(57)【要約】      （修正有）【課題】癌および他の疾患の処置のための様々な治療方法のいずれにおいても使用することができる、高親和性抗ＣＤ４０モノクローナル抗体および関連組成物の提供。【解決手段】特定のアミノ酸配列を有する、ＣＤ４０エピトープに結合する、単離された抗体、もしくはその抗原結合断片、抗体または抗原結合断片をコードする単離されたポリヌクレオチド、単離されたポリヌクレオチドを含む発現ベクター、並びに、単離された抗体またはその抗原結合断片とを含む組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書および図面に記載の物、方法またはシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の引用
本願は、２０１２年１０月３０日に出願された米国仮出願第６１／７２０，２８９号に対する優先権を主張する。この出願は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
配列表に関する記載
本願に関連した配列表をハードコピーの代わりにテキスト形式で提供し、参照により本明細書に援用する。配列表を含むテキストファイル名は、ＡＰＥＸ−０１６＿０１ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。該テキストファイルは、９２ＫＢであり、２０１３年１０月３０日に作成したものであり、それをＥＦＳ−Ｗｅｂ経由で電子提出している。
【０００３】
背景
技術分野
本発明は、一般に、抗ＣＤ４０抗体、組成物、およびそれらの使用方法に関する。かかる抗体は、例えば、様々な腫瘍学的疾患の処置方法に有用である。
【背景技術】
【０００４】
関連技術の説明
白血病およびリンパ腫の大部分は、Ｂ系列細胞の悪性形質転換から生ずる。ＣＤ２０などの細胞表面Ｂ系列拘束性抗原の発現は、それを抗体療法の魅力的な標的にする。抗体療法は、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）および慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）を有する患者への対応を劇的に変えた。リツキシマブの認可以来、単独でのまたは化学療法と併用での該抗体は、奏効率、長期成績および生活の質を著しく向上させてきた（Ｃｈｉｎｎ  Ｐ、Ｂｒａｓｌａｗｓｋｙ  Ｇ、Ｗｈｉｔｅ  Ｃら、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ２００３；５２：２５７−２８０；Ｒａｓｔｅｔｔｅｒ  Ｗ、Ｍｏｌｉｎａ  Ａ、Ｗｈｉｔｅ  ＣＡ、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ：Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｌｙｍｐｈｏｍａｓ  ａｎｄ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｄｉｓｅａｓｅｓ、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｍｅｄ  ２００４；５５：４７７−５０３）。しかし、相当な数の患者がリツキシマブに対する初期耐性または獲得耐性のいずれかを呈示し、これは、ＣＤ２０を標的にする現行アプローチには臨床成績の限界があること、ならびに抗ＣＤ４０  ｍＡｂ、ＡＰＸ００５などの、異なる作用機序を有するＢ細胞リンパ腫および白血病のための新規免疫療法を開発することにより向上させる必要があること（Ｓｔｏｌｚ  Ｃ、Ｓｃｈｕｌｅｒ  Ｍ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｉｔｓ  ｃｉｒｃｕｍｖｅｎｔｉｏｎ、Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ａｎｄ  ｌｙｍｐｈｏｍａ、２００９；５０（６）：８７３−８８５；Ｂｅｌｌｏ  Ｃ、Ｓｏｔｏｍａｙｏｒ  ＥＭ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａｓ：Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ
ａｎｄ  ｂｅｙｏｎｄ、Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｈｅｍａｔｏｌ  Ｅｄｕｃ  Ｐｒｏｇｒａｍ  ２００７；２３３−２４２；Ｄｕｐｉｒｅ  Ｓ、Ｃｏｉｆｆｉｅｒ  Ｂ、Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｎｅｗ  ａｇｅｎｔｓ  ｉｎ
ｄｉｆｆｕｓｅ  ｌａｒｇｅ  Ｂ  ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ２０１０；６月１８日（オンライン））を示唆している。
【０００５】
免疫応答の調節におけるＣＤ４０の役割
Ｔ細胞の完全活性化は、２つの別個のしかし相乗的なシグナルを必要とする。Ｔ細胞抗原受容体によって送達される第一のシグナルは、ＡＰＣ上の抗原およびＭＨＣ複合体によって提供され、免疫応答の特異性を担う。第二の、すなわち共刺激シグナルは、ＣＤ２８とＢ７−１（ＣＤ８０）／Ｂ７−２（ＣＤ８６）の相互作用およびＣＤ４０とＣＤ４０Ｌの相互作用によるものであり、これらの相互作用は、フルスケールＴ細胞応答を開始するために必要とされる。共刺激シグナル不在下では、Ｔ細胞は、抗原刺激に対して無応答性（アネルギー）になることがあり、または抗原刺激によりプログラム細胞死（アポトーシス）を被ることがある。
【０００６】
ＣＤ４０は、ＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーのメンバーであり、主として、Ｂ細胞ならびに他の抗原提示細胞（ＡＰＣ）、例えば樹状細胞およびマクロファージ、上で発現される。ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）は、主として、活性化されたＴ細胞によって発現される。
【０００７】
ＣＤ４０とＣＤ４０Ｌの相互作用は、Ｔ細胞活性化のための共刺激シグナルとして役立つ。休止Ｂ細胞上でのＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌエンゲージメントは、増殖、免疫グロブリンクラススイッチ、抗体分泌を誘導し、ならびにまた胚中心の発達および記憶Ｂ細胞の生存に一定の役割を果たし、これらのすべてが体液免疫応答に不可欠である（Ｋｅｈｒｙ  ＭＲ、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９６；１５６：２３４５−２３４８）。樹状細胞上のＣＤ４０へのＣＤ４０Ｌの結合は、Ｂ７ファミリー（ＣＤ８０、ＣＤ８６）などの共刺激分子の発現およびインターロイキン１２などの炎症誘発性サイトカインの生産の増加により顕在化されるようなＤＣ成熟を誘導する。これらが強力なＴ細胞応答をもたらす（Ｓｔｏｕｔ，Ｒ．Ｄ．、Ｊ．Ｓｕｔｔｌｅｓ、１９９６、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １７：４８７−４９２；Ｂｒｅｎｄａｎ  Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎ、Ｒａｎｊｅｎｙ  Ｔｈｏｍａｓ、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２００３；２３：８３−１０７；Ｃｅｌｌａ，Ｍ．、Ｄ．Ｓｃｈｅｉｄｅｇｇｅｒ、Ｋ．Ｐａｌｍｅｒ−Ｌｅｈｍａｎｎ、Ｐ．Ｌａｎｅ、Ａ．Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ、Ｇ．Ａｌｂｅｒ、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９９６；１８４：７４７−４５２）。
【０００８】
ＣＤ４０シグナル伝達は、活性化タンパク質、ｃ−Ｊｕｎ、ＡＴＦ２（活性化転写因子−２）およびＲｅｌ転写因子（Ｄａｄｇｏｓｔａｒ  Ｈら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ、２００２年２月５日；９９（３）：１４９７−５０２）の活性化により遺伝子発現を調節する、ＮＦ−カッパＢ（核内因子−カッパＢ）、ＭＡＰＫ（マイトジェン活性化プロテインキナーゼ）およびＳＴＡＴ３（シグナル伝達兼転写活性化因子−３）（Ｐｙｐｅ  Ｓら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２０００年６月１６日；２７５（２４）：１８５８６−９３）を含む、多数の経路を活性化する。ＴＮＦＲ受容体関連因子アダプタータンパク質（例えば、ＴＲＡＦ１、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ３、ＴＲＡＦ５およびＴＲＡＦ６）は、この受容体と相互作用し、シグナル伝達の媒介因子としての役割を果たす。特定の細胞タイプに依存して、ＣＤ４０エンゲージメントは、特定の遺伝子発現パターンを生じさせる結果となる。ＣＤ４０シグナリングに応じて活性化される遺伝子は、非常に多数のサイトカインおよびケモカイン（ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−α、およびマクロファージ炎症性タンパク質−１α（ＭＩＰ１α））を含む。一定の細胞タイプでは、ＣＤ４０の活性化が結果として細胞傷害性ラジカルの生成（Ｄａｄｇｏｓｔａｒら、上記）、ＣＯＸ２（シクロオキシゲナーゼ−２）、およびＮＯ（酸化窒素）の生成をもたらすこともある。
【０００９】
腫瘍におけるＣＤ４０の役割
ＣＤ４０は、正常免疫細胞によって発現されるばかりでなく、多くの悪性細胞によっても発現される。詳細には、ＣＤ４０は、Ｂ系列ＮＨＬ、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、有毛細胞白血病（ＨＣＬ）、ホジキン病（Ｕｃｋｕｎ  ＦＭ、Ｇａｊｌ−Ｐｅｃｚａｌｓｋａ  Ｋ、Ｍｙｅｒｓ  ＤＥら、Ｂｌｏｏｄ  １９９０；７６：２４４９−２４５６；Ｏ’Ｇｒａｄｙ  ＪＴ、Ｓｔｅｗａｒｔ  Ｓ、Ｌｏｗｒｅｙ  Ｊら、Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １９９４；１４４：２１−２６）、多発性骨髄腫（Ｐｅｌｌａｔ−Ｄｅｃｅｕｎｙｎｃｋ  Ｃ、Ｂａｔａｉｌｌｅ  Ｒ、Ｒｏｂｉｌｌａｒｄ  Ｎ、Ｈａｒｏｕｓｓｅａｕ  ＪＬ、Ｒａｐｐ  ＭＪ、Ｊｕｇｅ−Ｍｏｒｉｎｅａｕ  Ｎ、Ｗｉｊｄｅｎｅｓ  Ｊ、Ａｍｉｏｔ  Ｍ、Ｂｌｏｏｄ、１９９４；８４（８）：２５９７−６０３）において、ならびに膀胱、腎臓、卵巣、子宮頚部、乳房、肺、上咽頭の癌腫および悪性黒色腫（Ｙｏｕｎｇ
ＬＳ、Ｅｌｉｏｐｏｕｌｏｓ  ＡＧ、Ｇａｌｌａｇｈｅｒ  ＮＪら、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  １９９８；１９：５０２−６；Ｚｉｅｂｏｌｄ  ＪＬ、Ｈｉｘｏｎ  Ｊ、Ｂｏｙｄ  Ａら、Ａｒｃｈ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｈｅｒ  Ｅｘｐ（Ｗａｒｓｚ）２０００；４８：２２５−３３；Ｇｌａｄｕｅ  Ｒ、Ｃｏｌｅ  Ｓ、Ｄｏｎｏｖａｎ  Ｃら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２００６；２４（１８Ｓ）：１０３ｓ）において過発現される。
【００１０】
腫瘍細胞表面上でのＣＤ４０のライゲーションは、多くの場合、直接細胞傷害効果を媒介するものであり、アポトーシスおよび壊死により腫瘍退縮を生じさせる結果となる（Ｇｒｅｗａｌ  ＩＳ、Ｆｌａｖｅｌｌ  ＲＡ、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９８；１６：１１１−３５；ｖａｎ  Ｋｏｏｔｅｎ  Ｃ、Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ  Ｊ、Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ  ２０００；６７（１）：２−１７）。腫瘍細胞におけるＣＤ４０の正確な機能は不明である（Ｔｏｎｇ  ＡＷ、Ｓｔｏｎｅ  ＭＪ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ、２００３  １０（１）：１−１３）が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＣＤ４０のエンゲージメントは、固形腫瘍細胞および高悪性度Ｂ細胞リンパ腫細胞の成長を阻害する（Ｍａｇｉ  Ｋｈａｌｉｌ  ａｎｄ  Ｒｏｂｅｒｔ  Ｈ．Ｖｏｎｄｅｒｈｅｉｄｅ、Ｕｐｄａｔｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  ２００７；  ２（２）：６１−６５；Ｙｏｕｎｇ
ＬＳ、Ｅｌｉｏｐｏｕｌｏｓ  ＡＧ、Ｇａｌｌａｇｈｅｒ  ＮＪ、Ｄａｗｓｏｎ  ＣＷ、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  １９９８；１９（１１）：５０２−６；Ｆｕｎａｋｏｓｈｉ  Ｓ、Ｌｏｎｇｏ  ＤＬ、Ｂｅｃｋｗｉｔｈ  Ｍら、Ｂｌｏｏｄ  １９９４；８３（１０）：２７８７−９４；Ｈｅｓｓ  Ｓ、Ｅｎｇｅｌｍａｎｎ  Ｈ、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ
１９９６；１８３（１）：１５９−６７；Ｅｌｉｏｐｏｕｌｏｓ  ＡＧ、Ｄａｗｓｏｎ
ＣＷ、Ｍｏｓｉａｌｏｓ  Ｇら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １９９６；１３（１０）：２２４３−５４；ｖｏｎ  Ｌｅｏｐｒｅｃｈｔｉｎｇ  Ａ、ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｂｒｕｇｇｅｎ  Ｐ、Ｐａｈｌ  ＨＬ、Ａｒｕｆｆｏ  Ａ、Ｓｉｍｏｎ  ＪＣ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９９９；５９（６）：１２８７−９４）。これらの効果は、非新生物Ｂ細胞および樹状細胞上でのＣＤ４０のエンゲージメント後に誘導される増殖とは対照的である。
【００１１】
直接腫瘍阻害に加えて、ＣＤ４０シグナリングの活性化は、腫瘍保有宿主における抗原提示細胞の機能をレスキューし、腫瘍関連抗原に対する活性免疫応答を引き起こすまたは回復させる。ＣＤ４０アゴニストは、腫瘍保有マウスにおいてＴ細胞寛容性を克服すること、腫瘍関連抗原に対する有効な細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘発すること、および抗腫瘍ワクチンの効力を強化することが報告されている（Ｅｌｉｏｐｏｕｌｏｓ  ＡＧ、Ｄａｖｉｅｓ  Ｃ，  Ｋｎｏｘ  ＰＧら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２０００；２０（１５）：５５０３−１５；Ｔｏｎｇ  ＡＷ、Ｐａｐａｙｏｔｉ  ＭＨ、Ｎｅｔｔｏ  Ｇら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００１；７（３）：６９１−７０３）。
【００１２】
分子標的としてのＣＤ４０
ＣＤ４０は、広範な悪性細胞上で過発現される。腫瘍阻害および免疫系の刺激に関するＣＤ４０の役割がＣＤ４０を抗体による免疫療法の魅力的な標的にする（ｖａｎ  Ｍｉｅｒｌｏ  ＧＪ、ｄｅｎ  Ｂｏｅｒ  ＡＴ、Ｍｅｄｅｍａ  ＪＰら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ、２００２；９９（８）：５５６１−５５６６；Ｆｒｅｎｃｈ  ＲＲ、Ｃｈａｎ  ＨＴ、Ｔｕｔｔ  ＡＬ、Ｇｌｅｎｎｉｅ  ＭＪ、Ｎａｔ  Ｍｅｄ、１９９９；５（５）：５４８−５５３）。抗ＣＤ４０抗体は、多数の機序によって癌細胞に対して作用し得る：（ｉ）抗体エフェクター機能、例えばＡＤＣＣ、（ｉｉ）腫瘍細胞に対する直接細胞傷害効果、および（ｉｉｉ）抗腫瘍免疫応答の活性化。
【００１３】
開発中の抗ＣＤ４０治療用抗体
幾つかの抗ＣＤ４０抗体が抗腫瘍療法薬としての可能性を有すると報告されている。ＣＰ−８７０，８９３は、Ｐｆｉｚｅｒによって開発された完全ヒトＩｇＧ２ＣＤ４０アゴニスト抗体である。これは、３．４８×１０−１０ＭのＫＤでＣＤ４０を結合するが、ＣＤ４０Ｌの結合を遮断しない（例えば、米国特許第７，３３８，６６０号明細書参照）。ＣＰ−８７０８９３は、ＡＤＣＣ効果を示されておらず、これは、ことによるとそのＩｇＧ２アイソタイプに起因する。したがって、この抗体は、ＣＤ４０アゴニストとして作用し（すなわち、ＣＤ４０Ｌ結合に影響を及ぼさず）、アポトーシス促進性シグナリングを誘導し、ならびにＤＣおよび免疫監視機構を活性化する。しかし、この抗体は、ＡＤＣＣを媒介しない。
【００１４】
ＨＣＤ１２２は、Ｎｏｖａｒｔｉｓによって開発された完全ヒトＩｇＧ１  ＣＤ４０アンタゴニスト抗体である。これは、５．１×１０−１０ＭのＫＤでＣＤ４０に結合し、ＣＤ４０ＬへのＣＤ４０の結合を遮断し、Ｂ細胞ならびに一定の初代ＣＬＬおよびＭＭ細胞に対するＣＤ４０リガンド誘導シグナリングおよび生物学的効果を阻害する（Ｔａｉ  ＹＴら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、２００５年７月１日；６５（１３）：５８９８−９０６；Ｌｕｑｍａｎ  Ｍ、Ｋｌａｂｕｎｄｅ  Ｓら：Ｂｌｏｏｄ  １１２：７１１−７２０、２００８）。ｉｎ  ｖｉｖｏでのその抗腫瘍効果についての主要作用機序は、ＡＤＣＣである（Ｌｏｎｇ  Ｌら、２００５  ＩＭＦ  Ｏｒａｌ  Ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ
Ａｂｓｔｒａｃｔ  Ｎｏ．３；Ｂｌｏｏｄ  ２００４、１０４（１１，Ｐａｒｔ  １）：Ａｂｓｔ  ３２８１）。そのアンタゴニスト特徴のため、この抗体は、ＣＤ４０媒介抗腫瘍免疫応答を直接誘導できない。
【００１５】
ＳＧＮ−４０は、ヒト膀胱癌腫細胞系を免疫原として使用して産生された、マウス抗体クローンＳ２Ｃ６からＳｅａｔｔｌｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓによって開発されたヒト化ＩｇＧ１抗体である。これは、１．０×１０−９ＭのＫＤでＣＤ４０に結合し、ＣＤ４０とＣＤ４０Ｌ間の相互作用を増進させることにより作用し、かくて部分アゴニスト効果を呈示する（Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ  ＪＡら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、６０：３２２５−３１、２０００）。ＳＧＮ−４０は、高悪性度非ホジキンリンパ腫およびＭＭ細胞起源のＢリンパ腫系のパネルに増殖阻害性およびアポトーシスシグナルを送達する（Ｔａｉ  ＹＴ、Ｃａｔｌｅｙ  ＬＰ、Ｍｉｔｓｉａｄｅｓ  ＣＳら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００４；６４（８）：２８４６−２８５２）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ研究は、ＡＤＣＣによるアポトーシスシグナリングと抗体エフェクター機能の両方がＳＧＮ−４０の抗腫瘍活性に寄与することを示唆している（Ｌａｗ  ＣＬ、Ｇｏｒｄｏｎ  ＫＡ、Ｃｏｌｌｉｅｒ  Ｊら：Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００５；６５：８３３１−８３３８）。最近の研究は、ＳＧＮ−４０の抗腫瘍活性が、エフェクター細胞とのＦｃの相互作用に有意に依存すること、およびマクロファージが、その治療活性に寄与する主要エフェクターであることを示唆している（Ｏｆｌａｚｏｇｌｕ  Ｅら、Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ、２００９年１月１３日；１００（１）：１１３−７、Ｅｐｕｂ  ２００８年１２月９日）。ＳＧＮ−４０は、部分アゴニストであり、Ｔ細胞上で発現されるＣＤ４０Ｌを必要とするので、ＳＧＮ−４０が抗腫瘍免疫応答を十分に追加刺激する能力には限界があり得る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】米国特許第７，３３８，６６０号明細書
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Ｃｈｉｎｎ  Ｐ、Ｂｒａｓｌａｗｓｋｙ  Ｇ、Ｗｈｉｔｅ  Ｃら、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ２００３；５２：２５７−２８０
【非特許文献２】Ｒａｓｔｅｔｔｅｒ  Ｗ、Ｍｏｌｉｎａ  Ａ、Ｗｈｉｔｅ  ＣＡ、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ：Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｌｙｍｐｈｏｍａｓ  ａｎｄ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｄｉｓｅａｓｅｓ、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｍｅｄ  ２００４；５５：４７７−５０３
【非特許文献３】Ｓｔｏｌｚ  Ｃ、Ｓｃｈｕｌｅｒ  Ｍ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｉｔｓ  ｃｉｒｃｕｍｖｅｎｔｉｏｎ、Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ａｎｄ  ｌｙｍｐｈｏｍａ、２００９；５０（６）：８７３−８８５
【非特許文献４】Ｂｅｌｌｏ  Ｃ、Ｓｏｔｏｍａｙｏｒ  ＥＭ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａｓ：Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ  ａｎｄ  ｂｅｙｏｎｄ、Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｈｅｍａｔｏｌ  Ｅｄｕｃ  Ｐｒｏｇｒａｍ  ２００７；２３３−２４２
【非特許文献５】Ｄｕｐｉｒｅ  Ｓ、Ｃｏｉｆｆｉｅｒ  Ｂ、Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｎｅｗ  ａｇｅｎｔｓ  ｉｎ  ｄｉｆｆｕｓｅ  ｌａｒｇｅ  Ｂ  ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ２０１０；６月１８日（オンライン）
【非特許文献６】Ｋｅｈｒｙ  ＭＲ、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９６；１５６：２３４５−２３４８
【非特許文献７】Ｓｔｏｕｔ，Ｒ．Ｄ．、Ｊ．Ｓｕｔｔｌｅｓ、１９９６、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １７：４８７−４９２
【非特許文献８】Ｂｒｅｎｄａｎ  Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎ、Ｒａｎｊｅｎｙ  Ｔｈｏｍａｓ、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２００３；２３：８３−１０７
【非特許文献９】Ｃｅｌｌａ，Ｍ．、Ｄ．Ｓｃｈｅｉｄｅｇｇｅｒ、Ｋ．Ｐａｌｍｅｒ−Ｌｅｈｍａｎｎ、Ｐ．Ｌａｎｅ、Ａ．Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ、Ｇ．Ａｌｂｅｒ、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９９６；１８４：７４７−４５２
【非特許文献１０】Ｄａｄｇｏｓｔａｒ  Ｈら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ、２００２年２月５日；９９（３）：１４９７−５０２
【非特許文献１１】Ｐｙｐｅ  Ｓら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２０００年６月１６日；２７５（２４）：１８５８６−９３
【非特許文献１２】Ｕｃｋｕｎ  ＦＭ、Ｇａｊｌ−Ｐｅｃｚａｌｓｋａ  Ｋ、Ｍｙｅｒｓ  ＤＥら、Ｂｌｏｏｄ  １９９０；７６：２４４９−２４５６
【非特許文献１３】Ｏ’Ｇｒａｄｙ  ＪＴ、Ｓｔｅｗａｒｔ  Ｓ、Ｌｏｗｒｅｙ  Ｊら、Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １９９４；１４４：２１−２６
【非特許文献１４】Ｐｅｌｌａｔ−Ｄｅｃｅｕｎｙｎｃｋ  Ｃ、Ｂａｔａｉｌｌｅ  Ｒ、Ｒｏｂｉｌｌａｒｄ  Ｎ、Ｈａｒｏｕｓｓｅａｕ  ＪＬ、Ｒａｐｐ  ＭＪ、Ｊｕｇｅ−Ｍｏｒｉｎｅａｕ  Ｎ、Ｗｉｊｄｅｎｅｓ  Ｊ、Ａｍｉｏｔ  Ｍ、Ｂｌｏｏｄ、１９９４；８４（８）：２５９７−６０３
【非特許文献１５】Ｙｏｕｎｇ  ＬＳ、Ｅｌｉｏｐｏｕｌｏｓ  ＡＧ、Ｇａｌｌａｇｈｅｒ  ＮＪら、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  １９９８；１９：５０２−６
【非特許文献１６】Ｚｉｅｂｏｌｄ  ＪＬ、Ｈｉｘｏｎ  Ｊ、Ｂｏｙｄ  Ａら、Ａｒｃｈ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｈｅｒ  Ｅｘｐ（Ｗａｒｓｚ）２０００；４８：２２５−３３
【非特許文献１７】Ｇｌａｄｕｅ  Ｒ、Ｃｏｌｅ  Ｓ、Ｄｏｎｏｖａｎ  Ｃら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２００６；２４（１８Ｓ）：１０３ｓ
【非特許文献１８】Ｇｒｅｗａｌ  ＩＳ、Ｆｌａｖｅｌｌ  ＲＡ、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９８；１６：１１１−３５
【非特許文献１９】ｖａｎ  Ｋｏｏｔｅｎ  Ｃ、Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ  Ｊ、Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ  ２０００；６７（１）：２−１７
【非特許文献２０】Ｔｏｎｇ  ＡＷ、Ｓｔｏｎｅ  ＭＪ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ、２００３  １０（１）：１−１３
【非特許文献２１】Ｍａｇｉ  Ｋｈａｌｉｌ  ａｎｄ  Ｒｏｂｅｒｔ  Ｈ．Ｖｏｎｄｅｒｈｅｉｄｅ、Ｕｐｄａｔｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  ２００７；  ２（２）：６１−６５
【非特許文献２２】Ｙｏｕｎｇ  ＬＳ、Ｅｌｉｏｐｏｕｌｏｓ  ＡＧ、Ｇａｌｌａｇｈｅｒ  ＮＪ、Ｄａｗｓｏｎ  ＣＷ、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  １９９８；１９（１１）：５０２−６
【非特許文献２３】Ｆｕｎａｋｏｓｈｉ  Ｓ、Ｌｏｎｇｏ  ＤＬ、Ｂｅｃｋｗｉｔｈ  Ｍら、Ｂｌｏｏｄ  １９９４；８３（１０）：２７８７−９４
【非特許文献２４】Ｈｅｓｓ  Ｓ、Ｅｎｇｅｌｍａｎｎ  Ｈ、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９９６；１８３（１）：１５９−６７
【非特許文献２５】Ｅｌｉｏｐｏｕｌｏｓ  ＡＧ、Ｄａｗｓｏｎ  ＣＷ、Ｍｏｓｉａｌｏｓ  Ｇら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １９９６；１３（１０）：２２４３−５４
【非特許文献２６】ｖｏｎ  Ｌｅｏｐｒｅｃｈｔｉｎｇ  Ａ、ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｂｒｕｇｇｅｎ  Ｐ、Ｐａｈｌ  ＨＬ、Ａｒｕｆｆｏ  Ａ、Ｓｉｍｏｎ  ＪＣ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９９９；５９（６）：１２８７−９４
【非特許文献２７】Ｅｌｉｏｐｏｕｌｏｓ  ＡＧ、Ｄａｖｉｅｓ  Ｃ，  Ｋｎｏｘ  ＰＧら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２０００；２０（１５）：５５０３−１５
【非特許文献２８】Ｔｏｎｇ  ＡＷ、Ｐａｐａｙｏｔｉ  ＭＨ、Ｎｅｔｔｏ  Ｇら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００１；７（３）：６９１−７０３
【非特許文献２９】ｖａｎ  Ｍｉｅｒｌｏ  ＧＪ、ｄｅｎ  Ｂｏｅｒ  ＡＴ、Ｍｅｄｅｍａ  ＪＰら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ、２００２；９９（８）：５５６１−５５６６
【非特許文献３０】Ｆｒｅｎｃｈ  ＲＲ、Ｃｈａｎ  ＨＴ、Ｔｕｔｔ  ＡＬ、Ｇｌｅｎｎｉｅ  ＭＪ、Ｎａｔ  Ｍｅｄ、１９９９；５（５）：５４８−５５３
【非特許文献３１】Ｔａｉ  ＹＴら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、２００５年７月１日；６５（１３）：５８９８−９０６
【非特許文献３２】Ｌｕｑｍａｎ  Ｍ、Ｋｌａｂｕｎｄｅ  Ｓら：Ｂｌｏｏｄ  １１２：７１１−７２０、２００８
【非特許文献３３】Ｌｏｎｇ  Ｌら、２００５  ＩＭＦ  Ｏｒａｌ  Ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｂｓｔｒａｃｔ  Ｎｏ．３
【非特許文献３４】Ｂｌｏｏｄ  ２００４、１０４（１１，Ｐａｒｔ  １）：Ａｂｓｔ  ３２８１
【非特許文献３５】Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ  ＪＡら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、６０：３２２５−３１、２０００
【非特許文献３６】Ｔａｉ  ＹＴ、Ｃａｔｌｅｙ  ＬＰ、Ｍｉｔｓｉａｄｅｓ  ＣＳら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００４；６４（８）：２８４６−２８５２
【非特許文献３７】Ｌａｗ  ＣＬ、Ｇｏｒｄｏｎ  ＫＡ、Ｃｏｌｌｉｅｒ  Ｊら：Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００５；６５：８３３１−８３３８
【非特許文献３８】Ｏｆｌａｚｏｇｌｕ  Ｅら、Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ、２００９年１月１３日；１００（１）：１１３−７、Ｅｐｕｂ  ２００８年１２月９日
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
したがって、ＣＤ４０を標的にする、かつこの標的に対してアゴニストとして作用し、樹状細胞および免疫監視機構を活性化する、かつＡＤＣＣを活性化し、それにより改善された抗癌特性を提供する新規免疫療法薬が、当該技術分野において依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
簡単な概要
本開示の１つの態様は、（ｉ）配列番号３に示すＶＨＣＤＲ１領域、配列番号４に示すＶＨＣＤＲ２領域および配列番号５に示すＶＨＣＤＲ３領域を含む重鎖可変領域と、（ｉｉ）配列番号６に示すＶＬＣＤＲ１領域、配列番号７に示すＶＬＣＤＲ２領域および配列番号８に示すＶＬＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変領域とを含む、ヒトＣＤ４０に結合する単離された抗体、もしくはその抗原結合断片；または前記ＣＤＲ領域における８以下のアミノ酸置換を除き、（ｉ）および（ｉｉ）の重鎖可変領域および軽鎖可変領域と同一である重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む前記抗体のバリアント、もしくはその抗原結合断片を提供する。本明細書に開示する抗体の１つの実施形態において、前記重鎖可変領域は、配列番号１に示すアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態において、前記軽鎖可変領域は、配列番号２に示すアミノ酸配列を含む。
【００２０】
本開示のもう１つの態様は、配列番号１に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、ヒトＣＤ４０に結合する単離された抗体、またはその抗原結合断片を提供する。この態様の１つの実施形態において、前記単離された抗体、またはその抗原結合断片は、配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。この態様のさらなる実施形態において、前記単離された抗体、またはその抗原結合断片は、配列番号２に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【００２１】
本開示のなおさらなる態様は、配列番号２に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、ヒトＣＤ４０に結合する単離された抗体、またはその抗原結合断片を提供する。この態様の１つの実施形態において、前記単離された抗体、またはその抗原結合断片は、配列番号１に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。
【００２２】
一定の実施形態において、本明細書に開示の単離された抗体は、ヒト化されている。例証となるヒト化抗体可変領域を配列番号９のＶＨ領域アミノ酸配列および配列番号１０のＶＬ領域アミノ酸配列に示す。
【００２３】
１つの実施形態において、本明細書に開示する単離された抗体は、単鎖抗体、ＳｃＦｖ、ヒンジ領域を欠く一価抗体、ミニボディ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’断片、またはＦ（ａｂ’）２断片であり得る。一定の実施形態において、本明細書における抗体は、抗体全体である。
【００２４】
もう１つの実施形態において、本明細書に記載する単離された抗体は、ヒトＩｇＧ定常ドメイン、例えば、これらに限定されないがＩｇＧ１  ＣＨ１ドメインまたはＩｇＧ１  Ｆｃ領域を含む。
【００２５】
本開示のさらなる実施形態は、本明細書に記載する抗ＣＤ４０抗体とヒトＣＤ４０への結合について競合する単離された抗体、またはその抗原結合断片を提供する。
【００２６】
本開示の１つの態様において、ＣＤ４０を結合する前記単離された抗体、またはその抗原結合断片は、０．９６ｎＭ以下のＫＤで結合する。さらなる実施形態において、ＣＤ４０を結合する前記単離された抗体、またはその抗原結合断片は、１．１ｎＭと０．９０ｎＭの間のＫｄで結合する。さらなる実施形態において、ＣＤ４０を結合する前記単離された抗体、またはその抗原結合断片は、約１．２、１．１、１．０、０．９９、０．９８、０．９７、０．９６、０．９５、０．９４、０．９３、０．９２、０．９１、０．９０、０．８５、または約０．８０ｎＭのＫｄで結合する。もう１つの実施形態において、前記抗体は、約２．５、２．４、２．３、２．２、２．１、２．０、１．９、１．８、１．７、１．６、１．５、１．４、または１．３ｎＭのＫｄでＣＤ４０を結合する。
【００２７】
さらなる態様において、本発明は、本明細書に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片であって、ＣＤ４０のＣＤ４０Ｌへの結合を遮断する；ＣＤ４０アゴニストである；抗原提示細胞を活性化する；抗原提示細胞からのサイトカイン放出を刺激する；腫瘍細胞アポトーシスを誘導する；腫瘍細胞増殖を阻害する；抗体依存性細胞傷害、補体依存性細胞傷害および抗体依存性細胞食作用から成る群より選択されるエフェクター機能の誘導により腫瘍細胞を死なせる；抗腫瘍Ｔ細胞応答を刺激する；定着腫瘍を低減させる；リツキシマブ耐性腫瘍を阻害する；または上述のことのいずれか１つ以上の組み合わせである単離された抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【００２８】
本発明のもう１つの態様は、（ｉ）図１６に示すＶＨ領域のいずれか１つのＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２およびＶＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と（ｉｉ）図１６に示すＶＬ領域のいずれか１つの対応するＶＬ領域のＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変領域とを含み、ＣＤ４０に結合する、単離された抗体、もしくはその抗原結合断片、または前記ＣＤＲ領域における８以下のアミノ酸置換を除き、（ｉ）および（ｉｉ）の重鎖可変領域および軽鎖可変領域と同一である重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む前記抗体のバリアント、もしくはその抗原結合断片を提供する。
【００２９】
本発明のさらにもう１つの態様は、図１６に示すＶＨ領域のいずれか１つを含む重鎖可変領域を含み、ＣＤ４０に結合する、単離された抗体、もしくはその抗原結合断片を提供する。１つの実施形態において、かかる抗体は、図１６に示す通りの対応するＶＬ領域と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をさらに含む。もう１つの実施形態において、かかる抗体またはその抗原結合断片は、図１６に示す通りの対応する軽鎖可変領域をさらに含む。
【００３０】
本発明のさらにもう１つの態様は、図１６に示すＶＬ領域のいずれか１つを含む軽鎖可変領域を含み、ＣＤ４０に結合する、単離された抗体、またはその抗原結合断片を提供する。１つの実施形態において、かかる抗体は、図１６に示す通りの対応するＶＨ領域と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域をさらに含む。もう１つの実施形態において、かかる抗体またはその抗原結合断片は、図１６に示す通りの対応する重鎖可変領域をさらに含む。
