(57)【要約】【課題】化合物の合成反応（代謝経路）に必要な酵素の合成量の調整を通じて、目的化合物の生産量を最適化するための方法及び手段を提供すること。【解決手段】一つ若しくは複数の反応段階を経て合成される化合物の合成反応条件を最適化する方法であって、各反応段階における一つ若しくは複数の酵素について、少なくとも1つの酵素の発現量を、プロモーターの野生型及び／又は変異体を使用して調節する工程、並びに目的の化合物の合成量を測定する工程を含む方法。【選択図】図５
2020137460.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一つ若しくは複数の反応段階を経て合成される化合物の合成反応条件を最適化する方法であって、
各反応段階における一つ若しくは複数の酵素について、少なくとも1つの酵素の発現量を、プロモーターの野生型及び／又は変異体を使用して調節する工程、並びに
目的の化合物の合成量を測定する工程
を含む方法。
【請求項２】
酵素の発現量を調節する工程が、少なくとも1つの酵素の発現量を、複数のプロモーターの野生型及び／又は変異体を使用して調節することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
酵素の発現量を調節する工程が、複数の酵素の発現量を、プロモーターの野生型及び／又は変異体を使用して調節することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
酵素の発現量を調節する工程が、複数の酵素の発現量を、それぞれ複数のプロモーターの野生型及び／又は変異体を使用して調節することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記プロモーターがT7プロモーターである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記T7プロモーターの変異体が、以下：
TAATACGATTCACTATAGGG（配列番号1）、
TAATACGACCCACTATAGGG（配列番号2）、
TAATACGACTTACTATAGGG（配列番号3）、
TAATACGATCCACTATAGGG（配列番号4）、
TAATACGACCTACTATAGGG（配列番号5）、
TAATACGATTTACTATAGGG（配列番号6）、
TAATACGATCTACTATAGGG（配列番号7）、
TAATACGGCTCACTATAGGG（配列番号8）、
TAATACGACTCGCTATAGGG（配列番号9）、
TAATACGGCTCGCTATAGGG（配列番号10）、
TAATACGTCTCACTATAGGG（配列番号11）、
TAATACGCCTCACTATAGGG（配列番号12）、
TAATACGACTCTCTATAGGG（配列番号13）、及び
TAATACGACTCCCTATAGGG（配列番号14）
からなる群より選択される配列を有するものである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
調節された酵素の発現量を測定する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
発現量を測定する工程が、タグタンパク質を利用するものである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記タグタンパク質が、蛍光タンパク質、及び発光タンパク質からなる群より選択される少なくとも1種を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記蛍光タンパク質が、複数の酵素について異なる蛍光を発する複数の蛍光タンパク質を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
各反応段階の少なくとも1種の中間産物の合成量を測定する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
無細胞反応系で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記化合物が、タンパク質、糖タンパク質、糖鎖、脂質及び糖脂質からなる群より選択される少なくとも1種を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法により最適化された合成反応条件において化合物を製造する方法。
【請求項１５】
前記化合物が、前記合成反応条件において細胞内で製造される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
一つ若しくは複数の反応段階を経て合成される化合物の合成反応条件を最適化するためのキットであって、以下：
TAATACGATTCACTATAGGG（配列番号1）、
TAATACGACCCACTATAGGG（配列番号2）、
TAATACGACTTACTATAGGG（配列番号3）、
TAATACGATCCACTATAGGG（配列番号4）、
TAATACGACCTACTATAGGG（配列番号5）、
TAATACGATTTACTATAGGG（配列番号6）、
TAATACGATCTACTATAGGG（配列番号7）、
TAATACGGCTCACTATAGGG（配列番号8）、
TAATACGACTCGCTATAGGG（配列番号9）、
TAATACGGCTCGCTATAGGG（配列番号10）、
TAATACGTCTCACTATAGGG（配列番号11）、
TAATACGCCTCACTATAGGG（配列番号12）、
TAATACGACTCTCTATAGGG（配列番号13）、及び
TAATACGACTCCCTATAGGG（配列番号14）
からなる群より選択される配列を含むプロモーターを少なくとも1種含むキット。
【請求項１７】
前記プロモーターが発現ベクター中に存在する、請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
T7 RNAポリメラーゼをさらに含む、請求項１６に記載のキット。
【請求項１９】
一つ若しくは複数の反応段階を経て合成される化合物を合成するための自動化装置であって、
反応容器と
酵素量計測装置と、
試薬格納部と、
産物量計測装置と、
制御部と
を備え、
前記反応容器において、各反応段階における一つ若しくは複数の酵素の、野生型及び／又は変異型プロモーターの制御下における発現と、前記酵素による反応基質から最終産物への合成反応とが行われるものである、自動化装置。
【請求項２０】
（a）以下の配列：
TAATACGATTCACTATAGGG（配列番号1）、
