(57)【要約】【課題】イヌまたはネコである診断対象動物の健康状態を簡単に推測することが可能な診断方法を提供する。【解決手段】開示される方法は、イヌまたはネコである診断対象動物の健康状態を診断する方法である。この診断方法は、（ｉ）診断対象動物の糞便を分析することによって、糞便中における特定の細菌属の量に関係するデータを取得する分析ステップと、（ii）取得されたデータに基づいて、診断対象動物の健康状態を診断する診断ステップと、を含む。そして、特定の細菌属がファスコラークトバクテリウム属を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
イヌまたはネコである診断対象動物の健康状態を診断する方法であって、
（ｉ）前記診断対象動物の糞便を分析することによって、前記糞便中における特定の細菌属の量に関係するデータを取得する分析ステップと、
（ii）取得された前記データに基づいて、前記診断対象動物の健康状態を診断する診断ステップと、を含み、
前記特定の細菌属がファスコラークトバクテリウム属を含む、診断方法。
【請求項２】
前記データが、前記特定の細菌属の有無、前記特定の細菌属の定量値、または、前記特定の細菌属の存在比率である、請求項１に記載の診断方法。
【請求項３】
前記特定の細菌属がファスコラークトバクテリウム属である、請求項１または２に記載の診断方法。
【請求項４】
前記特定の細菌属が、ファスコラークトバクテリウム属およびフィーカリバクテリウム属である、請求項１または２に記載の診断方法。
【請求項５】
前記分析ステップにおいて前記糞便中の前記特定の細菌属の量が検出限界値未満であるという結果が得られた場合に、前記診断ステップにおいて前記診断対象動物の健康状態が良好ではない可能性が高いと診断する、請求項１、３または４に記載の診断方法。
【請求項６】
前記診断対象動物がイヌである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の診断方法。
【請求項７】
前記健康状態が、前記診断対象動物の腸内環境の状態を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の診断方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イヌまたはネコの健康状態の診断方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
動物の腸内には１，０００種、数十兆個にも上る腸内細菌が共生し、腸内細菌叢を形成している。この腸内細菌叢の変化が身体的な変化に影響していることが、従来から報告されている。たとえば、イヌのＩＢＤ（炎症性腸疾患）やＦＲＤ（フード反応性腸炎）といった複数の消化器疾患で腸内細菌叢が変動していることが報告されている。さらに、イヌの腸内細菌叢の変化と肥満や脳炎との関連も報告されている。これらのことから、腸内細菌叢の変化は様々な疾患や健康状態に影響を及ぼすことが考えられる。
【０００３】
ヒトの腸内細菌叢に含まれる特定の菌と疾患との関係については、従来から報告されている（例えば特許文献１）。しかし、ヒトにおけるそれらの関係をイヌやネコにそのまま当てはめることはできない。また、獣医療における腸内細菌に関する報告は少なく、疾患との関連性が指摘されている菌の機能解明には至っていない。さらに、研究に用いられる個体数が少ないこともあり、臨床検査として腸内細菌叢を調べることの妥当性は示されていない。
【０００４】
現在の獣医療におけるイヌやネコの健康評価法としては、血液検査、尿検査、糞便検査や、レントゲン、エコー、ＣＴ、ＭＲＩなどの画像検査などがあるが、その変化を見ながら健康状態を評価することは現実的ではない。そのため、腸内細菌を分析することによってイヌやネコの健康状態を評価することができれば、それを新たな検査ツールの１つとして用いることができ、それによって、イヌやネコの健康状態を多角的に評価することが可能となる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２０１８−５２５０３５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
以上のような状況において、本発明は、イヌまたはネコである診断対象動物の腸内細菌を分析することによって診断対象動物の健康状態を簡単に推測することが可能な診断方法を提供することを、目的の１つとする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記の課題を解決するために本願発明者らが鋭意検討した結果、発明者らは、腸内細菌叢に含まれる特定の細菌を診断対象動物の健康状態の指標として用いることができることを初めて見出した。本願発明は、この新たな知見に基づくものである。
