(57)【要約】【課題】アレルゲン検出のための組成物及び方法を提供する。【解決手段】本発明は、試料中のアレルゲン検出のための核酸アプタマーに基づくシグナル生成ポリヌクレオチド（ＳＰＮ）を対象とする。本明細書の開示は、前記ＳＰＮを使用して、試料中の１つ又は複数のアレルゲン、特に食品中の食物アレルゲンを検出するための、組成物、化合物、アッセイ及び方法を含む。【選択図】図１
2020054339.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
落花生アレルゲンを検出するためのシグナル生成ポリヌクレオチド（ＳＰＮ）において、コアヌクレオチド配列であって、前記アレルゲンに特異的に結合し、かつ前記ヌクレオチド配列の一端でフルオロフォアと結合し、前記ポリヌクレオチドは配列番号８のヌクレオチド配列を有したコアヌクレオチド配列を含んでなる、落花生アレルゲンを検出するためのシグナル生成ポリヌクレオチド（ＳＰＮ）。
【請求項２】
クエンチャーをさらに有し、前記クエンチャーが前記フルオロフォアの蛍光をクエンチするために十分に前記フルオロフォアに近接している、請求項１に記載のシグナル生成ポリヌクレオチド。
【請求項３】
前記フルオロフォアと前記クエンチャーとが、前記シグナル生成ポリヌクレオチド配列の反対の端に連結されており、ここで前記配列の５’端の５〜２０核酸塩基残基が、ヘアピン構造を形成することができる前記配列の３’端の５〜２０核酸塩基残基と少なくとも８０％相補性であり、それにより前記クエンチャーを、前記フルオロフォアの蛍光をクエンチするために前記フルオロフォアに対して十分近接させている、請求項２に記載のシグナル生成ポリヌクレオチド。
【請求項４】
試料中の１つの落花生アレルゲンの検出方法において、
（ａ）前記落花生アレルゲンを含む疑いがある試験試料を得る工程と、
（ｂ）前記試験試料を処理し、前記処理された試料から抽出バッファーを使用してタンパク質を抽出する工程と、
（ｃ）前記抽出されたタンパク質を、シグナル生成ポリヌクレオチド（ＳＰＮ）と混合する工程であって、前記シグナル生成ポリヌクレオチド（ＳＰＮ）は前記アレルゲン及びフルオロフォアと特異的に結合する配列番号８のコアヌクレオチド配列を有する、前記抽出されたタンパク質を、シグナル生成ポリヌクレオチド（ＳＰＮ）と混合する工程と、
（ｄ）工程（ｃ）の前記混合物を励起手段で処置する工程と、
（ｅ）前記試験試料中の前記アレルゲンの不在又は存在を示す、前記シグナル生成ポリヌクレオチドと前記アレルゲンとの間の相互作用を測定する工程と、
（ｆ）前記処理された試料について総タンパク質を測定し、及び、工程（ｅ）で測定した信号との比較において検出した信号を判定する工程と
を備える、方法。
【請求項５】
前記シグナル生成ポリヌクレオチドがクエンチャーをさらに有し、前記フルオロフォアと前記クエンチャーとは、前記クエンチャーが前記フルオロフォアの蛍光をクエンチするために十分近接している、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記フルオロフォアと前記クエンチャーとが、アプタマー配列の反対の端に連結されており、ここで配列の５’端の５〜２０核酸塩基残基が、ヘアピン構造を形成することができる配列の３’端の５〜２０核酸塩基残基と少なくとも８０％相補性であり、それにより前記クエンチャーを、前記フルオロフォアの蛍光をクエンチするために前記フルオロフォアに対して十分近接させている、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記シグナル生成ポリヌクレオチドが、アプタマー配列の５’端にアニールされており、前記アプタマー配列の５’端と少なくとも８０％相補性を有する５〜２０核酸塩基長のリンカー配列をさらに含んでなり、ここで前記アプタマー配列がフルオロフォアを含み、前記リンカー配列がクエンチャーを含むか、又は前記アプタマー配列がクエンチャーを含み、前記リンカー配列がフルオロフォアを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記シグナル生成ポリヌクレオチドのアレルゲンへの結合が、前記クエンチャーを前記フルオロフォアから分離させ、それにより前記フルオロフォアの蛍光の検出を可能とする、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
前記シグナル生成ポリヌクレオチドのアレルゲンへの結合は、前記シグナル生成ポリヌクレオチドの二次構造における変化を生じさせる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記総タンパク質が、ＰＲＭ因子を使用して測定される、請求項４に記載の方法。
【請求項１１】
前記総タンパク質が、６００ｎｍでの吸光度として決定される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記励起手段が、発光ダイオード（ＬＥＤ）光である、請求項４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アプタマーに基づくシグナル生成ポリヌクレオチド（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ、ＳＰＮ）、そのようなＳＰＮを含む組成物、ならびにタンパク質標的、特に食物アレルゲンの検出のためにそのようなＳＰＮを使用するアッセイ及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
アレルギーは、世界中の何百万もの人々が罹患している重大な病状であり、米国では、多くの子供を含む約１５００万人の人々が罹患している。アレルギー反応の間、免疫系はアレルゲンを誤って脅威として標的とし、攻撃する。アレルギー反応は、皮膚、消化器系、消化管、呼吸器系、循環器系及び心血管系に影響を与え、一部のアレルギー反応では、複数の臓器系が影響を受ける。アレルギー反応は、軽度から重度の範囲にわたり、あるいは生命を脅かす。重度の症状は、呼吸困難、低血圧、胸痛、意識喪失、及びアナフィラキシーを含みうる。食物アレルギーは、全ての工業先進国において大きな健康問題である。食物アレルギーを有する人々は、現状では、特異的アレルゲンを含有する可能性のあるあらゆる食品を避けることによって、アレルギーを制御している。これらの制限は患者の生活の質に大きな影響を与え、食品の実際のアレルゲン含量を評価する方法はないままである。米国では、食物アレルギーの症状により、３分ごとに１人が緊急治療室に送られる。
【０００３】
アレルゲン検出は、多くの理由から重要である。食物アレルギーを有するヒトが、食品を試験してアレルゲン含量を正確及び即座に決定するために容易に操作されうる迅速及び正確な検出方法ならびにポータブル装置は、摂取するか否かに関して情報に基づいた決定を提供するために有利である。食品産業において、アレルゲン検出は、食品の正確な標識づけ及び食品製造の間の夾雑物の有効な除去を確実にするために重要である。
【０００４】
アレルゲンを検出するための現行の利用可能な方法は、ほとんどが、抗体に基づく免疫化学的方法（例えば、ＥＬＩＳＡ、側方流動装置）、ペプチド（例えば、質量分析）、酵素、ＤＮＡに基づく方法（例えば、ＰＣＲ）及び他の全体的／非特異的方法（例えば、目視検査、ＡＴＰ試験）を使用している。これらの方法論は、しばしば、非常に複雑で、高価で、時間がかかり、信頼性が低い。アレルゲンの不在／存在を決定するための迅速及び正確な方法は、非常に有益であろう。微量のアレルゲンを検出することができる超高感度検出分子は、高感度の検出方法を開発するために不可欠であろう。
【０００５】
一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡ及びＲＮＡ分子であるアプタマーは、特異的な三次元構造により標的に結合することができ、その構造は、アレルゲンを含むタンパク質認識のための新たな検出分子として有利な特異的性質をアプタマーに与える。アプタマー及びアプタマーに基づくアッセイは、多くの他の有用な適用（例えば、診断試験）の中でも、食品安全コントロールにおける有望な代替物として示されてきた。最近の総論には、病原体、アレルゲン、混入物、毒素及び他の禁止された夾雑物をコントロールして食品の安全性を確保するためにアプタマーを使用して開発された分析ストラテジーが記載されている（非特許文献１及び非特許文献２）。グルテンを検出する方法も、アマヤ・ゴンザレスら（Ａｍａｙａ−Ｇｏｎｚａｌｅｚ，  ｅｔ  ａｌ．）によるＰＣＴ公開特許文献１、２０１３年６月２８日に記載されている。他の例は、ＰＣＴ出願公開特許文献２及び特許文献３（黄色ブドウ球菌（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）に特異的に結合するアプタマー（ａｐｔａｍｅｒｓ  ｔｈａｔ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ｂｉｎｄ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ））；特許文献４（サルモネラ・チフィリウム（ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｉｐｈｉｍｉｒｉｕｍ）株におけるｏｍｐｃタンパク質に対するアプタマー（ａｐｔａｍｅｒｓ  ｆｏｒ  ｏｍｐｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｉｐｈｉｍｉｒｉｕｍ  ｓｔｒａｉｎ））；特許文献５（サルモネラ菌（ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）夾雑を検出するためのアプタマー（ａｐｔａｍｅｒｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ））；ならびに特許文献６及び特許文献７（リステリア菌（ｌｉｓｔｅｒｉａ）表面タンパク質に結合するアプタマー（ａｐｔａｍｅｒｓ  ｔｈａｔ  ｂｉｎｄ  ｔｏ  ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ））に含まれている（これらの文献はそれぞれ全体として本願明細書に援用する）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際出願第ＰＣＴ／ＥＳ２０１３／０００１３３号
【特許文献２】国際出願公開第２０１３０６４８１８号パンフレット
【特許文献３】国際出願公開第２０１２０８１９０８号パンフレット
【特許文献４】国際出願公開第２０１２０８１９０６号パンフレット
【特許文献５】国際出願公開第２００９０７０７４９号パンフレット
【特許文献６】米国特許第７６４５５８２号
【特許文献７】米国特許第７８３８２４２号
【特許文献８】米国特許第８，６１７，９０３号
【特許文献９】国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１４／６２６５６号
【特許文献１０】米国仮出願第６２／１３３，６３２号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】アマヤ−ゴンザレスら（Ａｍａｙａ−Ｇｏｎｚａｌｅｚ，ｅｔ  ａｌ．）、アプタマーに基づく分析：食品安全コントロールにおける有望な代替物（Ａｐｔａｍｅｒ−Ｂａｓｅｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ  Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｆｏｒ  Ｆｏｏｄ  Ｓａｆｅｔｙ  Ｃｏｎｔｒｏｌ）、Ｓｅｎｓｏｒｓ、２０１３、１３  ：１６２９２−１６３１１
【非特許文献２】アマヤ−ゴンザレスら（Ａｍａｙａ−Ｇｏｎｚａｌｅｚ，ｅｔ  ａｌ．）、セリアック病誘発疎水性タンパク質に結合するアプタマー：高感度グルテン検出システムに向けて（Ａｐｔａｍｅｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｃｏｅｌｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅ−ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ  ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｔｏｗａｒｄｓ  ａ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｇｌｕｔｅｎ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）、Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２０１４、８６（５）、２７３３−２７３９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、アプタマーに基づく新規シグナル生成ポリヌクレオチド、そのようなＳＰＮを含む組成物、試験試料中のアレルゲンの不在もしくは存在を検出するため及び／又はアレルゲンの量を定量的に測定するための迅速、高感度及び正確なアッセイを提供する。本開示で開発されたシグナル生成ポリヌクレオチド及び検出アッセイは、当該分野における任意のアレルゲン検出装置、特許文献８に教示されているマイクロ流体チップなど、ならびに共有の２０１４年１０月２８日に出願された特許文献９及び２０１５年３月１６日に出願された特許文献１０に教示されるポータブル装置で使用されうる（これらの文献はそれぞれ全体として本願明細書に援用する）。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、試料中の１つ又は複数のアレルゲンを検出するための組成物、化合物、アッセイ及び方法に関する。一部の実施形態では、アレルゲンは食物アレルゲンである。
一部の実施形態では、本発明の組成物は、高親和性でアレルゲンに特異的に結合することができる核酸アプタマーに基づくシグナル生成ポリヌクレオチド（ＳＰＮ）を含む。他の実施形態では、前記ＳＰＮは、核酸配列の一端にフルオロフォア、反対の端にクエンチャーをさらに含む。本発明のＳＰＮは、ポリヌクレオチド配列を含んでもよく、ここでポリヌクレオチド配列の５’端の５〜２０核酸塩基残基は、ヘアピン構造を形成することができる配列の３’端の５〜２０核酸塩基残基と少なくとも８０％相補性であり、それによりクエンチャーを、フルオロフォアの蛍光をクエンチするためにフルオロフォアに対して十分近接させている。
【００１０】
一部の実施形態では、ＳＰＮは、本開示の表１に列挙される配列から選択されるポリヌクレオチド配列を含みうる。
一部の実施形態では、試験試料中の１つ又は複数のアレルゲンを検出するためのアッセイ及び方法が本発明で提供される。一部の実施形態では、方法は、（ａ）アレルゲンを含む疑いがある試験試料を得る工程と、（ｂ）試験試料を処理し、処理された試料から抽出バッファーを使用してタンパク質を抽出する工程と、（ｃ）工程（ｂ）のタンパク質抽出物を、アレルゲンに特異的に結合するＳＰＮと混合する工程と、（ｄ）エネルギー励起によりＳＰＮを活性化する工程と、（ｅ）ＳＰＮとアレルゲンタンパク質との間の相互作用を視覚化し、試験試料中のアレルゲンの不在又は存在を検出する工程を備えてもよい。一部の実施形態では、試験試料から抽出された総タンパク質が決定され、抽出バッファーは、タンパク質抽出を最大とするために最適化される。他の実施形態では、試験試料中に存在するアレルゲンの量が決定される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】コア配列２０２、フルオロフォア２０４、クエンチャー２０６及びリンカー配列２０８を含むシグナル生成ポリヌクレオチドＳＰＮ−Ａ＊２００によって表される検出分子の二次配列を示す図。
【図２】ヘアピン型シグナル生成ポリヌクレオチドＳＰＮ−Ｅ３００によって表される検出分子とその標的分子リゾチームとの間の反応を示す図。さらに、アプタマーコア配列３０２、フルオロフォア３０４、及びクエンチャー３０６が示される。
【図３】図３は、二量体シグナル生成ポリヌクレオチドＳＰＮ−Ｅ＊４００（アニールされたリンカー配列４０８を含む）によって表される検出分子とその標的分子リゾチームとの間の反応を示す図。さらに、アプタマーコア配列４０２、フルオロフォア４０４、及びクエンチャー４０６が示される。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の１つ又は複数の実施形態の詳細は、下記の添付の説明で示される。本明細書で記載されたものと類似又は同等の任意の材料及び方法が本発明の実施又は試験で使用されうるが、好適な材料及び方法がここで記載される。本発明の他の特長、目的及び利点は、この説明から明らかにされる。説明において、単数形は、文脈が明確にそうでないことを指示していない限り、複数形も含む。そうでないと定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書が優先する。
【００１３】
アレルゲンタンパク質に対して高親和性で特異的に結合することができる核酸アプタマーが選択され、選択されたアプタマーを使用してシグナル生成ポリヌクレオチドが設計され、本開示におけるアレルゲンの検出のために試験される。
【００１４】
アレルゲンは、食品、環境、又は家庭用ペットのフケなどの動物由来のアレルゲンを含む。食物アレルゲンは、限定されないが、落花生、エンドウ豆、レンズ豆及びインゲン豆などのマメ科植物、木の実、小麦、乳、魚類、卵白ならびにシーフード中のタンパク質が挙げられる。他のアレルゲンは、花粉、他の動物（例えば、ペット）、病原体、及び薬などの環境由来のものでありうる。様々な原料由来のアレルゲン性タンパク質の包括的リストが下記で論じられる。
本発明の組成物
本明細書において、組成物、組成物の設計、調製、使用及び製造のための方法、ならびに試料中の標的タンパク質、特にアレルゲンタンパク質を検出するための方法及びアッセイを説明する。
アプタマー
本発明によれば、本発明の組成物は、限定されないが、１つ又は複数のアレルゲンに対して会合又は結合することができる任意の１つ又は複数の分子を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物は、１つ又は複数のアプタマーを含む。
【００１５】
本明細書で使用されるとき、「アプタマー」は、小分子、タンパク質、核酸、さらには細胞、組織及び器官などの種々の分子標的に結合するように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの選択ラウンドの反復又は同等のＳＥＬＥＸ（ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ
ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ、指数関数的濃縮によるリガンドの組織的進化）を通じて工学的に作製される核酸種である。核酸アプタマーは、古典的ワトソン−クリック（Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ）塩基対合以外の相互作用を介して分子に対して特別な結合親和性を有する。ファージディスプレイによって生成されたペプチド又はモノクローナル抗体のような核酸アプタマーは、選択された標的に特異的に結合することができ、結合を介して、それらの標的が機能する能力を遮断する。一部の場合では、アプタマーは、ペプチドアプタマーであってもよい。本明細書で使用されるとき、「アプタマー」は、核酸アプタマーをとりわけ指す。
【００１６】
アプタマーは、「化学抗体」としばしば称され、抗体の特徴と類似の特徴を有する。典型的な核酸アプタマーは、サイズがおよそ１０〜１５ｋＤａ（２０〜４５ヌクレオチド）であり、少なくともナノモルの親和性でその標的に結合し、密接に関連する標的と区別する。
【００１７】
核酸アプタマーは、一価又は多価のいずれかでありうる。アプタマーは、単量体、二量体、三量体、四量体又はより高次の多量体でありうる。個々のアプタマーモノマーが連結されて、多量体アプタマー融合分子が形成されてもよい。非限定的な例として、連結オリゴヌクレオチド（つまり、リンカー）は、ランダムアプタマーの５’アーム及び３’アーム領域の両方に相補的な配列を含有して二量体アプタマーを形成するように設計されうる。三量体又は四量体アプタマーについて、小さい三量体又は四量体（つまり、ホリデイジャンクション様）ＤＮＡナノ構造は、ランダムアプタマーの３’アーム領域への配列相補性を含むように工学的に作製され、したがってハイブリダイゼーションを通じた多量体アプタマー融合を生じる。さらに、３〜５又は５〜１０ｄＴ濃縮ヌクレオチドは、アプタマー−結合モチーフ間の一本鎖領域としてリンカーポリヌクレオチド内に含まれるように工学的に作製されてもよい。これにより複数のアプタマーに柔軟性及び自由度が与えられ、細胞リガンド又は受容体との多価相互作用が調和及び協調される。
