(57)【要約】【課題】本発明の課題は、パームオイル製造工程から排出されるＰＯＭＥを用いて微細藻類を効率的に増殖させることができる培養方法と微細藻類から高付加価値有価物を効率的に生産する方法を提供することである。【解決手段】ＰＯＭＥを用いＤＨＡ（ドコサヘキサエン酸）といったω-3多価不飽和脂肪酸を産生する従属栄養性微細藻類を培養することで、これらの従属栄養性微細藻類が効率良く増殖されるとともにＤＨＡが高濃度で生産される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＯＭＥを含む培地を使用する、従属栄養性微細藻類の培養方法。
【請求項２】
前記従属栄養性微細藻類がω―３多価不飽和脂肪酸を産生する藻類である、請求項１に記載の培養方法。
【請求項３】
ω―３多価不飽和脂肪酸は、ＤＨＡである、請求項２に記載の培養方法。
【請求項４】
前記藻類が、ヤブレツボカビ類（Thraustochytriales）に属する藻類の株である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の培養方法。
【請求項５】
前記ヤブレツボカビ類が、オーランチオキトリウム属（Aurantiochytrium）に属する種である、請求項４に記載の培養方法。
【請求項６】
前記オーランチオキトリウム属の藻類がオーランチオキトリウム  リマシナム（Aurantiochytrium limacinum）に属する培養株である、請求項５に記載の培養方法。
【請求項７】
前記オーランチオキトリウム属の藻類がオーランチオキトリウム  マングローベイ（Aurantiochytrium mangrovei）に属する培養株である、請求項５に記載の培養方法。
【請求項８】
前記オーランチオキトリウム  リマシナムの培養株が４Ｗ−１ｂ株、オーランチオキトリウム  リマシナムＳＲ−２１株、又はオーランチオキトリウム  リマシナムＮＩＥＳ３７３７株から選択されるいずれかの株である、請求項６に記載の培養方法。
【請求項９】
前記オーランチオキトリウム  マングローベイの培養株がオーランチオキトリウム  マングローベイ１８Ｗ−１３ａ株である、請求項７に記載の培養方法。
【請求項１０】
ＰＯＭＥは遠心分離及び／又はろ過により清澄される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の培養方法。
【請求項１１】
前記培地は、糖成分を更に含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の培養方法。
【請求項１２】
前記糖成分はグルコース、ガラクトース、フルクトース、マルトース、シュクロース、ラクトース、オリゴ糖、及びグリセロール等の糖アルコール、等から選択される1又は複数の糖類である、請求項１１に記載の培養方法。
【請求項１３】
前記糖成分の添加量は、合計として１０〜３０ｇ／培地Ｌである、請求項１１又は１２に記載の培養方法。
【請求項１４】
前記培地は、ミネラル成分を更に含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の培養方法。
【請求項１５】
前記ミネラル成分は、硫酸カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸アンモニウム、又は硫酸銅、硫酸ニッケル、硫酸亜鉛等の硫酸塩；リン酸カリウム等のリン酸塩、又は炭酸カルシウム等の炭酸塩；塩化コバルト、塩化マンガン、塩化ナトリウム、塩化カルシウム等の塩化物；アルカリ金属酸化物；モリブデン酸ナトリウム及び亜セレン酸ナトリウム等の亜セレン酸塩及びモリブデン酸塩；臭化カリウム又はヨウ化カリウム等のハロゲン化物；天然海水塩類；並びに人工海水塩類から選択される単一又は複数の塩類である、請求項１４に記載の培養方法。
【請求項１６】
前記ミネラル成分の添加量は、合計として５〜３５ｇ／培地Ｌである、請求項１４又は１５に記載の培養方法。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の培養方法で培養した従属栄養性微細藻類を回収すること、当該回収された藻類からＤＨＡを抽出することを含む、ＤＨＡ製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、パームオイル工場排出液(Palm Oil Mill Effluent: POME)を培地として使用する従属栄養性微細藻類の培養方法とDHA製造方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
インドネシアやマレーシア等、油椰子（オイルパーム）果実から抽出するパームオイル製造が基幹産業となっている国では、パームオイル工場排液（以下ＰＯＭＥと称す）が大きな環境・経済問題となっている。例えば、インドネシアでは、パームオイル製造工場から、約455,000t/日のＰＯＭＥがラグーンに放流され酸化池処理→嫌気性処理→好気性処理されている。この過程で、発酵ガスによる悪臭や害虫・害獣被害、水質汚濁等を引き起こし、嫌気処理により発生するメタンガスは大気へ放出されている状況である。メタンの地球温暖化係数は二酸化炭素に比べて21倍と非常に大きく、地球温暖化に悪影響を及ぼしている。このようにＰＯＭＥは、温暖化物質の放出と水質汚濁をひきおこし、地球温暖化や生活環境悪化や野生生物への悪影響等広範でかつ深刻な環境問題を引き起こしている。例えば、パームオイル生産産業は、インドネシア、マレーシア等の基幹産業となっていることから、ＰＯＭＥの環境問題の解決は、インドネシアやマレーシア等パームオイル産業が盛んな国家社会の持続的発展のために重大な課題となっている。
【０００３】
