(57)【要約】      （修正有）【課題】患者における貧血、無効造血、βサラセミアを治療し、又は正染性赤芽球（Ｅｒｙ−Ｃ）を増加させる方法の提供。【解決手段】患者における貧血を治療する方法であって、治療を必要とする対象への成長分化因子１１（ＧＤＦ１１；別名、骨形態形成タンパク質１１（ＢＭＰ１１））のアンタゴニストの投与を含む、前記方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者における貧血を治療する方法であって、GDF11のアンタゴニストを投与することを
含む、前記方法。
【請求項２】
患者における無効造血を治療する方法であって、GDF11のアンタゴニストを投与するこ
とを含む、前記方法。
【請求項３】
患者におけるβサラセミアを治療する方法であって、GDF11のアンタゴニストを投与す
ることを含む、前記方法。
【請求項４】
患者における正染性赤芽球(Ery-C)を増加させる方法であって、GDF11のアンタゴニスト
を投与することを含む、前記方法。
【請求項５】
前記患者が、骨髄、脾臓、肝臓、血清、又は血漿中の上昇したGDF11レベルを有する、
請求項1、2、3、又は4記載の方法。
【請求項６】
前記GDF11のアンタゴニストがActRIIAポリペプチドである場合、該ActRIIAポリペプチ
ドはGDF11に優先的に結合する、請求項1、2、3、又は4記載の方法。
【請求項７】
前記GDF11のアンタゴニストがActRIIBポリペプチドである場合、該ActRIIBポリペプチ
ドはGDF11に優先的に結合する、請求項1、2、3、又は4記載の方法。
【請求項８】
前記GDF11のアンタゴニストが、GDF11の発現を低下させ、GDF11活性を低下させ、又はG
DF11タンパク質レベルを低下させる、請求項1、2、3、又は4記載の方法。
【請求項９】
前記GDF11のアンタゴニストが抗GDF11抗体である、請求項1、2、3、又は4記載の方法。
【請求項１０】
前記GDF11のアンタゴニストがGDF11に結合する切断された受容体である、請求項1、2、
3、又は4記載の方法。
【請求項１１】
前記GDF11のアンタゴニストがActRIIAの突然変異した細胞外ドメインを含み、ここで、
該ActRIIAの突然変異した細胞外ドメインは、ActRIIAの野生型と比較したとき、アクチビ
ンAと比べてGDF11に対する増大した親和性を有する、請求項1、2、3、又は4記載の方法。
【請求項１２】
GDF11レベルをモニタリングすることをさらに含む、請求項1、3、又は4記載の方法。
【請求項１３】
a.GDF11レベルを決定すること;及び
b.前記GDF11のアンタゴニストの用量を調整すること(ここで、GDF11が正常と比べて増
加している場合、該GDF11のアンタゴニストの用量を増加させ、GDF11が正常未満に減少し
ている場合、該GDF11のアンタゴニストの用量を減少させる)
をさらに含む、請求項1、3、又は4記載の方法。
【請求項１４】
前記GDF11レベルが、GDF11 mRNAレベル、GDF11タンパク質レベル、又はGDF11タンパク
質活性レベルとして決定される、請求項12又は13記載の方法。
【請求項１５】
前記投与することが、患者における後期好塩基性及び多染性赤芽球の細胞数の減少をも
たらす、請求項1、3、又は4記載の方法。
【請求項１６】
前記GDF11のアンタゴニストが、GDF11発現を低下させ、GDF11活性を低下させ、及び/又
はGDF11タンパク質レベルを低下させる、請求項1、3、又は4記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、その開示が引用により完全に本明細書中に組み込まれる、2012年10月24日に
出願された米国仮特許出願第61/718,128号に対する優先権を主張する。
【０００２】
(1.序論)
本明細書に提供されるのは、貧血の治療方法であって、該治療を必要とする対象への成
長分化因子11(GDF11;別名、骨形態形成タンパク質11(BMP11))のアンタゴニストの投与を
含む、方法である。
【背景技術】
【０００３】
(2.背景)
貧血とは、血液中の赤血球の数が減少し又はヘモグロビンの量もしくは機能が正常未満
になることである。貧血は、最も一般的な血液障害である。
【０００４】
貧血は、無効造血によって生じ得る。無効造血は、活発な赤血球産生が行われるが、成
熟赤血球が適切な割合で発生しない場合に存在する。始原細胞は、成熟赤血球の段階に達
する前に、アポトーシスを経る。貧血は、ヘモグロビンの酸素結合能の減少を伴うことも
ある。
【０００５】
サラセミアは、無効造血の一形態である。サラセミアにおいて、無効造血は、成熟途上
の有核赤血球細胞のアポトーシスを特徴とする。特に、β-サラセミアは、赤血球の成熟
及び産生の障害をもたらすヘモグロビン(又はHgb)合成の欠陥を特徴とする疾患である。
この減少は、主として、成熟赤血球産生の全体的な減少をもたらす、赤血球分化の後期好
塩基性/多染性赤芽球段階での赤血球分化の異常な促進及びアポトーシスが原因であると
考えられている。β-サラセミアは、過形成性骨髄区画を特徴とし、そこでは、異常な赤
芽球が蓄積し、アポトーシスを経て、全身性貧血が結果として生じる。
【０００６】
TGF-β、アクチビン、骨形態形成タンパク質(BMP)、並びに成長及び分化因子(GDF)を含
む、形質転換成長因子ベータ(TGF-β)ファミリーは、発生と組織ホメオスタシスの両方に
おける数多くの細胞プロセスを調節することが知られている分泌タンパク質を含む。TGF-
β1、アクチビンA、BMP-2、及びBMP-4は全て、様々なモデル系における赤血球産生の調節
と関連付けられている。TGF-β1は、状況に応じて、赤血球分化を阻害も促進もし、アク
チビンAは、赤血球分化促進物質であることが示され、一方、BMP-4は、マウスモデルにお
けるストレス赤血球産生と急性貧血からの回復とに関係があるとされている。BMP-2は、
初期赤血球細胞に作用して、動員された末梢血又は骨髄CD34+細胞から得られる試料中で
のコロニー形成を増大させる。これらの成長因子の一部の異常に高いレベルは、様々な血
液疾患と関連付けられている。例えば、高レベルのGDF-15は、通常は、正常な赤血球産生
の特徴ではないが、無効造血の状態では、GDF-15発現が上昇している。
【０００７】
TGF-βスーパーファミリーは、30種を超えるタンパク質からなり、これらは、限られた
数の受容体及びシグナル伝達経路だけを通じてシグナルを伝達し、その作用の内在的乱雑
性及び冗長性を示している。さらに、どの所与の組織においても、いくつかの異なるリガ
ンドを見出すことができ、シグナル伝達は、おそらくは、重複するサブセットの受容体を
介して生じ、特定のリガンドをその機能に関連付ける能力を複雑にしている。GDF11は、G
DFサブファミリーのメンバーであり、ミオスタチンとしても知られるGDF8と約90％のアミ
ノ酸相同性を共有している。どちらもアクチビンIIA型及びB型受容体に結合し、Smad 2/3
シグナル伝達経路を活性化することができる。GDF11は、発生において大きな役割を果た
し、筋肉、軟骨、骨、腎臓、及び神経系の形成に関与するが、成体組織において、GDF11
は、膵臓、腸、腎臓、骨格筋、脳、及び歯髄で検出された。少量のGDF-11は、循環中にも
見出すことができる。しかしながら、今日まで、赤血球産生におけるGDF-11の役割を説明
する証拠はない。
【０００８】
アクチビンのII型受容体はGDF11にも結合することができる。2つの関連するII型受容体
、ActRIIa及びActRIIbが同定されている(Mathews及びValeの文献、1991, Cell 65:973-98
2; Attisanoらの文献、1992, Cell 68: 97-108)。GDF11の他に、ActRIIa及びActRIIbは、
BMP7、Nodal、GDF8、及びアクチビンを含む、いくつかの他のTGF-βファミリータンパク
質と生化学的に相互作用することができる(Yamashitaらの文献、1995, J. Cell Biol. 13
0:217-226; Lee及びMcPherronの文献、2001, Proc. Natl. Acad. Sci. 98:9306-9311; Ye
o及びWhitmanの文献、2001, Mol. Cell 7: 949-957; Ohらの文献、2002, Genes Dev. 16:
2749-54)。ALK4は、アクチビン、特に、アクチビンAの主なI型受容体であり、ALK-7は、
同様に、アクチビン、特に、アクチビンBの受容体としての役割を果たし得る。
【０００９】
アクチビン受容体IIA型(ActRIIA)の細胞外ドメイン(ECD)及びヒトIgG1 Fcドメインから
なるヒト化融合タンパク質は、アクチビン-A及び他のTGFβスーパーファミリーリガンド
に高い親和性で結合し、内在性ActRIIA受容体を介するシグナル伝達を遮断する。アクチ
ビン-Aは、RBC成熟の後期に影響を及ぼす赤血球分化因子(EDF)としても知られている(Mur
ataの文献、1988)。ActRIIインヒビターは、赤血球レベルを増加させることについて記載
されている(例えば、特許出願公開第20110038831号;第20100204092号;第20100068215号;
第20100028332号;第20100028331号;及び第20090163417号)。
【発明の概要】
【００１０】
(3.概要)
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、患者における貧血、無効造血、β
サラセミアを治療し、又は正染性赤芽球(Ery-C)を増加させる方法であって、GDF11のアン
タゴニストを投与することを含む、方法である。ある実施態様において、患者は、健常個
体と比べて及び/又は貧血の発症前の該患者におけるGDF11レベルと比べて、骨髄、脾臓、
肝臓、血清、又は血漿中の上昇したGDF11レベルを有する。
【００１１】
ある実施態様において、GDF11のアンタゴニストがActRIIAポリペプチドである場合、該
ActRIIAポリペプチドは、GDF11に優先的に結合する。GDF11のアンタゴニストがActRIIBポ
リペプチドである場合、該ActRIIBポリペプチドは、GDF11に優先的に結合する。
【００１２】
ある実施態様において、GDF11のアンタゴニストは、GDF11の発現を低下させ、GDF11活
性を低下させ、又はGDF11タンパク質レベルを低下させる。ある実施態様において、GDF11
のアンタゴニストは、抗GDF11抗体である。ある実施態様において、該GDF11のアンタゴニ
ストは、GDF11に結合する切断された受容体である。ある実施態様において、GDF11のアン
タゴニストは、ActRIIAの突然変異した細胞外ドメインを含み、ここで、該ActRIIAの突然
変異した細胞外ドメインは、ActRIIAの野生型と比較したとき、アクチビンAと比べてGDF1
1に対する増大した親和性を有する。
【００１３】
ある実施態様において、本明細書に提供される方法は、GDF11レベルをモニタリングす
ることをさらに含む。ある実施態様において、該方法は、
a.GDF11レベルを決定すること;及び
b.GDF11のアンタゴニストの用量を調整すること(ここで、GDF11が正常と比べて増加し
ている場合、該GDF11のアンタゴニストの用量を増加させ、GDF11が正常未満に減少してい
る場合、該GDF11のアンタゴニストの用量を減少させる)をさらに含む。ある実施態様にお
いて、該GDF11レベルは、GDF11 mRNAレベル、GDF11タンパク質レベル、又はGDF11タンパ
ク質活性レベルとして決定される。
【００１４】
ある実施態様において、GDF11アンタゴニストの投与は、患者における後期好塩基性及
び多染性赤芽球の細胞数の減少をもたらす。ある実施態様において、GDF11のアンタゴニ
ストは、GDF11発現、GDF11活性、及び/又はGDF11タンパク質レベルを低下させる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
(4.図面の簡単な説明)
【図１】図1は、配列番号7のマウス対応物(mActRIIA-Fc)がβ-サラセミアマウスの血液学的パラメーターを改善することを示している。Hbbth1/th1マウス(Skow LCらの文献、Cell 34:1043-52, 1983)をPBS又はmActRIIA-Fc(10mg/Kg体重、週2回)で60日間処置した。血液学的パラメーターを5、10、30、及び60日目に評価した。(A)赤血球数、(B)ヘマトクリット、及び(C)ヘモグロビンの評価を(D)網状赤血球増加の減少と関連付けた。循環赤血球(RBC)パラメーターの解析により、(E)平均赤血球容積(MCV)、(F)平均赤血球ヘモグロビン(MCH)、及び(G)MCH濃度(MCHC)が、mActRIIA-Fcで処置したマウスで増加したことも示されている。(H)全体的な抗酸化状態。(I)形態学的解析により、赤血球不同、変形赤血球増加、及び標的赤血球(target cell)の減少が示された。(J)全身鉄レベル、(K)トランスフェリン合成、(L)トランスフェリン、及び(M)フェリチンレベル飽和もサラセミアマウスで評価した。(N)炎症細胞数も評価した。(O)脾臓重量及び全細胞数で評価したサラセミアマウスの脾腫に対するmActRIIA-Fcの効果。(P)骨髄赤芽球数及び増殖(エオシン/ヘマトキシリン染色)もmActRIIA-Fcで処置したマウスで減少した。(Q)骨髄及び脾臓赤芽球をTER119染色によるフローサイトメトリーにより定量した。各々の独立した実験について、*p＜0.05、N＝3〜5。
【００１６】
【図２】図2は、mActRIIA-Fcがサラセミアマウスにおける無効造血を減少させることを示している。(A〜C)骨髄及び脾臓を採取し、赤芽球分化をCD71/TER119染色及びFSC/SSC分布によるフローサイトメトリーにより評価した。(D)全ビリルビン及び直接ビリルビンレベルの解析。(E)初期前赤芽球分化時の活性酸素種(ROS)発生を、ジクロロジヒドロフルオレセインを用いるフローサイトメトリーにより評価した。(F)mActRIIA-Fc又はPBSで48時間処置した初期サラセミア前赤芽球のヘモグロビン溶解度の解析。各々の独立した実験について、*p＜0.05、**p＜0.01、***p＜0.005、N＝3〜5。
【００１７】
【図３】図3は、サラセミアマウス由来の赤芽球のアポトーシスに対するmActRIIA-Fcの効果を示している。mActRIIA-Fc又はPBSで処置したマウス由来の骨髄(A)及び脾臓(B)赤芽球上でのFas-Lの発現。(C)赤芽球のTunel染色は、mActRIIA-Fc処置マウスで増加した。
【００１８】
【図４】図4は、サラセミアマウスの脾臓におけるActRIIAリガンドの発現を示している。(A)ActRII、アクチビンA、アクチビンB、及びGDF11のmRNA発現レベルは、mActRIIA-Fc処置動物で増加した。(B)mActRIIA-Fc処置動物で減少したGDF11タンパク質レベルのウェスタンブロット解析。(C)GDF11についての骨髄の免疫組織化学染色は、野生型とmActRIIA-Fcで処置したマウスとの間で変化がないことを示した。
【００１９】
【図５】図5は、初期サラセミア前赤芽球におけるGDF11発現に対するmActRIIA-Fcの効果を示している。(A)サラセミアマウスにおけるGDF11、ActRII、及びp-Smad2のレベルの増加を示す、PBS又はmActRIIA-Fcで30日間処置したサラセミアマウスのアクチビン/GDFシグナル伝達経路の免疫組織化学的解析。(B)貧血の他のモデルと比較した、サラセミアマウスのアクチビンA、アクチビンB、及びGDF11の免疫組織化学的解析。(C)アクチビンA、アクチビンB、GDF11プロペプチド、及びGDF8/GDF11切断ペプチドに対する特異的抗体を用いた、PBS又はmActRIIA-Fcで48時間処理した初期サラセミア前赤芽球のFACS解析。GDF11染色の定量は、グラフバーで示されている。(D)PBS又はmActRIIA-Fcで処置したサラセミアマウスの脾臓におけるGDF11プロ形態発現の免疫組織化学的解析。*p＜0.05、N＝4。
【００２０】
【図６】図6は、GDF11の阻害がサラセミアマウスにおける無効造血を軽減することを示している。(A)骨髄及び脾臓を採取し、初期前赤芽球分化をCD71/TER119染色及びFSC/SSC分布によるフローサイトメトリーにより評価した。(B)初期前赤芽球分化時のROS発生を、ジクロロジヒドロフルオレセインを用いるフローサイトメトリーにより評価した。*p＜0.05、N＝4。
【００２１】
【図７】図7は、血清中のGDF11を検出するサンドイッチELISAアッセイを示している。(A)アッセイの概略図。(B)プレートを5μg/mLのmActRIIA-Fcでコーティングし、増加する用量の組換えGDF11(0ng/μl、0.1ng/μl、0.5ng/μl、2.5ng/μl)又は対照血清(1/4〜1/500希釈)をmActRIIA-Fcでコーティングしたプレートに添加し、該プレートを洗浄し、結合したタンパク質を抗GDF8/11抗体で検出し、その後、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗ウサギIgGを用いて検出した。GDF11タンパク質は、該プレートに用量依存的な様式で結合した。
【００２２】
【図８】図8は、β-サラセミア患者の血清中のGDF11のレベルの増加の検出を示している。血清は、サラセミアを示している患者及び健常対照から得られた。
【００２３】
【図９】図9は、血清中のアクチビンAを検出するサンドイッチELISAアッセイを示している。(A)アッセイの概略図。(B)プレートを5μg/mLのActRIIA-Fc(配列番号7)でコーティングし、増加する用量の組換えアクチビンA(0ng/μl、0.1ng/μl、0.5ng/μl、2.5ng/μl)又は対照血清(1/4〜1/500希釈)をActRIIA-Fcプレートに添加し、該プレートを洗浄し、結合したタンパク質を抗アクチビンA抗体で検出し、その後、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗ウサギIgGを用いて検出した。アクチビンAタンパク質は、該プレートに用量依存的な様式で結合した。(C)β-サラセミア患者の血清中のアクチビンAのレベルの検出。血清は、サラセミアを示している患者及び健常対照から得られた。サラセミア患者におけるアクチビンAの血清レベルに変化はなかった。
【００２４】
【図１０】図10は、血清中のアクチビンBを検出するサンドイッチELISAアッセイを示している。(A)アッセイの概略図。(B)プレートを5μg/mLのActRIIA-Fcでコーティングし、増加する用量の組換えアクチビンB(0ng/μl、0.1ng/μl、0.5ng/μl、2.5ng/μl)又は対照血清(1/4〜1/500希釈)をActRIIA-Fcプレートに添加し、該プレートを洗浄し、結合したタンパク質を抗アクチビンB抗体で検出し、その後、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗ウサギIgGを用いて検出した。アクチビンBタンパク質は、該プレートに用量依存的な様式で結合した。(C)β-サラセミア患者の血清中のアクチビンBのレベルの検出。血清は、サラセミアを示している患者及び健常対照から得られた。サラセミア患者におけるアクチビンBの血清レベルに変化はなかった。
【００２５】
【図１１】図11は、C57BL/6野生型マウスへのmActRIIA-Fcの投与がその血液学的パラメーターを変化させないことを示している。(A)赤血球数、(B)ヘマトクリット、(C)ヘモグロビンの評価は、mActRIIA-Fcとの関連を示さなかった。(D)網状赤血球増加はわずかに減少した。mActRIIA-Fcは、(E)平均赤血球容積(MCV)、(F)平均赤血球ヘモグロビン(MCH)、又は(G)MCH濃度(MCHC)などの赤血球(RBC)パラメーターを変化させなかった。各々の独立の実験について、*p＜0.05、N＝3〜5。
【００２６】
【図１２】図12は、C57BL/6野生型マウスへのmActRIIA-Fcの投与が該マウスの脾臓及び骨髄細胞の数に影響を及ぼさなかったことを示している。
【００２７】
【図１３】図13は、mActRIIA-FcがGDF11の阻害を通じて赤血球分化を刺激することを示している。(A〜C)EPO、+/-50μg/mLのmActRIIA-Fcを含む培地中で培養することにより、CD34+/CD36+細胞の赤血球分化を行った;(A)赤血球始原細胞、(B)細胞増殖、及び(C)赤血球前駆細胞を解析した。(D〜F)EPO、+/-50μg/mLのmActRIIA-Fcを含む培地中で骨髄(BM)細胞と共培養したときのCD34+/CD36+細胞の赤血球分化;(D)赤血球始原細胞、(E)細胞増殖、及び(F)赤血球前駆細胞を解析した。(G〜H)EPO、+/-200ng/mLのGDF11、+/-100ug/mLのmActRIIA-Fcを含む培地中で培養することにより、CD36+細胞の赤血球分化を行った;(G)細胞増殖及び(H)赤血球前駆細胞GPA+のパーセンテージを解析した。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
(5.詳細な説明)
(5.1  概説)
本明細書に提供されるのは、一態様において、貧血の治療方法であって、成長分化因子
11(GDF11;別名、骨形態形成因子11(BMP-11))のアンタゴニストを、治療を必要とする患者
に投与することを含む、方法である。ある実施態様において、該方法は、それを必要とす
る個体、例えば、貧血を有する個体に、治療有効量のGDF11アンタゴニストを投与するこ
とを含む。ある具体的な実施態様において、GDF11アンタゴニストは、ActRII受容体でも
、ActRII受容体の誘導体でもなく、例えば、ActRIIA-Fc融合タンパク質でも、ActRIIB-Fc
融合タンパク質でもない。GDF11のアンタゴニストは、GDF11のどのレベルにおいても作用
することができ、すなわち、それは、GDF11発現を低下もしくは消失させ、GDF11安定性を
(例えば、GDF11分解を増加させることにより)低下させ、又はGDF11活性に(例えば、その
受容体へのGDF11結合を妨げることにより)拮抗することができる。GDF11のアンタゴニス
トのより詳細な説明は、下記の第5.3節に見出すことができる。
【００２９】
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、貧血を有する患者における赤血球
レベルを増加させる方法である(例えば、本明細書に記載の方法で治療される貧血のタイ
プについては、第5.2節を参照されたい)。本明細書に提供される方法の生理学的結果は、
次のように記載することができる。特に、以下のパラメーターの増加は、患者における貧
血の治療を示すものである。ある実施態様において、赤血球レベルは、少なくとも1％、2
％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％
、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、
70％、75％、80％、85％、90％、95％、又は少なくとも100％増加する。ある実施態様に
おいて、ヘモグロビンレベルは、少なくとも1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、
9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30
％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％
、又は少なくとも100％増加する。ある実施態様において、ヘマトクリットレベルは、少
なくとも1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14
％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％
、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、又は少なくとも100％増加する。
ある実施態様において、コロニー形成単位レベルは、少なくとも1％、2％、3％、4％、5
％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19
％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％
、85％、90％、95％、又は少なくとも100％増加する。ある実施態様において、平均赤血
球容積は、少なくとも1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12
％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％
、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、又は少なくとも100
％増加する。ある実施態様において、平均赤血球ヘモグロビンは、少なくとも1％、2％、
3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17
％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％
、75％、80％、85％、90％、95％、又は少なくとも100％増加する。ある実施態様におい
て、平均赤血球ヘモグロビン濃度は、少なくとも1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8
％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％
、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、
95％、又は少なくとも100％増加する。
【００３０】
本明細書に提供される方法の生理学的結果は、次のように記載することもできる。特に
、以下のパラメーターの減少は、患者における無効造血の治療を示すものである。ある実
施態様において、血液中の網状赤血球の割合は、少なくとも1％、2％、3％、4％、5％、6
％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、2
0％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85
％、90％、95％、又は少なくとも100％低下する。ある実施態様において、血液中の網状
赤血球の割合は、少なくとも1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11
％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％
、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、又は少なくと
も100％低下する。ある実施態様において、脾臓重量又は脾臓全細胞数は、少なくとも1％
、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16
％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％
、70％、75％、80％、85％、90％、95％、又は少なくとも100％低下する。ある実施態様
において、大腿骨当たりの骨髄細胞数は、少なくとも1％、2％、3％、4％、5％、6％、7
％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、
25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90
％、95％、又は少なくとも100％低下する。ある実施態様において、骨髄赤芽球数は、少
なくとも1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14
％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％
、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、又は少なくとも100％低下する。
【００３１】
(5.2  治療される貧血)
ある実施態様において、本明細書に提供される方法で治療される患者は、貧血と診断さ
れる。あるより具体的な実施態様において、貧血は、無効造血によって引き起こされる。
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、遺伝性骨髄不全症候群(例えば、限
定されないが、無巨核球性血小板減少症、ダイアモンド-ブラックファン貧血、先天性角
化異常症、ファンコーニ貧血、ピアソン症候群、重度先天性好中球減少症、シュワックマ
ン-ダイアモンド症候群、血小板減少橈側列無形成)、特に、赤血球に影響を及ぼす遺伝性
骨髄不全症候群を治療する方法である。より具体的には、本明細書に提供されるのは、特
に赤血球に影響を及ぼす遺伝性骨髄不全症候群を治療する方法である。ある実施態様にお
いて、本明細書に提供されるのは、対象がエリスロポエチンの投与に応答しない貧血を治
療する方法である。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、対象が、鉄、ビ
タミンB-12、及び/又は葉酸塩の投与に応答しない貧血を治療する方法である。ある実施
態様において、本明細書に提供されるのは、赤血球始原細胞及び前駆細胞がアポトーシス
による死に感受性が高い結果として生じる貧血を治療する方法である。
【００３２】
あるさらにより具体的な実施態様において、本明細書に提供される方法で治療される患
者は、β-サラセミアと診断される。β-サラセミアは、赤血球の成熟及び産生の障害をも
たらすヘモグロビン合成の欠陥を特徴とする疾患である。この減少は、主として、成熟赤
血球産生の全体的な減少をもたらす、赤血球分化の後期好塩基性/多染性赤芽球段階での
赤血球分化の異常な促進及びアポトーシスが原因であると考えられている。この疾患は、
過形成性骨髄区画を特徴とし、そこでは、異常な赤芽球が蓄積し、アポトーシスを経て、
全身性貧血が結果として生じる。
【００３３】
ある実施態様において、本明細書に提供される方法で治療される患者は、脾臓及び/又
は骨髄及び/又は血清及び/又は血漿及び/又は肝臓におけるGDF11発現及び/又は活性のレ
ベルが増加している。ある実施態様において、該患者のGDF11レベルは、貧血前の同じ人
におけるGDF11発現及び/もしくは活性のレベル(試料もしくはデータが入手可能な場合)、
又は貧血を有しないヒトにおけるGDF11発現及び/もしくは活性のレベルと比較される。あ
る実施態様において、GDF11発現及び/又は活性レベルは、脾臓、骨髄、血清、血漿、及び
/又は肝臓から測定/比較される。ある実施態様において、本明細書に提供される方法で治
療される患者におけるGDF11 mRNAレベルは、少なくとも1％、2％、3％、4％、5％、6％、
7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％
、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、
90％、95％、100％、125％、150％、175％、200％、250％、又は少なくとも500％上昇す
る。ある実施態様において、本明細書に提供される方法で治療される患者におけるGDF11
タンパク質レベルは、少なくとも1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％
、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、
40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、1
25％、150％、175％、200％、250％、又は少なくとも500％上昇する。
【００３４】
ある実施態様において、本明細書に提供される方法で治療される患者は、エリスロポエ
チンによる治療に応答しない。ある実施態様において、本明細書に提供される方法は、EP
Oの共投与をさらに含み、ここで、該EPOは、GDF11のアンタゴニストの投与の前に、その
投与と同時に、又はその投与の後に投与することができる。
【００３５】
ある実施態様において、本明細書に提供される方法で治療される患者は、13g/dl未満、
12.5g/dl未満、12g/dl未満、11.5g/dl未満、11g/dl未満、10.5g/dl未満、10g/dl未満、9.
