(57)【要約】      （修正有）【課題】高活性炭化水素酸化生体触媒の提供。【解決手段】特定のアミノ酸配列又は特定のアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む炭化水素酸化活性を有するポリペプチド、或いは特定のアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むｓｐｍｏＢｄ１ドメイン、特定のアミノ酸配列又は特定のアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むｓｐｍｏＢｄ２ドメイン、ｐｍｏＡの部分配列であって、特定のアミノ酸配列から選択される１０個以上の連続するアミノ酸配列を含む配列又は該配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むｐｍｏＡドメイン（ＭＡＡＤ）を含み、ＭＡＡＤがｓｐｍｏＢｄ１ドメインとｓｐｍｏＢｄ２ドメインとの間に配置された炭化水素酸化活性を有するポリペプチドを活性型で発現している、炭化水素酸化活性を有する細胞を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号５で示されるアミノ酸配列を含む炭化水素酸化活性を有するポリペプチド、または配列番号５で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、炭化水素酸化活性を有するその変異体ポリペプチド。
【請求項２】
配列番号６で示されるアミノ酸配列を含む、請求項１記載の変異体ポリペプチド。
【請求項３】
炭化水素酸化活性を有するポリペプチドであって、
配列番号１で示されるアミノ酸配列、または配列番号１で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むｓｐｍｏＢｄ１ドメインと、
配列番号２で示されるアミノ酸配列、または配列番号２で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むｓｐｍｏＢｄ２ドメインと、
ｐｍｏＡの部分配列であって、配列番号３で示されるアミノ酸配列から選択される少なくとも１０個の連続するアミノ酸配列を含む配列、または該配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むｐｍｏＡドメイン（ＭＡＡＤ）と
を含み、前記ＭＡＡＤが前記ｓｐｍｏＢｄ１ドメインと前記ｓｐｍｏＢｄ２ドメインとの間に配置された、ポリペプチド。
【請求項４】
ＭＡＡＤが配列番号３で示されるアミノ酸配列の２１位のＶからＩへの置換を含む、請求項３記載のポリペプチド。
【請求項５】
短鎖状炭化水素骨格をもつ化合物を酸化することができる、請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項記載のポリペプチドを活性型で発現している、炭化水素酸化活性を有する細胞。
【請求項７】
短鎖状炭化水素骨格をもつ化合物を酸化することができる、請求項６記載の細胞。
【請求項８】
異種細胞である、請求項６または７記載の細胞。
【請求項９】
請求項１または２に記載のポリペプチドまたはその変異体ポリペプチド、請求項３〜５のいずれか１項記載のポリペプチド、あるいは請求項６〜８のいずれか１項記載の細胞を炭化水素と接触させることを含む、炭化水素の酸化生成物を製造する方法。
【請求項１０】
請求項６〜８のいずれか１項記載の細胞を炭化水素と接触させることを含む、炭化水素の代謝生成物を製造する方法。
【請求項１１】
炭化水素が短鎖状炭化水素骨格をもつ化合物である、請求項９または１０記載の方法。
【請求項１２】
請求項１または２に記載のポリペプチドまたはその変異体ポリペプチドあるいは請求項３〜５のいずれか１項記載のポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、簡便に活性型で発現される炭化水素酸化活性を有するポリペプチド、および該ポリペプチドを活性型で発現する細胞、ならびに該ポリペプチドまたは細胞を用いた炭化水素の酸化方法、および該細胞を用いた炭化水素の代謝生成物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
メタン酸化細菌は、その代謝経路の第一段階において、メタンモノオキシゲナーゼ（Methane monooxygenase: MMO）と呼ばれるメタン酸化酵素の触媒作用により、メタンをメタノールに酸化する。メタンモノオキシゲナーゼには、膜結合型のｐＭＭＯ（particulate MMO）と可溶性のｓＭＭＯ（soluble MMO）の２つのタイプがある。ｓＭＭＯはある種のメタン酸化細菌にしか存在しないが、ｐＭＭＯは既知のメタン酸化細菌のほとんどに存在している。ｐＭＭＯは、ｐｍｏＢ、ｐｍｏＡおよびｐｍｏＣとして知られる３つのサブユニットから構成され、各サブユニットを３コピー有するトリマー構造を取る。これらのサブユニットの一部分を用いて、膜貫通構造を有しなくても可溶性でメタン酸化活性のある人工的なたんぱく質を作製することが試みられてきた（特許文献１、非特許文献１および２を参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】米国特許第９８９６７００号
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Balasubramanian et al., Nature 465: 115-119 (2010)
