(57)【要約】【課題】皮膚生理的老化現象に近い状態に細胞を積極的に誘導することにより、表皮組織における老化の評価方法を提供すること。【解決手段】分化能を有する表皮角化細胞及びヒト３次元培養表皮モデルを培養する際、老化した線維芽細胞の分泌因子を含んだ培地を用いることにより、表皮を生理的老化状態に積極的に誘導させ、この再現老化モデルのバリア機能低下としてＴＥＷＬ(水分蒸散量)及び角化不全として角化関連遺伝子の遺伝子発現量を指標とすることを特徴とする、表皮組織における老化の評価方法を可能とした。  【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
老化した皮膚線維芽細胞の分泌因子により誘導された、表皮組織における老化の評価方法であって、表皮組織のバリア機能低下及び角化不全を指標にした方法。
【請求項２】
上記表皮組織が、表皮角化細胞及び／又はヒト３次元培養表皮モデルである請求項１に記載の表皮組織における老化の評価方法。
【請求項３】
上記表皮組織のバリア機能低下の指標が、ＴＥＷＬ(水分蒸散量)であり、角化不全の指標が角化関連遺伝子のＺＯ１、ＦＬＧ、ＫＲＴ１０、ＫＲＴ１４からなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子発現である請求項１〜２のいずれか一項に記載の表皮組織における老化の評価方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の表皮組織における老化の評価方法を用いた抗皮膚生理老化素材のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、生理的老化現象に近い状態で細胞を積極的に老化誘導することによる、表皮組織における老化の評価方法に関する。より詳細には、老化した線維芽細胞の分泌因子を添加した表皮角化細胞及びヒト３次元培養表皮モデルを培養することで、皮膚の生理的老化現象に近い状態の再現を可能とし、この再現老化モデルによる、表皮組織のバリア機能低下及び角化不全を指標にした表皮組織における老化の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は最外層から順に表皮、真皮、皮下組織の三層構造をとっている。表皮は表皮細胞（表皮角化細胞）で構成されており、さらに上層は表皮細胞が分化（角化）した角質細胞が堆積した角質層（角層）で覆われている。真皮は線維芽細胞と細胞外基質成分から構成される。皮下組織は大部分が脂肪細胞で構成される。とりわけ、真皮に存在する線維芽細胞は皮膚のハリや弾力に寄与する膠原繊維や弾性繊維を産生することから、従来から老化評価に利用されてきた。
【０００３】
一方で、寿命の長期化や美容促進のための抗老化剤や老化抑制剤の開発が望まれており、その評価のためには老化モデルが必要不可欠となっている。皮膚の老化は、外因的、内因的影響を受けながら進行する複合的な現象である。紫外線による外的因子で進行する光老化とは異なり、内因的老化要素となる生理的老化（自然老化）に関する報告は多くはない。これは、遺伝的素因や生活習慣の影響が個体差を大きくし、また、その外観的変化までに長期間を要するなど、適切な皮膚生理的老化モデルが乏しいことが一因と考えられる。
【０００４】
そのため、皮膚真皮組織の線維芽細胞のような分裂能を有する細胞において、細胞単位の老化である細胞老化現象を生体の老化と見立て、in vitroで皮膚の生理的老化を評価する方法が採用されている。これは、加齢に伴う生体の老化現象は、細胞単位の変化を伴い進行しており、細胞老化もまた、その変化の一つと位置づけられることに起因する。細胞老化は、有限の分裂能をもつ正常細胞を繰り返し継代し分裂を重ねた分裂限界付近において確認され、特に複製による細胞老化と呼ばれる。
【０００５】
