(57)【要約】【課題】マイクロＲＮＡのメチル化修飾を網羅的にかつ高精度にプロファイリングするのに適した計測方法を提供する。【解決手段】マイクロＲＮＡにおけるメチル化修飾部位を計測する方法であって、（１）リボヌクレオチドのメチル化候補部位の一つに選択的に作用しうる修飾剤をマイクロＲＮＡに作用させる工程；（２）工程（１）で得られた修飾マイクロＲＮＡに対して、質量分析により断片化測定を行う工程；及び（３）工程（２）で得られた、それぞれのリボヌクレオチドについての質量数の検出値を、未修飾の対応するリボヌクレオチドの質量数と比較し、差がないときに前記メチル化候補部位がメチル化されていると判定する工程を含む方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
１ミリ四方に１０００〜３０００種のリボヌクレオチドのスポットを形成するための捕捉用核酸が表面に固定化されたチップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロＲＮＡにおけるメチル化修飾部位を計測する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
リボ核酸（ＲＮＡ）の生体内におけるメチル化修飾は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）におけるものと比較してもより多彩であり、疾患との深い関連性等が指摘されている。
【０００３】
特に、発生を含む生物学、並びに慢性炎症、生活習慣病及び癌を含む疾患における重要性から、２３塩基対にサイズピークを有するマイクロＲＮＡが注目されている。所望のマイクロＲＮＡの検出には、定量ＲＴ−ＰＣＲ等が用いられる（非特許文献１）。
【０００４】
ＲＮＡのメチル化修飾を計測する方法として、核酸シークエンス法や液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ−ＭＳ）等を用いることも提案されている。しかし、従来の方法は、生体内におけるマイクロＲＮＡのメチル化修飾を網羅的にかつ高精度にプロファイリングするためには適しておらず、このため、マイクロＲＮＡのメチル化に関する生物医学的な意義の解明がほとんど進んでいない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｙｏｓｈｉｏｋａ  Ｙ．ら他１７名、「Ｕｌｔｒａ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｂｉｏｐｓｙ  ｏｆ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ＥｘｏＳｃｒｅｅｎ」、Ｎａｔ．  Ｃｏｍｍｕｎ．、２０１４年、７；５：３５９１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者らは、マイクロＲＮＡのメチル化修飾を網羅的にかつ高精度にプロファイリングするのに適した計測方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、ＲＮＡのメチル化候補部位の一つに選択的に作用しうる修飾剤を利用し、かつ質量分析により断片化測定を行うことにより、上記課題を解決できることを見出し、さらに試行錯誤を重ねることにより本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、下記の態様を含む。
項１．
マイクロＲＮＡにおけるメチル化修飾部位を計測する方法であって、
（１）リボヌクレオチドのメチル化候補部位の一つに選択的に作用しうる修飾剤をマイクロＲＮＡに作用させる工程；
（２）工程（１）で得られたマイクロＲＮＡに対して、質量分析により断片化測定を行う工程；及び
（３）工程（２）で得られた、それぞれのリボヌクレオチドについての質量数の検出値を、未修飾の対応するリボヌクレオチドの質量数と比較し、差がないときに前記メチル化候補部位がメチル化されていると判定する工程
