(57)【要約】【課題】血液脳関門を横切ることができる組成物、及び血液脳関門内の標的にエフェクター剤を送達させるためのこれらの組成物を使用する方法を提供することを目的とする。【解決手段】本発明は、血液脳関門を通過することが可能であるｌｙｎｘ１−ループ２由来のペプチドを含む組成物及び方法に関する。より具体的には、本発明は、配列番号４の配列を含む輸送因子ペプチドを含む組成物を提供する。該組成物は、エフェクター剤を含むことができ、所期の輸送能力を有する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ以上のリンカー、化学修飾、ペプチドリンカー、化学リンカー、共有結合もしくは非共有結合、および／またはタンパク質融合を介してエフェクター剤にコンジュゲートされた配列番号４を含む輸送因子ペプチドを含む組成物。
【請求項２】
１つ以上のリンカーがポリアルギニンリンカーを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
ポリアルギニンリンカーがポリＤアルギニンリンカーを含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
エフェクター剤が、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、鎖鋳型ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、アプタマー、並びにオリゴヌクレオチド、遺伝子、ペプチド、タンパク質、低化学分子、大化学分子、ウイルス粒子、リポソーム、エンドソーム、エキソソーム、ナノ粒子、デンドリマー、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）リガンド、真核細胞、原核細胞、マイクロスフェア、ナノゲル及びバイオナノカプセルの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
エフェクター剤がｓｉＲＮＡである、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
血液脳関門を横切って見出される標的に輸送因子ペプチドコンジュゲートを輸送するための医薬組成物であって、前記医薬組成物は、血液脳関門の受容体に輸送因子ペプチドコンジュゲートを輸送するのに適していて、１つ以上のリンカー、化学修飾、ペプチドリンカー、化学リンカー、共有結合もしくは非共有結合、および／またはタンパク質融合を介してエフェクター剤にコンジュゲートされた配列番号４を含む輸送因子ペプチドを含む、上記医薬組成物。
【請求項７】
１つ以上のリンカーがポリアルギニンリンカーを含む、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
標的に輸送因子ペプチドコンジュゲートを輸送することが、インビトロの細胞培養において行われる、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項９】
標的に輸送因子ペプチドコンジュゲートを輸送することが、マウス又はヒトの対象において行われる、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
血液脳関門の受容体が細胞又は細胞外分子上にある、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
細胞が、ニューロン、神経細胞、脳細胞、グリア細胞、星状細胞、神経支持細胞、及び中枢神経系の細胞からなる群から選択される、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
血液脳関門の受容体がニコチン性受容体である、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
細胞外分子がタンパク質を含む、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
エフェクター剤が、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、鎖鋳型ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、アプタマー、並びにオリゴヌクレオチド、遺伝子、ペプチド、タンパク質、低化学分子、大化学分子、ウイルス粒子、リポソーム、エンドソーム、エキソソーム、ナノ粒子、デンドリマー、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）リガンド、真核細胞、原核細胞、マイクロスフェア、ナノゲル及びバイオナノカプセルの組み合わせからなる群から選択される、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
エフェクター剤がｓｉＲＮＡである、請求項６に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その全内容が参照により本明細書に援用される、２０１１年６月３日に出願された米国仮出願第６１／４９２，８８４号優先権を主張し、その利益を主張する。
【０００２】
連邦政府支援の研究又は開発に関する陳述
本発明は、国立衛生研究所によって与えられた５Ｒ４３ＭＨ０９４００４−０１及び５Ｒ４３ＭＨ０９４００４−０２の下での政府支援を受けてなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
分野
本開示は、血液脳関門を横切ることができる組成物、及び血液脳関門内の標的にエフェクター剤を送達させるためのこれらの組成物を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
認知能力の減退は、多くの疾患状態（例えば、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、うつ病、統合失調症、及び注意欠陥多動性障害（ＡＤＨＤ）などの行動障害）と関連している。これらの疾患状態は、常に、生活の質に最も有害なものとなっている。過去数十年間において、コリン作動系、特にニコチン性アセチルコリン受容体は、正常な認知のために極めて重要であることが示されている。しかし、多くの努力にもかかわらず、ニコチン性アセチルコリン受容体に基づく認知強化療法が市場に投入されていない。実際、これまでに、有効な治療法は、認知機能の低下を軽減するために開発されていない。
【０００５】
有効な治療法はまだ開発されていないが、認知機能の低下を軽減するために可能性を示す多くの治療化合物が同定されている。例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、それらの優れた特異性、低毒性及び免疫原性プロファイルのために大きな期待を持っている。まだ課題は、これらの頭蓋治療薬の送達に残され、これは、細胞外及び細胞内環境において安定性問題の克服、そして特定の標的細胞へのインビボ送達のための方法の考案を含む。最近の研究では、狂犬病ウイルス糖タンパク質（ＲＶＧ２９）からのペプチドが正常にニコチン性アセチルコリン受容体に結合することにより、血液脳関門（ＢＢＢ）を横切って、無傷及び機能的ｓｉＲＮＡを送達することが示されている。同様に、キングコブラ毒素ｂ（ＫＣ２Ｓ）のループ２は、ニューロンのニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ類）に結合し、頭蓋内薬物送達を増強することが報告されている。しかしながら、狂犬病由来又は毒素由来のペプチドの使用は安全上の懸念をもたらし、ＢＢＢを通過するそれらの能力に関係なくリスクをもたらす。実際、最大のハードルは、脳内の関連する標的への治療薬の安全かつ効率的な頭蓋内送達である。
【発明の概要】
【０００６】
いくつかの実施形態において、本発明は、血液脳関門を通過することが可能であるｌｙｎｘ１−ループ２由来のペプチドを含む組成物及び方法に関する。本発明の他の実施形態において、ｌｙｎｘ１−ループ２由来ペプチドは、血液脳関門内に発見される標的への輸送のためのエフェクター剤にコンジュゲートされる。
【０００７】
本発明のいくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１の配列を有するペプチドを含む。いくつかの実施形態においては、配列番号１のペプチドは、配列番号２、３、４及び５から選択される配列を有する。他の実施形態において、配列番号１の配列は、残基３と４の間に挿入された配列番号８のペプチドをさらに含む配列番号１の配列を有する。
【０００８】
本発明のいくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１、２、３、４、及び５の配列を有するペプチドとエフェクター剤を含む。他の実施形態において、配列番号１のペプチドは、残基３と４の間に挿入された配列番号８のペプチドをさらに含む配列番号１の配列を有する。
【０００９】
いくつかの態様において、エフェクター剤は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、鎖鋳型ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、アプタマー、アナログ、並びにオリゴヌクレオチド、遺伝子、ペプチド、タンパク質、低化学分子、大化学分子、ウイルス粒子、リポソーム、エンドソーム、エキソソーム、ナノ粒子、デンドリマー、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）リガンド、真核細胞、原核細胞、マイクロスフェア、ナノゲル及びバイオナノカプセルの組み合わせからなる群から選択される。
【００１０】
いくつかの実施形態において、エフェクター剤は、ペプチドにコンジュゲートされたｓｉＲＮＡである。
【００１１】
いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１３、１４、又は１５の配列を有するペプチドを含む。他の実施形態において、配列番号１３、１４、又は１５の配列を有するペプチドを含む組成物もまたエフェクター剤を含む。
【００１２】
本発明のいくつか実施形態において、血液脳関門を通過するｌｙｎｘ１−ループ２由来のペプチドを輸送する方法は、血液脳関門に見出される標的に配列番号１の配列を有するペプチドを提供することを含み、ここで、該標的はインビボ又はインビトロであってもよい。他の実施形態において、ペプチドは、配列番号２、３，４、又は５の配列を有する。さらに他の実施形態において、ペプチドは、残基３と４の間に挿入された配列番号８のペプチドをさらに含む配列番号１の配列を有する。
【００１３】
