(57)【要約】      （修正有）【課題】好適な光コヒーレンス断層撮影および二光子発光撮像のための装置および方法を提供すること。【解決手段】本開示の例示的な実施形態は、複合カテーテルベースの光コヒーレンス断層撮影二光子発光（ＯＣＴ−ＴＰＬ）撮像システムを含む。例示的な実施形態は、さらに、生体内の高い空間分解能で薄い被膜の線維性アテローム中の細胞成分（例えば、マクロファージ、コラーゲン／エラスチン線維、脂質液滴）の分布を検出し、さらに特性評価する方法を含む。【選択図】図５Ａ
2020195806.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（関連出願の引用）
本願は、米国仮特許出願第６１／７８５，０３０号（２０１３年３月１４日出願）に対する優先権を主張し、上記出願の内容は、参照により本明細書に引用される。
【０００２】
（背景情報）
心筋梗塞につながるアテローム性動脈硬化症およびプラーク破裂は、世界中で主要な死因のままである［１］。炎症ならびに基礎的な細胞および分子機構［２−４］は、発生から進行を通したアテローム発生、プラーク破裂、および最終的には血栓症の一因となる。近年、Ｖｉｒｍａｎｉ［５］によって「薄い被膜の線維性アテローム」として定義されている、脆弱なプラークは、炎症に起因し、典型的には、厚さが６５μｍ未満の薄い線維性被膜、減少した平滑筋細胞を伴うマクロファージの浸潤の増加、および安定したプラークと比較して増加した脂質コアのサイズを有するものとして特徴付けられる［６−８］。
【０００３】
薄い被膜の線維性アテロームの破裂につながる、いくつかの細胞および分子事象が、現在理解され、新規の撮像アプローチを開発するために利用されている。薄い被膜の線維性アテローム中のマクロファージの蓄積は、薄い被膜の線維性アテロームの脆弱性および血栓形成の増加［１３−１５］の一因となると考えられる、マトリクスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）［９−１２］を過剰発現させる。マクロファージは、冠状、脳、および末梢循環におけるプラーク破裂の危険性を示す、重要な初期細胞マーカーである。プラーク脆弱性は、細胞組成ならびに解剖学的構造に関連するので、組成および構造の両方を同時に明らかにすることができる診断方法を開発することが、脆弱なプラークを識別するために望ましく、それは、心臓血管介入に応答した縦断研究におけるマクロファージ密度の生体内監視を可能にするであろう。
【０００４】
血管内ＯＣＴ（ＩＶＯＣＴ）は、高解像度血管内撮像のための最近開発されたカテーテルベースの方法である。心臓血管画像診断法のうちＩＶＯＣＴは、薄い被膜の線維性アテロームを撮像するための十分な空間分解能を提供する、唯一のアプローチである。
【０００５】
しかしながら、ＩＶＯＣＴ画像のみによって、プラーク破裂の危険性を容易に査定することはできない。二光子発光（ＴＰＬ）顕微鏡法は、組織の非線形光学性質を使用し、それらの内因性自己蛍光に基づいて、内皮細胞、平滑筋細胞［１６］、エラスチン線維［１７、１８］、酸化ＬＤＬ［１９］、および脂質液滴［２０］等のプラーク構成要素を撮像するために利用されてきた。ごく最近では、ＴＰＬ顕微鏡法によって、ナノ粒子を装填されたマクロファージを検出できることが報告されている［２１、２２］。ファイバベースのＯＣＴ［２３、２４］およびＴＰＬ顕微鏡法［２５−２８］は、それぞれ、フォトニック結晶ファイバを使用して、より高い空間分解能を達成するために広帯域光を透過させること、またはシステムサイズ小型化のために超短パルスを伝送することが報告されている。しかしながら、複合ファイバベースのＯＣＴ−ＴＰＬシステムは、これまで実現されていない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本開示の例示的実施形態は、生体内で高い空間分解能を用いて、薄い被膜の線維性アテローム中の細胞成分（例えば、マクロファージ、コラーゲン／エラスチン線維、脂質液滴）の分布を検出し、さらに特性評価する、複合カテーテルベースの光コヒーレンス断層撮影二光子発光（ＯＣＴ−ＴＰＬ）撮像システムを含む。カテーテルベースのＯＣＴ−ＴＰＬシステムの構成要素は、ＯＣＴ（例えば、１３１０ｎｍ）およびＴＰＬ（例えば、８００ｎｍ）用の光源、ＯＣＴ（例えば、平衡検出器）およびＴＰＬ（例えば、光子増倍管）用の検出器、ＴＰＬ励起パルスの群遅延分散を補償する透過回折格子圧縮機、ＯＣＴおよびＴＰＬ光源の両方から光を送達し、ＴＰＬ放出信号を伝送するファイバ（例えば、フォトニック結晶ファイバ）、および撮像カテーテルを含むことができる。本開示の実施形態は、撮像のための方法および装置、ならびに短パルスレーザ光および広帯域ＯＣＴ光の同時送達を必要とする、関連診断および治療カテーテルベースのモダリティを説明する。
【０００７】
装置のある実施形態は、第１の波長を放出するように構成されている光コヒーレンス断層撮影光源と、コヒーレンス断層撮影光源から放出される第１の波長を基準経路およびサンプル経路に向かわせるように構成されているスプリッタと、第２の波長を放出するように構成されている短パルス光源と、第１のダイクロイック要素と、第２のダイクロイック要素とを備えている。特定の実施形態では、光コヒーレンス断層撮影光源は、掃引源光コヒーレンス断層撮影光源として構成され得る。ある実施形態では、光コヒーレンス断層撮影光源は、広帯域光コヒーレンス断層撮影光源として構成され得る。いくつかの実施形態では、短パルス光源は、１０ｐＪ〜１ｍＪのパルスエネルギー、および５ｆｓ〜１００ｐｓパルス持続時間を有する、短パルスレーザであり得る。具体的実施形態では、サンプル経路は、フォトニック結晶ファイバを通して向かわせられ得る。ある実施形態は、平衡検出器を含み得、特定の実施形態では、平衡検出器は、非干渉ＯＣＴ構成要素を最小化するように構成され得る。
【０００８】
特定の実施形態は、光子計数検出器を含み得、ある実施形態では、光子計数検出器は、光電子増倍管であり得る。具体的実施形態では、光子計数検出器は、アバランシェフォトダイオードであり得る。いくつかの実施形態では、光子計数検出器は、二光子発光を検出するように構成され得る。ある実施形態では、第２のダイクロイック要素は、光子計数検出器の方へ二光子発光を向かわせるように構成され得る。特定の実施形態では、第１のダイクロイック要素は、第１および第２の波長をサンプル経路に向かわせるように構成され得る。ある実施形態では、サンプル経路は、ナノ粒子を備えているサンプル部位に向かわせられ得る。
【０００９】
特定の実施形態はさらに、サンプル部位の画像を表示するように構成されている視覚ディスプレイを備え得る。ある実施形態では、視覚ディスプレイは、装置とサンプル部位との間の距離に基づいて、サンプル部位の表示の一部分を増進するように構成され得る。いくつかの実施形態では、視覚ディスプレイは、検出値が正規化値を超えるサンプル部位の場所の輝度を増加させるように構成され得る。具体的実施形態では、ナノ粒子は、ナノロッドとして構成され得る。ある実施形態では、ナノロッドは、金を含み、約７５６ｎｍの表面プラズモン共鳴を有する。特定の実施形態はさらに、分散補償要素を備え得、いくつかの実施形態では、分散補償要素は、基準経路とサンプル経路との間の分散差を補償するように構成される。ある実施形態では、分散補償要素は、二光子発光励起光を事前補償するように構成される。
【００１０】
特定の実施形態はまた、サンプル部位を撮像する方法を含み得、本方法は、光コヒーレンス断層撮影光源からサンプル部位に向かって第１の波長を放出することと、短パルス光源からサンプル部位に向かって第２の波長を放出することと、サンプル部位から光コヒーレンス断層撮影信号を検出することであって、光コヒーレンス断層撮影信号は、第１の波長から生成される、ことと、サンプル部位から二光子発光放出信号を検出することであって、二光子発光放出信号は、第２の波長によって誘導される、こととを含む。ある実施形態では、短パルス光源は、１０ｐＪ〜１ｍＪのパルスエネルギー、および５ｆｓ〜１００ｐｓパルス持続時間を有する、短パルスレーザであり得る。
【００１１】
いくつかの実施形態では、光コヒーレンス断層撮影信号および二光子発光信号は、複数のサンプル部位から検出され得る。特定の実施形態では、サンプルは、組織を含み、具体的実施形態では、組織は、上皮組織または動脈組織であり得る。ある実施形態では、動脈組織は、冠状動脈の中に位置し得る。具体的実施形態では、組織は、血管管腔表面であり得る。特定の実施形態では、組織は、口腔粘膜であり得る。いくつかの実施形態では、光コヒーレンス断層撮影信号は、光コヒーレンス断層撮影像を生成するために使用され得る。特定の実施形態では、二光子発光信号は、光コヒーレンス断層撮影像と位置合わせされ得る。ある実施形態はさらに、３次元光コヒーレンス断層撮影像上で２次元二光子発光データを表示することを含み得る。いくつかの実施形態では、第１の処理要素は、光コヒーレンス断層撮影信号を使用し、光コヒーレンス断層撮影像を構築し得る。
【００１２】
いくつかの実施形態では、第１の処理要素は、中央処理ユニットまたはグラフィックス処理ユニットであり得る。特定の実施形態では、第２の処理要素は、光コヒーレンス断層撮影像上で位置合わせされた二光子発光画像を見るためにレンダリングする。ある実施形態では、サンプル部位は、ナノ粒子を備え得る。特定の実施形態では、二光子発光信号は、ナノ粒子から放出され得る。具体的実施形態では、二光子発光放出信号は、サンプル部位の組織から放出され得る。
【００１３】
ある実施形態は、撮像データを表示する方法を含み、本方法は、撮像システムを用いて光コヒーレンス断層撮影データを取得することと、撮像システムを用いて複数の発光粒子から二光子発光データを取得することと、光コヒーレンス断層撮影データおよび二光子発光データを複合画像で同時に表示することとを含む。いくつかの実施形態では、発光粒子は、ナノ粒子であり得る。特定の実施形態では、撮像システムは、カテーテルベースの撮像システムであり得る。
【００１４】
ある実施形態では、光コヒーレンス断層撮影データは、半径方向の次元および方位角の次元のデータを含み得、二光子発光データは、方位角信号を含み得る。特定の実施形態はさらに、半径方向寸法を二光子発光データに追加することを含み得る。ある実施形態では、半径方向寸法を二光子発光データに追加することは、二光子発光方位角信号によって正規化された半径方向確率分布関数を使用することを含み得る。具体的実施形態では、半径方向確率分布関数は、撮像システムの光学性質と、カテーテルベースの撮像システムとカテーテルベースの撮像システムが挿入される管腔壁との間の距離と、管腔壁の組織の光学性質とを使用して決定され得る。
【００１５】
特定の実施形態では、半径方向確率分布関数は、ナノ粒子の一様な分布を仮定することを使用して決定され得る。ある実施形態はさらに、カテーテルベースの撮像システムが管腔に沿って軸方向に移動させられるにつれてカテーテルベースの撮像システムから取得されるデータに基づいて、３次元画像を生成することを含み得る。
