(57)【要約】【課題】Ｏ２担体ポリペプチド（例えば、Ｈ−ＮＯＸタンパク質）の投与によって、低酸素媒介性腫瘍免疫をモジュレートするための方法を提供すること。【解決手段】本発明の方法は、腫瘍免疫の低酸素誘導性因子１アルファ（ＨＩＦ−１α）経路および非ＨＩＦ−１α経路の両方を標的化する。このような方法は、多種多様ながんの処置において有用であり、単独で、または他の抗がん療法と組み合わせて使用することができる。一部の実施形態では、本発明は、腫瘍に対する免疫応答を増強するための方法を提供する。一部の実施形態では、本発明は、個体における腫瘍へのリンパ球浸潤を増加させるための方法であって、個体に有効量のＯ２担体ポリペプチドを投与するステップを含む方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、２０１５年３月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／１３４，５２３号（この開示内容は、全ての目的のためにその全体が参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
【０００２】
ＡＳＣＩＩテキストファイルによる配列表の提出
次のＡＳＣＩＩテキストファイルによる提出物の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる：配列表のコンピュータ可読形式（ＣＲＦ）（ファイル名：６２７０４２０００９４０ＳｅｑＬｉｓｔ．ｔｘｔ、記録された日付：２０１６年３月１７日、サイズ：４１ＫＢ）。
【０００３】
本願は、タンパク質Ｏ２担体ポリペプチド；例えば、Ｈ−ＮＯＸタンパク質によって腫瘍に酸素を送達することによる、腫瘍免疫のモジュレーションに関する。
【背景技術】
【０００４】
低酸素腫瘍微小環境は、低酸素誘導性因子（ＨＩＦ−１）シグナル伝達が挙げられるがこれに限定されない複数のシグナル伝達経路をモジュレートすることにより、宿主の、免疫による抗腫瘍防御を抑制する（Ｃｏｄｏら、２０１４年、Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ、５巻（１７号）、７６５１〜７６６２頁；Ｌｅｅ，  Ｍａｃｅ，  ＆  Ｒｅｐａｓｋｙ、２０１０年、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉａ、２６巻（３号）、２３２〜２４６頁；Ｗｅｉら、２０１１年、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ、６巻（１号）、ｅ１６１９５頁）。主要な低酸素免疫調節経路は、図１に要約されている。手短に説明すると、ＨＩＦ−１は、ａ）抗腫瘍応答の鍵となるエフェクターであるヘルパーおよびキラーＴ細胞およびＮＫ細胞の動員および活性化を阻害する、アデノシン作動性（ａｄｅｎｏｓｉｎｅｒｇｉｃ）Ａ２およびＰＤ−Ｌ１経路を活性化すること（Ｎｏｍａｎら、２０１４年、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ、２１１巻（５号）、７８１〜７９０頁；Ｏｈｔａら、２００６年、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ、１０３巻（３５号）、１３１３２〜１３１３７頁）；ｂ）阻害性の調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）および他の骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）を動員および活性化すること（Ｃｈａｔｕｒｖｅｄｉら、２０１４年、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ、１１１巻（２０号）、Ｅ２１２０〜２１２９頁；Ｃｏｒｚｏら、２０１０年、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ、２０７巻（１１号）、２４３９〜２４５３頁；Ｗｅｉら、２０１１年）；ｃ）免疫系によって認識される腫瘍細胞の能力を直接的に阻害すること（Ｓｉｅｍｅｎｓら、２００８年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、６８巻（１２号）、４７４６〜４７５３頁）が示された。加えて、ＨＩＦ−１依存性および非依存性エピジェネティック機構は、抗腫瘍免疫応答の阻害に寄与し、腫瘍成長、血管新生および転移を増強する（Ｃｏｄｏら、２０１４年；Ｍｉｍｕｒａら、２０１１年、Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｓｃｉ、１１５巻（４号）、４５３〜４５８頁）。
【０００５】
マウス転移性腫瘍モデルにおいて、連続的補充的酸素負荷（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｌ
ｏｘｙｇｅｎａｔｉｏｎ）は、ＴおよびＮＫ細胞活性化をもたらすＡ２ＡＲ（Ａ２Ａアデノシン受容体）アデノシン作動性経路阻害により、腫瘍成長を阻害し、腫瘍の免疫回避を防止することが示された（Ｈａｔｆｉｅｌｄら、２０１５年、Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ、７巻（２７７号）、２７７ｒａ２３０頁）。特に、ＭＣＡ２０５、Ｂ１６または４Ｔ１肺転移を有するマウスの６０％呼吸酸素による連続的処置は、２倍超の転移性病巣数減少および生存増強をもたらした。これらのデータは、腫瘍およびリンパ球低酸素の減少、増加した活性化ＣＤ８Ｔ細胞（ＣＤ８＋ＣＤ６９＋ＣＤ４４＋）腫瘍浸潤、免疫賦活性サイトカインおよびケモカインの上方調節と相関し、インタクトなＡ２ＡＲシグナル伝達に依存した。同時に、呼吸による酸素過剰は、低下したＦｏｘｐ３、ＣＤ３９／ＣＤ７３（Ａ２ＡＲ上流のアデノシン生成酵素）およびＣＴＬＡ−４発現により、肺腫瘍微小環境（ＴＭＥ）におけるＴｒｅｇの数を低下させ、その活性を抑制することが示された。最後に、肺腫瘍の二重ＣＴＬＡ−４／ＰＤ−１遮断によって誘導される腫瘍退縮は、連続的な、呼吸による酸素過剰によって増強された。
【０００６】
免疫抑制性ＴＭＥを反転し、腫瘍成長を阻害する腫瘍酸素負荷の能力を実証する前臨床証拠は、説得力があるものであるにもかかわらず、ヒトの臨床治験において、高圧または常圧酸素を使用した補充的酸素負荷による効果は限定的であった（Ｏｖｅｒｇａａｒｄ、２００７年、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ、２５巻（２６号）、４０６６〜４０７４頁）。この結果は、可溶性酸素が、血管からほぼ８０μｍを越えて有効に拡散できず、酸素が低酸素腫瘍組織に深く浸透するのを限定することによるものである可能性がある。したがって、患者の腫瘍へと浸透して、正常拡散限界を越えて酸素を輸送し、これにより、低酸素微小環境に酸素を負荷して、免疫抑制性経路を妨害する酸素送達剤の必要がある。これは、単独で、ならびに他の免疫チェックポイント阻害剤および他のがん免疫療法アプローチと組み合わせての両方で、抗腫瘍免疫応答の最大の刺激をもたらすであろう。
【０００７】
Ｈ−ＮＯＸタンパク質（ヘム−一酸化窒素および酸素（Ｈｅｍｅ−Ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ  ａｎｄ  ＯＸｙｇｅｎ）結合ドメインにちなみ命名）は、ヘムタンパク質の高度に保存され十分に特徴付けされたファミリーのメンバーである（Ｉｙｅｒ，  ＬＭら（２００３年）ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４巻（１号）：５頁；Ｋａｒｏｗ，  ＤＳら（２００４年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４３巻（３１号）：１０２０３〜１０２１１頁；Ｂｏｏｎ，  ＥＭら（２００５年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．１巻：５３〜５９頁；Ｂｏｏｎ，  ＥＭら（２００５年）Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．９巻（５号）：４４１〜４４６頁；Ｂｏｏｎ，  ＥＭら（２００５年）Ｊ．  Ｉｎｏｒｇ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．９９巻（４号）：８９２〜９０２頁；Ｃａｒｙ，  ＳＰら（２００５年）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０２巻（３７号）：１３０６４〜９頁；Ｋａｒｏｗ  ＤＳら（２００５年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４４巻（４９号）：１６２６６〜７４頁；Ｃａｒｙ，  ＳＰら（２００６年）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ  ３１巻（４号）：２３１〜９頁；Ｂｏｏｎ，  ＥＭら（２００６年）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８１巻（３１号）：２１８９２〜９０２頁；Ｗｉｎｇｅｒ，  ＪＡら（２００７年）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２８２巻（２号）：８９７〜９０７頁）。Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、以前のヘモグロビンに基づく酸素キャリアとは異なり一酸化窒素にニュートラル（ｎｅｕｔｒａｌ）であり、Ｈ−ＮＯＸは循環一酸化窒素（ＮＯ）をスキャベンジせず、よって、高血圧性または腎性の副作用を伴わない。内在性ＮＯによるＨ−ＮＯＸタンパク質の不活性化の確率がより低く、Ｈ−ＮＯＸタンパク質により内在性ＮＯをスキャベンジする確率がより低いことによる内因性低ＮＯ反応性（および高ＮＯ安定性）は、野生型および変異体Ｈ−ＮＯＸタンパク質を望ましい代用血液とする。重要なことに、一部のＨ−ＮＯＸタンパク質における遠位ポケットチロシンの存在（Ｐｅｌｌｉｃｅｎａ，  Ｐ．ら（２００４年）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０１巻（３５号）：１２８５４〜１２８５９頁）は、望ましくない高ＮＯ反応性を示唆し、代用血液としての使用を禁忌とする。例えば、類推により、構造的に類似の遠位ポケットチロシンを有するＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓヘモグロビンタンパク質は、ＮＯと極度に迅速に反応し、感染宿主によって産生される防御的ＮＯを効果的にスキャベンジおよび回避するためにＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍによって使用される（Ｏｕｅｌｌｅｔ，  Ｈ．ら（２００２年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．Ｕ  Ｓ  Ａ  ９９巻（９号）：５９０２〜５９０７頁）。しかし、驚くべきことに、Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、実際にはヘモグロビンのＮＯ反応性よりもはるかに低いＮＯ反応性を有することが発見され、代用血液としてのその使用を可能にする。
【０００８】
治療および他の使用のためのＯ２および／またはＮＯの送達のためのＨ−ＮＯＸタンパク質は、米国特許第８，４０４，６３１号および同第８，４０４，６３２号；ＷＯ２００７／１３９７９１、ＷＯ２００７／１３９７６７およびＷＯ２０１４／１０７１７１；ならびに米国特許出願第１４／５３０，５６９号に記載されており、これらの文献それぞれの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００９】
特許出願および刊行物を含む、本明細書に引用されている全ての参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許第８，４０４，６３１号明細書
【特許文献２】米国特許第８，４０４，６３２号明細書
【特許文献３】国際公開第２００７／１３９７９１号
【特許文献４】国際公開第２００７／１３９７６７号
【特許文献５】国際公開第２０１４／１０７１７１号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、腫瘍を有する個体における腫瘍免疫をモジュレートするための方法であって、個体に有効量のＯ２担体ポリペプチドを投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、本発明は、腫瘍に対する免疫応答を増強するための方法を提供する。一部の実施形態では、本発明は、個体における腫瘍へのリンパ球浸潤を増加させるための方法であって、個体に有効量のＯ２担体ポリペプチドを投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、腫瘍へのリンパ球浸潤の増加は、ＣＤ４細胞、ＣＤ８細胞またはＮＫ細胞のうち１種または複数の浸潤の増加を含む。一部の実施形態では、腫瘍へのリンパ球浸潤の増加は、腫瘍におけるＴｒｅｇ細胞、腫瘍関連マクロファージまたは骨髄系由来サプレッサー細胞のうち１種または複数の阻害を伴う。一部の実施形態では、腫瘍へのリンパ球浸潤の増加は、腫瘍細胞におけるＭＨＣ１発現の増加を伴う。一部の実施形態では、腫瘍免疫のモジュレートは、抗原プロセシングの増加を含む。一部の実施形態では、腫瘍免疫のモジュレートは、樹状細胞（ＤＣ）の提示能力の増加を含む。
【００１２】
一部の実施形態では、本発明は、個体の腫瘍における低酸素誘導性因子１α（ＨＩＦ−１α）および／または低酸素誘導性因子２α（ＨＩＦ−２α）の発現を減少させるための方法であって、個体に有効量のＯ２担体ポリペプチドを投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、本発明は、個体の腫瘍におけるプログラム死リガンド−１（ＰＤ−Ｌ１）の発現を減少させるための方法であって、個体に有効量のＯ２担体ポリペプチドを投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、本発明は、個体の腫瘍におけるＡ２Ａアデノシン受容体（Ａ２ＡＲ）の発現を減少させるための方法であって、個体に有効量のＯ２担体ポリペプチドを投与するステップを含む方法を提供する。
【００１３】
上述の実施形態の一部の実施形態では、腫瘍は、脳腫瘍、神経膠芽腫、骨腫瘍、膵臓腫瘍、皮膚腫瘍、頭部もしくは頸部の腫瘍、メラノーマ、肺腫瘍、子宮腫瘍、卵巣腫瘍、結腸直腸腫瘍、肝臓腫瘍、肝細胞癌、胃腫瘍、精巣腫瘍、子宮内膜腫瘍、子宮頸部腫瘍、腟腫瘍、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、食道腫瘍、腸腫瘍、甲状腺腫瘍、副腎腫瘍、膀胱腫瘍、腎臓腫瘍、乳房腫瘍、多発性骨髄腫腫瘍、肉腫または扁平上皮腫瘍である。
【００１４】
一部の態様では、本発明は、個体におけるがんを処置するための方法であって、個体に有効量のＯ２担体ポリペプチドを投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、がんは、脳がん、神経膠芽腫、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭部もしくは頸部のがん、メラノーマ、肺がん、子宮がん、卵巣がん、結腸直腸がん、肛門がん、肝臓がん、肝細胞癌、胃がん、精巣がん、子宮内膜がん、子宮頸部がん、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、食道がん、腸がん、甲状腺がん、副腎がん、膀胱がん、腎臓がん、乳がん、多発性骨髄腫、肉腫、肛門がんまたは扁平上皮がんである。
【００１５】
上述の態様および実施形態の一部の実施形態では、個体は、哺乳動物である。さらなる実施形態では、哺乳動物は、ヒト（例えば、ヒト患者）である。他の実施形態において、哺乳動物は、ペット、実験研究用動物または家畜である。一部の実施形態において、ペット、研究用動物または家畜は、イヌ、ネコ、ウマ、サル、ウサギ、ラット、マウス、モルモット、ハムスター、ブタまたはウシである。
【００１６】
上述の態様および実施形態の一部の実施形態では、Ｏ２担体ポリペプチドは、静脈内、動脈内、腫瘍内、小胞内、吸入、腹腔内、肺内、筋肉内、皮下、気管内、経粘膜、眼内、髄腔内または経皮投与によって投与される。一部の実施形態では、Ｏ２担体ポリペプチドの投与は、反復される。一部の実施形態では、Ｏ２担体ポリペプチドの投与は、約４週間〜約８週間の間、毎日または１日２回反復される。一部の実施形態では、Ｏ２担体ポリペプチドは、約１〜約１０日間の期間、４時間毎、８時間毎、１２時間毎または２４時間毎に投与される。一部の実施形態では、Ｏ２担体ポリペプチドは、ボーラスとして投与される。他の実施形態では、Ｏ２担体ポリペプチドは、注入によって投与される。一部の実施形態では、Ｏ２担体ポリペプチドは、約１５分間、約３０分間、約１時間、約２時間、約３時間、約６時間、約１２時間、約２４時間または２４時間超かけて個体に注入される。
【００１７】
一部の実施形態では、本発明は、個体における腫瘍免疫をモジュレートするまたはがんを処置するための方法であって、Ｏ２担体ポリペプチドが、放射線療法と組み合わせて投与される方法を提供する。一部の実施形態では、放射線療法は、Ｏ２担体ポリペプチドが投与されてから１、２、３、４、５、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０または２４時間後に個体に投与される。一部の実施形態では、放射線は、Ｘ線照射である。一部の実施形態では、Ｘ線照射は、約０．５グレイ〜約７５グレイで投与される。一部の実施形態では、Ｏ２担体ポリペプチドの投与および／または放射線の投与は、反復される。一部の実施形態では、投与は、約２、３、４回、５回、１０回、１５回、２０回、２５回または３０回のいずれかを超えて反復される。一部の実施形態では、投与は、１週間、２週間、３週間または４週間後に反復される。
【００１８】
一部の実施形態では、本発明は、個体における腫瘍免疫をモジュレートするまたはがんを処置するための方法であって、Ｏ２担体ポリペプチドが、化学療法または免疫療法と組み合わせて投与される方法を提供する。一部の実施形態では、化学療法は、細胞毒を含む。一部の実施形態では、Ｏ２担体ポリペプチドの投与および／または化学療法の投与は、反復される。一部の実施形態では、免疫療法は、抗がんワクチン、養子免疫細胞療法、または免疫チェックポイント調節因子を標的化する薬剤のうち１種または複数である。一部の実施形態では、免疫療法は、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１または免疫チェックポイント調節因子のうち１種または複数を標的化する。一部の実施形態では、養子免疫療法は、キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞または工学的に操作されたＴＣＲ−Ｔ細胞である。一部の実施形態では、免疫療法は、腫瘍溶解性ウイルスまたは二重特異性Ｔ細胞誘導法（Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌ  Ｅｎｇａｇｅｒ）（ＢｉＴＥ）である。一部の実施形態では、Ｏ２担体ポリペプチドの投与および／または免疫療法の投与は、反復される。
【００１９】
上述の実施形態の一部の実施形態では、Ｏ２担体ポリペプチドは、医薬組成物中に存在する。一部の実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む。上述の実施形態のいずれかの一部の実施形態では、Ｏ２担体ポリペプチドは、Ｈ−ＮＯＸタンパク質である。
【００２０】
一部の態様では、本発明は、腫瘍を有する個体における腫瘍免疫をモジュレートするための方法であって、個体に有効量のＨ−ＮＯＸタンパク質を投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、本発明は、腫瘍に対する免疫応答を増強するための方法を提供する。一部の実施形態では、本発明は、個体における腫瘍への白血球浸潤を増加させるための方法であって、個体に有効量のＨ−ＮＯＸタンパク質を投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、本発明は、個体における腫瘍へのリンパ球浸潤を増加させるための方法であって、個体に有効量のＨ−ＮＯＸタンパク質を投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、腫瘍へのリンパ球浸潤の増加は、ＣＤ４細胞、ＣＤ８細胞またはＮＫ細胞のうち１種または複数の浸潤の増加を含む。一部の実施形態では、腫瘍へのリンパ球浸潤の増加は、腫瘍におけるＴｒｅｇ細胞、腫瘍関連マクロファージまたは骨髄系由来サプレッサー細胞のうち１種または複数の阻害を伴う。一部の実施形態では、腫瘍へのリンパ球浸潤の増加は、腫瘍細胞におけるＭＨＣ１発現の増加を伴う。一部の実施形態では、腫瘍免疫のモジュレートは、抗原プロセシングの増加を含む。一部の実施形態では、腫瘍免疫のモジュレートは、リンパ球活性化の増加を含む。一部の実施形態では、腫瘍免疫のモジュレートは、樹状細胞（ＤＣ）の提示能力の増加を含む。
【００２１】
一部の実施形態では、本発明は、個体の腫瘍における低酸素誘導性因子１α（ＨＩＦ−１α）および／または低酸素誘導性因子２α（ＨＩＦ−２α）の発現を減少させるための方法であって、個体に有効量のＨ−ＮＯＸタンパク質を投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、本発明は、個体の腫瘍におけるプログラム死リガンド−１（ＰＤ−Ｌ１）の発現を減少させるための方法であって、個体に有効量のＨ−ＮＯＸタンパク質を投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、本発明は、個体の腫瘍におけるＡ２Ａアデノシン受容体（Ａ２ＡＲ）の発現を減少させるための方法であって、個体に有効量のＨ−ＮＯＸタンパク質を投与するステップを含む方法を提供する。
【００２２】
上述の実施形態の一部の実施形態では、腫瘍は、脳腫瘍、神経膠芽腫、骨腫瘍、膵臓腫瘍、皮膚腫瘍、頭部もしくは頸部の腫瘍、メラノーマ、肺腫瘍、子宮腫瘍、卵巣腫瘍、結腸直腸腫瘍、肛門腫瘍、肝臓腫瘍、肝細胞癌、胃腫瘍、精巣腫瘍、子宮内膜腫瘍、子宮頸部腫瘍、腟腫瘍、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、食道腫瘍、腸腫瘍、甲状腺腫瘍、副腎腫瘍、膀胱腫瘍、腎臓腫瘍、乳房腫瘍、多発性骨髄腫腫瘍、肉腫または扁平上皮腫瘍である。
【００２３】
一部の態様では、本発明は、個体におけるがんを処置するための方法であって、個体に有効量のＨ−ＮＯＸタンパク質を投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、がんは、脳がん、神経膠芽腫、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭部もしくは頸部のがん、メラノーマ、肺がん、子宮がん、卵巣がん、結腸直腸がん、肛門がん、肝臓がん、肝細胞癌、胃がん、精巣がん、子宮内膜がん、子宮頸部がん、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、食道がん、腸がん、甲状腺がん、副腎がん、膀胱がん、腎臓がん、乳がん、多発性骨髄腫、肉腫または扁平上皮がんである。
【００２４】
上述の態様および実施形態の一部の実施形態では、個体は、哺乳動物である。さらなる実施形態では、哺乳動物は、ヒト（例えば、ヒト患者）である。他の実施形態において、哺乳動物は、ペット、実験研究用動物または家畜である。一部の実施形態において、ペット、研究用動物または家畜は、イヌ、ネコ、ウマ、サル、ウサギ、ラット、マウス、モルモット、ハムスター、ブタまたはウシである。
【００２５】
上述の態様および実施形態の一部の実施形態では、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、静脈内、動脈内、腫瘍内、小胞内、吸入、腹腔内、肺内、筋肉内、皮下、気管内、経粘膜、眼内、髄腔内または経皮投与によって投与される。一部の実施形態では、Ｈ−ＮＯＸタンパク質の投与は、反復される。一部の実施形態では、Ｈ−ＮＯＸタンパク質の投与は、約４週間〜約８週間の間、毎日または１日２回反復される。一部の実施形態では、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、約１〜約１０日間の期間、４時間毎、８時間毎、１２時間毎、２４時間毎または４８時間毎に投与される。一部の実施形態では、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、ボーラスとして投与される。他の実施形態では、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、注入によって投与される。一部の実施形態では、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、約１５分間、約３０分間、約１時間、約２時間、約３時間、約６時間、約１２時間、約２４時間または２４時間超かけて個体に注入される。
【００２６】
一部の実施形態では、本発明は、個体における腫瘍免疫をモジュレートするまたはがんを処置するための方法であって、Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、放射線療法と組み合わせて投与される方法を提供する。一部の実施形態では、放射線療法は、Ｈ−ＮＯＸタンパク質が投与されてから１、２、３、４、５、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０または２４時間後に個体に投与される。一部の実施形態では、放射線は、Ｘ線照射である。一部の実施形態では、Ｘ線照射は、約０．５グレイ〜約７５グレイで投与される。一部の実施形態では、Ｈ−ＮＯＸタンパク質の投与および／または放射線の投与は、反復される。一部の実施形態では、投与は、約２、３、４回、５回、１０回、１５回、２０回、２５回、３０回または４０回のいずれかを超えて反復される。一部の実施形態では、投与は、１週間、２週間、３週間または４週間後に反復される。
【００２７】
一部の実施形態では、本発明は、個体における腫瘍免疫をモジュレートするまたはがんを処置するための方法であって、Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、化学療法または免疫療法と組み合わせて投与される方法を提供する。一部の実施形態では、化学療法は、細胞毒を含む。一部の実施形態では、Ｈ−ＮＯＸタンパク質の投与および／または化学療法の投与は、反復される。一部の実施形態では、免疫療法は、抗がんワクチン、養子免疫細胞療法、または免疫チェックポイント調節因子を標的化する薬剤のうち１種または複数である。一部の実施形態では、免疫療法は、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１または免疫チェックポイント調節因子のうち１種または複数を標的化する。一部の実施形態では、養子免疫療法は、キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞または工学的に操作されたＴＣＲ−Ｔ細胞である。一部の実施形態では、免疫療法は、腫瘍溶解性ウイルスまたは二重特異性Ｔ細胞誘導法（Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌ  Ｅｎｇａｇｅｒ）（ＢｉＴＥ）である。一部の実施形態では、Ｈ−ＮＯＸタンパク質の投与および／または免疫療法の投与は、反復される。
【００２８】
上記の態様および実施形態の一部の実施形態では、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ、Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ  ２  Ｈ−ＮＯＸ、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ  β１、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  β１、Ｃ．ｌｕｐｕｓ  Ｈ−ＮＯＸ、Ｄ．ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒ  β１、Ｄ．ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒ  ＣＧ１４８８５−ＰＡ、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ＧＣＹ−３５、Ｎ．ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ  Ｈ−ＮＯＸ、Ｃ．ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ  Ｈ−ＮＯＸ、Ｓ．ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸまたはＣ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ  Ｈ−ＮＯＸである。一部の実施形態では、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、配列番号２に示されるＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓのＨ−ＮＯＸドメインに対応するＨ−ＮＯＸドメインを含む。
【００２９】
一部の実施形態では、Ｈ−ＮＯＸは、１個または複数の遠位ポケット変異を含む。一部の実施形態では、遠位ポケット変異は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸのＬ１４４に対応する部位におけるアミノ酸置換である。一部の実施形態では、Ｈ−ＮＯＸは、１４４位にアミノ酸置換を含むＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸである。一部の実施形態では、１４４位におけるアミノ酸置換は、Ｌ１４４Ｆ置換である。
【００３０】
一部の実施形態では、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質である。一部の実施形態では、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、単量体を含み、単量体は、Ｈ−ＮＯＸドメインおよび重合ドメインを含む。一部の実施形態では、Ｈ−ＮＯＸドメインは、重合ドメインに共有結合により連結されている。一部の実施形態では、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質である。一部の実施形態では、三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、１個または複数の三量体形成ドメインを含む。一部の実施形態では、三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、３個の単量体を含み、単量体は、Ｈ−ＮＯＸドメインおよび三量体形成ドメインを含み、三量体形成ドメインは、バクテリオファージＴ４三量体形成ドメインである。一部の実施形態では、三量体形成ドメインは、フォルドン（ｆｏｌｄｏｎ）ドメインである。一部の実施形態では、フォルドンドメインは、配列番号４のアミノ酸配列を含む。
【００３１】
一部の実施形態では、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、免疫グロブリンのＦｃドメインに融合されている。一部の実施形態では、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、ポリエチレングリコールに共有結合により結合している。
【００３２】
一部の実施形態では、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数は、ヘモグロビンのＯ２解離定数の２桁以内であり、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性は、ヘモグロビンのＮＯ反応性よりも少なくとも１０倍低い。一部の実施形態では、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数は、２０℃において約１ｎＭ〜約１０００ｎＭの間である。一部の実施形態では、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数は、２０℃において約１μＭ〜約１０μＭの間である。一部の実施形態では、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数は、２０℃において約１０μＭ〜約５０μＭの間である。一部の実施形態では、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性は、２０℃において約７００ｓ−１未満である。一部の実施形態では、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性は、ヘモグロビンのＮＯ反応性よりも少なくとも１００倍低い。一部の実施形態では、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性は、ヘモグロビンのＮＯ反応性よりも少なくとも１，０００倍低い。一部の実施形態では、Ｈ−ＮＯＸタンパク質の酸素に対するｋｏｆｆは、２０℃において約０．６５ｓ−１未満またはこれに等しい。一部の実施形態では、Ｈ−ＮＯＸタンパク質の酸素に対するｋｏｆｆは、２０℃において約０．２１ｓ−１〜約０．６５ｓ−１の間である。一部の実施形態では、Ｈ−ＮＯＸタンパク質の酸素に対するｋｏｆｆは、２０℃において約１．３５ｓ−１〜約２．９ｓ−１の間である。一部の実施形態では、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のヘム自動酸化の速度は、３７℃において約１ｈ−１未満である。
【００３３】
上述の実施形態の一部の実施形態では、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、医薬組成物中に存在する。一部の実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む。
【００３４】
一部の態様では、本発明は、個体における腫瘍免疫をモジュレートするためのＯ２担体タンパク質の使用を提供する。一部の実施形態では、腫瘍免疫のモジュレートは、腫瘍に対する免疫応答の増強を含む。一部の実施形態では、本発明は、個体における腫瘍への白血球浸潤を増加させるためのＯ２担体ポリペプチドの使用を提供する。一部の実施形態では、本発明は、個体における腫瘍へのリンパ球浸潤を増加させるためのＯ２担体ポリペプチドの使用を提供する。一部の実施形態では、腫瘍へのリンパ球浸潤の増加は、ＣＤ４細胞、ＣＤ８細胞またはＮＫ細胞のうち１種または複数の浸潤の増加を含む。一部の実施形態では、腫瘍へのリンパ球浸潤の増加は、腫瘍におけるＴｒｅｇ細胞、腫瘍関連マクロファージまたは骨髄系由来サプレッサー細胞のうち１種または複数の阻害を伴う。一部の実施形態では、腫瘍への白血球浸潤の増加は、腫瘍細胞におけるＭＨＣ１発現の増加を伴う。一部の実施形態では、腫瘍へのリンパ球浸潤の増加は、腫瘍細胞におけるＭＨＣ１発現の増加を伴う。  
【００３５】
一部の実施形態では、本発明は、個体の腫瘍におけるＨＩＦ−１αおよび／またはＨＩＦ−２αの発現を減少させるためのＯ２担体ポリペプチドの使用を提供する。一部の実施形態では、本発明は、個体の腫瘍におけるＰＤ−Ｌ１の発現を減少させるためのＯ２担体ポリペプチドの使用を提供する。一部の実施形態では、本発明は、個体の腫瘍におけるＡ２ＡＲの発現を減少させるためのＯ２担体ポリペプチドの使用を提供する。
【００３６】
上述の使用の一部の実施形態では、腫瘍は、脳腫瘍、神経膠芽腫、骨腫瘍、膵臓腫瘍、皮膚腫瘍、頭部もしくは頸部の腫瘍、メラノーマ、肺腫瘍、子宮腫瘍、卵巣腫瘍、結腸直腸腫瘍、肛門腫瘍、肝臓腫瘍、肝細胞癌、胃腫瘍、精巣腫瘍、子宮内膜腫瘍、子宮頸部腫瘍、腟腫瘍、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、食道腫瘍、腸腫瘍、甲状腺腫瘍、副腎腫瘍、膀胱腫瘍、腎臓腫瘍、乳房腫瘍、多発性骨髄腫腫瘍、肉腫または扁平上皮腫瘍である。
【００３７】
一部の実施形態では、本発明は、個体におけるがんを処置するためのＯ２担体ポリペプチドの使用を提供する。一部の実施形態では、がんは、脳がん、神経膠芽腫、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭部もしくは頸部のがん、メラノーマ、肺がん、子宮がん、卵巣がん、結腸直腸がん、肛門がん、肝臓がん、肝細胞癌、胃がん、精巣がん、子宮内膜がん、子宮頸部がん、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、食道がん、腸がん、甲状腺がん、副腎がん、膀胱がん、腎臓がん、乳がん、多発性骨髄腫、肉腫、肛門がんまたは扁平上皮がんである。
【００３８】
上述の使用の一部の実施形態では、個体は、哺乳動物である。一部の実施形態では、哺乳動物はヒトである。
【００３９】
上記の使用の一部の実施形態では、Ｏ２担体ポリペプチドはＨ−ＮＯＸタンパク質である。一部の実施形態では、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ、Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ  ２  Ｈ−ＮＯＸ、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ  β１、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  β１、Ｃ．ｌｕｐｕｓ  Ｈ−ＮＯＸ、Ｄ．ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒ  β１、Ｄ．ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒ  ＣＧ１４８８５−ＰＡ、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ＧＣＹ−３５、Ｎ．ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ  Ｈ−ＮＯＸ、Ｃ．ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ  Ｈ−ＮＯＸ、Ｓ．ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸまたはＣ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ  Ｈ−ＮＯＸである。一部の実施形態では、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、配列番号２に示されるＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓのＨ−ＮＯＸドメインに対応するＨ−ＮＯＸドメインを含む。一部の実施形態では、Ｈ−ＮＯＸは、１個または複数の遠位ポケット変異を含む。一部の実施形態では、遠位ポケット変異は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸのＬ１４４に対応する部位におけるアミノ酸置換である。一部の実施形態では、Ｈ−ＮＯＸは、１４４位にアミノ酸置換を含むＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸである。一部の実施形態では、１４４位におけるアミノ酸置換は、Ｌ１４４Ｆ置換である。
【００４０】
一部の実施形態では、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質である。一部の実施形態では、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、単量体を含み、単量体は、Ｈ−ＮＯＸドメインおよび重合ドメインを含む。一部の実施形態では、Ｈ−ＮＯＸドメインは、重合ドメインに共有結合により連結されている。一部の実施形態では、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質である。一部の実施形態では、三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、１個または複数の三量体形成ドメインを含む。一部の実施形態では、三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、３個の単量体を含み、単量体は、Ｈ−ＮＯＸドメインおよび三量体形成ドメインを含み、三量体形成ドメインは、バクテリオファージＴ４三量体形成ドメインである。一部の実施形態では、三量体形成ドメインは、フォルドン（ｆｏｌｄｏｎ）ドメインである。一部の実施形態では、フォルドンドメインは、配列番号４のアミノ酸配列を含む。
【００４１】
一部の実施形態では、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、免疫グロブリンのＦｃドメインに融合されている。一部の実施形態では、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、ポリエチレングリコールに共有結合により結合している。
【００４２】
一部の態様では、本発明は、個体における腫瘍免疫をモジュレートするためのキットであって、本明細書に記載されている方法における使用のためのＯ２担体タンパク質を含むキットを提供する。一部の実施形態では、本キットは、バイアル、容器、アンプル、瓶、ジャーまたは可撓性パッケージングのうち１種または複数をさらに含む。一部の実施形態では、本キットは、１種または複数のバッファーをさらに含む。一部の実施形態では、本キットは、使用のための指示をさらに含む。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
個体におけるがんを処置するための方法であって、前記個体に有効量のＯ２担体ポリペプチドを投与するステップを含む、方法。
（項目２）
前記がんが、脳がん、神経膠芽腫、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭部もしくは頸部のがん、メラノーマ、肺がん、子宮がん、卵巣がん、結腸直腸がん、肛門がん、肝臓がん、肝細胞癌、胃がん、精巣がん、子宮内膜がん、子宮頸部がん、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、食道がん、腸がん、甲状腺がん、副腎がん、膀胱がん、腎臓がん、乳がん、多発性骨髄腫、肉腫または扁平上皮がんである、項目１に記載の方法。
（項目３）
腫瘍を有する個体における腫瘍免疫をモジュレートするための方法であって、前記個体に有効量のＯ２担体ポリペプチドを投与するステップを含む、方法。
（項目４）
前記腫瘍免疫のモジュレートが、前記腫瘍に対する免疫応答の増強を含む、項目３に記載の方法。
（項目５）
個体における腫瘍へのリンパ球浸潤を増加させるための方法であって、前記個体に有効量のＯ２担体ポリペプチドを投与するステップを含む、方法。
（項目６）
