(57)【要約】【課題】抗原に対する親和性を向上させた変異ＶＨＨ抗体若しくはその製造方法、抗原に対する親和性を向上させた変異ＶＨＨ抗体をスクリーニングする方法、又はＶＨＨ抗体において、抗原に対する親和性を向上させる１つ以上のチロシンの位置を特定する方法等を提供する。【解決手段】ＶＨＨ抗体のアミノ酸配列中に存在するチロシンをハロゲン化チロシンに置換することで、ＶＨＨ抗体の抗原に対する親和性を向上させ得ることを見出した。従って、本発明において、抗原に対する親和性を向上させた変異ＶＨＨ抗体は、チロシンからハロゲン化チロシンへのアミノ酸置換を含む。また、本発明において、抗原に対する親和性を向上させた変異ＶＨＨ抗体を製造する方法等は、ＶＨＨ抗体のアミノ酸配列中、チロシンをハロゲン化チロシンに置換することを含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＶＨＨ抗体において、ハロゲン化チロシンへ置換することにより抗原に対する親和性を向上させる１つ以上のチロシンの位置を特定する方法であって、
（１）(i)野生型ＶＨＨ抗体のＤＮＡ配列と比較して、チロシンをコードする１つ以上のトリプレットがＴＡＧトリプレットに変更されているＤＮＡ配列を有する変異ＶＨＨ抗体遺伝子、及び
(ii)前記ＴＡＧトリプレットに対応するＵＡＧコドンを、ハロゲン化チロシンに翻訳するためのｔＲＮＡ及びハロゲン化チロシルｔＲＮＡ合成酵素を発現する遺伝子
を導入した組換え細菌を準備する工程と、
（２）前記遺伝子(i)と前記遺伝子(ii)を発現させる工程であって、前記組換え細菌を、ハロゲン化チロシンを含む培地にて培養するか、又は前記組換え細菌の抽出液にハロゲン化チロシンを添加し、前記遺伝子(i)と前記遺伝子(ii)が発現する条件下で前記抽出液を処理することを含む、該工程と、
（３）前記培養した細菌又は前記処理した抽出液から、変異ＶＨＨ抗体を得る工程であって、前記変異ＶＨＨ抗体が、前記野生型ＶＨＨ抗体のアミノ酸配列と比較して１つ以上のチロシンがハロゲン化チロシンに置換されているアミノ酸配列を有する、該工程と、
（４）前記変異ＶＨＨ抗体の抗原に対する親和性を測定する工程と、
（５）前記野生型ＶＨＨ抗体のアミノ酸配列中に存在する１つ以上のチロシンの位置のうち、チロシンをハロゲン化チロシンへ置換することにより前記抗原に対する親和性を向上させる１つ以上のチロシンの位置を特定する工程と
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記ハロゲン化チロシンが、３−クロロチロシン又は３−ブロモチロシンである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記チロシンをハロゲン化チロシンへ置換することにより前記抗原に対する親和性を向上させる１つ以上のチロシンの位置が、３個の抗原相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のいずれかの中にある、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記チロシンをハロゲン化チロシンへ置換することにより前記抗原に対する親和性を向上させる１つ以上のチロシンの位置が、抗原相補性決定領域ＣＤＲ３の中にある、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記チロシンをハロゲン化チロシンへ置換することにより前記抗原に対する親和性を向上させる１つ以上のチロシンの位置が、Kabatのナンバリングに従って番号処理された場合の位置26〜35、位置50〜65、位置90〜102の中に存在する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項６】
前記チロシンをハロゲン化チロシンへ置換することにより前記抗原に対する親和性を向上させる１つ以上のチロシンの位置が、Kabatのナンバリングに従って番号処理された場合の位置90〜102の中に存在する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
抗原に対する親和性を向上させた変異ＶＨＨ抗体を製造する方法であって、
（１）(i)野生型ＶＨＨ抗体のＤＮＡ配列と比較して、ハロゲン化チロシンへ置換することにより抗原に対する親和性を向上させる１つ以上のチロシンの位置におけるチロシンをコードする１つ以上のトリプレットが、ＴＡＧトリプレットに変更されているＤＮＡ配列を有する変異ＶＨＨ抗体遺伝子、及び
(ii)前記ＴＡＧトリプレットに対応するＵＡＧコドンを、ハロゲン化チロシンに翻訳するためのｔＲＮＡ及びハロゲン化チロシルｔＲＮＡ合成酵素を発現する遺伝子
を導入した組換え細菌を準備する工程と、
（２）前記遺伝子(i)と前記遺伝子(ii)を発現させる工程であって、前記組換え細菌を、ハロゲン化チロシンを含む培地にて培養するか、又は前記組換え細菌の抽出液にハロゲン化チロシンを添加し、前記遺伝子(i)と前記遺伝子(ii)が発現する条件下で前記抽出液を処理することを含む、該工程と、
（３）前記培養した細菌又は前記処理した抽出液から、変異ＶＨＨ抗体を得る工程と
を含み、
前記変異ＶＨＨ抗体が、前記野生型ＶＨＨ抗体のアミノ酸配列中に存在する１つ以上のチロシンの位置のうち、チロシンをハロゲン化チロシンへ置換することにより前記抗原に対する親和性を向上させる１つ以上のチロシンの位置において、１つ以上のチロシンがハロゲン化チロシンに置換されているアミノ酸配列を有する、前記方法。
【請求項８】
前記ハロゲン化チロシンが、３−クロロチロシン又は３−ブロモチロシンである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記チロシンをハロゲン化チロシンへ置換することにより前記抗原に対する親和性を向上させる１つ以上のチロシンの位置が、３個の抗原相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のいずれかの中にある、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
前記チロシンをハロゲン化チロシンへ置換することにより前記抗原に対する親和性を向上させる１つ以上のチロシンの位置が、抗原相補性決定領域ＣＤＲ３の中にある、請求項７〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記チロシンをハロゲン化チロシンへ置換することにより前記抗原に対する親和性を向上させる１つ以上のチロシンの位置が、Kabatのナンバリングに従って番号処理された場合の位置26〜35、位置50〜65、位置90〜102の中に存在する、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１２】
前記チロシンをハロゲン化チロシンへ置換することにより前記抗原に対する親和性を向上させる１つ以上のチロシンの位置が、Kabatのナンバリングに従って番号処理された場合の位置90〜102の中に存在する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
変異ＶＨＨ抗体における抗原に対する親和性を向上させるアミノ酸置換の有無を測定する方法であって、
（１）(i)野生型ＶＨＨ抗体のＤＮＡ配列と比較して、チロシンをコードする１つ以上のトリプレットがＴＡＧトリプレットに変更されているＤＮＡ配列を有する変異ＶＨＨ抗体遺伝子、及び
(ii)前記ＴＡＧトリプレットに対応するＵＡＧコドンを、ハロゲン化チロシンに翻訳するためのｔＲＮＡ及びハロゲン化チロシルｔＲＮＡ合成酵素を発現する遺伝子
を導入した組換え細菌を準備する工程と、
（２）前記遺伝子(i)と前記遺伝子(ii)を発現させる工程であって、前記組換え細菌を、ハロゲン化チロシンを含む培地にて培養するか、又は前記組換え細菌の抽出液にハロゲン化チロシンを添加し、前記遺伝子(i)と前記遺伝子(ii)が発現する条件下で前記抽出液を処理することを含む、該工程と、
（３）前記培養した細菌又は前記処理した抽出液から、変異ＶＨＨ抗体を得る工程であって、前記変異ＶＨＨ抗体が、前記野生型ＶＨＨ抗体のアミノ酸配列と比較して１つ以上のチロシンがハロゲン化チロシンに置換されているアミノ酸配列を有する、該工程と、
（４）前記変異ＶＨＨ抗体の抗原に対する親和性を測定し、前記変異ＶＨＨ抗体における、抗原に対する親和性を向上させる、チロシンからハロゲン化チロシンへのアミノ酸置換の有無を測定する工程と
を含む、前記方法。
【請求項１４】
前記ハロゲン化チロシンが、３−クロロチロシン又は３−ブロモチロシンである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記変異ＶＨＨ抗体におけるアミノ酸置換が、３個の抗原相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のいずれかの中にある、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記変異ＶＨＨ抗体におけるアミノ酸置換が、抗原相補性決定領域ＣＤＲ３の中にある、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記変異ＶＨＨ抗体におけるアミノ酸置換が、Kabatのナンバリングに従って番号処理された場合の位置26〜35、位置50〜65、位置90〜102の中に存在する、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記変異ＶＨＨ抗体におけるアミノ酸置換が、Kabatのナンバリングに従って番号処理された場合の位置90〜102の中に存在する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１〜６及び１３〜１８のいずれか１項に記載の方法によって１種以上の変異ＶＨＨ抗体を評価することを含む、抗原に対する親和性を向上させた変異ＶＨＨ抗体をスクリーニングする方法。
【請求項２０】
請求項１〜６及び１３〜１８のいずれか１項に記載の方法によって位置又は存在が確認された、抗原に対する親和性を向上させる、チロシンからハロゲン化チロシンへのアミノ酸置換、を含むアミノ酸配列を有する変異ＶＨＨ抗体の製造方法。
【請求項２１】
前記組換え細菌が、大腸菌由来又は枯草菌由来であり、
前記組換え細菌には、ＵＡＧコドンで翻訳を終結する翻訳終結因子をコードする遺伝子の欠損によって機能を喪失する遺伝子の群から選択される１以上の遺伝子の機能を前記翻訳終結因子の非存在下において発現させるＤＮＡ構築物が導入されている、及び／又は細菌染色体上の前記１以上の遺伝子に、当該遺伝子の機能を前記翻訳終結因子の非存在下において発現させるための改変が導入されていて、
前記１以上の遺伝子が、大腸菌のｃｏａＤ、ｍｕｒＦ、ｈｄａ、ｍｒｅＣ、ｈｅｍＡ、ｌｐｘＫ及びｌｏｌＡ、並びに枯草菌のａｃｃＤ、ａｃｐＳ、ｃｓｐＲ、ｄａｐＢ、ｄｉｖＩＣ、ｄｎａＡ、ｆｍｔ、ｆｏｌＤ、ｆｔｓＡ、ｍａｐ、ｍｒｐＤ、ｍｕｒＥ、ｍｕｒＧ、ｐｌｓＸ、ｐｐｎＫ、ｒａｃＥ、ｒｅｓＢ、ｒｅｓＣ、ｒｎｐＡ、ｒｐｌＸ、ｒｐｍＧＢ、ｒｐｍＨ、ｒｐｓＧ、ｓｅｃＡ、ｓｅｃＹ、ｔｏｐＡ、ｔｒｍＤ、ｙａｃＭ、ｙｄｉＣ、ｙｌｏＱ、ｙｐｕＨ及びｙｓｘＣの中から選択される１以上の遺伝子であり、
前記ＤＮＡ構築物が、前記１以上の遺伝子の終止コドンがアンバーコドン（ＵＡＧ）からオーカーコドン（ＵＡＡ）又はオパールコドン（ＵＧＡ）に置き換えられるようにした前記１以上の遺伝子の改変型遺伝子を含み、かつ