TAATACGACCCACTATAGGG（配列番号2）、
TAATACGACTTACTATAGGG（配列番号3）、
TAATACGATCCACTATAGGG（配列番号4）、
TAATACGACCTACTATAGGG（配列番号5）、
TAATACGATTTACTATAGGG（配列番号6）、
TAATACGATCTACTATAGGG（配列番号7）、
TAATACGGCTCACTATAGGG（配列番号8）、
TAATACGACTCGCTATAGGG（配列番号9）、
TAATACGGCTCGCTATAGGG（配列番号10）、
TAATACGTCTCACTATAGGG（配列番号11）、
TAATACGCCTCACTATAGGG（配列番号12）、
TAATACGACTCTCTATAGGG（配列番号13）、若しくは
TAATACGACTCCCTATAGGG（配列番号14）；又は
（b）前記（a）の配列に対して1若しくは数個の塩基の欠失、置換若しくは付加を含み、かつプロモーター活性を有する配列
を含むプロモーター。
【請求項２１】
請求項２０に記載のプロモーターを含む発現ベクター。
【請求項２２】
遺伝子が機能的に連結されている、請求項２１に記載の発現ベクター。
【請求項２３】
請求項２２に記載の発現ベクターを含む細胞。
【請求項２４】
請求項２２に記載の発現ベクター又は請求項２３に記載の細胞を用いて、前記プロモーターの制御下に前記遺伝子を発現させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一つ若しくは複数の反応段階を経て合成される化合物の合成反応条件を最適化するための方法、キット及び自動化装置に関する。また本発明は、最適化された合成反応条件で化合物を製造する方法に関する。さらに本発明は、新規なT7プロモーター変異体及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物のゲノムをデザインし、物質生産を行う「スマートセル・インダストリ」が進展している。スマートセルを利用してタンパク質の合成を幅広く応用できることが期待される。スマートセル作製のためには細胞内で発現する複数の酵素（タンパク質）の生成濃度を制御し代謝反応を最適化することが必要であるが、現状、この技術は十分に確立されていない。
【０００３】
現状はスマートセル細胞株樹立にいたるまでに、ゲノム構造を設計し（Design）、細胞への遺伝子組み込みを行い（Build）、仕様を満たす細胞であるかを確認し（Test）、学習する（Learn）フローを繰り返すことが一般的である。しかしながら、ゲノム設計から目的物質の生産効率の評価までのDBTLサイクル（Design-Build-Test-Learn）におよそ6カ月を要する。従来のDBTLサイクルは主にまた細胞の中で行われており、スマートセルの細胞株樹立に要するコストは1株に対して数億円かかり、形質転換、培養などの操作は数年間という時間がかかる。
【０００４】
ハイスループットな解析を可能にする無細胞タンパク質合成系を活用することは解決法のひとつとなり得、そのような無細胞合成系を利用した方法が報告されている。例えば、特許文献１では、無細胞合成系において単一のリガンド結合タンパク質の合成率と可溶化率を向上する方法が記載されている。この方法では、目的リガンドとして合成反応とは別の物質を添加することにより合成反応を調節しており、合成対象のタンパク質はリガンドと結合した状態で合成されるため、リガンドと分離する操作が必要であり、またリガンドに要するコストも増える。
【０００５】
特許文献２では、タンパク質の立体構造解析に適したドメインを選択するため、タンパク質をコードするDNAを断片化し、無細胞系で合成する方法が記載されている。しかしながら、タンパク質をコードするDNAが断片化されているため、完全な機能を持つ酵素を合成する方法には応用できない。また特許文献２に記載の方法は、大量合成が目的となっており、合成反応の最適化が目的ではない。
【０００６】
また、特許文献３は、対象とする経路の所望の産物を生産するために、代謝フラックスの制御に着目して、一連の複雑な酵素を含む無細胞系において代謝フラックス速度を制御するための方法を記載しており、酵素、基質、O2などの多様な環境要因を制御することにより、代謝フラックス速度を制御している。例えば、酵素の制御では、酵素を添加したり、酵素をコードする配列を添加することによって酵素量を制御しているが、複数の反応段階を同時に制御しようとする場合には、操作が煩雑となる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開2004-105070号公報
【特許文献２】特開2002-262873号公報
【特許文献３】特表2016-520324号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
スマートセルで物質を生産する際、代謝経路の中で、複数の酵素を触媒として多段階反応を行う必要がある。また、それぞれの反応に最適な酵素量も異なるため、各酵素の発現量を独自にコントロールする方法が必要である。さらに酵素は、さまざまなフィードバック制御、環境変化などの影響をうけており、代謝反応はさらに複雑になっている。特定の産物の生産量を上げるため、酵素の経時変化を計測する必要がある。つまりスマートセルを構築するための時間、コストなどを短縮するためには、複数のタンパク質の発現量を広いレンジで調節、計測可能な実験系が必要となる。
【０００９】
したがって、本発明は、化合物の合成反応（代謝経路）に必要な酵素の合成量の調整を通じて、目的化合物の生産量を最適化するための方法及び手段を提供することを課題とする。また、複数の酵素を同時に発現し、各酵素の比率をコントロールすることで代謝を制御することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題を解決するために鋭意検討を行ったところ、本発明者は、無細胞反応系において、異なる強度を有するプロモーターの変異体を利用して、複数の反応段階に関与する複数の酵素の合成量を調節することにより、化合物合成反応を簡便かつ低コストに最適化できるということを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
したがって、一態様において、一つ若しくは複数の反応段階を経て合成される化合物の合成反応条件を最適化する方法であって、
各反応段階における一つ若しくは複数の酵素について、少なくとも1つの酵素の発現量を、プロモーターの野生型及び／又は変異体を使用して調節する工程、並びに
目的の化合物の合成量を測定する工程
