０遺伝子、ｉｌｅＳ遺伝子、ｐｙｒＧ遺伝子、ｒｅｃＡ遺伝子、及びｒｅｃＧ遺伝子からなる７種のハウスキーピング遺伝子に基づくＭＬＳＡ分類で、クラスターＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、及びＶのうちのいずれかに分類されるラクトバチルス・デルブルッキー
であることを特徴とする、請求項１に記載の発酵食品の製造方法。
【請求項３】
前記ラクトバチルス・デルブルッキーが、
下記条件（ｉ）〜（ｖｉｉ）：
（ｉ）アレル番号が２又は１４であるｆｕｓＡ遺伝子を保有する、
（ｉｉ）アレル番号が３、１７、１８、及び２５から選択されるいずれか１つであるｇｙｒＢ遺伝子を保有する、
（ｉｉｉ）アレル番号が４、１８、２６、及び２７から選択されるいずれか１つであるｈｓｐ６０遺伝子を保有する、
（ｉｖ）アレル番号が１６、２０、２１、３０、及び３３から選択されるいずれか１つであるｉｌｅＳ遺伝子を保有する、
（ｖ）アレル番号が２２又は２３であるｐｙｒＧ遺伝子を保有する、
（ｖｉ）アレル番号が２、７、２４、及び２８から選択されるいずれか１つであるｒｅｃＡ遺伝子を保有する、
（ｖｉｉ）アレル番号が３であるｒｅｃＧ遺伝子を保有する、
を全て満たすラクトバチルス・デルブルッキー、並びに、
ｆｕｓＡ遺伝子、ｇｙｒＢ遺伝子、ｈｓｐ６０遺伝子、ｉｌｅＳ遺伝子、ｐｙｒＧ遺伝子、ｒｅｃＡ遺伝子、及びｒｅｃＧ遺伝子からなる７種のハウスキーピング遺伝子に基づくＭＬＳＡ分類で、前記条件（ｉ）〜（ｖｉｉ）を全て満たすラクトバチルス・デルブルッキーと同じクラスターに分類されるラクトバチルス・デルブルッキー
からなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の発酵食品の製造方法。
【請求項４】
前記ラクトバチルス・デルブルッキーが、
受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８７４号で特定されるラクトバチルス・デルブルッキー、並びに、
ｆｕｓＡ遺伝子、ｇｙｒＢ遺伝子、ｈｓｐ６０遺伝子、ｉｌｅＳ遺伝子、ｐｙｒＧ遺伝子、ｒｅｃＡ遺伝子、及びｒｅｃＧ遺伝子からなる７種のハウスキーピング遺伝子に基づくＭＬＳＡ分類で、前記受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８７４号で特定されるラクトバチルス・デルブルッキーと同じクラスターに分類されるラクトバチルス・デルブルッキー
からなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする、請求項１〜３のうちのいずれか一項に記載の発酵食品の製造方法。
【請求項５】
前記ラクトバチルス・デルブルッキーが、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８７４号で特定されるラクトバチルス・デルブルッキーであることを特徴とする、請求項１〜４のうちのいずれか一項に記載の発酵食品の製造方法。
【請求項６】
前記ラクトバチルス・デルブルッキーが、乳糖資化性のないラクトバチルス・デルブルッキーであることを特徴とする、請求項１又は２に記載の発酵食品の製造方法。
【請求項７】
前記ｐｒｔＳ遺伝子を保有するストレプトコッカス・サーモフィラスが、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８７５号で特定されるストレプトコッカス・サーモフィラスであることを特徴とする、請求項１〜６のうちのいずれか一項に記載の発酵食品の製造方法。
【請求項８】
ラクトバチルス・デルブルッキー及びｐｒｔＳ遺伝子を保有するストレプトコッカス・サーモフィラスを含有することを特徴とする、発酵食品。
【請求項９】
前記ラクトバチルス・デルブルッキーが、
ｆｕｓＡ遺伝子、ｇｙｒＢ遺伝子、ｈｓｐ６０遺伝子、ｉｌｅＳ遺伝子、ｐｙｒＧ遺伝子、ｒｅｃＡ遺伝子、及びｒｅｃＧ遺伝子からなる７種のハウスキーピング遺伝子に基づくＭＬＳＡ分類で、クラスターＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、及びＶのうちのいずれかに分類されるラクトバチルス・デルブルッキー
であることを特徴とする、請求項８に記載の発酵食品。
【請求項１０】
前記ラクトバチルス・デルブルッキーが、
下記条件（ｉ）〜（ｖｉｉ）：
（ｉ）アレル番号が２又は１４であるｆｕｓＡ遺伝子を保有する、
（ｉｉ）アレル番号が３、１７、１８、及び２５から選択されるいずれか１つであるｇｙｒＢ遺伝子を保有する、
（ｉｉｉ）アレル番号が４、１８、２６、及び２７から選択されるいずれか１つであるｈｓｐ６０遺伝子を保有する、
（ｉｖ）アレル番号が１６、２０、２１、３０、及び３３から選択されるいずれか１つであるｉｌｅＳ遺伝子を保有する、
（ｖ）アレル番号が２２又は２３であるｐｙｒＧ遺伝子を保有する、
（ｖｉ）アレル番号が２、７、２４、及び２８から選択されるいずれか１つであるｒｅｃＡ遺伝子を保有する、
（ｖｉｉ）アレル番号が３であるｒｅｃＧ遺伝子を保有する、
を全て満たすラクトバチルス・デルブルッキー、並びに、
ｆｕｓＡ遺伝子、ｇｙｒＢ遺伝子、ｈｓｐ６０遺伝子、ｉｌｅＳ遺伝子、ｐｙｒＧ遺伝子、ｒｅｃＡ遺伝子、及びｒｅｃＧ遺伝子からなる７種のハウスキーピング遺伝子に基づくＭＬＳＡ分類で、前記条件（ｉ）〜（ｖｉｉ）を全て満たすラクトバチルス・デルブルッキーと同じクラスターに分類されるラクトバチルス・デルブルッキー
からなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする、請求項８又は９に記載の発酵食品。
【請求項１１】
前記ラクトバチルス・デルブルッキーが、
受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８７４号で特定されるラクトバチルス・デルブルッキー、並びに、
ｆｕｓＡ遺伝子、ｇｙｒＢ遺伝子、ｈｓｐ６０遺伝子、ｉｌｅＳ遺伝子、ｐｙｒＧ遺伝子、ｒｅｃＡ遺伝子、及びｒｅｃＧ遺伝子からなる７種のハウスキーピング遺伝子に基づくＭＬＳＡ分類で、前記受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８７４号で特定されるラクトバチルス・デルブルッキーと同じクラスターに分類されるラクトバチルス・デルブルッキー
からなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする、請求項８〜１０のうちのいずれか一項に記載の発酵食品。
【請求項１２】
前記ラクトバチルス・デルブルッキーが、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８７４号で特定されるラクトバチルス・デルブルッキーであることを特徴とする、請求項８〜１１のうちのいずれか一項に記載の発酵食品。
【請求項１３】
前記ラクトバチルス・デルブルッキーが、乳糖資化性のないラクトバチルス・デルブルッキーであることを特徴とする、請求項８又は９に記載の発酵食品。
【請求項１４】
前記ｐｒｔＳ遺伝子を保有するストレプトコッカス・サーモフィラスが、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８７５号で特定されるストレプトコッカス・サーモフィラスであることを特徴とする、請求項８〜１３のうちのいずれか一項に記載の発酵食品。
【請求項１５】
受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８７５号で特定されるストレプトコッカス・サーモフィラス。
【請求項１６】
請求項１〜７のうちのいずれか一項に記載の発酵食品の製造方法に用いるためのｐｒｔＳ遺伝子を保有するストレプトコッカス・サーモフィラスである、請求項１５に記載の受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８７５号で特定されるストレプトコッカス・サーモフィラス。
【請求項１７】
下記条件（ｉ）〜（ｖｉｉ）：
（ｉ）アレル番号が２又は１４であるｆｕｓＡ遺伝子を保有する、
（ｉｉ）アレル番号が３、１７、１８、及び２５から選択されるいずれか１つであるｇｙｒＢ遺伝子を保有する、
（ｉｉｉ）アレル番号が４、１８、２６、及び２７から選択されるいずれか１つであるｈｓｐ６０遺伝子を保有する、
（ｉｖ）アレル番号が１６、２０、２１、３０、及び３３から選択されるいずれか１つであるｉｌｅＳ遺伝子を保有する、
（ｖ）アレル番号が２２又は２３であるｐｙｒＧ遺伝子を保有する、
（ｖｉ）アレル番号が２、７、２４、及び２８から選択されるいずれか１つであるｒｅｃＡ遺伝子を保有する、
（ｖｉｉ）アレル番号が３であるｒｅｃＧ遺伝子を保有する、
を全て満たすラクトバチルス・デルブルッキー、並びに、
ｆｕｓＡ遺伝子、ｇｙｒＢ遺伝子、ｈｓｐ６０遺伝子、ｉｌｅＳ遺伝子、ｐｙｒＧ遺伝子、ｒｅｃＡ遺伝子、及びｒｅｃＧ遺伝子からなる７種のハウスキーピング遺伝子に基づくＭＬＳＡ分類で、前記条件（ｉ）〜（ｖｉｉ）を全て満たすラクトバチルス・デルブルッキーと同じクラスターに分類されるラクトバチルス・デルブルッキー
からなる群から選択される少なくとも１種の、ラクトバチルス・デルブルッキー。
【請求項１８】
受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８７４号で特定されるラクトバチルス・デルブルッキー、並びに、
ｆｕｓＡ遺伝子、ｇｙｒＢ遺伝子、ｈｓｐ６０遺伝子、ｉｌｅＳ遺伝子、ｐｙｒＧ遺伝子、ｒｅｃＡ遺伝子、及びｒｅｃＧ遺伝子からなる７種のハウスキーピング遺伝子に基づくＭＬＳＡ分類で、前記受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８７４号で特定されるラクトバチルス・デルブルッキーと同じクラスターに分類されるラクトバチルス・デルブルッキー
からなる群から選択される少なくとも１種の、請求項１７に記載のラクトバチルス・デルブルッキー。
【請求項１９】
請求項１〜７のうちのいずれか一項に記載の発酵食品の製造方法に用いるためのラクトバチルス・デルブルッキーである、請求項１７又は１８に記載のラクトバチルス・デルブルッキー。
【請求項２０】
請求項１〜７のうちのいずれか一項に記載の発酵食品の製造方法に用いるための乳酸菌組成物であり、ラクトバチルス・デルブルッキー及び／又はｐｒｔＳ遺伝子を保有するストレプトコッカス・サーモフィラスを含有することを特徴とする乳酸菌組成物。
【請求項２１】
前記ストレプトコッカス・サーモフィラスが請求項１５又は１６に記載のストレプトコッカス・サーモフィラスであることを特徴とする請求項２０に記載の乳酸菌組成物。
【請求項２２】
前記ラクトバチルス・デルブルッキーが請求項１７〜１９のうちのいずれか一項に記載のラクトバチルス・デルブルッキーであることを特徴とする請求項２０又は２１に記載の乳酸菌組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、発酵食品の製造方法、発酵食品、乳酸菌、及び乳酸菌組成物に関し、より詳細には、発酵食品の製造方法、それに用いる乳酸菌及び乳酸菌組成物、並びに、それらによって得られる発酵食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
発酵食品には、例えば、日本の「乳及び乳製品の成分規格等に関する省令（乳等省令）」において、「乳又はこれと同等以上の無脂乳固形分を含む乳等を乳酸菌又は酵母で発酵させ、糊状又は液状にしたもの、又はこれらを凍結したもの」と定義されている発酵乳がある。かかる発酵乳の代表例としては、例えば、セットタイプヨーグルト（固形状発酵乳）、ソフトタイプヨーグルト（糊状発酵乳）、及びドリンクタイプヨーグルト（液状発酵乳）といったヨーグルトが挙げられる。
【０００３】
ヨーグルトの製造においては、例えば、乳酸菌として、ラクトバチルス属菌やストレプトコッカス・サーモフィラスが用いられている。近年では、ヨーグルトと言えば、原料乳に、Lactobacillus  delbrueckii  subsp.  bulgaricus（L.  delbrueckii  subsp.  bulgaricus、ブルガリア菌）及びStreptococcus  thermophilus（S.  thermophilus、サーモフィラス菌）を組み合わせて接種し、発酵させて調製したものが主流であり、このようなヨーグルトは、主に、爽やかな酸味及び発酵香気を有することに特徴がある。
【０００４】
例えば、国際公開第２０１８／１５１２４９号（特許文献１）には、原料ミックスに乳酸菌スターターを添加して発酵乳基材を得る工程と前記発酵乳基材を３５〜５０℃で発酵させる発酵工程とを含む発酵乳の製造方法が記載されており、前記乳酸菌スターターがブルガリア菌及びサーモフィルス（サーモフィラス）菌を含むことが記載されている。さらに、特表２０１５−５１８３７４号公報（特許文献２）には、発酵乳製品の製造のための、特定のストレプトコッカス・サーモフィルス株及びラクトバチルス・デルブルエッキ（デルブルッキー）亜種ブルガリクス株の使用が記載されている。
【０００５】
また、ブルガリア菌とは同種で、亜種の異なる菌種を用いた場合でも、発酵食品を調製することは可能ではある。しかしながら、発酵食品の製造において、ブルガリア菌とは同種で、亜種の異なる菌種を用いた場合、使用する（亜種の異なる）菌種によっては、発酵ができない、発酵食品を調製することは可能ではあるが発酵に時間がかかりすぎる、風味が良くないといった問題が生じることがあり、ブルガリア菌を用いた場合に比べて、発酵食品を安定的に製造することが困難であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２０１８／１５１２４９号
