(57)【要約】      （修正有）【課題】αフェトプロテイン(AFP)に由来するHLA-A2制限FMNKFIYEI(158〜166)ペプチドエピトープに結合するＴ細胞レセプター(TCR)を提供する。【解決手段】少なくとも１つのTCRα鎖可変ドメイン及び/又は少なくとも１つのTCRβ鎖可変ドメインを含んでなり、前記α鎖可変ドメインは、特定の配列のアミノ酸残基１〜112の配列に対して少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、そして/又は、前記β鎖可変ドメインは、他の特定の配列のアミノ酸残基１〜112の配列に対して少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、Ｔ細胞レセプター。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
FMNKFIYEI(配列番号１)-HLA-A2複合体に対する結合特性を有し、少なくとも１つのTCR α鎖可変ドメイン及び/又は少なくとも１つのTCR β鎖可変ドメインを含んでなり、
α鎖可変ドメインは、配列番号２のアミノ酸残基１〜112の配列に対して少なくとも90
％同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、及び/又は
β鎖可変ドメインは、配列番号３のアミノ酸残基１〜112の配列に対して少なくとも90
％同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、
天然に存在しない及び/又は精製された及び/又は遺伝子操作されたＴ細胞レセプター(TCR)。
【請求項２】
α鎖可変ドメインが、31Q、32S、94D、95S、96G、97Y及び98Aに相当するアミノ酸の１以
上で変異を含む、請求項１に記載のTCR。
【請求項３】
α鎖可変ドメインが以下の変異：
【表１】
2020054364.tif 000006
のうちの少なくとも１つを含む、請求項１又は２に記載のTCR。
【請求項４】
α鎖可変ドメインが、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19及び配列番号20のうちのいずれか１つの残基１〜112に対し
て少なくとも90％同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、請求項１〜３のいずれか１項に記載のTCR。
【請求項５】
α鎖可変ドメインが配列番号11、配列番号12又は配列番号13のQ1〜H112を含んでなり、及び/又はβ鎖可変ドメインが配列番号３のD1〜T112を含んでなる、請求項１〜４のいずれ
か１項に記載のTCR。
【請求項６】
α鎖可変ドメインが配列番号２のアミノ酸残基１〜112を含んでなり、β鎖可変ドメイン
が配列番号３のアミノ酸残基１〜112を含んでなる、請求項１に記載のTCR。
【請求項７】
α鎖TRAC定常ドメイン配列及び/又はβ鎖TRBC1若しくはTRBC2定常ドメイン配列を有する
、請求項１〜６のいずれか１項に記載のTCR。
【請求項８】
α及び/又はβ鎖定常ドメイン配列が、TRACのエキソン２のCys4とTRBC1又はTRBC2のエキ
ソン２のCys2との間の天然型ジスルフィド結合を欠失するように短縮又は置換により改変されている、請求項７に記載のTCR。
【請求項９】
α及び/又はβ鎖定常ドメイン配列が、TRACのThr 48から及びTRBC1又はTRBC2のSer 57か
らシステイン残基への置換により改変されており、該システイン同士が該TCRのα定常ド
メインとβ定常ドメインとの間のジスルフィド結合を形成している、請求項７又は８に記
載のTCR。
【請求項１０】
Vα-L-Vβ型、Vβ-L-Vα型、Vα-Cα-L-Vβ型、Vα-L-Vβ-Cβ型又はVα-Cα-L-Vβ-Cβ
型(式中、Vα及びVβはそれぞれTCR α及びβ可変領域であり、Cα及びCβはそれぞれTCR
α及びβ定常領域であり、Lはリンカー配列である)の単鎖形式である、請求項１〜９の
いずれか１項に記載のTCR。
【請求項１１】
α-βヘテロ二量体である、請求項１〜９のいずれか１項に記載のTCR。
【請求項１２】
検出可能な標識、治療剤又はPK調節成分と結合した、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のTCR。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載のTCRをコードする、天然に存在しない及び/又は精製された及び/又は遺伝子操作された核酸。
【請求項１４】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載のTCRを提示する、天然に存在しない及び/又は精製された及び/又は遺伝子操作された細胞、特にＴ細胞。
【請求項１５】
(ａ)単一のオープンリーディングフレーム又はそれぞれα鎖及びβ鎖の２つの異なるオープンリーディングフレームをコードする請求項１３に記載の核酸を含んでなるTCR発現
ベクター；又は
(ｂ)請求項１〜１２のいずれか１項に記載のTCRのα鎖をコードする核酸を含んでなる
第１の発現ベクター、及び請求項１〜１２のいずれか１項に記載のTCRのβ鎖をコードす
る核酸を含んでなる第２の発現ベクター
を有する細胞。
【請求項１６】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載のTCR又は請求項１４若しくは１５に記載の細胞を
、１以上の医薬的に許容され得る担体又は賦形剤と共に含んでなる医薬組成物。
【請求項１７】
医薬において使用するための、ペプチド-HLA-A2複合体として提示されているFMNKFIYEI(
配列番号１)ペプチドに結合する天然に存在しない及び/又は精製された及び/又は遺伝子
操作されたTCR、又は該TCRを発現及び/又は提示する細胞。
【請求項１８】
ガンの治療法に使用するための、請求項１７に記載のTCR又は細胞。
【請求項１９】
治療法が養子免疫療法を含む、請求項１８に記載のTCR又は細胞。
【請求項２０】
TCRが請求項１〜１２のいずれか１項に記載されるものであり及び/又は細胞が請求項１４又は１５に記載されるものである、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載のTCR又は細
胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、αフェトプロテイン(AFP)に由来するHLA-A2制限FMNKFIYEI(158-166)ペプチドエピトープに結合するＴ細胞レセプター(TCR)に関する。本発明の或る特定の好適なTCRは、このAFPエピトープに関する優れた結合特性及び特異性プロフィールを証明している。
【背景技術】
【０００２】
AFPは胎児発生の間に発現され、胎児血清の主成分である。発生の間、このタンパク質は、卵黄嚢及び肝臓により非常に高レベルで産生され、その後抑制される。AFP発現は、肝細胞ガンで頻繁に再活性化され(Butterfieldら，J Immunol., 2001, Apr 15;166(8):5300-8)、このタンパク質の高レベルは当該疾患の診断マーカーとして使用される。
肝細胞ガンは、全ての悪性腫瘍のうち、米国で報告されている５年生存率が最も低いものの１つであり、世界的な発生は年間1.2百万人であり、Ｂ型及びＣ型肝炎の流行に起因して増加しそうである。処置として代表的には外科手術が挙げられるが、これは、この疾患の初期段階で行なわれたときにのみ有益である。したがって、新たな処置が望まれている。
【０００３】
４つの既知のAFP由来エピトープが存在する：AFP158、AFP137、AFP325及びAFP542(Butterfieldら，J Immunol., 2001, Apr 15;166(8):5300-8及びButterfieldら，Cancer Res. 1999, 59: 3134-3142)。HLA-A2制限AFP158ペプチドFMNKFIYEI(配列番号１)は、新規な免疫療法的介入に適切な標的を提供する；このペプチドは天然にプロセッシングを受け、HepG2(HLA-A2陽性)肝臓ガン腫株から溶離され、質量分析により検出された(Butterfieldら，J Immunol., 2001, Apr 15;166(8):5300-8)。Ｔ細胞クローンはAFP158(及びAFP137)に対して生じる(Pichardら，J Immunother. 2008 Apr;31(3):246-53)。しかし、このペプチドを認識するＴ細胞レセプターは報告されていない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明の第１の観点によれば、FMNKFIYEI(配列番号１)-HLA-A2複合体に対する結合特性を有し、少なくとも１つのTCRα鎖可変ドメイン及び/又は少なくとも１つのTCRβ鎖可変ドメインを含んでなる、天然に存在しない及び/又は精製された及び/又は遺伝子操作されたＴ細胞レセプター(TCR)であって、α鎖可変ドメインが、配列番号２のアミノ酸残基１〜112の配列に対して少なくとも90％同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、及び/又はβ鎖可変ドメインが、配列番号３のアミノ酸残基１〜112の配列に対して少なくとも90％同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるTCRが提供される。
