(57)【要約】      （修正有）【課題】セサミノール２糖又は３糖配糖体、およびその製造方法の提供。【解決手段】セサミノール２’−Ｏ−β−Ｄ−グルコシル（１→２）−Ｏ−［β−Ｄ−グルコシル（１→２）］。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（５）に示されるセサミノール２’−Ｏ−β−Ｄ−グルコシル（１→２）−Ｏ−［β−Ｄ−グルコシル（１→２）］−β−Ｄ−グルコシド。
【化１】
2020183420.tif 000011
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セサミノール２糖又は３糖配糖体の製造方法、セサミノール２’−Ｏ−β−Ｄ−グルコシル（１→２）−Ｏ−［β−Ｄ−グルコシル（１→２）］−β−Ｄ−グルコシド、タンパク質、ポリヌクレオチド、発現ベクター、形質転換体及び植物体の選別方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ゴマ属（Ｓｅｓａｍｕｍ）のゴマの種子にはフェニルプロパノイド系の二次代謝物のリグナンが豊富に含まれる。その代表であるセサミン（ｓｅｓａｍｉｎ）は極性が低く、様々な生物活性が報告されており、日本では健康食品として販売されている。セサミノール（ｓｅｓａｍｉｎｏｌ）はセサミンが酸化された水酸基を有しており、さらにこの水酸基にグルコースが付加され、そのグルコース残基の２位及び６位にそれぞれグルコースが付加されたセサミノール２’−Ｏ−β−Ｄ−グルコシル（１→２）−Ｏ−［β−Ｄ−グルコシル（１→６）］−β−Ｄ−グルコシド（以下、ＳＧ３（２，６）と記載する）として蓄積している（非特許文献１）。これらはセサミンアグリコンと比べると水溶性が高く、物性の違いから異なる活性が期待されるとともに、その水溶性の高さから飲料などに添加することが可能である。
【０００３】
これまでセサミノールをグルコシル化し、セサミノール２’−Ｏ−β−Ｄ−グルコシド（以下、ＳＧ１と記載する）を生成する反応を触媒するタンパク質として、ゴマ由来ＵＤＰ−糖特異的糖転移酵素（ＵＤＰ−ｓｕｇａｒ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；ＵＧＴ）のＵＧＴ７１Ａ９と、ＳＧ１のグルコースの６位をグルコシル化し、セサミノール２’−Ｏ−β−Ｄ−グルコシル（１→６）−β−Ｄ−グルコシド（以下、ＳＧ２（６）と記載する）を生成するＵＧＴ９４Ｄ１が報告されていた（特許文献１、非特許文献１）。ＵＧＴ９４Ｄ１のようなセサミノール配糖体の糖に特異的にグルコースを転移するタンパク質は、配糖体特異的糖転移酵素（Ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（以下、「ＧＧＴ」とも記載する））と称されている。また、種々のＧＴＴは、種を超えてよく保存されている共通のアミノ酸配列を有している。しかし、アミノ酸配列情報から糖受容体となる化合物や糖を付加する位置を推定することは困難であった。
【０００４】
また、実際に、ＳＧ１のグルコース残基の２位、又は、ＳＧ２（６）のセサミノールに結合している一つ目のグルコース残基の２位をグルコシル化し、セサミノール２’−Ｏ−β−Ｄ−グルコシル（１→２）−β−Ｄ−グルコシド（以下、ＳＧ２（２）と記載する）、又は、ＳＧ３（２，６）を生成するタンパク質は見いだされていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００６−１２９７２８号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｎｏｇｕｃｈｉ，  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ  （２００８）  Ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  ｇｌｕｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｆｕｒｏｆｕｒａｎ  ｌｉｇｎａｎ，  （＋）−ｓｅｓａｍｉｎｏｌ，  ｂｙ  Ｓｅｓａｍｕｍ  ｉｎｄｉｃｕｍ  ＵＧＴ７１Ａ９  ａｎｄ  ＵＧＴ９４Ｄ１  ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ．  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  ５４，  ４１５−４２７.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、セサミノール１糖又は２糖配糖体の糖残基の所定の位置に糖を付与し、セサミノール２糖又は３糖配糖体を製造する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、ＳＧ１のグルコース残基の２位、ＳＧ２（６）の一つ目のグルコース残基の２位、及び、ＳＧ２（２）の２つ目のグルコース残基の２位をそれぞれグルコシル化して、ＳＧ２（２）、ＳＧ３（２，６）、及び、セサミノール２’−Ｏ−β−Ｄ−グルコシル（１→２）−Ｏ−［β−Ｄ−グルコシル（１→２）］−β−Ｄ−グルコシド（以下、ＳＧ３（２，２）と記載する）を生成するセサミノール配糖体特異的糖転移酵素（以下、「セサミノールＧＧＴ」とも記載する）を発見し、このタンパク質を用いることにより、セサミノール１糖又は２糖配糖体の糖残基の所定の位置に糖を付与し、セサミノール２糖又は３糖配糖体を製造できることを見出し、本発明を完成させた。
【０００９】
すなわち、本発明のセサミノール２糖又は３糖配糖体の製造方法は、セサミノール２糖又は３糖配糖体の製造方法であって、下記一般式（１）で示されるセサミノール１糖又は２糖配糖体及びＵＤＰ−糖に、下記タンパク質（Ｐ１−１）〜（Ｐ１−４）からなる群より選択される少なくとも１種のタンパク質（Ｐ１）を作用させる工程（ｉ）を含むことを特徴とする。
（Ｐ１−１）配列番号１又は２のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｐ１−２）配列番号１又は２のアミノ酸配列に１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、下記一般式（１）で示されるセサミノール１糖又は２糖配糖体のヘキソース残基へのβ−１→２結合の糖転移活性を有するタンパク質
（Ｐ１−３）配列番号１又は２のアミノ酸配列に対して、９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、下記一般式（１）で示されるセサミノール１糖又は２糖配糖体のヘキソース残基へのβ−１→２結合の糖転移活性を有するタンパク質
（Ｐ１−４）配列番号３又は４のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、下記一般式（１）で示されるセサミノール１糖又は２糖配糖体のヘキソース残基へのβ−１→２結合の糖転移活性を有するタンパク質
【００１０】
【化１】
2020183420.tif 000002
【００１１】
［一般式（１）中、（Ｓ１）は、ヘキソース残基を表し、ｎは１又は２の数を表す。セサミノールと結合している１つ目のヘキソース残基（Ｓ１）は、１位の炭素を介してセサミノールと結合している。ｎが２の場合、２つのヘキソース残基（Ｓ１）は同一であってもよく、異なっていてもよく、これらはβ−１→２結合、又は、β−１→６結合している。］
なお、本明細書中、β−１→２結合、及び、β−１→６結合は、Ｏ−グリコシド結合である。
【００１２】
本発明のセサミノール２糖又は３糖配糖体の製造方法では、上記ＵＤＰ−糖が、ＵＤＰ−ヘキソースであることが好ましく、ＵＤＰ−グルコースであることがより好ましい。
【００１３】
本発明のセサミノール２糖又は３糖配糖体の製造方法では、上記（Ｓ１）は、Ｄ−グルコース残基であることが好ましい。
【００１４】
本発明のセサミノール２糖又は３糖配糖体の製造方法では、上記一般式（１）で示されるセサミノール１糖又は２糖配糖体のヘキソース残基へのβ−１→２結合の糖転移活性が、ＳＧ１のグルコース残基へのβ−１→２結合のグルコース転移活性（Ｉ）、ＳＧ２（６）の１つ目のグルコース残基へのβ−１→２結合のグルコース転移活性（ＩＩ）、及び、ＳＧ２（２）の２つ目のグルコース残基へのβ−１→２結合のグルコース転移活性（ＩＩＩ）のいずれか１つ又は２以上であることが好ましい。
【００１５】
本発明のセサミノール２糖又は３糖配糖体の製造方法では、上記一般式（１）で示されるセサミノール１糖又は２糖配糖体は、下記式（２）に示されるＳＧ１であり、上記ＵＤＰ−糖は、ＵＤＰ−グルコースであり、上記ＳＧ１のグルコース残基へのβ−１→２結合のグルコース転移により下記式（３）に示されるＳＧ２（２）を生成させることが好ましい。
【００１６】
【化２】
2020183420.tif 000003
【００１７】
【化３】
2020183420.tif 000004
【００１８】
本発明のセサミノール２糖又は３糖配糖体の製造方法では、上記式（３）に示されるＳＧ２（２）及びＵＤＰ−グルコースに下記タンパク質（Ｐ２−１１）〜（Ｐ２−１８）からなる群より選択される少なくとも１種のタンパク質（Ｐ２）を作用させ、下記式（４）に示されるＳＧ３（２，６）を生成させる工程（ｉｉ）を含むことが好ましい。
（Ｐ２−１１）配列番号５のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｐ２−１２）配列番号５のアミノ酸配列に１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、セサミノール２’−Ｏ−β−Ｄ−グルコシル（１→１２）−β−Ｄ−グルコシドの１つ目のグルコース残基へのβ−１→６結合のグルコース転移活性を有するタンパク質
（Ｐ２−１３）配列番号５のアミノ酸配列に対して、９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、ＳＧ２（２）の１つ目のグルコース残基へのβ−１→６結合のグルコース転移活性を有するタンパク質
（Ｐ２−１４）配列番号６のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、ＳＧ２（２）の１つ目のグルコース残基へのβ−１→６結合のグルコース転移活性を有するタンパク質
（Ｐ２−１５）配列番号７のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｐ２−１６）配列番号７のアミノ酸配列に１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＳＧ２（２）の１つ目のグルコース残基へのβ−１→６結合のグルコース転移活性を有するタンパク質
（Ｐ２−１７）配列番号７のアミノ酸配列に対して、９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、ＳＧ２（２）の１つ目のグルコース残基へのβ−１→６結合のグルコース転移活性を有するタンパク質
（Ｐ２−１８）配列番号８のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、ＳＧ２（２）の１つ目のグルコース残基へのβ−１→６結合のグルコース転移活性を有するタンパク質
【００１９】
【化４】
2020183420.tif 000005
【００２０】
本発明のセサミノール２糖又は３糖配糖体の製造方法では、上記式（３）に示されるＳＧ２（２）及びＵＤＰ−グルコースに上記タンパク質（Ｐ１）を作用させ、下記式（５）に示されるＳＧ３（２，２）を生成させる工程をさらに含むことが好ましい。
【００２１】
【化５】
2020183420.tif 000006
【００２２】
本発明のセサミノール２糖又は３糖配糖体の製造方法では、上記一般式（１）で示されるセサミノール１糖又は２糖配糖体は、下記式（６）に示されるＳＧ２（６）であり、上記ＵＤＰ−糖が、ＵＤＰ−グルコースであり、上記ＳＧ２（６）の１つ目のグルコース残基へのβ−１→２結合のグルコース転移により、上記式（４）に示されるＳＧ３（２，６）を生成させることが好ましい。
【００２３】
【化６】
2020183420.tif 000007
【００２４】
本発明のセサミノール２糖又は３糖配糖体の製造方法では、上記一般式（１）で示されるセサミノール１糖又は２糖配糖体は、上記式（３）に示されるＳＧ２（２）であり、上記ＵＤＰ−糖が、ＵＤＰ−グルコースであり、上記ＳＧ２（２）の２つ目のグルコース残基へのβ−１→２結合のグルコース転移により、上記式（５）に示されるＳＧ３（２，２）を生成させることが好ましい。
【００２５】
上記式（５）に示されるＳＧ３（２，２）も、本発明の１つである。
【００２６】
本発明のタンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列からなることを特徴とする。
本発明のポリヌクレオチドは、配列番号４のヌクレオチド配列を含むことを特徴とする。
本発明の発現ベクターは、上記本発明のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする。
【００２７】
本発明の形質転換体は、発現ベクターが導入された非ヒト宿主である形質転換体であって、上記発現ベクターは、下記ポリヌクレオチド（Ｎ１−１）〜（Ｎ１−４）及びポリヌクレオチド（Ｎ２−１）〜（Ｎ２−４）からなる群より選択される少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むことを特徴とする。
（Ｎ１−１）配列番号３又は４のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
（Ｎ１−２）配列番号３又は４のヌクレオチド配列に１個又は数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドであり、かつ、上記一般式（１）で示されるセサミノール１糖又は２糖配糖体の１つ目のヘキソース残基へのβ−１→２結合の糖転移活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（Ｎ１−３）配列番号３又は４のヌクレオチド配列に対して、９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドであり、かつ、上記一般式（１）で示されるセサミノール１糖又は２糖配糖体の１つ目のヘキソース残基へのβ−１→２結合の糖転移活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（Ｎ１−４）配列番号３又は４のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドからなり、かつ、上記一般式（１）で示されるセサミノール１糖又は２糖配糖体の１つ目のヘキソース残基へのβ−１→２結合の糖転移活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（Ｎ２−１）配列番号６のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
