(57)【要約】      （修正有）【課題】血液脳関門受容体の一価の結合エンティティーに連結するモノクローナル抗体５Ｃ１および関連抗体を含む、血液脳関門シャトルを生産する方法の提供。【解決手段】血液脳関門シャトルを生産する方法であって、細胞が血液脳関門シャトルを分泌するように、血液脳関門シャトルをコードする核酸で形質転換した細胞を培養し、分泌された血液脳関門シャトルを精製することを含む方法。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液脳関門シャトルであって、
（ａ）少なくとも実質的に５Ｃ１抗体由来のＣＤＲを有する抗体を含む脳エフェクターエンティティー、ここで、５Ｃ１は配列番号９を含むアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号２４を含むアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を特徴とするマウス抗体である；および
（ｂ）血液脳関門受容体に結合する一価の結合エンティティー；
を含み、前記脳エフェクターエンティティーが前記一価の結合エンティティーと連結されている、血液脳関門シャトル。
【請求項２】
脳エフェクターエンティティー抗体が、配列番号１０、１１、および１２のアミノ酸配列をそれぞれ有する３つの重鎖ＣＤＲと、配列番号２５、２６、および２７のアミノ酸配列をそれぞれ有する３つの軽鎖ＣＤＲとを含む、請求項１に記載の血液脳関門シャトル。
【請求項３】
血液脳関門シャトルであって、
（ａ）ヒトα−シヌクレインに結合する抗体を含む脳エフェクターエンティティー、ここで、全長ヒトα−シヌクレインの残基１１８−１２６のアラニンスキャニング変異導入法は、残基１２０、１２１、および１２２のそれぞれが残基１２３および１２４のそれぞれよりも結合に寄与し、残基１２３および１２４のそれぞれが残基１１８、１１９、１２５および１２６のそれぞれよりも結合に寄与していることを示す；および
（ｂ）血液脳関門受容体に結合する一価の結合エンティティー；
を含み、前記脳エフェクターエンティティーが前記一価の結合エンティティーと連結されている、血液脳関門シャトル。
【請求項４】
脳エフェクターエンティティー抗体が、本質的に配列番号１の残基１２０−１２２からなり、かつ配列番号１の残基１１８−１１９を除くエピトープでヒトα−シヌクレインに結合する、請求項１−３のいずれか一項に記載の血液脳関門シャトル。
【請求項５】
脳エフェクターエンティティー抗体が、配列番号１の残基１２０−１２４からなるエピトープでヒトα−シヌクレインに結合する、請求項１−３のいずれか一項に記載の血液脳関門シャトル。
【請求項６】
血液脳関門シャトルであって、
（ａ）モノクローナル抗体５Ｃ１の、Ｋａｂａｔにより規定される３つの軽鎖ＣＤＲおよびＫａｂａｔにより規定される３つの重鎖ＣＤＲを含む抗体を含む脳エフェクターエンティティー、ここで、５Ｃ１は配列番号９を含むアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号２４を含むアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を特徴とするマウス抗体である；および
（ｂ）血液脳関門受容体に結合する一価の結合エンティティー；
を含み、前記脳エフェクターエンティティーが前記一価の結合エンティティーと連結されている、血液脳関門シャトル。
【請求項７】
脳エフェクターエンティティー抗体が、キメラ抗体、ベニヤ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体である、請求項１−６のいずれか一項に記載の血液脳関門シャトル。
【請求項８】
脳エフェクターエンティティー抗体がヒト化抗体である、請求項１−７のいずれか一項に記載の血液脳関門シャトル。
【請求項９】
脳エフェクターエンティティー抗体がキメラ抗体である、請求項１−７のいずれか一項に記載の血液脳関門シャトル。
【請求項１０】
脳エフェクターエンティティー抗体がベニヤ抗体である、請求項１−７のいずれか一項に記載の血液脳関門シャトル。
【請求項１１】
脳エフェクターエンティティー抗体のアイソタイプがヒトＩｇＧ１である、請求項１−１０のいずれか一項に記載の血液脳関門シャトル。
【請求項１２】
脳エフェクターエンティティー抗体が、定常領域に少なくとも１つ変異を有する、請求項１−１１のいずれか一項に記載の血液脳関門シャトル。
【請求項１３】
変異が、定常領域による補体結合または活性化を減少させる、請求項１２に記載の血液脳関門シャトル。
【請求項１４】
脳エフェクターエンティティー抗体が、ＥＵナンバリングの位置２４１、２６４、２６５、２７０、２９６、２９７、３２２、３２９、および３３１のうち１つ以上に変異を有する、請求項１３に記載の血液脳関門シャトル。
【請求項１５】
脳エフェクターエンティティー抗体が位置３１８、３２０、および３２２にアラニンを有する、請求項１４に記載の血液脳関門シャトル。
【請求項１６】
脳エフェクターエンティティー抗体が、ＥＵナンバリングの位置２３４、２３５、２３７、および３２９のうち１つ以上に変異を有する、請求項１３に記載の血液脳関門シャトル。
【請求項１７】
脳エフェクターエンティティー抗体が、位置２３４、２３５、および２３７のうち１つ以上にアラニンを有する、請求項１６に記載の血液脳関門シャトル。
【請求項１８】
脳エフェクターエンティティー抗体が、位置２３４および２３５にアラニンを有し、位置３２９にグリシンを有する、請求項１６に記載の血液脳関門シャトル。
【請求項１９】
脳エフェクターエンティティー抗体がヒトＩｇＧ２またはＩｇＧ４のアイソタイプを有する、請求項１−１０のいずれか一項に記載の血液脳関門シャトル。
【請求項２０】
脳エフェクターエンティティー抗体が、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、またはｓｃＦｖである、請求項１−１１のいずれか一項に記載の血液脳関門シャトル。
【請求項２１】
血液脳関門シャトルであって、
（ａ）Ｈ４（配列番号１７）に少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有する成熟重鎖可変領域およびＬ３（配列番号３１）に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する成熟軽鎖可変領域を含む抗体を含む、脳エフェクターエンティティーであって、前記抗体がヒトα−シヌクレインに特異的に結合する、脳エフェクターエンティティー；および
（ｂ）血液脳関門受容体に結合する一価の結合エンティティー；
を含み、前記脳エフェクターエンティティーが前記一価の結合エンティティーと連結されている、血液脳関門シャトル。
【請求項２２】
脳エフェクターエンティティー抗体が、配列番号９の３つのＫａｂａｔ ＣＤＲと、配列番号２４の３つのＫａｂａｔ ＣＤＲとを含む、請求項２１に記載の血液脳関門シャトル。
【請求項２３】
脳エフェクターエンティティー抗体の位置Ｈ１１、Ｈ２７、Ｈ３０、Ｈ４８、およびＨ７３の少なくとも１つが、Ｌ、Ｙ、Ｔ、Ｉ、およびＫによりそれぞれ占められ、および脳エフェクターエンティティー抗体の位置Ｌ１２およびＬ１４の少なくとも１つが、Ｓにより占められている、請求項２２に記載の血液脳関門シャトル。
【請求項２４】
脳エフェクターエンティティー抗体の位置Ｈ１１、Ｈ２７、Ｈ３０、Ｈ４８、およびＨ７３が、それぞれＬ、Ｙ、Ｔ、Ｉ、およびＫにより占められ、脳エフェクターエンティティー抗体の位置Ｌ１２およびＬ１４が、Ｓにより占められている、請求項２３に記載の血液脳関門シャトル。
【請求項２５】
脳エフェクターエンティティー抗体の位置Ｈ６７、Ｈ６９、およびＨ９４の少なくとも１つが、Ａ、Ｌ、およびＳによりそれぞれ占められている、請求項２２−２４のいずれか一項に記載の血液脳関門シャトル。
【請求項２６】
脳エフェクターエンティティー抗体の位置Ｈ６７、Ｈ６９、およびＨ９４が、Ａ、Ｌ、およびＳによりそれぞれ占められている、請求項２５に記載の血液脳関門シャトル。
【請求項２７】
脳エフェクターエンティティー抗体の位置Ｈ９４がＳによって占められている、請求項２５の血液脳関門シャトル。
【請求項２８】
脳エフェクターエンティティー抗体の位置Ｌ２、Ｌ４９、およびＬ８７の少なくとも１つが、Ｖ、Ｎ、およびＦによりそれぞれ占められている、請求項２２−２４のいずれか一項に記載の血液脳関門シャトル。
【請求項２９】
脳エフェクターエンティティー抗体の位置Ｌ２、Ｌ４９、およびＬ８７がＶ、Ｎ、およびＦによりそれぞれ占められている、請求項２８に記載の血液脳関門シャトル。
【請求項３０】
脳エフェクターエンティティー抗体が、Ｈ４（配列番号１７）に少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有する成熟重鎖可変領域と、Ｌ３（配列番号３１）に少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有する成熟軽鎖可変領域とを含む、請求項２１−２９のいずれか一項に記載の血液脳関門シャトル。
【請求項３１】
脳エフェクターエンティティー抗体の成熟重鎖可変領域および成熟軽鎖可変領域のＣＤＲにおける、それぞれＨ４（配列番号１７）およびＬ３（配列番号３１）のＣＤＲとのいずれの違いも、位置Ｈ６０−Ｈ６５に存在する、請求項２１−３０のいずれか一項に記載の血液脳関門シャトル。
【請求項３２】
脳エフェクターエンティティー抗体の成熟重鎖可変領域が、Ｈ４と名付けられたアミノ酸配列（配列番号１７）を有し、脳エフェクターエンティティー抗体の成熟軽鎖可変領域がＬ３と名付けられたアミノ酸配列（配列番号３１）を有する、請求項２１に記載の血液脳関門シャトル。
【請求項３３】
脳エフェクターエンティティー抗体の成熟重鎖可変領域がＨ５と名付けられたアミノ酸配列（配列番号１８）を有し、脳エフェクターエンティティー抗体の成熟軽鎖可変領域がＬ３と名付けられたアミノ酸配列（配列番号３１）を有する、請求項２１に記載の血液脳関門シャトル。
【請求項３４】
脳エフェクターエンティティー抗体の成熟重鎖可変領域が重鎖定常領域と融合し、脳エフェクターエンティティー抗体の成熟軽鎖可変領域が軽鎖定常領域と融合する、請求項２１−３３のいずれか一項に記載の血液脳関門シャトル。
【請求項３５】
脳エフェクターエンティティー抗体の重鎖定常領域が、天然のヒト重鎖定常領域と比較してＦｃγ受容体への結合を減少させた、天然のヒト重鎖定常領域の変異体である、請求項３４に記載の血液脳関門シャトル。
【請求項３６】
脳エフェクターエンティティー抗体の重鎖定常領域のアイソタイプがＩｇＧ１である、請求項３４または３５に記載の血液脳関門シャトル。
【請求項３７】
脳エフェクターエンティティー抗体の成熟重鎖可変領域が、配列番号６６の配列を有する重鎖定常領域に融合し、および／または脳エフェクターエンティティー抗体の成熟軽鎖可変領域が、配列番号５２の配列を有する軽鎖定常領域に融合している、請求項３４に記載の血液脳関門シャトル。
【請求項３８】
脳エフェクターエンティティー抗体が、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、またはｓｃＦｖである、請求項２１−３３のいずれか一項に記載の血液脳関門シャトル。
【請求項３９】
一価の結合エンティティーが、血液脳関門受容体リガンド、抗体フラグメント、または他のポリペプチドを含む、請求項１−３８または１０５のいずれか一項に記載の血液脳関門シャトル。
【請求項４０】
一価の結合エンティティーが、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｓｃＦａｂ、ｓＦａｂ、またはＶＨＨである抗体フラグメントを含む、請求項３９に記載の血液脳関門シャトル。
【請求項４１】
抗体フラグメントが、ｓＦａｂである、請求項４０に記載の血液脳関門シャトル。
【請求項４２】
血液脳関門受容体が、トランスフェリン受容体、インスリン受容体、インスリン様成長因子受容体、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質８、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１、またはヘパリン結合性上皮細胞成長因子様成長因子である、請求項１−４１、または１０５のいずれか一項に記載の血液脳関門シャトル。
【請求項４３】
血液脳関門受容体がトランスフェリン受容体である、請求項４２に記載の血液脳関門シャトル。
【請求項４４】
一価の結合エンティティーが、トランスフェリン受容体に特異的に結合するｓＦａｂを含む、請求項１−４３または１０５のいずれか一項に記載の血液脳関門シャトル。
【請求項４５】
ｓＦａｂが、配列番号４３、配列番号４４、および／または配列番号４５内のエピトープに結合する、請求項４４に記載の血液脳関門シャトル。
【請求項４６】
脳エフェクターエンティティーが、第一のリンカーにより一価の結合エンティティーに連結されている、請求項１−４５または１０５のいずれか一項に記載の血液脳関門シャトル。
【請求項４７】
第一のリンカーがペプチドリンカーである、請求項４６に記載の血液脳関門シャトル。
【請求項４８】
ペプチドリンカーが、少なくとも２０のアミノ酸長を有する、請求項４７に記載の血液脳関門シャトル。
【請求項４９】
ペプチドリンカーが２５〜５０のアミノ酸長を有する、請求項４８に記載の血液脳関門シャトル。
【請求項５０】
ペプチドリンカーが、配列番号４１のアミノ酸配列を有する、請求項４８に記載の血液脳関門シャトル。
【請求項５１】
ペプチドリンカーが、配列番号４２のアミノ酸配列を有する、請求項４８に記載の血液脳関門シャトル。
【請求項５２】
ペプチドリンカーが、配列番号７３のアミノ酸配列を有する、請求項４７に記載の血液脳関門シャトル。
【請求項５３】
一価の結合エンティティーが、第一のリンカーにより、脳エフェクターエンティティー抗体の重鎖のＣ末端に連結されている、請求項４６−５２のいずれか一項に記載の血液脳関門シャトル。
【請求項５４】
一価の結合エンティティーがＣＨ２−ＣＨ３ Ｉｇエンティティーおよび血液脳関門受容体に特異的に結合するｓＦａｂを含み、前記ｓＦａｂが前記ＣＨ２−ＣＨ３ ＩｇエンティティーのＣ末端に連結されている、請求項１−５３または１０５のいずれか一項に記載の血液脳関門シャトル。
【請求項５５】
（ａ）一価の結合エンティティーが、ＣＨ２−ＣＨ３ Ｉｇエンティティーおよび血液脳関門受容体に特異的に結合するｓＦａｂを含み；
（ｂ）第一のリンカーによりＣＨ２−ＣＨ３ ＩｇドメインのＮ末端が脳エフェクターエンティティーに連結され；かつ
（ｃ）第二のリンカーによりＣＨ２−ＣＨ３ ＩｇドメインのＣ末端がｓＦａｂに連結されている、
請求項１−４５または１０５のいずれか一項に記載の血液脳関門シャトル。
【請求項５６】
ＣＨ２−ＣＨ３ Ｉｇエンティティーが、ＣＨ２−ＣＨ３ ＩｇＧエンティティーである、請求項５４または５５に記載の血液脳関門シャトル。
【請求項５７】
脳エフェクターエンティティー抗体が重鎖のＦｃ領域を含み、一価の結合エンティティーが前記重鎖のＦｃ領域のＣ末端と連結されている、請求項１−１９、２１−３６、または３８−４３のいずれか一項に記載の血液脳関門シャトル。
【請求項５８】
脳エフェクターエンティティー抗体が２つの重鎖を含み、一価の結合エンティティーが前記重鎖の一方のＦｃ領域のＣ末端とのみ連結されている、請求項５７に記載の血液脳関門シャトル。
【請求項５９】
脳エフェクターエンティティー抗体が、第一および第二の二量体形成モジュールを含むヘテロ二量体化重鎖を含み、前記第一および第二の二量体形成モジュールの一方のみが一価の結合エンティティーに連結されている、請求項５７に記載の血液脳関門シャトル。
【請求項６０】
第一の二量体形成モジュールがノブを含み、第二の二量体形成モジュールが前記ノブを受けるホールを含む、請求項５９に記載の血液脳関門シャトル。
【請求項６１】
（ａ）脳エフェクターエンティティー抗体がＦｃ領域を含むＩｇＧ重鎖を含み；
（ｂ）一価の結合エンティティーがｓＦａｂを含み；
（ｃ）脳エフェクターエンティティー抗体重鎖のＦｃ領域のＣ末端がｓＦａｂの可変軽鎖ドメインのＮ末端に連結されており；かつ
（ｄ）ｓＦａｂのＣ−κ軽鎖ドメインのＣ末端が、ｓＦａｂの可変重鎖ドメインのＮ末端に連結されている、
請求項５７−６０のいずれか一項に記載の血液脳関門シャトル。
【請求項６２】
血液脳関門シャトルであって：
（ａ）配列番号５９を含むアミノ酸配列を有する軽鎖と、配列番号５３および６９をそれぞれ含む、または配列番号５５および７０をそれぞれ含むアミノ酸配列を有する第一および第二の二量体形成モジュールを伴うヘテロ二量体化重鎖とを伴う抗体を含む、脳エフェクターエンティティー；
（ｂ）第一のリンカー；および
（ｃ）配列番号６４を含むアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号６３を含むアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを含む８Ｄ３−ｓｃＦａｂを含む一価の結合エンティティーであって、前記８Ｄ３−ｓｃＦａｂの重鎖および軽鎖が第二のリンカーにより結連結されている、一価の結合エンティティー；
を含み、前記脳エフェクターエンティティー抗体の第一および第二の二量体形成モジュールの一方のみが、第一のリンカーにより一価の結合エンティティーと連結されている、血液脳関門シャトル。
【請求項６３】
８Ｄ３−ｓｃＦａｂが、それぞれ配列番号６２および６１を含むアミノ酸配列を有する重鎖および軽鎖を含む、請求項６２に記載の血液脳関門シャトル。
【請求項６４】
第一のリンカーが、脳エフェクターエンティティー抗体の重鎖のＣ末端を、一価の結合エンティティーのＮ末端と連結する、請求項６２または６３に記載の血液脳関門シャトル。
【請求項６５】
第一のリンカーが配列番号４１、４２、または７３を含むアミノ酸配列を有する、請求項６２−６４のいずれか一項に記載の血液脳関門シャトル。
【請求項６６】
第二のリンカーが配列番号４１、４２、または７３を含むアミノ酸配列を有する、請求項６２−６５のいずれか一項に記載の血液脳関門シャトル。
【請求項６７】
８Ｄ３−ｓｃＦａｂが、配列番号６０を含むアミノ酸配列を有する、請求項６２−６６のいずれか一項に記載の血液脳関門シャトル。
【請求項６８】
脳エフェクター抗体が第一の重鎖および第二の重鎖を含み:
(a)第一の重鎖が配列番号４６を含むアミノ酸配列を有する重鎖定常領域と融合する成熟重鎖可変領域を含み;かつ
(b)第二の重鎖が配列番号６７を含むアミノ酸配列を有する重鎖定常領域と融合する成熟重鎖可変領域を含む、
請求項３４に記載の血液脳関門シャトル。
【請求項６９】
一価の結合エンティティーが第二の重鎖のＣ末端と連結されている、請求項６８に記載の血液脳関門シャトル。
【請求項７０】
一価の結合エンティティーが、配列番号６４を含むアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号６３を含むアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを含む、８Ｄ３−ｓｃＦａｂを含む、請求項６９に記載の血液脳関門シャトル。
【請求項７１】
一価の結合エンティティーが、それぞれ、配列番号６２および６１を含むアミノ酸配列を有する重鎖および軽鎖を含む８Ｄ３−ｓｃＦａｂを含む、請求項７０に記載の血液脳関門シャトル。
【請求項７２】
脳エフェクターエンティティーおよび一価のエンティティーが第一のリンカーで連結されており、８Ｄ３の重鎖および軽鎖が第二のリンカーで連結されている、請求項７１に記載の血液脳関門シャトル。
【請求項７３】
第一のリンカーが、配列番号７３を含むアミノ酸配列を有し、第二のリンカーが、配列番号４１を含むアミノ酸配列を有する、請求項７２に記載の血液脳関門シャトル。
【請求項７４】
請求項１−７３または１０５のいずれか一項で規定される血液脳関門シャトル、および医薬上許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項７５】
請求項１−７３、または１０５のいずれか一項に記載の血液脳関門シャトルをコードする核酸。
【請求項７６】
配列番号５３、５７、および／または５９を含むアミノ酸配列をコードする核酸。
【請求項７７】
配列番号５５、５８、および／または５９を含むアミノ酸配列をコードする核酸。
【請求項７８】
請求項６５−６７のいずれか一項に記載の核酸を含む、組換え発現ベクター。
【請求項７９】
配列番号５３、配列番号５７、または配列番号５９を含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む、請求項７８に記載の組換え発現ベクター。
【請求項８０】
配列番号５５、配列番号５８、または配列番号５９を含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む、請求項７８に記載の組換え発現ベクター。
【請求項８１】
配列番号５３、５７、および５９をそれぞれ含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む、３つの組換え発現ベクターを含む、遺伝子導入混合物。
【請求項８２】
配列番号５５、５８、および５９をそれぞれ含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む、３つの組換え発現ベクターを含む、遺伝子導入混合物。
【請求項８３】
３つの組換え発現ベクターが当モル量存在する、請求項８１または８２に記載の遺伝子導入混合物。
【請求項８４】
請求項７８−８０のいずれか一項に記載の組換え発現ベクター、または請求項８１−８３のいずれか一項に記載の遺伝子導入混合物により形質転換された宿主細胞。
【請求項８５】
血液脳関門シャトルを生産する方法であって：
（a）細胞が血液脳関門シャトルを分泌するように、請求項７５−７７のいずれか一項に記載の核酸で形質転換した細胞を培養すること；および
（ｂ）分泌された血液脳関門シャトルを精製すること、
を含む方法。
【請求項８６】
血液脳関門シャトルを製造する細胞株を製造する方法であって：
（ａ）請求項７８−８０のいずれか一項に記載の組換え発現ベクターを細胞に導入すること、ここで、前記組換え発現ベクターはさらに選択マーカーを含む；
（ｂ）コピー数の増加したベクターを有する細胞を選択する条件下で細胞を増殖させること；
（ｃ）選択した細胞から単一細胞を単離すること；および
（ｄ）血液脳関門シャトルの産出量に基づき、単一細胞からクローン化した細胞を保存すること、
を含む方法。
【請求項８７】
選択的条件下で細胞を増殖させ、少なくとも１００ｍｇ／Ｌ／１０６細胞／２４時間で天然に発現し分泌する細胞株をスクリーニングすることをさらに含む、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
患者のシヌクレイン病を治療または予防する方法であって、請求項１−７３または１０５のいずれか一項に記載の血液脳関門シャトルの効果的な投与計画を、患者に施すことを含む方法。
【請求項８９】
シヌクレイン病がレビー小体病である、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
患者が、ＲＥＭ睡眠行動障害（ＲＢＤ）である、請求項８８に記載の方法。
【請求項９１】
シヌクレイン病を有するか、もしくはそのリスクがある患者のα−シヌクレインの凝集を抑制するか、またはα−シヌクレイン凝集体を減らす方法であって、患者に請求項１−７３または１０５のいずれか一項に記載の血液脳関門シャトルを有効量投与することを含む方法。
【請求項９２】
α−シヌクレイン凝集体がレビー小体を含み、シヌクレイン病がレビー小体病である、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
シヌクレイン病がパーキンソン病である、請求項８８−９２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９４】
シヌクレイン病が、多系統萎縮症（ＭＳＡ）またはレビー小体型認知症（ＤＬＢ）である、請求項８８、９０、または９１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９５】
患者の認知機能の低下を防ぐ、請求項８８−９４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９６】
神経突起の、および／または軸索の、α−シヌクレイン凝集体を減らす、請求項８８−９４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９７】
患者の神経突起のジストロフィーを減らす、請求項８８−９４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９８】
シナプスの、および／または樹状突起の密度を保つ、請求項８８−９４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９９】
患者のシナプトフィジンおよび／またはＭＡＰ２を保つ、請求項８８−９４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１００】
シヌクレイン病を有するか、またはそのリスクがある患者の、α−シヌクレイン凝集体を検出する方法であって：
（ａ）請求項１−７３または１０５のいずれか一項に記載の、脳エフェクターエンティティー抗体を患者に有効量投与すること、ここで、前記脳エフェクターエンティティー抗体はレビー小体に結合する；および
（ｂ）患者において結合脳エフェクターエンティティー抗体を検出すること、
を含む方法。
【請求項１０１】
α−シヌクレイン凝集体がレビー小体を含み、シヌクレイン病がレビー小体病である、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
血液脳関門を通過して脳エフェクターエンティティーを輸送する方法であって、一価の結合エンティティーが脳エフェクターエンティティーを、血液脳関門を通過して輸送するように、請求項１−７３または１０５のいずれか一項に記載の血液脳関門シャトルを、血液脳関門に曝すことを含む方法。
【請求項１０３】
（ａ）配列番号５９を含むアミノ酸配列をそれぞれ有する、一対の軽鎖；
（ｂ）配列番号５３を含むアミノ酸配列を有する第一の重鎖；および
（ｃ）配列番号５７を含むアミノ酸配列を有する第二の重鎖；
を含み、第一の重鎖と第二の重鎖がヘテロ二量体を形成する抗体。
【請求項１０４】
（ａ）配列番号５９を含むアミノ酸配列をそれぞれ有する、一対の軽鎖；
（ｂ）配列番号５５を含むアミノ酸配列を有する第一の重鎖；および
（ｃ）配列番号５８を含むアミノ酸配列を有する第二の重鎖；