前記改変が、前記細菌の染色体上の前記１以上の遺伝子の終止コドンをアンバーコドン（ＵＡＧ）からオーカーコドン（ＵＡＡ）又はオパールコドン（ＵＧＡ）に置き換えるための改変である、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
野生型ＶＨＨ抗体のアミノ酸配列と比較して１つ以上のチロシンがハロゲン化チロシンに置換されているアミノ酸配列を有する変異ＶＨＨ抗体であって、チロシンからハロゲン化チロシンへのアミノ酸置換が抗原に対する親和性を向上させるものである、前記変異ＶＨＨ抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、変異ＶＨＨ抗体及びその製造方法等に関する。本発明は、特には、抗原に対する親和性（抗原親和性）を向上させた変異ＶＨＨ抗体及びその製造方法等に関する。
また、本発明は、変異ＶＨＨ抗体における抗原に対する親和性を向上させるアミノ酸置換の有無を測定する方法、抗原に対する親和性を向上させた変異ＶＨＨ抗体をスクリーニングする方法、又はＶＨＨ抗体において、特定のアミノ酸置換により抗原に対する親和性を向上させる１つ以上のチロシンの位置を特定する方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
ラクダ科動物は、通常抗体と異なり軽鎖を持たない重鎖抗体を有することが知られている。ＶＨＨ抗体は、このような重鎖抗体の抗原結合ドメインを切り出した分子であり、通常抗体のＨ鎖等と同様に３本の抗原結合ループ（抗原相補性決定領域；ＣＤＲ）を有する、シングルドメイン構成の低分子抗体である。
通常抗体は熱や酸に対して安定性が低いが、ＶＨＨ抗体は室温や過度のｐＨでも長期的に安定である。また、ＶＨＨ抗体は通常抗体で認識されないエピトープへの結合能を示すことなどから、その利用が検討されている。
ＶＨＨ抗体は、ラクダ等の生体免疫によって得られる抗体であるにもかかわらず、ＩｇＧ抗体と比較して一般的に２〜３桁親和性が低いため、実用的には抗原親和性の向上が望まれる。しかしながら、ＶＨＨ抗体では分子内の様々な部位が複雑に関係し合って抗原親和性と構造安定性を同時に実現しているため、一旦取得された抗体の性状をタンパク質工学的手法によって改善することは一般的に難しく、タンパク質工学的手法では選別の指標とした性質以外については改悪されることもある。例えば、タンパク質工学的手法により抗原親和性を改善した結果、非標的分子に対する親和性をも増大させてしまうことも十分考えられる。
【０００３】
抗原親和性を改善する技術としては、ファージディスプレイ法が挙げられる（非特許文献１）。例えば、全長が120アミノ酸のＶＨＨ抗体の場合、いずれか１ヶ所のアミノ酸を置換するだけでも240（＝20×120）通りの可能性があり、３ヶ所の置換の組合せでさえ総数は107通り以上になる。そのような多数のバリアントを全て解析するのは現実的には実施不可能なので、バリアントライブラリー中から目的のバリアントを見出すために、ファージディスプレイ等を活用して親和性が向上した抗体バリアントを選別する方法が広く実施されているものの、大きく２つの問題点がある。
１つは、ファージ等のディスプレイ技術は高度で繊細な選別技術を使いこなす必要があることである。また、そこで得られた候補分子はファージ等との融合体の形で抗原親和性が判定されているため、融合体としては良好な性質を示していても、ファージから切り離されることで親和性が低下する、あるいは不溶性を示すことも稀ではない。
２つ目の問題は、一般にアミノ酸置換による化学構造の変化は大きなものであり、置換によって選別の指標とした抗原親和性以外の性質については改悪される場合がある。例えば、非標的分子に対する親和性が増すことも考えられ、ファージディスプレイ法で抗原親和性が向上した変異体を選別できたとしても、抗原特異性は低下することがある。
【０００４】
ファージディスプレイ法を利用しつつ、20種類の天然アミノ酸レパートリーに非天然アミノ酸である硫酸チロシン等を加えて抗体分子を作製する技術が報告されている（非特許文献２）。当該技術は硫酸チロシン等を用いることで、より多様な抗体バリアントライブラリーを作り出しているが（20億種類）、抗体バリアントを作製してディスプレイ法によって選別すること、および導入している非天然アミノ酸は通常のアミノ酸と大きく化学構造が異なるという点で、上記ファージディスプレイ法における問題点は何ら解決されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface, Smith, G P, Science (1985) 228, 1315
【非特許文献２】Protein evolution with an expanded genetic code, Liu C C et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2008) 105, 17688
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで、本発明は、ファージディスプレイ法とは異なる、抗原に対する親和性を向上させた変異ＶＨＨ抗体を製造する方法、変異ＶＨＨ抗体における抗原に対する親和性を向上させるアミノ酸置換の有無を測定する方法、抗原親和性を向上させた変異ＶＨＨ抗体をスクリーニングする方法、又はＶＨＨ抗体において、特定のアミノ酸置換により抗原に対する親和性を向上させる１つ以上のチロシンの位置を特定する方法、或いは抗原に対する親和性を向上させた変異ＶＨＨ抗体等を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、ＶＨＨ抗体の抗原結合部位に最も多く存在するアミノ酸であるチロシンをハロゲン化チロシンに置換することで、当該アミノ酸置換導入前に比べてＶＨＨ抗体の抗原親和性を向上させ得ることを見出した。本発明は、このような新規な知見に基づいて完成されたものである。
本発明の一実施態様において、
ＶＨＨ抗体において、ハロゲン化チロシンへ置換することにより抗原に対する親和性を向上させる１つ以上のチロシンの位置を特定する方法であって、
（１）(i)野生型ＶＨＨ抗体のＤＮＡ配列と比較して、チロシンをコードする１つ以上のトリプレットがＴＡＧトリプレットに変更されているＤＮＡ配列を有する変異ＶＨＨ抗体遺伝子、及び
(ii)前記ＴＡＧトリプレットに対応するＵＡＧコドンを、ハロゲン化チロシンに翻訳するためのｔＲＮＡ及びハロゲン化チロシルｔＲＮＡ合成酵素を発現する遺伝子
を導入した組換え細菌を準備する工程と、
（２）前記遺伝子(i)と前記遺伝子(ii)を発現させる工程であって、前記組換え細菌を、ハロゲン化チロシンを含む培地にて培養するか、又は前記組換え細菌の抽出液にハロゲン化チロシンを添加し、前記遺伝子(i)と前記遺伝子(ii)が発現する条件下で前記抽出液を処理することを含む、該工程と、
（３）前記培養した細菌又は前記処理した抽出液から、変異ＶＨＨ抗体を得る工程であって、前記変異ＶＨＨ抗体が、前記野生型ＶＨＨ抗体のアミノ酸配列と比較して１つ以上のチロシンがハロゲン化チロシンに置換されているアミノ酸配列を有する、該工程と、
（４）前記変異ＶＨＨ抗体の抗原に対する親和性を測定する工程と、
（５）前記野生型ＶＨＨ抗体のアミノ酸配列中に存在する１つ以上のチロシンの位置のうち、チロシンをハロゲン化チロシンへ置換することにより前記抗原に対する親和性を向上させる１つ以上のチロシンの位置を特定する工程と
を含む、前記方法が提供される。
【０００８】
本発明の一実施態様では、例えば、前記特定方法において、ハロゲン化チロシンは、３−クロロチロシン又は３−ブロモチロシンである。
本発明の一実施態様では、例えば、前記特定方法において、チロシンをハロゲン化チロシンへ置換することにより抗原に対する親和性を向上させる１つ以上のチロシンの位置が、３個の抗原相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のいずれかの中にある。
本発明の一実施態様では、例えば、前記特定方法において、チロシンをハロゲン化チロシンへ置換することにより抗原に対する親和性を向上させる１つ以上のチロシンの位置が、抗原相補性決定領域ＣＤＲ３の中にある。
本発明の一実施態様では、例えば、前記特定方法において、チロシンをハロゲン化チロシンへ置換することにより抗原に対する親和性を向上させる１つ以上のチロシンの位置が、Kabatのナンバリングに従って番号処理された場合の位置26〜35、位置50〜65、位置90〜102の中に存在する。
本発明の一実施態様では、例えば、前記特定方法において、チロシンをハロゲン化チロシンへ置換することにより抗原に対する親和性を向上させる１つ以上のチロシンの位置が、Kabatのナンバリングに従って番号処理された場合の位置90〜102の中に存在する。
【０００９】
本発明の一実施態様において、
抗原に対する親和性を向上させた変異ＶＨＨ抗体を製造する方法であって、
（１）(i)野生型ＶＨＨ抗体のＤＮＡ配列と比較して、ハロゲン化チロシンへ置換することにより抗原に対する親和性を向上させる１つ以上のチロシンの位置におけるチロシンをコードする１つ以上のトリプレットが、ＴＡＧトリプレットに変更されているＤＮＡ配列を有する変異ＶＨＨ抗体遺伝子、及び
(ii)前記ＴＡＧトリプレットに対応するＵＡＧコドンを、ハロゲン化チロシンに翻訳するためのｔＲＮＡ及びハロゲン化チロシルｔＲＮＡ合成酵素を発現する遺伝子
を導入した組換え細菌を準備する工程と、
（２）前記遺伝子(i)と前記遺伝子(ii)を発現させる工程であって、前記組換え細菌を、ハロゲン化チロシンを含む培地にて培養するか、又は前記組換え細菌の抽出液にハロゲン化チロシンを添加し、前記遺伝子(i)と前記遺伝子(ii)が発現する条件下で前記抽出液を処理することを含む、該工程と、
（３）前記培養した細菌又は前記処理した抽出液から、変異ＶＨＨ抗体を得る工程と
を含み、
前記変異ＶＨＨ抗体が、前記野生型ＶＨＨ抗体のアミノ酸配列中に存在する１つ以上のチロシンの位置のうち、チロシンをハロゲン化チロシンへ置換することにより前記抗原に対する親和性を向上させる１つ以上のチロシンの位置において、１つ以上のチロシンがハロゲン化チロシンに置換されているアミノ酸配列を有する、前記方法が提供される。
【００１０】
本発明の一実施態様では、例えば、前記製造方法において、ハロゲン化チロシンは、３−クロロチロシン又は３−ブロモチロシンである。
本発明の一実施態様では、例えば、前記製造方法において、チロシンをハロゲン化チロシンへ置換することにより抗原に対する親和性を向上させる１つ以上のチロシンの位置が、３個の抗原相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のいずれかの中にある。
本発明の一実施態様では、例えば、前記製造方法において、チロシンをハロゲン化チロシンへ置換することにより抗原に対する親和性を向上させる１つ以上のチロシンの位置が、抗原相補性決定領域ＣＤＲ３の中にある。
本発明の一実施態様では、例えば、前記製造方法において、チロシンをハロゲン化チロシンへ置換することにより抗原に対する親和性を向上させる１つ以上のチロシンの位置が、Kabatのナンバリングに従って番号処理された場合の位置26〜35、位置50〜65、位置90〜102の中に存在する。