を含む方法が提供される。
【００１２】
別の態様において、上記方法により最適化された合成反応条件において化合物を製造する方法が提供される。
【００１３】
また別の態様において、一つ若しくは複数の反応段階を経て合成される化合物の合成反応条件を最適化するためのキットであって、以下：
TAATACGATTCACTATAGGG（配列番号1）、
TAATACGACCCACTATAGGG（配列番号2）、
TAATACGACTTACTATAGGG（配列番号3）、
TAATACGATCCACTATAGGG（配列番号4）、
TAATACGACCTACTATAGGG（配列番号5）、
TAATACGATTTACTATAGGG（配列番号6）、
TAATACGATCTACTATAGGG（配列番号7）、
TAATACGGCTCACTATAGGG（配列番号8）、
TAATACGACTCGCTATAGGG（配列番号9）、
TAATACGGCTCGCTATAGGG（配列番号10）、
TAATACGTCTCACTATAGGG（配列番号11）、
TAATACGCCTCACTATAGGG（配列番号12）、
TAATACGACTCTCTATAGGG（配列番号13）、及び
TAATACGACTCCCTATAGGG（配列番号14）
からなる群より選択される配列を含むプロモーターを少なくとも1種含むキットが提供される。
【００１４】
さらに別の態様において、一つ若しくは複数の反応段階を経て合成される化合物を合成するための自動化装置であって、
反応容器と
酵素量計測装置と、
試薬格納部と、
産物量計測装置と、
制御部と
を備え、
前記反応容器において、各反応段階における一つ若しくは複数の酵素の、野生型及び／又は変異型プロモーターの制御下における発現と、前記酵素による反応基質から最終産物への合成反応とが行われるものである、自動化装置が提供される。
【００１５】
また別の態様において、（a）以下の配列：
TAATACGATTCACTATAGGG（配列番号1）、
TAATACGACCCACTATAGGG（配列番号2）、
TAATACGACTTACTATAGGG（配列番号3）、
TAATACGATCCACTATAGGG（配列番号4）、
TAATACGACCTACTATAGGG（配列番号5）、
TAATACGATTTACTATAGGG（配列番号6）、
TAATACGATCTACTATAGGG（配列番号7）、
TAATACGGCTCACTATAGGG（配列番号8）、
TAATACGACTCGCTATAGGG（配列番号9）、
TAATACGGCTCGCTATAGGG（配列番号10）、
TAATACGTCTCACTATAGGG（配列番号11）、
TAATACGCCTCACTATAGGG（配列番号12）、
TAATACGACTCTCTATAGGG（配列番号13）、若しくは
TAATACGACTCCCTATAGGG（配列番号14）；又は
（b）前記（a）の配列に対して1若しくは数個の塩基の欠失、置換若しくは付加を含み、かつプロモーター活性を有する配列
を含むプロモーターが提供される。
【００１６】
さらなる態様において、上記プロモーターを含む発現ベクターが提供される。
【００１７】
他の態様において、上記発現ベクターを含む細胞が提供される。
【００１８】
また他の態様において、上記発現ベクター又は上記細胞を用いて、前記プロモーターの制御下に前記遺伝子を発現させる方法が提供される。
【発明の効果】
【００１９】
本発明により、一つ若しくは複数の反応段階で合成される化合物の合成反応を、簡便、迅速、低コストかつ微小量で最適化することが可能となる。本発明に係る方法によって最適化された合成反応条件を使用して、化合物を大規模に製造することも可能となる。そのため、本発明は、化合物（特にタンパク質）の製造、医薬品製造などの分野において有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】複数の反応段階を経て化合物が合成される反応のイメージである。
【図２】発現ベクター（プラスミド）設計の一例と合成された酵素の概要を示す。
【図３】複数の酵素合成量を同時に計測する操作を示す概略図である。
【図４】化合物合成の中間産物及び最終産物を解析する操作を示す概略図である。
【図５】酵素合成量の調節により化合物合成の条件を最適化する概念図である。
【図６】無細胞タンパク質合成系を組み込んだ自動化装置の概略図である。
【図７】T7プロモーターとT7 RNAポリメラーゼの結合領域を示す図である。
【図８】T7プロモーターの変異体と対応する緑色蛍光タンパク質（GFP）の蛍光強度の時間変化を示すグラフである。図中、WTは野生型を、1〜14はそれぞれ変異体の番号を表す。
【図９】実施例１において使用したベクターの概略図と、T7プロモーター変異体の配列と対応する相対発現強度を示す図である。
【図１０】T7プロモーターの変異体を利用して化合物の合成条件を最適化する方法の一例のフローチャートを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
実施の形態について、図面を用いて詳細に説明する。ただし、本発明は以下に示す実施の形態の記載内容に限定して解釈されるものではない。本発明の思想ないし趣旨から逸脱しない範囲で、その具体的構成を変更し得ることは当業者であれば容易に理解される。
【００２２】
図面等において示す各構成の位置、大きさ、形状、範囲などは、発明の理解を容易にするため、実際の位置、大きさ、形状、範囲などを表していない場合がある。このため、本発明は、必ずしも、図面等に開示された位置、大きさ、形状、範囲などに限定されない。
【００２３】
本発明は、一つ若しくは複数の反応段階を経て合成される化合物の合成反応条件を最適化するための方法、キット及びこの方法を自動化して行うための装置を提供する。一例として複数の反応段階を経て化合物が合成される反応のイメージを図１に示す。最終産物である化合物の合成において、反応基質は酵素A、B及びCの触媒により、それぞれ中間産物1、中間産物2及び最終産物が生成される。中間産物や最終産物の合成量を高めるため、各酵素を適切な量で合成することが重要である。
【００２４】
一態様において、本発明は、一つ若しくは複数の反応段階を経て合成される化合物の合成反応条件を最適化する方法であって、
各反応段階における一つ若しくは複数の酵素について、少なくとも1つの酵素の発現量を、プロモーターの野生型及び／又は変異体を使用して調節する工程、並びに
目的の化合物の合成量を測定する工程
を含む方法を提供する。
【００２５】