5g/dl未満、又は9g/dl未満のヘモグロビンレベルを有する。
【００３６】
ある実施態様において、本明細書に提供される方法で治療される貧血は、化学療法誘導
性貧血である。
【００３７】
(5.3  GDF11のアンタゴニスト)
本明細書に提供される方法とともに使用することができるGDF11アンタゴニストは、以
下に記載されている。ある実施態様において、本明細書に提供される方法とともに使用す
ることができるGDF11アンタゴニストは、GDF11の発現を標的とする。他の実施態様におい
て、本明細書に提供される方法とともに使用することができるGDF11アンタゴニストは、G
DF11の活性を標的とする。他の実施態様において、本明細書に提供される方法とともに使
用することができるGDF11アンタゴニストは、GDF11のタンパク質安定性を標的とする(例
えば、分解を増加させる)。本明細書に提供される方法とともに使用することができるGDF
11アンタゴニストの好適性は、例えば、下の第5.4節に記載のアッセイを用いて、立証す
ることができる。
【００３８】
したがって、本明細書に提供される方法で使用されるGDF11アンタゴニストは、例えば
、GDF11発現及び/又はGDF11媒介性生体作用を下方調節し/低下させ、中和し、遮断し、阻
害し、及び/又は改善する。一実施態様において、GDF11アンタゴニストは、GDF11の活性
、シグナル伝達、受容体結合、発現、プロセシング、又は分泌を阻害することができる。
したがって、そのようなGDF11アンタゴニストは、該アンタゴニストの非存在下のGDF11活
性と比べて、GDF11の活性を低下させる。ある実施態様において、GDF11タンパク質の活性
は、少なくとも約1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、1
3％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50
％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、又は少なくとも100％低
下する。GDF11アンタゴニストは、一実施態様において、GDF11タンパク質の安定性にも影
響を及ぼし得る。別の実施態様において、GDF11アンタゴニストは、GDF11前駆タンパク質
から成熟GDF11形態への変換に影響を及ぼし得る。別の実施態様において、GDF11アンタゴ
ニストは、GDF11の同族受容体(例えば、ActRII受容体)への結合を妨害し、及び/又はGDF1
1同族受容体による細胞内シグナル伝達を阻害することができる。
【００３９】
GDF11アンタゴニストには、GDF11「トラップ」(例えば、阻害性GDF11受容体ポリペプチ
ド(例えば、ActRIIポリペプチド))、抗GDF11抗体、GDF11プロペプチド、GDF11類似体(例
えば、ドミナントネガティブポリペプチド、ペプチド模倣体)、他のGDF11結合タンパク質
(例えば、フォリスタチン、フォリスタチン関連遺伝子、フォリスタチンドメイン含有タ
ンパク質)、合成小分子インヒビター、GDF11発現を阻害するポリヌクレオチド(例えば、
アンチセンス、干渉RNA(RNAi)、並びに三重鎖形成分子及びリボザイム)などが含まれる。
他の実施態様において、GDF11アンタゴニストには、GDF11受容体(例えば、ActRIIB及びAc
tRIIA)に対する抗体も含まれる。ある具体的な実施態様において、GDF11のアンタゴニス
トは、GDF11受容体(例えば、ActRIIB及びActRIIA)に結合し、GDF11のその受容体への(例
えば、立体障害による)結合を妨げるが、他のリガンド(例えば、アクチビンA)の結合には
影響を及ぼさない(又はより低い程度にしか影響を及ぼさない)。
【００４０】
ある実施態様において、本明細書に提供される方法とともに使用されるGDF11アンタゴ
ニストは、ActRIIAポリペプチド及び/又はActRIIBポリペプチドではない。ある実施態様
において、本明細書に提供される方法とともに使用されるGDF11アンタゴニストは、ActRI
IAのインヒビター及び/又はActRIIBポリペプチドのインヒビターではない。ある実施態様
において、本明細書に提供される方法とともに使用されるGDF11アンタゴニストは、ActRI
IAのリガンド結合部分及び/又はActRIIBのリガンド結合部分を含まない。
【００４１】
ある実施態様において、GDF11アンタゴニストは、GDF11ポリペプチド配列、その断片又
は変異体に結合する。一実施態様において、GDF11アンタゴニストは、非哺乳動物(例えば
、ニワトリ、魚)のGDF11タンパク質に結合する。別の実施態様において、GDF11アンタゴ
ニストは、哺乳動物(例えば、ヒト、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ブタ、スナネズミ、
ハムスター、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ウサギ、ラクダ、カニクイザル、チンパンジー
、マーモセット、アカゲザル)のGDF11タンパク質に結合する。いくつかのGDF11分子が記
載されており、ホモログは当技術分野で周知である。また別の実施態様において、GDF11
アンタゴニストは、配列番号50又は配列番号52のポリペプチド配列を有するヒトGDF11タ
ンパク質に結合する。
【００４２】
他のTGF-βファミリーメンバーと同様、GDF11は、シグナル配列と、アミノ末端プロペ
プチドと、ジスルフィド結合断片からなるカルボキシ末端とから構成されるプレプロタン
パク質として合成される。該プロペプチドは、分子の残部からタンパク質分解的に切断さ
れ、生物活性のあるカルボキシ末端二量体を成熟した受容体結合形態として放出する。該
プロペプチドは、結合し、その活性を阻害する、成熟したGDF11二量体のインヒビターと
して機能する。プロセシングされていない全長の前駆タンパク質、すなわち、GDF11プレ
プロタンパク質は、配列番号48のアミノ酸配列を有することができ、該GDFプロペプチド
は、配列番号50のアミノ酸配列を有することができ、GDF11の成熟形態は、配列番号52の
アミノ酸配列を有する。
【００４３】
(5.3.1  抗GDF11抗体)
ある実施態様において、GDF11に対する抗体を、本明細書に提供される方法とともに使
用することができる。ある実施態様において、GDF11に対する抗体は、GDF11に免疫特異的
に結合する。特に、ある実施態様において、そのような抗GDF11抗体は、任意の他のタン
パク質に対してよりも高い結合親和性でGDF11に結合する。具体的な実施態様において、
抗GDF11抗体は、GDF8に対してよりも高い親和性でGDF11に結合する。具体的な実施態様に
おいて、抗GDF11抗体は、GDF8と交差反応しない。具体的な実施態様において、抗GDF11抗
体は、アクチビンAに対してよりも高い親和性でGDF11に結合する。具体的な実施態様にお
いて、抗GDF11抗体は、アクチビンAと交差反応しない。
【００４４】
GDF11を免疫原として使用することにより、抗タンパク質/抗ペプチド抗血清又はモノク
ローナル抗体を標準的なプロトコルによって作製することができる(例えば、抗体:実験マ
ニュアル(Antibodies: A Laboratory Manual)、Harlow及びLane編(Cold Spring Harbor P
ress: 1988)を参照されたい)。哺乳動物、例えば、マウス、ハムスター、又はウサギを、
GDF11の免疫原性形態、抗体応答を誘発することができる抗原性断片、又は融合タンパク
質で免疫することができる。タンパク質又はペプチドに免疫原性を付与する技術には、担
体へのコンジュゲーション又は当技術分野で周知の他の技術が含まれる。GDF11の免疫原
性部分は、アジュバントの存在下で投与することができる。免疫の進捗は、血漿又は血清
中の抗体力価の検出によりモニタリングすることができる。標準的なELISA又は他の免疫
アッセイを抗原としての免疫原とともに用いて、抗体のレベルを評価することができる。
【００４５】
動物をGDF11の抗原性調製物で免疫した後、抗血清を得ることができ、望ましい場合、
ポリクローナル抗体を血清から単離することができる。モノクローナル抗体を産生するた
めに、抗体産生細胞(リンパ球)を免疫動物から回収し、標準的な体細胞融合法によって骨
髄腫細胞などの不死化細胞と融合させて、ハイブリドーマ細胞を得ることができる。その
ような技術は当技術分野で周知であり、例えば、ハイブリドーマ技術(Kohler及びMilstei
n(1975) Nature, 256: 495-497により最初に開発されたもの)、ヒトB細胞ハイブリドーマ
技術(Kozbarらの文献(1983) Immunology Today, 4: 72)、及びヒトモノクローナル抗体を
産生するためのEBVハイブリドーマ技術(Coleらの文献(1985) モノクローナル抗体及び癌
療法(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy)、Alan R. Liss, Inc. pp. 77-96)を
含む。ハイブリドーマ細胞を、GDF11と特異的に反応する抗体の産生について免疫化学的
にスクリーニングし、モノクローナル抗体を、そのようなハイブリドーマ細胞を含む培養
物から単離することができる。
【００４６】
本明細書で使用される「抗体」という用語は、その断片を含むことが意図され、該断片
もまた、対象ポリペプチドと特異的に反応する。抗体を従来の技術を用いて断片化し、該
断片を、全抗体について上で記載されているのと同じ方法で、有用性についてスクリーニ
ングすることができる。例えば、F(ab)2断片は、抗体をペプシンで処理することにより作
製することができる。得られたF(ab)2断片を処理して、ジスルフィド架橋を還元し、Fab
断片を産生することができる。抗体は、抗体の少なくとも1つのCDR領域によって付与され
るActRII受容体又はアクチビンポリペプチドに対する親和性を有する二重特異性、単鎖、
キメラ、ヒト化、及び完全ヒト分子を含むことがさらに意図される。「抗体」という用語
は、Fab、Fab'、及びF(ab')断片も含む。
【００４７】
ある実施態様において、抗体は組換え抗体であり、この用語は、一部は分子生物学の技
術によって作製される任意の抗体を包含し、これには、CDR移植又はキメラ抗体、ライブ
ラリー選択抗体ドメインから組み立てられたヒト抗体又は他の抗体、単鎖抗体、並びに単
ドメイン抗体(例えば、ヒトVHタンパク質又はラクダ科VHHタンパク質)が含まれる。ある
実施態様において、抗体はモノクローナル抗体であることができる。各々のモノクローナ
ル抗体は、通常、単一のエピトープを認識するものであり、均一な、又は実質的に均一な
抗体の集団から得られる抗体である。「モノクローナル」という用語は、任意の特定の産
生方法によって限定されない。例えば、GDF11に特異的に結合するモノクローナル抗体を
作製する方法は、検出可能な免疫応答を刺激するのに有効な量の抗原ポリペプチドを含む
免疫原性組成物をマウスに投与し、該マウスから抗体産生細胞(例えば、脾臓由来の細胞)
を取得し、該抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させて、抗体産生ハイブリドーマを取得し
、該抗体産生ハイブリドーマを試験して、該抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体
を産生するハイブリドーマを同定することを含み得る。ひとたび取得されれば、ハイブリ
ドーマを、細胞培養物中で、及び任意に、ハイブリドーマ由来細胞が抗原に特異的に結合
するモノクローナル抗体を産生する培養条件で増殖させることができる。モノクローナル
抗体は、該細胞培養物から精製してもよい。
【００４８】
抗体に関して使用される「と特異的に反応する」という形容詞は、当技術分野で一般に
理解されているように、抗体が特定のタイプの生物学的試料中の関心対象の抗原の存在を
最小限検出するのに有用であるほど、抗体が関心対象の抗原(例えば、GDF11ポリペプチド
)と関心対象ではない他の抗原との間で十分に選択的であることを意味することが意図さ
れる。治療への応用などの、抗体を利用する特定の方法において、より高度の結合特異性
が望ましい場合がある。モノクローナル抗体は、通常、所望の抗原と交差反応性ポリペプ
チドとを効果的に識別する傾向が(ポリクローナル抗体と比較して)より高い。抗体:抗原
相互作用の特異性に影響を及ぼす1つの特徴は、抗原に対する抗体の親和性である。所望
の特異性は様々な異なる親和性を伴って達成され得るが、通常、抗体は、約10-6、10-7、
10-8、10-9、もしくは10-10、又はそれ未満の親和性(解離定数)を有する。
【００４９】
さらに、望ましい抗体を同定するために抗体をスクリーニングするために使用される技
術は、得られる抗体の特性に影響を及ぼし得る。例えば、抗体を溶液中の抗原に結合させ
るのに使用する場合、溶液結合を試験することが望ましい場合がある。抗体と抗原の相互
作用を試験して、特に望ましい抗体を同定するために、種々の異なる技術が利用可能であ
る。そのような技術としては、ELISA、表面プラズモン共鳴結合アッセイ(例えば、Biacor
e(商標)結合アッセイ、Biacore AB, Uppsala, Sweden)、サンドイッチアッセイ(例えば、
IGEN International社, Gaithersburg, Md.の常磁性ビーズシステム)、ウェスタンブロッ
ト、免疫沈降アッセイ、及び免疫組織化学が挙げられる。
【００５０】
一実施態様において、抗GDF11抗体は、高い親和性でGDF11に結合する。したがって、一
実施態様において、抗GDF11抗体は、約40nM、30nM、25nM、20nM、又は10nM以下のIC50を
有する。別の実施態様において、GDF11に特異的に結合する抗GDF11抗体は、GDF11に対す
る結合についてのインビトロアッセイ(例えば、BIACOREアッセイ又はELISAアッセイ)にお
いて、約5nM、4nM、3nM、又は1nM以下のIC50値を有する。一実施態様において、本方法で
使用される抗GDF11抗体は、GDF11に対する強い結合親和性(Kd)を有する。したがって、抗
GDF11抗体は、約4.2×10-9Mもしくは4.0×10-9M未満、約4.6×10-10M、4.0×10-10M、も
しくは2×10-10M未満、又は約8×10-11M、7×10-11M、5×10-12M、もしくは1.4×10-12M
未満のKdを有する。或いは、本明細書に記載の方法で使用される抗GDF抗体は、約4.2×10
-9Mもしくは4.0×10-9M以下、約4.6×10-10M、4.0×10-10M、もしくは2×10-10M以下、又
は約8×10-11M、7×10-11M、5×10-12M、もしくは1.4×10-12M以下のGDF11に対するKdを
有する。抗GDF11抗体のKdは、当技術分野で周知の方法(例えば、BIACORE(商標)システム
を使用するもの)により決定することができる。
【００５１】
別の実施態様において、抗GDF11抗体は、ミオスタチン/GDF8と比べて、GDF11に優先的
に結合する。したがって、一実施態様において、本明細書に記載の方法で使用される抗GD
F11抗体は、GDF-8と比較してGDF11を少なくとも1.5倍以上、少なくとも2倍以上、少なく
とも2.5倍以上、少なくとも3倍以上、少なくとも3.5倍以上、又は少なくとも4倍以上優先
してGDF11に結合する。別の実施態様において、抗GDF11抗体は、ミオスタチン/GDF8の活
性と比べて、GDF11活性を優先的に阻害する。抗GDF8/11抗体の例は、例えば、いくつかの
公開特許及び出願、例えば、米国特許第8,066,995号;第7,320,789号(マウスモノクローナ
ル抗体JA-16、ATCC寄託番号PTA-4236);米国特許第7,655,763号(例えば、ヒトモノクロー
ナル抗体Myo29(スタムルマブ)(ATCC寄託番号PTA-4741)、Myo22(ATCC寄託番号PTA-4740)、
Myo28(ATCC寄託番号PTA-4739));米国特許第7,261,893号、及び米国特許出願第2011029363
0号(特許出願第13/115,170号)に開示されている。本明細書に提供される方法とともに使
用することができるモノクローナル抗体の例としては、LifeSpan Biosciences社(Seattle
, WA)製のカタログ番号LS-C121127、LS-C138772、LS-C105098の抗体(入手可能); Santa C
ruz Biotechnology社(Santa Cruz, CA)から入手可能なカタログ番号(X-19)の抗体: sc-81
