(57)【要約】      （修正有）【課題】生物体によって合成されるヘム、クロロフィル、ＶＢ１２などのテトラピロール化合物の前駆体として、動物、植物、および微生物に広く存在する、５−アミノレブリン酸（５−ｍｉｎｏｌｅｖｕｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ，ＡＬＡ）を生産するための、活性が改善された５−アミノレブリン酸シンテターゼ（ＡＬＡシンテターゼ）、ＡＬＡシンテターゼ活性を向上させる方法、および得られたＡＬＡシンテターゼによってＡＬＡを生産する方法の提供。【解決手段】特定のアミノ酸配列を有すＡＬＡシンテターゼまたはその活性断片。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
５−アミノレブリン酸シンテターゼ（ＡＬＡシンテターゼ）またはその活性断片であって、
ａ．前記ＡＬＡシンテターゼのアミノ酸配列のＣ末端のアミノ酸残基が欠失したり、非アラニンであり、および／または
ｂ．前記ＡＬＡシンテターゼのアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列に対応する第４０３番のアミノ酸残基が欠失したり、非アラニンであり、および／または
ｃ．前記ＡＬＡシンテターゼのアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３に示されるアミノ酸配列に対応する第４０１番のアミノ酸残基が欠失したり、非アラニンであり、および／または
ｄ．前記ＡＬＡシンテターゼ的アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４２に示されるアミノ酸配列に対応する第４０３番または４０７番のアミノ酸残基が欠失したり、非アラニンであり、および／または
ｅ．前記ＡＬＡシンテターゼのＣ末端に１つまたは複数の任意のアミノ酸残基を添加し、好ましくは１−１０の任意のアミノ酸残基を添加し、より好ましくは１−６つ、より好ましくは１−３つ、最も好ましくは１つの任意のアミノ酸残基およびＡＬＡシンテターゼ機能を有するポリペプチドを添加することを特徴とする、前記５−アミノレブリン酸シンテターゼ（ＡＬＡシンテターゼ）またはその活性断片。
【請求項２】
請求項１に記載のＡＬＡシンテターゼまたはその活性断片のコーディング核酸配列。
【請求項３】
請求項１に記載のＡＬＡシンテターゼまたはその活性断片のコーディング核酸配列を含む発現担体。
【請求項４】
請求項１に記載のＡＬＡシンテターゼまたはその活性断片を含む宿主細胞。
【請求項５】
ＡＬＡ生成における請求項１に記載のＡＬＡシンテターゼまたはその活性断片、または請求項２に記載のコーディング核酸配列、または請求項３に記載の発現担体、または請求項４に記載の宿主細胞の応用。
【請求項６】
ＡＬＡの製造方法であって、
請求項４に記載の宿主細胞を培養するか、請求項４に記載の宿主細胞を休止細胞に製造して、ＡＬＡを生成するステップａと、および
培養液からステップａで生成されたＡＬＡを選択的に分離するステップｂとを含む、前記ＡＬＡの製造方法。
【請求項７】
ＡＬＡの製造方法であって、
請求項１に記載のＡＬＡシンテターゼまたはその活性断片を利用して、サクシニルＣｏＡおよびグリシンからのＡＬＡ合成を触媒するステップａと、および
前記反応システムからＡＬＡを選択的に分離するステップｂとを含む、前記ＡＬＡの製造方法。
【請求項８】
請求項１に記載のＡＬＡシンテターゼの製造方法であって、
請求項１に記載のＡＬＡシンテターゼのコーディング配列を得るステップａと、
ステップａから得られたコーディング配列を適切な宿主細胞に直接形質感染させるか、担体によって適切な宿主細胞に導入するステップｂと、
ステップｂから得られた宿主細胞を培養するステップｃと、および
ステップｃから得られた培養システムから前記宿主細胞で生成されたＡＬＡシンテターゼを分離するステップｄとを含む、前記請求項１に記載のＡＬＡシンテターゼの製造方法。
【請求項９】
改良ＡＬＡシンテターゼを提供してその活性を向上させる方法であって、
改良前のＡＬＡシンテターゼのアミノ酸配列に対して、改良されるＡＬＡシンテターゼのアミノ酸配列の第４０１番、第４０３番または第４０７番、またはＣ末端のアミノ酸残基を欠失させたり、非アラニンに置き換え、および／または前記ＡＬＡシンテターゼのＣ末端に１−Ｎ個の任意のアミノ酸残基を、好ましくは１−１０、より好ましくは１−６つ、より好ましくは添加１−３つ、最も好ましくは１つの任意のアミノ酸残基を添加し、および／または
改良されるＡＬＡシンテターゼのアミノ酸配列とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列を比較して、コーディングされたアミノ酸配列でＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列に対応される第４０３番またはＣ末端のアミノ酸残基を欠失させたり、非アラニンに置き換えるように、前記改良されるＡＬＡシンテターゼのコーディング配列を改良し、および／または
改良されるＡＬＡシンテターゼのアミノ酸配列とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２に示されるアミノ酸配列を比較して、コーディングされたアミノ酸配列でＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２に示されるアミノ酸配列に対応される第４０３番または第４０７番またはＣ末端のアミノ酸残基を欠失させたり、非アラニンに置き換えるように、前記改良されるＡＬＡシンテターゼのコーディング配列を改良し、および／または
改良されるＡＬＡシンテターゼのアミノ酸配列とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３に示されるアミノ酸配列を比較して、コーディングされたアミノ酸配列でＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３に示されるアミノ酸配列に対応される第４０１番またはＣ末端のアミノ酸残基を欠失させたり、非アラニンに置き換えるように、前記改良されるＡＬＡシンテターゼのコーディング配列を改良するステップａと、
ステップａから得られたコーディング配列を適切な宿主細胞に直接形質感染させるか、担体によって適切な宿主細胞に導入するステップｂと、
ステップｂから得られた宿主細胞を培養するステップｃと、および
ステップｃから得られた培養システムから前記宿主細胞で生成されたＡＬＡシンテターゼを分離するステップｄとを含む、前記改良ＡＬＡシンテターゼを提供してその活性を向上させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物技術分野に関する。具体的に、本発明は、５−アミノレブリン酸シンテターゼの変異体およびその宿主細胞と応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
５−アミノレブリン酸（５−ｍｉｎｏｌｅｖｕｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ，ＡＬＡ）は、生物体によって合成されるヘム、クロロフィル、ＶＢ１２などのテトラピロール化合物の前駆体として、動物、植物、および微生物に広く存在する。ＡＬＡは、医薬、農業、飼料および健康食品などの分野で広く使用され、開発の価値が高い高付加価値バイオベースの化学物質である。近年、微生物を利用して、Ｃ４経路を介してＡＬＡの発酵生産が産業的に応用されてきた。
【０００３】
５−アミノレブリン酸シンテターゼ（ＡＬＡシンテターゼ）は、Ｃ４経路によってＡＬＡおよびテトラピロール化合物を合成するための重要な酵素と律速酵素であり、その酵素的性質の優劣はＡＬＡ合成効率に直接影響を与える。近年、アグロバクテリウムラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ，ＣＮ１３２２１３２Ｃ）、ロドブラスタスアシドフィラス（Ｒｈｏｄｏｂｌａｓｔｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ，ＣＮ１９７４７５８Ｂ）、ロドバクタースフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ，ＣＮ１０３１４６６９４Ｂ）、ロドシュードモナスパルストリス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ，ＣＮ１０３９８１２０３Ｂ）などを含む異なる由来の大量のＡＬＡシンテターゼをクローニングして同定してＡＬＡ高収率菌株を構築した。しかし、前記ＡＬＡシンテターゼはすべて、異なる生物体内に天然的に存在する酵素のソースであり、これらの酵素自体の活性が高くないので（Ｍｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ.  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，  ２０１５，  ３７（１１）：  ２２４７−２２５３；Ｍｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ.  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，  ２０１５，  ３７（１１）：  ２２４７−２２５３）工学細菌（ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｂａｃｔｅｒｉａ）に応用するのは難しい。
【０００４】
近年、酵素工学、タンパク質工学技術の急速な発展に伴い、合理的な設計を通じた酵素の触媒活性などの性質の向上させることが広く応用されている。しかし、現在ＡＬＡシンテターゼの合理的な設計と改良に関する研究は多くなく、従来のレポートは、主に真核生物由来のＡＬＡシンテターゼに関するもので、Ｔｕｒｂｅｖｉｌｌｅらは、２つのマウス由来ＡＬＡシンテターゼを融合発現させた後、その触媒効率を増加させることができ（Ｔｕｒｂｅｖｉｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ.  Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，  ２０１１，  ５１１（１）：  １０７−１１７）、Ｌｅｎｄｒｉｈａｓらは、マウス赤血球細胞内ＡＬＡシンテターゼＩＩの変異体のライブラリーを構築して、酵素活性の向上されたＡＬＡシンテターゼ変異体をスクリーニングして得た（Ｌｅｎｄｒｉｈａｓ  ｅｔ  ａｌ.  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２０１０，  ２８５（１８）：  １３７０４）。上記の研究は、酵素活性が向上されたＡＬＡシンテターゼを得たが、真核生物由来のＡＬＡシンテターゼは、細菌の低発現活性を有するが、ＡＬＡ生合成に使用されていなかった。