【００１８】
あるいは、多量体アプタマーは、ビオチン化アプタマーをストレプトアビジンと混合することにより形成されてもよい。
本明細書で使用されるとき、用語「多量体アプタマー」又は「多価アプタマー」は、複数の単量体単位を含むアプタマーを指し、単量体単位のそれぞれは、それ自体アプタマーでありうる。多価アプタマーは、多価結合特性を有する。多量体アプタマーは、ホモ多量体又はヘテロ多量体でありうる。用語「ホモ多量体」は、同じ種類の複数の結合単位を含む多量体アプタマーを指し、つまりそれぞれの単位は、同じ標的分子の同じ結合部位に結合する。用語「ヘテロ多量体」は、様々な種類の複数の結合単位を含む多量体アプタマーを指し、つまり、それぞれの結合単位は同じ標的分子の様々な結合部位に結合するか、又はそれぞれの結合単位は様々な標的分子の結合部位に結合する。したがって、ヘテロ多量体は、様々な結合部位（ｓｔｉｅｓ）で１つの標的分子へ結合する多量体アプタマー、又は様々な標的分子へ結合する多量体アプタマーを指しうる。様々な標的分子に結合するヘテロ多量体は、多特異的多量体としても参照されうる。
【００１９】
核酸アプタマーは、一続きの連結されたヌクレオシド又はヌクレオチドを含む。用語「核酸」は、その広義の意味で、ヌクレオチドのポリマーを含む任意の化合物及び／又は物質を含む。これらのポリマーは、しばしばポリヌクレオチドとして参照される。本発明の例示的な核酸分子又はポリヌクレオチドは、限定されないが、Ｄ−又はＬ−核酸のいずれか、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ、β−Ｄ−リボ立体配置を有するＬＮＡ、α−Ｌ−リボ立体配置を有するα−ＬＮＡ（ＬＮＡのジアステレオマー）、２’−アミノ機能化を有する２’−アミノ−ＬＮＡ及び２’−アミノ機能化を有する２’−アミノ−α−ＬＮＡ）又はそれらのハイブリッドが挙げられる。
【００２０】
当業者は、用語「ＲＮＡ分子」又は「リボ核酸分子」が、天然に発現する又は見出されるＲＮＡ分子だけでなく、本明細書に記載される又は当該分野で公知の１つ又は複数のリボヌクレオチド／リボヌクレオシドアナログ又は誘導体を含むＲＮＡのアナログ及び誘導体も包含することを認識する。厳密にいえば、「リボヌクレオシド」は、ヌクレオシド塩基とリボース糖とを含み、「リボヌクレオチド」は、１つ、２つ又は３つのホスフェート部分を有するリボヌクレオシドである。しかしながら、用語「リボヌクレオシド」と「リボヌクレオチド」とは、本明細書で使用されるとき、同等と考えることが可能である。ＲＮＡは、核酸塩基構造、リボフラノシル環又はリボース−ホスフェート骨格において修飾されうる。
【００２１】
核酸アプタマーは、リボ核酸、デオキシリボ核酸、又は混合されたリボ核酸及びデオキシリボ核酸でありうる。アプタマーは、一本鎖のリボ核酸、デオキシリボ核酸、又は混合されたリボ核酸及びデオキシリボ核酸でありうる。
【００２２】
一部の実施形態では、アプタマーは、少なくとも１つの化学修飾を含む。一部の実施形態では、化学修飾は、糖の位置での核酸の化学的置換、ホスフェートの位置での化学的置換、及び塩基の位置の化学的置換から選択される。他の実施形態では、化学修飾は、修飾ヌクレオチドの組込み、３’キャッピング、高分子量の非免疫原性化合物へのコンジュゲーション、脂溶性化合物へのコンジュゲーション、及びホスフェート骨格へのホスホロチオエートの組込みから選択される。好適な実施形態では、高分子量の非免疫原性化合物は、ポリアルキレングリコール、より好適には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ＰＥＧの、別の分子、通常、薬物又は治療用タンパク質への共有結合的コンジュゲーションプロセスは、ＰＥＧ化として知られる。ＰＥＧ化は、通例的に、ＰＥＧの反応性誘導体を標的分子とともにインキュベーションすることにより達成される。ＰＥＧの薬物又は治療用タンパク質への共有結合的付加は、宿主の免疫系からその因子（ａｇｅｎｔ）をマスクし、それにより免疫原性及び抗原性を減少させ、及び因子の流体サイズ（溶液中のサイズ）を増加させ、それが腎クリアランスを減少させてその循環時間を延長させることができる。ＰＥＧ化は、疎水性薬物及びタンパク質に対して水溶性ももたらすことができる。
【００２３】
別の好適な実施形態では、３’キャップは、逆位デオキシチミジンキャップである。
一部の実施形態では、核酸アプタマーは、Ｐ（Ｏ）Ｏ基がＰ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、Ｐ（Ｏ）ＮＲ２（「アミデート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯもしくはＣＨ２（「ホルムアセタール」）又は３’−アミン（−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−）で置き換えられて提供され、ここで各Ｒ又はＲ’は独立してＨ又は置換されたもしくは置換されていないアルキルである。連結基は、−Ｏ−、−Ｎ−又は−Ｓ−連結を通じて隣接するヌクレオチドに付加させることができる。核酸アプタマーにおける全ての連結が同一である必要はない。
【００２４】
非限定的な例として、核酸アプタマーは、Ｄ−リボースもしくはＬ−リボース核酸残基を含んでもよく、限定されないが、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオシド、５’ホスホロチオエート基含有ヌクレオシド、コレステリル誘導体もしくはドデカン酸ビスデシルアミド基に連結された末端ヌクレオシド、ロックドヌクレオシド、脱塩基ヌクレオシド、逆位デオキシヌクレオシドもしくは逆位リボヌクレオシド、２’−デオキシ−２’−フルオロ−修飾ヌクレオシド、２’−アミノ−修飾ヌクレオシド、２’−アルキル−修飾ヌクレオシド、モルホリノヌクレオシド、ホスホルアミデートもしくは非天然塩基含有ヌクレオシド、又はそれらの任意の組合せを含む、少なくとも１つの修飾リボヌクレオシドを含んでもよい。あるいは、核酸アプタマーは、分子の全長までの少なくとも２つの修飾リボヌクレオシド、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０以上の修飾リボヌクレオシドを含みうる。修飾は、核酸分子中のそのような複数の修飾デオキシ又はリボヌクレオシドのそれぞれについて同じである必要はない。
【００２５】
核酸に基づく検出分子は、核酸塩基（しばしば当該分野で単に「塩基」と参照される）の修飾又は置換を含みうる。本明細書で使用されるとき、「無修飾」又は「天然」核酸塩基は、プリン塩基であるアデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基であるチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）を含む。修飾核酸塩基には、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニン及びグアニンの６−メチル及び他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの２−プロピル及び他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミン及び２−チオシトシン、５−ハロウラシル及びシトシン、５−プロピニルウラシル及びシトシン、６−アゾ（ａｚｏ）ウラシル、シトシン及びチミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル及び他の８−置換アデニン及びグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチル及び他の５−置換ウラシル及びシトシン、７−メチルグアニン及び７−メチルアデニン、８−アザグアニン及び８−アザアデニン、７−デアザグアニン及び７−デアザアデニン（ｄａａｚａａｄｅｎｉｎｅ）及び３−デアザグアニン及び３−デアザアデニンなどの他の合成及び天然核酸塩基が含まれる。さらに核酸塩基には、米国特許第３，６８７，８０８号に開示されている核酸塩基、生化学における修飾ヌクレオシド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ、ハージェウィン、ピー（Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ｐ．）編、ウィリーＶＣＨ（Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ）、２００８に開示されている核酸塩基；Ｔｈｅ  Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  Ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、８５８−８５９頁、クロシェビッツ、ジェイ．エル（Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｌ）編、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ）、１９９０に開示されている核酸塩基、イングリッシュら（Ｅｎｇｌｉｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ）、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、１９９１，３０，６１３に開示されている核酸塩基、及びサングビ、ワイ  エス（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ  Ｓ）、第１５章、ｄｓＲＮＡリサーチ及び適用（Ｃｈａｐｔｅｒ  １５、ｄｓＲＮＡ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、２８９−３０２頁、クルック  エス．ティ．及びレブリュー  ビー．（Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．  ａｎｄ  Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．）編、ＣＲＣプレス（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ）、１９９３に開示されている核酸塩基が含まれる。
【００２６】
アプタマーのための適切なヌクレオチド長は、約１５〜約１００ヌクレオチド（ｎｔ）の範囲であり、他の様々な好適な実施形態では、１５〜３０ｎｔ、２０〜２５ｎｔ、３０〜１００ｎｔ、３０〜６０ｎｔ、２５〜７０ｎｔ、２５〜６０ｎｔ、４０〜６０ｎｔ、２５〜４０ｎｔ、３０〜４０ｎｔ、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９もしくは４０のいずれか又は４０〜７０ｎｔ長である。一部の実施形態では、アプタマーは、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９又は７０ｎｔ長でありうる。他の実施形態では、アプタマーは、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００ｎｔ長でありうる。しかしながら、配列は、本明細書に記載の距離で２つの標的を有するアプタマーの相互作用に適応することができるような十分な柔軟性を有するように設計されうる。
【００２７】
一部の実施形態では、核酸アプタマーは、二本鎖特徴の１つ又は複数の領域を含む。そのような二本鎖領域は、内部自己相補性又は第２のもしくはさらなるアプタマーもしくはオリゴヌクレオチド分子との相補性から生じうる。一部の実施形態では、二本鎖領域は、４〜１２、４〜１０、４〜８塩基対の長さの領域でありうる。一部の実施形態では、二本鎖領域は、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２塩基対でありうる。一部の実施形態では、二本鎖領域は、ステム領域を形成しうる。二本鎖特徴を有するそのような拡張ステム領域は、核酸アプタマーを安定化するために役立ちうる。本明細書で使用されるとき、用語「二本鎖特徴」は、２つの核酸分子の任意の長さにわたって、それらの配列が、長さの５０パーセントを超える塩基対合（標準又は非標準）を形成することを意味する。
【００２８】
アプタマーは、ヌクレアーゼ及び他の酵素活性からの保護を提供するためにさらに修飾されてもよい。アプタマー配列は、当該分野で公知の任意の適切な方法により修飾されうる。例えば、ＤＮＡアプタマーのために、ホスホロチオエートが骨格に組み込まれてもよく、及び５’−修飾ピリミジンがｓｓＤＮＡの５’端に含まれてもよい。ＲＮＡアプタマーについて、修飾ヌクレオチド、例えばリボース骨格の２’−ＯＨ基の２’−デオキシ−ＮＴＰ又は２’−フルオロ−ＮＴＰを用いた置換などが、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ変異を使用してＲＮＡ分子に組み込まれてもよい。これらの修飾アプタマーのヌクレアーゼに対する耐性は、精製ヌクレアーゼ又はマウス血清由来のヌクレアーゼとともにそれらをインキュベートすることにより試験されることができ、アプタマーの完全性は、ゲル電気泳動により解析されることができる。
【００２９】
一部の実施形態では、そのような修飾核酸アプタマーは、修飾ヌクレオチドの全体、又は修飾ヌクレオチドのサブセットで合成されうる。修飾は、同じであっても異なっていてもよい。全てのヌクレオチドが修飾されてもよく、全てが同じ修飾を含んでもよい。全てのヌクレオチドが修飾されているが異なる修飾を含んでもよく、例えば、同じ塩基を含有する全てのヌクレオチドがある種の修飾を有し、一方で他の塩基を含有するヌクレオチドが別の種類の修飾を含んでいてもよい。例えば、全てのプリンヌクレオチドがある種の修飾を有し（又は無修飾であり）、一方で全てのピリミジンヌクレオチドが別の異なる種類の修飾を有しても（又は無修飾であっても）よい。このように、オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドのライブラリーは、本明細書に開示される修飾の任意の組合せを使用して生成される。
【００３０】
本発明のある特定の実施形態によれば、アプタマーのバリアント及び誘導体が提供される。用語「誘導体」は、用語「バリアント」と同義的に使用され、参照又は開始アプタマーに対して任意の様式で修飾又は変更されている分子を指す。アプタマーバリアントの核酸配列は、参照又は開始配列と比較して、ヌクレオチド配列内のある特定の位置において置換、欠失及び／又は挿入を有しうる。通常、バリアントは、参照配列に対して少なくとも約５０％の同一性（相同性）を有し、好適には参照配列に対して、少なくとも約８０％、より好適には少なくとも約９０％同一（相同）である。
【００３１】
一部の実施形態では、本発明のアプタマーの模倣バリアントが提供される。本明細書で使用されるとき、用語「模倣バリアント」は、活性配列を模倣する１つ又は複数の核酸を含むバリアントである。模倣バリアントの核酸配列は、天然核酸又は代替的に非天然核酸を含みうる。
アプタマーコンジュゲート及び標識
一部の実施形態では、本発明のアプタマーは、コンジュゲートを含みうる。本発明のそのようなコンジュゲートは、天然物質又はリガンド、タンパク質など；炭水化物（例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリンもしくはヒアルロン酸）又は脂質ならびに組換えもしくは合成分子、合成ポリマーなどを含みうる。
【００３２】
コンジュゲートの例としては、限定されないが、磁性ナノ粒子（ＭＮＰ）（例えば、超常磁性酸化鉄ナノ粒子（ｓｕｐｅｒｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｉｒｏｎ  Ｏｘｉｄｅ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ、ＳＰＩＯＮ）、金ＮＰ、及び量子ドット（ｑｕａｎｔｕｍ  ｄｏｔ、ＱＤ））；キトサン；及び薬物コンジュゲートを挙げることができる。
【００３３】
一部の実施形態では、本発明のアプタマーは、検出可能な因子、様々な有機小分子、無機化合物、ナノ粒子、酵素又は酵素基質、蛍光材料、発光材料（例えば、ルミノール）、生物発光材料（例えば、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びエクオリン）、化学発光材料、放射性材料（例えば、１８Ｆ、６７Ｇａ、８１ｍＫｒ、８２Ｒｂ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１３３Ｘｅ、２０１Ｔｌ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、３Ｈ、もしくは９９ｍＴｃ（例えば、過テクネチウム酸塩（テクネチウム酸塩（ＶＩＩ）、Ｔｃ０４））、ならびに造影剤（例えば、金（例えば、金ナノ粒子）、ガドリニウム（例えば、Ｇｄ錯体）、酸化鉄（例えば、超常磁性酸化鉄（ＳＰＩＯ）、単結晶酸化鉄ナノ粒子（ＭＩＯＮ）、及び超常磁性酸化鉄（ＵＳＰＩＯ））、マンガン錯体（例えば、Ｍｎ−ＤＰＤＰ）、硫酸バリウム、ヨウ素化造影媒体（イオヘキソール）、マイクロバブル、又はパーフルオロカーボン）などを含んでもよい。そのような光学的に検出可能な標識としては、例えば、限定されないが、４−アセトアミド−４’−イソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸；アクリジン及び誘導体（例えば、アクリジン及びアクリジンイソチオシアネート）；５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）；４−アミノ−Ｎ−［３−ビニルスルホニル）フェニル］ナフタルイミド−３，５−ジスルホネート；Ｎ−（４−アニリノ−１−ナフチル）マレイミド；アントラニルアミド；ＢＯＤＩＰＹ；ブリリアントイエロー；クマリン及び誘導体（例えば、クマリン、７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ、クマリン１２０）及び７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリン（クマリン１５１））；シアニン色素；シアノシン；４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）；５’５”−ジブロモピロガロール−スルホンフタレイン（ｓｕｌｆｏｎａｐｈｔｈａｌｅｉｎ）（ブロモピロガロールレッド）；７−ジエチルアミノ−３−（４’−イソチオシアナトフェニル）−４−メチルクマリン；ジエチレントリアミンペンタアセテート；４，４’−ジイソチオシアナトジヒドロ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸；４，４’−ジイソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸；５−［ジメチルアミノ］ナフタレン−１−スルホニルクロリド（ＤＮＳ、ダンシルクロリド）；４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−イソチオシアネート（ＤＡＢＩＴＣ）；エオシン及び誘導体（例えば、エオシン及びエオシンイソチオシアネート）；エリスロシン及び誘導体（例えば、エリスロシンＢ及びエリスロシンイソチオシアネート）；エチジウム；フルオレセイン及び誘導体（例えば、５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、５−（４，６−ジクロロトリアジン−２−イル）アミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）、２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、Ｘ−ローダミン−５−（及び６）−イソチオシアネート（ＱＦＩＴＣ又はＸＲＩＴＣ）及びフルオレスカミン）；２−［２−［３−［［１，３−ジヒドロ−１，１−ジメチル−３−（３−スルホプロピル）−２Ｈ−ベンズ［ｅ］インドール−２−イリデン］エチリデン］−２−［４−（エトキシカルボニル）−１−ピペラジニル］−１−シクロペンテン−１−イル］エテニル］−１，１−ジメチル−３−（３−スルホプロピル（ｓｕｌｆｏｒｐｒｏｐｙｌ））−１Ｈ−ベンズ［ｅ］インドリウムヒドロキシド、分子内塩、Ｎ，Ｎ−ジエチルエタナミンを有する化合物（１：１）（ＩＲ１４４）；５−クロロ−２−［２−［３−［（５−クロロ−３−エチル−２（３Ｈ）−ベンゾチアゾール−イリデン）エチリデン］−２−（ジフェニルアミノ）−１−シクロペンテン−１−イル］エテニル］−３−エチルベンゾチアゾリウム過塩素酸塩（ＩＲ１４０）；マラカイトグリーンイソチオシアネート；４−メチルウンベリフェロンオルト−クレゾールフタレイン；ニトロチロシン；パラロサニリン；フェノールレッド；Ｂ−フィコエリトリン；ｏ−フタルジアルデヒド；ピレン及び誘導体（例えば、ピレン、ピレン酪酸、及びスクシンイミジル１−ピレン）；酪酸量子ドット；反応性レッド４（ＣＩＢＡＣＲＯＮＴＭブリリアントレッド３Ｂ−Ａ）；ローダミン及び誘導体（例えば、６−カルボキシ−Ｘ−ロダニン（ＲＯＸ）、６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、リサミンローダミンＢ  スルホニルクロリドローダミン（Ｒｈｏｄ）、ローダミンＢ、ローダミン１２３、ローダミンＸイソチオシアネート、スルホローダミンＢ、スルホローダミン１０１、スルホローダミン１０１のスルホニルクロリド誘導体（Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）テトラメチルローダミン、及びテトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ））；リボフラビン；ロソール酸；テルビウム錯体誘導体；シアニン−３（Ｃｙ３）；シアニン−５（Ｃｙ５）；シアニン−５．５（Ｃｙ５．５）、シアニン−７（Ｃｙ７）；ＩＲＤ７００；ＩＲＤ８００；Ａｌｅｘａ６４７；Ｌａ  Ｊｏｌｔａ  Ｂｌｕｅ；フタロシアニン；ならびにナフタロシアニンが含まれる。