ＰＯＭＥの環境問題解決法として、上述のように嫌気状態でメタンガスが発生することから、これらを回収し、バイオガス発電を行う方法が知られている（特許文献１、２）。しかし、バイオガス発電量がそれ程高くないことから、採算性が悪く、ほとんどが事業として成立しない。その為、現地では依然としてＰＯＭＥの新たな利用方法へのニーズが高い。
【０００４】
従来から、微細藻類を増殖させ、微細藻類の細胞内に燃料、飼料、健康食品などの原料となる脂質、又は、タンパク質やビタミン等の有価物を生産・貯蔵させ、貯蔵した有価物を利用して燃料や食品等に利用することが行われている。特にω-3多価不飽和脂肪酸等高付加価値有価物の産生・貯蔵については、即産業化可能成分として注目されている。
【０００５】
この微細藻類の増殖は、下水・産業排水の浄化といった排水処理（特許文献３）や二酸化炭素の吸収・利用を目的とした排ガス処理など（特許文献４）にも利用されている。しかし、微細藻類が効率的に増殖しないと細胞内における有価物の貯蔵量が必ずしも十分なものとならないため、前記有価物の有効利用が困難になるおそれを有する。クロレラ等微細藻類はＰＯＭＥを利用して増殖することが報告されている（非特許文献１−５）が、藻体バイオマス生産性や脂質生産性が低く、ＰＯＭＥ利用効率が悪いことから、微細藻類からの高付加価値有価物の生産法は確立されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】再公表2017-026370号公報
【特許文献２】特許第6049937号公報
【特許文献３】特開平05-301097号公報
【特許文献４】特開2010-022331号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】HABIB et. al. “Growth and Nutritional Values of Moinamicrura Fed on Chlorella vulgaris Grown in Digested Palm Oil Mill Effluent”, Asian Fisheries Science, 16, 107-119, 2003
【非特許文献２】Putri et. al. “Investigation of Microalgae for High Lipid Content using Palm Oil Mill Effluent (Pome) as Carbon Source”, 2011 International Conference on Environment and Industrial Innovation, IPCBEE,12, 85-89, 2011
【非特許文献３】Nwuche et. al. “Use of Palm Oil Mill Effluent as Medium for Cultivation of Chlorella sorokiniana”, British Biotechnoloty Journal, 4(3): 305-316, 2014
【非特許文献４】Nur et. al. “Enhancement of Chlorella vulgaris Biomass Cultivated in POME Medium as Biofuel Feedstock under Mixotrophic Conditions”, Journal of Engineering and Technology Sciences, 47(5), 487-497, 2015
【非特許文献５】Cheah et. al. “Enhancing biomass and lipid productions of microalgae in palm oil mill effluent using carbon and nutrient supplementation”, Energy Conversion and Management, 164, 188-197, 2018
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、上記の問題点等に鑑み、パームオイル製造工程から排出されるＰＯＭＥを用いて微細藻類を効率的に増殖させることができる培養方法と微細藻類から高付加価値有価物を効率的に生産する方法を提供することを課題とする。
【０００９】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討を行ったところ、ＰＯＭＥを用い、必要に応じて糖などの有機炭素源およびミネラル成分を与えて又は与えずにＤＨＡ（ドコサヘキサエン酸）といったω-3多価不飽和脂肪酸を産生する従属栄養性微細藻類を培養することで、これらの従属栄養性微細藻類が効率良く増殖されるとともにＤＨＡが高濃度で生産されることを見出して本発明を完成させるにいたった。
【００１０】
即ち、上記課題を解決するための本発明に係る従属栄養性微細藻類の培養方法は、パームオイル製造過程でパーム果実からオイルをしぼりだした搾り汁を成分とするＰＯＭＥを用いて、高付加価値成分を産生する微細藻類を従属栄養培養することを特徴としている。
【００１１】
本発明に係る当該微細藻類の培養方法においてはパーム果実を圧搾してパームオイル製造後に生じる搾りかす汁を成分とするＰＯＭＥを供給することを特徴とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
従って、本願は、以下の発明を提供する。
（１）ＰＯＭＥを含む培地を使用する、従属栄養性微細藻類の培養方法。
（２）前記従属栄養性微細藻類がω―３多価不飽和脂肪酸を産生する藻類である、（１）に記載の培養方法。
（３）ω―３多価不飽和脂肪酸は、ＤＨＡである、（２）に記載の培養方法。
（４）前記藻類が、ヤブレツボカビ類（Thraustochytriales）に属する藻類の株である、（１）〜（３）のいずれか１項に記載の培養方法。