本発明の幾つかの実施形態において、α鎖可変ドメインは、配列番号２のアミノ酸残基１〜112に対して少なくとも91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％又は100％の配列同一性を有する。β鎖可変ドメインは、配列番号３のアミノ酸残基１〜112に対して少なくとも91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％又は100％の配列同一性を有していてもよい。
【０００５】
TCRは、国際免疫遺伝学(International Immunogenetics；IMGT)のTCR命名法を使用して説明され、IMGTのTCR配列についての公開データーベースに関連する。天然型α-βへテロ二量体TCRはα鎖及びβ鎖を有する。広義には、各鎖は、可変領域、連結領域及び定常領域を含んでなり、β鎖はまた、通常、可変領域と連結領域との間に短い多様性領域を含有するが、この多様性領域は、連結領域の一部と見なされる場合が多い。各可変領域は、フレームワーク配列に埋め込まれた３つのCDR(相補性決定領域)を含んでなり、その１つはCDR3と名付けられた超可変領域である。フレームワーク配列、CDR1配列及びCDR2配列並びに部分的に規定されるCDR3配列により弁別される幾つかのタイプのα鎖可変(Vα)領域及び幾つかのタイプのβ鎖可変(Vβ)領域が存在する。VαタイプはIMGT命名法では独特なTRAV番号で指称される。よって、「TRAV21」は、独特なフレームワーク配列、CDR1配列、CDR2配列及びCDR3配列(TCR間で保存されるアミノ酸配列により部分的に規定されるが、TCR間で変化するアミノ酸配列も含む)を有するTCR Vα領域を規定する。同様に、「TRBV5-1」は、独特なフレームワーク配列、CDR1配列及びCDR2配列を、部分的にのみ規定されるCDR3配列と共に有するTCR Vβ領域を規定する。
TCRの連結領域は、同様に、独特なIMGT TRAJ及びTRBJ命名法により規定され、定常領域もIMGT TRAC及びTRBC命名法により規定される。
【０００６】
β鎖多様性領域は、IMGT命名法では略号TRBDで呼ばれ、上記のように、TRBD/TRBJ連鎖領域は、併せて連結領域と見なされる場合が多い。
αβTCRのα鎖及びβ鎖は、一般に、各々が２つの「ドメイン」又は「領域」、すなわち可変ドメイン/領域及び定常ドメイン/領域を有すると考えられている。用語「ドメイン」及び「領域」は本明細書では交換可能に使用される。可変ドメインは可変領域及び連結領域の連鎖からなる。したがって、本明細書及び特許請求の範囲において、用語「TCR α可変ドメイン」とはTRAV及びTRAJ領域の連鎖をいい、用語 TCR α定常ドメインとは細胞外TRAC領域又はＣ末端短縮型TRAC配列をいう。同様に、用語「TCR β可変ドメイン」とは、TRBV及びTRBD/TRBJ領域の連鎖をいい、用語 TCR β定常ドメインとは、細胞外TRBC領域又はＣ末端短縮型TRBC配列をいう。
IMGT命名法により規定される独特な配列は、広く知られており、TCR分野の当業者に利用可能である。例えば、それらはIMGTの公開データベースに見出すことができる。「T cell Receptor Factsbook」(2001) LeFranc and LeFranc, Academic Press, ISBN 0-12-441352-8もまた、IMGT命名法により規定される配列を開示しているが、公開日及びその後のタイムラグのため、その情報は、時に、IMGTデータベースを参照して確認する必要がある。
【０００７】
配列番号２及び３は、それぞれ、本明細書において「親の」AFP TCRと呼ばれるもののα鎖及びβ鎖細胞外配列である。親のAFP TCRは以下のα鎖及びβ鎖を利用する：
α鎖：TRAV12-2*02/TRAJ41*01/TRAC (親のAFP TCR α鎖の細胞外配列は図１に示す(配列番号２))。CDRは、配列番号２のアミノ酸27〜32(CDR1)、50〜55(CDR2)及び90〜101(CDR3)により規定される。
β鎖：TRBV9*01/TRBD2/TRBJ2-7*01/TRBC2 (親のAFP TCR β鎖の細胞外配列は図２に示す(配列番号３)。CDRは、配列番号３のアミノ酸27〜31(CDR1)、49〜54(CDR2)及び92〜102(CDR3)により規定される。
(注記：用語「*01」及び「*02」は、IMGT命名法により指名されるように、この配列について１より多い対立遺伝子バリアント(変異型)が存在し、それが上記TCRクローンに存在する*01/*02バリアントであることを示す。また、限定詞「*」なしは、該当配列に関しては唯１つの対立遺伝子のみが既知であることを意味する。)
【０００８】
本発明の変異TCRの結合プロフィールと比較し得る参照TCRを提供する目的には、図３に示すAFP TCR α鎖の細胞外配列(配列番号４)及び図４に示すAFP TCR β鎖の細胞外配列(配列番号５)を有する可溶性TCRを用いることが好都合である。このTCRを本明細書では「参照TCR」又は「参照AFP TCR」と呼ぶ。配列番号４は、C159がT159(すなわちTRACのT48)から置換されていることを除き、親のα鎖細胞外配列(配列番号２)と同一であることに留意すべきである。同様に、配列番号５は、C169がS169(すなわちTRBC2のS57)から、A187がC187から、そしてD201がN201から置換されていることを除き、親のβ鎖細胞外配列(配列番号３)と同一である。親のAFP α鎖及びβ鎖細胞外配列に対するこれらシステイン置換により、リフォールドされた可溶性TCR(すなわち、細胞外α鎖及びβ鎖のリフォールディングにより形成されたTCR)を安定化する鎖間ジスルフィド結合の形成が可能となる。安定なジスルフィド連結可溶性TCRを参照TCRとして使用することにより、結合親和性及び結合半減期のより簡便な評価が可能となる。
【０００９】
本発明のTCRは、養子療法として知られる治療プロセスにおける患者への投与のために、Ｔ細胞に形質転換されてもよい。そうすることで、Ｔ細胞は、AFP HLA-A2複合体を提示する細胞を破壊できるようになる。この目的のためには、TCRは、ペプチド-HLA複合体に関して、該複合体に特異的な天然型TCRより高い親和性及び/又は遅い解離速度(off-rate)を有することが望ましい。親和性の劇的増大は、TCR遺伝子改変CD8 Ｔ細胞においては、抗原特異性の喪失と関連付けられており、結果として、このTCR-トランスフェクトCD8 Ｔ細胞は非特異的に活性化される。よって、ペプチド-HLA複合体に関して、該複合体に特異的な天然型TCRより、幾らか高いが劇的には高くない親和性及び/又は幾らか遅いが劇的には遅くない解離速度を有するTCRが、養子療法には好ましい(Zhaoら，(2007) J Immunol. 179: 5845-54；Robbinsら，(2008) J Immunol. 180: 6116-31；及びWO 2008/038002を参照)。
本発明の実施形態には、親のAFP TCRに対して変異したTCRが含まれる。変異TCRは、以下：31Q、32S、94D、95S、96G、97Y及び98A(配列番号２に示される番号付けを参照)に対応するアミノ酸の１以上に変異を含むα鎖可変ドメインを含んでなってもよい。例えば、α鎖可変ドメインは、下記の表に示す変異の１以上を有していてもよい。
【００１０】
【表１】
2020054364.tif 000002
上記で使用する番号付けは、図１(配列番号２)に示したものと同じである。
【００１１】
α鎖可変ドメインは、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19及び配列番号20のいずれか１つの残基１〜112に対して少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％又は100％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなってもよい。好ましくは、該アミノ酸配列は、配列番号２の残基１〜112に対して少なくとも90％の同一性を有する。図５において下線を付したアミノ酸は不変であり得る。