本発明に係る方法では、代謝反応による化合物合成の各反応段階における一つ若しくは複数の酵素について、少なくとも1つの酵素の発現量をプロモーターの野生型及び／又は変異体を使用して調節する。一実施形態では、少なくとも1つの酵素の発現量を、複数のプロモーターの野生型及び／又は変異体を使用して調節する。別の実施形態では、複数の酵素の発現量を、プロモーターの野生型及び／又は変異体を使用して調節する。また別の実施形態では、複数の酵素の発現量を、それぞれ複数のプロモーターの野生型及び／又は変異体を使用して調節する。どの酵素についてプロモーターのどの野生型／変異体を使用してその発現量を調節するかは、最適化の対象となる化合物の種類、反応段階の数、反応の規模などに応じて適宜設定することができる。一つ若しくは複数の酵素の発現量をそれぞれ複数のプロモーター野生型／変異体を使用して調節し、それぞれの酵素に適したプロモーター野生型／変異体を最終的に選択することが好ましい。
【００２６】
本発明において、最適化の対象となる化合物は、代謝反応による反応段階を経て合成される化合物であれば特に限定されるものではなく、タンパク質、糖タンパク質、糖鎖、脂質、糖脂質などが含まれる。発現量を調節する酵素は、化合物の種類に応じて異なるものであり、化合物の合成に必要な酵素は当業者であれば容易に理解することができる。
【００２７】
使用するプロモーターは、遺伝子組換え操作に慣用的に使用されているものであれば特に限定されるものではない。好ましくは、無細胞反応系で使用されているプロモーターであり、そのようなプロモーターとしては、T7プロモーター（T7 RNAポリメラーゼとの組み合わせで使用）、T3プロモーター（T3 RNAポリメラーゼとの組み合わせで使用）、SP6プロモーター（SP6 RNAポリメラーゼとの組み合わせで使用）、lacプロモーター、tacプロモーターなどが挙げられる。本発明では、野生型のプロモーターとはプロモーター活性の異なるプロモーターの変異体、好ましくは複数の変異体のセットを準備し、酵素の発現量を異なるレベルで調節する。
【００２８】
プロモーターとしてT7プロモーターを使用する場合、変異体は、例えばT7プロモーターにおけるT7 RNAポリメラーゼとの結合領域に変異を導入することにより準備することができる（例えば実施例１参照）。T7プロモーターの変異体は、例えば限定されるものではないが、以下：
TAATACGATTCACTATAGGG（配列番号1）、
TAATACGACCCACTATAGGG（配列番号2）、
TAATACGACTTACTATAGGG（配列番号3）、
TAATACGATCCACTATAGGG（配列番号4）、
TAATACGACCTACTATAGGG（配列番号5）、
TAATACGATTTACTATAGGG（配列番号6）、
TAATACGATCTACTATAGGG（配列番号7）、
TAATACGGCTCACTATAGGG（配列番号8）、
TAATACGACTCGCTATAGGG（配列番号9）、
TAATACGGCTCGCTATAGGG（配列番号10）、
TAATACGTCTCACTATAGGG（配列番号11）、
TAATACGCCTCACTATAGGG（配列番号12）、
TAATACGACTCTCTATAGGG（配列番号13）、及び
TAATACGACTCCCTATAGGG（配列番号14）
の配列を有するものが挙げられる。なお、T7プロモーターの野生型は配列TAATACGACTCACTATAGGG（配列番号15）を有する。
【００２９】
このようにプロモーターの野生型及び／又は変異体（好ましくは複数）を使用することで、合成反応に使用するポリメラーゼは、プロモーターの種類に対応した1種類でよい。例えば、T7プロモーター変異体を使用する場合には、T7 RNAポリメラーゼのみを使用して、酵素の合成量を異なるレベルで調節できる。そのため、外部環境の変化によって各酵素の合成量変化トレンドは均一となり、合成反応経路バランスの調節がより簡便となる。
【００３０】
本発明に係る方法は、細胞内で行ってもよいが、無細胞反応系で行うことが好ましい。無細胞反応系は、細胞から抽出される生体分子の転写・翻訳機構を活用して溶液中で組換えタンパク質を産出する迅速性、簡便性、低コスト及び微小量化の点で、化合物合成の最適条件を設定する上で利点がある。無細胞反応系を利用する場合、最適化させようとする化合物に応じて、原核細胞ベースの無細胞反応系（大腸菌抽出液など）、真核細胞ベースの無細胞反応系（ウサギ網状赤血球ライセート、昆虫細胞抽出液、コムギ胚芽抽出液など）を使用することができる。一方、細胞を利用する場合には、最適化させようとする化合物に応じて、遺伝子組換えやタンパク質産生に一般的に使用されている宿主細胞、例えば細菌（大腸菌、枯草菌等）、酵母、植物細胞、動物細胞（COS細胞、CHO細胞等）、昆虫細胞などを使用することができる。
【００３１】
プロモーターの変異体により調節された酵素の発現は、当技術分野で公知の方法により行うことができる。具体的には、適当なベクターに、プロモーター（野生型／変異体）と酵素をコードする遺伝子を連結（挿入）することにより発現ベクターを作製することができる。本発明で使用するベクターとしては、無細胞反応系において使用可能なもの、あるいは宿主細胞中で複製可能なものであれば特に限定されるものではなく、当業者であれば適宜選択することが可能である。このような用途に適したクローニングベクターは市販されており、また無細胞反応系用のキットに含まれていることもある。あるいは、無細胞反応系では、線状DNAを用いても転写及び翻訳を行うことが可能であるため、プロモーター（野生型／変異体）と酵素をコードする遺伝子を単に連結（挿入）することにより、発現のための線状DNAを調製することができる。
【００３２】
ベクターにプロモーター及び酵素をコードする遺伝子（DNA）を挿入するには、まず、精製されたDNAを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターDNAの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。ベクターや上述した発現用の線状DNAには、プロモーター及び遺伝子の配列のほか、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリA付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（SD配列）、ターミネーター配列などを連結することができる。
【００３３】
無細胞反応系で行う場合には、作製したベクター又は線状DNAを、ポリメラーゼ、反応基質などと共に無細胞反応系に導入することにより、プロモーターの制御下で酵素が発現される。
【００３４】