本発明の一実施態様では、例えば、前記製造方法において、チロシンをハロゲン化チロシンへ置換することにより抗原に対する親和性を向上させる１つ以上のチロシンの位置が、Kabatのナンバリングに従って番号処理された場合の位置90〜102の中に存在する。
【００１１】
本発明の一実施態様において、
変異ＶＨＨ抗体における抗原に対する親和性を向上させるアミノ酸置換の有無を測定する方法であって、
（１）(i)野生型ＶＨＨ抗体のＤＮＡ配列と比較して、チロシンをコードする１つ以上のトリプレットがＴＡＧトリプレットに変更されているＤＮＡ配列を有する変異ＶＨＨ抗体遺伝子、及び
(ii)前記ＴＡＧトリプレットに対応するＵＡＧコドンを、ハロゲン化チロシンに翻訳するためのｔＲＮＡ及びハロゲン化チロシルｔＲＮＡ合成酵素を発現する遺伝子
を導入した組換え細菌を準備する工程と、
（２）前記遺伝子(i)と前記遺伝子(ii)を発現させる工程であって、前記組換え細菌を、ハロゲン化チロシンを含む培地にて培養するか、又は前記組換え細菌の抽出液にハロゲン化チロシンを添加し、前記遺伝子(i)と前記遺伝子(ii)が発現する条件下で前記抽出液を処理することを含む、該工程と、
（３）前記培養した細菌又は前記処理した抽出液から、変異ＶＨＨ抗体を得る工程であって、前記変異ＶＨＨ抗体が、前記野生型ＶＨＨ抗体のアミノ酸配列と比較して１つ以上のチロシンがハロゲン化チロシンに置換されているアミノ酸配列を有する、該工程と、
（４）前記変異ＶＨＨ抗体の抗原に対する親和性を測定し、前記変異ＶＨＨ抗体における、抗原に対する親和性を向上させる、チロシンからハロゲン化チロシンへのアミノ酸置換の有無を測定する工程と
を含む、前記方法が提供される。
【００１２】
本発明の一実施態様では、例えば、前記測定方法において、ハロゲン化チロシンは、３−クロロチロシン又は３−ブロモチロシンである。
本発明の一実施態様では、例えば、前記測定方法において、変異ＶＨＨ抗体におけるアミノ酸置換が、３個の抗原相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のいずれかの中にある。
本発明の一実施態様では、例えば、前記測定方法において、変異ＶＨＨ抗体におけるアミノ酸置換が、抗原相補性決定領域ＣＤＲ３の中にある。
本発明の一実施態様では、例えば、前記測定方法において、変異ＶＨＨ抗体におけるアミノ酸置換が、Kabatのナンバリングに従って番号処理された場合の位置26〜35、位置50〜65、位置90〜102の中に存在する。
本発明の一実施態様では、例えば、前記測定方法において、変異ＶＨＨ抗体におけるアミノ酸置換が、Kabatのナンバリングに従って番号処理された場合の位置90〜102の中に存在する。
【００１３】
本発明の一実施態様において、前記特定方法又は前記測定方法によって１種以上の変異ＶＨＨ抗体を評価することを含む、抗原に対する親和性を向上させた変異ＶＨＨ抗体をスクリーニングする方法が提供される。
【００１４】
本発明の一実施態様において、前記特定方法又は前記測定方法によって位置又は存在が確認された、抗原に対する親和性を向上させる、チロシンからハロゲン化チロシンへのアミノ酸置換、を含むアミノ酸配列を有する変異ＶＨＨ抗体の製造方法が提供される。
【００１５】
本発明の一実施態様では、例えば、
前記組換え細菌が、大腸菌由来又は枯草菌由来であり、
前記組換え細菌には、ＵＡＧコドンで翻訳を終結する翻訳終結因子をコードする遺伝子の欠損によって機能を喪失する遺伝子の群から選択される１以上の遺伝子の機能を前記翻訳終結因子の非存在下において発現させるＤＮＡ構築物が導入されている、及び／又は細菌染色体上の前記１以上の遺伝子に、当該遺伝子の機能を前記翻訳終結因子の非存在下において発現させるための改変が導入されていて、
前記１以上の遺伝子が、大腸菌のｃｏａＤ、ｍｕｒＦ、ｈｄａ、ｍｒｅＣ、ｈｅｍＡ、ｌｐｘＫ及びｌｏｌＡ、並びに枯草菌のａｃｃＤ、ａｃｐＳ、ｃｓｐＲ、ｄａｐＢ、ｄｉｖＩＣ、ｄｎａＡ、ｆｍｔ、ｆｏｌＤ、ｆｔｓＡ、ｍａｐ、ｍｒｐＤ、ｍｕｒＥ、ｍｕｒＧ、ｐｌｓＸ、ｐｐｎＫ、ｒａｃＥ、ｒｅｓＢ、ｒｅｓＣ、ｒｎｐＡ、ｒｐｌＸ、ｒｐｍＧＢ、ｒｐｍＨ、ｒｐｓＧ、ｓｅｃＡ、ｓｅｃＹ、ｔｏｐＡ、ｔｒｍＤ、ｙａｃＭ、ｙｄｉＣ、ｙｌｏＱ、ｙｐｕＨ及びｙｓｘＣの中から選択される１以上の遺伝子であり、
前記ＤＮＡ構築物が、前記１以上の遺伝子の終止コドンがアンバーコドン（ＵＡＧ）からオーカーコドン（ＵＡＡ）又はオパールコドン（ＵＧＡ）に置き換えられるようにした前記１以上の遺伝子の改変型遺伝子を含み、かつ
前記改変が、前記細菌の染色体上の前記１以上の遺伝子の終止コドンをアンバーコドン（ＵＡＧ）からオーカーコドン（ＵＡＡ）又はオパールコドン（ＵＧＡ）に置き換えるための改変である。
【００１６】
本発明の一実施態様において、野生型ＶＨＨ抗体のアミノ酸配列と比較して１つ以上のチロシンがハロゲン化チロシンに置換されているアミノ酸配列を有する変異ＶＨＨ抗体であって、チロシンからハロゲン化チロシンへのアミノ酸置換が抗原に対する親和性を向上させるものである、前記変異ＶＨＨ抗体が提供される。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の一実施態様によれば、抗原に対する親和性を向上させた変異ＶＨＨ抗体及びその製造方法を提供することができる。
また、本発明の一実施態様によれば、抗原親和性が向上した抗体バリアントを見出し製造するために作製するバリアントの数が、ファージディスプレイ法等の従来技術による場合に比べて圧倒的に少なく、また、実験操作もファージディスプレイ法等の従来技術に比べて簡便である。そのため、ファージディスプレイ法等の従来技術に比べて、抗原親和性が向上した抗体バリアントを見出し製造するための時間を大幅に短縮することができ、コストの削減も可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】EGFRへ結合するＶＨＨ抗体（9g8）のアミノ酸配列（配列番号：１）を示し、チロシン残基を太字斜体で表す。配列中の下線部は、Ｎ末端側から順に抗原相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を表す。
【図２】9g8遺伝子の塩基配列（配列番号：２）を示す。配列中の下線部は、チロシンに対応するトリプレットを表す。
【図３】Biacore3000により測定した、9g8（野生型ＶＨＨ抗体）の抗原親和性測定結果（センサグラム）を示す。縦軸はレスポンス差（RU）、横軸は時間（秒）を表す。
【図４】Biacore3000により測定した、３２位における3-クロロチロシン置換9g8変異体の抗原親和性測定結果（センサグラム）を示す。縦軸はレスポンス差（RU）、横軸は時間（秒）を表す。
【図５】Biacore3000により測定した、５９位における3-クロロチロシン置換9g8変異体の抗原親和性測定結果（センサグラム）を示す。縦軸はレスポンス差（RU）、横軸は時間（秒）を表す。
【図６】Biacore3000により測定した、６０位における3-クロロチロシン置換9g8変異体の抗原親和性測定結果（センサグラム）を示す。縦軸はレスポンス差（RU）、横軸は時間（秒）を表す。
【図７】Biacore3000により測定した、８０位における3-クロロチロシン置換9g8変異体の抗原親和性測定結果（センサグラム）を示す。縦軸はレスポンス差（RU）、横軸は時間（秒）を表す。
【図８】Biacore3000により測定した、９４位における3-クロロチロシン置換9g8変異体の抗原親和性測定結果（センサグラム）を示す。縦軸はレスポンス差（RU）、横軸は時間（秒）を表す。
【図９】Biacore3000により測定した、９５位における3-クロロチロシン置換9g8変異体の抗原親和性測定結果（センサグラム）を示す。縦軸はレスポンス差（RU）、横軸は時間（秒）を表す。
【図１０】Biacore3000により測定した、１００位における3-クロロチロシン置換9g8変異体の抗原親和性測定結果（センサグラム）を示す。縦軸はレスポンス差（RU）、横軸は時間（秒）を表す。
【図１１】Biacore3000により測定した、１０７位における3-クロロチロシン置換9g8変異体の抗原親和性測定結果（センサグラム）を示す。縦軸はレスポンス差（RU）、横軸は時間（秒）を表す。
【図１２】Biacore3000により測定した、１１２位における3-クロロチロシン置換9g8変異体の抗原親和性測定結果（センサグラム）を示す。縦軸はレスポンス差（RU）、横軸は時間（秒）を表す。
【図１３】Biacore3000により測定した、１１４位における3-クロロチロシン置換9g8変異体の抗原親和性測定結果（センサグラム）を示す。縦軸はレスポンス差（RU）、横軸は時間（秒）を表す。
【図１４】Biacore3000により測定した、１１６位における3-クロロチロシン置換9g8変異体の抗原親和性測定結果（センサグラム）を示す。縦軸はレスポンス差（RU）、横軸は時間（秒）を表す。
【図１５】Biacore3000により測定した、５９位及び１１２位における3-クロロチロシン置換9g8変異体の抗原親和性測定結果（センサグラム）を示す。縦軸はレスポンス差（RU）、横軸は時間（秒）を表す。
【図１６】Biacore3000により測定した、９５位及び１１２位における3-クロロチロシン置換9g8変異体の抗原親和性測定結果（センサグラム）を示す。縦軸はレスポンス差（RU）、横軸は時間（秒）を表す。
【図１７】Biacore3000により測定した、１００位及び１１２位における3-クロロチロシン置換9g8変異体の抗原親和性測定結果（センサグラム）を示す。縦軸はレスポンス差（RU）、横軸は時間（秒）を表す。
【図１８】抗リゾチーム（ニワトリ卵白由来）ＶＨＨ抗体（cAb_Lys3）のアミノ酸配列（配列番号：３）を示し、チロシン残基を太字斜体で表す。配列中の下線部は、Ｎ末端側から順に抗原相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を表す。
【図１９】cAb_Lys3遺伝子の塩基配列（配列番号：４）を示す。配列中の下線部は、チロシンに対応するトリプレットを表す。
【図２０】各3-クロロチロシン置換cAb_Lys3変異体（横軸において置換の位置を示す）及びcAb_Lys3（WT）について、SPR測定（表面プラズモン共鳴法）に基づいて算出したＫD値［Ｍ］の比較を示したグラフである。なお、ｎ＝２であり、ＫD値は平均値で示される。
【図２１】cAb_Lys3（WT）の抗原親和性を１としたときの、各3-クロロチロシン置換cAb_Lys3変異体（横軸において置換の位置を示す）の抗原親和性を示したグラフである。なお、ｎ＝２でのＫD値の平均値に基づいて対比した。
【図２２】抗リゾチーム（ヒト由来）ＶＨＨ抗体（cAb_HuL5）のアミノ酸配列（配列番号：５）を示し、チロシン残基を太字斜体で表す。配列中の下線部は、Ｎ末端側から順に抗原相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を表す。
【図２３】cAb_HuL5遺伝子の塩基配列（配列番号：６）を示す。配列中の下線部は、チロシンに対応するトリプレットを表す。
【図２４】各3-クロロチロシン置換cAb_HuL5変異体（横軸において置換の位置を示す）及びcAb_HuL5（WT）について、SPR測定（表面プラズモン共鳴法）に基づいて算出したＫD値［Ｍ］の比較を示したグラフである。なお、ｎ＝２であり、ＫD値は平均値で示される。
