(57)【要約】      （修正有）【課題】ソリッドステートナノポアを用いて分子濃度を決定するための方法を提供する。【解決手段】電流信号を測定することと、第一および第二の電気シグネチャを特定するために、信号を用いることを含む。第一の集合は、未知の濃度を有する標的の第一の率を決定するために用いられ、第二の集合は、既知の濃度を有する対照の第二の率を決定するために用いられる。第一および第二の率は、各々、ソリッドステートナノポアの物理特性および動作条件を表すポア特性ファクタの関数である。第一の率は、さらに、標的の物理特性を表す第一の特性ファクタと、未知の濃度との関数である。第二の率は、さらに、対照の物理特性を表す第二の特性ファクタと既知の濃度との関数である。第二の率に対する第一の率の割合は、未知の濃度を決定するために用いられる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ソリッドステートナノポアを有する単一分子センサを用いて標的分析物の第一の濃度を決定するための検知方法であって、
所定の期間にわたって前記ソリッドステートナノポアの電流信号を測定することと、区別可能な電気シグネチャの第一および第二の集合を特定するために、前記測定された電流信号を用いることと、
前記区別可能な電気シグネチャの第一の集合を用いて、前記標的分析物の第一の捕獲率を決定することであって、前記第一の捕獲率は、前記第一の濃度と、前記標的分析物の一つ以上の物理特性を例示する第一の分析物特性ファクタとの関数である、ことと、
前記区別可能な電気シグネチャの第二の集合を用いて、第二の濃度を有する対照分析物の第二の捕獲率を決定することであって、前記第二の濃度は既知であり、前記第二の捕獲率は、前記第二の濃度と、前記対象分析物の一つ以上の物理特性を例示する第二の分析物特性ファクタとの関数である、ことと、
前記第二の捕獲率に対する前記第一の捕獲率の第一の割合と、前記第一の分析物特性ファクタに対する前記第二の分析物特性ファクタの第二の割合とを作成することと、前記第一の濃度を決定するために前記第一および第二の割合を用いることであって、前記第一の濃度は、前記第一および第二の割合によって前記第二の濃度を乗算することによって決定される、ことと、
を含む、
検知方法。
【請求項２】
前記方法は、前記第一の分析物および第二の分析物特性ファクタおよび前記第二の濃度を受信することをさらに含む、請求項１に記載の検知方法。
【請求項３】
前記第一および第二の分析物特性ファクタは等価であり、前記第二の割合は１に等しい、請求項１に記載の検知方法。
【請求項４】
前記第一の分析物特性ファクタによって例示される前記標的分析物の前記一つ以上の物理特性は、前記標的分析物のサイズ、拡散係数、電気泳動移動度および実効電荷を明示し、
前記第二の分析物特性ファクタによって例示される前記対照分析物の前記一つ以上の物理特性は、前記対照分析物のサイズ、拡散係数、電気泳動移動度、実効電荷のうちの一つ以上を明示する、請求項１に記載の検知方法。
【請求項５】
前記第一および第二の捕獲率は、コンダクタンス阻害、通過時間、電荷不足、個別のサブレベル数、事象の形状、事象周波数スペクトル、およびその組み合わせから成る群から選択された方法を用いて測定される、請求項１に記載の検知方法。
【請求項６】
前記標的分析物および前記対照分析物のうちの少なくとも一つは、結合されたプロキシラベルを含む、請求項１に記載の検知方法。
【請求項７】
前記プロキシラベルは、検出前に前記標的分析物および前記対照分析物のうちの前記少なくとも一つから分離される、請求項６に記載の検知方法。
【請求項８】
第一の分析物および第二の分析物を同時に転座させるソリッドステートナノポアを用いて未知の濃度を測定するための正確な検知方法であって、前記第一の分析物は未知の濃度を有し、前記第二の分析物は既知の濃度を有し、前記検知方法は、
所定の期間にわたって前記ソリッドステートナノポアから電流信号を受信することと、第一および第二の捕獲率を決定するために前記電流信号を用いることと、
前記第一および第二の捕獲率は、各々、前記ソリッドステートナノポアの一つ以上の物理特性を表すポア特性ファクタの関数であり、
前記第一の捕獲率は、さらに、前記第一の分析物の一つ以上の物理特性を表す第一の分析物特性ファクタと、前記未知の濃度との関数であり、前記第二の捕獲率は、さらに、前記第二の分析物の一つ以上の物理特性を表す第二の分析物特性ファクタと、前記既知の濃度との関数であり、
割合が、前記濃度決定における前記ソリッドステートナノポアの前記物理特性の任意の影響を相殺するように、前記第二の捕獲率に対する前記第一の捕獲率の割合を作成することと、前記割合を用いて、前記未知の濃度を決定することと、
を含む正確な検知方法。
【請求項９】
前記方法は、前記第一の分析物および前記第二の分析物特性ファクタおよび前記第二の濃度を受信することをさらに含む、請求項８に記載の正確な検知方法。
【請求項１０】
前記第一の分析物および第二の分析物特性ファクタは等価であり、前記第二の分析物特性ファクタに対する前記第一の分析物特性ファクタの割合は１である、請求項８に記載の正確な検知方法。
【請求項１１】
前記第一の分析物特性ファクタによって表される前記第一の分析物の前記一つ以上の物理特性は、前記第一の分析物のサイズ、拡散係数、電気泳動移動度、実効電荷のうちの一つ以上を明示し、
前記第二の分析物特性ファクタによって表される前記第二の分析物の前記一つ以上の物理特性は、前記第二の分析物のサイズ、拡散係数、電気泳動移動度、実効電荷のうちの一つ以上を明示する、請求項８に記載の正確な検知方法。
【請求項１２】
前記ポア特性ファクタによって表される前記ソリッドステートナノポアの前記一つ以上の物理特性は、前記ソリッドステートナノポアのサイズ、形状、表面電荷密度、表面粗さのうちの一つ以上を明示する、請求項８に記載の正確な検知方法。
【請求項１３】
前記第一および第二の捕獲率は、さらに、各々、前記ソリッドステートナノポアの一つ以上の動作条件を表す動作ファクタの関数である、請求項８に記載の正確な検知方法。
【請求項１４】
前記第二の捕獲率に対する前記第一の捕獲率の前記割合は、前記濃度決定に対する前記ソリッドステートナノポアの前記動作条件の任意の影響を相殺する、請求項１３に記載の正確な検知方法。
【請求項１５】
前記第一および第二の捕獲率は、コンダクタンス阻害、通過時間、電荷不足、個別のサブレベル数、事象の形状、事象周波数スペクトル、およびその組み合わせから成る群から選択された方法を用いて測定される、請求項８に記載の正確な検知方法。
【請求項１６】
前記第一の分析物および前記第二の分析物のうちの少なくとも一つは結合されたプロキシラベルを含む、請求項８に記載の正確な検知方法。
【請求項１７】
前記プロキシラベルは、検出前に、前記標的分析物および前記対照分析物のうちの前記少なくとも一つから分離される、請求項１６に記載の正確な検知方法。
【請求項１８】
第一の分析物および第二の分析物を同時に転座させるソリッドステートナノポアを用いて未知の濃度を測定するための正確な検知方法であって、前記第一の分析物は未知の濃度を有し、前記第二の分析物は既知の濃度を有し、