本発明のいくつか実施形態において、血液脳関門内に見出される標的にエフェクター剤を輸送する方法が提供される。該方法は、配列番号１の配列を有するペプチドをエフェクター剤にコンジュゲートさせて複合体を形成させ、該複合体を標的に提供することを含み、ここで、該標的は、インビボ又はインビトロであってもよい。
【００１４】
他の実施形態において、本方法は、配列番号２、３、４、５、又は１０の配列を有するペプチドを含む。
【００１５】
いくつかの実施形態において、複合体は、インビトロにおける細胞培養物中の標的に提供される。他の実施形態において、複合体は、マウス又はヒト被験体における標的に提供される。
【００１６】
いくつかの実施形態では、標的は、細胞又は細胞外分子である。いくつかの実施形態において、細胞は、ニューロン、神経細胞、脳細胞、グリア細胞、星状細胞、ニューロン支持細胞、又は中枢神経系の細胞から選択される。いくつかの実施形態において、標的細胞は、ニコチン性アセチルコリン受容体を含む。
【００１７】
いくつかの実施形態において、エフェクター剤は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、鎖鋳型ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、アプタマー、アナログ、並びにオリゴヌクレオチド、遺伝子、ペプチド、タンパク質、低化学分子、大化学分子、ウイルス粒子、リポソーム、エンドソーム、エキソソーム、ナノ粒子、デンドリマー、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）リガンド、真核細胞、原核細胞、マイクロスフェア、ナノゲル及びバイオナノカプセルの組み合わせからなる群から選択される。
【００１８】
いくつかの実施形態では、組成物は医薬組成物である。
【００１９】
本発明のいくつか実施形態において、血液脳関門を通過してｌｙｎｘ１−ループ２由来のペプチドを輸送する方法は、血液脳関門に見出される標的に配列番号１３の配列を有するペプチドを提供することを含み、ここで、該標的は、インビボ又はインビトロであってもよい。他の実施形態において、ペプチドは、配列番号１４又は１５の配列を有する。
【００２０】
他の実施形態において、血液脳関門内に見出される標的にエフェクター剤を輸送する方法が提供され、該方法は、エフェクター剤に配列番号１３、１４、又は１５の配列を有するペプチドをコンジュゲートし、複合体を形成させ、該標的に該複合体を提供することを含み、ここで、該標的はインビボ又はインビトロであってもよい。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１Ａ】図１Ａは、本発明の実施形態によれば、Ｎ（アミノ）とＣ（カルボキシ）末端を示すｌｙｎｘ１ペプチドの構造的な描写である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、本発明の実施形態によれば、Ｎ（アミノ）及びＣ（カルボキシ）末端を示すα−ブンガロトキシンタンパク質の構造的な描写である。
【図２】図２は、本発明の実施形態によれば、野生型、ｌｙｎｘ１ホモ接合ノックアウト（ＫＯ）、及びｌｙｎｘ１ヘテロ接合型ノックアウト（ＨＥＴ）マウスによってなされた「フリーズ」の回数を示すグラフである。
【図３】図３は、本発明の実施形態によれば、脳、筋肉、肺、腸、腎臓及び肝臓からの組織抽出物におけるｌｙｎｘ１のｍＲＮＡレベルと野生型マウスからの脳におけるｍＲＮＡレベル量と比較したグラフである。
【図４Ａ】図４Ａは、ｌｙｎｘ１を発現する（＋ｌｙｎｘ１）又はｌｙｎｘ１を発現しない（−ｌｙｎｘ１）α４β２ニコチン性アセチルコリン受容体細胞株からの細胞抽出物のウェルタンブロットである。
【図４Ｂ】図４Ｂは、本発明の実施形態によれば、ニコチン性アセチルコリン受容体活性に起因する生理学的変化をモニターする蛍光膜電位色素を用いた、ｌｙｎｘ１を発現する（プラスｌｙｎｘ１）又はｌｙｎｘ１を発現しない（ｌｙｎｘ１なし）α４β２ニコチン性アセチルコリン受容体細胞株へのニコチン曝露から得られる蛍光強度を比較したグラフである。
【図５Ａ】図５Ａは、本発明の実施形態によれば、ポリクローナル抗ｌｙｎｘ１抗体を用いた、＋／＋（野生型）から、＋／−（ｌｙｎｘ１ヘテロ接合ノックアウト）、及び−／−（ｌｙｎｘ１ホモ接合体ノックアウト）からの脳抽出物におけるｌｙｎｘ１タンパク質のウェスタンブロットである。
【図５Ｂ】図５Ｂは、本発明の実施形態によれば、野生型細胞の割合としてｌｙｎｘ１タンパク質レベルの正規化された量を比較したグラフであり、ＷＴ、ＨＥＴ、及びＫＯ細胞について、図５Ａのウェスタンブロットに対応する。
【図６】図６は、本発明の実施形態によれば、陰性対照トランスフェクション（擬似）と比較した、４つの異なるｌｙｎｘ１−ｓｉＲＮＡ種（ｓｉＲＮＡ１、ｓｉＲＮＡ２、ｓｉＲＮＡ３、又はｓｉＲＮＡ４）のうちの１つでトランスフェクトされた神経細胞培養物におけるｌｙｎｘ１のｍＲＮＡレベルを比較したグラフである。
【図７】図７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、及び７Ｄは、本発明の実施形態によれば、初代神経細胞培養物における、ビオチン化ｌｙｎｘ１−ループ２ペプチド（図７Ａ）；ビオチン化ＲＶＧ２９ペプチド（陽性対照）（図７Ｂ）；ビオチン化Ｌｙ６Ｈ−ループ２ペプチド（陰性対照）（図７Ｃ）；及びビオチン化ｌｙｎｘ２−ループ２ペプチド（図７Ｄ）の蛍光ストレプトアビジン検出を用いた蛍光像である。
【図８】図８は、本発明の実施形態によれば、左から右に示されるように、添加なし（擬似）、ｌｙｎｘ１のｍＲＮＡ単独、ｌｙ６Ｈ−ループ２を連結したｌｙｎｘ１−ｓｉＲＮＡ、ＲＶＧ２９を連結したｌｙｎｘ１−ｓｉＲＮＡ、及びｌｙｎｘ１−ループ２を連結したｌｙｎｘ１−ｓｉＲＮＡと比較した、培養ニューロンにおけるｌｙｎｘ１の発現をノックダウンするｌｙｎｘ１−ループ２を連結したｌｙｎｘ１のｓｉＲＮＡの有効性を示すグラフである。
【図９】図９は、本発明の実施形態によれば、ヒト、マウス、マカク、ウシ、チンパンジー、リスザル、ラット及びフェレット（それぞれ上から下へ）からの全長ｌｙｎｘ１アミノ酸配列とループ２（太字）のアラインメントである。
【図１０】図１０は、本発明の実施形態によれば、培養皮質ニューロンへの抗ｌｙｎｘ１  ｓｉＲＮＡの送達後のｌｙｎｘ１のｍＲＮＡを減少させる有効な能力を示すグラフであり、抗ｌｙｎｘ１  ｓｉＲＮＡは、指示されるペプチド（ｌｙｎｘ１−ループ２、改変体１、改変体４、改変体２、改変体３、ｌｙ６Ｈ、ＲＶＧ２９、ＲＶＧ１９、及び擬似（ｓｉＲＮＡなし）及びペプチドなし（ｓｉＲＮＡ単独））にコンジュゲートされ、この場合、ｌｙｎｘ１のｍＲＮＡを減少させる活性パーセントは、ｌｙｎｘ１−ループ２抗ｌｙｎｌ  ｓｉＲＮＡ（１００％に設定）の存在下でのｌｙｎｘ１のｍＲＮＡレベルと対比される。
【図１１Ａ】図１１Ａは、本発明の実施形態によれば、ｌｙ６Ｈ−ループ２ペプチド（陰性対照）とコンジュゲートされた、蛍光標識された核のｓｉＲＮＡを注射されたマウスからの脳切片の共焦点顕微鏡画像である。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、本発明の実施形態によれば、濃縮された蛍光周辺のサークルを有するｌｙｎｘ１−ループ２ペプチドとコンジュゲートされた、蛍光標識された核のｓｉＲＮＡを注射されたマウスからの脳切片の共焦点顕微鏡画像である。
【図１１Ｃ】図１１Ｃは、本発明の実施形態によれば、図１１Ｂにおけるサークルの蛍光の光学ズームであり、ここで、標識された細胞は毛細血管内皮細胞の鎌形状特性を提示する。
【図１１Ｄ】図１１Ｄは、毛細血管の内腔を取り囲む毛細血管内皮細胞の断面の典型的な電子顕微鏡像である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
ｌｙｎｘ１は、特定のグループのニューロンのニコチン性アセチルコリン受容体に対するアクセサリー分子であり、他のニコチン性アセチルコリン受容体結合タンパク質、例えば、α−ブンガロトキシン（図１）、ＳＬＵＲＰ（分泌性Ｌｙ−６／ｕＰＡＲ関連タンパク質（Ｓｅｃｒｅｔｅｄ  Ｌｙ−６／ｕＰＡＲ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ））、及び前立腺幹細胞抗原と構造が非常に類似している。ｌｙｎｘ１の治療態様は、少なくとも２倍である。第一に、ｌｙｎｘ１機能低下は、脳活動の増大を付与する。例えば、ｌｙｎｘ１ノックアウトマウスは、連想学習行動分析パラダイムにおいて有意な改善を示す（図２）。第二に、ｌｙｎｘ１タンパク質は、ニューロンのニコチン受容体（ＮＮＲ）又はニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）に結合することが示され、これは、Ｉｂａｎｅｚ−Ｔａｌｌｏｎら，２００２，Ｎｅｕｒｏｎ，３３：８９３−９０３（全内容は参照により本明細書に援用される）に開示されている。本明細書に開示されるように、ｌｙｎｘ１のループ２領域は、ＮＮＲの推定結合ドメインであり、血液脳関門（ＢＢＢ）を横切る治療薬の送達のためのペプチド輸送体として使用することができる。
【００２３】
アミノ酸の略語は、本開示を通じて使用され、当該技術分野において知られている標準的な命名法に従っている。例えば、当業者に理解されるように、アラニンは、Ａｌａ又はＡであり；アルギニンは、Ａｒｇ又はＲであり；アスパラギンは、Ａｓｎ又はＮであり；アスパラギン酸は、Ａｓｐ又はＤであり；システインは、Ｃｙｓ又はＣであり；グルタミン酸は、Ｇｌｕ又はＥであり；グルタミンは、Ｇｌｎ又はＱであり；グリシンは、Ｇｌｙ又はＧであり；ヒスチジンは、Ｈｉｓ又はＨであり；イソロイシンは、Ｉｌｅ又はＩであり；ロイシンは、Ｌｅｕ又はＬであり；リジンは、Ｌｙｓ又はＫであり；メチオニンは、Ｍｅｔ又はＭであり；フェニルアラニンは、Ｐｈｅ又はＦであり；プロリンは、Ｐｒｏ又はＰであり；セリンは、Ｓｅｒ又はＳであり；スレオニンは、Ｔｈｒ又はＴであり；トリプトファンは、Ｔｒｐ又はＷであり；チロシンは、Ｔｙｒ又はＹであり；バリンは、Ｖａｌ又はＶである。
【００２４】
本発明のいくつか実施形態において、エフェクター剤にコンジュゲートするとき、ｌｙｎｘ１の第２ループ（ループ２）のペプチド断片又は改変体は、種々の代表的なアッセイ及び共焦点顕微鏡法によって決定されるように、血液脳関門を通過し、脳及び／又はニューロンにエフェクター剤を送達することができる。
【００２５】
本明細書において使用するとき、ポリヌクレオチド又はポリペプチドの「断片」とは、参照ポリヌクレオチド又はポリペプチドと比較して、ヌクレオチド又はペプチドのより小さなセットを指す。
【００２６】
