(57)【要約】      （修正有）【課題】安全で有効な投与量を提供することができる、血液因子の医薬組成物の提供。【解決手段】血液因子と、生体適合性親水性ポリマーで誘導体化された約０．５〜２０モルパーセントの両親媒性脂質を含有するコロイド粒子と、を含み、前記血液因子が前記コロイド粒子に封入されていない、皮下投与用医薬組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液因子と、生体適合性親水性ポリマーで誘導体化された０．５〜２０モル％の両親媒性脂質を含有するコロイド粒子と、を含み、
前記血液因子が前記コロイド粒子に封入されておらず、
前記コロイド粒子が、パルミトイル−オレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）および１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノール−アミン（ＤＳＰＥ）を、（ＰＯＰＣ：ＤＳＰＥ）＝８５：１５〜９９：１のモル比で含む、皮下投与用医薬組成物。
【請求項２】
前記コロイド粒子が実質的に中性であり、および前記ポリマーが実質的に正味の電荷を有さない、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記コロイド粒子が、０．０３〜０．４ミクロン（μｍ）の平均粒径を有する、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記コロイド粒子が、パルミトイル−オレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）および１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノール−アミン（ＤＳＰＥ）を、（ＰＯＰＣ：ＤＳＰＥ）＝９０：１０〜９９：１のモル比で含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の皮下投与用医薬組成物。
【請求項５】
前記コロイド粒子が、パルミトイル−オレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）および１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノール−アミン（ＤＳＰＥ）を、（ＰＯＰＣ：ＤＳＰＥ）＝９７：３のモル比で含む、請求項４に記載の皮下投与用医薬組成物。
【請求項６】
コレステロールが前記組成物に補充される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記生体適合性親水性ポリマーが、ポリアルキルエーテル、ポリ乳酸、ポリエチレングリコールおよびポリグリコール酸からなる群より選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記ポリエチレングリコールが５００〜５０００ダルトンの分子量を有する、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記誘導体化された両親媒性脂質が、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノール−アミン−Ｎ−［ポリ−（エチレングリコール）］である、請求項７または８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記血液因子タンパク質またはポリペプチドが、第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第Ｘａ因子、第ＸＩ因子、第Ｖ因子、第ＸＩＩ因子、第ＸＩＩＩ因子、フォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ）、プロトロンビンもしくはプロテインＣおよび／またはそれらのフラグメントからなる群より選択される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記組成物が、他の治療的に活性な化合物をさらに含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
血液凝固疾患または外傷の治療のために使用される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
血液因子に対する抗体ができている患者に皮下投与されることによって使用される、請求項１２に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮下投与のための血液因子の医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
典型的には、血液因子は、静脈内投与のための医薬組成物として調製されている。この組成物は、多くの場合、循環の半減期を改善するためにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のようなポリマーに接合している活性タンパク質に基づいている。したがって、治療剤としてのＰＥＧ化血液因子の静脈内投与は、十分に理解され広く受け入れられている。第ＶＩＩＩ因子および第ＩＸ因子物質のような裸の（すなわち接合されていない、および修飾なしの）血液因子のリポソーム製剤も知られており、例えば国際公開第９５／０４５２４号を参照されたい。
【０００３】
第ＶＩＩＩ因子およびポリエチレングリコールの存在によって修飾されたリポソームを含む医薬組成物は、国際公開第９９／５５３０６号に記載されており、これは血液因子がリポソームに封入されていない。しかしながら、製剤は、静脈内投与のために調製されている。他のタンパク質のさらなる製剤は、国際公開第２００４／０９１７２３号に記載されており、これはタンパク質が血液凝固因子を含んでいる。タンパク質は、リポソームの表面に存在するポリエチレングリコールとの相互作用を介して非共有結合的にリポソームに結合するといわれている。しかし、この明細書の実施例に従って調製された血液凝固因子の製剤は静脈内投与のためのものでもある。
【０００４】
ＰＥＧとの複合体として存在する血液因子、第ＶＩＩＩ因子および第ＶＩＩａ因子の製剤の他の例は、それぞれ、国際公開第２０１１／１３５３０７および国際公開第２０１１／１３５３０８号に示されており、実際の調製製剤は静脈内投与用である。国際公開第２０１３／１５６４８８号はまた、皮下投与のための第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）および第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）のような血液因子を含む、改変された治療剤の剤形を記載している。
【０００５】
第ＶＩＩＩ因子は、ＰＥＧ化リポソームとの会合が可能であること、すなわち、血液因子がリポソームの内部に封入されていないことも判明している（Ｂａｒｕ等、Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ、９３、１０６１〜１０６８ページ（２００５））。しかし、ＦＶＩＩＩの組成物は、静脈内投与のための製剤としてのみ調製された。
【０００６】
Ｐｅｎｇ等のＴｈｅ  ＡＡＰＳ  Ｊｏｕｒｎａｌ、１４（１）、２５−４２ページ（２０１１）におけるさらなる研究は、調製後にＰＥＧを受動的にリポソームに添加することによってその後ＰＥＧ化されたリポソーム内に封入されたＦＶＩＩＩに基づく他のアプローチを開示している。Ｐｅｎｇ等の１つの実験では、免疫原性を調べるためにリポソーム製剤を皮下（ＳＣ）投与するが、この投与に治療目的の示唆はない。Ｐｅｎｇ等には、Ｂａｒｕ等（２００５）の論文と、Ｂａｒｕ等の「プロテアーゼやＩｇＧなどの血漿成分に曝露したＦＶＩＩＩ」というアプローチの記述も具体的に記載されている。組換え第ＶＩＩＩ因子を含有するＢａｒｕ等（２００５）の方法に従って調製したリポソームが被験者に静脈内投与された（Ｓｐｉｒａ等、Ｂｌｏｏｄ、１０８（１２）、３６６８〜３６７３ページ（２０１２））。
【０００７】
投与のための血液因子を処方するための現行の方法論は、静脈内投与様式に依存している。これは、患者の血液中の薬剤の不均一な治療レベルをもたらすいくつかの時点で、患者が必然的に活性薬剤の大きなボーラス注射を受けるため、問題である。
【０００８】
したがって、安全で有効な投与量を提供することができる血液因子の医薬組成物が必要とされている。
【発明の概要】
【０００９】
本発明によれば、血液因子と、生体適合性親水性ポリマーで誘導体化された約０．５〜２０モル％の両親媒性脂質を含有するコロイド粒子とを含み、前記血液因子が前記コロイド粒子に封入されていない、皮下投与用の医薬組成物が提供される。
【００１０】
