(57)【要約】【課題】筋芽細胞や骨芽細胞などさまざまな幹細胞を強固に根付かせ、かつ、その分化も正常に誘導することができ、しかも、金属アレルギーの発症や毒性を示すことがなく、耐食性や耐疲労強度などにも優れた生体用金属材料を提供する。【解決手段】Ｆｅ純度が９９．９９ｍａｓｓ％以上である高純度鉄、あるいは、表面に高純度鉄系の合金層を有する高純度鉄からなり、好ましくは細胞培養環境あるいは生体内環境において溶出する２価の鉄イオン濃度が０．０５ｍＭｏｌ／Ｌ以下である生体用金属材料。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｆｅ純度が９９．９９ｍａｓｓ％以上である高純度鉄を素材とする生体用金属材料。
【請求項２】
表面に高純度鉄系の合金層を有することを特徴とする請求項１に記載の生体用金属材料。
【請求項３】
細胞培養環境あるいは生体内環境において溶出する２価の鉄イオン濃度が０．０５ｍＭｏｌ／Ｌ以下であることを特徴とする請求項１または２に記載の生体用金属材料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体内に埋設する生体用金属材料に関し、具体的には、骨折プレート、人工関節、ステント、メタルインレー、入れ歯、クラウン、ペースメーカーなどに用いて好適な、高純度鉄（高純度鉄および高純度鉄合金）からなる生体用金属材料に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
金属材料は、塑性加工によってさまざまな形状に成形することが可能であり、長年の研究から、生体内のさまざまな部位の置換材料、補強材料として使用されてきた。例えば、歯科のメタルインレー、骨折を固定する骨折プレート、血管ステントなど多種多様に及んでいる。金属材料に接する体液には、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｃａ２＋、Ｃｌ−、ＨＰＯ４２−などのイオンが含まれ、炎症部位などでは酸性に傾くことが知られている。そのような生体内環境下に金属材料を数十年の長期にわたり埋設したままだと、金属材料表面は、腐食などの問題に直面することになる。また、生体用金属材料として実用化されているステンレス鋼やＣｏ−Ｃｒ合金、Ｃｏ−Ｃｒ−Ｍｏ合金、チタン合金などに含まれる金属元素は、毒性を示したり、アレルギーを発症したりすることが認められている。
【０００３】
さらに、生体に対して異物である金属材料は、生体細胞との接着性が劣ることから、金属材料の表面に接着性を高めるための物理的な加工や化学的な処理を施すことが行われている。例えば、生体用の金属材料、セラミックス、高分子化合物などの表面には、細胞を根付かせ、素材の毒性を低減するなどの目的で、素材表面を粗面化した上でアパタイトをコーティングするなどの技術開発がなされてきた。しかし、多種多様な全ての生体材料を安全に実用化するためには、今なおさまざまな問題が残されている。たとえば、人体内で金属材料の表面に根付き、分化した細胞は長期にわたり正常であり得るか、金属材料表面とコーティング材との結合やコーティングされた生体用金属材料の柔軟性や疲労強度が長期間にわたって安定に維持されるかなど、経年変化に関する問題も残存している。
【０００４】
生体金属材料としては、１９６０年代後半から、ステンレス鋼やＣｏ−Ｃｒ合金等が広く使用されるようになり、さらに、耐食性に優れた工業用チタンやＴｉ−６Ａｌ−４Ｖ合金といった汎用のチタン合金も実用化され、その後、細胞にとって毒性の強いバナジウム（Ｖ）を除いたバナジウムフリー耐熱チタン合金を用いたポーラスタイプの人工関節（非特許文献１参照）、金属アレルギーを発症しないとされている元素を添加した生体適合性に優れたＴｉ−２９Ｎｂ−１３Ｔａ−４．６Ｚｒ合金（非特許文献２参照）、金属材料に表面加工を施して細胞親和性を高めた技術の開発（非特許文献３参照）などが行なわれてきた。
