(57)【要約】      （修正有）【課題】予防、治療、又は診断目的のための、Ｋｖ１．３に特異的に結合する免疫グロブリンを提供する。【解決手段】カリウムチャネル３（Ｋｖ１．３）のＥＬ１細胞外ループに特異的に結合する免疫グロブリンであり、免疫グロブリンは、パッチクランプアッセイ法で決定された場合に、Ｔ細胞からのカリウムイオンの流出を減少させ、又は更に、同流出を完全に阻害することにより、Ｋｖ１．３の活性をモデュレーションする、免疫グロブリン。ポリペプチドをコードする核酸。ポリペプチドを製造するための方法。ポリペプチドを含む組成物、及び特に、医薬組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
カリウムチャネル３（Ｋｖ１．３）のＥＬ１細胞外ループに特異的に結合する免疫グロブリンであり、免疫グロブリンは、パッチクランプアッセイ法で決定された場合に、Ｔ細胞からのカリウムイオンの流出を減少させ、又は更に、同流出を完全に阻害することにより、Ｋｖ１．３の活性をモデュレーションする、
免疫グロブリン。
【請求項２】
免疫グロブリンが、１０−７M以下、好ましくは１０−８M以下、より好ましくは１０−９M以下、又は更に１０−１０M以下のＩＣ５０値で、Ｔ細胞からのカリウムイオンの流出を減少させ、又は、阻害する、請求項１記載の免疫グロブリン。
【請求項３】
免疫グロブリンが、Ｋｖ１．３の活性を、アロステリックにモデュレーションし、及び／又は、阻害する、請求項１又は２記載の免疫グロブリン。
【請求項４】
免疫グロブリンが、Ｋｖ１．３の活性をモデュレーションし、及び／又は、阻害することについて、他の関連するＫｖイオンチャネルファミリーメンバーより、１０倍超、１００倍超、好ましくは１０００倍超の選択性を有する、請求項１〜３のいずれか一項記載の免疫グロブリン。
【請求項５】
免疫グロブリンが、配列番号：１〜６４、４９５、４９８〜５１３、及び５２３〜５４０のいずれか１つと比較して、その配列内に同じ数のアミノ酸を有し、ここで、免疫グロブリンが、配列番号：１〜６４、４９５、４９８〜５１３、及び５２３〜５４０のいずれか１つと比較して、８９％以上の配列同一性を有する、８位〜１０６位（Ｋａｂａｔナンバリングに従った）のアミノ酸配列を有する、請求項１〜４のいずれか一項記載の免疫グロブリン。
【請求項６】
免疫グロブリンが、配列番号：６５〜１２３のいずれか１つと比較して、その配列内に同じ数のアミノ酸を有し、ここで、免疫グロブリンが、配列番号：６５〜１２３のいずれか１つと比較して、８９％以上の配列同一性を有する、８位〜１０６位（Ｋａｂａｔナンバリングに従った）のアミノ酸配列を有する、請求項１〜４のいずれか一項記載の免疫グロブリン。
【請求項７】
４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）と、３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）とから本質的になり、ここで、
ｉ）ＣＤＲ１が、
ａ）配列番号：１８１〜２１０、又は
ｂ）配列番号：１８２のアミノ酸配列に対して、４、３、２、もしくは１つのアミノ酸差を有するアミノ酸配列
からなる群より選択され、
及び／又は
ｉｉ）ＣＤＲ２が、
ｃ）配列番号：２６８〜２８９及び配列番号：５４１〜５５５、又は
ｄ）配列番号：２６９のアミノ酸配列に対して、４、３、２、もしくは１つのアミノ酸差を有するアミノ酸配列
からなる群より選択され、
及び／又は
ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、
ｅ）配列番号：３９３〜４１５、又は
ｆ）配列番号：３９７のアミノ酸配列に対して、３、２、もしくは１つのアミノ酸差を有するアミノ酸配列
からなる群より選択される、請求項１〜４のいずれか一項記載の免疫グロブリン。
【請求項８】
４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）と、３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）とから本質的になり、ここで、
ｉ）ＣＤＲ１が、
ａ）配列番号：１８１〜２１０、又は
ｂ）配列番号：１８２のアミノ酸配列に対して、４、３、２、もしくは１つのアミノ酸差を有するアミノ酸配列
からなる群より選択され、
及び
ｉｉ）ＣＤＲ２が、
ｃ）配列番号：２６８〜２８９及び配列番号：５４１〜５５５、又は
ｄ）配列番号：２６９のアミノ酸配列に対して、４、３、２、もしくは１つのアミノ酸差を有するアミノ酸配列
からなる群より選択され、
及び
ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、
ｅ）配列番号：３９３〜４１５、又は
ｆ）配列番号：３９７のアミノ酸配列に対して、３、２、もしくは１つのアミノ酸差を有するアミノ酸配列
からなる群より選択される、請求項７記載の免疫グロブリン。
【請求項９】
ｉ）ＣＤＲ１が、
ａ）配列番号：１８１〜２１０、又は
ｂ）配列番号：１８２のアミノ酸配列に対して、４、３、２、もしくは１つのアミノ酸差を有するアミノ酸配列、ここで、
−１位において、Ｇが、ＬもしくはＲに変更されており、
−２位において、Ｌが、Ｆ、Ｐ、もしくはＩに変更されており、
−３位において、Ｌが、ＰもしくはＦに変更されており、
−４位において、Ｆが、Ｓ、ＬもしくはＩに変更されており、
−５位において、Ｓが、ＩもしくはＲに変更されており、
−６位において、Ｒが、Ｃ、Ａ、Ｐ、Ｖ、もしくはＬに変更されており、
−７位において、Ｎが、Ｈ、Ｐ、Ｉ、Ｍ、Ｙ、Ｔ、もしくはＤに変更されており、
−８位において、Ｓが、Ｔ、Ｒ、もしくはＩに変更されており、
−９位において、Ａが、ＶもしくはＴに変更されており、及び／又は
−１０位において、Ｇが、Ｓ、Ｒ、もしくはＶに変更されている、
からなる群より選択され、
及び／又は
ｉｉ）ＣＤＲ２が、
ｃ）配列番号：２６８〜２８９及び配列番号：５４１〜５５５、又は
ｄ）配列番号：２６９のアミノ酸配列に対して、４、３、２、もしくは１つのアミノ酸差を有するアミノ酸配列、ここで、
−１位において、Ｒが、ＧもしくはＣに変更されており、
−２位において、Ｉが、Ｖ、Ｔ、Ｓ、もしくはＬに変更されており、
−３位において、Ｒが、ＧもしくはＬに変更されており、
−４位において、Ｍが、Ｓ、Ｒ、Ａ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｐ、Ｑ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、Ｉ、もしくはＴに変更されており、
−５位において、Ｇが、Ｖ、Ｓ、もしくはＴに変更されており、
−７位において、Ｓが、Ｇ、Ｃ、Ｄ、もしくはＥに変更されており、及び／又は
−８位において、Ｉが、Ｔ、Ｍ、もしくはＲに変更されている、
からなる群より選択され、
及び／又は
ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、
ｅ）配列番号：３９３〜４１５、又は
ｆ）配列番号：３９７のアミノ酸配列に対して、３、２、もしくは１つのアミノ酸差を有するアミノ酸配列、ここで、
−１位において、Ｗが、Ｇに変更されており、
−３位において、Ｅが、Ｔ、Ｋ、Ｇ、ＡもしくはＩに変更されており、
−４位において、Ｇが、ＥもしくはＤに変更されており、
−５位において、Ｆが、Ａ、Ｌ、Ｖ、Ｙ、Ｔ、もしくはＳに変更されており、
−６位において、Ｙが、ＦもしくはＤに変更されており、
−７位において、Ｅが、ＧもしくはＫに変更されており、
−８位において、Ｙが、ＳもしくはＨに変更されており、及び／又は
−９位において、Ｗが、Ｓ、Ｇ、もしくはＣに変更されている、
からなる群より選択される、請求項７又は８記載の免疫グロブリン。
【請求項１０】
ｉ）ＣＤＲ１が、
ａ）配列番号：１８１〜２１０、又は
ｂ）配列番号：１８２のアミノ酸配列に対して、４、３、２、もしくは１つのアミノ酸差を有するアミノ酸配列、ここで、
−１位において、Ｇが、ＬもしくはＲに変更されており、