（５）前記ヤブレツボカビ類が、オーランチオキトリウム属（Aurantiochytrium）に属する種である（４）に記載の培養方法。
（６）前記オーランチオキトリウム属の藻類がオーランチオキトリウム  リマシナム（Aurantiochytrium limacinum）に属する培養株である（５）に記載の培養方法。
（７）前記オーランチオキトリウム属の藻類がオーランチオキトリウム  マングローベイ（Aurantiochytrium mangrovei）に属する培養株である（５）に記載の培養方法。
（８）前記オーランチオキトリウム  リマシナムの培養株が４Ｗ−１ｂ株、オーランチオキトリウム  リマシナムＳＲ−２１株、又はオーランチオキトリウム  リマシナムＮＩＥＳ３７３７株から選択されるいずれかの株である（６）に記載の培養方法。
（９）前記オーランチオキトリウム  マングローベイの培養株がオーランチオキトリウム  マングローベイ１８Ｗ−１３ａ株である、（７）に記載の培養方法。
（１０）ＰＯＭＥは遠心分離及び／又はろ過により清澄される、（１）〜（９）のいずれか１項に記載の培養方法。
（１１）前記培地は、糖成分を更に含む、（１）〜（１０）のいずれか１項に記載の培養方法。
（１２）前記糖成分はグルコース、ガラクトース、フルクトース、マルトース、シュクロース、ラクトース、オリゴ糖、及びグリセロール等の糖アルコール、等から選択される1又は複数の糖類である、（１１）に記載の培養方法。
（１３）前記糖成分の添加量は、合計として１０〜３０ｇ／培地Ｌである、（１１）又は（１２）に記載の培養方法。
（１４）前記培地は、ミネラル成分を更に含む、（１）〜（１３）のいずれか１項に記載の培養方法。
（１５）前記ミネラル成分は、硫酸カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸アンモニウム、又は硫酸銅、硫酸ニッケル、硫酸亜鉛等の硫酸塩；リン酸カリウム等のリン酸塩；炭酸カルシウム等の炭酸塩；塩化コバルト、塩化マンガン、塩化ナトリウム、塩化カルシウム等の塩化物；アルカリ金属酸化物；モリブデン酸ナトリウム及び亜セレン酸ナトリウム等の亜セレン酸塩及びモリブデン酸塩；臭化カリウム又はヨウ化カリウム等のハロゲン化物；天然海水塩類；並びに人工海水塩類から選択される単一又は複数の塩類である、（１４）に記載の培養方法。
（１６）前記ミネラル成分の添加量は、合計として５〜３５ｇ／培地Ｌである（１４）又は（１５）に記載の培養方法。
（１７）（１）〜（１６）のいずれか１項に記載の培養方法で培養した従属栄養性微細藻類を回収すること、当該回収された藻類からＤＨＡを抽出することを含む、ＤＨＡ製造方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、ＰＯＭＥの有効利用が図れるとともに、従属栄養性微細藻類の培養を効率的に行い、有価物としてＤＨＡを製造することができる。
【００１４】
驚くべきことに、ＰＯＭＥを添加した培地を使用すると、これまでの微細藻類ではみられない早い増殖速度でオーランチオキトリウム リマシナム４Ｗ−１ｂ株等のＤＨＡ産生藻類を良好に増殖させ、高濃度のＤＨＡ生産を達成した。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、ＰＯＭＥ上清液の添加率が１０〜５０％となるように調整した人工海水塩類の添加培地を用いた場合のオーランチオキトリウム リマシナム４Ｗ−１ｂ株の藻体濃度の経時変化を示す（ＯＤ６６０）。
【図２】図２は、ＰＯＭＥ上清液の添加率が１０〜５０％となるように調整した人工海水塩類の添加培地を用いた場合のオーランチオキトリウム リマシナム ４Ｗ−１ｂ株の総脂質（左図）およびＤＨＡ（右図）の生産を示す。
【図３】図３は、ＰＯＭＥ上清液（１００％）およびＰＯＭＥ上清液の添加率が１０〜７５％となるように調整した希釈液にグルコースと人工海水塩類を添加した培地を用いた場合のオーランチオキトリウム リマシナム ４Ｗ−１ｂ株の藻体濃度の経時変化を示す（ＯＤ６６０）。
【図４】図４は、ＰＯＭＥ上清液（１００％）およびＰＯＭＥ上清液の添加率が１０〜７５％となるように調整した希釈液にグルコースと人工海水塩類を添加した培地を用いた場合のＰＯＭＥ上清液の添加率とオーランチオキトリウム リマシナム ４Ｗ−１ｂ株の増殖量の相関関係を示す。
【図５】図５は、ＰＯＭＥ上清液（１００％）およびＰＯＭＥ上清液の添加率が１０〜７５％となるように調整した希釈液にグルコースと人工海水塩類を添加した培地を用いた場合のオーランチオキトリウム リマシナム ４Ｗ−１ｂ株の総脂質およびＤＨＡの生産を示す。
【図６】図６は、ＰＯＭＥ上清液（１００％）にグルコース、及び０．００％、０．３８％、０．７５％、１．５０％、３．００％（重量％）のレッドシー塩を添加した培地を用いた場合のオーランチオキトリウム リマシナム ４Ｗ−１ｂ株の藻体濃度の経時的変化（ＯＤ６６０）およびＤＨＡ濃度を示す。
【図７】図７は、ＰＯＭＥ上清液（１００％）にグルコースと人工海水塩類を添加した培地を用いた場合のオーランチオキトリウム属の各種株の総脂質およびＤＨＡの生産を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
一般に、パームオイルの製造工程は、パーム果房（Fresh Fruit Bunch：FFB）の不活化のためのスチーム処理、パーム果実とパーム空房（Empty Fruit Bunch：EFB）の分離、パーム果実からの果実部（メソカ）と種部の分離という前処理工程を経る。果実部からのクルードパームオイル抽出、分離精製へと進み、純度の高いパームオイルが製造される。本発明におけるＰＯＭＥとは、このパ−ムオイルの製造過程において生じる、使用済みスチーム水、オイル絞り汁と未回収オイルの混合排出液、及び／又は、上記の混合液を遠心分離により未回収オイルを除去または回収した排出液（温度が70-90℃）、および、それらが冷却後に酸化池処理→嫌気性処理→好気性処理を経て、放流される排液をいう。ＰＯＭＥは、原材料に由来する、糖質、有機酸、ビタミン、アミノ酸、ペプチド、タンパク質及びミネラル等を豊富に含有する。本発明の藻類の培養に使用するＰＯＭＥは、酸化池処理、嫌気性処理、又は好気性処理を行う前のものであっても処理後のものであってもよい。ある実施形態では、これら酸化池処理、嫌気性処理、及び好気性処理を行う前のＰＯＭＥを使用することが好ましい。