【００１６】
以下では、「連結される」という用語は、必ずしも直接的ではなく、かつ必ずしも機械的ではないが、「接続される」と定義される。
【００１７】
「１つの」（「ａ」または「ａｎ」）という言葉の使用は、請求項および／または明細書で「備えている」という用語と併せて使用されるとき、「１つ」を意味し得るが、「１つ以上の」または「少なくとも１つ」の意味とも一致する。「約」という用語は、一般に、記述された値＋または−５％を意味する。請求項での「または」という用語の使用は、代替案のみを指すように明示的に指示されない限り、または代替案が相互排他的でない限り、「および／または」を意味するために使用されるが、本開示は、代替案のみ、ならびに「および／または」を指す定義を支持する。
【００１８】
「備えている」（ならびに「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」および「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」等の備えている（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）の任意の形態）、「有する」（ならびに「ｈａｓ」および「ｈａｖｉｎｇ」等の有する（ｈａｖｅ）の任意の形態）、「含む」（ならびに「ｉｎｃｌｕｄｅｓ」および「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」等の含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）の任意の形態）、および「含有する」（ならびに「ｃｏｎｔａｉｎｓ」および「ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ」等の含む（ｃｏｎｔａｉｎ）の任意の形態）という用語は、非制約的な連結動詞である。結果として、１つ以上のステップまたは要素を「備えている」、「有する」、「含む」、または「含有する」方法またはデバイスは、これらの１つ以上のステップまたは要素を保有するが、これらの１つ以上の要素のみを保有することに限定されない。同様に、１つ以上の特徴を「備えている」、「有する」、「含む」、または「含有する」方法のステップまたはデバイスの要素は、これらの１つ以上の特徴を保有するが、これらの１つ以上の特徴のみを保有することに限定されない。さらに、ある方法で構成されるデバイスまたは構造は、少なくともそのように構成されるが、また、記載されていない方法で構成され得る。
【００１９】
本発明の他の目的、特徴、および利点は、以下の発明を実施するための形態から明白となるであろう。しかしながら、本発明の精神および範囲内の種々の変更および修正が、詳細な説明から当業者に明白となるであろうため、詳細な説明および具体的実施例は、本発明の具体的実施形態を示す一方で、例証のみとして挙げられることを理解されたい。
本願明細書は、例えば、以下の項目も提供する。
（項目１）
第１の波長を放出するように構成されている光コヒーレンス断層撮影光源と、
前記コヒーレンス断層撮影光源から放出される前記第１の波長を基準経路およびサンプル経路に向かわせるように構成されているスプリッタと、
第２の波長を放出するように構成されている短パルス光源と、
第１のダイクロイック要素と、
第２のダイクロイック要素と
を備えている、装置。
（項目２）
前記光コヒーレンス断層撮影光源は、掃引源光コヒーレンス断層撮影光源として構成されている、項目１に記載の装置。
（項目３）
前記光コヒーレンス断層撮影光源は、広帯域光コヒーレンス断層撮影光源として構成されている、項目１に記載の装置。
（項目４）
前記サンプル経路は、フォトニック結晶ファイバを通して向かわせられる、項目１に記載の装置。
（項目５）
平衡検出器をさらに備えている、項目１に記載の装置。
（項目６）
前記平衡検出器は、非干渉ＯＣＴ構成要素を最小化するように構成されている、項目５に記載の装置。
（項目７）
光子計数検出器をさらに備えている、項目１に記載の装置。
（項目８）
前記光子計数検出器は、光電子増倍管である、項目７に記載の装置。
（項目９）
前記光子計数検出器は、アバランシェフォトダイオードである、項目７に記載の装置。
（項目１０）
前記光子計数検出器は、二光子発光を検出するように構成されている、項目７に記載の装置。
（項目１１）
前記第２のダイクロイック要素は、光子計数検出器の方へ二光子発光を向かわせるように構成されている、項目１に記載の装置。
（項目１２）
前記第１のダイクロイック要素は、前記第１および第２の波長を前記サンプル経路に向かわせるように構成されている、項目１に記載の装置。
（項目１３）
前記サンプル経路は、ナノ粒子を備えているサンプル部位に向かわせられる、項目１に記載の装置。
（項目１４）
前記サンプル部位の画像を表示するように構成されている視覚ディスプレイをさらに備えている、項目１に記載の装置。
（項目１５）
前記視覚ディスプレイは、前記装置と前記サンプル部位との間の距離に基づいて、前記サンプル部位の表示の一部分を増進するように構成されている、項目１４に記載の装置。
（項目１６）
前記視覚ディスプレイは、検出値が正規化値を超える、前記サンプル部位の場所の輝度を増加させるように構成されている、項目１５に記載の装置。
（項目１７）
前記ナノ粒子は、ナノロッドとして構成されている、項目１３に記載の装置。
（項目１８）
前記ナノロッドは、金を含み、約７５６ｎｍの表面プラズモン共鳴を有する、項目１７に記載の装置。
（項目１９）
分散補償要素をさらに備えている、項目１に記載の装置。
（項目２０）
前記分散補償要素は、前記基準経路と前記サンプル経路との間の分散差を補償するように構成されている、項目１９に記載の装置。
（項目２１）
前記分散補償要素は、二光子発光励起光を事前補償するように構成されている、項目１９に記載の装置。
（項目２２）
サンプル部位を撮像する方法であって、前記方法は、
光コヒーレンス断層撮影光源からサンプル部位に向かって第１の波長を放出することと、
短パルス光源から前記サンプル部位に向かって第２の波長を放出することと、
前記サンプル部位から光コヒーレンス断層撮影信号を検出することであって、前記光コヒーレンス断層撮影信号は、前記第１の波長から生成される、ことと、
前記サンプル部位から二光子発光放出信号を検出することであって、前記二光子発光放出信号は、前記第２の波長によって誘導される、ことと
を含む、方法。
（項目２３）
前記光コヒーレンス断層撮影信号および前記二光子発光信号は、複数のサンプル部位から検出される、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記サンプルは、組織を含む、項目２２に記載の方法。
（項目２５）
前記組織は、上皮組織である、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記組織は、動脈組織である、項目２４に記載の方法。
（項目２７）
前記動脈組織は、冠状動脈の中に位置する、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
前記組織は、血管管腔表面である、項目２４に記載の方法。
（項目２９）
前記組織は、口腔粘膜である、項目２４に記載の方法。
（項目３０）
前記光コヒーレンス断層撮影信号は、光コヒーレンス断層撮影像を生成するために使用される、項目２２に記載の方法。
（項目３１）
前記二光子発光信号は、光コヒーレンス断層撮影像と位置合わせされる、項目２２に記載の方法。
（項目３２）
３次元光コヒーレンス断層撮影像上で２次元二光子発光データを表示することをさらに含む、項目２２に記載の方法。
（項目３３）
第１の処理要素が、光コヒーレンス断層撮影信号を使用し、光コヒーレンス断層撮影像を構築する、項目２２に記載の方法。
（項目３４）
前記第１の処理要素は、中央処理ユニットまたはグラフィックス処理ユニットである、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
第２の処理要素が、光コヒーレンス断層撮影像上で位置合わせされた二光子発光画像を見るためにレンダリングする、項目３３に記載の方法。
（項目３６）
前記サンプル部位は、ナノ粒子を備えている、項目２２に記載の方法。
（項目３７）
前記二光子発光信号は、前記ナノ粒子から放出される、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
前記二光子発光放出信号は、前記サンプル部位の組織から放出される、項目２２に記載の方法。
（項目３９）
撮像データを表示する方法であって、前記方法は、
撮像システムを用いて光コヒーレンス断層撮影データを取得することと、
前記撮像システムを用いて複数の発光粒子から二光子発光データを取得することと、
前記光コヒーレンス断層撮影データおよび前記二光子発光データを複合画像で同時に表示することと
を含む、方法。
（項目４０）
前記発光粒子は、ナノ粒子である、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
前記撮像システムは、カテーテルベースの撮像システムである、項目３９に記載の方法。
（項目４２）
前記カテーテルベースの撮像システムが管腔に沿って軸方向に移動させられるにつれて前記カテーテルベースの撮像システムから取得されるデータに基づいて、３次元画像を生成することをさらに含む、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
前記光コヒーレンス断層撮影データは、半径方向の次元および方位角の次元のデータを含み、前記二光子発光データは、方位角信号を含む、項目３９に記載の方法。
（項目４４）
半径方向寸法を前記二光子発光データに追加することをさらに含む、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
前記半径方向寸法を前記二光子発光データに追加することは、前記二光子発光方位角信号によって正規化された半径方向確率分布関数を使用することを含む、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
前記半径方向確率分布関数は、
前記撮像システムの光学性質と、
前記カテーテルベースの撮像システムと前記カテーテルベースの撮像システムが挿入される管腔壁との間の距離と、
前記管腔壁の組織の光学性質と
を使用して決定される、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
前記半径方向確率分布関数は、ナノ粒子の一様な分布を仮定することを使用して決定される、項目４５に記載の方法。
（項目４８）
前記カテーテルベースの撮像システムが管腔に沿って軸方向に移動させられるにつれて前記カテーテルベースの撮像システムから取得されるデータに基づいて、３次元画像を生成することをさらに含む、項目４１に記載の方法。
【００２０】