細胞を使用する場合には、作製したベクターを、コードされる酵素が発現し得るように宿主細胞に導入する。宿主細胞への発現ベクターの導入方法は、当技術分野で公知の方法であれば特に限定されるものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、リポフェクション法等が挙げられる。
【００３５】
上述の工程によって、プロモーター変異体の野生型とは異なるプロモーター活性強度に基づき、酵素の発現量が調節される。
【００３６】
本発明に係る方法は、調節された酵素の発現量を測定する工程をさらに含むものであってもよい。本発明では、最終産物である目的の化合物の合成量が増大することが目的ではあるが、合成の各反応段階に寄与する酵素の発現量を測定することにより、酵素の最適な量や一つ若しくは複数の酵素の最適な比を理解することができる。酵素の発現量を測定する方法は、特に限定されるものではなく、当技術分野で公知の方法、例えば質量分析計（MS）、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）などを使用することができる。
【００３７】
一実施形態において、発現量を測定する工程は、タグタンパク質を利用することができる。ここで、タグタンパク質とは、酵素と同じプロモーター（野生型／変異体）の制御下に配置され、その量を測定することによって酵素の発現量を求めることができる任意のタンパク質をいう。タグタンパク質はその量を簡便に測定できるものであることが好ましく、例えば蛍光タンパク質、発光タンパク質、色素タンパク質など（測定可能なシグナルを発するものであればその一部であってもよい）のうち少なくとも1種を使用することができる。タグタンパク質と酵素は、同じプロモーターの制御下にあれば、融合タンパク質として発現してもよいし、又は独立発現されるタンパク質として発現してもよい。複数の酵素の発現量を調節する場合には、複数の酵素について異なる蛍光を発する複数の蛍光タンパク質を使用することができる。
【００３８】
タグタンパク質の量の測定は、使用するタグタンパク質の種類によって異なり、当業者であれば適当な方法を選択することができる。例えば、蛍光タンパク質を使用した場合には、蛍光の色及び強度の検出は、分光光度計、蛍光顕微鏡などにより行うことができる。なお、このようなタグタンパク質の測定のための計測装置が、上述した酵素の発現や合成反応の場を兼ねてもよい。そのため、本発明に係る方法を微小量反応系で実施することが可能である。
【００３９】
タグタンパク質として複数の蛍光タンパク質を使用した場合の、発現ベクター（プラスミド）設計の一例と合成された酵素の概要を図２に示す。図２に示されるように、酵素a、酵素b及び酵素cは、それぞれ異なるプロモーター変異体（プロモーター配列1、プロモーター配列2及びプロモーター配列3）による発現の調節を受ける。酵素a、酵素b及び酵素cをコードする遺伝子のそれぞれにタグタンパク質として異なる色の蛍光タンパク質（緑色、青色及び赤色）又はその一部をコードする遺伝子が対応して、一緒にプロモーター変異体による発現の調節を受ける。具体的には、プロモーター活性の強度が異なるプロモーター変異体、酵素、及びタグタンパク質をコードする配列を連結する（図２の上段）。酵素と蛍光タンパク質は、それぞれ独立して発現されるものであってもよいし、又は融合タンパク質として発現されるものであってもよい（図２の下段）。いずれの場合でも、タグタンパク質の量に基づいて酵素の発現量を求めることができる。図２に示したように、調節される複数の酵素それぞれに異なる色の蛍光を使用した場合、図３に示すように、発現された複数のタグタンパク質（すなわち複数の酵素）の量を同時に計測することができる。これにより、従来の方法で必要であったサンプリング手順を行うことなく、各酵素の最適量を確認することができる。
【００４０】
本発明に係る方法では、目的の化合物（最終産物）の合成量を測定する。さらに、場合により各反応段階の中間産物の合成量を測定してもよい。そのような中間産物及び化合物（最終産物）の測定は、対象となる中間産物及び化合物（最終産物）の種類に応じて異なるものであり、当業者であれば適当な方法を使用することができる。例えば、質量分析計（MS）、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）、液体クロマトグラフィ質量分析計（LC/MS）、NMR分析計、二次元電気泳動装置などを使用して、中間産物及び／又は化合物（最終産物）の合成量を測定又はモニターする（図４）。
【００４１】
図５に、酵素合成量の調節により化合物合成の条件を最適化する概念図を示す。具体的には以下のようになる。これは3段階の触媒反応を含む代謝経路で中間産物及び最終産物を合成する場合である。野生型プロモーター配列を使用した場合のタンパク質発現量を基準にする（100％）。酵素A、酵素B及び酵素Cの合成量を調節（図５では10〜100％）した場合、生成される中間産物及び最終産物の量が変化する。例えば中間産物量と最終産物量を等しくする細胞株を構築することを目標とした場合には、酵素Aの合成量を10％に、酵素Bの合成量を90％に、酵素Cの合成量を100％に設定すればよいことがわかる。また例えば最終産物量が最大化する細胞株を構築することを目標とした場合には、酵素Aの合成量を10％に、酵素Bの合成量を20％に、酵素Cの合成量を20％に設定すればよいことがわかる。相対発現量と対応するプロモーター変異体を用いることで、酵素合成量の調節と産物量の最適化を簡便かつ迅速に実現することができる。このようにして、最適化された合成反応条件として、最適な酵素量（酵素比）が得られる。また場合により最適な反応時間を決定してもよい。
【００４２】
したがって、別の態様において、本発明は、上述した方法により最適化された合成反応条件において化合物を製造する方法を提供する。最適化された合成反応条件を使用する限り、化合物の製造は、細胞内であっても無細胞反応系であってもよい。安定的かつ大規模な化合物製造の点から、細胞内で化合物が製造されることが好ましい。したがって、上述した方法により最適化された合成反応条件を細胞において再現することによって、化合物合成が最適化された細胞株（スマートセル）を作出することができる。本発明では、最適な合成反応条件を迅速に、簡便にかつ微小量で決定した後、最適化された合成反応条件を使用して大規模に化合物を合成することが可能となる。
【００４３】
本発明に係る方法は、低分子化合物の合成に広く応用可能な制御手法である。合成可能な酵素範囲が広く、サンプリングする必要もない。多種のタグタンパク質（蛍光レポータ）により、リアルタイムで酵素の合成量を計測する。本発明の変数は少ないため、従来の手法と比べ、合成反応の制御を簡単にかつ迅速に行うことが可能となった。既存のデータを使用し、モデルの構築と産物量の推測が可能になる。細胞内の代謝制御と解析に応用することも可能である。