952;及びSigma-Aldrich Co. LLCから入手可能な製品番号: WH0010220M3の抗体が挙げられ
る。当業者は、ルーチンの技術を用いて、これらの抗体の抗原結合配列(例えば、CDR)を
使用し、本明細書に開示される貧血の治療用のヒト化抗体を作製することができる。
【００５２】
(5.3.2  ActRIIポリペプチドを含むGDF11アンタゴニスト)
ある実施態様において、GDF11アンタゴニストは、ActRII受容体、例えば、ActRIIA又は
ActRIIB、例えば、ヒトActRIIA又はActRIIBの細胞外ドメインの一部を含む。より具体的
には、そのようなGDF11アンタゴニストは、ActRII、例えば、ActRIIA又はActRIIBのGDF11
結合ドメインを含むポリペプチドであることができる。理論によって束縛されるものでは
ないが、そのようなGDF11結合ドメインを含むポリペプチドは、GDF11を捕捉し、それによ
り、GDF11シグナル伝達を妨げる。これらのGDF11結合ドメインを含むポリペプチドは、Ac
tRII受容体の細胞外ドメインの全て又は一部(すなわち、ActRIIAの細胞外ドメインの全て
もしくは一部又はActRIIBの細胞外ドメインの全てもしくは一部)を含み得る。具体的な実
施態様において、ActRII受容体の細胞外ドメインは、可溶性である。
【００５３】
ある実施態様において、ActRII受容体のGDF11結合性細胞外ドメインが任意の他のTGFβ
に対してよりも高い親和性でGDF11に結合するように、ActRII受容体のGDF11結合性細胞外
ドメインを野生型受容体と比べて突然変異させる。特に、ActRII受容体のGDF11結合性細
胞外ドメインをがアクチビンAに対してよりも高い親和性でGDF11に結合するように、ActR
II受容体のGDF11結合性細胞外ドメインを野生型受容体と比べて突然変異させる。そのよ
うなより高い親和性は、次に高い親和性リガンドに対する親和性よりも少なくとも10％、
25％、50％、75％、100％、250％、500％、又は1000％高いものであることができる。
【００５４】
ある実施態様において、GDF11結合ドメインを含むポリペプチドは、抗体のFc部分に連
結される(すなわち、ActRII受容体のアクチビン結合ドメインを含むポリペプチドと抗体
のFc部分とを含むコンジュゲートが作製される)。理論によって束縛されるものではない
が、抗体部分は、コンジュゲートに増大した安定性を付与し、及び/又はGDF11アンタゴニ
ストに対する患者の免疫応答を低下させる。ある実施態様において、GDF11結合ドメイン
は、リンカー、例えば、ペプチドリンカーを介して、抗体のFc部分に連結される。
【００５５】
そのようなActRIIポリペプチドGDF11アンタゴニストの例は、いくつかの公開特許/出願
に開示されている。例えば、米国特許第7,709,605号;米国特許第8,252,900号;米国特許第
7,960,343号;米国特許第7,988,973号に開示されているActRIIAポリペプチドインヒビター
。いくつかのTGF-βリガンドに結合するActRIIBポリペプチドインヒビターの例は、当技
術分野で公知であり、例えば、米国特許第8,138,143号、米国特許第8,058,229号、及び米
国特許第7,947,646号に開示されている。GDF8及びGDF11に特異的に結合するActRIIBポリ
ペプチドインヒビターの例は、米国特許第7,842,663号に開示されている。GDF11に特異的
に結合するActRIIBアンタゴニストの例は、米国特許第8,216,997号に開示されている。臨
床的ActRIIトラップとしては、AMG-745、ACE-031、及びACE-011が挙げられる。
【００５６】
((a)ActRIIA)
本明細書で使用されるように、「ActRIIA」という用語は、任意の種由来のアクチビン
受容体IIa型(ActRIIA)タンパク質のファミリー及び突然変異生成又は他の修飾によってそ
のようなActRIIAタンパク質から得られた変異体を指す。本明細書中でのActRIIAに対する
言及は、現在同定されている形態のいずれか1つに対する言及であると理解される。ActRI
IAファミリーのメンバーは、一般に、システインに富む領域を含むリガンド結合細胞外ド
メイン、膜貫通ドメイン、及び予想上のセリン/トレオニンキナーゼ活性を有する細胞質
ドメインから構成される、膜貫通タンパク質である。
【００５７】
「ActRIIAポリペプチド」という用語には、ActRIIAファミリーメンバーの任意の天然の
ポリペプチド並びに有用な活性を保持するその任意の変異体(突然変異体、断片、融合体
、及びペプチド模倣形態を含む)を含むポリペプチドが含まれる。例えば、ActRIIAポリペ
プチドには、ActRIIAポリペプチドの配列と少なくとも約80％同一な、及び任意に、少な
くとも85％、90％、95％、97％、98％、99％、又はそれを上回って同一な配列を有する任
意の公知のActRIIAの配列に由来するポリペプチドが含まれる。ActRIIAポリペプチドの例
としては、ヒトActRIIA前駆ポリペプチド(配列番号1)並びに可溶性ヒトActRIIAポリペプ
チド(例えば、配列番号2、3、7、及び12)が挙げられる。そのアミノ酸配列が配列番号1に
示されているActRIIA前駆ポリペプチドに関して、ヒトActRIIA前駆ポリペプチドのシグナ
ルペプチドは、アミノ酸位置1〜20に位置し;細胞外ドメインは、アミノ酸位置21〜135に
位置し、ヒトActRIIA前駆ポリペプチド(配列番号1)のN結合型グリコシル化部位は、配列
番号1のアミノ酸位置43〜56に位置する。配列番号1のヒトActRIIB前駆ポリペプチドをコ
ードする核酸配列は、配列番号4(GenbankエントリーNM_001616のヌクレオチド164〜1705)
として開示されている。配列番号2の可溶性ヒトActRIIAポリペプチドをコードする核酸配
列は、配列番号5として開示されている。配列の説明については、表1を参照されたい。
【００５８】
具体的な実施態様において、本明細書に記載の組成物及び方法で使用されるActRIIAポ
リペプチドは、可溶性ActRIIAポリペプチドである。本明細書で使用される場合、「可溶
性ActRIIAポリペプチド」という用語は、通常、ActRIIAタンパク質の任意の天然の細胞外
ドメインを含む、ActRIIAタンパク質の細胞外ドメインを含むポリペプチド並びにその任
意の変異体(突然変異体、断片、及びペプチド模倣形態を含む)を指す。本明細書に提供さ
れる方法とともに使用される可溶性ActRIIAポリペプチドは、アクチビンAに対してよりも
高い親和性でGDF11に結合する。ある実施態様において、本明細書に提供される方法とと
もに使用される可溶性ActRIIAポリペプチドは、TGF-βスーパーファミリーの任意の他の
メンバーに対してよりも高い親和性でGDF11に結合する。天然又は改変ActRIIAタンパク質
を第二のGDF11選択的結合剤とカップリングさせることにより、該タンパク質に、GDF11に
対する特異性の付加を与えることができる。
【００５９】
具体的な実施態様において、本明細書に提供される方法とともに使用されるActRIIAポ
リペプチドは、配列番号2、3、6、7、12、及び13のアミノ酸配列を有するポリペプチドで
はなく、これらのアミノ酸配列のどれか1つと少なくとも80％、85％、90％、95％、96％
、97％、98％、又は99％同一である。
【００６０】
ActRIIAポリペプチドの合成のために、以下のリーダー配列:ミツバチメリチンリーダー
配列(配列番号8)、組織プラスミノーゲン活性化因子(TPA)リーダー(配列番号9)、又は天
然のActRIIAリーダー(配列番号10)を使用することができる。
【００６１】
ある実施態様において、本明細書に記載の組成物及び方法で使用されるGDF11アンタゴ
ニストは、抗体のFc部分に連結されたActRIIAのGDF11結合ドメインを含むコンジュゲート
/融合タンパク質を含む。ある実施態様において、該アクチビン結合ドメインは、リンカ
ー、例えば、ペプチドリンカーを介して、抗体のFc部分に連結される。任意に、Fcドメイ
ンは、Asp-265、リジン322、及びAsn-434などの残基に1以上の突然変異を有する。ある場
合には、これらの突然変異のうちの1つ又は複数(例えば、Asp-265突然変異)を有する突然
変異体Fcドメインは、野生型Fcドメインと比べてFcγ受容体に結合する能力が低下してい
る。他の場合には、これらの突然変異のうちの1つ又は複数(例えば、Asn-434突然変異)を
有する突然変異体Fcドメインは、野生型Fcドメイン比べてMHCクラスI関連Fc受容体(FcRN)
に結合する能力が増大している。
【００６２】
ある実施態様において、本明細書に記載の組成物及び方法で使用されるActRIIAのGDF11
結合ドメインは、ActRIIAの細胞外ドメインの切断形態を含む。切断は、ActRIIAポリペプ
チドのカルボキシ末端及び/又はアミノ末端にあることができる。ある実施態様において
、切断は、成熟したActRIIBポリペプチドの細胞外ドメインと比べて、1、2、3、4、5、6
、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、又は25ア
ミノ酸長いものであることができる。ある実施態様において、切断は、成熟したActRIIA
ポリペプチドの細胞外ドメインの1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15
、16、17、18、19、20、21、22、23、24、又は25個のN末端アミノ酸であることができる
。ある実施態様において、切断は、成熟したActRIIAポリペプチドの細胞外ドメインの1、
2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、
24、又は25個のC末端アミノ酸であることができる。例えば、ActRIIAの切断形態としては
、アミノ酸20〜119; 20〜128; 20〜129; 20〜130; 20〜131; 20〜132; 20〜133; 20〜134
; 20〜131; 21〜131; 22〜131; 23〜131; 24〜131;及び25〜131を有するポリペプチドが
挙げられ、ここで、該アミノ酸位置は、配列番号1におけるアミノ酸位置を指す。
【００６３】
ある実施態様において、本明細書に記載の組成物及び方法で使用されるActRIIAのGDF11
結合ドメインは、1以上のアミノ酸置換、付加、及び/又は欠失を有するActRIIAの細胞外
ドメインを含む。ある実施態様において、本明細書に記載の組成物及び方法で使用される
ActRIIAのインヒビターは、アミノ酸置換も保有するActRIIA細胞外ドメインの切断形態を
含む。
【００６４】
具体的な実施態様において、本明細書に記載の組成物及び方法で使用されるGDF11イン
ヒビターは、ヒトActRIIA受容体の細胞外ドメインとIgG1のFc部分の融合タンパク質であ
る。別の具体的な実施態様において、本明細書に記載の組成物及び方法で使用されるGDF1
1インヒビターは、ヒトActRIIA受容体の切断された細胞外ドメインとIgG1のFc部分の融合
タンパク質である。別の具体的な実施態様において、本明細書に記載の組成物及び方法で
使用されるGDF11インヒビターは、ヒトActRIIA受容体の切断された細胞外ドメインとIgG1
のFc部分の融合タンパク質であり、ここで、該ヒトActRIIA受容体の切断された細胞外ド
メインは、1以上のアミノ酸置換を保有する。
【００６５】
ActRIIAポリペプチドの機能的に活性のある断片は、例えば、ActRIIAポリペプチドをコ
ードする核酸の対応する断片から組換え産生されたポリペプチドをスクリーニングするこ
とにより得ることができる。さらに、断片を、従来のメリフィールド固相f-Moc又はt-Boc
化学などの当技術分野で公知の技術を用いて化学合成することができる。該断片を(組換
えによるか又は化学合成によって)産生し、試験して、ActRIIAタンパク質又はアクチビン
によって媒介されるシグナル伝達のアンタゴニスト(インヒビター)として機能し得るペプ
チジル断片を同定することができる。
【００６６】
さらに、ActRIIAポリペプチドの機能的に活性のある変異体は、ActRIIAポリペプチドを
コードする対応する突然変異核酸から組換え産生された修飾ポリペプチドのライブラリー
をスクリーニングすることにより得ることができる。該変異体を産生し、試験して、GDF1
1シグナル伝達又はActRIIAに対する結合のアンタゴニスト(インヒビター)として機能し得
るものを同定することができる。ある実施態様において、ActRIIAポリペプチドの機能的
変異体(すなわち、GDF11結合活性を有するもの)は、配列番号2又は3から選択されるアミ
ノ酸配列と少なくとも75％同一であるアミノ酸配列を含む。ある場合には、該機能的変異
体は、配列番号2又は3から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80％、85％、90％、95％
、97％、98％、99％、又は100％同一なアミノ酸配列を有する。
【００６７】
潜在的ホモログのライブラリーを縮重オリゴヌクレオチド配列から作製することができ
る多くの方法がある。縮重遺伝子配列の化学合成を自動DNA合成装置で実行することがで
き、その後、合成遺伝子を発現用の適当なベクターに連結することができる。縮重オリゴ
ヌクレオチドの合成は、当技術分野で周知である(例えば、Narang, S Aの文献(1983) Tet
rahedron 39:3; Itakuraらの文献(1981) Recombinant DNA, Proc. 3rd Cleveland Sympos
. Macromolecules, AG Walton, Amsterdam編: Elsevier pp 273-289; Itakuraらの文献(1
984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakuraらの文献(1984) Science 198:1056; Ikeらの
文献(1983) Nucleic Acid Res. 11:477を参照されたい)。そのような技術は、他のタンパ
ク質の定方向進化において利用されている(例えば、Scottらの文献(1990) Science 249:3
86-390; Robertsらの文献(1992) PNAS USA 89:2429-2433; Devlinらの文献(1990) Scienc
e 249: 404-406; Cwirlaらの文献(1990) PNAS USA 87: 6378-6382;並びに米国特許第5,22
3,409号、第5,198,346号、及び第5,096,815号を参照されたい)。
【００６８】
或いは、他の形態の突然変異生成を用いて、コンビナトリアルライブラリーを作製する
ことができる。例えば、ActRIIAポリペプチド変異体を、例えば、アラニンスキャニング
突然変異生成などを用いるスクリーニングによって(Rufらの文献(1994) Biochemistry 33
:1565-1572; Wangらの文献(1994) J. Biol. Chem. 269:3095-3099; Balintらの文献(1993
) Gene 137:109-118; Grodbergらの文献(1993) Eur. J. Biochem. 218:597-601; Nagashi
maらの文献(1993) J. Biol. Chem. 268:2888-2892; Lowmanらの文献(1991) Biochemistry
30:10832-10838;及びCunninghamらの文献(1989) Science 244:1081-1085)、リンカース
キャニング突然変異生成によって(Gustinらの文献(1993) Virology 193:653-660; Brown
らの文献(1992) Mol. Cell Biol. 12:2644-2652; McKnightらの文献(1982) Science 232:
316);飽和突然変異生成によって(Meyersらの文献(1986)Science 232:613); PCR突然変異
生成によって(Leungらの文献(1989) Method Cell Mol Biol 1:11-19);又は化学的突然変
異生成などを含むランダム突然変異生成によって(Millerらの文献(1992) 細菌遺伝学の短
期講座(A Short Course in Bacterial Genetics)、CSHL Press, Cold Spring Harbor, N.
