(57)【要約】      （修正有）【課題】ＦＧＦ受容体４（ＦＧＦＲ４）に対する新規の抗体に関し、特に、ＦＧＦＲ発現、過剰発現または機能亢進と関連する疾患の診断、予防または治療のための、その医学的利用の提供。【解決手段】ヒトＦＧＦＲ４に特異的に結合するヒト抗体、または前記抗体の機能性フラグメントであって、前記抗体は、特定の配列をもつＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３、を含む重鎖、および、特定の配列をもつＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３、を含む軽鎖を含み、ＦＧＦＲ４に対する解離定数が、１０−９Ｍ〜１０−１３Ｍである、ヒト抗体、または前記抗体の機能性フラグメントを提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト抗体であって、
ヒトＦＧＦＲ４のアミノ酸１１９〜２４８の間、好ましくはアミノ酸１５２〜２４０の間、より好ましくはアミノ酸２３０および２４０の間のエピトープに対して向けられる、
ヒト抗体、または前記抗体の機能性フラグメントまたは機能性誘導体。
【請求項２】
請求項１の抗体であって、
ＦＧＦＲ４のＩｇ様ドメイン２、具体的には、アミノ酸配列ＲＹＮＹを含むエピトープに結合する、
抗体。
【請求項３】
請求項１または２の抗体であって、
（ｉ）以下を含む重鎖：
配列番号１〜６のいずれか１つに示される配列またはそれから１または２アミノ酸が異なる配列を有する重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＨ１）、配列番号７〜１２のいずれか１つに示される配列またはそれから１または２アミノ酸が異なる配列を有する重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＨ２）、および／または、配列番号１３〜２０のいずれか１つに示される配列またはそれから１または２アミノ酸が異なる配列を有する重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＨ３）、および／または
（ｉｉ）以下を含む軽鎖：
配列番号２１〜２３および６８のいずれか１つに示される配列またはそれから１または２アミノ酸が異なる配列を有する軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＬ１）、配列番号２４〜２７のいずれか１つに示される配列またはそれから１または２アミノ酸が異なる配列を有する軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＬ２）、および／または、配列番号２８〜３５のいずれか１つに示される配列またはそれから１または２アミノ酸が異なる配列を有する軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＬ３）、
を含む、
抗体、またはヒトＦＧＲＦ４上の同一エピトープを認識するモノクローナル抗体。
【請求項４】
請求項３の抗体であって、
配列番号１〜６のいずれか１つに示される配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号７〜１２のいずれか１つに示される配列を有するＣＤＲＨ２、配列番号１３〜２０のいずれか１つに示される配列を有するＣＤＲＨ３、配列番号２１〜２３および６８のいずれか１つに示される配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号２４〜２７のいずれか１つに示される配列を有するＣＤＲＬ２、および、配列番号２８〜３５のいずれか１つに示される配列を有するＣＤＲＬ３、
を含む、
抗体。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか一項の抗体であって、
（ａ）配列番号１に示されるＣＤＲＨ１、またはそれから１または２アミノ酸が異なるＣＤＲＨ１配列、
（ｂ）配列番号７に示されるＣＤＲＨ２、またはそれから１または２アミノ酸が異なるＣＤＲＨ２配列、および
（ｃ）配列番号１３に示されるＣＤＲＨ３、またはそれから１または２アミノ酸が異なるＣＤＲＨ３配列、
を含む重鎖
および／または、
（ｄ）配列番号２１に示されるＣＤＲＬ１、またはそれから１または２アミノ酸が異なるＣＤＲＬ１配列、
（ｅ）配列番号２４に示されるＣＤＲＬ２、またはそれから１または２アミノ酸が異なるＣＤＲＬ２配列、および
（ｆ）配列番号２８に示されるＣＤＲＬ３、またはそれから１または２アミノ酸が異なるＣＤＲＬ３配列、
を含む軽鎖
を含む、
抗体、またはヒトＦＧＦＲ４上の同一エピトープを認識するモノクローナル抗体。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか一項の抗体であって、
（ａ）配列番号２に示されるＣＤＲＨ１、またはそれから１または２アミノ酸が異なるＣＤＲＨ１配列、
（ｂ）配列番号７に示されるＣＤＲＨ２、またはそれから１または２アミノ酸が異なるＣＤＲＨ２配列、および
（ｃ）配列番号１４に示されるＣＤＲＨ３、またはそれから１または２アミノ酸が異なるＣＤＲＨ３配列、
を含む重鎖、
および／または、
（ｄ）配列番号２２に示されるＣＤＲＬ１、またはそれから１または２アミノ酸が異なるＣＤＲＬ１配列、
（ｅ）配列番号２４に示されるＣＤＲＬ２、またはそれから１または２アミノ酸が異なるＣＤＲＬ２配列、および
（ｆ）配列番号２９に示されるＣＤＲＬ３、またはそれから１または２アミノ酸が異なるＣＤＲＬ３配列、
を含む軽鎖、
を含む、
抗体、またはヒトＦＧＦＲ４上の同一エピトープを認識するモノクローナル抗体。
【請求項７】
請求項１から５のいずれか一項の抗体であって、
（ａ）配列番号３に示されるＣＤＲＨ１、またはそれから１または２アミノ酸が異なるＣＤＲＨ１配列、
（ｂ）配列番号８に示されるＣＤＲＨ２、またはそれから１または２アミノ酸が異なるＣＤＲＨ２配列、および
（ｃ）配列番号１５に示されるＣＤＲＨ３、またはそれから１または２アミノ酸が異なるＣＤＲＨ３配列、
を含む重鎖、
および／または、
（ｄ）配列番号２３に示されるＣＤＲＬ１、またはそれから１または２アミノ酸が異なるＣＤＲＬ１配列、
（ｅ）配列番号２５に示されるＣＤＲＬ２、またはそれから１または２アミノ酸が異なるＣＤＲＬ２配列、および
（ｆ）配列番号３０に示されるＣＤＲＬ３、またはそれから１または２アミノ酸が異なるＣＤＲＬ３配列、
を含む軽鎖、
を含む、
抗体、またはヒトＦＧＦＲ４上の同一エピトープを認識するモノクローナル抗体。
【請求項８】
請求項１から５のいずれか一項の抗体であって、
（ａ）配列番号４に示されるＣＤＲＨ１、またはそれから１または２アミノ酸が異なるＣＤＲＨ１配列、
（ｂ）配列番号９に示されるＣＤＲＨ２、またはそれから１または２アミノ酸が異なるＣＤＲＨ２配列、および
（ｃ）配列番号１６に示されるＣＤＲＨ３、またはそれから１または２アミノ酸が異なるＣＤＲＨ３配列、
を含む重鎖、
および／または、
（ｄ）配列番号２２に示されるＣＤＲＬ１、またはそれから１または２アミノ酸が異なるＣＤＲＬ１配列、
（ｅ）配列番号２４に示されるＣＤＲＬ２、またはそれから１または２アミノ酸が異なるＣＤＲＬ２配列、および
（ｆ）配列番号３１に示されるＣＤＲＬ３、またはそれから１または２アミノ酸が異なるＣＤＲＬ３配列、
を含む軽鎖、
を含む、
抗体、またはヒトＦＧＦＲ４上の同一エピトープを認識するモノクローナル抗体。
【請求項９】
請求項１から５のいずれか一項の抗体であって、
（ａ）配列番号５に示されるＣＤＲＨ１、またはそれから１または２アミノ酸が異なるＣＤＲＨ１配列、
（ｂ）配列番号１０に示されるＣＤＲＨ２、またはそれから１または２アミノ酸が異なるＣＤＲＨ２配列、および
（ｃ）配列番号１７に示されるＣＤＲＨ３、またはそれから１または２アミノ酸が異なるＣＤＲＨ３配列、
を含む重鎖、
および／または、
（ｄ）配列番号２２に示されるＣＤＲＬ１、またはそれから１または２アミノ酸が異なるＣＤＲＬ１配列、
（ｅ）配列番号２４に示されるＣＤＲＬ２、またはそれから１または２アミノ酸が異なるＣＤＲＬ２配列、および
（ｆ）配列番号３２に示されるＣＤＲＬ３、またはそれから１または２アミノ酸が異なるＣＤＲＬ３配列、
を含む軽鎖、
を含む、
抗体、またはヒトＦＧＦＲ４上の同一エピトープを認識するモノクローナル抗体。
【請求項１０】
請求項１から５のいずれか一項の抗体であって、
（ａ）配列番号４に示されるＣＤＲＨ１、またはそれから１または２アミノ酸が異なるＣＤＲＨ１配列、
（ｂ）配列番号１１に示されるＣＤＲＨ２、またはそれから１または２アミノ酸が異なるＣＤＲＨ２配列、および
（ｃ）配列番号１８に示されるＣＤＲＨ３、またはそれから１または２アミノ酸が異なるＣＤＲＨ３配列、
を含む重鎖、
および／または、
（ｄ）配列番号２２に示されるＣＤＲＬ１、またはそれから１または２アミノ酸が異なるＣＤＲＬ１配列、
（ｅ）配列番号２４に示されるＣＤＲＬ２、またはそれから１または２アミノ酸が異なるＣＤＲＬ２配列、および
（ｆ）配列番号３３に示されるＣＤＲＬ３、またはそれから１または２アミノ酸が異なるＣＤＲＬ３配列、
を含む軽鎖、
を含む、
抗体、またはヒトＦＧＦＲ４上の同一エピトープを認識するモノクローナル抗体。
【請求項１１】
請求項１から５のいずれか一項の抗体であって、
（ａ）配列番号６に示されるＣＤＲＨ１、またはそれから１または２アミノ酸が異なるＣＤＲＨ１配列、
（ｂ）配列番号１２に示されるＣＤＲＨ２、またはそれから１または２アミノ酸が異なるＣＤＲＨ２配列、および
（ｃ）配列番号１９に示されるＣＤＲＨ３、またはそれから１または２アミノ酸が異なるＣＤＲＨ３配列、
を含む重鎖、
および／または、
（ｄ）配列番号２２に示されるＣＤＲＬ１、またはそれから１または２アミノ酸が異なるＣＤＲＬ１配列、
（ｅ）配列番号２６に示されるＣＤＲＬ２、またはそれから１または２アミノ酸が異なるＣＤＲＬ２配列、および
（ｆ）配列番号３４に示されるＣＤＲＬ３、またはそれから１または２アミノ酸が異なるＣＤＲＬ３配列、
を含む軽鎖、
を含む、
抗体、またはヒトＦＧＦＲ４上の同一エピトープを認識するモノクローナル抗体。
【請求項１２】
請求項１から５のいずれか一項の抗体であって、
（ａ）配列番号３に示されるＣＤＲＨ１、またはそれから１または２アミノ酸が異なるＣＤＲＨ１配列、
（ｂ）配列番号７に示されるＣＤＲＨ２、またはそれから１または２アミノ酸が異なるＣＤＲＨ２配列、および
（ｃ）配列番号２０に示されるＣＤＲＨ３、またはそれから１または２アミノ酸が異なるＣＤＲＨ３配列、
を含む重鎖、
および／または、
（ｄ）配列番号６８に示されるＣＤＲＬ１、またはそれから１または２アミノ酸が異なるＣＤＲＬ１配列、
（ｅ）配列番号２７に示されるＣＤＲＬ２、またはそれから１または２アミノ酸が異なるＣＤＲＬ２配列、および
（ｆ）配列番号３５に示されるＣＤＲＬ３、またはそれから１または２アミノ酸が異なるＣＤＲＬ３配列、
を含む軽鎖、
を含む、
抗体、またはヒトＦＧＦＲ４上の同一エピトープを認識するモノクローナル抗体。
【請求項１３】
請求項１から５のいずれか一項の抗体であって、
（ａ）配列番号３に示されるＣＤＲＨ１、またはそれから１または２アミノ酸が異なるＣＤＲＨ１配列、
（ｂ）配列番号８に示されるＣＤＲＨ２、またはそれから１または２アミノ酸が異なるＣＤＲＨ２配列、および
（ｃ）配列番号１５に示されるＣＤＲＨ３、またはそれから１または２アミノ酸が異なるＣＤＲＨ３配列、
および／または、
（ｄ）配列番号６８に示されるＣＤＲＬ１、またはそれから１または２アミノ酸が異なるＣＤＲＬ１配列、
（ｅ）配列番号２７に示されるＣＤＲＬ２、またはそれから１または２アミノ酸が異なるＣＤＲＬ２配列、および
（ｆ）配列番号３５に示されるＣＤＲＬ３、またはそれから１または２アミノ酸が異なるＣＤＲＬ３配列、
を含む軽鎖、
を含む、
抗体、またはヒトＦＧＦＲ４上の同一エピトープを認識するモノクローナル抗体。
【請求項１４】
請求項１から１３のいずれか一項の抗体であって、
配列番号５２〜５９のいずれか１つに示される重鎖可変領域および／または配列番号６０〜６７のいずれか１つに示される軽鎖可変領域を含む、
抗体。
【請求項１５】
請求項１から１４のいずれか一項の抗体であって、
Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）、フラグメント、Ｆｖフラグメント、ダイアボディ、または単鎖抗体分子である、
抗体。
【請求項１６】
請求項１から１５のいずれか一項の抗体であって、
ＩｇＧ１−、ＩｇＧ２−、ＩｇＧ３−またはＩｇＧ４−型の、
抗体。
【請求項１７】
請求項１から１６のいずれか一項の抗体であって、
前記抗体は、ＦＧＦＲ４シグナリングの阻害剤であり、具体的には、前記抗体は、ＦＧＲＦ４に結合するリガンドの阻害剤である、
抗体。
【請求項１８】
請求項１７の抗体であって、
前記抗体は、ＦＧＦＲ４に対する、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ４、ＦＧＦ６、ＦＧＦ８、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１および／またはＦＧＦ２３の結合を阻害する、
抗体。
【請求項１９】
請求項１から１８のいずれか一項の抗体であって、
前記抗体は、ＦＧＦＲ１−３ｂ、ｃに対して交差反応性がない、
抗体。
【請求項２０】
請求項１から１９のいずれか一項の抗体を含むコンジュゲートであって、
前記抗体は、標識基および／またはエフェクター基、好ましくは治療基に連結されている、
コンジュゲート。
【請求項２１】
ＩＬ−２に融合された請求項１から１９のいずれか一項の抗体を含む、
融合タンパク質。
【請求項２２】
単離された核酸分子であって、
（ａ）請求項１から１９のいずれか一項の、抗体、その抗体フラグメントまたは誘導体、または請求項２０のコンジュゲートまたは請求項２１の融合タンパク質をコードする、核酸配列、
（ｂ）配列番号３６〜４３および配列番号４４〜５１のいずれか１つに示される核酸配列、
（ｃ）  （ａ）または（ｂ）の配列のいずれか１つに相補な核酸配列；および、
（ｄ）  （ａ）、（ｂ）または（ｃ）に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸配列、
からなる群より選択される、
核酸分子。
【請求項２３】
請求項２２の核酸配列を含むベクター、好ましくは発現ベクターであって、
前記核酸配列は、制御配列に動作可能に連結されている、
ベクター。
【請求項２４】
請求項２２の核酸または請求項２３のベクターを含む、
宿主。
【請求項２５】
請求項２４の宿主であって、
ヒト、細菌、動物、真菌、両生類または植物細胞である、
宿主。
【請求項２６】
請求項２５の宿主であって、
非ヒトトランスジェニック動物である、
宿主。
【請求項２７】
請求項１から１９のいずれか一項の抗体、請求項２０のコンジュゲートまたは請求項２１の融合タンパク質を製造する方法であって、
請求項２４から２６のいずれか一項の宿主から、前記の抗体、抗体コンジュゲートまたは融合タンパク質を得るステップを含む、
方法。
【請求項２８】
医薬組成物であって、
請求項１から１９のいずれか一項の抗体、請求項２０のコンジュゲート、または請求項２１の融合タンパク質、請求項２２の核酸分子、請求項２３のベクター、請求項２４から２６のいずれか一項の宿主、または請求項２７の方法により生産される抗体を含む、
医薬組成物。
【請求項２９】
請求項２８の医薬組成物であって、
さらなる活性剤を含む、
医薬組成物。
【請求項３０】
請求項１から１９のいずれか一項の抗体、請求項２０のコンジュゲート、請求項２１の融合タンパク質、請求項２２の核酸分子、請求項２３のベクター、請求項２４から２６のいずれか一項の宿主、または請求項２８から２９のいずれか一項の医薬組成物であって、
ＦＧＦＲ４発現、過剰発現および／または機能亢進と関連する疾患の、診断、予防および／または治療での使用のための、
抗体、コンジュゲート、融合タンパク質、核酸分子、ベクター、宿主、または医薬組成物。
【請求項３１】
請求項３０の使用のための、抗体、コンジュゲート、融合タンパク質、核酸分子、ベクター、宿主、または医薬組成物であって、
前記疾患は、過剰増殖性疾患である、
抗体、コンジュゲート、融合タンパク質、核酸分子、ベクター、宿主、または医薬組成物。
【請求項３２】
請求項３１の使用のための、抗体、コンジュゲート、融合タンパク質、核酸分子、ベクター、宿主、または医薬組成物であって、
前記の過剰増殖性疾患は、好ましくは、肝細胞癌腫、乳癌、胃癌、結腸癌、横紋筋肉腫、前立腺癌、卵巣癌、軟組織肉腫、メラノーマ、頭頸部扁平上皮癌および肺腺癌からなる群より選択される癌、および、ＦＧＦＲ４を発現または過剰発現する他の癌、および腫瘍転移の形成である、
抗体、コンジュゲート、融合タンパク質、核酸分子、ベクター、宿主、または医薬組成物。
【請求項３３】
代謝疾患、具体的には、メタボリック症候群または肥満の、診断、予防および／または治療での使用のための、
請求項１から１９のいずれか一項の抗体、請求項２０に記載のコンジュゲート、請求項２１の融合タンパク質、請求項２２の核酸分子、請求項２３のベクター、請求項２４から２６のいずれか一項の宿主、または請求項２８から２９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項３４】