【０００５】
なお、ＡＬＡ合成過程での重要な酵素としては、ＡＬＡシンテターゼ活性の向上は、工学細菌の触媒効率を加速して、独自のタンパク質の合成と分解の過程でエネルギー損失を減らすことによって、工学細菌の安定性と生産性能を向上させて、ＡＬＡの生産コストを削減し、農業と畜産などの分野でＡＬＡの応用を促進するに当たり、大きな価値がある。
【０００６】
したがって、ＡＬＡを低コスト生産法により生産するために、活性の高いＡＬＡシンテターゼを開発することが当技術分野で緊急に必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、活性が改善されたＡＬＡシンテターゼ、ＡＬＡシンテターゼ活性を向上させる方法、および得られたＡＬＡシンテターゼによってＡＬＡを生産する方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
第１の態様において、本発明は、ＡＬＡシンテターゼまたはその活性断片を提供し、
ａ．前記ＡＬＡシンテターゼのアミノ酸配列のＣ末端のアミノ酸残基が欠失したり、非アラニンであり、および／または
ｂ．前記ＡＬＡシンテターゼのアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列に対応する第４０３番のアミノ酸残基が欠失したり、非アラニンであり、および／または
ｃ．前記ＡＬＡシンテターゼのアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３に示されるアミノ酸配列に対応する第４０１番のアミノ酸残基が欠失したり、非アラニンであり、および／または
ｄ．前記ＡＬＡシンテターゼ的アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２に示されるアミノ酸配列に対応する第４０３番または４０７番のアミノ酸残基が欠失したり、非アラニンであり、および／または
ｅ．前記ＡＬＡシンテターゼのＣ末端に１つまたは複数の任意のアミノ酸残基を添加し、好ましくは１−１０の任意のアミノ酸残基を添加し、より好ましくは１−６つ、より好ましくは１−３つ、最も好ましくは１つの任意のアミノ酸残基およびＡＬＡシンテターゼ機能を有するポリペプチドを添加することを特徴とする。
【０００９】
好ましい実施形態において、前記ＡＬＡシンテターゼは、突然変異によって得られる。
好ましい実施形態において、突然変異の前に、前記ＡＬＡシンテターゼは、アミノ酸配列の第４０１番、第４０３番、第４０７番、またはＣ末端のアミノ酸残基はアラニンであり、ＡＬＡシンテターゼ活性を有するポリペプチドである。
【００１０】
好ましい実施形態において、前記ＡＬＡシンテターゼは、様々な種から由来することができ、アグロバクテリウムラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）、ロドブラスタスアシドフィラス（Ｒｈｏｄｏｂｌａｓｔｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ロドバクタースフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）、ロドバクターカプスラータ（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）、ロドシュードモナスパルストリス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）を含むがこれらに限定されず、好ましくは、ロドシュードモナスパルストリスである。
【００１１】
より好ましい実施形態において、前記ＡＬＡシンテターゼのアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列と５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％、９７％、９８％、９９％の相同性を有するか、前記前記ＡＬＡシンテターゼのアミノ酸配列とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２に示されるアミノ酸配列は、８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％、９７％、９８％、９９％の相同性を有するか、前記ＡＬＡシンテターゼのアミノ酸配列とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３に示されるアミノ酸配列は、８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％、９７％、９８％、９９％の相同性を有する。
【００１２】
好ましい実施形態において、前記ＡＬＡシンテターゼは、
ａ．その第４０３番またはＣ末端のアミノ酸残基またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列に対応する第４０３番またはＣ末端のアミノ酸残基が欠失したり、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔから選択されるアミノ酸の１つであり、および／または
ｂ．その第４０１番またはＣ末端のアミノ酸残基またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３に示されるアミノ酸配列に対応する第４０１番またはＣ末端のアミノ酸残基が欠失したり、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔから選択されるアミノ酸の１つであり、および／または
ｃ．その第４０３番または第４０７番またはＣ末端のアミノ酸残基またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２に示されるアミノ酸配列に対応する第４０３番または第４０７番またはＣ末端のアミノ酸残基が欠失したり、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔから選択されるアミノ酸の１つであり、および／または
ｄ．Ｃ末端に１−１０の任意のアミノ酸残基を添加し、より好ましくは１−６つ、より好ましくは１−３つ、最も好ましくは１つの任意のアミノ酸残基およびＡＬＡシンテターゼ機能を有するポリペプチドを添加し、前記任意のアミノ酸残基は、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ａｌａから選択されるアミノ酸の１つである。
【００１３】
好ましい実施形態において、前記ＡＬＡシンテターゼは、
ａ．その第４０３番またはＣ末端のアミノ酸残基またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列に対応する第４０３番またはＣ末端のアミノ酸残基が欠失したり、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔから選択されるアミノ酸の１つであり、および／または
ｂ．その第４０１番またはＣ末端のアミノ酸残基またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３に示されるアミノ酸配列に対応する第４０１番またはＣ末端のアミノ酸残基が欠失したり、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔから選択されるアミノ酸の１つであり、および／または
ｃ．その第４０３番または第４０７番またはＣ末端のアミノ酸残基またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２に示されるアミノ酸配列に対応する第４０３番または第４０７番またはＣ末端のアミノ酸残基が欠失したり、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔから選択されるアミノ酸の１つであり、および／または
ｄ．前記ＡＬＡシンテターゼのＣ末端に１−６つ、より好ましくは１−３つ、最も好ましくは１つの任意のアミノ酸残基およびＡＬＡシンテターゼ機能を有するポリペプチドを添加し、前記任意のアミノ酸残基は、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ａｌａから選択されるアミノ酸の１つである。
【００１４】
好ましい実施形態において、前記ＡＬＡシンテターゼのＣ末端に添加されるアミノ酸残基は、ＧｌｕまたはＧｌｎである。
好ましい実施形態において、前記ＡＬＡシンテターゼのアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示され、
ａ．第４０３番またはＣ末端のアミノ酸残基が欠失したり、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌから選択されるアミノ酸の１つであり、および／または
ｂ．Ｃ末端に１−６つ、より好ましくは１−３つ、最も好ましくは１つの任意のアミノ酸残基およびＡＬＡシンテターゼ機能を有するポリペプチドを添加し、前記任意のアミノ酸残基は、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ａｌａから選択されるアミノ酸の１つである。
【００１５】
好ましい実施形態において、前記ＡＬＡシンテターゼのアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３に示され、
ａ．第４０１番またはＣ末端のアミノ酸残基が欠失したり、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌから選択されるアミノ酸の１つであり、および／または
ｂ．Ｃ末端に１−６つ、より好ましくは１−３つ、最も好ましくは１つ任意のアミノ酸残基およびＡＬＡシンテターゼ機能を有するポリペプチドを添加し、前記任意のアミノ酸残基は、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ａｌａから選択されるアミノ酸の１つである。
【００１６】