所定の期間にわたって前記ソリッドステートナノポアから電流信号を受信することと、第一および第二の個体群カウントを決定するために前記電流信号を用いることであって、前記第一の個体群カウントは、前記第一の分析物の単一分子カウントの関数であり、前記第二の個体群カウントは、前記第二の分析物の単一分子カウントの関数である、ことと、
前記第二の個体群カウントに対する前記第一の個体群カウントの割合を作成することと、前記割合を用いて前記未知の濃度を決定することであって、前記第一の濃度は、前記個体群カウントの割合によって前記第二の濃度を乗算することによって決定される、ことと、
を含む、正確な検知方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、ソリッドステートナノポアおよび捕獲率測定のリアルタイム校正を用いる、ソリッドステートナノポアによる分子濃度の正確な決定に関し、これは、内部キャリブレータの使用と、単一分子の制御されたカウンティングとを含む。
【背景技術】
【０００２】
ナノポアは、臨床関連の標的分析物の濃度を測定するために、単一分子センサとして用いられるもので、臨床関連の標的分析物は、ある範囲の生物学的分子を含み、ここで、少量のバイオマーカは、多くの疾病の兆候の前触れを示し、より迅速で低コストの治療を可能とすることができる。例えば、単一分子ナノポアセンサは、高感度かつ、診療現場でのフォーマットで臨床関連のバイオマーカ濃度のリアルタイムでの定量を可能とすることができる。しかしながら、現在のナノポアベースの方法は、制御できない変動源に起因する捕獲プロセスにおける固有の変動性が生じやすく、時間の経過による単一ナノポア分子内の変動や、名目上同一サイズを有する異なるナノポア間の変動を含む。したがって、定量ツールとして、単一分子ナノポアセンサの正確性および精度を改善する方法を開発することが望まれている。
【０００３】
さらに、ＤＮＡは、このようなソリッドステートナノポアが最適に機能する条件に適合されているために、ほとんどのナノポア研究は、第一の標的分子としてＤＮＡに焦点を当てている。しかしながら、多くの臨床関連の標的はたんぱく質である。このような例においては、ソリッドステートナノポアに対する動作条件は、注意深く調整されなければならない。なぜなら、例えば、たんぱく質は、高いナノポア信号用に必要とされる高モル濃度の塩濃度とはしばしば両立しないからである。さらに、たんぱく質は、その二次および三次構造だけでなく、低く不均一な電荷分布のために、複雑な輸送特性を有する。たんぱく質がナノポアで直接検出されることができる例においては、転座事象は、従来の電流増幅器に対して利用可能な限定された時間解像度ではしばしば速度が大きすぎる。
【０００４】
対照的に、ＤＮＡは、より高いモル濃度の塩に耐えることが可能であり、その高く均一な電荷分布は、より単純な輸送特性を可能とする。このように、たんぱく質、ならびに小分子およびウイルスを含む他のバイオマーカの検出に関する幾つかの最近の研究は、標的分析物用の代用ラベルまたはキャリアとして線形またはわずかに改変された線形ＤＮＡを用いてきた。ＤＮＡ代用ラベルを使用することは、多重化検出を許容しつつも、真の標的分析物の濃度を表すより頑強なナノポア信号をもたらす。このように、ＤＮＡの濃度を測定するための改良された方法は、特定のＤＮＡシーケンス、ｍｉＲＮＡ、たんぱく質および小分子を含む広範囲の臨床関連のバイオマーカに対して、正確かつ精密な濃度の測定を改良する。
【０００５】
本章は、必ずしも従来技術ではない本開示に関連する背景情報を提供する。
【発明の概要】
【０００６】
本章は、本開示の一般的な要約を提供し、その完全な範囲またはその特徴の全ての総合的な開示ではない。
【０００７】
様々な態様において、本開示は、ソリッドステートナノポアを有する単一分子センサを用いて、標的分析物の第一の濃度を決定するための検知方法を提供する。検知方法は、所定の期間にわたってソリッドステートナノポアの電流信号を測定することと、区別可能な電気的シグネチャの第一および第二の集合を特定するために、測定された電流信号を用いることとを含む。区別可能な電気的シグネチャの第一の集合は、標的分析物の第一の捕獲率を決定するために用いられ得る。第一の捕獲率は、第一の濃度と、標的分析物の一つ以上の物理的特性を例示する第一の分析物特性ファクタとの関数であり得る。区別可能な電気的シグネチャの第二の集合は、第二の濃度を有する対照分析物の第二の捕獲率を決定するために用いられ得る。第二の濃度は、既知であり得、第二の捕獲率は、第二の濃度と、対照分析物の一つ以上の物理的特性を例示する第二の分析物特性ファクタとの関数であり得る。方法は、第二の捕獲率に対する第一の捕獲率の第一の割合と、第一の分析物特性ファクタに対する第二の分析物特性ファクタの第二の割合とを生成することと、第一の濃度を決定するために第一および第二の割合を用いることと、をさらに含み得る。第一の濃度は、第一および第二の割合によって第二の濃度を乗算することによって決定され得る。
【０００８】
一態様においては、方法は、第一および第二の分析物特性ファクタと、第二の濃度とを受信することをさらに含み得る。
【０００９】
一態様においては、第一および第二の分析物特性ファクタは等価であり得、第二の割合は、１に等しいことがあり得る。
【００１０】
一態様においては、第一の分析物特性ファクタによって例示された標的分析物の一つ以上の物理的特性は、標的分析物のサイズ、拡散係数、電気泳動移動度および実効電荷のうちの一つ以上を明示し得、第二の分析物特性ファクタによって例示された対照分析物の一つ以上の物理的特性は、対照分析物のサイズ、拡散係数、電気泳動移動度および実効電荷のうちの一つ以上を明示し得る。
【００１１】
一態様においては、第一および第二の捕獲率は、コンダクタンス阻害、通過時間、電荷不足、個別のサブレベルの数、事象の形状、事象周波数スペクトル、およびその組み合わせから成る群から選択された方法を用いて測定され得る。
【００１２】
一態様においては、標的分析物および対照分析物のうちの少なくとも一つは、結合されたプロキシラベルを含み得る。
【００１３】
一態様においては、プロキシラベルは、検出前に標的分析物および対照分析物のうちの少なくとも一つから分離される。
【００１４】
様々な他の態様においては、本開示は、第一の分析物および第二の分析物を同時に転座させるソリッドステートナノポアを用いて、未知の濃度を測定するための正確な検知方法を提供する。第一の分析物は、未知の濃度を有し、第二の分析物は、既知の濃度を有する。検知方法は、所定の期間にわたってソリッドステートナノポアから電流信号を受信することと、第一および第二の捕獲率を決定するために電流信号を用いることとを含み得る。第一および第二の捕獲率は、各々、ソリッドステートナノポアの一つ以上の物理的特性を表すポア特性ファクタの関数であり得る。第一の捕獲率は、さらに、第一の分析物の物理的特性および未知の濃度のうちの一つ以上を表す、第一の分析物特性ファクタの関数であり得る。第二の捕獲率は、さらに、第二の分析物の物理的特性および既知の濃度のうちの一つ以上を表す第二の分析物特性ファクタの関数であり得る。方法は、第二の捕獲率に対する第一の捕獲率の割合を生成することと、その割合は、濃度決定に対するソリッドステートナノポアの物理的特性のあらゆる影響を相殺するように、その割合を用いて未知の濃度を決定することとをさらに含み得る。