左室肥大、心肥大または慢性腎臓疾患の、診断、予防および／または治療での使用のための、
請求項１から１９のいずれか一項の抗体、請求項２０のコンジュゲート、請求項２１の融合タンパク質、請求項２２の核酸分子、請求項２３のベクター、請求項２４から２６のいずれか一項の宿主、または請求項２８から２９のいずれか一項の医薬組成物。
【請求項３５】
ＦＧＦＲ４の発現、過剰発現および／または機能亢進と関連する症状の診断のための方法であって、
サンプルを、請求項１から１９のいずれか一項の抗体、請求項２０のコンジュゲートまたは請求項２１の融合タンパク質と接触させるステップ、および、ＦＧＦＲ４の存在を検出するステップ、を含む、
方法。
【請求項３６】
請求項１から１９のいずれか一項の抗体、請求項２０のコンジュゲート、請求項２１の融合タンパク質、請求項２２に記載の核酸分子、または請求項２３のベクター、および、さらなる抗悪性腫瘍剤を含む、
キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＦＧＦ受容体４（ＦＧＦＲ４）に対する新規の抗体に関し、特に、ＦＧＦＲ発現、過剰発現または機能亢進と関連する疾患の診断、予防または治療のための、その医学的利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）は、血管新生、創傷治癒、胚発生および様々な内分泌シグナル伝達経路に関与するメンバーを有する、さまざまな生物学的活性を有する成長因子のファミリーである。ヒトＦＧＦファミリーは、１８のメンバーを含み、それらは構造的にシグナリング分子と関連する。それらは、受容体チロシンキナーゼのファミリーであるそれらの同起源受容体（ＦＧＦＲ）と相互作用することにより、それらの生物学的活性を与える。哺乳類のＦＧＦＲファミリーは、４つのメンバー：ＦＧＦＲ１〜４を有し、それぞれ、３つの細胞外免疫グロブリン型ドメイン（Ｄ１〜Ｄ３）、シングルスパン膜貫通ドメインおよび細胞内スプリットチロシンキナーゼドメインからなる。ＦＧＦは、主に、Ｄ２およびＤ３ドメインと相互作用する。各ＦＧＦＲは、ＦＧＦの特定のサブセットに結合する。ほとんどのＦＧＦは、いくつかの異なるＦＧＦＲサブタイプと結合することができ、一方で、他のものは、１つの受容体、または受容体の１つのアイソフォームを特異的に活性化する。
【０００３】
受容体−リガンド間の相互作用は、受容体の二量体化および自己リン酸化、膜関連および細胞質のアクセサリータンパク質との複合体の形成、および、多数のシグナリングカスケードの開始をもたらす。ＦＧＦＲ−ＦＧＦシグナリングシステムは、増殖、分化、遊走、形態形成および血管新生のような細胞の機能およびプロセスを調節することにより、進行および組織修復において重要な役割を果たす。
【０００４】
ＦＧＦＲ４シグナリングは、ＦＧＦＲファミリーの他のメンバーも活性化するいくつかのＦＧＦにより活性化され（Ｏｒｎｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９６，２７１：１５２９２−７）、一方で、ＦＧＦ１９は、ＦＧＦＲ４に特異的である（Ｘｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，１１（１０）：７２０−３５）。ＦＧＦＲ４受容体の活性化は、ＦＧＦによるＦＧＦＲ４の刺激に続き、リン酸化カスケードが仲介するシグナル伝達経路の機構を含むいくつかのタイプの細胞シグナリングをもたらす。ＦＧＦＲ４の細胞外ドメインへのリガンドの結合の際に、受容体の二量体化およびその後のチロシンキナーゼ残基のリン酸化は、受容体へのシグナリング分子の結合を誘導することにより、シグナル伝達経路の活性化をもたらす（Ｖａｉｎｉｋｋａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，ＥＭＢＯ，１１（１２）：４２７３−４２８０、および、１９９４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１８３２０−１８３２６）。例えば、ＦＧＦＲ４はＰＬＣγ１と関連し、ＦＧＦ刺激（ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ）の際のＤＮＡ合成およびＭＡＰキナーゼ活性化の増大が観察されている。他のヒトＦＧＦ成長因子受容体ファミリーメンバーとのさらなる相互作用は、ＦＧＦＲ４のシグナリング能を拡張させ得て、シグナル多様化のためだけではなく、シグナル増幅のための手段である（ＭｃＫｅｅｈａｎ  Ｗ．Ｌ．ａｎｄ  Ｋａｎ  Ｍ．，１９９４，Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．３９：６９−８２）。８５ｋＤａのセリンキナーゼは、ＦＧＦＲ４のチロシンリン酸化をネガティブに調節することが見いだされているが、その正確な機能は解明されていない（Ｖａｉｎｉｋｋａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１２７０−１２７３）。ＮＣＡＭとＦＧＦＲ４の結合は、インテグリン依存性の付着を仲介することが示されているが（Ｃａｖａｌｌａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．３：６５０−６５７）、それは、腫瘍転移における決定的な役割を果たし得る。
【０００５】
ＦＧＦＲ４は、いくつかの細胞の役割を有することが報告されている。受容体は、骨格筋の分化および再生、間葉分化、または骨形成のような、インビトロおよびインビボでの様々な細胞分化プロセスの制御、あるいは、出生後の肝臓発達中の肺胞形成に関与する。さらに、ＦＧＦＲ４は、胆汁酸およびコレステロールのホメオスタシスの制御において説明され、肥満の制御に関与すると考えられている。さらに、胆汁生産とコレステロール生産との間のバランスは、インビトロおよびインビボで、ＦＧＦＲ４により制御される。また、ＦＧＦＲ４は、特定の腫瘍現象、例えば、肝細胞癌腫または結腸癌の進行、または、乳腺線維腺腫細胞または乳腺癌上皮細胞の増殖、例えば、乳腺または結腸直腸癌腫細胞運動にも関与する。また、ＦＧＦＲ４の過剰発現は、特定の膵癌株において説明されていて、星状細胞腫悪性腫瘍と相関する。
【０００６】
様々な障害におけるＦＧＦＲ４の関与は、受容体を、診断および治療的適用のための興味深い標的にさせる。この文脈において、効果的なストラテジーは、ＦＧＦＲ４に対する抗体の利用である。特に、ＦＧＦＲ４が仲介するシグナリングを妨げる抗体が望ましい。抗−ＦＧＦＲ４抗体の例は、国際出願ＷＯ０３／０６３８９３、ＷＯ２０１２／１３８９７５、ＷＯ２０１３／０１８３３１９および米国出願ＵＳ２０１１／０１５０９０３などの文献に記載されている。Ｂｕｍｂａｃａら（ｍＡｂｓ  ３：４，１−１１；２０１１）は、ＦＧＦ受容体４に対して高い特異性で結合するヒト化抗−ＦＧＦＲ４抗体を開示する。この抗体は本明細書において比較例として用いられ、ＧＴ−１３と呼ばれる。しかしながら、新規の抗−ＦＧＦＲ４抗体に対する必要性が存在し続ける。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の根底にある課題は、新規の抗−ＦＧＦＲ４抗体、および、ＦＧＦＲ４発現、過剰発現および／または機能亢進と関連する疾患の診断、予防および／または治療においてそれを用いるための方法を、提供することであった。
【０００８】
特に、ＦＧＦＲ４に対する新規のヒト抗体に関する必要が存在した。組み換え体により生産される抗体で通常生じる問題点は、非ヒト免疫系において生産される抗体のタンパク質配列が、ヒトにおいて天然に生じる対応する抗体と部分的に異なることである。それらはしたがって、ヒト患者に投与された場合に、潜在的に免疫原性である。したがって、ヒト投与のために設計されるモノクローナル抗体は、好ましくは、ヒトにおいて天然に生産される抗体変異体に対するそれらの類似性が増大するように改変されるべきであることが見いだされた。特に有利なのは、完全にヒトである抗体であり、すなわち、非ヒト起源であるいかなる部分も含まない。したがって、本発明は、ヒトでの診断および治療的利用に有利なヒト抗−ＦＧＦＲ４抗体の提供を目的とする。所望の抗体は、好ましくは、ＦＧＦＲ４シグナリングを防ぐ。本明細書に記載の発明は、この要求を満たし、さらなる利益を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の第一の態様は、ヒトＦＧＦＲ４のアミノ酸１１９〜２４８の間、好ましくはアミノ酸１５２〜２４０（Ｉｇ様ドメイン２）、より好ましくはアミノ酸２３０および２４０の間のエピトープに対して向けられるヒト抗体、または前記抗体の機能性フラグメントまたは機能性誘導体である。
【００１０】
抗体は、医薬、具体的にはヒト医薬での使用に、より具体的には、ＦＧＦＲ４発現、過剰発現および／または機能亢進と関連する疾患の診断、予防および／または治療に、適切である。
【００１１】
また、本発明は、本明細書に記載の抗体を含むコンジュゲートを提供する。特に、抗体薬コンジュゲートは本発明の要旨である。
【００１２】
本発明の別態様は、融合タンパク質であり、ここで本発明の抗体は、ＩＬ−２またはその機能性フラグメントに結合する。
【００１３】
本発明のさらなる態様は、抗体をコードする核酸分子であり、場合により発現制御配列に動作可能に連結されている。
【００１４】
本発明のさらなる態様は、宿主であり、具体的には、核酸分子を含む組み換え細胞である。細胞は、抗体の調製に用いられ得る。
【００１５】
また、本発明のさらなる態様は、抗体、核酸分子または宿主を、場合により薬学的に許容できる担体と一緒に含む、医薬組成物である。
【００１６】
また、本発明のさらなる態様は、ＦＧＦＲ４発現、過剰発現および／または機能亢進と関連する疾患の診断、予防および／または治療のための方法である。
【００１７】
本発明は、以下の図面および実施例によって、より詳細に説明される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】フィコエリトリン標識抗−ヒトＩｇＧ抗体を用いた、抗体Ｕ４−３、Ｕ４−５およびＵ４−６に関する、Ｈｕｈ−７に対する抗体結合の判定を示す。
【図２】ＦＧＦＲ４の細胞外ドメインに対する、抗−ＦＧＦＲ４抗体Ｕ４３およびＵ４−９の結合の判定を示す。
【図３】可逆的に捕捉された抗体Ｕ４−３と抗原の相互作用分析の結果を示す。
【図４】抗体ＧＴ−１３と比較した、本発明の抗体Ｕ４３の種−特異性の比較を示す。
【図５】異なるＦＧＦ受容体に対する、ヒト抗体Ｕ４−３の結合を示すグラフである。見ることができるように、抗体Ｕ４−３は高い特異性でヒトＦＧＦＲ４を認識し、ＦＧＦＲファミリーの他のメンバーと交差反応しない。
【図６】ＦＧＦＲ４の異なる細胞外ドメインに対する抗体結合を示す棒グラフである。
【図７】抗体Ｕ４−３およびＧＴ−１３に関する、ＦＧＦＲ４の結合エピトープの判定を示すグラフである。強調したテトラ−ペプチド配列ＲＹＮＹはＵ４−３によって認識されるがＧＴ−１３によって認識されないことが分かる。
【図８】ＦＧＦＲ４に対する抗体Ｕ４−３の結合の判定を示す棒グラフである。結果は、ＦＧＦＲ４細胞外ドメインのアラニンスキャニング突然変異誘発により得た。見ることができるように、ＦＧＦＲ４の結合は非常に特異的であり、Ｄ２ドメインにおける単一の酸突然変異誘発は、結合の有意な低下をもたらした。
【図９】抗−ＦＧＦＲ４抗体Ｕ４−３によるリガンド結合を示すグラフである。ｈＩｇＧを比較例として示す。
【図１０（Ａ）】異なる抗体濃度のＵ４３を用いた、ｂ−ＦＧＦ−が仲介するＥＲＫリン酸化の濃度依存的な阻害の判定に関する代表的な免疫ブロットを示す。
【図１０（Ｂ）】図１０（Ａ）によるデータの定量化を示す棒グラフである。
【図１１】Ｈｕｈ−７細胞における、抗−ＦＧＦＲ４抗体Ｕ４−３による内因性ＦＧＦＲ４リン酸化の阻害を示す。Ａ：免疫沈降（ＩＰ）；Ｂ：全細胞溶解物；Ｃ：１１Ａの定量化。
【図１２】抗体Ｕ４３およびＵ４−９を用いた、ＮＩＨ  ３Ｔ３スフェロイド増殖アッセイを示す。
【図１３】抗−ＦＧＦＲ４抗体Ｕ４−３またはコントロールＩｇＧ抗体の存在下での、Ｈｕｈ−７細胞における軟寒天コロニーの増殖阻害を示す棒グラフである。
【図１４】抗体Ｕ４−３およびコントロールＩｇＧの存在下で培養されたＺＲ−７５−１細胞の細胞増殖アッセイの結果を示す棒グラフである。
【図１５】異なる濃度のＵ４−３およびコントロールＩｇＧを用いた、ＭＧ−６３スフェロイド増殖アッセイの結果を示す棒グラフである。
【図１６】ミューリン腫瘍モデルにおける、抗−ＦＧＦＲ４抗体Ｕ４−３またはＧＴ−１３により仲介される増殖阻害を示すグラフである。Ａ：投与量−応答；Ｂ：異なる抗体、Ｃ：ＧＴ−１３に対する比較
【図１７】抗体Ｕ４−３を用いた、Ｈｕｈ−１（Ａ）およびＨｅｐ３Ｂ（Ｂ）腫瘍モデルにおける、インビボでの増殖阻害。
【図１８】抗体Ｕ４−３を用いた、ＳＮＵ−７６１ヒト肝臓異種移植片モデルにおける、インビボでの増殖阻害。
【図１９】患者由来の胃異種移植片腫瘍モデルにおける、インビボでの有効性。
【図２０】ヒト結腸異種移植片腫瘍モデルＳＷ６２０における、インビボでの有効性。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明は、ＦＧＦＲ４またはその機能性フラグメントまたは機能性誘導体に対して向けられるヒト抗体を指す。用語「抗体」は、具体的には、少なくとも１つの免疫グロブリン重鎖および少なくとも１つの免疫グロブリン軽鎖を含む分子を指す。重鎖および軽鎖のそれぞれは、可変ドメインおよび定常ドメインを含んでよい。抗原結合部位は、重鎖および軽鎖の可変ドメインから形成されてよい。可変領域（可変ドメインとも呼ばれる）は、相補性決定領域（ＣＤＲ）、例えばＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域、および、ＣＤＲに隣接するフレームワーク領域（ＦＲ）を含む。用語「相補性決定領域」は、当業者によって容易に理解され（例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ  （ｅｄｓ．），Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ＣＳＨＬ  ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８８を参照）、主に抗原と接触し、抗体特異性を決定する、抗体の可変ドメイン内のひと続きのアミノ酸を指す。この領域は超可変領域としても知られる。
【００２０】
用語「ヒト抗体」は、完全なヒトまたはヒト化抗体を包含し、ここで、完全なヒト抗体が好ましい。ヒト抗体は、公知技術に従って、遺伝学的に操作された動物、例えば異種間の免疫系を含む動物から、または、抗体ディスプレイライブラリーから調製され得る。ヒト抗体は、概して、ｖａｎ  Ｄｉｊｋ  ａｎｄ  ｖａｎ  ｄｅ  Ｗｉｎｋｅｌ（Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５：  ３６８−７４（２００１））およびＬｏｎｂｅｒｇ  （Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：４５０−４５９（２００８））に開示される。ヒト抗体は、抗原性チャレンジに応答して無傷のヒト抗体またはヒト可変領域を有する無傷の抗体を生産するように改変されたトランスジェニック動物に、免疫原を投与することにより調製され得る。そのような動物は、典型的に、ヒト免疫グロブリン座の全てまたは一部を含み、それは内因性免疫グロブリン座を置き換え、または染色体外に存在し、または動物の染色体内にランダムに組み込まれる。そのようなトランスジェニックマウスでは、内因性免疫グロブリン座は、通常、不活化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を得る方法の概説については、例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇ、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３：１１１７−１１２５（２００５）を参照。そのような動物により生産される無傷の抗体由来のヒト可変領域は、例えば異なるヒト定常領域と組み合わせることにより、さらに改変され得る。
【００２１】
また、ヒト抗体は、ハイブリドーマに基づく方法によって作製することもできる。ヒトモノクローナル抗体の生産のためのヒト骨髄腫およびマウス−ヒトヘテロミエローマ細胞株は開示されている（例えばＫｏｚｂｏｒ  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３を参照）。また、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術を介して生産されるヒト抗体は、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  １０３：３５５７−３５６２（２００６）に開示される。
【００２２】