を含み、第一の重鎖と第二の重鎖がヘテロ二量体を形成する抗体。
【請求項１０５】
脳エフェクターエンティティー抗体の成熟重鎖可変領域が、配列番号６６または７５の配列を有する重鎖定常領域と融合している、および／または脳エフェクターエンティティー抗体の成熟軽鎖可変領域が、配列番号５２の配列を有する軽鎖定常領域と融合している、請求項３４に記載の血液脳関門シャトル。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１４年４月８日に出願された米国特許出願第６１／９７７，０３９号、２０１４年４月８日に出願された米国特許出願第６１／９７７，０４２号、および２０１４年７月１１日に出願された米国特許出願第６２／０２３，３７３号の利益を主張するものであり、その各々は、あらゆる目的のために、その全体が参照により組み込まれる。
【０００２】
配列表
４５９０１５ＳＥＱＬＩＳＴ．ｔｘｔファイルに記載した配列表は、１２３キロバイトのサイズであり、２０１５年４月１日に作成したものであり、参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
背景
シヌクレイン病は、ドーパミン作動系および他の神経系の変性、運動障害、認知障害、および、例えばレビー小体（ＬＢ）またはレビー神経突起などの、ニューロン内またはグリア細胞内の特異的蓄積の形成を特徴とする、慢性の、ほとんどが加齢性の、神経変性疾患の一部における、神経病理学的な所見である。(McKeith et al., Neurology 47:1113-1124 (1996))。シヌクレイン病には、パーキンソン病（突発性パーキンソン病を含む）、びまん性レビー小体病（ＤＬＢＤ）（レビー小体型認知症（ＤＬＢ）としても知られる）、レビー小体型アルツハイマー病（ＬＢＶ）、アルツハイマー病およびパーキンソン病の併発などのレビー小体病、および純粋自律神経失調症、ならびに多系統萎縮症（ＭＳＡ；例えば、オリーブ橋小脳萎縮症、線条体黒質変性症およびシャイ・ドレーガー症候群）が含まれる。いくつかの非運動性の徴候および症状が、疾病の前駆期（すなわち、症状が出る前の、無症状の、前臨床の、または前運動の期間）でのシヌクレイン病の前兆と考えられる。これらの初期の徴候には、例えば、レム睡眠行動障害（ＲＢＤ）、嗅覚消失および便秘が含まれる(Mahowald et al., Neurology 75:488-489 (2010))。レビー小体病は、老齢人口における運動障害および認知衰退の共通原因であり続けている(Galasko et al., Arch. Neurol. 51:888-895(1994))。
【０００４】
α−シヌクレインは、β−シヌクレイン、γ−シヌクレインおよびシノレチンを含む大きなタンパク質ファミリーの一部である。α−シヌクレインは通常の状態で発現され、そのうちいくらかはシナプス前終末に局在し、小胞のシナプス膜への融合を制御して、神経機能、可塑性、学習および記憶において役割を果たすと信じられている。本タンパク質は病態時に、不溶性の原繊維を形成して凝集する場合があり、脳にこれらの凝集体が組織学的に存在することによる障害は、それゆえにシヌクレイン病と呼ばれる。いくつかの研究により、α−シヌクレインとパーキンソン病の病因のおける中心的役割とが関連づけられている。例えば、α−シヌクレインはレビー小体（ＬＢ）において蓄積する(Spillantini et al., Nature 388:839-840 (1997); Takeda et al., J. Pathol. 152:367-372 (1998); Wakabayashi et al., Neurosci．Lett．239:45-48 (1997))。α−シヌクレイン遺伝子の変異は、パーキンソニズムのまれな家族性の形態と同時分離（co-segregate）する(Kruger et al., Nature Gen. 18:106-108 (1998); Polymeropoulos, et al., Science 276:2045-2047 (1997))。トランスジェニックマウス(Masliah et al., Science 287:1265-1269 (2000))およびショウジョウバエ(Feany et al., Nature 404:394-398 (2000))でのα−シヌクレインの過剰発現は、レビー小体病のいくつかの病理学的局面を模倣している。さらに、α−シヌクレインの可溶性オリゴマーは、神経毒性があり得ると示唆されている(Conway et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 97:571-576 (2000); Volles et al., J. Biochem. 42:7871-7878 (2003))。ヒト、マウス、およびハエと同程度多様性に富んだ種および動物における、同様の形態学的および神経学的変化を示すα−シヌクレインの蓄積は、本分子がレビー小体病の発症に寄与することを示唆している。
【０００５】
α−シヌクレインの抗体、またはこれらの抗体を誘導するα−シヌクレインのフラグメントが、レビー小体病などのシヌクレイン病に対する免疫治療法として提案されている。しかしながら、抗体の脳への透過が、血液脳関門（ＢＢＢ）により制限され得る。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、血液脳関門シャトルであって、（ａ）少なくとも実質的に５Ｃ１抗体由来のＣＤＲを有する抗体を含む脳エフェクターエンティティー、ここで、５Ｃ１は配列番号９を含むアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号２４を含むアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を特徴とするマウス抗体である；および（ｂ）血液脳関門受容体に結合する一価の結合エンティティー；を含み、前記脳エフェクターエンティティーが前記一価の結合エンティティーと連結されている、血液脳関門シャトルを提供する。。場合により、脳エフェクターエンティティー抗体は配列番号１０、１１、および１２のアミノ酸配列をそれぞれ有する３つの重鎖ＣＤＲおよび配列番号２５、２６、および２７のアミノ酸配列をそれぞれ有する３つの軽鎖ＣＤＲを含む。
【０００７】
本発明はさらに、血液脳関門シャトルであって、（ａ）ヒトα−シヌクレインに結合する抗体を含む脳エフェクターエンティティー、ここで、全長ヒトα−シヌクレインの残基１１８−１２６のアラニンスキャニング変異導入法は、残基１２０、１２１、および１２２のそれぞれが残基１２３および１２４のそれぞれよりも結合に寄与し、残基１２３および１２４のそれぞれが残基１１８、１１９、１２５および１２６のそれぞれよりも結合に寄与していることを示す；および（ｂ）血液脳関門受容体に結合する一価の結合エンティティー；を含み、前記脳エフェクターエンティティーが前記一価の結合エンティティーと連結されている、血液脳関門シャトルを提供する。
【０００８】
上述した血液脳関門シャトルのうちいくつかでは、脳エフェクターエンティティー抗体が、本質的に配列番号１の残基１２０−１２２からなり、配列番号１の残基１１８−１１９を除くエピトープで、ヒトα−シヌクレインに結合する。上述した血液脳関門シャトルのうちいくつかでは、脳エフェクターエンティティー抗体が、配列番号１の残基１２０−１２４からなるエピトープで、ヒトα−シヌクレインに結合する。
【０００９】
本発明はさらに、血液脳関門シャトルであって、（ａ）モノクローナル抗体５Ｃ１の、Ｋａｂａｔにより規定される３つの軽鎖ＣＤＲおよびＫａｂａｔにより規定される３つの重鎖ＣＤＲを含む抗体を含む脳エフェクターエンティティー、ここで、５Ｃ１は配列番号９を含むアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号２４を含むアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を特徴とするマウス抗体である；および（ｂ）血液脳関門受容体に結合する一価の結合エンティティー；を含み、前記脳エフェクターエンティティーが前記一価の結合エンティティーと連結されている、血液脳関門シャトルを提供する。
【００１０】
上述した血液脳関門シャトルのうちいくつかでは、脳エフェクターエンティティー抗体はキメラ抗体、ベニヤ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体である。上述した血液脳関門シャトルのうちいくつかでは、脳エフェクターエンティティー抗体はヒト化抗体である。上述した血液脳関門シャトルのうちいくつかでは、脳エフェクターエンティティー抗体はキメラ抗体である。上述した血液脳関門シャトルのうちいくつかでは、脳エフェクターエンティティー抗体はベニヤ抗体である。上述した血液脳関門シャトルのうちいくつかでは、脳エフェクターエンティティー抗体は、アイソタイプがヒトＩｇＧ１抗体である。
【００１１】
上述した血液脳関門シャトルのうちいくつかでは、脳エフェクターエンティティー抗体は、定常領域に少なくとも１つの変異を有する。場合により、本変異は定常領域による補体結合または活性化を減少させる。場合により、脳エフェクターエンティティー抗体は、ＥＵナンバリングの位置２４１、２６４、２６５、２７０、２９６、２９７、３２２、３２９、および３３１の１つ以上において、定常領域に変異を有する。場合により、脳エフェクターエンティティー抗体は位置３１８、３２０、および３２２にアラニンを有する。場合により、脳エフェクターエンティティー抗体は、ＥＵナンバリングの位置２３４、２３５、２３７、および３２９の１つ以上に、変異を有する。場合により、脳エフェクターエンティティー抗体は、位置２３４、２３５および２３７の１つ以上に、アラニンを有する。場合により、脳エフェクターエンティティー抗体は、位置２３４および２３５にアラニンを有し、位置３２９にグリシンを有する。
【００１２】
上述した血液脳関門シャトルのうちいくつかでは、脳エフェクターエンティティー抗体がヒトＩｇＧ２またはＩｇＧ４のアイソタイプを有する。
【００１３】
上述した血液脳関門シャトルのうちいくつかでは、脳エフェクターエンティティー抗体がＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、またはｓｃＦｖである。
【００１４】
本発明はさらに、血液脳関門シャトルであって：（ａ）Ｈ４（配列番号１７）に少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有する成熟重鎖可変領域およびＬ３（配列番号３１）に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する成熟軽鎖可変領域を含む抗体を含む、脳エフェクターエンティティーであって、前記抗体がヒトα−シヌクレインに特異的に結合する、脳エフェクターエンティティー；および（ｂ）血液脳関門受容体に結合する一価の結合エンティティー；を含み、前記脳エフェクターエンティティーが前記一価の結合エンティティーと連結されている、血液脳関門シャトルを提供する。場合により、脳エフェクターエンティティー抗体は配列番号９の３つのＫａｂａｔ ＣＤＲおよび配列番号２４の３つのＫａｂａｔ ＣＤＲを含む。場合により、脳エフェクターエンティティー抗体の位置Ｈ１１、Ｈ２７、Ｈ３０、Ｈ４８、およびＨ７３のうち少なくとも１つを、Ｌ、Ｙ、Ｔ、Ｉ、およびＫがそれぞれ占め、脳エフェクターエンティティー抗体の位置Ｌ１２およびＬ１４のうち少なくとも１つを、Ｓが占める。場合により、脳エフェクターエンティティー抗体の位置Ｈ１１、Ｈ２７、Ｈ３０、Ｈ４８、およびＨ７３をＬ、Ｙ、Ｔ、Ｉ、およびＫがそれぞれ占め、脳エフェクターエンティティー抗体の位置Ｌ１２およびＬ１４を、Ｓが占める。場合により、脳エフェクターエンティティー抗体の位置Ｈ６７、Ｈ６９、およびＨ９４の少なくとも１つを、Ａ、Ｌ、およびＳがそれぞれ占める。場合により、脳エフェクターエンティティー抗体の位置Ｈ６７、Ｈ６９、およびＨ９４を、それぞれＡ、Ｌ、およびＳが占める。場合により、脳エフェクターエンティティー抗体の位置Ｈ９４をＳが占める。場合により、脳エフェクターエンティティー抗体の位置Ｌ２、Ｌ４９、およびＬ８７の少なくとも１つを、Ｖ、Ｎ、およびＦがそれぞれ占める。場合により、脳エフェクターエンティティー抗体の位置Ｌ２、Ｌ４９、およびＬ８７を、Ｖ、Ｎ、およびＦがそれぞれ占める。場合により、脳エフェクターエンティティー抗体は、Ｈ４（配列番号１７）に少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有する成熟重鎖可変領域およびＬ３（配列番号３１）に少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有する成熟軽鎖可変領域を含む。場合により、脳エフェクターエンティティー抗体の成熟重鎖可変領域および成熟軽鎖可変領域のＣＤＲにおける、Ｈ４（配列番号１７）およびＬ３（配列番号３１）のＣＤＲとの差異はいずれも、それぞれ、位置Ｈ６０−Ｈ６５に存在する。場合により、脳エフェクターエンティティー抗体の成熟重鎖可変領域は、Ｈ４と名付けられたアミノ酸配列（配列番号１７）を有し、脳エフェクターエンティティー抗体の成熟軽鎖可変領域は、Ｌ３と名付けられたアミノ酸配列（配列番号３１）を有する。場合により、脳エフェクターエンティティー抗体の成熟重鎖可変領域は、Ｈ５（配列番号１８）と名付けられたアミノ酸配列を有し、脳エフェクターエンティティー抗体の成熟軽鎖可変領域は、Ｌ３と名付けられたアミノ酸配列（配列番号３１）を有する。
【００１５】
上述した血液脳関門シャトルのうちいくつかでは、脳エフェクターエンティティー抗体の成熟重鎖可変領域は、重鎖定常領域と融合し、脳エフェクターエンティティー抗体の成熟軽鎖可変領域は、軽鎖定常領域と融合する。場合により、脳エフェクターエンティティー抗体の重鎖定常領域は、天然のヒト重鎖定常領域と比較してＦｃγ受容体への結合が減少した、天然のヒト重鎖定常領域の変異体である。場合により、脳エフェクターエンティティー抗体の成熟重鎖可変領域は配列番号６６の配列を有する重鎖定常領域と融合し、および／または脳エフェクターエンティティー抗体の成熟軽鎖可変領域は、配列番号５２の配列を有する軽鎖定常領域と融合する。場合により、脳エフェクターエンティティー抗体の成熟重鎖可変領域は、配列番号６６または７５の配列を有する重鎖定常領域と融合しており、および／または脳エフェクターエンティティー抗体の成熟軽鎖可変領域は配列番号５２の配列を有する軽鎖定常領域と融合している。
【００１６】
上述した血液脳関門シャトルのうちいくつかでは、脳エフェクターエンティティー抗体は、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、またはｓｃＦｖである。
【００１７】
上述した血液脳関門シャトルのうちいくつかでは、一価の結合エンティティーが、血液脳関門受容体リガンド、抗体フラグメント、または他のポリペプチドを含む。場合により、一価の結合エンティティーは、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｓｃＦａｂ、ｓＦａｂ、またはＶＨＨである抗体フラグメントを含む。場合により、一価の結合エンティティーはｓＦａｂを含む。
【００１８】
上述した血液脳関門シャトルのうちいくつかでは、血液脳関門受容体は、トランスフェリン受容体、インスリン受容体、インスリン様成長因子受容体、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質８、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１、またはヘパリン結合性上皮細胞成長因子様成長因子である。場合により、血液脳関門受容体は、トランスフェリン受容体である。
【００１９】
上述した血液脳関門シャトルのうちいくつかでは、一価の結合エンティティーがトランスフェリン受容体に特異的に結合するｓＦａｂを含む。場合により、ｓＦａｂは、配列番号４３、配列番号４４および／または配列番号４５内のエピトープに結合する。
【００２０】
上述した血液脳関門シャトルのうちいくつかでは、脳エフェクターエンティティーが第一のリンカーにより一価の結合エンティティーと連結されている。場合により、第一のリンカーはペプチドリンカーである。場合により、ペプチドリンカーは少なくとも２０のアミノ酸長を有する。場合により、ペプチドリンカーは２５〜５０のアミノ酸長を有する。場合により、ペプチドリンカーは配列番号４１のアミノ酸配列を有する。場合により、ペプチドリンカーは、配列番号４２のアミノ酸配列を有する。場合により、ペプチドリンカーは、配列番号７３のアミノ酸配列を有する。場合により、一価の結合エンティティーは、第一のリンカーにより、脳エフェクターエンティティー抗体の重鎖のＣ末端と連結されている。
【００２１】
上述した血液脳関門シャトルのうちいくつかでは、一価の結合エンティティーは、ＣＨ２−ＣＨ３ Ｉｇエンティティーおよび、血液脳関門受容体に特異的に結合するｓＦａｂを含み、前記ｓＦａｂは、前記ＣＨ２−ＣＨ３ ＩｇエンティティーのＣ末端に連結されている。場合により、前記ＣＨ２−ＣＨ３ ＩｇエンティティーはＣＨ２−ＣＨ３ ＩｇＧエンティティーである。
【００２２】
上述した血液脳関門シャトルのうちいくつかでは、一価の結合エンティティーはＣＨ２−ＣＨ３ Ｉｇエンティティーおよび血液脳関門受容体に特異的に結合するｓＦａｂを含み、第一のリンカーによりＣＨ２−ＣＨ３ ＩｇドメインのＮ末端が脳エフェクターエンティティーに連結され、かつ第二のリンカーによりＣＨ２−ＣＨ３ ＩｇドメインのＣ末端がｓＦａｂに連結されている。場合により、前記ＣＨ２−ＣＨ３ ＩｇエンティティーはＣＨ２−ＣＨ３ ＩｇＧエンティティーである。
【００２３】
上述した血液脳関門シャトルのうちいくつかでは、脳エフェクターエンティティー抗体が重鎖のＦｃ領域を含み、一価の結合エンティティーが前記重鎖のＦｃ領域のＣ末端に連結されている。場合により、脳エフェクターエンティティー抗体は２つの重鎖を含み、一価の結合エンティティーが、前記重鎖の一方のＦｃ領域のＣ末端のみに連結されている。場合により、脳エフェクターエンティティー抗体は、第一および第二の二量体形成モジュールを含むヘテロ二量体化重鎖を含み、前記第一および第二の二量体形成モジュールの一方のみが、一価の結合エンティティーに連結されている。場合により、第一の二量体形成モジュールは、ノブ（nob）を含み、第二の二量体形成モジュールは、前記ノブを受けるホール（hole）を含む。
【００２４】
上述した血液脳関門シャトルのうちいくつかでは、脳エフェクターエンティティー抗体はＦｃ領域を含むＩｇＧ重鎖を含み、一価の結合エンティティーはｓＦａｂを含み、脳エフェクターエンティティー抗体重鎖のＦｃ領域のＣ末端はｓＦａｂの可変軽鎖ドメインのＮ末端と連結され、ｓＦａｂのＣ−κ軽鎖ドメインのＣ末端はｓＦａｂの可変重鎖ドメインのＮ末端と連結されている。
【００２５】
本発明は、さらに、血液脳関門シャトルであって：（ａ）配列番号５９を含むアミノ酸配列を有する軽鎖と、配列番号５３および６９をそれぞれ含む、または配列番号５５および７０をそれぞれ含むアミノ酸配列を有する第一および第二の二量体形成モジュールを伴うヘテロ二量体化重鎖とを伴う抗体を含む、脳エフェクターエンティティー；（ｂ）第一のリンカー；および（ｃ）配列番号６４を含むアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号６３を含むアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを含む８Ｄ３−ｓｃＦａｂを含む一価の結合エンティティーであって、前記８Ｄ３−ｓｃＦａｂの重鎖および軽鎖が第二のリンカーにより連結されている、一価の結合エンティティー；を含み、前記脳エフェクターエンティティー抗体の第一および第二の二量体形成モジュールの一方のみが、第一のリンカーにより一価の結合エンティティーと連結されている、血液脳関門シャトルを提供する。場合により、８Ｄ３−ｓｃＦａｂは、配列番号６２および６１をそれぞれ含むアミノ酸配列を有する、重鎖および軽鎖を含む。場合により、第一のリンカーは、脳エフェクターエンティティー抗体の重鎖のＣ末端を、一価の結合エンティティーのＮ末端と連結する。場合により、第一のリンカーは、配列番号４１、４２、または７３を含むアミノ酸配列を有する。場合により、第二のリンカーは、配列番号４１、４２、または７３を含むアミノ酸配列を有する。場合により、８Ｄ３−ｓｃＦａｂは、配列番号６０を含むアミノ酸配列を有する。
【００２６】
上述した血液脳関門シャトルのうちいくつかでは、脳エフェクター抗体が第一の重鎖および第二の重鎖を含み、第一の重鎖が配列番号４６を含むアミノ酸配列を有する重鎖定常領域と融合する成熟重鎖可変領域を含み、かつ第二の重鎖が配列番号６７を含むアミノ酸配列を有する重鎖定常領域と融合する成熟重鎖可変領域を含む。場合により、一価の結合エンティティーは第二の重鎖のＣ末端に連結されている。場合により、一価の結合エンティティーは、配列番号６４を含むアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号６３を含むアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを含む、８Ｄ３−ｓｃＦａｂを含む。場合により、一価の結合エンティティーは、配列番号６２および６１をそれぞれ含むアミノ酸配列を有する、重鎖および軽鎖を含む８Ｄ３−ｓｃＦａｂを含む。場合により、脳エフェクターエンティティーおよび一価のエンティティーは第一のリンカーにより連結され、８Ｄ３重鎖および軽鎖は、第二のリンカーにより連結されている。場合により、第一のリンカーは配列番号７３を含むアミノ酸配列を有し、第二のリンカーは配列番号４１を含むアミノ酸配列を有する。
【００２７】
本発明はさらに、上述の血液脳関門シャトルのいずれか、および医薬上許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
【００２８】
本発明は、さらに、上述の血液脳関門シャトルのいずれかをコードする核酸を提供する。場合により、核酸は配列番号５３、５７、および／または５９を含むアミノ酸配列をコードする。場合により、核酸は、配列番号５５、５８、および／または５９を含むアミノ酸配列をコードする。
【００２９】
本発明は、さらに、上述の核酸のいずれかを含む、組換え発現ベクターを提供する。場合により、組換え発現ベクターは、配列番号５３、配列番号５７、または配列番号５９を含むアミノ配列をコードする核酸を含む。場合により、組換え発現ベクターは、配列番号５５、配列番号５８、または配列番号５９を含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む。
【００３０】
本発明は、さらに、配列番号５５、５８、および５９をそれぞれ含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む、３つの組換え発現ベクターを含む、遺伝子導入混合物を提供する。本発明は、さらに、配列番号５５、５８、および５９をそれぞれ含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む遺伝子導入混合物を提供する。場合により、３つの組換え発現ベクターは、等モル量で存在する。
【００３１】
本発明は、さらに、上述の組換え発現ベクターのいずれか、または上述の遺伝子導入混合物のいずれかで形質転換した宿主細胞を提供する。
【００３２】
本発明は、さらに、血液脳関門シャトルを製造する方法であって：（a）細胞が血液脳関門シャトルを分泌するように、上述の核酸のいずれかで形質転換した細胞を培養すること；および（ｂ）分泌した血液脳関門シャトルを精製することを含む方法を、提供する。
【００３３】
本発明は、さらに、血液脳関門シャトルを製造する細胞株を製造する方法であって：（ａ）上述の組換え発現ベクターのいずれかを細胞に導入すること、ここで前記組換え発現ベクターはさらに選択マーカーを含む；（ｂ）コピー数の増加したベクターを有する細胞を選択する条件下で細胞を増殖させること；（ｃ）選択した細胞から単一細胞を単離すること；および（ｄ）血液脳関門シャトルの産出量に基づき、単一細胞からクローン化した細胞を保存することを含む方法を提供する。場合により、本方法は、選択的条件下で細胞を増殖させ、少なくとも１００ｍｇ／Ｌ／１０６細胞／２４時間で天然に発現し分泌する細胞株をスクリーニングすることをさらに含む。
【００３４】
本発明は、さらに、患者のシヌクレイン病を治療または予防する方法であって、患者に、上述の血液脳関門シャトルのいずれかの効果的な投与計画を施すことを含む方法を、提供する。場合により、シヌクレイン病はレビー小体病である。場合により、患者はＲＥＭ睡眠行動障害（ＲＢＤ）である。場合により、シヌクレイン病はパーキンソン病である。場合により、シヌクレイン病は多系統萎縮症（ＭＳＡ）またはレビー小体型認知症（ＤＬＢ）である。場合により、本方法は患者の認知機能の低下を抑制する。場合により、本方法は、神経突起の、および／または軸索のα−シヌクレイン凝集体を減少させる。場合により、本方法は、患者の神経突起のジストロフィーを減少させる。場合により、本方法はシナプスの、および／または樹状突起の密度を保つ。場合により、本方法は、患者のシナプトフィジンおよび／またはＭＡＰ２を保つ。
【００３５】
本発明は、シヌクレイン病を有するか、またはそのリスクがある患者のα−シヌクレインの凝集を抑制するか、またはα−シヌクレイン凝集体を減らす方法であって、患者に上述の血液脳関門シャトルのいずれかの有効量を投与することを含む方法を、提供する。場合により、α−シヌクレイン凝集体はレビー小体を含み、シヌクレイン病はレビー小体病である。場合により、シヌクレイン病はパーキンソン病である。場合により、シヌクレイン病は、多系統萎縮症（ＭＳＡ）またはレビー小体型認知症（ＤＬＢ）である。場合により、本方法は患者の認知機能の低下を抑制する。場合により、本方法は、神経突起の、および／または軸索のα−シヌクレイン凝集体を減少させる。場合により、本方法は、患者の神経突起のジストロフィーを減少させる。場合により、本方法はシナプスの、および／または樹状突起の密度を保つ。場合により、本方法は、患者のシナプトフィジンおよび／またはＭＡＰ２を保つ。
【００３６】
本発明は、さらに、シヌクレイン病を有するか、またはそのリスクがある患者の、α−シヌクレイン凝集体を検出する方法であって：（ａ）患者に上述のいずれかの血液脳関門シャトルの有効量を投与すること、ここで、脳エフェクターエンティティー抗体はレビー小体に結合する；および（ｂ）患者の、結合脳エフェクターエンティティー抗体を検出すること、を含む方法を、提供する。場合により、α−シヌクレイン凝集体はレビー小体を含み、シヌクレイン病はレビー小体病である。
