(57)【要約】【課題】腎臓疾患の併用療法の提供。【解決手段】ａ）エプロサルタン、ロサルタン、バルサルタン、テルミサルタン、カンデサルタン、またはオルメサルタンからなるリストから選択される少なくとも１種のアンジオテンシン受容体１型（ＡＴ１Ｒ）遮断薬または薬学的に許容されるその塩と、ｂ）少なくとも１種のケモカイン受容体２（ＣＣＲ２）経路阻害薬または薬学的に許容されるその塩と、を含む医薬組成物であって、ＣＣＲ２経路阻害薬がプロパゲルマニウムである、医薬組成物。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）エプロサルタン、ロサルタン、バルサルタン、テルミサルタン、カンデサルタン、またはオルメサルタンからなるリストから選択される少なくとも１種のアンジオテンシン受容体１型（ＡＴ１Ｒ）遮断薬または薬学的に許容されるその塩、および
ｂ）少なくとも１種のケモカイン受容体２（ＣＣＲ２）経路阻害薬または薬学的に許容されるその塩、
を含む、タンパク尿に関連する腎臓疾患の治療、改善または予防において使用するための医薬組成物であって、前記ＣＣＲ２経路阻害薬がプロパゲルマニウムである、医薬組成物。
【請求項２】
前記ＡＴ１Ｒ遮断薬または薬学的に許容されるその塩がロサルタンである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記医薬組成物の全体効力が
ａ）他の成分を何ら投与することなくいずれかの成分を投与した場合の前記ＡＴ１Ｒ遮断薬または前記ＣＣＲ２経路阻害薬の効力と比較して、より大きい、
ｂ）他の成分を何ら投与することなくいずれかの成分を投与した場合の前記ＡＴ１Ｒ遮断薬および前記ＣＣＲ２経路阻害薬の効力の合計と比較して、より大きい、または
ｃ）他の成分を何ら投与することなくいずれかの成分を投与した場合の前記ＡＴ１Ｒ遮断薬および前記ＣＣＲ２経路阻害薬の効力の合計に等しい、
請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記医薬組成物の合わせた効力が、他の成分を何ら投与することなくいずれかの成分を投与した場合の前記ＡＴ１Ｒ遮断薬および前記ＣＣＲ２経路阻害薬の効力の合計未満であり、前記治療が、単独で投与されるＡＴ１Ｒ遮断薬または前記ＣＣＲ２経路阻害薬の単独治療と比較してより大きな効力をもたらす、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
少なくとも１種のＡＴ１Ｒ遮断薬または薬学的に許容されるその塩を含む、タンパク尿に関連する腎臓疾患の治療、改善または予防において使用するための医薬組成物であって、前記組成物は、少なくとも１種のＣＣＲ２経路阻害薬または薬学的に許容されるその塩と同時に、または順次に、対象に投与され、前記ＣＣＲ２経路阻害薬はプロパゲルマニウムであり、前記ＡＴ１Ｒ遮断薬は、エプロサルタン、ロサルタン、バルサルタン、テルミサルタン、カンデサルタン、またはオルメサルタンからなるリストから選択される、医薬組成物。
【請求項６】
少なくとも１種のＣＣＲ２経路阻害薬または薬学的に許容されるその塩を含む、タンパク尿に関連する腎臓疾患の治療、改善または予防において使用するための医薬組成物であって、前記組成物は、少なくとも１種のＡＴ１Ｒ遮断薬または薬学的に許容されるその塩と同時に、または順次に、対象に投与され、前記ＣＣＲ２経路阻害薬はプロパゲルマニウムであり、前記ＡＴ１Ｒ遮断薬は、エプロサルタン、ロサルタン、バルサルタン、テルミサルタン、カンデサルタン、またはオルメサルタンからなるリストから選択される、医薬組成物。
【請求項７】
前記少なくとも１種のＡＴ１Ｒ遮断薬または薬学的に許容されるその塩、および／または、前記少なくとも１種のＣＣＲ２経路阻害薬または薬学的に許容されるその塩が、剤形である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記剤形が、約５ｍｇ〜１ｇのＡＴ１Ｒ遮断薬または薬学的に許容されるその塩と、約５ｍｇ〜１ｇのＣＣＲ２経路阻害薬または薬学的に許容されるその塩と、を含む請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記腎臓疾患が、腎臓における繊維性障害、糖尿病性腎障害が原因の慢性腎臓疾患、腎不全、腎不全状態、糖尿病性腎障害、糸球体腎炎、糸球体硬化症、一次腎疾患のタンパク尿を含む群から選択される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
治療上有効な請求項１〜９のいずれか一項に記載の医薬組成物と放出遅延剤と、を含む経口徐放性医薬組成物または注射用徐放性医薬組成物。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の医薬組成物を含む注射用懸濁剤。
【請求項１２】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の医薬組成物を含む肺送達用または経鼻送達用の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくとも１種のケモカイン受容体経路阻害薬および少なくとも１種のアンジオテンシン受容体遮断薬を含む併用療法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質は細胞内で、孤立した状態では働かず、安定的か、または一過性の複合体の状態で働き、その際、タンパク質間相互作用が、タンパク質機能の重要な決定因子である（Ａｕｅｒｂａｃｈら、（２００２）、Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ２：６１１〜６２３）。さらに、タンパク質およびタンパク質複合体は、ＤＮＡ、ＲＮＡおよび小分子などの他の細胞成分と相互作用する。これらの相互作用に関与している個々のタンパク質と、それらの相互作用とを理解することが、生物学的プロセスをより良好に理解するためには重要である。
【０００３】
Ａｌｌｅｎ（Ａｌｌｅｎ，Ｓ．ら、（２００７）、Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２５：７８７〜８２０）によって報告されたケモカインの主な生理学的機能は、「日常的な免疫学的監視の間の細胞遊走、炎症および発生」の調節である。ケモカインは、炎症誘発性サイトカインに応答して放出され、ケモカインに対する生理学的応答を媒介するＧタンパク質共役受容体の大きなファミリーに選択的に結合する。ケモカインは元々は、走化性サイトカインと称されていた。
【０００４】
ケモカイン系がヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染および後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の病因において必須の役割を果たしていることが発見されて以来、有望な介入戦略を開発するために、ベースにある機構（複数可）を理解するためのかなりの努力が成されてきた（Ｌｕｓｓｏ，Ｐ．、（２００６）、ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２５：４４７〜４５６）。さらに、喘息を包含する特定の状態に関連している有害な免疫応答はいずれも、ほぼ常にケモカイン系の機能不全の結果として生じている。アテローム硬化症の病因も、ケモカインシグナル伝達経路を必要とすることが示されていて、その際、動脈病変へのマクロファージの浸潤が、この異常な炎症性障害の直接的な一助となっている（Ｂｏｉｓｖｅｒｔ，Ｗ．（２００４）  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １４：１６１〜１６５）。
【０００５】
慢性炎症性疾患の動物モデル研究によって、ＭＣＰ−１（単球走化性タンパク質−１、単球化学誘引タンパク質−１、単球走化性および活性化因子（ＭＣＡＦ）およびケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド２（ＣＣＬ２））と、ＣＣＲ２（ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）受容体２としても知られている）との結合をアンタゴニストによって阻害すると、炎症性応答は抑制されることが立証されている。ＭＣＰ−１とＣＣＲ２との相互作用（Ｒｏｌｌｉｎｓ  Ｂ  Ｊ（１９９６）  Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．Ｔｏｄａｙ、２：１９８；およびＤａｗｓｏｎ  Ｊら、（２００３）  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．  Ｔａｒｇｅｔｓ、７（１）：３５〜４８を参照されたい）は、ブドウ膜炎、アテローム硬化症、関節リウマチ、多発性硬化症、クローン病、腎炎、臓器同種移植拒絶、肺線維症、腎不全、糖尿病および糖尿病性合併症、糖尿病性腎障害、糖尿病性網膜症、糖尿病性網膜炎、糖尿病性細小血管症、結核、サルコイドーシス、侵襲性ブドウ球菌感染症、白内障外科手術後の炎症、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、慢性蕁麻疹、アレルギー性喘息、歯周病、腺周囲炎、歯肉炎、歯肉疾患、拡張期心筋症、心筋梗塞、心筋炎、慢性心不全、血管狭窄症、再狭窄、再灌流障害、糸球体腎炎、充実性腫瘍および癌、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄球性白血病、多発性骨髄腫、悪性骨髄腫、ホジキン病ならびに膀胱、乳房、子宮頸、結腸、肺、前立腺または胃の癌などの炎症性疾患の病理に関係している。
【０００６】
単球遊走は、関節炎、喘息およびブドウ膜炎の発生を阻害することが示されているＭＣＰ−１アンタゴニスト（ＭＣＰ−１の抗体または可溶性で不活性な断片のいずれか）によって阻害される。プロパゲルマニウム（３−オキシゲルミルプロピオン酸ポリマー）という慢性肝炎に対する治療薬として使用されている分子もまた、ＣＤ５５、ＣＤ５９およびＣＤ１６などのグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー型タンパク質を必要とすると考えられる機構を介して、ＭＣＰ−１による単球のインビトロ走化性遊走を特異的に阻害することが示されている（Ｙｏｋｏｃｈｉ，Ｓ．（２００１）  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２１：３８９〜３９８）。
【０００７】
ＭＣＰ−１およびＣＣＲ２両方のノックアウト（ＫＯ）マウスによって、炎症性病変への単球浸潤は有意に低下することが立証されている。加えて、そのようなＫＯマウスは、実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ、ヒトＭＳのモデル）、ゴキブリアレルゲン誘発喘息、アテローム硬化症およびブドウ膜炎の発生に対して耐性を有する。関節リウマチおよびクローン病患者は、ＭＣＰ−１発現および浸潤性マクロファージの数の減少と相関する用量レベルでＴＮＦ−αアンタゴニスト（例えば、モノクローナル抗体および可溶性受容体）で治療すると改善する。
【０００８】
ＭＣＰ−１は、チリダニアレルギーを有する多くの患者の鼻粘膜において見出される季節性および慢性アレルギー性鼻炎の病因に関係していてる。ＭＣＰ−１はまた、好塩基球からのヒスタミン放出をインビトロで惹起することが見出されている。アレルギー性条件下では、アレルゲンおよびヒスタミンの両方が、アレルギー性鼻炎を有するヒトの鼻粘膜においてＭＣＰ−１および他のケモカインの発現を誘発（即ち、アップレギュレート）することが示されており、このことは、そのような患者におけるポジティブフィードバックループの存在を示唆している。
【０００９】
腎臓疾患は、腎臓マクロファージの蓄積を特徴とする慢性炎症に関連している。糖尿病性腎臓による単球化学誘引性タンパク質−１（ＭＣＰ−１／ＣＣＬ２）の産生は、糖尿病性腎障害から生じている腎臓疾患におけるマクロファージ蓄積に影響を及ぼす主な因子として同定されている（Ｔｅｓｃｈ  ＧＨ（２００８）  ＭＣＰ−１／ＣＣＬ２：ａ  ｎｅｗ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｍａｒｋｅｒ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｔａｒｇｅｔ  ｆｏｒ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｒｅｎａｌ  ｉｎｊｕｒｙ  ｉｎ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ  Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｎａｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２９４：６９７〜７０１を参照されたい）。様々な動物モデルにおいて、ＣＣＲ２の阻害および／または特異的ＣＣＲ２経路の阻害および／またはＣＣＲ２リガンドＭＣＰ−１の阻害は、腎臓の損傷を低減することが示されている（上記のＴｅｓｃｈ（２００８）；Ｒａｏ  Ｖら（２００６）  Ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  Ｍｅｔａｌｌｏｅｌａｓｔａｓｅ  ｉｎ  Ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ  Ｂａｓｅｍｅｎｔ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｄａｍａｇｅ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ａｌｐｏｒｔ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．１６９（１）３２〜４６；Ｋａｎｇ  ＹＳ（２０１０）  ＣＣＲ２  ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，  ｌｉｐｉｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，  ａｎｄ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ  ｉｎ  ｔｙｐｅ  ２  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｍｉｃｅ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ７８、８８３〜８９４；Ｋｉｔａｇａｗａ  Ｋ（２００４）  Ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｏｆ  ＣＣＲ２  Ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  Ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｉｎ  Ｋｉｄｎｅｙ、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．１６５（１）２３７〜２４６；Ｐａｒｋ  Ｊ（２００８）  ＭＣＰ−１／ＣＣＲ２  ｓｙｓｔｅｍ  ｉｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ  ａｎｄ  ｔｙｐｅ  ＩＶ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｍｅｓａｎｇｉａｌ  ｃｅｌｌｓ、Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｎａｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２９５：Ｆ７４９〜Ｆ７５７を参照されたい）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
Ｔｅｓｃｈ（２００８）は、ＭＣＰ−１の選択的標的化は、糖尿病性腎障害を包含する腎臓疾患の動物モデルを抑制する際の有効な治療であることが証明されているが；しかしながら、そのような療法はヒト糖尿病性腎障害では未だ実証されていないと記している。ＣＣＲ２の小分子アンタゴニスト（ＩＮＣＢ３３４４、プロパゲルマニウム、ＲＳ−５０４３９３）を包含する治療は、多発性硬化症、腎臓虚血−再灌流障害、尿管閉塞および糖尿病性腎障害のマウスモデルならびに関節炎のラットモデルにおいて炎症を抑制することが示されており；ＣＣＲ２の操作された生物学的アンタゴニストもまた有効と証明されており；ＭＣＰ−１の切断不活性形態を発現するベクターをトランスフェクションされた細胞の皮下注射は、狼瘡腎炎のマウスモデルにおいて腎臓炎症の発生を抑制することが見出されている。同様に、７ＮＤ（ＭＣＰ−１の変異型）の筋肉トランスフェクションは、腎臓虚血−再灌流障害、狼瘡腎炎および糖尿病性腎障害のマウスモデルにおいて腎臓炎症を減少させる。今日まで、炎症性疾患についてのケモカイン単剤療法のヒト試験は、薬物認可に至っていない。Ａｎｄｅｒｓ  Ａ−Ｊらは、単独のケモカインアンタゴニスト治療が疾患治療において有効ではない理由を考察し、単一のケモカイン仲介因子の冗長度およびケモカイン受容体の変動性の発現パターンを包含する可能な説明を検討している（Ａｎｄｅｒｓ  Ａ−Ｊら（２００９）  Ｑｕｅｓｔｉｏｎｓ  ａｂｏｕｔ  Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ  ｉｎ  Ｒｅｎａｌ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，  Ｎｅｐｈｒｏｎ  Ｅｘｐ  Ｎｅｐｈｒｏｌ  ２０１０；１  １４：ｅ３３〜ｅ３８を参照されたい）。したがって、当分野では、ＣＣＲ２経路を介して引き起こされる疾患を有効に治療することが必要とされている。
【００１１】