Y.;及びGreenerらの文献(1994) Strategies in Mol Biol 7:32-34)、ライブラリーから作
製し、単離することができる。特にコンビナトリアル設定でのリンカースキャニング突然
変異生成は、ActRIIAポリペプチドの切断(生物活性)形態を同定する魅力的な方法である
。
【００６９】
点突然変異及び切断によって作製されたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物を
スクリーニングするための、さらに言うなら、特定の性質を有する遺伝子産物のcDNAライ
ブラリーをスクリーニングするための、広範な技術が当技術分野で公知である。そのよう
な技術は、一般に、ActRIIAポリペプチドのコンビナトリアル突然変異生成によって作製
される遺伝子ライブラリーの迅速スクリーニングに適用可能である。大きな遺伝子ライブ
ラリーのスクリーニングに最も広く使用されている技術は、通常、遺伝子ライブラリーを
複製可能な発現ベクターにクローニングすること、適当な細胞を得られたベクターのライ
ブラリーで形質転換すること、及びコンビナトリアル遺伝子を、所望の活性の検出によっ
て、その産物が検出された遺伝子をコードするベクターの比較的簡単な単離が容易になる
条件下で発現させることを含む。好ましいアッセイとしては、GDF11結合アッセイ及びア
クチビン媒介性細胞シグナル伝達アッセイが挙げられる。
【００７０】
ある態様において、ActRIIAポリペプチドの機能的変異体又は修飾形態には、ActRIIAポ
リペプチドの少なくとも一部及び1以上の融合ドメインを有する融合タンパク質が含まれ
る。そのような融合ドメインのよく知られた例としては、ポリヒスチジン、Glu-Glu、グ
ルタチオンSトランスフェラーゼ(GST)、チオレドキシン、プロテインA、プロテインG、免
疫グロブリン重鎖定常領域(Fc)、マルトース結合タンパク質(MBP)、又はヒト血清アルブ
ミンが挙げられるが、これらに限定されない。融合ドメインを、所望の特性を付与するよ
うに選択することができる。例えば、いくつかの融合ドメインは、親和性クロマトグラフ
ィーによる融合タンパク質の単離に特に有用である。親和性精製の目的で、親和性クロマ
トグラフィー用の関連するマトリックス、例えば、グルタチオン、アミラーゼ、及びニッ
ケル又はコバルトコンジュゲート樹脂が使用される。そのようなマトリックスの多くは、
「キット」形態で入手可能であり、これには、例えば、(HIS6)融合パートナーと合わせて
有用な、Pharmacia GST精製システム及びQIAexpress(商標)システム(Qiagen)がある。別
の例として、融合ドメインを、ActRIIAポリペプチドの検出を容易にするように選択する
ことができる。そのような検出ドメインの例としては、様々な蛍光タンパク質(例えば、G
FP)及び通常、特異的抗体が利用可能な短いペプチド配列である「エピトープタグ」が挙
げられる。特異的モノクローナル抗体がすぐに利用可能である周知のエピトープタグとし
ては、FLAG、インフルエンザウイルスヘマグルチニン(HA)、及びc-mycタグが挙げられる
。場合により、融合ドメインは、例えば、第Xa因子又はトロンビン用のプロテアーゼ切断
部位を有し、該部位は、関連するプロテアーゼが融合タンパク質を部分消化し、それによ
り、組換えタンパク質をそれから遊離させることを可能にする。その後、遊離したタンパ
ク質を、後続のクロマトグラフィー分離によって融合ドメインから単離することができる
。ある実施態様において、ActRIIAポリペプチドを、インビボでActRIIAポリペプチドを安
定化するドメイン(「スタビライザー」ドメイン)と融合させる。「安定化する」とは、血
清半減期を延長する全てのことを意味し、これは、破壊の減少によるものか、腎臓による
クリアランスの減少によるものか、又は他の薬物動態作用によるものかを問わない。免疫
グロブリンのFc部分との融合は、広範なタンパク質に望ましい薬物動態特性を付与するこ
とが知られている。同様に、ヒト血清アルブミンへの融合は、望ましい特性を付与するこ
とができる。選択され得る他のタイプの融合ドメインとしては、多量体化(例えば、二量
体化、四量体化)ドメイン及び(望ましい場合、追加の生物学的機能、例えば、骨成長又は
筋肉成長のさらなる刺激を付与する)機能ドメインが挙げられる。
【００７１】
融合タンパク質の様々なエレメントを、所望の機能と一致する任意の方法で配置し得る
ことが理解される。例えば、ActRIIAポリペプチドを異種ドメインのC末端に配置すること
ができ、又はその代わりに、異種ドメインをActRIIAポリペプチドのC末端に配置すること
ができる。ActRIIAポリペプチドドメイン及び異種ドメインは、融合タンパク質中で隣接
している必要がなく、追加のドメイン又はアミノ酸配列を、どちらかのドメインのC末端
もしくはN末端、又はこれらのドメインの間に含めることができる。
【００７２】
ある実施態様において、本明細書に記載の方法及び組成物で使用されるActRIIAポリペ
プチドは、ActRIIAポリペプチドを安定化することができる1以上の修飾を含む。例えば、
そのような修飾は、ActRIIAポリペプチドのインビトロ半減期を向上させるか、ActRIIAポ
リペプチドの循環半減期を向上させるか、又はActRIIAポリペプチドのタンパク質分解を
低下させる。そのような安定化修飾としては、融合タンパク質(例えば、ActRIIAポリペプ
チド及びスタビライザードメインを含む融合タンパク質を含む)、グリコシル化部位の修
飾(例えば、ActRIIAポリペプチドへのグリコシル化部位の付加を含む)、並びに炭水化物
部分の修飾(例えば、ActRIIAポリペプチドからの炭水化物部分の除去を含む)が挙げられ
るが、これらに限定されない。融合タンパク質の場合、ActRIIAポリペプチドを、スタビ
ライザードメイン、例えば、IgG分子(例えば、Fcドメイン)に融合させる。本明細書で使
用されるように、「スタビライザードメイン」という用語は、融合タンパク質の場合に見
られる融合ドメイン(例えば、Fc)を指すだけでなく、炭水化物部分などの非タンパク質性
修飾、又はポリエチレングリコールなどの非タンパク質性ポリマーも含む。
【００７３】
ある実施態様において、他のタンパク質から単離されているか、又は別の方法で他のタ
ンパク質を実質的に含まない、単離及び/又は精製された形態のActRIIAポリペプチドを、
本明細書に記載の方法及び組成物とともに使用することができる。ActRIIAポリペプチド
は、通常、組換え核酸からの発現によって産生される。
【００７４】
ある態様において、単離された及び/又は組換え核酸を用いて、本明細書に開示される
方法及び組成物で使用される断片、機能的変異体、及び融合タンパク質を含む、ActRIIA
ポリペプチドのいずれか(例えば、可溶性ActRIIAポリペプチド)を作製することができる
。
【００７５】
いくつかの哺乳動物発現ベクターは、細菌におけるベクターの増殖を促進する原核生物
配列と、真核細胞で発現される1以上の真核生物転写ユニットの両方を含む。pcDNAI/amp
、pcDNAI/neo、pRc/CMV、pSV2gpt、pSV2neo、pSV2-dhfr、pTk2、pRSVneo、pMSG、pSVT7、
pko-neo 及びpHyg由来ベクターは、真核細胞のトランスフェクションに好適な哺乳動物発
現ベクターの例である。これらのベクターのうちのいくつかは、原核細胞と真核細胞の両
方における複製及び薬物耐性選択を容易にするために、pBR322などの細菌プラスミド由来
の配列で修飾されている。或いは、ウシパピローマウイルス(BPV-1)、又はエプスタイン-
バーウイルス(pHEBo、pREP由来、及びp205)などのウイルスの派生物を、真核細胞におけ
るタンパク質の一過性発現に使用することができる。(レトロウイルスを含む)他のウイル
ス発現系の例は、以下の遺伝子療法送達系の記載において見出すことができる。プラスミ
ドの増殖及び宿主生物の形質転換に利用される様々な方法は、当技術分野で周知である。
原核細胞と真核細胞の両方に関する他の好適な発現系、及び一般的な組換え手順について
は、分子クローニング  実験マニュアル(Molecular Cloning A Laboratory Manual)、第3
版、Sambrook、Fritsch、及びManiatis編(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001)
を参照されたい。いくつかの例において、バキュロウイルス発現系の使用によって組換え
ポリペプチドを発現させることが望ましい場合がある。そのようなバキュロウイルス発現
系の例としては、pVL由来ベクター(例えば、pVL1392、pVL1393、及びpVL941)、pAcUW由来
ベクター(例えば、pAcUW1)、並びにpBlueBac由来ベクター(例えば、β-gal含有pBlueBac 
III)が挙げられる。
【００７６】
Pcmv-Scriptベクター(Stratagene, La Jolla, Calif.)、pcDNA4ベクター(Invitrogen, 
Carlsbad, Calif.)、及びpCI-neoベクター(Promega, Madison, Wis.)などのベクターを、
CHO細胞内での対象ActRIIAポリペプチドの産生用に設計することができる。明らかになる
ように、対象遺伝子コンストラクトを用いて、例えば、精製用の、融合タンパク質又は変
異体タンパク質を含む、タンパク質を産生するために、培養で増殖した細胞内での対象Ac
tRIIAポリペプチドの発現を生じさせることができる。
【００７７】
したがって、本明細書に提供されるのは、ActRIIAポリペプチドを産生する方法である
。例えば、ActRIIAポリペプチドをコードする発現ベクターでトランスフェクトされた宿
主細胞を、ActRIIAポリペプチドの発現が生じるのを可能にする適当な条件下で培養する
ことができる。ActRIIAポリペプチドを分泌させ、細胞とActRIIAポリペプチドを含む培地
の混合物から単離することができる。或いは、ActRIIAポリペプチドを細胞質内又は膜画
分に保持し、細胞を回収し、溶解させ、タンパク質を単離することができる。細胞培養物
には、宿主細胞、培地、及び他の副産物が含まれる。細胞培養用の好適な培地は、当技術
分野で周知である。対象ActRIIAポリペプチドは、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル
濾過クロマトグラフィー、限外濾過、電気泳動、ActRIIAポリペプチドの特定のエピトー
プに特異的な抗体による免疫親和性精製、及びActRIIAポリペプチドに融合したドメイン
に結合する物質による親和性精製(例えば、プロテインAカラムを用いて、ActRIIA-Fc融合
体を精製することができる)を含む、タンパク質を精製するための当技術分野で公知の技
術を用いて、細胞培養培地、宿主細胞、又はその両方から単離することができる。一実施
態様において、ActRIIAポリペプチドは、その精製を容易にするドメインを含む融合タン
パク質である。一実施態様において、精製は、例えば、以下のもの:プロテインAクロマト
グラフィー、Qセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフ
ィー、サイズ排除クロマトグラフィー、及び陽イオン交換クロマトグラフィーのうちの3
つ以上を、任意の順序で含む、一連のカラムクロマトグラフィー工程により達成される。
精製は、ウイルス濾過及びバッファー交換で終了させることができる。本明細書で実証さ
れるように、ActRIIA-hFcタンパク質は、サイズ排除クロマトグラフィーにより決定して9
8％を超える純度、SDS PAGEにより決定して95％を超える純度に精製された。この精製レ
ベルは、マウスの骨に対する望ましい効果並びにマウス、ラット、及び非ヒト霊長類にお
ける許容し得る安全性プロファイルを達成するのに十分であった。
【００７８】
別の実施態様において、組換えActRIIAポリペプチドの所望の部分のN末端におけるポリ
-(His)/エンテロキナーゼ切断部位配列などの精製リーダー配列をコードする融合遺伝子
は、Ni2+金属樹脂を用いる親和性クロマトグラフィーによる発現された融合タンパク質の
精製を可能にすることができる。次いで、精製リーダー配列をエンテロキナーゼによる処
理によって後から除去し、精製ActRIIAポリペプチドを提供することができる(例えば、Ho
chuliらの文献(1987) J. Chromatography 411:177;及びJanknechtらの文献、PNAS USA 88
:8972を参照されたい)。
【００７９】
融合遺伝子を作製する技術は周知である。本質的に、異なるポリペプチド配列をコード
する様々なDNA断片の接続は、ライゲーションのための平滑末端又は互い違い末端、適切
な末端を提供するための制限酵素消化、必要な場合の付着末端の充填(filling-in)、望ま
しくない接続を避けるためのアルカリホスファターゼ処理、及び酵素的ライゲーションを
利用する従来の技術に従って実施される。別の実施態様において、融合遺伝子は、自動化
DNA合成装置を含む従来の技術によって合成することができる。或いは、後からアニーリ
ングさせてキメラ遺伝子配列を生成させることができる2つの連続する遺伝子断片間の相
補的突出を生じさせるアンカープライマーを用いて、遺伝子断片のPCR増幅を実施するこ
とができる(例えば、分子生物学の最新プロトコル(Current Protocols in Molecular Bio
logy)、Ausubelら編、John Wiley & Sons: 1992を参照されたい)。
【００８０】
ActRIIA-Fc融合タンパク質は、安定にトランスフェクトされたCHO-DUKX Bl 1細胞で、
配列番号9の組織プラスミノーゲンリーダー配列を用いて、pAID4ベクター(SV40 ori/エン
ハンサー、CMVプロモーター)から発現させることができる。Fc部分は、配列番号7に示さ
れるヒトIgGl Fc配列である。ある実施態様において、発現させたとき、含まれるタンパ
ク質は、ActRIIA-Fc融合タンパク質1分子当たり、平均で約1.5〜2.5モルのシアル酸を有
する。
【００８１】
ある実施態様において、ActRIIA-Fc融合体の長い血清半減期は、ヒト患者で25〜32日で
あることができる。さらに、CHO細胞で発現される物質は、ヒト293細胞で発現されるActR
IIA-hFc融合タンパク質について報告されたものよりも高いアクチビンBリガンドに対する
親和性を有することができる(del Reらの文献、J Biol Chem. 2004 Dec 17;279(51):5312
6-35)。さらに、理論によって束縛されるものではないが、TPAリーダー配列の使用は、他
のリーダー配列よりも大きな産生をもたらし、天然のリーダーで発現されるActRIIA-Fcと
は異なり、極めて純粋なN末端配列を提供することができる。天然のリーダー配列の使用
は、各々異なるN末端配列を有する2つの主要な種のActRIIA-Fcを生じさせることができる
。
【００８２】
((b)ActRIIB)
本明細書で使用されるように、「ActRIIB」という用語は、任意の種由来のアクチビン
受容体IIb型(ActRIIB)タンパク質のファミリー及び突然変異生成又は他の修飾によってそ
のようなActRIIBタンパク質から得られた変異体を指す。本明細書中でのActRIIBに対する
言及は、現在同定されている形態のいずれか1つに対する言及であると理解される。ActRI
IBファミリーのメンバーは、一般に、システインに富む領域を含むリガンド結合細胞外ド
メイン、膜貫通ドメイン、及び予想上のセリン/トレオニンキナーゼ活性を有する細胞質
ドメインから構成される、膜貫通タンパク質である。
【００８３】
「ActRIIBポリペプチド」という用語は、ActRIIBファミリーメンバーの任意の天然のポ
リペプチド並びに有用な活性を保持するその任意の変異体(突然変異体、断片、融合体、
及びペプチド模倣形態を含む)を含むポリペプチドを含む。例えば、ActRIIBポリペプチド
には、ActRIIBポリペプチドの配列と少なくとも約80％同一な、及び任意に、少なくとも8
5％、90％、95％、97％、98％、99％、又はそれを上回って同一な配列を有する任意の公
知のActRIIBの配列に由来するポリペプチドが含まれる。ActRIIBポリペプチドの例として
は、ヒトActRIIB前駆ポリペプチド(配列番号16又は28)及び可溶性ヒトActRIIBポリペプチ
ドが挙げられる。本明細書に記載の全てのActRIIB関連ポリペプチドに関するアミノ酸の
付番は、配列番号16又は配列番号28のアミノ酸付番に基づく。そのアミノ酸配列が配列番
号16及び28に示されているActRIIB前駆ポリペプチドに関して、ヒトActRIIB前駆ポリペプ
チドのシグナルペプチドは、アミノ酸位置1〜18に位置し;細胞外ドメインは、アミノ酸位
置19〜134に位置し、ヒトActRIIB前駆ポリペプチドのN結合型グリコシル化部位は、アミ
ノ酸位置42及び65に位置する。配列番号16のヒトActRIIB前駆ポリペプチドの核酸配列は
、配列番号19として開示されている。配列の説明については、表1を参照されたい。
【００８４】
具体的な実施態様において、本明細書に記載の組成物及び方法で使用されるActRIIBポ
リペプチドは、可溶性ActRIIBポリペプチドである。「可溶性ActRIIBポリペプチド」とい
う用語は、通常、ActRIIBタンパク質の任意の天然の細胞外ドメインを含む、ActRIIBタン
パク質の細胞外ドメインを含むポリペプチド並びにその任意の変異体(突然変異体、断片
、及びペプチド模倣形態を含む)を指す。本明細書に提供される方法とともに使用される
可溶性ActRIIBポリペプチドは、アクチビンAに対してよりも高い親和性でGDF11に結合す
る。ある実施態様において、本明細書に提供される方法とともに使用される可溶性ActRII
Bポリペプチドは、TGF-βスーパーファミリーの任意の他のメンバーに対してよりも高い
親和性でGDF11に結合する。天然又は改変ActRIIBタンパク質を第二のGDF11選択的結合剤
とカップリングさせることにより、該タンパク質に、GDF11に対する特異性の付加を与え
ることができる。
【００８５】
具体的な実施態様において、本明細書に提供される方法とともに使用されるActRIIBポ
リペプチドは、配列番号17、18、23〜26、27、29、30、31、32、33、36、37、42、及び43
のアミノ酸配列を有するポリペプチドではなく、これらのアミノ酸配列のどれか1つと少
なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、又は99％同一である。ActRIIBポ
リペプチドを修飾する方法は、例えば、米国出願公開第2009/0005308号及び第2010/00682
15号、並びに国際特許出願公開WO 2006/012627号及びWO 2010/019261号に記載されている
(これらの参考文献の開示は、完全に本明細書に組み込まれる)。
【００８６】
ある実施態様において、本明細書に提供される方法とともに使用されるActRIIBポリペ
プチドは、ActRIIB前駆体アミノ酸配列の位置64にアルギニンを有する。
【００８７】
ActRIIBの細胞外ドメインのC末端におけるプロリンノットの欠失は、アクチビンに対す
る受容体の親和性を低下させることが示されている(例えば、Attisanoらの文献、Cell, 1
992, 68(1):97-108を参照されたい)。配列番号28のアミノ酸20〜119を含むActRIIB-Fc融
合タンパク質(すなわち、配列番号32)の「ActRIIB(20-119)-Fc」は、プロリンノット領域
及び完全な膜近傍領域を含む、配列番号28のアミノ酸20〜134を含むActRIIB-Fc融合タン
パク質(すなわち、配列番号31)の「ActRIIB(20-134)-Fc」と比べて、GDF-11及びアクチビ
ンに対する結合が低下している。しかしながら、配列番号28のアミノ酸20〜129を含むAct
RIIB-Fc融合タンパク質の「ActRIIB(20-129)-Fc」は、プロリンノット領域が破壊されて
いるにもかかわらず、ActRIIBの非切断型細胞外ドメインと比べて、同様の、しかし、若
干低下した活性を保持している。したがって、配列番号28(又は配列番号16)のアミノ酸13
4、133、132、131、130、及び129で終結する細胞外ドメインを含むActRIIBポリペプチド
は全て活性を有すると考えられるが、アミノ酸134又は133で終結するコンストラクトが最
も高い活性を有し得る。同様に、配列番号28のP129及びP130の突然変異がリガンド結合を
それほど減少させないという事実によって示されるように、残基129〜134のいずれかでの
突然変異は、リガンド結合親和性を大幅に変化させるとは考えられない。したがって、本
明細書に記載の方法及び組成物に従って使用されるActRIIBポリペプチドは、配列番号28(
又は配列番号16)のアミノ酸109(すなわち、最後のシステイン)で早くも終わり得るが、配
列番号28(又は配列番号16)のアミノ酸位置109と119又はその間で終わる形態は、低下した
リガンド結合能を有すると考えられる。
【００８８】
ある実施態様において、配列番号16及び配列番号28のアミノ酸29は、ActRIIB前駆体配
列中の最初のシステインに相当する。配列番号16もしくは配列番号28のN末端のアミノ酸2
9、又はこれらのアミノ酸位置の前から始まるActRIIBポリペプチドは、リガンド結合活性
を保持していると考えられる。配列番号16又は配列番号28の位置24におけるアラニンから
アスパラギンへの突然変異は、リガンド結合にそれほど影響を及ぼすことなく、N結合型
グリコシル化配列を導入する。これは、配列番号16又は配列番号28のアミノ酸20〜29に対
応するシグナル切断ペプチドとシステイン架橋領域の間の領域中の突然変異が良好に許容
されることを裏付けるものである。特に、配列番号16又は配列番号28のアミノ酸位置20、
21、22、23、及び24から始まるActRIIBポリペプチドは活性を保持しており、配列番号16
又は配列番号28のアミノ酸位置25、26、27、28、及び29から始まるActRIIBポリペプチド
も活性を保持すると考えられる。配列番号16又は配列番号28のアミノ酸位置22、23、24、
又は25から始まるActRIIBポリペプチドは最も大きい活性を有する。
【００８９】
ある実施態様において、本明細書に記載の方法及び組成物に従って使用されるActRIIB
前駆タンパク質(すなわち、配列番号16又は配列番号28)の活性部分(すなわち、ActRIIBポ
リペプチド)は、通常、配列番号16又は配列番号28のアミノ酸29〜109を含み、そのような
ActRIIBポリペプチドは、例えば、配列番号16又は配列番号28のアミノ酸19〜29のいずれ
か1つに対応する残基から始まり、配列番号16又は配列番号28のアミノ酸109〜134のいず
れか1つに対応する位置で終わることができる。本明細書に包含されるActRIIBポリペプチ
ドの具体的な例としては、配列番号16又は配列番号28の19〜29、20〜29、又は21〜29のア
ミノ酸位置から始まり、配列番号16又は配列番号28の119〜134、119〜133、又は129〜134
、129〜133のアミノ酸位置で終わるものが挙げられる。本明細書に包含されるActRIIBポ
リペプチドの他の具体的な例としては、配列番号16又は配列番号28の20〜24(又は21〜24
、又は22〜25)のアミノ酸位置から始まり、配列番号16又は配列番号28の109〜134(もしく
は109〜133)、119〜134(もしくは119〜133)、又は129〜134(もしくは129〜133)のアミノ