また、ヒト抗体は、ファージディスプレイ法によって生産してもよい（例えば、ＵＳ６，２４８，５１６、ＵＳ５，４０３，４８４、ＵＳ５，９６９，１０８、ＵＳ５，８８５，７９３、ＵＳ６，６９６，２４８、ＵＳ５，８４９，５００を参照）。抗体ライブラリーからヒト抗体を選択する技術は、当技術分野で知られている（例えば、Ｃａｒｍｅｎ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒｉｅｆｉｎｇｓ  ｉｎ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ（２００２），１（２），ｐ．１８９−２０３；および、Ｓｉｒｉｗａｒｄｅｎａ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ（２００２）１０９  （３），ｐ．４２７−４３１を参照）。例えば、ヒト抗体可変領域を単鎖抗体（ｓｃＦｖ）としてファージ表面上に発現させるステップ、および、抗原に結合するファージを選択するステップを含む、ファージディスプレイ法を用いることができる（Ｎａｔｕｒｅ（１９９１），３５２，（６３３６），ｐ．６２４−６２８，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９２），２２７，（２），ｐ３８１−３８８、および、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００５），２３，（９），ｐ．１１０５−１１１６）。同様に、ヒト抗体Ｆａｂ（抗原−結合フラグメント）をファージの表面上に発現させるステップ、および、抗原に結合するファージを選択するステップを含む、別のファージディスプレイ法も用いることができる（ＷＯ９７／０８３２０およびＷＯ０１／０５９５０）。抗原結合に基づいて選択されたファージの遺伝子を解析して、それにより、抗原に結合するヒト抗体可変領域をコードするＤＮＡ配列を決定することができる。抗原に結合するｓｃＦｖまたはＦａｂのＤＮＡ配列が明らかである場合は、ＣＤＲ配列がそれから抽出されて、そして、その配列を有する発現ベクターを調製して適切な宿主へ導入することができ、その後に遺伝子発現がされてヒト抗体が得られる（ＷＯ９２／０１０４７、ＷＯ９２／２０７９１、ＷＯ９３／０６２１３、ＷＯ９３／１１２３６、ＷＯ９３／１９１７２、ＷＯ９５／０１４３８、ＷＯ９５／１５３８８、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９４）１２，ｐ．４３３−４５５、および、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００５）２３（９），ｐ．１１０５−１１１６）。
【００２３】
また、ヒト抗体は、ヒト由来ファージディスプレイライブラリーから選択されるＦｖクローン可変ドメイン配列を単離することにより生産してもよい。そのような可変ドメイン配列は、それから、所望のヒト定常ドメインと組み合わせてよい。抗体ライブラリーからヒト抗体を選択する技術は、当技術分野で知られている。
【００２４】
ヒト化抗体は、公知技術に従ってモノクローナル抗体のヒト化により調製され得る。典型的に、非ヒト抗体は、親の非ヒト抗体の特異性および親和性を維持しながら、ヒトに対する免疫原性を低減するためにヒト化される。ヒト化抗体およびそれらを作製する方法は、例えば、Ａｌａｍａｇｒｏ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９−１６３３  （２００８）に概説される。
【００２５】
また、本発明は、ヒト抗体のフラグメント、例えば、少なくとも１つの抗原結合部位を含む上述の抗体の部分も包含する。抗体フラグメントの例は、ヒトＦＧＦＲ４に結合する所望の能力をそれらが示す限り、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、ダイアボディまたは単鎖抗体分子および他のフラグメントを含む。特定の抗体フラグメントの総説に関しては、Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｔ．９：１２９−１３４（２００３）を参照。
【００２６】
ダイアボディは、二価または二重特異性であり得る２つの抗原結合部位を有する抗体フラグメントである。例えば、Ｈｕｄｓｏｎら（２００３）を参照。単鎖抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全てまたは一部、または、軽鎖可変ドメインの全てまたは一部を含む、抗体フラグメントである。抗体フラグメントは、制限されないが、本明細書に記載の組み換え宿主（例えばＥ．ｃｏｌｉまたはファージ）による生産ならびに無傷の抗体のタンパク質消化を含む、様々な技術によって作製することができる。
【００２７】
特定の実施態様では、本明細書において提供される抗体は、二重特異性抗体のような多重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる部位に関して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。
【００２８】
特定の実施態様では、結合特異性の一方はＦＧＦＲ４に関するものであり、他方は任意の他の抗原に関するものである。
【００２９】
特定の実施態様では、二重特異性抗体は、ＦＧＦＲ４の２つの異なるエピトープに結合し得る。また、二重特異性抗体を用いて、ＦＧＦＲ４を発現する細胞に細胞傷害薬を局在化させてもよい。二重特異性抗体は、抗体全長または抗体フラグメントとして調製することができる。
【００３０】
多重特異性抗体を作製する技術は、限定されないが、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖ペアの組み換え共発現および「ｋｎｏｂ  ｉｎ  ｈｏｌｅ」エンジニアリングを含む。また、多重特異性抗体は、説明されるように、抗体Ｆｃ−ヘテロ二量体分子を作製するための静電ステアリング効果を設計することにより；２つまたはそれより多くの抗体またはフラグメントを架橋することにより；ロイシンジッパーを用いて二重特異性抗体を生産することにより；二重特異性抗体を作製するための「ダイアボディ」技術を用いることにより、および、単鎖Ｆｖを用いて三重特異性抗体を準備することにより、作製してもよい。「オクトパス抗体」を含む、３つまたはより多くの機能性抗原結合部位を有する操作された抗体もまた、本明細書中に含まれる。
【００３１】
特定の実施態様では、本明細書において提供される抗体のアミノ酸配列変異体は、ヒトＦＧＦＲ４に結合する所望の能力をそれらが示す限り、検討される。例えば、抗体の結合親和性および／または他の生物学的特性を改善することが望ましくあり得る。抗体のアミノ酸配列変異体は、適切な改変を、抗体をコードするヌクレオチド配列に導入することにより、またはペプチド合成により、調製され得る。そのような改変は、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基の欠失および／または挿入および／または置換を含む。最終構築物が所望の特性、例えば抗原結合を保有するという条件で、最終構築物に到達するように、欠失、挿入および置換の任意の組み合わせをすることができる。
【００３２】
用語「結合する」または抗体の「結合」は、標的抗原、すなわち、エピトープを含むそのフラグメントを含むヒトＦＧＦＲ４との、またはそれに対する、少なくとも一時的な相互作用または関連性を意味する。
【００３３】
特定の実施態様では、本明細書において提供される抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、または≦０．００１ｎＭ（例えば１０−８Ｍまたはそれ未満、例えば１０−８Ｍ〜１０−１３Ｍ、例えば１０−９Ｍ〜１０１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。
【００３４】
一実施態様では、Ｋｄは、目的の抗体のＦａｂバージョンおよびその抗原を用いて行なわれる放射能標識抗原結合アッセイ（ラジオイムノアッセイ、ＲＩＡ）によって測定される。
【００３５】
別の実施態様によれば、Ｋｄは、固定化抗原を用いた表面プラズモン共鳴アッセイを用いて測定される。本発明の好ましい一実施態様によれば、抗体は、本明細書に記載のヒトＦＧＦＲ４のエピトープに対して向けられるヒトモノクローナル抗体である。
【００３６】
本出願の発明者らは、ヒトＦＧＦＲ４のアミノ酸１１９〜２８４の間のエピトープに対して向けられる抗体、またはその機能性フラグメントまたは機能性誘導体が、治療的および診断的適用に特に有用であることを見いだした。特に好ましいものは、ヒトＦＧＦＲ４のアミノ酸１５２〜２４０の間、より好ましくはアミノ酸２３０および２４０の間のエピトープに対して向けられる、ヒト抗体である。特に好ましい実施態様によれば、本発明の抗体は、アミノ酸配列ＲＹＮＹを含む、から本質的になる、またはからなる、エピトープに対して向けられる。
【００３７】
本発明のヒト抗体により認識されるエピトープは、好ましくは、ヒトＦＧＦＲ４のＩｇ様ドメイン２内に位置する。
【００３８】
本発明の抗体は、様々な免疫グロブリン（Ｉｇ）型、例えばＩｇＡ−、ＩｇＤ−、ＩｇＥ−、ＩｇＧ−またはＩｇＭ−型、好ましくはＩｇＧ−またはＩｇＭ−型であってよく、制限されないが、ＩｇＧ１−、ＩｇＧ２−、ＩｇＧ３−、ＩｇＧ４−、ＩｇＭ１およびＩｇＭ２−型を含む。好ましい一実施態様では、抗体はＩｇＧ１型である。
【００３９】
本発明の特定の実施態様では、抗体は、後述する特定の重鎖相補性決定領域ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２および／またはＣＤＲＨ３を含んでよい。
【００４０】
一実施態様では、ヒト抗体は、配列番号１〜６のいずれか１つに示されるアミノ酸配列、またはそれから１または２アミノ酸が異なるアミノ酸配列を有する、重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＨ１）を含む。
【００４１】
さらなる実施態様では、抗体は、配列番号７〜１２のいずれか１つに示されるアミノ酸配列、またはそれから１または２アミノ酸が異なるアミノ酸配列を有する、重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＨ２）を含む。
【００４２】
また、さらなる実施態様では、抗体は、配列番号１３〜２０のいずれか１つに示されるアミノ酸配列、またはそれから１または２アミノ酸が異なるアミノ酸配列を有する、重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＨ３）を含む。
【００４３】
また、本発明に係る抗体は、特定の軽鎖相補性決定領域ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２および／またはＣＤＲＬ３を含んでもよい。
【００４４】
したがって、一実施態様では、抗体は、配列番号２１〜２３および６８のいずれか１つに示されるアミノ酸配列、またはそれから１または２アミノ酸が異なるアミノ酸配列を有する、軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＬ１）を含む。
【００４５】
さらなる実施態様では、抗体は、配列番号２４〜２７のいずれか１つに示されるアミノ酸配列、またはそれから１または２アミノ酸が異なるアミノ酸配列を有する、軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＬ２）を含む。
【００４６】
また、さらなる実施態様では、抗体は、配列番号２８〜３５のいずれか１つに示されるアミノ酸配列、またはそれから１または２アミノ酸が異なるアミノ酸配列を有する、軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＬ３）を含む。
【００４７】
本発明の抗体は、好ましくは、１つの重鎖内に、ＣＤＲ（すなわち、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３）の特定の組み合わせを含んでよい。
【００４８】
したがって、好ましい一実施態様では、抗体は、相補性決定領域ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３を含む重鎖を含み、ここで、ＣＤＲＨ１は、配列番号１〜６に示される配列、またはそれから１または２アミノ酸が異なるアミノ酸配列から選択され、ＣＤＲＨ２は、配列番号７〜１２に示される配列、またはそれから１または２アミノ酸が異なるアミノ酸配列から選択され、ＣＤＲＨ３は、配列番号１３〜２０に示される配列、またはそれから１または２アミノ酸が異なるアミノ酸配列から選択される。
【００４９】
最も好ましくは、本発明の抗体は、３つのＣＤＲを含む重鎖を含み、ここで、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３の組み合わせは、表１に示されるものから選択される。この表の各列は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３の１つの特定の組み合わせを表わすことが理解されよう。
【００５０】
【表１】
2020183418.tif 000002
【００５１】
本発明によれば、抗体は、１つの軽鎖内に、ＣＤＲ（すなわち、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３）の特定の組み合わせを含むことがさらに好ましい。
【００５２】
したがって、好ましい一実施態様では、抗体は、相補性決定領域ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３を含む軽鎖を含み、ここで、ＣＤＲＬ１は、配列番号２１〜２３および６８のいずれかに示されるアミノ酸配列、またはそれから１または２アミノ酸が異なるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲＬ２は、配列番号２４〜２７のいずれかに示されるアミノ酸配列、またはそれから１または２アミノ酸が異なるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲＬ３は、配列番号２８〜３５のいずれかに示されるアミノ酸配列、またはそれから１または２アミノ酸が異なるアミノ酸配列を有する。
【００５３】
最も好ましくは、本発明の抗体は、３つのＣＤＲを含む軽鎖を含み、ここで、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３の組み合わせは、表２に示されるものから選択される。この表の各列は、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３の１つの特定の組み合わせを表わすことが理解されよう。
【００５４】
【表２】
2020183418.tif 000003
【００５５】
上述のように、抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、フレームワーク領域が隣接してよい。３つのＣＤＲを含む抗体の重鎖または軽鎖は、例えば４つのフレームワーク領域を含む。
【００５６】
さらに、本発明は、上記の重鎖および／または軽鎖ＣＤＲによって特徴付けられる特定の抗体と同一のヒトＦＧＦＲ４上のエピトープを認識する抗体も包含する。これらの抗体の機能性フラグメントおよび機能性誘導体もまた、本発明の範囲内である。抗体によって認識されるＦＧＦＲ４上のエピトープを決定するために、ヒトＦＧＦＲ４の細胞外ドメインのアミノ酸配列由来の、化学的に調製されたタンパク質配列アレイ由来の短いペプチドを用いて、抗体エピトープの位置特定および同定をすることができる（Ｒｅｉｎｉｃｋｅ  Ｗ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００４，２４８：４４３−６３）。本発明の抗体により結合されるＦＧＦＲ４細胞外ドメイン内のエピトープをマッピングするためのさらなる方法は、Ｓｎａｐｓ／ＳＥＬＤＩ（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，２００１，Ｊｕｎｅ  １５；９２（６）：８７１−６）を含み、または、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ（１９８８）に記載されるような日常的なクロスブロッキングアッセイを行なうことができる。
【００５７】
特に好ましい実施態様によれば、本発明のヒト抗体は、
（ａ）配列番号１〜６に示されるＣＤＲＨ１、またはそれから１または２アミノ酸が異なるＣＤＲＨ１配列、
（ｂ）配列番号７〜１２に示されるＣＤＲＨ２、またはそれから１または２アミノ酸が異なるＣＤＲＨ２配列、および
（ｃ）配列番号１３〜２０に示されるＣＤＲＨ３、またはそれから１または２アミノ酸が異なるＣＤＲＨ３配列、
からなる群より選択される少なくとも１つのＣＤＲを含む重鎖、
および／または、
（ｄ）配列番号２１〜２３または６８に示されるＣＤＲＬ１、またはそれから１または２アミノ酸が異なるＣＤＲＬ１配列、
（ｅ）配列番号２４〜２７に示されるＣＤＲＬ２、またはそれから１または２アミノ酸が異なるＣＤＲＬ２配列、および
（ｆ）配列番号２８〜３５に示されるＣＤＲＬ３、またはそれから１または２アミノ酸が異なるＣＤＲＬ３配列
からなる群より選択される少なくとも１つのＣＤＲを含む軽鎖、
を含む。
【００５８】