本明細書で使用するとき、ポリヌクレオチド又はポリペプチドの「改変体」とは、参照ポリヌクレオチド又はポリペプチドと比較して、一次、二次、又は三次構造において変化することができるポリヌクレオチド又はポリペプチドを指す。例えば、ｌｙｎｘ１−ループ２ペプチドのペプチド断片は、ｌｙｎｘ１−ループ２の全ペプチド配列又はより短いペプチド配列を指すことができるペプチドであり、このペプチド断片は、本明細書に記載されるように、アミノ酸置換又は欠失を含んでもよい。例えば、ｌｙｎｘ１−ループ２ペプチドの「改変体」は、参照ｌｙｎｘ１−ループ２ペプチドと比較して、構造及び機能において実質的に類似する分子を指すが、さらに部分又は置換又は変更を含むことができる。そのため、改変体ペプチドは、例えば、ユビキチン化、標識化、Ｐｅｇ化（ポリエチレングリコールによる誘導体化）、又は他の分子の付加などの技術によって、化学的に修飾された参照ペプチドである誘導体を含むことができる。分子は、両方の分子が実質的に類似した構造を有するか、又は両方の分子が類似した生物学的活性を有する場合、別の分子と「実質的に類似している」と言われる。したがって、２つの分子が類似した活性を有する場合、これらの分子のうちの１つの構造が他方において見出されないか、又はアミノ酸残基の配列が同一でない場合、その用語が本明細書において使用されるとき、改変体であると考えられる。
【００２７】
本明細書で使用するとき、ｌｙｎｘ１−ループ２の断片、改変体、及び実質的に類似した分子は、総称して「ｌｙｎｘ１−ループ２由来」と呼ばれる。
【００２８】
本明細書で使用するとき、「エフェクター剤」とは、血液脳関門内の標的に影響を与える任意の分子を指し、本明細書に開示されているように、標的は、標的細胞又は細胞外分子であり得る。ｌｙｎｘ１−ループ２由来のペプチドにコンジュゲートされ又は連結され得るエフェクター剤の非制限的な例には、ｓｉＲＮＡ；短鎖ヘアピン又はステムループＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）；マイクロＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）；鎖鋳型ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）；オリゴヌクレオチド（ＤＮＡ又はＲＮＡ）；修飾オリゴヌクレオチド（ＤＮＡ又はＲＮＡ）；アプタマー；ＤＮＡ及びＲＮＡの類似体及び組み合わせ；遺伝子；タンパク質、例えば、抗体及び抗原断片；タンパク質、抗体及び抗原；小化学分子；大化学分子；ウイルス粒子；リポソーム；エンドソーム；エキソソーム；ナノ粒子；デンドリマー（例えば、ポリ（アミドアミン）、又はＰＡＭＡＭ）；陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）リガンド；真核細胞；原核細胞；マイクロスフェア；ナノゲル；バイオナノカプセルが挙げられる。
【００２９】
本明細書で使用するとき、「コンジュゲートした」、「連結した」、及び「複合化した」は、交換可能に使用される。本明細書で使用するとき、用語「コンジュゲートした」又は「コンジュゲート」とは、１つの実体を形成するために２つ以上の実体の結合を指す。例えば、本発明の方法は、エフェクター剤へのｌｙｎｘ１−ループ２由来ペプチドのコンジュゲーションを提供する。結合は、リンカー、化学修飾、ペプチドリンカー、化学リンカー、共有若しくは非共有結合、又はタンパク質融合によって、又は当業者に知られている任意の手段によって行うことができる。接合（ｊｏｉｎｉｎｇ）は、永続的又は可逆的であり得る。いくつかの実施形態において、いくつかのリンカーは、コンジュゲート中の各リンカー及び各成分の所望の特性を利用するために含めることができる。柔軟なリンカー、及びコンジュゲートの溶解性を増加させるリンカーの使用は、単独での使用、又は本明細書に開示される他のリンカーを伴う使用が企図される。ペプチドリンカーは、コンジュゲート中の１つ以上のタンパク質にリンカーをコードするＤＮＡを発現させることによって連結することができる。リンカーは、酵素的に切断可能なリンカー、酸によって切断可能なリンカー、光によって切断可能なリンカー、及び熱感受性リンカーであり得る。コンジュゲーションのための方法は、当業者によって周知である。
【００３０】
本明細書で使用するとき、「標的」とは、完全に、ＢＢＢで保護された中枢神経系（ＣＮＳ）組織内にある細胞又は細胞外分子を意味する。細胞外分子としては、限定されないが、細胞外タンパク質及び組織が挙げられる。ＢＢＢ内の細胞外タンパク質の例としては、Ｃｒａｍｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３５：１５０３，２０１２（全内容は参照により本明細書に援用される）に開示されるアルツハイマー病（ＡＤ）を特徴付けるアミロイド斑を含む。ＡＤに加えて、パーキンソン病及びレビー小体型認知症は、レビー小体と呼ばれる異常な折り畳み構造のタンパク質の凝集体によって特徴付けられ、これらの小体の主要成分の１つはα−シヌクレインタンパク質であり、これらは、Ｃｌｉｎｔｏｎら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃ，３０：７２８１−７２８９，２０１０（全内容は参照により本明細書に援用される）に開示されている。
【００３１】
本明細書で使用される用語「標的細胞」は、ニコチン性アセチルコリン受容体のアルファ（α）サブユニット及び／又はベータ（β）サブユニットを発現する細胞を指す。本明細書に開示されるｌｙｎｘ１−ループ２由来のペプチドは、ニコチン性アセチルコリン受容体のαサブユニットに結合する。したがって、本明細書に開示されるｌｙｎｘ１−ループ２由来ペプチドは、ニコチン性アセチルコリン受容体のアルファサブユニットを発現する細胞の選択的ターゲティングのためのターゲティング部分として有用である。ニコチン性アセチルコリン受容体のアルファ（α）サブユニットを発現する細胞には、例えば、ニューロン、グリア細胞、及び血液脳関門を含む内皮細胞が挙げられる。また、本発明の標的細胞は、内因性環境がＢＢＢによって分離される細胞、例えば、中枢神経系の細胞、例えば、脳細胞、脊髄細胞、グリア細胞、及びニューロンを支持する他の細胞、例えば、星状細胞又は「栄養細胞（ｎｕｒｓｉｎｇ  ｃｅｌｌ）」及び中枢神経系の細胞が挙げられる。いくつかの実施形態において、標的細胞は、ニコチン性アセチルコリン受容体のアルファサブユニットを発現するいずれかの細胞又はそのホモログであってもよく、例えば、限定されないが、対象（すなわち、インビボ）における神経細胞、エクスビボの神経細胞又は培養神経細胞（すなわち、インビトロ）、例えば、初代神経培養細胞、あるいは天然に存在する又はトランスフェクトされたアルファ及び／又はベータニコチン性アセチルコリン受容体構築物の安定な選択を介した、ニコチン性アセチルコリン受容体のアルファ及び／又はベータサブユニットを発現する不死化細胞株が挙げられる。いくつかの実施形態において、標的細胞は、神経前駆体又は神経前駆細胞、例えば、ニコチン性アセチルコリン受容体のαサブユニット又はそのホモログを発現するニューロン前駆幹細胞である。本発明のいくつかの実施形態において、標的は、対象、例えば哺乳動物対象、例えばヒト対象に存在する。代替の実施形態において、標的はエクスビボであり、さらなる実施形態において、標的は生物学的試料中、例えばインビボである。
【００３２】
ｌｙｎｘｌ−ループ２由来ペプチド
ヒトｌｙｎｘ１−ループ２ドメインとマウス、マカク、ウシ、チンパンジー、リスザル、ラット及びフェレット由来のｌｙｎｘ１−ループ２配列のアラインメントを図９に示す。本発明のいくつかの実施形態において、例えば、本明細書に開示されているエフェクター剤にコンジュゲートされたｌｙｎｘ１−ループ２由来のペプチド輸送因子を注射した対象の脳切片の細胞画像又は共焦点顕微鏡によって決定されるように、ｌｙｎｘ１−ループ２に由来するペプチドは、細胞取込み及び／又はＢＢＢを横切る輸送を付与する。したがって、本発明のいくつかの実施形態において、ｌｙｎｘ１−ループ２由来ペプチドは、一般配列Ｘ1−Ｘ2−Ｘ3−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6−Ｘ7−Ｘ8−Ｘ9−Ｘ10−Ｘ11−ＸI2−Ｘ13−Ｘ14−Ｘ15−Ｘ16（配列番号１）を有する１６マーのペプチドであり、ここで、配列番号１については以下の通りである。
【００３３】
Ｘ1は、Ｍ又はＴであり；
Ｘ2は、Ｔ又はＩであり；
Ｘ3は、Ｔ又はＷであり；
Ｘ4は、Ｒ又はＣであり；
Ｘ5は、Ｔ又はＤであり；
Ｘ6は、Ｙ、Ｉ、又はＧであり；
Ｘ7は、Ｆ又はＹであり；
Ｘ8は、Ｔ又はＣであり；
Ｘ9は、Ｐ、Ｎ、又はＳであり；
Ｘ10は、Ｙ、Ｔ、又はＳであり；
Ｘ12は、Ｍ又はＧであり；
Ｘ14は、Ｖ又はＲであり；
Ｘ15は、Ｒ、Ｓ、Ａ、又はＩであり；
Ｘ16は、Ｋ、Ｓ、又はＤである。
【００３４】
本発明のいくつかの実施形態において、ｌｙｎｘ１−ループ２由来ペプチドは、保存されているか又は図９に示される様々な種において見出される整列された配列に類似しているものを表す配列を有する。例えば、ＢＢＢを通過することができるｌｙｎｘ１−ループ２由来ペプチドは、ＭＴＴＲＴＹＦＴＰＹＲＭＫＶＲＫ（配列番号２）、ＭＴＴＲＴＹＹＴＰＴＲＭＫＶＳＫ（配列番号：３）、ＭＴＷＣＤＹＦＴＰＳＲＧＫＶＲＫＳ（配列番号４）、又はＭＴＴＲＴＹＦＴＰＹＲＧＫＶＲＫ（配列番号５）を含む。
【００３５】
図１０に示すように、抗ｌｙｎｘ１  ｓｉＲＮＡにコンジュゲートされた配列番号４（変異体１）は、培養皮質ニューロンにおいてｌｙｎｘ１発現を減少させることができ、並びに配列番号２の配列を有するペプチドである。しかしながら、アラニン（Ａ）で置換された、７位にフェニルアラニン（Ｆ）を有する変異体２（ＭＴＴＲＴＹＡＴＰＹＲＭＫＶＲＫＳ）（配列番号６）、及びＡＭＡＤで置換された、１１〜１４位にＲＭＫＶ残基を有する変異体３（ＭＴＴＲＴＹＦＴＰＹＡＭＡＤＲＫＳ）（配列番号７）は、図１０に示すように、抗ｌｙｎｘ１  ｓｉＲＮＡにコンジュゲートしたとき、培養皮質ニューロンにおけるｌｙｎｘ１発現の減少にそれほど効果的ではなかった。
【００３６】
本発明の他の実施形態において、さらなるアミノ酸配列は、１６マーのｌｙｎｘ１−ループ２ペプチドに付加されてもよい。例えば、ＭＰＥＮＰＲＰＧＴＰ（配列番号８）の配列は、配列番号１について上記で定義された１６マーのペプチドに付加される。一実施形態において、ＭＰＥＮＰＲＰＧＴＰ（配列番号８）は、上記で定義される配列番号１のＸ３とＸ４残基の間に付加され、Ｘ1Ｘ2Ｘ3ＭＰＥＮＰＲＰＧＴＰＸ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8Ｘ9Ｘ10ＲＸ12ＫＸ14Ｘ15Ｘ16（配列番号９）を与える。また、図１０に示すように、抗ｌｙｎｘ１  ｓｉＲＮＡにコンジュゲートされた、ＭＴＴＭＰＥＮＰＲＰＧＴＰＲＴＹＦＴＰＹＲＭＫＶＲＫＳ（配列番号１０）のペプチド配列を有する変異体４は、培養皮質ニューロンにおいてｌｙｎｘ１  ｍＲＮＡを減少させることができる。配列番号８は、ＲＶＧ２９に見出される配列であるが、ＲＶＧ１９において見出されない。ＲＶＧ２９は、配列ＹＴＩＷＭＰＥＮＰＲＰＧＴＰＣＤＩＦＴＮＳＲＧＫＲＡＳＮＧ（配列番号１１）を有し、ＲＶＧ１９は、配列ＹＴＩＷＣＤＩＦＴＮＳＲＧＫＲＡＳＮＧ（配列番号１２）を有する。図１０に示すようにｌｙｎｘ１−ループ２（配列番号２のペプチドを有する）、変異体１（配列番号４のペプチドを有する）、変異体４（配列番号１０ペプチドを有する）はすべて、抗ｌｙｎｘ１−ｓｉＲＮＡと比較した場合、ＲＶＧ２９とＲＶＧ１９ペプチドの両方よりも効果的に培養皮質ニューロンにおいてｌｙｎｘ１  ｍＲＮＡを減少させる。