１つの実施形態において、TCRは、配列番号11、配列番号12又は配列番号13のQ1〜H112を含むα鎖可変ドメイン及び/又は配列番号３のD1〜T112を含むβ鎖可変ドメインを含んでなる。
変異は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)をベースにするもの、制限酵素ベースのクローニング又はライゲーション非依存性クローニング(LIC)手順を含むがこれらに限定されない任意の適切な方法を用いて実施することができる。これら方法は、分子生物学の標準的教科書の多くに詳細に説明されている。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)及び制限酵素-ベースのクローニングに関しての更なる詳細については、Sambrook & Russell, (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd Ed.) CSHL Pressを参照。ライゲーション非依存性クローニング(LIC)手順についての更なる情報は、Rashtchian, (1995) Curr Opin Biotechnol 6(1): 30-6に見出すことができる。
【００１２】
本明細書に開示する任意のTCRの表現型上サイレントな変異型もまた、本発明の範囲に含まれる。用語「表現型上サイレントな変異型」とは、本明細書で使用する場合、FMNKFIYEI(配列番号１)-HLA-A2複合体に関して、下記の範囲内のKD及び/又は結合半減期を有するTCRをいうと理解される。例えば、当業者に公知であるように、FMNKFIYEI (配列番号１)-HLA-A2複合体との相互作用に関する親和性を変更することなく、定常ドメイン及び/又は可変ドメインに、上述のものからの変化が組み込まれているTCRを製造することは可能であり得る。１以上の保存的置換がなされているTCRもまた本発明の一部を構成する。
当業者に自明なように、提供される配列は、TCRの結合特性に実質的に影響を及ぼすことなく、そのＣ末端及び/又はＮ末端で１、２、３、４、５又はそれより多くの残基を切り取ることも可能であり得る。このような軽微な変異型の全てが本発明に包含される。
天然型TCRはへテロ二量体αβ又はγδ形態で存在する。しかし、αα又はββホモ二量体からなる組換えTCRがペプチドMHC分子に結合することは以前に示されている。したがって、本発明のTCRは、ヘテロ二量体αβTCRであってもよいし、αα又はββホモ二量体TCRであってもよい。
養子療法における使用のためには、αβヘテロ二量体TCRは、例えば、細胞質ドメイン及び膜貫通ドメインの両方を有する全長鎖としてトランスフェクトされてもよい。或る特定の実施形態において、本発明のTCRは、例えばWO 2006/000830に記載されているように、それぞれの定常ドメインの残基同士間に導入されたジスルフィド結合を有していてもよい。
【００１３】
本発明のTCR、特にα-βヘテロ二量体TCRは、α鎖TRAC定常ドメイン配列及び/又はβ鎖TRBC1若しくはTRBC2定常ドメイン配列を含んでなってもよい。α鎖及びβ鎖定常ドメイン配列は、TRACのエキソン２のCys4とTRBC1若しくはTRBC2のエキソン２のCys2との間の天然型ジスルフィド結合を欠失するように短縮化又は置換により改変されていてもよい。α鎖及び/又はβ鎖定常ドメイン配列はまた、TRACのThr48及びTRBC1若しくはTRBC2のSer57からシステイン残基への置換により改変され、当該システインがTCRのα定常ドメインとβ定常ドメインとの間のジスルフィド結合を形成していてもよい。。
本発明のTCRは単鎖形式であってもよい(例えば、WO 2004/033685を参照)。単鎖形式は、Vα-L-Vβ、Vβ-L-Vα、Vα-Cα-L-Vβ、Vα-L-Vβ-Cβ、Vα-Cα-L-Vβ-CβタイプのαβTCRポリペプチドを含む(ここで、Vα及びVβはそれぞれTCR α及びβ可変領域であり、Cα及びCβはそれぞれTCR α及びβ定常領域であり、Ｌはリンカー配列である)。或る特定の実施形態において、本発明の単鎖TCRは、WO 2004/033685に記載されているように、それぞれの定常ドメインの残基同士間の導入されたジスルフィド結合を有していてもよい。
【００１４】
本発明のTCRは、FMNKFIYEI(配列番号１)-HLA-A2複合体に結合する特性を有する。本発明の或る特定のTCRは、養子療法における使用に高度に適切であることが見出されている。このようなTCRは、複合体に関して、親のAFP TCRより小さいKD(例えば、約１μM〜約21μM)を有していてもよく、及び/又は複合体に関して、0.5秒未満から約２秒までの範囲の結合半減期(T1/2)を有していてもよい。天然型TCRの結合親和性を増大させると、ペプチド-MHCリガンドに関するTCRの選択性は低減することが多い。このことはZhao Yangbingら(J. Immunol, 2007 179: 9, p5845-5854)で証明されている。しかし、本発明の或る特定のTCRは、FMNKFIYEI-HLA-A2複合体に関する選択性を保持する(幾つかの実施形態においては、親のAFP TCRより高い結合親和性を有するにもかかわらず)(実施例６を参照)。
結合親和性(平衡定数KDに反比例する)及び結合半減期(T1/2と表される)は、任意の適切な方法により測定することができる。TCRの親和性が２倍になればKDは1/2になることが理解されている。T1/2はln2/解離速度(koff)として算出される。よって、T1/2が２倍になればkoffは1/2になる。TCRのKD値及びkoff値は、通常、可溶形態のTCR、すなわち細胞質ドメイン及び膜貫通ドメインの残基を除去するように短縮された形態のTCRについて測定する。したがって、所与のTCRは、その可溶形態が親のTCRに関して向上した結合親和性及び/又は結合半減期を有する場合には、該特性を有すると理解されるべきである。好ましくは、所与のTCRの結合親和性又は結合半減期は、同じアッセイプロトコルを用いて数回（例えば３回以上)測定して、結果の平均をとる。１つの好適な実施形態において、この測定は、本明細書の実施例３の表面プラズモン共鳴(BIAcore)法を用いてなされる。
【００１５】
１つの更なる観点において、本発明は本発明のTCRをコードする核酸を提供する。幾つかの実施形態において、核酸はcDNAである。幾つかの実施形態において、本発明は、本発明のTCRのα鎖可変ドメインをコードする配列を含んでなる核酸を提供する。幾つかの実施形態において、本発明は、本発明のTCRのβ鎖可変ドメインをコードする配列を含んでなる核酸を提供する。幾つかの実施形態において、本発明は、本発明のTCRのα鎖可変ドメイン及び本発明のTCRのβ鎖可変ドメインの両方をコードする配列を含んでなる核酸を提供する。核酸は、天然に存在しないものであってもよいし、及び/又は精製されていてもよいし、及び/又は遺伝子操作されていてもよい。
別の１つの観点において、本発明は、本発明の核酸を含んでなるベクターを提供する。好ましくは、ベクターはTCR発現ベクターである。
本発明はまた、本発明のベクター(好ましくはTCR発現ベクター)を有する細胞を提供する。ベクターは、単一のオープンリーディングフレーム内にα鎖及びβ鎖をコードするか又は２つの別個のオープンリーディングフレーム内にα鎖及びβ鎖をそれぞれコードする本発明の核酸を含んでなってもよい。別の１つの観点は、本発明のTCRのα鎖をコードする核酸を含んでなる第１の発現ベクター及び本発明のTCRのβ鎖をコードする核酸を含んでなる第２の発現ベクターを有する細胞を提供する。このような細胞は養子療法に特に有用である。細胞は、単離されていてもよいし、及び/又は組換であってもよいし、及び/又は天然に存在しないものであってもよいし、及び/又は遺伝子操作されていてもよい。
【００１６】
本発明のTCRは養子療法に有用であるので、本発明は、本発明のTCRを提示する、天然に存在しない及び/又は精製された及び/又は遺伝子操作された細胞、特にＴ細胞を包含する。本発明のTCRをコードする核酸(例えばDNA、cDNA又はRNA)でのＴ細胞のトランスフェクションに適切な方法が存在する(例えば、Robbinsら，(2008) J. Immunol. 180: 6116-6131)を参照)。本発明のTCRを発現するＴ細胞は、ガン(例えば膵臓及び肝臓のガン)の養子療法ベースの治療における使用に適切である。当業者に公知であるように、養子療法を行なうことができる適切な方法が存在する(例えば、Rosenbergら，(2008) Nat Rev Cancer 8 (4): 299-308を参照)。