【非特許文献２】Culpepper and Rosenzweig, Crit. Review. Biochem. Mol. Biol. 47: 483-492 (2012)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、上述の試みをもってしても、ｐＭＭＯの活性部分を有する人工的なたんぱく質を、可溶化させた状態で十分な量を得ることが困難であったり、可溶化させた人工的なたんぱく質を得られたとしても立体構造に欠陥があってメタン酸化活性を十分に発現できないものであったりした。このような状況下、本発明は、簡便な遺伝子組み換え技術で得られる高活性炭化水素酸化生体触媒を提供することを目的とした。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
鋭意研究の結果、本発明者らは、メタン酸化細菌Ｍｅｔｈｙｌｏｖｕｌｕｍ  ｍｉｙａｋｏｎｅｎｓｅ  ＨＴ１２株由来の膜結合型メタンモノオキシゲナーゼ（ｐＭＭＯ）のｐｍｏＢから膜貫通領域を除去し、２つの可溶性触媒領域（ｓｐｍｏＢｄ１およびｓｐｍｏＢｄ２）と、ｐｍｏＡの部分配列をリンカーで連結させたｓｐｍｏＢ改変体を作成し、メタノール資化性酵母Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｐｈａｆｆｉｉ（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）を宿主として、宿主内で活性型で発現させ、生きた細胞内でメタンを代謝させることに成功した。かくして、本発明が完成された。
【０００７】
すなわち、本発明は下記の態様を提供する。
（１）配列番号５で示されるアミノ酸配列を含む炭化水素酸化活性を有するポリペプチド、または配列番号５で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、炭化水素酸化活性を有するその変異体ポリペプチド、
（２）配列番号６で示されるアミノ酸配列を含む、（１）記載の変異体ポリペプチド、
（３）炭化水素酸化活性を有するポリペプチドであって、
配列番号１で示されるアミノ酸配列、または配列番号１で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むｓｐｍｏＢｄ１ドメインと、
配列番号２で示されるアミノ酸配列、または配列番号２で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むｓｐｍｏＢｄ２ドメインと、
ｐｍｏＡの部分配列であって、配列番号３で示されるアミノ酸配列から選択される少なくとも１０個の連続するアミノ酸配列を含む配列、または該配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むｐｍｏＡドメイン（ＭＡＡＤ）と
を含み、前記ＭＡＡＤが前記ｓｐｍｏＢｄ１ドメインと前記ｓｐｍｏＢｄ２ドメインとの間に配置された、ポリペプチド、
（４）ＭＡＡＤが配列番号３で示されるアミノ酸配列の２１位のＶからＩへの置換を含む、（３）記載のポリペプチド、
（５）短鎖状炭化水素骨格をもつ化合物を酸化することができる、（１）〜（４）のいずれか１項に記載のポリペプチド、
（６）（１）〜（５）のいずれか１項記載のポリペプチドを活性型で発現している、炭化水素酸化活性を有する細胞、
（７）短鎖状炭化水素骨格をもつ化合物を酸化することができる、（６）記載の細胞、
（８）異種細胞である、（６）または（７）記載の細胞、
（９）（１）または（２）に記載のポリペプチドまたはその変異体ポリペプチド、（３）〜（５）のいずれか１項記載のポリペプチド、あるいは（６）〜（８）のいずれか１項記載の細胞を炭化水素と接触させることを含む、炭化水素の酸化生成物を製造する方法、
（１０）（６）〜（８）のいずれか１項記載の細胞を炭化水素と接触させることを含む、炭化水素の代謝生成物を製造する方法、
（１１）炭化水素が短鎖状炭化水素骨格をもつ化合物である、（９）または（１０）記載の方法、
（１２）（１）または（２）に記載のポリペプチドまたはその変異体ポリペプチドあるいは（３）〜（５）のいずれか１項記載のポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、宿主細胞内で、宿主細胞に内在するたんぱく質合成過程を経て自律的に活性型で発現し、かつ高触媒活性を有する、高活性炭化水素酸化生体触媒に関する技術が提供される。なお、本明細書において、かかる炭化水素酸化生体触媒をＭＯＢ（Methane-oxidizing biocatalysts）と称する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】配列番号５で示されるアミノ酸配列を示す。
【図２】Ｍｅｔｈｙｌｏｖｕｌｕｍ  ｍｉｙａｋｏｎｅｎｓｅ  ＨＴ１２株由来ｓｕｐｅｒＭＯＢプロトタイプおよびｓｕｐｅｒＭＯＢのメタン酸化活性の測定結果を示す。
【図３】Ｍｅｔｈｙｌｏｖｕｌｕｍ  ｍｉｙａｋｏｎｅｎｓｅ  ＨＴ１２株由来ｓｕｐｅｒＭＯＢプロトタイプおよびｓｕｐｅｒＭＯＢのプロピレン酸化活性の測定結果を示す。
【図４】Ｍｅｔｈｙｌｏｖｕｌｕｍ  ｍｉｙａｋｏｎｅｎｓｅ  ＨＴ１２株由来ｓｕｐｅｒＭＯＢプロトタイプとＭｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈ株由来ｓｕｐｅｒＭＯＢプロトタイプの活性比較を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
１．定義
本明細書において、炭化水素は、鎖状炭化水素骨格をもつ化合物であり、好ましくはアルカンまたはアルケンなどの短鎖状炭化水素骨格をもつ化合物である。ここで、アルカンおよびアルケンには、例えばクロロメタンなどのハロゲン化やその他の官能基をもつ、修飾されたアルカンおよびアルケンも包含される。炭化水素の例として、限定するものではないが、炭素原子１〜１０個のアルカン、例えば、炭素原子２、３、４、５、６、７、８または９個のアルカン、または炭素原子２〜１０個のアルケン、例えば炭素原子３、４、５、６、７、８または９個のアルケンが挙げられる。
【００１１】