【０００８】
本発明の一実施形態は、イヌまたはネコである診断対象動物の健康状態を診断する方法を提供する。この診断方法は、（ｉ）前記診断対象動物の糞便を分析することによって、前記糞便中における特定の細菌属の量に関係するデータを取得する分析ステップと、（ii）取得された前記データに基づいて、前記診断対象動物の健康状態を診断する診断ステップと、を含み、前記特定の細菌属がファスコラークトバクテリウム属を含む。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、診断対象動物の健康状態を簡単に診断することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、ファスコラークトバクテリウム属の存在比率と健康状態の評価値との関係の一例を示すグラフである。
【図２】図２は、フィーカリバクテリウム属の存在比率と健康状態の評価値との関係の一例を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明の実施の形態について説明する。なお、以下の説明では、本発明の実施形態について例を挙げて説明するが、本発明は以下で説明する例に限定されない。以下の説明において特定の数値や特定の物質を例示する場合があるが、本発明はそれらの例示に限定されない。
【００１２】
（診断対象動物の診断方法）
本発明の診断方法の一例について以下に説明する。本発明の診断方法は、イヌまたはネコである診断対象動物の健康状態を診断（推定）する方法である。この診断方法は、以下に説明する分析ステップおよび診断ステップを含む。
【００１３】
診断対象動物は、イヌおよびネコから選ばれる少なくとも一種であり、イヌであってもよいしネコであってもよい。診断対象動物であるイヌ（犬）およびネコ（猫）に特に限定はない。
【００１４】
分析ステップ（分析ステップ（ｉ））では、診断対象動物の糞便を分析することによって、糞便中における特定の細菌属の量に関係するデータを取得する。以下では、当該特定の細菌属を「指標細菌属」と称する場合があり、当該特定の細菌属の量に関係するデータを「指標データ」と称する場合がある。指標細菌属は、少なくともファスコラークトバクテリウム属（Ｐｈａｓｃｏｌａｒｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属）を含む。なお、この明細書において、「細菌属」の意味には、その細菌属に属する細菌という意味が含まれる。
【００１５】
診断ステップ（診断ステップ（ii））では、取得された指標データに基づいて診断対象動物の健康状態を診断する。診断される健康状態は、腸内環境の状態を含んでもよいし、腸内環境の状態のみであってもよい。
【００１６】
指標データは、たとえば、指標細菌属の有無、指標細菌属の定量値、または、指標細菌属の存在比率であってもよい。
【００１７】
本方法の典型的な一例では、指標細菌属は、ファスコラークトバクテリウム属であってもよく、すなわちそれのみであってもよい。ファスコラークトバクテリウム属は、ファーミキューテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ門）に属する菌である。
【００１８】
本方法の典型的な他の一例では、指標細菌属は、ファスコラークトバクテリウム属およびフィーカリバクテリウム属（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属）であってもよく、すなわちそれらのみであってもよい。換言すれば、本発明の診断方法の一例は、上記の分析ステップ（ｉ）および診断ステップ（ii）を含み、指標細菌属が、ファスコラークトバクテリウム属およびフィーカリバクテリウム属である。なお、指標細菌属をフィーカリバクテリウム属のみとして診断対象動物の健康状態の診断を行うことも可能である。すなわち、指標細菌属を、ファスコラークトバクテリウム属およびフィーカリバクテリウム属からなる群より選ばれる少なくとも１つの細菌属とすることも可能である。
【００１９】
フィーカリバクテリウム属は、ファーミキューテス門に属する菌である。フィーカリバクテリウム属には、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）が含まれる。
【００２０】