【０００５】
しかし、従来の生体用金属材料は、複数種の金属を含む合金であり、ニッケル、クロム、コバルトなど、人体に対して毒性を示したり、金属アレルギー源となる元素や不純物元素を含むことから、長期間の使用に伴い僅かに溶出した合金元素等のイオンでも、細胞にとっては、毒性を示したり、アレルギーを発症したりする原因となっていた（非特許文献４，５参照）。また、近年、腐食し難くて安全性が高いと思われていたパラジウムや白金、チタンなどの金属でも、金属アレルギーを発症する例が多数報告されている（非特許文献６，７参照）。さらに、チタン合金やＣｏ−Ｃｒ合金などの表面に細胞を根付かせるために施されているコーティング処理においては、コーティング材の均質性、接合性、耐久性などの課題を抱えている。
【０００６】
一方、細胞との高い親和性を有し、毒性やアレルギーの発症リスクが低い生体用のセラミックス材料も開発されている。しかし、セラミックス材料は、金属材料よりも可塑性や柔軟性、微細な成形性には劣っていることから、現時点では、まだ局部的な使用に留まっている。
【０００７】
ところで、ヒトは、生命維持のための必須元素として、数グラムの「鉄」を体内に保有しており、その量や存在形態を自らが調節する機能を有している(非特許文献８参照)。すなわち、鉄は、ヒトにとって、必要不可欠なミネラルであり、比較的優しい金属といえる。しかしながら、生体が有する鉄代謝調節機構を超えた過剰な鉄イオンは、フリーラジカルの産生源となり生体に有害となる(非特許文献８参照)。たとえば、汎用されている鉄は、細胞の培養液環境では容易に溶解し、２価の鉄イオンを経て３価の鉄イオンとなる際、あるいは、逆に３価から２価に還元される際、ラジカルを発生することから、鉄イオンが過剰な環境は、細胞にとっては有毒であることが知られている(非特許文献８参照)。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】松下富春，土居憲司，佐々木佳男，前原克彦，須田豊太、「バナジウムフリー耐熱チタン合金を用いたポーラスタイプ人工関節の開発」、まてりあ，３８，２３９−２４１，１９９９．
【非特許文献２】新家光雄，福井壽男，服部友一，許健司，鈴木昭弘、「高生体融合機能性Ｔｉ合金Ｔｉ−２９Ｎｂ−１３Ｔａ−４．６Ｚｒの開発」、まてりあ，４１，２２１−２２３，２００２．
【非特許文献３】藤森伸也、「種々の微小表面形状を付与したチタン板の表面分析ならびにその表面上での骨芽細胞様細胞の増殖と分化に関する研究」、歯科材料・器械、１４，１５５−１６８，１９９５．
【非特許文献４】Kosayadiloka, K, Tangjit, N,Luppanapornlarp, S, Santiwong, P. “Metal Ion Release and Cytotoxicity ofTitanium Orthodontic Miniscrews”, Key Engineering Materials; Zurich, 730,141-147, 2017.
【非特許文献５】Goon, AT, Goh, CL, “MetalAllergy” in Singapore. Contact Dermatitis, 52, 130-132. 2005.
【非特許文献６】Hanawa, T. “Metal Ion Releasefrom Metal Implants”, Materials Science and Engineering C. 24, 745-752, 2004.
【非特許文献７】Thyssen, JP, Menne T. “MetalAllergy - a Review on Exposures, Penetration, Genetics, Prevalence, andClinical Implications”, Chem Res. Toxicol. 23, 309-318, 2010.