を含む方法。
項２．
前記工程（２）における断片化を、アンモニアによるアルカリ加水分解により行う、項１に記載の方法。
項３．
リボヌクレオチドを種類毎にスポット状に配置したプレート上において、前記工程（１）及び（２）を行う、項１又は２に記載の方法。
項４．
前記スポットを、前記プレート上に固定された捕捉用核酸に対して相補的な核酸配列を含むリボヌクレオチドを結合させることにより得る、項３に記載の方法。
項５．
１ミリ四方に、１０００〜３０００種の前記スポットを有する前記プレート上において、前記工程（１）及び（２）を行う、項３又は４に記載の方法。
項６．
前記工程（２）における質量分析により、リボヌクレオチドの量及び核酸配列情報も同時に計測する、項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
項７．
項５に記載のスポットを形成するための捕捉用核酸が表面に固定化されたチップ。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、マイクロＲＮＡのメチル化修飾を簡便にかつ高精度に計測できる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】測定１の結果を示す図面である。
【図２】測定２の結果を示す図面である。
【図３】測定３の結果を示す図面である。
【図４】測定４の結果を示す図面である。
【図５】硫酸ジメチル処理の概念図である。
【図６】クロロアセトアルデヒド処理の概念図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
１．  メチル化修飾部位を計測する方法
本発明の、マイクロＲＮＡにおけるメチル化修飾部位を計測する方法は、
（１）リボヌクレオチドのメチル化候補部位の一つに選択的に作用しうる修飾剤をマイクロＲＮＡに作用させる工程；
（２）工程（１）で得られたマイクロＲＮＡに対して、質量分析により断片化測定を行う工程；及び
（３）工程（２）で得られた、それぞれのリボヌクレオチドについての質量数の検出値を、未修飾の対応するリボヌクレオチドの質量数と比較し、差がないときに前記メチル化候補部位がメチル化されていると判定する工程
を含む。
【００１２】
１．１  工程（１）
計測対象とするマイクロＲＮＡは特に限定されず、目的に応じて適宜選択できる。マイクロＲＮＡは、特に限定されないが、典型的には、塩基数２０〜２５である。
【００１３】
計測対象とするリボヌクレオチドの例として、ヒトマイクロＲＮＡ等が挙げられる。ヒトマイクロＲＮＡは現在、２５７８種からなるとされている。
【００１４】
一種のリボヌクレオチドのみを計測対象としてもよいし、複数種のリボヌクレオチドを計測対象としてもよい。例えば、ヒトから採取した検体に含まれるヒトマイクロＲＮＡ総体をそのまま計測対象とすることもできる。この場合、必要に応じて、後述する工程（２）における質量分析により、個々のヒトマイクロＲＮＡについて、発現量及び核酸配列に関する情報も同時に取得できる。
【００１５】
また、ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ２本鎖を測定対象とすることもできる。本発明によれば、ＲＮＡ及びＤＮＡのそれぞれの鎖の識別が可能となる。
【００１６】
リボヌクレオチドのメチル化候補部位は、既に明らかにされており、具体的には、表１に示す通りである。
【００１７】
【表１】
2020150946.tif 000002
【００１８】
それぞれの部位に対して使用できる修飾剤の例も表１に示す。ハロゲン化アセトアルデヒドは、好ましくは、ブロモアセトアルデヒド又はクロロアセトアルデヒドであり、より好ましくはブロモアセトアルデヒドである。
【００１９】