コロイド粒子は、実質的に中性であってもよく、ポリマーは実質的に正味の電荷を有していなくてもよい。コロイド粒子は、約０．０３〜約０．４ミクロン（μｍ）の平均粒径を有していてもよく、例えば約０．１ミクロン（μｍ）の平均粒径を有する。この範囲の平均粒径は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの粒子の循環時間を増加させ、細網内皮系（ＲＥＳ）によるそれらの吸着を抑制しうる。
【００１１】
血液因子は、第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第Ｘａ因子、第ＸＩ因子、第Ｖ因子、第ＸＩＩ因子、第ＸＩＩＩ因子、フォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ）、プロトロンビン、もしくはプロテインＣおよび／またはそのフラグメントからなる群より選択されうる。血液因子は、医薬組成物を調製するときに、凍結乾燥形態で使用されうる。
【００１２】
組成物が血液因子のフラグメントを含む場合、因子は、好ましくは、そのフラグメントが生物学的活性を保持するその活性フラグメント、または天然血液因子と実質的に同じ生物学的活性の活性フラグメントでありうる。例えば、このような活性フラグメントの１つは、図１に示されるＢドメイン切断型第ＶＩＩＩ因子配列である。他のフラグメントとしては、図２に示される第ＶＩＩ因子フラグメント、図３に示されるトロンビンＢ鎖フラグメント、図４に示される第ＸＩＩ因子フラグメント、およびｖＷＦのＤ’Ｄ３ドメインを含む。
【００１３】
組成物は、天然の血液因子およびそのフラグメントの両方を含みうることがさらに可能である。
【００１４】
本発明の医薬組成物はまた、他の治療的に活性な化合物または分子を含んでいてもよく、例えば、抗炎症薬、鎮痛薬または抗生物質、または例えば他の血液凝固因子としてなどの、第ＶＩＩａ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第Ｘａ因子、第ＸＩ因子、第Ｖ因子、第ＸＩＩＩ因子、フォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ）、プロトロンビンもしくはプロテインＣ、またはそれらのフラグメントの活性を促進または強める他の薬学的に活性な薬剤をさらに含んでいてもよい。
【００１５】
第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）および第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）という用語はまた、文脈上他に明記しない限り、区別せずに用いられる。ＦＶＩＩＩは第ＶＩＩＩ因子の略語として使用され、ＦＩＸは第ＩＸ因子の略語として使用され、以下、本明細書に記載されるすべての血液因子についても同様である。
【００１６】
血液凝固（ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ）（凝固（ｃｌｏｔｔｉｎｇ））因子は、任意の適切な供給源に由来するものであってもよく、分子生物学的技術を用いた組み換えＤＮＡ技術によって産生された組換えタンパク質、または化学的に合成されたもの、または哺乳類の乳において遺伝子導入されたものであってもよく、または当該因子は天然源から単離されたもの（例えば、血漿から精製されたもの）であってもよい。好ましくは、この因子は、ヒト血液凝固因子のような哺乳動物の血液凝固因子である。血液凝固因子（ｂｌｏｏｄ
ｃｌｏｔｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）の言及には、血液凝固因子（ｂｌｏｏｄ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）が含まれる。
【００１７】
上述のように、血液因子は、とりわけ、表面接着の特性によってすべて特徴付けられる。これは、酵素および補因子が、カスケードの他の参加者、血小板の表面および損傷部位の組織に付着することを必要とする凝固カスケードに必要な特徴である。確かに、血栓が傷害部位に残っており、危険な血栓症を引き起こすような漂流をしないことが特に重要である。この特性は、ＶＩＩａ、ＶＩＩＩおよびＩＸのような血液因子があらゆるガラスおよびプラスチック表面にも過度に付着するので、薬物製品の製剤化において課題を提示する。実際には、これはポリソルベート（例えば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０）の広範な使用によって緩和される。
【００１８】
本発明のコロイド粒子は、当該分野で周知のように、典型的には脂質ベシクルまたはリポソームの形態である。本明細書中のコロイド粒子への言及は、文脈上他に明記しない限り、リポソームおよび脂質ベシクルを含む。
【００１９】
コロイド粒子において、両親媒性脂質は、天然源または合成源由来のリン脂質でありうる。両親媒性脂質は、約０．５〜約２０モル％、例えば、約１〜２０％、または約１〜６％または約３％の粒子を含むことができる。
【００２０】
そのような両親媒性脂質の好ましい例としては、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、カルバメート結合非荷電性リポポリマーもしくはアミノプロパンジオールジステアロイル（ＤＳ）、またはそれらの混合物が含まれる。ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）の好ましい例としては、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノール−アミン（ＤＳＰＥ）でありうる。生体適合性親水性ポリマーの目的は、ＳＵＶを立体的に安定化させることで、それによりｉｎ  ｖｉｔｒｏでのベシクルの融合を抑制し、ｉｎ  ｖｉｖｏでベシクルがＲＥＳによる吸着を回避できるようにすることである。
【００２１】
コロイド粒子は、天然源または合成源のいずれかから得られた第２の両親媒性脂質をさらに含んでもよい。第２の両親媒性脂質は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）でありうる。ホスファチジルコリン（ＰＣ）の好ましい例は、パルミトイル−オレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）でありうる。
【００２２】
そのような実施形態では、医薬組成物は、パルミトイル−オレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）と１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノール−アミン（ＤＳＰＥ）とを（ＰＯＰＣ：ＤＳＰＥ）の比８５〜９９：１５〜１で含むコロイド粒子からなりうる。いくつかの場合では、ＰＯＰＣ：ＤＳＰＥの比は、９０〜９９：１０〜１であってもよい。一実施形態では、ＰＯＰＣ：ＤＳＰＥの比は、９７：３であってもよい。
【００２３】
他の実施形態では、本発明の医薬組成物は、コレステロールを補充されてもよい。
【００２４】
生体適合性ポリマーは、約５００〜約５０００ダルトンの間、例えば約２０００ダルトンの分子量を有することができる。
【００２５】
本発明に従って使用される生体適合性親水性ポリマーは、ポリアルキルエーテル、ポリ乳酸およびポリグリコール酸からなる群より選択されうる。生体適合性親水性ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であってもよい。本発明の組成物に使用されるポリエチレングリコールは、約５００〜約５０００ダルトンの間の分子量を有することができ、例えば約１０００ダルトン、２０００ダルトンまたは３０００ダルトンの分子量を有することができる。一実施形態では、ＰＥＧの分子量は２０００ダルトンであってもよい。ポリエチレングリコールは、分枝状であっても非分枝状であってもよい。
【００２６】
好ましい誘導体化された両親媒性脂質の例としては、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノール−アミン−Ｎ−［ポリ−（エチレングリコール）］でありうる。ＰＥＧが２０００ダルトンの分子量を有する場合、誘導体化された両親媒性脂質は、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノール−アミン−Ｎ−  ［ポリ−（エチレングリコール）−２０００］（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ  ２０００）と記載されうる。
【００２７】
医薬組成物は、任意の適切な賦形剤、緩衝剤および／またはアジュバントを含みうる。そのような賦形剤、緩衝剤および／またはアジュバントの例としては、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、リン酸カリウム、リン酸ナトリウムおよび／またはクエン酸ナトリウムが含まれる。他の生物学的緩衝液としては、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳなどが挙げられる。
