(57)【要約】【課題】本発明は、認知症の根本的な治療薬であって重篤な副作用のないものをスクリーニングするための方法、および認知症の治療剤を提供することを目的とする。【解決手段】本発明に係る認知症治療薬のスクリーニング方法は、被検化合物の存在下または非存在下、ＢＲＩ２および／またはＢＲＩ３とＮＲＢＰ１とを反応させる工程、被検化合物の存在下および被検化合物の非存在下で、ＢＲＩ２および／またはＢＲＩ３−ＮＲＢＰ１複合体の量を比較する工程、および、被検化合物の存在下での上記量が被検化合物の非存在下での上記量よりも多い被検化合物を特定する工程を含むことを特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
認知症治療薬をスクリーニングするための方法であって、
被検化合物の存在下または非存在下、ＢＲＩ２および／またはＢＲＩ３とＮＲＢＰ１とを反応させる工程、
被検化合物の存在下および被検化合物の非存在下で、ＢＲＩ２および／またはＢＲＩ３−ＮＲＢＰ１複合体の量を比較する工程、および、
被検化合物の存在下での上記量が被検化合物の非存在下での上記量よりも多い被検化合物を特定する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
更に、ＴＳＣ２２Ｄ４によりＮＲＢＰ１を二量体化する工程を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
更に、ＴＳＣ２２Ｄ３によりＮＲＢＰ１を二量体化する工程を含む請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
上記認知症がアルツハイマー病である請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
上記認知症が家族性英国型認知症および／または家族性デンマーク型認知症である請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
ＮＲＢＰ１、ＴＳＣ２２Ｄ３、およびＴＳＣ２２Ｄ４からなる群より選択される１以上のタンパク質の発現または機能を阻害する化合物を有効成分として含む認知症治療剤。
【請求項７】
上記化合物が、ＮＲＢＰ１遺伝子、ＴＳＣ２２Ｄ３遺伝子およびＴＳＣ２２Ｄ４遺伝子からなる群より選択される遺伝子をノックダウンするものである請求項６に記載の認知症治療剤。
【請求項８】
上記化合物が、ＮＲＢＰ１遺伝子、ＴＳＣ２２Ｄ３遺伝子およびＴＳＣ２２Ｄ４遺伝子からなる群より選択される遺伝子のｓｉＲＮＡである請求項７に記載の認知症治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、重篤な副作用のない認知症治療薬をスクリーニングするための方法、および認知症治療剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
全世界における認知症の患者数は、２０１６年の時点で４７００万人であり、２０５０年には１億人をはるかに超えると予測されている。よって、世界中の研究機関や製薬会社が認知症治療薬の開発に取り組んでいるが、未だに根本的な治療薬の開発に至っていない。
【０００３】
現在認可されているアルツハイマー病（ＡＤ）治療薬はアセチルコリン等の神経伝達物質のモジュレーターであり、対症療法に過ぎないため効果は一時的で、認知症の進行を阻止できない。そこで、認知症を根本的に治療できる薬剤が探索されている。
【０００４】
アルツハイマー病の原因としては、以下の仮説がたてられている。先ず、アミロイドβ（Ａβ）が脳の神経細胞外に蓄積し、老人斑を形成すると、タウタンパク質のリン酸化が起こって凝集し、神経原線維変化を起こす。次にＡβの蓄積の過程で生じるオリゴマーや神経原線維変化が神経細胞の機能障害を誘発し、細胞死に至らしめるとされている。アミロイドβは、アミロイドタンパク質前駆体（ＡＰＰ）がβ−セクレターゼにより切断されてＡＰＰカルボキシ末端フラグメント（β−ＣＴＦ）が生成した後、β−ＣＴＦがγ−セクレターゼにより切断されることにより生成し、オリゴマー化することが知られている。そこで、アルツハイマー治療薬として、γ−セクレターゼやβ−セクレターゼの阻害剤が検討されている（特許文献１等）。
【０００５】
しかし、セクレターゼは生体内で様々なタンパク質を分解する重要な働きがあるため、セクレターゼ阻害剤の投与により、例えば皮膚がんや肝障害などの重篤な副作用が確認されている。よって、セクレターゼ阻害剤は、認知症の治療薬としては問題が多い。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２０１３／１０８７８０号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上述したように、認知症の真の治療薬であって重篤な副作用のないものは未だ開発されていないのが現状である。そこで本発明は、認知症の根本的な治療薬であって重篤な副作用のないものをスクリーニングするための方法、および認知症の治療剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた。その結果、アミロイド前駆体タンパク質プロセシングやアミロイドβのオリゴマー化を阻害するＢＲＩ２およびＢＲＩ３を分解するＣｕｌｌｉｎ−ＲＩＮＧユビキチンリガーゼ（ＣＲＬ）の基質受容体としてＮＲＢＰ１を同定し、ＮＲＢＰ１とＢＲＩ２／ＢＲＩ３の相互作用を指標とすれば、重篤な副作用のない認知症治療薬をスクリーニングできることを見出して、本発明を完成した。
以下、本発明を示す。
【０００９】
［１］  認知症治療薬をスクリーニングするための方法であって、
被検化合物の存在下または非存在下、ＢＲＩ２および／またはＢＲＩ３とＮＲＢＰ１とを反応させる工程、
被検化合物の存在下および被検化合物の非存在下で、ＢＲＩ２および／またはＢＲＩ３−ＮＲＢＰ１複合体の量を比較する工程、および、
被検化合物の存在下での上記量が被検化合物の非存在下での上記量よりも多い被検化合物を特定する工程を含むことを特徴とする方法。
［２］  更に、ＴＳＣ２２Ｄ４によりＮＲＢＰ１を二量体化する工程を含む上記［１］に記載の方法。
［３］  更に、ＴＳＣ２２Ｄ３によりＮＲＢＰ１を二量体化する工程を含む上記［１］または［２］に記載の方法。