【００３７】
いくつかの実施形態において、１個のアミノ酸又は少ない割合のアミノ酸を変更、付加又は欠失する個々の置換、欠失又は付加は、本発明のｌｙｎｘ１−ループ２由来のペプチドに対して作製される。挿入又は欠失は、典型的には、約１〜５個のアミノ酸の範囲である。保存的置換のための保存的アミノ酸の選択は、例えば、アミノ酸がペプチドの外側にあり、溶媒に曝露される場合、又は内部にあり、溶媒に曝露されない場合、ペプチドにおいて置換されるべきアミノ酸の位置に基づいて選択されてもよい。
【００３８】
代替の実施形態において、既存のアミノ酸の位置、すなわち、溶媒へのその曝露に基づいて（すなわち、溶媒に曝露されない内部に位置付けられたアミノ酸と比較して、アミノ酸が溶媒に曝露されるか、又はペプチド若しくはポリペプチドの外面に存在する場合）、既存のアミノ酸を置換するアミノ酸を選択することができる。保存的アミノ酸置換の選択は当該技術分野において周知であり、例えば、Ｄｏｒｄｏら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９９，２１７，７２１−７３９、及びＴａｙｌｏｒら，Ｊ．Ｔｈｅｏｒ，Ｂｉｏｌ．１１９（１９８６）ｌ２０５−２１８、及びＳ．Ｆｒｅｎｃｈ  ＆  Ｂ．Ｒｏｂｓｏｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．１９（１９８３）１７１に開示されている。したがって、タンパク質又はペプチドの外側におけるアミノ酸（すなわち、溶媒に曝露されるアミノ酸）に適した保存的アミノ酸置換を選択することができ、例えば、限定されないが、以下の置換を使用することができる：ＹをＦ；ＴをＳ、Ｋ又はＡ；ＰをＡ；ＥをＤ又はＱ；ＮをＤ又はＧ；ＲをＫ；ＧをＮ又はＡ；ＴをＳ、Ｋ又はＡ；ＤをＮ又はＥ；ＩをＬ又はＶ；ＦをＹ又はＬ；ＳをＴ又はＡ；ＲをＫ；ＧをＮ又はＡ；ＫをＲ；ＡをＳＫ、Ｐ、Ｇ、Ｔ又はＶ；ＷをＹ；及びＭをＬに置換する。本明細書に記載した結果を考慮し、変異体１〜４について図１０に示すように、及びｌｙｎｘ１類似体中の配列の観点から、本発明のいくつかの実施形態において、ｌｙｎｘ１−ループ２由来のペプチドは、Ｘ3−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6−Ｘ7−Ｘ8−Ｘ9−Ｘ10−Ｒ11−Ｘ12−Ｘ13−Ｘ14（配列番号１３）である配列番号１由来の配列を有する小さい１２マーのペプチドであり、ここで、配列番号１３については以下の通りである。
【００３９】
Ｘ3は、Ｔ又はＷであり；
Ｘ4は、Ｒ又はＣであり；
Ｘ5は、Ｔ又はＤであり；
Ｘ6は、任意のアミノ酸であり；
Ｘ7は、Ｆ又はＹであり；
Ｘ8は、任意のアミノ酸であり；
Ｘ9は、任意のアミノ酸であり；
Ｘ10は、任意のアミノ酸であり；
Ｘ12は、Ｍ又はＧであり；及び
Ｘ14は、Ｖ又はＲである。
【００４０】
代替の実施形態において、配列番号１由来の配列は、配列Ｘ3−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6−Ｘ7−Ｘ8−Ｘ9−Ｘ10−Ｒ−Ｘ12−Ｋ−Ｘ14（配列番号１４）を有し、ここで、配列番号１４については、以下の通りである。
【００４１】
Ｘ3は、Ｔ又はＷであり；
Ｘ4は、Ｒ又はＣであり；
Ｘ5は、Ｔ又はＤであり；
Ｘ6は、Ｙ、Ｇ、又はＩであり；
Ｘ7は、Ｆ又はＹであり；
Ｘ8は、Ｔ又はＣであり；
Ｘ9は、Ｐ、Ｎ、又はＳであり；
Ｘ10は、Ｙ、Ｔ、又はＳであり；
Ｘ12は、Ｍ又はＧであり；及び
Ｘ14は、Ｖである。
【００４２】
代替の実施形態において、配列番号１由来の配列は、配列Ｘ3−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6−Ｘ7−Ｘ8−Ｘ9−Ｘ10−Ｒ11−Ｘ12−Ｋ13−Ｘ14（配列番号１５）を有し、ここで、配列番号１５については、以下の通りである。
【００４３】
Ｘ3は、Ｔ又はＷであり；
Ｘ4は、Ｒ又はＣであり；
Ｘ5は、Ｔ又はＤであり；
Ｘ6は、Ｙ、Ｇ又はＩであり；
Ｘ7は、Ｆ又はＹであり；
Ｘ8は、Ｔであり；
Ｘ9は、Ｐであり；
Ｘ10は、Ｙ又はＴであり；
Ｘ12は、Ｍ又はＧであり；及び
Ｘ14は、Ｖである。
【００４４】
ｌｙｎｘ１−ループ２由来のペプチドを含む本明細書に開示されているすべてのペプチドは、当該技術分野において知られている任意の適切な方法によって構築することができる。例えば、ペプチドは、ペプチド合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍｏｄｅｌ  ４３３）を用いて合成されてもよく、又は当該該技術分野において周知の方法によって組換え的に合成することができる。ポリペプチドの化学合成のための方法及び材料は当業者に周知である。例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，１９６３，“Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８３：２１４９−２１５４を参照されたい。本発明のペプチドを合成する方法は、本発明を限定するものではない。例えば、ペプチドは、ＬｉｆｅＴｅｉｎ，ＬＬＣ又はＢｉｏ−Ｓｙｎｔｈｓｉｓ，Ｉｎｃ．から市販されている。
【００４５】
本発明のペプチドは、特定の標的効果に適合するように変更されてもよい。ｌｙｎｘ１−ループ２ペプチドは、エフェクター剤なしにＢＢＢを通過し、効果を付与することができるが、いくつかの所望の効果は、エフェクター剤にコンジュゲートして促進される。このように、ペプチドは特異的エフェクター剤に適合するように変更されてもよい。例えば、ｌｙｎｘ１−ループ２由来ペプチドは、例えば親水性を増加させるように、アミノ末端で修飾することができる。増加した親水性は、親ペプチド−脂質コンジュゲートがリポソーム又は脂質担体とともに使用するために組み込まれた脂質系担体の表面上へのペプチドの曝露を高める。疎水性を増大させるようにペプチドへの結合に適した極性基は周知であり、例えば、限定されないが、アセチル（「Ａｃ」）、３−シクロヘキシルアラニル（「Ｃｈａ」）、アセチル−セリン（「Ａｃ  Ｓｅｒ」）、アセチル−セリル−セリン（「Ａｃ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−」）、スクシニル（「Ｓｕｅ」）、スクシニル−セリン（「Ｓｕｃ−Ｓｅｒ」）、スクシニル−セリル−セリン（「Ｓｕｃ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ」）、メトキシスクシニル（「ＭｅＯ−Ｓｕｃ」）、メトキシスクシニル−セリン（「ＭｅＯ−Ｓｕｃ−Ｓｅｒ」）、メトキシスクシニル−セリル−セリン（「ＭｅＯ−Ｓｕｃ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ」）及びセリル−セリン（「Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−」）基、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）、ポリアクリルアミド、ポリアクリロモルホリン、ポリビニルピロリジン、ポリヒドロキシル基及びカルボキシ糖、例えば、ラクトビオン酸、Ｎ−アセチルノイラミン酸及びシアル酸基が挙げられる。これらの糖のカルボキシ基は、アミド結合を介してペプチドのＮ末端に連結される。現在、好ましいＮ末端修飾はメトキシ−スクシニル修飾である。
【００４６】
エフェクター剤
本発明のｌｙｎｘ１由来ペプチドは、血液脳関門を通過することができ、また、それが標的細胞及び／又は分子への送達のためにコンジュゲートされるエフェクター剤をターゲティングすることができる。エフェクター剤が本発明のｌｙｎｘ１由来ペプチドとコンジュゲートし、連結され又は複合化され得るエフェクター剤及び方法の例には、本明細書、及び全ての全内容が参照により本明細書に援用されるＫｕｍａｒら，Ｎａｔｕｒｅ  ４４８：３９−４３，２００７；Ｐｕｌｆｏｒｄら，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ５：ｅ１１０８５，２０１０；Ｒｏｈｎら，Ｊ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔ，２０：３８１−３８８，２０１２に開示されるｓｉＲＮＡ；全内容が参照により本明細書に援用されるＨｗａｎｇ  ｄｏら，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，３２：４９６８−４９７５，２０１１に記載されるｈｓＲＮＡ又はマイクロＲＮＡ；全内容が参照により本明細書に援用されるＰａｒｄｒｉｄｇｅ，  Ｊｐｎ  Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，８７：９７−１０３，２００１に記載されるオリゴヌクレオチド（ＤＮＡ又はＲＮＡ）；Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ，２０１１（上述）に記載される修飾されたオリゴヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）；Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ，２０１１（上述）、及び全内容が参照により本明細書に援用されるＧｏｎｇら，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，３３：３４５６−３４６３，２０１２に記載される遺伝子；Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ，２０１１（上述）に記載されるペプチド及びＰＥＴリガンド；Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ，２０１１（上述）、及び全内容が参照により本明細書に援用されるＸｉａｎｇら，Ｊ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔ，１９：６３２−６３６，２０１１に記載されるタンパク質；全内容が参照により本明細書に援用されるＺｈａｎら，Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍ，７：１９４０−１９４７，２０１０に記載される小化学分子；大化学分子；ウイルス粒子；Ｐｕｌｆｏｒｄら，２０１０（上述）に記載されるリポソーム；エンドソーム；全内容が参照により本明細書に援用されるＡｌｖａｒｅｚら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２９：３４１−３４５，２０１１に記載されるエキソソーム；全内容が参照により本明細書に援用されるＣｈｅｎら，Ｊ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔ，１９：２２８−２３４，２０１１及びＬｉｕら，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，３０：４１９５−４２０２，２００９に記載されるナノ粒子；Ｌｉｒら（上述）に記載されるデンドリマー（例えば、ＰＡＭＡＭ）；真核細胞；原核細胞；全内容が参照により本明細書に援用されるＰａｔｅｌら，ＣＮＳ  Ｄｒｕｇｓ，２３：３５−５８，２００９に記載されるマイクロスフェア、ナノゲル及びバイオナノカプセルが挙げられる。