【００１７】
ＰＯＭＥは、原材料由来の様々な固形物を含有する。ＤＨＡ産生藻類の培養に際して、ＰＯＭＥは固形物を含有していてもいなくてもよく、限定されない。ＰＯＭＥ中の固形物を除去する場合には、遠心分離や濾過等、公知の手段により除去し得られた清澄なＰＯＭＥを培地に使用してもよい。
【００１８】
本発明において、ＰＯＭＥは、濾過滅菌、オートクレーブ滅菌、煮沸滅菌、及び放射線滅菌等、公知の手段で滅菌されるが、次亜塩素酸ソーダ、オゾン処理等、公知の手段で殺菌されてもよい。
【００１９】
本発明において、当該従属栄養性微細藻類の培地におけるＰＯＭＥの含有量は限定されないものの、例えば、１％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、７５％、１００％（容量％）の濃度で前記培養液中に含有されてもよい。
【００２０】
本発明において、ＰＯＭＥを含む培地に様々な添加物を添加することにより、当該培地が、ＤＨＡ産生藻類の培養に適した組成となるように調整されてもよい。当該添加物として、糖類、有機酸、無機酸、有機塩基、無機塩基、ビタミン、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、ミネラル（天然海水、人工海水等も含む）が挙げられる。ある実施形態では、糖類及び／又はミネラルを添加することが好ましい場合がある。ある実施形態では、ミネラルを添加しないことが好ましい場合がある。ミネラルを添加しないと装置の金属腐食を防止できる、培養後の排水処理や放流が容易になる、培地コストを低く抑えるという利点がある。更に、必要であれば適当な酸又は塩基を加えることにより適宜ｐＨを調整できる。培地の好適なｐＨは培養するＤＨＡ産生藻類の種類に依存し、例えば、ｐＨ６〜ｐＨ７に調整してもよい。
【００２１】
ミネラル成分としては、限定されないが、化学的に定義された無機塩、例えばアルカリ及びアルカリ土類金属塩、並びに他の金属の塩であってよい。このような無機塩として、例えば、硫酸カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸アンモニウム、又は硫酸銅、硫酸ニッケル、硫酸亜鉛等の硫酸塩；リン酸カリウム等のリン酸塩；炭酸カルシウム等の炭酸塩；塩化コバルト、塩化マンガン、塩化ナトリウム、塩化カルシウム等の塩化物；アルカリ金属酸化物；モリブデン酸ナトリウム及び亜セレン酸ナトリウム等の亜セレン酸塩及びモリブデン酸塩；臭化カリウム又はヨウ化カリウム等のハロゲン化物；天然海水塩類；並びにＲｅｄ Ｓｅａ Ｓａｌｔ（レッドシー塩）といった人工海水塩類；から選択される単一又は複数の塩類が挙げられる。前記塩類は、合計で０．０１〜５．０、５〜４０、５〜３５、１０〜３０、又は１０〜２５‰（ｇ／培地Ｌ）の量で添加されてもよい。例えば、ある実施形態では、前記塩類は、合計で１６．７‰（１６．７ｇ／培地Ｌ）の量で添加される。
【００２２】
ある実施形態では、追加的なミネラル成分、例えば、塩化物等の塩類を培地に添加しない。かかる実施形態では、培地はＰＯＭＥ等に元々含まれていた以外に追加的なミネラル成分を含まない。ＰＯＭＥを用いる本願発明の培地にミネラル成分を添加せずヤブレツボカビ類（Thraustochytriales）等のＤＨＡ産生藻類を培養するとＤＨＡ生産性が増加することがある。ＰＯＭＥ等に元々含まれていた以外に追加的なミネラル成分を含まない培地の場合、かかる培地におけるミネラルの濃度は、例えば、ＮａＣｌ量換算で合計６．０‰、５．０‰、４．０‰、３．０‰、２．０‰、１．０‰（ｇ／培地Ｌ）未満、Ｃｌ量換算で合計３．０‰、２．０‰、１．０‰（ｇ／培地Ｌ）未満であり得る。
【００２３】
ある実施形態では、ＰＯＭＥとともに糖類を培養液に含有させることで、該従属栄養性微細藻類の増殖が促進される場合がある。糖類は、従属栄養性微細藻類の炭素源となるものであるが、ＰＯＭＥ原液に微細藻類が利用可能な糖類が十分に含有されていない場合や、該従属栄養性微細藻類の増殖を促進したい場合には、何等かの形で微細藻類が利用可能な糖類を培養液に添加してもよい。
【００２４】
糖類としては、限定されないが、例えば、グルコース、ガラクトース、フルクトース、マルトース、シュクロース、ラクトース、オリゴ糖、及びグリセロール等の糖アルコール、等から選択される1又は複数の糖類が挙げられる。前記糖類は、合計で５〜４０、１０〜３０、１５〜２５（ｇ／培地Ｌ）の量で添加されてもよい。例えば、ある実施形態では、前記糖類は、合計で２０‰（２０ｇ／培地Ｌ）の量で添加される。
【００２５】
本発明で使用する微細藻類としては、特にＤＨＡ等ω-３多価不飽和脂肪酸を産生する藻類（以下ＤＨＡ等産生藻類と称す）であってもよい。ＤＨＡ等産生藻類としては、ヤブレツボカビ類（Thraustochytriales）に属する生物であるオーランチオキトリウム属（Aurantiochytrium）、シゾキトリウム属（Schizochytrium）、スラウストキトリウム属（Thraustochytrium）、パリエティキトリウム属(Parietichytrium)、又はウルケニア属(Ulkenia)に属する生物、あるいはオブロンギキトリウム(Oblongichytrium)属に属する生物などが挙げられる。
