(57)【要約】【課題】改善されたインターフェロン療法を提供する。【解決手段】本発明はヒト療法剤としてのインターフェロンの有効性を改善するための方法を提供し、該方法は、ａ．ヒト患者において、インターフェロンで処置され得る状態を診断するステップと、その後、ｂ．該ヒトに、阻害性ヒト免疫系チェックポイントを阻害する第２の剤を投与するステップであって、該剤が、免疫活性を減少させることに対する該チェックポイントの活性を低減させるのに十分な量で投与される、ステップと、ｃ．該ヒトに、該状態を処置するのに有効な量で該ヒト患者のインターフェロンレベルを増大させる第１の剤を投与するステップとを含む。【選択図】図１
2020122019.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
出願人: ＦＫＤ  Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｃｈｉｎｎｏｒ，Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅ  Ｅｎｇｌａｎｄ，英国の国民
【０００２】
関連出願：本願は、２０１６年２月１５日に出願された米国仮出願番号第６２／２９５２６８号に基づく優先権を主張しており、その内容は、参考として本明細書に援用される。
【０００３】
政府に支援された研究＆開発：なし
【０００４】
共同研究契約：出願人は、とりわけ、Ｍ．Ｄ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｔｅｘａｓ）およびＴｈｅ  Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎｉｃ  （Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）と、本願に関する研究のための研究契約を有している。
【０００５】
配列表：なし
【０００６】
発明者による先の公示：なし
【背景技術】
【０００７】
背景
インターフェロンは、多くの臨床的利益を有する。例えば、インターフェロンは、免疫系をアップレギュレートすることが公知である。したがって、それは、がん細胞を識別および攻撃するために患者の自然免疫系をリクルートするのに有用である可能性がある。しかしながら、抗がん剤としてのインターフェロン有効性は現在までに、十分ではないことが証明されている。これは不可解なことであった。
【０００８】
例えば、現在米国で承認されている最も有効な膀胱がん処置は、尿道内Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎワクチンである。この抗原性ワクチンは、膀胱細胞がインターフェロンを発現するように刺激し、これは、今度は、患者の自然免疫系をリクルートして、より良くがん細胞表面抗原を認識し、がん細胞を攻撃すると考えられている。しかしながら、症例の３分の１より多くでは、ワクチンは有効ではない。
【０００９】
同様に、外因的に製造されたインターフェロンポリペプチドの膀胱内注入が、膀胱がんを処置するために試験されているが、期待したほど有効でないことが分かっている。
【００１０】
本発明者は、その理由を発見し、それを手直しする方法を考え出した。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
簡単な説明
本発明者は、インターフェロン発現を刺激することに加えて、（外因的に投与されたか、または内因的発現をアップレギュレートするワクチンもしくは他の剤に応答して発現したいずれかの）インターフェロンはまた、ＣＤ２７９とも呼ばれる、プログラム細胞死タンパク質１の発現を刺激することを発見した。したがって、本発明者は、以前に認識されていないインターフェロン療法の副作用を識別した。インターフェロンは、患者の免疫系のある特定の局面を有利に刺激するが、プログラム細胞死タンパク質１の発現もまたアップレギュレートする。結果としてのプログラム細胞死タンパク質１の増加は、今度は、保護的Ｔ細胞機能をダウンレギュレートする。これは、がん細胞表面抗原を有する細胞を識別および攻撃することにおけるＴ細胞の有効性を損なう。したがって、インターフェロンは、２つの相反する作用を生成する。それは免疫系活性を増大させるが、がん細胞表面抗原を識別する免疫系の能力を阻害する。
【００１２】
したがって、本発明者は、プログラム細胞死タンパク質１の発現を阻害する剤を共投与することによるインターフェロン療法の改善を提案する。これは、インターフェロンがその療法的可能性をより完全に達成することを可能にする。
本発明の実施形態の例として、以下の項目が挙げられる。
（項目１）
インターフェロンでヒト患者を処置する方法であって、
ａ．ヒト患者において、インターフェロンで処置され得る状態を診断するステップと、その後、
ｂ．第１の剤を投与するステップであって、前記第１の剤が、ヒト免疫系チェックポイントの機能に影響するのに十分な量で前記ヒト患者のインターフェロンレベルを増大させることができ、これにより前記チェックポイントが免疫機能を減少させる、ステップと、
ｃ．前記ヒトに、同じヒト免疫系チェックポイントの機能に影響する第２の剤を投与するステップであって、前記第２の剤が、前記第１の剤が前記チェックポイントに対して有する免疫機能の減少を実質的に改善するのに有効な量で投与される、ステップと
を含み、これにより第２の化合物が、前記第１の剤により引き起こされる前記免疫機能の減少を実質的に改善する、方法。
（項目２）
本質的に項目１に記載の方法からなる方法。
（項目３）
前記患者が、前記第１の剤および前記第２の剤でほぼ同時に処置される、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記第１の剤が、外因的に生成されたインターフェロンポリペプチドを含む、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記第１の剤が、前記患者がインターフェロンを内因的に発現することを誘導する剤を含む、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記第１の剤が、発現可能なインターフェロン導入遺伝子を有するベクターである、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記第１の剤が、微生物抗原、ウイルス抗原および微生物またはウイルス抗原アナログからなる群から選択される、項目５に記載の方法。
（項目８）
前記第１の剤が、ポリＩ：Ｃを含むウイルス抗原アナログを含む、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記第１の剤が、細菌抗原を含む、項目７に記載の方法。
（項目１０）
前記第１の剤が、ウイルス抗原を含む、項目７に記載の方法。
（項目１１）
前記第１の剤が、抗原性ウイルスを含む、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記ヒト患者のインターフェロンレベルが、阻害性ヒト免疫系チェックポイントの機能を増大させるのに十分な量で増大される、項目１に記載の方法。
（項目１３）
前記阻害性チェックポイントが、プログラム細胞死タンパク質１および細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４からなる群から選択される、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記阻害性チェックポイントが、プログラム細胞死タンパク質１を含み、前記第２の剤が、プログラム細胞死タンパク質１またはプログラム細胞死タンパク質１リガンドに結合する、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記状態が、がんを含む、項目１に記載の方法。
（項目１６）
ヒト免疫系チェックポイントの機能に影響し、これにより前記チェックポイントがヒト免疫機能を抑制しない剤であって、ヒト患者に対するインターフェロンの免疫抑制効果を消失させることにおける使用のためであり、インターフェロンの前記免疫抑制効果を低減させるのに有効な量で提供される、剤。