【非特許文献８】坂田真一，岩井一宏、「鉄の多様な作用と毒性 蛋白質 核酸 酵素」、５２，９８２−９８７，２００７．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記した従来技術が抱える問題点を解決するためには、金属材料の表面に特別な処理を施さずとも、細胞が強固に接着し、分化を誘導し、さらには毒性を示さず、アレルギー発症のない金属材料物質を発掘することであり、その第一歩は、細胞にとって高い親和性を有する金属を探査することである。
【００１０】
そこで、本発明の目的は、筋芽細胞や骨芽細胞などさまざまな幹細胞を強固に根付かせ、かつ、その分化も正常に誘導することができ、しかも、金属アレルギーの発症や毒性を示すことがなく、耐食性や耐疲労強度などにも優れた生体用金属材料を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
前述したように、汎用されている鉄は、腐食が起こり易く、生体用の金属材料としては最適ではない。しかしながら、発明者らの一人である安彦らの研究によれば、高純度鉄は、優れた耐食性、耐疲労強度、靱性などを有しながら、極めて塑性加工性にも優れていることが明らかとなっている。例えば、鉄は、純度が９９．９９ｍａｓｓ％以上になると、塩酸に反応し難くなるという優れた耐食性を示す。
【００１２】
そこで、本発明は、生体用金属材料の素材金属として、従来から生体用材料として顧みられることがなかった「高純度鉄」に焦点を絞り、高純度鉄を培地とした細胞培養試験を繰り返して行った。その結果、高純度鉄（高純度鉄およびその合金）であれば、特別な表面処理を施さずとも、細胞が強固に接着し、分化を誘導でき、しかも、金属アレルギーの発症や毒性を示すことがなく、生体用の金属材料として最適であることを見出し、本発明を開発するに至った。
【００１３】
すなわち、本発明は、Ｆｅ純度が９９．９９ｍａｓｓ％以上である高純度鉄を素材とする生体用金属材料である。
【００１４】
また、本発明の上記生体用金属材料は、表面に高純度鉄系の合金層を有することを特徴とすることを特徴とする。
【００１５】
また、本発明の上記生体用金属材料は、細胞培養環境あるいは生体内環境において溶出する２価の鉄イオン濃度が０．０５ｍＭｏｌ／Ｌ以下であることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、Ｆｅ純度が９９．９９ｍａｓｓ％以上の高純度鉄を素材とすることで、特殊な表面処理を施すことなく、金属材料の表面に細胞を接着させ、さまざまな細胞に分化させることができるだけでなく、毒性を示さず、アレルギーの発症もない生体用金属材料を提供することができる。また、本発明の上記高純度鉄は、それにさらに生体に優しい最適な元素を添加することによって、耐食性や強度、靱性、疲労強度、熱膨張係数、熱伝導度などを調整したり、向上させたりすることができる。したがって、本発明によれば、従来の生体用金属材料が抱えていた、生体内に長期間埋設したときのリスクや問題点を解決することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ＭＤＣＫ細胞をシャーレ内で培養したときのコロニーの形成状態を示す写真であり、（ａ）は試験片を投入していないシャーレ内の表面に付着した細胞（control）、（ｂ）はシャーレ内に投入した試験片Ｎｏ．４の高純度鉄表面上に付着した細胞（ＧＦＰ−ａｃｔｉｎ染色顕微鏡像）、（ｃ）はシャーレ内に投入した試験片Ｎｏ．５の高純度の窒化鉄合金表面上に付着した細胞である。また、（ｄ）は試験片Ｎｏ．６のＳＫ−５Ｍ、（ｅ）は試験片Ｎｏ．７のＳＵＹ−１および（ｆ）は試験片Ｎｏ．８のＳＵＳ３０４をシャーレ内に投入したときの、シャーレ内の試験片が存在しない部分において異形となった細胞である。