［４］  上記認知症がアルツハイマー病である上記［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［５］  上記認知症が家族性英国型認知症および／または家族性デンマーク型認知症である上記［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［６］  ＮＲＢＰ１、ＴＳＣ２２Ｄ３、およびＴＳＣ２２Ｄ４からなる群より選択される１以上のタンパク質の発現または機能を阻害する化合物を有効成分として含む認知症治療剤。
［７］  上記化合物が、ＮＲＢＰ１遺伝子、ＴＳＣ２２Ｄ３遺伝子およびＴＳＣ２２Ｄ４遺伝子からなる群より選択される遺伝子をノックダウンするものである上記［６］に記載の認知症治療剤。
［８］  上記化合物が、ＮＲＢＰ１遺伝子、ＴＳＣ２２Ｄ３遺伝子およびＴＳＣ２２Ｄ４遺伝子からなる群より選択される遺伝子のｓｉＲＮＡである上記［７］に記載の認知症治療剤。
【発明の効果】
【００１０】
従来の認知症治療薬は、アセチルコリン等の神経伝達物質のモジュレーターであることから症状の進行を根本的に停止することができないものであるか、或いは生体内において多様な機能を示すセクレターゼの阻害剤であるため、重篤な副作用が問題になっていた。
それに対して、本発明方法によれば、アルツハイマー病の原因とされているアミロイドβのオリゴマー化や凝集を阻害するＢＲＩ２およびＢＲＩ３の分解を抑制する化合物を認知症治療薬としてスクリーニングすることができる。よって、本発明方法により見出された認知症治療薬は、アミロイドβのオリゴマー化や凝集を直接抑制できるため、重篤な副作用を示さないか或いはほとんど示さないと考えられる。また、理論上、本発明方法により見出された認知症治療薬は、アルツハイマー病のみならず家族性英国型認知症および家族性デンマーク型認知症の治療薬にもなり得る。
よって本発明は、今後、患者数の激増が予想される認知症の治療に寄与できるものとして、産業上非常に価値が高いといえる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、ＮＲＢＰ１とＣｕｌ２との相互作用とＴＳＣ２２ＤＦとの関係を明らかにするための実験の結果を示す免疫ブロット画像である。
【図２】図２は、ＮＲＢＰ１の二量化とＴＳＣ２２ＤＦとの関係を明らかにするための実験の結果を示す免疫ブロット画像である。
【図３】図３は、ＮＲＢＰ１およびＣｕｌ２の安定性とＴＳＣ２２ＤＦとの関係を明らかにするための実験の結果を示す免疫ブロット画像である。
【図４】図４は、ＮＲＢＰ１−ユビキチンリガーゼの基質を探索するための実験の原理を示す模式図である。
【図５】図５は、ＢＲＩ３がＮＲＢＰ１−ユビキチンリガーゼの基質であることを証明するための実験の結果を示す免疫ブロット画像である。
【図６】図６は、ＢＲＩ３がＮＲＢＰ１−ユビキチンリガーゼの基質であることを証明するための実験の結果を示す免疫ブロット画像である。
【図７】図７は、ＢＲＩ２がＮＲＢＰ１−ユビキチンリガーゼの基質であることを証明するための実験の結果を示す免疫ブロット画像である。
【図８】図８は、ＢＲＩ２がＮＲＢＰ１−ユビキチンリガーゼの基質であることを証明するための実験の結果を示す免疫ブロット画像である。
【図９】図９は、ＮＲＢＰ１が細胞内のＢＲＩ２およびＢＲＩ３の安定性に影響を及ぼすか否かを調べるための実験の結果を示す免疫ブロット画像である。
【図１０】図１０は、ＮＲＢＰ１が細胞内のＢＲＩ２およびＢＲＩ３の安定性に影響を及ぼすか否かを調べるための実験の結果を示す免疫ブロット画像である。
【図１１】図１１は、外来性発現ＮＲＢＰ１の存在下、ＮＲＢＰ１−ユビキチンリガーゼによるＢＲＩ２とＢＲＩ３のユビキチン化へのＣｕｌ２とＣｕｌ４Ａの関与を調べるための実験の結果を示す免疫ブロット画像である。
【図１２】図１２は、外来性発現ＮＲＢＰ１の存在下、ＮＲＢＰ１−ユビキチンリガーゼによるＢＲＩ２とＢＲＩ３のユビキチン化へのＣｕｌ２とＣｕｌ４Ａの関与を調べるための実験の結果を示す免疫ブロット画像である。
【図１３】図１３は、外来性発現ＮＲＢＰ１の非存在下、ＮＲＢＰ１−ユビキチンリガーゼによるＢＲＩ２とＢＲＩ３のユビキチン化へのＣｕｌ２とＣｕｌ４Ａの関与を調べるための実験の結果を示す免疫ブロット画像である。
【図１４】図１４は、外来性発現ＮＲＢＰ１の非存在下、ＮＲＢＰ１−ユビキチンリガーゼによるＢＲＩ２とＢＲＩ３のユビキチン化へのＣｕｌ２とＣｕｌ４Ａの関与を調べるための実験の結果を示す免疫ブロット画像である。
【図１５】図１５は、ＮＲＢＰ１とＣｕｌ４Ａとの相互作用とＴＳＣ２２Ｄ３／ＴＳＣ２２Ｄ４との関係を明らかにするための実験の結果を示す免疫ブロット画像である。
【図１６】図１６は、ＮＲＢＰ１の二量体化に重要なアミノ酸配列を特定するための実験の結果を示す免疫ブロット画像である。
【図１７】図１７は、ＮＲＢＰ１二量体がＣｕｌ２およびＣｕｌ４Ａと結合してＣｕｌ２／Ｃｕｌ４Ａを含む二量体型Ｅ３ユビキチンリガーゼ複合体を形成するか否かを調べるための実験の結果を示す免疫ブロット画像である。
【図１８】図１８は、Ｃｕｌ２またはＣｕｌ４Ａとの結合性に重要なＮＲＢＰ１のアミノ酸配列を特定する実験に用いたＮＲＢＰ１変異体のアミノ酸配列を示す図である。
【図１９】図１９は、単量体型ＮＲＢＰ１の各変異体とＣｕｌ２またはＣｕｌ４Ａとの相互作用を調べるための実験の結果を示す免疫ブロット画像である。
【図２０】図２０は、野生型ＮＲＢＰ１または各変異型ＮＲＢＰ１を共発現させた場合におけるＢＲＩ２およびＢＲＩ３のユビキチン化傾向を示す免疫ブロット画像である。
【図２１】図２１は、ＮＲＢＰ１二量体を含むＣｕｌｌｉｎ−ＲＩＮＧ型Ｅ３ユビキチンリガーゼ複合体の模式図である。
【図２２】図２２は、野生型ＮＲＢＰ１または単量体型ＮＲＢＰ１のＢＲＩ２およびＢＲＩ３に対する結合能を示す免疫ブロット画像である。
【図２３】図２３は、ＮＲＢＰ１におけるＢＲＩ３との結合に重要なアミノ酸配列を特定するための実験の結果を示す免疫ブロット画像である。
【図２４】図２４は、ＢＲＩ３におけるＮＲＢＰ１との結合に重要なアミノ酸配列を特定するための実験の結果を示す免疫ブロット画像である。
【図２５】図２５は、ＢＲＩ２およびＢＲＩ３におけるＮＲＢＰ１との結合に重要なアミノ酸配列を特定するための実験の結果を示す免疫ブロット画像である。
【図２６】図２６は、ＮＲＢＰ１、ＴＳＣ２２Ｄ３またはＴＳＣ２２Ｄ４の遺伝子のノックダウンによる内在性ＢＲＩ２およびＢＲＩ３の量の変化を示す免疫ブロット画像である。
【図２７】図２７は、ＮＲＢＰ１、ＴＳＣ２２Ｄ３またはＴＳＣ２２Ｄ４の遺伝子のノックダウンによるアミロイドβの量の変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明方法を工程毎に説明する。
