(57)【要約】【課題】末梢血循環癌細胞を高い精度で検出することができる検出方法及び検出装置を提供する。【解決手段】末梢血循環癌細胞の検出方法は、被検試料中に含まれる標的細胞を濃縮する濃縮工程と、濃縮された被検試料を、上皮系細胞に発現する抗原以外の抗原であって標的細胞に特異的に発現する抗原に特異的に結合する抗体が第１の標識物質で標識された第１の標識抗体、及び標的細胞以外の他の成分に発現する表面抗原に結合する抗体が第２の標識物質で標識された第２の標識抗体と接触させて、標的細胞及び他の成分を標識する標識工程と、被検試料から、第１の標識抗体で標識され、かつ第２の標識抗体で標識されていない細胞を標的細胞として検出する検出工程と、を有する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検試料中に含まれる標的細胞としての末梢血循環癌細胞を検出する検出方法であり、
前記被検試料中に含まれる前記標的細胞を濃縮する濃縮工程と、
濃縮された前記被検試料を、上皮系細胞に発現する抗原以外の抗原であって前記標的細胞に特異的に発現する前記抗原に特異的に結合する抗体が第１の標識物質で標識された第１の標識抗体、及び前記標的細胞以外の他の成分に発現する抗原に結合する抗体が第２の標識物質で標識された第２の標識抗体と接触させて、前記標的細胞及び前記他の成分を標識する標識工程と、
前記被検試料から、前記第１の標識抗体で標識され、かつ前記第２の標識抗体で標識されていない細胞を前記標的細胞として検出する検出工程と、
を有することを特徴とする末梢血循環癌細胞の検出方法。
【請求項２】
前記標的細胞が、末梢血循環腎癌細胞であり、前記第１の標識抗体の前記抗体が、前記末梢血循環腎癌細胞に特異的に発現するＧ２５０抗原に特異的に結合する抗Ｇ２５０抗体であることを特徴とする請求項１に記載の末梢血循環癌細胞の検出方法。
【請求項３】
前記他の成分が、白血球を含む単核細胞であり、前記第２の標識抗体の前記抗体が、前記単核細胞の表面に発現するＣＤ４５抗原に結合する抗ＣＤ４５抗体であることを特徴とする請求項１又は２に記載の末梢血循環癌細胞の検出方法。
【請求項４】
前記上皮系細胞に発現する抗原が、ＥｐＣＡＭ、サイトケラチン、Ｅ−カドヘリン及びビメンチンのいずれかであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の末梢血循環癌細胞の検出方法。
【請求項５】
前記濃縮工程は、微小流路デバイス法により細胞の大きさの違いを利用して前記標的細胞を他の成分と分離して濃縮する工程であり、前記微小流路デバイス法では、前記被検試料が流れる少なくとも２層構造の流路を有し、前記流路間には、互いを連通する複数の連通路が設けられ、前記連通路を通って一方の前記流路から他方の前記流路に前記被検試料が流れるように構成され、前記連通路の一方の前記流路側に設けられた流入口のサイズが、前記標的細胞及び前記他の成分のサイズよりも大きく、他方の前記流路側に設けられた流出口のサイズが、前記標的細胞のサイズよりも小さくかつ前記他の成分のサイズよりも大きい微小流路デバイスを用いて前記標的細胞を濃縮することを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の末梢血循環癌細胞の検出方法。
【請求項６】
前記検出工程は、前記第１の標識物質及び前記第２の標識物質の蛍光又は発光信号に基づいて、フローサイトメトリーにより前記標的細胞を検出し、マイクロ流路を流れる細胞を空気圧制御により分離するFlow shift方式の分離法によって検出した前記標的細胞を分離する工程であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の末梢循環癌細胞の検出方法。
【請求項７】
既知の個数の基準標的細胞を混入した基準試料を濃縮し、前記第１の標識抗体及び前記第２の標識抗体と接触させた前記基準試料から、前記第１の標識抗体で標識され、かつ前記第２の標識抗体で標識されていない細胞を前記基準標的細胞としてフローサイトメトリーにより検出し、検出された前記基準標的細胞が包含されるようにゲーティングするゲーティング工程を有し、
前記検出工程では、前記ゲーティングに基づいて、前記被検試料に対して前記フローサイトメトリーにより前記標的細胞を検出することを特徴とする請求項６に記載の末梢循環癌細胞の検出方法。
【請求項８】
被検試料中に含まれる標的細胞としての末梢血循環癌細胞を検出する検出装置であり、
被検試料中に含まれる標的細胞を濃縮する濃縮部と、
上皮系細胞に発現する抗原以外の抗原であって前記標的細胞に特異的に発現する前記抗原に特異的に結合する抗体が第１の標識物質で標識された第１の標識抗体、及び前記標的細胞以外の他の成分に発現する抗原に結合する抗体が第２の標識物質で標識された第２の標識抗体と接触させて、前記標的細胞及び前記他の成分を標識した前記被検試料から、前記第１の標識抗体で標識され、かつ前記第２の標識抗体で標識されていない細胞を前記標的細胞として検出する検出部と、
前記検出部での検出結果及び所定のゲーティング情報に基づいて、前記標的細胞に関する表示画像を生成して表示部に表示する制御部と、を備えたことを特徴とする末梢血循環癌細胞の検出装置。
【請求項９】
前記ゲーティング情報の入力を受け付ける入力部を備え、