【００１５】
一態様においては、方法は、第一および第二の分析物特性ファクタと、第二の濃度とを受信することをさらに含み得る。
【００１６】
一態様においては、第一および第二の分析物特性ファクタは、等価であり得、第二の分析物特性ファクタに対する第一の分析物特性ファクタの割合は１であり得る。
【００１７】
一態様においては、第一の分析物特性ファクタによって表される第一の分析物の一つ以上の物理的特性は、第一の分析物のサイズ、拡散係数、電気泳動移動度、実効電荷のうちの一つ以上を明示し得、第二の分析物特性ファクタによって表される第二の分析物の一つ以上の物理的特性は、第二の分析物のサイズ、拡散係数、電気泳動移動度、実効電荷のうちの一つ以上を明示し得る。
【００１８】
一態様においては、ポア特性ファクタによって表されるソリッドステートナノポアの一つ以上の物理的特性は、ソリッドステートナノポアのサイズ、形状、表面電荷密度、および表面粗さのうちの一つ以上を明示し得る。  
【００１９】
一態様においては、第一および第二の捕獲率は、各々、さらに、ソリッドステートナノポアの一つ以上の動作条件を表す動作ファクタの関数であり得る。
【００２０】
一態様においては、第二の捕獲率に対する第一の捕獲率の割合は、濃度決定に対するソリッドステートナノポアの動作条件のあらゆる影響を相殺し得る。
【００２１】
一態様においては、第一および第二の捕獲率は、コンダクタンス阻害、通過時間、電荷不足、個別のサブレベル数、事象の形状、事象周波数スペクトルおよびその組み合わせから成る群から選択される方法を用いて測定され得る。
【００２２】
一態様においては、第一の分析物および第二の分析物のうちの少なくとも一つは、結合されたプロキシラベルを含む。
【００２３】
一態様においては、プロキシラベルは、検出前に、標的分析物および対照分析物のうちの少なくとも一つから分離される。
【００２４】
様々な他の態様においては、本開示は、第一の分析物および第二の分析物を同時に転座させるソリッドステートナノポアを用いて、未知の濃度を測定するための正確な検知方法を提供する。第一の分析物は未知の濃度を有し、第二の分析物は既知の濃度を有する。方法は、所定の期間にわたってソリッドステートナノポアから電流信号を受信することと、第一および第二の個体群カウントを決定するために、電流信号を用いることとを含む。第一の個体群カウントは、第一の分析物の単一分子カウントの関数であり、第二の個体群カウントは、第二の分析物の単一分子カウントの関数である。方法は、第二の個体群カウントに対する第一の個体群カウントの割合を生成することと、その割合を用いて未知の濃度を決定することとをさらに含む。第一の濃度は、個体群カウント割合に第二の濃度を乗算することによって決定され得る。
【００２５】
適応性のさらなる領域は、本明細書に提供される記述から明らかになるであろう。発明の概要における記述および具体例は、例示の目的だけを意図され、本開示の範囲を限定することを意図するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
本明細書に記述される図面は、選択された実施形態を例示する目的のためだけのものであって、全ての可能な実装ではなく、本開示の範囲を限定することを意図するものではない。
【図１】従来のナノポアベースの電気泳動捕獲システムにおける電界の概略図である。
【図２Ａ】異なる直径を有する二つのナノポアに対する時間の関数としての転座数を図示する。
【図２Ｂ】ＤＮＡ長の関数として濃度正規化捕獲率を図示し、ナノポアセンサは、３００ｍＶの印加電圧と、７ｎｍの最初のポア直径を有し、ｐＨが８を有する１．８ＭＬｉＣｌ溶液内に浸される。
【図２Ｃ】変動するポア直径を有する、異なるナノポアシステム内の電圧の関数として、異なる長さを有する二つのｄｓＤＮＡサンプルの相対的捕獲率を図示する。
【図３Ａ】ナノポアセンサの電流信号から一つ以上の分析物の捕獲率を抽出するための例示的方法を図示する。
【図３Ｂ】ナノポアセンサの電流信号から一つ以上の分析物の捕獲率を抽出するための例示的方法を図示する。
【図３Ｃ】ナノポアセンサの電流信号から一つ以上の分析物の捕獲率を抽出するための例示的方法を図示する。
【図４Ａ】１０ｋｂｐの長さを有するｄｓＤＮＡを捕獲し、転座させるナノポアセンサに対して、時間の関数としてオープンポア電流ベースラインを図示し、センサは、３００ｍＶの印加電圧と、９ｎｍの最初のポア直径とを有し、ｐＨが８の１．８ＭＬｉＣｌ溶液内に浸される。
【図４Ｂ】図４Ａの同一システムに対する時間の関数として、単一分子カウントを図示する。
【図５】１．５ｋｂｐの長さを有するｄｓＤＮＡを転座させるナノポアセンサに対して、時間の関数として、単一分子カウントおよびオープンポア電流を図示し、センサは、２００ｍＶの印加電圧と、１１ｎｍの最初のポア直径とを有し、ｐＨが８の３．６ＭＬｉＣｌ溶液内に浸される。
【図６】可変の長さのｄｓＤＮＡを捕獲して、転座させる３つの同等のナノポアセンサに対して、時間の関数として正規化捕獲率を図示し、各センサは、７±１ｎｍの最初のポア直径と、６±１ｎｍの膜厚と、を有し、ｐＨが８を有する１．８ＭＬｉＣｌ溶液内に浸される。
【図７Ａ】ＤＮＡ長の関数として正規化捕獲率を図示し、１３個の個別のナノポアセンサは、７±１ｎｍの最初のポア直径と、６±１ｎｍの膜厚と、を有し、ｐＨが８を有する１．８ＭＬｉＣｌ溶液内に各々浸される。
【図７Ｂ】図７Ａの拡散状態サンプルから全て組み合わせられたｄｓＤＮＡ長に対して、正規化捕獲率分布のヒストグラムである。
【図８】本開示の様々な態様に従う電気泳動捕獲システムの概略図である。
【図９Ａ】時間の関数として正規化捕獲率を図示し、ナノポアセンサ内の二つの個別の分析物（２５０ｂｐＤＮＡおよび１．５ｋｂｐＤＮＡ）は、１１ｎｍの最初のポア直径を有し、ｐＨが８の３．６ＭＬｉＣｌ溶液内に浸される。
【図９Ｂ】反対の軸上に図７Ａ−図７Ｂの正規化捕獲率を図示し、９５％の予測区間は、単純な線形回帰によって予測される。
【図１０】ソリッドステートナノポアを有する単一分子センサおよび既知の濃度を有する第二の分析物を用いて、標的分析物の未知の濃度を決定するための例示的な方法を図示するフローチャートである。
【図１１Ａ】二つの区別可能なＤＮＡ個体群に対する濃度の割合の関数として、捕獲率割合を図示する。
【図１１Ｂ】ＤＮＡ長の割合の関数として、正規化捕獲率割合を図示する。
【図１１Ｃ】図１１Ｂの捕獲率割合のヒストグラムである。
【図１２Ａ】図１１Ａに図示された同一の区別可能なＤＮＡ個体群に対する濃度の割合の関数として、個体群カウントの割合を図示する。
【図１２Ｂ】ＤＮＡ長の割合の関数として、正規化個体群カウント割合を図示する。
【図１２Ｃ】図１１Ｂの個体群カウントの割合のヒストグラムである。
【００２７】
対応する参照記号は、図面の幾つかの図を通して、対応する部品を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
ここで、添付の図面を参照して、例示的実施形態がより完全に記述されるだろう。
【００２９】