前記腫瘍へのリンパ球浸潤の前記増加が、ＣＤ４細胞、ＣＤ８細胞またはＮＫ細胞のうち１種または複数の浸潤の増加を含む、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記腫瘍へのリンパ球浸潤の前記増加が、前記腫瘍におけるＴｒｅｇ細胞、腫瘍関連マクロファージまたは骨髄系由来サプレッサー細胞のうち１種または複数の阻害を伴う、項目５または６に記載の方法。
（項目８）
前記腫瘍へのリンパ球浸潤の前記増加が、前記腫瘍細胞におけるＭＨＣ１発現の増加を伴う、項目５から７のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
個体の腫瘍における低酸素誘導性因子１α（ＨＩＦ−１α）および／または２α（ＨＩＦ−２α）の発現を減少させるための方法であって、前記個体に有効量のＯ２担体ポリペプチドを投与するステップを含む、方法。
（項目１０）
個体の腫瘍におけるプログラム死リガンド−１（ＰＤ−Ｌ１）の発現を減少させるための方法であって、前記個体に有効量のＯ２担体ポリペプチドを投与するステップを含む、方法。
（項目１１）
個体の腫瘍におけるＡ２Ａアデノシン受容体（Ａ２ＡＲ）の発現を減少させるための方法であって、前記個体に有効量のＯ２担体ポリペプチドを投与するステップを含む、方法。
（項目１２）
前記腫瘍が、脳腫瘍、神経膠芽腫、骨腫瘍、膵臓腫瘍、皮膚腫瘍、頭部もしくは頸部の腫瘍、メラノーマ、肺腫瘍、子宮腫瘍、卵巣腫瘍、結腸直腸腫瘍、肛門腫瘍、肝臓腫瘍、肝細胞癌、胃腫瘍、精巣腫瘍、子宮内膜腫瘍、子宮頸部腫瘍、腟腫瘍、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、食道腫瘍、腸腫瘍、甲状腺腫瘍、副腎腫瘍、膀胱腫瘍、腎臓腫瘍、乳房腫瘍、多発性骨髄腫腫瘍、肉腫または扁平上皮腫瘍である、項目３から１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
前記個体が、哺乳動物である、項目１から１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
前記哺乳動物が、ヒトである、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記哺乳動物が、ペット、実験用研究動物または家畜である、項目１４に記載の方法。（項目１６）
前記ペット、研究動物または家畜が、イヌ、ネコ、ウマ、サル、ウサギ、ラット、マウス、モルモット、ハムスター、ブタまたはウシである、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記Ｏ２担体ポリペプチドが、静脈内、動脈内、腫瘍内、小胞内、吸入、腹腔内、肺内、筋肉内、皮下、気管内、経粘膜、眼内、髄腔内または経皮投与によって投与される、項目１から１６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８）
前記Ｏ２担体ポリペプチドの投与が、反復される、項目１から１７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
前記Ｏ２担体ポリペプチドの投与が、約４週間〜約８週間の間、毎日、１日２回または１週間に約１〜４回反復される、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記Ｏ２担体ポリペプチドが、約１〜約１０日間の期間、４時間毎、８時間毎、１２時間毎または２４時間毎に投与される、項目１８または１９に記載の方法。
（項目２１）
前記Ｏ２担体ポリペプチドが、ボーラスとして投与される、項目１から２０のいずれか一項に記載の方法。
（項目２２）
前記Ｏ２担体ポリペプチドが、注入によって投与される、項目１から２０のいずれか一項に記載の方法。
（項目２３）
前記Ｏ２担体ポリペプチドが、約１５分間、約３０分間、約１時間、約２時間、約３時間、約６時間、約１２時間または約２４時間かけて前記個体に注入される、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記Ｏ２担体ポリペプチドが、放射線療法と組み合わせて投与される、項目１から２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
前記放射線療法が、前記Ｏ２担体ポリペプチドが投与されてから１、２、３、４、５、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０または２４時間後に前記個体に投与される、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記放射線が、Ｘ線照射である、項目２４または２５に記載の方法。
（項目２７）
前記Ｘ線照射が、約０．５グレイ〜約７５グレイで投与される、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
前記Ｏ２担体ポリペプチドの前記投与および／または前記放射線の前記投与が、反復される、項目２４から２７のいずれか一項に記載の方法。
（項目２９）
前記投与が、約２回〜約４０回の間のいずれかの回数またはそれを超えて反復される、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記投与が、１週間、２週間、３週間もしくは４週間またはそれを超えた後に反復される、項目２８または２９に記載の方法。
（項目３１）
前記Ｏ２担体ポリペプチドが、化学療法または免疫療法と組み合わせて投与される、項目１から２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目３２）
前記化学療法が、細胞毒を含む、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
前記Ｏ２担体ポリペプチドの前記投与および／または前記化学療法の前記投与が、反復される、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記免疫療法が、抗がんワクチン、養子免疫細胞療法、または免疫チェックポイント調節因子を標的化する薬剤のうち１種または複数である、項目３１に記載の方法。
（項目３５）
前記免疫療法が、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１または免疫チェックポイント調節因子のうち１種または複数を標的化する、項目３１または３４に記載の方法。
（項目３６）
前記養子免疫療法が、キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞または工学的に操作されたＴＣＲ−Ｔ細胞である、項目３１または３４に記載の方法。
（項目３７）
前記Ｏ２担体ポリペプチドの前記投与および／または前記免疫療法の前記投与が、反復される、項目３１または３４から３６のいずれか一項に記載の方法。
（項目３８）
前記Ｏ２担体ポリペプチドが、医薬組成物中に存在する、項目１から３７のいずれか一項に記載の方法。
（項目３９）
前記医薬組成物が、薬学的に許容される担体をさらに含む、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
前記Ｏ２担体ポリペプチドが、Ｈ−ＮＯＸタンパク質である、項目１から３９のいずれか一項に記載の方法。
（項目４１）
個体におけるがんを処置するための方法であって、前記個体に有効量のＨ−ＮＯＸタンパク質を投与するステップを含む、方法。
（項目４２）
前記がんが、脳がん、神経膠芽腫、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭部もしくは頸部のがん、メラノーマ、肺がん、子宮がん、卵巣がん、結腸直腸がん、肛門がん、肝臓がん、肝細胞癌、胃がん、精巣がん、子宮内膜がん、子宮頸部がん、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、食道がん、腸がん、甲状腺がん、副腎がん、膀胱がん、腎臓がん、乳がん、多発性骨髄腫、肉腫または扁平上皮がんである、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
腫瘍を有する個体における腫瘍免疫をモジュレートするための方法であって、前記個体に有効量のＨ−ＮＯＸタンパク質を投与するステップを含む、方法。
（項目４４）
前記腫瘍免疫のモジュレートが、前記腫瘍に対する免疫応答の増強を含む、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
個体における腫瘍へのリンパ球浸潤を増加させるための方法であって、前記個体に有効量のＨ−ＮＯＸタンパク質を投与するステップを含む、方法。
（項目４６）
前記腫瘍へのリンパ球浸潤の前記増加が、ＣＤ４細胞、ＣＤ８細胞またはＮＫ細胞のうち１種または複数の浸潤の増加を含む、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
前記腫瘍へのリンパ球浸潤の前記増加が、前記腫瘍におけるＴｒｅｇ細胞、腫瘍関連マクロファージまたは骨髄系由来サプレッサー細胞のうち１種または複数の阻害を伴う、項目４５または４６に記載の方法。
（項目４８）
前記腫瘍へのリンパ球浸潤の前記増加が、前記腫瘍細胞におけるＭＨＣ１発現の増加を伴う、項目４５から４７のいずれか一項に記載の方法。
（項目４９）
個体の腫瘍におけるＨＩＦ−１αおよび／またはＨＩＦ−２αの発現を減少させるための方法であって、前記個体に有効量のＨ−ＮＯＸタンパク質を投与するステップを含む、方法。
（項目５０）
個体の腫瘍におけるＰＤ−Ｌ１の発現を減少させるための方法であって、前記個体に有効量のＨ−ＮＯＸタンパク質を投与するステップを含む、方法。
（項目５１）
個体の腫瘍におけるＡ２ＡＲの発現を減少させるための方法であって、前記個体に有効量のＨ−ＮＯＸタンパク質を投与するステップを含む、方法。
（項目５２）
前記腫瘍が、脳腫瘍、神経膠芽腫、骨腫瘍、膵臓腫瘍、皮膚腫瘍、頭部もしくは頸部の腫瘍、メラノーマ、肺腫瘍、子宮腫瘍、卵巣腫瘍、結腸直腸腫瘍、肛門腫瘍、肝臓腫瘍、肝細胞癌、胃腫瘍、精巣腫瘍、子宮内膜腫瘍、子宮頸部腫瘍、腟腫瘍、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、食道腫瘍、腸腫瘍、甲状腺腫瘍、副腎腫瘍、膀胱腫瘍、腎臓腫瘍、乳房腫瘍、多発性骨髄腫腫瘍、肉腫または扁平上皮腫瘍である、項目４１から５１のいずれか一項に記載の方法。
（項目５３）
前記個体が、哺乳動物である、項目４１から５２のいずれか一項に記載の方法。
（項目５４）
前記哺乳動物が、ヒトである、項目５３に記載の方法。
（項目５５）
前記哺乳動物が、ペット、実験用研究動物または家畜である、項目５２に記載の方法。（項目５６）
前記ペット、研究動物または家畜が、イヌ、ネコ、ウマ、サル、ウサギ、ラット、マウス、モルモット、ハムスター、ブタまたはウシである、項目５５に記載の方法。
（項目５７）
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、静脈内、動脈内、腫瘍内、小胞内、吸入、腹腔内、肺内、筋肉内、皮下、気管内、経粘膜、眼内、髄腔内または経皮投与によって投与される、項目４１から５６のいずれか一項に記載の方法。
（項目５８）
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質の投与が、反復される、項目４１から５７のいずれか一項に記載の方法。
（項目５９）
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質の投与が、約４週間〜約８週間の間、毎日または１日２回反復される、項目５８に記載の方法。
（項目６０）
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、約１〜約１０日間の期間、４時間毎、８時間毎、１２時間毎または２４時間毎に投与される、項目５８または５９に記載の方法。
（項目６１）
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、ボーラスとして投与される、項目４１から６０のいずれか一項に記載の方法。
（項目６２）
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、注入によって投与される、項目４１から６０のいずれか一項に記載の方法。
（項目６３）
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、約１５分間、約３０分間、約１時間、約１時間、約２時間、約３時間、約６時間、約１２時間または約２４時間かけて前記個体に注入される、項目６２に記載の方法。
（項目６４）
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、放射線療法と組み合わせて投与される、項目４１から６３のいずれか一項に記載の方法。
（項目６５）
前記放射線療法が、前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が投与されてから１、２、３、４、５、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２または２４時間後に前記個体に投与される、項目６４に記載の方法。
（項目６６）
前記放射線が、Ｘ線照射である、項目６４または６５に記載の方法。
（項目６７）
前記Ｘ線照射が、約０．５グレイ〜約７５グレイで投与される、項目６６に記載の方法。
（項目６８）
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質の前記投与および／または前記放射線の前記投与が、反復される、項目６４から６７のいずれか一項に記載の方法。
（項目６９）
前記投与が、約２回〜約４０回の間のいずれかの回数またはそれを超えて反復される、項目６８に記載の方法。
（項目７０）
前記投与が、１週間、２週間、３週間もしくは４週間またはそれを超えた後に反復される、項目６８または６９に記載の方法。
（項目７１）
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、化学療法または免疫療法と組み合わせて投与される、項目４１から６３のいずれか一項に記載の方法。
（項目７２）
前記化学療法が、細胞毒を含む、項目７１に記載の方法。
（項目７３）
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質の前記投与および／または前記化学療法の前記投与が、反復される、項目７２に記載の方法。
（項目７４）
前記免疫療法が、抗がんワクチン、養子免疫細胞療法、または免疫チェックポイント調節因子を標的化する薬剤のうち１種または複数である、項目７１に記載の方法。
（項目７５）
前記免疫療法が、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１または免疫チェックポイント調節因子のうち１種または複数を標的化する、項目７１または７４に記載の方法。
（項目７６）
前記養子免疫療法が、キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞または工学的に操作されたＴＣＲ−Ｔ細胞である、項目７１、７４または７５に記載の方法。
（項目７７）
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質の前記投与および／または前記免疫療法の前記投与が、反復される、項目７１または７４から７６のいずれか一項に記載の方法。
（項目７８）
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ、Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ  ２  Ｈ−ＮＯＸ、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ  β１、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  β１、Ｃ．ｌｕｐｕｓ  Ｈ−ＮＯＸ、Ｄ．ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒ  β１、Ｄ．ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒ  ＣＧ１４８８５−ＰＡ、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ＧＣＹ−３５、Ｎ．ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ  Ｈ−ＮＯＸ、Ｃ．ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ  Ｈ−ＮＯＸ、Ｓ．ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸまたはＣ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ  Ｈ−ＮＯＸである、項目４１から７７のいずれか一項に記載の方法。
（項目７９）
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、配列番号２に示されるＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓのＨ−ＮＯＸドメインに対応するＨ−ＮＯＸドメインを含む、項目４１から７７のいずれか一項に記載の方法。
（項目８０）
前記Ｈ−ＮＯＸが、１個または複数の遠位ポケット変異を含む、項目４１から７８のいずれか一項に記載の方法。
（項目８１）
前記遠位ポケット変異が、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸのＬ１４４に対応する部位におけるアミノ酸置換である、項目８０に記載の方法。
（項目８２）
前記Ｈ−ＮＯＸが、１４４位にアミノ酸置換を含むＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸである、項目８０または８１に記載の方法。
（項目８３）
１４４位における前記アミノ酸置換が、Ｌ１４４Ｆ置換である、項目８２に記載の方法。
（項目８４）
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質である、項目４１から８３のいずれか一項に記載の方法。
（項目８５）
前記重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、単量体を含み、前記単量体が、Ｈ−ＮＯＸドメインおよび重合ドメインを含む、項目８４に記載の方法。
（項目８６）
前記Ｈ−ＮＯＸドメインが、前記重合ドメインに共有結合により連結されている、項目８５に記載の方法。
（項目８７）
前記重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質である、項目８４から８６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８８）
前記三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、１個または複数の三量体形成ドメインを含む、項目８７に記載の方法。
（項目８９）
前記三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、３個の単量体を含み、前記単量体が、Ｈ−ＮＯＸドメインおよび三量体形成ドメインを含み、前記三量体形成ドメインが、バクテリオファージＴ４三量体形成ドメインである、項目８８に記載の方法。
（項目９０）
前記三量体形成ドメインが、フォルドンドメインである、項目８８または８９に記載の方法。
（項目９１）
前記フォルドンドメインが、配列番号４のアミノ酸配列を含む、項目９０に記載の方法。
（項目９２）
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、免疫グロブリンのＦｃドメインに融合されている、項目４１から９１のいずれか一項に記載の方法。
（項目９３）
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、ポリエチレングリコールに共有結合により結合している、項目４１から９２のいずれか一項に記載の方法。
（項目９４）
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数が、ヘモグロビンのＯ２解離定数の２桁以内であり、前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性が、ヘモグロビンのＮＯ反応性よりも少なくとも１０倍低い、項目４１から９３のいずれか一項に記載の方法。
（項目９５）
前記重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数が、２０℃において約１ｎＭ〜約１０００ｎＭの間である、項目４１から９４のいずれか一項に記載の方法。
（項目９６）
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数が、２０℃において約１μＭ〜約１０μＭの間である、項目４１から９５のいずれか一項に記載の方法。
（項目９７）
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数が、２０℃において約１０μＭ〜約５０μＭの間である、項目４１から９６のいずれか一項に記載の方法。
（項目９８）
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性が、２０℃において約７００ｓ−１未満である、項目４１から９７のいずれか一項に記載の方法。
（項目９９）
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性が、ヘモグロビンのＮＯ反応性よりも少なくとも１００倍低い、項目４１から９８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１００）
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性が、ヘモグロビンのＮＯ反応性よりも少なくとも１，０００倍低い、項目９９に記載の方法。
（項目１０１）
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質の酸素に対するｋｏｆｆが、２０℃において約０．６５ｓ−１未満またはこれに等しい、項目４１から１００のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０２）
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質の酸素に対するｋｏｆｆが、２０℃において約０．２１ｓ−１〜約０．６５ｓ−１の間である、項目４１から１０１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０３）
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質の酸素に対するｋｏｆｆが、２０℃において約１．３５ｓ−１〜約２．９ｓ−１の間である、項目４１から１０２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０４）
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のヘム自動酸化の速度が、３７℃において約１ｈ−１未満である、項目４１から１０３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０５）
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、医薬組成物中に存在する、項目４１から１０４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０６）
前記医薬組成物が、薬学的に許容される担体をさらに含む、項目１０５に記載の方法。
（項目１０７）
個体におけるがんを処置するためのＯ２担体タンパク質の使用。
（項目１０８）
前記がんが、脳がん、神経膠芽腫、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭部もしくは頸部のがん、メラノーマ、肺がん、子宮がん、卵巣がん、結腸直腸がん、肛門がん、肝臓がん、肝細胞癌、胃がん、精巣がん、子宮内膜がん、子宮頸部がん、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、食道がん、腸がん、甲状腺がん、副腎がん、膀胱がん、腎臓がん、乳がん、多発性骨髄腫、肉腫または扁平上皮がんである、項目１０７に記載の使用。
（項目１０９）
個体における腫瘍免疫をモジュレートするためのＯ２担体タンパク質の使用。
（項目１１０）
前記腫瘍免疫のモジュレートが、前記腫瘍に対する免疫応答の増強を含む、項目１０９に記載の使用。
（項目１１１）
個体における腫瘍へのリンパ球浸潤を増加させるためのＯ２担体ポリペプチドの使用。（項目１１２）
前記腫瘍へのリンパ球浸潤の前記増加が、ＣＤ４細胞、ＣＤ８細胞またはＮＫ細胞のうち１種または複数の浸潤の増加を含む、項目１１１に記載の使用。
（項目１１３）
前記腫瘍へのリンパ球浸潤の前記増加が、前記腫瘍におけるＴｒｅｇ細胞、腫瘍関連マクロファージまたは骨髄系由来サプレッサー細胞のうち１種または複数の阻害を伴う、項目１１１または１１２に記載の使用。
（項目１１４）
前記腫瘍へのリンパ球浸潤の前記増加が、前記腫瘍細胞におけるＭＨＣ１発現の増加を伴う、項目１１１から１１３のいずれか一項に記載の使用。
（項目１１５）
個体の腫瘍におけるＨＩＦ−１αおよび／またはＨＩＦ−２αの発現を減少させるためのＯ２担体ポリペプチドの使用。
（項目１１６）
個体の腫瘍におけるＰＤ−Ｌ１の発現を減少させるためのＯ２担体ポリペプチドの使用。
（項目１１７）
個体の腫瘍におけるＡ２ＡＲの発現を減少させるためのＯ２担体ポリペプチドの使用。（項目１１８）
前記腫瘍が、脳腫瘍、神経膠芽腫、骨腫瘍、膵臓腫瘍、皮膚腫瘍、頭部もしくは頸部の腫瘍、メラノーマ、肺腫瘍、子宮腫瘍、卵巣腫瘍、結腸直腸腫瘍、肛門腫瘍、肝臓腫瘍、肝細胞癌、胃腫瘍、精巣腫瘍、子宮内膜腫瘍、子宮頸部腫瘍、腟腫瘍、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、食道腫瘍、腸腫瘍、甲状腺腫瘍、副腎腫瘍、膀胱腫瘍、腎臓腫瘍、乳房腫瘍、多発性骨髄腫腫瘍、肉腫または扁平上皮腫瘍である、項目１０９から１１７のいずれか一項に記載の使用。
（項目１１９）
前記個体が、哺乳動物である、項目１０７から１１８のいずれか一項に記載の使用。
（項目１２０）
前記哺乳動物が、ヒトである、項目１１９に記載の使用。
（項目１２１）
前記Ｏ２担体ポリペプチドが、Ｈ−ＮＯＸタンパク質である、項目１０７から１２０のいずれか一項に記載の使用。
（項目１２２）
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ、Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ  ２  Ｈ−ＮＯＸ、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ  β１、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  β１、Ｃ．ｌｕｐｕｓ  Ｈ−ＮＯＸ、Ｄ．ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒ  β１、Ｄ．ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒ  ＣＧ１４８８５−ＰＡ、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ＧＣＹ−３５、Ｎ．ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ  Ｈ−ＮＯＸ、Ｃ．ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ  Ｈ−ＮＯＸ、Ｓ．ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸまたはＣ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ  Ｈ−ＮＯＸである、項目１２１に記載の使用。
（項目１２３）
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、配列番号２に示されるＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓのＨ−ＮＯＸドメインに対応するＨ−ＮＯＸドメインを含む、項目１２１または１２２のいずれか一項に記載の使用。
（項目１２４）
前記Ｈ−ＮＯＸが、１個または複数の遠位ポケット変異を含む、項目１２１から１２３のいずれか一項に記載の使用。
（項目１２５）
前記遠位ポケット変異が、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸのＬ１４４に対応する部位におけるアミノ酸置換である、項目１２４に記載の使用。
（項目１２６）
前記Ｈ−ＮＯＸが、１４４位にアミノ酸置換を含むＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸである、項目１２４または１２５に記載の使用。
（項目１２７）
１４４位における前記アミノ酸置換が、Ｌ１４４Ｆ置換である、項目１２６に記載の使用。
（項目１２８）
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質である、項目１２１から１２７のいずれか一項に記載の使用。
（項目１２９）
前記重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、単量体を含み、前記単量体が、Ｈ−ＮＯＸドメインおよび重合ドメインを含む、項目１２８に記載の使用。
（項目１３０）
前記Ｈ−ＮＯＸドメインが、前記重合ドメインに共有結合により連結されている、項目１２９に記載の使用。
（項目１３１）
前記重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質である、項目１２８から１３０のいずれか一項に記載の使用。
（項目１３２）
前記三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、１個または複数の三量体形成ドメインを含む、項目１３１に記載の使用。
（項目１３３）
前記三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、３個の単量体を含み、前記単量体が、Ｈ−ＮＯＸドメインおよび三量体形成ドメインを含み、前記三量体形成ドメインが、バクテリオファージＴ４三量体形成ドメインである、項目１３２に記載の使用。
（項目１３４）
前記三量体形成ドメインが、フォルドンドメインである、項目１３２または１３３に記載の使用。
（項目１３５）
前記フォルドンドメインが、配列番号４のアミノ酸配列を含む、項目１３４に記載の使用。
（項目１３６）
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、免疫グロブリンのＦｃドメインに融合されている、項目１３１から１３５のいずれか一項に記載の使用。
（項目１３７）
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、ポリエチレングリコールに共有結合により結合している、項目１２１から１３６のいずれか一項に記載の使用。
（項目１３８）
個体における腫瘍免疫をモジュレートするためのキットであって、項目１から１０６のいずれか一項に記載の方法における使用のためのＯ２担体タンパク質を含む、キット。
（項目１３９）
バイアル、容器、アンプル、瓶、ジャーまたは可撓性パッケージングのうち１種または複数をさらに含む、項目１３８に記載のキット。
（項目１４０）
１種または複数のバッファーをさらに含む、項目１３８または１３９に記載のキット。
（項目１４１）
使用のための指示をさらに含む、項目１３８から１４０のいずれか一項に記載のキット。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１−１】図１Ａおよび図１Ｂは、低酸素によって促進される主要な免疫抑制性経路のモデル（図１Ａ）およびＯ２担体ポリペプチド処置によって発揮され得る治療介入のポイント（図１Ｂ）を示す。
【図１−２】図１Ａおよび図１Ｂは、低酸素によって促進される主要な免疫抑制性経路のモデル（図１Ａ）およびＯ２担体ポリペプチド処置によって発揮され得る治療介入のポイント（図１Ｂ）を示す。
【００４４】
【図２】図２Ａ〜図２Ｃは、ピモニダゾールおよびＨＩＦ−１  ＥＬＩＳＡによって評価される、ペグ化三量体Ｔｔ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｌ１４４Ｆの単一ボーラス用量の後の腫瘍酸素負荷を示す。図２Ａは、競合的ＥＬＩＳＡによって測定されるピモニダゾールレベルを示す。図２Ｂは、サンドイッチＥＬＩＳＡによって測定されるＨＩＦ−１αレベルを示す。グラフは、ペグ化三量体Ｔｔ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｌ１４４Ｆ投与後のピモニダゾールおよびＨＩＦ−１αシグナルの定量化を示す。平均値＋／−ＳＥＭ。一元配置ＡＮＯＶＡおよびボンフェローニの事後検定により、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１。図２Ｃは、サンドイッチＨ−ＮＯＸ  ＥＬＩＳＡによるペグ化三量体Ｔｔ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｌ１４４Ｆの蓄積に関する腫瘍の評価を示し、結果は、腫瘍組織１グラム当たりで表す。
【００４５】
【図３】図３Ａ〜図３Ｄは、ペグ化三量体Ｔｔ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｌ１４４Ｆ投与後の腫瘍組織酸素負荷の直接的測定を示す。腫瘍を、ペグ化三量体Ｔｔ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｌ１４４Ｆ（図３Ａ）、非機能的対照Ｔｔ  Ｈ−ＮＯＸタンパク質（図３Ｃ）またはｐＯ２＝０．４４ｍｍＨｇから開始する１００％酸素（図３Ｂ）またはｐＯ２＝５ｍｍＨｇから開始する１００％酸素（図３Ｄ）のいずれかで処置した。
【００４６】
【図４】図４は、Ｈ４６０腫瘍を有するマウスのペグ化三量体Ｔｔ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｌ１４４Ｆ処置後の照射有効性の増強を示す。Ｈ４６０皮下異種移植片腫瘍（１５０〜３００ｍｍ３）を有するマウスは、ペグ化三量体Ｔｔ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｌ１４４Ｆで前処置し、または１０Ｇｙ単独で処置し、照射し、腫瘍を抽出し、試験管内腫瘍細胞感受性試験のために処理した。７日後に、各腫瘍由来の三連の試料において細胞数を計数した。グラフの各ドットは、１個の腫瘍の平均生存率を表す。
【００４７】
【図５】図５Ａ〜図５Ｃは、ペグ化三量体Ｔｔ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｌ１４４Ｆが、免疫抑制に関与するＨＩＦ−１α標的を下方調節することを示す。Ｈ４６０皮下異種移植片腫瘍（１５０〜３００ｍｍ３）を有するマウスは、ペグ化三量体Ｔｔ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｌ１４４Ｆで前処置し、またはビヒクル単独で処置し、ｑＲＴ−ＰＣＲ解析のために収集した。図５Ａは、ＶＥＧＦの発現を示す。図５Ｂは、ＧＬＵＴ１の発現を示す。図５Ｃは、ＰＤ−Ｌ１の発現を示す。
【００４８】
【図６Ａ】図６Ａは、Ｈｉｓ６タグを含む、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｌ１４４Ｆ  Ｈ−ＮＯＸ配列のＣ末端に融合されたバクテリオファージＴ４フィブリチンのフォルドンドメインの核酸（配列番号５）およびアミノ酸配列（配列番号６）を示す。図６Ｂは、Ｈｉｓ６タグなしの、Ｌ１４４Ｆ  Ｈ−ＮＯＸ−フォルドン単量体の核酸（配列番号７）およびアミノ酸配列（配列番号８）を示す。
【図６Ｂ】図６Ａは、Ｈｉｓ６タグを含む、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｌ１４４Ｆ  Ｈ−ＮＯＸ配列のＣ末端に融合されたバクテリオファージＴ４フィブリチンのフォルドンドメインの核酸（配列番号５）およびアミノ酸配列（配列番号６）を示す。図６Ｂは、Ｈｉｓ６タグなしの、Ｌ１４４Ｆ  Ｈ−ＮＯＸ−フォルドン単量体の核酸（配列番号７）およびアミノ酸配列（配列番号８）を示す。
【００４９】
【図７】図７Ａ〜図７Ｃは、腫瘍低酸素の代表的な画像、ならびにＢ１６Ｆ１０皮下腫瘍（図７Ａ）、ＣＴ２６皮下腫瘍（図７Ｂ）およびＧＬ２６１頭蓋内腫瘍（図７Ｃ）におけるＴ細胞浸潤を示す。低酸素（上パネル）およびＴ細胞浸潤（中央パネル）は、免疫組織化学的検査によって示す。下パネルは、複数の腫瘍切片の定量的解析の結果を示す。有意により少ないＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞が、腫瘍の低酸素領域に浸潤する。
【００５０】
【図８】図８は、Ｈ−ＮＯＸ処置（ＯＭＸ）またはビヒクル対照処置（Ｖｅｈ）後の、腫瘍の低酸素区域におけるＣＤ８  Ｔ細胞の定量化を示す。代表的な画像を示す。低酸素区域は、免疫組織化学的解析によりピモニダゾール（ｐｉｍｏｎｄａｚｏｌｅ）で標識した。ＯＭＸ処置後に、ＯＭＸ投与に先立ち低酸素であった腫瘍の領域へのＣＤ４（データ図示せず）およびＣＤ８  Ｔ細胞浸潤の増加が見られる。
【００５１】
【図９】図９Ａおよび図９Ｂは、Ｈ−ＮＯＸ処置（ＯＭＸ）またはビヒクル対照処置（Ｖｅｈ）後の、腫瘍の正常酸素および低酸素区域におけるＴ細胞の定量化を示す。ＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞の両方を評価した。評価した腫瘍区域は、腫瘍周辺および腫瘍中心の区域を含んだ。複数の切片の定量的画像解析の結果を図９Ａに示し、代表的な画像を図９Ｂに示す。炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）発現の免疫組織化学的解析を使用して、低酸素区域を標識した。ＯＭＸ処置後に、ＯＭＸ投与に先立ち低酸素であった腫瘍の領域へのＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞浸潤の増加が見られる。
【００５２】
【図１０】図１０は、ＧＬ２６１腫瘍モデルにおける低酸素（ピモニダゾール）およびＣＤ３血管に関する免疫組織化学的検査の結果を示す。
【００５３】
【図１１】図１１は、イヌ口腔メラノーマ腫瘍におけるＨ−ＮＯＸ腫瘍浸透、腫瘍低酸素およびＣＤ８  Ｔ細胞局在の免疫組織化学的解析を示す。ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）、ＤＮＡインターカレート（ｉｎｔｅｒｃｈｅｌａｔｉｎｇ）色素（ＤＡＰＩ）ならびに抗Ｈ−ＮＯＸ（ＯＭＸ）、抗炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）および抗ＣＤ８抗体で組織を染色して、Ｈ−ＮＯＸ（ＯＭＸ）処置に先立ち低酸素であった腫瘍領域におけるＣＤ８リンパ球局在を評価した。画像は、ＣＤ８陽性Ｔ細胞が、Ｈ−ＮＯＸ（ＯＭＸ）処置に先立ち低酸素であった（ＣＡＩＸ陽性）腫瘍の領域の至るところに局在したことを明らかにする。
【００５４】
【図１２−１】図１２Ａ〜図１２Ｋは、より大きな腫瘍サイズが、皮下４Ｔ１−Ｌｕｃ同系マウス腫瘍における増強された低酸素および低下されたリンパ球浸潤と相関することを示す。図１２Ａは、植え込み後１０日目および１４日目の腫瘍体積を示す。図１２Ｂは、生細胞集団内のリンパ球の割合を示す。図１２Ｃは、生存可能集団内のリンパ球細胞絶対数を示す。図１２Ｄは、腫瘍体積およびリンパ球パーセンテージの間の負の相関を示す。図１２Ｅは、腫瘍体積および低酸素パーセンテージの間の正の相関を示す。図１２Ｆは、低酸素パーセンテージおよびリンパ球パーセンテージの間の負の相関を示す。図１２Ｇは、腫瘍体積およびＣＤ３陽性Ｔ細胞パーセンテージの間の負の相関を示す。図１２Ｈは、腫瘍体積およびＣＤ４陽性Ｔ細胞パーセンテージの間の負の相関を示す。図１２Ｉは、腫瘍体積およびＣＤ８陽性Ｔ細胞パーセンテージの間の負の相関を示す。図１２Ｊは、腫瘍体積およびＣＤ３−ＣＤ４二重陽性Ｔ細胞パーセンテージの間の負の相関を示す。図１２Ｋは、腫瘍体積およびＣＤ３−ＣＤ８二重陽性Ｔ細胞パーセンテージの間の負の相関を示す。
【図１２−２】図１２Ａ〜図１２Ｋは、より大きな腫瘍サイズが、皮下４Ｔ１−Ｌｕｃ同系マウス腫瘍における増強された低酸素および低下されたリンパ球浸潤と相関することを示す。図１２Ａは、植え込み後１０日目および１４日目の腫瘍体積を示す。図１２Ｂは、生細胞集団内のリンパ球の割合を示す。図１２Ｃは、生存可能集団内のリンパ球細胞絶対数を示す。図１２Ｄは、腫瘍体積およびリンパ球パーセンテージの間の負の相関を示す。図１２Ｅは、腫瘍体積および低酸素パーセンテージの間の正の相関を示す。図１２Ｆは、低酸素パーセンテージおよびリンパ球パーセンテージの間の負の相関を示す。図１２Ｇは、腫瘍体積およびＣＤ３陽性Ｔ細胞パーセンテージの間の負の相関を示す。図１２Ｈは、腫瘍体積およびＣＤ４陽性Ｔ細胞パーセンテージの間の負の相関を示す。図１２Ｉは、腫瘍体積およびＣＤ８陽性Ｔ細胞パーセンテージの間の負の相関を示す。図１２Ｊは、腫瘍体積およびＣＤ３−ＣＤ４二重陽性Ｔ細胞パーセンテージの間の負の相関を示す。図１２Ｋは、腫瘍体積およびＣＤ３−ＣＤ８二重陽性Ｔ細胞パーセンテージの間の負の相関を示す。
【００５５】
【図１３】図１３Ａ〜図１３Ｆは、低酸素腫瘍領域が、免疫抑制性であり、皮下４Ｔ１−Ｌｕｃ同系マウス腫瘍における低下したＴ細胞浸潤を示すことを示す。（図１３Ａ）ピモニダゾール陽性低酸素区域および（図１３Ｂ）ＣＤ８陽性Ｔ細胞に関する腫瘍領域＃１の免疫蛍光染色と、（図１３Ｃ）核を強調するためのＤＡＰＩによる対比染色。（図１３Ｄ）ピモニダゾール陽性低酸素区域および（図１３Ｅ）ＣＤ４陽性Ｔ細胞に関する腫瘍領域＃２の免疫蛍光染色と、（図１３Ｆ）核を強調するためのＤＡＰＩによる対比染色。
【発明を実施するための形態】
【００５６】