本特許または出願ファイルは、カラーで実行された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面を伴う本特許または特許出願公開のコピーが、要請および必要な料金の支払に応じて、特許庁によって提供されるであろう。
【００２１】
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本開示のある側面をさらに実証するように含まれる。本発明は、本明細書で提示される具体的実施形態の詳細な説明と組み合わせて、これらの図面のうちの１つを参照することによって、より理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、例示的実施形態による装置の概略図である。
【図２】図２は、ＩＶ−ＯＣＴシステムから取得された画像を示す。
【図３】図３は、ＩＶ−ＯＣＴシステムから取得された画像を示す。
【図４】図４は、例示的実施形態による装置から取得された画像を示す。
【図５Ａ】図５Ａおよび５Ｂは、例示的実施形態による装置の概略図を示す。
【図５Ｂ】図５Ａおよび５Ｂは、例示的実施形態による装置の概略図を示す。
【図６】図６は、例示的実施形態による装置の概略図を示す。
【図７】図７は、例示的実施形態による装置の概略図を示す。
【図８Ａ】図８は、例示的実施形態による装置の概略図を示す。
【図８Ｂ】図８は、例示的実施形態による装置の概略図を示す。
【図９】図９は、例示的実施形態による装置から取得された画像を示す。
【図１０Ａ】図１０は、例示的実施形態による装置の概略図を示す。
【図１０Ｂ】図１０は、例示的実施形態による装置の概略図を示す。
【図１０Ｃ】図１０は、例示的実施形態による装置の概略図を示す。
【図１０Ｄ】図１０は、例示的実施形態による装置の概略図を示す。
【図１０Ｅ】図１０は、例示的実施形態による装置の概略図を示す。
【図１１】図１１は、例示的実施形態による装置から取得されたデータを示す。
【図１２】図１２は、例示的実施形態による装置から取得されたデータを示す。
【図１３】図１３は、例示的実施形態による装置から取得されたデータを示す。
【図１４Ａ】図１４は、例示的実施形態による装置から取得されたデータを示す。
【図１４Ｂ】図１４は、例示的実施形態による装置から取得されたデータを示す。
【図１４Ｃ】図１４は、例示的実施形態による装置から取得されたデータを示す。
【図１４Ｄ】図１４は、例示的実施形態による装置から取得されたデータを示す。
【図１５】図１５は、例示的実施形態による、データ結果の表示を修正するようにコンピュータ読み取り可能な媒体によって行われるステップのフローチャートを示す。
【図１６Ａ】図１６は、例示的実施形態による装置から取得された画像およびデータを示す。
【図１６Ｂ】図１６は、例示的実施形態による装置から取得された画像およびデータを示す。
【図１６Ｃ】図１６は、例示的実施形態による装置から取得された画像およびデータを示す。
【図１６Ｄ】図１６は、例示的実施形態による装置から取得された画像およびデータを示す。
【図１６Ｅ】図１６は、例示的実施形態による装置から取得された画像およびデータを示す。
【図１６Ｆ】図１６は、例示的実施形態による装置から取得された画像およびデータを示す。
【図１７】図１７−２０は、例示的実施形態による装置から取得された画像を示す。
【図１８】図１７−２０は、例示的実施形態による装置から取得された画像を示す。
【図１９】図１７−２０は、例示的実施形態による装置から取得された画像を示す。
【図２０】図１７−２０は、例示的実施形態による装置から取得された画像を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
ここで図１を参照すると、装置５０の１つの例示的実施形態は、光コヒーレンス断層撮影光源１００と、スプリッタ２００と、二光子発光励起光源３００と、第１のダイクロイック要素（ｄｉｃｈｒｏｉｃ  ｅｌｅｍｅｎｔ）４００と、第２のダイクロイック要素４５０とを備えている。本実施形態では、光コヒーレンス断層撮影光源１００は、第１の波長１１０を放出するように構成され、スプリッタ２００は、第１の波長１１０を基準経路２１０およびサンプル経路２２０に向かわせるように構成される。ある実施形態では、光コヒーレンス断層撮影光源１００は、掃引源光コヒーレンス断層撮影光源または広帯域光コヒーレンス断層撮影光源として構成することができる。特定の実施形態では、サンプル経路２２０は、フォトニック結晶ファイバを通して向かわせることができる。示される実施形態では、二光子発光励起光源３００は、第２の波長３２０を放出するように構成される。
【００２４】
動作中、サンプル経路２２０および第２の波長３２０が（例えば、第１のダイクロイック要素４００ならびに図１の他の構成要素を介して）サンプル部位２８０に向かわせられるように、装置５０を位置付けることができる。
【００２５】
ある例示的実施形態では、サンプル部位２８０は、ナノ粒子２６０を備え得、具体的実施形態では、ナノ粒子２６０は、ナノロッドとして構成され得る。特定の実施形態では、ナノ粒子２６０は、約７５６ｎｍの表面プラズモン共鳴を伴う、金を含むナノロッドとして構成され得る。ある実施形態では、ナノロッドの構成は、以下で提供される実施例の第４節で確立される手順に従って、選択することができる。
【００２６】
装置５０はさらに、二光子発光（ＴＰＬ）を検出するように構成される光子計数検出器３５０と、非干渉ＯＣＴ構成要素を最小化するように構成される平衡検出器２５０とを備えている。具体的実施形態では、光子計数検出器３５０は、１つ以上の光電子増倍管（ＰＭＴ）として構成することができる。他の実施形態では、光子計数検出器３５０は、アバランシェフォトダイオードとして構成することができる。
【００２７】
特定の実施形態では、図１で図示されるシステムの構成要素は、サンプル経路２２０中の光とＴＰＬ励起光源３００からの第２の波長３２０とのサンプル部位２８０への伝搬を可能にするためにフォトニック結晶ファイバ（ＰＣＦ）を利用する、カテーテルベースのシステムに組み込むことができる。ＰＣＦは、ＯＣＴおよびＴＰＬ励起光の両方の単一モード透過を可能にする。単一モード透過は、モード干渉が起こらないことを保証するためにＯＣＴ撮像で必要とされる。単一モード透過は、ＴＰＬ励起光のパルス持続時間がモード分散により広がらないことを保証するために、ＴＰＬ撮像のために必要とされる。具体的実施形態では、カテーテルは、システム５０を利用して血管内画像を取得するように、血管に挿入することができる。
【００２８】
動作中、システム５０は、単一のシステムでＯＣＴおよびＴＰＬ撮像技術の両方の利益を提供する。例示的実施形態では、システム５０の構成要素は、ＯＣＴおよびＴＰＬ分野での確立された原理に従って機能する。したがって、個々のＯＣＴおよびＴＰＬの概説が提供されるであろうが、例示的実施形態は、環境条件または他の要因に従って、パラメータの種々の組み合わせを利用し得ることが理解される。例えば、ＯＣＴ光源１００は、近赤外光を生成することができ、比較的長い波長の光の使用は、動脈壁等の散乱媒体の中へのより深い浸透を可能にする。特定の実施形態では、ＯＣＴ光源１００は、約１３１０ｎｍの波長で光を提供するように構成することができる。
【００２９】
サンプル経路２２０中の光がサンプル部位２８０に向かわせられると、サンプル部位２８０の表面下特徴から反射するこの光のわずかな部分が収集される。動作中、サンプル経路２２０中の光の有意な部分は、反射されないが、むしろ、サンプルから後方散乱する。後方散乱光は、従来の撮像で画像を曖昧にする背景の一因となるが、この光は、干渉分光法を介してＯＣＴシステムで有益に使用することができる。例えば、受け取った光子の光路長を記録するために、平衡検出器２５０を使用することができ、検出前に組織における散乱を増加させる、ほとんどの光子の拒否を可能にする。これは、サンプル部位２８０において目的とする領域から直接反射される光を収集しながら、背景信号を拒否することによって、構築されるべき厚いサンプルの記録３次元画像を記録することを可能にすることができる。例示的実施形態では、ＯＣＴ撮像は、概して、サンプル部位２８０における生物組織中の表面の１〜２ミリメートル下方に限定される。より大きい深度で、散乱することなく脱出する光の割合は、典型的には、小さすぎて検出できない。
【００３０】
システム５０の動作中、ＴＰＬ光源３００および光子計数検出器３５０はまた、二光子発光顕微鏡法における確立された原理と一致して利用される。ある実施形態では、ＴＰＬ光源３００は、６ｎＪ〜５μＪの最大パルスエネルギー、１００ｆｓ〜１ｐｓのパルス幅、および５００ｋＨｚ〜８０ＭＨｚの繰り返し率を伴って、７６０ｎｍ〜１０４０ｎｍで第２の波長３２０の励起エネルギーを生成する、同調可能なフェムト秒レーザとして構成することができる。特定の実施形態では、ＴＰＬ光源３００はまた、約７８μｍ２〜７０６．８μｍ２のスポット面積および２０ミクロン秒のピクセル滞留時間を伴って、１０μｍ〜３０μｍのスポットサイズを生成するように構成され得る。加えて、ＴＰＬ光源３００はまた、５００ｍＷ〜２５００ｍＷのサンプル上の平均電力、０．０６２５ＭＷ〜５ＭＷの瞬間電力、および２Ｅ−４ＭＷ／μｍ２〜１６Ｅ−３ＭＷ／μｍ２の瞬間電力密度を伴って、ピクセルあたり１０〜１６００パルスを生成するように構成され得る。
【００３１】
図１に示される実施形態では、第１のダイクロイック要素４００は、フォトニック結晶ファイバ（ＰＣＦ）を介して第２の波長３２０をサンプル部位２８０に向かわせるように位置付けることができる。特定の実施形態では、ＰＣＦは、ＮＫＴ  Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓから入手可能な大型サイズのモードフィールド直径（２０μｍ）（ＬＭＡ−２０）を有することができる。ある実施形態では、ＰＣＦは、ダブルクラッドファイバとして構成されてもよく、具体的実施形態では、Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｆｉｂｒｅから入手可能なモデル番号ＤＣ−１６５−１６の受動ファイバ等のダブルクラッド高ＮＡファイバであり得る。例示的なダブルクラッドフォトニック結晶ファイバは、高ＮＡマルチモードファイバ構造に組み込まれた大型モード面積の単一モードコアを備え得る。そのようなファイバは、単一モードビームが、ファイバにおいて前方に伝搬されることを可能にすることができ、同時に、散乱光または二光子発光が、検出のために収集され、後方に伝搬され得る。単一クラッドフォトニック結晶ファイバの代わりのダブルクラッドファイバの使用は、高ＮＡ内側クラッディングを用いて、二光子発光検出効率を増加させること（低ＮＡコアと比較して）ができる。構成要素の特定の仕様は、実施例の目的のみで提示され、他の実施形態は、本明細書で説明されるものとは異なる仕様を伴う構成要素を備え得ることが理解される。
【００３２】