当該分野において周知であるように、本発明のTCRは、トランスフェクト細胞が発現するときに翻訳後修飾に付されていてもよい。グリコシル化はそのような修飾の１つであり、TCR鎖中の規定されたアミノ酸へのオリゴ糖部分の共有結合的付加を含む。例えば、アスパラギン残基又はセリン/スレオニン残基は、周知のオリゴ糖付加位置である。特定のタンパク質のグリコシル化状況は、タンパク質配列、タンパク質コンホメーション及び特定の酵素の利用可能性を含む幾つかの因子に依存する。更に、グリコシル化状況(すなわち、オリゴ糖タイプ、共有結合及び付加の総数)は、タンパク質の機能に影響することがある。したがって、組換えタンパク質を製造するときには、グリコシル化の制御が望ましい場合が多い。トランスフェクトTCRのグリコシル化は、トランスフェクトされた遺伝子の変異により制御されてもよい(Kuball Jら，(2009), J Exp Med 206(2):463-475)。このような変異もまた本発明に包含される。
【００１７】
本発明のTCRは、検出可能な標識、治療剤又はPK調節成分と結合されていてもよい。
本発明の或る特定のTCRは可溶形態(すなわち、膜貫通ドメインも細胞質ドメインも有しない形態)であってもよい。安定性のために、本発明のTCR(好ましくは、可溶性αβヘテロ二量体TCR)は、例えばWO 03/020763に記載されるように、それぞれの定常ドメインの残基同士間に導入されたジスルフィド結合を有していてもよい。本発明の幾つかの可溶性TCRは、検出可能な標識又は治療剤を抗原提示細胞及び抗原提示細胞を含有する組織に送達するために使用することができる融合タンパク質の製造に有用である。したがって、本発明の可溶性TCRは、検出可能な標識(TCRを使用してFMNKFIYEI(配列番号１)-HLA-A2複合体を提示する細胞の存在を検出する診断目的のため)；治療剤；PK調節成分と(共有結合的又はその他の様式で)(例えば、PEG化により)結合されていてもよい。
診断目的用の検出可能な標識としては、例えば、蛍光標識、放射性標識、酵素、核酸プローブ及び造影剤が挙げられる。
本発明のTCRと結合され得る治療剤としては、免疫調整剤、放射性化合物、酵素(例えばパーフォリン)又は化学療法剤(例えばシスプラチン)が挙げられる。所望の位置で毒性効果が発揮されることを確実にするため、毒性物質は、緩慢に放出されるように、TCRに連結したリポソームの内部に存在させることができる。これにより、身体内での輸送の間の損傷効果が予防され、毒性物質は、TCRが問題の抗原提示細胞に結合した後、最大効果を発揮することが確実になる。
【００１８】
他の適切な治療剤として、以下のものが挙げられる：
・小分子細胞傷害性物質、すなわち、哺乳動物細胞を殺傷する能力を有する分子量700ダルトン未満の化合物。このような化合物はまた、細胞傷害性効果を有することができる毒性金属を含有し得る。更に、これら小分子細胞傷害性物質にはまた、プロドラッグ、すなわち、生理学的条件下で崩壊又は変換して細胞傷害性物質を放出する化合物が含まれると理解される。このような物質の例として、シスプラチン、メイタンシン(maytansine)誘導体、ラケルマイシン(rachelmycin)、カリケアマイシン(calicheamicin)、ドセタキセル、エトポシド、ゲムシタビン、イホスファミド、イリノテカン、メルファラン、ミトキサントロン、ソルフィマーソディウムホトフィリンII(sorfimer sodiumphotofrin II)、テモゾロマイド(temozolmide)、トポテカン、トリメトレキサート(trimetreate)、グルクロナート、オーリスタチンＥ(auristatin E)、ビンクリスチン及びドキソルビシンが挙げられる；
・ペプチド細胞毒素、すなわち、哺乳動物細胞を殺傷する能力を有するタンパク質又はそのフラグメント。例えば、リシン、ジフテリア毒素、シュードモナス細菌外毒素Ａ、DNAアーゼ及びRNAアーゼ；
【００１９】
・放射性核種、すなわち、１以上のα粒子若しくはβ粒子又はγ線の同時放射を伴って崩壊する元素の不安定同位体。例えば、ヨウ素131、レニウム186、インジウム111、イットリウム90、ビスマス210及び213、アクチニウム225及びアスタチン213；高親和性TCR又はその多量体へのこれら放射性核種の結合を容易にするために、キレート化剤が使用されてもよい；
・免疫刺激物質、すなわち、免疫応答を刺激する免疫エフェクター分子。例えば、サイトカイン(例えばIL-2及びIFN-γ)、
・スーパー抗原及びその変異体；
・TCR-HLA融合体；
・ケモカイン、例えばIL-8、血小板第４因子、メラノーマ増殖刺激タンパク質など；
・抗体又はそのフラグメント。抗-Ｔ細胞又はNK細胞決定基抗体(例えば、抗-CD3、抗-CD28又は抗-CD16)が挙げられる；
・抗体様結合特性を有するオルターナティブタンパク質足場
・補体活性化物質；
・異種タンパク質ドメイン、同種タンパク質ドメイン、ウイルス性/細菌性タンパク質ドメイン、ウイルス性/細菌性ペプチド。
【００２０】
患者への投与のために、本発明のTCR又は細胞は、医薬組成物中で、医薬的に許容され得る１以上の担体又は賦形剤と共に提供されてもよい。本発明に従う細胞は、通常、医薬的に許容され得る担体を通常含む滅菌医薬組成物の一部として供給される。医薬組成物は、(患者への望ましい投与方法に依存して)任意の適切な形態であり得る。医薬組成物は、単位剤形で提供されてもよく、一般には密封された容器中で提供され、キットの一部として提供されてもよい。このようなキットは、(必須ではないが)通常、使用指示書を含む。キットは複数の単位剤形を含んでいてもよい。
医薬組成物は、任意の適切な経路(好ましくは、非経口経路[皮下、筋内、より好ましい静脈内経路を含む])による投与に適合されていてもよい。このような組成物は、薬学分野において公知の任意の方法により、例えば活性成分を担体又は賦形剤と滅菌条件下で混合することにより、製造されてもよい。
本発明のTCR、医薬組成物、ベクター、核酸及び細胞は、実質的に純粋な形態、例えば、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％又は100％純粋で提供されてもよい。
【００２１】
本発明はまた、以下のものを提供する：
・医薬における使用のため、好ましくは(養子療法を含み得る)ガン治療法における使用のための、ペプチド-HLA-A2複合体として提示されているFMNKFIYEIペプチドに結合する天然に存在しない及び/若しくは精製された及び/若しくは遺伝子操作されたTCR、又は当該TCRを発現及び/若しくは提示する細胞；
・ガン治療用医薬の製造における、ペプチド-HLA-A2複合体として提示されているFMNKFIYEIペプチドに結合するTCR又は当該TCRを発現及び/若しくは提示する細胞の使用；
・ペプチド-HLA-A2複合体として提示されているFMNKFIYEIペプチドに結合するTCR又は当該TCRを発現及び/若しくは提示する細胞を患者に投与することを含んでなる、患者におけるガンの治療法。
好ましくは、本発明のTCRは、ペプチド-HLA-A2複合体として提示されているFMNKFIYEIペプチドに結合するTCRである。
本発明の各々の観点の好適な特徴は、他の観点の各々についての通りである(しかし、必要な変更は加える)。本明細書において言及した刊行物は、法が許容する最大範囲まで組み込まれる。本願におけるいかなる書類の引用又は特定も、当該書類が本発明の先行技術として入手可能であることを自認するものでない。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１(配列番号２)は、TRAV12-2*02/TRAJ41*01/TRAC遺伝子を用いる親のAFP-特異的TCRのα鎖の細胞外部分のアミノ酸配列を示す。
【図２】図２(配列番号３)は、TRBV9*01/TRBD2/TRBJ2-7*01/TRBC2遺伝子を用いる親のAFP-特異的TCRのβ鎖の細胞外部分のアミノ酸配列を示す。
【図３】図３(配列番号４)は、(本明細書中で「参照TCR」と呼ばれる)可溶性TCRのα鎖のアミノ酸配列を示す。この配列は、システイン(太字及び下線)が配列番号２のT159(すなわち、TRAC定常領域のT48)から置換されていることを除き、図１(配列番号２)のものと同じである。
【図４】図４(配列番号５)は、(本明細書中で「参照TCR」と呼ばれる)可溶性TCRのβ鎖のアミノ酸配列を示す。この配列は、システイン(太字及び下線)が配列番号３のS169(すなわち、TRBC2定常領域のS57)から、A187がC187から、そしてD201がN201から置換されていることを除き、図２(配列番号３)のものと同じである。
