(57)【要約】      （修正有）【課題】対象に、その異種の疾患関連抗原に特異的な増加したＴ細胞免疫応答、及び抗体媒介性免疫応答を誘導する免疫原性組成物の提供。【解決手段】フラジェリンをコードする核酸配列と、異種の疾患関連抗原をコードする核酸配列とを含む組み換え改変ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）を含む免疫原性組成物であって、対象に投与すると、異種の疾患関連抗原をコードする核酸配列を含むが、フラジェリンをコードする核酸配列を含まない組み換えＭＶＡの投与によって誘導される、前記異種の疾患関連抗原に特異的なＴ細胞免疫応答及び／又はＢ細胞免疫応答に比べて、前記異種の疾患関連抗原に特異的な増加したＴ細胞免疫応答及び／又はＢ細胞免疫応答を誘導する前記免疫原性組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
フラジェリンをコードする核酸配列と、異種の疾患関連抗原をコードする核酸配列とを含む組み換え改変ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）を含む免疫原性組成物であって、対象に投与すると、異種の疾患関連抗原をコードする核酸配列を含むが、フラジェリンをコードする核酸配列を含まない組み換えＭＶＡの投与によって誘導される、前記異種の疾患関連抗原に特異的なＴ細胞免疫応答及び／またはＢ細胞免疫応答に比べて、前記異種の疾患関連抗原に特異的な増加したＴ細胞免疫応答及び／またはＢ細胞免疫応答を誘導する前記免疫原性組成物。
【請求項２】
前記増加したＴ細胞免疫応答は、前記異種の疾患関連抗原に特異的な細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の数が増えることを含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項３】
前記異種の疾患関連抗原に特異的なＣＴＬの数が増えることにより、異種の疾患関連抗原をコードする核酸配列を含むが、フラジェリンをコードする核酸配列を含まない組み換えＭＶＡの投与によって誘導されるＣＴＬと比べて、増加した細胞溶解活性も示す、請求項２に記載の免疫原性組成物。
【請求項４】
前記増加したＴ細胞免疫応答は、前記異種の疾患関連抗原に特異的なメモリーＴ細胞の数が増えることを含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項５】
前記増加したＴ細胞免疫応答は、前記異種の疾患関連抗原に特異的なＣＴＬの数が増えることと、前記異種の疾患関連抗原に特異的なメモリーＴ細胞の数が増えることとを含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項６】
前記異種の疾患関連抗原に特異的なＣＴＬの数が増えることにより、異種の疾患関連抗原をコードする核酸配列を含むが、フラジェリンをコードする核酸配列を含まない組み換えＭＶＡの投与によって誘導されるＣＴＬと比べて、増加した細胞溶解活性も示す、請求項５に記載の免疫原性組成物。
【請求項７】
前記核酸配列が、配列番号１に対するアミノ酸配列同一性が少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のフラジェリンをコードする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項８】
前記核酸配列が、配列番号１のアミノ酸配列を有するフラジェリンをコードする、請求項７に記載の免疫原性組成物。
【請求項９】
製薬学的に許容可能な担体を更に含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１０】
前記疾患関連抗原が、感染性疾患抗原または腫瘍関連抗原である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１】
前記疾患関連抗原が、感染性疾患抗原である、請求項１０に記載の免疫原性組成物。
【請求項１２】
前記感染性疾患抗原が、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原または寄生虫抗原である、請求項１１に記載の免疫原性組成物。
【請求項１３】
前記感染性疾患抗原が、ウイルス抗原である、請求項１２に記載の免疫原性組成物。
【請求項１４】
前記ウイルス抗原が、アデノウイルス、アルボウイルス、アストロウイルス、コロナウイルス、コクサッキーウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、サイトメガロウイルス（「ＣＭＶ」）、デングウイルス、エボラウイルス、エプスタイン・バーウイルス（「ＥＢＶ」）、口蹄疫ウイルス、グアナリトウイルス、ヘンドラウイルス、単純ヘルペスウイルス１型（「ＨＳＶ−１」）、単純ヘルペスウイルス２型（「ＨＳＶ−２」）、ヒトヘルペスウイルス６型（「ＨＨＶ−６」）、ヒトヘルペスウイルス８型（「ＨＨＶ−８」）、Ａ型肝炎ウイルス（「ＨＡＶ」）、Ｂ型肝炎ウイルス（「ＨＢＶ」）、Ｃ型肝炎ウイルス（「ＨＣＶ」）、Ｄ型肝炎ウイルス（「ＨＤＶ」）、Ｅ型肝炎ウイルス（「ＨＥＶ」）、ヒト免疫不全ウイルス（「ＨＩＶ」）、インフルエンザウイルス、日本脳炎ウイルス、フニンウイルス、ラッサウイルス、マチュポウイルス、マールブルグウイルス、麻疹ウイルス、ヒトメタニューモウイルス、伝染性軟属腫ウイルス、ムンプスウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ニパウイルス、ノロウイルス、ノーウォークウイルス、ヒトパピローマウイルス（「ＨＰＶ」）、パラインフルエンザウイルス、パルボウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（「ＲＳＶ」）、ライノウイルス、ロタウイルス、風疹ウイルス、サビアウイルス、重症急性呼吸器症候群ウイルス（「ＳＡＲＳ」）、水痘帯状疱疹ウイルス、痘瘡ウイルス、ウエストナイルウイルス及び黄熱病ウイルスからなる群から選択されるウイルス由来である、請求項１３に記載の免疫原性組成物。
【請求項１５】
前記感染性疾患抗原が、細菌抗原である、請求項１２に記載の免疫原性組成物。
【請求項１６】
前記細菌抗原が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｃａｎｉｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｓｕｉｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｍａｌｌｅｉ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｔｈｅｒｉａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、ｅｎｔｅｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）１５７：Ｈ７、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ及びＹｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓからなる群から選択される細菌に由来する、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項１７】
前記感染性疾患抗原が、真菌抗原である、請求項１２に記載の免疫原性組成物。
【請求項１８】
前記真菌抗原が、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｃｌａｖａｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｄｕｂｌｉｎｉｅｎｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｌｂｉｄｕｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｔｔｉｉ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｕｒｅｎｔｉｉ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ  ｃａｎｉｓ、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｊｉｒｏｖｅｃｉｉ、Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ  ｓｃｈｅｎｃｋｉｉ、Ｓｔａｃｈｂｏｔｒｙｓ  ｃｈａｒｔａｒｕｍ、Ｔｉｎｅａ  ｂａｒｂａｅ、Ｔｉｎｅａ  ｃａｐｔｉｔｉｓ、Ｔｉｎｅａ  ｃｏｒｐｏｒｉｓ、Ｔｉｎｅａ  ｃｒｕｒｉｓ、Ｔｉｎｅａ  ｆａｃｉｅｉ、Ｔｉｎｅａ  ｉｎｃｏｇｎｉｔｏ、Ｔｉｎｅａ  ｎｉｇｒａ、Ｔｉｎｅａ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｒｕｂｒｕｍ及びＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｔｏｎｓｕｒａｎｓからなる群から選択される真菌に由来する、請求項１７に記載の免疫原性組成物。
【請求項１９】
前記感染性疾患抗原が、寄生虫抗原である、請求項１２に記載の免疫原性組成物。
【請求項２０】
前記寄生虫抗原が、Ａｎｉｓａｋｉｓ  ｓｐｐ．、Ｂａｂｅｓｉａ  ｓｐｐ．、Ｂａｙｌｉｓａｓｃａｒｉｓ  ｐｒｏｃｙｏｎｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｐ．、Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒａ  ｃａｙｅｔａｎｅｎｓｉｓ、Ｄｉｐｈｙｌｌｏｂｏｔｈｒｉｕｍ  ｓｐｐ．、Ｄｒａｃｕｎｃｕｌｕｓ  ｍｅｄｉｎｅｎｓｉｓ、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ、Ｇｉａｒｄｉａ  ｄｕｏｄｅｎａｌｉｓ、Ｇｉａｒｄｉａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、Ｇｉａｒｄｉａ  ｌａｍｂｌｉａ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｓｐ．、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｍａｎｓｏｎｉ、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｈａｅｍａｔｏｂｉｕｍ、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ、Ｔａｅｎｉａ  ｓｐｐ．、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ、Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ  ｓｐｉｒａｌｉｓ及びＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉからなる群から選択される寄生虫由来である、請求項１９に記載の免疫原性組成物。
【請求項２１】
前記疾患関連抗原が、腫瘍関連抗原である、請求項１０に記載の免疫原性組成物。
【請求項２２】
前記腫瘍関連抗原が、５−α−レダクターゼ、α−フェトプロテイン（「ＡＦＰ」）、ＡＭ−１、ＡＰＣ、Ａｐｒｉｌ、Ｂメラノーマ抗原遺伝子（「ＢＡＧＥ」）、β−カテニン、Ｂｃｌ１２、ｂｃｒ−ａｂｌ、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、ＣＡ−１２５、カスパーゼ−８（「ＣＡＳＰ−８」、「ＦＬＩＣＥ」としても知られている）、カテプシン、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１／補体レセプター２（「ＣＲ２」）、ＣＤ２２／ＢＬ−ＣＡＭ、ＣＤ２３／ＦｃεＲＩＩ、ＣＤ３３、ＣＤ３５／補体レセプター１（「ＣＲ１」）、ＣＤ４４／ＰＧＰ−１、ＣＤ４５／白血球共通抗原（「ＬＣＡ」）、ＣＤ４６／膜補因子タンパク質（「ＭＣＰ」）、ＣＤ５２／ＣＡＭＰＡＴＨ−１、ＣＤ５５／崩壊促進因子（「ＤＡＦ」）、ＣＤ５９／プロテクチン、ＣＤＣ２７、ＣＤＫ４、癌胎児性抗原（「ＣＥＡ」）、ｃ−ｍｙｃ、シクロオキシゲナーゼ−２（「ｃｏｘ−２」）、大腸がん欠失遺伝子（「ＤＣＣ」）、ＤｃＲ３、Ｅ６／Ｅ７、ＣＧＦＲ、ＥＭＢＰ、Ｄｎａ７８、ファルネシルトランスフェラーゼ、線維芽細胞増殖因子−８ａ（「ＦＧＦ８ａ」）、線維芽細胞増殖因子−８ｂ（「ＦＧＦ８ｂ」）、ＦＬＫ−１／ＫＤＲ、葉酸レセプター、Ｇ２５０、Ｇメラノーマ抗原遺伝子ファミリー（「ＧＡＧＥ−ファミリー」）、ガストリン１７、ガストリン放出ホルモン、ガングリオシド２（「ＧＤ２」）／ガングリオシド３（「ＧＤ３」）／ガングリオシド−モノシアル酸−２（「ＧＭ２」）、ゴナドトロピン放出ホルモン（「ＧｎＲＨ」）、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ：Ｒ１Ｍａｎ（α１−６）Ｒ２［ＧｌｃＮＡｃ−Ｍａｎ（α１−６）］β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ（「ＧｎＴ  Ｖ」）、ＧＰ１、ｇｐ１００／Ｐｍｅ１１７、ｇｐ−１００−ｉｎ４、ｇｐ１５、ｇｐ７５／チロシン関連タンパク質−１（「ｇｐ７５／ＴＲＰ−１」）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（「ｈＣＧ」）、ヘパラナーゼ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ヒト乳癌ウイルス（「ＨＭＴＶ」）、７０キロダルトン熱ショックタンパク質（「ＨＳＰ７０」）、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（「ｈＴＥＲＴ」）、インスリン様増殖因子レセプター−１（「ＩＧＦＲ−１」）、インターロイキン−１３レセプター（「ＩＬ−１３Ｒ」）、誘導型一酸化窒素合成酵素（「ｉＮＯＳ」）、Ｋｉ６７、ＫＩＡＡ０２０５、Ｋ−ｒａｓ、Ｈ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ、ＫＳＡ、ＬＫＬＲ−ＦＵＴ、メラノーマ抗原コード遺伝子１（「ＭＡＧＥ−１」）、メラノーマ抗原コード遺伝子２（「ＭＡＧＥ−２」）、メラノーマ抗原コード遺伝子３（「ＭＡＧＥ−３」）、メラノーマ抗原コード遺伝子４（「ＭＡＧＥ−４」）、マンマグロビン、ＭＡＰ１７、Ｍｅｌａｎ−Ａ／Ｔ細胞認識メラノーマ抗原−１（「ＭＡＲＴ−１」）、メソセリン、ＭＩＣ  Ａ／Ｂ、ＭＴ−ＭＭＰ、ムチン、精巣特異的抗原ＮＹ−ＥＳＯ−１、オステオネクチン、ｐ１５、Ｐ１７０／ＭＤＲ１、ｐ５３、ｐ９７／メラノトランスフェリン、ＰＡＩ−１、血小板由来増殖因子（「ＰＤＧＦ」）、μＰＡ、ＰＲＡＭＥ、プロバシン、プロゲニポエチン、前立腺特異的抗原（「ＰＳＡ」）、前立腺特異的膜抗原（「ＰＳＭＡ」）、前立腺酸性ホスファターゼ（「ＰＡＰ」）、ＲＡＧＥ−１、Ｒｂ、ＲＣＡＳ１、ＳＡＲＴ���１、ＳＳＸファミリー、ＳＴＡＴ３、ＳＴｎ、ＴＡＧ−７２、形質転換増殖因子α（「ＴＧＦ−α」）、形質転換増殖因子β（「ＴＧＦ−β」）、チモシンβ１５、腫瘍壊死因子α（「ＴＮＦ−α」）、ＴＰ１、ＴＲＰ−２、チロシナーゼ、血管内皮増殖因子（「ＶＥＧＦ」）、ＺＡＧ、ｐ１６ＩＮＫ４及びグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（「ＧＳＴ」）からなる群から選択される、請求項２１に記載の免疫原性組成物。
【請求項２３】
疾患関連抗原に対する抗原特異的免疫応答の誘導方法であって、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の免疫原性組成物を、それが必要な対象に投与することを含み、前記免疫原性組成物が、対象に投与されると、前記異種の疾患関連抗原に特異的な増加したＴ細胞免疫応答及び／またはＢ細胞免疫応答を誘導する前記方法。
【請求項２４】
前記増加したＴ細胞免疫応答の増加は、前記異種の疾患関連抗原に特異的な細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の数が増えることが含まれる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記異種の疾患関連抗原に特異的なＣＴＬの数が増えることにより、異種の疾患関連抗原をコードする核酸配列を含むが、フラジェリンをコードする核酸配列を含まない組み換えＭＶＡの投与によって誘導されるＣＴＬと比べて、増加した細胞溶解活性も示す、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記増加したＴ細胞免疫応答は、前記異種の疾患関連抗原に特異的なメモリーＴ細胞の数が増えることが含まれる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記増加したＴ細胞免疫応答は、前記異種の疾患関連抗原に特異的なＣＴＬの数が増えることと、前記異種の疾患関連抗原に特異的なメモリーＴ細胞の数が増えることとが含まれる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
前記異種の疾患関連抗原に特異的なＣＴＬの数が増えることにより、異種の疾患関連抗原をコードする核酸配列を含むが、フラジェリンをコードする核酸配列を含まない組み換えＭＶＡの投与によって誘導されるＣＴＬと比べて、増加した細胞溶解活性を示す、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記核酸配列が、配列番号１に対するアミノ酸配列同一性が少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％であるフラジェリンをコードする、請求項２３〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記核酸配列が、配列番号１のアミノ酸配列を有するフラジェリンをコードする、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記免疫原性組成物が、製薬学的に許容可能な担体を更に含む、請求項２３〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記疾患関連抗原が、感染性疾患抗原または腫瘍関連抗原である、請求項２３〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記疾患関連抗原が、感染性疾患抗原である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記感染性疾患抗原が、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原または寄生虫抗原である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記感染性疾患抗原が、ウイルス抗原である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記ウイルス抗原が、アデノウイルス、アルボウイルス、アストロウイルス、コロナウイルス、コクサッキーウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、サイトメガロウイルス（「ＣＭＶ」）、デングウイルス、エボラウイルス、エプスタイン・バーウイルス（「ＥＢＶ」）、口蹄疫ウイルス、グアナリトウイルス、ヘンドラウイルス、単純ヘルペスウイルス１型（「ＨＳＶ−１」）、単純ヘルペスウイルス２型（「ＨＳＶ−２」）、ヒトヘルペスウイルス６型（「ＨＨＶ−６」）、ヒトヘルペスウイルス８型（「ＨＨＶ−８」）、Ａ型肝炎ウイルス（「ＨＡＶ」）、Ｂ型肝炎ウイルス（「ＨＢＶ」）、Ｃ型肝炎ウイルス（「ＨＣＶ」）、Ｄ型肝炎ウイルス（「ＨＤＶ」）、Ｅ型肝炎ウイルス（「ＨＥＶ」）、ヒト免疫不全ウイルス（「ＨＩＶ」）、インフルエンザウイルス、日本脳炎ウイルス、フニンウイルス、ラッサウイルス、マチュポウイルス、マールブルグウイルス、麻疹ウイルス、ヒトメタニューモウイルス、伝染性軟属腫ウイルス、ムンプスウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ニパウイルス、ノロウイルス、ノーウォークウイルス、ヒトパピローマウイルス（「ＨＰＶ」）、パラインフルエンザウイルス、パルボウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（「ＲＳＶ」）、ライノウイルス、ロタウイルス、風疹ウイルス、サビアウイルス、重症急性呼吸器症候群ウイルス（「ＳＡＲＳ」）、水痘帯状疱疹ウイルス、痘瘡ウイルス、ウエストナイルウイルス及び黄熱病ウイルスからなる群から選択されるウイルスに由来する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記感染性疾患抗原が、細菌抗原である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
前記細菌抗原が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｃａｎｉｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｓｕｉｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｍａｌｌｅｉ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｔｈｅｒｉａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、ｅｎｔｅｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）１５７：Ｈ７、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ及びＹｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓからなる群から選択される細菌に由来する、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記感染性疾患抗原が、真菌抗原である、請求項３４に記載の方法。
【請求項４０】
前記真菌抗原が、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｃｌａｖａｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｄｕｂｌｉｎｉｅｎｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｌｂｉｄｕｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｔｔｉｉ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｕｒｅｎｔｉｉ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ  ｃａｎｉｓ、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｊｉｒｏｖｅｃｉｉ、Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ  ｓｃｈｅｎｃｋｉｉ、Ｓｔａｃｈｂｏｔｒｙｓ  ｃｈａｒｔａｒｕｍ、Ｔｉｎｅａ  ｂａｒｂａｅ、Ｔｉｎｅａ  ｃａｐｔｉｔｉｓ、Ｔｉｎｅａ  ｃｏｒｐｏｒｉｓ、Ｔｉｎｅａ  ｃｒｕｒｉｓ、Ｔｉｎｅａ  ｆａｃｉｅｉ、Ｔｉｎｅａ  ｉｎｃｏｇｎｉｔｏ、Ｔｉｎｅａ  ｎｉｇｒａ、Ｔｉｎｅａ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｒｕｂｒｕｍ及びＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｔｏｎｓｕｒａｎｓからなる群から選択される真菌に由来する、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記感染性疾患抗原が、寄生虫抗原である、請求項３４に記載の方法。
【請求項４２】
前記寄生虫抗原が、Ａｎｉｓａｋｉｓ  ｓｐｐ．、Ｂａｂｅｓｉａ  ｓｐｐ．、Ｂａｙｌｉｓａｓｃａｒｉｓ  ｐｒｏｃｙｏｎｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｐ．、Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒａ  ｃａｙｅｔａｎｅｎｓｉｓ、Ｄｉｐｈｙｌｌｏｂｏｔｈｒｉｕｍ  ｓｐｐ．、Ｄｒａｃｕｎｃｕｌｕｓ  ｍｅｄｉｎｅｎｓｉｓ、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ、Ｇｉａｒｄｉａ  ｄｕｏｄｅｎａｌｉｓ、Ｇｉａｒｄｉａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、Ｇｉａｒｄｉａ  ｌａｍｂｌｉａ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｓｐ．、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｍａｎｓｏｎｉ、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｈａｅｍａｔｏｂｉｕｍ、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ、Ｔａｅｎｉａ  ｓｐｐ．、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ、Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ  ｓｐｉｒａｌｉｓ及びＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉからなる群から選択される寄生虫に由来する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記疾患関連抗原が、腫瘍関連抗原である、請求項３２に記載の方法。
【請求項４４】
前記腫瘍関連抗原が、５−α−レダクターゼ、α−フェトプロテイン（「ＡＦＰ」）、ＡＭ−１、ＡＰＣ、Ａｐｒｉｌ、Ｂメラノーマ抗原遺伝子（「ＢＡＧＥ」）、β−カテニン、Ｂｃｌ１２、ｂｃｒ−ａｂｌ、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、ＣＡ−１２５、カスパーゼ−８（「ＣＡＳＰ−８」、「ＦＬＩＣＥ」としても知られている）、カテプシン、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１／補体レセプター２（「ＣＲ２」）、ＣＤ２２／ＢＬ−ＣＡＭ、ＣＤ２３／ＦｃεＲＩＩ、ＣＤ３３、ＣＤ３５／補体レセプター１（「ＣＲ１」）、ＣＤ４４／ＰＧＰ−１、ＣＤ４５／白血球共通抗原（「ＬＣＡ」）、ＣＤ４６／膜補因子タンパク質（「ＭＣＰ」）、ＣＤ５２／ＣＡＭＰＡＴＨ−１、ＣＤ５５／崩壊促進因子（「ＤＡＦ」）、ＣＤ５９／プロテクチン、ＣＤＣ２７、ＣＤＫ４、癌胎児性抗原（「ＣＥＡ」）、ｃ−ｍｙｃ、シクロオキシゲナーゼ−２（「ｃｏｘ−２」）、大腸がん欠失遺伝子（「ＤＣＣ」）、ＤｃＲ３、Ｅ６／Ｅ７、ＣＧＦＲ、ＥＭＢＰ、Ｄｎａ７８、ファルネシルトランスフェラーゼ、線維芽細胞増殖因子−８ａ（「ＦＧＦ８ａ」）、線維芽細胞増殖因子−８ｂ（「ＦＧＦ８ｂ」）、ＦＬＫ−１／ＫＤＲ、葉酸レセプター、Ｇ２５０、Ｇメラノーマ抗原遺伝子ファミリー（「ＧＡＧＥ−ファミリー」）、ガストリン１７、ガストリン放出ホルモン、ガングリオシド２（「ＧＤ２」）／ガングリオシド３（「ＧＤ３」）／ガングリオシド−モノシアル酸−２（「ＧＭ２」）、ゴナドトロピン放出ホルモン（「ＧｎＲＨ」）、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ：Ｒ１Ｍａｎ（α１−６）Ｒ２［ＧｌｃＮＡｃ−Ｍａｎ（α１−６）］β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ（「ＧｎＴ  Ｖ」）、ＧＰ１、ｇｐ１００／Ｐｍｅ１１７、ｇｐ−１００−ｉｎ４、ｇｐ１５、ｇｐ７５／チロシン関連タンパク質−１（「ｇｐ７５／ＴＲＰ−１」）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（「ｈＣＧ」）、ヘパラナーゼ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ヒト乳癌ウイルス（「ＨＭＴＶ」）、７０キロダルトン熱ショックタンパク質（「ＨＳＰ７０」）、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（「ｈＴＥＲＴ」）、インスリン様増殖因子レセプター−１（「ＩＧＦＲ−１」）、インターロイキン−１３レセプター（「ＩＬ−１３Ｒ」）、誘導型一酸化窒素合成酵素（「ｉＮＯＳ」）、Ｋｉ６７、ＫＩＡＡ０２０５、Ｋ−ｒａｓ、Ｈ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ、ＫＳＡ、ＬＫＬＲ−ＦＵＴ、メラノーマ抗原コード遺伝子１（「ＭＡＧＥ−１」）、メラノーマ抗原コード遺伝子２（「ＭＡＧＥ−２」）、メラノーマ抗原コード遺伝子３（「ＭＡＧＥ−３」）、メラノーマ抗原コード遺伝子４（「ＭＡＧＥ−４」）、マンマグロビン、ＭＡＰ１７、Ｍｅｌａｎ−Ａ／Ｔ細胞認識メラノーマ抗原−１（「ＭＡＲＴ−１」）、メソセリン、ＭＩＣ  Ａ／Ｂ、ＭＴ−ＭＭＰ、ムチン、精巣特異的抗原ＮＹ−ＥＳＯ−１、オステオネクチン、ｐ１５、Ｐ１７０／ＭＤＲ１、ｐ５３、ｐ９７／メラノトランスフェリン、ＰＡＩ−１、血小板由来増殖因子（「ＰＤＧＦ」）、μＰＡ、ＰＲＡＭＥ、プロバシン、プロゲニポエチン、前立腺特異的抗原（「ＰＳＡ」）、前立腺特異的膜抗原（「ＰＳＭＡ」）、前立腺酸性ホスファターゼ（「ＰＡＰ」）、ＲＡＧＥ−１、Ｒｂ、ＲＣＡＳ１、ＳＡＲＴ���１、ＳＳＸファミリー、ＳＴＡＴ３、ＳＴｎ、ＴＡＧ−７２、形質転換増殖因子α（「ＴＧＦ−α」）、形質転換増殖因子β（「ＴＧＦ−β」）、チモシンβ１５、腫瘍壊死因子α（「ＴＮＦ−α」）、ＴＰ１、ＴＲＰ−２、チロシナーゼ、血管内皮増殖因子（「ＶＥＧＦ」）、ＺＡＧ、ｐ１６ＩＮＫ４及びグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（「ＧＳＴ」）からなる群から選択されている、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記免疫原性組成物を鼻腔内投与する、請求項２３〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
１回目の投与（プライミング）用の第１のバイアルまたは容器と、２回目の投与（ブースティング）用の第２のバイアルまたは容器に、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の免疫原性組成物を含むキット。
【請求項４７】
第３、第４またはそれ以降のバイアルまたは容器に、３回目、４回目またはそれ以降の投与（ブースティング）用の前記免疫原性組成物を含む、請求項４６に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フラジェリンをコードする核酸配列と、異種の疾患関連抗原をコードする核酸配列とを含む組み換え改変ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）を含む免疫原性組成物であって、対象、例えばヒト対象に投与すると、その異種の疾患関連抗原に特異的な増加したＴ細胞及び抗体媒介性免疫応答を誘導する免疫原性組成物と、特に粘膜経路、例えば鼻腔内経路によって投与するときの関連する方法及び用途とに関する。
【背景技術】
【０００２】
粘膜表面は、主な病原体侵入部位であり、最も危険な病原体のうちのいくつかは、その部位で宿主に侵入して、感染を開始する。したがって、上気道、胃腸管または尿生殖路は依然として、病原体の主な標的である。開始部位における感染を標的にすることは、病原体の粘膜侵襲を抑制及び防止し、病原体由来毒素を中和し、感染後期において、体内の病原体の複製を阻害することになり、紛れもなく、粘膜ワクチンの最も重要な特長いある（Ｈｏｌｍｇｒｅｎ，Ｊ．，ａｎｄ  Ｃ．Ｃｚｅｒｋｉｎｓｋｙ．２００５．Ｍｕｃｏｓａｌ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ａｎｄ  ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ  １１：Ｓ４５−Ｓ５３）。したがって、粘膜免疫と粘膜ワクチンの開発は、全てのワクチン学者にとって、依然として達成が非常に困難な究極の目標である。さらに、粘膜ワクチンの使用には、更なる利点があり、そのような利点は、多数かつ明確な利点である。コストの低下、無針送達、安全性、投与の簡便性（特にパンデミック中の集団予防接種の場合）、または熟練した人材の不足により、粘膜ワクチンは、従来の注射用ワクチンと比べて非常に魅力的である。加えて、粘膜からのワクチン接種には、古典的な非経口ワクチン接種では行えない、全身の区画と粘膜の区画の両方で防御免疫を誘導する機能があるので、二重の防御をもたらす（Ｆｕｊｋｕｙａｍａ，Ｙ．，Ｄ．Ｔｏｋｕｈａｒａ，Ｋ．Ｋａｔａｏｋａ，Ｒ．Ｓ．Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｊ．Ｒ．ＭｃＧｈｅｅ，Ｙ．Ｙｕｋｉ，Ｈ．Ｋｉｙｏｎｏ，ａｎｄ  Ｋ．Ｆｕｊｉｈａｓｈｉ．２０１２．Ｎｏｖｅｌ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｍｕｃｏｓａｌ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｅｘｐｅｒｔ．Ｒｅｖ．Ｖａｃｃｉｎｅｓ．１１：３６７）。粘膜免疫系全体は、免疫学的に関連を有することも十分に立証されており、「共通粘膜免疫機構」という概念が存在する（Ｂｒａｎｄｔｚａｅｇ，Ｐ．２００７．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ａｎｄ  ｍｅｍｏｒｙ  ａｔ  ｍｕｃｏｓａｌ  ｓｕｒｆａｃｅｓ．Ｖａｃｃｉｎｅ  ２５：５４６７）。したがって、１つの粘膜部位で免疫するとともに、かなり離れた別の粘膜部位で免疫を誘導することが可能である。このアプローチを示す最良の例は、依然として、鼻腔内（ｉ．ｎ．）経路によるワクチン接種であり、このワクチン接種は、ＨＳＶのモデル（Ｇａｌｌｉｃｈａｎ，Ｗ．Ｓ．，ａｎｄ  Ｋ．Ｌ．Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ．１９９８．Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  ２  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｕｒｉｎｅ  ｆｅｍａｌｅ  ｇｅｎｉｔａｌ  ｔｒａｃｔ  ａｆｔｅｒ  ｍｕｃｏｓａｌ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  １７７：１１５５）及びＨＩＶ感染のモデル（Ｇｈｅｒａｒｄｉ，Ｍ．Ｍ．，Ｅ．Ｐｅｒｅｚ−Ｊｉｍｅｎｅｚ，Ｊ．Ｌ．Ｎａｊｅｒａ，ａｎｄ  Ｍ．Ｅｓｔｅｂａｎ．２００４．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＨＩＶ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇｅｎｉｔａｌ  ｔｒａｃｔ  ａｆｔｅｒ  ｉｎｔｒａｎａｓａｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ａ  ＭＶＡ  ｖｅ��ｔｏｒ：ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ａｆｔｅｒ  ＤＮＡ  ｐｒｉｍｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ  Ａｎｋａｒａ  ｂｏｏｓｔ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｓｃｈｅｄｕｌｅ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７２：６２０９）において、尿生殖路で防御免疫を惹起できる。
【０００３】
しかしその一方で、粘膜ワクチンは、上記の全ての利点にもかかわらず、非経口ワクチンと比べると、市販されているものは非常に少ない。ヒトを対象として市販されているものは、生弱毒化または加熱死全菌体ワクチンをベースとしており、このようなワクチンとしては、経口コレラワクチン、経口ポリオワクチン、経口腸チフスワクチン、乳児用ロタウイルスワクチン、経鼻スプレー式インフルエンザワクチンが挙げられる。スイスで何人かの患者に顔面筋痺を誘導した季節型２００１−Ｈ１Ｎ１インフルエンザワクチンのように、これらのワクチンのいくつかは、いくつかの合併症及び副作用により、市場から撤退させなければならなかった（Ｍｕｔｓｃｈ，Ｍ．，Ｗ．Ｚｈｏｕ，Ｐ．Ｒｈｏｄｅｓ，Ｍ．Ｂｏｐｐ，Ｒ．Ｔ．Ｃｈｅｎ，Ｔ．Ｌｉｎｄｅｒ，Ｃ．Ｓｐｙｒ，ａｎｄ  Ｒ．Ｓｔｅｆｆｅｎ．２００４．Ｕｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｉｎｔｒａｎａｓａｌ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖａｃｃｉｎｅ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｒｉｓｋ  ｏｆ  Ｂｅｌｌ’ｓ  ｐａｌｓｙ  ｉｎ  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ  Ｍｅｄ  ３５０：８９６）。したがって、粘膜ワクチンを開発している時に考慮する必要がある懸念と安全対策も存在する。粘膜ワクチンの別の重要な面は、粘膜ワクチンと類似の従来ワクチンと比べて、依然として免疫原性が低い点である。このため、経口免疫の場合には、寛容原性環境を壊すとともに、より防御性が強く、長時間持続する免疫応答を誘導することを望む場合、アジュバントが必要になる。近年、粘膜免疫学分野の研究において、新たな進歩がみられており、今では、粘膜表面で生じる免疫機構への理解が深まっている。依然として道のりは長いが、この徹底した研究は、それぞれの病原体に合わせた最良の粘膜アジュバントと送達系の発見に通じる大きな一歩であった。