【００３１】
本開示は、本明細書に開示の単離された抗体またはその抗原結合断片をコードする単離されたポリヌクレオチドも提供する。
【００３２】
本開示は、生理的に許容され得る担体と治療有効量の本明細書に記載の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合断片とを含む組成物も提供する。
【００３３】
本開示のもう１つの態様は、癌を有する患者を処置するための方法であって、生理的に許容され得る担体と治療有効量の本明細書に記載の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合断片とを含む組成物を前記患者に投与し、それによって前記癌を処置することを含む方法を提供する。一定の実施形態において、前記癌は、異常ＣＤ４０発現に関連づけられる。さらなる態様において、前記癌は、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、慢性リンパ球性白血病、有毛細胞白血病、急性リンパ芽球性白血病、多発性骨髄腫、膵臓、結腸、胃腸、前立腺、膀胱、腎臓、卵巣、子宮頚部、乳房、肺、上咽頭の癌腫、悪性黒色腫ならびにリツキシマブ耐性ＮＨＬおよび白血病から成る群より選択される。
【００３４】
本開示のもう１つの態様は、癌および／または自己免疫疾患および／または炎症性疾患を有する患者を処置するための方法であって、生理的に許容され得る担体と治療有効量の本明細書に記載の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合断片とを含む組成物を前記患者に投与し、それによって自己免疫疾患および炎症性疾患を有する前記患者を処置することを含む方法を提供する。
【００３５】
本開示のもう１つの態様は、癌および／または自己免疫疾患および／または炎症性疾患を有する患者における症状を改善するための方法であって、生理的に許容され得る担体と治療有効量の本明細書に記載の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合断片とを含む組成物を前記患者に投与し、それによって癌および／または自己免疫疾患および／または炎症性疾患を有する前記患者における前記症状を改善することを含む方法を提供する。
【００３６】
本開示のもう１つの態様は、配列番号１１に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、ヒトＣＤ４０に結合する単離された抗体、またはその抗原結合断片を提供する。１つの実施形態において、ヒトＣＤ４０に結合する前記単離された抗体、またはその抗原結合断片は、配列番号１１に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、および配列番号２２に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または配列番号２２に示すアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。一定の実施形態において、本明細書に記載する単離された抗体は、配列番号２２に示す通りの軽鎖を含み、および配列番号１１に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。
【００３７】
本開示のさらなる態様は、配列番号１３に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、ヒトＣＤ４０に結合する単離された抗体、またはその抗原結合断片を提供する。１つの実施形態において、前記抗体は、配列番号１３に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２４に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。１つの実施形態において、前記軽鎖は、配列番号２４に示すアミノ酸配列を含む。
【００３８】
本開示のさらなる態様は、配列番号２４に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、ヒトＣＤ４０に結合する単離された抗体、またはその抗原結合断片を提供する。１つの実施形態において、前記抗体は、配列番号２４に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号１３に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを含む。
【００３９】
一定の態様において、ＣＤ４０を結合する前記単離された抗体、またはその抗原結合断片は、配列番号１７に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。１つの実施形態において、ＣＤ４０を結合する前記単離された抗体は、配列番号１７に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２８に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。１つの実施形態において、前記軽鎖可変領域は、配列番号２８に示すアミノ酸配列を含む。
【００４０】
本開示のもう１つの態様は、配列番号２８に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、ヒトＣＤ４０に結合する単離された抗体、またはその抗原結合断片を提供する。１つの実施形態において、ヒトＣＤ４０に結合する前記単離された抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２８に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号１７に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを含む。
【００４１】
本開示のもう１つの態様は、配列番号１９に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、ヒトＣＤ４０に結合する単離された抗体、またはその抗原結合断片を提供する。１つの実施形態において、ヒトＣＤ４０に結合する前記単離された抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１９に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号３０に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。１つの特定の実施形態において、前記軽鎖可変領域は、配列番号３０に示すアミノ酸配列を含む。
【００４２】
本開示のなおさらなる態様は、配列番号３０に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、ヒトＣＤ４０に結合する単離された抗体、またはその抗原結合断片を提供する。１つの実施形態において、ヒトＣＤ４０に結合する前記単離された抗体またはその抗原結合断片は、配列番号３０に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号１９に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを含む。
【００４３】
本開示のもう１つの態様は、重鎖可変領域ＣＤＲを含む重鎖可変領域と、対応する軽鎖可変領域ＣＤＲを含む軽鎖可変領域とを含み、前記ＣＤＲが図１６に示すとおりである、ヒトＣＤ４０に結合する単離された抗体、またはその抗原結合断片を提供する。
【００４４】
本発明の別の局面は、配列番号１９６、１９７、１９９および２０２のうちのいずれか１つもしくはそれより多くに示すＣＤ４０エピトープに結合する、単離された抗体、もしくはその抗原結合断片を提供する。１つの特定の実施形態では、上記単離された抗体、もしくはその抗原結合断片は、配列番号２０２に示すＣＤ４０エピトープに結合する。別の実施形態では、配列番号１９６、１９７、１９９または２０２に示すＣＤ４０エピトープに結合する、単離された抗体、もしくはその抗原結合断片は、配列番号３〜８に示すＣＤＲを含まない。１つの実施形態では、配列番号１９６、１９７、１９９および２０２のうちのいずれか１つもしくはそれより多くに示すＣＤ４０エピトープに結合する上記単離された抗体は、（ｉ）配列番号３に示すＶＨＣＤＲ１領域、配列番号４に示すＶＨＣＤＲ２領域および配列番号５に示すＶＨＣＤＲ３領域を含む重鎖可変領域と、（ｉｉ）配列番号６に示すＶＬＣＤＲ１領域、配列番号７に示すＶＬＣＤＲ２領域および配列番号８に示すＶＬＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変領域とを含む；あるいは、上記抗体のバリアント、もしくはその抗原結合断片は、上記ＣＤＲ領域における８以下のアミノ酸置換を除き、（ｉ）および（ｉｉ）の重鎖可変領域および軽鎖可変領域と同一である重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む；上記単離された抗体、もしくはその抗原結合断片は、上記単離された抗体、もしくはその抗原結合断片が、未改変バージョンの上記Ｆｃ領域を含む上記単離された抗体、もしくはその抗原結合断片と比較して増大したＦｃγＲＩＩＢ結合親和性、増大したＡＤＣＣ、もしくは増大した抗ＣＤ４０アゴニスト活性、またはそれらの組み合わせを有するように改変されたＦｃ領域をさらに含む。これに関して、上記Ｆｃ領域は、Ｓ２６７Ｅ変異を含み得る。
【００４５】
本開示はまた、配列番号１９６、１９７、１９９および２０２のうちのいずれか１つもしくはそれより多くに示すＣＤ４０エピトープに結合する、単離された抗体もしくはその抗原結合断片をコードする単離されたポリヌクレオチド；上記単離されたポリヌクレオチドを含む発現ベクター（ｅｘｐｅｃｔｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ）；およびこのようなベクターを含む単離された宿主細胞を提供する。
【００４６】
本開示はまた、生理的に許容され得る（ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ｅｘｃｅｐｔ）担体と、治療有効量の、配列番号１９６、１９７、１９９および２０２のうちのいずれか１つもしくはそれより多くに示すＣＤ４０エピトープに結合する上記単離された抗体もしくはその抗原結合断片とを含む組成物を提供する。
【００４７】
本開示はさらに、患者における癌を処置または改善するための方法であって、本明細書中に記載のとおりの配列番号１９６、１９７、１９９および２０２のうちのいずれか１つもしくはそれより多くに示すＣＤ４０エピトープに結合する上記抗体を含む組成物を上記患者に投与することを含む方法を提供する。これに関して、上記癌は、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、慢性リンパ球性白血病、有毛細胞白血病、急性リンパ芽球性白血病、多発性骨髄腫、膀胱、腎臓  卵巣、子宮頚部、乳房、肺、上咽頭の癌腫、悪性黒色腫またはリツキシマブ耐性ＮＨＬもしくは白血病であり得る。
【００４８】
本開示はまた、配列番号１９６、１９７、１９９および２０２のうちのいずれか１つもしくはそれより多くに示すＣＤ４０エピトープに結合する上記抗体を含む組成物を患者に投与することによって上記患者における自己免疫疾患または炎症性疾患の症状を改善するための方法を提供する。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
配列番号１９６、１９７、１９９および２０２のいずれか１つまたはそれより多くに示すＣＤ４０エピトープに結合する、単離された抗体、もしくはその抗原結合断片。
（項目２）
前記単離された抗体、またはその抗原結合断片が、配列番号２０２に示すＣＤ４０エピトープに結合する、項目１に記載の単離された抗体、またはその抗原結合断片。
（項目３）
前記抗体、またはその抗原結合断片が、配列番号３〜８に示すＣＤＲを含まない、項目１または項目２に記載の単離された抗体、またはその抗原結合断片。
（項目４）
前記単離された抗体、またはその抗原結合断片が、
（ｉ）配列番号３に示すＶＨＣＤＲ１領域、配列番号４に示すＶＨＣＤＲ２領域および配列番号５に示すＶＨＣＤＲ３領域を含む重鎖可変領域と、（ｉｉ）配列番号６に示すＶＬＣＤＲ１領域、配列番号７に示すＶＬＣＤＲ２領域および配列番号８に示すＶＬＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変領域とを含むか；または
該ＣＤＲ領域における８以下のアミノ酸置換を除き、（ｉ）および（ｉｉ）の重鎖可変領域および軽鎖可変領域と同一である重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む、該抗体のバリアント、もしくはその抗原結合断片を含み、
該単離された抗体、またはその抗原結合断片は、該単離された抗体、またはその抗原結合断片が、改変されていないバージョンのＦｃ領域を含む該単離された抗体またはその抗原結合断片と比較して増大したＦｃγＲＩＩＢ結合親和性、増大したＡＤＣＣ、もしくは増大した抗ＣＤ４０アゴニスト活性、またはそれらの組み合わせを有するように改変された該Ｆｃ領域をさらに含む、項目１に記載の単離された抗体。
（項目５）
前記Ｆｃ領域がＳ２６７Ｅ変異によって改変されている、項目４に記載の単離された抗体、またはその抗原結合断片。
（項目６）
ヒト化されている、項目１に記載の単離された抗体。
（項目７）
単鎖抗体、ＳｃＦｖ、ヒンジ領域を欠く一価抗体、およびミニボディから成る群より選択される、項目１に記載の単離された抗体。
（項目８）
Ｆａｂ断片またはＦａｂ’断片である、項目１に記載の単離された抗体。
（項目９）
Ｆ（ａｂ’）２断片である、項目１に記載の単離された抗体。
（項目１０）
抗体全体である、項目１に記載の単離された抗体。
（項目１１）
ヒトＩｇＧ定常ドメインを含む、項目１に記載の単離された抗体。
（項目１２）
前記ＩｇＧ定常ドメインが、ＩｇＧ１  ＣＨ１ドメインを含む、項目１１に記載の単離された抗体。
（項目１３）
前記ＩｇＧ定常ドメインが、ＩｇＧ１  Ｆｃ領域を含む、項目１１に記載の単離された抗体。
（項目１４）
前記ＩｇＧ１のＦｃ領域がＳ２６７Ｅ置換を有する、項目１３に記載の単離された抗体。（項目１５）
項目１に記載の抗体とＣＤ４０への結合について競合する、単離された抗体、またはその抗原結合断片。
（項目１６）
前述の項目のいずれか一項に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片をコードする単離されたポリヌクレオチド。
（項目１７）
項目１６に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
（項目１８）
項目１７に記載のベクターを含む単離された宿主細胞。
（項目１９）
生理的に許容され得る担体と治療有効量の前述の項目のいずれか一項に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片とを含む組成物。
（項目２０）
患者における癌の症状を処置または改善する方法であって、項目１９に記載の組成物を該患者に投与し、それによって該癌の該症状を処置または改善することを含む方法。
（項目２１）
前記癌が、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、慢性リンパ球性白血病、有毛細胞白血病、急性リンパ芽球性白血病、多発性骨髄腫、膀胱の癌腫、腎臓の癌腫、卵巣の癌腫、子宮頚部の癌腫、乳房の癌腫、肺の癌腫、上咽頭の癌腫、悪性黒色腫ならびにリツキシマブ耐性ＮＨＬおよび白血病から成る群より選択される、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
患者における自己免疫疾患の症状を改善するための方法であって、項目２０に記載の組成物を該患者に投与し、それによって自己免疫疾患の該症状を改善することを含む方法。
（項目２３）
患者における炎症性疾患の症状を改善するための方法であって、項目２０に記載の組成物を該患者に投与し、それによって炎症性疾患の該症状を改善することを含む方法。
【００４９】
配列の簡単な説明
配列番号１は、Ｒ−８ウサギ抗ＣＤ４０抗体のＶＨ領域のアミノ酸配列である。
【００５０】
配列番号２は、Ｒ−８ウサギ抗ＣＤ４０抗体のＶＬ領域のアミノ酸配列である。
【００５１】
配列番号３は、Ｒ−８ウサギ抗ＣＤ４０抗体のＶＨＣＤＲ１領域のアミノ酸配列である。
【００５２】
配列番号４は、Ｒ−８ウサギ抗ＣＤ４０抗体のＶＨＣＤＲ２領域のアミノ酸配列である。
【００５３】
配列番号５は、Ｒ−８ウサギ抗ＣＤ４０抗体のＶＨＣＤＲ３領域のアミノ酸配列である。
【００５４】
配列番号６は、Ｒ−８ウサギ抗ＣＤ４０抗体のＶＬＣＤＲ１領域のアミノ酸配列である。
【００５５】
配列番号７は、Ｒ−８ウサギ抗ＣＤ４０抗体のＶＬＣＤＲ２領域のアミノ酸配列である。
【００５６】
配列番号８は、Ｒ−８ウサギ抗ＣＤ４０抗体のＶＬＣＤＲ３領域のアミノ酸配列である。
【００５７】
配列番号９は、シグナルペプチドを伴わない、ＡＰＸ００５、Ｒ−８ウサギ抗ＣＤ４０抗体のヒト化バージョン、のＶＨ領域のアミノ酸配列である。
【００５８】
配列番号１０は、シグナルペプチドを伴わない、ＡＰＸ００５、Ｒ−８ウサギ抗ＣＤ４０抗体のヒト化バージョン、のＶＬ領域のアミノ酸配列である。
【００５９】
配列番号１１〜２１および３３〜４４は、機能活性を示したウサギ抗ＣＤ４０抗体候補の重鎖アミノ酸配列である（図１６参照）。
【００６０】
配列番号２２〜３２および４５〜５６は、機能活性を示したウサギ抗ＣＤ４０抗体候補の軽鎖アミノ酸配列である（図１６参照）。
【００６１】
配列番号５７〜７９は、図１６に示す抗ＣＤ４０抗体についてのＶＨＣＤＲ１アミノ酸配列である。
【００６２】
配列番号８０〜１０２は、図１６に示す抗ＣＤ４０抗体についてのＶＨＣＤＲ２アミノ酸配列である。
【００６３】
配列番号１０３〜１２５は、図１６に示す抗ＣＤ４０抗体についてのＶＨＣＤＲ３アミノ酸配列である。
【００６４】
配列番号１２６〜１４８は、図１６に示す抗ＣＤ４０抗体についてのＶＬＣＤＲ１アミノ酸配列である。
【００６５】
配列番号１４９〜１７１は、図１６に示す抗ＣＤ４０抗体についてのＶＬＣＤＲ２アミノ酸配列である。
【００６６】
配列番号１７２〜１９４は、図１６に示す抗ＣＤ４０抗体についてのＶＬＣＤＲ３アミノ酸配列である。
【００６７】
配列番号１９５は、Ｓ２６７Ｅ置換を有するＦｃ領域を含むヒトＩｇＧ１重鎖定常領域のアミノ酸配列である。
【００６８】
配列番号１９６は、ＡＰＸ００５抗体によって結合されたエピトープとして同定された、ヒトＣＤ４０のアミノ酸９２〜１０７である。
【００６９】
配列番号１９７は、ＡＰＸ００５抗体によって結合されたエピトープとして同定された、ヒトＣＤ４０のアミノ酸１２５〜１４４である。
【００７０】
配列番号１９８は、ヒトＣＤ４０のアミノ酸配列である。
【００７１】
配列番号１９９は、ＣＤ４０の残基８４〜１０２からの、ＣＤ４０  ＣＬＩＰＳペプチドのアミノ酸配列である。
【００７２】
配列番号２００は、９１位および９６位のシステイン残基に代えてのセリン置換を有するＣＤ４０の残基８４〜１０２のアミノ酸配列である。
【００７３】
配列番号２０１は、ヒトＣＤ４０のアミノ酸残基１２２〜１２５である。
【００７４】
配列番号２０２は、ＡＰＸ００５抗体によって結合された、ヒトＣＤ４０のアミノ酸残基９２〜１０２である。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１Ａ】図１Ａ〜１Ｄは、実施例１に記載のＤＣ成熟およびＴ細胞活性化を測定することによるアゴニスト抗体のスクリーニングの結果を示す。１Ａ：ＣＤ８３発現；１Ｂ：ＣＤ８０発現；１Ｃ：ＣＤ８６発現；１Ｄ：混合リンパ球反応におけるＴ細胞増殖。
【図１Ｂ】図１Ａ〜１Ｄは、実施例１に記載のＤＣ成熟およびＴ細胞活性化を測定することによるアゴニスト抗体のスクリーニングの結果を示す。１Ａ：ＣＤ８３発現；１Ｂ：ＣＤ８０発現；１Ｃ：ＣＤ８６発現；１Ｄ：混合リンパ球反応におけるＴ細胞増殖。
【図１Ｃ】図１Ａ〜１Ｄは、実施例１に記載のＤＣ成熟およびＴ細胞活性化を測定することによるアゴニスト抗体のスクリーニングの結果を示す。１Ａ：ＣＤ８３発現；１Ｂ：ＣＤ８０発現；１Ｃ：ＣＤ８６発現；１Ｄ：混合リンパ球反応におけるＴ細胞増殖。
【図１Ｄ】図１Ａ〜１Ｄは、実施例１に記載のＤＣ成熟およびＴ細胞活性化を測定することによるアゴニスト抗体のスクリーニングの結果を示す。１Ａ：ＣＤ８３発現；１Ｂ：ＣＤ８０発現；１Ｃ：ＣＤ８６発現；１Ｄ：混合リンパ球反応におけるＴ細胞増殖。
【図２】図２は、Ｒａｍｏｓ細胞増殖の阻害におけるリード候補の比較を示すグラフである。
【図３】図３は、ＡＤＣＣアッセイの結果を示す棒グラフである。４０：１のエフェクター（ヒトＰＢＭＣ）：標的細胞（Ｒａｍｏｓ細胞）比。
【図４Ａ】図４Ａおよび図４Ｂは、抗ＣＤ４０候補の抗腫瘍活性のｉｎ  ｖｉｖｏスクリーニングの結果を示すグラフである。
【図４Ｂ】図４Ａおよび図４Ｂは、抗ＣＤ４０候補の抗腫瘍活性のｉｎ  ｖｉｖｏスクリーニングの結果を示すグラフである。
【図５】図５は、ＡＰＸ００５が、ＣＤ４０に選択的に結合し、他のＴＮＦＲファミリーメンバーに結合しないことを実証するＥＬＩＳＡアッセイの結果を示すグラフである。
【図６】図６は、ＡＰＸ００５がＣＤ４０へのＣＤ４０Ｌの結合を遮断することを実証するＥＬＩＳＡアッセイの結果を示すグラフである
【図７】図７は、ＡＰＸ００５が、ＣＤ４０陽性細胞へ結合すると内在化しないことを示すグラフである。
【図８Ａ】図８Ａおよび図８Ｂは、ＣＤ４０陽性Ｒａｍｏｓ（図８Ａ）およびＤａｕｄｉ（図８Ｂ）腫瘍細胞のＡＰＸ００５媒介ＡＤＣＣを示すグラフである。
【図８Ｂ】図８Ａおよび図８Ｂは、ＣＤ４０陽性Ｒａｍｏｓ（図８Ａ）およびＤａｕｄｉ（図８Ｂ）腫瘍細胞のＡＰＸ００５媒介ＡＤＣＣを示すグラフである。
【図９Ａ】図９Ａおよび図９Ｂは、ＡＰＸ００５によるＲａｍｏｓ腫瘍細胞増殖のｉｎ  ｖｉｔｒｏ阻害を示すグラフである。パネルＡ：Ｆｃ架橋を伴わない；パネルＢ：Ｆｃ架橋を伴う。
【図９Ｂ】図９Ａおよび図９Ｂは、ＡＰＸ００５によるＲａｍｏｓ腫瘍細胞増殖のｉｎ  ｖｉｔｒｏ阻害を示すグラフである。パネルＡ：Ｆｃ架橋を伴わない；パネルＢ：Ｆｃ架橋を伴う。
【図１０】図１０は、ＡＰＸ００５によるＤＣ活性化の誘導を示す棒グラフである。
【図１１Ａ】図１１Ａおよび１１Ｂは、ＡＰＸ００５がヒトおよびサルＣＤ４０に結合し、マウスＣＤ４０に結合しないことを示す。
【図１１Ｂ】図１１Ａおよび１１Ｂは、ＡＰＸ００５がヒトおよびサルＣＤ４０に結合し、マウスＣＤ４０に結合しないことを示す。
【図１２Ａ】図１２Ａは、Ｒａｍｏｓモデルにおける腫瘍成長のＡＰＸ００５阻害を示すグラフである。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、最終投薬の２日後の第３４日の時点でのマウスにおける血清ヒトＩｇＧレベルを示す棒グラフである。
【図１３Ａ】図１３Ａおよび１３Ｂは、マウスモデルにおけるリツキシマブで前処置したリツキシマブ耐性腫瘍の阻害を示すグラフである。
【図１３Ｂ】図１３Ａおよび１３Ｂは、マウスモデルにおけるリツキシマブで前処置したリツキシマブ耐性腫瘍の阻害を示すグラフである。
【図１４】図１４は、Ｒａｊｉマウスモデルにおける腫瘍成長のＡＰＸ００５阻害を示すグラフである。
【図１５】図１５は、ＩＭ−９異種移植モデルにおけるヒト多発性骨髄腫に対するＡＰＸ００５の強力な抗腫瘍活性を示すグラフである。
【図１６Ａ】図１６Ａ〜１６Ｌは、ウサギ抗ＣＤ４０重（図１６Ａ〜１６Ｆ）および軽鎖（図１６Ｇ〜１６Ｌ）抗体配列の配列アラインメントである。重および軽鎖ＣＤＲ１〜３に下線が引かれている。配列番号は、次のとおりである。重鎖：Ｒ−３およびＲ−６：配列番号１１、１２；Ｒ−８：配列番号１、Ｒ−９、−１６、−１８、−２４、−３３、−３６、１９−２１、−４５、−５９：それぞれ、配列番号１３〜２１；Ｒ−２、Ｒ−５、Ｒ−７、Ｒ−１０、Ｒ−１２、Ｒ−２０、Ｒ−２６、Ｒ−３０、Ｒ−３５、１９−３５、１９−４１、１９−５７：それぞれ、配列番号３３〜４４。軽鎖：Ｒ−３およびＲ−６：配列番号２２および２３；Ｒ−８：配列番号２；Ｒ−９、−１６、−１８、−２４、−３３、−３６、１９−２１、−４５、−５９：それぞれ、配列番号２４〜３２；Ｒ−２、Ｒ−５、Ｒ−７、Ｒ−１０、Ｒ−１２、Ｒ−２０、Ｒ−２６、Ｒ−３０、Ｒ−３５、１９−３５、１９−４１、１９−５７：それぞれ、配列番号４５〜５６。前記アミノ酸配列は、ＶＨおよびＶＬシグナルペプチドを含む。前記Ｒ−８  ＶＨＣＤＲおよびＶＬＣＤＲアミノ酸配列を配列番号３〜８に示す。残りの抗体についてのＶＨＣＤＲアミノ酸配列およびＶＬＣＤＲアミノ酸配列を配列番号５７〜１２５および配列番号１２６〜１９４にそれぞれ示す。
【図１６Ｂ】図１６Ａ〜１６Ｌは、ウサギ抗ＣＤ４０重（図１６Ａ〜１６Ｆ）および軽鎖（図１６Ｇ〜１６Ｌ）抗体配列の配列アラインメントである。重および軽鎖ＣＤＲ１〜３に下線が引かれている。配列番号は、次のとおりである。重鎖：Ｒ−３およびＲ−６：配列番号１１、１２；Ｒ−８：配列番号１、Ｒ−９、−１６、−１８、−２４、−３３、−３６、１９−２１、−４５、−５９：それぞれ、配列番号１３〜２１；Ｒ−２、Ｒ−５、Ｒ−７、Ｒ−１０、Ｒ−１２、Ｒ−２０、Ｒ−２６、Ｒ−３０、Ｒ−３５、１９−３５、１９−４１、１９−５７：それぞれ、配列番号３３〜４４。軽鎖：Ｒ−３およびＲ−６：配列番号２２および２３；Ｒ−８：配列番号２；Ｒ−９、−１６、−１８、−２４、−３３、−３６、１９−２１、−４５、−５９：それぞれ、配列番号２４〜３２；Ｒ−２、Ｒ−５、Ｒ−７、Ｒ−１０、Ｒ−１２、Ｒ−２０、Ｒ−２６、Ｒ−３０、Ｒ−３５、１９−３５、１９−４１、１９−５７：それぞれ、配列番号４５〜５６。前記アミノ酸配列は、ＶＨおよびＶＬシグナルペプチドを含む。前記Ｒ−８  ＶＨＣＤＲおよびＶＬＣＤＲアミノ酸配列を配列番号３〜８に示す。残りの抗体についてのＶＨＣＤＲアミノ酸配列およびＶＬＣＤＲアミノ酸配列を配列番号５７〜１２５および配列番号１２６〜１９４にそれぞれ示す。
【図１６Ｃ】図１６Ａ〜１６Ｌは、ウサギ抗ＣＤ４０重（図１６Ａ〜１６Ｆ）および軽鎖（図１６Ｇ〜１６Ｌ）抗体配列の配列アラインメントである。重および軽鎖ＣＤＲ１〜３に下線が引かれている。配列番号は、次のとおりである。重鎖：Ｒ−３およびＲ−６：配列番号１１、１２；Ｒ−８：配列番号１、Ｒ−９、−１６、−１８、−２４、−３３、−３６、１９−２１、−４５、−５９：それぞれ、配列番号１３〜２１；Ｒ−２、Ｒ−５、Ｒ−７、Ｒ−１０、Ｒ−１２、Ｒ−２０、Ｒ−２６、Ｒ−３０、Ｒ−３５、１９−３５、１９−４１、１９−５７：それぞれ、配列番号３３〜４４。軽鎖：Ｒ−３およびＲ−６：配列番号２２および２３；Ｒ−８：配列番号２；Ｒ−９、−１６、−１８、−２４、−３３、−３６、１９−２１、−４５、−５９：それぞれ、配列番号２４〜３２；Ｒ−２、Ｒ−５、Ｒ−７、Ｒ−１０、Ｒ−１２、Ｒ−２０、Ｒ−２６、Ｒ−３０、Ｒ−３５、１９−３５、１９−４１、１９−５７：それぞれ、配列番号４５〜５６。前記アミノ酸配列は、ＶＨおよびＶＬシグナルペプチドを含む。前記Ｒ−８  ＶＨＣＤＲおよびＶＬＣＤＲアミノ酸配列を配列番号３〜８に示す。残りの抗体についてのＶＨＣＤＲアミノ酸配列およびＶＬＣＤＲアミノ酸配列を配列番号５７〜１２５および配列番号１２６〜１９４にそれぞれ示す。
【図１６Ｄ】図１６Ａ〜１６Ｌは、ウサギ抗ＣＤ４０重（図１６Ａ〜１６Ｆ）および軽鎖（図１６Ｇ〜１６Ｌ）抗体配列の配列アラインメントである。重および軽鎖ＣＤＲ１〜３に下線が引かれている。配列番号は、次のとおりである。重鎖：Ｒ−３およびＲ−６：配列番号１１、１２；Ｒ−８：配列番号１、Ｒ−９、−１６、−１８、−２４、−３３、−３６、１９−２１、−４５、−５９：それぞれ、配列番号１３〜２１；Ｒ−２、Ｒ−５、Ｒ−７、Ｒ−１０、Ｒ−１２、Ｒ−２０、Ｒ−２６、Ｒ−３０、Ｒ−３５、１９−３５、１９−４１、１９−５７：それぞれ、配列番号３３〜４４。軽鎖：Ｒ−３およびＲ−６：配列番号２２および２３；Ｒ−８：配列番号２；Ｒ−９、−１６、−１８、−２４、−３３、−３６、１９−２１、−４５、−５９：それぞれ、配列番号２４〜３２；Ｒ−２、Ｒ−５、Ｒ−７、Ｒ−１０、Ｒ−１２、Ｒ−２０、Ｒ−２６、Ｒ−３０、Ｒ−３５、１９−３５、１９−４１、１９−５７：それぞれ、配列番号４５〜５６。前記アミノ酸配列は、ＶＨおよびＶＬシグナルペプチドを含む。前記Ｒ−８  ＶＨＣＤＲおよびＶＬＣＤＲアミノ酸配列を配列番号３〜８に示す。残りの抗体についてのＶＨＣＤＲアミノ酸配列およびＶＬＣＤＲアミノ酸配列を配列番号５７〜１２５および配列番号１２６〜１９４にそれぞれ示す。
【図１６Ｅ】図１６Ａ〜１６Ｌは、ウサギ抗ＣＤ４０重（図１６Ａ〜１６Ｆ）および軽鎖（図１６Ｇ〜１６Ｌ）抗体配列の配列アラインメントである。重および軽鎖ＣＤＲ１〜３に下線が引かれている。配列番号は、次のとおりである。重鎖：Ｒ−３およびＲ−６：配列番号１１、１２；Ｒ−８：配列番号１、Ｒ−９、−１６、−１８、−２４、−３３、−３６、１９−２１、−４５、−５９：それぞれ、配列番号１３〜２１；Ｒ−２、Ｒ−５、Ｒ−７、Ｒ−１０、Ｒ−１２、Ｒ−２０、Ｒ−２６、Ｒ−３０、Ｒ−３５、１９−３５、１９−４１、１９−５７：それぞれ、配列番号３３〜４４。軽鎖：Ｒ−３およびＲ−６：配列番号２２および２３；Ｒ−８：配列番号２；Ｒ−９、−１６、−１８、−２４、−３３、−３６、１９−２１、−４５、−５９：それぞれ、配列番号２４〜３２；Ｒ−２、Ｒ−５、Ｒ−７、Ｒ−１０、Ｒ−１２、Ｒ−２０、Ｒ−２６、Ｒ−３０、Ｒ−３５、１９−３５、１９−４１、１９−５７：それぞれ、配列番号４５〜５６。前記アミノ酸配列は、ＶＨおよびＶＬシグナルペプチドを含む。前記Ｒ−８  ＶＨＣＤＲおよびＶＬＣＤＲアミノ酸配列を配列番号３〜８に示す。残りの抗体についてのＶＨＣＤＲアミノ酸配列およびＶＬＣＤＲアミノ酸配列を配列番号５７〜１２５および配列番号１２６〜１９４にそれぞれ示す。
【図１６Ｆ】図１６Ａ〜１６Ｌは、ウサギ抗ＣＤ４０重（図１６Ａ〜１６Ｆ）および軽鎖（図１６Ｇ〜１６Ｌ）抗体配列の配列アラインメントである。重および軽鎖ＣＤＲ１〜３に下線が引かれている。配列番号は、次のとおりである。重鎖：Ｒ−３およびＲ−６：配列番号１１、１２；Ｒ−８：配列番号１、Ｒ−９、−１６、−１８、−２４、−３３、−３６、１９−２１、−４５、−５９：それぞれ、配列番号１３〜２１；Ｒ−２、Ｒ−５、Ｒ−７、Ｒ−１０、Ｒ−１２、Ｒ−２０、Ｒ−２６、Ｒ−３０、Ｒ−３５、１９−３５、１９−４１、１９−５７：それぞれ、配列番号３３〜４４。軽鎖：Ｒ−３およびＲ−６：配列番号２２および２３；Ｒ−８：配列番号２；Ｒ−９、−１６、−１８、−２４、−３３、−３６、１９−２１、−４５、−５９：それぞれ、配列番号２４〜３２；Ｒ−２、Ｒ−５、Ｒ−７、Ｒ−１０、Ｒ−１２、Ｒ−２０、Ｒ−２６、Ｒ−３０、Ｒ−３５、１９−３５、１９−４１、１９−５７：それぞれ、配列番号４５〜５６。前記アミノ酸配列は、ＶＨおよびＶＬシグナルペプチドを含む。前記Ｒ−８  ＶＨＣＤＲおよびＶＬＣＤＲアミノ酸配列を配列番号３〜８に示す。残りの抗体についてのＶＨＣＤＲアミノ酸配列およびＶＬＣＤＲアミノ酸配列を配列番号５７〜１２５および配列番号１２６〜１９４にそれぞれ示す。
【図１６Ｇ】図１６Ａ〜１６Ｌは、ウサギ抗ＣＤ４０重（図１６Ａ〜１６Ｆ）および軽鎖（図１６Ｇ〜１６Ｌ）抗体配列の配列アラインメントである。重および軽鎖ＣＤＲ１〜３に下線が引かれている。配列番号は、次のとおりである。重鎖：Ｒ−３およびＲ−６：配列番号１１、１２；Ｒ−８：配列番号１、Ｒ−９、−１６、−１８、−２４、−３３、−３６、１９−２１、−４５、−５９：それぞれ、配列番号１３〜２１；Ｒ−２、Ｒ−５、Ｒ−７、Ｒ−１０、Ｒ−１２、Ｒ−２０、Ｒ−２６、Ｒ−３０、Ｒ−３５、１９−３５、１９−４１、１９−５７：それぞれ、配列番号３３〜４４。軽鎖：Ｒ−３およびＲ−６：配列番号２２および２３；Ｒ−８：配列番号２；Ｒ−９、−１６、−１８、−２４、−３３、−３６、１９−２１、−４５、−５９：それぞれ、配列番号２４〜３２；Ｒ−２、Ｒ−５、Ｒ−７、Ｒ−１０、Ｒ−１２、Ｒ−２０、Ｒ−２６、Ｒ−３０、Ｒ−３５、１９−３５、１９−４１、１９−５７：それぞれ、配列番号４５〜５６。前記アミノ酸配列は、ＶＨおよびＶＬシグナルペプチドを含む。前記Ｒ−８  ＶＨＣＤＲおよびＶＬＣＤＲアミノ酸配列を配列番号３〜８に示す。残りの抗体についてのＶＨＣＤＲアミノ酸配列およびＶＬＣＤＲアミノ酸配列を配列番号５７〜１２５および配列番号１２６〜１９４にそれぞれ示す。
【図１６Ｈ】図１６Ａ〜１６Ｌは、ウサギ抗ＣＤ４０重（図１６Ａ〜１６Ｆ）および軽鎖（図１６Ｇ〜１６Ｌ）抗体配列の配列アラインメントである。重および軽鎖ＣＤＲ１〜３に下線が引かれている。配列番号は、次のとおりである。重鎖：Ｒ−３およびＲ−６：配列番号１１、１２；Ｒ−８：配列番号１、Ｒ−９、−１６、−１８、−２４、−３３、−３６、１９−２１、−４５、−５９：それぞれ、配列番号１３〜２１；Ｒ−２、Ｒ−５、Ｒ−７、Ｒ−１０、Ｒ−１２、Ｒ−２０、Ｒ−２６、Ｒ−３０、Ｒ−３５、１９−３５、１９−４１、１９−５７：それぞれ、配列番号３３〜４４。軽鎖：Ｒ−３およびＲ−６：配列番号２２および２３；Ｒ−８：配列番号２；Ｒ−９、−１６、−１８、−２４、−３３、−３６、１９−２１、−４５、−５９：それぞれ、配列番号２４〜３２；Ｒ−２、Ｒ−５、Ｒ−７、Ｒ−１０、Ｒ−１２、Ｒ−２０、Ｒ−２６、Ｒ−３０、Ｒ−３５、１９−３５、１９−４１、１９−５７：それぞれ、配列番号４５〜５６。前記アミノ酸配列は、ＶＨおよびＶＬシグナルペプチドを含む。前記Ｒ−８  ＶＨＣＤＲおよびＶＬＣＤＲアミノ酸配列を配列番号３〜８に示す。残りの抗体についてのＶＨＣＤＲアミノ酸配列およびＶＬＣＤＲアミノ酸配列を配列番号５７〜１２５および配列番号１２６〜１９４にそれぞれ示す。
【図１６Ｉ】図１６Ａ〜１６Ｌは、ウサギ抗ＣＤ４０重（図１６Ａ〜１６Ｆ）および軽鎖（図１６Ｇ〜１６Ｌ）抗体配列の配列アラインメントである。重および軽鎖ＣＤＲ１〜３に下線が引かれている。配列番号は、次のとおりである。重鎖：Ｒ−３およびＲ−６：配列番号１１、１２；Ｒ−８：配列番号１、Ｒ−９、−１６、−１８、−２４、−３３、−３６、１９−２１、−４５、−５９：それぞれ、配列番号１３〜２１；Ｒ−２、Ｒ−５、Ｒ−７、Ｒ−１０、Ｒ−１２、Ｒ−２０、Ｒ−２６、Ｒ−３０、Ｒ−３５、１９−３５、１９−４１、１９−５７：それぞれ、配列番号３３〜４４。軽鎖：Ｒ−３およびＲ−６：配列番号２２および２３；Ｒ−８：配列番号２；Ｒ−９、−１６、−１８、−２４、−３３、−３６、１９−２１、−４５、−５９：それぞれ、配列番号２４〜３２；Ｒ−２、Ｒ−５、Ｒ−７、Ｒ−１０、Ｒ−１２、Ｒ−２０、Ｒ−２６、Ｒ−３０、Ｒ−３５、１９−３５、１９−４１、１９−５７：それぞれ、配列番号４５〜５６。前記アミノ酸配列は、ＶＨおよびＶＬシグナルペプチドを含む。前記Ｒ−８  ＶＨＣＤＲおよびＶＬＣＤＲアミノ酸配列を配列番号３〜８に示す。残りの抗体についてのＶＨＣＤＲアミノ酸配列およびＶＬＣＤＲアミノ酸配列を配列番号５７〜１２５および配列番号１２６〜１９４にそれぞれ示す。
【図１６Ｊ】図１６Ａ〜１６Ｌは、ウサギ抗ＣＤ４０重（図１６Ａ〜１６Ｆ）および軽鎖（図１６Ｇ〜１６Ｌ）抗体配列の配列アラインメントである。重および軽鎖ＣＤＲ１〜３に下線が引かれている。配列番号は、次のとおりである。重鎖：Ｒ−３およびＲ−６：配列番号１１、１２；Ｒ−８：配列番号１、Ｒ−９、−１６、−１８、−２４、−３３、−３６、１９−２１、−４５、−５９：それぞれ、配列番号１３〜２１；Ｒ−２、Ｒ−５、Ｒ−７、Ｒ−１０、Ｒ−１２、Ｒ−２０、Ｒ−２６、Ｒ−３０、Ｒ−３５、１９−３５、１９−４１、１９−５７：それぞれ、配列番号３３〜４４。軽鎖：Ｒ−３およびＲ−６：配列番号２２および２３；Ｒ−８：配列番号２；Ｒ−９、−１６、−１８、−２４、−３３、−３６、１９−２１、−４５、−５９：それぞれ、配列番号２４〜３２；Ｒ−２、Ｒ−５、Ｒ−７、Ｒ−１０、Ｒ−１２、Ｒ−２０、Ｒ−２６、Ｒ−３０、Ｒ−３５、１９−３５、１９−４１、１９−５７：それぞれ、配列番号４５〜５６。前記アミノ酸配列は、ＶＨおよびＶＬシグナルペプチドを含む。前記Ｒ−８  ＶＨＣＤＲおよびＶＬＣＤＲアミノ酸配列を配列番号３〜８に示す。残りの抗体についてのＶＨＣＤＲアミノ酸配列およびＶＬＣＤＲアミノ酸配列を配列番号５７〜１２５および配列番号１２６〜１９４にそれぞれ示す。
【図１６Ｋ】図１６Ａ〜１６Ｌは、ウサギ抗ＣＤ４０重（図１６Ａ〜１６Ｆ）および軽鎖（図１６Ｇ〜１６Ｌ）抗体配列の配列アラインメントである。重および軽鎖ＣＤＲ１〜３に下線が引かれている。配列番号は、次のとおりである。重鎖：Ｒ−３およびＲ−６：配列番号１１、１２；Ｒ−８：配列番号１、Ｒ−９、−１６、−１８、−２４、−３３、−３６、１９−２１、−４５、−５９：それぞれ、配列番号１３〜２１；Ｒ−２、Ｒ−５、Ｒ−７、Ｒ−１０、Ｒ−１２、Ｒ−２０、Ｒ−２６、Ｒ−３０、Ｒ−３５、１９−３５、１９−４１、１９−５７：それぞれ、配列番号３３〜４４。軽鎖：Ｒ−３およびＲ−６：配列番号２２および２３；Ｒ−８：配列番号２；Ｒ−９、−１６、−１８、−２４、−３３、−３６、１９−２１、−４５、−５９：それぞれ、配列番号２４〜３２；Ｒ−２、Ｒ−５、Ｒ−７、Ｒ−１０、Ｒ−１２、Ｒ−２０、Ｒ−２６、Ｒ−３０、Ｒ−３５、１９−３５、１９−４１、１９−５７：それぞれ、配列番号４５〜５６。前記アミノ酸配列は、ＶＨおよびＶＬシグナルペプチドを含む。前記Ｒ−８  ＶＨＣＤＲおよびＶＬＣＤＲアミノ酸配列を配列番号３〜８に示す。残りの抗体についてのＶＨＣＤＲアミノ酸配列およびＶＬＣＤＲアミノ酸配列を配列番号５７〜１２５および配列番号１２６〜１９４にそれぞれ示す。
【図１６Ｌ】図１６Ａ〜１６Ｌは、ウサギ抗ＣＤ４０重（図１６Ａ〜１６Ｆ）および軽鎖（図１６Ｇ〜１６Ｌ）抗体配列の配列アラインメントである。重および軽鎖ＣＤＲ１〜３に下線が引かれている。配列番号は、次のとおりである。重鎖：Ｒ−３およびＲ−６：配列番号１１、１２；Ｒ−８：配列番号１、Ｒ−９、−１６、−１８、−２４、−３３、−３６、１９−２１、−４５、−５９：それぞれ、配列番号１３〜２１；Ｒ−２、Ｒ−５、Ｒ−７、Ｒ−１０、Ｒ−１２、Ｒ−２０、Ｒ−２６、Ｒ−３０、Ｒ−３５、１９−３５、１９−４１、１９−５７：それぞれ、配列番号３３〜４４。軽鎖：Ｒ−３およびＲ−６：配列番号２２および２３；Ｒ−８：配列番号２；Ｒ−９、−１６、−１８、−２４、−３３、−３６、１９−２１、−４５、−５９：それぞれ、配列番号２４〜３２；Ｒ−２、Ｒ−５、Ｒ−７、Ｒ−１０、Ｒ−１２、Ｒ−２０、Ｒ−２６、Ｒ−３０、Ｒ−３５、１９−３５、１９−４１、１９−５７：それぞれ、配列番号４５〜５６。前記アミノ酸配列は、ＶＨおよびＶＬシグナルペプチドを含む。前記Ｒ−８  ＶＨＣＤＲおよびＶＬＣＤＲアミノ酸配列を配列番号３〜８に示す。残りの抗体についてのＶＨＣＤＲアミノ酸配列およびＶＬＣＤＲアミノ酸配列を配列番号５７〜１２５および配列番号１２６〜１９４にそれぞれ示す。