本発明の好ましい実施態様では、ヒト抗体は、配列番号５２〜５９のいずれか１つに示される重鎖可変領域（ＶＨ）またはそれから１または２アミノ酸が異なる配列を含む。さらに、本発明のヒト抗体は、好ましくは、配列番号６０〜６７のいずれか１つに示される軽鎖可変領域（ＶＬ）またはそれから１または２アミノ酸が異なる配列を含む。特に好ましいものは、配列番号５２〜５９のいずれか１つに示される重鎖可変領域および配列番号６０〜６７のいずれか１つに示される軽鎖可変領域を含む、ヒト抗体である。
【００５９】
特に好ましいものは、配列番号１に示されるＣＤＲＨ１、配列番号７に示されるＣＤＲＨ２および配列番号１３に示されるＣＤＲＨ３を含む重鎖、および、配列番号２１に示されるＣＤＲＬ１、配列番号２４に示されるＣＤＲＬ２および配列番号２８に示されるＣＤＲＬ３を含む軽鎖、を含む、ヒト抗体（Ｕ４−１）である。また、ＣＤＲの１つまたは複数が１または２アミノ酸異なるヒト抗体、または、ヒトＦＧＦＲ４上の同一エピトープを認識する抗体も包含される。特に好ましい実施態様では、ヒト抗体は、配列番号５２に係る重鎖可変領域および配列番号６０に係る軽鎖可変領域を含む。また、重鎖および／または軽鎖の可変領域の配列が、配列番号５２および６０に示されるものから１または２アミノ酸異なるヒト抗体も包含される。
【００６０】
特に好ましいものは、配列番号２に示されるＣＤＲＨ１、配列番号７に示されるＣＤＲＨ２および配列番号１４に示されるＣＤＲＨ３を含む重鎖、および、配列番号２２に示されるＣＤＲＬ１、配列番号２４に示されるＣＤＲＬ２および配列番号２９に示されるＣＤＲＬ３を含む軽鎖、を含む、ヒト抗体（Ｕ４−２）である。また、ＣＤＲの１つまたは複数が１または２アミノ酸異なるヒト抗体、または、ヒトＦＧＦＲ４上の同一エピトープを認識する抗体も包含される。特に好ましい実施態様では、ヒト抗体は、配列番号５３に係る重鎖可変領域および配列番号６１に係る軽鎖可変領域を含む。また、重鎖および／または軽鎖の可変領域の配列が、配列番号５３および６１に示されるものから１または２アミノ酸異なるヒト抗体も包含される。
【００６１】
特に好ましいものは、配列番号３に示されるＣＤＲＨ１、配列番号８に示されるＣＤＲＨ２および配列番号１５に示されるＣＤＲＨ３を含む重鎖、および、配列番号２３に示されるＣＤＲＬ１、配列番号２５に示されるＣＤＲＬ２および配列番号３０に示されるＣＤＲＬ３を含む軽鎖、を含む、ヒト抗体（Ｕ４−３）である。また、ＣＤＲの１つまたは複数が１または２アミノ酸異なるヒト抗体、または、ヒトＦＧＦＲ４上の同一エピトープを認識する抗体も包含される。特に好ましい実施態様では、ヒト抗体は、配列番号５４に係る重鎖可変領域および配列番号６２に係る軽鎖可変領域を含む。また、重鎖および／または軽鎖の可変領域の配列が、配列番号５４および６２に示されるものから１または２アミノ酸異なるヒト抗体も含まれる。
【００６２】
特に好ましいものは、配列番号４に示されるＣＤＲＨ１、配列番号９に示されるＣＤＲＨ２および配列番号１６に示されるＣＤＲＨ３を含む重鎖、および、配列番号２２に示されるＣＤＲＬ１、配列番号２４に示されるＣＤＲＬ２および配列番号３１に示されるＣＤＲＬ３を含む軽鎖、を含む、ヒト抗体（Ｕ４−４）である。また、ＣＤＲの１つまたは複数が１または２アミノ酸異なるヒト抗体、または、ヒトＦＧＦＲ４上の同一エピトープを認識する抗体も包含される。特に好ましい実施態様では、ヒト抗体は、配列番号５５に係る重鎖可変領域および配列番号６３に係る軽鎖可変領域を含む。また、重鎖および／または軽鎖の可変領域の配列が、配列番号５５および６３に示されるものから１または２アミノ酸異なるヒト抗体も包含される。
【００６３】
特に好ましいものは、配列番号５に示されるＣＤＲＨ１、配列番号１０に示されるＣＤＲＨ２および配列番号１７に示されるＣＤＲＨ３を含む重鎖、および、配列番号２２に示されるＣＤＲＬ１、配列番号２４に示されるＣＤＲＬ２および配列番号３２に示されるＣＤＲＬ３を含む軽鎖、を含む、ヒト抗体（Ｕ４−５）である。また、ＣＤＲの１つまたは複数が１または２アミノ酸異なるヒト抗体、または、ヒトＦＧＦＲ４上の同一エピトープを認識する抗体も包含される。特に好ましい実施態様では、ヒト抗体は、配列番号５６に係る重鎖可変領域および配列番号６４に係る軽鎖可変領域を含む。また重鎖および／または軽鎖の可変領域の配列が、配列番号５６および６４に示されるものから１または２アミノ酸異なるヒト抗体も包含される。
【００６４】
特に好ましいものは、配列番号６に示されるＣＤＲＨ１、配列番号１２に示されるＣＤＲＨ２および配列番号１９に示されるＣＤＲＨ３を含む重鎖、および、配列番号２２に示されるＣＤＲＬ１、配列番号２６に示されるＣＤＲＬ２および配列番号３４に示されるＣＤＲＬ３を含む軽鎖、を含む、ヒト抗体（Ｕ４−６）である。また、ＣＤＲの１つまたは複数が１または２アミノ酸異なるヒト抗体、または、ヒトＦＧＦＲ４上の同一エピトープを認識する抗体も包含される。特に好ましい実施態様では、ヒト抗体は、配列番号５８に係る重鎖可変領域および配列番号６６に係る軽鎖可変領域を含む。また、重鎖および／または軽鎖の可変領域の配列が、配列番号５８および６６に示されるものから１または２アミノ酸異なるヒト抗体も包含される。
【００６５】
特に好ましいものは、配列番号３に示されるＣＤＲＨ１、配列番号７に示されるＣＤＲＨ２および配列番号２０に示されるＣＤＲＨ３を含む重鎖、および、配列番号６８に示されるＣＤＲＬ１、配列番号２７に示されるＣＤＲＬ２および配列番号３５に示されるＣＤＲＬ３を含む軽鎖、を含む、ヒト抗体（Ｕ４−７）である。また、ＣＤＲの１つまたは複数が１または２アミノ酸異なるヒト抗体、または、ヒトＦＧＦＲ４上の同一エピトープを認識する抗体も包含される。特に好ましい実施態様では、ヒト抗体は、配列番号５９に係る重鎖可変領域および配列番号６７に係る軽鎖可変領域を含む。また、重鎖および／または軽鎖の可変領域の配列が、配列番号５９および６７に示されるものから１または２アミノ酸異なるヒト抗体も包含される。
【００６６】
特に好ましいものは、配列番号４に示されるＣＤＲＨ１、配列番号１１に示されるＣＤＲＨ２および配列番号１８に示されるＣＤＲＨ３を含む重鎖、および、配列番号２２に示されるＣＤＲＬ１、配列番号２４に示されるＣＤＲＬ２および配列番号３３に示されるＣＤＲＬ３を含む軽鎖、を含む、ヒト抗体（Ｕ４−８）である。また、ＣＤＲの１つまたは複数が１または２アミノ酸異なるヒト抗体、または、ヒトＦＧＦＲ４上の同一エピトープを認識する抗体も包含される。特に好ましい実施態様では、ヒト抗体は、配列番号５７に係る重鎖可変領域および配列番号６５に係る軽鎖可変領域を含む。また、重鎖および／または軽鎖の可変領域の配列が、配列番号５７および６５に示されるものから１または２アミノ酸異なるヒト抗体も包含される。
【００６７】
また、配列番号３に示されるＣＤＲ１、配列番号８に示されるＣＤＲＨ２および配列番号１５に示されるＣＤＲＨ３を含む重鎖、および、配列番号６８に示されるＣＤＲＬ１、配列番号２７に示されるＣＤＲＬ２および配列番号３５に示されるＣＤＲＬ３を含む軽鎖、を含む、ヒト抗体（Ｕ４−９）も好ましい。また、ＣＤＲの１つまたは複数が１または２アミノ酸異なるヒト抗体、または、ヒトＦＧＦＲ４上の同一エピトープを認識する抗体も包含される。特に好ましい実施態様では、ヒト抗体は、配列番号５４に係る重鎖可変領域および配列番号６７に係る軽鎖可変領域を含む。抗体Ｕ４−９は、好ましくは、抗体Ｕ４−３に関して特定される重鎖、および、抗体Ｕ４−７に関して特定される軽鎖、を含む。本出願において提供される実験では、抗体Ｕ４−９は、ＦＧＦＲ４に関する親和性が、Ｕ４−３よりも高いことが判明した。
【００６８】
上述のように、本発明の抗体は、それらの結合特異性および生物学的活性に関して、具体的には、ヒト抗−ＦＧＦＲ４のエピトープを認識するそれらの能力、細胞増殖および細胞遊走を低減させるそれらの能力、さらなる抗悪性腫瘍剤を活性化および／または腫瘍細胞を治療的処置に感作させるそれらの能力に関して、有利な特性を示す。本発明の抗体Ｕ４−１からＵ４−９は、内因性の抗腫瘍活性を有する。それらは、ＦＧＦＲ４に特異的に結合し、好ましくは、他のＦＧＦ受容体ＦＧＦＲ１−３ｂ、ｃに対して交差反応性を示さない。
【００６９】
抗体は、ヒトＦＧＦＲ４へのリガンド結合を阻害することが可能である。ＦＧＦＲ４へのリガンド結合に対する抗体の効果は、この受容体を発現する細胞（例えばＭＤＡ−ＭＢ４５３乳癌細胞）を、抗−ＦＧＦＲ４抗体の不存在下（コントロール）または存在下で、放射能標識リガンドとともにインキュベートすることにより判定することができる。ＦＧＦＲ４受容体に関するリガンドの結合親和性を低減させる抗体、またはＦＧＦＲ４へのリガンドの結合をブロックする抗体を、同定することができる。公知のＦＧＦＲ４リガンドは、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ４、ＦＧＦ６、ＦＧＦ８、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ１９およびＦＧＦ２０を含む。内因的にＦＧＦ１９を発現する細胞株は、Ｈｕｈ−７である。本発明の抗体は、これらのリガンドがヒトＦＧＦＲ４に結合するのを少なくとも部分的に阻害することが可能である。本発明の特に好ましい抗体は、１つまたは複数の上記のリガンドの結合を、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％または８７％、ブロックすることが可能である。特に好ましいものは、ヒトＦＧＦＲ４へのＦＧＦ１９の結合を、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％または少なくとも９０％、ブロックする本発明の抗体である。
【００７０】
ヒトＦＧＦＲ４へのリガンド結合のブロックは、ＦＧＦＲ４シグナリングの阻害をもたらす。リガンドにより誘導されるＦＧＦＲ４リン酸化を低減させる抗体を選択するために、細胞を、バッファー（コントロール）または抗体とともに事前インキュベートして、それから、リガンドまたはコントロールバッファーで処理することができる。それから細胞を溶解させて、クルード溶解物を遠心分離して不溶性物質を除去することができる。上清を、抗体特異的な純粋ＦＧＦＲ４およびプロテイン−Ａ−セファロースとともにインキュベートして、効率的な沈殿を可能にし得る。洗浄に続いて、免疫沈殿物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し得る。それから、ゲルのウエスタンブロットを抗−ホスホチロシン抗体でプローブする。可視化した後に、ブロットをストリップして抗−ＦＧＦＲ４抗体で再プローブし得る。ＨＲＧにより誘導される複合体形成に対する、問題とされる抗体の効果を定量するために、ゲルの反射走査デンシトメトリーを行なうことができる。コントロール（未処理細胞）と比較してＦＧＦＲ４リン酸化を低減させる抗体を選択する。
【００７１】
リガンドにより刺激される細胞増殖を本発明の抗体が阻害する能力を決定するために、インビトロ実験を行なうことができる。適切な数の目的細胞を、適切な培地中に希釈された抗体とともにインキュベートする。リガンドを抗体溶液に直接添加することにより細胞を刺激して、それからそのまま７２時間増殖させる。Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ；Ｕ．Ｓ．Ａ．）を添加して、３７℃で、暗所でインキュベートする。吸光度を３０分ごとに５９０ｎｍで測定する。
【００７２】
ＦＧＦＲ４により仲介される細胞遊走を低減させる抗体を選択するために、遊出実験を行なうことができる。血清が欠乏した細胞を、抗体とともにインキュベートする。適切な数の細胞を、８μｍのポアを有する、コーティングされたトランスウェルプレートの上部チャンバーに置くことができる（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ；Ｕ．Ｓ．Ａ．）。刺激の場合には、培地のみ、または走化性薬剤を含む培地を、底部チャンバーに用いる。細胞を遊走させたままにして、続いて染色する。染色された核をカウントする；阻害率は、コントロール抗体と比較した阻害として表される。
【００７３】
本発明の抗体は、公知の抗−ＦＧＦＲ４抗体と比較して改善された抗−腫瘍活性を有することが見いだされた。治療的抗体の抗−腫瘍の有効性は、ヒト異種移植片の腫瘍試験で評価され得る。これらの試験において、ヒト腫瘍は、免疫不全マウスにおける異種移植片として増殖し、治療的有効性は、腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）の度合いにより測定される。本発明のＦＧＦＲ４抗体が、ヌードマウスにおけるヒト癌細胞の腫瘍増殖を妨げるかどうかを判断するために、細胞をヌードマウスに移植する。腫瘍は、動物の背中または脇での皮下増殖である。処置は、直ちに、または腫瘍が特定の平均体積に到達したときに開始してよい。最初の処置の前に、マウスを無作為化して、統計試験を行なって、処置基にわたる開始時の腫瘍体積（平均、中央値および標準偏差）の均一性を確保する。処置は、２５ｍｇ／ｋｇの負荷投与量で始めて、その後に、腹腔内注射による週２回の２５ｍｇ／ｋｇ注射を行なう。
【００７４】
本発明の抗体は、医薬での使用、特にヒト医薬での使用に適切である。抗体は、ＦＧＦＲ４発現、過剰発現および／または機能亢進と関連する疾患の予防および／または治療において用いられ得る。本発明の抗体を用いて予防および／または治療することのできる疾患の例を後述する。
【００７５】
さらに、本発明の抗体は、診断薬として、例えば、ＦＧＦＲ４発現、過剰発現および／または機能亢進と関連する疾患の診断のために用いられ得る。本発明の抗体を用いて診断することのできる疾患の例を後述する。
【００７６】
本発明の抗体は、エフェクター基のような異種基に連結され得る。そのような抗体コンジュゲートは、治療的適用に特に適切である。用語「エフェクター基」は、細胞傷害性基、例えば、放射性同位体または放射性核種、毒素、治療基または当技術分野で知られている別のエフェクター基を指し得る。抗体が治療基に連結されたコンジュゲート、いわゆる抗体−薬剤−コンジュゲート（ＡＤＣ）が特に好ましい。あるいは、本発明の抗体は、標識基に連結され得る。そのような抗体コンジュゲートは、診断適用に特に適切である。本明細書において用いられる用語「標識基」は、検出可能なマーカー、例えば放射性標識されたアミノ酸またはビオチン部分、蛍光マーカー、酵素、または当技術分野で知られている任意の他のタイプのマーカーを指す。本発明の抗体または抗体フラグメントの、放射性同位体への結合は、例えば、腫瘍治療に利益を提供する。化学療法および他の形式の癌治療とは異なり、放射線免疫療法または放射性同位体−抗体の併用の投与は、周囲の正常の健康な組織に対する損傷を最小限にして癌細胞を標的化する。
【００７７】
本発明のさらなる実施態様は、上記に定義した抗体がインターロイキン−２（ＩＬ−２）に融合された融合タンパク質である。インターロイキン−２は、細胞傷害性Ｔリンパ球を刺激するＴヘルパー細胞およびＮＫ細胞により産生される１５ｋＤａのサイトカインである。ＩＬ−２は、癌患者の免疫系を刺激するために、メラノーマおよび腎細胞癌の治療において臨床的に用いられている。腫瘍における長期の高い投与量のＩＬ−２の達成は、そうでなければ致死となる腫瘍の拒絶をもたらす、長期にわたる抗−腫瘍応答の誘導をもたらし得る。本発明では、ＩＬ−２を、本発明の抗体を含む融合タンパク質へ、その活性を維持しながら取り込むことが可能であることが示されている。それ故に、本発明の抗体がＩＬ−２に融合されている融合タンパク質は、抗原結合特異性を保持しＩＬ−２の全活性を保有するデリバリーシステムとして作用するのに適切である。
【００７８】
また、本発明は、上述の抗体をコードする核酸分子にも言及する。用語「核酸分子」は、ＤＮＡ、例えば一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡを包含する。ＤＮＡは、ゲノム、ｃＤＮＡまたは合成起源、またはそれらの組み合わせであってよい。本発明の核酸分子は、発現制御配列、すなわちコーディング核酸配列の発現を生じさせるのに必要な配列に、動作可能に連結されていてよい。そのような発現制御配列は、プロモーター、エンハンサー、リボソーム結合部位および／または転写終結配列を含んでよい。適切な発現制御配列の具体例は当技術分野で知られている。
【００７９】
好ましい実施態様によれば、本発明は、
（ａ）上記に定義される抗体、そのフラグメントまたは誘導体をコードする核酸配列、
（ｂ）配列番号３６〜４３および配列番号４４〜５１のいずれか１つに示される核酸配列、
（ｃ）  （ａ）または（ｂ）の配列のいずれか１つと相補の核酸配列、および、
（ｄ）  （ａ）、（ｂ）または（ｃ）に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な、核酸配列、
からなる群より選択される、単離された核酸分子に関する。
【００８０】
