(57)【要約】【課題】副生成物が少なく、基質特異性が低く様々な糖のエピメリ化を触媒することができ、および／または耐熱性に優れ工業的規模での利用に適した、糖のエピメリ化を触媒する酵素の提供すること。【解決手段】以下の(ａ)から(ｃ)のいずれか一のタンパク質を含む、糖のエピメリ化触媒用の酵素剤を提供する。(ａ) 配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；(ｂ) 配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、糖のエピメリ化活性を有するタンパク質；(ｃ) 配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されたアミノ酸配列からなり、糖のエピメリ化活性を有するタンパク質。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(ａ)から(ｃ)のいずれかのタンパク質を含む、糖のエピメリ化触媒用の酵素剤。
(ａ) 配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
(ｂ) 配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、糖のエピメリ化活性を有するタンパク質；
(ｃ) 配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されたアミノ酸配列からなり、糖のエピメリ化活性を有するタンパク質。
【請求項２】
前記糖はＮ−アシル−Ｄ−グルコサミンを含まない、請求項１に記載の酵素剤。
【請求項３】
メリオリバクター・ロセウス（Ｍｅｌｉｏｒｉｂａｃｔｅｒ  ｒｏｓｅｕｓ）に由来し、下記の性質を有するタンパク質を含む、糖のエピメリ化触媒用の酵素剤。
(1)糖のエピメリ化活性を有する；
(2)Ｎ−アシル−Ｄ−グルコサミンを実質的に基質としない；
(3)ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定された分子量が４８〜５８ｋＤａである；
(4)最適ｐＨが６．８〜８．６の範囲である；
(5)ｐＨ５．８〜９．９の範囲で安定である；
(6)最適温度が５６℃〜６０℃の範囲である；
(7)５０℃以下で安定である。
【請求項４】
糖のエピメリ化が、Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノース、Ｄ−タロース、Ｄ−ガラクトース、セロビオース、ラクトース、エピラクトース、β−（１→４）−マンノビオース、β−（１→４）−グルコシルマンノース、およびβ−（１→４）−マンノシルグルコースからなる群から選択されるいずれかの糖のエピメリ化である請求項１〜３の何れか一項に記載の酵素剤。
【請求項５】
糖のエピメリ化反応生成物の製造に用いられる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の酵素剤。
【請求項６】
糖基質に、請求項１〜５のいずれか一項に記載の酵素剤を作用させて、糖のエピメリ化反応生成物を得る工程を含む、糖のエピメリ化反応生成物の製造方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法を実施して糖のエピメリ化反応生成物を得る工程、および前記工程で得られた糖のエピメリ化反応生成物を用いて食品、飼料、餌料、化粧料、または医薬品を得る工程を含む、食品、飼料、餌料、化粧料、または医薬品の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖のエピメリ化触媒用の酵素剤、当該酵素剤を作用させて、エピメリ化反応生成物を得る工程を含む、エピメリ化反応生成物の製造方法および当該製造方法で得られるエピメリ化反応生成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
希少糖には生理活性をもつものがあり、医薬品、化粧品および食品素材としての用途が期待されている。例えば、希少糖の一つであるプシコースは、ノンカロリーの糖であり、食後の血糖上昇の抑制や糖尿病予防等の効果が確認されている。アロースも同じくノンカロリーの糖であり、活性酸素の生産抑制効果が確認されている。
【０００３】
希少糖の製造方法を、希少糖の一つであるタロースを例にして、以下に説明する。タロースは、ガラクトースの２位のエピマーである。ガラクトースは、自然界に豊富に存在しかつ容易に調達可能であるが、タロースは自然界における存在量は少ない希少糖である。タロースが、自然界に存在する一様態として、抗生物質であるハイグロマイシンＢの構造の一部であることが知られている。なお、タロースの生理活性については研究が進んでいないが、将来的に何らかの生理活性が見出される可能性はある。
【０００４】
タロースの製造方法には化学反応法および酵素法が存在する。化学反応法には、Ｄ−ガラクタールなどをはじめとする不飽和糖へのＳｈａｒｐｌｅｓｓ不斉ジヒドロキシル化反応を行う方法があるが、基質自体の入手が容易ではなく、更に有機合成による水酸基の保護が必要となる等、工程が煩雑かつ低収率であるという問題が存在する。また、可能性として、上述のハイグロマイシンＢを加水分解する方法があるが、ハイグロマイシンＢ自体が希少で高価であり、現実的ではない。
【０００５】
酵素法としては、特許文献1に、カルジセルロシルプトル・サッカロリティカス（Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ）ＡＴＣＣ４３４９４由来のセロビオース  ２−エピメラーゼを、Ｄ−ガラクトースに作用させるＤ−タロースの製造方法が記載されている。
【０００６】
また、タロース以外の希少糖の酵素による製造方法としては、特許文献２には、ロドサーマス・マリナス（Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ）由来のセロビオース  ２−エピメラーゼをラクトースに対して作用させることにより、エピラクトースを製造する方法が記載されている。エピラクトースはカルシウム・ミネラル吸収促進効果、プレバイオティクス効果、脂質代謝改善効果等を示す難消化性の機能性糖質である。
【０００７】
酵素法は、有機合成を使用する化学反応法に比べ、収率が高い点が優れており、更には人体に有害な試薬を使用する必要性が低いため、当該糖質素材を医薬品、化粧品および食品素材として製造する場合に好適である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】ＷＯ２０１０／０９００９５
【特許文献２】特開２０１２−１３０３３２号公報（特許第５０９２０４９号公報）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、特許文献１に記載の酵素を用いるＤ−タロースの製造方法では、副生成物として高い割合でＤ−タガトースが生じるため、Ｄ−タロースの製造効率が低く、更には純度の高いＤ−タロースを得るためにはＤ−タロースとＤ−タガトースの分離工程が必要であり、製造工程が複雑であるという問題があった。また、特許文献２に記載の酵素は基質特異性が高いため、汎用性が低いという問題があり、基質特異性が低く様々な糖のエピメリ化を効率的に触媒することができる汎用性の高い酵素が求められていた。さらには、工業的規模での利用の点から、耐熱性に優れた酵素の開発が求められていた。
【００１０】
したがって、本発明は、副生成物が少なく、基質特異性が低く様々な糖のエピメリ化を触媒することができ、および／または耐熱性に優れ工業的規模での利用に適した、糖のエピメリ化を触媒する酵素の提供を目的とする。さらには、本発明は、従来技術では製造が難しいか、または製造効率が低かった糖質について、安価で効率的な製造法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、糖類の新規なエピメラーゼの探索を企図し、種々のタンパク質をコードする遺伝子について発現と諸性質の解析を行ってきた。その中で、中等度好熱性細菌であるメリオリバクター・ロセウス（Ｍｅｌｉｏｒｉｂａｃｔｅｒ  ｒｏｓｅｕｓ）のゲノム上に存在し、Ｎ−アシルグルコサミン  ２−エピメラーゼ（Ｎ−ａｃｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ  ２−ｅｐｉｍｅｒａｓｅ）と推定されるタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＦＮ７３７４９．１）をコードする遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＰ００３５５７．１の位置５６３３２３−５６４７０５）に着目して発現解析を行った。
【００１２】
しかしながら、当該遺伝子をクローニングして大腸菌にて発現させた組換えタンパク質は、Ｎ−アシルグルコサミン  ２−エピメラーゼ活性を示さなかった。そこで、当該タンパク質が作用可能な糖を探索したところ、β−１,４結合を有する二糖類、すなわち、セロビオース、ラクトース、β−（１→４）−マンノビオース等に対して作用しエピメリ化反応生成物が得られたことから、このタンパク質はセロビオース  ２−エピメラーゼ活性を有することが明らかとなった。さらに、上記タンパク質は、驚くべきことに、グルコースおよびマンノース、ガラクトースおよびタロースに対しても作用し、それぞれを相互に変換する２−エピメリ化活性を有していた。
【００１３】
本発明者らは、上記のとおり、糖類の新規なエピメラーゼを見出し、本発明を完成した。
本発明は以下の通りである。
［１］以下の(ａ)から(ｃ)のいずれかのタンパク質を含む、糖のエピメリ化触媒用の酵素剤。
(ａ) 配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
(ｂ) 配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、糖のエピメリ化活性を有するタンパク質；
(ｃ) 配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されたアミノ酸配列からなり、糖のエピメリ化活性を有するタンパク質。
［２］上記糖はＮ−アシル−Ｄ−グルコサミンを含まない、［１］に記載の酵素剤。
［３］メリオリバクター・ロセウス（Ｍｅｌｉｏｒｉｂａｃｔｅｒ  ｒｏｓｅｕｓ）に由来し、下記の性質を有するタンパク質を含む、糖のエピメリ化触媒用の酵素剤。
(1)糖のエピメリ化活性を有する；
(2)Ｎ−アシル−Ｄ−グルコサミンを実質的に基質としない；