前記制御部は、既知の個数の基準標的細胞を混入した基準試料を前記濃縮部で濃縮し、前記第１の標識抗体及び前記第２の標識抗体と接触させた前記基準試料から、前記検出部が検出した前記基準標的細胞の検出結果に基づいて、前記表示画像を生成して前記表示部に表示し、前記表示画像に基づいて前記入力部により入力された前記ゲーティング情報を取得し、記憶部に記憶しておくことを特徴とする請求項８に記載の末梢血循環癌細胞の検出装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、末梢血循環癌細胞の検出方法及び検出装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、がん患者から癌組織を採取する組織生検に代わり、がん患者から採取した血液等を用いる「リキッドバイオプシー」と呼ばれる方法が注目されている。この「リキッドバイオプシー」として、末梢血中の末梢血循環癌細胞（ＣＴＣ：Circulating Tumor Cells、以下「ＣＴＣ」という。）を検出する末梢血循環癌細胞検査（ＣＴＣ検査）が重要視されている。ＣＴＣは、原発腫瘍組織または転移腫瘍組織から遊離し、血液中を循環する細胞であり、他の臓器への転移能を有すると考えられている。したがって、ＣＴＣ検査によって血液中に存在するＣＴＣの数を測定することは、癌の診断、予後診断、治療効果の判定、転移癌の早期発見、病勢の把握などが期待できることから、有効な検査方法である（例えば、非特許文献１参照）。
【０００３】
このＣＴＣ検査のための装置として、ＦＤＡ（Food and Drug Administration）の承認を唯一受けたCellSearch System（登録商標）が知られている。この装置は、上皮細胞接着分子であるＥｐＣＡＭ（Epithelial cell adhesion molecule、CD326）に対する抗体を結合した磁気ビーズを用いて血液中から特異的にＣＴＣを分離・抽出し、蛍光標識したサイトケラチンと反応させるとともに核染色を行う。また、混入した白血球とＣＴＣとを区別するため、蛍光標識したＣＤ４５抗体を反応させる。その後、磁場を利用して浮上させた細胞に、レーザービームを照射して蛍光画像を取得し、この蛍光画像に基づいて人間がＣＴＣであるか否かを判定する。この従来技術では、ＣＤ４５陽性細胞を白血球として除外し、ＥｐＣＡＭとサイトケラチンを発現している細胞をＣＴＣとして検出する（以上、例えば、特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Vaidyanathan R, Soon RH, Zhang P, Jiang K, Lim CT， “Cancer diagnosis: from tumor to liquid biopsy and beyond.”, Lab Chip. 2018 Dec 18;19(1):11-34. doi: 10.1039/c8lc00684a.
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第４４０９０９６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、上皮性がん細胞由来のＣＴＣは、上皮間葉転換（ＥＭＴ：Epithelial Mesenchymal Transition、以下「ＥＭＴ」という。）を起こすことがあり、これによりＥｐＣＡＭの発現が低下又は消失することが知られている。そのため、ＥｐＣＡＭ抗体を利用する上記従来技術では、ＥＭＴ現象を起こしたＣＴＣを検出できず、取り逃がしている可能性があるという問題があった。
【０００７】
本発明は、上記の事情に鑑みて為されたもので、末梢血循環癌細胞を高い精度で検出することができる検出方法及び検出装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記の目的を達成するため鋭意研究を重ねた結果、微小流路デバイスを用いて標的となるＣＴＣを濃縮し、この濃縮試料と、ＥｐＣＡＭ抗原以外の抗原であって標的となるＣＴＣに発現する抗原に特異的に結合する標識された抗体と、白血球を含む単核細胞（ＰＢＭＣ：Peripheral Blood Mononuclear Cell、以下「ＰＢＭＣ」という。）の表面抗原に特異的に結合する標識された抗ＣＤ４５抗体を接触させ、抗ＣＤ４５抗体陽性を発現する細胞を除去することで、ＥＭＴ現象を起こしたＣＴＣであっても高精度に検出できることを知見し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本開示に係る末梢血循環癌細胞の検出方法は、被検試料中に含まれる標的細胞としての末梢血循環癌細胞を検出する検出方法であり、前記被検試料中に含まれる前記標的細胞を濃縮する濃縮工程と、濃縮された前記被検試料を、上皮系細胞に発現する抗原以外の抗原 であって前記標的細胞に特異的に発現する前記抗原に特異的に結合する抗体が第１の標識物質で標識された第１の標識抗体、及び前記標的細胞以外の他の成分に発現する抗原に結合する抗体が第２の標識物質で標識された第２の標識抗体と接触させて、前記標的細胞及び前記他の成分を標識する標識工程と、前記被検試料から、前記第１の標識抗体で標識され、かつ前記第２の標識抗体で標識されていない細胞を前記標的細胞として検出する検出工程と、を有することを特徴とする。
【００１０】