【００３４】
一部の実施形態では、検出可能な因子は、検出不可であるが活性化により検出可能となる前駆体（例えば、蛍光発生テトラジン−フルオロフォア構築物（例えば、テトラジン−ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、テトラジン−オレゴングリーン  ４８８もしくはテトラジン−ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ−Ｘ）又は酵素で活性化可能な蛍光発生因子（例えば、ＰＲＯＳＥＮＳＥ（登録商標）（ビゼンメディカル（ＶｉｓＥｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ））））でありうる。一部の実施形態では、検出不可の前駆体は、フルオロフォアとクエンチャーとの組合せ、例えば、フルオレセインとＤＡＢＣＹＬとの組合せなどを含む。フルオロフォアとクエンチャーの対の選択のためのガイドラインは、エス．エー．イー．マラス（Ｓ．Ａ．Ｅ．Ｍａｒｒａｓ）、蛍光核酸ハイブリダイゼーションプローブのためのフルオロフォアとクエンチャーの対の選択（Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ  ａｎｄ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ  Ｐａｉｒｓ  ｆｏｒ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｂｅｓ）」、ジデンコ、ウラジミルブイ（Ｄｉｄｅｎｋｏ、Ｖｌａｄｉｍｉｒ  Ｖ．）編、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅｓ：ｄｅｓｉｇｎｓ  ａｎｄ
ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．）、３３５巻、シュプリンガー（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）、２００６に記載されており、これらの文献は全体として本願明細書に援用する。
シグナル生成ポリヌクレオチド（ＳＰＮ）
ある特定の実施形態によれば、アレルゲン標的に対して高親和性及び特異性で結合するときに検出可能なポリヌクレオチド配列が提供される。そのようなポリヌクレオチド配列は、本明細書において上述されるＳＥＬＥＸプロセスを使用して製造されてもよい。
【００３５】
ある種の例示的シグナル生成ポリヌクレオチドでは、配列の５’端は蛍光分子に結合されており、３’端は５端に結合する５〜２０ヌクレオチド長の逆相補配列を有する。これにより、配列のフォールディング及びステム−ループ構造の形成に至る。クエンチャー分子は３’端に結合される。当業者は、クエンチャーが５’端に結合され、フルオロフォアが３’端に結合される代替的配置が可能であることを認識する。そのような代替シグナル生成ポリヌクレオチドは、本明細書の文脈で過度の実験なしに当業者によって調製されうる。
【００３６】
分子標的としてのリゾチームに結合するステム−ループ構造を用いて設計された例示的シグナル生成ポリヌクレオチドは、本明細書で以下の実施例１において記載されている。
ある特定の実施形態では、５’端のフルオロフォア分子は、Ｇヌクレオチド残基により生じるクエンチを防ぐために、Ｔヌクレオチド残基に結合される。
【００３７】
より高い融解温度（Ｔｍ）は避けるべきであるとの認識において、２つの鎖のＴｍ又はＡＧは、分子標的のシグナル生成ポリヌクレオチドに対する結合親和性よりも低くして、分子標的に対する結合へ熱力学的優先性をもたせる必要がある。好適な分子標的結合を維持するために、平衡をシフトするＭｇ＋２又はＫ＋を添加してもよい。最大で約３７ｍＭのＫＣｌの添加により、所与のシグナル生成ポリヌクレオチドの平衡が分子標的の結合に有利にシフトする一方、最大で約５ｍＭのＭｇＣｌ２の添加により、二重鎖構造の保持に向けて平衡がシフトし、それにより分子標的に対するシグナル生成ポリヌクレオチドの親和性が低下する。
【００３８】
２つの逆相補鎖は、ステム−ループ構造を生成するために反対側にある必要はない。逆相補鎖は、５’端に付加／アニールされることができる。配列は、構造と物理的に干渉するために十分な長さでなければならない。二本鎖結合は、分子標的に結合するために必要とされる二次構造フォールディングの形成を防ぐ必要がある。
【００３９】
ある特定の実施形態では、シグナル生成ポリヌクレオチドは、フルオロフォアに連結されたコア配列とクエンチャーに連結されたより短いアニールリンカー配列、又はその逆に連結された配列を有する二量体実体である。一例では、シグナル生成ポリヌクレオチドは、シグナル生成ポリヌクレオチドの配列の５’端にアニールし、シグナル生成ポリヌクレオチド配列の５’端と少なくとも８０％相補性を有する５〜２０核酸塩基長のリンカー配列を含んでもよく、ここでシグナル生成ポリヌクレオチドはフルオロフォアを含み、リンカー配列はクエンチャーを含む。
【００４０】
ある特定の実施形態では、シグナル生成ポリヌクレオチド配列は、２’−Ｏ−メチル修飾で化学的に修飾されている。そのような修飾は、分子標的の結合に関する結合親和性及び感度に顕著な影響を与えないが、安定性を増強させると予測される。
【００４１】
一部の実施形態では、いくつかの一般的な食物アレルゲンに対するシグナル生成ポリヌクレオチドが、本明細書で上述されるようにＳＥＬＥＸプロセスから選択されたポリヌクレオチド（例えば、アプタマー）を使用して設計される。そのようなアプタマーの核酸配列は、アレルゲンに対して高い結合親和性及び特異性を有する。表１は、シグナル生成ポリヌクレオチドが設計されるアプタマー配列を列挙する。
【００４２】
【表１】
2020054339.tif 000003
実施例で記載されたＳＥＬＥＸプロセスから選択された核酸アプタマーに加えて、シグナル生成ポリヌクレオチドは、他の研究から選択されたアプタマーを使用して設計されてもよい。５’端及び３’端ヌクレオチド、フルオロフォア／クエンチャー対及びステム−ループ構造を、上記基準にしたがってさらに設計し、標的に対するそれらの結合親和性及び特異性について試験してもよい。
【００４３】
一部の実施形態では、ＳＰＮは、当該分野で開示されている食物アレルゲンに対するアプタマーを使用して開発されてもよい。そのようなアプタマーには、限定されないが、Ｌｕｐ  ａｎ  １（β−コングルチン）（ナダル  ピーら（Ｎａｄａｌ  Ｐ  ｅｔａ  １）、Ｌｕｐ  ａｎ  １食物アレルゲンに対するＤＮＡアプタマー（ＤＮＡ  Ａｐｔａｍｅｒｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｔｈｅ  Ｌｕｐ  ａｎ  １  Ｆｏｏｄ  Ａｌｌｅｒｇｅｎ）、ＰＬｏｓ  Ｏｎｅ，２０１２，７：ｅ３５２５３）；レプチン（ｌｅｐ３）（アシュリー及びリ（Ａｓｈｌｅｙ  ａｎｄ  Ｌｉ）、キャピラリー電気泳動を使用するレプチンアプタマーの三次元選択及びクローン検証のための示唆（Ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｅｐｔｉｎ  ａｐｔａｍｅｒｓ  ｕｓｉｎｇ  ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｃｌｏｎｅ  ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ）、Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２０１３、４３４：１４６−１５２）、及びリゾチーム（卵白）（キルビーら（Ｋｉｒｂｙ  ｅｔ  ａｌ．）、タンパク質の検出及び定量のためのアプタマーに基づくセンサーアレイ（Ａｐｔａｍｅｒ−ｂａｓｅｄ  ｓｅｎｓｏｒ  ａｒｒａｙｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ．  ２００４、７６（１４）：４０６６−４０７５；ゾウ  エムら（Ｚｏｕ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．）、６−カルボキシフルオレセイン−標識ＤＮＡアプタマーを使用する唾液リゾチームの均一蛍光異方性センシング（Ｔｈｅ  ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｎｉｓｏｔｒｏｐｉｃ  ｓｅｎｓｉｎｇ  ｏｆ  ｓａｌｉｖａｒｙ  ｌｙｓｏｚｙｍｅ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ６−ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−ｌａｂｅｌｅｄ  ＤＮＡ  ａｐｔａｍｅｒ）、Ｂｉｏｓｅｎｓ  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ、２０１２、３２（１）：１４８−１５４；ロバートソン及びエリントン（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ  ａｎｄ  Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ）、ヌクレオテイン酵素のｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択（Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｏｏｔｅｉｎ  ｅｎｚｙｍｅｓ）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２００１：６５０−６５５；ならびにヘッセルベルツら（Ｈｅｓｓｅｌｂｅｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ）、アプタザイムリガーゼアレイを用いた多様な分析対象の同時検出（Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
ｏｆ  ｄｉｖｅｒｓｅ  ａｎａｌｙｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ａｐｔａｚｙｍｅ  ｌｉｇａｓｅ  ａｒｒａｙ）、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００３、３１２：１０６−１  １２、これらの文献はそれぞれ全体として本願明細書に援用する）に特異的なアプタマーが含まれうる。それぞれの開示からのアプタマーの核酸配列は、表２に列挙されている。
【００４４】
一部の実施形態では、シグナル生成ポリヌクレオチドは、スギ花粉のＣｒｙ  ｊ  ２アレルゲン（オギハラら（Ｏｇｉｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．）、バイオセンシング適用のためのスギ花粉のＣｒｙ  ｊ  ２アレルゲンに対するＤＮＡアプタマー（ＤＮＡ  ａｐｔａｍｅｒｓ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｃｒｙ  ｊ  ２  ａｌｌｅｒｇｅｎ  ｏｆ  Ｊａｐａｎｅｓｅ
ｃｅｄａｒ  ｐｏｌｌｅｎ  ｆｏｒ  ｂｉｏｓｅｎｓｉｎｇ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、Ｂｉｏｓｅｎｓ  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．、２０１５、６３、１５９−１６５）、ルーピン粉中に存在するｌｕｐ  ａｎ  １（β−コングルチン）サブユニット（スボボドバら（Ｓｖｏｂｏｄｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．）、β−コングルチン食物アレルゲンの超高感度アプタマーに基づく検出（Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ａｐｔａｍｅｒ  ｂａｓｅｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  β−ｃｏｎｇｌｕｔｉｎ  ｆｏｏｄ  ａｌｌｅｒｇｅｎ）、Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．、２０１４、１６５、４１９−４２３；ならびにマイライら（Ｍａｉｒａｌ  ｅｔ  ａｌ．）、選択的及び高感度Ｌｕｐ  ａｎ  １アレルゲン検出のためのＦＲＥＴに基づく二量体アプタマープローブ（ＦＲＥＴ−ｂａｓｅｄ  ｄｉｍｅｒｉｃ  ａｐｔａｍｅｒ  ｐｒｏｂｅ  ｆｏｒ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｌｕｐ  ａｎ  １  ａｌｌｅｒｇｅｎ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）、Ｂｉｏｓｅｎｓ  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．、２０１４、５４：２０７−２１０）、ならびにグリアジン（グルテン）（ピント  エイら（Ｐｉｎｔｏ  Ａ  ｅｔａ  ｌ．）、リアルタイムアプタＰＣＲによって媒介されるグリアジン食物アレルゲンの標識フリー検出（Ｌａｂｅｌ−ｆｒｅｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｉａｄｉｎ  ｆｏｏｄ  ａｌｌｅｒｇｅｎ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ａｐｔａ−ＰＣＲ）、Ａｎａｌ  Ｂｉｏａｎａｌ  Ｃｈｅｍ．、２０１４、４０６（２）：５１５−５２４）に結合するアプタマーを使用して開発されてもよく、これらの文献はそれぞれ全体として本願明細書に援用する。
【００４５】
【表２】
2020054339.tif 000004
一部の実施形態では、シグナル生成ポリヌクレオチドは、病原体に対する検出分子として選択されるアプタマーを使用して開発されてもよい。非限定的な例として、サルモネラ菌、リステリア菌、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、コウジカビ（ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）を特異的に認識することができるアプタマーを使用して、本明細書に記載されるシグナル生成ポリヌクレオチド（ＳＰＮ）を設計してもよい。そのようなアプタマーは、例えば、ハン及びリー（Ｈａｎ  ａｎｄ  Ｌｅｅ）、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）に特異的なＲＮＡアプタマーのｉｎ  Ｖｉｔｒｏ選択（Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＲＮＡ  Ａｐｔａｍｅｒ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｔｏ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１３、２３：８７８−８８４；ヒョン、ジェイら（Ｈｙｅｏｎ，Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．）、サルモネラ・エンテリティディス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｓ  Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓｓ）の検出のためのＲＮＡアプタマーの開発（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ＲＮＡ  Ａｐｔａｍｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｓ  Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓｓ）、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２０１２、８９：７９−８２；オークら（Ｏｈｋ  ｅｔ  ａｌ．）、食品からのリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）の特異的検出のための抗体−アプタマー機能化光ファイバーバイオセンサー（Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ａｐｔａｍｅｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ  ｆｉｂｒｅ−ｏｐｔｉｃ  ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ｆｏｒ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ｆｒｏｍ  ｆｏｏｄ）、Ｊ．  Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２０１０、１０９：８０８−８１７；リ、エイチら（Ｌｉ，Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｋ８８の検出のためのアプタマー選択（Ａｐｔａｍｅｒ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ８８）、Ｃａｎａｄｉａｎ
Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２０１１、５７：４５３−４５９；リーら（Ｌｅｅ  ａｔ  ａｌ．）、大腸菌Ｏ１５７のｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択：Ｈ７特異的ＲＮＡアプタマー（Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｏ１５７：Ｈ７−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＲＮＡ  ａｐｔａｍｅｒ）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、２０１２、４１７：２１４−２２０；アリら（Ａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．）、細菌指標としての蛍光発生ＤＮＡザイム  オベス（Ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ  ＤＮＡｚｙｍｅ  ｏｂｅｓ  ａｓ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ）、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、２０１１、５０：３７５１−３７５４；ならびにデグラッセ  ジェイエー（ＤｅＧｒａｓｓｅ  ＪＡ）、黄色ブドウ球菌エンテロトキシンＢに選択的に結合する一本鎖ＤＮＡアプタマー（Ａ  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＤＮＡ  Ａｐｔａｍｅｒ  Ｔｈａｔ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ  Ｂｉｎｄｓ  ｔｏ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｅｎｔｅｒ  ｏｔｏｘｉｎ  Ｂ）、Ｐｌｏｓ  Ｏｎｅ、２０１２、７：ｅ３３４１０で論じられており、これらの文献はそれぞれ全体として本願明細書に援用する。表３は、これらの開示からのそのようなアプタマーの配列を列挙する。