【００４４】
本発明に係る方法は、少なくとも1種のT7プロモーター変異体を含むキットを用いることによって、より容易かつ簡便に行うことができる。すなわち、一態様において、本発明は、一つ若しくは複数の反応段階を経て合成される化合物の合成反応条件を最適化するためのキットであって、以下：
TAATACGATTCACTATAGGG（配列番号1）、
TAATACGACCCACTATAGGG（配列番号2）、
TAATACGACTTACTATAGGG（配列番号3）、
TAATACGATCCACTATAGGG（配列番号4）、
TAATACGACCTACTATAGGG（配列番号5）、
TAATACGATTTACTATAGGG（配列番号6）、
TAATACGATCTACTATAGGG（配列番号7）、
TAATACGGCTCACTATAGGG（配列番号8）、
TAATACGACTCGCTATAGGG（配列番号9）、
TAATACGGCTCGCTATAGGG（配列番号10）、
TAATACGTCTCACTATAGGG（配列番号11）、
TAATACGCCTCACTATAGGG（配列番号12）、
TAATACGACTCTCTATAGGG（配列番号13）、及び
TAATACGACTCCCTATAGGG（配列番号14）
からなる群より選択される配列を含むプロモーターを少なくとも1種含むキットを提供する。
【００４５】
本発明に係るキットは、T7プロモーター変異体に加えて、野生型T7プロモーターを含んでもよい。これらのプロモーターは、発現ベクター中に存在するものとすることができる。例えば、発現ベクター中に、上記T7プロモーター変異体又は野生型T7プロモーターが挿入されており、必要であればマルチクローニング部位、タグタンパク質をコードする遺伝子、ターミネーター配列なども挿入される。これにより、合成反応条件を最適化させようとする化合物をコードする遺伝子をその発現ベクターに挿入するだけで、化合物の合成反応条件の最適化を簡便に行うことが可能となる。
【００４６】
本発明に係るキットは、化合物の合成反応条件の最適化を実施するにあたって必要な他の構成要素、例えばT7 RNAポリメラーゼ、基質などをさらに含んでもよい。また、化合物の合成反応条件の最適化を実施するための手順及びプロトコールを記載した説明書を含んでもよい。
【００４７】
さらなる態様において、本発明は、一つ若しくは複数の反応段階を経て合成される化合物を合成するための自動化装置であって、
反応容器と
酵素量計測装置と、
試薬格納部と、
産物量計測装置と、
制御部と
を備え、
前記反応容器において、各反応段階における一つ若しくは複数の酵素の、野生型及び／又は変異型プロモーターの制御下における発現と、前記酵素による反応基質から最終産物への合成反応とが行われるものである、自動化装置
を提供する。
【００４８】
図６に、無細胞タンパク質合成系を組み込んだ自動化装置の概略図を示す。自動化装置は、反応容器、酵素量計測装置、試薬格納部、産物量計測装置及び制御部から構成されている。
【００４９】
反応容器では、各反応段階における一つ若しくは複数の酵素の発現と、一つ若しくは複数の酵素による反応基質から最終産物への合成反応とが行われる。反応容器は、当技術分野で公知の任意のものを使用することができ、目的に応じて適当な大きさ及び材質を選択し得る。例えば、微小量で反応を行う場合には、ウエルを備えたプレート、例えば96ウエルプレートなどを使用し得る。あるいは、細胞内で反応を行う場合には、反応容器として細胞培養に適した容器を採用する。反応容器は、そこで行われる反応に最適な条件を設定するための温度制御部、pH制御部などと接続されてもよい。
【００５０】
試薬格納部には、反応容器で行われる反応に必要な試薬、例えば、野生型及び／又は変異型プロモーターの制御下で酵素を発現するためのベクター又は線状DNA、ポリメラーゼ、基質、出発物質、バッファー、培養培地などが格納される。
【００５１】
酵素量計測装置は、酵素量を測定できる装置であれば特に限定されるものではない。例えば、質量分析計（MS）、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）分光光度計、蛍光顕微鏡などを使用することができる。酵素量の測定は、好ましくは反応容器からの反応液のサンプリングを行うことなく、反応容器で行うことができるものである。
【００５２】
産物量計測装置は、反応容器で合成される化合物（最終産物）や中間産物の量を測定できる装置であれば等に限定されるものではない。例えば、質量分析計（MS）、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）、液体クロマトグラフィ質量分析計（LC/MS）、NMR分析計、二次元電気泳動装置などを使用することができる。
【００５３】
制御部は、直接的に又は無線を介して接続された各構成要素を制御するものであり、例えば、反応容器における酵素発現量の比率の調整、試薬格納部から反応容器への試薬の投入液量、タイミングなどの制御、酵素量計測装置からのデータの収集、反応容器における反応温度、時間などの制御、産物量計測装置からのデータの収集、反応容器からの産物量計測の制御のうちの少なくとも1つを制御する。例えば、制御部は、前記酵素量計測装置から収集した出力データに基づいて、反応容器における反応の温度及び時間、反応容器への投入試薬液量及びタイミングを制御するように構成される。制御部は、当技術分野で公知の任意の制御手段を使用することができ、例えばコンピュータとすることができる。
【００５４】
また、自動化装置は、出力装置を備えていてもよいし、あるいは外部の出力装置と接続されていてもよい。出力装置は、当技術分野で公知の任意の出力装置とすることができ、例えば画像および／またはデータ表示装置、警報装置、プリンターなどが挙げられる。さらに自動化装置は、収集したデータを記憶する記憶部を備えていてもよい。
【００５５】
別の態様において、本発明は、
（a）以下の配列：
TAATACGATTCACTATAGGG（配列番号1）、
TAATACGACCCACTATAGGG（配列番号2）、
TAATACGACTTACTATAGGG（配列番号3）、
TAATACGATCCACTATAGGG（配列番号4）、
TAATACGACCTACTATAGGG（配列番号5）、
TAATACGATTTACTATAGGG（配列番号6）、
TAATACGATCTACTATAGGG（配列番号7）、
TAATACGGCTCACTATAGGG（配列番号8）、
TAATACGACTCGCTATAGGG（配列番号9）、