【図２５】cAb_HuL5（WT）の抗原親和性を１としたときの、各3-クロロチロシン置換cAb_HuL5変異体（横軸において置換の位置を示す）の抗原親和性を示したグラフである。なお、ｎ＝２でのＫD値の平均値に基づいて対比した。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明において、抗原に対する親和性を向上させた変異ＶＨＨ抗体は、野生型ＶＨＨ抗体のアミノ酸配列と比較して、１つ以上のチロシンがハロゲン化チロシンに置換されているアミノ酸配列を有する。より詳細には、本発明において、抗原に対する親和性を向上させた変異ＶＨＨ抗体は、野生型ＶＨＨ抗体のアミノ酸配列中に存在する１つ以上のチロシンの位置のうち、チロシンをハロゲン化チロシンへ置換することにより前記抗原に対する親和性を向上させる１つ以上のチロシンの位置において、１つ以上のチロシンがハロゲン化チロシンに置換されているアミノ酸配列を有する。
このようなチロシンからハロゲン化チロシンへの置換は、チロシンにハロゲン原子が付与されるのみのわずかな変化であるが、抗原に対する親和性を向上させ得ることが新たに見出された。一方で、チロシンからハロゲン化チロシンへの置換により生じる変化は、アミノ酸単位で見ても小さなものであり、抗原と抗体の相互作用の様式を変える可能性は極めて低い。例えば、チロシン環の水酸基はしばしば水素結合の形成に関わるが、このような相互作用も維持されている。ファージディスプレイ法等の従来技術は、既存の抗原・抗体間の相互作用に変更を加えてしまう大きなリスクがあり、そのため極めて多くのアミノ酸置換の組合せを評価する必要があるが、本発明によれば、既存の相互作用を保存した上で、抗原親和性の向上効果だけを狙うことができる。
チロシンからハロゲン化チロシンへの置換は、10 kDaを超える抗体分子全体から見れば限りなく小さな変化であるが、このアミノ酸置換、即ちチロシンへのハロゲン原子の付与、が抗体の抗原親和性を向上させるという新たな知見は、驚くべきものである。
また、本発明において、[ｎＭ]以下の低いＫD値を示す良質なＶＨＨ抗体においても、抗原に対する親和性を向上させた変異体を簡便・迅速に取得でき、このことは本発明の高い有用性を表している。
【００２０】
抗原に対する親和性を向上させた変異ＶＨＨ抗体において、抗体の抗原親和性を向上させる、チロシンからハロゲン化チロシンへの置換は１つ以上であり、１個であっても、複数、例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個であってもよい。本発明の一実施態様において、抗体の抗原親和性を向上させる、チロシンからハロゲン化チロシンへの置換が複数あると、それぞれ１つの置換により得られる抗原親和性の向上効果を相加的に加算することができ、好ましい。
本発明の一実施態様において、抗体の抗原親和性を向上させる、チロシンからハロゲン化チロシンへの置換は、ＶＨＨ抗体中の３個の抗原相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のいずれかの中にあってもよく、好ましくは、抗原相補性決定領域ＣＤＲ３の中にある。
また、抗体の抗原親和性を向上させる、チロシンからハロゲン化チロシンへの置換は、ＶＨＨ抗体中において限定されないが、Kabatのナンバリングに従って番号処理された場合の、位置26〜35、位置50〜65、位置90〜102の中に存在する傾向が見られ、例えば、位置26〜35、位置50〜65、位置95〜102の中に存在し得る。特には、当該置換は、位置90〜102の中に、その中でも主に位置95〜102の中に存在し得る。本明細書及び本発明において、Kabatのナンバリングは、いずれもUS Department of Health and Human Services, Public Health Services, NIH, Bethesda, MD, Publication 91-3242 (1991)に記載のものを採用している。
なお、本発明において、抗原に対する親和性を向上させた変異ＶＨＨ抗体は、その親和性向上作用に影響を与えない範囲内で、チロシンからハロゲン化チロシンへの置換以外のアミノ酸置換を含んでもよい。
【００２１】
本発明において、ハロゲン化チロシンとしては、例えば、３−クロロチロシン、３−ブロモチロシン、３−ヨードチロシン、３，５−ジクロロチロシン、３，５−ジブロモチロシン、及び３，５−ジヨードチロシンが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、ハロゲン化チロシンは、３−クロロチロシン又は３−ブロモチロシンであり、より好ましくは、３−クロロチロシンである。なお、本明細書において、Ｄ体とＬ体の区別なくチロシンに言及するが、通常、チロシンはＬ−チロシンのことであるものの、チロシンがＤ−チロシンである可能性を排除するものではない。
本明細書において、「野生型ＶＨＨ抗体」とは、天然に存在する変異されていないＶＨＨ抗体と同じアミノ酸配列を有するＶＨＨ抗体を意味する。
本明細書において、「変異ＶＨＨ抗体」とは、野生型ＶＨＨ抗体とは異なるアミノ酸配列を有するＶＨＨ抗体を意味する。
本明細書において、「変異ＶＨＨ抗体遺伝子」とは、変異ＶＨＨ抗体をコードする遺伝子を意味する。
なお、本明細書において、単にＶＨＨ抗体と言った場合には、特に野生型ＶＨＨ抗体と変異ＶＨＨ抗体の区別をする意図がなく、従って、野生型ＶＨＨ抗体と変異ＶＨＨ抗体の両方を含み得る。
【００２２】
本発明の一実施態様において、ＶＨＨ抗体において、ハロゲン化チロシンへ置換することにより抗原に対する親和性を向上させる１つ以上のチロシンの位置を特定する方法は、以下の５つの工程を少なくとも含む。
（１）(i)野生型ＶＨＨ抗体のＤＮＡ配列と比較して、チロシンをコードする１つ以上のトリプレットがＴＡＧトリプレットに変更されているＤＮＡ配列を有する変異ＶＨＨ抗体遺伝子、及び
(ii)前記ＴＡＧトリプレットに対応するＵＡＧコドンを、ハロゲン化チロシンに翻訳するためのｔＲＮＡ及びハロゲン化チロシルｔＲＮＡ合成酵素を発現する遺伝子
を導入した組換え細菌を準備する工程。
（２）前記遺伝子(i)と前記遺伝子(ii)を発現させる工程であって、前記組換え細菌を、ハロゲン化チロシンを含む培地にて培養するか、又は前記組換え細菌の抽出液にハロゲン化チロシンを添加し、前記遺伝子(i)と前記遺伝子(ii)が発現する条件下で前記抽出液を処理することを含む、該工程。
（３）前記培養した細菌又は前記処理した抽出液から、変異ＶＨＨ抗体を得る工程であって、前記変異ＶＨＨ抗体が、前記野生型ＶＨＨ抗体のアミノ酸配列と比較して１つ以上のチロシンがハロゲン化チロシンに置換されているアミノ酸配列を有する、該工程。
（４）前記変異ＶＨＨ抗体の抗原に対する親和性を測定する工程。
（５）前記野生型ＶＨＨ抗体のアミノ酸配列中に存在する１つ以上のチロシンの位置のうち、チロシンをハロゲン化チロシンへ置換することにより前記抗原に対する親和性を向上させる１つ以上のチロシンの位置を特定する工程。
【００２３】
工程（１）に記載の、野生型ＶＨＨ抗体のＤＮＡ配列と比較して、チロシンをコードする１つ以上のトリプレットがＴＡＧトリプレットに変更されているＤＮＡ配列を有する変異ＶＨＨ抗体遺伝子（本明細書において、「遺伝子(i)」と言う。）は、周知の遺伝子組み換え技術を用いて、例えば、PrimeSTAR（登録商標） Mutagenesis Basal Kitを用いて作成することができる。
工程（１）に記載の、ＴＡＧトリプレットに対応するＵＡＧコドンを、ハロゲン化チロシンに翻訳するためのｔＲＮＡ及びハロゲン化チロシルｔＲＮＡ合成酵素を発現する遺伝子（本明細書において、「遺伝子(ii)」と言う。）は、上記遺伝子(i)と同じように、周知の遺伝子組み換え技術を用いて作成することができる。遺伝子(ii)は、具体的には、ＵＡＧコドンを認識するｔＲＮＡ（本明細書において、「アンバーサプレッサーｔＲＮＡ」ともいう。）をコードする遺伝子と、このｔＲＮＡにハロゲン化チロシンをエステル結合させてハロゲン化チロシルｔＲＮＡを合成する酵素をコードする遺伝子の組合せである。
遺伝子(ii)は、既知の遺伝子を用いることもでき、例えば、Biochem. Biophys. Res. Commun. 411, 757-761 (2011)やStructure 17, 335-344 (2009)に記載のものを用いることができる。具体的には、３位がハロゲン化されたチロシンについては、Methanocaldococcus jannaschiiのチロシルtRNA合成酵素およびtRNATyrペア由来の改変体が知られている。
【００２４】
本発明において、組換え細菌は、既に作成されている既存の組換え細菌であってもよいし、遺伝子(i)と遺伝子(ii)を導入して新たに作成された組換え細菌であってもよい。細菌への遺伝子(i)と遺伝子(ii)の導入は、周知の遺伝子組み換え技術を用いて行うことができる。
組換え細菌は、外来遺伝子の導入又は遺伝子の改変が可能な細菌に由来するものである限り、特に制限はないが、好ましくは大腸菌（Escherichia coli）由来又は枯草菌（Bacillus subtilis）由来であり、より好ましくは大腸菌由来である。
また、組換え細菌には、好ましくは、ＵＡＧコドンで翻訳を終結する翻訳終結因子をコードする遺伝子の欠損によって機能を喪失する遺伝子の群から選択される１以上の遺伝子の機能を前記翻訳終結因子の非存在下において発現させるＤＮＡ構築物が導入されている、及び／又は細菌染色体上の前記１以上の遺伝子に、当該遺伝子の機能を前記翻訳終結因子の非存在下において発現させるための改変が導入されている。
【００２５】
例えば、組換え細菌が大腸菌由来である場合、ＵＡＧコドンで翻訳を終結する翻訳終結因子をコードする遺伝子の欠損によって機能を喪失する遺伝子の群から選択される１以上の遺伝子は、ｃｏａＤ、ｍｕｒＦ、ｈｄａ、ｍｒｅＣ、ｈｅｍＡ、ｌｐｘＫ及びｌｏｌＡの中から選択され得る。
例えば、組換え細菌が枯草菌由来である場合、ＵＡＧコドンで翻訳を終結する翻訳終結因子をコードする遺伝子の欠損によって機能を喪失する遺伝子の群から選択される１以上の遺伝子は、ａｃｃＤ、ａｃｐＳ、ｃｓｐＲ、ｄａｐＢ、ｄｉｖＩＣ、ｄｎａＡ、ｆｍｔ、ｆｏｌＤ、ｆｔｓＡ、ｍａｐ、ｍｒｐＤ、ｍｕｒＥ、ｍｕｒＧ、ｐｌｓＸ、ｐｐｎＫ、ｒａｃＥ、ｒｅｓＢ、ｒｅｓＣ、ｒｎｐＡ、ｒｐｌＸ、ｒｐｍＧＢ、ｒｐｍＨ、ｒｐｓＧ、ｓｅｃＡ、ｓｅｃＹ、ｔｏｐＡ、ｔｒｍＤ、ｙａｃＭ、ｙｄｉＣ、ｙｌｏＱ、ｙｐｕＨ及びｙｓｘＣの中から選択され得る。
大腸菌や枯草菌以外においても、ＵＡＧコドンで翻訳終結する全ての遺伝子中で、ＵＡＧコドンで翻訳を終結する翻訳終結因子をコードする遺伝子の欠損によって機能を喪失する遺伝子、特には、単独で欠損させると致死になる遺伝子を発現させると、ＵＡＧコドンで翻訳を終結する翻訳終結因子をコードする遺伝子を欠損させても生育可能になると考えられる。そのため、本発明を適用できる細菌は、大腸菌や枯草菌に限定されず、他の細菌を含む。
【００２６】
本明細書において、「翻訳終結因子」は、終結因子又はポリペプチド鎖終結因子ともいい、ｍＲＮＡ上の終止コドンを認識し、ポリペプチド鎖をリボソームから遊離させる因子である。ＵＡＧコドンで翻訳を終結する翻訳終結因子（以下、単に、「ＵＡＧを認識する翻訳終結因子」ともいう。）としては、例えば、大腸菌及び枯草菌等の細菌では、ＲＦ−１である。ＲＦ−１をコードする遺伝子としては、例えば、大腸菌のｐｒｆＡ遺伝子が挙げられる。