（項目１７）
ヒト療法剤としてのインターフェロンの有効性を改善するための方法であって、
ａ．ヒト患者において、インターフェロンで処置され得る状態を診断するステップと、その後、
ｂ．前記ヒトに、阻害性ヒト免疫系チェックポイントを阻害する第２の剤を投与するステップであって、前記剤が、免疫活性を減少させることに対する前記チェックポイントの活性を低減させるのに十分な量で投与される、ステップと、
ｃ．前記ヒトに、前記状態を処置するのに有効な量で前記ヒト患者のインターフェロンレベルを増大させる第１の剤を投与するステップと
を含む、方法。
（項目１８）
本質的に、
ａ．ヒトに、阻害性ヒト免疫系チェックポイントを阻害する第２の剤を投与するステップと、
ｂ．前記ヒトに、前記ヒト患者のインターフェロンレベルを増大させる第１の剤を投与するステップと
からなる方法。
（項目１９）
前記第２の剤が、前記チェックポイントの活性を低減させるのに十分な量で投与される、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記第２の剤が、前記患者がインターフェロンを内因的に発現することを誘導し、前記第２の剤が、発現可能なインターフェロン導入遺伝子を有するベクターを含む、項目１９に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、ＲＴ１１２およびＳＷ７８０ヒト細胞株について、インターフェロン曝露に応答したＰＤ−Ｌ１発現を測定するグラフである。横軸：インターフェロン量。縦軸：発現したポリペプチド。
【００１４】
【図２】図２は、ＲＴ１１２およびＳＷ７８０ヒト細胞株について、インターフェロン曝露に応答したＴＲＡＩＬ発現を測定するグラフである。横軸：インターフェロン量。縦軸：発現したポリペプチド。
【００１５】
【図３】図３は、ＲＴ１１２およびＳＷ７８０ヒト細胞株について、インターフェロン曝露に応答したＩＲＦ１発現を測定するグラフである。横軸：インターフェロン量。縦軸：発現したポリペプチド。
【００１６】
【図４】図４は、ＳＷ７８０ヒトがん細胞株における、増加するインターフェロンアルファに対するｉｎ  ｖｉｔｒｏ用量応答を示すＰＡＧＥゲルの写真である。横軸：インターフェロン量。縦軸：発現したポリペプチド。
【００１７】
【図５】図５は、インターフェロン曝露に応答したＩＲＦ１、ＦＯＸＡ１およびＰＤ−Ｌ１のＲＴ１１２細胞における発現を測定する。実施例２を参照のこと。ＩＲＦ１を、インターフェロンで刺激される遺伝子対照として使用した。ＦＯＸＡ１は、インターフェロン曝露後に発現を変化しなかったＩ型インターフェロンで調節される遺伝子の例である。
【００１８】
【図６】図６は、インターフェロン曝露に応答したＩＲＦ１、ＦＯＸＡ１およびＰＤ−Ｌ１のＵＣ３細胞における発現を測定する。実施例２を参照のこと。ＩＲＦ１を、インターフェロンで刺激される遺伝子対照として使用した。ＦＯＸＡ１は、インターフェロン曝露後に発現を変化しなかったＩ型インターフェロンで調節される遺伝子の例である。
【００１９】
【図７】図７は、インターフェロン曝露に応答したＩＲＦ１、ＦＯＸＡ１およびＰＤ−Ｌ１のＴ２４細胞における発現を測定する。実施例２を参照のこと。ＩＲＦ１を、インターフェロンで刺激される遺伝子対照として使用した。ＦＯＸＡ１は、インターフェロン曝露後に発現を変化しなかったＩ型インターフェロンで調節される遺伝子の例である。
【００２０】
【図８】図８は、インターフェロン曝露に応答したＩＲＦ１、ＦＯＸＡ１およびＰＤ−Ｌ１のＵＣ１４細胞における発現を測定する。実施例２を参照のこと。ＩＲＦ１を、インターフェロンで刺激される遺伝子対照として使用した。ＦＯＸＡ１は、インターフェロン曝露後に発現を変化しなかったＩ型インターフェロンで調節される遺伝子の例である。
【００２１】
【図９】図９は、６レーンのＰＡＧＥゲルの写真である。それは、ＢＢＮ９７２細胞をマウスインターフェロンに曝露した後のＰＤ−Ｌ１ポリペプチドの存在を測定する。レーンは、（左から右へ）０（零）、１×１００、１×１０１、１×１０２、１×１０３および１×１０４国際単位インターフェロン／培地ｍＬである。
【００２２】
【図１０】図１０は、６レーンのＰＡＧＥゲルの写真である。それは、ＭＢ４９  ＃１（ＭＢ４９−ｌｕｃ）細胞をマウスインターフェロンに曝露した後のＰＤ−Ｌ１ポリペプチドの存在を測定する。レーンは、（左から右へ）０（零）、１×１００、１×１０１、１×１０２、１×１０３および１×１０４国際単位インターフェロン／培地ｍＬである。
【００２３】
【図１１】図１１は、６レーンのＰＡＧＥゲルの写真である。それは、ＢＢＮ９７２細胞をマウスインターフェロンに曝露した後のアクチンポリペプチドの存在を測定する。レーンは、（左から右へ）０（零）、１×１００、１×１０１、１×１０２、１×１０３および１×１０４国際単位インターフェロン／培地ｍＬである。
【００２４】
【図１２】図１２は、６レーンのＰＡＧＥゲルの写真である。それは、ＭＢ４９  ＃１細胞をマウスインターフェロンに曝露した後のアクチンポリペプチドの存在を測定する。レーンは、（左から右へ）０（零）、１×１００、１×１０１、１×１０２、１×１０３および１×１０４国際単位インターフェロン／培地ｍＬである。
【００２５】
【図１３】図１３は、ポリＩ：Ｃの腹腔内注射に応答したマウスにおける血清インターフェロンを測定する。
【００２６】
【図１４】図１４は、６時間でのポリＩ：Ｃの腫瘍内注射に応答したマウスにおける血清インターフェロンを測定する。
【００２７】
【図１５】図１５は、ポリＩ：Ｃ（５００μｇ）腹腔内注射２４時間後の腫瘍内ＰＤ−Ｌ１発現を測定する。
【００２８】
【図１６】図１６は、ヒトインターフェロンアルファ２Ｂ導入遺伝子を有するＩＮＳＴＩＬＡＤＲＩＮ（商標）組換え複製欠損アデノウイルス遺伝子療法ベクターで処置したヒトにおけるＲＮＡ発現を示す。
【００２９】
【図１７】図１７は、皮下Ｃ５７ＢＬ６／Ｊ腫瘍についての、時間に対するＭＢ４９腫瘍サイズを示す（１群当たりｎ＝５匹の雌マウス）。処置は、腫瘍移植後１０日目に開始する２００μｇ  ｑ３（１日１回、３日間）である。エラーバーは、ＳＥＭを表す。
【００３０】
【図１８】図１８は、腫瘍を植え付け、生理食塩水（最低部の線）、ＩｇＧ（次に高い線）、抗ＰＤ１モノクローナル抗体（次に高い線）、ポリＩ：Ｃ（次に高い線）およびポリＩ：Ｃと抗ＰＤ１モノクローナル抗体との組合せ（最も高い線）で処置した雌マウスについてのカプラン・マイヤー生存曲線を示す。
【００３１】
【図１９】図１９は、雄マウスにおける:経時的に正規化（平均値＋／−ＳＤ）放射を比較する。ログ・ランク検定を使用して、これらのデータは、組合せ療法がＩｇＧ対照よりも優れており（ｐ＝０．０６）、ポリＩ：Ｃ単独療法よりも優れており（ｐ＝０．３２）、かつ抗ＰＤ１モノクローナル抗体よりも優れている（ｐ＝０．１４）ことを示す。
【００３２】
【図２０】図２０は、「生存部分」、すなわち、図１９につき処置した雄マウスにおける、:経時的に生存する傾向の生存を示すデータを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
詳細な説明
インターフェロン療法
インターフェロンは、一群のシグナル伝達タンパク質である。それらは、いくつかの抗原性病原体、例えばウイルス、細菌および寄生生物ならびにまた腫瘍細胞の存在に応答してヒト細胞により発現および分泌される。典型的に、ウイルス感染細胞は、インターフェロンを放出し、近傍のバイスタンダー細胞にそれらの抗ウイルス防御を高めるようにシグナル伝達する。また、インターフェロンは、免疫細胞、例えばナチュラルキラー細胞およびマクロファージを活性化する。インターフェロンは、主要な組織適合性複合抗原の発現を増大させ、これは、今度は、免疫系への外来抗原の提示を増大させる。
【００３４】
インターフェロンは、それらがシグナル伝達する受容体の種類に従って選別または分類することができる。したがって、ヒトについて、インターフェロンは多くの場合、３つの種類：Ｉ型（ヒトＩＦＮ−α／β受容体に結合するインターフェロン）、ＩＩ型（ヒトＩＦＮ−γ受容体に結合するインターフェロン）およびＩＩＩ型（ヒトＩＦＮ−λ受容体に結合するインターフェロン）に選別される。
【００３５】