好ましい実施形態において、前記ＡＬＡシンテターゼのＣ末端に添加されるアミノ酸残基は、ＧｌｕまたはＧｌｎである。
好ましい実施形態において、前記ＡＬＡシンテターゼのアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２に示され、
ａ．第４０３番または第４０７番またはＣ末端のアミノ酸残基が欠失したり、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌから選択されるアミノ酸の１つであり、および／または
ｂ．Ｃ末端に１−６つ、より好ましくは１−３つ、最も好ましくは１つ任意のアミノ酸残基およびＡＬＡシンテターゼ機能を有するポリペプチドを添加し、前記任意のアミノ酸残基は、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ａｌａから選択されるアミノ酸の１つである。
【００１７】
好ましい実施形態において、前記ＡＬＡシンテターゼのＣ末端に添加されるアミノ酸残基は、ＧｌｕまたはＧｌｎである。
第２の態様において、本発明は、第１の態様によるＡＬＡシンテターゼまたはその活性断片のコーディング核酸配列を提供する。
【００１８】
第３の態様において、本発明は、第１の態様によるＡＬＡシンテターゼまたはその活性断片を含むコーディング核酸配列の発現担体を提供する。
第４の態様において、本発明は、第１の態様によるＡＬＡシンテターゼまたはその活性断片を含む宿主細胞を提供する。
【００１９】
好ましい実施形態において、前記宿主細胞は、第３の態様による発現担体または第２の態様によるコーディング核酸配列が統合されたそのゲノムを含む。
好ましい実施形態において、前記宿主細胞は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、ロドバクタースフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）、ロドバクターカプスラータ（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）、ロドシュードモナスパルストリス  （Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）であり、より好ましくは、大腸菌またはコリネバクテリウムグルタミカムである。
【００２０】
第５の態様において、本発明は、第１の態様によるＡＬＡシンテターゼまたはその活性断片、または第２の態様によるコーディング核酸配列、または第３の態様による発現担体、またはＡＬＡ生成における第４の態様による宿主細胞の応用を提供する。
【００２１】
第６の態様において、本発明は、ＡＬＡの製造方法を提供し、前記方法は、
第４の態様による宿主細胞を培養するか、第４の態様による宿主細胞を休止細胞に製造して、ＡＬＡを生成するステップａと、および
培養液からステップａで生成されたＡＬＡを選択的に分離するステップｂとを含む。
【００２２】
第７の態様において、本発明は、ＡＬＡの製造方法を提供し、前記方法は、
第１の態様によるＡＬＡシンテターゼまたはその活性断片を利用して、サクシニルＣｏＡおよびグリシンからのＡＬＡ合成を触媒するステップａと、および
前記反応システムからＡＬＡを選択的に分離するステップｂとを含む。
【００２３】
第８の態様において、本発明は、第１の態様によるＡＬＡシンテターゼの製造方法を提供し、前記方法は、
第１の態様によるＡＬＡシンテターゼのコーディング配列を得るステップａと、
ステップａから得られたコーディング配列を適切な宿主細胞に直接形質感染させるか、担体によって適切な宿主細胞に導入するステップｂと、
ステップｂから得られた宿主細胞を培養するステップｃと、および
ステップｃから得られた培養システムから前記宿主細胞で生成されたＡＬＡシンテターゼを分離するステップｄとを含む。
【００２４】
好ましい実施形態において、前記方法は、得られたＡＬＡシンテターゼの活性および菌株のＡＬＡ生産量を測定するステップをさらに含む。
第９の態様において、本発明は、改良ＡＬＡシンテターゼを提供してその活性を向上させる方法を提供し、前記方法は、
改良前のＡＬＡシンテターゼのアミノ酸配列に対して、改良されるＡＬＡシンテターゼのアミノ酸配列の第４０１番、第４０３番または第４０７番またはＣ末端のアミノ酸残基を欠失させたり、非アラニンに置き換え、および／または前記ＡＬＡシンテターゼのＣ末端に１−Ｎ個の任意のアミノ酸残基を添加し、好ましくは１−１０の任意のアミノ酸残基を添加し、より好ましくは１−６つ、より好ましくは１−３つ、最も好ましくは１つの任意のアミノ酸残基を添加し、および／または
改良されるＡＬＡシンテターゼのアミノ酸配列とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列を比較して、コーディングされたアミノ酸配列でＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列に対応される第４０３番またはＣ末端のアミノ酸残基を欠失させたり、非アラニンに置き換えるように、前記改良されるＡＬＡシンテターゼのコーディング配列を改良し、
改良されるＡＬＡシンテターゼのアミノ酸配列とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２に示されるアミノ酸配列を比較して、コーディングされたアミノ酸配列でＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２に示されるアミノ酸配列に対応される第４０３番または第４０７番またはＣ末端のアミノ酸残基を欠失させたり、非アラニンに置き換えるように、前記改良されるＡＬＡシンテターゼのコーディング配列を改良し、および／または
改良されるＡＬＡシンテターゼのアミノ酸配列とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３に示されるアミノ酸配列を比較して、コーディングされたアミノ酸配列でＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３に示されるアミノ酸配列に対応される第４０１番またはＣ末端のアミノ酸残基を欠失させたり、非アラニンに置き換えるように、前記改良されるＡＬＡシンテターゼのコーディング配列を改良するステップａと、
ステップａから得られたコーディング配列を適切な宿主細胞に直接形質感染させるか、担体によって適切な宿主細胞に導入するステップｂと、
ステップｂから得られた宿主細胞を培養するステップｃと、および
ステップｃから得られた培養システムから前記宿主細胞で生成されたＡＬＡシンテターゼを分離するステップｄとを含む。
【００２５】
好ましい実施形態において、前記ＡＬＡシンテターゼのアミノ酸配列の第４０３番またはＣ末端のアミノ酸残基またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列に対応する第４０３番またはＣ末端のアミノ酸残基が欠失したり、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔから選択されるアミノ酸の１つであり、および／または
前記ＡＬＡシンテターゼのアミノ酸配列の第４０３番または第４０７番またはＣ末端のアミノ酸残基またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２に示されるアミノ酸配列に対応する第４０３番または第４０７番またはＣ末端のアミノ酸残基が欠失したり、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔから選択されるアミノ酸の１つであり、および／または
前記ＡＬＡシンテターゼのアミノ酸配列の第４０１番またはＣ末端のアミノ酸残基またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２に示されるアミノ酸配列に対応する第４０１番またはＣ末端のアミノ酸残基が欠失したり、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔから選択されるアミノ酸の１つであり、および／または
前記ＡＬＡシンテターゼのＣ末端に１−Ｎ個の任意のアミノ酸残基を添加し、好ましくは１−１０の任意のアミノ酸残基を添加し、より好ましくは１−６つ、より好ましくは１−３つ、より好ましくは１つの任意のアミノ酸残基およびＡＬＡシンテターゼ機能を有するポリペプチドを添加し、前記任意のアミノ酸残基は、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ａｌａから選択されるアミノ酸の１つである。
【００２６】
好ましい実施形態において、前記ＡＬＡシンテターゼのＣ末端に添加されるアミノ酸残基は、ＧｌｕまたはＧｌｎである。
好ましい実施形態において、前記方法は、得られたＡＬＡシンテターゼの活性および前記ＡＬＡシンテターゼを含む工学菌株のＡＬＡ生産量を測定するステップをさらに含む。
【発明の効果】
【００２７】
本発明の範囲内で、本発明の上記の技術的特徴および以下（例えば、実施例）に具体的に説明する各技術的特徴を互いに組み合わせて、新規または好ましい技術的解決手段を形成することができることを理解されたい。スペースの制限のため、ここでは繰り返しない。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】ロドバクターカプスラータ（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）由来のＡＬＡシンテターゼとスクシニル−ＣｏＡの共結晶構造を示す。ここで、紫色のマークは基質結合に関連する領域である。
【図２】異なるロドシュードモナスパルストリスの異なる亜種ＨｅｍＡのアミノ酸配列アラインメント結果を示す。
【図３】異なる種のＡＬＡシンテターゼのアミノ酸配列アラインメントの結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
発明者らは、広範かつ徹底的な研究を経て、既知のＡＬＡ合成酵素がアミノ酸配列との相同性が比較的低いが、Ｃ末端または４０３番の部位がすべてアラニンであることを発見した。さらなる研究の後、ＡＬＡシンテターゼの第４０３番またはＣ末端で欠失または突然変異されるか、またはＡＬＡシンテターゼのＣ末端に複数の任意のアミノ酸残基を添加して、得られたＡＬＡシンテターゼは、酵素活性が向上するだけでなく、工学菌株のＡＬＡ生産量を向上させることができ、これは優れた応用の価値を有することを予期せず発見した。