液体サンプル内の分析物（例えば、生物分子）の濃度は、分析物の例がソリッドステートナノポアを転座する速度または周波数によって測定されることができる。例えば、図１は、分析物または分子１１０の濃度を測定するための従来のナノポアベースの電気泳動捕獲システム１００の概略図である。捕獲システム１００は、ナノポア１０４を有するソリッドステート膜１０２を含み、電界分布または電界勾配１０６を誘発する印加電圧にさらされる。電界勾配１０６は、ナノポア１０４に、およびナノポア１０４を通って分析物１１０の流入を促進するように方向づけられる。
【００３０】
印加電圧下でのナノポア１０４を通る分析物１１０の捕獲および転座は、以下の３つのステップに広く分類される。（１）ポアからある距離（ｒ＊）において、分析物１１０の移動は、純粋な拡散移動状態から、電気泳動優位なドリフト移動状態に遷移し、電界分布１０６は、ナノポア１０４に向かって分析物１１０を方向づけるか、または運び、（２）ナノポア１０４の近接領域―分析物１１０のサイズと同等な距離―に入ると、分析物１１０は、ナノポア１０４に入る分析物１１０に伝導力のある構成を見出し、（３）分析物１１０は、ナノポア１０４を通って転座するか、または、ナノポア１０４に引き込まれ、流れ出し、再度、バルク溶液の一部となる。
【００３１】
より詳細には、ナノポア１０４にわたって電圧差を印加することは、ナノポア１０４内とナノポア１０４の周囲との双方に電界分布または電界勾配１０６を誘発し、その結果、球対称と、ナノポア１０４からの距離のほぼ逆二乗に依存する電界勾配を生じる。転座または捕獲プロセスは、分析物１１０が勾配に対して如何に応答するかと同様に、ナノポア１０４周囲の電界勾配の特性に依存する。分析物１１０の応答は、電気泳動移動度ファクタ（μ）によって特徴づけられることができ、電気泳動移動度ファクタは、ナノポア１０４に向かって分析物１１０を駆動する電気泳動力と、分析物１１０を有する溶液内の対イオンと荷電分子によって引き起こされる粘性抵抗との間のつり合いを反映する。この方式においては、分析物１１０の移動度は、温度および塩濃度などの様々な外部条件によって影響を及ぼされ得る。様々な例においては、このような外部パラメータは、ほぼ制御され、固定されたままとすることができる。
【００３２】
電界勾配１０６は、オームの法則（Ｅ＝Ｊ／σ、ここで、Ｊはナノポア１０４を通る電流密度、σは溶液の導電率）と半球対称（Ｊ＝Ｉ／２πｒ２、ここで、Ｉはナノポア１０４を通る電流、ｒはナノポア１０４からの半径方向距離）の組み合わせを用いて概算されることができる。
【数１】
2020183933.tif 000002
Ｇは、ナノポア１０４についての全ての幾何学情報をコード化するナノポアコンダクタンスで、その直径（ｄ）および高さまたは長さ（ｈ）を含み、ΔＶは、印加電圧である。
【００３３】
ナノポア１０４の幾何学および表面特性に対する電界勾配１０６の依存性は、ナノポアコンダクタンス項（Ｇ）によって表される。高い塩濃度の環境においては（表面効果が最小化される）、ｒ＞ｄ／２によって定義されるナノポア１０４からの半径方向距離（ｒ）において、円筒形状のナノポア１０４のコンダクタンス（Ｇ）は、二つの半球アクセス領域コンダクタンスからの寄与と直列なバルクポアコンダクタンスによってモデル化されることができる（例えば、Ｇ−１＝２Ｇａｃｃ−１＋Ｇｃｙｌ−１）。このような例においては、電界勾配１０６は、したがって、以下のように概算されることができる。
【数２】
2020183933.tif 000003
高アスペクト比（即ち、ｈ＞ｄ）のナノポアに対しては、半径方向距離（ｒ＞ｄ／２）における電界勾配は、Ｅ（ｒ）≒ｄ２ΔＶ／８ｈｒ２として概算されることができる。しかしながら、このような概算は、１に近いアスペクト比（ｄ／ｈ）を有する薄い膜（例えば、ｈ≦１０ｎｍ）に対しては正確ではない。
【００３４】
捕獲半径（ｒ＊）は、分析物１１０（拡散定数（Ｄ）を有する）の半径方向拡散速度（例えば、Ｖｄ（ｒ）＝Ｄ／ｒ）が分析物１１０（電気泳動移動度（μ）を有する）に対する電界勾配１０６によって誘発される電気泳動ドリフト（例えば、ＶＥ（ｒ）＝μＥ）によってつり合いがとられる距離として概算されることができる。
【数３】
2020183933.tif 000004
分析物１１０が線形ＤＮＡを含むとき、拡散定数（Ｄ）は、Ｄ∝ＬＶによって概算されることができ、ここで、Ｌは、ＤＮＡ長であり、ｖはＦｌｏｒｙべき指数で、電気泳動移動度（μ）は、μ∝Ｌ０によって概算されることができる。
【００３５】
捕獲半径（ｒ＊）は、異なる長さを有する標的分析物１１０に対して異なるだろう。例えば、より大きく、より長く、またはより高く帯電した分子を有する標的分析物は、より小さく、より短く、またはより電荷が中性の分子を有する標的分析物と比較すると、より大きい捕獲半径を有する。同様に、より大きい直径（ｄ）を有するナノポア、したがって、より強くより空間的に広がりのあるポア外部の電界勾配１０６は、より大きい捕獲半径（ｒ＊）および捕獲率（Ｊ）を有する。例えば、図２Ａは、二つの異なる直径を有するナノポアに対して、時間の関数として、捕獲事象数を図示する。図示されるように、より大きいポア（ｄ＝１０ｎｍ）に対する捕獲率は、１０ｋｂｐの長さを有するＤＮＡの同一濃度（例えば、０．２ｎＭ）と、３００ｍＶの印加電圧の下で、より小さいポア（ｄ＝６ｎｍ）に対する捕獲率よりも大きい。
【００３６】
ナノポア１０４を通る分析物１１０の転座は、分析物１１０の自由溶液平衡からのそれ自体の撹拌および閉じ込めを必要とする。自由溶液平衡のエントロピー的性質の自由エネルギーバリアを克服するための要件は、二つの状態を引き起こす。つまり（１）拡散制限された捕獲状態と、（２）バリア制限された捕獲状態である。
【００３７】
拡散制限された状態は、分析物１１０を引き込む電位エネルギーと比較して、エントロピーバリアが有意でない場合の例、即ち，Ｆ＜＜ｑＥである例を指す。このような例においては、転座は、分析物１１０が捕獲半径（ｒ＊）に入ると成功する。拡散制限された状態における転座率（Ｊｄｉｆｆ）は、捕獲半径（ｒ＊）を定義する半球内に分析物１１０が拡散する率と等価であり、吸収半球の存在下で拡散方程式を解くことによって決定されることができる。
【数４】
2020183933.tif 000005
ここで、ｃは、分析物１１０の濃度である。拡散制限された状態においては、拡散制限された捕獲率（Ｊｄｉｆｆ）は、印加電圧に直接比例する（即ち、線形に電圧に依存する）。
【００３８】
バリア制限された状態は、ナノポア１０４の転座が成功する前に、ナノポア１０４から標的分子１１０を流れ出させるような、分子を引き込む電位エネルギーと比較するとエントロピーバリアが十分に大きく、ナノポア１０４の転座が成功する前に、幾らかの転座の試みを要し得る例を指す。バリア制限された捕獲率（Ｊｂａｒ）は、ＫｒａｍｅｒまたはＡｒｒｈｅｎｉｕｓプロセスを用いて定義されることができる。
【数５】
2020183933.tif 000006
ここでＦｂは、エネルギーバリアの高さ、ＦＥは、電界（Ｅ）内の分子の静電自由エネルギー、ωはバリア交差する試み率である。バリア制限された状態においては、バリア制限された捕獲率（Ｊｂａｒ）は、印加電圧に対して、指数関数的に比例する（即ち、電圧に指数関数的に依存する）。
【００３９】
