(57)【要約】【課題】イムノクロマトグラフ法やラテックス凝集法等の有用性を高め、臨床検査の信頼性や精度等の向上に資するべく、高感度に標的抗原を検出する手段を提供することを課題とする。【解決手段】補体成分C1qの存在下、標的抗原に対する抗体を用いて免疫反応を行い、検体中の標的抗原を検出する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体中の標的抗原を免疫学的に検出する方法であって、
補体成分C1qの存在下、前記標的抗原に対する抗体を用いて免疫反応を行うことを特徴とする、前記検出方法。
【請求項２】
イムノクロマトグラフ法によって検出する方法である、請求項１に記載の検出方法。
【請求項３】
以下のステップ（１）及び（２）を含む、請求項２に記載の検出方法：
（１）C1qを固定した検出部が形成された担体を備える試験デバイスの検体添加部材に、前記標的抗原に対する抗体を感作させた不溶性粒状物質と検体を添加するステップ、
（２）抗原、抗体及びC1qの複合体を前記検出部で検出するステップ。
【請求項４】
以下のステップ（ｉ）及び（ｉｉ）を含む、請求項２に記載の検出方法：
（ｉ）捕捉用抗体を固定した検出部が形成された担体を備える試験デバイスの検体添加部材に、前記標的抗原に対する抗体を感作させた不溶性粒状物質、検体及びC1qを添加するステップ、
（ｉｉ）抗原、抗体及びC1qの複合体を前記検出部で検出するステップ。
【請求項５】
以下のステップ（Ｉ）及び（ＩＩ）を含む、請求項２に記載の検出方法：
（Ｉ）捕捉用抗体を固定した検出部が形成された担体と、前記検出部の上流側に配置されるC1q担持部材とを備える試験デバイスの検体添加部材に、前記標的抗原に対する抗体を感作させた不溶性粒状物質と検体を添加するステップ、
（ＩＩ）抗原、抗体及びC1qの複合体を前記検出部で検出するステップ。
【請求項６】
前記不溶性粒状物質が着色合成高分子粒子又は金属コロイド粒子である、請求項３〜５のいずれか一項に記載の検出方法。
【請求項７】
前記金属コロイド粒子が金コロイド又は銀コロイドである、請求項６に記載の検出方法。
【請求項８】
肺炎マイコプラズマ又は黄色ブドウ球菌を検出するための方法である、請求項２〜７のいずれか一項に記載の検出方法。
【請求項９】
C1qを固定した検出部が形成された膜担体と、前記検出部の上流側に配置される検体添加部材とを備える、イムノクロマト試験デバイス。
【請求項１０】
捕捉用抗体を固定した検出部が形成された膜担体と、前記検出部の上流側に配置されるC1q担持部材と、該C1q担持部材の上流側に配置される検体添加部材とを備える、イムノクロマト試験デバイス。
【請求項１１】
請求項９又は１０に記載のイムノクロマト試験デバイスと、標的抗原に対する抗体を感作させた不溶性粒状物質とを含む、イムノクロマト試験キット。
【請求項１２】
ラテックス凝集反応を利用して検出する方法である、請求項１に記載の検出方法。
【請求項１３】
ラテックス凝集反応を利用して検出する方法がラテックススライド凝集法又はラテックス凝集比濁法である、請求項１２に記載の検出方法。
【請求項１４】
以下のステップ（１）及び（２）を含む、請求項１３に記載の検出方法：
（１）標的抗原に対する抗体とC1qを感作させたラテックス粒子と検体を混合するステップ、
（２）凝集を検出するステップ。
【請求項１５】
肺炎マイコプラズマ又は黄色ブドウ球菌を検出するための方法である、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の検出方法。
【請求項１６】
標的抗原に対する抗体とC1qを感作させたラテックス粒子を含む、ラテックス凝集法用試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は検体中の抗原を検出するための手段に関する。詳しくは、補体成分を利用することで高感度の検出を可能にした免疫学的検出方法に関する。本発明の免疫学的検出方法は例えば感染症の診断に利用される。
【背景技術】
【０００２】