【００３０】
本発明に関して、ＡＬＡシンテターゼは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列に対応するタンパク質であることができ（ＭＮＹＥＡＹＦＲＲＱＬＤＧＬＨＲＥＧＲＹＲＶＦＡＤＬＥＲＨＡＧＳＦＰＲＡＴＨＨＲＰＥＧＡＧＤＶＴＶＷＣＳＮＤＹＬＧＭＧＱＨＰＡＶＬＴＡＭＨＥＡＬＤＳＣＧＡＧＡＧＧＴＲＮＩＡＧＴＮＨＹＨＶＬＬＥＱＥＬＡＡＬＨＧＫＥＳＡＬＬＦＴＳＧＹＶＳＮＷＡＳＬＳＴＬＡＳＲＭＰＧＣＶＩＬＳＤＥＬＮＨＡＳＭＩＥＧＩＲＨＳＲＳＥＴＲＩＦＡＨＮＤＰＲＤＬＥＲＫＬＡＤＬＤＰＨＡＰＫＬＶＡＦＥＳＶＹＳＭＤＧＤＩＡＰＩＡＥＩＣＤＶＡＤＡＨＮＡＭＴＹＬＤＥＶＨＧＶＧＬＹＧＰＮＧＧＧＩＡＤＲＥＧＩＳＨＲＬＴＩＩＥＧＴＬＡＫＡＦＧＶＶＧＧＹＩＡＧＳＳＡＶＣＤＦＶＲＳＦＡＳＧＦＩＦＳＴＳＰＰＰＡＶＡＡＧＡＬＡＳＩＲＨＬＲＡＳＳＡＥＲＥＲＨＱＤＲＶＡＲＬＲＡＲＬＤＱＡＧＶＡＨＭＰＮＰＳＨＩＶＰＶＭＶＧＤＡＡＬＣＫＱＩＳＤＥＬＩＳＲＹＧＩＹＶＱＰＩＮＹＰＴＶＰＲＧＴＥＲＬＲＩＴＰＳＰＱＨＴＤＡＤＩＥＨＬＶＱＡＬＳＥＩＷＴＲＶＧＬＡＫＡＡ）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列に対応するタンパク質ではないこともでき、言い換えれば、本発明のＡＬＡシンテターゼは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列と比較的高い相同性を有することができ、比較的低い相同性を有することもできる。本発明的ＡＬＡシンテターゼは、様々な種から由来することができ、アグロバクテリウムラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）、ロドブラスタスアシドフィラス（Ｒｈｏｄｏｂｌａｓｔｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ロドバクタースフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）、ロドバクターカプスラータ（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）、ロドシュードモナスパルストリス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）を含むが、これに限定されず、ＡＬＡシンテターゼの活性を有し、対応する第４０３番またはＣ末端アミノ酸残基が欠失したり、突然変異され、および／またはそのＣ末端に１−Ｎ個の任意のアミノ酸残基を添加し、自然状態に比べて活性が向上されると、本発明の範囲内に属する。特に、本発明者らは、野生型ＡＬＡシンテターゼのアミノ酸配列から新しい突然変異部位を発見して、優れた活性を有するＡＬＡシンテターゼを得るために新しいアイデアを開拓して、物質の基盤を築いた。これに基づいて、本発明を完成した。
【００３１】
本明細書で使用される用語「自然状態」は、微生物で変形されていない状態のポリペプチドの活性、すなわち、自然状態での活性を指す。
「ＡＬＡシンテターゼ」
本明細書で使用される用語「５−アミノレブリン酸シンテターゼ」と、本発明の「ＡＬＡシンテターゼ」および「本発明のポリペプチド」は、相互交換して使用することができ、当業者に一般的に理解される意味を有する。本発明のＡＬＡシンテターゼは、サクシニルＣｏＡおよびグリシンからのＡＬＡ合成を触媒する活性を有する。
【００３２】
具体的に、本発明のＡＬＡシンテターゼのアミノ酸配列の第４０３番またはＣ末端のアミノ酸残基が欠失したり、非アラニンであり、前記ＡＬＡシンテターゼのアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列に対応する第４０３番またはＣ末端のアミノ酸残基が欠失したり、非アラニンであり、および／または
前記ＡＬＡシンテターゼのＣ末端に１−Ｎ個の任意のアミノ酸残基を添加し、好ましくは１−１０、好ましくは１−６つ、より好ましくは１−3つ、最も好ましくは１つの任意のアミノ酸残基およびＡＬＡシンテターゼ機能を有するポリペプチドを添加する。
【００３３】
当業者は、活性を向上させるため、野生型ポリペプチドを突然変異をさせることが必要な目的の部位を見つけることよりも重要であることを知っている。したがって、本発明の教示に基づいて、当業者は、改良されるＡＬＡシンテターゼの対応する第４０３番またはＣ末端アミノ酸残基を欠失させたりまたは突然変異させるか、またはＣ末端に１−Ｎ個の任意のアミノ酸残基を添加して、変異体の関連活性を測定した。
【００３４】
具体的な実施形態において、本発明のＡＬＡシンテターゼの第４０３番またはＣ末端のアミノ酸残基は、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔに欠失したり、突然変異することができる（これに限定されない）。
【００３５】
なお、当業者は、ポリペプチドの特定の領域では、少数のアミノ酸残基を変化させることは生物学的活性を基本的に変化させず、例えば、特定のアミノ酸を適切に置き換えて得られた配列がその活性に影響を与えないことを知っているのは難しくない。（Ｗａｔｓｏｎら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ，第４版，１９８７，Ｔｈｅ  Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  Ｐｕｂ.  Ｃｏ.  Ｐ２２４を参照することができる）。したがって、当業者は、これらの代替を行い、得られた分子は、まだ所望の生物学的活性を有することを保証することができる。
【００３６】
したがって、本発明は、本発明のＡＬＡシンテターゼの保存的変異体を含む。これらの保存的変異体は、下記の表に示したようなアミノ酸置き換えによって生成されることができる。
【００３７】
【表１】
2020195375.tif 000002
2020195375.tif 000003
【００３８】
本発明は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに提供する。用語「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」は、このポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むものであることができ、追加のコーディングおよび／または非コーディング配列をさらに含むポリヌクレオチドであることもできる。
【００３９】
ＡＬＡシンテターゼ遺伝子は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３に示されるアミノ酸配列に厳しい条件の下で製造されたプローブであることができ、例えば、初期機能を維持する限り、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３に示されるアミノ酸配列の一部または全体配列に相補的な配列と混成化されたＤＮＡである。前記「厳しい条件」は、いわゆる特異的混成化が形成されることができ、非特異的混成化が形成されない条件を指す。例えば、高い相同性を有するＤＮＡ、例えば、８０ ％以上の相同性を有するＤＮＡは互いに混成化され、８０％未満の相同性を有するＤＮＡは互いに混成化されていない条件、または通常のＳｏｕｔｈｅｒｎ混成化洗浄条件、すなわち６０ ℃、１ ＊ ＳＳＣ、０.１ ％のＳＤＳ、好ましくは、６０ ℃、０.１ ＊ ＳＳＣ、０.１ ％のＳＤＳ、より好ましくは６８ ℃、０.１ ＊ ＳＳＣ、０.１ ％のＳＤＳの塩濃度と温度下で１回洗浄し、好ましくは２〜３回洗浄する条件を意味する。
【００４０】
なお、コドンの変性は、宿主に応じて異なるので、ＡＬＡシンテターゼ遺伝子での任意のコドンは、対応される同等のコドンで置き換えることができ、すなわち、ＡＬＡシンテターゼ遺伝子は、遺伝子コードの変性により、上記の例の任意のＡＬＡシンテターゼ遺伝子の突然変異であることができる。例えば、ＡＬＡシンテターゼ遺伝子は、使用された宿主でのコドンの頻度に応じて最適のコドンを有するように変形された遺伝子であることができる。
【００４１】
したがって、具体的な実施形態において、前記ＡＬＡシンテターゼ遺伝子は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡとの相同性または配列同一性が８０％以上、好ましくは８５％以上、好ましくは９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％、９７％、９８％、９９％であるＤＮＡであることができる。
【００４２】
したがって、本明細書で使用される「含有する」、「有する」または「含む」は、「含む」、「主に……からなる」、「基本的に……からなる」、および「……からなる」を含み、「主に……からなる」、「基本的に……からなる」、および「……からなる」は、「含有する」、「有する」または「含む」の下位概念に属する。
【００４３】
本明細書で使用される用語「活性断片」は、当業者に一般的に理解されるものと同一または類似の意味を持ち、すべての前記断片のアミノ酸配列が、完全なタンパク質またはポリペプチドのアミノ酸配列の一部であるが、前記断片は、完全な蛋白質またはポリペプチドと同一または類似の機能または活性を有することを指す。具体的に、本発明において、「活性断片」は、本発明のＡＬＡシンテターゼから得られたＡＬＡシンテターゼ活性を有する任意のアミノ酸断片を示す。
【００４４】
本発明の教示と、本発明によって具体的に得られたＡＬＡシンテターゼに基づいて、当業者は、同一または類似の活性または機能を有する活性断片を得ることが難しくなく、これらの活性断片は、もちろん、本発明の保護範囲内にある必要がある。
【００４５】
「対応する」
本明細書で使用される用語「対応する」は、当業者に一般的に理解される意味を有する。具体的に、「対応する」は、二本鎖の配列の相同性または配列同一性を比較した後、一本鎖配列が、他の一本の配列で指定された位置に対応する位置を示す。したがって、例えば、「ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列に対応する第１１番のアミノ酸残基」の場合には、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列の一端に６×Ｈｉｓタグが添加されると、得られた変異体でＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列に対応される第１１番、第１７番であることができる。