また、本願に係る末梢血循環癌細胞の検出装置は、被検試料中に含まれる標的細胞としての末梢血循環癌細胞を検出する検出装置であり、被検試料中に含まれる標的細胞を濃縮する濃縮部と、上皮系細胞に発現する抗原以外の抗原であって前記標的細胞に特異的に発現する前記抗原に特異的に結合する抗体が第１の標識物質で標識された第１の標識抗体、及び前記標的細胞以外の他の成分に発現する抗原に結合する抗体が第２の標識物質で標識された第２の標識抗体と接触させて、前記標的細胞及び前記他の成分を標識した前記被検試料から、前記第１の標識抗体で標識され、かつ前記第２の標識抗体で標識されていない細胞を前記標的細胞として検出する検出部と、前記検出部での検出結果及び所定のゲーティング情報に基づいて、前記標的細胞に関する表示画像を生成して表示部に表示する制御部と、を備えたことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１１】
本開示によれば、末梢血循環癌細胞を高い精度で検出することができる検出方法及び検出装置を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】実施形態に係る末梢血循環癌細胞の検出方法の濃縮工程を説明するための説明図であり、（ａ）はＣＴＣを濃縮し捕獲している状態を示し、（ｂ）はＣＴＣを回収している状態を示す。
【図２】実施形態に係る末梢血循環癌細胞の検出方法の検出工程を説明するための説明図であり、検出工程を実行する検出装置の一例を示す。
【図３】本実施形態に係る末梢血循環癌細胞の検出方法を実行する末梢血循環癌細胞の検出装置の概略構成を示す図である。
【図４】実施例１における腎癌ＣＴＣの検出結果に基づく二次元プロットであり、（ａ）は検出されたすべての細胞の二次元プロットを示し、（ｂ）はゲーティングにより絞り込んだ腎癌ＣＴＣのみの二次元プロットを示し、（ｃ）は細胞のサイズをＸ軸のパラメータとしたときの二次元プロットを示す。
【図５】実施例１、２、３における腎癌ＣＴＣの同定率を示すグラフである。
【図６】実験例１における各癌細胞株と抗Ｇ２５０抗体との抗原抗体反応の結果を示すヒストグラムである。
【図７】実験例２における腎癌ＣＴＣの同定結果を示す二次元プロットである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、実施形態を説明する。本実施形態に係る末梢血循環癌細胞の検出方法（以下、「ＣＴＣの検出方法」ということがある。)は、被検試料中に含まれる標的細胞としての末梢血循環癌細胞を検出する検出方法であり、以下の工程を少なくとも含む。
【００１４】
（１）被検試料中に含まれる標的細胞を濃縮する濃縮工程。
（２）濃縮された被検試料を、上皮系細胞に発現する抗原以外の抗原であって標的細胞に特異的に発現する抗原に特異的に結合する抗体が第１の標識物質で標識された第１の標識抗体、及び標的細胞以外の他の成分に発現する表面抗原に結合する抗体が第２の標識物質で標識された第２の標識抗体と接触させて、標的細胞及び他の成分を標識する標識工程。
（３）被検試料から、第１の標識抗体で標識され、かつ第２の標識抗体で標識されていない細胞を標的細胞として検出する検出工程。
【００１５】
被検試料としては、がん患者やがんの疑いのある患者から採取されたものであれば、特に限定されるものではなく、末梢循環癌細胞を含む可能性のある被検試料を用いることができる。より具体的には、末梢循環癌細胞を含む可能性のある生体由来の液体試料であり、例えば、血液、尿、リンパ液、組織液、髄液、腹水、胸水等が挙げられる。これらの中でも、採血で簡単に採取できるという点で、末梢血が好適に挙げられる。
【００１６】
また、上記のような生体由来の液体試料そのものであってもよいし、これらの液体試料を生理食塩水等で希釈したもの、添加剤を加えたもの等であってもよい。
【００１７】
標的細胞としての末梢血循環癌細胞（ＣＴＣ）は、がん患者の血液中に極めて低濃度で検出される癌細胞であり、「抹消血循環腫瘍細胞」又は単に「循環癌細胞」、「循環腫瘍細胞」とも称される。本実施形態のＣＴＣの検索方法で検出されるＣＴＣとしては、特に限定されるものではないが、上皮性癌由来のＣＴＣの検出に好適である。
【００１８】
上皮性癌としては、例えば、膀胱癌、乳癌、大腸癌、直腸癌、腎癌、肝臓癌、肺癌、小細胞肺癌、食道癌、胆嚢癌、卵巣癌、膵臓癌、胃癌、子宮頸部癌、甲状腺癌、前立腺癌、扁平上皮癌、皮膚癌、十二指腸癌、腟癌、脳腫瘍が挙げられる。
【００１９】
実施形態のＣＴＣの検索方法では、ＥｐＣＡＭ抗体をターゲットとしていないため、ＥＭＴ現象によりＥｐＣＡＭの発現が低下又は消失したＣＴＣであっても、高精度に検出可能である。そして、これらの上皮性癌の中でも、未だ有効な腫瘍マーカーが存在しない腎癌（淡明細胞癌）、尿路上皮癌（膀胱癌、尿管癌、腎盂癌）等に由来するＣＴＣの検出に特に好適であり、特に、腎癌由来の末梢血循環腎癌細胞の検出に最適である。
【００２０】
被検試料に含まれる標的細胞以外の「他の成分」とは、ＣＴＣ以外の細胞を意味し、夾雑細胞とも称される。より具体的には、白血球（好酸球、好中球、好塩基球、単球、リンパ球）等の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、赤血球等が挙げられる。なお、ＰＢＭＣは濃縮工程で殆ど除去され、赤血球も濃縮工程や溶血によって除去されるため、濃縮後の被検試料中に含まれる「他の成分」は、主に残存ＰＢＭＣからなる。
【００２１】
以下、本実施形態のＣＴＣの検出方法の各工程、各工程で用いられる抗体、標識物質等について図面を参照しながら詳細に説明する。
【００２２】
（１）濃縮工程