また、薬剤処理や紫外線、放射線、酸化ストレスなどを与えることでも細胞老化は誘導されることが知られている。細胞老化の起因については、様々な仮説が提唱されているが、その分子機構はまだ分かっていない。
【０００６】
これまでに細胞老化マーカーであるＳＡ−β−Ｇａｌ活性陽性の細胞を計数し、老化の程度を判断することによる老化抑制物質の開発等が行われている（特許文献１）。
【０００７】
しかし、特許文献１に記載の皮膚の老化度の判定は、真皮組織、もしくは分裂能を有する真皮線維芽細胞における老化現象であり、皮膚最外層の表皮組織に関する老化現象を評価したものではない。
【０００８】
表皮組織は表皮細胞で構成されており、表皮基底層に存在する表皮幹細胞から分裂した未分化状態の表皮細胞は分化（角化）に伴い表層へと押し出され、角質細胞へと最終分化した後、垢となって剥がれ落ちる。そのため、分化能を有する表皮細胞は、真皮線維芽細胞とは異なり、基本的には細胞の複製に伴う細胞老化は誘導されないと考えられている。
【０００９】
皮膚表皮組織の重要な働きの一つとして、体内からの過剰な水分の蒸散を抑えて乾燥から生体を守るバリア機能が知られている。また、皮膚最外層の角層は表皮細胞の分化（角化）の状態を反映するとされ、この角化が正常に機能しない状態を角化不全と呼び、角化不全が進行すると、結果として、皮膚の乾燥や肌荒れなどの症状として現れる。
【００１０】
表皮組織のバリア機能の評価としては、細胞レベルにおいては、角化細胞の角化関連遺伝子の発現を確認し、角層の成熟度を指標とする方法が知られている。また、組織レベルにおいては、3次元培養表皮モデルやヒト皮膚を用いて、水分蒸散量の測定によるバリア機能評価が知られている。
【００１１】
表皮細胞の角化不全の評価としては、表皮細胞における角化関連遺伝子の発現状態を確認する方法が知られている。
【００１２】
しかし、これらはいずれも、表皮細胞のみで構成された単一細胞、または単一組織の現象を見ているに過ぎずない。また、真皮など、複数の組織で構成される皮膚の生理的老化時の表皮組織における老化の実態を反映したものとは言い難く、このようなモデルの構築が求められていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】特開２００５−４６１１７号公報（[００５１]、図１３(a)）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
そこで、この発明の課題は、上記の問題点を解決し、皮膚生理的老化現象に近い状態の表皮組織における老化の評価方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
上記の課題を解決するために、本発明者が鋭意研究を重ねた結果、老化した線維芽細胞の分泌因子を含有する培養上清を分取し、この培養上清を添加し培養した表皮角化細胞及びヒト３次元培養表皮モデルのバリア機能低下及び角化不全を指標にした、表皮組織における老化の評価方法を見出し、本発明を完成するに至った。
【００１６】
すなわち、本発明の表皮組織における老化の評価方法は、分化能を有する表皮角化細胞及びヒト３次元培養表皮モデルを培養する際、老化した線維芽細胞の分泌因子を含んだ培地を用いることにより、表皮を生理的老化状態に積極的に誘導させ、この再現老化モデルのバリア機能低下としてＴＥＷＬ(水分蒸散量)及び角化不全として角化関連遺伝子の遺伝子発現量を指標とすることを特徴とする、表皮組織における老化の評価方法に関する。
この発明でいう「老化した線維芽細胞の分泌因子」は、老化した線維芽細胞から液体の培地中に分泌され、浮遊する細胞等が懸濁している液体培地から不溶性物質を沈殿させた上清に含まれる物質である。
老化した線維芽細胞の分泌因子を含有する培養上清を添加した培地で分裂能を有する細胞を培養すると、その細胞の老化は有意に誘導される。
【００１７】