１．ＮＲＢＰ１の二量体化工程
本工程では、ＴＳＣ２２Ｄ４、ＴＳＣ２２Ｄ３、またはＴＳＣ２２Ｄ４とＴＳＣ２２Ｄ３との組み合わせによりＮＲＢＰ１の二量体化を促進する。本工程の実施は任意であり、ＮＲＢＰ１単量体でもＢＲＩ２および／またはＢＲＩ３に対する結合能を示すが、ＮＲＢＰ１単量体に比べてＮＲＢＰ１二量体の方がより安定であるため、本工程を実施することが好ましい。
【００１３】
ＴＳＣ２２Ｄ４は転写抑制因子として知られているが、本発明者らの実験的知見によれば、ＮＲＢＰ１の安定性を著しく増加させ、その二量体化を促進し、且つＮＲＢＰ１二量体を分解から保護する。
【００１４】
ＴＳＣ２２Ｄ３は、プロアポトーシス因子ＢＣＬ２Ｌ１１のダウンレギュレーションにつながるＦＯＸＯ３Ａ転写活性の阻害を介して、ＩＬ２欠乏誘導アポトーシスからＴ細胞を保護する。マクロファージでは、グルココルチコイドとＩＬ１０の抗炎症作用と免疫抑制作用で重要な役割を果たす。本発明者らの実験的知見によれば、ＴＳＣ２２Ｄ３は、ＮＲＢＰ１の立体構造変化を誘導してＮＲＢＰ１二量体と共にＣｕｌｌｉｎ−ＲＩＮＧ型Ｅ３ユビキチンリガーゼ複合体を形成するＣｕｌ２およびＣｕｌ４Ａに対する親和性を高め、ＮＲＢＰ１とＣｕｌ２およびＣｕｌ４Ａとの相互作用を安定化させる。
【００１５】
上記の通り、ＮＲＢＰ１に対するＴＳＣ２２Ｄ４とＴＳＣ２２Ｄ３の作用機序が異なることから、ＴＳＣ２２Ｄ４とＴＳＣ２２Ｄ３を併用することが好ましい。
【００１６】
Ｃｕｌｌｉｎ−ＲＩＮＧ型Ｅ３ユビキチンリガーゼ複合体は、足場タンパク質であるＣｕｌｌｉｎのほか、Ｅ２との結合性を有するＲｂｘタンパク質、アダプタータンパク質および基質受容体により構成される。ヒトではこれまでにＣｕｌ１、Ｃｕｌ２、Ｃｕｌ３、Ｃｕｌ４Ａ、Ｃｕｌ４Ｂ、Ｃｕｌ５、Ｃｕｌ７、ＰＡＲＣの８種類のＣｕｌｌｉｎサブタイプが報告されている。これらの内、Ｃｕｌ２とＣｕｌ５はアダプタータンパク質としてＥｌｏｎｇｉｎ  ＢＣを基質受容体としてＢＣ−ｂｏｘタンパク質を用いる。一方、Ｃｕｌ４ＡとＣｕｌ４Ｂはアダプタータンパク質としてＤＤＢ１を基質受容体としてＨ−ｂｏｘタンパク質を用いることが明らかとなっている。
【００１７】
ＮＲＢＰ１（Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  １）は、おそらくＲｈｏ型ＧＴＰａｓｅとの相互作用により、小胞体とゴルジ体の間の細胞内輸送に関与していると考えられているタンパク質である。ＮＲＢＰ１は、そのＣ末端でＬｉｓＨモチーフを介して二量体化する。本発明者らは、ＮＲＢＰ１が二量体化し、更にＣｕｌ２およびＣｕｌ４と結合してＣｕｌｌｉｎ−ＲＩＮＧ型Ｅ３ユビキチンリガーゼ複合体を形成することを見出した。よって本工程では、ＮＲＢＰ１の二量体化をより一層促進する点で実施することが好ましい。
【００１８】
本工程では、ＴＳＣ２２Ｄ４、またはＴＳＣ２２Ｄ４およびＴＳＣ２２Ｄ３をＮＲＢＰ１に添加するのみであってもよいが、ＮＲＢＰ１遺伝子と、ＴＳＣ２２Ｄ４遺伝子またはＴＳＣ２２Ｄ３遺伝子とＴＳＣ２２Ｄ４遺伝子により細胞を形質転換し、共発現させてもよい。ここで用いられる細胞としては、形質転換実験で一般的に用いられるヒト由来細胞であれば特に制限されないが、例えば、ＨｅＬａ細胞やＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用いることができる。
【００１９】
２．相互作用工程
本工程では、被検化合物の存在下または非存在下、ＢＲＩ２および／またはＢＲＩ３とＮＲＢＰ１とを反応させる。以下、「および／または」を単に「／」と略記する場合がある。
【００２０】
被検化合物は、認知症治療効果を試験すべき化合物であれば特に制限されない。試験のし易さの観点では水溶性のものが好ましいが、水溶性が十分でない化合物の場合には、反応が阻害されない範囲で溶媒としての水にエタノール等の水混和性溶媒を添加してもよいし、界面活性剤を併用してもよい。
【００２１】
反応液における被検化合物の濃度は、被検化合物の適度な濃度が不明であったり、ＮＲＢＰ１およびＢＲＩ２／ＢＲＩ３の濃度にも依存するため適宜調整することが好ましいが、例えば１０μＭ以上、１５０μＭ以下程度の範囲で調整すればよい。
【００２２】
ＢＲＩファミリーは、タイプＩＩ膜貫通タンパク質ファミリーに属し、ＢＲＩ１〜３がある。ＢＲＩ２が全身性の発現を示すのに対し、ＢＲＩ１とＢＲＩ３の発現は限局的で、ＢＲＩ１が骨や軟骨で発現するのに対して、ＢＲＩ３は主に中枢神経系で発現する。また、ＢＲＩ２とＢＲＩ３はアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）への結合能を有し、それにより両タンパク質はβ−セクレターゼによるＡＰＰのＮ末端フラグメントの切断を阻害し、また、ＢＲＩ２はγ−セクレターゼによるＡＰＰのＣ末端フラグメントの切断を阻害する。更に、ＢＲＩ２とＢＲＩ３はアミロイドβのオリゴマー化を阻害する。
【００２３】
本発明者らは、ＮＲＢＰ１の二量体がＣｕｌｌｉｎ−ＲＩＮＧ型Ｅ３ユビキチンリガーゼ複合体を形成し、ＢＲＩ２およびＢＲＩ３の基質受容体として機能することを見出した。ユビキチン−プロテアソーム系は基質特異的なタンパク質分解システムであり、ポリユビキチン鎖が結合した標的タンパク質がプロテアソームにより分解される。よって、ＮＲＢＰ１とＢＲＩ２またはＢＲＩ３との結合を阻害する化合物は、アミロイドβの形成を阻害し、アミロイドβのオリゴマーや凝集体を原因とする認知症の治療薬になり得る。
【００２４】
ＮＲＢＰ１とＢＲＩ２／ＢＲＩ３とを相互作用させる条件は特に制限されず、適宜調整すればよい。例えば、ＮＲＢＰ１およびＢＲＩ２／ＢＲＩ３を含む溶液に、被検化合物を添加し或いは添加せず、２０℃以上、４０℃以下程度で３０分間以上、５０時間以下程度インキュベートすればよい。また、ＮＲＢＰ１は単量体でも二量体でもよいが、安定性がより高いことからＮＲＢＰ１二量体が好ましい。
【００２５】
また、ＮＲＢＰ１とＢＲＩ２／ＢＲＩ３を含む溶液は、ＮＲＢＰ１遺伝子とＢＲＩ２／ＢＲＩ３の遺伝子により細胞を形質転換し、培養し、ホモジェネートした後に不溶成分を除去した溶液であってもよい。また、例えば、上記細胞にはＴＳＣ２２Ｄ４またはＴＳＣ２２Ｄ３とＴＳＣ２２Ｄ４の遺伝子も導入する等して、上記ＮＲＢＰ１の二量体化工程を相互作用工程と同時に実施してもよい。
【００２６】
３．比較工程
本工程では、上記相互作用工程において形成されたＢＲＩ２／ＢＲＩ３−ＮＲＢＰ１複合体の量を、被検化合物の存在下と被検化合物の非存在下とで比較する。