【０００４】
アジュバントの使用は、ワクチンの研究において、特に、それと対応する加熱死または生弱毒化ワクチンと比べて免疫原性が低いままである組み換えサブユニットワクチンを用いるときには不可欠である。実際、病原体ベースの生弱毒化または不活化ワクチンは、本来的にアジュバントを含むと考えられている。過去８０年間において、ヒトでの使用が認められた唯一のアジュバントは、Ａｌｕｍ（アルミニウム塩）と水中油型エマルジョンである。最近、２つの他のアジュバント、すなわちＧＳＫのＡＳ０４（モノホスホリルリピッドＡとアルミニウム塩との調製剤）及びＮｏｖａｒｔｉｓの季節型インフルエンザワクチンと併用されるＭＦ５９（水中油型調製剤）が認可され、今では、これらを使用することができる。水中油型エマルジョンとアルミニウム塩のデメリットは、強力な粘膜ヘルパーＴ細胞応答を惹起しない点である。研究により、最も有望な粘膜アジュバントは、細菌毒素誘導体、トール様レセプター（ＴＬＲ）リガンド、及び新規な小分子であることが示されている（Ｒｈｅｅ，Ｊ．Ｈ．，Ｓ．Ｅ．Ｌｅｅ，ａｎｄ  Ｓ．Ｙ．Ｋｉｍ．２０１２．Ｍｕｃｏｓａｌ  ｖａｃｃｉｎｅ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ  ｕｐｄａｔｅ．Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ．Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｒｅｓ．１：５０）。アジュバントの機能は、免疫系の自然免疫部分を高めることである。アジュバントは、樹状細胞（ＤＣ）のような抗原提示細胞（ＡＰＣ）に主に作用し、その結果、抗原に対するＴ細胞応答とＢ細胞応答を増強するからである（Ｓｃｈｉｊｎｓ，Ｖ．Ｅ．２００１．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｉｒｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｂｙ  ｖａｃｃｉｎｅ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ．Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１：７５）。パターン認識レセプター（ＰＲＲ）によって認識される病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）は、自然免疫細胞を強く刺激する非常に強力なアジュバントである。ＰＲＲは、細胞表面上または細胞内区画内で発現する。ＰＲＲファミリーのメンバーとしては、ＴＬＲ、ヌクレオチド結合ドメイン（ＮＯＤ）様レセプター（ＮＬＲ）、レチノイン酸誘導遺伝子（ＲＩＧ）様レセプター（ＲＬＲ）及びＣ型レクチンが挙げられる（Ａｋｉｒａ，Ｓ．２０１１．Ｉｎｎａｔｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ａｎｄ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ．  Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ  Ｒ．Ｓｏｃ  Ｌｏｎｄ  Ｂ  Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ  ３６６：２７４８）。したがって、細菌細胞壁リポペプチド（ＴＬＲ４、ＴＬＲ２）（Ｄｕｔｈｉｅ，Ｍ．Ｓ．，Ｈ．Ｐ．Ｗｉｎｄｉｓｈ，Ｃ．Ｂ．Ｆｏｘ，ａｎｄ  Ｓ．Ｇ．Ｒｅｅｄ．２０１１．Ｕｓｅ  ｏｆ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ＴＬＲ  ｌｉｇａｎｄｓ  ａｓ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ  ｗｉｔｈｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．２３９：１７８）及び細菌ＤＮＡのＣｐＧモチーフ（ＴＬＲ９）（Ｂｏｄｅ，Ｃ．，Ｇ．Ｚｈａｏ，Ｆ．Ｓｔｅｉｎｈａｇｅｎ，Ｔ．Ｋｉｎｊｏ，ａｎｄ  Ｄ．Ｍ．Ｋｌｉｎｍａｎ．２０１１．ＣｐＧ  ＤＮＡ  ａｓ  ａ  ｖａｃｃｉｎｅ  ａｄｊｕｖａｎｔ．Ｅｘｐｅｒｔ．Ｒｅｖ．Ｖａｃｃｉｎｅｓ．１０：４９９）を含むＴＬＲベースのアジュバントを用いることが、新世代ワクチンに組み込むアジュバントとして選ばれているもの���ある。
【０００５】
上述のように、アジュバントは、粘膜ワクチンの開発に不可欠な要素となっている。ＴＬＲ５のリガンドのフラジェリンは、細菌の運動に関与するグラム陰性の鞭毛の主要な構造タンパク質であり、多大な関心を呼んできており、１０年近く前の研究には、広範な組み換えワクチンとの関連で、フラジェリンを強力なアジュバントとして用いることが記載されている（Ｍｉｚｅｌ，Ｓ．Ｂ．，ａｎｄＪ．Ｂａｔｅｓ．２０１４．Ｆｌａｇｅｌｌｉｎ  ａｓ  ａｎ  ａｄｊｕｖａｎｔ：ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ．，ｐｐ．５６７７）。フラジェリンは、抗原とは別に用いられてきているか、または融合タンパク質として一般に投与されてきており、インフルエンザ（Ｗａｎｇ，Ｂ．Ｚ．，Ｒ．Ｘｕ，Ｆ．Ｓ．Ｑｕａｎ，Ｓ．Ｍ．Ｋａｎｇ，Ｌ．Ｗａｎｇ，ａｎｄ  Ｒ．Ｗ．Ｃｏｍｐａｎｓ．２０１０．Ｉｎｔｒａｎａｓａｌ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ＶＬＰｓ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｎｇ  ｍｅｍｂｒａｎｅ−ａｎｃｈｏｒｅｄ  ｆｌａｇｅｌｌｉｎ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｓｔｒｏｎｇ  ｈｅｔｅｒｏｓｕｂｔｙｐｉｃ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ．ＰＬｏＳ．Ｏｎｅ．５：ｅ１３９７２）、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ（Ｈｏｎｋｏ，Ａ．Ｎ．，Ｎ．Ｓｒｉｒａｎｇａｎａｔｈａｎ，Ｃ．Ｊ．Ｌｅｅｓ，ａｎｄ  Ｓ．Ｂ．Ｍｉｚｅｌ．２００６．Ｆｌａｇｅｌｌｉｎ  ｉｓ  ａｎ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ｆｏｒ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｌｅｔｈａｌ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ  ｗｉｔｈ  Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ．Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．７４：１１１３）、ウエストナイルウイルス（ＭｃＤｏｎａｌｄ，Ｗ．Ｆ．，Ｊ．Ｗ．Ｈｕｌｅａｔｔ，Ｈ．Ｇ．Ｆｏｅｌｌｍｅｒ，Ｄ．Ｈｅｗｉｔｔ，Ｊ．Ｔａｎｇ，Ｐ．Ｄｅｓａｉ，Ａ．Ｐｒｉｃｅ，Ａ．Ｊａｃｏｂｓ，Ｖ．Ｎ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｙ．Ｈｕａｎｇ，Ｖ．Ｎａｋａａｒ，Ｌ．Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｕ，Ｅ．Ｆｉｋｒｉｇ，ａｎｄ  Ｔ．Ｊ．Ｐｏｗｅｌｌ．２００７．Ａ  Ｗｅｓｔ  Ｎｉｌｅ  ｖｉｒｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｔｈａｔ  ｃｏａｃｔｉｖａｔｅｓ  ｉｎｎａｔｅ  ａｎｄ  ａｄａｐｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  １９５：１６０７）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（Ｗｅｉｍｅｒ，Ｅ．Ｔ．，Ｈ．Ｌｕ，Ｎ．Ｄ．Ｋｏｃｋ，Ｄ．Ｊ．Ｗｏｚｎｉａｋ，ａｎｄ  Ｓ．Ｂ．Ｍｉｚｅｌ．２００９．Ａ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ＯｐｒＦ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ８，ＯｐｒＩ，ａｎｄ  ｔｙｐｅ  Ａ  ａｎｄ  Ｂ  ｆｌａｇｅｌｌｉｎｓ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｌｅａｒａｎｃｅ  ｏｆ  ｎｏｎｍｕｃｏｉｄ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ．Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．７７：２３５６）、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ（Ｃａｒａｐａｕ，Ｄ．，Ｒ．Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，Ａ．Ｎａｃｅｒ，Ａ．Ｓｈａｗ，Ｃ．Ｏｔｈｏｒｏ，Ｕ．Ｆｒｅｖｅｒｔ，ａｎｄ  Ｅ．Ｎａｒｄｉｎ．２０１３．Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｈｕｍｏｒａｌ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｅｌｉｃ��ｔｅｄ  ｂｙ  ａ  ｎｅｅｄｌｅ−ｆｒｅｅ  ｍａｌａｒｉａ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ  ｏｆ  ａ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ  ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ａ  Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ５  ａｇｏｎｉｓｔ，ｆｌａｇｅｌｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．８１：４３５０）及びワクシニアウイルス（Ｄｅｌａｎｅｙ，Ｋ．Ｎ．，Ｊ．Ｐ．Ｐｈｉｐｐｓ，Ｊ．Ｂ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，ａｎｄ  Ｓ．Ｂ．Ｍｉｚｅｌ．２０１０．Ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｆｌａｇｅｌｌｉｎ−ｐｏｘｖｉｒｕｓ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｅｌｉｃｉｔｓ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ  ｗｉｔｈ  ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ｖｉｒａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：２０１）の動物モデルにおいて、非常に有効なワクチンであることが実証されている。フラジェリンの効果は、様々なＡＰＣ、ＤＣ、好中球、単球、更に具体的には、気道構造上皮細胞（Ｖａｎ，Ｍ．Ｌ．，Ｄ．Ｆｏｕｇｅｒｏｎ，Ｌ．Ｊａｎｏｔ，Ａ．Ｄｉｄｉｅｒｌａｕｒｅｎｔ，Ｄ．Ｃａｙｅｔ，Ｊ．Ｔａｂａｒｅａｕ，Ｍ．Ｒｕｍｂｏ，Ｓ．Ｃｏｒｖｏ−Ｃｈａｍａｉｌｌａｒｄ，Ｓ．Ｂｏｕｌｅｎｏｕａｒ，Ｓ．Ｊｅｆｆｓ，Ｗ．Ｌ．Ｖａｎｄｅ，Ｍ．Ｌａｍｋａｎｆｉ，Ｙ．Ｌｅｍｏｉｎｅ，Ｆ．Ｅｒａｒｄ，Ｄ．Ｈｏｔ，Ｔ．Ｈｕｓｓｅｌｌ，Ｂ．Ｒｙｆｆｅｌ，Ａ．Ｇ．Ｂｅｎｅｃｋｅ，ａｎｄ  Ｊ．Ｃ．Ｓｉｒａｒｄ．２０１４．Ａｉｒｗａｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｒｅｇｕｌａｔｅ  ＴＬＲ５−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｍｕｃｏｓａｌ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｍｕｃｏｓａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：４８９）と、腸細胞（Ｖａｎ，Ｍ．Ｌ．，Ｄ．Ｆｏｕｇｅｒｏｎ，Ｌ．Ｊａｎｏｔ，Ａ．Ｄｉｄｉｅｒｌａｕｒｅｎｔ，Ｄ．Ｃａｙｅｔ，Ｊ．Ｔａｂａｒｅａｕ，Ｍ．Ｒｕｍｂｏ，Ｓ．Ｃｏｒｖｏ−Ｃｈａｍａｉｌｌａｒｄ，Ｓ．Ｂｏｕｌｅｎｏｕａｒ，Ｓ．Ｊｅｆｆｓ，Ｗ．Ｌ．Ｖａｎｄｅ，Ｍ．Ｌａｍｋａｎｆｉ，Ｙ．Ｌｅｍｏｉｎｅ，Ｆ．Ｅｒａｒｄ，Ｄ．Ｈｏｔ，Ｔ．Ｈｕｓｓｅｌｌ，Ｂ．Ｒｙｆｆｅｌ，Ａ．Ｇ．Ｂｅｎｅｃｋｅ，ａｎｄ  Ｊ．Ｃ．Ｓｉｒａｒｄ．２０１４．Ａｉｒｗａｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｒｅｇｕｌａｔｅ  ＴＬＲ５−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｍｕｃｏｓａｌ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｍｕｃｏｓａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：４８９及びＧｅｗｉｒｔｚ，Ａ．Ｔ．，Ｔ．Ａ．Ｎａｖａｓ，Ｓ．Ｌｙｏｎｓ，Ｐ．Ｊ．Ｇｏｄｏｗｓｋｉ，ａｎｄ  Ｊ．Ｌ．Ｍａｄａｒａ．２００１．Ｃｕｔｔｉｎｇ  ｅｄｇｅ：ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｆｌａｇｅｌｌｉｎ  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  ｂａｓｏｌａｔｅｒａｌｌｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ＴＬＲ５  ｔｏ  ｉｎｄｕｃｅ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７：１８８２）で現れる。後者は、ＴＬＲの認識後、ケモカインを産生し、その結果、より多くのＡＰＣが免疫部位に動員されることが示されている。フラジェリンのＴＬ���５への結合により、免疫カスケードが開始され、それにより、炎症誘発性サイトカインのＩＬ−６及びＴＮＦ−αが産生される（Ｒａｏｕｓｔ，Ｅ．，Ｖ．Ｂａｌｌｏｙ，Ｉ．Ｇａｒｃｉａ−Ｖｅｒｄｕｇｏ，Ｌ．Ｔｏｕｑｕｉ，Ｒ．Ｒａｍｐｈａｌ，ａｎｄ  Ｍ．Ｃｈｉｇｎａｒｄ．２００９．Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＬＰＳ  ｏｒ  ｆｌａｇｅｌｌｉｎ  ａｒｅ  ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｔｏ  ａｃｔｉｖａｔｅ  ＴＬＲ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｍｕｒｉｎｅ  ａｌｖｅｏｌａｒ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ａｎｄ  ａｉｒｗａｙ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ．ＰＬｏＳ．Ｏｎｅ．４：ｅ７２５９）。加えて、フラジェリンが用いる別の認識経路は、Ｎｌｒｃ−４−インフラマソーム経路を含み（Ｍｉａｏ，Ｅ．Ａ．，ａｎｄ  Ｓ．Ｅ．Ｗａｒｒｅｎ．２０１０．Ｉｎｎａｔｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｖｉａ  ｔｈｅ  ＮＬＲＣ４  ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０：５０２）、このＮＬＲＣ４は、細胞内（ＮＬＲ）ファミリーのメンバーであり、ＮＬＲＣ４の場合、ＩＬ−１βとＩＬ−１８の産生に至る（Ｋｕｐｚ，Ａ．，Ｇ．Ｇｕａｒｄａ，Ｔ．Ｇｅｂｈａｒｄｔ，Ｌ．Ｅ．Ｓａｎｄｅｒ，Ｋ．Ｒ．Ｓｈｏｒｔ，Ｄ．Ａ．Ｄｉａｖａｔｏｐｏｕｌｏｓ，Ｏ．Ｌ．Ｗｉｊｂｕｒｇ，Ｈ．Ｃａｏ，Ｊ．Ｃ．Ｗａｉｔｈｍａｎ，Ｗ．Ｃｈｅｎ，Ｄ．Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｒｕｉｚ，Ｐ．Ｇ．Ｗｈｉｔｎｅｙ，Ｗ．Ｒ．Ｈｅａｔｈ，Ｒ．Ｃｕｒｔｉｓｓ，ＩＩＩ，Ｊ．Ｔｓｃｈｏｐｐ，Ｒ．Ａ．Ｓｔｒｕｇｎｅｌｌ  ａｎｄ  Ｓ．Ｂｅｄｏｕｉ．２０１２．ＮＬＲＣ４  ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅｓ  ｉｎ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｒｅｇｕｌａｔｅ  ｎｏｎｃｏｇｎａｔｅ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｍｅｍｏｒｙ  ＣＤ８（＋）Ｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：１６２）。適応免疫の点では、フラジェリンが、抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を誘導するとともに（Ｂａｔｅｓ，Ｊ．Ｔ．，Ｓ．Ｕｅｍａｔｓｕ，Ｓ．Ａｋｉｒａ，ａｎｄ  Ｓ．Ｂ．Ｍｉｚｅｌ．２００９．Ｄｉｒｅｃｔ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｌｒ５＋／＋  ＣＤ１１ｃ＋  ｃｅｌｌｓ  ｉｓ  ｎｅｃｅｓｓａｒｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｆｌａｇｅｌｌｉｎ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８２：７５３９）、強固な抗体応答を誘導し、高いＩｇＧ１力価と高いＩｇＧ２力価によって特徴付けられる（Ｈｕｌｅａｔｔ，Ｊ．Ｗ．，Ａ．Ｒ．Ｊａｃｏｂｓ，Ｊ．Ｔａｎｇ，Ｐ．Ｄｅｓａｉ，Ｅ．Ｂ．Ｋｏｐｐ，Ｙ．Ｈｕａｎｇ，Ｌ．Ｓｏｎｇ，Ｖ．Ｎａｋａａｒ，ａｎｄ  Ｔ．Ｊ．Ｐｏｗｅｌｌ．２００７．Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｎｇ  Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｒａｐｉｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  ｈｕｍｏｒａｌ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｖａｃｃｉｎｅ  ２５：７６３）ことが十分に認識されている。フラジェリン−抗原融合タンパク質として投与すると、フラジェリンの適応免��に対するアジュバント効果が高まると考えられている。
【０００６】
多くの考え得るワクチン様式の中では、Ｔ細胞応答とＢ細胞応答の両方を誘導する要件を満たすには、生ベクターウイルスが最良と思われる（Ｒ．Ａ．Ｋｏｕｐ  ａｎｄ  Ｄ．Ｃ．Ｄｏｕｅｋ，“Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ  ｆｏｒ  ＣＤ８＋  Ｔ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ，”Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ．Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．Ｍｅｄ．２０１１；１：ａ００７２５２）。ワクシニアウイルス及び黄熱病ウイルスのようないくつかの生ウイルスワクチンは、有効であるが、安全性プロファイルが好ましくなく、その一方で、アデノウイルスのようなその他のワクチンには、既存免疫による問題がある（Ａ．Ｒ．Ｔｈｏｒｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，“Ａｇｅ  Ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ  ｏｆ  Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｉｔｅｒｓ  ｉｎ  Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ  ｆｒｏｍ  Ｓｕｂ−Ｓａｈａｒａｎ  Ａｆｒｉｃａ，”Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４４（１０）：３７８１−３７８３（２００６））。既存免疫の影響を受けない安全な生ベクターワクチンは、Ａｎｔｏｎ  Ｍａｙｒが最初に作製した改変ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）であり、更に第三世代の天然痘ワクチン（ＭＶＡ−ＢＮ（登録商標））へと発展している（Ｋｅｎｎｅｄｙ  ＪＳ，Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ  ＲＮ  ＩＭＶＡＭＵＮＥ：ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｖａｃｃｉｎｉａ  Ａｎｋａｒａ  ｓｔｒａｉｎ  ａｓ  ａｎ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  ｓｍａｌｌｐｏｘ  ｖａｃｃｉｎｅ．．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ．２００９  Ｊａｎ；８（１）：１３−２４．ｄｏｉ：１０．１５８６／１４７６０５８４．８．１．１３．Ｒｅｖｉｅｗ）。
【０００７】
ヒト細胞における複製欠損性に起因する、ＭＶＡの優れた安全性プロファイルは、免疫力の低下した個体へのワクチン接種や、１９７０年代の天然痘撲滅運動中に、１２０，０００人にＭＶＡをワクチン接種した際を含む多くの臨床試験で実証されている（Ａ．Ｍａｙｒ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｈｅ  ｓｍａｌｌｐｏｘ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｓｔｒａｉｎ  ＭＶＡ：ｍａｒｋｅｒ，ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ  ｇａｉｎｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｂｅｈａｖｉｏｒ  ｉｎ  ｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｄｅｂｉｌｉｔａｔｅｄ  ｄｅｆｅｎｓｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ，”Ｚｅｎｔｒａｌｂｌ．Ｂａｋｔｅｒｉｏｌ．Ｂ  １６７（５−６）：３７５−３９０（１９７８））。それ以来、多くの様々な組み換えＭＶＡワクチンが生成され、感染性疾患（例えばＨＩＶ、マラリア）及び非感染性疾患（例えば前立腺がん）に対する免疫を動物とヒトに付与する機能について試験が行われてきた。そして、ＭＶＡは、その実証済みの安全性と良好な免疫原性によって、Ｔ細胞及びＢ細胞誘導ワクチンベクターの最有力候補となっている。
【０００８】
組み換えＭＶＡを用いた大半の研究は、全身適用後について説明している。それにもかかわらず、インフルエンザ（Ｓｕｔｔｅｒ，Ｇ．，Ｌ．Ｓ．Ｗｙａｔｔ，Ｐ．Ｌ．Ｆｏｌｅｙ，Ｊ．Ｒ．Ｂｅｎｎｉｎｋ，ａｎｄ  Ｂ．Ｍｏｓｓ．１９９４．Ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｖｅｃｔｏｒ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｈｏｓｔ  ｒａｎｇｅ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ａｎｄ  ｈｉｇｈｌｙ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  ＭＶＡ  ｓｔｒａｉｎ  ｏｆ  ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｔｏ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ．Ｖａｃｃｉｎｅ  １２：１０３２．）、ＲＳＶ（Ｗｙａｔｔ，Ｌ．Ｓ．，Ｓ．Ｔ．Ｓｈｏｒｓ，Ｂ．Ｒ．Ｍｕｒｐｈｙ，ａｎｄ  Ｂ．Ｍｏｓｓ．１９９６．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ３  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｎ  ａｎｉｍａｌ  ｍｏｄｅｌ．Ｖａｃｃｉｎｅ  １４：１４５１）及びＨＩＶ（Ｇｈｅｒａｒｄｉ，Ｍ．Ｍ．，Ｅ．Ｐｅｒｅｚ−Ｊｉｍｅｎｅｚ，Ｊ．Ｌ．Ｎａｊｅｒａ，ａｎｄ  Ｍ．Ｅｓｔｅｂａｎ．２００４．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＨＩＶ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇｅｎｉｔａｌ  ｔｒａｃｔ  ａｆｔｅｒ  ｉｎｔｒａｎａｓａｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ａ  ＭＶＡ  ｖｅｃｔｏｒ：ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ａｆｔｅｒ  ＤＮＡ  ｐｒｉｍｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ  Ａｎｋａｒａ  ｂｏｏｓｔ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｓｃｈｅｄｕｌｅ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７２：６２０９）の研究において、ＭＶＡの粘膜投与、特に鼻腔内送達後の免疫応答について調べた報告書は、わずかである。フラジェリン−ポックスウイルスワクチンの役割について記載している研究の１つ（このケースでは、フラジェリンに融合した組み換えワクシニアウイルス抗原タンパク質Ｌ１Ｒ及びＢ５Ｒが用いられている）では、このフラジェリン融合タンパク質によってワクシニアウイルス攻撃に対する免疫を付与されたマウスにおいて、防御効果が示された（Ｄｅｌａｎｅｙ，Ｋ．Ｎ．，Ｊ．Ｐ．Ｐｈｉｐｐｓ，Ｊ．Ｂ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，ａｎｄ  Ｓ．Ｂ．Ｍｉｚｅｌ．２０１０．Ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｆｌａｇｅｌｌｉｎ−ｐｏｘｖｉｒｕｓ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｅｌｉｃｉｔｓ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ  ｗｉｔｈ  ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ｖｉｒａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：２０１）。さらに、鼻腔内経路によって送達されるフラジェリンの使用は、多くの研究で、様々なマウスモデル及びヒト以外の霊長類において、極めて低用量で利用されており（Ｗｅｉｍｅｒ，Ｅ．Ｔ．，Ｓ．Ｅ．Ｅｒｖｉｎ，Ｄ．Ｊ．Ｗｏｚｎｉａｋ，ａｎｄ  Ｓ．Ｂ．Ｍｉｚｅｌ．２００９．Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｙｏｕｎｇ  Ａｆｒｉｃａｎ  ｇｒｅｅｎ  ｍｏｎｋｅｙｓ  ｗｉｔｈ  ＯｐｒＦ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ８−ＯｐｒＩ−ｔｙｐｅ  Ａ−  ａｎｄ  Ｂ−ｆｌａｇｅｌｌｉｎ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｎｏｎｍｕｃｏｉｄ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ．Ｖａｃｃｉｎｅ  ２７：６７６２）、これにより、フラジェリンは、ヒトワクチンで使用でき得る非常に魅力的な粘膜アジュバント候補となっている。現時点では、ｒＭＶＡをフラジェリン（特に、ベクター内で遺伝的にコードされ、鼻腔内経路によって投与されるフラジェリン）とともに用いた報告は存在しない。
【発明の概要】
【０００９】
本発明者は、フラジェリンを発現する組み換えＭＶＡ−ＢＮを生成したとともに、ＭＶＡ−ＢＮ−フラジェリンで鼻腔内免疫すると、アジュバント無添加の組み換えＭＶＡと比べて、全身及び免疫部位の両方において、増強された細胞性免疫応答と液性免疫応答が惹起されることを示した。本発明者は、組み換えＭＶＡ−フラジェリンで鼻腔内免疫すると、胃腸免疫応答を惹起できることも示した。したがって、組み換えＭＶＡ−フラジェリンは、胃腸病原体を含む広範な疾患に対する予防ワクチン及び治療用ワクチンの開発、すなわち、粘膜ワクチンの開発の際の主要候補ベクターである。
【００１０】
一態様では、本発明では、フラジェリンをコードする核酸配列と、異種の疾患関連抗原をコードする核酸配列とを含む組み換え改変ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）を含む免疫原性組成物であって、対象に投与すると、異種の疾患関連抗原をコードする核酸配列を含むが、フラジェリンをコードする核酸配列を含まない組み換えＭＶＡの投与によって誘導される、異種の疾患関連抗原に特異的なＴ細胞免疫応答及び／またはＢ細胞免疫応答に比べて、異種の疾患関連抗原に特異的な増加したＴ細胞免疫応答及び／または増加したＢ細胞免疫応答を誘導する免疫原性組成物を提供する。ある特定の実施形態では、増加したＴ細胞免疫応答には、異種の疾患関連抗原に特異的な細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の数が増えることが含まれる。ある特定の実施形態では、異種の疾患関連抗原に特異的なＣＴＬの数が増えることにより、異種の疾患関連抗原をコードする核酸配列を含むが、フラジェリンをコードする核酸配列を含まない組み換えＭＶＡの投与によって誘導されるＣＴＬと比べて、増加した細胞溶解活性も示す。ある特定の実施形態では、増加したＴ細胞免疫応答には、異種の疾患関連抗原に特異的なメモリーＴ細胞の数が増えることが含まれる。ある特定の実施形態では、増加したＴ細胞免疫応答には、異種の疾患関連抗原に特異的なＣＴＬの数が増えることと、異種の疾患関連抗原に特異的なメモリーＴ細胞の数が増えることが含まれる。ある特定の実施形態では、異種の疾患関連抗原に特異的なＣＴＬの数が増えることにより、異種の疾患関連抗原をコードする核酸配列を含むが、フラジェリンをコードする核酸配列を含まない組み換えＭＶＡの投与によって誘導されるＣＴＬと比べて、増加した細胞溶解活性も示す。
【００１１】
ある特定の実施形態では、上記の核酸配列は、配列番号１に対するアミノ酸配列同一性が少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％であるフラジェリンをコードする。ある特定の実施形態では、上記の核酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列を有するフラジェリンをコードする。ある特定の実施形態では、上記の免疫原性組成物は、製薬学的に許容可能な担体を更に含む。
【００１２】
ある特定の実施形態では、疾患関連抗原は、感染性疾患抗原または腫瘍関連抗原である。ある特定の実施形態では、疾患関連抗原は、感染性疾患抗原である。ある特定の実施形態では、感染性疾患抗原は、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原または寄生虫抗原である。
【００１３】
ある特定の実施形態では、感染性疾患抗原は、ウイルス抗原である。ある特定の実施形態では、ウイルス抗原は、アデノウイルス、アルボウイルス、アストロウイルス、コロナウイルス、コクサッキーウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、サイトメガロウイルス（「ＣＭＶ」）、デングウイルス、エボラウイルス、エプスタイン・バーウイルス（「ＥＢＶ」）、口蹄疫ウイルス、グアナリトウイルス、ヘンドラウイルス、単純ヘルペスウイルス１型（「ＨＳＶ−１」）、単純ヘルペスウイルス２型（「ＨＳＶ−２」）、ヒトヘルペスウイルス６型（「ＨＨＶ−６」）、ヒトヘルペスウイルス８型（「ＨＨＶ−８」）、Ａ型肝炎ウイルス（「ＨＡＶ」）、Ｂ型肝炎ウイルス（「ＨＢＶ」）、Ｃ型肝炎ウイルス（「ＨＣＶ」）、Ｄ型肝炎ウイルス（「ＨＤＶ」）、Ｅ型肝炎ウイルス（「ＨＥＶ」）、ヒト免疫不全ウイルス（「ＨＩＶ」）、インフルエンザウイルス、日本脳炎ウイルス、フニンウイルス、ラッサウイルス、マチュポウイルス、マールブルグウイルス、麻疹ウイルス、ヒトメタニューモウイルス、伝染性軟属腫ウイルス、ムンプスウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ニパウイルス、ノロウイルス、ノーウォークウイルス、ヒトパピローマウイルス（「ＨＰＶ」）、パラインフルエンザウイルス、パルボウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（「ＲＳＶ」）、ライノウイルス、ロタウイルス、風疹ウイルス、サビアウイルス、重症急性呼吸器症候群ウイルス（「ＳＡＲＳ」）、水痘帯状疱疹ウイルス、痘瘡ウイルス、ウエストナイルウイルス及び黄熱病ウイルスからなる群から選択されるウイルスに由来する。
【００１４】
ある特定の実施形態では、感染性疾患抗原は、細菌抗原である。ある特定の実施形態では、細菌抗原は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｃａｎｉｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｓｕｉｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｍａｌｌｅｉ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｔｈｅｒｉａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、ｅｎｔｅｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）１５７：Ｈ７、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ及びＹｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓからなる群から選択される細菌に由来する。
【００１５】
ある特定の実施形態では、感染性疾患抗原は、真菌抗原である。ある特定の実施形態では、真菌抗原は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｃｌａｖａｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｄｕｂｌｉｎｉｅｎｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｌｂｉｄｕｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｔｔｉｉ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｕｒｅｎｔｉｉ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ  ｃａｎｉｓ、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｊｉｒｏｖｅｃｉｉ、Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ  ｓｃｈｅｎｃｋｉｉ、Ｓｔａｃｈｂｏｔｒｙｓ  ｃｈａｒｔａｒｕｍ、Ｔｉｎｅａ  ｂａｒｂａｅ、Ｔｉｎｅａ  ｃａｐｔｉｔｉｓ、Ｔｉｎｅａ  ｃｏｒｐｏｒｉｓ、Ｔｉｎｅａ  ｃｒｕｒｉｓ、Ｔｉｎｅａ  ｆａｃｉｅｉ、Ｔｉｎｅａ  ｉｎｃｏｇｎｉｔｏ、Ｔｉｎｅａ  ｎｉｇｒａ、Ｔｉｎｅａ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｒｕｂｒｕｍ及びＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｔｏｎｓｕｒａｎｓからなる群から選択される真菌に由来する。
【００１６】