濃縮工程は、被検試料中に含まれる標的細胞としてのＣＴＣを他の成分から分離して濃縮する工程である。濃縮工程の手法としては、特に限定されないが、微小流路デバイス法が好適に用いられる。この微小流路デバイス法は、微小流路デバイス（チップ）を用いて、細胞の大きさの違いを利用して標的細胞を他の成分と分離して濃縮する手法である。
【００２３】
この微小流路デバイス１は、図１に示すように、被検試料が流れる少なくとも２層構造の流路２ａ，２ｂを有し、流路２ａ，２ｂ間には、互いを連通する複数の連通路（トンネル）３が設けられている。この連通路３は、上流側の流入口４のサイズ（直径）が、標的細胞及び他の成分のサイズよりも大きく、下流側の流出口５のサイズ（直径）が、標的細胞のサイズよりも小さくかつ他の成分のサイズよりも大きい構成となっている。より具体的には、流入口４のサイズ（直径）を２５μｍとし、流出口５のサイズ（直径）を８μｍとする。また、連通路３は、一つの微小流路デバイス１に約５万個設けてある。
【００２４】
上述のような構成の微小流路デバイス１では、一方の流路２ａ内に上流側から被検試料Ｌを供給しつつ、他方の流路２ｂの下流側からシリンジ等で陰圧をかけることで、一方の流路２ａから他方の流路２ｂへの被検試料Ｌの流れが生成される。これにより、一方の流路２ａに供給された被検試料Ｌは、一方の流路２ａ内を下流に向かって流動し、連通路３を通って、一方の流路２ａから他方の流路２ｂに流出する。このとき、流出口５よりもサイズが小さい赤血球やＰＢＭＣ等の他の成分のみが、連通路３を通過して他方の流路２ｂ内に流出する。なお、赤血球は、公知の薬品を用いて溶血除去しておいてもよい。
【００２５】
これに対して、流出口５よりもサイズの大きいＣＴＣは、流出口５を通過することができず、図１（ａ）に示すように、連通路３内に捕獲される。次いで、被検試料Ｌの供給が完了した後、図１（ｂ）に示すように、他方の流路２ｂから一方の流路２ａへの流れを生成することで（Back Flash）、ＣＴＣを回収できる。このように、細胞の大きさの違いを利用してＣＴＣと他の成分とを分離することで、抗原抗体反応に依存することなく、物理的に高効率でＣＴＣの濃縮を行なえる。
【００２６】
濃縮工程を行う濃縮装置としては、特に限定されないが、上記のような微小流路デバイス１を用いた濃縮装置として、例えば、Celsee（登録商標）が好適に用いられる。これにより、ＣＴＣをより簡便に、効率的かつ迅速に濃縮できる。
【００２７】
（２）標識工程
標識工程は、濃縮された被検試料の標的細胞（ＣＴＣ）及び他の成分（ＰＢＭＣ）を、第１の標識抗体及び第２の標識抗体と接触させて、各細胞を標識（マーキング）する工程である。この工程により、標的細胞としてのＣＴＣが第１の標識抗体によって標識され、標的細胞以外の他の成分としてのＰＢＭＣが第２の標識抗体によって標識される。
【００２８】
標識工程は、公知の手法を用いることがでる。例えば、被検試料に第１の標識抗体を添加し、４℃〜室温で数分〜数時間インキュベートする第１の標識工程と、被検試料に第２の標識抗体を添加し、４℃〜室温で数分〜数時間インキュベートする第２の工程とからなる。なお、第１の標識工程と第２の標識工程とは、同時に行ってもよいし、順次行ってもよい。順次行う場合は、第１の標識工程と第２の標識工程のいずれを先に行ってもよい。
【００２９】
［標的細胞に特異的に発現する抗原］
標的細胞としてのＣＴＣに特異的に発現する抗原は、ＥＭＴ現象によるＣＴＣ検出の低下を回避するため、上皮系細胞に発現する抗原以外の抗原とする。上皮系細胞に発現する抗原は、具体的にはＥｐＣＡＭ（上皮細胞接着分子）、サイトケラチン、Ｅ−カドヘリン及びビメンチン等の抗原以外の抗原、特にＥｐＣＡＭ抗原以外の抗原とする。本実施形態においてターゲットとなる抗原として、これらＥｐＣＡＭ抗原等以外であれば、特に限定されるものではなく、それぞれの癌に特異的に発現する抗原であればよい。具体的には、例えばＣＴＣが末梢血循環腎癌細胞である場合には、腎癌に特異的に発現するＧ２５０抗原が最も好適に挙げられる。
【００３０】
［他の成分に発現する表面抗原］
濃縮工程によって、ＣＴＣ以外の他の成分は殆ど除去されており、残留する他の成分は、白血球を含む単核細胞ＰＢＭＣである。このＰＢＭＣに発現し、ターゲットとする抗原としては、特に限定されないが、例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２９、ＣＤ３３、ＣＤ３６、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ５６、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ６６ｅ、ＣＤ６９、ＣＤ１２４等が好適に挙げられる。この中でも、ＰＢＭＣの殆どに存在していることから、ＣＤ４５が最も好適に挙げられる。
【００３１】
［第１の標識抗体及び第２の標識抗体］
第１の標識抗体は、第１の標識物質によって標識（マーキング）され、上記「標的細胞に特異的に発現する抗原」に特異的に結合する抗体から構成される。この抗体は、ＣＴＣには存在するが、ＰＢＭＣには存在しない抗原に対する抗体である。例えば、ＣＴＣが末梢血循環腎癌細胞である場合には、腎癌に存在するＧ２５０抗原に特異的に結合する抗Ｇ２５０抗体が好適に挙げられる。
【００３２】
第２の標識抗体は、第２の標識物質によって標識（マーキング）され、上記「他の成分」に発現する表面抗原に結合する抗体から構成される。この抗体は、ＣＴＣに存在せずＰＢＭＣに存在する抗原に結合する抗体であり、前述したＰＢＭＣの表面抗原に結合する抗体が好適に用いられる。これらの中でも、ＰＢＭＣを識別するのに最も好適な抗原がＣＤ４５であることから、抗体として抗ＣＤ４５抗体が最も好適に挙げられる。