本明細書において、「炭化水素酸化活性」とは、炭化水素を酸化する能力を意味する。炭化水素酸化活性の例として、限定するものではないが、アルカンをアルカノールへ変換する活性やアルケンをエポキシドに変換する活性が挙げられ、例えば、メタンからメタノールへの変換、エチレンからエチレンオキサイドへの変換、またはプロピレンからプロピレンオキサイドへの変換を触媒する活性が挙げられる。
【００１２】
本明細書において、炭化水素酸化活性の測定は、例えば、メタンからのメタノール生成活性またはプロピレンからのプロピレンオキサイド生成活性を測定することによって行う。メタノール生成活性は、発明者らが以前に開発したメタノールセンサー宿主細胞のＦＡＣＳ（Fluorescence Activated Cell Sorting）解析（Appl. Microbiol. Biotechnol. 102: 7017-7027, 2018）によって評価することができる。すなわち、本発明のポリペプチドをコードする核酸を上記メタノールセンサー宿主細胞に導入して該細胞内で該ポリペプチドを発現させ、メタンを含む培地中で該細胞を培養し、該細胞が発する蛍光を測定することによって、触媒活性の大小を比較することができる。プロピレンオキサイド生成量の測定は、常法により行うことができる。
【００１３】
本明細書において、「炭化水素酸化活性が保持される」とは、問題となるポリペプチド（例えは変異体ポリペプチド）が、比較対象ポリペプチド（例えば元のポリペプチド）の炭化水素酸化活性より高いかまたは同等の炭化水素酸化活性を有すること、または元のポリペプチドの炭化水素酸化活性の少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも８０％の炭化水素酸化活性を有することを意味する。
【００１４】
本明細書において、「変異体ポリペプチド」とは、少なくとも１つのアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加することによって元のポリペプチドのアミノ酸配列と相違するアミノ酸配列からなるポリペプチドをいう。本明細書において、欠失、置換、挿入および／または付加されるアミノ酸残基の種類、数および位置は、本発明のポリペプチドの炭化水素酸化活性が保持されるかぎり、特に限定されない。アミノ酸置換の例としては、保存的アミノ酸置換が挙げられるが、炭化水素酸化活性が保持されるかぎり、非保存的アミノ酸置換であってもよい。
【００１５】
本明細書において、「配列番号Ｘで示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性」（ここで、配列番号Ｘは任意の配列番号である）とは、配列番号Ｘで示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性であってもよい。例えば、配列の長さにも依存し、限定するものではないが、配列番号Ｘで示されるアミノ酸配列において１〜５０個、例えば１〜４０個、例えば１〜３０個、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、さらに好ましくは１〜１０個、またさらに好ましくは１〜５個、またさらに好ましくは１〜３個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されてなるアミノ酸配列が例示される。また同様に、本明細書において、「該配列に対して少なくとも８０％の配列同一性」とは、比較対象の配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性であってもよい。例えば、配列の長さにも依存し、限定するものではないが、比較対象のアミノ酸配列において１〜５０個、例えば１〜４０個、例えば１〜３０個、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、さらに好ましくは１〜１０個、またさらに好ましくは１〜５個、またさらに好ましくは１〜３個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されてなるアミノ酸配列が例示される。
【００１６】
本明細書において「細胞」または「宿主細胞」は、Ｍｅｔｈｙｌｏｖｕｌｕｍ  ｍｉｙａｋｏｎｅｎｓｅ  ＨＴ１２株以外の細胞であれば特に限定されない。例えば、限定するものではないが、細胞または宿主細胞の例として、Ｍｅｔｈｙｌｏｖｕｌｕｍ  ｍｉｙａｋｏｎｅｎｓｅ  ＨＴ１２株以外のメタン酸化細菌、メタン酸化細菌以外の細菌、真菌等が挙げられる。また、本明細書において「異種細胞」とは、メタン酸化細菌以外の微生物細胞や動植物など高等生物細胞をいう。例えば、宿主細胞としてメタノール資化性酵母やメタノール資化性細菌等を用いれば、１の細胞内でメタンからメタン代謝生成物を直接生産することができる。
【００１７】
本明細書において「活性型」とは、たんぱく質が活性を発現する立体構造を備えた状態であり、故に基質の存在下でその活性を発揮できる状態にあることをいう。例えば、限定するものではないが、たんぱく質が正しくフォールディングした状態が挙げられる。
【００１８】
２．本発明のポリペプチド
本発明は、メタン酸化細菌Ｍｅｔｈｙｌｏｖｕｌｕｍ  ｍｉｙａｋｏｎｅｎｓｅ  ＨＴ１２株由来のｐＭＭＯのサブユニットｐｍｏＢの２つの可溶性領域（ｓｐｍｏＢｄ１およびｓｐｍｏＢｄ２）に由来するｓｐｍｏＢｄ１ドメインおよびｓｐｍｏＢｄ２ドメインと、サブユニットｐｍｏＡに由来するｐｍｏＡドメイン（本明細書において、「ＭＡＡＤ（MOB-Activating pmoA Domain）」と称する）とを含む、炭化水素酸化活性を有するポリペプチドを提供する（以下、「本発明のポリペプチド」という）。本発明のポリペプチドにおいては、ｓｐｍｏＢｄ１ドメインとｓｐｍｏＢｄ２ドメインとの間にＭＡＡＤが配置され、好ましくは、Ｎ末端側から、ｓｐｍｏＢｄ１ドメイン、ＭＡＡＤ、ｓｐｍｏＢｄ２ドメインの順で配置される。
【００１９】