【００４７】
本発明のいくつかの実施形態において、エフェクター剤、例えば、本明細書に開示されているｓｉＲＮＡ治療薬は、「プロドラッグ」形態で送達されるように調製することができる。用語「プロドラッグ」は、内因性酵素若しくは他の化学物質の作用及び／又は条件によって、生体又はその細胞内で活性形態（すなわち、薬物）に変換される不活性な形態で調製される治療薬を示す。
【００４８】
いくつかの実施形態において、本発明のエフェクター剤は、種々の標的細胞又は組織に輸送することができる。例えば、本発明のエフェクター剤は、任意の神経細胞、例えば、中枢神経系、嗅覚、又は視覚系の神経細胞に輸送することができる。また、本発明のエフェクター剤は、神経学的に関連した標的細胞又は組織、例えば、神経系と相互作用し又は神経系の標的となる細胞又は組織に輸送することができる。
【００４９】
本明細書で使用するとき、用語「遺伝子」とは、エクソンと（任意に）イントロン配列の両方を含む、ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む核酸を指す。「遺伝子」は、遺伝子産物のコード配列、ならびに遺伝子産物の５’ＵＴＲと３’ＵＴＲ領域、イントロン及びプロモーターを含む遺伝子産物の非コード配列を指す。これらの定義は、一般に、一本鎖分子を指すが、特定の実施形態において、一本鎖分子に対して部分的に、実質的又は完全に相補的であるに追加の鎖も含む。このようにして、核酸は、二本鎖分子、又は１つ以上の相補鎖（単数又は複数）を含む二本鎖分子、又は特定配列を含む分子の「相補物（単数又は複数）」を包含することができる。本明細書で使用するとき、一本鎖核酸は、接頭辞「ｓｓ」によって表すことができ、二本鎖核酸は接頭辞「ｄｓ」によって、三本鎖は接頭辞「ｔｓ」で表すことができる。用語「遺伝子」は、ポリペプチド鎖の産生に関与するＤＮＡのセグメントを意味し、それはコード領域の前後の領域、ならびに個々のコードセグメント（エクソン）間の介在配列（イントロン）領域を含む。「プロモーター」は、転写の開始及び速度が制御される核酸配列の領域である。これは、核酸配列の特異的転写を開始させるために、ＲＮＡポリメラーゼ及び他の転写因子などの、調節タンパク質及び分子が結合可能な要素を含むことができる。用語「エンハンサー」は、核酸配列の転写活性化に関与するシス作用調節配列を指す。エンハンサーは、いずれかの配向において機能し、プロモーターの上流又は下流にあってもよい。本明細書で使用するとき、用語「遺伝子産物（単数又は複数）」は、遺伝子から転写されたＲＮＡ、又は遺伝子によってコードされる又はＲＮＡから翻訳されたポリペプチドを含むことを指すために使用される。
【００５０】
標的細胞の核内への遺伝子の転座について、シグナル配列は、エフェクター剤遺伝子にコンジュゲートされてもよい。多くの核シグナル配列は、当該技術分野において知られている。核膜シグナル配列又はペプチドは、一般に、約１０〜約５０個以上のアミノ酸残基の長さであるアミノ酸の配列であり、その多く（典型的には約５５〜６０％）の残基は疎水性であり、その結果、疎水性脂溶性部分を有する。一般に、シグナルペプチドは、細胞タンパク質のインポート及び／又はエクスポートを可能にするために、細胞膜（例えば、核膜）を貫通することができるペプチドである。そのようなシグナル配列は、遺伝子中に天然に存在してもよく、又は多くの周知の組換えＤＮＡ技術を用いて提供されてもよい。
【００５１】
シグナルペプチド配列は、ＳＩＧＰＥＰデータベース（ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  １：４１４２（１９８７）；ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ  ａｎｄ  Ａｂｒａｈｍｓｅｎ、Ｌ．、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２２４：４３９−４４６（１９８９）、両者の全内容は参照により本明細書に援用される）から選択することができます。
【００５２】
ｌｙｎｘ１−ループ２由来のペプチドを用いた血液脳関門を通過する輸送
本発明のいくつかの実施形態において、血液脳関門を通過させて脳内の標的にペプチドを輸送する方法は、標的を含む対象又は細胞培養物にｌｙｎｘ１−ループ２由来ペプチドを提供することを含む。いくつかの実施形態において、ＢＢＢ内で見出された標的に到達することができるｌｙｎｘ１−ループ２由来のペプチドは配列番号１を有する。他の実施形態において、ペプチドは、配列番号２、３、４又は５の配列を有する。さらに他の実施形態においては、ペプチドは、配列番号１の配列を有し、配列番号８のペプチドは残基３と４の間に挿入される。
【００５３】
ｌｙｎｘ１−ループ２由来のペプチドを用いたエフェクター剤の輸送
本発明のいくつかの実施形態において、標的細胞にエフェクター剤を輸送させる方法は、複合体を形成するために、エフェクター剤にｌｙｎｘ１−ループ２由来のペプチドをコンジュゲートさせ、標的細胞又は標的細胞を有する対象に複合体を提供することを含む。
【００５４】
いくつかの実施態様において、本方法は、配列番号１のｌｙｎｘ１−ループ２ペプチドを含む。他の実施形態において、本方法は、配列番号１３、１４又は１５から選択されるｌｙｎｘ１−ループ２ペプチドを含む。さらに他の実施形態において、本方法は、配列番号２、３、４、５又は１０から選択されるｌｙｎｘ１−ループ２ペプチドを含み、この場合、標的細胞への輸送は、コンジュゲートされたエフェクター剤の効果を測定することによって決定される。いくつかの実施形態において、コンジュゲートされたエフェクター剤の効果の測定は、標的でエフェクター剤の画像化することを含む。さらなる実施形態において、コンジュゲートされたエフェクター剤の効果の測定は、タンパク質又は核酸の活性又はレベルの増加又は減少を測定することによって、エフェクター剤の存在をアッセイすることを含む。例えば、エフェクター剤がｓｉＲＮＡである場合、ｓｉＲＮＡに対応するｍＲＮＡのレベルは、ｌｙｎｘ１−ループ２由来ペプチドにコンジュゲートされたｓｉＲＮＡの複合体を提供した後に測定することができ、この場合、効果は、エフェクター剤が標的に送達される指標となる。
【００５５】
いくつかの実施態様において、エフェクター剤を輸送する方法は、脳細胞、脊髄細胞、グリア細胞、ニューロン、分子及び中枢神経系の他の細胞から選択される標的細胞において起こる。いくつかの実施形態において、標的細胞にエフェクター剤を輸送する方法は、対象に複合体を提供することを含み、この場合、標的細胞が血液脳関門内にある。他の実施形態において、標的細胞を有する被験体はヒトである。いくつかの実施形態において、ＢＢＢ中に見られる標的にエフェクター剤を輸送する方法はインビトロで起こる。
【００５６】
本方法のいくつかの実施形態において、エフェクター剤は、ｓｉＲＮＡ；短鎖ヘアピン又はステムループＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）；マイクロＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）；鎖鋳型ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）；オリゴヌクレオチド（ＤＮＡ又はＲＮＡ）；修飾オリゴヌクレオチド（ＤＮＡ又はＲＮＡ）；ＤＮＡ及びＲＮＡの類似体及び組み合わせ；アプタマー；遺伝子又は遺伝子産物；抗体及び抗原断片を含むペプチド；タンパク質、例えば、抗体及び抗原；小化学分子；大化学分子；ウイルス粒子；リポソーム；エンドソーム；エキソソーム；ナノ粒子；デンドリマー；陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）リガンド；真核細胞；原核細胞；マイクロスフェア；ナノゲル；バイオナノカプセルを含む。
【００５７】
本方法の他の実施形態において、エフェクター剤はｓｉＲＮＡである。例えば、本明細書に開示されているように、ｓｉＲＮＡは、ｌｙｎｘ１−ループ２由来のペプチドにコンジュゲートされているｌｙｎｘ１のｓｉＲＮＡである。
【００５８】
本方法のいくつかの実施形態において、複合体は、医薬組成物である。
【００５９】
用語「組成物」又は「医薬組成物」は、本明細書において互換的に使用され、通常、当該技術分野において慣例である医薬として許容される担体などの賦形剤を含み、哺乳動物、例えば、ヒト又はヒト細胞への投与に適した組成物又は製剤を意味する。このような組成物は、多数の経路の１つ以上を介した投与用に具体的に製剤化されてもよく、該経路には、限定されないが、経口、非経口、静脈内、動脈内、皮下、鼻腔内、舌下、脊髄内、脳室内などが挙げられる。本明細書に開示される組成物を投与される細胞は、例えば、治療、診断、又は予防目的のために、対象の一部であってもよい。細胞はまた、例えば、潜在的な医薬組成物をスクリーニングするためのアッセイの一部として培養されもよく、細胞は、研究目的のためにトランスジェニック動物の一部であってもよい。また、局所（例えば、口腔粘膜、呼吸粘膜）投与及び／又は経口投与のための組成物は、溶液、懸濁剤、錠剤、丸剤、カプセル、徐放製剤、経口リンス、又は粉末を形成してもよく、本明細書に記載されるように当該技術分野において知られている。組成物はまた、安定剤及び保存剤を含むことができる。担体、安定剤及びアジュバントの例は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（２００５）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ｗｉｔｈ  Ｆａｃｔｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ，２１ｓｔ  Ｅｄ．を参照されたい。
【００６０】