【図２】ＭＤＣＫ細胞をシャーレ内で培養したときのコロニーの形成状態を示す写真であり、（ａ）はシャーレ内に投入した試験片Ｎｏ．１０のＣｏ−Ｃｒ−Ｍｏ合金の表面上に付着した細胞、（ｂ）はシャーレ内の試験片が存在しない部分に付着した細胞である。
【図３】ＭＤＣＫ細胞をシャーレ内で培養したときのコロニーの形成状態を示す写真であり、（ａ）はシャーレ内に投入した試験片Ｎｏ．１１のＴｉ−６Ａｌ−４Ｖ合金表面上に付着した細胞、（ｂ）はシャーレ内の試験片が存在しない部分に付着した細胞である。
【図４】培養液中のＦｅ２＋イオン濃度と、ＭＤＣＫ細胞を７２ｈｒ培養後のコロニー数との関係を示すグラフである。
【図５】培養液中のＦｅ２＋イオン濃度と、ＭＤＣＫ細胞培養における活性酸素分解酵素ＳＯＤ１遺伝子の発現変動との関係を示すグラフである。
【図６】試験片Ｎｏ．４の高純度鉄表面において、Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞を培養し、筋管細胞に分化誘導した結果を示す写真であり、（ａ）は分化誘導前の試験片表面上の細胞、（ｂ）は分化誘導５日後の試験片表面上の細胞を示す。
【図７】試験片Ｎｏ．３の高純度鉄表面において、間葉系幹細胞ＭＳＣを培養し、骨芽細胞に分化誘導した結果を示す写真であり、（ａ）は、分化誘導前のシャーレ上の細胞、（ｂ）は分化誘導１９日後の試験片表面上の細胞を示す。
【図８】試験片Ｎｏ．９の炭素鋼Ｓ４５Ｃ表面において、Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞を培養し、筋管細胞に分化誘導した結果を示す写真であり、（ａ）は分化誘導前のシャーレ上の細胞、（ｂ）は分化誘導５日後のシャーレ上の細胞を示す。
【図９】マウスの固体内に汎用純鉄と高純度鉄のワイヤを５日間埋設した後、摘出し、その表面を観察した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
発明者のうちの安彦は、高純度鉄を超高真空下において溶融精錬することで、純度がファイブナイン（９９．９９９ｍａｓｓ％）以上という超高純度鉄を溶製できることを見出している（例えば、安彦兼次、「超高純度金属の実用化への道」、まてりあ，５２，２５９−２６５，２０１３、または、Abiko, K. “Iron”, Encyclopedia of Materials: Science and Technology (EMSAT)  Article/Number: Iron, Ultrahigh-purity/200105を参照）。また、鉄の純度がフォーナイン（９９．９９ｍａｓｓ％）以上になると、鉄は、大気中では錆びなくなってくること、さらに、室温の６Ｍｏｌの塩酸溶液中でも、汎用鉄のような活発な水素の発生は認められなくなり、２価の鉄イオンの発生も、３価の鉄イオンへの遷移も少なくなることも見出している。
【００１９】
先述したように、今日まで、生体用材料として、金属やセラミックス、高分子化合物などが研究されてきた。しかし、ステンレス鋼やチタン合金、コバルト合金などの金属材料は、加工性や強度特性等で優れた特性を有しているものの、金属材料そのままの表面では、その表面に細胞を根づかせることが困難であり、また、毒性を示したり、アレルギーを発症したりする等の問題点を有するなど、多くの解決すべき課題が存在する。