【図１７Ａ】図１７Ａおよび１７Ｂは、Ｒａｍｏｓモデルにおける腫瘍成長のＡＰＸ００５による阻害をＳＧＮ−４０およびリツキシマブと比較して示す。
【図１７Ｂ】図１７Ａおよび１７Ｂは、Ｒａｍｏｓモデルにおける腫瘍成長のＡＰＸ００５による阻害をＳＧＮ−４０およびリツキシマブと比較して示す。
【図１８Ａ】図１８Ａおよび１８Ｂは、リツキシマブ耐性ヒトＮａｍａｌｗａリンパ腫異種移植モデルにおける腫瘍成長のＡＰＸ００５による阻害を示す。
【図１８Ｂ】図１８Ａおよび１８Ｂは、リツキシマブ耐性ヒトＮａｍａｌｗａリンパ腫異種移植モデルにおける腫瘍成長のＡＰＸ００５による阻害を示す。
【図１９】図１９は、ＣＤ４０に結合しているＡＰＸ００５とＡＰＸ００５Ｓ２６７Ｅとの比較を示す。
【図２０】図２０は、他の抗ＣＤ４０抗体と比較した、ＡＰＸ００５およびＡＰＸ００５  Ｓ２６７Ｅ変異体の結合親和性を示す。
【図２１】図２１は、ＡＰＸ００５  Ｓ２６７Ｅ変異体のＣＤ４０アゴニスト活性を示す。この実験についてのＥＣ５０（ｎｇ／ｍｌ）は以下の通りであった：ＡＰＸ００５：２４．３５；ＡＰＸ００５  Ｓ２６７Ｅ：４．１５；ＳＧＮ−４０：１２６４．００；ＣＰ８７０８９３：３７．００；１９−２１：７４．６５。
【図２２】図２２は、ＡＰＸ００５  Ｓ２６７Ｅ変異体のＡＤＣＣ活性を示す。
【図２３Ａ】図２３は、構造３ＱＤ６のカートゥーンレンダリング（ｃａｒｔｏｏｎｒｅｎｄｅｒｉｎｇ）（図２３Ａ）および表面レンダリング（図２３Ｂ）でのＡＰＸ００５エピトープの可視化を示す。エピトープ領域９２ＴＳＥＡＣＥＳＣＶＬＨＲＳＣＳＰ１０７（配列番号１９６）が、ＣＤ４０の結晶構造にマッピングされており、太く描かれている。ＡＰＸ００５抗体が結合することも見出された残基１２５〜１４４は、構造３ＱＤ６においては解明されていないが、システイン結合についての利用可能なデータに基づいて、残基９２〜１０７のごく近くにあると予測される。それゆえ、参照の目的および可視化の目的で、残基１２２〜１２５（配列番号２０１）を示す。
【図２３Ｂ】図２３は、構造３ＱＤ６のカートゥーンレンダリング（ｃａｒｔｏｏｎ  ｒｅｎｄｅｒｉｎｇ）（図２３Ａ）および表面レンダリング（図２３Ｂ）でのＡＰＸ００５エピトープの可視化を示す。エピトープ領域９２ＴＳＥＡＣＥＳＣＶＬＨＲＳＣＳＰ１０７（配列番号１９６）が、ＣＤ４０の結晶構造にマッピングされており、太く描かれている。ＡＰＸ００５抗体が結合することも見出された残基１２５〜１４４は、構造３ＱＤ６においては解明されていないが、システイン結合についての利用可能なデータに基づいて、残基９２〜１０７のごく近くにあると予測される。それゆえ、参照の目的および可視化の目的で、残基１２２〜１２５（配列番号２０１）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００７６】
詳細な説明
本開示は、ＣＤ４０に特異的に結合する抗体およびそれらの抗原結合断片、詳細には、特異的エピトープ特異性および機能特性を有する抗体に関する。本発明の１つの実施形態は、ＣＤ４０への結合が可能であり、ならびにＣＤ４０媒介下流細胞シグナリングおよび生物学的効果を誘導／強化することによりＣＤ４０アゴニストとして機能する、特異的ヒト化抗体およびそれらの断片を包含する。本発明のより特異的な実施形態において、本明細書に記載する抗体は、非常に高い親和性、例えば、少なくとも、９８０ピコモルと９５０ピコモルの間、少なくとも、９７０ピコモルと９５０ピコモルの間の親和性で、および一定の実施形態では９６０ピコモルの親和性でＣＤ４０に特異的に結合する。本明細書に記載する抗体は、数ある特質の中でも、腫瘍細胞においてＣＤ４０シグナリングを誘導し；樹状細胞および免疫監視機構を活性化し；腫瘍細胞に対する抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を活性化し；ＣＤ４０ＬへのＣＤ４０の結合を遮断し；ＣＤ４０アゴニスト活性を有し；抗原提示細胞を活性化し；抗原提示細胞からのサイトカイン放出を刺激し；腫瘍細胞アポトーシスを誘導し；腫瘍細胞増殖を阻害し；ＡＤＣＣ、ＣＤＣおよびＡＤＣＰをはじめとする（しかしこれらに限定されない）エフェクター機能の誘導により腫瘍細胞を死なせ；抗腫瘍Ｔ細胞応答を刺激し；定着腫瘍を低減させ；ならびにリツキシマブ耐性腫瘍を阻害する。本明細書に記載する抗体は、これらの特質または活性のいずれか１つ以上の組み合わせを有するまたは誘導することができる。
【００７７】
本発明の実施形態は、ＣＤ４０またはその異常発現と関連づけられる疾患および傷害の診断、評定および処置のための抗ＣＤ４０抗体またはそれらの抗原結合断片の使用に関係する。前記対象抗体は、数ある他の疾患の中でも、癌（非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、慢性リンパ球性白血病、有毛細胞白血病、急性リンパ芽球性白血病、多発性骨髄腫、膀胱、腎臓  卵巣、子宮頚部、乳房、肺、上咽頭の癌腫、悪性黒色腫ならびにリツキシマブ耐性ＮＨＬおよび白血病が挙げられるが、これらに限定されない）、自己免疫疾患および炎症性疾患の処置または予防において使用される。
【００７８】
本発明の実施は、特に相反する指示がない限り、当業者の範囲内のウイルス学、免疫学、微生物学、分子生物学および組換えＤＮＡ技術についての従来の方法を利用することとなり、これらの方法の多くを例証のために下に記載する。かかる技術は、文献の中で十分に説明されている。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｒ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．（２００９）；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第３版、Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、１９９５；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版、２００１）；Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８２）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、第ＩおよびＩＩ巻（Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ編集）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ．Ｇａｉｔ編集、１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編集、１９８５）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編集、１９８４）；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編集、１９８６）；Ｐｅｒｂａｌ、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）および他の同様の参考文献を参照されたし。
【００７９】
本明細書および添付の請求項において用いる場合、単数形「不定冠詞（ａ）」、「不定冠詞（ａｎ）」および「定冠詞（ｔｈｅ）」は、その内容による明確な別段の規定がない限り、複数照応を含む。
【００８０】
本明細書を通して、その文脈による別段の要求が無い限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語、または語尾変化形、例えば「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、述べられている要素、整数、要素群または整数群の包含を含意し、任意の他の要素、整数、要素群または整数群の除外を含意しないと解するものとする。
【００８１】
本明細書における各実施形態は、特に別段の言明がない限り、あらゆる他の実施形態に準用されるものとする。
【００８２】
組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、ならびに組織培養および形質転換（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）には標準技術を用いることができる。酵素反応および精製技術は、製造業者の仕様書に従って、または当該技術分野において一般に遂行されているように、または本明細書に記載するように行うことができる。一般に、これらの技術および手順ならびに関連技術および手順は、当該技術分野において周知の従来の方法に従って行うことができ、ならびに本明細書中の至る所で引用し、論じている様々な一般的なおよびより専門的な参考文献に記載されているように行うことができる。特定の定義を与えない限り、本明細書に記載する分子生物学、分析化学、合成有機化学、医化学および製薬化学に関連して用いる命名法、ならびに前記化学の実験手順および技術は、当該技術分野において周知の、一般に用いられているものである。組換え技術、分子生物学的合成、微生物学的合成、化学合成、化学分析、医薬調製、調合および送達、ならびに患者の処置には標準技術を用いることができる。
【００８３】
本発明の実施形態は、ＣＤ４０に結合する抗体に関する。詳細には、本明細書に記載する抗体は、予想外に高い親和性でＣＤ４０に特異的に結合し、ＣＤ４０シグナリング活性を強化し、免疫系を活性化し、ＡＤＣＣを活性化し、およびＣＤ４０の異常発現と関連づけられる疾患の処置に治療上の有用性を有する。
【００８４】
例証となる抗体、またはそれらの抗原結合断片、または相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列を配列番号１〜１９４に示す。
【００８５】
当該技術分野において周知であるように、抗体は、少なくとも１つのエピトープ認識部位によって標的、例えば炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなど、への特異的結合が可能な免疫グロブリン分子であり、該エピトープ認識部位は、該免疫グロブリン分子の可変領域内に位置する。本明細書において用いる場合、この用語は、インタクトポリクローナルまたはモノクローナル抗体ばかりでなく、それらの断片（例えば、ｄＡｂ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ）、単鎖（ＳｃＦｖ）、それらの合成バリアント、天然に存在するバリアント、必要特異性の抗原結合断片を有する抗体部分を含む融合タンパク質、ヒト化抗体、キメラ抗体、ならびに必要特異性の抗原結合部位または断片（エピトープ認識部位）を含む任意の他の修飾形態の免疫グロブリン分子も包含する。「ダイアボディ」、すなわち、遺伝子融合によって構築される多価または多重特異性断片（国際公開第９４／１３８０４号パンフレット；Ｐ．Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０  ６４４４−６４４８、１９９３）もまた、ここで考えられる抗体の特別な形である。ＣＨ３ドメインに連結されたｓｃＦｖを含むミニボディもまたここに含まれる（Ｓ．Ｈｕら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、５６、３０５５−３０６１、１９９６）。例えば、Ｗａｒｄ，Ｅ．Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４１、５４４−５４６（１９８９）；Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２、４２３−４２６、１９８８；Ｈｕｓｔｏｎら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、８５、５８７９−５８８３、１９８８）；ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９９６５号；国際公開第９４／１３８０４号パンフレット；Ｐ．Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０  ６４４４−６４４８、１９９３；Ｙ．Ｒｅｉｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、１４、１２３９−１２４５、１９９６；Ｓ．Ｈｕら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、５６、３０５５−３０６１、１９９６を参照されたし。
【００８６】
本明細書において用いる場合の用語「抗原結合断片」は、対象となる抗原、特にＣＤ４０、に結合する免疫グロブリン重および／または軽鎖の少なくとも１つのＣＤＲを含有するポリペプチド断片を指す。この関連で、本明細書に記載する抗体の抗原結合断片は、ＣＤ４０を結合する抗体からの本明細書に示すＶＨおよびＶＬ配列の１つ、２つ、３つ、４つ、５つのまたは６つすべてのＣＤＲを含むことがある。本明細書に記載するＣＤ４０特異的抗体の抗原結合断片は、ＣＤ４０への結合が可能である。一定の実施形態において、抗原結合断片、または抗原結合断片を含む抗体は、ＣＤ４０へのＣＤ４０Ｌの結合を防止または阻害する。一定の実施形態において、前記抗原結合断片は、ヒトＣＤ４０に特異的に結合する、および／またはヒトＣＤ４０の生物活性を強化する、もしくは変調させる。かかる生物活性としては、細胞シグナリング、樹状細胞の活性化が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８７】
用語「抗原」は、抗体などの選択的結合剤によって結合され得る、および加えて、その抗原のエピトープへの結合が可能な抗体を生産するために動物において使用され得る分子または分子の一部分を指す。抗原は、１つ以上のエピトープを有することができる。
【００８８】
用語「エピトープ」は、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体への特異的結合が可能な任意の決定基、好ましくはポリペプチド決定基を含む。エピトープは、抗体によって結合される抗原の領域である。一定の実施形態において、エピトープ決定基は、分子の化学的に活性な表面原子団、例えば、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリルまたはスルホニルを含み、ならびに一定の実施形態では、特異的三次元構造特性および／または特異的電荷特性を有し得る。一定の実施形態において、抗体がタンパク質および／または高分子の複合混合物中のその標的抗原を優先的に認識するとき、抗体が抗原に特異的に結合すると言う。平衡解離定数が、≦１０−７または１０−８Ｍであるとき、抗体が抗原に特異的に結合すると言う。一部の実施形態において、前記平衡解離定数は、≦１０−９Ｍまたは≦１０−１０Ｍであり得る。
【００８９】
一定の実施形態において、本明細書に記載の抗体およびそれらの抗原結合断片は、重鎖および軽鎖フレームワーク領域（ＦＲ）セット間にそれぞれ挿入された重鎖および軽鎖ＣＤＲセットを含み、前記ＦＲセットは、前記ＣＤＲを支持し、および前記ＣＤＲの互いに対する空間的関係を規定する。本明細書において用いる場合、用語「ＣＤＲセット」は、重または軽鎖Ｖ領域の３つの超可変領域を指す。重または軽鎖のＮ末端から進んで、これらの領域を「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」および「ＣＤＲ３」とそれぞれ表示する。したがって、抗原結合部位は、重および軽鎖Ｖ領域各々からのＣＤＲセットを含む、６つのＣＤＲを含む。単一のＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３）を含むポリペプチドを本明細書では「分子認識単位」と呼ぶ。多数の抗原−抗体複合体の結晶解析により、ＣＤＲのアミノ酸残基が、結合抗原との広範な接触を形成し、その最も広範な抗原接触が重鎖ＣＤＲ３とのものであることは立証されている。したがって、前記分子認識単位が主として抗原結合部位の特異性を担っている。
【００９０】
本明細書において用いる場合、用語「ＦＲセット」は、重または軽鎖Ｖ領域のＣＤＲセットのＣＤＲを枠組みする４つの隣接アミノ酸配列を指す。一部のＦＲ残基は、結合抗原と接触し得る；しかし、ＦＲ、特にＣＤＲに直接隣接したＦＲ残基は、主として、抗原結合部位へのＶ領域のフォールディングを担う。ＦＲ内では、一定のアミノ酸残基および一定の構造特徴が非常に高度に保存される。この関連で、すべてのＶ領域配列は、約９０アミノ酸残基の内部ジスルフィドループを含有する。Ｖ領域が結合部位へとフォールディングすると、ＣＤＲは、抗原結合面を形成する突出ループモチーフとして提示される。その正確なＣＤＲアミノ酸配列に関係なく、一定の「カノニカル」構造にフォールディングされたＣＤＲループ形状に影響を及ぼすＦＲの保存構造領域があることは、一般に認知されている。さらに、抗体重鎖と軽鎖の相互作用を安定させる非共有結合性ドメイン間接触に一定のＦＲ残基が関与することは公知である。
【００９１】
免疫グロブリン可変ドメインの構造および位置は、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第４版、ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、１９８７、および今ではインターネット（ｉｍｍｕｎｏ．ｂｍｅ．ｎｗｕ．ｅｄｕ）で利用できるその最新版を参照することにより、決定することができる。
【００９２】
「モノクローナル抗体」は同種抗体集団を指し、該モノクローナル抗体は、エピトープの選択的結合に関与する（天然に存在するまたは天然に存在しない）アミノ酸で構成されている。モノクローナル抗体は、高特異的であり、単一エピトープに指向されている。用語「モノクローナル抗体」は、インタクトモノクローナル抗体および完全長モノクローナル抗体ばかりでなく、それらの断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ）、単鎖（ＳｃＦｖ）、それらのバリアント、抗原結合部分を含む融合タンパク質、ヒト化モノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、ならびに必要特異性およびエピトープに結合する能力の抗原結合断片（エピトープ認識部位）を含む任意の他の修飾形態の免疫グロブリン分子も包含する。それは、抗体源または抗体を作製する手法（例えば、ハイブリドーマ、ファージ選択、組換え発現、トランスジェニック動物などによる）に関して限定することを意図したものではない。この用語は、全免疫グロブリンはもちろん、上で「抗体」の定義のもとに記載した断片なども含む。
【００９３】
タンパク質分解酵素パパインは、ＩｇＧ分子を優先的に切断して幾つかの断片を生じさせ、そのうちの２つ（Ｆ（ａｂ）断片）は、各々、インタクト抗原結合部位を含む共有結合性ヘテロ二量体を含む。酵素ペプシンは、ＩｇＧ分子を切断して、両方の抗原結合部位を含むＦ（ａｂ’）２断片をはじめとする幾つかの断片を生じさせることができる。本発明の一定の実施形態に従って使用するためのＦｖ断片を、ＩｇＭのおよび稀にＩｇＧまたはＩｇＡ免疫グロブリン分子の優先的タンパク質分解性切断によって生成することができる。しかし、より一般的には、当該技術分野において公知の組換え技術を用いてＦｖ断片を得る。前記Ｆｖ断片は、天然抗体分子の抗原認識および結合能力の大部分を保持する抗原結合部位を含む非共有結合性ＶＨ：：ＶＬヘテロ二量体を含む。Ｉｎｂａｒら（１９７２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ６９：２６５９−２６６２；Ｈｏｃｈｍａｎら（１９７６）Ｂｉｏｃｈｅｍ  １５：２７０６−２７１０；およびＥｈｒｌｉｃｈら（１９８０）Ｂｉｏｃｈｅｍ  １９：４０９１−４０９６。
【００９４】
一定の実施形態では、単鎖ＦｖまたはｓｃＦＶ抗体が考えられる。例えば、カッパ体（Ｉｌｌら、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．１０：９４９−５７（１９９７）；ミニボディ（Ｍａｒｔｉｎら、ＥＭＢＯ  Ｊ  １３：５３０５−９（１９９４）；ダイアボディ（Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、ＰＮＡＳ  ９０：６４４４−８（１９９３）；またはＪａｎｕｓｉｎ（Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、ＥＭＢＯ  Ｊ  １０：３６５５−５９（１９９１）およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｕｐｐｌ．７：５１−５２（１９９２）を、標準的な分子生物学技術を用い、所望の特異性を有する抗体の選択に関しては本願の教示に従って、調製することができる。さらに他の実施形態では、本開示のリガンドを包含する二重特異性またはキメラ抗体を作製することができる。例えば、キメラ抗体は、異なる抗体からのＣＤＲおよびフレームワークを含むことができ、その一方で、１つの結合ドメインによりＣＤ４０におよび第二の結合ドメインにより第二の分子に特異的に結合する二重特異性抗体を生成することができる。組換え分子生物学技術によってこれらの抗体を生産することができ、またはこれらの抗体を物理的に互いにコンジュゲートさせることができる。
【００９５】
単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ポリペプチドは、ペプチドをコードするリンカーによって連結されたＶＨをコードする遺伝子とＶＬをコードする遺伝子を含む遺伝子融合体から発現される共有結合で連結されたＶＨ：：ＶＬヘテロ二量体である。Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５（１６）：５８７９−５８８３。自然に凝集している−しかし化学的に分離されている−軽および重ポリペプチド鎖を、抗体Ｖ領域から、抗原結合部位の構造と実質的に同様の三次元構造にフォールディングすることとなるｓＦｖ分子に変換するための化学構造の多数の識別方法が記載されている。例えば、Ｈｕｓｔｏｎらの米国特許第５，０９１，５１３号明細書および同第５，１３２，４０５号明細書ならびにＬａｄｎｅｒらの米国特許第４，９４６，７７８号明細書を参照されたし。
【００９６】
一定の実施形態において、本明細書に記載のＣＤ４０結合抗体は、ダイアボディの形態である。ダイアボディは、ポリペプチドの多量体であって、各ポリペプチドが、免疫グロブリン軽鎖の結合領域を含む第一のドメインと免疫グロブリン重鎖の結合領域を含む第二のドメインとを含み、前記２つのドメインが（例えば、ペプチドリンカーによって）連結されているが、互いに会合して抗原結合部位を形成することはできない多量体である：抗原結合部位は、該多量体内の１つのポリペプチドの第一のドメインと該多量体内の別のポリペプチドの第二のドメインとの会合によって形成される（国際公開第９４／１３８０４号パンフレット）。
【００９７】
抗体のｄＡｂ断片は、ＶＨドメインから成る（Ｗａｒｄ，Ｅ．Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４１、５４４−５４６（１９８９））。
【００９８】
二重特異的抗体を使用する場合、これらは、様々な方法で製造することができる（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ  Ｇ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４、４４６−４４９（１９９３））、例えば、化学的にもしくはハイブリッドハイブリドーマから調製することができる、従来の二重特異性抗体であり得、または上述の任意の二重特異性抗体断片であり得る。Ｆｃ領域なしで、可変ドメインだけを用いてダイアボディおよびｓｃＦｖを構築して、抗イディオタイプ反応の影響を潜在的に低減させることができる。
【００９９】
二重特異性抗体全体と対照して、二重特異性ダイアボディもまた特に有用である。それらを容易に構築でき、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において発現させることができるからである。適切な結合特異性のダイアボディ（および多くの他のポリペプチド、例えば抗体断片）は、ファージディスプレイ（国際公開第９４／１３８０４号パンフレット）を用いてライブラリから容易に選択することができる。ダイアボディの１本のアーム、例えば抗原Ｘに対する特異性を有するアーム、を定常に保つべきである場合には、他のアームを変え、適切な特異性の抗体を選択するライブラリを作成することができる。二重特異性抗体全体は、ノブ・イントゥ・ホールエンジニアリング（ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）（Ｊ．Ｂ．Ｂ．Ｒｉｄｇｅｗａｙら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．、９、６１６−６２１、１９９６）によって作製することができる。
【０１００】
一定の実施形態では、本明細書に記載する抗体をＵｎｉＢｏｄｙ（登録商標）の形で提供することができる。ＵｎｉＢｏｄｙ（登録商標）は、ヒンジ領域が除去されたＩｇＧ４抗体である（ＧｅｎＭａｂ  Ｕｔｒｅｃｈｔ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓを参照されたし；例えば、米国特許出願公開第２００９０２２６４２１号明細書も参照されたし）。この独自の抗体技術は、現行の、小さい抗体フォーマットより長いと予想される治療ウインドウを有する、安定した、より小さい抗体フォーマットを作成する。ＩｇＧ４抗体は不活性と考えられ、したがって、免疫系と相互作用しない。完全ヒトＩｇＧ４抗体を該抗体のヒンジ領域の削除により修飾して、対応するインタクトＩｇＧ４（ＧｅｎＭａｂ、Ｕｔｒｅｃｈｔ）に比べて異なる安定性を有する半分子断片を得ることができる。ＩｇＧ４分子を半分にすることで、コグネイト抗原（例えば、疾患標的）に結合することができるＵｎｉＢｏｄｙ（登録商標）上の１領域だけが残り、したがって、ＵｎｉＢｏｄｙ（登録商標）は、標的細胞上の１部位のみに一価結合する。一定の癌細胞表面抗原については、この一価結合は、同じ抗原特異性を有する二価抗体を使用することにより見ることができるように癌細胞を刺激して成長させることができず、それ故、ＵｎｉＢｏｄｙ（登録商標）技術は、従来の抗体での治療に対して抗療性であり得る一部のタイプの癌に対する処置選択肢をもたらすことができる。ＵｎｉＢｏｄｙ（登録商標）の小さいサイズは、一部の形態の癌を処置するときに大いに有益であり得、より大きな固形腫瘍上でのより良好な分子分布を可能にし、およびことによると効力を増加させる。
【０１０１】
一定の実施形態において、本開示の抗体は、ナノボディの形をとることがある。ナノボディは、単一遺伝子によってコードされ、ならびにほぼすべての原核および真核宿主、例えば大腸菌（例えば、米国特許第６，７６５，０８７号明細書参照）、カビ（例えば、ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓまたはＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）および酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｍｙｃｅｓ、ＨａｎｓｅｎｕｌａまたはＰｉｃｈｉａ（例えば、米国特許第６，８３８，２５４号明細書参照））において効率的に生産される。この生産プロセスは、拡大縮小可能であり、何キログラムもの量のナノボディが生産されている。長い有効期間を有する使用準備済み溶液としてナノボディを調合することができる。ナノクローン法（例えば、国際公開第０６／０７９３７２号パンフレット参照）は、Ｂ細胞の自動ハイスループット選択に基づく、所望の標的に対するナノボディの独自の生成方法である。
【０１０２】
一定の実施形態において、本明細書に開示の抗ＣＤ４０抗体またはそれらの抗原結合断片は、ヒト化されている。これは、一般に組換え技術を用いて調製されるキメラ分子であって、非ヒト種からの免疫グロブリンに由来する抗原結合部位を有し、該分子の残りの免疫グロブリン構造がヒト免疫グロブリンの構造および／または配列に基づくものであるキメラ分子を指す。前記抗原結合部位は、定常ドメインに融合している完全可変ドメインを含むこともあり、または該可変ドメイン内の適切なフレームワーク領域にグラフトされたＣＤＲのみを含むこともある。エピトープ結合部位は、野生型であることもあり、または１つ以上のアミノ酸置換によって修飾されることもある。これにより、ヒト個体における免疫原としての定常領域は除去されるが、外来可変領域への免疫応答の可能性は残存する（ＬｏＢｕｇｌｉｏ，Ａ．Ｆ．ら、（１９８９）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ
ＵＳＡ  ８６：４２２０−４２２４；Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌら、ＰＮＡＳ（１９８８）８６：１００２９−１００３３；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８８）３３２：３２３−３２７）。本明細書に開示する抗ＣＤ４０抗体の例証的ヒト化方法は、米国特許第７，４６２，６９７号明細書に記載されている方法を含む。本発明の一定の実施形態による例証的ヒト化抗体は、配列番号９および１０に提供するヒト化配列を含む。
【０１０３】
もう１つのアプローチは、ヒト由来定常領域を提供することばかりでなく、ヒト形態にできる限り近く作り直すための可変領域の修飾にも焦点を当てている。重鎖と軽鎖両方の可変領域が、問題となるエピトープに応じて様々でありおよび結合能力を決める３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含有し、該ＣＤＲに４つのフレームワーク領域（ＦＲ）が隣接しており、該ＦＲが所与の種において比較的保存され、および前記ＣＤＲの足場を推定的に提供することは公知である。特定のエピトープに対する非ヒト抗体を調製するとき、修飾すべきヒト抗体内に存在するＦＲに非ヒト抗体に由来するＣＤＲをグラフトすることによってその可変領域を「作り直す」または「ヒト化する」ことができる。このアプローチの様々な抗体への適用は、Ｓａｔｏ，Ｋ．ら、（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５３：８５１−８５６；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｌ．ら、（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ，Ｍ．ら、（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ，Ｃ．Ａ．ら、（１９９１）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ４：７７３−３７８３；Ｍａｅｄａ，Ｈ．ら、（１９９１）Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ２：１２４−１３４；Ｇｏｒｍａｎ，Ｓ．Ｄ．ら、（１９９１）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８８：４１８１−４１８５；Ｔｅｍｐｅｓｔ，Ｐ．Ｒ．ら、（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：２６６−２７１；Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．ら、（１９９１）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８８：２８６９−２８７３；Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．ら、（１９９２）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：４２８５−４２８９；およびＣｏ，Ｍ．Ｓ．ら、（１９９２）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４８：１１４９−１１５４によって報告されている。一部の実施形態において、ヒト化抗体は、すべてのＣＤＲ配列を保存する（例えば、マウス抗体からの６つすべてのＣＤＲを含有するヒト化マウス抗体）。他の実施形態において、ヒト化抗体は、元の抗体を基準にして変更されている１つ以上（１、２、３、４、５、６）のＣＤＲを有し、該ＣＤＲは、元の抗体からの１つ以上のＣＤＲ「に由来する」１以上のＣＤＲとも呼ばれる。
【０１０４】
一定の実施形態において、本開示の抗体は、キメラ抗体であることがある。この関連で、キメラ抗体は、異なる抗体の異種Ｆｃ部分に作動可能に連結されているまたは別様に融合している抗ＣＤ４０抗体の抗原結合断片から成る。一定の実施形態において、前記異種Ｆｃドメインは、ヒト由来のものである。他の実施形態において、前記異種Ｆｃドメインは、ＩｇＡ（サブクラスＩｇＡ１およびＩｇＡ２を含む）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含む）およびＩｇＭを含む、親抗体からの異なるＩｇクラスからのものであり得る。さらなる実施形態において、前記異種Ｆｃドメインは、前記異なるＩｇクラスの１つ以上からのＣＨ２およびＣＨ３ドメインから成ることもある。ヒト化抗体に関して上で述べたように、キメラ抗体の抗ＣＤ４０抗原結合断片は、本明細書に記載する抗体の１つ以上のＣＤＲ（例えば、本明細書に記載する抗体の１、２、３、４、５もしくは６つのＣＤＲ）のみを含むこともあり、または全可変ドメイン（ＶＬ、ＶＨまたは両方）を含むこともある。
【０１０５】
一定の実施形態において、ＣＤ４０結合抗体は、本明細書に記載する抗体のＣＤＲの１つ以上を含む。この関連で、所望の特異的結合を保持したまま抗体のＶＨＣＤＲ３のみの移入を行うことができることが一部の事例で証明されている（Ｂａｒｂａｓら、ＰＮＡＳ（１９９５）９２：２５２９−２５３３）。ＭｃＬａｎｅら、ＰＮＡＳ（１９９５）９２：５２１４−５２１８、Ｂａｒｂａｓら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９９４）１１６：２１６１−２１６２も参照されたし。
【０１０６】
Ｍａｒｋｓら（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９９２、１０：７７９−７８３）は、可変ドメイン領域の５’末端に指向されたまたは隣接するコンセンサスプライマーをヒトＶＨ遺伝子の第三フレームワーク領域に対するコンセンサスプライマーと併用して、ＣＤＲ３を欠くＶＨ可変ドメインのレパートリーを提供する、抗体可変ドメインのレパートリーの生産方法を記載している。Ｍａｒｋｓらは、このレパートリーを特定の抗体のＣＤＲ３と組み合わせることができる方法をさらに記載している。類似の技術を用いて、本開示抗体のＣＤＲ３由来配列を、ＣＤＲ３を欠くＶＨまたはＶＬドメインのレパートリーとシャッフルすることができ、シャッフルされた完全ＶＨまたはＶＬドメインをコグネイトＶＬまたはＶＨドメインと組み合わせて、ＣＤ４０を結合する抗体またはその抗原結合断片を提供することができる。その後、そのレパートリーを適する宿主系、例えば国際公開第９２／０１０４７号パンフレットのファージディスプレイ系、において提示させることができ、その結果、適する抗体またはそれらの抗原結合断片を選択することができる。レパートリーは、少なくとも約１０４の個々のメンバー、かつ上方に数桁の幅、例えば約１０６から１０８または１０１０以上まで、のメンバーからなり得る。類似のシャッフリングまたはコンビナトリアル技術もＳｔｅｍｍｅｒ（Ｎａｔｕｒｅ、１９９４、３７０：３８９−３９１）によって開示されており、Ｓｔｅｍｍｅｒは、β−ラクタマーゼ遺伝子に関する技術を記載しているが、そのアプローチを抗体の産生に用いることができると述べている。
【０１０７】
さらなる代案は、１つ以上の選択されたＶＨおよび／またはＶＬ遺伝子のランダム変異誘発を用いて全可変ドメイン内で変異を生じさせることにより、本明細書に記載する本発明の実施形態の１つ以上のＣＤＲ由来配列を有する新規ＶＨまたはＶＬ領域を生成することである。かかる技術は、Ｇｒａｍら（１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ、８９：３５７６−３５８０）によって記載されており、ＧｒａｍらはエラープローンＰＣＲを用いた。用いることができるもう１つの方法は、ＶＨまたはＶＬ遺伝子のＣＤＲ領域に対する変異誘発を誘導する方法である。かかる技術は、Ｂａｒｂａｓら（１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ、９１：３８０９−３８１３）およびＳｃｈｉｅｒら（１９９６、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：５５１−５６７）によって開示されている。
【０１０８】
一定の実施形態では、本明細書に記載する抗体の特定のＶＨおよび／またはＶＬを使用して相補可変ドメインのライブラリをスクリーニングして、ＣＤ４０に対する親和性増加などの望ましい特性を有する抗体を同定することができる。かかる方法は、例えば、Ｐｏｒｔｏｌａｎｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９３）１５０：８８０−８８７；Ｃｌａｒｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９１）３５２：６２４−６２８に記載されている。
【０１０９】
他の方法を用いてＣＤＲを混合し、マッチングして、ＣＤ４０への結合などの所望の結合活性を有する抗体を同定することもできる。例えば、Ｋｌｉｍｋａら、Ｂｒｉｔｉｓｈ
Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ（２０００）８３：２５２−２６０には、マウスＶＨからのＣＤＲ３およびＦＲ４を保持しているマウスＶＬおよびヒトＶＨライブラリを使用するスクリーニングプロセスが記載されている。抗体を得た後、そのＶＨをヒトＶＬライブラリに対してスクリーニングして、抗原を結合した抗体を得た。Ｂｅｉｂｏｅｒら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．（２０００）２９６：８３３−８４９には、全マウス重鎖およびヒト軽鎖ライブラリを使用するスクリーニングプロセスが記載されている。抗体を得た後、１つのＶＬを、マウスのＣＤＲ３を保持しているヒトＶＨライブラリと組み合わせた。抗原を結合することが可能な抗体が得られた。Ｒａｄｅｒら、ＰＮＡＳ（１９９８）９５：８９１０−８９１５には、上記Ｂｅｉｂｏｅｒらに類似したプロセスが記載されている。
【０１１０】
今説明したばかりのこれらの技術は、それら自体が、それら自体として当該技術分野において公知である。しかし、当業者は、当該技術分野において常例的な方法論を用いて、本明細書に記載する本発明の幾つかの実施形態による抗体またはそれらの抗原結合断片を得るために、かかる技術を用いることができるだろう。
【０１１１】
ＣＤ４０抗原に特異的な抗体抗原結合ドメインを得るための方法も本明細書に開示し、この方法は、本明細書に示すＶＨドメインのアミノ酸配列中の１つ以上のアミノ酸の付加、欠失、置換または挿入により該ＶＨドメインのアミノ酸配列バリアントであるＶＨドメインを用意する段階、場合により、かくして用意した前記ＶＨドメインと１つ以上のＶＬドメインを組み合わせる段階、および前記ＶＨドメインまたはＶＨ／ＶＬ組み合わせ（単数もしくは複数）を試験して、ＣＤ４０に特異的なおよび場合により１つ以上の所望の特性を有する特異的結合メンバーまたは抗体抗原結合ドメインを同定する段階を含む。前記ＶＬドメインは、実質的に本明細書に示すとおりであるアミノ酸配列を有し得る。本明細書に開示するＶＬドメインの１つ以上の配列バリアントを１つ以上のＶＨドメインと組み合わせる類似の方法を用いてもよい。
【０１１２】
抗体またはポリペプチドに「特異的に結合する」または「優先的に結合する」（本明細書では同義で使用）エピトープは、当該技術分野において十分理解されている用語であり、かかる特異的または優先的結合を判定する方法もまた当該技術分野において周知である。分子は、それが特定の細胞または物質と、代替細胞または物質と反応または会合するよりも、高頻度で、より迅速に、より長い持続時間でおよび／またはより大きい親和性で反応または会合する場合、「特異的結合」または「優先的結合」を呈示すると言われる。抗体は標的に、それが他の物質に結合するより大きい親和性で、結合力で、より迅速におよび／またはより長い持続時間で結合する場合、「特異的に結合する」または「優先的に結合する」。例えば、ＣＤ４０エピトープに特異的にまたは優先的に結合する抗体は、１つのＣＤ４０エピトープに、それが他のＣＤ４０エピトープまたは非ＣＤ４０エピトープに結合するより大きな親和性で、結合力で、より迅速に、および／またはより長い持続時間で結合する抗体である。例えば、第一の標的に特異的にまたは優先的に結合する抗体（または部分もしくはエピトープ）が、第二の標的に特異的にまたは優先的に結合することもあり、しないこともあることも、この定義を読むことにより理解される。したがって、「特異的結合」または「優先的結合」は、排他的結合を（含む場合もあるが）必ずしも必要としない。一般に、必然的にではないが、結合への言及は優先的結合を意味する。
【０１１３】
免疫学的結合は、免疫グロブリン分子と該免疫グロブリンが特異的である抗原との間で、例えば、実例としておよび限定ではなく、静電、イオン、親水性および／または疎水性引力または反発力、立体障害力、水素結合、ファンデルワールス力ならびに他の相互作用の結果として起こるタイプの非共有結合性相互作用を指す。免疫学的結合相互作用の強度または親和性をその相互作用の解離定数（Ｋｄ）によって表現することができ、より小さいＫｄほどより大きい親和性を表す。選択されたポリペプチドの免疫学的結合特性を、当該技術分野において周知の方法を用いて定量することができる。１つのかかる方法は、抗原結合部位／抗原複合体形成および解離の速度の測定を必然的に伴い、それらの速度は、複合体パートナーの濃度、相互作用の親和性、および両方向の速度に等しく影響を及ぼす幾何学的パラメータに依存する。したがって、「オン速度定数」（Ｋｏｎ）と「オフ速度定数」（Ｋｏｆｆ）の両方を、濃度ならびに実際の会合および解離速度の計算によって決定することができる。Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎの比は、親和性に関係しないすべてのパラメータの相殺を可能にし、したがって解離定数Ｋｄに等しい。一般に、Ｄａｖｉｅｓら（１９９０）Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９：４３９−４７３を参照されたし。
【０１１４】
一定の実施形態において、本明細書に記載する抗ＣＤ４０抗体は、約１００、１５０、１５５、１６０、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８または１９９ピコモルの親和性を有し、一部の実施形態において、前記抗体は、ＣＤ４０に対してよりいっそう高い親和性を有することがある。
【０１１５】
存在するエピトープに関しての用語「免疫学的に活性の」または「依然として免疫学的に活性の」は、エピトープに異なる条件下で、例えばそのエピトープを還元および変性条件に付した後、結合する抗体（例えば、抗ＣＤ４０抗体）の能力を指す。
【０１１６】
本願の一定の好ましい実施形態による抗体またはその抗原結合断片は、（ｉ）該抗原に特異的に結合し、かつ（ｉｉ）本明細書に開示するＶＨおよび／もしくはＶＬドメインを含む、または本明細書に開示するＶＨ  ＣＤＲ３、またはこれらの任意のバリアントを含む本明細書に記載する任意の抗体と、ＣＤ４０への結合について競合するものであり得る。抗体間の競合は、例えば、ＥＬＩＳＡを用いて、および／または同じエピトープもしくはオーバーラップしているエピトープを結合する特異的抗体の同定を可能にするために一方の抗体に特異的レポーター分子をタグ付けすることにより（この抗体を、他方のタグを付けていない抗体の存在下で検出することができる）、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで容易にアッセイすることができる。したがって、ＣＤ４０に結合する本明細書に記載する抗体と競合するヒト抗体抗原結合部位を含む特異的抗体またはその抗原結合断片を本明細書において提供する。
【０１１７】
この関連で、本明細書において用いる場合、用語「と競合する」、「結合を阻害する」および「結合を遮断する」（例えば、ＣＤ４０へのＣＤ４０Ｌの結合の阻害／遮断を指す、またはＣＤ４０への抗ＣＤ４０抗体の結合の阻害／遮断を指す）は、同義で用いており、部分的阻害／遮断と完全阻害／遮断の両方を包含する。阻害および遮断は、本明細書に開示の抗ＣＤ４０抗体と接触しているときのＣＤ４０ＬのＣＤ４０への結合の、抗ＣＤ４０抗体と接触していないリガンドと比較して任意の測定可能な減少、例えば、ＣＤ４０ＬのＣＤ４０への少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％遮断を含むことを意図したものでもある。
【０１１８】
免疫グロブリンの定常領域は、可変領域より少ない配列多様性を示し、および重要な生化学的事象を惹起するための多数の天然タンパク質への結合を担う。ヒトの場合、ＩｇＡ（これは、サブクラスＩｇＡ１およびＩｇＡ２を含む）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（これは、サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含む）およびＩｇＭを含む、抗体の５つの異なるクラスがある。より微細な相違がＶ領域に存在することもあるが、これらの抗体クラス間の識別特徴は、それらの定常領域である。
【０１１９】
抗体のＦｃ領域は、多数のＦｃ受容体およびリガンドと相互作用し、それによって、エフェクター機能と呼ばれる一連の重要な機能的能力を付与する。ＩｇＧについてのＦｃ領域は、ＩｇドメインＣＨ２およびＣＨ３と、ＣＨ２につながるＮ末端ヒンジとを含む。ＩｇＧクラスについてのＦｃ受容体の重要なファミリーはＦｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）である。これらの受容体は、抗体と免疫系の細胞アームとの情報交換を媒介する（Ｒａｇｈａｖａｎら、１９９６、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  １２：１８１−２２０；Ｒａｖｅｔｃｈら、２００１、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９：２７５−２９０）。ヒトの場合、このタンパク質ファミリーは、アイソフォームＦｃγＲＩａ、ＦｃγＲＩｂおよびＦｃγＲＩｃを含む、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）；アイソフォームＦｃγＲＩＩａ（アロタイプＨ１３１およびＲ１３１を含む）、ＦｃγＲＩＩｂ（ＦｃγＲＩＩｂ−１およびＦｃγＲＩＩｂ−２を含む）およびＦｃγＲＩＩｃを含む、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）；ならびにアイソフォームＦｃγＲＩＩＩａ（アロタイプＶ１５８およびＦ１５８を含む）およびＦｃγＲＩＩＩｂ（アロタイプＦｃγＲＩＩＩｂ−ＮＡ１およびＦｃγＲＩＩＩｂ−ＮＡ２を含む）を含む、ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）を含む（Ｊｅｆｆｅｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２，  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ  ８２：５７−６５）。これらの受容体は、Ｆｃへの結合を媒介する細胞外ドメインと、膜貫通領域と、細胞内の一部のシグナリング事象を媒介し得る細胞内ドメインとを典型的に有する。これらの受容体は、単球、マクロファージ、好中球、樹状細胞、好酸球、肥満細胞、血小板、Ｂ細胞、大顆粒状リンパ球、ランゲルハンス細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびＴ細胞をはじめとする様々な免疫細胞において発現される。Ｆｃ／ＦｃγＲ複合体の形成は、これらのエフェクター細胞を結合抗原部位に動員し、概して、細胞内のシグナリング事象および重要な後続の免疫応答、例えば、炎症媒介因子の放出、Ｂ細胞活性化、エンドサイトーシス、食作用および細胞傷害性攻撃を生じさせる結果となる。
【０１２０】
細胞傷害性および食作用性エフェクター機能を媒介する能力は、抗体が標的細胞を破壊する潜在的機序である。ＦｃγＲを発現する非特異的細胞傷害性細胞が標的細胞上の結合抗体を認識し、その後、その標的細胞の溶解を生じさせる細胞媒介反応は、抗体依存性細胞媒介細胞傷害（ＡＤＣＣ）と呼ばれる（Ｒａｇｈａｖａｎら、１９９６、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  １２：１８１−２２０；Ｇｈｅｔｉｅら、２０００、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８：７３９−７６６；Ｒａｖｅｔｃｈら、２００１、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９：２７５−２９０）。ＦｃγＲを発現する非特異的細胞傷害性細胞が標的細胞上の結合抗体を認識し、その後、その標的細胞の食作用を生じさせる細胞媒介反応は、抗体依存性細胞媒介食作用（ＡＤＣＰ）と呼ばれる。すべてのＦｃγＲは、Ｆｃの同じ領域をＣｇ２（ＣＨ２）ドメインのＮ末端およびその前のヒンジで結合する。この相互作用は、構造的に十分特性付けされており（Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎら、２００１、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３０９：７３７−７４９）、ヒトＦｃγＲＩＩＩｂの細胞外ドメインに結合したヒトＦｃの幾つかの構造が解明されている（ｐｄｂアクセッションコード１Ｅ４Ｋ）（Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎら、２０００、Ｎａｔｕｒｅ
４０６：２６７−２７３）（ｐｄｂアクセッションコード１ＩＩＳおよび１ＩＩＸ）（Ｒａｄａｅｖら、２００１、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６：１６４６９−１６４７７）。
【０１２１】
異なるＩｇＧサブクラスは、ＦｃγＲに対して異なる親和性を有し、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３は、典型的に、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４より実質的に良好にその受容体に結合する（Ｊｅｆｆｅｒｉｓら、２００２、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ  ８２：５７−６５）。すべてのＦｃγＲは、異なる親和性でだが、ＩｇＧ  Ｆｃ上の同じ領域を結合する；高親和性結合剤ＦｃγＲＩは、ＩｇＧ１に対して１０−８Ｍ−１のＫｄを有するが、低親和性受容体ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩは、一般に、それぞれ１０−６および１０−５で結合する。ＦｃγＲＩＩＩａおよびＦｃγＲＩＩＩｂの細胞外ドメインは９６％同一であるが、ＦｃγＲＩＩＩｂは、細胞内シグナリングドメインを有さない。さらに、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ／ｃ、およびＦｃγＲＩＩＩａは、免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を有する細胞内ドメインを有することを特徴とする、免疫複合体誘発活性化の陽性調節因子であるが、ＦｃγＲＩＩｂは、免疫受容抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）を有し、したがって阻害性である。故に、前者は活性化受容体と呼ばれ、ＦｃγＲＩＩｂは阻害性受容体と呼ばれる。これらの受容体はまた、異なる免疫細胞上では発現パターンおよびレベルが異なる。さらにもう１つの複雑性レベルは、ヒトプロテオームにおける多数のＦｃγＲの存在である。臨床的有意性を有する特に有意義な多形は、Ｖ１５８／Ｆ１５８ＦｃγＲＩＩＩａである。ヒトＩｇＧ１は、Ｆ１５８アロタイプより大きい親和性でＶ１５８アロタイプに結合する。親和性の点ならびにおそらくＡＤＣＣおよび／またはＡＤＣＰに対するその効果の点でのこの差が抗ＣＤ２０抗体リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）、ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの登録商標）の効力の有意な決定因子であることは証明されている。Ｖ１５８アロタイプを有する患者はリツキシマブ処置に好適に応答するが、低親和性Ｆ１５８アロタイプを有する患者はあまり応答しない（Ｃａｒｔｒｏｎら、２００２、Ｂｌｏｏｄ  ９９：７５４−７５８）。おおよそ１０〜２０％のヒトはＶ１５８／Ｖ１５８ホモ接合型であり、４５％はＶ１５８／Ｆ１５８ヘテロ接合型であり、および３５〜４５％のヒトは、Ｆ１５８／Ｆ１５８ホモ接合型である（Ｌｅｈｒｎｂｅｃｈｅｒら、１９９９、Ｂｌｏｏｄ  ９４：４２２０−４２３２；Ｃａｒｔｒｏｎら、２００２、Ｂｌｏｏｄ  ９９：７５４−７５８）。したがって、８０〜９０％のヒトは不良応答者であり、すなわち、彼らはＦ１５８
ＦｃγＲＩＩＩａの少なくとも１つの対立遺伝子を有する。
【０１２２】
前記Ｆｃ領域は、補体カスケードの活性化にも関与する。古典的補体経路では、Ｃ１は、そのＣ１ｑサブユニットを用いて、抗原（単数または複数）と複合体を形成しているＩｇＧまたはＩｇＭのＦｃ断片に結合する。本発明の一定の実施形態において、Ｆｃ領域に対する修飾は、補体系を活性化する本明細書に記載のＣＤ４０特異的抗体の能力を変更する（強化するまたは低下させる）修飾を含む（例えば、米国特許第７，７４０，８４７号明細書参照）。補体活性化を評定するために、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）アッセイを行ってもよい（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、２０２：１６３（１９９６）参照）。
【０１２３】
したがって、一定の実施形態において、本発明は、変更された機能特性、例えば、低減もしくは強化されたＣＤＣ、ＡＤＣＣもしくはＡＤＣＰ活性、または特異的ＦｃγＲに対する強化された結合親和性、または増加された血清半減期を有する修飾Ｆｃ領域を有する抗ＣＤ４０抗体を提供する。ここで考えられる他の修飾Ｆｃ領域は、例えば、発行米国特許第７，３１７，０９１号、同第７，６５７，３８０号、同第７，６６２，９２５号、同第６，５３８，１２４号、同第６，５２８，６２４号、同第７，２９７，７７５号および同第７，３６４，７３１号明細書、米国特許出願公開第２００９０９２５９９号、同第２００８０１３１４３５号および同第２００８０１３８３４４号明細書、ならびに国際公開第２００６／１０５３３８号、同第２００４／０６３３５１号、同第２００６／０８８４９４号および同第２００７／０２４２４９号パンフレットに記載されている。
【０１２４】
１つの実施形態では、Ｆｃにおける１つもしくはそれより多くの置換は、ＦｃγＲＩＩＢに対する結合親和性を増大させ得、ＣＤ４０分子の架橋を増強し得、そして抗ＣＤ４０抗体によるより強いＣＤ４０活性化をもたらし得る。１つの実施形態では、本発明は、２６７位（ＥＵ番号付け；例えば、Ｅｄｅｌｍａｎ，  Ｇ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９６９  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  ＵＳＡ，  ６３，  ７８−８５を参照のこと；ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＣｈａｒｔ／Ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおけるｔｈｅ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）データベースウェブサイトもまた参照のこと）に改変されたＦｃ領域を有する抗ＣＤ４０抗体を提供する。１つの実施形態では、本明細書中の抗ＣＤ４０抗体は、Ｓ２６７Ｅ置換（Ｌｉ  Ｆｕ，  Ｒａｖｅｔｃｈ  ＪＶ．  ２０１１  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３３：１０３０；Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．
２０１１，  １８７：１７５４−１７６３；  ｍＡｂｓ  ２０１０，  ２：１８１−１８９もまた参照のこと）を含む改変されたＦｃを含む。例示的な改変されたＦｃを含む重鎖定常領域のアミノ酸配列を配列番号１９５に示す。
【０１２５】
したがって、一定の実施形態では、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメインを免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合させる。一定の実施形態において、前記融合は、少なくともヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域の一部分を含むＩｇ重鎖定常ドメインとのものである。融合体の少なくとも１つの中に存在する、軽鎖結合に必要な部位を含有する第一の重鎖定常領域（ＣＨ１）を有するほうが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合体および、必要に応じて、免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡを別個の発現ベクターに挿入し、適する宿主細胞にコトランスフェクトする。これにより、その構築に用いられた３つのポリペプチドの不等比が、所望の二重特異性抗体の最適な収量をもたらす実施形態では、それら３つのポリペプチド断片の相互の割合の調節におけるより大きな自由度が得られる。しかし、少なくとも２つのポリペプチド鎖の等比での発現が、高収量を生じさせる結果となるとき、またはそれらの比が所望の鎖の組み合わせの収量に有意な影響を及ぼさないときには、２つのまたは３つすべてのポリペプチド鎖についてのコーディング配列を単一発現ベクターに挿入することが可能である。
【０１２６】
本発明の抗体（ならびにそれらの抗原結合断片およびバリアント）を、例えば精製または診断への応用に用いるために、エピトープタグまたは標識を含むように修飾することもできる。抗体コンジュゲートを作製するための多くの連結基は、例えば米国特許第５，２０８，０２０号明細書または欧州特許第０  ４２５  ２３５号Ｂ１明細書、ならびにＣｈａｒｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５２：１２７−１３１（１９９２）に開示されているものを含めて、当該技術分野において公知である。前記連結基としては、上で特定した特許に開示されているような、ジスルフィド（ｄｉｓｕｆｉｄｅ）基、チオエーテル基、酸不安定性基、感光性基、ペプチダーゼ不安定性基、またはエステラーゼ不安定性基が挙げられ、ジスルフィドおよびチオエーテル基が好ましい。
【０１２７】
もう１つの考えられる実施形態では、本明細書に記載のＣＤ４０特異的抗体を、本明細書においてコンジュゲートと呼ぶ別の治療用化合物にコンジュゲートさせるまたは作動可能に連結させることができる。前記コンジュゲートは、細胞傷害性薬剤、化学療法薬、サイトカイン、抗血管新生剤、チロシンキナーゼ阻害剤、毒素、放射性同位元素、または他の治療活性薬剤であり得る。化学療法薬、サイトカイン、抗血管新生剤、チロシンキナーゼ阻害剤および他の治療薬は、上に記載されており、ならびにこれらの上述の治療薬のすべてが抗体コンジュゲートとして利用を見出すことができる。
【０１２８】
代替実施形態では、細菌、真菌、植物または動物由来の小分子毒素および酵素活性毒素含む（しかしこれらに限定されない）毒素に前記抗体（その断片および／またはバリアントを含む）をコンジュゲートさせる、または作動可能に連結させる。小分子毒素としては、サポリン（Ｋｕｒｏｄａ  Ｋら、Ｔｈｅ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ７０：１２８６−１２９４（２０１０）；Ｌｉｐ，ＷＬ．ら、２００７  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ４：２４１−２５１；Ｑｕａｄｒｏｓ  ＥＶ．ら、２０１０  Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ；９（１１）；３０３３−４０；Ｐｏｌｉｔｏ  Ｌ．ら、２００９  Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ、１４７、７１０−７１８）、カリケアマイシン、メイタンシン（米国特許第５，２０８，０２０号明細書）、トリコテセン（ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｎｅ）、およびＣＣ１０６５が挙げられるが、これらに限定されない。毒素としては、ＲＮａｓｅ、ゲロニン、エンジイン、リシン、アブリン、ジフテリア毒素、コレラ毒素、ゲロニン、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素（ＰＥ４０）、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）毒素、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ
ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）毒素、およびヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２９】
１つの実施形態では、本開示の抗体またはその抗原結合断片を１つ以上のメイタンシノイド分子にコンジュゲートさせる。メイタンシノイドは、チューブリン重合を阻害することにより作用する有糸分裂阻害剤である。メイタンシンは、最初、東アフリカの低木メイテナス・セラタ（Ｍａｙｔｅｎｕｓ  ｓｅｒｒａｔａ）から単離された（米国特許第３，８９６，１１１号明細書）。その後、一定の微生物もメイタンシノイド、例えばメイタンシノールおよびＣ−３メイタンシノールエステル、を生産することが発見された（米国特許第４，１５１，０４２号明細書）。合成メイタンシノールならびにその誘導体および類似体は、例えば、米国特許第４，１３７，２３０号、同第４，２４８，８７０号、同第４，２５６，７４６号、同第４，２６０，６０８号、同第４，２６５，８１４号、同第４，２９４，７５７号、同第４，３０７，０１６号、同第４，３０８，２６８号、同第４，３０８，２６９号、同第４，３０９，４２８号、同第４，３１３，９４６号、同第４，３１５，９２９号、同第４，３１７，８２１号、同第４，３２２，３４８号、同第４，３３１，５９８号、同第４，３６１，６５０号、同第４，３６４，８６６号、同第４，４２４，２１９号、同第４，４５０，２５４号、同第４，３６２，６６３号および同第４，３７１，５３３号明細書に開示されている。メイタンシノイドを含有する免疫コンジュゲートおよびそれらの治療用途は、例えば、米国特許第５，２０８，０２０号および同第５，４１６，０６４号ならびに欧州特許第０  ４２５  ２３５号Ｂ１明細書に開示されている。Ｌｉｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：８６１８−８６２３（１９９６）には、ヒト結腸直腸癌に対するモノクローナル抗体Ｃ２４２に連結されたＤＭ１と称するメイタンシノイドを含む免疫コンジュゲートが記載されている。前記コンジュゲートは、培養結腸癌細胞に対して高細胞傷害性であることが判明しており、ならびにｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍成長アッセイにおいて高腫瘍活性を示した。
【０１３０】
抗体−メイタンシノイドコンジュゲートは、抗体またはメイタンシノイド分子いずれかの生物活性を有意に減少させることなく、抗体をメイタンシノイド分子に化学的に連結させることによって調製される。抗体分子あたり平均で３〜４個のメイタンシノイド分子は、抗体の機能または溶解度に負の影響を及ぼすことなく標的細胞の細胞傷害性を強化する効力を示したが、１分子の毒素／抗体でさえ裸の抗体の使用より細胞傷害性を強化すると予想された。メイタンシノイドは当該技術分野において周知であり、メイタンシノイドを公知の技術によって合成することができ、または天然源から単離することができる。適するメイタンシノイドは、例えば、米国特許第５，２０８，０２０号明細書、ならびに本明細書において上で言及した他の特許および非特許刊行物に開示されている。好ましいメイタンシノイドは、メイタンシノール、およびメイタンシノール分子の芳香族環または他の部分が修飾されているメイタンシノール類似体、例えば様々なメイタンシノールエステルである。
【０１３１】
対象となるもう１つのコンジュゲートは、１つ以上のカリケアマイシン分子にコンジュゲートされた抗体を含む。抗体のカリケアマイシンファミリーは、サブピコモル濃度で二本鎖ＤＮＡ破断を生じさせることが可能である。使用することもできるカリケアマイシンの構造類似体（Ｈｉｎｍａｎら、１９９３、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５３：３３３６−３３４２；Ｌｏｄｅら、１９９８、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５８：２９２５−２９２８）（米国特許第５，７１４，５８６号、同第５，７１２，３７４号、同第５，２６４，５８６号および同第５，７７３，００１号明細書）。ドラスタチン１０アナログ、例えば、オーリスタチンＥ（ＡＥ）およびモノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）は、本開示抗体またはそれらのバリアントのためのコンジュゲートとしての利用を見出すことができる（Ｄｏｒｏｎｉｎａら、２００３、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２１（７）：７７８−８４；Ｆｒａｎｃｉｓｃｏら、２００３  Ｂｌｏｏｄ  １０２（４）：１４５８−６５）。有用な酵素活性毒素としては、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素Ａ鎖（緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）からのもの）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデッシンＡ鎖、α−サルシン、シナアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、ツルレイシ（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、クルシン、クロチン、サンボンソウ（ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシンおよびトリコテセンが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、ＰＣＴ国際公開第９３／２１２３２号パンフレットを参照されたし。本開示は、本明細書に記載のＣＤ４０特異的抗体と、核酸分解活性を有する化合物、例えば、リボヌクレアーゼまたはＤＮＡエンドヌクレアーゼ、例えばデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）、との間でコンジュゲートまたは融合体を形成する実施形態をさらに考えている。
【０１３２】
代替実施形態では、本明細書開示抗体を、放射性同位元素にコンジュゲートさせて、または作動可能に連結させて、放射性コンジュゲートを形成することができる。様々な放射活性同位元素を放射性コンジュゲート抗体の生産に利用できる。例としては、９０Ｙ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、２１１Ａｔおよび２１２Ｂｉが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３３】
一定の他の実施形態では、本明細書に記載する抗体を治療用部分、例えば、細胞毒（例えば、細胞増殖抑制剤または細胞破壊剤）、治療薬または放射活性元素（例えば、α放射体、γ放射体など）にコンジュゲートさせることができる。細胞毒または細胞傷害性薬剤は、細胞にとって有害である任意の薬剤を含む。例としては、パクリタキセル／パクリタキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン（ｃｏｌｃｈｉｃｉｎ）、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、糖質コルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロールおよびピューロマイシンならびにこれらのアナログまたはホモログが挙げられる。１つの好ましい例示的細胞毒は、サポリン（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州サンディエゴから入手可能）である。治療薬としては、代謝拮抗薬（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシル  デカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオテパ（ｔｈｉｏｅｐａ）  クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ）、マイトマイシンＣ、およびｃｉｓ−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前はダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン（ＡＭＣ）、ならびに抗有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３４】
さらに、一定の実施形態では、ＣＤ４０特異的抗体（本明細書に提供するようなそれらの機能的断片、例えば抗原結合断片を含む）を放射性金属イオンのコンジュゲーションに有用な治療用部分、例えば、放射活性材料または大環状キレーターにコンジュゲートさせることができる。一定の実施形態において、前記大環状キレーターは、リンカー分子によって抗体に付けることができる１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸（ＤＯＴＡ）である。かかるリンカー分子は当該技術分野において一般に公知であり、Ｄｅｎａｒｄｏら、１９９８、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４：２４８３−９０；Ｐｅｔｅｒｓｏｎら、１９９９、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１０：５５３；およびＺｉｍｍｅｒｍａｎら、１９９９、Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２６：９４３−５０に記載されている。
【０１３５】
さらにもう１つの実施形態では、腫瘍前処置に利用するために「受容体」（例えば、ストレプトアビジン）に抗体をコンジュゲートさせることができ、前記腫瘍前処置では、その抗体受容体コンジュゲートを患者に投与し、続いてキレート剤を使用して循環から未結合コンジュゲートを除去し、その後、細胞傷害性薬剤（例えば、放射性ヌクレオチド）にコンジュゲートされている「リガンド」（例えば、アビジン）を投与する。代替実施形態では、抗体依存性酵素媒介プロドラッグ療法（ＡＤＥＰＴ）を利用するために、前記抗体を酵素にコンジュゲートさせる、または作動可能に連結させる。プロドラッグ（例えば、ペプチジル化学療法薬、ＰＣＴ国際公開第８１／０１１４５号パンフレット参照）を活性抗癌薬に変換するプロドラッグ活性化酵素に前記抗体をコンジュゲートさせるまたは作動可能に連結させることにより、ＡＤＥＰＴを用いることができる。例えば、ＰＣＴ国際公開第８８／０７３７８号パンフレットおよび米国特許第４，９７５，２７８号明細書を参照されたし。ＡＤＥＰＴに有用な免疫コンジュゲートの酵素成分としては、プロドラッグに対して、それをそのより活性な細胞傷害形態に変換するように作用することが可能な任意の酵素が挙げられる。これらおよび関連実施形態の方法において有用である酵素としては、ホスファート含有プロドラッグの遊離薬物への変換に有用なアルカリホスファターゼ；スルファート含有プロドラッグの遊離薬物への変換に有用なアリールスルファターゼ；非毒性５−フルオロシトシンの抗癌薬、５−フルオロウラシルへの変換に有用なシトシンデアミナーゼ；ペプチド含有プロドラッグの遊離薬物への変換に有用なプロテアーゼ、例えばセラチアプロテアーゼ、サーモリシン、スブチリシン、カルボキシペプチターゼおよびカテプシン（例えば、カテプシンＢおよびＬ）；Ｄ−アミノ酸置換基を含有するプロドラッグの変換に有用なＤ−アラニルカルボキシペプチダーゼ；グリコシル化プロドラッグの遊離薬物への変換に有用な炭水化物切断酵素、例えば  −ガラクトシダーゼおよびノイラミニダーゼ；  −ラクタムで誘導体化された薬物の遊離薬物への変換に有用なβ−ラクタマーゼ；ならびにアミン窒素がフェノキシアセチルまたはフェニルアセチル基でそれぞれ誘導体化された薬物の遊離薬物への変換に有用なペニシリンアミダーゼ、例えばペニシリンＶアミダーゼまたはペニシリンＧアミダーゼが挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、当該技術分野において「アブザイム」としても公知の、酵素活性を有する抗体を使用して、プロドラッグを活性薬物に変換することができる（例えば、Ｍａｓｓｅｙ、１９８７、Ｎａｔｕｒｅ  ３２８：４５７−４５８参照）。腫瘍細胞集団へのアブザイムの送達用の抗体−アブザイムコンジュゲートを調製することができる。
【０１３６】
様々な二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラート、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、アジプイミド酸ジメチルＨＣＬ）、活性エステル（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド（ｇｌｕｔａｒｅｌｄｅｈｙｄｅ））、ビス−アジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアナート（例えば、トルエン２，６−ジイソシアナート）、およびビス活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）を使用して、免疫コンジュゲートを作製することができる。特定のカップリング剤としては、ジスルフィド連結を提供するためのＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）（Ｃａｒｌｓｓｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１７３：７２３−７３７［１９７８］）およびＮ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルチオ）ペンタノアート（ＳＰＰ）が挙げられる。前記リンカーは、１つ以上の切断可能成分の放出を助長する「切断可能リンカー」であってもよい。例えば、酸不安定性リンカーを使用してもよい（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５２：１２７−１３１（１９９２）；米国特許第５，２０８，０２０号明細書）。