TAATACGGCTCGCTATAGGG（配列番号10）、
TAATACGTCTCACTATAGGG（配列番号11）、
TAATACGCCTCACTATAGGG（配列番号12）、
TAATACGACTCTCTATAGGG（配列番号13）、若しくは
TAATACGACTCCCTATAGGG（配列番号14）；又は
（b）前記（a）の配列に対して1若しくは数個の塩基の欠失、置換若しくは付加を含み、かつプロモーター活性を有する配列
を含むプロモーターを提供する。
【００５６】
配列番号1〜14の配列を含むプロモーターは、野生型T7プロモーターの変異体であり、実施例１においていずれも1.5％未満から126％のプロモーター活性を保持することが確認されている。そのため、目的に応じたプロモーター活性を有するプロモーターを選択して、所望のレベルでの遺伝子発現を行うことが可能となる。例えば、強力なプロモーターが望まれる場合には、プロモーター活性の高い配列番号9又は配列番号12の配列を有するプロモーターを使用し、一方、弱いプロモーターが望まれる場合（遺伝子発現の阻害若しくは抑制が望まれる場合）には、プロモーター活性の低い配列番号4〜7又は配列番号10の配列を有するプロモーターを使用し得る。ここでプロモーター活性とは、プロモーターの下流に発現可能な状態で遺伝子を連結し、宿主に導入した際、宿主内又は宿主外においてその遺伝子を転写する能力及び機能を有することをいう。上記（b）の配列、すなわち配列番号1〜14に対して1若しくは数個の塩基の欠失、置換若しくは付加を含む配列は、プロモーター活性を有していればよく、配列番号1〜14の配列からなるプロモーターが機能する条件と同一の条件でほぼ同様の利用が可能な程度のプロモーター活性が維持されていることをいう。例えば、配列番号1〜14の配列からなるプロモーター活性の約0.01〜100倍、好ましくは約0.5〜20倍、より好ましくは約0.5〜2倍の活性を維持する配列である。
【００５７】
このようなプロモーターは、配列番号1〜14の配列を参照すれば、当技術分野で公知の方法に従って調製することができる。例えば、化学合成により、プロモーター配列を有するオリゴヌクレオチドを簡便に合成することができる。あるいは、野生型T7プロモーターの配列（配列番号15）や変異体の配列（配列番号1〜14）を基にして、当該配列から欠失、置換若しくは付加を人為的に行う技術、例えば部位特異的突然変異誘発法により、プロモーター活性を維持しつつ配列の異なる変異体を作製することができる。
【００５８】
上記のように取得したプロモーターの変異体がプロモーターとしての活性を有するか否かは、以下のような手法により確認することができる。すなわち、上記のようにして得られるプロモーターのプロモーター活性は、好ましくは種々のレポーター遺伝子、例えばルシフェラーゼ遺伝子（LUC）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（CAT）、βガラクトシダーゼ遺伝子（GAL）等をプロモーターの下流域に連結したベクターを作製し、当該ベクターを無細胞反応系に添加した後又は当該ベクターを宿主細胞に導入した後、当該レポーター遺伝子の発現を測定することにより確認することができる。
【００５９】
本発明に係る発現ベクターは、適当なベクターに本発明に係るプロモーターを連結することにより得ることができる。また、発現ベクターには、遺伝子が機能的に連結されていてもよい。プロモーター（及び遺伝子）を挿入するためのベクターは、当技術分野で慣用的に使用されているベクターであれば特に限定されるものではなく、例えば、プラスミド、ウイルスベクター、バクテリオファージ、人工染色体ベクターなどが挙げられる。ベクターにプロモーター（及び遺伝子）を挿入するには、まず、精製されたDNAを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターDNAの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法等が採用される。
【００６０】
本発明に係るプロモーターは、遺伝子の機能が発揮されるように機能的にベクターに組み込まれることが必要である。機能的とは、プロモーターの制御下に遺伝子が発現されるように、遺伝子とプロモーターとが連結されてベクターに組み込まれることを意味する。好ましい実施形態では、本発明に係る発現ベクターには、プロモーターのほか、遺伝子、ターミネーター（T7ターミネーター）、所望によりエンハンサー等のシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリA付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（SD配列）等を連結することができる。
【００６１】
本発明に係る細胞は、本発明に係る発現ベクターを、遺伝子がプロモーターの制御下に発現し得るように宿主細胞中に導入することにより得ることができる。ここで、宿主細胞としては、本発明に係るプロモーターの制御下に遺伝子を発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、細菌（大腸菌など）、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞などを宿主細胞として使用することができる。宿主細胞への発現ベクターの導入方法は、当技術分野で公知の方法であれば特に限定されるものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、リポフェクション法、アグロバクテリウム法等が挙げられる。
【００６２】
本発明はさらに、本発明に係る発現ベクター又は本発明に係る細胞を用いて、本発明に係るプロモーターの制御下に遺伝子を発現させる方法を提供する。例えば、本発明に係る発現ベクターを無細胞反応系に添加することにより、又は本発明に係る細胞を培養することにより、発現ベクター上のプロモーターの制御下に遺伝子を発現させることができる。このような手法はいずれも当技術分野で慣用的に行われている操作であり、使用する無細胞反応系や細胞の種類などに応じて、当業者であれば適当な条件において本発明に係る方法を実施することができる。
【００６３】
以下に実施例を例示し、本発明を具体的に説明するが、この実施例は単に本発明の説明のために提供するものであり、本出願において開示する発明の範囲を限定したり制限したりするものではない。
【実施例】
【００６４】
［実施例１］
本実施例では、T7プロモーターにおけるT7 RNAポリメラーゼとの結合領域の塩基配列を変化させることで、野生型T7プロモーター配列におけるタンパク質発現量を基準とした場合に、相対発現量を1〜126％に変化した例を説明する。