【００２８】
医薬組成物に好ましいｐＨ値としては、ｉｎ  ｖｉｖｏ投与に一般的に許容されるあらゆるｐＨ値が含まれ、例えばｐＨ５．０からｐＨ９．０、好ましくはｐＨ６．８からｐＨ７．２、またはｐＨ７．０である。
【００２９】
驚くべきことに、本発明者らは、生体適合性ポリマーで誘導体化されたコロイド粒子（リポソーム）と組み合わせた血液因子の製剤が皮下投与に成功し、血友病に罹患した患者に治療有効量の血液因子を達成できることを見出した。好ましくは、生体適合性ポリマーはポリエチレングリコールである。
【００３０】
本発明の実施例では、ＰＥＧは、血液因子との会合の前、ベシクル形成の間にリポソームに組み込まれる。血液因子上の特定のアミノ酸配列は、リポソームの外側のＰＥＧ分子のカルバメート官能（ｃａｒｂａｍａｔｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ）に非共有的に結合していると考えられる。
【００３１】
Ｐｅｎｇ等（２０１１）において、マウスへのリポソームのＦＶＩＩＩの皮下（ＳＱ）への投与についての文献があるが、これは相対的な免疫原性を見るためにのみ行われ、実行可能な治療選択肢とはみなされていないことは明らかである。これを強調すると、著者らは、４１ページの上部に、「ＦＶＩＩＩ−ＰＩ／ＰＥＧは、ＦＶＩＩＩの臨床的投与経路、静脈内に投与された」と明確に述べている。すなわち、Ｐｅｎｇ等は、実行可能な治療選択肢として皮下投与を開示していないし、示唆すらしていない。さらに、Ｐｅｎｇ等（２０１１）の著者らは、彼らのアプローチはＢａｒｕ等（２００５）のアプローチとは「全く異なる」と４０ページに述べている。したがって、本分野における最新の刊行物は、本発明と相互排他的かつ異なる代替物を提示している。
【００３２】
上記で検討したように、リポソームは血液因子を封入していないので、必要に応じて、ｉｎ  ｖｉｖｏでより長い半減期を有するより小さいサイズのリポソームを使用することができ、よって細網内皮系（ＲＥＳ）によって除去されない。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏで見られた完全な活性およびｉｎ  ｖｉｖｏでの注射直後に見られた完全な活性が実施例に示されるように、処方された血液因子の活性は損なわれない。
【００３３】
欧州特許出願公開第０６８９４２８号明細書に開示されている組成物とは異なり、血液因子は、リポソームの外側表面上のポリマー鎖と非共有結合的に相互作用し、化学反応はポリマー鎖を活性化するために行われない。血液因子と生体適合性親水性ポリマーで誘導体化されたリポソームとの間の相互作用の性質は、イオン相互作用、疎水性相互作用、水素結合およびファンデルワールス力のようなあらゆる非共有結合性のメカニズムによるものでありうる（Ａｒａｋａｗａ、Ｔ．  ａｎｄ  Ｔｉｍａｓｈｅｆｆ、ＳＮ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２４：６７５６−６７６２（１９８５）；Ｌｅｅ、ＪＣ  ａｎｄ  Ｌｅｅ、ＬＬＹ、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ。２２６：６２５−６３１（１９８１））。そのようなポリマーの例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。
【００３４】
親水性ポリマーで誘導体化されたベシクル形成脂質を調製するために、種々の公知のカップリング反応を使用することができる。例えば、ポリマー（ＰＥＧなど）は、塩化シアヌル基を介してホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）などの脂質に誘導体化されてもよい。あるいは、キャップされたＰＥＧを、カルボニルジイミダゾールカップリング試薬で活性化して、活性化されたイミダゾール化合物を形成することができる。カルバメート結合化合物は、ＭＰＥＧ（メトキシＰＥＧ）の末端ヒドロキシルをｐ−ニトロフェニルクロロホルメートと反応させてｐ−ニトロフェニルカーボネートを生成することによって調製することができる。次いで、この生成物を１−アミノ−２，３−プロパンジオールと反応させて中間カルバメートを得る。ジオールのヒドロキシル基をアシル化して最終生成物を得る。国際公開第０１／０５８７３号に記載されているように、１−アミノ−２，３−プロパンジオールの代わりにグリセロールを用いた同様の合成を用いてカーボネート結合生成物を生成することができる。他の反応はよく知られており、例えば米国特許第５，０１３，５５６号などに記載されている。
【００３５】
コロイド粒子（リポソーム）は、様々なパラメータに従って分類することができる。例えば、サイズおよび層（構造パラメータ）の数をパラメータとして使用する場合、３つの主要タイプのリポソームとして多重層ベシクル（ＭＬＶ）、小さな一枚膜ベシクル（ＳＵＶ）および大きな一枚膜ベシクル（ＬＷ）と記述することができる。
【００３６】
ＭＬＶは、ゲル−液晶相転移温度（Ｔｍ）以上の温度で乾燥したリン脂質の水和において自発的に形成する種である。ＭＬＶのサイズは不均一であり、それらの構造は、同心の水層および脂質層が交互となっており、タマネギの皮に似ている。
【００３７】
ＳＵＶは、超音波処理または押出し、高圧ホモジナイゼーションまたは高せん断混合などの他の方法によってＭＬＶから形成され、単層である。それらは、表面対体積比が高い最小の種であり、従って、脂質の重量に対する水性空間の占有体積（ｃａｐｔｕｒｅ  ｖｏｌｕｍｅ）が最も低い。
【００３８】
第３のタイプのリポソームＬＵＶは、大きな水性区画および単一の（単層状）脂質層または少数の（オリゴラメラ状）脂質層を有する。さらなる詳細は、Ｄ．ＬｉｃｈｔｅｎｂｅｒｇおよびＹ．Ｂａｒｅｎｈｏｌｚ、“Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ：Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ、Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ、ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ”、Ｖｏｌ．３３、３３７〜４６２頁（１９８８年）に記載されている。
【００３９】
本明細書で使用される「導入（ｌｏａｄｉｎｇ）」という用語は、導入される生体高分子物質のあらゆる種類の相互作用を意味し、例えば、生体高分子物質の押出しを伴なったりまたは伴わなかったりする封入、接着（ベシクルの内壁または外壁への接着）または壁内への組み込みなどのような相互作用を意味する。
【００４０】
本明細書中で使用され、上で示されたように、「リポソーム」という用語は、コロイド粒子を指し、自発的にまたは非自発的に小胞化するあらゆる両親媒性化合物（例えば少なくともひとつのアシル基が複雑なリン酸エステルで置換されたリン脂質など）のすべての球体またはベシクルを含むことを意図している。リポソームは、ガラス状態から液晶までの任意の物理的状態で存在しうる。大部分のトリアシルグリセリドは好ましく、本発明での使用に適した最も一般的なリン脂質はレシチン（ホスファチジルコリン（ＰＣ）とも呼ばれる）であり、リン酸のコリンエステルに結合したステアリン酸、パルミチン酸およびオレイン酸のジグリセリドの混合物である。レシチンは、卵、大豆、および動物組織（脳、心臓など）などのすべての動物および植物に見出され、また合成的に製造することもできる。リン脂質の供給源またはその合成方法は重要ではなく、任意の天然または合成のホスファチドを使用することができる。
【００４１】
特定のリン脂質の例としては、Ｌ−ａ−（ジステアロイル）レシチン、Ｌ−ａ−（ジパルミトイル）レシチン、Ｌ−ａ−ホスファチジド酸、Ｌ−ａ−（ジラウロイル）−ホスファチジン酸、Ｌ−ａ（ジミリストイル）ホスファチジン酸、Ｌ−ａ（ジオレオイル）ホスファチジン酸、ＤＬ−ａ（ジパルミトイル）ホスファチジン酸、Ｌ−ａ（ジステアロイル）ホスファチジン酸、および脳、肝臓、卵黄、心臓、大豆などから調製されたまたは合成的に調製された様々なタイプのＬ−ａ−ホスファチジルコリン、ならびにそれらの塩である。他の好ましい修飾としては、ホスファチジルコリン（ＰＣ）中および単独で、またはＰＣのアルキル類似体のようなＰＣと混合したときにミセルを形成する両性イオン両親媒性物質（ａｍｐｈｉｐａｔｈａｔｅ）の脂肪アシル残基架橋剤の制御された過酸化が含まれる。
【００４２】
リン脂質は、純度が異なり、完全または部分的に水素化することもできる。水素化は、望ましくない過酸化のレベルを低下させ、パッキングおよび漏れに影響するゲル−液晶相転移温度（Ｔｍ）を変更および制御する。
【００４３】
リポソームは、種々の生物学的液体を含むあらゆる特定のリザーバの要件に合わせて調整することができ、凝集またはクロマトグラフィーによる分離を伴わずに安定性を維持し、注入された液体中に十分に分散し懸濁する。系内での流動性は、組成、温度、塩分、二価イオンおよびタンパク質の存在により変化する。リポソームは、他の溶媒または界面活性剤の有無にかかわらず使用することができる。