臨床検査において免疫学的に抗原を検出することは、感染症などの診断に欠かすことのできない重要な検査である。免疫学的に抗原を検出する方法の内、イムノクロマトグラフ法（イムノクロマトグラフィー）及びラテックス凝集法は簡便で迅速に結果が得られるため、臨床検査における抗原の検出に常用されている。特に、イムノクロマトグラフ法の有用性は高く、様々な病原体の検出に利用が試みられている（例えば特許文献１、２）を参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１７−０８８５２９号公報
【特許文献１】特開２０１７−０８８５２８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
イムノクロマトグラフ法及びラテックス凝集法は臨床で利用されている。しかしながら、大きな欠点として十分な感度が得られない場合があり、高感度を要する反応には適した方法とは言い難い。即ち、その検出感度には改善の余地があり、高感度化が切望されている。そこで本発明は、イムノクロマトグラフ法やラテックス凝集法等の有用性を高め、臨床検査の信頼性や精度等の向上に資するべく、高感度で抗原を検出する手段を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、反応系に補体成分の一つであるC1qを加えると検出感度が格段に向上し、高感度で抗原を検出できることが判明した。即ち、補体成分C1qを利用して高感度に抗原を検出するという、画期的な検出方法を開発することに成功した。この検出方法は様々な抗原の検出に利用できるものであり、即ち汎用性に優れ、その利用価値は極めて高い。
以上の成果に基づき、以下の発明が提供される。
［１］検体中の標的抗原を免疫学的に検出する方法であって、
補体成分C1qの存在下、前記標的抗原に対する抗体を用いて免疫反応を行うことを特徴とする、前記検出方法。
［２］イムノクロマトグラフ法によって検出する方法である、［１］に記載の検出方法。
［３］以下のステップ（１）及び（２）を含む、［２］に記載の検出方法：
（１）C1qを固定した検出部が形成された担体を備える試験デバイスの検体添加部材に、前記標的抗原に対する抗体を感作させた不溶性粒状物質と検体を添加するステップ、
（２）抗原、抗体及びC1qの複合体を前記検出部で検出するステップ。
［４］以下のステップ（ｉ）及び（ｉｉ）を含む、［２］に記載の検出方法：
（ｉ）捕捉用抗体を固定した検出部が形成された担体を備える試験デバイスの検体添加部材に、前記標的抗原に対する抗体を感作させた不溶性粒状物質、検体及びC1qを添加するステップ、
（ｉｉ）抗原、抗体及びC1qの複合体を前記検出部で検出するステップ。
［５］以下のステップ（Ｉ）及び（ＩＩ）を含む、［２］に記載の検出方法：
（Ｉ）捕捉用抗体を固定した検出部が形成された担体と、前記検出部の上流側に配置されるC1q担持部材とを備える試験デバイスの検体添加部材に、前記標的抗原に対する抗体を感作させた不溶性粒状物質と検体を添加するステップ、
（ＩＩ）抗原、抗体及びC1qの複合体を前記検出部で検出するステップ。
［６］前記不溶性粒状物質が着色合成高分子粒子又は金属コロイド粒子である、［３］〜［５］のいずれか一項に記載の検出方法。
［７］前記金属コロイド粒子が金コロイド又は銀コロイドである、［６］に記載の検出方法。
［８］肺炎マイコプラズマ又は黄色ブドウ球菌を検出するための方法である、［２］〜［７］のいずれか一項に記載の検出方法。
［９］C1qを固定した検出部が形成された膜担体と、前記検出部の上流側に配置される検体添加部材とを備える、イムノクロマト試験デバイス。
［１０］捕捉用抗体を固定した検出部が形成された膜担体と、前記検出部の上流側に配置されるC1q担持部材と、該C1q担持部材の上流側に配置される検体添加部材とを備える、イムノクロマト試験デバイス。
［１１］［９］又は［１０］に記載のイムノクロマト試験デバイスと、標的抗原に対する抗体を感作させた不溶性粒状物質とを含む、イムノクロマト試験キット。
［１２］ラテックス凝集反応を利用して検出する方法である、［１］に記載の検出方法。
［１３］ラテックス凝集反応を利用して検出する方法がラテックススライド凝集法又はラテックス凝集比濁法である、［１２］に記載の検出方法。