【００３３】
第１の標識抗体及び第２の標識抗体は、ポリクローナル抗体であってもよいし、モノクローナル抗体であっても組換え抗体であってもよい。また、これらの抗体の抗原結合部位を有する抗体フラグメント等であってもよい。抗体フラグメントとしては、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、又はＦｖ等が挙げられる。
【００３４】
第１の標識抗体の第１の標識物質及び第２の標識抗体の第２の標識物質としては、特に限定されるものではなく、公知の標識物質が用いられる。これらの標識物質として、例えば、蛍光色素、蛍光タンパク質、発光酵素等が好適に挙げられる。
【００３５】
蛍光色素としては、例えば、Alexa Fluorシリーズ（Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 647等）、Brilliant Violetシリーズ（BV421、BV570等）、BODIPYシリーズ（BODIPY FL、BODIPY TR等）、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＰＥ−Ｃｙ７、ＦＩＴＣ（fluorescein isothiocyanate）、ＰＥ、ＰｅｒＣＰ、クマリン系蛍光色素等が好適に挙げられる。蛍光タンパク質としては、例えば、フィコシアニン、アロフィコシアニン、フィコエリスリン、フィコエリスロシアニン等が好適に挙げられる。発光酵素としては、例えば、ルシフェラーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等が好適に挙げられる。
【００３６】
（３）検出工程
検出工程は、上記標識工程により標識された被検試料に含まれる細胞に対して、第１の標識抗体で標識され、かつ第２の標識抗体で標識されていない細胞を標的細胞（ＣＴＣ）として検出する工程である。
【００３７】
検出工程の手法としては、特に限定されないが、細胞の検出だけでなく、細胞の単離もできることから、例えば、第１の識別物質及び第２の識別物質の蛍光又は発光信号に基づいて、フローサイトメトリーにより行うことが望ましい。
【００３８】
フローサイトメトリーとは、細胞を一列に並べて流し、分光学的手法により細胞の数をカウントする技術である。例えば、蛍光や発光酵素によって標識された細胞にレーザー光を照射し、これによって細胞から発せられる蛍光又は発光信号をフォトダイオード等の検出器で検出することで、標的細胞の数をカウントする。また、検出器での検出結果をコンピュータに取り込んで、二次元プロットを生成して表示することもできる。これにより、標的細胞の有無、及びその数等を容易に把握できる。
【００３９】
また、フローサイトメトリーで検出した標的細胞を分離（セルソーティング）する方式として、例えば、標的細胞を含む液滴を荷電して流れる方向を制御し、標的細胞を分取する方式（Jet in Air方式）等を用いてもよいが、Flow shift方式がより好適に用いられる。Flow shift方式を用いることで、標的細胞をより高い精度で検出し分離することが可能となる。Flow shift方式は、マイクロ流路を流れる標的細胞を、空気圧制御により分離する方式である。
【００４０】
図２を用いて、Flow shift方式を用いたフローサイトメトリー及びセルソーティングによる検出工程の概略を説明する。図２は、当該検出工程を実行する検出装置の概略構成を示す図である。図２に示すように、検出装置１０は、フローサイトメーター及びセルソーターとしての機能を備え、フローセル１１と、レーザー光源等からなる光照射部１２と、フォトダイオード等からなる検出部１３と、電磁弁及びポンプを有する加圧部１５と、加圧部１５を駆動制御する制御部１４と、目的の細胞が捕捉されるソーティングリザーバー１６と、廃液を貯留する廃液リザーバー１７とから概略構成される。フローセル１１は、十字状のマイクロ流路を有するマイクロ流路チップからなる。このマイクロ流路は、被検試料導入用流路１１ａと、シース液導入用流路１１ｂと、合流流路１１ｃと、合流流路１１ｃの下流に設けられて合流流路１１ｃに直角に交差する分岐流路１１ｄと、を有している。
【００４１】
上記検出装置１０では、被検試料導入用流路１１ａを流れる被検試料と、シース液導入用流路１１ｂを流れるシース液とが合流流路１１ｃで合流することで、流体力学的絞り込み（hydrodynamic focusing）により、非常に細い被検試料の流れを生成でき、これにより細胞を一列に並べて流すことができる。
【００４２】
そして、合流流路１１ｃを流れる被検試料に対して、光照射部１２からレーザー光を照射することで、第１、第２の識別物質で識別された細胞から蛍光又は散乱光が発生する。この蛍光又は散乱光を、検出部１３が検出し、これらの信号強度に基づいて標的細胞（ＣＴＣ）とその他の成分（ＰＢＭＣ）とを識別し、標的細胞を検出する。
【００４３】
また、検出部１３での検出結果は制御部１４に送出され、制御部１４は、検出結果及び目的に応じたヒストグラム、二次元プロット、三次元プロット等をモニタ等の表示部に表示する。また、制御部１４は、検出結果に基づいて、標的細胞が合流流路１１ｃと分岐流路１１ｄとの交差部分を通過する瞬間に、電磁バルブを制御してポンプを作動させ、分岐流路１１ｄの両側からＰｕｓｈとＰｕｌｌの圧力を加える。これにより、標的細胞が分岐流路１１ｄに移動し、ソーティングリザーバー１６に回収される。一方、標的細胞以外の他の成分は、そのまま合流流路１１ｃを流下し、廃液リザーバー１７に回収される。このような検出装置１０により、ＥｐＣＡＭに依存することなく、標的細胞を迅速かつ簡便に検出及び分離できる。