【図５−１】図５(配列番号６〜20)は、本発明のTCRに存在し得る変異α鎖のアミノ酸配列を示す。CDR領域には下線が付され、親のAFP TCRに対するアミノ酸変化は影が付けられている。
【図５−２】図５−２の続き
【図６】図６(配列番号21)及び(配列番号22)は、図３及び４にそれぞれ示すTCR α鎖及びβ鎖をコードするDNA配列を示す。
【図７】図７(配列番号23)は、Ｔ細胞の形質導入のための、親のAFP TCR遺伝子のDNA配列を示す(α鎖-2A-β鎖構築物；ブタテシオウイルス-１の2A配列を太字及び下線で示す)。
【図８−１】図８(配列番号24)は、図７のDNA配列から作製した、Ｔ細胞形質導入用の、親のAFP TCRのアミノ酸配列を示す。ブタテシオウイルス-１の2A配列を太字及び下線で示す。
【図８−２】図８−１の続き
【図９】図９は、一連の標的細胞に応答したAFP TCR-形質導入Ｔ細胞のIFN-γ放出を評価したELISPOTアッセイの結果を示す。
【実施例】
【００２３】
本発明を以下の非限定的実施例において更に説明する。
実施例
実施例１
pGMT7-ベースの発現プラスミド中への親のAFP TCR α鎖及びβ鎖可変領域配列のクローニング
参照AFP TCR可変αドメイン及びTCR可変βドメインを、AFP Ｔ細胞クローンから単離したトータルcDNAからPCR増幅した。α鎖の場合、制限部位NdeIをコードするα鎖可変領域配列特異的オリゴヌクレオチドA1(gaattccatatgcaaaaagaagttgaacaaaattctggacccctc；配列番号25)と、制限部位SalIをコードするα鎖定常領域配列特異的オリゴヌクレオチドA2(ttgtcagtcgacttagagtctctcagctggtacacg；配列番号26))とを使用してα鎖可変ドメインを増幅する。β鎖の場合、制限部位NdeIをコードするβ鎖可変領域配列特異的オリゴヌクレオチドB1(gaattccatatggattctggagttacacaaaccccaaagcacctg；配列番号27)と、制限部位AgeIをコードするβ鎖定常領域配列特異的オリゴヌクレオチドB2(tagaaaccggtggccaggcacaccagtgtggc；配列番号28)とを使用してβ鎖可変ドメインを増幅する。
Sambrook及びRussellによるMolecular Cloning a Laboratory Manual(第３版)に記載の標準的方法によって、α可変ドメイン及びβ可変ドメインを、Cα又はCβを含有するpGMT7-ベースの発現プラスミド中にクローニングした。Applied Biosystems 3730xl DNA分析機を使用してプラスミドを配列決定した。
NdeI及びSalIで切断したTCR α鎖をコードするDNA配列を、NdeI及びXhoIで切断したpGMT7＋Cαベクターにライゲートした。NdeI及びAgeIで切断したTCR β鎖をコードするDNA配列を、NdeI及びAgeIで切断したpGMT7＋Cβベクターにライゲートした。
【００２４】
ライゲーション
ライゲートしたプラスミドを、コンピテントなE. coli株XL1-blue細胞に形質転換し、100μg/mlアンピシリン含有LB/アガープレートに播種した。37℃にて一晩のインキュベーション後、単一コロニーを採取し、100μg/mlアンピシリンを含有する10mlのLB中で一晩37℃にて振盪しながら増殖させる。Miniprepキット(Qiagen)を使用してクローン化プラスミドを精製し、Applied Biosystems 3730xl DNA分析機を使用してプラスミドを配列決定した。
図３及び４はそれぞれ、図７(配列番号21)(配列番号22)のDNA配列からそれぞれ生じる参照AFP TCRのα鎖及びβ鎖細胞外アミノ酸配列(それぞれ配列番号４及び５)を示す。リフォールディングの際にへテロ二量体TCRを形成する人工的な鎖間ジスルフィド結合が提供されるように、親のTCRに関して、α鎖及びβ鎖の定常領域においてシステインが置換導入されたことに留意すべきである。導入システインを太字及び下線で示す。
【００２５】
実施例２
可溶性の親AFP TCRの発現、リフォールディング及び精製
実施例１で作製したように、TCR α鎖及びβ鎖をそれぞれ含有する発現プラスミドを、E.coli株BL21pLysSに別々に形質転換し、単一アンピシリン耐性コロニーを、0.6〜0.8程度のOD600までTYP(アンピシリン100μg/ml)培地で37℃にて増殖後、0.5mM IPTGでタンパク質発現を誘導した。誘導後３時間で、Beckman J-6Bでの4000rpmにて30分間の遠心分離により細胞を採取した。MgCl2及びDNaseIの存在下に25mlのBug Buster(登録商標)(Novagen)を用いて細胞ペレットを溶解させた。Beckman J2-21遠心分離機での13000rpmにて30分間の遠心分離により封入体ペレットを回収した。その後、３回の界面活性剤洗浄を行って細胞残渣及び膜成分を除去した。各回、封入体ペレットをTriton緩衝液(50mM Tris-HCl pH8.0、0.5％ Triton-X100、200mM NaCl、10mM NaEDTA)中でホモジナイズした後、Beckman J2-21で13000rpmにて15分間の遠心分離によりペレット化した。次いで、以下の緩衝液：50mM Tris-HCl pH8.0、１mM NaEDTA中での同様な洗浄により界面活性剤及び塩を除去した。最後に、封入体を30mgのアリコートに分け、−70℃にて凍結させた。封入体タンパク質の収量を６Ｍグアニジン-HClで溶解することによって定量し、OD測定はHitachi U-2001分光光度計で行った。次いで、消光率を用いてタンパク質濃度を算出した。
【００２６】
約15mgのTCR β鎖及び15mgのTCR α鎖の可溶化封入体を凍結ストックから解凍し、10mlのグアニジン溶液(６Ｍグアニジン-塩酸、50mM Tris HCl pH8.1、100mM NaCl、10mM EDTA、10mM DTT)中に希釈して、完全な鎖変性を確実にした。その後、十分に還元及び変性したTCR鎖を含有するグアニジン溶液を、0.5リットルの以下のリフォールディング緩衝液中に注入した：100mM Tris pH8.1、400mM L-アルギニン、２mM EDTA、５Ｍ尿素。酸化還元カップル(システアミン塩酸及びシスタミン二塩酸)をそれぞれ6.6mM及び3.7mMの最終濃度まで添加し、約５分後に変性TCR鎖を添加した。溶液を30分間程度放置した。リフォールドしたTCRを、Spectra/Por(登録商標)1膜(Spectrum；Product No. 132670)において10ＬのH2Oに対して18〜20時間透析した。その後、透析緩衝液を新鮮な10mM Tris pH8.1(10Ｌ)に２回交換し、透析を５℃±３℃にて更に８時間程度継続した。
POROS(登録商標) 50HQアニオン交換カラムに透析後のリフォールド産物をロードし、50カラム容量を超える10mM Tris pH8.1中０〜500mM NaClのグラジエントで結合タンパク質を溶出させ、Akta(登録商標)精製装置(GE Healthcare)を使用することによって、変性産物及び不純物から、可溶性TCRを分離した。ピーク画分をプールし、プロテアーゼインヒビターカクテル(Calbiochem)を加えた。次いで、プールした画分を４℃で保存し、クーマシー-染色SDS-PAGEにより分析後、プールして濃縮した。最後に、PBS緩衝液(Sigma)中で予め平衡化したGE Healthcare Superdex(登録商標) 75HRゲル濾過カラムを使用して、可溶性TCRを精製し、特徴付けた。約50kDaの相対分子量で溶出するピークをプールし、濃縮後、BIAcore(登録商標)表面プラズモン共鳴分析により特徴決定した。
【００２７】
実施例３
結合特徴決定
BIAcore分析
表面プラズモン共鳴バイオセンサ(BIAcore(登録商標) 3000)を使用して、可溶性TCRのペプチド-MHCリガンドへの結合を分析することができる。これは、ストレプトアビジン-被覆結合表面(センサチップ)に固定可能な可溶性ビオチン化ペプチド-HLA(「pHLA」)複合体の製造によって容易になる。センサチップは、４つの異なるpHLA複合体へのＴ細胞レセプター結合の同時測定を可能にする４つの個別フローセルを備える。pHLA複合体の手動注入により、固定化クラスＩ分子の正確なレベルを容易に操作することができる。