ある特定の実施形態では、感染性疾患抗原は、寄生虫抗原である。ある特定の実施形態では、寄生虫抗原は、Ａｎｉｓａｋｉｓ  ｓｐｐ．、Ｂａｂｅｓｉａ  ｓｐｐ．、Ｂａｙｌｉｓａｓｃａｒｉｓ  ｐｒｏｃｙｏｎｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｐ．、Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒａ  ｃａｙｅｔａｎｅｎｓｉｓ、Ｄｉｐｈｙｌｌｏｂｏｔｈｒｉｕｍ  ｓｐｐ．、Ｄｒａｃｕｎｃｕｌｕｓ  ｍｅｄｉｎｅｎｓｉｓ、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ、Ｇｉａｒｄｉａ  ｄｕｏｄｅｎａｌｉｓ、Ｇｉａｒｄｉａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、Ｇｉａｒｄｉａ  ｌａｍｂｌｉａ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｓｐ．、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｍａｎｓｏｎｉ、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｈａｅｍａｔｏｂｉｕｍ、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ、Ｔａｅｎｉａ  ｓｐｐ．、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ、Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ  ｓｐｉｒａｌｉｓ及びＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉからなる群から選択される寄生虫に由来する。
【００１７】
ある特定の実施形態では、疾患関連抗原は、腫瘍関連抗原である。ある特定の実施形態では、腫瘍関連抗原は、５−α−レダクターゼ、α−フェトプロテイン（「ＡＦＰ」）、ＡＭ−１、ＡＰＣ、Ａｐｒｉｌ、Ｂメラノーマ抗原遺伝子（「ＢＡＧＥ」）、β−カテニン、Ｂｃｌ１２、ｂｃｒ−ａｂｌ、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、ＣＡ−１２５、カスパーゼ−８（「ＣＡＳＰ−８」、「ＦＬＩＣＥ」としても知られている）、カテプシン、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１／補体レセプター２（「ＣＲ２」）、ＣＤ２２／ＢＬ−ＣＡＭ、ＣＤ２３／ＦｃεＲＩＩ、ＣＤ３３、ＣＤ３５／補体レセプター１（「ＣＲ１」）、ＣＤ４４／ＰＧＰ−１、ＣＤ４５／白血球共通抗原（「ＬＣＡ」）、ＣＤ４６／膜補因子タンパク質（「ＭＣＰ」）、ＣＤ５２／ＣＡＭＰＡＴＨ−１、ＣＤ５５／崩壊促進因子（「ＤＡＦ」）、ＣＤ５９／プロテクチン、ＣＤＣ２７、ＣＤＫ４、癌胎児性抗原（「ＣＥＡ」）、ｃ−ｍｙｃ、シクロオキシゲナーゼ−２（「ｃｏｘ−２」）、大腸がん欠失遺伝子（「ＤＣＣ」）、ＤｃＲ３、Ｅ６／Ｅ７、ＣＧＦＲ、ＥＭＢＰ、Ｄｎａ７８、ファルネシルトランスフェラーゼ、線維芽細胞増殖因子−８ａ（「ＦＧＦ８ａ」）、線維芽細胞増殖因子−８ｂ（「ＦＧＦ８ｂ」）、ＦＬＫ−１／ＫＤＲ、葉酸レセプター、Ｇ２５０、Ｇメラノーマ抗原遺伝子ファミリー（「ＧＡＧＥ−ファミリー」）、ガストリン１７、ガストリン放出ホルモン、ガングリオシド２（「ＧＤ２」）／ガングリオシド３（「ＧＤ３」）／ガングリオシド−モノシアル酸−２（「ＧＭ２」）、ゴナドトロピン放出ホルモン（「ＧｎＲＨ」）、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ：Ｒ１Ｍａｎ（α１−６）Ｒ２［ＧｌｃＮＡｃ−Ｍａｎ（α１−６）］β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ（「ＧｎＴ  Ｖ」）、ＧＰ１、ｇｐ１００／Ｐｍｅ１１７、ｇｐ−１００−ｉｎ４、ｇｐ１５、ｇｐ７５／チロシン関連タンパク質−１（「ｇｐ７５／ＴＲＰ−１」）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（「ｈＣＧ」）、ヘパラナーゼ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ヒト乳癌ウイルス（「ＨＭＴＶ」）、７０キロダルトン熱ショックタンパク質（「ＨＳＰ７０」）、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（「ｈＴＥＲＴ」）、インスリン様増殖因子レセプター−１（「ＩＧＦＲ−１」）、インターロイキン−１３レセプター（「ＩＬ−１３Ｒ」）、誘導型一酸化窒素合成酵素（「ｉＮＯＳ」）、Ｋｉ６７、ＫＩＡＡ０２０５、Ｋ−ｒａｓ、Ｈ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ、ＫＳＡ、ＬＫＬＲ−ＦＵＴ、メラノーマ抗原コード遺伝子１（「ＭＡＧＥ−１」）、メラノーマ抗原コード遺伝子２（「ＭＡＧＥ−２」）、メラノーマ抗原コード遺伝子３（「ＭＡＧＥ−３」）、メラノーマ抗原コード遺伝子４（「ＭＡＧＥ−４」）、マンマグロビン、ＭＡＰ１７、Ｍｅｌａｎ−Ａ／Ｔ細胞認識メラノーマ抗原−１（「ＭＡＲＴ−１」）、メソセリン、ＭＩＣ  Ａ／Ｂ、ＭＴ−ＭＭＰ、ムチン、精巣特異的抗原ＮＹ−ＥＳＯ−１、オステオネクチン、ｐ１５、Ｐ１７０／ＭＤＲ１、ｐ５３、ｐ９７／メラノトランスフェリン、ＰＡＩ−１、血小板由来増殖因子（「ＰＤＧＦ」）、μＰＡ、ＰＲＡＭＥ、プロバシン、プロゲニポエチン、前立腺特異的抗原（「ＰＳＡ」）、前立腺特異的膜抗原（「ＰＳＭＡ」）、���立腺酸性ホスファターゼ（「ＰＡＰ」）、ＲＡＧＥ−１、Ｒｂ、ＲＣＡＳ１、ＳＡＲＴ−１、ＳＳＸファミリー、ＳＴＡＴ３、ＳＴｎ、ＴＡＧ−７２、形質転換増殖因子α（「ＴＧＦ−α」）、形質転換増殖因子β（「ＴＧＦ−β」）、チモシンβ１５、腫瘍壊死因子α（「ＴＮＦ−α」）、ＴＰ１、ＴＲＰ−２、チロシナーゼ、血管内皮増殖因子（「ＶＥＧＦ」）、ＺＡＧ、ｐ１６ＩＮＫ４及びグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（「ＧＳＴ」）からなる群から選択される。
【００１８】
別の態様では、本発明では、疾患関連抗原に対する抗原特異的免疫応答の誘導方法であって、、本発明で提供する免疫原性組成物のいずれか１つを、それが必要な対象に投与することを含み、その免疫原性組成物が、対象に投与されると、その異種の疾患関連抗原に特異的なＴ細胞免疫応答及び／またはＢ細胞免疫応答の増強を誘導する方法を提供する。ある特定の実施形態では、対象は哺乳動物である。ある特定の実施形態では、哺乳動物はヒトである。ある特定の実施形態では、増加したＴ細胞免疫応答には、異種の疾患関連抗原に特異的な細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の数が増えることが含まれる。ある特定の実施形態では、異種の疾患関連抗原に特異的なＣＴＬの数が増えることにより、異種の疾患関連抗原をコードする核酸配列を含むが、フラジェリンをコードする核酸配列を含まない組み換えＭＶＡの投与によって誘導されるＣＴＬと比べて、増加した細胞溶解活性も示す。ある特定の実施形態では、増加したＴ細胞免疫応答には、異種の疾患関連抗原に特異的なメモリーＴ細胞の数が増えることが含まれる。ある特定の実施形態では、増加したＴ細胞免疫応答には、異種の疾患関連抗原に特異的なＣＴＬの数が増えることと、異種の疾患関連抗原に特異的なメモリーＴ細胞の数が増えることが含まれる。ある特定の実施形態では、異種の疾患関連抗原に特異的なＣＴＬの数が増えることにより、異種の疾患関連抗原をコードする核酸配列を含むが、フラジェリンをコードする核酸配列を含まない組み換えＭＶＡの投与によって誘導されるＣＴＬと比べて、増加した細胞溶解活性も示す。
【００１９】
ある特定の実施形態では、核酸配列は、配列番号１に対するアミノ酸配列同一性が少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のフラジェリンをコードする。ある特定の実施形態では、核酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列を有するフラジェリンをコードする。ある特定の実施形態では、免疫原性組成物は、製薬学的に許容可能な担体を更に含む。
【００２０】
ある特定の実施形態では、疾患関連抗原は、感染性疾患抗原または腫瘍関連抗原である。ある特定の実施形態では、疾患関連抗原は、感染性疾患抗原である。ある特定の実施形態では、感染性疾患抗原は、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原または寄生虫抗原である。
【００２１】
ある特定の実施形態では、感染性疾患抗原は、ウイルス抗原である。ある特定の実施形態では、ウイルス抗原は、アデノウイルス、アルボウイルス、アストロウイルス、コロナウイルス、コクサッキーウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、サイトメガロウイルス（「ＣＭＶ」）、デングウイルス、エボラウイルス、エプスタイン・バーウイルス（「ＥＢＶ」）、口蹄疫ウイルス、グアナリトウイルス、ヘンドラウイルス、単純ヘルペスウイルス１型（「ＨＳＶ−１」）、単純ヘルペスウイルス２型（「ＨＳＶ−２」）、ヒトヘルペスウイルス６型（「ＨＨＶ−６」）、ヒトヘルペスウイルス８型（「ＨＨＶ−８」）、Ａ型肝炎ウイルス（「ＨＡＶ」）、Ｂ型肝炎ウイルス（「ＨＢＶ」）、Ｃ型肝炎ウイルス（「ＨＣＶ」）、Ｄ型肝炎ウイルス（「ＨＤＶ」）、Ｅ型肝炎ウイルス（「ＨＥＶ」）、ヒト免疫不全ウイルス（「ＨＩＶ」）、インフルエンザウイルス、日本脳炎ウイルス、フニンウイルス、ラッサウイルス、マチュポウイルス、マールブルグウイルス、麻疹ウイルス、ヒトメタニューモウイルス、伝染性軟属腫ウイルス、ムンプスウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ニパウイルス、ノロウイルス、ノーウォークウイルス、ヒトパピローマウイルス（「ＨＰＶ」）、パラインフルエンザウイルス、パルボウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（「ＲＳＶ」）、ライノウイルス、ロタウイルス、風疹ウイルス、サビアウイルス、重症急性呼吸器症候群ウイルス（「ＳＡＲＳ」）、水痘帯状疱疹ウイルス、痘瘡ウイルス、ウエストナイルウイルス及び黄熱病ウイルスからなる群から選択されるウイルスに由来する。
【００２２】
ある特定の実施形態では、感染性疾患抗原は、細菌抗原である。ある特定の実施形態では、細菌抗原は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｃａｎｉｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｓｕｉｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｍａｌｌｅｉ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｔｈｅｒｉａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、ｅｎｔｅｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）１５７：Ｈ７、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ及びＹｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓからなる群から選択される細菌に由来する。
【００２３】
ある特定の実施形態では、感染性疾患抗原は、真菌抗原である。ある特定の実施形態では、真菌抗原は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｃｌａｖａｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｄｕｂｌｉｎｉｅｎｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｌｂｉｄｕｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｔｔｉｉ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｕｒｅｎｔｉｉ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ  ｃａｎｉｓ、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｊｉｒｏｖｅｃｉｉ、Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ  ｓｃｈｅｎｃｋｉｉ、Ｓｔａｃｈｂｏｔｒｙｓ  ｃｈａｒｔａｒｕｍ、Ｔｉｎｅａ  ｂａｒｂａｅ、Ｔｉｎｅａ  ｃａｐｔｉｔｉｓ、Ｔｉｎｅａ  ｃｏｒｐｏｒｉｓ、Ｔｉｎｅａ  ｃｒｕｒｉｓ、Ｔｉｎｅａ  ｆａｃｉｅｉ、Ｔｉｎｅａ  ｉｎｃｏｇｎｉｔｏ、Ｔｉｎｅａ  ｎｉｇｒａ、Ｔｉｎｅａ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｒｕｂｒｕｍ及びＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｔｏｎｓｕｒａｎｓからなる群から選択される真菌に由来する。
【００２４】
ある特定の実施形態では、感染性疾患抗原は、寄生虫抗原である。ある特定の実施形態では、寄生虫抗原は、Ａｎｉｓａｋｉｓ  ｓｐｐ．、Ｂａｂｅｓｉａ  ｓｐｐ．、Ｂａｙｌｉｓａｓｃａｒｉｓ  ｐｒｏｃｙｏｎｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｐ．、Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒａ  ｃａｙｅｔａｎｅｎｓｉｓ、Ｄｉｐｈｙｌｌｏｂｏｔｈｒｉｕｍ  ｓｐｐ．、Ｄｒａｃｕｎｃｕｌｕｓ  ｍｅｄｉｎｅｎｓｉｓ、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ、Ｇｉａｒｄｉａ  ｄｕｏｄｅｎａｌｉｓ、Ｇｉａｒｄｉａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、Ｇｉａｒｄｉａ  ｌａｍｂｌｉａ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｓｐ．、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｍａｎｓｏｎｉ、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｈａｅｍａｔｏｂｉｕｍ、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ、Ｔａｅｎｉａ  ｓｐｐ．、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ、Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ  ｓｐｉｒａｌｉｓ及びＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉからなる群から選択される寄生虫に由来する。
【００２５】
ある特定の実施形態では、疾患関連抗原は、腫瘍関連抗原である。ある特定の実施形態では、腫瘍関連抗原は、５−α−レダクターゼ、α−フェトプロテイン（「ＡＦＰ」）、ＡＭ−１、ＡＰＣ、Ａｐｒｉｌ、Ｂメラノーマ抗原遺伝子（「ＢＡＧＥ」）、β−カテニン、Ｂｃｌ１２、ｂｃｒ−ａｂｌ、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、ＣＡ−１２５、カスパーゼ−８（「ＣＡＳＰ−８」、「ＦＬＩＣＥ」としても知られている）、カテプシン、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１／補体レセプター２（「ＣＲ２」）、ＣＤ２２／ＢＬ−ＣＡＭ、ＣＤ２３／ＦｃεＲＩＩ、ＣＤ３３、ＣＤ３５／補体レセプター１（「ＣＲ１」）、ＣＤ４４／ＰＧＰ−１、ＣＤ４５／白血球共通抗原（「ＬＣＡ」）、ＣＤ４６／膜補因子タンパク質（「ＭＣＰ」）、ＣＤ５２／ＣＡＭＰＡＴＨ−１、ＣＤ５５／崩壊促進因子（「ＤＡＦ」）、ＣＤ５９／プロテクチン、ＣＤＣ２７、ＣＤＫ４、癌胎児性抗原（「ＣＥＡ」）、ｃ−ｍｙｃ、シクロオキシゲナーゼ−２（「ｃｏｘ−２」）、大腸がん欠失遺伝子（「ＤＣＣ」）、ＤｃＲ３、Ｅ６／Ｅ７、ＣＧＦＲ、ＥＭＢＰ、Ｄｎａ７８、ファルネシルトランスフェラーゼ、線維芽細胞増殖因子−８ａ（「ＦＧＦ８ａ」）、線維芽細胞増殖因子−８ｂ（「ＦＧＦ８ｂ」）、ＦＬＫ−１／ＫＤＲ、葉酸レセプター、Ｇ２５０、Ｇメラノーマ抗原遺伝子ファミリー（「ＧＡＧＥ−ファミリー」）、ガストリン１７、ガストリン放出ホルモン、ガングリオシド２（「ＧＤ２」）／ガングリオシド３（「ＧＤ３」）／ガングリオシド−モノシアル酸−２（「ＧＭ２」）、ゴナドトロピン放出ホルモン（「ＧｎＲＨ」）、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ：Ｒ１Ｍａｎ（α１−６）Ｒ２［ＧｌｃＮＡｃ−Ｍａｎ（α１−６）］β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ（「ＧｎＴ  Ｖ」）、ＧＰ１、ｇｐ１００／Ｐｍｅ１１７、ｇｐ−１００−ｉｎ４、ｇｐ１５、ｇｐ７５／チロシン関連タンパク質−１（「ｇｐ７５／ＴＲＰ−１」）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（「ｈＣＧ」）、ヘパラナーゼ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ヒト乳癌ウイルス（「ＨＭＴＶ」）、７０キロダルトン熱ショックタンパク質（「ＨＳＰ７０」）、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（「ｈＴＥＲＴ」）、インスリン様増殖因子レセプター−１（「ＩＧＦＲ−１」）、インターロイキン−１３レセプター（「ＩＬ−１３Ｒ」）、誘導型一酸化窒素合成酵素（「ｉＮＯＳ」）、Ｋｉ６７、ＫＩＡＡ０２０５、Ｋ−ｒａｓ、Ｈ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ、ＫＳＡ、ＬＫＬＲ−ＦＵＴ、メラノーマ抗原コード遺伝子１（「ＭＡＧＥ−１」）、メラノーマ抗原コード遺伝子２（「ＭＡＧＥ−２」）、メラノーマ抗原コード遺伝子３（「ＭＡＧＥ−３」）、メラノーマ抗原コード遺伝子４（「ＭＡＧＥ−４」）、マンマグロビン、ＭＡＰ１７、Ｍｅｌａｎ−Ａ／Ｔ細胞認識メラノーマ抗原−１（「ＭＡＲＴ−１」）、メソセリン、ＭＩＣ  Ａ／Ｂ、ＭＴ−ＭＭＰ、ムチン、精巣特異的抗原ＮＹ−ＥＳＯ−１、オステオネクチン、ｐ１５、Ｐ１７０／ＭＤＲ１、ｐ５３、ｐ９７／メラノトランスフェリン、ＰＡＩ−１、血小板由来増殖因子（「ＰＤＧＦ」）、μＰＡ、ＰＲＡＭＥ、プロバシン、プロゲニポエチン、前立腺特異的抗原（「ＰＳＡ」）、前立腺特異的膜抗原（「ＰＳＭＡ」）、���立腺酸性ホスファターゼ（「ＰＡＰ」）、ＲＡＧＥ−１、Ｒｂ、ＲＣＡＳ１、ＳＡＲＴ−１、ＳＳＸファミリー、ＳＴＡＴ３、ＳＴｎ、ＴＡＧ−７２、形質転換増殖因子α（「ＴＧＦ−α」）、形質転換増殖因子β（「ＴＧＦ−β」）、チモシンβ１５、腫瘍壊死因子α（「ＴＮＦ−α」）、ＴＰ１、ＴＲＰ−２、チロシナーゼ、血管内皮増殖因子（「ＶＥＧＦ」）、ＺＡＧ、ｐ１６ＩＮＫ４及びグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（「ＧＳＴ」）からなる群から選択される。
【００２６】
別の態様では、本発明では、１回目の投与（プライミング）用の第１のバイアルまたは容器と、２回目の投与（ブースティング）用の第２のバイアルまたは容器に、本発明で提供する免疫原性組成物を含むキットを提供する。
【００２７】
ある特定の実施形態では、キットは、３回目、４回目またはそれ以降の投与（ブースティング）用の第３、第４またはそれ以降のバイアルまたは容器に、本発明で提供する免疫原性組成物を含む。
【００２８】
本発明の更なる目的及び利点は、部分的には、下記の説明に示されており、部分的には、下記の説明から明らかになり、あるいは、本発明を実施することにより理解できる。本発明の目的及び利点は、添付の請求項に具体的に示されている要素及び組み合わせによって実現されるとともに、達成される。
【００２９】
上記の概要と下記の詳細な説明のいずれも、例示的かつ説明的なものに過ぎず、特許請求されているような、本発明の範囲を限定するものではないことを理解されたい。
【００３０】
本明細書に組み込まれているとともに、本明細書の一部をなす添付の図面は、本発明の様々な実施形態を示しており、説明文とともに、本発明の原理を説明する役割を果たす。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】ｒＭＶＡ−フラジェリンによる鼻腔内免疫後の、全身部位と免疫部位において、増強したＣＴＬ応答を示している。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを３．５×１０７  ＴＣＩＤ５０のｒＭＶＡまたはｒＭＶＡ−フラジェリンで、０日目及び２１日目に鼻腔内免疫した。鼻腔内投与したＰＢＳを対照として使用した。ＯＶＡ特異的ＣＤ８Ｔ細胞（ａ）とＢ８特異的ＣＤ８Ｔ細胞（ｅ）の脾臓における頻度をＭＨＣ  Ｉデキストラマー染色によって、免疫から３５日目に決定した。ＯＶＡ特異的ＣＤ８Ｔ細胞（ｂ）の脾臓における絶対数を決定した。ＯＶＡ特異的ＣＤ８Ｔ細胞（ｃ）とＢ８特異的ＣＤ８Ｔ細胞（ｆ）の肺における頻度も、３５日目目に決定した。ＯＶＡ特異的ＣＤ８Ｔ細胞／肺（ｄ）の絶対数も決定した。
【図２】血中ＣＴＬ応答を示している。血中ＣＤ８Ｔ細胞の解析のために、１回目の免疫から７日後と、ブーストを行ってから２週間後の２８日目に、血液を採取した。血中のＯＶＡ特異的ＣＴＬ応答（ａ）とＢ８特異的ＣＴＬ応答（ｂ）を決定した。結果は、平均（＋／−標準誤差）として示されており、エラーバーは、１グループ当たりのマウスが５匹の２回の独立した実験を表している。
【図３】ｒＭＶＡ−フラジェリンによる鼻腔内免疫後に、脾臓において、サイトカイン産生ＣＴＬの上昇した頻度を示している。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを３．５×１０７ＴＣＩＤ５０のｒＭＶＡまたはｒＭＶＡ−フラジェリンで、０日目及び２１日目に鼻腔内免疫した。鼻腔内投与したＰＢＳを対照として使用した。３５日目に、脾臓を採取し、ＯＶＡ特異的サイトカイン産生ＣＴＬ（ａ、ｃ）と、Ｂ８特異的サイトカイン産生ＣＴＬ（ｂ、ｄ）の頻度を決定した。標準的に、６時間、Ｂ８２０−２７とＯＶＡ２５７−２６４ペプチドによってインビトロで再刺激した後、細胞内サイトカイン染色によって、ＩＦＮ−γ（ａ、ｂ）とＴＮＦ−α（ｃ、ｄ）の産生を解析した。データは、１グループ当たりのマウスが５匹の２回の独立した実験を表している。
【図４】ｒＭＶＡ−フラジェリンによる鼻腔内免疫後に、脾臓において、ＣＤ８Ｔ細胞応答の質が向上することを示している。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを３．５×１０７ＴＣＩＤ５０のｒＭＶＡまたはｒＭＶＡ−フラジェリンで、０日目及び２１日目に鼻腔内免疫した。鼻腔内投与したＰＢＳを対照として使用した。３５日目に、脾臓を採取し、ＯＶＡ特異的ＣＴＬ産生サイトカインの頻度を決定した。サイトカインの産生は、標準的に、６時間、ＯＶＡ２５７−２６４ペプチドによってインビトロで再刺激した後、細胞内サイトカイン染色によって解析した。ＩＦＮ−γ（ａ）及びＴＮＦ−α（ｂ）の産生は、ＯＶＡ特異的ＣＤ８Ｔ細胞にゲーティングして、ＧＭＦＩ（＋／−標準誤差）によって決定した。ＯＶＡ特異的ＣＤ８Ｔ細胞の発現するＩＦＮ−γとＴＮＦ−αの相対的頻度を決定した。結果は、平均（＋／−標準誤差）として示されており、１グループ当たりのマウスが５匹の２回の独立した実験を表している。
【図５】ｒＭＶＡ−フラジェリンで鼻腔内免疫したマウスが、増加した血清抗体応答を呈することを示している。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを３．５×１０７ＴＣＩＤ５０のｒＭＶＡまたはｒＭＶＡ−フラジェリンで、０日目及び２１日目に鼻腔内免疫した。鼻腔内投与したＰＢＳを対照として使用した。血清を３５日目に採取した。ＭＶＡ特異的ＩｇＧ及びＯＶＡ特異的ＩｇＧ（ａ）、ＭＶＡ特異的ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ｃ（ｂ）、ならびにＯＶＡ特異的ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ｃ（ｃ）のレベルをＥＬＩＳＡによって決定した。結果は、１／６４００の血清希釈率におけるＯＤとして示されており、平均（＋／−標準誤差）を表している。データは、１グループ当たりのマウスが５匹の２回の独立した実験を表している。
【図６】ｒＭＶＡ−フラジェリンで鼻腔内免疫したマウスで、ＢＡＬにおける抗体応答が増強することを示している。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを３．５×１０７ＴＣＩＤ５０のｒＭＶＡまたはｒＭＶＡ−フラジェリンで、０日目及び２１日目に鼻腔内免疫した。鼻腔内投与したＰＢＳを対照として使用した。３５日目に、ＢＡＬを採取し、ＩｇＧ（ａ）、ＩｇＧ１（ｂ）、ＩｇＧ２ｃ（ｃ）及びＩｇＡ（ｄ、ｅ）について解析した。ＭＶＡ特異的ＩｇＧ及びＩｇＡ、ならびにＯＶＡ特異的ＩｇＧ及びＩｇＡのレベルをＥＬＩＳＡによって測定した。結果は、１／８０の血清希釈率におけるＯＤとして示されており、平均（＋／−標準誤差）を表しており、１グループ当たりのマウスが５匹の２回の独立した実験を表している。
【図７】胃腸免疫応答の誘導と、ＣＤ４  Ｔ細胞とＣＤ８  Ｔ細胞のｍＬＮへのホーミングを示している。３．５×１０７ＴＣＩＤ５０のｒＭＶＡまたはｒＭＶＡ−フラジェリンによる鼻腔内免疫の前日に、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、１×１０４個のＣＤ４５．１＋ＯＴ−Ｉ  ＣＤ８  Ｔ細胞と１×１０５個のＣＤ４５．１＋ＯＴ−ＩＩ  ＣＤ４  Ｔ細胞を静脈内経路で養子導入した。鼻腔内投与したＰＢＳを対照として使用した。鼻腔内免疫から７日後に、導入したＯＴ−Ｉ  ＣＤ８  Ｔ細胞とＯＴ−ＩＩ  ＣＤ４  Ｔ細胞のホーミングをｍＬＮにおいて決定した。ＣＤ４５．１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞とＣＤ４５．１＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度をフローサイトメトリーによって、ＰＢＳで免疫したマウス、ｒＭＶＡで免疫したマウス、及びｒＭＶＡ−フラジェリンで免疫したマウスのｍＬＮにおいて決定した。ｍＬＮに移動した養子導入ＣＤ４５．１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度（ａ）と絶対数（ｂ）を決定した。ｍＬＮにおける養子導入ＣＤ４５．１＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の（ｃ）頻度と（ｄ）絶対数。結果は、平均（＋／−標準誤差）として示されており、１グループ当たりのマウスが３匹の２回の独立した実験を表している。
【図８】ｒＭＶＡによる鼻腔内免疫が、腸管内ＩｇＡの産生を誘導することを示している。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを３．５×１０７ＴＣＩＤ５０のｒＭＶＡまたはｒＭＶＡ−フラジェリンで、０日目及び２１日目に鼻腔内免疫した。鼻腔内投与したＰＢＳを対照として使用した。３５日目に、小腸を採取し、小腸の遠位部から腸洗浄液を採取した。腸洗浄液中のＯＶＡ特異的ＩｇＡのレベルをＥＬＩＳＡによって測定した。結果は、１／１０の血清希釈率におけるＯＤとして示されており、平均（＋／−標準誤差）を表しており、１グループ当たりのマウスが５匹の２回の独立した実験を表している。
【図９】ｒＭＶＡ−フラジェリンで鼻腔内免疫したマウスのＢＡＬにおけるインフラマソーム依存性及びＴＬＲ−５依存性自然免疫サイトカイン応答を示している。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを３．５×１０７ＴＣＩＤ５０のｒＭＶＡまたはｒＭＶＡ−フラジェリンで鼻腔内免疫した。翌日にＢＡＬを採取し、サイトカイン応答をＬｕｍｉｎｅｘ解析によって測定した。ＩＬ−１β（ａ）、ＩＬ−１８（ｂ）、ＴＮＦ−α（ｃ）及びＣＸＣＬ１（ｄ）のタンパク質のレベルを測定した。Ｃ５７ＢＬ／６及びＮＬＲＣ４−／−（ｅ、ｆ）マウスを３．５×１０７ＴＣＩＤ５０のｒＭＶＡまたはｒＭＶＡ−フラジェリンで鼻腔内免疫し、翌日にＢＡＬを採取した。ＩＬ−１β（ｅ）及びＩＬ−１８（ｆ）のタンパク質のレベルをｌｕｍｉｎｅｘによって測定した。
【図１０】ｒＭＶＡ−フラジェリンによるＨｅｋ−ｂｌｕｅ  ｈＴＬＲ５の活性化を示している。４×１０４細胞／ウェルの濃度のＨｅｋ−ｂｌｕｅ  ｈＴＬＲ５細胞を播種し、２時間、３７℃でインキュベートした。２時間後、培地を除去し、ｒＭＶＡまたはｒＭＶＡ−フラジェリン感染Ｈｅｌａ細胞から得た細胞溶解液または上清のいずれかを加えて、更に１８時間置いた。組み換えフラジェリンを陽性対照として用いた。培養液から上清を回収し、ＴＬＲ５の活性化について、ＳＥＡＰ活性を測定した。
【図１１】ＦＬＤＣによるｒＭＶＡ−フラジェリンのインフラマソーム依存性及びＴＬＲ−５依存性自然認識を示している。８日、ＦＬＤＣを生成し、５×１０５ＤＣ／ウェルを４ＴＣＩＤ５０／細胞のｒＭＶＡ、ｒＭＶＡ−フラジェリン、ｒＭＶＡ及びフラジェリン、フラジェリン、ならびにトランスフェクションしたフラジェリンに感染させた。感染から６時間後に、上清を回収し、サイトカインの産生について解析した。ＩＬ−１β（ａ）、ＩＬ−１８（ｂ）、ＩＬ−６（ｃ）及びＴＮＦ−α（ｄ）のタンパク質のレベルをＬｕｍｉｎｅｘで測定した。
【図１２】ｒＭＶＡ−フラジェリンによる粘膜ＤＣの刺激を示している。８日間ＦＬ処置したマウスの粘膜ＤＣサブセットをソーティングした。ＣＤ１７２ａ−ＣＤ１０３＋、ＣＤ１７２ａ−ＣＤ１０３−及びＣＤ１７ａ＋ＣＤ１０３＋という３つのサブセットを得るために、ＣＤ１１ｃ＋ＭＨＣ−ＩＩ＋ＤＣにゲーティングした３つのサブセットをＣＤ１７２ａ及びＣＤ１０３に応じて分けた。１×１０４ＤＣ／ウェルを４ＴＣＩＤ５０／細胞のｒＭＶＡ及びｒＭＶＡ−フラジェリンに感染させた。１８時間のインキュベーション後、上清を回収し、ＩＬ−１βの産生をＬｕｍｉｎｅｘで測定した。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
配列の簡単な説明
配列番号１は、フラジェリン（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）のアミノ酸配列である。
【００３３】
配列番号２は、フラジェリン（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）の核酸配列である。
【００３４】
配列番号３は、ＭＶＡ由来ペプチドＢ８２０−２７のアミノ酸配列である。
【００３５】
配列番号４は、オボアルブミン由来ペプチドＯＶＡ２５７−２６４のアミノ酸配列である。
【００３６】
本発明の詳細説明
以下では、本発明の例示的な実施形態について詳しく言及していくが、それらの例については、添付の図面に示されている。可能な場合には、同じまたは類似の部分について言及する際には、図面の全体にわたって、同じ符号を用いる。
【００３７】
定義
特に断りのない限り、本明細書における専門用語は、分子生物学分野の当業者による慣例的な用法に従って使用する。分子生物学における一般用語については、慣例的な用法は、例えば、Ｇｅｎｅｓ  Ｖ  ｂｙ  Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｌｅｗｉｎ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９４（ＩＳＢＮ  ０−１９−８５４２８７−９）、Ｋｅｎｄｒｅｗ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）、Ｔｈｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．，１９９４（ＩＳＢＮ  ０−６３２−０２１８２−９）及びＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｒｏｂｅｒｔ  Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，１９９５（ＩＳＢＮ  １−５６０８１−５６９−８）のような標準的な教科書に見出すことができる。
【００３８】
本明細書で使用する場合、「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」という単数形には、文脈上明らかに別に解すべき場合を除き、複数の言及物が含まれる。したがって、例えば、「１つのエピトープ」への言及には、１つ以上のエピトープへの言及が含まれ、「その方法」への言及には、当業者に知られている均等のステップ及び方法であって、修正できるか、または本明細書に記載の方法の代替にできるステップ及び方法への言及が含まれる。
【００３９】
特に示されていない限り、一連の要素の直前に付された「少なくとも」という用語は、その一連の要素の全ての各要素を指すと理解されたい。当業者であれば、単なる日常的な実験を用いて、本明細書に記載されている、本発明の具体的な実施形態に対する多くの均等物を認識するか、または解明できるであろう。このような均等物は、本発明に包含される。
【００４０】
本明細書、及びそれに続く請求項の全体にわたり、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、「ｃｏｍｐｒｉｓｅ（含む）」という用語と、「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ（含む）」及び「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）」などの変形表現は、「ｉｎｃｌｕｄｅｓ（含む）」を意味し、従って、示されている完全体もしくはステップ、または完全体群もしくはステップ群を含むとともに、いずれかの他の完全体もしくはステップ、または完全体群もしくはステップ群をも除外しない。本明細書で使用する場合、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）」という用語は、「ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ（含む）」、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ（含む）」または「ｈａｖｉｎｇ（有する）」という用語と置換できる。上記の用語（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）、ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ（含む）、ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ（含む）、ｈａｖｉｎｇ（有する））のいずれも、本明細書において、本発明の態様または実施形態の文脈で用いる場合には必ず、「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ（からなる）」という用語と置換できる。
【００４１】
本明細書で使用する場合、「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ（からなる）」という用語は、請求項に示されていないいずれの要素、ステップ、または成分も除外する。本明細書で使用する場合、「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ（から本質的になる）」は、残りの請求項に定義されている製品または方法の「基本的特徴及び新規特徴に影響を及ぼすことになる」いずれの材料またはステップも除外する。Ｗａｔｅｒ  Ｔｅｃｈｓ．Ｃｏｒｐ．ｖ．Ｃａｌｃｏ  Ｌｔｄ．，７  Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｑ．２ｄ  １０９７，１１０２（Ｆｅｄ．Ｃｉｒ．１９８８）
【００４２】
本明細書で使用する場合、示されている複数の要素間の「ａｎｄ／ｏｒ（及び／または）」という接続詞は、個別の選択と組み合わせの選択の両方を含むものとして理解する。例えば、２つの要素が「ａｎｄ／ｏｒ（及び／または）」によって接続されている場合、第１の選択は、第２の要素なしに、第１の要素を適用可能なことを指す。第２の選択は、第１の要素なしに、第２の要素を適用可能なことを指す。第３の選択は、第１の要素と第２の要素を併せて適用可能なことを指す。これらの選択のうちのいずれもが、趣旨の範囲に含まれ、すなわち、本明細書で使用される「ａｎｄ／ｏｒ（及び／または）」という用語の要件を満たすことが分かる。これらの選択の２つ以上を同時に適用可能な場合も、趣旨の範囲に含まれ、すなわち、「ａｎｄ／ｏｒ（及び／または）」という用語の要件を満たすことが分かる。
【００４３】
本明細書で言及される全ての文献、特許出願、特許及び他の参照文献は、参照により、その全体が本明細書に援用される。矛盾が生じた場合には、本明細書が、全ての定義を含め、優先される。
【００４４】
アジュバント：抗原性を高めるために用いるビヒクル。アジュバントとしては、（１）抗原を吸着する鉱物（Ａｌｕｍ、水酸化アルミニウムまたはリン酸塩）の懸濁液と、（２）抗原溶液が鉱油中で乳化された油中水型乳剤（フロイント不完全アジュバント）（場合によっては、抗原の分解を阻害し、及び／またはマクロファージの流入を招くことによって更に抗原性を高めるために、死菌マイコバクテリアを含める（フロイント完全アジュバント））と、（３）免疫刺激オリゴヌクレオチド（例えば、ＣｐＧモチーフを含む免疫刺激オリゴヌクレオチドなど）（例えば、米国特許第６，１９４，３８８号、米国特許第６，２０７，６４６号を参照されたい）と、（４）精製または組み換えタンパク質（共刺激分子など）を挙げることができる。例示的なアジュバントとしては、Ｂ７−１、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−３及びＧＭ−ＣＳＦが挙げられるが、これらに限らない。