本明細書に開示される組成物は、非経口、経腸、経粘膜、局所、例えば、皮下、静脈内、局所、筋肉内、腹腔内、経皮、直腸、膣、鼻内又は眼内を含む任意の都合のよい経路によって投与することができる。一実施形態において、本明細書に開示される組成物は、局所的に投与されない。一実施形態において、送達は、組成物製剤の経口投与による。一実施形態において、送達は、特に脳及び関連臓器（例えば、髄膜及び脊髄）の治療に使用するために、組成物の鼻腔内投与による。これらのラインに沿って、眼内投与も可能である。別の実施形態において、送達手段は、長期の持続的なｉ．ｖ．製剤が望まれる場合に特に有利である組成物の静脈内（ｉ．ｖ．）投与による。適切な製剤は、各々が参照により本明細書に援用されるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ  ａｎｄ  １８ｔｈ  Ｅｄｓ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ（１９８０  ａｎｄ  １９９０），及びＩｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌｅａ  ＆  Ｆｅｂｉｇｅｒ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈａ（１９８５）に見出すことができる。
【００６１】
本明細書に開示される組成物は、予防上又は治療上の有効な量で投与することができる。本明細書に開示される標的化送達組成物は、医薬として許容される担体とともに投与することができる。予防上又は治療上の有効量は、少なくとも部分的には、所望の効果を達成し、又は治療されるべき特定の疾患若しくは障害の発症を遅延させ、その進行を阻害し、又はその発症若しくは進行を完全に停止させるのに必要な両を意味する。このような量は、当然に、治療される特定の状態、該状態の重症度及び個々の患者のパラメータ、例えば、年齢、体調、大きさ、体重及び併用療法に依存する。これらの因子は当業者に周知であり、日常的な実験程度で対処することができる。一般に、最大投薬量、すなわち、健全な医学的判断に従った最も安全な投薬量を用いることが好ましい。しかしながら、当業者は、より低い用量又は耐容用量が医学的理由、心理学的理由又は事実上の任意の他の理由のために投与することができることを理解する。
【００６２】
「医薬として許容される担体」は、対象への標的化された送達組成物を混合及び／又は送達するための任意の医薬として許容される手段を意味する。使用する用語「医薬として許容される担体」は、本明細書で使用するとき、生体のある臓器又はその一部から、別の臓器又はその一部に対象薬物を運ぶ又は輸送することを伴う、医薬として許容される材料、組成物又はビヒクル、例えば、液体若しくは固体充填剤、希釈剤、溶媒又はカプセル化材料を意味する。各担体は、製剤の他の成分と適合するという意味において「許容される」ものでなければならず、対象、例えばヒトへの投与に適合している。本発明のいくつかの実施形態に従う方法の臨床的使用に関して、いくつかの実施形態に従う標的化された送達組成物は、非経口投与、例えば静脈内投与；粘膜、例えば鼻腔内；経腸、例えば経口；局所、例えば経皮；眼、例えば角膜乱切又は他の様式を介した投与用の医薬組成物又は医薬製剤に製剤化される。医薬組成物は、１つ以上の医薬として許容される成分と組み合わせて、本発明のいくつかの実施形態に従う化合物を含む。担体は、固体、半固体又は液体希釈剤、クリーム又はカプセルの形態であってもよい。これらの医薬調製物は、本発明のいくつかの実施形態に従うさらなる目的である。通常、活性化合物の量は、調製物に基づいて０．１〜９５重量％の間であり、例えば、非経口投与については調製物に基づいて０．２〜２０重量％の間であり、例えば、経口投与については調製物に基づいて１〜５０重量％の間である。
【００６３】
用語「非経口投与」及び「非経口的に投与される」は、本明細書で使用するとき、経腸及び局所投与以外の投与様式を指し、通常は、注射による投与であり、限定されないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、脳室内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、気管内、皮下、くも膜、サブ莢膜、くも膜下、脊髄内、脳内脳脊髄、及び胸骨内の注射及び注入が挙げられる。語句「全身投与」、「全身的に投与される」、「末梢投与」、「末梢的に投与される」は、本明細書で使用するとき、中枢神経系に直接的に投与すること以外で、化合物、薬物又は他の材料の投与を意味し、その結果、それが、動物系に進入し、したがって、代謝及び他の似たプロセスに供される、例えば、皮下投与が挙げられる。
【００６４】
本明細書で使用するとき、用語「投与すること」、「導入すること」、及び「提供すること」は互換的に使用され、本発明の実施形態によれば、所望の部位で薬剤（例えば、標的細胞及び／又は分子）の少なくとも部分的な局在化をもたらす方法又は経路によって、対象又はインビトロの培養物に、コンジュゲートされたエフェクター剤を含む又は含まないｌｙｎｘ１−ループ２由来のペプチドを含む医薬組成物の配置を指す。本発明の薬剤は、対象における効果的な治療をもたらす任意の適切な経路によって投与されてもよい。
【００６５】
経口投与用の投与単位の形態で本発明の標的化された送達組成物を含む医薬製剤の製造において、選択された化合物は、固体、粉末成分、例えば、ラクトース、サッカロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アミロペクチン、セルロース誘導体、ゼラチン、又は他の適切な成分と混合してもよく、ならびに崩壊剤及び潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリルフマル酸ナトリウム及びポリエチレングリコールワックスと混合されてもよい。次に、混合物を顆粒に加工されてもよく、又は錠剤に圧縮されてもよい。
【００６６】
以下の実施例は、説明のみを目的として提示され、本出願の範囲又は内容を限定するものではない。
【実施例】
【００６７】
実施例１：マウスにおいて観察されるｌｙｎｘ１の効果。魅力的な生物学の原理証明は、遺伝子操作されたマウスにおいてｌｙｎｘ１を操作することによって実証された（全内容が参照により本明細書に援用されるＭｉｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ，５１：５８７−６００，２００６参照）。Ｌｙｎｘ１ノックアウトマウスは、連想学習行動分析パラダイムにおいて有意な改善を示す（図２）。ニコチン性アセチルコリン受容体におけるｌｙｎｘ１の大きな打撃と、コリン作動性トーンが認知機能の低下と関連付けられるという事実を考慮すると、この結果はｌｙｎｘ１の除去が実際にコリン作動性トーンを増大させることを示している。しかしながら、同じｌｙｎｘ１ノックアウトマウスは、それらの生命の後期段階において神経変性表現型を示したので、長期間にわたるｌｙｎｘ１の完全な除去は、潜在的に最適窓の外側にあるコリン作用をスペクトルの高活性端にシフトさせるようである。この実証は、ヘテロ接合ｌｙｎｘ１ノックアウトマウスにおけるｌｙｎｘ１の部分的な減少が神経変性を全く示さなかったという事実である。興味深いことに、認知増強は、ホモ接合ｌｙｎｘ１ノックアウト又は野生型動物と比較してさらに改善された（図２）。このようにして、広範囲のｌｙｎｘ１投与量は、調整コリン作動性トーンを微調整する実施可能な戦略であるようである。ニコチン性アセチルコリン自体を操作することが同様の結果を生じさせなかったことは注目すべきことであり、これは、ｌｙｎｘ１操作が、ニコチン性アセチルコリン受容体に基づく認識促進薬の治療薬を開発するためのより望ましい方法であると実際に証明する可能性があり、他の認知促進戦略と肩を並べるか、又はそれらより優れている可能性があることを示す。
【００６８】
具体的には、図２は、恐怖条件付けアッセイにおける野生型（ＷＴ）と比較して、ｌｙｎｘ１ホモ接合ノックアウト（ＫＯ）及びヘテロ接合ｌｙｎｘ１ノックアウト（ＨＥＴ）マウスに関する連想学習能力を高めたことを示す。マウスは、無害刺激、トーン、有害刺激、軽度の足のショックの組み合わせによって条件付けられ、恐怖はフリーズによって測定された。翌日、ｌｙｎｘ１のＫＯ動物は、ＷＴ動物と比較して、穏やかなトーンに対してフリーズことを示し、これは、ＷＴマウスよりも良好な連想学習を指示した。ＨＥＴ動物は、このタスクにおいて、ＫＯ動物よりもさらに良好に振る舞った。ｌｙｎｘ１のＫＯとＨＥＴ動物についてＰ＜０．０５であった。Ｙ軸は、フリーズの数（＃）である。
【００６９】
実施例２：ｑＰＣＲアッセイ。ｌｙｎｘ１発現の程度を決定するために、ｍＲＮＡ転写物は、マウスにおいて定量的に測定された。マウスは、動物福祉ガイドラインに従ってＣＯ2窒息により安楽死させた。器官を回収し、均質化し、超音波処理した。ＲＮＡは、ＲＮＡｅａｓｙプロテクトミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて抽出し、ＤＮａｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ）で処理された。ＲＮＡ濃度を決定した。ＲＮＡを５ｎｇ／μｌに希釈し、５０ｎｇのＲＮＡは、ｑＳｃｒｉｐｔ  ｃＤＮＡスーパーミックス（Ｑｕａｎｔａ  Ｂｉｏ）を用いて逆転写された。ｑＰＣＲは、Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのアッセイとＱｕａｎｔａ  ＢｉｏからのＰｅｒｆｅＣＴａ  Ｆａｓｔｍｉｘ  ＩＩを用いて、ウェルあたり１ｎｇのｃＤＮＡについて行われた。３つの複製が試料あたり行われ、３匹の動物を用いた。ｌｙｎｘ１のＣＴ（サイクル閾値）値は、ＧＡＰＤＨレベルのものに対して標準化した。データは、脳の発現レベルを１００％として、脳発現のパーセンテージとして表される。
【００７０】
Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＳｔｅｐＯｎｅ  ｑＰＣＲ機器を用いて、ｌｙｎｘ１と、ニコチン性アセチルコリン受容体サブユニットα４、α７及びβ２についてＴａｑＭａｎアッセイを開発した。ｌｙｎｘ１のｍＲＮＡレベルは、マウスにおける多くの組織（図３）、培養皮質ニューロン、及びｌｙｎｘ１安定細胞株において測定された。図３に示されるように、ｙ軸は、すべての他の組織よりも顕著に高かった脳の発現レベルのパーセンテージとしての相対量である。腸が小腸である。肝臓は、バックグラウンドを超えるｌｙｎｘ１発現を示さず、腎臓は最小のｌｙｎｘ１発現であった。
【００７１】