システム５０の動作中、第２の波長３２０は、ナノ粒子２６０に励起エネルギーを提供することができ、ナノ粒子２６０は、第２のダイクロイック要素４５０を介して光子計数検出器３５０に向かわせられる発光２７０を放出することができる。例示的実施形態では、光子計数検出器３５０および平衡検出器２５０からの出力は、ユーザが、重ね合わせられるＯＣＴおよびＴＰＬ撮像の両方の結果を視覚化することを可能にする、単一のディスプレイで組み合わせられるように構成することができる。
【００３３】
血管内ＯＣＴおよびＴＰＬ画像の表示は、有用なデータを提供する方法で迅速に解釈することができる様式で、情報をユーザに提示することに、ある課題を提起する。例えば、血管内ＯＣＴが、２次元（半径方向および方位角）である一方で、ＴＰＬ情報は、いくつかの実施形態では、１次元（方位角）である。２次元ＩＶ−ＯＣＴ画像の内側または外側のいずれかのリングまたはバンドとしてのＴＰＬ方位角情報の１次元表示もまた、複合ＩＶ−ＯＣＴおよびＴＰＬ画像情報を提示する方法として評価された。
【００３４】
複合ＩＶ−ＯＣＴおよびＴＰＬを表示するための例示的実施形態は、その位置でのＴＰＬ方位角信号によって正規化されるであろう、半径方向確率分布関数［ｐ（ｒ）］を使用するＴＰＬデータに半径方向寸法を組み込むことを含む。半径方向確率分布関数［ｐ（ｒ）］は、（部分的に）（１）カテーテルの光学部、（２）カテーテルと管腔壁との間の距離、（３）組織光学性質から決定することができる。この情報は、ナノ粒子２６０の一様な分布仮定するＴＰＬ信号の半径方向依存性［ｐ（ｒ）］を予測するように組み合わせることができる。
【００３５】
方位角および半径方向依存性の両方を含むＴＰＬ情報を用いると、１つの画像データセットで情報の両方のセットを示すように、ＴＰＬおよびＩＶ−ＯＣＴ画像を融合することができる。加えて、３次元ＩＶ−ＯＣＴおよびＴＰＬデータセットを単一の画像データセットに融合することができるように、引き戻し全体に対して同一の手順に従うことができる。
【００３６】
ここで図２を参照すると、組み合わされたＴＰＬデータなしで、典型的なＩＶ−ＯＣＴ画像を生成するように構成されるカテーテル５１０を使用して、ＩＶ−ＯＣＴ画像５００が生成されている。図２に示されるように、画像５００は、実質的に一様な壁を伴う健康な冠状動脈５２０を示す。動脈５２０の側面断面図５３０が、図２の下部分に示されている。側面断面図５３０は、カテーテル５１０の引き戻し中に線５６０に沿って得られた動脈５２０の再構築された図である。
【００３７】
ここで図３を参照すると、同様に組み合わされたＴＰＬデータなしで、典型的なＩＶ−ＯＣＴ画像を生成するように構成されるカテーテル６１０を使用して、ＩＶ−ＯＣＴ画像６００が生成されている。図３に示されるように、画像６００は、ほぼ１時〜３時の位置で大きな脂質コアの上を覆って位置する、薄い被膜の線維性アテローム６４０を伴う冠状動脈６２０を示す。動脈６２０の側面断面図６３０は、図３の下部分に示されている。側面断面図６３０は、カテーテル６１０の引き戻し中に線６６０に沿って得られた動脈６２０の再構築された図である。
【００３８】
画像６００は、薄い被膜の線維性アテローム６４０を示すが、提供される画像からプラーク破裂の危険性を容易に査定することはできない。画像６００は、解剖学的構造の表示を提供するが、ユーザが細胞組成を評価することを可能にしない。例えば、画像６００は、マクロファージ、脂質沈着、およびコラーゲン／エラスチン線維の存在の指示、すなわち、プラーク破裂の危険性を示すことができる初期細胞マーカーを直接提供しない。
【００３９】
本発明の実施形態（例えば、図１に示されるシステム５０、または図５Ａ、５Ｂ、６、あるいは７に示される特定の例示的システムを含む）は、図４で図示されるような画像７００に類似する、複合ＯＣＴ−ＴＰＬ画像を提供するように構成される。画像７００は、冠状動脈の一部を検査する複合ＯＣＴ−ＴＰＬシステムによって生成することができる。例えば、冠状動脈７２０は、ほぼ１時〜３時の位置で大きな脂質コアの上を覆って位置する、薄い被膜の線維性アテローム６４０を備えている。
【００４０】
図３の画像と異なり、図４に示される画像（拡張ＯＣＴ−ＴＰＬ画像）は、解剖学的構造の表示および構造の細胞組成を分析する能力の両方をユーザに提供する。例えば、例示的なＯＣＴ−ＴＰＬシステム内の光子計数検出器は、例えば、マクロファージ、エラスチン線維、および／または脂質液滴を含む、薄い被膜の線維性アテローム７４０の細胞成分中で濃縮され得るナノ粒子からの二光子発光（ＴＰＬ）７５０を検出することができる。解剖学的構造の複合画像、ならびに構造の細胞組成の指示は、ユーザが、特定の構造に関連付けられるプラーク破裂の危険性のより徹底的な分析を行うことを可能にすることができる。
【００４１】
本開示の例示的実施形態はまた、本装置によって取得される画像を定量的に分析し、ある側面の視覚表示を増進する、コンピュータ読み取り可能な媒体（例えば、ソフトウェア）を備え得る。例えば、カテーテルが血管管腔内で中心に置かれない場合、カテーテルからより遠くにある、目的とする部位から放出される光は、（カテーテルにより近い部位から放出される光と比較して）肉眼には明るく見えない場合がある。
【００４２】
ここで図１５−１６を参照すると、一実施形態では、コンピュータ読み取り可能な媒体は、プロセス８００の以下のステップを行うように構成することができる。（１）ステップ８１０でカテーテルを識別する。（２）ステップ８２０で管腔（例えば、分析されている組織の血管壁）を識別する。（３）ステップ８３０で、各Ａスキャンに対するカテーテルと管腔との間の距離、およびカテーテルまでの全体的平均距離（Ｍｅａｎｏｖｅｒａｌｌ）を計算する。（４）ステップ８４０で、Ｍｅａｎｏｖｅｒａｌｌ（Ａｃｌｏｓｅｒ）よりカテーテルに近いＡスキャンの平均、およびＭｅａｎｏｖｅｒａｌｌ（Ａｆｕｒｔｈｅｒ）よりカテーテルまで遠いＡスキャンの平均を計算する。（５）ステップ８５０で、Ｂスキャンにおける値の範囲、（最大値−最小値）によって、ＡｃｌｏｓｅｒおよびＡｆｕｒｔｈｅｒを正規化（それぞれ、ＡｃｌｏｓｅｒＮ、およびＡｆｕｒｔｈｅｒＮ）する。（６）ステップ８６０で、各Ａスキャンにおいて、Ａスキャン管腔がＭｅａｎｏｖｅｒａｌｌと比較してカテーテルにより近いかまたは遠いかどうかに応じて、ＡｃｌｏｓｅｒＮまたはＡｆｕｒｔｈｅｒＮにおける対応するピクセルより大きいそれらのピクセルとして、輝点を識別する。加えて、輝点を識別するためにＡスキャンの平均化を行うことは、強度対深度を補正するように、カテーテルビームのガウス形状によって各Ａスキャンを拡大縮小することによって置き換えることができる。
【００４３】
ここで図１６Ａを具体的に参照すると、図１６Ｂの処理された画像と比較して、未処理画像が示されている。図１６Ｃでは、Ｂスキャン画像が長方形で示されている。青色の指示線で強調表示されたＢスキャンの一部分は、平均距離より小さい、カテーテルと管腔壁との間の距離を伴う場所から取得されていることに留意されたい。同様に、緑色の指示線で強調表示されたＢスキャンの一部分は、平均距離より大きい、カテーテルと管腔壁との間の距離を伴う場所から取得されている。図１６Ｄは、管腔で整列させられたＡスキャンを示す。図１６Ｆは、（赤紫色の）例示的Ａスキャン、ならびにカテーテルと管腔壁との間の距離が平均距離より小さい（青色）、および平均距離より大きい（緑色）、それらの場所の正規化基準値を示す。
【００４４】
図１６Ｆの例示的スキャンが正規化値を超える場所は、「輝点」として識別することができ、画像を図１６Ｂに示されるように増進することができる。これは、さらに調査されることができる目的とする部位を、ユーザがより客観的に識別することを可能にすることができる。
【００４５】
例示的実施形態はまた、ＯＣＴ情報にＴＰＬデータを重ね合わせることによって、テクスチャ分析を行うことも可能である。データセットは、プラークの場所、組織型、および他の生理学的情報等の追加の情報を医師に提供するように、３次元レンダリングおよび処理中に分析することができる。この情報は、テクスチャ分析、レイトレーシング、または他の高度処理技法を使用して、３次元データセットから計算され得る。
【００４６】
角度分解されたＯＣＴシステムの例示的実施形態は、複数の３次元データセットを生成し得、その場合、分析が全てのデータセットに対して行われ、追加の情報を医師に提供するように組み合わせられることも、そうでないこともある。
【００４７】
要約すると、本明細書で説明される複合ＯＣＴ−ＴＰＬ撮像システムは、２つの光学コントラスト機構、すなわち、後方散乱および二光子発光を提供することができる。本明細書で説明されるカテーテルベースの装置の実施形態は、高ピーク電力短パルスレーザ光、およびＯＣＴに利用されるもの等の広帯域光の両方の同時単一モード送達を必要とする、光ベースのモダリティに利用され得る。本開示の例示的実施形態は、生体内で薄い被膜の線維性アテローおよびその細胞成分（例えば、マクロファージ、コラーゲン／エラスチン線維、脂質液滴）を同時に撮像するように、カテーテルベースのＯＣＴ−ＴＰＬ撮像システムにおいてＩＶＯＣＴをＴＰＬ撮像と組み合わせ、これは、ＩＶＯＣＴ単独に優る決定的利点を有し、心臓血管介入中に経時的に薄い被膜の線維性アテロームの脆弱性についての重要な情報を心臓専門医に提供するであろう。特定の実施形態の特定の構成、特徴、および方法は、以下で提供される実施例に記載される。
【００４８】
（実施例１−カテーテルベースの強度ＯＣＴ−ＴＰＬシステム）
カテーテルベースの強度ＯＣＴ−ＴＰＬシステム（図５Ａおよび５Ｂに示される）の実施例は、同調可能なフェムト秒レーザ励起（例えば、７６０ｎｍ〜１０４０ｎｍ、６ｎＪ〜５μＪ、１００ｆｓ〜１ｐｓ、５００ｋＨｚ〜８０ＭＨｚ）を使用するＴＰＬと組み合わせられた、１３１０ｎｍで動作するスペクトル領域ＯＣＴシステムを組み込むことができる。フェムト秒レーザ光の群分散遅延を事前に補償して、管腔表面に変換制限パルスを提供するために、パルス圧縮機を利用することができる。撮像カテーテルは、ＯＣＴ光およびＴＰＬ励起光の両方の単一モード伝搬、ならびにＴＰＬ放射光の透過（例えば、ＯＣＴ光およびＴＰＬ励起光が同時に透過させられる）を可能にすることができる、ＯＣＴ−ＴＰＬ撮像システムのフォトニック結晶ファイバ（ＰＣＦ）（例えば、ＬＭＡ−２０、ＮＫＴ  Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ）に接続される。ある実施形態では、ＰＣＦは、１５μｍコア（例えば、ＬＭＡ−１５）を備え得る。
【００４９】
図５Ａは、ビームスプリッタ（ＢＳ）と、帯域通過フィルタ（ＢＰ）と、ショートパスフィルタ（ＳＰ）と、光子増倍管（ＰＭＴ）と、フォトニック結晶ファイバ（ＰＣＦ）を備えている、カテーテルベースの強度ＯＣＴ−ＴＰＬ撮像システムを描写する。図５Ａは、ＴＰＬ励起光がダイクロイックミラーを通してＰＣＦファイバに透過させられない、実施例を図示する。
【００５０】