【００４４】
一般的に、好ましい脂質は、少なくとも卵または大豆ＰＣのアシル鎖成分の転移温度（Ｔｍ）に関連した特有なアシル鎖組成を有していてもよく、すなわち、１つは飽和の鎖であり１つは不飽和の鎖である、または２つともが不飽和の鎖であるといったようなアシル鎖組成を有していてもよい。しかしながら、２つともが飽和鎖のものを使用する可能性は排除されない。
【００４５】
リポソームは、不安定性および／または凝集および／またはクロマトグラフィー分離を誘導しないのであれば、他の脂質成分を含みうる。これは、日常的な実験によって決定することができる。
【００４６】
生体適合性親水性ポリマーは、物理的にリポソームの表面に付着していてもよく、またはリポソームの膜に挿入されていてもよい。従って、ポリマーは、リポソームに共有結合していてもよい。
【００４７】
単層または多重層である修飾リポソームを製造するための様々な方法が知られており、利用可能である（ＬｉｃｈｔｅｎｂｅｒｇおよびＢａｒｅｎｈｏｌｚ、（１９８８）参照）：
１．リン脂質の薄膜を水性媒体で水和させた後、機械的に振とうおよび／もしくは超音波照射および／もしくは適当なフィルターを通して押し出しを行う；
２．リン脂質を適切な有機溶媒に溶解し、水性媒体と混合した後、溶媒を除去する。
３．その気体の臨界点を超える気体を使用する（すなわち、フレオンおよびＣＯ２もしくはＣＯ２と他のガス状炭化水素との混合物などの他のガス）または
４．次に、脂質と界面活性剤との混合ミセルを調製し、次いで、界面活性剤の濃度を、リポソームが形成されるその臨界濃度よりも低いレベルまで低下させる。
【００４８】
一般に、このような方法は、約０．０２〜１０μｍまたはそれ以上の不均一なサイズを有するリポソームを生成する。比較的小さくサイズが明確なリポソームが本発明での使用に好ましいので、「リポソームダウンサイジング」と定義される第２の処理工程が、リポソーム懸濁液のサイズおよびサイズの異質性を低減するために使用されうる。
【００４９】
リポソーム懸濁液は、ベシクルの選択的サイズ分布が約５μｍ未満、例えば、＜０．４μｍのサイズ範囲を達成するように製造されうる。本発明の一実施形態では、コロイド粒子は、約０．０３〜０．４ミクロン（μｍ）、好ましくは約０．１ミクロン（μｍ）の平均粒径を有する。
【００５０】
この範囲のリポソームは、適切なフィルターによるろ過によって容易に滅菌することができる。より小さいベシクルはまた、保管時に凝集する傾向が少なく、したがって、リポソームが静脈内または皮下に注入されるときに重大な閉塞（ｂｌｏｃｋａｇｅ）または閉塞（ｐｌｕｇｇｉｎｇ）の問題を潜在的に減少させる。最終的に、サブミクロン範囲までサイズダウンされたリポソームは、より均一な分布を示す。
【００５１】
本発明に適した方法で、リポソームのサイズおよびサイズの異質性を減少させるためのいくつかの技術が利用可能である。標準的なバスまたはプローブでの音波処理のいずれかによるリポソーム懸濁液の超音波照射は、サイズが０．０２〜０．０８μｍの間の小さな単層ベシクル（ＳＵＶ）まで著しいサイズ縮小をもたらす。
【００５２】
ホモジナイゼーションは、大きなリポソームをより小さなものにフラグメント化するためにエネルギーをせん断することに依存する別の方法である。典型的なホモジナイゼーション手順では、選択されたリポソームサイズ、典型的には約０．１〜０．５μｍが観察されるまで、リポソーム懸濁液を標準エマルジョンホモジナイザーに再循環させる。両方の方法において、粒度分布は、従来のレーザービーム粒径測定によってモニターすることができる。
【００５３】
孔径の小さいポリカーボネートフィルターまたは同等の膜を通すリポソームの押出しもまた、リポソームのサイズを、比較的よく規定されたサイズ分布に減少させるのに有効な方法であり、その平均は膜の孔径によるが約０．０２〜５μｍの範囲内である。
【００５４】
典型的には、懸濁液は、所望のリポソームサイズ分布が達成されるまで、１枚または２枚の積み重ねられた膜を通して数回循環される。リポソームは連続的により小さな孔径の膜を通して押し出され、リポソームのサイズが徐々に減少する。
【００５５】
遠心分離およびモレキュラーシーブクロマトグラフィーは、１μｍ未満の選択された閾値未満の粒径を有するリポソーム懸濁液を製造するために利用可能な他の方法である。これらの２つのそれぞれの方法は、大きな粒子をより小さな粒子に変換するというよりむしろ、大きなリポソームを優先的に除去することを伴う。それに対応して、リポソーム収率も低下する。
【００５６】
サイズ処理されたリポソーム懸濁液は、従来の厚みが０．４５μｍのメンブランフィルターのような約０．４μｍの粒子識別サイズを有する滅菌膜を通すことによって容易に滅菌されうる。リポソームは凍結乾燥形態で安定であり、使用直前に水に溶解することによって簡単に再構成することができる。
【００５７】
リポソームを形成するのに好ましい脂質は上記に記載されている。好ましい例としては、これに制限されないが、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）および／またはジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）などのリン脂質、部分的または完全な精製後に直接得られるかまたは部分的または完全な水素添加後に得られる卵および大豆由来のリン脂質が含まれる。
【００５８】
以下の４つの方法が国際特許出願公開第９５／０４５２４号に記載されており、一般に、本発明に従って使用されるコロイド粒子（リポソーム）の調製に適している。
【００５９】
方法Ａ
ａ）水と混和しない有機溶媒中にベシクルを形成するのに適した脂質などの両親媒性物質を混合する
ｂ）固体支持体の存在下で溶媒を除去するか、あるいは乾燥した両親媒性物質またはその混合物は、任意の形態（粉末、顆粒など）で直接用いられうる
ｃ）生理学的に適合する溶液中で工程ｂ）の生成物を生体高分子物質の溶液に取り込む工程
ｄ）可溶化または分散性を有する有機溶媒を加え、そして
ｅ）工程ｄ）で得られた画分を生体高分子物質の機能を保持する条件下で乾燥する工程。
【００６０】
方法Ａの工程ａ）によれば、上述のようにベシクルを形成するのに適した両親媒性物質は水と混和しない有機溶媒中で混合される。水と混和しない有機溶媒としては、フッ素化された炭化水素、塩素化された炭化水素などの極性プロトン性溶媒でありうる。
【００６１】
本発明の方法の工程ｂ）において、固体支持体の存在下で溶媒を除去する。固体支持体は、ビーズ状構造を有する不活性有機または無機材料であってもよい。無機支持体材料の材料はガラスであってもよく、有機材料はテフロン（登録商標）または他の同様のポリマーであってもよい。
【００６２】
本発明の方法Ａの工程ｃ）は、生理学的に適合する溶液中で、工程ｂ）の生成物を内包されるための物質の溶液に取り込むためのものである。
【００６３】
生理学的に適合する溶液は、約１．５重量％までの塩化ナトリウム溶液と同等であり得る。生理学的に適合性である限り、他の塩を使用することも可能であり、例えば砂糖および／またはアミノ酸のような凍結防止剤としてのものが挙げられる。例えば、ラクトース、スクロースまたはトレハロースを凍結防止剤として使用することができる。
【００６４】
場合により、工程ａ）とｂ）との間に、工程ａ）のウイルス不活性化、滅菌、発熱物質除去、画分のろ過などの工程を提供することができる。これは、調製の初期段階で薬学的に許容される溶液を得るために有利でありうる。
【００６５】
方法Ａの工程ｄ）は、可溶化特性または分散特性を有する有機溶媒を添加することである。
【００６６】
有機溶媒は、水と混和する有機極性プロトン性溶媒であってもよい。ｔｅｒｔｉａｒｙ−ブタノール（ｔｅｒｔ−ブタノール）のような、アルキル鎖中に１〜５個の炭素原子を有する低級脂肪族アルコールも使用することができる。水と混和する有機極性プロトン性溶媒の量は、リポソームに導入される物質との干渉に強く依存する。例えば、タンパク質が導入される場合、上限は、タンパク質の活性が影響を受ける溶媒の量によって設定される。これは、導入される物質の性質によって大きく変わりうる。例えば、血液凝固因子が第ＩＸ因子を含む場合、ｔｅｒｔ−ブタノールの量は約３０％であるのに対して、第ＶＩＩＩ因子についてはｔｅｒｔ−ブタノールの量は１０％未満が適切である（第ＶＩＩＩ因子はｔｅｒｔ−ブタノールの影響に対してはるかに敏感である）。これらの実施例におけるｔｅｒｔ−ブタノールのパーセンテージは、最終濃度について計算された体積％に基づく。
【００６７】
必要に応じて、工程ｄ）の後、工程ｄ）の後に得られた画分のウイルス不活性化、滅菌および／または分割を行うことができる。
【００６８】
本発明の工程ｅ）は、導入される物質の機能を保持する条件下で、工程ｄ）で得られた画分を乾燥する工程である。混合物を乾燥させる１つの方法は、凍結乾燥である。凍結乾燥は、例えば乳糖もしくは他の糖類またはアミノ酸などの凍結防止剤の存在下で行うことができる。あるいは、蒸発または噴霧乾燥が使用されうる。