本発明において、修飾剤は、特に表１に記載のものに限定されず、同様の作用を有するものを適宜使用することができる。後述する工程（３）において、修飾剤の作用による質量数の変化の有無により計測を行うことが重要である。したがって、本発明で用いる修飾剤は、個々のメチル化候補部位に選択的に作用するものであり、かつ後述の工程（２）で検出可能な質量変化を生じうるものであればよい。
【００２０】
修飾剤を作用させる条件は、修飾剤毎により異なり、適宜選択することができる。
【００２１】
必要に応じて、複数種の修飾剤を同時に作用させることもできる。
【００２２】
１．２  工程（２）
質量分析による核酸の断片化測定の方法は既に知られており、特に限定されないが、例えば、ブルカーダルトニクス社製ｕｌｔｒａｆｌｅｘ  ｔｏｆ／ｔｏｆ等に代表されるような、ＭＡＬＤＩ型質量分析計を利用できる。
【００２３】
この場合、特に限定されないが、断片化を、アンモニアによるアルカリ加水分解により行うとＤＮＡは分解を受けずＲＮＡのみが断片化を受ける上に、塩の除去が不要なために、ターゲットプレート上での操作が可能となり有利である。この場合、加水分解は主として５’末端側から進行する。アンモニアによる加水分解の条件としては、特に限定されないが、例えば、０．１Ｎ  アンモニア水６０℃、３０分間等が挙げられる。
【００２４】
ターゲットプレート上の断片化処理を行った検体、又は未処理の検体について、ＭＡＬＤＩ用マトリクス（イオン化助剤）を塗布した後に、ＭＡＬＤＩ型質量分析計にて質量分析を行う。この場合、特に限定されないが、例えば、３−ＨＰＡ（３-ヒドロキシピコリン酸）、ＤＨＣ（クエン酸二アンモニウム）、ＣＨＣＡ（α-シアノ-4-ヒドロキシけい皮酸）等が利用出来る。  
【００２５】
特に限定されないが、リボヌクレオチドを種類毎にスポット状に配置したターゲットプレート上において、工程（１）及び（２）を行うと、一度に複数種のリボヌクレオチドに対する計測結果を得ることができ、有利である。
【００２６】
特に限定されないが、そのようなスポットとしては、例えば、直径１０μｍ〜１００μｍのもの等が挙げられる。そのスポット内に、特に限定されないが、例えば、１０７以上の同一種のリボヌクレオチドを配置してもよい。
【００２７】
そのようなスポットは、特に限定されないが、例えば、前記プレート上に固定された捕捉用核酸に対して相補的な核酸配列を含むリボヌクレオチドを結合させることにより得ることができる。
【００２８】
特に限定されないが、アビジンからなる基盤をスポット内に配置し、捕捉用核酸をビオチン化したものをかかる基盤に固定化することにより、上記スポットを作成することができる。
【００２９】
特に限定されないが、１ミリ四方に、１０００〜３０００種の前記スポットを配置することができる。一例として、２５７８種のヒトマイクロＲＮＡをそれぞれ選択的に捕捉しうる捕捉核酸が種類毎に固定化されている２５７８種のスポットを、１ミリ四方内に配置することができる。
【００３０】
異なるスポット同士が互いに近接している場合には、質量分析による断片化測定の際に近接するスポットにそれぞれ由来するシグナル同士が干渉し合い、スポット毎の計測値に影響が生じ得る。したがって、必要に応じて、所定領域内における各スポットの配置に際しては、シグナル間の干渉が生じても影響が最小限で済むように配置順に配慮することが重要となる。配置順の決定においては、必要に応じて数理的統計的手法を利用することができる。
【００３１】
特に限定されないが、各スポットの配置順の決定は、例えば以下のようにして行うことができる。
【００３２】
（１）全マイクロＲＮＡの分類
この段階においては、全マイクロＲＮＡを、それぞれ特定の部分配列を共有するもの同士からなる集団に分類する。この際、同じ集団に属するマイクロＲＮＡ同士の間に、観測機器により判別可能な質量差があることが必要となる。この条件を満たす部分配列が、捕捉核酸の候補となる。
【００３３】
（２）捕捉核酸の最適化
上記（１）により得られた捕捉核酸の候補の中には、捕捉しようとするマイクロＲＮＡが互いに重複しているものがある場合がある。この場合、全マイクロＲＮＡを漏れなく捕捉しつつ、捕捉核酸の総数が最小となるように捕捉核酸の集約を行う。