（Ｎ２−２）配列番号６のヌクレオチド配列に１個又は数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドであり、かつ、上記一般式（１）で示されるセサミノール１糖又は２糖配糖体の１つ目のヘキソース残基へのβ−１→６結合の糖転移活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（Ｎ２−３）配列番号６のヌクレオチド配列に対して、９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドであり、かつ、上記一般式（１）で示されるセサミノール１糖又は２糖配糖体の１つ目のヘキソース残基へのβ−１→６結合の糖転移活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（Ｎ２−４）配列番号６のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドからなり、かつ、上記一般式（１）で示されるセサミノール１糖又は２糖配糖体の１つ目のヘキソース残基へのβ−１→６結合の糖転移活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
【００２８】
本発明の形質転換体では、上記非ヒト宿主は、植物体又はその部分であることが好ましく、ゴマの植物体又はその部分であることがさらに好ましい。
【００２９】
本発明のセサミノール２糖又は３糖配糖体の製造方法は、本発明の形質転換体を栽培又は培養する工程を含むことを特徴とする。
【００３０】
本発明の植物体の選別方法は、配列番号３、４又は６のヌクレオチド配列の少なくとも一部の配列を含むポリヌクレオチドを使用して、セサミノール２糖又は３糖配糖体合成能が異なる植物体を選別することを特徴とする。
【発明の効果】
【００３１】
本発明によれば、セサミノール配糖体のヘキソース残基に糖をβ−１→２転移するタンパク質（セサミノールＧＧＴ）を用いることにより、セサミノール１糖又は２糖配糖体の所定の位置に糖を転移させ、所定の構造のセサミノール２糖又は３糖配糖体を製造することができる。
また、本発明によれば、新規なセサミノール３糖配糖体を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図１は、ＳＧ３（２，６）、又は、ＳＧ３（２，２）を合成する経路を模式的に示す反応図である。
【図２】図２の（ａ）は、ゴマ種子ｃＤＮＡを鋳型として、タンパク質ＳｉＧＧＴ２１８４２用フォワードプライマー及びタンパク質ＳｉＧＧＴ２１８４２用リバースプライマーを用いて得られたＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動の写真であり、（ｂ）は、ゴマ種子ｃＤＮＡを鋳型として、タンパク質ＳｉＧＧＴ２１６４６用フォワードプライマー及びタンパク質ＳｉＧＧＴ２１６４６用リバースプライマーを用いて得られたＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動の写真である。
【図３】図３の（ａ）は、ＳＧ１及び精製タンパク質ＳｉＧＧＴ２１８４２溶液を用いた反応液の逆相ＬＣ−ＭＳ分析のチャートであり、図３の（ｂ）は、ＳＧ２（２）の標準品の逆相ＬＣ−ＭＳ分析のチャートであり、図３の（ｃ）は、ＳＧ１及びネガティブコントロール画分を用いた反応液の逆相ＬＣ−ＭＳ分析のチャートである。
【図４】図４の（ａ）は、ＳＧ２（２）及び精製タンパク質ＳｉＧＧＴ２１８４２溶液を用いた反応液の逆相ＬＣ−ＭＳ分析のチャートであり、図４の（ｂ）は、ＳＧ２（２）及びネガティブコントロール画分を用いた反応液の逆相ＬＣ−ＭＳ分析のチャートである。
【図５】図５の（ａ）は、ＳＧ２（６）及び精製タンパク質ＳｉＧＧＴ２１８４２溶液を用いた反応液の逆相ＬＣ−ＭＳ分析のチャートであり、図５の（ｂ）は、ＳＧ３（２，６）及びネガティブコントロール画分を用いた反応液の逆相ＬＣ−ＭＳ分析のチャートであり、図５の（ｃ）は、ＳＧ２（６）及びネガティブコントロール画分を用いた反応液の逆相ＬＣ−ＭＳ分析のチャートである。
【図６】図６の（ａ）は、実施例４のネガティブコントロールの反応液の逆相ＬＣ−ＭＳ分析のチャートであり、図６の（ｂ）は、実施例４の第１反応の反応液の逆相ＬＣ−ＭＳ分析のチャートであり、図６の（ｃ）は、実施例４の第２反応の反応液の逆相ＬＣ−ＭＳ分析のチャートである。
【図７】図７は、試験例１の反応液の逆相ＬＣ−ＭＳ分析のチャートである。
【図８】図８は、試験例２の反応液の逆相ＬＣ−ＭＳ分析のチャートである。
【図９】図９は、試験例３の反応液の逆相ＬＣ−ＭＳ分析のチャートである。
【図１０】図１０は、試験例４の反応液の逆相ＬＣ−ＭＳ分析のチャートである。
【図１１】図１１は、試験例５の反応液の逆相ＬＣ−ＭＳ分析のチャートである。
【図１２】図１２は、試験例６の反応液の逆相ＬＣ−ＭＳ分析のチャートである。
【図１３】図１３は、試験例７の反応液の逆相ＬＣ−ＭＳ分析のチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
以下、本発明のセサミノール２糖又は３糖配糖体の製造方法について具体的な実施形態を示しながら説明する。しかしながら、本発明は、以下の実施形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を変更しない範囲において適宜変更して適用することができる。
【００３４】
本発明のセサミノール２糖又は３糖配糖体の製造方法は、下記一般式（１）で示されるセサミノール１糖又は２糖配糖体及びＵＤＰ−糖に、後述するタンパク質（Ｐ１）を作用させる工程（ｉ）を含む。本明細書中、下記一般式（１）で示されるセサミノール１糖又は２糖配糖体を、「セサミノール配糖体（１）」ともいう。本発明のセサミノール２糖又は３糖配糖体の製造方法は、本発明の効果を損なわない限り、上記工程（ｉ）以外の１又は２以上の工程を含んでいてもよい。例えば、工程（ｉ）の基質であるセサミノール配糖体（１）を準備する工程、得られるセサミノール２糖又は３糖配糖体を精製する工程を含んでいてもよい。また、例えば、工程（ｉ）で得られるセサミノール２又は３糖配糖体がセサミノール２糖配糖体の場合に、該配糖体及びＵＤＰ−糖に、さらにタンパク質（Ｐ１）又は後述するタンパク質（Ｐ２）を作用させる工程を含んでいてもよい。
【００３５】
【化７】
2020183420.tif 000008
【００３６】
［一般式（１）中、（Ｓ１）は、ヘキソース残基を表し、ｎは１又は２の数を表す。セサミノールと結合している１つ目のヘキソース残基（Ｓ１）は、１位の炭素を介してセサミノールと結合している。ｎが２の場合、２つのヘキソース残基（Ｓ１）は同一であってもよく、異なっていてもよく、これらはβ−１→２結合、又は、β−１→６結合している。］
【００３７】
上記一般式（１）中の（Ｓ１）は、ヘキソース残基であり、ヘキソース残基としては、グルコース、アロース、アルトロース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース等の残基があげられ、これらはＤ型であってもよく、Ｌ型であってもよいが、好ましくはＤ型である。中でも、グルコース残基であることがより好ましく、Ｄ−グルコース残基であることがさらに好ましい。
ｎは、ヘキソース残基（Ｓ１）の数であり、１又は２である。
【００３８】
本明細書において、セサミノール配糖体（１）における「１つ目のヘキソース残基（Ｓ１）」とは、セサミノールの水酸基と結合しているヘキソース残基（Ｓ１）のことを意味する。また、「１つ目のヘキソース残基（Ｓ１）」に結合しているヘキソース残基（Ｓ１）のことを「２つ目のヘキソース残基（Ｓ１）」等と記載する。ｎが１の場合、セサミノール配糖体（１）が有するヘキソース残基は１つである。換言すると、ｎが１の場合には、セサミノール配糖体（１）の１つ目のヘキソース残基は、該配糖体が有するヘキソース残基である。ｎが２の場合、つまりヘキソース残基（Ｓ１）が２つ結合している場合、１つ目の（Ｓ１）と２つ目の（Ｓ１）とは、β−１→２結合、又は、β−１→６結合している。
【００３９】
セサミノール配糖体（１）として、セサミノールにヘキソース残基（Ｓ１）が１つ結合している場合（ｎが１の場合）は、上記一般式（２）のＳＧ１であることが好ましい。
工程（ｉ）の基質である一般式（１）で示されるセサミノール１糖又は２糖配糖体は、１種又は２種以上用いることができる。
【００４０】
セサミノール配糖体（１）として、セサミノールにヘキソース残基（Ｓ１）が２つ結合している場合（ｎが２の場合）は、上記式（３）のＳＧ２（２）、又は、上記式（６）のＳＧ２（６）が好ましい。
セサミノール配糖体（１）として、ＳＧ１、ＳＧ２（２）及びＳＧ２（６）からなる群より選択される少なくとも１種を用いることが好ましい。
【００４１】
上記セサミノール配糖体（１）は、ゴマの種子に含まれており、公知の方法により精製して得ることができる（例えば、「Ｊ  Ａｇｒｉｃ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．  ２００６  Ｆｅｂ  ８；５４（３）：６３３−８．  ＨＰＬＣ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｓｅｓａｍｉｎｏｌ  ｇｌｕｃｏｓｉｄｅｓ  ｉｎ  ｓｅｓａｍｅ  ｓｅｅｄｓ．  Ｍｏａｚｚａｍｉ  ＡＡ１，  Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ  ＲＥ，  Ｋａｍａｌ−Ｅｌｄｉｎ  Ａ．」に記載された方法）。また、例えばＳＧ１は、上記の特許文献１（特開２００６−１２９７２８号公報）又は非特許文献１（Ｎｏｇｕｃｈｉ，  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ  （２００８）  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  ５４，  ４１５−４２７．）に記載のＵＧＴ７１Ａ９を、セサミノール及びＵＤＰ−グルコースに作用させることにより得ることができる。ＳＧ２（２）は、非特許文献１に記載のＵＧＴ９４Ｄ１をさらに作用させることにより得ることができる。また、セサミノール配糖体（１）は、化学合成することもできる。
また、このようなセサミノール１糖又は２糖配糖体としては、市販品を利用することもできる。このような市販品としては、例えば、製品番号：ＮＳ１８５２０１、製造元：長良サイエンス株式会社（ＳＧ２（２）の市販品）、製品番号：ＮＳ１８５３０１、製造元：長良サイエンス株式会社（ＳＧ２（６）の市販品）等があげられる。
【００４２】
本発明のセサミノール２糖又は３糖配糖体の製造方法では、上記ＵＤＰ（ウリジン二リン酸）−糖は特に限定されず、ＵＤＰ−ペントース、ＵＤＰ−ヘキソース、ＵＤＰ−ヘプトース等があげられる。ＵＤＰ−糖は、１種又は２種以上用いることができる。
ＵＤＰ−ペントースとしては、ＵＤＰ−アラビノース、ＵＤＰ−キシロース等があげられる。
ＵＤＰ−ヘキソースとしては、ＵＤＰ−グルコース、ＵＤＰ−アロース、ＵＤＰ−アルトロース、ＵＤＰ−マンノース、ＵＤＰ−グロース、ＵＤＰ−イドース、ＵＤＰ−ガラクトース、ＵＤＰ−タロース等があげられる。
ＵＤＰ−ヘプトースとしてはＵＤＰ−セドヘプツロース等があげられる。
これらの中では、ＵＤＰ−ヘキソースであることが好ましく、ＵＤＰ−グルコースであることがさらに好ましい。
ＵＤＰ−糖が、ＵＤＰ−グルコースであると、本発明におけるタンパク質（Ｐ１）との基質特異性が高く、タンパク質（Ｐ１）によるセサミノール２糖又は３糖配糖体の合成速度が速くなり、効率的にセサミノール２糖又は３糖配糖体を製造することができる。
【００４３】
本発明のセサミノール２糖又は３糖配糖体の製造方法において、タンパク質（Ｐ１）は、セサミノール配糖体（１）のヘキソース残基へのβ−１→２結合の糖転移活性を有するセサミノールＧＧＴである。この糖転移活性は、通常、ＵＤＰ−糖特異的糖転移活性である。
具体的には、本発明におけるタンパク質（Ｐ１）は、以下のタンパク質（Ｐ１−１）〜（Ｐ１−４）からなる群より選択される少なくとも１種である。これらは、単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
【００４４】
（Ｐ１−１）配列番号１又は２のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｐ１−２）配列番号１又は２のアミノ酸配列に１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、上記一般式（１）で示されるセサミノール１糖又は２糖配糖体のヘキソース残基へのβ−１→２結合の糖転移活性を有するタンパク質
（Ｐ１−３）配列番号１又は２のアミノ酸配列に対して、９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、上記一般式（１）で示されるセサミノール１糖又は２糖配糖体のヘキソース残基へのβ−１→２結合の糖転移活性を有するタンパク質
（Ｐ１−４）配列番号３又は４のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、上記一般式（１）で示されるセサミノール１糖又は２糖配糖体のヘキソース残基へのβ−１→２結合の糖転移活性を有するタンパク質
【００４５】
また、本発明のセサミノール２糖又は３糖配糖体の製造方法において、上記一般式（１）で示されるセサミノール１糖又は２糖配糖体のヘキソース残基へのβ−１→２結合の糖転移活性は、該ヘキソース残基の２位に糖残基をβ−１→２結合する糖転移活性である。より具体的には、基質であるセサミノール配糖体（１）が、（Ａ）ｎが１の場合又はｎが２であり２つのヘキソース残基（Ｓ１）がβ−１→６結合している場合は、１つ目のヘキソース残基へのβ−１→２結合の糖転移活性であり、（Ｂ）ｎが２であり、２つのヘキソース残基（Ｓ１）がβ−１→２結合している場合は、２つ目のヘキソース残基（Ｓ１）へのβ−１→２結合の糖転移活性である。この活性により、β−１→２結合を分子内（より具体的には、その糖部）に１又は２個含むセサミノール２糖又は３糖配糖体が生成する。
本発明において、セサミノール配糖体に転移される糖は、上述したＵＤＰ−糖における糖と同じであり、ペントース、ヘキソース、ヘプトースが挙げられ、好ましくはヘキソースであり、より好ましくはグルコースである。
一般式（１）で示されるセサミノール１糖又は２糖配糖体のヘキソース残基へのβ−１→２結合の糖転移活性は、ＳＧ１のグルコース残基へのβ−１→２結合のグルコース転移活性（Ｉ）、ＳＧ２（６）の１つ目のグルコース残基へのβ−１→２結合のグルコース転移活性（ＩＩ）、及び、ＳＧ２（２）の２つ目のグルコース残基へのβ−１→２結合のグルコース転移活性（ＩＩＩ）のいずれか１つ又は２以上の活性であることが好ましく、（Ｉ）〜（ＩＩＩ）の全ての活性であることがより好ましい。
【００４６】