【００６９】
次いで、乾燥した残りは使用前に水性媒体中に取り込むことができる。固体を取り込んだ後、それはそれぞれのリポソームの分散液を形成する。水性媒体は生理食塩水を含有し、形成された分散液は必要に応じてリポソームのサイズを小さくするために、場合により適切なフィルターを通されうる。好ましくは、リポソームは０．０２〜５μｍ、例えば＜０．４μｍの範囲のサイズを有しうる。
【００７０】
方法Ａによって得られるリポソームは、血液因子の高い導入を示す。
【００７１】
本発明の医薬組成物はまた、方法Ａの工程ｃ）またはｄ）のいずれかの画分を単離することによって得ることができる中間生成物でありうる。従って、本発明の製剤はまた、方法Ａの工程ｅ）の生成物を水中で分散の形態で取り込んだ後に得られる水分散を含む（水性媒体中のリポソーム）。
【００７２】
あるいは、本発明の医薬組成物は、方法Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥと呼ばれる以下の方法によっても得ることができる。
【００７３】
方法Ｂ
この方法は、方法Ａの工程ａ）、ｂ）およびｃ）も含む。しかし、方法Ａの工程ｄ）およびｅ）は省略される。
【００７４】
方法Ｃ
方法Ｃにおいて、方法Ａの工程ｄ）は、少なくとも２回繰り返さなければならない凍結融解サイクルに置き換えられる。この工程は、リポソームを製造するための先行技術において周知である。
【００７５】
方法Ｄ
方法Ｄは浸透性成分の使用を除外する。方法Ｄでは、ベシクルの調製、導入される物質の実質的に塩を含まない溶液と混合、および得られたフラクションの共乾燥の工程が関与する。
【００７６】
方法Ｅ
方法Ｅは、上記の方法Ａ〜Ｄよりも簡単である。それは、リポソーム調製に使用される化合物（脂質酸化防止剤など）を、ｔｅｒｔ−ブタノールなどの極性プロトン性水混和性溶媒に溶解する必要がある。次いで、この溶液を血液因子を含有する水溶液または分散液と混合する。混合は、薬剤の生物学的および薬理学的活性を維持するために必要な最適な体積比で行われる。
【００７７】
次いで、混合物を凍結防止剤の存在下または非存在下で凍結乾燥させる。リポソーム製剤の使用前には再水和が必要である。これらのリポソームは多重層であり、それらのサイズ縮小は国際公開第９５／０４５２４号に記載されている方法の１つによって達成することができる。
【００７８】
本発明はまた、本明細書で定義される薬学的組成物または投与量を、それを必要とする被験者に皮下投与することを含む、被験者における血液凝固疾患（例えば、血友病）または外傷の治療方法を含む。そのような方法には、患者が血液因子に対する抗体（すなわち阻害剤）ができている被験者における血液凝固疾患または外傷の治療方法も含まれうる。
【００７９】
血液凝固疾患または病気は、血液凝固因子の機能の喪失、または自己抗体の産生によって特徴付けられうる。血液凝固疾患の例には、血友病Ａおよび血友病Ｂのような血友病が含まれる。
【００８０】
したがって、本発明は、血液凝固疾患（例えば、血友病）または外傷の治療に使用するための上記で定義した医薬組成物に及ぶ。患者が前記血液因子に対する抗体ができた場合には、血液凝固疾患または外傷の治療に使用するためのそのような医薬組成物を使用してもよい。この態様による本発明の使用はまた、血液凝固疾患または外傷の治療に使用するための、上記定義の医薬品の製造における血液因子の使用を含む。
【００８１】
第ＶＩＩａ因子は、血友病ＡまたはＢにおける出血症状の治療、またはＦＶＩＩＩもしくはＩＸに対する阻害抗体がそれぞれできた患者の治療に使用することができる。第ＶＩＩＩ因子は、血友病Ａの患者における出血症状の治療に用いることができ、および第ＩＸ因子は血友病Ｂの患者の治療に用いることができる。
【００８２】
本明細書中で使用される場合、「治療」という用語は、ヒトまたは非ヒト哺乳動物に利益をもたらすことができるあらゆる形態を含む。「非ヒト哺乳動物」の治療は、ウマおよびコンパニオンアニマル（例えば、ネコおよびイヌ）ならびにヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ亜科およびウマ科のメンバーを含む農場／農業動物を含む家畜哺乳類の治療に及ぶ。この治療は、あらゆる存在する症状または疾患に関して行われてもよく、または予防的（予防的治療）であってもよい。治療は遺伝性疾患または後天性疾患であってもよい。治療は、急性または慢性の症状でありうる。
【００８３】
血液凝固カスケードにおける活性レベルは、任意の適切なアッセイ、例えば、全血凝固時間（ＷＢＣＴ）試験または活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）によって測定することができる。
【００８４】
全血凝固時間（ＷＢＣＴ）試験は、全血が外部環境（通常はガラス管または皿）で血栓を形成するのにかかる時間を測定する。
【００８５】
活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）試験は、血液凝固経路部分のパラメータを測定する。それは血友病および静脈内ヘパリン療法によって異常に上昇する。ＡＰＴＴには静脈から数ミリリットルの血液が必要である。ＡＰＴＴ時間は、「内因性経路」として知られる凝固系の１部分の尺度である。ＡＰＴＴ値は実験室試験で起こる、特定の凝固プロセスのための時間（秒）である。この結果は、常に正常血液の「対照」サンプルと比較される。試験サンプルが対照サンプルよりも長くかかる場合、それは内因性経路における凝固機能の低下を示す。一般的な医学療法は、通常、４５〜７０秒程度のＡＰＴＴの範囲を目標とするが、その値は、試験対正常の比、例えば正常の１．５倍として表されてもよい。ヘパリン治療がない場合の高ＡＰＴＴは血友病によるものであり、さらなる検査が必要となるかもしれない。
【００８６】
本発明はまた、本発明の医薬組成物および皮下投与のための注射用溶液を含む投与用ビヒクルを含むパーツのキットを提供し、該キットは、好ましくはその使用説明書を含む。
【００８７】
したがって、本発明はまた、本発明の医薬組成物の剤形を適切に提供することができる。そのような剤形は、患者に適切な用量を含む適切な容器またはバイアルとして提供されうる。
【００８８】
本発明の皮下投与のための医薬組成物または剤形は、単独で、または他の化合物、例えば治療化合物または分子などと一緒に投与することができ、例えば、抗炎症薬、鎮痛薬または抗生物質、第ＶＩＩａ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第Ｘａ因子、第ＸＩ因子、第Ｖ因子、第ＸＩＩＩ因子、フォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ）、プロトロンビンもしくはプロテインＣ、またはそれらのフラグメントの活性を促進または増強することができる他の薬学的に活性な薬剤（例えば他の血液凝固因子など）と一緒に投与することができる。他の化合物によるこのような投与は、同時、別々または連続的でありうる。成分は、必要に応じて説明書を含むキットの形態で調製することができる。
【００８９】
本発明の医薬組成物は、血液凝固疾患または外傷を患う患者を治療するために血液因子が投与される疾患の改善された治療を可能にする。
【００９０】
本発明の一実施形態では、血液因子と、生体適合性親水性ポリマーで誘導体化された約１〜２０モルパーセントの両親媒性脂質を含むコロイド粒子と、皮下投与に好適な生理学的ｐＨに調整された薬学的に許容される緩衝剤と、を含む皮下投与用医薬組成物であって、前記血液因子が前記コロイド粒子に封入されていない皮下投与用医薬組成物が提供される。
【００９１】
当業者であれば、本発明の薬剤の投与量は、生体高分子物質の有効な濃度およびその効率に依存することが理解される。
【００９２】
体重１ｋｇあたりリポソーム脂質２．０００ｍｇまでの用量で患者に投与することができ、この際、リポソーム中の活性因子は、導入されたリポソームを調製するために使用される全活性に基づいて５０％より高い効率で導入されている。
【００９３】
したがって、本発明の他の態様において、患者への送達のための製剤の容量は、２ｍｌ以下でありうる。好ましくは、送達容量は、５μｌ、１０μｌ、２５μｌ、５０μｌ、１００μｌ、２５０μｌ、５００μｌ、７５０μｌ、または１ｍｌであってもよい。他の実施形態では、送達のための製剤の容量は、１．５ｍｌ、２ｍｌ、２．５ｍｌ、３．０ｍｌまたは３．５ｍｌ以下であってもよい。
【００９４】
本発明は、患者の血流に直接送達されないので、静脈注射よりも安全に、単一の皮下注射で送達される活性薬剤をより高い濃度にできることに留意することが重要である。これは、血液凝固因子を扱う場合に特に重要である。なぜなら、静脈内投与される血液凝固因子の高濃度は、患者に望ましくない危険な血栓をもたらしうるからである。
【００９５】