ビオチン化クラスＩ HLA-A*02分子を、構成成分のサブユニットタンパク質及び合成ペプチドを含有する細菌発現封入体からインビトロでリフォールドさせ、続いて精製及びインビトロでの酵素的ビオチン化を行った(O'Callaghanら(1999) Anal. Biochem. 266: 9-15)。HLA-A*02-重鎖を、該タンパク質の膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインに代えてＣ末端ビオチン化タグと共に適切な構築物で発現させた。約75mg/リットル細菌培養物の封入体発現レベルが得られた。MHC軽鎖又はβ2-ミクログロブリンもまたE.coliで適切な構築物から封入体として約500mg/リットル細菌培養物のレベルで発現させた。
【００２８】
E. coli細胞を溶解し、封入体を約80％の純度まで精製した。封入体からのタンパク質を６Ｍグアニジン-HCl、50mM Tris pH8.1、100mM NaCl、10mM DTT、10mM EDTA中で変性させ、0.4Ｍ L-アルギニン、100mM Tris pH8.1、3.7mMシスタミン二塩酸、6.6mMシステアミン塩酸、４mg/Ｌの(HLA-A*02分子によるローディングに必要な)AFPペプチド中、＜５℃のリフォールディング緩衝液中への変性タンパク質の単発添加により、30mg/リットルの重鎖、30mg/リットルのβ2mの濃度でリフォールドさせた。少なくとも１時間４℃にて完全にリフォールドさせた。
10容量の10mM Tris pH8.1への透析により緩衝液を交換した。次いで、タンパク質溶液を1.5μm酢酸セルロースフィルターに通して濾過し、POROS(登録商標) 50HQアニオン交換カラム(８mlのベッド容積)にロードした。Akta(登録商標)精製装置(GE Healthcare)を使用して、10mM Tris pH8.1中０〜500mM NaCl線形グラジエントでタンパク質を溶出させた。HLA-A*02-ペプチド複合体は約250mM NaClで溶出した。ピーク画分を収集し、プロテアーゼインヒビターカクテル(Calbiochem)を加え、該画分を氷上で冷却した。
ビオチンタグ化pHLA分子を、10mM Tris pH8.1、５mM NaCl中に、同じ緩衝液中で平衡化させたGE Healthcare迅速脱塩カラムを用いて緩衝液交換した。溶出直後に、タンパク質含有画分を氷上で冷却し、プロテアーゼインヒビターカクテル(Calbiochem)を加えた。次いで、ビオチン化試薬を添加した：１mMビオチン、５mM ATP(pH８に緩衝化)、7.5mM MgCl2、及び５μg/ml BirA酵素(O'Callaghanら(1999) Anal. Biochem. 266: 9-15に従って精製)。その後、混合物を室温にて一晩インキュベートした。
【００２９】
ゲル濾過クロマトグラフィーを使用してビオチン化pHLA-A*01分子を精製した。GE Healthcare Superdex(登録商標) 75 HR 10/30カラムを、濾過PBSで予め平衡化した。１mlのビオチン化反応混合物をロードし、Akta(登録商標)精製装置(GE Healthcare)を使用してカラムをPBSで0.5ml/分にて展開した。ビオチン化pHLA-A*02分子は、約15mlで単一ピークとして溶出した。タンパク質を含有する画分をプールし、氷上で冷却し、プロテアーゼインヒビターカクテルを加えた。タンパク質濃度はクーマシー-結合アッセイ(PerBio)を用いて決定し、ビオチン化pHLA-A*02分子のアリコートを−20℃にて凍結保存した。
BIAcore(登録商標) 3000表面プラズモン共鳴(SPR)バイオセンサは、小さなフローセル内のセンサ表面近くでの、応答単位(RU)で表された屈折指数の変化(レセプターリガンド相互作用を検出し、親和性及び動力学的パラメータを分析するために使用することができる原理である)を測定する。BIAcore(登録商標)実験は、PBS緩衝液(Sigma, pH7.1〜7.5)をランニング緩衝液として及びタンパク質サンプルの希釈物の調製に使用して、温度25℃にて実施した。ストレプトアビジンは、標準アミンカップリング法によりフローセルに固定化した。pHLA複合体は、ビオチンタグを介して固定化した。次いで、可溶性TCRを、異なるフローセルの表面上を一定の流速で通過させ、その際のSPR応答を測定することによりアッセイを実施した。
【００３０】
平衡結合定数
上記BIAcore(登録商標)分析法を使用して、平衡結合定数を決定した。ジスルフィド連結可溶性へテロ二量体形態の参照AFP TCRの系列希釈物を調製し、５μl/分の一定流速にて２つの異なるフローセル上に注入した；一方は1000RU程度の特異的HLA-A*02複合体が被覆され、他方は1000RU程度の非特異的HLA-A2-ペプチド複合体が被覆されていた。応答は、コントロールセルからの測定値を用いて、各濃度に関して規格化した。規格化した応答データをTCRサンプルの濃度に対してプロットし、平衡結合定数KDを算出するために、非線形曲線フィッティングモデルにフィットさせた(Price & Dwek, Principles and Problems in Physical Chemistry for Biochemists (第２版) 1979, Clarendon Press, Oxford)。ジスルフィド連結可溶形態の参照AFP TCR(実施例２)は、KDが約754μMであることが示された。同じBIAcore(登録商標)データからT1/2は＜約0.5秒であった。
動力学的パラメータ
上記BIAcore(登録商標)分析法を用いて、平衡結合定数及び解離速度も決定した。
高親和性TCR(下記実施例４参照)に関して、KDは、解離速度定数koff及び会合速度定数konを実験的に測定することにより決定した。平衡定数KDはkoff/konとして算出した。
一方は約1000RUのFMNKFIYEI-HLA-A*02複合体が被覆され、他方は約1000RUの非特異的HLA-A2-ペプチド複合体が被覆された２つの異なるセルに、TCRを注入した。流速は50μl/分に設定した。代表的には、250μlのTCRを約１μM濃度で注入した。その後、応答がベースラインに復帰するか又は２時間以上が経過するまで、緩衝液を流した。動力学的パラメータはBIAevaluation(登録商標)ソフトウエアを用いて算出した。解離相を一次指数関数減衰式にフィットさせた。これにより半減期の算出が可能になった。
【００３１】
実施例４
本発明の変異TCRの作製
ファージディスプレイは、AFP TCR変異型のライブラリを作製してより高い親和性の変異体を同定することができる１つの手段である。Liら(2005) Nature Biotech 23 (3): 349-354に記載されたTCRファージディスプレイ及びスクリーンニング法を、実施例１の親AFP TCRに適用した。
α鎖可変ドメインのアミノ酸残基31Q、32S、94D、95S、96G、97Y及び98A(配列番号２に示される番号付けを使用)に１以上の変異を有し、親のAFP TCRと比較して向上した結合性を有するTCRを特定した。より高い親和性のTCRのα鎖可変領域アミノ酸配列の具体例(配列番号６〜20)を図５に示す。これらα鎖はCDR1及び/又はCDR3で変異している。
本発明の下記のTCRについて、TCR α鎖及びβ鎖をそれぞれ含有する発現プラスミドを、実施例１のとおりに作製した：
【００３２】
【表２】
2020054364.tif 000003
【００３３】
プラスミドを、E.coli株BL21pLysSに別々に形質転換し、単一アンピシリン耐性コロニーを、0.6〜0.8程度のOD600までTYP(アンピシリン100μg/ml)培地で37℃にて増殖後、0.5mM IPTGでタンパク質発現を誘導した。誘導後３時間で、Beckman J-6Bでの4000rpmにて30分間の遠心分離により細胞を採取した。MgCl2及びDNaseIの存在下に25mlのBug Buster(登録商標)(Novagen)を用いて細胞ペレットを溶解させた。Beckman J2-21遠心分離機での13000rpmにて30分間の遠心分離により封入体ペレットを回収した。その後、３回の界面活性剤洗浄を行って細胞残渣及び膜成分を除去した。各回、封入体ペレットをTriton緩衝液(50mM Tris-HCl pH8.0、0.5％ Triton-X100、200mM NaCl、10mM NaEDTA)中でホモジナイズした後、Beckman J2-21で13000rpmにて15分間の遠心分離によりペレット化した。次いで、以下の緩衝液：50mM Tris-HCl pH8.0、１mM NaEDTA中での同様な洗浄により界面活性剤及び塩を除去した。最後に、封入体を30mgのアリコートに分け、−70℃にて凍結させた。封入体タンパク質の収量を６Ｍグアニジン-HClで溶解することによって定量し、OD測定はHitachi U-2001分光光度計で行った。次いで、消光率を用いてタンパク質濃度を算出した。
【００３４】