タンパク質（Ｐ１−２）及び後述するタンパク質（Ｐ２）において、アミノ酸配列に、１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたとは、同一配列中の任意かつ１個又は数個のアミノ酸配列中の位置において、１又は数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加があることを意味し、欠失、置換及び付加のうち２種以上が同時に生じていてもよい。
このような欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸の数として、１又は数個は、１〜３０個であることが好ましく、１〜２０個であることがより好ましく、１〜１０個であることがさらに好ましく、１〜５であることが特に好ましい。
【００４７】
タンパク質（Ｐ１−３）の、配列番号１又は２のアミノ酸配列に対する同一性（配列同一性）は、セサミノール配糖体（１）のヘキソース残基へのβ−１→２結合の糖転移活性を有する範囲であればよく、例えば、９２％以上であることが好ましく、より好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、さらに好ましくは、９８％以上、特に好ましくは９９％以上である。
【００４８】
なお、アミノ酸配列やヌクレオチド配列の同一性は、例えば、ＢＬＡＳＴ等の解析ソフトウェアを用いて、デフォルトのパラメータにより算出することができる。
【００４９】
また、本発明においては、配列番号３又は４のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドとしては、配列番号３又は４のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと９０％以上の同一性（配列同一性）を有するものであることが好ましい。より好ましくは、配列番号３又は４のヌクレオチド配列と９２％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の同一性を有するものである。
【００５０】
本明細書において「ポリヌクレオチド」とは、ＤＮＡ又はＲＮＡを意味する。
【００５１】
本明細書において「ヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの一部又は全部をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法又はサザンハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるポリヌクレオチドをいう。ハイブリダイゼーションの方法としては、例えば、“Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ＆  Ｒｕｓｓｅｌｌ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｖｏｌ．  ３，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  ２００１”及び“Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  １９８７−１９９７”等に記載されている方法を利用することができる。
【００５２】
本明細書において「ストリンジェントな条件」とは、例えば、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。
「低ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、３２℃の条件である。「中ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、４２℃又は５×ＳＳＣ、１％  ＳＤＳ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５０％ホルムアミド、４２℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、５０℃又は０．２×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、６５℃の条件である。これらの条件において、温度を上げるほど高い同一性を有するポリヌクレオチドが効率的に得られることが期待できる。ただし、ストリンジェンシーに影響する要素としては、温度、塩濃度、プローブの濃度及び長さ、イオン強度、時間等の複数の要素が考えられ、当業者であれば、これらの要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
「ストリンジェントな条件」は、例えば、前述したＳａｍｂｒｏｏｋ  ＆  Ｒｕｓｓｅｌｌ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｖｏｌ．  ３，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  ２００１等に記載の条件を採用することもできる。
【００５３】
本発明のセサミノール２糖又は３糖配糖体の製造方法において、タンパク質（Ｐ１）は、タンパク質（Ｐ１−１）であることが好ましい。すなわち、タンパク質（Ｐ１）は、配列番号１又は２のアミノ酸配列からなるタンパク質であることが好ましい。配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質及び配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質は、上述したセサミノール配糖体（１）のヘキソース残基の２位に、糖残基をβ−１→２結合させる糖転移活性を有するセサミノールＧＧＴである。
なお、本明細書において、以下、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質を「タンパク質ＳｉＧＧＴ２１８４２」と、配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質を「タンパク質ＳｉＧＧＴ２１８４２Ｒ２２９Ｑ」とも記載する。
【００５４】
タンパク質（Ｐ１）を用いる工程（ｉ）を行うことにより、セサミノール配糖体（１）に結合しているヘキソース残基の２位に、ヘキソースをβ−１→２転移させ、所定の構造のセサミノール２糖又は３糖配糖体を製造することができる。より具体的には、セサミノール配糖体（１）が、セサミノール１配糖体（例えば、糖残基がグルコース残基の場合には、ＳＧ１）の場合は、１つ目のヘキソース残基へのβ−１→２結合の糖転移により、β−１→２結合を分子内に１個含むセサミノール２糖配糖体が生成する。セサミノール配糖体（１）が、ｎが２であり２つのヘキソース残基（Ｓ１）がβ−１→６結合しているセサミノール２糖配糖体（例えば、糖残基がグルコース残基の場合には、ＳＧ２（６）等）の場合には、１つ目のヘキソース残基へのβ−１→２結合の糖転移により、β−１→２結合を分子内に１個含むセサミノール３糖配糖体（トリグルコシド）が生成する。セサミノール配糖体（１）が、ｎが２であり２つのヘキソース残基（Ｓ１）がβ−１→２結合しているセサミノール２糖配糖体（例えば、糖残基がグルコース残基の場合には、ＳＧ２（２）等）の場合には、２つ目のヘキソース残基へのβ−１→２結合の糖転移により、β−１→２結合を分子内に２個含むセサミノール３糖配糖体が生成する。このように、工程（ｉ）を行うことにより、β−１→２結合を分子内に１又は２含むセサミノール２糖又は３糖配糖体を製造することができる。
【００５５】
本発明においては、所望により、セサミノール１糖又は２糖配糖体の１つ目のヘキソース残基へのβ−１→６結合の糖転移活性を有するセサミノールＧＧＴを使用してもよい。このような酵素を、タンパク質（Ｐ２）ともいう。セサミノール配糖体（１）の１つ目のヘキソース残基へのβ−１→６結合の糖転移活性は、該ヘキソース残基の６位に、糖をβ−１→６結合する糖転移活性である。糖の好ましい態様は上述した通りであり、グルコースが特に好ましい。この活性により、β−１→６結合を分子内（より具体的には、その糖部）に１個含むセサミノール２糖又は３糖配糖体が生成する。この糖転移活性は、通常、ＵＤＰ−糖特異的糖転移活性である。
セサミノール配糖体（１）の１つ目のヘキソース残基へのβ−１→６結合の糖転移活性は、ＳＧ１のグルコース残基へのβ−１→６結合のグルコース転移活性（ＩＶ）、及び、ＳＧ２（２）の１つ目のグルコース残基へのβ−１→６結合のグルコース転移活性（Ｖ）のいずれか１つ又は２つの活性であることが好ましく、（ＩＶ）及び（Ｖ）の両方の活性であることがより好ましい。
【００５６】
本発明におけるタンパク質（Ｐ２）として、以下のタンパク質（Ｐ２−１）〜（Ｐ２−８）からなる群より選択される少なくとも１種のタンパク質が好ましい。
（Ｐ２−１）配列番号５のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｐ２−２）配列番号５のアミノ酸配列に１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、セサミノール配糖体（１）の１つ目のヘキソース残基の６位に、糖をβ−１→６結合する糖転移活性を有するタンパク質
（Ｐ２−３）配列番号５のアミノ酸配列に対して、９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、セサミノール配糖体（１）の１つ目のヘキソース残基の６位に、糖をβ−１→６結合する糖転移活性を有するタンパク質
（Ｐ２−４）配列番号６のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、セサミノール配糖体（１）の１つ目のヘキソース残基の６位に、糖をβ−１→６結合する糖転移活性を有するタンパク質
（Ｐ２−５）配列番号７のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｐ２−６）配列番号７のアミノ酸配列に１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、セサミノール配糖体（１）の１つ目のヘキソース残基の６位に、糖をβ−１→６結合する糖転移活性を有するタンパク質
（Ｐ２−７）配列番号７のアミノ酸配列に対して、９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、セサミノール配糖体（１）の１つ目のヘキソース残基の６位に、糖をβ−１→６結合する糖転移活性を有するタンパク質
（Ｐ２−８）配列番号８のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、セサミノール配糖体（１）の１つ目のヘキソース残基の６位に、糖をβ−１→６結合する糖転移活性を有するタンパク質
【００５７】
上記（Ｐ２−２）及び（Ｐ２−６）における欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸の数として、１個又は数個は、１〜３０個であることが好ましく、１〜２０個であることがより好ましく、１〜１０個であることがさらに好ましく、１〜５個であることが特に好ましい。
【００５８】
上記（Ｐ２−３）及び（Ｐ２−７）における配列番号５又は７のアミノ酸配列に対する同一性は、９２％以上であることが好ましく、より好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、さらに好ましくは、９８％以上、特に好ましくは９９％以上である。
【００５９】
上記（Ｐ２−４）及び（Ｐ２−８）のポリヌクレオチドとしては、配列番号６又は８のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと９０％以上の同一性を有するものであることが好ましい。より好ましくは、配列番号６又は８のヌクレオチド配列と９２％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の同一性を有するものである。
【００６０】
中でもタンパク質（Ｐ２）は、タンパク質（Ｐ２−１）又は（Ｐ２−５）であることが好ましい。すなわち、タンパク質（Ｐ２）は、配列番号５又は７のアミノ酸配列からなるタンパク質であることが好ましい。配列番号５のアミノ酸配列からなるタンパク質及び配列番号７のアミノ酸配列からなるタンパク質はセサミノール配糖体（１）の１つ目のヘキソース残基の６位に、糖残基をβ−１→６結合させる糖転移活性を有するセサミノールＧＧＴである。これらのタンパク質は、ＳＧ１のグルコース残基へのβ−１→６結合のグルコース転移活性（ＩＶ）、及び、ＳＧ２（２）の１つ目のグルコース残基へのβ−１→６結合のグルコース転移活性（Ｖ）を有する。
なお、本明細書において、以下、配列番号５のアミノ酸配列からなるタンパク質を「タンパク質ＳｉＧＧＴ２１６４６」と、配列番号７のアミノ酸配列からなるタンパク質を「ＵＧＴ９４Ｄ１」とも記載する。
セサミノール１糖又は２糖配糖体及びＵＤＰ−糖に、タンパク質（Ｐ２）を作用させる工程を行うことにより、β−１→６結合を分子内に１個含むセサミノール２糖又は３糖配糖体を得ることができる。ＵＤＰ−糖及びその好ましい態様は、上述した通りである。
【００６１】
本発明の製造方法における工程（ｉ）は、基質としてセサミノール配糖体（１）及びＵＤＰ−糖を使用し、これらの基質にタンパク質（Ｐ１）を作用させればよく、条件等は特に限定されない。
【００６２】
工程（ｉ）は、例えば、タンパク質（Ｐ１）を、上記一般式（１）で示されるセサミノール１糖又は２糖配糖体及びＵＤＰ−糖を含む反応系に添加して行うことができる。反応は、水溶液中で行うことが好ましい。工程（ｉ）の反応条件としては、例えば、１０〜５０℃、ｐＨ５〜８であることが好ましい。反応温度は、３０〜４０℃とすることがより好ましい。基質とタンパク質（Ｐ１）の割合は適宜設定すればよい。
【００６３】
また、非ヒト宿主にタンパク質（Ｐ１）をコードするポリヌクレオチドを導入し、該非ヒト宿主（後述する本発明の形質転換体）において、タンパク質（Ｐ１）を発現させ、形質転換体を用いて工程（ｉ）を行うこともできる。形質転換体は、後述する方法により作製することができる。
この場合、形質転換体の宿主としては、植物、好ましくはゴマ属植物（より好ましくはゴマ）；大腸菌、酵母、麹菌等の微生物を用いることが好ましい。
【００６４】
本発明のセサミノール２糖又は３糖配糖体の製造方法によりセサミノール２糖配糖体を製造する場合、該セサミノール２糖配糖体は、ＳＧ２（２）であることが好ましい。
本発明のセサミノール２糖又は３糖配糖体の製造方法によりセサミノール３糖配糖体を製造する場合、該セサミノール３糖配糖体は、上記式（５）で示されるＳＧ３（２，２）、又は、上記式（４）で示されるＳＧ３（２，６）であることが好ましい。
本発明のセサミノール２糖又は３糖配糖体の製造方法は、これらのセサミノール２糖又は３糖配糖体の製造方法として好適である。
【００６５】
次に、セサミノール２糖又は３糖配糖体として、ＳＧ２（２）を製造する方法の一例についてより詳しく説明する。
ＳＧ２（２）の製造方法は、ＳＧ１及びＵＤＰ−グルコースにタンパク質（Ｐ１）を作用させる工程（ｉ）を含む。この工程を行う前にＳＧ１を準備する工程を行ってもよい。
【００６６】
（ＳＧ１を準備する工程）