酸位置で終わるものが挙げられる。これらの範囲に含まれる変異体ActRIIBポリペプチド
、特に、配列番号16又は配列番号28の対応する部分との少なくとも80％、85％、90％、91
％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、又は99％の配列同一性又は配列相同性
を有するものも企図される。
【００９０】
例えば、ActRIIBの切断形態としては、アミノ酸20〜119; 20〜128; 20〜129; 20〜130;
20〜131; 20〜132; 20〜133; 20〜134; 20〜131; 21〜131; 22〜131; 23〜131; 24〜131
;及び25〜131を有するポリペプチドが挙げられ、ここで、該アミノ酸位置は、配列番号16
又は配列番号28におけるアミノ酸位置を指す。
【００９１】
ActRIIBのさらなる例示的な切断形態としては、(i)配列番号16又は配列番号28のアミノ
酸21〜29のいずれかのアミノ酸から始まり(任意に、配列番号16又は配列番号28の22〜25)
、配列番号16又は配列番号28のアミノ酸109〜134のいずれかで終わるポリペプチド;(ii)
配列番号16又は配列番号28のアミノ酸20〜29のアミノ酸のいずれかから始まり(任意に、
配列番号16又は配列番号28の22〜25から始まり)、配列番号16又は配列番号28のアミノ酸1
09〜133のいずれかで終わるポリペプチド;(iii)配列番号16又は配列番号28のアミノ酸20
〜24のアミノ酸のいずれかから始まり(任意に、配列番号16又は配列番号28の22〜25から
始まり)、配列番号16又は配列番号28のアミノ酸109〜133のいずれかで終わるポリペプチ
ド;(iv)配列番号16又は配列番号28のアミノ酸21〜24のいずれかから始まり、配列番号16
又は配列番号28のアミノ酸109〜134のいずれかで終わるポリペプチド;(v)配列番号16又は
配列番号28のアミノ酸20〜24のいずれかから始まり、配列番号16又は配列番号28のアミノ
酸118〜133のいずれかで終わるポリペプチド;(vi)配列番号16又は配列番号28のアミノ酸2
1〜24のいずれかから始まり、配列番号16又は配列番号28のアミノ酸118〜134のいずれか
で終わるポリペプチド;(vii)配列番号16又は配列番号28のアミノ酸20〜24のいずれかから
始まり、配列番号16又は配列番号28のアミノ酸128〜133のいずれかで終わるポリペプチド
;(viii)配列番号16又は配列番号28のアミノ酸20〜24のいずれかから始まり、配列番号16
又は配列番号28のアミノ酸128〜133のいずれかで終わるポリペプチド;(ix)配列番号16又
は配列番号28のアミノ酸21〜29のいずれかから始まり、配列番号16又は配列番号28のアミ
ノ酸118〜134のいずれかで終わるポリペプチド;(x)配列番号16又は配列番号28のアミノ酸
20〜29のいずれかから始まり、配列番号16又は配列番号28のアミノ酸118〜133のいずれか
で終わるポリペプチド;(xi)配列番号16又は配列番号28のアミノ酸21〜29のいずれかから
始まり、配列番号16又は配列番号28のアミノ酸128〜134のいずれかで終わるポリペプチド
;及び(xii)配列番号16又は配列番号28のアミノ酸20〜29のいずれかから始まり、配列番号
16又は配列番号28のアミノ酸128〜133のいずれかで終わるポリペプチドが挙げられる。具
体的な実施態様において、ActRIIBポリペプチドは、配列番号16もしくは配列番号28のア
ミノ酸位置25から始まり、配列番号16もしくは配列番号28のアミノ酸位置131で終わるア
ミノ酸配列を含むか、それらから本質的になるか、又はそれらからなる。別の具体的な実
施態様において、ActRIIBポリペプチドは、配列番号17、18、23、26、27、29、30、31、3
2、33、36、37、42、もしくは43のアミノ酸配列からなるか、又はそれらから本質的にな
る。
【００９２】
ActRIIBポリペプチドの合成のために、以下のリーダー配列:ミツバチメリチンリーダー
配列(配列番号8)、組織プラスミノーゲン活性化因子(TPA)リーダー(配列番号9)、又は天
然のActRIIBリーダー(配列番号10)を使用することができる。
【００９３】
ある実施態様において、本明細書に記載の組成物及び方法で使用されるGDF11アンタゴ
ニストは、抗体のFc部分に連結されたActRIIBのGDF11結合ドメインを含むコンジュゲート
/融合タンパク質を含む。ある実施態様において、該アクチビン結合ドメインは、リンカ
ー、例えば、ペプチドリンカーを介して、抗体のFc部分に連結される。任意に、Fcドメイ
ンは、Asp-265、リジン322、及びAsn-434などの残基に1以上の突然変異を有する。ある場
合には、これらの突然変異のうちの1つ又は複数(例えば、Asp-265突然変異)を有する突然
変異体Fcドメインは、野生型Fcドメインと比べてFcγ受容体に結合する能力が低下してい
る。他の場合には、これらの突然変異のうちの1つ又は複数(例えば、Asn-434突然変異)を
有する突然変異体Fcドメインは、野生型Fcドメイン比べてMHCクラスI関連Fc受容体(FcRN)
に結合する能力が増大している。
【００９４】
ある実施態様において、本明細書に記載の組成物及び方法で使用されるActRIIBのGDF11
結合ドメインは、ActRIIBの細胞外ドメインの切断形態を含む。切断は、ActRIIBポリペプ
チドのカルボキシ末端及び/又はアミノ末端にあることができる。ある実施態様において
、切断は、成熟したActRIIBポリペプチドの細胞外ドメインと比べて、1、2、3、4、5、6
、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、又は25ア
ミノ酸長いものであることができる。ある実施態様において、切断は、成熟したActRIIB
ポリペプチドの細胞外ドメインの1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15
、16、17、18、19、20、21、22、23、24、又は25個のN末端アミノ酸であることができる
。ある実施態様において、切断は、成熟したActRIIBポリペプチドの細胞外ドメインの1、
2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、
24、又は25個のC末端アミノ酸であることができる。
【００９５】
ある実施態様において、本明細書に記載の組成物及び方法で使用されるActRIIBのGDF11
結合ドメインは、1以上のアミノ酸置換、付加、及び/又は欠失を有するActRIIBの細胞外
ドメインを含む。ある実施態様において、本明細書に記載の組成物及び方法で使用される
ActRIIBのインヒビターは、アミノ酸置換も保有するActRIIB細胞外ドメインの切断形態を
含む。
【００９６】
具体的な実施態様において、本明細書に記載の組成物及び方法で使用されるGDF11イン
ヒビターは、ヒトActRIIB受容体の細胞外ドメインとIgG1のFc部分の融合タンパク質であ
る。別の具体的な実施態様において、本明細書に記載の組成物及び方法で使用されるGDF1
1インヒビターは、ヒトActRIIB受容体の切断された細胞外ドメインとIgG1のFc部分の融合
タンパク質である。別の具体的な実施態様において、本明細書に記載の組成物及び方法で
使用されるGDF11インヒビターは、ヒトActRIIB受容体の切断された細胞外ドメインとIgG1
のFc部分の融合タンパク質であり、ここで、該ヒトActRIIB受容体の切断された細胞外ド
メインは、1以上のアミノ酸置換を保有する。
【００９７】
ActRIIBポリペプチドの機能的に活性のある断片は、例えば、ActRIIBポリペプチドをコ
ードする核酸の対応する断片から組換え産生されたポリペプチドをスクリーニングするこ
とにより得ることができる。さらに、断片を、従来のメリフィールド固相f-Moc又はt-Boc
化学などの当技術分野で公知の技術を用いて化学合成することができる。該断片を(組換
えによるか又は化学合成によって)産生し、試験して、ActRIIBタンパク質又はアクチビン
によって媒介されるシグナル伝達のアンタゴニスト(インヒビター)として機能し得るペプ
チジル断片を同定することができる。
【００９８】
さらに、ActRIIBポリペプチドの機能的に活性のある変異体は、例えば、ActRIIBポリペ
プチドをコードする対応する突然変異核酸から組換え産生された修飾ポリペプチドのライ
ブラリーをスクリーニングすることにより得ることができる。該変異体を産生し、試験し
て、GDF11シグナル伝達又はActRIIBに対する結合のアンタゴニスト(インヒビター)として
機能し得るものを同定することができる。ある実施態様において、ActRIIBポリペプチド
の機能的変異体(すなわち、GDF11結合活性を有するもの)は、ActRIIBの細胞外ドメインと
少なくとも75％同一であるアミノ酸配列を含む。ある場合には、該機能的変異体は、配列
番号から選択されるアミノ酸配列と:ActRIIBの細胞外ドメインと少なくとも80％、85％、
90％、95％、97％、98％、99％、又は100％同一なアミノ酸配列を有する。
【００９９】
潜在的ホモログのライブラリーを縮重オリゴヌクレオチド配列から作製することができ
る多くの方法がある。縮重遺伝子配列の化学合成を自動DNA合成装置で実行することがで
き、その後、合成遺伝子を発現用の適当なベクターに連結することができる。縮重オリゴ
ヌクレオチドの合成は、当技術分野で周知である(例えば、Narang, S Aの文献(1983) Tet
rahedron 39:3; Itakuraらの文献(1981) Recombinant DNA, Proc. 3rd Cleveland Sympos
. Macromolecules, AG Walton, Amsterdam編: Elsevier pp 273-289; Itakuraらの文献(1
984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakuraらの文献(1984) Science 198:1056; Ikeらの
文献(1983) Nucleic Acid Res. 11:477を参照されたい)。そのような技術は、他のタンパ
ク質の定方向進化において利用されている(例えば、Scottらの文献(1990) Science 249:3
86-390; Robertsらの文献(1992) PNAS USA 89:2429-2433; Devlinらの文献(1990) Scienc
e 249: 404-406; Cwirlaらの文献(1990) PNAS USA 87: 6378-6382;並びに米国特許第5,22
3,409号、第5,198,346号、及び第5,096,815号を参照されたい)。
【０１００】
或いは、他の形態の突然変異生成を用いて、コンビナトリアルライブラリーを作製する
ことができる。例えば、ActRIIBポリペプチド変異体を、例えば、アラニンスキャニング
突然変異生成などを用いるスクリーニングにより(Rufらの文献(1994) Biochemistry 33:1
565-1572; Wangらの文献(1994) J. Biol. Chem. 269:3095-3099; Balintらの文献(1993) 
Gene 137:109-118; Grodbergらの文献(1993) Eur. J. Biochem. 218:597-601; Nagashima
らの文献(1993) J. Biol. Chem. 268:2888-2892; Lowmanらの文献(1991) Biochemistry 3
0:10832-10838;及びCunninghamらの文献(1989) Science 244:1081-1085)、リンカースキ
ャニング突然変異生成により(Gustinらの文献(1993) Virology 193:653-660; Brownらの
文献(1992) Mol. Cell Biol. 12:2644-2652; McKnightらの文献(1982) Science 232:316)
;飽和突然変異生成により(Meyersらの文献(1986)Science 232:613); PCR突然変異生成に
より(Leungらの文献(1989) Method Cell Mol Biol 1:11-19);又は化学的突然変異生成な
どを含むランダム突然変異生成により(Millerらの文献(1992) 細菌生物学の短期講座(A S
hort Course in Bacterial Genetics)、CSHL Press, Cold Spring Harbor, N.Y.;及びGre
enerらの文献(1994) Strategies in Mol Biol 7:32-34)、ライブラリーから作製し、単離
することができる。特にコンビナトリアル設定でのリンカースキャニング突然変異生成は
、ActRIIBポリペプチドの切断(生物活性)形態を同定する魅力的な方法である。
【０１０１】
点突然変異及び切断によって作製されたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物を
スクリーニングするための、さらに言うなら、特定の性質を有する遺伝子産物のcDNAライ
ブラリーをスクリーニングするための、広範な技術が当技術分野で公知である。そのよう
な技術は、一般に、ActRIIBポリペプチドのコンビナトリアル突然変異生成によって作製
される遺伝子ライブラリーの迅速スクリーニングに適用可能である。大きな遺伝子ライブ
ラリーのスクリーニングに最も広く使用されている技術は、通常、遺伝子ライブラリーを
複製可能な発現ベクターにクローニングすること、適当な細胞を得られたベクターのライ
ブラリーで形質転換すること、及びコンビナトリアル遺伝子を、所望の活性の検出によっ
て、その産物が検出された遺伝子をコードするベクターの比較的簡単な単離が容易になる
条件下で発現させることを含む。好ましいアッセイとしては、GDF11結合アッセイ及びア
クチビン媒介性細胞シグナル伝達アッセイが挙げられる。
【０１０２】
ある態様において、ActRIIBポリペプチドの機能的変異体又は修飾形態には、ActRIIBポ
リペプチドの少なくとも一部及び1以上の融合ドメインを有する融合タンパク質が含まれ
る。そのような融合ドメインのよく知られた例としては、ポリヒスチジン、Glu-Glu、グ
ルタチオンSトランスフェラーゼ(GST)、チオレドキシン、プロテインA、プロテインG、免
疫グロブリン重鎖定常領域(Fc)、マルトース結合タンパク質(MBP)、又はヒト血清アルブ
ミンが挙げられるが、これらに限定されない。融合ドメインを、所望の特性を付与するよ
うに選択することができる。例えば、いくつかの融合ドメインは、親和性クロマトグラフ
ィーによる融合タンパク質の単離に特に有用である。親和性精製の目的で、親和性クロマ
トグラフィー用の関連するマトリックス、例えば、グルタチオン、アミラーゼ、及びニッ
ケル又はコバルトコンジュゲート樹脂が使用される。そのようなマトリックスの多くは、
「キット」形態で入手可能であり、これには、例えば、(HIS6)融合パートナーと合わせて
有用な、Pharmacia GST精製システム及びQIAexpress(商標)システム(Qiagen)がある。別
の例として、融合ドメインを、ActRIIBポリペプチドの検出を容易にするように選択する
ことができる。そのような検出ドメインの例としては、様々な蛍光タンパク質(例えば、G
FP)及び通常、特異的抗体が利用可能な短いペプチド配列である「エピトープタグ」が挙
げられる。特異的モノクローナル抗体がすぐに利用可能である周知のエピトープタグとし
ては、FLAG、インフルエンザウイルスヘマグルチニン(HA)、及びc-mycタグが挙げられる
。場合により、融合ドメインは、例えば、第Xa因子又はトロンビン用のプロテアーゼ切断
部位、を有し、該部位は、関連するプロテアーゼが融合タンパク質を部分消化し、それに
より、組換えタンパク質をそれから遊離させることを可能にする。その後、遊離したタン
パク質を、後続のクロマトグラフィー分離によって融合ドメインから単離することができ
る。ある好ましい実施態様において、ActRIIBポリペプチドを、インビボでActRIIBポリペ
プチドを安定化するドメイン(「スタビライザー」ドメイン)と融合させる。「安定化する
」とは、血清半減期を延長する全てのことを意味し、これは、破壊の減少によるものか、
腎臓によるクリアランスの減少によるものか、又は他の薬物動態作用によるものかを問わ
ない。免疫グロブリンのFc部分との融合は、広範なタンパク質に望ましい薬物動態特性を
付与することが知られている。同様に、ヒト血清アルブミンへの融合は、望ましい特性を
付与することができる。選択され得る他のタイプの融合ドメインとしては、多量体化(例
えば、二量体化、四量体化)ドメイン及び(望ましい場合、追加の生物学的機能、例えば、
骨成長又は筋肉成長のさらなる刺激を付与する)機能ドメインが挙げられる。
【０１０３】
融合タンパク質の様々なエレメントを、所望の機能と一致する任意の方法で配置し得る
ことが理解される。例えば、ActRIIBポリペプチドを異種ドメインのC末端に配置すること
ができ、又はその代わりに、異種ドメインをActRIIBポリペプチドのC末端に配置すること
ができる。ActRIIBポリペプチドドメイン及び異種ドメインは、融合タンパク質中で隣接
している必要がなく、追加のドメイン又はアミノ酸配列を、どちらかのドメインのC末端
もしくはN末端、又はこれらのドメインの間に含めることができる。
【０１０４】
ある実施態様において、本明細書に記載の方法及び組成物で使用されるActRIIBポリペ
プチドは、ActRIIBポリペプチドを安定化することができる1以上の修飾を含む。例えば、
そのような修飾は、ActRIIBポリペプチドのインビトロ半減期を向上させるか、ActRIIBポ
リペプチドの循環半減期を向上させるか、又はActRIIBポリペプチドのタンパク質分解を
低下させる。そのような安定化修飾としては、融合タンパク質(例えば、ActRIIBポリペプ
チド及びスタビライザードメインを含む融合タンパク質を含む)、グリコシル化部位の修
飾(例えば、ActRIIBポリペプチドへのグリコシル化部位の付加を含む)、並びに炭水化物
部分の修飾(例えば、ActRIIBポリペプチドからの炭水化物部分の除去を含む)が挙げられ
るが、これらに限定されない。融合タンパク質の場合、ActRIIBポリペプチドを、スタビ
ライザードメイン、例えば、IgG分子(例えば、Fcドメイン)に融合させる。本明細書で使
用されるように、「スタビライザードメイン」という用語は、融合タンパク質の場合に見
られる融合ドメイン(例えば、Fc)を指すだけでなく、炭水化物部分などの非タンパク質性
修飾、又はポリエチレングリコールなどの非タンパク質性ポリマーも含む。
【０１０５】
ある実施態様において、他のタンパク質から単離されているか、又は別の方法で他のタ
ンパク質を実質的に含まない、単離及び/又は精製された形態のActRIIBポリペプチドを、
本明細書に記載の方法及び組成物とともに使用することができる。ActRIIBポリペプチド
は、通常、組換え核酸からの発現によって産生される。
【０１０６】
ある態様において、単離された及び/又は組換え核酸を用いて、本明細書に開示される
方法及び組成物で使用される断片、機能的変異体、及び融合タンパク質を含む、ActRIIB
ポリペプチドのいずれか(例えば、可溶性ActRIIBポリペプチド)を作製することができる
。ActRIIポリペプチドは、ActRIIAポリペプチドについて上で考察されている通りに発現
させることができる。
【０１０７】
ActRIIB-Fc融合体の長い血清半減期は、ヒト患者で25〜32日であることができる。さら
に、CHO細胞で発現される物質は、ヒト293細胞で発現されるActRIIB-hFc融合タンパク質
について報告されたものよりも高いアクチビンBリガンドに対する親和性を有することが
できる。さらに、理論によって束縛されるものではないが、TPAリーダー配列の使用は、
他のリーダー配列よりも大きな産生をもたらし、天然のリーダーで発現されるActRIIB-Fc
とは異なり、極めて純粋なN末端配列を提供することができる。天然のリーダー配列の使
用は、各々異なるN末端配列を有する2つの主要な種のActRIIB-Fcを生じさせることができ
る。
【０１０８】
本明細書に記載の組成物及び方法で使用されるActRIIBポリペプチドはいずれも、ホモ
二量体として産生することができる。本明細書に記載の組成物及び方法で使用されるActR
IIBポリペプチドはいずれも、IgG重鎖由来の定常領域、例えば、Fcドメインを含む異種部
分を有する融合タンパク質として製剤化することができる。本明細書に記載の組成物及び
方法で使用されるActRIIBポリペプチドはいずれも、任意に、配列番号16又は配列番号28
に対する1以上の追加のアミノ酸置換、欠失、又は挿入と組み合わせて、配列番号16又は
配列番号28の位置79に対応する位置に酸性アミノ酸を含むことができる。
【０１０９】
具体的な実施態様において、本明細書に記載の組成物及び方法で使用されるActRIIBの
インヒビターは、1以上のアミノ酸置換/突然変異を有するActRIIBの細胞外ドメインを含
む。そのようなアミノ酸置換/突然変異は、例えば、配列番号16又は配列番号28のアミノ
酸位置79のロイシンからアスパラギン酸又はグルタミン酸などの酸性アミノ酸への交換で
あり得る。例えば、配列番号16又は配列番号28の位置L79をActRIIB細胞外ドメインポリペ
プチド中で改変して、改変されたアクチビン-ミオスタチン(GDF-11)結合特性を付与する
ことができる。L79A及びL79P突然変異は、アクチビン結合よりも大きい程度にGDF-11結合
を低下させる。L79E及びL79D突然変異はGDF-11結合を保持する一方で、大きく低下したア
クチビン結合を示す。ある実施態様において、本明細書に提供される方法とともに使用さ
れるActRIIBポリペプチドは、L79E又はL79D突然変異、及び結果として生じる分子がGDF11
に対する増大した結合親和性を保持し又はそれを有するような追加の突然変異を有する。
ある実施態様において、本明細書に提供される方法とともに使用されるActRIIBポリペプ
チドは、L79E又はL79D突然変異を有するのではなく、GDF11に対する増大した結合親和性
を保持し又はそれを有しながら、別の形で修飾されている。
【０１１０】
ActRIIBのリガンド結合ポケットは、配列番号16又は配列番号28の残基Y31、N33、N35、
L38〜T41、E47、E50、Q53〜K55、L57、H58、Y60、S62、K74、W78〜N83、Y85、R87、A92、
及びE94〜F101によって規定されることが示されている。これらの位置では、保存的突然
変異は許容されるが、K74A突然変異は、R40A、K55A、F82A、及び位置L79での突然変異が
そうであるように、良好に許容されると考えられる。R40は、ゼノパス(Xenopus)ではKで
あり、この位置の塩基性アミノ酸が許容されることを示している。Q53は、ウシActRIIBで
はR、及びゼノパスActRIIBではKであり、それゆえ、R、K、Q、N、及びHを含むアミノ酸が
この位置で許容される。したがって、本明細書に記載の方法及び組成物で使用されるActR
IIBポリペプチドの一般式は、配列番号16又は配列番号28のアミノ酸29〜109を含むが、任
意に、配列番号16又は配列番号28の20〜24又は22〜25の範囲のアミノ酸位置から始まり、
配列番号16又は配列番号28の129〜134の範囲のアミノ酸位置で終わり、リガンド結合ポケ