【特許文献２】特表２０１５−５１８３７４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
また、本発明者らがラクトバチルス属菌やストレプトコッカス・サーモフィラスを用いる発酵食品の製造方法について検討したところ、ヨーグルトを主とした発酵乳の製造に従来から用いられている、ｐｒｔＳ遺伝子を保有しないｐｒｔＳ（−）のサーモフィラス菌は、乳糖（ラクトース）をエネルギー源として利用できない、すなわち、乳糖資化性のないラクトバチルス・デルブルッキー種と組み合わせて用いると、発酵ができなかったり、発酵に時間がかかりすぎるといった問題が生じることを見出した。
【０００８】
また、従来は、上記のような爽やかな酸味及び発酵香気を有するヨーグルトが主流であったが、近年、消費者の嗜好性やヨーグルトの喫食方法の多様化により、酸味、旨味、発酵香気、及び濃厚感の全てにおいてバランスのとれた穏やか（マイルド）な風味に対する需要が高まりつつある。
【０００９】
本発明は、ラクトバチルス属菌とストレプトコッカス・サーモフィラスとを用いる発酵食品の製造方法において、乳糖資化性のないラクトバチルス・デルブルッキーを用いても発酵食品を製造することが可能であり、かつ、酸味、旨味、発酵香気、及び濃厚感の全てにおいてバランスのとれた穏やか（マイルド）な風味を有する発酵食品を得ることができる発酵食品の製造方法、それに用いることができる乳酸菌及び乳酸菌組成物、並びに、それらによって得られる発酵食品を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を行った結果、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Streptococcus  thermophilus)の中でも、日本国生乳由来の菌にはｐｒｔＳ遺伝子を保有するものが多いことを見出した。ｐｒｔＳ遺伝子を保有するストレプトコッカス・サーモフィラスは単菌での発酵も可能であり、さらに、これらをラクトバチルス・デルブルッキー（Lactobacillus  delbrueckii）と組み合わせて原料乳の発酵に用いると、発酵に要する時間を大幅に短縮できるが、さらに本発明者らは、かかるｐｒｔＳ遺伝子を保有するストレプトコッカス・サーモフィラスによれば、前記ラクトバチルス・デルブルッキーが乳糖資化性のないものであっても、短時間で発酵食品を調製することができることを見い出した。
【００１１】
さらに、本発明者らは、かかるｐｒｔＳ遺伝子を保有するストレプトコッカス・サーモフィラスに、従来のラクトバチルス・デルブルッキーとはＭＬＳＡ分類で異なるクラスターに分類される特定のラクトバチルス・デルブルッキーを組み合わせることにより特に、酸味、旨味、発酵香気、及び濃厚感全てにおいてバランスのとれた穏やか（マイルド）な風味を有する発酵食品を安定的に得られることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち、本発明は、
［１］原料乳を含有する調乳液に、ラクトバチルス・デルブルッキー（Lactobacillus  delbrueckii）及びｐｒｔＳ遺伝子を保有するストレプトコッカス・サーモフィラス（Streptococcus  thermophilus）を添加して発酵させる発酵工程を含む、発酵食品の製造方法。
［２］前記ラクトバチルス・デルブルッキーが、
ｆｕｓＡ遺伝子、ｇｙｒＢ遺伝子、ｈｓｐ６０遺伝子、ｉｌｅＳ遺伝子、ｐｙｒＧ遺伝子、ｒｅｃＡ遺伝子、及びｒｅｃＧ遺伝子からなる７種のハウスキーピング遺伝子に基づくＭＬＳＡ分類で、クラスターＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、及びＶのうちのいずれかに分類されるラクトバチルス・デルブルッキー
である、［１］に記載の発酵食品の製造方法。
［３］前記ラクトバチルス・デルブルッキーが、
下記条件（ｉ）〜（ｖｉｉ）：
（ｉ）アレル番号が２又は１４であるｆｕｓＡ遺伝子を保有する、
（ｉｉ）アレル番号が３、１７、１８、及び２５から選択されるいずれか１つであるｇｙｒＢ遺伝子を保有する、
（ｉｉｉ）アレル番号が４、１８、２６、及び２７から選択されるいずれか１つであるｈｓｐ６０遺伝子を保有する、
（ｉｖ）アレル番号が１６、２０、２１、３０、及び３３から選択されるいずれか１つであるｉｌｅＳ遺伝子を保有する、
（ｖ）アレル番号が２２又は２３であるｐｙｒＧ遺伝子を保有する、
（ｖｉ）アレル番号が２、７、２４、及び２８から選択されるいずれか１つであるｒｅｃＡ遺伝子を保有する、
（ｖｉｉ）アレル番号が３であるｒｅｃＧ遺伝子を保有する、
を全て満たすラクトバチルス・デルブルッキー、並びに、
ｆｕｓＡ遺伝子、ｇｙｒＢ遺伝子、ｈｓｐ６０遺伝子、ｉｌｅＳ遺伝子、ｐｙｒＧ遺伝子、ｒｅｃＡ遺伝子、及びｒｅｃＧ遺伝子からなる７種のハウスキーピング遺伝子に基づくＭＬＳＡ分類で、前記条件（ｉ）〜（ｖｉｉ）を全て満たすラクトバチルス・デルブルッキーと同じクラスターに分類されるラクトバチルス・デルブルッキー
からなる群から選択される少なくとも１種である、［１］又は［２］に記載の発酵食品の製造方法。
［４］前記ラクトバチルス・デルブルッキーが、
受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８７４号で特定されるラクトバチルス・デルブルッキー、並びに、
ｆｕｓＡ遺伝子、ｇｙｒＢ遺伝子、ｈｓｐ６０遺伝子、ｉｌｅＳ遺伝子、ｐｙｒＧ遺伝子、ｒｅｃＡ遺伝子、及びｒｅｃＧ遺伝子からなる７種のハウスキーピング遺伝子に基づくＭＬＳＡ分類で、前記受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８７４号で特定されるラクトバチルス・デルブルッキーと同じクラスターに分類されるラクトバチルス・デルブルッキー
からなる群から選択される少なくとも１種である、［１］〜［３］のうちのいずれか一項に記載の発酵食品の製造方法。
［５］前記ラクトバチルス・デルブルッキーが、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８７４で号特定されるラクトバチルス・デルブルッキーである、［１］〜［４］のうちのいずれか一項に記載の発酵食品の製造方法。
［６］前記ラクトバチルス・デルブルッキーが、乳糖資化性のないラクトバチルス・デルブルッキーである、［１］又は［２］に記載の発酵食品の製造方法。
［７］前記ｐｒｔＳ遺伝子を保有するストレプトコッカス・サーモフィラスが、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８７５号で特定されるストレプトコッカス・サーモフィラスである、［１］〜［６］のうちのいずれか一項に記載の発酵食品の製造方法。
［８］ラクトバチルス・デルブルッキー及びｐｒｔＳ遺伝子を保有するストレプトコッカス・サーモフィラスを含有する、発酵食品。
［９］前記ラクトバチルス・デルブルッキーが、
ｆｕｓＡ遺伝子、ｇｙｒＢ遺伝子、ｈｓｐ６０遺伝子、ｉｌｅＳ遺伝子、ｐｙｒＧ遺伝子、ｒｅｃＡ遺伝子、及びｒｅｃＧ遺伝子からなる７種のハウスキーピング遺伝子に基づくＭＬＳＡ分類で、クラスターＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、及びＶのうちのいずれかに分類されるラクトバチルス・デルブルッキー
である、［８］に記載の発酵食品。
［１０］前記ラクトバチルス・デルブルッキーが、
下記条件（ｉ）〜（ｖｉｉ）：
（ｉ）アレル番号が２又は１４であるｆｕｓＡ遺伝子を保有する、
（ｉｉ）アレル番号が３、１７、１８、及び２５から選択されるいずれか１つであるｇｙｒＢ遺伝子を保有する、
（ｉｉｉ）アレル番号が４、１８、２６、及び２７から選択されるいずれか１つであるｈｓｐ６０遺伝子を保有する、
（ｉｖ）アレル番号が１６、２０、２１、３０、及び３３から選択されるいずれか１つであるｉｌｅＳ遺伝子を保有する、
（ｖ）アレル番号が２２又は２３であるｐｙｒＧ遺伝子を保有する、
（ｖｉ）アレル番号が２、７、２４、及び２８から選択されるいずれか１つであるｒｅｃＡ遺伝子を保有する、
（ｖｉｉ）アレル番号が３であるｒｅｃＧ遺伝子を保有する、
を全て満たすラクトバチルス・デルブルッキー、並びに、
ｆｕｓＡ遺伝子、ｇｙｒＢ遺伝子、ｈｓｐ６０遺伝子、ｉｌｅＳ遺伝子、ｐｙｒＧ遺伝子、ｒｅｃＡ遺伝子、及びｒｅｃＧ遺伝子からなる７種のハウスキーピング遺伝子に基づくＭＬＳＡ分類で、前記条件（ｉ）〜（ｖｉｉ）を全て満たすラクトバチルス・デルブルッキーと同じクラスターに分類されるラクトバチルス・デルブルッキー
からなる群から選択される少なくとも１種である、［８］又は［９］に記載の発酵食品。
［１１］前記ラクトバチルス・デルブルッキーが、
受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８７４号で特定されるラクトバチルス・デルブルッキー、並びに、
ｆｕｓＡ遺伝子、ｇｙｒＢ遺伝子、ｈｓｐ６０遺伝子、ｉｌｅＳ遺伝子、ｐｙｒＧ遺伝子、ｒｅｃＡ遺伝子、及びｒｅｃＧ遺伝子からなる７種のハウスキーピング遺伝子に基づくＭＬＳＡ分類で、前記受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８７４号で特定されるラクトバチルス・デルブルッキーと同じクラスターに分類されるラクトバチルス・デルブルッキー
からなる群から選択される少なくとも１種である、［８］〜［１０］のうちのいずれか一項に記載の発酵食品。
［１２］前記ラクトバチルス・デルブルッキーが、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８７４号で特定されるラクトバチルス・デルブルッキーである、［８］〜［１１］のうちのいずれか一項に記載の発酵食品。
［１３］前記ラクトバチルス・デルブルッキーが、乳糖資化性のないラクトバチルス・デルブルッキーである、［８］又は［９］に記載の発酵食品。
［１４］前記ｐｒｔＳ遺伝子を保有するストレプトコッカス・サーモフィラスが、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８７５号で特定されるストレプトコッカス・サーモフィラスである、［８］〜［１３］のうちのいずれか一項に記載の発酵食品。
［１５］受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８７５号で特定されるストレプトコッカス・サーモフィラス。
［１６］［１］〜［７］のうちのいずれか一項に記載の発酵食品の製造方法に用いるためのｐｒｔＳ遺伝子を保有するストレプトコッカス・サーモフィラスである、［１５］に記載の受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８７５号で特定されるストレプトコッカス・サーモフィラス。
［１７］下記条件（ｉ）〜（ｖｉｉ）：
（ｉ）アレル番号が２又は１４であるｆｕｓＡ遺伝子を保有する、
（ｉｉ）アレル番号が３、１７、１８、及び２５から選択されるいずれか１つであるｇｙｒＢ遺伝子を保有する、
（ｉｉｉ）アレル番号が４、１８、２６、及び２７から選択されるいずれか１つであるｈｓｐ６０遺伝子を保有する、
（ｉｖ）アレル番号が１６、２０、２１、３０、及び３３から選択されるいずれか１つであるｉｌｅＳ遺伝子を保有する、
（ｖ）アレル番号が２２又は２３であるｐｙｒＧ遺伝子を保有する、
（ｖｉ）アレル番号が２、７、２４、及び２８から選択されるいずれか１つであるｒｅｃＡ遺伝子を保有する、
（ｖｉｉ）アレル番号が３であるｒｅｃＧ遺伝子を保有する、
を全て満たすラクトバチルス・デルブルッキー、並びに、
ｆｕｓＡ遺伝子、ｇｙｒＢ遺伝子、ｈｓｐ６０遺伝子、ｉｌｅＳ遺伝子、ｐｙｒＧ遺伝子、ｒｅｃＡ遺伝子、及びｒｅｃＧ遺伝子からなる７種のハウスキーピング遺伝子に基づくＭＬＳＡ分類で、前記条件（ｉ）〜（ｖｉｉ）を全て満たすラクトバチルス・デルブルッキーと同じクラスターに分類されるラクトバチルス・デルブルッキー
からなる群から選択される少なくとも１種の、ラクトバチルス・デルブルッキー。
［１８］受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８７４号で特定されるラクトバチルス・デルブルッキー、並びに、
ｆｕｓＡ遺伝子、ｇｙｒＢ遺伝子、ｈｓｐ６０遺伝子、ｉｌｅＳ遺伝子、ｐｙｒＧ遺伝子、ｒｅｃＡ遺伝子、及びｒｅｃＧ遺伝子からなる７種のハウスキーピング遺伝子に基づくＭＬＳＡ分類で、前記受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８７４号で特定されるラクトバチルス・デルブルッキーと同じクラスターに分類されるラクトバチルス・デルブルッキー
からなる群から選択される少なくとも１種の、［１７］に記載のラクトバチルス・デルブルッキー。
［１９］［１］〜［７］のうちのいずれか一項に記載の発酵食品の製造方法に用いるためのラクトバチルス・デルブルッキーである、［１７］又は［１８］に記載のラクトバチルス・デルブルッキー。
［２０］［１］〜［７］のうちのいずれか一項に記載の発酵食品の製造方法に用いるための乳酸菌組成物であり、ラクトバチルス・デルブルッキー及び／又はｐｒｔＳ遺伝子を保有するストレプトコッカス・サーモフィラスを含有する、乳酸菌組成物。
［２１］前記ストレプトコッカス・サーモフィラスが［１５］又は［１６］に記載のストレプトコッカス・サーモフィラスである、［２０］に記載の乳酸菌組成物。
［２２］前記ラクトバチルス・デルブルッキーが［１７］〜［１９］のうちのいずれか一項に記載のラクトバチルス・デルブルッキーである、［２０］又は［２１］に記載の乳酸菌組成物。