本発明は、個体におけるがんを処置するための方法であって、個体に、有効量のＨ−ＮＯＸタンパク質等のＯ２担体ポリペプチドを投与するステップを含む方法を提供する。ある特定の態様では、本発明は、個体における低酸素媒介性腫瘍免疫をモジュレートするための方法であって、個体に、有効量のＨ−ＮＯＸタンパク質等のＯ２担体ポリペプチドを投与するステップを含む方法を提供する。Ｏ２担体ポリペプチドは、腫瘍に送達され、そこで、腫瘍に対する免疫応答を増強する。腫瘍に対する免疫応答の増強は、腫瘍免疫の低酸素誘導性因子１α（ＨＩＦ−１α）媒介性経路および／または腫瘍免疫の非ＨＩＦ−１α媒介性経路を標的化することにより媒介され得る。一部の態様では、本発明は、個体における腫瘍へのリンパ球浸潤を増加させるための方法であって、個体に有効量のＯ２担体ポリペプチドを投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、腫瘍へのリンパ球浸潤の増加は、ＣＤ４細胞、ＣＤ８細胞またはＮＫ細胞のうち１種または複数の浸潤の増加を含む。一部の実施形態では、腫瘍へのリンパ球浸潤の増加は、腫瘍におけるＴｒｅｇ細胞、腫瘍関連マクロファージまたは骨髄系由来サプレッサー細胞のうち１種または複数の阻害を伴う。一部の実施形態では、腫瘍へのリンパ球浸潤の増加は、腫瘍細胞におけるＭＨＣ１発現の増加を伴う。一部の実施形態では、本発明は、個体の腫瘍における低酸素誘導性因子１α（ＨＩＦ−１α）の発現を減少させるための方法であって、個体に有効量のＯ２担体ポリペプチド（例えば、Ｈ−ＮＯＸタンパク質）を投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、本発明は、個体の腫瘍におけるプログラム死リガンド−１（ＰＤ−Ｌ１）の発現を減少させるための方法であって、個体に有効量のＯ２担体ポリペプチド（例えば、Ｈ−ＮＯＸタンパク質）を投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、本発明は、個体の腫瘍におけるＡ２Ａアデノシン受容体（Ａ２ＡＲ）の発現を減少させるための方法であって、個体に有効量のＯ２担体ポリペプチド（例えば、Ｈ−ＮＯＸタンパク質）を投与するステップを含む方法を提供する。
【００５７】
定義
他に特段の定めがなければ、本明細書に使用されているあらゆる技術および科学用語の意味は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されている意味である。当業者であれば、本明細書に記載されている方法および材料と同様または均等ないずれかの方法および材料を使用して、本発明を実施または試験してよいことも十分に理解されよう。
【００５８】
本明細書における使用のため、それ以外のことが明らかに指示されていなければ、「ａ」、「ａｎ」などの用語の使用は、１個または複数を指す。
【００５９】
本願において、「または」の使用は、明確に記述されていない限り、あるいは当業者によって理解されない限り、「および／または」を意味する。複数の従属クレームの文脈において、「または」の使用は、２項以上の先行する独立または従属クレームを遡って指す。
【００６０】
「約」による値またはパラメータへの言及は、本明細書において、値またはパラメータそれ自体に関する実施形態を含む（記載する）。例えば、「約Ｘ」を指す記載は、「Ｘ」の記載を含む。
【００６１】
本明細書に記載されている本発明の態様および実施形態が、態様および実施形態「を含む」、「からなる」および「から本質的になる」ことを含むことが理解される。
【００６２】
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基の重合体を指すよう互換的に使用されており、最小の長さに限定されない。このようなアミノ酸残基の重合体は、天然または非天然アミノ酸残基を含有することができ、その例として、ペプチド、オリゴペプチド、アミノ酸残基の二量体、三量体および重合体が挙げられるがこれらに限定されない。この定義によって、全長タンパク質およびその断片の両方が包含される。この用語は、ポリペプチドの発現後改変、例えば、グリコシル化、シアリル化（ｓｉａｌｙｌａｔｉｏｎ）、アセチル化、リン酸化なども含む。さらに、本発明のために、「ポリペプチド」は、タンパク質が所望の活性を維持するのであれば、ネイティブ配列に対する欠失、付加および置換（一般に、保存的な性質）等の改変を含むタンパク質を指す。これらの改変は、部位特異的変異誘発によるなど、計画的であってもよいし、あるいはタンパク質を産生する宿主の変異またはＰＣＲ増幅によるエラーによるなど、偶発的であってもよい。本明細書において使用する場合、タンパク質は、共有結合または非共有結合により会合した２個以上のサブユニットを含むことができる；例えば、タンパク質は、２個以上の会合した単量体を含むことができる。
【００６３】
用語「核酸分子」、「核酸」および「ポリヌクレオチド」は、互換的に使用することができ、ヌクレオチドの重合体を指す。このようなヌクレオチドの重合体は、天然および／または非天然ヌクレオチドを含有することができ、その例として、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびＰＮＡが挙げられるがこれらに限定されない。「核酸配列」は、核酸分子またはポリヌクレオチドを含むヌクレオチドの直鎖状配列を指す。
【００６４】
本明細書において、用語「低酸素誘導性因子」または「ＨＩＦ」は、細胞環境における酸素の減少すなわち低酸素に応答する転写因子のファミリーを指す。ヒトＨＩＦファミリーのメンバーは、ＨＩＦ−１α、ＨＩＦ−１β、ＨＩＦ−２α、ＨＩＦ−２β、ＨＩＦ３α、ＨＩＦ３βを含む。ＨＩＦ−１は、エネルギー代謝、血管新生、アポトーシスに関与する遺伝子、およびそのタンパク質産物が酸素送達を増加させるまたは低酸素への代謝適応を容易にする他の遺伝子を含む多くの遺伝子の転写を活性化することにより、低酸素に対する恒常性応答の主要調節因子として機能する。ＨＩＦ−１は、胚の血管形成、腫瘍血管新生および虚血性疾患の病態生理学における役割を果たす。ヒト低酸素誘導性因子１、アルファサブユニットまたはヒトＨＩＦ−１αは、ＡＲＮＴＬ、ＡＲＮＴ、ＣＲＥＢＢ、ＥＰ３００、ＨＩＦ−１ＡＮ、Ｍｄｍ２、ＮＲ４Ａ、ｐ５３、ＰＳＭＡ７、ＳＴＡＴ３、ＵＢＣ、ＶＨおよびｐＶＨＬが挙げられるがこれらに限定されない多数のポリペプチドと相互作用する。ヒトＨＩＦ−１αは、ＨＩＦ−１Ａ遺伝子によってコードされる。ヒトＨＩＦ−１αのアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１２３００１３によって提供され、ヒトＨＩＦ−１α  ｍＲＮＡのヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１２４３０８４によって提供される。マウスＨＩＦ−１αのアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０１０４３１によって提供され、マウスＨＩＦ−１α  ｍＲＮＡのヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０３４５６１によって提供される。
【００６５】
本明細書において、「プログラム死−リガンド１」または「ＰＤ−Ｌ１」は、免疫系の抑制における役割を果たす免疫チェックポイント経路の部分である膜貫通タンパク質を指す。ＰＤ１受容体またはＢ７．１受容体とＰＤＬ１との相互作用は、ＩＬ−２のＴ細胞受容体媒介性活性化およびＴ細胞増殖を阻害する。ヒトＰＤ−Ｌ１は、ＣＤ２７４遺伝子によってコードされる。ヒトＰＤ−Ｌ１のアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１２５４６３５によって提供され、ヒトＰＤ−Ｌ１  ｍＲＮＡのヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１２６７７０６によって提供される。マウスＰＤ−Ｌ１のアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０２１８９３によって提供され、マウスＰＤ−Ｌ１  ｍＲＮＡのヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０６８６９３によって提供される。
【００６６】
本明細書において、「アデノシンＡ２Ａ受容体」または「Ａ２ＡＲ」は、Ｇタンパク質共役型受容体スーパーファミリーの受容体を指す。Ａ２ＡＲは、酸素消費における役割を果たすアデノシンの受容体であり、ｃＡＭＰのレベル増加によって、過剰反応性（ｏｖｅｒｒｅａｃｔｉｖｅ）免疫細胞の抑制における役割を果たすと考えられる。ヒトＡ２ＡＲは、ＡＤＯＲＡ２Ａ遺伝子によってコードされる。ヒトＡ２ＡＲのアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０００６６６によって提供され、ヒトＡ２ＡＲ  ｍＲＮＡのヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００６７５によって提供される。マウスＡ２ＡＲのアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０３３７６０によって提供され、マウスＡ２ＡＲ  ｍＲＮＡのヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０９６３０によって提供される。
【００６７】
本明細書において使用する場合、「Ｈ−ＮＯＸタンパク質」は、Ｈ−ＮＯＸドメイン（ヘム−一酸化窒素および酸素（Ｈｅｍｅ−Ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ  ａｎｄ  ＯＸｙｇｅｎ）結合ドメインにちなみ命名）を有するタンパク質を意味する。Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、Ｈ−ＮＯＸドメインに加えて１個または複数の他のドメインを含有しても含有しなくてもよい。一部の例において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、グアニリルシクラーゼドメインを含まない。Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、重合ドメインを含んでも含まなくてもよい。
【００６８】
本明細書において使用する場合、「重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質」は、２個以上のＨ−ＮＯＸドメインを含むＨ−ＮＯＸタンパク質である。Ｈ−ＮＯＸドメイン同士は、共有結合または非共有結合により会合され得る。
【００６９】
本明細書において使用する場合、「Ｈ−ＮＯＸドメイン」は、ヘムによって一酸化窒素および／または酸素に結合するタンパク質の全体または一部である。Ｈ−ＮＯＸドメインは、ヘムを含むことができる、あるいはヘムに結合することができるアポプロタンパク質（ａｐｏｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎ）として見出すことができる。一部の例において、Ｈ−ＮＯＸドメインは、６個のアルファ−ヘリックスと、続く２個のベータ鎖と、続く１個のアルファ−ヘリックスと、続く２個のベータ鎖を含む。一部の例において、Ｈ−ＮＯＸドメインは、配列番号２に示されるＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸのＨ−ＮＯＸドメインに対応する。例えば、Ｈ−ＮＯＸドメインは、配列番号２に示されるＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸのＨ−ＮＯＸドメインに対し、少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％同一であり得る。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸドメインは、配列番号２に示されるＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸのＨ−ＮＯＸドメインに対し、１０％〜２０％、２０％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜８０％、８０％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％または１００％同一であり得る。
【００７０】
本明細書において使用する場合、「重合ドメイン」は、単量体部分の会合を促進して、重合体構造を形成させるドメイン（例えば、ポリペプチドドメイン）である。例えば、重合ドメインは、単量体型Ｈ−ＮＯＸドメインの会合を促進して、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を作製することができる。例示的な重合ドメインは、三量体型ポリペプチドの形成を促進する、Ｔ４バクテリオファージのフォルドンドメインである。重合ドメインの他の例として、Ａｒｃ、ＰＯＺ、コイルドコイルドメイン（ＧＣＮ４、ロイシンジッパー、Ｖｅｌｃｒｏ（登録商標）を含む）、ウテログロビン、コラーゲン、３本鎖コイルドコイル（ｃｏｌｉｓ）（マトリリン−１）、トロンボスポリン（ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｒｉｎ）、ＴＲＰＶ１−Ｃ、Ｐ５３、Ｍｎｔ、アビジン（ａｖａｄｉｎ）、ストレプトアビジン、Ｂｃｒ−Ａｂｌ、ＣＯＭＰ、ベロ毒素サブユニットＢ、ＣａｍＫＩＩ、ＲＣＫおよびＮエチルマレイミド感受性融合タンパク質由来のドメイン、ＳＴＭ３５４８、ＫａｉＣ、ＴｙｒＲ、Ｈｃｐ１、ＣｃｍＫ４、ＧＰ４１、炭疽菌防御抗原、アエロリジン、ａ−ヘモリジン、Ｃ４ｂ結合タンパク質、Ｍｉ−ＣＫ、アリールスルファターゼ（ａｒｙｌｓｕｒｆａｔａｓｅ）Ａおよびウイルスカプシドタンパク質が挙げられるがこれらに限定されない。
【００７１】
本明細書において使用する場合、「アミノ酸リンカー配列」または「アミノ酸スペーサー配列」は、タンパク質の２個のドメインの連結に使用することができる短いポリペプチド配列である。一部の実施形態において、アミノ酸リンカー配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１個以上のアミノ酸の長さである。例示的なアミノ酸リンカー配列として、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ配列およびＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ配列が挙げられるがこれらに限定されない。
【００７２】
本明細書において使用する場合、「Ｈｉｓ６タグ」は、ポリペプチドに結合した６個のＨｉｓ残基を含むペプチドを指す。Ｈｉｓ６タグを使用して、タンパク質精製を容易にすることができる；例えば、Ｈｉｓ６タグに特異的なクロマトグラフィーを使用する。精製後に、Ｈｉｓ６タグは、エキソペプチダーゼを使用して切断することができる。
【００７３】
用語「実質的に類似」または「実質的に同じ」は、本明細書において使用する場合、当業者が、２種以上の数値の間の差に、該値によって評価される（ｍｅａｓｕｒｅｄ）生物学的特徴の文脈の範囲内で、生物学的および／または統計学的有意性が殆どないまたは全くないとみなすような、該２種以上の数値の間の十分に高度な類似性を表す。一部の実施形態において、２種以上の実質的に類似の値は、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％または約５０％のうちいずれか１種以下だけ異なる。
【００７４】
語句「実質的に低下した」または「実質的に異なる」は、本明細書において使用する場合、当業者が、２種の数値の間の差に、該値によって評価される生物学的特徴の文脈の範囲内で、統計学的有意性があるとみなすような、該２種の数値の間の十分に高度な差を表す。一部の実施形態において、２種の実質的に異なる数値は、約１０％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％または約９０％のうちいずれか１種を超えて異なる。一部の実施形態において、２種の実質的に異なる数値は、約１０％〜約２０％、約２０％〜約３０％、約３０％〜約４０％、約４０％〜約５０％、約５０％〜約６０％、約６０％〜約７０％、約７０％〜約８０％、約８０％〜約９０％、約９０％〜約９５％、約９５％〜約９９％または約１００％のうちいずれか１種だけ異なる。
【００７５】
「ネイティブ配列」のポリペプチドは、自然に見出されるポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。よって、ネイティブ配列のポリペプチドは、いずれかの生物由来の天然起源のポリペプチドのアミノ酸配列を有することができる。このようなネイティブ配列のポリペプチドは、自然から単離することができる、あるいは組換えまたは合成手段により生成することができる。用語「ネイティブ配列」のポリペプチドは、天然起源のトランケートまたは分泌型のポリペプチド（例えば、細胞外ドメイン配列）、天然起源のバリアント型（例えば、選択的スプライス型）および天然起源のアレルバリアントのポリペプチドを特に包含する。
【００７６】
ポリペプチド「バリアント」は、配列を整列し、必要であればギャップを導入して、配列同一性の一部としていかなる保存的置換も考慮せず、最大パーセント配列同一性を達成した後に、ネイティブ配列のポリペプチドと少なくとも約８０％アミノ酸配列同一性を有する生物活性ポリペプチドを意味する。このようなバリアントは、例えば、ポリペプチドのＮまたはＣ末端において１個または複数のアミノ酸残基が付加または欠失されたポリペプチドを含む。一部の実施形態において、バリアントは、ネイティブ配列のポリペプチドと、少なくとも約８０％、約９０％または約９５％アミノ酸配列同一性のうちいずれか１種を有する。一部の実施形態において、バリアントは、ネイティブ配列のポリペプチドと、約８０％〜約９０％、約９０％〜約９５％または約９５％〜約９９％アミノ酸配列同一性のうちいずれか１種を有する。
【００７７】
本明細書において使用する場合、「変異体タンパク質」は、自然に存在するタンパク質と比較して、１個または複数の変異を有するタンパク質を意味する。一実施形態において、変異体タンパク質は、自然に存在するあらゆるタンパク質の配列とは異なる配列を有する。様々な実施形態において、変異体タンパク質のアミノ酸配列は、自然に存在するタンパク質の対応する領域の配列に対し、少なくとも約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約９５、約９７、約９８、約９９または約９９．５％同一のうちいずれかである。一部の実施形態において、変異体タンパク質のアミノ酸配列は、自然に存在するタンパク質の対応する領域の配列に対し、少なくとも約１０％〜約２０％、約２０％〜約３０％、約３０％〜約４０％、約４０％〜約５０％、約５０％〜約６０％、約６０％〜約７０％、約７０％〜約８０％、約８０％〜約９０％、約９０％〜約９５％、約９５％〜約９９％または約１００％同一のうちいずれかである。一部の実施形態において、変異体タンパク質は、全長タンパク質から少なくとも約２５、約５０、約７５、約１００、約１５０、約２００、約３００または約４００個の連続アミノ酸のうちいずれかを含有するタンパク質断片である。一部の実施形態において、変異体タンパク質は、全長タンパク質から約２５〜約５０、約５０〜約７５、約７５〜約１００、約１００〜約１５０、約１５０〜約２００、約２００〜約３００または約３００〜約４００個の連続アミノ酸のうちいずれかを含有するタンパク質断片である。配列同一性は、例えば、配列解析ソフトウェアを使用して、その中で指定されたデフォルトパラメータにより測定することができる（例えば、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒ、１７１０  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｖｅｎｕｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ  ５３７０５）。このソフトウェアプログラムは、様々なアミノ酸置き換え、欠失および他の改変に相同性の程度を割り当てることにより、類似の配列をマッチさせる。
【００７８】
本明細書において使用する場合、「変異」は、自然に存在する参照核酸配列またはアミノ酸配列の変更を意味する。例示的な核酸変異は、挿入、欠失、フレームシフト変異、サイレント変異、ナンセンス変異またはミスセンス変異を含む。一部の実施形態において、核酸変異は、サイレント変異ではない。例示的なタンパク質変異は、１個もしくは複数のアミノ酸の挿入（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸の挿入）、１個もしくは複数のアミノ酸の欠失（例えば、少なくとも約５、約１０、約１５、約２５、約５０、約７５、約１００、約１５０、約２００、約３００個以上のアミノ酸のうちいずれかの欠失、または約５〜約１０、約１０〜約１５、約１５〜約２５、約２５〜約５０、約５０〜約７５、約７５〜約１００、約１００〜約１５０、約１５０〜約２００、約２００〜約３００もしくは約３００〜約４００個のアミノ酸のうちいずれかの欠失等、Ｎ末端、Ｃ末端および／または内側残基の欠失）、１個もしくは複数のアミノ酸の置き換え（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸の置き換え）、または上記の２種以上の組合せを含む。特定のアミノ酸変異の言及に使用される命名法は、先ず野生型アミノ酸、続いて残基番号、最後に置換アミノ酸を同定する。例えば、Ｙ１４０Ｌは、残基番号１４０のチロシンがロイシンに置き換えられたことを意味する。同様に、バリアントＨ−ＮＯＸタンパク質は、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のアミノ酸変種（ｖａｒｉａｔｉｏｎ）により参照することができる。例えば、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｙ１４０Ｌ  Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、位置番号１４０のチロシン残基がロイシン残基に置き換えられたＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸタンパク質を指し、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｗ９Ｆ／Ｙ１４０Ｌ  Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、９位のトリプトファン残基がフェニルアラニン残基に置き換えられ、位置番号１４０のチロシン残基がロイシン残基に置き換えられたＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸタンパク質を指す。
【００７９】
「進化的に保存された変異」は、あるタンパク質におけるアミノ酸の、同じタンパク質ファミリーの別のタンパク質の対応する位置におけるアミノ酸による置き換えである。
【００８０】
本明細書において使用する場合、「に由来する」は、１個または複数の変異が導入されるタンパク質の供給源を指す。例えば、「哺乳動物タンパク質に由来する」タンパク質は、野生型（即ち、自然に存在する配列）哺乳動物タンパク質の配列への１個または複数の変異の導入から結果として生ずる目的のタンパク質を指す。
【００８１】
本明細書において使用する場合、ペプチド、ポリペプチドまたは抗体配列に関する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」および「相同性」は、配列を整列し、必要であればギャップを導入して、配列同一性の一部としていかなる保存的置換も考慮せず、最大パーセント配列同一性を達成した後に、特定のペプチドまたはポリペプチド配列におけるアミノ酸残基と同一である、候補配列におけるアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアライメントは、当業者の技能範囲内の様々な仕方で達成することができ、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮまたはＭＥＧＡＬＩＧＮＴＭ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア等、公開されているコンピュータソフトウェアを使用する。当業者であれば、比較されている配列の全長にわたる最大アライメントの達成に必要とされるいずれかのアルゴリズムを含む、アライメントの測定に適切なパラメータを決定することができる。
【００８２】
本明細書において使用する場合、「ｋｏｆｆ」は、タンパク質からのＯ２またはＮＯの放出速度等、解離速度を指す。数値的により低いｋｏｆｆは、より遅い解離速度を示す。
【００８３】
本明細書において使用する場合、「ｋｏｎ」は、タンパク質へのＯ２またはＮＯの結合速度等、会合速度を指す。数値的により低いｋｏｎは、より遅い会合速度を示す。
【００８４】
本明細書において使用する場合、「解離定数」は、「動力学的解離定数」または「計算された解離定数」を指す。「動力学的解離定数」または「ＫＤ」は、動力学的解離速度（ｋｏｆｆ）の動力学的結合速度（ｏｎ−ｒａｔｅ）（ｋｏｎ）に対する比であり、例えば、当業者に公知のおよび／または本明細書に記載されている方法を含む標準方法（例えば、標準分光学的方法、ストップトフロー法または閃光光分解法）を使用して絶対値として決定されるＫＤ値である。「計算された解離定数」または「計算されたＫＤ」は、測定されたｋｏｆｆに基づく動力学的解離定数の近似値を指す。ｋｏｎの値は、本明細書に記載されている動力学的ＫＤおよびｋｏｆｆの間の相関によって導かれる。
【００８５】
本明細書において使用する場合、「酸素親和性」は、タンパク質のヘム部分への酸素結合の強度を指す定性的用語である。この親和性は、酸素に対するｋｏｆｆおよびｋｏｎの両方によって影響される。数値的により低い酸素ＫＤ値は、より高い親和性を意味する。
【００８６】
本明細書において使用する場合、「ＮＯ親和性」は、タンパク質へのＮＯ結合の強度を指す定性的用語である（タンパク質と会合したヘム基へのまたはヘム基に結合した酸素への結合等）。この親和性は、ＮＯに対するｋｏｆｆおよびｋｏｎの両方によって影響される。数値的により低いＮＯ  ＫＤ値は、より高い親和性を意味する。
【００８７】
本明細書において使用する場合、「ＮＯ安定性」は、酸素の存在下におけるＮＯによる酸化に対するタンパク質の安定性または抵抗性を指す。例えば、酸素の存在下においてＮＯに結合したときに酸化されないタンパク質の能力は、タンパク質のＮＯ安定性を示す。一部の実施形態において、約１、約２、約４、約６、約８、約１０、約１５または約２０時間のうちいずれかの間、２０℃でインキュベーションした後に、Ｈ−ＮＯＸタンパク質の約５０％未満、約４０％未満、約３０％未満、約１０％未満または約５％未満のうちいずれかが酸化される。
【００８８】
本明細書において使用する場合、「ＮＯ反応性」は、酸素の存在下においてＮＯによってヘム結合タンパク質のヘムにおける鉄が酸化される速度を指す。ｓ−１単位で表すＮＯ反応性のより低い数値は、より低いＮＯ反応性を示す。
【００８９】
本明細書において使用する場合、「自動酸化速度」は、ヘム結合タンパク質のヘムにおける鉄が自動酸化される速度を指す。ｓ−１の単位で表すより低い数値の自動酸化速度は、より低い自動酸化速度を示す。
【００９０】
用語「ベクター」は、宿主細胞において増やすことができる、クローニングされたポリヌクレオチド（単数または複数）を含有するよう操作する（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）ことができるポリヌクレオチドを記載するために使用される。ベクターは、次のエレメントのうち１種または複数を含むことができる：複製起点、目的のポリペプチドの発現を調節する１種もしくは複数の調節配列（例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサー等）および／または１種もしくは複数の選択可能マーカー遺伝子（例えば、抗生物質抵抗性遺伝子および比色分析アッセイにおいて使用することができる遺伝子、例えばβ−ガラクトシダーゼ等）。用語「発現ベクター」は、宿主細胞における目的のポリペプチドの発現に使用されるベクターを指す。
【００９１】
「宿主細胞」は、ベクターまたは単離されたポリヌクレオチドのレシピエントであり得るまたはベクターまたは単離されたポリヌクレオチドのレシピエントであった細胞を指す。宿主細胞は、原核細胞または真核細胞であり得る。例示的な真核細胞は、霊長類または非霊長類の動物細胞等の哺乳動物細胞；酵母等の真菌細胞；植物細胞；および昆虫細胞を含む。例示的な原核細胞は、細菌細胞；例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を含む。
【００９２】
用語「単離された」は、本明細書において使用する場合、典型的に自然に見出されるまたは産生される構成成分の少なくとも一部から分離された分子を指す。例えば、ポリペプチドは、該ポリペプチドが産生された細胞の構成成分の少なくとも一部から分離される場合、「単離された」と称される。発現後に細胞によってポリペプチドが分泌され、産生した細胞から該ポリペプチドを含有する上清を物理的に分離する場合、それは、ポリペプチドを「単離すること」とみなされる。同様に、ポリヌクレオチドは、該ポリヌクレオチドが典型的に自然に見出されるより大型のポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡポリヌクレオチドの場合、ゲノムＤＮＡまたはミトコンドリアＤＮＡ等）の一部ではない場合、あるいは該ポリヌクレオチドが産生された細胞の構成成分の少なくとも一部から分離される場合、例えば、ＲＮＡポリヌクレオチドの場合、「単離された」と称される。よって、宿主細胞内部のベクターに含有されるＤＮＡポリヌクレオチドは、「単離された」と称することができる。
【００９３】
用語「個体」または「被験体」は、動物；例えば、哺乳動物を指すよう、本明細書において互換的に使用される。一部の実施形態において、ヒト、齧歯類、サル、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、哺乳動物の実験動物、哺乳動物の家畜、哺乳動物の競技（ｓｐｏｒｔ）動物および哺乳動物のペットが挙げられるがこれらに限定されない、哺乳動物を処置する方法が提供される。一部の例において、「個体」または「被験体」は、疾患または障害の処置を必要とする個体または被験体を指す。
【００９４】
「疾患」または「障害」は、本明細書において使用する場合、処置が必要とされる状態を指す。
【００９５】
用語「がん」は、制御できない細胞増殖、無制限の細胞成長およびアポトーシスによる細胞死の減少と関連する悪性増殖性障害を指す。
【００９６】
用語「腫瘍」は、異常に高レベルの増殖および成長を示す細胞の群を指すよう本明細書において使用される。腫瘍は、良性、前悪性または悪性であり得る；悪性腫瘍細胞はがん性である。腫瘍細胞は、固形腫瘍細胞または白血病性腫瘍細胞であり得る。用語「腫瘍成長」は、腫瘍サイズの対応する増加をもたらす、腫瘍を含む細胞（単数または複数）による増殖または成長を指すよう本明細書において使用される。
【００９７】
本明細書において使用する場合、「処置」は、有益なまたは所望の臨床結果を得るためのアプローチである。「処置」は、本明細書において使用する場合、ヒトを含む哺乳動物における疾患のための療法のいずれかの投与または適用を網羅する。本発明の目的のため、有益なまたは所望の臨床結果として、検出可能であれ検出不能であれ、症状の軽減、疾患の程度の縮小、安定化された（例えば、悪化していない）疾患状態、疾患の伝播（例えば、転移）の防止、疾患進行の遅延または緩徐化、疾患状態の好転（ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｏｎ）または緩和、および寛解（部分的であれ完全であれ）が挙げられるがこれらに限定されない。「処置」は、処置を受けていない場合に予想される生存と比較した、生存の延長を意味することもできる。「処置」には、増殖性疾患の病理学的意義の低下も包含される。本発明の方法は、処置の上述の態様のうちいずれか１種または複数を企図する。
【００９８】
がんの文脈において、用語「処置する」は、次のうちいずれかまたは全てを含む：腫瘍細胞またはがん細胞の成長の阻害、腫瘍細胞またはがん細胞の複製の阻害、全体的な腫瘍負荷を和らげること、および疾患に関連する１種または複数の症状の好転。
【００９９】
用語「阻害」または「阻害する」は、いずれかの表現型特徴の減少もしくは休止または該特徴の発生率、程度もしくは見込みの減少もしくは休止を指す。「低下する」または「阻害する」は、参照と比較して、活性、機能および／または量を減少、低下または抑止することである。ある特定の実施形態において、「低下する」または「阻害する」とは、２０％以上の全体的な減少を引き起こす能力を意味する。別の実施形態において、「低下する」または「阻害する」とは、５０％以上の全体的な減少を引き起こす能力を意味する。さらに別の実施形態において、「低下する」または「阻害する」とは、７５％、８５％、９０％、９５％または９９％の全体的な減少を引き起こす能力を意味する。
【０１００】
本明細書において使用する場合、「疾患の発症の遅延」は、疾患（がん等）の発症を延期する、妨害する、遅くする、減速する、安定化する、抑制するおよび／または先送りすることを意味する。この遅延は、疾患の病歴および／または処置されている個体に応じて時間の長さを変えることができるというものである。当業者に明らかな通り、十分なまたは有意な遅延は、事実上、個体が疾患を発症しないという点において、防止を包含することができる。例えば、転移の発症等、後期がんを遅延させることができる。
【０１０１】
「参照」は、本明細書において使用する場合、比較目的で使用されるいずれかの試料、標準またはレベルを指す。参照は、健常および／または非罹患試料から得ることができる。一部の例において、参照は、未処置試料から得ることができる。一部の例において、参照は、被験体個体の非罹患または無処置試料から得られる。一部の例において、参照は、被験体または患者ではない１名または複数の健常個体から得られる。
【０１０２】
「防止」は、本明細書において使用する場合、疾患の素因を有する可能性があるが該疾患であるとは未だ診断されていない被験体における該疾患の発生または再発に関する予防の提供を含む。
【０１０３】
薬剤の「有効量」は、必要とされる投薬量および期間において、所望の治療的または予防的結果の達成に有効な量を指す。
【０１０４】
本発明の物質／分子、アゴニストまたはアンタゴニストの「治療有効量」は、個体の疾患状態、年齢、性別および体重、ならびに個体において所望の応答を誘発する物質／分子、アゴニストまたはアンタゴニストの能力等の因子に応じて変動し得る。治療有効量は、また、物質／分子、アゴニストまたはアンタゴニストの治療に有益な効果が、その物質／分子、アゴニストまたはアンタゴニストのいかなる毒性または有害効果をも上回る量である。治療有効量は、１回または複数の投与において送達することができる。
【０１０５】
「予防有効量」は、必要とされる投薬量および期間において、所望の予防的結果の達成に有効な量を指す。典型的には、但し、必ずしもそうではないが、予防的用量は、疾患に先立ちまたはその初期に被験体において使用されるため、予防有効量は、治療有効量に満たない。
【０１０６】
用語「医薬製剤」および「医薬組成物」は、活性成分（複数可）の生物活性を有効にするような形態の、かつ製剤が投与される被験体に許容できない毒性を有する追加の構成成分を含有しない調製物を指す。このような製剤は、滅菌されエンドトキシンを本質的に含まないものとし得る。
【０１０７】
「薬学的に許容されるキャリア」は、無毒性固体、半固体もしくは液体充填剤、希釈剤、カプセル封入材料、製剤補助剤、または被験体への投与のための「医薬組成物」を共に含む治療剤と使用するための当技術分野における従来のキャリアを指す。薬学的に許容されるキャリアは、用いられている投薬量および濃度において、レシピエントに対し無毒性であり、製剤の他の成分と適合性である。薬学的に許容されるキャリアは、用いられている製剤に適切である。
【０１０８】
「滅菌」製剤は、無菌であるまたは生きた微生物およびその胞子を本質的に含まない。
【０１０９】
１種または複数のさらに別の治療剤「と組み合わせた」投与は、同時（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ）（同時（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔ））およびいずれかの順序の継続的または逐次投与を含む。
【０１１０】
用語「同時に」は、投与の少なくとも一部が時間的に重複する、または一方の治療剤の投与が他方の治療剤の投与と比べて短い期間内に収まる、２種以上の治療剤の投与を指すよう本明細書において使用される。例えば、２種以上の治療剤は、約３０分間以下、約１５分間以下、約１０分間以下、約５分間以下または約１分間以下のうちいずれか等、約６０分間以下の時間的な隔たりで投与される。
【０１１１】
用語「逐次的に」は、１種または複数の薬剤の投与が１種または複数の他の薬剤の投与の中断後に続く、２種以上の治療剤の投与を指すよう本明細書において使用される。例えば、２種以上の治療剤の投与は、約２０、約３０、約４０、約５０もしくは約６０分間、約１日間、約２日間、約３日間、約１週間、約２週間または約１カ月間のうちいずれか等、約１５分間を超える時間的な隔たりで投与される。
【０１１２】
本明細書において使用する場合、「と併せて」は、ある処置様式の、別の処置様式に加えた投与を指す。そのようなものとして、「と併せて」は、個体へのある処置様式の、他の処置様式の投与の前、最中または後における投与を指す。
【０１１３】
用語「添付文書」は、このような治療製品の使用に関する適応症、利用法、投薬量、投与、併用療法、禁忌および／または警告に関する情報を含有する、治療製品の商業的パッケージに習慣的に含まれる指示を指すよう使用される。
【０１１４】
「製造品」は、少なくとも１種の試薬、例えば、疾患もしくは障害（例えば、がん）の処置のための医薬、または本明細書に記載されているバイオマーカーを特異的に検出するためのプローブを含むいずれかの製造物（例えば、パッケージまたは容器）またはキットである。ある特定の実施形態において、製造物またはキットは、本明細書に記載されている方法を実施するための単位として販売促進、配給または販売される。
【０１１５】
Ｈ−ＮＯＸタンパク質
Ｈ−ＮＯＸタンパク質ファミリーの概要
他に特段の断りがなければ、本明細書に記載されている組成物、キットおよび方法において、いかなる野生型または変異体Ｈ−ＮＯＸタンパク質を使用してもよい。本明細書において使用する場合、「Ｈ−ＮＯＸタンパク質」は、Ｈ−ＮＯＸドメイン（ヘム−一酸化窒素および酸素（Ｈｅｍｅ−Ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ  ａｎｄ  ＯＸｙｇｅｎ）結合ドメインにちなみ命名）を有するタンパク質を意味する。Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、Ｈ−ＮＯＸドメインに加えて１個または複数の他のドメインを含有しても含有しなくてもよい。Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、ヘムタンパク質の高度に保存され十分に特徴付けされたファミリーのメンバーである（Ｉｙｅｒ，  Ｌ．  Ｍ．ら（２００３年２月３日）ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４巻（１号）：５頁；Ｋａｒｏｗ，  Ｄ．  Ｓ．ら（２００４年８月１０日）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４３巻（３１号）：１０２０３〜１０２１１頁；Ｂｏｏｎ，  Ｅ．  Ｍ．ら（２００５年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．１巻：５３〜５９頁；Ｂｏｏｎ，  Ｅ．  Ｍ．ら（２００５年１０月）Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．９巻（５号）：４４１〜４４６頁；Ｂｏｏｎ，  Ｅ．  Ｍ．ら（２００５年）Ｊ．  Ｉｎｏｒｇ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．９９巻（４号）：８９２〜９０２頁）。Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、Ｐｆａｍ  ０７７００タンパク質またはＨＮＯＢタンパク質とも称される（Ｐｆａｍ  −  タンパク質ドメインファミリーアライメントおよび隠れマルコフモデルのデータベース、著作権（Ｃ）１９９６〜２００６年、Ｔｈｅ  Ｐｆａｍ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ；ＧＮＵ  ＬＧＰＬ  Ｆｒｅｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．、５９  Ｔｅｍｐｌｅ  Ｐｌａｃｅ  −  Ｓｕｉｔｅ  ３３０、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ  ０２１１１−１３０７、ＵＳＡ）。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、６個のアルファ−ヘリックスと、続く２個のベータ鎖と、続く１個のアルファ−ヘリックスと、続く２個のベータ鎖を含む二次構造を有するまたは有すると予測される。Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、ヘムに結合することができるアポタンパク質またはヘムが結合したホロタンパク質であり得る。Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、ヘム基に共有結合または非共有結合により結合することができる。一部のＨ−ＮＯＸタンパク質は、ＮＯに結合するが、Ｏ２には結合せず、その他は、ＮＯおよびＯ２の両方に結合する。単離された通性好気性菌由来のＨ−ＮＯＸドメインは、ＮＯに結合するが、Ｏ２には結合しない。偏性好気性原核生物、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓおよびＤ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ由来のＨ−ＮＯＸタンパク質は、ＮＯおよびＯ２に結合する。哺乳動物は、２種のＨ−ＮＯＸタンパク質：β１およびβ２を有する。マウス、ラット、ウシおよびヒトＨ−ＮＯＸ配列のアライメントは、これらの種が、＞９９％同一性を共有することを示す。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＨ−ＮＯＸドメインまたはＨ−ＮＯＸタンパク質全体は、天然起源のＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸタンパク質（例えば、配列番号２）または天然起源のｓＧＣタンパク質（例えば、天然起源のｓＧＣ  β１タンパク質）の対応す��領域のそれに対し、少なくとも約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約９５、約９７、約９８、約９９または約９９．５％同一のうちいずれかである。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＨ−ＮＯＸドメインまたはＨ−ＮＯＸタンパク質全体は、天然起源のＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸタンパク質（例えば、配列番号２）または天然起源のｓＧＣタンパク質（例えば、天然起源のｓＧＣ  β１タンパク質）の対応する領域のそれに対し、少なくとも約１０〜約２０％、約２０〜約３０％、約３０〜約４０％、約４０〜約５０％、約５０〜約６０％、約６０〜約７０％、約７０〜約８０％、約８０〜約９０％、約９０〜約９５％、約９５〜約９９または約９９〜約９９．９％同一のうちいずれかである。本明細書にさらに記述されている通り、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、対応する天然起源のＨ−ＮＯＸタンパク質と比べて、１個または複数の変異を必要に応じて含有することができる。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、Ｈ−ＮＯＸドメインに加えて１個または複数のドメインを含む。特定の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、別のタンパク質由来の１個もしくは複数のドメインまたは配列全体を含む。例えば、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、Ｈ−ＮＯＸドメインと、アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）等の別のタンパク質の一部または全体とを含む融合タンパク質であり得る。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸドメインのみが存在する。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、グアニリルシクラーゼドメインを含まない。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、タグ；例えば、Ｈｉｓ６タグを含む。