−２位において、Ｌが、Ｆ、Ｐ、もしくはＩに変更されており、
−３位において、Ｌが、ＰもしくはＦに変更されており、
−４位において、Ｆが、Ｓ、ＬもしくはＩに変更されており、
−５位において、Ｓが、ＩもしくはＲに変更されており、
−６位において、Ｒが、Ｃ、Ａ、Ｐ、Ｖ、もしくはＬに変更されており、
−７位において、Ｎが、Ｈ、Ｐ、Ｉ、Ｍ、Ｙ、Ｔ、もしくはＤに変更されており、
−８位において、Ｓが、Ｔ、Ｒ、もしくはＩに変更されており、
−９位において、Ａが、ＶもしくはＴに変更されており、及び／又は
−１０位において、Ｇが、Ｓ、Ｒ、もしくはＶに変更されている、
からなる群より選択され、
及び
ｉｉ）ＣＤＲ２が、
ｃ）配列番号：２６８〜２８９及び配列番号：５４１〜５５５、又は
ｄ）配列番号：２６９のアミノ酸配列に対して、４、３、２、もしくは１つのアミノ酸差を有するアミノ酸配列、ここで、
−１位において、Ｒが、ＧもしくはＣに変更されており、
−２位において、Ｉが、Ｖ、Ｔ、Ｓ、もしくはＬに変更されており、
−３位において、Ｒが、ＧもしくはＬに変更されており、
−４位において、Ｍが、Ｓ、Ｒ、Ａ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｐ、Ｑ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、Ｉ、もしくはＴに変更されており、
−５位において、Ｇが、Ｖ、Ｓ、もしくはＴに変更されており、
−７位において、Ｓが、Ｇ、Ｃ、Ｄ、もしくはＥに変更されており、及び／又は
−８位において、Ｉが、Ｔ、Ｍ、もしくはＲに変更されている、
からなる群より選択され、
及び
ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、
ｅ）配列番号：３９３〜４１５、又は
ｆ）配列番号：３９７のアミノ酸配列に対して、３、２、もしくは１つのアミノ酸差を有するアミノ酸配列、ここで、
−１位において、Ｗが、Ｇに変更されており、
−３位において、Ｅが、Ｔ、Ｋ、Ｇ、ＡもしくはＩに変更されており、
−４位において、Ｇが、ＥもしくはＤに変更されており、
−５位において、Ｆが、Ａ、Ｌ、Ｖ、Ｙ、Ｔ、もしくはＳに変更されており、
−６位において、Ｙが、ＦもしくはＤに変更されており、
−７位において、Ｅが、ＧもしくはＫに変更されており、
−８位において、Ｙが、ＳもしくはＨに変更されており、及び／又は
−９位において、Ｗが、Ｓ、Ｇ、もしくはＣに変更されている、
からなる群より選択される、請求項９記載の免疫グロブリン。
【請求項１１】
ｉ）ＣＤＲ１が、
ａ）配列番号：１８１〜１８５、又は
ｂ）配列番号：１８２のアミノ酸配列に対して、２もしくは１つのアミノ酸差を有するアミノ酸配列、ここで、
−６位において、Ｒが、ＡもしくはＶに変更されており、及び／又は
−９位において、Ａが、Ｖに変更されている、
からなる群より選択され、
及び／又は
ｉｉ）ＣＤＲ２が、
ｃ）配列番号：２６８〜２７１、５４１、及び５４９、又は
ｄ）配列番号：２６９のアミノ酸配列に対して、４、３、２、もしくは１つのアミノ酸差を有するアミノ酸配列、ここで、
−２位において、Ｉが、Ｌに変更されており、
−４位において、Ｍが、Ｓ、Ｑ、Ａ、もしくはＴに変更されており、
−５位において、Ｇが、ＳもしくはＴに変更されており、及び／又は
−８位において、Ｉが、Ｔに変更されている、
からなる群より選択され、
及び／又は
ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、
ｅ）配列番号：３９３〜３９８、又は
ｆ）配列番号：３９７のアミノ酸配列に対して、３、２、もしくは１つのアミノ酸差を有するアミノ酸配列、ここで、
−３位において、Ｅが、ＴもしくはＩに変更されており、
−４位において、Ｇが、Ｅに変更されており、
−５位において、Ｆが、Ａに変更されており、及び／又は
−８位において、Ｙが、Ｈに変更されている、
からなる群より選択される、請求項７〜１０のいずれか一項記載の免疫グロブリン。
【請求項１２】
ｉ）ＣＤＲ１が、
ａ）配列番号：１８１〜１８５、又は
ｂ）配列番号：１８２のアミノ酸配列に対して、２もしくは１つのアミノ酸差を有するアミノ酸配列、ここで、
−６位において、Ｒが、ＡもしくはＶに変更されており、及び／又は
−９位において、Ａが、Ｖに変更されている、
からなる群より選択され、
及び
ｉｉ）ＣＤＲ２が、
ｃ）配列番号：２６８〜２７１、５４１、及び５４９、又は
ｄ）配列番号：２６９のアミノ酸配列に対して、４、３、２、もしくは１つのアミノ酸差を有するアミノ酸配列、ここで、
−２位において、Ｉが、Ｌに変更されており、
−４位において、Ｍが、Ｓ、Ｑ、Ａ、もしくはＴに変更されており、
−５位において、Ｇが、ＳもしくはＴに変更されており、及び／又は
−８位において、Ｉが、Ｔに変更されている、
からなる群より選択され、
及び
ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、
ｅ）配列番号：３９３〜３９８、又は
ｆ）配列番号：３９７のアミノ酸配列に対して、３、２、もしくは１つのアミノ酸差を有するアミノ酸配列、ここで、
−３位において、Ｅが、ＴもしくはＩに変更されており、
−４位において、Ｇが、Ｅに変更されており、
−５位において、Ｆが、Ａに変更されており、及び／又は
−８位において、Ｙが、Ｈに変更されている、
からなる群より選択される、請求項１１記載の免疫グロブリン。
【請求項１３】
前記免疫グロブリンが、
−ＣＤＲ１が配列番号：１８２であり、ＣＤＲ２が配列番号：２６９であり、ＣＤＲ３が配列番号：３９７であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：１８２であり、ＣＤＲ２が配列番号：２６９であり、ＣＤＲ３が配列番号：３９４であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：１８１であり、ＣＤＲ２が配列番号：２６８であり、ＣＤＲ３が配列番号：３９３であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：１８１であり、ＣＤＲ２が配列番号：２６８であり、ＣＤＲ３が配列番号：３９５であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：１８１であり、ＣＤＲ２が配列番号：２６８であり、ＣＤＲ３が配列番号：３９６であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：１８１であり、ＣＤＲ２が配列番号：２７０であり、ＣＤＲ３が配列番号：３９３であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：１８３であり、ＣＤＲ２が配列番号：２６８であり、ＣＤＲ３が配列番号：３９３であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：１８４であり、ＣＤＲ２が配列番号：２６８であり、ＣＤＲ３が配列番号：３９３であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：１８５であり、ＣＤＲ２が配列番号：２７１であり、ＣＤＲ３が配列番号：３９８であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：１８２であり、ＣＤＲ２が配列番号：５４１であり、ＣＤＲ３が配列番号：３９４であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：１８２であり、ＣＤＲ２が配列番号：５４１であり、ＣＤＲ３が配列番号：３９７であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：１８２であり、ＣＤＲ２が配列番号：５４９であり、ＣＤＲ３が配列番号：３９４であり；及び
−ＣＤＲ１が配列番号：１８２であり、ＣＤＲ２が配列番号：５４９であり、ＣＤＲ３が配列番号：３９７である、ポリペプチドからなる群より選択される、請求項１〜４又は請求項７〜１２のいずれか一項記載の免疫グロブリン。