老化した線維芽細胞の分泌因子としては、老化細胞の定量ＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子解析やＥＬＩＳＡ法によるタンパク質解析において、若齢細胞の分泌因子の組成と比較して量的に変動の認められる物質を採用することが、老化誘導分子をスクリーニングするにあたり指標となるので有利である。
【００１８】
また上記の表皮組織における老化の評価方法において、用いる表皮組織がヒト皮膚由来の表皮組織、表皮角化細胞またはヒト３次元培養表皮モデルであることが好ましい。
【００１９】
また上記の表皮組織における老化の評価方法において、バリア機能低下の指標が、ＴＥＷＬ(水分蒸散量)であり、角化不全の指標が角化関連遺伝子のＺＯ１、ＦＬＧ、ＫＲＴ１０、ＫＲＴ１４からなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子発現であることが好ましい。
【００２０】
この発明でいう「バリア機能低下」は、ヒト３次元培養表皮モデルにおいて、培養日数が増加すると角層形成の進行によりバリア機能がより強固になるため、培養日数とともにその水分蒸散量は低下するが、老化誘導によってその水分蒸散量の低下が抑制される状態を表す。
また「角化不全」は、表皮角化細胞における角化関連遺伝子の発現が老化様な状態を表す。
具体的には若齢細胞の分泌因子を含む培養上清 (ＥＰＣＭ；early passage conditioned medium)と老化細胞の分泌因子を含む培養上清(ＬＰＣＭ；late passage conditioned medium)をそれぞれ添加して培養した表皮角化細胞における角化関連遺伝子の発現量の差異を表す。
【発明の効果】
【００２１】
この発明は、老化した線維芽細胞の分泌因子を添加した液体培地で細胞を培養することによって、生理的環境に近い状態で細胞が老化誘導されるので、その老化誘導の影響を表皮組織のバリア機能低下及び角化不全を指標として判断すれば、効率的に表皮組織における老化を評価できる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】ＳＡ−β−Ｇａｌ活性陽性細胞数とＰＤＬの関係を示す図表
【図２】線維芽細胞における若齢細胞と老化細胞の定量ＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現解析を示す図表
【図３】線維芽細胞における若齢細胞と老化細胞の各培養上清に含まれるＴＮＦ−αの量を示す図表
【図４】線維芽細胞における若齢細胞と老化細胞の各培養上清に含まれるＩＬ−６の量を示す図表
【図５】線維芽細胞における若齢細胞と老化細胞の各培養上清のＳＡ−β−Ｇａｌ活性陽性細胞数と培養日数との関係を示す図表
【図６】線維芽細胞における若齢細胞と老化細胞の各培養上清のＳＡ−β−Ｇａｌ活性陽性細胞数とＰＤＬの関係を示す図表
【図７】線維芽細胞における若齢細胞と老化細胞の各培養上清を添加して培養したヒト３次元培養表皮モデルのＴＥＷＬ(水分蒸散量)を示す図表
【図８】線維芽細胞における若齢細胞と老化細胞の各培養上清を添加して培養した表皮角化細胞の遺伝子発現量を示す図表。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明の抗皮膚生理老化素材のスクリーニング方法では、いずれも老化した線維芽細胞の分泌因子を含有する培養上清を分取し、この培養上清を添加した培地で培養した分裂能を有する表皮角化細胞及びヒト３次元培養表皮モデルを使用する。
［老化した線維芽細胞の分泌因子の調整方法］
【００２４】
これらの発明に用いる老化した線維芽細胞は、細胞分裂回数の限界（ヘイフリック限界）または生物学的ストレスによって分裂を停止した細胞である。