(3)ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定された分子量が４８〜５８ｋＤａである；
(4)最適ｐＨが６．８〜８．６の範囲である；
(5)ｐＨ５．８〜９．９の範囲で安定である；
(6)最適温度が５６℃〜６０℃の範囲である；
(7)５０℃以下で安定である。
［４］糖のエピメリ化が、Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノース、Ｄ−タロース、Ｄ−ガラクトース、セロビオース、ラクトース、エピラクトース、β−（１→４）−マンノビオース、β−（１→４）−グルコシルマンノース、およびβ−（１→４）−マンノシルグルコースからなる群から選択されるいずれかの糖のエピメリ化である［１］〜［３］の何れか一に記載の酵素剤。
［５］糖のエピメリ化反応生成物の製造に用いられる、［１］〜［４］のいずれか一に記載の酵素剤。
［６］糖基質に、［１］〜［５］のいずれか一に記載の酵素剤を作用させて、糖のエピメリ化反応生成物を得る工程を含む、糖のエピメリ化反応生成物の製造方法。
［７］［６］に記載の方法を実施して糖のエピメリ化反応生成物を得る工程、および上記工程で得られた糖のエピメリ化反応生成物を用いて食品、飼料、餌料、化粧料、または医薬品を得る工程を含む、食品、飼料、餌料、化粧料、または医薬品の製造方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、エピメリ化活性を有する新規な酵素剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１Ａ】メリオリバクター・ロセウス由来のタンパク質をコードする塩基配列（配列番号１）。
【図１Ｂ】メリオリバクター・ロセウス由来のタンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）。
【図２】メリオリバクター・ロセウス由来のタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ。メリオリバクター・ロセウス由来のタンパク質のバンドを矢印で示す。
【図３】酵素反応生成物のＴＬＣ分析。以下に、略称の説明を記載する。Ｇｌｃ：Ｄ−グルコース、Ｍａｎ：Ｄ−マンノース、Ｆｒｕ：Ｄ−フルクトース、Ｔａｌ：Ｄ−タロース、Ｇａl：Ｄ−ガラクトース、Ｔａｇ：Ｄ−タガトース、Ｘｙｌ：Ｄ−キシロース、Ｌｙｘ：Ｄ−リキソース、Ｘｕｌ：Ｄ−キシルロース、Ｃｅｌ：セロビオース、Ｌａｃ：ラクトース、Ｅｐｉｌａｃ：エピラクトース、ＧＭ：β−（１→４）−グルコシルマンノース、ＭＧ：β−（１→４）−マンノシルグルコース、およびＭａｎ2：β−（１→４）−マンノビオース、Ｂ：酵素反応前、Ｒ：酵素反応後。黒い丸（●）は反応生成物を示す。
【図４】本組換えタンパク質の活性に対するｐＨの影響。
【図５】本組換えタンパク質の活性に対する温度の影響。
【図６】本組換えタンパク質およびセロビオース  ２−エピメラーゼのマンノースに対するｋcat／Ｋm値の比較。
【図７】本組換えタンパク質によるマンノースの合成。
【図８】本組換えタンパク質によるタロースの合成。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下に記載する本発明の説明は、代表的な実施形態や具体例に基づいてなされることがあるが、本発明はそのような実施形態に限定されるものではない。なお、本明細書について、糖質の記載は特に明記しない場合はＤ体を表す。また、「〜」を用いて表される数値範囲は「〜」の前後に記載される数値を下限値および上限値として含む範囲を意味する。本明細書では、数値が「約」の用語を伴う場合、その値の±１０％の範囲を含むことを意図する。
【００１７】
本発明の酵素による反応生成物の糖組成（％）は、ＨＰＬＣで検出されたピークの総面積を１００とした場合の、各糖類に対応するピークの面積比率（％）として算出したものである。
【００１８】
（酵素剤）
本発明は、以下の(ａ)から(ｃ)のいずれかのタンパク質を含む、糖のエピメリ化触媒用の酵素剤を提供する。
(ａ) 配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
(ｂ) 配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、糖のエピメリ化活性を有するタンパク質；
(ｃ) 配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されたアミノ酸配列からなり、糖のエピメリ化活性を有するタンパク質。
なお、本明細書中において、上記(ａ)から(ｃ)のいずれかのタンパク質を、本発明の酵素剤に含まれるタンパク質、または本タンパク質ということがある。
【００１９】
「糖のエピメリ化」または「糖に対するエピメリ化」とは、糖の複数ある不斉炭素のうち、１つの不斉炭素上の立体を反転させる反応であり、具体的には、一例として、糖の２位の水酸基をエピメリ化（異性化）する反応、またはその逆反応を挙げることができる。エピメリ化を触媒する酵素を、通常、エピメラーゼといい、例えば、よく研究されているエピメラーゼとして、セロビオース  ２−エピメラーゼ（ＣＥ）を挙げることができる。ＣＥは、セロビオースの還元末端グルコース残基をマンノース残基に異性化する反応を触媒する。
【００２０】
配列番号２に記載のアミノ酸配列は、好熱性細菌メリオリバクター・ロセウス（Ｍｅｌｉｏｒｉｂａｃｔｅｒ  ｒｏｓｅｕｓ）のゲノム情報から取得したアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＦＮ７３７４９．１）である。ここで、配列番号２に記載のアミノ酸配列は、Ｎ−アシルグルコサミン  ２−エピメラーゼファミリーとアノテーションされているものの、タンパク質として発現させた場合の具体的活性は、本願出願時において知られていなかった。
【００２１】
本発明者らは、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質を、大腸菌発現系による組換えタンパク質として発現させ、その酵素活性を解析したところ、当該タンパク質は、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンに作用しないが、少なくともＤ−グルコース、Ｄ−マンノース、Ｄ−タロース、Ｄ−ガラクトース、セロビオース、ラクトース、エピラクトース、β−（１→４）−マンノビオース、β−（１→４）−グルコシルマンノース、およびβ−（１→４）−マンノシルグルコースに作用することを発見した。すなわち、本発明者らは、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質は、Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノース、Ｄ−タロースおよびＤ-ガラクトース等の単糖、並びにセロビオース、ラクトース、エピラクトース、β−（１→４）−マンノビオース、β−（１→４）−グルコシルマンノース、およびβ−（１→４）−マンノシルグルコースの還元性糖残基における２位の炭素上の水酸基に対しエピメリ化を触媒する酵素であることを見出した。
【００２２】
メリオリバクター・ロセウス由来の配列番号２に記載のアミノ酸配列は、既知のＣＥが有するアミノ酸配列に対して、一次アミノ酸配列同一性が３０％程度と低いものであった。具体的には、配列番号２に記載のアミノ酸配列は、それぞれロドサーマス・マリナス（Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ）由来ＣＥ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＡＫ６１７７７．１）に対して２８％、バクテロイデス・フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）由来ＣＥ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＡＨ２３７７３．１）に対して２９％、セルビブリオ・ブルガリス（Ｃｅｌｌｖｉｂｒｉｏ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）由来ＣＥ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＳ１９６９４．１）に対して２７％、ルミノコッカス・アルブス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ａｌｂｕｓ）由来ＣＥ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＡＦ８１１０８．１）に対して２８％の一次アミノ酸配列同一性を有する（同一性はＣｌｕｓｔａｌＷ（Ｌａｒｋｉｎ  Ｍ.  Ａ.  ｅｔ  ａｌ.,  ２００７,  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ,  ２００７；  ２３：２９４７−２９４８）を用いて評価した）。そのため、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質がＣＥ活性を有することは予想外の結果であった。
【００２３】
本発明の酵素剤に含まれるタンパク質は、配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して、９０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ糖のエピメリ化活性を示すタンパク質であってもよい。一実施形態では、本発明の酵素剤に含まれるタンパク質は、配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ糖のエピメリ化活性を示すタンパク質であってもよい。
【００２４】
アミノ酸配列同一性は、比較する２本のアミノ酸配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならばギャップを導入した後、２本のアミノ酸配列間で同一であるアミノ酸残基のパーセントとして定義される。アミノ酸配列同一性は、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用することにより決定することができる。
【００２５】