全てのインターフェロンは、いくつかの共通の効果を共有する。それらは、抗ウイルス剤であり、それらは免疫系の機能を調節する。Ｉ型ＩＦＮの投与は、実験動物において腫瘍増殖を阻害することが示されているが、ヒト腫瘍における有益な作用は、広く実証されてはいない。ウイルス感染細胞は、近傍の細胞に感染し得るウイルス粒子を放出する。しかしながら、感染細胞は、インターフェロンを放出することにより、ウイルスによる感染の可能性に対して近隣の細胞を準備させることができる。インターフェロンに応答して、細胞は、大量のタンパク質キナーゼＲ（ＰＫＲ）として公知の酵素を生成する。この酵素は、新しいウイルス感染に応答してｅＩＦ−２として公知のタンパク質をリン酸化する。リン酸化ｅＩＦ−２は、ｅＩＦ２Ｂと呼ばれる別のタンパク質と不活性複合体を形成して、細胞内のタンパク質合成を低減させる。別の細胞酵素、ＲＮアーゼＬ（これもまたインターフェロン作用により誘導される）は、細胞内のＲＮＡを破壊して、ウイルスおよびホスト遺伝子両方のタンパク質合成をさらに低減させる。タンパク質合成の阻害のために、ウイルスおよび感染ホスト細胞の両方が破壊される。加えて、インターフェロンは、ウイルスおよびインターフェロンにより生成される他の作用と戦う役割を有する数百の他のタンパク質（インターフェロンで刺激される遺伝子（ＩＳＧ）として集合的に公知）の生成を誘導する。また、それらは、アポトーシスを促進することによりウイルス感染細胞を殺滅するｐ５３活性を増大させることにより、ウイルス拡散を制限する。また、ｐ５３に対するＩＦＮの効果は、ある特定のがんに対するその保護的役割に連結されている。
【００３６】
インターフェロンの別の機能は、主要な組織適合性複合体分子、ＭＨＣ  ＩおよびＭＨＣ  ＩＩの発現をアップレギュレートし、免疫プロテアソーム活性を増大させることである。より高いＭＨＣ  Ｉ発現は、細胞傷害性Ｔ細胞へのウイルスペプチドの提示を増大させ、一方で、免疫プロテアソームは、ＭＨＣ  Ｉ分子上へのローディングのためにウイルスペプチドを処理し、これにより感染細胞の認識および殺滅を増大させる。より高いＭＨＣ  ＩＩ発現は、ヘルパーＴ細胞へのウイルスペプチドの提示を増大させ、これらの細胞は、他の免疫細胞にシグナル伝達し、かつそれらの活性を協調させるサイトカイン（例えば、数ある中で、より多くのインターフェロンおよびインターロイキン）を放出する。
【００３７】
インターフェロンの生成は、主に微生物、例えばウイルスおよび細菌ならびにそれらの生成物に応答して起こる。パターン認識受容体、例えば膜結合Ｔｏｌｌ様受容体または細胞質受容体ＲＩＧ−ＩもしくはＭＤＡ５による、微生物で独特に見られる分子（ウイルス糖タンパク質、ウイルスＲＮＡ、細菌エンドトキシン（リポ多糖）、細菌鞭毛、ＣｐＧモチーフ）の結合は、ＩＦＮの放出を誘発し得る。Ｔｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）は、二本鎖ＲＮＡウイルスの存在に応答してインターフェロンを誘導するために重要であり、この受容体に対するリガンドは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）である。ｄｓＲＮＡの結合後、この受容体は、転写因子ＩＲＦ３およびＮＦ−κＢを活性化し、これらは多くの炎症性タンパク質の合成を開始するのに重要である。ＲＮＡ干渉技術ツール、例えばｓｉＲＮＡまたはベクターベースの試薬は、インターフェロン経路を発現停止することも、または刺激することもできる。細胞からのＩＦＮ（特にリンパ系細胞におけるＩＦＮ）の放出もまた、マイトジェンにより誘導される。また、他のサイトカイン、例えばインターロイキン１、インターロイキン２、インターロイキン−１２、腫瘍壊死因子およびコロニー刺激因子は、インターフェロン生成を高め得る。
【００３８】
インターフェロン療法は、一部のがんの処置として（化学療法および放射線との組合せで）使用されている。この処置は、血液系腫瘍；有毛細胞白血病、慢性骨髄性白血病、結節性リンパ腫および皮膚性Ｔ細胞リンパ腫を含む白血病ならびにリンパ腫で使用され得る。再発性黒色腫を有する患者は、組換えＩＦＮ−ａ２ｂを受容する。Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎の両方は、多くの場合他の抗ウイルス薬との組合せで、ＩＦＮ−ｂで処置される。インターフェロンで処置される患者の一部は、持続するウイルス学的応答を有し、肝炎ウイルスを消失させることができる。最も有害な株（Ｃ型肝炎遺伝子型Ｉウイルス）は、現在のインターフェロンの標準処置、ＲＩＢＡＶＩＲＩＮ（商標）および最近承認されたプロテアーゼ阻害剤、例えばＴｅｌａｐｒｅｖｉｒ（Ｉｎｃｉｖｅｋ（商標））２０１１年５月、Ｂｏｃｅｐｒｅｖｉｒ（ＶＩＣＴＲＥＬＩＳ（商標））２０１１年５月またはヌクレオチドアナログポリメラーゼ阻害剤Ｓｏｆｏｓｂｕｖｉｒ（ＳＯＶＡＬＤＩ（商標））２０１３年１２月で６０〜８０％の成功率にて処置することができる。処置を受けた患者の生検は、肝臓損傷および肝硬変の低減を示す。一部の証拠は、感染直後にインターフェロンを与えることが慢性Ｃ型肝炎を予防し得ることを示すが、Ｃ型肝炎感染初期では身体的症状が希薄であるので、感染初期の診断は困難である。ＩＦＮによる慢性Ｃ型肝炎の制御は、肝細胞癌腫の低減を伴う。
【００３９】
本分野は、インターフェロンが外因性ポリペプチドとして投与され得ることを教示する。
【００４０】
あるいは、天然インターフェロン遺伝子の内因的発現を誘導することができる。例えば、本分野は、例えば抗原性Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−ＧｕｅｒｉｎまたはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属もしくはＡｄｅｎｏｖｉｒｕｓワクチンを教示する。かかる抗原性調製物は、患者自身の細胞がインターフェロンを発現することを誘導する。
【００４１】
あるいは、インターフェロン導入遺伝子を送達するベクターをホスト細胞にトランスフェクトすることにより、非天然インターフェロン導入遺伝子の内因的発現を誘導することができる。実際に、外因的に投与したインターフェロンポリペプチドそれ自体でさえも、インターフェロン生成を刺激するメッセンジャーとして働く。
【００４２】
本明細書で使用されるとき、「インターフェロン」（「ＩＦＮ」と略される）という用語は集合的に、１型および２型インターフェロンを指し、その欠失、挿入または置換バリアント、生物学的に活性な断片および対立遺伝子形態を含む。本明細書で使用されるとき、インターフェロン（「ＩＦＮ」と略される）という用語は集合的に、１型および２型インターフェロンを指す。１型インターフェロンは、インターフェロン−α、−βおよび−ωならびにそれらのサブタイプを含む。ヒトインターフェロン−αは、少なくとも１４個の識別されたサブタイプを有し、一方で、インターフェロン−βは、３つの識別されたサブタイプを有する。特に、好ましいインターフェロン−アルファは、非限定的にα−１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ０７６９１８）、α−１ｂ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＬ３５２２３）、α−２、α−２ａ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ０００５９６）、α−２ｂ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＰ２００９９）、α−４（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ０６６５４６）、α−４ｂ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＣＡＡ２６７０１）、α−５（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ００２１６０およびＣＡＡ２６７０２）、α−６（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＣＡＡ２６７０４）、α−７（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ０６６４０１およびＣＡＡ２６７０６）、α−８（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ００２１６１およびＣＡＡ２６９０３）、α−１０（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ００２１６２）、α−１３（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ００８８３１およびＣＡＡ５３５３８）、α−１４（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ００２１６３およびＣＡＡ２６７０５）、α−１６（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ００２１６４およびＣＡＡ２６７０３）、α−１７（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ０６７０９１）、α−２１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ０１５６８およびＮＰ００２１６６）を含むヒトインターフェロンアルファサブタイプならびに１９９６年７月３０日発行のStabinsky、米国特許第５，５４１，２９３号、１９９０年１月３０日発行のStabinsky、米国特許第４，８９７，４７１号および１９８７年９月２２日発行のStabinsky、米国特許第４，６９５，６２９号で説明されているコンセンサスインターフェロン（当該特許の教示は、参照により本明細書に組み込まれる）および１９８３年１１月８日発行のGoeddelら、米国特許第４，４１４，１５０号で説明されているハイブリッドインターフェロン（当該特許の教示は、参照により本明細書に組み込まれる）を含む。２型インターフェロンは、インターフェロンγ（ＥＰ７７，６７０ＡおよびＥＰ１４６，３５４Ａ）およびサブタイプと呼ばれる。ヒトインターフェロンガンマは、インターフェロンオメガ１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ００２１６８）を含む、少なくとも５つの特定されたサブタイプを有する。発現のためのインターフェロンをコードするＤＮＡ配列の構築は、上記に参照され、かつ２００２年１１月１９日発行のGoeddelら、米国特許第６，４８２，６１３号で説明されている周知のアミノ酸配列に基づいて従来の組換えＤＮＡ技術により達成することができ、当該特許の教示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００４３】
インターフェロンの「生物学的に活性な」断片は、本分野で周知の技術（例えばOpenakkerら、上記；Mossman、J. Immunol. Methods、６５巻：５５頁（１９８３年）を参照のこと）により測定される、任意の抗腫瘍または抗増殖活性を有するものとして識別することができ、ＩＦＮ受容体媒介機構を通してＩＦＮ応答性遺伝子を活性化する。可溶性ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−βタンパク質は一般的に、１型ＩＦＮ受容体複合体（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ０００８６５）と会合するものとして識別されており、同様の細胞内シグナル伝達経路を活性化する。ＩＦＮ−γは一般的に、ＩＩ型ＩＦＮ受容体と会合するものとして識別されている。両方の種類のＩＦＮ受容体のリガンドが誘導した会合は、ヤヌスキナーゼによる受容体のリン酸化をもたらし、次にＳＴＡＴ（ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒｓ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）タンパク質および追加のリン酸化事象を活性化し、これはＩＦＮ誘導性遺伝子に存在するＩＦＮ応答エレメントに結合するＩＦＮ誘導性転写因子の形成をもたらす。１型および／または２型ＩＦＮ受容体との会合後にＩＦＮ経路を活性化するものとして識別されるポリペプチドは、本発明の目的のためのインターフェロンと考えられる。
【００４４】
プログラム細胞死タンパク質１
プログラム細胞死タンパク質１（「ＰＤ−１」）は、ＣＤ２７９としても公知であり、ヒトにおいてＰＤＣＤ１遺伝子によりコードされるタンパク質である。ＰＤ−１は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属し、細胞表面受容体として機能し、２つの公知のリガンド、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２に結合する。
【００４５】
ＰＤ−１は、Ｔ細胞の活性化を防ぐことによりヒト免疫系をダウンレギュレートする重要な役割を果たし、これは、今度は、自己免疫を低減し、「自己免疫寛容」を促進する。ＰＤ−１の免疫調節効果は、サプレッサーＴ細胞を保護する一方で、活性Ｔ細胞を選別して取り除くことにより影響される。ＰＤ−１は、リンパ節において抗原特異的Ｔ細胞のアポトーシスを促進するが、調節性（「サプレッサー」）Ｔ細胞でアポトーシスを低減する。
【００４６】
ＰＤ−Ｌ１は、ある特定の腫瘍で高く発現され得る。これは、腫瘍における免疫細胞の増殖の低減、または消失さえももたらし、患者の自然免疫系ががん細胞表面抗原を認識し、このようにして識別されたがん細胞と戦う能力を損なう。
【００４７】
ＰＤ−１は、Ｔ細胞およびプロＢ細胞上で発現される。免疫チェックポイントとして機能するＰＤ−１は、Ｔ細胞の活性化を防ぐことにより免疫系をダウンレギュレートする重要な役割を果たし、これは、今度は、自己免疫を低減し、自己免疫寛容を促進する。ＰＤ−１の阻害効果は、リンパ節において抗原特異的Ｔ細胞のアポトーシス（プログラム細胞死）を促進し、一方で同時に調節性Ｔ細胞（サプレッサーＴ細胞）においてアポトーシスを低減する二重の機構を通して達成される。
【００４８】
プログラム死１は、２６８個のアミノ酸のＩ型膜タンパク質である。ＰＤ−１は、Ｔ細胞レギュレータの拡張されたＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４ファミリーのメンバーである。タンパク質の構造は、細胞外ＩｇＶドメイン、それに続く膜貫通領域および細胞内尾部を含む。細胞内尾部は、免疫受容体チロシンベースの阻害性モチーフおよび免疫受容体チロシンベースのスイッチモチーフに位置する２つのリン酸化部位を含有し、このことは、ＰＤ−１がＴＣＲシグナルを負に調節することを示唆する。これは、リガンド結合に際してのＰＤ−１の細胞質尾部へのＳＨＰ−１およびＳＨＰ−２ホスファターゼの結合と一致する。加えて、ＰＤ−１ライゲーションは、Ｅ３ユビキチンリガーゼＣＢＬ−ｂおよびｃ−ＣＢＬをアップレギュレートし、これはＴ細胞受容体ダウンモジュレーションを誘発する。ＰＤ−１は、活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞およびマクロファージの表面上で発現され、このことはＣＴＬＡ−４と比較して、ＰＤ−１は免疫応答をより広く負に調節することを示唆する。
【００４９】
ＰＤ−１は、Ｂ７ファミリーのメンバーである２つのリガンド、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２を有する。ＰＤ−Ｌ１タンパク質は、ＬＰＳおよびＧＭ−ＣＳＦ処置に応答してマクロファージおよび樹状細胞（ＤＣ：ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ）上で、ならびにＴＣＲおよびＢ細胞受容体シグナル伝達に際してＴ細胞およびＢ細胞上でアップレギュレートされ、一方で、安静時のマウスでは、ＰＤ−Ｌ１  ｍＲＮＡは、心臓、肺、胸腺、脾臓および腎臓で検出され得る。
【００５０】