レニン−アンジオテンシンシステム（ＲＡＳ）は、交感神経系および流体ホメオスターシスにおいて重要な役割を果たしている。レニンは、腎臓によって分泌されて、グロブリン前駆体、アンジオテンシノーゲンからのアンジオテンシンＩ（ＡｎｇＩ）の形成を媒介するタンパク分解性酵素である（Ｒａｎｇ、Ｈ．Ｐ．ら、Ｐｈａｒｍａｃｏｏｇｙ：第３版、１９９５、Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ出版、Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ、ＵＫ．）。ＡｎｇＩ自体は、ＡｎｇＩを高度に活性なアンジオテンシンＩＩ（ＡｎｇＩＩ）に変換する第２の酵素であるアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）のための基質を提供する以外はほとんど生理学的重要性を有さないようである。しかしながら、ＡｎｇＩＩは別のＡＣＥ依存性機構によって生じ得ることには特に注意すべきである。ＡｎｇＩＩは続いて、アミノペプチダーゼによって代謝されてＡｎｇＩＩＩになり得る。
【００１２】
ＡｎｇＩＩは、極めて強力な血管収縮物質であり、その結果、心疾患および高血圧の病因に関連して広く研究されている（Ｒａｍａｓｕｂｂｕ、Ｋ．（２００７）  Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ  Ｃｌｉｎｉｃｓ  ２５：５７３〜５８０）。
【００１３】
慢性腎疾患は、死亡および罹患の主な原因であるが、しかしながら、その進行を促進する基本的な細胞事象は不明なままであり、炎症、低酸素および細胞外マトリックス（ＥＣＭ）沈着の増加をもたらす炎症誘発性仲介因子が腎不全の主な原因であるようである（Ｇｉｌｂｅｒｔ（１９９９）  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ  ５６：１６２７〜１６３７、１９９９）。これらの病的事象はタンパク尿を随伴し、糸球体濾過率（ＧＦＲ）の低下は最終的に、末期腎不全をもたらす。アンジオテンシン変換酵素阻害薬（ＡＣＥｉ）およびアンジオテンシン受容体遮断薬が現在、慢性腎疾患のための第一線の治療として考えられていて、腎臓保護をもたらすことは明らかに示されているが、慢性腎疾患は、最終的には腎不全をもたらす進行性障害であり続けている。共同研究群試験（Ｌｅｗｉｓ  （１９９３）。Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｎ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ。Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３２９：１４５６〜１４６２）において、カプトプリル療法は、腎不全での衰退を遅らせるが、患者の大部分において糖尿病性腎障害の進行を止めることはなかった。臨床的設定とは異なり、腎臓保護薬の実験的研究は多くの場合に、糖尿病性腎障害の一般的に使用されるモデルにおいて腎臓構造および機能異常の完全な改善を示している。糖尿病性Ｒｅｎ−２ラットおよび腎亜全摘出（ＳＴＮｘ）モデルの主な利点は、ヒトで観察されるように、ＡＣＥｉまたはアンジオテンシン受容体遮断薬が腎不全の進展を緩和することであるが、予防はしない（Ｋｅｌｌｙ（１９９８）  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ  ５４：３４３〜３５２およびＫｅｌｌｙ（２０００）  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ  ５７：１８８２〜１８９４）。さらに、糖尿病性Ｒｅｎ−２ラットおよびＳＴＮｘモデルを使用して、随伴性ＡＣＥｉまたはアンジオテンシン受容体遮断に関連して腎疾患進行における前途をさらに改善する可能性を有する追加の療法を研究することができる。
【００１４】
血圧制御、電解質ホメオスターシスならびに細胞の増殖および死に関連するホルモンカスケードであるレニン−アンジオテンシンシステム（ＲＡＳ）は、腎臓内の２つの主要な部位、即ち、糸球体および近位尿細管に存在する。ＲＡＳは、このシステムを遮断することで、ヒトおよび実験的糖尿病の両方においてタンパク質尿ならびに糸球体および尿細管間質性疾患が緩和されるので、腎臓疾患の進行に関連しているＬｅｗｉｓ（１９９３）。ＲＡＳ遮断薬の腎臓保護作用は、糸球体圧力を低減するその能力によっている（Ｚａｔｚ（１９８５）  Ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｃｅ  ｏｆ  ｈｅｍｏｄｙｎａｍｉｃ  ｒａｔｈｅｒ  ｔｈａｎ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ．  ＰＮＡＳ  ８２：５９６３〜５９６７）。しかしながら、アンジオテンシンＩＩの局所増加は、その細胞増殖促進特性を介して硬化症および炎症を引き起こし得ることが認められている（Ｗｏｌｆ  （１９９３）  Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  ＩＩ  ａｓ  ａ  ｒｅｎａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ．  Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ  ３：１５３１〜１５４０）。様々な糸球体疾患の研究から、ＡｎｇＩＩが、形質転換成長因子−β（ＴＧＦ−β）などの他の成長因子のアップレギュレーションによって細胞損傷をもたらすという十分な証拠が存在する（Ｒｕｉｚ  Ｏｒｔｅｇａ  （１９９４）  Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  ＩＩ  ａｎｄ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ  ｉｎ  ｍａｔｒｉｘ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｎａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．  Ｊ  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ  Ｓｕｐｐｌ．  １２：Ｓ５１〜Ｓ５８）。確かにこれらの成長因子は腎臓によって産生され、ＡｎｇＩＩによって増加して、細胞増殖、細胞周期停止および細胞死、細胞表現型の改変ならびにＥＣＭ蓄積を引き起こす（Ｋｅｌｌｙ（１９９８）、Ｋｅｌｌｙ（２０００）およびＫｅｌｌｙ（２００２））。証拠は、ＡｎｇＩＩが成長因子のアップレギュレーションによって様々な応答を引き起こすことを示唆しているが、ほんの僅かな研究が、ＡｎｇＩＩが糖尿病性状況において成長因子の活性化を促進する方法を記載している（Ｎａｉｔｏ（２００４）  Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｎａｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２８６：Ｆ２７８〜Ｆ２８７）。
【００１５】
高血圧を伴う患者における糖尿病性腎障害の管理におけるアンジオテンシン受容体遮断薬イルベサルタン（ＡＴ２Ｒ、商品名Ａｖａｐｒｏ（登録商標）、ＳａｎｏｆｉＡｖｅｎｔｉｓ）の効力は、２つの大規模（ｎ＞５００）で無作為化された二重盲検プラセボ制御の多国籍試験ＩＲＭＡ  ２（高血圧性患者におけるイルベサルタン微量アルブミン尿２型糖尿病）で評定されている（Ｐａｒｖｉｎｇ  （２００１）  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３４５  （１２）：８７０〜８およびＩＤＮＴ（Ｉｒｂｅｓａｒｔａｎ  Ｄｉａｂｅｔｉｃ  Ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ  Ｔｒｉａｌ）  Ｌｅｗｉｓ  （２００１）  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３４５  （１２）：８５１〜６０）。
【００１６】
高血圧を伴う患者［末期腎疾患の開始］におけるＡｎｇＩＩの有害な血管収縮効果に対処するために、ＡｎｇＩＩシグナル伝達のレベルで介入する治療戦略が開発されている。詳細には、ＡＣＥの活性を阻害して、ＡｎｇＩからＡｎｇＩＩへの変換を予防する化合物およびアンジオテンシン受容体（ＡＴＲ）の活性化を特異的に遮断する化合物が、そのような状態を治療する際に使用されている（Ｍａｔｃｈａｒ、Ｄ．Ｂ．（２００８）  Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １４８：１６〜２９）。
【００１７】
発明者らは、アンジオテンシン受容体をケモカイン受容体ファミリーのメンバーでヘテロマー化することを示している（ＷＯ２０１０／１０８２３２号）。発明者らは、ケモカイン受容体はアンジオテンシン受容体と、ケモカイン受容体／アンジオテンシン受容体ヘテロ−ダイマー／−オリゴマーとして会合することを示している。発明者らは、ＣＣＲ２がＡＴ１Ｒと、ＣＣＲ２／ＡＴ１Ｒヘテロ−ダイマー／−オリゴマーとして会合することを示している。
【００１８】
アンジオテンシンおよびＣＣＲ２シグナル伝達経路は、相互作用することが以前に示されている。例えば：血管病理に対するアンジオテンシンＩＩの効果は、ＣＣＲ２受容体が欠乏すると緩和される（Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ  Ａ（２０１０）  Ｃｌｉｎ  Ｓｃｉ（Ｌｏｎｄ）．  １１８（１１）：６８１〜９；Ｉｓｈｉｂａｃｈｉ  Ｍ（２００４）  Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ，  ａｎｄ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２４；  Ｔｉｅｕ  （２０１１）  Ａｏｒｔｉｃ  Ａｄｖｅｎｔｉｔｉａｌ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  Ｐａｒｔｉｃｉｐａｔｅ  ｉｎ  Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ−ｌｎｄｕｃｅｄ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｗａｌｌ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｍｏｄｅｌｌｉｎｇ  Ｊ  Ｖａｓｅ  Ｒｅｓ  ４８（３）２６１〜２７２）。
【００１９】
さらに、ＭＣＰ−１発現を誘発するアンジオテンシンＩＩは年齢と共に増加して、ＭＣＰ−１およびその受容体ＣＣＲ２のアップレギュレーションをもたらす。このアップレギュレーションはまた、様々な疾患で生じ得る（Ｓｐｉｎｅｔｔｉ  Ｇ（２００４）  Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｅ  Ｂｉｏｌ  ２４（８）：１３９７〜４０２）。
【００２０】
アンジオテンシン受容体遮断薬は、ＭＣＰ−１およびＣＣＲ２の発現を阻害することが示されている（Ｄａｉ（２００７）  Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  １５２、１０４２〜１０４８）。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
発明者らは、アンジオテンシン受容体遮断薬をケモカイン受容体経路阻害薬と一緒に投与することで、先行する技術の欠点の一部または全てが克服されることを意外にも見出した。
【００２２】
先行する検討は、本発明の理解を容易にすることのみを意図したものである。それらは、本発明の下記の記載の範囲および用途を制限するものとは決して理解されるべきでもなければ、検討されている情報のいずれも優先権日の時点で、適切な分野の当業者の一般的な知識の範囲内であることを認めるものとして理解されるべきではない。
【００２３】
本発明は、
ａ）少なくとも１種のアンジオテンシン受容体遮断薬または薬学的に許容されるその塩および
ｂ）少なくとも１種のケモカイン受容体経路阻害薬または薬学的に許容されるその塩
を含む医薬組成物を提供する。
【００２４】
医薬組成物は場合によって、薬学的に許容される担体をさらに含んでよい。
【００２５】
一態様では、医薬組成物は、アレスチン補充を阻害するか、または一部阻害する。
【００２６】
他の態様では、医薬組成物は、イノシトールリン酸産生を阻害するか、または一部阻害する。
【００２７】
本発明は、状態または疾患を治療、改善または予防する方法をさらに提供し、その方法は、対象に、（ｉ）アンジオテンシン受容体遮断薬および（ｉｉ）ケモカイン受容体経路阻害薬の治療有効量の組合せを投与することを含む。
【００２８】
一態様では、ケモカイン受容体経路阻害薬は、ケモカイン受容体以外のタンパク質を阻害するか、または一部阻害し、より好ましくは、阻害薬は、ＣＤ５５、ＣＤ５９およびＣＤ１６などのグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー型タンパク質の標的化を介して、ＭＣＰ−１誘発遊走および単球活性化および走化性遊走を遮断する。好ましくは、ケモカイン受容体経路阻害薬は、プロパゲルマニウムである。別法では、ケモカイン受容体経路阻害薬は、ＲＳ５０４３９３である。
【００２９】
好ましくは、アンジオテンシン受容体遮断薬は、イルベサルタンである。
【００３０】
本発明はまた、少なくとも１種のアンジオテンシン受容体遮断薬または薬学的に許容されるその塩および少なくとも１種のケモカイン受容体経路阻害薬または薬学的に許容されるその塩を含む医薬組成物を、疾患を治療するための剤形を製造するために使用することを企図している。医薬組成物は場合によって、薬学的に許容される担体をさらに含んでよい。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】実施例１に記載されているとおり、未処置の動物およびアンジオテンシン受容体遮断薬のみで処置された動物と比較しての、イルベサルタン（Ｉｒｂ）、アンジオテンシン受容体遮断薬およびプロパゲルマニウム（ＰＰＧ）（ケモカイン受容体経路阻害薬）（低用量）の組み合わせで治療された場合に終末器官腎疾患の腎亜全摘出（ＳＴＮｘ）モデルで達成されるタンパク尿のレベルの改善を示す棒グラフである。
【図２】実施例２に記載されているとおり、未処置の動物、ＰＰＧのみで処置された動物およびアンジオテンシン受容体遮断薬のみで処置された動物と比較しての、イルベサルタン（Ｉｒｂ）、アンジオテンシン受容体遮断薬およびプロパゲルマニウム（ＰＰＧ）（ケモカイン受容体経路阻害薬）（高用量）の組み合わせで治療された場合に終末器官腎疾患の腎亜全摘出（ＳＴＮｘ）モデルで達成されるタンパク尿のレベルの改善を示す棒グラフである。
【図３】実施例１に記載されている終末器官腎疾患の腎亜全摘出（ＳＴＮｘ）モデルから得られた組織断片の代表的な位相差イメージであり、ここでは、未処置または対照動物（Ａ）；ＳＴＮｘのみ（Ｂ）；ＳＴＮｘおよびプロパゲルマニウム（Ｃ）；ＳＴＮｘおよびイルベサルタン（Ｄ）；ならびにＳＴＮｘおよびイルベサルタンの組み合わせ（Ｅ）から得られた腎臓試料が示されている。糸球体中で強く茶色に染色された細胞は、有足細胞を表している。
【図４】実施例２に記載されているとおり、未処置の動物、ＰＰＧのみで処置された動物およびイルベサルタン（アンジオテンシン受容体遮断薬）のみで処置された動物と比較しての、イルベサルタン（Ｉｒｂ）、アンジオテンシン受容体遮断薬およびプロパゲルマニウム（ＰＰＧ）（ケモカイン受容体経路阻害薬）（高用量）の組み合わせで治療された場合に終末器官腎疾患の腎亜全摘出（ＳＴＮｘ）モデルで達成されるタンパク尿のレベルの改善を示す棒グラフである。
【図５】リガンド−誘発ＢＲＥＴによって測定され、実施例３に記載されているとおりのβ−アレスチン２補充に対するＡＴ１ＲおよびＣＣＲ２遮断の効果を示す棒グラフである。ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞をβ−アレスチン２−Ｖｅｎｕｓおよび示されている受容体：ＣＣＲ２−Ｒｌｕｃ８（上のパネル）、ＡＴ１  Ｒ−Ｒｌｕｃ８（中央のパネル）またはＡＴ１Ｒ−Ｒｌｕｃ８および非標識ＣＣＲ２（下のパネル）をコードするプラスミドによって一時的にトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に、細胞を、生きている細胞中でアゴニスト誘発ＢＲＥＴシグナルを発生させるために使用した。このために、細胞を初めに、イルベサルタン（１０μＭ）、ＲＳ５０４３９３（１０μＭ）または両方あわせたものと一緒に３７℃で３０分間、前インキュベートするか、しなかった。次いで、細胞を１００ｎＭのＡｎｇＩＩ、ＭＣＰ−１または両方合わせたもので３７℃で３０分間刺激するか、またはせず、ＢＲＥＴシグナルを測定した。データは、三重に行われた３つの独立した実験の平均±ＳＥＭを表している。
【図６】実施例４に記載されているとおり、イノシトールリン酸産生に対するＡＴ１ＲおよびＣＣＲ２遮断の効果を示す棒グラフである。ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞を、ＡＴ１Ｒ−Ｒｌｕｃ８および−アレスチン２−Ｖｅｎｕｓをコードするプラスミドで、未標識ＣＣＲ２の不在下（上のパネル）および存在下（下のパネル）で一時的にトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に、細胞を、アゴニスト誘発イノシトール（１）リン酸（ＩＰ１）産生測定を生じさせるために使用した。このために、細胞を初めに、イルベサルタン（１０μＭ）、ＲＳ５０４３９３（１０μＭ）または両方あわせたものと一緒に３７℃で３０分間、前インキュベートするか、しなかった。次いで、細胞を１００ｎＭのＡｎｇＩＩ、ＭＣＰ−１または両方合わせたもので３７℃で３０分間刺激するか、またはせず、ＩＰ１産生を測定した。ＡＴ１Ｒのみを発現する細胞でのＡｎｇＩＩ誘発ＩＰ１産生に対するパーセンテージとしてデータを正規化する。データは、三重に行われた３つの独立した実験の平均±ＳＥＭを表している。