さらには、本発明の酵素剤に含まれるタンパク質は、配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質からなり、且つ糖のエピメリ化活性を有するタンパク質であってもよい。本明細書で言う「１もしくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されたアミノ酸配列」における「１もしく数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１から５個、特に好ましくは１から３個程度を意味する。
本発明の酵素剤に含まれるタンパク質の製造方法については、後述の＜タンパク質の製造＞を参照されたい。
【００２６】
本発明の酵素剤に含まれるタンパク質のエピメリ化活性の評価は、Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノース、Ｄ−タロース、Ｄ−ガラクトース、セロビオース、ラクトース、エピラクトース、β−（１→４）−マンノビオース、β−（１→４）−グルコシルマンノース、およびβ−（１→４）−マンノシルグルコースからなる群から選択される何れかを基質として、本発明のタンパク質を作用させ、得られたエピメリ化した反応生成物を検出することにより行なわれる。本発明の酵素剤に含まれるタンパク質のエピメリ化活性を一種類の糖のみで評価する場合には、特にβ−（１→４）−マンノビオースを用いることができる。反応生成物は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用い、ＲＩ検出器や荷電化粒子検出器などで検出することができる。検出は、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）および高性能イオン交換クロマトグラフィー／パルスドアンペロメトリ検出法（ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ）を用いて行うこともできる。
【００２７】
Ｄ−グルコースのエピメリ化によりＤ−マンノースが生成され、Ｄ−マンノースのエピメリ化によりＤ−グルコースが生成され、Ｄ−タロースのエピメリ化によりＤ−ガラクトースが生成され、およびＤ−ガラクトースのエピメリ化によりＤ−タロースが生成される。さらには、セロビオースのエピメリ化によりβ−（１→４）−グルコシルマンノースが生成され、β−（１→４）−グルコシルマンノースのエピメリ化によりセロビオースが生成され、ラクトースのエピメリ化によりエピラクトースが生成され、エピラクトースのエピメリ化によりラクトースが生成され、β−（１→４）−マンノビオースのエピメリ化によりβ−（１→４）−マンノシルグルコースが生成され、およびβ−（１→４）−マンノシルグルコースのエピメリ化によりβ−（１→４）−マンノビオースが生成される。
【００２８】
本発明の糖のエピメリ化触媒用の酵素剤は、少なくともＤ−グルコース、Ｄ−マンノース、Ｄ−タロース、Ｄ−ガラクトース、セロビオース、ラクトース、エピラクトース、β−（１→４）−マンノビオース、β−（１→４）−グルコシルマンノース、およびβ−（１→４）−マンノシルグルコースから選択されるいずれかの糖のエピメリ化反応を触媒するために用いることができる。ただし、上記糖には、Ｎ−アシル−Ｄ−グルコサミンは含まれない。また、上記糖には、Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミンも含まれない。本発明の酵素剤に含まれるタンパク質は、Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−タロース、セロビオース、β−（１→４）−グルコシルマンノース、ラクトース、エピラクトース、β−（１→４）−マンノビオース、およびβ−（１→４）−マンノシルグルコースに作用し、これらの糖のエピメリ化を触媒するが、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンおよびＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンを実質的に基質としないためである。
【００２９】
本明細書において、特定の糖を実質的に基質にしないとは、例えば、マンノースを基質とした活性を１００％とした場合に、上記特定の糖を基質とした相対活性が５％以下であることを意味し、好ましくは１％以下であり、より好ましくは０％であり、さらに好ましくは、上記特定の糖を基質とする活性が測定不可であり、特に好ましくは、上記特定の糖を基質とする触媒反応が完全に生じないことを意味する。
【００３０】
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを実質的に基質にしないとは、例えば、マンノースを基質とした活性を１００％とした場合に、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（Ｎ−アシル−Ｄ−グルコサミンの代表的な一例）を基質とした相対活性が５％以下であることを意味し、好ましくは１％以下であり、より好ましくは０％であり、さらに好ましくは、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを基質とする活性が測定不可であり、特に好ましくは、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを基質とする触媒反応が完全に生じないことを意味する。Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミンについても、同様である。
【００３１】
本発明の酵素剤に含まれるタンパク質は、単糖の２位の水酸基をエピメリ化することができる。さらには、本発明の酵素剤に含まれるタンパク質は、β−１，４結合で結合している２つ以上の糖残基からなる糖について、還元性糖残基における２位の水酸基をエピメリ化することができる。
【００３２】
本発明の糖のエピメリ化触媒用の酵素剤は、糖のエピメリ化反応生成物の製造に用いることができる。具体的には、本発明の糖のエピメリ化触媒用の酵素剤は、Ｄ−グルコースを基質としてＤ−マンノースを製造するために使用することができ、またＤ−マンノースを基質としてＤ−グルコースを製造するために使用することができる。本発明の一実施態様において、本酵素剤は、Ｄ−グルコースを基質としてＤ−マンノースを製造するために使用することが好ましい。Ｄ−グルコースは、工業的に大量生産され安価であることから、工業的製造法に課題のあるＤ−マンノースを製造するために、容易に調達できるためである。
【００３３】
本発明の糖のエピメリ化触媒用の酵素剤は、Ｄ−ガラクトースを基質としてＤ−タロースを製造するために使用することができ、またＤ−タロースを基質としてＤ−ガラクトースを製造するために使用することができる。本発明の一実施態様において、本酵素剤は、Ｄ−ガラクトースを基質としてＤ−タロースを製造するために使用することが好ましい。Ｄ−ガラクトースは、自然界に豊富に存在するラクトースの加水分解等によりに得られることから、希少糖の一つであるＤ−タロースを製造するために、容易に調達できるためである。
【００３４】
さらには、本発明の糖のエピメリ化触媒用の酵素剤は、ラクトースを基質としてエピラクトースを製造するために使用することができ、また、エピラクトースを基質としてラクトースを製造するために使用することができる。本発明の一実施態様において、本酵素剤は、ラクトースを基質としてエピラクトースを製造するために使用することが好ましい。ラクトースは、自然界に豊富に存在するので、自然界に微量に存在するオリゴ糖であるエピラクトースを製造するために、容易に調達できるためである。
【００３５】
本発明の糖のエピメリ化触媒用の酵素剤は、セロビオースを基質としてβ−（１→４）−グルコシルマンノースを製造するために使用することができ、また、β−（１→４）−グルコシルマンノースを基質としてセロビオースを製造するために使用することができる。本発明の一実施態様において、本酵素剤は、セロビオースを基質としてβ−（１→４）−グルコシルマンノースを製造するために使用することが好ましい。セロビオースは、自然界に豊富に存在するセルロースの加水分解等により比較的容易に調製可能であることから、自然界に微量に存在するオリゴ糖であるβ−（１→４）−グルコシルマンノースを製造する上で好適である。
【００３６】
本発明の糖のエピメリ化触媒用の酵素剤は、β−（１→４）−マンノシルグルコースを基質としてβ−（１→４）−マンノビオースを製造するために使用することができ、また、β−（１→４）−マンノビオースを基質としてβ−（１→４）−マンノシルグルコースを製造するために使用することができる。
【００３７】
本発明はまた、メリオリバクター・ロセウス（Ｍｅｌｉｏｒｉｂａｃｔｅｒ  ｒｏｓｅｕｓ）に由来し、下記の性質を有するタンパク質を含む、糖のエピメリ化触媒用の酵素剤を提供する。
(1)糖のエピメリ化活性を有する；
(2)Ｎ−アシル−Ｄ−グルコサミンを実質的に基質としない；
(3)ＳＤＳ-ＰＡＧＥにより測定された分子量が４８〜５８ｋＤａである；
(4)最適ｐＨが６．８〜８．６の範囲である；
(5)ｐＨ５．８〜９．９の範囲で安定である；
(6)最適温度が５６℃〜６０℃の範囲である；
(7)５０℃以下で安定である。
【００３８】
本発明の酵素剤に含まれるタンパク質は、更に、以下の性質を有する。
(8)基質として、Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノース、Ｄ−タロース、Ｄ−ガラクトース、セロビオース、ラクトース、エピラクトース、β−（１→４）−グルコシルマンノース、β−（１→４）−マンノシルグルコース、およびβ−（１→４）−マンノビオースからなる群から選択されるいずれかに作用する。
【００３９】
本発明の酵素剤に含まれるタンパク質は、糖のエピメリ化活性を有する酵素である。しかし、本発明の酵素剤に含まれるタンパク質は、上記のとおり、Ｎ−アシル−Ｄ−グルコサミンを実質的に基質としない。
【００４０】
本発明の酵素剤に含まれるタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定される分子量が４８〜５８ｋＤａの範囲であるか、または約５３ｋＤａである。なお、ここで示す本タンパク質の分子量は、プラスミドに組換えて、大腸菌を宿主細胞として発現させたタンパク質の分子量である。実施例１において４８〜５８ｋＤａの範囲又は約５３ｋＤａと測定された本タンパク質は、Ｃ末端側にＨｉｓ−Ｔａｇ（ヒスチジン６個付加）を有する。なお、本タンパク質の分子量の理論値は、５４．４ｋＤａ（Ｈｉｓ−Ｔａｇなし）である。
【００４１】
本発明の酵素剤に含まれるタンパク質は、温度３７℃で測定した場合、最適ｐＨは６．８〜８．６の範囲である。また、本タンパク質は、温度４℃で２４時間保持する試験において、ｐＨ５．８〜９．９の範囲で安定であった。なお、最適ｐＨおよびｐＨ安定性は、エピメリ化活性を実施例５に示す条件で測定したものである。