【００４５】
抗原、抗原決定基、エピトープ：動物に注入または吸収される組成物を含め、動物において、抗体の産生、またはＣＤ４＋もしくはＣＤ８＋Ｔ細胞応答を刺激できる化合物、組成物または物質。抗原は、免疫系と反応して、抗原特異的液性免疫応答または細胞性免疫応答を引き起こす。「抗原」という用語には、特定の化合物、組成物または物質の全ての関連するエピトープが含まれる。「エピトープ」または「抗原決定基」という用語は、単独で、または別のタンパク質（例えば、主要組織適合遺伝子複合体（「ＭＨＣ」）タンパク質もしくはＴ細胞レセプターなど）と連動して、Ｂ細胞及び／またはＴ細胞が応答する、抗原上の部位を指す。エピトープは、連続的なアミノ酸、またはタンパク質の二次及び／または三次フォールディングによって並列された非連続的なアミノ酸の両方から形成できる。連続的なアミノ酸から形成されたエピトープは典型的には、変性溶媒にさらされても保持されるが、三次フォールディングによって形成されたエピトープは典型的には、変性溶媒による処理で失われる。エピトープは典型的には、特有の空間コンフォメーションに、少なくとも５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはそれを超えるアミノ酸を含むが、概ね、２０個未満のアミノ酸を含む。エピトープの空間コンフォメーションを割り出す方法としては、例えば、Ｘ線結晶解析法及び二次元核磁気共鳴法が挙げられる。例えば、“Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ”ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６６，Ｇｌｅｎｎ  Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ，Ｅｄ（１９９６）を参照されたい。
【００４６】
抗原は、組織特異的（もしくは組織関連）抗原であることも、または疾患特異的（もしくは疾患関連）抗原であることもできる。これらの用語は、互いに相容れないものではない。組織特異的抗原は、疾患特異的抗原であることもできるからである。組織特異的抗原は、限られた数の組織で発現する。組織特異的抗原としては、例えば、前立腺特異的抗原（「ＰＳＡ」）が挙げられる。疾患特異的抗原は、疾患プロセスと同時に発現し、その場合、抗原の発現は、特定の疾患の発現と相関するか、または特定の疾患の発現を予測するものである。疾患特異的抗原としては、例えば、特定のタイプの乳がんと関連があるＨＥＲ−２、または前立腺がんと関連があるＰＳＡが挙げられる。疾患特異的抗原は、Ｔ細胞またはＢ細胞によって認識される抗原であることができる。
【００４７】
がん、新生物、腫瘍：特定の体内組織に起因する悪性増殖で、構造分化の特徴的な喪失を起こし、概して、増加した細胞分裂能、周囲組織への浸潤、及び転移能を伴う。腫瘍は、良性であっても、悪性であってもよい。例えば、前立腺がんは、前立腺組織に発生するか、または前立腺組織に起因する悪性新生物であり、卵巣がんは、卵巣組織に発生するか、または卵巣組織に起因する悪性新生物であり、結腸がんは、結腸組織に発生するか、または結腸組織に起因する悪性新生物であり、肺がんは、肺組織に発生するか、または肺組織に起因する悪性新生物である。残存がんは、がんを減少または根絶するために、対象に治療を行った後に、対象に残存するがんである。転移がんは、転移がんの由来元である元の（原発）がんの発生部位以外の１つ以上の体内部位のがんである。
【００４８】
ｃＤＮＡ（相補的ＤＮＡ）：内部の非コードセグメント（イントロン）と、転写の開始と終結のタイミングと位置を決定する調節配列とを欠失した１本のＤＮＡ。ｃＤＮＡは、研究室において、細胞から抽出したメッセンジャーＲＮＡ（「ｍＲＮＡ」）の逆転写によって合成できる。
【００４９】
保存的バリアント：「保存的」バリアントは、タンパク質またはその抗原エピトープのの活性または抗原性に実質的に作用しないか、または低下させない１つ以上のアミノ酸置換を有するバリアントタンパク質またはポリペプチドである。概して、保存的置換は、特定のアミノ酸が、同じまたは類似の化学的特徴を持つ別のアミノ酸で置換されたものである。例えば、リシンのような塩基性アミノ酸を、アルギニンまたはグルタミンのような別の塩基性アミノ酸に置き換えることが、保存的置換である。保存的バリアントという用語には、非置換の親アミノ酸の代わりに置換アミノ酸を用いることも含まれる。ただし、その置換ポリペプチドに対して産生された抗体が、非置換ポリペプチドと免疫反応し、及び／または置換ポリペプチドが、非置換ポリペプチドの機能を保持することを条件とする。非保存的置換は、特定のアミノ酸を、化学的特徴の異なるアミノ酸、典型的には、そのタンパク質またはその抗原エピトープの活性または抗原性を低下させるアミノ酸に置き換えることである。
【００５０】
保存的置換の具体的な非限定例としては、下記の例が挙げられる。
【００５１】
【表１】
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【００５２】
ＣＤ４：分化因子クラスター４のことで、ＭＨＣクラスＩＩ分子との相互作用を仲介するＴ細胞表面タンパク質である。ＣＤ４を発現する細胞（「ＣＤ４＋」細胞という）は、ヘルパーＴ（「ＴＨ」）細胞であることが多い。
【００５３】
ＣＤ８：分化因子クラスター８のことで、ＭＨＣクラスＩ分子との相互作用を仲介するＴ細胞表面タンパク質である。ＣＤ８を発現する細胞（「ＣＤ８＋細胞細胞という）は、細胞傷害性Ｔ（「ＣＴＬ」）細胞であることが多い。
【００５４】
ＴＬＲ５のリガンド、ＴＬＲ５Ｌ、フラジェリン：トール様レセプター５（ＴＬＲ５）は、グラム陽性菌とグラム陰性菌の両方に由来するフラジェリンを認識する。このレセプターが活性化すると、アダプタータンパク質ＭｙＤ８８を介したシグナル伝達を通じて、ＴＮＦ−αのような炎症性サイトカインの産生が刺激される。ＴＬＲ５は、炎症性シグナルをホモダイマーとして生成でき、このことから、フラジェリンの認識に関与しているのは、ＴＬＲのみである可能性が示唆されている。しかしながら、ＴＬＲ５は、効率的なリガンド認識及び／またはシグナル伝達のためには、コレセプターまたはアダプター分子の存在を必要とし得る。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｈｉｍｕｒｉｕｍ由来のフラジェリンＦｌｉＣ（４９４個のアミノ酸からなるタンパク質）は、グラム陰性菌及びグラム陽性菌の両方の中で、高度に保存された分子である。フラジェリンは、多くの真核細胞及び生物（哺乳動物及び植物の両方を含む）における自然免疫応答の強力な刺激因子である。哺乳動物では、フラジェリンは、ＴＬＲ５とインフラマソームによって認識され、全身と上皮表面の両方において、防御応答を誘発する。フラジェリンは、ＴＬＲ５シグナル伝達複合体の性質に応じて、ＮＦ−κＢの活性化と、サイトカインと一酸化窒素の産生を誘導する。
【００５５】
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｈｉｍｕｒｉｕｍ由来のフラジェリンＦｌｉＣのアミノ酸配列は、配列番号１に示されている。フラジェリンという用語には、例えば配列番号１に示されているような天然アミノ酸配列と、対象において免疫応答を依然として惹起できるタンパク質断片と、タンパク質及びタンパク質断片のホモログまたはバリアント（例えば、糖化タンパク質またはポリペプチドを含む）が含まれる。したがって、フラジェリンタンパク質及びポリペプチドは、特定の天然アミノ酸配列に限定されず、天然配列と同一の配列と、天然配列に改変（欠失、付加、挿入及び置換など）を行った配列とを含む。好ましくは、このようなホモログまたはバリアントは、基準タンパク質または基準ポリペプチドに対するアミノ酸配列同一性が、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％もしくは８９％、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％もしくは９４％、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％、または約１００％である。ホモログまたはバリアントという用語には、トランケート、欠失、または別段の改質ヌクレオチドまたはタンパク質配列も含まれる。
【００５６】
アミノ酸配列間の配列同一性を割り出す技法は、当該技術分野において既知である。２つ以上の配列は、それらの「同一性パーセント」を決定することによって比較できる。２つの配列の同一性パーセントは、アライメントした２つの配列間の完全一致数を短い方の配列の長さで除して、１００を乗じた値である。
【００５７】
本明細書に記載されているタンパク質、ポリペプチド、抗原タンパク質断片、抗原及びエピトープに関する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、配列をアライメントして、必要に応じて、最大配列同一性パーセントを得るためにギャップを導入し、いずれの保存的置換も配列同一性として考慮しないうえで、候補配列におけるアミノ酸残基のうち、基準配列（すなわち、由来元のタンパク質、ポリペプチド、抗原タンパク質断片、抗原またはエピトープ）におけるアミノ酸残基と同一であるアミノ酸残基のパーセントとして定義する。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するためのアライメントは、当業者のレベル内である様々な方法で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）のような公共のコンピューターソフトウェアを用いて行うことができる。当業者であれば、比較する配列の完全長に対して最大のアライメントを得るために必要ないずれかのアルゴリズムを含め、アライメントを測定するための適切なパラメーターを定めることができる。
【００５８】
化学療法、化学療法剤：腫瘍、新生物及びがんを含め、異常な細胞増殖によって特徴付けられる疾患を治療するための、治療上有用ないずれかの化学薬品。一般的に用いられている化学療法剤の種類としては、アルキル化剤、代謝拮抗剤、天然物またはホルモン及びそれらのアンタゴニストが挙げられる。アルキル化剤としては、ナイトロジェンマスタード、スルホン酸アルキル及びニトロソウレアが挙げられる。代謝拮抗剤としては、葉酸アナログ、ピリミジンアナログ及びプリンアナログが挙げられる。天然物としては、ビンカアルカロイド、エピポドフィロトキシン、抗生物質及び酵素が挙げられる。その他の種々の薬剤としては、白金配位複合体、置換尿素、メチルヒドラジン誘導体及び副腎皮質抑制剤が挙げられる。ホルモン及びホルモンアンタゴニストとしては、副腎皮質ステロイド、プロゲスチン、エストロゲン、抗エストロゲン及びアンドロゲンが挙げられる。
【００５９】
共刺激分子：Ｔ細胞の活性化には、典型的に、Ｔ細胞レセプター（「ＴＣＲ」）とペプチド・ＭＨＣ複合体の結合と、共刺激分子とそのリガンドとの相互作用を介して伝達される第２のシグナルとが必要である。共刺激分子は、そのリガンドに結合すると、Ｔ細胞の活性化に必要な第２のシグナルを伝達する分子である。最もよく知られている、Ｔ細胞上の共刺激分子は、ＣＤ２８であり、ＣＤ２８は、Ｂ７−１またはＢ７−２のいずれかに結合する。Ｔ細胞の活性化に必要な第２のシグナルを供給できるその他の共刺激分子としては、細胞内接着分子−１（「ＩＣＡＭ−１」）、細胞内接着分子−２（「ＩＣＡＭ−２」）、白血球機能関連抗原−１（「ＬＦＡ−１」）、白血球機能関連抗原−２（「ＬＦＡ−２」）及び白血球機能関連抗原−３（「ＬＦＡ−３」）が挙げられる。
【００６０】
縮重変異体：タンパク質またはその断片をコードするポリヌクレオチドであって、天然または野生型遺伝子配列と異なるが、それにもかかわらず、同じアミノ酸を指定するコドンを含む配列を含むポリヌクレオチド。その遺伝子暗号には、２０個の天然アミノ酸が含まれ、その大半は、１つより多いコドンによって指定される。本開示には、全ての縮重ヌクレオチド配列が含まれる。ただし、その縮重ポリヌクレオチドによってコードされるＢｒａｃｈｙｕｒｙタンパク質のアミノ酸配列が不変であることを条件とする。
【００６１】
樹状細胞（ＤＣ）：樹状細胞は、一次免疫応答に関与する主要な抗原提示細胞（「ＡＰＣ」）である。樹状細胞には、形質細胞様樹状細胞と骨髄樹状細胞がある。それらの主な機能は、組織内に抗原を取得し、リンパ器官に移動し、Ｔ細胞を活性化するために、抗原を提示することである。未熟な樹状細胞は、骨髄で作られ、未熟細胞として末梢に存在する。
【００６２】
疾患関連抗原：疾患関連抗原は、特定の疾患プロセスと同時に発現し、その際、抗原の発現は、その疾患の発現と相関するか、またはその疾患の発現を予測するものである。疾患関連抗原としては例えば、特定のタイプの乳がんと関連があるＨＥＲ−２、または前立腺がんと関連がある前立腺特異的抗原（「ＰＳＡ」）が挙げられる。疾患特異的抗原は、Ｔ細胞またはＢ細胞によって認識される抗原であることができる。一部の疾患関連抗原は、組織特異的であることもある。組織特異的抗原は、限られた数の組織で発現する。組織特異的抗原としては、例えば、前立腺特異的抗原ＰＳＡが挙げられる。
【００６３】
疾患関連抗原は、例えば、腫瘍抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原または寄生虫抗原であることができる。
【００６４】
「腫瘍抗原」という用語は、腫瘍組織のみに存在、発現するか、腫瘍組織と関連するか、または腫瘍組織で過剰発現する抗原を指す。例示的な腫瘍抗原としては、５−α−レダクターゼ、α−フェトプロテイン（「ＡＦＰ」）、ＡＭ−１、ＡＰＣ、Ａｐｒｉｌ、Ｂメラノーマ抗原遺伝子（「ＢＡＧＥ」）、β−カテニン、Ｂｃｌ１２、ｂｃｒ−ａｂｌ、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、ＣＡ−１２５、カスパーゼ−８（「ＣＡＳＰ−８」、「ＦＬＩＣＥ」としても知られている）、カテプシン、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１／補体レセプター２（「ＣＲ２」）、ＣＤ２２／ＢＬ−ＣＡＭ、ＣＤ２３／ＦｃεＲＩＩ、ＣＤ３３、ＣＤ３５／補体レセプター１（「ＣＲ１」）、ＣＤ４４／ＰＧＰ−１、ＣＤ４５／白血球共通抗原（「ＬＣＡ」）、ＣＤ４６／膜補因子タンパク質（「ＭＣＰ」）、ＣＤ５２／ＣＡＭＰＡＴＨ−１、ＣＤ５５／崩壊促進因子（「ＤＡＦ」）、ＣＤ５９／プロテクチン、ＣＤＣ２７、ＣＤＫ４、癌胎児性抗原（「ＣＥＡ」）、ｃ−ｍｙｃ、シクロオキシゲナーゼ−２（「ｃｏｘ−２」）、大腸がん欠失遺伝子（「ＤＣＣ」）、ＤｃＲ３、Ｅ６／Ｅ７、ＣＧＦＲ、ＥＭＢＰ、Ｄｎａ７８、ファルネシルトランスフェラーゼ、線維芽細胞増殖因子−８ａ（「ＦＧＦ８ａ」）、線維芽細胞増殖因子−８ｂ（「ＦＧＦ８ｂ」）、ＦＬＫ−１／ＫＤＲ、葉酸レセプター、Ｇ２５０、Ｇメラノーマ抗原遺伝子ファミリー（「ＧＡＧＥ−ファミリー」）、ガストリン１７、ガストリン放出ホルモン、ガングリオシド２（「ＧＤ２」）／ガングリオシド３（「ＧＤ３」）／ガングリオシド−モノシアル酸−２（「ＧＭ２」）、ゴナドトロピン放出ホルモン（「ＧｎＲＨ」）、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ：Ｒ１Ｍａｎ（α１−６）Ｒ２［ＧｌｃＮＡｃ−Ｍａｎ（α１−６）］β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ（「ＧｎＴ  Ｖ」）、ＧＰ１、ｇｐ１００／Ｐｍｅ１１７、ｇｐ−１００−ｉｎ４、ｇｐ１５、ｇｐ７５／チロシン関連タンパク質−１（「ｇｐ７５／ＴＲＰ−１」）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（「ｈＣＧ」）、ヘパラナーゼ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ヒト乳癌ウイルス（「ＨＭＴＶ」）、７０キロダルトン熱ショックタンパク質（「ＨＳＰ７０」）、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（「ｈＴＥＲＴ」）、インスリン様増殖因子レセプター−１（「ＩＧＦＲ−１」）、インターロイキン−１３レセプター（「ＩＬ−１３Ｒ」）、誘導型一酸化窒素合成酵素（「ｉＮＯＳ」）、Ｋｉ６７、ＫＩＡＡ０２０５、Ｋ−ｒａｓ、Ｈ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ、ＫＳＡ、ＬＫＬＲ−ＦＵＴ、メラノーマ抗原コードファミリー（「ＭＡＧＥファミリー」、少なくともＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３及びＭＡＧＥ−４を含む）、マンマグロビン、ＭＡＰ１７、Ｍｅｌａｎ−Ａ／Ｔ細胞認識メラノーマ抗原−１（「ＭＡＲＴ−１」）、メソセリン、ＭＩＣ  Ａ／Ｂ、ＭＴ−ＭＭＰ、ムチン、精巣特異的抗原ＮＹ−ＥＳＯ−１、オステオネクチン、ｐ１５、Ｐ１７０／ＭＤＲ１、ｐ５３、ｐ９７／メラノトランスフェリン、ＰＡＩ−１、血小板由来増殖因子（「ＰＤＧＦ」）、μＰＡ、ＰＲＡＭＥ、プロバシン、プロゲニポエチン、前立腺特異的抗原（「ＰＳＡ」）、前立腺特異的膜抗原（「ＰＳＭＡ」）、前立腺酸性ホスファター���（「ＰＡＰ」）、ＲＡＧＥ−１、Ｒｂ、ＲＣＡＳ１、ＳＡＲＴ−１、ＳＳＸファミリー、ＳＴＡＴ３、ＳＴｎ、ＴＡＧ−７２、形質転換増殖因子α（「ＴＧＦ−α」）、形質転換増殖因子β（「ＴＧＦ−β」）、チモシンβ１５、腫瘍壊死因子α（「ＴＮＦ−α」）、ＴＰ１、ＴＲＰ−２、チロシナーゼ、血管内皮増殖因子（「ＶＥＧＦ」）、ＺＡＧ、ｐ１６ＩＮＫ４及びグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（「ＧＳＴ」）が挙げられるが、これらに限らない。
【００６５】
「ウイルス抗原」という用語は、いずれかの疾患関連病原性ウイルスに由来する抗原を指す。例示的な疾患関連ウイルス抗原としては、アデノウイルス、アルボウイルス、アストロウイルス、コロナウイルス、コクサッキーウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、サイトメガロウイルス（「ＣＭＶ」）、デングウイルス、エボラウイルス、エプスタイン・バーウイルス（「ＥＢＶ」）、口蹄疫ウイルス、グアナリトウイルス、ヘンドラウイルス、単純ヘルペスウイルス１型（「ＨＳＶ−１」）、単純ヘルペスウイルス２型（「ＨＳＶ−２」）、ヒトヘルペスウイルス６型（「ＨＨＶ−６」）、ヒトヘルペスウイルス８型（「ＨＨＶ−８」）、Ａ型肝炎ウイルス（「ＨＡＶ」）、Ｂ型肝炎ウイルス（「ＨＢＶ」）、Ｃ型肝炎ウイルス（「ＨＣＶ」）、Ｄ型肝炎ウイルス（「ＨＤＶ」）、Ｅ型肝炎ウイルス（「ＨＥＶ」）、ヒト免疫不全ウイルス（「ＨＩＶ」）、インフルエンザウイルス、日本脳炎ウイルス、フニンウイルス、ラッサウイルス、マチュポウイルス、マールブルグウイルス、麻疹ウイルス、ヒトメタニューモウイルス、伝染性軟属腫ウイルス、ムンプスウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ニパウイルス、ノロウイルス、ノーウォークウイルス、ヒトパピローマウイルス（「ＨＰＶ」）、パラインフルエンザウイルス、パルボウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（「ＲＳＶ」）、ライノウイルス、ロタウイルス、風疹ウイルス、サビアウイルス、重症急性呼吸器症候群ウイルス（「ＳＡＲＳ」）、水痘帯状疱疹ウイルス、痘瘡ウイルス、ウエストナイルウイルス及び黄熱病ウイルスに由来する抗原が挙げられるが、これらに限らない。
【００６６】
「細菌抗原」という用語は、いずれかの疾患関連病原性ウイルスに由来する抗原を指す。例示的な細菌抗原としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｃａｎｉｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｓｕｉｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｍａｌｌｅｉ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｔｈｅｒｉａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、ｅｎｔｅｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）１５７：Ｈ７、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ及びＹｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓに由来する抗原が挙げられるが、これらに限らない。
【００６７】
「真菌抗原」という用語は、いずれかの疾患関連病原性真菌に由来する抗原を指す。例示的な真菌抗原としては、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｃｌａｖａｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｄｕｂｌｉｎｉｅｎｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｌｂｉｄｕｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｔｔｉｉ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｕｒｅｎｔｉｉ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ  ｃａｎｉｓ、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｊｉｒｏｖｅｃｉｉ、Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ  ｓｃｈｅｎｃｋｉｉ、Ｓｔａｃｈｂｏｔｒｙｓ  ｃｈａｒｔａｒｕｍ、Ｔｉｎｅａ  ｂａｒｂａｅ、Ｔｉｎｅａ  ｃａｐｔｉｔｉｓ、Ｔｉｎｅａ  ｃｏｒｐｏｒｉｓ、Ｔｉｎｅａ  ｃｒｕｒｉｓ、Ｔｉｎｅａ  ｆａｃｉｅｉ、Ｔｉｎｅａ  ｉｎｃｏｇｎｉｔｏ、Ｔｉｎｅａ  ｎｉｇｒａ、Ｔｉｎｅａ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｒｕｂｒｕｍ及びＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｔｏｎｓｕｒａｎｓに由来する抗原が挙げられるが、これらに限らない。
【００６８】
「寄生虫抗原」という用語は、いずれかの疾患関連病原寄生虫に由来する抗原を指す。例示的な寄生虫抗原としては、Ａｎｉｓａｋｉｓ  ｓｐｐ．、Ｂａｂｅｓｉａ  ｓｐｐ．、Ｂａｙｌｉｓａｓｃａｒｉｓ  ｐｒｏｃｙｏｎｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｐ．、Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒａ  ｃａｙｅｔａｎｅｎｓｉｓ、Ｄｉｐｈｙｌｌｏｂｏｔｈｒｉｕｍ  ｓｐｐ．、Ｄｒａｃｕｎｃｕｌｕｓ  ｍｅｄｉｎｅｎｓｉｓ、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ、Ｇｉａｒｄｉａ  ｄｕｏｄｅｎａｌｉｓ、Ｇｉａｒｄｉａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、Ｇｉａｒｄｉａ  ｌａｍｂｌｉａ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｓｐ．、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｍａｎｓｏｎｉ、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｈａｅｍａｔｏｂｉｕｍ、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ、Ｔａｅｎｉａ  ｓｐｐ．、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ、Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ  ｓｐｉｒａｌｉｓ及びＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉに由来する抗原が挙げられるが、これらに限らない。
【００６９】
発現制御配列：機能的に連結される異種の核酸配列の発現を調節する核酸配列。発現制御配列は、核酸配列の転写及び／または翻訳を制御及び調節するときに、核酸配列に機能的に連結される。したがって、「発現制御配列」という用語には、プロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、開始コドン、イントロンに対するスプライシングシグナル、及び終止コドンが含まれる。「制御配列」という用語には少なくとも、その存在により、異種の核酸配列の転写及び／または翻訳に影響を及ぼすことができる成分が含まれ、例えば、リーダー配列及び融合パートナー配列など、その存在が有益である追加の成分も含めることができる。
【００７０】
「発現制御配列」という用語には、プロモーター配列が含まれる。プロモーターは、相同遺伝子または異種遺伝子の転写を誘導するのに十分な最小配列である。また、プロモーター依存的遺伝子発現を細胞腫特異的、組織特異的にするのに十分なプロモーター要素、または外部シグナルもしくは作用物質によって誘導可能なプロモーター要素も含まれ、そのような要素は、遺伝子の５’または３’末端領域に位置し得る。「プロモーター」という用語には、構成的プロモーターと誘導性プロモーターの両方が含まれる。例えば、Ｂｉｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １５３：５１６−５４４（１９８７）を参照されたい。例示的なプロモーター配列としては、レトロウイルス長鎖末端反復配列（「ＬＴＲ」）、アデノウイルス主要後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター（「Ｐｒ７．５」）、ワクシニアウイルス合成初期／後期プロモーター（「ｓＥ／Ｌ」）、ＰｒＳｙｎＩＩｍプロモーター、ＰｒＬＥ１プロモーター、ＰｒＨ５ｍプロモーター、ＰｒＳプロモーター、ハイブリッド初期／後期プロモーターまたは牛痘ウイルスＡＴＩプロモーターが挙げられるが、これらに限らない。
【００７１】
異種：別個の遺伝子源または種に由来すること。ヒトＢｒａｃｈｙｕｒｙに対して異種であるポリペプチドは、例えば、マウスＢｒａｃｈｙｕｒｙ、β−ガラクトシダーゼ、マルトース結合タンパク質またはヒト血清アルブミンなど、ヒトＢｒａｃｈｙｕｒｙをコードしない核酸に由来する。
【００７２】
宿主細胞：その細胞内でベクターを増殖できるとともに、そのＤＮＡを発現できる細胞。宿主細胞は、原核細胞（例えば細菌細胞）であっても、真核細胞（例えば哺乳動物細胞またはヒト細胞）であってもよい。この用語には、元の宿主細胞の子孫細胞も含まれる。ただし、複製中に変異が起こる可能性があるので、全ての子孫細胞は、親細胞と同一でない可能性がある。
【００７３】
免疫応答：Ｂ細胞、Ｔ細胞または単球などの免疫系細胞の、刺激に対する適応応答。適応応答は、特定の抗原に対する応答であるので、「抗原特異的」と称される。適応免疫応答としては、Ｂ細胞による、特定の抗原に対する抗体の産生、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞によるＴ細胞ヘルプであって、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞（「ＣＴＬ」）集団を拡大させるＴ細胞ヘルプ、特定の抗原を発現する細胞に対する、ＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞傷害活性、または更に別のタイプの抗原特異的免疫応答を挙げることができる。
【００７４】
免疫原性組成物：本明細書で使用する場合、「免疫原性組成物」という用語は、ポックスウイルスベクターのように、発現制御配列またはプロモーターの制御下でフラジェリンタンパク質をコードする核酸と、発現制御配列またはプロモーターの制御下で疾患関連抗原をコードする核酸とを含む組成物であって、測定可能な疾患関連抗原特異的適応免疫応答を誘導する組成物を指す。核酸またはポックスウイルスベクターは任意に応じて、例えば、本明細書の他の箇所に記載されているような１つ以上の共刺激分子をコードする追加の核酸を含んでもよい。その免疫応答は、例えば、疾患関連抗原を発現する細胞に対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答、すなわちＣＴＬ応答、または疾患関連抗原特異的抗体を産生するＢ細胞応答であってよい。このような組成物は、任意に応じて１つ以上の製薬学的に許容可能な担体とともに配合された単離核酸またはベクターを含んでよい。
【００７５】
リンパ球：体の免疫防御に関与する白血球の一種。リンパ球には、大きく分けて、Ｂ細胞とＴ細胞という２つの種類がある。
【００７６】
主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）：ヒト白血球抗原（「ＨＬＡ」）を含め、様々な種において説明されている組織適合抗原系を含むように意図している総称。
【００７７】
哺乳動物：この用語には、ヒトと、ヒト以外の哺乳動物の両方が含まれる。同様に、「対象」という用語には、ヒト対象と動物対象の両方が含まれる。
【００７８】
オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）：一連のアミノ酸を指定する一連のヌクレオチドコドンであって、いずれの内部終止コドンも含まず、翻訳されてポリペプチドを産生できるヌクレオチドコドン。
【００７９】
機能的に連結されている：第１の核酸配列が、第２の核酸配列と機能的な関係で配置されているとき、第１の核酸配列は、第２の核酸配列に機能的に連結されている。例えば、プロモーターが、コーディング配列の転写を誘導できる位置に配置されている場合、そのプロモーターは、コーディング配列に機能的に連結されている。概して、機能的に連結されているＤＮＡ配列は、連続しており、２つのタンパク質コード領域を結合させる必要がある場合には、同じリーディングフレーム内にある。
【００８０】
製薬学的に許容可能な担体：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｂｙ  Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９７５）には、本明細書に開示されているベクター及び組成物の投与に適する従来の製薬学的に許容可能な担体を用いる組成物と製剤が記載されている。概して、用いる担体の性質は、用いる具体的な投与方法に左右される。例えば、非経口製剤は通常、水、生理食塩水、平衡塩類溶液、水性デキストロース、グリセロールなどのような製薬学的及び生理学的に許容可能な流体をビヒクルとして含む注射用流体を含む。固体組成物（散剤、丸剤、錠剤またはカプセル剤）用では、従来の無毒性固体担体としては、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプンまたはステアリン酸マグネシウムが挙げられる。医薬組成物は、湿潤剤、乳化剤、保存剤、ｐＨ緩衝剤など（例えば、酢酸ナトリウムまたはモノラウリン酸ソルビタンなど）のような無毒性の補助物質を少量含むこともできる。
【００８１】
ポリヌクレオチド、核酸：ポリヌクレオチドという用語は、少なくとも３００塩基の長さである核酸ポリマーであって、リボヌクレオチドで構成されているか（すなわちＲＮＡ）、またはデオキシリボヌクレオチドで構成されており（すなわちＤＮＡまたはｃＤＮＡ）、ポリペプチドまたはタンパク質をコードできる核酸ポリマーを指す。この用語には、一本鎖形態及び二本鎖形態のＤＮＡが含まれる。
【００８２】
ポリペプチドまたはタンパク質：ポリペプチドまたはタンパク質という用語は、少なくとも１００個のアミノ酸の長さであり、一般的には５０個超のアミノ酸の長さであるポリマーを指す。
【００８３】
ポックスウイルス：ポックスウイルスという用語は、生産的か否かを問わず、ヒトに感染できるいずれかのポックスウイルス属を指す（例えば、オルトポックスウイルス、アビポックスウイルス、パラポックスウイルス、ヤタポックスウイルス及びモラシポックスウイルス）が、好ましくは、オルトポックス及び／またはアビポックスウイルスを指す。オルトポックスウイルスとしては、天然痘ウイルス（痘瘡ウイルスとしても知られている）、ワクシニアウイルス、牛痘ウイルス及びサル痘ウイルスが挙げられる。アビポックスウイルスとしては、カナリア痘ウイルス及び鶏痘ウイルスが挙げられる。「ワクシニアウイルス」という用語は、野生型ワクシニアウイルスと、後で単離したいずれかの様々な弱毒株または単離物の両方を指し、例えば、ワクシニアウイルスＷｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅｒｖｅ、ワクシニアウイルスＣｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｄｒｙｖａｘ（ワクシニアウイルスＷｙｅｔｈとしても知られる）、ＡＣＡＭ２０００、改変ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（「ＭＶＡ」）及び改変ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ−Ｂａｖａｒｉａｎ  Ｎｏｒｄｉｃ（「ＭＶＡ−ＢＮ」）が挙げられる。
【００８４】
プライム−ブーストワクチン接種：「プライム−ブーストワクチン接種」という用語は、特異的抗原を標的とするワクチンを最初にプライミングとして接種してから、時間を置いて、同じワクチンをブースティングとして１回以上接種するワクチン接種策を指す。プライム−ブーストワクチン接種は、同種であっても、異種であってもよい。同種のプライム−ブーストワクチン接種では、プライミング接種用と、１回以上のブースティング接種用のいずれでも、同じ免疫原と同じベクターを含むワクチンを用いる。異種のプライム−ブーストワクチン接種では、プライミング接種用と、１回以上のブースティング接種用のいずれでも、同じ免疫原を含むが、プライミング接種用と、１回以上のブースティング接種用で、異なるベクターを含むワクチンを用いる。例えば、同種のプライム−ブーストワクチン接種では、プライミング接種用と、１回以上のブースティング接種用のいずれでも、ＢｒａｃｈｙｕｒｙとＴＲＩＣＯＭを発現する核酸を含むＭＶＡベクターを用いてよい。これに対して、異種のプライム−ブーストワクチン接種では、プライミング接種用には、ＢｒａｃｈｙｕｒｙとＴＲＩＣＯＭを発現する核酸を含むＭＶＡベクターを、１回以上のブースティング接種用には、ＢｒａｃｈｙｕｒｙとＴＲＩＣＯＭを発現する核酸を含む鶏痘ベクターを用いてよい。異種のプライム−ブーストワクチン接種には、例えば、プライミング接種では、免疫原をコードするプラスミドを使用し、１回以上のブースティング接種では、同じ免疫原をコードするポックスウイルスベクターを用いるか、またはプライミング接種では、組み換えタンパク質免疫原を使用し、１回以上のブースティング接種では、同じタンパク質免疫原をコードするプラスミドもしくはポックスウイルスベクターを用いるなど、様々な組み合わせも含まれる。
【００８５】
組み換え、組み換え核酸、組み換えベクター、組み換えポックスウイルス：「組み換え」という用語は、核酸、ベクター、ポックスウイルスなどに適用する場合、２つ以上の異種の核酸配列セグメントを人工的に組み合わせることによって作製した核酸、ベクターもしくはポックスウイルス、またはそのような、２つ以上の異種の核酸配列セグメントを人工的に組み合わせたものを含む核酸、ベクターもしくはポックスウイルスを指す。その人工的な組み合わせは、最も一般的には、十分に確立された遺伝子組み換え技法を用いて、単離核酸セグメントを人為的に操作することによって行う。
【００８６】
配列同一性：「配列同一性」という用語は、核酸またはアミノ酸配列同士の類似度を指す。配列同一性は、同一性パーセントで測定することが多い（配列「類似性」または「相同性」と記載することが多い）。配列同一性パーセントが大きいほど、２つの配列の類似性は高くなる。Ｂｒａｃｈｙｕｒｙタンパク質のホモログまたはバリアントは、標準的な方法を用いてアライメントすると、配列同一度が比較的高くなる。
【００８７】
比較のために、配列をアライメントする方法は、当該技術分野において周知である。様々なプログラム及びアライメントアルゴリズムが、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２，１９８１、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３，１９７０、Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，Ｇｅｎｅ  ７３：２３７，１９８８、Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１，１９８９、Ｃｏｒｐｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：１０８８１，１９８８及びＰｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４，１９８８に記載されている。加えて、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．６：１１９，１９９４には、配列アライメント方法と相同性の算出の詳細な考察が示されている。配列解析プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ及びｔｂｌａｓｔｘとともに用いるように、ＮＣＢＩ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３，１９９０）は、米国国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ、メリーランド州ベセスダ、ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉも参照されたい）を含むいくつかの供給源から入手可能である。