【００６５】
本実施例で使用するT7プロモーターとT7 RNAポリメラーゼの共結晶構造を図７に示す。T7プロモーター配列の1番目のTから13番目のCまではT7 RNAポリメラーゼとの結合領域と呼ばれ、ポリメラーゼとの結合親和性とタンパク質の発現量に影響を与える。ここでは、T7プロモーターの3つの塩基CTC（9から11番目の塩基）に対して相補的な塩基配列部位が、RNAポリメラーゼの親水性アミノ酸と水素結合しているため、T7プロモーターのCTCの塩基配列が転写効率に特に影響を与えると考えた。そのため、T7プロモーターのCTCの塩基配列を中心として塩基置換をした変異体を複数設計した。
【００６６】
具体的には、プロモーターとして設計したT7プロモーターの変異体を有し、またレポータータンパク質として緑色蛍光タンパク質（GFP）を有するベクターについて説明する。プラスミドはpIVEX2.3 GFPwt（RTS 100 E. coli HY Kit付属, biotechrabbit GmbH）をバックボーンにした（図９の左側）。QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit（アジレント・テクノロジー株式会社）を用いて、設計した変異導入プライマーによりT7プロモーター配列に点変異を入れた。野生型配列と比べ、2塩基以上を置換する場合は複数回QuikChangeによる点変異を実施して作製した。具体的な変異体の配列は、図９の右側に示す通りであり、下線が変異箇所を表す。
【００６７】
次に、設計した複数のプラスミドを用いてGFPの発現量を評価した。評価には無細胞タンパク質合成反応液（大陽日酸販売の無細胞くんQuickキット）を用いて、反応液量20μLで蛍光タンパク質を合成し、GFPの蛍光強度をプレート分光光度計でリアルタイムに計測した。プロモーター配列の変異体を含むプラスミドを投入した後の、反応溶液におけるGFP蛍光強度の時間変化を図８に示す。図８から、野生型と変異体1〜14の蛍光強度の時間変化がわかる。
【００６８】
図９の右側及び以下に、T7プロモーター変異体を用いた場合の、計算されたGFP発現量比を示す。蛍光強度がプラトーになった時点における蛍光強度比を算出した。T7プロモーターの8番目から12番目の塩基に変異をいれたプロモーター変異体全14種類について示すと、野生型T7プロモーター配列（TAATACGACTCACTATAGGG：配列番号15）におけるタンパク質発現量を100％とした場合の発現量は、それぞれ以下の通りである：
【００６９】
変異体1（TAATACGATTCACTATAGGG：配列番号1）  発現量4％
変異体2（TAATACGACCCACTATAGGG：配列番号2）        10％
変異体3（TAATACGACTTACTATAGGG：配列番号3）        20％
変異体4（TAATACGATCCACTATAGGG：配列番号4）        1.5％以下
変異体5（TAATACGACCTACTATAGGG：配列番号5）        1.5％以下
変異体6（TAATACGATTTACTATAGGG：配列番号6）        1.5％以下
変異体7（TAATACGATCTACTATAGGG：配列番号7）        1.5％以下
変異体8（TAATACGGCTCACTATAGGG：配列番号8）        33％
変異体9（TAATACGACTCGCTATAGGG：配列番号9）        110％
変異体10（TAATACGGCTCGCTATAGGG：配列番号10）      7％
変異体11（TAATACGTCTCACTATAGGG：配列番号11）      88％
変異体12（TAATACGCCTCACTATAGGG：配列番号12）      126％
変異体13（TAATACGACTCTCTATAGGG：配列番号13）      80％
変異体14（TAATACGACTCCCTATAGGG：配列番号14）      36％
【００７０】
上述の通り作製したT7プロモーターの変異体には、同じポリメラーゼ、すなわちT7 RNAポリメラーゼが結合する。そのため、異なるT7プロモーター変異体をそれぞれ連結した複数の遺伝子を、同じポリメラーゼを使用して、すなわち同じ反応条件で、転写させ発現させることができ、簡便な操作で複数の遺伝子の発現を調節することが可能となる。
【００７１】
［実施例２］
本実施例では、実施例１に記載のように作製したT7プロモーターの変異体を利用して、化合物合成の反応条件を最適化する方法の一例について、図１０のフローチャートを用いて説明する。
【００７２】
図１０に本発明の全体像を示す。まず、T7プロモーター配列と化合物量関係のデータベースが存在する。多段階の代謝反応を通じて、目標化合物の合成量が設定されている。この化合物の合成量を達成するため、データベースの中から、多段階の代謝反応に使用する各酵素に対する適当なT7プロモーター配列を探す。酵素の発現量に応じた各T7プロモーター配列をデザインした後、このT7プロモーター配列が含まれたプラスミドに酵素とタグタンパク質をコードする配列を入れてベクターを構築する。構築したベクターを無細胞合成系に投入し、酵素とタグタンパク質を発現させる。その後、無細胞合成系内の各タグタンパク質と化合物の量を計測し、データ収集する。タグタンパク質量により、酵素の発現量が得られる。酵素発現量の比率と化合物量の関係を記録する。このとき目標化合物の量が最適化されているかどうかを判断する。
【００７３】
最適化された場合は、各酵素を適切な発現量で発現可能な本ベクターを用いて目的化合物の生産を実施する。目標化合物の量が最適化されていない場合は、サイクルの最初に戻し、各酵素の比率をデザインし直す。このとき、新しく得られた実験データを元にT7プロモーター配列と化合物量関係データベースを更新し、より適切な解が得られるようにする。なお、データーベースの更新は目標化合物の量が最適化されていない場合に限らず、必要に応じて実施する。このようにして、化合物合成反応の最適化を行う。
【図１】
2020137460.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2020137460.tif 000009
【図８】
2020137460.tif 000010
【図９】
2020137460.tif 000011
【図１０】
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【配列表】
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