【００４４】
上述のような検出装置１０として、例えば、株式会社オンチップ・バイオテクノロジーのOn-Chip Sort（登録商標）が好適に用いられる。On-chip Sortを用いることで、標的細胞を高い精度で検出できるだけでなく、細胞へのダメージが抑制される、無菌環境下での分収が実現できる、培養液中でも分収が可能である、微量サンプルに対応できる、クリーンベンチ内に設置可能である等の有利な効果を奏することができる。
【００４５】
（その他の工程）
また、本実施形態のＣＴＣの検出方法では、既知の個数の基準標的細胞を混入した基準試料を用いて、フローサイトメトリーによって基準標的細胞を検出し、この検出結果に基づいて、ゲーティングを予め行うゲーティング工程を含んでいてもよい。
【００４６】
このゲーティング工程では、まず基準標的細胞として、培養した既知の個数の癌細胞を、健康体から採取した末梢血にスパイクして基準試料を得る。得られた基準試料に対して、前述の（１）の濃縮工程、（２）の標識工程を行った後、（３）の検出工程と同様の工程で、第１の標識抗体で標識され、かつ第２の標識抗体で標識されていない細胞を基準標的細胞としてフローサイトメトリーにより検出する。この検出結果（ヒストグラム、二次元プロット）に基づいて、基準標的細胞が存在する領域を指定して、ゲーティングを行う。
【００４７】
そして、被検試料に対してＣＴＣの検出を行う際には、（３）の検出工程で、ゲーティング工程により得られたゲーティングに基づいて、被検試料に対してフローサイトメトリーにより標的細胞を検出する。これにより、より確実かつ効率的に標的細胞を検出できる。
【００４８】
以上、本実施形態のＣＴＣの検出方法では、濃縮工程によって被検試料中に含まれる標的細胞（末梢血循環癌細胞）を濃縮することで、標的細胞以外のその他の成分（例えばＰＢＭＣ）を効率的に除去できる。また、標識工程によって、第１の識別抗体で標的細胞を標識し、第２の識別抗体で標的細胞以外のその他の成分を標識できる。第１の標識物質と第２の標識物質とを異なる標識物質とすることで、標的細胞とそれ以外の成分とを容易に区別することができる。これにより、次の検出工程で、被検試料から、第１の標識物質で標識され、かつ第２の標識抗体で標識されていない細胞を標的細胞として容易かつ確実に検出できる。
【００４９】
また、標的細胞の抗原として、ＥｐＣＡＭ抗原等の上皮系細胞に発現する抗原以外の抗原であって標的細胞に特異的に発現する抗原をターゲットとし、この抗原に特異的に結合する第１の標識抗体を結合させている。したがって、本実施形態のＣＴＣの検出方法では、ＥｐＣＡＭに依存することがなく、ＥＭＴを起こした癌細胞であっても高い精度で検出できる。その結果、末梢血循環癌細胞の検出精度をより高めることができる。
【００５０】
本実施形態のＣＴＣの検出方法は、末梢血循環腎癌細胞（腎癌ＣＴＣ）の検出に特に有効である。末梢血循環腎癌細胞に特異的に発現するＧ２５０抗原に特異的に結合し第１の標識物質で標識された抗Ｇ２５０抗体を第１の標識抗体とすることで、ＥｐＣＡＭに依存することなく、高い精度で末梢血循環腎癌細胞を検出できる。また、被検試料に含まれるＰＢＭＣを除外するべく第２の標識抗体として、第２の標識物質で標識された抗ＣＤ４５抗体を用いることで、Ｇ２５０陽性、かつＣＤ４５陰性の細胞を、末梢血循環腎癌細胞として高い精度で容易に検出できる。
【００５１】
次に、上記した本実施形態に係る末梢血循環癌の検出方法を実施するための末梢血循環癌の検出装置の実施形態について、図面を参照しながら説明する。図３は、末梢血循環癌の検出装置の一実施形態としてのＣＴＣ検出装置１００の全体構成を示す概略図である。
【００５２】
図３に示すように、本実施形態に係るＣＴＣ検出装置１００は、濃縮部２０と、標識部２１と、検出部２２と、制御部２３と、表示部２４と、入力部２５と、記憶部２６とから主に構成される。
【００５３】
濃縮部２０は、検試料中に含まれる標的細胞を濃縮する濃縮工程を実行する。濃縮部２０としては、例えば、図１に示す微小流路デバイス１を用いることができる。
【００５４】
標識部２１は、被検試料に第１の識別抗体及び第２の識別抗体を接触させて被検試料を標識する標識工程を実行する。標識部２１は、被検試料が収容されたフラスコ等に、自動で第１の識別抗体及び第２の識別抗体を投入する構成でもよいし、人手により投入する構成でもよい。
【００５５】
検出部２２は、第１の識別抗体及び第２の識別抗体と接触させた被検試料から、標的細胞を検出する検出工程を実行する。検出部２２としては、例えば、図２に示す検出装置１０を用いることができる。
【００５６】
制御部２３は、ＣＰＵ等から構成される。制御部２３は、記憶部２６に記憶されたプログラムを、例えばＲＡＭ上に展開することで、ＣＴＣ検出装置１００全体の動作を制御する。また、制御部２３は、検出部２２での検出結果及び記憶部２６に記憶されたゲーティング情報基づいて、標的細胞に関する表示画像（例えば、ヒストグラムや二次元プロット）を生成して表示部２４に表示する。
【００５７】
制御部２３は、表示部２４や入力部２５を備えたパーソナルコンピューター等の情報処理装置に設けられていてもよい。また、検出部２２として図２に示すような検出装置１０を用いる際には、検出装置１０の制御部１４を、制御部２３として機能させてもよい。