【００４２】
本発明の酵素剤に含まれるタンパク質は、ｐＨ８．０で測定した場合、最適温度は５６〜６０℃の範囲である。また、本タンパク質は、ｐＨ８．０で２０分保持した試験において、温度５０℃以下で安定であった。なお、最適温度および温度安定性は、エピメリ化活性を実施例５に示す条件で測定したものである。
【００４３】
従来のエピメラーゼの中には、熱安定性の点から工業的規模での使用について制限があるものがあった。しかし、本発明の酵素剤に含まれるタンパク質は、高い耐熱性を示し、工業的規模での使用に適した熱安定性を有している。
【００４４】
本発明の酵素剤に含まれるタンパク質は、これらに限定されないが、少なくとも、Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノース、Ｄ−タロース、Ｄ−ガラクトース、セロビオース、ラクトース、エピラクトース、β−（１→４）−マンノビオース、β−（１→４）−グルコシルマンノース、およびβ−（１→４）−マンノシルグルコースに作用し、これらの糖のエピメリ化反応を触媒することができる。
【００４５】
従来のセロビオース  ２−エピメラーゼには、Ｄ−ガラクトースからＤ−タロースおよびＤ−タガトースを生成するものがある（特許文献１）。しかし、本発明の酵素剤に含まれるタンパク質は、Ｄ−ガラクトースを主にＤ−タロースに変換することができる。本タンパク質を用いると、Ｄ−ガラクトースから、わずかにＤ−タガトースが生成されることがあるが、非常に微量である。
【００４６】
本発明の酵素剤は、上記の糖のエピメリ化活性を有するタンパク質以外に、糖のエピメリ化反応を阻害しないものであれば、さらなる成分を含むことができる。これらは、例えば、緩衝液、安定化剤、賦形剤など、通常の酵素製剤に用いる成分であってもよい。このようなさらなる成分は、先行技術より公知であり、また当業者によく知られている。また、本発明の酵素剤は、その形状も特に制限は無く、固体（たとえば、粉末状）や液体であり得る。本発明の酵素剤は、例えば、固体や液体のものを、糖基質の溶液に添加することにより使用することができる。
【００４７】
本発明の酵素剤は、例えば、本発明の糖のエピメリ化活性を有するタンパク質が固定化担体に固定された酵素剤として提供することができる。固定化された酵素剤とすることで、例えば、高基質濃度および高温において、反応生成物の製造を行うことができ、また、バイオリアクター方式による反応生成物の製造を行うこともできる。
【００４８】
上記固定化担体は、特に制限されず、例えば、糖のエピメリ化活性を有するタンパク質が吸着または架橋結合され、本タンパク質の活性が保持されるものであれば使用できる。上記固定化担体は、例えば、陰イオン交換担体、陽イオン交換担体、疎水性担体等があげられる。上記固定化担体の具体例は、例えば、イオン交換ゲルである。上記イオン交換ゲルは、例えば、ダイヤイオン（登録商標）ＳＫ１Ｂ、ダイヤイオン（登録商標）ＰＫ２１２、ダイヤイオン（登録商標）ＨＰＡ２５等のダイヤイオン（登録商標）シリーズ（三菱ケミカル社製）；セパビーズ（登録商標）ＳＰ−２０７、セパビーズ（登録商標）ＳＰ−８５０等のセパビーズ（登録商標）シリーズ（三菱ケミカル社製）；デュオライトＡ５６８、デュオライトＰＷＡ７、デュオライトＸＡＤ７６１等のデュオライトシリーズ（住化ケムテックス社製）等があげられる。
【００４９】
Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノース、Ｄ−タロース、Ｄ−ガラクトース、セロビオース、ラクトース、エピラクトース、β−（１→４）−マンノビオース、β−（１→４）−グルコシルマンノース、およびβ−（１→４）−マンノシルグルコース以外の糖であっても、本発明の酵素剤に含まれるタンパク質がエピメリ化を触媒できるものであれば、本発明の酵素剤を用いることができる。
【００５０】
上記固定化担体の形状は、特に制限されず、例えば、膜、ビーズ、プレート等があげられる。
糖のエピメリ化活性を有するタンパク質の上記固定化担体への固定方法は、特に制限されず、例えば、緩衝液等の溶媒に本タンパク質と上記固定化担体とを添加し、この混合液を振とうすることで行うことができる。
【００５１】
（糖のエピメリ化生成物の製造方法）
本発明は、糖基質に、本発明の糖のエピメリ化触媒用の酵素剤を作用させて、糖のエピメリ化反応生成物を得る工程を含む、糖のエピメリ化反応生成物の製造方法を提供する。糖基質に、本発明の酵素剤を作用させることは、例えば、糖基質の水溶液を調製し、必要に応じてｐＨを調整した後、当該水溶液に本発明の酵素剤を添加することにより実施することができる。さらには、本発明の糖のエピメリ化活性を有するタンパク質を担体に固定して酵素剤とし、当該酵素剤に糖基質の水溶液を接触させることにより実施することができる。本発明の酵素剤を用いた糖のエピメリ化反応は、反応液中で実施することができるためである。
【００５２】
糖のエピメリ化反応生成物の製造方法に用いることができる糖基質は、グルコース、マンノース、ガラクトース、タロース、セロビオース、β−（１→４）−グルコシルマンノース、ラクトース、エピラクトース、β−（１→４）−マンノビオース、およびβ−（１→４）−マンノシルグルコースからなる群から選択されるいずれかであってもよいが、これらに限定されず、これ以外の糖であっても本発明の酵素剤に含まれるタンパク質がエピメリ化を触媒できるものであれば、糖基質として使用することができる。上記糖基質としては、純品を用いても良いが、コスト等の点から他の糖質が含まれる糖組成物を用いてもよい。具体的には、例えば、グルコースを主な基質に用いる場合、グルコースに加えて澱粉の分解で生じるマルトースやマルトトリオースなどを含む糖組成物でもよい。
【００５３】
糖基質に、本発明の酵素剤に含まれるタンパク質を作用させる際の反応温度は、酵素活性が発現する温度域であれば、特に制限はない。本発明の酵素剤に含まれるタンパク質は、上記のとおり、ｐＨ８．０で測定した場合、最適温度が５６℃〜６０℃の範囲である。よって、本発明の酵素剤を作用させる際の反応温度（反応液の液温）を、３５〜６０℃といった幅広い温度域に設定することができる。工業的規模の反応系では正確な温度管理が難しい場合があるが、本タンパク質は、幅広い温度域で安定的に使用できる点で有利である。
【００５４】
上記反応温度は、３５〜６０℃の範囲に設定することができるが、４５〜５０℃の範囲に設定することが好ましい。反応温度が４５℃以上であれば、糖を栄養分とする混入菌が繁殖しにくく、５０℃以下で、本タンパク質は温度安定性を示すためである。
【００５５】
糖のエピメリ化生成物の製造方法においては、後述のとおり、本発明の酵素剤と、その他の酵素を併用することができる。その他の酵素を併用する場合には、上記反応温度は、本発明の酵素剤に含まれるタンパク質が安定に作用する温度域であればよい。上記のとおり、本発明の酵素剤に含まれるタンパク質は幅広い温度域で安定性を有するため、併用するその他の酵素が安定に活性化する温度を勘案して、反応系で使用するすべての酵素の活性が十分に利用できる範囲に、温度設定ができる場合が多い。
【００５６】
反応温度は、反応時間の全体を通して一定である必要はなく、反応時間の初期に併用するその他の酵素の活性を高めることが望ましい場合には、その酵素の活性が高くなる温度域に、反応初期の温度を設定し、反応時間の中期や後期には、本発明の酵素剤に含まれるタンパク質の活性が高くなる温度域に温度を設定するなど、適宜調整することができる。
【００５７】
糖基質に、本発明の酵素剤に含まれるタンパク質を作用させる際の反応液のｐＨは、酵素活性が安定的に発現するｐＨ域であれば、特に制限はないが、ｐＨ５．８〜９．９の範囲に設定することができる。上記のとおり、本発明の酵素剤に含まれるタンパク質はｐＨ５．８〜９．９の範囲で安定であるためである。効率よく糖のエピメリ化生成物を得るには、本発明の酵素剤に含まれるタンパク質を作用させる際の反応液のｐＨを、ｐＨ６．８〜８．６の範囲に設定することが好ましい。上記のとおり、本タンパク質の最適ｐＨは６．８〜８．６の範囲であるためである。反応液のｐＨの調整は、必要に応じ、酸又はアルカリの添加により行うことができる。
【００５８】
糖のエピメリ化生成物の製造方法における基質と本発明の酵素剤に含まれるタンパク質の反応時間は、反応温度や基質の濃度、その他の酵素を併用する場合には使用する酵素の特性等を考慮して適宜決定できる。また、本分野の従来技術に基づいて、効率よくエピメリ化生成物を製造するための、好適な反応時間を適宜決定することができる。具体的な反応時間の例としては、１０分から７２時間を挙げることができるが、これに限定する意図はない。反応中、本発明の酵素剤を、適宜添加することができる。
【００５９】
反応液中の基質濃度は、特に制限されず、例えば、上記酵素反応が進行可能な範囲において、基質濃度が高いほど経済的に有利である。基質としてガラクトースを使用する場合、ガラクトース濃度は、例えば、反応液の溶媒を水１００ｇと仮定した場合、上記溶媒１００ｇあたり０．１ｇ〜１００ｇの範囲である。上記反応液の溶媒は、特に制限されず、例えば、水、緩衝液等があげられる。なお、選択した基質の溶媒への溶解度が低い場合、例えば、所望の濃度で完全に溶解されない場合がある。バッチ式で酵素反応を行う場合、例えば、反応初期において基質が完全に溶解された状態である必要はなく、酵素反応の終了時に溶解される基質濃度を選択すればよい。一方、固定化された酵素剤を充填したカラムを酵素反応に使用する場合、例えば、カラムの目詰まりによる圧力損失を避けるために、基質が完全に溶解された状態であることが好ましい。また、固定化された酵素剤を充填したカラムを酵素反応に使用する場合、例えば、基質溶液を、上記カラムに還流させて、連続的に通液するのが好ましい。
【００６０】
糖のエピメリ化生成物の製造方法において、本発明の酵素剤と、その他の酵素を併用することができる。その他の酵素は、これに制限されないが、本発明の糖のエピメリ化活性を有する酵素基質となりうる糖を生成するものであってもよい。例えば、その他の酵素として、乳糖等のガラクトースを構成糖として含む糖質を加水分解する酵素を用いることができる。本発明の酵素剤（すなわち、糖のエピメリ化触媒用酵素剤）と、当該加水分解酵素をその他の酵素として併用することにより、乳糖等のガラクトースを構成糖として含む糖質から、加水分解によりガラクトースを生成しつつ、エピメリ化によりガラクトースからタロースを生成することができる。
【００６１】