【請求項１４】
４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）と、３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）とから本質的になり、ここで、
ｉ）ＣＤＲ１が、
ａ）配列番号：２１１〜２２６、又は
ｂ）配列番号：２１４のアミノ酸配列に対して、３、２、もしくは１つのアミノ酸差を有するアミノ酸配列
からなる群より選択され、
及び／又は、
ｉｉ）ＣＤＲ２が、
ｃ）配列番号：２９０〜３０９、又は
ｄ）配列番号：３０３のアミノ酸配列に対して、４、３、２、もしくは１つのアミノ酸差を有するアミノ酸配列
からなる群より選択され、
及び／又は
ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、
ｅ）配列番号：４１６〜４３５、又は
ｆ）配列番号：４２２のアミノ酸配列に対して、３、２、もしくは１つのアミノ酸差を有するアミノ酸配列
からなる群より選択される、請求項１記載の免疫グロブリン。
【請求項１５】
４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）と、３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）とから本質的になり、ここで、
ｉ）ＣＤＲ１が、
ａ）配列番号：２１１〜２２６、又は
ｂ）配列番号：２１４のアミノ酸配列に対して、３、２、もしくは１つのアミノ酸差を有するアミノ酸配列
からなる群より選択され、
及び
ｉｉ）ＣＤＲ２が、
ｃ）配列番号：２９０〜３０９、又は
ｄ）配列番号：３０３のアミノ酸配列に対して、４、３、２、もしくは１つのアミノ酸差を有するアミノ酸配列
からなる群より選択され、
及び
ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、
ｅ）配列番号：４１６〜４３５、又は
ｆ）配列番号：４２２のアミノ酸配列に対して、３、２、もしくは１つのアミノ酸差を有するアミノ酸配列
からなる群より選択される、請求項１４記載の免疫グロブリン。
【請求項１６】
ｉ）ＣＤＲ１が、
ａ）配列番号：２１１〜２２６、又は
ｂ）配列番号：２１４のアミノ酸配列に対して、３、２、もしくは１つのアミノ酸差を有するアミノ酸配列、ここで、
−１位において、Ｇが、Ｒ、Ａ、Ｖ、Ｓ、もしくはＫに変更されており、
−３位において、Ｔが、Ｎに変更されており、
−４位において、Ｆが、Ｌに変更されており、
−６位において、Ｎが、Ｓに変更されており、
−７位において、Ｆが、Ｙに変更されており、
−８位において、Ｇが、Ａに変更されており、及び／又は
−９位において、Ｍが、Ｖに変更されている、
からなる群より選択され、
及び／又は
ｉｉ）ＣＤＲ２が、
ｃ）配列番号：２９０〜３０９、又は
ｄ）配列番号：３０３のアミノ酸配列に対して、４、３、２、もしくは１つのアミノ酸差を有するアミノ酸配列、ここで、
−１位において、Ａが、Ｔに変更されており、
−２位において、Ｉが、Ｖに変更されており、
−５位において、Ｔが、ＳもしくはＡに変更されており、
−６位において、Ｇが、ＮもしくはＡに変更されており、
−７位において、Ｇが、ＳもしくはＲに変更されており、
−８位において、Ｈが、ＲもしくはＹに変更されており、
−９位において、Ｔが、ＩもしくはＫに変更されており、及び／又は
−１０位において、Ｙが、Ｆに変更されている、
からなる群より選択され、
及び／又は
ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、
ｅ）配列番号：４１６〜４３５、又は
ｆ）配列番号：４２２のアミノ酸配列に対して、３、２、もしくは１つのアミノ酸差を有するアミノ酸配列、ここで、
−４位において、Ｆが、ＹもしくはＳに変更されており、
−５位において、Ｇが、Ｄに変更されており、
−６位において、Ｄが、Ｇに変更されており、
−７位において、Ｇが、Ｄに変更されており、
−８位において、Ｔが、Ａに変更されており、
−９位において、Ｙが、Ｓに変更されており、
−１０位において、Ｙが、Ｆに変更されており、
−１２位において、Ｑが、Ｅに変更されており、
−１４位において、Ａが、Ｎ、Ｔ、Ｉ、もしくはＲに変更されており、
−１７位において、Ｄが、ＮもしくはＧに変更されており、及び／又は
−１８位において、Ｆが、Ｌに変更されている、
からなる群より選択される、請求項１４又は１５記載の免疫グロブリン。
【請求項１７】
ｉ）ＣＤＲ１が、
ａ）配列番号：２１１〜２２６、又は
ｂ）配列番号：２１４のアミノ酸配列に対して、３、２、もしくは１つのアミノ酸差を有するアミノ酸配列、ここで、
−１位において、Ｇが、Ｒ、Ａ、Ｖ、Ｓ、もしくはＫに変更されており、
−３位において、Ｔが、Ｎに変更されており、
−４位において、Ｆが、Ｌに変更されており、
−６位において、Ｎが、Ｓに変更されており、
−７位において、Ｆが、Ｙに変更されており、
−８位において、Ｇが、Ａに変更されており、及び／又は
−９位において、Ｍが、Ｖに変更されている、
からなる群より選択され、
及び
ｉｉ）ＣＤＲ２が、
ｃ）配列番号：２９０〜３０９、又は
ｄ）配列番号：３０３のアミノ酸配列に対して、４、３、２、もしくは１つのアミノ酸差を有するアミノ酸配列、ここで、
−１位において、Ａが、Ｔに変更されており、
−２位において、Ｉが、Ｖに変更されており、
−５位において、Ｔが、ＳもしくはＡに変更されており、
−６位において、Ｇが、ＮもしくはＡに変更されており、
−７位において、Ｇが、ＳもしくはＲに変更されており、
−８位において、Ｈが、ＲもしくはＹに変更されており、
−９位において、Ｔが、ＩもしくはＫに変更されており、及び／又は
−１０位において、Ｙが、Ｆに変更されている、
からなる群より選択され、
及び
ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、
ｅ）配列番号：４１６〜４３５、又は
ｆ）配列番号：４２２のアミノ酸配列に対して、３、２、もしくは１つのアミノ酸差を有するアミノ酸配列、ここで、
−４位において、Ｆが、ＹもしくはＳに変更されており、
−５位において、Ｇが、Ｄに変更されており、
−６位において、Ｄが、Ｇに変更されており、
−７位において、Ｇが、Ｄに変更されており、
−８位において、Ｔが、Ａに変更されており、
−９位において、Ｙが、Ｓに変更されており、
−１０位において、Ｙが、Ｆに変更されており、
−１２位において、Ｑが、Ｅに変更されており、
−１４位において、Ａが、Ｎ、Ｔ、Ｉ、もしくはＲに変更されており、
−１７位において、Ｄが、ＮもしくはＧに変更されており、及び／又は
−１８位において、Ｆが、Ｌに変更されている、
からなる群より選択される、請求項１６記載の免疫グロブリン。
【請求項１８】
前記免疫グロブリンが、