を提供する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、ラクトバチルス属菌とストレプトコッカス・サーモフィラスとを用いる発酵食品の製造方法において、乳糖資化性のないラクトバチルス・デルブルッキーを用いても発酵食品を製造することが可能であり、かつ、酸味、旨味、発酵香気、及び濃厚感の全てにおいてバランスのとれた穏やか（マイルド）な風味を有する発酵食品を得ることができる発酵食品の製造方法、それに用いることができる乳酸菌及び乳酸菌組成物、並びに、それらによって得られる発酵食品を提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】６１菌株のラクトバチルス・デルブルッキーについて、ＭＬＳＡ分類をおこなって得られた系統樹を示す図である。
【図２Ａ】ｆｕｓＡ遺伝子のアレル番号及びその塩基配列（１〜２００塩基）を示す図である。
【図２Ｂ】ｆｕｓＡ遺伝子のアレル番号及びその塩基配列（２０１〜４００塩基）を示す図である。
【図２Ｃ】ｆｕｓＡ遺伝子のアレル番号及びその塩基配列（４０１〜４７４塩基）を示す図である。
【図３Ａ】ｇｙｒＢ遺伝子のアレル番号及びその塩基配列（１〜１００塩基）を示す図である。
【図３Ｂ】ｇｙｒＢ遺伝子のアレル番号及びその塩基配列（１０１〜２００塩基）を示す図である。
【図３Ｃ】ｇｙｒＢ遺伝子のアレル番号及びその塩基配列（２０１〜３００塩基）を示す図である。
【図３Ｄ】ｇｙｒＢ遺伝子のアレル番号及びその塩基配列（３０１〜３８０塩基）を示す図である。
【図４Ａ】ｈｓｐ６０遺伝子のアレル番号及びその塩基配列（１〜１００塩基）を示す図である。
【図４Ｂ】ｈｓｐ６０遺伝子のアレル番号及びその塩基配列（１０１〜２００塩基）を示す図である。
【図４Ｃ】ｈｓｐ６０遺伝子のアレル番号及びその塩基配列（２０１〜３００塩基）を示す図である。
【図４Ｄ】ｈｓｐ６０遺伝子のアレル番号及びその塩基配列（３０１〜４００塩基）を示す図である。
【図４Ｅ】ｈｓｐ６０遺伝子のアレル番号及びその塩基配列（４０１〜５００塩基）を示す図である。
【図４Ｆ】ｈｓｐ６０遺伝子のアレル番号及びその塩基配列（５０１〜５１１塩基）を示す図である。
【図５Ａ】ｉｌｅＳ遺伝子のアレル番号及びその塩基配列（１〜１００塩基）を示す図である。
【図５Ｂ】ｉｌｅＳ遺伝子のアレル番号及びその塩基配列（１０１〜２００塩基）を示す図である。
【図５Ｃ】ｉｌｅＳ遺伝子のアレル番号及びその塩基配列（２０１〜３００塩基）を示す図である。
【図５Ｄ】ｉｌｅＳ遺伝子のアレル番号及びその塩基配列（３０１〜４００塩基）を示す図である。
【図５Ｅ】ｉｌｅＳ遺伝子のアレル番号及びその塩基配列（４０１〜４９６塩基）を示す図である。
【図６Ａ】ｐｙｒＧ遺伝子のアレル番号及びその塩基配列（１〜１００塩基）を示す図である。
【図６Ｂ】ｐｙｒＧ遺伝子のアレル番号及びその塩基配列（１０１〜２００塩基）を示す図である。
【図６Ｃ】ｐｙｒＧ遺伝子のアレル番号及びその塩基配列（２０１〜３００塩基）を示す図である。
【図６Ｄ】ｐｙｒＧ遺伝子のアレル番号及びその塩基配列（３０１〜３９２塩基）を示す図である。
【図７Ａ】ｒｅｃＡ遺伝子のアレル番号及びその塩基配列（１〜１００塩基）を示す図である。
【図７Ｂ】ｒｅｃＡ遺伝子のアレル番号及びその塩基配列（１０１〜２００塩基）を示す図である。
【図７Ｃ】ｒｅｃＡ遺伝子のアレル番号及びその塩基配列（２０１〜３００塩基）を示す図である。
【図７Ｄ】ｒｅｃＡ遺伝子のアレル番号及びその塩基配列（３０１〜４００塩基）を示す図である。
【図７Ｅ】ｒｅｃＡ遺伝子のアレル番号及びその塩基配列（４０１〜４１２塩基）を示す図である。
【図８Ａ】ｒｅｃＧ遺伝子のアレル番号及びその塩基配列（１〜１００塩基）を示す図である。
【図８Ｂ】ｒｅｃＧ遺伝子のアレル番号及びその塩基配列（１０１〜２００塩基）を示す図である。
【図８Ｃ】ｒｅｃＧ遺伝子のアレル番号及びその塩基配列（２０１〜３００塩基）を示す図である。
【図８Ｄ】ｒｅｃＧ遺伝子のアレル番号及びその塩基配列（３０１〜４００塩基）を示す図である。
【図８Ｅ】ｒｅｃＧ遺伝子のアレル番号及びその塩基配列（４０１〜４９０塩基）を示す図である。
【図９】Ｓ．サーモフィラスｐｒｔＳ（−）を用いたとき及びＳ．サーモフィラスｐｒｔＳ（＋）を用いたときの各発酵時間をそれぞれ示すグラフである。
【図１０】Ｌ．デルブルッキーＬａｃ（−）を用いたとき及びＬ．デルブルッキーＬａｃ（＋）を用いたときの各発酵時間をそれぞれ示すグラフである。
【図１１】水溶性成分分析の結果（１）において、第１主成分得点（ＰＣ１）と第２主成分得点（ＰＣ２）との関係を示す図である。
【図１２】水溶性成分分析の結果（１）において、第１主成分得点（ＰＣ１）と第２主成分得点（ＰＣ２）との関係を示す図である。
【図１３】水溶性成分分析の結果（１）において、第１主成分得点（ＰＣ１）と第３主成分得点（ＰＣ３）との関係を示す図である。
【図１４】水溶性成分分析の結果（１）において、第２主成分得点（ＰＣ２）と第３主成分得点（ＰＣ３）との関係を示す図である。
【図１５】水溶性成分分析の結果（２）において、第１主成分得点（ＰＣ１）と第２主成分得点（ＰＣ２）との関係を示す図である。
【図１６】水溶性成分分析の結果（２）において、図１５に対応する各水溶性成分の散布図である。
【図１７】香気成分分析の結果（１）において、第１主成分得点（ＰＣ１）と第２主成分得点（ＰＣ２）との関係を示す図である。
【図１８】香気成分分析の結果（２）において、第１主成分得点（ＰＣ１）と第２主成分得点（ＰＣ２）との関係を示す図である。
【図１９】香気成分分析の結果（２）において、図１８に対応する各香気成分の散布図である。
【図２０】官能評価の結果（１）において、Ｓ．サーモフィラスｐｒｔＳ（−）を用いたときについて、第１主成分得点（ＰＣ１）と第２主成分得点（ＰＣ２）との関係を示す図である。
【図２１】官能評価の結果（１）において、図２０に対応する各官能評価項目の散布図である。
【図２２】官能評価の結果（１）において、Ｓ．サーモフィラスｐｒｔＳ（＋）を用いたときについて、第１主成分得点（ＰＣ１）と第２主成分得点（ＰＣ２）との関係を示す図である。
【図２３】官能評価の結果（１）において、図２２に対応する各官能評価項目の散布図である。
【図２４】官能評価の結果（２）において、第１主成分得点（ＰＣ１）と第２主成分得点（ＰＣ２）との関係を示す図である。
【図２５】官能評価の結果（２）において、図２４に対応する各官能評価項目の散布図である。
【図２６】乳酸量測定の結果（１）において、各発酵乳中のＤ−乳酸量と酸味スコアとの関係を示すグラフである。
【図２７】乳酸量測定の結果（１）において、各発酵乳中のＬ−乳酸量と酸味スコアとの関係を示すグラフである。
【図２８】乳酸量測定の結果（１）において、各発酵乳中のＤ−乳酸の割合と酸味スコアとの関係を示すグラフである。
【図２９】乳酸量測定の結果（２）において、クラスターＩ〜Ｖに分類されるＬ．デルブルッキー（全）を用いたときについて、Ｓ．サーモフィラスｐｒｔＳ（−）を用いたとき及びＳ．サーモフィラスｐｒｔＳ（＋）を用いたときの各発酵乳中のＤ−乳酸の割合をそれぞれ示すグラフである。
【図３０】乳酸量測定の結果（２）において、クラスターＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、及びＶに分類されるＬ．デルブルッキー（ＩＶ以外）を用いたときについて、Ｓ．サーモフィラスｐｒｔＳ（−）を用いたとき及びＳ．サーモフィラスｐｒｔＳ（＋）を用いたときの各発酵乳中のＤ−乳酸の割合をそれぞれ示すグラフである。
【図３１】Ｓ．サーモフィラスの検討の結果（１）において、Ｓ．サーモフィラスｐｒｔＳ（−）を用いたとき及びＳ．サーモフィラスｐｒｔＳ（＋）を用いたときの各発酵時間をそれぞれ示すグラフである。
【図３２】Ｓ．サーモフィラスの検討の結果（２）において、Ｓ．サーモフィラスｐｒｔＳ（−）を用いたとき及びＳ．サーモフィラスｐｒｔＳ（＋）を用いたときの各発酵乳中のＤ−乳酸の割合をそれぞれ示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明をその好適な実施形態に即して詳細に説明する。
【００１６】
＜発酵食品の製造方法＞
本発明の発酵食品の製造方法は、原料乳を含有する調乳液に、ラクトバチルス・デルブルッキー（Lactobacillus  delbrueckii）及びｐｒｔＳ遺伝子を保有するストレプトコッカス・サーモフィラス（Streptococcus  thermophilus）を添加して発酵させる発酵工程を含むものである。
【００１７】
（調乳液）
本発明に係る調乳液は、原料乳を含有する。前記原料乳としては、乳糖を含有するものであることが好ましく、例えば、生乳（例えば、ウシ、スイギュウ、ヒツジ、ヤギ等の乳）、殺菌乳、全脂乳、脱脂乳、ホエイ、及びこれらの加工品（例えば、全脂粉乳、全脂濃縮乳、脱脂粉乳、脱脂濃縮乳、練乳、ホエイ粉、バターミルク、バター、クリーム、チーズ、ホエイタンパク質濃縮物（ＷＰＣ）、ホエイタンパク質単離物（ＷＰＩ）、α−ラクトアルブミン（α−Ｌａ）、β−ラクトグロブリン（β−Ｌｇ））が挙げられ、これらのうちの１種であっても２種以上の混合物であってもよい。
【００１８】
本発明に係る調乳液としては、前記原料乳のみからなるものであっても、前記原料乳の水溶液、希釈液、又は濃縮液であってもよく、前記原料乳の他に、必要に応じて他の成分をさらに含有するものであってもよい。このような他の成分としては、水；豆乳、砂糖を始めとする糖類や甘味料、香料、果汁、果肉、ビタミン、ミネラル、油脂、セラミド、コラーゲン、ミルクリン脂質、ポリフェノール等の食品、食品成分、食品添加物；ペクチン、大豆多糖類、ＣＭＣ（カルボキシメチルセルロース）、寒天、ゼラチン、カラギーナン、ガム類などの安定化剤、増粘剤、ゲル化剤が挙げられ、これらのうちの１種であっても２種以上の混合物であってもよい。前記調乳液は、必要に応じて加温しながら、及び／又は、必要に応じて均質化させながら、前記成分を混合することにより調製することができる。また、前記調乳液としては、加熱殺菌したものを用いることもできる。
【００１９】
（ラクトバチルス・デルブルッキー（Lactobacillus  delbrueckii））
本発明の発酵食品の製造方法においては、前記調乳液に、ラクトバチルス・デルブルッキー及び下記のｐｒｔＳ遺伝子を保有するストレプトコッカス・サーモフィラスを組み合わせて添加し、発酵させる。
【００２０】
ラクトバチルス・デルブルッキー（以下、場合により「Ｌ．デルブルッキー」という）は、ラクトバチルス属のデルブルッキー種に分類される菌であり、Lactobacillus  delbrueckii  subsp.  bulgaricus、Lactobacillus  delbrueckii  subsp.  delbrueckii、Lactobacillus  delbrueckii  subsp.  lactis、Lactobacillus  delbrueckii  subsp.  indicus、Lactobacillus  delbrueckii  subsp.  sunkii、Lactobacillus  delbrueckii  subsp.  jakobsenii等の亜種が知られている。
【００２１】
また、Ｌ．デルブルッキーには、乳糖（ラクトース）をグルコース及びガラクトースに分解してエネルギー源として利用できる、すなわち、乳糖資化性のあるＬ．デルブルッキー（以下、場合により「Ｌ．デルブルッキーＬａｃ（＋）」という）と、乳糖をエネルギー源として利用できない、すなわち、乳糖資化性のないＬ．デルブルッキー（以下、場合により「Ｌ．デルブルッキーＬａｃ（−）」という）とがあり、従来はＬ．デルブルッキーＬａｃ（−）を用いても、乳糖を主な糖源とする発酵食品（特に発酵乳）を得ることは困難であるとされていたが、本発明においては、いずれのＬ．デルブルッキーであっても（Ｌ．デルブルッキーＬａｃ（−）であっても）、下記のｐｒｔＳ遺伝子を保有するストレプトコッカス・サーモフィラスと組み合わせることにより、前記調乳液を発酵して、短時間で安定的に発酵食品を得ることが可能である。
【００２２】
本発明において、Ｌ．デルブルッキーに乳糖資化性があるか否かの確認方法としては、特に制限されないが、例えば、単一糖源としてラクトースを含有する培地において、適正温度及び適正ｐＨで４８時間培養しても、培地内のラクトースをグルコース及びガラクトースに分解できないことや培地のｐＨが乳酸によって変化しないことで確認することができる。
【００２３】
本発明に係るＬ．デルブルッキーとしては、特に制限されず、上記の亜種として知られているものから選択されてもよいが、特に酸味、旨味、発酵香気、及び濃厚感の全てにおいてバランスのとれた穏やか（マイルド）な風味を有する発酵食品（特に発酵乳）を得ることができる傾向にある観点から、
ｆｕｓＡ遺伝子、ｇｙｒＢ遺伝子、ｈｓｐ６０遺伝子、ｉｌｅＳ遺伝子、ｐｙｒＧ遺伝子、ｒｅｃＡ遺伝子、及びｒｅｃＧ遺伝子からなる７種のハウスキーピング遺伝子に基づくＭＬＳＡ分類で、クラスターＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、及びＶのうちのいずれかに分類されるラクトバチルス・デルブルッキーであることが好ましく、
下記条件（ｉ）〜（ｖｉｉ）：
（ｉ）アレル番号が２又は１４であるｆｕｓＡ遺伝子を保有する、
（ｉｉ）アレル番号が３、１７、１８、及び２５から選択されるいずれか１つであるｇｙｒＢ遺伝子を保有する、
（ｉｉｉ）アレル番号が４、１８、２６、及び２７から選択されるいずれか１つであるｈｓｐ６０遺伝子を保有する、
（ｉｖ）アレル番号が１６、２０、２１、３０、及び３３から選択されるいずれか１つであるｉｌｅＳ遺伝子を保有する、