【０１３７】
本発明の抗体（およびポリペプチド）の他の修飾もまたここで考えられる。例えば、前記抗体を様々な非タンパク質様ポリマーのうちの一つ、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、またはポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールのコポリマーに連結させることができる。例えばコアセルベーション技術によってもしくは界面重合によって調製した、マイクロカプセル（例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ（メチルメタクリラート）マイクロカプセル）内に、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）内に、またはマクロエマルジョン内に抗体を捕捉することもできる。かかる技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６版、Ｏｓｌｏ，Ａ．編集（１９８０）に開示されている。
【０１３８】
本明細書において用いる場合の「担体」は、用いられる投薬量および濃度でそれに曝露される細胞または哺乳動物に非毒性である医薬的に許容され得る担体、賦形剤または安定剤を含む。多くの場合、生理的に許容され得る担体は、ｐＨ緩衝水溶液である。生理的に許容され得る担体の例としては、緩衝剤、例えばリン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸；抗酸化物質（アスコルビン酸を含む）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチンもしくは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンもしくはリシン；単糖類、二糖類および他の炭水化物（グルコース、マンノースもしくはデキストリンを含む）；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；糖アルコール、例えばマンニトールもしくはソルビトール；塩形成性対イオン、例えばナトリウム；ならびに／または非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ（商標））  ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびポロキサマー（ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標））、ならびにこれらに類するものが挙げられる。
【０１３９】
本明細書中の他の箇所で述べるように、本開示の抗体は、腫瘍細胞においてＣＤ４０シグナリングを誘導し、樹状細胞および免疫監視機構を活性化し、腫瘍細胞に対する抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を活性化し、ＣＤ４０ＬへのＣＤ４０の結合を遮断し；ＣＤ４０アゴニスト活性を有し；抗原提示細胞を活性化し；抗原提示細胞からのサイトカイン放出を刺激し；腫瘍細胞アポトーシスを誘導し；腫瘍細胞増殖を阻害し；ＡＤＣＣ、ＣＤＣおよびＡＤＣＰをはじめとする（しかしこれらに限定されない）エフェクター機能の誘導により腫瘍細胞を死なせ；抗腫瘍Ｔ細胞応答を刺激し；定着腫瘍を低減させ；ならびにリツキシマブ耐性腫瘍を阻害する。本明細書に記載する抗体は、これらの特質または活性のいずれか１つ以上の組み合わせを有するまたは誘導することができる。当業者に公知の様々な方法、例えば、親和性／結合アッセイ（例えば、表面プラズモン共鳴、競合阻害アッセイ）；細胞傷害性アッセイ、細胞生存率アッセイ、細胞増殖、活性化または分化アッセイ、ＡＤＣＣおよびＣＤＣアッセイ、ＣＤ４０細胞シグナリング事象の結果として生ずる他の細胞活性（例えば、ＳＴＡＴ３リン酸化、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−αおよびＭＩＰ１αをはじめとするサイトカインの生産）、ならびにｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏモデルを使用する癌細胞および／または腫瘍成長阻害を用いて、抗ＣＤ４０抗体の所望の機能特性を評定することができる。他のアッセイは、ＣＤ４０への正常なＣＤ４０Ｌ結合またはＣＤ４０媒介応答、例えば細胞シグナリング、細胞活性化（例えば、免疫細胞活性化、増殖；抗原提示細胞活性化（例えば、樹状細胞、Ｂ細胞、マクロファージ）および成熟アッセイ）、免疫応答（細胞媒介および体液性応答を含む）などを遮断する、本明細書に記載する抗体の能力を試験することができる。本明細書に記載する抗体をＣＤ４０内在化、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ効力などに対する効果について試験することもできる。かかるアッセイは、当業者に公知の十分に確立されたプロトコル（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌ．Ａｓｓｏｃ．Ｉｎｃ．＆  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、ＮＹ、ＮＹ）；Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（編集：Ｊｏｈｎ  Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ、Ａｄａ  Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ、Ｄａｖｉｄ  Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ、Ｅｔｈａｎ  Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ、Ｗａｒｒｅｎ  Ｓｔｒｏｂｅｒ  ２００１  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ＮＹ、ＮＹ参照）または市販のキットを使用して行うことができる。
【０１４０】
一定の実施形態において、本発明は、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片をコードする単離された核酸、例えば、本明細書に記載のＣＤＲまたはＶＨもしくはＶＬドメインをコードする核酸をさらに提供する。核酸としては、ＤＮＡおよびＲＮＡが挙げられる。これらおよび関連実施形態は、本明細書に記載のＣＤ４０を結合する抗体をコードするポリヌクレオチドを含み得る。本明細書において用いる場合の用語「単離されたポリヌクレオチド」は、ゲノム、ｃＤＮＡもしくは合成起源のポリヌクレオチドであって、その起源のため、その単離されたポリヌクレオチドが、（１）自然界で該単離されたポリヌクレオチドが見つけられるポリヌクレオチドのすべてもしくは一部分と会合していない、（２）自然界でそれが連結されていないポリヌクレオチドに連結されている、または（３）より大きな配列の一部として自然界に存在しないものであるポリヌクレオチドまたはそれらのいくつかの組み合わせを意味するものとする。
【０１４１】
用語「作動可能に連結されている」は、この用語が適用される成分が、適する条件下でそれらの固有の機能を行うことができる関係にあることを意味する。例えば、タンパク質コーディング配列に「作動可能に連結されている」転写制御配列は、該タンパク質コーディング配列の発現が該制御配列の転写活性と適合性の条件下で達成されるように、該タンパク質コーディング配列にライゲートされている。
【０１４２】
本明細書において用いる場合の用語「制御配列」は、ポリヌクレオチド配列であって、それらがライゲートされるまたは作動可能に連結されるコーディング配列の発現、プロセッシングまたは細胞内局在に影響を及ぼし得るものであるポリヌクレオチド配列を指す。かかる制御配列の性質は、宿主生物に依存し得る。特定の実施形態において、原核生物についての転写制御配列は、プロモーター、リボソーム結合部位、および転写終結配列を含み得る。他の特定の実施形態において、真核生物についての転写制御配列は、転写因子についての１つまたは複数の認識部位を含むプロモーター、転写エンハンサー配列、転写終結配列およびポリアデニル化配列を含み得る。一定の実施形態において、「制御配列」は、リーダー配列および／または融合パートナー配列を含み得る。
【０１４３】
本明細書において用いる場合の用語「ポリヌクレオチド」は、一本鎖または二本鎖核酸ポリマーを意味する。一定の実施形態において、ポリヌクレオチドを構成するヌクレオチドは、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチド、またはいずれかのタイプのヌクレオチドの修飾形態であり得る。前記修飾としては、塩基修飾、例えばブロモウリジン、リボソーム修飾、例えばアラビノシドおよび２’，３’−ジデオキシリボース、およびヌクレオチド間連結修飾、例えばホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ホスホロセレノアート、ホスホロジセレノアート、ホスホロアニロチオアート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｎｉｌｏｔｈｉｏａｔｅ）、ホスホラニラダート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｎｉｌａｄａｔｅ）およびホスホロアミダートが挙げられる。用語「ポリヌクレオチド」は、特に、一本鎖および二本鎖形態のＤＮＡを含む。
【０１４４】
用語「天然に存在するヌクレオチド」は、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを含む。用語「修飾ヌクレオチド」は、修飾または置換された糖基およびこれらに類するものを有するヌクレオチドを含む。用語「オリゴヌクレオチド連結」は、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ホスホロセレノアート、ホスホロジセレノアート、ホスホロアニロチオアート、ホスホラニラダート、ホスホロアミダートおよびこれらに類するものなどの、オリゴヌクレオチド連結を含む。例えば、ＬａＰｌａｎｃｈｅら、１９８６、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１４：９０８１；Ｓｔｅｃら、１９８４、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１０６：６０７７；Ｓｔｅｉｎら、１９８８、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１６：３２０９；Ｚｏｎら、１９９１、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ、６：５３９；Ｚｏｎら、１９９１、ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ  ＡＮＤ  ＡＮＡＬＯＧＵＥＳ：Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ、８７−１０８頁（Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ編集）、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｅｎｇｌａｎｄ；Ｓｔｅｃら、米国特許第５，１５１，５１０号明細書；Ｕｈｌｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｐｅｙｍａｎ、１９９０、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、９０：５４３を参照されたし（これらの開示はあらゆる目的で参照により本明細書に援用されている）。オリゴヌクレオチドは、該オリゴヌクレオチドまたはそれらのハイブリダイゼーションの検出を可能にするために検出可能標識を含むことがある。
【０１４５】
用語「ベクター」は、宿主細胞にコーディング情報を伝達するために使用される任意の分子（例えば、核酸、プラスミドまたはウイルス）を指すために用いている。用語「発現ベクター」は、宿主細胞の形質転換に適しているベクターであって、挿入される異種核酸配列の発現を命令するおよび／または制御する核酸配列を含有するものであるベクターを指す。発現は、転写、翻訳、およびイントロンが存在する場合にはＲＮＡスプライシングなどの過程を含むが、これらに限定されない。
【０１４６】
当業者には理解されるであろうが、ポリヌクレオチドは、ゲノム配列、ゲノム外およびプラスミドコード配列、ならびにタンパク質、ポリペプチド、ペプチドおよびこれらに類するものを発現する、または発現するように作り変えることができる、より小さい改変遺伝子セグメントを含み得る。かかるセグメントは、自然に単離されることもあり、または当業者によって合成的に修飾されることもある。
【０１４７】
当業者にはやはり分かるであろうが、ポリヌクレオチドは、一本鎖（コーディングもしくはアンチセンス）または二本鎖であることがあり、およびＤＮＡ（ゲノム、ｃＤＮＡもしくは合成）またはＲＮＡ分子であることがある。ＲＮＡ分子としては、イントロンを含有し、ＤＮＡ分子に１対１様式で対応するＨｎＲＮＡ分子、およびイントロンを含有しないｍＲＮＡ分子を挙げることができる。追加のコーディングまたは非コーディング配列が本開示によるポリヌクレオチド内に、必要ではないが、存在することもあり、ポリヌクレオチドが他の分子および／または支持材料に、必要ではないが、連結されていることもある。ポリヌクレオチドは、天然配列を含むこともあり、またはかかる配列のバリアントもしくは誘導体をコードする配列を含むこともある。
【０１４８】
したがって、これらおよび関連実施形態によると、本開示は、本明細書に記載する抗ＣＤ４０抗体をコードするポリヌクレオチドも提供する。一定の実施形態では、本明細書に記載の抗体をコードするポリヌクレオチド配列の一部またはすべてを含むポリヌクレオチド、およびかかるポリヌクレオチドの相補体を提供する。
【０１４９】
他の関連実施形態において、ポリヌクレオチドバリアントは、本明細書に記載する抗ＣＤ４０抗体をコードするポリヌクレオチド配列との実質的同一性を有することがある。例えば、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載する方法（例えば、下で説明するような標準パラメータを使用するＢＬＡＳＴ分析）を用いて、本明細書に記載する抗体をコードする配列などの基準ポリヌクレオチド配列と比較して、少なくとも７０％の配列同一性、好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％以上の配列同一性を含むポリヌクレオチドであり得る。コドン縮重、アミノ酸類似性、リーディングフレーム位置決めおよびこれらに類するものを考慮することによりこれらの値を適切に調整して、２つのヌクレオチド配列によってコードされているタンパク質についての対応する同一性を決定することができることは、当業者には分かるであろう。
【０１５０】
典型的に、ポリヌクレオチドバリアントは、好ましくは、該バリアントポリヌクレオチドによってコードされている抗体の結合親和性が、本明細書に具体的に示すポリヌクレオチド配列によってコードされている配列に比べて実質的に減少されないように、１つ以上の置換、付加、欠失および／または挿入を含有することとなる。
【０１５１】
一定の他の関連実施形態において、ポリヌクレオチド断片は、本明細書に記載の抗体をコードする配列と同一のまたは相補的な配列の様々な長さの連続ストレッチを含み得るまたはそれらから本質的に成り得る。例えば、本明細書に開示する抗体、またはその抗原結合断片、をコードする配列の少なくとも約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、２００、３００、４００、５００または１０００以上の連続するヌクレオチドならびにこれらの間のすべての中間長のヌクレオチドを含むまたはそれらから本質的に成るポリヌクレオチドを提供する。この文脈での「中間長」が、引用値間の任意の長さ、例えば、５０、５１、５２、５３など；１００、１０１、１０２、１０３など；１５０、１５１、１５２、１５３などであって、２００〜５００、５００〜１０００およびこれらに類するものを通してすべての整数を含む任意の長さを意味することは、容易に理解されるであろう。ここに記載のポリヌクレオチド配列は、天然配列中では見つけられない追加のヌクレオチドにより、一端または両端で延長されることがある。この追加の配列は、本明細書に記載する抗体をコードするポリヌクレオチドのいずれかの末端における、または本明細書に記載する抗体をコードするポリヌクレオチドの両端における１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０ヌクレオチドから成り得る。
【０１５２】
もう１つの実施形態では、本明細書に提供する抗体、もしくはその抗原結合断片、をコードするポリヌクレオチド配列に中から高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすることが可能であるポリヌクレオチド、またはそれらの断片、またはそれらの相補配列を提供する。ハイブリダイゼーション技術は、分子生物学技術分野において周知である。例証を目的として、本明細書に提供するようなポリヌクレオチドの他のポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの試験に適する中ストリンジェント条件は、５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の溶液中での予備洗浄；５０℃〜６０℃、５×ＳＳＣで一晩のハイブリダイジング；続いて６５℃で２０分間、０．１％ＳＤＳを含有する各２×、０．５×および０．２×ＳＳＣでの２回の洗浄を含む。例えばハイブリダイゼーション溶液の塩含有量および／またはハイブリダイゼーションを行う温度を変えることにより、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを容易に操作することができることは、当業者には理解されるであろう。例えば、もう１つの実施形態において、適する高ストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーションの温度を例えば６０℃〜６５℃または６５℃〜７０℃に上昇させることを除き、上に記載したものを含む。
【０１５３】
一定の実施形態において、上に記載したポリヌクレオチド、例えば、ポリヌクレオチドバリアント、断片およびハイブリダイジング配列は、ＣＤ４０を結合する抗体、またはそれらの抗原結合断片をコードする。他の実施形態において、かかるポリヌクレオチドは、本明細書に具体的に示す抗体配列をコードするばかりでなく、ＣＤ４０に少なくとも約５０％、少なくとも約７０％および一定の実施形態では少なくとも約９０％結合する抗体もしくは抗原結合断片、またはそれらのＣＤＲ、をコードする。さらなる実施形態において、かかるポリヌクレオチドは、本明細書に具体的に示す抗体配列をコードするばかりでなく、本明細書に記載する抗体より大きい親和性でＣＤ４０に結合する、例えば、定量的に少なくとも約１０５％、１０６％、１０７％、１０８％、１０９％または１１０％結合する抗体もしくは抗原結合断片、またはそれらのＣＤＲ、をコードする。
【０１５４】
本明細書中の他の箇所に記載するように、代表ポリペプチド（例えば、本明細書に提供するようなバリアントＣＤ４０特異的抗体、例えば、本明細書に提供するような抗原結合断片を有する抗体タンパク質）の三次元構造の決定を常例的方法論によって行うことができるので、選択された天然または非天然アミノ酸での１つ以上のアミノ酸の置換、付加、欠失または挿入を、そのようにして誘導された構造バリアントが本開示種の空間充填特性を保持するかどうかを判定するために、仮想モデル化することができる。例えば親和性が維持されるまたはより良好な親和性が達成されるような抗体内の適切なアミノ酸置換（または該アミノ酸配列をコードする適切なポリヌクレオチド）を決定するための様々なコンピュータプログラムが当業者に公知である。
【０１５５】
本明細書に記載するポリヌクレオチドまたは、それ自体のコーディング配列長にかかわらず、その断片を、他のＤＮＡ配列、例えばプロモーター、ポリアデニル化シグナル、追加の制限酵素部位、多数のクローニング部位、他のコーディングセグメントおよびこれらに類するものと組み合わせることができるので、それらの全長はかなり様々であり得る。したがって、ほぼあらゆる長さの核酸断片を利用することができることが考えられ、その全長は、好ましくは、所期の組換えＤＮＡプロトコルでの調製および使用の容易さによって制限される。例えば、約１０，０００、約５０００、約３０００、約２，０００、約１，０００、約５００、約２００、約１００、約５０塩基対の長さおよび（すべての中間長を含む）これらに類する長さの総長を有する例証的ポリヌクレオチドセグメントは、有用であると考えられる。
【０１５６】
ポリヌクレオチド配列を比較するとき、２配列は、下で説明するような最大一致のためにアラインしたときにそれらの２配列中のヌクレオチドの配列が同じである場合、「同一」であると言われる。２配列間の比較は、典型的に、比較ウインドウにわたって配列を比較して配列類似性の局所領域を同定し、比較することによって行われる。本明細書において用いる場合の「比較ウインドウ」は、少なくとも約２０、通常は３０から約７５、４０から約５０の連続する位置のセグメントであって、ある配列を、２配列を最適にアラインした後に同数の連続した位置の基準配列と比較することができるセグメントを指す。
【０１５７】
比較のための配列の最適なアラインメントは、デフォルトパラメータを用いて、バイオインフォマティクスソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．、ウィスコンシン州マディソン）のＬａｓｅｒｇｅｎｅ  ｓｕｉｔｅにおけるＭｅｇａｌｉｇｎプログラムを用いることにより行うことができる。このプログラムは、次の参考文献に記載されている幾つかのアラインメントスキームを具現する：Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．（１９７８）Ａ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｃｈａｎｇｅ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ｄｉｓｔａｎｔ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ．Ｉｎ  Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．（編集）Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ  第５巻、増刊３号、３４５−３５８頁；Ｈｅｉｎ  Ｊ．、Ｕｎｉｆｉｅｄ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｓ、６２６−６４５頁（１９９０）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  第１８３巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，Ｐ．Ｍ．、ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−１５３（１９８９）；Ｍｙｅｒｓ，Ｅ．Ｗ．ａｎｄ  Ｍｕｌｌｅｒ  Ｗ．、ＣＡＢＩＯＳ  ４：１１−１７（１９８８）；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｅ．Ｄ．、Ｃｏｍｂ．Ｔｈｅｏｒ  １１：１０５（１９７１）；Ｓａｎｔｏｕ，Ｎ．Ｎｅｓ，Ｍ．、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．４：４０６−４２５（１９８７）；Ｓｎｅａｔｈ，Ｐ．Ｈ．Ａ．ａｎｄ  Ｓｏｋａｌ，Ｒ．Ｒ．、Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ
Ｔａｘｏｎｏｍｙ−ｔｈｅ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ
Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ、Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ（１９７３）；Ｗｉｌｂｕｒ，Ｗ．Ｊ．ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．，Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：７２６−７３０（１９８３）。
【０１５８】
あるいは、比較のための配列の最適なアラインメントは、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｄ．ＡＰＬ．Ｍａｔｈ  ２：４８２  （１９８１）の局所同一性アルゴリズムにより、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の同一性アラインメントアルゴリズムにより、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４（１９８８）の類似性検索方法により、これらのアルゴリズムのコンピュータ実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、ウィスコンシン州マディソンの５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．）中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）により、または検査により行うことができる。
【０１５９】
配列同一性および配列類似性パーセントの決定に適しているアルゴリズムの１つの好ましい例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴＳ  ２．０アルゴリズムであり、これらは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２（１９７７）およびＡｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）にそれぞれ記載されている。ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ  ２．０を例えば本明細書に記載するパラメータで使用して、２つ以上のポリヌクレオチド間の配列同一性パーセントを決定することができる。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、米国国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を通して公的に入手することができる。１つの例証となる例では、ヌクレオチド配列について、パラメータＭ（１対のマッチ残基についての報酬スコア；常に＞０）およびＮ（ミスマッチの残基についてのペナルティスコア；常に＜０）を用いて、累積スコアを計算することができる。各方向のワードヒットの拡張は、次の場合、停止される：累積アラインメントスコアがその最大達成値からＸ量低下した場合；１つ以上の負のスコアの残基アラインメントの蓄積のため、蓄積スコアがゼロ以下になった場合；またはいずれかの配列の末端に達した場合。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ、およびＸによってアラインメントの感度および速度が決まる。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列について）は、デフォルトとして１１のワード長（Ｗ）、および１０の期待値（Ｅ）、ならびにＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５（１９８９）参照）アラインメント、５０の（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両鎖の比較を用いる。
【０１６０】
一定の実施形態において、「配列同一性百分率」は、少なくとも２０の位置の比較ウインドウにわたって２つの最適にアラインされた配列を比較することにより決定され、この場合、比較ウインドウ内のポリヌクレオチド配列の構成部分は、２配列の最適なアラインメントのために（付加および欠失を含まない）基準配列と比較して２０パーセント以下、通常は５〜１５パーセントまたは１０〜１２パーセントの付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含むことがある。前記百分率は、同一核酸塩基が両方の配列内に出現する位置の数を判定してマッチ位置の数を得ること、そのマッチ位置数を基準配列内の位置の総数（すなわち、ウインドウサイズ）で割ること、そしてそれらの結果に１００をかけて配列同一性百分率を得ることによって計算される。
【０１６１】
遺伝子コードの縮重の結果として、本明細書に記載の抗体をコードする多くのヌクレオチド配列があることは、当業者には理解されるであろう。これらのポリヌクレオチドの一部は、ＣＤ４０に結合する抗体をコードする天然のまたは元のポリヌクレオチド配列のヌクレオチド配列と最小限の配列同一性しか持たない。それにもかかわらず、コドン使用頻度の差のため異なるポリヌクレオチドは、明確に本開示によって考えられる。一定の実施形態では、哺乳動物発現用にコドン最適化された配列が特に考えられる。
【０１６２】
したがって、本発明のもう１つの実施形態では、部位特異的変異誘発などの変異誘発アプローチを、本明細書に記載する抗体のバリアントおよび／または誘導体の調製に利用することができる。このアプローチにより、ポリペプチド配列の特定の修飾を、それらをコードする基礎ポリヌクレオチドの変異誘発によって行うことができる。これらの技術は、１つ以上のヌクレオチド配列変化をポリヌクレオチドに導入することによる、例えば上述の考慮事項の１つ以上を含む配列バリアントを調製および試験するための単刀直入なアプローチを提供する。
【０１６３】
部位特異的変異誘発は、所望の変異のＤＮＡ配列をコードする特異的オリゴヌクレオチド配列、および十分な数の隣接ヌクレオチドの使用による変異体の生産であって、欠失接合部のそれを横切る両側に安定した二重鎖を形成するために十分なサイズおよび配列複雑性のプライマー配列をもたらすための生産を可能にする。選択されたポリヌクレオチド配列において変異を用いてそのポリヌクレオチド自体の特性を改善、変更、低下、修飾もしくは別様に変化させることができ、および／またはコードされたポリペプチドの特性、活性、組成、安定性もしくは一次配列を変更することができる。
【０１６４】
一定の実施形態において、本発明者らは、本明細書に開示する抗体、またはその抗原結合断片、をコードするポリヌクレオチド配列の変異誘発であって、コードされたポリペプチドの１つ以上の特性、例えば、前記抗体もしくはその抗原結合断片の結合親和性、または特定のＦｃ領域の機能、または特定のＦｃγＲに対するＦｃ領域の親和性を変更するためのものである変異誘発を考えている。部位特異的変異誘発の技術は当該技術分野において周知であり、ポリペプチドとポリヌクレオチド両方のバリアントを作るために広範に用いられている。例えば、部位特異的変異誘発は、ＤＮＡ分子の特異的部分を変更するためによく用いられる。かかる実施形態では、典型的には約１４〜約２５ヌクレオチドほどを含む長さのプライマーを用い、その配列の接合部の両側の約５〜約１０残基を変更する。
【０１６５】
当業者には理解されるであろうが、部位特異的変異誘発技術は、一本鎖および二本鎖形態の両方に存在するファージベクターを利用することが多い。部位指向性変異誘発において有用な典型的ベクターには、Ｍ１３ファージなどのベクターが挙げられる。これらのファージは、市場で容易に入手することができ、それらの使用は、当業者に一般に周知である。二本鎖プラスミドはまた、対象となる遺伝子をプラスミドからファージへと移入する段階をなくす部位指向性変異誘発において常例的に利用されている。
【０１６６】
一般に、本明細書による部位指向性変異誘発は、先ず、一本鎖ベクターを得ること、または所望のペプチドをコードするＤＮＡ配列をその配列内に含む二本鎖ベクターの２本の鎖を別々に融解することによって行う。所望の変異配列を保有するオリゴヌクレオチドプライマーを、一般には合成的に、調製する。次に、このプライマーを前記一本鎖ベクターとアニールし、大腸菌ポリメラーゼＩクレノウ断片などのＤＮＡ重合酵素に供して、変異を保有する鎖の合成を完了する。かくして、１本の鎖が元の変異されていない配列をコードし、第二の鎖が所望の変異を保有するヘテロ二重鎖が形成される。その後、このヘテロ二重鎖ベクターを使用して、大腸菌細胞などの適切な細胞を形質転換させ、変異配列配置を保有する組換えベクターを含むクローンを選択する。
【０１６７】
部位指向性変異誘発を用いる、選択されたペプチドをコードするＤＮＡセグメントの配列バリアントの調製は、潜在的に有用な種の生産手段を提供するものであり、ペプチドの配列バリアントおよびそれらをコードするＤＮＡ配列を得ることができる他の方法があるので、限定的であることを意図したものではない。例えば、所望のペプチド配列をコードする組換えベクターをヒドロキシルアミンなどの変異誘発剤で処理して、配列バリア
ントを得ることができる。これらの方法およびプロトコルに関する具体的な詳細は、Ｍａｌｏｙら、１９９４；Ｓｅｇａｌ、１９７６；Ｐｒｏｋｏｐ  ａｎｄ  Ｂａｊｐａｉ、１９９１；Ｋｕｂｙ、１９９４；およびＭａｎｉａｔｉｓら、１９８２の教示の中で見出され、その目的のために、前記各教示は参照により本明細書に援用されている。
【０１６８】
本明細書において用いる場合、用語「オリゴヌクレオチド指向性変異誘発手順」は、特異的核酸分子の濃度がその初期濃度に比べて増加するまたは増幅などの検出可能シグナルの濃度が増加する結果となる、テンプレート依存性プロセスおよびベクター媒介増殖を指す。本明細書において用いる場合、用語「オリゴヌクレオチド指向性変異誘発手順」は、プライマー分子のテンプレート依存性伸長を含むプロセスを指すことを意図したものである。テンプレート依存性プロセスという用語は、核酸の新規合成鎖の配列が相補的塩基対合についての周知の規則（例えば、Ｗａｔｓｏｎ、１９８７参照）によって規定される、ＲＮＡまたはＤＮＡ分子の核酸合成を指す。典型的に、ベクター媒介方法論は、核酸断片のＤＮＡまたはＲＮＡへの導入、そのベクターのクローン増幅、および増幅された核酸断片の回収を含む。かかる方法論の例は、米国特許第４，２３７，２２４号明細書に提供されており、これはその全体が参照により本明細書に特に援用されている。
【０１６９】
ポリペプチドバリアントの生産のためのもう１つのアプローチでは、米国特許第５，８３７，４５８号明細書に記載されているような再帰的配列組換えを利用することができる。このアプローチでは、組換えおよびスクリーニングまたは選択の反復サイクルを行って、例えば増加した結合親和性を有する個々のポリヌクレオチドバリアントを「発生」させる。一定の実施形態は、本明細書に記載の少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むプラスミド、ベクター、転写または発現カセットの形態で構築物も提供する。
【０１７０】
多くの実施形態では、対象モノクローナル抗体をコードする核酸を宿主細胞に直接導入し、コードされた抗体の発現を誘導するのに十分な条件下でその細胞をインキュベートする。当業者に周知の標準的な技術を本明細書に提供するポリペプチドおよび核酸配列と併用して本開示の抗体を調製する。それによって開示される特定の抗体をコードする適切な核酸配列を、前記ポリペプチド配列を使用して決定することができる。当業者に周知の標準的な方法に従って様々な発現系に対する個々のコドン「選好」を反映するように前記核酸配列を最適化することができる。
【０１７１】
一定の関連実施形態に従って、本明細書に記載の１つ以上の構築物を含む組み換え宿主細胞；任意の抗体、そのＣＤＲ、ＶＨもしくはＶＬドメイン、または抗原結合断片、をコードする核酸；およびコードされた産物の生産方法を提供し、前記方法は、その産物についてコードしている核酸からの発現を含む。発現は、核酸を含有する組換え宿主細胞を適切な条件下で培養することによって都合よく達成することができる。発現による生産の後、抗体またはその抗原結合断片を、任意の適する技術を用いて単離および／または精製することができ、そしてその後、必要に応じて使用することができる。
【０１７２】
本明細書に提供するような抗体または抗原結合断片、ならびにコードする核酸分子およびベクターは、例えばそれらの天然の環境から実質的に純粋なもしくは均質な形態で単離および／もしくは精製することができ、または核酸の場合には、所望の機能を有するポリペプチドをコードする配列以外、元の核酸もしくは遺伝子がないもしくは実質的にないことがある。核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含むことができ、完全にまたは部分的に合成のものであることがある。本明細書に示す場合のヌクレオチド配列への言及は、指定配列を有するＤＮＡ分子を包含し、および文脈による別段の要求がない限り、ＵでＴが置換されている指定配列を有するＲＮＡ分子を包含する。
【０１７３】
様々な異なる宿主細胞におけるポリペプチドのクローニングおよび発現のための系は周知である。適する宿主細胞としては、細菌、哺乳動物細胞、酵母およびバキュロウイルス系が挙げられる。異種ペプチドの発現のために当該技術分野において利用可能な哺乳動物細胞系としては、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、ＮＳＯマウス黒色腫細胞および多くの他のものが挙げられる。一般的な好ましい細菌宿主は、大腸菌である。
【０１７４】