本発明のポリペプチドは、高い触媒活性（すなわち、基質炭化水素に対する高い酸化活性）を有し、例えばメタノール資化性酵母などの宿主細胞内で内在のたんぱく質合成過程を経て活性型で発現し、かつ、自然界にない新規なアミノ酸配列を有する。
【００２０】
Ｍｅｔｈｙｌｏｖｕｌｕｍ  ｍｉｙａｋｏｎｅｎｓｅ  ＨＴ１２株は、兵庫県の森林土壌から単離された、至適生育温度２０〜３０℃のメタン酸化細菌である。したがって、本発明のポリペプチドは、常温で高い活性を示す。
【００２１】
本発明のポリペプチドは、好ましくは、さらにリンカーを含む。別の態様において、本発明のポリペプチドはリンカーを含んでいなくてもよい。本発明のポリペプチドがリンカーを含む場合、該リンカーはＭＡＡＤの両側面またはいずれか一方の側面に位置し、ｓｐｍｏＢｄ１ドメインとＭＡＡＤおよび／またはＭＡＡＤとｓｐｍｏＢｄ２ドメインを連結する。さらに好ましくは、本発明のポリペプチドは２つのリンカーを含み、該リンカーはＭＡＡＤの両側面に配置され、ｓｐｍｏＢｄ１ドメインとＭＡＡＤおよびＭＡＡＤとｓｐｍｏＢｄ２ドメインをそれぞれ連結する。本発明のポリペプチドが２つのリンカーを含む場合、該２つのリンカーは同一であっても、異なっていてもよい。リンカーは、好ましくは、数個〜数十個のアミノ酸からなるペプチドリンカーである。ここで、数個とは、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個程度をいい、数十個とは、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８または１９個程度をいう。また、上記リンカー配列は、特に限定されず、例えば、ＳＧリンカー配列の他、Ｋ、Ｌなどの他のアミノ酸を含むリンカー配列であってもよい。リンカー配列の種類および長さは、特に限定されず、当業者によって適宜決定することができる。
【００２２】
本発明のポリペプチドにおいて、ｓｐｍｏＢｄ１ドメインは、配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその変異体ポリペプチドである。変異体ポリペプチドの例として、限定するものではないが、配列番号１で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられる。例えば、ｓｐｍｏＢｄ１ドメインは、配列番号１で示されるアミノ酸配列、または配列番号１で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであってもよい。
【００２３】
本発明のポリペプチドにおいて、ｓｐｍｏＢｄ２ドメインは、配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその変異体ポリペプチドである。変異体ポリペプチドの例として、限定するものではないが、配列番号２で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられる。例えば、ｓｐｍｏＢｄ２ドメインは、配列番号２で示されるアミノ酸配列、または配列番号２で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであってもよい。
【００２４】
本発明のポリペプチドにおいて、ＭＡＡＤは、ｐＭＭＯの立体構造においてｓｐｍｏＢｄ１およびｓｐｍｏＢｄ２の近くに位置するたんぱく質部分に相当し、好ましくは約１０〜３５個の連続するアミノ酸残基からなる領域である。ＭＡＡＤは、ｓｐｍｏＢｄ１およびｓｐｍｏＢｄ２と共に炭化水素酸化活性に関与していることが想定される。ＭＡＡＤは、Ｍｅｔｈｙｌｏｖｕｌｕｍ  ｍｉｙａｋｏｎｅｎｓｅ  ＨＴ１２株由来のｐｍｏＡ（配列番号４）の部分配列であって、配列番号３で示されるアミノ酸配列から選択される少なくとも１０個、好ましくは少なくとも１５個、さらに好ましくは少なくとも２０個の連続するアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその変異体ポリペプチドである。ＭＡＡＤは、好ましくは、配列番号３で示されるアミノ酸配列から選択される少なくとも１０個、好ましくは少なくとも１５個、さらに好ましくは少なくとも２０個の連続するアミノ酸配列を含み、かつ、Ｍｅｔｈｙｌｏｖｕｌｕｍ  ｍｉｙａｋｏｎｅｎｓｅ  ＨＴ１２株由来のｐｍｏＡ領域（配列番号４）から選択される約１０〜３５個、例えば１５〜３０個、好ましくは１７〜２５個、例えば、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、または２４個の連続するアミノ酸残基からなるポリペプチド、またはその変異体ポリペプチドである。変異体ポリペプチドの例として、限定するものではないが、ｐｍｏＡの部分配列であって、配列番号３で示されるアミノ酸配列から選択される少なくとも１０個の連続するアミノ酸配列を含む配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられる。例えば、限定するものではないが、ＭＡＡＤは、ｐｍｏＡの部分配列であって、配列番号３で示されるアミノ酸配列を含む配列、または該配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられる。さらなる例として、ＭＡＡＤは、配列番号３で示されるアミノ酸配列、または配列番号３で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであってもよい。さらなる例として、ＭＡＡＤは、限定するものではないが、配列番号３で示されるアミノ酸配列の２１位のＶ（バリン）からＩ（イソロイシン）への置換を含んでいてもよい。
【００２５】
本発明のポリペプチドは、そのアミノ酸配列の一部(Ｎ末端およびＣ末端を含む)に、タグ、分泌シグナルペプチド、細胞表層・オルガネラへの局在化シグナルペプチド等の付加配列を有していてもよい。例えば、当該分野で使用されるいずれのタグを用いてもよく、例えば、限定するものではないが、ＨＡ、Ｈｉｓ、Ｍｙｃ、Ｓｔｒeｐ、Ｆｌａｇ、Ｖ５、ｍｙｃ−Ｈｉｓなどのペプチドタグや、ポリペプチドタグ、蛍光たんぱく質等が挙げられ、当業者により適宜選択される。