【図７】リガンド−誘発ＢＲＥＴによって測定され、実施例５に記載されているとおりのβ−アレスチン２補充に対するＡＴ１ＲおよびＣＣＲ２遮断の効果を示す棒グラフである。ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞を、ＣＣＲ２−Ｒｌｕｃ８およびβ−アレスチン２−Ｖｅｎｕｓをコードするプラスミドによって、血球凝集素（ＨＡ）で標識されたＡＴＩ１の不在下（上のパネル）および存在下（下のパネル）で一時的にトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に、細胞を、生きている細胞中でアゴニスト誘発ＢＲＥＴシグナルを発生させるために使用した。このために、細胞を初めに、イルベサルタン（１０μＭ）、ＥＸＰ３１７４（ロサルタンの活性な代謝産物）、ＲＳ５０４３９３（１０μＭ）またはイルベサルタンおよびＲＳ５０４３９３もしくはＥＸＰ３１７４およびＲＳ５０４３９３の組み合わせと一緒に３７℃で３０分間、前インキュベートするか、しなかった。次いで、細胞を１００ｎＭのＡｎｇＩＩ、ＭＣＰ−１または両方合わせたもので３７℃で３０分間刺激するか、またはせず、ＢＲＥＴシグナルを測定した。
【図８】実施例６に記載されているとおりのイノシトールリン酸産生に対するＡＴ１ＲおよびＣＣＲ２遮断の効果を示す棒グラフである。ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞をＡＴ１Ｒ−Ｒｌｕｃ８およびβ−アレスチン２−Ｖｅｎｕｓをコードするプラスミドで、未標識のＣＣＲ２の不在下（上のパネル）および存在下（下のパネル）で一時的にトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に、細胞を、アゴニスト誘発イノシトール（１）リン酸（ＩＰ１）産生測定を生じさせるために使用した。このために、細胞を初めに、ＥＸＰ３１７４（ロサルタンの活性な代謝産物；１０μＭ）、ＲＳ５０４３９３（１０μＭ）または両方を組み合わせたものと一緒に３７℃で３０分間、前インキュベートするか、しなかった。次いで、細胞を１００ｎＭのＡｎｇＩＩ、ＭＣＰ−１または両方合わせたもので３７℃で３０分間刺激するか、またはせず、ＩＰ１産生を測定した。データは、誘発ＩＰ１（任意単位）として示されている。
【図９】リガンド誘発ＢＲＥＴによって測定され、実施例７に記載されているとおり、Ｇαｉ１カップリングに関して、活性化ＡＴ１Ｒの不在下および存在下でＣＣＲ２を活性化させる効果を示している用量応答曲線である。ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞を、Ｇαｉ１−Ｒｌｕｃ８およびＣＣＲ２−ＹＦＰをコードするプラスミドによって、血球凝集素（ＨＡ）で標識されたＡＴＩ１の不在下（上のパネル）および存在下（下のパネル）で一時的にトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に、細胞を、さまざまな濃度のＭＣＰ−１で、または１００ｎＭのＭＣＰ−１の存在下でのさまざまな濃度のＡｎｇＩＩで、生きている細胞中でアゴニスト誘発ＢＲＥＴシグナルを発生させるために使用した。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
略語
ＡＣＥ    アンジオテンシン変更酵素
ＡＣＥｉ    アンジオテンシン変換酵素阻害薬
ＡＩＤＳ    後天性免疫不全症候群
ＡｎｇＩ    アンジオテンシンＩペプチド
ＡｎｇＩＩ    アンジオテンシンＩＩペプチド
ＡｎｇＩＩＩ  アンジオテンシンＩＩＩペプチド
ＡＴ１Ｒ    アンジオテンシン受容体１型
ＡＴ２Ｒ    アンジオテンシン受容体２型
ｂａｒｒ    ベータ−アレスチン
ＢＰ    血圧
ＣＣＬ２    ケモカイン（Ｃ−Ｃモティーフ）リガンド２
ＣＣＲ    ＣＣケモカイン受容体
ＤＯＰ    デルタオピオイド
ＧＦＲ    糸球体濾過率
ＧＰＣＲ    Ｇタンパク質共役受容体
ＨＩＶ    ヒト免疫不全ウイルス
ＫＯＰ    カッパオピオイド
ＬＰＯ    外側視錯野
ＭＣＰ−１    単球走化性タンパク質−１（単球化学誘引物質タンパク質−１としても知られている）
ＮＰＹ    神経ペプチドＹ
ＳＴＮｘ    腎亜全摘出
総論
本明細書で引用される特許および特許出願を包含するすべての刊行物は、前出または後出にかかわらず、その全体が本明細書に援用される。しかしながら、本明細書で述べられる刊行物は、当該刊行物において報告され、本発明に関連して使用され得るプロトコル、試薬およびベクターを説明および開示する目的で引用されている。本明細書の一切の記載内容は、先行の発明のために本発明がこうした開示に先行しないことを容認するものとして解釈されてはならない。
【００３３】
本明細書中および添付の請求項中で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、特に文脈において明確に別段に規定されないかぎり、複数のものを包含する。したがって例えば、「ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ」といった言及には、複数のこうしたタンパク質が包含され、「ａｎ  ａｎａｌｙｔｅ」といった言及は、１つまたは複数の分析物などに対する言及である。
【００３４】
別段に定義されていないかぎり、本明細書において使用される技術的および科学的用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと同様または同等のあらゆる材料および方法を本発明を実施または試験するために使用することができるが、好ましい材料および方法については下記で述べる。
【００３５】
本明細書に記載されている発明には、１つまたは複数の値の範囲が含まれうる（例えば、サイズ、濃度など）。ある値の範囲は、その範囲を規定する値、およびその範囲の境界を規定する値のごく近傍の値と同じかまたは実質的に同じ結果をもたらすその範囲の近傍の値を含む、その範囲内のすべての値を包含するものとして理解される。
【００３６】
本明細書の全体を通じて、文脈上で別段に必要とされないかぎり、「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」という単語、または「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」もしくは「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」などのその変化形は、記載されている整数または整数群を包含することを示唆するものとして理解されるが、他の任意の整数または整数群を除外することを示唆するものではない。
【００３７】
最近の研究によって、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）は、モノマーとしてだけでなく、別のリガンド結合、シグナル伝達および細胞内取り込み作用（Ｒｉｏｓら、（２０００）  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．  ９２：７１〜８７）をもたらすホモ−およびヘテロ−ダイマーおよび／またはホモ−およびヘテロ−オリゴマー（ホモマーおよびヘテロマーとしても知られている）としても働き得ることが示されている。したがって、特異的な受容体のアゴニストまたはアンタゴニストとして働く薬物の作用は、この受容体の結合対に左右され得る。薬物の作用を、特異的な受容体ダイマーまたはオリゴマーによって媒介される細胞応答に限定することが望ましいことがある。
【００３８】
ヘテロ−ダイマーの異なるレパートリーを有する異なる組織の例が報告されている。例えば、よく知られているカッパオピオイド（ＫＯＰ）受容体リガンドの類似体である６’−グアニジノアルトリンドールは、脊髄選択的な鎮痛剤としての薬効を有するデルタオピオイド−カッパオピオイド（ＤＯＰ−ＫＯＰ）ヘテロダイマーに選択的なアゴニストとして同定されており、ＤＯＰ−ＫＯＰヘテロダイマーが脊髄において発現されるが、脳では発現されないという結論が導かれている（Ｗａｌｄｈｏｅｒ，Ｍ．ら（２００５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０２：９０５０〜９０５５）。したがって、少なくとも１個のケモカイン受容体サブユニットが少なくとも１個のアンジオテンシン受容体サブユニットと会合しているヘテロダイマーまたはヘテロオリゴマー受容体は新規な薬物標的を代表するものである。
【００３９】
６’−グアニジノアルトリンドールの場合におけるように、既知のリガンドがヘテロダイマー受容体を活性化させる異なる能力を示す場合があり、これにより既存の分子の新たな用途が見出される可能性がある。
Ｈｉｌａｉｒｅｔ  Ｓ．ら、２００３（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：２３７３１〜２３７３７）によって、ＣＢ１アンタゴニストがＣＢ１／ＯｘＲ１のヘテロダイマーのペアによって作用することにより食欲を抑制することが最近になって示されている。
ソマトスタチンＳＳＴＲ５受容体がドーパミンＤ２受容体とヘテロマー化することが示されている（Ｒｏｃｈｅｖｉｌｌｅ  Ｍ．ら（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８８：１５４〜１５７）。
アンジオテンシンおよびＣＣＲ２シグナル伝達経路は以前に、相互作用することが示されている。例えば、血管病理に対するアンジオテンシンＩＩの作用は、ＣＣＲ２受容体の不全によって緩和される（Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ  Ａ（２０１０）Ｃｌｉｎ  Ｓｃｉ（Ｌｏｎｄ）．１１８（１１）：６８１〜９；Ｉｓｈｉｂａｃｈｉ  Ｍ（２００４）  Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ，  ａｎｄ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２４）。
発明者らは、アンジオテンシン受容体とケモカイン受容体ファミリーのメンバーとのヘテロマー化を示している（ＷＯ２０１０／１０８２３２号）。
【００４０】
これらの例は、受容体の機能性相互作用を示しているが、それらは、治療結果の改善をもたらし得る併用療法の具体的な製剤を同定するものではない。
【００４１】
医薬組成物
好ましくは、併用療法は、ケモカイン受容体経路およびアンジオテンシン受容体を介して作用する。したがって本発明は、
ａ）少なくとも１種のアンジオテンシン受容体遮断薬または薬学的に許容されるその塩；および
ｂ）少なくとも１種のケモカイン受容体経路阻害薬または薬学的に許容されるその塩を含む医薬組成物を提供する。
【００４２】
医薬組成物は場合によって、薬学的に許容される担体をさらに含んでよい。
【００４３】
「ケモカイン受容体」という語句は、ＣＣケモカイン受容体１（ＣＣＲ１）、ＣＣケモカイン受容体２（ＣＣＲ２）、ＣＣケモカイン受容体３（ＣＣＲ３）、ＣＣケモカイン受容体４（ＣＣＲ４）、ＣＣケモカイン受容体５（ＣＣＲ５）、ＣＣケモカイン受容体６（ＣＣＲ６）、ＣＣケモカイン受容体７（ＣＣＲ７）、ＣＣケモカイン受容体８（ＣＣＲ８）、ＣＣケモカイン受容体９（ＣＣＲ９）、ＣＣケモカイン受容体１０（ＣＣＲ１０）を包含するＧタンパク質共役ＣＣケモカイン受容体（ＣＣＲ）を少なくとも包含するものとして理解されるべきである。「ケモカイン受容体」という語句はさらに、ＣＸＣケモカイン受容体１（ＣＸＣＲ１）、ＣＸＣケモカイン受容体２（ＣＸＣＲ２）、ＣＸＣケモカイン受容体３（ＣＸＣＲ３）、ＣＸＣケモカイン受容体４（ＣＸＣＲ４）、ＣＸＣケモカイン受容体５（ＣＸＣＲ５）、ＣＸＣケモカイン受容体６（ＣＸＣＲ６）およびＣＸＣケモカイン受容体７（ＣＸＣＲ７）を包含するＧタンパク質共役ＣＸＣケモカイン受容体（ＣＸＣＲ）を包含するものとしても理解されるべきである。「ケモカイン受容体」という語句はさらに、Ｇタンパク質共役ＸＣケモカイン受容体１（ＸＣＲ１）を包含するものとしても理解されるべきである。「ケモカイン受容体」という語句はさらに、Ｇタンパク質共役ＣＸ３ケモカイン受容体（ＣＸ３ＣＲ１）を含むものとして理解されるべきである。「ケモカイン受容体」という語句はさらに、Ｇタンパク質共役ＣＣＸ−ＣＫＲケモカイン受容体（ＣＣＸ−ＣＫＲ）を包含するものとして理解されるべきである。「ケモカイン受容体」という語句はさらに、Ｇタンパク質共役Ｄ６ケモカイン受容体（Ｄ６）を包含するものとしても理解される。「ケモカイン受容体」という語句はさらに、Ｇタンパク質共役ＤＡＲＣ／Ｄｕｆｆｙケモカイン受容体（ＤＡＲＣ）を包含するものとして理解されるべきである。このケモカイン受容体のリストは、アレンによる概説（Ａｌｌｅｎ，Ｓ．ら（２００７）  Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ：  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ．  Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２５：７８７〜８２０）から編集したものである。最後に、「ケモカイン受容体」という語句はさらに、新たに発見されたあらゆるＣＣＲ／ＣＸＣＲ／ＸＣＲ／ＣＸ３ＣＲ／ＣＣＸ−ＣＫＲ／Ｄ６／ＤＡＲＣファミリーのメンバーを包含するものとして理解されるべきである。
【００４４】
ケモカイン受容体は、ＣＣケモカイン受容体１（ＣＣＲ１）、ＣＣケモカイン受容体２（ＣＣＲ２）、ＣＣケモカイン受容体３（ＣＣＲ３）、ＣＣケモカイン受容体４（ＣＣＲ４）、ＣＣケモカイン受容体５（ＣＣＲ５）、ＣＣケモカイン受容体６（ＣＣＲ６）、ＣＣケモカイン受容体７（ＣＣＲ７）、ＣＣケモカイン受容体８（ＣＣＲ８）、ＣＣケモカイン受容体９（ＣＣＲ９）、ＣＣケモカイン受容体１０（ＣＣＲ１０）、ＣＸＣケモカイン受容体１（ＣＸＣＲ１）、ＣＸＣケモカイン受容体２（ＣＸＣＲ２）、ＣＸＣケモカイン受容体３（ＣＸＣＲ３）、ＣＸＣケモカイン受容体４（ＣＸＣＲ４）、ＣＸＣケモカイン受容体５（ＣＸＣＲ５）、ＣＸＣケモカイン受容体６（ＣＸＣＲ６）およびＣＸＣケモカイン受容体７（ＣＸＣＲ７）、Ｇタンパク質共役ＸＣケモカイン受容体１（ＸＣＲ１）、Ｇタンパク質共役ＣＸ３ケモカイン受容体（ＣＸ３ＣＲ１）、Ｇタンパク質共役ＣＣＸ−ＣＫＲケモカイン受容体（ＣＣＸ−ＣＫＲ）、Ｇタンパク質共役Ｄ６ケモカイン受容体（Ｄ６）、Ｇタンパク質共役ＤＡＲＣ／Ｄｕｆｆｙケモカイン受容体（ＤＡＲＣ）およびＣＣＲ／ＣＸＣＲ／ＸＣＲ／ＣＸ３ＣＲ／ＣＣＸ−ＣＫＲ／Ｄ６／ＤＡＲＣケモカイン受容体を含む群から選択することができる。
【００４５】
「ケモカイン受容体経路」という語句は、上記に列挙されているケモカイン受容体によって活性化される経路のいずれか１つを少なくとも包含するものと理解される。好ましくは、ケモカイン受容体経路は、ＣＣケモカイン受容体２（ＣＣＲ２）を包含するＧタンパク質共役ＣＣケモカイン受容体（ＣＣＲ）によって活性化される経路である。
【００４６】
「ケモカイン受容体以外のケモカイン受容体経路の成分」という用語は、本明細書で使用される場合、上記に列挙されているケモカイン受容体の１種または複数によって活性化される上記に列挙されている経路のうちのいずれか１つの成分を包含するものと理解され、その際、その成分は、上記に列挙されているケモカイン受容体自体ではない。好ましくは、その成分は、これらに限られないが、トランスダクションまたはシグナル伝達タンパク質などのタンパク質である。ケモカイン受容体経路の成分は、ケモカイン受容体の活性化と直接相互作用し得る。別法では、ケモカイン受容体経路の成分は、タンパク質間相互作用または複合体の形成によるケモカイン受容体の活性化と直接相互作用し得る。別法では、ケモカイン受容体経路の成分は、当分野で知られているようなシグナル伝達経路によるケモカイン受容体の活性化と直接相互作用し得る。
【００４７】
「ケモカイン受容体経路阻害薬」という語句は、ケモカイン受容体自体以外のケモカイン受容体経路の成分を阻害する化合物または薬剤を包含する、上記に列挙されているケモカイン受容体に関連する経路のいずれか１つを阻害するか、または一部阻害する任意の化合物または薬剤を包含することを意図したものである、例えば、該阻害薬は、ケモカイン受容体と会合するタンパク質を阻害するか、もしくは一部阻害し得るか、またはケモカイン受容体自体の後および／または前に、化合物または経路ステップを阻害し得る。好ましくは、ケモカイン受容体経路阻害薬は、ＣＣＲ２アンタゴニスト、ＣＣＲ２インバースアゴニストまたはＣＣＲ２ネガティブアロステリック調節薬である。
【００４８】
ケモカイン受容体経路阻害薬は、直接的なＣＣＲ２アンタゴニスト、インバースＣＣＲ２アゴニスト、ネガティブアロステリックＣＣＲ２調節薬；間接的なＣＣＲ２アンタゴニスト、間接的なインバースＣＣＲ２アゴニストおよび間接的なネガティブアロステリックＣＣＲ２調節薬を含む群から選択することができる。
【００４９】
より好ましくは、該語句には、ＭＣＰ−１および／またはＣＣＲ２に関連するケモカイン受容体経路のいずれか一つを阻害するか、または一部阻害する任意の阻害薬が包含され、これらには、直接的なＣＣＲ２および／またはＭＣＰ−１アンタゴニスト、インバースアゴニストまたはネガティブアロステリック調節薬；または様々なレベルでこれらの経路を遮断することで間接的に作用するアンタゴニスト、インバースアゴニストまたはネガティブアロステリック調節薬が包含される。
【００５０】