−ＣＤＲ１が配列番号：２１４であり、ＣＤＲ２が配列番号：３０３であり、ＣＤＲ３が配列番号：４２２であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２１１であり、ＣＤＲ２が配列番号：２９０であり、ＣＤＲ３が配列番号：４１６であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２１２であり、ＣＤＲ２が配列番号：２９１であり、ＣＤＲ３が配列番号：４１７であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２１３であり、ＣＤＲ２が配列番号：２９２であり、ＣＤＲ３が配列番号：４１８であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２１３であり、ＣＤＲ２が配列番号：２９３であり、ＣＤＲ３が配列番号：４１８であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２１４であり、ＣＤＲ２が配列番号：２９４であり、ＣＤＲ３が配列番号：４１８であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２１５であり、ＣＤＲ２が配列番号：２９５であり、ＣＤＲ３が配列番号：４１７であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２１６であり、ＣＤＲ２が配列番号：２９６であり、ＣＤＲ３が配列番号：４１９であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２１３であり、ＣＤＲ２が配列番号：２９５であり、ＣＤＲ３が配列番号：４１８であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２１４であり、ＣＤＲ２が配列番号：２９５であり、ＣＤＲ３が配列番号：４１８であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２１１であり、ＣＤＲ２が配列番号：２９７であり、ＣＤＲ３が配列番号：４２０であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２１５であり、ＣＤＲ２が配列番号：２９８であり、ＣＤＲ３が配列番号：４２１であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２１７であり、ＣＤＲ２が配列番号：２９９であり、ＣＤＲ３が配列番号：４２２であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２１１であり、ＣＤＲ２が配列番号：２９８であり、ＣＤＲ３が配列番号：４１８であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２１２であり、ＣＤＲ２が配列番号：２９１であり、ＣＤＲ３が配列番号：４２３であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２１２であり、ＣＤＲ２が配列番号：３００であり、ＣＤＲ３が配列番号：４１８であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２１４であり、ＣＤＲ２が配列番号：３０１であり、ＣＤＲ３が配列番号：４１８であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２１５であり、ＣＤＲ２が配列番号：３００であり、ＣＤＲ３が配列番号：４２４であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２１１であり、ＣＤＲ２が配列番号：３０２であり、ＣＤＲ３が配列番号：４１６であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２１８であり、ＣＤＲ２が配列番号：２９１であり、ＣＤＲ３が配列番号：４２５であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２１８であり、ＣＤＲ２が配列番号：２９１であり、ＣＤＲ３が配列番号：４２６であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２１３であり、ＣＤＲ２が配列番号：３０３であり、ＣＤＲ３が配列番号：４２２であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２１８であり、ＣＤＲ２が配列番号：２９１であり、ＣＤＲ３が配列番号：４１７であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２１９であり、ＣＤＲ２が配列番号：２９６であり、ＣＤＲ３が配列番号：４２７であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２１３であり、ＣＤＲ２が配列番号：３０４であり、ＣＤＲ３が配列番号：４２８であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２２０であり、ＣＤＲ２が配列番号：３０５であり、ＣＤＲ３が配列番号：４１６であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２１３であり、ＣＤＲ２が配列番号：３０３であり、ＣＤＲ３が配列番号：４２１であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２２０であり、ＣＤＲ２が配列番号：２９６であり、ＣＤＲ３が配列番号：４２９であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２２１であり、ＣＤＲ２が配列番号：３０５であり、ＣＤＲ３が配列番号：４１６であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２２２であり、ＣＤＲ２が配列番号：３０５であり、ＣＤＲ３が配列番号：４３０であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２１３であり、ＣＤＲ２が配列番号：３０６であり、ＣＤＲ３が配列番号：４１８であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２２３であり、ＣＤＲ２が配列番号：３０３であり、ＣＤＲ３が配列番号：４２２であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２１５であり、ＣＤＲ２が配列番号：２９８であり、ＣＤＲ３が配列番号：４３１であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２２０であり、ＣＤＲ２が配列番号：２９６であり、ＣＤＲ３が配列番号：４３２であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２２４であり、ＣＤＲ２が配列番号：３００であり、ＣＤＲ３が配列番号：４１８であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２２０であり、ＣＤＲ２が配列番号：３０７であり、ＣＤＲ３が配列番号：４３３であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２２５であり、ＣＤＲ２が配列番号：３００であり、ＣＤＲ３が配列番号：４１８であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２２６であり、ＣＤＲ２が配列番号：３０８であり、ＣＤＲ３が配列番号：４３４であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２１２であり、ＣＤＲ２が配列番号：２９５であり、ＣＤＲ３が配列番号：４１７であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２１３であり、ＣＤＲ２が配列番号：３０１であり、ＣＤＲ３が配列番号：４２６であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２１２であり、ＣＤＲ２が配列番号：３０５であり、ＣＤＲ３が配列番号：４１７であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２１７であり、ＣＤＲ２が配列番号：３０５であり、ＣＤＲ３が配列番号：４２２であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２１５であり、ＣＤＲ２が配列番号：２９８であり、ＣＤＲ３が配列番号：４３５であり；及び
−ＣＤＲ１が配列番号：２１３であり、ＣＤＲ２が配列番号：３０９であり、ＣＤＲ３が配列番号：４１８である、ポリペプチドからなる群より選択される、請求項１又は請求項１４〜１７のいずれか一項記載の免疫グロブリン。
【請求項１９】