図５Ｂもまた、ビームスプリッタ（ＢＳ）と、帯域通過フィルタ（ＢＰ）と、ショートパスフィルタ（ＳＰ）と、光子増倍管（ＰＭＴ）と、フォトニック結晶ファイバ（ＰＣＦ）を備えている、カテーテルベースの強度ＯＣＴ−ＴＰＬ撮像システムを描写する。しかしながら、対照的に、図５Ｂは、ＴＰＬ励起光の一部分がダイクロイックミラーを通してＰＣＦファイバに（後に、走査光学モジュールおよびサンプルに）透過させられる、実施例を図示する。結果として、ＴＰＬおよびＯＣＴ光源、ならびに関連器具類の配列もまた、図５Ａおよび５Ｂに示されるように異なる。いずれか一方の構成では、分散補償器もまた、当技術分野で公知であるようにＯＣＴ基準アーム分岐に配置することができる。
【００５１】
ある実施形態では、ＴＰＬおよびＯＣＴ画像のマージした画像を生成するために、図５Ａおよび５Ｂに示されるシステムを使用することができる。ヒト冠状動脈のＴＰＬ、ＯＣＴ、およびマージした組織画像の実施例が、図１７および１８に示される。図に示されるように、マージした画像は、ＯＣＴ（本実施例では緑色）およびＴＰＬ（本実施例では赤色）を用いて取得された画像の一部分を示すために、異なる色を使用し得る。
【００５２】
図１７および１８の画像を生成するために使用されるシステムの動作中、ＯＣＴパラメータは、以下の通りであった。掃引レーザ：１３１０ｎｍ／１１０ｎｍ、ビームサイズ：２０μｍ、レーザ出力：１．２ｍＷ、視野：２ｍｍ×２ｍｍ、およびＡスキャン速度：２０ｋＨｚ。加えて、図１７および１８の画像を生成するために使用されるシステムのＴＰＬパラメータは、以下の通りである。２−Ｐ励起レーザ：７６０ｎｍ〜１０４０ｎｍ、１２０ｆｓ、８０ＭＨｚ、ピクセル滞留時間：４ミクロン秒、レーザ出力：５００ｍＷ、ビームサイズ：２０μｍ、放射フィルタ：＜７００ｎｍ、視野：２ｍｍ×２ｍｍ。
【００５３】
ここで図１９を参照すると、例示的実施形態によるＴＰＬ撮像技法を用いて取得された画像が表示されている。画像は、アテローム動脈硬化性プラークを伴うウサギ大動脈組織切片を表示する。明るいＴＰＬ信号は、脂質液滴、コラーゲン、およびエラスチン線維からの自然自己蛍光である。
【００５４】
図２０は、例示的実施形態によるファイバベースのシステムを用いて取得されたヒト冠状動脈組織のＴＰＬ、ＯＣＴ、およびマージしたＴＣＬ−ＯＣＴ画像を表示する。加えて、図２０の右下部分は、脂質の分布を示す、染色組織切片を備えている。
【００５５】
（実施例２−カテーテルベースの高偏光感度ＯＣＴ−ＴＰＬシステム）
カテーテルベースの高偏光感度ＯＣＴ−ＴＰＬシステム（図６に示される）の一実施例は、同調可能なフェムト秒レーザ励起（例えば、７６０ｎｍ〜１０４０ｎｍ、６ｎＪ〜５μＪ、１００ｆｓ〜１ｐｓ、５００ｋＨｚ〜８０ＭＨｚ）を使用するＴＰＬと組み合わせられた、１３１０ｎｍで動作するスペクトル領域高偏光感度ＯＣＴ（ＰＳＯＣＴ）システムを組み込むことができる。図６のシステムは、インラインファイバ偏光計の役割を果たす偏光維持ファイバ区画（ＰＭ１およびＰＭ２）と、偏光ビームスプリッタ（ＰＢＳ）と、帯域通過フィルタ（ＢＰ）と、ショートパスフィルタ（ＳＰ）と、光子増倍管（ＰＭＴ）と、フォトニック結晶ファイバ（ＰＣＦ）とを備えている。
【００５６】
ＰＳＯＣＴシステムは、基準光および干渉縞の両方の偏光状態を測定するために、平衡検出およびインラインファイバ偏光計［２９］を利用する。干渉計のサンプル経路中の開放光学スイッチは、（基準光とサンプル光との間に干渉縞を伴わない）基準光の偏光状態のみを含む信号の測定を可能にする。フェムト秒レーザ光の群分散遅延を事前に補償して、管腔表面に変換制限パルスを提供するために、パルス圧縮機を利用することができる。撮像カテーテルは、ＯＣＴ光およびＴＰＬ励起／放射光の両方の伝搬を可能にすることができる、ＯＣＴ−ＴＰＬ撮像システムのフォトニック結晶ファイバ（ＰＣＦ）（例えば、ＬＭＡ−２０、ＮＫＴ  Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ）に接続することができる。
【００５７】
（実施例３−カテーテルベースのスペクトル領域高位相感度ＯＣＴ−ＴＰＬシステム）
カテーテルベースの高位相感度ＯＣＴ−ＴＰＬシステム（図７に示される）の一実施例は、同調可能なフェムト秒レーザ励起（例えば、７６０ｎｍ〜１０４０ｎｍ、６ｎＪ〜５μＪ、１００ｆｓ〜１ｐｓ、５００ｋＨｚ〜８０ＭＨｚ）を使用するＴＰＬと組み合わせられた、１３１０ｎｍで動作するスペクトル領域高位相感度ＯＣＴ（ＰｈＳＯＣＴ）システムを組み込むことができる。図７のシステムは、偏光ビームスプリッタ（ＢＳ）と、帯域通過フィルタ（ＢＰ）と、ショートパスフィルタ（ＳＰ）と、光子増倍管（ＰＭＴ）と、フォトニック結晶ファイバ（ＰＣＦ）とを備えている。
【００５８】
フェムト秒レーザ光の群分散遅延を事前に補償して、撮像されている血管の管腔表面に入射する変換制限パルスを提供するために、パルス圧縮機を利用することができる。撮像カテーテルは、ＯＣＴ光およびＴＰＬ励起光の両方の単一モード伝搬、ならびにＴＰＬ放射光の透過を可能にすることができる、ＯＣＴ−ＴＰＬ撮像システムのフォトニック結晶ファイバ（ＰＣＦ）（例えば、ＬＭＡ−２０、ＮＫＴ  Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ）に接続することができる。
【００５９】
（実施例４−ＯＣＴ−ＴＰＬカテーテル設計およびＺＥＭＡＸを使用する光学シミュレーション）
本実施例では、ＯＣＴ−ＴＰＬカテーテルが、ＴＰＬ励起および放射を組み込むように、現在のＯＣＴカテーテルを修正するであろう。以前、ナノ粒子を装填されたマクロファージの検出は、特注の多重光子顕微鏡を使用して行われた［３０］。したがって、提案されたカテーテルベースのＯＣＴ−ＴＰＬ撮像システムのＴＰＬ励起効率を、多重光子顕微鏡と比較することが望ましい。表１は、両方の撮像システムからのレーザ励起の特性評価を示す。
【００６０】
【表１】
2020195806.tif 000003
ＴＰＬ励起光を送達するためにＰＣＦが使用されるであろうため、送達することができる瞬間電力は、非線形シュレディンガー方程式を使用して表すことができる、ＰＣＦにおける非線形効果の発生によって制限される。
【００６１】
【数１】
2020195806.tif 000004
式中、｜Ａ｜２、β２、γ、ｚ、およびｔは、それぞれ、パルス瞬間電力［Ｗ］、群速度分散パラメータ［ｆｓ２ｃｍ−１］、非線形パラメータ［Ｗ−１ｋｍ−１］、位置［ｃｍ］、および時間［秒］である。本実施例で使用されるＰＣＦに対して、γ＝２１Ｗ−１ｋｍ−１［１７］、β２＝−１７２ｆｓ２ｃｍ−１、λ＝８００ｎｍ、ｃ＝３×１０８ｍ／秒を考慮すると、ＰＣＦにおける非線形効果の閾値を下回る最大瞬間電力は、非線形シュレディンガー方程式から解かれ、すなわち、｜Ａ｜２＝−２π２ｃ２β２／（λ２γ）＝４．４９ＭＷである。ＯＣＴ−ＴＰＬシステムにおけるフェムト秒レーザは、５ＭＷの瞬間電力を提供することができる（表１参照）が、ＰＣＦにおいて伝搬する実際の瞬間電力は、非線形効果の閾値より小さくなるように、約４．４９ＭＷに制限され得る。ＰＣＦにおけるいくらかの非線形性の許容は、スペクトルの広がりおよび追加のパルス圧縮を提供し得る。
【００６２】
ＺＥＭＡＸは、光学システムの設計をモデル化、分析、および支援することができる、ソフトウェアプログラムである。ＺＥＭＡＸを使用して、ＯＣＴ−ＴＰＬカテーテルの例示的実施形態をシミュレートして検証することができる。ＯＣＴ−ＴＰＬカテーテルのＺＥＭＡＸのモデルが、金ナノ粒子を含む動脈組織とのＯＣＴおよびＴＰＬ光相互作用をシミュレートするために構築されている（例えば、（ａ）ＯＣＴ−ＴＰＬカテーテルの２Ｄ側面図、および（ｂ）ＯＣＴ−ＴＰＬカテーテルの３Ｄ正面図を提供する、図８を参照）。
【００６３】
カテーテルは、グリンレンズ（材料：ＧＴＡＧ）、プリズム（ＢＫ７）、シース（ＴＨＶ＿ＧＥＮＥＲＩＣ）、およびフラッシュ流体（海水）を使用してモデル化される。動脈組織は、２層幾何学形状を使用してモデル化される。最上層が、金ナノ粒子（μａ＝１８１ｃｍ−１）と、内膜（μｓ＝２３９ｃｍ−１）とを含む一方で、底層は、内膜のみから成る。内膜組織の吸収係数およびナノ粒子の散乱係数は、それぞれ、金ナノ粒子および内膜組織のものと比較するとごくわずかであるため無視される。
【００６４】
動脈組織とのＯＣＴおよびＴＰＬ光相互作用のＺＥＭＡＸシミュレーションは、３つのステップで行われる。（１）グリンレンズの前面の中心に位置する点光源から動脈組織上への入射ＯＣＴ（１３１０ｎｍ）およびＴＰＬ（８００ｎｍ、１．３５ＭＷ、ＮＡ＝０．０４）励起光線。（２）ビーム組織界面における単一のマクロファージ細胞（金ナノ粒子を含む）が励起させられ、ＴＰＬを放射する。（３）マクロファージ細胞からのＴＰＬ放射光線がカテーテルまで辿られ、グリンレンズの前面に位置する検出器（図６に示されていない）によって検出される。
【００６５】
ＴＰＬ光路長（ＯＰＬ）、グリンレンズの前面におけるＯＣＴおよびＴＰＬ放射スポットサイズ、およびＰＣＦの中へ連結されることができるグリンレンズの前面におけるＴＰＬ放射出力を含む、３つの重要なパラメータが、ＺＥＭＡＸシミュレーションから計算される。具体的には、表２は、主光線および縁光線方向の両方において７９８ｎｍ〜８０２ｎｍに及ぶ、ＴＰＬ励起の５つの異なる波長のＯＰＬを示す。結果は、グリンレンズの前面から動脈組織表面までの５ｎｍの範囲内のＴＰＬ励起パルスの分散が１ｆｓ未満であることを示す。
【００６６】
【表２】
2020195806.tif 000005
グリンレンズの前面におけるＯＣＴおよびＴＰＬスポットサイズは、ＺＥＭＡＸ内の同一の位置に位置する検出器によって測定される（図９は、同一の位置に位置する検出器によって測定される、グリンレンズの前面におけるＯＣＴおよびＴＰＬスポットサイズを示す。検出器のサイズはグリンレンズの直径と同一である）。ＯＣＴ光のＮＡ（０．０５）がＴＰＬ励起（０．０４）より高いため、ＯＣＴスポットサイズ（１７．１μｍ）は、ＴＰＬ放射スポットサイズ（２１．８μｍ）よりわずかに小さい。使用されるＰＣＦは、例えば、２５μｍのコア直径を有し、それは、ＯＣＴおよびＴＰＬスポットサイズの両方がコアの中に収まることができることを示す。
【００６７】
次いで、ＰＣＦコアの中へ連結されることができるＴＰＬ放射出力が、図５に示される検出器から計算され、スポットサイズの中心から２５μｍ直径内の光線のみが含まれる。ＴＰＬ励起瞬間電力（１．３５ＭＷ）に基づいて、２５μｍ直径内の検出器における検出されるＴＰＬ放射瞬間電力は、１．５１×１０−４Ｗであるように計算され、それは、単一のＴＰＬ励起パルス（８００ｆｓ）が４２５個の光子／パルスを生成できることを示唆する。ＴＰＬ励起およびＯＣＴの繰り返し率が、それぞれ、５００ｋＨｚおよび５０ｋＨｚであるので、１０個のＴＰＬ励起パルスが単一のＯＣＴ  Ａスキャン内で記録されることができ、これは、４２５０個の光子／ＯＣＴ  Ａスキャンをもたらす。比較すると、データを収集するために使用される多重光子顕微鏡は、０．７個の光子／パルス（Ｈａｍａｍａｔｓｕ  ＰＭＴ仕様［３１］から計算される、データ図示せず）を記録し、多重光子顕微鏡からのナノローズの典型的なＴＰＬ画像中の蓄積光子／ピクセルは、１３３個の光子／ピクセルに制限される。従って、カテーテルベースのＯＣＴ−ＴＰＬシステム検出効率は、現在使用されている多重光子顕微鏡より１桁を上回って高い。