より具体的には、該語句には、慢性肝炎に対する治療薬として使用されていて、他にも、ＣＤ５５、ＣＤ５９およびＣＤ１６などのグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー型タンパク質を必要とするようである機構を介して、ＭＣＰ−１による単球の走化性遊走をインビトロで特異的に阻害することが示されている分子であるプロパゲルマニウム（３−オキシゲルミルプロピオン酸ポリマー）が包含される（Ｙｏｋｏｃｈｉ，Ｓ．（２００１）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２１：３８９〜３９８）。プロパゲルマニウムはまた、３−［（２−カルボキシエチル−オキソゲルミル）オキシ−オキソゲルミル］プロパン酸、プロキシゲルマニウム、Ｇｅ−１３２、ビス（２−カルボキシエチルゲルマニウム）セスキオキシド（ＣＥＧＳ）、２−カルボキシエチルゲルマセセスキオキサン、ＳＫ−８１８、有機ゲルマニウム、ゲルマニウムセスキオキシド、３，３’−（１，３−ジオキソ−１，３−ジゲルマノオキサンジイル）ビスプロピオン酸、３−オキシゲルミルプロピオン酸ポリマー、ポリ−トランス−（２−カルボキシエチル）ゲルマセスキオキサン、プロキシゲルマニウム、レパゲルマニウム（ｒｅｐａｇｅｒｍａｎｉｕｍ）およびセロシオン（Ｓｅｒｏｃｉｏｎ）としても知られている。プロパゲルマニウムは、下式を有する：
【化１】
2020122015.tif 000003
【００５１】
該語句はまた、ＲＳ５０４３９３を包含する。ＲＳ５０４３９３は、下式を有する：
【化２】
2020122015.tif 000004
【００５２】
したがって、本発明はまた、
ａ）少なくとも１種のアンジオテンシン受容体遮断薬または薬学的に許容されるその塩；および
ｂ）少なくとも１種の、ケモカイン受容体以外のケモカイン受容体経路の成分を阻害するケモカイン受容体経路阻害薬または薬学的に許容されるその塩
を含む医薬組成物を提供する。
【００５３】
医薬組成物は場合によって、薬学的に許容される担体をさらに含んでよい。
【００５４】
好ましい一実施形態では、ケモカイン受容体経路阻害薬は、
（ｉ）ケモカイン受容体のまたはケモカイン受容体以外のケモカイン受容体経路の成分のアンタゴニスト；
（ｉｉ）ケモカイン受容体またはケモカイン受容体以外のケモカイン受容体経路の成分のインバースアゴニスト；
（ｉｉｉ）ケモカイン受容体またはケモカイン受容体以外のケモカイン受容体経路の成分のネガティブアロステリック調節薬
からなる群から選択される。
【００５５】
ケモカイン受容体以外のケモカイン受容体経路の成分を標的化するケモカイン受容体経路阻害薬のより具体的な例は、ＭＣＰ−１誘発遊走、単球活性化および走化性遊走に関連する経路を遮断する薬剤であろう。標的化され得るそのような薬剤には、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー型タンパク質、より具体的にはＣＤ５５、ＣＤ５９およびＣＤ１６が包含される。
【００５６】
ケモカイン受容体の既知のアンタゴニストには、ＲＳ５０４３９３、ＲＳ１０２８９５、ＭＬＮ−１２０２（Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＩＮＣＢ３３４４、ＩＮＣＢ３２８４およびＩＮＣＢ８６９６（Ｉｎｃｙｔｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＭＫ−０８１２（Ｍｅｒｃｋ）、ＣＣＸ１４０（ＣｈｅｍｏＣｅｎｔｒｙｘ）、ＰＦ−４１３６３０９（Ｐｆｉｚｅｒ）、ＢＭＳ−７４１６７２（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）；レペルタキシン（ＣＸＣＲ２）、ＴＡＫ−７７９（ＣＣＲ５）、ＴＡＫ−２２０（ＣＣＲ５）、ＴＡＫ−６５２（ＣＣＲ５）、ＡＫ６９２（ＣＣＲ５）、ＣＭＰＤ１６７（ＣＣＲ５）、ＢＸ−４７１（ＣＣＲ１）、ＡＭＤ３１００（ＣＸＣＲ４）、ＡＭＤ１１０７０（ＣＸＣＲ４）、ＦＣ１３１（ＣＸＣＲ４）、ＭＬＮ３８９７（ＣＣＲ１）、ＣＰ−４８１７１５（ＣＣＲ１）、ＧＷ−８７３１４０（ＣＣＲ５）が包含される．ケモカイン受容体経路阻害薬は、ＲＳ５０４３９３、ＲＳ１０２８９５、ＭＬＮ−１２０２、ＩＮＣＢ８６９６、ＭＫ−０８１２、ＣＣＸ１４０、ＰＦ−４１３６３０９、ＢＭＳ−７４１６７２；レペルタキシン（ＣＸＣＲ２）、ＴＡＫ−７７９（ＣＣＲ５）、ＴＡＫ−２２０（ＣＣＲ５）、ＴＡＫ−６５２（ＣＣＲ５）、ＡＫ６９２（ＣＣＲ５）、ＣＭＰＤ１６７（ＣＣＲ５）、ＢＸ−４７１（ＣＣＲ１）、ＡＭＤ３１００（ＣＸＣＲ４）、ＡＭＤ１１０７０（ＣＸＣＲ４）、ＦＣ１３１（ＣＸＣＲ４）、ＭＬＮ３８９７（ＣＣＲ１）、ＣＰ−４８１７１５（ＣＣＲ１）およびＧＷ−８７３１４０（ＣＣＲ５）を含む群から選択することができる。
【００５７】
好ましい一実施形態では、ケモカイン受容体経路阻害薬は、ケモカイン受容体のアンタゴニストである。好ましい一実施形態では、ケモカイン受容体経路阻害薬は、ＲＳ５０４３９３、ＲＳ１０２８９５、ＭＬＮ−１２０２（Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＩＮＣＢ３３４４、ＩＮＣＢ３２８４、ＩＮＣＢ８６９６（Ｉｎｃｙｔｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＭＫ−０８１２（Ｍｅｒｃｋ）、ＣＣＸ１４０（ＣｈｅｍｏＣｅｎｔｒｙｘ）、ＰＦ−４１３６３０９（Ｐｆｉｚｅｒ）、ＢＭＳ−７４１６７２（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）；レペルタキシン（ＣＸＣＲ２）、ＴＡＫ−７７９（ＣＣＲ５）、ＴＡＫ−２２０（ＣＣＲ５）、ＴＡＫ−６５２（ＣＣＲ５）、ＡＫ６９２（ＣＣＲ５）、ＣＭＰＤ１６７（ＣＣＲ５）、ＢＸ−４７１（ＣＣＲ１）、ＡＭＤ３１００（ＣＸＣＲ４）、ＡＭＤ１  １０７０（ＣＸＣＲ４）、ＦＣ１３１（ＣＸＣＲ４）、ＭＬＮ３８９７（ＣＣＲ１）、ＣＰ−４８１７１５（ＣＣＲ１）およびＧＷ−８７３１４０（ＣＣＲ５）からなる群から選択される。好ましい一実施形態では、ケモカイン受容体経路阻害薬は、ＲＳ１０２８９５ではない。
【００５８】
好ましい一実施形態では、ケモカイン受容体経路阻害薬は、プロパゲルマニウム（プロパゲルマニウムはまた、ビス（２−カルボキシエチルゲルマニウム）セスキオキシド（ＣＥＧＳ）、有機ゲルマニウム、ゲルマニウムセスキオキシド、３，３’−（１，３−ジオキソ−１，３−ジゲルマノオキサンジイル）ビスプロピオン酸、３−オキシゲルミルプロピオン酸ポリマー、ポリ−トランス−（２−カルボキシエチル）ゲルマセスキオキサン、プロキシゲルマニウム、レパゲルマニウム（ｒｅｐａｇｅｒｍａｎｉｕｍ）およびＳｅｒｏｃｉｏｎとしても知られている）である。
【００５９】
好ましい一実施形態では、ケモカイン受容体経路阻害薬は、ＭＣＰ−１によって誘発される単球のインビトロ走化性遊走を阻害する。他の好ましい実施形態では、ケモカイン受容体経路阻害薬は、ＣＤ５５、ＣＤ５９およびＣＤ１６などのグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー型タンパク質にを必要とする機構を介して、ＭＣＰ−１によって誘発される単球のインビトロ走化性遊走を阻害する。他の好ましい実施形態では、ケモカイン受容体経路阻害薬は、複合体ＣＣＲ２／ＣＤ５５および／またはＣＣＲ２／ＣＤ５９および／またはＣＣＲ２／ＣＤ１６を安定化する。ケモカイン受容体経路阻害薬は、ペプチド、ポリペプチドまたは小化学成分であってよい。例えば、ケモカイン受容体経路阻害薬は、タンパク質、結合タンパク質または抗体であってよい。
【００６０】
ケモカイン受容体経路阻害薬は、ＣＤ５５、ＣＤ５９およびＣＤ１６を含む群から選択される１種または複数のグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー型タンパク質の標的化を介して、ＭＣＰ−１誘発遊走および単球活性化および走化性遊走を阻害し得る。ケモカイン受容体経路阻害薬は、複合体ＣＣＲ２／ＣＤ５５および／またはＣＣＲ２／ＣＤ５９および／またはＣＣＲ２／ＣＤ１６を安定化し得る。
【００６１】
プロパゲルマニウムは、ケモカイン受容体経路阻害薬であるが、これは、ＭＣＰ−１結合を阻害せず、ＣＤ５５、ＣＤ５９およびＣＤ１６などのグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー型タンパク質を標的化するようである（Ｙｏｋｏｃｈｉ（２００１）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２１：３８９〜３９８；Ｙａｍａｄａ（２００４）  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １７２：３８６９〜３８７５）。プロパゲルマニウムは、ＭＣＰ−１による単球のインビトロ走化性遊走を阻害する（Ｙｏｋｕｃｈｉ（２００１）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２１：３８９〜３９８）。
【００６２】
本発明は、
ａ）少なくとも１種のアンジオテンシン受容体遮断薬または薬学的に許容されるその塩；および
ｂ）プロパゲルマニウムまたは薬学的に許容されるその塩
を含む医薬組成物を提供する。
【００６３】
本発明は、
ａ）少なくとも１種のアンジオテンシン受容体遮断薬または薬学的に許容されるその塩；および
ｂ）ＲＳ５０４３９３または薬学的に許容されるその塩を含む医薬組成物を提供する。
【００６４】
重要な補体調節因子であるＣＤ５５（崩壊促進因子）およびＣＤ５９（プロテクチン）は両方とも、ＧＰＩアンカー型形質膜タンパク質である（Ｙｏｋｏｃｈｉ（２００１）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２１：３８９〜３９８；Ｙａｍａｄａ（２００４）Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １７２：３８６９〜３８７５）。補体阻害因子の調節の欠陥および低レベルのＣＤ５５およびＣＤ５９が、下記を包含するいくつかの病態で示されている：
ｉ）腎臓疾患および腎臓虚血再灌流障害（Ｙａｍａｄａ（２００４）Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  Ｒｅｎａｌ  Ｉｓｈｅｍｉａ  Ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  Ｉｎｊｕｒｙ  ｂｙ  ＣＤ５５  ａｎｄ  ＣＤ５９、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １７２：３８６９〜３８７５）；
ｉｉ）糖尿病（その際、補体阻害因子の調節の欠陥およびＣＤ５５およびＣＤ５９のレベル低下は、糖尿病の一次作用およびこれらのＧＰＩアンカー型補体阻害因子の選択的低下を伴う糖尿病血管における補体活性化に関する機構のうちの１つとみなすことができ、これらの分子の合成または加工に共通する調節ステップに対する糖尿病の作用を示唆している）。糖尿病においてＣＤ５９およびＣＤ５５のレベル低下をもたらす機構は細胞または組織特異的であり得ることが提案されている（Ｚｈａｎｇ（２００２）Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５１：３４９９〜３５０４）；
ｉｉｉ）大血管性疾患（Ｍａ（２００９）Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ、  １  ２２（１８）２１  ２３〜２１２８）；
ｉｖ）黄斑変性（Ｂｏｒａ（２００７）Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１７８（３）１７８３〜１７９０；およびＭａ  Ｋ（２０１０）Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ．Ｄｅｃ；５１（１２）：６７７６〜８３．Ｅｐｕｂ  ２０１０  Ａｕｇ）。
【００６５】
「アンジオテンシン受容体」または「ＡＴＲ」という語句は、Ｇタンパク質共役受容体であるアンジオテンシン受容体１（ＡＴ１Ｒ；ＡＴ１Ｒ）またはアンジオテンシン受容体２（ＡＴ２Ｒ；ＡＴ２Ｒ）のいずれかを意味するものとして理解されるべきである。好ましい一実施形態では、それらは、ポレロらによって記載されていて（Ｐｏｒｅｌｌｏ，Ｅ．Ｒ．ら（２００９）Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、１４：９５８〜９７２）、アンジオテンシンＩＩ（ＡｎｇＩＩ）および／またはアンジオテンシンＩＩＩ（ＡｎｇＩＩＩ）によって活性化されるものである。「アンジオテンシン受容体」または「ＡＴＲ」は、新たに発見されたアンジオテンシン受容体ファミリーのメンバーを包含すると理解されるべきである。
【００６６】
「アンジオテンシン受容体遮断薬」という語句は、ＡＴＲの活性化を阻害するか、または一部阻害し得る薬剤または化合物を意味すると理解される。これには、ＡＴＲのアンタゴニスト、インバースアゴニストおよびネガティブアロステリック調節薬が包含される。好ましくは、アンジオテンシン受容体遮断薬はＡＴ１Ｒを遮断する。
【００６７】
「阻害する」という用語は本明細書で使用される場合、参照と比較した場合に検出可能な限界未満への低減を意味する。該語句には、望ましくない結果を予防するために作用を遮断、遅延または妨害することが包含される。
【００６８】
「一部阻害する」という用語は本明細書で使用される場合、参照と比較した場合に検出可能な限界内での何らかの低減を意味する。該語句には、望ましくない結果を予防するために作用を遮断、遅延または妨害することが包含される。
【００６９】
本明細書に記載されていて、これらに限られないが、当分野で公知のようなＭＣＰ−１による単球のインビトロ走化性遊走を評価するための生化学または細胞アッセイを包含するインビトロ方法を使用して、さらにはイノシトールリン酸産生、細胞外調節キナーゼ（ＥＲＫ）リン酸化、ｃＡＭＰ産生の測定、無標識技術（インピーダンス、光屈折、電荷再配分を使用するなど）、近接レポーターシステムまたは他の手法を使用するＧタンパク質共役、β−アレスチン補充または媒介シグナル伝達、転写因子をベースとするレポーターシステム、蛍光標識を使用する顕微鏡可視化、受容体細胞位置限定を推定するための抗体の使用（酵素結合免疫吸着検定法など）および蛍光活性化細胞分類を使用して、阻害または一部阻害を測定することができる。
【００７０】
本明細書に記載されていて、これらに限られないが、自動分析器などによって血漿クレアチニンおよび尿を測定することによって成される腎臓機能の連続測定を包含するインビボ方法；ラジオイムノアッセイなどによるタンパク尿の測定、アルブミン尿の測定；およびＧＦＲ（シングルショット同位体技術）；糸球体および心臓肥大、糸球体硬化症および／または線維症および／または有足細胞変化を評価するための、例えば光学顕微鏡（ＬＭ）による腎臓および／または心臓および／または眼構造などの終点の評価および／または；マトリックス沈着の規模ならびに線維化促進性成長因子の変調およびその活性を測定するための免疫組織化学；収縮期血圧、インスリン空腹時血漿グルコースの変調、ヘモグロビンＡ１ｃの変調の評価；ならびに当分野で公知のような慣用のアッセイに従って腎臓および心臓および眼構造を評価するための分子生物学的技術を使用して、阻害または一部阻害を測定することができる。阻害または一部阻害は、上述の終点のうちの１つまたは複数によって測定されるとおり、腎臓および／または心臓および／または眼構造における定性改善によって示され得る。
【００７１】
「成分」という用語は、本発明の医薬組成物の文脈において本明細書で使用される場合、アンジオテンシン受容体遮断薬またはケモカイン受容体経路阻害薬のいずれかを意味する。
【００７２】
好ましい一実施形態では、アンジオテンシン受容体遮断薬は、
ａ）アンジオテンシン受容体アンタゴニスト；
ｂ）アンジオテンシン受容体インバースアゴニスト；または
ｃ）アンジオテンシン受容体ネガティブアロステリック調節薬
からなる群から選択される。
【００７３】
さらに好ましい実施形態では、アンジオテンシン受容体遮断薬は、ＣＧＰ−４２１１２Ａ（ＡＴ２Ｒアンタゴニスト；Ｓｉｇｍａ  ＃Ｃ−１６０）、エプロサルタン（ＡＴ１Ｒ；市販名Ｔｅｖｅｔｅｎ（登録商標）、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ＵＳＡ）、ロサルタン（ＡＴ１Ｒ；市販名Ｃｏｚａａｒ（登録商標）、Ｍｅｒｃｋ  ＆  Ｃｏ）、バルサルタン（ＡＴ１Ｒ；市販名Ｄｉｏｖａｎ（登録商標）、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、テルミサルタン（ＡＴ１Ｒ、市販名Ｍｉｃａｒｄｉｓ（登録商標）、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）、イルベサルタン（ＡＴ１Ｒ、市販名Ａｖａｐｒｏ（登録商標）、ＳａｎｏｆｉＡｖｅｎｔｉｓ）、カンデサルタン（ＡＴ１Ｒ、市販名Ａｔａｃａｎｄ（登録商標）、ＡｓｔｒａＺｅｎｉｃａ）、オルメサルタン（ＡＴ１Ｒ、市販名Ｂｅｎｉｃａｒ（登録商標）、Ｄａｉｉｃｈｉ  Ｓａｎｋｙｏ  Ｉｎｃ）、ＰＤ１２３３１９（ＡＴ２Ｒ、Ｔｏｃｒｉｓ）、ＺＤ−７１１５（ＡＴ１Ｒ）、サララシン（（Ｓａｒ１−Ａｌａ８）ＡｎｇＩＩ）、サルスラン（（Ｓａｒ１−Ｔｈｒ８）ＡｎｇＩＩおよびＤｕＰ７５３（ＡＴ１Ｒ）からなる群から選択される。例として、アンジオテンシン受容体遮断薬は、イルベサルタンであってよい。アンジオテンシン受容体遮断薬は、ＣＧＰ−４２１１２Ａ（ＡＴ２Ｒアンタゴニスト）、Ｅｐｒｏｓａｒｔａｎ（ＡＴ１Ｒ）、ロサルタン（ＡＴ１Ｒ）、バルサルタン（ＡＴ１Ｒ）、テルミサルタン（ＡＴ１Ｒ）、イルベサルタン（ＡＴ１Ｒ）、カンデサルタン（ＡＴ１Ｒ）、オルメサルタン（ＡＴ１Ｒ）、ＰＤ１２３３１９（ＡＴ２Ｒ）、ＺＤ−７１１５（ＡＴ１Ｒ）、サララシン（（Ｓａｒ１−Ａｌａ８）ＡｎｇＩＩ）、サルスラン（（Ｓａｒ１−Ｔｈｒ８）ＡｎｇＩＩ）およびＤｕＰ７５３（ＡＴ１Ｒ）を含む群から選択され得る。
【００７４】
イルベサルタンは、２−ブチル−３−（｛４−［２−（２Ｈ−１，２，３，４−テトラゾール−５−イル）フェニル］フェニル｝メチル）−１，３−ジアザスピロ［４．４］ノナ−１−エン−４−オンとしても公知のアンジオテンシンＩＩ受容体アンタゴニストである。イルベサルタンは下式を有する：
【化３】
2020122015.tif 000005
【００７５】
好ましい一実施形態では、アンジオテンシン受容体遮断薬はオルメサルタンではない。他の好ましい実施形態では、アンジオテンシン受容体遮断薬はオルメサルタンではなく、ケモカイン受容体経路阻害薬はＲＳ１０２８９５ではない。他の好ましい実施形態では、アンジオテンシン受容体遮断薬はオルメサルタンであり、ケモカイン受容体経路阻害薬はプロパゲルマニウムである。他の好ましい実施形態では、アンジオテンシン受容体遮断薬はオルメサルタンであり、ケモカイン受容体経路阻害薬は、ケモカイン受容体以外のケモカイン受容体経路の成分を標的化するケモカイン受容体経路阻害薬である。