皮下送達は、活性薬剤のリンパ系を介した血流への安定した注入を可能にし、したがって活性薬剤が血液系に直接送達される危険なレベルの影響を回避する。したがって、血流中への薬剤の送達濃度は、患者のリンパ系によって調節されるので、皮下投与用量でより高い濃度が送達され、静脈内送達で伝統的に使用されるよりも少ない容量が使用されうる。
【００９６】
本発明の製剤は、少なくとも１日に１回、少なくとも１日に２回、１週間に約１回、１週間に約２回、２週間に約１回、または１ヶ月に約１回投与することができる。
【００９７】
ある治療物質については、１日１回の投与計画で十分であるが、他のものではより頻繁な投与計画がより適切または望ましい場合があり、皮下投与される各投与量で送達される量は標準静脈内投与量に対して減少する。したがって、例えば、本発明の製剤は１日１回、１日２回（必要であればそれ以上）投与することができる。
【００９８】
本発明は、血液中の治療薬の濃度の急激な上昇およびその後の落下（すなわち、「のこぎり歯」）の抑制を可能にする。本発明は、静脈内に繰り返し送達される場合に同じ薬剤の標準的な医薬製剤で伝統的に見られるよりも長い期間にわたり、患者の血液中の薬剤のより一貫した予測可能な濃度を提供する。
【００９９】
本発明のさらなる利点は、静脈内に安全に投与できるよりも高い用量の薬剤を皮下投与することが可能なことである。これにより、静脈内送達によるより高い用量またはより頻繁な投薬によって通常かつ安全に達成できるよりも長い期間の治療利益が提供される。例えば、血液因子の場合、製品が胸管を介して鎖骨下静脈に送達されるので、１回の時点で静脈内に静脈内投与することができるよりも大量の製品を１回の時点で１回の用量として皮下投与することを可能にする。静脈への高用量ボーラスの送達は、望ましくない血栓性事象を引き起こしうる。
【０１００】
本発明のさらなる利点は、治療剤を間隔をあけて再投与することができ、薬剤の血中濃度を一定のレベルに維持し、血液中の薬剤の濃度が治療的に無関係のレベルに低下するまで再投与するのを待つ必要がなく、持続的で予測可能な治療効果を提供することができることである。伝統的な実施では、直後のＣｍａｘおよび作用開始を伴う血液凝固因子の静脈内再投与は、新たな注射からのＣｍａｘの追加が血液を凝固させうるレベルに達していないレベルにまで治療薬のレベルが低下したと推定されるまで遅延される（すなわち、不利な事象のリスクを減少させる）が、これは患者の血流中の薬剤のレベルが「不健全な」範囲に達したことを意味する。言い換えれば、薬剤の「健康なレベル」または治療的に有効なレベルが依然として血流中に存在している間は、その後の薬剤の用量は通常患者に与えられない。しかし、本発明は、薬剤の血中レベルが依然として治療有効範囲にある間に薬剤の再投与を行うことを可能にする。したがって、本発明は、より理想的に予防に適した血流中のタンパク質のより一貫した治療レベルを提供する。薬剤が胸管を介して血流に一貫して送達されるため、血流中の薬剤を望ましくない高いレベルにまで増加させるという問題は回避される。
【０１０１】
本発明は、被験者における全血凝固時間を２０分以内に維持するのに十分な血液凝固因子の剤形を被験者に投与することを可能にする被験者への皮下投与用製剤を提供し、言い換えれば、１ヶ月に１回以下の投与である。血液凝固疾患の治療への使用のための静脈内に投与された場合の同等の参照剤形と比較して、少なくとも１０％および９０％以下のＣｍａｘを有する剤形である、月に１回以下の皮下投与のための血液凝固因子の製剤もまた提供される。好ましくは、Ｃｍａｘは２０％〜８０％、または３０％〜７０％、または４０％〜６０％である。
【０１０２】
「以下」とは、剤形が規定された期間より頻繁に投与されうることを意味するが、そうする必要はない；そのような剤形の皮下投与の効果は、その期間の持続時間にわたってその効果が見られることを意味する。しかし、より低い一貫したＣｍａｘのために、患者に悪影響を及ぼすことなくより頻繁な投薬が起こりうる。
【０１０３】
好ましくは、血液凝固因子の剤形は、被験者における全血液凝固時間を１５分未満、または好ましくは１２分未満に維持するのに十分でありうる。一実施形態では、血液凝固因子の剤形は、少なくとも週に１回の剤形、または少なくとも月に１回、少なくとも２週間に１回、少なくとも半週間に１回の剤形である。
【０１０４】
また、血液凝固因子の投与量が１〜１０００ＩＵ／ｋｇ、または５〜５００ＩＵ／ｋｇ、または１００〜２５０ＩＵ／ｋｇである、または２５〜５０ＩＵ／ｋｇ、または５〜５０ＩＵ／ｋｇである、本発明による投薬製剤が提供される。
【０１０５】
血液凝固因子を含む本発明の剤形は、剤形の投与頻度をより少なくすることができ、被験者における全血液凝固時間を２０分以下、または１５分以下、または１０分以下に維持するのになお十分である。一実施形態では、剤形は、全血液凝固時間を１２分未満に維持するのに十分である。剤形は、２週間に１回以下、１週間に１回以下、１週間に２回以下、３日に１回以下、２日に１回以下、１日に１回以下または多かれ少なかれ頻繁な剤形を提供する。
【０１０６】
本発明の１つの利点は、薬剤が血液凝固因子である場合の剤形が、全血凝固時間を健康な範囲で維持し続けるために、これらの間隔よりも頻繁に患者に投与する必要がないことに留意することが重要である。しかしながら放出制御製剤と同様の「定常状態」を提供するのを助けるためにより頻繁に投与されてもよい。「正常な」全血凝固時間は、当業者によって一般的に１０〜１２分であると考えられ、１５分未満のものは、血友病でない人において健康であると考えられる。全血凝固時間が２０分を超えると、それは不健康な範囲にあると考えられる。１５分から２０分の間は、出血が制御されているが正常ではないことを示すと考えられる。
【０１０７】
別の実施形態では、剤形は、ボーラス静脈内注射の血漿半減期によって予測されるよりも少ない頻度で投与される。例えば、修飾された第ＩＸ因子のボーラス注射は週に１回必要とされうるが、本発明にしたがって皮下に送達される同一の薬剤では、たったの１０日に１回またはそれ以下で必要とされうる。
【０１０８】
本発明のさらなる態様によれば、静脈内投与される血液凝固因子と同じまたはより低い頻度で、皮下投与のための血液凝固因子の２５〜５０ＩＵ／ｋｇの医薬組成物の剤形が提供される。
【０１０９】
したがって、全血凝固時間（ＷＢＣＴ）の正常値が１５分未満、好ましくは約１２分以内として定義されるが、本発明の製剤は７日までの止血の正常値を維持することができる。
【０１１０】
製剤が血液因子を含む本発明の特定の実施形態の製剤は、２５〜５０ＩＵ／ｋｇの投与量を含みうる。いくつかの実施形態では、投与量は、２５、３０、３５、４０、４５、または５０ＩＵ／ｋｇでありうる。投与量は、２５ＩＵ／ｋｇ〜３０ＩＵ／ｋｇ、３５ＩＵ／ｋｇ〜４０ＩＵ／ｋｇ、または４０ＩＵ／ｋｇ〜５０ＩＵ／ｋｇでありうる。
【０１１１】
あるいは、製剤が血液因子を含む本発明の特定の実施形態の製剤は、５〜５０ＩＵ／ｋｇの投与量を含みうる。いくつかの実施形態において、投与量は、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０ＩＵ／ｋｇでありうる。投与量は、５ＩＵ／ｋｇ〜１０ＩＵ／ｋｇ、２５ＩＵ／ｋｇ〜３０ＩＵ／ｋｇ、３５ＩＵ／ｋｇ〜４０ＩＵ／ｋｇ、または４０ＩＵ／ｋｇ〜５０ＩＵ／ｋｇでありうる。
【０１１２】
一実施形態では、剤形が１５０ＩＵ／ｋｇの投与量として調製される場合、製剤は、それを必要とする被験者に２週間に１回投与するのに適していてもよい。好ましくは、製剤は、２週間に１回以下の投与であってもよい。あるいは、投与量は、１００ＩＵ／ｋｇの用量として調製されてもよい
本発明の一実施形態によれば、血液凝固因子を含む本発明の製剤は、正常な止血が少なくとも半週間維持されることができる。
【０１１３】
本発明による剤形は、皮下に投与された場合、同じ治療終点を達成するのに必要な修飾血液凝固（凝固）因子の量が少なくなり、それにより治療を必要とする被験者にとってより安全な製品を提供する。一実施形態では、静脈内投与された修飾血液凝固因子の調整された用量の半分は、特に血液凝固因子が第ＶＩＩａ因子または第ＶＩＩＩ因子である場合、被験者における少なくとも１週間の正常な止血を達成するのに十分である。正常な止血に適した値としては、上記のように、全血凝固時間（ＷＢＣＴ）は約１２分間である。
【０１１４】
本発明の製剤は、好ましくは、同じ治療効果を達成するために同じ修飾血液凝固因子を含む静脈内投与用に製剤化された参照製剤の治療的に有効な量に調整された用量の半分未満を含みうる。
【０１１５】
したがって、本発明はまた、効果的な作用の同じ持続期間を達成するために、静脈内投与に必要な量に調整された用量の５０％を含む剤形である、皮下投与用の修飾血液凝固因子の剤形を提供する。
【０１１６】
皮下投与に適した製剤は、水性または実質的に水性の製剤として適切に調製することができる。製剤は、必要に応じて、そのような追加の塩、保存剤および安定剤、および／または賦形剤もしくはアジュバントを含みうる。本発明の剤形は、適切な水性媒体中で即時製剤化の準備ができている無水粉末として提供されうる。
【０１１７】