【００２７】
ＢＲＩ２／ＢＲＩ３−ＮＲＢＰ１複合体の量は、常法により定性的または定量的に測定すればよく、定量的に測定することが好ましい。例えば、ＮＲＢＰ１とＢＲＩ２／ＢＲＩ３との複合体の形成を免疫沈降法により確認し、免疫ブロットによりその量を複合体のバンドの濃淡で定性的に比較できるが、ＮａｎｏＢｉｔ(R)やＮａｎｏＢＲＥＴ(R)など、タンパク質間の相互作用を発光強度により定量評価できるシステムを用いることが好ましい。
【００２８】
例えばＮａｎｏＢｉｔ(R)では、ＮＲＢＰ１およびＢＲＩ２／ＢＲＩ３の一方とルシフェラーゼをベースに作製されたＬａｒｇｅ  Ｂｉｔとを融合させたタンパク質をコードする遺伝子と、他方とＳｍａｌｌ  Ｂｉｔとを融合させたタンパク質をコードする遺伝子により細胞を形質転換し、被検化合物の存在下または非存在下、形質転換細胞を培養する。ＮＲＢＰ１とＢＲＩ２／ＢＲＩ３が相互作用すると、Ｌａｒｇｅ  ＢｉｔとＳｍａｌｌ  Ｂｉｔも相互作用して発光酵素が形成されることから、ＮＲＢＰ１とＢＲＩ２／ＢＲＩ３の相互作用を発光強度として定量化することができる。ＮａｎｏＢｉｔ(R)は、一般的なルミノメーターを用いて簡便に測定できるという利点がある。
【００２９】
ＮａｎｏＢＲＥＴ(R)では、ＮＲＢＰ１およびＢＲＩ２／ＢＲＩ３の一方にエネルギー転移ドナーとしてルシフェラーゼを、他方にエネルギー転移アクセプターとして蛍光リガンドで標識されたタンパク質を導入したタンパク質をコードする遺伝子により細胞を形質転換し、被検化合物の存在下または非存在下、形質転換細胞を培養する。ＮＲＢＰ１とＢＲＩ２／ＢＲＩ３が相互作用すると、上記ルシフェラーゼと蛍光リガンド標識タンパク質が近接し、ＢＲＥＴ（Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ）が起こって蛍光シグナルが発せられる。ＮＲＢＰ１とＢＲＩ２／ＢＲＩ３の相互作用を、この蛍光シグナルの強度として定量化することができる。
【００３０】
４．特定工程
本工程では、被検化合物の存在下でのＢＲＩ２／ＢＲＩ３−ＮＲＢＰ１複合体の量が被検化合物の非存在下でのＢＲＩ２／ＢＲＩ３−ＮＲＢＰ１複合体の量よりも多い被検化合物を、認知症治療薬として特定する。
【００３１】
上述した通り、Ｃｕｌｌｉｎ−ＲＩＮＧ型Ｅ３ユビキチンリガーゼ複合体においてＮＲＢＰ１二量体が分解標的タンパク質の受容体として働くので、本発明方法により見出された認知症治療薬は、ＮＲＢＰ１二量体とＢＲＩ２／ＢＲＩ３の相互作用を阻害することにより、アミロイドβ前駆体タンパク質からのアミロイドβの生成を阻害し、また、アミロイドβのオリゴマー化を阻害することにより、アミロイドβが関与する認知症の進行を根本的に阻害すると考えられる。また、本発明に係る認知症治療薬は、生体内酵素の働きを阻害するものではなく、アミロイドβが関与する認知症の進行を負に調整するＢＲＩ２／ＢＲＩ３の分解を阻害するものであるので、重篤な副作用を起こさないと考えられる。
【００３２】
また、ＢＲＩ２遺伝子の２つの突然変異が家族性英国型認知症（ＦＢＤ）および家族性デンマーク型認知症（ＦＤＤ）の原因として特定されており、両認知症では正常ＢＲＩ２タンパク質の減少によりアミロイドβの生成とオリゴマー化が亢進し、アルツハイマー病類似の病像を呈することが知られている。よって本発明方法により見出された認知症治療薬は、アルツハイマー病のみでなく家族性英国型認知症と家族性デンマーク型認知症にも効果的であると考えられる。
【００３３】
また、本工程で認知症治療薬として特定された化合物が、ＮＲＢＰ１ユビキチンリガーゼによるＢＲＩ２／ＢＲＩ３のユビキチン化を実際に抑制するか否かを二次評価することが好ましい。かかる工程により、特定された化合物が認知症治療薬として実際に効果を示す可能性が高まる。例えば、特定された化合物の存在下または非存在下において、ＮＲＢＰ１−ユビキチンリガーゼによるＢＲＩ２／ＢＲＩ３のユビキチン化が実際に抑制されるか否かを、ユビキチン化されたＢＲＩ２／ＢＲＩ３を脱ユビキチン化やプロテアソームによる分解から保護するＴＲ−ＴＵＢＥ（Ｔｒｙｐｓｉｎ−Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｔａｎｄｅｍ  Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｅｎｔｉｔｙ）の存在下、免疫沈降−ウェスタンブロット、或いはウェスタンブロットのみにより確認する。
【００３４】
上述した通り、本発明者らの実験的知見によれば、ＮＲＢＰ１の二量体化とＣｕｌｌｉｎ−ＲＩＮＧ型Ｅ３ユビキチンリガーゼ複合体の形成がアミロイドβの産生を促進し、ＴＳＣ２２Ｄ３とＴＳＣ２２Ｄ４がＮＲＢＰ１の二量体化とＥ３複合体の形成を促進する。よって、ＮＲＢＰ１、ＴＳＣ２２Ｄ３およびＴＳＣ２２Ｄ４からなる群より選択される１以上のタンパク質の発現または機能を阻害する化合物は、認知症治療剤の有効成分として有効であると考えられる。
【００３５】
上記化合物としては、例えば、ＮＲＢＰ１遺伝子、ＴＳＣ２２Ｄ３遺伝子およびＴＳＣ２２Ｄ４遺伝子からなる群より選択される遺伝子をノックダウンするものが挙げられる。更に、ＮＲＢＰ１遺伝子、ＴＳＣ２２Ｄ３遺伝子およびＴＳＣ２２Ｄ４遺伝子からなる群より選択される遺伝子のｓｉＲＮＡが挙げられる。
【００３６】
ｓｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡに相補的な塩基配列を有するアンチセンス鎖と、アンチセンス鎖に相補的なセンス鎖からなる二本鎖核酸であり、通常、２１〜２５ｍｅｒ程度の短鎖ＲＮＡであり、各末端は２塩基ＴＴが突出している構造を有する。ｓｉＲＮＡは標的ｍＲＮＡに結合し、ＲＮＡ干渉を起こすことにより標的ｍＲＮＡが切断される。例えば、以下のｓｉＲＮＡを挙げることができる。
【００３７】
ｓｉＲＮＡ１：  配列番号１〜１２から選択される１以上の塩基配列とＴＴ配列を有するアンチセンス鎖を含むｓｉＲＮＡ；
【００３８】
ｓｉＲＮＡ２：  上記ｓｉＲＮＡ１に規定される塩基配列において、１個または２個の塩基が欠損、置換および／または付加された塩基を有し、且つ、ＮＲＢＰ１遺伝子、ＴＳＣ２２Ｄ３遺伝子またはＴＳＣ２２Ｄ４遺伝子に対する親和性がｓｉＲＮＡ１に比べて同等またはより高いｓｉＲＮＡ；
ｓｉＲＮＡ３：  上記ｓｉＲＮＡ１に規定される塩基配列に対して９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有し、且つ、ＮＲＢＰ１遺伝子、ＴＳＣ２２Ｄ３遺伝子またはＴＳＣ２２Ｄ４遺伝子に対する親和性がｓｉＲＮＡ１に比べて同等またはより高いｓｉＲＮＡ。