特に好ましい本発明の実施態様によれば、核酸分子は、抗体の重鎖の可変領域をコードする配列および軽鎖の可変領域をコードする配列を含む。代替の実施態様では、２つの核酸分子の組み合わせが提供され、ここで、一方の核酸分子は抗体の軽鎖をコードし、他方の核酸分子は抗体の重鎖をコードする。重鎖の可変領域をコードする核酸配列は、好ましくは、配列番号３６〜４３のいずれか１つに示される配列から選択される。抗体の軽鎖の可変領域をコードする核酸配列は、好ましくは、配列番号４４〜５１のいずれか１つに示される配列から選択される。特に好ましいものは、配列番号３６〜４３に示される配列の少なくとも１つおよび配列番号４４〜５１に示される配列の少なくとも１つを含む、核酸配列の組み合わせである。核酸配列は、１つの単離された核酸分子内に、または２つの単離された核酸分子の組み合わせで存在し得る。
【００８１】
用語「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」は、２つの核酸フラグメントが、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８９），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＵＳＡの、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｏｎｅｄ  Ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｅ．  ｃｏｌｉ」に記載の標準化されたハイブリダイゼーション条件下で、互いにハイブリダイズすることを意味する。そのような条件は、例えば、６．０×ＳＳＣ（クエン酸ナトリウム生理食塩水（Ｓａｌｉｎｅ  Ｓｏｄｉｕｍ  Ｃｉｔｒａｔｅ））中、約４５℃でのハイブリダイゼーションの後に、５０℃の２．０×ＳＳＣ、好ましくは６５℃の２．０×ＳＳＣ、または５０℃の０．２×ＳＳＣ、好ましくは６５℃の０．２×ＳＳＣでの洗浄ステップを行なう。
【００８２】
本発明の核酸分子は、複製起点および／または選択マーカー遺伝子をさらに含み得るベクター上に位置してよい。ベクターの例は、例えばプラスミド、コスミド、ファージ、ウイルスなどである。したがって、本発明のさらなる実施態様は、本明細書に開示の核酸配列を含むベクターである。好ましくは、ベクターは発現ベクターである。前記ベクターは、例えば、ファージ、プラスミド、ウイルスまたはレトロウイルスベクターであってよい。レトロウイルスベクターは、複製コンピテントまたは複製欠損であってよい。後者の場合には、ウイルス増殖は一般に、宿主／細胞の補完でのみ生じる。
【００８３】
本発明の核酸分子は、宿主での増殖について選択可能なマーカーを含むベクターに結合され得る。一般に、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈殿物または塩化ルビジウム沈殿物のような沈殿物内に、または帯電した脂質を有する複合体内に、またはフラーレンのような炭素系クラスター内に導入される。ベクターがウイルスであるならば、宿主細胞への適用の前に、適切なパッケージング細胞株を用いてインビトロでパッケージングされ得る。
【００８４】
好ましくは、本発明のベクターは発現ベクターであり、ここで核酸分子は、１つまたは複数の制御配列に作動可能に連結していて、原核生物および／または真核生物の宿主細胞における転写および場合により発現を可能にする。前記核酸分子の発現は、好ましくは翻訳可能なｍＲＮＡへの核酸分子の転写を含む。真核生物の細胞、好ましくは哺乳類の細胞での発現を確保する調節エレメントは、当業者によく知られている。それらは通常、転写の開始を確保する調節配列、および場合により転写終結および転写産物の安定化を確保するポリ−Ａシグナルを含む。さらなる調節エレメントは、転写ならびに翻訳エンハンサーを含んでよい。原核生物の宿主細胞における発現を可能にする、あり得る調節エレメントは、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのｌａｃ、ｔｒｐまたはｔａｃプロモーターを含み、真核生物の宿主細胞における発現を可能にする調節エレメントの例は、酵母のＡＯＸＩまたはＧＡＬ−１プロモーター、または、哺乳類および他の動物細胞のＣＭＶ（サイトメガロウイルス）−、ＳＶ４０（シミアンウイルス４０）−、ＲＳＶ−プロモーター（ラウス肉腫ウイルス）、ＣＭＶ−エンハンサー、ＳＶ４０−エンハンサーまたはグロビンイントロンである。転写の開始の要因となるエレメントの他に、そのような調節エレメントは、ポリヌクレオチドの下流に、ＳＶ４０−ポリ−Ａ部位またはｔｋ−ポリ−Ａ部位のような転写終結シグナルを含んでもよい。この文脈において、適切な発現ベクターは、Ｏｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ  ｃＤＮＡ発現ベクターｐｃＤＶ１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＣＤＭ８、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ１、ｐｃＤＮＡ３またはｐＳＰＯＲＴＩ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）など、当技術分野で知られているものである。好ましくは、前記ベクターは、発現ベクターおよび／または遺伝子導入または標的化ベクターである。レトロウイルス、ｖａｃｃｉｎａウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルスまたはウシ乳頭腫ウイルスのようなウイルス由来の発現ベクターを、本発明のベクターまたはポリヌクレオチドの標的細胞集団への送達に用いてよい。当業者によく知られている方法を用いて組み換えウイルスベクターを構築することができる；例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（２００１，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｎ．Ｙ．および、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．（１９９４）のＡｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓに記載される技術を参照。あるいは、本発明の核酸分子は、標的細胞への送達のために、リポソーム内に再構成することができる。
【００８５】
さらに、本発明は、上述のベクターまたは核酸分子を含む宿主を言及する。核酸分子またはベクターは、当技術分野で知られている任意の方法に従って形質転換、トランスフェクションまたは形質導入によって宿主へ導入され得る。
【００８６】
前記宿主は、原核生物または真核生物の細胞または非ヒトのトランスジェニック動物であってよい。宿主内に存在する本発明のベクターまたはポリヌクレオチドは、宿主のゲノム内に組み込まれ得るか、または染色体外に維持され得るかのいずれかである。この点において、相同組み換えを介した突然変異体遺伝子の作製または突然変異体遺伝子の復元のために、本発明の核酸分子を、「遺伝子ターゲッティング」および／または「遺伝子置換」に用いることができることも理解される；例えば、Ｍｏｕｅｌｌｉｃ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７（１９９０），４７１２−４７１６；Ｊｏｙｎｅｒ，Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓを参照。
【００８７】
宿主は、細菌、昆虫、真菌、植物、動物、哺乳類または好ましくはヒト細胞のような、任意の原核生物または真核生物の細胞であってよい。好ましい真菌細胞は、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属のもの、具体的にはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ種のものである。用語「原核生物」は、本発明の変異ポリペプチドの発現のためのポリヌクレオチドで形質転換またはトランスフェクトすることのできる全ての細菌を含むことを意味する。原核生物宿主は、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、および、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓのようなグラム陽性ならびにグラム陰性細菌を含んでよい。本発明の変異ポリペプチドの変異型をコードするポリヌクレオチドを用いて、当業者に一般に知られる任意の技術を用いて宿主を形質転換またはトランスフェクトすることができる。融合され動作可能に連結された遺伝子の作製および細菌または動物細胞におけるそれらの発現のための方法は、当技術分野でよく知られている（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（２００１，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ）。遺伝子構築物および本明細書に記載の方法を、例えば原核生物宿主において、本発明の変異抗体、その抗体フラグメントまたは誘導体の発現に使用することができる。一般に、挿入された核酸分子の効率的な転写を促進するプロモーター配列を含む発現ベクターが、宿主に関して用いられる。発現ベクターは、典型的に、複製起点、プロモーターおよびターミネーター、ならびに、形質転換された細胞の表現型選択を与えることが可能な特定の遺伝子を含む。形質転換された原核生物宿主を発酵装置中で増殖させ、当技術分野で知られている技術に従って培養して、最適な細胞増殖を達成することができる。それから、本発明の抗体、その抗体フラグメントまたは誘導体を、増殖培地、細胞溶解物または細胞膜画分から単離することができる。微生物的または他の方法で発現された、本発明の抗体、その抗体フラグメントまたは誘導体の単離および精製は、例えば、予備的クロマトグラフィー分離およびモノクローナルまたはポリクローナル抗体の使用を伴うもののような免疫学的分離などの任意の従来の方法によりなされ得る。
【００８８】
本発明の一実施態様によれば、宿主は、ヒト、細菌、動物、真菌、両生類または植物細胞である。好ましい動物細胞は、限定されないが、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、マウス胚線維芽細胞細胞（ＮＩＨ−３Ｔ３）およびヒト細胞を含む多くの他の細胞株を含む。
【００８９】
別の好ましい実施態様では、前記動物細胞は昆虫細胞である。好ましい昆虫細胞は、限定されないが、ＳＦ９細胞株由来の細胞を含む。
【００９０】
好ましくは、細胞は、哺乳類の細胞、例えばハムスター、ウサギまたはヒト細胞である。最も好ましくは、細胞はヒト細胞である。前記のヒト細胞は、限定されないが、ヒト胚腎臓細胞（ＨＥＫ２９３、２９３Ｔ、２９３フリースタイル）を含む。さらに、前記ヒト細胞株は、限定されないが、ＨｅＬａ細胞、ヒト肝細胞癌腫細胞（例えばＨＥＰＧ２、Ｈｕｈ−７）、Ａ５４９細胞を含む。別の実施態様によれば、本発明の宿主は、非ヒトトランスジェニック動物である。本発明は、本発明の抗体を生産するのに用いられ得る１つまたは複数の本発明の核酸分子を含む、トランスジェニック非ヒト動物を提供する。抗体は、ヤギ、ウシ、ウマ、ブタ、ラット、マウス、ウサギ、ハムスターまたは他の哺乳類の乳、血液または尿のような体液または組織において生産されて、そこから回収することができる。例えば、米国特許第５，８２７，６９０；５，７５６，６８７；５，７５０，１７２；および５，７４１，９５７号を参照。上述のように、ヒト免疫グロブリン座を含む非ヒトトランスジェニック動物は、ＦＧＦＲ４またはその一部で免疫化することにより生産することができる。
【００９１】
本発明の抗体は、前記抗体が上述の宿主から得られる方法により調製され得る。したがって、本発明のさらなる実施態様は、前記抗体の合成を可能にする条件下で本発明の宿主を培養するステップ、および、前記培養から前記抗体を回収するステップ、を含む、抗体を調製する方法である。
【００９２】
形質転換された宿主を発酵装置内で増殖させて、当技術分野で知られている技術に従って培養して、最適な細胞増殖を達成することができる。発現した時点で、本発明の抗体全体、それらの二量体、個々の軽鎖および重鎖、または他の免疫グロブリンの形態は、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などを含む、当技術分野の標準的な手順に従って精製することができる；Ｓｃｏｐｅｓ，「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．（１９８２）を参照。それから、本発明の抗体またはその対応する免疫グロブリン鎖（単数または複数）は、増殖培地、細胞溶解物または細胞膜画分から単離することができる。例えば、微生物によって発現される本発明の抗体または免疫グロブリン鎖の単離および精製は、例えば、予備的クロマトグラフィー分離、および、本発明の抗体の定常領域などに対して向けられるモノクローナルまたはポリクローナル抗体の使用を伴うもののような免疫学的分離などの任意の従来の方法によってなされ得る。
【００９３】
本発明の抗体は、他の部分、例えば薬物ターゲッティングおよびイメージングの適用にさらに連結することができることが、当業者に明らかであろう。そのような連結は、付着側への抗体または抗原の発現後に化学的に行なわれ得て、または、連結産物は、ＤＮＡレベルで本発明の抗体または抗原に改変され得る。それから、ＤＮＡは適切な宿主系において発現され、発現されたタンパク質が集められて、必要な場合は復元される。
【００９４】
一実施態様によれば、上述の組み換え細胞は、核酸分子をコードする抗体の発現を可能にする条件下で培養される。抗体は、培養細胞または培養上清から集めてよい。好ましくは、抗体は、哺乳類、具体的にはヒト細胞から調製される。
【００９５】
また、本発明のさらなる態様は、上述の抗体、コンジュゲート、融合タンパク質、核酸分子、ベクターまたは宿主を、場合により薬学的に許容できる担体とともに含む、医薬組成物に関する。
【００９６】
用語「担体」は、用いられる用量および濃度でそれに露出される哺乳類または細胞に対して非毒性である薬剤、例えば希釈剤、安定剤、アジュバントまたは他のタイプの賦形剤を含む。薬学的に許容できる担体の例は当技術分野でよく知られていて、リン酸緩衝生理食塩水溶液、水、油／水エマルションなどのエマルション、様々なタイプの湿潤剤、滅菌溶液などを含む。しばしば、薬学的に許容できる担体は、薬物輸送、具体的には抗体分子の送達に有用な、ｐＨ−緩衝水溶液である。医薬組成物は、よく知られる従来法により、すなわち、活性剤を、担体および場合により製剤内に通常取り込まれる他の薬剤と混合することにより、製剤化され得る。例えば、組成物は、凍結乾燥製剤、水溶液、分散または固形製剤の形態で製剤化され得る。
【００９７】
適切な組成物の投与は、異なる方法により、例えば、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、局所、皮内、鼻腔内または気管支内投与により効果をもたらし得る。また、本発明の組成物は、標的部位に、例えば微粒子銃送達によって、脳などの標的部位の外側または内側に、直接的に投与してもよい。投与レジメンは、主治医および臨床因子により決定される。
【００９８】
また、本発明は、それを必要とする対象、具体的には、ＦＧＦＲ４発現、過剰発現および／または機能亢進と関連する障害を患っているヒト患者への、医薬組成物の投与も含む。医療分野においてよく知られているように、任意の一人の患者のための用量は、患者のサイズ、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与の時間および経路、健康全般および同時に投与される他の薬を含む、多くの因子に依存する。治療される状態のタイプおよび重症度に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇの有効成分が、例えば１または複数の別個の投与により、または連続的な注入により、それを必要とする患者に投与され得る。典型的な１日の用量は、上述した因子に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇの範囲である。数日またはそれより長くにわたる繰り返しの投与については、治療される状態に応じて、治療は、疾患または症状の発生の所望の抑制まで持続される。組成物は、任意の適切な経路により、例えば、非経口（ｐａｒｅｎｔａｌ）、皮下、鼻腔内、血管内、静脈内、動脈内または髄腔内注射または注入により、投与され得る。
【００９９】
進行は、定期的な評価により監視することができる。本発明の組成物は、局所的または全身的に投与され得る。非経口投与のための製剤は、滅菌された水性の溶液または非水性の溶液、懸濁液およびエマルションを含む。非水性の溶媒の例は、プロピレン、グリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、および、エチル−オレエートのような注射可能な有機物エステルである。水性の担体は、水、アルコール／水性の溶液、エマルションまたは懸濁液を含み、生理食塩水および緩衝培地を含む。非経口ビヒクルは、塩化ナトリウム溶液、リンガーブドウ糖、ブドウ糖および塩化ナトリウム、乳酸リンガーまたは固定油を含む。静脈内ビヒクルは、流体および栄養補給、電解質補給（例えばリンガーブドウ糖に基づくもの）などを含む。また、防腐剤、および、例えば抗菌剤、抗酸化、キレート剤および不活性ガスなどのような他の添加剤が存在してもよい。