【０１１６】
重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質
一部の態様において、本発明は、２個以上のＨ−ＮＯＸドメインを含む重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を提供する。２個以上のＨ−ＮＯＸドメインは、共有結合により連結または非共有結合により連結されていてよい。一部の実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体（ｏｃｔｏｍｅｒ）、九量体（ｎａｎｏｍｅｒ）または十量体の形態である。一部の実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、同種Ｈ−ＮＯＸドメインを含む。一部の実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、異種Ｈ−ＮＯＸドメインを含む；例えば、Ｈ−ＮＯＸドメインは、特定の種のＨ−ＮＯＸドメインのアミノ酸バリアントを含むことができる、あるいは異なる種由来のＨ−ＮＯＸドメインを含むことができる。一部の実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＨ−ＮＯＸドメインのうち少なくとも１個は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸのＬ１４４Ｆ変異に対応する変異を含む。一部の実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＨ−ＮＯＸドメインのうち少なくとも１個は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸのＷ９Ｆ／Ｌ１４４Ｆ変異に対応する変異を含む。一部の実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、１個または複数の重合ドメインを含む。一部の実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質である。一部の実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、少なくとも１個の三量体形成ドメインを含む。一部の実施形態において、三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、３個のＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸドメインを含む。一部の実施形態において、三量体型Ｈ−ＮＯＸドメインは、３個のＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｌ１４４Ｆ  Ｈ−ＮＯＸドメイン（三量体型Ｔｔ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｌ１４４Ｆ）を含む。一部の実施形態において、三量体型Ｈ−ＮＯＸドメインは、３個のＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｗ９Ｆ／Ｌ１４４Ｆ  Ｈ−ＮＯＸドメインを含む。
【０１１７】
本発明の一部の態様において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、２個以上の会合した単量体を含む。単量体は、共有結合により連結または非共有結合により連結され得る。一部の実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質の単量体サブユニットが産生され、単量体サブユニットは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで会合して、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を形成する。一部の実施形態において、単量体は、Ｈ−ＮＯＸドメインおよび重合ドメインを含む。一部の実施形態において、重合ドメインは、Ｈ−ＮＯＸドメインに共有結合により連結される；例えば、Ｈ−ＮＯＸドメインのＣ末端は、重合ドメインのＮ末端またはＣ末端に共有結合により連結される。他の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸドメインのＮ末端は、重合ドメインのＮ末端またはＣ末端に共有結合により連結される。一部の実施形態において、アミノ酸スペーサーは、Ｈ−ＮＯＸドメインおよび重合ドメインの間に共有結合により連結される。「アミノ酸スペーサー」および「アミノ酸リンカー」は、本明細書において互換的に使用される。一部の実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質の単量体サブユニットのうち少なくとも１個は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸのＬ１４４Ｆ変異に対応する変異を含む。一部の実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質の単量体サブユニットのうち少なくとも１個は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸのＷ９Ｆ／Ｌ１４４Ｆ変異に対応する変異を含む。一部の実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質である。一部の実施形態において、三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質の単量体は、Ｈ−ＮＯＸドメインと、Ｔ４バクテリオファージのフォルドンドメインとを含む。一部の実施形態において、三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質の単量体は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸドメインと、フォルドンドメインとを含む。一部の実施形態において、三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質の単量体は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｌ１４４Ｆ  Ｈ−ＮＯＸドメインと、フォルドンドメインとを含む。一部の実施形態において、三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質の単量体は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｗ９Ｆ／Ｌ１４４Ｆ  Ｈ−ＮＯＸドメインと、フォルドンドメインとを含む。一部の実施形態において、三量体Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、３個の単量体を含み、各単量体は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｌ１４４Ｆ  Ｈ−ＮＯＸドメインと、フォルドンドメインとを含む。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸドメインは、アミノ酸リンカー；例えば、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙリンカーによりフォルドンドメインに連結される。一部の実施形態において、少なくとも１個のＨ−ＮＯＸドメインは、タグを含む。一部の実施形態において、少なくとも１個のＨ−ＮＯＸドメインは、Ｈｉｓ６タグを含む。一部の実施形態において、Ｈｉｓ６タグは、アミノ酸リンカー；例えば、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカーによりフォルドンドメインに連結される。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸドメインの全てが、Ｈｉｓ６タグを含む。一部の実施形態において、三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、配列番号６ま��は配列番号８に示されるアミノ酸配列を含む。
【０１１８】
Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ由来の例示的なＨ−ＮＯＸドメインは、およそ２６．７ｋＤａｌである。一部の実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、約５０ｋＤａｌ、７５ｋＤａｌ、１００ｋＤａｌ、１２５ｋＤａｌまたは約１５０ｋＤａｌのうちいずれかを超える原子質量を有する。
【０１１９】
本発明は、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質であって、個体への該Ｈ−ＮＯＸタンパク質の投与後に、単一のＨ−ＮＯＸドメインを含む対応する単量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質と比較して、該個体の１種または複数の組織においてより多くの蓄積を示す重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を提供する。対応するＨ−ＮＯＸタンパク質は、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＨ−ＮＯＸドメインのうちの少なくとも１個を含むＨ−ＮＯＸタンパク質の単量体形態を指す。優先的な重合体型Ｈ−ＮＯＸ蓄積組織として、腫瘍および血管系が損傷した組織が挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、個体へのＨ−ＮＯＸタンパク質の投与後に、哺乳動物に少なくとも約１、２、３、４、６、１２または２４時間にわたって存続する。一部の実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、個体へのＨ−ＮＯＸタンパク質の投与後に、哺乳動物に約１〜２、２〜３、３〜４、４〜６、６〜１２または１２〜２４時間にわたって存続する。一部の実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸの約１０％未満が、個体へのＨ−ＮＯＸタンパク質の投与後に、約１時間、２時間または３時間のうちいずれか未満以内に、腎臓によって哺乳動物から排除される。
【０１２０】
Ｈ−ＮＯＸタンパク質およびＨ−ＮＯＸドメインの供給源
本明細書に記載されている組成物、キットおよび方法において、いかなる属または種由来のＨ−ＮＯＸタンパク質およびＨ−ＮＯＸドメインを使用することもできる。様々な実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質または重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＨ−ＮＯＸドメインは、哺乳動物（例えば、霊長類（例えば、ヒト、サル、ゴリラ、類人猿、キツネザル等）、ウシ、ウマ、ブタ、イヌまたはネコ）、昆虫、酵母または細菌由来のタンパク質またはドメインである、あるいはこのようなタンパク質に由来する。例示的な哺乳動物Ｈ−ＮＯＸタンパク質として、野生型ヒトおよびラット可溶性グアニル酸シクラーゼ（β１サブユニット等）が挙げられる。Ｈ−ＮＯＸタンパク質の非限定的な例として、野生型哺乳動物Ｈ−ＮＯＸタンパク質、例えば、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ、Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓ、Ｃ．ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ、Ｂ．Ｔａｕｒｕｓ、Ｃ．ｌｕｐｕｓおよびＲ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓが挙げられ、原核生物野生型Ｈ−ＮＯＸタンパク質の例として、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａ、Ｖ．ｆｉｓｃｈｅｒｉｉ、Ｎ．ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ、Ｄ．ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ、Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ  １、Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ  ２およびＣ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍが挙げられる。そのＮＣＢＩ受託番号を含むＨ−ＮＯＸタンパク質の例は、米国特許第８，４０４，６３１号および同第８，４０４，６３２号、ＷＯ２００７／１３９７９１ならびにＷＯ２００７／１３９７６７に見出すことができ；これらの参考文献のそれぞれの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１２１】
本明細書に記載されている医薬組成物および方法における使用に適し得る追加のＨ−ＮＯＸタンパク質、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＨ−ＮＯＸドメインおよび核酸は、標準方法を使用して同定することができる。例えば、標準配列アライメントおよび／または構造予測プログラムを使用して、追加のＨ−ＮＯＸタンパク質および核酸であって、それらの一次構造および／または予測されるタンパク質二次構造の、公知Ｈ−ＮＯＸタンパク質および核酸のそれとの類似性に基づき、該追加のＨ−ＮＯＸタンパク質および核酸を同定することができる。例えば、Ｐｆａｍデータベースは、定義されたアライメントアルゴリズムおよび隠れマルコフモデル（Ｐｆａｍ  ２１．０等）を使用して、タンパク質をＨ−ＮＯＸタンパク質ファミリー等のファミリーにカテゴリー化する（Ｐｆａｍ  −  タンパク質ドメインファミリーアライメントおよび隠れマルコフモデルのデータベース、著作権（Ｃ）１９９６〜２００６年、Ｔｈｅ  Ｐｆａｍ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ；ＧＮＵ  ＬＧＰＬ  Ｆｒｅｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，  Ｉｎｃ．、５９  Ｔｅｍｐｌｅ  Ｐｌａｃｅ  −  Ｓｕｉｔｅ  ３３０、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ  ０２１１１−１３０７、ＵＳＡ）。ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ−ｔｒｅｍｂｌデータベース（「ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ」のワールドワイドウェブ、Ｓｗｉｓｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  ｇｒｏｕｐ  ＣＭＵ  −  １  ｒｕｅ  Ｍｉｃｈｅｌ  Ｓｅｒｖｅｔ  ＣＨ−１２１１  Ｇｅｎｅｖａ  ４、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）等の標準データベースを使用して、Ｈ−ＮＯＸタンパク質ファミリーのメンバーを同定することもできる。ＰｒｅｄｉｃｔＰｒｏｔｅｉｎ（６３０  Ｗｅｓｔ、１６８  Ｓｔｒｅｅｔ、ＢＢ２１７，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．  １００３２、ＵＳＡ）等の標準構造予測プログラムのデフォルト設定を使用して、Ｈ−ＮＯＸタンパク質の二次および／または三次構造を予測することができる。あるいは、標準方法を使用して、Ｈ−ＮＯＸタンパク質の実際の二次および／または三次構造を決定することができる。
【０１２２】
一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸドメインは、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸにおける次の遠位ポケット残基のいずれかと同じアミノ酸を対応する位置に有する：Ｔｈｒ４、Ｉｌｅ５、Ｔｈｒ８、Ｔｒｐ９、Ｔｒｐ６７、Ａｓｎ７４、Ｉｌｅ７５、Ｐｈｅ７８、Ｐｈｅ８２、Ｔｙｒ１４０、Ｌｅｕ１４４または上記の２種以上のいずれかの組合せ。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸドメインは、そのアミノ酸配列の配列アライメントに基づき、それぞれＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸのＰｒｏ１１５またはＡｒｇ１３５の位置に対応する位置にプロリンまたはアルギニンを有する。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸドメインは、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  β１  Ｈ−ＮＯＸのＨｉｓ１０５に対応するヒスチジンを有する。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸドメインは、６個のアルファ−ヘリックスと、続く２個のベータ鎖と、続く１個のアルファ−ヘリックスと、続く２個のベータ鎖を含む二次構造を有するまたはそれを有すると予測される。Ｈ−ＮＯＸタンパク質についてのこの二次構造が報告されている。
【０１２３】
必要な場合、新たに同定されたＨ−ＮＯＸタンパク質またはＨ−ＮＯＸドメインを試験して、これがヘムに結合するかどうかを、標準方法を使用して決定することができる。Ｏ２キャリアとして機能するＨ−ＮＯＸドメインの能力は、本明細書に記載されている方法等の標準方法を使用して、Ｈ−ＮＯＸドメインがＯ２に結合するかどうかを決定することにより試験することができる。必要な場合、本明細書に記載されている変異のうち１種または複数をＨ−ＮＯＸドメインに導入して、Ｏ２キャリアとしてのその特徴を最適化することができる。例えば、１個または複数の変異を導入して、酸素に対するそのＯ２解離定数ｋｏｆｆ、ヘム自動酸化の速度、ＮＯ反応性、ＮＯ安定性または上記のうち２種以上のいずれかの組合せを変更することができる。本明細書に記載されている技法等の標準技法を使用して、これらのパラメータを測定することができる。
【０１２４】
変異体Ｈ−ＮＯＸタンパク質
本明細書にさらに記述されている通り、Ｈ−ＮＯＸタンパク質または重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＨ−ＮＯＸドメインは、対応する野生型タンパク質のＨ−ＮＯＸドメインと比較して、Ｏ２解離定数、酸素に対するｋｏｆｆ、ヘム自動酸化の速度、ＮＯ反応性、ＮＯ安定性または上記のうち２種以上のいずれかの組合せを変更する変異等、１個または複数の変異を含有することができる。一部の実施形態において、本発明は、Ｏ２解離定数、酸素に対するｋｏｆｆ、ヘム自動酸化の速度、ＮＯ反応性、ＮＯ安定性または上記のうち２種以上のいずれかの組合せを、対応する野生型タンパク質のそれと比較して、変更する変異等の１個または複数の変異を含有し得る１個または複数のＨ−ＮＯＸドメインを含む重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を提供する。操作されたＨ−ＮＯＸドメインのパネルは、本明細書に提供されている教示を考慮して、本明細書に記載の、当業者に公知の技法を使用して、ランダム変異誘発と、続く必要なまたは所望の解離定数、解離速度、ＮＯ反応性、安定性、生理的適合性または上記のうち２種以上のいずれかの組合せに関する経験的スクリーニングによって作製することができる。あるいは、変異誘発は、Ｈ−ＮＯＸタンパク質の実験的に決定されるもしくは予測される三次元構造から明らかとなる遠位ポケット残基（特に、野生型および変異体Ｈ−ＮＯＸタンパク質の配列に関して、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｏｏｎ，  Ｅ．  Ｍ．ら（２００５年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １巻：５３〜５９頁を参照）または配列アライメントから同定される進化的に保存された残基（特に、野生型および変異体Ｈ−ＮＯＸタンパク質の配列に関して、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｏｏｎ  Ｅ．Ｍ．ら（２００５年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １巻：５３〜５９頁を参照）等の特定の領域または残基を選択的に標的化することができる。
【０１２５】
本発明の一部の実施形態において、変異体Ｈ−ＮＯＸタンパク質または重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質の変異体Ｈ−ＮＯＸドメインは、自然に存在するいかなるＨ−ＮＯＸタンパク質またはドメインの配列とも異なる配列を有する。様々な実施形態において、変異体タンパク質のアミノ酸配列は、自然に存在するＨ−ＮＯＸタンパク質の対応する領域の配列に対し、少なくとも約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約９５、約９７、約９８、約９９または約９９．５％同一のうちいずれかである。様々な実施形態において、変異体タンパク質のアミノ酸配列は、自然に存在するＨ−ＮＯＸタンパク質の対応する領域の配列に対し、約１０〜２０％、２０〜３０％、３０〜４０％、４０〜５０％、５０〜６０％、６０〜７０％、７０〜８０％、８０〜９０％、９０〜９５％、９５〜９９％または９９．５％同一である。一部の実施形態において、変異体タンパク質は、全長タンパク質由来の少なくとも約２５、約５０、約７５、約１００約、１５０、約２００、約３００または約４００個の連続アミノ酸のうちいずれかを含有するタンパク質断片である。一部の実施形態において、変異体タンパク質は、全長タンパク質由来の２５〜５０、５０〜７５、７５〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００、２００〜３００または３００〜４００個の連続アミノ酸を含有するタンパク質断片である。配列同一性は、例えば、配列解析ソフトウェアを使用して、それに指定されたデフォルトパラメータにより測定することができる（例えば、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒ、１７１０  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｖｅｎｕｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ  ５３７０５）。このソフトウェアプログラムは、様々なアミノ酸置き換え、欠失、および他の改変に相同性の程度を割り当てることにより、類似の配列をマッチさせる。
【０１２６】
本発明の一部の実施形態において、変異体Ｈ−ＮＯＸタンパク質または重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質の変異体Ｈ−ＮＯＸドメインは、１個または複数のアミノ酸の挿入を含む（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸の挿入）。本発明の一部の実施形態において、変異体Ｈ−ＮＯＸタンパク質または変異体Ｈ−ＮＯＸドメインは、１個または複数のアミノ酸の欠失を含む（例えば、少なくとも約５、約１０、約１５、約２５、約５０、約７５、約１００、約１５０、約２００、約３００個以上のアミノ酸のうちいずれかの欠失または５〜１０、１０〜１５、１５〜２５、２５〜５０、５０〜７５、７５〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００、２００〜３００または３００〜４００個のアミノ酸の欠失等、Ｎ末端、Ｃ末端および／または内側残基の欠失）。本発明の一部の実施形態において、変異体Ｈ−ＮＯＸタンパク質または変異体Ｈ−ＮＯＸドメインは、１個または複数のアミノ酸の置き換え（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸の置き換え）、または上記のうち２種以上の組合せを含む。一部の実施形態において、変異体タンパク質は、自然に存在するタンパク質と比較して、少なくとも１個のアミノ酸変更を有する。一部の実施形態において、変異体核酸配列は、自然に存在するタンパク質と比較して、少なくとも１個のアミノ酸変更を有するタンパク質をコードする。一部の実施形態において、核酸は、自然に存在するタンパク質と同一のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする自然に存在する核酸の縮重バージョンではない。
【０１２７】
一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質または重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＨ−ＮＯＸドメインにおける変異は、進化的に保存された変異である（クラスＩ変異とも表される）。クラスＩ変異の例は、表１Ａに記載されている。表１Ａにおいて、変異は、ヒトβ１  Ｈ−ＮＯＸの配列に従って番号をつけられている／アノテートされているが、あらゆるＨ−ＮＯＸ配列に対し類似である。よって、他のいずれかのＨ−ＮＯＸタンパク質における対応する位置を表示の残基へと変異させることができる。例えば、ヒトβ１
Ｈ−ＮＯＸのＰｈｅ４をチロシンへと変異させることができるが、その理由として、他のＨ−ＮＯＸタンパク質が、この位置にチロシンを有するためである。他のいずれかのＨ−ＮＯＸタンパク質において、対応するフェニルアラニン残基をチロシンへと変異させることができる。特定の実施形態において、１個または複数の変異は、進化的に保存された残基に限定される。一部の実施形態において、１個または複数の変異は、少なくとも１個の進化的に保存された変異および少なくとも１個の進化的に保存されていない変異を含むことができる。必要な場合、これらの変異体Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、本明細書に提供される教示を考慮して、ＮＯ／Ｏ２解離定数、ＮＯ反応性、安定性および生理的適合性に関する経験的スクリーニングに付される。
【表１Ａ】
2020183450.tif 000002
【０１２８】
一部の実施形態において、変異は、アルファ−ヘリックスＡ、Ｄ、ＥまたはＧにおける残基の変異等の遠位ポケット変異である（Ｐｅｌｌｉｃｅｎａ，  Ｐ．ら（２００４年８月３１日）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０１巻（３５号）：１２８５４〜１２８５９頁）。例示的な遠位ポケット変異（クラスＩＩ変異とも表される）は、表１Ｂに記載されている。表１Ｂにおいて、変異は、ヒトβ１  Ｈ−ＮＯＸの配列に従って番号をつけられている／アノテートされているが、あらゆるＨ−ＮＯＸ配列に対して類似である。列挙された残基それぞれにおいて、いくつかの置換は生存可能な変異をもたらすため、示された位置それぞれにおける残基は、他のいずれかの天然または非天然起源のアミノ酸（「Ｘ」と表される）に交換することができる。このような変異は、種々の所望の親和性、安定性および反応性の特徴を有するＨ−ＮＯＸタンパク質を産生することができる。
【表１Ｂ】
2020183450.tif 000003
【０１２９】
特定の実施形態において、変異は、ヘム遠位ポケット変異である。本明細書に記載されている通り、Ｈ−ＮＯＸファミリーのＮＯ結合メンバーにおけるＯ２結合を防止する重大な分子決定要因は、ヘムの遠位ポケットにおけるＨ結合ドナーの欠如である。したがって、一部の実施形態において、変異は、遠位ポケット内のＨ−ＮＯＸドメインおよびリガンドの間のＨ結合を変更する。一部の実施形態において、変異は、遠位ポケットのＨ結合ドナーを破壊する、および／または対応する野生型Ｈ−ＮＯＸドメインと比べて低下したＯ２リガンド結合を付与する。例示的な遠位ポケット残基として、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸのＴｈｒ４、Ｉｌｅ５、Ｔｈｒ８、Ｔｒｐ９、Ｔｒｐ６７、Ａｓｎ７４、Ｉｌｅ７５、Ｐｈｅ７８、Ｐｈｅ８２、Ｔｙｒ１４０およびＬｅｕ１４４ならびに他のいずれかのＨ−ＮＯＸタンパク質における対応する残基が挙げられる。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質または重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＨ−ＮＯＸドメインは、１個または複数の遠位ポケット変異を含む。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質または重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＨ−ＮＯＸドメインは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１個以上の遠位ポケット変異を含む。一部の実施形態において、遠位ポケット変異は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸのＬ１４４Ｆ変異に対応する。一部の実施形態において、遠位ポケット変異は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸのＬ１４４Ｆ変異である。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質または重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＨ−ＮＯＸドメインは、２個の遠位ポケット変異を含む。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質または重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＨ−ＮＯＸドメインは、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸのＷ９Ｆ／Ｌ１４４Ｆ変異に対応する。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質または重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＨ−ＮＯＸドメインは、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸのＷ９Ｆ／Ｌ１４４Ｆ変異である。
【０１３０】
遠位ポケットに存在しない残基も、ヘム基の三次元構造に影響を与え得る；この構造は次に、ヘム基における鉄へのＯ２およびＮＯの結合に影響を与える。したがって、一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質または重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＨ−ＮＯＸドメインは、遠位ポケットを除く１個または複数の変異を有する。変異させることができるが遠位ポケットに存在しない残基の例として、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸのＰｒｏ１１５およびＡｒｇ１３５が挙げられる。一部の実施形態において、変異は、ヘム鉄にライゲーションする残基としてＨｉｓ１０５を含む近位ポケットに存在する。
【０１３１】
一部の実施形態において、２個以上の変異が存在する場合；少なくとも１個の変異は、遠位ポケットに存在し、少なくとも１個の変異は、遠位ポケット以外にある（例えば、近位ポケットにおける変異）。一部の実施形態において、全変異が遠位ポケットに存在する。
【０１３２】
ヒト以外の供給源に由来するＨ−ＮＯＸタンパク質またはＨ−ＮＯＸドメインの免疫原性を低下させるために、Ｈ−ＮＯＸタンパク質またはＨ−ＮＯＸドメインにおけるアミノ酸を、ヒトＨ−ＮＯＸにおける対応するアミノ酸へと変異させることができる。例えば、非ヒトＨ−ＮＯＸタンパク質またはＨ−ＮＯＸドメインの三次構造の表面における１個または複数のアミノ酸を、ヒトＨ−ＮＯＸタンパク質またはＨ−ＮＯＸドメインにおける対応するアミノ酸へと変異させることができる。一部の変種において、１個または複数の表面アミノ酸の変異は、２個以上の遠位ポケット残基の変異、遠位ポケットを除く１個もしくは複数の残基の変異（例えば、近位ポケットにおける変異）または上記のうち２種以上の組合せと組み合わせることができる。
【０１３３】
本発明は、また、二重、三重またはより高次の多重変異等、本明細書に記載されている変異のいずれかの組合せに関する。例えば、本明細書に記載されている変異のいずれかの組合せは、同じＨ−ＮＯＸタンパク質で為すことができる。他の哺乳動物または非哺乳動物Ｈ−ＮＯＸタンパク質における均等な位置における変異も、本発明によって包含されることに留意されたい。例示的な変異体Ｈ−ＮＯＸタンパク質または変異体Ｈ−ＮＯＸドメインは、対応する野生型Ｈ−ＮＯＸドメインと比べて変更されたＯ２またはＮＯリガンド結合を付与し、生理学的に適合性の哺乳動物Ｏ２血液ガスキャリアとして働く（ｏｐｅｒａｔｉｖｅ）、１個または複数の変異を含む。
【０１３４】
変異の残基番号は、記載されている特定のＨ−ＮＯＸタンパク質の配列における位置を示す。例えば、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｉ５Ａは、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸの第５の位置における、アラニンによるイソロイシンの置き換えを指す。同じイソロイシンからアラニンへの変異は、他のいずれかのＨ−ＮＯＸタンパク質またはＨ−ＮＯＸドメインにおける対応する残基において為され得る（この残基は、他のＨ−ＮＯＸタンパク質の配列における第５の残基であってもよいし、それでなくてもよい）。哺乳動物β１  Ｈ−ＮＯＸドメインのアミノ酸配列は、せいぜい２個のアミノ酸が異なるため、野生型ラットβ１  Ｈ−ＮＯＸタンパク質に導入されると望ましい変異体Ｈ−ＮＯＸタンパク質またはＨ−ＮＯＸドメインを産生する変異は、ヒト等、他の哺乳動物由来の野生型β１  Ｈ−ＮＯＸタンパク質またはＨ−ＮＯＸドメインに導入されると望ましい変異体Ｈ−ＮＯＸタンパク質またはＨ−ＮＯＸドメインを産生するとも予想される。
【０１３５】
一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、３個のＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｌ１４４Ｆ  Ｈ−ＮＯＸドメインおよび３個のフォルドンドメインを含む三量体である。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、３個のＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｗ９Ｆ／Ｌ１４４Ｆ  Ｈ−ＮＯＸドメインおよび３個のフォルドンドメインを含む三量体である。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、３個のＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ野生型Ｈ−ＮＯＸドメインおよび３個のフォルドンドメインを含む三量体である。
【０１３６】
Ｈ−ＮＯＸタンパク質への改変
重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を含む、野生型または変異体Ｈ−ＮＯＸタンパク質のいずれかは、治療上または産業上の利用を増強するための標準方法を使用して改変および／または製剤化することができる。例えば、そして特に、異種の操作されたＨ−ＮＯＸタンパク質に適用される場合、架橋、ペグ化、炭水化物デコレーション等を含む、免疫監視機構からこのような薬剤を遮蔽するための種々の方法（特に、タンパク質の改変に関して、例えば、それぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｏｈｌｆｓ，  Ｒ．  Ｊ．ら（１９９８年５月１５日）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２７３巻（２０号）：１２１２８〜１２１３４頁；Ｍｉｇｉｔａ，  Ｒ．ら（１９９７年６月）Ｊ．  Ａｐｐｌ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．８２巻（６号）：１９９５〜２００２頁；Ｖａｎｄｅｇｒｉｆｆ，  Ｋ．  Ｄ．ら（２００４年８月１５日）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．３８２巻（Ｐｔ  １）：１８３〜１８９頁）と共に当業者に公知の他の技法が、当技術分野において公知である。ヒト血清アルブミン等のヒトタンパク質と、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を含むＨ−ＮＯＸタンパク質との融合は、血清半減期、粘性およびコロイド性膠質浸透圧を増加させることができる。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、その合成の最中または後に改変されて、その免疫原性を減少させる、および／またはその血漿保持時間を増加させる。Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、カプセル封入することもできる（リポソームまたはナノ粒子内へのカプセル封入等）。
【０１３７】
一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、例えば、Ｈ−ＮＯＸタンパク質の精製を助ける、１個または複数のタグを含む。タグの例として、Ｈｉｓ６、ＦＬＡＧ、ＧＳＴおよびＭＢＰが挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、１個または複数のＨｉｓ６タグを含む。１個または複数のＨｉｓ６タグは、例えば、エキソペプチダーゼ処理により、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質の使用に先立ち除去することができる。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、３個のＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｌ１４４Ｆ  Ｈ−ＮＯＸドメイン、３個のフォルドンドメインおよび３個のＨｉｓ６タグを含む三量体である。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、３個のＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｗ９Ｆ／Ｌ１４４Ｆ
Ｈ−ＮＯＸドメイン、３個のフォルドンドメインおよび３個のＨｉｓ６タグを含む三量体である。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、３個のＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ野生型Ｈ−ＮＯＸドメイン、３個のフォルドンドメインおよび３個のＨｉｓ６タグを含む三量体である。
【０１３８】
一部の実施形態では、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、１個または複数のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子を含む（すなわち、ペグ化されている）。一部の実施形態では、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、３個のＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｌ１４４Ｆ  Ｈ−ＮＯＸドメインと、３個のフォルドンドメインと、１個または複数のポリエチレングリコール分子とを含む三量体である（ペグ化三量体Ｔｔ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｌ１４４Ｆ）。一部の実施形態では、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、３個のＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｗ９Ｆ／Ｌ１４４Ｆ  Ｈ−ＮＯＸドメインと、３個のフォルドンドメインと、１個または複数のポリエチレングリコール分子とを含む三量体である。一部の実施形態では、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、３個のＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ野生型Ｈ−ＮＯＸドメインと、３個のフォルドンドメインと、１個または複数のポリエチレングリコール分子とを含む三量体である。一部の実施形態では、ＰＥＧの分子量は、約１ｋＤａ〜約５０ｋＤａの間である。一部の実施形態では、ＰＥＤの分子量は、約１ｋＤａ〜約５０ｋＤａ、約１ｋＤａ〜約４０ｋＤａ、約１ｋＤａ〜約３０ｋＤａ、約１ｋＤａ〜約２５ｋＤａ、約１ｋＤａ〜約２０ｋＤａ、約１ｋＤａ〜約１５ｋＤａ、約１ｋＤａ〜約１０ｋＤａ、約１ｋＤａ〜約５ｋＤａ、約５ｋＤａ〜約５０ｋＤａ、約５ｋＤａ〜約４０ｋＤａ、約５ｋＤａ〜約３０ｋＤａ、約５ｋＤａ〜約２５ｋＤａ、約５ｋＤａ〜約２０ｋＤａ、約５ｋＤａ〜約１５ｋＤａ、約５ｋＤａ〜約１０ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜約５０ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜約４０ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜約３０ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜約２５ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜約２０ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜約１５ｋＤａ、約１５ｋＤａ〜約５０ｋＤａ、約１５ｋＤａ〜約４０ｋＤａ、約１５ｋＤａ〜約３５ｋＤａ、約１５ｋＤａ〜約３０ｋＤａ、約１５ｋＤａ〜約２５ｋＤａ、約１５ｋＤａ〜約２０ｋＤａ、約２０ｋＤａ〜約５０ｋＤａ、約２０ｋＤａ〜約４０ｋＤａ、約２０ｋＤａ〜約３０ｋＤａ、約２０ｋＤａ〜約２５ｋＤａ、約２５ｋＤａ〜約５０ｋＤａ、約２５ｋＤａ〜約４０ｋＤａ、約２５ｋＤａ〜約３０ｋＤａ、約３０ｋＤａ〜約５０ｋＤａ、約３０ｋＤａ〜約４０ｋＤａまたは約４０ｋＤａ〜約５０ｋＤａのいずれかの間である。一部の実施形態では、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、Ｈ−ＮＯＸ単量体あたり約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５または約５０超またはその間の任意の数のいずれか１つのＰＥＧ分子を含む。一部の実施形態では、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、Ｈ−ＮＯＸ単量体あたり平均で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０あるいはその間の任意の数のＰＥＧ分子を含む。