【００４６】
【表３】
2020054339.tif 000005
他の実施形態では、当業者であれば想像しうるように、非タンパク質標的、例えば小分子に対して特異的に結合するアプタマーも、本明細書に記載されるシグナル生成ポリヌクレオチドを設計するために使用されうる。表４は、非限定的な例としての一部のアプタマーの配列を列挙する（ファーガソンら（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）、アロステリックリボザイムの選択のための新規戦略により、カフェイン及びアスパルテームに対するリボレポーターＴＭセンサを得る（Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃ  ｒｉｂｏｚｙｍｅｓ  ｙｉｅｌｄｓ  ＲｉｂｏＲｅｐｏｒｔｅｒ  ＴＭ  ｓｅｎｓｏｒｓ  ｆｏｒ  ｃａｆｆｅｉｎｅ  ａｎｄ  ａｓｐａｒｔａｍｅ）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００４、３２：１７５６−１７６６；ならびにオノ及びトガシ（Ｏｎｏ  ａｎｄ  Ｔｏｇａｓｈｉ）、水溶液中の水銀（ＩＩ）に対するオリゴヌクレオチドに基づく高選択性センサ（Ｈｉｇｈｌｙ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｂａｓｅｄ  ｓｅｎｓｏｒ  ｆｏｒ  ｍｅｒｃｕｒｙ（ＩＩ）  ｉｎ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）、Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．，２００４、４３：４３００−４３０２）。
【００４７】
【表４】
2020054339.tif 000006
シグナル生成ポリヌクレオチドの標的
本発明は、標的分子に結合する、アプタマーに基づくシグナル生成ポリヌクレオチド（ＳＰＮ）を提供する。後述するように、標的分子は、アレルゲンタンパク質又はそのバリアントでありうる。一部の実施形態では、ＳＰＮは、それ自体アレルゲンと会合するタンパク質又は他の生体分子と結合又は会合するように設計されうる。
【００４８】
本発明によれば、理論に拘束されることを望まないが、検出ポリヌクレオチドは、完全に又は部分的にアレルゲンに結合しうる。
アレルゲン
一部の実施形態では、アレルゲンは、食物アレルゲンである。食物に関連するアレルゲン性タンパク質の例としては、限定されないが、ブラインシュリンプ（Ａｒｔ  ｆｉｒ  ５）、カニ（Ｃｈａ  ｆ  １）、北海エビ（Ｃｒａ  ｃ  １、Ｃｒａ  ｃ  ２、Ｃｒａ  ｃ  ４、Ｃｒａ  ｃ  ５、Ｃｒａ  ｃ  ６、Ｃｒａ  ｃ  ８）、アメリカンロブスター（Ｈｏｍ  ａ  １、Ｈｏｍ  ａ  ３、Ｈｏｍ  ａ  ６）、ホワイトシュリンプ（Ｌｉｔ  ｖ
１、Ｌｉｔ  ｖ  ２、Ｌｉｔ  ｖ  ３、Ｌｉｔ  ｖ４）、ジャイアント淡水エビ（Ｍａｃ  ｒ  １）、エビ（Ｍｅｔ  ｅ  １、Ｐｅｎ  ａ  １、Ｐｅｎ  ｉ  １）、北部エビ（Ｐａｎ  ｂ  １）、イセエビ（Ｐａｎ  ｓ  １）、ブラックタイガーエビ（Ｐｅｎ  ｍ  １、Ｐｅｎ  ｍ  ２、Ｐｅｎ  ｍ  ３、Ｐｅｎ  ｍ  ４、Ｐｅｎ  ｍ  ６）、狭ツメガエルザリガニ（Ｐｏｎ  ｉ  ４、Ｐｏｎ  ｉ  ７）、青スイマーカニ（Ｐｏｒ  ｐ  １）、畜牛（Ｂｏｓ  ｄ  ４、Ｂｏｓ  ｄ  ５、Ｂｏｓ  ｄ  ６、Ｂｏｓ  ｄ  ７、Ｂｏｓ  ｄ
８、Ｂｏｓ  ｄ  ９、Ｂｏｓ  ｄ  １０、Ｂｏｓ  ｄ  １１、Ｂｏｓ  ｄ  １２）、大西洋ニシン（Ｃｌｕ  ｈ  １）、コイ（Ｃｙｐ  ｃ  １）、バルトタラ（Ｇａｄ  ｃ  １）、大西洋タラ（Ｇａｄ  ｍ  １、Ｇａｄ  ｍ  ２、Ｇａｄ  ｍ  ３）、タラ（Ｇａｄ  ｃ  １）、ニワトリ（Ｇａｌ  ｄ  １、Ｇａｌ  ｄ  ２、Ｇａｌ  ｄ  ３、Ｇａｌ  ｄ  ４、Ｇａｌ  ｄ  ５）、バラマンディ（Ｂａｒｒａｍｕｎｄａ）（Ｌａｔ  ｃ  １）、メグリム（Ｌｅｐｉｄｏｒｈｏｍｂｕｓ  ｗｈｉｆｆｉａｇｏｎｉｓ）（Ｌｅｐ  ｗ  １）、シロザケ（Ｏｎｃ  ｋ  ５）、大西洋サケ（Ｓａｌ  ｓ  １、Ｓａｌ  ｓ  ２、Ｓａｌ
ｓ  ３）、ニジマス（Ｏｎｃ  ｍ  １）、モザンビークティラピア（Ｏｒｅ  ｍ  ４）、食用カエル（Ｒａｎ  ｅ  １、Ｒａｎ  ｅ  ２）、パシフィックピルチャード（Ｓａｒ
ｓａ  １）、海洋パーチ（Ｓｅｂ  ｍ  １）、キハダ（Ｔｈｕ  ａ  １、Ｔｈｕ  ａ  ２、Ｔｈｕ  ａ  ３）、メカジキ（Ｘｉｐ  ｇ  １）、アワビ（Ｈａｌ  ｍ  １）、ヒメリンゴマイマイ（Ｈｅｌ  ａｓ  １）、イカ（Ｔｏｄ  ｐ  １）、パイナップル（Ａｎａ
ｃ  １、Ａｎａ  ｃ  ２）、アスパラガス（Ａｓｐａ  ｏ  １）、オオムギ（Ｈｏｒ  ｖ  １２、Ｈｏｒ  ｖ  １５、Ｈｏｒ  ｖ  １６、Ｈｏｒ  ｖ  １７、Ｈｏｒ  ｖ  ２０、Ｈｏｒ  ｖ  ２１）、バナナ（Ｍｕｓ  ａ  １、Ｍｕｓ  ａ  ２、Ｍｕｓ  ａ  ３、Ｍｕｓ  ａ  ４、Ｍｕｓ  ａ  ５）、バナナ（Ｍｕｓｘｐ１）、イネ（Ｏｒｙ  ｓ  １２）、ライ麦（Ｓｅｃ  ｃ  ２０）、小麦（Ｔｒｉ  ａ  １２、Ｔｒｉ  ａ  １４、Ｔｒｉ  ａ  １８、Ｔｒｉ  ａ  １９、Ｔｒｉ  ａ  ２５、Ｔｒｉ  ａ  ２６、Ｔｒｉ  ａ  ３６、Ｔｒｉ  ａ  ３７）、トウモロコシ（コーン）（Ｚｅａ  ｍ  １４、Ｚｅａ  ｍ  ２５）、キウイフルーツ（Ａｃｔ  ｃ１、Ａｃｔ  ｃ  ２、Ａｃｔ  ｃ  ５、Ａｃｔ  ｃ  ８、Ａｃｔ  ｃ  １０、Ａｃｔ  ｄ  １、Ａｃｔ  ｄ  ２、Ａｃｔ  ｄ  ３、Ａｃｔ  ｄ  ４、Ａｃｔ  ｄ  ５、Ａｃｔ  ｄ  ６、Ａｃｔ  ｄ  ７、Ａｃｔ  ｄ  ８、Ａｃｔ  ｄ  ９、Ａｃｔ  ｄ  １０、Ａｃｔ  ｄ  １１）、カシューナッツ（Ａｎａ  ｏ  １、Ａｎａ
ｏ  ２、Ａｎａ  ｏ  ３）、セロリ（Ａｐｉ  ｇ  １、Ａｐｉ  ｇ  ２、Ａｐｉ  ｇ  ３、Ａｐｉ  ｇ  ４、Ａｐｉ  ｇ  ５、Ａｐｉ  ｇ  ６）、落花生（Ａｒａ  ｈ  １、Ａｒａ  ｈ  ２、Ａｒａ  ｈ  ３、Ａｒａ  ｈ  ４、Ａｒａ  ｈ  ５、Ａｒａ  ｈ  ６、Ａｒａ  ｈ  ７、Ａｒａ  ｈ  ８、Ａｒａ  ｈ  ９、Ａｒａ  ｈ  １０、Ａｒａ  ｈ  １１、Ａｒａ  ｈ  １２、Ａｒａ  ｈ  １３）、ブラジルナッツ（Ｂｅｒ  ｅ  １、Ｂｅｒ  ｅ  ２）、オリエンタルマスタード（Ｂｒａ  ｊ  １）、ナタネ（Ｂｒａ  ｎ  １）、キャベツ（Ｂｒａ  ｏ  ３）、カブ（Ｂｒａ  ｒ  １、Ｂｒａ  ｒ  ２）、ピーマン（Ｃａｐ  ａ  ｌｗ、Ｃａｐ  ａ  ２）、ペカン（Ｃａｒ  ｉ  １、Ｃａｒ  ｉ  ４）、クリ（Ｃａｓ  ｓ  １、Ｃａｓ  ｓ  ５、Ｃａｓ  ｓ  ８、Ｃａｓ  ｓ  ９）、レモン（Ｃｉｔ
Ｉ  ３）、タンジェリン（Ｃｉｔ  ｒ  ３）、スイートオレンジ（Ｃｉｔ  ｓ  １、Ｃｉｔ  ｓ  ２、Ｃｉｔ  ｓ  ３）、ハシバミ（Ｃｏｒ  ａ  １、Ｃｏｒ  ａ  ２、Ｃｏｒ
ａ  ８、Ｃｏｒ  ａ  ９、Ｃｏｒ  ａ  １１、Ｃｏｒ  ａ  １２、Ｃｏｒ  ａ  １３、Ｃｏｒ  ａ  １４）、マスクメロン（Ｃｕｃ  ｍ  １、Ｃｕｃ  ｍ  ２、Ｃｕｃ  ｍ  ３）、ニンジン（Ｄａｕ  ｃ  １、Ｄａｕ  ｃ  ４、Ｄａｕ  ｃ  ５）、普通ソバ（Ｆａｇ
ｅ  ２、Ｆａｇ  ｅ  ３）、韃靼ソバ（Ｆａｇ  ｔ  ２）、イチゴ（Ｆｒａ  ａ  １、Ｆｒａ  ａ  ３、Ｆｒａ  ａ  ４）、大豆（Ｇｌｙ  ｍ  １、Ｇｌｙ  ｍ  ２、Ｇｌｙ  ｍ  ３、Ｇｌｙ  ｍ  ４、Ｇｌｙ  ｍ  ５、Ｇｌｙ  ｍ  ６、Ｇｌｙ  ｍ  ７、Ｇｌｙ  ｍ  ８）、ヒマワリ（Ｈｅｌ  ａ１、Ｈｅｌ  ａ  ２、Ｈｅｌ  ａ  ３）、黒クルミ（Ｊｕｇ  ｎ  １、Ｊｕｇ  ｎ  ２）、セイヨウグルミ（Ｊｕｇ  ｒ  １、Ｊｕｇ  ｒ  ２、Ｊｕｇ  ｒ  ３、Ｊｕｇ  ｒ  ４）、栽培レタス（Ｌａｃ  ｓ  １）、レンズマメ（Ｌｅｎ  ｃ  １、Ｌｅｎ  ｃ  ２、Ｌｅｎ  ｃ  ３）、ライチ（Ｌｉｔ  ｃ  １）、ホソバアオバナルーピン（ｎａｒｒｏｗ−ｌｅａｖｅｄ  ｂｌｕｅ  ｌｕｐｉｎ）（Ｌｕｐ  ａｎ
１）、リンゴ（Ｍａｌ  ｄ  １、Ｍａｌ  ｄ  ２、Ｍａｌ  ｄ  ３、Ｍａｌ  ｄ  ４）、キャッサバ（Ｍａｎ  ｅ  ５）、クワ（Ｍｏｒ  ｎ  ３）、アボカド（Ｐｅｒｓ  ａ  １）、サヤインゲン（Ｐｈａ  ｖ  ３）、ピスタチオ（Ｐｉｓ  ｖ  １、Ｐｉｓ  ｖ  ２、Ｐｉｓ  ｖ  ３、Ｐｉｓ  ｖ  ４、Ｐｉｓ  ｖ  ５）、エンドウ（Ｐｉｓ  ｓ  １、Ｐｉｓ  ｓ  ２）、アプリコット（Ｐｒｕ  ａｒ  １、Ｐｒｕ  ａｒ  ３）、オウトウ（Ｐｒｕ  ａｖ  １、Ｐｒｕ  ａｖ  ２、Ｐｒｕ  ａｖ  ３、Ｐｒｕ  ａｖ  ４）、セイヨウスモモ（Ｐｒｕ  ｄ  ３）、アーモンド（Ｐｒｕ  ｄｕ  ３、Ｐｒｕ  ｄｕ  ４、Ｐｒｕ
ｄｕ  ５、Ｐｒｕ  ｄｕ  ６）、モモ（Ｐｒｕ  ｐ  １、Ｐｒｕ  ｐ  ２、Ｐｒｕ  ｐ
３、Ｐｒｕ  ｐ  ４、Ｐｒｕ  ｐ  ７）、ザクロ（Ｐｕｎ  ｇ  １）、ナシ（Ｐｙｒ  ｃ  １、Ｐｙｒ  ｃ  ３、Ｐｙｒ  ｃ  ４、Ｐｙｒ  ｃ  ５）、トウゴマ（Ｒｉｃ  ｃ  １）、赤ラズベリー（Ｒｕｂ  ｉ  １、Ｒｕｂ  ｉ  ３）、ゴマ（Ｓｅｓ  ｉ  １、Ｓｅｓ  ｉ  ２、Ｓｅｓ  ｉ  ３、Ｓｅｓ  ｉ  ４、Ｓｅｓ  ｉ  ５、Ｓｅｓ  ｉ  ６、Ｓｅｓ  ｉ  ７）、イエローマスタード（Ｓｉｎ  ａ  １、Ｓｉｎ  ａ  ２、Ｓｉｎ  ａ  ３、Ｓｉｎ  ａ  ４）、トマト（Ｓｏｌａ  Ｉ  １、Ｓｏｌａ  Ｉ  ２、Ｓｏｌａ  Ｉ  ３、Ｓｏｌａ  Ｉ  ４）、ジャガイモ（Ｓｏｌａ  ｔ  １、Ｓｏｌａ  ｔ  ２、Ｓｏｌａ  ｔ  ３、Ｓｏｌａ  ｔ  ４）、緑豆（Ｖｉｇ  ｒ  １、Ｖｉｇ  ｒ  ２、Ｖｉｇ  ｒ  ３、Ｖｉｇ  ｒ  ４、Ｖｉｇ  ｒ  ５、Ｖｉｇ  ｒ  ６）、ブドウ（Ｖｉｔ  ｖ  １）、ナツメ（Ｚｉｚ  ｍ  １）、アナカルディウム・オクシデンタル（Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅ）（Ａｎａ  ｏ  １．０１０１、Ａｎａ  ｏ  １．０１０２）、アピウム・グラヴェオレンス（Ａｐｉｕｍ  ｇｒａｖｅｏｌｅｎｓ）（Ａｐｉ  ｇ  １．０１０１、Ａｐｉ  ｇ  １．０２０１）、ダウカス・カロタ（Ｄａｕｃｕｓ  ｃａｒｏｔａ）（Ｄａｕ  ｃ１．０１０１、Ｄａｕ  ｃ１．０１０２、Ｄａｕ  ｃ１．０１０３、Ｄａｕ  ｃ１．０１０４、Ｄａｕ  ｃ１．０１０５、Ｄａｕ  ｃ１．０２０１）、シトラス・シネンシス（Ｃｉｔｒｕｓ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）（Ｃｉｔ  ｓ３．０１０１、Ｃｉｔ  ｓ３．０１０２）、グリシン・マックス（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）（Ｇｌｙ  ｍ１．０１０１、Ｇｌｙ  ｍ１．０１０２、Ｇｌｙ  ｍ３．０１０１、Ｇｌｙ  ｍ３．０１０２）、レンズ・クリナリス（Ｌｅｎｓ  ｃｕｌｉｎａｒｉｓ）（Ｌｅｎ  ｃ１．０１０１、Ｌｅｎ  ｃ１．０１０２、Ｌｅｎ  ｃ１．０１０３）、ピサム・サティバム（Ｐｉｓｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ）（Ｐｉｓ  ｓ１．０１０１、Ｐｉｓ  ｓ１．０１０２）、リコペルシコン・サティバム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｓａｔｉｖｕｍ）（Ｌｙｃ  ｅ２．０１０１、Ｌｙｃ  ｅ２．０１０２）、フラグリア・アナナッサ（Ｆｒａｇａｒｉａ  ａｎａｎａｓｓａ）（Ｆｒａ  ａ３．０１０１、Ｆｒａ  ａ３．０１０２、Ｆｒａ  ａ３．０２０１、Ｆｒａ  ａ３．０２０２、Ｆｒａ  ａ３．０２０３、Ｆｒａ  ａ３．０２０４、Ｆｒａ  ａ３．０３０１）、マルス・ドメスティカ（Ｍａｌｕｓ  ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）（Ｍａｌ  ｄ１．０１０１、Ｍａｌ  ｄ１．０１０２、Ｍａｌ  ｄ１．０１０３、Ｍａｌ  ｄ１．０１０４、Ｍａｌ  ｄ１．０１０５、Ｍａｌ  ｄ１．０１０６、Ｍａｌ  ｄ１．０１０７、Ｍａｌ  ｄ１．０１０８、Ｍａｌ  ｄ１．０１０９、Ｍａｌ  ｄ１．０２０１、Ｍａｌ  ｄ１．０２０２、Ｍａｌ  ｄ１．０２０３、Ｍａｌ  ｄ１．０２０４、Ｍａｌ  ｄ１．０２０５、Ｍａｌ  ｄ１．０２０６、Ｍａｌ  ｄ１．０２０７、Ｍａｌ  ｄ１．０２０８、Ｍａｌ  ｄ１．０３０１、Ｍａｌ  ｄ１．０３０２、Ｍａｌ  ｄ１．０３０３、Ｍａｌ  ｄ１．０３０４、Ｍａｌ  ｄ１．０４０１、Ｍａｌ  ｄ１．０４０２、Ｍａｌ  ｄ１．０４０３、Ｍａｌ  ｄ３．０１０１ｗ、Ｍａｌ  ｄ３．０１０２ｗ、Ｍａｌ  ｄ３．０２０１ｗ、Ｍａｌ  ｄ３．０２０２ｗ、Ｍａｌ  ｄ３．０２０３ｗ、Ｍａｌ  ｄ４．０１０１、Ｍａｌ  ｄ４．０１０２��Ｍａｌ  ｄ４．０２０１、Ｍａｌ  ｄ４．０２０２、Ｍａｌ  ｄ４．０３０１、Ｍａｌ  ｄ４．０３０２）、プリムス・アビウム（Ｐｒｉｍｕｓ  ａｖｉｕｍ）（Ｐｒｕ  ａｖ１．０１０１、Ｐｒｕ  ａｖ１．０２０１、Ｐｒｕ  ａｖ１．０２０２、Ｐｒｕ  ａｖ１．０２０３）、及びプルヌス・ペルシカ（Ｐｒｕｎｕｓ
ｐｅｒｓｉｃａ）（Ｐｒｕ  ｐ４．０１０１、Ｐｒｕ  ｐ４．０２０１）；ならびにそれらの任意のバリアントが含まれる。食品に関連するアレルゲンの名前は、組織的に命名され、ＩＵＩＳアレルゲン命名分科委員会（ａｌｌｅｒｇｅｎ  ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ｓｕｂｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）によってリスト化されている（国際免疫学会連合（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｉｅｓ）アレルゲン命名分科委員会、イソアレルゲン及びバリアントのリスト参照）。
【００４９】
食物アレルゲンに加えて、本発明のシグナル生成ポリヌクレオチドは、大気中の粒状物／アレルゲン及び他の環境アレルゲンを検出しうる。アレルゲンを含有する試料は、植物（例えば、雑草、草、木、花粉）、動物（例えば、ネコ、イヌ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、ウサギ、ラット、モルモット、マウス、及びアレチネズミなどの哺乳動物のフケ、尿、唾液、血液又は他の体液にみられるアレルゲン）、真菌／カビ、昆虫（例えば、刺咬昆虫、ミツバチ、アシナガバチ、スズメバチ及びユスリカ（ｃｈｉｒｎｏｍｉｄａｅ）（非ヌカカ）など、ならびに他の昆虫、イエバエ、ミバエ、羊クロバエ、ネジワームフライ、穀物ゾウムシ、カイコ、ミツバチ、非ヌカカ幼虫、ハチミツガ幼虫、ゴミムシダマシ、ゴキブリ及びチャイロコメノゴミムシダマシ（Ｔｅｎｉｂｒｉｏ  ｍｏｌｉｔｏｒ  ｂｅｅｔｌｅ）の幼虫など；クモ及びダニ、ハウスダストダニなど）、ゴム（例えば、ラテックス）、金属、化学物質（例えば、薬物、タンパク質洗浄添加剤）、ならびに自己アレルゲン及びヒト自己アレルゲン（例えば、Ｈｏｍ  ｓ  １、Ｈｏｍ  ｓ  ２、Ｈｏｍ  ｓ  ３、Ｈｏｍ  ｓ  ４、Ｈｏｍ  ｓ  ５）（アレルゲン命名法：国際免疫学会連合アレルゲン命名分科委員会、アレルゲンのリスト、ならびにアレルゲン命名法：国際免疫学会連合アレルゲン命名分科委員会、イソアレルゲン及びバリアントのリスト参照）から得られうる。
【００５０】
本発明の組成物を使用して検出することができる植物由来のアレルゲン性タンパク質の例としては、限定されないが、灰（Ｆｒａ  ｅ  １）、ヒノキ（Ｃｈａ  ｏ１、Ｃｈａ  ｏ  ２）、スギ（Ｃｒｙ  ｊ１、Ｃｒｙ  ｊ  ２）、イトスギ（Ｃｕｐ  ａ  １）、セイヨウヒノキ（Ｃｕｐ  ｓ  １、Ｃｕｐ  ｓ  ３）、ヤマスギ（Ｊｕｎ  ａ  １、Ｊｕｎ  ａ  ２、Ｊｕｎ  ａ  ３、Ｊｕｎ  ｓ  １）、ケードネズ（Ｊｕｎ  ｏ  ４）、エンピツビャクシン（ｅａｓｔｅｒｎ  ｒｅｄ  ｃｅｄａｒ）（Ｊｕｎ  ｖ  １、Ｊｕｎ  ｖ  ３）、ハルガヤ（ｓｗｅｅｔ  ｖｅｒｎａｌ  ｇｒａｓｓ）（Ａｎｔ  ｏ  １）、サフロン（ｓａｆｆｒｏｎ  ｃｒｏｃｕｓ）（Ｃｒｏ  ｓ  １、Ｃｒｏ  ｓ  ２）、ギョウギシバ（Ｂｅｒｍｕｄａ  ｇｒａｓｓ）（Ｃｙｎ  ｄ  １、Ｃｙｎ  ｄ  ７、Ｃｙｎ  ｄ  １２、Ｃｙｎ  ｄ  １５、Ｃｙｎ  ｄ  ２２ｗ、Ｃｙｎ  ｄ  ２３、Ｃｙｎ  ｄ  ２４）、カモガヤ（ｏｒｃｈａｒｄ  ｇｒａｓｓ）（Ｄａｃ  ｇ  １、Ｄａｃ  ｇ  ２、Ｄａｃ  ｇ
３、Ｄａｃ  ｇ  ４、Ｄａｃ  ｇ  ５）、ヒロハノウシノケグサ（ｍｅａｄｏｗ  ｆｅｓｃｕｅ）（Ｆｅｓ  ｐ  ４）、シラゲガヤ（ｖｅｌｖｅｔ  ｇｒａｓｓ）（Ｈｏｌ  Ｉ
１、Ｈｏｌ  Ｉ  ５）、大麦（Ｈｏｒ  ｖ  １、Ｈｏｒ  ｖ  ５）、ドクムギ（ｒｙｅ
ｇｒａｓｓ）（Ｌｏｌ  ｐ  １、Ｌｏｌ  ｐ  ２、Ｌｏｌ  ｐ  ３、Ｌｏｌ  ｐ  ４、Ｌｏｌ  ｐ  １１）、バヒアグラス（ｂａｈｉａ  ｇｒａｓｓ）（Ｐａｓ  ｎ  １）、カナリークサヨシ（ｃａｎａｒｙ  ｇｒａｓｓ）（Ｐｈａ  ａ  １、Ｐｈａ  ａ  ５）、オオアワガエリ（ｔｉｍｏｔｈｙ）（Ｐｈｌ  ｐ  １、Ｐｈｌ  ｐ  ２、Ｐｈｌ  ｐ  ４、Ｐｈｌ  ｐ  ５、Ｐｈｌ  ｐ  ６、Ｐｈｌ  ｐ  ７、Ｐｈｌ  ｐ  １１、Ｐｈｌ  ｐ  １２、Ｐｈｌ  ｐ  １３）、ナツメヤシ（ｄａｔｅ  ｐａｌｍ）（Ｐｈｏ  ｄ  ２）、ナガハグサ（Ｋｅｎｔｕｃｋｙ  ｂｌｕｅ  ｇｒａｓｓ）（Ｐｏａ  ｐ  １、Ｐｏａ  ｐ  ５）、ライ麦（Ｓｅｃ  ｃ  １、Ｓｅｃ  ｃ  ５、Ｓｅｃ  ｃ  ３８）、セイバンモロコシ（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｇｒａｓｓ）（Ｓｏｒ  ｈ  １）、小麦（Ｔｒｉ  ａ  １５、Ｔｒｉ
ａ  ２１、Ｔｒｉ  ａ  ２７、Ｔｒｉ  ａ  ２８、Ｔｒｉ  ａ  ２９、Ｔｒｉ  ａ  ３０、Ｔｒｉ  ａ  ３１、Ｔｒｉ  ａ  ３２、Ｔｒｉ  ａ  ３３、Ｔｒｉ  ａ  ３４、Ｔｒｉ  ａ  ３５、Ｔｒｉ  ａ  ３９）、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍ  １、Ｚｅａ  ｍ  １２）、ハンノキ（Ａｌｎ  ｇ  １、Ａｌｎ  ｇ  ４）、アオゲイトウ（ｒｅｄｒｏｏｔ  ｐｉｇｗｅｅｄ）（Ａｍａ  ｒ  ２）、ブタクサ（ｓｈｏｒｔ  ｒａｇｗｅｅｄ）（Ａｍｂ
ａ  １、Ａｍｂ  ａ  ２、Ａｍｂ  ａ  ３、Ａｍｂ  ａ  ４、Ａｍｂ  ａ  ５、Ａｍｂ
ａ  ６、Ａｍｂ  ａ  ７、Ａｍｂ  ａ  ８、Ａｍｂ  ａ  ９、Ａｍｂ  ａ  １０、Ａｍｂ  ａ  １１）、ブタクサモドキ（ｗｅｓｔｅｒｎ  ｒａｇｗｅｅｄ）（Ａｍｂ  ｐ  ５）、オオブタクサ（ｇｉａｎｔ  ｒａｇｗｅｅｄ）（Ａｍｂ  ｔ  ５）、ヨモギ（Ａｒｔ
ｖ  １、Ａｒｔ  ｖ  ２、Ａｒｔ  ｖ  ３、Ａｒｔ  ｖ  ４、Ａｒｔ  ｖ  ５、Ａｒｔ
ｖ  ６）、テンサイ（Ｂｅｔａ  ｖ  １、ｂｅｔａ  ｖ  ２）、ヨーロッパシラカバ（Ｂｅｔ  ｖ  １、Ｂｅｔ  ｖ  ２、Ｂｅｔ  ｖ  ３、Ｂｅｔ  ｖ  ４、Ｂｅｔ  ｖ  ６、Ｂｅｔ  ｖ  ７）、カブ（Ｂｒａ  ｒ  ５）、シデ（Ｃａｒ  ｂ  １）、クリ（Ｃａｓ  ｓ  １）、ツルニチニチソウ（ｒｏｓｙ  ｐｅｒｉｗｉｎｋｌｅ）（Ｃａｔ  ｒ  １）、アカザ（ｌａｍｂ’ｓ−ｑｕａｒｔｅｒｓ、ｐｉｇｗｅｅｄ）（Ｃｈｅ  ａ  １、Ｃｈｅ