［１４］以下のステップ（１）及び（２）を含む、［１３］に記載の検出方法：
（１）標的抗原に対する抗体とC1qを感作させたラテックス粒子と検体を混合するステップ、
（２）凝集を検出するステップ。
［１５］肺炎マイコプラズマ又は黄色ブドウ球菌を検出するための方法である、［１２］〜［１４］のいずれか一項に記載の検出方法。
［１６］標的抗原に対する抗体とC1qを感作させたラテックス粒子を含む、ラテックス凝集法用試薬。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】イムノクロマト試験デバイスの構成の一例（テストストリップ）。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
本発明は補体成分C1qを利用して検体中の抗原を免疫学的に検出する方法を提供する。本明細書において、検出対象となる、検体中の抗原のことを「標的抗原」と呼ぶ。本発明の検出方法は、補体成分C1qの存在下、標的抗原に対する抗体を用いて免疫反応を行うこと、によって特徴付けられる。標的抗原は特に限定されない。換言すれば、本発明の検出方法は様々な抗原の検出に利用可能である。典型的には、感染症を引き起こすウイルスや寄生虫等の病原体の抗原（特定の病原体に特異的ないし特徴的なタンパク質又はペプチド）が標的となる。従って、本発明は感染症の診断のための検査として特に有用である。病原体の例を挙げると、黄色ブドウ球菌、マイコプラズマ、インフルエンザウイルス、溶血性レンサ球菌、肺炎球菌、水痘・帯状疱疹ウイルス、ノロウイルス、ロタウイルス、単純ヘルペスウイルス、アデノウイルス、ＲＳウイルス、クラミジア、各種寄生虫（マラリア、バンクロフト糸状虫、リーシュマニア等）である。尚、抗原の具体例を挙げると、黄色ブドウ球菌の抗原であるタイコ酸、プロテインＡ、コアグラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ（DNase）等、マイコプラズマのP1タンパク質、P30タンパク質、Ribosomal Protein L7/L12タンパク質等、水痘・帯状疱疹ウイルスの抗原である糖タンパク質E糖、糖タンパク質H、糖タンパク質Lである。
【０００８】
標的抗原に特異的な抗体が用いられる。ポリクローナル抗体を用いることも可能であるが、好ましくは特異性や精度等の観点からモノクローナル抗体を用いる。抗体は公知の方法（例えば免疫学的手法、ファージディスプレイ法、リボソームディスプレイ法）によって作製すればよい。また、市販の抗体を利用してもよい。
【０００９】
本発明は補体成分C1qの存在下で免疫反応を行うことで検出の高感度化を実現する。C1qは血清中の補体第一成分の亜成分であり、3種のポリペプチド鎖（A、B、C）が6本ずつ、計18本で構成される分子量41万のタンパク質である。C1qにはIgGやIgMのFc部分との結合部位があり、結合が多価であるとC1qの高次構造が変化する。殊に、C1qは抗原と結合した抗体にのみ結合する性質がある。本発明ではこのC1qの特性を巧みに利用し、抗原抗体反応を高感度化する。
【００１０】
C1qはヒト血清から精製することができる。精製法は公知であり（例えば、「補体学−基礎・測定法・臨床−、第１版、医歯薬出版株式会社発行」の「ＩＩＩ．補体系蛋白の精製法」を参考にすることができる）。C1qは市販もされており（例えば、メルク社、アブカム社などが提供する）、容易に入手可能である。
【００１１】
本発明の検出方法は、例えばイムノクロマトグラフ法によって検出する方法として構成される。この場合、典型的な一態様（第１態様）として、以下のステップ（１）及び（２）が行われる。
（１）C1qを固定した検出部が形成された担体を備える試験デバイスの検体添加部材に、標的抗原に対する抗体（抗原特異的抗体）を感作させた不溶性粒状物質と検体を添加するステップ
（２）抗原、抗体及びC1qの複合体を前記検出部で検出するステップ
【００１２】
ステップ（１）には、C1qを固定した検出部が形成された担体を備える試験デバイスが用いられる。以下、図１（具体例であるテストストリップ）を参照しつつ、試験デバイスの詳細を説明する。