本明細書において、「ＵＡＧコドンで翻訳を終結する翻訳終結因子をコードする遺伝子の欠損」とは、当該遺伝子が細胞内に存在しないことを指す場合のほか、当該遺伝子のＯＲＦの大半が欠損している場合、当該遺伝子の主要部分が欠損している場合、当該遺伝子が発現しない場合、あるいは当該遺伝子に変異が含まれており翻訳終結因子がＵＡＧコドンを認識できないなど翻訳終結因子としての機能が阻害されている場合なども含むことを意図している。
【００２７】
ＵＡＧを認識する翻訳終結因子をコードする遺伝子（以下、単に、「ＵＡＧ認識翻訳終結因子遺伝子」ともいう。）は、遺伝子の相同性組換えを利用した方法など、周知の遺伝子破壊方法によって欠損させることができるが、特に、Ｒｅｄ／ＥＴ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ＳｙｓｔｅｍＱｕｉｃｋ  ａｎｄ  Ｅａｓｙ  ＢＡＣ  ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  Ｋｉｔ（Ｇｅｎｅ  Ｂｒｉｄｇｅｓ  ＧｍｂＨ、ドイツ）を用いることが好ましい。ここで、アンバーサプレッサーｔＲＮＡを発現するように細菌を形質転換した後に、ＵＡＧ認識翻訳終結因子遺伝子を欠損させることが、欠損効率の点で好ましい。
本明細書において、「ＵＡＧコドンで翻訳を終結する翻訳終結因子をコードする遺伝子の欠損によって機能を喪失する」とは、ある遺伝子の機能に関し、ＵＡＧ認識翻訳終結因子遺伝子の欠損によって機能を完全に喪失する場合のほか、機能の一部を喪失する場合、機能が阻害される場合、及び機能が低下する場合も含むことを意図している。ある遺伝子が、ＵＡＧ認識翻訳終結因子遺伝子の欠損によって機能を喪失する機構としては、例えば、ＵＡＧコドンで翻訳が終結せず、Ｃ末端に余分なペプチドが付加されることによって、タンパク質の機能が阻害される機構が考えられる。あるいは、ＵＡＧコドンで翻訳が終結せず、染色体上その遺伝子の下流にある遺伝子の翻訳が適切になされなくなり、この下流の遺伝子のタンパク質の機能が阻害される機構が考えられる。しかしながら機能を喪失する機構はこれらに限定されるものではない。
【００２８】
本明細書において、「ＵＡＧコドンで翻訳を終結する翻訳終結因子をコードする遺伝子の欠損によって機能を喪失する遺伝子」は、終止コドンがＵＡＧコドンである遺伝子であって、ＵＡＧ認識翻訳終結因子遺伝子の上記定義の欠損によって、機能を喪失する遺伝子、及び、終止コドンがＵＡＧコドンではないが、染色体上、終止コドンがＵＡＧコドンである遺伝子の下流にある遺伝子であって、終止コドンがＵＡＧコドンである上流の遺伝子の翻訳終結が適切になされないことによって、適切に翻訳されなくなる遺伝子を意図している。
本明細書において、「遺伝子の機能を発現させる」とは、その遺伝子の正常に機能するタンパク質が翻訳されるようにすることを意図している。したがって、「ＵＡＧコドンで翻訳を終結する翻訳終結因子をコードする遺伝子の欠損によって機能を喪失する遺伝子の機能を、前記翻訳終結因子の非存在下において発現させる」とは、ＵＡＧ認識翻訳終結因子遺伝子の欠損によって機能を喪失する遺伝子の正常なタンパク質が、当該翻訳終結因子の非存在下において発現するようにすることを意図している。
【００２９】
本明細書において、「ＤＮＡ構築物」とは、細菌に導入できる形態であって、細胞内で自己複製が可能なもの、又は細胞の染色体内に組み込まれ得るものが意図される。ＤＮＡ構築物としては、バクテリア人工染色体（ＢＡＣ）、プラスミド及び直鎖状ＤＮＡの形態が可能である。
ＤＮＡ構築物を細菌染色体に導入する場合、細菌染色体にトランスに導入してもよいし、シスに導入してもよい。本明細書において「細菌染色体にトランスに導入する」とは、細菌の細胞内には導入されるものの、細菌染色体に組み込まれないことを意図している。また、本明細書において「細菌染色体にシスに導入する」とは、細菌の細胞内に導入され、さらに細菌染色体に組み込まれることを意図している。
ＵＡＧコドンで翻訳を終結する翻訳終結因子をコードする遺伝子の欠損によって機能を喪失する遺伝子の機能を前記翻訳終結因子の非存在下において発現させるＤＮＡ構築物とは、具体的には、ＵＡＧ認識翻訳終結因子遺伝子の欠損によって機能を喪失する遺伝子の終止コドンがアンバーコドン（ＵＡＧ）からオーカーコドン（ＵＡＡ）又はオパールコドン（ＵＧＡ）に置き換えられるようにした、これらの改変型遺伝子を含むＤＮＡ構築物を指す。
ＵＡＧコドンで翻訳を終結する翻訳終結因子をコードする遺伝子の欠損によって機能を喪失する遺伝子のための改変の導入とは、具体的には、細菌の染色体上にある、ＵＡＧ認識翻訳終結因子遺伝子の欠損によって機能を喪失する遺伝子に対して、当該遺伝子の終止コドンを、アンバーコドン（ＵＡＧ）からオーカーコドン（ＵＡＡ）又はオパールコドン（ＵＧＡ）に置き換えるための改変を導入することを指す。
【００３０】
細菌の染色体上にあるこれらの遺伝子の終止コドンをアンバーコドン以外の終止コドンとすることによって、ＵＡＧを認識する翻訳終結因子が存在しない場合であっても、本来の位置で翻訳を終止させることができ、これらの遺伝子の正常に機能するタンパク質を生成することができる。従って、このような改変型遺伝子を含むＤＮＡ構築物を細菌に導入すること、又はこのような改変を細菌の染色体に導入することによって、ＵＡＧを認識する翻訳終結因子が存在しない場合であっても、ＵＡＧ認識翻訳終結因子遺伝子の欠損によって機能を喪失する遺伝子の機能を細菌内において発現させることができる。
染色体上の遺伝子の終止コドンに改変を導入する方法としては、周知の方法を用いて行うことができ、例えば、遺伝子の相同性組換えを利用する方法、あるいはランダムに細菌染色体上に生じる突然変異の中から該当する変異を選別する方法などが可能である。
【００３１】
大腸菌において、ＵＡＧ認識翻訳終結因子遺伝子の非存在下においてもその機能を発現させる遺伝子としては、ｃｏａＤ、ｍｕｒＦ、ｈｄａ、ｍｒｅＣ、ｈｅｍＡ、ｌｐｘＫ及びｌｏｌＡの中から選択される１以上の遺伝子であることが好ましく、これらの中から選択される任意の６つの遺伝子であることがより好ましく、これら全ての遺伝子が選択されることが特に好ましい。ＵＡＧ認識翻訳終結因子遺伝子の欠損によって機能を喪失する遺伝子の中には、単独で遺伝子欠損させると致死になる遺伝子も含まれ、大腸菌において、このような遺伝子としては、上記の７種類が挙げられる。
また、ＵＡＧ認識翻訳終結因子遺伝子の欠損によって機能を喪失する遺伝子の中には、機能の喪失によって細菌が致死になるわけではないが、機能の喪失によって細菌の増殖速度が低下する遺伝子も含まれる。細菌の増殖速度が低下すると、得られるタンパク質の量が低下することが予想される。そのため、ＵＡＧコドンで翻訳を終結する翻訳終結因子をコードする遺伝子の欠損によって機能を喪失する遺伝子から選択される１以上の遺伝子には、機能の喪失によって細菌の増殖速度が低下することが知られている遺伝子が含まれていることが好ましい。
例えば、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）において、TＡＧで終了する遺伝子は２７３個あるが、このうちの９５個の遺伝子をＴＡＡ又はＴＧＡに置換し、ｐｒｆＡ遺伝子を欠損した大腸菌株は、Ｂ−９５ΔＡ株として知られている（“Highly reproductive Escherichia coli cells with no specific assignment to the UAG codon”, Mukai T. et al., Scientific Reports (2015) 5: 9699）。
【００３２】
なお、本発明において用いられる組換え細菌は、特許第5858543号公報の記載に基づいて作製することができる。例えば、本発明において用いられる組換え細菌は、特許第5858543号公報の記載に基づき、以下の作製方法により作製することができる。
非天然タンパク質製造用の組換え細菌の作製方法であって、
（Ａ）ＵＡＧコドンを認識するｔＲＮＡを細菌内に発現させるステップと、
（Ｂ）前記ｔＲＮＡをハロゲン化チロシンによってアシル化するハロゲン化チロシル−ｔＲＮＡ合成酵素を細菌内に発現させるステップと、
（Ｃ）ＵＡＧコドンで翻訳を終結する翻訳終結因子をコードする遺伝子の欠損によって機能を喪失する遺伝子の群から選択される１以上の遺伝子の機能を、前記翻訳終結因子の非存在下において発現させるための処理を細菌に対して行うステップと、
（Ｄ）細菌内の前記翻訳終結因子をコードする遺伝子を欠損させるステップと、
を含み、
前記（Ａ）〜（Ｄ）のステップにおける前記各細菌は全て同一の細菌であり、
前記細菌は、大腸菌または枯草菌であり、
前記１以上の遺伝子が、大腸菌のｃｏａＤ、ｍｕｒＦ、ｈｄａ、ｍｒｅＣ、ｈｅｍＡ、ｌｐｘＫ及びｌｏｌＡ、並びに枯草菌のａｃｃＤ、ａｃｐＳ、ｃｓｐＲ、ｄａｐＢ、ｄｉｖＩＣ、ｄｎａＡ、ｆｍｔ、ｆｏｌＤ、ｆｔｓＡ、ｍａｐ、ｍｒｐＤ、ｍｕｒＥ、ｍｕｒＧ、ｐｌｓＸ、ｐｐｎＫ、ｒａｃＥ、ｒｅｓＢ、ｒｅｓＣ、ｒｎｐＡ、ｒｐｌＸ、ｒｐｍＧＢ、ｒｐｍＨ、ｒｐｓＧ、ｓｅｃＡ、ｓｅｃＹ、ｔｏｐＡ、ｔｒｍＤ、ｙａｃＭ、ｙｄｉＣ、ｙｌｏＱ、ｙｐｕＨ及びｙｓｘＣの中から選択される１以上の遺伝子であり、
前記処理が、前記１以上の遺伝子の機能を前記翻訳終結因子の非存在下において発現させるＤＮＡ構築物を前記細菌に導入する処理及び／又は前記細菌の染色体上の前記１以上の遺伝子に、当該遺伝子の機能を前記翻訳終結因子の非存在下において発現させるための改変を導入する処理であり、
前記ＤＮＡ構築物は、前記１以上の遺伝子の終止コドンをアンバーコドン（ＵＡＧ）からオーカーコドン（ＵＡＡ）又はオパールコドン（ＵＧＡ）に置き換えた前記１以上の遺伝子の改変型遺伝子を含み、かつ
前記改変は、前記細菌の染色体上の前記１以上の遺伝子の終止コドンをアンバーコドン（ＵＡＧ）からオーカーコドン（ＵＡＡ）又はオパールコドン（ＵＧＡ）に置き換える改変である、作製方法。
【００３３】
また、本発明において用いられる組換え細菌は、特許第5858543号公報の記載に基づき、以下の作製方法により作製することもできる。
非天然タンパク質製造用の組換え細菌の作製方法であって、
ＵＡＧコドンを認識するｔＲＮＡを発現する細菌に対して、
（Ｅ）前記ｔＲＮＡをハロゲン化チロシンによってアシル化するハロゲン化チロシル−ｔＲＮＡ合成酵素を発現させるステップと、
（Ｆ）ＵＡＧコドンで翻訳を終結する翻訳終結因子をコードする遺伝子の欠損によって機能を喪失する遺伝子の群から選択される１以上の遺伝子の機能を、前記翻訳終結因子の非存在下において発現させるための処理を行うステップと、
（Ｇ）前記翻訳終結因子をコードする遺伝子を欠損させるステップと、
を含み、
前記細菌は、大腸菌または枯草菌であり、
前記１以上の遺伝子が、大腸菌のｃｏａＤ、ｍｕｒＦ、ｈｄａ、ｍｒｅＣ、ｈｅｍＡ、ｌｐｘＫ及びｌｏｌＡ、並びに枯草菌のａｃｃＤ、ａｃｐＳ、ｃｓｐＲ、ｄａｐＢ、ｄｉｖＩＣ、ｄｎａＡ、ｆｍｔ、ｆｏｌＤ、ｆｔｓＡ、ｍａｐ、ｍｒｐＤ、ｍｕｒＥ、ｍｕｒＧ、ｐｌｓＸ、ｐｐｎＫ、ｒａｃＥ、ｒｅｓＢ、ｒｅｓＣ、ｒｎｐＡ、ｒｐｌＸ、ｒｐｍＧＢ、ｒｐｍＨ、ｒｐｓＧ、ｓｅｃＡ、ｓｅｃＹ、ｔｏｐＡ、ｔｒｍＤ、ｙａｃＭ、ｙｄｉＣ、ｙｌｏＱ、ｙｐｕＨ及びｙｓｘＣの中から選択される１以上の遺伝子であり、
前記処理が、前記１以上の遺伝子の機能を前記翻訳終結因子の非存在下において発現させるＤＮＡ構築物を前記細菌に導入する処理及び／又は前記細菌の染色体上の前記１以上の遺伝子に、当該遺伝子の機能を前記翻訳終結因子の非存在下において発現させるための改変を導入する処理であり、