【００３７】
本発明は、さらに、脳エフェクターエンティティーが血液脳関門を通過して輸送される方法であって、一価の結合エンティティーが、脳エフェクターエンティティーが血液脳関門を通過して輸送されるように、上述の血液脳関門シャトルのいずれかを、血液脳関門に曝すことを含む方法を、提供する。
【００３８】
本発明は、さらに：（ａ）配列番号５９を含むアミノ酸配列をそれぞれ有する、一対の軽鎖；（ｂ）配列番号５３を含むアミノ酸配列を有する第一の重鎖；および（ｃ）配列番号５７を含むアミノ酸配列を有する第二の重鎖；を含む抗体であって、第一および第二の重鎖がヘテロ二量体を形成する抗体を提供する。
【００３９】
本発明は、さらに：（ａ）配列番号５９を含むアミノ酸配列をそれぞれ有する、一対の軽鎖；（ｂ）配列番号５５を含むアミノ酸配列を有する第一の重鎖；および（ｃ）配列番号５８を含むアミノ酸配列を有する第二の重鎖；を含む抗体であって、第一および第二の重鎖がヘテロ二量体を形成する抗体を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】マウス５Ｃ１重鎖成熟可変領域のアミノ酸配列を示す。Ｋａｂａｔの規定に従うＣＤＲ領域は、下線または太字で示している。
【００４１】
【図２】マウス５Ｃ１軽鎖成熟可変領域のアミノ酸配列を示す。Ｋａｂａｔの規定に従うＣＤＲ領域は、下線または太字で示している。
【００４２】
【図３】モリス水迷路試験の、プローブ部分における、ヒトα−シヌクレイントランスジェニックマウスの記憶能力についての、５Ｃ１による受動免疫療法の結果を示している。
【００４３】
【図４】ラウンドビームテストにおける速度とエラーについての、５Ｃ１による、ヒトα−シヌクレイントランスジェニックマウスにおける、受動免疫療法の結果を示している。
【００４４】
【図５】様々なヒト化５Ｃ１抗体の親和性を試験したＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。
【００４５】
【図６】９Ｅ４抗体が結合するα−シヌクレインのエピトープを決定するために用いられたアラニンスキャニング変異導入実験の結果を示す。図の上部は、９Ｅ４抗体（左図）またはコントロール抗体１Ｈ７（右図）で染色された、完全長α−シヌクレイン（野生型または、図のように、残基１１８−１２６の個々の点変異）のウエスタンブロットを示している。図の下部は、９Ｅ４抗体が結合するα−シヌクレインのエピトープを示している。
【００４６】
【図７】５Ｃ１抗体が結合するα−シヌクレインのエピトープを決定するために用いられたアラニンスキャニング変異導入実験の結果を示す。図の上部は、５Ｃ１抗体（左図）またはコントロール抗体１Ｈ７（右図）で染色された、完全長α−シヌクレイン（野生型または、図のように、残基１１８−１２６の個々の点変異）のウエスタンブロットを示している。図の下部は、５Ｃ１抗体が結合するα−シヌクレインのエピトープを示している。
【００４７】
【図８】５Ｄ１２抗体が結合するα−シヌクレインのエピトープを決定するために用いられたアラニンスキャニング変異導入実験の結果を示す。図の上部は、５Ｄ１２抗体（左図）またはコントロール抗体１Ｈ７（右図）で染色された、完全長α−シヌクレイン（野生型または、図のように、残基１１８−１２６の個々の点変異）のウエスタンブロットを示している。図の下部は、５Ｄ１２抗体が結合するα−シヌクレインのエピトープを示している。
【００４８】
【図９】Ｅ４、５Ｃ１および５Ｄ１２抗体の結合部位に近接したα−シヌクレインのアミノ酸の球棒モデルを図示している。
【００４９】
【図１０】「ノブ」５Ｃ１Ｈ４−ＨｕＩｇＧ１−ｓｃＦａｂ（８Ｄ３）重鎖融合タンパク質を図示している。
【００５０】
【図１１】「ホール」５Ｃ１Ｈ４−ＨｕＩｇＧ１重鎖融合タンパク質を図示している。
【００５１】
【図１２】５Ｃ１Ｌ３−ＨｕＩｇＫａｐｐａ軽鎖融合タンパク質を図示している。
【００５２】
【図１３】脳エフェクターエンティティーが５Ｃ１抗体を含み、一価の結合エンティティーが８Ｄ３−ｓＦａｂを含む、血液脳関門シャトルのバージョンを図示している。
【００５３】
配列の簡単な説明
配列番号１は、野生型ヒトα−シヌクレインである。
【００５４】
配列番号２は、Jensen et al. (1995)により報告された、α−シヌクレインの非アミロイド成分（ＮＡＣ）ドメインである。
【００５５】
配列番号３は、Ueda et al. (1993)により報告された、α−シヌクレインの非アミロイド成分（ＮＡＣ）ドメインである。
【００５６】
配列番号４は、５Ｃ１ペプチド免疫原であるヒトα−シヌクレインのアミノ酸残基１１８−１２９である。
【００５７】
配列番号５は、シグナルペプチドをコードする配列を伴うマウス５Ｃ１重鎖可変領域をコードする核酸配列である。
【００５８】
配列番号６は、シグナルペプチドを伴うマウス５Ｃ１重鎖可変領域である。
【００５９】
配列番号７は、シグナルペプチドをコードする配列を伴うマウス５Ｃ１軽鎖可変領域をコードする核酸配列である。
【００６０】
配列番号８は、シグナルペプチドを伴うマウス５Ｃ１軽鎖可変領域である。
【００６１】
配列番号９は、マウス５Ｃ１成熟重鎖可変領域である。
【００６２】
配列番号１０は、Ｋａｂａｔにより規定される５Ｃ１重鎖ＣＤＲ１の配列である。
【００６３】
配列番号１１は、Ｋａｂａｔにより規定される５Ｃ１重鎖ＣＤＲ２の配列である。
【００６４】
配列番号１２は、Ｋａｂａｔにより規定される５Ｃ１重鎖ＣＤＲ３の配列である。
【００６５】
配列番号１３は、ヒトＶＨ受容体ＦＲ（アクセッション番号ＡＡＹ４２８７６．１）である。
【００６６】
配列番号１４は、ヒト化５Ｃ１Ｈ１の配列である。
【００６７】
配列番号１５は、ヒト化５Ｃ１Ｈ２の配列である。
【００６８】
配列番号１６は、ヒト化５Ｃ１Ｈ３の配列である。
【００６９】
配列番号１７は、ヒト化５Ｃ１Ｈ４の配列である。
【００７０】
配列番号１８は、ヒト化５Ｃ１Ｈ５の配列である。
【００７１】
配列番号１９は、シグナルペプチドをコードする配列を伴うヒト化５Ｃ１Ｈ１をコードする核酸配列である。
【００７２】
配列番号２０は、シグナルペプチドをコードする配列を伴うヒト化５Ｃ１Ｈ２をコードする核酸配列である。
【００７３】
配列番号２１は、シグナルペプチドをコードする配列を伴うヒト化５Ｃ１Ｈ３をコードする核酸配列である。
【００７４】
配列番号２２は、シグナルペプチドをコードする配列を伴うヒト化５Ｃ１Ｈ４をコードする核酸配列である。
【００７５】
配列番号２３は、シグナルペプチドをコードする配列を伴うヒト化５Ｃ１Ｈ５をコードする核酸配列である。
【００７６】
配列番号２４は、マウス５Ｃ１成熟軽鎖可変領域配列である。
【００７７】
配列番号２５は、Ｋａｂａｔにより規定される５Ｃ１軽鎖ＣＤＲ１の配列である。
【００７８】
配列番号２６は、Ｋａｂａｔにより規定される５Ｃ１軽鎖ＣＤＲ２の配列である。
【００７９】
配列番号２７は、Ｋａｂａｔにより規定される５Ｃ１軽鎖ＣＤＲ３の配列である。
【００８０】
配列番号２８は、ヒトＶＬ受容体ＦＲ（アクセッション番号ＣＡＢ５１２９３．１）である。
【００８１】
配列番号２９は、ヒト化５Ｃ１Ｌ１の配列である。
【００８２】
配列番号３０は、ヒト化５Ｃ１Ｌ２の配列である。
【００８３】
配列番号３１は、ヒト化５Ｃ１Ｌ３の配列である。
【００８４】
配列番号３２は、ヒト化５Ｃ１Ｌ４の配列である。
【００８５】
配列番号３３は、シグナルペプチドをコードする配列を伴うヒト化５Ｃ１Ｌ１をコードする核酸配列である。
【００８６】
配列番号３４は、シグナルペプチドをコードする配列を伴うヒト化５Ｃ１Ｌ２をコードする核酸配列である。
【００８７】
配列番号３５は、シグナルペプチドをコードする配列を伴うヒト化５Ｃ１Ｌ３をコードする核酸配列である。
【００８８】
配列番号３６は、シグナルペプチドをコードする配列を伴うヒト化５Ｃ１Ｌ４をコードする核酸配列である。
【００８９】
配列番号３７は、例示的なヒトＩｇＧ１定常領域をコードする核酸配列である。
【００９０】
配列番号３８は、例示的なヒトＩｇＧ１定常領域をコードするアミノ酸配列である。
【００９１】
配列番号３９は、Ｎ末端アルギニンを欠く、例示的なヒトκ軽鎖定常領域をコードする核酸配列である。
【００９２】
配列番号４０は、Ｎ末端アルギニンを欠く、例示的なヒトκ軽鎖定常領域のアミノ酸配列である。
【００９３】
配列番号４１は、式（Ｇ４Ｓ）６Ｇ２を有するペプチドリンカーのアミノ酸配列である。
【００９４】
配列番号４２は、式（Ｇ４Ｓ）４を有するペプチドリンカーのアミノ酸配列である。
【００９５】
配列番号４３は、８Ｄ３エピトープマッピングペプチド３７３のアミノ酸配列である。
【００９６】
配列番号４４は、８Ｄ３エピトープマッピングペプチド３７４のアミノ酸配列である。
【００９７】
配列番号４５は、８Ｄ３エピトープマッピングペプチド３７５のアミノ酸配列である。
【００９８】
配列番号４６は、ＨＵ−ＩＧＧ１−ＨＣ−ＨＯＬＥのアミノ酸配列である。
【００９９】
配列番号４７は、ＨＵ−ＩＧＧ１−ＨＣ−ＫＮＯＢのアミノ酸配列である。
【０１００】
配列番号４８は、ＨＵ−ＩＧＧ１−ＨＣ−ＨＯＬＥ＿ＬＡＬＡＰＧのアミノ酸配列である。
【０１０１】
配列番号４９は、ＨＵ−ＩＧＧ１−ＨＣ−ＫＮＯＢ＿ＬＡＬＡＰＧのアミノ酸配列である。
【０１０２】
配列番号５０は、ＨＵ−ＩＧＧ１−ＨＣ−ＫＮＯＢ＿８Ｄ３−ｓｃＦａｂのアミノ酸配列である。
【０１０３】
配列番号５１は、ＨＵ−ＩＧＧ１−ＨＣ−ＫＮＯＢ＿ＬＡＬＡＰＧ＿８Ｄ３−ｓｃＦａｂのアミノ酸配列である。
【０１０４】
配列番号５２は、（Ｎ末端アルギニンを伴う）ＨＵ−ＩＧＫＡＰＰＡ−ＬＣのアミノ酸配列である。
【０１０５】
配列番号５３は、５Ｃ１−Ｈ４＿ＨＵ−ＩＧＧ１−ＨＣ−ＨＯＬＥのアミノ酸配列である。
【０１０６】
配列番号５４は、５Ｃ１−Ｈ４＿ＨＵ−ＩＧＧ１−ＨＣ−ＫＮＯＢのアミノ酸配列である。
【０１０７】
配列番号５５は、５Ｃ１−Ｈ４＿ＨＵ−ＩＧＧ１−ＨＣ−ＨＯＬＥ＿ＬＡＬＡＰＧのアミノ酸配列である。
【０１０８】
配列番号５６は、５Ｃ１−Ｈ４＿ＨＵ−ＩＧＧ１−ＨＣ−ＫＮＯＢ＿ＬＡＬＡＰＧのアミノ酸配列である。
【０１０９】
配列番号５７は、５Ｃ１−Ｈ４＿ＨＵ−ＩＧＧ１−ＨＣ−ＫＮＯＢ＿８Ｄ３−ｓｃＦａｂのアミノ酸配列である。
【０１１０】
配列番号５８は、５Ｃ１−Ｈ４＿ＨＵ−ＩＧＧ１−ＨＣ−ＫＮＯＢ＿ＬＡＬＡＰＧ＿８Ｄ３−ｓｃＦａｂのアミノ酸配列である。
【０１１１】
配列番号５９は、５Ｃ１−Ｌ３＿ＨＵ−ＩＧＫＡＰＰＡ−ＬＣのアミノ酸配列である。
【０１１２】
配列番号６０は、８Ｄ３−ｓｃＦａｂのアミノ酸配列である。
【０１１３】
配列番号６１は、８Ｄ３ＶＬ−ＨＵ−ＩＧＫＡＰＰＡ−ＬＣのアミノ酸配列である。
【０１１４】
配列番号６２は、８Ｄ３ＶＨ−ＨＵ−ＣＨ１のアミノ酸配列である。
【０１１５】
配列番号６３は、８Ｄ３ＶＬのアミノ酸配列である。
【０１１６】
配列番号６４は、８Ｄ３ＶＨのアミノ酸配列である。
【０１１７】
配列番号６５は、ＨＵ−ＣＨ１のアミノ酸配列である。
【０１１８】
配列番号６６は、ＩｇＧ１ Ｇ１ｍ３アロタイプの例示的なヒトＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列である。
【０１１９】
配列番号６７は、Ｃ末端のグリシンおよびリシン残基を除去したＨＵ−ＩＧＧ１−ＨＣ−ＫＮＯＢのアミノ酸配列である。
【０１２０】
配列番号６８は、Ｃ末端のグリシンおよびリシン残基を除去したＨＵ−ＩＧＧ１−ＨＣ−ＫＮＯＢ＿ＬＡＬＡＰＧのアミノ酸配列である。
【０１２１】
配列番号６９は、Ｃ末端のグリシンおよびリシン残基を除去した５Ｃ１−Ｈ４＿ＨＵ−ＩＧＧ１−ＨＣ−ＫＮＯＢのアミノ酸配列である。
【０１２２】
配列番号７０は、Ｃ末端のグリシンおよびリシン残基を除去した５Ｃ１−Ｈ４＿ＨＵ−ＩＧＧ１−ＨＣ−ＫＮＯＢ＿ＬＡＬＡＰＧのアミノ酸配列である。
【０１２３】
配列番号７１は、（Ｎ末端アルギニンを有する）ＨＵ−ＩＧＫＡＰＰＡ−ＬＣをコードする核酸配列である。
【０１２４】
配列番号７２は、ＩｇＧ１ Ｇ１ｍ３アロタイプの例示的なヒトＩｇＧ１定常領域をコードする核酸配列である。
【０１２５】
式Ｇ３Ｓ（Ｇ４Ｓ）３を有するペプチドリンカーのアミノ酸配列である。
【０１２６】
配列番号７４は、ヒトα−シヌクレインの残基１１８−１２６のアミノ酸である。
【０１２７】
配列番号７５は、ＩｇＧ１ Ｇ１ｍ３アロタイプの例示的なヒトＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列である。
【発明を実施するための形態】
【０１２８】
定義
基本的な抗体の構造単位は、サブユニットのテトラマーである。各テトラマーは、２つの同一のポリペプチド鎖のペアを含み、各ペアは１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）および１つの「重」鎖（約５０−７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分には、主に抗原認識を担う約１１０〜１１０以上のアミノ酸の可変領域が含まれる。最初に発現された際、本可変領域は一般的に切断可能なシグナルペプチドと繋がっている。シグナルペプチドのない可変領域は、時々、成熟可変領域と呼ばれる。従って、例えば、軽鎖成熟可変領域は、軽鎖シグナルペプチドのない軽鎖可変領域を意味する。各鎖のカルボキシ末端部分は、主にエフェクター機能を担う定常領域を規定している。定常領域は、ＣＨ１領域、ヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域のいずれかまたは全てを含み得る。
【０１２９】
軽鎖は、κ（kappa）またはλ（lambda）のいずれかに分類される。重鎖は、γ（gamma）、μ（mu）、α（alpha）、δ（delta）、またはε（epsilon）として分類され、それぞれ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥとして抗体のアイソトープを規定している。軽鎖および重鎖において、可変領域および定常領域は、約１２以上のアミノ酸の「Ｊ」領域により連結され、重鎖はまた、約１０以上のアミノ酸の「Ｄ」領域を含む（generally、Fundamental Immunology (Paul、W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y., 1989), Ch. 7) を参照されたい）（参照により、その全体が、あらゆる目的のために組み込まれる）。
【０１３０】
各重鎖／軽鎖の対の成熟可変領域が、抗体結合部位を形成する。二機能性抗体または二重特異性抗体を除いて、２つの結合部位は同一である。これらの鎖は全て、３つの、相補性決定領域またはＣＤＲとも呼ばれる超可変領域によって比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）が連結されるという、同一の全体構造を提示する。各対の２つの鎖のＣＤＲは、フレームワーク領域により整列し、特異的エピトープへの結合が可能になっている。Ｎ末端からＣ末端にかけて、軽鎖および重鎖は共に、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４の領域を含む。各領域へのアミノ酸の割当は、Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987 and 1991)、またはChothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Chothia et al., Nature 342:878-883 (1989) の規定に従っている。Ｋａｂａｔはまた、広く用いられる番号付け規則（Ｋａｂａｔナンバリング）を提供し、異なる重鎖間の、または異なる軽鎖間の、対応する残基には、同じ番号が割り当てられる（例えば、Ｈ８３は成熟重鎖可変領域の、Ｋａｂａｔナンバリングの位置８３を意味し：同様に、位置Ｌ３６は、成熟軽鎖可変領域のＫａｂａｔナンバリングの位置３６を意味する）。Ｋａｂａｔナンバリングは、他に明記しない限り、抗体の可変領域における位置を言及するのに、あらゆる場合に用いられる。
【０１３１】
「抗体」という用語には、完全な抗体およびその結合フラグメントが含まれる。一般的に、フラグメントは、標的への特異的結合に対して、フラグメントが由来する完全な抗体と競合する。フラグメントには、分離した重鎖、分離した軽鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）ｃ、Ｆｖ、単鎖抗体、および単一ドメイン抗体が含まれる。単一（可変）ドメイン抗体には、従来の抗体の、ＶＬパートナーから分離したＶＨ領域（またはその逆）(Ward et al., 1989, Nature 341: 544-546)、並びに、ＶＨ領域がＶＬ領域と会合していないラクダ科（Camelidae）または軟骨魚類(例えば、テンジクザメ)などの種由来のＶＨ領域（時にＶＨＨとして知られる）が含まれる（例えば、WO 9404678参照）。天然のパートナーから一本鎖が分離した単一ドメイン抗体は、時々Ｄａｂｓとして知られ、ラクダ科（Camelidae）または軟骨魚類由来の単一ドメイン抗体は時々、ナノボディとして知られる。定常領域または定常領域の一部は、単一ドメイン抗体に存在してもよく、または存在しなくてもよい。例えば、ラクダ科由来の天然の単一可変領域抗体には、ＶＨＨ可変領域、並びにＣＨ２およびＣＨ３定常領域が含まれる。単一ドメイン抗体、例えばナノボディは、従来の抗体と類似の手法により、ヒト化され得る。Ｄａｂｓ抗体はたいてい、ヒト起源の抗体から取得される。フラグメントは、組換えＤＮＡ技術、または完全免疫グロブリンの酵素的若しくは化学的分離により、生産される。
【０１３２】
「抗体」という用語にはまた、二重特異性抗体および／またはヒト化抗体が含まれる。二重特異性抗体または二機能性抗体は、２つの異なる重鎖／軽鎖ペアおよび２つの異なる結合部位を有する、人工のハイブリッド抗体である（例えば、Songsivilai and Lachmann、Clin. Exp. Immunol., 79:315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol. 148:1547-53 (1992)を参照されたい）。いくつかの二重特異性抗体において、２つの異なる重鎖／軽鎖ペアには、ヒト化５Ｃ１重鎖／軽鎖ペアと、５Ｃ１が結合するエピトープとは異なるα−シヌクレイン上のエピトープに特異的な重鎖／軽鎖ペアとが含まれる。
【０１３３】
いくつかの二重特異性抗体において、１つの重鎖軽鎖ペアは、以下にさらに開示されるヒト化５Ｃ１抗体であり、重鎖軽鎖ペアは、血液脳関門上に発現する受容体、例えばインスリン受容体、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）受容体、レプチン受容体、またはリポタンパク質受容体、またはトランスフェリン受容体に、結合する抗体由来である(Friden et al., PNAS 88:4771-4775, 1991; Friden et al., Science 259:373-377, 1993)。これらの二重特異性抗体は、受容体媒介経細胞輸送により、血液脳関門を通過して輸送され得る。二重特異性抗体の脳への取り込みは、二重特異性抗体を、血液脳関門受容体への親和性を減少させるように設計することにより、さらに増強され得る。当該受容体への親和性の減少は、脳へのより広範囲への分布をもたらした（例えば、Atwal. et al. Sci. Trans. Med. 3, 84ra43, 2011; Yu et al. Sci. Trans. Med. 3, 84ra44, 2011を参照されたい）。
【０１３４】
例示的な二重特異性抗体はまた、（１）軽鎖および重鎖がそれぞれ、短いペプチド結合によりタンデムになった２つの可変ドメインを含む、二重可変ドメイン抗体（ＤＶＤ−Ｉｇ）(Wu et al., Generation and Characterization of a Dual Variable Immunogloblin (DVD-IgTM) Molecule, In: Antibody Engineering, Springer Berlin Heidelberg (2010))；（２）２つの一本鎖二重特異性抗体の融合物であって、その結果それぞれの標的抗原に対して２つの結合部位を有する四価の二重特異性抗体となっている、Ｔａｎｄａｂ；（３）ｓｃＦｖと二重特異性抗体との組み合わせであって、その結果多価分子となっている、ｆｌｅｘｉｂｏｄｙ；（４）Ｆａｂに適用されたときに、異なるＦａｂフラグメントに繋がった２つの同一のＦａｂフラグメントからなる三価の二重特異性の結合タンパク質を生成する、プロテインキナーゼＡの「二量体化およびドッキングドメイン」に基づく、いわゆる「ドックアンドロック（dock and lock）」分子；（５）例えば、ヒトＦｃ領域の両末端に融合した２つのｓｃＦｖを含む、いわゆるスコーピオン分子（Scorpion molecule）、でもあり得る。二重特異性抗体の調製に有用なプラットホームの例には、ＢｉＴＥ（Ｍｉｃｒｏｍｅｔ）、ＤＡＲＴ（ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ）、ＦｃａｂおよびＭａｂ２（Ｆ−ｓｔａｒ）、Ｆｃ操作ＩｇＧｌ（Ｘｅｎｃｏｒ）またはＤｕｏＢｏｄｙ（Ｆａｂアーム交換に基づく、Ｇｅｎｍａｂ）が含まれる。
【０１３５】
「抗原」は、抗体が特異的に結合するエンティティーである。
【０１３６】
「エピトープ」という用語は、抗体が結合する抗原上の部位を指す。タンパク質抗原では、エピトープは、近接アミノ酸、または１つ以上のタンパク質の三次フォールディングにより並置された非近接のアミノ酸から、形成され得る。近接のアミノ酸から形成されるエピトープは、一般的に、変性溶媒にさらされた状態で保持され、一方、三次フォールディングにより形成されるエピトープは、一般的に、変性溶媒の処理により失われる。エピトープには、一般的に、特有の空間的コンフォメーションにおいて、少なくとも２つ、３つ、およびたいていはそれ以上、少なくとも５つまたは８−１０アミノ酸が含まれる。エピトープの空間的コンフォメーションを決定する方法には、例えば、Ｘ線結晶構造解析および二次元核磁器共鳴が含まれる。例えば、Methods in Molecular Biology, Vol．66, Glenn E．Morris, Ed．(1996)のEpitope Mapping Protocolsを参照されたい。エピトープには、Ｃ末端残基またはＮ末端残基が含まれ得る。エピトープにはまた、ポリペプチドの遊離アミノ基、またはポリペプチドの遊離カルボキシル基が含まれ得るが、含まれる必要はない。このように、エピトープには、Ｃ末端残基またはＮ末端残基が含まれ得るが、必ずしも遊離カルボキシル基または遊離アミノ基のそれぞれが、含まれない。抗体の結合特異性は、時にアミノ酸の範囲で規定される。抗体が、配列番号１のアミノ酸１１８−１２６内のエピトープに結合すると言われる場合、例えば、意味するところは、そのエピトープが、範囲の外側の限界を規定するアミノ酸を含め列挙されたアミノ酸の範囲内であるということである。範囲内の全てのアミノ酸が、エピトープの一部を構成することを意味するのではない。従って、例えば、配列番号１のアミノ酸１１８−１２６内のエピトープが、配列番号１の他の区分の、アミノ酸１１８−１２４、１１９−１２５、１２０−１２６、１２０−１２４、または１２０−１２２で構成されてもよい。
【０１３７】
同一の、または重複するエピトープを認識する抗体は、ある抗体が別の抗体の標的抗原に対する結合と競合する能力を示す、単純な免疫アッセイで、同定され得る。抗体のエピトープは、接触する残基を決定するための、抗原に結合する抗体のＸ線結晶構造解析により規定され得る（エピトープは接触する残基により規定される）。あるいは、ある抗体の結合を減らすか、または取り除く、抗原における全てのアミノ酸変異が、他の抗体の結合を減らすか、または取り除く場合、２つの抗体は、同じエピトープを有する。
【０１３８】
抗体間の競合は、供試の抗体が共通抗原に対する参照抗体の特異的結合を抑制するアッセイにより決定される。例えば、Junghans et al．(1990)、Cancer Res. 50:1495を参照されたい。競合的結合アッセイで測定したとき、過剰の試験抗体（例えば、少なくとも２倍、５倍、１０倍、２０倍または１００倍）が、参照抗体の結合を少なくとも５０％、７５％、９０％、９５％、９８％、または９９％抑制する場合、試験抗体は参照抗体と競合する。競合アッセイにより同定された抗体（競合抗体）には、参照抗体と同じエピトープに結合する抗体、および参照抗体が結合するエピトープに対し、立体障害を生じるのに十分近位の近接したエピトープに結合する抗体が含まれる。
【０１３９】
抗体は、一般的に、少なくとも１０６、１０７、１０８、１０９、または１０１０Ｍ−１の親和性定数で、指定された標的に結合する。この結合は、検出可能な程度に高く、少なくとも１つの無関係な標的に対して生じる非特異的結合から区別可能な、特異的結合である。特異的結合は、特定の官能基間の結合または特定の空間的適合（例えば、鍵と鍵穴タイプ）の形成の結果であり得、一方、非特異的結合は、たいていファンデルワールス力の結果である。特異的結合は、しかしながら、モノクローナル抗体が唯一の標的に結合することを必ずしも意味するのではない。
【０１４０】
抗体の配列を比較する際、配列同一性パーセントは、Ｋａｂａｔナンバリング規則により最大限配列された抗体配列で決定される。アライメント後、対象の抗体領域（例えば、重鎖または軽鎖の全体成熟可変領域）を、参照抗体の同じ領域と比較した場合、対象抗体および参照抗体の領域間の配列同一性パーセントは、対象抗体および参照抗体の両方の領域における同じアミノ酸が占める位置の数を、ギャップを計算に入れずに、２つの領域の整列した位置の全ての数で割って、パーセントに変換するための１００を乗じた数である。
【０１４１】
保存的、または非保存的としてアミノ酸置換を分類する目的で、アミノ酸を次のようにグループ化する：グループＩ（疎水性側鎖）：ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；グループＩＩ（中性親水性側鎖）：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；グループＩＩＩ（酸性側鎖）：ａｓｐ、ｇｌｕ；グループＩＶ（塩基性側鎖）：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；グループＶ（鎖配向に影響を与える残基）：ｇｌｙ、ｐｒｏ；およびグループＶＩ（芳香族性側鎖）：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。保存的置換には、同じクラス内のアミノ酸間の置換が包含される。非保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーを、別のクラスのメンバーと交換することにより構成される。