【００２０】
一方、人体にとって鉄分は不可欠な必須元素であり、人体内には平均３〜５グラムの鉄分が含まれている。しかし、鉄そのものを、生体用金属材料として活用可能であるかについては、現時点では十分な報告例は見当たらない。また、高純度鉄は、優れた疲労強度や靱性特性などを有しているだけでなく、極めて軟らかくて薄箔や極細線を容易に作ることができるほど加工性に優れ、かつ、合金化することによって、強度特性や耐食性等の特性を調整したり、より高めたりすることができるので、生体用金属材料として極めて大きな可能性を秘めている。
【００２１】
また、人体を模擬した細胞培養液は、弱酸性であることから、９９．９９ｍａｓｓ％の鉄からの２価の鉄イオンの発生は、上記した６Ｍｏｌの塩酸溶液中よりも少なく、３価の鉄イオンへの遷移は極めて少なくなる。その結果、高純度鉄は、人体の細胞にとって、鉄イオンの過剰環境とは成り難く、毒性も示さないため、細胞との親和性が優れていることが期待される。さらに、鉄の純度が高い９９．９９９％以上になると、２価および３価の鉄イオンには、より成り難くなると考えられる。
【００２２】
そこで、高純度鉄が有する上記の極めて優れた特性に注目し、高純度鉄と細胞との親和性や、高純度鉄表面で細胞が強固に接着し分化する状況などの、高純度鉄の生体適合性を調査するため、以下に説明する細胞培養試験を行った。
【００２３】
＜試験１：金属表面における細胞の接着、増殖試験＞
個々の細胞は、物質に触れると、細胞表層タンパク質の吸着と接着が始まる。さらに、細胞は、物質が養分を保有しているか、毒性はあるか、迅速に分化するために十分強固な足場と成り得るかなどを判断し、増殖の見極めをする性質がある。
そこで、下記の表１に示した１１種の試験片、すなわち、Ｆｅの純度が９９．９９ｍａｓｓ％以上の高純度鉄（試験片Ｎｏ．１〜５）、炭素鋼ＳＫ５Ｍ（試験片Ｎｏ．６）、汎用純鉄（ＳＵＹ−１）、ステンレス鋼ＳＵＳ３０４（試験片Ｎｏ．８）、炭素鋼Ｓ４５Ｃ（試験片Ｎｏ．９）、および、現在、医療用に使用されている生体用金属材料であるＣｒ−Ｃｏ−Ｍｏ合金とＴｉ−６Ａｌ−４Ｖ合金（試験片Ｎｏ．１０、１１）の合計１１種類の試験片（幅：７ｍｍ×長さ：７ｍｍ×厚さ：０．５ｍｍ）を準備し、これらをアセトンとエタノールで洗浄し、滅菌し、クリーンベンチ内で風乾した後、直径３５ｍｍの細胞培養シャーレ内に投入して、細胞培養を行い、上記試験片と細胞との親和性を評価した。
【００２４】
【表１】
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【００２５】
上記細胞培養試験では、イヌ腎臓由来の接着性上皮細胞ＭＤＣＫをＭＥＭ＋１０％子牛血清（ＦＢＳ）液体培地に約５×１０４植え付け、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で、３日間培養した。なお、上記実験に用いたＭＤＣＫ細胞は、金属表面の細胞をライブ状態で観察できるようにするため、細胞骨格タンパク質アクチンに緑色蛍光タンパク質を融合させた組換え遺伝子を導入したものであり、そのライブ状態は、落射蛍光顕微鏡を用いて観察した。
【００２６】
上記細胞培養試験の結果、以下のことがわかった。
１）  細胞培養シャーレ内（以降、単に「シャーレ内」ともいう）に試験片を投入していない場合（control）には、植え付けた約５×１０４のＭＤＣＫ細胞は、３日後に、約１×１０６まで増殖し、７０〜９０％の細胞被覆率（コンフルエント）となった。