ＳＧ１を準備する方法としては、特に限定されない。例えば、上述したように、特許文献１又は非特許文献１に記載のＵＧＴ７１Ａ９を、セサミノール及びＵＤＰ−グルコースに作用させることにより得ることができる。
また、ゴマ種子等から抽出、精製を行いＳＧ１を準備してもよい。
【００６７】
（ＳＧ１及びＵＤＰ−グルコースにタンパク質（Ｐ１）を作用させる工程（ｉ））
ＳＧ１及びＵＤＰ−グルコースにタンパク質（Ｐ１）を作用させることにより、ＳＧ１のグルコース残基へのβ−１→２結合のグルコース転移によりＳＧ２（２）を合成する。
上記では、タンパク質（Ｐ１）は、ＳＧ１のグルコース残基へのβ−１→２結合のグルコース転移活性（Ｉ）を有するセサミノールＧＧＴとして機能する。
【００６８】
次に、セサミノール２糖又は３糖配糖体として、ＳＧ３（２，６）を製造する方法について２つの例をあげより詳しく説明する。
【００６９】
ＳＧ３（２，６）を製造する第１の方法は、ＳＧ１及びＵＤＰ−グルコースにタンパク質（Ｐ１）を作用させる工程（ｉ）と、ＳＧ２（２）及びＵＤＰ−グルコースにタンパク質（Ｐ２）を作用させる工程（ｉｉ）とを含む。また、上記のＳＧ１を準備する工程を含んでいてもよい。
【００７０】
タンパク質（Ｐ２）は、上述したように、セサミノール配糖体（１）のヘキソース残基へのβ−１→６結合の糖転移活性を有するセサミノールＧＧＴである。
上記第一の方法において、タンパク質（Ｐ２）は、上記糖転移活性として、ＳＧ１のグルコース残基へのβ−１→６結合のグルコース転移活性（ＩＶ）を有することが好ましい。このようなタンパク質（Ｐ２）として、以下タンパク質（Ｐ２−１１）〜（Ｐ２−１８）からなる群より選択される少なくとも１種であることが好ましい。これらは、単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
【００７１】
（Ｐ２−１１）配列番号５のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｐ２−１２）配列番号５のアミノ酸配列に１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＳＧ２（２）の１つ目のグルコース残基へのβ−１→６結合のグルコース転移活性を有するタンパク質
（Ｐ２−１３）配列番号５のアミノ酸配列に対して、９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、ＳＧ２（２）の１つ目のグルコース残基へのβ−１→６結合のグルコース転移活性を有するタンパク質
（Ｐ２−１４）配列番号６のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、ＳＧ２（２）の１つ目のグルコース残基へのβ−１→６結合のグルコース転移活性を有するタンパク質
（Ｐ２−１５）配列番号７のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｐ２−１６）配列番号７のアミノ酸配列に１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＳＧ２（２）の１つ目のグルコース残基へのβ−１→６結合のグルコース転移活性を有するタンパク質
（Ｐ２−１７）配列番号７のアミノ酸配列に対して、９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、ＳＧ２（２）の１つ目のグルコース残基へのβ−１→６結合のグルコース転移活性を有するタンパク質
（Ｐ２−１８）配列番号８のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、ＳＧ２（２）の１つ目のグルコース残基へのβ−１→６結合のグルコース転移活性を有するタンパク質
タンパク質（Ｐ２−１１）及び（Ｐ２−１５）は、タンパク質（Ｐ２−１）及び（Ｐ２−５）と同じである。タンパク質（Ｐ２−１２）〜（Ｐ２−１４）及び（Ｐ２−１６）〜（Ｐ２−１８）は、タンパク質（Ｐ２−２）〜（Ｐ２−４）及び（Ｐ２−６）〜（Ｐ２−８）の好ましい態様の一例であり、アミノ酸の同一性等の好ましい態様は、タンパク質（Ｐ２−２）〜（Ｐ２−４）及び（Ｐ２−６）〜（Ｐ２−８）と同じである。
【００７２】
この第１の方法において、ＳＧ１及びＵＤＰ−グルコースにタンパク質（Ｐ１）を作用させる工程（ｉ）は、上記セサミノール２糖又は３糖配糖体として、ＳＧ２（２）を製造する方法における工程（ｉ）と同じであるのでここでの説明は省略する。
【００７３】
（ＳＧ２（２）及びＵＤＰ−グルコースにタンパク質（Ｐ２）を作用させる工程（ｉｉ））
本工程では、タンパク質（Ｐ２）を用いることにより、ＳＧ２（２）と、ＵＤＰ−グルコースとを反応させ、ＳＧ２（２）の１つ目のグルコース残基へのβ−１→６結合のグルコース転移によりＳＧ３（２，６）を合成する。反応は、水溶液中で行うことが好ましい。この工程における反応条件は、特に限定されないが、１０〜５０℃、ｐＨ５〜８であることが好ましい。反応温度は、３０〜４０℃とすることがより好ましい。基質とタンパク質（Ｐ２）の割合は適宜設定すればよい。
【００７４】
ＳＧ３（２，６）を製造する第２の方法は、ＳＧ２（６）及びＵＤＰ−グルコースにタンパク質（Ｐ１）を作用させる工程（ｉ）を含む。また、ＳＧ２（６）を準備する工程を含んでいてもよい。ＳＧ２（６）は、例えば、ＳＧ１及びＵＤＰ−グルコースにタンパク質（Ｐ２）を作用させることにより製造することができる。さらに、上記のＳＧ１を準備する工程を含んでいてもよい。
【００７５】
この第２の方法においてＳＧ１及びＵＤＰ−グルコースにタンパク質（Ｐ２）を作用させる工程を行う場合、タンパク質（Ｐ２）は、ＳＧ１のグルコース残基へのβ−１→６結合のグルコース転移活性を有することが好ましい。このようなタンパク質（Ｐ２）として、上記（Ｐ２−１）〜（Ｐ２−８）として、ＳＧ１のグルコース残基へのβ−１→６結合のグルコース転移活性（ＩＶ）を有するタンパク質を用いればよく、配列番号５のアミノ酸配列からなるタンパク質及び／又は配列番号７のアミノ酸配列からなるタンパク質を用いることが好ましい。これらは、単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
反応条件は、特に限定されず、上記のタンパク質（Ｐ２）を用いる反応と同じとすればよい。
【００７６】
（ＳＧ１及びＵＤＰ−グルコースにタンパク質（Ｐ２）を作用させる工程）
本工程では、タンパク質（Ｐ２）を用いることにより、ＳＧ１と、ＵＤＰ−グルコースとを反応させ、ＳＧ２（６）を合成する。
なお、好ましい反応条件は、上記のタンパク質（Ｐ２）を使用する際と同様である。
【００７７】
ＳＧ３（２，６）を製造する第１の方法及び第２の方法において、タンパク質（Ｐ２）は、ＳＧ１のグルコース残基へのβ−１→６結合のグルコース転移活性、及び、ＳＧ２（２）の１つ目のグルコース残基へのβ−１→６結合のグルコース転移活性を有することが好ましく、例えば、配列番号５又は７のアミノ酸配列からなるタンパク質がより好ましい。
【００７８】
（ＳＧ２（６）及びＵＤＰ−グルコースにタンパク質（Ｐ１）を作用させる工程（ｉ））
タンパク質（Ｐ１）用いることにより、ＳＧ２（６）と、ＵＤＰ−グルコースとを反応させ、ＳＧ２（６）の１つ目のグルコース残基へのβ−１→２結合のグルコース転移によりＳＧ３（２，６）を合成する。
上記において、タンパク質（Ｐ１）は、ＳＧ２（６）の１つ目のグルコース残基へのβ−１→２結合のグルコース転移活性（ＩＩ）を有するタンパク質として機能する。
【００７９】
次に、セサミノール２糖又は３糖配糖体として、ＳＧ３（２，２）を製造する方法についてより詳しく説明する。
ＳＧ３（２，２）を製造する方法は、ＳＧ２（２）及びＵＤＰ−グルコースにタンパク質（Ｐ１）を作用させる工程（ｉ）を含む。ＳＧ２（２）は、上述したＳＧ１及びＵＤＰ−グルコースにタンパク質（Ｐ１）を作用させる工程（ｉ）を行って製造してもよい。この場合、製造方法は、ＳＧ１のグルコース残基へのβ−１→２結合のグルコース転移によりＳＧ２（２）を生成させる工程（ｉ）、及び、該ＳＧ２（２）及びＵＤＰ−グルコースに上記タンパク質（Ｐ１）を作用させ、ＳＧ３（２，２）を生成させる工程を含む。また、上記のＳＧ１を準備する工程を含んでいてもよい。
【００８０】
（ＳＧ１及びＵＤＰ−グルコースにタンパク質（Ｐ１）を作用させる工程（ｉ））
本工程では、タンパク質（Ｐ１）を用いることにより、ＳＧ１とＵＤＰ−グルコースとを反応させ、ＳＧ１のグルコース残基へのβ−１→２結合のグルコース転移によりＳＧ２（２）を合成する。
【００８１】
（ＳＧ２（２）及びＵＤＰ−グルコースにタンパク質（Ｐ１）を作用させる工程（ｉ））
タンパク質（Ｐ１）を用いることにより、ＳＧ２（２）と、ＵＤＰ−グルコースとを反応させ、ＳＧ２（２）の２つ目のグルコース残基へのβ−１→２結合のグルコース転移によりＳＧ３（２，２）を合成する。
上記において、タンパク質（Ｐ１）は、ＳＧ２（２）の２つ目のグルコース残基へのβ−１→２結合のグルコース転移活性（ＩＩＩ）を有するタンパク質として機能する。
【００８２】
このようにして得られたＳＧ３（２，２）は本発明の新規化合物でもある。
【００８３】
なお、ＳＧ３（２，２）を製造する方法において、反応系に上記タンパク質（Ｐ２）が存在していると、最終生成物として、ＳＧ３（２，６）と共にＳＧ３（２，２）が合成される。
そのため、ＳＧ３（２，２）を製造する方法の反応系には、タンパク質（Ｐ２）が存在していないことが好ましい。
【００８４】
図１は、ＳＧ３（２，６）、又は、ＳＧ３（２，２）を合成する経路を模式的に示す反応図である。
図１に示すように、タンパク質（Ｐ１）及び所望によりタンパク質（Ｐ２）を用い、セサミノール１糖又は２糖配糖体を原料としてセサミノール２糖又は３糖配糖体を製造することができる。
これらの各反応は、別々の反応系で行ってもよく、同一の反応系で行ってもよい。
【００８５】
上記では、セサミノール配糖体（１）として、一般式（１）における（Ｓ１）がグルコース残基の場合に、該グルコース残基へのβ−１→２結合のグルコース転移によりセサミノール２糖又は３糖配糖体を製造する方法を例に挙げたが、これらは本発明の製造方法の一例であり、上記に限定されない。
【００８６】
本発明の製造方法により製造されるセサミノール２糖又は３糖配糖体は、通常、セサミンアグリコンと比較して水溶性が高い。すなわち、該セサミノール２糖又は３糖配糖体は、水系溶媒に容易に溶解する。そのため、該セサミノール２糖又は３糖配糖体を用いることにより、例えば、飲食品分野、医療分野において、該セサミノール２糖又は３糖配糖体が溶解した水溶液を容易に得ることができる。
【００８７】
次に、タンパク質（Ｐ１）、特に、タンパク質（Ｐ１−１）について詳述する。
【００８８】
タンパク質（Ｐ１−１）は、配列番号１又は２のアミノ酸配列からなるタンパク質である。
現在まで、配列番号１及び２のアミノ酸配列からなるタンパク質の機能は知られていなかった。
【００８９】
上記の通り、配列番号１及び２のアミノ酸配列からなるタンパク質であるタンパク質ＳｉＧＧＴ２１８４２及びタンパク質ＳｉＧＧＴ２１８４２Ｒ２２９Ｑは、以下の（Ｉ）〜（ＩＩＩ）の３つの活性を有する。
すなわち、これらタンパク質は、ＳＧ１のグルコース残基へのβ−１→２結合のグルコース転移活性（Ｉ）、ＳＧ２（６）の１つ目のグルコース残基へのβ−１→２結合のグルコース転移活性（ＩＩ）、及び、ＳＧ２（２）の２つ目のグルコース残基へのβ−１→２結合のグルコース転移活性（ＩＩＩ）を有する。上述したようにタンパク質（Ｐ１）はＵＤＰ−糖特異的糖転移酵素である。
【００９０】
また、配列番号３のヌクレオチド配列は、配列番号１のアミノ酸配列をコードし、配列番号４のヌクレオチド配列は、配列番号２のアミノ酸配列をコードする。
配列番号２のアミノ酸配列は新規なアミノ酸配列である。すなわち、タンパク質ＳｉＧＧＴ２１８４２Ｒ２２９Ｑは新規なタンパク質である。配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質も、本発明の１つである。
配列番号４のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドも、本発明の１つである。
【００９１】
次に、タンパク質（Ｐ１）の製造方法の一例について説明する。
これらタンパク質の製造方法としては、以下の方法があげられる。
例えば、配列番号３又は４のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドをベクターに組み込んで発現ベクターを作製する。上記発現ベクターを宿主に導入し、宿主の形質転換を行い形質転換体とする。形質転換体及びその製造方法は後述する。
そして、該形質転換体にタンパク質を発現させ、タンパク質を精製することにより上記タンパク質（Ｐ１）を得ることができる。
【００９２】
配列番号３又は４のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの準備方法としては特に限定されない。例えば、公知の遺伝子工学的手法又は合成手法によって取得することができる。配列番号３又は４のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドは、例えば、ゴマ属植物（好ましくはゴマ）から得ることができる。本発明のポリヌクレオチドは、植物体等から単離された天然由来のポリヌクレオチド、遺伝子工学の手法により製造された組換え型のポリヌクレオチド、化学合成されたポリヌクレオチドを含む。
【００９３】
ベクターとしては、特に限定されず、例えば、導入する宿主の種類に応じて、適宜選択すればよい。上記ベクターは、アグロバクテリウム法を用いて形質転換を行う場合、例えば、バイナリーベクターが好ましく、例えば、ｐＢＩ１２１、ｐＰＺＰ２０２、ｐＢＩＮＰＬＵＳ及びｐＢＩＮ１９等があげられる。大腸菌等の細菌に形質転換を行う場合、ベクターとして、例えば、ｐＥＴベクター（Ｍｅｒｃｋ社）、ｐＣｏｌｄベクター（タカラバイオ株式会社）、ＰＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ社）等があげられる。酵母等の真核生物に形質転換を行う場合、ベクターとして、例えば、ｐＹＥ２２ｍ等があげられ、また、ｐＹＥＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ｐＥＳＣ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）等の市販の酵母発現ベクターを用いることもできる。
【００９４】