また、本発明の酵素剤を用いて、グルコースを基質としてマンノースを生成する場合、水飴、粉飴、ハイドロール（結晶グルコース製造の際に生ずる分蜜液）などを用いることができる。さらに、例えばデキストリン、澱粉等のグルコースを構成糖として含む糖質を原料とし、本発明の酵素剤と共に加水分解酵素を添加し、原料より基質となるグルコースを生成しつつグルコースからマンノースを製造することができる。
【００６２】
本発明の酵素剤を用いるエピメリ化生成物の製造は、具体的な例としては、基質としてガラクトースを用いる場合、固形分濃度１〜６５％程度のガラクトース水溶液を調製し、必要に応じて酸またはアルカリを用いて当該水溶液のｐＨを５．８〜９．９程度に調整し、当該水溶液に本発明の酵素剤を添加し、温度３０〜７０℃の範囲で、約１〜７２時間保持することでタロースを製造することができる。
【００６３】
上記製造方法により、エピメリ化反応生成物を含む糖水溶液が得られる。このエピメリ化反応生成物を含む糖水溶液に対し、必要に応じて常法を用いて脱色、脱塩、精製処理などを施すことができる。また、エピメリ化反応生成物を含む糖水溶液に、樹脂分画処理、エタノール等を用いた有機溶媒による沈殿法、クロマト分画法や限外濾過膜による処理等を施すことにより、未反応の基質等を除去し、エピメリ化反応生成物の純度を高めることができる。精製処理は、単独の操作によって、またはいくつかの操作を組み合わせることにより、より効率的にエピメリ化反応生成物を精製することができる。
【００６４】
本発明は、糖のエピメリ化反応生成物の製造方法を実施して糖のエピメリ化反応生成物を得る工程、および当該工程で得られた糖のエピメリ化反応生成物を用いて食品、飼料、餌料、化粧料、または医薬品を得る工程を含む、食品、飼料、餌料、化粧料、または医薬品の製造方法を提供する。
【００６５】
糖のエピメリ化反応生成物の製造方法を実施して糖のエピメリ化反応生成物を得る工程は、上述の糖のエピメリ化反応生成物の製造方法に基づいて実施することができる。
【００６６】
上記工程で得られたエピメリ化反応生成物を用いて食品、飼料、餌料、化粧料、または医薬品を得る工程では、エピメリ化反応生成物を原料の一つとして、食品、飼料、餌料、化粧料、または医薬品を製造すること、またはエピメリ化反応生成物そのものを適当な形態（粉末、液体など）に調製し、食品、飼料、餌料、化粧料、または医薬品として提供することができる。
【００６７】
本発明の方法で製造される食品の例には、限定されるものではないが、各種炭水化物類（パン、麺、米飯、もち）、各種和菓子類（せんべい、あられ、おこし、求肥、もち類、まんじゅう、どら焼き、ういろう、餡類、羊羹、水羊羹、錦玉、カステラ、飴玉）、各種洋菓子類（パン、ビスケット、クラッカー、クッキー、パイ、ドーナツ、蒸しケーキ、プリン、ゼリー、ムース、ババロア、カスタードクリーム、シュークリーム、ワッフル、スポンジケーキ、チョコレート、チューインガム、キャラメル、ヌガー、キャンディー、シロップ類）、各種氷菓（アイスクリーム、シャーベット、ジェラート、かき氷）、各種ペースト状食品（フラワーペースト、ピーナッツペースト、マーガリン、フルーツペースト）、各種飲料（果汁含有飲料、果汁ジュース、野菜ジュース、サイダー、ジンジャーエール、アイソトニック飲料、アミノ酸飲料、ゼリー飲料、コーヒー飲料、緑茶、紅茶、ウーロン茶、麦茶、乳飲料、乳酸菌飲料、ココア、ビール、発泡酒、第三のビール、ノンアルコール飲料、ビール風味飲料、リキュール、チューハイ、清酒、果実酒、蒸留酒、栄養ドリンク、健康飲料、粉末飲料）、果物・野菜加工品（ジャム、マーマレード、シロップ漬、糖果、漬物）、各種乳製品（チーズ、ヨーグルト、バター、練乳、粉乳）、粉末食品（粉末スープ、粉末ムース、粉末ゼリー、粉末甘味料）、栄養食、ダイエット食、スポーツ用栄養食、流動食、半固形流動食、介護食、嚥下食等が挙げられる。
【００６８】
本発明の方法で製造される飼料および餌料の例には、限定されるものではないが、家畜、家禽、魚介類、昆虫（ミツバチ、蚕など）用飼料および餌料を挙げることができる。その形態としては、粉体、ペレット、錠剤、練り餌、カプセルなどである。
【００６９】
本発明の方法で製造される化粧料の例には、限定されるものではないが、保湿剤および美容剤などを挙げることができる。それらの形態としては、乳液、クリームおよびエマルジョンなどである。
【００７０】
本発明の方法で製造される医薬品の例には、限定されるものではないが、例えば抗肥満剤、血糖値上昇抑制剤などを挙げることができ、それらの形態としては、錠剤、粉剤、液剤、カプセル剤などである。
【００７１】
＜タンパク質の製造＞
本発明の酵素剤に含まれるタンパク質の取得方法は、特に制限されず、化学合成により合成したタンパク質であってもよいし、遺伝子組換え技術により作製した組換えタンパク質であってもよい。以下に、組換えタンパク質を作製する場合について説明する。
【００７２】
配列番号２に示されるアミノ酸配列、または配列番号２に示されるアミノ酸配列に対して９０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列、及び配列番号２に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質は、遺伝子工学的手法によって調製することができる。例えば、配列番号２のアミノ酸配列をコードする遺伝子は、宿主細胞内で複製可能であるか、あるいは染色体に組み込まれかつ同遺伝子を発現可能な状態で含むＤＮＡ分子として、特に発現ベクターに挿入された形態で宿主細胞の形質転換を行い、宿主細胞を培養することでタンパク質を産生させることができる。このＤＮＡ分子は、配列番号２に示されるアミノ酸配列、配列番号２に示されるアミノ酸配列に対して９０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列、または配列番号２に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されたアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片をベクター分子に組み込むことによって得ることができる。本発明の好ましい態様によれば、このベクターはプラスミドである。本発明におけるＤＮＡ分子の作成は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌに記載の方法に準じて行なうことができる。
【００７３】
本発明において利用できるベクターは、使用する宿主細胞の種類を勘案しながら、ウイルス、プラスミド、コスミドベクターなどから適宜選択できる。例えば、宿主細胞が枯草菌の場合はｐＪＥＸＯＰＴ２系（特開２００９−１７８４１号公報を参照）、ｐＨＴ系のプラスミド、大腸菌の場合はλファージ系のバクテリオファージ、ｐＥＴ系、ｐＵＣ系、ｐＣｏｌｄ系、ｐＧＥＸ系のプラスミド、酵母の場合はＹＥｐ、ＹＣｐ系、ＹＩｐ系のベクター、あるいはｐＬｅｕ４、ｐＰＰＬｅｕ４、ｐＪＰＬｅｕ４系（特開平４−２１８３８２号公報に記載）などが挙げられるが、これらに限定されない。このプラスミドは形質転換体を選択するためのマーカーを含んでいてもよく、該選択マーカーとしては薬剤耐性マーカーや栄養要求マーカー遺伝子を使用することができるが、これらに限定されない。
【００７４】
さらに、本発明で利用できる発現ベクターは、酵素遺伝子の発現に必要なＤＮＡ配列、例えばプロモーター、ターミネーター、リボゾーム結合部位、転写終結シグナルなどの転写調節信号、翻訳調節信号などを有することができる。該プロモーターとしては、枯草菌においてはズブチリシン、ＳＰＡＣ等のプロモーター、酵母ではアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）、酸性フォスファターゼ（ＰＨＯ）、ガラクトース遺伝子（ＧＡＬ）、グリセルアルデビド３リン酸脱水素酵素遺伝子（ＧＡＰ）等のプロモーターを用いることができるが、これらに限定されない。シグナルペプチドの付与は、目的酵素が培養上清中に分泌され、精製が容易になるという利点があるので使用することが好ましい。また、シグナルペプチドを枯草菌や酵母由来のもの（例えば、インベルターゼシグナル、酸性フォスファターゼシグナル、λ−ファクターシグナルなど）に置き換えることができる。また、大腸菌においては、一般に慣用されるｌａｃプロモーターやＴ７プロモーターのほかに、ｃｓｐＡプロモーター等を用いて分子シャペロンを同時に発現させるなど、発現をより効率化する工夫を行うことができる
【００７５】
形質転換を行なった宿主細胞の培養は、使用する宿主細胞に関して一般的な方法を用いることができる。通常は、１〜４日程度の培養により細胞内または細胞外の培養物中に酵素が生成され蓄積される。培養条件（培地、ｐＨ、温度等）に関しては、例えば、細菌では２５〜３７℃、酵母では２５〜３０℃、真核細胞では３７℃程度が一般的である。培養条件については、遺伝子発現実験マニュアル（講談社）等を参照することができる。
【００７６】
宿主細胞としては、大腸菌、枯草菌等の細菌、カンディダ・ウチリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）等の酵母以外に、リゾープス・ニベウス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｎｉｖｅｕｓ）、リゾープス・デルマー（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｄｅｌｅｍａｒ）や高等真核生物（例えばＣＨＯ細胞など）を用いることができる。枯草菌としてはバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物を用いることが好ましい。バチルス属にはタンパク質を菌体外へ分泌する株（例えば、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）など）が存在することが知られている。またプロテアーゼを殆ど分泌しない株も知られており、このような株を宿主として用いることも好ましい。本発明においては、宿主細胞として酵母、糸状菌または細菌が好ましいが、細菌がより好ましく、特に大腸菌やバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）が好ましい。
【００７７】
形質転換体が産生したタンパク質の単離・精製は、公知の分離方法や精製方法を適当に組み合わせて行なうことができる。これらの分離・精製方法としては例えば塩沈殿、溶媒沈殿のような溶解性の差を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾過およびＳＤＳ−ポリアクリル電気泳動のような分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーのような電荷の差を利用する方法、疎水クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーのような疎水性の差を利用する方法、さらに等電点電気泳動のような等電点の差を利用する方法、このほかにアフィニティークロマトグラフィー等が挙げられる。実施例に記載した生成方法のほかに、一般的な分離・精製法に関しては、例えば蛋白質・酵素の基礎実験法（南江堂）等を参照することができる。