【０１４２】
モノクローナル抗体は、一般的に、単離した形態で提供される。このことは、抗体が一般的に、その生産または精製から生じる妨害タンパク質および他の夾雑物に対して、少なくとも５０％ｗ／ｗの純度であることを意味するが、薬剤を、過剰量の、薬学的に許容される担体またはその使用を促進することを意図した他の担体と組み合わせる可能性を除外しない。時々、モノクローナル抗体は、これらのモノクローナル抗体の、または他のタンパク質および夾雑物の、凝集体またはフラグメントに対し、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％ｗ／ｗの純度である。いくつかのこれらのモノクローナル抗体は、凝集体またはフラグメントを含んでもよいが、他のタンパク質および夾雑物に対し、少なくとも９９％ｗ／ｗの純度である。
【０１４３】
１つ以上の列挙される要素を「含む」組成物または方法は、具体的に列挙されていない他の要素を含んでも良い。例えば、抗体を「含む」組成物は、抗体を単独で含んでもよく、または他の成分と組み合わせて含んでもよい。
【０１４４】
値の範囲の指定には、当該範囲内の全ての整数または当該範囲を規定する全ての整数、および当該範囲内の整数により規定される全ての小範囲が含まれる。
【０１４５】
特に文脈から明らかでない限り、「約」という用語は、記載された値の測定値の誤差範囲内の値（平均値の標準誤差（ＳＥＭ））を包含する。
【０１４６】
統計学的有意性は、ｐ≦０．０５を意味する。
【０１４７】
「患者」には、予防的または治療的処置のいずれかを受ける、ヒトまたは他の哺乳動物の対象が含まれる。
【０１４８】
リスク因子を有する個体がリスク因子を有さない個体と比較してある疾患を発症するリスクが統計学的に顕著に高いとされるリスク因子（例えば、遺伝的、生化学的、家族歴、さらされる状況（situational exposure））を対象が少なくとも１つ有する場合、その個体は当該疾患のリスクが上昇している。
【０１４９】
「症状」という用語は、例えば歩行の変化などの、患者が気付いた、疾患の主観的証拠を指す。「徴候」という用語は、医師により観察された疾患の客観的証拠を指す。
【０１５０】
「認知機能」という用語は、例えば、注意、記憶、言語の作成並びに理解、問題解決、および環境並びにセルフケアに関心を持つことの、いずれかまたは全ての精神機能を指す。
【０１５１】
「認知機能の増強」または「認知機能の改善」とは、ベースライン（例えば、診断または処置の開始時）と比較した改善をを指す。「認知機能の低下」とは、このベースラインと比較した機能の低下を指す。
【０１５２】
ラットまたはマウスなどの動物モデルシステムにおいて、認知機能は、対象が空間情報を使用する迷路（モリス水迷路、バーンズ円形迷路、高架式放射状迷路、Ｔ迷路など）、恐怖条件付け、能動的回避、照明オープンフィールド、暗所活動度計、高架式十字迷路、２コンパートメント探索試験、または、強制水泳試験などを使用する方法によって、測定してよい。
【０１５３】
ヒトにおいて、認知機能は、いくつかの標準試験のうちの１つ以上によって、測定できる。認知機能の試験またはアッセイの例は記載されており（Ruoppila and Suutama, Scand. J. Soc. Med. Suppl. 53, 44-65, 1997）、それには、標準心理試験（例えば、Wechsler Memory Scale, the Wechsler Adult Intelligence Scale, Raven's Standard Progressive Matrices, Schaie-Thurstone Adult Mental Abilities Test）、神経心理検査（例えば、Luria-Nebraska）、メタ認知自己評価（例えば、Metamemory Questionnaire）、視覚空間アッセイ試験（例えば、Poppelreuter's Figures, Clock Recognition, Honeycomb Drawing and Cancellation）、認知アッセイ試験（例えば、Folstein's Mini Mental State Test）、および、反応時間検査が含まれる。他の認知能力の標準試験には、アルツハイマー病評価尺度−認知サブスケール（ＡＤＡＳ−ｃｏｇ）；臨床的全般的印象の変化尺度（ＣＩＢＩＣ−ｐｌｕｓ ｓｃａｌｅ）；アルツハイマー病共同研究の日常生活動作の評価（ＡＤＣＳ−ＡＤＬ）；ミニメンタルステート検査（ＭＭＳＥ）；神経精神症状評価法（ＮＰＩ）；臨床的認知症重症度判定尺度（ＣＤＲ）；ケンブリッジ神経心理学自動検査バッテリー（ＣＡＮＴＡＢ）、または、Ｓａｎｄｏｚ臨床評価−老人病（ＳＣＡＧ）、ストループ検査、トレイルメイキング、ウェクスラー数字復唱検査(Wechsler Digit Span)、およびＣｏｇＳｔａｔｅコンピュータ化認識試験が含まれる。さらに、認識機能は、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）、機能的磁気共鳴画像法（ｆＭＲＩ）、単光子放射型コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）、または、脳機能の測定を可能にする他のあらゆるイメージング技術などの、イメージング技術を用いて測定してもよい。
【０１５４】
「遺伝子導入混合物」は、任意の方法により細胞外の核酸を宿主細胞に導入する上で必要な薬剤の、任意の組み合わせである。これらの方法には、例えば、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介遺伝子導入、ポリブレン媒介遺伝子導入、エレクトロポレーション、微量注入法、微粒子銃法（microparticle bombardment）、リポソーム融合、リポフェクション、プロトプラスト融合、レトロウイルス感染、ウイルス形質導入、および遺伝子銃が含まれる。
【０１５５】
単数形の、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」の記述には、文脈が他に明確に示さない限り、複数形の参照が含まれる。例えば、「化合物」または「少なくとも１つの化合物」には、複数の化合物が含まれ得、それらの混合物が含まれる。
【０１５６】
詳細な説明
Ｉ．概要
本発明は、モノクローナル抗体５Ｃ１または関連抗体、例えばα−シヌクレイン上の同じエピトープに結合する抗体を、ＢＢＢを形成する細胞上の受容体（血液脳関門受容体、またはＢＢＢ受容体）に結合する一価の結合エンティティーに連結させることにより形成される、血液脳関門（ＢＢＢ）シャトルを提供する。本発明の実施はメカニズムの理解に左右されないが、一価の結合エンティティーの血液脳関門受容体への結合は、抗体の血液脳関門の通過を促進する。抗体は、例えば、α−シヌクレインの蓄積に関連する障害(例えば、シヌクレイン病）を治療するのに有用である。これらの障害には、レビー小体病、例えばパーキンソン病、びまん性レビー小体病（ＤＬＢＤ）、レビー小体型アルツハイマー病（ＬＢＶ）、アルツハイマー病およびパーキンソン病の併発、および純粋自律神経失調症、ならびに多系統萎縮症（ＭＳＡ）が含まれる。抗体はまた、シヌクレイン病の診断に有用である。
【０１５７】
ＩＩ．標的分子
天然のヒト野生型α−シヌクレインは、配列番号１のアミノ酸配列を有する１４０アミノ酸のペプチドである（Ueda et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:11282-6, 1993; GenBank アクセッション番号: P37840）。当該タンパク質は、３つの認識ドメイン、アミノ酸１−６１をカバーするＫＴＫＥ反復ドメイン、アミノ酸約６０−９５から始まるＮＡＣ（非アミロイド成分）ドメイン、およびアミノ酸約９８−１４０から始まるＣ末端酸性ドメインを有する。Jensen et al. (1995) は、ＮＡＣが配列番号２のアミノ酸配列を有すると報告した (Jensen et al., Biochem. J. 310.1: 91-94; GenBank アクセッション番号 S56746) 。しかしながら、Ueda et al. (1993)は、ＮＡＣが配列番号３のアミノ酸配列を有すると報告した(Ueda et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:11282-6) 。
【０１５８】
特に文脈から明らかでない限り、α−シヌクレインまたはそのフラグメントへの言及には、上に示した天然のヒト野生型アミノ酸配列、およびそのヒト対立遺伝子変異型が含まれ、特にレビー小体およびパーキンソン病の家族性遺伝型に関連するヒト対立遺伝子変異型が含まれる（例えば、Ｅ４６Ｋ、Ａ３０ＰおよびＡ５３Ｔであり、最初の文字は配列番号１におけるアミノ酸であり、数字は配列番号１におけるコドンの位置であり、二番目の文字は対立遺伝子多型におけるアミノ酸である）。これらの変異体は、場合により、独立して、または任意の組み合わせで存在する。α−シヌクレイン凝集を増強する、誘導された変異Ｅ８３Ｑ、Ａ９０Ｖ、Ａ７６Ｔはまた、独立して、または互いに組み合わせて、および／またはヒト対立遺伝子多型Ｅ４６Ｋ、Ａ３０ＰおよびＡ５３Ｔと組み合わせて、存在し得る。
【０１５９】
ＩＩＩ．レビー小体疾患および他のシヌクレイン病
レビー小体疾患（ＬＢＤ）、特にパーキンソン病は、ドーパミン作動系の変性、運動変化、認知障害、およびレビー小体（ＬＢ）の形成を特徴とする(McKeith et al., Neurology (1996) 47:1113-24)。レビー小体は、神経細胞に見られる球状タンパク質沈着物である。脳におけるこれらの存在は、アセチルコリンおよびドーパミンを含む化学伝達物質の作用を遮断して、脳の正常な機能を妨害する。レビー小体病には、パーキンソン病（特発性パーキンソン病を含む）、びまん性レビー小体病（ＤＬＢＤ）（レビー小体型認知症（ＤＬＢ）としてもまた知られる）、レビー小体型アルツハイマー病（ＬＢＶ）、およびアルツハイマー病およびパーキンソン病の併発が含まれる。ＤＬＢＤは、アルツハイマー病およびパーキンソン病の双方と症状が同じである。ＤＬＢＤは、主に、シヌクレイン病が最初に観察される脳の領域においてパーキンソン病と異なる。ＤＬＢＤでは、レビー小体は最初に皮質に形成される。パーキンソン病では、レビー小体は、中脳および脳幹、例えば黒質に生じる。両障害において、病状は、時空間的に規定された方法で、脳の他の領域まで慢性的に進行する。他のレビー小体病には、純粋自律神経失調症、レビー小体嚥下障害、偶発性ＬＢＤ、および遺伝性ＬＢＤ（例えば、α−シヌクレイン遺伝子、ＰＡＲＫ３およびＰＡＲＫ４の変異）が含まれる。多系統萎縮症（ＭＳＡ；例えば、オリーブ橋小脳萎縮症、線条体黒質変性症およびシャイ・ドレーガー症候群）は、オリゴデンドロサイトが、α−シヌクレインの細胞内沈着と同時に神経筋伝達の機能障害により影響されているシヌクレイン病である。
【０１６０】
ＩＶ．抗体
Ａ．結合特異性および機能特性
５Ｃ１は、本明細書に記載される脳シャトルに組み込まれるための例示的な抗体である。その重鎖および軽鎖成熟可変領域は、配列番号９および配列番号２４に、それぞれ示されている。組み込まれ得る他の抗体には、５Ｃ１と同じエピトープに結合する抗体が含まれる。これらの抗体は、同様の機能特性、例えばα−シヌクレインの神経細胞の凝集体の減少、認知機能の改善、および／またはシナプスの密度および／または樹状突起の密度の維持などを、有し得る。５Ｃ１抗体および関連抗体を記述する先の出願には、２０１３年１０月８日に出願されたＰＣＴ国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／６３９４５、および２０１２年１０月８日に出願された米国特許出願第６１／７１１，２０４、２０１２年１０月２６日に出願された米国特許出願第６１／７１９，２８１、２０１３年６月２７日に出願された米国特許出願第６１／８４０，４３２、２０１３年８月３０日に出願された米国特許出願第６１／８７２，３６６および２０１３年１０月８日に出願された米国特許出願第１４／０４９，１６９が含まれ、これらは全て、あらゆる目的のために、その全体が参照により組み込まれる。
【０１６１】
この結合特異性を有する他の抗体は、マウスまたは他の動物(例えば、モルモット、霊長類、ウサギ、またはラット)を、α−シヌクレインまたはそのフラグメント（例えば、アミノ酸残基１１８−１２６、またはその一部を含むフラグメント）で免疫化することにより生産され得る。Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (CSHP NY、1988)を参照されたい。この免疫原は、天然の供給源から取得されるか、ペプチド合成により取得されるか、または組換え発現により取得され得る。免疫原は、場合により、担体タンパク質と融合されて、あるいは他の方法で複合体化されて、投与され得る。免疫原は、場合により、アジュバントと一緒に投与され得る。フロイント完全アジュバントに続けて不完全アジュバントが、実験動物の免疫化に使用され得る。ウサギまたはモルモットは、一般的に、ポリクローナル抗体を作成するために使用される。マウスは一般的に、モノクローナル抗体を作成するために使用される。得られた抗体は、α−シヌクレインへの結合で、場合により、５Ｃ１との競合で、選別され得る。抗体はまた、以下における効果で、選別され得る：（１）例えばモリス水迷路（ＭＷＭ）試験または水平ビームテストなどの行動学的アッセイ、および／または脳組織における、α−シヌクレイン、α−シヌクレイン凝集、シナプトフィジン、ＭＡＰ２、および／またはＰＳＤ９５を検出するための免疫学的アッセイを受けた、α−シヌクレイン形質導入げっ歯類モデルにおける効果で選別され；（２）例えばモリス水迷路（ＭＷＭ）試験または水平ビームテストなどの行動学的アッセイ、および／または脳組織におけるα−シヌクレイン、α−シヌクレイン凝集、シナプトフィジン、ＭＡＰ２、および／またはＰＳＤ９５を検出するための免疫学的アッセイを用いて、α−シヌクレイン蓄積を特徴とする疾患のための、げっ歯類または他の非ヒト動物モデルにおける効果で選別され；および／または（３）適切な行動学的アッセイを用いて、α−シヌクレイン蓄積に関連する症状を有するヒトにおける効果で選別され得る。前述の手法のいずれかの代わりに、またはそれに加えて、抗体は、変異性の変化のコレクションに対して、５Ｃ１と同じ、または同様の結合プロファイルを示す抗体を同定するために、α−シヌクレインの変異導入された形態に対して、選別することができる。変異は、一度に１つの残基の、またはα−シヌクレイン全体にわたる、若しくはエピトープが存在すると知られているα−シヌクレインの部分（例えば残基１１８−１２６）にわたる、より広い間隔が空いた、アラニン（あるいは、アラニンがすでに存在する場合は、セリン）による体系的な置換であり得る。
【０１６２】
図６−８および実施例６は、残基１１８−１２６内に結合する他の２つの抗体、すなわち９Ｅ４および５Ｄ１２と比較して、５Ｃ１のエピトープを特徴付けている。アラニン変異導入により、α−シヌクレインの残基１１８−１２６において、１つずつ、個々のアミノ酸に変異導入する影響を試験している。残基１１８−１２６内の様々なアミノ酸の変異により引き起こされる、結合親和性（言い換えると、結合への寄与）の相対的な変化のプロファイルは、エピトープを特徴付ける。５Ｃ１にとって、残基１２０−１２２のいずれかの変異導入は、最大の結合の減少を示す。残基１２３または１２４の変異導入は、結合の顕著な減少をもたらすが、位置１２０−１２２のいずれかの変異には及ばない。残基１１８、１１９、１２５または残基１２６の変異導入は、結合親和性の減少をほとんど示さず、本質的には変化しない。簡単にするために、変異導入の効果をおよそ３つのカテゴリーに細分することができる：残基１２０−１２２の結合が本質的に完全に減少するカテゴリー（ネガティブコントロールと区別できない）、残基１１８、１１９、１２５および１２６の結合が本質的には減少しないカテゴリー（ポジティブコントロールと区別できない）、残基１２３および１２４の結合親和性が中程度に減少するカテゴリー。それゆえに、５Ｃ１のエピトープは、配列番号１の残基１２０−１２４からなる、または本質的になる直線状エピトープとして、おおよそ特徴づけることができ、残基１２０−１２２が結合に最大に寄与する。本段落の記述のいずれかで特徴づけられる５Ｃ１エピトープを有する抗体が、提供される。いくつかの抗体は、残基１２０−１２２から本質的になり、かつ残基１１９−１２０を含まないエピトープにより特徴付けられ、このことは、残基１２０−１２２がそれぞれ、他のいずれの残基よりも結合に寄与していること、および残基１１９および１２０が結合への（例えば実施例のアラニンスキャニング法により）検出可能な寄与を示さないことを意味している。残基１２３および１２４は、これらの抗体における結合に小さく寄与してもよいし、しなくてもよい。
【０１６３】
選択したマウス抗体の結合特異性を有する抗体（例えば、５Ｃ１）はまた、ファージディスプレイ法の変形を用いて生産され得る。Winter, WO 92/20791を参照されたい。本方法は、特に、ヒト抗体の生産に適している。本方法において、選択したマウス抗体の重鎖または軽鎖可変領域のいずれかが、出発物質として用いられる。例えば、軽鎖可変領域が出発物質として選択された場合、ファージライブラリーは、同じ軽鎖可変領域（すなわち、マウス出発物質）と異なる重鎖可変領域を提示するメンバーで構成される。例えば、重鎖可変領域は、再構成された重鎖可変領域のライブラリーから取得され得る。α−シヌクレインに強い特異的結合（例えば、少なくとも１０８Ｍ−１または１０９Ｍ−１）を示すファージが選択される。その後、当該ファージ由来の重鎖可変領域は、さらなるファージライブラリーを構成するための出発物質としての役割を果たす。このライブラリーにおいて、各ファージは同じ重鎖可変領域（最初のディスプレイライブライブラリーから同定された領域）および異なる軽鎖可変領域を提示する。例えば、軽鎖可変領域は、最構成されたヒト可変軽鎖領域のライブラリーから取得され得る。この場合も、α−シヌクレインに強い特異的結合を示すファージが選択される。結果として得られた抗体はたいてい、マウス出発物質と同じまたは同様のエピトープ特異性を有する。
【０１６４】
他の抗体は、例示される抗体、例えば５Ｃ１の重鎖および軽鎖をコードするｃＤＮＡの変異導入により取得され得る。従って、成熟重鎖および軽鎖可変領域のアミノ酸配列において５Ｃ１と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であり、かつその機能特性を維持するモノクローナル抗体、および／または少数の機能的に重要でないアミノ酸の置換（例えば、保守的な置換）、欠失、または挿入により各抗体から異なる抗体もまた、本発明に含まれる。
【０１６５】
全体的にまたは実質的に５Ｃ１に由来するＣＤＲのうち、いくつかまたは全て（例えば、３、４、５および６つ）を有する抗体は、本明細書に記載される脳シャトルに組み込まれ得る。これらの抗体は、５Ｃ１の重鎖可変領域に全体的にまたは実質的に由来するＣＤＲを少なくとも２つ、およびたいていは３つ全て有する重鎖可変領域、および／または５Ｃ１の軽鎖可変領域に全体的にまたは実質的に由来するＣＤＲを少なくとも２つ、およびたいていは３つ全て有する軽鎖可変領域を含み得る。当該抗体は、重鎖および軽鎖を共に含み得る。ＣＤＲが、４、３、２または１つ以下の置換、挿入または欠失を含む場合、ＣＤＲは対応する５Ｃ１ ＣＤＲに実質的に由来するが、ＣＤＲＨ２（Ｋａｂａｔにより規定された）は、６、５、４、３、２、または１つ以下の置換、挿入または欠失を有し得る。これらの抗体は、成熟重鎖および／または軽鎖可変領域のアミノ酸配列において５Ｃ１と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有し、かつその機能特性を維持し得、かつ／または、少数の機能的に重要でないアミノ酸の置換（例えば、保守的な置換）、欠失、または挿入により５Ｃ１から異なり得る。
【０１６６】
いくつかの抗体は、５Ｃ１と同様の機能的活性、例えば、神経突起および／または軸索のα−シヌクレイン凝集体の減少、神経突起のジストロフィーの減少、認知機能の改善、認知低下の回復、治療または抑制、および／またはシナプスの密度および／または樹状突起の密度の維持または増加を示す。
【０１６７】
Ｂ．キメラ抗体およびベニヤ抗体
非ヒト抗体、特に５Ｃ１のキメラおよびベニヤの形態は、本明細書に記載される脳シャトルに組み込まれ得る。
【０１６８】
キメラ抗体は、非ヒト抗体（例えば、マウス）の軽鎖および重鎖の成熟可変領域がヒト軽鎖および重鎖定常領域と組み合わされた抗体である。一般的に、軽鎖および重鎖定常領域はヒト由来であるが、定常領域は必要に応じて（例えば、適切な動物モデルにおいて非ヒト抗体の試験を促進させるために）異なる非ヒト種に由来し得る。これらの抗体は実質的にまたは全体的にマウス抗体の結合特異性を保持し、およびヒト定常領域が寄与するヒト配列の約３分の２であり得る。
【０１６９】
ベニヤ抗体は、非ヒト抗体のＣＤＲのうちのいくつかおよびたいてい全て、および非ヒト可変領域フレームワーク残基のうちのいくつかを保持するが、Ｂ細胞またはＴ細胞のエピトープに寄与し得る他の可変領域フレームワーク残基、例えば曝露残基（exposed residues）(Padlan, Mol．Immunol．28:489、1991)を、ヒト抗体配列の対応する位置の残基と置換している、ヒト化抗体の１つのタイプである。結果として得られるのは、ＣＤＲが全体的にまたは実質的に、非ヒト抗体に由来しており、非ヒト抗体の可変領域フレームワークが置換により、よりヒト様に作成されている抗体である。
【０１７０】
Ｃ．ヒト化抗体
ヒト化５Ｃ１抗体は、ヒトα−シヌクレインに特異的に結合する。いくつかのヒト化抗体の親和性（すなわちＫａ）は、例えば、マウス５Ｃ１抗体の親和性の５または２の倍数の範囲内であり得る。いくつかのヒト化抗体は、実験誤差の範囲内で、マウス５Ｃ１と同じ親和性を有する。いくつかのヒト化抗体は、マウス５Ｃ１よりも大きな親和性を有する。いくつかのヒト化抗体は、同じエピトープに結合する、および／またはヒトα−シヌクレインへの結合について、マウス５Ｃ１と競合する。
【０１７１】
ヒト化抗体は、非ヒト「ドナー」抗体（例えば、マウス５Ｃ１）由来のＣＤＲが、ヒト「アクセプター」抗体配列に移植された、遺伝子操作された抗体である（例えば、Queen, US 5,530,101および5,585,089; Winter, US 5,225,539、Carter, US 6,407,213、Adair, US 5,859,205 6,881,557、Foote, US 6,881,557参照）。アクセプター抗体配列は、例えば、成熟ヒト抗体配列、これらの配列の複合体、ヒト抗体配列のコンセンサス配列、または生殖系列領域配列（germline region sequence）であり得る。従って、ヒト化５Ｃ１抗体は、全体的にまたは実質的にマウス５Ｃ１抗体に由来するＣＤＲのいくつかまたは全て、および、存在する場合、全体的にまたは実質的にヒト抗体配列に由来する可変領域フレームワーク配列並びに定常領域を有する。同様に、ヒト化重鎖は、全体的にまたは実質的にドナー抗体重鎖に由来する少なくとも２つのＣＤＲおよびたいていは３つ全てのＣＤＲ、並びに、実質的にヒト重鎖可変領域フレームワークおよび定常領域配列に由来する、重鎖可変領域フレームワーク配列および重鎖定常領域（存在する場合）を有する。同様に、ヒト化軽鎖は、全体的にまたは実質的に、ドナー抗体軽鎖に由来する、少なくとも２つのＣＤＲおよびたいてい３つ全てのＣＤＲ、並びに、実質的にヒト軽鎖可変領域フレームワークおよび定常領域配列に由来する、軽鎖可変領域フレームワーク配列および軽鎖定常領域（存在する場合）を有する。ナノボディおよびｄＡｂｓ以外、ヒト化抗体はヒト化重鎖およびヒト化軽鎖を含む。（Ｋａｂａｔによって規定される）対応する残基の少なくとも８５％、９０％、９５％または１００％がそれぞれのＣＤＲ間で同一であるとき、ヒト化抗体のＣＤＲは、実質的に、非ヒト抗体の対応するＣＤＲに由来する。抗体鎖の可変領域フレームワーク配列または抗体鎖の定常領域は、Ｋａｂａｔによって規定される対応する残基の少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％が同一のとき、実質的に、それぞれヒト可変領域フレームワーク配列またはヒト定常領域に由来する。
【０１７２】
ヒト化抗体はしばしば、マウス抗体由来の、６つ全てのＣＤＲ（好ましくはＫａｂａｔにより規定された）を組み込んでいるが、ヒト化抗体はまた、マウス抗体由来の全てのＣＤＲより少ないＣＤＲ（少なくとも３、４、または５つ）で作成され得る（例えば、Pascalis et al.,J.Immunol.169:3076, 2002; Vajdos et al., Journal of Molecular Biology, 320: 415-428,2002; Iwahashi et al.,Mol.Immunol.36:1079-1091, 1999; Tamura et al, Journal of Immunology,164:1432-1441,2000）。
【０１７３】
いくつかの抗体において、特異性決定残基（ＳＤＲ）と名付けられている(Kashmiri et al., Methods (2005) 36(1):25-34)、ＣＤＲの一部のみ、すなわち結合に必要なＣＤＲ残基のサブセットが、ヒト化抗体において結合を維持するのに必要である。抗原と接触していないＣＤＲ残基およびＳＤＲにないＣＤＲ残基は、以前の研究（例えば、ＣＤＲ Ｈ２の、残基Ｈ６０−Ｈ６５の１つ以上、または全てが、時々必要でない）に基づき、コチア超可変ループ(Chothia, J. Mol. Biol. 196:901 (1987))の外側にあるＫａｂａｔ ＣＤＲの領域から、分子モデル化により、および／または経験的に、またはGonzales et al., Mol. Immunol. 41: 863、2004に記載されるように、同定することができる。これらのヒト化抗体において、１つ以上のドナーＣＤＲ残基が存在しない位置、またはドナーＣＤＲ全体が除かれた位置において、その位置を占めるアミノ酸は、アクセプター抗体配列の対応する位置（Ｋａｂａｔナンバリングによる）を示すアミノ酸であり得る。含んでいるＣＤＲにおいて、アクセプターをドナーアミノ酸へこのように置換する数は、競合する考慮点のバランスを反映する。このような置換は、ヒト化抗体のマウスアミノ酸の数を減らし、結果として潜在的な免疫原性を低下させるのに、潜在的に有利である。しかしながら、置換はまた、親和性の変化を引き起こし得、親和性の顕著な低下は、好ましくは避けられる。ＣＤＲ内の置換の位置、および、置換されるアミノ酸はまた、経験的に選択できる。