【００８８】
ヒトＢｒａｃｈｙｕｒｙタンパク質のホモログ及びバリアントは典型的には、野生型ヒトＢｒａｃｈｙｕｒｙのアミノ酸配列との完全長アライメントにおいて、デフォルトパラメーターに設定したｂｌａｓｔｐを用いて、ＮＣＢＩ  Ｂｌａｓｔ  ｖ２．０で算出すると、アミノ酸配列同一性が、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％になる。約３０個超のアミノ酸のアミノ酸配列の比較のためには、デフォルトパラメーター（ギャップ存在コスト：１１、１残基当たりのギャップコスト：１）に設定したデフォルトのＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスを用いて、Ｂｌａｓｔ  ２  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ機能を用いる。
【００８９】
対象：生きている多細胞動物のことであり、例えば、ヒト、ヒト以外の哺乳動物及びトリを含む。「対象」という用語は、本明細書では、「動物」という用語と同様の意味で用いることがある。
【００９０】
Ｔ細胞：適応免疫応答に不可欠なリンパ球または白血球。Ｔ細胞としては、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞が挙げられるが、これらに限らない。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、「分化クラスター４」（「ＣＤ４」）として知られているマーカーをその表面に有する免疫細胞である。これらの細胞は、ヘルパーＴ細胞としても知られており、抗体応答とＣＴＬ応答の両方を含む免疫応答を司る助けとなる。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、「分化クラスター８」（「ＣＤ８」）マーカーを有する。ＣＤ８＋Ｔ細胞には、ＣＴＬ、メモリーＣＴＬ及びサプレッサーＴ細胞のいずれもが含まれる。
【００９１】
治療上活性なポリペプチド：Ｂｒａｃｈｙｕｒｙタンパク質のように、臨床応答（例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞もしくはＢ細胞の増加、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ特異的細胞溶解活性の増加、腫瘍サイズの測定可能な減少、または転移数の減少）によって測定される適応免疫応答を誘導するアミノ酸で構成されている物質。治療上活性な分子は、例えば、発現制御配列に機能的に連結されているヒトＢｒａｃｈｙｕｒｙをコードする核酸を含むポックスウイルスベクターのように、核酸から作製することもできる。
【００９２】
形質導入または形質転換：「形質導入」または「形質転換」という用語は、標準的な分子生物学的方法によって組み換え核酸が導入された細胞を指す。本明細書で使用する場合、形質導入という用語には、ウイルスベクターへの感染、プラスミドベクターでの形質転換、及びエレクトロポレーション、リポフェクションまたは粒子銃による加速による裸のＤＮＡの導入を含め、核酸分子を細胞に導入できる全ての技法が含まれる。
【００９３】
がん治療：「がん治療」という用語は、がんの徴候または病状を軽減もしくは排除するか、またはがんの進行を遅らせるとともに、がんを有する対象の全生存率を向上させることを意図している治療行為を指す。がんは、標準的な化学療法、放射線治療、または能動免疫療法（例えば、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙタンパク質をコードする核酸を含む組み換えワクシニアウイルスの投与など）によって治療してよい。がんの徴候または病状を軽減または排除することには、例えば、腫瘍の徴候または病状の軽減、腫瘍体積の減少、転移数の減少、応答期間の延長、進行までの期間の延長、無病生存率の向上、無増悪生存率の向上、またはその疾患を有する患者の全生存率の向上を含め、多種多様な効果が含まれる。
【００９４】
ＴＲＩＣＯＭ：Ｂ７−１（ＣＤ８０としても知られる）、細胞内接着分子−１（ＩＣＡＭ−１、ＣＤ５４としても知られる）、及びリンパ球機能関連抗原−３（ＬＦＡ−３、ＣＤ５８としても知られる）からなる３つの共刺激分子（Ｔｒｉａｄ  ｏｆ  ＣＯｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）であり、一般的には、抗原特異的免疫応答を増強させる目的で、特異的抗原を発現する組み換えウイルスベクター（例えばポックスウイルスベクター）に含まれる。ＴＲＩＣＯＭの個々の成分は、同じまたは異なるプロモーターの制御下にでき、特異的抗原とともに、同じベクターまたは別々のベクターに供給できる。例示的なベクターは、例えば、Ｈｏｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａ  Ｔｒｉａｄ  ｏｆ  Ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  Ｓｙｎｅｒｇｉｚｅ  ｔｏ  Ａｍｐｌｉｆｙ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，”Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９：５８００−５８０７（１９９９）及び米国特許第７，２１１，４３２Ｂ２号に開示されており、これらの文献はいずれも、参照により本明細書に援用される。
【００９５】
ベクター：宿主細胞に導入される核酸分子で、それにより、形質導入または形質転換宿主細胞を作製する。ベクターは概して、複製起点のように、宿主細胞内でベクターを複製可能にする核酸配列、ならびに、１つ以上の選択マーカー遺伝子、発現制御配列、制限酵素認識配列、プライマー配列及び当該技術分野において既知の様々な他の遺伝要素を含む。一般的に用いられているベクターの種類としては、細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）または酵母（例えば、Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における発現用プラスミド、組み換えポックスウイルスを構築するためのシャトルベクター、コスミド、細菌人工染色体、酵母人工染色体及びウイルスベクターが挙げられる。ウイルスベクターとしては、ポックスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、シンドビスウイルスベクター、及びポリオウイルスベクターなどが挙げられる。ポックスウイルスベクターとしては、オルトポックスウイルス、アビポックスウイルス、パラポックスウイルス、ヤタポックスウイルス及びモラシポックスウイルスが挙げられるが、これらに限らず、好ましくは、オルトポックス及び／またはアビポックスウイルスである。オルトポックスウイルスとしては、天然痘ウイルス（痘瘡ウイルスとしても知られている）、ワクシニアウイルス、牛痘ウイルス及びサル痘ウイルスが挙げられる。アビポックスウイルスとしては、カナリア痘ウイルス及び鶏痘ウイルスが挙げられる。「ワクシニアウイルス」という用語は、野生型ワクシニアウイルスと、後で単離したいずれかの様々な弱毒株または単離物の両方を指し、例えば、ワクシニアウイルスＷｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅｒｖｅ、ワクシニアウイルスＣｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｄｒｙｖａｘ（ワクシニアウイルスＷｙｅｔｈとしても知られている）、ＡＣＡＭ２０００、改変ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（「ＭＶＡ」）及び改変ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ−Ｂａｖａｒｉａｎ  Ｎｏｒｄｉｃ（「ＭＶＡ−ＢＮ」）が挙げられる。
【００９６】
考察
本開示の実施形態では、粘膜経路によって（この場合鼻腔内経路を用いて）投与するｒＭＶＡ−フラジェリン構築物の利点を示す。ｒＭＶＡ−フラジェリンによる鼻腔内免疫は、同様の経路によって投与する単独のｒＭＶＡよりも優れたワクチンであることが示されている。ｒＭＶＡ−フラジェリンは、ｒＭＶＡに比べて、良好な免疫応答を全身的に、かつ粘膜区画内で誘導する機能を有する。このことは、脾臓と肺の両方におけるＭＶＡ特異的ＣＴＬとＯＶＡ特異的ＣＴＬの頻度の向上とともに、脾臓におけるこれらのサイトカイン産生ＣＴＬ、すなわちＩＦＮ−γとＴＮＦ−αの頻度の向上によって示されている。本明細書に開示されている免疫原性組成物は、脾臓によるＩＦＮ−γ＋ＴＮＦ−α＋産生ＣＴＬの増大により、免疫応答の質を向上させることも示されている。これにより、より良好なＴ細胞応答の誘導における、ｒＭＶＡ−フラジェリンの有益な作用が示唆されている。本明細書に開示されている免疫原性組成物では、ｒＭＶＡ−フラジェリンが、Ｂ細胞応答、より具体的にはＴｈ１型の免疫応答に有益な作用を及ぼすとともに、ｒＭＶＡに比べて、血清中のＩｇＧ２ｃの力価がより高いことも示されている。ｒＭＶＡ−フラジェリンによる鼻腔内免疫後に、血清及びＢＡＬにおけるＭＶＡ特異的ＩｇＧ２ｃとＯＶＡ特異的ＩｇＧ２ｃの両方の向上した力価を観察できる。もちろん、粘膜免疫は最終的に、粘膜表面における分泌型ＩｇＡの産生によって特徴付けられる粘膜抗体応答を誘導する。これらの結果によって、鼻腔内経路によって投与する単独のｒＭＶＡとｒＭＶＡ−フラジェリンワクチンの両方が、ＢＡＬにおけるＩｇＡの産生を誘導できることを示す。この免疫原性組成物の方が、上気道において全身性免疫応答と粘膜免疫応答を誘導する効率が高いことが立証されているので、ｒＭＶＡ−フラジェリンによる鼻腔内免疫が、胃腸区画においても免疫応答を誘導できるかを調べた。腸管免疫を賦活できたとともに、腸洗浄液にＩｇＡが存在することが確認された。
【００９７】
インビボの自然免疫応答を調べることによって、ｒＭＶＡによって鼻腔内免疫したマウスに比べて、ｒＭＶＡ−フラジェリンで免疫したマウスのＢＡＬにおける増強したサイトカイン応答とともに、ＩＬ−１β、ＩＬ−１８及びＴＮＦ−αの増強した産生が示された。加えて、ｒＭＶＡ−フラジェリンの自然免疫認識を調べたところ、ｒＭＶＡ−フラジェリン特異的インフラマソーム及びＴＬＲ５依存性自然免疫認識を確認できた。また、ｒＭＶＡ−フラジェリンによる粘膜ＤＣの活性化も示された。
【００９８】
改変ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）
ＭＶＡは、トルコのアンカラのＶａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅに長年保持されているとともに、ヒトへのワクチンのベースとして用いられている皮膚ワクシニア株Ａｎｋａｒａ［漿尿膜ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａウイルス、ＣＶＡ、検討のためには、Ｍａｙｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９７５），Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ３，６−１４を参照］を鶏胚線維芽細胞で５７０回超連続継代することによって生成されている。しかしながら、ワクシニアウイルスと関連して、ワクチン接種後に重度の合併症が頻繁に起こることにより、更に弱毒化され、更に安全である天然痘ワクチンを生成する取り組みがいくつか行われた。
【００９９】
１９６０年〜１９７４年の期間中に、Ａｎｔｏｎ  Ｍａｙｒ教授は、ＣＥＦ細胞で５７０回超連続継代することにより、ＣＶＡの弱毒化に成功した［Ｍａｙｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９７５）］。様々な動物モデルにおいて、得られたＭＶＡが無発病性であることが示された［Ｍａｙｒ，Ａ．＆Ｄａｎｎｅｒ，Ｋ．（１９７８），Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．４１：２２５−２３４］。天然痘ワクチン前駆体としてのＭＶＡの初期開発の一部として、ワクシニアによる副作用のリスクを持つ対象において、ＭＶＡ−５１７をＬｉｓｔｅｒ  Ｅｌｓｔｒｅｅ［Ｓｔｉｃｋｌ（１９７４），Ｐｒｅｖ．Ｍｅｄ．３：９７−１０１、Ｓｔｉｃｋｌ  ａｎｄ  Ｈｏｃｈｓｔｅｉｎ−Ｍｉｎｔｚｅｌ（１９７１），Ｍｕｎｉｃｈ  Ｍｅｄ．Ｗｏｃｈｅｎｓｃｈｒ．１１３：１１４９−１１５３］とともに用いた臨床試験が行われた。１９７６年に、ＭＶＡ−５７１種株（継代５７１代目に相当する）に由来するＭＶＡが、ドイツで、非経口天然痘ワクチンの２段階接種プログラムにおけるプライマーワクチンとして登録された。その後、ＭＶＡ−５７２が、約１２０，０００人の白人（大半は、１〜３歳の小児）に使用され、その対象の多くは、ワクシニアと関連する合併症に対するリスクの高い集団に属していたが、重度の副作用は報告されなかった（Ｍａｙｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９７８），Ｚｅｎｔｒａｌｂｌ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（Ｂ）１６７：３７５−３９０）。ＭＶＡ−５７２は、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  ＣｕｌｔｕｒｅｓにＥＣＡＣＣ  Ｖ９４０１２７０７として寄託された。
【０１００】
ＭＶＡを弱毒化するために継代培養が用いられた結果、ＣＥＦ細胞における継代数に応じて、多種多様な株または単離物が存在している。例えば、ＭＶＡ−５７２は、ドイツにおいて、天然痘撲滅プログラムで使用され、ＭＶＡ−５７５は、動物用ワクチンとして広く用いられた。ＭＶＡ−５７５は、２０００年１２月７日に、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）に、寄託番号Ｖ００１２０７０７で寄託された。弱毒化ＣＶＡウイルスＭＶＡ（改変ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ）は、初代鶏胚線維芽細胞におけるＣＶＡの連続増殖（５７０回超の継代）によって得られた。
【０１０１】
１９７０年代に、Ｍａｙｒらのグループにより、ＭＶＡが、ヒト及び哺乳動物において高い弱毒性と無発病性を有することが示されたが、ある特定の研究者により、ＭＶＡは、哺乳動物及びヒト細胞株においては、残存複製を行い得るので、完全に弱毒性を持つわけではないことが報告されている［Ｂｌａｎｃｈａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８），Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ７９：１１５９−１１６７、Ｃａｒｒｏｌｌ＆Ｍｏｓｓ（１９９７），Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２３８：１９８−２１１、米国特許代５，１８５，１４６号、Ａｍｂｒｏｓｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９），Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｒｅｓ  ５５：５６９］。これらの文献に報告されている結果は、様々な既知のＭＶＡ株で得られたと考えられる。用いたウイルスは、特性、特に様々な細胞株における増殖挙動が本質的に異なるからである。このような残存複製は、ヒトでの使用に関連する安全性に対する懸念を含む様々な理由から、望ましくない。
【０１０２】
より安全な製品（ワクチンまたは医薬など）の開発のために、安全性プロファイルが向上したＭＶＡ株が、Ｂａｖａｒｉａｎ  Ｎｏｒｄｉｃによって開発された。すなわち、Ｂａｖａｒｉａｎ  Ｎｏｒｄｉｃは、ＭＶＡを更に継代して、ＭＶＡ−ＢＮとした。ＭＶＡとＭＶＡ−ＢＮは、祖先ＣＶＡウイルスと比べて、ゲノムの約１５％（６領域に由来する３１ｋｂ）が欠損している。この欠失は、病原性遺伝子及び宿主域遺伝子の数と、Ａ型封入体遺伝子に影響を及ぼす。継代５８３代目に相当するＭＶＡ−ＢＮのサンプルは、２０００年８月３０日に、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）にＶ０００８３００８という番号で寄託された。
【０１０３】
ＭＶＡ−ＢＮは、ヒト細胞に結合して進入することができ、その細胞内では、ウイルスによってコードされる遺伝子が、非常に効率的に発現する。しかしながら、子孫ウイルスの組み立てと放出は行われない。ＭＶＡ−ＢＮは、初代鶏胚線維芽（ＣＥＦ）細胞に強く適応しており、ヒト細胞では複製しない。ヒト細胞では、ウイルス遺伝子が発現し、感染性ウイルスは産生されない。ＭＶＡ−ＢＮは、米国の疾病予防管理センターによれば、バイオセーフティレベル１の有機物として分類される。ＭＶＡ−ＢＮ及び誘導体の調製物は、多くの種類の動物と、免疫不全の個体を含む２０００人超のヒト対象に投与されている。全てのワクチン接種は、概ね安全で、十分に耐えられることが証明されている。その高度な弱毒化と、低下した病原性にもかかわらず、前臨床試験において、ＭＶＡ−ＢＮは、ワクシニアと、ＭＶＡゲノムにクローニングした遺伝子によってコードされる異種の遺伝子産物に対する液性免疫応答と細胞性免疫応答の両方を惹起することが示されている［Ｅ．Ｈａｒｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００５），Ａｎｔｉｖｉｒ．Ｔｈｅｒ．１０（２）：２８５−３００、Ａ．Ｃｏｓｍａ  ｅｔ  ａｌ．（２００３），Ｖａｃｃｉｎｅ  ２２（１）：２１−９、Ｍ．Ｄｉ  Ｎｉｃｏｌａ  ｅｔ  ａｌ．（２００３），Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１４（１４）：１３４７−１３６０、Ｍ．Ｄｉ  Ｎｉｃｏｌａ  ｅｔ  ａｌ．（２００４），Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１０（１６）：５３８１−５３９０］。
【０１０４】
ＭＶＡの「誘導体」または「バリアント」は、本明細書に記載されているようなＭＶＡと本質的に同じ複製特性を示すが、ゲノムの１つ以上の部分が異なるウイルスを指す。ＭＶＡ−ＢＮと、ＭＶＡ−ＢＮの誘導体またはバリアントは、ヒト及びマウスでは、重度に免疫が抑制されたマウスでも、インビボにおいて増殖的に複製しない。より具体的には、ＭＶＡ−ＢＮまたはＭＶＡ−ＢＮの誘導体もしくはバリアントには、好ましくは、鶏胚線維芽細胞（ＣＥＦ）において増殖的に複製する機能はあるが、ヒトケラチノサイト細胞株ＨａＣａｔ［Ｂｏｕｋａｍｐ  ｅｔ  ａｌ（１９８８），Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １０６：７６１−７７１］、ヒト骨骨肉腫細胞株１４３Ｂ（ＥＣＡＣＣ  Ｎｏ．９１１１２５０２）、ヒト胚腎臓細胞株２９３（ＥＣＡＣＣ  Ｎｏ．８５１２０６０２）及びヒト子宮頸癌細胞株ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ−２）において増殖的に複製する機能はない。加えて、ＭＶＡ−ＢＮの誘導体またはバリアントのウイルス増幅倍率は、Ｈｅｌａ細胞及びＨａＣａＴ細胞株において、ＭＶＡ−５７５の少なくとも２倍減、より好ましくは３倍減である。ＭＶＡバリアントのこれらの特性の試験及びアッセイは、ＷＯ０２／４２４８０（ＵＳ２００３／０２０６９２６）及びＷＯ０３／０４８１８４（ＵＳ２００６／０１５９６９９）に記載されており、これらの特許はいずれも、参照により、本明細書に援用される。
【０１０５】
「増殖的に複製できない」または「増殖的複製の機能がない」という用語は、例えば、ＷＯ０２／４２４８０に説明されており、この特許には、上述のような所望の特性を有するＭＶＡを得る方法も教示されている。この用語は、ＷＯ０２／４２４８０または米国特許第６，７６１，８９３号に記載されているアッセイを用いた場合に、感染から４日目のウイルス増幅倍率が１未満であるウイルスに適用される。
【０１０６】
「増殖的に複製しない」という用語は、感染から４日目のウイルス増幅倍率が１未満であるウイルスを指す。ウイルス増幅倍率を求めるには、ＷＯ０２／４２４８０または米国特許第６，７６１，８９３号に記載されているアッセイを適用可能である。
【０１０７】
ウイルスの増幅または複製は通常、最初に細胞を感染させるために最初に用いた量（インプット）に対する、感染細胞から産生されたウイルス（アウトプット）の比（「増幅倍率」という）として表される。増幅倍率「１」は、感染細胞から産生されたウイルスの量が、細胞を感染させるために最初に用いた量と同じである増幅状態を定義するものであり、感染細胞が、ウイルスの感染及び複製に対する許容性を有することを意味する。これに対して、１未満の増幅倍率、すなわち、インプットレベルに比べてアウトプットが少ないことは、増殖的複製の欠乏、すなわち、ウイルスの弱毒化を示す。
【０１０８】
ＭＶＡベースのワクチンの利点としては、その安全性プロファイルと、大規模なワクチン生産への利用可能性が挙げられる。前臨床試験により、ＭＶＡ−ＢＮが、他のＭＶＡ株に比べて、優れた弱毒性と有効性を示すことが明らかになった（ＷＯ０２／４２４８０）。ＭＶＡ−ＢＮ株の更なる特性は、ワクシニアウイルスプライム／ワクシニアウイルスブーストのレジメにおいて、ＤＮＡプライム／ワクシニアウイルスブーストのレジメと比べると、実質的に同じレベルの免疫を誘導できることである。
【０１０９】
本発明における最も好ましい実施形態である組み換えＭＶＡ−ＢＮウイルスは、哺乳動物細胞における明らかな複製欠損性と、十分に確立された非病原性から、安全であると考えられる。さらに、その有効性に加えて、工業規模の製造の実現可能性は、有益であり得る。加えて、ＭＶＡベースのワクチンは、複数の異種の抗原を送達して、液性免疫と細胞性免疫を同時に誘導可能にできる。
【０１１０】
好ましい実施形態では、組み換えウイルスを生成するのに用いるいずれかの実施形態の組み換えＭＶＡベクターは、鶏胚線維芽細胞（ＣＥＦ）細胞においてインビトロで増殖的に複製できるが、ヒトケラチノサイト細胞株ＨａＣａｔ、ヒト骨骨肉腫細胞株１４３Ｂ、ヒト胚腎臓細胞株２９３及びヒト子宮頸癌細胞株ＨｅＬａにおいては増殖的に複製できないＭＶＡ−ＢＮウイルスまたは誘導体である。
【０１１１】
別の実施形態では、組み換えウイルスを生成するのに用いるいずれかの実施形態の組み換えＭＶＡベクターは、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）に、受託番号Ｖ０００８３００８で寄託されたようなＭＶＡ−ＢＮである。
【０１１２】
本発明で有用なＭＶＡベクターは、ＷＯ０２／０４２４８０及びＷＯ０２／２４２２４に記載されているような、当該技術分野において既知の方法を用いて調製でき、これらの特許はいずれも、参照により、本明細書に援用される。
【０１１３】
別の態様では、組み換えウイルスを生成するのに適するＭＶＡウイルス株は、ＭＶＡ−５７２株、ＭＶＡ−５７５株またはいずれかの同程度の弱毒化ＭＶＡ株であってよい。欠失漿尿膜ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ｄＣＶＡ）のような変異ＭＶＡも適することがある。ｄＣＶＡは、ＭＶＡゲノムのｄｅｌ  Ｉ、ｄｅｌ  ＩＩ、ｄｅｌ  ＩＩＩ、ｄｅｌ  ＩＶ、ｄｅｌ  Ｖ及びｄｅｌ  ＶＩ欠失部位を含む。これらの部位は、複数の異種配列の挿入のために特に有用である。ｄＣＶＡは、ヒト細胞株（ヒト２９３細胞株、１４３Ｂ細胞株及びＭＲＣ−５細胞株など）において増殖的に複製でき（増幅倍率１０超）、そして、ウイルスベースのワクチン接種策に有用な更なる変異によって最適化を可能にする（例えばＷＯ２０１１／０９２０２９を参照されたい）。
【０１１４】
免疫原性組成物及び疾患関連抗原
一態様では、本発明では、フラジェリンをコードする核酸配列と、異種の疾患関連抗原をコードする核酸配列とを含む組み換えポックスウイルス（例えば、改変ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）など）を含む免疫原性組成物であって、対象、例えばヒト対象に投与すると、異種の疾患関連抗原をコードする核酸配列を含むが、フラジェリンをコードする核酸配列を含まない組み換えＭＶＡの投与によって誘導される、その異種の疾患関連抗原に特異的なＴ細胞免疫応答及び／またはＢ細胞免疫応答に比べて、その異種の疾患関連抗原に特異的な増加したＴ細胞免疫応答及び／またはＢ細胞免疫応答を誘導する免疫原性組成物を提供する。
【０１１５】
ある特定の実施形態では、上記の核酸配列は、配列番号１に対するアミノ酸配列同一性が少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％であるアミノ酸配列を有するフラジェリンをコードする。ある特定の実施形態では、核酸配列は、配列番号１に対するアミノ酸配列同一性が少なくとも９５％であるアミノ酸配列を有するフラジェリンをコードする。ある特定の実施形態では、核酸配列は、配列番号１に対するアミノ酸配列同一性が少なくとも９６％であるアミノ酸配列を有するフラジェリンをコードする。ある特定の実施形態では、核酸配列は、配列番号１に対するアミノ酸配列同一性が少なくとも９７％であるアミノ酸配列を有するフラジェリンをコードする。ある特定の実施形態では、核酸配列は、配列番号１に対するアミノ酸配列同一性が少なくとも９８％であるアミノ酸配列を有するフラジェリンをコードする。ある特定の実施形態では、核酸配列は、配列番号１に対するアミノ酸配列同一性が少なくとも９９％であるアミノ酸配列を有するフラジェリンをコードする。ある特定の実施形態では、核酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列を有するフラジェリンをコードする。
【０１１６】
ある特定の実施形態では、上記の免疫原性組成物は、少なくとも２つの組み換えポックスウイルス（例えばＭＶＡ）を含み、その１つは、フラジェリンをコードする核酸を含み、１つは、異種の疾患関連抗原をコードする核酸を含み、この免疫原性組成物は、ヒト対象に投与されると、異種の疾患関連抗原に特異的な増加したＴ細胞免疫応答を誘導する。
【０１１７】
フラジェリンをコードする核酸は、発現制御配列に機能的に連結できる。コーディング配列に機能的に連結されている発現制御配列は、その発現制御配列と適合する条件で、そのコーディング配列の発現が行われるように結合されている。発現制御配列としては、適切なプロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、タンパク質コードオープンリーディングフレームの最初の開始コドン、イントロンのスプライシングシグナル及びフレーム内終止コドンが挙げられるが、これらに限らない。適切なプロモーターとしては、ＳＶ４０初期プロモーター、レトロウイルスＬＴＲ、アデノウイルス主要後期プロモーター、ヒトＣＭＶ前初期Ｉプロモーター及び様々なポックスウイルスプロモーターが挙げられるが、これらに限らず、様々なポックスウイルスプロモーターとしては、ワクシニアウイルスすなわちＭＶＡ由来プロモーター（３０Ｋプロモーター、Ｉ３プロモーター、ｓＥ／Ｌプロモーター、Ｐｒ７．５Ｋ、４０Ｋプロモーター、Ｃ１プロモーター、ＰｒＳｙｎＩＩｍプロモーター、ＰｒＬＥ１プロモーター、ＰｒＨ５ｍプロモーター、ＰｒＳプロモーター、ハイブリッド初期／後期プロモーター、ＰｒＳ５Ｅプロモーター、ＰｒＡ５Ｅプロモーター及びＰｒ４ＬＳ５Ｅプロモーター）、牛痘ウイルスＡＴＩプロモーター、または鶏痘由来プロモーター（Ｐｒ７．５Ｋプロモーター、Ｉ３プロモーター、３０Ｋプロモーターまたは４０Ｋプロモーター）が挙げられるが、これらに限らない。
【０１１８】
追加の発現制御配列としては、リーダー配列、終止コドン、ポリアデニル化シグナル、及び所望の宿主系において、所望の組み換えタンパク質（例えばフラジェリン）をコードする核酸配列を適切に転写し、その後翻訳するのに必要なその他の配列が挙げられるが、これらに限らない。組み換えポックスウイルス（例えばＭＶＡ）は、所望の宿主系において、核酸配列を含む発現ベクターの転写と、その後の複製に必要な追加の要素も含んでよい。更に、当業者であれば、このようなベクターは、従来の方法（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）ｉｎ  “Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，”Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）を用いれば、容易に構築されるとともに、市販されていることが分かるであろう。
【０１１９】
ある特定の実施形態では、本明細書に開示されている組み換えポックスウイルス（例えばＭＶＡ）は、１つ以上の共刺激分子をコードする核酸分子を更に含む。ある特定の実施形態では、１つ以上の共刺激分子は、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−３、４−１ＢＢＬ、ＣＤ５９、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＶＣＡＭ−１及びＯＸ−４０Ｌからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、本明細書に開示されている組み換えポックスウイルス（例えばＭＶＡ）は、１つの共刺激分子をコードする核酸分子を更に含む。ある特定の実施形態では、本明細書に開示されている組み換えポックスウイルス（例えばＭＶＡ）は、２つの共刺激分子をコードする１つ以上の核酸分子を更に含む。ある特定の実施形態では、本明細書に開示されている組み換えポックスウイルス（例えばＭＶＡ）は、３つの共刺激分子をコードする１つ以上の核酸分子を更に含む。ある特定の実施形態では、その３つの共刺激分子は、Ｂ７−１、ＩＣＡＭ−１及びＬＦＡ−３（すなわちＴＲＩＣＯＭ）である。ある特定の実施形態では、組み換えポックスウイルス（例えばＭＶＡ）は、ヒトＢ７．１、ヒトＩＣＡＭ−１及びヒトＬＦＡ−３をコードする１つ以上の核酸分子を含む。ある特定の実施形態では、Ｂ７−１、ＩＣＡＭ−１及びＬＦＡ−３をコードする核酸分子は、同じ発現制御配列の制御下にある。ある特定の実施形態では、Ｂ７−１、ＩＣＡＭ−１及びＬＦＡ−３をコードする核酸は、異なる発現制御配列の制御下にある。
【０１２０】
少なくとも３つの共刺激分子を用いると、フラジェリンをコードする組み換えポックスウイルス（例えばＭＶＡ）によって誘導される免疫応答が相乗的に増強され、この相乗作用は、１つまたは２つの共刺激分子を用いるだけでは得られない。共刺激分子の有効な組み合わせは、所望の免疫応答と、治療する疾患または状態に応じて、Ｂ７−１、ＩＣＡＭ−１及びＬＦＡ−３、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＩＣＡＭ−１及びＬＦＡ−３、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＩＣＡＭ−１及び４−１ＢＢＬ、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−３及び４−１ＢＢＬ、ＣＤ５９及びＶＣＡＭ−１、Ｂ７−１及びＢ７−２、ＣＤ５９、ＣＤ４０、４−１ＢＢＬ及びＣＤ７０、ＶＣＡＭ−１、Ｂ７−１及びＢ７−２、ならびにＯＸ−４０Ｌ及び４−１ＢＢＬなどからなる群から選択される（例えば、米国特許７，２１１，４３２を参照されたい。この特許は、参照により、その全体が本明細書に援用される）。
【０１２１】
本明細書に開示されている組み換えポックスウイルス（例えばＭＶＡ）に組み込むことができる共刺激分子をコードする遺伝子またはその機能部分としては、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−３、４−１ＢＢＬ、ＣＤ５９、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＯＸ−４０Ｌ及びそれらの哺乳動物ホモログが挙げられるが、これらに限らない。
【０１２２】
「Ｂ７」という用語は、免疫グロブリン（「Ｉｇ」）遺伝子スーパーファミリーのメンバーである共刺激分子のファミリーを指す。そのメンバーとしては、Ｂ７−１（「ＣＤ８０」としても知られている）及びＢ７−２（「ＣＤ８６」としても知られている）が挙げられ、これらは、ＣＤ２８及びＣＴＬＡ−４（「ＣＤ１５２」としても知られている）の天然リガンドである。マウスＢ７．１の遺伝子配列は、ＧｅｎＢａｎｋに、受託番号Ｘ６０９５８で寄託されている。例えば、Ｆｒｅｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：２７１４−２７２２（１９８９）を参照されたい。マウスＢ７．２の遺伝子配列は、ＧｅｎＢａｎｋに、受託番号Ｌ２５６０６で寄託されている。例えば、Ａｚｕｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６６：７６−７９（１９９３）を参照されたい。共刺激分子のマウスＢ７−１及びＢ７−２のヒトホモログとしては、ＣＤ８０（マウスＢ７．１のホモログ）と、ＣＤ８６（マウスＢ７．２のホモログ）が挙げられる。ヒトＢ７．１の遺伝子配列は、ＧｅｎＢａｎｋに、受託番号Ｍ２７５３３で寄託されている。ヒトＢ７．２（ＣＤ８６）の遺伝子配列は、ＧｅｎＢａｎｋに、受託番号Ｕ０４３４３及びＡＦ０９９１０５で寄託されている。
【０１２３】
「細胞間接着分子」（「ＩＣＡＭ」）という用語は、Ｉｇ遺伝子スーパーファミリーのメンバーである共刺激分子のファミリーを指す。そのメンバーとしては、ＩＣＡＭ−１（「ＣＤ５４」としても知られている）、ＩＣＡＭ−２（「ＣＤ１０２」としても知られている）、ＩＣＡＭ−３（「ＣＤ５０」としても知られている）、ＩＣＡＭ−４（「ＣＤ２４２」としても知られている）及びＩＣＡＭ−５が挙げられ、これらは、リンパ球と顆粒球の表面に発現する白血球インテグリンＣＤ１１ａ／ＣＤ１８（「白血球機能関連抗原−１」または「ＬＦＡ−１」としても知られている）の天然リガンドである。ヒトＩＣＡＭ−１の遺伝子配列は、ＧｅｎＢａｎｋに、受託番号Ｊ０３１３２で寄託されている。マウスＩＣＡＭ−１の遺伝子配列は、ＧｅｎＢａｎｋに、受託番号Ｘ５２２６４で寄託されている。
【０１２４】
「白血球機能関連抗原」（「ＬＦＡ」）という用語は、細胞接着に関与する共刺激分子のファミリーを指す。そのメンバーとしては、ＬＦＡ−１（「ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８」としても知られている）、ＬＦＡ−２（「ＣＤ２」としても知られている）及びＬＦＡ−３（「ＣＤ５８」としても知られている）が挙げられる。ＬＦＡ−３は、グリコシル−ホスファチジルイノシトール結合型糖タンパク質であり、Ｉｇ遺伝子スーパーファミリーのＣＤ２ファミリーのメンバーである。ＬＦＡ−３の天然リガンドは、胸腺細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞及びナチュラルキラー（「ＮＫ」）細胞の上で発現するＣＤ２（「ＬＦＡ−２」としても知られている）である。ヒトＬＦＡ−３の遺伝子配列は、ＧｅｎＢａｎｋに、受託番号Ｙ００６３６で寄託されている。マウスＬＦＡ−３の遺伝子配列は、ＧｅｎＢａｎｋに、受託番号Ｘ５３５２６で寄託されている。
【０１２５】
本発明の実施の際に有用であるポックスウイルス株の例としては、オルトポックスウイルス、アビポックスウイルス、パラポックスウイルス、ヤタポックスウイルス及びモラシポックスウイルスが挙げられるが、これらに限らず、好ましくは、オルトポックスウイルス及び／またはアビポックスウイルスである。ある特定の実施形態では、組み換えポックスウイルスは、オルトポックスウイルス、アビポックスウイルス、パラポックスウイルス、ヤタポックスウイルス及びモラシポックスウイルスからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、組み換えポックスウイルスは、アビポックスウイルスである。ある特定の実施形態では、アビポックスウイルスは、カナリア痘ウイルス及び鶏痘ウイルスからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、アビポックスウイルスは、カナリア痘ウイルスである。ある特定の実施形態では、アビポックスウイルスは、鶏痘ウイルスである。
【０１２６】
ある特定の実施形態では、組み換えポックスウイルスは、オルトポックスウイルスである。ある特定の実施形態では、オルトポックスウイルスは、ワクシニアウイルス、牛痘ウイルス及びサル痘ウイルスからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、オルトポックスウイルスは、ワクシニアウイルスである。ある特定の実施形態では、ワクシニアウイルスは、野生型ワクシニアウイルス、ワクシニアウイルスＷｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅｒｖｅ、ワクシニアウイルスＣｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｄｒｙｖａｘ（ワクシニアウイルスＷｙｅｔｈとしても知られている）、ＡＣＡＭ２０００及びＭＶＡからなる群から選択される。
【０１２７】