本発明の各TCRについて、約10mgのTCR β鎖及び10mgのTCR α鎖の可溶化封入体を、10mlのグアニジン溶液(６Ｍグアニジン-塩酸、50mM Tris HCl pH8.1、100mM NaCl、10mM EDTA、10mM DTT)中に希釈して、完全な鎖変性を確実にした。その後、十分に還元及び変性したTCR鎖を含有するグアニジン溶液を、0.5リットルの以下のリフォールディング緩衝液中に注入した：100mM Tris pH8.1、400mM L-アルギニン、２mM EDTA、５Ｍ尿素。酸化還元カップル(システアミン塩酸及びシスタミン二塩酸)をそれぞれ6.6mM及び3.7mMの最終濃度まで添加し、約５分後に変性TCR鎖を添加した。溶液を約30分間放置した。リフォールドしたTCRを、Spectra/Por(登録商標)1膜(Spectrum；Product No. 132670)において10ＬのH2Oに対して18〜20時間透析した。その後、透析緩衝液を新鮮な10mM Tris pH8.1(10Ｌ)に２回交換し、透析を５℃±３℃にて更に約８時間継続した。
POROS(登録商標) 50HQアニオン交換カラムに透析後のリフォールド産物をロードし、15カラム容量を超える10mM Tris pH8.1中０〜500mM NaClのグラジエントで結合タンパク質を溶出させ、Akta(登録商標)精製装置(GE Healthcare)を使用することによって、変性産物及び不純物から、可溶性TCRを分離した。次いで、プールした画分を４℃にて保存し、クーマシー-染色SDS-PAGEにより分析後、プールして濃縮した。最後に、PBS緩衝液(Sigma)中で予め平衡化したGE Healthcare Superdex(登録商標) 75HRゲル濾過カラムを使用して、可溶性TCRを精製し、特徴付けた。約50kDaの相対分子量で溶出するピークをプールし、濃縮後、BIAcore(登録商標)表面プラズモン共鳴分析により特徴決定した。
こうして作製したTCRのAFPエピトープに関する親和性プロフィールを、実施例３の方法を用いて評価し、参照TCRと比較した。結果を下記の表に示す。
【００３５】
【表３】
2020054364.tif 000004
【００３６】
実施例５
親の及び変異型のAFP TCRでのＴ細胞のトランスフェクション
(ａ)293T細胞のExpress-In媒介一過性トランスフェクションによるレンチウイルスベクターの作製
第３世代レンチウイルスパッケージングシステムを使用して、所望のTCRをコードする遺伝子を含有するレンチウイルスベクターをパッケージした。Express-In媒介トランスフェクション(Open Biosystems)を用いて、293T細胞を４つのプラスミド(下記の実施例5cに記載するTCR α鎖-P2A-TCR β鎖単一ORF遺伝子を含む１つのレンチウイルスベクター及び感染性であるが非複製性であるレンチウイルス粒子の構築に必要な他の構成要素を含む３つのプラスミド)でトランスフェクトする。
トランスフェクションのために、細胞がプレート上に一様に分布し、50％を僅かに超えるコンフルーエンスである指数増殖期の293T細胞のT150フラスコを１つ準備する。Express-Inアリコートを室温にする。滅菌15ml円錐管中に３mlの無血清培地(RPMI 1640＋10mM HEPES)を入れる。174μlのExpress-In試薬を無血清培地に直接添加する(これにより、試薬 対 DNAの重量比は3.6：1となる)。３〜４回円錐管を倒置して十分に混合し、室温にて５〜20分間インキュベートする。
【００３７】
別の1.5mlマイクロチューブにおいて、15μgのプラスミドDNAを、予め混合したパッケージングミックスアリコート(18μgのpRSV.REV(Rev発現プラスミド)、18μgのpMDLg/p.RRE(Gag/Pol発現プラスミド)、７μgのpVSV-G(VSV糖タンパク質発現プラスミド)を含有、通常22μl程度)に添加し、DNAミックスの均質性を確実にするためにピペッティングを行う。DNAミックスに１ml程度のExpress-In/無血清培地を滴下して加え、次いで穏やかにピペッティングを行った後、Express-In/無血清培地の残余分に移し戻す。管を３〜４回倒置させ、室温にて15〜30分間インキュベートする。
古い培養培地を細胞のフラスコから除去する。Express-In/培地/DNA(３ml)複合物を、正立させた293T細胞のフラスコの底に直接添加する。細胞が覆われるようにフラスコをゆっくりとフラットにして、確実に一様分布するようにフラスコを非常に穏やかに振盪させる。１分後、22mlの新鮮培養培地(R10＋HEPES：RPMI 1640、10％熱不活化FBS、１％ Pen/Strep/L-グルタミン、10mM HEPES)を加え、インキュベーターに注意深く戻す。37℃/５％CO2にて一晩インキュベートする。24時間後、パッケージされたレンチウイルスベクターを含有する培地を採集する。
パッケージされたレンチウイルスベクターを採集するため、細胞培養上清を0.45ミクロンのナイロンシリンジフィルターに通して濾過し、培養培地を10,000ｇにて18時間(又は112,000ｇにて２時間)遠心分離し、上清のほとんどを除去し(ペレットを廃棄しないように注意する)、残る数mlの上清(通常、チューブあたり31mlの出発容量から約２ml)中にペレットを再懸濁する。１mlアリコートに小分けして、ドライアイス上で素早く凍結させ、−80℃で貯蔵する。
【００３８】
(ｂ)対象遺伝子を含有するパッケージ化レンチウイルスベクターでのＴ細胞の形質導入
パッケージ化レンチウイルスベクターの形質導入前に、ヒトＴ細胞(必要に応じてCD8若しくはCD4又はその両方)を、健常ボランティアの血液から単離する。これら細胞を計数し、48ウェルプレートにおいて、50U/mlのIL-2を含有するR10中１×106細胞/ml(0.5ml/ウェル)にて、予め洗浄した抗CD3/CD28抗体被覆マイクロビーズ(Dynabeads(登録商標) T cell expander, Invitrogen)と３ビーズ/細胞の比で一晩インキュベートする。
一晩の刺激後、0.5mlのニート(neat)のパッケージ化レンチウイルスベクターを、所望の細胞に添加する。37℃/５％ CO2にて３日間インキュベートする。形質導入の３日後、細胞を計数し、0.5×106細胞/mlに希釈する。必要に応じてIL-2を含有する新鮮培地を添加する。形質導入の５〜７日後ビーズを除去する。細胞を計数し、IL-2を含有する新鮮培地を２日間隔で交換又は添加する。細胞を0.5×106〜１×106細胞/mlに維持する。細胞は、３日目からフローサイトメトリにより分析することができ、５日目から機能アッセイ(例えば、IFNγ放出についてのELISpot；実施例６を参照)に使用することができる。10日目から又は細胞がゆっくりと分裂し、サイズが減少しはじめると、貯蔵のために、少なくとも４×106細胞/バイアル(90％ FBS/10％ DMSO中１×107細胞/ml)のアリコートで細胞を凍結させる。
【００３９】
(ｃ)上記方法(ａ)及び(ｂ)によるＴ細胞トランスフェクションのための親TCR遺伝子
図７は、(最大のヒト細胞発現のためにコドン最適化された)親のAFP TCRをコードするDNA配列(配列番号23)である。これは、全長α鎖-ブタテシオウイルス-１ 2A-全長β鎖の単一オープンリーディングフレーム構築物である。2A配列には下線を付す。2A配列のタンパク質分解性除去を補助するためのフリン切断部位をコードするヌクレオチドが、当該2A配列の前に存在する(図８(配列番号24)に関して下記で更に議論する)。mRNAのタンパク質翻訳の間の、2A配列の３'末端でのペプチド結合スキッピングにより、２つのタンパク質が生じる：１)αTCR鎖-2A融合物、２)βTCR鎖。配列番号23は、NheI及びSalI制限部位(下線)を含む。
【００４０】
図８は、図７に対応するアミノ酸配列(配列番号24)である。
図８において：
M1〜Q22は、親のα鎖TCRの成熟により除去されるリーダー配列である；
Q23〜S274は親のα鎖配列に相当する；
Q23〜N246は親のα鎖細胞外ドメインに相当する；
L247〜L268は成熟TCRのα鎖膜貫通領域である；
L269〜S274は成熟TCRのα鎖細胞内領域である；
R277〜R280は、ゴルジ体におけるP2A配列A285〜P303のタンパク質分解的除去を補助するフリン切断部位である；
G275、S276、S281〜G284は、フリン切断及びP2A配列の完全な機能化を可能にするフレキシブルリンカーである；
R304〜V323は、親のβ鎖TCRの成熟により除去されるリーダー配列である；
D324〜G614は親のβ鎖配列に相当する；
D324〜E585は親のβ鎖細胞外ドメインに相当する；
I586〜V607は成熟TCRのβ鎖膜貫通領域である；
K608〜G614は成熟TCRのβ鎖細胞内領域である。