【０１３９】
重合ドメイン
一部の態様において、本発明は、２個以上のＨ−ＮＯＸドメインと、１個または複数の重合ドメインとを含む重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を提供する。重合ドメインは、２個以上のＨ−ＮＯＸドメインを連結して、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を形成するために使用される。１個または複数の重合ドメインは、Ｈ−ＮＯＸタンパク質の二量体、三量体、四量体、五量体等を産生するために使用することができる。Ｔ４バクテリオファージフィブリチンのフォルドン、Ａｒｃ、ＰＯＺ、コイルドコイルドメイン（ＧＣＮ４、ロイシンジッパー、Ｖｅｌｃｒｏ（登録商標）を含む）、ウテログロビン、コラーゲン、３本鎖コイルドコイル（ｃｏｌｉｓ）（マトリリン−１）、トロンボスポリン、ＴＲＰＶ１−Ｃ、Ｐ５３、Ｍｎｔ、アビジン（ａｖａｄｉｎ）、ストレプトアビジン、Ｂｃｒ−Ａｂｌ、ＣＯＭＰ、ベロ毒素サブユニットＢ、ＣａｍＫＩＩ、ＲＣＫおよびＮエチルマレイミド感受性融合タンパク質由来のドメイン、ＳＴＭ３５４８、ＫａｉＣ、ＴｙｒＲ、Ｈｃｐ１、ＣｃｍＫ４、ＧＰ４１、炭疽菌防御抗原、アエロリジン、ａ−ヘモリジン、Ｃ４ｂ−結合タンパク質、Ｍｉ−ＣＫ、アリールスルファターゼ（ａｒｙｌｓｕｒｆａｔａｓｅ）Ａならびにウイルスカプシドタンパク質等、重合ドメインは、当技術分野において公知である。重合ドメインは、Ｈ−ＮＯＸドメインに共有結合または非共有結合により連結され得る。一部の実施形態において、複数の単量体サブユニット由来の重合ドメインが会合して、重合体型Ｈ−ＮＯＸドメインを形成するように、重合ドメインがＨ−ＮＯＸドメインに連結されて、単量体サブユニットを形成する。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸドメインのＣ末端が、重合ドメインのＮ末端に連結される。他の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸドメインのＮ末端が、重合ドメインのＮ末端に連結される。さらに他の実施形態（ｅｍｏｄｉｍｅｎｔ）において、Ｈ−ＮＯＸドメインのＣ末端が、重合ドメインのＣ末端に連結される。一部の実施形態（ｅｍｏｄｉｍｅｎｔ）において、Ｈ−ＮＯＸドメインのＮ末端が、重合ドメインのＣ末端に連結される。
【０１４０】
リンカーを使用して、重合ドメインをＨ−ＮＯＸドメインに繋ぐことができる。例えば、例えば、アミノ酸リンカー。一部の実施形態において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１個以上のアミノ酸のうちいずれか１種を含むリンカーを重合ドメインおよびＨ−ＮＯＸドメインの間に置くことができる。例示的なリンカーとして、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−ＧｌｙリンカーおよびＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカーが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１４１】
バクテリオファージＴ４フィブリチン三量体形成ドメイン
例示的な重合ドメインは、バクテリオファージＴ４のフォルドンドメインである。バクテリオファージＴ４由来のｗａｃ遺伝子は、Ｃ末端三量体形成ドメイン（残基４５７〜４８３）を有する４８６アミノ酸のタンパク質である、フィブリチンタンパク質をコードする（Ｅｆｉｍｏｖ，  Ｖ．  Ｐ．ら（１９９４年）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２４２巻：４７０〜４８６頁）。このドメインは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方でフィブリチンを三量体形成させることができる（Ｂｏｕｄｋｏ，  Ｓ．  Ｐ．ら（２００２年）Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２６９巻：８３３〜８４１頁；Ｌｅｔａｒｏｖ，  Ａ．  Ｖ．，ら（１９９９年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  （Ｍｏｓｃ）６４巻：８１７〜８２３頁；Ｔａｏ，  Ｙ．，ら（１９９７年）Ｓｔｒｕｃｔｕｅ  ５巻：７８９〜７９８頁）。多くの場合「フォルドンドメイン」と称される、単離された２７残基の三量体形成ドメインは、多数の異なるタンパク質においてキメラ三量体の構築に使用されてきた（ＨＩＶ外被糖タンパク質（Ｙａｎｇ，  Ｘ．ら（２００２年）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７６巻：４６３４〜４６４２頁）、アデノウイルスアドヘシン（Ｐａｐａｎｉｋｏｌｏｐｏｕｌｏｕ，  Ｋ．，ら（２００４年）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７９巻：８９９１〜８９９８頁；Ｐａｐａｎｉｋｏｌｏｐｏｕｌｏｕ，  Ｋ．ら（２００４年）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３４２巻：２１９〜２２７頁）、コラーゲン（Ｚｈａｎｇ，  Ｃ．，ら（２００９年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ  ２５巻：１６６０〜１６６８頁）、ファージＰ２２  ｇｐ２６（Ｂｈａｒｄｗａｊ，  Ａ．，ら（２００８年）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  １７巻：１４７５〜１４８５頁）および狂犬病ウイルス糖タンパク質（Ｓｉｓｓｏｅｆｆ，  Ｌ．，ら（２００５年）Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ８６巻：２５４３〜２５５２頁）を含む）。フォルドンドメインの例示的な配列を図１に示し、配列番号４に提示する。
【０１４２】
単離されたフォルドンドメインは、単一のβ−ヘアピン構造へと折り畳まれ、３個のヘアピンを含むβ−プロペラ構造へと三量体形成する（Ｇｕｔｈｅ，  Ｓ．ら（２００４年）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３３７巻：９０５〜９１５頁）。フォルドンドメイン単独の構造は、ＮＭＲによって決定され（Ｇｕｔｈｅ，  Ｓ．ら（２００４年）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３３７巻：９０５〜９１５頁）、フォルドンドメインにより三量体形成した数種のタンパク質の構造は、Ｘ線結晶学によって解析した（Ｐａｐａｎｉｋｏｌｏｐｏｕｌｏｕ，  Ｋ．，ら、（２００４年）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７９巻：８９９１〜８９９８頁；Ｓｔｅｔｅｆｅｌｄ，  Ｊ．ら（２００３年）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  １１巻：３３９〜３４６頁；Ｙｏｋｏｉ，  Ｎ．ら（２０１０年）Ｓｍａｌｌ  ６巻：１８７３〜１８７９頁）。このドメインは、迅速に折り畳まれ、三量体形成し、ミスフォールディング中間体または経路を外れた（ｏｆｆ−ｐａｔｈｗａｙ）オリゴマー形成産物の機会を低下させる（Ｇｕｔｈｅ，  Ｓ．ら（２００４年）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３３７巻：９０５〜９１５頁）。フォルドンドメインは、非常に安定的であり、＞１０％ＳＤＳ、６．０Ｍ塩酸グアニジンまたは８０℃において三次構造およびオリゴマー形成を維持することができ（Ｂｈａｒｄｗａｊ，  Ａ．，ら（２００８年）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  １７巻：１４７５〜１４８５頁；Ｂｈａｒｄｗａｊ，  Ａ．，ら（２００７年）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３７１巻：３７４〜３８７頁）、フォルドンドメインに融合された配列の安定性を改善することができる（Ｄｕ，  Ｃ．ら（２００８年）Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ７９巻：１９５〜２０２頁）。
【０１４３】
一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸドメインのＣ末端は、フォルドンドメインのＮ末端に連結される。他の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸドメインのＮ末端は、フォルドンドメインのＮ末端に連結される。さらに他の実施形態（ｅｍｏｄｉｍｅｎｔ）において、Ｈ−ＮＯＸドメインのＣ末端は、フォルドンドメインのＣ末端に連結される。一部の実施形態（ｅｍｏｄｉｍｅｎｔ）において、Ｈ−ＮＯＸドメインのＮ末端は、フォルドンドメインのＣ末端に連結される。
【０１４４】
一部の実施形態において、リンカーが使用されて、フォルドンドメインをＨ−ＮＯＸドメインに繋ぐ。一部の実施形態において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１個以上のアミノ酸のうちいずれか１種を含むリンカーを、重合ドメインおよびＨ−ＮＯＸドメインの間に置くことができる。例示的なリンカーとして、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−ＧｌｙおよびＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカーが挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態において、本発明は、Ｎ末端からＣ末端へと：Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙアミノ酸リンカーおよびフォルドンドメインを含む、三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を提供する。一部の実施形態において、本発明は、Ｎ末端からＣ末端へと：Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙアミノ酸リンカー、フォルドンドメイン、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒアミノ酸リンカーおよびＨｉｓ６タグを含む、三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を提供する。一部の実施形態において、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸドメインは、Ｌ１４４Ｆ変異を含む。一部の実施形態において、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸドメインは、Ｗ９Ｆ変異およびＬ１４４Ｆ変異を含む。一部の実施形態において、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸドメインは、野生型Ｈ−ＮＯＸドメインである。
【０１４５】
単量体型Ｈ−ＮＯＸドメインサブユニット
一態様において、本発明は、会合して、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を形成することができる、組換え単量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質（即ち、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質の単量体型Ｈ−ＮＯＸサブユニット）を提供する。一部の実施形態において、本発明は、本明細書に記載されているＨ−ＮＯＸドメインおよび重合ドメインを含む、組換えＨ−ＮＯＸタンパク質を提供する。Ｈ−ＮＯＸドメインおよび重合ドメインは、共有結合により連結または非共有結合により連結され得る。一部の実施形態において、組換え単量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＨ−ＮＯＸドメインのＣ末端は、重合ドメインのＮ末端に連結される。他の実施形態において、組換え単量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＨ−ＮＯＸドメインのＮ末端は、重合ドメインのＮ末端に連結される。さらに他の実施形態（ｅｍｏｄｉｍｅｎｔ）において、組換え単量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＨ−ＮＯＸドメインのＣ末端は、重合ドメインのＣ末端に連結される。一部の実施形態（ｅｍｏｄｉｍｅｎｔ）において、組換え単量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＨ−ＮＯＸドメインのＮ末端は、重合ドメインのＣ末端に連結される。一部の実施形態において、組換え単量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、グアニリルシクラーゼドメインを含まない。
【０１４６】
一部の実施形態において、単量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、野生型Ｈ−ＮＯＸドメインを含む。本発明の一部の実施形態において、単量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、Ｈ−ＮＯＸドメインに１個または複数の変異を含む。一部の実施形態において、１個または複数の変異は、Ｏ２解離定数、酸素に対するｋｏｆｆ、ヘム自動酸化の速度、ＮＯ反応性、ＮＯ安定性（ｓｔａｂｉｌｔｙ）または上記のうち２種以上のいずれかの組合せを、対応する野生型Ｈ−ＮＯＸドメインのそれと比較して、変更する。一部の実施形態において、変異は、遠位ポケット変異である。一部の実施形態において、変異は、遠位ポケットに存在しない変異を含む。一部の実施形態において、遠位ポケット変異は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓのＬ１４４変異に対応する（例えば、Ｌ１４４Ｆ変異）。一部の実施形態において、組換え単量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓのＷ９およびＬ１４４変異に対応する２個の遠位ポケット変異を含む（例えば、Ｗ９Ｆ／Ｌ１４４Ｆ変異）。
【０１４７】
一部の態様において、本発明は、会合して三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を形成する、組換え単量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を提供する。一部の実施形態において、組換えＨ−ＮＯＸタンパク質は、Ｈ−ＮＯＸドメインおよび三量体形成ドメインを含む。一部の実施形態において、三量体形成ドメインは、本明細書に記述されているフォルドンドメインである。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸドメインは、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸドメインである。一部の実施形態において、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸドメインのＣ末端は、フォルドンドメインのＮ末端に共有結合により連結される。一部の実施形態において、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸドメインのＣ末端は、フォルドンドメインのＣ末端に共有結合により連結される。一部の実施形態において、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓドメインは、Ｌ１４４Ｆ  Ｈ−ＮＯＸドメインである。一部の実施形態において、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓドメインは、Ｗ９Ｆ／Ｌ１４４Ｆ  Ｈ−ＮＯＸドメインである。一部の実施形態において、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓドメインは、野生型Ｈ−ＮＯＸドメインである。
【０１４８】
一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸドメインは、アミノ酸リンカー配列を使用して、重合ドメインに共有結合により連結される。一部の実施形態において、アミノ酸リンカー配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１個以上のアミノ酸の長さである。例示的なアミノ酸リンカー配列として、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ配列およびＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ配列が挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、３個のＨ−ＮＯＸドメインおよび３個の三量体形成配列を含む三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質であり、Ｈ−ＮＯＸドメインは、アミノ酸リンカー配列を介して三量体形成ドメインに共有結合により連結されている。一部の実施形態において、単量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へと、次のものを含む：Ｌ１４４Ｆ  Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙアミノ酸リンカー配列およびフォルドンドメイン。一部の実施形態において、単量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へと、次のものを含む：Ｗ９Ｆ／Ｌ１４４Ｆ  Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙアミノ酸リンカー配列およびフォルドンドメイン。一部の実施形態において、単量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へと、次のものを含む：野生型Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙアミノ酸リンカー配列およびフォルドンドメイン。
【０１４９】
一部の実施形態において、組換え単量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、タグ；例えば、Ｈｉｓ６、ＦＬＡＧ、ＧＳＴまたはＭＢＰタグを含む。一部の実施形態において、組換え単量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、Ｈｉｓ６タグを含む。一部の実施形態において、組換え単量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、タグを含まない。一部の実施形態において、タグ（例えば、Ｈｉｓ６タグ）は、アミノ酸スペーサー配列を使用して、重合ドメインに共有結合により連結される。一部の実施形態において、アミノ酸リンカー配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１個以上のアミノ酸の長さである。例示的なアミノ酸リンカー配列として、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ配列およびＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ配列が挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、３個のＨ−ＮＯＸドメイン、３個の三量体形成配列および３個のＨｉｓ６タグを含む三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質であり、Ｈ−ＮＯＸドメインは、アミノ酸リンカー配列を介して三量体形成ドメインに共有結合により連結されており、三量体形成ドメインは、アミノ酸リンカー配列を介してＨｉｓ６タグに共有結合により連結されている。一部の実施形態において、単量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へと、次のものを含む：Ｌ１４４Ｆ  Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙアミノ酸リンカー配列、フォルドンドメイン、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカー配列およびＨｉｓ６タグ。一部の実施形態において、単量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へと、次のものを含む：Ｗ９Ｆ／Ｌ１４４Ｆ  Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙアミノ酸リンカー配列、フォルドンドメイン、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカー配列およびＨｉｓ６タグ。一部の実施形態において、単量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へと、次のものを含む：野生型Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙアミノ酸リンカー配列、フォルドンドメイン、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカー配列およびＨｉｓ６タグ。
【０１５０】
一部の実施形態において、組換え単量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、配列番号６または配列番号８のアミノ酸配列を含む。
【０１５１】
野生型および変異体Ｈ−ＮＯＸタンパク質の特徴
本発明は、例えば、腫瘍低酸素に伴う免疫抑制的活性を阻害することによる、腫瘍免疫原性の増強における使用のためのＯ２担体ポリペプチドの使用を提供する。Ｏ２担体ポリペプチドの非限定的な例示的なファミリーは、Ｏ２担体ポリペプチドのＨ−ＮＯＸファミリーである。本明細書に記載されている通り、様々なＮＯおよびＯ２解離定数、Ｏ２  ｋｏｆｆ、ＮＯ反応性および安定性をもたらす、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を含む多数の多様なＨ−ＮＯＸ変異体タンパク質が作製された。実働性の血液ガスキャリアを提供するために、Ｈ−ＮＯＸタンパク質を使用して、ヘモグロビン等の内在性Ｏ２キャリアを機能的に置き換えるまたは補充することができる。一部の実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質等のＨ−ＮＯＸタンパク質は、放射線療法または化学療法に対するアジュバントとして、低酸素腫瘍組織（例えば、神経膠芽腫）へのＯ２の送達に使用される。したがって、一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、ヘモグロビン等の内在性Ｏ２キャリアと比較して、同様のまたは改善されたＯ２会合速度、Ｏ２解離速度、Ｏ２結合に対する解離定数、ＮＯ安定性、ＮＯ反応性、自動酸化速度、血漿保持時間または上記のうち２種以上のいずれかの組合せを有する。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質である。一部の実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、３個の単量体を含む三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質であり、各単量体は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｌ１４４Ｆ  Ｈ−ＮＯＸドメインおよびフォルドンドメインを含む。一部の実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、３個の単量体を含む三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質であり、各単量体は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｗ９Ｆ／Ｌ１４４Ｆ  Ｈ−ＮＯＸドメインおよびフォルドンドメインを含む。一部の実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、３個の単量体を含む三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質であり、各単量体は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ
Ｌ１４４Ｆ  Ｈ−ＮＯＸドメインおよびフォルドンドメインを含む。
【０１５２】
様々な実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を含むＨ−ＮＯＸタンパク質のＯ２に対するｋｏｆｆは、約０．１〜約２００ｓ−１、約０．１〜１００ｓ−１、約１．０〜約１６．０ｓ−１、約１．３５〜約２３．４ｓ−１、約１．３４〜約１８ｓ−１、約１．３５〜約１４．５ｓ−１、約０．２１〜約２３．４ｓ−１、約１．３５〜約２．９ｓ−１、約２〜約３ｓ−１、約５〜約１５ｓ−１または約０．１〜約１ｓ−１等、２０℃において約０．０１〜約２００ｓ−１の間である。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、２０℃において約０．６５ｓ−１以下の酸素に対するｋｏｆｆを有する（２０℃における約０．２１ｓ−１〜約０．６５ｓ−１の間等）。
【０１５３】
様々な実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を含むＨ−ＮＯＸタンパク質のＯ２に対するｋｏｎは、約６〜約６０μＭ−１ｓ−１、約６〜１２μＭ−１ｓ−１、約１５〜約６０μＭ−１ｓ−１、約５〜約１８μＭ−１ｓ−１または約６〜約１５μＭ−１ｓ−１等、２０℃において約０．１４〜約６０μＭ−１ｓ−１の間である。
【０１５４】
様々な実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を含むＨ−ＮＯＸタンパク質によるＯ２結合に対する動力学的ＫＤまたは計算されたＫＤは、約１ｎＭ〜１ｍＭ、約１μＭ〜約１０μＭまたは約１０μＭ〜約５０μＭの間である。一部の実施形態において、Ｏ２結合に対する計算されたＫＤは、２０℃において約２ｎＭ〜約２μＭ、約２μＭ〜約１ｍＭ、約１００ｎＭ〜約１μＭ、約９μＭ〜約５０μＭ、約１００μＭ〜約１ｍＭ、約５０ｎＭ〜約１０μＭ、約２ｎＭ〜約５０μＭ、約１００ｎＭ〜約１．９μＭ、約１５０ｎＭ〜約１μＭまたは約１００ｎＭ〜約２５５ｎＭ、約２０ｎＭ〜約２μＭ、２０ｎＭ〜約７５ｎＭ、約１μＭ〜約２μＭ、約２μＭ〜約１０μＭ、約２μＭ〜約９μＭまたは約１００ｎＭ〜５００ｎＭのうちいずれか１種である。一部の実施形態において、Ｏ２結合に対する動力学的ＫＤまたは計算されたＫＤは、２０℃において約１００ｎＭ未満、約８０ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約３０ｎＭ未満、約２５ｎＭ未満、約２０ｎＭ未満または約１０ｎＭ未満のうちいずれかである。
【０１５５】
様々な実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を含むＨ−ＮＯＸタンパク質によるＯ２結合に対する動力学的ＫＤまたは計算されたＫＤは、同じ条件下における（２０℃等）ヘモグロビンのそれの約０．１〜約１０倍の間または約０．５〜約２倍の間等、同じ条件下における（２０℃等）ヘモグロビンのそれの約０．０１〜約１００倍以内である。様々な実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質によるＮＯ結合に対する動力学的ＫＤまたは計算されたＫＤは、同じ条件下における（２０℃等）ヘモグロビンのそれの約０．１〜約１０倍の間または約０．５〜約２倍の間等、同じ条件下における（２０℃等）ヘモグロビンのそれの約０．０１〜約１００倍以内である。
【０１５６】
一部の実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を含むＨ−ＮＯＸタンパク質の約５０％未満、約４０％未満、約３０％未満、約１０％未満または約５％未満のうちいずれかは、２０℃における約１、約２、約４、約６、約８、約１０、約１５または約２０時間のうちいずれかのインキュベーション後に酸化される。
【０１５７】
様々な実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を含むＨ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性は、２０℃における約６００ｓ−１、５００ｓ−１、４００ｓ−１、３００ｓ−１、２００ｓ−１、１００ｓ−１、７５ｓ−１、５０ｓ−１、２５ｓ−１、２０ｓ−１、１０ｓ−１、５０ｓ−１、３ｓ−１、２ｓ−１、１．８ｓ−１、１．５ｓ−１、１．２ｓ−１、１．０ｓ−１、０．８ｓ−１、０．７ｓ−１または０．６ｓ−１未満等、２０℃における約７００ｓ−１未満である。様々な実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性は、２０℃における約０．５〜約４００ｓ−１、約０．５〜約１００ｓ−１、約０．５〜約５０ｓ−１、約０．５〜約１０ｓ−１、約１〜約５ｓ−１または約０．５〜約２．１ｓ−１の間等、２０℃における約０．１〜約６００ｓ−１の間である。様々な実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質の反応性は、２０℃において等の同じ条件下におけるヘモグロビンのそれよりも少なくとも約１０、１００、１，０００または１０，０００倍低い。
【０１５８】
様々な実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を含むＨ−ＮＯＸタンパク質のヘム自動酸化の速度は、３７Ｃにおける約０．９ｈ−１未満、約０．８ｈ−１未満、約０．７ｈ−１未満、約０．６ｈ−１未満、約０．５ｈ−１未満、約０．４ｈ−１未満、約０．３ｈ−１未満、約０．２ｈ−１未満、約０．１ｈ−１未満または約０．０５ｈ−１未満のうちいずれか等、３７℃における約１．０ｈ−１未満である。様々な実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のヘム自動酸化の速度は、３７℃における約０．００６〜約１．０ｈ−１、０．００６〜約０．９ｈ−１または約０．０６〜約０．５ｈ−１等、３７℃における約０．００６〜約５．０ｈ−１の間である。
【０１５９】
様々な実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を含む変異体Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、（ａ）Ｏ２またはＮＯ解離定数、会合速度（Ｏ２またはＮＯに対するｋｏｎ）または解離速度（Ｏ２またはＮＯに対するｋｏｆｆ）がヘモグロビンのそれの２桁以内である、（ｂ）ＮＯ親和性が、それぞれｓＧＣ  β１のＮＯ親和性よりも弱い（例えば、少なくとも約１０倍、１００倍または１０００倍弱い）、（ｃ）結合したＯ２とのＮＯ反応性が、ヘモグロビンのものよりも少なくとも１０００倍低い、（ｄ）ｉｎ  ｖｉｖｏ血漿保持時間が、ヘモグロビンのｉｎ  ｖｉｖｏ血漿保持時間よりも少なくとも２、１０、１００または１０００倍高い、あるいは（ｅ）上記のうち２種以上のいずれかの組合せを有する。
【０１６０】
例示的な適したＯ２キャリアは、ヘモグロビンの解離定数の２桁以内、即ち、ヘモグロビンの解離定数の約０．１〜１０倍の間または約０．５〜２倍の間等、約０．０１〜１００倍の間の解離定数をもたらす。本明細書に記載されている技法（特に解離定数の測定に関して、それぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｏｏｎ，  Ｅ．  Ｍ．ら（２００５年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．１巻：５３〜５９頁；Ｂｏｏｎ，  Ｅ．  Ｍ．ら（２００５年１０月）Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．９巻（５号）：４４１〜４４６頁；Ｂｏｏｎ，  Ｅ．  Ｍ．ら（２００５年）Ｊ．
Ｉｎｏｒｇ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．９９巻（４号）：８９２〜９０２頁）、Ｖａｎｄｅｇｒｉｆｆ，  Ｋ．  Ｄ．ら（２００４年８月１５日）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．３８２巻（Ｐｔ  １）：１８３〜１８９頁）と共に当業者に公知の技法等、種々の確立された技法を使用して、解離定数を定量化することができる。例示的なＯ２キャリアは、ヘモグロビンのＮＯ反応性よりも低いＮＯ反応性等、結合したＯ２を有するＨ−ＮＯＸタンパク質の低いまたは最小化されたＮＯ反応性をもたらす。一部の実施形態において、上記ＮＯ反応性は、ヘモグロビンのＮＯ反応性よりも少なくとも約１０、１００、１，０００または１０，０００倍低い等、さらにより低い。種々の確立された技法（特にＮＯ反応性の測定に関して、それぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｏｏｎ，  Ｅ．  Ｍ．ら（２００５年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．１巻：５３〜５９頁；Ｂｏｏｎ，  Ｅ．  Ｍ．ら（２００５年１０月）Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．９巻（５号）：４４１〜４４６頁；Ｂｏｏｎ，  Ｅ．  Ｍ．ら（２００５年）Ｊ．  Ｉｎｏｒｇ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．９９巻（４号）：８９２〜９０２頁）、Ｖａｎｄｅｇｒｉｆｆ，  Ｋ．  Ｄ．ら（２００４年８月１５日）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．３８２巻（Ｐｔ  １）：１８３〜１８９頁）と共に当業者に公知の技法を使用して、ＮＯ反応性を定量化することができる。野生型Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸは、このように低いＮＯ反応性を有するため、他の野生型Ｈ−ＮＯＸタンパク質および変異体Ｈ−ＮＯＸタンパク質も同様の低いＮＯ反応性を有し得る。例えば、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ
Ｈ−ＮＯＸ  Ｙ１４０Ｈは、野生型Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸのＮＯ反応性と同様のＮＯ反応性を有する。
【０１６１】
加えて、適したＯ２キャリアは、高いまたは最大化された安定性、特に、ｉｎ  ｖｉｖｏ安定性をもたらす。酸化的安定性（例えば、自動酸化またはＮＯによる酸化に対する安定性）、温度安定性およびｉｎ  ｖｉｖｏ安定性等、種々の安定性測定基準（ｍｅｔｒｉｃ）を使用することができる。本明細書に記載されている技法（Ｂｏｏｎ，  Ｅ．  Ｍ．ら（２００５年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．１巻：５３〜５９頁；Ｂｏｏｎ，  Ｅ．  Ｍ．ら（２００５年１０月）Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．９巻（５号）：４４１〜４４６頁；Ｂｏｏｎ，  Ｅ．  Ｍ．ら（２００５年）Ｊ．  Ｉｎｏｒｇ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．９９巻（４号）：８９２〜９０２頁）と共に当業者に公知の技法等、種々の確立された技法を使用して、安定性を定量化することができる。血漿、血液または組織におけるｉｎ  ｖｉｖｏ安定性に関して、安定性の例示的な測定基準は、保持時間、クリアランスの速度および半減期を含む。好熱性生物由来のＨ−ＮＯＸタンパク質は、高温で安定的であると予想される。様々な実施形態において、血漿保持時間は、ヘモグロビンの血漿保持時間よりも少なくとも約２、１０、１００または１０００倍長い（例えば、Ｂｏｂｏｆｃｈａｋ，  Ｋ．  Ｍ．ら（２００３年８月）Ａｍ．  Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｈｅａｒｔ  Ｃｉｒｃ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２８５巻（２号）：Ｈ５４９〜Ｈ５６１）。当業者に認められる通り、ヘモグロビンに基づく代用血液は、血漿から無細胞ヘモグロビンを除去するヘモグロビンの受容体の存在による、血漿からの無細胞ヘモグロビンの急速なクリアランスによって制限される。血漿にはＨ−ＮＯＸタンパク質の受容体が存在しないため、野生型および変異体Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、ヘモグロビンの血漿保持時間よりも長い血漿保持時間を有すると予想される。所望の場合、標準方法（本明細書に記載されている方法および当業者に公知の方法等）を使用して、Ｈ−ＮＯＸタンパク質をペグ化もしくは架橋することまたはＨ−ＮＯＸタンパク質を別のタンパク質と融合させることにより、血漿保持時間を増加させることができる。
【０１６２】
様々な実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を含むＨ−ＮＯＸタンパク質は、２０℃における約１ｎＭ〜約１ｍＭの間のＯ２解離定数および２０℃等の同じ条件下におけるヘモグロビンのＮＯ反応性よりも少なくとも約１０倍低いＮＯ反応性を有する。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、２０℃における約１ｎＭ〜約１ｍＭの間のＯ２解離定数および２０℃における約７００ｓ−１未満のＮＯ反応性（例えば、２０℃における約６００ｓ−１、５００ｓ−１、１００ｓ−１、２０ｓ−１または１．８ｓ−１未満）を有する。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、ヘモグロビンのＯ２解離定数の２桁以内のＯ２解離定数および２０℃等の同じ条件下におけるヘモグロビンのＮＯ反応性よりも少なくとも約１０倍低いＮＯ反応性を有する。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、２０℃における約０．０１〜約２００ｓ−１の間の、酸素に対するｋｏｆｆおよび２０℃等の同じ条件下におけるヘモグロビンのＮＯ反応性よりも少なくとも約１０倍低いＮＯ反応性を有する。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、２０℃における約０．６５ｓ−１未満の、酸素に対するｋｏｆｆ（２０℃における約０．２１ｓ−１〜約０．６４ｓ−１の間等）および２０℃等の同じ条件下におけるヘモグロビンのＮＯ反応性よりも少なくとも約１０倍低いＮＯ反応性を有する。本発明の一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数は、約１ｎＭ〜約１μＭ（１０００ｎＭ）、約１μＭ〜約１０μＭまたは約１０μＭ〜約５０μＭの間である。特定の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数は、２０℃における約２ｎＭ〜約５０μＭ、約５０ｎＭ〜約１０μＭ、約１００ｎＭ〜約１．９μＭ、約１５０ｎＭ〜約１μＭまたは約１００ｎＭ〜約２５５ｎＭの間である。様々な実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数は、２０℃における約２０ｎＭ〜約７５ｎＭの間等、２０℃における約８０ｎＭ未満である。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性は、２０℃等の同じ条件下におけるヘモグロビンのＮＯ反応性よりも少なくとも約１００倍低いまたは約１，０００倍低い。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性は、２０℃における約６００ｓ−１、５００ｓ−１、４００ｓ−１、３００ｓ−１、２００ｓ−１、１００ｓ−１、７５ｓ−１、５０ｓ−１、２５ｓ−１、２０ｓ−１、１０ｓ−１、５０ｓ−１、３ｓ−１、２ｓ−１、１．８ｓ−１、１．５ｓ−１、１．２ｓ−１、１．０ｓ−１、０．８ｓ−１、０．７ｓ−１または０．６ｓ−１未満等、２０℃における約７００ｓ−１未満である。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質の酸素に対するｋｏｆｆは、約０．１〜約２００ｓ−１、約０．１〜１００ｓ−１、約１．３５〜約２３．４ｓ−１、約１．３４〜約１８ｓ−１、約１．３５〜約１４．５ｓ−１、約０．２１〜約２３．４ｓ−１、約２〜約３ｓ−１、約５〜約１５ｓ−１または約０．１〜約１ｓ−１等、２０℃における０．０１〜２００ｓ−１の間である。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数は、２０℃における約１００ｎＭ〜約１．９μ���の間であり、Ｈ−ＮＯＸタンパク質の酸素に対するｋｏｆｆは、２０℃における約１．３５ｓ−１〜約１４．５ｓ−１の間である。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のヘム自動酸化の速度は、約０．９ｈ−１未満、約０．８ｈ−１未満、約０．７ｈ−１未満、約０．６ｈ−１未満、約０．５ｈ−１未満、約０．４ｈ−１未満、約０．３ｈ−１未満、約０．２ｈ−１未満または約０．１ｈ−１未満のうちいずれか等、３７℃における約１ｈ−１未満である。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質の酸素に対するｋｏｆｆは、２０℃における約１．３５ｓ−１〜約１４．５ｓ−１の間であり、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のヘム自動酸化の速度は、３７℃における約１ｈ−１未満である。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質の酸素に対するｋｏｆｆは、２０℃における約１．３５ｓ−１〜約１４．５ｓ−１の間であり、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性は、２０℃における約７００ｓ−１未満である（例えば、２０℃における約６００ｓ−１、５００ｓ−１、１００ｓ−１、２０ｓ−１または１．８ｓ−１未満）。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のヘム自動酸化の速度は、３７℃における約１ｈ−１未満であり、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性は、２０℃における約７００ｓ−１未満である（例えば、２０℃における約６００ｓ−１、５００ｓ−１、１００ｓ−１、２０ｓ−１または１．８ｓ−１未満）。