【００４６】
上述されたように、既知のＡＬＡシンテターゼのアミノ酸配列の相同性は高くないが、そのＣ末端または４０３番の部位は、基本的にアラニンである。したがって、本発明のＡＬＡシンテターゼは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列と必ずしも高い配列相同性または同一性を持つ必要はない。例えば、前記相同性または配列同一性は３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、または７０％以上であることができる。具体的な実施形態において、前記相同性または配列同一性は８０％以上、９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の相同性であることができる。
【００４７】
当業者に公知された配列相同性または同一性を測定する方法は、コンピュータ分子生物学（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｌｅｓｋ、Ａ.Ｍ.編集、オックスフォード大学出版社、ニューヨーク、１９８８；バイオコンピューティング：情報科学とゲノムプロジェクト（Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ）、Ｓｍｉｔｈ、Ｄ.Ｗ.編集、学術出版社、ニューヨーク、１９９３；シーケンスデータのコンピュータ分析（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ）、第１の部分、Ｇｒｉｆｆｉｎ、Ａ.Ｍ.とＧｒｉｆｆｉｎ、Ｈ.Ｇ.編集、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、ニュージャージー州、１９９４；分子生物学での配列分析（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ、Ｇ.、学術出版社、１９８７、および配列分析プライマー（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ）、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ、Ｍ.およびＤｅｖｅｒｅｕｘ、Ｊ.編集Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、  １９９１とＣａｒｉｌｌｏ、Ｈ.およびＬｉｐｍａｎ，Ｄ.，ＳＩＡＭ  Ｊ.  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ.，４８：１０７３  （１９８８）を含むが、これに限定されない。相同性を測定する好ましい方法は、試験された配列の間で最大の一致を得るものである。同一性を測定する方法は、公的に利用可能なコンピュータプログラムにコンパイルされている。二本鎖の配列の間の同一性を測定する好ましいコンピュータプログラム方法は、ＧＣＧパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ.ら，１９８４）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ，Ｆ.ら，１９９０）を含むが、これらに限定されない。大衆はＮＣＢＩおよび他のソースからのＢＬＡＳＴＸプログラムを得ることができる（ＢＬＡＳＴ手帳，Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ.ら，ＮＣＢＩ  ＮＬＭ  ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ.  ２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ.ら，１９９０）。よく知られているＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用して同一性を測定することもできる。
【００４８】
宿主細胞
本明細書で使用される用語「宿主細胞」は、当業者に一般的に理解される意味を有し、すなわち、本発明のＡＬＡシンテターゼを生成することができる宿主細胞を指す。言い換えれば、本発明のＡＬＡシンテターゼが宿主細胞で発現することができる限り、本発明は、任意の宿主細胞を利用することができる。
【００４９】
例えば、本発明に適用される宿主細胞は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、ロドバクタースフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）、ロドシュードモナスパルストリス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）由来することができ（これに限定されない）、より好ましくは、大腸菌またはコリネバクテリウムグルタミカムである。
【００５０】
固定化酵素
本明細書で使用される用語「固定化酵素」は、当業者に一般的に理解される意味を有する。具体的に、前記用語は、水溶性の酵素が物理的または化学的方法で処理された後、酵素が水不溶性巨大分子担体に結合されたり、酵素をその中に包埋されて、酵素が水で可溶性ゲルまたは半透膜マイクロカプセルを形成して流動性が減少されたことを示す。
【００５１】
固定化された酵素は、まだ酵素活性を有し、触媒反応で固体状態での基質に作用する。酵素は、一般的に固定された後、安定性が増加し、反応システムから分離されやすく、制御が容易で、繰り返して複数回使用することができ、輸送と保管に便利で自動化生産に有利である。固定化酵素は、過去１０年の間に開発された酵素応用技術で、工業生産、化学分析、医薬などの方面で魅力的な応用の見通しを持っている。
【００５２】
本明細書の教示を考慮すると、当業者は、本発明のＡＬＡシンテターゼをグリシンとサクシニルＣｏＡからＡＬＡの生産を触媒するために、固定化酵素または全細胞触媒の形態に処理することは難しくない。
【００５３】
本発明の応用および利点
１.本発明のＡＬＡシンテターゼは、工業的に適用され、ＡＬＡの低コスト生産を実現することができ、
２.本発明のＡＬＡシンテターゼは活性が高く、工業界で広範囲の応用の見通しを有し、
３.本発明は、改良ＡＬＡシンテターゼの突然変異部位を提供し、これらの部位の突然変異は改良されるＡＬＡシンテターゼの酵素活性を効果的に向上させることができる。
【００５４】
以下、具体的な実施例に結びつけて、本発明をさらに説明する。これらの実施例は、単に本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を制限しないことを理解されたい。下記の実施例で具体的な実験条件を明示していない実験方法は通常の条件、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、分子クローン：実験室ハンドブック（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に基づく条件、または製造メーカーで提案される条件に従う。
【００５５】
材料と方法
本発明の実施例に使用されたＤＮＡポリメラーゼは、Ｄａｌｉａｎ  Ｂａｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ＣｏｍｐａｎｙのＰｙｒｏｂｅｓｔから購入し、制限酵素およびＤＮＡリガーゼなどはすべてＦｅｒｍｅｎｔａｓ社から購入し、
酵母粉末とペプトンは、英国Ｏｘｏｉｄ会社から購入された製品であり、グリシンとＩＰＴＧはＰｒｏｍｅｇａ社から購入し、ＡＬＡとＰ−ジメチルアミノベンズアルデヒド（Ｐ−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｂｅｎｚａｌｄｅｈｙｄｅ）などは、Ｓｉｇｍａ社から購入し、ペルクロルヘム、寒天粉末、抗生物質はＢｅｉｊｉｎｇ  Ｓｏｌａｒｂｉｏから購入し、グルコース、氷酢酸、過塩素酸、トリクロロ酢酸（ｔｒｉｃｈｌｏｒｏａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）、アセチルアセトンクロロホルム（ａｃｅｔｙｌａｃｅｔｏｎｅ  ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ）およびその他の一般的に使用される化学試薬はすべてＴＣＭから購入した。
【００５６】
プラスミド抽出キットとアガロースゲル電気泳動回収キットは、Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｓａｎｇｏｎから購入し、関連操作はマニュアルに従って厳しく実行され、
プラスミドの構築シーケンス検証はＧＥＮＥＷＩＺによって完了され、
Ｅ.  ｃｏｉｌ  ＤＨ５α適格細胞は、Ｂｅｉｊｉｎｇ  ＴｒａｎｓＧｅｎ会社から購入した。
【００５７】
ＬＢ培地成分：５ ｇ／Ｌの酵母粉末、１０ ｇ／Ｌのペプトン、１０ ｇ／ＬのＮａＣｌ、固体培地に２％の寒天粉末を添加した。
Ｍ９培地成分：１７.１ ｇ／ＬのＮａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、３.０ ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、０.５ ｇ／ＬのＮａＣｌ、１.０ ｇ／ＬのＮＨ４Ｃｌ、２ ｍＭのＭｇＳＯ４、０.１ ｍＭのＣａＣｌ２、２０ ｇ／Ｌのグルコース、２ ｇ／Ｌの酵母粉末である。
【００５８】
抗生物質の濃度は、１００ μｇ／ｍＬのアンピシリン（Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）、５０ μｇ／ｍＬのカナマイシン（Ｋａｎａｍｙｃｉｎ）である。
ＡＬＡの検出方法：２００μＬの希釈された発酵液または酵素活性の測定反応が終了したサンプルを、１００μＬのｐＨ４.６である酢酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ）緩衝液に添加した後、５μＬのアセチルアセトン（ａｃｅｔｙｌａｃｅｔｏｎｅ）を入れて、１００ ℃のウェトバス（ｗａｔｅｒ  ｂａｔｈ）で１５分間インキュベーション（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）し、室温まで冷却した後、同じ体積のＥｈｒｌｉｓｈ’ｓ試薬（４２ ｍＬの氷酢酸、８  ｍＬの７０％の過塩素酸、１ ｇのジメチルアミノベンズアルデヒド（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｂｅｎｚａｌｄｅｈｙｄｅ）を入れて混合し、１０分間発色させた後、５５３  ｎｍの波長での吸光度を測定した。