【０１７４】
ヒトアクセプター抗体配列は、場合により、ヒトアクセプター配列可変領域フレームワークおよび対応するドナー抗体鎖の可変領域フレームワークの間の高い配列同一性（例えば、６５％）を提供するために、多くの既知のヒト抗体配列から選択され得る。
【０１７５】
ヒト可変領域フレームワーク残基に由来するアミノ酸には、ＣＤＲコンフォメーションおよび／または抗原への結合に影響を及ぼすそれらの可能性に基づいて、置換のために選択し得るものがある。そのような影響の可能性は、モデル化すること、特定位置のアミノ酸の特性を試験すること、特定アミノ酸の置換または変異の影響を実験的に観察すること、によって調べられる。
【０１７６】
例えば、マウス成熟可変領域フレームワーク残基と選択したヒト成熟可変領域フレームワーク残基とでアミノ酸が異なるとき、ヒトフレームワークアミノ酸は、そのアミノ酸が、
（１）非共有結合で抗原に直接結合する、
（２）ＣＤＲ領域に隣接する、
（３）他の態様でＣＤＲ領域と相互作用する（例えば、ＣＤＲ領域の約６Å以内に位置する）、（例えば、相同な既知の免疫グロブリン鎖の解析された構造上の軽鎖または重鎖をモデル化することにより同定される）
（４）重鎖と軽鎖との相互作用を媒介する残基である、
と合理的に期待できるときには、マウス抗体由来の等価なフレームワークアミノ酸で置換することができる。
【０１７７】
Queen,US 5,530,101により規定されたクラス（１）−（３）由来のフレームワーク残基は、時には代わりに、カノニカル（canonical）およびバーニヤ（vernier）残基と呼ばれる。ＣＤＲループのコンフォメーションを規定するのを助けるフレームワーク残基は、時にはカノニカル（canonical）残基と呼ばれる(Chothia and Lesk, J.Mol.Biol.196:901-917 (1987), Thornton & Martin J. Mol. Biol., 263:800-815 (1996))。抗原結合ループコンフォメーションをサポートし、抗体が抗原に適合するよう微調整する役割をするフレームワーク残基は、時にはバーニヤ残基と呼ばれる(Foote & Winter, J. Mol. Biol. 224:487-499 (1992))。
【０１７８】
置換の候補となる他のフレームワーク残基は、潜在的グリコシル化部位を作成する残基である。さらに他の置換の候補は、その位置でヒト免疫グロブリンにとって異常であるアクセプターヒトフレームワークアミノ酸である。これらのアミノ酸は、マウスドナー抗体由来の等価な位置の、またはより一般的なヒト免疫グロブリンの等価な位置の、アミノ酸で置換可能である。
【０１７９】
マウス５Ｃ１抗体のヒト化形態が、本明細書に記載の脳シャトルに組み込まれ得る。マウス抗体は、配列番号９および配列番号２４をそれぞれ含むアミノ酸配列を有する、成熟重鎖および軽鎖可変領域を含む。本発明は、５つの例示されるヒト化成熟可変領域を提供する：Ｈ１、配列番号１４；Ｈ２、配列番号１５；Ｈ３、配列番号１６；Ｈ４、配列番号１７；およびＨ５、配列番号１８。本発明はさらに、４つの例示されるヒト化成熟軽鎖可変領域を提供する：Ｌ１、配列番号２９；Ｌ２、配列番号３０；Ｌ３、配列番号３１；およびＬ４、配列番号３２。抗体は、提供されるこれらの成熟重鎖および軽鎖可変領域の任意の並び替え、すなわちＨ１Ｌ２、Ｈ１Ｌ３、Ｈ１Ｌ４、Ｈ２Ｌ１、Ｈ２Ｌ２、Ｈ２Ｌ３、Ｈ２Ｌ４、Ｈ３Ｌ１、Ｈ３Ｌ２、Ｈ３Ｌ３、Ｈ３Ｌ４、Ｈ４Ｌ１、Ｈ４Ｌ２、Ｈ４Ｌ３、Ｈ４Ｌ４、Ｈ５Ｌ１、Ｈ５Ｌ２、Ｈ５Ｌ３、またはＨ５Ｌ４を含む。８つの重鎖逆突然変異と５つの軽鎖逆突然変異とを含むＨ４Ｌ３変異体は、マウスおよびキメラ５Ｃ１抗体の２倍の親和性の範囲内である、α−シヌクレインへの親和性（Ｂｉａｃｏｒｅ装置で測定される）を有する。下記の表３を参照されたい。ＥＬＩＳＡで測定されるように、Ｈ４Ｌ３変異体は、実質的にキメラ抗体と同じ（実験誤差の範囲内）、かつマウス５Ｃ１抗体よりも優れた、α−シヌクレインに対する親和性を有する。図５を参照されたい。さらに、６つの重鎖逆突然変異および５つの軽鎖逆突然変異を含むＨ５Ｌ３変異体は、マウスおよびキメラ５Ｃ１抗体の４倍の親和性の範囲内である、ヒトα−シヌクレインへの親和性（Ｂｉａｃｏｒｅ装置で測定される）を提供する。下記の表３を参照されたい。９つの重鎖逆突然変異および２つの軽鎖逆突然変異を含むＨ３Ｌ４変異体はまた、実質的にキメラ５Ｃ１抗体と実験誤差範囲内で同じ、ヒトα−シヌクレインへの親和性（ＥＬＩＳＡにより測定される）を提供し、それぞれ、９つの重鎖逆突然変異並びに５つのおよび６つの軽鎖逆突然変異を含む、Ｈ３Ｌ３およびＨ３Ｌ１変異体は、マウス５Ｃ１抗体よりも優れた、α−シヌクレインへの親和性を提供する(ＥＬＩＳＡにより測定される)。
【０１８０】
本発明は、ヒト化成熟重鎖可変領域がＨ４（配列番号１７）に少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を示し、およびヒト化成熟軽鎖可変領域がＬ３（配列番号３１）に少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を示す、Ｈ４Ｌ３ヒト化５Ｃ１抗体の変異体を提供する。いくつかのこのような抗体において、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３個全てのＨ４Ｌ３の逆突然変異が、保持されている。本発明はまた、ヒト化成熟重鎖可変領域が、Ｈ５（配列番号１８）に少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を示し、ヒト化成熟軽鎖可変領域が、Ｌ３（配列番号３１）に少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を示す、Ｈ５Ｌ３ヒト化５Ｃ１抗体の変異体を提供する。いくつかのこのような抗体において、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１個全てのＨ５Ｌ３の逆突然変異が保持されている。ヒト化成熟重鎖可変領域が、Ｈ３（配列番号１６）に少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を示し、ヒト化成熟軽鎖可変領域が、Ｌ４（配列番号３２）に、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を示す、Ｈ３Ｌ４ヒト化５Ｃ１抗体の変異体が、本明細書に記載の脳シャトルに組み込まれ得る。いくつかのこのような抗体において、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１個全てのＨ３Ｌ４の逆突然変異が保持されている。いくつかの抗体において、Ｖｈ領域のＨ１１、Ｈ２７、Ｈ３０、Ｈ４８、およびＨ７３の位置のうち少なくとも１つが、それぞれＬ、Ｙ、Ｔ、Ｉ、およびＫで占められている。いくつかの抗体において、Ｖｈ領域のＨ１１、Ｈ２７、Ｈ３０、Ｈ４８、およびＨ７３の位置が、それぞれＬ、Ｙ、Ｔ、Ｉ、およびＫで占められている。いくつかの抗体において、Ｖｈ領域のＨ６７、Ｈ６９、Ｈ９１、およびＨ９４の位置のうち少なくとも１つが、それぞれＡ、Ｌ、Ｆ、およびＳで占められている。いくつかの抗体において、例えばＨ４の場合、Ｖｈ領域のＨ６７、Ｈ６９、およびＨ９４の位置が、Ａ、Ｌ、およびＳでそれぞれ占められている。いくつかの抗体において、例えばＨ５の場合、Ｈ９４の位置がＳで占められている。いくつかの抗体において、例えばＨ３の場合、Ｖｈ領域のＨ６７、Ｈ６９、Ｈ９１およびＨ９４の位置が、それぞれＡ、Ｌ、Ｆ、およびＳにより占められている。いくつかの抗体において、Ｖｋ領域のＬ１２およびＬ１４の位置の少なくとも１つが、Ｓで占められている。いくつかの抗体において、例えばＬ３およびＬ４の場合、Ｖｋ領域のＬ１２およびＬ１４の位置が、Ｓで占められている。いくつかの抗体において、Ｖｋ領域のＬ２、Ｌ４５、Ｌ４９およびＬ８７の位置のうち少なくとも１つが、それぞれＶ、Ｋ、Ｎ、およびＦで占められている。いくつかの抗体において、例えばＬ３の場合、Ｖｋ領域のＬ２、Ｌ４９、およびＬ８７の位置が、それぞれＶ、Ｎ、およびＦで占められている。いくつかの抗体において、例えばＬ１の場合、Ｖｋ領域のＬ２、Ｌ４５、Ｌ４９、およびＬ８７の位置が、それぞれＶ、Ｋ、Ｎ、およびＦで占められている。これらのヒト化抗体のＣＤＲ領域は、マウスドナー抗体のＣＤＲ領域と同じである、Ｈ４Ｌ３またはＨ５Ｌ３のＣＤＲ領域に、同一または実質的に同一であり得る。ＣＤＲ領域は、任意の従来の定義（例えば、コチア（Ｃｈｏｔｈｉａ））により規定され得るが、好ましくはＫａｂａｔにより規定される。
【０１８１】
ヒト化５Ｃ１変異体のさらなる変異の可能性の１つは、可変領域フレームワークのさらなる逆突然変異である。ヒト化ｍＡｂにおいてＣＤＲと隣接していない多くのフレームワーク残基は、ドナーマウスｍＡｂ、または他のマウス若しくはヒト抗体の、対応する位置のアミノ酸置換を受け入れることができ、多くの潜在的なＣＤＲ隣接残基でさえまた、置換を受け入れることができ、または、ＣＤＲ内のアミノ酸でさえ、例えば可変領域フレームワークを提供するために用いられるヒトアクセプター配列の対応する位置で見出される残基で改変されてもよい。さらに、代替のヒトアクセプター配列を、例えば重鎖および／または軽鎖に用いることができる。異なるアクセプター配列を用いる場合、上記で推奨された１つ以上の逆突然変異は、対応するドナー残基とアクセプター残基が逆突然変異することなくすでに同一であるために、行われなくてもよい場合がある。例えば、位置Ｈ１１をすでにＬが占め、Ｈ４８をすでにＩが占め、および／またはＨ７３をすでにＫが占める重鎖アクセプター配列を用いるとき、対応する逆突然変異は必要ない。同様に、位置Ｌ１２および／またはＬ１４をＳが占める軽鎖アクセプター配列を用いるとき、対応する逆突然変異は必要ない。
【０１８２】
成熟軽鎖および重鎖可変領域が、ヒト化５Ｃ１の成熟軽鎖および重鎖可変領域、Ｈ１Ｌ１、Ｈ１Ｌ２、Ｈ１Ｌ３、Ｈ１Ｌ４、Ｈ２Ｌ１、Ｈ２Ｌ２、Ｈ２Ｌ３、Ｈ２Ｌ４、Ｈ３Ｌ１、Ｈ３Ｌ２、Ｈ３Ｌ３、Ｈ４Ｌ１、Ｈ４Ｌ２、Ｈ４Ｌ４、Ｈ５Ｌ１、Ｈ５Ｌ２、またはＨ５Ｌ４に少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を示すヒト化抗体は、本明細書に記載の脳シャトルに組み込まれ得る。これらのヒト化抗体のＣＤＲ領域は、マウスドナー抗体のＣＤＲ領域に、同一または実質的に同一であり得る。ＣＤＲ領域は、任意の従来の定義（例えば、コチア（Ｃｈｏｔｈｉａ））により規定され得るが、好ましくはＫａｂａｔにより規定される。
【０１８３】
定常領域の選択
キメラ、ヒト化、ベニヤ、またはヒト抗体の重鎖および軽鎖可変領域は、Ｆｃ受容体と相互作用するのに十分な定常領域のうち少なくとも一部と連結することができる。定常領域は一般的に、ヒト定常領域であるが、必要に応じて非ヒト定常領域が選択され得る。
【０１８４】
定常領域の選択は、抗体依存性補体媒介細胞傷害、および／または抗体依存性細胞媒介細胞傷害が、必要であるかどうかによって部分的には決まる。例えば、ヒトアイソタイプＩｇＧ１およびＩｇＧ３は、補体媒介細胞傷害を有するが、ヒトアイソタイプＩｇＧ２およびＩｇＧ４は補体媒介細胞傷害が不十分であるか、または有さない。ヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ３はまた、ヒトＩｇＧ２およびＩｇＧ４よりも強い細胞媒介エフェクター機能を誘導する。抗体に含めるのに好適なヒトＩｇＧ１定常領域は、配列番号３８の配列を有し得る。軽鎖定常領域は、λまたはκであり得る。抗体に含めるのに好適なヒトκ軽鎖定常領域は、配列番号５２を有し得る。配列番号５２のＮ末端アルギニンは削除することができ、その場合、κ軽鎖定常領域は配列番号４０のアミノ酸配列を有する。抗体は、２つの軽鎖および重鎖を含むテトラマーとして、分離した重鎖として、分離した軽鎖として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２またはＦｖフラグメントとして、または重鎖および軽鎖可変領域がスペーサーを介して連結している単鎖抗体として、発現され得る。
【０１８５】
ヒト定常領域は、異なる個体間で、アロタイプ変異および同型アロタイプ変異を示す。つまり、定常領域は、異なる個体において、１つ以上の多型位置にて相違し得る。同型アロタイプは、同型アロタイプを認識する血清が１つ以上の他のアイソタイプの非多型領域に結合する点で、アロタイプと異なる。したがって、例えば、他の重鎖定常領域は、ＩｇＧ１ Ｇ１ｍ３アロタイプであり、配列番号６６のアミノ酸配列を有する。ＩｇＧ１ Ｇ１ｍ３アロタイプの別の重鎖定常領域は、配列番号７５のアミノ酸配列を有する。ヒト定常領域と言えば、任意の天然のアロタイプの定常領域、または天然のアロタイプの多型位置を占める任意の残基の並べ替え、または下記に記載したようにエフェクター機能の減少または増大のための最大３、５、または１０個の置換を含む。
【０１８６】
軽鎖および／または重鎖のアミノ末端またはカルボキシ末端の、１つまたは複数のアミノ酸、例えば重鎖のＣ末端リシンは、分子の一部または全部において、欠損するか、または誘導体化されていてよい。エフェクター機能、例えば補体媒介細胞傷害またはＡＤＣＣを、減少もしくは増大させるために(例えば、Winter et al., US Patent No. 5,624,821; Tso et al., US Patent No. 5,834,597;およびLazar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:4005, 2006を参照)、またはヒトにおける半減期を長くするために(例えば、Hinton et al., J. Biol. Chem. 279:6213, 2004を参照)、定常領域で置換を行うことができる。例示的な置換には、抗体の半減期を増すための、位置２５０のＧｌｎおよび／または位置４２８（この段落において、定常領域にＥＵナンバリングを使用する）のＬｅｕが含まれる。位置２３４、２３５、２３６および／または２３７残基のいずれかまたは全ての置換は、Ｆｃγ受容体、特にＦｃγＲＩ受容体に対する親和性を減少させる（例えば、ＵＳ６，６２４，８２１を参照）。エフェクター機能を減少させるために、ヒトＩｇＧ１の位置２３４、２３５および２３７に、アラニン置換を用いることができる。場合により、ヒトＩｇＧ２の位置２３４、２３６および２３７はアラニンで置換され、位置２３５はグルタミンで置換される（例えば、ＵＳ５，６２４，８２１を参照）。いくつかの抗体において、ヒトＩｇＧ１のＥＵナンバリングの位置２４１、２６４、２６５、２７０、２９６、２９７、３２２、３２９、および３３１の１つ以上における変異が用いられる。いくつかの抗体において、ヒト１ｇＧ１のＥＵナンバリングの３１８、３２０、および３２２の１つ以上における変異が用いられる。いくつかの抗体において、位置２３４および／または２３５はアラニンに置換され、および／または位置３２９はグリシンに置換されている。いくつかの抗体において、例えば配列番号７５において、位置２３４および２３５がアラニンに置換されている。いくつかの抗体において、アイソタイプはヒトＩｇＧ２またはＩｇＧ４である。
【０１８７】
Ｅ．ヒト抗体
α−シヌクレインに対するヒト抗体は、以下に記載の様々な技術により提供される。いくつかのヒト抗体は、５Ｃ１と同じまたは重複するエピトープ特異性を有するように、競合的結合実験または他の方法で選択される。ヒト抗体はまた、α−シヌクレインの１つのフラグメント（例えば、アミノ酸残基１１８−１２６）のみを免疫原として用いることにより、および／またはα−シヌクレインの欠失変異体コレクションに対する抗体を選別することにより、特定のエピトープ特異性について選別できる。ヒト抗体を作成する技術の１つは、トリオーマ法（trioma methodology）である(Oestberg et al., Hybridoma 2:361-367 (1983); Oestberg, U.S.Pat.No.4,634,664;およびEngleman et al.,U.S.Pat.No.4,634,666)。他の技術には、ヒト免疫グロブリン遺伝子、例えばXenoMouse（登録商標）、AlivaMab Mouse または Veloceimmune mouse を発現するトランスジェニックマウスの免疫化が含まれる(例えば、Lonberg et al., W093/1222、U.S.Pat.No.5,877,397、U.S.Pat.No.5,874,299、U.S.Pat.No.5,814,318、U.S.Pat.No.5,789,650、U.S.Pat.No.5,770,429、U.S.Pat.No.5,661,016、U.S.Pat.No.5,633,425、U.S.Pat.No.5,625,126、U.S.Pat.No.5,569,825、U.S.Pat.No.5,545,806、Nature 148, 1547-1553 (1994)、Nature Biotechnology 14, 826 (1996)、Kucherlapati、およびWO 91/10741を参照)。別の技術は、ファージディスプレイである(例えば、Dower et al., WO 91/17271およびMcCafferty et al., WO 92/01047、U.S.Pat.No.5,877,218、U.S.Pat.No.5,871,907、U.S.Pat.No.5,858,657、U.S.Pat.No.5,837,242、U.S.Pat.No.5,733,743およびU.S.Pat.No.5,565,332を参照)。これらの方法において、外表面に様々な抗体を提示するファージライブラリーが作成される。抗体はたいてい、ＦｖまたはＦａｂフラグメントとして提示される。所望の特異性を有する抗体を提示するファージは、α−シヌクレインペプチドまたはそのフラグメントに対する親和性の増大により、選択される。別の技術は、Reddy et al., Nat. Biotechnol. 2010 Sept 28(9):965-9 (Epub 2010 Aug 29)、およびUS 20110053803、20100099103、20100291066、20100035763、および20100151471において概説される一般的なプロトコールに従い、ヒトＢ細胞由来のＤＮＡを配列決定することである。簡潔に言うと、抗α−シヌクレイン抗体を有すると考えられるヒト、例えば、α−シヌクレイン、そのフラグメント、α−シヌクレインまたはそのフラグメントを含む長鎖ポリペプチド、または抗イディオタイプ抗体で免疫化したヒトから、Ｂ細胞を取得できる。その後、Ｂ細胞由来の抗体のｍＲＮＡは、ｃＤＮＡに逆転写され、例えば４５４配列決定技術を用いて配列決定される。各抗体由来の鎖の配列を獲得した後、鎖を一対にし（例えば、バイオインフォマティクスを用いて）、クローン化し、発現し、また所望の特性について選別することができる。
【０１８８】
Ｆ．組換え抗体の発現
抗体発現細胞株（例えば、ハイブリドーマ）を用いて、キメラおよびヒト化抗体を作成するための多くの方法が知られている。例えば、抗体の免疫グロブリン可変領域は、よく知られた方法を用いて、クローン化および配列決定することができる。ある方法では、重鎖可変ＶＨ領域が、ハイブリドーマ細胞から調製したｍＲＮＡを用いたＲＴ−ＰＣＲによりクローン化される。転写開始コドンを包含するＶＨ領域リーダーペプチドに対する、５’プライマーおよびｇ２ｂ定常領域特異的３’プライマーとして、コンセンサスプライマーが用いられる。例示的なプライマーが、Schenk et al によるU.S.patent publication US 2005/0009150に、記載されている（以下、「Ｓｃｈｅｎｋ」）。複数の、個別に作成されたクローン由来の配列は、増幅の間に変化が導入されていないかを確かめるために、比較され得る。ＶＨ領域の配列はまた、５’ＲＡＣＥ ＲＴ−ＰＣＲ法および３'ｇ２ｂ特異的プライマーにより取得したＶＨフラグメントの配列決定によって、決定または確認することができる。
【０１８９】
軽鎖可変ＶＬ領域は、類似の方法でクローン化できる。ある手法において、転写開始コドンを包含するＶＬ領域とハイブリダイズするように設計された５’プライマーと、Ｖ−Ｊ連結領域の下流のＣｋ領域に特異的な３’プライマーとを用いて、コンセンサスプライマーセットは、ＶＬ領域の増幅のために設計される。第二の手法において、ＶＬをコードするｃＤＮＡをクローン化するために、５’ＲＡＣＥ ＲＴ−ＰＣＲ法が用いられる。例示的なプライマーは、上述のＳｃｈｅｎｋに記載されている。クローン化された配列は、その後、ヒト（または他の非ヒト種）定常領域をコードする配列と組み合わせられる。ヒト定常領域をコードする例示的な配列には、配列番号３８および６６により示されるヒトＩｇＧ１定常領域をそれぞれコードする配列番号３７および７２、並びに、配列番号４０および５２により示されるヒトκ軽鎖定常領域をそれぞれコードする配列番号３９および７１を含む。
【０１９０】
ある手法において、重鎖および軽鎖可変領域は、ＶＤＪまたはＶＪジャンクションそれぞれの下流にスプライスドナー配列をコードするように再設計され、また哺乳動物発現ベクター、例えば重鎖はｐＣＭＶ−ｈγ１、軽鎖はｐＣＭＶ−Ｍｃｌにクローン化される。これらのベクターは、挿入された可変領域カセットの下流に、エキソンフラグメントとしてヒトγ１およびＣｋ定常領域をコードしている。配列検証に続いて、キメラ抗体を作成するために、重鎖および軽鎖発現ベクターをＣＨＯ細胞に同時導入することができる。遺伝子導入後４８時間に、ならし培地を回収し、抗体作成のためにウエスタンブロット解析で評価するか、または抗原結合のためにＥＬＩＳＡで評価する。キメラ抗体は、上述にようにヒト化されている。
【０１９１】
キメラ、ベニヤ、ヒト化、およびヒト抗体は、一般的に、組換え発現により作成される。組み換え核酸構築物は、一般的に、抗体鎖のコード配列に作動可能に連結された発現調節配列を含み、天然の発現調節エレメントまたは異種発現調節エレメント、例えばプロモーターを含む。発現調節配列は、真核または原核の宿主細胞に対して形質転換または遺伝子導入可能なベクターのプロモーターシステムであり得る。ベクターが、一度適切な宿主に組み込まれると、ヌクレオチド配列の高発現、並びに交差反応抗体の回収および精製に好適な条件下で、宿主は保持される。
【０１９２】
これらの発現ベクターは、一般的に、エピソームまたは宿主染色体ＤＮＡの不可欠な部分のいずれかとして、宿主生物において複製可能である。通常、発現ベクターは、所望のＤＮＡ配列で形質転換した細胞の検出を可能にするために、選択マーカー、例えばアンピシリン耐性またはハイグロマイシン耐性を含有する。
【０１９３】
大腸菌（E.coli）は、本明細書で開示されるポリペプチドをコードするＤＮＡ配列をクローン化するのに有用である。微生物、例えば酵母はまた、発現に有用である。サッカロマイセス（Saccharomyces）は、発現調節配列、複製起点、終結配列、および所望される配列を有する好適なベクター持つ、酵母宿主である。典型的なプロモーターには、３−ホスホグリセリン酸キナーゼおよび他の糖分解酵素が含まれる。酵母誘導性プロモーターには、特に、アルコールデヒドロゲナーゼ、イソシトクロムＣ、マルトースおよびガラクトースの利用に関連する酵素由来のプロモーターが含まれる。
【０１９４】
哺乳動物細胞は、免疫グロブリンまたはそのフラグメントをコードするヌクレオチド区分を発現するための宿主細胞である。Winnacker,From Genes to Clones,(VCH Publishers,NY,1987)を参照されたい。完全な異種タンパク質を分泌することが可能な、多くの好適な宿主細胞株が開発されており、ＣＨＯ細胞株、種々のＣＯＳ細胞株、ＨｅＬａ細胞、Ｌ細胞、ヒト胎児由来腎臓細胞（ＨＥＫ２９３細胞）、および骨髄腫細胞株が含まれる。細胞は、非ヒトであり得る。これらの細胞の発現ベクターには、発現調節配列、例えば複製起点、プロモーター、エンハンサー (Queen et al., Immunol. Rev. 89:49 (1986))、および必要な処理情報部位、例えば、リボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写終結配列が含まれ得る。発現調節配列には、内在性遺伝子、サイトメガロウイルス、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシパピローマウイルスなどに由来するプロモーターが含まれ得る。Co et al., J.Immunol.148:1149 (1992) を参照されたい。
【０１９５】
あるいは、抗体コード配列は、トランスジェニック動物のゲノムに導入され、続いてトランスジェニック動物の乳中で発現されるために、導入遺伝子に組み込まれ得る(例えば、U.S.Pat.No.5,741,957、U.S.Pat.No.5,304,489、U.S.Pat.No. 5,849,992を参照)。好適な導入遺伝子には、乳腺特異的遺伝子、例えばカゼインまたはβラクトグロブリン由来のプロモーターおよびエンハンサーと作動可能に連結された軽鎖および／または重鎖のコード配列が含まれる。
【０１９６】
目的のＤＮＡ区分を含有するベクターは、細胞宿主の型に応じた方法により、宿主細胞に導入することができる。例えば、カルシウムクロライド遺伝子導入は通常、原核細胞に対して利用され、一方、リン酸カルシウム処置、エレクトロポレーション、リポフェクション、遺伝子銃、またはウイルスをベースにした遺伝子導入は、他の細胞宿主に対して用いることができる。哺乳動物細胞を形質転換するために用いられる他の方法には、ポリブレンの使用、プロトプラスト融合、リポソーム、エレクトロポレーション、および微量注入法が含まれる。トランスジェニック動物の作成のために、導入遺伝子は受精した卵母細胞に微量注入することができ、または、胚性幹細胞のゲノムおよび除核した卵母細胞に導入された細胞の核に組み込むことができる。
【０１９７】
抗体の重鎖および軽鎖をコードする誘導ベクターを細胞培養に導入した後、細胞プールを、無血清培地における生産性向上および製品品質についてスクリーニングすることができる。次いで、最高生産性の細胞プールをＦＡＣＳ系単一細胞クローニングに付して、モノクローナル株を産生することができる。７．５ｇ／Ｌ培地を超える生産力価に相当する、細胞当たり１日当たり５０ｐｇまたは１００ｐｇを超える比生産性が、用いられ得る。単一細胞クローンによって作成される抗体は、濁度、ろ過特性、ＰＡＧＥ、ＩＥＦ、ＵＶスキャン、ＨＰ-ＳＥＣ、糖−オリゴ糖マッピング、質量分析、および、ＥＬＩＳＡまたはＢｉａｃｏｒｅなどの結合アッセイについて、試験することもできる。その後、選択されたクローンは、後の使用のために、多数のバイアルに入れて蓄え、冷凍貯蔵することができる。