【００４１】
(ｄ)親の及び高親和性のAFP TCRをトランスフェクトしたＴ細胞
上記(ａ)及び(ｂ)に記載した手順に従って、親のAFPα-2A-βTCR遺伝子(配列番号23 (図7))をpELNSxvレンチベクターに、両DNA構築物に特有なNheI及びSalI制限部位を用いて挿入し、トランスフェクトＴ細胞を作製した。
Ｔ細胞は、親のβ鎖(配列番号３)の可変ドメイン配列(D1〜T112)と結合した、配列番号６〜20の１つを有するα鎖可変ドメインをコードすること以外は同様にして、配列番号23(図７)と同一の遺伝子のトランスフェクションにより作製してもよい。
【００４２】
実施例６
AFP TCR操作Ｔ細胞の活性化
以下のアッセイを行なって、腫瘍細胞株に応答した、TCR-形質導入細胞傷害性Ｔリンパ球(CTL)の活性化を証明した。(ELISPOTアッセイを利用して測定した)IFN-γ産生を、細胞傷害性Ｔリンパ球(CTL)活性化の読取値として用いた。
ELISPOT
試薬
アッセイ培地：10％ FCS(Gibco, Cat# 2011-09)、88％ RPMI 1640(Gibco, Cat# 42401)、１％グルタミン(Gibco Cat# 25030)及び１％ペニシリン/ストレプトマイシン(Gibco Cat# 15070-063)
洗浄緩衝液：0.01Ｍ PBS/0.05％ Tween 20 
PBS(Gibco Cat# 10010)
ヒトIFNγ ELISPOTキット(BD Bioscience；Cat# 551849)(捕捉抗体及び検出抗体並びにヒトIFN-γ PVDF ELISPOT 96ウェルプレートを含む)と、関連するAEC基質セット(BD Bioscience, Cat# 551951)
【００４３】
方法
標的細胞の調製
この方法で使用した標的細胞は、天然のエピトープ提示細胞であった：HLA-A2+ AFP+であるHepG2肝細胞ガン腫の細胞。HLA-A2+ AFP-であるHEP2正常ヒト肝細胞を陰性コントロールとして使用した。十分な標的細胞(50,000細胞/ウェル)を、Megafuge(登録商標) 1.0(Heraeus)において、1200rpmにて10分間の遠心分離により３回洗浄した。その後、細胞をアッセイ培地に106細胞/mlにて再懸濁した。
【００４４】
エフェクター細胞の調製
この方法で使用したエフェクター細胞(Ｔ細胞)は、健常なボランティアの静脈血から単離した新鮮な末梢血単核細胞(PBMC)から、CD14及びCD25マイクロビーズキット(Miltenyi Biotech、それぞれCat# 130-050-201及び130-092-983)を用いるネガティブ選択により取得した末梢血リンパ球(PBL)であった。細胞を抗CD3/CD28被覆ビーズ(Dynabeads(登録商標) T cell expander, Invitrogen)で刺激し、対象の完全αβTCRをコードする遺伝子を有するレンチウイルスを(実施例５に記載し、図７に示した構築物に基づいて)形質導入し、形質導入後10〜13日まで50U/mlのIL-2を含有するアッセイ培地で拡大した。次いで、これら細胞をアッセイ培地に播種後、Megafuge(登録商標) 1.0(Heraeus)における1200rpmにて10分間の遠心分離により洗浄した。その後、細胞をアッセイ培地に４×必要な最終濃度にて再懸濁した。
【００４５】
プレートを下記のとおり準備した：100μlの抗IFN-γ捕捉抗体を、プレートあたり10mlの滅菌PBSに希釈した。次いで、100μlの希釈した捕捉抗体を各ウェルに小分けした。その後、プレートを４℃にて一晩インキュベートした。インキュベーション後、プレートを洗浄して(プログラム１、プレートタイプ２、Ultrawash Plus 96-ウェルプレートウォッシャー；Dynex)、捕捉抗体を除去した。次いで、200μlのアッセイ培地を各ウェルに添加して室温にて２時間インキュベートすることによって、プレートをブロックした。その後、アッセイ培地をプレートから洗い流し(プログラム１、プレートタイプ２、Ultrawash Plus 96-ウェルプレートウォッシャー, Dynex)、ELISPOTプレートをペーパータオル上で軽く叩いたりはじいたりして残る全ての培地を除去した。
その後、アッセイの構成成分をELISPOTプレートに以下の順序で添加した：
50μlの標的細胞  106細胞/ml(合計50,000 標的細胞/ウェルを得る)
50μlの培地(アッセイ培地)
50μlのエフェクター細胞(20,000のTCR形質導入PBL細胞/ウェル)
【００４６】
次いで、プレートを一晩インキュベートした(37℃/５％CO2)。翌日、プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄し(プログラム１、プレートタイプ２、Ultrawash Plus 96-ウェルプレートウォッシャー, Dynex)、ペーパータオル上で軽く叩いて過剰の洗浄緩衝液を除去して乾燥させた。次いで、100μlの一次検出抗体を各ウェルに添加した。一次検出抗体を、製造業者の指示書で指定された希釈率を用いて10mlの希薄緩衝液(１つのプレートに必要な量)に希釈した。次いで、プレートを室温にて少なくとも２時間インキュベートした後、洗浄緩衝液で３回洗浄した(プログラム１、プレートタイプ２、Ultrawash Plus 96-ウェルプレートウォッシャー, Dynex)；プレートをペーパータオル上で軽く叩いて過剰の洗浄緩衝液を除去した。
二次検出は、100μlの希釈ストレプトアビジン-HRPを各ウェルに添加し、プレートを室温にて１時間インキュベートすることにより実施した。ストレプトアビジン-HRPを、製造業者の指示書で指定された希釈率を用いて10mlの希薄緩衝液(１つのプレートに必要な量)に希釈した。その後、プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄し(プログラム１、プレートタイプ２、Ultrawash Plus 96-ウェルプレートウォッシャー, Dynex)、ペーパータオル上で軽く叩いて過剰の洗浄緩衝液を除去した。次いで、プレートを、200μlのPBSを各ウェルに添加して２回洗浄し、プレートをペーパータオル上で軽く叩いたりはじいたりして過剰の緩衝液を除去した。使用のせいぜい15分前に、１滴(20μl)のAEC色素原を各１mlのAEC基質に加えて混合した。10mlのこの溶液を各プレートについて調製した；ウェルあたり10μlを加えた。次いで、ホイルを用いてプレートを遮光し、(通常５〜20分以内に起こる)スポット発色を定期的にモニターした。水道水でプレートを洗浄して発色反応を終了させ、振って乾燥させた後、プレートを３つの構成パーツに解体した。その後、プレートを室温にて少なくとも２時間乾燥させた後、Immunospot(登録商標)プレートリーダー(CTL；Cellular Technology Limited)を用いてスポットを計数した。
【００４７】
結果
種々のAFP陽性腫瘍細胞株及びコントロール腫瘍細胞株に応じた、活性化TCR形質導入Ｔ細胞によるIFNγ放出を、ELISPOTアッセイにより試験した(上記のとおり)。各ウェルで観察されたELISPOTスポット数をGraph Pad Prism(登録商標)を用いてプロットした。
WT TCR又は番号１〜５のTCR(下記の表に記載のとおり)の１つを発現するCD4+、CD8+又はCD4+/CD8+混合Ｔ細胞を、AFP+ HLA:A2+腫瘍細胞株HepG2又はAFP- HLA:A2+ HEP2正常肝細胞とインキュベートした。Ｔ細胞を含有しないサンプルをコントロールとして用いた。
【００４８】
【表４】
2020054364.tif 000005
【００４９】
図９は、上記表に記載されるTCRを形質導入されたＴ細胞がAFP陽性腫瘍細胞(HepG2)に応じて活性化されることを証明している。これら変異型TCRの活性化はWT TCRのものより大きい。AFP陰性正常肝細胞(HEP2)による活性化は最小であり、このことにより、AFPに関するTCRの特異性が証明される。
【図１】
2020054364.tif 000007
【図２】
2020054364.tif 000008
【図３】
2020054364.tif 000009
【図４】
2020054364.tif 000010
【図５−１】
2020054364.tif 000011
【図５−２】
2020054364.tif 000012
【図６】
2020054364.tif 000013
【図７】
2020054364.tif 000014
【図８−１】
2020054364.tif 000015
【図８−２】
2020054364.tif 000016
【図９】
2020054364.tif 000017
【配列表】
2020054364000001.app