【００５９】
粗酵素活性測定の手順は、下記の通りである。
（１）遠心分離して収集し、−８０℃の温度に保持した菌体（ＯＤ６００ ＝ ２５）を１ ｍＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７.５、１００ ｍＭのＮａＣｌを含有する）に再懸濁させ、
（２）ＭＰで細胞破壊：６ Ｍ／Ｓ、３０秒の条件で７回破壊し、
（３）上記のステップで得られた細胞破壊液を遠心分離して上澄み液を収集し、
（４）タンパク質濃度は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のＢＣＡタンパク質定量キットを使用してマニュアルを参照して、測定した。
【００６０】
酵素活性の測定：測定反応は総体積が２００μＬである５０ ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７.５、１００ ｍＭのＮａＣｌを含有）システムで実行され、酵素反応システムでは、各成分は、表１に示した通りである。１０μＬの細胞破壊上澄み液を入れて、金属バス（ｂａｔｈ）で３７ ℃の温度下で６分間振とう反応させた後、システムに１００μＬの１０％のトリクロロ酢酸溶液を入れて反応を終了させた。
【００６１】
【表２】
2020195375.tif 000004
【００６２】
実施例１．ＡＬＡシンテターゼ構造分析
文献では、ロドバクターカプスラータ（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）に由来するＡＬＡシンテターゼ（ＲｃＡ）のタンパク質構造（ＰＤＢデータベース番号：２ＢＷＮ）およびその基質であるグリシン（ＰＤＢデータベース番号：２ＢＷＰ）およびスクシニル−ＣｏＡ（ＰＤＢデータベース番号：２ＢＷＯ）と共結晶化したそのタンパク質構造を報告している。ここで、Ａｒｇ３７４部位はグリシンと直接相互作用し、Ｔｈｒ３６５部位はスクシニル−ＣｏＡと直接相互作用する（Ａｓｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２００５；  ２４：  ３１６６−３１７７）。前記酵素の構造を分析した後、そのアミノ酸配列の２つの領域３３２−３４８および３５８−３７４（紫色で表示）が基質結合に関連し（図１を参照）、前記領域には、グリシンと直接相互作用するＡｒｇ３７４部位と、スクシニル−ＣｏＡと直接相互作用するＴｈｒ３６５部位が含まれ、その柔軟なＣ末端は前記２つの領域の空間位置に近いことを分かった。本発明者らは、前記柔軟なＣ末端残基の変異が前記基質構造の上記２つの領域間に異なる相互作用を引き起こし、それにより基質結合およびＡＬＡシンテターゼ活性に影響を及ぼし得ると推測した。
【００６３】
なお、本発明者らは、ロドシュードモナスパルストリス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）ＡＴＣＣ１７００１に由来するＨｅｍＡ（ＲｐＡ）の構造もシミュレーションしたが、前記酵素のアミノ酸配列は、前記タンパク質構造が解析されたロドバクターカプスラータＡＬＡシンテターゼの（ＲｃＡ）の配列同一性はわずか５６％であるが、シミュレーションで予測されたタンパク質構造は前記構造に似ており、Ｃ末端（４０３番）に類似の柔軟な領域があり、Ｃ末端４０３番の変異は基質結合とＡＬＡシンテターゼ活性に影響を与える可能性があると推測した。
【００６４】
実施例２．異なる種に由来するＡＬＡシンテターゼ配列分析
まず、本発明者らは、報告されている異なるロドシュードモナスパルストリス亜種のＨｅｍＡのアミノ酸配列を比較および分析し、異なる株間の配列同一性が非常に高く、９４％に達し、Ｃ末端４０３番のアミノ酸残基は高度に保存されており、すべてアラニンである（図２を参照）ことを発見した。
【００６５】
本発明者らは、さらに、配列アラインメントの範囲を拡大し、ＮＣＢＩでロドシュードモナスパルストリスＡＴＣＣ１７００１  ＨｅｍＡ（ＲｐＡ）アミノ酸配列のＢｌａｓｔアラインメントを実行して、ＡＬＡシンテターゼと注釈された配列を分析した。報告されているＡＬＡシンテターゼ種の由来は異なるが、ＡＬＡシンテターゼのアミノ酸配列のＣ末端または第４０３番はほとんどはアラニンである。具体的なアラインメント結果は図３に示したとおりである。
【００６６】
例えば、タンパク質構造が解析されたロドバクターカプスラータのＡＬＡシンテターゼ（ＲｃＡ）は、ロドシュードモナスパルストリスのＲｐＡアミノ酸配列と５９％同一であるが、Ｃ末端の４０１番もアラニンである。別の例として、ＡＬＡ生合成で最も一般的に使用されているロドバクタースフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）のＡＬＡシンテターゼ（ＲｓＡ）は、ロドシュードモナスパルストリスのＲｐＡアミノ酸配列と５７％同一であるが、その４０３番およびＣ末端４０７番はまだアラニンである。実施例１におけるタンパク質構造の解析を組み合わせると、本発明者らはさらに、ＡＬＡシンテターゼのＣ末端または４０３番における変異が、異なる種に由来するＡＬＡシンテターゼの活性を増強し得ると推測した。
【００６７】
実施例３．ロドシュードモナスパルストリスＡＴＣＣ１７００１  ＨｅｍＡ（ＲｐＡ）変異体担体の構築
ＳｔｒａｔａｇｅｎｅシリーズＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）ＸＬ−ＩＩ部位指定突然変異キットを使用して、３９対のプライマー（表２参照）を設計し、ｐＥＣ−ＸＫ９９Ｅ−ｈｅｍＡ野生型プラスミドをテンプレートとして（構築プロセスは、コリネバクテリウムグルタミカムによる５−アミノレブリン酸合成経路の構築と発酵の最適化［Ｊ］。生物技術通報，２０１７，３３（０１）：１４８−１５６.を参照）、上記プライマーを利用してＰＣＲ増幅して、ロドシュードモナスパルストリスＡＴＣＣ１７００１  ＨｅｍＡ（ＲｐＡ）の第４０３番アミノ酸残基をそれぞれアルギニン（Ｒ）、アスパラギン（Ｎ）、アスパラギン酸（Ｄ）、システイン（Ｃ）、グルタミン（Ｑ）、グルタミン酸（Ｅ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、リジン（Ｋ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、プロリン（Ｐ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、バリン（Ｖ）に突然変異させる。ＰＣＲ反応条件は、９５ ℃の温度下で５ 分間、１０ 回のサイクル（９５ ℃で３０ 秒、７４ ℃−６５ ℃で３０ 秒、７２ ℃で４.５ 分間）、１３ 回のサイクル（９５ ℃で３０ 秒、６５ ℃で３０ 秒、７２ ℃で４.５ 分間）、７２ ℃で１０ 分間行う。ＰＣＲ増幅システム（５０ μＬ）は、１μＬのテンプレート、それぞれ１μＬの上流および下流プライマー、４μＬのｄＮＴＰ  ｍｉｘ、１０μＬの５×ＴｒａｎｓＳｔａｒｔ（登録商標）  Ｆａｓｔ  Ｐｆｕ  Ｆｌｙ  Ｂｕｆｆｅｒ、３２μＬの滅菌された二重蒸留水、１μＬのＴｒａｎｓＳｔａｒｔ（登録商標）  ＦａｓｔＰｆｕ  Ｆｌｙ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅである。上記ＰＣＲ産物をゲル回収キットを使用して精製および回収し、大腸菌ＤＨ５α適格細胞に形質転換させ、カナマイシンを含有するＬＢプレートにコーティングして、３７ ℃の温度下で一晩培養し、形質転換体のシーケンスによって検証し、正確な発現担体をそれぞれｐ４０３Ｒ、ｐ４０３Ｎ、ｐ４０３Ｄ、ｐ４０３Ｃ、ｐ４０３Ｑ、ｐ４０３Ｅ、ｐ４０３Ｇ、ｐ４０３Ｈ、ｐ４０３Ｉ、ｐ４０３Ｌ、ｐ４０３Ｋ、ｐ４０３Ｍ、ｐ４０３Ｆ、ｐ４０３Ｐ、ｐ４０３Ｓ、ｐ４０３Ｔ、ｐ４０３Ｗ、ｐ４０３Ｙ、ｐ４０３Ｖと命名した。
【００６８】
【表３】
2020195375.tif 000005
2020195375.tif 000006
【００６９】
実施例４.組換え菌株の構築と発酵検証
ＲｐＡ突然変異の正確な発現担体を構築してＣ.  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２菌株に形質転換し、工学菌株を得て、ＲｐＡ変異体工学菌株を２４ウェルプレートでＡＬＡ発酵させ、変異体工学菌株を酵母粉末を含有したＭ９培地の２４ウェルプレートで１６時間培養して、シード溶液（ｓｅｅｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）とし、０.５である初期ＯＤ６００によりＭ９培地を含有した２４ウェルプレートに移し、発酵を検証し、３時間培養し、誘導剤ＩＰＴＧ  １００ μＭの最終濃度で添加し、２４時間後、発酵が終了し、ＡＬＡシンテターゼ粗酵素活性とＡＬＡ生産量を測定した。粗酵素活性の検出方法は、ＡＬＡの検出とグルコース分析方法は、「材料と方法」に記載されている通りである。検出後、各変異体の粗酵素活性は、野生型菌株よりすべて向上され、それぞれの組換え菌株のＡＬＡ生産量は一定の差があり、表３に示したように、野生型菌株のＡＬＡ生産量を１に設定した。
【００７０】
結果、野生型と比較して、ＲｐＡの４０３番が非アラニン以外の任意のアミノ酸に突然変異が、ＡＬＡ生産量を向上させることができ、向上幅が３ ％−４０ ％の間であることが分かった。
【００７１】
【表４】
2020195375.tif 000007
【００７２】
実施例５．５ Ｌの発酵タンクの検証
上記に記載された効果が良い変異体（４０３番がＡｓｐ、Ｇｌｎに突然変異される）発現菌株を選択して、５ Ｌの発酵タンクを検証して、発酵培地成分は、５ ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、５ ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、２ ｇ／Ｌのコーンスティープリカー乾燥粉末、２ ｇ／ＬのＭｇＳＯ４  ７Ｈ２Ｏ、１ ｍｇ／Ｌのチアミン塩酸塩（Ｔｈｉａｍｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）であり、発酵過程の制御温度は、３０ ℃であり、ｐＨ６.５であり、溶存酸素は３０％以上である。結果、上記菌株のＡＬＡ生産量がそれぞれ２０.６ ｇ／Ｌ、２２ ｇ／Ｌに達したが、対照菌株（１７.２ ｇ／Ｌ）よりそれぞれ２０ ％、２８.４ ％向上し、これは上記の変異体を発現する工学菌株が発酵タンクからのレベルで産物ＡＬＡの生産量を効果的に向上させることができることを示す。