【０１６３】
一部の実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質溶液を含むＨ−ＮＯＸタンパク質溶液の粘性は、１〜４センチポアズ（ｃＰ）の間である。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質溶液のコロイド膠質浸透圧は、２０〜５０ｍｍＨｇの間である。
【０１６４】
Ｏ２および／またはＮＯ結合の測定
当業者であれば、当技術分野において公知の方法および後述する非限定的な例示的な方法によって、三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質等、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を含むいずれかのＨ−ＮＯＸタンパク質の酸素および一酸化窒素結合の特徴を容易に決定することができる。
【０１６５】
動力学的ＫＤ：ｋｏｆｆのｋｏｎに対する比
重合体型Ｈ−ＮＯＳタンパク質を含む野生型および変異体Ｈ−ＮＯＸタンパク質の動力学的ＫＤ値は、特にＯ２会合速度、Ｏ２解離速度、Ｏ２結合に対する解離定数、自動酸化速度およびＮＯ解離速度の測定に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｏｏｎ，  Ｅ．Ｍ．ら（２００５年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １巻：５３〜５９頁に本質的に記載されている通りに決定される。
【０１６６】
ｋｏｎ（Ｏ２会合速度）
ヘムへのＯ２会合は、２０℃において閃光光分解を使用して測定される。非常に速い対再結合動力学の結果としてのＦｅＩＩ−Ｏ２複合体を閃光除去する（ｆｌａｓｈ  ｏｆｆ）ことは不可能である；よって、ＦｅＩＩ−ＣＯ複合体は、５６０ｎｍのレーザー光による閃光光分解に付され（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）、５配位ＦｅＩＩ中間体を産生し、これに対し、分子Ｏ２の結合が様々な波長で追跡される。タンパク質試料は、１０ｍＭ亜ジチオン酸塩による嫌気的還元と、続くＰＤ−１０カラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，  Ｉｎｃ．、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）における脱塩によって作製される。次に、１００μＬ〜１ｍＬサイズで１ｃｍ路長のガス制御（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ−ａｔｍｏｓｐｈｅｒｅ）石英キュベット内で５０ｍＭ  ＴＥＡ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５バッファーにおける２０μＭヘムへと試料を希釈する。このキュベットのヘッドスペースを通して１０分間ＣＯガスを流動させて、ＦｅＩＩ−ＣＯ複合体を形成させ、この形成をＵＶ−可視分光法により確かめる（ソーレー最大４２３ｎｍ）。次に、この試料は、１気圧のＣＯガス下のままで閃光光分解後のＣＯ−再結合動態の測定に使用される、あるいは開放して、空気中で３０分間撹拌して、閃光光分解前にバッファーを完全に酸素化して、Ｏ２再結合事象を観察する。ヘムへのＯ２会合は、時間に対して複数の波長でモニターされる。Ｉｇｏｒ  Ｐｒｏソフトウェア（Ｗａｖｅｍｅｔｒｉｃｓ，
Ｉｎｃ．、Ｏｓｗｅｇｏ、ＯＲ；最新２００５年バージョン）を使用した単一指数関数により、これらのトレースを適合させる。この速度は、観察波長に非依存性であるが、Ｏ２濃度に依存性である。全体を通してＵＶ−可視分光法が使用されて、あらゆる複合体および中間体を確認する（Ｃａｒｙ  ３Ｋ、Ｖａｒｉａｎ，  Ｉｎｃ．、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）。特に機器使用に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｄｍｏｃｈｏｗｓｋｉ，  Ｉ．  Ｊ．ら（２０００年８月３１日）Ｊ  Ｉｎｏｒｇ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．８１巻（３号）：２２１〜２２８頁に記載されている機器を使用して、一過性吸収データが収集される。この機器は、２０ｎｓの応答時間を有し、データは２００メガ試料ｓ−１でデジタル化される。
【０１６７】
ｋｏｆｆ（Ｏ２解離速度）
ｋｏｆｆを測定するために、タンパク質（５μＭヘム）のＦｅＩＩ−Ｏ２複合体を嫌気的５０ｍＭ  ＴＥＡ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５バッファーに希釈し、様々な濃度の亜ジチオン酸塩および／または飽和ＣＯガスを含有する等体積の同じバッファー（嫌気的）と迅速に混合する。２０℃に設定したＮｅｓｌａｂ  ＲＴＥ−１００恒温槽を備えるＨＩ−ＴＥＣＨ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＳＦ−６１ストップトフロー分光光度計においてデータを取得する（ＴＧＫ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＬＴＤ．、Ｂｒａｄｆｏｒｄ  Ｏｎ  Ａｖｏｎ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）。４３７ｎｍ（ＦｅＩＩ−ＦｅＩＩ−Ｏ２差スペクトルにおける最大）、または４２５ｎｍ（ＦｅＩＩ−ＦｅＩＩ−ＣＯ差スペクトルにおける最大）における吸光度の増加として、ヘムからのＯ２の解離をモニターする。機器の一部であるソフトウェアを使用して、最終トレースを単一指数関数に適合させる。各実験を最小で６回行い、得られた速度を平均化する。測定された解離速度は、亜ジチオン酸塩濃度に非依存性であり、１０ｍＭ亜ジチオン酸塩の存在および非存在の両方において、還元種のトラップとしての飽和ＣＯに非依存性である。
【０１６８】
動力学的ＫＤ
動力学的ＫＤは、上述のｋｏｆｆおよびｋｏｎの測定値を使用して、ｋｏｆｆのｋｏｎに対する比を計算することにより決定される。
【０１６９】
計算されたＫＤ
計算されたＫＤを測定するために、上述の通りに得られるｋｏｆｆおよび動力学的ＫＤの値をグラフにする。ｋｏｆｆおよび動力学的ＫＤの間の直線関係性は、等式（ｙ＝ｍｘ＋ｂ）によって定義される。次に、Ｅｘｃｅｌ：ＭＡＣ  ２００４（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ、Ｒｅｄｍｏｎｄ、ＷＡ）を使用して、ｋｏｆｆ値を線に沿って内挿して、計算されたＫＤを導く。測定されたｋｏｎの非存在下において、この内挿は、ｋｏｆｆをＫＤに関係付ける仕方をもたらす。
【０１７０】
自動酸化の速度
自動酸化の速度を測定するために、タンパク質試料を嫌気的に還元し、続いて好気的５０ｍＭ  ＴＥＡ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５バッファーにおける５μＭヘムへと希釈した。次に、３７℃に設定したＮｅｓｌａｂ  ＲＴＥ−１００恒温槽を備えるＣａｒｙ
３Ｅ分光光度計において、これらの試料をインキュベートし、定期的に走査する（Ｃａｒｙ  ３Ｅ、Ｖａｒｉａｎ，  Ｉｎｃ．、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）。自動酸化の速度は、Ｅｘｃｅｌ：ＭＡＣ  ２００４（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ、Ｒｅｄｍｏｎｄ、ＷＡ）を使用して、時間に対してプロットされ、単一指数関数と適合されたＦｅＩＩＩ−ＦｅＩＩ差スペクトルの最大および最小の間の差から決定される。
【０１７１】
ＮＯとの反応速度
ＮＯ反応性は、バッファーＡにおいて２μＭとなるよう調製された精製タンパク質（Ｈ−ＮＯＸ、重合体型Ｈ−ＮＯＸ、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓヘモグロビン（Ｈｓ  Ｈｂ）等）およびバッファーＡにおいて２００μＭとなるよう調製されたＮＯを使用して測定される（バッファーＡ：５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．５、５０ｍＭ  ＮａＣｌ）。２０℃に設定したＮｅｓｌａｂ  ＲＴＥ−１００恒温槽を備えるＨＩ−ＴＥＣＨ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＳＦ−６１ストップトフロー分光光度計において、データを取得する（ＴＧＫ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＬＴＤ．、Ｂｒａｄｆｏｒｄ  Ｏｎ  Ａｖｏｎ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）。０．００１２５秒の積分時間を伴い、タンパク質をＮＯと１：１比で迅速に混合する。ＮＯによる酸化の律速段階を本質的に測定して、分光計の一部であるソフトウェアを使用して、最大変化の波長を単一指数関数に適合させる。反応の最終産物は、ＨＮＯＸタンパク質に関しては三価鉄（ｆｅｒｒｉｃ）−ＮＯであり、Ｈｓ  Ｈｂに関しては三価鉄−水和（ａｑｕｏ）である。
【０１７２】
ｐ５０測定
所望の場合、特にｐ５０値の測定に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｕａｒｎｏｎｅ，  Ｒ．ら（１９９５年９月／１０月）Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ  ８０巻（５号）：４２６〜４３０頁に記載されている通り、変異体または野生型Ｈ−ＮＯＸタンパク質のｐ５０値を測定することができる。ｐ５０値は、ＨｅｍＯｘ分析計を使用して決定される。測定チャンバーは、０％酸素で開始し、１００％酸素に向けてゆっくりと徐々に上げる。チャンバーにおける酸素プローブは、酸素飽和％を測定する。第２のプローブ（ＵＶ−Ｖｉｓ光）は、ヘムタンパク質（例えば、ヘムと複合体形成したＨ−ＮＯＸ等のタンパク質）ＵＶ−Ｖｉｓスペクトルのアルファおよびベータピークに調整される、吸収の２波長を測定する。これらの吸収ピークは、ヘムタンパク質が酸素に結合するにつれて直線的に増加する。次に、非結合から１００％結合へのパーセント変化を％酸素値に対しプロットして、曲線を作成する。ｐ５０は、ヘムタンパク質の５０％が酸素に結合する、曲線上の点である。
【０１７３】
詳細には、Ｈｅｍｏｘ分析計（ＴＣＳ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｎｅｗ  Ｈｏｐｅ、ＰＡ）は、５０μＬの血液またはヘムタンパク質を増加する酸素分圧に曝露し、これを窒素ガスで脱酸素化することにより、オキシヘムタンパク質解離曲線（ＯＤＣ）を決定する。Ｃｌａｒｋ酸素電極は、酸素圧の変化を検出し、これをｘ−ｙ記録計のｘ軸に記録する。５６０ｎｍおよび５７６ｎｍの二重波長分光光度法によって、得られたオキシヘムタンパク質画分の増加を同時にモニターし、ｙ軸に表示する。前内側（ａｎｔｅｍｅｄｉａｌ）静脈から血液試料を採取し、ヘパリンで抗凝固剤処置し、アッセイするまで湿った氷上で４℃にて維持する。溶液のｐＨを７．４±０．０１の値に維持する製造業者提供のバッファーである５μＬのＨｅｍｏｘ溶液に、５０μＬの全血を希釈する。Ｈｅｍｏｘ分析計の一部であるキュベットに試料−バッファーを引き入れ、混合物の温度を平衡化し、３７℃にする；次に、試料を空気により１００％まで酸素化する。ｐＯ２値の調整後に、試料を窒素で脱酸素化する；脱酸素化プロセスの間に、曲線をグラフ用紙に記録する。Ｈｅｍｏｘ分析計の一部であるソフトウェアを使用して、Ｏ２飽和が５０％である点として、Ｐ５０値をｘ軸に外挿する。完全な記録に要求される時間は、およそ３０分間である。
【０１７４】
Ｈ−ＮＯＸ核酸
本発明は、また、本明細書に記載されている変異体Ｈ−ＮＯＸタンパク質、重合体型Ｈ−ＮＯＸまたは組換え単量体Ｈ−ＮＯＸタンパク質サブユニットのうちいずれかをコードする核酸を特色とする。
【０１７５】
特定の実施形態において、核酸は、Ｈ−ＮＯＸタンパク質またはＨ−ＮＯＸドメインをコードする核酸のうちいずれかのセグメントまたはその核酸配列全体を含む。一部の実施形態において、核酸は、Ｈ−ＮＯＸ核酸由来の少なくとも約５０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００個以上の連続ヌクレオチドを含み、これが由来するＨ−ＮＯＸ核酸と比較して、１個または複数の変異（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の変異）を含有する。様々な実施形態において、変異体Ｈ−ＮＯＸ核酸は、これが由来するＨ−ＮＯＸ核酸と比較して、約２０、１５、１２、１０、９、８、７、６、５、４、３または２個未満の変異を含有する。本発明は、また、変異体Ｈ−ＮＯＸタンパク質をコードするいずれかの核酸の縮重バリアントを特色とする。
【０１７６】
一部の実施形態において、核酸は、２個以上のＨ−ＮＯＸドメインをコードする核酸を含む。一部の実施形態において、２個以上のＨ−ＮＯＸドメインを含む核酸は、該核酸から重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質が発現されるように連結される。さらなる実施形態において、核酸は、１個または複数の重合ドメインをコードする核酸を含む。一部の実施形態において、２個以上のＨ−ＮＯＸドメインおよび１個または複数の重合ドメインを含む核酸は、該核酸から重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質が発現されるように連結される。
【０１７７】
一部の実施形態において、核酸は、重合ドメインをコードするいずれかの核酸のセグメントまたは該核酸の核酸配列全体を含む。一部の実施形態において、核酸は、Ｈ−ＮＯＸドメインおよび重合ドメインをコードする核酸を含む。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸドメインをコードする核酸および重合ドメインをコードする核酸は、産生されたポリペプチドが、Ｈ−ＮＯＸドメインおよび重合ドメインを含む融合タンパク質となるように連結される。
【０１７８】
一部の実施形態において、核酸は、１個または複数のＨｉｓ６タグをコードする核酸を含む。一部の実施形態において、核酸は、Ｈ−ＮＯＸドメイン、重合ドメインおよび／またはＨｉｓ６タグをコードする核酸の間に位置する、リンカー配列をコードする核酸をさらに含む。
【０１７９】
一部の実施形態において、本発明は、Ｈ−ＮＯＸドメインおよびフォルドンドメインをコードする核酸を提供する。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸドメインは、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  Ｈ−ＮＯＸドメインである。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸドメインは、野生型Ｔ．ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  Ｈ−ＮＯＸドメインである。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸドメインは、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  Ｌ１４４Ｆ  Ｈ−ＮＯＸドメインである。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸドメインは、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  Ｗ９Ｆ／Ｌ１４４Ｆ  Ｈ−ＮＯＸドメインである。
【０１８０】
一部の実施形態において、本発明は、５’から３’へと、次のもの：Ｌ１４４Ｆ  Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙアミノ酸リンカー配列およびフォルドンドメインをコードする核酸を提供する。一部の実施形態において、本発明は、５’から３’へと、次のもの：Ｗ９Ｆ／Ｌ１４４Ｆ  Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙアミノ酸リンカー配列およびフォルドンドメインをコードする核酸を提供する。一部の実施形態において、本発明は、５’から３’へと、次のもの：野生型Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙアミノ酸リンカー配列およびフォルドンドメインをコードする核酸を提供する。
【０１８１】
一部の実施形態において、本発明は、５’から３’へと、次のもの：Ｌ１４４Ｆ  Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙアミノ酸リンカー配列、フォルドンドメイン、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカー配列およびＨｉｓ６タグをコードする核酸を提供する。一部の実施形態において、本発明は、５’から３’へと、次のもの：Ｗ９Ｆ／Ｌ１４４Ｆ  Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙアミノ酸リンカー配列、フォルドンドメイン、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカー配列およびＨｉｓ６タグをコードする核酸を提供する。一部の実施形態において、本発明は、５’から３’へと、次のもの：野生型Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙアミノ酸リンカー配列、フォルドンドメイン、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカー配列およびＨｉｓ６タグをコードする核酸を提供する。
【０１８２】
一部の実施形態において、核酸は、配列番号５または配列番号７に示される核酸配列を含む。
【０１８３】
本発明は、また、本明細書に記載されている変異体Ｈ−ＮＯＸタンパク質をコードする少なくとも１種の核酸を含有する細胞または細胞の集団を含む。例示的な細胞として、昆虫細胞、植物細胞、酵母細胞、細菌細胞および哺乳動物細胞が挙げられる。これらの細胞は、本明細書に記載されている方法等、標準方法を使用した変異体Ｈ−ＮＯＸタンパク質の産生に有用である。
【０１８４】
一部の実施形態において、本発明は、Ｈ−ＮＯＸドメインおよびフォルドンドメインをコードする核酸を含む細胞を提供する。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸドメインは、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  Ｈ−ＮＯＸドメインである。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸドメインは、野生型Ｔ．ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  Ｈ−ＮＯＸドメインである。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸドメインは、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  Ｌ１４４Ｆ  Ｈ−ＮＯＸドメインである。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸドメインは、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  Ｗ９Ｆ／Ｌ１４４Ｆ  Ｈ−ＮＯＸドメインである。一部の実施形態において、本発明は、配列番号５または配列番号７に示される核酸配列を含む核酸を含む細胞を提供する。
【０１８５】
Ｈ−ＮＯＸタンパク質の製剤
本発明は、例えば、腫瘍低酸素に伴う免疫抑制的活性を阻害することによる、腫瘍免疫原性の増強における使用のためのＯ２担体ポリペプチドの製剤を提供する。Ｏ２担体ポリペプチドの非限定的な例示的なファミリーは、Ｏ２担体ポリペプチドのＨ−ＮＯＸファミリーである。本明細書に記載されている重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を含むいずれかの野生型または変異体Ｈ−ＮＯＸタンパク質を、医薬組成物または非医薬組成物の製剤に使用することができる。一部の実施形態において、製剤は、単量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質がｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで会合して、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を産生するように、Ｈ−ＮＯＸドメインおよび重合ドメインを含む単量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を含む。さらに後述する通り、これらの製剤は、種々の治療上および産業上の利用において有用である。
【０１８６】
一部の実施形態において、医薬組成物は、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を含む本明細書に記載されている１種または複数の野生型または変異体Ｈ−ＮＯＸタンパク質と、薬学的に許容されるキャリアまたは賦形剤とを含む。薬学的に許容されるキャリアまたは賦形剤の例として、リン酸緩衝食塩水溶液、水、油／水エマルション等のエマルションおよび様々な種類の湿潤剤等、標準医薬品キャリアまたは賦形剤のうちいずれかが挙げられるがこれらに限定されない。エアロゾルまたは非経口的投与のための例示的な希釈剤は、リン酸緩衝食塩水またはノーマル（０．９％）セーラインである。このようなキャリアを含む組成物は、周知の従来方法によって製剤化される（例えば、特に製剤に関して、それぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、Ａ．  Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｍａｃｋ
Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、１９９０年；およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ，  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２０版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、２０００年を参照）。一部の実施形態において、製剤は、滅菌されている。一部の実施形態において、製剤は、エンドトキシンを本質的に含まない。
【０１８７】
本発明の医薬組成物において、当業者に公知のいかなる適したキャリアを用いることもできるが、キャリアの種類は、投与モードに応じて変動する。例えば、静脈内、動脈内、小胞内、腫瘍内、吸入、腹腔内、肺内、筋肉内、皮下、気管内、経粘膜、眼内、髄腔内または経皮投与を含むいずれかの適切な投与様式のために、組成物を製剤化することができる。皮下注射等の非経口的投与のために、キャリアは、例えば、水、食塩水、アルコール、脂肪、ワックスまたはバッファーを含むことができる。経口投与のために、上述のキャリアまたはマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース、グルコース、スクロースもしくは炭酸マグネシウム等の固体キャリアのうちいずれかを用いることができる。生分解性マイクロスフェア（例えば、ポリラクテート、ポリグリコレート）をキャリアとして使用することもできる。
【０１８８】
一部の実施形態において、医薬組成物または非医薬組成物は、バッファー（例えば、中性緩衝食塩水、リン酸緩衝食塩水等）、炭水化物（例えば、グルコース、マンノース、スクロース、デキストラン等）、抗酸化剤、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ、グルタチオン等）、保存料、酸素の結合および／または輸送に有用な別の化合物、不活性成分（例えば、安定剤、充填剤等）または上記のうち２種以上の組合せを含む。一部の実施形態において、組成物は、凍結乾燥物として製剤化される。Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、周知の技術を使用して、リポソームまたはナノ粒子内にカプセル封入することもできる。Ｈ−ＮＯＸタンパク質に使用することができる他の例示的な製剤は、例えば、特にタンパク質の製剤に関して、それぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，９７４，７９５号および同第６，４３２，９１８号に記載されている。
【０１８９】
本明細書に記載されている組成物は、徐放製剤（例えば、投与後に化合物の緩慢放出を生じるカプセルまたはスポンジ等の製剤）の一部として投与することができる。このような製剤は、一般に、周知の技術を使用して調製し、例えば、経口、直腸もしくは皮下植え込みによってまたは所望の標的部位における植え込みによって投与することができる。徐放製剤は、キャリアマトリックス中に分散されたおよび／または速度制御膜に囲まれたリザーバー内に含有されたＨ−ＮＯＸタンパク質を含有することができる。このような製剤内における使用のためのキャリアは、生体適合性であり、生分解性となることもできる。一部の実施形態において、製剤は、相対的に一定レベルのＨ−ＮＯＸタンパク質放出をもたらす。徐放製剤内に含有されるＨ−ＮＯＸタンパク質の量は、植え込み部位、放出の速度および予想される持続時間ならびに処置または防止しようとする状態の性質に依存する。
【０１９０】
一部の実施形態において、医薬組成物は、有効量の野生型または変異体Ｈ−ＮＯＸタンパク質を含有する。一部の実施形態において、医薬組成物は、２個以上の野生型または変異体Ｈ−ＮＯＸドメインを含む有効量の重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を含有する。一部の実施形態において、医薬組成物は、本明細書に記載されている野生型または変異体Ｈ−ＮＯＸドメインおよび重合ドメインを含む有効量の組換え単量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を含有する。一部の実施形態において、製剤は、３個の単量体を含む三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を含み、各単量体は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｌ１４４Ｆ  Ｈ−ＮＯＸドメインおよびフォルドンドメインを含む。一部の実施形態において、製剤は、３個の単量体を含む三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を含み、各単量体は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｗ９Ｆ／Ｌ１４４Ｆ  Ｈ−ＮＯＸドメインおよびフォルドンドメインを含む。一部の実施形態において、製剤は、３個の単量体を含む三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を含み、各単量体は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｌ１４４Ｆ  Ｈ−ＮＯＸドメインおよびフォルドンドメインを含む。一部の実施形態では、本製剤は、３個の単量体を含むペグ化三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を含み、各単量体は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｌ１４４Ｆ  Ｈ−ＮＯＸドメインおよびフォルドンドメインを含む。一部の実施形態では、本医薬組成物は、腫瘍免疫のモジュレート（例えば、腫瘍に対する免疫応答の増強）に有効な量のＯ２担体ポリペプチド（例えば、Ｈ−ＮＯＸタンパク質）を含む。
【０１９１】
一部の実施形態において、ヒトへの投与のための有効量のＨ−ＮＯＸタンパク質は、数グラム〜約３５０グラム超の間である。Ｈ−ＮＯＸタンパク質の他の例示的な用量は、約０．５ｍｌ／分等の適切な注入速度における約４．４、約５、約１０または約１３Ｇ／ＤＬ（Ｇ／ＤＬは、循環への注入前のＨ−ＮＯＸタンパク質溶液の濃度である）のうちいずれかを含む（例えば、Ｗｉｎｓｌｏｗ，  Ｒ．、第１２章、Ｂｌｏｏｄ  Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｓを参照）。複数の投与の効果の組み合わせによって必要な有効量に達することができるため、各剤形の個々の用量に含有される活性成分の単位含有量それ自体が、有効量を構成する必要がないことが認められよう。医薬組成物に含まれるＨ−ＮＯＸタンパク質の量の選択は、当該分野の当業者の決定に従って、利用される剤形、処置されている状態および達成しようとする特定の目的に依存する。
【０１９２】
例示的な組成物は、単離または精製することができる、遺伝子操作された組換えＨ−ＮＯＸタンパク質を含み、該Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、対応する野生型Ｈ−ＮＯＸタンパク質と比べて、変更されたＯ２またはＮＯリガンド結合をまとめて付与する１個または複数の変異を含み、生理学的に適合性の哺乳動物血液ガスキャリアとして働く。例えば、本明細書に記載されている変異体Ｈ−ＮＯＸタンパク質。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質である。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、本明細書に記載されている野生型または変異体Ｈ−ＮＯＸドメインおよび重合ドメインを含む組換え単量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質である。一部の実施形態において、組成物は、３個の単量体を含む三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を含み、各単量体は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｌ１４４Ｆ  Ｈ−ＮＯＸドメインおよびフォルドンドメインを含む。一部の実施形態において、組成物は、３個の単量体を含む三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を含み、各単量体は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｗ９Ｆ／Ｌ１４４Ｆ  Ｈ−ＮＯＸドメインおよびフォルドンドメインを含む。一部の実施形態において、組成物は、３個の単量体を含む三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を含み、各単量体は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｌ１４４Ｆ  Ｈ−ＮＯＸドメインおよびフォルドンドメインを含む。一部の実施形態では、本組成物は、３個の単量体を含むペグ化三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を含み、各単量体は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｌ１４４Ｆ  Ｈ−ＮＯＸドメインおよびフォルドンドメインを含む。
【０１９３】
医薬組成物を投与されたヒト被験体における免疫応答を低下または防止するために、ヒトＨ−ＮＯＸタンパク質もしくはドメイン（野生型ヒトタンパク質または１個もしくは複数の変異が導入されたヒトタンパク質のいずれか）または他の非抗原性Ｈ−ＮＯＸタンパク質もしくはドメイン（例えば、哺乳動物Ｈ−ＮＯＸタンパク質）を使用することができる。ヒト以外の供給源に由来するＨ−ＮＯＸタンパク質の免疫原性を低下または排除するために、Ｈ−ＮＯＸタンパク質またはＨ−ＮＯＸドメインにおけるアミノ酸を、ヒトＨ−ＮＯＸにおける対応するアミノ酸へと変異させることができる。例えば、非ヒトＨ−ＮＯＸタンパク質の三次構造の表面における１個または複数のアミノ酸を、ヒトＨ−ＮＯＸタンパク質における対応するアミノ酸へと変異させることができる。
【０１９４】
腫瘍免疫をモジュレートするための方法
一部の態様では、本発明は、腫瘍免疫をモジュレートするための方法を提供し、よってこれは、抗がん処置において使用することができる。低酸素腫瘍微小環境は、低酸素誘導性因子（ＨＩＦ−１）シグナル伝達（Ｃｏｄｏら、２０１４年、Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ、５巻（１７号）、７６５１〜７６６２頁；Ｌｅｅ，  Ｍａｃｅ，  ＆  Ｒｅｐａｓｋｙ、２０１０年、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉａ、２６巻（３号）、２３２〜２４６頁；Ｗｅｉら、２０１１年、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ、６巻（１号）、ｅ１６１９５頁）、抗腫瘍Ｔ細胞のｍｉＲＮＡエピジェネティック調節、腫瘍細胞におけるＭＨＣ１発現、ならびに腫瘍関連マクロファージおよび骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）の動員が挙げられるがこれらに限定されない複数のシグナル伝達経路をモジュレートすることにより（図１）、宿主の、免疫による抗腫瘍防御を抑制する。ＨＩＦ−１経路の低酸素活性化は、アデノシン作動性Ａ２およびＰＤ−Ｌ１経路を活性化し、次いでこれらが、ヘルパーおよびキラーＴ細胞ならびにＮＫ細胞の動員および活性化を阻害することが示された（Ｎｏｍａｎら、２０１４年、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ、２１１巻（５号）、７８１〜７９０頁；Ｏｈｔａら、２００６年、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ、１０３巻（３５号）、１３１３２〜１３１３７頁）。ＨＩＦ−１経路の低酸素活性化は、阻害性の調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）および他の骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）の動員および活性化をもたらすこともできる（Ｃｈａｔｕｒｖｅｄｉら、２０１４年、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ、１１１巻（２０号）、Ｅ２１２０〜２１２９頁；Ｃｏｒｚｏら、２０１０年、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ、２０７巻（１１号）、２４３９〜２４５３頁；Ｗｅｉら、２０１１年）。ＨＩＦ−１経路活性化は、ＭＨＣ１受容体の腫瘍での脱落（ｔｕｍｏｒ  ｓｈｅｄｄｉｎｇ）を増加させることにより、免疫系によって認識される腫瘍細胞の能力を直接的に阻害することもできる（Ｓｉｅｍｅｎｓら、２００８年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、６８巻（１２号）、４７４６〜４７５３頁）。
【０１９５】
一部の態様では、本発明は、腫瘍を有する個体における腫瘍免疫をモジュレートするための方法であって、個体に有効量のＯ２担体ポリペプチド（例えば、Ｈ−ＮＯＸタンパク質）を投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、腫瘍免疫のモジュレートは、腫瘍に対する免疫応答の増強を含む。一部の実施形態では、本発明は、個体における腫瘍への白血球浸潤を増加させるための方法であって、個体に有効量のＯ２担体ポリペプチドを投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、本発明は、個体における腫瘍へのリンパ球浸潤を増加させるための方法であって、個体に有効量のＯ２担体ポリペプチドを投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、腫瘍へのリンパ球浸潤の増加は、ＣＤ４細胞、ＣＤ８細胞またはＮＫ細胞のうち１種または複数の浸潤の増加を含む。一部の実施形態では、腫瘍免疫のモジュレートは、抗原プロセシングの増加を含む。一部の実施形態では、腫瘍免疫のモジュレートは、樹状細胞（ＤＣ）の提示能力の増加を含む。一部の実施形態では、腫瘍免疫のモジュレートは、腫瘍へのリンパ球浸潤の増加、抗原プロセシングの増加、またはＤＣ提示能力の増加のうち１種または複数を含む。一部の実施形態では、腫瘍免疫のモジュレートは、リンパ球活性化を含む。一部の実施形態では、腫瘍免疫のモジュレートは、サイトカイン分泌を含む。一部の実施形態では、Ｏ２担体ポリペプチドは、三量体型Ｔｔ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｌ１４４Ｆポリペプチドである。一部の実施形態では、Ｏ２担体ポリペプチドは、ペグ化三量体型Ｔｔ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｌ１４４Ｆポリペプチドである。
【０１９６】
本発明の一部の実施形態では、腫瘍へのリンパ球浸潤の増加は、腫瘍におけるＴｒｅｇ細胞、腫瘍関連マクロファージまたは骨髄系由来サプレッサー細胞のうち１種または複数の阻害を伴う。一部の実施形態では、腫瘍へのリンパ球浸潤の増加は、腫瘍細胞におけるＭＨＣ１発現の増加を伴う。
【０１９７】
一部の実施形態では、本発明は、個体における腫瘍中のＨＩＦ−１αの発現を減少させるための方法であって、個体に有効量のＯ２担体ポリペプチド（例えば、Ｈ−ＮＯＸタンパク質）を投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、個体へのＯ２担体ポリペプチド（例えば、Ｈ−ＮＯＸタンパク質）の有効量の投与は、ＨＩＦ−１αの発現の減少をもたらす。一部の実施形態では、ＨＩＦ−１αの発現は、Ｏ２担体ポリペプチドによる処置の非存在下におけるＨＩＦ−１αの発現と比較して約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％または約１００％超のいずれかだけ減少する。一部の実施形態では、ＨＩＦ−１αの発現は、Ｏ２担体タンパク質による処置の非存在下におけるＨＩＦ−１αの発現と比較して約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約８時間、約１０時間、約１２時間、約１６時間、約２０時間、約２４時間、約３０時間、約３６時間、約４２時間または約４８時間超のいずれかにかけて低下する。一部の実施形態では、Ｏ２担体ポリペプチドは、三量体ＴｔＨ−ＮＯＸ  Ｌ１４４Ｆポリペプチドである。一部の実施形態では、Ｏ２担体ポリペプチドは、ペグ化三量体Ｔｔ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｌ１４４Ｆポリペプチドである。
【０１９８】
一部の実施形態では、本発明は、個体における腫瘍中のＨＩＦ−１αの発現を減少させるための方法であって、個体に有効量のＯ２担体ポリペプチド（例えば、Ｈ−ＮＯＸタンパク質）を投与するステップを含む方法を提供し、ここで、ＨＩＦ−１αの発現の減少は血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）の発現の減少として測定される。一部の実施形態では、個体へのＯ２担体ポリペプチド（例えば、Ｈ−ＮＯＸタンパク質）の有効量の投与は、ＶＥＧＦの発現の減少をもたらす。一部の実施形態では、ＶＥＧＦの発現は、Ｏ２担体ポリペプチドによる処置の非存在下におけるＶＥＧＦの発現と比較して約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％または約１００％超のいずれかだけ減少する。一部の実施形態では、ＶＥＧＦの発現は、Ｏ２担体タンパク質による処置の非存在下におけるＶＥＧＦの発現と比較して約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約８時間、約１０時間、約１２時間、約１６時間、約２０時間、約２４時間、約３０時間、約３６時間、約４２時間または約４８時間超のいずれかにかけて低下する。一部の実施形態では、Ｏ２担体ポリペプチドは、三量体ＴｔＨ−ＮＯＸ  Ｌ１４４Ｆポリペプチドである。一部の実施形態では、Ｏ２担体ポリペプチドは、ペグ化三量体Ｔｔ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｌ１４４Ｆポリペプチドである。
【０１９９】
一部の実施形態では、本発明は、個体における腫瘍中のＨＩＦ−１αの発現を減少させるための方法であって、個体に有効量のＯ２担体ポリペプチド（例えば、Ｈ−ＮＯＸタンパク質）を投与するステップを含む方法を提供し、ここで、ＨＩＦ−１αの発現の減少は１型グルコーストランスポーター（Ｇｌｕｔ１）の発現の減少として測定される。一部の実施形態では、個体へのＯ２担体ポリペプチド（例えば、Ｈ−ＮＯＸタンパク質）の有効量の投与は、Ｇｌｕｔ１の発現の減少をもたらす。一部の実施形態では、Ｇｌｕｔ１の発現は、Ｏ２担体ポリペプチドによる処置の非存在下におけるＧｌｕｔ１の発現と比較して約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％または約１００％超のいずれかだけ減少する。一部の実施形態では、Ｇｌｕｔ１の発現は、Ｏ２担体タンパク質による処置の非存在下におけるＧｌｕｔ１の発現と比較して約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約８時間、約１０時間、約１２時間、約１６時間、約２０時間、約２４時間、約３０時間、約３６時間、約４２時間または約４８時間超のいずれかにかけて低下する。一部の実施形態では、Ｏ２担体ポリペプチドは、三量体ＴｔＨ−ＮＯＸ  Ｌ１４４Ｆポリペプチドである。一部の実施形態では、Ｏ２担体ポリペプチドは、ペグ化三量体Ｔｔ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｌ１４４Ｆポリペプチドである。