前記免疫グロブリンが、ドメイン抗体、ドメイン抗体として使用するのに適した免疫グロブリン、シングルドメイン抗体、シングルドメイン抗体として使用するのに適した免疫グロブリン、ｄＡｂ、ｄＡｂとして使用するのに適した免疫グロブリン、ナノボディ、ＶＨＨ配列、ヒト化ＶＨＨ配列、ラクダ化ＶＨ配列、又は親和性成熟により得られたＶＨＨ配列から本質的になる、請求項１〜１８のいずれか一項記載の免疫グロブリン。
【請求項２０】
前記免疫グロブリンが、配列番号：１〜１２３、４９５、４９８〜５１３、及び５２３〜５４０を有する免疫グロブリン、又は、配列番号：１〜１２３、４９５、４９８〜５１３、及び５２３〜５４０に対して、８０％超の配列同一性を有する免疫グロブリンからなる群より選択される、請求項１〜１９のいずれか一項記載の免疫グロブリン。
【請求項２１】
前記免疫グロブリンが、配列番号：１〜１２３、４９５、４９８〜５１３、及び５２３〜５４０からなる群より選択される、請求項１〜２０のいずれか一項記載の免疫グロブリン。
【請求項２２】
前記Ｋｖ１．３が、ヒトＫｖ１．３である、請求項１〜２１のいずれか一項記載の免疫グロブリン。
【請求項２３】
前記免疫グロブリンが、配列番号：１〜１２３、４９５、４９８〜５１３、及び５２３〜５４０を有する少なくとも１つのポリペプチドのＫｖ１．３への結合をクロスブロックし、及び／又は、配列番号：１〜１２３、４９５、４９８〜５１３、及び５２３〜５４０を有する少なくとも１つのポリペプチドにより、Ｋｖ１．３に結合するのをクロスブロックされる、請求項１〜２２のいずれか一項記載の免疫グロブリン。
【請求項２４】
請求項１〜２３のいずれか一項記載の１つ以上の免疫グロブリンを含むか、又は、同免疫グロブリンから本質的になる、
ポリペプチド。
【請求項２５】
請求項１〜２３のいずれか一項記載の少なくとも２つの免疫グロブリンを含むか、又は、同免疫グロブリンから本質的になる、請求項２４記載のポリペプチド。
【請求項２６】
前記少なくとも２つの免疫グロブリンが、同じか又は異なることができる、請求項２５記載のポリペプチド。
【請求項２７】
前記少なくとも２つの免疫グロブリンが、互いに直接連結しているか、又は、リンカーを介して互いに連結している、請求項２５又は２６記載のポリペプチド。
【請求項２８】
リンカーが、配列番号：４７９〜４９４を有するリンカーからなる群より選択される、請求項２７記載のポリペプチド。
【請求項２９】
前記ポリペプチドが、配列番号：４５１〜４７３、４９６〜４９７、及び５１４〜５２２を有するポリペプチド、又は、配列番号：４５１〜４７３、４９６〜４９７、及び５１４〜５２２に対して、８０％超の配列同一性を有するポリペプチドからなる群より選択される、請求項２４〜２８のいずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項３０】
前記ポリペプチドが、配列番号：４５１〜４７３、４９６〜４９７、及び５１４〜５２２からなる群より選択される、請求項２４〜２９のいずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項３１】
請求項１〜２３のいずれか一項記載の免疫グロブリン又は請求項２４〜３０のいずれか一項記載のポリペプチドを含むか、又は、これらから本質的になり、場合により、１つ以上のペプチドリンカーを介して連結している、１つ以上の他の基、残基、部分、又は結合ユニットを更に含む、
化合物又は構築物。
【請求項３２】
対応する請求項１〜２３のいずれか一項記載の免疫グロブリン又は請求項２４〜３０のいずれか一項記載のポリペプチド自体と比較して、延長した半減期を有する、請求項３１記載の化合物又は構築物。
【請求項３３】
前記１つ以上の他の基、残基、部分、又は結合ユニットが、対応する請求項１〜２３のいずれか一項記載の免疫グロブリン又は請求項２４〜３０のいずれか一項記載のポリペプチドと比較して、延長した半減期を有するポリペプチドを提供する、請求項３２記載の化合物又は構築物。
【請求項３４】
延長した半減期を有する免疫グロブリン又はポリペプチドを提供する前記１つ以上の他の基、残基、部分、又は結合ユニットが、ポリエチレングリコール分子、血清タンパク質又はそのフラグメント、血清タンパク質に結合することができる結合ユニット、Ｆｃ部分、及び、血清タンパク質に結合することができる小型タンパク質又はペプチドからなる群より選択される、請求項３３記載の化合物又は構築物。
【請求項３５】
延長した半減期を有する免疫グロブリン又はポリペプチドを提供する前記１つ以上の他の基、残基、部分、又は結合ユニットが、ヒト血清アルブミン又はそのフラグメントからなる群より選択される、請求項３３又は３４記載の化合物又は構築物。
【請求項３６】
延長した半減期を有するポリペプチドを提供する前記１つ以上の他の結合ユニットが、血清アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）又は血清免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ）に結合することができる結合ユニットからなる群より選択される、請求項３３又は３４記載の化合物又は構築物。
【請求項３７】
延長した半減期を有するポリペプチドを提供する前記１つ以上の他の結合ユニットが、血清アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）又は血清免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ）に結合することができる、ドメイン抗体、ドメイン抗体として使用するのに適したアミノ酸、シングルドメイン抗体、シングルドメイン抗体として使用するのに適したアミノ酸、「ｄＡｂ」、ｄＡｂとして使用するのに適したアミノ酸、ナノボディ、ＶＨＨ配列、ヒト化ＶＨＨ配列、ラクダ化ＶＨ配列からなる群より選択される、請求項３６記載の化合物又は構築物。
【請求項３８】
前記化合物又は構築物が、配列番号：４６１〜４７３、４９６〜４９７、及び５１４〜５２２を有する化合物もしくは構築物、又は、配列番号：４６１〜４７３、４９６〜４９７、及び５１４〜５２２に対して、８０％超の配列同一性を有する化合物もしくは構築物からなる群より選択される、請求項３７記載の化合物又は構築物。
【請求項３９】
前記化合物又は構築物が、配列番号：４６１〜４７３、４９６〜４９７、及び５１４〜５２２からなる群より選択される、請求項３７〜３９のいずれか一項記載の化合物又は構築物。
【請求項４０】
対応する請求項１〜２３のいずれか一項記載の免疫グロブリン又は請求項２４〜３０のいずれか一項記載のポリペプチド自体の半減期より、少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも２倍、例えば、少なくとも５倍、例えば、少なくとも１０倍、又は２０倍超の血清半減期を有する、請求項３６〜３９のいずれか一項記載の化合物又は構築物。
【請求項４１】
対応する請求項１〜２３のいずれか一項記載の免疫グロブリン又は請求項２４〜３０のいずれか一項記載のポリペプチド自体と比較して、１時間超、好ましくは２時間超、より好ましくは６時間超、例えば、１２時間超、又は更に、２４、４８、もしくは７２時間超延長した血清半減期を有する、請求項３６〜４０のいずれか一項記載の化合物又は構築物。
【請求項４２】
少なくとも約１２時間、好ましくは少なくとも２４時間、より好ましくは少なくとも４８時間、更により好ましくは少なくとも７２時間以上、例えば、少なくとも５日（例えば、約５〜１０日）、好ましくは少なくとも９日（例えば、約９〜１４日）、より好ましくは少なくとも約１０日（例えば、約１０〜１５日）、又は少なくとも約１１日（例えば、約１１〜１６日）、より好ましくは少なくとも約１２日（例えば、約１２〜１８日以上）、又は１４日超（例えば、約１４〜１９日）のヒトにおける血清半減期を有する、請求項３６〜４１のいずれか一項記載の化合物又は構築物。
【請求項４３】
請求項１〜２３のいずれか一項記載の免疫グロブリン、請求項２４〜３０のいずれか一項記載のポリペプチド、又は請求項３１〜４２のいずれか一項記載の化合物もしくは構築物をコードする、
核酸。
【請求項４４】
請求項４３記載の核酸を含む、
発現ベクター。