【００２６】
かくして、本発明のポリペプチドの１の実施形態として、「配列番号５で示されるアミノ酸配列を含む炭化水素酸化活性を有するポリペプチド、または配列番号５で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、炭化水素酸化活性を有するその変異体ポリペプチド」が提供される。
【００２７】
配列番号５で示されるアミノ酸配列は、ｓｐｍｏＢｄ１ドメインおよびｓｐｍｏＢｄ２ドメインと、ＭＡＡＤ、さらにこれらの配列を連結するためのリンカー配列（ＳＧリンカー）を含む。１の態様において、本発明のポリペプチドは、配列番号５で示されるアミノ酸配列を含む。また別の態様において、本発明のポリペプチドは、配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである。本明細書において、配列番号５で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを「ＳｕｐｅｒＭＯＢプロトタイプ」と称する。
【００２８】
上記したように、変異体ポリペプチドにおいて欠失、置換、挿入および／または付加されるアミノ酸残基の種類、数および位置は、炭化水素酸化活性が保持されるかぎり、特に限定されない。したがって、配列番号５で示されるアミノ酸配列においてアミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加は、炭化水素酸化活性が保持されるかぎり、ｓｐｍｏＢｄ１ドメイン、ｓｐｍｏＢｄ２ドメイン、ＭＡＡＤ、またはリンカー配列、あるいはそれらのいずれかの組み合わせにおいて存在していてもよく、また、欠失、置換、挿入および／または付加されるアミノ酸残基の数は、配列番号５で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）の配列同一性を有する範囲内から選択されればよい。本発明の変異体ポリペプチドの一例としては、少なくとも１つのアミノ酸残基が配列番号５で示されるアミノ酸配列と相違するアミノ酸配列であって、配列番号５の１６８位のバリンのイソロイシンへの置換を含むアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられる。さらなる例として、本発明のポリペプチドは、配列番号６で示されるアミノ酸配列を含んでいてもよく、例えば、配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドであってもよい。本明細書において、配列番号６で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを「ＳｕｐｅｒＭＯＢ」と称する。
【００２９】
上記したように、本発明のポリペプチドは、そのアミノ酸配列の一部(Ｎ末端およびＣ末端を含む)に付加配列を有していてもよい。したがって、例えば、本発明のポリペプチドは、配列番号７または配列番号９で示されるアミノ酸配列を含んでいてもよく、また、配列番号７または配列番号９で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドであってもよい。
【００３０】
また、本発明のポリペプチドの他の実施形態として、「炭化水素酸化活性を有するポリペプチドであって、配列番号１で示されるアミノ酸配列または配列番号１で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むｓｐｍｏＢｄ１ドメインと、配列番号２で示されるアミノ酸配列または配列番号２で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むｓｐｍｏＢｄ２ドメインと、ｐｍｏＡの部分配列であって、配列番号３で示されるアミノ酸配列から選択される少なくとも１０個の連続するアミノ酸配列を含む配列、または該配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むｐｍｏＡドメイン（ＭＡＡＤ）とを含み、前記ＭＡＡＤが前記ｓｐｍｏＢｄ１ドメインと前記ｓｐｍｏＢｄ２ドメインとの間に配置された、ポリペプチド」が提供される。
【００３１】
上記したように、本発明のポリペプチドはリンカーを含んでいてもよく、リンカーの数は、１つであっても、２つであってもよい。したがって、本発明のさらなる態様において、本発明のポリペプチドには、
「炭化水素酸化活性を有するポリペプチドであって、
配列番号１で示されるアミノ酸配列または配列番号１で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むｓｐｍｏＢｄ１ドメインと、
配列番号２で示されるアミノ酸配列または配列番号２で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むｓｐｍｏＢｄ２ドメインと、
ｐｍｏＡの部分配列であって、配列番号３で示されるアミノ酸配列から選択される少なくとも１０個の連続するアミノ酸配列を含む配列、または該配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むｐｍｏＡドメイン（ＭＡＡＤ）と、
リンカーと
を含み、前記ＭＡＡＤが前記ｓｐｍｏＢｄ１ドメインと前記ｓｐｍｏＢｄ２ドメインとの間に配置され、前記ｓｐｍｏＢｄ１ドメインと前記ＭＡＡＤまたは前記ＭＡＡＤと前記ｓｐｍｏＢｄ２ドメインが前記リンカーによって連結されている、ポリペプチド」および
「炭化水素酸化活性を有するポリペプチドであって、
配列番号１で示されるアミノ酸配列または配列番号１で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むｓｐｍｏＢｄ１ドメインと、