大腸菌などの原核細胞における抗体および抗原結合断片の発現は、当該技術分野において十分に確立されている。総説については、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：５４５−５５１（１９９１）を参照されたし。真核細胞における培養での発現も、抗体またはそれらの抗原結合断片の生産の選択肢として当業者は利用することができ、最近の総説については、例えば、Ｒｅｆ，Ｍ．Ｅ．（１９９３）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．４：５７３−５７６；Ｔｒｉｌｌ  Ｊ．Ｊ．ら（１９９５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ６：５５３−５６０を参照されたし。
【０１７５】
プロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子および他の配列を適宜含む適切な調節配列を含有する、適したベクターを選択または構築することができる。ベクターは、適宜、プラスミド、ウイルス性、例えばファージ、またはファージミドであってよい。さらなる詳細については、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ：第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓを参照されたし。核酸の操作、例えば核酸構築物の調製、変異誘発、シークエンシング、ＤＮＡの細胞への導入および遺伝子発現に関するもの、ならびにタンパク質の分析についての多くの公知技術およびプロトコルは、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２版、Ａｕｓｕｂｅｌら編集、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、１９９２またはその後のその最新版に詳細に記載されている。
【０１７６】
用語「宿主細胞」は、本明細書記載の抗体のうちの１つ以上をコードする核酸配列が導入されている細胞、または導入されていることに耐え得る細胞であって、さらに、任意の本明細書記載抗体をコードする遺伝子などの対象となる選択された遺伝子を発現するまたは発現することが可能である細胞を指すために用いている。この用語は、親細胞の後代を、その後代が形態の点でまたは構成する遺伝子の点でその元の親と同一であろうと、なかろうと、選択された遺伝子が存在する限り含む。したがって、かかる核酸の宿主細胞への導入を含む方法も考えられる。前記導入には任意の利用可能な技術を用いることができる。真核細胞に適する技術としては、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン、エレクトロポレーション、リポソーム媒介トランスフェクション、およびレトロウイルスまたは他のウイルス、例えばワクシニアウイルスもしくは昆虫細胞についてはバキュロウイルス、を使用する形質導入を挙げることができる。細菌細胞に適する技術としては、塩化カルシウム形質転換、エレクトロポレーション、およびバクテリオファージを使用するトランスフェクションを挙げることができる。前記導入の後、例えば遺伝子の発現のための条件下で宿主細胞を培養することにより、核酸からの発現を生じさせるまたは可能にすることができる。１つの実施形態では、その核酸を宿主細胞のゲノム（例えば、染色体）に組み込む。そのゲノムでの組換えを促進する配列を標準的な技術により含めることによって、組み込みを促進することができる。
【０１７７】
一定の実施形態において、本発明は、本明細書に記載のＣＤ４０特異的抗体などの特定のポリペプチドを発現させるための発現系における上述の構築物の使用を含む方法も提供する。用語「形質導入」は、通常はファージによる、ある細菌から別の細菌への遺伝子の移入を指すために用いている。「形質導入」は、レトロウイルスによる真核細胞配列の獲得および移入も指す。用語「トランスフェクション」は、細胞による外来または外因性ＤＮＡの取り込みを指すために使用され、細胞は、外因性ＤＮＡが細胞膜の内部に導入されている場合、「トランスフェクト」されている。多数のトランスフェクション技術が当該技術分野において周知であり、それらを本明細書に開示する。例えば、Ｇｒａｈａｍら、１９７３、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２：４５６；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ，Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ｄａｖｉｓら、１９８６、ＢＡＳＩＣ  ＭＥＴＨＯＤＳ  １Ｎ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ；およびＣｈｕら、１９８１、Ｇｅｎｅ  １３：１９７を参照されたし。かかる技術を用いて、１つ以上の外因性ＤＮＡ部分を適する宿主細胞に導入することができる。
【０１７８】
本明細書において用いる場合の用語「形質転換」は、細胞の遺伝子の特徴の変化を指し、細胞は、新たなＤＮＡを含有するように修飾されている場合、形質転換されている。例えば、細胞は、その天然の状態から遺伝子修飾されると、形質転換される。トランスフェクションまたは形質導入後、形質転換するＤＮＡを、細胞の染色体への物理的組み込みによりその細胞のＤＮＡと組み換えることができ、または複製することなくエピソーム成分として一過的に維持することができ、またはプラスミドとして独立して複製することができる。細胞は、その細胞の分裂に伴ってＤＮＡが複製されるとき安定的に形質転換されると考えられる。生体物質、例えば核酸分子、ポリペプチド、宿主細胞およびこれらに類するものとの関連で用いるときの用語「天然に存在する」または「天然の」は、自然界で見つけられる材料であって、ヒトによって操作されていない材料を指す。類似して、本明細書において用いる場合の「天然に存在しない」または「非天然の」は、自然界では見つけられない材料であって、ヒトによって構造的に修飾されたまたは合成された材料を指す。
【０１７９】
用語「ポリペプチド」、「タンパク質」および「ペプチド」および「糖タンパク質」は同義で用いており、いずれの特定の長さにも限定されないアミノ酸のポリマーを意味する。この用語は、修飾、例えばミリスチル化、硫酸化、グリコシル化、リン酸化、およびシグナル配列の付加または欠失を除外しない。用語「ポリペプチド」または「タンパク質」は、アミノ酸の１つ以上の鎖を意味し、この場合、各鎖は、ペプチド結合によって共有結合で連結されているアミノ酸を含み、ならびに該ポリペプチドまたはタンパク質は、ペプチド結合によって互いに非共有結合でおよび／または共有結合で連結された複数の鎖であって、天然タンパク質、すなわち、天然に存在するおよび特に非組み換え細胞によって生産されたタンパク質、または遺伝子改変もしくは組換え細胞によって生産されたタンパク質、の配列を有するものである鎖を含むことができ、ならびに天然タンパク質のアミノ酸配列を有する分子、または前記天然配列の１つ以上のアミノ酸からの欠失、該アミノ酸への付加および／もしくは該アミノ酸の置換を有する分子を含むことができる。用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、具体的には、本開示のＣＤ４０に結合する抗体、または抗ＣＤ４０抗体の１つ以上のアミノ酸からの欠失、該アミノ酸への付加および／もしくは該アミノ酸の置換を有する配列を包含する。したがって、「ポリペプチド」または「タンパク質」は、１つのアミノ酸鎖（「単量体」と呼ばれる）または複数のアミノ酸鎖（「多量体」と呼ばれる）を含み得る。
【０１８０】
本明細書において言及する用語「単離されたタンパク質」は、対象タンパク質が、（１）自然界で典型的に共に見つけられる少なくとも一部の他のタンパク質を欠く、（２）同じ源からの、例えば同じ種からの、他のタンパク質を本質的に欠く、（３）異なる種からの細胞によって発現される、（４）自然界でそれが会合しているポリヌクレオチド、脂質、炭水化物または他の材料の少なくとも約５０パーセントから分離されている、（５）該「単離されたタンパク質」が自然界で会合しているタンパク質の部分と（共有結合性もしくは非共有結合性相互作用によって）会合していない、（６）自然界でそれが会合していないポリペプチドと（共有結合性もしくは非共有結合性相互作用によって）作動可能に会合している、または（７）自然界に存在しないことを意味する。かかる単離されたタンパク質は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡもしくは他のＲＮＡによってコードされている場合があり、合成起源のものであることがあり、またはそれらの任意の組み合わせであることがある。一定の実施形態において、前記単離されたタンパク質には、その用途（治療、診断、予防、研究または別様の用途）に干渉することとなるその天然の環境において見つけられるタンパク質またはポリペプチドまたは他の混入物が実質的にない。
【０１８１】
用語「ポリペプチド断片」は、単量体である場合もあり、多量体である場合もあるポリペプチドであって、天然に存在するまたは組換え生産されたポリペプチドのアミノ末端欠失、カルボキシル末端欠失、および／または内部欠失もしくは置換を有するものであるポリペプチドを指す。一定の実施形態において、ポリペプチド断片は、少なくとも５から約５００アミノ酸長のアミノ酸鎖を含む場合がある。一定の実施形態において、断片が、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００または４５０アミノ酸長であることは理解されるであろう。特に有用なポリペプチド断片としては、抗体の抗原結合ドメインまたは断片をはじめとする、機能性ドメインが挙げられる。抗ＣＤ４０抗体の場合、有用な断片としては、ＣＤＲ領域、特に、重または軽鎖のＣＤＲ３領域；重または軽鎖の可変領域；２つのＣＤＲを含む抗体鎖の部分またはその可変領域のみ；およびこれらに類するものが挙げられるが、それらに限定されない。
【０１８２】
ポリペプチドは、そのタンパク質の移入を翻訳中または翻訳後に命令するシグナル（またはリーダー）配列をそのタンパク質のＮ末端に含むことがある。かかるシグナルまたはリーダーペプチドを伴わない、シグナルペプチドを含む本明細書に提供する任意のポリペプチドアミノ酸配列もまた、本明細書に記載する任意の用途に考えられる。当業者には分かるであろうが、前記シグナルペプチドは、通常はプロセッシング中に切断され、活性抗体タンパク質に含まれない。ポリペプチドの合成、精製もしくは同定を容易にするために（例えば、ポリ−Ｈｉｓ）、または固体支持体へのポリペプチドの結合を強化するために、ポリペプチドをリンカーまたは他の配列にインフレーム融合またはコンジュゲートさせることもできる。
【０１８３】
多数のポリペプチド成分を、各ポリペプチドが確実にその二次および／または三次構造にフォールディングするために十分な距離だけ離隔するために、必要に応じてペプチドリンカー／スペーサー配列を利用することもできる。当該技術分野において周知の標準的な技術を用いて、かかるペプチドリンカー配列を融合ポリペプチドに組み込むことができる。
【０１８４】
一定のペプチドスペーサー配列を、例えば（１）それらが柔軟な伸長された立体配座構造をとることができること；（２）それらが第一および第二のポリペプチド上の機能的エピトープと相互作用し得る二次構造をとることができないこと；ならびに／または（３）前記ポリペプチドの機能的エピトープと反応し得る疎水性または荷電残基の欠如に基づいて、選択することができる。
【０１８５】
１つの例証的実施形態において、ペプチドスペーサー配列は、例えば、Ｇｌｙ、ＡｓｎおよびＳｅｒ残基を含有する。他のほぼ中性のアミノ酸、例えばＴｈｒおよびＡｌａも前記スペーサー配列に含めることができる。
【０１８６】
スペーサーとして有用に利用することができる他のアミノ酸配列としては、Ｍａｒａｔｅａら、Ｇｅｎｅ  ４０：３９  ４６（１９８５）；Ｍｕｒｐｈｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：８２５８  ８２６２（１９８６）；米国特許第４，９３５，２３３号明細書および同第４，７５１，１８０号明細書に開示されているものが挙げられる。
【０１８７】
他の例証的スペーサーとしては、例えば、Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｓｐ（Ｃｈａｕｄｈａｒｙら、１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：１０６６−１０７０）およびＬｙｓ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ（Ｂｉｒｄら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６）を挙げることができる。
【０１８８】
一部の実施形態において、前記第一および第二のポリペプチドが、機能的ドメインを離隔するためにおよび立体障害を防止するために用いることができる非必須Ｎ末端アミノ酸領域を有するとき、スペーサー配列は必要とされない。スペーサーを一切用いずに、または例えば１〜３回反復される５量体Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒから成る柔軟なポリリンカーを使用することにより、直接２つのコーディング配列を融合させることができる。かかるスペーサーは、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）を構築する際にＶＨとＶＬの間に挿入することにより使用されている（Ｂｉｒｄら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；Ｈｕｓｔｏｎら、１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：５９７９−５８８３）。
【０１８９】
一定の実施形態では、単鎖抗体の可変領域を形成する２つのベータシート間の妥当な相互作用を可能にするようにペプチドスペーサーを設計する。
【０１９０】
一定の例証的実施形態において、ペプチドスペーサーは、１〜５の間のアミノ酸、５〜１０の間のアミノ酸、５〜２５の間のアミノ酸、５〜５０の間のアミノ酸、１０〜２５の間のアミノ酸、１０〜５０の間のアミノ酸、１０〜１００の間のアミノ酸、または任意の介在範囲のアミノ酸である。
【０１９１】
他の例証的実施形態において、ペプチドスペーサーは、長さ約１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０以上のアミノ酸を含む。
【０１９２】
本明細書に記載する抗体のアミノ酸配列修飾（単数または複数）が考えられる。例えば、前記抗体の結合親和性および／または他の生物学的特性を改善することが望ましいことがある。例えば、抗体のアミノ酸配列バリアントを、その抗体をコードするポリヌクレオチドもしくはその鎖に適切なヌクレオチド変化を導入することにより、またはペプチド合成により調製することができる。かかる修飾としては、例えば、前記抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失および／または該残基への挿入および／または該残基の置換が挙げられる。欠失、挿入および置換のいずれかの組み合わせを行って、最終抗体に到達してもよいが、但し、その最終構築物が所望の特性（例えば、ＣＤ４０への高親和性結合）を有することを条件とする。前記アミノ酸変化は、抗体の翻訳後プロセスを変更する、例えば、グリコシル化部位の数または位置を変化させることもある。本発明のポリペプチドについて上で説明した任意の変異および修飾を本発明の抗体に含めることができる。
【０１９３】
本開示は、本明細書に開示する抗体のバリアントを提供する。一定の実施形態では、本明細書に具体的に示す抗体配列ばかりでなく、かかるバリアント抗体もしくはそれらの抗原結合断片、またはそれらのＣＤＲはＣＤ４０に少なくとも約５０％、少なくとも７０％、および一定の実施形態では、少なくとも約９０％結合する。さらなる実施形態では、本明細書に具体的に示す抗体配列ばかりでなく、かかるバリアント抗体もしくはそれらの抗原結合断片、またはそれらのＣＤＲ、本明細書に示す抗体より大きい親和性でＣＤ４０に結合する、例えば、定量的に少なくとも約１０５％、１０６％、１０７％、１０８％、１０９％または１１０％結合する。
【０１９４】
特定の実施形態において、対象抗体は、ａ）本明細書に記載する抗ＣＤ４０抗体の重鎖可変領域と少なくとも８０％同一である、少なくとも９５％同一である、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；およびｂ）本明細書に記載する抗ＣＤ４０抗体の軽鎖可変領域と少なくとも８０％同一である、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有し得る。例証となる重および軽鎖領域のアミノ酸配列を配列番号１〜５６に示す。
【０１９５】
特定の実施形態において、前記抗体は、ａ）重鎖可変領域であって、ｉ．本明細書に記載する選択された抗体の重鎖ＣＤＲ１領域とアミノ酸配列の点で同一であるＣＤＲ１領域；ｉｉ．前記選択された抗体の重鎖ＣＤＲ２領域とアミノ酸配列の点で同一であるＣＤＲ２領域；およびｉｉｉ．前記選択された抗体の重鎖ＣＤＲ３領域とアミノ酸配列の点で同一であるＣＤＲ３領域を含むものである重鎖可変領域と、ｂ）軽鎖可変ドメインであって、ｉ．前記選択された抗体の軽鎖ＣＤＲ１領域とアミノ酸配列の点で同一であるＣＤＲ１領域；ｉｉ．前記選択された抗体の軽鎖ＣＤＲ２領域とアミノ酸配列の点で同一であるＣＤＲ２領域；およびｉｉｉ．前記選択された抗体の軽鎖ＣＤＲ３領域とアミノ酸配列の点で同一であるＣＤＲ３領域を含むものである軽鎖可変ドメインとを含み得、選択された標的（例えば、ＣＤ４０）を特異的に結合する。さらなる実施形態において、前記抗体またはその抗原結合断片は、バリアント抗体であり、該バリアントは、ＶＨおよびＶＬ領域のＣＤＲ領域における８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５以上までのアミノ酸置換を除き、選択された抗体と同一の重および軽鎖を含む。この関連で、前記選択された抗体のＣＤＲ領域には、さらに１、２、３、４、５、６、７、８、または一定の実施形態では９、１０、１１、１２、１３、１４、１５のアミノ酸置換があることがある。置換は、ＶＨおよび／またはＶＬ領域いずれかにおけるＣＤＲでのものであり得る。（例えば、Ｍｕｌｌｅｒ、１９９８、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ６：１１５３−１１６７参照）。
【０１９６】
代表ポリペプチド（例えば、本明細書に提供するようなバリアントＣＤ４０特異的抗体、例えば、本明細書に提供するような抗原結合断片を有する抗体タンパク質）の三次元構造の決定を常例的方法論によって行うことができるので、選択された天然または非天然アミノ酸での１つ以上のアミノ酸の置換、付加、欠失または挿入を、そのように誘導された構造バリアントが本開示種の空間充填特性を保持するかどうかを判定するために、仮想モデル化することができる。例えば、Ｄｏｎａｔｅら、１９９４  Ｐｒｏｔ．Ｓｃｉ．３：２３７８；Ｂｒａｄｌｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０９：１８６８−１８７１（２００５）；Ｓｃｈｕｅｌｅｒ−Ｆｕｒｍａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１０：６３８（２００５）；Ｄｉｅｔｚ  ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０３：１２４４（２００６）；Ｄｏｄｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ４５０：１７６（２００７）；Ｑｉａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ４５０：２５９（２００７）；Ｒａｍａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２７：１０１４−１０１８（２０１０）を参照されたし。これらおよび関連実施形態のために、例えば、本明細書に提供するようなＣＤ４０特異的抗体  それらの抗原結合ドメインの合理的設計のために用いることができるコンピュータアルゴリズムの一部の追加の非限定的な例としては、３−Ｄグラフィックおよび内蔵スクリプトを使用して大きな生体分子系を表示、動画化および分析するための分子可視化プログラムであるＶＭＤが挙げられる（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｌｌｉｎｏｉｓ  ａｔ  Ｕｒｂａｎａ−ＣｈａｍｐａｇｎｅのＴｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  Ｇｒｏｕｐのウェブサイトをｋｓ．ｕｉｕｃ．ｅｄｕ／Ｒｅｓｅａｒｃｈ／ｖｍｄ／にて参照されたし）。多くの他のコンピュータプログラムが当該技術分野において公知であり、それらを当業者は利用することができ、それらによりエネルギー最小化立体配座の空間充填モデル（ファンデルワールス半径）からの原子寸法の決定が可能になる；種々の化学基に対して高親和性の領域を決定し、それにより結合を強化しようと努めるＧＲＩＤ、数学的アルゴリズムを計算するモンテカルロサーチ、ならびに力の場の計算を評定し、分析するＣＨＡＲＭＭ（Ｂｒｏｏｋｓら（１９８３）Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．４：１８７−２１７）およびＡＭＢＥＲ（Ｗｅｉｎｅｒら（１９８１）Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．１０６：７６５）（Ｅｉｓｅｎｆｉｅｌｄら（１９９１）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６１：Ｃ３７６−３８６；Ｌｙｂｒａｎｄ（１９９１）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｅｌｇ．４６：４９−５４；Ｆｒｏｉｍｏｗｉｔｚ（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ８：６４０−６４４；Ｂｕｒｂａｍら（１９９０）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ７：９９−１１１；Ｐｅｄｅｒｓｅｎ（１９８５）Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．６１：１８５−１９０；およびＫｉｎｉら（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｄｙｎ．９：４７５−４８８も参照されたし）。種々の適切な計算用コンピュータプログラムは、例えばＳｃｈｒｏｅｄｉｎｇｅｒ（ドイツ国ミュンヘン）から、市販もされている。
【０１９７】
本発明のもう１つの実施形態において、抗ＣＤ４０抗体およびそれらのヒト化バージョンはウサギモノクローナル抗体に由来し、詳細には、ＲａｂＭＡｂ（登録商標）技術を用いてそれらを産生する。これらの抗体は、最小限の配列修飾しか必要とせず、それにより、変異系列誘導（ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｌｉｎｅａｇｅ  ｇｕｉｄｅｄ：ＭＬＧ）ヒト化技術（例えば、米国特許第７，４６２，６９７号明細書参照）を用いるヒト化後の機能特性の保持が助長されるので、有利である。したがって、本開示の抗ＣＤ４０抗体の例証的作製方法は、例えば米国特許第５，６７５，０６３号および同第７，４２９，４８７号明細書に記載されている、ＲａｂＭａｂ（登録商標）ウサギモノクローナル抗体技術を含む。この関連で、一定の実施形態では、本開示の抗ＣＤ４０抗体をウサギにおいて生産する。特定の実施形態では、ウサギ脾細胞との融合が可能なウサギ由来不死Ｂリンパ球を使用して、抗体を生産するハイブリッド細胞を生産する。前記不死Ｂリンパ球は、内因性免疫グロブリン重鎖を検出可能に発現せず、一定の実施形態では変更された免疫グロブリン重鎖をコードする遺伝子を含有し得る。
【０１９８】
組成物および使用方法
本開示は、ＣＤ４０特異的抗体、それらの抗原結合断片、を含む組成物、様々な治療設定でのかかる組成物の投与を提供する。
【０１９９】
本明細書に記載するＣＤ４０特異的抗体の純粋な形態でのまたは適切な医薬組成物での投与を、同様の有用性をもたらす薬剤の投与について承認されているいずれかの方式によって行うことができる。前記医薬組成物は、抗体または抗体含有組成物を適切な生理的に許容され得る担体、希釈剤または賦形剤と併せることによって調製することができ、固体、半固体、液体または気体形態の製剤、例えば錠剤、カプセル、粉末、顆粒、軟膏、溶液、坐剤、注射剤、吸入剤、ゲル、マイクロスフェアおよびエアロゾルに調合することができる。加えて、他の医薬活性成分（本明細書中の他の箇所に記載の他の抗癌剤を含む）ならびに／または適する賦形剤、例えば塩、緩衝剤および安定剤が、必要ではないが、前記組成物中に存在することもある。投与は、経口、非経口、鼻、静脈内、皮内、皮下または局所経路をはじめとする様々な異なる経路によって達成することができる。好ましい投与方式は、処置または予防すべき病態の性質に依存する。投与後に癌の進行および／または転移を低減させる、阻害する、予防するまたは遅延させる量が有効と見なされる。
【０２００】
一定の実施形態において、投与する量は、生存腫瘍の量の統計学的に有意な減少、例えば、腫瘍質量の少なくとも５０％減少によってまたはスキャン寸法変更（例えば、統計学的有意性のある減少）によって示されるような腫瘍退縮を結果として生じさせるのに十分な量である。他の実施形態において、投与する量は、熟練した臨床医には公知の特定の疾患適応症の症状の臨床的に意義のある低減を結果として生じさせるのに十分な量である。
【０２０１】
正確な投薬量および処置の継続期間は、処置する疾患の関数であり、公知の試験プロトコルを用いて経験的に決定することができ、または当該技術分野において公知のモデル系で組成物を試験し、そこから外挿することにより決定することができる。管理された臨床治験を行うこともできる。病態の重症度が緩和されるにつれて投薬量を変えることもできる。医薬組成物は、一般に、治療的に有用な効果を発揮し、その上、望ましくない副作用を最小限にするように調合され、投与される。前記組成物を１回で投与してもよいし、または多数のより小さい用量に分割して、間隔をあけて投与してもよい。いずれの特定の被験体についても、具体的な投薬レジメンを個々の必要に応じて経時的に調整することができる。
【０２０２】
前記ＣＤ４０特異的抗体含有組成物を単独で投与してもよいし、他の公知の癌処置、例えば、放射線療法、化学療法、移植、免疫療法、ホルモン療法、光力学的療法などと併用で投与してもよい。前記組成物を抗生物質と併用で投与することもできる。
【０２０３】
したがって、これらのおよび関連医薬組成物の典型的投与経路としては、限定ではないが、経口、局所、経皮、吸入、非経口、舌下、頬側、直腸内、膣および鼻腔内経路が挙げられる。本明細書において用いる場合の用語非経口は、皮下注射、静脈内、筋肉内、胸骨内注射または注入技術を含む。本発明の一定の実施形態による医薬組成物は、患者にその組成物を投与すると中に含有されている活性成分が生物学的に利用可能になるようにすることができるように調合される。被験体または患者に投与することとなる組成物は、１つ以上の投薬単位の形態をとることがあり、例えば、錠剤は、単一投薬単位であり得、およびエアロゾル形態の本明細書記載ＣＤ４０特異的抗体の容器は、複数の投薬単位を保持することができる。かかる投薬形態の実際の調製方法は当業者に公知であり、または明らかであろう；例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２０版（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０００）を参照されたし。いずれにせよ、投与することとなる組成物は、本明細書における教示に従って対象となる疾患または病態を処置するために、治療有効量の本開示の抗体を含有する。
【０２０４】
医薬組成物は、固体の形態であることもあり、または液体の形態であることもある。１つの実施形態において、前記組成物が例えば錠剤または粉末形態であるために前記担体（単数または複数）は粒状である。前記担体（単数または複数）は、前記組成物が、例えば、経口油、注射液、または例えば吸入投与の際に有用であるエアロゾルであると、液体であり得る。経口投与が意図されるとき、前記医薬組成物は、好ましくは固体または液体形態であり、半固体、半液体、懸濁液およびゲル形態は、本明細書において固体または液体のいずれかとして考えられる形態の中に含まれる。
【０２０５】
経口投与用の固体組成物として、前記医薬組成物を粉末、顆粒、圧縮錠剤、ピル、カプセル、チューインガム、ウエハースまたはこれらに類するものに調合することができる。かかる固体組成物は、典型的に、１つ以上の不活性希釈剤または可食担体を含有することとなる。加えて、次のものの１つ以上が存在することもある：結合剤、例えばカルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、微結晶性セルロース、トラガカントガムまたはゼラチン；賦形剤、例えばデンプン、ラクトースまたはデキストリン、崩壊剤、例えばアルギン酸、アルギン酸ナトリウム、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、トウモロコシデンプンおよびこれらに類するもの；滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウムまたはＳｔｅｒｏｔｅｘ；流動化促進剤、例えばコロイド状二酸化ケイ素；甘味剤、例えばスクロースまたはサッカリン；着香剤、例えばペパーミント、サリチル酸メチルまたはオレンジフレーバリング；ならびに着色剤。前記医薬組成物がカプセル、例えばゼラチンカプセルの形態であるとき、それは、上のタイプの材料に加えて、液体担体、例えばポリエチレングリコールまたは油を含有し得る。
【０２０６】
前記医薬組成物は、液体、例えばエリキシル、シロップ、溶液、エマルジョンまたは懸濁液の形態であることがある。前記液体は、２つ例として、経口投与用であることがあり、または注射による送達用であることがある。経口投与が意図されるとき、好ましい組成物は、本化合物に加えて、甘味剤、保存剤、色素／着色剤および香味増強剤のうちの１つ以上を含有する。注射により投与することを意図した組成物の場合には、界面活性剤、保存剤、湿潤剤、分散剤、懸濁化剤、緩衝剤、安定剤および等張剤のうちの１つ以上を含むことがある。
【０２０７】
前記液体医薬組成物は、溶液であろうと、懸濁液であろうと、または他の同様の形態であろうと、次のアジュバントのうちの１つ以上を含むことがある：無菌希釈剤、例えば、注射用水、食塩溶液、好ましくは生理食塩水、リンガー溶液、等張性塩化ナトリウム、溶媒または懸濁媒体としての役割を果たすことができる固定油、例えば合成モノもしくはジグリセリド、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の溶媒；抗菌剤、例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン；酸化防止剤、例えば、アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウム；キレート剤、例えば、エチレンジアミン四酢酸；緩衝剤、例えば、酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩、および等張性の調整用の剤、例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロース。前記非経口製剤をガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨て注射器または多回投与用バイアルに封入することができる。生理食塩水が好ましいアジュバントである。注射用医薬組成物は、好ましくは無菌である。
【０２０８】
非経口投与または経口投与のいずれかが意図された液体医薬組成物は、適する投薬量が得られることとなるような量の本明細書開示のＣＤ４０特異的抗体を含有しなければならない。典型的に、この量は、前記組成物中に少なくとも０．０１％の前記抗体である。経口投与が意図されるとき、この量を、前記組成物の重量の０．１％と約７０％の間になるように変えることができる。一定の経口医薬組成物は、約４％と約７５％の間の抗体を含有する。一定の実施形態では、非経口投薬単位が希釈前に０．０１重量％と１０重量％の間の抗体を含有するように、本発明による医薬組成物および製剤を調製する。
【０２０９】
前記医薬組成物は、局所投与を意図したものであることがあり、この場合の担体は、適切には、溶液、エマルジョン、軟膏またはゲル基剤を含む。前記基剤は、例えば、次のうちの１つ以上を含むことがある：ワセリン、ラノリン、ポリエチレングリコール、蜜蝋、鉱油、希釈剤、例えば水およびアルコール、ならびに乳化剤および安定剤。局所投与用の医薬組成物中に増粘剤が存在することもある。経皮投与が意図される場合、その組成物は、経皮パッチまたはイオン泳動デバイスを含み得る。前記医薬組成物は、例えば、直腸内で融解して薬物を放出することとなる坐剤の形態での、直腸内投与を意図したものであることもある。直腸内投与用の組成物は、適する無刺激賦形剤として油性基剤を含有することがある。かかる基剤としては、限定ではないが、ラノリン、カカオ脂およびポリエチレングリコールが挙げられる。
【０２１０】
前記医薬組成物は、固体または液体投薬単位の物理的形態を修飾する様々な材料を含むことがある。例えば、前記組成物は、活性成分の周囲にコーティングシェルを形成する材料を含むことがある。コーティングシェルを形成する材料は、典型的に不活性であり、例えば、糖、シェラック、および他の腸溶コーティング剤から選択され得る。あるいは、前記活性成分をゼラチンカプセルに入れることができる。固体または液体形態の医薬組成物は、本発明の抗体に結合する剤を含むことがあり、それによって該化合物の送達を支援する。この能力の点で作用することができる適する剤としては、他のモノクローナルもしくはポリクローナル抗体、１つ以上のタンパク質またはリポソームが挙げられる。前記医薬組成物は、エアロゾルとして投与することができる投薬単位から本質的に成り得る。用語エアロゾルは、コロイド的性質のものから、加圧パッケージから成る系にわたる、様々な系を示すために用いている。送達は、液化もしくは圧縮ガスによることもあり、または活性成分を投薬する適切なポンプシステムによることもある。活性成分（単数または複数）を送達するために、単相、二相または三相系でエアロゾルを送達することができる。エアロゾルの送達は、一緒にキットを形成することができる必要容器、アクチベータ、弁、副容器およびこれらに類するものを含む。当業者は、過度の実験を伴うことなく、好ましいエアロゾルを決定することができる。
【０２１１】
前記医薬組成物を製薬技術分野において周知の方法論によって調製することができる。例えば、注射により投与することを意図した医薬組成物は、本明細書に記載のＣＤ４０特異的抗体と場合により塩、緩衝剤および／または安定剤のうちの１つ以上とを含む組成物を滅菌蒸留水と併せて溶液を形成することにより調製することができる。均質な溶液または懸濁液の形成を助長するために界面活性剤を添加してもよい。界面活性剤は、前記抗体組成物と非共有結合的に相互作用して、水性送達系への該抗体の溶解または均質な懸濁を助長する化合物である。
【０２１２】
前記組成物を治療有効量で投与することができ、この治療有効量は、利用する具体的な化合物（例えば、ＣＤ４０特異的抗体）；前記化合物の代謝安定性および作用長；患者の年齢、体重、全身の健康状態、性別および食事；投与方式および回数；排泄速度；薬物の組み合わせ；特定の障害または病態の重症度；ならびに治療を受ける被験体をはじめとする様々な要因に依存して変わるであろう。一般に、治療有効日用量は、（７０ｋｇ哺乳動物については）約０．００１ｍｇ／ｋｇ（すなわち０．０７ｍｇ）から約１００ｍｇ／ｋｇ（すなわち７．０ｇ）であり；好ましくは、治療有効量は、（７０ｋｇ哺乳動物については）約０．０１ｍｇ／ｋｇ（すなわち０．７ｍｇ）から約５０ｍｇ／ｋｇ（すなわち３．５ｇ）であり；さらに好ましくは、治療有効量は、（７０ｋｇ哺乳動物については）約１ｍｇ／ｋｇ（すなわち７０ｍｇ）から約２５ｍｇ／ｋｇ（すなわち１．７５ｇ）である。
【０２１３】
本開示のＣＤ４０特異的抗体を含む組成物はまた、１つ以上の他の治療薬と同時に投与してもよく、該治療薬の前に投与してもよく、または該治療薬の後に投与してもよい。かかる併用療法は、本発明の化合物と１つ以上の追加の活性薬剤とを含有する単一の医薬投薬用製剤の投与はもちろん、本発明の抗体と各活性薬剤とを含む組成物のその固有の別々の医薬投薬用製剤での投与も含み得る。例えば、本明細書に記載の抗体および他の活性薬剤を患者に単一の経口投薬組成物、例えば錠剤もしくはカプセル、で一緒に投与することができ、または各薬剤を別々の経口投薬用製剤で投与することができる。類似して、本明細書に記載の抗体および他の活性薬剤を患者に単一の非経口投薬用組成物、例えば食塩溶液もしくは他の生理的に許容され得る溶液で一緒に投与することができ、または各薬剤を別々の非経口投薬用製剤で投与することができる。別々の投薬用製剤を使用する場合、抗体および１つ以上の追加の活性薬剤を含む組成物を本質的に同じときに、すなわち同時に投与することができ、または時間をずらして別々に、すなわち逐次的におよび任意の順序で投与することができる；併用療法は、これらすべてのレジメンを含むと解される。
【０２１４】
したがって、一定の実施形態では、１つ以上の他の治療薬と併用での本開示の抗ＣＤ４０抗体組成物の投与も考えられる。かかる治療薬は、本明細書に記載の特定の病状、例えば、関節リウマチ、炎症または癌についての標準的処置として当該技術分野において受け入れられ得る。考えられる例示的治療薬としては、サイトカイン、成長因子、ステロイド、ＮＳＡＩＤ、ＤＭＡＲＤ、抗炎症剤、化学療法薬、放射線療法薬、または他の
活性および補助的薬剤が挙げられる。
【０２１５】