【実施例】
【００７８】
以下の例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。なお、本明細書において、特に記載しない限り、「％」は質量基準であり、数値範囲はその端点を含むものとして記載される。また、操作手順は特に記載しない限り、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ(１９８９))に記載の方法に従った。
【００７９】
本実施例では、メリオリバクター・ロセウス（Ｍｅｌｉｏｒｉｂａｃｔｅｒ  ｒｏｓｅｕｓ）からＮ−アシルグルコサミン  ２−エピメラーゼ（ＡＧＥ）と推定される機能未確認のタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＦＮ７３７４９．１）をコードする遺伝子をクローニングして組換えタンパク質を得て、その酵素活性に関し特性評価を行った。
【００８０】
実施例１：大腸菌によるタンパク質の発現
１．発現プラスミドの構築
メリオリバクター・ロセウス（ＤＳＭ２３８４０）から、Ｎ−アシルグルコサミン  ２−エピメラーゼ（ＡＧＥ）と推定されているタンパク質をコードする遺伝子をクローニングした。この遺伝子の塩基配列（配列番号１）および本遺伝子にコードされるアミノ酸配列（配列番号２）をそれぞれ図１Ａ、および図１Ｂに示す。
【００８１】
配列番号１に示す塩基配列からＴＡＡの終止コドンを除いた配列をｐＥＴ２３ａベクターのＮｄｅ１−Ｘｈｏ１制限酵素切断サイトに導入し、ヒスチジンタグ融合タンパク質発現用のベクターを構築した。上記発現ベクターを、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入して、形質転換体を得た。
【００８２】
２．組換えタンパク質の調製
上記形質転換体を１００μｇ／ｍＬ  アンピシリンを含む２０ｍＬのＬＢ培地に植菌し、３７℃にて一晩振盪培養した。この培養液２０ｍＬを１Ｌの同培地に植え継ぎ、濁度（波長６００ｎｍ）が０．５に達するまで同条件で培養した。０．１Ｍ  イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を終濃度０．１ｍＭになるように添加し、誘導培養を開始した。ＩＰＴＧ添加後、培養温度を１８℃とし、２４時間振盪培養した。遠心分離（６，０００×ｇ、４℃、１０分間）を行い、菌体を回収した。菌体を０．３Ｍ  ＮａＣｌを含む１０ｍＭ  イミダゾール−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁し、超音波破砕により破砕した。得られた菌体破砕液を１０，０００×ｇ、４℃、１０分間の条件で遠心分離し、上清を回収した。ニッケルイオンをキレートしたキレーティングセファロースファストフロー（ＧＥヘルスケア）に得られた菌体破砕液を供して、ヒスチジンタグ融合タンパク質を精製した。すなわち、０．５Ｍ  ＮａＣｌを含む０．０３Ｍ  イミダゾール−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）で担体を洗浄後、０．３Ｍ  ＮａＣｌを含む０．５Ｍ  イミダゾール−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）により溶出した。得られた試料を１０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）に透析して以後の解析に用いた。試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析し、単一バンドであることを確認した（図２）。本組換えタンパク質の分子量は４８〜５８ｋＤａまたは約５３ｋＤａと見積もられた。以下の実施例では、実施例１で調製した組換えタンパク質を、本酵素と記載する。
【００８３】
実施例２：酵素反応生成物のＴＬＣ分析
本実施例では、本酵素が触媒する酵素反応を検証した。酵素反応の基質には、Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノース、Ｄ−フルクトース、Ｄ−タロース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−タガトース、Ｄ−キシロース、Ｄ−リキソース、Ｄ−キシルロース、セロビオース、ラクトース、エピラクトース、β−（１→４）−グルコシルマンノース、β−（１→４）−マンノシルグルコース、およびβ−（１→４）−マンノビオースを用いた。
【００８４】
５ｍＭ  トリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ  各種基質および１．７４μＭ  本酵素からなる、反応液５μＬを３７℃にて２４時間保持し、このうち１μＬを薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）に供した。
【００８５】
展開溶媒は基質ごとに異なるものを使用した。単糖を基質とした場合には、２−プロパノール／１−ブタノール／水の混合液（順に２：２：１の混合比（すべて体積比））を用い、二糖を基質とした場合には２−プロパノール／１−ブタノール／水の混合液（順に１２：３：４の混合比（すべて体積比））を用いた。
【００８６】
糖の検出は、呈色剤としてアニスアルデヒド／硫酸／酢酸の混合液（順に１：２：９７の混合比（すべて体積比））をＴＬＣプレートに噴霧後、加熱することにより実施した。その結果を図３に示す。
【００８７】
酵素反応前の糖（基質）と反応後の糖の移動距離に違いがあったのは、基質に、Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノース、Ｄ−タロース、Ｄ−ガラクトース、セロビオース、ラクトース、エピラクトース、β−（１→４）−グルコシルマンノース、β−（１→４）−マンノシルグルコースおよびβ−（１→４）−マンノビオースを使用した反応液であった。
【００８８】
実施例３：酵素反応生成物のＨＰＡＥＣ−ＰＡＤによる分析
本実施例では、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンおよびＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンに対する本酵素の反応性について検証した。
５ｍＭ  トリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ  各種基質および１．７４μＭ  本酵素からなる、反応液１００μＬを３７℃にて２４時間保持した。酵素反応液を以下の条件にて分析した。
分析条件はカラム：ＣａｒｂｏＰａｃ  ＰＡ−１（４×２５０ｍｍ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、溶離液：０．５％  酢酸ナトリウム（０〜５分）、０．５％  酢酸ナトリウム−０．３％  酢酸ナトリウム／０．３％  酢酸（５〜３５分）、０．５％  酢酸（３５〜４５分）、０．５％  酢酸ナトリウム（４５〜７０分）、流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：３５℃、検出器：パルスドアンペロメトリ検出器とした。
結果、両物質共に反応前後でのクロマトグラムに変化は認められなかった。
【００８９】
実施例２および３より、本酵素は、Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノース、Ｄ−タロース、Ｄ−ガラクトース、セロビオース、ラクトース、エピラクトース、β−（１→４）−グルコシルマンノース、β−（１→４）−マンノシルグルコースおよびβ−（１→４）−マンノビオースに作用することが分かった。一方で、本酵素は、調べた糖の中では、Ｄ−フルクトース、Ｄ−タガトース、Ｄ−キシロース、Ｄ−リキソース、Ｄ−キシルロース、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンおよびＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンを実質的に基質としないことが分かった。表１に、結果をまとめる。
【表１】
2020137485.tif 000003
【００９０】
実施例４：本酵素の活性測定
１．β−（１→４）−マンノビオースに対する活性の測定
１０ｍＭ  β−（１→４）−マンノビオース、４０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ８．０）および本酵素からなる反応液２５０μＬを３７℃にて保持した。反応３、６、１０分に反応液５０μＬを採取して１．０Ｍ  ＨＣｌを２０μＬ添加し、１００℃にて５分間保持して反応を停止した。酵素反応により生成したβ−（１→４）−マンノシルグルコースを以下の手法により定量した。
【００９１】
１．０Ｍ  ＮａＯＨを２０μＬと１００ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）５０μＬを上記反応液に加えて中和し、氷上で冷却した。得られた反応液１４０μＬに１３μｇ／ｍＬ  ルミノコッカス・アルブス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ａｌｂｕｓ）由来４−Ｏ−β−Ｄ−ｍａｎｎｏｓｙｌ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ（Ｋａｗａｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ.,  ２０１２,  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ.，  ２０１２；２８７(５０)：４２３８９−９９.）１０μＬおよびグルコスタット試薬（グルコースＣII−テストワコー  発色剤（３５０ｍＬ用）１瓶（和光純薬工業，大阪）、４−アミノアンチピリン  ０．１ｇおよびフェノール  ０．６５６ｇを１００ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）により１７５ｍＬに定容したもの）２０μＬを添加し、３７℃にて３０分間保持した。この溶液の波長５０５ｎｍにおける吸光度を測定することで酵素反応溶液中のグルコース濃度を定量し、酵素反応で生成したβ−（１→４）−マンノシルグルコースの濃度を算出した。本実施例の反応条件下で１分間に１ｎｍｏｌのβ−（１→４）−マンノシルグルコースを生じる酵素量を１Ｕと定義すると、本酵素の１０ｍＭ  β−（１→４）−マンノビオースに対する比活性は４７４，０００  Ｕ/ｍｇであった。