【０２００】
一部の実施形態では、本発明は、個体における腫瘍中のＰＤ−Ｌ１の発現を減少させるための方法であって、個体に有効量のＯ２担体ポリペプチド（例えば、Ｈ−ＮＯＸタンパク質）を投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、個体へのＯ２担体ポリペプチド（例えば、Ｈ−ＮＯＸタンパク質）の有効量の投与は、ＰＤ−Ｌ１の発現の減少をもたらす。一部の実施形態では、ＰＤ−Ｌ１の発現は、Ｏ２担体ポリペプチドによる処置の非存在下におけるＰＤ−Ｌ１の発現と比較して約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％または約１００％超のいずれかだけ減少する。一部の実施形態では、個体へのＯ２担体ポリペプチド（例えば、Ｈ−ＮＯＸタンパク質）の有効量の投与は、ＰＤ−Ｌ１のＰＤ−１との相互作用の減少をもたらす。一部の実施形態では、ＰＤ−Ｌ１のＰＤ−１との相互作用は、Ｏ２担体ポリペプチドによる処置の非存在下におけるＰＤ−Ｌ１のＰＤ−１との相互作用と比較して約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％または約１００％超のいずれかだけ減少する。一部の実施形態では、ＰＤ−Ｌ１の発現は、Ｏ２担体タンパク質による処置の非存在下におけるＰＤ−Ｌ１の発現と比較して約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約８時間、約１０時間、約１２時間、約１６時間、約２０時間、約２４時間、約３０時間、約３６時間、約４２時間または約４８時間超のいずれかにかけて低下する。一部の実施形態では、Ｏ２担体ポリペプチドは、三量体ＴｔＨ−ＮＯＸ  Ｌ１４４Ｆポリペプチドである。一部の実施形態では、Ｏ２担体ポリペプチドは、ペグ化三量体Ｔｔ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｌ１４４Ｆポリペプチドである。
【０２０１】
一部の実施形態では、本発明は、個体における腫瘍中のＡ２ＡＲの発現を減少させるための方法であって、個体に有効量のＯ２担体ポリペプチド（例えば、Ｈ−ＮＯＸタンパク質）を投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、個体へのＯ２担体ポリペプチド（例えば、Ｈ−ＮＯＸタンパク質）の有効量の投与は、Ａ２ＡＲの発現の減少をもたらす。一部の実施形態では、Ａ２ＡＲの発現は、Ｏ２担体ポリペプチドによる処置の非存在下におけるＡ２ＡＲの発現と比較して約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％または約１００％超のいずれかだけ減少する。一部の実施形態では、個体へのＯ２担体ポリペプチド（例えば、Ｈ−ＮＯＸタンパク質）の有効量の投与は、Ａ２ＡＲのアデノシンとの相互作用の減少をもたらす。一部の実施形態では、Ａ２ＡＲのアデノシンとの相互作用は、Ｏ２担体ポリペプチドによる処置の非存在下におけるＡ２ＡＲのアデノシンとの相互作用と比較して約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％または約１００％超のいずれかだけ減少する。一部の実施形態では、Ａ２ＡＲの発現は、Ｏ２担体タンパク質による処置の非存在下におけるＡ２ＡＲの発現と比較して約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約８時間、約１０時間、約１２時間、約１６時間、約２０時間、約２４時間、約３０時間、約３６時間、約４２時間または約４８時間超のいずれかにかけて低下する。一部の実施形態では、Ｏ２担体ポリペプチドは、三量体ＴｔＨ−ＮＯＸ  Ｌ１４４Ｆポリペプチドである。一部の実施形態では、Ｏ２担体ポリペプチドは、ペグ化三量体Ｔｔ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｌ１４４Ｆポリペプチドである。
【０２０２】
一部の実施形態では、本発明は、個体における腫瘍中のＨＩＦ−２αの発現を減少させるための方法であって、個体に有効量のＯ２担体ポリペプチド（例えば、Ｈ−ＮＯＸタンパク質）を投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、個体へのＯ２担体ポリペプチド（例えば、Ｈ−ＮＯＸタンパク質）の有効量の投与は、ＨＩＦ−２αの発現の減少をもたらす。一部の実施形態では、ＨＩＦ−２αの発現は、Ｏ２担体ポリペプチドによる処置の非存在下におけるＨＩＦ−２αの発現と比較して約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％または約１００％超のいずれかだけ減少する。一部の実施形態では、個体へのＯ２担体ポリペプチド（例えば、Ｈ−ＮＯＸタンパク質）の有効量の投与は、ＨＩＦ−２αの発現の減少をもたらす。一部の実施形態では、ＨＩＦ−２αの発現は、Ｏ２担体ポリペプチドによる処置の非存在下におけるＨＩＦ−２αの発現と比較して約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％または約１００％超のいずれかだけ減少する。一部の実施形態では、ＨＩＦ−２αの発現は、Ｏ２担体タンパク質による処置の非存在下におけるＨＩＦ−２αの発現と比較して約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約８時間、約１０時間、約１２時間、約１６時間、約２０時間、約２４時間、約３０時間、約３６時間、約４２時間または約４８時間超のいずれかにかけて低下する。一部の実施形態では、Ｏ２担体ポリペプチドは、三量体ＴｔＨ−ＮＯＸ  Ｌ１４４Ｆポリペプチドである。一部の実施形態では、Ｏ２担体ポリペプチドは、ペグ化三量体Ｔｔ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｌ１４４Ｆポリペプチドである。
【０２０３】
一部の実施形態では、本発明は、本明細書に記載されている方法のいずれかによって、個体における腫瘍免疫をモジュレート（例えば、腫瘍に対する免疫応答を増強）するための方法を提供する。腫瘍の例として、脳腫瘍、神経膠芽腫、骨腫瘍、膵臓腫瘍、皮膚腫瘍、頭部もしくは頸部の腫瘍、メラノーマ、肺腫瘍、子宮腫瘍、卵巣腫瘍、結腸直腸腫瘍、肛門腫瘍、肝臓腫瘍、肝細胞癌、胃腫瘍、精巣腫瘍、子宮内膜腫瘍、子宮頸部腫瘍、腟腫瘍、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、食道腫瘍、腸腫瘍、甲状腺腫瘍、副腎腫瘍、膀胱腫瘍、腎臓腫瘍、乳房腫瘍、多発性骨髄腫腫瘍、肉腫または扁平上皮腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０４】
一部の実施形態では、本発明は、本明細書に記載されている方法のいずれかによって、個体における腫瘍免疫をモジュレート（例えば、腫瘍に対する免疫応答を増強）するための方法を提供し、これにより、個体におけるがんを処置するための方法を提供する。本発明の方法によって処置され得るがんの例として、脳がん、神経膠芽腫、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭部もしくは頸部のがん、メラノーマ、肺がん、子宮がん、卵巣がん、結腸直腸がん、肛門がん、肝臓がん、肝細胞癌、胃がん、精巣がん、子宮内膜がん、子宮頸部がん、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、食道がん、腸がん、甲状腺がん、副腎がん、膀胱がん、腎臓がん、乳がん、多発性骨髄腫、肉腫または扁平上皮がんが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０５】
一部の実施形態では、本発明は、本明細書に記載されている方法のいずれかによって、個体における腫瘍免疫をモジュレートするための方法を提供する。一部の実施形態では、個体は、哺乳動物；例えば、ヒトである。一部の実施形態では、哺乳動物は、ペット、実験用研究動物または家畜である。ペット、研究動物または家畜の非限定例として、イヌ、ネコ、ウマ、サル、ウサギ、ラット、マウス、モルモット、ハムスター、ブタおよびウシが挙げられる。
【０２０６】
Ｏ２担体ポリペプチドは、静脈内、動脈内、腫瘍内、小胞内、吸入、腹腔内、肺内、筋肉内、皮下、気管内、経粘膜、眼内、髄腔内または経皮投与が挙げられるがこれらに限定されない任意の経路によって投与され得る。
【０２０７】
一部の態様では、腫瘍への酸素の持続した送達が、低酸素媒介性腫瘍免疫の阻害および腫瘍に対する免疫応答の増強に望まれる。本発明の一部の実施形態では、Ｏ２担体ポリペプチド（例えば、Ｈ−ＮＯＸタンパク質）の投与は、反復される。Ｏ２担体ポリペプチドの投与は、腫瘍に対する頑強な免疫応答が確立されるまで反復され得る。一部の実施形態では、Ｏ２担体ポリペプチドの投与は、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１２回、１４回、２０回、３０回、４０回、５０回または１００回のうち少なくともほぼいずれか１種の回数で反復される。一部の実施形態では、Ｏ２担体ポリペプチドの投与は、約２回〜約２０回の間で反復される。一部の実施形態では、Ｏ２担体ポリペプチドの投与は、約２０回〜約４０回のうちいずれか１種、約４０回〜約６０回のうちいずれか１種、約６０回〜約８０回のうちいずれか１種、約８０回〜約１００回のうちいずれか１種の間で、またはそれらの間のいずれかの回数で反復される。一部の実施形態では、Ｏ２担体ポリペプチドの投与は、約４２回〜約８４回の投与にわたり、毎日または１日２回反復される。
【０２０８】
例示的な投薬頻度として、１週間に少なくとも１、２、３、４、５、６または７回（即ち、毎日）が挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態において、Ｏ２担体ポリペプチド（例えば、Ｈ−ＮＯＸタンパク質）は、１日少なくとも２、３、４または６回投与される。一部の実施形態では、Ｏ２担体ポリペプチドは、４時間毎、８時間毎、１２時間毎、２４時間毎、４８時間毎に、または１週間に２回または１週間に３回投与される。一部の実施形態では、Ｏ２担体ポリペプチドは、１時間〜２時間、２時間〜４時間、４時間〜８時間、８時間〜１２時間または１２時間〜２４時間のうちいずれか１種で投与される。一部の実施形態では、Ｏ２担体ポリペプチドは、約１〜約１０日間の期間、４時間毎、８時間毎、１２時間毎または２４時間毎に投与される。一部の実施形態において、Ｏ２担体ポリペプチドは、例えば、数日間または数週間の期間にわたり投与することができる。一部の実施形態において、Ｏ２担体ポリペプチドは、数カ月間または数年間等、より長期間投与される。組成物の投薬頻度は、投与担当の医師の判断に基づき、処置の経過にわたり調整することができる。
【０２０９】
一部の実施形態では、Ｏ２担体ポリペプチド（例えば、Ｈ−ＮＯＸタンパク質）は、ボーラスとして投与される。一部の実施形態では、ボーラスの体積は、約１ｍＬ、約２ｍＬ、約３ｍＬ、約４ｍＬ、約５ｍＬ、約６ｍＬ、約７ｍＬ、約８ｍＬ、約９ｍＬ、約１０ｍＬ、約１５ｍＬ、約２０ｍＬ、約２５ｍＬ、約５０ｍＬ、約７５ｍＬ、または約１００ｍＬ超のいずれかである。一部の実施形態では、ボーラス用量の投与が上記の通り反復される。
【０２１０】
一部の実施形態では、Ｏ２担体ポリペプチド（例えば、Ｈ−ＮＯＸタンパク質）は注入により投与される。一部の実施形態では、注入は、約１５分間、約３０分間、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１２時間、約１６時間、約２０時間または約２４時間超のいずれかである。一部の実施形態では、注入は、約１５分間〜約３０分間、約３０分間〜約１時間、約１時間〜約２時間、約２時間〜約３時間、約３時間〜約４時間、約４時間〜約５時間、約５時間〜約６時間、約６時間〜約７時間、約７時間〜約８時間、約８時間〜約９時間、約９時間〜約１０時間、約１０時間〜約１２時間、約１２時間〜約１６時間、約１６時間〜約２０時間または約２０時間〜約２４時間のいずれかの間である。一部の実施形態では、注入速度は、約１ｍＬ／時間、約２ｍＬ／時間、約３ｍＬ／時間、約４ｍＬ／時間、約５ｍＬ／時間、約６ｍＬ／時間、約７ｍＬ／時間、約８ｍＬ／時間、約９ｍＬ／時間、約１０ｍＬ／時間、約２０ｍＬ／時間、約３０ｍＬ／時間、約４０ｍＬ／時間、約５０ｍＬ／時間、約６０ｍＬ／時間、約７０ｍＬ／時間、約８０ｍＬ／時間、約９０ｍＬ／時間、約１００ｍＬ／時間、約２００ｍＬ／時間、約３００ｍＬ／時間、約４００ｍＬ／時間、約５００ｍＬ／時間、約６００ｍＬ／時間、約７００ｍＬ／時間、約８００ｍＬ／時間、約９００ｍＬ／時間、約１０００ｍＬ／時間、約２０００ｍＬ／時間、約３０００ｍＬ／時間、約４０００ｍＬ／時間、約５０００ｍＬ／時間、約６０００ｍＬ／時間、約７０００ｍＬ／時間、約８０００ｍＬ／時間、約９０００ｍＬ／時間、約１０，０００ｍＬ／時間超またはその間の任意の速度のいずれかである。一部の実施形態では、注入は、上記の通り反復される。
【０２１１】
一部の実施形態では、Ｏ２担体ポリペプチド（例えば、Ｈ−ＮＯＸタンパク質）は、約１ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ、約９ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約１５ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ、約３５ｍｇ／ｋｇ、約４０ｍｇ／ｋｇ、約４５ｍｇ／ｋｇ、約５０ｍｇ／ｋｇ、約５５ｍｇ／ｋｇ、約６０ｍｇ／ｋｇ、約６５ｍｇ／ｋｇ、約７０ｍｇ／ｋｇ、約７５ｍｇ／ｋｇ、約８０ｍｇ／ｋｇ、約８５ｍｇ／ｋｇ、約９０ｍｇ／ｋｇ、約９５ｍｇ／ｋｇ、約１００ｍｇ／ｋｇ、約２００ｍｇ／ｋｇ、約３００ｍｇ／ｋｇ、約４００ｍｇ／ｋｇ、約５００ｍｇ／ｋｇ、約６００ｍｇ／ｋｇ、約７００ｍｇ／ｋｇ、約８００ｍｇ／ｋｇ、約９００ｍｇ／ｋｇ、約１０００ｍｇ／ｋｇ超またはその間の任意の用量のいずれかの用量で投与される。一部の実施形態では、用量は、１回または複数のボーラス投与として提供される。一部の実施形態では、用量は、１回または複数の注入として提供される。一部の実施形態では、用量は、２回以上の投与で提供される（例えば、１００ｍｇ／ｋｇの用量は、２用量の５０ｍｇ／ｋｇによって提供することができる）。
【０２１２】
本発明の一部の実施形態において、Ｏ２担体ポリペプチド（例えば、Ｈ−ＮＯＸタンパク質）は、放射線療法と組み合わせて使用される。一部の実施形態において、Ｏ２担体ポリペプチドは、放射線の投与の少なくとも１、２、３、４、５、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２または２４時間前のうちいずれかにおいて個体に投与される。一部の実施形態において、放射線は、Ｘ線照射である。一部の実施形態において、Ｘ線照射の線量は、約０．５Ｇｙ〜約７５Ｇｙのうちいずれかである。一部の実施形態において、Ｏ２担体ポリペプチド投与および放射線投与のサイクルは、１、２、３、４、５または６回のうちいずれか１種の回数、反復される。一部の実施形態において、Ｏ２担体ポリペプチド投与および放射線投与のサイクルは、約１週間、２週間、３週間、４週間、５週間または６週間のうちいずれか１種の後に反復される。一部の実施形態では、Ｏ２担体ポリペプチドおよび放射線療法の投与は、別の治療法；例えば、化学療法および／または免疫療法と併せて使用される。
【０２１３】
本発明の一部の実施形態では、Ｏ２担体ポリペプチド（例えば、Ｈ−ＮＯＸタンパク質）は、化学療法と組み合わせて使用される。一部の実施形態では、化学療法は、細胞毒である。細胞毒を含む化学療法剤は、当技術分野において公知である。一部の実施形態では、細胞毒は、アルキル化剤である。一部の実施形態では、細胞毒は、シクロホスファミドまたはテモゾロミドである。一部の実施形態では、Ｏ２担体ポリペプチドは、化学療法の投与の前に投与される。一部の実施形態では、Ｏ２担体ポリペプチドは、化学療法の投与とともに投与される。一部の実施形態では、Ｏ２担体ポリペプチドは、化学療法の投与の後に投与される。一部の実施形態では、Ｏ２担体ポリペプチドは、化学療法の投与の前に、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２または２４時間のいずれかで個体に投与されるか、または１、２、３、４、５、６または７日の間、毎日また１日２回投与される。一部の実施形態では、Ｏ２担体ポリペプチドは、化学療法の投与の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、１０、１２または２４時間のいずれかの後に個体に投与される。一部の実施形態では、Ｏ２担体ポリペプチドの投与および／または化学療法の投与は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０回または１０回超のうちいずれか１種で反復される。一部の実施形態では、Ｏ２担体ポリペプチドの投与および／または化学療法の投与は、約１週間、２週間、３週間、４週間、５週間または６週間のうちいずれか１種の後で反復される。一部の実施形態では、Ｏ２担体ポリペプチドおよび化学療法の投与は、同じ投薬サイクル上にある。一部の実施形態では、Ｏ２担体ポリペプチドおよび化学療法の投与は、異なる投薬サイクル上にある。一部の実施形態では、Ｈ−ＮＯＸおよび放射線療法の投与（ａｄｍｉｒａｔｉｏｎ）は、別の治療法；例えば、放射線療法および／または免疫療法と併せて使用される。
【０２１４】
一部の実施形態では、Ｏ２担体ポリペプチド（例えば、Ｈ−ＮＯＸタンパク質）は、免疫療法に先立ちおよび／またはこれと併せてがん患者に投与される。一部の実施形態では、免疫療法は、抗がんワクチン、養子免疫細胞療法、免疫チェックポイント調節因子を標的化する薬剤、腫瘍溶解性ウイルスまたはＢｉＴＥのうち１種または複数である。一部の実施形態では、免疫療法標的は、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１または免疫チェックポイント調節因子のうち１種または複数である。一部の実施形態では、免疫療法は、二重ＰＤ１／ＣＴＬＡ−４遮断療法である。一部の実施形態では、免疫療法は、ＰＤＬ１＋腫瘍を有する患者のためのＰＤＬ−１処置である、または二重ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１遮断である。非限定例として、抗体（例えば、ニボルマブ）等、ＰＤ−１およびＰＤＬ−１アンタゴニストが挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態（ｅｍｏｂｉｍｅｎｔ）では、チェックポイント阻害剤は、抗体（例えば、イピリムマブ（ｉｐｉｌｕｍｕｍａｂ））等、ＣＴＬＡ４アンタゴニストである。一部の実施形態では、免疫療法は、キメラ抗原受容体Ｔ細胞（例えば、ＣＡＲ−Ｔ細胞）または工学的に操作されたＴＣＲ−Ｔ細胞が挙げられるがこれらに限定されない養子Ｔ細胞療法である。一部の実施形態では、免疫療法は、二重特異性Ｔ細胞誘導法（ＢｉＴＥ）である。一部の実施形態では、免疫療法は、抗リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ−３）療法、抗Ｔ細胞免疫グロブリン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｉｎ）ムチン−３（ＴＩＭ−３）療法、抗キラー免疫グロブリン様受容体（ｒｅｃｅｐｔｏｓ）（ＫＩＲ）療法（ｔｈｅｒｅａｐｙ）、抗４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）作用／刺激性療法またはグルココルチコイド誘導性ＴＮＦＲファミリー関連遺伝子（ＧＩＴＲ）作用／刺激性療法（ｔｈｅｒｅｐｙ）のうち１種または複数を含み、これらはそれぞれ単独で、または互いに組み合わせて、および／またはＰＤ１、ＰＤＬ−１、ＣＴＬＡ−４もしくは他の療法のうち１種もしくは複数と組み合わせてよい。
【０２１５】
ＰＤ−１／ＰＤＬ−１およびＣＴＬＡ４の負の調節因子以外のチェックポイントタンパク質を標的化する治療法の非限定例として、免疫応答の正のおよび負の（チェックポイント阻害剤）調節因子の両方が挙げられ、直接的ＩＤＯ酵素活性阻害剤（例えば、ＮＬＧ９１９）、ＩＤＯエフェクター経路阻害剤（例えば、Ｄ−１−メチル−トリプトファン、インドキシモド（Ｉｎｄｏｘｉｍｏｄ）、ＮＬＧ８１８９）、ＴＤＯ（トリプトファン２，３−ジオキシゲナーゼ）阻害剤またはＩＤＯ−ＴＤＯ二重阻害剤等、ＩＤＯ（インドールアミン−２．３ジオキシゲナーゼ）経路阻害剤；リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ−３、ＣＤ２２３）抗体アンタゴニスト（例えば、ＩＭＰ３２１、ＢＭＳ−９８６０１６）；抗体（例えば、リリルマブ（ｌｉｒｉｌｕｍａｂ）、ＩＰＨ２１０１）等、キラー免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）アンタゴニスト；抗体等、Ｔ細胞免疫グロブリンムチン−３（ＴＩＭ−３）アンタゴニスト；抗体等、ＢおよびＴ細胞アテニュエータ（ＢＴＬＡ、ＣＤ２７２）アンタゴニスト；活性化／刺激抗体等、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）アゴニスト；刺激性抗体（例えば、ＢＭＳ−６６３５１３）等、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニスト；刺激性抗体（例えば、ＴＲＸ５１８）等、グルココルチコイド誘導性ＴＮＦＲファミリー関連遺伝子（ＧＩＴＲ）アゴニスト；ならびに腫瘍溶解性ウイルス等、抗体または小分子となることができる。
【０２１６】
一部の実施形態では、Ｏ２担体ポリペプチドは、免疫療法の投与の前に投与される。一部の実施形態では、Ｏ２担体ポリペプチドは、免疫療法の投与とともに投与される。一部の実施形態では、Ｏ２担体ポリペプチドは、免疫療法の投与の後に投与される。一部の実施形態では、Ｏ２担体ポリペプチドは、免疫療法の投与の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、１０、１２、２４または４８時間のいずれかの前に個体に投与される。一部の実施形態では、Ｏ２担体ポリペプチドは、免疫療法の投与の少なくとも３、４、５、６、７日またはより多くの日のいずれかの前に個体に投与される。一部の実施形態では、Ｏ２担体ポリペプチドは、免疫療法の投与の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、１０、１２、２４または４８時間のいずれかの後に個体に投与される。一部の実施形態では、Ｏ２担体ポリペプチドは、免疫療法の投与の少なくとも３、４、５、６、７日またはより多くの日のいずれかの後に個体に投与される。一部の実施形態では、Ｏ２担体ポリペプチドの投与および／または免疫療法の投与は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０回または１０回超のうちいずれか１種で反復される。一部の実施形態では、Ｏ２担体ポリペプチドの投与および／または免疫療法の投与は、約１週間、２週間、３週間、４週間、５週間または６週間のうちいずれか１種の後で反復される。一部の実施形態では、Ｏ２担体ポリペプチドおよび免疫療法の投与は、同じ投薬サイクル上にある。一部の実施形態では、Ｏ２担体ポリペプチドおよび免疫療法の投与は、異なる投薬サイクル上にある。一部の実施形態では、Ｈ−ＮＯＸおよび放射線療法の投与（ａｄｍｉｒａｔｉｏｎ）は、別の治療法；例えば、放射線療法および／または化学療法と併せて使用される。
【０２１７】
一部の実施形態では、Ｏ２担体ポリペプチド（例えば、Ｈ−ＮＯＸタンパク質）の投与の有効性は、モニターされる；例えば、腫瘍低酸素、低酸素関連腫瘍サプレッサーおよび／またはアクチベーターの発現、腫瘍関連免疫細胞および／または腫瘍細胞に対して方向付けられた免疫細胞の存在、および／または局所的（腫瘍生検、リンパ節生検）もしくは全身的（例えば、末梢血）サイトカインおよび免疫細胞プロファイルが挙げられるがこれらに限定されない。腫瘍低酸素のレベルを決定するための方法は、当技術分野において公知である。例として、１８Ｆ−フルオロミソニダゾール（ＦＭＩＳＯ）腫瘍取込み、ピモニダゾール（ｐｉｍｉｄａｚｏｌｅ）取込み、１８Ｆ−フルオロアゾマイシンアラビノシド（ＦＡＺＡ）取込み、ニトロイミダゾール取込み、銅（ＩＩ）−ジアセチル−ビス（Ｎ４−メチルチオセミカルバゾン（Ｃｕ−ＡＴＳＭ）取込み、１９Ｆ磁気共鳴画像法によるヘキサフルオロベンゼン（Ｃ６Ｆ６）取込み、１Ｈ  ＭＲＩによるヘキサメチルジシロキサン取込み、腫瘍ＨＩＦ−１α発現、腫瘍ＨＩＦ−２α発現、腫瘍ＨＩＦ−３α発現、腫瘍Ｇｌｕｔ−１発現、腫瘍ｐＨ（ｐＨ加重ＭＲＩ）ｑＢＯＬＤ、ＯＥ−ＭＲＩ、ＭＯＢＩＬＥ  ＭＲＩ腫瘍ＬＤＨＡ発現、腫瘍炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡ−９）発現、ＶＥＧＦ発現、または乳酸塩および／またはピルビン酸塩レベルのうちいずれか１種の測定が挙げられるがこれらに限定されない。上述の治療法をモニター、処置および最適化する方法の一部の実施形態では、腫瘍低酸素は、１８Ｆ−ＦＭＩＳＯ取込みによって測定される。一部の実施形態では、１８Ｆ−ＦＭＩＳＯ取込みは、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）走査、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）走査またはコンピュータ体軸断層撮影（ｃｏｍｐｕｔｅｄ
ａｘｉａｌ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）（ＣＡＴ）走査によって測定される。ＨＩＦ−１α、ＰＤ−Ｌ１およびＡ２ＡＲ等、遺伝子の発現を検出するための方法は、当技術分野において公知である；例えば、イムノアッセイ、免疫組織化学的検査、定量的ＰＣＲ、ハイブリダイゼーション（例えば、遺伝子チップ上の）その他によって為される。
【０２１８】
Ｈ−ＮＯＸタンパク質を含むキット
個体における腫瘍免疫のモジュレーションのための製造品およびキットも提供される。一部の実施形態において、製造品またはキットは、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質およびペグ化重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を含む本明細書に記載されているＨ−ＮＯＸタンパク質のいずれかを含むＯ２担体ポリペプチドのうちいずれかと、適したパッケージングとを含む。一部の実施形態において、本発明は、（ｉ）Ｈ−ＮＯＸタンパク質（本明細書に記載されている野生型もしくは変異体Ｈ−ＮＯＸタンパク質または本明細書に記載されているその製剤等）と、（ｉｉ）個体へのＯ２の送達にキットを使用するための指示とを有するキットを含む。
【０２１９】
本明細書に記載されている組成物に適したパッケージングは、当技術分野において公知であり、例えば、バイアル（例えば、密封されたバイアル）、容器、アンプル、瓶、ジャー、可撓性パッケージング（例えば、密封されたＭｙｌａｒまたはプラスチック袋）などを含む。これらの製造品は、さらに滅菌および／または密封されていてよい。本明細書に記載されている組成物を含む単位剤形も提供される。これらの単位剤形は、適したパッケージングにおいて単一または複数の単位投薬量で貯蔵することができ、さらに滅菌および密封することもできる。本発明のキットに供給される指示は、典型的には、ラベルまたは添付文書における書面の指示である（例えば、キットに含まれる紙面）が、機械可読指示（例えば、磁気または光学式記憶ディスクに入力された指示）も許容される。Ｈ−ＮＯＸタンパク質の使用に関する指示は、一般に、企図される処置または産業使用のための投薬量、投薬スケジュールおよび投与経路に関する情報を含む。キットは、処置に適した個体の選択に関する記述をさらに含むことができる。
【０２２０】
容器は、単位用量、バルクパッケージ（例えば、マルチ用量パッケージ）またはサブユニット用量であってよい。例えば、約１週間、約２週間、約３週間、約４週間、約６週間、約８週間、約３カ月間、約４カ月間、約５カ月間、約６カ月間、約７カ月間、約８カ月間、約９カ月間以上のうちいずれか等、延長された期間個体に有効な処置を提供するのに十分な投薬量の本明細書に開示されているＨ−ＮＯＸタンパク質を含有するキットを提供することもできる。キットは、Ｈ−ＮＯＸタンパク質の複数の単位用量および使用のための指示を含み、薬局、例えば、病院内薬局および調剤薬局における貯蔵および使用に十分な含量でパッケージされ得る。一部の実施形態において、キットは、再構成、再懸濁または再度水分補給させて、一般にＨ−ＮＯＸタンパク質の安定的な水性懸濁液を形成することができる乾燥（例えば、凍結乾燥した）組成物を含む。
【０２２１】
Ｈ−ＮＯＸタンパク質の産生のための例示的な方法
上に記す通り、数種類の野生型Ｈ−ＮＯＸタンパク質および核酸の配列は公知であり、本発明の変異体Ｈ−ＮＯＸドメインおよび核酸の作製に使用することができる。組換えＨ−ＮＯＸタンパク質の変異、発現および精製のための技法は、例えば、特に組換えＨ−ＮＯＸタンパク質の変異、発現および精製に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｏｏｎ，  Ｅ．Ｍ．ら（２００５年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １巻：５３〜５９頁およびＫａｒｏｗ，  Ｄ．  Ｓ．ら（２００４年８月１０日）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４３巻（３１号）：１０２０３〜１０２１１頁、米国特許第８，４０４，６３１号および同第８，４０４，６３２号、ＷＯ  ２００７／１３９７９１およびＷＯ  ２００７／１３９７６７に記載されている。これらの技法または他の標準技法を使用して、いずれかの変異体Ｈ−ＮＯＸタンパク質を作製することができる。
【０２２２】
変異体Ｈ−ＮＯＸ核酸は、標準技法を使用して、発現ベクター等のベクターに組み入れることができる。例えば、制限酵素を使用して、変異体Ｈ−ＮＯＸ核酸およびベクターを切断することができる。次に、切断された変異体Ｈ−ＮＯＸ核酸および切断されたベクターの適合性末端をライゲーションすることができる。コードされたＨ−ＮＯＸタンパク質の発現のため、標準技法（例えば、エレクトロポレーション）を使用して、得られたベクターを細胞（例えば、昆虫細胞、植物細胞、酵母細胞または細菌細胞）に挿入することができる。
【０２２３】
特に、昆虫細胞、植物細胞、酵母細胞および細菌細胞等、多数の生物学的発現系において、異種タンパク質が発現されてきた。よって、いずれかの適した生物学的タンパク質発現系を利用して、多量の組換えＨ−ＮＯＸタンパク質を産生することができる。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質（例えば、変異体または野生型Ｈ−ＮＯＸタンパク質）は、単離されたタンパク質である。
【０２２４】
所望の場合、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、標準技法を使用して精製することができる。一部の実施形態において、上記タンパク質は、少なくとも約６０重量％であり、該タンパク質が産生される際に存在する他の構成成分を含まない。様々な実施形態において、上記タンパク質は、少なくとも約７５重量％、９０重量％または９９重量％純粋である。精製されたタンパク質は、例えば、天然の供給源、組換え発現系または化学合成の反応混合物からの精製（例えば、抽出）により得ることができる。例示的な精製方法として、免疫沈降、免疫親和性クロマトグラフィー等のカラムクロマトグラフィー、磁気ビーズ免疫親和性精製およびプレート結合抗体によるパニング、ならびに当業者に公知の他の技法が挙げられる。純度は、いずれかの適切な方法により、例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはＨＰＬＣ解析によりアッセイすることができる。一部の実施形態において、精製されたタンパク質は、本発明の医薬組成物に取り込まれる、あるいは本発明の方法において使用される。本発明の医薬組成物は、精製されたタンパク質に加えて、添加物、キャリアまたは他の構成成分を有し得る。
【０２２５】
一部の実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、１個または複数のＨｉｓ６タグを含む。少なくとも１個のＨｉｓ６タグを含むＨ−ＮＯＸタンパク質は、クロマトグラフィーを使用して；例えば、Ｎｉ２＋親和性クロマトグラフィーを使用して精製することができる。精製後に、Ｈｉｓ６タグは、例えば、エキソペプチダーゼを使用することにより除去することができる。一部の実施形態において、本発明は、Ｈｉｓ６タグの使用により精製された、精製された重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を提供する。一部の実施形態において、精製されたＨ−ＮＯＸタンパク質は、エキソペプチダーゼで処理されて、Ｈｉｓ６タグを除去する。
【０２２６】
一部の実施形態では、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、ポリエチレングリコールの１個または複数の分子を含む（すなわち、ペグ化されている）。ペグ化タンパク質を産生するための方法は、当技術分野において公知である。
【実施例】
【０２２７】
本実施例は、本発明を純粋に例示するものとして企図されており、したがって、決して本発明を限定するものと考慮するべきではなく、また、上述の本発明の態様および実施形態を説明および詳述する。本実施例は、後述する実験が、実施される全てまたは唯一の実験であることを表すようには企図されていない。他に断りがなければ、温度は、セ氏温度で表されており、圧力は大気圧またはその前後である。
【０２２８】
（実施例１）
Ｈ−ＮＯＸは、低酸素腫瘍微小環境の効率的な酸素負荷を可能にする
遠位ポケットにＬ１４４Ｆ置換を有するペグ化三量体型Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ（Ｔｔ．）Ｈ−ＮＯＸ（図６Ｂ）を、腫瘍微小環境に酸素負荷し、放射線感受性を増加させる能力に関して評価した。外部低酸素マーカーであるピモニダゾール、低酸素誘導性転写因子１アルファ、ＨＩＦ−１−αおよびＯｘｙＬｉｔｅ酸素感知ナノファイバーによって直接的に測定される通り（それぞれ図２および図３）、低酸素腫瘍を有するマウスへのペグ化三量体型Ｔｔ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｌ１４４Ｆの投与は、腫瘍の急速かつ持続した酸素負荷を誘導する。
【０２２９】
Ｈ４６０皮下異種移植片腫瘍を有するマウスに、腫瘍体積がほぼ３００〜３５０ｍｍ３に達したら（腫瘍細胞皮下植え込みからほぼ１０〜１４日後）、６５０ｍｇ／ｋｇのペグ化三量体Ｈ−ＮＯＸ（Ｌ１４４Ｆ）をｉ．ｖ．注射した。安楽死に先立ち、マウスに、６０ｍｇ／ｋｇの外因性低酸素マーカー、ピモニダゾールを注射し、腫瘍を収集した。それぞれ競合的（ピモニダゾール）およびサンドイッチ（ＨＩＦ−１α、Ａｂｃａｍ）ＥＬＩＳＡによって、ピモニダゾール（図２Ａ）（Ｈｙｐｏｘｙｐｒｏｂｅ−１）およびＨＩＦ−１α（図２Ｂ）レベルを測定した。グラフは、ペグ化Ｈ−ＮＯＸ（Ｌ１４４Ｆ）投与後のピモニダゾールおよびＨＩＦ−１αシグナルの定量化を示す。ビヒクル、１時間および４時間：ｎ＝２２、７時間：ｎ＝１８、１２時間：ｎ＝１６、２４時間：ｎ＝６。４回の独立した実験の結果。平均値＋／−ＳＥＭ。一元配置ＡＮＯＶＡおよびボンフェローニの事後検定による、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５。（図２Ｃ）注射後１、４、７、１６および２４時間目に、サンドイッチＨ−ＮＯＸ  ＥＬＩＳＡによってペグ化Ｈ−ＮＯＸ（Ｌ１４４Ｆ）の蓄積に関して腫瘍を評価し、腫瘍組織１グラム当たりで結果を表す。７〜８週齢Ｎｕ／Ｎｕ雌マウスの皮下に、３×１０６個のＨ４６０ヒト肺がん細胞を植え込み、腫瘍が、ほぼ３００ｍｍ３の平均サイズに達するまで（腫瘍細胞の植え込み１０〜１４日後）モニターした。２００〜３５０ｍｍ３異種移植片腫瘍を有するマウスに、ボーラスビヒクル（製剤バッファー：５０ｍＭコハク酸塩、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３．４ｍＭ  ＥＤＴＡおよび１０ｍＭ還元型グルタチオン、ｐＨ７）または６５０ｍｇ／ｋｇのペグ化三量体Ｈ−ＮＯＸ（Ｌ１４４Ｆ）を含有する製剤バッファーをｉ．ｖ．注射した。腫瘍低酸素を測定するために、安楽死に先立ち、マウスに、６０ｍｇ／ｋｇの外因性低酸素マーカー、ピモニダゾールを注射した。腫瘍を収集し、アンチプロテアーゼを補充した抽出バッファー（Ａｂｃａｍキット＃ａｂ１１７９９６）中でホモジナイズした。Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイを使用して、各腫瘍におけるタンパク質濃度を定量化した。Ｏｍｎｉｏｘによって開発された競合的ＥＬＩＳＡアッセイを使用してピモニダゾール（Ｈｙｐｏｘｙｐｒｏｂｅ−１）量に関して、また、Ａｂｃａｍ  ＥＬＩＳＡキット（ａｂ１１７９９６）を使用してＨＩＦ−１αに関して試料をアッセイした。
【０２３０】
Ｈ４６０肺癌マウスモデルにおいて、４時間〜８時間の間で最大酸素負荷を達成し、これは、ＥＬＩＳＡによって評価されるＨ−ＮＯＸ（Ｌ１４４Ｆ）腫瘍蓄積のピークと相関した（図２Ｃ）。
【０２３１】
Ｈ−ＮＯＸ（Ｌ１４４Ｆ）腫瘍蓄積の評価のため、注射後の異なる時点で腫瘍を収集した。アンチプロテアーゼを補充した抽出バッファー（Ａｂｃａｍキット＃ａｂ１１７９９６）中で腫瘍をホモジナイズし、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイを使用して、各腫瘍におけるタンパク質濃度を定量化した。Ｏｍｎｉｏｘによって開発されたＨ−ＮＯＸのためのサンドイッチＥＬＩＳＡによってペグ化Ｈ−ＮＯＸ（Ｌ１４４Ｆ）濃度を定量化し、腫瘍重量に対して正規化した。
【０２３２】
動物の補充的酸素負荷は、５〜１０ｍｍＨｇ酸素濃度におけるマウス腫瘍組織の酸素負荷の増加に成功したが、より低い酸素レベル（＜５ｍｍＨｇ）を有する領域には効果がなかった。対照的に、ペグ化三量体Ｔｔ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｌ１４４Ｆは、著しく低酸素の腫瘍組織（＜５ｍｍＨｇ）であっても酸素負荷を増加させることができる。これは、酸素勾配拡散限界を越えた区域への酸素送達を可能にする、ペグ化三量体Ｔｔ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｌ１４４Ｆの優れた組織浸透によるものである可能性がある。さらに、マウス腫瘍の最大補充的酸素負荷は、動物を９５％〜１００％呼吸酸素へと連続的に曝露することにより達成されるが［正常組織への過酸素症および炎症性損傷のリスクを増加させる（Ｋａｌｌｅｔ  ＆  Ｍａｔｔｈａｙ、２０１３年、Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃａｒｅ、５８巻（１号）：１２３〜１４１頁；Ｔｈｉｅｌら、２００５年、ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌ、３巻（６号）、ｅ１７４頁）］、ペグ化三量体Ｔｔ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｌ１４４Ｆの単一ボーラスｉ．ｖ．用量は、正常組織における酸素レベルを増加させることなく、７時間を超えて組織酸素負荷を維持することができる。低酸素組織に存在する酸素濃度では酸素を放出することができない、対照Ｔｔ  Ｈ−ＮＯＸタンパク質（野生型バリアント）は、腫瘍酸素負荷に対していかなる効果も有さなかった（図３Ｃ）。
【０２３３】
７〜８週齢Ｎｕ／Ｎｕ雌マウスの皮下に、３×１０６個のＨ４６０ヒト肺がん細胞を植え込み、腫瘍が、ほぼ５００ｍｍ３の平均サイズに達するまで（腫瘍細胞の植え込み１０〜１８日後）モニターした。Ｈ４６０腫瘍を有するマウスを、２０％の酸素に混合したイソフルランで麻酔し、マイクロマニピュレーターを使用して、ＯｘｙＬｉｔｅ（商標）プローブ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｏｐｔｒｏｎｉｘ、ＵＫ）をＨ４６０皮下異種移植片腫瘍に植え込んだ。ＯｘｙＬｉｔｅ（商標）は、先端における直径２３０μｍのポリマーマトリックス中に保持された塩化ルテニウム色素からなる。ほぼ２０〜３０分間平衡化した後に、４−チャネルユニットに取り付けた光学蛍光センサを使用して、ｐＯ２を測定した。低い開始ｐＯ２は、隣接する血管から離れた低酸素組織への進入を確認した（ほぼ０．２ｍｍＨｇ；５ｍｍＨｇの図３Ｄを除いて）。プローブ植え込み後に、ｐＯ２測定が安定化するように、プローブをほぼ２０〜３０分間放置し、マウスに１００％Ｏ２を呼吸させた（図３Ｂ、図３Ｄ）、またはペグ化Ｈ−ＮＯＸ（図３ＡはＬ１４４Ｆ、図３Ｃはｗｔ）を注射し、蛍光クエンチングを記録した。
【０２３４】
過酸素ガスの投与と比べた、低酸素腫瘍領域へと酸素を送達するペグ化三量体Ｔｔ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｌ１４４Ｆの優れた能力は、より効率的な照射腫瘍細胞死滅によってさらに実証された（図４）。
【０２３５】
Ｈ４６０皮下異種移植片腫瘍（２００〜３５０ｍｍ３）を有するマウスを、１０Ｇｙ単独で、または照射の７時間前にｉ．ｖ．注射した６５０ｍｇ／ｋｇのペグ化三量体Ｈ−ＮＯＸ（Ｌ１４４Ｆ）と組み合わせて処置した。照射後に腫瘍を抽出し、試験管内腫瘍細胞感受性試験のために処理した。各腫瘍由来の三連の試料における細胞数を１０〜１４日後に計数した。グラフ上の各ドットは、１個の腫瘍の平均生存率を表す。平均値＋／−ＳＥＭ（実験当たりｎ＝３）。７〜８週齢Ｎｕ／Ｎｕ雌マウスの皮下に、３×１０６個のＨ４６０ヒト肺がん細胞を植え込み、腫瘍が、ほぼ３００ｍｍ３の平均サイズに達するまで（腫瘍細胞の植え込み１０〜１４日後）モニターした。２００〜３５０ｍｍ３異種移植片腫瘍を有するマウスに、１０Ｇｙを単独で、またはボーラスビヒクル（製剤バッファー：５０ｍＭコハク酸塩、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３．４ｍＭ  ＥＤＴＡおよび１０ｍＭ還元型グルタチオン、ｐＨ７）もしくは６５０ｍｇ／ｋｇのペグ化Ｈ−ＮＯＸ（Ｌ１４４Ｆ）を含有する製剤バッファーのいずれかの静脈内送達と組み合わせて照射した。照射後にマウスを屠殺し、腫瘍を収集し、ｅｘ−ｖｉｖｏ試験管内腫瘍細胞感受性試験のために処理した。手短に説明すると、腫瘍細胞をメスで細片に細かく刻み、コラゲナーゼ（２００Ｕ／ｍｌ）、ヒアルロニダーゼ（２００Ｕ／ｍｌ）およびＤＮＡｓｅの混合物を含有する酵素カクテル（１０ｍｌのカクテル／１ｇの腫瘍）で、ほぼ３０分間消化した。次に、抽出された細胞を計数し、無処置はウェル当たり５００／１２５／２５細胞で、照射した腫瘍試料はウェル当たり２０００／５００／１００細胞で、６ウェルプレートにおいて二連で播種した。１０〜１２日後、細胞コロニーをＰＦＡで固定し、クリスタルバイオレットで染色した。クローンの数（５０個の細胞を超える）を計数し、無処置試料におけるプレーティング効率を計算した（ウェルにおける計数された細胞数÷プレーティングされた細胞数×１００）。全試料における生存率を計算した（計数された細胞数÷プレーティング効率×１００）。