（ｖ）アレル番号が２２又は２３であるｐｙｒＧ遺伝子を保有する、
（ｖｉ）アレル番号が２、７、２４、及び２８から選択されるいずれか１つであるｒｅｃＡ遺伝子を保有する、
（ｖｉｉ）アレル番号が３であるｒｅｃＧ遺伝子を保有する、
を全て満たすＬ．デルブルッキー、並びに、
ｆｕｓＡ遺伝子、ｇｙｒＢ遺伝子、ｈｓｐ６０遺伝子、ｉｌｅＳ遺伝子、ｐｙｒＧ遺伝子、ｒｅｃＡ遺伝子、及びｒｅｃＧ遺伝子からなる７種のハウスキーピング遺伝子に基づくＭＬＳＡ分類で、前記条件（ｉ）〜（ｖｉｉ）を全て満たすＬ．デルブルッキーと同じクラスターに分類されるＬ．デルブルッキー
からなる群から選択される少なくとも１種であることがより好ましい。
【００２４】
本発明において、「ｆｕｓＡ遺伝子」とは、伸長因子ＥＦ−２（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＥＳ−２）をコードする遺伝子を示し、「ｇｙｒＢ遺伝子」とは、ＤＮＡジャイレース・サブユニットＢ（ＤＮＡ  ｇｙｒａｓｅ，ｓｕｂｕｎｉｔ  Ｂ）をコードする遺伝子を示し、「ｈｓｐ６０遺伝子」とは、ヒートショックプロテイン６０（Ｈｅａｔ−ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ６０）をコードする遺伝子を示し、「ｉｌｅＳ遺伝子」とは、イソロイシル  ｔＲＮＡ  合成酵素（Ｉｓｏｌｅｕｃｙｌ−ｔＲＮＡ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）をコードする遺伝子を示し、「ｐｙｒＧ遺伝子」とは、ＣＴＰ合成酵素（ＣＴＰ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）をコードする遺伝子を示し、「ｒｅｃＡ遺伝子」とは、リコンビナーゼＡ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ  Ａ）をコードする遺伝子を示し、「ｒｅｃＧ遺伝子」とは、ＡＴＰ依存性ＤＮＡヘリカーゼ（ＡＴＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ＤＮＡ  ｈｅｌｉｃａｓｅ）をコードする遺伝子を示す。これらの７遺伝子はいずれも、Ｌ．デルブルッキーの維持、増殖に不可欠なハウスキーピング遺伝子である。
【００２５】
これらの７種のハウスキーピング遺伝子に基づくＭＬＳＡ分類とは、多座配列解析（Ｍｕｌｔｉｌｏｃｕｓ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＭＬＳＡ））による分類であり、各菌株について上記の各ハウスキーピング遺伝子の塩基配列を連結させた配列（連結配列）を取得し、得られた連結配列を用いて系統樹を作製し、得られた系統樹により菌株をクラスターに分類する手法をいう。本発明においては、下記の表１〜２に示す菌株Ｎｏ．１〜５９の５９菌株（より好ましくは下記の表１〜２に示す菌株Ｎｏ．１〜６１の６１菌株）、又は対象となる菌株が前記５９菌株（又は前記６１菌株）に含まれていない場合には、前記５９菌株（又は前記６１菌株）に同対象となる１菌株を含めた６０菌株（又は６２菌株）のＬ．デルブルッキーについてＭＬＳＡ分類をおこない、各菌株のクラスターを決定する。
【００２６】
下記の表１〜２中、菌株Ｎｏ．１〜４１の菌株は、Ｔａｎｉｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２０１１年、１５７、ｐ．７２７−７３８（以下、「Ｔａｎｉｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．」という）に記載のＬ．デルブルッキーであり、菌株Ｎｏ．４２の菌株は、Ａｄｉｍｐｏｎｇ  Ｄ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ａｎｄ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｌｙ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２０１３年、６３、ｐ．３７２０−３７２６（以下、「Ａｄｉｍｐｏｎｇ  Ｄ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．」という）に記載のＬ．デルブルッキーである。また、菌株Ｎｏ．４３〜６１の菌株は、生乳、ヨーグルト、すんき漬等から採取した乳酸菌数種のうちの１９菌株のＬ．デルブルッキーである。
【００２７】
各ハウスキーピング遺伝子の塩基配列は、菌株Ｎｏ．１〜４１についてはＴａｎｉｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．に記載の各ＧｅｎｅＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ  アクセス番号から取得し、菌株Ｎｏ．４２についてはＡｄｉｍｐｏｎｇ  Ｄ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．に記載のＧｅｎｅＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ  アクセス番号ＡＬＰＹ０００００００から取得した。また、菌株Ｎｏ．４３〜６１については、下記の実施例に記載の方法で、各ハウスキーピング遺伝子の保存性の高い配列から作製した下記プライマーを用いてＰＣＲ法で得られた産物より、当該遺伝子の塩基配列をそれぞれ決定して取得した。取得した塩基配列のうち、今回新たに取得した塩基配列（Ｔａｎｉｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．に記載のない塩基配列；今回新たに下記のアレル番号を付与した塩基配列）の配列番号の一覧は、後述のアレル番号と共に下記の表３に示す。前記６１菌株以外のＬ．デルブルッキーのハウスキーピング遺伝子の塩基配列については、例えば、菌株Ｎｏ．４３〜６１と同様の方法によって、前記プライマーを用いて取得することができる。
【００２８】
本発明において、各菌株における連結配列は、取得した７遺伝子分の塩基配列を、ｆｕｓＡ遺伝子、ｇｙｒＢ遺伝子、ｈｓｐ６０遺伝子、ｉｌｅＳ遺伝子、ｐｙｒＧ遺伝子、ｒｅｃＡ遺伝子、及びｒｅｃＧ遺伝子の順に連結させて得られる。前記連結配列を用いて系統樹を作製する方法としては、従来公知の方法を適宜採用することができ、例えば、前記系統樹は、Ｇｅｎｅｔｙｘ  ｖ．１３（株式会社ゼネティックス製）等のソフトウエアを用いて作製することができるが、非加重結合法（Ｕｎｗｅｉｇｈｔｅｄ  Ｐａｉｒ  Ｇｒｏｕｐ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｗｉｔｈ  Ａｒｉｔｈｍｅｔｉｃ  ｍｅａｎ（ＵＰＧＭＡ））によることが好ましい。下記の表１〜２に記載の菌株Ｎｏ．１〜６１のＬ．デルブルッキーについて、前記連結配列を用いてＧｅｎｅｔｙｘ  ｖ．１３により非加重結合法で作製した系統樹を図１に示す。また、得られた系統樹により各菌株が分類されたクラスターを、後述のアレル番号と共に下記の表１〜２に示す。
【００２９】
図１及び下記の表１〜２に示すように、上記方法で得られた系統樹によって分類されるクラスターＩのうち、サブクラスターＩ−Ｂ（クラスターＩ−Ｂ）は、従来公知であったＬ．デルブルッキー（例えば、菌株Ｎｏ．１〜４２のＬ．デルブルッキー）が含まれない、新規のＬ．デルブルッキーからなる新たなクラスターである。
【００３０】
このようなＬ．デルブルッキーとしては、下記のｐｒｔＳ遺伝子を保有するストレプトコッカス・サーモフィラスと組み合わせると特に、酸味、旨味、発酵香気、及び濃厚感の全てにおいてバランスのとれた穏やか（マイルド）な風味を有する発酵食品（特に発酵乳）を得ることができる傾向にある観点から、
上記のＭＬＳＡ分類で、クラスターＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、及びＶのうちのいずれかに分類されるＬ．デルブルッキーであることが好ましく、
下記条件（ｉ）〜（ｖｉｉ）：
（ｉ）アレル番号が２又は１４であるｆｕｓＡ遺伝子を保有する、
（ｉｉ）アレル番号が３、１７、１８、及び２５から選択されるいずれか１つであるｇｙｒＢ遺伝子を保有する、
（ｉｉｉ）アレル番号が４、１８、２６、及び２７から選択されるいずれか１つであるｈｓｐ６０遺伝子を保有する、
（ｉｖ）アレル番号が１６、２０、２１、３０、及び３３から選択されるいずれか１つであるｉｌｅＳ遺伝子を保有する、
（ｖ）アレル番号が２２又は２３であるｐｙｒＧ遺伝子を保有する、
（ｖｉ）アレル番号が２、７、２４、及び２８から選択されるいずれか１つであるｒｅｃＡ遺伝子を保有する、
（ｖｉｉ）アレル番号が３であるｒｅｃＧ遺伝子を保有する、
を全て満たすＬ．デルブルッキー、並びに、
前記ＭＬＳＡ分類で、前記条件（ｉ）〜（ｖｉｉ）を全て満たすＬ．デルブルッキーと同じクラスター（図１のクラスターＩ）に分類されるＬ．デルブルッキー
からなる群から選択される少なくとも１種であることがより好ましく、
前記条件（ｉ）〜（ｖｉｉ）を全て満たすＬ．デルブルッキー、及び、
前記条件（ｉ）〜（ｖｉｉ）を全て満たすＬ．デルブルッキーと同じサブクラスター（図１のサブクラスターＩ−Ｂ）に分類されるＬ．デルブルッキー
からなる群から選択される少なくとも１種であることがさらに好ましい。
【００３１】
本発明において、「クラスターＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、及びＶのうちのいずれかに分類されるＬ．デルブルッキー（以下、場合により「Ｌ．デルブルッキー（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、Ｖ）」という）」とは、前記条件（ｉ）〜（ｖｉｉ）を全て満たすＬ．デルブルッキーが分類されるクラスターをクラスターＩとしたときに、以降、非加重結合法で順に分類される４つのクラスター（クラスターＩＩ〜Ｖ）のうち、クラスターＩＶを除くクラスターＩＩ、ＩＩＩ、Ｖに分類されるＬ．デルブルッキー、並びに、前記クラスターＩに分類されるＬ．デルブルッキーのうちのいずれかを示す。クラスターＩ〜Ｖは、さらにサブクラスターに分かれていてもよい（例えば、図１において、クラスターＩはサブクラスターＩ−Ａ〜Ｇ、クラスターＩＩＩはサブクラスターＩＩＩ−Ａ〜Ｂに分かれる）。
【００３２】
これらの中でも、本発明に係るＬ．デルブルッキーとしては、特に酸味、旨味、発酵香気、及び濃厚感の全てにおいてバランスのとれた穏やか（マイルド）な風味を有する発酵食品（特に発酵乳）を得ることができる傾向にある観点から、クラスターＩに分類されるＬ．デルブルッキーであることが好ましく、サブクラスターＩ−Ｂに分類されるＬ．デルブルッキー（以下、場合により「Ｌ．デルブルッキー（Ｉ−Ｂ）」という）であることが特に好ましい。
【００３３】
本発明に係るｆｕｓＡ遺伝子、ｇｙｒＢ遺伝子、ｈｓｐ６０遺伝子、ｉｌｅＳ遺伝子、ｐｙｒＧ遺伝子、ｒｅｃＡ遺伝子、及びｒｅｃＧ遺伝子からなる７種のハウスキーピング遺伝子のアレル番号、その塩基配列、及びその多型性部位の一覧を図２Ａ〜図８Ｅに示す（図２Ａ〜Ｃ：ｆｕｓＡ遺伝子（「ｆｕｓＡ」の次のハイフン（−）以下の番号がアレル番号を示す、以下同様）、図３Ａ〜Ｄ：ｇｙｒＢ遺伝子、図４Ａ〜Ｆ：ｈｓｐ６０遺伝子、図５Ａ〜Ｅ：ｉｌｅＳ遺伝子、図６Ａ〜Ｄ：ｐｙｒＧ遺伝子、図７Ａ〜Ｅ：ｒｅｃＡ遺伝子、図８Ａ〜Ｅ：ｒｅｃＧ遺伝子）。図２Ａ〜図８Ｅにおいては、それぞれアレル番号１番の全塩基配列（Ｔａｎｉｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．に記載の塩基配列）を示し、以降のアレル番号で示される遺伝子については、これと異なる塩基のみを示す。Ｔａｎｉｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．に記載の菌株Ｎｏ．１〜４１の菌株の各遺伝子のアレル番号は、基本的に、Ｔａｎｉｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．に記載のアレル番号を示す。ただし、Ｔａｎｉｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．において、ｈｓｐ６０遺伝子のアレル番号１３及び１４、ｒｅｃＧ遺伝子アレル番号１６及び１７には、それぞれ、別の番号が付されているが、図４Ａ〜Ｆ及び図８Ａ〜Ｅに示すように、これらは同じ１つの配列であるため、本発明では、表１〜２に示すように、これらをそれぞれアレル番号１３／１４及び１６／１７とした。菌株Ｎｏ．４２〜６１の菌株の各遺伝子のアレル番号については、上記のＭＬＳＡ分類に記載の方法で取得した各ハウスキーピング遺伝子の塩基配列について、遺伝子毎に、上記の菌株Ｎｏ．１〜４１の塩基配列と比較し、菌株Ｎｏ．１〜４１の塩基配列のいずれとも一致しない塩基配列に新たなアレル番号を付与した。下記の表１〜２に、上記６１菌株の各遺伝子のアレル番号を示す。表１〜２には、上記のＭＬＳＡ分類によって得られた系統樹により各菌株が分類されたクラスターも併せて示す。また、下記の表３には、今回新たにアレル番号を付与したハウスキーピング遺伝子の塩基配列（今回新たに取得した塩基配列；Ｔａｎｉｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．に記載のない塩基配列）の配列番号及びアレル番号の一覧を示す。
【００３４】
【表１】
2020137517.tif 000002
【００３５】
【表２】
2020137517.tif 000003
【００３６】
【表３】
2020137517.tif 000004