発現ベクターは、例えば、ポリヌクレオチドの発現及びポリヌクレオチドがコードするタンパク質の発現を調節する、調節配列を有することが好ましい。調節配列としては、例えば、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル配列、複製起点配列（ｏｒｉ）等があげられる。例えば、細菌用発現ベクターのプロモーターとしては、慣用的なプロモーター（例えば、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター等）を使用することができ、酵母用プロモーターとしては、例えば、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター、ＰＨ０５プロモーター等があげられ、糸状菌用プロモーターとしては、例えば、アミラーゼ、ｔｒｐＣ等があげられる。また、植物細胞内で目的遺伝子を発現させるためのプロモーターの例としては、カリフラワーモザイクウィルスの３５Ｓ  ＲＮＡプロモーター、ｒｄ２９Ａ遺伝子プロモーター、ｒｂｃＳプロモーター、上記カリフラワーモザイクウィルスの３５Ｓ  ＲＮＡプロモーターのエンハンサー配列をアグロバクテリウム由来のマンノピン合成酵素プロモーター配列の５’側に付加したｍａｃ−１プロモーター等があげられる。動物細胞宿主用プロモーターとしては、ウイルス性プロモーター（例えば、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター等）があげられる。
【００９５】
発現ベクターにおいて、調節配列の配置は特に限定されない。上記調節配列は、例えば、ポリヌクレオチドの発現及びこれがコードするタンパク質の発現を、機能的に調節できるように配置されていればよく、公知の方法に基づいて配置できる。また、調節配列は、導入されるべき宿主の種類に応じて適宜選択すればよい。調節配列は、例えば、ベクターが予め備える配列を利用してもよいし、ベクターに、さらに、調節配列を挿入してもよいし、ベクターが備える調節配列を、他の調節配列に置き換えてもよい。
【００９６】
発現ベクターは、例えば、さらに、選択マーカーや精製タグのコード配列を１又は２以上の有してもよい。選択マーカーとしては、例えば、薬剤耐性マーカー、蛍光タンパク質マーカー、酵素マーカー、細胞表面レセプターマーカー等があげられる。精製タグとしては、例えば、Ｈｉｓタグ、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質等があげられる。
【００９７】
発現ベクターを宿主に導入する方法は特に限定されず、公知の方法により行うことができる。上記導入方法は、例えば、宿主の種類、発現ベクターの種類等に応じて、適宜決定できる。
【００９８】
発現ベクターを導入する宿主は、特に限定されないが、非ヒト宿主であることが好ましく、例えば、植物体又はその部分、微生物、動物細胞、昆虫細胞、これらの培養細胞等があげられる。中でも、植物体又はその部分、微生物を宿主とすることが好ましい。
【００９９】
宿主が植物体又はその部分である場合、宿主植物としては、例えば、ゴマ属植物（ゴマ等）、カラハナソウ属植物（例えば、ホップ（Ｈｕｍｕｌｕｓ  ｌｕｐｕｌｕｓ）等）、バラ科植物（例えば、イチゴ、ウメ、サクラ、バラ、ブルーベリー、ブラックベリー、ビルベリー、カシス、ラズベリー等）、ナデシコ科植物（カーネーション、カスミソウ等）、キク科植物（キク、ガーベラ、ヒマワリ、デイジー等）、ラン科植物（ラン等）、サクラソウ科植物（シクラメン等）、リンドウ科植物（トルコギキョウ、リンドウ等）、アヤメ科植物（フリージア、アヤメ、グラジオラス等）、ゴマノハグサ科植物（キンギョソウ、トレニア等）、ベンケイソウ（カランコエ）、ユリ科植物（ユリ、チューリップ等）、ヒルガオ科植物（アサガオ、モミジヒルガオ、ヨルガオ、サツマイモ、ルコウソウ、エボルブルス等）、アジサイ科植物（アジサイ、ウツギ等）、ウリ科植物（ユウガオ等）、フロウソウ科植物（ペラルゴニウム、ゼラニウム等）、モクセイ科植物（レンギョウ等）、ブドウ科植物（例えば、ブドウ等）、ツバキ科植物（チャ、ツバキ、チャノキ等）、イネ科植物（例えば、イネ、オオムギ、コムギ、エンバク、ライムギ、トウモロコシ、アワ、ヒエ、コウリャン、サトウキビ、タケ、カラスムギ、シコクビエ、モロコシ、マコモ、ハトムギ、牧草等）、クワ科植物（クワ、ホップ、コウゾ、ゴムノキ、アサ等）、アカネ科植物（コーヒーノキ、クチナシ等）、ブナ科植物（ナラ、ブナ、カシワ等）、ミカン科植物（例えば、ダイダイ、ユズ、ウンシュウミカン、サンショウ）、アブラナ科植物（赤キャベツ、ハボタン、ダイコン、シロナズナ、アブラナ、キャベツ、ブロッコリー、カリフラワー等）、シソ科（サルビア、シソ、ラベンダー、タツナミソウ等）、ナス科植物（例えば、ナス、トマト、トウガラシ、ジャガイモ、タバコ、チョウセンアサガオ、ホオズキ、ペチュニア、カリブラコア、ニーレンベルギア等）、マメ科植物（例えば、ダイズ、アズキ、ラッカセイ、インゲンマメ、ソラマメ、ミヤコグサ等）があげられる。
これらの中では、ゴマ属植物が好ましく、ゴマの植物体又はその部分であることが好ましい。
【０１００】
本明細書において、「植物体」は、植物全体を示す植物個体を意味し、「植物体の部分」は、上記植物個体の部分であり、例えば、器官、組織又は細胞等があげられ、いずれでもよい。上記器官として、例えば、花弁、花冠、花、毬花、腺毛、葉、種子、果実、茎、根、むかご等があげられる。茎として、例えば、球根等の鱗茎、塊茎、球茎、根茎、ライナー等があげられる。根として、例えば、塊根、横走根等があげられる。上記組織は、例えば、上記器官の部分（例えば、表皮、師部、柔組織、木部、維管束、柵状組織、海面状組織等）である。植物体の部分は、例えば、一種類の器官、組織及び／又は細胞でもよいし、二種類以上の器官、組織及び／又は細胞でもよい。植物の細胞は、培養細胞であってもよく、種々の形態の細胞（例えば、懸濁培養細胞）、プロトプラスト、カルス等のいずれをも意味する。
【０１０１】
発現ベクターを宿主に導入する方法は特に限定されず、公知の形質転換方法を使用することができる。導入方法としては、例えば、アグロバクテリウム法、パーティクルガン等の遺伝子銃による導入法、リン酸カルシウム法、ポリエチレングリコール法、リポソームを用いるリポフェクション法、エレクトロポレーション法、超音波核酸導入法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、微小ガラス管等を用いた直接注入法、ハイドロダイナミック法、カチオニックリポソーム法、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ法（例えば、Ｗｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３３，  １１６２−１１６４  （２０１５））、導入補助剤を用いる方法等があげられる。リポソームとしては、例えば、リポフェクタミン及びカチオニックリポソーム等があげられる。導入補助剤としては、例えば、アテロコラーゲン、ナノ粒子及びポリマー等があげられる。導入方法は、宿主の種類等に応じて適宜選択すればよい。例えば、宿主が植物体又はその部分の場合には、アグロバクテリウム法が好ましい。
【０１０２】
上記宿主が、植物体又はその部分の場合、発現ベクターの導入は、例えば、植物体及びその部分のいずれに行ってもよく、好ましくは、植物体の部分であり、より好ましくは、組織又は細胞であり、さらに好ましくは細胞である。上記組織は、例えば、植物体から切り出した切片等があげられ、具体的には、葉、茎、根等の切片である。細胞としては、例えば、植物体又はその組織から採取した細胞、該細胞の培養細胞、プロトプラスト、カルス等があげられる。
【０１０３】
発現ベクターが宿主に導入されたか否かの確認は、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法等によって行うことができる。例えば、形質転換体からＤＮＡを調製し、ＤＮＡ特異的プライマーを設計してＰＣＲを行う。ＰＣＲにより得られた増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウム、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ液等によって染色し、そして増幅産物を１本のバンドとして検出することによって、形質転換されたことを確認することができる。また、予め蛍光色素等によって標識したプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレート等の固相に増幅産物を結合させ、蛍光又は酵素反応等によって増幅産物を確認する方法も採用することができる。
【０１０４】
このように発現ベクターが導入された宿主を培養し、タンパク質（Ｐ１−１）等のタンパク質（Ｐ１）を発現させる。
宿主の培養方法及びタンパク質の発現方法は、宿主の種類に応じた公知の方法を適用することができる。
【０１０５】
タンパク質（Ｐ１）の精製方法は、特に限定されず、公知の方法を用いることができる。
このような方法により、タンパク質（Ｐ１−１）を製造することができる。
【０１０６】
なお、配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号４のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、及び、該ポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、それぞれ、本発明のタンパク質、ポリヌクレオチド及び発現ベクターでもある。
【０１０７】
また、上記タンパク質（Ｐ１）を製造する方法において、配列番号３又は４のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの代わりに、以下のポリヌクレオチド（Ｎ１−２）〜（Ｎ１−４）をベクターに組み込んで発現ベクターを作製することによっても、タンパク質（Ｐ１）を製造することができる。
（Ｎ１−２）配列番号３又は４のヌクレオチド配列に１個又は数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドであり、かつ、上記一般式（１）で示されるセサミノール１糖又は２糖配糖体のヘキソース残基へのβ−１→２結合の糖転移活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（Ｎ１−３）配列番号３又は４のヌクレオチド配列に対して、９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドであり、かつ、上記一般式（１）で示されるセサミノール１糖又は２糖配糖体のヘキソース残基へのβ−１→２結合の糖転移活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（Ｎ１−４）配列番号３又は４のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドからなり、かつ、上記一般式（１）で示されるセサミノール１糖又は２糖配糖体のヘキソース残基へのβ−１→２結合の糖転移活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
【０１０８】
上記（Ｎ１−２）において、「１又は数個」は、例えば、上記（Ｎ１−２）のポリヌクレオチドにコードされるタンパク質が、セサミノール配糖体（１）のヘキソース残基へのβ−１→２結合の糖転移活性を有する範囲であればよい。上記（Ｎ１−２）における「１又は数個」は、好ましくは１〜５０個、１〜３０個、１〜２０個、１〜１０個、より好ましくは１〜９個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個、最も好ましくは１又は２個である。付加は、例えば、配列内への挿入の意味も含む。ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列において、１もしくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたとは、同一配列中の任意かつ１もしくは複数のヌクレオチド配列中の位置において、１もしくは複数個のヌクレオチドの欠失、置換及び／又は付加があることを意味し、欠失、置換及び付加のうち２種以上が同時に生じていてもよい。
【０１０９】
上記（Ｎ１−３）において、同一性（配列同一性）は、例えば、上記（Ｎ１−３）のポリヌクレオチドにコードされるタンパク質が、セサミノール配糖体（１）のヘキソース残基へのβ−１→２結合の糖転移活性を有する範囲であればよい。同一性は、９０％以上であり、好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上である。
【０１１０】
次に、タンパク質（Ｐ２）、特に、タンパク質（Ｐ２−１）及び（Ｐ２−５）について詳述する。
【０１１１】
タンパク質（Ｐ２−１）は、配列番号５のアミノ酸配列からなるタンパク質である。
タンパク質（Ｐ２−５）は、配列番号７のアミノ酸配列からなるタンパク質である。
現在まで、配列番号５のアミノ酸配列からなるタンパク質の機能は知られていなかった。
【０１１２】
タンパク質（Ｐ２−１）（タンパク質ＳｉＧＧＴ２１６４６）、及び、タンパク質（Ｐ２−５）（タンパク質ＵＧＴ９４Ｄ１）は、以下の２つの活性を有する。
すなわち、これらタンパク質は、ＳＧ１のグルコース残基へのβ−１→６結合のグルコース転移活性（ＩＶ）、及び、ＳＧ２（２）の１つ目のグルコース残基へのβ−１→６結合のグルコース転移活性（Ｖ）を有する。上述したようにタンパク質（Ｐ２）はＵＤＰ−糖特異的糖転移酵素である。
【０１１３】
また、配列番号６のヌクレオチド配列は、配列番号５のアミノ酸配列をコードし、また、配列番号８のヌクレオチド配列は、配列番号７のアミノ酸配列をコードする。
【０１１４】
次に、タンパク質（Ｐ２−１）（タンパク質ＳｉＧＧＴ２１６４６）の製造方法について説明する。
上記タンパク質（Ｐ１）を製造する方法において、配列番号３又は４のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの代わりに、以下のポリヌクレオチド（Ｎ２−１）〜（Ｎ２−８）のいずれか又は２以上をベクターに組み込んで発現ベクターを作製することにより、タンパク質（Ｐ２−１）（タンパク質ＳｉＧＧＴ２１６４６）等のタンパク質（Ｐ２）を製造することができる。
（Ｎ２−１）配列番号６のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
（Ｎ２−２）配列番号６のヌクレオチド配列に１個又は数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドであり、かつ、上記一般式（１）で示されるセサミノール１糖又は２糖配糖体の１つ目のヘキソース残基へのβ−１→６結合の糖転移活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（Ｎ２−３）配列番号６のヌクレオチド配列に対して、９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドであり、かつ、上記一般式（１）で示されるセサミノール１糖又は２糖配糖体の１つ目のヘキソース残基へのβ−１→６結合の糖転移活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（Ｎ２−４）配列番号６のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドからなり、かつ、上記一般式（１）で示されるセサミノール１糖又は２糖配糖体の１つ目のヘキソース残基へのβ−１→６結合の糖転移活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（Ｎ２−５）配列番号８のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