【０１００】
本発明に係る活性剤は、他の活性剤とともに投与され得る。さらなる活性剤（単数または複数）は、別個または本発明の医薬組成物の一部として投与され得る。
【０１０１】
本発明の好ましい実施態様によれば、本発明の医薬組成物は、医薬組成物の使用目的に応じて、さらなる薬剤を含んでよい。医薬組成物は、例えば、さらなる抗悪性腫瘍剤、小分子阻害剤、抗腫瘍剤または化学療法剤のような、さらなる活性剤を含むことが特に好ましい。また、本発明は、本発明の抗体を、少なくとも１つのさらなる抗悪性腫瘍剤と組み合わせて含む、医薬組成物に関する。そのような組み合わせは、例えば、異常な細胞増殖を阻害するのに効果的である。
【０１０２】
多くの抗悪性腫瘍剤が、現在、当技術分野で知られている。一実施態様では、抗悪性腫瘍剤は、制限されないが、抗体または免疫調節性タンパク質を含む治療的タンパク質の群より選択される。
【０１０３】
別の実施態様では、抗悪性腫瘍剤は、小分子阻害剤、または、分裂阻害剤、キナーゼ阻害剤、アルキル化剤、代謝拮抗剤、インターカレート抗体、成長因子阻害剤、細胞周期阻害剤、酵素、トポイソメラーゼ阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、抗生存剤、生物学的応答修飾剤、抗−ホルモン、例えば抗−アンドロゲン、および血管新生阻害剤からなる化学療法剤の群より選択される。
【０１０４】
上述のさらなる活性剤は、もちろん、本発明の抗体と一緒に、共通の医薬組成物内で投与することができるだけでなく、それらは別個に投与することもできる。
【０１０５】
さらに別の実施態様では、本発明は、患者組織または患者サンプル中のＦＧＦＲ４の量および／または局在を判定するステップを含む診断方法に関する。この実施態様では、上述の標識基を保有する抗体を用いることが特に好ましい。参照データに対する、患者組織または患者サンプルに関して得られた結果の比較は、ＦＧＦＲ４発現、過剰発現および／または機能亢進と関連する疾患の診断を可能にする。本発明の診断方法は、異なる細胞、組織または他の適切なサンプルにおける、ヒトＦＧＦＲ４の望ましくない発現、過剰発現または機能亢進を検出するのに有用である。したがって、ＦＧＦＲ４発現、過剰発現および／または機能亢進と関連する疾患の発症または病状を評価することができる。また、本発明の診断方法は、得られた結果に基づいて患者のための治療レジメンを確立するステップを含んでもよい。
【０１０６】
別の実施態様では、本発明は、ＦＧＦＲ４を発現している細胞の存在を評価する方法に関し、本発明の抗体を、ＦＧＦＲ４をそれら／それの表面上に保有する疑いのある細胞または組織と接触させるステップを含む。サンプル中のＦＧＦＲ４発現を検出する適切な方法は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）または免疫組織化学（ＩＨＣ）であり得る。
【０１０７】
ＥＬＩＳＡアッセイをマイクロタイタープレート形式で行なうことができ、ここで例えば、マイクロタイタープレートのウェルは、抗−ＦＧＦＲ４抗体が吸着している。ウェルをリンスして、分析物の非特異的な吸着を防ぐために乳タンパク質またはアルブミンなどのブロッキング剤で処理する。続いて、ウェルを試験サンプルで処理する。試験サンプルまたはスタンダードをリンスで除去した後に、ウェルを、例えばビオチンでコンジュゲートすることにより標識された第二の抗−ＦＧＦＲ４抗体で処理する。過剰の二次抗体を洗い流した後に、例えば、アビジン−コンジュゲートされたホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）および適切な発色性基質により標識を検出する。試験サンプル中のＦＧＦＲ４抗原の濃度を、スタンダードサンプルから作成した検量線と比較することにより決定する。
【０１０８】
ＩＨＣのために、パラフィン包埋された組織を用いてよく、組織は、例えば、最初にキシレン中で脱パラフィン化されて、それから、例えばエタノールを用いて脱水され、そして蒸留水中でリンスされる。ホルマリン固定およびパラフィン包埋によりマスクされた抗原性エピトープは、エピトープ脱マスク、酵素消化またはサポニンによって露出され得る。エピトープ脱マスクのために、パラフィン部分を、スチーマー、水浴またはマイクロ波オーブン中で、例えば、２Ｎ  ＨＣＬ溶液（ｐＨ１．０）などのエピトープ−回復溶液中で２０〜４０分間加熱してよい。酵素消化の場合は、組織切片を、例えばプロテイナーゼＫ、トリプシン、プロナーゼ、ペプシンなどの異なる酵素溶液中で、３７℃で１０３０分間インキュベートしてよい。
【０１０９】
エピトープ−回復溶液または過剰の酵素をリンスで除去した後に、非特異的な相互作用を防ぐために組織切片をブロッキングバッファーで処理する。一次抗−ＦＧＦＲ４抗体を、適切な濃度で添加する。過剰の一次抗体をリンスで除去して、切片を室温で１０分間、ペルオキシダーゼブロッキング溶液中でインキュベートする。さらに洗浄した後、組織切片を、例えば、酵素に関するアンカーとして作用し得る基で標識された第二の標識抗体とともにインキュベートする。したがって、例は、ストレプトアビジンが連結したホースラディッシュペルオキシダーゼにより認識される、ビオチン標識された二次抗体である。抗体／酵素複合体の検出は、適切な発色性基質とインキュベートすることにより達成される。
【０１１０】
さらなる実施態様では、本発明は、抗体がＦＧＦＲ４機能をブロックすることが可能な条件下で、本発明の抗体を、ＦＧＦＲ４をそれら／それの表面上に保有する疑いがある細胞または組織と接触させるステップを含む、ＦＧＦＲ４機能をブロックする方法に関する。接触させるステップは、インビトロまたはインビボで行なってよい。
【０１１１】
さらに、本発明は、ＦＧＦＲ４発現、過剰発現および／または機能亢進と関連する疾患の診断または治療のためのキットに関する。本発明のキットは、少なくとも１つの上述の抗体、核酸分子および／またはベクターを含む。加えて、キットは、少なくとも１つの他の活性剤またはさらなる構成要素をさらに含んでよい。本発明の診断キットは、好ましくは、本明細書で上述した標識抗体を含む。さらに、診断キットは、同一タイプの組織またはサンプル中のＦＧＦＲ４の量および／または局在についての参照データを含んでよい。参照データは、１または複数の健康な対象および／または公知の病状を有する１または複数の対象から得てよい。前記の参照データに対する比較は、ＦＧＦＲ４発現、過剰発現および／または機能亢進と関連する疾患の診断を可能にする。得られた結果に基づいて、患者への治療レジメンが確立され得る。
【０１１２】
本発明によれば、ＦＧＦＲ４発現、過剰発現および／または機能亢進と関連する疾患は、例えば、癌のような過剰増殖性疾患である。本発明により診断、予防および／または治療することのできる癌は、肝細胞癌腫、乳癌、胃癌、結腸癌、横紋筋肉腫、前立腺癌、卵巣癌、軟組織肉腫、メラノーマ、頭頸部扁平上皮癌および肺腺癌、および、ＦＧＦＲ４を発現または過剰発現している他の癌および腫瘍転移の形成からなる群より選択され得る。
【０１１３】
別の実施態様によれば、ＦＧＦＲ４発現、過剰発現および／または機能亢進と関連する疾患は、代謝疾患、具体的には、メタボリック症候群または肥満である。
【０１１４】
またさらなる本発明の実施態様によれば、ＦＧＦＲ４発現、過剰発現および／または機能亢進と関連する疾患は、心室肥大、心肥大または慢性腎疾患である。
【実施例】
【０１１５】
実施例１：ＦＧＦＲ４特異的な抗体の生産
Ｆａｂ抗体フラグメントの単離
ｎ−ＣｏＤｅＲ  Ｆａｂライブラリー（ＢｉｏＩｎｖｅｎｔ，Ｌｕｎｄ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて、ヒトＦＧＦＲ４を認識するＦａｂ抗体フラグメントを単離した。スクリーニングは、ヒトＦＧＦＲ４−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ；Ｕ．Ｓ．Ａ．）、ヒトＦＧＦＲ４−Ｈｉｓ／Ｍｙｃ、または、ヒトＦＧＦＲ４を安定的に発現するラット筋芽細胞株Ｌ６（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ；Ｕ．Ｓ．Ａ．）のいずれかに対する、差動パニング法として設定した。ヒトＦＧＦＲｓ−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ヒトＦｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｎｅｗｍａｒｋｅｔ；ＵＫ）およびＬ６細胞の他のファミリーを、ネガティブ選択で用いた。液体パニングにおいて、ヒトＦＧＦＲ４−ＦｃおよびヒトＦＧＦＲ４−Ｈｉｓ／Ｍｙｃを、ＥＺ−Ｌｉｎｋ  ＮＨＳ−発色性−ビオチン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてビオチン化した。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−２８０ストレプトアビジン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を加えて、ＦＧＦＲ４−結合ファージを回収した。固形パニングにおいて、ヒトＦＧＦＲ４−ＦｃおよびヒトＦＧＦＲ４−Ｈｉｓ／Ｍｙｃをポリスチレンボール上に直接固定化した。ファージをビーズとともにインキュベートして、ボールまたはＦＧＦＲ４を発現しているＬ６細胞および未結合画分を洗浄により除去した。結合したファージを、トリプシンとのインキュベーションによりリリースさせて、Ｅ．ｃｏｌｉ中で増幅させた。合計５回の異なるパニングの後に、Ｅ．ｃｏｌｉ（ＴＯＰ１０Ｆ’）をＦａｂ−発現プラスミドで形質転換して、最終的に個々のＦａｂクローンを発現させた。
【０１１６】
実施例２：特有のＦＧＦＲ４結合Ｆａｂの同定
上述の３回目のパニングによるＦａｂを、以下のように結合について試験した：１ｐｍｏｌｅのＦＧＦＲ４−ＦｃまたはＦＧＦＲ４−Ｈｉｓ／ＭｙｃをＥＬＩＳＡプレートの各ウェルにコーティングして、４℃で一晩インキュベートした。洗浄およびブロッキングの後に、Ｆａｂを発現しているＥ．ｃｏｌｉ  ＴＯＰ１０Ｆ’の培養培地をウェルに加えて、１時間インキュベートした。最後に、結合したＦａｂを、ペルオキシダーゼ−コンジュゲート抗−Ｈｉｓ−抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）またはペルオキシダーゼ−コンジュゲート抗−ヒトＦａｂ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）とインキュベートすることにより検出した。シグナルは、Ｓｕｐｅｒ  Ｓｉｇｎａｌ  ＥＬＩＳＡ  Ｐｉｃｏ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加することにより検出した。ＦＧＦＲ４−結合Ｆａｂをシーケンスして、標準的なシーケンス技術を用いて特有のクローンを同定し、精製した特有のＦａｂを、フローサイトメトリーによって、Ｌ６または２９３Ｔ細胞を発現しているヒトＦＧＦＲ４（一過的または安定的な発現）への結合について分析した。確認された、ＦＧＦＲ４−結合Ｆａｂクローンを、標準的な組み換え技術を用いてＩｇＧ形式に変換した。
【０１１７】
実施例３：Ｅｌｋ１ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイを介した、ＦＧＦＲ４結合Ｆａｂによるシグナル中和活性
ＦＧＦＲ４に対するＦａｂ結合の機能性を、Ｅｌｋ１ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイを介して試験し、以下のとおり実証された：
【０１１８】
インテグリンαｖおよびインテグリンβ３を安定して発現しているＨＥＫ２９３細胞を、９６ウェル培養プレート上に蒔いて、製造元のプロトコルに従って、リポフェクタミン２０００を用いて、ｐＧＡＬ４．１２［ｌｕｃ２ＣＰ］およびｐＧＬ４．７４［ｈＲｌｕｃ／ＴＫ］（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ；Ｕ．Ｓ．Ａ．）のクローニングサイトに位置するｐＦＲ−Ｌｕｃ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の５×ＧＡＬ４結合エレメントを含む、ｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４０−ｈＦＧＦＲ４、ｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４０、ｐＦＡ２−Ｅｌｋ１（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ；Ｕ．Ｓ．Ａ．）、ｐＦＲ−Ｌｕｃ２ＣＰで一時的にトランスフェクトした。翌日に、細胞をＦａｂ（１０、１、０．１μｇ／ｍｌの濃度で、ＤＭＥＭ  ２％  ＦＢＳ中に希釈）とともに３７℃で１時間インキュベートして、その後にリガンド１０ｎｇ／ｍｌ（組み換えヒトＦＧＦ−１７（（ｒｈＦＧＦ１７）、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）で６時間インキュベーションした。最後に、ルシフェラーゼ活性を、Ｄｕａｌ−Ｇｌｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加することにより決定した。標準化（ウミシイタケルシフェラーゼ）に関するシグナルに対する特定の（ホタルルシフェラーゼ）活性の比を計算して、異なるＦａｂに関する値をコントロール値と比較したパーセンテージとして示す（表３）。試験された全てのＦａｂは、有意な阻害活性を示し、１μｇ／ｍｌで５０％を超えるシグナルおよび１０μｇ／ｍｌで３５％を超えるシグナルを低減させた。
【０１１９】
【表３】
2020183418.tif 000004
【０１２０】
実施例４：フローサイトメトリーによる、Ｈｕｈ−７細胞における抗−ＦＧＦＲ４抗体に関するＫＤの決定
Ｈｕｈ−７細胞（ＪＣＲＢ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋから取得）を、３７℃および５％ＣＯ２での標準的な条件下で、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で培養した。細胞を、５ｍＭ  ＥＤＴＡ（ＰＢＳ中）を用いて回収して、サンプル当たり２００，０００細胞を、示された抗−ＦＧＦＲ４抗体（１：３段階希釈；開始濃度３０μｇ／ｍｌ）とともに４℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後に、細胞を洗浄して、結合した抗体を、フィコエリトリン標識抗−ヒトＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて判定した。Ｈｕｈ−７への抗体結合を、ＢＤ  Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ６フローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ；Ｕ．Ｓ．Ａ．）で測定して、ＡｃｃｕｒｉＣ６ソフトウェアを用いて解析した。続いて、Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用いて平衡解離定数（ＫＤ）を決定した。Ｕ３  Ｐｈａｒｍａ抗体に関する計算されたＫＤ値は、非常に似ていた（０．２および１．６ｎＭの間）。図１は代表的な実験を示し、残りの抗体に関するＫＤは独立に決定した。ＧＴ−１３に関する親和力は、全ての試験されたＵ３  Ｐｈａｒｍａ抗体と比較した場合、より低いことが分かった（表４）。
【０１２１】
【表４】
2020183418.tif 000005
【０１２２】
実施例５：ＥＬＩＳＡによる、ＦＧＦＲ４の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に対する抗体Ｕ４−３およびＵ４−９に関するＫＤの決定。
マウス抗−Ｈｉｓタグ抗体をＢｉｏ−Ｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ；Ｕ．Ｓ．Ａ．）から取得し、２μｇ／ｍｌの濃度でＭａｘｉＳｏｒｐ（登録商標）平底９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ；Ｕ．Ｓ．Ａ．）上にコーティングした。コーティング後に、ヒトＦＧＦＲ４の細胞外ドメイン（ｍｙｃ−およびＨｉｓ−タグ化）を０．０１μｇ／ｍｌの濃度で加えた。非結合タンパク質の除去後に、示された抗ＦＧＦＲ４抗体を添加して（１：４段階希釈、開始濃度１０μｇ／ｍｌ）、結合は最終的に、ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ（Ｏｒｔｅｎｂｅｒｇ；Ｇｅｒｍａｎｙ）によるＦｌｕｏｓｔａｒ  Ｏｍｅｇａ蛍光プレートリーダー機で、アルカリフォスファターゼ連結ヤギ抗−ヒトＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）フラグメントを用いたＡｔｔｏＰｈｏｓ（登録商標）ＡＰ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）により検出した。代表的な結果を図２に示す。続いて、Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍを用いて、解離定数をＵ４−３、−５および−９について計算した（表５）。試験した全ての抗体は卓越したＫＤを示し、Ｕ４−３について観察された値は、以前に見られたものと同様であった。