前記ＤＮＡ構築物は、前記１以上の遺伝子の終止コドンをアンバーコドン（ＵＡＧ）からオーカーコドン（ＵＡＡ）又はオパールコドン（ＵＧＡ）に置き換えた前記１以上の遺伝子の改変型遺伝子を含み、かつ
前記改変は、前記細菌の染色体上の前記１以上の遺伝子の終止コドンをアンバーコドン（ＵＡＧ）からオーカーコドン（ＵＡＡ）又はオパールコドン（ＵＧＡ）に置き換える改変である、作製方法。
【００３４】
工程（２）では、組換え細菌に導入された遺伝子(i)と遺伝子(ii)を発現させる。遺伝子(i)と遺伝子(ii)が発現すると、遺伝子(i)のＤＮＡ配列中のＴＡＧトリプレットに対応する箇所おいてハロゲン化チロシンを有するアミノ酸配列を有する、所望の変異ＶＨＨ抗体が産生される。
工程（２）において、遺伝子(i)と遺伝子(ii)を組換え細菌内で発現させてもよいし、組換え細菌の抽出液内で発現させてもよい。
遺伝子(i)と遺伝子(ii)を組換え細菌内で発現させる場合には、組換え細菌を、ハロゲン化チロシンを含む培地にて培養する。この場合、培養培地は、ハロゲン化チロシンを含む限り、使用される組換え細菌の種類に応じて、当業者の技術常識に基づき適宜選択されることができる。また、組換え細菌を培養する際の温度、酸素分圧、二酸化炭素分圧、及び時間等の培養条件は、使用される組換え細菌の種類に応じて、当業者の技術常識に基づき適宜選択されることができる。
【００３５】
遺伝子(i)と遺伝子(ii)を組換え細菌の抽出液内で発現させる場合には、抽出液にハロゲン化チロシンを添加し、遺伝子(i)と遺伝子(ii)が発現する条件下で前記抽出液を処理する。例えば、Ｚｕｂａｙら（Zubay et al., Ann. Rev. Genet. Vol.7, pp.267-287 (1973)）、Ｐｒａｔｔら（Pratt,J.M.et al., Transcription and Translation - A practical approach, (1984), pp.179-209, Henes,B.D.et al. eds.,IRL Press, Oxford）、又はＫｉｇａｗａら（Kigawa, T. et al, J. Struct. Funct. Genomics, Vol.5, pp63-68 (2004)）に記載の方法に従って組換え細菌株の抽出液を調製し、該抽出液の中で遺伝子(i)と遺伝子(ii)を発現させてもよい。
遺伝子(i)と前記遺伝子(ii)が発現する条件下での抽出液の処理は、適宜、当業者の技術常識に基づいて実施され得る。
【００３６】
組換え細菌の抽出物は、具体的には、以下の調製方法を用いて調製することができるが、これに限定されるものではない。ハロゲン化チロシンに特異的なハロゲン化チロシル−ｔＲＮＡ合成酵素を生成することができる組換え細菌を培養し、遠心分離により回収する。回収した細菌を、洗浄し、緩衝液に再懸濁し、フレンチプレスやガラスビーズ、ワーリングブレンダー等を用いて破砕する。細菌の不溶分画を遠心分離で除去し、インキュベーションする。このインキュベーションによって内在性の核酸（ＤＮＡ及びＲＮＡ）を分解することができる。内在性の核酸は、インキュベーション溶液に、さらにカルシウム塩やマイクロコッカスのヌクレアーゼ等を添加することでさらに分解できる。インキュベーション後、透析によって内在性のアミノ酸、核酸、ヌクレオシドなど除去して、抽出液を調製する。
組換え細菌の抽出物を、遺伝子(i)と前記遺伝子(ii)が発現する条件下で処理するとは、例えば以下の方法を採用することができるが、これに限定されるものではない。インビトロで調製したアンバーサプレッサーｔＲＮＡと、市販のｔＲＮＡ画分と、鋳型ＤＮＡ／ＲＮＡとを、組換え細菌の抽出物に加える。ここで、ハロゲン化チロシンを加え、さらにエネルギー、イオン、緩衝液、ＡＴＰ再生系、核酸分解酵素阻害剤、還元剤、ポリエチレングリコール、ｃＡＭＰ、葉酸類及び抗菌剤等を加えてもよい。さらに、ハロゲン化チロシル‐ｔＲＮＡ合成酵素を添加してもよい。また、鋳型としてＤＮＡを用いる場合には、ＲＮＡ合成系（基質、及びポリメラーゼなど）を加えることが好ましい。このように種々の成分が添加された抽出液を、２０℃〜３７℃の温度にて、インキュベーションする。
【００３７】
工程（２）において遺伝子(i)と遺伝子(ii)が発現すると、遺伝子(i)のＤＮＡ配列中のＴＡＧトリプレットに対応する箇所おいてハロゲン化チロシンを有するアミノ酸配列を有する、所望の変異ＶＨＨ抗体が産生される。産生された変異ＶＨＨ抗体は、当業者の技術常識に基づき、適宜、単離、精製及び／又は回収され得る。
本発明において、工程（３）は、このように産生された変異ＶＨＨ抗体を、当業者の技術常識に基づき、前記培養した細菌又は前記処理した抽出液から、適宜、単離、精製及び／又は回収することを含む。
本発明の一実施態様において、このようにして得られた変異ＶＨＨ抗体は、野生型ＶＨＨ抗体のアミノ酸配列と比較して１つ以上のチロシンがハロゲン化チロシンに置換されているアミノ酸配列を有する。
【００３８】
本発明において、工程（４）は、抗体の抗原に対する親和性を測定する周知の技術を用いて行われることができ、例えば、Surface Plasmon Resonance (SPR)測定（表面プラズモン共鳴法）により行われてもよい。工程（４）において、得られた変異ＶＨＨ抗体の抗原に対する親和性を、野生型ＶＨＨ抗体の前記抗原に対する親和性と比較してもよい。
本発明において、工程（５）では、工程（４）で得られた測定結果に基づき、適宜、野生型ＶＨＨ抗体のアミノ酸配列中に存在する１つ以上のチロシンの位置のうち、チロシンをハロゲン化チロシンへ置換することにより抗原に対する親和性を向上させる１つ以上のチロシンの位置を特定し得る。
本発明の一実施態様において、チロシンをハロゲン化チロシンへ置換することにより抗原に対する親和性を向上させる１つ以上のチロシンの位置は、ＶＨＨ抗体中の３個の抗原相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のいずれかの中にあってもよく、好ましくは、抗原相補性決定領域ＣＤＲ３の中にある。
また、チロシンをハロゲン化チロシンへ置換することにより抗原に対する親和性を向上させる１つ以上のチロシンの位置は、ＶＨＨ抗体中において限定されないが、Kabatのナンバリングに従って番号処理された場合の、位置26〜35、位置50〜65、位置90〜102の中に存在する傾向が見られ、例えば、位置26〜35、位置50〜65、位置95〜102の中に存在し得る。特には、当該チロシンの位置は、位置90〜102の中に、その中でも主に位置95〜102の中に存在し得る。
【００３９】
抗原に対する親和性を向上させた変異ＶＨＨ抗体を製造する方法は、以下の３つの工程を少なくとも含む。
（１）(i)野生型ＶＨＨ抗体のＤＮＡ配列と比較して、ハロゲン化チロシンへ置換することにより抗原に対する親和性を向上させる１つ以上のチロシンの位置におけるチロシンをコードする１つ以上のトリプレットが、ＴＡＧトリプレットに変更されているＤＮＡ配列を有する変異ＶＨＨ抗体遺伝子、及び
(ii)前記ＴＡＧトリプレットに対応するＵＡＧコドンを、ハロゲン化チロシンに翻訳するためのｔＲＮＡ及びハロゲン化チロシルｔＲＮＡ合成酵素を発現する遺伝子
を導入した組換え細菌を準備する工程。
（２）前記遺伝子(i)と前記遺伝子(ii)を発現させる工程であって、前記組換え細菌を、ハロゲン化チロシンを含む培地にて培養するか、又は前記組換え細菌の抽出液にハロゲン化チロシンを添加し、前記遺伝子(i)と前記遺伝子(ii)が発現する条件下で前記抽出液を処理することを含む、該工程。
（３）前記培養した細菌又は前記処理した抽出液から、変異ＶＨＨ抗体を得る工程。
【００４０】
本発明において、上記製造方法における工程（１）は、上記特定方法における工程（１）と実質的に同じものであり得るが、上記製造方法における工程（１）では、遺伝子(i)は、野生型ＶＨＨ抗体のＤＮＡ配列と比較して、ハロゲン化チロシンへ置換することにより抗原に対する親和性を向上させる１つ以上のチロシンの位置におけるチロシンをコードする１つ以上のトリプレットが、ＴＡＧトリプレットに変更されているＤＮＡ配列を有する変異ＶＨＨ抗体遺伝子である。
従って、このような変異ＶＨＨ抗体遺伝子からコードされる、本発明の製造方法によって製造される変異ＶＨＨ抗体は、野生型ＶＨＨ抗体のアミノ酸配列中に存在する１つ以上のチロシンの位置のうち、チロシンをハロゲン化チロシンへ置換することにより抗原に対する親和性を向上させる１つ以上のチロシンの位置において、１つ以上のチロシンがハロゲン化チロシンに置換されているアミノ酸配列を有する。
上記製造方法において、野生型ＶＨＨ抗体のアミノ酸配列中に存在する１つ以上のチロシンの位置のうち、チロシンをハロゲン化チロシンへ置換することにより抗原に対する親和性を向上させる１つ以上のチロシンの位置は、上記特定方法と実質的同じ方法により特定され得る。
【００４１】
本発明において、上記製造方法における工程（２）は、上記特定方法における工程（２）と実質的に同じものであり得る。
本発明において、上記製造方法における工程（３）は、上記特定方法における工程（３）と実質的に同じものであり得る。
【００４２】
本発明の一実施態様において、変異ＶＨＨ抗体における抗原に対する親和性を向上させるアミノ酸置換の有無を測定する方法は、以下の４つの工程を少なくとも含む。
（１）(i)野生型ＶＨＨ抗体のＤＮＡ配列と比較して、チロシンをコードする１つ以上のトリプレットがＴＡＧトリプレットに変更されているＤＮＡ配列を有する変異ＶＨＨ抗体遺伝子、及び
(ii)前記ＴＡＧトリプレットＵＡＧコドンを、ハロゲン化チロシンに翻訳するためのｔＲＮＡ及びハロゲン化チロシルｔＲＮＡ合成酵素を発現する遺伝子
を導入した組換え細菌を準備する工程。
（２）前記遺伝子(i)と前記遺伝子(ii)を発現させる工程であって、前記組換え細菌を、ハロゲン化チロシンを含む培地にて培養するか、又は前記組換え細菌の抽出液にハロゲン化チロシンを添加し、前記遺伝子(i)と前記遺伝子(ii)が発現する条件下で前記抽出液を処理することを含む、該工程。
（３）前記培養した細菌又は前記処理した抽出液から、変異ＶＨＨ抗体を得る工程であって、前記変異ＶＨＨ抗体が、前記野生型ＶＨＨ抗体のアミノ酸配列と比較して１つ以上のチロシンがハロゲン化チロシンに置換されているアミノ酸配列を有する、該工程。
（４）前記変異ＶＨＨ抗体の抗原に対する親和性を測定し、前記変異ＶＨＨ抗体における、抗原に対する親和性を向上させる、チロシンからハロゲン化チロシンへのアミノ酸置換の有無を測定する工程。
【００４３】
本発明において、上記測定方法における工程（１）は、上記特定方法における工程（１）と実質的に同じものであり得る。
本発明において、上記測定方法における工程（２）は、上記特定方法における工程（２）と実質的に同じものであり得る。
本発明において、上記測定方法における工程（３）は、上記特定方法における工程（３）と実質的に同じものであり得る。
【００４４】
上記測定方法における工程（４）において、変異ＶＨＨ抗体の抗原に対する親和性の測定は周知の技術を用いて行われることができ、例えば、Surface Plasmon Resonance (SPR)測定（表面プラズモン共鳴法）により行われてもよい。上記測定方法における工程（４）において、得られたＶＨＨ抗体の抗原に対する親和性を、野生型ＶＨＨ抗体の前記抗原に対する親和性と比較してもよい。