線形ｄｓＤＮＡポリマーを含む分析物１１０の例においては、拡散制限された捕獲率（Ｊｄｉｆｆ）は、ｄｓＤＮＡポリマーの長さとは無関係で、バリア制限された捕獲率（Ｊｂａｒ）は、ｄｓＤＮＡポリマーの長さに依存する。例えば、図２Ｂに図示されるように、バリア制限された状態は、小分子（≦２ｋｂｐ）に対して観察され、拡散制限された状態の長さに対する独立性は、より長い分子（≧２ｋｂｐ）に対して観察される。二つの状態が交差する場合のＤＮＡ長は、垂直線２１０によって表される。クロスオーバ長さ（Ｌ＊）は、引き付ける電界の強度およびポア幾何学などの様々な実験パラメータに依存する。
【００４０】
図２Ｃは、異なるナノポアシステムにおける第一および第二のサンプルの相対的な捕獲率を比較することによって、バリア制限された状態と拡散制限された状態との電圧依存性に注目する。第一のサンプルは、１．８ＭＬｉＣｌ溶液内に１０ｋｂｐの長さを有するｄｓＤＮＡを含む。第二のサンプルは、３．６ＭＬｉＣｌ溶液内に５０ｂｐの長さを有するｄｓＤＮＡを含む。第一のサンプル（円形）は、７ｎｍのポア直径を有するナノポアセンサによって測定され、第二のサンプル（正方形）は、２．５ｎｍのポア直径を有するナノポアセンサによって測定される。各例においては、バリア制限された状態は、より低い電圧で観察され、拡散制限された状態は、より高い電圧で観察される（図示せず）。クロスオーバ長さ（Ｌ＊）と同様に、クロスオーバ電圧（Ｖ＊）は、ポア幾何学およびサンプル長さなどの様々な実験パラメータに依存する。例えば、より長いｄｓＤＮＡは、結果として、より小さいＶ＊値を生じる。
【００４１】
一般的に、バリア制限された状態および拡散制限された状態の双方におけるｄｓＤＮＡ線形ポリマーの電気泳動に基づく捕獲率は、以下の式を用いて定義されることができる。
【数６】
2020183933.tif 000007
ポアコンダクタンス（Ｇ）は、拡散制限された状態におけるポア幾何学依存性を表し、β１、β２およびαは、バリア制限された状態における様々な実験条件およびナノポア特性に関連する倍率である。この方式においては、拡散制限された状態およびバリア制限された状態は、Ｓｍｏｌｕｃｈｏｗｓｋｉ微分方程式の解法の特別な場合である。様々な例においては、純粋な電気泳動捕獲モデルは、固有（例えば、ポア幾何学、電界）および外部（例えば、温度、塩濃度）実験条件に対する捕獲率の依存性の概要を満足する。電気泳動捕獲体制に従って、転座周波数およびオープンポアコンダクタンスは、同一の基礎的機構の二つの表明である。例えば、システム幾何学に依存するプロファイルを有する電界を通る荷電分子の移動。
【００４２】
図１を新たに参照すると、標的分析物１１０の捕獲率（Ｊ）は、ナノポア１０４の測定された信号電流から抽出されることができる。例えば、ある例においては、図３Ａに図示されるように、捕獲率（Ｊ）は、時間の関数として、累積する単一分子転座事象カウントの傾きから得ることができる。他の例においては、図３Ｂに図示されるように、捕獲率（Ｊ）は、生存確率によって計算されるような事象間の時間の統計解析から得ることができる。さらに他の例においては、図３Ｃに図示されるように、捕獲率（Ｊ）は、事象間の時間の対数の分散を近似することによって得ることができる。様々な態様においては、捕獲率（Ｊ）は、コンダクタンス阻害、通過時間、電荷不足、個別のサブレベル数、事象の形状、事象周波数スペクトル、その組み合わせから成る群から選択された方法を用いて測定されることができる。
【００４３】
様々な態様においては、解法における分析物１１０の分子濃度は、ナノポア１０４を標的分析物が転座する率または周波数（Ｊ）を測定することによって決定されることができる。より具体的には、分子間相互作用がそれほど重要ではないと考えられる希釈溶液においては、抽出される捕獲率（Ｊ）は、分析物１１０の濃度（ｃ）に線形に比例する。
【数７】
2020183933.tif 000008
ここで、Ｒは、正規化捕獲率である。正規化捕獲率（Ｒ）は、ナノポア捕獲システム１００の幾何学および分析物１１０の電気泳動移動特性に依存し、校正曲線を用いて決定されることができる。このような校正曲線は、様々な濃度（ｃｉ、ここで、ｉ＞１）に対して捕獲率（Ｊ）を測定することによって作成され得る。校正曲線は、同一条件下であらゆる同一のナノポアに対して妥当な原則内にある。
【００４４】
ナノポア濃度決定の正確性は、このように、校正曲線から正規化捕獲率（Ｒ）を抽出する性能と、同一の捕獲特性を有するナノポア捕獲システムを矛盾なく製造し、同一条件下でこれらの捕獲システムを体系的に動作させる（即ち、外部パラメータを制御する）性能との双方に依存し、これは、最新式のナノ製造ツールを用いて現実世界の条件で実行できない。さらに、抽出される捕獲率における変動を引き起こし得る現実世界のナノポア測定におけるさらなる依存性が存在する。このような変動は、時間の経過とともに単一ナノポア内（即ち、ポア内変動）だけでなく、名目上同一のポア間（即ち、ポア間変動）に生じ得る。
【００４５】
これらの変動には幾つかの潜在的な起源が存在する。変動に対する潜在的な起源の幾つかは、ユーザによる正確性の変動具合で制御されることができる。例えば、塩濃度（±２％）、印加電圧（±１ｍＶ）、名目上の膜の厚さ（±１ｎｍ）、最初のポアサイズ（±１ｎｍ）である。しかしながら、実際には、類似の寸法を有し、類似の環境条件下で動作するナノポアでさえ、類似または同一の実験パラメータで動作するとき、顕著に異なる捕獲特性を示すことがある。すなわち、名目上同一のナノポアが同一か、または類似でさえない正規化捕獲率（Ｒ）を有すると特定される限り、ナノスケールの相違は、測定技術から容易に識別可能ではないポア間に存在し得る。
【００４６】
さらに、変動の潜在的な起源のうちの多くは、容易には制御されることができない。例えば、有効なポア長さ、正確なポア幾何学およびポアサイズ安定性を含む。同一のコンダクタンスおよび電気特性を有するナノポアは、そうでなければ電気的に同一性を表すナノポア間で捕獲率に影響を及ぼし得る、広く変動する幾何学を有し得る。ある例においては、捕獲率は、ソリッドステートナノポア内、ソリッドステートナノポア周囲の局所的な詳細に依存することもある。例えば、膜表面の電荷によって誘発される電気浸透流は、様々な荷電分子の捕獲および転座特性に影響を与え、ある例においては、転座を完全に妨げることが示されてきた。同様に、静電相互作用は、荷電ナノポア表面に近づく標的分析物によって感じられる力に寄与し得る。例えば、ナノポア近くの膜に引きつく分子によって引き起こされるポリマー・ポリマー静電反発力は、ポアコンダクタンスおよび捕獲率における変化を引き起こし得る。
【００４７】
図４Ａ−図４Ｂおよび図５は、潜在的なポア内変動に注目する。より具体的には、図４Ａは、６±１ｎｍの最初のポア直径を有し、ｐＨが８の１．８ＭＬｉＣｌ溶液内に浸されたナノポアセンサに対して、オープンなポア電流（ｎＡ）を図示する。約３００ｍＶの電圧は、約２０分にわたって印加され、ナノポアセンサは、１０ｋｂｐの長さを有するｄｓＤＮＡを捕獲し、転座させた。図示されるように、約６００秒の安定したベースライン後、オープンポア電流における約３％の減少が観察された。３％の減少は、約３５０ｐＡの変化を表し、これは、同一の実験条件下でナノポア内部に捕獲されたｄｓＤＮＡの結果として予測される阻害レベル（約８５０ｐＡ）より小さい。図４Ｂは、同一のｄｓＤＮＡに対して時間の関数として単一分子カウントを図示し、同時に捕獲率における約３０％の減少を示している。