一定の実施形態では、本明細書に開示する抗ＣＤ４０抗体を任意の数の化学療法薬と併用で投与することができる。化学療法薬の例としては、アルキル化剤、例えば、チオテパおよびシクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（商標））；アルキルスルホナート、例えば、ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファン；アジリジン、例えば、ベンゾドパ、カルボコン、メツレドパおよびウレドパ；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド（ｔｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈａｏｒａｍｉｄｅ）およびトリメチロールメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）を含む、エチレンイミンおよびメチルメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅｓ）；ナイトロジェンマスタード、例えば、クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノブエンビキン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード；ニトロソウレア（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａｓ）、例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン；抗生物質、例えば、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリケアマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポルフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝拮抗薬、例えば、メトトレキサートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）；葉酸類似体、例えば、デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサート；プリンアナログ、例えば、フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジンアナログ、例えば、アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロキシウリジン、５−ＦＵ；アンドロゲン、例えば、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン；抗副腎薬、例えば、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸補充薬、例えば、フォリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビスアントレン；エダトレキサート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；デホファミン；デメコルシン；ジアジクオン；エフロルニチン（ｅｌｆｏｒｍｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；���ニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ．ＲＴＭ．；ラゾキサン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２”−トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えば、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、ニュージャージー州プリンストン）およびドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、Ｒｈｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ、フランス国アントニー）；クロラムブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金アナログ、例えば、シスプラチンおよびカルボプラチン；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ  ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ｄｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌｏｍｉｔｈｉｎｅ（ＤＭＦＯ））；レチノイン酸誘導体、例えば、Ｔａｒｇｒｅｔｉｎ（商標）（ベキサロテン）、Ｐａｎｒｅｔｉｎ（商標）（アリトレチノイン）；ＯＮＴＡＫ（商標）（デノロイキンディフティトックス）；エスペラマイシン；カペシタビン；上記いずれかのものの医薬的に許容され得る塩、酸または誘導体が挙げられる。この定義には、腫瘍に対するホルモン作用を調節または阻害するように作用する抗ホルモン薬、例えば、抗エストロゲン（例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害性４（５）−イミダゾール、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストンおよびトレミフェン（Ｆａｒｅｓｔｏｎ）を含む）；ならびに抗アンドロゲン、例えば、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリドおよびゴセレリン；ならびに上記いずれかのものの医薬的に許容され得る塩、酸または誘導体も含まれる。
【０２１６】
様々な他の治療薬を本明細書に記載の抗ＣＤ４０抗体と共に使用することができる。１つの実施形態では、前記抗体を抗炎症剤と共に投与する。抗炎症剤または薬としては、ステロイドおよび糖質コルチコイド（ベタメタゾン、ブデソニド、デキサメタゾン、酢酸ヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾン、トリアムシノロンを含む）、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤＳ）（アスピリン、イブプロフェン、ナプロキセン、メトトレキサート、スルファサラジン、レフルノミド、抗ＴＮＦ薬、シクロホスファミドおよびミコフェノール酸塩を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２１７】
例示的ＮＳＡＩＤは、イブプロフェン、ナプロキセン、ナプロキセンナトリウム、Ｃｏｘ−２阻害剤、例えばＶＩＯＸＸ（登録商標）（ロフェコキシブ）およびＣＥＬＥＢＲＥＸ（登録商標）（セレコキシブ）、ならびにシアル酸塩から成る群より選択される。例示的鎮痛薬は、アセトアミノフェン、オキシコドン、トラマドールまたはプロポキシフェン（ｐｒｏｐｏｒｘｙｐｈｅｎｅ）塩酸塩から成る群より選択される。例示的糖質コルチコイドは、コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロンまたはプレドニゾンから成る群より選択される。例示的生物学的応答修飾物質としては、細胞表面マーカー（例えば、ＣＤ４、ＣＤ５など）に指向された分子、サイトカイン阻害剤、例えばＴＮＦアンタゴニスト（例えば、エタネルセプト（ＥＮＢＲＥＬ（登録商標））、アダリムマブ（ＨＵＭＩＲＡ（登録商標））およびインフリキシマブ（ＲＥＭＩＣＡＤＥ（登録商標）））、ケモカイン阻害剤および接着分子阻害剤が挙げられる。生物学的応答修飾物質としては、モノクローナル抗体はもちろん、組換え型の分子も挙げられる。例示的ＤＭＡＲＤとしては、アザチオプリン、シクロホスファミド、シクロスポリン、メトトレキサート、ペニシラミン、レフルノミド、スルファサラジン、ヒドロキシクロロキン、金（経口（オーラノフィン）および筋肉内）およびミノサイクリンが挙げられる。
【０２１８】
一定の実施形態では、本明細書に記載する抗体をサイトカインと共に投与する。本明細書において用いる場合の「サイトカイン」とは、別の細胞に対して細胞間媒介因子として作用するある細胞集団によって放出されるタンパク質についての総称を意味する。かかるサイトカインの例は、リンフォカイン、モノカイン、および旧来のポリペプチドホルモンである。サイトカインには、成長ホルモン、例えば、ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモンおよびウシ成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；リラキシン；プロリラキシン；糖タンパクホルモン、例えば、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）および黄体形成ホルモン（ＬＨ）；肝成長因子；線維芽細胞成長因子；プロラクチン；胎盤性ラクトゲン；腫瘍壊死因子−αおよび−β；ミュラー管抑制因子；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；神経成長因子、例えば、ＮＧＦ−β；血小板成長因子；形質転換成長因子（ＴＧＦ）、例えば、ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β；インスリン様成長因子−Ｉおよび−ＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘導因子；インターフェロン、例えば、インターフェロン−α、β、および−γ；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えば、マクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）；顆粒球−マクロファージ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）；および顆粒球−ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）；インターロイキン（ＩＬ）、例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２；ＩＬ−１５、腫瘍壊死因子、例えば、ＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−β；ならびに他のポリペプチド因子（ＬＩＦおよびｋｉｔリガンド（ＫＬ）を含む）が含まれる。本明細書において用いる場合、用語サイトカインは、天然源からのまたは組換え細胞からのタンパク質、および天然配列サイトカインの生物活性等価物を含む。
【０２１９】
本明細書に記載のＣＤ４０特異的抗体を含む組成物を、本明細書に記載するような疾患に罹患している個体に投与することができ、該疾患としては、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、慢性リンパ球性白血病、有毛細胞白血病、急性リンパ芽球性白血病、多発性骨髄腫、膵臓、結腸、胃腸、前立腺、膀胱、腎臓  卵巣、子宮頚部、乳房、肺、上咽頭の癌腫、悪性黒色腫、ならびにリツキシマブ耐性ＮＨＬおよび白血病、自己免疫疾患ならびに炎症性疾患が挙げられるが、これらに限定されない。自己免疫疾患としては、関節炎（関節リウマチ、反応性関節炎を含む）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、乾癬および炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、脳脊髄炎、ブドウ膜炎、重症筋無力症、多発性硬化症、インスリン依存型糖尿病、アジソン病、セリアック病、慢性疲労症候群、自己免疫性肝炎、自己免疫性脱毛症、強直性脊椎炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、線維筋痛症、尋常性天疱瘡、シェーグレン症候群、川崎病、甲状腺機能亢進／ブレーブス病、甲状腺機能低下／橋本病、子宮内膜症、強皮症、悪性貧血、グッドパスチャー症候群、ギラン・バレー症候群、ウェーグナー病、糸球体腎炎、再生不良性貧血（頻回輸血再生不良性貧血患者を含む）、発作性夜間ヘモグロビン尿症、骨髄異形成症候群、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫性溶血性貧血、エバンス症候群、第ＶＩＩＩ因子阻害物質症候群、全身性血管炎、皮膚筋炎、多発性筋炎およびリウマチ熱、自己免疫性リンパ増殖症候群（ＡＬＰＳ）、自己免疫性水疱性類天疱瘡、パーキンソン病、サルコイドーシス、白斑、原発性胆汁性肝硬変、ならびに自己免疫性心筋炎が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２２０】
炎症性疾患としては、クローン病、大腸炎、皮膚炎、乾癬、憩室炎、肝炎、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、エリテマトーデス、腎炎、パーキンソン病、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症（ＭＳ）、アルツハイマー病、関節炎、関節リウマチ、喘息、ならびに様々な心血管疾患、例えばアテローム性動脈硬化症および血管炎が挙げられるが、これらに限定されない。一定の実施形態において、前記炎症性疾患は、関節リウマチ、糖尿病、痛風、クリオピリン関連周期性症候群、および慢性閉塞性肺疾患から成る群より選択される。この関連で、１つの実施形態は、炎症もしくは炎症性疾患を処置する、炎症もしくは炎症性疾患の重症度を低減させる、または炎症もしくは炎症性疾患を予防する方法であって、それを必要とする患者に抗ＣＤ４０抗体を含む治療有効量の本明細書開示組成物を投与することによる方法を提供する。
【０２２１】
ヒト疾患の処置のためのｉｎ  ｖｉｖｏでの使用のために、本明細書に記載する抗体を、一般に、投与前に医薬組成物に組み込む。医薬組成物は、本明細書中の他の箇所に記載の生理的に許容され得る担体または賦形剤との組み合わせで、本明細書に記載する１つ以上の抗体を含む。医薬組成物を調製するために、有効量の１つ以上の前記化合物を、特定の投与方式に適していることが当業者に公知の任意の製薬用担体（単数もしくは複数）または賦形剤と混合する。製薬用担体は、液体であってもよいし、半液体であってもよいし、または固体であってもよい。非経口、皮内、皮下または局所適用に用いる溶液または懸濁液は、例えば、無菌希釈剤（例えば水）、食塩溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒；抗菌剤（例えば、ベンジルアルコールおよびメチルパラベン）；酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸および重亜硫酸ナトリウム）およびキレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））；緩衝剤（例えば、酢酸塩、クエン酸塩およびリン酸塩）を含むことがある。静脈内投与する場合、適する担体としては、生理食塩水またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ならびに増粘剤および可溶化剤、例えばグルコース、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールおよびこれらの混合物、を含有する溶液が挙げられる。
【０２２２】
本明細書に記載のＣＤ４０特異的抗体を含む組成物を、該抗体の身体からの急速排出を防ぐ担体、例えば、持効性製剤またはコーティングを用いて調製することができる。かかる担体としては、制御放出製剤、例えば、これらに限定されないが、インプラントおよびマイクロカプセル化送達系、および生体分解性、生体適合性ポリマー、例えばエチレンビニルアセタート、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、ＰＥＧ、ポリオルトエステル、ポリ乳酸および当業者に公知のものが挙げられる。
【０２２３】
ＣＤ４０を結合する抗体を使用する処置方法を本明細書に提供する。１つの実施形態では、本発明の抗体を、ＣＤ４０の不適切な発現を伴う疾患を有する患者に投与し、前記ＣＤ４０の不適切な発現を伴う疾患は、本開示の文脈では、例えば、存在するタンパク質の量の変更（例えば、統計学的に有意な増加もしくは減少）、もしくは変異型タンパク質の存在、または両方に起因する異常ＣＤ４０発現または活性を特徴とする疾患および障害を含むことを意図したものである。過剰存在量は、正常に検出できるものを基準にしてＣＤ４０の分子レベルでの過発現、作用部位での持続的もしくは蓄積された様相、または増加された（例えば、統計学的に有意に）活性を含む（しかしこれらに限定されない）、任意の原因に起因し得る。ＣＤ４０のかかる過剰存在量は、ＣＤ４０シグナリング事象の正常な発現、様相または活性を基準にして測定することができ、前記測定は、本明細書に記載する抗体の開発および／または臨床試験において重要な役割を果たし得る。
【０２２４】
本抗体は、様々な癌の処置に有用である。一定の実施形態において、本明細書に記載する抗体は、抗腫瘍免疫応答を活性化させることにより抗腫瘍活性を発揮する。一定の実施形態において、本抗体は、ＣＤ４０の異常発現に関連付けられる様々な癌の処置に有用である。本発明の１つの実施形態では、治療有効量の本明細書開示ＣＤ４０特異的抗体を癌患者に投与することによる、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、慢性リンパ球性白血病、有毛細胞白血病、急性リンパ芽球性白血病、多発性骨髄腫、膵臓、結腸、胃腸、前立腺、膀胱、腎臓  卵巣、子宮頚部、乳房、肺、上咽頭の癌腫、悪性黒色腫、ならびにリツキシマブ耐性ＮＨＬおよび白血病をはじめとする（しかし、これらに限定されない）癌の処置方法を提供する。投与後、癌の進行および／または転移を統計学的に有意に（すなわち、当業者には公知であろうような適切な対照を基準にして）阻害する、予防するまたは遅延させる量を有効とみなす。
【０２２５】
もう１つの実施形態は、治療有効量（例えば、投与後、癌の転移を統計学的に有意に、すなわち当業者には公知であろうような適切な対照を基準にして、阻害する、予防するまたは遅延させる量）の本明細書開示ＣＤ４０特異的抗体を癌患者に投与することによる、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、慢性リンパ球性白血病、有毛細胞白血病、急性リンパ芽球性白血病、多発性骨髄腫、膵臓、結腸、胃腸、前立腺、膀胱、腎臓  卵巣、子宮頚部、乳房、肺、上咽頭の癌腫、悪性黒色腫、ならびにリツキシマブ耐性ＮＨＬおよび白血病をはじめとする（しかし、これらに限定されない）癌の転移の予防方法を提供する。
【０２２６】
もう１つの実施形態は、治療有効量の本明細書開示ＣＤ４０特異的抗体を癌患者に投与することによる、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、慢性リンパ球性白血病、有毛細胞白血病、急性リンパ芽球性白血病、多発性骨髄腫、膵臓、結腸、胃腸、前立腺、膀胱、腎臓  卵巣、子宮頚部、乳房、肺、上咽頭の癌腫、悪性黒色腫、ならびにリツキシマブ耐性ＮＨＬおよび白血病をはじめとする（しかし、これらに限定されない）癌の予防方法を提供する。
【０２２７】
もう１つの実施形態は、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、慢性リンパ球性白血病、有毛細胞白血病、急性リンパ芽球性白血病、多発性骨髄腫、膵臓、結腸、胃腸、前立腺、膀胱、腎臓  卵巣、子宮頚部、乳房、肺、上咽頭の癌腫、悪性黒色腫、ならびにリツキシマブ耐性ＮＨＬおよび白血病を処置する、該疾患の症状を改善する、該疾患の進行を阻害する、または該疾患を予防するための方法であって、これらの疾患の１つ以上に罹患している患者に治療有効量の本明細書開示ＣＤ４０特異的抗体を投与することによる方法を提供する。
【０２２８】
もう１つの実施形態は、自己免疫疾患を処置する、該疾患の症状を改善する、該疾患の進行を阻害する、または該疾患を予防するための方法であって、これらの疾患の１つ以上に罹患している患者に治療有効量の本明細書開示抗ＣＤ４０抗体を投与することによる方法を提供する。この関連で、自己免疫疾患としては、関節炎（関節リウマチ、反応性関節炎を含む）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、乾癬および炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、脳脊髄炎、ブドウ膜炎、重症筋無力症、多発性硬化症、インスリン依存型糖尿病、アジソン病、セリアック病、慢性疲労症候群、自己免疫性肝炎、自己免疫性脱毛症、強直性脊椎炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、線維筋痛症、尋常性天疱瘡、シェーグレン症候群、川崎病、甲状腺機能亢進／グレーブス病、甲状腺機能低下／橋本病、子宮内膜症、強皮症、悪性貧血、グッドパスチャー症候群、ギラン・バレー症候群、ウェーグナー病、糸球体腎炎、再生不良性貧血（頻回輸血再生不良性貧血患者を含む）、発作性夜間ヘモグロビン尿症、骨髄異形成症候群、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫性溶血性貧血、エバンス症候群、第ＶＩＩＩ因子阻害物質症候群、全身性血管炎、皮膚筋炎、多発性筋炎およびリウマチ熱、自己免疫性リンパ増殖症候群（ＡＬＰＳ）、自己免疫性水疱性類天疱瘡、パーキンソン病、サルコイドーシス、白斑、原発性胆汁性肝硬変、ならびに自己免疫性心筋炎が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２２９】
もう１つの実施形態は、炎症性疾患を処置する、該疾患の症状を改善する、該疾患の進行を阻害する、または該疾患を予防するための方法であって、これらの疾患の１つ以上に罹患している患者に治療有効量の本明細書開示抗ＣＤ４０抗体を投与することによる方法を提供する。炎症性疾患としては、クローン病、大腸炎、皮膚炎、乾癬、憩室炎、肝炎、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、エリテマトーデス、腎炎、パーキンソン病、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症（ＭＳ）、アルツハイマー病、関節炎、関節リウマチ、喘息、ならびに様々な心血管疾患、例えばアテローム性動脈硬化症および血管炎が挙げられるが、これらに限定されない。一定の実施形態において、前記炎症性疾患は、関節リウマチ、糖尿病、痛風、クリオピリン関連周期性症候群、および慢性閉塞性肺疾患から成る群より選択される。
【０２３０】
もう１つの実施形態では、本発明の抗ＣＤ４０抗体を使用して、結合抗原、例えば立体配座エピトープ、の構造を判定し、その後、その構造を用いて、この構造を有するまたは模倣する化合物を、例えば化学的モデリングおよびＳＡＲ法により、開発することができる。
【０２３１】
本発明の様々な他の実施形態は、一部分、ＣＤ４０を発現する細胞または組織の存在を検出するための診断応用に関する。したがって、本開示は、ＣＤ４０を発現する細胞または組織の検出などの、試料中ＣＤ４０の検出方法を提供する。かかる方法は、免疫組織化学（ＩＨＣ）、免疫細胞化学（ＩＣＣ）、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）、ホールマウントｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＷＩＳＨ）、蛍光ＤＮＡ
ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、フローサイトメトリー、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）および酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）をはじめとする（しかしこれらに限定されない）様々な公知検出形式で利用することができる。
【０２３２】
ＩＳＨは、標識された相補ＤＮＡまたはＲＮＡ鎖（すなわち、一次結合剤）を使用して、細胞もしくは組織の一部または切片（ｉｎ  ｓｉｔｕ）またはその組織が十分に小さい場合には全組織（ｗｈｏｌｅ  ｍｏｕｎｔ  ＩＳＨ）における特異的ＤＮＡまたはＲＮＡ配列を局在定位するタイプのハイブリダイゼーションである。これが、主結合剤として抗体を使用して組織切片におけるタンパク質を局在定位する免疫組織化学とは異なることは、当業者には理解されるであろう。ＤＮＡ  ＩＳＨは、染色体の構造を判定するためにゲノムＤＮＡに関して用いることができる。蛍光ＤＮＡ  ＩＳＨ（ＦＩＳＨ）は、例えば、染色体の完全性を評定するための医学的診断において使用することができる。ＲＮＡ  ＩＳＨ（ハイブリダイゼーション組織化学）は、組織切片またはホールマウント内のｍＲＮＡおよび他の転写産物を測定および局在定位するために用いられる。
【０２３３】
様々な実施形態において、本明細書に記載する抗体を、直接または間接的に検出することができる検出可能標識にコンジュゲートさせる。この関連で、抗体「コンジュゲート」は、検出可能標識に共有結合で連結されている抗ＣＤ４０抗体を指す。本発明において、ＤＮＡプローブ、ＲＮＡプローブ、モノクローナル抗体、それらの抗原結合断片、およびそれらの抗体誘導体、例えば単鎖可変断片抗体またはエピトープタグ付き抗体は、すべて、検出可能標識に共有結合で連結させることができる。「直接検出」の場合、１つだけの検出可能抗体、すなわち一次検出可能抗体を使用する。したがって、直接検出は、第二の抗体（二次抗体）の追加の必要なく、検出可能標識にコンジュゲートされている抗体、それ自体を検出することができることを意味する。
【０２３４】
「検出可能標識」は、試料中の標識の存在および／または濃度を示す（例えば、視覚的に、電子的にまたは別様に）検出可能なシグナルを生じさせることができる分子または材料である。抗体にコンジュゲートさせると、その検出可能標識を使用して、その特異的抗体が指向されている標的の位置を突き止めることまたは該標的を定量することができる。それにより、検出可能標識によって生成されたシグナルを検出することによって試料中の標的の存在および／または濃度を検出することができる。検出可能標識を直接または間接的に検出することができ、および異なる特異的抗体にコンジュゲートさせた幾つかの異なる検出可能標識を併用して１つ以上の標的を検出することができる。
【０２３５】
直接検出することができる検出可能標識の例としては、蛍光色素および放射性物質および金属粒子が挙げられる。対照的に、間接的検出は、一次抗体の適用後に１つ以上の追加の抗体、すなわち二次抗体の適用を必要とする。したがって、この検出は、二次抗体または結合剤の一次検出可能抗体への結合の検出によって行われる。二次結合剤または抗体の追加を必要とする一次検出可能結合剤または抗体の例としては、酵素的に検出可能な結合剤およびハプテン検出可能結合剤または抗体が挙げられる。
【０２３６】
一部の実施形態では、第一の結合剤を含む核酸ポリマーに検出可能標識をコンジュゲートさせる（例えば、ＩＳＨ、ＷＩＳＨまたはＦＩＳＨプロセスの場合）。他の実施形態では、第一の結合剤を含む抗体に検出可能標識をコンジュゲートさせる（例えば、ＩＨＣプロセスの場合）。
【０２３７】
本開示の方法において使用する抗体にコンジュゲートさせることができる検出可能標識の例としては、蛍光標識、酵素標識、放射性同位元素、化学発光標識、電気化学発光標識、生物発光標識、ポリマー、ポリマー粒子、金属粒子、ハプテンおよび色素が挙げられる。
【０２３８】
蛍光標識の例としては、５−（および６）−カルボキシフルオレセイン、５−または６−カルボキシフルオレセイン、６−（フルオレセイン）−５−（および６）−カルボキサミドヘキサン酸、フルオレセインイソチオシアナート、ローダミン、テトラメチルローダミン、ならびに色素、例えばＣｙ２、Ｃｙ３およびＣｙ５、場合により置換されているクマリン（ＡＭＣＡを含む）、ＰｅｒＣＰ、フィコビリタンパク質（Ｒ−フィコエリトリン（ＲＰＥ）およびアロフィコエリトリン（ＡＰＣ）を含む）、テキサスレッド、プリンストンレッド、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）およびその類似体、ならびにＲ−フィコエリトリンまたはアロフィロエリトリンのコンジュゲート、無機蛍光標識、例えば、被覆ＣｄＳｅナノ微結晶のような半導体材料に基づく粒子が挙げられる。
【０２３９】
ポリマー粒子標識の例としては、蛍光色素を埋め込むことができる、ポリスチレン、ＰＭＭＡもしくはシリカの微粒子またはラテックス粒子、または、色素、酵素もしくは基質を含有するポリマーミセルまたはカプセルが挙げられる。
【０２４０】
金属粒子標識の例としては、銀染剤によって変換され得る、金粒子および被覆金粒子が挙げられる。ハプテンの例としては、ＤＮＰ、フルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）、ビオチンおよびジゴキシゲニンが挙げられる。酵素的標識の例としては、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰまたはＡＰ）、β−ガラクトシダーゼ（ＧＡＬ）、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、β−グルクロニダーゼ、インベルターゼ、キサンチンオキシダーゼ、蛍ルシフェラーゼおよびグルコースオキシダーゼ（ＧＯ）が挙げられる。ホースラディッシュペルオキシダーゼに一般に用いられる基質の例としては、３、３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、ニッケルで強化されたジアミノベンジジン、３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）、ベンジジン二塩酸塩（ＢＤＨＣ）、ハンカー（Ｈａｎｋｅｒ）・イェーツ（Ｙａｔｅｓ）試薬（ＨＹＲ）、インドファンブルー（ＩＢ）、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、４−クロロ−１−ナフトール（ＣＮ）、α−ナフトールピロニン（α−ＮＰ）、ｏ−ジアニシジン（ＯＤ）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファート（ＢＣＩＰ）、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）、２−（ｐ−ヨードフェニル）−３−ｐ−ニトロフェニル−５−フェニルテトラゾリウムクロリド（ＩＮＴ）、テトラニトロブルーテトラゾリウム（ＴＮＢＴ）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−ガラクトシド／フェロ−フェリシアニド（ＢＣＩＧ／ＦＦ）が挙げられる。
【０２４１】
アルカリホスファターゼに一般に用いられる基質の例としては、ナフトール−ＡＳ−Ｂ１−ホスファート／ファストレッドＴＲ（ＮＡＢＰ／ＦＲ）、ナフトール−ＡＳ−ＭＸ−ホスファート／ファストレッドＴＲ（ＮＡＭＰ／ＦＲ）、ナフトール−ＡＳ−Ｂ１−ホスファート／−ファストレッドＴＲ（ＮＡＢＰ／ＦＲ）、ナフトール−ＡＳ−ＭＸ−ホスファート／ファストレッドＴＲ（ＮＡＭＰ／ＦＲ）、ナフトール−ＡＳ−Ｂ１−ホスファート／ニューフクシン（ｆｕｓｃｈｉｎ）（ＮＡＢＰ／ＮＦ）、ブロモクロロインドリルホスファート／ニトロブルーテトラゾリウム（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ｂ−−ｄ−ガラクトピラノシド（ＢＣＩＧ）が挙げられる。
【０２４２】
発光標識の例としては、ルミノール、イソルミノール、アクリジニウムエステル、１，２−ジオキセタンおよびピリドピリダジンが挙げられる。電気化学発光標識の例としては、ルテニウム誘導体が挙げられる。放射性標識の例としては、ヨウ化物、コバルト、セレン、トリチウム、炭素、硫黄およびリンの放射活性同位元素が挙げられる。
【０２４３】
本明細書に記載する抗体、または対象となる生物学的マーカー、例えば抗体、核酸プローブまたはポリマー、に特異的に結合する任意の他の分子に、検出可能標識を連結させることができる。さらに、検出可能標識を第二および／または第三および／または第四および／または第五の結合剤または抗体などにもコンジュゲートさせることができることは、当業者には理解されるであろう。さらに、対象となる生物学的マーカーの特性付けに使用する各追加の結合剤または抗体が、シグナル増幅段階としての役割を果たし得ることは、当業者には理解されるであろう。検出可能物質が、例えば色素、コロイド状金粒子、発光性試薬である場合、例えば、光学顕微鏡法、蛍光顕微鏡法、電子顕微鏡法を使用して、前記生物学的マーカーを視覚的に検出することができる。生物学的マーカーに結合している視覚的検出可能物質を、分光光度計を使用して検出することもできる。検出可能物質が、放射活性同位元素である場合、検出は、オートラジオグラフィーによる視覚的検出である場合もあり、シンチレーションカウンターを使用する非視覚的検出である場合もある。例えば、Ｌａｒｓｓｏｎ、１９８８、Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、Ｆｌａ．）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第８０巻、１９９８、Ｊｏｈｎ  Ｄ．Ｐｏｕｎｄ（編集）（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、Ｎ．Ｊ．）を参照されたし。
【０２４４】
本発明は、試料中のＣＤ４０またはＣＤ４０を発現する細胞もしくは組織を検出するためのキットをさらに提供し、該キットは、本明細書に記載の少なくとも１つの抗体、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクターまたは宿主細胞を含有する。一定の実施形態において、キットは、緩衝剤、酵素、標識、基質、本発明の抗体を付けるビーズまたは他の表面、およびこれらに類するもの、ならびに使用説明書を含むことがある。
【実施例】
【０２４５】
実施例１：抗ＣＤ４０抗体の生産およびヒト化
４羽のニュージーランドホワイトウサギを、組換えウサギＦｃ−ｈＣＤ４０で免疫した。ヒトＣＤ４０への特異的結合の最高血清力価を有するウサギを細胞融合に選択した。合計１７２のハイブリドーマを可溶性Ｆｃ−ｈＣＤ４０への陽性結合剤として同定し、そのうち４４のクローンは、細胞表面ＣＤ４０への陽性結合剤であることが判明した。エピトープ・クラスタリング・アッセイの後、２４の代表ハイブリドーマを組換え発現のために選択し、さらに特性付けした。下でさらに説明するとおりのおよび次のことを含む、第二の機能性スクリーニングを行った：１）ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６アップレギュレーション（アゴニスト活性）によって測定されるようなＤＣ成熟の誘導；直接腫瘍成長阻害（アゴニスト活性）の誘導；および３）ＡＤＣＣ抗体エフェクター機能。次の２つのアームを含む二重機能性スクリーニングに基づき候補を選択した：１）結合親和性、抗体内在化、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）および抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）；および２）アゴニストＤＣ活性化／成熟機能、受容体−リガンド相互作用、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）、細胞増殖およびアポトーシス。
【０２４６】
樹状細胞成熟によるアゴニスト抗体のスクリーニング
抗ＣＤ４０抗体の初期パネルのアゴニストまたはアンタゴニスト効果をさらに明らかにするために、機能性抗体についてのスクリーニングの指標としてＤＣ成熟アッセイを用いた。抗ＣＤ４０または対照抗体をヒト単球由来ＤＣ培養溶液に２日間にわたって添加した。ヒト樹状細胞の最も知られている成熟マーカーの１つであるＣＤ８３のアップレギュレーションを測定して、アゴニスト抗体についてスクリーニングした。樹状細胞成熟を誘導するマウスモノクローナル抗体である５Ｃ１１を陽性対照として使用した。抗体Ｒ−３、Ｒ−６、Ｒ−８、Ｒ−９、Ｒ−１６、Ｒ−１８、Ｒ−２４、Ｒ−３３、Ｒ−３６、１９−２１、１９−４５および１９−５９は、ＣＤ８３発現の５０％より多くをＩｇ対照と比較して増加させた（図１Ａ）。共刺激分子ＣＤ８０およびＣＤ８６の抗体誘導アップレギュレーションを選択された抗体について測定することにより、ＤＣ成熟をさらに判定した。図１Ｂおよび図１Ｃに示すように、抗体Ｒ−３、Ｒ−８、Ｒ−９、Ｒ−３３および１９−２１は、ＣＤ８０とＣＤ８６の両方をアップレギュレートしたが、他の抗体は、ほんのわずかな効果しかなかった。これらの結果は、これらの抗体のＣＤ８３変調効果と一致した。興味深いことに、ＤＣ成熟の誘導が可能な抗体の中で、クローン１９−２１のみが、混合リンパ球反応においてＴ細胞増殖を増進させる強い活性を示した（図１Ｄ）。
【０２４７】
腫瘍成長の直接阻害についてのスクリーニング
アゴニスト抗ＣＤ４０抗体のパネルを、ＣＤ４０発現腫瘍細胞の腫瘍成長阻害を誘導する能力についてさらに評定した。試験したすべての抗ＣＤ４０抗体が腫瘍細胞増殖を阻害した。抗体１９−２１は、最高力価を明示した。（図２）。
【０２４８】
ＡＤＣＣ活性についてのスクリーニング
ＡＰＣ活性化および腫瘍成長阻害の誘導に加えて、抗体エフェクター機能、ＡＤＣＣ、を抗体候補のスクリーニングおよびランク付けのための重要な基準として用いた。ヒトＰＢＭＣを使用するＡＤＣＣアッセイを行うために、選択抗体すべてを、ウサギＦａｂおよびヒトＩｇＧ１でウサギｍＡｂからキメラｍＡｂに変換した。図３に示すように、選択候補すべてがＩｇＧ１対照と比較して有意なＡＤＣＣ活性を示した。最大ＡＤＣＣ活性に基づき、リードｍＡｂをｃＲ−８＞ｃＲ−３＞ｃＲ−３３＞ｃ１９−２１＞ｃＲ−９＞ｃ１９−５９とランク付けした。
【０２４９】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ機能性スクリーニングに基づいて４候補（ｃ１９−２１、ｃＲ−８、ｃＲ−３、ｃＲ−３３）を選択した。それらのｉｎ  ｖｉｔｒｏ特性付けを表１に要約する。抗体ｃ１９−２１は、ＤＣ活性化および腫瘍成長阻害を強く増進させ、その一方で抗体ｃＲ−８およびｃＲ−３は、より強力なＡＤＣＣ活性を示した。
【表１】
2020195388.tif 000002
【０２５０】
Ｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍活性スクリーニング
最上位４候補が異なるｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて異なる効力を示したので、本発明者らは、リード選択のために、それらの抗腫瘍活性を評価および比較するためのｉｎ