【００５８】
表示部２４は、ヒストグラム等の表示画像が表示される。入力部２５は、ゲーティング情報の入力を受け付ける。表示部２４は、液晶ディスプレイや有機ＥＬＴ等のタッチパネルディスプレイを用いることができる。この表示部２４には、画像等が表示される表示面に重畳して、タッチパネル式の入力部２５が設けられている。また、入力部２５として、マウス、キーボード等が設けられている。
【００５９】
記憶部２６は、例えば、ＲＯＭ（Read Only Memory）、ＲＡＭ（Random Access Memory）、フラッシュメモリ、ハードディスクなどから構成される。記憶部２６には、ＣＴＣ検出装置１００の動作に必要な各種プログラム、パラメータ等の各種情報が記憶される。また、記憶部２６には、ゲーティング情報、ＣＴＣの検出結果等が記憶される。
【００６０】
上述のような構成のＣＴＣ検出装置１００では、被検試料が濃縮部２０によって濃縮され、標識部２１で第１の標識抗体及び第２の標識抗体と接触される。次いで、標識後の被検試料が検出部２２に供給されることで、検出部２２によってＣＴＣが検出され、分離される。制御部２３は、検出部２２の検出結果に基づいて、所定のヒストグラム等を生成し、表示部２４に表示する。このとき、制御部２３は、検出された各細胞をゲーティングして、ＣＴＣのみのデータを表示してもよい。これにより、検出されたＣＴＣの数等を、より明確に把握できる。
【００６１】
ゲーティング情報は、予め決められて記憶部２６に記憶されたものを用いてもよいし、ユーザが表示画像を視認しながら、入力部２５のタッチパネルのタッチ操作やマウスのクリック操作によって領域を指定し、この領域に存在する細胞集団のみを制御部２３が抽出してヒストグラム等を生成し表示してもよい。
【００６２】
ゲーティング情報を予め決める場合、既知の個数の基準標的細胞を混入した基準試料を用いて、ＣＴＣ検出装置１００により基準標的細胞を検出し、この検出結果に基づいて、ゲーティング情報を決めてもよい。より具体的には、基準試料を濃縮部２０で濃縮し、標識部２１で第１の標識抗体及び第２の標識抗体と接触させ、次いで基準試料から、検出部２２により第１の標識抗体で標識され、かつ第２の標識抗体で標識されていない細胞を基準標的細胞として検出する。制御部２３は、検出結果にも続いて、表示画像を生成して表示部２４に表示する。そして、ユーザが表示画像を視認しながら、入力部２５により標的細胞を包含する適切な領域を指定すると、指定された領域の座標を制御部２３が取得し、ゲーティング情報として記憶部２６に記憶する。なお、検出結果に基づいて、制御部２３がゲーティング情報を自動で生成して記憶部２６に記憶するものでもよい。
【００６３】
このように予め基準試料を用いてゲーティング情報を取得し、記憶部２６に記憶しておくことにより、被検試料について標的細胞の検出を行ったときに、標的細胞のみに関するヒストグラム等を、自動で、高精度かつ迅速に表示してユーザに提示できる。
【００６４】
上述のような構成のＣＴＣ検出装置１００は、CelseeとOn-Chip Sortを組み合わせて構成したものでもよいし、これらの機能を備えた一つの装置としたものでもよい。
【実施例】
【００６５】
以下、実施例により本実施形態を詳細に説明するが、本実施形態が、これら実施例により限定されるものではない。
【００６６】
（実施例１）
被検試料として、ＣＴＣを含むモデルサンプルを用いて、本実施形態のＣＴＣの検出方法により、ＣＴＣを検出した。
【００６７】
［被検試料の調整］
被検試料として、健常者から４ｃｃの末梢血を採取し、この末梢血に、１０個の腎癌細胞由来の末梢血循環腎癌細胞（以下、「腎癌ＣＴＣ」という。）をスパイク(混入)し、被検試料を調整した。腎癌細胞は、VMRC-RCWを使用した。
【００６８】
［第１の標識抗体の精製］
腎癌ＣＴＣのＧ２５０抗原を認識して結合する第１の識別抗体（抗Ｇ２５０抗体）として、Anti-Carbonic Anhydrase 9-PE human（Miltenyi Biotec GmbH社製）を用いた。
【００６９】
［第２の標識抗体の精製］
ＰＢＭＣに発現するＣＤ４５抗原を認識して結合する第２の識別抗体（抗ＣＤ４５抗体）として、PerCP anti-humanCD45（BioLegend社製）を用いた。
【００７０】
［被検試料の濃縮］
調整した被検試料を、Celseeを用いて濃縮した。
【００７１】
［細胞群の標識］
濃縮後の被検試料４ｃｃを遠心し、１００μＬ〜２００μＬのバッファーに懸濁した後に、第１の識別抗体（抗Ｇ２５０抗体）を１０μＬ添加し、次いで、第２の識別抗体（抗ＣＤ４５抗体）を５μＬ添加した。以上により、腎癌細胞とＰＢＭＣとを標識した。
【００７２】
［腎癌ＣＴＣの検出］
標識後の細胞集団を含む被検試料を、On-Chip Sortを用いてフローサイトメトリーにより分析し、腎癌ＣＴＣを検出した。図５に、検出結果に基づく二次元プロットを示す。図４（ａ）は、検出されたすべての細胞の二次元プロットである。この図４（ａ）に図示された多角形状の領域（ゲートリージョン）Ａ内の細胞は、抗ＣＤ４５抗体陽性の細胞、つまりＰＢＭＣであり、領域Ｂ内の細胞は、自家蛍光した細胞であり、領域Ｃ内の細胞は、抗Ｇ２５０抗体陽性の細胞、つまり腎癌ＣＴＣである。
【００７３】