【００４８】
図５は、１．５ｋｂｐの長さを有するｄｓＤＮＡを捕獲し、転座させたナノポアセンサに対して、時間の関数として、単一分子カウントと、オープンポア電流（ｎＡ）とを図示する。ナノポアセンサは、１１ｎｍの最初のポア直径を有し、ｐＨが８の３．６ＭＬｉＣｌ溶液内に浸された。約２００ｍＶの電圧は、約３時間にわたって印加された。図示されるように、約２０％の捕獲率変動が実験にわたって観察された。オープンポア電流は、捕獲率変動がオープンポア電流変動に対してこの場合非相関であることを示すために、重ねられた。
【００４９】
図６および図７Ａ−図７Ｂは、ポア間変動に注目する。より具体的には、図６は、７±１ｎｍの最初のポア直径および６±１ｎｍの膜厚を有し、ｐＨが８の１．８ＭＬｉＣｌ溶液内に浸された３つの同等ナノポアセンサの電圧（ｍＶ）の関数として、濃度正規化された捕獲率（Ｈｚ／ｎＭ）を図示する。３つのナノポアのうちの二つで、１０ｋｂｐの長さを有するＤＮＡが捕獲され、転座した。第一のナノポア（即ち、ポア１）に対する結果は矩形を用いて図示され、第二のナノポア（即ち、ポア２）に対する結果は、三角形を用いて図示される。第三のナノポアに対して、２０ｋｂｐの長さを有するＤＮＡが捕獲され、転座した。第三のナノポア（即ち、ポア３）に対する結果は、円形を用いて図示される。寸法は類似であり、ＤＮＡ長が同一であり、拡散制限された状態が長さとは無関係の捕獲率を仮定するので、第一および第二のナノポアに対して正規化捕獲率は同一であるべきである。しかしながら、図示されるように、ポア１およびポア２に対する正規化捕獲率は異なる。例えば、３００ｍＶにおいて、ポア１は約２．９Ｈｚ／ｎＭの捕獲率を有し、ポア２は、約２．２Ｈｚ／ｎＭの捕獲率を有する。また、拡散制限された状態は長さとは無関係の捕獲率を仮定するので、ポア１、ポア２およびポア３の寸法が同一であるため、第一、第二、第三のナノポアに対して正規化捕獲率は同一であるべきである。しかしながら、図示されるように、ポア１、ポア２、ポア３に対して正規化捕獲率は異なる。例えば、３００ｍＶにおいて、ポア３は、約３．９Ｈｚ／ｎＭの捕獲率を有するが、ポア１は、２．９Ｈｚ／ｎＭの捕獲率を有し、ポア２は２．２Ｈｚ／ｎＭの捕獲率を有する。
【００５０】
図７Ａは、１３個の個別のナノポアセンサのＤＮＡ長（ｂｐ）の関数として、正規化捕獲率（Ｈｚ／ｎＭ）を図示し、各々は、同一の最初のポア直径（ｄ＝７±１ｎｍ）および有効な膜厚（Ｌ＝６±１ｎｍ）で製造され、ｐＨが８の１．８ＭＬｉＣｌ溶液内に浸された。約３００ｍＶの電圧がナノポアに印加される。垂直線７１０は、バリア制限された状態および拡散制限された状態をおおよそ区別する。バリア制限された状態は、垂直線７１０の左側に現れ、拡散制限された状態は垂直線７１０の右側に現れる。図７Ｂは、拡散状態から全て組み合わせられたｄｓＤＮＡ長さに対して正規化捕獲率分散のヒストグラムであり、捕獲率は、ポリマー長に依存性を有しない。顕著な広がりは、０．２９の変動係数に対応して観察される。其々の捕獲率およびオープンポアコンダクタンスが弱くのみ相関される（ｒ＝０．３３）ので、このような変動は、単純な幾何学変動によって引き起こされると予測されない。垂直線７２０は、約０．２９の変動係数で、約３．０８Ｈｚ／ｎＭの平均の正規化捕獲率を描く。
【００５１】
これらのポア間およびポア内エラー源を克服するために、様々な態様においては、本開示は、内部キャリブレータとして機能する、正確に既知の濃度を有する第二の分子個体群を同時に検知することに依存する制御されたカウンティング法を提供する。第二の分子個体群は、第一の標的分子または分析物のそれとは容易に区別できる電気シグネチャを有する。以下にさらに詳細に記述されるように、第一および第二の分析物の双方の其々の捕獲率は、上記で注目された変動の制御されていない源とは関係なく、ポア間と同様に、時間と高く相関を有する。
【００５２】
高い相関は、第一および第二の分子個体群の双方の捕獲率の割合を計算することを通じて、濃度計算における正確性を改善することを可能とする。捕獲率割合は、測定の不確実性を減少させ、同一かつ時間不変の特性を有するポアを使用する必要性を除去し、それによって、制御されていないナノポア特性に対する依存性を排除する。例えば、図８は、標的または第一の分析物８１０および対照または第二の分析物８１２の濃度を同時に測定するための電気泳動捕獲システム８００を図示する。ナノポアセンサ８００は、ナノポア８０４を有するソリッドステート膜８０２を含む。捕獲半径８０６は、図１に図示されたものと類似の方法で決定される。
【００５３】
様々な態様においては、正規化捕獲率（Ｒ）は、ナノポアの一つ以上の物理特性（Ｐ）および標的分析物の一つ以上の物理特性（Ｑ）の関数として示されることができる。
【数８】
2020183933.tif 000009
標的分析物８１０の一つ以上の物理特性（Ｑ）は、例示的でのみ、電気泳動移動度ファクタ（μ）および拡散係数だけでなく、標的分析物８１０の寸法および静電特性を指す。標的分析物８１０の一つ以上の物理特性（Ｑ）は、ナノポア８０４の物理特性とは無関係で、固定または時間的に一定の実験条件の例では、時間的に一定である。ナノポア８０４の一つ以上の物理特性（Ｐ）は、例示的でのみ、表面電荷密度および表面粗さだけでなく、そのサイズおよび形状を含む、ナノポア８０４の寸法および静電特性を指す。
【００５４】
各ナノポア８０４は、時間で変動可能であり得る一意的なＰ値を有する。しかしながら、第一および第二の分析物８１０、８１２は、同一のＰ値が双方の分析物に対して適用されるように選択されることができる。例えば、第一および第二の分析物８１０、８１２は、線形ｄｓＤＮＡの二つの異なる長さであり得る。このような例においては、特定のナノポア８０４の物理および／または化学特性は、既知の濃度の標的および分析物８１０、８１２の双方に同様に影響を及ぼし得る。すなわち、分子が、制御されないエラーに起因すると期待されるよりも高い捕獲率を有するならば、溶液内に存在する任意の他の分子種（例えば、分析物８１０、８１２）は、また、より高い捕獲率を有するだろう。
【００５５】
例えば、図９Ａは、約１１ｎｍのポア直径を有するナノポアセンサによって、３．６ＭＬｉＣｌ溶液内に、２５０ｂｐの長さを有する第一のＤＮＡ分析物と、１．５ｋｂｐの長さを有する第二のＤＮＡ分析物との混合物の単一分子転座カウントの約３時間の期間にわたる時間変化を図示する。図示されるように、二つのＤＮＡ種は、良好に区別される事象特性を有する。しかしながら、ＤＮＡ種は、高く相関するポア内捕獲変動を示し、これは、時間に対して敏感ではない分析物特性（Ｑ）ではなく、時間で変動するナノポア特性（Ｐ）から、ポア内捕獲率変動が生じるという事実を示す。さらに、図９Ｂは、図７Ａ−図７Ｂで解析された１３個のナノポアセンサからの拡散状態捕獲率のデータを用いて、ここで、各実験は、二つの区別可能なｄｓＤＮＡ長さの混合物を含むが、反対の軸上に正規化捕獲率を図示する。正規化捕獲率間の強い相関（ｒ＝０．７７）が観察される。
【００５６】