一例では、分析ステップにおいて糞便中の指標細菌属の量が検出限界値未満である（実質的に存在しない）という結果が得られた場合に、診断ステップにおいて診断対象動物の健康状態が良好ではない可能性が高い（別の観点では健康状態が良好である可能性が低い）と診断してもよい。別の観点では、分析ステップにおいて糞便中の指標細菌属の量が検出限界値以上である（実質的に存在する）という結果が得られた場合に、診断ステップにおいて診断対象動物の健康状態が良好である可能性が高いと診断してもよい。検出限界値は、一般的によく用いられるＫａｉｓｅｒの検出限界に従って、コントロール測定値の標準偏差の３倍としてもよい。あるいは、検出限界値を用いることなく単純に指標細菌族が検出されなかった場合に診断対象動物の健康状態が良好ではない可能性が高いと診断してもよい。
【００２１】
以下では、診断ステップにおいて診断対象動物の健康状態が良好である可能性が高いと診断するかどうかの基準となる指標データの値を、「所定値」または「所定値（境界値）」と称する場合がある。
【００２２】
指標データは、指標細菌属の定量値であってもよい。たとえば、分析ステップにおいて、単位質量の糞便中に存在する指標細菌属の量（たとえば菌数）が所定値未満（または所定値以下）という結果が得られた場合に、診断ステップにおいて診断対象動物の健康状態が良好ではない可能性が高いと診断してもよい。別の観点では、分析ステップにおいて、単位質量の糞便中に存在する指標細菌属の量が所定値以上（または所定値より多い）という結果が得られた場合に、診断ステップにおいて診断対象動物の健康状態が良好である可能性が高いと診断してもよい。
【００２３】
あるいは、指標データは、指標細菌属を含まない１つ以上の他の腸内細菌（たとえばファーミキューテス門以外の細菌など）に対する指標細菌属の存在比率に関係する値（典型的には存在比率）であってもよい。あるいは、指標データは、指標細菌属を含む複数の腸内細菌に対する指標細菌属の存在比率に関係する値（典型的には存在比率）であってもよい。指標細菌属を含む複数の腸内細菌の例としては、たとえば、指標データを得るための測定で検出されるすべての腸内細菌が挙げられる。存在比率の例には、菌数比が含まれる。
【００２４】
指標データが指標細菌属の上記存在比率である場合、分析ステップにおいて指標細菌属の存在比率が所定値未満である（または所定値以下である）という結果が得られた場合に、診断ステップにおいて診断対象動物の健康状態が良好ではない可能性が高いと診断してもよい。別の観点では、分析ステップにおいて、指標細菌属の存在比率が所定値以上である（または所定値より多い）という結果が得られた場合に、診断ステップにおいて診断対象動物の健康状態が良好である可能性が高いと診断してもよい。
【００２５】
上記の所定値は、たとえば、以下の方法で決定してもよい。まず、複数の検体（診断対象動物）について、健康状態の判定と糞便の分析とを行う。糞便の分析によって、分析ステップで分析される細菌全体に占める指標細菌属の比率、または、分析ステップで分析される特定の細菌グループに対する指標細菌属の比率を求める。これによって、健康状態の判定結果と指標細菌属の比率との関係が得られる。そして、その関係に基づいて所定値を決定することができる。このようにして所定値（境界値）を決定する一例について、後述する実施例で説明する。なお、このようにして所定値を決定する方法は、指標データが存在比率ではなく定量値である場合にも適用できる。
【００２６】
なお、所定値（境界値）は１つであってもよいし、複数であってもよい。たとえば、複数の所定値を設定し、所定値で分けられた指標データの複数の領域に対して、レベルの異なる健康状態の診断結果を割り当ててもよい。たとえば、指標データの値が最も低い領域について健康状態が良好ではない可能性が高いと判定し、指標データの値が最も高い領域について健康状態が良好である可能性が高いと判定し、指標データの値が中間の領域については健康状態が普通である可能性が高いと判定してもよい。
【００２７】
なお、糞便の分析方法が異なると、同じ糞便でも、分析によって得られる指標細菌属の存在比率や定量値が変化する場合がある。そのため、上記の方法で所定値（境界値）を決定する場合には、分析方法ごとに所定値を決定することが好ましい。
【００２８】
指標細菌属がファスコラークトバクテリウム属およびフィーカリバクテリウム属の２つである場合、それぞれの指標データに基づいて２つの診断を行ってもよく、さらにそれに基づいて総合評価をしてもよい。たとえば、分析ステップにおいて、ファスコラークトバクテリウム属およびフィーカリバクテリウム属が共に検出限界値未満である（実質的に存在しない）という結果が得られた場合に、診断ステップにおいて、診断対象動物の健康状態が良好ではない可能性が特に高いと診断してもよい。