【０１９８】
一旦発現すると、抗体は、プロテインＡ捕捉、ＨＰＬＣ精製、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などを含む、標準的な手順に従って精製することができる（一般に、Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, NY, 1982) を参照）。
【０１９９】
抗体の商業的生産の方法には、コドン最適化、プロモーターの選択、転写要素の選択、ターミネーターの選択、無血清単一細胞クローニング、細胞バンキング、複製数増幅のための選択マーカーの使用、ＣＨＯターミネーター、またはタンパク力価の向上が含まれる（例えば、US 5,786,464、US 6,114,148、US 6,063,598、US 7,569,339、W02004/050884、W02008/012142、W02008/012142、W02005/019442、W02008/107388、およびW02009/027471、およびUS 5,888,809を参照）。
【０２００】
Ｇ．抗体スクリーニングアッセイ
抗体は、結合アッセイ、機能性選別、α−シヌクレイン沈着物に関連する疾患の動物モデルにおける選別、および臨床試験を含む、いくつかの選別を受けることができる。結合アッセイでは、特異的結合を試験し、場合によりα−シヌクレイン（またはそのフラグメント、例えばアミノ酸残基１１８−１２６）への親和性およびエピトープ特異性を試験する。これらの選別は、時々、５Ｃ１などの例示的抗体と競合させて行われる。場合により、抗体またはα−シヌクレイン標的は、これらのアッセイにおいて、固定化されている。機能性アッセイは、天然にα−シヌクレインを発現する細胞、またはα−シヌクレイン若しくはそのフラグメントをコードするＤＮＡで遺伝子導入された細胞を含む細胞モデルにおいて行うことができる。好適な細胞には、神経細胞が含まれる。α−シヌクレインレベルの減少（例えば、細胞抽出物または上清の、ウェスタンブロッティングまたは免疫沈降）、凝集α−シヌクレインレベルの減少（例えば、免疫組織化学法および／または共焦点法）、および／またはα−シヌクレインに起因し得る毒性の減少に関して、細胞を選別することができる。
【０２０１】
動物モデル選別は、α−シヌクレイン沈着物に関連するヒト疾患、例えばレビー小体病をシミュレートする動物モデルにおいて、徴候または症状を、治療的または予防的に処置する抗体の能力を試験する。モニターし得る好適な徴候または症状には、運動バランス、協調、および認知障害が含まれる。障害の程度は、適切なコントロール、例えばコントロール抗体（例えば、アイソトープ適合コントロール抗体）を受け取ったコントロール動物、プラセボ、または全く処置していない動物における、運動バランス、協調、または認知障害との比較により、決定され得る。レビー小体病のトランスジェニック動物または他の動物は、ヒトα−シヌクレイン導入遺伝子を発現し得る。動物モデルにおける試験を促進するために、動物モデルに適切な定常領域を有する抗体が、使われ得る。対応するマウス抗体またはキメラ抗体が適切な動物モデルで有効であり、ヒト化抗体が同様の結合親和性（例えば、１．５倍、２倍、または３倍、実験誤差内）を有する場合に、抗体のヒト化バージョンは有効であろうと結論づけることができる。
【０２０２】
臨床試験は、α−シヌクレイン沈着物に関連する疾患を有するヒトにおいて、安全性および有効性を試験する。
【０２０３】
Ｈ．核酸
本発明は、さらに、上述の重鎖および軽鎖のいずれかをコードする核酸を提供する。一般的に、これらの核酸は、成熟重鎖および成熟軽鎖に融合したシグナルペプチドもコードする。シグナルペプチドの好適な例には、配列番号６のアミノ酸残基１−１９（配列番号５のヌクレオチド１−５７によりコードされる）および配列番号８のアミノ酸残基１−１９（配列番号７のヌクレオチド１−５７にコードされる）が含まれる。核酸上のコード配列は、そのコード配列の発現を確実にするために、例えばプロモーター、エンハンサー、リボソーム結合部位、転写終結シグナルなどの、調節配列と作動可能に連結することができる。重鎖および軽鎖をコードする核酸は、単離型で存在することができ、または、１つ以上のベクターにクローン化することができる。核酸は、例えば、固相合成または重複オリゴヌクレオチドのＰＣＲによって、合成することが可能である。重鎖および軽鎖をコードする核酸は、例えば発現ベクター内で、１つの近接核酸として一緒にすることができ、または、別個にして、例えば、各々それ自体の発現ベクターにクローン化することができる。
【０２０４】
Ｖ．血液脳関門シャトル
本明細書で開示される抗α−シヌクレイン抗体は、血液脳関門受容体に結合可能な一価の結合エンティティーに連結することができ、その結果血液脳関門シャトルを形成する。連結は、直接またはリンカーを介してであり得る。連結は、例えば、一方の鎖、通常抗α−シヌクレイン抗体の重鎖、任意のリンカー、および一価の結合エンティティーを含む近接融合タンパク質を形成するものであり、この重鎖が抗α−シヌクレイン抗体の軽鎖と複合体化しうる。化学的結合もまた、抗α−シヌクレイン抗体と一価の結合エンティティーとの間に使用可能である。血液脳関門シャトルは、Bohrmann et al., WO 2014/033074に記載され、参照により、その全体が、あらゆる目的のために組み込まれる。
【０２０５】
脳エフェクターエンティティーは、血液脳関門シャトルにより、血液脳関門を通過して脳に輸送される分子または化合物である。脳エフェクターエンティティーは、一般的に、脳に送達されることが望まれる特徴的な治療活性を有する。本明細書で開示される抗α−シヌクレイン抗体が血液脳関門シャトルの一部である場合、それらを脳エフェクターエンティティー抗体と呼ぶ。脳エフェクターエンティティー抗体は、単独で、または他の化合物と組み合わせて、脳エフェクターエンティティーを構成する。
【０２０６】
血液脳関門シャトルにおいて、抗α−シヌクレイン抗体を一価の結合エンティティーに連結させることは、血液脳関門を通過する抗体の輸送を促進することができる。全身投与された血液脳関門シャトルの取り込みおよび血液脳関門シャトルの他の活性を評価するためのアッセイが、WO 2014/033074に開示されている。中枢神経系の実質（parenchyma space）内の濃度また、測定可能である。例えば、微小透析または毛細管単離法（capillary depletion method）は、ＥＬＩＳＡまたは標識した血液脳関門シャトルの放射能測定と組み合わせることができる。
【０２０７】
Ａ．血液脳関門受容体
血液脳関門（ＢＢＢ）は、末梢循環と脳と脊髄の間の、生理学的障壁である。ＢＢＢは、脳毛細血管内皮原形質膜内の密着結合により形成されており、ウレア（６０ダルトン）などの非常に小さい分子を含む分子の脳への輸送を制限する頑強な障壁を作っている。血液脳関門（ＢＢＢ）は、合わせて、脳内のＢＢＢ、脊髄内の血液−脊髄関門、および網膜内の血液−網膜関門のことを指し、これらは中枢神経系内の近接する毛細血管関門である。ＢＢＢはまた、毛細血管内皮細胞でなく上衣細胞から成る、血液−ＣＳＦ関門（脈絡叢）を包含する。
【０２０８】
血液脳関門受容体（Ｒ／ＢＢＢ）は、ＢＢＢを通過して分子を輸送することができるか、あるいは外因的に投与された分子を輸送するのに用いることができる、脳内皮細胞に発現した細胞外膜連結受容体タンパク質である。血液脳関門受容体の例には、以下が含まれる：トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）(例えば、UniProt アクセッション番号 P02786)、インスリン受容体（例えば、UniProt アクセッション番号 P06213）、インスリン様成長因子受容体（ＩＧＦ−Ｒ）(例えば、UniProt アクセッション番号 P08069)、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク１（ＬＲＰ１）を含む低密度リポタンパク質受容体(例えば、UniProt アクセッション番号 Q07954)および低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質８（ＬＲＰ８）(例えば、UniProt アクセッション番号 Q14114)、およびヘパリン結合性上皮細胞成長因子様成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）（例えば、UniProt アクセッション番号 Q99075)。
【０２０９】
トランスフェリン受容体は、分子量約１８０，０００ダルトンの膜貫通型糖タンパク質であり、脊椎動物の鉄の取り込みに関与する２つのジスルフィド結合したサブユニット（それぞれ見かけ上約９０，０００ダルトンの分子量）から構成される。例えば、トランスフェリン受容体は、Schneider et al., Nature 311:675-678 (1984)に記載されるアミノ酸配列を含むヒトＴｆＲであり得る。
【０２１０】
Ｂ．一価の結合エンティティー
一価の結合エンティティーは、特異的に、かつ一価の結合様式で、血液脳関門受容体に結合することができる分子（すなわち、受容体に１：１で結合する分子）である。血液脳関門受容体抗原は、一価の結合エンティティーの、作成または選別のために、用いられ得る。これらの抗原は、例えば、所望のエピトープを含有する、血液脳関門受容体またはその一部（例えば、細胞外ドメイン）の可溶性の形態であり得る。あるいは、細胞表面に血液脳関門受容体を発現する細胞が、一価の結合エンティティーを産生または選別するために、用いられ得る。
【０２１１】
一価の結合エンティティーの血液脳関門受容体への結合を決定するために、様々な技術が利用可能である。これらのアッセイの１つは、組換え血液脳関門受容体でプレートをコーティングし、そのプレートを一価の結合エンティティーを含むサンプルを培養した後に、一価の結合エンティティーの血液脳関門受容体への結合を測定する、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）である。
【０２１２】
一価の結合エンティティーは、血液脳関門受容体リガンドなどの、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドであり得る。一価の結合エンティティーは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆｖ、またはＶＨＨフラグメントなどの抗体フラグメントであり得、または単鎖ＦａｂまたはｓｃＦｖなどの単鎖抗体分子であり得る。単鎖Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）フォーマットは、Hust et al., BMC Biotechnol. 7:14 (March 8, 2007)に記載されている。ｓｃＦａｂには、リンカーを介してＶＬおよびＣＬ領域を含む軽鎖と繋がる、重鎖のＶＨおよびＣＨ１領域（すなわち、Ｆａｂフラグメントに含まれる重鎖の一部であって、Ｆｄフラグメントとしても知られている）が含まれる。ある場合には、リンカーは、ＶＨ領域のＮ末端を、ＣＬ領域のＣ末端に連結させる（図１０参照）。完全な抗体において、重鎖ＣＨ１領域と軽鎖定常領域の間にジスルフィドを形成する１つ以上のシステインが、取り除かれ得る。唯一のｓｃＦａｂを含む一価の結合エンティティーは、単一Ｆａｂ（ｓＦａｂ）を有していると言われる。一価の結合エンティティーは、ファージディスプレイまたは免疫化などの技術を用いて設計された足場タンパク質であり得る。血液脳関門シャトルは、一価の結合エンティティーの単一ユニットの存在により特徴づけられ得る（すなわち、血液−脳シャトルには、一価の結合エンティティーのユニットが１つだけ含まれる）。
【０２１３】
一価の結合エンティティーにはまた、ＣＨ２−ＣＨ３ Ｉｇドメインおよび血液脳関門受容体を対象とするｓＦａｂが含まれ得る。ｓＦａｂは、リンカーにより、ＣＨ２−ＣＨ３ ＩｇドメインのＣ末端に連結され得る。ＣＨ２−ＣＨ３ Ｉｇエンティティーは、免疫グロブリンＣＨ２またはＣＨ３ドメイン由来のタンパク質エンティティーである。ＣＨ２−ＣＨ３ Ｉｇエンティティーには、二量体を形成する２つのＣＨ２−ＣＨ３ポリペプチドが含まれ得る。免疫グロブリンは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭであり得る。ＣＨ２−ＣＨ３ Ｉｇエンティティーには、天然のＣＨ２−ＣＨ３ドメイン配列および／または変異体のＣＨ２−ＣＨ３ドメイン配列が含まれ得る。ＣＨ２−ＣＨ３ Ｉｇエンティティーは、ＩｇＧ免疫グロブリンに由来し得、この場合、ＣＨ２−ＣＨ３ ＩｇＧエンティティーと呼ばれる。例えば、ＣＨ２−ＣＨ３ Ｉｇエンティティーは、重鎖のＣｙｓ２２６またはＰｒｏ２３０からカルボキシル末端に伸びる、ヒト重鎖ＣＨ２−ＣＨ３ ＩｇＧドメインであり得る。Ｆｃ領域のＣ末端リシン（Ｌｙｓ４４７）は、存在することもしないこともできる。特記されない限り、ＣＨ２−ＣＨ３ドメイン領域または定常領域のアミノ酸残基の番号付けは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)に記載される、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵナンバリングシステムに従う。
【０２１４】
いくつかの一価の結合エンティティーは、トランスフェリン受容体を対象とする。例えば、一価の結合エンティティーには、トランスフェリン受容体を対象とする１つのｓｃＦａｂ（すなわち、ｓＦａｂ）が含まれ得る。ある場合には、ｓＦａｂは、配列番号４３、配列番号４４、および／または配列番号４５内のアミノ酸配列を含む、トランスフェリン受容体のエピトープを認識する。トランスフェリン受容体を対象とするいくつかの一価の結合エンティティーは、Boado et al., BiotechnologyおよびBioengineering 102:1251-1258 (2009)およびWO 2014/033074に記載される、マウス８Ｄ３抗トランスフェリン抗体に由来する。例えば、一価の結合エンティティーには、実施例７のように（図１３もまた参照）、８Ｄ３抗体のｓｃＦａｂが含まれ得る。
【０２１５】
一価の結合様式とは、一価の結合エンティティーと血液脳関門受容体の間の相互作用が、単一エピトープを介して起こる、血液脳関門受容体への特異的結合のことを指す。一価の結合様式の単一エピトープ相互作用部位は、血液脳関門受容体のいずれの二量体化または多量体化も妨げ得る。一価の結合様式を測定する様々なアッセイが利用でき、スキャッチャードアッセイおよび表面プラズモン共鳴技術（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅを用いて）、およびWO 2014/033074に記載のインビボ研究が含まれる。エピトープマッピングおよびＸ線構造決定はまた、一価の結合エンティティーの、血液脳関門受容体に対する単一抗原結合活性を試験するために、用いられ得る。
【０２１６】
脳エフェクターエンティティー抗体が重鎖を含む場合の、一価の結合様式を達成する方法の１つは、一価の結合エンティティーを１つの重鎖のみ（例えば、重鎖のＦｃ領域）に連結することである。これは、Ridgway et al., Protein Engineering 9(7): 617-621 (1996)およびCarter et al., Immunotechnology 2(1):73-73(1) (1996)に記載された、「ノブ・イントゥ・ホール」抗体設計戦略の使用を通じて、成し遂げられ得る。例えば、ＣＨ３鎖は、ＣＨ３ドメイン間の接点の小さなアミノ酸側鎖を、大きなアミノ酸側鎖に置換することによって「ノブ」を作成することで、また大きな側鎖を小さな側鎖に置換することによって「ホール」を作成することで、本方法によりヘテロ二量体を形成するために、改変することができる。
【０２１７】
いくつかの血液脳関門シャトルにおいて、脳エフェクターエンティティー抗体の第一の重鎖には第一の二量体形成モジュールが含まれ、脳エフェクターエンティティー抗体の第二の重鎖には第二の二量体形成モジュールが含まれ、これにより、２つの重鎖のヘテロ二量体形成が可能となる。例えば、第一の二量体形成モジュールには、「ノブ」が含まれ得、第二の二量体形成モジュールには、「ノブ・イントゥ・ホール」戦略に従いノブを受けるための「ホール」が含まれ得る。ノブまたは隆起は、抗体鎖の表面から突き出た少なくとも１つの側鎖を有する抗体鎖のアミノ酸と空間的に隣接したアミノ酸または小さなクラスターを指す、技術用語である。このようなノブは、好ましい接触をさせ、鎖間の相互作用を安定化させるために、別の抗体鎖との接点で、ホールまたは腔（cavity）、すなわち湾入（indentation）またはポケットに、突き出るか、または挿入してもよい；その時、ホールはノブを受けたと言われる。
【０２１８】
「ノブ・イントゥ・ホール」戦略は、一価の結合エンティティーを第一の二量体形成モジュールに結合させ、第二の二量体形成モジュールに結合させないことにより、一価の結合を達成するために、このように、用いられ得る。例えば、第一の二量体形成モジュールは、次の要素を次の順番で含む、融合タンパク質であり得る：（１）５Ｃ１ Ｈ４の重鎖可変領域；（２）ヒトＩｇＧ１定常領域；（３）リンカー；（４）マウス８Ｄ３トランスフェリン抗体の軽鎖可変領域；（５）ヒトＩｇκ軽鎖定常領域；（６）リンカー；（７）マウス８Ｄ３抗トランスフェリン抗体の重鎖可変領域；および（８）ヒトＩｇＧ１ ＣＨ１重鎖ドメイン。第二の二量体形成モジュールは、次の要素を次の順番で含む、融合タンパク質であり得る：（１）５Ｃ１ Ｈ４の重鎖可変領域および（２）ヒトＩｇＧ１定常領域。実施例７および図１０−１２参照。第一および第二の二量体形成モジュールがヘテロ二量体化する場合、単一の一価の結合エンティティーのみが、存在するだろう。
【０２１９】
Ｃ．血液脳関門シャトルのエンティティーの結合
血液脳関門シャトルの異なるエンティティーの結合は、直接共有結合により達成され得る。例えば、このような結合は、本明細書で開示される抗α−シヌクレイン抗体と一価の結合エンティティーとを連結することが可能である。直接結合は、単一のタンパク質として発現されるように、一価の結合エンティティーと脳エフェクターエンティティーをコードする２つの遺伝子の遺伝的融合物を介して、タンパク質融合物を構築することによって達成され得る。直接結合はまた、一価の結合エンティティーの反応性の基と、脳エフェクターエンティティーの対応する基またはアクセプターとの間に共有結合を形成することによって、達成され得る。直接結合はまた、適切な条件下で結合するように他の分子への共有結合を形成する、反応性の基を含むように、結合している２つの分子の１つを修飾（例えば遺伝的に修飾）することにより、達成され得る。例えば、所望の反応性の基（例えばシステイン残基）を有する分子（例えば、アミノ酸）は、一価の結合エンティティーに組み込まれ得、その後、ジスルフィド結合が脳エフェクターエンティティー抗体と形成され得る。核酸をタンパク質へ共有結合させる方法もまた、知られている（すなわち、光架橋、例えば、Zatsepin et al., Russ. Chem. Rev. 74:77-95 (2005) 参照）。
【０２２０】
共有結合はまた、様々なリンカーを用いて行われてもよい。これらのリンカーは、血液脳関門シャトルの様々なエンティティーに共有結合的に繋がり得る。いくつかのリンカーは、脳エフェクターエンティティーを一価の結合エンティティーに繋げる。一価の結合エンティティーは、リンカーにより脳エフェクターエンティティーのＣ末端に連結され得る。例えば、一価の結合エンティティーは、リンカーにより脳エフェクターエンティティー抗体の重鎖のＦｃ領域のＣ末端に連結され得る。いくつかの場合、一価の結合エンティティーに繋がっている脳エフェクターエンティティー抗体の重鎖Ｆｃ領域は、全長Ｆｃ領域と比較して切り詰めることができる。
【０２２１】
リンカーはまた、血液脳関門シャトルの他のエンティティーを繋げることができる。例えば、いくつかの血液脳関門シャトルにおいて、一価の結合エンティティーは、ＣＨ２−ＣＨ３ Ｉｇエンティティーおよび血液脳関門受容体を対象とするｓＦａｂを含み得る。これらの血液脳関門シャトルにおいて、リンカーはｓＦａｂを、ＣＨ３−ＣＨ２ ＩｇエンティティーのＣ末端に繋げることができる。例えば、これらの血液脳関門シャトルは、脳エフェクターエンティティーをＣＨ２−ＣＨ３ ＩｇエンティティーのＮ末端に繋げる第一のリンカーと、ｓＦａｂをＣＨ２−ＣＨ３ ＩｇドメインのＣ末端に繋げる第二のリンカーとを有し得る。第一のおよび第二のリンカーは、同じであり得るか、または異なり得る。
【０２２２】
２つ以上のリンカーを有する血液脳関門シャトルの別の例において、一価の結合エンティティーはｓｃＦａｂを含み得る。いくつかのこれらの血液脳関門シャトルにおいて、脳エフェクターエンティティー抗体のＩｇＧ重鎖のＦｃ領域は、そのＣ末端でｓｃＦａｂに連結されている。例えば、これらの血液脳関門シャトルは、次の成分を、次の順番でつながって、含むことができる：（１）脳エフェクターエンティティー抗体のＩｇＧ重鎖；（２）ＩｇＧ重鎖のＦｃ領域のＣ末端をｓｃＦａｂの可変軽鎖ドメインのＮ末端に結合させるリンカー；（３）ｓｃＦａｂの可変軽鎖ドメインおよびＣ−κ軽鎖ドメイン；（４）ｓｃＦａｂのＣ−κ軽鎖ドメインのＣ末端を、ｓｃＦａｂの可変重鎖ドメインのＮ末端に結合させるリンカー；および（５）ｓｃＦａｂの可変重鎖ドメインおよびＩｇＧ ＣＨ１重鎖ドメイン。第一および第二のリンカーは、同じであり得るか、または異なり得る。
【０２２３】
リンカーは、単鎖ペプチドリンカーであり得る。いくつかのこれらのリンカーは、ペプチド結合で連結された１〜２０個のアミノ酸を含み得る。アミノ酸は、２０個の、天然起源のアミノ酸から選択され得る。ある場合には、１つ以上のアミノ酸が、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミンおよびリシンから選択され得る。他のこれらのリンカーには、少なくとも２０個のアミノ酸または少なくとも２５個のアミノ酸が含まれ得る。例えば、リンカーは、３２〜５０個のアミノ酸長を有し得る。いくつかのリンカーは、式（ＧｘＳ）ｎＧｍを有し、Ｇ＝グリシンおよびＳ＝セリンである。いくつかのリンカーにとって、ｘ＝３；ｎ＝８、９または１０；およびｍ＝０、１、２または３である。他のリンカーにとって、ｘ＝４；ｎ＝６、７または８；およびｍ＝０、１、２または３である。さらに他のリンカーにとって、ｘ＝４；ｎ＝６または７；およびｍ＝０、１、２または３である。さらに他のリンカーにとって、ｘ＝４、ｎ＝７、およびｍ＝２である。３つの代表的なリンカーは、式（Ｇ４Ｓ）４（配列番号４２）、（Ｇ４Ｓ）６Ｇ２（配列番号４１）、およびＧ３Ｓ（Ｇ４Ｓ）３（配列番号７３）を有する。
【０２２４】
血液脳関門シャトルの異なるエンティティー（例えば、本明細書で開示される抗α−シヌクレイン抗体および一価の結合エンティティー）の連結はまた、様々な化学リンカーを用いた結合によってであり得る。例えば、一価の結合エンティティーおよび脳エフェクターエンティティーは、様々な二機能性のタンパク質カップリング剤、例えばＮ−サクシニミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、サクシニミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−ｌ−カルボン酸塩（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二機能性の誘導体（例えばジメチルアジピミデートＨＣ１）、活性エステル（例えばジサクシニミジルスベリン酸塩）、アルデヒド（例えばグルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えばビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えばビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えばトルエン２，６−ジイソシアネート）、およびビス−活性フッ素化合物（例えばｌ，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）を用いて、結合され得る。リンカーは、切断可能なリンカーであることができ、脳エフェクターエンティティーの放出と脳への輸送を促進する。例えば、酸に不安定なリンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、感光性のリンカー、ジメチルリンカー、またはジスルフィド含有リンカーが用いられ得る（例えば、Chari et al., Cancer Res. 52: 127-131 (1992); U.S.Patent No. 5,208,020参照）。
【０２２５】
血液脳関門シャトルの様々なエンティティーはまた、標識と連結され得る。これらの標識は、検出またはイメージングに用いられるマーカーであり得る。これらの標識の例には、放射標識、フルオロフォア、発色団、および親和性タグが含まれる。これらの標識は、医用画像のための放射標識（例えば、テクネチウム９９ｍ（ｔｃ９９ｍ）またはヨウ素−１２３（Ｉ１２３））、または核磁気共鳴（ＮＭＲ）画像法または磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）のためのスピン標識、例えばヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マンガン、または鉄であり得る。
【０２２６】
Ｄ．核酸