ａ  ２、Ｃｈｅ  ａ  ３）、アラビアコーヒー（Ｃｏｆ  ａ  １、Ｃｏｆ  ａ  ２、Ｃｏｆ  ａ  ３）、ハシバミ（Ｃｏｒ  ａ  ６、Ｃｏｒ  ａ  １０）、ヘーゼルナッツ（Ｃｏｒ  ａ１．０４、Ｃｏｒ  ａ２、Ｃｏｒ  ａ８）、ヨーロッパブナ（Ｆａｇ  ｓ  １）、灰（Ｆｒａ  ｅ  １）、ヒマワリ（Ｈｅｌ  ａ  １、Ｈｅｌ  ａ  ２）、パラゴムノキ（Ｈｅｖ  ｂ  １、Ｈｅｖ  ｂ  ２、Ｈｅｖ  ｂ  ３、Ｈｅｖ  ｂ  ４、Ｈｅｖ  ｂ  ５、Ｈｅｖ  ｂ  ６、Ｈｅｖ  ｂ  ７、Ｈｅｖ  ｂ  ８、Ｈｅｖ  ｂ  ９、Ｈｅｖ  ｂ  １０、Ｈｅｖ  ｂ  １１、Ｈｅｖ  ｂ  １２、Ｈｅｖ  ｂ  １３、Ｈｅｖ  ｂ  １４）、金葎（Ｈｕｍ  ｊ  １）、イボタ（Ｌｉｇ  ｖ  １）、メルクリアリス・アヌア（Ｍｅｒｃｕｒｉａｌｉｓ  ａｎｎｕａ）（Ｍｅｒ  ａ  １）、オリーブ（Ｏｌｅ  ｅ  １、Ｏｌｅ
ｅ  ２、Ｏｌｅ  ｅ  ３、Ｏｌｅ  ｅ  ４、Ｏｌｅ  ｅ  ５、Ｏｌｅ  ｅ  ６、Ｏｌｅ
ｅ  ７、Ｏｌｅ  ｅ  ８、Ｏｌｅ  ｅ  ９、Ｏｌｅ  ｅ  １０、Ｏｌｅ  ｅ  １１）、ヨーロッパホップホーンビーン（Ｏｓｔ  ｃ  １）、パリエタリア・ジュダイカ（Ｐａｒｉｅｔａｒｉａ  ｊｕｄａｉｃａ）（Ｐａｒ  ｊ  １、Ｐａｒ  ｊ  ２、Ｐａｒ  ｊ  ３、Ｐａｒ  ｊ  ４）、パリエタリア・オフィシナリス（Ｐａｒｉｅｔａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）（Ｐａｒ  ｏ  １）、プランタゴ・ランセオラタ（Ｐｌａｎｔａｇｏ  ｌａｎｃｅｏｌａｔａ）（Ｐａｌ  Ｉ  １）、ロンドン・プレイン・ツリー（Ｐｌａ  ａ
１、Ｐｌａ  ａ  ２、Ｐｌａ  ａ  ３）、プラタナス・オリエンタリス（Ｐｌａｔａｎｕｓ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）（Ｐｌａ  ｏｒ  １、Ｐｌａ  ｏｒ  ２、Ｐｌａ  ｏｒ  ３）、ホワイトオーク（Ｑｕｅ  ａ  １）、ロシアアザミ（Ｒｕｓｓｉａｎ  ｔｈｉｓｔｌｅ）（Ｓａｌ  ｋ  １、Ｓａｌ  ｋ  ２、Ｓａｌ  ｋ  ３、Ｓａｌ  ｋ  ４、Ｓａｌ  ｋ  ５）、トマト（Ｓｏｌａ  Ｉ  ５）、ライラック（Ｓｙｒ  ｖ  １、Ｓｙｒ  ｖ  ５）、ロシアアザミ（Ｒｕｓｓｉａｎ−ｔｈｉｓｔｌｅ）（Ｓａｌ  ｋ  １）、イギリスオオバコ（Ｐｌａ  ｌ１）、アムブロシア・アルテミシフォリア（Ａｍｂｒｏｓｉａ  ａｒｔｅｍｉｓｉｉｆｏｌｉａ）（Ａｍｂ  ａ８．０１０１、Ａｍｂ  ａ８．０１０２、Ａｍｂ  ａ９．０１０１、Ａｍｂ  ａ９．０１０２）、プランタゴ・ランセオラタ（Ｐｌａｎｔａｇｏ  ｌａｎｃｅｏｌａｔａ）（Ｐｌａ  １１．０１０１、Ｐｌａ  １１．０１０２、Ｐｌａ  １１．０１０３）、パリエタリア・ジュダイカ（Ｐａｒｉｅｔａｒｉａ  ｊｕｄａｉｃａ）（Ｐａｒ  ｊ  ３．０１０２）、シノドン・ダクチロン（Ｃｙｎｏｄｏｎ  ｄａｃｔｙｌｏｎ）（Ｃｙｎ  ｄ１．０１０１、Ｃｙｎ  ｄ１．０１０２、Ｃｙｎ  ｄ１．０１０３、Ｃｙｎ  ｄ１．０１０４、Ｃｙｎ  ｄ１．０１０５、Ｃｙｎ  ｄ１．０１０６、Ｃｙｎ  ｄ１．０１０７、Ｃｙｎ  ｄ１．０２０１、Ｃｙｎ  ｄ１．０２０２、Ｃｙｎ  ｄ１．０２０３、Ｃｙｎ  ｄ１．０２０４）、ホルクス・ラナツス（Ｈｏｌｃｕｓ  ｌａｎａｔｕｓ）（Ｈｏｌ  Ｉ１．０１０１、Ｈｏｌ  Ｉ１．０１０２）、ロリウム・ペレネ（Ｌｏｌｉｕｍ  ｐｅｒｅｎｎｅ）（Ｐｈｌ  ｐ１．０１０１、Ｐｈｌ  ｐ１．０１０２、Ｐｈｌ  ｐ４．０１０１、Ｐｈｌ  ｐ４．０２０１、Ｐｈｌ  ｐ５．０１０１、Ｐｈｌ  ｐ５．０１０２、Ｐｈｌ  ｐ５．０１０３、Ｐｈｌ  ｐ５．０１０４、Ｐｈｌ  ｐ５．０１０５、Ｐｈｌ  ｐ５．０１０６、Ｐｈｌ  ｐ５．０１０７、Ｐｈｌ  ｐ５．０１０８、Ｐｈｌ  ｐ５．０２０１、Ｐｈｌ  ｐ５．０２０２）、セカレ・セレアル（Ｓｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ）（Ｓｅｃ  ｃ２０．０１０１、Ｓｅｃ  ｃ２０．０２０１）、ベツラ・ベルコサ（Ｂｅｔｕｌａ  Ｖｅｒｒｕｃｏｓａ）（Ｂｅｔ  ｖ１．０１０１、Ｂｅｔ  ｖ１．０１０２、Ｂｅｔ  ｖ１．０１０３、Ｂｅｔ  ｖ１．０２０１、Ｂｅｔ  ｖ１．０３０１、Ｂｅｔ  ｖ１．０４０１、Ｂｅｔ  ｖ１．０４０２、Ｂｅｔ  ｖ１．０５０１、Ｂｅｔ  ｖ１．０６０１、Ｂｅｔ  ｖ１．０６０２、Ｂｅｔ  ｖ１．０７０１、Ｂｅｔ  ｖ１．０８０１、Ｂｅｔ  ｖ１．０９０１、Ｂｅｔ  ｖ１．１００１、Ｂｅｔ  ｖ１．１１０１、Ｂｅｔ  ｖ１．１２０１、Ｂｅｔ  ｖ１．１３０１、Ｂｅｔ  ｖ１．１４０１、Ｂｅｔ  ｖ１．１４０２、Ｂｅｔ  ｖ１．１５０１、Ｂｅｔ  ｖ１．１５０２、Ｂｅｔ  ｖ１．１６０１、Ｂｅｔ  ｖ１．１７０１、Ｂｅｔ  ｖ１．１８０１、Ｂｅｔ  ｖ１．１９０１、Ｂｅｔ  ｖ１．２００１、Ｂｅｔ  ｖ１．２１０１、Ｂｅｔ  ｖ１．２２０１、Ｂｅｔ  ｖ１．２３０１、Ｂｅｔ  ｖ１．２４０１、Ｂｅｔ  ｖ１．２５０１、Ｂｅｔ  ｖ１．２６０１、Ｂｅｔ  ｖ１．２７０１、Ｂｅｔ  ｖ１．２８０１、Ｂｅｔ  ｖ１．２９０１、Ｂｅｔ  ｖ１．３００１、Ｂｅｔ  ｖ１．３１０１、Ｂｅｔ  ｖ６．０１０１、Ｂｅｔ  ｖ６．０１０２）、カルピナス・ベツルス（Ｃａｒｐｉｎｕｓ  ｂｅｔｕｌｕｓ）（Ｃａｒ  ｂ１．０１０１、Ｃａｒ  ｂ１．０１０２、Ｃａｒ  ｂ１．０１０３、Ｃａｒ  ｂ１．０１０４、Ｃａｒ  ｂ１．０１０５、Ｃａｒ  ｂ１．０１０６、Ｃａｒ
ｂ１．０１０６、Ｃａｒ  ｂ１．０１０６、Ｃａｒ  ｂ１．０１０６、Ｃａｒ  ｂ１．０１０７、Ｃａｒ  ｂ１．０１０７、Ｃａｒ  ｂ１．０１０８、Ｃａｒ  ｂ１．０２０１、Ｃａｒ  ｂ１．０３０１、Ｃａｒ  ｂ１．０３０２）、コリルス・アベラナ（Ｃｏｒｙｌｕｓ  ａｖｅｌｌａｎａ）（Ｃｏｒ  ａ１．０１０１、Ｃｏｒ  ａ１．０１０２、Ｃｏｒ  ａ１．０１０３、Ｃｏｒ  ａ１．０１０４、Ｃｏｒ  ａ１．０２０１、Ｃｏｒ  ａ１．０３０１、Ｃｏｒ  ａ１．０４０１、Ｃｏｒ  ａ１．０４０２、Ｃｏｒ  ａ１．０４０３、Ｃｏｒ  ａ１．０４０４）、リグストルム・ブルガレ（Ｌｉｇｕｓｔｒｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）（Ｓｙｒ  ｖ１．０１０１、Ｓｙｒ  ｖ１．０１０２、Ｓｙｒ  ｖ１．０１０３）、クリプトメリア・ジャポニカ（Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）（Ｃｒｙ  ｊ２．０１０１、Ｃｒｙ  ｊ２．０１０２）、及びキュプレッサス・セムパービレンス（Ｃｕｐｒｅｓｓｕｓ  ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ）（Ｃｕｐ  ｓ１．０１０１、Ｃｕｐ  ｓ１．０１０２、Ｃｕｐ  ｓ１．０１０３、Ｃｕｐ  ｓ１．０１０４、Ｃｕｐ  ｓ１．０１０５）；ならびにそれらの任意のバリアントが含まれる。
【００５１】
ルーピンは、ルピナス属（ｇｅｎｕｓ  Ｌｕｐｉｎｕｓ）に属するマメ科の草本植物である。ヨーロッパでは、ルーピンの粉及び種子は、パン、クッキー、ペストリー、パスタ、ソースにおいて、乳又は大豆の代用として飲料において、及びグルテンフリー食品において、広く使用されている。国際免疫学会連合（ＩＵＩＳ）アレルゲン命名分科委員会は、最近、β−コングルチンをＬｕｐ  ａｎ  １アレルゲンと指定した（ナダルら（Ｎａｄａｌ，ｅｔ  ａｌ．）、（２０１２）、Ｌｕｐ  ａｎ  １食物アレルゲンに対するＤＮＡアプタマー（ＤＮＡ  Ａｐｔａｍｅｒｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｔｈｅ  Ｌｕｐ  ａｎ  １  Ｆｏｏｄ  Ａｌｌｅｒｇｅｎ）、ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ７（４）：ｅ３５２５３）。より最近では、Ｌｕｐ  ａｎ  １（β−コングルチン）に対する高親和性１１マーＤＮＡアプタマーが報告された（ナダルら（Ｎａｄａｌ，ｅｔ  ａｌ．）、（２０１３）、Ｌｕｐ  ａｎ  １（β−コングルチン）に対する高親和性１１マーＤＮＡアプタマーのプロービング（Ｐｒｏｂｉｎｇ  ｈｉｇｈａｆｆｉｎｉｔｙ  １１−ｍｅｒ  ＤＮＡ  ａｐｔａｍｅｒ
ａｇａｉｎｓｔ  Ｌｕｐ  ａｎ  １  （β−ｃｏｎｇｌｕｔｉｎ））、Ａｎａｌ．  Ｂｉｏａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．４０５：９３４３−９３４９）。
【００５２】
本発明の組成物を使用して検出することができるダニ由来のアレルゲン性タンパク質の例としては、限定されないが、ダニ（Ｂｌｏ  ｔ  １、Ｂｌｏ  ｔ  ３、Ｂｌｏ  ｔ  ４、Ｂｌｏ  ｔ  ５、Ｂｌｏ  ｔ  ６、Ｂｌｏ  ｔ  １０、Ｂｌｏ  ｔ  １１、Ｂｌｏ  ｔ
１２、Ｂｌｏ  ｔ  １３、Ｂｌｏ  ｔ  １９、Ｂｌｏｔ  ｔ  ２１）；アメリカハウスダストダニ（Ｄｅｒ  ｆ  １、Ｄｅｒ  ｆ  ２、Ｄｅｒ  ｆ  ３、Ｄｅｒ  ｆ  ７、Ｄｅｒ  ｆ  １０、Ｄｅｒ  ｆ  １１、Ｄｅｒ  ｆ  １３、Ｄｅｒ  ｆ  １４、Ｄｅｒ  ｆ  １５、Ｄｅｒ  ｆ  １６、Ｄｅｒ  ｆ  １７、Ｄｅｒ  ｆ  １８、Ｄｅｒ  ｆ  ２２、Ｄｅｒ  ｆ  ２４）；デルマトファゴイデス・ミクロセラス（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ  ｍｉｃｒｏｃｅｒａｓ）（ハウスダストダニ）（Ｄｅｒ  ｍ  １）；ヨーロッパハウスダストダニ（Ｄｅｒ  ｐ  １、Ｄｅｒ  ｐ  ２、Ｄｅｒ  ｐ  ３、Ｄｅｒ  ｐ  ４、Ｄｅｒ  ｐ  ５、Ｄｅｒ  ｐ  ６、Ｄｅｒ  ｐ  ７、Ｄｅｒ  ｐ  ８、Ｄｅｒ  ｐ  ９、Ｄｅｒ  ｐ  １０、Ｄｅｒ  ｐ  １１、Ｄｅｒ  ｐ  １４、Ｄｅｒ  ｐ  １５、Ｄｅｒ
ｐ  ２０、Ｄｅｒ  ｐ  ２１、Ｄｅｒ  ｐ  ２３）；ユーログリファス・マイネイ（Ｅｕｒｏｇｌｙｐｈｕｓ  ｍａｙｎｅｉ）（ハウスダストダニ）（Ｅｕｒ  ｍ  ２、Ｅｕｒ
ｍ  ２、Ｅｕｒ  ｍ  ３、Ｅｕｒ  ｍ  ４、Ｅｕｒ  ｍ  １４）；貯蔵庫ダニ（Ａｃａ
ｓ  １３、Ｇｌｙ  ｄ  ２、Ｌｅｐ  ｄ  ２、Ｌｅｐ  ｄ  ５、Ｌｅｐ  ｄ  ７、Ｌｅｐ  ｄ  １０、Ｌｅｐ  ｄ  １３、Ｔｙｒ  ｐ  ２、Ｔｙｒ  ｐ  ３、Ｔｙｒ  ｐ  １０、Ｔｙｒ  ｐ  １３、Ｔｙｒ  ｐ  ２４）、デルマトファゴイデス・ファリナエ（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ  ｆａｒｉｎａｅ）（Ｄｅｒ  ｆ１．０１０１、Ｄｅｒ  ｆ１．０１０２、Ｄｅｒ  ｆ１．０１０３、Ｄｅｒ  ｆ１．０１０４、Ｄｅｒ  ｆ１．０１０５、Ｄｅｒ  ｆ２．０１０１、Ｄｅｒ  ｆ２．０１０２、Ｄｅｒ  ｆ２．０１０３、Ｄｅｒ  ｆ２．０１０４、Ｄｅｒ  ｆ２．０１０５、Ｄｅｒ  ｆ２．０１０６、Ｄｅｒ  ｆ２．０１０７、Ｄｅｒ  ｆ２．０１０８、Ｄｅｒ  ｆ２．０１０９、Ｄｅｒ  ｆ２．０１１０、Ｄｅｒ  ｆ２．０１１１、Ｄｅｒ  ｆ２．０１１２、Ｄｅｒ  ｆ２．０１１３、Ｄｅｒ  ｆ２．０１１４、Ｄｅｒ  ｆ２．０１１５、Ｄｅｒ  ｆ２．０１１６、Ｄｅｒ  ｆ２．０１１７）、デルマトファゴイデス・プテロニシヌス（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ  ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ）（Ｄｅｒ  ｐ１．０１０１、Ｄｅｒ  ｐ１．０１０２、Ｄｅｒ  ｐ１．０１０３、Ｄｅｒ  ｐ１．０１０４、Ｄｅｒ  ｐ１．０１０５、Ｄｅｒ  ｐ１．０１０６、Ｄｅｒ  ｐ１．０１０７、Ｄｅｒ  ｐ１．０１０８、Ｄｅｒ  ｐ１．０１０９、Ｄｅｒ  ｐ１．０１１０、Ｄｅｒ  ｐ１．０１１１、Ｄｅｒ  ｐ１．０１１２、Ｄｅｒ  ｐ１．０１１３、Ｄｅｒ  ｐ１．０１１４、Ｄｅｒ  ｐ１．０１１５、Ｄｅｒ  ｐ１．０１１６、Ｄｅｒ  ｐ１．０１１７、Ｄｅｒ  ｐ１．０１１８、Ｄｅｒ  ｐ１．０１１９、Ｄｅｒ  ｐ１．０１２０、Ｄｅｒ  ｐ１．０１２１、Ｄｅｒ  ｐ１．０１２２、Ｄｅｒ  ｐ１．０１２３、Ｄｅｒ  ｐ２．０１０１、Ｄｅｒ  ｐ２．０１０２、Ｄｅｒ  ｐ２．０１０３、Ｄｅｒ  ｐ２．０１０４、Ｄｅｒ  ｐ２．０１０５、Ｄｅｒ  ｐ２．０１０６、Ｄｅｒ  ｐ２．０１０７、Ｄｅｒ  ｐ２．０１０８、Ｄｅｒ  ｐ２．０１０９、Ｄｅｒ  ｐ２．０１１０、Ｄｅｒ  ｐ２．０１１１、Ｄｅｒ  ｐ２．０１１２、Ｄｅｒ  ｐ２．０１１３）、ユーログリファス・マイネイ（Ｅｕｒｏｇｌｙｐｈｕｓ  ｍａｙｎｅｉ）（Ｅｕｒ  ｍ２．０１０１、Ｅｕｒ  ｍ２．０１０２）、レピドグリファス・デストラクター（Ｌｅｐｉｄｏｇｌｙｐｈｕｓ  ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ）（Ｌｅｐ  ｄ２．０１０１、Ｌｅｐ  ｄ２．０１０１、Ｌｅｐ  ｄ２．０１０１、Ｌｅｐ  ｄ２．０１０２、Ｌｅｐ  ｄ２．０２０１、Ｌｅｐ  ｄ２．０２０）及びグリシファガス・ドメスティカス（Ｇｌｙｃｙｐｈａｇｕｓ  ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ）（Ｇｌｙ  ｄ２．０１０１、Ｇｌｙ  ｄ２．０２０１）；ならびにそれらの任意のバリアントが含まれる。
【００５３】
本発明の組成物を使用して検出することができる動物由来のアレルゲン性タンパク質の例としては、限定されないが、畜牛（Ｂｏｓ  ｄ  ２、Ｂｏｓ  ｄ  ３、Ｂｏｓ  ｄ  ４、Ｂｏｓ  ｄ  ５、Ｂｏｓ  ｄ  ６、Ｂｏｓ  ｄ  ７、Ｂｏｓ  ｄ  ８）、イヌ（Ｃａｎ
ｆ  １、Ｃａｎ  ｆ  ２、Ｃａｎ  ｆ  ３、Ｃａｎ  ｆ  ４、Ｃａｎ  ｆ  ５、Ｃａｎ
ｆ  ６）、畜馬（Ｅｑｕ  ｃ  １、Ｅｑｕ  ｃ  ２、Ｅｑｕ  ｃ  ３、Ｅｑｕ  ｃ  ４、Ｅｑｕ  ｃ  ５）、ネコ（Ｆｅｌ  ｄ  １、Ｆｅｌ  ｄ  ２、Ｆｅｌ  ｄ  ３、Ｆｅｌ
ｄ  ４、Ｆｅｌ  ｄ  ５ｗ、Ｆｅｌ  ｄ  ６ｗ、Ｆｅｌ  ｄ  ７、Ｆｅｌ  ｄ  ８）、マウス（Ｍｕｓ  ｍ  １）、モルモット（Ｃａｖ  ｐ  １、Ｃａｖ  ｐ  ２、Ｃａｖ  ｐ
３、Ｃａｖ  ｐ  ４、Ｃａｖ  ｐ  ６）、ウサギ（Ｏｒｙ  ｃ  １、Ｏｒｙ  ｃ  ３、Ｏｒｙ  ｃ  ４）ラット（Ｒａｔ  ｎ  １）、ボース・ドメスティカス（Ｂｏｓ  ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ）（Ｂｏｓ  ｄ  ２．０１０１、Ｂｏｓ  ｄ  ２．０１０２、Ｂｏｓ  ｄ
２．０１０３）及びエクゥウス・カバルス（Ｅｑｕｕｓ  ｃａｂａｌｌｕｓ）（Ｅｑｕ
ｃ２．０１０１、Ｅｑｕ  ｃ２．０１０２）；ならびにそれらの任意のバリアントが含まれる。
【００５４】
本発明の組成物を使用して検出することができる昆虫由来のアレルゲン性タンパク質の例としては、限定されないが、黄熱病カ（Ａｅｄ  ａ  １、Ａｅｄ  ａ  ２、Ａｅｄ  ａ
３）、東ハイブハチ（Ｅａｓｔｅｒｎ  ｈｉｖｅ  ｂｅｅ）（Ａｐｉ  ｃ  １）、オオミツバチ（Ａｐｉ  ｄ  １）、ミツバチ（Ａｐｉ  ｍ  １、Ａｐｉ  ｍ  ２、Ａｐｉ  ｍ
３、Ａｐｉ  ｍ  ４、Ａｐｉ  ｍ  ５、Ａｐｉ  ｍ  ６、Ａｐｉ  ｍ  ７、Ａｐｉ  ｍ
８、Ａｐｉ  ｍ  ９、Ａｐｉ  ｍ  １０、Ａｐｉ  ｍ  １１、Ａｐｉ  ｍ  １２）、鳩扁ダニ（Ａｒｇ  ｒ  １）、チャバネゴキブリ（Ｂｌａ  ｇ  １、Ｂｌａ  ｇ  ２、Ｂｌａ  ｇ  ３、Ｂｌａ  ｇ  ４、Ｂｌａ  ｇ  ５、Ｂｌａ  ｇ  ６、Ｂｌａ  ｇ  ７、Ｂｌａ  ｇ  ８、Ｂｌａ  ｇ  １１）、クマバチ（Ｂｏｍ  ｐ  １、Ｂｏｍ  ｐ  ４、Ｂｏｍ
ｔ  １、Ｂｏｍ  ｔ  ４）、カイコガ（Ｂｏｍｂ  ｍ  １）、ユスリカ（Ｃｈｉ  ｋ  １０、Ｃｈｉ  ｔ  １、Ｃｈｉ  ｔ  １．０１、Ｃｈｉ  ｔ  ２、Ｃｈｉ  ｔ  ２．０１０１、Ｃｈｉ  ｔ  ２．０１０２、Ｃｈｉ  ｔ  ３、Ｃｈｉ  ｔ  ４、Ｃｈｉ  ｔ  ５、Ｃｈｉ  ｔ  ６、Ｃｈｉ  ｔ  ６．０１、Ｃｈｉ  ｔ  ７、Ｃｈｉ  ｔ  ８、Ｃｈｉ  ｔ
９）、ネコノミ（Ｃｔｅ  ｆ  １、Ｃｔｅ  ｆ  ２、Ｃｔｅ  ｆ  ３）、キイロスズメバチ（Ｄｏｌ  ａ  ５）、北米産スズメバチ（Ｄｏｌ  ｍ  １、Ｄｏｌ  ｍ  ２、Ｄｏｌ
ｍ  ５）、ヌカカ（Ｆｏｒ  ｔ  １、Ｆｏｒ  ｔ  ２）、サバンナツェツェバエ（Ｇｌｏ  ｍ  ５）、アジアテントウムシ（Ｈａｒ  ａ  １、Ｈａｒ  ａ  ２）、シミ（Ｌｅｐ
ｓ  １）、チャタテムシ（Ｌｉｐ  ｂ  １）、ブルドッグアリキバハリアリ（Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ  ｊｕｍｐｅｒ  ａｎｔ）（Ｍｙｒ  ｐ  １、Ｍｙｒ  ｐ  ２、Ｍｙｒ  ｐ
３）、アメリカゴキブリ（Ｐｅｒ  ａ  １、Ｐｅｒ  ａ  ３、Ｐｅｒ  ａ  ６、Ｐｅｒ
ａ  ７、Ｐｅｒ  ａ  ９、Ｐｅｒ  ａ  １０）、ノシメマダラメイガ（Ｐｌｏ  ｉ  １、Ｐｌｏ  ｉ  ２）、アシナガバチ（Ｐｏｌ  ａ  １、Ｐｏｌ  ａ  ２、Ｐｏｌ  ａ  ５、Ｐｏｌ  ｅ  １、Ｐｏｌ  ｅ  ４、Ｐｏｌ  ｅ  ５、Ｐｏｌ  ｆ  ５、Ｐｏｌ  ｇ  １、Ｐｏｌ  ｇ  ５、Ｐｏｌ  ｍ  ５、Ｐｏｌｙ  ｐ  １、Ｐｏｌｙ  ｓ  ５、Ｖｅｓ  ｖｉ  ５）、地中海コアシナガバチ（Ｐｏｌ  ｄ  １、Ｐｏｌ  ｄ  ４、Ｐｏｌ  ｄ  ５）、熱帯ヒアリ（Ｓｏｌ  ｇ  ２、Ｓｏｌ  ｇ  ３、Ｓｏｌ  ｇ  ４）、ソレノプシス・インビクタ（Ｓｏｌｅｎｏｐｓｉｓ  ｉｎｖｉｃｔａ）（アカヒアリ）（Ｓｏｌ  Ｉ  １、Ｓｏｌ  Ｉ  ２、Ｓｏｌ  Ｉ  ３、Ｓｏｌ  Ｉ  ４）、クロヒアリ（Ｓｏｌ  ｒ  ２、Ｓｏｌ  ｒ  ３）、ブラジルヒアリ（Ｓｏｌ  ｓ  ２、Ｓｏｌ  ｓ  ３）、ウシアブ（Ｔａｂ  ｙ  １、Ｔａｂ  ｙ  ２、Ｔａｂ  ｙ  ５）、マツカレハ（ｐｉｎｅ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｏｎａｒｙ  ｍｏｔｈ）（Ｔｈａ  ｐ  １、Ｔｈａ  ｐ  ２）、オオサシガメ（Ｔｒｉａ  ｐ  １）、モンスズメバチ（Ｖｅｓｐ  ｃ  １、Ｖｅｓｐ  ｃ  ５）、ベスパ・マグニフィカ（Ｖｅｓｐａ  ｍａｇｎｉｆｉｃａ）（スズメバチ）（Ｖｅｓｐ  ｍａ  ２、Ｖｅｓｐ  ｍａ  ５）、ベスパ・マンダリニア（Ｖｅｓｐａ  ｍａｎｄａｒｉｎｉａ）（アジアオオスズメバチ（Ｇｉａｎｔ  ａｓｉａｎ  ｈｏｒｎｅｔ））（Ｖｅｓｐ  ｍ１、Ｖｅｓｐ  ｍ  ５）、イエロージャケット（Ｖｅｓ  ｆ  ５、Ｖｅｓ  ｇ  ５、Ｖｅｓ  ｍ  １、Ｖｅｓ  ｍ  ２、Ｖｅｓ  ｍ  ５）、ベスプラ・ゲルマニカ（Ｖｅｓｐｕｌａ  ｇｅｒｍａｎｉｃａ）（イエロージャケット）（Ｖｅｓ  ｐ  ５）、ベスプラ・スクアモサ（Ｖｅｓｐｕｌａ  ｓｑｕａｍｏｓａ）（イエロージャケット）（Ｖｅｓ  ｓ  １、Ｖｅ  ｓ  ｓ５）、ベスプラ・ブルガリス（Ｖｅｓｐｕｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）（イエロージャケット）（Ｖｅｓ  ｖ  １、Ｖｅｓ  ｖ  ２、Ｖｅｓ  ｖ  ３、Ｖｅｓ  ｖ  ４、Ｖｅｓ  ｖ  ５、Ｖｅｓ  ｖ  ６）、ブラテラ・ゲルマニカ（Ｂｌａｔｔｅｌｌａ  ｇｅｒｍａｎｉｃａ）（Ｂｌａ  ｇ  １．０１０１、Ｂｌａ  ｇ  １．０１０２、Ｂｌａ  ｇ
１．０１０３、Ｂｌａ  ｇ  １．０２、Ｂｌａ  ｇ  ６．０１０１、Ｂｌａ  ｇ  ６．０２０１、Ｂｌａ  ｇ  ６．０３０１）、ペリプラネタ・アメリカナ（Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ  Ａｍｅｒｉｃａｎａ）（Ｐｅｒ  ａ１．０１０１、Ｐｅｒ  ａ１．０１０２、Ｐｅｒ  ａ１．０１０３、Ｐｅｒ  ａ１．０１０４、Ｐｅｒ  ａ１．０２、Ｐｅｒ  ａ３．０１、Ｐｅｒ  ａ３．０２０１、Ｐｅｒ  ａ３．０２０２、Ｐｅｒ  ａ３．０２０３、Ｐｅｒ  ａ７．０１０１、Ｐｅｒ  ａ７．０１０２）、モンスズメバチ（Ｖｅｓｐａ  ｃｒａｂｏ）（Ｖｅｓ  ｐｃ  ５．０１０１、Ｖｅｓ  ｐｃ  ５．０１０１）、ベスパ・マンダリナ（Ｖｅｓｐａ  ｍａｎｄａｒｉｎａ）（Ｖｅｓｐ  ｍ  １．０１、Ｖｅｓｐ  ｍ  １．０２）；ならびにそれらの任意のバリアントが含まれる。
【００５５】