【００３４】
（３）捕捉核酸の配置最適化
上記（２）により集約された捕捉核酸を、隣接する捕捉核酸により捕捉されるマイクロＲＮＡ同士の質量差が最大となるように、配置順を最適化する。この際に、必要に応じてモンテカルロ法等の数理的統計的手法を利用することができる。
【００３５】
１．３  工程（３）
工程（２）で得られた、それぞれのリボヌクレオチドについての質量数の検出値を、未修飾の対応するリボヌクレオチドの質量数と比較し、差がないときに前記メチル化候補部位がメチル化されていると判定する。このとき、修飾剤がその標的箇所を修飾できなかったことを意味している。すなわち、その標的箇所は、メチル化されているといえる。
【００３６】
反対に、上記において差があるときは、修飾剤がその標的箇所を修飾したことを意味している。すなわち、その標的箇所は、メチル化されていないといえる。
【００３７】
２．  計測用チップ
本発明の計測用チップは、上記に記載のスポットを形成するための捕捉用核酸が表面に固定化されたチップである。
【００３８】
特に限定されないが、そのようなスポットとしては、例えば、直径１０μｍ〜１００μｍのもの等が挙げられる。そのスポット内に、特に限定されないが、例えば、１０７以上の同一種のリボヌクレオチドが配置されていてもよい。
【００３９】
そのようなスポットは、特に限定されないが、例えば、前記プレート上に固定された捕捉用核酸に対して相補的な核酸配列を含むリボヌクレオチドを結合させることにより得ることができる。
【００４０】
特に限定されないが、アビジンからなる基盤をスポット内に配置し、捕捉用核酸をビオチン化したものをかかる基盤に固定化することにより、上記スポットを作成することができる。
【００４１】
特に限定されないが、１ミリ四方に、１０００〜３０００種の前記スポットを配置することができる。一例として、２５７８種のヒトマイクロＲＮＡをそれぞれ選択的に捕捉しうる捕捉核酸が種類毎に固定化されている２５７８種のスポットを、１ミリ四方内に配置することができる。
【００４２】
スポットの配置順については、既に説明した通りである。
【００４３】
チップの基材としては、特に限定されないが、例えば、導電性を付与したガラス及びプラスチック（ポリエチレン）等が挙げられる。
【００４４】
特に限定されないが、高速解析を行うため、上記のスポットを有する多数のウェルを備える計測用チップとすることができる。特に限定されないが、３８４ウェルプレート等が例示できる。
【００４５】
この計測用チップは、既に説明した、メチル化修飾部位を計測する方法のために使用できる。また、メチル化修飾の有無とは無関係に、質量分析により、リボヌクレオチドの量及び／又は核酸配列情報を計測するために使用することもできる。
【実施例】
【００４６】
以下、本発明を実施例及び比較例により具体的に説明するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
【００４７】
以下の手順においては、質量分析用試薬（マトリクスなど）、化学合成用試薬（クロロアセトアルデヒドなど）、分子生物学用（塩基や合成核酸など）、特級試薬（アンモニア水など）を使用した。
【００４８】
測定１
メチル化アデニンとメチル化シトシンを含むように合成したマイクロＲＮＡ２００−ｃ−５ｐ（ヒト配列／１本鎖）を分け取り、ＲＮａｓｅ-Ｆｒｅｅ超純水に溶解し吸光度測定により濃度を確認した後、濃度を１ｐｍｏｌｅ／μＬに調整した。あらかじめＭＡＬＤＩ用マトリクス（イオン化助剤）として、１０ｍｇ／ｍＬ  ３−ＨＰＡ（３-ヒドロキシピコリン酸）、１０ｍｇ／ｍＬ  ＤＨＣ（クエン酸二アンモニウム）水溶液１μＬをターゲットプレートに塗布し乾燥させた。この同じ位置に先のマイクロＲＮＡ水溶液１μＬを重層して乾燥した。完全な乾燥を確認した後、ＭＡＬＤＩ型質量分析計にて質量分析を行い、プリカーサーイオンの観察により全体の質量を確認するとともに、該プリカーサーイオンに対して、ｉｎ  ｓｏｕｒｃｅ  ｄｅｃａｙ（インソース分解、ＩＳＤ）を用いた測定を実施することによりメチル化塩基を含めた内部配列を確認した。図に示さないが濃度を増減させることである程度の定量性が確保されることもあわせて確認した（図１）。