配列番号２で示されるアミノ酸配列または配列番号２で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むｓｐｍｏＢｄ２ドメインと、
ｐｍｏＡの部分配列であって、配列番号３で示されるアミノ酸配列から選択される少なくとも１０個の連続するアミノ酸配列を含む配列、または該配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むｐｍｏＡドメイン（ＭＡＡＤ）と、
リンカーと
を含み、前記ＭＡＡＤが前記ｓｐｍｏＢｄ１ドメインと前記ｓｐｍｏＢｄ２ドメインとの間に配置され、前記ｓｐｍｏＢｄ１ドメインと前記ＭＡＡＤおよび前記ＭＡＡＤと前記ｓｐｍｏＢｄ２ドメインが前記リンカーによって連結されている、ポリペプチド」が包含される。
【００３２】
当該実施態様における本発明のポリペプチドにおいて、ｓｐｍｏＢｄ１ドメイン、ｓｐｍｏＢｄ２ドメイン、およびＭＡＡＤについては上記したとおりである。上記したように、変異体ポリペプチドにおいて欠失、置換、挿入および／または付加されるアミノ酸残基の種類、数および位置は、炭化水素酸化活性が保持されるかぎり、特に限定されない。したがって、上記のポリペプチドの炭化水素酸化活性が保持されるかぎり、ｓｐｍｏＢｄ１ドメイン、ｓｐｍｏＢｄ２ドメイン、またはＭＡＡＤ、あるいはそれらのいずれかの組み合わせにおいてアミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加が存在していてもよく、また、各ドメインにおける欠失、置換、挿入および／または付加されるアミノ酸残基の数は、その示された配列に対して少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）の配列同一性を有する範囲内から選択されればよい。本発明のポリペプチドの一例としては、配列番号３で示されるアミノ酸配列の２１位のＶからＩへの置換を含むＭＡＡＤを含むポリペプチドが挙げられる。
【００３３】
また、上記したように、当該実施態様における本発明のポリペプチドは付加配列を含んでいてもよい。
【００３４】
３．本発明の細胞
本発明のさらなる態様において、本発明のポリペプチドを活性型で発現している細胞（以下、「本発明の細胞」という）が提供される。本発明の細胞は、本発明のポリペプチドをコードしている核酸を上記の宿主細胞中に導入することによって製造される。宿主細胞中への核酸の導入は、当該分野で知られた種々の方法によって行うことができる。例えば、限定するものではないが、プラスミドやファージをベクターとして用いる方法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法などが挙げられ、当業者によって適宜選択される。かくして得られた本発明の細胞は、その細胞内に本発明のポリペプチドを活性型で発現しており、炭化水素の存在下で、高い炭化水素酸化活性を示す。
【００３５】
本発明のポリペプチドは、宿主細胞内で内在のたんぱく質合成過程を経て自律的に活性型として発現される。本発明によれば、従来のように宿主細胞から発現たんぱく質を抽出し、これを活性型とするために試験管内でのリフォールディング操作を必要としない。すなわち、本発明のポリペプチドは、通常の遺伝子組み換え技術を用いることにより細胞内で簡便に活性型として得られる。したがって、本発明の細胞は、細胞のまま使用することができる。また、本発明のポリペプチドは、２０〜３０℃の至適生育温度を有するＭｅｔｈｙｌｏｖｕｌｕｍ  ｍｉｙａｋｏｎｅｎｓｅ  ＨＴ１２株のｐＭＭＯ由来の配列を含むため、本発明の細胞は常温での利用に適している。
【００３６】
また、本発明の細胞内で発現された本発明のポリペプチドは、該細胞から単離してもよい。単離された本発明のポリペプチドは、試験管内でリフォールディング操作する必要無しに、炭化水素酸化活性を有する。単離された本発明のポリペプチドは、さらに精製してもよい。ポリペプチドの単離および精製方法は、当該分野で既知の方法によって行うことができる。
【００３７】
本発明はさらに、本発明のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。該ポリヌクレオチドの例として、配列番号８または１０で示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、および配列番号８または１０で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。
【００３８】
４．本発明の炭化水素の酸化方法および代謝生成物の製造方法
本発明のさらなる態様において、本発明のポリペプチドまたは本発明の細胞を炭化水素と接触させることを含む、炭化水素の酸化生成物を製造する方法が提供される。本発明のポリペプチドまたは細胞と炭化水素の接触は、基質炭化水素を含む溶液中に本発明のポリペプチドまたは細胞を入れること、または本発明のポリペプチドまたは細胞に基質炭化水素を含む溶液を加えることによって達成される。該接触により、本発明のポリペプチドまたは細胞と基質炭化水素が反応して、該炭化水素の酸化生成物が製造される。例えば、該接触は、基質炭化水素を含む培地中で本発明の細胞を培養することによって達成される。本発明の細胞は、本発明のポリペプチドを活性型で発現しているので、該ポリペプチドをリフォールディングする必要はなく、該細胞と基質炭化水素を接触させた際に該細胞は該基質に対して酸化活性を発揮する。
【００３９】
またさらなる態様において、本発明の細胞を炭化水素と接触させることを含む、炭化水素の代謝生成物を製造する方法が提供される。本発明の細胞と炭化水素との接触については上記したとおりである。該接触により、本発明の細胞と基質炭化水素が反応して、該炭化水素の代謝生成物が製造される。例えば、炭化水素の酸化物を資化する宿主細胞内で本発明のポリペプチドを発現させ、該細胞と炭化水素を接触させることにより、該炭化水素から該炭化水素の代謝生成物までの一連の反応（多段階反応）を１つの細胞内で実施させ、原料炭化水素から直接代謝生成物を得ることができる。例えば、メタノール資化性微生物内で本発明のポリペプチドを発現させることにより、メタノール由来の有用物質がメタンからの直接発酵生産により得られる。かくして、本発明によれば、原料となる炭化水素からの有用物質直接発酵生産技術が提供される。