この方式においては、既知の濃度（ｃ２）を有する第二の分析物８１２の捕獲率（Ｊ２）は、未知の濃度を有する第一の分析物８１０の捕獲率（Ｊ１）と相関を有することができる。このような相関は、ナノポア濃度測定の正確性を改善するために使用されることができる。既知の濃度（ｃ２）を有する第二の個体群（即ち、第二の分析物）８１２が標的個体群（即ち、第一もしくは標的分析物）８１０と同時に存在する場合、第二の個体群８１２は、制御されないポア特性（Ｐ）の効果を正規化するために、内部キャリブレータとして用いられることができ、これは、第一および第二の分析物の双方に同様に影響する。例えば、様々な態様においては、第一の捕獲率（Ｊ１）は、以下のように示される。
【数９】
2020183933.tif 000010
第二の捕獲率（Ｊ２）は以下のように示される。
【数１０】
2020183933.tif 000011
第一および第二の分析物８１０、８１２の双方の捕獲率は、実験中のあらゆる時間で同一のポア特性関数（Ｐ）に依存するため、未知の濃度は、以下の割合を用いて決定されることができる。
【数１１】
2020183933.tif 000012
【００５７】
様々な例においては、標的又は第一の分析物は、線形ｄｓＤＮＡポリマーを含み得る。このような例においては、拡散制限された状態は、状態が上記で議論されたようなときに観察され得る。すなわち、自由溶液のエネルギーバリアは、ナノポアの電位エネルギーと比較して些細なものであり得、標的分子を引き込む捕獲半径と関連し、Ｑ１およびＱ２が等価であり得、Ｑ１／Ｑ２〜１であり得るようにする。したがって、未知の濃度は、既知の濃度によって、第一および第二の捕獲率の割合を単に乗算することによって決定されることができる。
【数１２】
2020183933.tif 000013
ある態様においては、第一および第二の捕獲率（Ｊ１およびＪ２）は、さらに、捕獲率が測定される条件を表す動作ファクタの関数であり得る。
【００５８】
図１０は、ソリッドステートナノポアを有する単一分子センサと、既知の濃度を有する第二の分析物を用いて、標的分析物の未知の濃度（ｃ１）を決定するための例示的方法１０００を図示するフローチャートである。方法は、１００２で、所定の期間にわたって、ソリッドステートナノポアから電流信号を受信することを含む。１００６で、受信された電流信号は、区別可能な電気シグネチャの第一および第二の集合を特定するために用いられる。
【００５９】
１０１０で、区別可能な電気シグネチャの第一の集合は、標的分析物の第一の捕獲率（Ｊ１）を決定するために用いられる。１０１４で、区別可能な電気シグネチャの第二の集合は、対照分析物の第二の捕獲率（Ｊ２）を決定するために用いられる。様々な態様においては、１０１０における第一の捕獲率（Ｊ１）の決定および１０１４における第二の捕獲率（Ｊ２）の決定は、パラレルに生じ得る。ある態様においては、図示されていないが、１０１０における第一の捕獲率（Ｊ１）の決定と、１０１４における第二の捕獲率（Ｊ２）の決定は、シリアルに生じ得る。
【００６０】
様々な態様においては、方法は、１０１８で、第一および第二の分析物特性ファクタ（Ｑ１およびＱ２）ならびに／または、既知の濃度値（ｃ２）を受信することを含む。１０２２で、第二の捕獲率に対する第一の捕獲率の割合が計算され、ソリッドステートナノポアの物理特性の任意の影響を相殺し、幾つかの例においては、第一および第二の分析物特性ファクタの影響を相殺する。数式１１および数式１２を参照されたい。第二の捕獲率に対する第一の捕獲率の割合は、その後、未知の濃度（ｃ１）を決定するために１０２６で用いられる。ある態様においては、図示されないが、方法は、未知の濃度（ｃ１）の決定に続いて、１０２２に戻る周期であり得る。
【００６１】
図１１Ａ−図１１Ｃは、この方法の例示的確認を提供する。より具体的には、図１１Ａは、二つの区別可能なＤＮＡ個体群に対する濃度の割合の関数として、捕獲率割合を図示する。図１１Ａにおける実線は、予想される関係ｙ＝ｘを図示し、べき乗指数は０．８８±０．０５である。図１１Ｂは、ＤＮＡ長の割合（Ｌ１／Ｌ２）の関数として、正規化捕獲率（ｒＪ＝Ｒ１／Ｒ２＝Ｊ１ｃ２／Ｊ２ｃ１）の割合を図示する。図示されるように、ＤＮＡ長の割合に対する正規化捕獲率の割合は、明確な長さに対する依存性を示さない。割合の値は、必要に応じて、全て１に近い。図１１Ｃは、ｒＪの分布を図示する。図示されるように、変動係数は０．１６であり、これは、以前観察された０．２９からは大幅に減少している。このように、既知の濃度の内部キャリブレータを用いることは、特定のナノポアセンサの使用中の影響を除去し、体系的なエラーの制御できない源とは関係ない未知の標的濃度のより正確な測定を可能とする。特に、多くの態様において、内部キャリブレータを用いることは、個別の校正曲線の使用の必要性および正確なポア幾何学または幾何学的安定性の必要性を排除し得る。
【００６２】
様々な態様においては、実験中に顕著なポア内変動が存在し、捕獲率は不明確な品質（例えば、図４Ａ−４Ｂおよび図５を参照されたい）になり得る。このような例においては、事象間の時間に近似することによる捕獲率の計算は、一定の正規化捕獲率（Ｒ）を誤って仮定し、その結果、不明確な捕獲率値（Ｊ）の抽出を生じる。その結果、正規化捕獲率（Ｒ）が一定ではなく、仮定は維持されず、個体群カウント割合（Ｎ１／Ｎ２）は、捕獲率割合（Ｊ１／Ｊ２）には望ましくはない。なぜなら、単一分子カウントは、捕獲の時間変動を本質的に考慮するからである。例えば、図１１Ａ−図１１Ｃは、捕獲率割合（Ｊ１／Ｊ２）の代わりに、個体群カウント割合（Ｎ１／Ｎ２）を用いて、図１２Ａ−図１２Ｃに再プロットされる。
【００６３】
図１２Ａは、図１１Ａの二つの区別可能なＤＮＡ個体群の濃度割合の関数として、個体群カウント割合を図示する。図１２Ａにおける実線は、予想される関係ｙ＝ｘを図示し、べき乗指数は、０．９４±０．０５であり、ここで、期待値１に近い。図１２Ｂは、ＤＮＡ長の割合（Ｌ１／Ｌ２）の関数として、正規化された個体群カウントの割合（ｒＮ＝Ｎ１ｃ２／Ｎ２ｃ１）を図示する。図１２Ｂは、二つの割合間に相関は示さない。図１２Ｃは、ｒNの分散を図示する。図示されるように、変動係数は０．１２である。このように、捕獲率割合とは対照的に、未知の分子標的の濃度を決定するために個体群カウントの割合を使用することは、ポア内変動が存在するとき特に、測定の正確性をさらに改善することができる。
【００６４】
個体群カウント割合の代わりに捕獲率割合を用いるとき、変動の係数が増加する最も確実な源は、捕獲率が時間で変動し得るという事実であり得、一定の捕獲率が仮定されるときにさらなる不確実性を追加する。さらに、様々な態様においては、変動係数は、キャリブレータの範囲の代わりに単一のあらかじめ決められ、あらかじめ測定された内部キャリブレータのみを用いるときにさらに減少し得る。ｒＪおよびｒＮの双方は、４つの測定されたパラメータに依存するが、数式１１を用いて計算された標的濃度（ｃ１）は、線形ｄｓＤＮＡの場合に対しては３つの測定されたパラメータのみに依存する。このように、数式１１によって要約される方法を用いて行われる濃度測定の正確性は、さらに改善される。
【００６５】