ｖｉｖｏ研究を行った。Ｒａｍｏｓ腫瘍異種移植モデルを使用した。腫瘍保有マウスを５ｍｇ／ｋｇで週３回、合計９用量のキメラ抗体ｃＲ−３、ｃＲ−８、ｃＲ−３３またはｃ１９−２１で、腹腔内処置した（１群あたり８匹のマウス）。同じレジメンでのリツキシマブの抗腫瘍活性を基準として用いた。図４Ａに示すように、ｃＲ−８およびｃＲ−３は、最強の抗腫瘍効果を示した。対照的に、１９−２１は、より低い抗腫瘍活性を呈示し、投薬停止後により速やかに腫瘍がリバウンドした。ｃＲ−３３の抗腫瘍効果は、間であったが、リツキシマブより良好なｉｎ  ｖｉｖｏ効力を依然として呈示した。抗体ｃＲ−３およびｃＲ−８のｉｎ  ｖｉｖｏ効力を用量応答研究でさらに評価した。図４Ｂに示すように、ｃＲ−８は、ｃＲ−３より強力な抗腫瘍効力を示し、したがって、リード抗ＣＤ４０抗体と同定した。
【０２５１】
Ｒ−８クローンの重鎖および軽鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号１および２に示す。そのＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を配列番号３〜５および６〜８にそれぞれ示す。機能活性を示した他の抗体候補のうちのいくつかの重および軽鎖配列のアミノ酸配列を配列番号１１〜５６に示す。これらの抗体のＶＨＣＤＲおよびＶＬＣＤＲアミノ酸配列を配列番号５７〜１９４に提供する。図１６は、Ｒ−８クローンをはじめとするこれらの配列のアラインメントを示すものであり、ＣＤＲに下線が引かれている。
【０２５２】
独自の変異系列誘導（ＭＬＧ）ヒト化技術（例えば、米国特許第７，４６２，６９７号明細書参照）を用いて、Ｒ−８をヒト化した。ヒト化Ｒ−８（ＡＰＸ００５）の軽および重鎖フレームワークは、ヒト生殖細胞系配列と９５％同一である。そのヒト化ＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列を配列番号９および１０にそれぞれ示す。ＣＤ４０へのＡＰＸ００５の結合は、その親クローンＲ−８に類似していることが判明した。
【０２５３】
実施例２：ＡＰＸ００５ヒト化抗ＣＤ４０抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ特性付け
非常に多くのｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験を行って、ＡＰＸ００５ヒト化抗体をさらに特性付けした。
【０２５４】
ＡＰＸ００５はＣＤ４０に選択的に結合する
ＡＰＸ００５の結合選択性をＴＮＦＲファミリータンパク質のパネルに対する直接ＥＬＩＳＡによって評定した。ウサギＦｃおよびＣＤ４０、ＲＡＮＫ  ＴｗｅａｋＲ、ＯＸ４０、ＤＲ５および４−１ＢＢの合計１μｇ／ｍＬの融合タンパク質をＥＬＩＳＡプレートにコーティングした。ヤギ抗ヒトＨＲＰコンジュゲートＩｇＧを使用して結合ＡＰＸ００５を検出した。図５に示すように、ＡＰＸ００５は、ヒトＣＤ４０に選択的に結合するが、試験した他のＴＮＦＲファミリータンパク質にはしなかった。
【０２５５】
ＡＰＸ００５はＣＤ４０へのＣＤ４０Ｌの結合を遮断する
ＥＬＩＳＡを行って、ＣＤ４０へのＣＤ４０Ｌの結合に対するＡＰＸ００５の効果を評定した。詳細には、ＣＤ４０Ｌ（４μｇ／ｍＬの最終濃度）を使用して、ＥＬＩＳＡプレート上の固定化ヒトＣＤ４０を結合し、固定化ＣＤ４０をＡＰＸ００５と共にプレインキュベートした後、ＣＤ４０へのＣＤ４０Ｌの結合量の変化を測定した。固定化ＣＤ４０へのＣＤ４０Ｌの結合は、マウス抗ＣＤ４０Ｌモノクローナル抗体によって検出した。図６に示すように、ＡＰＸ００５は、ＣＤ４０へのＣＤ４０Ｌの結合を遮断する。対照的に、ＳＧＮ−４０はその結合を増加させる。
【０２５６】
ＡＰＸ００５／ＣＤ４０複合体は内在化されない
ＡＤＣＣ活性に対するその影響を評価するためにＡＰＸ００５の標的媒介内在化を評定するために、Ｒａｍｏｓ細胞をＡＰＸ００５と共に４時間、３７℃（内在化が許容される温度）で、または３０分間４℃（内在化が最小にされる温度）でインキュベートした。細胞を染色用緩衝液で洗浄し、その後、Ａｌｅｘａ  ４８８標識ヤギ抗ヒトＩｇＧと共にさらに３０分間、４℃でインキュベートした。ＦＡＣＳ分析を行って、細胞表面のＡＰＸ００５レベルを検査した。図７に示すように、３７℃でのインキュベーション後、細胞表面のＡＰＸ００５レベルの低減はなかった（わずかに増加）。このデータは、ＣＤ４０に結合すると、ＡＰＸ００５／ＣＤ４０複合体は腫瘍細胞によって内在化されず、それ故、ＡＤＣＣへのエフェクター細胞の動員に最適な条件がもたらされたことを示唆している。
【０２５７】
ＡＰＸ００５はＡＤＣＣを媒介する
ＣＤ４０を発現する腫瘍細胞に対するＡＰＸ００５のＡＤＣＣ活性を評定するために、ＣＤ４０発現性ＲａｍｏｓおよびＤａｕｄｉを標的細胞として使用し、新鮮なヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をエフェクター細胞として使用した。カルセイン−ＡＭ放出アッセイによりＡＤＣＣを測定した。標的細胞をカルセイン−ＡＭ（１５ｕＭ／１０６細胞）で標識し、洗浄し、丸底９６ウェルプレートに１ウェルあたり５×１０３で、三つ組みでプレーティングした。漸増濃度（０．０００１〜１０μｇ／ｍＬ）のＡＰＸ００５または対照抗体いずれかを４℃で３０分間プレインキュベートし、その後、健常ヒトドナーからのＰＢＭＣエフェクター細胞を、１ウェルあたり２００μＬの最終体積中、４０：１の最終エフェクター：標的細胞比で添加した。少なくとも３人の異なるドナーからのＰＢＭＣを使用して実験を行った。４時間のインキュベーションの後、１００μＬの培養上清をＢｌａｃｋ  Ｖｉｅｗ  Ｐｌａｔｅ−９６プレートに移し、任意蛍光単位（ＡＦＵ）をＶｉｃｔｏｒ  ＩＩプレートリーダー（４８５ｎｍ励起／５３５ｎｍ放射）で読み取った。特異的溶解パーセント＝（ＡＦＵ平均実験放出−ＡＦＵ平均自然放出）／（ＡＦＵ平均最大放出−ＡＦＵ平均自然放出）。図８に示すように、ＡＰＸ００５は、用量依存式にＡＤＣＣを誘導した。同様の効果がＳＧＮ−４０について観察された。ＲａｍｏｓおよびＤａｕｄｉ細胞のＡＤＣＣに対する異なる感度は、異なるＣＤ４０発現レベルに起因し得る（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００５；６５：８３３１−８３３８）。
【０２５８】
ＡＰＸ００５は腫瘍細胞増殖を阻害する。
腫瘍細胞増殖を阻害するＡＰＸ００５の能力を評定するために、９６ウェル平底プレート内の、様々な濃度のＡＰＸ００５、ＳＧＮ−４０または対照ヒトＩｇＧを含有する、１０％ＦＢＳを補足した２００μＬのＲＰＭＩ  １６４０に、５０，０００細胞／ウェルでＲａｍｏｓ細胞を播種した。架橋のために、ＡＰＸ００５、ＳＧＮ−４０または対照ＩｇＧをヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ断片特異的抗体のＦ（ａｂ’）２断片と共に前記培地中で３０分間、室温でプレインキュベートし、その後、前記細胞に添加した。細胞を合計７２時間処置した。その後、１０％ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）（Ｓｅｒｏｔｅｃ、英国オックスフォード）を各ウェルに添加し、さらに２４時間インキュベートした。細胞生存率をＣｙｔｏＦｌｕｏｒ蛍光リーダーにより５３０ｎｍの励起波長および５９０ｎｍの放射波長で測定した。すべての研究を２回、および各試料濃度について三重反復で行った。図９に示すように、モノマーＡＰＸ００５は、Ｒａｍｏｓ細胞の増殖を阻害した（図９Ａ）。ＡＰＸ００５を二次抗体によって架橋させたとき、それは、増加したおよび用量依存性の増殖阻害効果をもたらした（図９Ｂ）。ＡＰＸ００５の架橋は、Ｆｃ受容体発現細胞によってｉｎ  ｖｉｖｏで達成することができる。
【０２５９】
ＡＰＸ００５はＤＣ活性化を誘導する
ＤＣ細胞の成熟を刺激するＡＰＸ００５の能力を評定するために、リンパ球単離溶液を使用して密度勾配遠心法によりＰＢＭＣを調製した。２時間、３７℃でインキュベートした後、付着単球を回収した。単離された単球を、２４ウェルプレートにおいて１０％ＦＣＳを補足したＲＰＭＩ１６４０培地中の１００ｎｇ／ｍＬの組換えヒトＧＭ−ＣＳＦおよび１００ｎｇ／ｍＬの組換えヒトＩＬ−４と共に培養した。培地の半分を３日後に交換した。培養第５日に、１．３ｎＭの抗ＣＤ４０抗体、ＣＤ４０Ｌまたは対照抗体をそれらのＤＣ細胞に添加し、さらに４８時間、２４ウェルプレートにおいて培養した。ＤＣ活性化マーカー染色のために、ＰＥコンジュゲート抗ＣＤ８３、抗ＣＤ８６抗体および抗ＣＤ８０抗体を使用した。ＦＡＣＳを用いて分析を行った。データは、１つの代表研究からのものである。図１０に示すように、ＡＰＸ００５は、著しいＤＣ成熟を誘導した。その効果は、ＳＧＮ−４０およびＣＤ４０Ｌより強力に見える。ＤＣの活性化増加は、より強力な抗腫瘍Ｔ細胞応答をもたらすことができる。
【０２６０】
ＡＰＸ００５はサルＣＤ４０と交差反応性であるがマウスＣＤ４０とは交差反応性でない
交差反応性を直接ＥＬＩＳＡによって評定した。合計１μｇ／ｍＬのヒトＣＤ４０、サルＣＤ４０またはマウスＣＤ４０をＥＬＩＳＡプレートにコーティングし、その後、１μｇ／ｍＬのＡＰＸ００５または対照ＩｇＧ１と共にインキュベートした。ＣＤ４０に結合した抗体を、ＨＲＰとコンジュゲートしているヤギ抗ヒトＩｇＧを使用して検出した。ＡＰＸ００５は、サルＣＤ４０と明確に交差反応するが、マウスＣＤ４０とはしない。（図１１Ａ）。
【０２６１】
ＡＰＸ００５とマウスＣＤ４０の交差反応性を、マウスＣＤ４０を発現するマウスＡ２０細胞系へのＦＡＣＳ結合によって、さらに判定した。０．５×１０６のＡ２０細胞のアリコートを９６ウェルプレートに添加し、１００μＬの希釈ラット抗マウスＣＤ４０抗体（ＰＥとコンジュゲートしている）、ＡＰＸ００５またはＩｇＧ１対照抗体と共にインキュベートした。洗浄後、ＡＰＸ００５および対照ヒトＩｇＧ１の検出のために、Ｒ−ＰＥとコンジュゲートしている１００μＬのヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ
Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＣＡＴ＃２０４０−０９）をＰＢＳ中、１：２００希釈で試料に添加し、インキュベートした。ＰＥとコンジュゲートしているラット抗マウスＣＤ４０抗体を陽性対照として使用した。試料を０．５ｍＬ  ＰＢＳで再び懸濁させ、ＦＡＣＳによって分析した。ＦＡＣＳデータは、ＡＰＸ００５がマウスＣＤ４０と交差反応しないことを示した（図１１Ｂ）。
【０２６２】
要約すると、この実施例における実験は、ＡＰＸ００５が、ＣＤ４０を結合するヒト化ＩｇＧ１抗体であることを証明した。ＡＰＸ００５は、９．６×１０−１０ＭのＫｄでＣＤ４０に特異的に結合し、ＣＤ４０へのＣＤ４０Ｌ結合を遮断する。これは、ＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ相互作用を強化するＳＧＮ４０抗ＣＤ４０抗体とは対照的である。これは、これらの２つの抗体が異なるエピトープに結合することを示唆している。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、ＡＰＸ００５は、ＣＤ４０陽性リンパ腫細胞（ＲａｍｏｓおよびＤａｕｄｉ）に対する強力なＡＤＣＣ活性、ならびに架橋すると腫瘍細胞（Ｒａｍｏｓ）増殖を直接阻害する能力を示した。ＡＰＸ００５はまた、樹状細胞の成熟を刺激して、細胞免疫応答を強化した。加えて、ＡＰＸ００５は、サルＣＤ４０と交差反応することが証明された。
【０２６３】
実施例３：ＡＰＸ００５ヒト化抗ＣＤ４０抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ特性付け
非常に多くのｉｎ  ｖｉｖｏ実験を行って、ＡＰＸ００５ヒト化抗体をさらに特性付けした。
【０２６４】
Ｒａｍｏｓモデルにおける腫瘍成長のＡＰＸ００５阻害
ヒトＢ細胞リンパ腫の異種移植モデルに対するＡＰＸ００５の効果を評価するために、雌ＢＡＬＢ／ｃ  ｎｕ／ｎｕマウス６〜８週齢を腫瘍細胞接種（ｉｎｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ）に使用した。１×１０７腫瘍細胞／マウスの背側・側腹部への皮下接種によって異種移植片を定着させた。腫瘍が約１００ｍｍ３（５０〜２００ｍｍ３）の平均体積に達したら、マウスを無作為に群に割り当てた。第１３日に開始して３ｍｇ／ｋｇの抗体を腹腔内投与した（図１２参照）。週３回、合計９用量の投薬を施した（１群あたり８匹のマウス）。Ｖｅｒｎｉｅｒスケールキャリパーを使用して、腫瘍の垂直寸法を測定した。次の式を用いて腫瘍体積を計算した：体積＝（長さ×幅２）／２。図１２Ａに示すように、ＡＰＸ００５は、強力な持続性の抗腫瘍活性を明示した。ヒトＩｇＧ濃度を測定することによりｉｎ  ｖｉｖｏ薬物レベルを判定するために、最終投薬の２日後の第３４日に血清を採取した（図１２Ｂ参照）。ＡＰＸ００５によって媒介される抗腫瘍効力は、ＳＧＮ−４０のものより大きく、投薬期間後、長く持続された。１点ＰＫ分析は、ＡＰＸ００５の優れた抗腫瘍活性がＰＫの差に起因しないことを示した。
【０２６５】
リツキシマブで前処置したリツキシマブ耐性腫瘍のＡＰＸ００５阻害
この実験の目的は、リツキシマブで前処置したリツキシマブ耐性Ｂ細胞リンパ腫に対するＡＰＸ００５の効果を評価することであった。定着したＲａｍｏｓ腫瘍を保有するヌードマウスを、先ず、３ｍｇ／ｋｇのリツキシマブで５用量にわたって処置した。腫瘍成長は、部分的にリツキシマブによって阻害された（図１３Ａ）。これらの腫瘍が約７００ｍｍ３のサイズに達したら、それらマウスを無作為に４群に割り当て（１群あたり７匹のマウス）、ＡＰＸ００５、リツキシマブ、ＳＧＮ４０アナログ  ３ｍｇ／ｋｇまたは食塩水対照を用いて３週間、腹腔内経路で再処置した（図１３Ｂ）。図１３に示すように、リツキシマブ前処置腫瘍は、リツキシマブ再処置に応答することができなかった。これは、これらの腫瘍がリツキシマブ耐性であることを示唆している（図１３Ｂ）。ＡＰＸ００５は、リツキシマブ耐性腫瘍の成長を阻害する能力を呈示した。
【０２６６】
Ｒａｊｉモデルにおける腫瘍成長のＡＰＸ００５阻害
この実験の目的は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＡＰＸ００５の用量と効力の関係を判定することであった。定着したＣＤ４０陽性Ｒａｊｉ腫瘍を保有するヌードマウスを、第１５日に開始してＡＰＸ００５で処置した。０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇにわたるＡＰＸ００５の用量を３回／週で２週間、腹腔内投与した（１群あたり８匹のマウス）（図１４参照）。食塩水を対照処置として使用した。各投薬日に腫瘍体積を測定した。最終投薬の３日後に各群におけるＡＰＸ００５の血清レベルも測定して、そのｉｎ  ｖｉｖｏ効力と循環におけるＡＰＸ００５のレベルとの相関関係を判定した。明確な用量依存性抗腫瘍活性が観察された（図１４参照）。第２９から３３日における対照群と用量レベル≧１ｍｇ／ｋｇでの抗体処置群の間の腫瘍体積の差は有意であった（Ｐ≦０．０５）。最小有効用量は、１ｍｇ／ｋｇと判定され、これは、第３６日における０．４９μｇ／ｍＬの中央値血清濃度に対応した。３、５および１０ｍｇ／ｋｇ用量群間の腫瘍体積の差は、統計学的に有意でなかった。したがって、最大抗腫瘍活性は、中央値血清濃度≧１．６μｇ／ｍＬでの用量≧３ｍｇ／ｋｇで達成された。
【０２６７】
ＡＰＸ００５によるヒトＭＭ  ＩＭ−９モデルにおける腫瘍成長の阻害
ヒト多発性骨髄腫モデルにおけるＡＰＸ００５の抗腫瘍活性を評価するために、定着したＣＤ４０陽性多発性骨髄腫ＩＭ−９腫瘍を保有するヌードマウスを、第１５日で開始してＡＰＸ００５またはＳＧＮ４０で腹腔内処置した。ＡＰＸ００５を３ｍｇ／ｋｇ、３回／週で３週間にわたって与えた（１群あたり５匹のマウス）。各投薬日に腫瘍体積を測定した。
【０２６８】
ＡＰＸ００５は、ＩＭ−９異種移植モデルにおいてヒト多発性骨髄腫に対して強力な抗腫瘍活性を明示した（図１５参照）。ＡＰＸ００５によって媒介された抗腫瘍効力は、ＳＧＮ−４０のものより有意に大きかった（Ｐ＜０．０５）。
【０２６９】
ＳＧＮ−４０およびリツキシマブと比較してのＡＰＸ００５によるＲａｍｏｓモデルにおける腫瘍成長の阻害
この実験の目的は、ヒトＢ細胞リンパ腫Ｒａｍｏｓ異種移植モデルにおけるＡＰＸ００５、リツキシマブおよびＳＧＮ−４０の抗腫瘍活性を比較することであった。雌ＳＣＩＤ
Ｃ．Ｂ  −１７マウスの背側・側腹部へのＲａｍｏｓ細胞の皮下接種により、異種移植片を定着させた。腫瘍が約２００〜３００ｍｍ３の平均体積に達したら、マウスを無作為に６群に割り当てた。図１７に示した通りの用量で抗体を腹腔内投与した。週３回、合計９用量の投薬を施した（１群あたり１０匹のマウス）。Ｖｅｒｎｉｅｒスケールキャリパーを使用して、腫瘍の垂直寸法を測定した。次の式を用いて腫瘍体積を計算した：体積＝（長さ×幅２）／２。マウスの生存期間も判定し、記録した。
【０２７０】
ＡＰＸ００５は、用量依存性抗腫瘍活性を明示した。高用量のＡＰＸ００５（１０ｍｇ／ｋｇ）での処置は、完全腫瘍退縮を生じさせる結果となったが、リツキシマブは、同じ用量（１０ｍｇ／ｋｇ）で腫瘍成長を遅延させたに過ぎなかった。これは、このモデルではＡＰＸ００５のほうがリツキシマブより効能があることを示唆している。ＡＰＸ００５はまた、ＳＧＮ−４０より強力である（図１７Ａ）。ＡＰＸ００５は、腫瘍成長を阻害するばかりでなく、腫瘍保有マウスの生存期間も向上させた（図１７Ｂ）。
【０２７１】
リツキシマブ耐性ヒトＮａｍａｌｗａリンパ腫異種移植モデルにおける腫瘍成長の阻害
この実験の目的は、リツキシマブ耐性ヒトＮａｍａｌｗａリンパ腫モデルにおけるＡＰＸ００５、リツキシマブおよびＳＧＮ−４０の抗腫瘍活性を比較することであった。雌ＳＣＩＤ  Ｃ．Ｂ  −１７マウスの背側・側腹部へのＮａｍａｌｗａ細胞の皮下接種により、異種移植片を定着させた。腫瘍が約２００〜３００ｍｍ３の平均体積に達したら、マウスを無作為に６群に割り当てた。図１８に示した通りの用量で抗体を腹腔内投与した。週３回、合計９用量の投薬を施した（１群あたり１０匹のマウス）。Ｖｅｒｎｉｅｒスケールキャリパーを使用して、腫瘍の垂直寸法を測定した。次の式を用いて腫瘍体積を計算した：体積＝（長さ×幅２）／２。マウスの生存期間も判定し、記録した。
【０２７２】
ＡＰＸ００５は、リツキシマブ耐性Ｎａｍａｌｗａリンパ腫モデルにおいて強力な抗腫瘍活性を明示した（図１８Ａ）。ＡＰＸ００５は、リツキシマブ耐性腫瘍保有マウスの生存期間も向上させた（図１８Ｂ）。
【０２７３】
要約すると、この実施例における実験は、ＡＰＸ００５の効力が多数の異種移植腫瘍モデルにおいて検査されたことを示した。ＡＰＸ００５は、Ｒａｍｏｓモデルにおいて腫瘍成長を著しく阻害した。興味深いことに、その治療効果は、投薬期間をはるかに越えて持続された。ＡＰＸ００５処置は、リツキシマブで前処置したリツキシマブ耐性腫瘍を阻害する結果となった。用量範囲を見つける研究をＲａｊｉモデルにおいて行い、最小有効用量が１ｍｇ／ｋｇと判定されることが判明し、最大抗腫瘍活性は、用量≧３ｍｇ／ｋｇで観察された。Ｂ細胞リンパ腫に加えて、ＡＰＸ００５は、ヒト多発性骨髄腫ＩＭ−９モデルにおいても有意で強力な抗腫瘍活性を呈示した。
【０２７４】
したがって、上の実施例は、ＡＰＸ００５を使用して、ＮＨＬ、ＣＬＬ、多発性骨髄腫、およびＣＤ４０標的を発現する一定の固形腫瘍を有する患者の処置を向上させることができることを実証するものである。ＣＤ４０に結合すると、ＡＰＸ００５は、細胞傷害性細胞を動員してＡＤＣＣにより腫瘍細胞を死なせる。ＡＰＸ００５はまた、そのアゴニスト活性により、腫瘍細胞増殖を直接阻害することおよびＡＰＣを活性化することができる。ｉｎ  ｖｉｖｏでは、ＡＰＸ００５は、多数のＣＤ４０発現性ヒト腫瘍異種移植片の成長を著しく阻害し、持続性の抗腫瘍効果を示した。ＡＰＸ００５は、ヒト多発性骨髄腫、およびリツキシマブで前処置したリツキシマブ耐性の腫瘍を阻害することも可能である。
【０２７５】
（実施例４：ＡＰＸ００５  Ｓ２６７Ｅ  ＦＣ変異体は、ＦｃγＲＩＩＢに対する結合およびＣＤ４０アゴニスト活性を増大させる）
ＦＣγレセプターに対する結合を増大させ、そしてＡＰＸ００５抗体のアゴニスト活性を増大させる試みにおいて、ＡＰＸ００５  Ｆｃの２６７位のセリン（Ｓ）（ＩｇＧ１、ＥＵ番号付け）をグルタミン酸（Ｅ）へと変異させて、ＡＰＸ００５  Ｓ２６７Ｅ変異体を生成した。ＡＰＸ００５の重鎖Ｆｃ領域に位置する２６７位のＡＧＣ（Ｓ）からＧＡＧ（Ｅ）への変異を配列決定によって確認した。改変されたＦｃ領域配列を含むＩｇＧ１重鎖定常領域を配列番号１９５に提供する（この配列は、ＩｇＧ１のＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３を含む）。
【０２７６】
ＡＰＸ００５  Ｓ２７６Ｅ変異体のＣＤ４０結合能を評価するために、ＡＰＸ００５  Ｓ２６７Ｅの重鎖プラスミドおよび軽鎖プラスミドを、形質転換された細菌から精製し、そして２９３−６Ｅ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの４日後、抗体を含む培養上清を収集し、そしてＥＬＩＳＡ（ＣＤ４０−Ｆｃタンパク質でコーティングしたＥＬＩＳＡプレート）を用いてＣＤ４０に対する結合について試験した。上記ＥＬＩＳＡのデータは、ＡＰＸ００５  Ｓ２６７Ｅ変異体が、ＡＰＸ００５と類似したＣＤ４０結合活性を有することを示した（図１９を参照のこと）。
【０２７７】
別の実験では、上記ＣＤ４０抗体のネイティブＣＤ４０タンパク質への結合能力を、生きたＲａｍｏｓ細胞を用いたＦＡＣＳ分析によって決定した。Ｒａｍｏｓ細胞を収集し、そして１．５ｍｌのブロッキング緩衝液（０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳ）で３０分間にわたってブロッキングした。種々の濃度の抗体を細胞に添加し、そして１時間にわたってインキュベートした。洗浄後、５０μｌのヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）  ＰＥ抗体（ブロッキング溶液中、１：１０００希釈）を添加し、そして３０分間にわたってインキュベートした。次いで、細胞をPBSで洗浄し、そして１ｍ  ＰＢＳで再懸濁し、そしてＦＡＣＳによっ
て分析した。試験した抗体は、１９−２１ウサギ抗ＣＤ４０アゴニスト抗体である、Ｓｅａｔｔｌｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓによって開発されたＳＧＮ−４０およびＰｆｉｚｅｒからのＣＰ８７０８９３であった。図２０に示すように、ＡＰＸ００５およびＡＰＸ００５  Ｓ２６７Ｅ変異体は、ＳＧＮ４０と類似の、しかし、ＣＰ８７０８９３よりも６倍高い親和性の、ＣＤ４０結合親和性を示した。
【０２７８】
実験を行って、Ｂ細胞活性化アッセイにおいて、ＡＰＸ００５、ＡＰＸ００５  Ｓ２６７Ｅ変異体および他の抗ＣＤ４０抗体のＣＤ４０アゴニスト活性を比較した。特に、ｉｎ
ｖｉｔｒｏでの種々の抗ＣＤ４０抗体での処理後に、ヒトＢ細胞に対する、Ｂ細胞活性化マーカーであるＣＤ８６のアップレギュレーションを測定することによってＣＤ４０アゴニスト活性を試験した。新たなヒトＢ細胞を、ネガティブ選択法（全細胞）を用いて末梢血からＢ細胞を単離することによって得た。上記Ｂ細胞を、１０、３．３３、１．１１、０．３７、０．１２、０．０４、０．０１および０．００４５μｇ／ｍｌの異なるヒト抗体で４８時間にわたって処理した。次いで上記細胞を収集し、そしてフローサイトメトリーによって、生きたＢ細胞上のヒトＣＤ８６発現について分析した。１９−２１、ＳＧＮ−４０およびＣＰ８７０８９３（上記の説明を参照のこと）を試験した。図２１に示すように、ＡＰＸ００５  Ｓ２６７Ｅ変異体は、ＡＰＸ００５と比較して有意に増大した力価（ｐｏｔｅｎｃｙ）（ＥＣ５０）および効力（ｅｆｆｉｃａｃｙ）（ＥＣ１００）を実証した。本アッセイにおいて試験した抗ＣＤ４０抗体のうちでＡＰＸ００５  Ｓ２６７Ｅが最も強力なＣＤ４０アゴニスト抗体であった。
【０２７９】
さらなる実験を行って、ＡＰＸ００５およびＡＰＸ００５  Ｓ２６７Ｅ変異体のＡＤＣＣ活性を評価した。特に、ＣＤ４０抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＡＤＣＣ効果媒介能力を、標的細胞としてＤａｕｄｉ細胞を用い、エフェクター細胞としてヒトＰＢＭＣを用いてアッセイした。標識された標的細胞を、丸底９６ウェルプレートの１ウェルあたり５×１０３細胞において三連でプレーティングした。漸増濃度の抗体（完全培地中、１ウェルあたり５０μｌ）を上記標識した細胞に添加した。最終抗体濃度は、０〜１０μｇ／ｍｌ（完全培地中）の範囲に及んだ。上記細胞を、上記抗体で３７℃において３０分にわたって処理した。完全培地中のエフェクター細胞（ＰＢＭＣ）を標的細胞へと播種した（エフェクター細胞／標的細胞比＝４０／１）。エフェクター細胞の最終体積は１００μｌ／ウェルである。３７℃のインキュベーター中での４時間のインキュベーション後、各ウェル由来の１００μｌの培養上清を９６ウェルブラックビュープレートに移し、そしてＲＦＵを４８５ｅｘ／５３５ｅｍで読み取った。特異的溶解（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｌｙｓｉｓ）を式：特異的溶解＝［（試験放出−自然放出）／（最大放出−自然放出）]×１００に従っ
て計算した。リツキサンを陽性対照として用いた。図２２に示すように、上記ＡＰＸ００５  Ｓ２６７Ｅ変異体は、ＡＰＸ００５野生型と比較してわずかに増大したＡＤＣＣ活性を示した。
【０２８０】
実施例５
ＡＰＸ００５のエピトープの特徴付け
本実施例は、ヒト化抗ＣＤ４０抗体であるＡＰＸ００５のエピトープの特徴付けを記載する。下記でさらに詳細に記載するとおり、合計５８４１種の直鎖状ペプチドおよび足場上に化学的に連結したペプチド（ＣＬＩＰＳ）を合成し、そして結合について分析した。優勢な結合領域が、９２ＴＳＥＡＣＥＳＣＶＬＨＲＳＣＳＰ１０７（配列番号１９６）および１２５ＰＣＰＶＧＦＦＳＮＶＳＳＡＦＥＫＣＨＰＷ１４４（配列番号１９７）と同定された。同定された結合残基のうち、Ｔ９２、Ｅ９７および１００ＶＬ１０１は、ＣＤ４０とＣＤ４０Ｌトリマーとの間の接触残基であることが公知である。具体的には、Ｅ９７は、リガンドへのＣＤ４０の結合に重要な残基と考えられている。
【０２８１】
ＣＤ４０タンパク質配列を配列番号１９８に示し、そしてこれは単結晶構造３ＱＤ６として直接入手可能である。ＣＤ４０Ｌトリマーに結合すると推定されているＣＤ４０の残基は、Ｅ７４、Ｙ８２、Ｄ８４、Ｎ８６およびＥ１１７である（例えば、Ｂａｊｏｒａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３４：９８８４−９８９２を参照のこと。３ＱＤ６構造における配列番号付けは、本明細書中で言及した数字より２０残基大きいことに留意されたい。したがって、推定される重要な結合残基は、Ｅ５４、Ｙ６２、Ｄ６４、Ｎ６６およびＥ９７
である。
【０２８２】
ペプチドの合成およびスクリーニング手順
【０２８３】
上記標的分子の不連続エピトープを再構築するために、構造化されたペプチドのライブラリーを合成した。Ｐｅｐｓｃａｎの専有の足場上に化学的に連結したペプチド（ＣＬＩＰＳ）の技術（Ｐｅｐｓｃａｎ  Ｐｒｅｓｔｏ，  Ｌｅｌｙｓｔａｄ  Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）（例えば、Ｔｉｍｍｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）．Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．  ２０：２８３−９９；Ｓｌｏｏｔｓｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  １：  ８７−９６を参照のこと）を用いて、これを行った。ＣＬＩＰＳ技術は、ペプチドを単一ループ、二重ループ、三重ループ、シート様フォールディング、ヘリックス様フォールディングおよびそれらの組み合わせという構造にする能力を提供する。ＣＬＩＰＳテンプレートを、システイン残基へと結合させる。この実験に関して、上記ペプチドの複数のシステインの側鎖を、１つまたは２つのＣＬＩＰＳテンプレートへと結合させた。例えば、Ｔ２  ＣＬＩＰＳテンプレートである１，３−ビス（ブロモメチル）ベンゼンの０．５ｍＭ溶液を、重炭酸アンモニウム（２０ｍＭ、ｐＨ７．９）／アセトニトリル（１：１（ｖ／ｖ））中に溶解した。この溶液を、上記一連のペプチドに添加した。上記ＣＬＩＰＳテンプレートは、上記一連のペプチド（３μｌウェルを有する４５５ウェルプレート）の固相に結合したペプチド中に存在する２つのシステインの側鎖に結合する。上記一連のペプチドを、溶液中に完全に漬かった状態で、上記溶液中で３０〜６０分間にわたって穏やかに振盪した。最後に、上記一連のペプチドを、過剰のＨ２Ｏで徹底的に洗浄し、そしてＰＢＳ（ｐＨ７．２）中１パーセントＳＤＳ／０．１パーセントβ−メルカプトエタノールを含む崩壊緩衝液中で、７０℃において３０分間超音波処理し、その後、Ｈ２Ｏ中でさらに４５分間超音波処理した。Ｔ３  ＣＬＩＰＳ保有ペプチドを、３つのシステインを含むこと以外は類似の方法で作製した。
【０２８４】
上記合成したペプチドのそれぞれに対する抗体の結合を、ＰＥＰＳＣＡＮベースのＥＬＩＳＡにおいて試験した。上記一連のペプチドを、一次抗体溶液とともにインキュベートした（４℃において一晩）。洗浄後、上記一連のペプチドを、１／１０００希釈の抗体ペルオキシダーゼ結合体（ＳＢＡ、カタログ番号２０１０−０５）とともに、２５℃で１時間にわたってインキュベートした。洗浄後、ペルオキシダーゼ基質である２，２’−アジノ−ジ−３−エチルベンゾチアゾリンスルホネート（２，２’−ａｚｉｎｏ−ｄｉ−３−ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ  ｓｕｌｆｏｎａｔｅ；ＡＢＴＳ）および２μｌ／ｍｌの３パーセントＨ２Ｏ２を添加した。１時間後、発色を測定した。発色を、電荷結合素子（ＣＣＤ）−カメラおよび画像処理システムを用いて定量した。
【０２８５】
データ処理
上記ＣＣＤカメラから得られる値は、標準的な９６ウェルプレートＥＬＩＳＡ−リーダーと同様に０〜３０００ｍＡＵの範囲に及ぶ。上記結果を定量し、そしてＰｅｐｌａｂデータベースに保存した。結合値を、分析用に抽出した。時折、ウェルは気泡を含んでおり、偽陽性の値を生じた。カードを手動で検査し、気泡によって引き起こされた任意の値を０とスコア付けした。
【０２８６】
エピトープの決定を、２０マーの重複ペプチドと上記タンパク質の１２個の特定領域の単一残基変異誘発との組み合わせにより行った。これらの１２領域を、ＣＤ４０の公知の３次元構造および上記タンパク質中の公開されたシステイン結合に基づいて選んだ。合計５８４１個の化学合成ＣＬＩＰＳペプチドを合成した。
【０２８７】
重複する２０マーペプチドの評価は、２つの別個の結合領域（９２ＴＳＥＡＣＥＳＣＶＬＨＲＳＣＳＰ１０７（配列番号１９６）および１２５ＰＣＰＶＧＦＦＳＮＶＳＳＡＦＥＫＣＨＰＷ１４４（配列番号１９７））を示した。２つのアラニン置換を加えた重複配列の評価により、類似の結果が得られた。
【０２８８】
選んだ１２個の候補エピトープ「ホットスポット」は各々、何も変異が行われていない少なくとも１０個の同一の「対照ペプチド」を含む。１２個の変異誘発データセットの各々についてのこれらの対照配列の評価により、２個の類似する別個の結合領域（８４ＴＣＥＥＧＷＨＣＴＳＥＡＣＥＳＣＶＬＨ１０２（配列番号１９９）および１２５ＰＣＰＶＧＦＦＳＮＶＳＳＡＦＥＫＣＨＰＷ１４４（配列番号１９７））が同定された。得られたＥＬＩＳＡの読み出し情報は、統計的に非常に有意である（ｐ＜２ｅ−１０）。９２ＴＳＥＡＣＥＳＣＶＬＨＲＳＣＳＰ１０７（配列番号１９６）と８４ＴＣＥＥＧＷＨＣＴＳＥＡＣＥＳＣＶＬＨ１０２（配列番号１９９）の重複を考慮すると、残基９２〜１０２（配列番号２０２）はおそらく、結合に最も関連する残基である。不連続エピトープを同定するために３個の異なる配列領域を組み合わせたＣＬＩＰＳマトリックスセットからのデータにより、さらなる洞察は得られなかった。
【０２８９】
２個の変異誘発データセットの詳細分析（８４ＴＣＥＥＧＷＨＣＴＳＥＡＣＥＳＣＶＬＨ１０２（配列番号１９９）および１２５ＰＣＰＶＧＦＦＳＮＶＳＳＡＦＥＫＣＨＰＷ１４４（配列番号１９７））により、Ｗ１４４は例外の可能性があるが、重要な残基は何も示されなかった。しかし、残基８４〜１０２の変異誘発をまた、ＣＬＩＰＳを含まない直鎖状ペプチド（配列８４ＴＣＥＥＧＷＨＳＴＳＥＡＳＥＳＣＶＬＨ１０２（配列番号２００）、下線を付した２個の残基を、ＣからＳに置き換えている）について行った。この直鎖状にされたペプチドにおける、ＡＰＸ００５による結合は、ほぼ完全に消失した。このことは、この抗体の結合が、これらの２個のシステインに特異的に依存するか、またはＣＬＩＰＳアセンブリによってこのペプチドが置かれた特定の立体配座状態に依存することを示す。
【０２９０】
ＣＤ４０の結晶構造上への領域９２ＴＳＥＡＣＥＳＣＶＬＨＲＳＣＳＰ１０７（配列番号１９６）および１２５ＰＣＰＶＧＦＦＳＮＶＳＳＡＦＥＫＣＨＰＷ１４４（配列番号１９７）の可視化は、アミノ酸９２〜１０７がＣＤ４０Ｌトリマー（９７ＥＳＣ１００は上記リガンドの４Ａ内にある）に面するループ状構造を形成することを示した（図２３を参照のこと）。残基１２５〜１４４は、構造３ＱＤ６において解明されていないが、システイン結合についての利用可能なデータに基づけば、残基９２〜１０７の極めて近位に存在すると予想される。可視化の目的のために、残基１２２〜１２５（配列番号２０１）を図２３に示す。
【０２９１】
したがって、本実験は、Ｐｅｐｓｃａｎ  Ｐｒｅｓｔｏ  ＢＶによって実施された直鎖状ペプチドおよびＣＬＩＰＳペプチドを用いた、ＣＤ４０に対するヒト化抗体ＡＰＸ００５の結合のマッピングを記載する。このマッピングにより、２個の特異的結合領域が同定された。これらは、９２ＴＳＥＡＣＥＳＣＶＬＨＲＳＣＳＰ１０７（配列番号１９６）および１２５ＰＣＰＶＧＦＦＳＮＶＳＳＡＦＥＫＣＨＰＷ１４４（配列番号１９７）である。領域９２〜１０７内では、残基９２ＴＳＥＡＣＥＳＣＶＬＨ１０２（配列番号２０２）が、おそらく、結合に最も関連する残基である。同定された結合残基のうち、Ｔ９２、Ｅ９７および１００ＶＬ１０１は、ＣＤ４０とＣＤ４０Ｌトリマーとの間の接触残基であることが公知である。具体的には、Ｅ９７は、リガンドへのＣＤ４０の結合に重要な残基と考えられている。
【０２９２】
上で説明した様々な実施形態を組み合わせて、さらなる実施形態を提供することができる。本明細書において言及するおよび／または出願データシートに収載する米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許刊行物のすべては、それら全体が参照により本明細書に援用されている。前記実施形態の態様を修飾して、必要に応じて前記様々な特許、出願および刊行物の内容を利用して、なおさらなる実施形態を提供することができる。
【０２９３】
上で詳述した説明にかんがみて、これらおよび他の変更を前記実施形態に加えることができる。一般に、後続の請求項において用いる用語は、本明細書および本請求項に開示する特定の実施形態に本請求項を限定するものと解釈してはならず、かかる請求項が権利を有する等価物の全範囲と共に、すべての可能な実施形態を含むと解釈すべきである。したがって、請求項は、実施形態の開示によって限定されない。
【図１Ａ】
2020195388.tif 000003
【図１Ｂ】
2020195388.tif 000004
【図１Ｃ】
2020195388.tif 000005
【図１Ｄ】
2020195388.tif 000006
【図２】
2020195388.tif 000007
【図３】
2020195388.tif 000008
【図４Ａ】
2020195388.tif 000009
【図４Ｂ】
2020195388.tif 000010
【図５】
2020195388.tif 000011
【図６】
2020195388.tif 000012
【図７】
2020195388.tif 000013
【図８Ａ】
2020195388.tif 000014
【図８Ｂ】
2020195388.tif 000015
【図９Ａ】
2020195388.tif 000016
【図９Ｂ】
2020195388.tif 000017
【図１０】
2020195388.tif 000018
【図１１Ａ】
2020195388.tif 000019
【図１１Ｂ】
2020195388.tif 000020
【図１２Ａ】
2020195388.tif 000021
【図１２Ｂ】
2020195388.tif 000022
【図１３Ａ】
2020195388.tif 000023
【図１３Ｂ】
2020195388.tif 000024
【図１４】
2020195388.tif 000025
【図１５】
2020195388.tif 000026
【図１６Ａ】
2020195388.tif 000027
【図１６Ｂ】
2020195388.tif 000028
【図１６Ｃ】
2020195388.tif 000029
【図１６Ｄ】
2020195388.tif 000030
【図１６Ｅ】
2020195388.tif 000031
【図１６Ｆ】
2020195388.tif 000032
【図１６Ｇ】
2020195388.tif 000033
【図１６Ｈ】
2020195388.tif 000034
【図１６Ｉ】
2020195388.tif 000035
【図１６Ｊ】
2020195388.tif 000036
【図１６Ｋ】
2020195388.tif 000037
【図１６Ｌ】
2020195388.tif 000038
【図１７Ａ】
2020195388.tif 000039
【図１７Ｂ】
2020195388.tif 000040
【図１８Ａ】
2020195388.tif 000041
【図１８Ｂ】
2020195388.tif 000042
【図１９】
2020195388.tif 000043
【図２０】
2020195388.tif 000044
【図２１】
2020195388.tif 000045
【図２２】
2020195388.tif 000046
【図２３Ａ】
2020195388.tif 000047
【図２３Ｂ】
2020195388.tif 000048
【配列表】
2020195388000001.app
【外国語明細書】
2020195388000001.pdf