本発明の実施の際に有用であるとともに、ブダペスト条約の規定下で寄託されているＭＶＡウイルス株の例は、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ），Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｐｏｒｔｏｎ  Ｄｏｗｎ，Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ  ＳＰ４  ０ＪＧ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）に、寄託番号ＥＣＡＣＣ９４０１２７０７で、１９９４年１月２７日に寄託されたＭＶＡ５７２株、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）に、寄託番号ＥＣＡＣＣ００１２０７０７で、２０００年１２月７日に寄託されたＭＶＡ５７５株である。２０００年８月３０日に、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）に、寄託番号Ｖ０００８３００８で寄託されたＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）とその誘導体は、更なる例示的な株である。
【０１２８】
ある特定の実施形態では、組み換えＭＶＡは、ＭＶＡ−５７２である。ある特定の実施形態では、組み換えＭＶＡは、ＭＶＡ−５７５である。ある特定の実施形態では、組み換えＭＶＡは、ＭＶＡ−ＢＮまたはその誘導体である。
【０１２９】
ある特定の実施形態では、増加したＴ細胞免疫応答には、異種の疾患関連抗原に特異的な細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の数が増えることが含まれる。ある特定の実施形態では、異種の疾患関連抗原に特異的なＣＴＬの数が増えることにより、異種の疾患関連抗原をコードする核酸配列を含むが、フラジェリンをコードする核酸配列を含まない組み換えＭＶＡの投与によって誘導されるＣＴＬと比べて、増加した細胞溶解活性も示す。ある特定の実施形態では、増加したＴ細胞免疫応答には、異種の疾患関連抗原に特異的なメモリーＴ細胞の数が増えることも含まれる。ある特定の実施形態では、増加したＴ細胞免疫応答には、異種の疾患関連抗原に特異的なＣＴＬの数が増えることと、異種の疾患関連抗原に特異的なメモリーＴ細胞の数が増えることが含まれる。ある特定の実施形態では、異種の疾患関連抗原に特異的なＣＴＬの数が増えることにより、異種の疾患関連抗原をコードする核酸配列を含むが、フラジェリンをコードする核酸配列を含まない組み換えＭＶＡの投与によって誘導されるＣＴＬと比べて、増加した細胞溶解活性も示す。
【０１３０】
ある特定の実施形態では、異種の疾患関連抗原は、感染性疾患抗原または腫瘍関連抗原である。ある特定の実施形態では、異種の疾患関連抗原は、腫瘍関連抗原である。ある特定の実施形態では、腫瘍関連抗原は、５−α−レダクターゼ、α−フェトプロテイン（「ＡＦＰ」）、ＡＭ−１、ＡＰＣ、Ａｐｒｉｌ、Ｂメラノーマ抗原遺伝子（「ＢＡＧＥ」）、β−カテニン、Ｂｃｌ１２、ｂｃｒ−ａｂｌ、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、ＣＡ−１２５、カスパーゼ−８（「ＣＡＳＰ−８」、「ＦＬＩＣＥ」としても知られている）、カテプシン、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１／補体レセプター２（「ＣＲ２」）、ＣＤ２２／ＢＬ−ＣＡＭ、ＣＤ２３／ＦｃεＲＩＩ、ＣＤ３３、ＣＤ３５／補体レセプター１（「ＣＲ１」）、ＣＤ４４／ＰＧＰ−１、ＣＤ４５／白血球共通抗原（「ＬＣＡ」）、ＣＤ４６／膜補因子タンパク質（「ＭＣＰ」）、ＣＤ５２／ＣＡＭＰＡＴＨ−１、ＣＤ５５／崩壊促進因子（「ＤＡＦ」）、ＣＤ５９／プロテクチン、ＣＤＣ２７、ＣＤＫ４、癌胎児性抗原（「ＣＥＡ」）、ｃ−ｍｙｃ、シクロオキシゲナーゼ−２（「ｃｏｘ−２」）、大腸がん欠失遺伝子（「ＤＣＣ」）、ＤｃＲ３、Ｅ６／Ｅ７、ＣＧＦＲ、ＥＭＢＰ、Ｄｎａ７８、ファルネシルトランスフェラーゼ、線維芽細胞増殖因子−８ａ（「ＦＧＦ８ａ」）、線維芽細胞増殖因子−８ｂ（「ＦＧＦ８ｂ」）、ＦＬＫ−１／ＫＤＲ、葉酸レセプター、Ｇ２５０、Ｇメラノーマ抗原遺伝子ファミリー（「ＧＡＧＥ−ファミリー」）、ガストリン１７、ガストリン放出ホルモン、ガングリオシド２（「ＧＤ２」）／ガングリオシド３（「ＧＤ３」）／ガングリオシド−モノシアル酸−２（「ＧＭ２」）、ゴナドトロピン放出ホルモン（「ＧｎＲＨ」）、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ：Ｒ１Ｍａｎ（α１−６）Ｒ２［ＧｌｃＮＡｃ−Ｍａｎ（α１−６）］β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ（「ＧｎＴ  Ｖ」）、ＧＰ１、ｇｐ１００／Ｐｍｅ１１７、ｇｐ−１００−ｉｎ４、ｇｐ１５、ｇｐ７５／チロシン関連タンパク質−１（「ｇｐ７５／ＴＲＰ−１」）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（「ｈＣＧ」）、ヘパラナーゼ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ヒト乳癌ウイルス（「ＨＭＴＶ」）、７０キロダルトン熱ショックタンパク質（「ＨＳＰ７０」）、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（「ｈＴＥＲＴ」）、インスリン様増殖因子レセプター−１（「ＩＧＦＲ−１」）、インターロイキン−１３レセプター（「ＩＬ−１３Ｒ」）、誘導型一酸化窒素合成酵素（「ｉＮＯＳ」）、Ｋｉ６７、ＫＩＡＡ０２０５、Ｋ−ｒａｓ、Ｈ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ、ＫＳＡ、ＬＫＬＲ−ＦＵＴ、メラノーマ抗原コードファミリー（「ＭＡＧＥファミリー」、少なくともＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３及びＭＡＧＥ−４を含む）、マンマグロビン、ＭＡＰ１７、Ｍｅｌａｎ−Ａ／Ｔ細胞認識メラノーマ抗原−１（「ＭＡＲＴ−１」）、メソセリン、ＭＩＣ  Ａ／Ｂ、ＭＴ−ＭＭＰ、ムチン、精巣特異的抗原ＮＹ−ＥＳＯ−１、オステオネクチン、ｐ１５、Ｐ１７０／ＭＤＲ１、ｐ５３、ｐ９７／メラノトランスフェリン、ＰＡＩ−１、血小板由来増殖因子（「ＰＤＧＦ」）、μＰＡ、ＰＲＡＭＥ、プロバシン、プロゲニポエチン、前立腺特異的抗原（「ＰＳＡ」）、前立腺特異的���抗原（「ＰＳＭＡ」）、前立腺酸性ホスファターゼ（「ＰＡＰ」）、ＲＡＧＥ−１、Ｒｂ、ＲＣＡＳ１、ＳＡＲＴ−１、ＳＳＸファミリー、ＳＴＡＴ３、ＳＴｎ、ＴＡＧ−７２、形質転換増殖因子α（「ＴＧＦ−α」）、形質転換増殖因子β（「ＴＧＦ−β」）、チモシンβ１５、腫瘍壊死因子α（「ＴＮＦ−α」）、ＴＰ１、ＴＲＰ−２、チロシナーゼ、血管内皮増殖因子（「ＶＥＧＦ」）、ＺＡＧ、ｐ１６ＩＮＫ４及びグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（「ＧＳＴ」）からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、腫瘍関連抗原はＢｒａｃｈｙｕｒｙである。ある特定の実施形態では、腫瘍関連抗原はＰＳＡである。ある特定の実施形態では、腫瘍関連抗原はＣＥＡである。ある特定の実施形態では、腫瘍関連抗原、ＭＵＣ−１である。ある特定の実施形態では、腫瘍関連抗原は、ＣＥＡ及びＭＵＣ−１である。
【０１３１】
ある特定の実施形態では、異種の疾患関連抗原は、感染性疾患抗原である。ある特定の実施形態では、感染性疾患抗原は、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原または寄生虫抗原である。
【０１３２】
ある特定の実施形態では、感染性疾患抗原は、ウイルス抗原である。ある特定の実施形態では、ウイルス抗原は、アデノウイルス、アルボウイルス、アストロウイルス、コロナウイルス、コクサッキーウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、サイトメガロウイルス（「ＣＭＶ」）、デングウイルス、エボラウイルス、エプスタイン・バーウイルス（「ＥＢＶ」）、口蹄疫ウイルス、グアナリトウイルス、ヘンドラウイルス、単純ヘルペスウイルス１型（「ＨＳＶ−１」）、単純ヘルペスウイルス２型（「ＨＳＶ−２」）、ヒトヘルペスウイルス６型（「ＨＨＶ−６」）、ヒトヘルペスウイルス８型（「ＨＨＶ−８」）、Ａ型肝炎ウイルス（「ＨＡＶ」）、Ｂ型肝炎ウイルス（「ＨＢＶ」）、Ｃ型肝炎ウイルス（「ＨＣＶ」）、Ｄ型肝炎ウイルス（「ＨＤＶ」）、Ｅ型肝炎ウイルス（「ＨＥＶ」）、ヒト免疫不全ウイルス（「ＨＩＶ」）、インフルエンザウイルス、日本脳炎ウイルス、フニンウイルス、ラッサウイルス、マチュポウイルス、マールブルグウイルス、麻疹ウイルス、ヒトメタニューモウイルス、伝染性軟属腫ウイルス、ムンプスウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ニパウイルス、ノロウイルス、ノーウォークウイルス、ヒトパピローマウイルス（「ＨＰＶ」）、パラインフルエンザウイルス、パルボウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（「ＲＳＶ」）、ライノウイルス、ロタウイルス、風疹ウイルス、サビアウイルス、重症急性呼吸器症候群ウイルス（「ＳＡＲＳ」）、水痘帯状疱疹ウイルス、痘瘡ウイルス、ウエストナイルウイルス及び黄熱病ウイルスからなる群から選択されるウイルスに由来する。
【０１３３】
ある特定の実施形態では、感染性疾患抗原は、細菌抗原である。ある特定の実施形態では、細菌抗原は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｃａｎｉｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｓｕｉｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｍａｌｌｅｉ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｔｈｅｒｉａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、ｅｎｔｅｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）１５７：Ｈ７、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ及びＹｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓに由来する抗原からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、細菌抗原は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓに由来する。
【０１３４】
ある特定の実施形態では、感染性疾患抗原は、真菌抗原である。ある特定の実施形態では、真菌抗原は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｃｌａｖａｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｄｕｂｌｉｎｉｅｎｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｌｂｉｄｕｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｔｔｉｉ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｕｒｅｎｔｉｉ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ  ｃａｎｉｓ、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｊｉｒｏｖｅｃｉｉ、Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ  ｓｃｈｅｎｃｋｉｉ、Ｓｔａｃｈｂｏｔｒｙｓ  ｃｈａｒｔａｒｕｍ、Ｔｉｎｅａ  ｂａｒｂａｅ、Ｔｉｎｅａ  ｃａｐｔｉｔｉｓ、Ｔｉｎｅａ  ｃｏｒｐｏｒｉｓ、Ｔｉｎｅａ  ｃｒｕｒｉｓ、Ｔｉｎｅａ  ｆａｃｉｅｉ、Ｔｉｎｅａ  ｉｎｃｏｇｎｉｔｏ、Ｔｉｎｅａ  ｎｉｇｒａ、Ｔｉｎｅａ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｒｕｂｒｕｍ及びＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｔｏｎｓｕｒａｎｓに由来する抗原からなる群から選択される。
【０１３５】
ある特定の実施形態では、感染性疾患抗原は、寄生虫抗原である。ある特定の実施形態では、寄生虫抗原は、Ａｎｉｓａｋｉｓ  ｓｐｐ．、Ｂａｂｅｓｉａ  ｓｐｐ．、Ｂａｙｌｉｓａｓｃａｒｉｓ  ｐｒｏｃｙｏｎｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｐ．、Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒａ  ｃａｙｅｔａｎｅｎｓｉｓ、Ｄｉｐｈｙｌｌｏｂｏｔｈｒｉｕｍ  ｓｐｐ．、Ｄｒａｃｕｎｃｕｌｕｓ  ｍｅｄｉｎｅｎｓｉｓ、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ、Ｇｉａｒｄｉａ  ｄｕｏｄｅｎａｌｉｓ、Ｇｉａｒｄｉａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、Ｇｉａｒｄｉａ  ｌａｍｂｌｉａ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｓｐ．、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｍａｎｓｏｎｉ、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｈａｅｍａｔｏｂｉｕｍ、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ、Ｔａｅｎｉａ  ｓｐｐ．、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ、Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ  ｓｐｉｒａｌｉｓ及びＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉに由来する抗原からなる群から選択される。
【０１３６】
医薬組成物
ある特定の実施形態では、本発明で提供する免疫原性組成物のいずれも、製薬学的に許容可能な担体を更に含む。ある特定の実施形態では、免疫原性組成物は、溶液に、１０４〜１０９ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０５〜５×１０８ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０６〜１０８ＴＣＩＤ５０／ｍｌまたは１０７〜１０８ＴＣＩＤ５０／ｍｌの濃度範囲で配合できる。ヒトに対する好ましい用量には、１０６ＴＣＩＤ５０、１０７ＴＣＩＤ５０、１０８ＴＣＩＤ５０または５×１０８ＴＣＩＤ５０の用量を含め、１０６〜１０９ＴＣＩＤ５０が含まれる。
【０１３７】
本発明で提供する免疫原性組成物は概して、１つ以上の製薬学的に許容可能及び／または認可された担体、添加剤、抗生物質、保存剤、アジュバント、希釈剤及び／または安定剤を含んでよい。このような補助物質は、水、生理食塩水、グリセロール、エタノール、湿潤剤、乳化剤、ｐＨ緩衝物質などであることができる。適切な担体は典型的には、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー、脂質集合体などのように、ゆっくり代謝される大分子である。
【０１３８】
ワクチンの調製のために、本発明で提供する免疫原性組成物は、生理学的に許容可能な形態に変換できる。この変換は、Ｈ．Ｓｔｉｃｋｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｔｓｃｈ．ｍｅｄ．Ｗｓｃｈｒ．９９：２３８６−２３９２（１９７４）に記載されているような、天然痘に対するワクチン接種に用いるポックスウイルスワクチンの調製の際の経験に基づいて行うことができる。
【０１３９】
例えば、精製ウイルスを−８０℃で、５×１０８ＴＣＩＤ５０／ｍｌの力価で、約１０ｍＭのＴｒｉｓ、１４０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．７）に配合した状態で保存できる。ワクチン注射剤の調製のためには、例えば、アンプル、好ましくはガラスアンプル内で、１００ｍｌのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中で、２％ペプトンと１％ヒトアルブミンの存在下で、１０２〜１０８または１０２〜１０９個のウイルス粒子を凍結乾燥できる。あるいは、ワクチン注射剤は、製剤中のウイルスを段階的に凍結乾燥することによっても生成できる。この製剤は、マンニトール、デキストラン、糖、グリシン、ラクトースもしくはポリビニルピロリドンのような追加の添加剤、またはインビボ投与に適する酸化防止剤、不活性ガス、安定剤もしくは組み換えタンパク質（例えばヒト血清アルブミン）のような他の補助剤を含むことができる。続いて、そのガラスアンプルを密封し、４℃〜室温で、数カ月間保存することができる。しかしながら、必要がない限りは、アンプルは、好ましくは−２０℃未満の温度で保存する。
【０１４０】
ワクチン接種または治療の際には、凍結乾燥体を水溶液、好ましくは生理食塩水またはトリス緩衝液に溶解させて、全身または局所投与でき、すなわち、非経口経路、皮下経路、静脈内経路、筋内経路、鼻腔内経路、または当業者に知られているいずれかの他の投与経路で投与することができる。好ましい実施形態では、凍結乾燥体は、鼻腔内投与する。当業者は、既知の方法で、投与方法、投与用量及び投与数を最適化できる。
【０１４１】
免疫原性組成物を含むキット
本発明では、本明細書に開示されている免疫原性組成物のいずれか１つ以上を含むキットも提供する。このキットは、免疫原性組成物の１つまたは複数の容器またはバイアルとともに、感染性疾患に罹患するか、または腫瘍を患うリスクのある対象に免疫原性組成物を投与することに関する説明書を含むことができる。ある特定の実施形態では、対象はヒトである。説明書には、免疫原性組成物を対象に１回または複数回（すなわち、２回、３回、４回など）投与すべき旨を示してもよい。ある特定の実施形態では、説明書には、ナイーブ対象または非ナイーブ対象に対して、免疫原性組成物の１回目の投与（プライミング）を行ってから、１回以上ブースティング投与を行うべき旨が示される。さらに、免疫原性組成物を、１回目の投与（プライミング）用の第１のバイアルまたは容器と、その後の１回以上のブースティング投与用の１つ以上の追加のバイアルまたは容器に含むキットも提供する。
【０１４２】
組み換えＭＶＡウイルスの方法及び使用
本発明では、疾患関連抗原に対する抗原特異的免疫応答を増強させる方法であって、本発明で提供する免疫原性組成物のいずれかを、それが必要な対象に投与することを含み、その免疫原性組成物が、対象に投与されると、その異種の疾患関連抗原に特異的な増加したＴ細胞免疫応答を誘導する方法と、本発明で提供する免疫原性組成物であって、対象を免疫する方法で用いる免疫原性組成物のいずれかと、対象を免疫する医薬の調製の際に、本発明で提供する免疫原性組成物のいずれかを使用することとも提供する。
【０１４３】
本発明では、フラジェリンをコードする核酸配列と、異種の疾患関連抗原をコードする核酸配列とを含む組み換え改変ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）を含む免疫原性組成物であって、対象に投与すると、異種の疾患関連抗原をコードする核酸配列を含むが、フラジェリンをコードする核酸配列を含まない組み換えＭＶＡの投与によって誘導される、その異種の疾患関連抗原に特異的なＴ細胞免疫応答及び／またはＢ細胞免疫応答に比べて、その異種の疾患関連抗原に特異的な増加したＴ細胞免疫応答及び／またはＢ細胞免疫応答を誘導する際に用いる免疫原性組成物も提供する。
【０１４４】
ある特定の実施形態では、対象は哺乳動物である。ある特定の実施形態では、哺乳動物は、ラット、ウサギ、ブタ、マウスまたはヒトであり、上記の方法は、対象に、本発明で提供する免疫原性組成物のいずれか１つ以上を、ある用量投与することを含む。
【０１４５】
対象は、好ましくはヒトであり、成人であってよい。ある特定の実施形態では、その成人の年齢は、５０歳超、５５歳超、６０歳超、６５歳超、７０歳超、７５歳超、８０歳超または８５歳超である。ある特定の実施形態では、対象は、５歳未満、３歳未満、２歳未満、１５カ月未満、１２カ月未満、９カ月未満、６カ月未満または３カ月未満である。ある特定の実施形態では、対象は、０〜３カ月、３〜６カ月、６〜９カ月、９〜１２カ月、１〜２歳または２〜５歳である。ある特定の実施形態では、対象は、１歳、２歳、３歳、４歳、５歳、６歳、７歳、８歳、９歳、１０歳、１１歳、１２歳、１３歳、１４歳、１５歳、１６歳、１７歳、１８歳、１９歳、２０歳、２１歳、２２歳、２３歳、２４歳、２５歳、２６歳、２７歳、２８歳、２９歳、３０歳、３１歳、３２歳、３３歳、３４歳、３５歳、３６歳、３７歳、３８歳、３９歳、４０歳、４１歳、４２歳、４３歳、４４歳、４５歳、４６歳、４７歳、４８歳、４９歳、５０歳、５１歳、５２歳、５３歳、５４歳、５５歳、５６歳、５７歳、５８歳、５９歳、６０歳、６１歳、６２歳、６３歳、６４歳、６５歳、６６歳、６７歳、６８歳、６９歳、７０歳、７１歳、７２歳、７３歳、７４歳、７５歳、または７５歳超の年齢である。
【０１４６】
ある特定の実施形態では、本発明で提供する免疫原性組成物のいずれも、対象に、１０６〜１０９ＴＣＩＤ５０の用量、１０６〜５×１０８ＴＣＩＤ５０の用量、または１０７〜１０８ＴＣＩＤ５０で投与する。本発明で提供する免疫原性組成物は、対象に、１０６ＴＣＩＤ５０、１０７ＴＣＩＤ５０、１０８ＴＣＩＤ５０または５×１０８ＴＣＩＤ５０の用量で投与してもよい。ある特定の実施形態では、本発明で提供する免疫原性組成物のいずれも、ヒト対象に、１０７ＴＣＩＤ５０、１０８ＴＣＩＤ５０または５×１０８ＴＣＩＤ５０の用量で投与する。
【０１４７】
ある特定の実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、少なくとも２つの組み換えポックスウイルス（例えばＭＶＡ）を含み、その１つは、フラジェリンをコードする核酸を含み、１つは、異種の疾患関連抗原をコードする核酸を含み、この免疫原性組成物は、ヒト対象に投与されると、その異種の疾患関連抗原に特異的な増加したＴ細胞免疫応答及び／またはＢ細胞免疫応答を誘導する。
【０１４８】
ある特定の実施形態では、本発明で提供する免疫原性組成物は、対象に、１回または複数回（すなわち、２回、３回、４回など）投与する。ある特定の実施形態では、免疫原性組成物は、１回目の（プライミング）接種を行ってから、１回以上ブースティング投与を行う。ある特定の実施形態では、１回目の用量は、１０７〜１０８ＴＣＩＤ５０の免疫原性組成物を含み、２回目の用量は、１０７〜１０８ＴＣＩＤ５０の免疫原性組成物を含む。
【０１４９】
ある特定の実施形態では、１回目の後の１回以上のブースティング投与には、その前に投与したものと同じ組み換えポックスウイルスベクターが含まれ、上記の方法には、同種のプライム−ブーストワクチン接種が含まれる。ある特定の実施形態では、１回目の後の１回以上のブースティング投与には、その前に投与したものとは異なる組み換えポックスウイルスベクターが含まれ、上記の方法には、異種のプライム−ブーストワクチン接種が含まれる。ある特定の実施形態では、投与される第１のポックスウイルスベクター（すなわち、プライミングワクチン接種）は、オルトポックスウイルスベクターである。ある特定の実施形態では、そのオルトポックスウイルスベクターは、ＭＶＡまたはＭＶＡ−ＢＮである。ある特定の実施形態では、投与される第２のポックスウイルスベクター（すなわち、１回以上のブースティングワクチン接種）は、アビポックスウイルスである。ある特定の実施形態では、投与される第２の組み換えポックスウイルスベクター（すなわち、１回以上のブースティングワクチン接種）は、アビポックスウイルスである。ある特定の実施形態では、そのアビポックスウイルスベクターは、カナリア痘ウイルスベクターまたは鶏痘ウイルスベクターである。ある特定の実施形態では、アビポックスウイルスベクターは、カナリア痘ウイルスベクターである。ある特定の実施形態では、アビポックスウイルスベクターは、鶏痘ウイルスベクターである。
【０１５０】
ある特定の実施形態では、１回目の後の１回以上の投与（すなわち、１回以上のブースティングワクチン接種）は、最初のプライミングワクチン接種の投与後、数日、数週間、数カ月を含む間隔で行う。ある特定の実施形態では、１回目の後の１回以上の組み換えポックスウイルスベクター投与（すなわち、１回以上のブースティングワクチン接種）は、初期量の組み換えポックスウイルスベクターの投与（すなわち、プライミングワクチン接種）後、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、またはそれを超える間隔で行う。ある特定の実施形態では、１回目の後の１回以上の組み換えポックスウイルスベクター投与（すなわち、１回以上のブースティングワクチン接種）は、初期量の組み換えポックスウイルスベクターの投与（すなわち、プライミングワクチン接種）後、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、またはそれを超える間隔で行う。ある特定の実施形態では、１回目の後の１回以上の組み換えポックスウイルスベクターの投与（すなわち、１回以上のブースティングワクチン接種）は、最初のプライミングワクチン接種の投与後、１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月、７カ月、８カ月、９カ月、１０カ月、１１カ月、１２カ月、またはそれを超える間隔で行う。ある特定の実施形態では、１回目の後の１回以上の組み換えポックスウイルスベクター投与（すなわち、１回以上のブースティングワクチン接種）は、最初のプライミングワクチン接種の投与後、本明細書に開示されている間隔（例えば、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、もしくは７日超、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間もしくは８週間超、または１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月、７カ月、８カ月、９カ月、１０カ月、１１カ月、１２カ月もしくは１２カ月超）のいずれかを組み合わせて行う。
【０１５１】
ある特定の実施形態では、免疫原性組成物は、全身投与、局所投与、非経口投与、皮下投与、静脈内投与、筋内投与または鼻腔内投与でき、好ましくは、皮下投与もしくは鼻腔内投与でき、より好ましくは、鼻腔内投与できる。免疫原性組成物は、当業者に知られているいずれかの他の投与経路によって投与することもできる。
【０１５２】
好ましい実施形態では、本発明では、対象を免疫する方法であって、免疫原性組成物を対象に鼻腔内投与することを含む方法を提供する。
【０１５３】
下記の詳細な実施例は、本発明への理解を深めるのを助けるように意図されている。しかしながら、本発明は、実施例によって限定されない。本発明の他の実施形態が、本明細書と本明細書に開示されている本発明の実施内容を考察すれば、当業者には明らかであろう。
【実施例】
【０１５４】
実施例１：材料及び方法
マウス：Ｃ５７ＢＬ／６（Ｈ−２ｂ）マウスを、Ｊａｎｖｉｅｒ  Ｌａｂｓから購入した。Ｃ５７ＢＬ／６−Ｔｇ（ＴｃｒａＴｃｒｂ）１１００ＭｊｂＪ（ＯＴ−Ｉ）マウス、Ｃ５７ＢＬ／６−Ｔｇ（ＴｃｒａＴｃｒｂ）４２５ｂｎＪ（ＯＴ−ＩＩ）マウス及びＢ６．ＳＪＬ−Ｐｔｐｒｃａ  Ｐｅｐｃｂ／ＢｏｙＪ（ＣＤ４５．１）マウスをＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｚｕｒｉｃｈから得て、交配し、それぞれＣＤ４５．１＋ＯＴ−Ｉマウス及びＣＤ４５．１＋ＯＴ−ＩＩマウスを得た。ＮＬＲＣ４−／−も、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｚｕｒｉｃｈから得た。マウスは、Ｂａｖａｒｉａｎ  Ｎｏｒｄｉｃ  ＧｍｂＨまたはＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｚｕｒｉｃｈの動物施設のいずれかで、研究所のガイドラインに従って交配及び維持した。
【０１５５】
ウイルス、ＭＶＡ組み換え体の生成：本研究で用いた組み換えウイルスベクターはいずれも、細菌人工染色体（ＢＡＣ）におけるＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）のクローン型をベースとした。ＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）は、Ｂａｖａｒｉａｎ  Ｎｏｒｄｉｃが開発したものであり、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）に寄託されている（Ｖ０００８３００８）。ＭＶＡ組み換え体の生成は、近年説明されたようにして行った（Ｂａｕｒ，Ｋ．，Ｋ．Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ，Ｍ．Ｓｃｈｗｅｎｅｋｅｒ，Ｊ．Ｐａｔｚｏｌｄ，Ｃ．Ｍｅｉｓｉｎｇｅｒ−Ｈｅｎｓｃｈｅｌ，Ｊ．Ｈｅｒｍａｎｎ，Ｒ．Ｓｔｅｉｇｅｒｗａｌｄ，Ｐ．Ｃｈａｐｌｉｎ，Ｍ．Ｓｕｔｅｒ，ａｎｄ  Ｊ．Ｈａｕｓｍａｎｎ．２０１０．Ｉｍｍｅｄｉａｔｅ−ｅａｒｌｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｂｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ  ａｎｋａｒａ  ｂｒｅａｋｓ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｃｅ  ｏｆ  ｓｔｒｏｎｇ  ｖｅｃｔｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｂ８Ｒ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｉｎ  ａｃｕｔｅ  ａｎｄ  ｍｅｍｏｒｙ  ＣＤ８  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．８４：８７４３、Ｌａｕｔｅｒｂａｃｈ，Ｈ．，Ｊ．Ｐａｔｚｏｌｄ，Ｒ．Ｋａｓｓｕｂ，Ｂ．Ｂａｔｈｋｅ，Ｋ．Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ，Ｐ．Ｃｈａｐｌｉｎ，Ｍ．Ｓｕｔｅｒ，ａｎｄ  Ｈ．Ｈｏｃｈｒｅｉｎ．２０１３．Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｄｊｕｖａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＭＶＡ  ｗｉｔｈ  ＣＤ４０Ｌ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｔｅｓ  ＣＤ８  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｆｒｏｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．４：２５１）。簡潔に述べると、強力な合成初期後期ｐＳプロモーターの配列は、以前に説明された配列と完全に一致する４０個のヌクレオチドを含む（Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ，Ｓ．，Ｊ．Ｒ．Ｓｉｓｌｅｒ，ａｎｄ  Ｂ．Ｍｏｓｓ．１９９７．Ｃｏｍｐａｃｔ，ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ，ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ  ｅａｒｌｙ／ｌａｔｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２３：１０９４）。このｐＳプロモーターを鶏ＯＶＡのオープンリーディングフレームの上流にクローニングした。ｐＨｙｂプロモーターは、Ｂａｕｅｒらによって開発及び説明されたものであり（Ｂａｕｒ，Ｋ．，Ｋ．Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ，Ｍ．Ｓｃｈｗｅｎｅｋｅｒ，Ｊ．Ｐａｔｚｏｌｄ，Ｃ．Ｍｅｉｓｉｎｇｅｒ−Ｈｅｎｓｃｈｅｌ，Ｊ．Ｈｅｒｍａｎｎ，Ｒ．Ｓｔｅｉｇｅｒｗａｌｄ，Ｐ．Ｃｈａｐｌｉｎ，Ｍ．Ｓｕｔｅｒ，ａｎｄ  Ｊ．Ｈａｕｓｍａｎｎ．２０１０．Ｉｍｍｅｄｉａｔｅ−ｅａｒｌｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｂｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ  ａｎｋａｒａ  ｂｒｅａｋｓ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｃｅ  ｏｆ  ｓｔｒｏｎｇ  ｖｅｃｔｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｂ８Ｒ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｉｎ  ａｃｕｔｅ  ａｎｄ  ｍｅｍｏｒｙ  ＣＤ８  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．８４：８７４３）、牛痘ウイルスにおけるＡＴ１タンパク質の発現を誘導するプロモーターに由来する後期要素（Ｆｕｎａｈａｓｈｉ，Ｓ．，Ｔ．Ｓａｔｏ，ａｎｄ  Ｈ．Ｓｈｉｄａ．１９８８．Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｍａｊｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａ−ｔｙｐｅ  ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ  ｂｏｄｙ  ｏｆ  ｃｏｗｐｏｘ  ｖｉｒｕｓ．Ｊ  Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６９（Ｐｔ１）：３５、Ｐａｔｅｌ，Ｄ．Ｄ．，Ｃ．Ａ．Ｒａｙ，Ｒ．Ｐ．Ｄｒｕｃｋｅｒ，ａｎｄ  Ｄ．Ｊ．Ｐｉｃｋｕｐ．１９８８．Ａ  ｐｏｘｖｉｒｕｓ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｖｅｃｔｏｒ  ｔｈａｔ  ｄｉｒｅｃｔｓ  ｈｉｇｈ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｏｎｅｄ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ  ８５：９４３１）と、改変ｐ７．５プロモーターに由来する５つのタンデム配列初期要素（Ｄａｖｉｓｏｎ，Ａ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｂ．Ｍｏｓｓ．１９８９．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ  ｅａｒｌｙ  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ．Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１０：７４９）を含む。ｐＨｙｂプロモーターをＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｈｙｐｉｍｕｒｉｕｍ  ＦｌｉＣ（以下、フラジェリンという）のオープンリーディングフレームの上流にクローニングした。感染性ウイルスは、ＢＡＣ  ＤＮＡをＢＨＫ−２１細胞にトランスフェクションし、それらをヘルパーウイルスとしてのショープ線維腫ウイルスに重感染させることによって、ＢＡＣから再構成した。初代鶏胚線維芽細胞（ＣＥＦ）において３回追加で継代後、ヘルパーウイルスを含まないＭＶＡ−ＯＶＡ、ＭＶＡ−ＯＶＡ−フラジェリンウイルスを得た。これらのウイルスは、ＭＶＡ−ＯＶＡに関してはｒＭＶＡ、ＭＶＡ−ＯＶＡ−フラジェリンに関してはｒＭＶＡ−フラジェリンと称する。動物実験で用いたいずれのウイルスも、スクロースクッションによって２回精製した。
【０１５６】
免疫：鼻腔内免疫のために、マウスは、麻酔をして、２０μｌ（１０μｌ／鼻孔）の体積で、３．５×１０７ＴＣＩＤ５０の様々なＭＶＡ組み換え体を含む滴下剤で免疫した。５匹のマウスからなる群を用いて、０日目と２１日目に２回免疫した。１４日目から７日おきに血清を採取してから、抗体力価を得た。
【０１５７】
養子細胞移入：ＣＤ４５．１＋ＯＴ−ＩマウスまたはＣＤ４５．１＋ＯＴ−ＩＩマウスを、同種レシピエント動物への養子細胞移入の細胞ドナーとして用いた。リンパ球を脾臓から単離し、ＳｔｅｍＣｅｌｌ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙのＥａｓｙＳｅｐキットをメーカーのプロトコールに従って用いて、ＣＤ８＋Ｔ細胞とＣＤ４＋Ｔ細胞を精製した。後眼窩静脈を介して、免疫の１日前に、１×１０４個のＯＴ−Ｉ  ＣＤ８＋Ｔ細胞と、１×１０５個のＯＴ−ＩＩ  ＣＤ４＋Ｔ細胞を静脈内注射した。
【０１５８】
細胞の単離（脾臓、肺、ｍＬＮ）：脾臓細胞と肺細胞をマウスから採取し、コラゲナーゼ／ＤＮａｓｅとともに、３０分間、３７℃でインキュベートした。続いて、７０μｍのフィルターによって器官を機械的に破壊することによって、単一細胞浮遊液を調製した。続いて、脾臓細胞に対して赤血球溶解処理（Ｅｒｙｌｙｓｉｓ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を行い、一方４４％パーコールで遠心分離することによって、肺細胞を単離した。２％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ培地に、腸間膜リンパ節を採取し、７０μｍのセルストレイナーによって機械的に破壊した。単核球を洗浄し、計数した。