【００３７】
上記６１菌株以外のＬ．デルブルッキーについては、例えば、上記のＭＬＳＡ分類に記載の方法で取得した各ハウスキーピング遺伝子の塩基配列について、遺伝子毎に、上記の図２Ａ〜図８Ｅに記載の塩基配列及びアレル番号と対比することで、各アレル番号を取得することができる。
【００３８】
前記条件（ｉ）〜（ｖｉｉ）を全て満たすＬ．デルブルッキーの好ましい例としては、保有する前記ハウスキーピング遺伝子のアレル番号が、ｆｕｓＡ遺伝子、ｇｙｒＢ遺伝子、ｈｓｐ６０遺伝子、ｉｌｅＳ遺伝子、ｐｙｒＧ遺伝子、ｒｅｃＡ遺伝子、ｒｅｃＧ遺伝子の順に、
２、３、４、１６、２２、２、３；
２、３、４、２１、２２、７、３；
２、３、４、２１、２３、７、３；
２、３、１８、２１、２２、２、３；
２、３、１８、２１、２２、７、３；
２、３、１８、２１、２３、２、３；
２、３、１８、３０、２２、７、３；
２、１８、４、１６、２２、７、３；
２、１８、４、１６、２３、７、３；
２、２５、１８、２１、２２、２８、３；
１４、１７、１８、２０、２２、７、３；
１４、１７、１８、２１、２２、７、３；
１４、１７、１８、２１、２２、２４、３；
１４、１７、１８、３３、２２、７、３；
１４、１７、２６、２１、２２、７、３；又は
２、３、２７、２１、２２、７、３
であるＬ．デルブルッキーが挙げられる。
【００３９】
上記のＬ．デルブルッキーの中でも、本発明に係るＬ．デルブルッキーとしては、
受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８７４号（受領番号ＮＩＴＥ  ＡＢＰ−０２８７４号）で特定されるＬ．デルブルッキー（L.  delbrueckii  NITE  ABP-02874：表２の菌株Ｎｏ．４６）、及び、
前記ＭＬＳＡ分類で、前記受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８７４号（受領番号ＮＩＴＥ  ＡＢＰ−０２８７４号）で特定されるＬ．デルブルッキーと同じクラスター（すなわち、クラスターＩ）に分類されるＬ．デルブルッキー
からなる群から選択される少なくとも１種であることがより好ましく、
前記受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８７４号で特定されるＬ．デルブルッキー、及び、
前記ＭＬＳＡ分類で、前記受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８７４号（受領番号ＮＩＴＥ  ＡＢＰ−０２８７４号）で特定されるＬ．デルブルッキーと同じサブクラスター（すなわち、サブクラスターＩ−Ｂ）に分類されるＬ．デルブルッキー
からなる群から選択される少なくとも１種であることがさらに好ましく、
前記受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８７４号で特定されるＬ．デルブルッキー
であることが特に好ましい。
【００４０】
受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８７４号で特定されるＬ．デルブルッキーは、（１）寄託機関：独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（郵便番号２９２−０８１８  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２２号室）、（２）受領日（原寄託日）：２０１９年２月５日、（３）受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８７４号（受領番号：ＮＩＴＥ  ＡＢＰ−０２８７４）、（４）識別の表示：Lactobacillus  delbrueckii  OLL204989で、前記寄託機関に寄託している。なお、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８７４号で特定されるＬ．デルブルッキーとしては、同株の継代株、又は本発明の効果を阻害しない範囲内（好ましくは、本発明に係るＬ．デルブルッキーの好ましい条件を満たす範囲内）において、同株又はその継代株の人工変異株、自然変異株、又は遺伝子組み換え株であってよい。受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８７４号で特定されるＬ．デルブルッキーは、Ｌ．デルブルッキーＬａｃ（＋）であり、Ｌ．デルブルッキー（Ｉ−Ｂ）であり、かつ、保有するハウスキーピング遺伝子のアレル番号が、ｆｕｓＡ遺伝子、ｇｙｒＢ遺伝子、ｈｓｐ６０遺伝子、ｉｌｅＳ遺伝子、ｐｙｒＧ遺伝子、ｒｅｃＡ遺伝子、ｒｅｃＧ遺伝子の順に、２、３、１８、２１、２２、２、３である、Ｌ．デルブルッキーである。
【００４１】
（ストレプトコッカス・サーモフィラス（Streptococcus  thermophilus））
本発明の発酵食品の製造方法においては、前記調乳液に、上記のＬ．デルブルッキーと組み合わせてｐｒｔＳ遺伝子を保有するストレプトコッカス・サーモフィラスを添加し、発酵させる。
【００４２】
本発明に係るストレプトコッカス・サーモフィラス（以下、場合により「Ｓ．サーモフィラス」という）としては、ｐｒｔＳ遺伝子を保有するものであれば特に制限されず、１種を単独で用いても２種以上を組み合わせて用いてもよい。本発明において、「ｐｒｔＳ遺伝子」とは、カゼインを分解する細胞壁結合型セリンプロテアーゼをコードする遺伝子を示す。
【００４３】
本発明において、Ｓ．サーモフィラスがｐｒｔＳ遺伝子を保有するか否かは、例えば、下記の実施例に記載の方法で、ｐｒｔＳ遺伝子の保存性の高い配列から作製した下記プライマーを用いてｐｒｔＳ遺伝子の一部を増幅し、所望のＰＣＲ産物が得られるか否かによって判定することができる。ｐｒｔＳ遺伝子を保有するＳ．サーモフィラス（以下、場合により「Ｓ．サーモフィラスｐｒｔＳ（＋）」という）を用いることにより、前記Ｌ．デルブルッキーＬａｃ（−）と組み合わせても、ｐｒｔＳ遺伝子を保有しないＳ．サーモフィラス（以下、場合により「Ｓ．サーモフィラスｐｒｔＳ（−）」という）を用いた場合に比べて、発酵時間を有意に短縮することができる。さらに、かかるＳ．サーモフィラスｐｒｔＳ（＋）と、前記ＭＬＳＡ分類でクラスターＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、及びＶのうちのいずれか（より好ましくはクラスターＩ、さらに好ましくはサブクラスターＩ−Ｂ）に分類されるＬ．デルブルッキーとを組み合わせることにより特に、酸味、旨味、発酵香気、及び濃厚感の全てにおいてバランスのとれた穏やか（マイルド）な風味を有する発酵食品を得ることが可能となる。
【００４４】
このようなＳ．サーモフィラスｐｒｔＳ（＋）としては、好ましくは、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８７５号（受領番号ＮＩＴＥ  ＡＢＰ−０２８７５号）で特定されるＳ．サーモフィラスが挙げられる。受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８７５号で特定されるＳ．サーモフィラスは、日本国生乳由来のＳ．サーモフィラスｐｒｔＳ（＋）である。
【００４５】
受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８７５号で特定されるＳ．サーモフィラスは、（１）寄託機関：独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（郵便番号２９２−０８１８  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２２号室）、（２）受領日（原寄託日）：２０１９年２月５日、（３）受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８７５号（受領番号：ＮＩＴＥ  ＡＢＰ−０２８７５）、（４）識別の表示：Streptococcus  thermophilus  OLS4496で、前記寄託機関に寄託している。なお、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８７５号で特定されるＳ．サーモフィラスとしては、同株の継代株、又は本発明に係る条件を満たす範囲内において、同株又はその継代株の人工変異株、自然変異株、又は遺伝子組み換え株であってよい。
【００４６】
（発酵）
前記調乳液に、前記Ｌ．デルブルッキー及び前記Ｓ．サーモフィラスｐｒｔＳ（＋）を添加して発酵させる発酵工程としては、従来公知の方法を適宜採用することができ、特に制限されないが、例えば、前記調乳液に、前記Ｌ．デルブルッキー及び前記Ｓ．サーモフィラスｐｒｔＳ（＋）を発酵スターターとして接種し、発酵させる方法が挙げられる。
【００４７】
前記Ｌ．デルブルッキー及び前記Ｓ．サーモフィラスｐｒｔＳ（＋）としては、これらの乳酸菌をいずれも含有する、又はそれぞれ独立して含有する、乳酸菌組成物及び／又は該乳酸菌の処理物の形態であってもよい。本発明において、前記乳酸菌組成物には、乳酸菌（Ｌ．デルブルッキー及び／又はＳ．サーモフィラスｐｒｔＳ（＋））の培養終了後の培養上清、培地成分等である培養物；前記培養物の濃縮物、希釈物、乾燥物、凍結物等が含まれ、これらのうちの１種を単独であっても２種以上の組み合わせであってもよい。また、本発明において、前記乳酸菌組成物及び／又は乳酸菌の処理物には、乳酸菌又は前記培養物の破砕物及び加熱処理物、これらの濃縮物、希釈物、乾燥物、凍結物等が含まれ、これらのうちの１種を単独であっても２種以上の組み合わせであってもよい。これらの中でも、前記Ｌ．デルブルッキー及び前記Ｓ．サーモフィラスｐｒｔＳ（＋）としては、前記乳酸菌組成物の形態、より好ましくは、培養物又は培養物の濃縮物の形態で前記調乳液に添加されることが好ましい。
【００４８】
前記発酵スターターの添加量は、従来公知の発酵食品の製造方法において採用されている添加量に従って、適宜設定することができるが、例えば、前記調乳液の体積に対して、乳酸菌数（Ｌ．デルブルッキー及びＳ．サーモフィラスｐｒｔＳ（＋）の合計菌数）換算で、１×１０７〜５×１０９ＣＦＵ／ｍＬであることが好ましく、１×１０８〜２×１０９ＣＦＵ／ｍＬであることがより好ましい。
【００４９】
また、前記調乳液に添加されるＬ．デルブルッキーとＳ．サーモフィラスｐｒｔＳ（＋）との菌数の比率（Ｌ．デルブルッキー：Ｓ．サーモフィラスｐｒｔＳ（＋））としては、１：０．１〜１：１００であることが好ましく、１：１〜１：１０であることがより好ましい。
【００５０】
前記発酵スターターの接種方法は、特に制限されることなく、発酵食品の製造方法で慣用されている方法を適宜用いることができ、前記Ｌ．デルブルッキー及び前記Ｓ．サーモフィラスｐｒｔＳ（＋）は、これらを互いに単独で同時期に接種しても、これらを混合してから（例えばこれらをいずれも含有する乳酸菌組成物の形態で）同時に接種してもよい。前記発酵の条件としては、添加されるＬ．デルブルッキー及びＳ．サーモフィラスｐｒｔＳ（＋）の生育条件、前記調乳液の量等に応じて適宜選択することができ、特に制限されないが、例えば、温度３５〜４５℃、より好ましくは温度３８〜４３℃において、好気又は嫌気条件下で、前記Ｌ．デルブルッキー及び前記Ｓ．サーモフィラスｐｒｔＳ（＋）を添加した調乳液のｐＨが４．８以下、より好ましくは４．０〜４．６になるまで、通常、３〜２４時間、より好ましくは３〜８時間、さらに好ましくは４〜６時間、静置又は撹拌（好ましくは静置）することが好ましい。本発明によれば、Ｌ．デルブルッキーＬａｃ（−）を用いても発酵にかかる時間を十分に短くすることが可能である。また、前記嫌気条件としては、例えば、窒素通気条件下での発酵を採用することができる。
【００５１】
上記発酵により、本発明の発酵食品を得ることができる。前記発酵工程後の発酵物は、そのまま、又は必要に応じて濃縮、希釈、乾燥、若しくは凍結等することにより、本発明の発酵食品とすることができる。また、前記発酵物における乳酸菌を破砕若しくは加熱処理等して、又は必要に応じてこれを濃縮、希釈、乾燥、若しくは凍結等することにより、本発明の発酵食品としてもよい。
【００５２】
＜発酵食品＞
本発明の発酵食品は、前記Ｌ．デルブルッキー及び前記Ｓ．サーモフィラスｐｒｔＳ（＋）を含有するものであり、上記の本発明の発酵食品の製造方法によって得ることができる。
【００５３】
本発明の発酵食品としては、特に限定されるものではなく、例えば、日本国厚生労働省の乳及び乳製品の成分規格等に関する省令（乳等省令）による「発酵乳」の規格を満たす発酵乳（より具体的には、無脂乳固形分の含有量が８．０％以上、乳酸菌数又は酵母数（好ましくは乳酸菌数（より好ましくはＬ．デルブルッキー及びＳ．サーモフィラスｐｒｔＳ（＋）の合計数、以下同じ））が１，０００万/ｍＬ以上のもの）、「乳製品乳酸菌飲料」の規格を満たすもの（より具体的には、無脂乳固形分の含有量が３．０％以、乳酸菌数又は酵母数（好ましくは乳酸菌数）が１０００万／ｍＬ以上のもの）、「乳酸菌飲料」の規格を満たすもの（より具体的には、無脂乳固形分の含有量が３．０％未満、乳酸菌数又は酵母数（好ましくは乳酸菌数）が１００万／ｍＬ以上のもの）のいずれであってもよい。なお、前記無脂乳固形分とは、全乳固形分から脂肪分を差引いた残りの成分（主に、たんぱく質、乳糖、及びミネラル等）を示し、前記乳酸菌及び酵母数は、殺菌前において、前記乳等省令で定められた検査法により測定される。
【００５４】