【００４０】
以下、実施例を用いて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００４１】
実施例１：ｓｕｐｅｒＭＯＢの炭化水素酸化活性の測定
１．ＭｍｓｐｍｏＢ発現プラスミドの構築
Ｍｅｔｈｙｌｏｖｕｌｕｍ  ｍｉｙａｋｏｎｅｎｓｅ  ＨＴ１２株（以下、「Ｍｍ」と略す）のゲノムＤＮＡを鋳型とし、プライマー１とプライマー２を用いてｓｐｍｏＢｄ１領域を、プライマー３とプライマー４を用いてｓｐｍｏＢｄ２領域をそれぞれＰＣＲにより増幅した。増幅した断片を混合して鋳型とし、プライマー１とプライマー４を用いてＭｍｓｐｍｏＢ遺伝子断片を増幅した。この断片とｐＧＡＰＺＢ（Invitrogen社製）をそれぞれＫｐｎＩとＸｂａＩで消化し、両断片をライゲーションしてＭｍｓｐｍｏＢ発現プラスミド（ｐＧＡＰＺＢ−ｓｐｍｏＢ）を構築した。該プラスミド中に含まれるＭｍｓｐｍｏＢ遺伝子断片のヌクレオチド配列を配列番号１２に、発現するＭｍｓｐｍｏＢのアミノ酸配列を配列番号１１に示す。発現するＭｍｓｐｍｏＢは、ｓｐｍｏＢｄ１領域とｓｐｍｏＢｄ２領域がＧＫＬＧＧＧリンカーを介して連結されており、Ｃ末端にｃ−ｍｙｃ−Ｈｉｓ６が付加されているポリペプチドである。
【００４２】
２．ｓｕｐｅｒＭＯＢプロトタイプ発現プラスミドの構築
ＭｍｓｐｍｏＢのｓｐｍｏＢｄ１領域とｓｐｍｏＢｄ２領域を、ＭｍｐｍｏＡに由来する配列（ＭＡＡＤ）に連結したＭｍｓｐｍｏＢｄ１−ＭＡＡＤ−ｄ２（ｓｕｐｅｒＭＯＢプロトタイプ）発現プラスミドを下記の様に構築した。ＭＡＡＤ領域とＳＧリンカー配列をコードする遺伝子（合成ＤＮＡ１）を鋳型としてプライマー５とプライマー６を用いてＰＣＲ増幅した断片と、ｐＧＡＰＺＢ−ｓｐｍｏＢを鋳型としてプライマー７とプライマー８を用いてＰＣＲ増幅した断片を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて連結し、ｐＧＡＰＺＢ−ｓｐｍｏＢｄ１−ＭＡＡＤ−ｄ２を構築した。該プラスミド中に含まれるｓｕｐｅｒＭＯＢプロトタイプ遺伝子断片のヌクレオチド配列を配列番号８に、発現するｓｕｐｅｒＭＯＢプロトタイプのアミノ酸配列を配列番号７に示す。発現するｓｕｐｅｒＭＯＢプロトタイプは、ｓｐｍｏＢｄ１領域、配列番号３のアミノ酸配列（２２アミノ酸）からなるＭＡＡＤ配列、およびｓｐｍｏＢｄ２領域がＳＧリンカーを介して連結されており、Ｃ末端にｃ−ｍｙｃ−Ｈｉｓ６が付加されているポリペプチドである。
【００４３】
３．ｓｕｐｅｒＭＯＢ発現プラスミドの構築
ｓｕｐｅｒＭＯＢプロトタイプの１６８位のバリンをイソロイシンに置換した変異体を発現するプラスミドを下記の様に構築した。ｐＧＡＰＺＢ−ｓｐｍｏＢｄ１−ＭＡＡＤ−ｄ２を鋳型とし、プライマー９とプライマー１０を用い、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｂａｓａｌ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いてｐＧＡＰＺＢ−ｓｐｍｏＢｄ１−ＭＡＡＤ（Ｖ１６８Ｉ）−ｄ２を構築した。該プラスミド中に含まれるｓｕｐｅｒＭＯＢ遺伝子断片のヌクレオチド配列を配列番号８に、発現するｓｕｐｅｒＭＯＢのアミノ酸配列を配列番号７に示す。
【００４４】
【表１】
2020137469.tif 000002
【００４５】
４．Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｐｈａｆｆｉｉ（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）メタノールセンサー細胞への導入
ｐＧＡＰＺＢ−ｓｐｍｏＢ、ｐＧＡＰＺＢ−ｓｐｍｏＢｄ１−ＭＡＡＤ−ｄ２、ｐＧＡＰＺＢ−ｓｐｍｏＢｄ１−ＭＡＡＤ（Ｖ１６８Ｉ）−ｄ２をそれぞれＡｖｒＩＩで消化して直鎖状にし、既知の方法により作成したＫ．ｐｈａｆｆｉｉメタノールセンサー細胞（ＰＭＴ１３０２株，Appl. Microbiol. Biotechnol. 102, 7017-7207, 2018）にエレクトロポレーション法により導入し、ＭｍｓｐｍｏＢ、ｓｕｐｅｒＭＯＢプロトタイプ、ｓｕｐｅｒＭＯＢを発現する酵母株を構築した。対照株として、ｐＧＡＰＺＢベクターのみを同様に導入した株（ＥＶ）を構築した。
【００４６】
５．ＦＡＣＳを用いたメタノール生成活性測定
各株を、５ｍＬのＹＰＤ培地（１％酵母エキス、２％ペプトン、２％グルコース）中で２８℃で２４時間振とう培養した後、ＯＤ６１０＝０．２となるように５ｍＬのＹＰＤ培地に接種した。２８℃で８時間振とう培養した後、ＯＤ６１０＝０．０５となるように０〜１０ｍＭ  ＣｕＳＯ４を含む５０ｍＬのＹＰＤ培地に接種し、２８℃で１６時間振とう培養した。培養菌体の遠心分離と氷冷したＹＮＢＹＰ培地（０．６７％酵母用ニトロゲンベースｗ／ｏアミノ酸、０．０２％酵母エキス、０．０４％ペプトン）による洗浄を２回行い、ＯＤ６１０＝０．７となるようにＹＮＢＹＰ培地に懸濁した。この懸濁液５ｍＬを２５ｍＬ容ガラスバイアルにとり、十分量のｄｕｒｏｑｕｉｎｏｌを添加してゴム栓で密封した後、Ｎ２またはメタンを５ｍＬ注入し、２８℃で１２０ｒｐｍで４時間振とうした。４時間後の培養液をＰＢＳバッファー（phosphate buffered saline）で希釈し、氷上に置いた。フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）解析は、既報（Appl. Microbiol. Biotechnol. 102, 7017-7207, 2018）に従い、ＦＡＣＳＡｒｉａ  ＩＩＩｕ（BD Biosciences社製）を用いて行った。メタン酸化によるメタノール生成は、メタンを注入した際の値とＮ２を注入した際の値との差（平均ＦＩＴＣ−Ａ／ＦＳＣ−Ａ（ＣＨ４−Ｎ２））として評価した。