細胞老化マーカーであるＳＡ−β−Ｇａｌ（Senescence-associated-beta-galactosidase）の活性化については、 X-gal染色または蛍光基質を用いて測定可能な市販の生化学アッセイキット（フナコシ社 、コスモ・バイオ社等の細胞老化アッセイ酸性βガラクトシダーゼ測定キット）などを用いて識別することができる。
【００２５】
そして、この発明において培養された細胞の促成効果の発現についての判定基準は、図１に示されるように染色されたＳＡ−β−Ｇａｌ活性陽性細胞の顕微鏡下での１視野あたりの細胞数の割合（％）、すなわち下記の数式においてＳＡ−β−Ｇａｌ活性（％）が２０％以上であることをもって有効と判断する。
このとき顕鏡倍率は、できるだけ多数の細胞数を確認できる倍率で観察することが好ましく、１００倍率で観察することがより好ましい。
【００２６】
[数１]
ＳＡ−β−Ｇａｌ活性（％）＝（顕鏡１視野あたりのSA-β-Gal活性陽性細胞数／前記同顕鏡１視野あたりの全細胞数）×１００
【００２７】
本発明で使用する細胞は、ヒトまたはヒト以外の動物の組織由来のものであって樹立された細胞株であってもよく、ヒトまたはヒト以外の動物の組織や器官から直接取り出して培養された初代培養細胞であっても良い。
【００２８】
細胞の由来する組織は、特に限定されないが理論的には、真皮組織の他、筋組織や結合組織に由来するもの、また浮遊細胞でも付着細胞でも使用可能である。
しかしながら、実験の時間的効率に鑑みると、できるだけ活発に細胞分裂する組織の細胞を採用することが好ましく、例えば皮膚細胞、すなわち真皮組織由来の線維芽細胞を用いることが好ましい。
【００２９】
老化した線維芽細胞を培養する液体培地は、本発明に用いる老化細胞を含む細胞の培養に適切な周知の培地を使用することが可能であるが、例えば、イーグル(E)最小必須培地（ＭＥＭ）を用いることが好ましい。
【００３０】
なお、これらの培地には、常法に従って、適量の血清等を添加して細胞分裂を確実に行なわせることが好ましい。培養する細胞に適切な栄養源となる血清としては、例えばウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加すれば充分な細胞分裂が起きる。
【００３１】
また、充分な量の分泌因子が含有されている培養上清を得るためには、皮膚細胞を継代培養してＳＡ−β−Ｇａｌ活性が２０％以上である皮膚老化細胞を生成し、この皮膚老化細胞をさらに３日以上培養し、濾過または遠心分離などによって培養上清を分離して採取することが好ましい。      
【００３２】
この発明に用いる老化した線維芽細胞からなる分泌因子は、若齢細胞と比較して量的変動の認められる物質を採用することができるが、遺伝子発現に量的変動が認められるものが好ましい。
【００３３】
定量ＲＴ−ＰＣＲは、リアルタイムにポリメラーゼ連鎖反応による増幅を測定する際に 、線維芽細胞における老化細胞の特定遺伝子と、若齢細胞の特定遺伝子をそれぞれ目的遺伝子とリファレンス遺伝子として、同時に解析し、リファレンス遺伝子に比べて目的遺伝子がどれだけ増幅しているかを定量的に測定できる。分泌因子の遺伝子発現が上昇すれば 、培養上清中の含有量も増加していることがわかる。
【００３４】
また、それぞれの因子の抗体を用いてＥＬＩＳＡ法を行えば、実際の培養上清中の遺伝子含有量を定量化できる。
【００３５】
［バリア機能；ＴＥＷＬ(水分蒸散量)による表皮組織における老化の評価方法］
バリア機能の指標であるＴＥＷＬ(水分蒸散量)は、ヒト３次元培養表皮モデルにおいて、培養日数が増加すると角層形成の進行によりバリア機能がより強固になるため、培養日数とともにその水分蒸散量は低下する。ＴＥＷＬが高い状態は、バリア機能が低い状態にあると考えられ、ヒト３次元培養表皮モデルがＬＰＣＭによって老化誘導された場合、バリア機能が低下し、ＴＥＷＬがＥＰＣＭを添加したものと比較し高い状態に留まっていれば、表皮組織の老化を評価することができる。
【００３６】
［角化関連遺伝子］