（Ｎ２−６）配列番号８のヌクレオチド配列に１個又は数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドであり、かつ、上記一般式（１）で示されるセサミノール１糖又は２糖配糖体の１つ目のヘキソース残基へのβ−１→６結合の糖転移活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（Ｎ２−７）配列番号８のヌクレオチド配列に対して、９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドであり、かつ、上記一般式（１）で示されるセサミノール１糖又は２糖配糖体の１つ目のヘキソース残基へのβ−１→６結合の糖転移活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（Ｎ２−８）配列番号８のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドからなり、かつ、上記一般式（１）で示されるセサミノール１糖又は２糖配糖体の１つ目のヘキソース残基へのβ−１→６結合の糖転移活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
【０１１５】
上記（Ｎ２−２）及び（Ｎ２−６）において、「１又は数個」は、例えば、上記（Ｎ２−２）及び（Ｎ２−６）のポリヌクレオチドにコードされるタンパク質が、セサミノール配糖体（１）の１つ目のヘキソース残基へのβ−１→６結合の糖転移活性を有する範囲であればよい。上記（Ｎ２−２）及び（Ｎ２−６）における「１又は数個」は、好ましくは１〜５０個、１〜３０個、１〜２０個、１〜１０個、より好ましくは１〜９個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個、最も好ましくは１又は２個である。
【０１１６】
上記（Ｎ２−３）及び（Ｎ２−７）において、同一性（配列同一性）は、例えば、上記（Ｎ２−３）及び（Ｎ２−７）のポリヌクレオチドにコードされるタンパク質が、セサミノール配糖体（１）の１つ目のヘキソース残基へのβ−１→６結合の糖転移活性を有する範囲であればよい。同一性は、９０％以上であり、好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上である。
【０１１７】
また、上記ポリヌクレオチド（Ｎ１−１）〜（Ｎ１−４）及びポリヌクレオチド（Ｎ２−１）〜（Ｎ２−４）からなる群より選択される少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む発現ベクターが導入された非ヒト宿主である形質転換体は、本発明の形質転換体でもある。このような発現ベクター及び形質転換体の製造方法は、上述したタンパク質（Ｐ−１）の製造における発現ベクター及び形質転換体の製造方法と同じである。
好ましくは、ポリヌクレオチド（Ｎ１−１）〜（Ｎ１−４）からなる群より選択される少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む発現ベクターが導入された非ヒト宿主である形質転換体であり、この形質転換体に、さらに、ポリヌクレオチド（Ｎ２−１）〜（Ｎ２−４）からなる群より選択される少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む発現ベクターが導入されていてもよい。
【０１１８】
なお、形質転換体を栽培又は培養する方法は、形質転換体の種類に応じた公知の方法を適用することができる。形質転換体を栽培又は培養することにより、形質転換体において上記ポリヌクレオチドを発現させ、タンパク質（Ｐ１）及び／又はタンパク質（Ｐ２）を合成することができる。この際、形質転換体において合成されたタンパク質（Ｐ１）及び／又はタンパク質（Ｐ２）を単離して、上述したセサミノール２糖又は３糖配糖体の製造に使用することができる。タンパク質（Ｐ１）及び（Ｐ２）は、精製タンパク質であってもよく、非精製タンパク質であってもよい。また、上記形質転換体において、上記タンパク質の合成と上記セサミノール２糖又は３糖配糖体の合成とを行ってもよい。このように、上記形質転換体を培養することにより、上記タンパク質（Ｐ１）及び／又は（Ｐ２）合成工程及びセサミノール２糖又は３糖配糖体合成工程を行うことができ、セサミノール２糖又は３糖配糖体を合成することができる。
【０１１９】
これまで、ポリヌクレオチド（Ｎ１−１）〜（Ｎ１−４）及びポリヌクレオチド（Ｎ２−１）〜（Ｎ２−８）を用いて作製された形質転換体を用いてタンパク質（Ｐ１）及び（Ｐ２）を製造する方法等を説明してきた。
この他に、例えば、ゴマ種子からタンパク質（Ｐ１）及び（Ｐ２）を抽出、精製することにより、タンパク質（Ｐ１）及び（Ｐ２）を得てもよい。
【０１２０】
次に、配列番号３、４又は６のヌクレオチド配列の少なくとも一部の配列を含むポリヌクレオチドを使用して、セサミノール２糖又は３糖配糖体合成能が異なる植物体を選別する本発明の植物体の選別方法について説明する。
セサミノール２糖又は３糖配糖体合成能が異なる植物体としては、例えば、既存品種と比較してセサミノール２糖又は３糖配当体合成能が高い、又は、低い植物体があげられる。
セサミノール２糖又は３糖配糖体としては、上述した製造方法により製造されるセサミノール２糖又は３糖配糖体が挙げられ、好ましくは、ＳＧ２（２）、ＳＧ３（２，６）、ＳＧ３（２，２）、及び、ＳＧ２（６）からなる群より選択される１種又は２種以上である。
【０１２１】
本発明の植物体の選別方法は、配列番号３、４又は６のヌクレオチド配列の少なくとも一部の配列を含むポリヌクレオチドを使用した植物体の選別方法であれば、どのような方法であってもよい。本発明の植物体の選別方法について２つの例（第１例及び第２例）をあげて以下に説明する。
【０１２２】
本発明の植物体の選別方法の第１例としては、（１）ポリヌクレオチド抽出工程と、（２）ＤＮＡ増幅工程と、（３）遺伝的変異選別工程と、（４）比較工程とを含む方法があげられる。
各工程について以下に詳述する。
【０１２３】
（１）ポリヌクレオチド抽出工程
まず、植物体又はその部分からＤＮＡ又はＲＮＡであるポリヌクレオチドを抽出する。
抽出したポリヌクレオチドがＲＮＡである場合、ＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを合成する。
ポリヌクレオチドの抽出、及び、ｃＤＮＡの合成は公知の方法を用いることができる。
ＤＮＡ又はＲＮＡを抽出する被検植物の部位は特に限定されないが、例えば、ゴマの植物体を選別する場合には、ゴマの種子等が好ましい。
【０１２４】
（２）ＤＮＡ増幅工程
次に、ＤＮＡ又はｃＤＮＡから配列番号３、４又は６のヌクレオチド配列の少なくとも一部の配列を含むポリヌクレオチドを増幅し、増幅ＤＮＡ断片を作製する。
ポリヌクレオチドを増幅する方法としては、特に限定されないが、例えばＰＣＲを用いることができる。
ＤＮＡの増幅方法や、ＰＣＲで用いるプライマーの設計及び合成は、当該技術分野において周知であり、当業者であれば配列に基づき容易に実施可能である。
【０１２５】
（３）遺伝的変異選別工程
次に、増幅ＤＮＡ断片のヌクレオチド配列と配列番号３、４又は６のヌクレオチド配列とを比較することにより、セサミノールＧＧＴの活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の遺伝的変異を特定し、遺伝的変異を含む遺伝子を有する変異植物体を選別する。
なお、本明細書において、「遺伝的変異」とは、突然変異及び／又は遺伝子多型のことを意味する。
【０１２６】
（４）比較工程
次に、変異植物体における遺伝的変異を含む遺伝子の発現量、又は、遺伝的変異を含む遺伝子がコードするタンパク質のセサミノールＧＧＴの活性と、既存品種の配列番号３、４又は６のヌクレオチド配列を含む遺伝子の発現量、又は、配列番号３、４又は６のヌクレオチド配列を含む遺伝子がコードするタンパク質のセサミノールＧＧＴの活性とを比較する。
【０１２７】
変異植物体における遺伝的変異を含む遺伝子の発現量が、既存品種の配列番号３、４又は６のヌクレオチド配列を含む遺伝子の発現量よりも多い場合や、遺伝的変異を含む遺伝子がコードするタンパク質のセサミノールＧＧＴの活性が、配列番号３、４又は６のヌクレオチド配列を含む遺伝子がコードするタンパク質のセサミノールＧＧＴの活性よりも高い場合、このような変異植物体は、既存品種と比較してセサミノール２糖又は３糖配糖体合成能が高い植物体であると選別することができる。
また、変異植物体における遺伝的変異を含む遺伝子の発現量が、既存品種の配列番号３、４又は６のヌクレオチド配列を含む遺伝子の発現量よりも少ない場合や、遺伝的変異を含む遺伝子がコードするタンパク質のセサミノールＧＧＴの活性が、配列番号３、４又は６のヌクレオチド配列を含む遺伝子がコードするタンパク質のセサミノールＧＧＴの活性よりも低い場合、このような変異植物体は、既存品種と比較してセサミノール２糖又は３糖配糖体合成能が低い植物体であると選別することができる。
【０１２８】
なお、本発明における既存品種は、通常、被検植物の種に含まれる既存品種であり、分類学上同一の属の植物であることが好ましい。既存品種は、被検植物体が得られたときに存在するすべての品種をいい、野生型、交配、遺伝子操作等の人為的操作により作出された品種が含まれる。本発明でセサミノール２糖又は３糖配糖体合成能が異なる植物体は、すべての既存品種に対して上記遺伝子の発現量又は上記遺伝子がコードするタンパク質のセサミノールＧＧＴの活性が高い又は低い必要はない。特定の既存品種に対して上記遺伝子の発現量又は上記タンパク質のセサミノールＧＧＴの活性が高ければ、セサミノール２糖又は３糖配糖体合成能が高い植物体として選別することができる。
【０１２９】
次に、本発明の植物体の選別方法の別の一例（第２例）を説明する。
本発明の植物体の選別方法の第２例は、配列番号３、４又は６のヌクレオチド配列の少なくとも一部の配列を含むポリヌクレオチドの発現量を測定する工程を含み、該発現量を指標として、セサミノール２糖又は３糖配糖体合成能が異なる植物体を選別する。
ポリヌクレオチドは、配列番号３、４又は６のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであり、より好ましくは配列番号３、４又は６のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドである。本発明においては、配列番号３、４又は６のヌクレオチド配列のポリヌクレオチドの発現量を指標とすることが好ましい。これらの２以上のヌクレオチド配列の発現を指標として用いてもよい。本発明のポリヌクレオチドの発現量の測定方法は特に限定されず、上述した方法により植物体又はその部分からＲＮＡを抽出し、上記ポリヌクレオチドのｍＲＮＡを定量すればよい。
配列番号３、４又は６のヌクレオチド配列を有する遺伝子の発現量が多い植物体は、タンパク質ＳｉＧＧＴ２１８４２、タンパク質ＳｉＧＧＴ２１８４２Ｒ２２９Ｑ、又は、タンパク質ＳｉＧＧＴ２１６４６の発現量が多いことになる。
そのため、配列番号３、４又は６のヌクレオチド配列を有する遺伝子の発現量が多い植物体を、セサミノール２糖又は３糖配糖体合成能が高い植物体であると選別することができる。
また、配列番号３、４又は６のヌクレオチド配列を有する遺伝子の発現量が少ない植物体は、タンパク質ＳｉＧＧＴ２１８４２、タンパク質ＳｉＧＧＴ２１８４２Ｒ２２９Ｑ、又は、タンパク質ＳｉＧＧＴ２１６４６の発現量が少ないことになる。
そのため、配列番号３、４又は６のヌクレオチド配列を有する遺伝子の発現量が少ない植物体を、セサミノール２糖又は３糖配糖体合成能が低い植物体であると選別することができる。
【０１３０】
本発明の選別方法においては、上記ポリヌクレオチドの発現量を複数の植物体間で比較して、上記発現量が多い植物体をセサミノール２糖又は３糖配糖体合成能が高い植物体として選別することができる。比較する複数の植物体は、分類学上同一の種又は属の植物体であることが好ましい。
セサミノール２糖又は３糖配糖体合成能が高い植物体は、好ましくは、その植物の種に含まれる既存品種に対してセサミノール２糖又は３糖配糖体合成能が高い植物体である。例えば、ある植物体（被検植物体）と既存品種の植物体との間で上記ポリヌクレオチドの発現量を比較し、既存品種よりも該発現量が多い植物体を選別することにより、既存品種に対してセサミノール２糖又は３糖配糖体合成能が高い植物体を選別することができる。
また、例えば、被検植物体と既存品種の植物体との間で上記ポリヌクレオチドの発現量を比較し、既存品種よりも該発現量が少ない植物体を選別することにより、既存品種に対してセサミノール２糖又は３糖配糖体合成能が低い植物体を選別することができる。
【０１３１】
本発明の植物体の選別方法は、ゴマ属植物の選別に用いることが好ましく、ゴマの選別に用いることがより好ましい。植物は、野生型植物体、変異した植物体、交配選抜で得られた植物体等のいずれであってもよい。
【実施例】
【０１３２】
以下、本発明をより具体的に説明する実施例を示す。なお、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。
【０１３３】
実施例等で使用する化合物の略称を以下に説明する。
ＳＧ１                  ：セサミノール２’−Ｏ−β−Ｄ−グルコシド
Ｅｐｉ−ＳＧ１          ：セサミノール２’−Ｏ−β−Ｄ−グルコシドのエピマー
ＳＧ２（２）            ：セサミノール２’−Ｏ−β−Ｄ−グルコシル（１→２）−β
−Ｄ−グルコシド
ＳＧ２（６）            ：セサミノール２’−Ｏ−β−Ｄ−グルコシル（１→６）−β
−Ｄ−グルコシド
Ｅｐｉ−ＳＧ２（６）    ：セサミノール２’−Ｏ−β−Ｄ−グルコシル（１→６）−β
−Ｄ−グルコシドのエピマー
ＳＧ３（２，２）        ：セサミノール２’−Ｏ−β−Ｄ−グルコシル（１→２）−Ｏ
−［β−Ｄ−グルコシル（１→２）］−β−Ｄ−グルコシド
ＳＧ３（２，６）        ：セサミノール２’−Ｏ−β−Ｄ−グルコシル（１→２）−Ｏ
−［β−Ｄ−グルコシル（１→６）］−β−Ｄ−グルコシド
Ｅｐｉ−ＳＧ３（２，６）：セサミノール２’−Ｏ−β−Ｄ−グルコシル（１→２）−Ｏ
−［β−Ｄ−グルコシル（１→６）］−β−Ｄ−グルコシド
のエピマー
【０１３４】
＜セサミノール配糖体の特異的糖転移酵素の候補遺伝子の単離＞
本明細書において用いる分子生物学的手法は、他で詳述しない限り、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ２００１）に記載の方法に従った。