【０１２３】
【表５】
2020183418.tif 000006
【０１２４】
実施例６：Ｂｉａｃｏｒｅアッセイを用いた、Ｕ４−３に関するＫＤの決定。
標準的なアミンカップリングを用いて、ヤギ抗−ヒトＩｇＧ捕捉Ｓ−ＣＭ５センサーチップを用意した（参照のフローセルは捕捉抗体を同様に含んだ）。カルボキシメチル化デキストラン（ＣＭＤ）表面を、２００ｍＭ  ＥＤＣおよび５０ｍＭ  ＮＨＳの混合物を７分間（１０μｌ／分）注入することにより活性化した。続いて、１０ｍＭ酢酸Ｎａ（ｐＨ５．０）中に希釈した３０μｇ／ｍｌの抗−ヒトＩｇＧ抗体を、７分間注入した（１０μｌ／分）。残りの未反応のエステルを１Ｍエタノールアミン（ｐＨ８．５）でクエンチさせた（７分、１０μｌ／ｍｌ）。１７８９２〜１８３７６ＲＵの表面密度が抗ヒトＩｇＧ抗体に関して得られた。
【０１２５】
可逆的に捕捉された抗体と抗原の相互作用分析を、ＨＢＳ分析バッファー（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，５０μＭ  ＥＤＴＡ，０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０）中２５℃で、ＢｉａｃｏｒｅＴＭ  Ｔ１００機（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ；Ｕ．Ｓ．Ａ．））を用いて行なった。３７〜３８ＲＵの特異的な抗体をフローセル上に捕捉した。続いて、５つの一連の３倍希釈の抗原（３．７、１１．１、３３．３、１００および３００ｎＭ）を、単一サイクルのモードで２分間、それぞれ注入した（５０μｌ／分）。解離を同一の流速で１０分間記録した。抗−ヒトＩｇＧ捕捉抗体を含むフローセルを参照として用いた。完全な再生（結合した抗原と一緒に、捕捉表面からの特異的抗体の除去）は、５％最終パーセンテージの１，４−ジオキサンで補充された１０ｍＭグリシンｐＨ１．７の繰り返しの注入により達成した。
【０１２６】
データ処理（例えば空試験減法）および評価は、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン２．０．３を用いた二価分析物結合モデルを適用する全体的なフィッティングにより行なった。平衡解離定数ＫＤ１は、ｋｄ１をｋａ１で割ることにより計算した。図３は、抗体Ｕ４−３に関する代表的な測定を示す；この抗体およびＵ４−９に関するＫＤ値（３回の測定の平均）を表６に報告する。
【０１２７】
【表６】
2020183418.tif 000007
【０１２８】
実施例７：フローサイトメトリーによる、種特異性の決定
Ｈｅｋ２９３細胞をＣＬＳ（Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅｓ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｅｐｐｅｌｈｅｉｍ；Ｇｅｒｍａｎｙ）より取得し、３７℃および５％ＣＯ２の標準的な条件下で、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で培養した。０日目に、細胞を４×１０５細胞／１０ｃｍ皿で蒔いた。２４時間後、細胞を、ラット、マウス、ヒトまたはカニクイザル由来のＦＧＦＲ４をコードするプラスミドでトランスフェクトした。細胞は４８時間、タンパク質を発現させて、それから、ＰＢＳ中５ｍＭ  ＥＤＴＡで皿から分離して、その後に、示された濃度の抗−ＦＧＦＲ４抗体Ｕ４−３またはＧＴ−１３とともにインキュベートした。結合は、フィコエリトリン−コンジュゲート抗−ヒトＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｕｒｏｐｅ）を用いて判定した。データをＢＤ  Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ６フローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．）で取得し、ＡｃｃｕｒｉＣ６ソフトウェアを用いて解析した。抗体滴定試験（開始濃度１０μｇ／ｍｌ；１：３希釈）は、抗体に関する解離定数の計算を可能にした（以下の表を参照）。抗体は、非常に低い濃度［１μｇ／ｍｌ］で既に試験した全ての種と同様の親和力を示し、ＫＤは、ヒトおよびカニクイザルタンパク質に対して最良の結合を示す種で同等であった。しかしながら、Ｕ４−３は、ＧＴ−１３と比較した場合、試験した全ての種にわたってより良い結合を示した。
【０１２９】
【表７】
2020183418.tif 000008
【０１３０】
実施例８：他のＦＧＦＲに対する結合。
Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃより購入したＮｕｎｃ  ＭａｘｉＳｏｒｐ（登録商標）平底９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを、１００μｇ／ウェルの終濃度で、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓより得られた前述の組み換えヒトＦＧＦＲ（細胞外ドメイン、Ｆｃキメラ）（またはコントロールとしてＢＳＡ）でコーティングして、製造元の説明書に従って処理した。示されたとおりに抗−ＦＧＦＲ４抗体Ｕ４−３でインキュベーションした後に、Ｐｒｏｍｅｇａより購入したＡｔｔｏＰｈｏｓ（登録商標）ＡＰ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍを用いてアルカリフォスファターゼ連結ヤギ抗−ヒトＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）で結合を検出して、ＢＭＧ  ＬａｂｔｅｃｈのＦｌｕｏｓｔａｒ  Ｏｍｅｇａ蛍光プレートリーダーで検出した。結果を図５に示す。
【０１３１】
抗体Ｕ４−３は、ヒトＦＧＦＲ４を高い特異性で認識し、重大なことに、ＦＧＦＲファミリーの他のメンバーと交差反応しない。
【０１３２】
実施例９：ＦＧＦＲ４の異なる細胞外ドメインに対する、抗体結合の判定。
Ｈｅｋ２９３細胞をＣＬＳから取得し、３７℃および５％ＣＯ２の標準的な状態下で、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で培養した。０日目に細胞を蒔いて、２４時間後に、示されたドメインを含むＦＧＦＲ４をコードするプラスミドで細胞をトランスフェクトした。細胞は４８時間、タンパク質を発現させて、それから、ＰＢＳ中５ｍＭ  ＥＤＴＡで皿から分離して、その後に、示された抗−ＦＧＦＲ４抗体とともにインキュベートした。結合を、フィコエリトリン−コンジュゲート抗−ヒトＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｕｒｏｐｅ）を用いて判定した。データをＢＤ  Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ６フローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で取得し、ＡｃｃｕｒｉＣ６ソフトウェアを用いて解析した。ＦＧＦＲ４に対するＵ４−３の結合は、主に受容体のＩｇ様ドメイン２で生じ、Ｉｇ様ドメイン１（アミノ酸２２〜１８０）および３（アミノ酸２４９〜３４９）では結合は見られなかった。結果を図６に示す。
【０１３３】
実施例１０：ＦＧＦＲ４の結合エピトープの決定。
標準的なＦｍｏｃ−化学を用いて標的タンパク質（ヒトＦＧＦＲ４細胞外ドメインのドメイン２）のアミノ酸配列に基づいてペプチドを合成し、スカベンジャーを用いて三フッ化酸を使用して脱保護した。立体構造的エピトープを再構成するために、Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｌｉｎｋｅｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｏｎ  Ｓｃａｆｆｏｌｄｓ（ＣＬＩＰＳ）技術を用いて、拘束性（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ）ペプチドを化学的足場上に合成した。ポリプロピレンＰＥＰＳＣＡＮカード（４５５ペプチドフォーマット／カード）上へ、重炭酸アンモニウム（２０ｍＭ，ｐＨ７．９）／アセトニトリル（１：１（ｖ／ｖ））中１，３−ビス（ブロモメチル）ベンゼンのような、ＣＬＩＰＳテンプレートの０．５ｍＭ溶液と反応させることにより、ペプチド中の多数のシステインの側鎖をＣＬＩＰＳテンプレートに連結させた。カードを、溶液中に完全に覆われながら３０〜６０分間、溶液中で穏やかに振った。最後に、カードを過剰のＨ２Ｏで広範囲にわたって洗浄して、１％ＳＤＳ／０．１％β−メルカプトエタノールをＰＢＳ中に含む破壊−バッファー（ｐＨ７．２）中で、７０℃で３０分間超音波処理して、さらに４５分間、Ｈ２Ｏ中で超音波処理を続けた。各ペプチドに対する抗体の結合を、ＰＥＰＳＣＡＮに基づくＥＬＩＳＡにおいて試験する。共有結合したペプチドを含む、４５５ウェルのクレジットカード形式のポリプロピレンカードを、例えば、ＰＢＳ／１％Ｔｗｅｅｎ中、４％ウマ血清、５％オボアルブミン（ｗ／ｖ）のようなブロッキング溶液中に希釈された１μｇ／ｍｌからなる一次抗体溶液とともにインキュベートした。洗浄後（３×１０分）、ペプチドを２５℃で１時間、１：１０００希釈の抗体ペルオキシダーゼコンジュゲートとともにインキュベートした（またはストレプトアビジン−ＨＲＰ）。洗浄後（３×１０分）、ペルオキシダーゼ基質２，２’−アジノ−ジ−３−エチルベンズチアゾリンスルホネート（ＡＢＴＳ）および２μｌの３％Ｈ２Ｏ２を添加した。１時間後、発色現像を、電荷結合素子（ＣＣＤ）−カメラおよび画像処理システムで測定および定量した。図７は、試験された抗体によるペプチド認識の違いを示し；具体的には、強調したテトラ−ペプチド配列ＲＹＮＹは、Ｕ４−３によって認識されるがＧＴ−１３によって認識されない。
【０１３４】
実施例１１：アラニンスキャニング突然変異誘発ＦＧＦＲ４細胞外ドメイン。
Ｈｅｋ２９３細胞をＣＬＳから取得し、３７℃および５％ＣＯ２の標準的な条件下で、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で培養した。０日目に細胞を２×１０５細胞／６０ｍｍ皿で蒔いた。２４時間後、ＦＧＦＲ４の細胞外ドメイン２（Ｄ２）をコードするプラスミド４．８μｇで細胞をトランスフェクトした（表７）。発現したタンパク質はｆｌａｇ−タグを保有し、以下に示されるようにアミノ酸配列が異なった。細胞を６０時間、タンパク質を発現させて（合間に培地交換した）、そして最終的に、ＰＢＳ中５ｍＭ  ＥＤＴＡで皿から分離した。細胞を、示された濃度の抗−ＦＧＦＲ４抗体Ｕ４−３とともにインキュベートして、フィコエリトリン−コンジュゲート抗−ヒトＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて結合を判定した。データをＢＤ  Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ６フローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で取得して、ＡｃｃｕｒｉＣ６ソフトウェアを用いて解析した。蛍光強度をｆｌａｇタグの発現に対して標準化した。結果を図８に示す。
【０１３５】
ＦＧＦＲ４の結合は非常に特異的であり、Ｄ２ドメインにおける単一アミノ酸突然変異誘発は、有意に低減した結合をもたらした。
【０１３６】
【表８】
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【０１３７】
実施例１２：抗−ＦＧＦＲ４抗体によるリガンド結合の阻害。
Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃより購入したＮｕｎｃ  ＭａｘｉＳｏｒｐ（登録商標）平底９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを、４μｇ／ウェルの終濃度で、組み換えヒトＦＧＦＲ４（細胞外ドメイン、Ｆｃキメラ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓより取得）でコーティングして、製造元の説明書に従って処理した。各ウェルをＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ由来の１．２μｇ／ｍｌの組み換えＦＧＦ−１９とともにインキュベートして、その後に、示された濃度の抗−ＦＧＦＲ４抗体Ｕ４−３で処理した。インキュベーションおよび洗浄の後に、結合したＦＧＦ−１９を、０．２μｇ／ｍｌのビオチン化抗−ＦＧＦ１９抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）で検出して、その後に、アルカリフォスファターゼコンジュゲートストレプトアビジンとともにインキュベートした。ＡｔｔｏＰｈｏｓ（登録商標）ＡＰ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）とのインキュベーションにより酵素的反応を引き起こして、ＢＭＧ  ＬａｂｔｅｃｈのＦｌｕｏｓｔａｒ  Ｏｍｅｇａ蛍光プレートリーダーを用いて検出した。データは、Ｕ４−３が、受容体へのＦＧＦ−１９の結合を効率的に競合することができることを示す。結果を図９に示す。
【０１３８】
実施例１３：Ｕ４−３による、ｂ−ＦＧＦが誘導するＥＲＫリン酸化の阻害。
全長ヒトＦＧＦＲ４を安定的に発現するＬ６細胞（ＡＴＣＣ）を、標準的な組織培養条件下（３７℃、５％ＣＯ２）で、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭを用いて、１２ウェル皿（１×１０５細胞／ウェル）にプレーティングした。翌日に、示された濃度の抗−ＦＧＦＲ４またはコントロール抗体を含む増殖培地で培地を置き換えた。１時間後、ｂ−ＦＧＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を２０ｎｇ／ｍｌの濃度で、示されたウェルに添加した。１０分間インキュベートした後、ホスファターゼ（Ｍｅｒｃｋ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）およびプロテアーゼ（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ；Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）の阻害剤を含むバッファー中にそれらが溶解される前に、ウェルを冷たいＰＢＳで急いで洗浄した。サンプルは、最終的にゲル電気泳動に供して、その後に、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ（Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ；Ｕ．Ｓ．Ａ．）由来のホスホ−ＥＲＫおよびＥＲＫに対する抗体を用いて免疫ブロッティングをした（ニトロセルロース膜上）。バンドを検出して、適切な、蛍光標識された二次抗体と一緒に、Ｌｉ−Ｃｏｒ（Ｌｉｎｃｏｌｎ，ＮＥ；Ｕ．Ｓ．Ａ．）のＯｄｙｓｓｅｙ検出機を用いて定量化した。バンドは、Ｏｄｙｓｓｅｙソフトウェアで定量化して、ｐＥＲＫおよび全ＥＲＫ強度の間の比としてプロットした。図１０（Ａ）は代表的な免疫ブロットを示し、図１０（Ｂ）はその後に定量化されたデータを示す。Ｕ４−３は、ｂ−ＦＧＦが仲介するＥＲＫリン酸化の濃度依存的な阻害を示す。
【０１３９】
実施例１４：Ｕ４−３抗体とのインキュベーションによる、内因性ＦＧＦＲ４リン酸化の阻害。
３℃および５％ＣＯ２の標準的な条件下で、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で培養された、Ｈｕｈ−７細胞（ＪＣＲＢ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋから取得）を、６０ｍｍ皿へ蒔いた（２×１０５細胞／皿）。翌日に、培地を取り除き、示されたとおりの抗−ＦＧＦＲ抗体Ｕ４−３（０．１、１、３および１０μｇ／ｍｌ）またはコントロールＩｇＧを含む、増殖培地で置き換えた。６日後に、細胞をＰＢＳで２回洗浄して、ＩＰ溶解バッファー（Ｍｅｒｃｋ由来のホスファターゼ阻害剤およびＲｏｃｈｅ由来のプロテアーゼ阻害剤を含む）中で溶解させた。抗−ＦＧＦＲ４抗体（マウス）およびＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−ＳｃｉｅｎｃｅｓのｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗマトリックスを用いて、全ＦＧＦＲ４を免疫沈降した。マトリックスを洗浄して、サンプルを最終的に電気泳動により分離させた。タンパク質をゲルからニトロセルロース膜に移して、リン酸化チロシン残基（ｐＦＧＦＲ４の検出）または全ＦＧＦＲ４を認識する抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ；Ｕ．Ｓ．Ａ．）でブロットして、サンプルの均等なローディングを確認した。適切な二次抗体およびＬｉ−ＣｏｒのＯｄｙｓｓｅｙ検出機を用いてバンドを検出した。代表的なスキャンを、免疫沈降に関して図１１（Ａ）に示し、全細胞溶解物の免疫ブロットに関して図１１（Ｂ）に示す。バンドをスキャンした後に、ＦＧＦＲ４およびｐＦＧＦＲ４の間の比をＯｄｙｓｓｅｙソフトウェアで判定して、図１１（Ｃ）に見ることができるようにＩｇＧコントロール値に対して標準化した。抗−ＦＧＦＲ４抗体Ｕ４−３は、試験した全ての濃度で、ＦＧＦＲ４リン酸化の強い阻害を示した。