上記測定方法における工程（４）では、変異ＶＨＨ抗体の抗原に対する親和性を測定することにより、変異ＶＨＨ抗体中、抗原に対する親和性を向上させる、チロシンからハロゲン化チロシンへのアミノ酸置換の有無を測定することができる。
【００４５】
本発明の一実施態様において、変異ＶＨＨ抗体におけるアミノ酸置換が、３個の抗原相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のいずれかの中にあってもよく、好ましくは、抗原相補性決定領域ＣＤＲ３の中にある。具体的には、上記測定方法は、３個の抗原相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のいずれかの中にある、変異ＶＨＨ抗体における抗原に対する親和性を向上させるアミノ酸置換の有無を測定する方法であってもよく、抗原相補性決定領域ＣＤＲ３の中にある、変異ＶＨＨ抗体における抗原に対する親和性を向上させるアミノ酸置換の有無を測定する方法であってもよい。また、上記測定方法は、Kabatのナンバリングに従って番号処理された場合の、位置26〜35、位置50〜65、位置90〜102の中に存在する、変異ＶＨＨ抗体における抗原に対する親和性を向上させるアミノ酸置換の有無を測定する方法であってもよく、Kabatのナンバリングに従って番号処理された場合の位置90〜102の中に存在する、変異ＶＨＨ抗体における抗原に対する親和性を向上させるアミノ酸置換の有無を測定する方法であってもよい。同様に、上記測定方法は、Kabatのナンバリングに従って番号処理された場合の、位置26〜35、位置50〜65、位置95〜102の中に存在する、変異ＶＨＨ抗体における抗原に対する親和性を向上させるアミノ酸置換の有無を測定する方法であってもよく、Kabatのナンバリングに従って番号処理された場合の位置95〜102の中に存在する、変異ＶＨＨ抗体における抗原に対する親和性を向上させるアミノ酸置換の有無を測定する方法であってもよい。
例えば、ＣＤＲ３中のチロシン又はKabatのナンバリングに従って番号処理された場合の位置90〜102、特には位置95〜102の中に存在するチロシンを優先的に置換し、変異ＶＨＨ抗体の抗原に対する親和性を測定することで、従来のアミノ酸配列ランダマイズおよびディスプレイ技術の組合せと比較して、より迅速および簡便にＶＨＨ抗体の抗原に対する親和性を向上し得るアミノ酸置換を判別することができる。
【００４６】
本発明の一実施態様において、抗原に対する親和性を向上させた変異ＶＨＨ抗体をスクリーニングする方法は、上記した、ＶＨＨ抗体において、ハロゲン化チロシンへ置換することにより抗原に対する親和性を向上させる１つ以上のチロシンの位置を特定する方法の各工程を含む。
本発明の一実施態様において、抗原に対する親和性を向上させた変異ＶＨＨ抗体をスクリーニングする方法は、上記した、ＶＨＨ抗体において、ハロゲン化チロシンへ置換することにより抗原に対する親和性を向上させる１つ以上のチロシンの位置を特定する方法によって、１種以上の変異ＶＨＨ抗体を評価することを含む。
【００４７】
本発明の一実施態様において、抗原に対する親和性を向上させた変異ＶＨＨ抗体をスクリーニングする方法は、上記した、変異ＶＨＨ抗体における抗原に対する親和性を向上させるアミノ酸置換の有無を測定する方法の各工程を含む。
本発明の一実施態様において、抗原に対する親和性を向上させた変異ＶＨＨ抗体をスクリーニングする方法は、上記した、変異ＶＨＨ抗体における抗原に対する親和性を向上させるアミノ酸置換の有無を測定する方法によって、１種以上の変異ＶＨＨ抗体を評価することを含む。
本発明のスクリーニング方法は、抗原親和性が向上した変異ＶＨＨ抗体を見出すために作製する変異体の数が、ファージディスプレイ法等の従来技術による場合に比べて圧倒的に少なく、また、実験操作もファージディスプレイ法等の従来技術に比べて簡便である。そのため、ファージディスプレイ法等の従来技術に比べて、抗原親和性が向上した変異ＶＨＨ抗体を見出すための時間を大幅に短縮することができ、コストの削減も可能となる。
【００４８】
本発明の一実施態様において、変異ＶＨＨ抗体の製造方法は、上記した、ＶＨＨ抗体において、ハロゲン化チロシンへ置換することにより抗原に対する親和性を向上させる１つ以上のチロシンの位置を特定する方法によって位置が確認された、抗原に対する親和性を向上させる、チロシンからハロゲン化チロシンへのアミノ酸置換、を含むアミノ酸配列を有する変異ＶＨＨ抗体を対象とするものである。
本発明の一実施態様において、変異ＶＨＨ抗体の製造方法は、上記した、変異ＶＨＨ抗体における抗原に対する親和性を向上させるアミノ酸置換の有無を測定する方法によって存在が確認された、抗原に対する親和性を向上させる、チロシンからハロゲン化チロシンへのアミノ酸置換、を含むアミノ酸配列を有する変異ＶＨＨ抗体を対象とするものである。
【実施例】
【００４９】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００５０】
＜実施例１：チロシン残基を部位特異的にハロゲン化チロシンへ置換した抗上皮成長因子受容体（Epidermal-Growth-Factor Receptor:EGFR）ＶＨＨ抗体の変異体の調製＞
１．変異ＶＨＨ抗体（9g8）遺伝子を含むプラスミドベクターの作成
EGFRへ結合するＶＨＨ抗体（9g8）（そのアミノ酸配列（配列番号：１）を図１に示す。）のチロシン部位にハロゲン化チロシン（３−クロロチロシン又は３−ブロモチロシン）を導入（チロシンをハロゲン化チロシンに置換）するため、9g8遺伝子を、T7プロモーターの下流領域に、pelBリーダー配列およびC末端Hisタグ配列と共にpET26bベクター（pET26b(+)ベクター（Novagen）のカナマイシン薬剤耐性をアンピシリン薬剤耐性に変更）へクローニングした。続いて、9g8遺伝子中のハロゲン化チロシンへ置換するチロシン残基をコードするトリプレット（TAT/TAC）を、終止コドンの１つであるＵＡＧコドンに対応するＴＡＧトリプレットに変更した。
9g8中、チロシン残基は、図１に示されるとおり、３２位、５９位、６０位、８０位、９４位、９５位、１００位、１０７位、１１２位、１１４位及び１１６位の１１ヶ所に存在する。本実施例においては、9g8遺伝子（その塩基配列（配列番号：２）を図２に示す。）中、各部位におけるチロシンをコードするトリプレットを、それぞれ１ヶ所ずつＴＡＧトリプレットに変更して、１１種類の１置換変異ＶＨＨ抗体（9g8）遺伝子を作成した。
また、対照として、変異ＶＨＨ抗体（9g8）遺伝子に代えて9g8遺伝子を用いた。
【００５１】
２．ＩＹＮ３ ＤＮＡカセットを含むプラスミドベクターの作成
ＩＹＮ３ ＤＮＡカセットは、古細菌由来のハロゲン化チロシンに特化させたハロゲン化チロシルｔＲＮＡ合成酵素、および同じくハロゲン化チロシン特異的、かつＵＡＧコドンを翻訳可能なサプレッサーｔＲＮＡ分子をコードするＤＮＡフラグメントである（Biochem. Biophys. Res. Commun. 411, 757-761 (2011)）。このＩＹＮ３ ＤＮＡカセットを大腸菌Ｂ−９５ΔＡ株に導入すると、Ｂ−９５ΔＡ株内では、ＵＡＧコドンは終止コドンではなくハロゲン化チロシンのコドンとなる。具体的には、培地に添加されたハロゲン化チロシンはＢ−９５ΔＡ株に取込まれ、ハロゲン化チロシルｔＲＮＡ合成酵素によりサプレッサーｔＲＮＡの末端に結合される。この複合体はＢ−９５ΔＡ株のタンパク質生合成過程において、ｍＲＮＡ中のＵＡＧコドンの位置でハロゲン化チロシンとして翻訳され、ＵＡＧコドンの位置にハロゲン化チロシンが導入されたタンパク質が合成される。
このＩＹＮ３ ＤＮＡカセットを、pCDF-1bベクター（Novagen）由来のプラスミド上、lacI遺伝子の下流にクローニングした。
【００５２】
３．9g8変異体の作成
上記のとおり作成した変異ＶＨＨ抗体（9g8）遺伝子を含むプラスミドベクターおよびＩＹＮ３ ＤＮＡカセットを含むプラスミドベクターによりＢ−９５ΔＡ株を同時に形質転換し、１１種類の変異ＶＨＨ抗体（9g8）遺伝子のうちのいずれか１種が導入され、かつＩＹＮ３ ＤＮＡカセットが導入された１１種類のＢ−９５ΔＡ株をそれぞれ調製した。この１１種類のＢ−９５ΔＡ株を、1 [mM]のハロゲン化チロシンを添加した培地にて25 ℃で、30時間培養することで、本来チロシンであった位置にハロゲン化チロシンが導入された9g8変異体をそれぞれ取得した。その後、Ni-Sepharoseカラム（GE Healthcare）にて精製し、各9g8変異体を[mg/L]オーダーにて取得した。
また、対照として、変異ＶＨＨ抗体（9g8）遺伝子に代えて9g8遺伝子を用いて、9g8（野生型ＶＨＨ抗体）を得た。
【００５３】
＜実施例２：チロシン残基を部位特異的にハロゲン化チロシンへ置換した9g8変異体の抗原親和性の評価＞
9g8変異体および9g8のEGFRに対する親和性を、EGFR細胞外ドメインを用いたSurface Plasmon Resonance (SPR)測定（Biacore3000 (GE Healthcare)）により評価した。測定は25 ℃にて実施し、ランニングバッファーはHBS-P (10 mM HEPES (pH 7.4), 150 mM NaCl, および0.05% Surfactant P20) (GE Healthcare)を用いた。リガンドとして5 [μg/ml]（酢酸ナトリウムバッファー、pH 5.5)EGFRをCM5センサーチップ (GE Healthcare)表面に3000RUとなるように固定化した（アミンカップリング）。各9g8変異体の濃度は0.37〜30 [nM] (HBS-Pバッファー）とし、single cycle kinetics method、インジェクション量30 μL、流速30 μL/分、抗原−抗体解離時間15秒にて測定した。異なるサンプルの測定間に1 [M] NaCl を含む10 [mM]クエン酸バッファー(pH 4)でセンサーチップを再生した。得られたセンサグラムはsingle cycle kinetics 1:1結合モデルによって解析した（図３〜１４）。結合親和性の指標となる解離定数ＫDを、表１にまとめる。
【００５４】
【表１】
2020137414.tif 000002
各ＫD値を比較したところ、３−クロロチロシン置換9g8変異体の特定部位（５９、９５、１００および１１２位）における３−クロロチロシン置換による親和性向上効果が高く、１１２位における３−クロロチロシン置換による親和性向上効果が最も高かった。
なお、9g8における５９、９５、１００及び１１２位は、Structure 21, 1214-1224 (2013)（US Department of Health and Human Services, Public Health Services, NIH, Bethesda, MD, Publication 91-3242 (1991)を参照している）に記載のKabatのナンバリングに従って番号処理された場合、それぞれ、５８、９１、９６及び１００ｋの位置に相当する。
【００５５】
３−クロロチロシンによる置換に代えて３−ブロモチロシンによる置換においても同様に試験したところ、おおよそ同様の傾向であった。結合親和性の指標となる解離定数ＫDを、表２にまとめる。
【表２】
2020137414.tif 000003
【００５６】
更に、３−クロロチロシン置換による親和性向上効果が高かった５９、９５、１００および１１２位における置換について、いくつかの置換の組合せを有する9g8変異体を、上記実施例１と同じように作成し、EGFRに対する親和性を上記と同様に測定した。