なお、Ｋａｗａｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ.(２０１２)は、ルミノコッカス・アルブスのマンナン代謝において、当該酵素が長鎖マンノオリゴ糖の加リン酸分解に機能していることが記載された文献である。
【００９２】
２．マンノースに対する活性の測定
１０ｍＭ  マンノース、４０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ８．０）および本酵素を含む反応液３００μＬを３７℃に保持した。反応５、１０、１５および２０分に反応液５０μＬを採取して２．０Ｍ  ＨＣｌを１０μＬ添加し、１００℃にて５分間保持して反応を停止した。これに２．０Ｍ  ＮａＯＨを１０μＬ添加して中和し、１３，４００×ｇ、４℃にて５分間遠心分離した。
【００９３】
得られた上清７０μＬに含まれるグルコース量をＴｈｉｏ−ＮＡＤ+を用いたヘキソキナーゼ法により定量した。具体的には、５ｍＭ  Ｔｈｉｏ−ＮＡＤ+  １０μＬ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2を含む０．１Ｍ  トリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）１０  μＬ、４０Ｕ/ｍＬ  ヘキソキナーゼ（パン酵母由来、ナカライテクス）２．５μＬ、４０Ｕ/ｍＬ  グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（ナカライテクス）２．５μＬおよび１４０ｍＭ  ＡＴＰ  ５μＬを、反応液に加えて、３７℃で２０分間保持した。グルコース−６−リン酸の酸化反応に伴い生成されたＴｈｉｏ−ＮＡＤＨの最大吸光波長４０５ｎｍの吸光度を分光光度計により測定することで反応液中のグルコースを定量した。本実施例の反応条件下で１分間に１ｎｍｏｌのグルコースを生じる酵素量を１Ｕと定義すると、本酵素の１０ｍＭ  マンノースに対する比活性は７４２Ｕ/ｍｇであった。
【００９４】
実施例５：本酵素の諸性質（ｐＨおよび温度）
本酵素のｐＨおよび温度に対する特性を、β−（１→４）−マンノビオースに対する活性を指標として調査した。本実施例において、下記の測定はいずれも、独立に３回繰り返して実施した。
１．最適ｐＨ
８０ｍＭ  ブリトン−ロビンソン緩衝液（ｐＨ２．０〜１２.０）、１０ｍＭ  β−（１→４）−マンノビオースおよび６．６４ｎＭ  本酵素からなる反応液５０μＬを３７℃に１０分間保持して酵素反応に供した後、実施例４−１に記載の方法にて反応を停止し、反応液中の生成物β−（１→４）−マンノシルグルコースの濃度を測定した。
【００９５】
その結果を、図４（白丸）に示す。本酵素は、β−（１→４）−マンノビオースを基質とした場合、ｐＨ８．１において、酵素活性が最大となった。また、ｐＨ６．８〜８．６で最大活性に対し８０％以上の活性を示した。なお、図４（白丸）ではｐＨ８．１における活性を１００％とし、各反応ｐＨにおける活性を相対値として示した。
【００９６】
２．ｐＨ安定性
１００ｍＭ  ブリトン−ロビンソン緩衝液（ｐＨ２．０〜１２.０）および５５３ｎＭ  本酵素からなる溶液１００μＬを４℃に２４時間保持し、保持後の残存活性を以下の系にて測定した。１０ｍＭ  β−（１→４）−マンノビオース、３６９ｎＭ  本酵素、および４０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ８．０）からなる反応液５０μＬを３７℃に１０分間保持した。実施例４−１に記載の方法で反応を停止し、生成物β−（１→４）−マンノシルグルコースの濃度を測定した。各ｐＨに保持する前の活性を１００％とし、保持後の残存活性を相対値にて表した（図４、黒丸）。本酵素は５．８〜９．９の範囲において９５％以上の残存活性を示し、安定であることが明らかになった。なお、調べた範囲において８０％以上の残存活性が確認された。
【００９７】
３．最適温度
１０ｍＭ  β−（１→４）−マンノビオース、０．３７７ｎＭ  本酵素および４０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ８．０）からなる反応液５０μＬを３０〜７０℃に１０分間保持した。実施例４−１に記載の方法で反応を停止し、生成物β−（１→４）−マンノシルグルコースの濃度を求めた。その結果を図５（白丸）に示した。本酵素は５６℃で最大活性を示し、５６〜６０℃の範囲で最大活性の８０％以上の活性を示した。尚、図５（白丸）では５６℃における活性を１００％とし、各反応温度における活性を相対値として示した。
【００９８】
４．温度安定性
９．２１ｎＭ  本酵素および６６．７ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ８．０）を含む３０μＬの溶液を３０℃〜８０℃に２０分間保持した。保持後の残存活性を以下の系にて測定した。１０ｍＭ  β−（１→４）−マンノビオース、５．５３ｎＭ  本酵素および４０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ８．０）からなる反応液５０μＬを３７℃にて１０分間保持した。実施例４−１の手順で反応を停止し、生成物β−（１→４）−マンノシルグルコースの濃度を求めた。各温度に保持する前の活性を１００％とし、保持後の残存活性を相対値にて表した（図５、黒丸）。本酵素は、５０℃以下で９７％以上の残存活性を示し安定であった。
【００９９】
実施例６：反応速度パラメーターの測定
１．本酵素のβ−（１→４）−マンノビオースに対する速度パラメーター
１〜１５ｍＭ  β−（１→４）−マンノビオース、４０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ８．０）および４．５６ｎＭ  本酵素からなる反応液２５０μＬを３７℃に保持した。反応３、６および１０分に反応液５０μＬを採取して実施例４−１の手順にて反応を停止し、生成物β−（１→４）−マンノシルグルコースの濃度を求めた。反応曲線の傾きから得られた反応速度をプロットしたところ、飽和曲線が得られた。これをミカエリス・メンテンの速度式に回帰し、ｋcat／Ｋm  １２２ｓ-1ｍＭ-1を得た。
【０１００】
２．本酵素のマンノースに対する反応速度パラメーター
１０〜１００ｍＭ  マンノース、４０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ８．０）および０．２５１μＭ  本酵素からなる反応液２５０μＬを３７℃に保持し、反応５、１０および１５分に反応液５０μＬを採取して実施例４−２の手順にて反応停止し、生成したグルコースを定量した。得られた反応速度をプロットしたところ、飽和曲線が得られた。これをミカエリス・メンテンの速度式に回帰し、ｋcat／Ｋm  ８．８９×１０-2ｓ-1ｍＭ-1を得た。
【０１０１】
３．本酵素のガラクトースに対する反応速度パラメーター
５０〜２５０ｍＭ  ガラクトース、４０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ８．０）および４１．５〜８２．９μＭ  本酵素からなる反応液５００μＬを３７℃に保持し、反応５、１０、１５および２０分に反応液１００μＬを採取して、２．０Ｍ  ＨＣｌを１０μＬ添加し、１００℃にて５分間保持して反応を停止した。これに２．０Ｍ  ＮａＯＨを１０μＬ添加して中和し、内部標準として１３％  ラクチトールを１０μＬ添加した後、ＭＢ４で脱塩し、ＨＰＬＣによりタロースを定量した。
分析条件はカラム：ＶＧ−５０  ４Ｅ（Ｓｈｏｄｅｘ）、溶離液：７５％  アセトニトリル／２０％  メタノール、流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：４０℃、検出器：ＲＩ検出器とした。
得られた反応速度をプロットしたところ、飽和曲線が得られた。これをミカエリス・メンテンの速度式に回帰し、ｋcat／Ｋm  ６．４２ｓ-1Ｍ-1を得た。
【０１０２】
４．ロドサーマス・マリナス（Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ）由来のＣＥ（ＲｍＣＥ）のマンノースに対する反応速度パラメーター
Ｊａｉｔｏ  Ｎ．ｅｔ  ａｌ.,  ２０１４,  Ｊ.  Ａｐｐｌ.  Ｇｌｙｃｏｓｃｉ.,２０１４；  ６１：１１７−１１９に記載の方法に従いＲｍＣＥ組換え酵素を調製し、５０〜５００ｍＭ  マンノース、１５ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）および９．７５μＭ  ＲｍＣＥ組換え酵素からなる反応液１００μＬを６０℃に保持し、反応１５分の時点で０．１Ｍ  ＨＣｌを２５μＬ添加し、１００℃にて３分間保持し、反応を停止した。０．２Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）２５μＬ添加し、反応液を中和させ、生成したグルコースを定量した。得られた反応速度をプロットしたところ、飽和曲線が得られた。これをミカエリス・メンテンの速度式に回帰し、ｋcat／Ｋm  ５．２８ｓ-1Ｍ-1を得た。
【０１０３】
５．考察
本酵素と既知ＣＥについて、マンノースに対する速度パラメーターｋcat／Ｋm値を用い、単糖に対する反応性を比較した。ＣｖＣＥが０.４６１ｓ-1Ｍ-1、ＲｍＣＥが５．２８ｓ-1Ｍ-1であったのに対し、メリオリバクター・ロセウス由来の本酵素は８８.９ｓ-1Ｍ-1であった(図６)。尚、比較対象としたＣｖＣＥの反応速度パラメーターはＳａｂｕｒｉ  Ｗ.  ｅｔ  ａｌ.,  ２０１５,  Ｂｉｏｓｃｉ.  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.  Ｂｉｏｃｈｅｍ.,  ２０１５；７９：９６９−９７７に記載の値を参照した。メリオリバクター・ロセウス由来の本酵素は比較対象の２酵素（ＣｖＣＥおよびＲｍＣＥ）と比較して、単糖にもよく作用できる酵素であることが明らかとなった。
【０１０４】
実施例７：Ｄ−マンノースの合成試験
１．方法