【００６８】
（実施例５−ナノロッド選択）
金ナノロッドは、マクロファージ（アテローム性動脈硬化症および癌に関与する重要な初期細胞マーカー）によって取り込まれ、マクロファージ標的化のための種々の撮像技法用の造影剤として使用されることができる。この研究の目的は、それぞれ、７００、７５６、８４４、および１０６０ｎｍでの表面プラズモン共鳴をともなう４つのサイズの金ナノロッドの二光子発光（ＴＰＬ）性質を比較することである。レーザ走査ＴＰＬ顕微鏡を使用して、単一ナノロッドおよびローダミン６Ｇ粒子からのＴＰＬが測定された。ナノロッドからのＴＰＬ放射スペクトルが、光子増倍ＣＣＤを伴う分光計によって記録された。４つ全てのサイズのナノロッドは、励起波長への依存性を伴う強いＴＰＬ強度を生成し、二光子作用断面（ＴＰＡＣＳ）がプラズモン増進されることを示した。（ＴＰＬプロセスを確認する）励起出力への発光強度の二次の依存性が、低出力レベルで観察され、その後、光退色効果による高出力レベルでの強度飽和または減少が続いた。単一のナノロッドの最大ＴＰＡＣＳは、７６０ｎｍ励起での単一のローダミン６Ｇ粒子の２５ＧＭと比較して、１２２７１ＧＭと測定された。ナノロッドＴＰＬ放射スペクトルの特性は、ブリユアン領域中のＸおよびＹ対称点付近の穴とのフェルミレベル付近の電子の再結合によって説明することができる。選択された撮像用途のためのもっとも明るい造影剤の選択を誘導するために、ナノロッドのＴＰＬ輝度、ＴＰＡＣＳ、および放射スペクトルの比較結果を使用することができる。
【００６９】
最も一般的な心臓血管疾患のうちの１つである、アテローム性動脈硬化症は、米国内の全ての死亡の３分１を占める［３２］。血流中のマクロファージは、アテローム動脈硬化性プラークを含む血管の内膜層に浸透し、プラークベースのマクロファージ（ＰＢＭ）になる。ＰＢＭは、薄い線維性被膜（厚さ６５μｍ未満）を浸食し、プラークをより破裂しやすくする、マトリクスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）を放出することによって、炎症を加速する［３３、３４］。腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）は、多くの癌（例えば、乳、前立腺、卵巣、子宮頸、肺癌、および皮膚黒色腫）の進行において基本的な役割を果たすことが知られている［３５］。腫瘍において、浸透ＴＡＭは、（毒性Ｔ細胞活性の直接および間接的抑制を通して）腫瘍成長のための免疫抑制性微小環境を提供し、血管形成を助長し、悪性細胞の増殖および存続を支援する可溶性メディエータを生成する［３６］。これらの理由により、固形腫瘍におけるＴＡＭ密度は、概して、患者予後と逆の相関があると表される［３５］。加えて、ＴＡＭの存在と異所性組織への局所侵入および／または転移との間の関連性が、多くの癌で確立されている［３５、３６］。したがって、マクロファージは、将来のプラーク破裂の危険性、ならびに癌の病期および転移に関連する情報を提供する、重要な初期細胞マーカーである。生体内マクロファージ検出は、多大に臨床的に有意であり、金ナノ粒子等のマクロファージ標的造影剤の開発の動機になっている。
【００７０】
ナノスフェア［３７、３８］、ナノシェル［３９、４０］、ナノケージ［４１、４２］、ナノローズ［４３、４４］、ナノロッド［４５、４６］等を含む、異なるコーティングを伴う種々の金ナノ粒子が、それらの独特の光学性質（すなわち、吸収、散乱、および蛍光）、ごくわずかな細胞毒性、および良好な生体適合性により、マクロファージを標的にするように開発されてきた。バルク金蛍光の量子収量が極めて弱い（約１０−１０）ことが観察されたが［４７］、金ナノ粒子は、局所光照射野振幅を強力に増進し［４８、４９］、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）効果［５１−５３］によって量子収量を１０−４レベルまで有意に増加させることができ［４９］、これは、光の入射電磁光照射野と共鳴する金ナノ粒子の伝導帯における電子のコヒーレント振動として知られている。バンド間減衰の著しい抑制により、ナノロッドは、小さいナノスフェアより高い局所照射野増進係数を呈する［５４］。Ｍｏｈａｍｅｄらは、バルク金にわたる単一光子プラズモン励起によって、金ナノロッドの量子収量の１０６倍またはそれを上回る増進を観察した［５５］。ナノロッドは、対称形状を伴うそれらの対応物（例えば、ナノスフェア、ナノシェル、およびナノケージ）と異なり、アスペクト比を変動させることによってＳＰＲを近赤外線波長（組織吸収が最小である）に容易に合わせることができる［５６−５９］。また、ナノロッドの合成手順が確立されており、他の複雑ナノ構造（例えば、ナノローズおよびナノケージ）の合成と比較して、より良好な単分散および安定性を提供する。単一光子励起より良好な二光子または多重光子励起プロセスは、追加の局所照射野増進、したがって、より強力な放射信号を伴う量子収量のさらなる増進を提供する。ナノロッドの単一光子量子収量は、約１０−４であるが、ナノロッドの二光子作用断面（ＴＰＡＣＳ）は、量子ドットの範囲（２０００ＧＭ〜４７０００ＧＭ）［６０］内であり、有機フルオロフォア（例えば、ローダミン６Ｇ）よりはるかに高い、２３２０ＧＭに達することができ、二光子励起を使用して、生物組織中でこれらのナノロッドを検出する有望なアプローチを提供することが報告されている。
【００７１】
二光子発光顕微鏡法（ＴＰＬＭ）は、組織がより弱く散乱し、より少ない吸収を有する、その近赤外線励起により、特に興味を引く。ＴＰＬＭは、他の画像診断法（例えば、ＭＲＩ、ＣＴ、ＰＥＴ、ＯＣＴ、および超音波）と比較して、ナノロッドの最良コントラストおよび最高３Ｄ空間分解能を提供することができる（例えば、［６１−６３］）。単一ナノロッドのいくつかのＴＰＬＭ研究が、二次電力依存性［６４、６５］、ナノロッドの特定の位置における局所照射野増進［６５］、発光偏光およびスペクトル［６０、６７］の詳細な説明とともに報告されている。しかしながら、複数の励起波長における異なるサイズのナノロッドからの二光子発光（ＴＰＬ）のさらなる特性評価および比較が必要とされ、これらは、（１）ナノロッドのＴＰＬ輝度の比較、（２）ＴＰＬプロセスの範囲励起出力、およびナノロッドの光退色効果、（３）ナノロッドのＴＰＡＣＳ、および（４）ナノロッドのＴＰＬスペクトルを含む。これらの研究は、ナノロッドからのＴＰＬのより深い理解を提供し、造影剤選択および最適化を誘導することができる。
【００７２】
この研究では、複数の励起波長での異なるサイズのナノロッドのＴＰＬ特性評価を調査するために、レーザ走査ＴＰＬ顕微鏡が使用された。７５６ｎｍでプラズモン共鳴を伴うナノロッドが、７６０ｎｍ励起での４つ全てのサイズのナノロッドの間で（同一の励起出力において）最も明るいことが分かった。全てのナノロッドは、低電力レベルで励起出力へのＴＰＬ強度の二次の依存性を呈し、その後に、光退色効果による、高電力レベルでの強度飽和または減少が続く。３つの励起波長における４つのナノロッドのＴＰＡＣＳが計算されて比較された。ナノロッドのＴＰＬ放射スペクトルは、電子正孔再結合によって解釈され、ＴＰＬ輝度測定と一致する。これらの実験および分析の結果は、ナノロッドサイズがＳＰＲ位置だけでなく、ＴＰＬ輝度、ＴＰＡＣＳ、およびＴＰＬ放射スペクトルも決定することを示唆する。
【００７３】
（材料および方法）
（サンプル調製）
以前に説明されたような種結晶成長方法を使用して、金ナノロッドが溶液中で合成された［６８］。それぞれ、７００、７５６、８４４、および１０６０ｎｍで表面プラズモン共鳴を伴う４つのサイズのナノロッドが、Ｎａｎｏｐａｒｔｚから購入され、簡潔に超音波分解され、使用前に原液濃度から１０回希釈された。ナノロッドサンプルが、スライドガラス上に５μｌ希釈を分散することによって調製され、カバースリップによって覆われ、厚さ５μｍのナノロッド溶液を形成した。スライドガラス上の４つのサイズのナノロッドの最終濃度は、それぞれ、５．７×１０１０、４×１０１０、７．２×１０１０、および２．８×１０１０ナノ粒子／ｍｌである。透過電子顕微鏡法（ＴＥＭ）は、ナノロッドの形態を明らかにし、ＴＰＬ画像は、回折限界での単一のナノロッドの形状を示した（図１０ａ−ｄ）。図１０は、研究で使用された金ナノロッドのＴＥＭ画像、（ａ）Ａｕ７００、（ｂ）Ａｕ７５６、（ｃ）Ａｕ８４４、（ｄ）Ａｕ１０６０を提供する。（ａ、ｂ、ｃ、ｄ）中の差し込み図は、４００ｎｍ〜７００ｎｍのスペクトル範囲内の８４０ｎｍ励起での単一のナノロッドのＴＰＬ画像である。ＴＥＭおよびＴＰＬ画像中のスケールバーは、それぞれ、２０ｎｍおよび１μｍを表す。（ｅ）レーザ走査ＴＰＬ顕微鏡の概略図。ＥＯＭ：電気光学変調器、ＰＭＴ：光電子増倍管。
【００７４】
金ナノロッドの長軸は、それぞれ、２．９、３．５、４．４、および６．７の対応するアスペクト比を伴って、３５ｎｍ〜６７ｎｍの範囲内である。ローダミン６Ｇ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）が、脱イオン水中で２つの濃度、すなわち、１１０μＭおよび１ｐＭに希釈された。１１０μＭを伴うサンプルがキュベットの中に密閉された一方で、１ｐＭを伴うサンプルは分散させられ、次いで、スライドガラス上で乾燥させられた（単一ローダミン６Ｇ粒子の分布を形成した）。ＴＰＡＣＳスペクトルが、キュベットおよび乾燥ローダミン６Ｇ粒子の両方に対して測定された。
【００７５】
（ＴＰＬ顕微鏡法）
レーザ走査ＴＰＬ顕微鏡（図１０ｂ、Ｐｒａｉｒｉｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ，ＷＩ）を使用して、ナノロッドからのＴＰＬが測定された。７６０ｎｍ〜１０４０ｎｍ（８０ＭＨｚ、１００ｆｓ）で放射するフェムト秒Ｔｉ：サファイアレーザ（Ｍａｉ  Ｔａｉ  ＨＰ，Ｎｅｗｐｏｒｔ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）が、励起光源として使用された。顕微鏡に進入するレーザビームの強度が、電気光学変調器（３５０−８０，ＣｏｎＯｐｔｉｃｓ，Ｄａｎｂｕｒｙ，ＣＴ）によって変調され、サンプルに送達される電力を測定するための電力計を伴うピックミラー（反射率１％）によって監視された。２Ｄ画像を生成するために、一対のガルバノメトリック走査鏡を使用して、ｘ−ｙ面内のサンプルにわたって対物レンズ（４０倍、ＮＡ＝０．８、水出現、Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｃｅｎｔｅｒ  Ｖａｌｌｅｙ，ＰＡ）の焦点量が走査された。サンプルからのＴＰＬ放射が、同一の対物レンズを通して収集され、７２０ｎｍロングパスダイクロイックミラーによって励起レーザ線から分離され、４つのチャネルの中へ向かわせられ、それぞれ、６４０ｎｍ〜６８０ｎｍ、５７０ｎｍ〜６２０ｎｍ、４９０ｎｍ〜５６０ｎｍ、および４３５ｎｍ〜４８５ｎｍのスペクトル範囲内で４つの光電子増倍管（ＰＭＴ１、２：Ｈ７４２２Ｐ−４０、ＰＭＴ３、４：Ｒ３８９６、Ｈａｍａｍａｔｓｕ，Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ，ＮＪ）によって検出された。励起レーザ線からの光子カウントを最小化するために、ショートパスフィルタ（ｅｔ７２０ｓｐ，Ｃｈｒｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｅｌｌｏｗｓ
Ｆａｌｌｓ，ＶＴ）がダイクロイックミラーの後に配置された。この研究では、検出光路中のダイクロイックミラーおよび帯域通過フィルタなしでＴＰＬ放射信号（７２０ｎｍ未満）を収集するために、ＰＭＴ１のみが使用された。ＴＰＬはまた、ＰＭＴ１を光子増倍ＣＣＤ（Ｓｈａｍｒｏｃｋ  ３０３ｉ，Ａｎｄｏｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｅｌｆａｓｔ，Ｉｒｅｌａｎｄ）を伴うファイバ連結分光計と交換することによっても測定された。
【００７６】
（ＴＰＡＣＳ計算）
ナノロッドのＴＰＡＣＳが、基準ローダミン６ＧサンプルからのＴＰＬ放射の比較方法によって決定された。サンプルからのＴＰＬ放射は、関連パラメータを用いた方程式（１）で表すことができる［６９］。
【００７７】
【数２】
2020195806.tif 000006
式中、Ｆ（光子／秒単位）は、単位時間につき収集されるＴＰＬ光子であり、φ（無次元）は、測定システムのＴＰＬ収集効率であり、Ｃ（モル／ｍｌ単位）は、フロオロフォア濃度（すなわち、ナノロッドおよびローダミン６Ｇ）であり、ｇｐ（無次元）は、励起源の二次時間コヒーレンスの程度であり、ｆは、レーザ変調周波数であり、τは、ＦＷＨＭパルス幅であり、ｎは、サンプルの屈折率であり、Ｐ（光子／秒単位）は、励起レーザ出力であり、λは、励起波長であり、η２σ２（ＧＭ単位、１ＧＭ＝１０−５０ｃｍ４ｓ／光子）は、ＴＰＡＣＳであり、η２およびσ２は、それぞれ、量子収量および二光子吸収断面である。ＴＰＬ画像中の単一粒子からＴＰＬ放射強度を測定することによって、Ｆｎ（ナノロッド）およびＦｒ（ｒローダミン６Ｇ）が取得された。ここで、全てのＴＰＬ信号は、同一のシステムにおいて同一の実験条件を用いて同一励起波長下で測定され、したがって、φ、ｇｐ、ｆ、τ、およびλは、ナノロッドおよびローダミン６Ｇサンプルについて同一である。２つのサンプルに方程式（１）を使用し、Ｐを平均電力
【００７８】
【数２−１】
2020195806.tif 000007
（ワット単位）に変更すると、方程式（２）に示されるように、ローダミン６Ｇの既知のＴＰＡＣＳ（（η２σ２）ｒ）と比較することによって、ナノロッドのＴＰＡＣＳ（（η２σ２）ｎ）を決定することができる。
【００７９】
【数３】
2020195806.tif 000008
（結果）
（ナノロッド輝度の電力依存性）
図１１ａは、４×１０１１ナノ粒子／ｍｌの濃度で測定された４つのサイズのナノロッドの単一光子吸収スペクトルを示す。図１１ｂは、７６０、８４０、および１０４０ｎｍの波長でのナノロッドの励起レーザ出力（１３２μＷ〜４．８ｍＷ）へのＭＰＬ強度依存性を示す。図１１ｃは、（ｂ）の低電力レベルでの励起レーザへのナノロッドの発光強度の二次の依存性を示す。（異なる励起波長でのナノロッドの各サイズに対する）１．７〜２．２の傾きが、ＴＰＬプロセスを確認する。
【００８０】
各ナノロッドに対して、２つの表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）吸収ピークを見ることができ、約５２０ｎｍでの１つのピークは、電子の横振動によるものであり、ナノロッドのサイズに対して鈍感である。他方の吸収ピークは、より長い波長に赤方偏移させられ、ナノロッドアスペクト比とともに増加するピーク波長を伴う電子の縦振動によるものである［５５、６９］。縦ＳＰＲ比の振幅もまた、理論的計算と一致してアスペクト比とともに増加する（Ａｕ８４４を除く）［５６］。３つの励起波長（すなわち、７６０、８４０、１０６０ｎｍ）における４つのサイズのナノロッドの多重光子発光（ＭＰＬ）が、ＴＰＬ顕微鏡によって測定された。図１１ｂは、対数尺度で励起レーザ出力（１３２μＷ〜４．８ｍＷ）へのナノロッド輝度依存性を示す。ＭＰＬ信号強度は、各ナノロッドに対して、より低い励起出力で最初に直線的に増加すること（すなわち、傾き≒２）が観察され、次いで、曲線が屈曲し、指数関数様増加を形成し始め、その後に信号飽和（例えば、Ａｕ７００−Ｅｘ７６０、８４０、１０４０、Ａｕ７５６−Ｅｘ７６０、Ａｕ８４４−Ｅｘ８４０、１０６０、Ａｕ１０６０−Ｅｘ８４０）または信号減少（Ａｕ７６０−Ｅｘ１０４０、Ａｕ１０６０−Ｅｘ１０４０）が続く。同一の励起出力で、ＭＰＬ信号強度は、励起波長がナノロッドの縦ＳＰＲにより近いときにより高い。励起が縦ＳＰＲ波長にある（またはそれに近い）とき、ＭＰＬ信号強度（すなわち、ナノロッド輝度）は、Ａｕ７５６＞Ａｕ７００＞Ａｕ８４４＞Ａｕ１０６０に従うことが観察され、Ａｕ７５６は、３７２μＷの励起出力で、Ａｕ１０６０より１１倍明るく見える。図１１ｃは、図１１ｂのより低い励起出力レベルでナノロッドＭＰＬを示す。１．７〜２．２に及ぶ全ての曲線の傾きは、ＴＰＬプロセスを示す、レーザ励起出力への発光信号強度の二次の依存性を示す。着目すべきことは、ＴＰＬプロセス出力範囲がナノロッドサイズとともに変動し、より大きいナノロッド（例えば、Ａｕ８４４、Ａｕ１０６０）がより小さいナノロッド（例えば、Ａｕ７００、Ａｕ７５６）より広い出力範囲を有すると考えられることである。
【００８１】
時間の関数としてのＭＰＬ応答が、ナノロッドのＭＰＬ光退色性質を検査するように測定された。より小さい視野（２０×２０μｍ２）内のナノロッドが、２ｍＷで３０秒間照射され、図１２ａに示されるようなより大きい視野（８０×８０μｍ２）に即時にズームアウトすることによって、ＴＰＬ画像が記録された。同図において、赤色ボックスは、より小さい視野を示す。各励起波長について、赤色ボックス内のナノロッドの平均強度が、より大きい視野内の赤色ボックス外のナノロッドの平均強度に対して正規化され、結果が図１１ｂに示された。赤色ボックス内の全てのサイズのナノロッドは、ナノロッドがはるかに短い照射時間を体験したより大きい視野内のものと比較して、３０秒間レーザ照射後にＭＰＬ信号減少を示した一方で、より大きいサイズのナノロッド（すなわち、Ａｕ８４４、Ａｕ１０６０）は、より小さいナノロッド（例えば、７６０ｎｍ励起でＡｕ７５６に対して２％減少）と比較して、縦ＳＰＲ励起波長でより著しい信号減少（例えば、１０４０ｎｍ励起でＡｕ１０６０に対して３５％減少）を示したことが観察された。ナノロッドのＭＰＬ時間的応答は、特に、より大きいサイズのナノロッドにおいて、光退色効果が明白であることを示唆する。
【００８２】
図１２ａは、ナノロッドのＭＰＬ信号減少が観察された、（ａ）における赤色ボックス（２０×２０μｍ２）内で２ｍＷでの３０秒間レーザ照射後に取得された、８４４ｎｍ励起でのＡｕ１０６０の典型的なＴＰＬ画像（８０×８０μｍ２）を示す。図１２ｂは、３つの励起波長での４つのサイズのナノロッドに対して、より大きい視野内の赤色ボックス外のナノロッドの平均ＭＰＬ信号（同一色の第１のバー）に対して正規化された赤色ボックス内のナノロッドの平均ＭＰＬ信号（同一色の第二のバー）を示す。エラーバーは、標準偏差を表す。
【００８３】
（ナノロッドのＴＰＡＣＳ測定）
ナノロッドのＴＰＡＣＳが決定されることができる前に、ローダミン６ＧのＴＰＡＣＳが測定される必要がある。６９０ｎｍ〜９６０ｎｍの励起波長範囲を伴うローダミン６Ｇ溶液のＴＰＡＣＳが、Ａｌｂｏｔａら［７１］によって報告されているが、このデータは、９６０ｎｍ〜１０４０ｎｍの波長範囲を含まない。この研究では、我々は、Ａｌｂｏｔａらのデータを８０ｎｍだけ拡張する７６０ｎｍ〜１０４０ｎｍの励起波長範囲で方程式（１）を使用して、ローダミン６Ｇ溶液および単一粒子の両方の正規化ＴＰＡＣＳを測定して計算した。ローダミン６ＧのＴＰＬプロセスが、全ての励起波長およびを適用された電力範囲（データ図示せず）において観察され、ローダミン６Ｇ溶液の測定は、８２０ｎｍで重複した主要吸収ピークを伴う７６０ｎｍ〜９６０ｎｍ範囲内の報告値に合理的に合致する。単一のローダミン粒子の吸収ピークは、８００ｎｍへの青色偏移を有し、１０００ｎｍでの第２のピークは、ローダミン６Ｇ溶液と比較して著しく減衰させられる。次いで、単一のローダミン６Ｇ粒子のＴＰＡＣＳが、方程式（２）に従ってナノロッドと比較するために輝度基準として使用された。
【００８４】
ナノロッドのＴＰＬ信号は、ＴＰＬプロセスを保証することができる、１ｍＷ励起出力未満で測定された。次いで、方程式（２）を使用して、単一のナノロッドのＴＰＬ輝度が、単一のローダミン６Ｇ粒子のものと比較され、結果が表３に示されている。我々は、（１）全てのナノロッドが、８２０ｎｍにおいて縦ＳＰＲを伴う金ナノロッドに対する以前の測定［６０］と一致する縦ＳＰＲ波長で、またはその近くで最大ＴＰＡＣＳを有することを観察した。ＴＰＡＣＳは、縦ＳＰＲから離れる励起波長とともに単調に減少する。（２）より小さいナノロッドは、縦ＳＰＲで、またはその近くで励起波長を伴う、より大きいナノロッドより大きいＴＰＡＣＳを有する（例えば、Ａｕ８４４に対するＥｘ８４０およびＡｕ１０６０に対するＥｘ１０４０と比較して、Ａｕ７５６およびＡｕ７００に対するＥｘ７６０）。７６０ｎｍ励起でのＡｕ７５６のＴＰＡＣＳは、調査される全てのナノロッドおよび励起波長の間で最大であり（単一のローダミン６Ｇ粒子の２５ＧＭと比較して１２２７１ＧＭ）、１０４０ｎｍ励起でＡｕ１０６０のＴＰＡＣＳより約１５倍大きい。８４０ｎｍ励起でのＡｕ８４４のＴＰＡＣＳは、２０３９ＧＭであり、それは、８３０ｎｍで励起させられた、わずかにより大きいサイズのナノロッドについて以前に報告された２３２０ＧＭ［６０］に非常に近い。
【００８５】
図１３は、７６０ｎｍ〜１０４０ｎｍの波長範囲でのローダミン６Ｇ単粒子、ローダミン６Ｇ溶液、およびＡｌｂｏｔａら［４１］からの報告値の正規化ＴＰＡＣＳを示す。単一ローダミン６Ｇ粒子は、乾燥水溶液から形成され、ローダミン６Ｇ溶液は、脱イオン水中に溶解させられた１１０μＭの濃度を有し、報告データは、ＭｅＯＨ中に溶解させられた１１０μＭのローダミン６Ｇ濃度を使用していた。
【００８６】
【表３】
2020195806.tif 000009
（３．３  ナノロッドのＴＰＬ放射スペクトル）
ナノロッドのＴＰＬ放射をより良く特性評価するために、ＴＰＬ放射スペクトルが、複数の励起波長（すなわち、７６０、８００、８４０、および１０４０ｎｍ）において３５０ｎｍ〜７００ｎｍの範囲内でナノロッド溶液（８０×８０μｍ２視野）から収集された。全てのナノロッドに対する平均励起出力は、ＴＰＬプロセスを満たすことができるように、１ｍＷ未満に保たれた。次いで、ＴＰＬ放射が、入射光子の数およびナノロッドの濃度によって正規化され、図１４に示された。
【００８７】