本発明のシグナル生成ポリヌクレオチド及びアッセイを使用して検出することができる真菌／カビ由来のアレルゲン性タンパク質の例としては、限定されないが、アルテルナリア・アルテルナータ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ａｌｔｅｒｎａｔａ）（アルテルナリア属腐朽菌（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｒｏｔ  ｆｕｎｇｕｓ））（Ａｌｔ  ａ  １、Ａｌｔ  ａ  ３、Ａｌｔ  ａ  ４、Ａｌｔ  ａ  ５、Ａｌｔ  ａ  ６、Ａｌｔ  ａ  ７、Ａｌｔ  ａ  ８、Ａｌｔ  ａ  １０、Ａｌｔ  ａ  １２、Ａｌｔ  ａ  １３）、アスペルギルス・フラバス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓ）（真菌（ｆｕｎｇｕｓ））（Ａｓｐ
ｆｌ  １３）、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）（真菌）（Ａｓｐ  ｆ  １、Ａｓｐ  ｆ  ２、Ａｓｐ  ｆ  ３、Ａｓｐ  ｆ  ４、Ａｓｐ  ｆ  ５、Ａｓｐ  ｆ  ６、Ａｓｐ  ｆ  ７、Ａｓｐ  ｆ  ８、Ａｓｐ  ｆ  ９、Ａｓｐ  ｆ  １０、Ａｓｐ  ｆ  １１、Ａｓｐ  ｆ  １２、Ａｓｐ  ｆ  １３、Ａｓｐ  ｆ  １５、Ａｓｐ  ｆ  １６、Ａｓｐ  ｆ  １７、Ａｓｐ  ｆ  １８、Ａｓｐ  ｆ  ２２、Ａｓｐ  ｆ  ２３、Ａｓｐ  ｆ  ２７、Ａｓｐ  ｆ  ２８、Ａｓｐ  ｆ  ２９、Ａｓｐ  ｆ  ３４）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）（Ａｓｐ  ｎ  １４、Ａｓｐ  ｎ  １８、Ａｓｐ  ｎ  ２５）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）（Ａｓｐ  ｏ  １３、Ａｓｐ  ｏ  ２１）、アスペルギルス・ベルシカラー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）（Ａｓｐ  ｖ  １３）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）（酵母）（Ｃａｎｄ  ａ  １、Ｃａｎｄ  ａ  ３）、カンジダ・ボイジニイ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｉｄｉｎｉｉ）（酵母）（Ｃａｎｄ  ｂ  ２）、クラドスポリウム・クラドスポリオイデス（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ）（Ｃｌａ  ｃ  ９、Ｃｌａ  ｃ  １４）、クラドスポリウム・ヘルバルム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｈｅｒｂａｒｕｍ）（Ｃｌａ  ｈ  ２、Ｃｌａ  ｈ  ５、Ｃｌａ  ｈ  ６、Ｃｌａ  ｈ  ７、Ｃｌａ  ｈ  ８、Ｃｌａ  ｈ  ９、Ｃｌａ  ｈ  １０、Ｃｌａ  ｈ  １２）、カルブラリア・ルナタ（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｌｕｎａｔａ）（同義語：コクリオ・ボルスルナトゥス（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ  ｌｕｎａｔｕｓ））（Ｃｕｒ  Ｉ  １、Ｃｕｒ  Ｉ  ２、Ｃｕｒ  Ｉ  ３、Ｃｕｒ  Ｉ  ４）、エピコッカム・パープラスセンス（Ｅｐｉｃｏｃｃｕｍ  ｐｕｒｐｕｒａｓｃｅｎｓ）（土壌菌）（Ｅｐｉ  ｐ  １）、フザリウム・クルモルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕｍ）（Ｎ．Ａ．）（Ｆｕｓ  ｃ  １、Ｆｕｓ  ｃ  ２）、フザリウム・プラリフェラタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｕｍ）（Ｆｕｓ  ｐ  ４）、ペニシリウム・ブレビコンパクツム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｂｒｅｖｉｃｏｍｐａｃｔｕｍ）（Ｐｅｎ  ｂ  １３、Ｐｅｎ  ｂ  ２６）、ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）（Ｐｅｎ  ｃｈ  １３、Ｐｅｎ  ｃｈ  １８、Ｐｅｎ  ｃｈ  ２０、Ｐｅｎ  ｃｈ  ３１、Ｐｅｎ  ｃｈ  ３３、Ｐｅｎ  ｃｈ  ３５）、ペニシリウム・シトリナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｉｔｒｉｎｕｍ）（Ｐｅｎ  ｃ  ３、Ｐｅｎ  ｃ  １３、Ｐｅｎ  ｃ  １９、Ｐｅｎ  ｃ  ２２、Ｐｅｎ  ｃ  ２４、Ｐｅｎ  ｃ  ３０、Ｐｅｎ  ｃ  ３２）、ペニシリウム・クルストサム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｒｕｓｔｏｓｕｍ）（Ｐｅｎ  ｃｒ  ２６）、ペニシリウム・オキサリカム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｏｘａｌｉｃｕｍ）（Ｐｅｎ  ｏ  １８）、スタキボトリス・チャータラム（Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ  ｃｈａｒｔａｒｕｍ）（Ｓｔａ  ｃ  ３）、トリコフィトン・ルブルム（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｒｕｂｒｕｍ）（Ｔｒｉ  ｒ  ２、Ｔｒｉ  ｒ  ４）、トリコフィトン・トンズランス（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｔｏｎｓｕｒａｎｓ）（Ｔｒｉ  ｔ  １、Ｔｒｉ  ｔ  ４）、シロシベ・クベンシス（Ｐｓｉｌｏｃｙｂｅ  ｃｕｂｅｎｓｉｓ）（Ｐｓｉ  ｃ  １、Ｐｓｉ  ｃ  ２）、キクバナイグチ（Ｓｈａｇｇｙ  ｃａｐ）（Ｃｏｐ  ｃ
１、Ｃｏｐ  ｃ  ２、Ｃｏｐ  ｃ  ３、Ｃｏｐ  ｃ  ５、Ｃｏｐ  ｃ  ７）、ロドトルラ・ムシラギノーサ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ）（Ｒｈｏ  ｍ  １、Ｒｈｏ  ｍ  ２）、マラセジア・フルフール（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ  ｆｕｒｆｕｒ）（Ｍａｌａｆ２、Ｍａｌａｆ３、Ｍａｌａｆ４）、マラセチア・シンポジアリス（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ  ｓｙｍｐｏｄｉａｌｉｓ）（Ｍａｌａｓ１、Ｍａｌａｓ５、Ｍａｌａｓ６、Ｍａｌａｓ７、Ｍａｌａｓ８、Ｍａｌａｓ９、Ｍａｌａｓ１０、Ｍａｌａｓ１１、Ｍａｌａｓ１２、Ｍａｌａｓ１３）及びアルタナリア・アルタナータ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ａｌｔｅｒｎａｔｅ）（Ａｌｔ  ａ１．０１０１、Ａｌｔ  ａ１．０１０２）；ならびにそれらの任意のバリアントが含まれる。
【００５６】
さらなるアレルゲンの例としては、限定されないが、線虫（Ａｎｉ  ｓ  １、Ａｎｉ  ｓ  ２、Ａｎｉ  ｓ  ３、Ａｎｉ  ｓ  ４）、蠕虫（Ａｓｃ  ｓ  １）、軟体サンゴ（Ｄｅｎ  ｎ  １）、ゴム（ラテックス）（Ｈｅｖ  ｂ  １、Ｈｅｖ  ｂ  ２、Ｈｅｖ  ｂ  ３、Ｈｅｖ  ｂ  ５、Ｈｅｖ  ｂ  ６、Ｈｅｖ  ｂ  ７、Ｈｅｖ  ｂ  ８、Ｈｅｖ  ｂ  ９、Ｈｅｖ  ｂ  １０、Ｈｅｖ  ｂ  １１、Ｈｅｖ  ｂ  １２、Ｈｅｖ  ｂ  １３）、オベチェ（Ｔｒｉｐ  ｓ  １）及びパラゴムノキ（Ｈｅｖ  ｂ６．０１、Ｈｅｖ  ｂ６．０２０１、Ｈｅｖ  ｂ６．０２０２、Ｈｅｖ  ｂ６．０３、Ｈｅｖ  ｂ８．０１０１、Ｈｅｖ  ｂ８．０１０２、Ｈｅｖ  ｂ８．０２０１、Ｈｅｖ  ｂ８．０２０２、Ｈｅｖ  ｂ８．０２０３、Ｈｅｖ  ｂ８．０２０４、Ｈｅｖ  ｂ１０．０１０１、Ｈｅｖ  ｂ１０．０１０２、Ｈｅｖ  ｂ１０．０１０３、Ｈｅｖ  ｂ１１．０１０１、Ｈｅｖ  ｂ１１．０１０２）；ならびにそれらの任意のバリアントが含まれる。
【００５７】
一部の実施形態では、本発明のＳＰＮ及び組成物は、臨床の食物アレルギー又はアレルギー試験において、患者がアレルギーを有する食品／アレルゲンを識別するために病院で使用されてもよい。さらに、本発明のＳＰＮ及び組成物は、食物／環境アレルギーを有する人のための携帯テスターとして、例えば、家で市販の食品を試験するために、又はレストランで注文した料理を検査するために、使用されうる。食品試料は、動物由来の肉及び／又は野菜を含有する生鮮食品、冷凍食品、冷蔵食品又は処理された食品であってもよい。
他の標的分子
一部の実施形態では、本発明のＳＰＮ及び組成物は、他の標的分子、限定されないが、試料中の病原体微生物、細菌、酵母、真菌、胞子、ウイルス又はプリオン由来などの病原体；疾患タンパク質（例えば、疾患の診断及び予後のためのバイオマーカー）；環境中に残存している農薬及び化学肥料；ならびに毒素を検出してもよい。他の実施形態では、本発明のＳＰＮ及び組成物は、非タンパク質標的、ミネラル及び小分子（例えば、抗生物質）などに結合しうる。
適用
本発明によれば、本発明の分子、シグナル生成ポリヌクレオチド（ＳＰＮ）、化合物及び組成物の検出は、広い概念で、多種多様な適用、民間及び戦場での食品安全、診断及び予後試験、環境モニタリング／コントロール、及び生物兵器のための軍事的使用などにおいて、試料中の任意のタンパク質を検出するために使用されうる。さらに広い適用ては、本発明の検出分子、シグナル生成ポリヌクレオチド（ＳＰＮ）、化合物及び組成物は、核酸に基づく検出分子が結合する任意の物質、水中のミネラルなどを検出するために使用されうる。
【００５８】
食品安全コントロールにおける適用には、限定されないが、食品夾雑物（例えば、病原体及び毒素）、食品品質（例えば、栄養素）、栄養補助食品及び食物アレルゲンの検出及びモニタリングが含まれうる。戦場における適用としては、限定されないが、抗生物質、生物学的薬物、生物兵器、感染症モニタリング、及び食品安全の試験が挙げられうる。
【００５９】
種々の方法及びアッセイが、本発明の検出分子、シグナル生成ポリヌクレオチド、化合物及び組成物と組み合わせて使用されうる。選択は、適用分野に依存しうる。
検出方法及びアッセイ：食物アレルゲン
一部の実施形態では、試料中の種々のアレルゲン（例えば、食物アレルゲン）を検出するための分析アッセイ及び方法が提供される。提供されるアッセイ及び方法が、試料中の目的のアレルゲンの存在もしくは不在を検出、ならびに／又は試料中のアレルゲンの量を決定することができる。
【００６０】
一部の実施形態では、食品試料などの試験試料中の１つ又は複数のアレルゲンを検出するための方法は、（ａ）アレルゲンを含む疑いがある試験試料を得る工程と、（ｂ）試験試料を処理し、処理された試料から抽出バッファーを使用してタンパク質を抽出する工程と、（ｃ）工程（ｂ）のタンパク質抽出物を、アレルゲンに特異的に結合するＳＰＮと混合する工程と、（ｄ）エネルギー励起により、試料とＳＰＮとの混合物を活性化する工程と、（ｅ）ＳＰＮとアレルゲンタンパク質との間の相互作用を視覚化し、試験試料中のアレルゲンの不在又は存在を検出する工程とを含む。一部の実施形態では、発光ダイオード（ＬＥＤ）光が、励起手段として使用されてもよい。
試料処理及び抽出バッファー
試験試料中のアレルゲンタンパク質を検出するための検出アッセイ及び方法の能力は、本発明で使用される検出分子が試料抽出物中のこれらのタンパク質を検出する効率に加えて、これらのタンパク質が試料から抽出される効率によって影響される。一部の実施形態では、検出アッセイの迅速性、信頼性、高感度を確保するために、試料は処理され、アレルゲンタンパク質が抽出される。試料のサイズ及び重量、抽出溶液及び抽出プロセスは、有効で非破壊的な反応のために、最適化されてもよい。試料を分解できる任意の機構、切断、粉砕、均質化及びろ過などを、単独で又は組み合わせて使用して、試料を処理してもよい。
【００６１】
一部の実施形態では、任意の食品マトリックスから分析のために十分な標的タンパク質（例えば、アレルゲン）（最小で２ｍｇ／ｍｌの総タンパク質）を取得するために、汎用タンパク質抽出バッファーを使用してもよい。一部の実施形態では、汎用タンパク質抽出バッファー製剤は、タンパク質を室温及び最短時間で抽出することができる。一部の態様では、アレルゲンタンパク質は、約２分未満で、又は約１分未満で、又は約３０秒未満で抽出されうる。バッファーは、食品試料採取、均質化、ろ過を含む抽出プロトコールに組み込まれる必要がありうる。抽出プロトコールは、効率的で経時的に再現性のある様式で、様々な食品マトリックスで実装されてもよい。この汎用製剤は、試験される食品に最小限の影響しか与えないようにすることに関して臨床的に適切であり、およそ０．５ｇの食品の試料のみで、試料中で最小濃度である微量のアレルゲンを検出することができる。最適化されたタンパク質抽出プロセスは、任意の食品マトリックスにおけるアレルゲンの検出を可能にする、迅速で、正確で、汎用のプロトコールを提供する。
【００６２】
この汎用抽出バッファーは、タンパク質抽出及びアレルゲン取得を最大化することができる。汎用抽出バッファーは、任意のアレルゲン及び全ての食品（例えば、処理前又は処理後）に適用可能である。さらに、汎用抽出バッファーは、シグナル生成ポリヌクレオチド（ＳＰＮ）の結合親和性を改善し、非特異的結合を最小化し、かつシグナル対ノイズ比を増加させることができる。
アレルゲン検出アッセイ
一部の実施形態では、本発明の組成物、化合物、及びシグナル生成ポリヌクレオチドは、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）における代替的分子認識要素として抗体に置き換えて使用されうる。ＥＬＩＳＡにおけるアプタマーに基づくシグナル生成ポリヌクレオチドの適用は、酵素結合アプタ吸着アッセイ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ａｐｔａ−ｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ、ＥＬＡＳＡ）と呼ばれるＥＬＩＳＡ由来アッセイを生じさせる。ＥＬＩＳＡ法と同様に、ＥＬＡＳＡは、いくつかの異なる構成、直接的、間接的、及びサンドイッチアッセイなどで使用されうる（トーら（Ｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｂｉｏｓｅｎｓ．  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ、２０１５、６４、３９２−４０３、この文献の内容は全体として本願明細書に援用する）。
【００６３】
一部の実施形態では、本発明の組成物、化合物、及びシグナル生成ポリヌクレオチドは、試料中の標的タンパク質の検出のためのリアルタイムアプタＰＣＲで使用されうる。このアッセイにおいて、試験試料中の標的と、固定化された同じ標的とは、アプタマー結合について競合する。競合後、固定化された標的タンパク質に結合された任意のアプタマーは、熱溶出されて、リアルタイムＰＣＲを使用して定量的に増幅されうる。このアッセイのために使用されるアプタマーは、無標識であってもよい（ピントら（Ｐｉｎｔｏ  ｅｔ
ａｌ．）、Ａｎａｌ−Ｂｉｏａｎａｌ  Ｃｈｅｍ．、２０１４、４０６（２）、５１５−５２４；及びスボボドバら（Ｓｖｏｂｏｄｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．、２０１４、１６５、４１９−４２３；これらの文献の内容はそれぞれ全体として本願明細書に援用する）。
【００６４】
一部の実施形態では、アレルゲン検出アッセイは、蛍光共鳴エネルギー移動（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ、ＦＲＥＴ）からの蛍光発光シグナルに依存しうる。シグナル生成ポリヌクレオチド（ＳＰＮ）は、配列の末端においてフルオロフォアで標識されている。標的との特異的相互作用により、ビアプタマー構造の変化が誘導され、蛍光放出の増加が生じる。この方法は、非常に特異的であり、高感度である。
【００６５】
ある特定の実施形態では、１つ又は複数のシグナル生成ポリヌクレオチド（ＳＰＮ）が、食品マトリックスの性質に依存して、使用されうる。一部の食品は、複数のアレルゲン性タンパク質、例えば、Ａｒａ  ｈ１及びＡｒａ  ｈ２などの少なくとも８つの落花生タンパク質を含み、免疫学的応答を潜在的に生じうる。そのような場合には、２以上のアレルゲン性タンパク質に対する２以上のシグナル生成ポリヌクレオチド（ＳＰＮ）が、落花生の不在又は存在を検出するための混合カクテル中で使用されうる。他の態様では、魚類、甲殻類、軟体動物などの一部の食品マトリックスは、主要なアレルゲン性タンパク質を１つのみ含有する。この主要なアレルゲンタンパク質に特異的に結合する１つ又は複数のＳＰＮが、アレルゲン検出のために使用されうる。
【００６６】
アレルゲン検出アッセイにおいて正確かつ信頼性の高い検出結果を提供するために、試験試料から抽出された総タンパク質が測定される。試験試料から抽出された総タンパク質は、当該分野の当業者に公知の任意のタンパク質アッセイ、例えば、ビシンコニン酸アッセイ（ＢＣＡ）を使用して決定されてもよい。一部の態様では、タンパク質識別分子（例えば、ピロガロールレッドモリブデン酸塩（Ｐｙｒｏｇａｌｂｌ  Ｒｅｄ−ｍｏｌｙｂｄａｔｅ）、ＰＲＭ）が使用されて総タンパク質が決定される。検出分子−アレルゲン相互作用から検出された任意のシグナルが、総タンパク質測定によりノミネートされる。
【００６７】
一部の実施形態では、本発明のアレルゲン検出アッセイ及び方法により、特定のアレルゲンのための較正標準（つまり、較正曲線）及び使用されるＳＰＮが提供される。特定のアレルゲンタンパク質の較正標準は、そのようなアレルゲン又は精製アレルゲンを含む粗製又は処理材料から生成されうる。
【００６８】
一部の実施形態では、本発明のアレルゲン検出アッセイ及び方法は、食品試料中のアレルゲンをより低い濃度で検出することができる。核酸アプタマーの感度により、０．０００１ｐｐｍもの低量のアレルゲンの存在を検出することができる。一部の態様では、検出されうるアレルゲンの濃度又は質量は、０．００１ｐｐｍ〜５ｐｐｍ、又は０．００１ｐｐｍ〜０．１ｐｐｍ、又は０．１ｐｐｍ〜３ｐｐｍ、又は１ｐｐｍ〜５ｐｐｍ、又は５ｐｐｍ〜１０ｐｐｍの範囲でありうる。一部の態様では、検出されうる食品試料中のアレルゲンの濃度又は質量は、０．００１ｐｐｍ、０．００２ｐｐｍ、０．００３ｐｐｍ、０．００４ｐｐｍ、０．００５ｐｐｍ、０．００６ｐｐｍ、０．００７ｐｐｍ、０．００８ｐｐｍ、０．００９ｐｐｍ、０．０１ｐｐｍ、０．０２ｐｐｍ、０．０３ｐｐｍ、０．０４ｐｐｍ、０．０５ｐｐｍ、０．０６ｐｐｍ、０．０７ｐｐｍ、０．０８ｐｐｍ、０．０９ｐｐｍ、０．１ｐｐｍ、０．２ｐｐｍ、０．３ｐｐｍ、０．４ｐｐｍ、０．５ｐｐｍ、０．６ｐｐｍ、０．７ｐｐｍ、０．８ｐｐｍ、０．９ｐｐｍ、１．０ｐｐｍ、１．５ｐｐｍ、２ｐｐｍ、２．５ｐｐｍ、３ｐｐｍ、３．５ｐｐｍ、４ｐｐｍ、４．５ｐｐｍ、５ｐｐｍ又は１０ｐｐｍでありうる。
【００６９】
一部の実施形態では、本発明のアレルゲン検出アッセイ及び方法は、５分未満で実装を完了しうる。一部の態様では、アッセイ時間は、約１分〜約５分、約１分〜約３分、約２分〜約１０分、約５分〜約１０分でありうる。他の態様では、アッセイ時間は、１分、２分  ３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分、又は１０分未満継続しうる。さらなる他の態様では、アッセイ時間は、約１０秒、約１５秒、約２０秒、約２５秒、約３０秒、約３５秒、約４０秒、約４５秒、約５０秒、約５５秒又は約６０秒未満継続しうる。
検出システム及び表示プラットフォーム
アプタマーとタンパク質との相互作用を検出及び表示するために使用される方法及びシステムは、検出結果を表示するために使用されうる。
【００７０】
当該分野で一般的に使用される方法は、アプタマーと標的との相互作用の間の質量及び電荷移動を検出する電気化学的指示薬の使用である。この方法によれば、アプタマーは電極に対して負荷され、電気化学的指示薬は目的の標的に対して結合される。電気化学的指示薬としては、限定されないが、メチレンブルー（ＭＢ）が挙げられうる。
【００７１】