本酵素を基質濃度約３０％のグルコースに作用させ、マンノースの合成反応を実施した。すなわち、２．９０〜５．８０μＭ  本酵素、４０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ８．０）、３０％  グルコースおよび０．０２％  アジ化ナトリウムからなる反応液１００μＬを４０℃および５０℃にて２４〜７２時間保持した。また、共存する緩衝液成分等による異性化反応への影響を調査するため、あらかじめ本酵素を３０分間煮沸して得た失活酵素を用いた反応液についても同様に調製、保持した。各反応時間にて採取した反応液を、塩酸を用いてｐＨを３．５とし、１０分間煮沸することで反応停止させた。その後、反応液１０μＬと純水８００μＬを混合させ希釈した。
【０１０５】
グルコースおよび本酵素の生成物の糖組成をＨＰＬＣで分析した。分析条件はカラム：ＶＧ―５０  ４Ｅ（Ｓｈｏｄｅｘ）、溶離液：８０％  アセトニトリル、流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：４０℃、検出器：荷電化粒子検出器とした。
【０１０６】
２．結果
Ｄ−グルコースに対して本酵素を作用させたときの反応生成物について、その糖組成解析結果を表２に示した。
【表２】
2020137485.tif 000004
2020137485.tif 000005
＊ＨＰＬＣ分析のピーク面積比より算出した。
【０１０７】
酵素添加区ではＤ−グルコースからＤ−マンノースおよびＤ−フルクトースが生成した（図７、白丸、白四角、白三角、白菱形）。酵素濃度５．８０μＭ、５０℃、７２時間保持の条件においてその生成率は最大でそれぞれ２８．３％、３．８％であった。一方で失活酵素添加区ではＤ−マンノースは生成せず、Ｄ−フルクトースのみ生成した。失活酵素濃度５．８０μＭ、反応温度５０℃の試験区におけるＤ−フルクトースの生成率は最大で３．７％であった。ここから、Ｄ−フルクトースは非酵素的な反応（例えば、緩衝液やpHの影響によるグルコースからフルクトースへの異性化等）によって生成されたものであることが示唆された。
【０１０８】
実施例８：Ｄ−タロースの合成試験
１．方法
本酵素を基質濃度約２０％のガラクトースに作用させ、タロースの合成反応を実施した。すなわち、１．５５〜１２．４μＭ  本酵素、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ８．０）、２０％  ガラクトースおよび０．０２％  アジ化ナトリウムからなる反応液１００μＬを４０℃にて２４〜７２時間反応させた。また、共存する緩衝液成分等による異性化反応への影響を調査するため、あらかじめ本酵素を３０分間煮沸して得た失活酵素を用いた反応液についても同様に保持した。各反応時間にて採取した反応液を、塩酸を用いてｐＨを３．５程度まで落とし、１０分間煮沸することで反応停止させた。その後、反応液１０μＬと純水８００μＬを混合させ希釈した。
【０１０９】
ガラクトースおよび本酵素の生成物の糖組成をＨＰＬＣで分析した。分析条件はカラム：ＶＧ−５０  ４Ｅ（Ｓｈｏｄｅｘ）、溶離液：８０％  アセトニトリル、流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：４０℃、検出器：荷電化粒子検出器とした。
【０１１０】
２．結果
Ｄ−ガラクトースに対して本酵素を作用させたときの反応生成物について、その糖組成解析結果を表３に示した。
【表３】
2020137485.tif 000006
2020137485.tif 000007
＊ＨＰＬＣ分析のピーク面積比より算出した。
【０１１１】
酵素添加区ではＤ−ガラクトースからＤ−タロースおよびＤ−タガトースが生成し（図８、白丸、白四角、白三角、白菱形）、その最大生成率はそれぞれ１６．８％、１．０％であった。一方で失活酵素添加区ではＤ−タロースは生成せず、Ｄ−タガトースのみ生成し、その生成率は最大で０．２％であった。
【産業上の利用可能性】
【０１１２】
本発明は、機能性糖質として期待される希少糖や希少オリゴ糖を工業レベルで生産することを可能にする。
【配列表フリーテキスト】
【０１１３】
配列番号１：メリオリバクター・ロセウス由来のタンパク質の塩基配列
配列番号２：メリオリバクター・ロセウス由来のタンパク質をコードするアミノ酸配列
【図１Ａ】
2020137485.tif 000008
【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2020137485.tif 000016
【配列表】
2020137485000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年11月15日(2019.11.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(ａ)から(ｃ)のいずれかのタンパク質を含む、糖のエピメリ化触媒用の酵素剤であって、前記糖がＮ−アシル−Ｄ−グルコサミンを含まず、且つ前記糖が、Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノース、Ｄ−タロース、Ｄ−ガラクトース、及びβ−１，４結合を有する二糖類からなる群から選択されるいずれかである、糖のエピメリ化触媒用の酵素剤。
(ａ) 配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
(ｂ) 配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、糖のエピメリ化活性を有するタンパク質；
(ｃ) 配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されたアミノ酸配列からなり、糖のエピメリ化活性を有するタンパク質。
【請求項２】
メリオリバクター・ロセウス（Ｍｅｌｉｏｒｉｂａｃｔｅｒ  ｒｏｓｅｕｓ）に由来し、下記の性質を有するタンパク質を含む、糖のエピメリ化触媒用の酵素剤。
(1)糖のエピメリ化活性を有し、前記糖が、Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノース、Ｄ−タロース、Ｄ−ガラクトース、及びβ−１，４結合を有する二糖類からなる群から選択されるいずれかである；
(2)Ｎ−アシル−Ｄ−グルコサミンを実質的に基質としない；
(3)ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定された分子量が４８〜５８ｋＤａである；
(4)最適ｐＨが６．８〜８．６の範囲である；
(5)ｐＨ５．８〜９．９の範囲で安定である；
(6)最適温度が５６℃〜６０℃の範囲である；
(7)５０℃以下で安定である。
【請求項３】
前記β−１，４結合を有する二糖類が、セロビオース、ラクトース、エピラクトース、β−（１→４）−マンノビオース、β−（１→４）−グルコシルマンノース、およびβ−（１→４）−マンノシルグルコースからなる群から選択されるいずれかである請求項１又は２に記載の酵素剤。
【請求項４】
糖のエピメリ化反応生成物の製造に用いられる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の酵素剤。
【請求項５】
糖基質に、請求項１〜４のいずれか一項に記載の酵素剤を作用させて、糖のエピメリ化反応生成物を得る工程を含む、糖のエピメリ化反応生成物の製造方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法を実施して糖のエピメリ化反応生成物を得る工程、および前記工程で得られた糖のエピメリ化反応生成物を用いて食品、飼料、餌料、化粧料、または医薬品を得る工程を含む、食品、飼料、餌料、化粧料、または医薬品の製造方法。
【手続補正書】
【提出日】令和1年11月15日(2019.11.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(ａ)から(ｃ)のいずれかのタンパク質を含む、糖のエピメリ化触媒用の酵素剤であって、前記糖がＮ−アシル−Ｄ−グルコサミンを含まず、且つ前記糖が、Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノース、Ｄ−タロース、Ｄ−ガラクトース、及びβ−１，４結合を有する二糖類からなる群から選択されるいずれかである、糖のエピメリ化触媒用の酵素剤。
(ａ) 配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
(ｂ) 配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、糖のエピメリ化活性を有するタンパク質；
(ｃ) 配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されたアミノ酸配列からなり、糖のエピメリ化活性を有するタンパク質。
【請求項２】
メリオリバクター・ロセウス（Ｍｅｌｉｏｒｉｂａｃｔｅｒ  ｒｏｓｅｕｓ）に由来し、下記の性質を有するタンパク質を含む、糖のエピメリ化触媒用の酵素剤。
(1)糖のエピメリ化活性を有し、前記糖が、Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノース、Ｄ−タロース、Ｄ−ガラクトース、及びβ−１，４結合を有する二糖類からなる群から選択されるいずれかである；
(2)Ｎ−アシル−Ｄ−グルコサミンを実質的に基質としない；
(3)ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定された分子量が４８〜５８ｋＤａである；
(4)最適ｐＨが６．８〜８．６の範囲である；
(5)ｐＨ５．８〜９．９の範囲で安定である；
(6)最適温度が５６℃〜６０℃の範囲である；
(7)５０℃以下で安定である。
【請求項３】
前記β−１，４結合を有する二糖類が、セロビオース、ラクトース、エピラクトース、β−（１→４）−マンノビオース、β−（１→４）−グルコシルマンノース、およびβ−（１→４）−マンノシルグルコースからなる群から選択されるいずれかである請求項１又は２に記載の酵素剤。
【請求項４】
糖のエピメリ化反応生成物の製造に用いられる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の酵素剤。
【請求項５】
糖基質に、請求項１〜４のいずれか一項に記載の酵素剤を作用させて、糖のエピメリ化反応生成物を得る工程を含む、糖のエピメリ化反応生成物の製造方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法を実施して糖のエピメリ化反応生成物を得る工程、および前記工程で得られた糖のエピメリ化反応生成物を用いて食品、飼料、餌料、化粧料、または医薬品を得る工程を含む、食品、飼料、餌料、化粧料、または医薬品の製造方法。