【請求項４５】
請求項４３記載の核酸又は請求項４４記載の発現ベクターを含む、
ホスト又はホスト細胞。
【請求項４６】
請求項１〜２３のいずれか一項記載の免疫グロブリン、請求項２４〜３０のいずれか一項記載のポリペプチド、請求項３１〜４２のいずれか一項記載の化合物もしくは構築物、又は請求項４３記載の核酸の内の少なくとも１つを含む、
組成物。
【請求項４７】
医薬組成物である、請求項４６記載の組成物。
【請求項４８】
少なくとも１つの薬学的に許容し得る単体、希釈剤、もしくは賦形剤、及び／又は補助剤を更に含み、及び場合により、１つ以上の更なる薬学活性ポリペプチド及び／又は化合物を含む、請求項４７記載の組成物。
【請求項４９】
医薬として使用するための、請求項４６〜４８のいずれか一項記載の組成物、請求項１〜２３のいずれか一項記載の免疫グロブリン、請求項２４〜３０のいずれか一項記載のポリペプチド、請求項３１〜４２のいずれか一項記載の化合物又は構築物。
【請求項５０】
Ｔ細胞からのカリウムイオンの流出を減少させ、及び／又は、阻害するのに使用するための、請求項４９記載の組成物、免疫グロブリン、ポリペプチド、又は化合物もしくは構築物。
【請求項５１】
Ｔ細胞の活性化及び／又は増殖を阻害する、及び／又は、ブロックするのに使用するための、請求項４９記載の組成物、免疫グロブリン、ポリペプチド、又は化合物もしくは構築物。
【請求項５２】
活性化されたＴ細胞を阻害する、及び／又は、ブロックするのに使用するための、請求項４９記載の組成物、免疫グロブリン、ポリペプチド、又は化合物もしくは構築物。
【請求項５３】
Ｔ細胞媒介性疾患の予防及び／又は治療に使用するための、請求項４９記載の組成物、免疫グロブリン、ポリペプチド、又は化合物もしくは構築物。
【請求項５４】
自己免疫疾患の予防及び／又は治療に使用するための、請求項４９記載の組成物、免疫グロブリン、ポリペプチド、又は化合物もしくは構築物。
【請求項５５】
Ｋｖ１．３関連疾患、障害、又は症状の治療又は予防に使用するための、請求項４６〜４８のいずれか一項記載の組成物、請求項１〜２３のいずれか一項記載の免疫グロブリン、請求項２４〜３０のいずれか一項記載のポリペプチド、又は請求項３１〜４２のいずれか一項記載の化合物もしくは構築物。
【請求項５６】
前記疾患、障害、又は症状が、多発性硬化症、関節リウマチ、１型糖尿病、２型糖尿病、乾癬、炎症性腸疾患、接触媒介性皮膚炎、乾癬性関節炎、喘息、アレルギー、再狭窄、全身性硬化症、線維症、強皮症、糸球体腎炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、シェーグレン症候群、アルツハイマー病、炎症性骨吸収、全身性エリテマトーデス、潰瘍性大腸炎、肥満、移植片対宿主疾患、移植拒絶、血管炎、抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）関連血管炎（ＡＡＶ）、ブドウ膜炎、及び遅延型過敏から選択される、請求項５５記載の組成物、免疫グロブリン、ポリペプチド、又は化合物もしくは構築物。
【請求項５７】
少なくとも下記、
ａ）適切なホスト細胞又はホスト生物中において、又は、別の適切な発現系において、請求項４３記載の核酸配列を発現させる工程と、場合により続けて、
ｂ）請求項１〜２３のいずれか一項記載の免疫グロブリン又は請求項２４〜３０のいずれか一項記載のポリペプチドを単離し、及び／又は、精製する工程とを含む、
請求項１〜２３のいずれか一項記載の免疫グロブリン又は請求項２４〜３０のいずれか一項記載のポリペプチドを製造するための方法。
【請求項５８】
Ｔ細胞からのカリウムイオンの流出を減少させ、及び／又は、阻害するための方法であって、薬学活性量の、請求項１〜２３のいずれか一項記載の免疫グロブリン、請求項２４〜３０のいずれか一項記載のポリペプチド、請求項３１〜４２のいずれか一項記載の化合物もしくは構築物、又は請求項４６〜４９のいずれか一項記載の組成物の内の少なくとも１つを投与することを含む、
方法。
【請求項５９】
Ｔ細胞の活性化及び／又は増殖を阻害する、及び／又は、ブロックするための方法であって、薬学活性量の、請求項１〜２３のいずれか一項記載の免疫グロブリン、請求項２４〜３０のいずれか一項記載のポリペプチド、請求項３１〜４２のいずれか一項記載の化合物もしくは構築物、又は請求項４６〜４９のいずれか一項記載の組成物の内の少なくとも１つを投与することを含む、
方法。
【請求項６０】
活性化されたＴ細胞を阻害する、及び／又は、ブロックするための方法であって、薬学活性量の、請求項１〜２３のいずれか一項記載の免疫グロブリン、請求項２４〜３０のいずれか一項記載のポリペプチド、請求項３１〜４２のいずれか一項記載の化合物もしくは構築物、又は請求項４６〜４９のいずれか一項記載の組成物の内の少なくとも１つを投与することを含む、
方法。
【請求項６１】
Ｔ細胞媒介性疾患の予防及び／又は治療のための方法であって、それを必要とする対象に、薬学活性量の、請求項１〜２３のいずれか一項記載の免疫グロブリン、請求項２４〜３０のいずれか一項記載のポリペプチド、請求項３１〜４２のいずれか一項記載の化合物もしくは構築物、又は請求項４６〜４９のいずれか一項記載の組成物の内の少なくとも１つを投与することを含む、
方法。
【請求項６２】
自己免疫疾患の予防及び／又は治療のための方法であって、それを必要とする対象に、薬学活性量の、請求項１〜２３のいずれか一項記載の免疫グロブリン、請求項２４〜３０のいずれか一項記載のポリペプチド、請求項３１〜４２のいずれか一項記載の化合物もしくは構築物、又は請求項４６〜４９のいずれか一項記載の組成物の内の少なくとも１つを投与することを含む、
方法。
【請求項６３】
Ｋｖ１．３関連疾患、障害、又は症状の予防及び／又は治療のための方法であって、それを必要とする対象に、薬学活性量の、請求項１〜２３のいずれか一項記載の免疫グロブリン、請求項２４〜３０のいずれか一項記載のポリペプチド、請求項３１〜４２のいずれか一項記載の化合物もしくは構築物、又は請求項４６〜４９のいずれか一項記載の組成物の内の少なくとも１つを投与することを含む、
方法。
【請求項６４】
前記疾患、障害、又は症状が、多発性硬化症、関節リウマチ、１型糖尿病、２型糖尿病、乾癬、炎症性腸疾患、接触媒介性皮膚炎、乾癬性関節炎、喘息、アレルギー、再狭窄、全身性硬化症、線維症、強皮症、糸球体腎炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、シェーグレン症候群、アルツハイマー病、炎症性骨吸収、全身性エリテマトーデス、潰瘍性大腸炎、肥満、移植片対宿主疾患、移植拒絶、血管炎、抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）関連血管炎（ＡＡＶ）、ブドウ膜炎、及び遅延型過敏から選択される、請求項６３記載の方法。
【請求項６５】
Ｔ細胞からのカリウムイオンの流出を減少させ、及び／又は、阻害するための医薬組成物の製造における、請求項１〜２３のいずれか一項記載の免疫グロブリン、請求項２４〜３０のいずれか一項記載のポリペプチド、請求項３１〜４２のいずれか一項記載の化合物もしくは構築物、又は請求項４６〜４９のいずれか一項記載の組成物の使用。
【請求項６６】
Ｔ細胞の活性化及び／又は増殖を阻害する、及び／又は、ブロックするための医薬組成物の製造における、請求項１〜２３のいずれか一項記載の免疫グロブリン、請求項２４〜３０のいずれか一項記載のポリペプチド、請求項３１〜４２のいずれか一項記載の化合物もしくは構築物、又は請求項４６〜４９のいずれか一項記載の組成物の使用。
【請求項６７】
活性化されたＴ細胞を阻害する、及び／又は、ブロックするための医薬組成物の製造における、請求項１〜２３のいずれか一項記載の免疫グロブリン、請求項２４〜３０のいずれか一項記載のポリペプチド、請求項３１〜４２のいずれか一項記載の化合物もしくは構築物、又は請求項４６〜４９のいずれか一項記載の組成物の使用。
【請求項６８】