【００７３】
実施例６．ロドバクターカプスラータＡＬＡシンテターゼ（ＲｃＡ）Ｃ末端アラニン突然変異とその効果の検証
ＡＬＡシンテターゼの活性に対するＡＬＡシンテターゼのＣ末端の401番の非アラニンの重要な役割をさらに確認するために、本発明者らは、構造研究を比較的明確で、ＡＬＡ生合成で成功的に応用されたロドバクターカプスラータ由来のＡＬＡシンテターゼ(ＲｃＡ)(Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２０１６；  ８２：  ２７０９−２７１７)を使用し、異なる特性の３つのアミノ酸（Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｔｙｒ）をＣ末端での変異テストに選択した。
【００７４】
まず、ＮＣＢＩにより公表された前記ＲｃＡアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３；ＧｅｎＢａｎｋ：  ＡＭＬ８３９２６．１）に従って、対応するＤＮＡコーディング配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４）を合成した。上記の合成された遺伝子断片をテンプレートとして使用して、ＤＮＡ配列に従ってプライマーを設計し（表４を参照）、ＰＣＲ増幅により、Ｃ末端第４０１番のアラニンをアスパラギン酸（Ａｓｐ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、チロシン（Ｔｙｒ）の遺伝子断片および野生型遺伝子断片にそれぞれ置換し、同時にｐＥＣ−Ｒｃ−Ｆ／Ｒプライマーを使用してｐＥＣ−ＸＫ９９Ｅ−ｈｅｍＡを逆増幅し、元のｈｅＭＡ遺伝子が除去されたプラスミド断片を得た。ＰＣＲ反応条件：９５ ℃で５ 分、１０ サイクル（９５ ℃で３０ 秒、６５ ℃−５５ ℃で３０ 秒、７２ ℃で４分）、２０ サイクル（９５ ℃で３０ 秒、５５ ℃で３０ 秒、７２ ℃で４分）、７２ ℃で５ 分。ＰＣＲ増幅システム（５０ μＬ）：テンプレート１μＬ、上流および下流プライマーそれぞれ１ μＬ、ｄＮＴＰミックス４ μＬ、５×ＴｒａｎｓＳｔａｒｔ（登録商標）Ｆａｓｔ  Ｐｆｕ  Ｆｌｙ  Ｂｕｆｆｅｒ  １０  μＬ、滅菌済み再蒸留水３２ μＬ、ＴｒａｎｓＳｔａｒｔ（登録商標）ＦａｓｔＰｆｕ  Ｆｌｙ  ＤＮＡ  ポリメラーゼ１ μＬ。ゲル回収キットを用いて前記ＰＣＲ産物を精製および回収し、組換えキットを用いて前記標的遺伝子断片およびプラスミド断片を組換え、大腸菌Ｔ１コンピテントセルに形質転換し、カナマイシンを含むＬＢプレートでコーティングし、３７ ℃で一晩インキュベートし、形質転換体を配列決定して、正しい組換えベクターをｐＲｃ４０１ＷＴ、ｐＲｃ４０１Ｄ、ｐＲｃ４０１Ｈ、およびｐＲｃ４０１Ｙと命名した。
【００７５】
続いて、前記ベクターをＣ．  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２株に形質転換し、対応する組換え株を得た。２４ウェルプレートを用いた前記株を発酵検証し、培養プロセスおよびパラメーターは実施例４と同じであった。発酵結果は、ロドバクターカプスラータＡＬＡシンテターゼ（ＲｃＡ）Ｃ末端４０１番アラニンのアスパラギン酸、ヒスチジン、チロシンへの変異が酵素の活性を大幅に高めることができ、組換え株ＡＬＡ収量はそれぞれ野生型酵素を発現する対照株より１９ ％、１５ ％、１１ ％増加したことを示した。
【００７６】
【表５】
2020195375.tif 000008
【００７７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３、ロドバクターカプスラータ（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）ＡＬＡシンテターゼ（ＲｃＡ）アミノ酸配列
ＭＤＹＮＬＡＬＤＫＡＩＱＫＬＨＤＥＧＲＹＲＴＦＩＤＩＥＲＥＫＧＡＦＰＫＡＱＷＮＲＰＤＧＧＫＱＤＩＴＶＷＣＧＮＤＹＬＧＭＧＱＨＰＶＶＬＡＡＭＨＥＡＬＥＡＶＧＡＧＳＧＧＴＲＮＩＳＧＴＴＡＹＨＲＲＬＥＡＥＩＡＤＬＨＧＫＥＡＡＬＶＦＳＳＡＹＩＡＮＤＡＴＬＳＴＬＲＶＬＦＰＧＬＩＩＹＳＤＳＬＮＨＡＳＭＩＥＧＩＫＲＮＡＧＰＫＲＩＦＲＨＮＤＶＡＨＬＲＥＬＩＡＡＤＤＰＡＡＰＫＬＩＡＦＥＳＶＹＳＭＤＧＤＦＧＰＩＫＥＩＣＤＩＡＤＥＦＧＡＬＴＹＩＤＥＶＨＡＶＧＭＹＧＰＲＧＡＧＶＡＥＲＤＧＬＭＨＲＩＤＩＦＮＧＴＬＡＫＡＹＧＶＦＧＧＹＩＡＡＳＡＫＭＶＤＡＶＲＳＹＡＰＧＦＩＦＳＴＳＬＰＰＡＩＡＡＧＡＱＡＳＩＡＦＬＫＴＡＥＧＱＫＬＲＤＡＱＱＭＨＡＫＶＬＫＭＲＬＫＡＬＧＭＰＩＩＤＨＧＳＨＩＶＰＶＶＩＧＤＰＶＨＴＫＡＶＳＤＭＬＬＳＤＹＧＶＹＶＱＰＩＮＦＰＴＶＰＲＧＴＥＲＬＲＦＴＰＳＰＶＨＤＬＫＱＩＤＧＬＶＨＡＭＤＬＬＷＡＲＣＡ
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４：ロドバクターカプスラータ（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）ＡＬＡシンテターゼ（ＲｃＡ）ＤＮＡ配列
ＡＴＧＧＡＣＴＡＣＡＡＴＣＴＣＧＣＧＣＴＣＧＡＣＡＡＡＧＣＧＡＴＣＣＡＧＡＡＡＣＴＣＣＡＣＧＡＣＧＡＧＧＧＡＣＧＴＴＡＣＣＧＣＡＣＧＴＴＣＡＴＣＧＡＣＡＴＣＧＡＡＣＧＣＧＡＧＡＡＧＧＧＣＧＣＣＴＴＣＣＣＣＡＡＧＧＣＧＣＡＧＴＧＧＡＡＣＣＧＣＣＣＣＧＡＴＧＧＣＧＧＣＡＡＧＣＡＧＧＡＣＡＴＣＡＣＣＧＴＣＴＧＧＴＧＣＧＧＣＡＡＣＧＡＣＴＡＴＣＴＧＧＧＣＡＴＧＧＧＣＣＡＧＣＡＣＣＣＧＧＴＣＧＴＴＣＴＧＧＣＣＧＣＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＧＣＴＧＧＡＡＧＣＧＧＴＣＧＧＧＧＣＣＧＧＴＴＣＧＧＧＣＧＧＣＡＣＣＣＧＣＡＡＣＡＴＣＴＣＧＧＧＣＡＣＣＡＣＧＧＣＣＴＡＴＣＡＣＣＧＣＣＧＴＣＴＧＧＡＡＧＣＣＧＡＧＡＴＣＧＣＣＧＡＴＣＴＧＣＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＡＧＣＧＧＣＧＣＴＴＧＴＣＴＴＣＴＣＣＴＣＧＧＣＣＴＡＴＡＴＣＧＣＣＡＡＴＧＡＣＧＣＧＡＣＧＣＴＣＴＣＧＡＣＧＣＴＧＣＧＧＣＴＧＣＴＴＴＴＣＣＣＣＧＧＣＣＴＧＡＴＣＡＴＣＴＡＴＴＣＣＧＡＣＡＧＣＣＴＧＡＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＧＡＴＧＡＴＣＧＡＧＧＧＧＡＴＣＡＡＧＣＧＣＡＡＴＧＣＣＧＧＧＣＣＧＡＡＧＣＧＧＡＴＣＴＴＣＣＧＴＣＡＣＡＡＴＧＡＣＧＴＣＧＣＣＣＡＴＣＴＧＣＧＣＧＡＧＣＴＧＡＴＣＧＣＣＧＣＴＧＡＴＧＡＴＣＣＧＧＣＣＧＣＧＣＣＧＡＡＧＣＴＧＡＴＣＧＣＣＴＴＣＧＡＡＴＣＧＧＴＣＴＡＴＴＣＧＡＴＧＧＡＴＧＧＣＧＡＣＴＴＣＧＧＣＣＣＧＡＴＣＡＡＧＧＡＡＡＴＣＴＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＡＴＧＡＡＴＴＣＧＧＣＧＣＧＣＴＧＡＣＣＴＡＴＡＴＣＧＡＣＧＡＡＧＴＣＣＡＴＧＣＣＧＴＣＧＧＣＡＴＧＴＡＴＧＧＣＣＣＣＣＧＣＧＧＣＧＣＧＧＧＣＧＴＧＧＣＣＧＡＧＣＧＴＧＡＣＧＧＴＣＴＧＡＴＧＣＡＣＣＧＣＡＴＣＧＡＣＡＴＣＴＴＣＡＡＣＧＧＣＡＣＧＣＴＧＧＣＧＡＡＡＧＣＣＴＡＴＧＧＣＧＴＣＴＴＣＧＧＣＧＧＣＴＡＣＡＴＣＧＣＣＧＣＴＴＣＧＧＣＧＡＡＧＡＴＧＧＴＣＧＡＴＧＣＣＧＴＧＣＧＣＴＣＣＴＡＴＧＣＧＣＣＧＧＧＣＴＴＣＡＴＣＴＴＣＴＣＧＡＣＣＴＣＧＣＴＧＣＣＧＣＣＧＧＣＧＡＴＣＧＣＣＧＣＴＧＧＣＧＣＧＣＡＧＧＣＣＴＣＧＡＴＣＧＣＧＴＴＴＴＴＧＡＡＡＡＣＣＧＣＣＧＡＡＧＧＧＣＡＧＡＡＧＣＴＧＣＧＣＧＡＣＧＣＧＣＡＡＣＡＧＡＴＧＣＡＣＧＣＧＡＡＧＧＴＧＣＴＧＡＡＡＡＴＧＣＧＧＣＴＣＡＡＧＧＣＧＣＴＧＧＧＧＡＴＧＣＣＧＡＴＣＡＴＣＧＡＣＣＡＴＧＧＣＡＧＣＣＡＣＡＴＣＧＴＴＣＣＧＧＴＧＧＴＣＡＴＣＧＧＴＧＡＣＣＣＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＡＡＧＧＣＧＧＴＧＴＣＧＧＡＣＡＴＧＣＴＣＣＴＧＴＣＧＧＡＴＴＡＣＧＧＣＧＴＴＴＡＣＧＴＧＣＡＧＣＣＧＡＴＣＡＡＣＴＴＣＣＣＧＡＣＧＧＴＧＣＣＧＣＧＣＧＧＣＡＣＣＧＡＡＣＧＧＣＴＧＣＧＣＴＴＣＡＣＣＣＣＣＴＣＧＣＣＧＧＴＧＣＡＴＧＡＣＣＴＧＡＡＡＣＡＧＡＴＣＧＡＣＧＧＧＣＴＧＧＴＴＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＡＴＣＴＧＣＴＣＴＧＧＧＣＧＣＧＣＴＧＴＧＣＧＴＡＡ
実施例７．ロドバクタースフェロイデスＡＬＡシンテターゼ（ＲｓＡ）Ｃ末端および第４０３番の変異およびその効果の検証
ＡＬＡシンテターゼの活性におけるＣ末端または第４０３番での非アラニンの重要な役割を再確認するために、本発明者らはさらに、最も一般的に使用されるＡＬＡ生合成であるロドバクタースフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）に由来するＡＬＡシンテターゼ（ＲｓＡ）を選択し（アミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２を参照）、変異効果をテストするために、それぞれその４０３番およびＣ末端４０７番のアラニンをＡｓｐに置き換えた。
【００７８】
まず、文献（Ｍｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，  ２０１５，  ３７（１１）：  ２２４７−２２５３）に開示されているロドバクタースフェロイデス由来のＲｓｈｅｍＡ遺伝子の配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５）に基づいてプライマー（表５に示すように）を設計し、ｐＲｓＡ（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｆｕｅｌｓ，  ２０２０，  １３：  ４１）をテンプレートとして使用して、ＰＣＲ増幅を実行し、それぞれ第４０３番とＣ末端の第４０７番アラニンをアスパラギン酸（Ａｓｐ）に置換したプラスミド断片を得た。ＰＣＲ反応条件：９５ ℃で５ 分、１０サイクル（９５ ℃で３０ 秒、６５ ℃−５５ ℃で３０ 秒、７２ ℃で４ 分）、２０ サイクル（９５ ℃で３０ 秒、５５ ℃で３０ 秒、７２ ℃で４ 分）、７２ ℃で５ 分。ＰＣＲ増幅システム（５０ μＬ）：テンプレート１ μＬ、上流および下流プライマーそれぞれ１ μＬ、ｄＮＴＰミックス４ μＬ、５×ＴｒａｎｓＳｔａｒｔ（登録商標）Ｆａｓｔ  Ｐｆｕ  Ｆｌｙ  Ｂｕｆｆｅｒ  １０ μＬ、滅菌済み再蒸留水３２ μＬ、ＴｒａｎｓＳｔａｒｔ（登録商標）ＦａｓｔＰｆｕ  Ｆｌｙ  ＤＮＡ  ポリメラーゼ１ μＬ。ゲル回収キットを用いて前記ＰＣＲ産物を精製および回収し、Ｔ４  ＰＮＫを使用してリン酸化した後、Ｔ４リガーゼでライゲーションして大腸菌Ｔ１コンピテントセルを形質転換し、カナマイシンを含むＬＢプレートでコーティングし、３７℃で一晩インキュベートし、形質転換体を配列決定して、正しい組換えベクターをｐＲｓ４０３ＤおよびｐＲｓ４０７Ｄと命名した。