ット内に1、2、5、又は15以下の保存的アミノ酸変化を含み、かつリガンド結合ポケット
内の配列番号16又は配列番号28のアミノ酸位置40、53、55、74、79、及び/又は82に0、1
、又はそれより多くの非保存的変化を含むものである。そのようなActRIIBポリペプチド
は、配列番号16又は配列番号28のアミノ酸29〜109の配列との80％、90％、95％、又は99
％を超える配列同一性又は配列相同性を保持し得る。ばらつきが特に良好に許容され得る
結合ポケットの外側の部位としては、ActRIIBの細胞外ドメインのアミノ末端及びカルボ
キシ末端、並びに位置42〜46及び65〜73が挙げられる。配列番号16又は配列番号28の位置
65におけるアスパラギンからアラニンへの変化(N65A)は、A64バックグラウンドでのリガ
ンド結合を実際に改善し、したがって、R64バックグラウンドでのリガンド結合に悪影響
を及ぼさないと考えられる。この変化は、おそらくは、A64バックグラウンドでのN65にお
けるグリコシル化を消失させ、したがって、この領域での顕著な変化が許容される可能性
が高いことを示している。R64A変化はあまり許容されないが、R64Kは良好に許容され、し
たがって、Hなどの別の塩基性残基は、位置64で許容され得る。
【０１１１】
したがって、ある実施態様において、本明細書に提供される方法とともに使用されるAc
tRIIBポリペプチドを作製するために、アミノ酸置換、欠失、又は付加をActRIIBのリガン
ド結合ポケット中のアミノ酸のうちの1つ又は複数に導入し、得られる分子をGDF11に対す
るその結合親和性について試験する。あるより具体的な実施態様において、得られる分子
を、TGFβスーパーファミリーの他のメンバーと比べたGDF11に対するその結合親和性につ
いて試験する。あるより具体的な実施態様において、得られる分子をアクチビンAと比べ
たGDF11に対するその結合親和性について試験する。
【０１１２】
具体的な実施態様において、本明細書に提供される方法とともに使用されるActRIIBポ
リペプチドは、リガンド結合ドメイン中で、正電荷を有するアミノ酸残基Asp(D80)に突然
変異を有する。具体的な実施態様において、該D80残基を、非荷電アミノ酸残基、負電荷
を有する(negative)アミノ酸残基、及び疎水性アミノ酸残基:からなる群から選択される
アミノ酸残基に変化させる。
【０１１３】
(5.3.3  GDF11プロペプチド)
ある実施態様において、GDF11プロペプチドは、本明細書に記載の方法で使用されるGDF
11アンタゴニストである。GDFに結合し、その活性、シグナル伝達、受容体結合、発現、
プロセシング、又は分泌を阻害する任意のGDF11プロペプチド、その断片又は類似体を本
明細書に記載の方法で使用することができる。例えば、GDF11プロペプチドアンタゴニス
トは、GDF11のその成熟形態への切断を妨げることによるか、成熟GDF11との複合体を形成
することによるか、又は他の関連メカニズムによって、GDF11活性を阻害することができ
る。一実施態様において、GDF11プロペプチドアンタゴニストは、配列番号50の天然のGDF
11プロペプチドである。GDF11プロペプチドアンタゴニストは、GDF11結合能及びGDF11阻
害活性をも保持又は増強する天然のGDF11プロペプチド(配列番号50)のその任意の断片、
変異体、類似体、ホモログ、ムテイン、又は模倣体であることもできる。したがって、別
の実施態様において、GDF11プロペプチドアンタゴニストは、改善された薬物動態特性、
例えば、延長された循環半減期又は増大したタンパク質分解からの保護を有する修飾型GD
F11ポリペプチドである。そのような安定化修飾としては、他のポリペプチド配列(例えば
、IgGのFc領域又はアルブミン)への融合、非タンパク質性ポリマーへの結合、グリコシル
化部位の修飾(例えば、付加)、炭水化物部分の修飾(例えば、除去)などを挙げることがで
きる。そのような修飾型GDF11プロペプチドの例は、当技術分野で公知であり、例えば、
米国特許第7,737,116号及び米国特許第8,236,751号に開示されている。一実施態様におい
て、GDF11プロペプチドアンタゴニストは、例えば、ヒト血清中で、単量体、二量体、又
は潜在的複合体として平衡状態で存在することができるGDF11の成熟ヒト形態に結合する
。別の実施態様において、該GDF11アンタゴニストは、GDF11のホモ二量体活性形態に結合
する。
【０１１４】
一実施態様において、GDF11プロペプチドアンタゴニストは、生物学的源から産生及び
単離される。別の実施態様において、GDF11プロペプチドアンタゴニストは、組換え産生
されるか、又は当技術分野で周知の方法によって合成により作製される。さらに別の実施
態様において、GDF11プロペプチドアンタゴニストは、ポリヌクレオチド配列として導入
及び/又は投与され、該配列からGDF11プロペプチドがインビボで翻訳される。
【０１１５】
(5.3.4  GDF11結合タンパク質)
いくつかの実施態様において、他のGDF11結合タンパク質は、本明細書に記載の方法で
使用されるGDF11アンタゴニストである。例えば、フォリスタチンは、高い親和性でGDF11
に結合し、インビボでGDF11活性に拮抗する。したがって、一実施態様において、本方法
で使用されるフォリスタチンGDF11アンタゴニストは、生物学的源で産生され、それから
単離される天然タンパク質、組換え産生されるポリペプチド、又は合成によって作製され
るフォリスタチンポリペプチドである。阻害性フォリスタチンポリペプチドは、インビト
ロで、及び好ましくはインビボで、GDF11に結合し、その活性を阻害する、その任意の断
片、変異体、又は突然変異体であることができる。ある実施態様において、該フォリスタ
チンポリペプチドは、GDF11結合以外のフォリスタチン生体活性を示さない。特に、ある
実施態様において、該フォリスタチンポリペプチドは、アクチビンに対する結合を示さな
い。
【０１１６】
フォリスタチンとのかなりの構造的及び機能的相同性を共有し、結果として、いくつか
のTGF-βファミリーメンバー(例えば、GDF8、骨形態形成タンパク質)にも結合し、その活
性をも阻害する遺伝子も存在する。したがって、他の実施態様において、GDF11アンタゴ
ニストは、フォリスタチン様3(FSTL3)及びフォリスタチン関連タンパク質(FSRP)としても
知られる、フォリスタチン関連遺伝子(FLRG)である。FLRGポリペプチドアンタゴニストの
例は、例えば、米国特許第8,236,751号に開示されている。
【０１１７】
また別の実施態様において、GDF11アンタゴニストは、1以上のフォリスタチンドメイン
を有するポリペプチドであり、したがって、GDF11に結合し、その活性を阻害する。フォ
リスタチンドメインを含むタンパク質は、システインに富む反復を特徴とするアミノ酸ド
メインを有し、該反復は、通常、65〜90個のアミノ酸にわたり、10個の保存されたシステ
イン残基を含有する。一実施態様において、GDF11アンタゴニストは、GDF11結合タンパク
質GDF関連血清タンパク質-1(GASP-1)又は-2(GASP-2)である。GASP-1又はGASP-2ポリペプ
チドアンタゴニストの例は、例えば、米国特許第7,572,763号に開示されている。
【０１１８】
任意のGDF11結合タンパク質、その変異体又は断片を、該ポリペプチドがGDF11に結合し
、その生体活性を阻害する限り、本明細書に記載の方法で使用することができる。GDF11
結合タンパク質アンタゴニストは、生体発現系において、化学法、組換えDNA法によるか
、又は当技術分野で公知の任意の他の方法によって産生させることができる。別の実施態
様において、GDF11結合タンパク質アンタゴニストは、ポリヌクレオチド配列として導入
及び/又は投与することができる。
【０１１９】
(5.3.5  GDF11類似体)
GDF11アンタゴニストには、GDF11に結合し、その活性を阻害するGDF11類似体も含まれ
る。一実施態様において、拮抗性GDF11類似体は、ドミナントネガティブGDF11ポリペプチ
ドであり、これは、GDF11に結合し(GDF11と二量体化し)、その切断、プロセシング、及び
/又は修飾を阻害し、それにより、その活性を阻害するGDF11の変異体を包含する。別の実
施態様において、GDF11アンタゴニスト類似体は、非ペプチド性である。例えば、非ペプ
チドGDF11類似体は、GDF11プロペプチドの結合及び機能を模倣する化合物(GDF11プロペプ
チドペプチド模倣体)又はGDF11結合タンパク質の結合及び機能を模倣する化合物(GDF11結
合タンパク質ペプチド模倣体)であることができる。理論によって束縛されるものではな
いが、ペプチド模倣体分子は、ペプチドの二次構造のエレメントを模倣する。一実施態様
において、その場合、GDF11類似体は、配列番号48又は配列番号50のGDF11に結合し、それ
を阻害する。
【０１２０】
(5.3.6  GDF11ポリヌクレオチドアンタゴニスト)
GDF11発現(例えば、転写又は翻訳)を阻害するポリヌクレオチドも本明細書に記載の方
法において有用であり得る。いくつかの実施態様において、GDF11アンタゴニストは、GDF
11アンチセンス分子、干渉RNA(RNAi)、リボ核酸コード酵素(リボザイム)、又は三重鎖形
成分子をコードするポリヌクレオチド分子である。GDF11ポリヌクレオチドアンタゴニス
トは、GDF11標的ヌクレオチド配列(例えば、DNA、RNA、mRNA)に相補的であり(例えば、特
異的に結合し)、DNA又はRNAであることができ、かつコード配列又は阻害性配列(例えば、
アンチセンス、RNAi)であることができる。一実施態様において、GDF11アンタゴニストポ
リヌクレオチドは、アンチセンスGDF11分子である。アンチセンス分子は、通常、少なく
とも約1〜25ヌクレオチド長であり、GDF11標的配列に特異的にハイブリダイズするように
設計される。アンチセンス分子に有用な特異的GDF11アンチセンスヌクレオチド配列は、
当技術分野で周知の方法によって同定することができる。
【０１２１】
ある実施態様において、Santa Cruz Biotechnology社, Santa Cruz, CAから入手可能な
以下の遺伝子サイレンサー:カタログ番号: sc-44724、sc-44725、sc-44724-PR、sc-44725
-PR; shRNA: sc-44724-SH、sc-44725-SH、sc-44724-V、及びsc-44725-Vの配列を用いたsi
RNA遺伝子サイレンサーが使用される。
【０１２２】
(5.4  アッセイ)
GDF-11のアンタゴニストを、以下に示す様々なアッセイで試験することができる。これ
らのアッセイを用いて、GDF11アンタゴニストを試験及び同定することができる。さらに
、これらのアッセイを用いて、貧血患者の治療又はGDF11アンタゴニストによる治療に対
する患者の応答性を追跡調査することができる。例えば、インビトロ細胞培養系を患者の
細胞から作出して、GDF11アンタゴニストによる治療に対する特定の患者の応答性を決定
することができる。
【０１２３】
(5.4.1  赤血球レベル)
RBC数は、血液の容積当たりの赤血球の実数のカウントであり、標準的な全血算値の一
部として含まれ得る。通常、男性は、1マイクロリットル当たり4,700,000〜6,100,000細
胞のRBC数を有し、女性は、1マイクロリットル当たり4,200,000〜5,400,000細胞のRBC数
を有する。しかしながら、サラセミア患者は、通常見られるRBC数よりも少ないRBC数を有
し得る。したがって、本明細書に提供される方法に従って治療されている貧血患者、例え
ば、サラセミア患者のRBC数の決定により、そのような治療の効力の決定が可能になる。
【０１２４】
(5.4.2  赤血球コロニー形成単位(CFU-E))
CFU-Eを、例えば、コロニー形成アッセイで、細胞の数及び形態によって、及び特定の
細胞表面マーカーの有無によってアッセイし、同定することができる。赤血球コロニー形
成単位のレベルを、例えば、抗体染色、次いで、フローサイトメトリー解析(FACs)を用い
て測定して、マーカー、例えば、分化状態マーカー、例えば、Epo受容体、c-Kit(幹細胞
因子受容体)、トランスフェリン受容体(CD71+)、CD36、及びTer119(グリコフォリン-A関
連抗原)(CFU-E細胞はTer119(グリコフォリン-A関連抗原)陰性である)の発現を評価するこ
とができる(例えば、Terszowskyらの文献、2005を参照されたい)。CFU-E段階の細胞は、
エリスロポエチン受容体(EpoR)を発現しており、培養培地中のエリスロポエチンのみの存
在下、インビトロで、2〜3日で最終分化するように誘導することができる。CFU-E細胞を
メチルセルロース上にプレーティングし、ジアミノベンジジン試薬でヘモグロビンについ
て染色することができ、その後、CFU-Eコロニーをカウントすることができる。プレーテ
ィングの時点から2日目までに、各々のCFU-Eコロニーは、その大部分が赤血球分化の最終
段階にある8〜64個のヘモグロビン発現(hemoglobinized)細胞を生じさせることができる
。
【０１２５】
コロニー形成単位アッセイは、当技術分野で公知である(例えば、MesenCult(商標)培地
、Stem Cell Technologies社, Vancouver British Columbia; Wuらの文献(Wu H、Liu X、
Jaenisch R、Lodish HFの文献(1995)。「運命が決定された(committed)赤血球BFU-E及びC
FU-E始原細胞の生成は、エリスロポエチンもエリスロポエチン受容体も必要としない(Gen
eration of committed erythroid BFU-E and CFU-E progenitors does not require eryt
hropoietin or the erythropoietin receptor」、Cell 83(1): 59-67; Marley SB, Lewis
JL, Goldman JM, Gordon MY(1996)も参照されたい)。
【０１２６】
(5.4.3  赤血球バースト形成単位(BFU-E))
CFU-eと同様に、BFU-eを、例えば、コロニー形成アッセイで、細胞の数及び形態によっ
て、及び特定の細胞表面マーカーの有無によってアッセイし、同定することができる。具
体的には、BFU-eを、いくつかの細胞表面マーカー、例えば、CD33、CD34、及びHLA-DRの
発現、並びにグリコフォリン-Aの発現の欠如によって同定することができる。例えば、Wu
らの文献に記載されているBFU-eアッセイを利用することができる(Wu H、Liu X、Jaenisc
h R、Lodish HFの文献(1995)。「運命が決定された赤血球BFU-E及びCFU-E始原細胞の生成
は、エリスロポエチンもエリスロポエチン受容体も必要としない(Generation of committ
ed erythroid BFU-E and CFU-E progenitors does not require erythropoietin or the 
erythropoietin receptor」、Cell 83(1): 59-67)。
【０１２７】
(5.4.4  ヘマトクリット)
ヘマトクリットは、所与の容積の全血中の赤血球の割合を測定するものであり、標準的
な全血算値の一部として含まれ得る。ヘマトクリットは、通常、男性では約45％、女性で
は約40％である。しかしながら、サラセミア患者は、一般に、通常見られるよりも低いヘ
マトクリットを有する。したがって、本明細書に提供される方法に従って治療されている
サラセミア患者のヘマトクリットの決定により、そのような治療の効力の決定が可能にな
る。
【０１２８】
(5.4.5  赤血球始原細胞のアポトーシス)
赤血球始原細胞のアポトーシスは、例えば、ターミナルデオキシヌクレオチジルトラン
スフェラーゼ媒介dUTPニック末端標識(TUNEL)染色を用いることにより決定することがで
きる。TUNEL染色は、インサイチュアポトーシス検出キット(Takara Bio, Otsu, Japan)を
用いて実施することができる。
【０１２９】
(5.4.6  赤血球共培養系)
インビボ環境により類似したインビトロ環境での赤血球分化に対する薬剤の効果を試験
するために、骨髄細胞とヒトCD36+細胞の共培養系を使用することができる。赤血球始原
細胞が高度に濃縮されているヒトCD36+細胞をエリスロポエチン(EPO)補充培地(2U/mL)中
で長期骨髄培養物とともに共培養する。6日後、該培養物の細胞出力(例えば、細胞型)を
、例えば、フローサイトメトリー(例えば、FACS)解析により評価することができる。様々
な赤血球分化レベルの赤血球細胞(例えば、前赤芽球、好塩基球、後期好塩基性/多染性、
正染性/網状赤血球、糖タンパク質A+細胞)の数は、試験されている薬剤が赤血球分化を調
節する能力を示す。このアッセイをGDF11の存在下及び非存在下で実施する。その後、GDF
11のアンタゴニストを、GDF11の効果を逆転させるその能力について試験することができ
る。
【０１３０】
(5.4.7  転写応答アッセイ)
ある実施態様において、転写応答アッセイを用いて、GDF11のアンタゴニストを試験す
ることができる。GDF11シグナル伝達によって、特定の遺伝子の転写が上方調節又は下方
調節される。使用される細胞培養系とGDF11に対する転写応答とを(例えば、RT-PCTにより
)測定することができる。転写応答に対するGDF11のアンタゴニストの効果は、アンタゴニ
ストとしてのその有効性の尺度である。例えば、C2C12細胞では、GDF11に対する応答とし
てrunx2/cbfa1が上方調節される(例えば、Bessaの文献、2009 Protein Expression and P
urification 63:89-94を参照されたい)。ある実施態様において、GDF11シグナル伝達に応
答することが知られているプロモーター領域をレポーター遺伝子の上流にクローニングす
ることができる。このように、アッセイを、レポーター遺伝子の活性しかアッセイする必
要がないように簡略化することができる。
【０１３１】
(5.5  医薬組成物)
ある実施態様において、GDF11のアンタゴニストは、本明細書に提供される方法ととも
に使用される医薬として許容される担体とともに製剤化することができる。例えば、GDF1
1のアンタゴニストは、単独で又は医薬製剤(治療的組成物)の成分として投与することが
できる。対象化合物は、ヒト又は動物用医薬品で使用される任意の好都合な方法での投与
のために製剤化することができる。
【０１３２】
ある実施態様において、本明細書に記載の治療方法は、該組成物を全身に又はインプラ
ントもしくは装置として局所に投与することを含む。投与されるとき、治療的組成物は、
パイロジェンフリーの生理的に許容される形態にあり得る。上記の組成物中に任意に含め
ることもできるGDF11のアンタゴニスト以外の治療的に有用な薬剤は、GDF11のアンタゴニ
ストと同時に又は連続的に投与することができる。
【０１３３】
GDF11のアンタゴニストは非経口投与される。非経口投与に好適な医薬組成物は、GDF11
の1以上のアンタゴニストを、1以上の医薬として許容し得る滅菌等張性水性もしくは非水
性溶液、分散液、懸濁液、もしくはエマルジョン、又は使用直前に滅菌注射溶液もしくは
分散液へと再構成され得る滅菌粉末と組み合わせて含むことができ、これらは、抗酸化剤
、緩衝剤、静菌薬、製剤を意図されるレシピエントの血液と等張にする溶質、又は懸濁化
剤もしくは増粘剤を含有することができる。本明細書に記載の医薬組成物中で利用され得
る好適な水性及び非水性担体の例としては、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリ
セロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど)、及びこれらの好適な
混合物、植物油、例えば、オリーブ油、並びに注射可能な有機エステル、例えば、オレイ
ン酸エチルが挙げられる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材料の
使用によって、分散液の場合、必要とされる粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用
によって維持することができる。
【０１３４】
さらに、該組成物は、標的組織部位(例えば、骨)に送達するための形態で封入又は注射
することができる。ある実施態様において、本明細書に提供される組成物は、GDF11の1以
上のアンタゴニストを標的組織部位(例えば、骨)に送達し、成長する組織に構造を提供し
、最適には体内に再吸収されることができるマトリックスを含むことができる。例えば、
該マトリックスは、GDF11のアンタゴニストの低速放出を提供することができる。そのよ
うなマトリックスは、他のインプラント型医療用途に現在使用されている材料から形成さ
れてもよい。
【０１３５】
マトリックス材料の選択は、生体適合性、生体分解性、機械的特性、美容上の外観、及
び界面特性に基づく。対象組成物の特定の用途により、適切な製剤が規定される。該組成
物用の潜在的マトリックスは、生体分解性でかつ化学的に規定されている硫酸カルシウム
、リン酸三カルシウム、ハイドロキシアパタイト、ポリ乳酸、及びポリ無水物であっても
よい。他の潜在的材料は、骨又は皮膚コラーゲンなどの生体分解性でかつ生物学的に十分
に規定されているものである。さらなるマトリックスは、純粋なタンパク質又は細胞外マ
トリックス成分から構成される。他の潜在的マトリックスは、焼成ハイドロキシアパタイ
ト、バイオガラス、アルミン酸塩、又は他のセラミックスなどの、非生体分解性でかつ化
学的に規定されているものである。マトリックスは、上述のタイプの材料のいずれかの組
合せ、例えば、ポリ乳酸とハイドロキシアパタイト又はコラーゲンとリン酸三カルシウム
から構成されていてもよい。バイオセラミックスは、例えば、カルシウム-アルミネート-
ホスフェート中の組成を変化させ、並びに加工して、孔径、粒径、粒子形状、及び生体分
解性を変化させることができる。
【０１３６】
ある実施態様において、本明細書に記載の方法で使用される組成物は、各々所定の量の
薬剤を活性成分として含む、例えば、カプセル剤、カシェ剤、丸剤、錠剤、ロゼンジ剤(
フレーバー付きの主成分、通常、スクロース及びアラビアゴムもしくはトラガカントを使
用)、散剤、顆粒剤の形態で、又は水性もしくは非水性液中の液剤もしくは懸濁剤として
、又は水中油型もしくは油中水型液体エマルジョンとして、又はエリキシル剤もしくはシ
ロップ剤として、又はトローチ剤(不活性基剤、例えば、ゼラチン及びグリセリン、もし
くはスクロース及びアラビアゴムを使用)として、並びに/或いは洗口液などとして、経口
投与することができる。薬剤は、大丸剤(bolus)、舐剤、又はペースト剤として投与する
こともできる。
【０１３７】
経口投与用の固体剤形(カプセル剤、錠剤、丸剤、糖衣錠、散剤、顆粒剤など)中で、本
明細書に提供される方法とともに使用される1以上の治療的化合物を、1以上の医薬として
許容し得る担体、例えば、クエン酸ナトリウムもしくは第二リン酸カルシウム、並びに/
又は以下のもの:(1)充填剤もしくは増量剤、例えば、デンプン、ラクトース、スクロース
、グルコース、マンニトール、及び/もしくはケイ酸;(2)結合剤、例えば、カルボキシメ
チルセルロース、アルギネート、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース、及び/
もしくはアラビアゴムなど;(3)保湿剤、例えば、グリセロール;(4)崩壊剤、例えば、寒天
-寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモもしくはタピオカデンプン、アルギン酸、特定のケ
イ酸塩、及び炭酸ナトリウム;(5)溶解遅延剤、例えば、パラフィン;(6)吸収促進剤、例え
ば、四級アンモニウム化合物;(7)湿潤剤、例えば、セチルアルコール及びモノステアリン
酸グリセロールなど;(8)吸収剤、例えば、カオリン及びベントナイト粘土;(9)滑沢剤、例
えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレン
グリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、及びこれらの混合物;並びに(10)着色剤のうちの
いずれかと混合することができる。カプセル剤、錠剤、及び丸剤の場合、医薬組成物は、
緩衝化剤を含むこともできる。同様のタイプの固体組成物を、ラクトース又は乳糖、及び
高分子量ポリエチレングリコールなどような賦形剤を用いる軟及び硬充填ゼラチンカプセ
ル中の充填剤として利用することもできる。
【０１３８】
経口投与用の液体剤形としては、医薬として許容し得るエマルジョン、マイクロエマル
ジョン、液剤、懸濁剤、シロップ剤、及びエリキシル剤が挙げられる。活性成分に加えて
、該液体剤形は、当技術分野で一般に使用される不活性希釈剤、例えば、水又は他の溶媒
、可溶化剤及び乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチ
ル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、1,3-
ブチレングリコール、油(特に、綿実油、ピーナッツ油、トウモロコシ油、胚種油、オリ
ーブ油、ヒマシ油、及びゴマ油)、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリ
エチレングリコール、並びにソルビタンの脂肪酸エステル、並びにこれらの混合物を含む
ことができる。不活性希釈剤の他に、経口組成物は、補助剤、例えば、湿潤剤、乳化剤及
び懸濁化剤、甘味剤、香味剤、着色剤、芳香剤、及び防腐剤を含むこともできる。
【０１３９】
懸濁剤は、活性化合物に加えて、懸濁化剤、例えば、エトキシ化イソステアリルアルコ
ール、ポリオキシエチレンソルビトール、及びソルビタンエステル、微結晶性セルロース
、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天-寒天、及びトラガカント、並び
にこれらの混合物を含むことができる。
【０１４０】
本明細書に記載の組成物は、補助剤、例えば、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、及び分散剤を
含むこともできる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベ
ン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などを含めることにより確保することがで
きる。等張剤、例えば、糖、塩化ナトリウムなどを該組成物中に含めることが望ましい場
合もある。さらに、注射用医薬形態の持続的吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モ
ノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを含めることによりもたらすことができる。
【０１４１】
投薬レジメンは、GDF11のアンタゴニストの作用を修飾する様々な因子を考慮して、担
当医により決定されるということが理解される。様々な因子としては、血液の生理的パラ
メーター(例えば、赤血球レベル、ヘマトクリット、網状赤血球レベル、ヘモグロビンレ
ベルなど)並びに脾臓及び/又は骨髄中のGDF11レベルが挙げられるが、これらに限定され
ない。ある実施態様において、本明細書に提供される方法で治療される貧血患者は、脾臓
、骨髄、肝臓、血清、及び/又は血漿中のGDF11レベルが上昇していると診断されている(
第5.2節参照)。ある実施態様において、脾臓、骨髄、肝臓、血清、及び/又は血漿中のGDF
11レベルは、GDF11アンタゴニストによる治療の用量を調整するためにモニタリングされ
る。例えば、患者が、上昇したGDF11レベルを最初に有している場合、GDF11アンタゴニス
トによる治療を開始してから; 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10日; 1、2、3、4、5、6、7
、8、9、10週間; 1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10カ月後に、脾臓、骨髄、肝臓、血
清、及び/又は血漿中のGDF11レベルを再度測定し、最初のレベルと比較する。GDF11レベ
ルが減少し、正常なGDF11レベルに近づくか又はそれ未満になった場合、GDF11アンタゴニ
ストの投与を減少させることができる。
【０１４２】
ある実施態様において、GDF11のアンタゴニストは、患者の脾臓及び/又は骨髄及び/又
は肝臓に特異的に標的化及び/又は投与される。
【０１４３】
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、GDF11のアンタゴニストのインビ
ボ産生のための遺伝子療法である。そのような療法は、上記の障害を有する細胞又は組織
へのGDF11のアンタゴニストのポリヌクレオチド配列の導入によって、その治療効果を達
成する。ポリヌクレオチド配列の送達は、キメラウイルスなどの組換え発現ベクター、又
はコロイド分散系を用いて達成することができる。具体的で例証的な治療的送達系として
は、標的化リポソーム、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニア、又は好ましく
は、レトロウイルスなどのRNAウイルスを含むウイルスベクターが挙げられる。好ましく
は、レトロウイルスベクターは、マウス又はトリレトロウイルスの派生物である。単一の
異種遺伝子を挿入することができるレトロウイルスベクターの例としては:モロニーマウ
ス白血病ウイルス(MoMuLV)、ハーベイマウス肉腫ウイルス(HaMuSV)、マウス乳癌ウイルス
(MuMTV)、及びラウス肉腫ウイルス(RSV)が挙げられるが、これらに限定されない。いくつ
かのさらなるレトロウイルスベクターは、複数の遺伝子を組み込むことができる。これら
のベクターは全て、遺伝子導入された細胞を同定及び作製することができるように、選択
可能マーカーの遺伝子を転移し又は組み込むことができる。レトロウイルスベクターは、
例えば、糖、糖脂質、又はタンパク質を付着させることによって標的特異的にすることが
できる。好ましい標的化は、抗体を用いて達成される。当業者は、特異的ポリヌクレオチ
ド配列をレトロウイルスゲノムに挿入するか、又はウイルスエンベロープに付着させて、
GDF11のアンタゴニストをコードするポリヌクレオチドを含むレトロウイルスベクターの
標的特異的送達を可能にすることができることを認識しているであろう。一実施態様にお
いて、該ベクターは、骨髄及び/又は脾臓に標的化される。
【０１４４】
ポリヌクレオチドの別の標的化送達系は、コロイド分散系である。コロイド分散系とし
ては、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、並びに水中油型エマルジ
ョン、ミセル、混合ミセル、及びリポソームを含む脂質ベースの系が挙げられる。具体的
な実施態様において、コロイド系は、リポソームである。リポソームは、インビトロ及び
インビボでの送達ビヒクルとして有用である人工膜小胞である。RNA、DNA、及び無傷のビ
リオンを水性内部に封入し、生物活性形態で細胞に送達することができる(例えば、Frale
y,らの文献、Trends Biochem. Sci., 6:77, 1981を参照されたい)。リポソームビヒクル
を用いる効率的な遺伝子導入法は当技術分野で公知であり、例えば、Manninoらの文献、B
iotechniques, 6:682, 1988を参照されたい。リポソームの組成物は、通常、リン脂質の
組合せであり、これは、通常、ステロイド、特にコレステロールと組み合わされている。
他のリン脂質又は他の脂質を使用することもできる。リポソームの物理学的特徴は、pH、
イオン強度、及び二価カチオンの存在によって決まる。
【０１４５】
リポソーム産生において有用な脂質の例としては、ホスファチジル化合物、例えば、ホ
スファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチ
ジルエタノールアミン、スフィンゴ脂質、セレブロシド、及びガングリオシドが挙げられ
る。例示的なリン脂質としては、卵ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジ
ルコリン、及びジステアロイルホスファチジルコリンが挙げられる。リポソームの標的化
も、例えば、臓器特異性、細胞特異性、及びオルガネラ特異性に基づいて可能であり、当
技術分野で公知である。
【０１４６】
ある実施態様において、GDF11のアンタゴニストは、医薬組成物中で実質的に純粋であ
る。具体的には、医薬組成物中の化合物の高々20％、10％、5％、2.5％、1％、0.1％、又
は高々0.05％が、GDF11のアンタゴニスト及び医薬として許容し得る担体以外の化合物で
ある。
【実施例】
【０１４７】
(6.実施例)
本明細書に提示される実施例は、GDF11タンパク質レベルがサラセミアで上昇している
こと、及びGDF11の阻害がβ-サラセミアのマウスモデルで貧血を治療することができるこ
とを示す。
【０１４８】
(6.1  ActRIIAデコイはβ-サラセミアを治療する)
β-サラセミアは、無効造血、赤血球分化の促進、及びアポトーシスと関連し、貧血及
び鉄過剰症を引き起こす。無効造血の効果の根底にある分子メカニズムは完全には理解さ
れていない。TGF-βスーパーファミリーのメンバーは赤血球始原細胞の増殖と分化の両方
に関係があるとされているが、β-サラセミアで見られる無効造血における多くのTGF-β
ファミリーメンバーの役割は不明である。
【０１４９】
β-サラセミアの無効造血におけるTGF-βファミリーメンバーの役割を評価するために
、いくつかのTGF-βスーパーファミリーリガンドに結合する組換え融合タンパク質をヒト
β-サラセミアのマウスモデルで用いた。ActRIIA-Fc融合タンパク質(すなわち、配列番号
7のマウス対応物)は、アクチビン受容体IIA(ActRIIA)の細胞外ドメインがヒト免疫グロブ
リン1(IgG1)Fcドメインに結合したものからなり、該タンパク質は、アクチビンA、アクチ
ビンB、成長分化因子-11(GDF11)、及び骨形態形成タンパク質-10(BMP-10)のようなTGF-β
ファミリーメンバーのリガンドトラップとして作用する。Hbbth1/th1は、ヒトβ-サラセ
ミアのマウスモデルであり、このマウスは、β-主要遺伝子の天然の欠失を有する(Skowら
の文献、1983)。Hbbth1/th1マウスは、異常に低いヘモグロビン(Hgb)、ヘマトクリット(H
ct)、及び平均細胞容積(MCV)、並びに骨髄(BM)過形成及び異常に高いレベルのビリルビン
を有する。ビリルビンは、広範な赤血球破壊を表すヘモグロビン破壊の副産物である。
【０１５０】
(6.2  材料及び方法)
(6.2.1  マウス)
C57BL/6を交配し、INSERM U699のパイロジェンフリーの施設で飼育した。プロトコルは
全て、INSERMの動物管理委員会により承認された。Hbbth1/th1モデルは、β-主要遺伝子
の天然の欠失から生じた(Skow LCらの文献; Cell 1983)。Hbbth1/th1マウスは、中間型β
-サラセミアのモデルに相当する。これらのマウスは、無効な骨髄赤血球産生、前駆細胞
アポトーシス、実質内鉄分布、ヘプシジン発現の減少、及び低い骨髄鉄レベルの一方で、
肝臓及び脾臓でのレベルが増加していることなどの、ヒトβ-サラセミアを再現するいく
つかの臨床パラメーターを有する。
【０１５１】
(6.2.2  全血算値)
血液試料をEDTAコートチューブに回収し、全血算値をMS9-5 Blood Analyzer(Melet Sch
loesing Laboratories)で製造業者の指示に従って測定した。選択されたパラメーターは
、赤血球(RBC)、ヘマトクリット(Ht)、平均赤血球容積(MCV)、ヘモグロビン(Hb)であった
。網状赤血球数は、網状赤血球計数試薬(BD Biosciences Retic-Count(商標)キット)で決
定した。
【０１５２】
(6.2.3定量的リアルタイムRT-PCR)
RNAを、RNeasy Plus Mini Kit(Qiagen)を用いて、赤血球始原細胞から抽出した。1マイ
クログラムの全RNAを、iScript reverse transcription Supermix(Bio-rad)を用いる逆転
写に42℃で30分間使用した。その後、酵素を85℃で5分間不活化させた。qPCRのために、c
DNA試料をCFX96 PCR System(Bio-rad)で増幅させた。PCR産物を、SsoFast EvaGreen Supe
rmix(Bio-rad)を用いて定量した。
【０１５３】
(6.2.4  インビトロ赤芽球培養)
各組織由来の細胞を、2U/mLヒト組換えEpo(Roche)、100ng/mL SCF(PeproTech)、10-6M
デキサメタゾン(D2915; Sigma)、40、及びペニシリン/ストレプトマイシン(Pen/Strep; I
nvitrogen)を補充したStemPro34＋栄養補給剤(Life Technologies Gibco-BRL)のどちらか
からなる無血清「赤血球増殖培地」に再懸濁させた。培養から5日後、非接着細胞を、10
μg/mlのmActRIIA-Fcを補充した又は補充していない分化培地(1U/ml Epo及び1mg/ml鉄-ト
ランスフェリン(Sigma)を補充したStemPro-34)に2〜3日間移した。生細胞数及び死細胞数
をTrypan Blue(Gibco/BRL)排出によって毎日決定し、細胞濃度を部分的な培地交換によっ
て2×106全細胞/mLに毎日調整した。
【０１５４】
(6.2.5  メチルセルロースアッセイ)
成獣マウスBM又は脾臓の単一細胞懸濁液をmethocult M3434培地(Stem Cell Technologi
es)と混合し、35mmディッシュにプレーティングし、5％CO2加湿雰囲気下、37℃で培養し
た。BFU-Eコロニーを10日目にスコアリングした(いくつかの実験では、マウスBFU-Eを7日
目以降10日目までスコアリングし、7日目と10日目のコロニー数に差がなかった)。
【０１５５】
(6.2.6  統計解析)
統計解析は、GraphPad Prism(バージョン5.0; GraphPad Software)を用いて実施した。
別途注記されない限り、データは、N回の測定の平均±SEMとして表されている。スチュー
デントt-検定又はマン-ホイットニー検定を用いて、2群を比較したのに対し、多群比較は
、二元ANOVA検定、次いで、事後解析(ボンフェローニ検定)を用いて行った。差は、0.05
未満(*)、0.01未満(**)、又は0.001未満(***)のP値で有意とみなした。
【０１５６】
(6.2.7  フローサイトメトリーによる免疫蛍光解析)
マウス由来の骨髄(BM)及び脾細胞懸濁液について、抗FcγR mAb 2.4G2を用いてIgG受容
体のブロッキングを行った。その後、細胞(1×106)を抗TER-119抗体及び抗マウスTfR1抗
体で染色した。染色された細胞を、FlowJoソフトウェア(Tree Star)を用いるフローサイ
トメトリー(FACScalibur; Becton Dickinson)によりさらに解析した。
【０１５７】
(6.2.8  組織回収及び組織検査)
骨髄及び脾臓を回収し、10％ホルマリン中で固定し、パラフィン包埋し、ヘマトキシリ
ン及びエオシン(H&E)染色用に3〜6μmで薄切した。
【０１５８】
(6.2.9  鉄、フェリチン、ビリルビン、及びトランスフェリン定量)
血液をヘパリン添加チューブに採取し、遠心分離した(5分、4℃、1,100g)。血漿を新た
に遠心分離して(5分、4℃、1,100g)、混入している赤血球を除去した。生化学的パラメー
ターを、製造業者の指示に従って、Olympus AU400 automatで定量した。
【０１５９】
(6.3  結果)
(6.3.1  mActRIIA-Fcはサラセミアマウスにおける血液学的パラメーターを改善する)
β-サラセミアは、赤血球成熟及び産生の障害をもたらすヘモグロビン合成の欠陥を特
徴とする疾患である。赤血球の減少は、主として、成熟赤血球産生の全体的な減少をもた
らす、赤血球分化の後期好塩基性/多染性赤芽球段階での赤血球分化の異常な促進及びア
ポトーシスが原因であると考えられている。この疾患は、異常な赤芽球が蓄積し、アポト
ーシスを経て、全身性貧血を引き起こす、過形成性骨髄区画を特徴とする。
【０１６０】
β-サラセミアの疾患機序におけるTGF-βリガンドの役割を調べるために、Hbbth1/th1
マウスを、mActRIIA-Fc(配列番号7のマウス対応物)又はPBSで、0、5、10、30、又は60日
間(10mg/Kg体重)、週2回、皮下処置した(各々の独立した実験について、*p＜0.05、N＝3
〜5)。PBS処置動物と比較して、mActRIIA-Fcによる処置は、赤血球数(図1A)並びにヘマト
クリット(図1B)及びヘモグロビン(図1C)レベルを有意に増加させ、同時に網状赤血球数(
図1D)を(処置後10日目から60日目まで)減少させた。循環赤血球(RBC)パラメーターの解析
も、平均赤血球容積(MCV)(図1E)、平均赤血球ヘモグロビン(MCH)(図1F)、及びMCH濃度(MC
HC)(図1G)の全てが、mActRIIA-Fcで処置した全てのマウスで増加することを示し、mActRI
IA-Fcが、サラセミアの小球性貧血を改善し、RBC当たりのヘモグロビン含有量を回復させ
ることを示唆した。さらに、骨髄及び脾臓細胞充実度並びに後期好塩基性/多染性赤芽球
は、mActRIIA-Fcによる治療の後に有意に低下した。赤血球の形態学的解析をメイ-グリュ
ンワルド(MGG)染色で評価し、これにより、赤血球不同、変形赤血球増加、及び標的赤血
球(図1I)の減少が示された。β-サラセミアと関連する貧血に対するmActRIIA-Fcの効果を
明らかにするために、全身鉄レベル(図1J)、トランスフェリン合成(図1K)、トランスフェ
リン飽和(図1L)、及びフェリチンレベル(図1M)をサラセミアマウスで評価した。トランス
フェリン飽和は、トランスフェリン合成の誘導又は全身鉄レベルの減少を伴って低下して
いた(図1L)。血小板、単球、リンパ球、及び好中球レベルも評価した(図1N)。
【０１６１】
サラセミアマウスの脾腫に対するmActRIIA-Fcの効果を脾臓重量及び全脾臓細胞数測定
により評価した。脾臓細胞数及び脾臓重量は、PBS処置サラセミアマウスと比較してmActR
IIA-Fcで処置した動物で低下していた(図1O)。同様に、(エオシン/ヘマトキシリン染色で
決定したときの)骨髄赤芽球の数及び増殖(図1P)も、mActRIIA-Fc-処置マウスで減少して
いた。骨髄及び脾臓を採取し、赤芽球をTER119染色によるフローサイトメトリーにより定
量した。mActRIIA-Fcによる処置は、サラセミアマウスにおける赤血球の数を有意に低下
させ(図1Q)、それによりマウスの無効造血が解消されたことを示している。
【０１６２】
(6.3.2  mActRIIA-Fcはサラセミアマウスの無効造血を軽減する)
β-サラセミアの無効造血におけるTGF-βスーパーファミリーリガンドの役割をさらに
調べるために、脾臓(図2A、図2C)及び骨髄(図2B、図2C)を採取し、赤芽球分化をCD71/TER
119染色及び前方散乱/側方散乱(FSC/SSC)分布によるフローサイトメトリーにより評価し
た。前赤芽球(Pro-E)、好塩基性赤芽球(Ery-A)、後期好塩基性(Ery-B)及び多染性赤芽球
、並びに正染性赤芽球(Ery-C)という赤血球分化の進行段階にある細胞のパーセントの経
時的解析から、mActRIIA-Fcで処置したマウスが、脾臓における未成熟TER119/CD71細胞(
後期好塩基性及び多染性赤芽球、Ery-B)の有意な減少と同時に、正染性赤芽球(Ery-C)の
割合の増加を示すことが示された(図2A)。これらの結果は、mActRIIA-Fcによる無効造血
の軽減と一致した。mActRIIA-Fcで処置したマウス由来の骨髄ではTER-199+赤芽球とEry-B
の数とが減少していたが(図2B)、成熟赤芽球の量は増加しておらず、サラセミアマウスの
骨髄における無効造血が、mActRIIA-Fcによるマウスの処置では解消されないことを示唆
している。
【０１６３】
サラセミアの慢性貧血は、ストレス赤血球産生代償性応答を誘導する。しかしながら、
これらの応答は、無効造血のために効果がない。無効造血はRBC産生の要求を特徴とする
。このRBC産生は、成熟途上の細胞のアポトーシスによる早期の細胞死が原因で、未成熟
赤芽球の増殖及び分化の促進によって補償することができない。それゆえ、不均衡な未成
熟/成熟赤芽球比は、サラセミアの無効造血の特徴である。赤血球分化及び無効造血に対
するmActRIIA-Fcの影響をさらに調べるために、mActRIIA-Fc処置マウス及びそのそれぞれ
の対照由来の細胞懸濁液を、TfR1及びTER119に対する抗体で標識した。赤血球前駆細胞分
化を、先に記載されている通りに(Liuらの文献、Blood 2006)、フローサイトメトリーに
よりTER119highゲート内で解析した。その結果、mActRIIA-Fc処置マウスは、脾臓での未
成熟/成熟赤芽球比の比率の減少を示し、無効なストレス赤血球産生の解消を示した。骨
髄では、未成熟/成熟赤芽球比は、対照とmActRIIA-Fc処置マウスで違いがなく、サラセミ
アマウスの骨髄における無効造血がmActRIIA-Fc処置により解消されなかったことをさら
に示唆している。これらの結果は、ActRIIaリガンドが赤芽球分化に寄与するだけでなく
、β-サラセミアにおける無効な脾臓赤血球産生にも寄与することを示唆している。
【０１６４】
ビリルビンは、ヘモグロビン分解の産物であり、溶血によって生じる血漿ビリルビンの
増加は、β-サラセミア18における無効造血の特徴である。経時的解析において、全ビリ
ルビン及び直接ビリルビンの血清レベルは、mActRIIA-Fcで処置したサラセミアマウスで
処置5日目から減少しており、無効造血によって生じる溶血がmActRIIA-Fc投与によって影
響を受けたことを示唆している(図2D)。ビリルビン値と一致して、血清乳酸脱水素酵素(L
DH)のレベルも、処置から60日後に、対照と比較したmActRIIA-Fcで処置した動物で低下し
ており(図2D)、組織溶血がmActRIIA-Fcで処置したマウスで低下していたことをさらに裏
付けている。
【０１６５】
後期赤血球産生は、2つのα-グロビンサブユニットと2つのβ-グロビンサブユニットか
ら構成される四量体タンパク質である酸素担体ヘモグロビン(Hb)の産生の方向に大部分向
けられる。β-サラセミアは、β-グロビン遺伝子産生の障害又は欠如と、それに伴う、不
対α-サブユニットの蓄積を特徴とする一般的な遺伝性異常ヘモグロビン症である。成熟
途上の赤血球細胞における過剰な未結合の遊離α-グロビンは沈殿し、赤血球前駆細胞の
早期の死を誘導する活性酸素種(ROS)の産生及び細胞性酸化ストレス損傷をもたらす。グ