前記オーランチオキトリウム（Aurantiochytrium）属に属する生物としては、例えば、オーランチオキトリウム  リマシナム（Aurantiochytrium limacinum）、オーランチオキトリウム  マングローベイ（Aurantiochytrium mangrovei）などが挙げられる。
前記シゾキトリウム（Schizochytorium）属に属する生物としては、例えば、Schizochytrium aggregatumなどが挙げられる。例えば、Schizochytrium sp. Maku-1等の株が使用できる。
前記スラウストキトリウム（Thraustochytrium）属に属する生物としては、例えば、Thraustochytrium aureum、Thraustochytrium pachydermum、Thraustochytrium aggregatumなどが挙げられる。
前記パリエティキトリウム(Parietichytrium)属に属する生物としては、例えば、Parietichytrium sarkarianumなどが挙げられる。例えば、Parietichytrium sp. 6F-10b等の株が使用できる。
前記ウルケニア属(Ulkenia)属に属する生物としては、例えば、Ulkenia visurgensis、又は、Ulkenia profundaなどが挙げられる。例えば、Ulkenia sp. Yonez6-9等の株が使用できる。
前記オブロンギキトリウム(Oblongichytrium)属に属する生物としては、例えば、Oblongichytrium multirudimentale、Oblongichytrium minutumなどが挙げられる。例えば、Oblongichytrium sp. H9等の株が使用できる。
特に好ましいのはオーランチオキトリウム属の藻類であり、例えば、オーランチオキトリウム  リマシナム４Ｗ−１ｂ株、オーランチオキトリウム  リマシナムＳＲ−２１株、及びオーランチオキトリウム  リマシナムＮＩＥＳ３７３７株などのオーランチオキトリウム  リマシナムの株、並びにオーランチオキトリウム  マングローベイ１８Ｗ−１３ａ株などのオーランチオキトリウム  マングローベイの株等が使用できる。
【００２６】
本発明におけるＤＨＡ等産生藻類の培養は、当該藻類を上記のように調整されたＰＯＭＥを含む培地に播種し、定法にしたがって培養することにより行われる。培養条件は培養するＤＨＡ等産生藻類の種類に依存し、温度は５〜４０℃、好ましくは１０〜３５℃、特に好ましいのは２０〜２５℃、より好ましくは２５℃±１℃にて、通常１〜１０日間、好ましくは３〜７日間、例えば４〜５日間培養を行い、通気攪拌培養、振とう培養又は静置培養で行うことができる。
【００２７】
本発明に使用するＤＨＡ等産生藻類は、適当な細胞培養手段を有する培養装置で培養してよい。「細胞培養手段」とは、細胞を培養するためのあらゆる機能を有する手段を意味し、例えば、培養槽であり、当該培養槽は、攪拌装置、振動装置、温度制御装置、ｐＨ調節装置、濁度測定装置、光制御装置、Ｏ２、ＣＯ２等の特定気体濃度測定装置及び圧力測定装置から選択される１又は複数の装置を有してもよい。当該培養槽は濃縮・分離槽と同一の槽であっても、濃縮・分離槽とは別の槽であってもよい。濃縮・分離槽と別の槽である場合、適切な手段、例えば流路等により連結されていてもよい。
【００２８】
本発明はさらに、ＰＯＭＥを含む培地を使用し上記培養方法で培養したＤＨＡ産生藻類を回収し、当該回収されたＤＨＡ等産生藻類からＤＨＡを抽出する、ＤＨＡ製造方法を提供する。本発明のＤＨＡ製造方法は、ＰＯＭＥを含む培地を使用してＤＨＡ等産生藻類を培養することにより、当該ＤＨＡ等産生藻類にＤＨＡを産生させることを特徴とする。
【００２９】
本発明のＤＨＡ等産生藻類が産生するＤＨＡは、当業者に既知の方法で抽出及び分析することができる。例えば、上記の通りＤＨＡ産生藻類を培養して増殖させ、得られた培養液からＤＨＡ産生藻類を回収する場合は、遠心分離又は濾過等既存の方法で回収することができる。回収したＤＨＡ産生藻類のペレットを、凍結乾燥又は加温による乾燥等により乾燥させた藻体、または、ＤＨＡ産生藻類培養を濃縮したのち乾燥していない湿潤の藻体をＤＨＡの抽出ステップに用いてもよい。
【００３０】
得られた乾燥藻体、又は湿潤藻体から、ＤＨＡを抽出できる。抽出方法は、特に限定されず、有機溶媒抽出や圧搾、超臨界抽出等既知の方法で行うことができる。有機溶媒抽出法に用いられる有機溶媒としては、例えばヘキサン、アセトン、クロロホルム、メタノール、エタノール、ジエチルエーテル等が挙げられ、単体で用いてもよく、又は極性溶媒と無極性溶媒といった２液以上の混合液を用いることもできる。抽出前に藻体を破砕してもよく、以下に限定されないが、アルカリや酸による化学的破砕、ホモジナイザーや超音波、ビーズミル等の機械的破砕、酵素による生物的破砕等、既知の方法で行ってもよい。上記抽出後に、得られた抽出液を、当業者に既知の方法で濃縮・精製してもよく、例えば、シリカゲルや酸性白土を用いたカラムクロマトグラフィ、高速液体クロマトグラフィ、液液分配、尿素付加法等を既知の方法を用いて、濃縮・精製してもよい。
【００３１】
前記ＤＨＡ等産生藻類は、その乾燥重量当たり、少なくとも５％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％（重量％）のＤＨＡを含有することがある。
【実施例】
【００３２】
次に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１：ＰＯＭＥ上清液の添加率が１０〜５０％となるように調整した人工海水塩類の添加培地におけるオーランチオキトリウム リマシナム４Ｗ−１ｂ株の増殖、総脂質とＤＨＡの生産
（種藻）
下記培地にて、筑波大学から提供されたヤブレツボカビ類に属するオーランチオキトリウム リマシナム４Ｗ−１ｂ株をＧＴＹ培地（1/2希釈海水１Ｌにグルコース２０ｇ、酵母エキス５ｇ、トリプトン１０ｇ含有）で４日間培養し、種藻とした。