本発明の発酵食品としては、前記発酵工程後の発酵物であっても、若しくは前記発酵物を殺菌処理したものであってもよく、又はこれらを濃縮、希釈、乾燥、若しくは凍結等したものであってもよく、例えば、前記発酵乳としては、上記の発酵乳、乳製品乳酸菌飲料、又は乳酸菌飲料を殺菌処理したものであってもよく、この場合、上記乳酸菌数（好ましくはＬ．デルブルッキー及びＳ．サーモフィラスｐｒｔＳ（＋）の合計数）は、生菌数換算である。本発明の発酵食品に含有される乳酸菌には、生菌の他、死菌も含み、乳酸菌の破砕物及び加熱処理物、これらの濃縮物、希釈物、乾燥物、凍結物も含むが、本発明の発酵食品に含有される乳酸菌としては、少なくとも生菌を含むことが好ましい。
【００５５】
本発明の発酵食品としては、本発明の効果を阻害しない範囲内において、乳酸菌として、本発明に係るＬ．デルブルッキー及びＳ．サーモフィラスｐｒｔＳ（＋）以外の他の乳酸菌を含有していてもよく、また、酵母をさらに含有していてもよい。これらの他の乳酸菌及び酵母としては、従来から発酵食品（例えば発酵乳）に含有させることが公知の乳酸菌や酵母が挙げられる。
【００５６】
また、本発明の発酵食品としては、他に、飲食品に含有させることが可能な各種成分をさらに含有してもよい。このような成分としては、特に制限されず、例えば、水、糖類、糖アルコール類、ミネラル類、ビタミン類、タンパク質、ペプチド、アミノ酸類、有機酸、ｐＨ調整剤、澱粉及び加工澱粉、食物繊維、果実・野菜及びその加工品、動物及び植物生薬エキス、天然由来高分子（コラーゲン、ヒアルロン酸、コンドロイチン等）、油脂、増粘剤、乳化剤、溶剤、界面活性剤、ゲル化剤、安定剤、緩衝剤、懸濁化剤、粘稠剤、賦形剤、崩壊剤、結合剤、流動化剤、保存料、着色料、香料、矯味剤、甘味剤等が挙げられ、これらのうちの１種を単独で含有していても２種以上を組み合わせて含有していてもよい。
【００５７】
このような発酵食品としては、発酵乳が好ましく、前記発酵乳としては、ヨーグルト、チーズ、発酵クリーム、発酵バター等が好ましく、特にヨーグルトが好ましい。前記ヨーグルトとしては、具体的には、プレーンヨーグルト等のセットタイプヨーグルト（固形状発酵乳）、ソフトタイプヨーグルト（糊状発酵乳）、及びドリンクタイプヨーグルト（液状発酵乳）が挙げられ、これらを材料として用いたフローズンヨーグルトであってもよい。また、本発明の発酵食品は、チーズ、発酵クリーム、発酵バター、ケフィア等の発酵食品の材料として用いることもできる。
【実施例】
【００５８】
以下、実施例及び比較例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。以下の実施例及び比較例において、Ｓ．サーモフィラスのｐｒｔＳ遺伝子保有の有無の確認、Ｌ．デルブルッキーの乳糖資化性の有無の確認、及びＬ．デルブルッキーのクラスター分類（ＭＬＳＡ分類）は、それぞれ下記の方法でおこなった。
【００５９】
＜Ｓ．サーモフィラスのｐｒｔＳ遺伝子保有の有無の確認＞
ゲノム配列が既知である５株のサーモフィラス菌（S.  thermophilus）のｐｒｔＳ遺伝子配列をＮＣＢＩデータベースより取得し、保存性の高い配列から、下記プライマー（カッコ内の配列番号は各プライマーの塩基配列を示す）：
ｐｒｔＳ遺伝子フォワードプライマー（配列番号２６）
ｐｒｔＳ遺伝子リバースプライマー（配列番号２７）
を作製した。また、ＩｎｓｔａＧｅｎｅＭａｔｒｉｘ（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いて、各菌株のＭ１７培養液からゲノムＤＮＡを抽出した。抽出したゲノムＤＮＡ（テンプレート）０．５μＬ、作製したプライマー（５μＭ）各１μＬ、Ｐｈｕｓｉｏｎ  ｈｉｇｈ  ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ０．１μＬ、５×ＨＦバッファー２μＬ、２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ０．８μＬ、及び超純水４．６μＬを混合し（全１０μＬ）、下記の表４に示す条件でＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動し、６８４ｂｐの位置にバンドが確認された菌株をｐｒｔＳ遺伝子を保有するＳ．サーモフィラス（Ｓ．サーモフィラスｐｒｔＳ（＋））とし、同バンドが確認されなかった菌株をｐｒｔＳ遺伝子を保有しないＳ．サーモフィラス（Ｓ．サーモフィラスｐｒｔＳ（−））とした。
【００６０】
【表４】
2020137517.tif 000005
【００６１】
＜Ｌ．デルブルッキーの乳糖資化性の有無の確認＞
先ず、単一糖源を無し（水を添加）又はグルコース若しくはラクトースとし（陽性対照用：グルコース；陰性対照用：水）、ｐＨ指示薬（ブロモクレゾールパープル：ＢＣＰ）をさらに添加したｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＭＲＳ培地（紫色）を調製した。ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＭＲＳ培地の組成を下記の表５に示す。次いで、評価対象のＬ．デルブルッキーの菌株をＭＲＳ液体培地で２回賦活培養（３７℃、嫌気、１８時間培養）した後、菌液を遠心（２０００×ｇ、４℃、２０分間）し、上清を捨てて集菌した。集めた菌体に生理食塩水を加えて２倍濃縮した菌液を調製し、この菌液をｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＭＲＳ培地に３．２５％（ｍＬ／１００ｍＬ）となるように添加し、３７℃で４８時間、静置培養した。培養終了後に培養液の色を観察し、次の基準：
乳糖資化性無し（Ｌａｃ（−））：単一糖源をラクトースとした培養液の色が培養終了後も変色せず、単一糖源を無し（水）とした培養液の培養終了後の色と同じ紫色のままであり、単一糖源をグルコースとした培養液の培養終了後の色と異なる、
乳糖資化性有り（Ｌａｃ（＋））：単一糖源をラクトースとした培養液の培養終了後の色が黄色に変色しており、単一糖源をグルコースとした培養液の培養終了後の色と同じである、
に従ってラクトース（乳糖）の資化性を確認した。
【００６２】
【表５】
2020137517.tif 000006
【００６３】
＜Ｌ．デルブルッキーのクラスター分類（ＭＬＳＡ分類）＞
（１）５９菌株のＬ．デルブルッキー（L.  delbrueckii）について、ＭＬＳＡ分類をおこなった。すなわち、先ず、上記の表２の菌株Ｎｏ．４３〜５９に示す１７菌株のＬ．デルブルッキーの菌株について、Ｔａｎｉｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．に記載の方法と同様にして、ｆｕｓＡ遺伝子、ｇｙｒＢ遺伝子、ｈｓｐ６０遺伝子、ｉｌｅＳ遺伝子、ｐｙｒＧ遺伝子、ｒｅｃＡ遺伝子、及びｒｅｃＧ遺伝子の各保存性の高い配列から作製した下記プライマー（カッコ内の配列番号は各プライマーの塩基配列を示す）：
ｆｕｓＡ遺伝子：フォワードプライマー（配列番号２８）、リバースプライマー（配列番号２９）
ｇｙｒＢ遺伝子：フォワードプライマー（配列番号３０）、リバースプライマー（配列番号３１）
ｈｓｐ６０遺伝子：フォワードプライマー（配列番号３２）、リバースプライマー（配列番号３３）
ｉｌｅＳ遺伝子：フォワードプライマー（配列番号３４）、リバースプライマー（配列番号３５）
ｐｙｒＧ遺伝子：フォワードプライマー（配列番号３６）、リバースプライマー（配列番号３７）
ｒｅｃＡ遺伝子：フォワードプライマー（配列番号３８）、リバースプライマー（配列番号３９）
ｒｅｃＧ遺伝子：フォワードプライマー（配列番号４０）、リバースプライマー（配列番号４１）
を用い、各遺伝子の配列をＰＣＲ法で増幅した。次いで、得られたＰＣＲ産物の塩基配列を決定し、菌株毎に、７遺伝子分の塩基配列を、ｆｕｓＡ遺伝子、ｇｙｒＢ遺伝子、ｈｓｐ６０遺伝子、ｉｌｅＳ遺伝子、ｐｙｒＧ遺伝子、ｒｅｃＡ遺伝子、及びｒｅｃＧ遺伝子の順に連結して連結配列とした。
【００６４】
また、Ｔａｎｉｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．に記載の４１菌株（表１の菌株Ｎｏ．１〜４１の菌株）、及びＡｄｉｍｐｏｎｇ  Ｄ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．に記載の１菌株（表１の菌株Ｎｏ．４２の菌株）のｆｕｓＡ遺伝子、ｇｙｒＢ遺伝子、ｈｓｐ６０遺伝子、ｉｌｅＳ遺伝子、ｐｙｒＧ遺伝子、ｒｅｃＡ遺伝子、及びｒｅｃＧ遺伝子の塩基配列については、同文献に記載の各ＧｅｎｅＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ  アクセス番号から取得し、これらをそれぞれ上記と同様にして連結し、連結配列を得た。
【００６５】
次いで、上記の全５９菌株について、得られた連結配列より、Ｇｅｎｅｔｙｘ  ｖ．１３（株式会社ゼネティックス製）を用いて、非加重結合法（ＵＰＧＭＡ）で系統樹を作製した。
【００６６】
また、上記の表２の菌株Ｎｏ．６０〜６１に示す２菌株のＬ．デルブルッキーの菌株についても、前記プライマーを用いて各遺伝子の配列をＰＣＲ法で増幅し、各菌株毎に連結配列を得た。次いで、上記の５９菌株に、当該菌株Ｎｏ．６０〜６１に示す２菌株のＬ．デルブルッキーの菌株を加え、全６１菌株について、上記と同様にして系統樹を作製した。上記の菌株Ｎｏ．１〜５９に示す５９菌株において、同５９菌株で得られた系統樹により分類されたクラスターと、上記の６１菌株で得られた系統樹により分類されたクラスターとは、サブクラスターも含めて、互いに一致していた。上記の全６１菌株で得られた系統樹は上記の図１に示す。また、該系統樹により分類されたクラスターは、それぞれ、上記の表１〜２に示す。
【００６７】
（２）上記６１菌株以外で下記の表６に記載のＬ．デルブルッキー（L.  delbrueckii）については、先ず、上記菌株Ｎｏ．４３〜５９の菌株と同様にして、前記７遺伝子の各塩基配列及び連結配列を取得した。次いで、上記の全５９菌株の連結配列、及び得られた対象１菌株の連結配列（全６０菌株の連結配列）より、上記の（１）と同様にして系統樹を作製した。得られた系統樹において、対象菌株の分類されたクラスターを、その菌株のクラスターとした。
【００６８】
＜発酵時間測定＞
上記方法でｐｒｔＳ遺伝子保有の有無を確認した、ｐｒｔＳ遺伝子を保有しないＳ．サーモフィラスの菌株（S.  thermophilus  1131、明治ブルガリアヨーグルトＬＢ８１（株式会社明治製）より単離）、又はｐｒｔＳ遺伝子を保有するＳ．サーモフィラスの菌株（S.  thermophilus  NITE  ABP-02875、日本国生乳由来、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８７５号（受領番号ＮＩＴＥ  ＡＢＰ−０２８７５号）で特定されるＳ．サーモフィラス）と、上記方法で乳糖資化性の有無及びクラスターを確認した下記の表６に示すＬ．デルブルッキー（L.  delbrueckii）の菌株とを、下記の表６の組み合わせ（Ｙ１〜Ｙ２０、Ｙ６Ｋ（−）：比較例；Ｙ２１〜Ｙ４０、Ｙ６Ｋ（＋）：実施例；Ｓ１〜Ｓ２：参考例）で用いて、発酵にかかる時間を測定した。表６には、各Ｓ．サーモフィラスのｐｒｔＳ遺伝子保有の有無（ｐｒｔＳ（＋）／ｐｒｔＳ（−））、各Ｌ．デルブルッキーのＭＬＳＡ分類によるクラスター（ＭＬＳＡクラスター）及び乳糖資化性（＋：Ｌａｃ（＋）／−：Ｌａｃ（−））を併せて示す。
【００６９】
【表６】
2020137517.tif 000007
【００７０】
発酵は、市販の牛乳に、各菌株を０．５％（０．５ｍＬ／１００ｍＬ、以下同じ）、又はその組み合わせ（Ｌ．デルブルッキー：Ｓ．サーモフィラス＝約１：１（菌数））を各菌株量がそれぞれ０．５％（計１％）、となるように添加し、４３℃において２４時間発酵させ（好気、静置培養）、各発酵乳を得た。それぞれ菌株を添加してからｐＨが４．５となるまでの時間を測定し、発酵にかかる発酵時間とした。結果を下記の表７に示す。なお、菌株を添加してから２４時間以内にｐＨが４．５に達しなかったものについては、発酵時間を２４時間（１４４０分）として発酵を終了した。
【００７１】
【表７】
2020137517.tif 000008
【００７２】
また、図９に、Ｓ．サーモフィラスｐｒｔＳ（−）（Ｙ１〜Ｙ２０、Ｙ６Ｋ（−）（ｎ＝２１））を用いたとき（ｐｒｔＳ（−））、及びＳ．サーモフィラスｐｒｔＳ（＋）（Ｙ２１〜Ｙ４０、Ｙ６Ｋ（＋）（ｎ＝２１））を用いたとき（ｐｒｔＳ（＋））の発酵時間（平均値、分）をそれぞれ示す。ｔ検定の結果、ｐｒｔＳ（＋）の結果は、ｐｒｔＳ（−）の結果に対して、Ｐ値が０．０５未満であった。図９に示すように、Ｓ．サーモフィラスｐｒｔＳ（＋）を用いた場合には、Ｓ．サーモフィラスｐｒｔＳ（−）を用いた場合に比べて、発酵時間が有意に短縮されることが確認された。また、Ｓ．サーモフィラスｐｒｔＳ（＋）を用いた場合には、表７に示すように、単菌であっても発酵時間が短縮されることも確認された。
【００７３】
図１０には、これらのＳ．サーモフィラス別に、Ｌ．デルブルッキーの乳糖資化性の有無による発酵時間（平均値、分）を示す。すなわち、Ｓ．サーモフィラスｐｒｔＳ（−）及びＬ．デルブルッキーＬａｃ（＋）を用いたとき（ｐｒｔＳ（−）−Ｌａｃ（＋）：Ｙ１〜Ｙ６、Ｙ８〜Ｙ１０、Ｙ１３、Ｙ１４、Ｙ１６〜Ｙ２０、Ｙ６Ｋ（−）、ｎ＝１７）、Ｓ．サーモフィラスｐｒｔＳ（−）及びＬ．デルブルッキーＬａｃ（−）を用いたとき（ｐｒｔＳ（−）−Ｌａｃ（−）：Ｙ７、Ｙ１１、Ｙ１２、Ｙ１５、ｎ＝４）、Ｓ．サーモフィラスｐｒｔＳ（＋）及びＬ．デルブルッキーＬａｃ（＋）を用いたとき（ｐｒｔＳ（＋）−Ｌａｃ（＋）：Ｙ２１〜Ｙ２６、Ｙ２８〜Ｙ３０、Ｙ３３、Ｙ３４、Ｙ３６〜Ｙ４０、Ｙ６Ｋ（＋）、ｎ＝１７）、Ｓ．サーモフィラスｐｒｔＳ（＋）及びＬ．デルブルッキーＬａｃ（−）を用いたとき（ｐｒｔＳ（＋）−Ｌａｃ（−）：Ｙ２７、Ｙ３１、Ｙ３２、Ｙ３５、ｎ＝４）、の発酵時間をそれぞれ示す。ｔ検定の結果、各Ｌａｃ（−）の結果は、Ｌａｃ（＋）の結果に対して、それぞれＰ値が０．０５未満であった。図１０に示すように、いずれのＳ．サーモフィラスを用いた場合にも、Ｌ．デルブルッキーＬａｃ（＋）に比べてＬ．デルブルッキーＬａｃ（−）を用いた方が発酵時間は長かったが、Ｓ．サーモフィラスｐｒｔＳ（＋）を用いた場合には、このようなＬ．デルブルッキーＬａｃ（−）と組み合わせても、有意に発酵時間が短縮されることが確認された。