本発明は、さらに、上述の血液脳関門シャトルのいずれかをコードする核酸を提供する。核酸上のコード配列は、そのコード配列の発現を確実にするために、例えばプロモーター、エンハンサー、リボソーム結合部位、転写終結シグナルなどの、調節配列と作動可能に連結することができる。核酸は、単離した形態で存在することができ、または１つ以上のベクターにクローン化することができる。例えば、配列番号５３、５７、および５９をコードする核酸は、１つ、２つ、３つまたはそれを超えるベクターにクローン化することができる。同様に、配列番号５５、５８、および５９をコードする核酸は、１つ、２つ、３つまたはそれを超えるベクターにクローン化することができる。核酸は、例えば、固相合成または重複オリゴヌクレオチドのＰＣＲによって、合成することが可能である。脳エフェクターエンティティー抗体の重鎖および軽鎖をコードする核酸は、例えば発現ベクター内で、１つの近接した核酸として連結することができ、または、別個にして、例えば、各々それ自体の発現ベクターにクローン化することができる。脳エフェクターエンティティー抗体の２つの異なるバージョンの重鎖（例えば、第一の二量体形成モジュールおよび第二の二量体形成モジュール、または「ノブ・イントゥ・ホール」戦略に従った「ノブ」バージョンおよび「ホール」バージョン）をコードする核酸は、１つの発現ベクターにクローン化すること、または別々の発現ベクターにクローン化することができる。一価の結合エンティティーをコードする核酸は、１つの発現ベクターまたは複数の発現ベクターにクローン化することができる。脳エフェクターエンティティーの全てまたはいくつか、および一価の結合エンティティーの全てまたはいくつかをコードする核酸は、１つの発現ベクターまたは別々の発現ベクターに、クローン化することができる。
【０２２７】
Ｅ．血液脳関門シャトルの発現
血液脳関門シャトルは、組み換え発現によって産生することができる。組み換え核酸構造物は、一般的に、天然会合または異種発現調節エレメント、例えばプロモーターを含む、血液脳関門シャトルの成分のコード配列に作動可能に連結された発現調節配列を含む。発現調節配列は、真核または原核宿主細胞を形質転換または遺伝子導入することが可能なベクターにおけるプロモーター系であり得る。ベクターが適切な宿主に導入されると、宿主はヌクレオチド配列の高レベル発現、ならびに血液脳関門シャトルの回収および精製に適する条件下に保たれる。
【０２２８】
これらの発現ベクターは、一般的に、エピソームまたは宿主染色体ＤＮＡの不可欠な部分として、宿主生物において複製可能である。通常、発現ベクターは、所望のＤＮＡ配列で形質転換された細胞の検出を可能にするために、選択マーカー、例えばアンピシリン耐性またはハイグロマイシン耐性を含有する。
【０２２９】
血液脳関門シャトル核酸配列の発現に有用な好適な宿主細胞が、ＩＶ．Ｆの部分に記載されており、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、酵母などの微生物、哺乳動物細胞が含まれる。目的のＤＮＡ区分を含有するベクターは、ＩＶ．Ｆの部分に記載された方法を用いて宿主細胞に導入することができる。
【０２３０】
血液脳関門シャトルの成分をコードするベクターを細胞培養に導入した後、細胞プールを、無血清培地における生産性向上および製品品質についてスクリーニングすることができる。次いで、最高生産性の細胞プールをＦＡＣＳ系単一細胞クローニングに付して、モノクローナル株を産生することができる。７．５ｇ／Ｌ培地を超える生産力価に相当する、細胞当たり１日当たり５０ｐｇまたは１００ｐｇを超える比生産性が、用いられ得る。単一細胞クローンによって産生される血液脳関門シャトルは、濁度、ろ過特性、ＰＡＧＥ、ＩＥＦ、ＵＶスキャン、ＨＰ-ＳＥＣ、糖−オリゴ糖マッピング、質量分析、および、ＥＬＩＳＡまたはＢｉａｃｏｒｅなどの結合アッセイについて、試験することもできる。その後、選択されたクローンは、後の使用のために、多数のバイアルに入れて蓄え、冷凍貯蔵することができる。
【０２３１】
一旦発現すると、血液脳関門シャトルは、プロテインＡ捕捉、ＨＰＬＣ精製、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などを含む、標準的な手順に従って精製することができる（一般に、Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, NY, 1982) を参照）。
【０２３２】
ＶＩ．治療への適用
本発明は、レビー小体病（ＬＢＤ）またはＭＳＡなどのシヌクレイン病を患っている患者またはその危険性のある患者における、その疾患の治療または効果的な予防の方法を提供する。治療に適する患者には、シヌクレイン病の疾患の危険性があるが症状を示していない個体のほか、シヌクレイン病の症状、または、例えば、ＥＥＧ低速化、精神神経兆候（抑鬱、痴呆、幻覚、不安、無関心、快感消失）、自律神経系の変化（起立性低血圧、膀胱障害、便秘、便失禁、流涎、嚥下困難、性機能不全、脳血流の変化）、感覚の変化（嗅覚、痛覚、色識異常感覚）、睡眠障害（レム睡眠行動障害（ＲＢＤ）、レストレスレッグス症候群／周期性四肢運動、睡眠過剰、不眠）、ならびに、さまざまな他の兆候および症状（疲労、複視、視朦、脂漏、体重減少／増加）などの、シヌクレイン病の初期の危険な兆候を現在示している患者が含まれる。したがって、本方法は、ＬＢＤの遺伝的危険性のあることが判っている個体に、予防的に施すことができる。そのような個体には、この疾患の経験者の親類、および、遺伝的または生化学的マーカーの分析で危険性が決定された個体が含まれる。パーキンソン病に対する危険性の遺伝的マーカーには、α−シヌクレイン遺伝子の変異、特にα−シヌクレインの二重複もしくは三重複およびα−シヌクレインタンパク質の位置３０および５３における点変異、または、ＬＲＲＫ２、ＧＢＡ、Ｐａｒｋｉｎ、ＵＣＨＬ１、およびＣＹＰ２Ｄ６遺伝子における変異が含まれる。現在パーキンソン病を患っている個体は、安静時振戦、筋硬直、運動緩慢および姿勢不安定を含むその臨床症状から、認定することが可能である。
【０２３３】
無症状の患者において、治療はどの年齢（例えば、１０、２０、または３０歳）でも開始することができる。しかし、通常、患者が４０、５０、６０または７０歳に達するまで、治療を開始する必要はない。治療は、一般的に、ある期間にわたって複数の投与を必要とする。治療は、抗体、または、治療剤（例えば、アルファシヌクレインペプチドの切断型）に対する活性化Ｔ細胞もしくはＢ細胞の反応を長期にわたってアッセイすることによって、監視することが可能である。反応が低下する場合、ブースター投与が指示される。
【０２３４】
本発明は、患者に有益な治療反応（例えば、神経突起および／または軸索α−シヌ
クレイン凝集体の減少、神経突起ジストロフィーの減少、認知機能の改善、および／または認知低下の逆転、治療もしくは防止）を生じる条件下で、血液脳関門シャトル組成物を投与することによって、患者におけるレビー小体病またはＭＳＡなどのシヌクレイン病を治療または有効に予防する方法を提供する。いくつかの方法において、新皮質および／または基底核の神経網における神経突起ジストロフィーの面積は、対照と比較して、１０％、２０％、３０％、４０％以上、低減することが可能である。
【０２３５】
認識障害、認識機能の進行性の低下、脳形態の変化および脳血管機能の変化は、レビー小体病を患っているまたはレビー小体病の危険性のある患者において、通常見られる。本発明は、そのような患者における認知機能の低下を抑制する方法を提供する。
【０２３６】
本発明はまた、シナプス密度および／または樹状突起密度を保存または増加させる方法も提供する。シナプス密度または樹状突起密度の変化の指標は、シナプス形成のマーカー（シナプトフィジン）および／または樹状突起のマーカー（ＭＡＰ２）によって測定することができる。いくつかの方法において、シナプス密度または樹状突起密度の変化の指標は、健康な対象におけるシナプス密度または樹状突起密度のレベルまで回復することが可能である。いくつかの方法において、患者のシナプス密度または樹状突起密度のレベルは、対照と比べて５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％以上、上昇し得る。
【０２３７】
ＶＩＩ．医薬組成物および処置の方法
予防用途においては、本明細書で開示される血液脳関門シャトルまたはその医薬組成物は、疾患に感染し易いまたは疾患の危険性のある患者に、その疾患の危険性を低減し、重症度を軽減し、または、少なくとも１つの徴候または症状の発現を遅らせるのに有効な投与計画（投与の用量、頻度および経路）で投与される。いくつかの予防用途において、投与計画は、α−シヌクレインおよび切断フラグメントの脳内の蓄積を、抑制し、もしくは遅らせ、および／または、その有毒作用を抑制し、もしくは遅らせ、および／または、行動の欠陥の進行を妨げおよび／もしくは遅らせるのに有効である。治療用途において、血液脳関門シャトルは、レビー小体病またはＭＳＡなどのシヌクレイン病の疑いのあるまたはシヌクレイン病を既に患っている患者に、その疾患の兆候もしくは症状の少なくとも１つを改善し、または、少なくともさらなる悪化を抑制するのに有効な投与計画（投与の用量、頻度および経路）で投与される。いくつかの治療用途において、投与計画は、毒性および／もしくは行動の欠陥に関連するα−シヌクレインおよび切断フラグメントのレベルを低減し、または、少なくともさらなる増加を抑制するのに有効である。
【０２３８】
投与計画は、処置を受けた個々の患者が、本明細書に記載の方法で処置されない同等の患者の対照集団における平均の転帰よりも、好ましい転帰を遂げる場合に、または、比較臨床試験（例えば、第ＩＩ相、第ＩＩ／ＩＩＩ相、または第ＩＩＩ相試験）において、対照患者に対して処置患者で、ｐ＜０．０５もしくは０．０１またはさらに０．００１のレベルで、より好ましい転帰が示される場合に、治療上または予防上、有効であると認められる。
【０２３９】
有効な用量は、使用される血液脳関門シャトルの種類、投与の方法、対象部位、シヌクレイン病の種類を含む患者の生理状態、患者がシヌクレイン病を含む神経変性疾患の特定の遺伝的リスク因子（例えば、ＡｐｏＥ、ＧＢＡ、ＬＲＲＫ２、ＭＡＰＴ、およびＳＮＣＡに存在する遺伝的リスク因子など）の保有者であるかどうか、患者がヒトであるか動物であるか、投与される他の薬物、および処置が予防であるか治療であるか、を含む多くの因子に応じて変動する。
【０２４０】
血液脳関門シャトルの例示的な用量範囲は、患者の体重の、約０．００１〜１５ｍｇ／ｋｇであり、より一般的には０．０５〜１０ｍｇ／ｋｇまたは０．１〜３ｍｇ／ｋｇまたは０．１５〜２ｍｇ／ｋｇまたは０．１５〜１．５ｍｇ／ｋｇである。血液脳関門シャトルは、そのような用量を、毎日、隔日、毎週、隔週、毎月、毎四半期、または、経験的分析によって定める他のあらゆるスケジュールに従って、投与することができる。例示的処置は、例えば少なくとも６ヵ月の、長期間にわたる複数の用量での投与を必要とする。追加の例示的処置計画は、２週に１回、１ヶ月に１回、または３〜６ヶ月に１回の投与を必要とする。いくつかの場合、最初に高用量の投与が、その後一回以上の低用量の投与がされてもよい。投与計画には、様々な時点での１回のまたは複数回の投与、急速投与、およびパルス注入が含まれ得る。
【０２４１】
血液脳関門シャトルは、末梢経路で（すなわち、投与された血液脳関門シャトルが、血液脳関門を通過して脳内の意図する部位に達する経路で）、投与することが可能である。投与経路には、局所、静脈内、経口、皮下、動脈内、頭蓋内、髄腔内、腹腔内、鼻腔内、病巣内、肺内または筋肉内が含まれる。血液脳関門シャトルについてのいくつかの投与経路は、静脈内および皮下である。この種の注射は、腕または脚の筋肉になされるのがもっとも一般的である。いくつかの方法において、血液脳関門シャトルは、沈着物が蓄積している特定の組織に直接注射され、例えば頭蓋内注射である。
【０２４２】
非経口投与のための医薬組成物は、無菌で実質的に等張であり、すなわち約２５０−３５０ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏの浸透圧を意味し、ＧＭＰ条件下で製造することができる。医薬組成物は、単位用量形態（つまり、単回投与のための用量）で提供することができる。医薬組成物は、１つ以上の生理的におよび医薬上許容される担体、希釈剤、賦形剤または助剤を用いて製剤化することが可能である（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980) 参照）。これらの担体、希釈剤、賦形剤、および助剤は、使用される用量および濃度において、レシピエントに対し無毒性であり得る。製剤は選択される投与経路に依存する。注射については、血液脳関門シャトルは水溶液で、例えばハンクス液、リンゲル液、生理食塩水、または酢酸緩衝液などの生理的に許容される緩衝液中で（注射部位の不快感低減のため）、製剤化することができる。溶液は、懸濁剤、安定剤および／または分散剤などの製剤化剤を含有することができる。これに代えて、血液脳関門シャトルは、抗体は、滅菌した発熱性物質非含有水などの好適な媒体で使用前に調製するために、凍結乾燥の形態とすることもできる。徐放性製剤もまた、調製することができる（例えば、WO 2014/033074参照）。活性成分をマイクロカプセルに封入することもまた、可能である（例えば、WO 2014/033074参照）。
【０２４３】
本投与計画は、処置する疾患の治療または予防において有効な他の薬剤と組み合わせて、施すことが可能である。これらの他の薬剤は、本投与計画に悪影響を与えないように、相補的な活性を有することができる。例えば、パーキンソン病の場合、α−シヌクレインに対する免疫療養剤WO/2008/103472、レボドパ、ドーパミン作動剤、ＣＯＭＴ阻害剤、ＭＡＯ−Ｂ阻害剤、アマンタジン、または、抗コリン作動剤を、本投与計画と組み合わせて使用することができる。このような併用療法には、併用投与（２つ以上の治療剤が同一のまたは別々の製剤に含まれている）および単独投与（すなわち、血液脳関門シャトルの投与が、追加の治療剤および／またはアジュバントの投与の前に、同時に、および／または後に行われ得る）が包含される。血液脳関門シャトルはまた、放射線療法などの介入治療、行動療法、または疾患を治療または予防するために適切な他の治療と組み合わせて、用いることができる。
【０２４４】
ＶＩＩＩ．他の適用
上述の血液脳関門シャトルは、臨床診断もしくは治療に関連して、または研究において、α−シヌクレインを検出可能なエンティティーを脳へ運ぶために、使用することができる。血液脳関門シャトルはまた、α−シヌクレインを持つ細胞、および、様々な刺激に対するそれらの応答の検出における実験室研究用の研究試薬として、使用することができる。そのような使用では、脳エフェクターエンティティー抗体は、蛍光分子、スピンラベル分子、酵素またはラジオアイソトープで標識することが可能であり、血液脳関門シャトルは、α−シヌクレインのアッセイを行うために必要なすべての試薬を備えるキットの形態で、提供することができる。
【０２４５】
血液脳関門シャトルは、患者において、ＬＢなどのα−シヌクレイン凝集体を検出可能なエンティティーを脳へ運ぶために、使用することができる。そのような方法は、パーキンソン病、脳におけるα−シヌクレイン凝集体の存在に関連する他の疾患、またはそれに対する罹患しやすさを診断し、または診断を確認するのに、有用である。例えば、前記方法は、認知症の症状を呈している患者に使用することが可能である。患者がＬＢを有している場合、その患者は、おそらく、パーキンソン病などのレビー小体病を患っている。前期方法はまた、無症状の患者に使用することもできる。レビー小体またはα−シヌクレインの他の異常沈着物の存在は、症状性疾患に対する将来の罹患し易さを示す。前記方法ははまた、レビー小体病などのシヌクレイン病であると診断されたことのある患者における、疾患の進行および／または治療に対する応答を監視するためにも有用である。
【０２４６】
前記方法は、本明細書で開示される抗α−シヌクレイン抗体を含む血液脳関門シャトルを投与し、次いで抗体が結合した後に抗体を検出することによって、実施することが可能である。望まれる場合、消失応答は、Ｆａｂなどの、完全長定常領域を欠く抗体フラグメントを使用することによって、避けることが可能である。いくつかの方法において、同じ抗体が、治療薬および診断試薬の双方として機能する。
【０２４７】
診断（例えば、インビボ造影）のためには、血液脳関門シャトルは、静脈注射によって患者の身体に、または、脳内投与によって、もしくは、頭蓋骨を貫通する孔を開けることによって、直接脳に投与することができる。試薬の用量は、治療法と同じ範囲内とすべきである。一般的に、脳エフェクターエンティティー抗体は標識されるが、いくつかの方法においては、抗体は標識されず、抗体に結合する二次標識剤が使用される。標識の選択は、検出の手段に依存する。例えば、光学的検出には蛍光標識が適している。外科的介入なしでの断層検出には常磁性標識の使用が適する。ＰＥＴまたはＳＰＥＣＴを使用して放射性標識を検出することも可能である。
【０２４８】
診断は、標識された場所の数、大きさおよび/または強度を、それぞれの基準値と比較することによって行われる。基準値は、罹患していない個体の集団における平均のレベルを代表し得る。基準値は、同じ患者において決定した先のレベルを代表することもできる。例えば、基準値は、治療前の患者において決定することができ、その後の測定値はその基準値と比較することができる。基準に対する値の低下は、治療に対する陽性の応答を示唆する。
【０２４９】
抗α−シヌクレイン抗体を含む血液脳関門シャトルは、抗イディオタイプ抗体を生成するために使用することが可能である（例えば、Greenspan & Bona, FASEB J.7(5) :437-444 (1989)およびNissinoff, J.Immunol.147:2429-2438 (1991)参照）。このような抗イディオタイプ抗体は、その抗体で処置された個体における臨床ヒト抗ヒト抗体（ＨＡＨＡ）応答の研究のほか、薬物動態研究、薬力学研究、生体内分布研究に利用することができる。例えば、抗イディオタイプ抗体は、脳エフェクターエンティティー５Ｃ１抗体の可変領域に特異的に結合し、したがって、薬物動態研究において脳エフェクターエンティティー５Ｃ１抗体を検出するのに使用することが可能であり、処置を受けた個体におけるヒト抗ヒト抗体（ＨＡＨＡ）応答を定量化するのに役立つ。
【０２５０】
ＩＸ．キット
本明細書で開示される血液脳関門シャトルを含むキットと使用説明書もまた、提供される。これらのキットは、例えば、上述の診断方法を実施するために用いることができる。キットにはまた、標識が含まれ得る。キットはまた、一般的に、キットを使用するための指示を提供するラベリング（Labeling）を含有する。ラベリングにはまた、測定した標識のレベルと、α−シヌクレインに対する抗体のレベルとを相関させる図表または他の対応する投与計画が含まれてよい。ラベリングは一般的に、製造、輸送、販売または使用のいずれの時点のキットにも添付している、あるいは他の方法で付随している、記載された、または記録されたいずれの物質をも指す。例えば、ラベリングという用語は、広告用リーフレットおよびパンフレット、梱包材、使用説明書、オーディオカセットまたはビデオカセット、コンピューターディスク、ならびにキットに直接刻み込まれた文書を包含する。
【０２５１】
インビボ造影を実施するための診断キットもまた、提供される。これらのキットは、一般的に、本明細書に記載のα−シヌクレインのエピトープと結合する抗体を含む血液脳関門シャトルを含有する。抗体は、標識することができ、二次標識剤がキットに含まれる。キットは、インビボ造影アッセイを実施するための説明書を含むことができる。
【０２５２】
Ｘ．製品
レビー小体病（例えば、パーキンソン病）またはＭＳＡなどのシヌクレイン病を治療および／または予防するために有用な物質を含有する製品もまた、提供される。製品には、容器、および容器に掲載されている、または結びついているラベルまたはパケージが含まれ得る。これらの容器の例には、ボトル、バイアル、シリンジ、および静脈注射用溶液バッグが含まれる。これらの容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な物質から形成されてよい。容器は、当該疾患を治療、予防、および／または診断するために、単独で、または他の組成物と組み合わせて、組成物を保持する。組成物中の少なくとも１つの活性薬剤は、本明細書で開示される血液脳関門シャトルである。ラベルまたは添付文書は、組成物が当該疾患を治療するために用いられることを示している。いくつかの製品には、血液脳関門シャトルを含む組成物を含有する第一の容器と、さらなる細胞傷害性薬物または治療剤を含む組成物を含有する第二の容器とが含まれてもよい。製品にはまた、組成物を、当該疾患を治療するために用いることができることを示す添付文書が、含まれ得る。製品にはまた、対象の当該疾患を治療するための指示が記載された添付文書が含まれ得る。これらの添付文書では、血液脳関門シャトルが血液脳関門を横切った取り込みを改善していることが、示されてもよい。製品はまた、薬学的に許容される緩衝液を含有する１つ以上の他の容器を含むことができる。含まれ得る他の物質は、商業的観点および使用者の観点から望まれる物質、例えば他の緩衝液、希釈剤、フィルター、ニードル、およびシリンジである。
【０２５３】
上記または下記で引用するすべての特許出願、ウェブサイト、他の出版物、アクセッション番号などは、個々の各項目が、あらゆる目的のために参照によって全体が取り込まれると、具体的かつ個別に示されているのと同様に、あらゆる目的のために参照によって全体が取り込まれる。配列の異なるバージョンが異なる時点でアクセッション番号に関連付けられている場合、本出願の有効出願日のアクセッション番号に関連付けられたバージョンを意味する。有効出願日は、実際の出願日、または、該当する場合、アクセッション番号に言及する優先出願の出願日の、早い方を意味する。同様に、出版、ウェブサイトなどの異なるバージョンが異なる時点で公開されている場合、そうでないと示されない限り、本出願の有効出願日における最新公開のバージョンを意味する。本発明の、あらゆる特徴、ステップ、要素、態様、または局面は、具体的にそうでないと示されない限り、他のいずれとも組み合わせて使用することが可能である。本発明を、明瞭化および理解のために、図面および例を用いてある程度詳しく説明したが、添付の特許請求の範囲内で、ある程度の変更および修正を実施してもよいことが明らかであろう。
【実施例】
【０２５４】
実施例１：マウス５Ｃ１の単離
マウス５Ｃ１抗体は、ヒツジ抗マウス抗体に連結されたペプチド免疫原ＶＤＰＤＮＥＡＹＥＧＧＣ（配列番号４）を含むペプチド複合体を注射したマウスで産生された。Ｃ末端ＧＧＣペプチドに融合したα−シヌクレインの残基１１８−１２６を含むこのペプチドは、Ｃ末端システイン残基に結合するマレイミドリンカーを介して、ヒツジ抗マウス抗体に連結されていた。
【０２５５】
実施例２：α−シヌクレイン抗体による受動免疫
レビー小体病の動物モデルにおけるα−シヌクレイン抗体の影響を試験する目的で、様々なα−シヌクレイン抗体を用いてマウスを受動免疫した。３−４月齢の野生型、α−シヌクレインノックアウト、およびα−シヌクレイントランスジェニック（６１系統）の雌マウスを用いた（ｎ＝１４／グループ）。試験した抗体には、以下が含まれた：
９Ｅ４（ＩｇＧ１、エピトープ：α−シヌクレインのアミノ酸１１８−１２６）；
５Ｃ１（ＩｇＧ１、免疫原：α−シヌクレインのアミノ酸１１８−１２６、シス−リンカー）；
５Ｄ１２（ＩｇＧ２、免疫原：α−シヌクレインのアミノ酸１１８−１２６、ｎ−リンカー）；
１Ｈ７（ＩｇＧ１、エピトープ：α−シヌクレインのアミノ酸９１−９９）；および
２７−１（ＩｇＧ１コントロール抗体）。
【０２５６】
マウスは、５ヵ月に渡って、１０ｍｇ／ｋｇの抗体の投与を受け、合計２１回の注射を受けた。さらに、ヒトα−シヌクレイン（ｗｔ）を発現するレンチウイルス（ＬＶ）を、海馬へのヒトα−シヌクレイン（ｗｔ）の片側導入によって、動物に注射した。
【０２５７】
検出抗体（readout antibody）には、Chemiconからのα−シヌクレイン抗体（エピトープ、完全長α−シヌクレイン）、Milliporeからのα−シヌクレイン抗体（エピトープ、完全長α−シヌクレイン）、およびＥＬＡＤＷ １０５（エピトープ：α−シヌクレインのアミノ酸１２１−１２４、ある場合には、残基１２２−１２４で切断されたα−シヌクレイン）が含まれる。
【０２５８】
終点：抗体力価を、実験終了前に監視した。行動は、モリス水迷路試験（ＭＷＭ）および水平ラウンドビームテストを用いて評価した。ラウンドビームテストは、異なる直径の２つのビームを用いて、運動バランス、協調、および歩調を評価する。ビームＡ（練習ビーム）がより大径であり、それゆえ横切るのがより容易である。ビームＤ（試験ビーム）がより小径であり、それゆえ横切るのがより困難である。水迷路能力は、第１０週および実験終了前に実施した。実験終了時に、マウスを屠殺し、α−シヌクレイン凝集、シナプトフィジン、およびＭＡＰ２の神経病理学測定値を得た。さらに、α−シヌクレイン、ＰＳＤ９５、およびシナプトフィジンの生化学測定値を得た。シナプスマーカー、ニューロンマーカーおよびグリアマーカーを用いて、選択多重標識および共焦点標識を行った。
【０２５９】
結果：結果は、５Ｄ１２以外のすべての抗体が、α−シヌクレイン蓄積を有意に低下させ、ＭＷＭ能力における陽性の成果に加えて、シナプスおよび樹状突起密度を保存することを示した。９Ｅ４抗体は、行動試験のみならず、インビトロおよびインビボの研究において有効であった。特に、本結果は、α−シヌクレイン抗体が神経突起／軸索のα−シヌクレイン凝集体を低減しうることを示唆している。
【０２６０】
行動結果：５Ｃ１および９Ｅ４抗体はα−シヌクレイントランスジェニックマウスにおいて、より少ない程度であるが１Ｈ７のように水迷路能力を改善した。図３を参照されたい。対照的に、５Ｄ１２抗体は、α−シヌクレイントランスジェニックマウスの水迷路能力を改善しなかった。水平ラウンドビームテストに関して、９Ｅ４抗体および１Ｈ７抗体は、速さおよびエラー数の両方で測定した能力を改善したが、５Ｄ１２抗体および５Ｃ１抗体は改善しなかった。図４を参照されたい。図４のデータは、１０ｃｍ当たりのスリップ数として（すなわち「エラー」）、および移動した距離を、その距離を移動した時間で割った割合（すなわち、１０ｃｍ／ｓｅｃの単位で測定した「速度」）として、表している。
【０２６１】
神経病理学結果：５Ｃ１抗体、９Ｅ４抗体および１Ｈ７抗体が、ＥＬＡＤＷ−１０５陽
性神経突起ジストロフィーを低減したのに対し、５Ｄ１２抗体は低減しなかった。α−シヌクレイントランスジェニックマウスにおいて、９Ｅ４抗体は、コントロールマウス（すなわち、２７−１ ＩｇＧ１コントロール抗体を受けたマウス）と比較して、神経網の面積を、新皮質で４３％、基底核で４０％減少させた。９Ｅ４抗体はまた、新皮質および基底核において、シナプトフィジンおよびＭＡＰ２の染色を保存した。
【０２６２】
実施例３：５Ｃ１の可変ドメインの配列決定