ゴマ種子のＥｘｐｒｅｓｓｅｄ  Ｔａｇ  Ｓｅｑ（ＥＳＴ）の中から先行技術文献（非特許文献１）の配糖体化酵素遺伝子（ＵＧＴ）とは異なるＵＧＴ様配列を相同性検索により探索を行った。その結果、配列番号７のアミノ酸配列からなるＵＧＴ９４Ｄ１とＤＮＡレベルで５４％、アミノ酸レベルで４２％の配列同一性を示す配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質ＳｉＧＧＴ２１８４２と、ＤＮＡレベルで５６％、アミノ酸レベルで４５％の配列同一性を示す配列番号５のアミノ酸配列からなるタンパク質ＳｉＧＧＴ２１６４６を見出した。なお、これらタンパク質を「ＳｉＧＧＴタンパク質」とも記載し、これらのタンパク質をコードする遺伝子を以下「ＳｉＧＧＴ遺伝子」とも記載する。
これらのＳｉＧＧＴ遺伝子は両者とも約１４００ｂｐのヌクレオチド長を有し、完全長オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むと考えられたため、下記のプライマーセット（配列番号９及び１０、並びに、配列番号１１及び１２）でゴマ種子から調製したｃＤＮＡを鋳型にＰＣＲによる増幅を行った。
なお、ゴマ種子ｃＤＮＡについてはゴマ種子からＲＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉキット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて総ＲＮＡを抽出し、そのうち０．５μｇをＲａｎｄｏｍ  Ｏｌｉｇｏ−ｄＴプライマーで逆転写（ＲＴ）反応することによって得た。
【０１３５】
タンパク質ＳｉＧＧＴ２１８４２用フォワードプライマー（ＳｉＧＧＴ−２１８４２−ｐＥＴ−ＦＷ）：
５’−ＴＧＣＣＧＣＧＣＧＧＣＡＧＣＣＡＴＡＴＧＧＡＧＡＡＡＡＡＡＧＡＡＧＣＴＡＡＡＴＴＣＡＧ−３’（配列番号９）
タンパク質ＳｉＧＧＴ２１８４２用リバースプライマー（ＳｉＧＧＴ−２１８４２−ｐＥＴ−ＲＶ）：
５’−ＧＴＴＡＧＣＡＧＣＣＧＧＡＴＣＣＴＣＡＣＴＴＴＴＣＡＣＴＧＣＣＴＡＡＴＣＴＧ−３’（配列番号１０）
【０１３６】
タンパク質ＳｉＧＧＴ２１６４６用フォワードプライマー（ＳｉＧＧＴ−２１６４６−ｐＥＴ−ＦＷ）：
５’−ＴＧＣＣＧＣＧＣＧＧＣＡＧＣＣＡＴＡＴＧＧＧＴＴＣＡＧＡＣＡＡＡＧＡＧＴＧＣ−３’（配列番号１１）
タンパク質ＳｉＧＧＴ２１６４６用リバースプライマー（ＢａｍＨＩ−ＳｉＧＧＴ−２１６４６−ｐＥＴ−ＲＶ）：
５’−ＧＴＴＡＧＣＡＧＣＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＡＴＴＣＣＣＡＣＡＡＡＴＴＴＧＴＧＣＴＡＡＣＴＴＧ−３’（配列番号１２）
【０１３７】
ＰＣＲ反応液（５０μＬ）は、ゴマ種子由来ｃＤＮＡ  １μＬ、１×ＥｘＴａｑ  ｂｕｆｆｅｒ（ＴａＫａＲａＢｉｏ）、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、プライマー各０．４ｐｍｏｌ／μＬ、ＥｘＴａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ２．５Ｕの組成とした。ＰＣＲ反応は、９４℃で３分間反応させた後、９４℃で１分間、５０℃で１分間、７２℃で２分間の反応を計３０サイクル行いＤＮＡの増幅を行った。得られたＰＣＲ産物を、０．８％アガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイド染色した。その結果、それぞれの鋳型ＤＮＡから推定された１４００ｂｐサイズ付近に増幅ＤＮＡのバンドが確認された。結果を図２（ａ）及び（ｂ）に示す。
図２の（ａ）は、ゴマ種子ｃＤＮＡを鋳型として、タンパク質ＳｉＧＧＴ２１８４２用フォワードプライマー及びタンパク質ＳｉＧＧＴ２１８４２用リバースプライマーを用いて得られたＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動の写真であり、（ｂ）は、ゴマ種子ｃＤＮＡを鋳型として、タンパク質ＳｉＧＧＴ２１６４６用フォワードプライマー及びタンパク質ＳｉＧＧＴ２１６４６用リバースプライマーを用いて得られたＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動の写真である。
図２の（ａ）中、Ａのレーンは、タンパク質ＳｉＧＧＴ２１８４２用プライマーを用いたＰＣＲ産物であり、図２の（ｂ）中、Ｂのレーンは、タンパク質ＳｉＧＧＴ２１６４６用プライマーを用いたＰＣＲ産物であり、図２（ａ）及び（ｂ）中のＭはマーカーである。
また、図２（ａ）及び（ｂ）の１４００ｂｐ付近のバンドを矢印で示す。
なお、図２中、Ｍは、サイズマーカーである。
【０１３８】
＜発現ベクターの構築＞
次に、ＰＣＲ産物をＧｅｎｅＡｒｔ  Ｓｅａｍｌｅｓｓ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて製造業者が推奨する方法で大腸菌発現ベクターｐＥＴ１５ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎｅ）にサブクローニングした。本ベクターのＮｄｅＩサイト上流にあるＨｉｓタグをコードするサイトとＳｉＧＧＴ遺伝子のＯＲＦが合っており、ＳｉＧＧＴタンパク質のＮ末端にＨｉｓタグが融合されたキメラタンパク質として発現するよう設計した。
【０１３９】
次に、サブクローニングした発現ベクターのヌクレオチド配列をキャピラリーシークエンサー（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ３１３０ｘｌ，  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で解析した。
【０１４０】
その結果、タンパク質ＳｉＧＧＴ２１８４２用プライマーを用いたＰＣＲ産物をサブクローニングした発現ベクターには、配列番号３又は配列番号４のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドが組み込まれていることが確認された。配列番号４のヌクレオチド配列は、配列番号３のヌクレオチド配列の６８６番目のグアニン残基がアデニン残基になったヌクレオチド配列であり、配列番号４のヌクレオチド配列は、配列番号３のヌクレオチド配列の対立遺伝子と考えられた。また、配列番号４によりコードされるタンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列からなる。配列番号２のアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列の２２９番目のアルギニン残基が、グルタミン残基になったアミノ酸配列である。
【０１４１】
また、タンパク質ＳｉＧＧＴ２１６４６用プライマーを用いたＰＣＲ産物をサブクローニングした発現ベクターには、配列番号６のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドが組み込まれていることが確認された。
【０１４２】
配列番号３のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドが組み込まれている発現ベクターをＳｉＧＧＴ２１８４２発現ベクターとし、配列番号４のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドが組み込まれている発現ベクターをＳｉＧＧＴ２１８４２Ｒ２２９Ｑ発現ベクターとし、配列番号６のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドが組み込まれている発現ベクターをＳｉＧＧＴ２１６４６発現ベクターとした。
また、各発現ベクターの接続部分にエラーがないことも確認した。
【０１４３】
＜組み換えタンパク質の発現および精製＞
ＳｉＧＧＴ２１８４２発現ベクター、ＳｉＧＧＴ２１６４６発現ベクター及びネガティブコントロールとして発現ベクターｐＥＴ１５ｂ（空のｐＥＴ１５ｂベクター）を用い、定法に従って大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
得られた各形質転換体を、５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地（１０ｇ／Ｌ  ｔｙｐｔｏｎｅ  ｐｅｐｔｏｎ，  ５ｇ／Ｌ  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ，  １ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ）４ｍＬにて、３７℃で一晩振盪培養した。静止期に達した培養液２ｍＬを同組成の培地９８ｍＬに接種し、Ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ａｕｔｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  １（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を用いて２５℃で２０時間振盪培養した。
【０１４４】
以下のすべての操作は４℃で行った。
培養した形質転換体を遠心分離（５，０００×ｇ、１０ｍｉｎ）にて集菌し、Ｂｕｆｆｅｒ  Ｓ［２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．５）、２０ｍＭ  ｉｍｉｄａｚｏｌ、  １４ｍＭ  β−メルカプトエタノール］を１ｍＬ／ｇ  ｃｅｌｌとなるように添加して懸濁した。
続いて、超音波破砕（１５ｓｅｃ×８回）を行い、遠心分離（１５，０００×ｇ、１５ｍｉｎ）を行った。得られた上清を粗酵素液として回収した。
粗酵素液をＢｕｆｆｅｒ  Ｓにて平衡化したＨｉｓ  ＳｐｉｎＴｒａｐ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に負荷し、遠心分離（７０×ｇ、３０ｓｅｃ）した。
Ｂｕｆｆｅｒ  Ｓで洗浄後、１００ｍＭ、及び、５００ｍＭのイミダゾールを含むＢｕｆｆｅｒ  Ｓ  各５ｍＬにて、カラムに結合したタンパク質を段階的に溶出した。
各溶出画分をＭｉｃｒｏｃｏｎ  ＹＭ−３０（Ａｍｉｃｏｎ社）を用いて２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．５）、１４ｍＭ  β−メルカプトエタノールにバッファー置換した。このバッファー置換した生成酵素溶液を以下の反応に用いた。
【０１４５】
各溶出画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、分離後のポリアクリルアミドゲルをＣＢＢ染色した。
ＳｉＧＧＴ２１８４２発現ベクター及びＳｉＧＧＴ２１６４６発現ベクターを用いて得られた粗酵素液から得られた５００ｍＭ  イミダゾール溶出画分において、ＨｉｓＴａｇ融合ＳｉＧＧＴタンパク質の推定分子質量である分子質量５０ｋＤａ付近の位置にタンパク質のバンドが観察された。
【０１４６】
さらに、抗Ｈｉｓタグ−抗体を用いたウェスタンブロッティング解析を行った。
ＳｉＧＧＴ２１８４２発現ベクター及びＳｉＧＧＴ２１６４６発現ベクターを用いて得られた各粗酵素液から得られた５００ｍＭ  イミダゾール溶出画分において、分子質量約５０ｋＤａ付近にタンパク質が検出された。一方、発現ベクターｐＥＴ１５ｂを用いて得られた粗酵素液から得られた溶出画分（以下、「ネガティブコントロール画分」とも記載する）には、上記分子質量約５０ｋＤａのタンパク質が検出されなかった。
【０１４７】
従って、上記ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果及びウェスタンブロッティング解析の結果から、各形質転換体が、タンパク質ＳｉＧＧＴ２１８４２又はタンパク質ＳｉＧＧＴ２１６４６を発現していることが確認できた。
【０１４８】
また、ＳｉＧＧＴ２１８４２発現ベクター及びＳｉＧＧＴ２１６４６発現ベクターのかわりにＳｉＧＧＴ２１８４２Ｒ２２９Ｑ発現ベクターを用いた以外は、上記と同様の方法で形質転換体を作製し、タンパク質ＳｉＧＧＴ２１８４２Ｒ２２９Ｑを精製した。
【０１４９】
（実施例１：タンパク質ＳｉＧＧＴ２１８４２の機能解析１）
以下のに示す方法で、タンパク質ＳｉＧＧＴ２１８４２とＳＧ１との反応を解析した。
【０１５０】
（ＬＣ条件）
装置名：ＬＣＭＳ−ＩＴ−ＴＯＦ（製造元：島津製作所：Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ  ＬＣ２０シリーズ）
カラム：Ｗａｔｅｒｓ  Ｓｕｎｆｉｒｅ  Ｃ１８  ３．５ｕｍ   ２．０ｍｍ  Ｉ．Ｄ．×２０ｍｍ
移動相：Ａ：１０ｍＭ  酢酸アンモニウム水溶液  Ｂ：  アセトニトリル
流速：０．４ｍＬ／ｍｉｎ
カラムオーブン：４０℃
グラジエント：Ｂ（ｖ／ｖ％）：２０％（０ｍｉｎ）−８０％（６ｍｉｎ）−８０％（８ｍｉｎ）−２０％（８．１ｍｉｎ）−２０％（１２ｍｉｎ）
本条件では、セサミノール２糖配糖体のＳＧ２（２）のピークは保持時間３．９１分、ＳＧ２（６）のピークは保持時間３．７７分であり、これらは分離される。
【０１５１】
（ＭＳ条件）
ＥＳＩ  （ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｍｏｄｅ）
Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  ｉｏｎ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ：ｍ／ｚ  ３１７，４７９，６４１，６８７，８０３及び８４９
【０１５２】
実施例１に係る反応液（２ｍＭ  ＵＤＰ−グルコース，糖受容体基質として０．１ｍＭ  ＳＧ１，１００ｍＭ  リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５），酵素溶液として精製タンパク質ＳｉＧＧＴ２１８４２溶液２５μＬを蒸留水で５０μＬに調製）を準備し、３０℃、１時間反応させた。反応後の反応液５μＬについて上記条件で逆相ＬＣ−ＭＳ分析を行った。
【０１５３】
また、ポジティブコントロールとして、ＳＧ２（２）の標準品を用い、上記の条件で逆相ＬＣ−ＭＳ分析を行った。
【０１５４】
また、ネガティブコントロールとして、反応液（２ｍＭ  ＵＤＰ−グルコース，糖受容体基質として０．１ｍＭ  ＳＧ１，１００ｍＭ  リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５），ネガティブコントロール画分２５μＬを蒸留水で５０μＬに調製）を準備し、３０℃、１時間反応させた。反応後の反応液５μＬについて上記条件で逆相ＬＣ−ＭＳ分析を行った。
【０１５５】
これらの逆相ＬＣ−ＭＳ分析の結果を図３に示す。
図３の（ａ）は、ＳＧ１及び精製タンパク質ＳｉＧＧＴ２１８４２溶液を用いた反応液の逆相ＬＣ−ＭＳ分析のチャートであり、図３の（ｂ）は、ＳＧ２（２）の標準品の逆相ＬＣ−ＭＳ分析のチャートであり、図３の（ｃ）は、ＳＧ１及びネガティブコントロール画分を用いた反応液の逆相ＬＣ−ＭＳ分析のチャートである。
すなわち、図３の（ａ）は、実施例１の反応液の逆相ＬＣ−ＭＳ分析のチャートであり、図３の（ｂ）は、実施例１のポジティブコントロールとして標準品のＳＧ２（２）を用いた逆相ＬＣ−ＭＳ分析のチャートであり、図３の（ｃ）は、実施例１のネガティブコントロールの反応液の逆相ＬＣ−ＭＳ分析のチャートである。