がんの処置のために、免疫系をブーストする、ＰＤ−１を標的にするモノクローナル抗体が開発されている。多くの腫瘍細胞は、免疫抑制性ＰＤ−１リガンドであるＰＤ−Ｌ１を発現する。ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との間の相互作用の阻害は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＴ細胞応答を高め、前臨床抗腫瘍活性を媒介し得る。これは、免疫チェックポイント阻害として公知である。
【００５１】
１つのかかる抗ＰＤ−１抗体薬物、ニボルマブ（ＯＰＤＩＶＯ（商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ  Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｃｏ．、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、ＮＪから市販されている）は、全部で２９６人の患者での臨床試験において、非小細胞肺がん、黒色腫および腎細胞がんで完全なまたは部分的な応答を生成した。結腸および膵臓がん患者は、応答を有しなかった。ニボルマブ（ＯＰＤＩＶＯ（商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ  Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）は、またＰＤ−１受容体を標的にするものであり、２０１４年７月に日本で、および２０１４年１２月に米国ＦＤＡにより、転移性黒色腫を処置するために承認された。
【００５２】
ペンブロリズマブ（ＫＥＹＴＲＵＤＡ（商標）またはＭＫ−３４７５、Ｍｅｒｃｋ  ＆  Ｃｏ．、Ｒａｈｗａｙ、ＮＪから市販されている）は、またＰＤ−１受容体を標的にするものであり、２０１４年９月にＦＤＡにより、転移性黒色腫を処置するために承認されている。ペンブロリズマブは、２０１５年３月に英国でＵＫ  Ｅａｒｌｙ  Ａｃｃｅｓｓ  ｔｏ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ  Ｓｃｈｅｍｅ（ＥＡＭＳ）により進行期黒色腫患者に使用可能になっている。それは、肺がん、リンパ腫および中皮腫について米国における臨床試験で使用されている。それは正確に測定され成功を有し、ほとんど副作用がなかった。２０１５年１０月２日に、ペンブロリズマブは、疾患が他の処置後に進行した進行期（転移性）非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）患者についてＦＤＡにより承認された。
【００５３】
ＰＤ−１受容体を標的にする初期開発段階にある他の薬物（多くの場合、「チェックポイント阻害剤」と呼ばれる）：ピディリズマブ（ＣＴ−０１１、Ｃｕｒｅ  Ｔｅｃｈ）、ＢＭＳ  ９３６５５９（Ｂｒｉｓｔｏｌ  Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）、ＭＰＤＬ３２８ＯＡ（Ｒｏｃｈｅ）およびアテゾリズマブ（Ａｍｇｅｎ）。
【００５４】
組合せ療法
本発明者は、インターフェロンでのがん処置（インターフェロンポリペプチドを投与することによるか、または細胞がインターフェロンを発現することを誘導する剤を投与することによる）は、同時にＰＤ−１発現を誘導することを発見した。
【００５５】
したがって、本発明者は、インターフェロンを、ＰＤ−１活性を阻害する化合物と共投与することによりインターフェロンベースのがん療法の有効性を改善することを提案する。
【００５６】
これは、例えば、がん療法として有効な量でインターフェロンポリペプチドを静脈内投与すること、ならびにインターフェロンが引き起こしたＰＤ−１発現の増大を防ぐのに有効な量でおよび好ましくはＰＤ−１の効果を低減させる量でモノクローナル抗体チェックポイント阻害用阻害剤を静脈内投与することを必要とする。
【００５７】
あるいは、これは、がん療法として有効な量でインターフェロン発現を誘導する剤を膀胱内に注入すること、ならびにインターフェロンが引き起こしたＰＤ−１発現の増大を防ぐのに有効な量でおよび好ましくはＰＤ−１の効果を低減させる量でチェックポイント阻害用阻害剤を予防的に静脈内投与することを必要とする。この剤は、インターフェロン発現を誘導する抗原性ワクチン（例えばウイルスまたはＢＣＧワクチンもしくはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍワクチン）であってもよい。あるいは、この剤は、ホスト細胞を発現可能なインターフェロン導入遺伝子で形質転換する導入遺伝子ベクターであってもよい。あるいは、これは、これもまたインターフェロン導入遺伝子を送達する抗原性ウイルスまたは細菌であってもよい。
【実施例】
【００５８】
（実施例１）
ＩＦＮαは、ＰＤ−Ｌ１およびＴＲＡＩＬ発現を誘導する。
【００５９】
インターフェロン−アルファ（ＩＦＮａ）は、臨床的に顕著に有効ではなかった。本発明者は、これが、ベクター媒介ＩＦＮａ遺伝子療法の設定においてはより有効であり得ると仮定した。数年前、本発明者は、ＩＮＳＴＩＬＡＤＲＩＮ（商標）ブランドのアデノウイルスベクター媒介インターフェロンアルファ２ｂのフェーズＩＩヒト臨床試験を開始した。この実験では、本発明者は、インターフェロンへの曝露に応答したＰＤ−Ｌ１、ＴＲＡＩＬ、ＩＲＦ１およびＬａｍｉｎ  Ａの発現を測定した。
【００６０】
材料および方法：ＲＴ１１２およびＳＷ７８０細胞を培地中で培養し、その後インターフェロンアルファポリペプチドを含有する培地に曝露した。インターフェロン量は、０（対照）〜１０４国際単位／ｍＬに及んだ。遺伝子発現を、市販されている抗体およびプライマーを使用して、ウェスタンブロットおよび定量的リアルタイムＰＣＲにより評価した。ＭＩＲＶＡＮＡ（商標）キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）で、培養物中の細胞からＲＮＡを単離した。ＴＡＱＭＡＮ（商標）Ａｒｒａｙ  Ｃａｒｄｓ（ＡおよびＢ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して、ＲＴ１１２においてｍＩＲをプロファイルした。Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｕｍａｎＨＴ＿１２＿ｖ４  ＢＥＡＤＣＨＩＰ（商標）アレイ（４７３２３個のプローブ）で、ＲＴ１１２およびＵＣ３において全ゲノムｍＲＮＡ発現プロファイリングを行った。
【００６１】
結果：結果を図１〜４に示す。インターフェロンへの曝露に応答して、両方の細胞株は、ＰＤ−Ｌ１、ＴＲＡＩＬおよびＩＲＦ１発現をアップレギュレートし、Ｌａｍｉｎ  Ａ発現に対しては測定可能な効果を有しなかった。ＰＤ−Ｌ１、ＴＲＡＩＬおよびＩＲＦ１発現について、異なる細胞株では、効果は異なる大きさであった。図１、２、３、４を参照のこと。
【００６２】
結論：がん細胞株のパネルでは、インターフェロン曝露は、ＰＤ−Ｌ１免疫チェックポイント発現の顕著な増大をもたらす。本発明者は、この発見が、現在までの本分野で、有効ながん療法としてインターフェロンを使用することができなかった理由を示唆するので、それは驚くべきことであると見出した。インターフェロンは理論的には有効な抗がん剤であるはずであるが、インターフェロンはまた、ＰＤ−Ｌ１発現をアップレギュレートし、したがってインターフェロンの療法効果を妨げ得る。
【００６３】
（実施例２）
ＩＦＮαは、用量依存的様式でＰＤ−Ｌ１発現を誘導する。
【００６４】
ここで、本発明者は、インターフェロンアルファでの処理後に免疫チェックポイントＰＤ−Ｌ１の発現、マイクロ−ＲＮＡ（ｍｉＲ）およびｍＲＮＡ発現プロファイルを測定した。
【００６５】