ｍＲＮＡを、QIAGEN（登録商標） OLIGOTEX（登録商標） mRNA kitを用いて、５Ｃ１ハイブリドーマ細胞ペレットから抽出して精製した。精製したｍＲＮＡを、次いで、オリゴチミジンアンチセンスプライマーおよびINVITROGEN（登録商標） SUPERSCRIPT（登録商標） II キットを用いて、ｃＤＮＡに転写した。５Ｃ１重鎖および軽鎖可変領域をコードする核酸配列を、ＰＣＲにより、縮重ＶＨおよびＶＬセンスプライマーおよび遺伝子特異的（ＣＨ／ＣＬ）アンチセンスプライマーを用いて、ｃＤＮＡから増幅した。シグナルペプチド、可変ドメイン、および定常ドメインの配列を（アンチセンスプライマーまでに）含むように設計されたＰＣＲ産物を、ゲル精製し、ブラント（blunt）ベクターまたはＴＡベクターにクローン化し、その後配列決定した。配列は、メチオニンで始まり、可変領域から定常領域に伸びる翻訳領域を有する、少なくとも３つの独立したクローンの解析から推定した。
【０２６３】
５Ｃ１重鎖可変領域をコードする核酸は、配列番号５の配列を有する。位置１−１９にシグナルペプチドを含む、対応するタンパク質配列（図１）は、配列番号６の配列を有する。
【０２６４】
５Ｃ１軽鎖可変領域をコードする核酸は、配列番号７の配列を有する。位置１−１９にシグナルペプチドを含む、対応するタンパク質配列（図２）は、配列番号８の配列を有する。
【０２６５】
成熟重鎖可変領域（配列番号９）のアミノ酸配列は、表１（下記）に示しており、成熟軽鎖可変領域（配列番号２４）の対応するアミノ酸配列は、表２（下記）に示している。Ｋａｂａｔナンバリングを、全体を通して使用している。
【０２６６】
実施例４：マウス５Ｃ１のヒト化
５Ｃ１Ｖｈ領域のＣＤＲの解析により、５残基のＣＤＲ−Ｈ１（配列番号１０）、７残基のＣＤＲ−Ｈ２（配列番号１１）、および６残基のＣＤＲ−Ｈ３（配列番号１２）を明らかにしている。５Ｃ１Ｖｋ領域のＣＤＲの同様の解析により、１６残基のＣＤＲ−Ｌ１（配列番号２５）、７残基のＣＤＲ−Ｌ２（配列番号２６）、および９残基のＣＤＲ−Ｌ３（配列番号２７）を明らかにしている。
【０２６７】
５Ｃ１ＶｋおよびＶＨ領域の間の接点残基の解析により、残基のほとんどが、通常見られる残基であることを、明らかにしている。
【０２６８】
ＮＣＢＩの非重複タンパク質配列データベースの調査により、５Ｃ１マウスＣＤＲを移植する好適なヒトフレームワークの選択が可能となった。Ｖｋについては、ＮＣＢＩアクセッションコードＣＡＢ５１２９３．１（ＧＩ：５５７８７８６；配列番号２８）のヒトκ軽鎖が選ばれた。Ｖｈについては、ヒトＩｇ重鎖ＡＡＹ４２８７６．１（ＧＩ：６６０９６５５７；配列番号１３）が選ばれた。
【０２６９】
選択されたヒトフレームワークに基づく逆突然変異を伴う、例示的なヒト化Ｖｈおよびヒト化Ｖｋのデザインを表１および表２にそれぞれ示している。
【０２７０】
例示的なヒト化Ｖｈデザイン
５Ｃ１ Ｖｈ領域の５つの異なるヒト化バージョンを、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、およびＨ５と設計した。逆突然変異の選択において、残基Ｈ１１、Ｈ２７、Ｈ３０、Ｈ４８、Ｈ６７、Ｈ６９、Ｈ７３、Ｈ９１、およびＨ９４に最終的に注目した。これら残基がコチア定義に従いＣＤＲ−Ｈ１の一部を形成したために（Ｈ２７およびＨ３０）、または、ヒトフレームワーク配列の対応する残基が低頻度残基であるために（位置Ｈ１１のＶ、位置Ｈ４８のＭ、および位置Ｈ７３のＥ）、各ヒト化Ｖｈ領域デザインにおいて、残基Ｈ１１、Ｈ２７、Ｈ３０、Ｈ４８、およびＨ７３は、それぞれＬ、Ｙ、Ｔ、Ｉ、およびＫに逆突然変異させた。バージョンＨ１（配列番号１４）については、さらなる残基Ｈ６７およびＨ６９を、ＣＤＲパッキングを保つために、（それぞれＡおよびＬに）逆突然変異させた。バージョンＨ２（配列番号１５）においては、さらなる逆突然変異は導入されなかった（すなわち、バージョンＨ１の位置Ｈ６７およびＨ６９の逆突然変異は除かれた）。バージョンＨ３（配列番号１６）において、さらなる残基Ｈ６７、Ｈ６９、Ｈ９１、およびＨ９４を、（それぞれＡ、Ｌ、Ｆ、およびＳに）逆突然変異させた。Ｈ６７、Ｈ６９、およびＨ９４の逆突然変異はＣＤＲパッキングを保つためであったが、Ｈ９１、Ｖｈ／Ｖｋの接点残基は、その接点への影響を調べるために、逆突然変異させた。バージョンＨ４（配列番号１７）において、さらなる残基Ｈ６７、Ｈ６９、およびＨ９４を、（それぞれＡ、Ｌ、およびＳに）逆突然変異させた。このように、バージョンＨ４は、Ｈ９１の逆突然変異が除かれている点で、Ｈ３と異なる。バージョン５（配列番号１８）において、さらなる残基Ｈ９４を、ＣＤＲパッキングを保つために、（Ｓに）逆突然変異させた。
【表１−１】
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【表１−２】
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【表１−３】
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【表１−４】
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【表１−５】
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【表１−６】
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【表１−７】
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【０２７１】
ヒト化５Ｃ１ Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、およびＨ５をコードする例示的な核酸配列は、配列番号１９、２０、２１、２２、および２３において、それぞれ提供される。
【０２７２】
例示的なヒト化Ｖｋデザイン
５Ｃ１ Ｖｋ領域の４つの異なるヒト化バージョンを、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、およびＬ４と設計した。逆突然変異の選択において、残基Ｌ２、Ｌ１２、Ｌ１４、Ｌ４５、Ｌ４９、およびＬ８７に最終的に注目した。ヒトフレームワーク配列の対応する残基が低頻度残基であるために（それぞれＰおよびＴ）、各ヒト化Ｖｋ領域デザインにおいて、残基Ｌ１２およびＬ１４をＳに逆突然変異させた。バージョンＬ１（配列番号２９）について、さらなる残基Ｌ２、Ｌ４５、Ｌ４９およびＬ８７を、（それぞれＶ、Ｋ、Ｎ、およびＦに）逆突然変異させた。Ｌ２は、カノニカル／ＣＤＲ相互作用残基である；Ｌ４５はマウスからヒトフレームワーク配列への極性／電荷スイッチを起こし（ＫからＱへ）、従ってフォールディングに影響を与え得る；Ｌ４９はバーニヤ残基である；Ｌ８７はＶｈ／Ｖｋ接点残基である。バージョンＬ２（配列番号３０）において、さらなる残基Ｌ４５をＫに逆突然変異させた。従って、Ｌ１と比べて、残基Ｌ２、Ｌ４９およびＬ８７の逆突然変異は除かれた。バージョンＬ３（配列番号３１）において、さらなる残基Ｌ２、Ｌ４９、およびＬ８７を（それぞれＶ、Ｎ、およびＦに）逆突然変異させた。従って、Ｌ１と比べて、残基Ｌ４５の逆突然変異は除かれた。バージョンＬ４（配列番号３２）において、さらなる残基は突然変異させなかった（すなわち、残基Ｌ１２およびＬ１４のみ突然変異させた）。
【表２−１】
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【表２−２】
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【表２−３】
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【表２−４】
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【０２７３】
ヒト化５Ｃ１ Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、およびＬ４をコードする例示的な核酸配列は、配列番号３３、３４、３５、および３６において、それぞれ提供される。
【０２７４】
実施例５：ヒト化５Ｃ１抗体のα−シヌクレインに対する親和性
５Ｃ１ヒト化重鎖タンパク質およびヒト化軽鎖タンパク質の様々な組み合わせの、α−シヌクレインに対する親和性を、ＥＬＩＳＡで解析した。図５に示したように、ヒト化５Ｃ１抗体のＨ１Ｌ１バージョンは、当該アッセイ条件下で、α−シヌクレインに親和性を示さなかった。対照的に、キメラ５Ｃ１抗体は、α−シヌクレインに対して、マウス５Ｃ１抗体よりも高い親和性を有した。ヒト化バージョンＨ３Ｌ４、Ｈ４Ｌ３、およびキメラＨ＋Ｌ３は、同程度の能力であり、キメラ５Ｃ１抗体とほどんど同様の能力であった。さらに、ヒト化バージョンＨ３Ｌ３およびＨ３Ｌ１は、Ｈ３Ｌ４、Ｈ４Ｌ３、およびキメラＨ＋Ｌ３よりもわずかに低い親和性であったが、同程度の能力であった。図５のｘ軸は、それぞれの抗体のｎｇ／ｍＬを表し、ｙ軸は吸光度を表している。
【０２７５】
様々なヒト化５Ｃ１抗体バージョンはまた、より詳細に結合親和性を決定するために、Ｂｉａｃｏｒｅにより解析した。抗ヒトＩｇＧ ＣＭ５ Ｂｉａｃｏｒｅ ｃｈｉｐを、GE Healthcareにより供給されたプロトコールに従い、準備した。各ヒト化５Ｃ１抗体バージョンは、次式を用いてＲｍａｘが５０を超えないレベルまで、それぞれ捕捉した：
Ｒｍａｘ＝（捕捉抗体のＲＵ）＊（シヌクレインのＭＷ）／（捕捉抗体のＭＷ）＊２
分母の２の係数は、抗体の結合部位の数である。α−シヌクレインは、予想ＫＤの約１０倍を上回る値から約１０分の１を下回る値に渡る濃度で、チップ上に流した。データを収集し、ドリフトと少量の非特異的結合を考慮するために、２つの参照値を減算した。データを、１：１モデルおよびグローバルフィットを使用したＢｉａｃｏｒｅ評価ソフトウェアを用いて、解析した。
【０２７６】
Ｂｉａｃｏｒｅ解析の結果を、表３（下記）に要約している。本データは、α−シヌクレインへの親和性の減少のほとんどが、いくつかの抗体バージョンにおける解離速度の増加によるものであることを示している。Ｈ４Ｌ３は、高い親和性を有することが確認された。
【表３】
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【０２７７】
実施例６：アラニンスキャニング変異導入法
これら抗体の重複ペプチドへの結合によると、抗体５Ｃ１、９Ｅ４および５Ｄ１２が結合するエピトープは、α−シヌクレインの残基１１８−１２６内に、ほぼ位置している。本実施例は、α−シヌクレインの位置１１８から１２６の間の各残基についての、アラニンスキャニング変異導入法による、より詳細なマッピングを述べる。アラニンは、嵩張らず、化学的不活性で、それにもかかわらず他の多くのアミノ酸が保持する二次構造選好を真似るメチル官能基を有するために、用いられる。図６、７、および８の上部は、それぞれ、抗体９Ｅ４、５Ｃ１および５Ｄ１２で染色されたウエスタンブロットの結果を示している。ブロットには、完全長α−シヌクレインおよびアラニンスキャニング変異導入法により残基１１８−１２６になされたα−シヌクレインの点変異が含まれ、０．５μｇ／ｍｌの抗体で染色した。位置１２２および１２５の変異は、本質的に９Ｅ４の結合を消失させるが、他の位置の変異は、何らかの効果がある場合も、ほとんど結合を消失させない。従って、９Ｅ４は主に残基１２２および１２５に接触する。位置１２０−１２２の変異は、本質的に５Ｃ１の結合を消失させ、位置１２３および１２４の変異は、実質的に結合を減少させるが消失はさせない。従って、５Ｃ１は主に残基１２０−１２２に接触し、より少ない程度で残基１２３−１２４に接触する。位置１２０−１２２の変異は、本質的に５Ｄ１２の結合を消失させ、位置１１８、１１９、１２３および１２４の変異は実質的に結合を減少させたが消失はさせなかった。従って、５Ｄ１２は主に位置１２０−１２２に結合し、より少ない程度で位置１１８、１１９、１２３、および１２４に結合する。図６−８の各図の下部では、配列番号７４内の残基の大きさが、各抗体のα−シヌクレインに対する結合への残基の寄与と相関している。例えば、図８の残基１２０の「Ｐ」は、この残基の変異が、本質的に５Ｄ１２のα−シヌクレインへの結合を消失させたために、大きく、１１８の「Ｖ」残基は、この残基の変異が５Ｄ１２のα−シヌクレインへの結合を減少させたが消失はさせなかったために、小さく、残基１２６の「Ｅ」は、この残基の変異が５Ｄ１２のα−シヌクレインへの結合にほとんど影響がなかったために、さらに小さい。図６−８のそれぞれにおいて、１Ｈ７抗体はコントロールとして使用されている。１Ｈ７はα−シヌクレインの残基９１−９８に結合するため、残基１１６−１２６の変異の存在にかかわらず、α−シヌクレインに結合すると予想される。
【０２７８】
５Ｃ１および５Ｄ１２と比較した、９Ｅ４の異なる結合特異性は、個々の生産方法を部分的に反映しているだろう。９Ｅ４は完全長α−シヌクレインの免疫化により生産され、その結果、抗体は立体構造的なエピトープに結合した。５Ｃ１および５Ｄ１２は１０アミノ酸のペプチドの免疫化により生産され、その結果、直線上のエピトープに結合した。
【０２７９】
図９は、９Ｅ４、５Ｃ１および５Ｄ１２抗体の結合部位に近接する、α−シヌクレインのアミノ酸の球棒モデルである。９Ｅ４が結合するエピトープの２つの不連続な残基、残基１２２および１２５が、完全長α−シヌクレインタンパク質の立体構造において、ポケットを形成する。
【０２８０】
実施例７：発現プラスミドの作成
次の抗体−ｓＦａｂ融合ポリペプチドをコードする発現プラスミドを構築する：
ノブ５Ｃ１−Ｈ４−ｓｃＦａｂ（８Ｄ３）重鎖融合タンパク質（５Ｃ１−Ｈ４＿ＨＵ−ＩＧＧ１−ＨＣ−ＫＮＯＢ）の組成（図１０参照）（配列番号５７であるが、配列番号５８もまた使用可能である）：
・５Ｃ１−Ｈ４重鎖可変領域（配列番号１７）；
・さらなるジスルフィド架橋を形成するための、ＣＨ３ノブ変異Ｔ３６６ＷおよびＳ３５４Ｃ変異を含有する、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域（配列番号６７であるが、配列番号６８もまた使用可能である）；
・グリシン−セリンリンカー（配列番号７３であるが、配列番号４１および４２もまた使用可能である）；
・マウス８Ｄ３抗トランスフェリン抗体の可変軽鎖ドメイン変異体（Ｌ５９６ＶおよびＬ５９８Ｉ）(Boado et al., Biotechnology and Bioengineering 102:1251-1258 (2009)) （配列番号６３）；
・ヒトＣ−κ軽鎖（配列番号５２）；
・リシン−セリンリンカー（配列番号４１であるが、配列番号４２および７３もまた使用可能である）；
・マウス８Ｄ３抗トランスフェリン抗体の可変重鎖ドメイン（配列番号６４）；および
・ヒトＩｇＧ１ ＣＨ１重鎖ドメイン（配列番号６５）。
ホール５Ｃ１−Ｈ４重鎖融合タンパク質（５Ｃ１−Ｈ４＿ＨＵ−ＩＧＧ１−ＨＣ−ＨＯＬＥ）の組成（図１１参照）（配列番号５３であるが、配列番号５５もまた使用可能である）：
・５Ｃ１−Ｈ４重鎖可変領域（配列番号１７）；および
・さらなるジスルフィド架橋を形成するための、ＣＨ３ホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ、並びに、Ｙ３４９Ｃ変異を含有する、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域（配列番号４６であるが、配列番号４８もまた使用可能である）。
ホール５Ｃ１−Ｌ３軽鎖タンパク質（５Ｃ１−Ｌ３＿ＨＵ−ＩＧＫＡＰＰＡ−ＬＣ）の組成（図１２参照）（配列番号５９）：
・５Ｃ１−Ｌ３軽鎖可変領域（配列番号３１）；および
・ヒトＣ−κ軽鎖（配列番号５２）。
【０２８１】
上述の「ノブ」および「ホール」変異は、図１０および１１において四角で囲まれており、さらなるジスルフィド架橋を形成するためのシステインへの変異は、図１０および１１において丸で囲まれている。
【０２８２】
これらの発現プラスミドを用いて作成された血液脳関門シャトルは、図１３に図示している。図１３において、ＨＣは重鎖を示し、ＬＣは軽鎖を示している。
【０２８３】
実施例８：５Ｃ１−ｃＦａｂ構築物の精製
この抗体鎖は、ＨＥＫ２９３細胞（ヒト胎児腎臓細胞株２９３由来）の一過性遺伝子導入と、Ｆ１７培地(Invitrogen Corp.)での培養により、作成される。遺伝子導入のために、「２９３−Ｆｅｃｔｉｎ」遺伝子導入試薬(Invitrogen）を用いる。抗体鎖は、それぞれ「ノブ」５Ｃ１−ｓｃＦａｂ（８Ｄ３）重鎖、「ホール」５Ｃ１−ｓｃＦａｂ（８Ｄ３）重鎖、および対応する５Ｃ１軽鎖をコードする、３つの異なるプラスミドから発現される。３つのプラスミドは、遺伝子導入において、等モルのプラスミドの割合で、用いられる。遺伝子導入は、製造業者の説明書に規定されるように、実施する。細胞培養上清を含有する抗体融合タンパク質は、遺伝子導入後７日目に回収する。上清は、精製まで凍結保存する。
【０２８４】
タンパク質を、ろ過した培養上清から精製する。上清を、タンパク質Ａセファロースカラム(GE Healthcare)に負荷し、ＰＨ７．４のＰＢＳで洗浄する。抗体の溶出は、１００ｍＭクエン酸緩衝液によりｐＨ３．０で行い、次いで直ちにサンプルをｐＨ６．５に中和する。濃縮後、凝集タンパク質および他の副産物を、分子ふるいクロマトグラフィー (Superdex 200; GE Healthcare)により、２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ６．０において、分離する。不完全に構築された分子および他の副産物を定量するために、分析型ＳＥＣ(TSK G3000SWXL)およびチップベースキャピラリー電気泳動システム(CE-SDS, LabChipGX, Caliper)で解析する。副産物のない、単量体の抗体画分をプールする。MILLIPORE Amicon Ultra（分画分子量３０）遠心濃縮器を用いた濃縮後、タンパク質を−８０℃で保管する。最終産物の解析評価は、ＵＶタンパク質測定、ＣＥ−ＳＤＳ、分子ふるいクロマトグラフィー、質量分析によって行い、またエンドトキシン測定によっても行う。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年8月31日(2020.8.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液脳関門シャトルを生産する方法であって：
（ａ）細胞が血液脳関門シャトルを分泌するように、血液脳関門シャトルをコードする核酸で形質転換した細胞を培養すること、ここで、血液脳シャトルは、
（ｉ）配列番号１０、１１、および１２のアミノ酸配列をそれぞれ有する重鎖ＣＤＲ１−３と、配列番号２５、２６、および２７のアミノ酸配列をそれぞれ有する軽鎖ＣＤＲ１−３とを含む抗体を含む脳エフェクターエンティティー；および
（ｉｉ）血液脳関門受容体に結合する一価の結合エンティティー
を含み、前記脳エフェクターエンティティーが前記一価の結合エンティティーと連結されている；および
（ｂ）分泌された血液脳関門シャトルを精製すること、
を含む方法。
【請求項２】
血液脳関門シャトルを製造する細胞株を製造する方法であって：
（ａ）血液脳関門シャトルをコードする核酸を含む組換え発現ベクターを導入すること、ここで、血液脳シャトルは、
（ｉ）配列番号１０、１１、および１２のアミノ酸配列をそれぞれ有する重鎖ＣＤＲ１−３と、配列番号２５、２６、および２７のアミノ酸配列をそれぞれ有する軽鎖ＣＤＲ１−３とを含む抗体を含む脳エフェクターエンティティー；および
（ｉｉ）血液脳関門受容体に結合する一価の結合エンティティー
を含み、前記脳エフェクターエンティティーが前記一価の結合エンティティーと連結されており、前記組換え発現ベクターはさらに選択マーカーを含む；
（ｂ）コピー数の増加したベクターを有する細胞を選択する条件下で細胞を増殖させること；
（ｃ）選択した細胞から単一細胞を単離すること；および
（ｄ）血液脳関門シャトルの産出量に基づき、単一細胞からクローン化した細胞を保存すること、
を含む方法。
【請求項３】
選択的条件下で細胞を増殖させ、少なくとも１００ｍｇ／Ｌ／１０６細胞／２４時間で天然に発現し分泌する細胞株をスクリーニングすることをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
患者のシヌクレイン病の治療または予防における使用のための血液脳シャトルであって：
（ｉ）配列番号１０、１１、および１２のアミノ酸配列をそれぞれ有する重鎖ＣＤＲ１−３と、配列番号２５、２６、および２７のアミノ酸配列をそれぞれ有する軽鎖ＣＤＲ１−３とを含む抗体を含む脳エフェクターエンティティー；および
（ｉｉ）血液脳関門受容体に結合する一価の結合エンティティー
を含み、前記脳エフェクターエンティティーが前記一価の結合エンティティーと連結されている、
血液脳シャトル。
【請求項５】
シヌクレイン病がレビー小体病である、請求項４に記載の使用のための血液脳シャトル。
【請求項６】
患者が、ＲＥＭ睡眠行動障害（ＲＢＤ）を有する、請求項４に記載の使用のための血液脳シャトル。
【請求項７】
シヌクレイン病を有するか、もしくはそのリスクがある患者のα−シヌクレインの凝集を抑制するか、またはα−シヌクレイン凝集体を減らすことにおける使用のための血液脳シャトルであって：
（ｉ）配列番号１０、１１、および１２のアミノ酸配列をそれぞれ有する重鎖ＣＤＲ１−３と、配列番号２５、２６、および２７のアミノ酸配列をそれぞれ有する軽鎖ＣＤＲ１−３とを含む抗体を含む脳エフェクターエンティティー；および
（ｉｉ）血液脳関門受容体に結合する一価の結合エンティティー
を含み、前記脳エフェクターエンティティーが前記一価の結合エンティティーと連結されている、
血液脳シャトル。
【請求項８】
α−シヌクレイン凝集体がレビー小体を含み、シヌクレイン病がレビー小体病である、請求項７に記載の使用のための血液脳シャトル。
【請求項９】
シヌクレイン病がパーキンソン病である、請求項４−８のいずれか一項に記載の使用のための血液脳シャトル。
【請求項１０】
シヌクレイン病が、多系統萎縮症（ＭＳＡ）またはレビー小体型認知症（ＤＬＢ）である、請求項４、６、または７のいずれか一項に記載の使用のための血液脳シャトル。
【請求項１１】
患者の認知機能の低下を防ぐ、請求項４−１０のいずれか一項に記載の使用のための血液脳シャトル。
【請求項１２】
神経突起の、および／または軸索の、α−シヌクレイン凝集体を減らす、請求項４−１０のいずれか一項に記載の使用のための血液脳シャトル。
【請求項１３】
患者の神経突起のジストロフィーを減らす、請求項４−１０のいずれか一項に記載の使用のための血液脳シャトル。
【請求項１４】
シナプスの、および／または樹状突起の密度を保つ、請求項４−１０のいずれか一項に記載の使用のための血液脳シャトル。
【請求項１５】
患者のシナプトフィジンおよび／またはＭＡＰ２を保つ、請求項４−１０のいずれか一項に記載の使用のための血液脳シャトル。
【請求項１６】
シヌクレイン病を有するか、またはそのリスクがある患者の、α−シヌクレイン凝集体を検出することにおける使用のための、血液脳シャトルを含む組成物であって：
血液脳シャトルは、
（ｉ）配列番号１０、１１、および１２のアミノ酸配列をそれぞれ有する重鎖ＣＤＲ１−３と、配列番号２５、２６、および２７のアミノ酸配列をそれぞれ有する軽鎖ＣＤＲ１−３とを含む抗体を含む脳エフェクターエンティティー；および
（ｉｉ）血液脳関門受容体に結合する一価の結合エンティティー
を含み、前記脳エフェクターエンティティーが前記一価の結合エンティティーと連結されている、組成物。
【請求項１７】
α−シヌクレイン凝集体がレビー小体を含み、シヌクレイン病がレビー小体病である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
血液脳関門を通過して脳エフェクターエンティティーを輸送することにおける使用のための、血液脳シャトルであって、
（ｉ）配列番号１０、１１、および１２のアミノ酸配列をそれぞれ有する重鎖ＣＤＲ１−３と、配列番号２５、２６、および２７のアミノ酸配列をそれぞれ有する軽鎖ＣＤＲ１−３とを含む抗体を含む脳エフェクターエンティティー；および
（ｉｉ）血液脳関門受容体に結合する一価の結合エンティティー
を含み、前記脳エフェクターエンティティーが前記一価の結合エンティティーと連結されており、一価の結合エンティティーが脳エフェクターエンティティーを、血液脳関門を通過して輸送する、血液脳シャトル。
【請求項１９】
患者のシヌクレイン病を治療または予防するための医薬の製造のための血液脳シャトルの使用であって、前記シャトルは、
（ｉ）配列番号１０、１１、および１２のアミノ酸配列をそれぞれ有する重鎖ＣＤＲ１−３と、配列番号２５、２６、および２７のアミノ酸配列をそれぞれ有する軽鎖ＣＤＲ１−３とを含む抗体を含む脳エフェクターエンティティー；および
（ｉｉ）血液脳関門受容体に結合する一価の結合エンティティー
を含み、前記脳エフェクターエンティティーが前記一価の結合エンティティーと連結されている、使用。
【請求項２０】
シヌクレイン病を有するか、もしくはそのリスクがある患者のα−シヌクレインの凝集を抑制するか、またはα−シヌクレイン凝集体を減らすための医薬の製造のための血液脳シャトルの使用であって、前記シャトルは、
（ｉ）配列番号１０、１１、および１２のアミノ酸配列をそれぞれ有する重鎖ＣＤＲ１−３と、配列番号２５、２６、および２７のアミノ酸配列をそれぞれ有する軽鎖ＣＤＲ１−３とを含む抗体を含む脳エフェクターエンティティー；および
（ｉｉ）血液脳関門受容体に結合する一価の結合エンティティー
を含み、前記脳エフェクターエンティティーが前記一価の結合エンティティーと連結されている、使用。
【請求項２１】
シヌクレイン病がレビー小体病である、請求項１９に記載の医薬の製造のための血液脳シャトルの使用。
【請求項２２】
シヌクレイン病がパーキンソン病である、請求項１９に記載の医薬の製造のための血液脳シャトルの使用。
【請求項２３】
患者が、ＲＥＭ睡眠行動障害（ＲＢＤ）を有する、請求項１９に記載の医薬の製造のための血液脳シャトルの使用。
【請求項２４】
シヌクレイン病が、多系統萎縮症（ＭＳＡ）またはレビー小体型認知症（ＤＬＢ）である、請求項１９または２３のいずれか一項に記載の医薬の製造のための血液脳シャトルの使用。
【請求項２５】
医薬が、患者の認知機能の低下を防ぐ、請求項１９−２４のいずれか一項に記載の医薬の製造のための血液脳シャトルの使用。
【請求項２６】
医薬が、神経突起の、および／または軸索の、α−シヌクレイン凝集体を減らす、請求項１９−２４のいずれか一項に記載の医薬の製造のための血液脳シャトルの使用。
【請求項２７】
医薬が、患者の神経突起のジストロフィーを減らす、請求項１９−２４のいずれか一項に記載の医薬の製造のための血液脳シャトルの使用。
【請求項２８】
医薬が、シナプスの、および／または樹状突起の密度を保つ、請求項１９−２４のいずれか一項に記載の医薬の製造のための血液脳シャトルの使用。
【外国語明細書】
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