ロビン沈殿の生成に対するmActRIIA-Fcの影響をさらに調べた。初期前赤芽球分化時のROS
発生を、ジクロロジヒドロフルオレセインを用いるフローサイトメトリーにより評価した
(図2E)。mActRIIA-Fc又はPBSで48時間処置した初期サラセミア前赤芽球のヘモグロビン溶
解度の解析(図2F)。
【０１６６】
mActRIIA-Fcによる処理と関連する細胞メカニズムについての知見を得るために、脾臓
由来前赤芽球を培養し、mActRIIA-Fcの存在下又は非存在下でHbbth1/th1マウスから回収
した。前赤芽球分化の十分に確立されたインビトロモデルを用いた(脾臓前駆細胞を、マ
ウス幹細胞因子、Epo、及びデキサメタゾンを補充した無血清幹細胞増殖培地中で5日間培
養した)。その後、これらの前赤芽球濃縮培養物を1U/ml Epo及び1mg/ml Fe-Tfの存在下で
3日間分化させた。インビボでの観察と同様に、mActRIIA-Fcによる処理は、サラセミア赤
芽球におけるヘモグロビンの総量を増加させた。しかしながら、これらの細胞は、対照処
理細胞と比較したとき、膜に関連した沈殿ヘモグロビンの量の減少を示した(図2F)。した
がって、これらの細胞で検出された活性酸素種(ROS)の量は、mActRIIA-Fcで処理した細胞
で減少した(図2E)。それゆえ、mActRIIA-Fcによる処理は、無効造血に寄与する細胞傷害
性グロビン沈殿及びそれに付随するROS産生の減少をもたらした。まとめると、これらの
データは、ActRIIaシグナル伝達の標的化が赤芽球分化を調節し、mActRIIA-FcによるActR
IIaリガンドの捕捉が、成熟赤芽球の形成に有利に働き、かつ膜関連ヘモグロビン沈殿を
低下させることによって、無効造血を解消することを示唆した。
【０１６７】
(6.3.3  mActRIIA-Fcはサラセミアマウスにおけるアポトーシスを調節する)
赤血球上でのアポトーシス促進タンパク質の発現を、フローサイトメトリーを用いて解
析することにより、β-サラセミア関連無効造血におけるアポトーシス過程へのTGF-βフ
ァミリーメンバーの関与を調べた。骨髄赤芽球におけるアポトーシスタンパク質の発現に
有意な変化はなかったが(図3A)、脾臓赤芽球の解析は、Fas-LがEry-B細胞集団で増加して
いることを示した(図3B)。PBS及びmActRIIA-Fcで処置したマウス由来の脾臓細胞に対する
マルチパラメトリックフローサイトメトリー比較解析は、Fas-L発現が、未成熟後期好塩
基性及び多染性赤芽球(Ery-B)で増加し、正染性赤芽球(Ery-C)で減少していることを示し
た(図3B)。対照的に、Fas-L発現は、BM赤芽球では調節されなかった(図3A)。まとめると
、これらの結果は、ActRIIaシグナル伝達が成熟途上の赤芽球でFas/Fas-L経路を調節する
ことを示した。総合すると、これらのデータは、ActRIIaシグナル伝達が、無効造血の方
向に向けられた成熟途上の赤芽球の早期の細胞死を誘導することを示唆した。驚くことに
、Fas-L発現は、Ery-A及びEry-Cサブセットの細胞で減少しており、ActRIIaシグナル伝達
の影響が成熟途上の赤芽球でより顕著であったことを示している(図3B)。tunel陽性細胞
の数も、mActRIIA-Fcで処置した動物で増加していた(図3C)。サラセミアの無効造血は、
成熟途上の赤芽球の大規模なアポトーシスを特徴とする。アポトーシスに対するmActRIIA
-Fcによる処置の影響を調べることにより、mActRIIA-Fcによるマウスの処置が、そのそれ
ぞれの対照と比較したtunnel陽性細胞の数の減少を示すことが示され(図3C)、Smad-2,3活
性化を通じたActRIIaシグナル伝達が、成熟途上の赤芽球のアポトーシスレベルを調節す
ることにより、無効造血を制御し得ることが示唆された。
【０１６８】
(6.3.4  アクチビン/GDF11リガンドはサラセミアマウス由来の脾臓で過剰発現している)
ActRII、アクチビンA、アクチビンB、及びGDF11のRNA(mRNA)発現レベルを、qPCRにより
、野生型及びサラセミアマウス由来の脾臓で評価した。ActRII、アクチビンA、アクチビ
ンB、及びGDF11のmRNAレベルは全て増加しており、mActRIIA-Fcが、そのリガンドの1つを
通じて、その無効造血の改善において作用し得ることが示唆された(図4A)。mActRIIA-Fc
で処置したサラセミアマウス由来の脾臓から得られたタンパク質のウェスタンブロット解
析は、PBS処置と比較したGDF11タンパク質レベルの有意な減少を示し(図4B)、GDF11を無
効造血に関与するActRIIAリガンドとしてさらに関連付けた。さらなる免疫組織化学的解
析は、GDF11タンパク質レベル(及びそれよりはるかに劣る程度に、アクチビンA又はアク
チビンB)がサラセミアマウス由来の脾臓生検で大きく増加しており、mActRIIA-Fcで処置
した動物で抑制されていることを明らかにした(図3A)。これらの結果は、免疫ブロッティ
ングによりさらに確認された(図4B)。脾臓切片とは対照的に、BMに関するActRIIaリガン
ドの解析は、サラセミアマウスにおけるGDF11の蓄積を示さなかった(図4B)。それゆえ、
サラセミアマウスの脾臓切片におけるGDF11過剰発現を無効造血と関連付けることができ
た。
【０１６９】
(6.3.5  mActRIIA-Fcは初期サラセミア前赤芽球で見られるGDF11発現レベルの増加を低下
させる)
どのTGF-βファミリーメンバーがmActRIIA-Fcによるβ-サラセミアの治療に関係があり
得るかということを決定するために、アクチビン/GDFシグナル伝達経路のタンパク質の免
疫組織化学的解析を行った。サラセミアマウスをPBS又はmActRIIA-Fcで30日間処置し、脾
臓を採取し、固定し、アクチビンA、アクチビンB、GDF8、GDF11、ActRII、及びp-Smad2に
ついて染色した(図5A)。免疫組織化学染色は、サラセミアマウスにおけるGDF11、ActRII
、及びp-Smad2のレベルの増加を示した。アクチビン/GDFシグナル伝達経路のタンパク質
が貧血の他のマウスモデルで過剰発現されているかどうかを調べるために、サラセミアマ
ウスにおけるアクチビンA、アクチビンB、及びGDF11の発現を、酸素正常状態マウス、低
酸素症マウス、及びαRBCマウスと比較した(図5B)。PBS又はmActRIIA-Fcで48時間処理し
、その後、アクチビンA、アクチビンB、GDF11プロペプチド、及びGDF8/GDF11切断ペプチ
ドに対する特異的抗体とともにインキュベートした初期サラセミア前赤芽球のFACS解析は
、mActRIIA-Fc処置がGDF11発現を正常化することを示した。GDF11染色の定量は、mActRII
A-Fcによるマウスの処理がGDF11レベルを有意に低下させることを示した(図5C)。サラセ
ミアマウスをmActRIIA-Fcで処置したときのこのGDF11発現の低下は、該マウスの脾臓の免
疫組織化学的解析により確認された(図5D)。*p＜0.05、N＝4。したがって、mActRIIA-Fc
がサラセミア組織におけるGDF11過剰発現を減少させるという事実は、mActRIIA-FcがGDF1
1を標的とすることによって無効造血を解消するというさらなる証拠となった。
【０１７０】
(6.3.6  GDF11の中和は赤芽球分化を回復させる)
GDF11発現の増加が無効造血に関与するかどうかを明らかにするために、サラセミア前
赤芽球をアクチビンA及びB及びGDF11に対するブロッキング抗体の存在下で培養した。(ア
クチビンA及びB抗体ではなく)抗GDF11抗体は、赤血球産生を促進し、これにより、CD71/T
ER119染色後のフローサイトメトリーにより定量したとき、GDF11が無効造血を誘導するこ
とによって赤血球産生を負に調節することがさらに確認された(図6A)。初期前赤芽球分化
時のROS発生を、ジクロロジヒドロフルオレセインを用いるフローサイトメトリーにより
評価した(図6B)。*p＜0.05、N＝4。したがって、抗GDF11ブロッキング抗体は、細胞分化
を回復させ、サラセミア赤芽球におけるヘモグロビン凝集体を低下させた。
【０１７１】
(6.3.7  ActRIIAリガンド検出アッセイ)
血液血清中に存在するActRIIAリガンド、並びに特に、無効造血と関連する疾患(例えば
、サラセミア、骨髄異形成症候群、慢性悪性貧血、及び鎌状赤血球貧血)におけるその異
常な発現を検出、同定、及び定量するためのアッセイを開発した。このアッセイは、ActR
IIA-Fcコーティングと、それに続く、血清中に存在するActRIIAリガンドの検出に基づく
サンドイッチELISAからなる。治療決定の助けとするために及び/又はTGF-βリガンドもし
くは受容体レベルを調節するよう設計された治療の有効性を決定するために、ActRIIA EL
ISAアッセイを実験的に(例えば、動物に)又は臨床的に(例えば、ヒト患者に)用いて、血
液血清中のリガンド又は受容体レベルを同定、検出、及び/又は定量することができる。
【０１７２】
(6.3.8  GDF11レベルはサラセミア患者の血清中で上昇している)
血清中のGDF11レベルを測定するために、上記のサンドイッチELISAアッセイを開発した
。ELISAプレートを5μg/mLのmActRIIA-Fcでコーティングした(図7A)。増加する用量の組
換えGDF11をプレートに添加した(0.1ng/マイクロリットル、0.5ng/マイクロリットル、2.
5ng/マイクロリットル)。プレートをPBS 0.1％Tweenで洗浄し、結合したタンパク質を、
抗GDF8/11抗体を用いて検出し、その後、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗ウサギIgGを
用いて検出した。GDF11は、mActRIIA-Fcでコーティングしたプレートに用量依存的な様式
で結合し、これにより、GDF11レベルを検出及び定量するために、このアッセイを効果的
に使用することができることが示された(図7B)。mActRIIA-Fcを用いるELISAでは、わずか
100pg/mL程度の組換えGDF11が検出された。
【０１７３】
サラセミアを有する患者由来の血清を、mActRIIA-FcによるサンドイッチELISAを用いて
GDF11発現について試験した。図8に示すように、GDF11レベルは、健常対照でのレベルと
比較して、サラセミアを有する患者で3倍上昇していた。
【０１７４】
他のActRIIAリガンドのレベルもサラセミア患者で上昇しているかどうかを明らかにす
るために、アクチビンA及びアクチビンB発現レベルもこれらの患者の血清で測定した。ア
クチビンA及びアクチビンBを検出するためのELISAアッセイも開発した。ELISAプレートを
5マイクログラム/mLのActRIIA-Fcでコーティングした。増加する用量の組換えアクチビン
A及びアクチビンBをプレートに添加した(0.1ng/マイクロリットル、0.5ng/マイクロリッ
トル、2.5ng/マイクロリットル)。プレートをPBS 0.1％Tweenで洗浄し、結合したタンパ
ク質を、抗アクチビンA(図9A)及び抗アクチビンB(図10A)抗体(R&D systems)で検出し、そ
の後、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗ウサギIgGを用いて検出した。アクチビンA(図9
B)とアクチビンB(図10B)は両方ともActRIIA-Fcコートプレートに用量依存的な様式で結合
し、これにより、両方のタンパク質を検出及び定量するために、このアッセイを効果的に
使用することができることが示された。GDF11と同様、アクチビンA及びアクチビンBも100
pg/mL程度の低いレベルで検出された。
【０１７５】
ActRIIA-Fc ELISAを用いて、サラセミアを有する患者の血清中のアクチビンA及びアク
チビンBの発現レベルを決定した。GDF11とは対照的に、アクチビンAのタンパク質レベル(
図9C)もアクチビンBのタンパク質レベル(図10C)もサラセミア患者で上昇しておらず、Act
RIIAリガンドGDF11がサラセミア疾患過程に独自に関与することが示された。
【０１７６】
(6.3.9  mActRIIA-Fcは野生型マウスの血液学的パラメーターを変化させない)
野生型C57BL/6マウスをmActRIIA-Fc(10mg/Kg BW、週2回)又はPBSで30日間処置した。赤
血球数(図11A)、ヘマトクリット(図11B)、ヘモグロビン(図11C)の評価は、mActRIIA-Fcに
よるマウスの処置の結果として、これらのパラメーターのレベルの変化を示さなかった。
網状赤血球増加のごくわずかな減少が観察された(図11D)。mActRIIA-Fcは、MCV(図11E)、
MCH(図11F)、及びMCHC(図12G)などの赤血球(RBC)パラメーターも変化させなかった。各々
の独立した実験について、*p＜0.05、N＝3〜5。
【０１７７】
脾臓及び骨髄に対するmActRIIA-Fcの効果も野生型C57BL/6マウスで評価した。mActRIIA
-Fcは、野生型マウスの脾臓重量を増加させたが、脾臓細胞数にはそれほど影響を及ぼさ
なかった。mActRIIA-Fcは、骨髄細胞数にも影響を及ぼさなかった(図12)。
【０１７８】
(6.3.10  mActRIIA-FCはGDF11の阻害を通じて赤血球産生性分化を刺激する)
mActRIIA-Fcが赤血球パラメーターを増加させる細胞メカニズムを調べるために、一連
のインビトロ実験を実施した。これらの実験において、コロニー形成アッセイ(図13A)及
び液体培養物中での赤血球分化(図13B及び13C)で評価したとき、ヒトCD34+細胞に対するm
ActRIIA-Fcの直接的な作用を支持する証拠は見つけられなかった。臨床的知見と薬理学的
知見の両方がRBCパラメーターの刺激におけるmActRIIA-Fcの明白な役割を示したので、mA
ctRIIA-Fcの作用が骨髄(BM)微小環境のアクセサリー細胞によって媒介され得るという仮
説を立てた。赤血球始原細胞が高度に濃縮されているヒトCD36+細胞を長期BM培養物とと
もに共培養し、その後、EPO(2U/mL)補充培地中で6日間培養した後、その赤血球分化を評
価した。6日目に、該培養物の産生物は、主に、EryA(〜好塩基性赤芽球)であると特徴付
けられたが、mActRIIA-Fc(50μM)を添加すると、CD36+細胞のかなりの割合がEryB/C細胞(
多染色性/正染性赤芽球)に成熟し、これにより、BMアクセサリー細胞によって産生される
因子がmActRIIA-Fcの赤血球産生作用を媒介すること、及びEPOとは対照的に、mActRIIA-F
cが赤芽球成熟の後期において役割を果たし得ることを示唆した(図13D〜13F)。mActRIIA-
Fcの作用を媒介し得るサイトカインを同定するために、CD36+細胞をいくつかのActRIIAリ
ガンドで処理した。GDF11処理は、分化過程における糖タンパク質A陽性(GPA+)細胞の増殖
を有意に減少させ、mActRIIA-Fcは、未処理の細胞に影響を及ぼすことなく、この作用を
効果的に逆転させた(図13G及び13H)。これらのデータは、GDF11の阻害がmActRIIA-Fcの赤
血球産生刺激作用を媒介することを示している。
【０１７９】
(6.4  結論)
まとめると、これらのデータは、アクチビン/BMPシグナル伝達が赤芽球分化を制御する
こと、及びBMP II型/アクチビンII型受容体の標的化が、β-サラセミアにおいて、無効造
血を減少させ、貧血を改善することができることを示している。特に、これらのデータは
、β-サラセミア関連貧血におけるGDF11の関与を示し、サラセミア患者のGDF11レベルを
抑制し又は減少させることが、無効造血と関連する貧血の有効な治療であることを示して
いる。
(7.配列の記載)
表1：配列情報
【表１】
2020183390.tif 000002
2020183390.tif 000003
2020183390.tif 000004
2020183390.tif 000005
2020183390.tif 000006
2020183390.tif 000007
2020183390.tif 000008
2020183390.tif 000009
2020183390.tif 000010
2020183390.tif 000011
2020183390.tif 000012
2020183390.tif 000013
2020183390.tif 000014
2020183390.tif 000015
2020183390.tif 000016
2020183390.tif 000017
【０１８０】
(8.等価物)
本発明は、その具体的な実施態様に関して詳細に記載されているが、機能的に等価であ
るバリエーションが本発明の範囲内にあることが理解されるであろう。実際、本明細書に
示され、記載されたものに加えた本発明の様々な変更は、前述の説明及び付随する図面か
ら当業者に明らかになるであろう。そのような変更は、添付の特許請求の範囲の範囲内に
含まれることが意図される。当業者は、本明細書に記載の本発明の具体的な実施態様の多
くの等価物を認識するか、又はルーチンの実験だけを用いて、それらを確認することがで
きるであろう。そのような等価物は、以下の特許請求の範囲によって包含されることが意
図される。
【０１８１】
本明細書に言及された全ての刊行物、特許、及び特許出願は、各々の個々の刊行物、特
許、又は特許出願が、その全体として引用により具体的かつ個別に組み込まれることが示
される場合と同じ程度に、引用により本明細書中に組み込まれる。
【図１Ａ−Ｃ】
2020183390.tif 000018
【図１Ｄ−Ｅ】
2020183390.tif 000019
【図１Ｆ−Ｈ】
2020183390.tif 000020
【図１Ｉ】
2020183390.tif 000021
【図１Ｊ−Ｌ】
2020183390.tif 000022
【図１Ｍ】
2020183390.tif 000023
【図１Ｎ】
2020183390.tif 000024
【図１Ｏ】
2020183390.tif 000025
【図１Ｐ】
2020183390.tif 000026
【図１Ｑ】
2020183390.tif 000027
【図２Ａ−１】
2020183390.tif 000028
【図２Ａ−２】
2020183390.tif 000029
【図２Ｂ】
2020183390.tif 000030
【図２Ｂ−２】
2020183390.tif 000031
【図２Ｃ】
2020183390.tif 000032
【図２Ｄ】
2020183390.tif 000033
【図２Ｅ】
2020183390.tif 000034
【図２Ｆ】
2020183390.tif 000035
【図３Ａ−Ｂ】
2020183390.tif 000036
【図３Ｃ】
2020183390.tif 000037
【図４Ａ】
2020183390.tif 000038
【図４Ｂ−Ｃ】
2020183390.tif 000039
【図５Ａ】
2020183390.tif 000040
【図５Ｂ】
2020183390.tif 000041
【図５Ｃ】
2020183390.tif 000042
【図５Ｄ】
2020183390.tif 000043
【図６】
2020183390.tif 000044
【図７】
2020183390.tif 000045
【図８】
2020183390.tif 000046
【図９】
2020183390.tif 000047
【図１０】
2020183390.tif 000048
【図１１】
2020183390.tif 000049
【図１２】
2020183390.tif 000050
【図１３Ａ−Ｃ】
2020183390.tif 000051
【図１３Ｄ−Ｆ】
2020183390.tif 000052
【図１３Ｇ−Ｈ】
2020183390.tif 000053
【配列表】
2020183390000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年7月20日(2020.7.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に実質的に記載された、新規な物、方法及び製造方法。
【手続補正書】
【提出日】令和2年7月20日(2020.7.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８１】
本明細書に言及された全ての刊行物、特許、及び特許出願は、各々の個々の刊行物、特
許、又は特許出願が、その全体として引用により具体的かつ個別に組み込まれることが示
される場合と同じ程度に、引用により本明細書中に組み込まれる。
本件出願は、以下の構成の発明を提供する。
（構成１）
患者における貧血を治療する方法であって、GDF11のアンタゴニストを投与することを
含む、前記方法。
（構成２）
患者における無効造血を治療する方法であって、GDF11のアンタゴニストを投与するこ
とを含む、前記方法。
（構成３）
患者におけるβサラセミアを治療する方法であって、GDF11のアンタゴニストを投与す
ることを含む、前記方法。
（構成４）
患者における正染性赤芽球(Ery-C)を増加させる方法であって、GDF11のアンタゴニスト
を投与することを含む、前記方法。
（構成５）
前記患者が、骨髄、脾臓、肝臓、血清、又は血漿中の上昇したGDF11レベルを有する、
構成1、2、3、又は4記載の方法。
（構成６）
前記GDF11のアンタゴニストがActRIIAポリペプチドである場合、該ActRIIAポリペプチ
ドはGDF11に優先的に結合する、構成1、2、3、又は4記載の方法。
（構成７）
前記GDF11のアンタゴニストがActRIIBポリペプチドである場合、該ActRIIBポリペプチ
ドはGDF11に優先的に結合する、構成1、2、3、又は4記載の方法。
（構成８）
前記GDF11のアンタゴニストが、GDF11の発現を低下させ、GDF11活性を低下させ、又はG
DF11タンパク質レベルを低下させる、構成1、2、3、又は4記載の方法。
（構成９）
前記GDF11のアンタゴニストが抗GDF11抗体である、構成1、2、3、又は4記載の方法。
（構成１０）
前記GDF11のアンタゴニストがGDF11に結合する切断された受容体である、構成1、2、3
、又は4記載の方法。
（構成１１）
前記GDF11のアンタゴニストがActRIIAの突然変異した細胞外ドメインを含み、ここで、
該ActRIIAの突然変異した細胞外ドメインは、ActRIIAの野生型と比較したとき、アクチビ
ンAと比べてGDF11に対する増大した親和性を有する、構成1、2、3、又は4記載の方法。
（構成１２）
GDF11レベルをモニタリングすることをさらに含む、構成1、3、又は4記載の方法。
（構成１３）
a.GDF11レベルを決定すること;及び
b.前記GDF11のアンタゴニストの用量を調整すること(ここで、GDF11が正常と比べて増
加している場合、該GDF11のアンタゴニストの用量を増加させ、GDF11が正常未満に減少し
ている場合、該GDF11のアンタゴニストの用量を減少させる)をさらに含む、構成1、3、又
は4記載の方法。
（構成１４）
前記GDF11レベルが、GDF11 mRNAレベル、GDF11タンパク質レベル、又はGDF11タンパク
質活性レベルとして決定される、構成12又は13記載の方法。
（構成１５）
前記投与することが、患者における後期好塩基性及び多染性赤芽球の細胞数の減少をも
たらす、構成1、3、又は4記載の方法。
（構成１６）
前記GDF11のアンタゴニストが、GDF11発現を低下させ、GDF11活性を低下させ、及び/又
はGDF11タンパク質レベルを低下させる、構成1、3、又は4記載の方法。
【外国語明細書】
2020183390000001.pdf