アプタマー−標的相互作用を検出するための方法のいくつかの非限定的な例には、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞（ＣＣＬ−１１９  Ｔ細胞、ヒト急性リンパ芽球性白血病）及びラモス（Ｒａｍｏｓ）細胞（ＣＲＬ−１５９６、Ｂ細胞、ヒトバーキットリンパ腫）上の細胞表面分子に対して選択的なアプタマー−コンジュゲート金ナノ粒子（ＡＣＧＮＰ）を使用してがん細胞を直接的に検出するアッセイ（メドレーら（Ｍｅｄｌｅｙ，ｅｔ  ａｌ．）、がん細胞の直接検出のための金ナノ粒子に基づく比色アッセイ（Ｇｏｌｄ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ−Ｂａｓｅｄ  Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  Ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒｏｕｓ  Ｃｅｌｌｓ）、Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２００８、８０：１０６７−１０７２）；標的である分析対象の結合に際して赤色分散ナノ粒子に迅速に分解するアプタマー連結金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）の使用（ルら（Ｌｕ，ｅｔ  ａｌ．）、第１４章：ナノ粒子／ディップスティック、核酸及びペプチドアプタマーにおいて：方法及びプロトコール（Ｃｈａｐｔｅｒ  １４：Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ／Ｄｉｐ  Ｓｔｉｃｋ、ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ａｐｔａｍｅｒｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）、ギュンター  メイヤー（Ｇｕｎｔｅｒ  Ｍａｙｅｒ）（編）．５３５：２２３−２３９）；ならびにヒト血清におけるＩｇＥの超高感度検出（１〜１０，０００ｎｇ／ｍＬの範囲で０．５２ｎｇ／ｍＬの低いＬＯＤ）のためのサンドイッチ増幅素子としてアプタマー−ＡｕＮＰコンジュゲートを用いる微分パルスボルタンメトリー（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｐｕｌｓｅ  ｖｏｌｔａｍｍｅｔｒｙ、ＤＰＶ）に基づくバイオセンサ（ワングら（Ｗａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．），タンパク質の高感度電気化学免疫アッセイのためのアプタマーＡｕ  ＮＰコンジュゲート蓄積メチレンブルー（Ａｐｔａｍｅｒ−Ａｕ  ＮＰｓ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ−ａｃｃｕｍｕｌａｔｅｄ  ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｂｌｕｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、Ｔａｌａｎｔａ、２０１０年４月１５日、８１（１−２）：６３−６７）を含む。
【００７２】
しかしながら、多くの電気化学的バイオセンサによって共有される少なくとも一つの欠点は、測定のオフライン性であり、分析対象溶液との長時間のインキュベーションを必要とし、リアルタイム検出ではない（ピロリら（Ｐｉｌｌｏｌｉ，ｅｔ  ａｌ．）、統合ナノテクノロジー及び食品−アレルゲン管理への適用におけるバイオセンサ開発における進歩（Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ  ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｅｄ  ｔｏ  ｆｏｏｄ−ａｌｌｅｒｇｅｎ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ）．Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２０１３年６月、４７：１２−２６）。
【００７３】
本発明によれば、光学的アセンブリが、ＳＰＮと標的アレルゲンとの間の相互作用を検出するために使用されうる。光学的アセンブリは、シグナル生成ポリヌクレオチドのフルオロフォアを励起するために適切な励起波長の光を提供する発光ダイオード（ＬＥＤ）を含みうる。ＳＰＮのフルオロフォアから発せられる蛍光はフィルターにかけられてもよく、目的の波長（複数可）のみが送られる。次いで、蛍光シグナルを有用な読出し（つまり、デジタルシグナル）に処理及び変換させるための手段が使用されうる。
【００７４】
本アッセイからの検出結果は、表示ウインドウなどのユーザが容易に読むことができるプラットフォームで表示されてもよい。一実施形態では、携帯電話におけるプラットフォームアプリケーションでありうる（コスクンら（Ｃｏｓｋｕｎ  ｅｔ  ａｌ．）、携帯電話でのパーソナライズされた食物アレルゲンの試験プラットフォーム（Ａ  ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ  ｆｏｏｄ  ａｌｌｅｒｇｅｎ  ｔｅｓｔｉｎｇ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｏｎ
ａ  ｃｅｌｌｐｈｏｎｅ）、Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ．、２０１３、１３（４）、６３６−６４０；この文献の内容は全体として本願明細書に援用する）。
製剤、パッケージング、キット、装置及びシステム
製剤：本発明の検出分子、化合物、シグナル生成ポリヌクレオチドは、標準的手順にしたがって製剤化されうる。一部の実施形態では、検出分子、本発明のＳＰＮは、検出分子とアレルゲンとの間の相互作用に有利な溶液中で製剤化されてもよい。
【００７５】
パッケージング：本発明の検出分子、シグナル生成ポリヌクレオチドの製剤及び／又は組成物は、製剤がＰＶＣ含有及びＰＶＣ不含容器ならびに容器栓に適合性であるとき、任意の許容される容器栓を使用して、種々の薬学的又は診断的に許容される容器で使用するためにパッケージングされてもよい。許容される容器の例としては、限定されないが、アンプル及びプレフィルドシリンジ、カートリッジなどが挙げられる。
【００７６】
あるいは、製剤は、混和バッグの１コンパートメントに凍結乾燥アプタマーを、及び混和バッグの別のコンパートメントに許容される溶媒を、２つのコンパートメントが患者に投与される前に一緒に混合されうるように含んでもよい。許容される容器は当該分野で周知であり、市販されている。好適には、製剤は、ブチルゴム栓を備えた１型ガラスバイアルで保存される。液体形態の製剤が、冷蔵環境で保存されてもよい。あるいは、凍結乾燥製剤が、室温で、又は冷蔵もしくは冷凍されて保存されてもよい。
【００７７】
好適には、製剤は、無菌である。「無菌」製剤は、本明細書で使用されるとき、無菌の状態にされ、その後に微生物夾雑に曝露されていない、つまり無菌組成物を保持する容器が損なわれていない製剤を意味する。無菌組成物は、一般的に、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）の現行の適正製造基準（ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｇｏｏｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、ｃＧＭＰ）の規則にしたがって製薬業者により調製される。
【００７８】
一部の実施形態では、無菌医薬製剤は、防腐処理技術を使用して調製されうる。無菌は、無菌材料及び制御された作業環境を使用して維持される。全ての容器及び機器は、充填前に、好適には加熱無菌化により、無菌化される。その後、容器は、防腐条件下で、組成物をフィルターに通すことなど、その単位を充填することにより、充填される。したがって、製剤は、最終無菌化の熱ストレスを避けて、容器に無菌充填されうる。
【００７９】
一部の実施形態では、製剤は、湿熱を使用して、最終的に無菌化される。最終無菌化は、医薬製剤を含む最終密封容器内で全ての生存微生物を殺滅するために使用されうる。医薬品の最終パッケージングにおける最終加熱無菌化を達成するために、オートクレーブが典型的に使用される。最終製品の最終無菌化を達成するための、製薬産業における典型的なオートクレーブサイクルは、１２１℃で少なくとも１０分間である。
【００８０】
キット：本発明の検出分子、化合物及び組成物は、他の配合成分又は試薬と組み合わせてもよく、あるいはキット又は商業的販売もしくは頒布のための他の小売製品の構成要素として調製されてもよい。キットは、化合物又は組成物を、キットの投与及び／又は使用に関する指示書とともに含む。キットは、１つ又は複数のシリンジ、バッグ又はボトルを含んでもよい。
【００８１】
装置及びシステム：本発明のシグナル生成ポリヌクレオチド、化合物及び組成物は、任意のアレルゲン検出装置及びシステムで使用されうる。一部の非限定的な例としては、側方流動装置（ＬＦＤ）、マイクロ流体チップ（米国特許第８，６１７，９０３号）、２０１５年３月１６日に出願された米国特許出願第６２／１３３，６３２号に記載のポータブル検出装置／システム、及び２０１４年１０月２８日に出願された共有のＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１４／６２６５６号に記載のカートリッジが挙げられ、これらの文献はそれぞれ全体として本願明細書に援用する。
定義
本明細書の様々な箇所において、本開示の化合物の置換基は、群又は範囲で開示されている。本開示は、そのような群及び範囲のメンバーのそれぞれ及び全ての個々の部分組合せも含むことが、とりわけ意図されている。以下は、用語の定義の非限定的列挙である。
【００８２】
約：本明細書で使用されるとき、用語「約」は、重量、時間、用量に関する量などの測定可能な値を参照するとき、特定の量から±２０％又は±１０％、より好適には±５％、さらにより好適には±１％、より一層好適には±０．１％の変動を、そのような変動が開示された方法を実行するために適切であるとき、包含することを意味する。
【００８３】
活性：本明細書で使用されるとき、用語「活性」は、物事が起こっているか又は行われている状態を指す。本発明の組成物は活性を有することができ、この活性は標的分子への結合に関与しうる。
【００８４】
アレルゲン：本明細書で使用されるとき、用語「アレルゲン」は、対象において免疫反応を生じさせる、誘発する又は引き起こす化合物、物質又は組成物を意味する。したがって、アレルゲンは、典型的に、抗原として言及される。アレルゲンは、典型的に、タンパク質又はポリペプチドである。
【００８５】
アレルゲン検出分子：本明細書で使用されるとき、用語「アレルゲン検出分子」は、試料中のアレルゲンの検出を可能にする様式で１つ又は複数のそのようなアレルゲンに対して相互作用及び／又は結合することができる又は相互作用及び／又は結合する任意の分子を指し、本明細書において、「アレルゲン検出分子」又は「検出分子」として参照される。
【００８６】
結合親和性：本明細書で使用されるとき、用語「結合親和性」は、検出分子（例えば、アプタマー）が標的（例えば、アレルゲン）に結合する又は結合しない傾向を指し、検出分子が標的に結合する結合の強度又は親和性の尺度を説明する。
【００８７】
生体分子：本明細書で使用されるとき、用語「生体分子」は、アミノ酸、核酸、炭水化物又は脂質などに基づく任意の天然分子である。
相補性及び実質的相補性：本明細書で使用されるとき、用語「相補性」は、互いに塩基対を形成するためのポリヌクレオチドの能力を指す。塩基対は、逆平行ポリヌクレオチド鎖におけるヌクレオチド単位間の水素結合によって典型的に形成される。相補性ポリヌクレオチド鎖は、ワトソン−クリック様式（例えば、Ａ対Ｔ、Ａ対Ｕ、Ｃ対Ｇ）又は二重鎖の形成を可能にする任意の他の様式で塩基対を形成することができる。当業者であれば、ＤＮＡではなくＲＮＡを使用するとき、チミンではなくウラシルが、アデノシンと相補性であると考えられている塩基であることを知っている。しかしながら、本発明の文脈でＵが示されるとき、そうでないことが示されない限り、Ｔを代替する能力が示唆される。完全に相補性又は１００％相補性とは、１つのポリヌクレオチド鎖のそれぞれのヌクレオチド単位が、第２のポリヌクレオチド鎖のヌクレオチド単位と水素結合を形成することができる状況を指す。完全より低い相補性は、２つの鎖の全てではないが一部のヌクレオチド単位が互いに水素結合を形成することができる状況を指す。例えば、２０マーでは、各鎖における２つの塩基対のみが互いに水素結合を形成可能である場合、ポリヌクレオチド鎖は１０％の相補性を呈する。同じ例で、各鎖における１８塩基対が互いに水素結合を形成可能である場合、ポリヌクレオチド鎖は９０％の相補性を呈する。
【００８８】
検出：本明細書で使用されるとき、用語「検出」は、多くの非標的タンパク質の混合物から特定の標的タンパク質を抽出し、多くの非標的タンパク質の混合物における標的タンパク質の不在、存在及び／又は量を示すことを意味する。
【００８９】
検出可能な標識：本明細書で使用されるとき、「検出可能な標識」は、別の実体に付加され、組み込まれ、又は会合した１つ又は複数のマーカー、シグナル又は部分であって、ラジオグラフィ、蛍光、化学発光、酵素活性、吸光度、免疫学的検出などを含む、当該分野で公知の方法、により、容易に検出されるマーカー、シグナル又は部分を指す。検出可能な標識としては、放射性同位元素、フルオロフォア、発色団、酵素、色素、金属イオン、リガンド、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン及びハプテン、量子ドット、ポリヒスチジンタグ、ｍｙｃタグ、フラッグタグ、ヒトインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タグなどが含まれうる。検出可能な標識は、標識が付加され、組み込まれ、又は会合した実体の任意の位置に設置されうる。例えば、標識がペプチド又はタンパク質に対して付加され、組み込まれ、又は会合するとき、標識は、アミノ酸内、ペプチド内、もしくはタンパク質内でありえ、又はＮ−もしくはＣ末端において設置されうる。
【００９０】
含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）：本明細書で使用されるとき、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、「限定されないが含む」ことを指す。「含む」及び「限定されないが含む」は、交換可能に使用される。
【００９１】
相互作用：本明細書で使用されるとき、用語「相互作用」は、２つ以上の分子が互いに効果を有するときに起こる作用の１種である。本発明の文脈では、検出分子と標的との間の相互作用は、検出分子の構造に影響を与え、そのような効果は、視覚化することができるエネルギー変化を生じる。
【００９２】
病原体：本明細書で使用されるとき、用語「病原体」は、疾患を生ずる任意の因子（特に、ウイルスもしくは細菌又は他の微生物）を意味する。
ポリヌクレオチド：本明細書で使用されるとき、用語「ポリヌクレオチド」は、核酸塩基が、糖ホスフェート連結（糖−ホスフェート骨格）により接続されている核酸塩基ポリマー又はオリゴマーを指す。例示的なポリ−及びオリゴヌクレオチドには、２’デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）のポリマー及びリボヌクレオチド（ＲＮＡ）のポリマーが含まれる。ポリヌクレオチドは、完全にリボヌクレオチドで構成されてもよく、完全に２’デオキシリボヌクレオチドで構成されてもよく、又はそれらの組合せで構成されてもよい。
【００９３】
ポリヌクレオチドバリアント：本明細書で使用されるとき、用語「ポリヌクレオチドバリアント」は、天然又は開始配列と比較してそれらの核酸配列にいくつかの違いを有する分子を指す。
【００９４】
ｐｐｍ：本明細書で使用されるとき、用語「ｐｐｍ」は、百万分率の略で、ｐｐｍは、１／１００００００の単位の全体の数に対する部分を表す値である。ｐｐｍは、無次元量であり、同じ単位の２つの量の比率である。例えば、ｍｇ／ｋｇ。１ｐｐｍは、全体の１／１００００００と等しく、１ｐｐｍ＝１／１００００００＝０．０００００１＝１×１０−６である。ｐｐｍは、本明細書において、通常、溶液中の、化学物質（タンパク質）濃度を測定するために使用される。溶質濃度１ｐｐｍは、溶質の濃度が溶液の１／１００００００であることである。ｐｐｍ単位の濃度Ｃは、ミリグラム単位の溶質質量ｍｓｏｌｕｔｅ及びミリグラム単位の溶液質量ｍｓｏｌｕｔｉｏｎから計算される。Ｃ（ｐｐｍ）＝１００００００×ｍｓｏｌｕｔｅ／（ｍｓｏｌｕｔｉｏｎ＋ｍｓｏｌｕｔｅ）。
【００９５】
試料：本明細書で使用されるとき、用語「試料」は、限定されないが、対象（下記に示すヒト及び動物試料を含む）から得られる生物学的試料、環境から得られる試料、例えば土壌試料、水試料、農業試料（植物及び作物試料を含む）又は食品試料を含む、分析される目的の標的を含みうる任意の組成物を指す。食品試料は、生鮮食品、処理された／調理された食品、又は冷凍食品から得られうる。
【００９６】
感度：本明細書で使用されるとき、用語「感度」は、標的分子に対して結合する検出分子の能力を意味する。
特異的に結合する：本明細書で使用されるとき、用語「特異的に結合する」は、検出分子（例えば、アプタマー）が、特定の標的、アレルゲンタンパク質などに、代替標的よりも高い頻度で、より迅速に、より長期間及び／又はより高い親和性で、反応又は会合することを意味する。例えば、アレルゲンタンパク質に対して特異的に結合するアプタマーは、そのタンパク質又はその断片に、無関係のタンパク質及び／又はその断片に対する結合よりも高い親和性で、結合活性で、より容易に、及び／又はより長期間結合する。この定義によって、例えば、第１の標的に対して特異的に結合する検出分子（例えば、アプタマー）が、第２の標的に、特異的に結合してもしなくてもよいことが、当業者によって理解される。したがって「特異的結合」は、排他的結合又は別の分子の結合が検出不可であることを必ずしも必要とせず、用語「選択的結合」によって包含される。全体的に、必ずしもそうではないが、結合への参照は、特異的結合を意味する。結合の特異性は、アプタマー及び環境中の他の材料又は一般の無関係の分子についての解離定数と比較した、標的についてのアプタマーの比較解離定数（Ｋｄ）という意味で定義される。典型的に、標的についてのアプタマーのＫｄは、標的及び環境中の無関係の材料又は付随する材料についてのＫｄよりも、２倍、５倍又は１０倍低い。さらにより好適には、Ｋｄは、２５倍、５０倍、７５倍、１００倍、１５０倍、又は２００倍低い。
【００９７】
標的：本明細書で使用されるとき、用語「標的」及び「標的分子」は、試験された試料で見出されうる分子であって、アプタマー又は抗体などの検出分子、に結合することができる分子を指す。
【００９８】
汎用バッファー：本明細書で使用されるとき、用語「汎用バッファー」は、種々の試料のために使用されうるバッファーを指す。
均等物及び範囲
当業者は、本明細書に記載された発明による特定の実施形態に対する多くの均等物を、認識し、通例にすぎない実験を使用して確認することができる。本発明の範囲は、上記説明により限定されることは意図されておらず、添付の請求項において示される通りである。
【００９９】
請求項において、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」などの冠詞は、矛盾が示されない限り又は文脈からそうでないことが明らかでない限り、１つ又は２つ以上を意味しうる。群の１つ又は複数のメンバーの間に「又は」を含む請求項の範囲又は説明は、矛盾が示されない限り又は文脈からそうでないことが明らかでない限り、その群のメンバーの１つ、２つ以上又は全てが、存在する、用いられる、又は別の方法で所与の物もしくはプロセスと関連すれば十分とみなされる。本発明には、群のたった１つのメンバーが、存在する、用いられる、又は別の方法で所与の物又はプロセスと関連する実施形態が含まれる。本発明には、群の２以上又は全てのメンバーが、存在する、用いられる、又は別の方法で所与の物又はプロセスと関連する実施形態が含まれる。
【０１００】
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、開放的であることも意図されており、追加的な要素又は工程を含むことが許容されるが、必須とはされない。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」が本明細書で使用されるとき、用語「からなる」も包含され、開示される。
【０１０１】
範囲が与えられている場合、端点が含まれる。さらに、文脈及び当業者の理解からそうでないことが示される又はそうでないことが明らかでない限り、範囲として示される値は、本発明の様々な実施形態で示されている範囲内の任意の特別の値又は部分範囲を、文脈が明確にそうでないことを指示していない限り、範囲の下限の単位の十分の一まで想定することができることが理解されるべきである。
【０１０２】