【００２９】
あるいは、ファスコラークトバクテリウム属およびフィーカリバクテリウム属の量に関する１つの指標データに基づいて診断を行ってもよい。たとえば、両者の定量値の合計に基づいて診断を行ってもよい。また、両者以外の他の菌に対する両者の存在比率の合計に基づいて診断を行ってもよい。また、両者を含む複数の菌に対する両者の存在比率の合計に基づいて診断を行ってもよい。
【００３０】
本発明の方法において、診断対象動物はイヌであってもよい。
【００３１】
診断ステップで診断される健康状態は、総合的な健康状態であってもよい。また、診断ステップで診断される健康状態は、診断対象動物の腸内環境の状態を含んでもよく、腸内環境の状態（腸内環境の状態のみ）であってもよい。
【００３２】
（分析ステップについて）
分析ステップで用いられる分析方法は、診断ステップ（ii）で必要とされる指標データに応じて任意に選択すればよい。具体的には、指標細菌属の存在の有無を決定できる分析方法（定性的な分析方法）や、指標細菌属の存在量や存在比率を取得するための分析方法（定量的な分析方法）を用いることができる。もちろん、定量的な分析方法を用いて、指標細菌属の存在の有無を決定してもよい。
【００３３】
分析方法に特に限定はなく、公知の分析方法を用いてもよい。そのような分析方法の例には、次世代シークエンサーを用いたシークエンシング、定量ＰＣＲ法、ＤＧＧＥ（Ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  Ｇｅｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法）、およびＴ−ＲＬＦＰ（Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）が含まれる。これらは、一般に提供されている受託解析サービスを用いて実施してもよい。次世代シークエンサーを用いたシークエンシングの一例では、メタゲノム解析を行うことによって、診断対象動物の糞便中の細菌の存在比率を求めることが可能である。
【００３４】
本発明によれば、指標細菌属の有無のみから診断対象動物の健康状態を診断することが可能であるため、簡単に診断を行うことが可能である。また、指標細菌属の存在比率から診断対象動物の健康状態を診断する場合でも、指標細菌属以外のすべての菌の存在比率を分析する必要が必ずしもないため、簡単に診断することが可能である。
【００３５】
（分析ステップの一例）
次世代シークエンサーを用いる分析ステップの一例を以下に説明する。以下の方法の各手順はそれぞれ、市販のキットや一般に提供されている受託解析サービスを用いて行うことができる。
【００３６】
まず、診断対象動物の糞便を採取する。糞便は、必要に応じて、適切な方法で保存する。次に、糞便からＤＮＡを抽出する。抽出法に限定はなく、たとえば、酵素を用いて菌を溶解させる方法であってもよいし、物理的に菌を破砕する方法であってもよい。
【００３７】
次に、抽出したＤＮＡのＰＣＲ増幅を行う。たとえば、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の特定の領域をＰＣＲ増幅してもよい。増幅する領域は、目的とする指標データや解析の度合いに応じて選択すればよい。たとえば、Ｖ１−Ｖ２領域、Ｖ３−Ｖ４領域、またはその他の領域を増幅してもよい。増幅の際に用いるプライマーとしては、増幅する領域に応じた公知のプライマーを用いてもよい。たとえば、Ｖ１−Ｖ２領域を増幅する場合、広く用いられている２７Ｆｍｏｄ（フォワードプライマー）と３３８Ｒ（リバースプライマー）とを用いてもよい。
【００３８】
次に、必要に応じて、ＰＣＲ産物（たとえば１６Ｓアンプリコン）に対して処理や測定を行う。たとえば、精製、蛍光法や吸光度分析によるＤＮＡ濃度測定、特定の塩基配列や原子団の付加などを行う。
【００３９】
次に、上記ＰＣＲ産物について、次世代シークエンサーを用いてシークエンシングを行う。用いる機器および方法は、指標データに応じて適宜選択できる。たとえば、Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ法を用いてもよい。
【００４０】
次に、シークエンシングによって得られたデータから指標データを算出する。指標データの算出は、公知の方法で行ってもよい。メタゲノム解析の場合、たとえば、公知のＱＩＩＭＥやＱＩＩＭＥ２などの微生物群集解析ツールを用いてＰＣＲ産物中の菌の存在比率などを求めてもよい。このようにして、分析ステップを行うことができる。なお、一般に行われている受託解析サービスを利用する場合、糞便または糞便に所定の処理を行ったサンプルを受託解析サービス機関に提供することによって、必要な指標データを得ることも可能である。