Ｔ細胞媒介性疾患の予防及び／又は治療のための医薬組成物の製造における、請求項１〜２３のいずれか一項記載の免疫グロブリン、請求項２４〜３０のいずれか一項記載のポリペプチド、請求項３１〜４２のいずれか一項記載の化合物もしくは構築物、又は請求項４６〜４９のいずれか一項記載の組成物の使用。
【請求項６９】
自己免疫疾患の予防及び／又は治療のための医薬組成物の製造における、請求項１〜２３のいずれか一項記載の免疫グロブリン、請求項２４〜３０のいずれか一項記載のポリペプチド、請求項３１〜４２のいずれか一項記載の化合物もしくは構築物、又は請求項４６〜４９のいずれか一項記載の組成物の使用。
【請求項７０】
少なくとも１つのＫｖ１．３関連疾患、障害、もしくは症状の予防及び／又は治療のための医薬組成物の製造における、及び／又は、請求項５７〜６４のいずれか一項記載の１つ以上の方法に使用するための、請求項１〜２３のいずれか一項記載の免疫グロブリン、請求項２４〜３０のいずれか一項記載のポリペプチド、請求項３１〜４２のいずれか一項記載の化合物もしくは構築物、又は請求項４６〜４９のいずれか一項記載の組成物の使用。
【請求項７１】
前記疾患、障害、又は症状が、多発性硬化症、関節リウマチ、１型糖尿病、２型糖尿病、乾癬、炎症性腸疾患、接触媒介性皮膚炎、乾癬性関節炎、喘息、アレルギー、再狭窄、全身性硬化症、線維症、強皮症、糸球体腎炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、シェーグレン症候群、アルツハイマー病、炎症性骨吸収、全身性エリテマトーデス、潰瘍性大腸炎、肥満、移植片対宿主疾患、移植拒絶、血管炎、抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）関連血管炎（ＡＡＶ）、ブドウ膜炎、及び遅延型過敏から選択される、請求項７０記載の免疫グロブリンの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｋｖ１．３に結合する免疫グロブリン、及びとりわけ、１つ以上のこのような免疫グロブリンを含むか、又は、同免疫グロブリンから本質的になるポリペプチド（本明細書において、それぞれ「本発明の免疫グロブリン」及び「本発明のポリペプチド」とも呼ばれる）に関する。
【０００２】
また、本発明は、このようなポリペプチドをコードする核酸（本明細書において、「本発明の核酸」とも呼ばれる）、このようなポリペプチドを製造するための方法、このようなポリペプチドを発現するか、又は、発現可能なホスト細胞、このようなポリペプチド、核酸、及び／又はホスト細胞を含む組成物、及び特に、医薬組成物、ならびに、特に、予防及び／又は治療の目的、例えば、本明細書で言及された予防及び／又は治療の目的での、ポリペプチド、核酸、ホスト細胞、及び／又は組成物の使用に関する。
【０００３】
本発明の他の態様、実施態様、利点、及び用途は、本明細書における更なる説明から明らかとなるであろう。
【背景技術】
【０００４】
イオンチャネルは、膜を通過するイオンの選択的流動を制御することにより、電気的なシグナル伝達プロセス中のイオンの急速な移動を可能にする、複雑な膜孔形成膜タンパク質である。イオンチャネルは、全ての生細胞の膜に存在し、静止膜電位、活動電位の形状、及び、細胞膜を通過するイオンの流れをゲーティングすることによる他の電気的シグナルを確立するのに重要である。
【０００５】
多くのチャネルは、イオン流が特定の刺激、例えば、リガンド会合、機械的応力、ｐＨ、又は膜電圧に対する応答においてのみトリガーされるように、ゲーティングされる（すなわち、イオンチャネル孔が開閉される）。その結果に従って、イオンチャネルは分類されてきた。チャネルゲーティング用の細胞膜間の電位差に応答するイオンチャネル（例えば、Ｋ、Ｎａ、Ｃａ、ＨＣＮ、及びＴＲＰチャネル）の大きなグループは、複数の構造的類似性を共有している。これらのチャネルは、共通する祖先から進化して、「電位作動型様（ＶＧＬ）イオンチャネルＣｈａｎｏｍｅ」として共に分類されてきたと考えられている（Yu et al., Pharmacol Rev 57(4): 387-95, 2005）（非特許文献１）。他のイオンチャネル、例えば、Ｃｌチャネル、アクアポリン、及びコネクシンは、全く別に進化してきており、ＶＧＬチャネルとは完全に異なる構造的特性を示す。
【０００６】
Ｋｖ１．３チャネルは、これらの電位作動型様イオンチャネルに代表的な全体的なトポロジーを有するカリウム選択的電位作動型イオンチャネルである。構造的に、Ｋｖ１．３は、ホモ四量体構成で存在し、ここで、各モノマーは、６つの膜貫通セグメント（Ｓ１〜Ｓ６）からなり、Ｓ５〜Ｓ６領域は、孔を形成する。６つの膜貫通ドメインは、ＥＬ１〜ＥＬ３と呼ばれる３つの細胞外ループにより互いに連結している。ＥＬ１〜ＥＬ３は、外側からアクセス可能である。このチャネルのＮ末端及びＣ末端は両方とも、細胞の細胞内側に位置しており、補助サブユニットと会合することができる（図１）。第１の細胞外ループＥＬ１は、第１及び第２の膜貫通セグメント（Ｓ１〜Ｓ２）を連結している。第３及び第４の膜貫通セグメント（Ｓ３〜Ｓ４）間の連結ループにより形成された電圧センサーの上部は、第２の細胞外アクセス可能領域ＥＬ２を構成している。電圧センサーがゲーティングプロセス中に実質的に動くため、おそらく、この潜在的なエピトープのコンフォーメーションは、このチャネルのゲーティングプロセスにより変更されるものである。最後の細胞外領域ＥＬ３は、チャネル孔の上部を裏打ちする孔へリックスを有する４つの構成サブユニットの第５及び第６の膜貫通セグメント（Ｓ５〜Ｓ６）により形作られる孔領域である。各膜貫通タンパク質Ｓ１〜Ｓ６のアミノ酸位置は、UniProtKB/Swiss-Protデータベースにより提供されている。細胞外ループＥＬ１のアミノ酸配列は、膜貫通領域Ｓ１の後から始まり、Ｓ２で終わる。細胞外ループＥＬ２のアミノ酸配列は、膜貫通領域Ｓ３の後から始まり、Ｓ４で終わる。細胞外ループＥＬ３のアミノ酸配列は、膜貫通領域Ｓ５の後から始まり、Ｓ６で終わる。カリウムイオンがこのイオンチャネルを通過して輸送されるメカニズム及びカリウムイオンに対するその選択性のための分子メカニズムは、Yellen et al.（Q Rev Biophys 31(3):239-95, 1998）、Morais-Cabral et al.（Nature 414(6859):37, 2001）、Kurata and Fedida（Prog Biophys Mol Biol 92(2):185, 2006）、及びHoshi and Armstrong（J Gen Physiol  141(2):151, 2013）（非特許文献２〜５）に記載されている。
【０００７】
生理的に、このチャネルは、元々、ヒトの島細胞及びＴリンパ球において、カルシウム活性型カリウムチャネルと共に特定された。カルシウム活性型カリウムチャネルは、特定のサブセットのＴ細胞の活性化を支持する。特に、活性化されたエフェクターメモリーＴ細胞集団（ＴＥＭ）におけるＫｖ１．３のアップレギュレーション及び活性化は、カルシウム放出活性型チャネルを通した細胞内への持続性のカルシウム流入を可能し、シグナル伝達カスケード及び遺伝子レギュレーションの開始をもたらす。
【０００８】
このチャネルの阻害は、膜の脱分極をもたらし、この脱分極は、Ｔ細胞刺激に基づくリンパ球活性化に必要とされる細胞内Ｃａ２＋レベルを低下させ、ｉｎ  ｖｉｖｏでの免疫応答を阻害する。今日、疾患に対するＫｖ１．３の関連性が、複数の動物及びヒトの研究により証明されてきた。自己免疫環境、例えば、ＭＳ、１型糖尿病、又は関節リウマチにおける疾患関連Ｔ細胞を処置するターゲットとしてのその可能性が、広く調査されてきた（Ther Adv Neurol Disord 6(5): 322-36, 2013）（非特許文献６）。
【０００９】