この図４（ａ）の二次元プロットから、ゲーティングによってＰＢＭＣと自家蛍光細胞を除去し、領域Ｃ内の腎癌ＣＴＣのみを絞り込んで、図４（ｂ）に示す二次元プロットを作成した。この図４（ｂ）に図示した領域Ｄ内の細胞について、図４（ｃ）に示すように、サイズを横軸のパラメータとする二次元プロットを作成した。この図４（ｃ）で矩形状の領域Ｅ内の細胞が腎癌ＣＴＣであり、領域Ｅ外の細胞は、腎癌ＣＴＣ以外の成分（デブリ、ゴミ等）である。
【００７４】
この図４（ｂ）、図４（ｃ）によれば、１０個のスパイクした腎癌ＣＴＣのうち、９個が検出された。この実施例１の結果から、本実施形態の末梢血循環癌細胞の検出方法及び検出装置によれば、末梢血循環癌細胞を高い精度で検出できることが示された。
【００７５】
（実施例２、実施例３）
健常者の抹消血４ｃｃに、それぞれ２０個、４０個の腎癌ＣＴＣをスパイクして、実施例２、実施例３の被検試料を調整した。これら実施例２、実施例３の被検試料に対して、上記実施例１と同様の手順により、濃縮、標識及び腎癌ＣＴＣの検出を行った。
【００７６】
上記実施例１〜実施例３での検出結果に基づく腎癌ＣＴＣの同定率のグラフを図５に示す。このグラフ中、Ｘ軸の「混和細胞数」は末梢血中にスパイクした腎癌細胞の数であり、Ｙ軸の「同定細胞数」は各実施例で実際に検出された腎癌ＣＴＣの数である。この図５のグラフの結果からわかるように、本実施形態によれば、末梢血中の腎癌ＣＴＣを９０％〜１００％の高い確率で検出できる。
【００７７】
（実験例１）
実験例１として、腎癌のマーカーとしてＧ２５０抗原が有効であることを検証するための検証実験を行った。この実験例１では、腎癌細胞株（OS-RC02及びVMRC-RCW）、前立腺癌細胞株（DU145、LNCap）、膀胱癌細胞株(T24、KK47)に、抗Ｇ２５０抗体を接触させた。その抗原抗体反応の結果を図６に示す。この図６の結果によれば、腎癌細胞株は１００％に近い確率で、抗Ｇ２５０抗体に対して陽性を示した。したがって、腎癌ＣＴＣの検出に、抗Ｇ２５０抗体が有効であることが明らかである。
【００７８】
（実験例２）
実験例２として、抗Ｇ２５０抗体を用いることで、ＥＭＴを起こしたＣＴＣであっても高い精度で検出できることを検証するための検証実験を行った。この実験例２では、健常者の末梢血４ｃｃに、腎癌細胞樹立株であるVMRC-RCWをそれぞれ５０個と１００個をスパイクして、実験試料１、２を調整した。
【００７９】
実験試料１、２に対して、溶血後、抗ＣＤ４５抗体でコーティングした磁性ビーズを用いて白血球を除去し、腎癌ＣＴＣを濃縮した。その後、腎癌ＣＴＣに対する、抗Ｇ２５０抗体の特異性と、抗ＥｐＣＡＭ抗体の特異性とを比較するため、ＦＩＴＣで標識した抗Ｇ２５０抗体及びＰＥで標識した抗ＥｐＣＡＭ抗体と反応させた。また、ＰＢＭＣとの識別のため、ＰＥ−Ｃｙ７で標識した抗ＣＤ４５抗体とも反応させた。
【００８０】
標識後、On-Chip Sortを用いて腎癌ＣＴＣとＰＢＭＣの識別を行った。抗ＣＤ４５抗体陰性かつ抗Ｇ２５０抗体陽性の細胞を、腎癌ＣＴＣとしてカウントした。腎癌ＣＴＣの同定結果（検出結果）を図７に示す。この図７の紙面上段の二次元プロットによれば、Ｇ２５０抗原をターゲットとすることで、腎癌ＣＴＣを高い精度で検出できることがわかる。
【００８１】
また、図７の紙面下段の二次元プロットにおいて、抗ＣＤ４５抗体陰性かつ抗ＥｐＣＡＭ抗体陽性の細胞を腎癌ＣＴＣとしてカウントすると、実験試料１では５０個中３２個、実験試料２では１００個中３５個の腎癌ＣＴＣが除外されてしまう。これらはＥＭＴを起こした細胞であるため、検出されなかったと推測される。これに対して、抗ＣＤ４５抗体陰性かつ抗Ｇ２５０抗体陽性の細胞を腎癌ＣＴＣとしてカウントすると、実験試料１では５０個中３８個（７６％）、実験試料２では１００個中７５個（７５％）の確率で腎癌ＣＴＣを検出できることがわかった。つまり、ＥＭＴを起こした細胞でも高い精度で検出できることがわかった。
【００８２】
以上の結果より、腎癌ＣＴＣの検出に、Ｇ２５０抗原をターゲットとして、抗Ｇ２５０抗体を用いることが極めて有効であることがわかった。
【００８３】
以上、本発明の実施形態及び実施例を詳述してきたが、上記実施形態及び各実施例は本発明の例示にしか過ぎないものであり、本発明は上記実施形態及び各実施例の構成にのみ限定されるものではない。本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計の変更等があっても、本発明に含まれる。
【産業上の利用可能性】
【００８４】
また、本発明の末梢血循環癌細胞の検出法用及び検出装置によれば、末梢血循環癌細胞を高い精度で検出できるため、検出結果を癌の診断、予後診断、治療効果の判定、転移癌の早期発見、病勢の把握等に好適に利用できる。これにより、抗がん剤その他のがん治療の効果がより期待される患者の特定、特定の副作用が発現するおそれの高い患者の特定、抗がん剤等の用法・用量の最適化又は投与中止の判断等を適切に実施できる。また、新たなバイオマーカーや検査キットとしての利用、コンパニオン診断薬の効果の予測等、コンパニオン診断の分野にも応用できる。
【符号の説明】
【００８５】
１  微小流路デバイス（濃縮部）    １０  検出装置（検出部）
２０  濃縮部    ２１  標識部    ２２  検出部    ２３  制御部    ２４  表示部
２５  入力部    ２６  記憶部
１００  ＣＴＣ検出装置（末梢血循環癌細胞の検出装置）    Ｌ  被検試料
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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