【００７６】
オルメサルタンは、（５−メチル−２−オキソ−２Ｈ−１，３−ジオキソール−４−イル）メチル４−（２−ヒドロキシプロパン−２−イル）−２−プロピル−１−（｛４−［２−（２Ｈ−１，２，３，４−テトラゾール−５−イル）フェニル］フェニル｝メチル）−１Ｈ−イミダゾール−５−カルボキシレートとしても公知のアンジオテンシンＩＩ受容体アンタゴニストである。
【００７７】
オルメサルタンは、下式を有する：
【化４】
2020122015.tif 000006
【００７８】
したがって本発明はまた、
ａ）オルメサルタンまたは薬学的に許容されるその塩；および
ｂ）少なくとも１種の、ケモカイン受容体以外のケモカイン受容体経路の成分を阻害するケモカイン受容体経路阻害薬または薬学的に許容されるその塩
を含む医薬組成物を提供する。
【００７９】
したがって本発明はまた、
ａ）少なくとも１種のアンジオテンシン受容体遮断薬または薬学的に許容されるその塩；および
ｂ）プロパゲルマニウムまたは薬学的に許容されるその塩
を含む医薬組成物を提供する。
【００８０】
したがって本発明はまた、
ａ）オルメサルタンまたは薬学的に許容されるその塩；および
ｂ）プロパゲルマニウムまたは薬学的に許容されるその塩
を含む医薬組成物を提供する。
【００８１】
したがって本発明はまた、
ａ）イルベサルタンまたは薬学的に許容されるその塩；および
ｂ）少なくとも１種のケモカイン受容体経路阻害薬または薬学的に許容されるその塩
を含む医薬組成物を提供する。
【００８２】
本発明はさらに、
ａ）イルベサルタンまたは薬学的に許容されるその塩；および
ｂ）ＲＳ５０４３９３または薬学的に許容されるその塩。
を含む医薬組成物を提供する。
【００８３】
本発明はさらに、
ａ）イルベサルタンまたは薬学的に許容されるその塩；および
ｂ）少なくとも１種の、ケモカイン受容体以外のケモカイン受容体経路の成分を阻害するケモカイン受容体経路阻害薬または薬学的に許容されるその塩を含む医薬組成物を提供する。
【００８４】
好ましい一実施形態では、他の成分の投与を何ら投与することなくいずれかの成分を投与した場合のアンジオテンシン受容体遮断薬またはケモカイン受容体経路阻害薬の効力と比較して、医薬組成物の全体効力は大きい。したがって、合わせた組成物を治療量以下の用量または多くの場合に、それら２種の成分のいずれかが単一の化合物として投与される場合よりも少ない用量を包含する一回投与で投与することができる。
【００８５】
好ましくは、他の成分の投与を何ら投与することなくいずれかの成分を投与した場合のアンジオテンシン受容体遮断薬およびケモカイン受容体経路阻害薬の効力の合計と比較して、医薬組成物の全体効力は大きい。より好ましくは、アンジオテンシン受容体遮断薬およびケモカイン受容体経路阻害薬を同時または順次投与すると、効力の相乗効果が観察される。
【００８６】
別法では、医薬組成物の全体効力は、他の成分の投与を何ら投与することなくいずれかの成分を投与した場合のアンジオテンシン受容体遮断薬およびケモカイン受容体経路阻害薬の効力の合計に等しい。この選択肢のさらに好ましい実施形態として、アンジオテンシン受容体遮断薬およびケモカイン受容体経路阻害薬を同時または順次投与すると、効力の相加効果が観察される。
【００８７】
さらなる選択肢では、医薬組成物の全体効力は、他の成分の投与を何ら投与することなくいずれかの成分を投与した場合のアンジオテンシン受容体遮断薬およびケモカイン受容体経路阻害薬の効力の合計未満である。さらなる実施形態では、合わせた効力が、他の成分の投与を何ら投与することなくいずれかの成分を投与した場合のアンジオテンシン受容体遮断薬およびケモカイン受容体経路阻害薬の効力の合計未満であっても、その治療は、単独で投与されるアンジオテンシン受容体遮断薬またはケモカイン受容体経路阻害薬の単独治療と比較して、より大きな効力をもたらす。
【００８８】
好ましくは、それら２種の成分を同時に同じ時間で（例えば、２つの錠剤として一緒に、またはそれぞれの成分を用いて製剤化された単一の錠剤として）、または順次に（例えば１つの錠剤の後に他の錠剤を摂取）投与する。各成分の用量は、一緒に（同時に）、または順次に、それぞれ数秒、数分、数日、数週間または数ヶ月以内に摂取することができる。
【００８９】
治療方法
本発明は、状態または疾患を治療、改善または予防する方法をさらに提供し、その方法は、前記対象に、治療有効量の（ｉ）アンジオテンシン受容体遮断薬および（ｉｉ）ケモカイン受容体の阻害薬またはその下流経路の阻害薬（ケモカイン受容体経路阻害薬）の組合せを投与することを含む。
【００９０】
本発明の方法で使用されるケモカイン受容体の阻害薬またはその下流経路の阻害薬（ケモカイン受容体経路阻害薬）およびアンジオテンシン受容体遮断薬は、上記で検討されているものから選択することができる。
【００９１】
好ましくは、治療または予防される状態または疾患は、腎臓疾患、より詳細には、腎臓における繊維性障害、糖尿病性腎障害が原因の慢性腎臓疾患、腎不全（糖尿病性および非糖尿病性）ならびに糖尿病性腎障害、糸球体腎炎、強皮症、糸球体硬化症、一次腎疾患のタンパク尿および腎臓血管高血圧を包含する腎不全状態からなる群から選択される疾患である。
【００９２】
本発明の方法はまた、（急性および慢性）鬱血性心不全、左心室機能不全および肥大性心筋症、糖尿病性心筋症、上室性および心室性不整脈、心房性原線維形成または心房性粗動、心筋梗塞およびその続発症、アテローム硬化症、アンギナ（不安定的または安定的）、心不全、狭心症、糖尿病、二次アルドステロン症、一次および二次肺高アルドステロン症、一次および肺高血圧、糖尿病性網膜症、黄斑変性、眼障害、インスリン耐性、片頭痛などの他の血管障害の管理、レイノー病、管腔過形成、認知機能不全（アルツハイマー病など）、卒中、高カリウム血症、子癇前症、サルコイドーシス、ＨＩＶ感染およびＡＩＤＳ発症、虚血および再灌流障害、アテローム発生、慢性閉塞性肺疾患、喘息およびアレルギー性腎疾患、関節リウマチを包含する心臓血管疾患からなる群から選択される状態を治療または予防するためにも使用することができる。
【００９３】
一般に、ケモカインが関連している病気の範囲は、本発明の方法によって治療することができ、その際、ケモカインの産生の増加または低下、および／またはケモカインに対する細胞の応答性の増加または低下に関連する病気が包含される。ケモカイン関連病とは、ケモカイン受容体が異常な特性を示すか、特定の病原体の標的であるか、または薬理学的介入の標的である状態を意味するとも理解されるべきである。下記のリストは、ケモカイン関連病の一部の例を示している：
ＨＩＶ感染およびＡＩＤＳ発症、
虚血再潅流傷害、
アテローム発生、
慢性閉塞性肺疾患、
喘息およびアレルギー、
腎疾患、
関節リウマチ。
【００９４】
しかしながら、「ケモカイン関連介入」という語句および「ケモカイン関連病」という語句はこれらに限定されるものではない点は理解されるべきである。
【００９５】
アンジオテンシンが関連している病気の範囲もまた、本発明の方法によって治療することができ、その際、アンジオテンシンの産生の増加または低下、および／またはアンジオテンシンに対する細胞の応答性の増加または低下に関連する病気が包含される。下記のリストは、アンジオテンシンシステムの異常調節に由来すると提案されているか、またはアンジオテンシンをベースとする介入を使用して治療することができるであろういくつかの状態である：
慢性心不全；
アテローム硬化症／虚血；
高血圧；
高カリウム血症；
子癇前症；
糖尿病；
糖尿病性網膜症；
サルコイドーシス；
アルツハイマー病。
【００９６】
治療または予防される状態または疾患は、腎臓における繊維性障害、糖尿病性腎障害が原因の慢性腎臓疾患、腎不全、腎不全状態、糖尿病性腎障害、糸球体腎炎、強皮症、糸球体硬化症、一次腎疾患のタンパク尿および腎臓血管高血圧、心臓血管疾患、慢性心不全、高血圧、鬱血性心不全、左心室機能不全、肥大性心筋症、糖尿病性心筋症、上室性および心室性不整脈、心房性原線維形成、心房性粗動、心筋梗塞およびその続発症、アテローム硬化症、アンギナ、心不全、狭心症、二次アルドステロン症、一次および二次肺高アルドステロン症、一次肺高血圧、糖尿病性網膜症、黄斑変性、眼障害、インスリン耐性、血管障害、片頭痛、レイノー病、管腔過形成、認知機能不全、アルツハイマー病、卒中、高カリウム血症、子癇前症、サルコイドーシス、糖尿病、糖尿病性網膜症、ＨＩＶ感染、ＡＩＤＳ発症、虚血および再灌流障害、アテローム発生、慢性閉塞性肺疾患、喘息、アレルギー性腎疾患および関節リウマチを含む群から選択される疾患であってよい。
【００９７】
一態様では、ケモカイン受容体経路阻害薬は、ケモカイン受容体以外のタンパク質を阻害するか、または一部阻害し、より好ましくは、阻害薬は、ＣＤ５５、ＣＤ５９およびＣＤ１６などのグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー型タンパク質を標的化することで、ＭＣＰ−１誘発遊走および単球活性化および走化性遊走を遮断する薬剤である。最も好ましくは、ケモカイン受容体経路阻害薬は、プロパゲルマニウムである。
【００９８】
何らかの特定の作用機序に制限されることを意図したものではないが、好ましい一実施形態では、ケモカイン受容体がアンジオテンシン受容体と関連している場合にケモカイン受容体と相互作用するか、またはその下流経路をモジュレートすると、ケモカイン受容体阻害薬は、より高い親和性および／または効力および／または有効性を有する。例えば、ケモカイン受容体およびアンジオテンシン受容体は、ケモカイン受容体／アンジオテンシン受容体ヘテロダイマー／−オリゴマーとして会合していてよい。さらなる好ましい実施形態では、アンジオテンシン受容体遮断薬と組み合わせて（同時にでも順次にでも）投与されていない場合に達成されるであろう親和性、効力および／または有効性と比較して、ケモカイン受容体阻害薬を対象に、アンジオテンシン受容体遮断薬と同時に、または順次に投与すると、合わせた親和性、効力および／または有効性はより大きい。なおさらなる好ましい実施形態では、ケモカイン受容体阻害薬を対象に、アンジオテンシン受容体遮断薬と組み合わせて（同時でも順次でも）投与すると、相乗効果（親和性、抗力および／または有効性によって測定した場合）が達成される。
【００９９】
何らかの特定の作用機序に制限されることを意図したものではないが、好ましい一実施形態では、アンジオテンシン受容体がケモカイン受容体と関連している場合にアンジオテンシン受容体と相互作用すると、アンジオテンシン受容体遮断薬は、より大きな親和性および／または抗力および／または有効性を有する。例えば、ケモカイン受容体およびアンジオテンシン受容体は、ケモカイン受容体／アンジオテンシン受容体ヘテロダイマー／−オリゴマーとして会合していてよい。さらに好ましい実施形態では、アンジオテンシン受容体遮断薬をケモカイン受容体阻害薬と組み合わせて（同時にでも順次にでも）投与されていない場合に達成されるであろう親和性、効力および／または有効性と比較して、アンジオテンシン受容体遮断薬を対象に、ケモカイン受容体阻害薬と同時に、または順次に投与すると、合わせた親和性、効力および／または有効性はより大きい。なおさらに好ましい実施形態では、アンジオテンシン受容体遮断薬を対象に、ケモカイン受容体阻害薬と組み合わせて（同時でも順次でも）投与すると、相乗効果（親和性、抗力および／または有効性によって測定した場合）が達成される。
【０１００】
医薬品の製造
本発明はまた、疾患を治療するための剤形を製造するための、少なくとも１種のアンジオテンシン受容体遮断薬または薬学的に許容されるその塩および少なくとも１種のケモカイン受容体経路阻害薬または薬学的に許容されるその塩を含む医薬組成物の使用を提供する。医薬組成物は場合によって、薬学的に許容される担体をさらに含んでよい。
【０１０１】
剤形、製剤および投与
本発明によって提供される剤形は、本発明の医薬組成物を含むバイアル、カートリッジ、容器、錠剤またはカプセル剤を、疾患を治療、改善または予防するために対象に剤形を投与するための投薬指示書と一緒にさらに含んでよい。
【０１０２】
本発明の化合物の投薬レベルは通常、体重１キログラム当たり約０．５ｍｇから約２０ｍｇの範囲であり、好ましい投薬範囲は、１日当たり体重１キログラム当たり約０．５ｍｇから約１０ｍｇ（患者１人当たり１日当たり約０．５ｇから約３ｇ）である。単一の投薬量を生じさせるために担体材料と合わせることができる各活性成分の量は、治療される受容者および特定の投与様式に応じて変動する。例えば、ヒトに経口投与することが意図されている製剤は、各活性化合物約５ｍｇから１ｇを、全体組成のうちの約５から９５パーセントまでで変動してよい適切かつ簡便な量の担体材料と共に含有してよい。投薬単位形態は一般に、活性成分約５ｍｇから５００ｍｇを含有する。
【０１０３】
好ましくは、アンジオテンシン受容体遮断薬は、１日当たり５０ｍｇから５００ｍｇの用量で与えられる。なおより好ましくは、ケモカイン受容体経路阻害薬は、１日当たり１５０ｍｇから３００ｍｇの用量で与えられる。例えば、アンジオテンシン受容体遮断薬はイルベサルタンであり、１日当たり３００ｍｇの用量で投与される。
【０１０４】
好ましくは、ケモカイン受容体経路阻害薬は、１日当たり５ｍｇから２０００ｍｇの用量で与えられる。なおより好ましくは、ケモカイン受容体経路阻害薬は、１日当たり５ｍｇから５０ｍｇの用量で与えられる。例えば、ケモカイン受容体経路阻害薬はプロパゲルマニウムであり、１日当たり３０ｍｇの用量で投与される。
【０１０５】
剤形は、アンジオテンシン受容体遮断薬または薬学的に許容されるその塩約５ｍｇから１ｇおよびケモカイン受容体経路阻害薬または薬学的に許容されるその塩約５ｍｇから１ｇを含んでよい。剤形は、約５０ｍｇから５００ｍｇのアンジオテンシン受容体遮断薬の１日用量を含んでよい。アンジオテンシン受容体遮断薬は、イルベサルタンであってよく、剤形は、約３００ｍｇのイルベサルタンの１日用量を含んでよい。剤形はまた、約５ｍｇから５０ｍｇのケモカイン受容体経路阻害薬の１日用量を含んでよい。ケモカイン受容体経路阻害薬はプロパゲルマニウムであってよく、剤形は、約３０ｍｇのプロパゲルマニウムの１日用量を含んでよい。
【０１０６】
しかしながら、どの特定の患者についても具体的な用量レベルは、使用される具体的な化合物の活性、年齢、体重、全身健康、性別、食事、投与時間、投与経路、排泄速度、併用薬物および治療を受ける特定の疾患の重症度を包含する様々な因子に左右されることは理解されるであろう。
【０１０７】
本発明の医薬品は様々な態様で注射によって投与するか、または経口、経肺、経鼻もしくは他の任意の投与形態のために調製することができる。好ましくは医薬品を例えば、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、眼窩内投与、眼内投与、心室内投与、頭蓋内投与、関節嚢内投与、髄腔内投与、大槽内投与、腹腔内投与、頬側投与、直腸投与、膣内投与、鼻腔内投与またはエアロゾル投与によって投与する。
【０１０８】
一態様では、投与方法は、医薬品が調製された形態に少なくとも適したものである。一態様では、最も有効な反応が得られる投与方法は経験的に決定されるものであり、後述する投与手段は例として示されているものであって、本発明の組成物の送達方法をいかなる意味においても限定するものではない。上記の製剤はいずれも医薬品工業では一般的に用いられており、適当な資格を有する医師には一般的に知られている。
【０１０９】
ある種の態様では、本発明の医薬品は、薬学的に許容される無害な賦形剤および担体を包含してよく、皮下注射、静脈内注射および腹腔内注射などの任意の非経口的方法によって投与することができる。加えて、本製剤は場合によって１種または複数のアジュバントを含有してよい。本明細書で使用される場合、「医薬担体」は、被験体に化合物を送達するための薬学的に許容される溶媒、懸濁化剤、賦形剤またはビヒクルである。担体は液体または固体であってよく、所望の計画されている投与方法に応じて選択される。
【０１１０】
注射用途に適した医薬形態には場合によって、滅菌水性液剤（水溶性の場合）または分散剤および滅菌注射用液剤または分散剤を即時調製するための滅菌散剤が包含される。別法では、ある種の実施形態では、細胞膜を通過する輸送を助けるために、本発明の化合物をリポソームに封入して注射用液剤で送達する。別法で、またはこれに加えて、そうした製剤は、細胞膜を通過する輸送を促進するために、自己組織化型の小孔構造の成分を含有する。様々な態様において、担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）、これらの適当な混合物および植物油を含有する溶媒または分散剤である。例えば、限定ではないが、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散剤の場合には必要な粒径の維持によって、かつ界面活性剤の使用によって、適切な流動性を維持する。ある種の態様では、組成物中で例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収を遅らせる物質を使用することによって、注射用組成物を長期にわたって吸収させる。
【０１１１】
本発明はまた、治療上有効な本発明による医薬組成物および放出遅延剤を含む注射用徐放性医薬組成物を提供する。放出遅延剤は例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンであってよい。
【０１１２】
滅菌注射用液剤は、必要な量の活性化合物を適当な溶媒に、必要に応じて上記に示した様々な他の成分とともに加えてから、フィルター滅菌することによって調製される。一般的に、分散剤は、様々な滅菌活性成分を、ベースとなる分散媒および上記で示されたものから選ばれた必要な他の成分を含んだ滅菌溶媒に加えることによって調製される。滅菌注射用液剤を調製するための滅菌散剤の場合には、ある種の態様における調製法には、限定ではないが、予め滅菌フィルター処理した溶液から活性成分および任意の追加的な所望の成分の粉末を生成する真空乾燥法および凍結乾燥法が包含される。
【０１１３】