材料および方法：ＲＴ１１２、Ｔ２４、ＵＣ３およびＵＣ１４細胞を培地中で培養し、その後、対照培地または１０００ＩＵ／ｍｌのインターフェロンアルファポリペプチドを含有する培地のいずれかに６時間曝露した。ＰＤ−Ｌ１発現を、市販されている抗体およびプライマーを使用して、ウェスタンブロットおよび定量的リアルタイムＰＣＲにより評価した。ＭＩＲＶＡＮＡ（商標）キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）で、培養物中の細胞からＲＮＡを単離した。ＴＡＱＭＡＮ（商標）Ａｒｒａｙ  Ｃａｒｄｓ（ＡおよびＢ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して、ＲＴ１１２においてｍＩＲをプロファイルした。Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｕｍａｎＨＴ＿１２＿ｖ４  ＢＥＡＤＣＨＩＰ（商標）アレイ（４７３２３個のプローブ）で、ＲＴ１１２およびＵＣ３において全ゲノムｍＲＮＡ発現プロファイリングを行った。統計的信頼性を増大させるために、全ての実験を三重で行った。
【００６６】
結果：全ての細胞株は、ＩＦＮａへの曝露に応答してＰＤ−Ｌ１発現をアップレギュレートした。この効果は、ＵＣ３細胞（図６）よりも、ＲＴ１１２細胞（図５を参照のこと）で最も明白であった。対照的に、ＲＴ１１２：１２３３細胞（ｐ＝０．００３６）、１９ｂ−１＃（ｐ＝０．０１５７）および２２２＃（ｐ＝０．００６１）において、３つの可能性のあるｏｎｃｏｍＩＲ領域の発現は、ＩＦＮａへの曝露後に顕著にダウンレギュレートされた。ＩＦＮａ曝露後にログ（発現）（偽陽性率＜０．００１）で少なくとも２倍の差を有する差次的に発現した遺伝子を分析すると、ＲＴ１１２およびＵＣ３細胞株で、それぞれ、３０２個および１８１個の差次的に発現した遺伝子があった。両方の細胞株でトップランクのＩＦＮａ誘導遺伝子は、膀胱がんで以前に記載されていない数個を含み、ＩＦＩＴ２（転移の負のレギュレータ）およびＩＦＩ２７（ＴＲＡＩＬへの感受性と関連する）を含んだ。また、ＩＦＮａ誘導ＰＤ−Ｌ１発現は、リアルタイムＰＣＲデータに対応する倍変化で、ｍＲＮＡ遺伝子チップで実証可能であった。
【００６７】
結論：がん細胞株のパネルでは、ＩＦＮａ曝露は、ＰＤ−Ｌ１免疫チェックポイント発現の顕著な増大をもたらす。アレイベースのマイクロＲＮＡおよびｍＲＮＡプロファイリングは、膀胱がんにおけるＩＦＮａ応答の新しい可能性のあるメディエータを明らかにした。この膀胱ＩＦＮａプロファイルは、アデノウイルスＩＦＮａ遺伝子療法への応答を測定するための中間エンドポイントとして有用であり得る。ＩＦＮａ療法でのＰＤ−Ｌ１発現の将来予測は、免疫チェックポイント阻害剤を利用する合理的な組合せ処置をもたらし得る。
【００６８】
（実施例３）
マウスインターフェロンは、ＰＤ−Ｌ１発現を誘導する
材料および方法：ＢＢＮ９７２およびＭＢ４９＃１（ＭＢ４９−ｌｕｃ）細胞を培養し、その後、０（零）〜１×１０４国際単位のマウスインターフェロンを含有する培地に曝露した。続くＰＤ−Ｌ１および（対照としての）アクチンの発現を測定した。
【００６９】
結果：マウスインターフェロンは、いずれの細胞株でもアクチン発現に対して効果がなかった。図１１、１２を参照のこと。対照的に、マウスインターフェロンは、ＰＤ−Ｌ１発現に対して顕著な用量依存的効果を有した。図９、１０を参照のこと。
【００７０】
結論：これらのデータは、ＰＤ−Ｌ１発現に対するインターフェロンの効果が、ヒトインターフェロンアルファ２ａに限定されず、実際にはヒトインターフェロンに限定されないことを示す。むしろ、ＰＤ−Ｌ１発現に対するインターフェロンの効果は、概してインターフェロンに一般的であるように見える。
【００７１】
（実施例４）
ポリイノシン酸：ポリシチジル酸（ポリＩ：Ｃ）は、ＰＤ−Ｌ１を誘導する
材料および方法：上記データは、インターフェロンがＰＤ−Ｌ１発現を誘導し、用量依存的様式でそれを行い、迅速にそれを行い、かつ異なる種からのインターフェロンに応答して明らかにそれを行うことを示す。インターフェロンを採取した動物種にかかわらず、効果があるので、本発明者は、この効果はインターフェロンに限定されず、他の種類の免疫刺激剤により、より一般的に引き起こされ得ると仮定した。この概念を試験するために、本発明者は、ポリイノシン酸：ポリシチジル酸（多くの場合、「ポリＩ：Ｃ」と略される）を評価した。ポリＩ：Ｃは、免疫刺激剤である。それはウイルス感染をシミュレートするために、そのナトリウム塩形態で使用される。ポリＩ：Ｃは、構造的に二本鎖ＲＮＡに類似している。ｄｓＲＮＡは、一部のウイルスに存在する。本発明者は、ポリＩ：Ｃを、移植したｐｌｃまたはｕｌｃ腫瘍を有する研究用マウスに腹腔内注射により投与した。
【００７２】
結果。図１３は、対照マウス（ｎ＝３）が、血清インターフェロンａの僅少のベースライン測定を示したことを示す。対照的に、ポリＩ：Ｃの腹腔内注射は、血清インターフェロンａの時間依存的増加を生成する。図１４は、６時間でのポリＩ：Ｃの腫瘍内注射の結果を示す。データ（各組についてｎ＝１）は、腫瘍内インターフェロンａは、ｐｌｃ腫瘍で顕著に増加し、ｕｌｃ腫瘍でいくらか増加し、対照腫瘍では測定可能なほど増加しないことを示す。図１５は、また、ポリＩ：Ｃ（５００μｇ）が腫瘍内でＰＤ−Ｌ１発現を（２４時間で）誘導することを示す（マン・ホイットニー  ｐ＝０．０４９５）。
【００７３】
結論：これらのデータは、ＰＤ−Ｌ１発現が、インターフェロンによってのみではなく、ｄｓＲＮＡを模倣し、インターフェロン発現を誘導する化合物であるポリＩ：Ｃによっても誘導されることを示す。
【００７４】
（実施例５）
インターフェロンウイルス遺伝子療法は、ヒトにおいてＰＤ−Ｌ１を誘導する
材料および方法：これらのデータは、ＢＣＧ療法に非応答性であるか、またはＢＣＧ療法後に難治性である患者における、ヒトインターフェロンアルファ２ｂ導入遺伝子を有するＩＮＳＴＩＬＡＤＲＩＮ（商標）複製欠損アデノウイルス遺伝子療法ベクターについてのヒトフェーズＩＩヒト臨床試験から取られる。その研究計画は、公開されており、参照により本明細書に組み込む。
【００７５】
結果：図１６は、ヒトインターフェロンアルファ２Ｂ導入遺伝子を有するＩＮＳＴＩＬＡＤＲＩＮ（商標）組換え複製欠損アデノウイルス遺伝子療法ベクターで処置したヒトにおける８処置サイクルのＲＮＡ発現を示す。奇数（白色に色分けした）カラムは、処置前のＲＮＡ転写を測定し、偶数（水色に色分けした）カラムは、後を測定する。ＲＮＡ量は定量的に示され、薄緑色は最も少ないもの、桃色は最も多いものを示す。カラム１および２は、−２処置前から＋２後に増大するＰＤ−Ｌ１  ＲＮＡを示す。カラム３および４は同様に、−２処置前から＋３後に増大するＰＤ−Ｌ１  ＲＮＡを示す。全てにおいて、処置ペアの３分の１は、処置後にＰＤ−Ｌ１発現の顕著な増大を示す。また、処置は、他の免疫チェックポイントマーカーをアップレギュレートした。
【００７６】
結論：これらのデータは、患者の３分の１は、インターフェロン遺伝子療法での処置後にＴ細胞および免疫チェックポイントマーカー（ＰＤ−Ｌ１を含む）の誘導を示すことを示す。
【００７７】
（実施例６）
組合せ療法は、生存を増大させる
材料および方法：研究用雌ラットに腫瘍細胞を植え付け、細胞を測定可能な腫瘍に発達させた。その後、ラットを、生理食塩水（対照）、ＩｇＧ（対照として）、抗ＰＤ１モノクローナル抗体（単独療法）、ポリＩ：Ｃ（インターフェロン発現を誘導する単独療法）およびポリＩ：Ｃと抗ＰＤ１モノクローナル抗体との組合せ（組合せ療法）で処置した。
【００７８】
結果：図１７は、皮下Ｃ５７ＢＬ６／Ｊ腫瘍についての、時間に対するＭＢ４９腫瘍サイズを示す（１群当たりｎ＝５匹の雌マウス）。処置は、腫瘍移植後１０日目に開始する２００μｇ  ｑ３（（１日１回、３日間））デある。エラーバーは、ＳＥＭを表す。最も高い（黄色）線は、４０日目で最も大きな腫瘍体積を示しており、対照群である（全ての群はｎ＝５、雌のみ）。次に低い（青色）線は、ＩｇＧ対照である。次に低い（赤色）線は、ポリＩ：Ｃである。次に低い（緑色）線は、抗ＰＤ１モノクローナル抗体である。最も低い（黒色）線は、Ｘ軸それ自体の上にかかっており、組合せ療法である。
【００７９】
図１８は、腫瘍を植え付け、生理食塩水（最低部の線）、ＩｇＧ（次に高い線）、抗ＰＤ１モノクローナル抗体（次に高い線）、ポリＩ：Ｃ（次に高い線）およびポリＩ：Ｃと抗ＰＤ１モノクローナル抗体との組合せ（最も高い線）で処置した雌マウスのカプラン・マイヤー生存曲線を示す。これらのデータは、インターフェロン誘導剤（ポリＩ：Ｃ）とＰＤ１阻害剤（抗ＰＤ１モノクローナル抗体）とを組み合わせることは、顕著に生存を増大させることを示す。５０日目で、対照動物の約２０％が生存し、ポリＩ：Ｃ動物の５０％が生存し、組合せ処置動物の１００％が生存する。