実施例３：ｌｙｎｘ１でトランスフェクトされたα４β２  ｎＡＣｈＲ細胞株。マウスのニコチン性アセチルコリン受容体サブユニットであるα４−黄色蛍光タンパク質（α４ＹＦＰ）とβ２−シアン蛍光タンパク質（β２ＣＦＰ）の一過性のバージョンは、堅牢なアセチルコリン（ＡＣＨ）とニコチン応答を示し、高品質の細胞株を単離するための、α４とβ２の蛍光タグを付されたバージョンの使用の有用性を確認する。Ｎａｓｈｍｉら（全内容が参照により本明細書に援用されるＪ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，２００３，２３：１１５５４−１１５６７）によれば、報告されているように、α４ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）ｃＤＮＡはＹＦＰとインフレームで融合され、かつβ２  ｎＡＣｈＲはＣＦＰとインフレームで融合された。構築物をＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトし、安定な組込みを有するコロニーを選択するために抗生物質で処理された。２００を超える単離され、選択されたクローンは、ＣＦＰとＹＦＰ蛍光測定、蛍光共鳴エネルギー移動（２５％を超えるＦＲＥＴ効率）、及びＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ（登録商標）（ニコチン応答を測定するための流体工学を用いたリアルタイム蛍光ベースのマルチウェルプレートリーダー）における機能的分析などのアッセイを用いた反復的等級付け及び選抜プロセスをうけた。これらの分析後、最適化されたα４ＹＦＰβ２ＣＦＰ  ｎＡＣｈＲ細胞株は、受容体のタンパク質レベルを検出するためのウェスタンブロット研究、及びα４とβ２の相互作用を確認するための共免疫沈降研究を用いて、さらに特徴付けられた。α４ＹＦＰβ２ＣＦＰ細胞株を選択し、特徴付けた後、優良のα４ＹＦＰβ２ＣＦＰの安定な細胞株は、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）−ｌｙｎｘ１構築物でトランスフェクトされた。そのトランスフェクションからのクローンは、親α４ＹＦＰβ２ＣＦＰ細胞株からのｌｙｎｘ１の安定な組込みについて再び選択された。２０を超えるコロニーを選択し、増殖し、特徴付けた。測定されたパラメータは、最大ニコチン誘発性応答のＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ（登録商標）測定、ニコチンの連続希釈に対する用量反応であった。最良の細胞株をさらに増殖させ、ウェスタンブロットによって特徴付け、ｌｙｎｘ１タンパク質量を決定した。さらに、細胞株は、受容体が抗ＧＦＰ抗体によって沈降される共免疫沈降研究に供され、ｌｙｎｘタンパク質は、ｌｙｎｘ１：受容体相互作用を確認するために、抗ｌｙｎｘ１抗体で検出された。受容体に対するｌｙｎｘ１の機能的差異は、さらに、圧押出されるニコチンパルスを用いて、パッチクランプ電気生理学的測定によって確認された。
【００７２】
市販の抗ｌｙｎｘ１モノクローナル抗体を用いたウェスタンブロットアッセイによるｌｙｎｘ１−α４ＹＦＰβ２ＣＦＰ  ｎＡＣｈＲ細胞株におけるｌｙｎｘ１の測定可能な減少を図４Ａに示す。ｌｙｎｘ１は、−ｌｙｎｘ１細胞株において検出可能ではないが、＋ｌｙｎｘ１細胞株においてかなり検出される。ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ（登録商標）蛍光は、ｌｙｎｘ１−α４ＹＦＰβ２ＣＦＰ  ｎＡＣｈＲ細胞株及びα４ＹＦＰβ２ＣＦＰ  ｎＡＣｈＲ細胞株の両方において定量される（図４Ｂ）。ｌｙｎｘ１−α４ＹＦＰβ２ＣＦＰ（プラスｌｙｎｘ１）における最大の記録可能なシグナル差を用いて、ｌｙｎｘ１を発現しないα４ＹＦＰβ２ＣＦＰ  ｎＡＣｈＲ細胞株（ｌｙｎｘ１なし）と比較した。
【００７３】
ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ（登録商標）アッセイで検出可能な最大シグナル。膜電位に応答する蛍光染料を使用して、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ（登録商標）プレートリーダーは、ｌｙｎｘ１を含まない（左）又はｌｙｎｘ１を含む（右）のいずれかのα４ＹＦＰβ２ＣＦＰニコチン性アセチルコリン受容体細胞株を１００μＭニコチンに曝露させることから得られる最大シグナルを測定する。ニコチン性アセチルコリン受容体はイオンチャネルであるため、ニコチンの結合は、細胞膜を通過する電流および膜電位の同時変化をもたらす。ｓｉＲＮＡ誘導によるｌｙｎｘ１  ｍＲＮＡ分解に起因したｌｙｎｘ１細胞株内でのｌｙｎｘ１発現の何らかの低下は、α４ＹＦＰ２βＣＦＰ細胞株のみに見られるものまでに最大シグナルを増加させる。
【００７４】
実施例４：定量的ウェスタンブロットアッセイ。ｌｙｎｘ１の脳タンパク質レベルをモニターするために、定量的ウェスタンブロットアッセイを確立した。ｌｙｎｘ１抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．から購入した）及びＬｉ−Ｃｏｒ  Ｏｄｙｓｓｅｙ機器を用いて、タンパク質発現は、野生型、ヘテロ接合及びホモ接合ｌｙｎｘ１  ＫＯマウスにおいて定量された（図５Ａ及び５Ｂ）。タンパク質はｌｙｎｘ１  ＫＯマウスの脳組織から抽出された（野生型＝＋／＋、ヘテロ接合＝＋／−、及びホモ接合＝−／−）、レーン１〜３。タンパク質をブロットし、抗ｌｙｎｘ１抗体を用いて検出した。ウェスタンブロットは、Ｌｉ−Ｃｏｒ  Ｏｄｙｓｓｅｙ検出系を用いて定量され（図５）、野生型レベルに対して正規化された。Ｙ軸は、野生型マウスと比較したｌｙｎｘ１レベルのパーセンテージを示す。値は、遺伝子型あたり４匹のマウスからの４つ試料の平均である。
【００７５】
実施例５：細胞におけるｌｙｎｘ１ノックダウン。ｌｙｎｘ１  ＴａｑＭａｎアッセイを使用して、ｌｙｎｘ１  ｓｉＲＮＡ種は、培養皮質ニューロンにおけるｌｙｎｘ１ノックダウンについてアッセイされた（図６）。４つのｓｉＲＮＡ種は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ／Ｄｈａｒｍａｃｏｎから購入した。アクセルｓｉＲＮＡ種を次のように注文した：ｓｉＲＮＡ１（ＧＣＡＣＵＧＡＵＵＵＧＡＵＡＧＡＡＵＵ）（配列番号１６）、ＳＭＡＲＴプールｓｉＲＮＡ  Ａ−０６２８１１−１３ＬＹＮＸ１；ｓｉＲＮＡ２：（ＣＵＵＵＧＧＵＧＣＡＵＧＧＵＵＡＣＵＵ）（配列番号１７）、アクセルＳＭＡＲＴプールｓｉＲＮＡ  Ａ−０６２８１１−１４  ＬＹＮＸ１；ｓｉＲＮＡ  ３：（ＧＣＡＵＣＵＧＧＧＡＧＡＡＵＧＵＵＵＡ）（配列番号１８）、アクセルＳＭＡＲＴプールｓｉＲＮＡ  Ａ−０６２８１１−１５  ＬＹＮＸ１；及びｓｉＲＮＡ４：（ＵＧＧＵＵＡＵＣＵＡＧＡＧＵＵＧＣＡＡ）（配列番号１９）、アクセルＳＭＡＲＴプールｓｉＲＮＡ  Ａ−０６２８１１−１６  ＬＹＮＸ１。
【００７６】
図６に示されるように、ｌｙｎｘ１  ｍＲＮＡレベルは、培養ニューロンにおけるｌｙｎｘ１発現の非常なレベルを指示する皮質ニューロン（擬似）において測定される。ノックダウン実験では、ｓｉＲＮＡは、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によるアクセル法を用いて、培養ニューロンにトランスフェクトされた。ｓｉＲＮＡ１、ｓｉＲＮＡ２、ｓｉＲＮＡ３、及びｓｉＲＮＡ４の各々は、それ自体で又は２つ、３つ若しくは４つすべてを組み合わせて使用された。すべてのｓｉＲＮＡ及びそれらの組み合わせがｌｙｎｘ１のｍＲＮＡレベルを容易に減少させ、図６に示すように、ｓｉＲＮＡ１は、９０％を超えるまでｌｙｎｘ１発現を減少させた。従って、その後、ｓｉＲＮＡ１（ＧＣＡＣＵＧＡＵＵＵＧＡＵＡＧＡＡＵＵ）（配列番号１６）は、脳内へのニューロン取り込み及び輸送をアッセイするために、様々なペプチドと複合して使用された。
【００７７】
実施例６：結合試験。培養中のニューロンに結合するｌｙｎｘ１−ループ２ペプチド（配列番号２）の能力を測定した。これを行うために、初代皮質ニューロンを培養し、培養物は、それらがニコチン性アセチルコリン受容体を発現する時点まで成熟させた。次に、細胞は、指示されたビオチン化ペプチドと結合され、その後、蛍光ストレプトアビジンに結合された。ニューロンは、共焦点顕微鏡を用いて画像化された。ニューロンは、ＲＶＧ２９ペプチド：ＹＴＩＷＭＰＥＮＰＲＰＧＴＰＣＤＩＦＴＮＳＲＧＫＲＡＳＮＧ（配列番号１１）（全内容が参照により本明細書に援用されるＫｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４４８：３９−４３，２００７）（図７Ｂ）とｌｙｎｘ１−ループ２ペプチドＵ（図７Ａ）を用いて、神経突起様過程中に標識された。さらに、ＲＶＧ２９とｌｙｎｘ１−ループ２の間の同等数のニューロンが、このアッセイにおいて観察され、一方、ニコチン性アセチルコリン受容体に結合しないことが知られている（図７Ｃ）、構造的に類似したｌｙ６Ｈ−ループ２ペプチド（ＶＲＩＴＤＰＳＳＳＲＫＤＨＳＶＮ）（配列番号２０）は、ニューロンに結合せず、ｌｙｎｘ２−ループ２ペプチド（ＥＶＭＥＱＳＡＧＩＭＹＲＫＳ（配列番号２１）（図７Ｄ）は、ニューロンに容易に結合しなかった。このように、ＲＶＧ２９は、ｌｙｎｘ１−ループ２ペプチドの陽性対照であり、ｌｙ６Ｈ−ループ２とｌｙｎｘ２−ループ２の両方は陰性対照である。
【００７８】
実施例７：ニューロンへのペプチド−ｓｉＲＮＡ複合体のｓｉＲＮＡ取り込み試験。実験は、ニューロン内のｌｙｎｘ１−ループ２ペプチド−ｌｙｎｘ１  ｓｉＲＮＡ複合体をアッセイし、ｌｙｎｘ１ノックダウンの程度、及びこの複合体の細胞内取り込み効率を決定するために実施された。ｌｙｎｘ１  ｓｉＲＮＡ（配列番号１６）（ｓｉＲＮＡ１）と結合したペプチドの種々の複合体は、マウス皮質ニューロンから作られた一次ニューロン培養物とともにインキュベートされた。特に明示がない限り、ｌｙｎｘ１  ｍＲＮＡノックダウン実験を以下のように行った。ペプチドとｓｉＲＮＡのモル比は１０：１であった。ペプチド及びｓｉＲＮＡの最終濃度は２５μＭペプチド（ＬｉｆｅＴｅｉｎ）＋２．５μＭ  ｌｙｎｘ１  ｓｉＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）であった。ペプチドは、各ペプチドのＣ末端に結合したポリＤアルギニンリンカーを介して最終体積の半分のＮｅｕｒａｌ  Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉａ中で室温にて３０分間、ｓｉＲＮＡと複合体化された。複合体は、アルギニンの正電荷とｓｉＲＮＡ中に存在するリン酸基の負電荷の間の静電（非共有結合）相互作用に起因して形成された。３０分後、２倍の最終濃度のサプリメントＢ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＮｅｕｒａｌ  Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を最終体積の半分を加えた。複合体を十分にボルテックスし、細胞に添加した。ニューロン培養物は、２４時間のインキュベーション後に回収され、ホモジナイズされ、ＲＮＡは、ＲＮＡｅａｓｙ  Ｐｒｏｔｅｃｔ  Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて抽出され、ＤＮａｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ）で処理された。ＲＮＡ濃度は、Ｑｕｂｉｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を介して決定された。ＲＮＡは５ｎｇ／μｌに希釈され、５０ｎｇのＲＮＡは、ｑＳｃｒｉｐｔ  ｃＤＮＡ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｑｕａｎｔａ  Ｂｉｏ）を用いて逆転写された。ｑＰＣＲは、Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのアッセイとＱｕａｎｔａ  ＢｉｏからのＰｅｒｆｅＣＴａ  Ｆａｓｔｍｉｘ  ＩＩを用いて、ウェルあたり１ｎｇのｃＤＮＡについて行われた。試料あたり４つの複製が行われ、３つの試料を条件ごとに処理した。ＲＱ値は、ｌｙｎｘ１のＣＴ値に基づいて計算され、それはＧＡＰＤＨレベルに対して正規化された（ＲＱ＝２∧−デルタデルタＣｔ）。データは、ｌｙｎｘ１ループ２−ｌｙｎｘ１  ｓｉＲＮＡ試料からノックダウンのレベルを１００％として、ノックダウンの割合として表される。ｍＲＮＡレベルを減少させない処置を０％ノックダウンとして表した。試料をスチューデントＴ検定により分析した。