【００４９】
測定２
先述のメチル化塩基を含む合成したマイクロＲＮＡ２００−ｃ−５ｐ（ヒト配列／１本鎖）水溶液に、０．１Ｎ  アンモニア水を等量加え、６０℃、３０分反応させた後、遠心乾燥によりアンモニアを除去した後、先述のとおりマトリクスとともにターゲットプレート上に塗布・乾燥させ、ＭＡＬＤＩ型質量分析計にて質量分析を行い、アルカリ加水分解が５’末端側から進行すること、並びにアルカリ加水分解が内部塩基配列の確認にきわめて有効であることを確認した（図２）。
【００５０】
測定３
合成したマイクロＲＮＡ３６９−３ｐ（ヒト配列／１本鎖）とその相補配列を有する合成ＤＮＡ（ヒト配列の３６９−３ｐの相補鎖／１本鎖）を同じモル数ずつ混合し、いったん加熱させた後に、徐冷することでアニールさせ、ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ２本鎖を形成し、濃度を１ｐｍｏｌｅ／μＬに調整した。このＲＮＡ−ＤＮＡキメラ２本鎖を先述のとおりマトリクスとともにターゲットプレート上に塗布・乾燥させ、ＭＡＬＤＩ型質量分析計にて質量分析を行い、ＤＮＡ、ＲＮＡそれぞれについてプリカーサーイオンの観察により全体の質量を確認するとともに、ＩＳＤによりＤＮＡ、ＲＮＡそれぞれの鎖の識別および配列決定が可能であることを確認した（図３）。
【００５１】
測定４
ヒト培養細胞を開始材料として抽出・精製して得られた小分子ＲＮＡ画分をＲＮａｓｅ-Ｆｒｅｅ超純水に溶解して、吸光度測定により濃度を確認した後、濃度を１００ｐｍｏｌｅ／μＬに調整した。あらかじめＭＡＬＤＩ用マトリクス（イオン化助剤）として、１０ｍｇ／ｍＬ３−ＨＰＡ（３-ヒドロキシピコリン酸）、１０ｍｇ／ｍＬＤＨＣ（クエン酸二アンモニウム）水溶液１μＬをターゲットプレートに塗布し乾燥させた。ターゲットプレート上に塗布・乾燥させ、ＭＡＬＤＩ型質量分析計にて質量分析を行い、プリカーサーイオンの観察によりマイクロＲＮＡ３６９−３ｐ（ヒト）に相当する質量数の親イオンを見いだし、該プリカーサーイオンに対してＩＳＤを用いた測定を実施することによりメチル化塩基を含めた内部配列を確認し、マイクロＲＮＡ３６９−３ｐであることを確認した（図５）。
【００５２】
硫酸ジメチル処理
図５に模式的に示したとおり、アデニン、１−メチルアデニン、Ｎ６−メチルアデニン
について、硫酸ジメチル処理によるメチル化処理においては、アデニン、Ｎ６−メチルアデニンの２種の分子では１位の窒素メチル化を受けることが期待されるが、すでにメチル化を受けている１−メチルアデニンについてはさらなるメチル化は生じず、質量数は変化しない。
【００５３】
以下に示す手順に従って反応を行い、ＨＰＬＣによる溶出位置の変化およびＬＣ−ＭＳＭＳによる溶出位置および質量数の変化は期待通りのものであった。アデニン、１−メチルアデニン、Ｎ６−メチルアデニンを１００μＭとなるように１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に、それぞれ個別に溶解し、用時調整した１５％硫酸ジメチルのエタノール溶液を終濃度０．５％添加し、２５℃で１分処理を行った。終濃度２％となるようβメルカプトエタノールを添加し、十分に攪拌することで、反応を停止させた後、ＨＰＬＣあるいはＬＣ−ＭＳＭＳによる測定に供した。また、上述のメチル化アデニンとメチル化シトシンを含むように合成したマイクロＲＮＡ２００−ｃ−５ｐ（ヒト配列／１本鎖）についても同様に硫酸ジメチル処理を行い、先述の手段に従ってＭＡＬＤＩ型質量分析計にて質量分析を行い、誘導体化の有効性を確認した。
【００５４】
クロロアセトアルデヒド処理