【００３９】
上記ｓｉＲＮＡ２において、欠損、置換および／または付加の数、即ち変異の数としては、１個が好ましい。また、上記ｓｉＲＮＡ３において、上記配列同一性としては、９５％以上が好ましく、９８％以上または９９％以上がより好ましく、９９．５％以上がより更に好ましい。
【００４０】
本発明に係る認知症治療剤の形態は特に制限されないが、注射剤とすることが好ましい。具体的には、有効成分がｓｉＲＮＡである場合、ＮＲＢＰ１遺伝子、ＴＳＣ２２Ｄ３遺伝子およびＴＳＣ２２Ｄ４遺伝子からなる群より選択される１以上の遺伝子に対応するｍＲＮＡの一部と相補的なアンチセンス鎖を含むｓｉＲＮＡを、生理食塩水やリン酸緩衝液などに溶解して体液と等張または略等張の溶液を注射剤とすることができる。
【００４１】
本発明に係る認知症治療剤の投与量は、患者の重篤度、年齢、体重、性別などに応じて適宜調整すればよいが、例えば、体重１ｋｇあたり０．１ｎｇ／ｋｇ以上、１００ｍｇ／ｋｇ以下とすることができ、好ましくは１ｎｇ／ｋｇ以上、１０ｍｇ／ｋｇ以下である。本発明に係る認知症治療剤の投与頻度も適宜調整すればよいが、例えば、１ヶ月あたり１回以上、１日あたり１回以下とすることができる。
【実施例】
【００４２】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例によって制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。
【００４３】
実施例１：  ＮＲＢＰ１の二量化とＣｕｌ２との相互作用とＴＳＣ２２ＤＦとの関係
図１に示す組み合わせで、ＦＬＡＧタグ付きＮＲＢＰ１、Ｃｕｌ２、およびＴＳＣ２２ＤＦメンバーを、ＨｅＬａ細胞で共発現させた。次いで、細胞を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１０％グリセロール、プロテアーゼインヒビターカクテル錠（Ｒｏｃｈｅ社製）を含む緩衝液（ｐＨ８．０）で細胞を溶解した後、４℃、１０，０００×ｇで遠心分離することにより細胞溶解物を得た。
更に、図１，２に結果を示す実験では、細胞溶解物にＦＬＡＧタグに対する抗体を加え、４℃で１時間インキュベートした後、プロテインＡ／Ｇ−アガロースビーズ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社製）を加えて４℃で１時間インキュベートした。アガロースビーズを４０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ、１５０〜１０００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、および１０％グリセロールを含む緩衝液（ｐＨ７．９）で５回洗浄した。
細胞溶解物および免疫沈降したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ポリビニリデンジフルオリド膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）に移し、抗体を用いた免疫ブロッティングにより分析した。メーカーの指示に従って、免疫ブロットをＷｅｓｔｅｒｎ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ  Ｐｌｕｓ−ＥＣＬ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社）、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ  Ｗｅｓｔｅｒｎ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）、またはＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｆｅｍｔｏ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｉｅｒｃｅ社）のいずれかで可視化した。
その結果、ＮＲＢＰ１に付加したＦＬＡＧタグに対する抗体を使って免疫沈降させたビーズにはＮＲＢＰ１と相互作用するタンパク質が検出されるところ、図１に示される結果の通り、ＴＳＣ２２ＤＦメンバーの非存在下では、ＮＲＢＰ１とＣｕｌ２は検出可能なほど相互作用しなかった。一方、ＴＳＣ２２Ｄ３の存在によって、ＮＲＢＰ１とＣｕｌ２との会合は著しく増加した。また、ＴＳＣ２２Ｄ３と各ＴＳＣ２２ＤＦタンパク質との同時発現の効果を分析した。その結果、ＴＳＣ２２Ｄ３とＴＳＣ２２Ｄ４とを共発現させた場合、ＮＲＢＰ１とＣｕｌ２との会合は最も顕著に増加した。
【００４４】
また、ＮＲＢＰ１二量体化に対するＴＳＣ２２ＤＦタンパク質の効果を、ＮＲＢＰ１の異なるタグ付きバージョンを同時トランスフェクトすることによって分析した。図２に示される結果の通り、ＴＳＣ２２Ｄ３とＴＳＣ２２Ｄ４の両方が過剰発現されたとき、ＮＲＢＰ１二量体の形成は最も顕著に増強された。
【００４５】
更に、ＴＳＣ２２Ｄ３とＴＳＣ２２Ｄ４を共発現させると、ＮＲＢＰ１の発現が増加することも観察され、ＴＳＣ２２Ｄ４との相互作用がＮＲＢＰ１の安定性を高める可能性があることが示唆された。実際、シクロヘキシミド追跡分析によれば、ＴＳＣ２２Ｄ３はＮＲＢＰ１の安定性にほとんど影響を及ぼさなかったが、ＴＳＣ２２Ｄ４はその安定性を著しく増加させた。また、図３に示される結果の通り、ＴＳＣ２２Ｄ３とＴＳＣ２２Ｄ４の両方を共発現させるとＣｕｌ２の安定性も増加した。
【００４６】
以上の実験結果をまとめると、ＴＳＣ２２Ｄ３は、Ｃｕｌ２に対する親和性を増加させるようにＮＲＢＰ１の立体構造変化を誘導するか、ＮＲＢＰ１とＣｕｌ２との間の相互作用を安定化させ、また、ＴＳＣ２２Ｄ４は、ＮＲＢＰ１の二量体化を促進し、それを分解から保護した。このように、ＴＳＣ２２Ｄ３とＴＳＣ２２Ｄ４は異なるメカニズムによってＮＲＢＰ１の二量体化やＮＲＢＰ１−Ｃｕｌ２の結合を促進するための分子シャペロンとして働くので、ＴＳＣ２２Ｄ３またはＴＳＣ２２Ｄ４単独でも効果があるのみならず、ＴＳＣ２２Ｄ３とＴＳＣ２２Ｄ４の併用により更に顕著な効果が得られると考えられる。
【００４７】
実施例２：  ＢＲＩ３とＢＲＩ２がＮＲＢＰ１−ユビキチンリガーゼの基質であることの証明
ＮＲＢＰ１は、第３３０〜３５７位にＢＣ−ｂｏｘとＣｕｌ２−ｂｏｘを有し、Ｃｕｌ２−ｂｏｘにＣｕｌ２が結合してＣｕｌｌｉｎ−ＲＩＮＧ型Ｅ３ユビキチンリガーゼ複合体を形成する。