本明細書において使用が企図されるのは、参照によって本明細書に援用されるＭａｒｔｉｎ、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１８版（１９９０  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．  Ｅａｓｔｏｎ  ＰＡ１８０４２）Ｃｈａｐｔｅｒ８９）に一般的に記載されている経口固体剤形である。固体剤形には、錠剤、カプセル剤、丸剤、トローチ剤もしくはロゼンジ剤、カシェ剤またはペレット剤が包含される。また、リポソームまたはプロテイノイドによる封入を用いて本発明の組成物を製剤化することもできる（例えば、米国特許第４，９２５，６７３号に報告されるプロテイノイドマイクロスフェアのように）。リポソームによる封入を用い、該リポソームを様々なポリマーによって誘導体化することができる（例えば、米国特許第５，０１３，５５６号）。治療薬で可能な固体剤形についての記載が、参照によって本明細書に援用されるＭａｒｓｈａｌｌ、Ｍｏｄｅｒｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ、Ｃｈａｐｔｅｒ１０、ＢａｎｋｅｒａｎｄＲｈｏｄｅｓｅｄ．、（１９７９）に示されている。一般的に該製剤は、本発明の一部として記載される化合物（またはその化学的に修飾された形態）および胃内の環境に対する保護を与え、腸内で生物学的活性物質を放出させる不活性成分を包含する。
【０１１４】
本発明のケモカイン受容体関連化合物またはアンジオテンシン受容体関連化合物では、放出部位は、胃、小腸（十二指腸、空腸または回腸）または大腸であってよい。当業者であれば、胃の中では溶解せずに、十二指腸または腸内の他の部位で物質を放出する製剤を入手可能である。一態様では、そうした放出によって、組成物を保護するか、あるいは腸などの胃内環境を超えた部位において化合物を放出することによって胃内環境の悪影響が回避される。
【０１１５】
本発明は、治療上有効な本発明による医薬組成物および放出遅延剤を含む経口徐放性医薬組成物をさらに提供する。
【０１１６】
本発明の一態様では、放出遅延剤は、水溶性、水膨潤性および／または水不溶性ポリマーである。特定すると、水溶性ポリマーは、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、腸溶コーティング；および半透膜を含む群から選択される。本発明の他の態様では、放出遅延剤は非ポリマー放出遅延剤である。より詳細には、非ポリマー放出遅延剤は、硬化ヒマシ油である。本発明の組成物は当分野で公知の慣用の手順に従って、摩砕または顆粒化され、錠剤に圧縮されるか、またはカプセル剤にカプセル封入されてよい。
【０１１７】
胃からの保護を完全なものとするためには、少なくともｐＨ５．０まで不透過性のコーティングを使用する。腸溶コーティングとして用いられるより一般的な不活性成分の例は、トリメリト酸酢酸セルロース（ＣＡＴ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート（ＨＰＭＣＰ）、ＨＰＭＣＰ５０、ＨＰＭＣＰ５５、ポリビニルアセテートフタレート（ＰＶＡＰ）、ＥｕｄｒａｇｉｔＬ３０Ｄ、Ａｑｕａｔｅｒｉｃ、セルロースアセテートフタレート（ＣＡＰ）、ＥｕｄｒａｇｉｔＬ、ＥｕｄｒａｇｉｔＳおよびシェラックである。これらのコーティングは混合フィルムとして使用することもできる。
【０１１８】
胃に対する保護を意図したものではないコーティングまたはコーティングの混合物もまた錠剤上で使用することができる。こうしたコーティングには、限定ではないが、糖衣または錠剤を飲み込みやすくするコーティングが挙げられる。例示的なカプセル剤は、乾燥治療薬（すなわち散剤）を送達するためのハードシェル（ゼラチンなど）からなり、液体の剤形ではソフトゼラチンシェルを使用することもできる。ある種の態様におけるカシェ剤のシェル材料は、厚いデンプンまたは他の可食紙である。丸剤、ロゼンジ剤、成形錠剤または粉薬錠剤では、限定ではないが湿式塊化法（ｍｏｉｓｔ  ｍａｓｓｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）も企図される。
【０１１９】
本明細書で使用される場合、「徐放性」という用語は、経口摂取の後に、治療用化合物含分を比較的長期間にわたって徐々に、しかし連続的または持続的に放出することを意味する。その放出は、医薬組成物が胃を通過した後、医薬組成物が小腸に達するまで、およびその後まで連続し得る。「徐放性」という語句はまた、医薬組成物が胃に達したら治療用化合物の放出がすぐに開始されるのではなく、むしろ例えば、医薬組成物が小腸に達するときまで、ある期間にわたって遅延する遅延放出を意味する。小腸に達したら、ｐＨの上昇が、医薬組成物からの治療用化合物の放出を開始させ得る。
【０１２０】
「放出遅延剤」という用語が本明細書中では使用されているが、それは、経口摂取された場合に医薬組成物からの治療用化合物の放出速度を低下させる物質を意味する。放出遅延剤は、ポリマーまたは非ポリマーであってよい。放出遅延剤は例えば、拡散システム、溶解システムおよび／または浸透システムを包含するいくつかの徐放性系のいずれかにしたがって使用することができる。
【０１２１】
ある種の態様では、治療薬を粒径約１ｍｍの顆粒またはペレットの形態で微細な多重粒子として製剤中に含有させる。ある種の態様では、カプセル投与用の材料の製剤は、粉末、軽く圧縮したプラグ、またはさらには錠剤である。一態様では、治療薬は圧縮によって調製することができる。
【０１２２】
場合によって着色料および香味料をすべて包含させる。例えば、化合物を製剤化（限定ではないが、リポソームまたはマイクロスフェアへの封入などにより）した後、着色料および香味料を含んだ冷蔵飲料などの食品にさらに含有させることができる。
【０１２３】
一態様では、治療薬の体積を不活性物質によって希釈または増大させる。これらの希釈剤には、炭水化物、特にマンニトール、α−ラクトース、無水ラクトース、セルロース、スクロース、修飾デキストリンおよびデンプンが包含される。場合によって、三リン酸カルシウム（ｃａｌｃｉｕｍ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、炭酸マグネシウムおよび塩化ナトリウムなどのある種の無機塩類を充填剤として使用することもできる。市販の希釈剤の一部は、Ｆａｓｔ−Ｆｌｏ、Ｅｍｄｅｘ、ＳＴＡ−Ｒｘ１５００、ＥｍｃｏｍｐｒｅｓｓおよびＡｖｉｃｅｌｌである。
【０１２４】
他の実施形態では、治療薬の製剤に崩壊剤を包含させて固体剤形とする。崩壊剤として使用される材料には、これらに限られないが、市販のデンプンベースの崩壊剤であるＥｘｐｌｏｔａｂを包含するデンプンが包含される。グリコール酸デンプンナトリウム、アンバーライト、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ウルトラミロペクチン（ｕｌｔｒａｍｙｌｏｐｅｃｔｉｎ）、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、オレンジピール、酸カルボキシメチルセルロース、天然スポンジおよびベントナイトの使用も考えられる。崩壊剤の別の形態は、不溶性カチオン交換樹脂である。場合によって粉末化したガムを崩壊剤として、また結合剤として用いるが、これらには限定ではないが、寒天、カラヤガムまたはトラガカントガムなどの粉末化ガムが包含される。アルギン酸およびそのナトリウム塩も崩壊剤として有用である。
【０１２５】
治療用化合物を互いに結着して硬質の錠剤を形成するための結合剤が企図され、限定ではないが、アラビアガム、トラガカントガム、デンプンおよびゼラチンなどの天然物由来の材料が包含される。他の結合剤には、限定ではないが、メチルセルロース（ＭＣ）、エチルセルロース（ＥＣ）およびカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）が包含される。治療薬を造粒するためにアルコール溶液中でポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）およびヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）を使用することも企図される。
【０１２６】
製剤化プロセスの際のくっつきを防止するために場合によって、減摩剤を治療薬の製剤に包含させる。場合によって治療薬と金型壁との間に層として滑沢剤を使用し、これらには、限定ではないが、マグネシウム塩およびカルシウム塩を含むステアリン酸、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、流動パラフィン、植物油およびろうが包含される。ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム、分子量の異なるポリエチレングリコール、Ｃａｒｂｏｗａｘ４０００および６０００などの例示的な可溶性滑沢剤もまた使用することができる。
【０１２７】
場合によって、製剤化の際の化合物の流動性を向上させ、圧縮時の再配置を助けるための流動促進剤を添加する。流動促進剤には、限定ではないが、デンプン、デンプン、タルク、焼成シリカおよび水和シリコアルミネートが包含される。
【０１２８】
水性環境中への治療薬の溶解を助けるため、ある種の実施形態では湿潤剤として界面活性剤を添加してよい。界面活性剤には、例であって限定ではないが、ラウリル硫酸ナトリウム、スルホコハク酸ジオクチルナトリウムおよびスルホン酸ジオクチルナトリウムなどのアニオン性洗剤が包含される。場合によってカチオン性界面活性剤が用いられるが、こうしたカチオン性界面活性剤には、限定ではないが、塩化ベンザルコニウムまたは塩化ベンゼトニウムが包含される。製剤中に界面活性剤として包含され得る潜在的な非イオン性洗剤のリストは、ラウロマクロゴール４００、ステアリン酸ポリオキシル４０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油１０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油５０およびポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０、モノステアリン酸グリセリン、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート６５およびポリソルベート８０、スクロース脂肪酸エステル、メチルセルロースならびにカルボキシメチルセルロースである。これらの界面活性剤が使用される場合、化合物の製剤中に単独で、または異なる比の混合物として存在し得る。
【０１２９】
化合物の吸収を助ける可能性のある添加剤は、例であって限定ではないが、脂肪酸であるオレイン酸、リノール酸、およびリノレン酸である。
【０１３０】
制御放出製剤が望ましいこともある。該製剤も企図される。ある種の態様では、拡散または滲出機構による放出を可能とする不活性基質、即ちゴムに化合物を取り込ませる。一部の態様では、徐々に溶解する基質を製剤中に取り込ませてもよい。この治療薬の別の制御放出形態は、Ｏｒｏｓ治療システム（Ａｌｚａ  Ｃｏｒｐ．）に基づく方法により、即ち、水を流入させ、薬物を１個の小開口部から浸透圧効果によって押し出すような半透膜に薬物を封入する。一部の腸溶コーティングは、遅延放出効果を有する。
【０１３１】
他の態様では、最適なフィルムコーティングを与えるために材料の混合物を用いてよい。フィルムコーティングは、例であって限定ではないが、パンコーターもしくは流動床中、または圧縮コーティングによって実施することができる。
【０１３２】
本明細書においては、化合物の肺投与も企図される。これらの態様では、化合物を吸入によって哺乳動物の肺に投与し、肺の上皮内層を通過して血流に送達することができる。
【０１３３】
本発明の実施においては、限定ではないが、ネブライザー、定量吸入器、および粉剤吸入器などを包含するいずれも当業者にはよく知られた治療薬製品の肺送達用に設計された様々な機械的装置の使用が企図される。
【０１３４】
本発明の実施に適した市販の装置の一部の具体例は、例であって限定ではないが、Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ，Ｉｎｃ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）の製造するＵｌｔｒａｖｅｎｔネブライザー；Ｍａｒｑｕｅｓｔ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ、Ｃｏｌｏｒａｄｏ）の製造するＡｃｏｒｎＩＩネブライザー；Ｇｌａｘｏ  Ｉｎｃ．（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｐａｒｋ、Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ）の製造するＶｅｎｔｏｌｉｎ定量吸入器；およびＦｉｓｏｎｓ  Ｃｏｒｐ．（Ｂｅｄｆｏｒｄ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）の製造するＳｐｉｎｈａｌｅｒ粉剤吸入器である。
【０１３５】
そうした装置はいずれも、化合物の投薬に適した製剤の使用を必要とする。典型的に各製剤は使用される装置の種類に固有のものであり、治療に有用な通常の希釈剤、アジュバントおよび／または担体以外に適切な推進材料の使用を必要とする。リポソーム、マイクロカプセルもしくはマイクロスフェア、包接複合体、または他の種類の担体の使用も企図される。
【０１３６】
噴霧式または超音波式のいずれかのネブライザーとの使用に適した製剤は典型的には、水に懸濁されている化合物を含む。一態様では、該製剤は、緩衝剤および単糖（例えば、タンパク質の安定化および浸透圧の調節のため）もまた含んでよい。一実施形態では、ネブライザー製剤は、エアロゾールを形成する際に溶液の霧化によって引き起こされる表面で誘発される化合物の凝集を低減または防止するための界面活性剤もまた含んでよい。
【０１３７】
一態様では、定量吸入装置と使用するための製剤は、界面活性剤によって噴射剤中に懸濁された化合物を含有する微粉末を含む。噴射剤は、限定ではないが、トリクロロフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタノールおよび１，１，１，２−テトラフルオロエタンを包含するクロロフルオロカーボン、ヒドロクロロフルオロカーボン、ヒドロフルオロカーボンもしくは炭化水素またはこれらの組み合わせなどのこの目的で使用される任意の従来の材料である。好適な界面活性剤には、限定ではないが、トリオレイン酸ソルビタンおよび大豆レシチンが包含される。ある種の態様では、界面活性剤としてオレイン酸も有用であり得る。
【０１３８】
粉剤吸入装置から投薬するための製剤は、化合物を含有する微細な乾燥粉末を含み、限定ではないがラクトース、ソルビトール、スクロースまたはマンニトールなどの増量剤を、装置からの粉末の分散を助ける量、例えば、製剤の５０重量％〜９０重量％の量で包含してもよい。ある種の実施形態では、化合物（複数可）を、肺末梢部に最も効果的に送達されるように平均粒径が１０ミクロン未満、最も好ましくは０．５ミクロン〜５ミクロンである微粒子で調製する。
【０１３９】
化合物の鼻腔内送達も企図される。鼻腔内送達は、肺内に治療薬製品を蓄積させることを必要とせずに、治療薬製品を鼻腔に投与した直後に血流にタンパク質を通過させることができる。鼻腔内送達用の製剤には、例であって限定ではないが、デキストランまたはシクロデキストランを含むものが包含される。
【０１４０】
ある種の態様では、本発明の医薬品は、一回投与スケジュールとして、または好ましくは複数回投与スケジュールで投与されることは理解されるであろう。複数回投与スケジュールとは、例えば、１回〜１０回の別々の投与による最初の送達期間の後、場合によって治療効果を維持または強化するうえで必要な間隔で他の用量を引き続き投与するというものである。この投与計画は、個体のニーズおよび医師の判断に少なくとも一部は基づいて決定される。
【０１４１】
したがって本発明は、本発明の医薬組成物を含む錠剤；本発明の医薬組成物を含むカプセル剤および本発明の医薬組成物を含む注射用懸濁剤ならびに本発明の医薬競合物を含む肺送達用の組成物を提供する。
【０１４２】
医薬組成物の効力の評価
本発明の他の態様では、本発明の医薬組成物の効力を評価する方法を提供し、その際、その方法は、インビトロ生化学または細胞アッセイによって、ＭＣＰ−１による単球のインビトロ走化性遊走を評価するステップ；イノシトールリン酸産生、細胞外調節キナーゼ（ＥＲＫ）リン酸化またはｃＡＭＰ産生を測定するステップ；インピーダンス、光屈折または電荷再分配などを使用する無標識技術を使用して組成物の効果を測定するステップ；近接レポーターシステムまたは他の手法を使用してＧタンパク質カップリングを測定するステップ；β−アレスチン補充または媒介シグナル伝達を測定するステップ；転写因子をベースとするレポーターシステムを使用して組成物の効果を測定するステップ；蛍光標識を使用する顕微鏡可視化、抗体の使用（酵素結合免疫吸着検定法など）および蛍光活性化細胞選別などの、細胞位置限定を測定するためのインビトロ生化学または細胞技術を利用するステップ；自動分析器などによって、腎臓機能の指標として血漿クレアチニンおよび尿のインビボレベルを測定するステップ；ラジオイムノアッセイによってタンパク尿のレベルを測定するステップ、アルブミン尿のレベルを測定するステップ；ＧＦＲ（シングルショット同位体技術）を測定するステップ；光学顕微鏡（ＬＭ）による腎臓および／または心臓および／または眼または他の組織構造を評価するステップ；糸球体および／または心臓肥大、糸球体硬化症および／または線維症の存在および／または規模を評価するステップ；マトリックス沈着の規模を評価するステップ、線維化促進性成長因子の変調およびその活性を評価するステップ；腎臓および／または心臓構造および／または眼構造および／または他の組織構造を評価するステップ；ならびに収縮期血圧、インスリン空腹時血漿グルコースの変調、ヘモグロビンＡ１ｃの変調を評価するステップを包含する群から選択されるステップを包含する。
【０１４３】