【００３３】
２０１８年４月にインドネシアのリアウ州にある工場から提供された高温のＰＯＭＥを速やかに冷蔵庫で冷却して３日間保存したのち、５０００ｒｐｍ、１５分で遠心分離後、上清液（以下ＰＯＭＥ上清液と称す）を得た。ＰＯＭＥ上清液の添加率が１０％、２５％、５０％（容量％）となるように１６．７ｇ／Ｌのレッドシー塩（人工海水塩類）を含む培地を作成した。
【００３４】
上記各培地を、５００ｍｌ容積の三角フラスコに２００ｍｌ注ぎ、オートクレーブで１２０℃、２０分間滅菌した。培地冷却後にオーランチオキトリウム リマシナム ４Ｗ−１ｂ株の種藻を滅菌海水で洗浄したのち、培地に播種した。フラスコの口をシリコ栓で封じ、２５℃で往復振盪培養した（１００ストローク／分）。
【００３５】
培養中の培養液１ｍｌを所定のタイムポイントで回収し、紫外可視吸光度計により６６０ｎｍの光学濁度を計測することで、増殖曲線を得た。培養は、全ての培養で増殖がプラトーに達するまで、最長で４８時間実施された。培養終了後の培養液を５０〜１００ｍＬ回収し、高速冷却遠心分離機で３９００ｒｐｍ、１５分遠心分離した。その後、上清を捨て、ペレットを蒸留水で洗浄し、再度遠心分離を行った。その後、試料を−８０℃で凍結し、これらを凍結乾燥機で乾燥させることで、乾燥藻体を得た。乾燥藻体重量を微量天秤により計量し、培養液１Ｌ当たりの藻体量を算出した。
【００３６】
上記藻類培養液１０ｍＬから遠心分離により回収した藻体ペレットを超音波破砕し、クロロホルム／メタノール（体積比２：１）混合溶液２０ｍＬを添加後、よく混合した。さらに、0.9％塩化ナトリウム水溶液4mLを加えてよく混合し、遠心分離後、クロロホルム層をろ紙でろ過しながら回収した。当該濾液を濃縮乾固して、脂質量を測定した。当該脂質に内部標準物質としてトリコメサンメチルエステルを０．２ｍｇ加え、０．５Ｍ  ＮａＯＨメタノール溶液０．５ｍＬを添加し、１００℃、９分間でけん化反応を行った後、14％三フッ化ホウ素メタノール溶液０．７ｍＬを加え、１００℃、7分間でメチルエステル化反応を行った。当該試料に飽和食塩水３ｍＬとヘキサン３ｍＬを加えてよく混合し、遠心分離後、ヘキサン層をＧＣ（ガスクロマトグラフィー）分析によりＤＨＡ含有量を測定した。
【００３７】
以上の結果を図１、図２に示す。
図１は、ＰＯＭＥ上清液の添加率１０％、２５％、及び、５０％系列の培地で培養したオーランチオキトリウム  リマシナム４Ｗ−１ｂの藻体濃度の経時変化を示す（ＯＤ６６０）。すべての添加率培地で当該株は増殖しており、ＰＯＭＥ濃度（添加率）が高いほど当該株の増殖が高くなった。
図２は培養４８時間後の総脂質とＤＨＡの生産量を示す。すべての添加率培地で脂質およびＤＨＡが産生され、ＰＯＭＥ濃度（添加率）が高いほど、当該株の脂質およびＤＨＡの生産量が高くなった。
【００３８】
表１に実施例１の各添加率培地において当該株を４８時間増殖させた後の増殖量（ｇ／Ｌ）、藻体生産性（ｍｇ／Ｌ／日）、脂質含有量（％）、総脂質量（ｍｇ／Ｌ）、脂質生産性（ｍｇ／Ｌ／日）、ＤＨＡ含有量（％）、ＤＨＡ生産量（ｍｇ／Ｌ）、およびＤＨＡ生産性（ｍｇ／Ｌ／日）をまとめた表を示す。生産性は、48時間増殖後の藻体量、総脂質量、およびＤＨＡ量をそれぞれ１日当たりに換算した値である。脂質含有量及びＤＨＡ含有量は、それぞれ藻体量に対する割合を示す（重量％）。
【表１】
2020054391.tif 000003
【００３９】
ＰＯＭＥ濃度（添加率）が高いほど、藻体増殖量・生産性、総脂質およびＤＨＡの生産量・生産性が高くなり、特に藻体生産性と脂質生産性はそれぞれ１７６０ｍｇ／Ｌ／日および３９５ｍｇ／Ｌ／日と高くなっていた。
【００４０】
表２にＰＯＭＥを用いて他の微細藻類を培養した従来技術と本願発明との藻体増殖量・生産性および総脂質生産量・生産性についての比較を示す。
【表２】
2020054391.tif 000004
【００４１】
表２より、従来技術の微細藻類の藻体生産性は２．９〜１，０４０（ｍｇ／Ｌ／日）であるのに対し、本願発明の藻体生産性は５０％ＰＯＭＥ、グルコース無添加の培地を使用した場合でも１，７６０（ｍｇ／Ｌ／日）であり、１．７倍〜６００倍もの高い値を示した。また、従来技術の微細藻類の総脂質生産性は０．６３（ｍｇ／Ｌ／日）〜１００．９（ｍｇ／Ｌ／日）であるのに対し、本願発明においてオーランチオキトリウム リマシナム ４Ｗ−１ｂを用いた場合の藻体生産性は５０％ＰＯＭＥ、グルコース無添加の培地を使用した場合でも３．９倍〜６２６倍もの高い値を示した。下記に示すように、１００％ＰＯＭＥを使用し、２０ｇ／Ｌのグルコース添加した培地を使用した場合これらの効果はさらに顕著になった。さらに、従来技術の微細藻類はいずれも飽和脂肪酸もしくは一価の不飽和脂肪酸を主成分とした脂質を蓄積するものであり、ここから有価物であるＤＨＡなどのω-3多価不飽和脂肪酸を得ることは困難である。
【００４２】
実施例２：ＰＯＭＥ上清液（１００％）およびＰＯＭＥ上清液の添加率が１０〜７５％となるように調整した希釈液にグルコースと人工海水塩類を添加した培地とした場合のオーランチオキトリウム リマシナム ４Ｗ−１ｂ株の増殖、総脂質とＤＨＡの生産
実施例１と同じＰＯＭＥと種藻を使い、同様の方法で得たＰＯＭＥ上清液（１００％）に２０ｇ／Ｌのグルコースと１６．７ｇ／Ｌのレッドシー塩をを添加して１００％ＰＯＭＥ培地を作成した。また、ＰＯＭＥ上清液の添加率が１０％、２５％、５０％、７５％（容量％）となるように蒸留水で希釈し、１６．７ｇ／Ｌのレッドシー塩と２０ｇ／Ｌのグルコースを含むように調整した培地も作成した。これらを、ＰＯＭＥの添加系列とした。そして、上記実施例１について行ったのと同様に、ＯＤでオーランチオキトリウム  リマシナム４Ｗ−１ｂの増殖を評価するとともに、藻体の乾燥重量を測定して培養液１Ｌ当たりの藻体量を算出し、総脂質とＤＨＡ量を測定した。