１置換9g8変異体において親和性向上効果が最も高かった１１２位における３−クロロチロシン置換を、１置換9g8変異体において親和性向上効果が認められた他の置換と組合せることで、更に親和性が向上した（図１５〜１７）。中でも、最も親和性が向上した変異体は１００位と１１２位の二置換体であり、親和性は9g8（野生型ＶＨＨ抗体）と比較して約40倍にまで向上した。結合親和性の指標となる解離定数ＫDを、表３にまとめる。
【表３】
2020137414.tif 000004
【００５７】
＜実施例３：チロシン残基を部位特異的に３−クロロチロシンへ置換した抗リゾチーム（Lysozyme）（ニワトリ卵白由来）ＶＨＨ抗体の変異体の調製＞
１．変異ＶＨＨ抗体（cAb_Lys3）遺伝子を含むプラスミドベクターの作成
本発明の汎用性を確認するため、異なる抗原に対するＶＨＨ抗体の親和性改善を検討した。
抗リゾチーム（ニワトリ卵白由来）ＶＨＨ抗体（cAb_Lys3）（そのアミノ酸配列（配列番号：３）を図１８に示す。）のチロシン部位に３−クロロチロシンを導入（チロシンを３−クロロチロシンに置換）するため、cAb_Lys3遺伝子をpET26bベクター（pET26b(+)ベクター（Novagen）のカナマイシン薬剤耐性をアンピシリン薬剤耐性に変更）上のT7プロモーター下流領域に、pelBリーダー配列およびC末端Hisタグ配列と共にクローニングした。続いて、cAb_Lys3遺伝子中の３−クロロチロシンへ置換するチロシン残基をコードするトリプレット（TAT/TAC）を、終止コドンの１つであるＵＡＧコドンに対応するＴＡＧトリプレットに変更した。
cAb_Lys3中、チロシン残基は、図１８に示されるとおり、２７位、３２位、５９位、６０位、８０位、９４位、９５位、１０３位、１０６位、１０７位、１１８位及び１２０位に存在する。ＶＨＨ抗体の抗原との結合には、抗原相補性決定領域ＣＤＲ３が大きく関与していることが知られている。そこで、本実施例においては、cAb_Lys3遺伝子（その塩基配列（配列番号：４）を図１９に示す。）中、ＣＤＲ３に対応する領域に存在する５つのチロシンをコードするトリプレットを、それぞれ１ヶ所ずつＴＡＧトリプレットに変更して、５種類の１置換変異ＶＨＨ抗体（cAb_Lys3）遺伝子を作成した。なお、cAb_Lys3における１０３、１０６、１０７、１１８及び１２０位は、Protein Science 11, 500-515 (2002)（US Department of Health and Human Services, Public Health Services, NIH, Bethesda, MD, Publication 91-3242 (1991)を参照している）に記載のKabatのナンバリングに従って番号処理された場合、それぞれ、９９、１００ｂ、１００ｃ、１００ｎ及び１００ｐの位置に相当する。
また、対照として、変異ＶＨＨ抗体（cAb_Lys3）遺伝子に代えてcAb_Lys3遺伝子を用いた。
【００５８】
２．ＩＹＮ３ ＤＮＡカセットを含むプラスミドベクターの作成
実施例１の２．に記載のとおり作成した。
【００５９】
３．cAb_Lys3変異体の作成
上記のとおり作成した変異ＶＨＨ抗体（cAb_Lys3）遺伝子を含むプラスミドベクターおよびＩＹＮ３ ＤＮＡカセットをを含むプラスミドベクターによりＢ−９５ΔＡ株を同時に形質転換し、５種類の変異ＶＨＨ抗体（cAb_Lys3）遺伝子のうちのいずれか１種が導入され、かつＩＹＮ３ ＤＮＡカセットが導入された５種類のＢ−９５ΔＡ株をそれぞれ調製した。この５種類のＢ−９５ΔＡ株を、1 [mM]のハロゲン化チロシンを添加した培地にて25 ℃で、30時間培養することで、本来チロシンであった位置に３−クロロチロシンが導入されたcAb_Lys3変異体をそれぞれ取得した。その後、Ni-Sepharoseカラム（GE Healthcare）にて精製し、各cAb_Lys3変異体を[mg/L]オーダーにて取得した。
また、対照として、変異ＶＨＨ抗体（cAb_Lys3）遺伝子に代えてcAb_Lys3遺伝子を用いて、cAb_Lys3（野生型ＶＨＨ抗体）を得た。
【００６０】
＜実施例４：チロシン残基を部位特異的に３−クロロチロシンへ置換したcAb_Lys3変異体の抗原親和性の評価＞
cAb_Lys3変異体のLysozyme（ニワトリ卵白由来）に対する親和性を、試薬Lysozyme（SIGMA-ALDRICH）を用い、SPR測定（Biacore T200 (GE Healthcare)）によりＫD値を評価した。測定は25 ℃にて実施し、ランニングバッファーはHBS-EP+ (10 [mM] HEPES (pH 7.4), 150 [mM] NaCl, および0.05% Surfactant P20) (GE Healthcare)を用いた。リガンドとして1〜5 [μg/ml]（リン酸ナトリウムバッファー、pH 7.0）LysozymeをCM5センサーチップ (GE Healthcare)表面に50RUとなるように固定化した（アミンカップリング）。各cAb_Lys3変異体の濃度は1.2〜100 [nM] (HBS-Pバッファー）とし、single cycle kinetics method、流速30 μL/分、抗原−抗体解離時間は300秒にて測定した。センサーチップの再生には10 [mM] Gly-HClバッファー(pH 1.5)を用いた。得られたセンサグラムはsingle cycle kinetics 1:1結合モデルによって解析した。
各ＫD値を比較したところ（ｎ＝２）、図２０及び２１に示すように、１０７位における３−クロロチロシン置換により、親和性がcAb_Lys3（野生型）と比較して約３倍向上した。この結果は、ＶＨＨ抗体のＣＤＲ３中のチロシンを優先的に置換することで、従来のアミノ酸配列ランダマイズおよびディスプレイ技術の組合せと比較して、より迅速および簡便にＶＨＨ抗体の親和性を向上できる可能性を示唆している。
【００６１】
＜実施例５：チロシン残基を部位特異的に３−クロロチロシンへ置換した抗リゾチーム（Lysozyme）（ヒト由来）ＶＨＨ抗体の変異体の調製＞
１．変異ＶＨＨ抗体（cAb_HuL5）遺伝子を含むプラスミドベクターの作成
本発明の汎用性を確認するため、また異なる抗原に対するＶＨＨ抗体の親和性改善を検討した。
抗リゾチーム（ヒト由来）ＶＨＨ抗体（cAb_HuL5）（そのアミノ酸配列（配列番号：５）を図２２に示す。）のチロシン部位に３−クロロチロシンを導入（チロシンを３−クロロチロシンに置換）するため、cAb_HuL5遺伝子をpET26bベクター（pET26b(+)ベクター（Novagen）のカナマイシン薬剤耐性をアンピシリン薬剤耐性に変更）上のT7プロモーター下流領域に、pelBリーダー配列およびC末端Hisタグ配列と共にクローニングした。続いて、cAb_HuL5遺伝子中の３−クロロチロシンへ置換するチロシン残基をコードするトリプレット（TAT/TAC）を、終止コドンの１つであるＵＡＧコドンに対応するＴＡＧトリプレットに変更した。
cAb_HuL5中、チロシン残基は、図２２に示されるとおり、５０位、５７位、５８位、７８位、９２位、９３位、１０３位及び１１３位に存在する。ＶＨＨ抗体の抗原との結合には、抗原相補性決定領域ＣＤＲ３が大きく関与していることが知られている。そこで、本実施例においては、cAb_HuL5遺伝子（その塩基配列（配列番号：６）を図２３に示す。）中、ＣＤＲ３に対応する領域に存在する２つのチロシンをコードするトリプレットを、それぞれ１ヶ所ずつＴＡＧトリプレットに変更して、２種類の１置換変異ＶＨＨ抗体（cAb_HuL5）遺伝子を作成した。なお、cAb_HuL5における１０３及び１１３位は、J. Phys. Chem. B 117, 13245-13258 (2013)（US Department of Health and Human Services, Public Health Services, NIH, Bethesda, MD, Publication 91-3242 (1991)を参照している）に記載のKabatのナンバリングに従って番号処理された場合、それぞれ、１００ａ及び１００ｋの位置に相当する。
また、対照として、変異ＶＨＨ抗体（cAb_HuL5）遺伝子に代えてcAb_HuL5遺伝子を用いた。
【００６２】
２．ＩＹＮ３ ＤＮＡカセットを含むプラスミドベクターの作成
実施例１の２．に記載のとおり作成した。
【００６３】
３．cAb_HuL5変異体の作成
上記のとおり作成した変異ＶＨＨ抗体（cAb_HuL5）遺伝子を含むプラスミドベクターおよびＩＹＮ３ ＤＮＡカセットを含むプラスミドベクターによりＢ−９５ΔＡ株を同時に形質転換し、２種類の変異ＶＨＨ抗体（cAb_HuL5）遺伝子のうちのいずれか１種が導入され、かつＩＹＮ３ ＤＮＡカセットが導入された２種類のＢ−９５ΔＡ株をそれぞれ調製した。この２種類のＢ−９５ΔＡ株を、1 [mM]のハロゲン化チロシンを添加した培地にて25 ℃で、30時間培養することで、本来チロシンであった位置に３−クロロチロシンが導入されたcAb_HuL5変異体をそれぞれ取得した。その後、Ni-Sepharoseカラム（GE Healthcare）にて精製し、各cAb_HuL5変異体を[mg/L]オーダーにて取得した。
また、対照として、変異ＶＨＨ抗体（cAb_HuL5）遺伝子に代えてcAb_HuL5遺伝子を用いて、cAb_HuL5（野生型ＶＨＨ抗体）を得た。
【００６４】
＜実施例６：チロシン残基を部位特異的に３−クロロチロシンへ置換したcAb_HuL5変異体の抗原親和性の評価＞
cAb_HuL5変異体のLysozyme（ヒト由来）に対する親和性を、試薬Lysozyme （SIGMA-ALDRICH）を用い、SPR測定（Biacore T200 (GE Healthcare)）により評価した。測定は25 ℃にて実施し、ランニングバッファーはHBS-EP+ (10 [mM] HEPES (pH 7.4), 150 [mM] NaCl, および0.05% Surfactant P20) (GE Healthcare)を用いた。リガンドとして1〜5 [μg/ml]（リン酸ナトリウムバッファー、pH 7.0) LysozymeをCM5センサーチップ (GE Healthcare)表面に50RUとなるように固定化した（アミンカップリング）。各cAb_HuL5変異体の濃度は1.2〜100 [nM]（HBS-Pバッファー）とし、single cycle kinetics method、流速30 μL/分、抗原−抗体解離時間は300秒にて測定した。センサーチップの再生には10 [mM] Gly-HClバッファー(pH 1.5)を用いた。得られたセンサグラムはsingle cycle kinetics 1:1結合モデルによって解析した。
各ＫD値を比較したところ（ｎ＝２）、図２４及び２５に示すように、１１３位における３−クロロチロシン置換により、親和性がcAb_HuL5（野生型）と比較して約２．７倍向上した。この結果は、ＶＨＨ抗体のＣＤＲ３中のチロシンを優先的に置換することで、従来のアミノ酸配列ランダマイズおよびディスプレイ技術の組合せと比較して、より迅速および簡便にＶＨＨ抗体の親和性を向上できる可能性を示唆している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【配列表】
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