図１４は、７６０、８００、８４０、および１０４０ｎｍの励起波長での（ａ）Ａｕ７００、（ｂ）Ａｕ７５６、（ｃ）Ａｕ８４４、および（ｄ）Ａｕ１０６０のＴＰＬ放射スペクトルを示す。（ａ）における差し込み図は、電子増倍ＣＣＤおよび分光計の格子を含む、検出システムの全量子効率を表す。スペクトルは、量子効率に対して補正され、入射光子の数およびナノロッド濃度に基づき正規化された。
【００８８】
全てのＴＰＬスペクトルが、電子増倍ＣＣＤおよび分光計の格子の全量子効率に対して補正された（図１４ａの差し込み図）。各ナノロッドに対して、ＴＰＬ放射強度は、ナノロッドの縦ＳＰＲ波長で最高と考えられ、縦ＳＰＲピークから離れる励起波長とともに単調に減少し、ＳＰＲ吸収による電場増進を示唆する。励起波長がＳＰＲからより離れるほど、より著しくＴＰＬ放射信号が減少し、これは、図１１ｂに示されるようなナノロッド輝度のＰＭＴ測定の結果と一致する。全ての放射スペクトル強度は、（１０４０ｎｍ励起でのＡｕ１０６０を除いて）励起波長が位置する、より低い光子エネルギーに対して増加し、これは、局所的ＳＰＲの分散に起因し得る［７２］。放射スペクトル範囲は、３つの波長帯、すなわち、４００ｎｍ〜５７５ｎｍ、５７５ｎｍ〜６４０ｎｍ、および６４０ｎｍ〜７００ｎｍに分離することができる。約５７５および６４０ｎｍでの２つの下落が、全てのサイズのナノロッドのスペクトルで見られ、Ａｕ７５６、Ａｕ８４４、およびＡｕ１０６０に対して、より明白である。より小さいナノロッド（すなわち、Ａｕ７００、Ａｕ７５６）に対して、６４０ｎｍ〜７００ｎｍ帯域内のＴＰＬ放射強度は、より大きいナノロッド（すなわち、Ａｕ８４４）と比較して、他の２つの帯域より急速に増加する。興味深いことに、Ａｕ１０６０のＴＰＬ放射は、４００ｎｍ〜５７５ｎｍ帯域で停滞状態を呈し、その後に、５７５ｎｍ〜６４０ｎｍおよび６４０ｎｍ〜７００ｎｍ帯域で信号減少が続く。金ナノロッドに対するＴＰＬ機構がバルク金の金属に対するものと同一であるため［７２］、放射ピーク領域は、フェルミレベルでの励起電子とｄ帯内の正孔との間のエネルギー間隙に起因するはずである。我々は、第２の高調波信号も１０４０ｎｍ励起でナノロッドに対して観察されるが、他の励起波長では全く見られないことに着目している。スペクトル特徴の詳細が以下で議論される。
【００８９】
（考察）
ナノロッド輝度が、マクロファージ標的および検出における非常に重要なパラメータであり、それは、撮像システムの感度も決定するので、最も強いＴＰＬ信号を生じるナノロッドのサイズを選択することは、大いに臨床的関心であり、重要である。この研究では、４つのサイズのナノロッドが比較され、Ａｕ７５６が、同一の励起出力で、および対応する縦ＳＰＲの励起波長で最も強く放射することが分かった。実際、金ナノロッドからの単一光子励起による蛍光放射は、ＥｕｓｔｉｓおよびＥｌ−Ｓａｙｅｄによって実験およびシミュレーション研究［７３］で実証されるように、３つの要因、すなわち、（１）増加するナノロッドアスペクト比とともに増加するはずである、縦ＳＰＲ波長での単一光子吸収度の強度（図１１ａ）、（２）ｄ帯と伝導帯との間の電子遷移に起因し、約１．８ｅＶ（６８９ｎｍ）の閾値エネルギーで開始された、ＳＰＲ吸収帯とバンド間遷移との間の重複［７４、７５］、（３）約５２５ｎｍでピークになり、その後減少し、約７５０ｎｍを超えると減退する、バルク金のＳＰＲ吸収と蛍光帯との間の重複［４７］によって決定される。第１の要因は、他の２つの要因に対する競合構成要素であり、その正味の効果は、ＴＰＬ放射の増進を決定する。この研究では、ナノロッドのアスペクト比が２．９から６．７まで増加すると、縦ＳＰＲの増進が増加する一方で、ＳＰＲ吸収帯とバンド間遷移との間の重複、または金のバルク蛍光が両方とも減少する。したがって、観察された最も強い増進は、３．５のアスペクト比を伴うＡｕ７５６をもたらし、それは、Ａｕ１０６０より約１２倍高い。この観察は、単一光子励起を伴うナノロッドについて報告されたものに非常に類似し、ナノロッドの量子収量は、３．４を下回るアスペクト比に対して二次的に増加し、その後減少し［７６］、蛍光放射は、アスペクト比が３．２５を超えて増加すると、６のアスペクト比で約１桁弱くなるまで減退し始める［７３］。
【００９０】
ナノロッドが光退色に対して本質的に不活性であり、ナノロッド上の光散乱が、量子ドットまたは染料からの蛍光とは対照的に、数時間の測定時間にわたって一定のままとなることができる単一光子励起［７７］と異なり、ナノロッドからのＴＰＬ放射信号は、ナノロッドのサイズに応じて、種々のレベルの光退色を呈する（図１２）。実際、ＴＰＬ放射は、瞬間入射電力によって決定される。ＴＰＬ放射信号は、励起出力を増加させると、最初、入射野による放射の増進により増加し、次いで、減少し、最終的に、ナノロッド形状変換または損傷による増進の消失により減退する。ＬｉｎｋおよびＥｌ−Ｓａｙｅｄら［７８］は、ナノロッドの完全融解のための閾値が、８００ｎｍ励起、１００ｆｓのパルス持続時間で約０．０１Ｊ／ｃｍ２（１００ＧＷ／ｃｍ２）であることを実証した一方で、ナノロッドの明白な形状変換および縦ＳＰＲ帯の減少は、１０ＧＷ／ｃｍ２で観察される。Ｂｏｕｈｅｌｉｅｒら［７９］は、ナノロッドを高励起出力で球形に変換されることができ、対応する発光ピークが青色偏移させられ、放射増進が大幅に低減させられ得ることを示した。この研究では、ビーム焦点での瞬間電力密度は、１０４０ｎｍ励起で１３ＧＷ／ｃｍ２であり（２ｍＷの平均電力）、それは、１０ＧＷ／ｃｍ２より大きく、視野内のナノロッドの一部を再成形する可能性が非常に高い。したがって、発光放射が低減させられ、さらに、この光退色効果が、特に、入射レーザ光の偏光と整列させられたより大きいサイズを伴うもの（すなわち、Ａｕ８４４、Ａｕ１０６０）に対して、成形または部分ナノロッド損傷に起因することが予測される。
【００９１】
金結晶構造は、電子遷移がＸおよびＬ対称点付近で優先的に発生する第１のブリユアン領域において、いくつかの対称点を有することが知られている［６７、８０］。金ナノロッドでは、ＸおよびＬ対称点は、それぞれ、ナノロッドの長軸および対角線の方向に沿うことができる［６７］。ナノロッドにおけるＴＰＬ放射プロセスは、３つのステップで解釈することができる［４６、５４、７４］。（１）占有ｄ帯（またはおそらくフェルミレベルを下回るｓｐ伝導帯［６７］）内の電子が、二光子吸収によってフェルミレベルを上回る未占有ｓｐ伝導帯へ励起させられ、電子正孔対が作成される。（２）次いで、励起した電子が、（例えば、バンド内散乱を通して）エネルギーを損失し、エネルギー的にフェルミレベルにより近づく。（３）電子正孔対の再結合が発光放射をもたらす。金のバンド構造計算［７２、８１］によると、放射ピーク領域は、６−５Ｘ、６−５Ｌ、および６−４Ｌの対称点に起因する、それぞれ、１．８ｅＶ〜１．９ｅＶ（６５２ｎｍ〜６８９ｎｍ）、２．３ｅＶ〜２．４ｅＶ（５１７ｎｍ〜５３９ｎｍ）、および３．１ｅＶ〜３．３ｅＶ（３７６ｎｍ〜４００ｎｍ）のスペクトル範囲内にあるはずである。この研究では、対応する縦ＳＰＲ励起波長でのナノロッドのＴＰＬ放射ピークは全て、約６８０ｎｍおよび５３０ｎｍに位置することが観察され、急な立ち上がりエッジが約４００ｎｍで発現し、これは、それぞれ、６−５Ｘ、６−５Ｌ、および６−４Ｌ対称点からの放射のバンド計算と非常に一致する。着目に値することは、第２の高調波信号が（報告された観察［７１］と一致して）１０４０ｎｍ励起のみで明白であるが、他の励起波長では観察されないことであり、これは、ＴＰＬ放射の分散における、弱い第２の高調波信号の浸漬に起因し得る。
【００９２】
（結語）
ＴＰＬＭを利用することによって、金ナノロッドのＴＰＬ性質が調査され、特性評価された。７００、７５６、８４４、および１０６０ｎｍの縦ＳＰＲ波長を伴う４つのサイズのナノロッドが、複数の励起波長（すなわち、７６０、８４０、１０４０ｎｍ）で励起させられた。Ａｕ７５６は、全てのナノロッドの間で、同一の励起出力を用いて７６０ｎｍ励起で最も強いＴＰＬ信号を放出することが観察された。励起出力へのＴＰＬ強度の二次の依存性が、低電力レベル（例えば、＜１．６ｍＷ）で満たされた一方で、光退色効果は、特により大きいサイズのナノロッドについて、高電力レベル（例えば、＞１．６ｍＷ）で明白であった。３つの励起波長でのナノロッドのＴＰＡＣＳが、単一のローダミン６Ｇ粒子の正規化ＴＰＡＣＳスペクトルの測定に基づいて計算された。ナノロッドのＴＰＬ放射スペクトルは、金の電子バンド計算に合致し、ＴＰＬ輝度測定と一致する。結果は、金ナノロッドがＴＰＬＭのための有望な造影剤であり、ナノロッドのＴＰＬ輝度、ＴＰＡＣＳ、および放射スペクトルの比較によって、最も明るいナノロッドを決定できることを示唆する。
【００９３】
本開示に照らして、必要またはそれを上回る実験を伴わずに、本明細書で開示および請求されるデバイス、システム、および／または方法の全てを作製し、実行することができる。本発明のデバイス、システム、および方法は、特定の実施形態に関して説明されているが、本発明の概念、精神、および範囲から逸脱することなく、本明細書で説明される方法のステップにおいて、または一連のステップにおいて、変形例がデバイス、システム、および／または方法に適用され得ることが当業者に明白となるであろう。当業者に明白である全てのそのような類似置換および修正は、添付の請求項によって定義されるような本発明の精神、範囲、および概念内であると見なされる。
【００９４】
（参考文献：）
以下の参考文献の概念は、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【００９５】
【化１−１】
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【００９６】
【化１−２】
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【００９７】
【化１−３】
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【００９８】
【化１−４】
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【００９９】
【化１−５】
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【０１００】
【化１−６】
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【０１０１】
【化１−７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１６Ｅ】
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【図１６Ｆ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【外国語明細書】
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