好ましくは、このような剤形は、緩衝化した水性製剤として製剤化することができる。好ましい緩衝溶液は、これに制限されないが、アミノ酸（例えば、ヒスチジン）、無機酸およびアルカリ金属またはアルカリ土類金属の塩（例えば、ナトリウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、リチウム塩またはカルシウム塩−塩化ナトリウム、リン酸ナトリウムまたはクエン酸ナトリウムとして例示される）などである。界面活性剤または乳化剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ  ８０（登録商標）または他の任意の形態のＴｗｅｅｎ（登録商標））などの他の成分が存在してもよく、安定剤（例えば、ベンズアミジンまたはベンズアミジン誘導体）が存在してもよい。糖（例えば、スクロース）などの賦形剤もまた存在しうる。ｐＨの好ましい値は、生理学的ｐＨであり、例えばｐＨ６．８〜７．４またはｐＨ７．０である。液体の剤形は、このような投与ビヒクルの使用の準備をして調製されうる。
【０１１８】
本発明の１つの特定の実施形態において、以下のような皮下投与のための医薬組成物が提供される：
−５０ｍＭクエン酸ナトリウム
−ｐＨ  ７．０
−１００ｍＭリン脂質    パルミトイル−オレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）および１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［ポリ（エチレングリコール）−２０００］（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ  ２０００）の９７：３モル比
−凍結乾燥ｒＦＶＩＩＩ（Ｈｅｌｉｘａｔｅ  ＮｅｘＧｅｎ）。
【図面の簡単な説明】
【０１１９】
【図１】図１はＢドメイン切断型第ＶＩＩＩ因子配列である。
【図２】図２は第ＶＩＩ因子フラグメントである。
【図３】図３はトロンビンＢ鎖フラグメントである。
【図４】図４は第ＸＩＩ因子フラグメントである。
【発明を実施するための形態】
【０１２０】
本発明は、以下の実施例を参照してさらに説明するが、これらは単なる例示のためであり、本発明を限定するものではない。
【０１２１】
実施例
実施例１：リポソームの合成
パルミトイル−オレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）およびＰＥＧ−２０００（ＰＥＧの分子量  ２０００ダルトン）で誘導体化された１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［ポリ（エチレングリコール）−２０００］（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ  ２０００）から以下のようにして混合脂質を調製した：
ＰＯＰＣの分子量：７６０．０８ｇ／ｍｏｌ
ＤＳＰＥ−２ｋＰＥＧの分子量：２７８９．５ｇ／ｍｏｌ
最終調製物は、１００ｍＭのリン脂質の濃度を有していた。ＰＯＰＣ：ＤＳＰＥ−２ｋＰＥＧの９７：３モル比で脂質の１５％ｗ／ｖ混合物を作製した。以下のものを計量し、混合した：
ＰＯＰＣ  ２．０４ｇ
ＤＳＰＥ−２ｋＰＥＧ  ０．２３２ｇ
１４．９ｍＬのｔｅｒｔ−ブタノール（３５℃の水浴中で融解）を、全て１００ｍＬのＳｃｈｏｔｔボトルに入れた。
【０１２２】
混合物を水浴中で３５℃に維持し、すべての固体が溶解／分散するまで断続的に攪拌した。最終材料は透明な無色の混合物であった。混合物を−８０℃で一晩凍結させた。
【０１２３】
乾燥／濃縮した溶媒の使用後の洗浄の間、封じ込めるために操作はヒュームフード内で維持された。Ｃｈｒｉｓｔ  Ａｌｐｈａ  １−２ＬＤ凍結乾燥機および真空ポンプを２０分間温め、凍結脂質／溶媒混合物を−８０℃保存から移し、一晩乾燥させた。
【０１２４】
翌朝乾燥した脂質を乾燥機から回収した。それらは乾いた結晶の固まりのように見えた。さらなる処理には１００ｍＭの脂質溶液が必要であった。存在する脂質の量は、約８２μｍｏｌのＤＳＰＥ−２ｋＰＥＧおよび２．６９ｍｍｏｌｅのＰＯＰＣとして計算され、したがって脂質は約２．７７ミリモルである。よって、２７．７ｍＬの希釈剤が必要であった。乾燥した脂質に２７．７ｍＬの５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液を添加し、得られた混合物を撹拌し、約３５℃に加熱した。約１２０分後、明白な大きな固形物のない白色のエマルションが得られた。これを以下のように押し出した。
【０１２５】
サルトリウス（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）４７ｍｍステンレス鋼製加圧ろ過ハウジングを組み立て、３５℃に維持されたウォータージャケット（熱サーキュレーターを介して供給される包装チューブ）で包んだ。ハウジングには、ポリカーボネートのトラックエッチングされた膜（詳細は下記参照）を取り付け、ガラス繊維のプレフィルター（Ｗｈａｔｍａｎ  ＧＦ／Ｄ）で覆った。エマルジョンをハウジングに注ぎ、４バールの窒素ガス下で押出し、ろ液を５０ｍＬチューブに集めた。各押し出しの継続時間は計測され、記録された。
【０１２６】
ろ過順序は、０．８μｍ、０．４μｍ、０．２μｍ、０．２μｍ、０．１μｍおよび０．１μｍであり（すなわち、より大きいフィルターは１回のパスで、より小さい０．２および０．１μｍフィルターは２回のパス）、パス間、ろ液は３５℃に温めなおされた。リポソームは押し出され、一覧のデータを以下に示す。
【０１２７】
【表１】
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【０１２８】
得られた押出脂質を＋５℃で保存した。冷却されたストックから１５ｍＬの「押し出されたリポソーム」を取り出し、ＭｉｃｒｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓａｆｅｔｙ  Ｃａｂｉｎｅｔ内の滅菌の５０ｍＬチューブに分注した。押し出されたリポソームのサイズは、ＡＬＶ５０００光子相関分光計を用いて分析した。平均半径は７５．４０±０．８６ｎｍであり、平均ピーク幅は２２．２１±３．８６ｎｍであり、１５０．８０ｎｍの平均直径および０．０８７の多分散指数が得られた。
【０１２９】
実施例２：血友病Ａのイヌにおける皮下投与後のＰＥＧ化リポソームで再構成された組換えヒトＦＶＩＩＩの薬物動態／薬理学
血友病Ａを有するイヌ（イヌ番号「１」と識別される）は、第ＶＩＩＩ因子に関連するＰＥＧ化リポソーム（ＰＥＧＬｉｐ  ＦＶＩＩＩ  ＳＱ）の皮下用量を以下のように受けた：
この研究の目的は、皮下投与（ＳＱ）されたＰＥＧ化リポソーム中で再構成された完全長ｒＦＶＩＩＩの血友病ＡイヌにおけるＰＫおよびＰＤを決定することであった。
【０１３０】
完全長ｒＦＶＩＩＩ
凍結乾燥した完全長ｒＦＶＩＩＩ（Ｈｅｌｉｘａｔｅ  ＮｅｘＧｅｎ、Ｌｏｔ  ２７０ＬＲ８ＷＢ）を試験品として使用した。
【０１３１】
ＰＥＧ化リポソーム製剤
クエン酸緩衝液中のＰＥＧ化リポソームを、Ｂａｒｕ等（２００５）の方法による上記実施例１に従って製造した。リポソーム製剤は以下の組成を有していた；パルミトイル−オレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）と１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノール−アミン−Ｎ−［ポリ（エチレングリコール）−２０００］（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ  ２０００）との９７：３モル比の混合物を含有するリン脂質１００ｍＭを含む、ｐＨ７．０の５０ｍＭクエン酸ナトリウム。
【０１３２】
実験試験の被験体の犬は、アラバマ大学医学部（ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ａｌａｂａｍａ  Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ）に収容された血友病Ａコロニーからのものであった。全ての犬は先天性重度血友病Ａを有する。試験被験体は体重１６．４ｋｇであり、ヒトのタンパク質にはナイーブであった。
【０１３３】
投与前に、完全血液化学、血清化学プロファイルフィブリノゲン、フィブリノーゲン由来ペプチド（ＦＤＰ）、トロンビン時間および尿分析を含む正常な健康状態を確認するためにイヌを試験した。
【０１３４】
この研究の設計は、単一の個体における単一のＳＱ投与の実現可能性試験であった。
【０１３５】
完全長の組換えヒトＦＶＩＩＩ（Ｈｅｌｉｘａｔｅ  ＮｅｘＧｅｎ、２０００ＩＵ）を１３．３ｍｌのＰＥＧ化リポソーム希釈液で再構成した。再構成したｒＦＶＩＩＩを室温で５〜１０分間穏やかに混合して、使用前にタンパク質をリポソームに吸着させた。いったん再構成され、懸濁液は１５０ＩＵ／ｍｌのＦＶＩＩＩ活性を有した。
【０１３６】
試験個体に１００ＩＵ／ｋｇでＳＱ投与した。投与される薬物の量の計算は、以下の式に従って行った：