【００１３】
まず、担体の一部にC1qが固定されて検出部を構成する。本明細書において「固定」とは、対象物（この態様ではC1q）が移動しないように膜等の担体に配置されることを意味する。「検出部」とは、抗原抗体反応によって形成される免疫複合体が集積し、抗原の存在を検出する部位をいう。本発明では、抗原、抗体及びC1qが複合体を形成することで、抗原と抗体によって複合体が形成される場合に比較して、免疫複合体の集積ないし凝集の程度が格段に高まる。
【００１４】
担体には、静電作用や疎水相互作用等の物理的作用によりタンパク質を結合でき、且つ検体中の成分などを展開できる材質のものが用いられる。担体の材質としてニトロセルロース、ポリビニリデンジフルオリド（PVDF）、セルロースアセテートを挙げることができる。好ましくは、担体は膜状（膜担体）である。検出部に加え、検体が適切に展開されたか否かを確認するための対照部を担体が備えることにしてもよい。好ましくは、検出部と対照部は、担体上に、展開方向を横断する方向で線状に設置され得る（それぞれ「テストライン」および「コントロールライン」とも称される）。担体上の検出部及び対照部の位置関係は限定されないが、通常は、検出部よりも下流側に対照部が形成される。
【００１５】
C1qの固定は、担体の種類に応じて、常法に従って行うことができる。例えば、適切に希釈したC1q溶液を、市販の塗布機を用いて塗布し、乾燥することでC1qを固定することができる。検出部に固定されるC1qの量は、好ましくは0.05〜10μgであり、より好ましくは0.1〜3μgである。
【００１６】
検出部の上流側には検体添加部材が配置される。典型的には、検体添加部材はその下面が担体の上面に接した状態となる。好ましくは、担体の下流に配置される検体吸収部材が備えられる。検体吸収部材は、その上流側領域の下面が、担体の検出部よりも下流側に存在する領域の上面と接触するよう配置される。
【００１７】
ステップ（１）では、標的抗原に特異的な抗体を感作させた不溶性粒状物質（「抗体感作不溶性粒子」と呼ぶ）が用いられる。不溶性粒状物質としては、ラテックス、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、スチレン−ブタジエン共重合体、ポリ塩化ビニル、ポリ酢酸ビニル、ポリアクリルアミド、ポリメタクリレート、スチレン−メタクリレート共重合体、ポリグリシジルメタクリレート、アクロレイン−エチレングリコールジメタクリレート共重合体などの合成高分子を色素分子で標識して得られる着色合成高分子粒子、金属コロイド粒子（金、銀、銅、鉄、白金、パラジウム、これらの混合物（例えば、金と白金の混合物、金と銀の混合物、パラジウムと白金の混合物）のコロイド粒子）、赤血球などが挙げられる。変化を目視で簡便かつ迅速に観察できる粒子が好ましく、着色合成高分子粒子又は金属コロイド粒子を採用するとよい。粒子の粒径は、例えば15〜100nm、好ましくは30〜80nmである。金属コロイド粒子は市販品を用いても良いし、常法により調製しても良い。金属コロイド粒子の中でも、利用し易い等の理由から、金コロイド粒子又は銀コロイド粒子が好ましい。
【００１８】
金属コロイド粒子の場合を例として、抗体を感作させる方法を説明すると、金属コロイド粒子溶液（通常、540nmにおける吸光度が約2.0）１Lに対して、通常、0.1〜100mg、好ましくは0.5〜20mgの抗体を添加し、冷蔵または室温で5分〜24時間撹拌する。次いで、ウシ血清アルブミン（BSA）（通常、0.01〜10ｇ、好ましくは0.1〜2g）などでブロッキングし、遠心分離後の沈殿として、抗体を感作させた金属コロイド粒子を得ることができる。緩衝液としては、免疫学的試験に通常使用される緩衝液、例えばトリス緩衝液、リン酸緩衝液などを用いることができる。緩衝液のpHは通常4.5〜9.5、好ましくは5.5〜8.5の範囲である。
【００１９】