角化関連遺伝子は特に限定はされないが、一般的に知られる角化マーカーとしてＺＯ１、ＦＬＧ、ＫＲＴ１０、ＩＶＬ、ＬＯＲ及びその逆の未分化マーカーのＫＲＴ１４等が挙げられる。
［角化不全；角化関連遺伝子の遺伝子発現量による表皮組織における老化の評価方法］
もう一つの指標である、角化関連遺伝子の遺伝子発現量に関して、ＥＰＣＭ、ＬＰＣＭをそれぞれ添加し培養した表皮角化細胞において比較することで、発現量の差異が大きければ細胞老化の影響が顕著であり、少なければ影響がわずかであることから、表皮組織の老化を評価することができる。
【００３７】
［抗皮膚生理老化素材のスクリーニング方法］
本発明の抗皮膚生理老化素材のスクリーニング方法は、次の(Ａ)〜(Ｄ)の工程を含む。
(Ａ)  集団倍加数(ＰＤＬ)を指標として線維芽細胞における若齢細胞の分泌因子を含む培養上清(ＥＰＣＭ)と老化細胞の分泌因子を含む培養上清(ＬＰＣＭ)を調整するステップ。
(Ｂ)  甲：ＥＰＣＭのみ、乙：ＬＰＣＭのみ、丙：ＬＰＣＭと抗皮膚生理老化候補素材それぞれを添加して培養したヒト３次元培養表皮モデルのＴＥＷＬ(水分蒸散量)を定量するステップ。
(Ｃ)   甲：ＥＰＣＭのみ、乙：ＬＰＣＭのみ、丙：ＬＰＣＭと抗皮膚生理老化候補素材それぞれを添加して培養した表皮角化細胞の角化関連遺伝子の発現量を定量するステップ。
定量する角化関連遺伝子はＺＯ１、ＦＬＧ、ＫＲＴ１０、ＫＲＴ１４からなる群より選択される少なくとも１種以上が好ましい。
(Ｄ)  (Ｂ)と(Ｃ)におけるステップにおいて丙の定量値が甲の定量値に近似する場合、抗老化作用を有すると判定するステップ。
［抗皮膚生理老化素材検体］
本発明の抗皮膚生理老化素材の検体は、特段の限定はないが皮膚外用剤に適用される成分であることが好ましい。
【実施例】
【００３８】
［線維芽細胞と培養条件］
ヒト正常皮膚線維芽細胞（理研バイオリソースセンター：ＮＢ１ＲＧＢ）を用いて、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むイーグル培地（ＭＥＭ）にて、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。
【００３９】
［老化した線維芽細胞（細胞の複製老化の誘導）］
細胞の複製老化は、５％ＦＢＳ含有のＭＥＭの培地を用い、ヒト正常皮膚線維芽細胞を集団倍加数(ＰＤＬ)２８〜６９の範囲で長期間継代培養することで老化を誘導した。老化誘導の成否は、細胞老化マーカーであるＳＡ−β−Ｇａｌ活性陽性の細胞数を顕微鏡下で１視野当たりについて計測し、図１に測定したＳＡ−β−Ｇａｌ活性陽性細胞数とＰＤＬとの関係を示した。
【００４０】
その結果からも明らかなように、長期継代培養によるＰＤＬの増加に伴い、老化度の指標となるＳＡ−β−Ｇａｌ活性が上昇し、ＰＤＬ６０以上においてＳＡ−β−Ｇａｌ活性が２０％以上となる細胞老化が確認された。
【００４１】
ＰＤＬ２０〜３５に複製された細胞を若齢細胞とし、ＰＤＬ６０以上に複製された細胞を老化細胞とし、これらをそれぞれ比較例用の若齢細胞と実施例用の老化細胞に用いた。
【００４２】
［分泌因子を含有する培養上清の調製］
８×１０＾５ｃｅｌｌｓ／１００ｍｍディッシュの数の若齢細胞または老化細胞を、それぞれ比較例用および実施例用にして２４時間前培養し、培地を０．１％ＦＢＳ含有ＭＥＭに交換して７２時間培養した後、培地を回収した。次いで０．２μｍフィルターにて濾過したものを培養上清（ＣＭ；Conditioned  Medium）とした。また、細胞からＲＮＡを抽出し、定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより遺伝子発現を確認し、結果を図２に示した 。
【００４３】
さらに、ＣＭに含有するＴＮＦαとＩＬ−６のタンパク質をＥＬＩＳＡ法にて確認し、これらの結果を、それぞれ図３、図４に示した。
【００４４】