【００７９】
続いて、前記株とｐＲｓＡを保有する対照株を２４ウェルプレートを用いた発酵により検証した。組換え株をＬＢ培地で１２時間シード溶液として培養し、初期ＯＤ６００が０.１のＭ９培地を含む２４ウェルプレートに移して発酵を確認し、３時間培養した後、最終濃度５０ ｕＭのＩＰＴＧを添加して誘導し、２０時間後発酵が完了し、ＡＬＡ生産量を検出した。発酵の結果は、第４０３番および第４０７番のアラニンのアスパラギン酸への変異がロドバクタースフェロイデスＡＬＡシンテターゼ（ＲｓＡ）の活性を大幅に高めることができ、組換え株ＡＬＡ収量はそれぞれ野生型酵素を発現する対照株より１１ ％、２２ ％増加したことを示した。
【００８０】
【表６】
2020195375.tif 000009
【００８１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２、ロドバクタースフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）ＡＬＡシンテターゼ（ＲｓＡ）アミノ酸配列
ＭＤＹＮＬＡＬＤＴＡＬＮＲＬＨＴＥＧＲＹＲＴＦＩＤＩＥＲＲＫＧＡＦＰＫＡＭＷＲＫＰＤＧＳＥＫＥＩＴＶＷＣＧＮＤＹＬＧＭＧＱＨＰＶＶＬＧＡＭＨＥＡＬＤＳＴＧＡＧＳＧＧＴＲＮＩＳＧＴＴＬＹＨＫＲＬＥＡＥＬＡＤＬＨＧＫＥＡＡＬＶＦＳＳＡＹＩＡＮＤＡＴＬＳＴＬＰＱＬＩＰＧＬＶＩＶＳＤＫＬＮＨＡＳＭＩＥＧＩＲＲＳＧＴＥＫＨＩＦＫＨＮＤＬＤＤＬＲＲＩＬＴＳＩＧＫＤＲＰＩＬＶＡＦＥＳＶＹＳＭＤＧＤＦＧＲＩＥＥＩＣＤＩＡＤＥＦＧＡＬＫＹＩＤＥＶＨＡＶＧＭＹＧＰＲＧＧＧＶＡＥＲＤＧＬＭＤＲＩＤＩＩＮＧＴＬＧＫＡＹＧＶＦＧＧＹＩＡＡＳＳＫＭＣＤＡＶＲＳＹＡＰＧＦＩＦＳＴＳＬＰＰＶＶＡＡＧＡＡＡＳＶＲＨＬＫＧＤＶＥＬＲＥＫＨＱＴＱＡＲＩＬＫＭＲＬＫＧＬＧＬＰＩＩＤＨＧＳＨＩＶＰＶＨＶＧＤＰＶＨＣＫＭＩＳＤＭＬＬＥＨＦＧＩＹＶＱＰＩＮＦＰＴＶＰＲＧＴＥＲＬＲＦＴＰＳＰＶＨＤＳＧＭＩＤＨＬＶＫＡＭＤＶＬＷＱＨＣＡＬＮＲＡＥＶＶＡ
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５、ロドバクタースフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）ＡＬＡシンテターゼ（ＲｓＡ）ＤＮＡ配列
ＡＴＧＧＡＣＴＡＣＡＡＣＣＴＧＧＣＧＣＴＧＧＡＣＡＣＣＧＣＧＣＴＧＡＡＣＣＧＴＣＴＧＣＡＣＡＣＣＧＡＡＧＧＴＣＧＴＴＡＣＣＧＴＡＣＣＴＴＣＡＴＣＧＡＣＡＴＣＧＡＡＣＧＴＣＧＴＡＡＡＧＧＴＧＣＧＴＴＣＣＣＧＡＡＡＧＣＧＡＴＧＴＧＧＣＧＴＡＡＡＣＣＧＧＡＣＧＧＴＴＣＴＧＡＡＡＡＡＧＡＡＡＴＣＡＣＣＧＴＴＴＧＧＴＧＣＧＧＴＡＡＣＧＡＣＴＡＣＣＴＧＧＧＴＡＴＧＧＧＴＣＡＧＣＡＣＣＣＧＧＴＴＧＴＴＣＴＧＧＧＴＧＣＧＡＴＧＣＡＣＧＡＡＧＣＧＣＴＧＧＡＣＴＣＴＡＣＣＧＧＴＧＣＧＧＧＴＴＣＴＧＧＴＧＧＴＡＣＣＣＧＴＡＡＣＡＴＣＴＣＴＧＧＴＡＣＣＡＣＣＣＴＧＴＡＣＣＡＣＡＡＡＣＧＴＣＴＧＧＡＡＧＣＧＧＡＡＣＴＧＧＣＧＧＡＣＣＴＧＣＡＣＧＧＴＡＡＡＧＡＡＧＣＧＧＣＧＣＴＧＧＴＴＴＴＣＴＣＴＴＣＴＧＣＧＴＡＣＡＴＣＧＣＧＡＡＣＧＡＣＧＣＧＡＣＣＣＴＧＴＣＴＡＣＣＣＴＧＣＣＧＣＡＧＣＴＧＡＴＣＣＣＧＧＧＴＣＴＧＧＴＴＡＴＣＧＴＴＴＣＴＧＡＣＡＡＡＣＴＧＡＡＣＣＡＣＧＣＧＴＣＴＡＴＧＡＴＣＧＡＡＧＧＴＡＴＣＣＧＴＣＧＴＴＣＴＧＧＴＡＣＣＧＡＡＡＡＡＣＡＣＡＴＣＴＴＣＡＡＡＣＡＣＡＡＣＧＡＣＣＴＧＧＡＣＧＡＣＣＴＧＣＧＴＣＧＴＡＴＣＣＴＧＡＣＣＴＣＴＡＴＣＧＧＴＡＡＡＧＡＣＣＧＴＣＣＧＡＴＣＣＴＧＧＴＴＧＣＧＴＴＣＧＡＡＴＣＴＧＴＴＴＡＣＴＣＴＡＴＧＧＡＣＧＧＴＧＡＣＴＴＣＧＧＴＣＧＴＡＴＣＧＡＡＧＡＡＡＴＣＴＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＧＧＡＣＧＡＧＴＴＣＧＧＴＧＣＧＣＴＧＡＡＡＴＡＣＡＴＣＧＡＣＧＡＡＧＴＴＣＡＣＧＣＧＧＴＴＧＧＴＡＴＧＴＡＣＧＧＴＣＣＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＴＴＧＣＧＧＡＡＣＧＴＧＡＣＧＧＴＣＴＧＡＴＧＧＡＣＣＧＴＡＴＣＧＡＣＡＴＣＡＴＣＡＡＣＧＧＴＡＣＣＣＴＧＧＧＴＡＡＡＧＣＧＴＡＣＧＧＴＧＴＴＴＴＣＧＧＴＧＧＴＴＡＣＡＴＣＧＣＧＧＣＧＴＣＴＴＣＴＡＡＡＡＴＧＴＧＣＧＡＣＧＣＧＧＴＴＣＧＴＴＣＴＴＡＣＧＣＧＣＣＧＧＧＴＴＴＣＡＴＣＴＴＣＴＣＴＡＣＣＴＣＴＣＴＧＣＣＧＣＣＧＧＴＴＧＴＴＧＣＧＧＣＧＧＧＴＧＣＧＧＣＧＧＣＧＴＣＴＧＴＴＣＧＴＣＡＣＣＴＧＡＡＡＧＧＴＧＡＣＧＴＴＧＡＡＣＴＧＣＧＴＧＡＡＡＡＡＣＡＣＣＡＧＡＣＣＣＡＧＧＣＧＣＧＴＡＴＣＣＴＧＡＡＡＡＴＧＣＧＴＣＴＧＡＡＡＧＧＴＣＴＧＧＧＴＣＴＧＣＣＧＡＴＣＡＴＣＧＡＣＣＡＣＧＧＴＴＣＴＣＡＣＡＴＣＧＴＴＣＣＧＧＴＴＣＡＣＧＴＴＧＧＴＧＡＣＣＣＧＧＴＴＣＡＣＴＧＣＡＡＡＡＴＧＡＴＣＴＣＴＧＡＣＡＴＧＣＴＧＣＴＧＧＡＡＣＡＣＴＴＣＧＧＴＡＴＣＴＡＣＧＴＴＣＡＧＣＣＧＡＴＣＡＡＣＴＴＣＣＣＧＡＣＣＧＴＴＣＣＧＣＧＴＧＧＴＡＣＣＧＡＡＣＧＴＣＴＧＣＧＴＴＴＣＡＣＣＣＣＧＴＣＴＣＣＧＧＴＴＣＡＣＧＡＣＴＣＴＧＧＴＡＴＧＡＴＣＧＡＣＣＡＣＣＴＧＧＴＴＡＡＡＧＣＧＡＴＧＧＡＣＧＴＴＣＴＧＴＧＧＣＡＧＣＡＣＴＧＣＧＣＧＣＴＧＡＡＣＣＧＴＧＣＧＧＡＡＧＴＴＧＴＴＧＣＧＴＡＡ
実施例８．ロドシュードモナスパルストリスＡＴＣＣ１７００１  ＨｅｍＡ（ＲｐＡ）４０３番欠失および発酵検証
本発明者らは、ＡＬＡシンテターゼの活性におけるＡＬＡシンテターゼ４０３番またはＣ末端の重要性を検証するために、ＲｐＡを例にとり、４０３番を欠失し、欠失後の効果を検証した。テンプレートとしてｐＥＣ−ＸＫ９９Ｅ−ｈｅｍＡ野生型プラスミドを使用して（構築プロセスについては、コリネバクテリウムグルタミカムで５−アミノレブリン酸を合成する経路の構築と発酵の最適化［Ｊ］．生物技術通報、２０１７，  ３３（０１）：  １４８−１５６．を参照）、プライマーを設計し（表６に示したように）、前記プライマーを使用してＰＣＲ増幅を実行し、ＲｐＡの第４０３番のアミノ酸残基を停止コドン（Ｓｔｏｐ）に変異させた。ＰＣＲ反応条件、増幅システム、および形質転換の検証は、実施例３と同じであり、正しい発現ベクターｐ４０３Ｓｔｏｐを取得し、前記発現ベクターをＣ．  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２株に形質転換し、エンジニアリング株Ｃ．  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２／ｐ４０３Ｓｔｏｐを取得し、２４ウェルプレートＡＬＡ発酵を実行し、粗酵素活性とＡＬＡ生産量を検出した。ウェルプレート発酵工程は実施例４に示したように、粗酵素活性の検出方法、ＡＬＡ検出およびグルコース分析方法は、「材料および方法」のセクションに記載されている。検出後、野生型株と比較して、終止コドン（すなわち４０３番欠失）に変異した粗酵素活性が増加し、４０３番欠失後のＡＬＡ生産量は野生株と比較して１０％近く増加した。
【００８２】
【表７】
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【００８３】
実施例９．異なる由来のＡＬＡシンテターゼＣ端伸長効果のテスト
上記のデータおよび結果に基づいて、発明者らは、４０３番またはＣ末端のアミノ酸残基を変化させることなく、Ｃ末端伸長がＡＬＡシンテターゼの活性を増加させるのに有益であり得ると推測した。上記の推測を検証するために、上記３つの異なる由来のＡＬＡシンテターゼ（ＲｐＡ、ＲｃＡ、およびＲｓＡ）を使用して、Ｃ末端にランダムにグルタミン酸（Ｇｌｕ）またはグルタミン（Ｇｌｎ）を追加し、Ｃ末端の伸長の応用効果をテストしました。
【００８４】
上記異なる由来のＡＬＡシンテターゼをコードする遺伝子の配列に従ってプライマーを（表７に示すように）設計した。前述のｐＥＣ−ＸＫ９９Ｅ−ｈｅｍＡ、ｐＲｃＷＴ、およびｐＲｓＡをテンプレートとして使用して、ＰＣＲ増幅して、対応するプラスミド断片を得た。ＰＣＲ反応条件：９５ ℃で５ 分、１０ サイクル（９５ ℃で３０ 秒、６５ ℃−５５ ℃で３０ 秒、７２ ℃で４ 分）、２０ サイクル（９５ ℃で３０ 秒、５５ ℃で３０ 秒、７２ ℃で４ 分）、７２ ℃で５ 分。ＰＣＲ増幅システム（５０ μＬ）：テンプレート１ μＬ、上流および下流プライマーそれぞれ１ μＬ、ｄＮＴＰミックス４ μＬ、５×ＴｒａｎｓＳｔａｒｔ（登録商標）Ｆａｓｔ  Ｐｆｕ  Ｆｌｙ  Ｂｕｆｆｅｒ  １０μＬ、滅菌済み再蒸留水３２ μＬ、ＴｒａｎｓＳｔａｒｔ（登録商標）ＦａｓｔＰｆｕ  Ｆｌｙ  ＤＮＡ  ポリメラーゼ１ μＬ。ゲル回収キットを用いて前記ＰＣＲ産物を精製および回収し、Ｔ４  ＰＮＫを使用してリン酸化した後、Ｔ４リガーゼでライゲーションして大腸菌Ｔ１コンピテントセルを形質転換し、カナマイシンを含むＬＢプレートでコーティングし、３７ ℃で一晩インキュベートし、形質転換体を配列決定して、正しい組換えベクターをｐＲｐＥ、ｐＲｐＱ、ｐＲｃＥ、ｐＲｃＱ、ｐＲｓＥ、ｐＲｓＱと命名した。
【００８５】
２４ウェルプレートを用いて上記株および対応する対照株を発酵検証し、培養プロセスおよびパラメーターは実施例４と同じである。発酵結果は、異なる種に由来するＡＬＡシンテターゼＣ末端に上記のアミノ酸残基を加えた後、ＡＬＡ収率が１０ ％−２５ ％増加したことを示した。
【００８６】
【表８】
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【００８７】
本発明で言及されるすべての文書は、あたかも各文書が個々に参照により組み込まれたかのように、本出願に参照により組み込まれている。さらに、本発明の上記の教示内容を読んだ後、当業者は本発明に様々な変更または修正を加えることができ、これらの同等の形態も本願に添付された特許請求の範囲によって定義される範囲内にあることを理解されたい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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