【０１５９】
ＭＨＣ  Ｉデキストラマー染色及び細胞内サイトカイン染色：２％ＦＣＳ、０．１％アジ化ナトリウム及び２．５Ｕ／ｍｌのヘパリンを含むＰＢＳに、血液を採取した。赤血球を赤血球溶解バッファー（Ｅｒｙｌｙｓｉｓ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）によって、メーカーのプロトコールに従って溶解させることによって、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を調製した。Ｂ８Ｒ特異的ＣＤ８Ｔ細胞とＯＶＡ特異的ＣＤ８Ｔ細胞の検出のために、メーカーのプロトコール（Ｉｍｍｕｄｅｘ）に従って、Ｂ８２０−２７−ペプチド（ＴＳＹＫＦＥＳＶ）をロードしたＡＰＣコンジュゲートＭＨＣクラスＩ  Ｈ−２ｋｂデキストラマーまたはＯＶＡ２５７−２６４−ペプチド（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）をロードしたＰＥコンジュゲートＭＨＣクラスＩ  Ｈ−２ｋｂデキストラマーでＰＢＭＣを染色してから、抗ＣＤ８α−ＢＶ４２１、ＣＤ４４−ＡＰＣ−Ｃｙ７及びＣＤ４−ＦＩＴＣで染色した。いずれの抗体も、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅまたはＢｉｏＬｅｇｅｎｄから購入した。細胞内サイトカイン染色のために、脾臓細胞と肺細胞を２．５μｇ／ｍｌのＭＨＣクラスＩ拘束性ペプチド（Ｂ８２０−２７、ＯＶＡ２５７−２６４）とともに、５〜６時間、３７℃で、コンプリートＲＰＭＩにおいて、１μｇ／ｍｌのＧｏｌｇｉＰｌｕｇ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の存在下でインキュベートした。上記と同様に、細胞を抗ＣＤ８α−ＢＶ４２１、ＣＤ４４−ＡＰＣ−Ｃｙ７、ＣＤ４−ＦＩＴＣ、ＩＦＮ−γ−ＰＥＣｙ７、ＴＮＦ−α−ＰＥ及びＩＬ−２−ＡＰＣで染色した。ペプチドは、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔから購入した。ＩＦＮ−γとＴＮＦ−αの細胞内サイトカイン染色は、固定化／浸透化後、メーカーのプロトコール（ＢＤ  Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に従って行った。生存／死滅の判別のために、固定化の前に、メーカーのプロトコール（ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ  ｆｉｘａｂｌｅ  ｖｉｏｌｅｔ  ｄｅａｄ  ｃｅｌｌ  ｓｔａｉｎｉｎｇ  ｋｉｔ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従って、細胞を染色した。いずれの細胞も、デジタルフローサイトメーター（ＬＳＲ  ＩＩ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて入手し、データをＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ）で解析した。
【０１６０】
ＥＬＩＳＡ：ＭＶＡ特異的ＩｇＡとＯＶＡ特異的ＩｇＡの検出のために、カニューレを用いて、気管を１ｍｌのＰＢＳ／０．５ｍＭＥＤＴＡで３回、洗い流すことによって、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液を採取した。続いて、そのＢＡＬ液を遠心分離して、ＢＡＬ液由来の細胞をペレット状にして、ＥＬＩＳＡに備えて回収した。トリプシンインヒビター、５０ｍＭのＥＤＴＡ及び０．１％ＢＳＡを含む１ｍｌのＰＢＳで、小腸の遠位部を洗い流すことによって、腸洗浄液を採取した。その液を４０００ｇで１５分、４℃で回転させた。９６ウェルプレートを５μｇ／ｍｌのＯＶＡまたはＭＶＡでコーティングしてから、５％ＦＣＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳでブロックすることによって、ＥＬＩＳＡを行った。血清のインキュベーション後、ＨＲＰコンジュゲート抗体の後に、ＴＭＢ基質を用いて、ＢＡＬ液または腸洗浄液、ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ｃ及びＩｇＡを検出した。吸光度を４５０ｎｍで測定した。
【０１６１】
サイトカインアッセイ−Ｌｕｍｉｎｅｘ：メーカーのプロトコールに従ってＬｕｍｉｎｅｘを用いて、ＢＡＬ液と、回収した上清のサイトカインを測定した。Ｈｅｋ−ｂｌｕｅ  ｈＴＬＲ５細胞を用いたＴＬＲ５の刺激：ｒＭＶＡ−フラジェリンによるＴＬＲ５の刺激を調べるために、Ｈｅｋ−ｂｌｕｅ  ｈＴＬＲ５細胞を使用した（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）。簡潔に述べると、細胞をｒＭＶＡまたはｒＭＶＡ−フラジェリンに、ＭＯＩ２で１８時間感染させ、上清を回収した。組み換えフラジェリンを陽性対照として用いた。ＴＬＲ５の刺激後に誘導されるＳＥＡＰ（分泌型胚性アルカリホスファターゼ）のレベルは、メーカーのプロトコールに従って、Ｈｅｋ−Ｂｌｕｅ検出培地を用いて検出できる。
【０１６２】
ＦＬＤＣのインビトロ生成：ＦＬのＢＭ培養液由来ＤＣ（ＦＬＤＣ）を、以前に説明されたようにして調製した。インビトロで生成したＦＬ依存性ＤＣ（ＦＬ−ＤＣ）を生成し、ソーティングした）。簡潔に述べると、ＢＭ細胞をヒト組み換えＦＬの存在下で、８日間培養した。
【０１６３】
粘膜ＤＣのソーティング：ＦＬ処理マウスの粘膜固有層由来のＤＣサブセットをプールし、ソーティングした。簡潔に述べると、マウスをヒトＦＬで１回処置し、粘膜固有層細胞を８日後に採取した。死滅細胞をプロピジウムアイオダイド染色によって除外した。ＣＤ１９の発現により、非ＤＣ系細胞を除外した。ＣＤ１１ｃ、ＭＨＣ−ＩＩ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１０３及びＣＤ１７２ａの発現に基づき、粘膜固有層ｃＤＣ集団をソーティングした。細胞ソーティングは、ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ（ＢＤ）という装置で行った。
【０１６４】
実施例２：ｒＭＶＡ−フラジェリンによる鼻腔内免疫後の脾臓及び肺における増強したＣＤ８＋Ｔ細胞応答
鼻腔内免疫は、全身性免疫応答と粘膜免疫応答の両方を誘導することが知られている。従って、我々は、ｒＭＶＡによる鼻腔内免疫後に両方の部位でＣＤ８＋Ｔ細胞応答を評価したいと考えた。より具体的には、本発明のアジュバント添加ｒＭＶＡ−フラジェリン構築物によって、ｒＭＶＡに比べてより良好なＣＤ８＋Ｔ細胞応答を得ることができるかを知りたいと考えた。この目的のために、Ｂ８２０−２７ペプチドをロードしたＭＨＣ−Ｉ（Ｈ２−ｋｂ）デキストラマーを用いてＭＶＡ特異的応答を、またはＯＶＡ２５７−２６４ペプチドをロードしたＭＨＣ−Ｉ（Ｈ２−ｋｂ）デキストラマーを用いてＯＶＡ特異的応答を検出した。Ｂ８２０−２７とＯＶＡ２５７−２６４は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける免疫優性ＣＤ８Ｔ細胞エピトープである。
【０１６５】
我々のデータは、脾臓と肺の両方で、ｒＭＶＡ−フラジェリンによる鼻腔内免疫後、３５日目（ブーストを行ってから２週間後）に、ｒＭＶＡに比べて増強したＯＶＡ特異的ＣＴＬ応答を明らかに示す。脾臓では、ｒＭＶＡ−フラジェリンで免疫したマウスでは、４％（＋／−０．６）のＯＶＡ特異的ＣＴＬが観察されたのに対して、ｒＭＶＡで免疫したマウスでは１．６（＋／−０．２）であり（図１ａ）、２．５倍の増加であった。同様に、肺においては、ｒＭＶＡ−フラジェリンで免疫したマウスでは、１５．８％（＋／−１．１）のＯＶＡ特異的ＣＴＬが観察され、ｒＭＶＡで免疫したマウスでは、７．６％（＋／−１．６）のＯＶＡ特異的ＣＴＬが観察され（図１ｃ）、肺でも、２倍の増加であった。このことは、両方の器官において、ＯＶＡ特異的ＣＴＬの絶対数の観点でも示すことができた。脾臓においては、ｒＭＶＡ−フラジェリンで鼻腔内免疫したマウスでは、２６５０００（＋／−４５０００）個のＯＶＡ特異的ＣＴＬ／脾臓が観察されたのに対して、ｒＭＶＡで鼻腔内免疫したマウスでは、１２００００（＋／−１５０００）個のＯＶＡ特異的ＣＴＬ／脾臓が観察された（図１ｂ）。同様に、ｒＭＶＡ−フラジェリンで免疫したマウスでは、２７３０００（＋／−４４０００）個のＯＶＡ特異的ＣＴＬ／肺が観察され、ｒＭＶＡで免疫したマウスでは、９００００（＋／−１４０００）個のＯＶＡ特異的ＣＴＬ／肺が観察された（図１ｄ）。
【０１６６】
両方の臓器で、ｒＭＶＡ特異的ＣＴＬ応答も測定し、ｒＭＶＡ−フラジェリンで免疫したマウスでは、増強されたＯＶＡ特異的ＣＴＬ応答が観察されたのに対して、脾臓（図１ｅ）または肺（図１ｆ）において、ｒＭＶＡで免疫したマウスと、ｒＭＶＡ−フラジェリンで免疫したマウスとの間で、Ｂ８特異的ＣＴＬの頻度の有意な上昇は見られなかった。導入遺伝子に特異的なより良好なＣＴＬ応答が得られるとともに、我々の単独のｒＭＶＡとの差が、ＭＶＡ特異的ＣＴＬにおける差よりも大きいことについて言及することは重要であり、これこそが、我々が目指すものである。
【０１６７】
免疫期間中に、ＯＶＡ特異的ＣＴＬの動態を血中において追跡したところ、ｒＭＶＡに比べて、鼻腔内投与したｒＭＶＡ−フラジェリン構築物のアジュバント効果を明らかに見ることができた（図２）。実際、２８日目、ブーストを行ってから１週間後に、ｒＭＶＡ−フラジェリンで免疫したマウスでは、ＯＶＡ特異的ＣＴＬは４．５％（＋／−０．５）、ｒＭＶＡで免疫したマウスでは、３．２％（＋／−０．４）であった（図２ａ）。同様に、上記の所見のように、血中のＭＶＡ特異的ＣＴＬの頻度は、ｒＭＶＡで鼻腔内免疫したマウス（１３．８５％＋／−１．７）とｒＭＶＡ−フラジェリンで鼻腔内免疫したマウス（９．８％＋／−１．７）との間で、上昇は見られなかった。加えて、１回目の免疫から７日後でも、ｒＭＶＡ−フラジェリンで免疫したマウスとｒＭＶＡで免疫したマウスとの間で、ＭＶＡ特異的ＣＴＬとＯＶＡ特異的ＣＴＬの両方の頻度の差は観察できなかった（図２ａ、ｂ）。これによって、ＭＶＡコードフラジェリンのアジュバント効果は、１回目の免疫後よりも、２回目の免疫後の方が顕著であることが示唆される。
【０１６８】
合わせると、このデータにより、ｒＭＶＡ−フラジェリンによる鼻腔内免疫が、ｒＭＶＡに比べて、増強したＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導することが明らかに示されている。この増加したＣＴＬ応答は、全身的に、脾臓及び血液において、及び粘膜区画、肺においての双方に生じる。
【０１６９】
実施例３：ｒＭＶＡ−フラジェリンで鼻腔内免疫したマウスの脾臓におけるサイトカイン産生ＣＴＬの増加した頻度
ＭＨＣ  Ｉ多量体染色によって、ｒＭＶＡ−フラジェリンによる鼻腔内免疫後に抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の向上した頻度が立証されたので、我々は、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αなどのサイトカインを迅速に産生させることが知られているサイトカイン産生メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度について検討したいと考えた。Ｂ８ペプチドとＯＶＡペプチドの両方によって、インビトロで再刺激した後、細胞内サイトカイン染色によって、ＭＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞とＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を測定した。
【０１７０】
脾臓においては、ｒＭＶＡ−フラジェリンによる免疫後に、サイトカイン産生ＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度の増加を観察することができた（図３）。実際、ｒＭＶＡ−フラジェリンで免疫したマウスでは、３．５％（＋／−０．２）のＩＦＮ−γ＋ＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞（図３ａ）、３．２％（＋／−０．２）のＴＮＦ−α＋ＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞（図３ｃ）が観察されたのに対して、ｒＭＶＡで免疫したマウス免疫では、１．３％（＋／−０．２）のＩＦＮ−γ＋ＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞（図３ａ）、１．２％（＋／−０．１）のＴＮＦ−α＋ＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞（図３ｃ）が観察され、それぞれ、２．５倍の増加と、２．７倍の増加であった。このことは、絶対数の観点でも示すことができた（データは示されていない）。これに対して、ｒＭＶＡで免疫したマウスと、ｒＭＶＡ−フラジェリンで免疫したマウスとの間では、サイトカイン産生Ｂ８特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度の有意な差は見られなかった。ｒＭＶＡ−フラジェリンで免疫したマウスでは、７．７％（＋／−１．７）のＩＦＮ−γ＋Ｂ８特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞（図３ｂ）と、６．３％（＋／−０．９）のＴＮＦ−α＋Ｂ８特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞（図３ｄ）が観察されたのに対して、ＭＶＡで免疫したマウス免疫では、６％（＋／−０．６）のＩＦＮ−γ＋Ｂ８特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞（図３ｂ）と、４．６％（＋／−０４）のＴＮＦ−α＋Ｂ８特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞（図３ｄ）が観察された。
【０１７１】
総括すると、これらのデータによって、鼻腔内投与した我々のＴＬＲ５Ｌアジュバント添加ＭＶＡの使用には、同じ経路によって投与したｒＭＶＡに比べて、サイトカイン産生メモリーＣＴＬの頻度を改善させる機能があることが示される。加えて、この増強した抗原特異的免疫応答は、全身と免疫部位の両方において生じる。
【０１７２】
実施例４：ｒＭＶＡフラジェリンによる鼻腔内免疫は、抗原特異的ＣＴＬ応答の質的改善を誘導する。
ｒＭＶＡ−フラジェリンが、鼻腔内投与後に、サイトカイン産生ＭＶＡ特異的ＣＴＬとＯＶＡ特異的ＣＴＬの両方の頻度を向上させるのに有効であることが立証されたので、我々は、その応答の質を決定したいと考えた。
【０１７３】
我々の結果によって、脾臓において、ｒＭＶＡ−フラジェリンで免疫したマウスでは、ｒＭＶＡで免疫したマウスに比べて、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞から産生されるＩＦＮ−γ（図４ａ）とＴＮＦ−α（図４ｂ）が１細胞当たりにおいて多い傾向があることが示されている。実際、ＩＦＮ−γ＋ＯＶＡ特異的ＣＴＬは、ｒＭＶＡ−フラジェリンで免疫したマウスでは、ＧＭＦＩが１９００（＋／−８６）であり、ｒＭＶＡで免疫したマウスでは、ＧＭＦＩが１５７０（＋／−４３）であった（図４ａ）。同様に、向上したＴＮＦ−α＋ＯＶＡ特異的ＣＴＬのＧＭＦＩが、ｒＭＶＡ−フラジェリンで免疫したマウスと、ｒＭＶＡで免疫したマウスで観察され、ｒＭＶＡ−フラジェリンで免疫したマウスでは、５８５０（＋／−２９０）のＧＭＦＩ、ｒＭＶＡで免疫したマウスででは、４７００（＋／−１３０）のＧＭＦＩであった（図４ｂ）。
【０１７４】
したがって、このデータによって、ｒＭＶＡ−フラジェリンの鼻腔内投与が、メモリーＣＴＬ応答の量と質を向上させるのに有益であることが更に確認される。
【０１７５】
実施例５：ｒＭＶＡ−フラジェリンの鼻腔内投与は、ｒＭＶＡよりも強力な血清抗体応答を誘導する。
上記の結果から、質的にも量的にも、より強力なＣＤ８＋Ｔ細胞応答を得るために、我々のＴＬＲ５Ｌアジュバント添加ＭＶＡワクチンを鼻腔内経路で用いる利点を我々は明らかに示すことができる。それにもかかわらず、新たなワクチンを設計するときには、長期免疫を獲得するために、効率的な抗体応答を得ることも非常に重要である。したがって、我々の鼻腔内モデルにおける、ｒＭＶＡ−フラジェリンの抗体応答促進に対する寄与度も決定した。本質的な疑問の１つは、ｒＭＶＡ−フラジェリンによって、ｒＭＶＡよりも良好血清抗体応答を得ることができるかということであった。
【０１７６】
したがって、我々は、３５日目（ブーストから２週間後）に、マウスの血清におけるＭＶＡ特異的ＩｇＧとＯＶＡ特異的ＩｇＧのレベルの測定を試みた。我々のデータには、ｒＭＶＡ−フラジェリンで免疫したマウスでは、ｒＭＶＡで免疫したマウスに比べて、ＭＶＡ特異的ＩｇＧとＯＶＡ特異的ＩｇＧのレベルの有意な差がなかったことが示されている（図５ａ）。ｒＭＶＡ−フラジェリンで免疫したマウスは、増強された血清ＩｇＧ応答を示さなかったようであるが、ｒＭＶＡ−フラジェリンの鼻腔内投与後に生じる免疫応答の種類の知見を深めるために、我々は、特異的ＩｇＧアイソタイプ応答を特徴付けようと試みた。ＩｇＧ１は、Ｔｈ２型の免疫応答への偏向を示し、ＩｇＧ２ｃは、Ｔｈ１型の免疫応答への偏向を示唆することになる。ｒＭＶＡで免疫したマウスと、ｒＭＶＡで免疫したマウスとの間で、ＭＶＡ特異的ＩｇＧ１（図５ｂ）とＯＶＡ特異的ＩｇＧ１（図５ｃ）の血清レベルの有意な差はなかったが、ｒＭＶＡ−フラジェリンで免疫したマウスでは、ｒＭＶＡで免疫したマウスに比べて、増強した血清のＭＶＡ特異的ＩｇＧ２ｃ（図５ｂ）とＯＶＡ特異的ＩｇＧ２ｃ（図５ｃ）の力価が観察され、増強したＴｈ１応答の増強が示唆される。
【０１７７】
更に詳細に、抗原特異的抗アイソタイプ応答について考察すると、ｒＭＶＡで免疫したマウスでは、血清のＩｇＧ１の力価が、ＩｇＧ２ｃに比べて高く、Ｔｈ２型の免疫応答への偏向が見られることに明らかに気付くことができる（図５ｃ）。これに対して、ｒＭＶＡ−フラジェリンで免疫したマウスでは、Ｔｈ１免疫応答とＴｈ２免疫応答が組み合わさっており、血清において、ＩｇＧ１力価が、ＩｇＧ２ｃ力価に比べてわずかに高い（図５ｃ）。
【０１７８】
総括すると、このデータによって、ｒＭＶＡによる鼻腔内免疫は、血清抗体応答を誘導することができ、ｒＭＶＡ−フラジェリンによる免疫は、ｒＭＶＡ単独に比べて、Ｔｈ１免疫応答の誘導が優れていることが示される。
【０１７９】
実施例６：鼻腔内免疫後のＢＡＬにおけるＩｇＧ及びＩｇＡ応答の誘導
ｒＭＶＡで免疫したマウスとｒＭＶＡ−フラジェリンで免疫したマウスの血清において抗体応答が発現し、ｒＭＶＡ−フラジェリンによる鼻腔内免疫後に、向上した血清のＩｇＧ２ｃの力価が立証されたので、我々は、ＢＡＬにおいて、同様の応答を免疫部位で局所的に観察できるかを明らかにすることに興味を持った。実際、ＢＡＬにおけるＩｇＧ応答の観点で、同様の応答を観察できる（図６）。ｒＭＶＡで免疫したマウスと、ｒＭＶＡ−フラジェリンで免疫したマウスとの間で、ＢＡＬの総ＩｇＧの差は確認できなかった（図６ａ）。加えて、血清で観察されたように、ｒＭＶＡで免疫したマウスとｒＭＶＡ−フラジェリンで免疫したマウスのＢＡＬにおいて、同様のレベルのｒＭＶＡ特異的ＩｇＧ１の力価（図６ｂ）とＯＶＡ特異的ＩｇＧ１の力価（図６ｃ）を検出できた。これに対して、ＩｇＧ２ｃの力価に関しては、ｒＭＶＡで免疫したマウスに比べて、ｒＭＶＡ−フラジェリンで免疫したマウスは、向上したｒＭＶＡ特異的ＩｇＧ２ｃの力価（図６ｂ）とＯＶＡ特異的ＩｇＧ２ｃの力価（図６ｃ）の両方を呈した。さらに、ｒＭＶＡで免疫したマウスは、ＢＡＬにおいて、より顕著な抗原特異的Ｔｈ２免疫応答を呈し、ＩｇＧ１力価のレベルの方が、ＩｇＧ２ｃに比べて高かった（図６ｃ）が、ｒＭＶＡ−フラジェリンで免疫したマウスのＢＡＬでは、血清中で観察されたように、Ｔｈ１免疫応答とＴｈ２免疫応答が組み合わさっていることを確認できた（図６ｃ）。これにより、ｒＭＶＡ−フラジェリンによる免疫が、粘膜免疫部位において、よりバランスの取れた免疫応答を誘導することが示唆される。
【０１８０】
粘膜免疫の顕著な特徴は、免疫部位における局所的なＩｇＡの産生である。したがって、ｒＭＶＡ−フラジェリンで免疫したマウスのＢＡＬにおけるＩｇＡの存在を評価して、そのような応答を、ｒＭＶＡによって鼻腔内免疫したマウスと比較することが非常に重要であった。我々の結果は、ＢＡＬにおいて、ｒＭＶＡによる鼻腔内免疫と、ｒＭＶＡ−フラジェリンによる鼻腔内免疫の両方が、ＯＶＡ特異的ＩｇＡ応答を誘導できる（図６ｄ）ことを示しており、肺における粘膜免疫の発現が示唆される。それにもかかわらず、ｒＭＶＡ鼻腔内免疫と、ｒＭＶＡ−フラジェリン鼻腔内免疫との間で、同様のレベルのＯＶＡ特異的ＩｇＡ力価を得られた（図６ｅ）。これにより、我々のアジュバント添加ｒＭＶＡの使用とは無関係に、ｒＭＶＡの鼻腔内投与が、肺においてＩｇＡ抗体応答を確実に誘導できることが示唆される。
【０１８１】
これらの知見により、強力な全身性免疫と粘膜免疫、具体的には、粘膜表面におけるＩｇＡの産生を惹起することにおいて、鼻腔内経路によって投与するｒＭＶＡワクチンが有益であることが確認され、これにより、そのようなｒＭＶＡワクチンが、粘膜ワクチンの非常に優れた候補として立証される。
【０１８２】
実施例７：ｒＭＶＡによる鼻腔内免疫後の養子導入細胞の腸間膜リンパ節（ｍＬＮ）への移動
近年、粘膜ワクチンを開発するために、徹底的な取り組みが行われており、鼻腔内免疫は、既に述べたように、多種多様な理由から、非常に魅力的な経路であることが証明されている。さらに、鼻腔内免疫は、強力な上気道免疫を惹起するのみならず、胃腸免疫応答も惹起することが説明されている。したがって、我々は、鼻腔内投与したｒＭＶＡとｒＭＶＡ−フラジェリンが、胃腸管でも免疫応答を誘導できるか立証したいと考えた。胃腸管で免疫を誘導できる場合には、間違いなく、胃腸病原体に特異的な粘膜ｒＭＶＡワクチンの開発において、新たな機会を生み出すことになる。
【０１８３】
したがって、我々は、まず、ｒＭＶＡ及びｒＭＶＡ−フラジェリンによる鼻腔内免疫から７日後に、ｍＬＮにおいてＴ細胞のホーミングを調べようと試みた。マウスに、それぞれＣＤ４５．１＋  ＯＴ−ＩマウスとＣＤ４５．１＋ＯＴ−ＩＩマウスのＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞とＯＶＡ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の混合物を養子導入し、ｒＭＶＡ−フラジェリンまたはｒＭＶＡで鼻腔内免疫した。７日後に、マウスを殺処分し、ＣＤ４５．１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞とＣＤ４５．１＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度を決定した。我々の結果は、ｒＭＶＡ鼻腔内免疫とｒＭＶＡ−フラジェリン鼻腔内免疫から７日後に、ｍＬＮにおいて、ＣＤ８＋Ｔ細胞とＣＤ４＋Ｔ細胞のホーミングを観察できたことを明らかに示しており、胃腸免疫応答の誘導が発生したことが示唆される。実際、ｒＭＶＡで免疫したマウスからは、１．７％の導入ＯＴ−Ｉ−ＣＤ８＋Ｔ細胞、ｒＭＶＡ−フラジェリンで免疫したマウスからは、２％の導入ＯＴ−Ｉ−ＣＤ８＋Ｔ細胞がｍＬＮにおいて観察された（図７ａ）。このＣＤ８＋Ｔ細胞のｍＬＮへのホーミングは、絶対数の観点でも示すことができた（図７ｂ）。ＣＤ４＋Ｔ細胞のホーミングに関しても、同様の応答を観察できた。実際、ｒＭＶＡで鼻腔内免疫したマウスと、ｒＭＶＡ−フラジェリンで鼻腔内免疫したマウスの両方のｍＬＮにおいて、０．５％の導入ＯＴ−ＩＩ−ＣＤ４＋Ｔ細胞が観察された（図７ｃ、ｄ）。７日目において、ｒＭＶＡで免疫したマウスと、ｒＭＶＡ−フラジェリンで免疫したマウスの間で、ＣＤ８＋Ｔ細胞とＣＤ４＋Ｔ細胞のホーミングの差を我々は観察できなかったが、このデータによって、鼻腔内投与が、胃腸免疫応答の発現を誘導できることが強く示唆されている。
【０１８４】
これは、我々のｒＭＶＡとアジュバント添加ＭＶＡの両方の鼻腔内投与が実際に、胃腸管にまで免疫応答を誘導できることを示す初めての所見である。
【０１８５】
実施例８：ｒＭＶＡによる鼻腔内免疫後の腸管内ＩｇＡ
ｒＭＶＡによる鼻腔内免疫とｒＭＶＡ−フラジェリンによる鼻腔内免疫の後に、養子導入Ｔ細胞がｍＬＮに移動することが既に示され、それにより、ｒＭＶＡ−フラジェリンで免疫したマウスのＢＡＬにおけるＩｇＡの誘導とともに、胃腸免疫応答の誘導が示されたので、免疫したマウスの粘膜固有層においてＩｇＡも検出できるかを明らかにしたいと我々は考えた（検出できたら、実際に、胃腸免疫の成立が確認されることになる）。
【０１８６】
ｒＭＶＡ−フラジェリンで鼻腔内免疫したマウスとｒＭＶＡで鼻腔内免疫したマウスの腸洗浄液から得たＯＶＡ特異的ＩｇＡを３５日目に解析した。我々の結果は、鼻腔内免疫した両方のマウスの粘膜固有層に腸管内ＩｇＡが存在することを明らかに示す（図８）。既にＢＡＬで観察されたのと同様に、ｒＭＶＡで免疫したマウスと、ｒＭＶＡ−フラジェリンで免疫したマウスとの間には、ＯＶＡ特異的ＩｇＡの力価の有意な差はないようである。ｒＭＶＡで鼻腔内免疫したマウスの粘膜固有層における腸管内ＩｇＡの存在は、これまで示してきた全てのデータと、ｍＬＮにおける免疫応答の誘導ときちんと相関している。これらの知見を踏まえると、我々の組み換えＭＶＡワクチンを用いて鼻腔内経路で免疫した後に、胃腸免疫が誘導されたことを我々は強く認めることができる。これにより、胃腸病原体に対する可能性のあるｒＭＶＡ粘膜ワクチンの開発への新たな道が開かれる。
【０１８７】
実施例９：ｒＭＶＡ−フラジェリンによる鼻腔内免疫後のＢＡＬにおけるインビボでの自然免疫サイトカイン応答
鼻腔内ｒＭＶＡ−フラジェリンが、ｒＭＶＡに比べて、増強した全身性免疫と粘膜免疫を誘導することが立証されたので、ｒＭＶＡ−フラジェリンによる鼻腔内免疫後のインビボでの自然免疫応答を明らかにしたいと我々は考えた。そこで、免疫から２４時間後に、ｒＭＶＡ−フラジェリンで鼻腔内免疫したマウスのＢＡＬ液を採取し、サイトカイン産生について解析した。
【０１８８】
我々の結果は、ｒＭＶＡ−フラジェリンで免疫したマウスのＢＡＬ液において、免疫から２４時間後に、ＩＬ−１β（図９ａ）、ＩＬ−１８（図９ｂ）、ＴＮＦ−α（図９ｃ）及びＣＸＣＬ１（図９ｄ）が産生されたことを示す。ＩＬ−１β及びＩＬ−１８の産生によって、ＮＬＲＣ４インフラマソーム経路による特異的フラジェリンの自然免疫認識が確認される。これは、ｒＭＶＡ−フラジェリンで鼻腔内免疫したＮＬＣＲ４−／−マウスのＢＡＬでの、ｒＭＶＡ−フラジェリンで鼻腔内免疫した野生型マウスに比べた、ＩＬ−１βとＩＬ−１８の強い減少により更に確認された（図９ｅ、ｆ）。ＴＮＦ−αの産生は、ＡＰＣによるＴＬＲ−５自然免疫認識の結果である。ｒＭＶＡによる免疫後には、ＩＬ−１８の産生も検出でき（図９ｂ）、これは、ＮＬＲＰ２インフラマソームによるＭＶＡの自然免疫認識の結果と推測される。
【０１８９】
すなわち、上の結果は、インビボでのｒＭＶＡ−フラジェリンの自然免疫認識は、ＴＬＲ５及びＮＬＣＲ４インフラマソームに依存する形で行われ、ＴＬＲ５に依存する場合には、ＴＮＦ−αが産生され、ＮＬＣＲ４インフラマソームに依存する場合には、ＩＬ１−β／ＩＬ−１８が産生されることを示す。これらの結果は、過去の研究で観察された、フラジェリンアジュバントの特異性によって裏付けられており、この結果により、遺伝的にコードされる我々のフラジェリンｒＭＶＡワクチンが、ｒＭＶＡに比べて、鼻腔内投与後に強力な自然免疫応答を誘導する機能が確認される。
【０１９０】
実施例１０：ＴＬＲ５によるｒＭＶＡ−フラジェリンの認識
上の結果から、ｒＭＶＡ−フラジェリンが、ＴＬＲ５経路の活性化を誘発して、ＴＮＦ−αを分泌させることができることが既に示されたので、ＴＬＲ５によってｒＭＶＡ−フラジェリンを認識する機構を更に調べたいと我々は考えた。実際、ｒＭＶＡ−フラジェリン構築物内でコードされるフラジェリンは、真核細胞性分泌シグナルを含まないので、形質導入後にフラジェリンが細胞内に留まるのか、分泌されるのか決定することが知りたい対象である。我々は、ＨＥＫ−ｂｌｕｅ  ｈＴＬＲ５レポーター細胞株を用いて、ｒＭＶＡ−フラジェリン形質導入Ｈｅｌａ細胞が、ＴＬＲ５の活性化を誘発できることを示すことができた（図１０）。加えて、ｒＭＶＡ−フラジェリン形質導入細胞の上清または細胞溶解液とともにインキュベートしたＨＥＫ−Ｂｌｕｅ細胞も、ＳＥＡＰ活性を示したことから、ｒＭＶＡ−フラジェリン形質導入細胞からフラジェリンが分泌または放出され、それぞれ、形質導入細胞内に蓄積することが示唆される（図１０）。予想どおりに、ｒＭＶＡは、ＳＥＡＰ活性を検出できなかったので、ＴＬＲ５の活性化を誘発できない。同様に、ｒＭＶＡのみで形質導入を行った細胞の上清では、このアッセイにおいてＳＥＡＰ活性を測定できなかったので、この上清がＴＬＲ５を刺激しないことも我々は示した（図１０）。組み換えフラジェリンを陽性対照として用いて、フラジェリンタンパク質が実際にＨＥＫ−ｂｌｕｅ細胞を刺激することを我々は確認した（図１０）。ｒＭＶＡ−フラジェリン形質導入細胞から得た上清は、ＴＬＲ５の活性化を誘発することから、フラジェリンが分泌されることが強く示唆されているものの、ピロトーシス後に、死にかけている形質導入細胞からフラジェリンが放出される可能性は排除されないことに言及することが重要であり、このことは、上記の結果ですでに観察されている（図１０）。
【０１９１】
実施例１１：ｒＭＶＡ−フラジェリンは、インビトロで、ＤＣによるＴＬＲ５依存性及びインフラマソーム依存性サイトカイン応答をを誘導する。
我々の古典的なｒＭＶＡワクチンの免疫原性を向上させるために、十分に確立された粘膜アジュバントフラジェリンによって、遺伝的アジュバント添加構築物を設計して、我々のワクチンを粘膜経路によって用いることを目指した。インビボ投与前に、ＦＬＤＣを用いたインビトロ研究によって、生物活性と自然免疫認識能を割り出すことが重要であった。
【０１９２】
フラジェリンの認識は、ＴＬＲ５によるフラジェリンシグナルの細胞外認識と、ＮＡＩＰ５／ＮＬＲＣ４インフラマソームを介したフラジェリンシグナルの細胞質内認識という２つの機構に媒介されることが知られている。これらの２つの別個の認識経路により、ＴＬＲ５シグナル伝達に応答して、ＩＬ−６及びＴＮＦ−αのような特異的自然免疫サイトカインが産生されるようになるとともに、インフラマソームによるカスパーゼ−１の活性化に続いて、ＩＬ−１βとＩＬ−１８が産生されるようになる。そこで、我々のアジュバント添加ｒＭＶＡ−フラジェリンに、ＴＬＲ５もしくはインフラマソーム経路のいずれか、または両方を同時に誘発して、上記の特異的サイトカインの産生を誘発する機能があるかを知りたいと我々は考えた。この課題に取り組むために、ＦＬＤＣをｒＭＶＡ、ｒＭＶＡ−フラジェリン、ｒＭＶＡ及びフラジェリン、または組み換えフラジェリン単独で、６時間刺激した（図１１）。続いて、その上清のサイトカインを解析した。我々の結果は、ｒＭＶＡ−フラジェリンが実際に、インフラマソーム依存性認識経路を刺激して、ＩＬ−１ββ（図１１ａ）とＩＬ−１８（図１１ｂ）の両方の産生が観察されることを明らかに示す。ＩＬ−１βは、ｒＭＶＡ−フラジェリンに特異的であった。ｒＭＶＡも、組み換えフラジェリンも、ＦＬＤＣからのＩＬ−１βの産生を誘導しなかったからである。ただし、ＤＣを刺激するトランスフェクション試薬とともに組み換えフラジェリンを用いると、ＩＬ１−βが多少産生されるが、ｒＭＶＡ−フラジェリンよりもかなり少ないレベルである（図１１ａ）。これに対し、ｒＭＶＡで刺激したＦＬＤＣからも、ｒＭＶＡ＋フラジェリンで刺激したＦＬＤＣからも、ＩＬ−１８を観察できたが、ｒＭＶＡ−フラジェリンに比べてかなり低いレベルであったことから（図１１ｂ）、ｒＭＶＡ−フラジェリンによって、インフラマソーム経路が活性化されることも示唆される。組み換えフラジェリンのみで刺激したＦＬＤＣは、ＩＬ−１８の産生を誘導しなかった（図１１ｂ）。ＩＬ−６（図１１ｃ）とＴＮＦ−α（図１１ｄ）も、６時間ほどの早さで、ｒＭＶＡ−フラジェリンで刺激したＦＬＤＣから検出できたことから、ＴＬＲ５経路の活性化が確認される。加えて、ｒＭＶＡ＋フラジェリンで刺激したＤＣは、感染から６時間後に、ＩＬ６とＴＮＦ−αを、ｒＭＶＡ−フラジェリンで刺激したＤＣと近いレベルで誘導したことから（図１１ｃ、ｄ）、添加したフラジェリンの効果と、ＴＬＲ５の刺激が示されているが、ｒＭＶＡで刺激したＤＣでは、ＩＬ−６の誘導も、ＴＮＦ−αの誘導も、ｒＭＶＡ−フラジェリンで刺激したＤＣに比べて不十分なレベルであった。総括すると、これらの結果は、ｒＭＶＡ−フラジェリンの認識が、ＤＣにおいて、ＴＬＲ５とＮＬＣＲ４インフラマソーム経路の両方を、時間に依存する形で誘導し、刺激から６時間ほどの早さで、サイトカインの産生が最も高くなることを示唆する。
【０１９３】
実施例１２：粘膜樹状細胞からのｒＭＶＡ−フラジェリン特異的ＩＬ−１βの産生
ｒＭＶＡ−フラジェリンによる鼻腔内免疫後に、インビボ及びインビトロで、ｒＭＶＡ−フラジェリン特異的ＩＬ−１βが産生されるとともに、胃腸免疫応答が発現することが立証されたので、粘膜ＤＣ、より具体的には、粘膜固有層由来のＤＣの刺激を誘導可能であるかを明らかにしたいと我々は考えた。
【０１９４】
古典的ＤＣには、粘膜固有層において、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１７２ａ及びＣＤ１０３に基づき説明されてきた３つの主要サブセットがある。ＣＤ１１ｂ−ＣＤ１７２ａ−ＣＤ１０３＋は、リンパ器官でみられるＣＤ８α＋ＤＣの対応物を表す。ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１７２ａ＋ＣＤ１０３−ＤＣは、フラジェリンに応答することが説明されているので、ｒＭＶＡ−フラジェリンに、この特定の粘膜ＤＣサブセットを刺激する機能があるか明らかにすることが興味の対象であった。実際、我々の結果は、このサブセットの粘膜ＤＣをソーティングして、エキソビボでｒＭＶＡ−フラジェリンによって刺激したところ、ＩＬ−１βを観察することができたことを示す（図１２）。すなわち、このデータは、ｒＭＶＡ−フラジェリンが粘膜ＤＣを刺激できることを示唆する。
【０１９５】
配列
配列番号１（Ｐ０６１７９（ＵｎｉＰｒｏｔ）フラジェリン（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）のアミノ酸配列：
ＭＡＱＶＩＮＴＮＳＬＳＬＬＴＱＮＮＬＮＫＳＱＳＡＬＧＴＡＩＥＲＬＳＳＧＬＲＩＮＳＡＫＤＤＡＡＧＱＡＩＡＮＲＦＴＡＮＩＫＧＬＴＱＡＳＲＮＡＮＤＧＩＳＩＡＱＴＴＥＧＡＬＮＥＩＮＮＮＬＱＲＶＲＥＬＡＶＱＳＡＮＳＴＮＳＱＳＤＬＤＳＩＱＡＥＩＴＱＲＬＮＥＩＤＲＶＳＧＱＴＱＦＮＧＶＫＶＬＡＱＤＮＴＬＴＩＱＶＧＡＮＤＧＥＴＩＤＩＤＬＫＱＩＮＳＱＴＬＧＬＤＴＬＮＶＱＱＫＹＫＶＳＤＴＡＡＴＶＴＧＹＡＤＴＴＩＡＬＤＮＳＴＦＫＡＳＡＴＧＬＧＧＴＤＱＫＩＤＧＤＬＫＦＤＤＴＴＧＫＹＹＡＫＶＴＶＴＧＧＴＧＫＤＧＹＹＥＶＳＶＤＫＴＮＧＥＶＴＬＡＧＧＡＴＳＰＬＴＧＧＬＰＡＴＡＴＥＤＶＫＮＶＱＶＡＮＡＤＬＴＥＡＫＡＡＬＴＡＡＧＶＴＧＴＡＳＶＶＫＭＳＹＴＤＮＮＧＫＴＩＤＧＧＬＡＶＫＶＧＤＤＹＹＳＡＴＱＮＫＤＧＳＩＳＩＮＴＴＫＹＴＡＤＤＧＴＳＫＴＡＬＮＫＬＧＧＡＤＧＫＴＥＶＶＳＩＧＧＫＴＹＡＡＳＫＡＥＧＨＮＦＫＡＱＰＤＬＡＥＡＡＡＴＴＴＥＮＰＬＱＫＩＤＡＡＬＡＱＶＤＴＬＲＳＤＬＧＡＶＱＮＲＦＮＳＡＩＴＮＬＧＮＴＶＮＮＬＴＳＡＲＳＲＩＥＤＳＤＹＡＴＥＶＳＮＭＳＲＡＱＩＬＱＱＡＧＴＳＶＬＡＱＡＮＱＶＰＱＮＶＬＳＬＬＲ
【０１９６】
配列番号２（フラジェリン（Ｐ０６１７９）のＤＮＡコーディング配列、ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ＮＣ＿００３１９７．１：
ａｔｇｇｃａｃａａｇ  ｔｃａｔｔａａｔａｃ  ａａａｃａｇｃｃｔｇ  ｔｃｇｃｔｇｔｔｇａ  ｃｃｃａｇａａｔａａ  ｃｃｔｇａａｃａａａ  ｔｃｃｃａｇｔｃｃｇ  ｃｔｃｔｇｇｇｃａｃ  ｃｇｃｔａｔｃｇａｇ  ｃｇｔｃｔｇｔｃｔｔ  ｃｃｇｇｔｃｔｇｃｇ  ｔａｔｃａａｃａｇｃ  ｇｃｇａａａｇａｃｇ  ａｔｇｃｇｇｃａｇｇ  ｔｃａｇｇｃｇａｔｔ  ｇｃｔａａｃｃｇｔｔ  ｔｔａｃｃｇｃｇａａ  ｃａｔｃａａａｇｇｔ  ｃｔｇａｃｔｃａｇｇ  ｃｔｔｃｃｃｇｔａａ  ｃｇｃｔａａｃｇａｃ  ｇｇｔａｔｃｔｃｃａ  ｔｔｇｃｇｃａｇａｃ  ｃａｃｔｇａａｇｇｃ  ｇｃｇｃｔｇａａｃｇ  ａａａｔｃａａｃａａ  ｃａａｃｃｔｇｃａｇ  ｃｇｔｇｔｇｃｇｔｇ  ａａｃｔｇｇｃｇｇｔ  ｔｃａｇｔｃｔｇｃｔ  ａａｃａｇｃａｃｃａ  ａｃｔｃｃｃａｇｔｃ  ｔｇａｃｃｔｃｇａｃ  ｔｃｃａｔｃｃａｇｇ  ｃｔｇａａａｔｃａｃ  ｃｃａｇｃｇｃｃｔｇ  ａａｃｇａａａｔｃｇ  ａｃｃｇｔｇｔａｔｃ  ｃｇｇｃｃａｇａｃｔ  ｃａｇｔｔｃａａｃｇ  ｇｃｇｔｇａａａｇｔ  ｃｃｔｇｇｃｇｃａｇ  ｇａｃａａｃａｃｃｃ  ｔｇａｃｃａｔｃｃａ  ｇｇｔｔｇｇｔｇｃｃ  ａａｃｇａｃｇｇｔｇ  ａａａｃｔａｔｃｇａ  ｔａｔｃｇａｔｃｔｇ  ａａｇｃａｇａｔｃａ  ａｃｔｃｔｃａｇａｃ  ｃｃｔｇｇｇｔｃｔｇ  ｇａｔａｃｇｃｔｇａ  ａｔｇｔｇｃａａｃａ  ａａａａｔａｔａａｇ  ｇｔｃａｇｃｇａｔａ  ｃｇｇｃｔｇｃａａｃ  ｔｇｔｔａｃａｇｇａ  ｔａｔｇｃｃｇａｔａ  ｃｔａｃｇａｔｔｇｃ  ｔｔｔａｇａｃａａｔ  ａｇｔａｃｔｔｔｔａ  ａａｇｃｃｔｃｇｇｃ  ｔａｃｔｇｇｔｃｔｔ  ｇｇｔｇｇｔａｃｔｇ  ａｃｃａｇａａａａｔ  ｔｇａｔｇｇｃｇａｔ  ｔｔａａａａｔｔｔｇ  ａｔｇａｔａｃｇａｃ  ｔｇｇａａａａｔａｔ  ｔａｃｇｃｃａａａｇ  ｔｔａｃｃｇｔｔａｃ  ｇｇｇｇｇｇａａｃｔ  ｇｇｔａａａｇａｔｇ  ｇｃｔａｔｔａｔｇａ  ａｇｔｔｔｃｃｇｔｔ  ｇａｔａａｇａｃｇａ  ａｃｇｇｔｇａｇｇｔ  ｇａｃｔｃｔｔｇｃｔ  ｇｇｃｇｇｔｇｃｇａ  ｃｔｔｃｃｃｃｇｃｔ  ｔａｃａｇｇｔｇｇａ  ｃｔａｃｃｔｇｃｇａ  ｃａｇｃａａｃｔｇａ  ｇｇａｔｇｔｇａａａ  ａａｔｇｔａｃａａｇ  ｔｔｇｃａａａｔｇｃ  ｔｇａｔｔｔｇａｃａ  ｇａｇｇｃｔａａａｇ  ｃｃｇｃａｔｔｇａｃ  ａｇｃａｇｃａｇｇｔ  ｇｔｔａｃｃｇｇｃａ  ｃａｇｃａｔｃｔｇｔ  ｔｇｔｔａａｇａｔｇ  ｔｃｔｔａｔａｃｔｇ  ａｔａａｔａａｃｇｇ  ｔａａａａｃｔａｔｔ  ｇａｔｇｇｔｇｇｔｔ  ｔａｇｃａｇｔｔａａ  ｇｇｔａｇｇｃｇａｔ  ｇａｔｔａｃｔａｔｔ  ｃｔｇｃａａｃｔｃａ  ａａａｔａａａｇａｔ  ｇｇｔｔｃｃａｔａａ  ｇｔａｔｔａａｔａｃ  ｔａｃｇａａａｔａｃ  ａｃｔｇｃａｇａｔｇ  ａｃｇｇｔａｃａｔｃ  ｃａａａａｃｔｇｃａ  ｃｔａａａｃａａａｃ  ｔｇｇｇｔｇｇｃｇｃ  ａｇａｃｇｇｃａａａ  ａｃｃｇａａｇｔｔｇ  ｔｔｔｃｔａｔｔｇｇ  ｔｇｇｔａａａａｃｔ  ｔａｃｇｃｔｇｃａａ  ｇｔａａａｇｃｃｇａ  ａｇｇｔｃａｃａａｃ  ｔｔｔａａａｇｃａｃ  ａｇｃｃｔｇａｔｃｔ  ｇｇｃｇｇａａｇｃｇ  ｇｃｔｇｃｔａｃａａ  ｃｃａｃｃｇａａａａ  ｃｃｃｇｃｔｇｃａｇ  ａａａａｔｔｇａｔｇ  ｃｔｇｃｔｔｔｇｇｃ  ａｃａｇｇｔｔｇａｃ  ａｃｇｔｔａｃｇｔｔ  ｃｔｇａｃｃｔｇｇｇ  ｔｇｃｇｇｔａｃａｇ  ａａｃｃｇｔｔｔｃａ  ａｃｔｃｃｇｃｔａｔ  ｔａｃｃａａｃｃｔｇ  ｇｇｃａａｃａｃｃｇ  ｔａａａｃａａｃｃｔ  ｇａｃｔｔｃｔｇｃｃ  ｃｇｔａｇｃｃｇｔａ  ｔｃｇａａｇａｔｔｃ  ｃｇａｃｔａｃｇｃｇ  ａｃｃｇａａｇｔｔｔ  ｃｃａａｃａｔｇｔｃ  ｔｃｇｃｇｃｇｃａｇ  ａｔｔｃｔｇｃａｇｃ  ａｇｇｃｃｇｇｔａｃ  ｃｔｃｃｇｔｔｃｔｇ  ｇｃｇｃａｇｇｃｇａ  ａｃｃａｇｇｔｔｃｃ  ｇｃａａａａｃｇｔｃ  ｃｔｃｔｃｔｔｔａｃ  ｔｇｃｇｔｔａａ