【００７４】
＜水溶性成分分析＞
上記の発酵時間測定において、各組み合わせの菌株を用いて得られた発酵乳中の水溶性成分を、ＣＥ−ＴＯＦＭＳ（キャピラリー電気泳動−飛行時間型質量分析計）で下記の方法に従って分析した（ヒューマン・メタボローム・テクノロジーズ株式会社）。
【００７５】
（前処理）
内部標準物質の濃度が１０μＭとなるように調製した９００μＬのメタノール溶液に、１００μＬの発酵乳を添加して撹拌した。これに、１，０００μＬのクロロホルム及び４００μＬの超純水を加えて撹拌し、遠心分離（２，３００×ｇ、４℃、５分間）を行った。遠心分離後、水層を限外ろ過チューブ（ウルトラフリーＭＣ  ＰＬＨＣＣ、ＨＭＴ、遠心式フィルターユニット５ｋＤａ）に４００μＬ移し取った。これを遠心（９，１００×ｇ、４℃、１２０分間）し、限外ろ過処理を行った。ろ液を乾固させ、再び５０μＬの超純水に溶解して測定に供した。
【００７６】
（測定）
カチオンモード、アニオンモードの測定を以下の表８に示す条件で行った。
【００７７】
【表８】
2020137517.tif 000009
【００７８】
（データ処理）
ＣＥ−ＴＯＦＭＳで検出されたピークは、自動積分ソフトウェアのＭａｓｔｅｒＨａｎｄｓ  ｖｅｒ．２．１７．１．１１（慶應義塾大学開発）を用いて、シグナル／ノイズ（Ｓ／Ｎ）比が３以上のピークを自動抽出し、質量電荷比（ｍ／ｚ）、ピーク面積値、泳動時間（Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ：ＭＴ）を得た。得られたピーク面積値は次式：
相対面積値＝（目的ピークの面積値）／（内部標準物質の面積値×試料量）
を用いて相対面積値に変換した。また、これらのデータには、Ｎａ＋やＫ＋等のアダクトイオン、及び、脱水、脱アンモニウム等のフラグメントイオンが含まれているので、これらの分子量関連イオンを削除した。ただし、物質特異的なアダクトやフラグメントも存在するため、すべてを精査することはできなかった。精査したピークについて、ｍ／ｚとＭＴの値を基に、各試料間のピークの照合・整列化を行った。
【００７９】
（候補代謝物質検索）
検出されたピークに対して、ｍ／ｚとＭＴの値を基に、ＨＭＴ代謝物質ライブラリ及びＫｎｏｗｎ−Ｕｎｋｎｏｗｎライブラリ（ヒューマン・メタボローム・テクノロジーズ株式会社）に登録された全物質との照合、検索を行った。検索のための許容誤差はＭＴで±０．５ｍｉｎ、ｍ／ｚでは±１０ｐｐｍとした（質量誤差（ｐｐｍ）＝（実測値−理論値）×１０６／実測値）。なお、候補が絞り込めず、複数のピークに同一の候補代謝物質が付与された場合は、枝番を付与して表記した。
【００８０】
（対象代謝化合物の定量）
対象代謝化合物について解析を行った。検量線は内部標準物質により補正したピーク面積を用い、各物質について、１００μＭの一点検量（内部標準物質：２００μＭ）として、濃度を算出した。
【００８１】
（結果）
（１）各Ｓ．サーモフィラスと、クラスターＩのサブクラスターＩ−Ｂに分類されるＬ．デルブルッキー（Ｌ．デルブルッキー（Ｉ−Ｂ））又はクラスターＩＶに分類されるＬ．デルブルッキー（Ｌ．デルブルッキー（ＩＶ））との表６に記載の各組み合わせで得られた発酵乳中の水溶性成分について、主成分分析（ＰＣＡ）を行った。各発酵乳における第１主成分得点（ＰＣ１）と第２主成分得点（ＰＣ２）との関係を示す図を図１１及び図１２に示し、第１主成分得点（ＰＣ１）と第３主成分得点（ＰＣ３）との関係を示す図を図１３に、第２主成分得点（ＰＣ２）と第３主成分得点（ＰＣ３）との関係を示す図を図１４に、それぞれ示す。図１１に示すように、Ｓ．サーモフィラスのｐｒｔＳ遺伝子保有の有無（ｐｒｔＳ（＋）／ｐｒｔＳ（−））で結果が２分され、発酵乳中の水溶性成分には、ｐｒｔＳ遺伝子保有の有無が大きく影響することが示唆された。また、図１２〜１４に示すように、Ｌ．デルブルッキーのクラスターによっても結果が分かれ、特にＳ．サーモフィラスｐｒｔＳ（＋）を用いた場合には、Ｌ．デルブルッキー（Ｉ−Ｂ）とＬ．デルブルッキー（ＩＶ）との間で結果が２分され、発酵乳中の水溶性成分にはさらに、Ｌ．デルブルッキーのクラスターが影響することが示唆された。
【００８２】
（２）各Ｓ．サーモフィラスと、クラスターＩのサブクラスターＩ−Ｂに分類されるＬ．デルブルッキーであるL.  delbrueckii  NITE  ABP-02874（受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８７４号（受領番号ＮＩＴＥ  ＡＢＰ−０２８７４号）で特定されるＬ．デルブルッキー）又はクラスターＩＶに分類されるＬ．デルブルッキーであるL.  delbrueckii  2038（明治ブルガリアヨーグルトＬＢ８１（株式会社明治製）より単離）との組み合わせ（Ｙ１６、Ｙ３６、Ｙ６Ｋ（−）、Ｙ６Ｋ（＋））で得られた発酵乳中の水溶性成分について、主成分分析（ＰＣＡ）を行った。各発酵乳における第１主成分得点（ＰＣ１）と第２主成分得点（ＰＣ２）との関係を示す図を図１５に示す。また、図１５に対応する各水溶性成分の散布図を図１６に示す。図１５〜１６に示すように、ＰＣ１軸正の方向にアミノ酸、糖代謝関連物質、乳酸が多いものが、ＰＣ２軸正の方向にオルニチン、ポリアミンが多いものが、それぞれプロットされた。
【００８３】
＜香気成分分析＞
上記の発酵時間測定において、各組み合わせの菌株を用いて得られた発酵乳中の香気成分を、動的ヘッドスペース・ＧＣ／ＭＳ（ガスクロマトグラフィー質量分析）法で下記の方法に従って分析した。
【００８４】
（分析方法）
２０ｍＬのバイアル瓶に、５ｇの発酵乳、５ｇの１ｍｏｌ／Ｌ−リン酸緩衝液（ｐＨ６．９８）、及び内部標準としてメチルイソブチルケトンを加えて密栓した。動的ヘッドスペース捕集装置（ゲステル社製）を用い、前記バイアル瓶を２５℃に保ちつつ、１０ｍＬの窒素ガスでヘッドスペースを置換し、窒素ガス中の香気成分を吸着剤（ＴＥＮＡＸ−ＴＡ）に捕集した。次いで、前記吸着剤を下記の表９に示す条件で加熱脱着してＧＣ／ＭＳに導入分析した。検出されたピークのマススペクトルをＮＩＳＴマススペクトルライブラリと照合し、検出化合物を定性した。さらに、各化合物に特有のイオンを用いてピークを積分し、検出量とした。また、必要に応じて、ピーク面積を内部標準のピーク面積で除した値を検出量とした。
【００８５】
【表９】
2020137517.tif 000010
【００８６】
（結果）
（１）各Ｓ．サーモフィラスと、Ｌ．デルブルッキー（Ｉ−Ｂ）又はＬ．デルブルッキー（ＩＶ）とを表６に記載の各組み合わせで用いて得られた発酵乳中の香気成分について、主成分分析（ＰＣＡ）を行った。各発酵乳における第１主成分得点（ＰＣ１）と第２主成分得点（ＰＣ２）との関係を示す図を図１７に示す。図１７に示すように、香気成分についても、Ｓ．サーモフィラスのｐｒｔＳ遺伝子保有の有無、及び、Ｌ．デルブルッキーのクラスターの違いで結果が分かれ、特にＬ．デルブルッキー（Ｉ−Ｂ）を用いた場合、発酵乳中の香気成分には、Ｓ．サーモフィラスｐｒｔＳ（＋）がさらに影響することが示唆された。
【００８７】
（２）各Ｓ．サーモフィラスと、クラスターＩのサブクラスターＩ−Ｂに分類されるＬ．デルブルッキーであるL.  delbrueckii  NITE  ABP-02874又はクラスターＩＶに分類されるＬ．デルブルッキーであるL.  delbrueckii  2038との組み合わせ（Ｙ１６、Ｙ３６、Ｙ６Ｋ（−）、Ｙ６Ｋ（＋））で得られた発酵乳中の香気成分について、主成分分析（ＰＣＡ）を行った。各発酵乳における第１主成分得点（ＰＣ１）と第２主成分得点（ＰＣ２）との関係を示す図を図１８に示す。また、図１８に対応する各香気成分の散布図を図１９に示す。図１８〜１９に示すように、ＰＣ１軸負−ＰＣ２軸負エリアには、アセトアルデヒドが多いものがプロットされ、ここにＳ．サーモフィラスｐｒｔＳ（−）とＬ．デルブルッキー（ＩＶ）（L.  delbrueckii  2038）との組み合わせ（Ｙ１６）を用いた発酵乳がプロットされた。他方、ＰＣ１軸正−ＰＣ２軸正のエリアには、アセトアルデヒドが少なく、ベンズアルデヒド（アーモンド様、杏仁様の香気）、メチルブタナール（焦げ臭の１つ、麦芽臭、ココア様の香気とも表される）、ＤＭＳ（海苔様の香気、牛のような香気とも表される）が多いものがプロットされ、ここに、Ｓ．サーモフィラスｐｒｔＳ（＋）とＬ．デルブルッキー（Ｉ−Ｂ）（L.  delbrueckii  NITE  ABP-02874）との組み合わせ（Ｙ６Ｋ（＋））を用いた発酵乳がプロットされた。
【００８８】
＜官能評価＞
上記の発酵時間測定において、表６に記載の各組み合わせの菌株を用いて得られた発酵乳の官能評価を、下記の方法に従って行った。
【００８９】
（評価方法）
発酵後の発酵乳を直ちに氷冷し、訓練されたパネル計６名で官能評価をおこなった。評価項目は、次の１１項目：酸味、甘味、苦味、旨味、えぐ味・雑味、ミルク感、ヨーグルト感、チーズ感（クリームチーズ様）、脂肪感（バター様など）、乳のコク・濃厚感（クリーム様など）、後味のすっきり感、とし、各々１〜７の７段階尺度法により評価した。６名分の評価結果を平均した値を官能評価値とした。
【００９０】
（結果）
（１）Ｓ．サーモフィラスｐｒｔＳ（−）と各Ｌ．デルブルッキーとの表６に記載の各組み合わせで得られた発酵乳の官能評価値について、主成分分析（ＰＣＡ）を行って得られた、各発酵乳における第１主成分得点（ＰＣ１）と第２主成分得点（ＰＣ２）との関係を示す図を図２０に示す。また、図２０に対応する官能評価項目の散布図を図２１に示す。さらに、Ｓ．サーモフィラスｐｒｔＳ（＋）と各Ｌ．デルブルッキーとの組み合わせで得られた発酵乳の官能評価値について、主成分分析（ＰＣＡ）を行って得られた、各発酵乳における第１主成分得点（ＰＣ１）と第２主成分得点（ＰＣ２）との関係を示す図を図２２に示し、図２２に対応する官能評価項目の散布図を図２３に示す。
【００９１】
図２０〜図２１に示すように、Ｓ．サーモフィラスｐｒｔＳ（−）にＬ．デルブルッキー（ＩＶ）を組み合わせて用いた発酵乳では、ヨーグルト感や酸味を感じる人が多かったのに対し、Ｓ．サーモフィラスｐｒｔＳ（−）にＬ．デルブルッキー（Ｉ−Ｂ）を組み合わせて用いた発酵乳では、旨味やエグ味を感じたという結果になった。他方、図２２〜図２３に示すように、Ｓ．サーモフィラスｐｒｔＳ（＋）にＬ．デルブルッキー（ＩＶ）を組み合わせて用いた発酵乳では、酸味やエグ味を感じた人が多かったのに対し、Ｓ．サーモフィラスｐｒｔＳ（＋）にクラスターＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、及びＶに分類されるＬ．デルブルッキー（特にＬ．デルブルッキー（Ｉ−Ｂ））を組み合わせて用いた発酵乳では、多くは乳のコク・濃厚感やミルク感のある全体のバランスがとれたマイルドな風味と評価された。図２０〜図２３に示すように、Ｌ．デルブルッキーのクラスターによって結果が分かれ、特に、Ｓ．サーモフィラスｐｒｔＳ（＋）を用いた場合には、クラスターＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、及びＶに分類されるＬ．デルブルッキーとクラスターＩＶに分類されるＬ．デルブルッキー（ＩＶ）との間で大きく２分され、Ｓ．サーモフィラスｐｒｔＳ（＋）とクラスターＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、及びＶに分類されるＬ．デルブルッキー（より好ましくはＬ．デルブルッキー（Ｉ−Ｂ））とを組み合わせることで特にマイルドな風味の発酵乳が得られることが確認された。
【００９２】
（２）各Ｓ．サーモフィラスと、クラスターＩのサブクラスターＩ−Ｂに分類されるＬ．デルブルッキーであるL.  delbrueckii  NITE  ABP-02874又はクラスターＩＶに分類されるＬ．デルブルッキーであるL.  delbrueckii  2038との組み合わせ（Ｙ１６、Ｙ３６、Ｙ６Ｋ（−）、Ｙ６Ｋ（＋））で得られた発酵乳の官能評価値について、主成分分析（ＰＣＡ）を行って得られた、各発酵乳における第１主成分得点（ＰＣ１）と第２主成分得点（ＰＣ２）との関係を示す図を図２４に示す。また、図２４に対応する各官能評価項目の散布図を図２５に示す。
【００９３】
図２４〜図２５に示すように、Ｓ．サーモフィラスｐｒｔＳ（−）にＬ．デルブルッキー（ＩＶ）（L.  delbrueckii  2038）を組み合わせて用いた発酵乳（Ｙ１６）では酸味が強く、また、Ｌ．デルブルッキー（Ｉ−Ｂ）（L.  delbrueckii  NITE  ABP-02874）を組み合わせて用いた発酵乳（Ｙ６Ｋ（−））では旨味や甘味が弱く、発酵前の牛乳の風味と大差がなく発酵乳としての風味に乏しい傾向にあった。他方、Ｓ．サーモフィラスｐｒｔＳ（＋）にＬ．デルブルッキー（ＩＶ）（L.  delbrueckii  2038）を組み合わせて用いた発酵乳（Ｙ３６）では、えぐ味・雑味、旨味が強い傾向にあった。これらに対して、Ｓ．サーモフィラスｐｒｔＳ（＋）にＬ．デルブルッキー（Ｉ−Ｂ）（L.  delbrueckii  NITE  ABP-02874）を組み合わせて用いた発酵乳（Ｙ６Ｋ（＋））では、甘味、ヨーグルト感が強い傾向にあり、全体のバランスがとれたマイルドな風味と評価され、また、他の菌株の組み合わせによる発酵乳とは風味が明確に差別化された発酵乳であることが確認された。