【００７９】
ｌｙｎｘ１  ｓｉＲＮＡ分子がｌｙｎｘ１−ループ２ペプチドと複合化された場合、又はＲＶＧ２９ペプチドと複合化された場合、ｓｉＲＮＡ無し（擬似）と比較して、ｌｙｎｘ１  ｍＲＮＡの減少が観察された。陰性対照ペプチドであるｌｙ６Ｈ−ループ２、及び裸のｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ単独）は、ｌｙｎｘ１  ｍＲＮＡレベルの有意な減少を示さなかった（図８）。これらのデータは、ニューロンにｓｉＲＮＡ分子を運搬するｌｙｎｘ１−ループ２ペプチドの能力を実証する。
【００８０】
実施例８：ペプチド−ｓｉＲＮＡ複合体を介した培養皮質ニューロンへの抗ｌｙｎｘ１  ｓｉＲＮＡの送達後のｌｙｎｘ１  ｍＲＮＡのノックダウン。培養皮質ニューロンへのｓｉＲＮＡを送達させる、異なるｌｙｎｘ１−ループ２ペプチド改変体の能力を試験するために、ペプチド改変体と抗ｌｙｎｘ１  ｓｉＲＮＡのいくつかの異なる複合体を調製した。これらの複合体はニューロン培養物に添加され、ニューロンにｓｉＲＮＡを移動させるペプチドの能力はｑＰＣＲによって測定された。結果を図１０に示す。４つのｌｙｎｘ１−ループ２改変体をアッセイした。これらの改変体は、変異体１（ＭＴＷＣＤＹＦＴＰＳＲＧＫＶＲＫＳ）（配列番号４）、変異体２（ＭＴＴＲＴＹＡＴＰＹＲＭＫＶＲＫＳ）（配列番号６）、変異体３（ＭＴＴＲＴＹＦＴＰＹＡＭＡＤＲＫＳ）（配列番号７）及び変異体４（ＭＴＴＭＰＥＮＰＲＰＧＴＰＲＴＹＦＴＰＹＲＭＫＶＲＫＳ（配列番号１０）と呼ばれ、これらは、ｌｙｎｘ１−ループ２ペプチド（配列番号２）と比較された。陰性対照は、Ｌｙ６Ｈ−ループ２ペプチド（配列番号２０）、非複合化ｓｉＲＮＡ（ペプチドなし）、擬似のインキュベートした試料である。ＲＶＧ２９ペプチド（配列番号１１）とＲＶＧ１９ペプチド：ＹＴＩＷＣＤＩＦＴＮＳＲＧＫＲＡＳＮＧ（配列番号１２）はともに、ｌｙｎｘ１−ｓｉＲＮＡにコンジュゲートされ、比較のためにアッセイされた。ｌｙｎｘ１  ｍＲＮＡレベルのノックダウンレベルは、ｌｙｎｘ１−ループ２ペプチド−ｓｉＲＮＡ複合体の割合として提示される。
【００８１】
一次皮質培養物は、野生型マウスから調製され、培養物を４８ウェルディッシュ中で約２週間インキュベートした。ニューロンは、５μＭペプチド及び０．５μＭのｓｉＲＮＡ（１０：１のモル比）の複合体とともに２４時間インキュベートされた。複合体は、それぞれのペプチドのＣ末端に結合したポリＤアルギニンリンカーを介して形成された。細胞を回収し、ｍＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡに転写し、ｑＰＣＲを用いて分析した。データは、指定されたペプチドとｌｙｎｘ１−ループ２ペプチド効率（１００％）と間の比較として表示された。したがって、低い割合は、培養ニューロンへのｓｉＲＮＡのより少ない効果的な送達を示す。ｓｉＲＮＡ単独（ペプチドなし）を０％に設定している。
【００８２】
【表１】
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【００８３】
変異体１は、表１、上記の表１に記載したアミノ酸の第１及び第２ブロックの両方の代替的改変体を含む（すなわち、ｌｙｎｘ１  ＴＲＴの代わりにＷＣＤ、ｌｙｎｘ１  ＲＭＫＶの代わりにＲＧＫＶ）。ｌｙｎｘ１−ループ２は、両ブロックがいずれかの亜種において機能的であることを指示しているので、この変異体１（配列番号４のペプチドを有する）は、ニューロンにｓｉＲＮＡを移動させることができる。変異体２（配列番号６ペプチドを有する）は、第１のブロックのＦをＡと置換し、この置換は、ニューロンにｓｉＲＮＡを移動させるｌｙｎｘ１−ループ２ペプチド能力を低下させ、その後のノックダウンは、この位置でのフェニルアラニン（Ｆ）の有用性を示す。変異体３（配列番号７のペプチドを有する）は、Ｒ（Ｍ／Ｇ）ＫＶモチーフにおけるＲ（アルギニン）、Ｋ（リジン）、及びＶ（バリン）を、それぞれＡ（アラニン）、Ａ（アラニン）、及びＤ（アスパラギン酸）で置換する。変異体４（配列番号１０を有する）は、残基３と４の間に挿入されたＭＰＥＮＰＲＰＧＴＰ（配列番号８）を有する配列番号２の改変体である。示されるように、変異体３の置換は、ｌｙｎｘ１−ループ２ペプチドの機能を無効にし、これは、このブロック内のこれらのアミノ酸の有用性を示す。Ｌｙ６Ｈ−ループ２、ｓｉＲＮＡ単独、及び擬似処置は、ｌｙｎｘ１  ｍＲＮＡのノックダウンをもたらさなかった。変異体１及び変異体４は、配列番号２のペプチドに比べてノックダウンを増強した。興味深いことに、配列番号２（ｌｙｎｘ１−ループ２）、変異体１及び変異体４は、ＲＶＧ２９及びＲＶＧ１９と比較して、ｌｙｎｘ１  ｍＲＮＡレベルの減少により効果的であった。
【００８４】
実施例９：マウス脳内の毛細血管内皮細胞へのペプチド−複合体の送達。ｌｙｎｘ１−ループ２ペプチドが脳内にｓｉＲＮＡを輸送することができるかどうかを同定するために、蛍光標識したｓｉＲＮＡは、静脈内注射されたマウスの脳切片において可視化された。ｌｙｎｘ１−ループ２は、製造業者の使用説明書に従って、細胞の核内で蛍光的に視覚化し、局在化し得る特異的に修飾されたｓｉＲＮＡ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ／ＤｈａｒｍａｃｏｎからのｓｉＧＬＯ）を有する複合体においてコンジュゲートされた。ＲＶＧ２９ペプチド（配列番号１１）−ｓｉＲＮＡ複合体は陽性対照であり、ｌｙ６Ｈ−ループ２（配列番号２０）−ｓｉＲＮＡ複合体は陰性対照である。
【００８５】
核ｓｉＲＮＡにコンジュゲートしたｌｙｎｘ１−ループ２ペプチド（配列番号２）を尾静脈に注射し、動物を２時間後に屠殺した。蛍光標識された核は、脳の毛細血管内皮細胞であると思われるものにおいて同定された。これは、２時間は、ペプチド−ｓｉＲＮＡ複合体が血管を横切って実際の脳に入るには不十分な時間であるが、ペプチド−ｓｉＲＮＡが上皮細胞に取り込まれるには十分な時間であることが推論された。このように、これは、血液脳関門横断の第一段階を構成している。類似の染色は、マウスに注射されたＲＶＧ２９−ｓｉＲＮＡ複合体で見ることができたが、このような染色は、マウスに注射されたｌｙ６Ｈ−ループ２−ｓｉＲＮＡの複合体では見られなかった。
１モル比：
【００８６】
複合体は、１０：１のモル比で細胞核に入るように設計された、蛍光的にコンジュゲートされたｓｉＲＮＡ分子とペプチド分子を混合することによって調製された。具体的には、ペプチドは、ＬｉｆｅＴｅｉｎから購入され、３０分間、室温にてｓｉＧＬＯ  ｓｉＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）（最終濃度：３８．７μＭペプチドと３．８７μＭのｓｉＧＬＯ）と複合体を形成させた。試料を完全にボルテックスし、動物に５０ｍｌ／ｋｇで投与した。体重が３３ｇ以下のＣＤ−１マウスに尾静脈を介して注入し、２時間後、４％パラホルムアルデヒドで心臓を通して潅流させた。脳を氷上で４％パラホルムアルデヒド中にて２時間、後固定し、４℃にて一晩、１％パラホルムアルデヒドを含有する３０％ショ糖に沈めた。脳を３０ミクロンに切断した。顕微鏡スライド上に切片をマウントした後、蛍光ｓｉＲＮＡ分子は、共焦点顕微鏡法を介して検出された。血管の同定は、明視野画像によって確認された。
【００８７】
図１１Ａ、１１Ｂ、及び１１Ｃは、脳の毛細血管内皮細胞に輸送された後の核蛍光標識されたｓｉＲＮＡの画像を示す。図１１Ａは、血管を染色しない（蛍光ｓｉＧＬＯとコンジュゲートされたｌｙ６Ｈ−ループ２対照ペプチドを注射された）陰性対照動物からの脳切片の共焦点顕微鏡画像である。図１１Ｂは、蛍光標識された核ｓｉＲＮＡとコンジュゲートされたｌｙｎｘ１−ループ２ペプチドに由来する複合体を注射されたマウスの脳切片の共焦点顕微鏡画像である。画像は、毛細血管内皮細胞内でのペプチド−ｓｉＲＮＡ複合体の取り込みを提示する毛細血管を示す。蛍光は鎌状であり、これは、図１１Ｄの参照電子顕微鏡（ＥＭ）画像に示すように、毛細血管内皮細胞の形態を反映する。図１１Ｃは、毛細管の管腔の端で、鎌状を提示する２つの標識細胞（白矢印）を示す、画像図１１Ｂの光学ズームである。図１１Ｄは、毛細管の管腔を囲む毛細血管内皮細胞の断面における代表的な電子顕微鏡（ＥＭ）画像である。形態は長く、細い、三日月形状を提示し、この鎌状形態は、図１１Ｂ及び１１Ｃに見られる形状と類似した毛細血管の内腔の境界で見られる。
【００８８】
全体の開示及び図面から分かるように、ｌｙｎｘ１−ループ２由来ペプチドは、血液脳関門を通過することができる。例えば、図７Ｂに示すように、ｌｙｎｘ１−ループ２ペプチドは、初代神経培養物に取り込まれた。さらに、図１０のｍＲＮＡのノックダウンデータ及び図１１Ａ〜１１Ｃの共焦点顕微鏡は、ｌｙｎｘ１−ループ２由来のペプチドが血液脳関門を通過し、ニューロンへのエフェクター剤を送達することができることを示す。さらに、ｌｙｎｘ１−ループ２由来ペプチドを単独で、及び血液脳関門を通過するための少なくともエフェクター剤と複合して用いる方法を提供する。
【００８９】
本発明は特定の例示的な実施形態を参照して図示及び説明してきたが、当業者は、種々の修正及び変更が、本の精神及び範囲から逸脱することなく、記載された実施形態に対してなされ得ることを理解する。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【配列表】
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