さらに、先行技術の範囲に入る本発明の任意の特定の実施形態は、任意の１つ又は複数の請求項から明確に除外されうることが理解されるべきである。そのような実施形態は、当業者にとって公知と考えられるので、除外が明確に本明細書に示されていない場合であっても除外されうる。本発明の組成物の任意の特定の実施形態（例えば、任意の抗生物質、治療薬又は活性成分、任意の製造方法、任意の使用方法など）は、先行技術の存在に関係するか否かにかかわらず、何らかの理由で、任意の１つ又は複数の請求項から除外されうる。
【０１０３】
使用されている語句は、限定ではなく説明するための語句であって、変更が、より広い態様で、本発明の真の範囲及び趣旨から逸脱することなく、添付の特許請求の範囲内でなされうることが理解されるべきである。
【０１０４】
本発明は、いくつかの記載された実施形態に関して、いくらかの長さで、いくらかの特定性をもって説明されているが、そのような任意の特定物もしくは実施形態又は特定の実施形態に限定されることは意図されておらず、先行技術の観点でそのような特許請求の範囲の可能な限り広い解釈を提供するために、したがって、本発明の意図される範囲を効果的に包含するために、添付の特許請求の範囲を参照して解釈されるべきものである。
実施例
【実施例１】
【０１０５】
シグナル生成ポリヌクレオチドとしてのアプタマーの設計
この概念実証例では、２つの既知のアプタマー配列を使用して、３つの異なるシグナル生成ポリヌクレオチドを設計した。Ａｒａ  ｈ  １タンパク質アレルゲンに対するアプタマーは、トランら（Ｔｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．）  食品マトリックス中の落花生アレルゲンのＦＯ−ＳＰＲバイオセンシングのためのＡｒａ  ｈ  １タンパク質に対するアプタマーの選択（Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｐｔａｍｅｒｓ  ａｇａｉｎｓｔ  Ａｒａ  ｈ  １  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｏｒ  ＦＯ−ＳＰＲ  ｂｉｏｓｅｎｓｉｎｇ  ｏｆ  ｐｅａｎｕｔ  ａｌｌｅｒｇｅｎｓ  ｉｎ  ｆｏｏｄ  ｍａｔｒｉｃｅｓ）、Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ及びＢｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ、２０１３、４３、２４５−２５１（全体として本願明細書に援用する）に記載されている。このアプタマーの配列は下記に示される。
【化１】
2020054339.tif 000007
【０１０６】
配列番号１の原型アプタマーは、フルオロフォア−クエンチャー対の機能を改善するために５’−Ｔ残基を加えて修飾された。その後、下記に示されるように、フルオレセインが５’−Ｔ残基に連結された。
【化２】
2020054339.tif 000008
【０１０７】
３’−ＤＡＢＣＹＬクエンチャーを有する９ヌクレオチドのリンカーを、下記に示すように、配列番号２のＴ−修飾アプタマーの５’端の最初の１０残基に相補的であるように設計した。
【化３】
2020054339.tif 000009
【０１０８】
次いで、フルオレセインフルオロフォアをＤＡＢＣＹＬクエンチャー部分に近接させるように、９ヌクレオチドのリンカー（配列番号３）が、主な修飾抗落花生アレルゲンアプタマー配列（配列番号２）の５’端にアニールされた。落花生アレルゲンＡｒａ  ｈ  １の検出のために組み立てられたシグナル生成ポリヌクレオチドの構造を以下に示す。
【化４】
2020054339.tif 000010
【０１０９】
配列番号２及び３のアニーリングから調製されたシグナル生成ポリヌクレオチドは、本明細書でＳＰＮ−Ａ＊と指定された二量体実体である。ＳＰＮ−Ａ＊の二次構造は、図１に示される。シグナル生成ポリヌクレオチド２００の構成要素の配置は、コア配列２０２、フルオロフォア２０４、クエンチャー２０６及びリンカー配列２０８である。
【０１１０】
同様に、シグナル生成ポリヌクレオチドが、トランら（Ｔｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．）による、卵白リゾチームに対するＤＮＡアプタマーの選択及び特徴付け（Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ
ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  Ａｐｔａｍｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｅｇｇ  Ｗｈｉｔｅ  Ｌｙｓｏｚｙｍｅ）、Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２０１０、１５（３）、１１２７−１１４０（全体として本願明細書に援用する）において記載された卵白リゾチームに対するアプタマー配列に基づいて設計された。このアプタマーの配列は下記に示される。
【化５】
2020054339.tif 000011
【０１１１】
配列番号４の原型アプタマーは、フルオロフォア−クエンチャー対の機能を改善するために５’−Ｔ残基を加えて修飾された。次いで、下記に示されるように、フルオレセインが５’−Ｔ残基に連結された。
【化６】
2020054339.tif 000012
【０１１２】
３’−ＤＡＢＣＹＬクエンチャーを有する１０ヌクレオチドのリンカーを、下記に示すように、配列番号５のＴ修飾アプタマーの５’端の最初の１０残基に相補的であるように設計された。
【化７】
2020054339.tif 000013
【０１１３】
次いで、フルオレセインフルオロフォアをＤＡＢＣＹＬクエンチャー部分に近接させるように、１０ヌクレオチドのリンカー（配列番号６）が、主の修飾抗リゾチームアプタマー配列（配列番号５）の５’端にアニールされた。リゾチームの検出のために組み立てられたシグナル生成ポリヌクレオチドの構造を以下に示す。
【化８】
2020054339.tif 000014
【０１１４】
配列番号５及び６から調製された二量体シグナル生成ポリヌクレオチドは、本明細書でＳＰＮ−Ｅ＊と指定される。ＳＰＮ−Ｅ＊とリゾチームとの間の反応が、図３に模式的に示されている。シグナル生成ポリヌクレオチドＳＰＮ−Ｅ＊４００の構成要素の配置は、コア配列４０２、フルオロフォア４０４、クエンチャー４０６及びリンカー配列４０８である。リゾチームの結合により、ヘアピン構造が破壊され、フルオロフォア４０４がクエンチャー４０６から離れ、それによりフルオロフォア４０４が励起による蛍光を発することが可能となることが分かる。
【０１１５】
第３のシグナル生成ポリヌクレオチドは、上記の配列番号４のアプタマー配列に基づいて設計された。５’−Ｔ残基が、配列番号４に付され、３’端は、配列番号４の原型アプタマー配列の５’端の最後の５つの核酸塩基に相補的な５つの核酸塩基セグメントの追加によって修飾された。次いで、５’−フルオレセインと３’−ＤＡＢＣＹＬ部分とを連結させて下記に示す配列（配列番号７）が生成された。下記に示す配列では、追加の５核酸塩基セグメントは、原型アプタマー配列の５’端の最初の５つの核酸塩基（追加された５’−Ｔ残基は含まない）とともに下線が付されている。
【化９】
2020054339.tif 000015
【０１１６】
このシグナル生成ポリヌクレオチドは、本明細書でＳＰＮ−Ｅと指定されたヘアピン実体である。５’端及び３’端で下線が付された残基は、図２の左端の構造に示されるようなヘアピン二次構造を形成する目的のために相補性であることが認識される（コア配列３０２）。この構造は、フルオロフォア３０４とクエンチャー３０６とを互いに近接させ、クエンチャー３０６にフルオロフォア３０４をクエンチさせる。シグナル生成ポリヌクレオチドのリゾチームへの結合により、コア配列３０２の右端の構造に示されるようにシグナル生成ポリヌクレオチド３００の２つの端のハイブリダイゼーションを破壊することができ、結果としてフルオロフォア３０４がクエンチャー３０６から分離し、それによりフルオロフォア３０４が活性化される。
【実施例２】
【０１１７】
アプタマーポリヌクレオチドの選択及び最適化
ＳＥＬＥＸ法に基づくｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニング実験が実施され、アプタマーは、卵、グルテン、乳、大豆、魚類、落花生、カシューナッツ、甲殻類を含むアレルゲン標的に対して、カウンター標的（非標的タンパク質の組合せ）を上回って選択され、さらに標的食物アレルゲンを検出するそれらの性能について工学的に操作された。
実験計画
種々のＲＮＡライブラリーが使用され、１００ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８）、５ｍＭのＥＤＴＡ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣ１２、０．１％ＳＤＳ、０．１％ゼラチン、１％ＮＰ−４０（Ｔｅｒｇｉｔｏｌ）、０．５％のデオキシコール酸ナトリウムからなる選択バッファー中の結合能力について２３℃で選択された。所与の選択ラウンドは、ＲＮＡライブラリーメンバーを単独のバッファー中でインキュベート（陰性選択）し、次いで応答（つまり、切断）がなかったライブラリーの一部を回収することで開始した。各ラウンドの第２の部分（要求されるとき）は、先の陰性選択工程からの非応答分子を、非陽性標的の全組合せ（カウンターとして）と、又は第２の陰性選択のため再び選択バッファーのみとインキュベートすることからなった。再び非応答（非切断）分子が回収されることになる。それぞれのラウンドの最終工程は、前工程由来の材料を、陽性標的（必要に応じてアレルゲンのそれぞれ）とバッファー中でインキュベートすること、次いで応答材料（つまり、切断されたＲＮＡ）を回収することからなる。各選択ラウンドの後は、ＤＮＡを生成するための逆転写、ＰＣＲを通じたライブラリー増幅、及び転写によるＲＮＡライブラリーの再生が続いた。多様なランダム配列の初期ライブラリーを、変化のある連続的な選択（つまり、陰性、カウンター及び陽性選択）ラウンドに、再びプロジェクト依存的にかけた後、濃縮されたライブラリーが３つの画分に分割され、並行評価が実行された。
【０１１８】
陰性、カウンター及び陽性選択のラウンド後に濃縮されたライブラリー濃縮の並行評価には、濃縮されたライブラリーの３分の１を選択バッファーのみに対して、別の３分の１を選択バッファー中のカウンター標的複合体に対して、及び濃縮されたライブラリーの最後の３分の１をバッファー中の標的アレルゲンに対して同時に曝露することを含む。標的アレルゲン及びカウンター標的の両方に無差別に反応する、又は標的アレルゲンの不在において依然として応答を生じる任意の残余のＲＮＡ分子が同定され、さらなるバイオインフォマティクス解析の間に破棄された。
【０１１９】
並行評価後の濃縮されたＲＮＡライブラリーが、ＰＡＧＥゲル評価にかけられた。４０ピコモルの濃縮されたライブラリーは、陰性（バッファーのみ）、カウンター標的、又は選択バッファー中の標的アレルゲン（例えば、乳、小麦、卵白及び落花生）のいずれかに別個に曝露された。２３℃で５分間インキュベーションした後、陽性応答（つまり、切断）材料を提示するライブラリーが回収され、エタノール沈殿され、逆転写され、シーケンシング及びバイオインフォマティクス解析のためにＰＣＲ増幅された。
材料及び方法
標的（カシューナッツ、落花生、魚類、乳、大豆、グルテン、卵及び甲殻類由来のタンパク質の複合体）が、必要に応じて乾燥された後、予備分析及びアプタマースクリーニングのためにＲＮアーゼ不含水と混合された。必要な場合、標的はプールされ、陽性選択標的として指定されていなかった標的の適切な量と組み合わせてカウンター標的混合物が生成された。初期アプタマーライブラリー鋳型及びプライマーが、ＩＤＴ（米国アイオワ州コーラルビル（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ）所在）により一本鎖ＤＮＡとして合成された。次いで、ライブラリーは、クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）（米国カリフォルニア州マウンテン・ビュー（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ）所在）製のＴｉｔａｎｉｕｍ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  ポリメラーゼを使用して、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を提供するためにプライマー拡張された。
【０１２０】
実験計画にしたがって、所与のライブラリーの生成のために、ＲＮＡは、先のｄｓＤＮＡからエピセンター（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）（米国ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）所在）製のＡｍｐｌｉ  Ｓｃｒｉｂｅ  Ｔ７転写キットを用いて転写され、１０％変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を使用して精製された。精製されたＲＮＡは選択バッファーと組み合わされ、次いで、陰性選択のために、１×濃度（１００ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８）、５ｍＭのＥＤＴＡ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣ１２、０．１％のＳＤＳ、０．１％のゼラチン、１％＞ＮＰ−４０（Ｔｅｒｇｉｔｏｌ）、０．５％のデオキシコール酸ナトリウム）へ希釈された。陰性選択が、再フォールディングサイクルを用いて開始された。このサイクルは、試料を６５℃に加熱してＲＮＡを変性し、その後、試料を２３℃にして残りのインキュベーションを行うことを含んだ。インキュベーション後、非切断ＲＮＡは、１０％の変性ＰＡＧＥを使用して、切断ＲＮＡから分離された。回収された非切断材料は、カウンター標的及びバッファーと組み合わされ、選択工程に依存して、標的及びバッファー又はバッファーのみが２３℃でインキュベートされ、１０％の変性ＰＡＧＥで区分された。回収及び別の選択工程が、要求される場合に実装された。次いで、ｃＤＮＡが、溶出された選択後ライブラリーから、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；米国カリフォルニア州カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ）所在）を使用して生成され、その後、Ｔｉｔａｎｉｕｍ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（クロンテック；米国カリフォルニア州マウンテン・ビュー（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ）所在）を用いてＰＣＲ増幅されて、選択ラウンドが完了した。数ラウンドの選択工程後、ライブラリーが濃縮され、陰性切断量が３０％未満であること、及びカウンターと比較して陽性処理における切断が少なくとも５％多いことが示された。
【０１２１】
およそ１０１４のランダム配列からなる初期ライブラリーが、リボザイムに基づくＳＥＬＥＸの変動ラウンドにかけられ、標的アレルゲンに結合する配列が濃縮され、複数の選択ラウンドにわたってカウンター標的に結合する配列が除去された。結果として、シーケンシングされる集団は、可能性のあるアプタマー候補を複数コピー含むと予測される（ヴァン・シマイズら（Ｖａｎ  Ｓｉｍａｅｙｓ  ｅｔ  ａｌ．）、卵巣がん細胞−ＳＥＬＥＸを通じて選択されたアプタマーの分子認識研究（Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｐｔａｍｅｒｓ  Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｏｖａｒｉａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ−ＳＥＬＥＸ）、２０１０、ＰＬＯＳ  Ｏｎｅ、５（１１）：ｅ１３７７０）。
シーケンシング及びバイオインフォマティクス
イルミナ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）（米国カリフォルニア州サンディエゴ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）所在）ＭｉＳｅｑシステムが実装されて、ペアエンドリード技術を使用して選択した後のアプタマーがシーケンシングされた。シーケンシングデータのバイオインフォマティクス解析により、候補アプタマー分子を識別した。ディープシーケンシング及びその後のデータ解析は、スクリーニングプロセスによるエラー及びバイアスを誘導しうる、多数の選択を実行する従来的アプローチを簡潔化した（シュッツら（Ｓｃｈｕｔｚｅ  ｅｔ  ａｌ）、次世代シーケンシングを用いたＳＥＬＥＸ  プロセスのプロービング（Ｐｒｏｂｉｎｇ  ｔｈｅ  ＳＥＬＥＸ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  ｗｉｔｈ  Ｎｅｘｔ−Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、ＰＬｏｓ  Ｏｎｅ、２０１１、６（１２）：ｅ２９６０４）。
アプタマー候補選択
配列ファミリー構築により、モチーフの存在が強調された。このことは陽性標的集団における配列の頻度が因子として含まれたことを意味するが、全集団におけるサブ配列の広がりに対してより重点をおくものである（全配列に対する１００％一致はファミリーに属するために必ずしも必要でない）。２つの他の因子が使用されて、モチーフ−ファミリーサイズの重要性が調節され、候補配列が決定された。１つの因子は、陰性及びカウンター標的集団における配列の存在である。３つのライブラリー：陽性標的曝露ライブラリー、バッファーのみの陰性ライブラリー、及びカウンター標的曝露ライブラリーが、並行評価から回収された。全てのライブラリーが分析されて、陰性−又はカウンター選択工程の間に除去されていないが標的及びカウンター標的の両方に親和性を有するいくつかの配列が発見された。所与の配列は、カウンター標的曝露集団よりも陽性集団で頻度が高いようであり、さらなる試験のための魅力的な候補である。
【０１２２】
また所与の候補配列の二次構造が、Ｍｆｏｌｄ二次構造モデリングソフトウェアを使用して予測された（ザッカー（Ｚｕｃｋｅｒ）、核酸フォールディング及びハイブリダイゼーション予測のためのＭｆｏｌｄウェブサーバ（Ｍｆｏｌｄ  ｗｅｂ  ｓｅｒｖｅｒ  ｆｏｒ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｆｏｌｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ
ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、２００３、３１（１３）：３４０６−３４１５）。
【０１２３】
一連のアプタマー配列が選択され、落花生、卵白、小麦及び乳を含む、様々な食物アレルゲンを検出するためのシグナル生成ポリヌクレオチドとしてさらに設計された。選択されたアプタマーが、表１に列挙される。次いで、各食物アレルゲンのために選択されたアプタマーは、標的化されたアレルゲンへの結合親和性を最適化するために５’端及び３’端のいずれか一方又は両方にさらに修飾される。５’端にフルオレセイン（例えば、ＦＩＴＣ／ＦＡＭ分子）及び３’端にクエンチャーを有することが意図されている修飾配列は、
本明細書に記載されるアレルゲン検出のために試験されるシグナル生成ポリヌクレオチドである。
【実施例３】
【０１２４】
総タンパク質測定
総タンパク質の測定は、ピロガロールレッド−モリブデン酸塩（ＰＲＭ）タンパク質色素結合アッセイを使用して試験される。ＰＲＭは、０．１５６ｍＭのピロガロールレッド、０．２０９ｍＭのモリブデン酸ナトリウム、及び５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌを含む溶液中で最初に作製される。試験プレートは、２０μｌ／ウェルのＰＲＭ溶液を添加することにより調製され、プレートは一晩乾燥される。試験食品マトリックスを処理した後、処理された試料溶液（４００μｌ）は、各ウェルに添加され、タンパク質吸光度が、６００ｎｍで即座に読みとられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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