【００４３】
以上の結果を図３、図４、図５に示す。
図３は作成したＰＯＭＥの添加系列を培地とした場合の、当該藻類株の藻体濃度の経時変化を示す（ＯＤ６６０）。グルコース無添加条件でおこなった実施例１のＰＯＭＥ添加率１０％，２５％、５０％と比較して、実施例２のグルコースを添加したＰＯＭＥ１０％、２５％及び５０％の添加系列の各々において、当該株はあきらかに高い増殖を示した。さらに実施例１と同様にＰＯＭＥ濃度（添加率）が高いほど、増殖は高くなり、１００％ＰＯＭＥ含有培地で最も高い増殖を示した。図４にＰＯＭＥ添加率と増殖量の関係を示した。添加率（x）と増殖量（y）の関係は、ｙ＝４．２３０８ｘ＋１．６４（Ｒ２＝０．９５７９）の直線的比例関係にあることがわかった。
図５は培養４８時間後の総脂質とＤＨＡの生産量を示す。実施例１と同様にすべての添加率培地で脂質およびＤＨＡが産生され、ＰＯＭＥの添加率が高いほど、脂質およびＤＨＡの生産量が高くなり、１００％ＰＯＭＥ含有培地で最も高い生産を示した。
【００４４】
表３に実施例２の各添加率培地において当該株を４８時間増殖させた後の増殖量（ｇ／Ｌ）、藻体生産性（ｍｇ／Ｌ／日）、脂質含有量（％）、総脂質量（ｍｇ／Ｌ）、脂質生産性（ｍｇ／Ｌ／日）、ＤＨＡ含有量（％）、ＤＨＡ生産量（ｍｇ／Ｌ）、およびＤＨＡ生産性（ｍｇ／Ｌ／日）をまとめた表を示す。各数値の求め方および単位は表１と同様である。
【表３】
2020054391.tif 000005
【００４５】
グルコース無添加条件でおこなった実施例１と比較して、実施例２のグルコースを添加したＰＯＭＥ１０％、２５％及び５０％の添加系列の各々において、当該株はあきらかに高い増殖を示した。表３に示すように、表１のグルコース無添加系の５０％添加系列と比較して、グルコース添加での５０％添加系列では藻体生産性は２，８１５ｍｇ／Ｌ／日と２倍、総脂質生産性は１，１１０ｍｇ／Ｌ／日と２．８倍、ＤＨＡ生産性は２２８．５ｍｇ／Ｌ／日と７．７倍も高かった。また、表３に示すように、１００％ＰＯＭＥでのグルコース添加での当該株の藻体生産性は４，１５０ｍｇ／Ｌ／日、脂質生産性は１，６７５ｍｇ／Ｌ／日と、従来技術の他の微細藻類の藻体生産性や総脂質生産性と比較すると、それぞれ４倍〜１４３０倍および１６．６倍〜２６６０倍の高い値を示した。
【００４６】
実施例３：ＰＯＭＥ上清液（１００％）にグルコースおよび各濃度の人工海水塩類を添加した培地におけるオーランチオキトリウム リマシナム ４Ｗ−１ｂ株の増殖の経時変化およびＤＨＡ濃度
実施例１、２と同じＰＯＭＥと種藻を使い、同様の方法で得たＰＯＭＥ上清液（１００％）に２０ｇ／Ｌのグルコース、及び０．００％、０．３８％、０．７５％、１．５０％、３．００％（重量％）のレッドシー塩を添加した。
【００４７】
実施例１、２と同様に、培地を滅菌し冷却後、同じ培養条件（５００ｍＬ容三角フラスコ（培地仕込み量２００ｍＬ）、２５℃、往復振盪培養（１００ストローク／分））で培養し、ＯＤでオーランチオキトリウム  リマシナム４Ｗ−１ｂの増殖を評価するとともに、藻体の乾燥重量を測定して培養液１Ｌ当たりの藻体量を算出し、ＤＨＡ濃度を測定した。
【００４８】
結果を図６に示す。図６は藻体濃度（ＯＤ６６０）の経時的変化および、４８時間増殖させた後のＤＨＡ濃度を示す。藻体濃度は添加ミネラル成分の濃度にあまり影響されなかったが、ＤＨＡの濃度は添加ミネラル成分濃度が低い（０．００％、０．３８％、０．７５％添加）ほうが、高い（１．５０％、３．００％添加）場合に比べて高い傾向にあった。つまり、添加したミネラル成分の濃度が低いほうがＤＨＡ生産量（ｍｇ／Ｌ）が優れていることがわかる。
【００４９】
なお、ミネラル成分およびグルコースを添加する前のＰＯＭＥ上清液（１００％）の塩濃度を測定したところ、Ｃｌ（塩化物イオン）換算で２２３０（ｍｇ／Ｌ）であった。これは、１２．５重量％の海水に相当し、ＮａＣｌ換算で約０．３７５重量％に相当する。つまり、ミネラル成分を追加しなくてもＰＯＭＥに元々含まれていたミネラル成分のみで増殖に十分であり、ＤＨＡ生産量についてはより好ましいことがわかる。
【００５０】
実施例４：オーランチオキトリウム属の各種株を用いた培養試験
インドネシアの北スマトラ州にある工場から提供されたＰＯＭＥを用いた以外は実施例１〜３と同様の方法で得たＰＯＭＥ上清液（１００％）に２０ｇ／Ｌのグルコースと１６．７ｇ／Ｌのレッドシー塩を添加して１００％ＰＯＭＥ培地を作成し、滅菌および冷却を行った。以下の表４に示すオーランチオキトリウム属の各種株を用いて実施例１〜３と同様の培養条件（５００ｍＬ容三角フラスコ（培地仕込み量２００ｍＬ）、２５℃、往復振盪培養（１００ストローク／分））で培養し、ＯＤで各種株の増殖を評価するとともに、藻体の乾燥重量を測定して培養液１Ｌ当たりの藻体量を算出し、総脂質とＤＨＡ濃度を測定した。
【表４】
2020054391.tif 000006
【００５１】
結果を図７および表５に示す。図７はオーランチオキトリウム属の各種株の総脂質量（ｍｇ／Ｌ）とＤＨＡ濃度（ｍｇ／Ｌ）を示す。表５は、実施例４において各種株を一定時間増殖させた後の増殖量（ｇ／Ｌ）、藻体生産性（ｍｇ／Ｌ／日）、脂質含有量（％）、総脂質量（ｍｇ／Ｌ）、脂質生産性（ｍｇ／Ｌ／日）、ＤＨＡ含有量（％）、ＤＨＡ生産量（ｍｇ／Ｌ）、およびＤＨＡ生産性（ｍｇ／Ｌ／日）をまとめた表である。各値の定義は表１と同じである。これらの結果より、オーランチオキトリウム属の藻類は、本発明の培地を用いると、非常に優れた藻体増殖量・生産性、総脂質およびＤＨＡの生産量・生産性を示すことが分かる。
【表５】
2020054391.tif 000007
【００５２】
実施例５：他のＤＨＡ産生藻類の各種株を用いた培養試験
以下の表６に示すようなヤブレツボカビ類およびその他のＤＨＡ産生藻類の各種株を用いる以外は実施例４と同一の条件で培養を行い、藻体、総脂質、およびＤＨＡの生産性を測定した。