【００８０】
図１９は、雄マウスにおける:経時的に正規化（平均値＋／−ＳＤ）放射を比較する。ログ・ランク検定を使用して、これらのデータは、組合せ療法がＩｇＧ対照よりも優れており（ｐ＝０．０６）、ポリＩ：Ｃ単独療法よりも優れており（ｐ＝０．３２）、かつ抗ＰＤ１モノクローナル抗体よりも優れている（ｐ＝０．１４）ことを示す。
【００８１】
図２０は、「生存部分」、すなわち、:経時的に生存する傾向の生存を示すデータを示す。
【００８２】
結論：これらのデータは、組合せ療法は、単なる相加的効果より多くのものを与え、相乗的に有効であることを示す。
【００８３】
（実施例７）
表在拡大型黒色腫
材料および方法：表在拡大型黒色腫と診断されたヒト患者を、広範囲局所切除術およびセンチネルリンパ節生検により処置して、リンパ系または遠位器官への疾患の広がりがないことを確認する。その後、患者をＩＮＳＴＩＬＡＤＲＩＮ（商標）とＫＥＹＴＲＵＤＡ（商標）との組合せで処置する。処置は、外科的切除後実施可能な限りすぐに開始する。
【００８４】
ＩＮＳＴＩＬＡＤＲＩＮ（商標）ブランドのアデノウイルスは、インターフェロンアルファ２ｂ導入遺伝子を有する複製欠損組換えアデノウイルス遺伝子療法ベクターである。かかる遺伝子療法ベクターの製造は、例えばMuralidhara Ramachandraら、Selectively  Replicating Viral Vector、米国特許証第７６９１３７０号で説明されている。インターフェロン導入遺伝子の単離は、例えばCharles Weissmann、DNA Sequences, Recombinant  DNA Molecules and Processes for Producing Human Interferon-Like Polypeptides、米国特許証第６８３５５５７号で説明されている。
【００８５】
ＫＥＹＴＲＵＤＡ（商標）ブランドのペンブロリズマブは、ヒト化モノクローナル抗プログラム細胞死−１（ＰＤ−１）抗体（Ｆｃ領域に安定化配列改変を有するＩｇＧ４／カッパアイソタイプ）である。
【００８６】
ＩＮＳＴＩＬＡＤＲＩＮ（商標）は、単回用量バイアルで提供される。ＩＮＳＴＩＬＡＤＲＩＮ（商標）の１用量を、注射用滅菌生理食塩水中に再構成し、切除部位に局所的に皮下投与する。投与は、４週毎に１回繰り返す。１バイアルのＫＥＹＴＲＵＤＡ（商標）粉末は、５０ｍｇのペンブロリズマブを含有する。ＫＥＹＴＲＵＤＡ（商標）を、３０分間にわたる静脈内点滴として投与し、３週毎に繰り返し、疾患進行または許容できない毒性があるまで患者を処置する。非定型応答（すなわち、最初の数ヶ月以内の腫瘍サイズの最初の一過的な増大または新しい小病変、続く腫瘍縮小）が観察され得る。疾患進行の初期の証拠を有する臨床的に安定な患者については、疾患進行が確認されるまで処置を続けることが好ましい。
【００８７】
試験対象を登録し、その後処置群：切除後ＫＥＹＴＲＵＤＡ（商標）のみ、切除後ＩＮＳＴＩＬＡＤＲＩＮ（商標）のみ、切除後ＫＥＹＴＲＵＤＡ（商標）およびＩＮＳＴＩＬＡＤＲＩＮ（商標）を同時、切除後ＩＮＳＴＩＬＡＤＲＩＮ（商標）およびＮＳＡＩＤ（ＣＯＸ−２阻害剤）、ならびに切除後ＫＥＹＴＲＵＤＡ（商標）およびＩＮＳＴＩＬＡＤＲＩＮ（商標）およびＮＳＡＩＤを同時：に割り当てる。
【００８８】
結果：主要有効性評価項目は、進行を伴わない生存（例えばＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｒｅｖｉｅｗ  ｕｓｉｎｇ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｉｎ  Ｓｏｌｉｄ  Ｔｕｍｏｕｒｓ（［ＲＥＣＩＳＴ（固形がんの処置効果判定基準）］を使用した放射線学および腫瘍学総合査定概要）により査定される）、全体的な生存、およびセンチネルリンパ節生検である。他の有効性評価項目は、全体的な応答速度および応答持続期間であり得る。続くセンチネルリンパ節生検は、疾患の広がりがないことを示すことが予測される。
【００８９】
本発明者は、ＣＯＸ−２阻害剤を伴うＩＮＳＴＩＬＡＤＲＩＮ（商標）の投与は、ＩＮＳＴＩＬＡＤＲＩＮ（商標）のみに優る有効性を示すと予測する。本発明者は、ＫＥＹＴＲＵＤＡ（商標）およびＩＮＳＴＩＬＡＤＲＩＮ（商標）の同時投与は、いずれかの剤単独の投与と比較して優れた有効性評価項目を示すと予測し、この利点は単なる相加的なものより大きいと予測する。本発明者は、ＫＥＹＴＲＵＤＡ（商標）およびＩＮＳＴＩＬＡＤＲＩＮ（商標）およびＮＳＡＩＤの同時投与は、ＫＥＹＴＲＵＤＡ（商標）単独またはＩＮＳＴＩＬＡＤＲＩＮ（商標）およびＮＳＡＩＤ単独の投与と比較して優れた有効性評価項目を示すと予測し、この利点は単なる相加的なものより大きいと予測する。
【００９０】
（実施例８）
表在拡大型黒色腫
材料および方法：上記の実施例のＫＥＹＴＲＵＤＡ（商標）。
【００９１】
インターフェロン源として、ＳＹＬＡＴＲＯＮ（商標）ペグ化インターフェロンアルファ２ｂを、６μｇ／ｋｇで毎週１回８用量（誘導）、続いて３μｇ／ｋｇで毎週１回最大５年間（維持）皮下投与する。有害反応のために処置の１〜８週（誘導）中にＳＹＬＡＴＲＯＮ（商標）投与量調節が必要な場合、元の投与量（毎週１回６μｇ／ｋｇ）からの３ステップ減少が好ましい（すなわち、投与量を毎週１回３μｇ／ｋｇに減少し；必要に応じて、毎週１回２μｇ／ｋｇに減少し；その後必要に応じて、さらに毎週１回１μｇ／ｋｇに減少する）。有害反応のために処置の９〜２６０週（維持）中に投与量調節が必要な場合、元の投与量（毎週１回３μｇ／ｋｇ）からの２ステップ減少が推奨される（すなわち、投与量を毎週１回２μｇ／ｋｇに減少し；必要に応じて、毎週１回１μｇ／ｋｇに減少する）。
【００９２】
試験対象を登録し、その後処置群：切除後ＫＥＹＴＲＵＤＡ（商標）のみ、切除後ＳＹＬＡＴＲＯＮ（商標）のみ、切除後ＫＥＹＴＲＵＤＡ（商標）およびＳＹＬＡＴＲＯＮ（商標）を同時的、切除後ＳＹＬＡＴＲＯＮ（商標）およびＮＳＡＩＤ（ＣＯＸ−２阻害剤）、ならびに切除後ＫＥＹＴＲＵＤＡ（商標）およびＳＹＬＡＴＲＯＮ（商標）およびＮＳＡＩＤを同時的：に割り当てる。
【００９３】
結果：主要有効性評価項目は、進行を伴わない生存（例えばＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｒｅｖｉｅｗ  ｕｓｉｎｇ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｉｎ  Ｓｏｌｉｄ  Ｔｕｍｏｕｒｓ（［ＲＥＣＩＳＴ（固形がんの処置効果判定基準）］を使用した放射線学および腫瘍学総合査定概要）により査定される）、全体的な生存、およびセンチネルリンパ節生検である。他の有効性評価項目は、全体的な応答速度および応答持続期間であり得る。続くセンチネルリンパ節生検は、疾患の広がりがないことを示すことが予測される。
【００９４】
本発明者は、ＣＯＸ−２阻害剤を伴うＳＹＬＡＴＲＯＮ（商標）の投与は、ＳＹＬＡＴＲＯＮ（商標）のみに優る有効性を示すと予測する。本発明者は、ＫＥＹＴＲＵＤＡ（商標）およびＳＹＬＡＴＲＯＮ（商標）の同時投与は、いずれかの剤単独の投与と比較して優れた有効性評価項目を示すと予測し、この利点は単なる相加的なものより大きいと予測する。本発明者は、ＫＥＹＴＲＵＤＡ（商標）およびＳＹＬＡＴＲＯＮ（商標）およびＮＳＡＩＤの同時投与は、ＫＥＹＴＲＵＤＡ（商標）単独またはＳＹＬＡＴＲＯＮ（商標）およびＮＳＡＩＤ単独の投与と比較して優れた有効性評価項目を示すと予測し、この利点は単なる相加的なものより大きいと予測する。
【００９５】
（実施例９）
非小細胞肺がん
材料および方法：上記実施例７による医薬剤。ヒト試験対象は、非小細胞肺癌腫を有すると診断されている。患者をGreene, Frederick L.、Cancer Staging Manual（American Joint Committee on Cancer、出版、第６版）に従ってスクリーニングして、同等の試験対象が同等の疾患を有することを保証する。試験対象を、検証された試験により確認される発現である腫瘍ＰＤ−Ｌ１発現に基づいて、処置についてスクリーニングする。