【０１５６】
図３（ａ）に示すように、タンパク質ＳｉＧＧＴ２１８４２とＳＧ１とを反応させたところ、ＳＧ１にグルコースが一つ付加されたと思われる分子量を有する新しいピークが検出された。これは図３（ｂ）に示す、ポジティブコントロールの保持時間３．９１分の標準品のＳＧ２（２）のピークと合致した。一方、図３（ｃ）に示すように、実施例１のネガティブコントロールでは、糖受容体基質のＳＧ１、及び、そのエピマー体が残存しており、実施例１では、タンパク質ＳｉＧＧＴ２１８４２の特異的な反応によりＳＧ２（２）が生成していることが確認された。
なお、図３（ｃ）に示す保持時間４．３９分のピークは、ＳＧ１であり、保持時間４．４６分のピークは、Ｅｐｉ−ＳＧ１のピークであると考えられる。
【０１５７】
（実施例２：タンパク質ＳｉＧＧＴ２１８４２の機能解析２）
以下に示す方法で、タンパク質ＳｉＧＧＴ２１８４２とＳＧ２（２）との反応を解析した。
【０１５８】
実施例２に係る反応液（２ｍＭ  ＵＤＰ−グルコース，糖受容体基質として０．１ｍＭ  ＳＧ２（２），１００ｍＭ  リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５），酵素溶液として精製タンパク質ＳｉＧＧＴ２１８４２溶液２５μＬを蒸留水で５０μＬに調製）を準備し、３０℃、１時間反応させた。反応後の反応液５μＬについて上記条件で逆相ＬＣ−ＭＳ分析を行った。
【０１５９】
また、ネガティブコントロールとして、上記反応液において酵素溶液の替りにネガティブコントロール画分２５μＬを使用して反応液を準備し、３０℃、１時間反応させた。反応後の反応液５μＬについて上記条件で逆相ＬＣ−ＭＳ分析を行った。
【０１６０】
これらの逆相ＬＣ−ＭＳ分析の結果を図４に示す。
図４の（ａ）は、ＳＧ２（２）及び精製タンパク質ＳｉＧＧＴ２１８４２溶液を用いた反応液の逆相ＬＣ−ＭＳ分析のチャートであり、図４の（ｂ）は、ＳＧ２（２）及びネガティブコントロール画分を用いた反応液の逆相ＬＣ−ＭＳ分析のチャートである。
すなわち、図４の（ａ）は、実施例２の反応液の逆相ＬＣ−ＭＳ分析のチャートであり、図４の（ｂ）は、実施例２のネガティブコントロールの反応液の逆相ＬＣ−ＭＳ分析のチャートである。
【０１６１】
図４（ａ）に示すように、タンパク質ＳｉＧＧＴ２１８４２とＳＧ２（２）とを反応させたところ、ＳＧ２（２）にグルコースが一つ付加された三糖配糖体と思われる新しいピークが保持時間３．３２分に検出された。タンパク質ＳｉＧＧＴ２１８４２の位置特異性からこの生成物はＳＧ２（２）の２つ目のグルコース残基の２位がさらにグルコシル化されたＳＧ３（２，２）だと推察された。ゴマ種子にはこのような糖鎖結合したセサミノール配糖体の報告はない。
なお、図４（ａ）において保持時間３．９０分のピークは、ＳＧ２（２）のピークである。
また、図４（ｂ）に示す、保持時間３．８９分のピークは、ＳＧ２（２）のピークである。
【０１６２】
（実施例３：タンパク質ＳｉＧＧＴ２１８４２の機能解析３）
以下に示す方法で、タンパク質ＳｉＧＧＴ２１８４２とＳＧ２（６）との反応を解析した。
【０１６３】
実施例３に係る反応液（２ｍＭ  ＵＤＰ−グルコース，糖受容体基質として０．１ｍＭ  ＳＧ２（６），１００ｍＭ  リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５），酵素溶液として精製タンパク質ＳｉＧＧＴ２１８４２溶液２５μＬを蒸留水で５０μＬに調製）を準備し、３０℃、１時間反応させた。反応後の反応液５μＬについて上記条件で逆相ＬＣ−ＭＳ分析を行った。
【０１６４】
また、ポジティブコントロールとして、反応液（２ｍＭ  ＵＤＰ−グルコース，糖受容体基質として０．１ｍＭ  ＳＧ３（２，６），１００ｍＭ  リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５），ネガティブコントロール画分２５μＬを蒸留水で５０μＬに調製）を準備し、３０℃、１時間反応させた。反応後の反応液５μＬについて上記条件で逆相ＬＣ−ＭＳ分析を行った。
【０１６５】
また、ネガティブコントロールとして、反応液（２ｍＭ  ＵＤＰ−グルコース，糖受容体基質として０．１ｍＭ  ＳＧ２（６），１００ｍＭ  リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５），ネガティブコントロール画分２５μＬを蒸留水で５０μＬに調製）を準備し、３０℃、１時間反応させた。反応後の反応液５μＬについて上記条件で逆相ＬＣ−ＭＳ分析を行った。
【０１６６】
これらの逆相ＬＣ−ＭＳ分析の結果を図５に示す。
図５の（ａ）は、ＳＧ２（６）及び精製タンパク質ＳｉＧＧＴ２１８４２溶液を用いた反応液の逆相ＬＣ−ＭＳ分析のチャートであり、図５の（ｂ）は、ＳＧ３（２，６）及びネガティブコントロール画分を用いた反応液の逆相ＬＣ−ＭＳ分析のチャートであり、図５の（ｃ）は、ＳＧ２（６）及びネガティブコントロール画分を用いた反応液の逆相ＬＣ−ＭＳ分析のチャートである。
すなわち、図５の（ａ）は、実施例３の反応液の逆相ＬＣ−ＭＳ分析のチャートであり、図５の（ｂ）は、実施例３のポジティブコントロールの反応液の逆相ＬＣ−ＭＳ分析のチャートであり、図５の（ｃ）は、実施例３のネガティブコントロールの反応液の逆相ＬＣ−ＭＳ分析のチャートである。
なお、図５（ｂ）において保持時間３．３０分のピークは、ＳＧ３（２，６）のピークである。
【０１６７】
図５（ａ）に示すように、タンパク質ＳｉＧＧＴ２１８４２とＳＧ２（６）とを反応させたところ、ＳＧ２（６）の１つ目のグルコース残基の２位にグルコースが一つ付加された三糖配糖体と思われる分子量を有する新しいピークが保持時間３．３１分に検出された。生成物の保持時間から生成された新たなピークはＳＧ３（２，６）のピークであった。
なお、図５（ｃ）において保持時間３．８０分のピークは、ＳＧ２（６）のピークである。
【０１６８】
（実施例４：タンパク質ＳｉＧＧＴ２１８４２の機能解析４）
以下に示す方法で、セサミノールを出発物質としてＳＧ３（２，６）を製造する方法を検討した。
【０１６９】
（ネガティブコントロール）
反応液（２ｍＭ  ＵＤＰ−グルコース，糖受容体基質として０．１ｍＭ  セサミノール，１００ｍＭ  リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５），ネガティブコントロール画分２５μＬを蒸留水で５０μＬに調製）を、３０℃、１時間反応させた。反応後の反応液５μＬについて上記条件で逆相ＬＣ−ＭＳ分析を行った。結果を図６（ａ）に示す。
図６の（ａ）は、実施例４のネガティブコントロールの反応液の逆相ＬＣ−ＭＳ分析のチャートである。
【０１７０】
（第１反応）
反応液（２ｍＭ  ＵＤＰ−グルコース，糖受容体基質として０．１ｍＭ  セサミノール，１００ｍＭ  リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５），ＵＧＴ７１Ａ９，ＵＧＴ９４Ｄ１を蒸留水で５０μＬに調整）を、３０℃、１時間反応させた。反応後の反応液５μＬについて上記条件で逆相ＬＣ−ＭＳ分析を行った。結果を図６（ｂ）に示す。
図６の（ｂ）は、実施例４の第１反応の反応液の逆相ＬＣ−ＭＳ分析のチャートである。
なお、ＵＧＴ７１Ａ９及びＵＧＴ９４Ｄ１は、非特許文献１に記載の方法で準備した。
【０１７１】
（第２反応）
反応液（２ｍＭ  ＵＤＰ−グルコース，糖受容体基質として０．１ｍＭ  セサミノール，１００ｍＭ  リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５），ＵＧＴ７１Ａ９、ＵＧＴ９４Ｄ１，精製タンパク質ＳｉＧＧＴ２１８４２溶液２５μＬを蒸留水で５０μＬに調製し、３０℃、１時間反応させた。反応後の反応液５μＬについて上記条件で逆相ＬＣ−ＭＳ分析を行った。結果を図６（ｃ）に示す。
図６の（ｃ）は、実施例４の第２反応の反応液の逆相ＬＣ−ＭＳ分析のチャートである。
【０１７２】
図６（ａ）では、保持時間６．０６分、及び、保持時間６．２８分の位置にピークが認められた。
図６（ｂ）では、保持時間３．７７分、及び、保持時間３．８５分の位置にピークが認められた。
図６（ｃ）では、保持時間３．３０分、及び、保持時間３．４０分の位置にピークが認められた。
【０１７３】
図６（ａ）の保持時間６．０６分のピークは、セサミノールのピークであり、保持時間６．２８分のピークは、セサミノールのエピマーであるエピセサミノールのピークである。
【０１７４】
図６（ｂ）の保持時間３．７７分のピークは、ＳＧ２（６）のピークであり、保持時間３．８５分のピークは、Ｅｐｉ−ＳＧ２（６）のピークである。
この結果より、ＵＧＴ７１Ａ９及びＵＧＴ９４Ｄ１により、ＳＧ２（６）が生成することが確認された。またこれらの酵素は、エピマーを厳密に区別していないことが示唆された。
【０１７５】
図６（ｃ）の保持時間３．３０分のピークは、ＳＧ３（２，６）のピークであり、保持時間３．４０分のピークは、Ｅｐｉ−ＳＧ３（２，６）のピークである。
【０１７６】
これらの結果から、酵素としてＵＧＴ７１Ａ９、ＵＧＴ９４Ｄ１及びタンパク質ＳｉＧＧＴ２１８４２をセサミノールにを反応させると、３箇所のグリコシル化が連続して起こり、ＳＧ３（２，６）が生成することが確認できた。
つまり、第１反応として、ＵＧＴ７１Ａ９及びＵＧＴ９４Ｄ１とセサミノールとが反応し、
ＳＧ２（６）が生成し、第２反応として、タンパク質ＳｉＧＧＴ２１８４２とＳＧ２（６）とが反応しＳＧ３（２，６）が生成することが確認できた。
また、タンパク質ＳｉＧＧＴ２１８４２は、エピマーを厳密に区別していないことが示唆された。
【０１７７】
実施例１〜４におけるタンパク質ＳｉＧＧＴ２１８４２の機能解析の反応液等に使用した糖受容体、酵素溶液等の組み合わせを以下の表１にまとめて示す。
【０１７８】
【表１】
2020183420.tif 000009
【０１７９】
（実施例５：タンパク質ＳｉＧＧＴ２１８４２Ｒ２２９Ｑの機能解析）
タンパク質ＳｉＧＧＴ２１８４２の代わりにタンパク質ＳｉＧＧＴ２１８４２Ｒ２２９Ｑを用いて上記（タンパク質ＳｉＧＧＴ２１８４２の機能解析１）〜（タンパク質ＳｉＧＧＴ２１８４２の機能解析４）と同様の試験を行ったところ、タンパク質ＳｉＧＧＴ２１８４２Ｒ２２９Ｑはタンパク質ＳｉＧＧＴ２１８４２と同じ機能を有していることが判明した。
【０１８０】
以上より、タンパク質ＳｉＧＧＴ２１８４２及びタンパク質ＳｉＧＧＴ２１８４２Ｒ２２９Ｑはこれまで同定されていなかったＵＤＰ−糖特異的糖転移酵素であり、その機能はＳＧ１のグルコース残基の２位、ＳＧ２（２）（の２つ目のグルコース残基の２位、及び、ＳＧ２（６）の１つ目のグルコース残基の２位をグルコシル化する機能であることが判明した。
【０１８１】
（タンパク質ＳｉＧＧＴ２１６４６の機能解析）
以下の試験例１〜７に示す方法で、タンパク質ＳｉＧＧＴ２１６４６の機能を解析した。
【０１８２】
（試験例１）〜（試験例７）
糖受容体基質及び酵素の組み合わせを表２に示すようにして試験例１〜７の反応液を準備した。
各反応液は、２ｍＭ  ＵＤＰ−グルコース，０．１ｍＭ  糖受容体基質、１００ｍＭ  リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）、酵素溶液又はネガティブコントロール画分を２５μＬ含み、蒸留水で５０μＬに調製された。
すなわち、試験例１の反応液は、糖受容体基質としてセサミノールを含み、酵素としてタンパク質ＳｉＧＧＴ２１６４６を含む。
試験例２の反応液は、糖受容体基質としてＳＧ２（２）を含み、酵素としてタンパク質ＳｉＧＧＴ２１６４６を含む。
試験例３の反応液は、糖受容体基質としてセサミノールを含み、酵素としてＵＧＴ７１Ａ９及びタンパク質ＳｉＧＧＴ２１６４６を含む。
試験例４の反応液は、糖受容体基質としてＳＧ２（２）を含み、酵素としてＵＧＴ９４Ｄ１を含む。
試験例５の反応液は、糖受容体基質としてセサミノールを含み、酵素としてＵＧＴ７１Ａ９及びＵＧＴ９４Ｄ１を含む。
試験例６の反応液は、糖受容体基質としてＳＧ２（６）を含み、酵素としてタンパク質ＳｉＧＧＴ２１６４６を含む。
試験例７の反応液は、糖受容体基質としてＳＧ２（６）を含み、酵素としてＵＧＴ９４Ｄ１を含む。
【０１８３】
【表２】
2020183420.tif 000010
【０１８４】
次に、各反応液を３０℃、１時間反応させた。反応後の反応液５μＬについて上記条件で逆相ＬＣ−ＭＳ分析を行った。結果を図７〜１３に示す。
図７は、試験例１の反応液の逆相ＬＣ−ＭＳ分析のチャートである。
図８は、試験例２の反応液の逆相ＬＣ−ＭＳ分析のチャートである。
図９は、試験例３の反応液の逆相ＬＣ−ＭＳ分析のチャートである。
図１０は、試験例４の反応液の逆相ＬＣ−ＭＳ分析のチャートである。
図１１は、試験例５の反応液の逆相ＬＣ−ＭＳ分析のチャートである。
図１２は、試験例６の反応液の逆相ＬＣ−ＭＳ分析のチャートである。
図１３は、試験例７の反応液の逆相ＬＣ−ＭＳ分析のチャートである。
【０１８５】
図７に示すように、タンパク質ＳｉＧＧＴ２１６４６をセサミノールと反応させたところ生成物は認められなかった。
一方、図８に示すようにタンパク質ＳｉＧＧＴ２１６４６をＳＧ２（２）と反応させたところグルコースが１分子付加されたピークが認められ、これは保持時間からセサミノＳＧ３（２，６）と同定された。
また、図９に示すように、ＵＧＴ７１Ａ９及びタンパク質ＳｉＧＧＴ２１６４６をセサミノールと反応させたところ、グルコースが２分子付加されたピークが認められ、これは保持時間からセサミノールＳＧ２（６）と同定された。
図１０及び図１１に示すようにこれらの反応はＵＧＴ９４Ｄ１でも同様にみられることと、及び、図１２及び図１３に示すようにこれらタンパク質はＳＧ２（６）をグルコシル化する活性がほとんどないことから、タンパク質ＳｉＧＧＴ２１６４６はＵＧＴ９４Ｄ１と同じように、ＳＧ１のグルコース残基の６位、及び、ＳＧ２（２）の一つ目のグルコース残基の６位をグルコシル化する糖特異的糖転移酵素であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【０１８６】
本発明によれば、上記タンパク質（Ｐ１）を利用して、ＳＧ１のグルコース残基の２位、及び、ＳＧ２（６）の１つ目のグルコース残基の２位をグルコシル化することができ、ＳＧ２（２）、及び、ＳＧ３（２，６）を製造することができる。
さらにタンパク質（Ｐ１）を利用して、ＳＧ２（２）の２つ目のグルコース残基の２位をグルコシル化することができ、ＳＧ３（２，２）を製造することができる。
今回、タンパク質（Ｐ１）に含まれるタンパク質ＳｉＧＧＴ２１８４２及びタンパク質ＳｉＧＧＴ２１８４２Ｒ２２９Ｑの機能を解析することにより、セサミノールからＳＧ３（２，６）までの生合成経路の全容が明らかになった。そのため、植物のみならず微生物において水溶性リグナン配糖体であるセサミノール３糖配糖体、その他類縁化合物を生産させるための育種マーカーおよび分子ツールを与えうる。
【図１】
2020183420.tif 000012
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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