一方、シャーレ内に本発明の高純度鉄試験片（試験片Ｎｏ．１〜５）を投入した場合には、すべての場合において、試験片の表面上において７０％を超える細胞被覆率まで細胞が増殖していた。また、試験片が存在していないシャーレ部分では、試験片を投入しない場合と同様、７０％を超える細胞被覆率まで細胞の増殖が進行していた。
例として、図１の（ａ）には、シャーレ内に試験片を投入しないでＭＤＣＫ細胞を培養したときのシャーレ上に付着した細胞の写真（control）を、（ｂ）には、シャーレ内に試験片Ｎｏ．４の高純度鉄（ＵＨＰ−ＨＡ−ＣＲ）を投入したときの試験片表面上に付着した細胞の写真（ＧＦＰ−ａｃｔｉｎ染色顕微鏡像）を、（ｃ）には、シャーレ内に試験片Ｎｏ．５の高純度鉄（ＳＨＰ−ＣＲ−Ｎ）を投入したときの試験片表面上に付着した細胞の写真を示した。
２）  これに対して、細胞培養シャーレ内に、試験片Ｎｏ．６の炭素鋼（ＳＫ−５Ｍ）、試験片Ｎｏ．７の汎用純鉄（ＳＵＹ−１）、試験片Ｎｏ．８のステンレス鋼（ＳＵＳ３０４）および試験片Ｎｏ．９の炭素鋼（Ｓ４５Ｃ）の試験片を投入した場合は、いずれの場合も、細胞は、試験片表面には付着すらできず、試験片が存在していない部分においても異形となった。
例として、図１の（ｄ）には試験片Ｎｏ．６（ＳＫ−５Ｍ）、（ｅ）には試験片Ｎｏ．７（ＳＵＹ−１）および（ｆ）には試験片Ｎｏ．８（ＳＵＳ３０４）のそれぞれの試験片をシャーレ内に投入したときの、各シャーレ内の試験片以外の部分でも細胞は異形となった。
３）  また、試験片Ｎｏ．１０のＣｒ−Ｃｏ−Ｍｏ合金をシャーレ内に投入した場合には、試験片表面では、細胞は定着したが、増殖の進行が遅く、３０％以下の低い細胞被覆率であった（図２参照）。しかし、試験片が存在していないシャーレ部分では、約７０％の細胞被覆率まで通常の増殖がみられた。
４）  また、試験片Ｎｏ．１１のＴｉ−６Ａｌ−４Ｖ合金をシャーレ内に投入した場合も、試験片表面でも細胞は定着したが、増殖は３０−４０％と低い細胞被覆率であった（図３参照）。しかし、試験片が存在していないシャーレ部分では、増殖の進行が遅く、約５０％の細胞被覆率であった。
以上の結果から、本発明の純度が９９．９９ｍａｓｓ％以上の高純度鉄試験片を投入し表面では、試験片を入れない培養細胞シャーレ上とほぼ同等の細胞被覆率が得られる、すなわち、本発明の高純度鉄は細胞との親和性に優れていることが確認された。
【００２７】
＜試験２：鉄イオン過剰における細胞の増殖阻害試験との比較＞
上記試験１の結果から、本発明の高純度鉄の表面では、ＭＤＣＫ細胞は根付き、増殖ができるが、汎用純鉄や炭素鋼およびステンレス鋼の表面では、ＭＤＣＫ細胞は根付くことも、増殖することもができないことが明らかとなった。この原因は、本発明の高純度鉄との耐食性の差、すなわち、培地中に溶出するＦｅイオン濃度の差によるものと推定される。
そこで、ＭＤＣＫ細胞の培養液に、Ｆｅ２＋イオン濃度が０ｍＭｏｌ／Ｌの状態をベース（control）とし、これに、０．０１ｍＭｏｌ／Ｌ、０．１ｍＭｏｌ／Ｌ、１ｍＭｏｌ／Ｌおよび５ｍＭｏｌ／ＬとなるようＦｅＳＯ４を加えた５水準のＤＭＥＭ培地に、試験１と同じＭＤＣＫ細胞を１．０×１０５接種し、３７℃の温度下で３日間、細胞培養試験を行い、コロニー数の変化を調査した。
【００２８】