【００４７】
メタノール生成活性測定の結果を図２に示す。ＥＶ株およびＭｍｓｐｍｏＢ発現株では活性が検出されなかったが、ｓｕｐｅｒＭＯＢプロトタイプ発現株、ｓｕｐｅｒＭＯＢ発現株では、細胞内における顕著なメタン酸化活性の発現が認められた。Ｖ１６８Ｉ変異を含むｓｕｐｅｒＭＯＢの活性は著しく増大した。
【００４８】
６．プロピレン酸化活性測定
５ｍＭ  ＣｕＳＯ４を含む、または含まないＹＰＤ培地で培養した各株の細胞を、ＯＤ６１０＝２５〜２００となるように５ｍＭ  ＣｕＳＯ４を含む、または含まないＹＮＢＹＰ培地に懸濁した。この懸濁液５ｍＬを２５ｍＬ容ガラスバイアルにとり、十分量のｄｕｒｏｑｕｉｎｏｌを添加してゴム栓で密封した後、プロピレンを５ｍＬ注入し、２８℃で１２０ｒｐｍで振とうした。５〜４８０分後の反応液と反応液の５分の１量のクロロホルムを混合し、遠心分離後のクロロホルム層１μＬを、キャピラリーカラム（ＤＢ−１  １２５−１０６４カラム、Agilent Technologies社製）を用いたガスクロマトグラフィー（ＧＣ−２０１４，島津製作所製）分析に供し、酸化プロピレンを定量した。
【００４９】
プロピレン酸化活性測定の結果を図３に示す。ｓｕｐｅｒＭＯＢプロトタイプ、ｓｕｐｅｒＭＯＢは、対照と比べて細胞内におけるプロピレン酸化活性を著しく増大させた。Ｖ１６８Ｉ変異を含むｓｕｐｅｒＭＯＢの活性は特に顕著であった。
【実施例２】
【００５０】
実施例２：Ｍｅｔｈｙｌｏｖｕｌｕｍ  ｍｉｙａｋｏｎｅｎｓｅ  ＨＴ１２株由来ｓｕｐｅｒＭＯＢプロトタイプとＭｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈ株由来ｓｕｐｅｒＭＯＢプロトタイプとの活性比較
１．ＭｍｓｕｐｅｒＭＯＢプロトタイプ−ＳｔｒｅｐおよびＭｃｓｕｐｅｒＭＯＢプロトタイプ−Ｓｔｒｅｐ発現プラスミドの構築
Ｍｅｔｈｙｌｏｖｕｌｕｍ  ｍｉｙａｋｏｎｅｎｓｅ  ＨＴ１２株の配列に由来するｓｕｐｅｒＭＯＢプロトタイプのＣ末端にＳｔｒｅｐタグを付加したポリペプチド（ＭｍｓｕｐｅｒＭＯＢプロトタイプ−Ｓｔｒｅｐ）を発現するためのプラスミドを以下のように構築した。合成ＤＮＡ２（配列番号２４）を鋳型としてプライマー１１（配列番号２５）とプライマー１２（配列番号２６）を用いてＰＣＲ増幅した断片と、ｐＧＡＰＺＢを鋳型としてプライマー１３（配列番号２７）とプライマー１４（配列番号２８）を用いてＰＣＲ増幅した断片を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔを用いて連結し、ｐＧＡＰＺＢ−Ｍｍｐｒｏｔｏｔｙｐｅ−Ｓｔｒｅｐを構築した。発現するＭｍｓｕｐｅｒＭＯＢプロトタイプ−Ｓｔｒｅｐのアミノ酸配列を配列番号２９に示す。Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈ株の配列に由来するｓｕｐｅｒＭＯＢプロトタイプのＣ末端にＳｔｒｅｐタグを付加したポリペプチド（ＭｃｓｕｐｅｒＭＯＢプロトタイプ−Ｓｔｒｅｐ）を発現するためのプラスミドを以下のように構築した。合成ＤＮＡ３（配列番号３０）を鋳型としてプライマー１５（配列番号３１）とプライマー１６（配列番号３２）を用いてＰＣＲ増幅した断片と、ｐＧＡＰＺＢを鋳型としてプライマー１３（配列番号２７）とプライマー１４（配列番号２８）を用いてＰＣＲ増幅した断片を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔを用いて連結し、ｐＧＡＰＺＢ−Ｍｃｐｒｏｔｏｔｙｐｅ−Ｓｔｒｅｐを構築した。発現するＭｃｓｕｐｅｒＭＯＢプロトタイプ−Ｓｔｒｅｐのアミノ酸配列を配列番号３３に示す。
【００５１】
２．Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｐｈａｆｆｉｉ（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）メタノールセンサー細胞への導入
ｐＧＡＰＺＢ−Ｍｍｐｒｏｔｏｔｙｐｅ−Ｓｔｒｅｐ、ｐＧＡＰＺＢ−Ｍｃｐｒｏｔｏｔｙｐｅ−ＳｔｒｅｐをそれぞれＡｖｒＩＩで消化して直鎖状にし、既知の方法により作成したＫ．ｐｈａｆｆｉｉメタノールセンサー細胞（ＰＭＴ１３０２株，Appl. Microbiol. Biotechnol. 102, 7017-7207, 2018）にエレクトロポレーション法により導入し、ＭｍｓｕｐｅｒＭＯＢプロトタイプ−Ｓｔｒｅｐ、ＭｃｓｕｐｅｒＭＯＢプロトタイプ−Ｓｔｒｅｐを発現する酵母株を構築した。
【００５２】
３．メタノール生成活性測定およびプロピレン酸化活性測定
実施例１に記載したのと同様の方法で、ＦＡＣＳを用いたメタノール生成活性およびプロピレン酸化活性を測定した。
【００５３】
結果を図４に示す。メタノール生成活性およびプロピレン酸化活性の両者ともに、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈ株由来の配列（ＭｃｓｕｐｅｒＭＯＢプロトタイプ−Ｓｔｒｅｐ）よりも、Ｍｅｔｈｙｌｏｖｕｌｕｍ  ｍｉｙａｋｏｎｅｎｓｅ  ＨＴ１２株由来の配列（ＭｍｓｕｐｅｒＭＯＢプロトタイプ−Ｓｔｒｅｐ）の方が高い活性を示した。
【配列表フリーテキスト】
【００５４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
2020137469.tif 000005
【図４】
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【配列表】
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