【０２３６】
ペグ化三量体Ｔｔ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｌ１４４Ｆ投与後に、全てのペグ化三量体Ｔｔ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｌ１４４Ｆ処置腫瘍において照射処置有効性の、１５倍超の増加が見られ、これは、１０Ｇｙ処置単独群における３０％から、Ｈ−ＮＯＸ（Ｌ１４４Ｆ）前処置腫瘍における２％未満へと、腫瘍細胞の生存率を低下させた。同じ実験において、腫瘍を有するマウスの、１００％酸素による処置は、照射増強の可変的な増加を示した（ほぼ３倍）が、これはおそらく、腫瘍間の一様でない血管密度によるものである可能性がある、個々の腫瘍間の不均等な腫瘍酸素負荷に起因する。
【０２３７】
（実施例２）
Ｈ−ＮＯＸは、宿主抗腫瘍応答を増強するイムノアクチベーターとして作用する
ペグ化三量体Ｔｔ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｌ１４４Ｆ誘導性酸素負荷は、ＨＩＦ−１α経路を阻害し（図２Ｂ）、ＨＩＦ−１α依存性およびＨＩＦ−１α非依存性腫瘍免疫抑制を軽減する。Ｈ４６０皮下異種移植片腫瘍（２００〜３５０ｍｍ３）を有するマウスを、ビヒクル単独またはペグ化三量体Ｈ−ＮＯＸ（Ｌ１４４Ｆ）のいずれかで処置し、ｑＲＴ−ＰＣＲ解析のために注射の７、１６または２４時間後に収集した。平均値＋／−ＳＥＭ。１群当たりＮ＝５〜６匹、ｔ検定による＊ｐ＜０．０５。単一用量のＨ−ＮＯＸによる処置は、ＨＩＦ−１α、ならびに宿主の免疫応答の直接的および間接的なモジュレーターを含むそのエフェクター：ＰＤ／ＰＤＬ−１およびＶＥＧＦシグナル伝達、代謝および増殖因子の調節因子の有意な下方調節をもたらした（図５）。
【０２３８】
７〜８週齢Ｎｕ／Ｎｕ雌マウスの皮下に、３×１０６個のＨ４６０ヒト肺がん細胞を植え込み、腫瘍が、ほぼ３００ｍｍ３の平均サイズに達するまでモニターした（腫瘍細胞の植え込み１０〜１４日後）。２００〜３５０ｍｍ３異種移植片腫瘍を有するマウスに、ボーラスビヒクル（製剤バッファー：５０ｍＭコハク酸塩、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３．４ｍＭ  ＥＤＴＡおよび１０ｍＭ還元型グルタチオン、ｐＨ７）または６５０ｍｇ／ｋｇのペグ化三量体Ｈ−ＮＯＸ（Ｌ１４４Ｆ）を含有する製剤バッファーのいずれかを注射した。ｑＲＴ−ＰＣＲ解析のための試料を調製するために、マウスを屠殺し、腫瘍を切除した。ＲＮｅａｓｙキット（ＱＩＡＧＥＮ）をメーカーの指示に従って使用して、腫瘍試料から全ＲＮＡを抽出した。ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（商標）Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）において逆転写およびリアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を記載の通りに行った。２μＬのｃＤＮＡ鋳型、１２．５μＬのＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）ならびに１μＬの次のセンスおよびアンチセンスプライマーを使用して、２５μＬの反応液を調製した：ＶＥＧＦ：フォワード、５’−ＣＡＡＴＣＧＡＧＡＣＣＣＴＧＧＴＧＧＡ−３’（配列番号２３）；リバース、５’−ＧＣＡＣＡＣＡＣＴＣＣＡＧＧＣＣＣＴ−３’（配列番号２４）；Ｇｌｕｔ１：フォワード、５’−ＣＡＡＣＣＡＧＡＣＡＴＧＧＧＴＣＣＡＣ−３’（配列番号２５）；リバース、５’−ＧＴＴＡＡＣＧＡＡＡＡＧＧＣＣＣＡＣＡＧＡ−３’（配列番号２６）；ＰＤＬ１：フォワード、５’−ＧＴＴＧＴＧＧＡＴＣＣＡＧＴＣＡＣＣＴＣＴ−３’（配列番号２７）；リバース、５’−ＧＡＴＴＣＴＣＡＧＴＧＴＧＣＴＧＧＴＣＡＣ−３’（配列番号２８）；Ｌ７：フォワード、５’−ＣＡＡＧＧＡＧＧＡＡＧＣＴＴＡＴＣＴＡＴＧＡＡ−３’（配列番号２９）；リバース、５’−ＡＴＴＴＧＡＣＧＡＡＧＧＣＧＡＡＧＡＡＧＣＴ−３’（配列番号３０）。熱サイクル（ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｉｎｇ）条件を次に示す：最初のステップは１０分間９５℃であり、次いで４０サイクルの、１５秒間９５℃の変性に続く１分間６０℃のアニーリングおよび伸長であった。結果は、比較ＣＴ方法を使用したＳｔｅｐＯｎｅソフトウェアｖ２．０により解析した。目的の遺伝子の転写物は、マウスリボソームタンパク質Ｌ７ハウスキーピング遺伝子の転写物に対して正規化し、Ｌ７転写物含量と比べた倍数的変化として提示した。
【０２３９】
例えば、ＨＩＦ−１αおよびＡ２ＡＲアデノシン作動性シグナル伝達のペグ化三量体Ｔｔ  Ｈ−ＮＯＸ  Ｌ１４４Ｆ媒介性下方調節は、腫瘍組織へのエフェクターＴ細胞の活性化および動員をもたらし、リンパ球腫瘍浸潤の増加、転移性腫瘍成長の減少および腫瘍退縮を生じることができる。さらに、腫瘍のＨ−ＮＯＸ誘導性酸素負荷は、腫瘍細胞表面におけるＭＨＣ１の下方調節およびＰＤＬ−１発現の上方調節ならびに免疫エフェクター細胞を直接的に抑制すると共に血管新生および転移を促進する、ＴＡＭを含む骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）の活性化および動員を含む複数の低酸素依存性機構を阻害することにより、腫瘍細胞の免疫回避（ｉｍｍｕｎｏｅｖａｓｉｏｎ）を低下させることができる（図１Ｂを参照）。Ｈ−ＮＯＸ処置は、ＶＥＧＦ、ＣＳＦ１および他のＨＩＦ−１依存性サイトカインシグナル伝達（Ｃｈａｔｕｒｖｅｄｉら、２０１４年、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１１１巻（２０号）：Ｅ２１２０〜２１２９頁；Ｌｅｗｉｓ  ＆  Ｈｕｇｈｅｓ、２００７年、Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、９巻（３号）：２０９頁）ならびにＨＩＦ−１およびＨＩＦ−２媒介性マクロファージ活性化（Ｆａｎｇら、２００９年、Ｂｌｏｏｄ、１１４巻（４号）：８４４〜８５９頁；Ｔａｋｅｄａら、２０１０年、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ、２４巻（５号）：４９１〜５０１頁）を下方調節することにより、ＴＭＥへのマクロファージの動員を阻害することができる。
【０２４０】
最後に、宿主の抗腫瘍免疫応答の刺激に際して、Ｈ−ＮＯＸは、抗ＰＤ１（プログラム細胞死タンパク質１）、抗ＰＤＬ−１（プログラム細胞死タンパク質リガンド１）、抗ＣＴＬＡ−４もしくは他の免疫チェックポイントの調節因子を標的化する治療法、抗がんワクチン、養子免疫細胞療法またはこれらの組合せ等が挙げられるがこれらに限定されない他の標的化がん免疫療法を増強するコアクチベーターとして作用することができる。例えば、Ｈ−ＮＯＸは、二重ＰＤ１／ＣＴＬＡ−４遮断療法に先立ちおよびこれと併せて、またはＰＤＬ１＋腫瘍を有する患者におけるＰＤＬ−１処置と組み合わせて、がん患者に投与することができる。これは、化学療法、放射線療法または活性抗腫瘍免疫防御から恩恵を被ることができる他の非免疫標的化もしくは細胞に基づく療法が挙げられるがこれらに限定されない他のがん処置にとってのアジュバントとして作用することもできる。実際に、Ｈ−ＮＯＸは、損傷した腫瘍組織由来の放射線曝露された腫瘍特異的抗原に対する抗腫瘍免疫応答（Ｄｅｍａｒｉａら、２００５年、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｒａｄｉａｔ  Ｏｎｃｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｐｈｙｓ、６３巻（３号）、６５５〜６６６頁）および酸素依存性腫瘍細胞死滅（Ｂｒｏｗｎ、２０１０年、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｒａｄｉａｔ  Ｂｉｏｌ、８６巻（１１号）、９０７〜９１７頁）を同時に刺激することにより、照射と協同することができる。放射線療法の際に、Ｈ−ＮＯＸは、放射線誘導性血管損傷に起因する低酸素を改善することにより、正常組織放射線保護剤として作用することもできる。
【０２４１】
（実施例３）
Ｂ１６Ｆ１０およびＣＴ２６皮下腫瘍ならびに頭蓋内ＧＬ２６１−ルシフェラーゼ腫瘍における低酸素およびＴ細胞の測定
Ｂ１６Ｆ１０およびＣＴ２６皮下腫瘍ならびに頭蓋内ＧＬ２６１−ルシフェラーゼ腫瘍の生成。６〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ雌マウスの側腹部における皮下に、１×１０６個のＢ１６Ｆ１０マウスメラノーマがん細胞を植え込んだ（図７Ａ）。６〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃ雌マウスの側腹部における皮下に（ｓｕｂｃｕｔａｎｏｕｓｌｙ）、１×１０６個のＣＴ２６結腸腫瘍細胞を植え込んだ（図７Ｂ）。２０ｇの重さの雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊの頭蓋内の右尾状核に（＋０．５ｍｍ  Ａ／Ｐ、＋２．３ｍｍ  Ｍ／Ｌおよび−３．２ｍｍ
Ｄ／Ｖ）、３×１０５個のＧＬ２６１−ｌｕｃ細胞を注射した（図７Ｃ）。頭蓋内腫瘍を２１日間成長させ、その後に屠殺した。ノギスを使用して皮下腫瘍を１週間に３回測定し、次式に基づき腫瘍サイズを計算した：（長さ×幅２）÷０．５。腫瘍が、ほぼ３００ｍｍ３の平均サイズに達したら（腫瘍細胞の植え込み１０〜１４日後）、処置を開始した。
【０２４２】
処置。２００〜４００ｍｍ３皮下腫瘍または２１日目の頭蓋内腫瘍を有するマウスに、屠殺１〜８時間前に、外因性低酸素マーカー、ピモニダゾールｉｐ．（６０ｍｇ／ｋｇ、Ｈｙｐｏｘｙｐｒｏｂｅ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を注射した。
【０２４３】
免疫組織化学的検査。齧歯類を安楽死させ、免疫組織化学（ＩＨＣ）アッセイのために腫瘍を切除した。腫瘍をＯＣＴ中で凍結し、ＩＨＣ処理のために１２μＭで切片を作製した。切片を４％ＰＦＡで１５分間４℃にて固定し、次いで５％ＢＳＡ、５％ヤギ血清および０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０で１〜２時間、室温にてブロッキングおよび透過処理した。次に、切片を、ウサギ抗ピモニダゾール（Ｈｙｐｏｘｙｐｒｏｂｅ、１：１００）（図７Ａ、図７Ｂ、図７Ｃ、上パネル）およびラット抗ＣＤ３、ラット抗ＣＤ４（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、１：５０）またはラット抗ＣＤ８（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、１：５０）抗体（図７Ａ、図７Ｂ、図７Ｃ、中央パネル）と共に一晩４℃でインキュベートし、続いて抗ウサギまたは抗ラット二次抗体（１：１０００、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ、ＵＳＡ）と共に２時間、室温にてインキュベートした。ＳｌｏｗＦａｄｅ  ＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に切片をマウントした。ＣＣＤデジタルカメラを備えるＨＤ  ＡｘｉｏＩｍａｇｅｒ  Ｚｅｉｓｓ顕微鏡により、切片を撮像した。定量化。各動物において、腫瘍の厚さ１〜１．５ｍｍに及ぶ５枚の腫瘍切片において、切片当たり２〜４枚の写真中のピモニダゾール陽性およびピモニダゾール陰性区域におけるＣＤ３＋、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の数を計数した。各区域におけるＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞の和を、ピモニダゾール陽性（ｐｏｓｔｉｖｅ）およびピモニダゾール陰性面積の和で割って、腫瘍組織１ｍｍ２当たりのＴ細胞の総数を得た（図７Ａ、図７Ｂおよび図７Ｃ、下パネル）。腫瘍の低酸素領域（Ｈ）は、正常酸素領域（Ｎ）よりも２．５〜１０倍超少ないＴ細胞を示した。
【０２４４】
（実施例４）
低酸素腫瘍のＨ−ＮＯＸ処置
Ｂ１６Ｆ１０皮下腫瘍の生成。６〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ雌マウスの側腹部における皮下に、１×１０６個のＢ１６Ｆ１０マウスメラノーマがん細胞を植え込んだ。ノギスを使用して腫瘍を１週間に３回測定し、次式に基づき腫瘍サイズを計算した：（長さ×幅２）÷０．５。腫瘍が、ほぼ３００ｍｍ３の平均サイズに達したら（腫瘍細胞の植え込み１０〜１４日後）、処置を開始した。
【０２４５】
処置。各処置群において２００〜４００ｍｍ３腫瘍を有するマウスを腫瘍サイズに基づきランダム化し、ビヒクル（製剤バッファー：５０ｍＭコハク酸塩、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３．４ｍＭ  ＥＤＴＡおよび１０ｍＭ還元型グルタチオン、ｐＨ７）または２ｍｇのペグ化Ｈ−ＮＯＸ（Ｌ１４４Ｆ）を含有する１００μｌの製剤バッファーを腫瘍内に注射した。ビヒクルまたはＨ−ＮＯＸ処置の１時間前に、マウスに、外因性低酸素マーカー、ピモニダゾールｉｐ．（６０ｍｇ／ｋｇ、Ｈｙｐｏｘｙｐｒｏｂｅ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ
Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を注射した。
【０２４６】
免疫組織化学的検査。Ｈ−ＮＯＸ注射の６時間後に、齧歯類を安楽死させ、免疫組織化学（ＩＨＣ）アッセイのために腫瘍を切除した。腫瘍をＯＣＴ中で凍結し、ＩＨＣ処理のために１２μＭで切片を作製した。切片を４％ＰＦＡで１５分間４℃にて固定し、次いで５％ＢＳＡ、５％ヤギ血清および０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０で１〜２時間、室温にてブロッキングおよび透過処理した。次に、切片を、ウサギ抗ピモニダゾール（Ｈｙｐｏｘｙｐｒｏｂｅ、１：１００）またはウサギ抗炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ、Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  １：１０００）およびラット抗ＣＤ４（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、１：５０）またはラット抗ＣＤ８（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、１：５０）抗体と共に一晩４℃でインキュベートし、続いて抗ウサギまたは抗ラット二次抗体（１：１０００、Ｊａｃｋｓｏｎ
Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ、ＵＳＡ）と共に２時間、室温にてインキュベートした。ＳｌｏｗＦａｄｅ  ＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に切片をマウントした。ＣＣＤデジタルカメラを備えるＨＤ  ＡｘｉｏＩｍａｇｅｒ  Ｚｅｉｓｓ顕微鏡により、切片を撮像した（図８および図９Ｂ）。
【０２４７】
定量化。各動物において、腫瘍の厚さ１〜１．５ｍｍに及ぶ５枚の腫瘍切片において、切片当たり４枚の写真中のピモニダゾール陽性、ピモニダゾール陰性、ＣＡＩＸ陽性およびＣＡＩＸ陰性区域におけるＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の数を計数した。各区域におけるＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞の和を、ピモニダゾール陽性、ピモニダゾール陰性、ＣＡＩＸ陽性およびＣＡＩＸ陰性面積の和で割って、腫瘍組織１ｍｍ２当たりのＴ細胞の総数を得た。図８および図９Ａに示す結果は、ビヒクル対照（製剤バッファー）と比較して、ＯＭＸ処置が、腫瘍の以前はピモニダゾール陰性（図８）またはＣＡＩＸ陰性（図９Ｂ）に標識された低酸素領域におけるＣＤ４＋およびＣＤ８＋リンパ球の蓄積を増強することを実証する。
【０２４８】
（実施例５）
腫瘍低酸素および腫瘍血管の測定
Ｈ４６０、Ｂ１６Ｆ１０およびＣＴ２６皮下腫瘍ならびに頭蓋内ＧＬ２６１−ルシフェラーゼ腫瘍の生成。７〜８週齢Ｎｕ／Ｎｕ雌マウスの後肢における皮下に、３×１０６個のＨ４６０ヒト肺がん細胞を植え込んだ。６〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ雌マウスの側腹部における皮下に、１×１０６個のＢ１６Ｆ１０マウスメラノーマがん細胞を植え込んだ。６〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃ雌マウスの側腹部における皮下に、１×１０６個のＣＴ２６結腸腫瘍細胞を植え込んだ。２０ｇの重さの雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊの頭蓋内の右尾状核に（＋０．５ｍｍ  Ａ／Ｐ、＋２．３ｍｍ  Ｍ／Ｌおよび−３．２ｍｍ  Ｄ／Ｖ）、３×１０５個のＧＬ２６１−ｌｕｃ細胞を注射した。頭蓋内腫瘍を２１日間成長させ、その後に屠殺した。ノギスを使用して皮下腫瘍を１週間に３回測定し、次式に基づき腫瘍サイズを計算した：（長さ×幅２）÷０．５。腫瘍が、ほぼ３００ｍｍ３の平均サイズに達したら（腫瘍細胞の植え込み１０〜１４日後）、処置を開始した。処置。２００〜４００ｍｍ３皮下腫瘍または２１日目の頭蓋内腫瘍を有するマウスに、屠殺１〜８時間前に、外因性低酸素マーカー、ピモニダゾールｉｐ．（６０ｍｇ／ｋｇ、Ｈｙｐｏｘｙｐｒｏｂｅ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を注射した。
【０２４９】
免疫組織化学的検査およびＥＬＩＳＡ。齧歯類を安楽死させ、免疫組織化学的検査（ＩＨＣ）およびＥＬＩＳＡアッセイのために腫瘍を切除した。ＥＬＩＳＡのために、Ｂ１６Ｆ１０、ＣＴ２６およびＨ４６０腫瘍を、アンチプロテアーゼを補充した抽出バッファー（Ａｂｃａｍキット＃ａｂ１１７９９６）中でホモジナイズした。Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイを使用して、各腫瘍におけるタンパク質濃度を定量化し、競合的ピモニダゾール（Ｈｙｐｏｘｙｐｒｏｂｅ−１、Ｈｙｐｏｘｙｐｒｏｂｅ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、低酸素レベルに関して試料をアッセイした。ＩＨＣのために、ＧＬ２６１腫瘍をＯＣＴ中で凍結し、ＩＨＣ処理のために１２μＭで切片を作製した。切片を１００％メタノールで２０分間、−２０℃にて固定し、次いで５％ＢＳＡ、５％ヤギ血清および０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０で１〜２時間、室温にてブロッキングおよび透過処理した。次に、切片を、ウサギ抗ピモニダゾール（Ｈｙｐｏｘｙｐｒｏｂｅ、１：１００）およびラット抗ＣＤ３１（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、１：５０）抗体と共に一晩４℃でインキュベートし、続いて抗ウサギまたは抗ラット二次抗体（１：１０００、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ、ＵＳＡ）と共に２時間、室温にてインキュベートした。ＳｌｏｗＦａｄｅ  ＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に切片をマウントした。ＣＣＤデジタルカメラを備えるＨＤ  ＡｘｉｏＩｍａｇｅｒ  Ｚｅｉｓｓ顕微鏡により、切片を撮像した（図１０）。
【０２５０】
定量化。ピモニダゾールＥＬＩＳＡのために、検量線の５−パラメータ適合により、ＩＣ５０値（「Ｋｄ」）の定量化を行い、各試料におけるタンパク質濃度に従って値を正規化した。ＧＬ２６１  ＩＨＣのために、各動物において、ＩｍａｇｅＪを使用して、腫瘍組織内のピモニダゾール＋面積のパーセントを決定した（腫瘍の厚さ１ｍｍに及ぶ５枚の腫瘍切片における切片当たり１〜２枚の写真）（図１０）。これらのデータは、個々の動物の間および腫瘍型の間に低酸素のレベルはある範囲にわたるが、その存在は、試験したサイズの腫瘍の大部分で有意であることを示す。
【０２５１】
（実施例６）
腫瘍におけるＨ−ＮＯＸ蓄積の測定
Ｂ１６Ｆ１０およびＣＴ２６皮下腫瘍ならびに頭蓋内ＧＬ２６１−ルシフェラーゼ腫瘍の生成。６〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ雌マウスの側腹部における皮下に、１×１０６個のＢ１６Ｆ１０マウスメラノーマがん細胞を植え込んだ。６〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃ雌マウスの側腹部における皮下に、１×１０６個のＣＴ２６結腸腫瘍細胞を植え込んだ。２０ｇの重さの雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊの頭蓋内の右尾状核に（＋０．５ｍｍ  Ａ／Ｐ、＋２．３ｍｍ  Ｍ／Ｌおよび−３．２ｍｍ  Ｄ／Ｖ）、３×１０５個のＧＬ２６１−ｌｕｃ細胞を注射した。頭蓋内腫瘍を２１日間成長させ、その後に屠殺した。ノギスを使用して皮下腫瘍を１週間に３回測定し、次式に基づき腫瘍サイズを計算した：（長さ×幅２）÷０．５。腫瘍が、ほぼ３００ｍｍ３の平均サイズに達したら（腫瘍細胞の植え込み１０〜１４日後）、処置を開始した。
【０２５２】
処置。各処置群における２００〜４００ｍｍ３皮下腫瘍を有するマウスを、腫瘍サイズに基づきランダム化し、ビヒクル（製剤バッファー：５０ｍＭコハク酸塩、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３．４ｍＭ  ＥＤＴＡおよび１０ｍＭ還元型グルタチオン、ｐＨ７）またはペグ化Ｈ−ＮＯＸ（Ｌ１４４Ｆ）を含有する製剤バッファーを静脈内（６５０ｍｇ／ｋｇ）、皮下（６５０ｍｇ／ｋｇ）または腫瘍内（２ｍｇ、１００μｌ）注射した。各処置群における２１日目の頭蓋内腫瘍を有するマウスを、Ｘｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳスペクトルにより測定された生物発光シグナルに基づきランダム化し、製剤バッファー単独または７５０ｍｇ／ｋｇのＨ−ＮＯＸ（Ｌ１４４Ｆ）を含有する製剤バッファーを静脈内注射した。
【０２５３】
皮下腫瘍組織におけるペグ化Ｈ−ＮＯＸ（Ｌ１４４Ｆ）蓄積の測定。Ｈ−ＮＯＸまたはビヒクル注射の６時間（Ｂ１６Ｆ１０）または８時間（ＣＴ２６）後に腫瘍を収集した。アンチプロテアーゼを補充した抽出バッファー（Ａｂｃａｍキット＃ａｂ１１７９９６）中で腫瘍をホモジナイズし、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイを使用して、各腫瘍におけるタンパク質濃度を定量化した。Ｈ−ＮＯＸのためのサンドイッチＥＬＩＳＡ  ＥＬＩＳＡ（１ｎｇ／ｍｌにおける検出感度）によってペグ化Ｈ−ＮＯＸ（Ｌ１４４Ｆ）濃度を定量化し、腫瘍重量に対して正規化して、Ｈ−ＮＯＸ量をμｇ／ｇ腫瘍組織の単位で表した。検量線の５−パラメータ適合によって、腫瘍ライセートにおけるＨ−ＮＯＸレベルの定量化を決定した。
【０２５４】
ＩＨＣによるＧＬ２６１におけるＨ−ＮＯＸ（Ｌ１４４Ｆ）の体内分布。Ｈ−ＮＯＸ注射の２時間後に、齧歯類を安楽死させ、免疫組織化学（ＩＨＣ）アッセイのために腫瘍を切除した。腫瘍をＯＣＴ中で凍結し、ＩＨＣ処理のために１２μＭで切片を作製した。切片を１００％メタノールで２０分間、−２０℃にて固定し、次いで５％ＢＳＡ、５％ヤギ血清および０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０で１〜２時間、室温にてブロッキングおよび透過処理した。次に、切片を、ウサギ抗Ｈ−ＮＯＸ（１：５００、ＡｎａＳｐｅｃ  Ｉｎｃ、Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡによって産生された特注のウサギポリクローナル）およびラット抗ＣＤ３１（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、１：５０）抗体と共に一晩４℃でインキュベートし、続いて抗ウサギまたは抗ラット二次抗体（１：１０００、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ、ＵＳＡ）と共に２時間、室温にてインキュベートした。ＳｌｏｗＦａｄｅ  ＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に切片をマウントした。ＣＣＤデジタルカメラを備えるＨＤ  ＡｘｉｏＩｍａｇｅｒ  Ｚｅｉｓｓ顕微鏡により、切片を撮像した。各動物において、ＩｍａｇｅＪを使用して、腫瘍組織内のＨ−ＮＯＸ陽性面積のパーセントを決定した（腫瘍の厚さ１ｍｍに及ぶ５枚の腫瘍切片における切片当たり１〜２枚の写真）。
【０２５５】
（実施例７）
イヌ口腔メラノーマ腫瘍における低酸素およびＴ細胞の測定
イヌ口腔メラノーマ。口腔メラノーマ腫瘍を有するペットのイヌを飼い主の同意により試験のために動員し、外科手術の４時間前にペグ化Ｈ−ＮＯＸ（Ｌ１４４Ｆ）を静脈内注射（緩徐注入）した。外科手術から摘出された組織をＩＨＣによって解析した。
【０２５６】
免疫組織化学的検査。Ｈ−ＮＯＸ注射の４時間後に、腫瘍を切除し、ＯＣＴ中で凍結し、ＩＨＣ処理のために１２μＭで切片を作製した。切片を４％ＰＦＡで１５分間４℃にて固定し、次いで５％ＢＳＡ、５％ヤギ血清および０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０で１〜２時間、室温にてブロッキングおよび透過処理した。次に、切片を、ウサギ抗炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ、Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  １：１０００）またはウサギ抗Ｈ−ＮＯＸ（１：５００、ＡｎａＳｐｅｃ  Ｉｎｃ、Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡによって産生された特注のウサギポリクローナル）およびラット抗ＣＤ４（Ａｂｄ  Ｓｅｒｏｔｅｃｈ、１：５０）またはラット抗ＣＤ８（Ａｂｄ  Ｓｅｒｏｔｅｃｈ、１：５０）抗体と共に一晩４℃でインキュベートし、続いて抗ウサギまたは抗ラット二次抗体（１：１０００、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ、ＵＳＡ）と共に２時間、室温にてインキュベートした。ＳｌｏｗＦａｄｅ
ＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に切片をマウントした。ＣＣＤデジタルカメラを備えるＨＤ  ＡｘｉｏＩｍａｇｅｒ  Ｚｅｉｓｓ顕微鏡により、切片を撮像した（図１１）。画像は、ＯＭＸ投与に先立ち、低酸素状態を示す低酸素マーカーＣＡＩＸを発現した腫瘍領域における多くのリンパ球数の存在を明らかにし、ＯＭＸ処置が、免疫抑制性微小環境を軽減し、リンパ球を浸潤させたことを示唆する。
【０２５７】
（実施例８）
腫瘍体積、腫瘍低酸素および低下したＴ細胞浸潤の相関
４Ｔ１−Ｌｕｃ腫瘍モデル。Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｓから８週齢雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを購入した。ルシフェラーゼ発現４Ｔ１マウス乳房腫瘍細胞（４Ｔ１−Ｆｌｕｃ−Ｎｅｏ；Ｉｍａｎｉｓ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を、１０％ウシ胎仔血清、１×ペニシリン（ｐｅｎｉｃｉｌｉｎ）／ストレプトマイシンおよび０．７ｍｇ／ｍｌ
Ｇ−４１８（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を補充したＲＰＭＩ培地において育成した。細胞をトリプシン処理し、培地：マトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ）の５０：５０混合物に再懸濁し、１００μｌ容量の２×１０５個の細胞をマウスに皮下注射した。植え込み後１０日目および１４日目に、腫瘍を測定し、体積を計算し（長さ×幅×高さ×０．５２３）、マウスに、１２０ｍｇ／ｋｇピモニダゾールｉ．ｐ．（ＰＩＭＯ、Ｈｙｐｏｘｙｐｒｏｂｅ）および３０ｍｇ／ｋｇ  ＥＦ５  ｉ．ｖ．（Ｈｙｐｏｘｉａ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｃｅｎｔｅｒ）を同時に注射し、ＰＩＭＯ／ＥＦ５注射の９０分後に屠殺し、腫瘍を収集した。収集された腫瘍は、免疫染色のためにＯＣＴ中に凍結すると共に、ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ解離装置（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ）を使用して単一細胞へと解離し、続いて０．７５ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼ／ディスパーゼ（Ｒｏｃｈｅ）と共に３７℃で振盪しつつ４５分間インキュベートした。解離された細胞を７０μｍフィルターに通した。
【０２５８】
フローサイトメトリー。固定されていない解離された細胞を、Ｔ細胞のための抗体（ハムスター抗マウスＣＤ３−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ４８８、クローン１４５−２Ｃ１１、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ；ラット抗マウスＣＤ４−ＡＰＣ、クローンＲＭ４−５、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；ラット抗マウスＣＤ８−ＰＥ、クローン５３−６．７、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒを使用してフローサイトメトリーを行った。ゲーティング目的のＴ細胞陽性対照として脾臓を使用した。また、解離された細胞の７０μｍフィルターを通した濾過後に、細胞を生存能色素５７０（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色し、ホルマリンおよびメタノールで固定し、低酸素マーカーのための抗体（ウサギ抗ピモニダゾール、Ｈｙｐｏｘｙｐｒｏｂｅ、続いて、ロバ抗ウサギＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ６４７；ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ４８８にコンジュゲートされたマウス抗ＥＦ５、Ｈｙｐｏｘｉａ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｃｅｎｔｅｒ）で染色し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒで解析した。ＦｌｏｗＪｏを使用してフローサイトメトリーデータを解析した。
【０２５９】
免疫蛍光染色。凍結切片を１０μｍでカットし、４％ＰＦＡで固定し、一次抗体（ラット抗マウスＣＤ４、ラット抗マウスＣＤ８、ウサギ抗ＰＩＭＯ）と、続く二次抗体（ロバ抗ラットＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ５９４、ロバ抗ＰＩＭＯ  ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ４８８）で染色し、ＤＡＰＩで対比染色した。
【０２６０】
図１３Ａ〜図１３Ｋに示す通り、より大きい腫瘍サイズは、皮下４Ｔ１−Ｌｕｃ同系腫瘍における増強された低酸素および低下したリンパ球浸潤と相関する。図１２Ａは、植え込み後１０日目および１４日目の腫瘍体積を示す。図１２Ｂは、生細胞集団内のリンパ球の割合を示し、図１２Ｃは、生存可能集団内のリンパ球細胞絶対数を示す。腫瘍体積およびリンパ球パーセンテージの間（図１２Ｄ）ならびに低酸素パーセンテージおよびリンパ球パーセンテージの間（図１２Ｆ）の負の相関が実証された一方、腫瘍体積および低酸素パーセンテージの間の関係性は、正の相関を示した（図１２Ｅ）。負の相関は、腫瘍体積およびＣＤ３陽性Ｔ細胞パーセンテージの間（図１２Ｇ）、腫瘍体積およびＣＤ４陽性Ｔ細胞パーセンテージの間（図１２Ｈ）、腫瘍体積およびＣＤ８陽性Ｔ細胞パーセンテージの間（図１２Ｉ）、腫瘍体積およびＣＤ３−ＣＤ４二重陽性Ｔ細胞パーセンテージの間（図１２Ｊ）ならびに腫瘍体積およびＣＤ３−ＣＤ８二重陽性Ｔ細胞パーセンテージの間（図１２Ｋ）にも見られた。
【０２６１】
図１３Ａ〜図１３Ｆは、低酸素腫瘍領域が、免疫抑制性であることを示し、皮下４Ｔ１−Ｌｕｃ同系マウス腫瘍における低下したＴ細胞浸潤を示す。
【化１−１】
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【化１−２】
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【化１−３】
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【化１−４】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2020183450.tif 000019
【図１１】
2020183450.tif 000020
【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年8月4日(2020.8.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２８】
上記の態様および実施形態の一部の実施形態では、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ、Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ  ２  Ｈ−ＮＯＸ、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ  β１、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  β１、Ｃ．ｌｕｐｕｓ  Ｈ−ＮＯＸ、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ  β１、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ  ＣＧ１４８８５−ＰＡ、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ＧＣＹ−３５、Ｎ．ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ  Ｈ−ＮＯＸ、Ｃ．ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ  Ｈ−ＮＯＸ、Ｓ．ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸまたはＣ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ  Ｈ−ＮＯＸである。一部の実施形態では、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、配列番号２に示されるＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓのＨ−ＮＯＸドメインに対応するＨ−ＮＯＸドメインを含む。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３９】
上記の使用の一部の実施形態では、Ｏ２担体ポリペプチドはＨ−ＮＯＸタンパク質である。一部の実施形態では、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸ、Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ  ２  Ｈ−ＮＯＸ、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ  β１、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  β１、Ｃ．ｌｕｐｕｓ  Ｈ−ＮＯＸ、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ  β１、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ  ＣＧ１４８８５−ＰＡ、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ＧＣＹ−３５、Ｎ．ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ  Ｈ−ＮＯＸ、Ｃ．ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ  Ｈ−ＮＯＸ、Ｓ．ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸまたはＣ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ  Ｈ−ＮＯＸである。一部の実施形態では、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、配列番号２に示されるＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓのＨ−ＮＯＸドメインに対応するＨ−ＮＯＸドメインを含む。一部の実施形態では、Ｈ−ＮＯＸは、１個または複数の遠位ポケット変異を含む。一部の実施形態では、遠位ポケット変異は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸのＬ１４４に対応する部位におけるアミノ酸置換である。一部の実施形態では、Ｈ−ＮＯＸは、１４４位にアミノ酸置換を含むＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  Ｈ−ＮＯＸである。一部の実施形態では、１４４位におけるアミノ酸置換は、Ｌ１４４Ｆ置換である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１３】
本発明の一部の実施形態では、Ｏ２担体ポリペプチド（例えば、Ｈ−ＮＯＸタンパク質）は、化学療法と組み合わせて使用される。一部の実施形態では、化学療法は、細胞毒である。細胞毒を含む化学療法剤は、当技術分野において公知である。一部の実施形態では、細胞毒は、アルキル化剤である。一部の実施形態では、細胞毒は、シクロホスファミドまたはテモゾロミドである。一部の実施形態では、Ｏ２担体ポリペプチドは、化学療法の投与の前に投与される。一部の実施形態では、Ｏ２担体ポリペプチドは、化学療法の投与とともに投与される。一部の実施形態では、Ｏ２担体ポリペプチドは、化学療法の投与の後に投与される。一部の実施形態では、Ｏ２担体ポリペプチドは、化学療法の投与の前に、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２または２４時間のいずれかで個体に投与されるか、または１、２、３、４、５、６または７日の間、毎日また１日２回投与される。一部の実施形態では、Ｏ２担体ポリペプチドは、化学療法の投与の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、１０、１２または２４時間のいずれかの後に個体に投与される。一部の実施形態では、Ｏ２担体ポリペプチドの投与および／または化学療法の投与は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０回または１０回超のうちいずれか１種で反復される。一部の実施形態では、Ｏ２担体ポリペプチドの投与および／または化学療法の投与は、約１週間、２週間、３週間、４週間、５週間または６週間のうちいずれか１種の後で反復される。一部の実施形態では、Ｏ２担体ポリペプチドおよび化学療法の投与は、同じ投薬サイクル上にある。一部の実施形態では、Ｏ２担体ポリペプチドおよび化学療法の投与は、異なる投薬サイクル上にある。一部の実施形態では、Ｈ−ＮＯＸおよび放射線療法の投与は、別の治療法；例えば、放射線療法および／または免疫療法と併せて使用される。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１６】
一部の実施形態では、Ｏ２担体ポリペプチドは、免疫療法の投与の前に投与される。一部の実施形態では、Ｏ２担体ポリペプチドは、免疫療法の投与とともに投与される。一部の実施形態では、Ｏ２担体ポリペプチドは、免疫療法の投与の後に投与される。一部の実施形態では、Ｏ２担体ポリペプチドは、免疫療法の投与の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、１０、１２、２４または４８時間のいずれかの前に個体に投与される。一部の実施形態では、Ｏ２担体ポリペプチドは、免疫療法の投与の少なくとも３、４、５、６、７日またはより多くの日のいずれかの前に個体に投与される。一部の実施形態では、Ｏ２担体ポリペプチドは、免疫療法の投与の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、１０、１２、２４または４８時間のいずれかの後に個体に投与される。一部の実施形態では、Ｏ２担体ポリペプチドは、免疫療法の投与の少なくとも３、４、５、６、７日またはより多くの日のいずれかの後に個体に投与される。一部の実施形態では、Ｏ２担体ポリペプチドの投与および／または免疫療法の投与は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０回または１０回超のうちいずれか１種で反復される。一部の実施形態では、Ｏ２担体ポリペプチドの投与および／または免疫療法の投与は、約１週間、２週間、３週間、４週間、５週間または６週間のうちいずれか１種の後で反復される。一部の実施形態では、Ｏ２担体ポリペプチドおよび免疫療法の投与は、同じ投薬サイクル上にある。一部の実施形態では、Ｏ２担体ポリペプチドおよび免疫療法の投与は、異なる投薬サイクル上にある。一部の実施形態では、Ｈ−ＮＯＸおよび放射線療法の投与は、別の治療法；例えば、放射線療法および／または化学療法と併せて使用される。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2020183450000001.app
【外国語明細書】
2020183450000001.pdf