本発明のさらなる態様では、本発明の医薬組成物の阻害または部分阻害活性を評価する方法を提供し、その際、その阻害または一部阻害は、下記の１種または複数によって測定されるとおりの腎臓および／または心臓および／または眼および／または他の組織構造における定性改善によって示される：血漿クレアチニンおよび尿のレベル；；タンパク尿のレベル、アルブミン尿のレベル；ＧＦＲ（シングルショット同位体技術を使用）；腎臓および／または心臓および／または眼構造の完全性；マトリックス沈着の規模；線維化促進性成長因子の活性の変調；糸球体および／または心臓肥大、糸球体硬化症および／または線維症を測定するための光学顕微鏡（ＬＭ）；マトリックス沈着の規模および線維化促進性成長因子およびその活性の変調を測定するための免疫組織化学；ならびに腎臓および／または心臓および／または眼構造を評価するための分子生物学的技術。
【０１４４】
本発明を以下の非限定的な実施例をあくまで参考として以下に詳述する。しかしながら、以下の実施例はあくまで説明的なものとして理解されるべきものであり、上記び本発明の一般性をいかなる意味においても限定するものとして解釈されるべきではない。
【０１４５】
実施例
実施例１  ＳＴＮｘモデルでのタンパク尿の低減（低用量のプロパゲルマニウム）
腎亜全摘出（ＳＴＮｘ）外科手術
動物
６週齢の雄のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラット（体重２００〜２５０ｇ）は、Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  Ｃｅｎｔｒｅ（Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ａｕｓｔｒａｌｉａ）から供給される。Ａｎｉｍａｌ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（Ｓｔ  Ｖｉｎｃｅｎｔ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌおよびｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｕｓｔｒａｌｉａ）からの認可を受けて、動物研究を行う。全てのラットが通常のラット用固形飼料（Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ  Ｒｏｄｅｎｔ  Ｄｉｅｔ  ＃５００２、ＬａｂＤｉｅｔ、ＵＳＡ）および飲料水を自由に摂取する。全ての動物を２２±１℃に維持されている安定な環境中、午前６時に開始される１２時間明暗サイクルで飼育する。ＳＴＮｘ外科手術をＳｔ  Ｖｉｎｃｅｎｔ’ｓ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｕｎｉｔの手術シアター内で行う。全ての外科手術は、以前に記載された外科手術から変更されたものである（Ｇｉｌｂｅｒｔ,Ｒ．Ｅ．、Ｌ．Ｌ．Ｗｕら（１９９９）。「Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｎｉｎ  ａｎｄ  ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  ＩＩ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒｅｎａｌ  ｔｕｂｕｌｅ  ａｆｔｅｒ  ｓｕｂｔｏｔａｌ  ｎｅｐｈｒｅｃｔｏｍｙ．  Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｔｕｂｕｌｏｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ」、Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １５５（２）：４２９〜４０；Ｋｅｌｌｙ,Ｄ．Ｊ．、Ａ．Ｊ．Ｅｄｇｌｅｙら（２００９）、「Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ｃ−ｂｅｔａ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ  ｉｎ  ｎｏｎ−ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｋｉｄｎｅｙ  ｄｉｓｅａｓｅ」、Ｎｅｐｈｒｏｌ  Ｄｉａｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ２４（６）：１７８２〜９０．；Ｋｅｌｌｙ，Ｄ．Ｊ．、Ｃ．Ｈｅｐｐｅｒら（２００３）。「Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｌｏｓｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒｅｍｎａｎｔ  ｋｉｄｎｅｙ  ｍｏｄｅｌ」  Ｎｅｐｈｒｏｌ  Ｄｉａｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  １８（７）：１２８６〜９２．；Ｗｕ，Ｌ、Ａ．Ｃｏｘら（１９９７）。「Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  β１  ａｎｄ  ｒｅｎａｌ  ｉｎｊｕｒｙ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｓｕｂｔｏｔａｌ  ｎｅｐｈｒｅｃｔｏｍｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒａｔ：Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｅｎｉｎ−ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  ｓｙｓｔｅｍ」、Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ  ５１：１５５３〜１５６７）。
【０１４６】
手術前ケア
外科手術の前の午後に、ラットの体重を計り、１用量の抗生物質（オキシテトラサイクリン、３０ｍｇ／ｋｇ）を経口胃管により予防として与える。次いでラットを一晩絶食させる。
【０１４７】
手術中ケア
麻酔
Ｐｅｒｓｐｅｘプラスチックボックス中の酸素と混合されている２．５％イソフルランで、麻酔を誘発する。
【０１４８】
麻酔にかかったら、次いで、ラットをヒートパッド（３７℃に維持）上に仰向けに寝かせ、次いで、ラットの鼻および口の上に、イソフルランを送達するためのフェースマスクを置いて、イソフルラン１〜２％／酸素９７％での麻酔を１ｍｌ／体重１００ｇの換気体積で維持する。
【０１４９】
皮膚調製
ラットの腹部領域を胸骨から骨盤まで、クリッパを使用して剃毛する。剃毛領域を、アルコール７０％中のクロルヘキシジンで、切開点（正中線）から開始して、外側へと清浄化する円形運動で３回清浄化する。
【０１５０】
外科手術
有窓ドレープを切開部位の上に置き、皮膚切開を、胸骨の下１０ｍｍから、生殖器の１０ｍｍ上までＮｏ．２３メスブレードで行う。次いで、筋肉層を露出させ、組織鉗子で持ち上げて、白線（正中線に沿って筋肉層をつなぐ筋膜）に沿った切開を可能にする。筋肉層をこうして持ち上げることによって、小腸が偶発的に鋭利な機器によって損傷を受けることを防ぐ。
【０１５１】
ナイフブレードを使用して、筋肉層中に小さな穴を作成したら、小さなハサミを使用して、切開を完了する。両方の切開が完了したら、ガーゼを切開部位の回りのドレープの上に置き、０．９％生理食塩水を使用して、ガーゼを湿らせる。湿ったコットンバドを使用して、左の腎臓の位置を定め、ガーゼの上に持ち上げる。次いで顕微鏡下で、歯車鉗子およびコットンバドを使用して、腎盂から脂肪を分離して、腎臓の直前の腎臓動脈の枝を露出させる。次いで、腎臓動脈（３−４）の個々の枝を、微細な鉗子を使用する鈍的切開によって単離する。次いで、腎臓の血液流を２／３まで無能力化するのに十分な動脈が単離されるまで、４．０シルクを動脈の下に通して、この領域を死滅させる。出血がなく、腎臓の１／３はまだ機能していることが確かめられたら、腎臓を腹部に戻し入れる。
【０１５２】
次いで、右の腎臓を露出させ、腎被膜を除去する。４．０シルクを使用して、腎臓を腎盂で結び、腎臓全体および尿管を結紮する。３つの結び目を一方の側で結び、シルクを他方に編み合わせ、さらに３つの結び目を他方に結んだ。次いで、腎臓を切除する。出血がないことが確認されたら、血管断端を腹部に戻し入れる。次いで、左の腎臓を再びチェックして、色変化が十分であり、腎臓の残りの１／３がなお機能していることを保証することができる。左右両方の尿管を何ら損傷なしにチェックし、次いで、腹腔が開いている間に流体が失われた場合には、０．９％生理食塩水２．０ｍｌを腹部に入れて、ラットの再水化を補助する。
【０１５３】
創傷閉鎖
次いで、５．０溶解性縫合糸（ＰＧＡ−ポリグリコール酸縫合糸）を使用して、連続する縫い目で筋肉層を縫う。次いで、皮膚を４．０シルクの連続する縫い目で縫う。次いで、領域をアルコール７０％中のクロルヘキシジンで清浄化して、皮膚からの血液を全て除去する。次いで、麻酔マスクを外し、Ｏｐ部位スプレー（組織スプレー）を切開部位に噴霧して、感染に対して保護するための特別なバリアを加える。ラットが麻酔から目覚め始めている間に、ブプレノルフィン（Ｔｅｍｇｅｓｉｃ）を０．０３ｍｇ／ｋｇの用量で皮下で与えた。
【０１５４】
回復期間
次いでラットを、３７℃に維持されたヒートパッド上で回復させる。
【０１５５】
術後ケア
術後に５％グルコース溶液を、水用ボトルと並べた飲料ボトル中で与えて、ラットが一方または他方を選んで飲めるようにする。食餌も、食べやすいようにボックスの床に置く。外科手術から１２から２４時間後に、ラットが食べないか、または飲まなければ、ブプレノルフィンを皮下投与する。外科手術から２４から４８時間後に、ラットが元気がないか、動きたがらないが、または丸まっているならば、これは腎不全の結果であり得る。この場合に、ラットを、過量のペントバルビトンナトリウム（１２０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）を使用してえりのける。
【０１５６】
４週毎に、収縮期血圧（ＳＢＰ）を予め温めておいた意識のあるラットで、ｔａｉｌ−ｃｕｆｆプレチスモグラフ法を介して、非侵襲性血圧（ＮＩＢＰ）制御装置およびＰｏｗｅｒｌａｂ（ＡＤ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＮＳＷ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を使用して決定する。
【０１５７】
シャム外科手術
対照ラットで、上記のとおりの開腹術および両方の腎臓の処理からなるが、ただし、創傷閉鎖の前に腎臓動脈の切開は伴わないシャム手術を行う。
【０１５８】
研究設計および手順
外科手術から１４日後に、治療を開始する。
長期間（１２週）
未処置群
群１、２  未処置：対照、糖尿病性
単一薬剤群
群３  ＳＴＮｘ  ＋  イルベサルタン（ＡＲＢ）（１０ｍｇ／ｋｇ／日）
併用群
群４  ＳＴＮｘ  ＋  イルベサルタン（１０ｍｇ／ｋｇ／日）／プロパゲルマニウム（３ｍｇ／ｋｇ／日）
１群当たりｎ＝１６ラット
【０１５９】
臨床パラメーター
収縮期血圧（ＳＢＰ）および臨床パラメーターの一連の測定を、動物研究のための標準的なプロトコルに従った間隔で行った（４週毎）（Ｋｅｌｌｙ  ＤＪ、Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ−Ｂｅｒｋａ  ＪＬ、Ｔ．Ｊ．Ａら、Ａ  ｎｅｗ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｒｅｎａｌ  ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  （ｍＲｅｎ−２）２７  ｒａｔ．  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．  ５４：３４３〜３５２、１９９８）。
【０１６０】
腎臓および心臓機能（一次終点）
動物研究のための標準的なプロトコル（Ｋｅｌｌｙら、１９９８）に従って血漿クレアチニンおよび尿（自動分析器）、アルブミン尿（ラジオイムノアッセイ、４週毎）およびＧＦＲ（シングルショット同位体技術、４および１２週）の測定によって、腎臓機能の一連の測定を行った。
【０１６１】
未来実験  腎臓および心臓構造（二次終点）
行うことができるであろうさらなる実験には、腎臓および心臓構造などの二次終点の評価が包含される。例えば、光学顕微鏡（ＬＭ）を使用して、糸球体および心臓肥大、糸球体硬化症および線維症を測定することができるであろう。免疫組織化学を使用して、マトリックス沈着の規模ならびに線維化促進性成長因子の変調およびその活性を測定することができるであろう。分子生物学も使用して、腎臓および心臓構造を評価することができるであろう。
【０１６２】
統計的検討
ＡＮＯＶＡをＦｉｓｈｅｒｓ事後検定と共に使用して、動物群の間での比較を行った。動物使用の正当化は、１群当たりｎ＝１６ラットであると算出されている（組織診ではｎ＝８、分子生物学ではｎ＝８）。ｐ＜０．０５の値を、統計的に有意とみなした。データおよび幾何平均×／÷許容係数を対数変換した後に、アルブミン尿を分析した。
【０１６３】
図１に示されているとおり、未処置のＳＴＮｘ動物およびアンジオテンシン受容体遮断薬のみ（ＳＴＮｘ＋Ｉｒｂ）で処置された動物と比較して、動物をアンジオテンシン受容体遮断薬および低用量のプロパゲルマニウムの組合せ（ＳＴＮｘ＋Ｉｒｂ＋ＰＰＧ）で治療した場合に、タンパク尿レベルの改善が終末器官腎疾患の腎亜全摘出（ＳＴＮｘ）モデルにおいて達成された。
【０１６４】
実施例２  ＳＴＮｘモデルでのタンパク尿の低減（高用量のプロパゲルマニウム）
実施例１に記載されているとおりであるが、次の処置を伴った：
研究設計および手順
外科手術から１４日後に、治療を開始する。
長期間（１２週）
未処置群
群１、２  未処置：対照、糖尿病性
単一薬剤群
群３  ＳＴＮｘ  ＋  イルベサルタン（ＡＲＢ）（１０ｍｇ／ｋｇ／日）またはＳＴＮｘ  ＋  プロパゲルマニウム（３０ｍｇ／ｋｇ／日）
併用群
群４  ＳＴＮｘ  ＋  イルベサルタン（１０ｍｇ／ｋｇ／日）／プロパゲルマニウム（３０ｍｇ／ｋｇ／日）
１群当たりｎ＝１６ラット
【０１６５】
図２に示されているとおり、未処置のＳＴＮｘ動物、高用量のプロパゲルマニウムのみで処置されたＳＴＮｘ動物（ＳＴＮｘ＋ＰＰＧ）およびアンジオテンシン受容体遮断薬のみ（ＳＴＮｘ＋Ｉｒｂ）で処置された動物と比較して、動物をアンジオテンシン受容体遮断薬および高用量のプロパゲルマニウムの組合せ（ＳＴＮｘ＋Ｉｒｂ＋ＰＰＧ）で治療した場合に、タンパク尿レベルの改善が終末器官腎疾患の腎亜全摘出（ＳＴＮｘ）モデルにおいて達成された。
【０１６６】
上記の終末器官腎疾患の腎亜全摘出（ＳＴＮｘ）モデルから、組織学的切片を得、標準的な手順に従って染色して、糸球体中の有足細胞を検出した。組織学的切片を位相差顕微鏡によって評価した。図３は、未処置の対照動物（Ａ）；ＳＴＮｘ未処置（Ｂ）；プロパゲルマニウムで処置されたＳＴＮｘ（Ｃ）；イルベサルタンで処置されたＳＴＮｘ（Ｄ）；およびプロパゲルマニウムおよびイルベサルタンの組み合わせで処置されたＳＴＮｘ（Ｅ）から得られた腎臓試料の糸球体中の強く茶色に染色された細胞（有足細胞）を示している。図４は、検出された有足細胞の数の改善の棒グラフを示している。イルベサルタンおよびプロパゲルマニウムの組合せで処置された動物での有足細胞のレベルは、終末器官腎疾患の腎亜全摘出（ＳＴＮｘ）モデルに掛けられた未処置の動物およびプロパゲルマニウムまたはイルベサルタンのいずれかのみで処置されたＳＴＮｘ動物のレベルよりも高いことが分かり得る。
【０１６７】
実施例３
ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞の一過性トランスフェクションを介してのＡＴ１ＲおよびＣＣＲ２の同時発現の際に、両方の受容体を合わせて阻害することは、いずれかの受容体単独の阻害よりも大規模にアレスチン補充を遮断する。
【０１６８】
インビトロでのＣＣＲ２およびＡＴ１Ｒ阻害の組み合わせ効果を、ＲＳ５０４３９３をイルベサルタンと組み合わせて使用することによって調査した。
【０１６９】
図５は、アレスチン２補充に対するＡＴ１ＲおよびＣＣＲ２遮断の効果を示している。ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞に、β−アレスチン２−Ｖｅｎｕｓおよび示されている受容体：ＣＣＲ２−Ｒｌｕｃ８（上のパネル）、ＡＴ１Ｒ−Ｒｌｕｃ８（中央のパネル）またはＡＴ１Ｒ−Ｒｌｕｃ８および未標識ＣＣＲ２（下のパネル）をコードするプラスミドを一時的にトランスフェクションした。
【０１７０】
トランスフェクションの２４時間後に、細胞を５％ＦＣＳを含有するＨＥＰＥＳ緩衝フェノールレッド不含の完全培地に収集し、ポリ−Ｌ−リシン−コーティングされている白色の９６ウェルプレートに加えた。トランスフェクションの４８時間後に、プレートを３７℃、５％ＣＯ２で２時間、３０μＭのＥｎｄｕＲｅｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と共にインキュベートして、基質平衡が達成されることを保証した。
【０１７１】
細胞を初めに、３７℃でイルベサルタン（１０μＭ）、ＲＳ５０４３９３（１０μＭ）または両方合わせたものと一緒に３７℃で３０分間、前インキュベートするか、しなかった。細胞を１００ｎＭのＡｎｇＩＩ、ＭＣＰ−１または両方合わせたもので３７℃で３０分間刺激するか、またはせず、ＢＲＥＴシグナルを測定した。
【０１７２】
アゴニストを加える前後に、４００〜４７５ｎｍおよび５２０〜５４０ｎｍでの連続光放射を測定することによって、ＢＲＥＴ検出を生きている細胞で実施した。ビヒクル処置された細胞試料での５２０〜５４０ｎｍ発光と４００〜４７５ｎｍ発光との比を、リガンドで処置された同じ細胞の第２のアリコットでの同じ比（リガンド−誘発ＢＲＥＴ）から引くことによって、ＢＲＥＴシグナルを算出した。データは、三重に行われた３つの独立した実験の平均±ＳＥＭを表している。
【０１７３】