【実施例】
【００４１】
本発明の詳細について、実施例によって以下に説明する。まず、イヌ１５２検体の糞便を準備した。そして、その糞便について、株式会社ビケンバイオミクスに、次世代シークエンサーを用いたメタゲノム解析を依頼した。その解析によって、糞便中の腸内細菌叢に含まれる３１５種類の細菌の存在比率を取得した。３１５種類の細菌には、ファーミキューテス門に属する１１７の細菌、アキドバクテリウム門（Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ）に属する５０の細菌、プロテオバクテリア門（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）に属する９４の細菌、フソバクテリウム門（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａ）に属する６つの細菌、バクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）に属する２８の細菌、および他の細菌が含まれる。ファーミキューテス門に属する１１７の細菌のうちの２つは、ファスコラークトバクテリウム属およびフィーカリバクテリウム属である。
【００４２】
また、上記分析を行ったイヌ１５２検体について、健康状態をチェックした。具体的には、表現系、肥満度数、菌の多用度（Ｓｈａｎｎｏｎ−Ｗｉｅｎｅｒ  Ｈ’）に基づいて、それぞれの検体について獣医師が健康状態をスコア化した。最も健康状態がよいと判断された場合の評価値（スコア）は９であり、健康状態の判断結果が悪くなるにつれて評価値は小さくなる。
【００４３】
上記のメタゲノム解析および健康状態のスコア化によって得られたデータを分析した。分析の結果の一部を図１に示す。図１の横軸は、健康状態の評価値を示す。図１の縦軸は、解析された３１５種類の細菌に占めるファスコラークトバクテリウム属の存在比率（菌数比）の平均値を示す。なお、縦軸のエラーバーは、標準偏差を示す。
【００４４】
図１に示すように、ファスコラークトバクテリウム属の存在比率が高いほど、健康状態の評価値が高かった。ファスコラークトバクテリウム属が検出限界値未満の場合には、評価値が４以下であった。図１の結果の場合、たとえば、分析ステップにおいてファスコラークトバクテリウム属が検出されなかったときやその検出量が検出限界値未満であったときに、診断ステップにおいて診断対象動物の健康状態が良好ではない可能性が高いと判断してもよい。
【００４５】
図１のグラフにおいて、評価値が６の検体のファスコラークトバクテリウム属の存在比率の平均値は０．９５％であり、評価値が５のときの当該存在比率の平均値は０．１０％であった。評価値が５以下の場合に診断対象動物の健康状態が良好ではない可能性が高いと判断する場合、ファスコラークトバクテリウム属についての上述した所定値（境界値）を、０．１０％以上０．９５％未満の範囲で決定すればよい。たとえば、０．６％を所定値としてもよい。
【００４６】
図１と同様に、３１５種類の細菌に占めるフィーカリバクテリウム属の存在比率と健康状態の評価値との関係を図２に示す。図２に示すように、フィーカリバクテリウム属の存在比率が高いほど、健康状態の評価値が高かった。フィーカリバクテリウム属が検出限界値未満の場合には、評価値が３以下であった。
【００４７】
図２のグラフにおいて、評価値が６の検体のフィーカリバクテリウム属の存在比率の平均値は１．７７％であり、評価値が５のときの当該存在比率の平均値は０．０８％であった。評価値が５以下の場合に診断対象動物の健康状態が良好ではない可能性が高いと判断する場合、フィーカリバクテリウム属についての上述した所定値（境界値）を、０．０８％以上１．７７％未満の範囲で決定すればよい。たとえば、１．０％を所定値としてもよい。
【００４８】
以上の結果は、ファスコラークトバクテリウム属およびフィーカリバクテリウム属から選ばれる少なくとも１つの属の存在比率を指標として、診断対象動物の健康状態を推測することが可能であることを示している。たとえば、ファスコラークトバクテリウム属および／またはフィーカリバクテリウム属が実質的に検出されない場合には、診断対象動物の健康状態が良好ではないと判断することが可能である。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
本発明は、イヌまたはネコの健康状態の診断に利用できる。
【図１】
2020197442.tif 000002
【図２】
2020197442.tif 000003