【表６】
2020054391.tif 000008
【００５３】
結果を表７に示す。表７は、実施例５において各種株を増殖させた後の藻体生産性（ｍｇ／Ｌ／日）、脂質生産性（ｍｇ／Ｌ／日）、およびＤＨＡ生産性（ｍｇ／Ｌ／日）をまとめた表である。各値の定義は、表１と同じである。なお、培養時間が各株により異なるため生産性のみを記載した。これらの結果より、ヤブレツボカビ類をはじめとするＤＨＡ産生藻類は総じて、本発明の培地を用いると、非常に優れた藻体生産性、総脂質およびＤＨＡの生産性を示すことが分かる。
【表７】
2020054391.tif 000009
【図１】
2020054391.tif 000010
【図２】
2020054391.tif 000011
【図３】
2020054391.tif 000012
【図４】
2020054391.tif 000013
【図５】
2020054391.tif 000014
【図６】
2020054391.tif 000015
【図７】
2020054391.tif 000016
【手続補正書】
【提出日】令和2年1月17日(2020.1.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ω―３多価不飽和脂肪酸の生産方法であって、
ＰＯＭＥを含む培地を使用して従属栄養性微細藻類を培養することを含む、前記方法。
【請求項２】
ω―３多価不飽和脂肪酸高含有組成物の生産方法であって、
ＰＯＭＥを含む培地を使用して従属栄養性微細藻類を培養することを含む、前記方法。
【請求項３】
従属栄養性微細藻類の培養方法であって、
ω―３多価不飽和脂肪酸を得るために、ＰＯＭＥを含む培地を使用して従属栄養性微細藻類を培養することを含む、前記方法。
【請求項４】
従属栄養性微細藻類の培養方法であって、
ω―３多価不飽和脂肪酸高含有組成物を得るために、ＰＯＭＥを含む培地を使用して従属栄養性微細藻類を培養することを含む、前記方法。
【請求項５】
ＰＯＭＥを含む培地を使用する従属栄養性微細藻類の培養方法であって、
該培養方法で培養された従属栄養性微細藻類の藻類生産性、脂質生産性、ＤＨＡ生産性の少なくとも一つはＰＯＭＥ濃度に依存する、前記方法。
【請求項６】
ω―３多価不飽和脂肪酸は、ＤＨＡである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の培養方法。
【請求項７】
前記藻類が、ヤブレツボカビ類（Thraustochytriales）に属する藻類の株である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の培養方法。
【請求項８】
前記ヤブレツボカビ類が、オーランチオキトリウム属（Aurantiochytrium）に属する種である、請求項７に記載の培養方法。
【請求項９】
前記オーランチオキトリウム属の藻類がオーランチオキトリウム  リマシナム（Aurantiochytrium limacinum）に属する培養株である、請求項８に記載の培養方法。
【請求項１０】
前記オーランチオキトリウム属の藻類がオーランチオキトリウム  マングローベイ（Aurantiochytrium mangrovei）に属する培養株である、請求項８に記載の培養方法。
【請求項１１】
前記オーランチオキトリウム  リマシナムの培養株が４Ｗ−１ｂ株、オーランチオキトリウム  リマシナムＳＲ−２１株、又はオーランチオキトリウム  リマシナムＮＩＥＳ３７３７株から選択されるいずれかの株である、請求項９に記載の培養方法。
【請求項１２】
前記オーランチオキトリウム  マングローベイの培養株がオーランチオキトリウム  マングローベイ１８Ｗ−１３ａ株である、請求項１０に記載の培養方法。
【請求項１３】
ＰＯＭＥは遠心分離及び／又はろ過により清澄される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の培養方法。
【請求項１４】
前記培地は、糖成分を更に含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の培養方法。
【請求項１５】
前記糖成分はグルコース、ガラクトース、フルクトース、マルトース、シュクロース、ラクトース、オリゴ糖、及びグリセロール等の糖アルコール、等から選択される1又は複数の糖類である、請求項１４に記載の培養方法。
【請求項１６】
前記糖成分の添加量は、合計として１０〜３０ｇ／培地Ｌである、請求項１４又は１５に記載の培養方法。
【請求項１７】
前記培地は、ミネラル成分を更に含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の培養方法。
【請求項１８】
前記ミネラル成分は、硫酸カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸アンモニウム、又は硫酸銅、硫酸ニッケル、硫酸亜鉛等の硫酸塩；リン酸カリウム等のリン酸塩、又は炭酸カルシウム等の炭酸塩；塩化コバルト、塩化マンガン、塩化ナトリウム、塩化カルシウム等の塩化物；アルカリ金属酸化物；モリブデン酸ナトリウム及び亜セレン酸ナトリウム等の亜セレン酸塩及びモリブデン酸塩；臭化カリウム又はヨウ化カリウム等のハロゲン化物；天然海水塩類；並びに人工海水塩類から選択される単一又は複数の塩類である、請求項１７に記載の培養方法。
【請求項１９】
前記ミネラル成分の添加量は、合計として５〜３５ｇ／培地Ｌである、請求項１７又は１８に記載の培養方法。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれか１項に記載の培養方法で培養した従属栄養性微細藻類を回収すること、当該回収された藻類からＤＨＡを抽出することを含む、ＤＨＡ製造方法。