図４に上記試験の結果を示した。この結果から、ＭＤＣＫ細胞の増殖活動は、Ｆｅ２＋イオン濃度に依存し、Ｆｅ２＋イオン濃度が高くなるほど抑制されること、特に、Ｆｅ２＋イオン濃度が１ｍＭｏｌ／Ｌを超えると、Ｆｅ２＋イオン無添加の条件（control）に対して約１／２以下にまで増殖が抑制されることがわかった。また、図５の結果から、細胞数が約１／２に抑制される１ｍＭｏｌ／Ｌ以上のＦｅ２＋イオン濃度では、活性酸素を分解する酵素ＳＯＤ１遺伝子の著しい発現誘導も認められた。これは、Ｆｅ２＋イオン濃度が１ｍＭｏｌ／Ｌを超えると、細胞は極めて大きなストレスを感じるようになるためと考えられる。この試験結果は、人体の血清中に含まれる鉄分は０．０１０〜０．０３０ｍＭｏｌ／Ｌであることからも理解できる。
【００２９】
また、上記の試験結果から、生体用金属材料として用いる高純度鉄は、細胞培養環境下あるいは生体内環境下における鉄の溶出量がＦｅ２＋イオン濃度で０．０５ｍＭｏｌ／Ｌ程度以下であることが好ましいといえる。図４から、この値以下であれば、Ｆｅ２＋イオン無添加の場合に対する細胞数の減少量を１／３以下に抑制することができる。より好ましくは、１／４以下に抑制することができる０．０１ｍＭｏｌ／Ｌ以下である。
【００３０】
本試験結果と、上記試験１において、細胞培養シャーレ内に高純度鉄試験片を投入した場合には、細胞増殖の抑制ならびにＳＯＤ１遺伝子の発現誘導もみられなかったことを考慮すると、Ｆｅの純度が９９．９９ｍａｓｓ％以上の高純度鉄は、細胞培養の環境下においては、腐食や酸化を起こすことはなく、したがって、細胞内に取り込まれる鉄イオン濃度が過剰になることはないと考えられる。
【００３１】
また、本発明の生体用金属材料は、表１の試験片Ｎｏ．５のように、Ｆｅの純度が９９．９９ｍａｓｓ％以上の高純度鉄を素材とし、その表面に耐食性や細胞との親和性等を高めるための合金層（浸窒層、浸炭層、高純度鉄合金層等）を付加することも有効であることがわかる。
【００３２】
＜試験３：金属表面における細胞の分化誘導試験＞
生体内の組織や器官を構成する細胞は、それぞれの細胞の元となる幹細胞が、各組織や器官に特有の細胞に分化することにより生成される。そこで、表１に示した各種試験片の表面に幹細胞を接種して、組織や器官の細胞への分化誘導性を調査した。
図６は、表１に示した試験片Ｎｏ．４の高純度鉄の試験片を細胞培養シャーレ内に投入し、該試験片表面にマウス筋芽細胞Ｃ２Ｃ１２を接種して培養し、筋管細胞に分化誘導した結果を示した写真であり、（ａ）は分化誘導前の試験片表面上の細胞、（ｂ）は分化誘導５日後の試験片表面上の細胞である。この写真から、分化誘導５日後には筋管細胞に分化していることがわかる。なお、上記した分化誘導は、試験片Ｎｏ．４に限らず、他の試験片Ｎｏ．１〜３の高純度鉄試験片や、試験片Ｎｏ．５の高純度窒化鉄合金でも、試験片表面に細胞は根付き、筋管細胞に分化することが確認された。
【００３３】
また、図７は、表１に示した試験片Ｎｏ．３の高純度鉄を細胞培養シャーレ内に投入し、該試験片表面に間葉系幹細胞ＭＳＣを接種して培養し、骨芽細胞に分化誘導した結果を示した写真であり、（ａ）は分化誘導前のシャーレ上の細胞、（ｂ）は分化誘導１９日後の試験片表面上の細胞（アリザリンレッドで染色後）である。分化誘導後１９日後の写真では、Ｃａを蓄積した細胞が赤色に染色されていることから、骨芽細胞に分化していることが確認できる。
【００３４】
これに対して、表１に示した試験片Ｎｏ．９の炭素鋼Ｓ４５Ｃを細胞培養シャーレ内に投入し、該試験片表面にマウス筋芽細胞Ｃ２Ｃ１２を接種して培養し、筋管細胞に分化誘導したところ、接種した細胞は、試験片表面では付着も増殖もすることもなく、試験片が存在していないシャーレ上においても、細胞の分化が抑制されていることがわかった。図８は、その結果を示す写真であり、（ａ）は分化誘導前のシャーレ上の細胞、（ｂ）は分化誘導５日後のシャーレ上の細胞である。炭素鋼Ｓ４５Ｃで、このように細胞の増殖、分化が抑制される原因は、上述した試験２の結果から、試験片から鉄が溶出し、過剰鉄イオンの環境が生じたためと考えられる。