投与量（ｍｌ）＝（ａ×ｂ）／ｃ
ここで、ａはターゲット用量（１００ＩＵ／ｋｇ）であり、
ｂはイヌの体重（ｋｇ）であり、
ｃはｒＦＶＩＩＩ活性（１５０ＩＵ／ｍｌ）である。
【０１３７】
投与後、試験動物に臨床徴候が認められた。予期しない毒性は、投与後４８時間および５日目にＣＢＣおよび血清化学試験を実施することによってスクリーニングされた。フィブリノーゲン、ＦＤＰおよびトロンビン時間（ＴＴ）を評価して、血栓症リスクの増加を試験した。
【０１３８】
投与後の以下の時点で、血液サンプル（５ｍｌ）をＳＱ投与されたイヌから採取した：薬剤投与前、および投与後０．５、１、２、４、８、１２、２４、３６、４８、６０、７２、８４、９６、１０８および１２０時間。
【０１３９】
全血凝固アッセイおよび活性化凝固時間アッセイのために、全血（非クエン酸処理；１ｍｌ）を使用した。残りの４ｍｌ血液サンプルを、０．１０９Ｍクエン酸三ナトリウム抗凝固剤（９：１  ｖ／ｖ）を含む試験管に氷上で移した。
【０１４０】
活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）、活性化凝固時間（ＡＣＴ）およびトロンボエラストグラム（ＴＥＧ）アッセイを、クエン酸処理した全血（ｃｉｔｒａｔｅｄ  ｗｈｏｌｅ  ｂｌｏｏｄ）に対して行った。
【０１４１】
血漿は残りのクエン酸処理血液の遠心分離によって調製し、得られた血漿試料を約１００μｌの一定分量で−８０℃で保存した。
【０１４２】
アッセイ
（ｉ）非クエン酸処理全血：全血凝固アッセイ
血液試料を２つの真空管（２×０．５ｍｌ）の間で分割し、完全に水平な位置での流れの中断によって血栓が決定されるまで、チューブの定期的かつ賢明なレべリングにより慎重に観察した。血栓の質は、チューブを完全に反転した位置に保持することによって観察された。全血液凝固時間は、サンプル抽出から両方のサンプルの血栓の目視観察までの総時間の平均として記録し、逆位の血栓の質を記録した。
【０１４３】
（ｉｉ）クエン酸処理全血：トロンボエラストグラム（ＴＥＧ）アッセイ
製造元の推奨に従って、止血分析装置モデル５０００（Ｈａｅｍｏｓｃｏｐｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）トロンボエラストグラフを用いて、再石灰化したクエン酸処理全血を用いてＴＥＧを実施した。簡潔には、カオリンを含有する市販の（Ｔｅｇ（登録商標）造血システムカオリン、Ｈａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ）バイアルに１ｍｌのクエン酸処理全血を入れた。混合は、カオリン含有バイアルを５回穏やかに反転させることによって確実に行った。ピンおよびカップは、製造業者によって推奨される標準的な手順に従ってＴＥＧ分析器に配置された。各標準ＴＥＧカップを３７℃の予熱した器具ホルダーに置き、２０μｌの塩化カルシウム（０．２Ｍ）で満たした。次いで、３４０μｌのカオリン活性化クエン酸処理全血を全容量の３６０μｌで添加した。
【０１４４】
（ｉｉｉ）活性化凝固時間（ＡＣＴ）および活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）
Ｈａｅｍａｃｈｒｏｎ  Ｊｒ凝固分析器（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｄｙｎｅ  Ｃｏｒｐｓ．）を製造者の指示に従って使用して、ＡＣＴおよびａＰＴＴ試験を行った。
【０１４５】
（ｉｖ）血漿：ＦＶＩＩＩ活性アッセイ（発色性）
ＦＶＩＩＩ血漿活性は、Ｃｏａｔｅｓｔ  Ａｓｓａｙ（Ｄｉａ  Ｐｈａｒｍａ、Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ、ＯＨ）を用いて測定した。血漿サンプルをアッセイ希釈剤で１：２０から１：８０に希釈し、製造者の指示に従ってアッセイした。正常な止血参照血漿（ａｍｅｒｉｃａｎ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ  ｉｎｃ、Ｓｔａｍｆｏｒｄ、ＣＴ）および精製ＰＥＧ−ＦＶＩＩＩタンパク質を用いて標準曲線を確立した。
【０１４６】
（ｖ）血漿：ＦＶＩＩＩ  ＥＬＩＳＡ
血漿サンプル中のＦＶＩＩＩ抗原の濃度は、Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（Ａｎｃａｓｔｅｒ、Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ）のＶｉｓｕｌｉｚｅ  ＦＶＩＩＩ抗原キットを製造者の指示に従って使用してＥＬＩＳＡによって測定する。
【０１４７】
（ｖｉ）血漿：免疫原性
試験血漿をＦＶＩＩＩ欠損ヒト血漿中への１：４、１：１０および１：２０希釈でベセスダ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ）アッセイを行った。等量の希釈試験血漿および正常ヒト参照血漿を３７℃で２時間インキュベートし、上述のようにａＰＴＴアッセイおよび正常ヒト血漿標準曲線を用いてベセスダ力価を測定した。
【０１４８】
【表２】
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【０１４９】
【表３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年9月25日(2020.9.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血友病Ａに罹患している患者の治療に使用するための医薬組成物であって、
血液因子第ＶＩＩＩ因子と、コロイド粒子と、を含み、
前記コロイド粒子が、生体適合性親水性ポリマーで誘導体化された両親媒性脂質を０．５〜２０モル％の含み、
前記血液因子第ＶＩＩＩ因子が、前記コロイド粒子に封入されておらず、
皮下投与され、前記患者の血液中での血液因子第ＶＩＩＩ因子の濃度が治療的に無関係のレベルに低下する前に再投与されて用いられる、医薬組成物。
【請求項２】
前記コロイド粒子が実質的に中性であり、および前記ポリマーが実質的に正味の電荷を有さない、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記コロイド粒子が、０．０３〜０．４ミクロン（μｍ）の平均粒径を有する、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記両親媒性脂質が、天然源または合成源に由来するリン脂質である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記両親媒性脂質が、カルバメート結合非荷電性リポポリマーである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記コロイド粒子が、天然源または合成源のいずれかから得られた第２の両親媒性脂質をさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記コロイド粒子が、パルミトイル−オレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）および１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノール−アミン（ＤＳＰＥ）を、（ＰＯＰＣ：ＤＳＰＥ）＝８５：１５〜９９：１のモル比で含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の皮下投与用医薬組成物。
【請求項８】
コレステロールが前記組成物に補充される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記生体適合性親水性ポリマーが、ポリアルキルエーテル、ポリ乳酸、ポリエチレングリコールおよびポリグリコール酸からなる群より選択される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記ポリエチレングリコールが５００〜５０００ダルトンの分子量を有する、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記両親媒性脂質が、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノール−アミン−Ｎ−［ポリ−（エチレングリコール）］である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記組成物が、他の治療的に活性な化合物をさらに含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記患者が、前記血液因子第ＶＩＩＩ因子に対する抗体ができている、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の医薬組成物および皮下投与のための注射用溶液を含有する投与用ビヒクルを含む、パーツのキット。