【００９４】
＜乳酸量測定＞
上記の発酵時間測定において、表６に記載の各組み合わせの菌株を用いて得られた発酵乳中のＤ−乳酸量及びＬ−乳酸量を、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）で下記の方法に従って測定した。
【００９５】
（測定方法）
発酵乳を超純水で２倍希釈し、カレッツ試薬を用いて除タンパクした。除タンパク後の上清をフィルターバイアル（ＰＶＤＦ、０．２μｍ、１０３０−１９０２２、ＴＨＯＭＳＯＮ社製）にてろ過し、次の条件：
ガードカラム：ＳＵＭＩＣＨＩＲＡＬ  ＯＡ−５０００  ５μｍ  ４ｍｍ  ｉ．ｄ．×１０ｍｍ（株式会社住化分析センター製）
カラム：ＳＵＭＩＣＨＩＲＡＬ  ＯＡ−５０００  ４．６ｍｍ  ｉ．ｄ．×１５０ｍｍ（株式会社住化分析センター製）
オーブン温度：４０℃
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
検出器：ＳＰＤ−Ｍ２０Ａ（株式会社島津製作所製）
注入量：１０μｌ
移動相：２ｍＭ  ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ＋５％  イソプロパノール
で各発酵乳中のＤ−乳酸量及びＬ−乳酸量（ｍＭ）を測定した。
【００９６】
（結果）
（１）各発酵乳中のＤ−乳酸量及びＬ−乳酸量（ｍＭ）と上記の官能評価における酸味のスコア（酸味スコア、大きいほど酸味が強い）との関係をそれぞれ図２６及び図２７に示す。また、発酵乳中の全乳酸量に対するＤ−乳酸の割合（｛Ｄ−乳酸量／（Ｄ−乳酸量＋Ｌ−乳酸量）｝×１００（％））を算出した。得られたＤ−乳酸の割合と前記酸味スコアとの関係を図２８に示す。図２６〜２８に示すように、酸味スコアとＤ−乳酸量とが正の相関を示し、酸味スコアとＬ−乳酸量とは負の相関を示した。また、Ｄ−乳酸の割合が多いほど、酸味スコアが高いことが示された。このことから、Ｄ−乳酸の割合が少ないほど、酸味が軽減した、すなわちマイルドな風味の発酵乳となることが確認された。
【００９７】
（２）図２９には、各Ｓ．サーモフィラス別に、発酵乳中のＤ−乳酸の割合を比較したグラフを示す。すなわち、Ｓ．サーモフィラスｐｒｔＳ（−）とＬ．デルブルッキーとを用いたとき（ｐｒｔＳ（−）：Ｙ１〜Ｙ２０、Ｙ６Ｋ（−）、ｎ＝２１）、Ｓ．サーモフィラスｐｒｔＳ（＋）とＬ．デルブルッキーとを用いたとき（ｐｒｔＳ（＋）：Ｙ２１〜Ｙ４０、Ｙ６Ｋ（＋）、ｎ＝２１）、の発酵乳中のＤ−乳酸の割合（全）（平均値、％）をそれぞれ示す。
【００９８】
また、図３０には、各Ｓ．サーモフィラスとクラスターＩＶ以外に分類されるＬ．デルブルッキー（Ｌ．デルブルッキー（ＩＶ以外））との組み合わせで得られた発酵乳中のＤ−乳酸の割合を比較したグラフを示す。すなわち、Ｓ．サーモフィラスｐｒｔＳ（−）とＬ．デルブルッキー（ＩＶ以外）とを用いたとき（ｐｒｔＳ（−）：Ｙ１〜Ｙ１５、Ｙ１９〜Ｙ４０、Ｙ６Ｋ（−）、ｎ＝１８）、Ｓ．サーモフィラスｐｒｔＳ（＋）とＬ．デルブルッキー（ＩＶ以外）とを用いたとき（ｐｒｔＳ（＋）：Ｙ２１〜Ｙ３５、Ｙ３９〜Ｙ４０、Ｙ６Ｋ（＋）、ｎ＝１８）、の発酵乳中のＤ−乳酸の割合（ＩＶ以外）（平均値、％）をそれぞれ示す。
【００９９】
図２９に示すように、クラスターＩ〜Ｖに分類されるＬ．デルブルッキーを対象にＳ．サーモフィラス別に発酵乳中のＤ−乳酸の割合を比較したところ、有意差が認められなかった。これに対して、図３０に示すように、Ｌ．デルブルッキー（ＩＶ以外）、すなわち、クラスターＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、及びＶに分類されるＬ．デルブルッキーについては、Ｓ．サーモフィラスｐｒｔＳ（＋）を組み合わせて用いた発酵乳におけるＤ−乳酸の割合が、Ｓ．サーモフィラスｐｒｔＳ（−）を組み合わせて用いた発酵乳に比べて有意に少なくなり（ｔ検定によるＰ値が０．０５未満）、Ｓ．サーモフィラスｐｒｔＳ（＋）と組み合わせることで、酸味が軽減した、すなわちマイルドな風味の発酵乳となることが確認された。
【０１００】
＜Ｓ．サーモフィラスの検討＞
上記のS.  thermophilus  NITE  ABP-02875以外のＳ．サーモフィラスの菌株を用いた場合の効果を検討した。検討には、上記方法でｐｒｔＳ遺伝子保有の有無を確認した、ｐｒｔＳ遺伝子を保有しないＳ．サーモフィラスの菌株（Ｓ．サーモフィラスｐｒｔＳ（−）：ＭＥＰ１９００４１５、ＭＥＰ１９００４１６、ＭＥＰ１９００４１７、ＭＥＰ１９００４１８）、及び、ｐｒｔＳ遺伝子を保有するＳ．サーモフィラスの菌株（Ｓ．サーモフィラスｐｒｔＳ（＋）：ＭＥＰ１９００４１９、ＭＥＰ１９００４２０、ＭＥＰ１９００４２１、ＭＥＰ１９００４２２）を用いた。これらの「ＭＥＰ」で始まる番号を付した菌株は、いずれも株式会社明治内の明治イノベーションセンター（〒１９２−０９１９  日本国東京都八王子市七国１−２９−１）により保管されている。
【０１０１】
（１）上記の各Ｓ．サーモフィラスｐｒｔＳ（−）とL.  delbrueckii  NITE  ABP-02874とをそれぞれ組み合わせて用い、発酵にかかる時間を測定した。すなわち、各菌株を、脱脂粉乳１０％（ｗｔ／ｗｔ）、酵母エキス０．１％（ｗｔ／ｗｔ）で調製した１０％脱脂粉乳培地（１２１℃、７分滅菌）で、３７℃において１６時間、２回賦活培養した。これら菌株を各組み合わせで、１０％脱脂粉乳培地（９５℃、達温殺菌）に合計１％（Ｌ．デルブルッキー：Ｓ．サーモフィラス＝約１：１（菌数））となるように添加し、４３℃において２４時間発酵させ（好気、静置培養）、各発酵乳を得た。それぞれ菌株を添加してからｐＨが４．５となるまでの時間を測定し、発酵にかかる発酵時間とした。また、上記の各Ｓ．サーモフィラスｐｒｔＳ（＋）とL.  delbrueckii  NITE  ABP-02874とをそれぞれ組み合わせて用い、上記と同様にして、発酵にかかる時間を測定した。図３１に、Ｓ．サーモフィラスｐｒｔＳ（−）を用いたとき（ｐｒｔＳ（−）、ｎ＝４）、及びＳ．サーモフィラスｐｒｔＳ（＋）を用いたとき（ｐｒｔＳ（＋）、ｎ＝４）の発酵時間（平均値、分）をそれぞれ示す。マンホイットニーのＵ検定の結果、ｐｒｔＳ（＋）の結果は、ｐｒｔＳ（−）の結果に対して、Ｐ値が０．０５未満であった。図３１に示すように、S.  thermophilus  NITE  ABP-02875以外のＳ．サーモフィラスｐｒｔＳ（＋）を用いた場合にも、S.  thermophilus  NITE  ABP-02875を用いた場合と同様に、Ｓ．サーモフィラスｐｒｔＳ（−）を用いた場合に比べて、発酵時間が有意に短縮されることが確認された。
【０１０２】
（２）上記（１）の各Ｓ．サーモフィラスｐｒｔＳ（−）とL.  delbrueckii  NITE  ABP-02874とをそれぞれ組み合わせて用いて得られた発酵乳中のＤ−乳酸の割合を、上記の乳酸量測定と同様にして測定し、算出した。また、上記（１）の各Ｓ．サーモフィラスｐｒｔＳ（＋）とL.  delbrueckii  NITE  ABP-02874とをそれぞれ組み合わせて用いて得られた発酵乳中のＤ−乳酸の割合を、上記の乳酸量測定と同様にして測定し、算出した。図３２に、Ｓ．サーモフィラスｐｒｔＳ（−）を用いたとき（ｐｒｔＳ（−）、ｎ＝４）、及びＳ．サーモフィラスｐｒｔＳ（＋）を用いたとき（ｐｒｔＳ（＋）、ｎ＝４）のＤ−乳酸の割合（平均値、％）をそれぞれ示す。ｔ検定の結果、ｐｒｔＳ（＋）の結果は、ｐｒｔＳ（−）の結果に対して、Ｐ値が０．０５未満であった。図３２に示すように、S.  thermophilus  NITE  ABP-02875以外のＳ．サーモフィラスｐｒｔＳ（＋）を用いて得られた発酵乳においても、S.  thermophilus  NITE  ABP-02875を用いた場合と同様に、Ｓ．サーモフィラスｐｒｔＳ（−）を用いて得られた発酵乳に比べて、Ｄ−乳酸の割合が有意に少なくなり、酸味が軽減した、マイルドな風味の発酵乳となることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【０１０３】
以上説明したように、本発明によれば、ラクトバチルス属菌とストレプトコッカス・サーモフィラスとを用いる発酵乳の製造方法において、乳糖資化性のないラクトバチルス・デルブルッキーを用いても発酵乳を製造することが可能であり、かつ、酸味、旨味、発酵香気、及び濃厚感の全てにおいてバランスのとれた穏やか（マイルド）な風味を有する発酵乳を得ることができる発酵乳の製造方法、それに用いることができる乳酸菌及び乳酸菌組成物、並びに、それらによって得られる発酵乳を提供することが可能となる。
【受託番号】
【０１０４】
１．
（１）識別の表示：Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ  ＯＬＬ２０４９８９
（２）受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８７４
（３）原寄託日：２０１９年２月５日
（４）寄託機関：独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター
２．
（１）識別の表示：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＯＬＳ４４９６
（２）受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８７５
（３）原寄託日：２０１９年２月５日
（４）寄託機関：独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター
【配列表フリーテキスト】
【０１０５】
配列番号：２６
＜２２３＞  ｐｒｔＳ遺伝子フォワードプライマー
配列番号：２７
＜２２３＞  ｐｒｔＳ遺伝子リバースプライマー
配列番号：２８
＜２２３＞  ｆｕｓＡ遺伝子フォワードプライマー
配列番号：２９
＜２２３＞  ｆｕｓＡ遺伝子リバースプライマー
配列番号：３０
＜２２３＞  ｇｙｒＢ遺伝子フォワードプライマー
配列番号：３１
＜２２３＞  ｇｙｒＢ遺伝子リバースプライマー
配列番号：３２
＜２２３＞  ｈｓｐ６０遺伝子フォワードプライマー
配列番号：３３
＜２２３＞  ｈｓｐ６０遺伝子リバースプライマー
配列番号：３４
＜２２３＞  ｉｌｅＳ遺伝子フォワードプライマー
配列番号：３５
＜２２３＞  ｉｌｅＳ遺伝子リバースプライマー
配列番号：３６
＜２２３＞  ｐｙｒＧ遺伝子フォワードプライマー
配列番号：３７
＜２２３＞  ｐｙｒＧ遺伝子リバースプライマー
配列番号：３８
＜２２３＞  ｒｅｃＡ遺伝子フォワードプライマー
配列番号：３９
＜２２３＞  ｒｅｃＡ遺伝子リバースプライマー
配列番号：４０
＜２２３＞  ｒｅｃＧ遺伝子フォワードプライマー
配列番号：４１
＜２２３＞  ｒｅｃＧ遺伝子リバースプライマー
【図１】
2020137517.tif 000011
【図２Ａ】
2020137517.tif 000012
【図２Ｂ】
2020137517.tif 000013
【図２Ｃ】
2020137517.tif 000014
【図３Ａ】
2020137517.tif 000015
【図３Ｂ】
2020137517.tif 000016
【図３Ｃ】
2020137517.tif 000017
【図３Ｄ】
2020137517.tif 000018
【図４Ａ】
2020137517.tif 000019
【図４Ｂ】
2020137517.tif 000020
【図４Ｃ】
2020137517.tif 000021
【図４Ｄ】
2020137517.tif 000022
【図４Ｅ】
2020137517.tif 000023
【図４Ｆ】
2020137517.tif 000024
【図５Ａ】
2020137517.tif 000025
【図５Ｂ】
2020137517.tif 000026
【図５Ｃ】
2020137517.tif 000027
【図５Ｄ】
2020137517.tif 000028
【図５Ｅ】
2020137517.tif 000029
【図６Ａ】
2020137517.tif 000030
【図６Ｂ】
2020137517.tif 000031
【図６Ｃ】
2020137517.tif 000032
【図６Ｄ】
2020137517.tif 000033
【図７Ａ】
2020137517.tif 000034
【図７Ｂ】
2020137517.tif 000035
【図７Ｃ】
2020137517.tif 000036
【図７Ｄ】
2020137517.tif 000037
【図７Ｅ】
2020137517.tif 000038
【図８Ａ】
2020137517.tif 000039
【図８Ｂ】
2020137517.tif 000040
【図８Ｃ】
2020137517.tif 000041
【図８Ｄ】
2020137517.tif 000042
【図８Ｅ】
2020137517.tif 000043
【図９】
2020137517.tif 000044
【図１０】
2020137517.tif 000045
【図１１】
2020137517.tif 000046
【図１２】
2020137517.tif 000047
【図１３】
2020137517.tif 000048
【図１４】
2020137517.tif 000049
【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【配列表】
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