【００３５】
また、上記Ｎｏ．９の炭素鋼Ｓ４５Ｃ試験片の表面に間葉系幹細胞ＭＳＣを接種して培養し、骨芽細胞に分化誘導した結果も、上記と同様、接種した細胞は、試験片表面では付着も増殖もすることもなく、試験片が存在していないシャーレ上においても、細胞の分化が抑制されていた。
【００３６】
上記試験の結果から、本発明の高純度鉄は、組織や器官の細胞に分化する細胞に対しても高い親和性と安全性を有することが確認された。また、２価の鉄イオンになりにくい本発明の高純度鉄は、細胞が根付く培地としても利用できることが明らかになった。
【００３７】
＜試験４：マウス個体への移植試験＞
上記試験１〜３の結果から、本発明の高純度鉄からなる生体用金属材料の有効性が、培養細胞レベルで確認することができた。そこでさらに、マウス個体に対して、汎用純鉄（ＣＯＭ−Ｆｅ：表１の試験片Ｎｏ．７（ＳＵＹ−１）に相当）と、高純度鉄（ＵＨＰ−Ｆｅ：表１の試験片Ｎｏ．４（ＵＨＰ−ＨＡ−ＣＲ）に相当）のワイヤを、アルコール消毒し、乾燥した後、マウス内に埋設して５日後に摘出し、ワイヤ表面ならびに移植したワイヤの周辺組織の細胞の様子を観察した。
【００３８】
その結果、汎用純鉄のワイヤの場合には、図９の左上図に示した摘出したワイヤ表面の光学顕微鏡写真からわかるように、ワイヤの表面には粒状の鉄錆が発生しており、細胞の強固な付着は認められなかった。さらに、図９の左下図には、摘出したワイヤ表面をＳＥＭ−ＥＤＸで測定した結果を示したが、極微量のＰの付着が認められるものの、Ｃａの付着は認められなかった。しかも、埋設したワイヤの周辺組織には炎症が生じていた。
【００３９】
これに対して、本発明の高純度鉄のワイヤの場合には、摘出したワイヤ表面には細胞が強固に付着しており、細胞を剥離するには、小刀で切り取る必要があった。また、細胞を切り取ったワイヤ表面に認められた白色部（図９の右上図に示した光学顕微鏡写真の白線丸内）をＳＥＭ−ＥＤＸで測定した結果を図９の右下図に示したが、高純度鉄のワイヤ表面には、多量のＰとＣａが検出されている。この結果は、骨芽細胞の関与によって、高純度鉄のワイヤ表面にリン酸カルシウムが形成されていることを示している。また、ワイヤの周辺組織には炎症は認められなかった。
【００４０】
以上の試験結果から、本発明の高純度鉄は、in vitroの培養細胞での試験結果と同様、in vivoの生体内においても、（１）耐食性、（２）毒性、（３）細胞との親和性のいずれにおいても優れており、生体用金属材料として極めて有望な材料であることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００４１】
上記に説明したように、本発明の高純度鉄は、生体適合性に極めて優れているので、既存の骨折プレート、人工関節、ステント、メタルインレー、入れ歯、クラウン、ペースメーカー、心臓内などのベン、胃袋の強酸に耐える部材などの材料として好適であるばかりでなく、さまざまな細胞の培地として、骨、歯、血管、筋肉のサポート材としても好適に用いることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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