以上のようにして用意した抗体感作不溶性粒子と、必要に応じて前処理した検体を試験デバイスの検体添加部材に添加（滴下）すると、抗体感作不溶性粒子と検体の混合物が担体に浸潤・移動し、担体中にて検出部に向けて展開する。尚、操作の簡便性の点から、抗体感作不溶性粒子と検体を混合した後に検体添加部材に添加（滴下）することが好ましい。
【００２０】
検体に標的抗原が含まれる場合、標的抗原と抗体感作不溶性粒子が複合体を形成しつつ展開する。そして、検出部においてC1qが作用し、抗原−抗体感作不溶性粒子−C1qからなる免疫複合体が形成、集積し、発色する。従って、検出部における呈色の度合いを目視で観察し、検体中の標的抗原の有無を判定することが可能となる。C1qの作用によって免疫複合体の集積ないし凝集が促進される結果、検出感度が格段に高められる。
【００２１】
検体として用いることが可能な生体由来材料としては、膿汁、化膿部位の組織、喀痰、咽頭拭い液、鼻咽頭液、鼻腔吸引液、鼻腔洗浄液、気管支吸引液が挙げられるが、これに限定はされない。
【００２２】
検体の前処理として、被検体（例えば、特定の感染症に関する罹患の有無の判定が必要な者）から採取された生体由来材料を前処理試薬に溶解し、試験デバイスに滴下するための液体を調製することが挙げられる。このような前処理は、検体を展開可能にするため、或いは検体の良好な展開を可能にするために行われる。前処理試薬には各種緩衝液を用いることができる。緩衝液としては、免疫学的試験に通常使用される緩衝液、例えば、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、グッド緩衝液などを用いることができる。非特異的結合反応を低下させる目的で前処理試薬に界面活性剤を含有させても良い。界面活性剤としてはTriton X-100(商品名、ポリエチレングリコールモノ-p-イソオクチルフェニルエーテル）、Tween20（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート）、Tween80（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレート）、CHAPS（3-[(3- コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]プロパンスルフォン酸）、SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）などを用いることができる。２種類以上の界面活性剤を併用してもよい。
【００２３】
イムノクロマトグラフ法によって検出する場合の別の態様（第２態様）では、以下のステップ（ｉ）及び（ｉｉ）が行われる。
（ｉ）捕捉用抗体を固定した検出部が形成された担体を備える試験デバイスの検体添加部材に、標的抗原に対する抗体（抗原特異的抗体）を感作させた不溶性粒状物質、検体及びC1qを添加するステップ
（ｉｉ）抗原、抗体及びC1qの複合体を前記検出部で検出するステップ
【００２４】
この態様では捕捉用抗体（第２抗体）が用いられ、当該捕捉用抗体を固定した検出部が試験デバイスの担体に形成される。試験デバイスのその他の構成は上記第１態様に準ずる。この態様の場合、抗体感作不溶性粒子、必要に応じて前処理した検体、及びC1qを試験デバイスの検体添加部材に添加（滴下）する。これら三者を別々に添加することにしてもよいが、好ましくはC1qを抗体感作不溶性粒子又は検体に予め混合しておき、抗体感作不溶粒子の滴下とC1qの滴下が同時に、又は検体とC1qの滴下が同時に達成されるようにする。また、特に好ましくは抗体感作不溶性粒子、検体及びC1qを混合した上で（混合する際の順序は特に限定されない）検体添加部材に添加する。
【００２５】
以上の操作によって、抗体感作不溶性粒子、検体及びC1qの混合物が担体に浸潤・移動し、担体中にて検出部に向けて展開する。検体に標的抗原が含まれる場合、標的抗原、抗体感作不溶性粒子及びC1qが免疫複合体を形成しつつ展開する。そして、検出部において免疫複合体が捕捉用抗体に捕捉され、集積し、発色する。従って、検出部における呈色の度合いを目視で観察し、検体中の標的抗原の有無を判定することが可能となる。C1qの作用によって免疫複合体の集積ないし凝集が促進される結果、検出感度が格段に高められる。