本実験では、Ｃｕｌ２−ｂｏｘに、Ｉ３４８Ａ、Ｐ３４９ＡおよびＬ３５３Ａの変異を有する変異体であるＮＲＢＰ１−ＩＰＬを作製した。ＮＲＢＰ１−ＩＰＬは、Ｃｕｌ２との結合のために重要と予測された第３４８位、第３４９位および第３５３位のアミノ酸残基をアラニンに置換したものである。具体的には、ユビキチン鎖結合プローブであるＴＲ−ＴＵＢＥ、ＴＳＣ２２Ｄ３、ＴＳＣ２２Ｄ４、およびＦＬＡＧタグ付き野生型（ＷＴ）ＮＲＢＰ１またはＮＲＢＰ１−ＩＰＬを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において共発現させた（図４）。免疫ブロッティングの結果によれば（図５）、野生型ＮＲＢＰ１とＴＲ−ＴＵＢＥを共発現する細胞ではユビキチン化が明確に認められたが、ＮＲＢＰ１−ＩＰＬとＴＲ−ＴＵＢＥを共発現する細胞では認められなかった。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における外来性発現ＮＲＢＰ１とＢＲＩ３の間の相互作用も共免疫沈降分析によって調べた。図６に示される結果の通り、ユビキチン化やプロテアソームによる分解はＮＲＢＰ１−ＩＰＬよりも野生型ＮＲＢＰ１の場合に効率的に進行すると予想されるところ、ＢＲＩ３とＮＲＢＰ１−ＩＰＬとの共免疫沈降に比べて、ＢＲＩ３と野生型ＮＲＢＰ１との共免疫沈降の方が実質的に少なかった。この結果は、野生型ＮＲＢＰ１からＣｕｌｌｉｎ−ＲＩＮＧ型Ｅ３ユビキチンリガーゼ複合体が形成され、ＢＲＩ３が分解されたことによると考えられる。
ＢＲＩ３は、マウスおよびヒトの両方においてホモログＢＲＩ１、ＢＲＩ２およびＢＲＩ３を含むＢＲＩ遺伝子ファミリーのメンバーである。ＢＲＩ２およびＢＲＩ１は、それぞれＢＲＩ３と４３．７％および３８．３％のアミノ酸配列同一性を示す。そこで、ＢＲＩ１とＢＲＩ２がＮＲＢＰ１の基質であるか否か調べた。その結果、共免疫沈降分析により、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において、ＢＲＩ２とＢＲＩ１のうち、ＢＲＩ２のみがＮＲＢＰ１と結合することが判明した。また、図７に示される結果の通り、ＢＲＩ３と同様に、ＢＲＩ２とＮＲＢＰ１−ＩＰＬとの共免疫沈降に比べて、ＢＲＩ２と野生型ＮＲＢＰ１との共免疫沈降の方が少なかった。更に、図８に示される結果の通り、ＮＲＢＰ１−ＩＰＬとＴＲ−ＴＵＢＥを同時発現する細胞よりも、野生型ＮＲＢＰ１とＴＲ−ＴＵＢＥを同時発現する細胞において、実質的により多くのユビキチン化ＢＲＩ２が検出された。
ＢＲＩ２遺伝子における突然変異は、野生型ＢＲＩ２に比べてアミノ酸残基数が１１多く、それぞれ家族性英国型認知症（ＦＢＤ）と家族性デンマーク型認知症（ＦＤＤ）を引き起こす変異体タンパク質ＦＢＤ−ＢＲＩ２とＦＤＤ−ＢＲＩ２の産生を導く。そこで、これら２つの変異型タンパク質がＮＲＢＰ１の基質でもあるか否か調べた。その結果、ＦＢＤ−ＢＲＩ２およびＦＤＤ−ＢＲＩ２の両方とも、野生型ＢＲＩ２と同様に、ＮＲＢＰ１−ＩＰＬと相互作用し、また、野生型ＢＲＩ２の場合とほぼ同程度のユビキチン化が、野生型ＮＲＢＰ１遺伝子とＴＲ−ＴＵＢＥ遺伝子を発現する細胞において観察された。
次に、ＮＲＢＰ１が細胞内のＢＲＩ２およびＢＲＩ３の安定性に影響を及ぼすか否かを調べた。シクロヘキシミド追跡実験によれば、図９に示される結果の通り、ＮＲＢＰ１−ＩＰＬ遺伝子が過剰発現している細胞と比較して、野生型ＮＲＢＰ１遺伝子が過剰発現している細胞において、ＢＲＩ２およびＢＲＩ３の両方の安定性が低下していた。また、図１０に示される結果の通り、ＢＲＩ２およびＢＲＩ３の安定性は、対照細胞と比較してＮＲＢＰ１ノックダウン細胞で増加した。
以上の結果をまとめると、ＮＲＢＰ１含有ユビキチンリガーゼ複合体がＢＲＩ２とＢＲＩ３の両方をユビキチン化し、細胞内でのそれらの代謝回転を調節することが明らかになった。
【００４８】
実施例３：  ＮＲＢＰ１−ユビキチンリガーゼによるＢＲＩ２とＢＲＩ３のユビキチン化へのＣｕｌ２とＣｕｌ４Ａの関与
ＮＲＢＰ１は、そのアミノ酸配列中にＣｕｌ２−ｂｏｘを含み、ＴＳＣ２２Ｄ３およびＴＳＣ２２Ｄ４の存在下、Ｃｕｌ２と会合する。そこで、（１）Ｃｕｌ２がＮＲＢＰ１依存性のＢＲＩ２およびＢＲＩ３のユビキチン化に寄与するか否かと、（２）Ｅ２ユビキチン結合酵素の動員に関与する領域を欠くために触媒として不活性な種々のドミナントネガティブ（ＤＮ）Ｃｕｌｌｉｎを用いて、他のＣｕｌｌｉｎサブタイプが同様の作用を示すか否か調べた。これらの実験において、本発明者らは、野生型ＮＲＢＰ１、ＴＳＣ２２Ｄ３およびＴＳＣ２２Ｄ４を安定的に発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、ＤＮ−Ｃｕｌ２、ＤＮ−Ｃｕｌ３、ＤＮ−Ｃｕｌ４Ａ、ＤＮ−Ｃｕｌ４ＢまたはＤＮ−Ｃｕｌ５、およびＢＲＩ２またはＢＲＩ３を外来性に発現させて、ＨＡタグ付きＴＲ−ＴＵＢＥを用いたインビボユビキチン化アッセイを行った。
図１１に示すように、ＢＲＩ２とＢＲＩ３の両方のユビキチン化は、ＤＮ−Ｃｕｌ２だけでなくＤＮ−Ｃｕｌ４Ａの同時発現によっても劇的に減少した。また、Ｃｕｌ２とＣｕｌ４Ａの過剰発現が、ＢＲＩ２とＢＲＩ３のユビキチン化に影響を与えるかどうかを調べた。図１２に示される結果の通り、ＢＲＩ２およびＢＲＩ３のユビキチン化は、Ｃｕｌ２またはＣｕｌ４Ａのいずれかの共発現によって明らかに強く増強された。図１３および図１４に示される結果の通り、外来性ＮＲＢＰ１遺伝子が発現されなかった細胞においても、これらのユビキチン化のＤＮ−Ｃｕｌ２依存性の減少とＤＮ−Ｃｕｌ４Ａ依存性の減少、並びにＣｕｌ２依存性の増強とＣｕｌ４Ａ依存性の増強の両方が観察された。
これらの結果は、ＢＣ−ｂｏｘタンパク質であるＮＲＢＰ１が、ＢＣ−ｂｏｘ含有基質受容体と共に作用することが以前より知られているＣｕｌ２だけでなく、驚くべきことにＣｕｌ４Ａとも協働して、ＢＲＩ２およびＢＲＩ３のユビキチン化を調節することを示す。
【００４９】
実施例４：  ＮＲＢＰ１二量体化のＣｕｌ２／Ｃｕｌ４Ａ型Ｅ３複合体形成における役割
本発明者らの上記データは、ＮＲＢＰ１が関与するＢＲＩ２とＢＲＩ３のユビキチン化におけるＣｕｌ２とＣｕｌ４Ａの両方の役割を支持するので、ＮＲＢＰ１がＣｕｌ４Ａとも複合体を形成するか否かにつき調べた。図１５に示す結果の通り、ＮＲＢＰ１とＣｕｌ４Ａは、外来性発現されたＴＳＣ２２ＤＦタンパク質の非存在下では細胞内で相互作用しなかった。しかしながら、Ｃｕｌ４ＡおよびＤＤＢ１とＮＲＢＰ１との会合は、ＴＳＣ２２Ｄ３とＴＳＣ２２Ｄ４の同時発現によって著しく増加した。