【０１４０】
実施例１５：ＮＩＨ３Ｔ３スフェロイド増殖アッセイ
ヒトＦＧＦＲ４およびヒトＦＧＦ１９を安定的に発現しているＮＩＨ３Ｔ３細胞を、１０％のＦＢＳ、５００μｇ／ｍｌのＧ４１８および１５０μｇ／ｍｌのハイグロマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０中で培養した。実験の初日に、２，０００細胞を、示された濃度のＵ４−３またはＵ４−９抗体を含む９６ウェルＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｔｅ（Ｓｕｍｉｔｏｍｏ  Ｂａｋｅｌｉｔｅ，Ｔｏｋｙｏ；Ｊａｐａｎ）の各ウェルに蒔いた。標準的な組織培養インキュベーター（３７℃および５％ＣＯ２）での５日のインキュベーション後に、細胞増殖を、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ；Ｕ．Ｓ．Ａ．）のＶＩＣＴＯＲプレートリーダーを用いてＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で判定した。値を未処置サンプルに標準化し、両方の抗体は、細胞増殖を７０％よりも高く効率的に低減させた。ＩＣ５０値を計算して、それぞれ２４．７ｎＭおよび１０．６ｎＭ（Ｕ４−９）であると決定された。結果を図１２に示す。
【０１４１】
実施例１６：Ｈｕｈ−７肝臓癌細胞における軟寒天コロニー増殖の阻害
Ｈｕｈ−７細胞（ＪＣＲＢ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ）を、３７℃および５％ＣＯ２の標準的な条件下で、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で培養した。細胞をＰＢＳ／０．０５％トリプシンで回収して、上部寒天培地（イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、０．４寒天、２０％ＦＢＳ）中に再懸濁して、凝固させた下部寒天培地（ＩＭＤＭ中２０％ＦＢＳ、０．７５％寒天）上に注意深く注いだ。９６ウェルプレートの各ウェルは、２，０００細胞を含んだ。ウェルを、抗−ＦＧＦＲ４抗体Ｕ４−３（最高濃度３０μｇ／ｍｌ）またはコントロールＩｇＧ抗体の存在下でインキュベートして；コロニー形成を経時的に観察した（約３週）。Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ；Ｕ．Ｓ．Ａ．）のＭＴＴ試薬を用いて生存細胞を染色して、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｏｐｔｒｏｎｉｘ（Ａｂｉｎｇｄｏｎ；ＵＫ）のコロニー計数システムを用いてコロニーを定量化して、未処理のコントロールに対して標準化した。試験した抗−ＦＧＦＲ４抗体Ｕ４−３は、コントロール抗体と比較した場合、Ｈｕｈ−７細胞の濃度依存的な増殖阻害を示した。結果を図１３に示す。
【０１４２】
実施例１７：ＺＲ−７５−１乳癌細胞増殖アッセイ。
ＺＲ−７５−１細胞（ＣＬＳ）を、１０％ＦＢＳ、１０μｇ／ｍｌインスリンおよび２ｍＭグルタミンで補充されたＲＰＭＩ１６４０中で培養した。実験の日に、２，０００細胞を、示された量の抗体を含む培地中に、６ウェルプレートの各ウェルに蒔いた。培地および抗体を週に２回交換して、細胞を合計１６日間培養した（３７℃および５％ＣＯ２）。培地を最後に除去して、細胞を、０．５％クリスタルバイオレット溶液（Ｃａｒｌ  Ｒｏｔｈ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で染色した。目に見えるコロニーをコロニー計数システム（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｏｐｔｒｏｎｉｘ）でカウントして、いかなる処理も受けなかったウェル（ＮＴ）に対して標準化した。結果を図１４に示す。Ｕ４−３は、コントロール処理と比較した場合、目に見えるコロニーの形成を、約５０％効率的に阻害した。
【０１４３】
実施例１８：ＭＧ−６３骨肉腫スフェロイド増殖アッセイ。
ＭＥＭ（１０％ＦＢＳ）中で培養した１０００のＭＧ−６３細胞（ＡＴＣＣ）を、示された量の抗体を含む９６ウェルＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅプレート（Ｓｕｍｉｔｏｍｏ  Ｂａｋｅｌｉｔｅ）の各ウェルに蒔いた。標準的な組織培養インキュベーター（３７℃および５％ＣＯ２）での５日のインキュベーション後、細胞増殖を、Ｐｅｒｋｉｎ  ＥｌｍｅｒのＶＩＣＴＯＲプレートリーダーを用いてＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で判定した。結果を図１５に示す。抗体Ｕ４−３は、細胞増殖を約２５％低減させ；これは０．４μｇ／ｍｌの濃度で既に見られた。
【０１４４】
実施例１９：Ｈｕｈ−７腫瘍増殖のインビボ阻害。
増殖阻害は、ミューリン腫瘍モデルにおいて、抗−ＦＧＦＲ４抗体により仲介された。雌ＮＵ／ＮＵヌードマウスを、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ；Ｕ．Ｓ．Ａ．）から取得した。誕生後６週に、動物に５×１０６Ｈｕｈ−７細胞を皮下注射した（マトリゲル中、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。注射の１４日後、同様の腫瘍体積を有する動物をプールして、腹腔内注射により抗−ＦＧＦＲ４抗体で処置した（ｑ３ｄ×３）。腫瘍体積（ｍｍ３）を、式［体積＝０．５２×（幅）２×（長さ）］を用いて、腫瘍接種後１５、１８、２１および２４日目に測定した。図１６（Ａ）は、Ｈｕｈ−７での処置の際の腫瘍増殖の用量依存的阻害、最大増殖阻害（２５ｍｐｋの投与量で約６８％が観察された）を示す。１０ｍｐｋでは、Ｕ４−３およびＵ−４−９の両方とも、腫瘍増殖の同等の阻害を示した（図１６（Ｂ））。同一の投与レジメンを用いてＧＴ−１３とＵ４−３を直接比較した場合、Ｕ４−３は優れた効能を示し、統計的に有意に、より良好に腫瘍増殖を阻害した（図１６（Ｃ））。
【０１４５】
実施例２０：Ｈｕｈ−１およびＨｅｐ３Ｂ腫瘍モデルにおける、インビボでの増殖阻害。
実施例Ａ：Ｈｕｈ−１腫瘍モデルにおける、抗−ＦＧＦＲ４抗体により仲介される増殖阻害。
雌Ｂａｌｂ／ｃヌードマウス（５〜６週齢）を、５×１０６Ｈｕｈ−１細胞で皮下注射した。腫瘍サイズが１５０ｍｍ３に到達した後に、動物を、腹腔内注射［２５ｍｐｋ］により投与される抗−ＦＧＦＲ４抗体を用いて３週間、週に２回処置した。腫瘍体積（ｍｍ３）を、式（Ｌ×Ｗ２）／２を用いて、カリパスにより、示されるとおりに測定した。結果を図１７（Ａ）に示す。
【０１４６】
実施例Ｂ：Ｈｅｐ３Ｂ腫瘍モデルにおける、抗−ＦＧＦＲ４抗体により仲介される増殖阻害。
Ｈｅｐ３Ｂ細胞を用いたこと、および、マトリゲル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてそれらが移植されたことを除いて、上記のとおりに動物を処置した。腫瘍体積を、示された時間に、上述のとおりに決定した。結果を図１７（Ｂ）に示す。
【０１４７】
腫瘍増殖は、Ｕ４−３により阻害され、Ｈｕｈ−１細胞の場合は、腫瘍増殖阻害は５０％を超えた。
【０１４８】
実施例２１：ＳＮＵ−７６１腫瘍増殖のインビボでの阻害。
別の肝臓ミューリン腫瘍モデルにおける、抗−ＦＧＦＲ４抗体により仲介される増殖阻害。
雌ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスを、Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｌｉｎｇｃｈａｎｇ  Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．Ｌｔｄ（ＬＣ，Ｓｈａｎｇｈａｉ，Ｃｈｉｎａ）から取得した。誕生後７週に、動物を、０．１ｍｌのＰＢＳ（マトリゲル中１：１、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ；Ｕ．Ｓ．Ａ．）中、１×１０７ＳＮＵ−７６１腫瘍細胞を皮下注射した。平均腫瘍サイズが１１９ｍ３に到達したときに処置を開始した。抗−ＦＧＦＲ４抗体を５週間、週に２回、腹腔内注射により投与した。腫瘍体積は任意の所定の処置の有効性に影響し得るので、マウスを、それらの腫瘍体積に基づいて、無作為化されたブロックデザインを用いてグループに割り当てた。このことは、全てのグループが同等のベースラインを有することを確実にした。実験動物を割り当てるのに無作為化されたブロックデザインを用いることは、各動物が、任意の所定の処置群に割り当てられる可能性が同一であることを確実にさせて、したがって、体系的なエラーが最小限化された。腫瘍体積は、カリパスを用いて二次元で週に２回測定し、体積は、式：Ｖ＝０．５ａ×ｂ２（ここでａおよびｂは、それぞれ腫瘍の長い直径および短い直径である）を用いてｍｍ３で表わした。
【０１４９】
腫瘍体積（ｍｍ３）は、約３〜４日の間隔で９５〜１３０日目に測定した。図１８は、抗−ＦＧＦＲ４抗体Ｕ４−３での処置の際の、ヒト肝臓ＳＮＵ−７６１癌腫異種移植片細胞の腫瘍増殖の阻害を示す。Ｕ４−３は、皮下ＳＮＵ−７６１ヒト肝臓癌腫異種移植片モデルにおいて、２５ｍｇ／ｋｇ投与量レベルで有意な抗−腫瘍活性を示した。腫瘍増殖阻害は、％ＴＧＩ＝１−（Ｔｉ−Ｔ０）／（Ｖｉ−Ｖ０））＊１００として計算され；Ｔｉは、測定日における処置群の幾何学的平均腫瘍体積であり；Ｔ０は、Ｄ１における処置群の幾何学的平均腫瘍体積であり；Ｖｉは、測定日におけるコントロール群の幾何学的平均腫瘍体積であり；Ｖ０は、Ｄ１におけるコントロール群の幾何学的腫瘍体積である。
【０１５０】
実施例２２：患者由来の胃異種移植片腫瘍モデルにおける、インビボでの効能。
患者由来の胃異種移植片腫瘍モデルＧＡ００８０における、抗−ＦＧＦＲ４抗体により仲介される増殖阻害。
雌ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（８〜９週齢）を、Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｌｉｎｇｃｈａｎｇ  Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．Ｌｔｄ（ＬＣ，Ｓｈａｎｇｈａｉ，Ｃｈｉｎａ）から取得した。女性患者に由来するＨｕＰｒｉｍｅ（登録商標）胃癌モデルＧＡ００８０を、この効能試験に選択した。このモデルの病理は、適度−低度に分化された腺癌である。
【０１５１】
選択された原発性ヒト胃組織を接種した、ストックマウス由来の腫瘍フラグメントを回収して、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスへの接種に用いた。各マウスは、腫瘍発達のために右脇腹（直径２〜４ｍｍ）に皮下接種した。平均腫瘍サイズが約１５３ｍｍ３に到達したときに処置を開始した。マウスは、それらの腫瘍サイズに従って無作為に２つの実験グループに割り当てられた。ＦＧＦＲ４抗体Ｕ４−３を、腫瘍を有するマウスに、１日目から２２日目まで、１、４、８、１１、１５、１８、２２のスケジュールで投与した。腫瘍サイズを２回、上述のとおりに測定した。
【０１５２】
図１９は、抗−ＦＧＦＲ４抗体Ｕ４−３での処置の際の、ＨｕＰｒｉｍｅ（登録商標）胃癌モデルＧＡ００８０の腫瘍増殖の阻害を示す。Ｕ４−３は、胃異種移植片モデルにおいて、約２５％の抗−腫瘍活性を示した。
【０１５３】
実施例２３：ヒト結腸癌異種移植片腫瘍モデルにおける、インビボでの効能。
ヒト結腸癌（ＳＷ６２０）異種移植片腫瘍モデルにおける、抗−ＦＧＦＲ４抗体により仲介される増殖阻害。
雌ＮＭＲＩヌードマウス（５〜６週齢）を、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  ＧｍｂＨ（Ｓｕｌｚｆｅｌｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から取得した。１００μｌ  ＰＢＳ中、５×１０６ＳＷ６２０腫瘍細胞（ＡＴＴＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ−２２７）を、２０匹の雌ＮＭＲＩヌードマウスの左脇腹に皮下接種した。１２日目に、約１５０〜２００ｍｍ３の平均腫瘍サイズに到達した後、２０匹の腫瘍を有する動物を、１０匹の動物の２グループに、それぞれ腫瘍サイズに従ってブロック無作為化した。抗−ＦＧＦＲ４抗体Ｕ４−３を、１日目から３８日目まで、１３、１７、２０、２４、２７、３１、３４および３８のスケジュールで、腫瘍を有するマウスに、腹腔内に週に２回投与した。腫瘍サイズを、上述のとおりに週に２回測定した。図２０は、抗−ＦＧＦＲ４抗体Ｕ４−３での処置の際の、腫瘍増殖の阻害を示す。Ｕ４−３は、原発腫瘍の増殖の著しい阻害を示した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ−Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年7月20日(2020.7.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＦＧＦＲ４に特異的に結合するヒト抗体、または前記抗体の機能性フラグメントであって、
前記抗体は、
（ｉ）
（ａ）配列番号３に示されるＣＤＲＨ１、
（ｂ）配列番号８に示されるＣＤＲＨ２、および
（ｃ）配列番号１５に示されるＣＤＲＨ３、を含む重鎖、
および、
（ｄ）配列番号２３に示されるＣＤＲＬ１、
（ｅ）配列番号２５に示されるＣＤＲＬ２、および
（ｆ）配列番号３０に示されるＣＤＲＬ３、を含む軽鎖
または、
（ｉｉ）
（ａ）配列番号３に示されるＣＤＲＨ１、
（ｂ）配列番号８に示されるＣＤＲＨ２、および
（ｃ）配列番号１５に示されるＣＤＲＨ３、を含む重鎖、
および、
（ｄ）配列番号６８に示されるＣＤＲＬ１、
（ｅ）配列番号２７に示されるＣＤＲＬ２、および
（ｆ）配列番号３５に示されるＣＤＲＬ３、を含む軽鎖
を含み、
ＦＧＦＲ４に対する解離定数が、１０−９Ｍ〜１０−１３Ｍである、
ヒト抗体、または前記抗体の機能性フラグメント。
【請求項２】
請求項１の抗体、または前記抗体の機能性フラグメントであって、
ヒトＦＧＦＲ４へのＦＧＦ１９の結合を、少なくとも８０％ブロックする、
ヒト抗体、または前記抗体の機能性フラグメント。
【請求項３】
請求項２の抗体、または前記抗体の機能性フラグメントであって、
ヒトＦＧＦＲ４のアミノ酸配列ＲＹＮＹを含むエピトープに結合する、
ヒト抗体、または前記抗体の機能性フラグメント。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか一項の抗体であって、
配列番号５４に示される重鎖可変領域および配列番号６２または６７に示される軽鎖可変領域、または、配列番号５４、６２および６７に示されるアミノ酸配列から１または２アミノ酸が異なる重鎖および軽鎖可変領域を含む、
抗体。
【請求項５】
請求項１から３のいずれか一項の抗体であって、
配列番号５４に示される重鎖可変領域および配列番号６２に示される軽鎖可変領域、または、配列番号５４および６２に示されるアミノ酸配列から１または２アミノ酸が異なる重鎖および軽鎖可変領域を含む、
抗体。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか一項の抗体であって、
ＩｇＧ１−型の、
抗体。
【請求項７】
医薬組成物であって、
請求項１から６のいずれか一項の抗体を含む、
医薬組成物。
【請求項８】
請求項１から６のいずれか一項の抗体、または請求項７の医薬組成物であって、
ＦＧＦＲ４発現、過剰発現および／または機能亢進と関連する疾患の治療のための、
抗体または医薬組成物。
【請求項９】
請求項８の抗体または医薬組成物であって、
前記疾患は、過剰増殖性疾患である、
抗体または医薬組成物。
【請求項１０】
請求項９の抗体または医薬組成物であって、
前記の過剰増殖性疾患は、肝細胞癌腫、乳癌、胃癌、結腸癌、横紋筋肉腫、前立腺癌、卵巣癌、軟組織肉腫、メラノーマ、頭頸部扁平上皮癌および肺腺癌、および、ＦＧＦＲ４を発現または過剰発現する他の癌、および腫瘍転移の形成、からなる群より選択される癌である、
抗体または医薬組成物。
【外国語明細書】
2020183418000001.pdf
2020183418000002.pdf
2020183418000003.pdf
2020183418000004.pdf