内部制御濃度不確実性とは別として、捕獲率割合の測定に対する正確性の基本的限界は、最終的にポアソン雑音であり、割合を計算するために用いられる事象の数の逆平方根で減少する。バリア制限された状態と拡散制限された状態との間のポリマー長さの遷移は、理論によって記述されるほど鋭くはないことにも留意されたい。その境界近くのＤＮＡ長で動作することは、結果として不確実性の増加を生じ、ｄｓＤＮＡに対するＱ１＝Ｑ２という基本的な仮定に起因し、仮定は、Ｌ／Ｌ＊＞＞１という限界で改善するだろう。
【００６６】
様々な例におけるナノポアセンサ（例えば、電気泳動捕獲システム８００）が幾つかのたんぱく質から直接情報を得ることができることが示されてきたが、プロトコルは複雑であり、ナノポア信号の特異性は、複雑な生物学的サンプルの直接検出に対して適切ではないことがある。このように、様々な態様においては、特定の抗体を使用するプロキシラベルに、たんぱく質の免疫アッセイ型の変換を用いて、実際に検出される単位としてＤＮＡなどのプロキシラベルを用いることは、望ましいことがある。このような変換は、ＥＬＩＳＡ型のサンドイッチアッセイを用いて達成され得る。
【００６７】
このような例においては、標的たんぱく質に対する一時捕獲抗体は、標的分子をトラップする表面または常磁性ビーズに結合され得る。標的分子は、標的たんぱく質に対する二次検出抗体で終端された線形ｄｓＤＮＡなどのプロキシラベルでさらにその後タグ付けされ得、サンドイッチを形成する。サンプルは、その後、標的分子およびプロキシラベルをその場に保ったままで洗浄され得、結合されていない任意のサンプルまたはバックグラウンド分子を除去する。最後に、プロキシラベルは、制限酵素、光分解性結合部位、またはストランド媒介置換アプローチを用いて、検出抗体を解放されることができる。プロキシラベル濃度は、測定可能であり、標的分子濃度と直接対応する。
【００６８】
ある態様においては、このようなプロキシラベル濃度は、不確実性の源に悩まされ得る。例えば、磁気ビーズごとに、または単位面積当たりに結合された抗体数は、制御することが困難であり、測定することはさらに困難であり得る。さらに、サンドイッチの結合効率は、塩濃度などの局所的な条件に対して非常に敏感であり得る。洗浄ステップもまた、バックグラウンドとともに標的の幾つかのサブセットを除去し得、プロキシラベル解放の分解効率は、完全ではなく、測定することが困難である。これらのエラー源の全ては、抽出された濃度値において大きく不確実性に寄与し得る。
【００６９】
様々な態様においては、上述されたように、エラーのこれらの源は、内部制御を用いて軽減され得る。例えば、標的たんぱく質、関連抗体、プロキシラベルのうちの二つの集合が用いられ得る。対照分子は、サンプル内に元々は存在せず、既知の濃度で導入される。標的もしくは対象分子と、対照分子は、類似の特性（例えば、サイズ、分子量、分離定数（Ｋｄ）など）を各々有し得る。このように、二つの個別の抗体のビーズに対する結合は、拮抗するプロセスである。例えば、標的たんぱく質に対するＫｄ値および内部キャリブレータは類似であるため、各々は、局所的な条件に同様に敏感であり、各反応に対して、相対的な濃度およびＫｄ値にのみ依存する割合で、沈殿した抗体に結合するだろう。さらに、洗浄ステップは、等しい比率で標的および対照の双方を除去し、プロキシラベルの分解効率は、標的および対照またはキャリブレータの双方に対して同一であろう。キャリブレータおよび標的代用ラベルの双方の捕獲率および／または個体群カウントは、決定され得、測定の正確性とそうでなければ干渉し得るようなエラーを補正するために、上述されるように其々の割合が使用され得る。このように、明確にアッセイ自体の間のエラーの源を測定するための困難の原因となることなく、測定の正確性を改善するための方法が提供される。
【００７０】
例示的実施形態は、本開示が徹底的であるように提供され、当業者にその範囲を完全に伝えるだろう。本開示の実施形態の完全な理解を提供するために、多数の特定の詳細事項、特定のコンポーネント、デバイス、方法の実施例などが、説明される。特定の詳細事項が必ずしも使用される必要はなく、例示的実施形態は、多くの異なる形態で具現化されてもよく、本開示の範囲を限定すると解釈されるべきではないことも当業者には明らかであろう。幾つかの例示的実施形態においては、既知のプロセス、既知のデバイス構造、および既知の技術は詳細には記述されていない。
【００７１】
本明細書で用いられる専門用語は、特定の例示的実施形態を記述する目的のためのものであって、限定することを意図するものではない。本明細書で用いられるように、文脈がそうでないと明確に示さない限りは、単数形“一つ（ａ）”、“一つ（ａｎ）”、“その（ｔｈｅ）”は、同様に複数形を含むことが意図され得る。用語“含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）”、“含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）”、“含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）”、“有する（ｈａｖｉｎｇ）”は包括的であり、したがって、言及された特徴、整数、ステップ、動作、構成要素、および／またはコンポーネントの存在を明示するが、一つ以上の他の特徴、整数、ステップ、動作、構成要素、コンポーネントおよび／またはその集合の存在または追加を排除しない。本明細書に記述される方法ステップ、プロセス、動作は、実施の順序として具体的に特定されない限りは、特定の議論され、図示された順序での実施を必ずしも必要とすると解釈されるべきではない。また、追加的または代替的ステップが使用されてもよいことも理解されたい。
【００７２】
第一、第二、第三などの用語は、様々な構成要素、コンポーネント、領域、層、および／または区分を記述するために本明細書で用いられ得るが、これらの構成要素、コンポーネント、領域、層および／または区分は、これらの用語によって限定されることはない。これらの用語は、ある構成要素、コンポーネント、領域、層または区分を、別の領域、層、または区分から区別するためにのみ用いられ得る。“第一”、“第二”および他の数字的用語などの用語は、本明細書で用いられるとき、文脈によって明確に示されない限りは、連続または順序を暗示しない。したがって、以下に議論される第一の構成要素、コンポーネント、領域、層または区分は、例示的実施形態の教示から逸脱することなく、第二の構成要素、コンポーネント、領域、層または区分として呼ばれることができる。
【００７３】
実施形態の前記の記述は、例示および説明の目的のために提供されてきた。それは、網羅的であることは意図されず、本開示を限定することを意図されない。特定の実施形態の個々の構成要素または特徴は、特定の実施形態のそれに概して限定されることはないが、適用可能である場合、具体的に図示され、記述されていないとしても、交換可能であって、選択された実施形態において使用されることができる。同じものが多くの方法で変形されてもよい。このような変形は、本開示から逸脱するとみなされるべきではなく、全てのこのような改変は、本開示の範囲内に含まれることが意図される。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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