【００９６】
ＫＥＹＴＲＵＤＡの推奨される用量は、以前に化学療法で処置されていないＮＳＣＬＣについて２００ｍｇ、および以前に化学療法で処置されたＮＳＣＬＣまたは黒色腫について２ｍｇ／ｋｇである。
【００９７】
ＩＮＳＴＩＬＡＤＲＩＮ（商標）を、胸膜内注入により投与する。この方法は、図２で米国特許公開公報２０１４／１７２０２号にて示される。
【００９８】
試験対象を登録し、その後処置群：ＫＥＹＴＲＵＤＡ（商標）のみ、ＩＮＳＴＩＬＡＤＲＩＮ（商標）のみ、ＫＥＹＴＲＵＤＡ（商標）およびＩＮＳＴＩＬＡＤＲＩＮ（商標）を同時的、ＩＮＳＴＩＬＡＤＲＩＮ（商標）およびＮＳＡＩＤ（ＣＯＸ−２阻害剤）、ならびにＫＥＹＴＲＵＤＡ（商標）およびＩＮＳＴＩＬＡＤＲＩＮ（商標）およびＮＳＡＩＤを同時的：に割り当てる。
【００９９】
結果：主要有効性評価項目は、進行を伴わない生存、全体的な生存、およびセンチネルリンパ節生検である。他の有効性評価項目は、全体的な応答速度および応答持続期間であり得る。続くセンチネルリンパ節生検は、疾患の広がりがないことを示すことが予測される。
【０１００】
本発明者は、ＣＯＸ−２阻害剤を伴うＩＮＳＴＩＬＡＤＲＩＮ（商標）の投与は、ＩＮＳＴＩＬＡＤＲＩＮ（商標）のみに優る有効性を示すと予測する。本発明者は、ＫＥＹＴＲＵＤＡ（商標）およびＩＮＳＴＩＬＡＤＲＩＮ（商標）の同時投与は、いずれかの剤単独の投与と比較して優れた有効性評価項目を示すと予測し、この利点は単なる相加的なものより大きいと予測する。本発明者は、ＫＥＹＴＲＵＤＡ（商標）およびＩＮＳＴＩＬＡＤＲＩＮ（商標）およびＮＳＡＩＤの同時投与は、ＫＥＹＴＲＵＤＡ（商標）単独またはＩＮＳＴＩＬＡＤＲＩＮ（商標）およびＮＳＡＩＤ単独の投与と比較して優れた有効性評価項目を示すと予測し、この利点は単なる相加的なものより大きいと予測する。
【０１０１】
要約
上記実施例は、ある特定のがんの処置を論じている。しかしながら、本発明者らの発見はより一般的に、インターフェロンシグナル伝達から利益を得、かつＣＤ２７９の過剰発現を患う任意の状態を処置するために使用することができる。
【０１０２】
添付した特許請求の範囲では、完全な治癒を必要とせず、緩和を必要とする「処置する」という用語を使用する。例えば、がんを「処置すること」は、がんを完全に消失させることによって、また例えば、かかる処置を有しない患者と比較して、腫瘍増殖を遅延させること、死亡のリスクを低減することまたは疾患進行を遅延させることによって達成され得る。
【０１０３】
本明細書中の本発明者らの開示から、当業者は、特定の適用またはその変形を容易に理解し得る。例えば、上記論述は、特定の種類のヒトインターフェロンについて言及しているが、同様に機能する他の種類およびインターフェロン誘導体またはアナログは、同じ利益を提供する。したがって、本発明者は、本発明者らの特許の法律上の範囲が、本発明者が論じている実施例ではなく、添付した法律上の特許請求の範囲およびその許容される均等物によって決定されることを意図する。
【０１０４】
添付した法律上の特許請求の範囲が、およそ「同時」に処置することを言及する場合（例えば元の請求項３を参照のこと）、これは、２つの化合物が同時に患者において働くことを必要とする。それは、同時期の投与を必要としない。したがって、第２の剤の効果が少なくとも１週間持続する場合、第１の剤を、第２の剤の投与１週間後に投与してもよい。
（項目１）
インターフェロンでヒト患者を処置する方法であって、
ａ．ヒト患者において、インターフェロンで処置され得る状態を診断するステップと、その後、
ｂ．第１の剤を投与するステップであって、前記第１の剤が、ヒト免疫系チェックポイントの機能に影響するのに十分な量で前記ヒト患者のインターフェロンレベルを増大させることができ、これにより前記チェックポイントが免疫機能を減少させる、ステップと、
ｃ．前記ヒトに、同じヒト免疫系チェックポイントの機能に影響する第２の剤を投与するステップであって、前記第２の剤が、前記第１の剤が前記チェックポイントに対して有する免疫機能の減少を実質的に改善するのに有効な量で投与される、ステップと
を含み、これにより第２の化合物が、前記第１の剤により引き起こされる前記免疫機能の減少を実質的に改善する、方法。
（項目２）
本質的に項目１に記載の方法からなる方法。
（項目３）
前記患者が、前記第１の剤および前記第２の剤でほぼ同時に処置される、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記第１の剤が、外因的に生成されたインターフェロンポリペプチドを含む、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記第１の剤が、前記患者がインターフェロンを内因的に発現することを誘導する剤を含む、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記第１の剤が、発現可能なインターフェロン導入遺伝子を有するベクターである、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記第１の剤が、微生物抗原、ウイルス抗原および微生物またはウイルス抗原アナログからなる群から選択される、項目５に記載の方法。
（項目８）
前記第１の剤が、ポリＩ：Ｃを含むウイルス抗原アナログを含む、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記第１の剤が、細菌抗原を含む、項目７に記載の方法。
（項目１０）
前記第１の剤が、ウイルス抗原を含む、項目７に記載の方法。
（項目１１）
前記第１の剤が、抗原性ウイルスを含む、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記ヒト患者のインターフェロンレベルが、阻害性ヒト免疫系チェックポイントの機能を増大させるのに十分な量で増大される、項目１に記載の方法。
（項目１３）
前記阻害性チェックポイントが、プログラム細胞死タンパク質１および細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４からなる群から選択される、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記阻害性チェックポイントが、プログラム細胞死タンパク質１を含み、前記第２の剤が、プログラム細胞死タンパク質１またはプログラム細胞死タンパク質１リガンドに結合する、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記状態が、がんを含む、項目１に記載の方法。
（項目１６）
ヒト免疫系チェックポイントの機能に影響し、これにより前記チェックポイントがヒト免疫機能を抑制しない剤であって、ヒト患者に対するインターフェロンの免疫抑制効果を消失させることにおける使用のためであり、インターフェロンの前記免疫抑制効果を低減させるのに有効な量で提供される、剤。
（項目１７）
ヒト療法剤としてのインターフェロンの有効性を改善するための方法であって、
ａ．ヒト患者において、インターフェロンで処置され得る状態を診断するステップと、その後、
ｂ．前記ヒトに、阻害性ヒト免疫系チェックポイントを阻害する第２の剤を投与するステップであって、前記剤が、免疫活性を減少させることに対する前記チェックポイントの活性を低減させるのに十分な量で投与される、ステップと、
ｃ．前記ヒトに、前記状態を処置するのに有効な量で前記ヒト患者のインターフェロンレベルを増大させる第１の剤を投与するステップと
を含む、方法。
（項目１８）
本質的に、
ａ．ヒトに、阻害性ヒト免疫系チェックポイントを阻害する第２の剤を投与するステップと、
ｂ．前記ヒトに、前記ヒト患者のインターフェロンレベルを増大させる第１の剤を投与するステップと
からなる方法。
（項目１９）
前記第２の剤が、前記チェックポイントの活性を低減させるのに十分な量で投与される、項目１８に記載の方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【外国語明細書】
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