【０１９７】
配列番号３（Ｂ８２０−２７−ペプチド）：ＴＳＹＫＦＥＳＶ
【０１９８】
配列番号４（ＯＶＡ２５７−２６４−ペプチド）：ＳＩＩＮＦＥＫＬ
【０１９９】
本発明の他の実施形態は、本明細書と、本明細書に開示されている本発明の実施内容を考察すれば、当業者には明らかであろう。本明細書と実施例は、単なる例示としてみなす
ように意図されており、本発明の真の範囲及び趣旨は、下記の請求項によって示される。
【図１】
2020183430.tif 000003
【図２】
2020183430.tif 000004
【図３】
2020183430.tif 000005
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
2020183430000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年8月5日(2020.8.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９９】
本発明の他の実施形態は、本明細書と、本明細書に開示されている本発明の実施内容を考察すれば、当業者には明らかであろう。本明細書と実施例は、単なる例示としてみなすように意図されており、本発明の真の範囲及び趣旨は、下記の請求項によって示される。  なお、本願は、特許請求の範囲に記載の発明に関するものであるが、他の態様として以下も包含し得る。
１．フラジェリンをコードする核酸配列と、異種の疾患関連抗原をコードする核酸配列とを含む組み換え改変ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）を含む免疫原性組成物であって、対象に投与すると、異種の疾患関連抗原をコードする核酸配列を含むが、フラジェリンをコードする核酸配列を含まない組み換えＭＶＡの投与によって誘導される、前記異種の疾患関連抗原に特異的なＴ細胞免疫応答及び／またはＢ細胞免疫応答に比べて、前記異種の疾患関連抗原に特異的な増加したＴ細胞免疫応答及び／またはＢ細胞免疫応答を誘導する前記免疫原性組成物。
２．前記増加したＴ細胞免疫応答は、前記異種の疾患関連抗原に特異的な細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の数が増えることを含む、上記１に記載の免疫原性組成物。
３．前記異種の疾患関連抗原に特異的なＣＴＬの数が増えることにより、異種の疾患関連抗原をコードする核酸配列を含むが、フラジェリンをコードする核酸配列を含まない組み換えＭＶＡの投与によって誘導されるＣＴＬと比べて、増加した細胞溶解活性も示す、上記２に記載の免疫原性組成物。
４．前記増加したＴ細胞免疫応答は、前記異種の疾患関連抗原に特異的なメモリーＴ細胞の数が増えることを含む、上記１に記載の免疫原性組成物。
５．前記増加したＴ細胞免疫応答は、前記異種の疾患関連抗原に特異的なＣＴＬの数が増えることと、前記異種の疾患関連抗原に特異的なメモリーＴ細胞の数が増えることとを含む、上記１に記載の免疫原性組成物。
６．前記異種の疾患関連抗原に特異的なＣＴＬの数が増えることにより、異種の疾患関連抗原をコードする核酸配列を含むが、フラジェリンをコードする核酸配列を含まない組み換えＭＶＡの投与によって誘導されるＣＴＬと比べて、増加した細胞溶解活性も示す、上記５に記載の免疫原性組成物。
７．前記核酸配列が、配列番号１に対するアミノ酸配列同一性が少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のフラジェリンをコードする、上記１〜６のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
８．前記核酸配列が、配列番号１のアミノ酸配列を有するフラジェリンをコードする、上記７に記載の免疫原性組成物。
９．製薬学的に許容可能な担体を更に含む、上記１〜８のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
１０．前記疾患関連抗原が、感染性疾患抗原または腫瘍関連抗原である、上記１〜９のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
１１．前記疾患関連抗原が、感染性疾患抗原である、上記１０に記載の免疫原性組成物。１２．前記感染性疾患抗原が、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原または寄生虫抗原である、上記１１に記載の免疫原性組成物。
１３．前記感染性疾患抗原が、ウイルス抗原である、上記１２に記載の免疫原性組成物。１４．前記ウイルス抗原が、アデノウイルス、アルボウイルス、アストロウイルス、コロナウイルス、コクサッキーウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、サイトメガロウイルス（「ＣＭＶ」）、デングウイルス、エボラウイルス、エプスタイン・バーウイルス（「ＥＢＶ」）、口蹄疫ウイルス、グアナリトウイルス、ヘンドラウイルス、単純ヘルペスウイルス１型（「ＨＳＶ−１」）、単純ヘルペスウイルス２型（「ＨＳＶ−２」）、ヒトヘルペスウイルス６型（「ＨＨＶ−６」）、ヒトヘルペスウイルス８型（「ＨＨＶ−８」）、Ａ型肝炎ウイルス（「ＨＡＶ」）、Ｂ型肝炎ウイルス（「ＨＢＶ」）、Ｃ型肝炎ウイルス（「ＨＣＶ」）、Ｄ型肝炎ウイルス（「ＨＤＶ」）、Ｅ型肝炎ウイルス（「ＨＥＶ」）、ヒト免疫不全ウイルス（「ＨＩＶ」）、インフルエンザウイルス、日本脳炎ウイルス、フニンウイルス、ラッサウイルス、マチュポウイルス、マールブルグウイルス、麻疹ウイルス、ヒトメタニューモウイルス、伝染性軟属腫ウイルス、ムンプスウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ニパウイルス、ノロウイルス、ノーウォークウイルス、ヒトパピローマウイルス（「ＨＰＶ」）、パラインフルエンザウイルス、パルボウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（「ＲＳＶ」）、ライノウイルス、ロタウイルス、風疹ウイルス、サビアウイルス、重症急性呼吸器症候群ウイルス（「ＳＡＲＳ」）、水痘帯状疱疹ウイルス、痘瘡ウイルス、ウエストナイルウイルス及び黄熱病ウイルスからなる群から選択されるウイルス由来である、上記１３に記載の免疫原性組成物。１５．前記感染性疾患抗原が、細菌抗原である、上記１２に記載の免疫原性組成物。
１６．前記細菌抗原が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ
ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ
ａｂｏｒｔｕｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｃａｎｉｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｓｕｉｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｍａｌｌｅｉ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｔｈｅｒｉａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、ｅｎｔｅｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）１５７：Ｈ７、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ
ｔｙｐｈｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ及びＹｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓからなる群から選択される細菌に由来する、上記１５に記載の免疫原性組成物。
１７．前記感染性疾患抗原が、真菌抗原である、上記１２に記載の免疫原性組成物。
１８．前記真菌抗原が、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｃｌａｖａｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｄｕｂｌｉｎｉｅｎｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ
ｒｕｇｏｓａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｌｂｉｄｕｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｔｔｉｉ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
ｌａｕｒｅｎｔｉｉ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ  ｃａｎｉｓ、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｊｉｒｏｖｅｃｉｉ、Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ  ｓｃｈｅｎｃｋｉｉ、Ｓｔａｃｈｂｏｔｒｙｓ  ｃｈａｒｔａｒｕｍ、Ｔｉｎｅａ  ｂａｒｂａｅ、Ｔｉｎｅａ  ｃａｐｔｉｔｉｓ、Ｔｉｎｅａ  ｃｏｒｐｏｒｉｓ、Ｔｉｎｅａ  ｃｒｕｒｉｓ、Ｔｉｎｅａ  ｆａｃｉｅｉ、Ｔｉｎｅａ  ｉｎｃｏｇｎｉｔｏ、Ｔｉｎｅａ  ｎｉｇｒａ、Ｔｉｎｅａ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｒｕｂｒｕｍ及びＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｔｏｎｓｕｒａｎｓからなる群から選択される真菌に由来する、上記１７に記載の免疫原性組成物。
１９．前記感染性疾患抗原が、寄生虫抗原である、上記１２に記載の免疫原性組成物。
２０．前記寄生虫抗原が、Ａｎｉｓａｋｉｓ  ｓｐｐ．、Ｂａｂｅｓｉａ  ｓｐｐ．、Ｂａｙｌｉｓａｓｃａｒｉｓ  ｐｒｏｃｙｏｎｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｐ．、Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒａ  ｃａｙｅｔａｎｅｎｓｉｓ、Ｄｉｐｈｙｌｌｏｂｏｔｈｒｉｕｍ  ｓｐｐ．、Ｄｒａｃｕｎｃｕｌｕｓ  ｍｅｄｉｎｅｎｓｉｓ、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ、Ｇｉａｒｄｉａ  ｄｕｏｄｅｎａｌｉｓ、Ｇｉａｒｄｉａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、Ｇｉａｒｄｉａ  ｌａｍｂｌｉａ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｓｐ．、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｍａｎｓｏｎｉ、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｈａｅｍａｔｏｂｉｕｍ、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ、Ｔａｅｎｉａ  ｓｐｐ．、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ、Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ  ｓｐｉｒａｌｉｓ及びＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉからなる群から選択される寄生虫由来である、上記１９に記載の免疫原性組成物。２１．前記疾患関連抗原が、腫瘍関連抗原である、上記１０に記載の免疫原性組成物。
２２．前記腫瘍関連抗原が、５−α−レダクターゼ、α−フェトプロテイン（「ＡＦＰ」）、ＡＭ−１、ＡＰＣ、Ａｐｒｉｌ、Ｂメラノーマ抗原遺伝子（「ＢＡＧＥ」）、β−カテニン、Ｂｃｌ１２、ｂｃｒ−ａｂｌ、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、ＣＡ−１２５、カスパーゼ−８（「ＣＡＳＰ−８」、「ＦＬＩＣＥ」としても知られている）、カテプシン、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１／補体レセプター２（「ＣＲ２」）、ＣＤ２２／ＢＬ−ＣＡＭ、ＣＤ２３／ＦｃεＲＩＩ、ＣＤ３３、ＣＤ３５／補体レセプター１（「ＣＲ１」）、ＣＤ４４／ＰＧＰ−１、ＣＤ４５／白血球共通抗原（「ＬＣＡ」）、ＣＤ４６／膜補因子タンパク質（「ＭＣＰ」）、ＣＤ５２／ＣＡＭＰＡＴＨ−１、ＣＤ５５／崩壊促進因子（「ＤＡＦ」）、ＣＤ５９／プロテクチン、ＣＤＣ２７、ＣＤＫ４、癌胎児性抗原（「ＣＥＡ」）、ｃ−ｍｙｃ、シクロオキシゲナーゼ−２（「ｃｏｘ−２」）、大腸がん欠失遺伝子（「ＤＣＣ」）、ＤｃＲ３、Ｅ６／Ｅ７、ＣＧＦＲ、ＥＭＢＰ、Ｄｎａ７８、ファルネシルトランスフェラーゼ、線維芽細胞増殖因子−８ａ（「ＦＧＦ８ａ」）、線維芽細胞増殖因子−８ｂ（「ＦＧＦ８ｂ」）、ＦＬＫ−１／ＫＤＲ、葉酸レセプター、Ｇ２５０、Ｇメラノーマ抗原遺伝子ファミリー（「ＧＡＧＥ−ファミリー」）、ガストリン１７、ガストリン放出ホルモン、ガングリオシド２（「ＧＤ２」）／ガングリオシド３（「ＧＤ３」）／ガングリオシド−モノシアル酸−２（「ＧＭ２」）、ゴナドトロピン放出ホルモン（「ＧｎＲＨ」）、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ：Ｒ１Ｍａｎ（α１−６）Ｒ２［ＧｌｃＮＡｃ−Ｍａｎ（α１−６）］β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ（「ＧｎＴ  Ｖ」）、ＧＰ１、ｇｐ１００／Ｐｍｅ１１７、ｇｐ−１００−ｉｎ４、ｇｐ１５、ｇｐ７５／チロシン関連タンパク質−１（「ｇｐ７５／ＴＲＰ−１」）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（「ｈＣＧ」）、ヘパラナーゼ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ヒト乳癌ウイルス（「ＨＭＴＶ」）、７０キロダルトン熱ショックタンパク質（「ＨＳＰ７０」）、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（「ｈＴＥＲＴ」）、インスリン様増殖因子レセプター−１（「ＩＧＦＲ−１」）、インターロイキン−１３レセプター（「ＩＬ−１３Ｒ」）、誘導型一酸化窒素合成酵素（「ｉＮＯＳ」）、Ｋｉ６７、ＫＩＡＡ０２０５、Ｋ−ｒａｓ、Ｈ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ、ＫＳＡ、ＬＫＬＲ−ＦＵＴ、メラノーマ抗原コード遺伝子１（「ＭＡＧＥ−１」）、メラノーマ抗原コード遺伝子２（「ＭＡＧＥ−２」）、メラノーマ抗原コード遺伝子３（「ＭＡＧＥ−３」）、メラノーマ抗原コード遺伝子４（「ＭＡＧＥ−４」）、マンマグロビン、ＭＡＰ１７、Ｍｅｌａｎ−Ａ／Ｔ細胞認識メラノーマ抗原−１（「ＭＡＲＴ−１」）、メソセリン、ＭＩＣ  Ａ／Ｂ、ＭＴ−ＭＭＰ、ムチン、精巣特異的抗原ＮＹ−ＥＳＯ−１、オステオネクチン、ｐ１５、Ｐ１７０／ＭＤＲ１、ｐ５３、ｐ９７／メラノトランスフェリン、ＰＡＩ−１、血小板由来増殖因子（「ＰＤＧＦ」）、μＰＡ、ＰＲＡＭＥ、プロバシン、プロゲニポエチン、前立腺特異的抗原（「ＰＳＡ」）、前立腺特異的膜抗原（「ＰＳＭＡ」）、前立腺酸性ホスファターゼ（「ＰＡＰ」）、ＲＡＧＥ−１、Ｒｂ、ＲＣＡＳ１、Ｓ���ＲＴ−１、ＳＳＸファミリー、ＳＴＡＴ３、ＳＴｎ、ＴＡＧ−７２、形質転換増殖因子α（「ＴＧＦ−α」）、形質転換増殖因子β（「ＴＧＦ−β」）、チモシンβ１５、腫瘍壊死因子α（「ＴＮＦ−α」）、ＴＰ１、ＴＲＰ−２、チロシナーゼ、血管内皮増殖因子（「ＶＥＧＦ」）、ＺＡＧ、ｐ１６ＩＮＫ４及びグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（「ＧＳＴ」）からなる群から選択される、上記２１に記載の免疫原性組成物。
２３．疾患関連抗原に対する抗原特異的免疫応答の誘導方法であって、上記１〜２２のいずれか１項に記載の免疫原性組成物を、それが必要な対象に投与することを含み、前記免疫原性組成物が、対象に投与されると、前記異種の疾患関連抗原に特異的な増加したＴ細胞免疫応答及び／またはＢ細胞免疫応答を誘導する前記方法。
２４．前記増加したＴ細胞免疫応答の増加は、前記異種の疾患関連抗原に特異的な細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の数が増えることが含まれる、上記２３に記載の方法。
２５．前記異種の疾患関連抗原に特異的なＣＴＬの数が増えることにより、異種の疾患関連抗原をコードする核酸配列を含むが、フラジェリンをコードする核酸配列を含まない組み換えＭＶＡの投与によって誘導されるＣＴＬと比べて、増加した細胞溶解活性も示す、上記２４に記載の方法。
２６．前記増加したＴ細胞免疫応答は、前記異種の疾患関連抗原に特異的なメモリーＴ細胞の数が増えることが含まれる、上記２３に記載の方法。
２７．前記増加したＴ細胞免疫応答は、前記異種の疾患関連抗原に特異的なＣＴＬの数が増えることと、前記異種の疾患関連抗原に特異的なメモリーＴ細胞の数が増えることとが含まれる、上記２３に記載の方法。
２８．前記異種の疾患関連抗原に特異的なＣＴＬの数が増えることにより、異種の疾患関連抗原をコードする核酸配列を含むが、フラジェリンをコードする核酸配列を含まない組み換えＭＶＡの投与によって誘導されるＣＴＬと比べて、増加した細胞溶解活性を示す、上記２７に記載の方法。
２９．前記核酸配列が、配列番号１に対するアミノ酸配列同一性が少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％であるフラジェリンをコードする、上記２３〜２８のいずれか１項に記載の方法。
３０．前記核酸配列が、配列番号１のアミノ酸配列を有するフラジェリンをコードする、上記２９に記載の方法。
３１．前記免疫原性組成物が、製薬学的に許容可能な担体を更に含む、上記２３〜３０のいずれか１項に記載の方法。
３２．前記疾患関連抗原が、感染性疾患抗原または腫瘍関連抗原である、上記２３〜３１のいずれか１項に記載の方法。
３３．前記疾患関連抗原が、感染性疾患抗原である、上記３２に記載の方法。
３４．前記感染性疾患抗原が、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原または寄生虫抗原である、上記３３に記載の方法。
３５．前記感染性疾患抗原が、ウイルス抗原である、上記３４に記載の方法。
３６．前記ウイルス抗原が、アデノウイルス、アルボウイルス、アストロウイルス、コロナウイルス、コクサッキーウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、サイトメガロウイルス（「ＣＭＶ」）、デングウイルス、エボラウイルス、エプスタイン・バーウイルス（「ＥＢＶ」）、口蹄疫ウイルス、グアナリトウイルス、ヘンドラウイルス、単純ヘルペスウイルス１型（「ＨＳＶ−１」）、単純ヘルペスウイルス２型（「ＨＳＶ−２」）、ヒトヘルペスウイルス６型（「ＨＨＶ−６」）、ヒトヘルペスウイルス８型（「ＨＨＶ−８」）、Ａ型肝炎ウイルス（「ＨＡＶ」）、Ｂ型肝炎ウイルス（「ＨＢＶ」）、Ｃ型肝炎ウイルス（「ＨＣＶ」）、Ｄ型肝炎ウイルス（「ＨＤＶ」）、Ｅ型肝炎ウイルス（「ＨＥＶ」）、ヒト免疫不全ウイルス（「ＨＩＶ」）、インフルエンザウイルス、日本脳炎ウイルス、フニンウイルス、ラッサウイルス、マチュポウイルス、マールブルグウイルス、麻疹ウイルス、ヒトメタニューモウイルス、伝染性軟属腫ウイルス、ムンプスウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ニパウイルス、ノロウイルス、ノーウォークウイルス、ヒトパピローマウイルス（「ＨＰＶ」）、パラインフルエンザウイルス、パルボウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（「ＲＳＶ」）、ライノウイルス、ロタウイルス、風疹ウイルス、サビアウイルス、重症急性呼吸器症候群ウイルス（「ＳＡＲＳ」）、水痘帯状疱疹ウイルス、痘瘡ウイルス、ウエストナイルウイルス及び黄熱病ウイルスからなる群から選択されるウイルスに由来する、上記３５に記載の方法。
３７．前記感染性疾患抗原が、細菌抗原である、上記３４に記載の方法。
３８．前記細菌抗原が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ
ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ
ａｂｏｒｔｕｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｃａｎｉｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｓｕｉｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｍａｌｌｅｉ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｔｈｅｒｉａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、ｅｎｔｅｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）１５７：Ｈ７、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ
ｔｙｐｈｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ及びＹｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓからなる群から選択される細菌に由来する、上記３７に記載の方法。
３９．前記感染性疾患抗原が、真菌抗原である、上記３４に記載の方法。
４０．前記真菌抗原が、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｃｌａｖａｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｄｕｂｌｉｎｉｅｎｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ
ｒｕｇｏｓａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｌｂｉｄｕｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｔｔｉｉ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
ｌａｕｒｅｎｔｉｉ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ  ｃａｎｉｓ、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｊｉｒｏｖｅｃｉｉ、Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ  ｓｃｈｅｎｃｋｉｉ、Ｓｔａｃｈｂｏｔｒｙｓ  ｃｈａｒｔａｒｕｍ、Ｔｉｎｅａ  ｂａｒｂａｅ、Ｔｉｎｅａ  ｃａｐｔｉｔｉｓ、Ｔｉｎｅａ  ｃｏｒｐｏｒｉｓ、Ｔｉｎｅａ  ｃｒｕｒｉｓ、Ｔｉｎｅａ  ｆａｃｉｅｉ、Ｔｉｎｅａ  ｉｎｃｏｇｎｉｔｏ、Ｔｉｎｅａ  ｎｉｇｒａ、Ｔｉｎｅａ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｒｕｂｒｕｍ及びＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｔｏｎｓｕｒａｎｓからなる群から選択される真菌に由来する、上記３９に記載の方法。
４１．前記感染性疾患抗原が、寄生虫抗原である、上記３４に記載の方法。
４２．前記寄生虫抗原が、Ａｎｉｓａｋｉｓ  ｓｐｐ．、Ｂａｂｅｓｉａ  ｓｐｐ．、Ｂａｙｌｉｓａｓｃａｒｉｓ  ｐｒｏｃｙｏｎｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｐ．、Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒａ  ｃａｙｅｔａｎｅｎｓｉｓ、Ｄｉｐｈｙｌｌｏｂｏｔｈｒｉｕｍ  ｓｐｐ．、Ｄｒａｃｕｎｃｕｌｕｓ  ｍｅｄｉｎｅｎｓｉｓ、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ、Ｇｉａｒｄｉａ  ｄｕｏｄｅｎａｌｉｓ、Ｇｉａｒｄｉａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、Ｇｉａｒｄｉａ  ｌａｍｂｌｉａ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｓｐ．、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｍａｎｓｏｎｉ、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｈａｅｍａｔｏｂｉｕｍ、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ、Ｔａｅｎｉａ  ｓｐｐ．、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ、Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ  ｓｐｉｒａｌｉｓ及びＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉからなる群から選択される寄生虫に由来する、上記４１に記載の方法。
４３．前記疾患関連抗原が、腫瘍関連抗原である、上記３２に記載の方法。
４４．前記腫瘍関連抗原が、５−α−レダクターゼ、α−フェトプロテイン（「ＡＦＰ」）、ＡＭ−１、ＡＰＣ、Ａｐｒｉｌ、Ｂメラノーマ抗原遺伝子（「ＢＡＧＥ」）、β−カテニン、Ｂｃｌ１２、ｂｃｒ−ａｂｌ、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、ＣＡ−１２５、カスパーゼ−８（「ＣＡＳＰ−８」、「ＦＬＩＣＥ」としても知られている）、カテプシン、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１／補体レセプター２（「ＣＲ２」）、ＣＤ２２／ＢＬ−ＣＡＭ、ＣＤ２３／ＦｃεＲＩＩ、ＣＤ３３、ＣＤ３５／補体レセプター１（「ＣＲ１」）、ＣＤ４４／ＰＧＰ−１、ＣＤ４５／白血球共通抗原（「ＬＣＡ」）、ＣＤ４６／膜補因子タンパク質（「ＭＣＰ」）、ＣＤ５２／ＣＡＭＰＡＴＨ−１、ＣＤ５５／崩壊促進因子（「ＤＡＦ」）、ＣＤ５９／プロテクチン、ＣＤＣ２７、ＣＤＫ４、癌胎児性抗原（「ＣＥＡ」）、ｃ−ｍｙｃ、シクロオキシゲナーゼ−２（「ｃｏｘ−２」）、大腸がん欠失遺伝子（「ＤＣＣ」）、ＤｃＲ３、Ｅ６／Ｅ７、ＣＧＦＲ、ＥＭＢＰ、Ｄｎａ７８、ファルネシルトランスフェラーゼ、線維芽細胞増殖因子−８ａ（「ＦＧＦ８ａ」）、線維芽細胞増殖因子−８ｂ（「ＦＧＦ８ｂ」）、ＦＬＫ−１／ＫＤＲ、葉酸レセプター、Ｇ２５０、Ｇメラノーマ抗原遺伝子ファミリー（「ＧＡＧＥ−ファミリー」）、ガストリン１７、ガストリン放出ホルモン、ガングリオシド２（「ＧＤ２」）／ガングリオシド３（「ＧＤ３」）／ガングリオシド−モノシアル酸−２（「ＧＭ２」）、ゴナドトロピン放出ホルモン（「ＧｎＲＨ」）、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ：Ｒ１Ｍａｎ（α１−６）Ｒ２［ＧｌｃＮＡｃ−Ｍａｎ（α１−６）］β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ（「ＧｎＴ  Ｖ」）、ＧＰ１、ｇｐ１００／Ｐｍｅ１１７、ｇｐ−１００−ｉｎ４、ｇｐ１５、ｇｐ７５／チロシン関連タンパク質−１（「ｇｐ７５／ＴＲＰ−１」）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（「ｈＣＧ」）、ヘパラナーゼ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ヒト乳癌ウイルス（「ＨＭＴＶ」）、７０キロダルトン熱ショックタンパク質（「ＨＳＰ７０」）、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（「ｈＴＥＲＴ」）、インスリン様増殖因子レセプター−１（「ＩＧＦＲ−１」）、インターロイキン−１３レセプター（「ＩＬ−１３Ｒ」）、誘導型一酸化窒素合成酵素（「ｉＮＯＳ」）、Ｋｉ６７、ＫＩＡＡ０２０５、Ｋ−ｒａｓ、Ｈ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ、ＫＳＡ、ＬＫＬＲ−ＦＵＴ、メラノーマ抗原コード遺伝子１（「ＭＡＧＥ−１」）、メラノーマ抗原コード遺伝子２（「ＭＡＧＥ−２」）、メラノーマ抗原コード遺伝子３（「ＭＡＧＥ−３」）、メラノーマ抗原コード遺伝子４（「ＭＡＧＥ−４」）、マンマグロビン、ＭＡＰ１７、Ｍｅｌａｎ−Ａ／Ｔ細胞認識メラノーマ抗原−１（「ＭＡＲＴ−１」）、メソセリン、ＭＩＣ  Ａ／Ｂ、ＭＴ−ＭＭＰ、ムチン、精巣特異的抗原ＮＹ−ＥＳＯ−１、オステオネクチン、ｐ１５、Ｐ１７０／ＭＤＲ１、ｐ５３、ｐ９７／メラノトランスフェリン、ＰＡＩ−１、血小板由来増殖因子（「ＰＤＧＦ」）、μＰＡ、ＰＲＡＭＥ、プロバシン、プロゲニポエチン、前立腺特異的抗原（「ＰＳＡ」）、前立腺特異的膜抗原（「ＰＳＭＡ」）、前立腺酸性ホスファターゼ（「ＰＡＰ」）、ＲＡＧＥ−１、Ｒｂ、ＲＣＡＳ１、Ｓ���ＲＴ−１、ＳＳＸファミリー、ＳＴＡＴ３、ＳＴｎ、ＴＡＧ−７２、形質転換増殖因子α（「ＴＧＦ−α」）、形質転換増殖因子β（「ＴＧＦ−β」）、チモシンβ１５、腫瘍壊死因子α（「ＴＮＦ−α」）、ＴＰ１、ＴＲＰ−２、チロシナーゼ、血管内皮増殖因子（「ＶＥＧＦ」）、ＺＡＧ、ｐ１６ＩＮＫ４及びグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（「ＧＳＴ」）からなる群から選択されている、上記４３に記載の方法。４５．前記免疫原性組成物を鼻腔内投与する、上記２３〜４４のいずれか１項に記載の方法。
４６．１回目の投与（プライミング）用の第１のバイアルまたは容器と、２回目の投与（ブースティング）用の第２のバイアルまたは容器に、上記１〜２２のいずれか１項に記載の免疫原性組成物を含むキット。
４７．第３、第４またはそれ以降のバイアルまたは容器に、３回目、４回目またはそれ以降の投与（ブースティング）用の前記免疫原性組成物を含む、上記４６に記載のキット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フラジェリンをコードする核酸配列を含み、異種の疾患関連抗原をコードする核酸配列をさらに含む組み換え改変ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）を含む免疫原性組成物であって、対象に投与すると、異種の疾患関連抗原をコードする核酸配列を含むが、フラジェリンをコードする核酸配列を含まない組み換えＭＶＡの投与によって誘導される、前記異種の疾患関連抗原に特異的なＴ細胞免疫応答及び／またはＢ細胞免疫応答ならびに自然免疫応答に比べて、ａ）前記異種の疾患関連抗原に特異的な増加したＴ細胞免疫応答及び／またはＢ細胞免疫応答ならびにｂ）増加した自然免疫応答を誘導する前記免疫原性組成物において、
前記の組み換え改変ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）が鶏胚線維芽細胞（ＣＥＦ）において増殖的に複製できる、免疫原性組成物。
【請求項２】
前記増加したＴ細胞免疫応答は、前記異種の疾患関連抗原に特異的な細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の数が増えることを含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項３】
前記核酸配列が、配列番号１に対するアミノ酸配列同一性が少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のフラジェリンをコードする、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項４】
前記核酸配列が、配列番号１のアミノ酸配列を有するフラジェリンをコードする、請求項３に記載の免疫原性組成物。
【請求項５】
製薬学的に許容可能な担体を更に含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項６】
前記疾患関連抗原が、感染性疾患抗原または腫瘍関連抗原である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項７】
前記感染性疾患抗原が、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原または寄生虫抗原である、請求項６に記載の免疫原性組成物。
【請求項８】
フラジェリンをコードする核酸配列を含み、異種の疾患関連抗原をコードする核酸配列をさらに含む組み換え改変ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）を含む免疫原性組成物であって、対象に投与すると、異種の疾患関連抗原をコードする核酸配列を含むが、フラジェリンをコードする核酸配列を含まない組み換えＭＶＡの投与によって誘導される、前記異種の疾患関連抗原に特異的なＴ細胞免疫応答及び／またはＢ細胞免疫応答ならびに自然免疫応答に比べて、ａ）前記異種の疾患関連抗原に特異的な増加したＴ細胞免疫応答及び／またはＢ細胞免疫応答ならびにｂ）増加した自然免疫応答を誘導するための、前記免疫原性組成物において、
前記の組み換え改変ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）が鶏胚線維芽細胞（ＣＥＦ）において増殖的に複製できる、免疫原性組成物。
【請求項９】
前記増加したＴ細胞免疫応答は、前記異種の疾患関連抗原に特異的な細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の数が増えることが含まれる、請求項８に記載の免疫原性組成物。
【請求項１０】
前記核酸配列が、配列番号１に対するアミノ酸配列同一性が少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％であるフラジェリンをコードする、請求項８〜９のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１】
前記核酸配列が、配列番号１のアミノ酸配列を有するフラジェリンをコードする、請求項１０に記載の免疫原性組成物。
【請求項１２】
前記免疫原性組成物が、製薬学的に許容可能な担体を更に含む、請求項８〜１１のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１３】
前記疾患関連抗原が、感染性疾患抗原または腫瘍関連抗原である、請求項８〜１２のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１４】
前記感染性疾患抗原が、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原または寄生虫抗原である、請求項１３に記載の免疫原性組成物。
【請求項１５】
前記免疫原性組成物を鼻腔内投与する、請求項８〜１４のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１６】
１回目の投与（プライミング）用の第１のバイアルまたは容器と、２回目の投与（ブースティング）用の第２のバイアルまたは容器に、請求項１〜７のいずれか１項に記載の免疫原性組成物を含むキット。
【請求項１７】
第３、第４またはそれ以降のバイアルまたは容器に、３回目、４回目またはそれ以降の投与（ブースティング）用の前記免疫原性組成物を含む、請求項１６に記載のキット。
【外国語明細書】
2020183430000001.pdf