図６に模式的に示したとおり、シトシン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシンについて、クロロアセトアルデヒド処理によるメチル化処理においては、シトシン、５−メチルシトシンの２種の分子では３位窒素原子とＮ４位窒素原子による環状化が期待されるが、３位窒素原子がメチル化を受けている３−メチルシトシンについてはさらなるメチル化は生じず、質量数の変化は生じない。
【００５５】
以下に示す手順に従って反応を行い、ＨＰＬＣによる溶出位置の変化およびＬＣ−ＭＳＭＳによる溶出位置および質量数の変化は期待通りのものであった。シトシン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシンを１００μＭとなるように１０ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ５）に、それぞれ個別に溶解し、終濃度１％となるようにブロモアセトアルデヒドあるいはクロロアセトアルデヒドを添加し、３７℃で２時間処理を行った。過剰のブロモアセトアルデヒドあるいはクロロアセトアルデヒドをジエチルエーテル抽出により除去した後、水層を乾燥させて得られた残渣をＨＰＬＣあるいはＬＣ−ＭＳＭＳによる測定に供した。また、上述のメチル化アデニンとメチル化シトシンを含むように合成したマイクロＲＮＡ２００−ｃ−５ｐ（ヒト配列／１本鎖）についても同様にブロモアセトアルデヒドあるいはクロロアセトアルデヒドを添加し、３７℃で２時間処理を行い、先述の手段に従ってＭＡＬＤＩ型質量分析計にて質量分析を行い、誘導体化の有効性を確認した。
【図１】
2020150946.tif 000003
【図２】
2020150946.tif 000004
【図３】
2020150946.tif 000005
【図４】
2020150946.tif 000006
【図５】
2020150946.tif 000007
【図６】
2020150946.tif 000008
【配列表】
2020150946000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年5月13日(2020.5.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１ミリ四方に１０００〜３０００種のリボヌクレオチドのスポットを形成するための捕捉用核酸が表面に固定化された質量分析用のチップであって、該捕捉用核酸が、マイクロＲＮＡ同士で共有される部分配列を捕捉するように設計されている、チップ。
【請求項２】
前記捕捉用核酸のうちのある種類の捕捉用核酸によって捕捉されるマイクロＲＮＡ同士の間に前記質量分析により判別可能な質量差があるように、該捕捉用核酸が設計されている、請求項１に記載のチップ。
【請求項３】
１ミリ四方に１０００〜３０００種のリボヌクレオチドのスポットを形成するための捕捉用核酸が表面に固定化された質量分析用のチップであって、該チップの基材が、導電性を付与したガラスまたはプラスチックを含む、チップ。
【請求項４】
質量分析によりマイクロＲＮＡの修飾を測定するための、請求項１〜３のいずれか一項に記載のチップ。
【請求項５】
質量分析によりマイクロＲＮＡのメチル化修飾を測定するための、請求項１〜３のいずれか一項に記載のチップ。
【請求項６】
マイクロＲＮＡにおけるメチル化修飾部位を計測する方法であって、
（１）リボヌクレオチドのメチル化候補部位の一つに選択的に作用しうる修飾剤をマイクロＲＮＡに作用させる工程；
（２）工程（１）で得られたマイクロＲＮＡに対して、質量分析により断片化測定を行う工程；及び
（３）工程（２）で得られた、それぞれのリボヌクレオチドについての質量数の検出値を、未修飾の対応するリボヌクレオチドの質量数と比較し、差がないときに前記メチル化候補部位がメチル化されていると判定する工程
を含む方法において使用するための、請求項１〜３のいずれか一項に記載のチップ。
【請求項７】
さらに質量分析により前記リボヌクレオチドの量及び／又は核酸配列情報を計測するための、請求項４〜６のいずれか一項に記載のチップ。