【００２６】
イムノクロマトグラフ法によって検出する場合の更に別の態様（第３態様）では、以下のステップ（Ｉ）及び（ＩＩ）が行われる。
（Ｉ）捕捉用抗体を固定した検出部が形成された担体と、前記検出部の上流側に配置されるC1q担持部材とを備える試験デバイスの検体添加部材に、標的抗原に対する抗体（抗原特異的抗体）を感作させた不溶性粒状物質と検体を添加するステップ
（ＩＩ）抗原、抗体及びC1qの複合体を前記検出部で検出するステップ
【００２７】
この態様では、第２態様の場合と同様に捕捉用抗体（第２抗体）が用いられ、当該捕捉用抗体を固定した検出部が試験デバイスの担体に形成される。一方、検出部の上流側にはC1q担持部材が、担体の上面と接触した状態で配置される。「担持」とは、担体の中又は表面を移動可能に配置されることを意味する。C1q担持部材の上流側には検体添加部材が配置される。好ましくは、検体添加部材中の少なくとも下流側領域の下面が、C1q担持部材中の上流側の領域の上面と接触している。C1q担持部材の一部が、検体添加部材の下面と担体の上流側の領域の上面との間に挟み込まれていることが好ましい。試験デバイスのその他の構成は上記第１態様に準ずる。この態様の場合、抗体感作不溶性粒子、及び必要に応じて前処理した検体を試験デバイスの検体添加部材に添加（滴下）する。これら二者を別々に添加することにしてもよいが、好ましくは、抗体感作不溶性粒子と検体を予め混合しておき、抗体感作不溶粒子の滴下と検体の滴下が同時に達成されるようにする。
【００２８】
以上の操作によって、抗体感作不溶性粒子と検体の混合物がC1q担持部材に浸潤する。検体に標的抗原が含まれる場合、C1q担持部材において標的抗原、抗体感作不溶性粒子及びC1qが免疫複合体を形成しつつ、担体に浸潤・移動し、担体中にて検出部に向けて展開する。そして、検出部において免疫複合体が捕捉用抗体に捕捉され、集積し、発色する。従って、検出部における呈色の度合いを目視で観察し、検体中の標的抗原の有無を判定することが可能となる。C1qの作用によって免疫複合体の集積ないし凝集が促進される結果、検出感度が格段に高められる。
【００２９】
本発明の検出方法は、ラテックス凝集反応を利用して検出する方法（即ちラテックス凝集法）として構成することもできる。ラテックス凝集法は抗体感作ラテックス粒子と抗原との凝集反応を利用した方法であり、ラテックス粒子の凝集を観察ないし測定することにより、標的抗原が検出される。例えば、スライド凝集板を用いるラテックススライド凝集法やラテックス凝集比濁法が採用される。ラテックス凝集法に用いるラテックス試薬は、標的抗原に特異的な抗体をラテックス粒子に感作して（抗体感作ラテックス試薬の場合）、或いは標的抗原に特異的な抗体とC1qをラテックス粒子に感作して（抗体・C1q感作ラテックス試薬の場合）、調製すればよい。調製したラテックス試薬は適当な溶液（例えば緩衝液）に分散させた状態で保存することができる。
【００３０】
ラテックス凝集法を利用した場合、典型的には、以下のステップ（１）及び（２）が行われる。
（１）標的抗原に対する抗体（抗原特異的抗体）とC1qを感作させたラテックス粒子と検体を混合するステップ
（２）凝集を検出するステップ
【００３１】
ステップ（１）では標的抗原に特異的な抗体とC1qを感作させたラテックス粒子（即ち、抗体・C1q感作ラテックス試薬）を用意しておき、当該感作ラテックス粒子と検体を混合する。検体に標的抗原が含まれる場合、抗原、抗体及びC1qが免疫複合体を形成することでラテックス粒子が凝集する。この凝集を検出することにより（ステップ（２））、検体中に抗原が存在するか否かを判定できる。C1qの作用によって免疫複合体の形成、凝集が促進される結果、検出感度が格段に高められる。ラテックス凝集比濁法として構成した場合、低濃度の抗原まで測定することができる。
【００３２】
以上の態様ではC1qを抗体とともにラテックス粒子に感作させることにしたが、これに代えて、（ａ）抗体のみを感作させたラテックス粒子（即ち、抗体感作ラテックス試薬）を用い、ラテックス粒子にC1qを添加した後に検体と混合する、（ｂ）抗体のみを感作させたラテックス粒子を用い、ラテックス粒子と検体を混合する際にC1qも混合する、又は（ｃ）抗体のみを感作させたラテックス粒子を用い、ラテックス粒子と、C1qを添加しておいた検体を混合する、といった操作を採用することにしてもよい。