ＮＲＢＰ１は、第４０６〜４７９位のアミノ酸残基を介してホモ二量体化することが知られている。ＮＲＢＰ１の第４６５〜４７６位には、ＬＩＳ１タンパク質の二量体化に関わる配列として見出されたＬ−Ｘ−Ｘ−Ｌ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｌ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｌモチーフ（ＬｉｓＨモチーフ）と同様の配列が含まれる。ＮＲＢＰ１におけるこれらＬｅｕ残基の繰り返しがその二量体化にとって重要であるかどうかを調べるために、本発明者らは２つのＮＲＢＰ１置換変異体、即ちＮＲＢＰ１［Ｌ４６５Ｅ；Ｌ４６８Ｅ；Ｌ４７２Ｅ；Ｌ４７６Ｅ］（ＬｉｓＨ−Ｍ１）およびＮＲＢＰ１［Ｌ４６４Ｅ；Ｌ４６５Ｅ；Ｌ４６６Ｅ；Ｌ４６８Ｅ；Ｌ４７２Ｅ；Ｌ４７６Ｅ］（ＬｉｓＨ−Ｍ２）と、３つの欠失変異体、即ちＮＲＢＰ１［Δ（４６４−４７６）］、ＮＲＢＰ１［Δ（４６６−４８５）］、およびＮＲＢＰ１［Δ（４０６−４７９）］を構築した。これらの変異体のそれぞれとＶ５タグ付き野生型ＮＲＢＰ１との共免疫沈降分析を行ったところ、図１６に示される結果の通り、ＬｉｓＨ変異体の全てにおいて野生型ＮＲＢＰ１と相互作用する能力が低下していることが示されたことから、ＬｉｓＨドメインがＮＲＢＰ１の二量体化に重要であることが分かった。
【００５０】
ＮＲＢＰ１はホモ二量体化することができ、そしてまたＣｕｌ２およびＣｕｌ４Ａの両方と相互作用することができるので、ＮＲＢＰ１がＣｕｌ２およびＣｕｌ４Ａと結合してＣｕｌ２／Ｃｕｌ４Ａを含む二量体型Ｅ３ユビキチンリガーゼ複合体を形成する可能性が考えられる。この可能性を調べるために、それぞれ異なるタグを付加されたＣｕｌ２およびＣｕｌ４Ａを、ＴＳＣ２２Ｄ３およびＴＳＣ２２Ｄ４の存在下で、野生型ＮＲＢＰ１、または二量体を形成できないＮＲＢＰ１変異体であるＬｉｓＨ−Ｍ２と共免疫沈降させた。その結果、図１７に示される通り、Ｃｕｌ２およびＣｕｌ４Ａは、外来性発現された野生型ＮＲＢＰ１との相互作用が認められたが、ＬｉｓＨ−Ｍ２との相互作用は認められなかった。注目すべきことに、野生型ＮＲＢＰ１の存在下では、Ｃｕｌ２およびＣｕｌ４Ａの何れもがホモ二量体を形成できることが判明した。これらの知見は、単量体型ではなく二量体型のＮＲＢＰ１のみがＣｕｌ２およびＣｕｌ４Ａと結合して、Ｃｕｌ２／Ｃｕｌ４Ａを含む二量体型Ｅ３ユビキチンリガーゼ複合体を形成できることを示唆する。
【００５１】
実施例５：  ＢＲＩ２とＢＲＩ３のユビキチン化に対するＮＲＢＰ１の二量体化能とＣｕｌ２およびＣｕｌ４Ａとの結合能の寄与
ＣＲＬ４Ａユビキチンリガーゼでは、基質受容体ＤＣＡＦ中のＷＤ４０モチーフおよびＨ−ｂｏｘと呼ばれる短いα−ヘリックスモチーフが、ＤＣＡＦとＣｕｌ４Ａとの相互作用を橋渡しするアダプタータンパク質ＤＤＢ１との相互作用に関与している。ＮＲＢＰ１はＷＤ４０モチーフを持たないが、標準的なＢＣ−ｂｏｘ配列を含むＮＲＢＰ１の第３３１〜３４３位には潜在的なＨ−ｂｏｘモチーフ配列が存在する。注目すべきことに、潜在的なＨ−ｂｏｘ配列は、ＣＲＬ２の別の基質受容体であるＦＥＭ１ＢのＢＣ−ｂｏｘ配列にも存在する。ＮＲＢＰ１およびＦＥＭ１ＢにおけるこれらＨ−ｂｏｘ配列の機能的意義を明らかにし、同時に、Ｃｕｌ２またはＣｕｌ４Ａとの結合性が選択的に損なわれているＮＲＢＰ１変異体を同定するために、本発明者らは、更に３つのＮＲＢＰ１変異体を構築した。内１つは、ＨＢｘおよびＤＣＡＦ１においてＤＤＢ１への結合に重要なＨ−ｂｏｘモチーフの第９位の電荷を変更すべく、ＮＲＢＰ１の第３３９位のヒスチジンをグルタミン酸に置換したＮＲＢＰ１［Ｈ３３９Ｅ］（Ｈ−ｂｏｘ−Ｍ１）であり、もう一つは、予測されるα−ヘリックスを完全に破壊するため第３３６位のロイシンをプロリンに置換する変異を加えたＮＲＢＰ１［Ｌ３３６Ｐ；Ｈ３３９Ｅ］（Ｈ−ｂｏｘ−Ｍ２）である。残りの一つは、ＮＲＢＰ１のＨ−ｂｏｘをＦＥＭ１ＢのＨ−ｂｏｘ（第５９５〜６０７位）とほぼ同一の配列で置き換えたＨ−ｂｏｘ−Ｍ３である（図１８）。外来性に発現された野生型またはこれら変異型Ｈ−ｂｏｘ配列を有するＮＲＢＰ１が内在性ＮＲＢＰ１と二量体を形成するのを防ぐために、本発明者らは、第４０６〜４７９位のアミノ酸配列を欠失させて二量体化できないようにした単量体型のＮＲＢＰ１構築物を解析に用いた。
図１９に示される結果の通り、ＨＡタグ付きＣｕｌ２またはＣｕｌ４ＡとＦＬＡＧタグ付きの単量体型ＮＲＢＰ１各変異体との共免疫沈降分析によれば、ＮＲＢＰ１［Δ（４０６−４７９）］および単量体型Ｈ−ｂｏｘ−Ｍ３がＣｕｌ２およびＣｕｌ４Ａの両方と会合することが明らかにされた。対照的に、単量体型のＨ−ｂｏｘ−Ｍ１は、Ｃｕｌ２に結合した一方でＣｕｌ４Ａとの結合性の減少を示したが、単量体型のＨ−ｂｏｘ−Ｍ２ではＣｕｌ２およびＣｕｌ４Ａの両方への結合性が顕著に損なわれた。予想通り、単量体型のＮＲＢＰ１−ＩＰＬにおいてはＣｕｌ２に対する結合性が選択的に損なわれていた。
これらの結果は、ＮＲＢＰ１およびＦＥＭ１Ｂの潜在的なＨ−ｂｏｘ配列が、Ｃｕｌ４Ａとの会合に関与していることを示唆している。
【００５２】
ＮＲＢＰ１は、ＴＳＣ２２Ｄ３およびＴＳＣ２２Ｄ４の存在下で、二量体化し、Ｃｕｌ２およびＣｕｌ４Ａの両方と結合できるので、細胞内では、単量体型のＣＲＬ２またはＣＲＬ４Ａ、ホモ二量体型のＣＲＬ２またはＣＲＬ４Ａ、およびＣＲＬ２／ＣＲＬ４Ａヘテロ二量体型など、様々なＮＲＢＰ１含有ＣＲＬ複合体が形成され得る。ＮＲＢＰ１の二量体化とＣｕｌ２およびＣｕｌ４Ａとの結合が、ＮＲＢＰ１−ユビキチンリガーゼによるＢＲＩ２およびＢＲＩ３のユビキチン化に必要であるかどうかを調べるために、ＢＲＩ２またはＢＲＩ３をＴＳＣ２２Ｄ３、ＴＳＣ２２Ｄ４、ＨＡタグ付きＴＲ−ＴＵＢＥおよび野生型または変異型のＮＲＢＰ１と共発現させたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用いて、インビボユビキチン化アッセイを行った。
図２０に示される結果の通り、明らかに増加したユビキチン化ＢＲＩ２およびＢＲＩ３の蓄積が、野生型ＮＲＢＰ１を共発現する細胞において観察されたが、ユビキチン化ＢＲＩ２およびＢＲＩ３の蓄積は、ＬｉｓＨ−Ｍ２、ＮＲＢＰ１−ＩＰＬ、Ｈ−ｂｏｘ−Ｍ１、Ｈ−ｂｏｘ−Ｍ２、およびＨ−ｂｏｘ−Ｍ３を共発現する細胞においては減弱するか或いは観察されなかった。ＮＲＢＰ１−ＩＰＬおよびＨ−ｂｏｘ−Ｍ１が、Ｈ−ｂｏｘ−Ｍ２およびＬｉｓＨ−Ｍ２よりもわずかに多いユビキチン化ＢＲＩ２およびＢＲＩ３の蓄積を示したのは、前者が細胞内で内在性ＮＲＢＰ１と少なくとも部分的にヘテロ二量体化し、ＮＲＢＰ１−ＩＰＬまたはＨ−ｂｏｘ−Ｍ１と各二量体化パートナーが、それぞれＣｕｌ４ＡまたはＣｕｌ２、およびＣｕｌ２またはＣｕｌ４Ａと結合し、Ｅ３ユビキチンリガーゼ活性を発揮することができたためと推測される。