図５（上のパネル）に示されているとおり、イルベサルタンではなく１０μＭのＲＳ５０４３９３は、ＣＣＲ２−Ｒｌｕｃ８および−アレスチン２−Ｖｅｎｕｓとの間でのＭＣＰ−１誘発ＢＲＥＴシグナルをかなり低減させた。両方のアンタゴニストの組合せは、ＲＳ５０４３９３（図５：上のパネル）の阻害効果を実質的に変えなかった。逆に、ＡＴ１  Ｒ−Ｒｌｕｃ８および−アレスチン２−Ｖｅｎｕｓを同時発現する細胞では、ＲＳ５０４３９３ではなく１０μＭのイルベサルタンが、Ａｎｇｌｌ誘発ＢＲＥＴ応答をかなり遮断し、その組み合わせは、予期されていたのとは異なる効果を何らもたらさなかった（図５：中央のパネル）。
【０１７４】
しかしながら、ＡＴ１Ｒ−Ｒｌｕｃ８、−アレスチン２−Ｖｅｎｕｓおよび未標識ＣＣＲ２を同時発現し、その際、ＡｎｇｌｌおよびＭＣＰ−１の両方によって誘発されるＢＲＥＴが、別の程度まで高まる細胞では、イルベサルタンは、ＭＣＰ−１ではなくＡｎｇｌｌ誘発ＢＲＥＴを実質的に遮断するようである（図５：下のパネル）。同様に、ＲＳ５０４３９３は、ＡｎｇｌｌではなくＭＣＰ−１促進ＢＲＥＴシグナルを部分的に遮断した（図５：下のパネル）。重要なことに、両方のアンタゴニストの組み合わせが、ＢＲＥＴ応答を、個々のアンタゴニストのみで観察されるレベル未満のレベルまで低下させ、これは、組み合わせた受容体阻害の結果として、受容体媒介細胞応答、この場合はβ−アレスチン補充のより大きな阻害についてのインビトロ証拠を示している。
【０１７５】
実施例４
ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞の一過性トランスフェクションを介してのＡＴ１ＲおよびＣＣＲ２の同時発現の際に、両方の受容体を合わせて阻害することは、いずれかの受容体単独の阻害よりも大規模にイノシトールリン酸シグナル伝達を遮断する。
【０１７６】
ＲＳ５０４３９３をイルベサルタンと組み合わせて使用して、ＣＣＲ２およびＡＴ１Ｒ阻害の組合せ効果をインビトロで調査した。
【０１７７】
図６は、ＡＴ１ＲおよびＣＣＲ２遮断のイノシトールリン酸産生に対する効果を示している。ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞に、ＡＴ１Ｒ−Ｒｌｕｃ８および−アレスチン２−Ｖｅｎｕｓをコードするプラスミドを、未標識ＣＣＲ２の不在下（上のパネル）および存在下（下のパネル）で一時的にトランスフェクションした。トランスフェクションの４８時間後に、細胞を使用して、アゴニスト誘発イノシトール（１）リン酸（ＩＰ１）産生測定を、ＩＰ−Ｏｎｅ  Ｔｂキット（Ｃｉｓｂｉｏ  Ｂｉｏａｓｓａｙｓ、Ｂａｇｎｏｌ  ｓｕｒ  Ｃｅｚｅ、Ｆｒａｎｃｅ）を使用して生じさせた。
【０１７８】
細胞を初めに、３７℃でイルベサルタン（１０μＭ）、ＲＳ５０４３９３（１０μＭ）または両方合わせたものと一緒に３７℃で３０分間、前インキュベートするか、しなかった。次いで細胞を、１００ｎＭのＡｎｇｌｌ、ＭＣＰ−１または両方合わせたものを含有する刺激緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１ｍＭのＣａＣｌ２、０．５ｍＭのＭｇＣｌ２、４ｍＭのＫＣｌ、１４６ｍＭのＮａＣｌ、５．５ｍＭのグルコースおよび５０ｍＭのＬｉＣｌ）中、３７℃でさらに３０分間インキュベートした。次いで、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有する溶解緩衝液中で予め希釈されているＨＴＲＦ（登録商標）アッセイ試薬、Ｔｅｒｂｉｕｍ  Ｃｒｙｐｔａｔｅ標識抗ＩＰ１抗体およびｄ２標識ＩＰ１類似体を加えることによって、細胞を溶解させた。アッセイを室温で１時間インキュベートし、Ｔｅｒｂｉｕｍ  Ｃｒｙｐｔａｔｅ蛍光および時間分解ＦＲＥＴシグナルを、それぞれ３４０、６２０および６６５ｎｍで励起してから５０μｓ後に、ＥｎＶｉｓｉｏｎ  ２１０２マルチラベルプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して測定した。
【０１７９】
データを、ＡＴ１Ｒのみを発現する細胞におけるＡｎｇｌｌ誘発ＩＰ１産生に対するパーセンテージとして正規化する。データは、三重に行われた３つの独立した実験の平均±ＳＥＭを表している。
【０１８０】
図６に示されているとおり（上のパネル）、ＲＳ５０４３９３ではなく１０μＭのイルベサルタンは、ＡＴ１Ｒ−Ｒｌｕｃ８を発現する細胞においてＡｎｇｌｌ誘発ＩＰ１産生を実質的に止めた。イルベサルタン効果は、ＣＣＲ２同時発現の不在下でＲＳ５０４３９３とそれを組み合わせることによって、実質的に代わらず、このことは、アンタゴニストの特異性を証明していた。
【０１８１】
ＡＴ１Ｒ−Ｒｌｕｃ８およびＣＣＲ２の両方を同時発現する細胞では、Ａｎｇｌｌ媒介ＩＰ１応答に加えて、ＭＣＰ−１もまた、部分的なＩＰ１応答を刺激するようである（図６：下のパネル）。興味深いことに、イルベサルタンは、ＭＣＰ−１誘発ＩＰ１産生を部分的に低減し、他にも、Ａｎｇｌｌによって誘発される応答を実質的に阻害する（図６：下のパネル）。対照的に、ＲＳ５０４３９３は、Ａｎｇｌｌ誘発ＩＰ１産生に対してほとんど効果を有さなかったが、ＭＣＰ−１誘発ＩＰ１応答は実質的かつ選択的に阻害した（図６：下のパネル）。さらに興味深いことに、両方のアンタゴニストの組合せは、ＭＣＰ−１およびＡｎｇｌｌの両方によって促進されるＩＰ１産生を、それら２種の受容体を同時に阻害するので、実質的に止めた（図６：下のパネル）。まとめると、これらのデータは、ＣＣＲ２を介してのＭＣＰ−１依存性ＩＰ１応答の特異性を明らかに示しており、かつＡＴ１ＲおよびＣＣＲ２の両方の活性が、そのような応答には必要であることを意味している。さらに、これらの所見は、組み合わせの受容体阻害の結果として、受容体媒介細胞応答、この場合にはイノシトールリン酸産生のより大規模な阻害についてのさらなるインビトロ証拠を示している。
【０１８２】
実施例５
標識受容体と未標識受容体の反対の配向を使用して、かつ２種の異なるＡｎｇｌｌアンタゴニストのいずれかを使用して観察されるとおり、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞の一過性トランスフェクションを介してＡＴ１ＲおよびＣＣＲ２を同時発現させる際に、両方の受容体を合わせて阻害することは、いずれかの受容体単独の阻害よりも大規模にアレスチン補充を遮断する。
【０１８３】
ＲＳ５０４３９３をイルベサルタンまたはＥＸＰ３１７４、ロサルタンの活性代謝産物を使用することによって、ＣＣＲ２およびＡＴ１Ｒ阻害の組合せ効果をインビトロで調査した。
【０１８４】
図７は、β−アレスチン２補充に対するＡＴ１ＲおよびＣＣＲ２遮断の効果を示している。ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞を、血球凝集素（ＨＡ）標識ＡＴ１Ｒの不在下（上のパネル）および存在下（下のパネル）でＣＣＲ２−Ｒｌｕｃ８およびβ−アレスチン２−Ｖｅｎｕｓをコードするプラスミドによって一時的にトランスフェクションした。
【０１８５】
トランスフェクションの２４時間後に、細胞を、５％ＦＣＳを含有するＨＥＰＥＳ緩衝フェノールレッド不含の完全培地に収集し、ポリ−Ｌ−リシン−コーティングされている白色の９６ウェルプレートに加えた。トランスフェクションの４８時間後に、プレートを３７℃、５％ＣＯ２で２時間、３０μＭのＥｎｄｕＲｅｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と共にインキュベートして、基質平衡が達成されることを保証した。
【０１８６】
細胞を初めに、３７℃でイルベサルタン（１０μＭ）、ＥＸＰ３１７４（ロサルタンの活性代謝産物；１０μＭ）、ＲＳ５０４３９３（１０μＭ）またはイルベサルタンおよびＲＳ５０４３９３もしくはＥＸＰ３１７４およびＲＳ５０４３９３の組合せと一緒に３７℃で３０分間、前インキュベートするか、しなかった。次いで、細胞を１００ｎＭのＡｎｇＩＩ、ＭＣＰ−１または両方合わせたもので３７℃で３０分間刺激するか、またはせず、ＢＲＥＴシグナルを測定した。
【０１８７】
アゴニストを加える前後に、４００〜４７５ｎｍおよび５２０〜５４０ｎｍでの連続光放射を測定することによって、ＢＲＥＴ検出を生きている細胞で実施した。ビヒクル処置された細胞試料での５２０〜５４０ｎｍ発光と４００〜４７５ｎｍ発光との比を、リガンドで処置された同じ細胞の第２のアリコットでの同じ比（リガンド−誘発ＢＲＥＴ）から引くことによって、ＢＲＥＴシグナルを算出した。
【０１８８】
図７（上のパネル）に示されているとおり、ＣＣＲ２−Ｒｌｕｃ８およびβ−アレスチン２−Ｖｅｎｕｓを同時発現する細胞では、１００ｎＭのＡｎｇｌｌは効果を有さなかった。イルベサルタンでもＥＸＰ３１７４でもなく１０μＭのＲＳ５０４３９３は、ＭＣＰ−１誘発ＢＲＥＴ応答を実質的に遮断せず、その組合せは、予期されていたのとは異なる効果を何らもたらさなかった（図７：上のパネル）。
【０１８９】
しかしながら、ＣＣＲ２−Ｒｌｕｃ８、β−アレスチン２−ＶｅｎｕｓおよびＨＡ−標識ＡＴ１Ｒを同時発現し、その際、ＡｎｇｌｌおよびＭＣＰ−１の両方によって誘発されるＢＲＥＴが別の程度まで高まる細胞では、ＲＳ５０４３９３は、Ａｎｇｌｌ誘発ＢＲＥＴではなくＭＣＰ−１誘発を実質的に阻害した（図７：下のパネル）。同様に、イルベサルタンまたはＥＸＰ３１７４は、ＭＣＰ−１ではなくＡｎｇｌｌ促進ＢＲＥＴシグナルを部分的に遮断した（図７：下のパネル）。しかしながら特記すべきことに、ＭＣＰ−１およびＡｎｇｌｌでの組合せ処置では、ＲＳ５０４３９３での処置にも関わらず、実質的なＢＲＥＴシグナルが残った。重要なことに、イルベサルタンまたはＥＸＰ３１７４とＲＳ５０４３９３との組合せが、ＢＲＥＴ応答を、個々のアンタゴニストのみで観察されるレベル未満のレベルまで低下させ、これは、組み合わせた受容体阻害の結果として、受容体媒介細胞応答、この場合はβ−アレスチン補充のより大きな阻害についてのインビトロ証拠を示している。
【０１９０】
実施例６
他のＡｎｇｌｌアンタゴニスト、ＥＸＰ３１７４、ロサルタンの活性代謝産物で実証されるとおり、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞の一過性トランスフェクションを介してＡＴ１ＲおよびＣＣＲ２を同時発現させる際に、両方の受容体を合わせて阻害することは、いずれかの受容体単独の阻害よりも大規模にイノシトールリン酸シグナル伝達を遮断する。
【０１９１】
ＲＳ５０４３９３をＥＸＰ３１７４と組み合わせて使用して、ＣＣＲ２およびＡＴ１Ｒ阻害の組合せ効果をインビトロで調査した。
【０１９２】
図８は、ＡＴ１ＲおよびＣＣＲ２遮断のイノシトールリン酸産生に対する効果を示している。ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞を、ＡＴ１Ｒ−Ｒｌｕｃ８および−アレスチン２−Ｖｅｎｕｓをコードするプラスミドで、未標識ＣＣＲ２の不在下（上のパネル）および存在下（下のパネル）で一時的にトランスフェクションした。トランスフェクションの４８時間後に、細胞を使用して、アゴニスト誘発イノシトール（１）リン酸（ＩＰ１）産生測定を、ＩＰ−Ｏｎｅ  Ｔｂキット（Ｃｉｓｂｉｏ  Ｂｉｏａｓｓａｙｓ、Ｂａｇｎｏｌ  ｓｕｒ  Ｃｅｚｅ、Ｆｒａｎｃｅ）を使用して生じさせた。
【０１９３】
細胞を初めに、３７℃でＥＸＰ３１７４（１０μＭ）、ＲＳ５０４３９３（１０μＭ）または両方あわせたものと一緒に３７℃で３０分間、前インキュベートするか、しなかった。次いで細胞を、１００ｎＭのＡｎｇｌｌ、ＭＣＰ−１または両方合わせたものを含有する刺激緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１ｍＭのＣａＣｌ２、０．５ｍＭのＭｇＣｌ２、４ｍＭのＫＣｌ、１４６ｍＭのＮａＣｌ、５．５ｍＭのグルコースおよび５０ｍＭのＬｉＣｌ）中、３７℃でさらに３０分間インキュベートした。次いで、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有する溶解緩衝液中で予め希釈されているＨＴＲＦ（登録商標）アッセイ試薬、Ｔｅｒｂｉｕｍ  Ｃｒｙｐｔａｔｅ標識抗ＩＰ１抗体およびｄ２標識ＩＰ１類似体を加えることによって、細胞を溶解させた。アッセイを室温で１時間インキュベートし、Ｔｅｒｂｉｕｍ  Ｃｒｙｐｔａｔｅ蛍光および時間分解ＦＲＥＴシグナルを、それぞれ３４０、６２０および６６５ｎｍで励起してから５０μｓ後に、ＥｎＶｉｓｉｏｎ  ２１０２マルチラベルプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して測定した。データは、誘発ＩＰ１（任意の単位）として示されている。ＩＰ−Ｏｎｅ  Ｔｂキットは競合アッセイであり、ＩＰ１の誘発は、絶対アッセイシグナルの低下をもたらす。したがって、リガンド誘発アッセイシグナルを基礎アッセイシグナルから引くことによって、誘発ＩＰ１（任意の単位）を生じさせる。
【０１９４】
図８に示されているとおり（上のパネル）、ＲＳ５０４３９３ではなく１０μＭのＥＸＰ３１７４は、ＡＴ１Ｒ−Ｒｌｕｃ８を発現する細胞においてＡｎｇｌｌ誘発ＩＰ１産生を実質的に止めた。ＥＸＰ３１７４の効果は、ＣＣＲ２同時発現の不在下でＲＳ５０４３９３とそれを組み合わせることによって、実質的に変わらず、このことは、アンタゴニストの特異性を証明していた。
【０１９５】
ＡＴ１Ｒ−Ｒｌｕｃ８およびＣＣＲ２の両方を同時発現する細胞では、Ａｎｇｌｌ媒介ＩＰ１応答に加えて、ＭＣＰ−１もまた、部分的なＩＰ１応答を刺激するようである（図８：下のパネル）。ＥＸＰ３１７４は、Ａｎｇｌｌによって誘発される応答を実質的に阻害した（図８：下のパネル）。対照的に、ＲＳ５０４３９３は、Ａｎｇｌｌ誘発ＩＰ１産生に対してほとんど効果を有さなかったが、ＭＣＰ−１誘発ＩＰ１応答は実質的かつ選択的に阻害した（図８：下のパネル）。さらに興味深いことに、両方のアンタゴニストの組合せは、ＭＣＰ−１およびＡｎｇｌｌの両方によって促進されるＩＰ１産生を、それら２種の受容体を同時に阻害するので、実質的に止めた（図８：下のパネル）。これらの所見は、組み合わせの受容体阻害の結果として、受容体媒介細胞応答、この場合にはイノシトールリン酸産生のより大規模な阻害についてのさらなるインビトロ証拠を示している。
【０１９６】
実施例７
ＡＴ１Ｒの特異的活性化は、Ｇαｉ１へのＭＣＰ−１媒介カップリングを用量依存的に阻害し、このことは、ＡＴ１ＲがＣＣＲ２機能をモジュレートすることについてのインビトロ証拠を示し、かつＡｎｇｌｌに加えてＣＣＲ２の阻害についてのさらなる合理性を示している。
【０１９７】
図９は、活性化ＡＴ１Ｒの不在下および存在下でのＣＣＲ２の活性化の効果を、リガンド誘発ＢＲＥＴによって測定されるとおりのＧαｉ１カップリングに関して示している用量応答曲線を示している。ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞を、血球凝集素（ＨＡ）標識ＡＴ１Ｒの不在下（上のパネル）および存在下（下のパネル）でＧαｉ１−Ｒｌｕｃ８およびＣＣＲ２−ＹＦＰをコードするプラスミドによって一時的にトランスフェクションした。トランスフェクションの４８時間後に、細胞を、様々な濃度のＭＣＰ−１で、または１００ｎＭのＭＣＰ−１の存在下での様々な濃度のＡｎｇｌｌで、生きている細胞中でアゴニスト誘発ＢＲＥＴシグナルデータを発生させるために使用した。
【０１９８】
ＢＲＥＴ基質を加えたら、アゴニストの添加の前後に、４００〜４７５ｎｍおよび５２０〜５４０ｎｍでの連続光放射を測定することによって、ＢＲＥＴ検出を生きている細胞で実施した。ビヒクル処置された細胞試料での５２０〜５４０ｎｍ発光と４００〜４７５ｎｍ発光との比を、リガンドで処置された同じ細胞の第２のアリコットでの同じ比（リガンド−誘発ＢＲＥＴ）から引くことによって、ＢＲＥＴシグナルを算出した。ＣＣＲ２の活性化はＢＲＥＴ比の低下をもたらしたが、このことは、ＰＡＲＩ−Ｇαｉ１相互作用について最近記載されたとおり（Ａｙｏｕｂ  ＭＡ、Ｔｒｉｎｑｕｅｔ  Ｅ、Ｐｆｌｅｇｅｒ  ＫＤＧ  ａｎｄ  Ｐｉｎ  ＪＰ（２０１０）  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｍｏｄｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｈｒｏｍｂｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＰＡＲＩ  ｗｉｔｈ  Ｇαｉ１,  Ｇα１２  ａｎｄ  β−ａｒｒｅｓｔｉｎ  １．  ＦＡＳＥＢ  Ｊ  ２４：３５２２〜３５３５）、活性化がＣＣＲ２とプリアセンブリされたＧαｉ１タンパク質の構造変化をもたらしたことを示している。したがって、データは、１μＭのＭＣＰ−１で観察されるＢＲＥＴシグナルの変化を１００％とし、ＢＲＥＴシグナルに変化がないことを０％とする「ＢＲＥＴ変化（対照に対する％）」として表されている。
【０１９９】
ＭＣＰ−１は、受容体活性化およびＧαｉ１媒介シグナル伝達へのカップリングを示す、Ｇαｉ１およびＣＣＲ２にそれぞれ融合しているＲｌｕｃ８とＹＦＰとの間の距離および／または配向を用量依存的に変える。ＡＴ１Ｒ同時発現の不在下では、Ａｎｇｌｌの用量を増やすことは、観察されるＢＲＥＴシグナルにおけるＭＣＰ−１誘発変化を変えない（図９：上のパネル）。対照的に、ＡＴ１Ｒが同時発現されると、ＡｎｇｌｌはＢＲＥＴシグナルにおけるＭＣＰ−１誘発変化を用量依存的に阻害する（図９：下のパネル）。
【０２００】
この実施例は、ＡｎｇｌｌがＣＣＲ２によるＧαｉ１のＭＣＰ−１誘発活性化を阻害することの証拠を示している。したがって、Ａｎｇｌｌアンタゴニストを使用してＡｎｇｌｌのみを遮断することは、ＭＣＰ−１誘発Ｇαｉ１シグナル伝達のこの阻害を除去すると予測されるであろう。Ａｎｇｌｌアンタゴニストと組み合わせてＣＣＲ２経路阻害薬で処置することは、ＡＴ１Ｒ遮断によって増悪されるＣＣＲ２媒介Ｇαｉ１の活性化を妨げると予測される。
【０２０１】
したがって、この実施例は、ＣＣＲ２経路阻害薬およびＡＴ１Ｒアンタゴニストの組合せを使用することについての合理性を支持するさらなるインビトロ証拠を提供する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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