図２の結果からも明らかなように、比較例の培養による若齢細胞と比べて、実施例の培養による老化細胞では、炎症関連因子を含む複数の遺伝子発現の変動が認められ、比較例の若齢細胞ＣＭと実施例の老化細胞ＣＭの成分組成が異なることがわかる。
【００４５】
また、老化細胞で遺伝子発現が上昇していた。またＣＭ中に含まれるタンパク質のＴＮＦαとＩＬ−６は、いずれも増加していることがわかる（図３、４）。
【００４６】
[培養上清(ＣＭ)を用いた長期継代培養試験]
ウシ胎児血清(ＦＢＳ)４．９％を添加して増殖能を高めたＥＰＣＭと同様に増殖能を高めたＬＰＣＭを分取し、これらを添加した培地を用いて新たに用意した若齢細胞の長期間継代培養を行なった。その際、培養日数１４〜７０日、ＰＤＬ３７〜５８の間で継代の度に、一部の細胞を採取し、そのＳＡ−β−Ｇａｌ活性を顕鏡により確認することで各細胞の老化度(ＳＡ−β−Ｇａｌ活性陽性細胞の含有率％)を判定しこれらの結果を図５、６に示した。対照として、無細胞培養上清 (ＮＣＣＭ；none of the cell conditioned medium)に４．９％ＦＢＳを追加したものを用いた。
【００４７】
図５、６に示す結果からも明らかなように、対照となるＮＣＣＭ及び比較例のＥＰＣＭと比較して、実施例のＬＰＣＭでは、より短期間に、しかもより少ないＰＤＬ数で老化度の指標となるＳＡ−β−Ｇａｌ活性が上昇した。これらのことから、ＬＰＣＭは細胞の老化を効率的に誘導することが分かり、また早期老化を誘導することが分かる。
【００４８】
[ヒト３次元培養表皮モデルを用いたＴＥＷＬ(水分蒸散量)試験]
ヒト３次元培養表皮モデル（ＬａｂＣｙｔｅ  ＥＰＩ−ＭＯＤＥＬ１２  ６Ｄ、ジャパンティッシュエンジニアリング社製）を、専用培地で２４時間前培養後、それぞれ比較例用および実施例用として得られたＥＰＣＭおよびＬＰＣＭにそれぞれ交換し、さらに１〜７日間培養を行った。培養後、経皮水分蒸散量測定機器（ＶＡＰＯ  ＳＣＡＮ、アサヒバイオメッド社製）を用いて角層側のＴＥＷＬ値をそれぞれ定量しこの結果を図７に示した。
【００４９】
図７に示す結果からも明らかなように、比較例のＥＰＣＭと比較して、実施例のＬＰＣＭを含んだヒト３次元培養表皮モデルでは、培養１日後のＴＥＷＬの低下の抑制が確認された。
これは、ＬＰＣＭがヒト３次元培養表皮モデルのバリア機能の低下を誘導したことを意味する。
【００５０】
［表皮角化細胞を用いた角化関連遺伝子の遺伝子発現試験］
正常ヒト表皮角化細胞(クラボウ社製)を２４時間前培養後、それぞれ比較例用および実施例用として得られたＥＰＣＭおよびＬＰＣＭにそれぞれ交換し、さらに４８時間培養した。培養後、細胞からＲＮＡを抽出し、定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより角化関連遺伝子のＺＯ１、ＦＬＧ、ＫＲＴ１０、ＫＲＴ１４の遺伝子発現量を定量しこの結果を図８に示した。
【００５１】
図８に示す結果からも明らかなように、比較例のＥＰＣＭと比較して、実施例のＬＰＣＭを含んだ表皮角化細胞では、角化関連遺伝子の発現量に優位な差が確認されており、特にＺＯ１、ＫＲＴ１０遺伝子において顕著な差が確認された。
これは、角化関連遺伝子が一律に角化の方向に同調して増加しておらず、ＬＰＣＭが表皮角化細胞の角化不全を促進したことを意味する。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
生理的老化現象をエミュレートとした老化細胞を用いた表皮のバリア機能・角化不全を指標にした表皮組織における老化の評価方法は、細胞の抗老化試験や検査、研究などに利用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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