これらの結果は、二量体化だけでなく、Ｃｕｌ２およびＣｕｌ４Ａの両方との結合もＮＲＢＰ１機能にとって重要であり、図２１に示すＣＲＬ２およびＣＲＬ４Ａを含むヘテロ二量体型のＮＲＢＰ１−ユビキチンリガーゼのみが効率的にＢＲＩ２およびＢＲＩ３をユビキチン依存性のタンパク分解に導くことができることを示唆する。
更に、Ｈ−ｂｏｘ−Ｍ３については、Ｃｕｌ２とＣｕｌ４Ａの両方との結合性を保持しているにも関わらず、ＢＲＩ２およびＢＲＩ３に対するユビキチン化能が損なわれていたことから、ＮＲＢＰ１とＦＥＭ１Ｂ間のＢＣ/Ｈ−ｂｏｘの配列の違いは、多少なりともＮＲＢＰ１のＥ３ユビキチンリガーゼ活性に寄与しているものと考えられる。
【００５３】
次に、ＮＲＢＰ１の二量体化が基質の認識に影響を与えるか否かを調べた。ＢＲＩ２またはＢＲＩ３のいずれかを、ＴＳＣ２２Ｄ３、ＴＳＣ２２Ｄ４およびＦＬＡＧタグ付きの野生型またはＬｉｓＨ−Ｍ２変異を伴うＮＲＢＰ１とＨＥＫ２９３Ｔ細胞で共発現させ、抗ＦＬＡＧ抗体を用いた共免疫沈降分析を行った。なお、ＢＲＩ２およびＢＲＩ３のユビキチン化と分解を防ぐために、細胞はプロテアソーム／プロテアーゼ阻害剤（「ＭＧ１３２」ＢｏｓｔｏｎＢｉｏｃｈｅｍ社製）で処理した。図２２に示すように、野生型ＮＲＢＰ１およびＬｉｓＨ−Ｍ２は、ＢＲＩ２およびＢＲＩ３に対して同程度の結合能を示した。この結果は、ＮＲＢＰ１の二量体化がＢＲＩ２およびＢＲＩ３に対する親和性にほとんど影響を及ぼさないことを示唆する。
【００５４】
実施例６：  ＮＲＢＰ１とＢＲＩ２／ＢＲＩ３との結合に重要な位置の特定
基質との相互作用に必要なＮＲＢＰ１領域を調査するために、一連のＦＬＡＧタグ付きＮＲＢＰ１欠失変異体を作製し、それらがＶＳＶ−Ｇタグ付きＢＲＩ２またはＢＲＩ３と会合する能力について試験した。
図２３に示される結果の通り、Ｃ末端欠失変異体Δ（３２８〜５３５）はＢＲＩ３に結合することができず、Ｎ末端欠失変異体Δ（２〜７２）、Δ（２〜３２７）、およびΔ（２〜４０５）は全て結合することができた。この結果は、ＢＲＩ３との結合にはＮＲＢＰ１のＮ末端は必要ではないこと、および第４０６〜５３５位のアミノ酸残基が相互作用に十分であることを示している。しかしながら、ＮＲＢＰ１欠失変異体Δ（４０６〜５３５）は依然としてＢＲＩ３に結合することができたので、第３２８〜４０５位および第４０６〜５３５位の内の少なくとも２つの領域が相互作用に寄与することが示唆された。同様の結果がＢＲＩ２でも得られた。
【００５５】
本発明者らは、更に一連のＶＳＶ−Ｇタグ付きＢＲＩ３欠失変異体およびＢＲＩ２欠失変異体とＦＬＡＧタグ付きＮＲＢＰ１との相互作用を調べた。
図２４に示される結果の通り、Δ（９１〜１２０）、Δ（１２１〜１５０）、およびΔ（１８１〜２１０）などのＢＲＩ３内部欠失変異体は、ＮＲＢＰ１に結合できなかった。より小さな欠失を有する一連の変異体を用いた更なる分析によれば、ＢＲＩ３の２つの中央部分である第１２１〜１４０位および第１９１〜２１０位が相互作用にとって重要である。
更に、図２５に示される結果の通り、ＢＲＩ３またはＢＲＩ２の第６１〜１３５位および第８１〜２１０位または第６１〜１３６位および第７７〜２１０位からなる切断型欠失変異体は、ＮＲＢＰ１に結合する能力を保持していた。各タンパク質のルーメン側部分は重要であり、フリンプロテアーゼによる切断後に分泌されるＣ末端ペプチド部分は、相互作用に必要ではないということである。
【００５６】
実施例７：  ＮＲＢＰ１とＴＳＣ２２Ｄ３／ＴＳＣ２２Ｄ４がＢＲＩ２とＢＲＩ３の分解およびＡＰＰプロセシングに関与することの確認
ＮＲＢＰ１の過剰発現がＴＳＣ２２Ｄ３およびＴＳＣ２２Ｄ４の存在下でＢＲＩ２およびＢＲＩ３のユビキチン化をもたらしたので、次に本発明者らは、内在性ＮＲＢＰ１またはＴＳＣ２２Ｄ３／ＴＳＣ２２Ｄ４のノックダウンがアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）プロセシングおよび神経細胞からのアミロイドβの産生に影響を及ぼすか否かを調べた。
Ｆ１１細胞に、対照ｓｉＲＮＡ、ＮＲＢＰ１を標的とするｓｉＲＮＡ（配列番号１〜４）、ＴＳＣ２２Ｄ３を標的とするｓｉＲＮＡ（配列番号５〜８）、ＴＳＣ２２Ｄ４を標的とするｓｉＲＮＡ（配列番号９〜１２）、またはＮＲＢＰ１、ＴＳＣ２２Ｄ３およびＴＳＣ２２Ｄ４を標的とするｓｉＲＮＡ（配列番号１〜１２）をトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、培地を交換し、細胞を更に２４時間インキュベートし、そして細胞溶解物および馴化培地を調製した。
図２６に示される結果の通り、ＲＮＡｉによるＮＲＢＰ１、ＴＳＣ２２Ｄ３またはＴＳＣ２２Ｄ４のいずれかのノックダウンは、内在性ＢＲＩ２およびＢＲＩ３の量の増加をもたらし、培地中のｓＡＰＰαではなくｓＡＰＰβのレベルも中程度に減少した。また、図２７に示される結果の通り、ＮＲＢＰ１、ＴＳＣ２２Ｄ３またはＴＳＣ２２Ｄ４のいずれかをノックダウンすると、分泌されたＡβ４０およびＡβ４２のレベルは有意に減少させた。これら結果は、神経細胞におけるアミロイド形成経路がこれらタンパク質の内在性レベルによって微調整されることを示唆している。
更に、図２６に示される結果の通り、分泌されたＩＤＥはやや増加したが、細胞溶解物中のＢＡＣＥ１はＮＲＢＰ１、ＴＳＣ２２Ｄ３またはＴＳＣ２２Ｄ４の遺伝子のノックダウンによって明らかに減少した。注目すべきことに、図２７に示される結果の通り、低濃度のｓｉＲＮＡを用いた３種類の遺伝子すべての同時ノックダウンは、ＮＲＢＰ１、ＴＳＣ２２Ｄ３またはＴＳＣ２２Ｄ４のいずれかをコードする遺伝子のノックダウンと比較して、分泌されたアミロイドβの更なる減少を引き起こした。
以上の結果は、ＮＲＢＰ１およびシャペロンタンパク質ＴＳＣ２２Ｄ３／ＴＳＣ２２Ｄ４が、協働して細胞内ＢＲＩ２およびＢＲＩ３の代謝回転を調節することにより、アミロイドβの産生を制御していることを示唆するものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【配列表】
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