【００３３】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００３４】
１．C1qを利用したイムノクロマトグラフ法
（１）肺炎マイコプラズマの検出
金コロイド粒子（田中貴金属、60m、Lot A703）1mlに肺炎マイコプラズマP1タンパク質特異的抗体（P1-4抗体。（株）富山研究所）1ml（40μg/ml）を混合し、室温で10分間感作した後、1mlのPBSに懸濁して感作金コロイドとした。
【００３５】
一方、ニトロセルロース膜（ミリポア社製）にC1q（640μg/ml）を直線状に塗抹し、乾燥させ、検出部を形成した。検出部から約2cm離れた位置に、感作金コロイドと肺炎マイコプラズマ抗原溶液の混合物を滴下し、15分間静置した後、判定した。コントロールとして感作金コロイドとPBSを混合した溶液を用いた。
【００３６】
判定の結果、次の如く、マイコプラズマ抗原溶液をサンプルとした場合のみ陽性（金コロイドの赤色ラインの出現）を示した。
マイコプラズマ抗原溶液：＋＋＋
コントロール：−
【００３７】
（２）イムノクロマト試験デバイスの作製
C1qを0.5mg/mlの濃度になるように希釈し、検出部固定用溶液として調製した。この検出部固定用溶液を長さ25cm×幅2.5cmのニトロセルロース膜（ミリポア社製：HF120）の長軸側の一端（この端を展開方向の上流側端、反対側を下流側端とする）から1cm離れた位置に、抗体塗布機（BioDot社製）を用いて1μl/cmの塗布量で線状に塗布した。塗布後、42℃にて60分間乾燥させ、検出部を備えたニトロセルロース膜担体を得た。
【００３８】
ニトロセルロース膜担体のC1q塗布面（この面を上面とする）の反対側（この面を下面とする）にプラスチック製バッキングシートを接着した。次いで、ニトロセルロース膜担体の上面の上流端に幅5mm×長さ23mmのグラスファイバー製サンプルパッド（ポール社製：8000006801）を貼り付けた。一方、幅5mm×長さ25mmの吸収パッド（ポール社製）を、ニトロセルロース膜担体の上面に、ニトロセルロース膜担体の下流側端が15mm重なるように張り付けた。最後に、長軸方向に沿って5mmずつ切断し、イムノクロマト試験デバイスを得た。
【００３９】
２．C1qを利用したラテックス凝集法（黄色ブドウ球菌の検出）
0.5％ポリスチレンラテックス（藤倉化成）に黄色ブドウ球菌DNaseに対するモノクローナル抗体No.1とNo.13（いずれも（株）富山研究所、各320μg/ml）1mlとC1q（Sigma、320μg/ml）1mlを混和し、室温で10分間感作した後、3000rpm、10分の遠心処理に供した。沈殿を回収し、1mlのPBSに懸濁し、感作ラテックスを得た。C1qを加えない比較品も同様に調製した。
【００４０】
スライドグラス上に黄色ブドウ球菌培養液を50μl滴下し、その上に感作ラテックスを50μl滴下、混合し、1分間水平に揺り動かし、凝集の有無を判定した。結果を以下の表１に示す。
【表１】
2020144058.tif 000003
【００４１】
抗体に加えてC1qを感作したラテックスを用いると感度が格段に向上した（16倍の高感度を実現）。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
抗原抗体反応系にC1qを加えることによって高感度化を達成する、画期的な検出方法が提供される。本発明によれば、従来、感度が不十分で応用範囲が限られていた免疫クロマトグラフ法やラテックス凝集法の利用価値を格段に高めることができる。従って本発明には、感染症の診断等に利用されるこれらの検出方法の普及や利用拡大への多大な貢献を期待できる。
【００４３】
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
【図１】
2020144058.tif 000004