Ｋｖ１．３イオンチャネル機能のモデュレーターは、典型的には、小分子ならびに植物及び毒液から得られるペプチドトキシンを含む。複数の天然毒フラグメントが特定されており、Ｋｖ１．３の第３の細胞外（ＥＬ３）領域、すなわち、孔領域に結合する特徴を有する（Zhu et al., Mol Cell Proteomics 10(2): M110.002832, 2011；Bergeron and Bingham, Toxins 4(11): 1082-1119, 2012）（非特許文献７及び８）。Ｋｖ１．３のこの領域は、特に興味深いと考えられる。ＥＬ３への結合によるかく乱は、おそらくコンダクタンスに影響を及ぼすであろうためである。トキシンペプチドの結合は、孔を物理的に塞ぐことにより、Ｋ＋イオンの流れを停止させる。ただし、この孔領域がＫｖ１．３のファミリーメンバー間で比較的保存されているため、これらの天然毒は、ファミリーメンバーの内の１つに対する高い特異性を欠く傾向にある。生きた生物中のＫｖ１．３イオンチャネルの普遍的な分布を考えれば、Ｋｖ１．３に対するこの選択性の欠如は、治療剤として天然毒を使用するための大きな障害である。製薬業界及び大学の研究者は、この特異性の欠点を改善するために、いくつかの成功とともに相当な操作上の試行錯誤を費やしてきた（Chi et al., Toxicon 59(4): 529-46, 2012；Berkut et al., J Biol Chem 289: 14331-14340, 2014；Takacs et al., PNAS 106(52): 22211-22216, 2009）（非特許文献９〜１１）。さらに、このような詳細な操作は、各トキシンペプチド個々に必要とされるであろう。この必要性には、時間を費やされ、プロセスに費用がかかる。dalazatide（以前は、ＳｈＫ−１８６）は、イソギンチャクから得られたトキシンペプチドの例である。Dalazatideについては、近年、活動型尋常性乾癬を患う患者における陽性第１ｂ相臨床結果が報告されている（http://www.kinetabio.com/autoimmunediseases.html)（非特許文献１２）
【００１０】
天然毒ペプチドの次に、イオンチャネルをその機能においてブロックする試みにおいて、イオンチャネルに対する抗体も生成されてきた。抗体は明らかに望ましいが、その精巧な特異性のために、機能的にブロックする抗体を生成するのは容易ではなかった。イオンチャネルに対するＦＤＡ認可抗体系治療剤が存在しないのは、これに関する典型である。
【００１１】
ここまで、少なくとも１１個のイオンチャネルが、第３の細胞外ループに結合する抗体の生成によりターゲットにされてきた（Naylor and Beech, Methods Mol Biol 998:245-56, 2013）（非特許文献１３）。不幸なことに、多くの場合、これらのツール抗体は、ポリクローナル抗体であった。プール中の機能的なモノクローナル抗体を単離する試みは、全活性の損失をもたらした。さらに、イオン流を妨げる有効性が限られていることが留意されてきた。孔領域が選択性フィルターに対する空洞を形成するため、イオン流を直接ブロックするような、全長ｍＡｂがこの領域内に入るのは困難である場合がある。１つの記載された抗体は、このチャネルの機能をブロックすると考えられるが、チャネルタンパク質のターンオーバーにおけるモデュレーションを通して、より機能すると考えられる（Yang et al., PlosOne 7(4): e36379, 2012）（非特許文献１４）。
【００１２】
明らかに、治療的な免疫抑制剤として使用するための改善された活性及び選択性を有するＫｖ１．３阻害剤についての必要性が広く認識された状態にある。さらに明らかに、加えて、保護性免疫応答を損なわない、改善された活性及び選択性を有するＫｖ１．３阻害剤についての必要性が広く認識された状態にある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Yu et al., Pharmacol Rev 57(4): 387-95, 2005
【非特許文献２】Q Rev Biophys 31(3):239-95, 1998
【非特許文献３】Nature 414(6859):37, 2001
【非特許文献４】Prog Biophys Mol Biol 92(2):185, 2006
【非特許文献５】J Gen Physiol  141(2):151, 2013
【非特許文献６】Ther Adv Neurol Disord 6(5): 322-36, 2013
【非特許文献７】Zhu et al., Mol Cell Proteomics 10(2): M110.002832, 2011
【非特許文献８】Bergeron and Bingham, Toxins 4(11): 1082-1119, 2012
【非特許文献９】Chi et al., Toxicon 59(4): 529-46, 2012
【非特許文献１０】Berkut et al., J Biol Chem 289: 14331-14340, 2014
【非特許文献１１】Takacs et al., PNAS 106(52): 22211-22216, 2009
【非特許文献１２】http://www.kinetabio.com/autoimmunediseases.html
【非特許文献１３】Naylor and Beech, Methods Mol Biol 998:245-56, 2013
【非特許文献１４】Yang et al., PlosOne 7(4): e36379, 2012
【発明の概要】
【００１４】
本発明は、従来技術のアミノ酸配列及び抗体と比較して、他の有利な特性（例えば、改善された調製の容易性、良好な安定性、及び／又は商品原価の低減等）に加えて、改善された予防的、治療的、及び／又は薬理学的特性を有する免疫グロブリンを提供する。
【００１５】
広範なスクリーニング、特徴決定、及びコンビナトリアル戦略に基づいて、本発明者らにより、驚くべきことに、Ｋｖ１．３の第１の細胞外ループＥＬ１上の特定のエピトープを認識する免疫グロブリンが異なってモデュレーションする活性、非常に改善された種間交叉反応性、及び精巧な選択性を示したことが観察された。より具体的には、本発明者らにより、驚くべきことに、例えば、電気生理学（IonFlux（商標）、Molecular Devices）により、Ｋｖ１．３に結合する１２５Ｉ−マルガトキシンのそのブロックにより、ならびにＴ細胞の活性化及び／又は増殖を阻害するその能力により証明されたように、Ｋｖ１．３の第１の細胞外ループ（ＥＬ１）に結合する免疫グロブリンが、このイオンチャネルの活性をモデュレーションする、及び／又は、部分的にもしくは完全にブロックすることができたことが観察された。
【００１６】
上記されたように、Ｋｖ１．３の孔チャネルは、Ｋｖ１．３の細胞外領域ＥＬ３により構成されている。したがって、ＥＬ１に結合し、Ｋｖ１．３活性をモデュレーションし、阻害し、及び／又は、ブロックもする免疫グロブリンの発見は予想されなかった。本発明の免疫グロブリンは、Ｋｖ１．３の孔チャネルをなるほど物理的にブロックすることができないが、むしろ、Ｋｖ１．３の孔の活性に間接的な影響を発揮するであろう。この間接的な影響は、本明細書において、（本明細書において更に定義された）アロステリックモデュレーションとも呼ばれる。
【００１７】
したがって、本発明は、カリウムチャネル３（Ｋｖ１．３）のＥＬ１細胞外ループに対し、及び／又は、（本明細書で定義されたように）特異的に結合することができる免疫グロブリンに関し、ここで、前記免疫グロブリンの前記ＥＬ１細胞外ループへの結合は、Ｋｖ１．３（特に、ヒトＫｖ１．３）の活性をモデュレーションする。とりわけ、本発明は、Ｋｖ１．３活性を部分的に又は完全にブロックすることにより、Ｋｖ１．３の活性をモデュレーションする免疫グロブリンを提供する。
【００１８】
上記されたように、Ｋｖ１．３チャネルは、カリウム選択的電位作動型イオンチャネルである。Ｋｖ１．３活性を部分的に又は完全にブロックすることは、Ｋｖ１．３チャネルを有する細胞からのカリウムイオンの流出を減少させ、又は更に、同流出を完全に阻害するであろう。したがって、また、本発明は、Ｋｖ１．３のＥＬ１細胞外ループに特異的に結合する免疫グロブリンに関し、前記免疫グロブリンの前記ＥＬ１細胞外ループへの結合は、Ｔ細胞からのカリウムイオンの流出を減少させ、又は更に、同流出を完全に阻害することにより、Ｋｖ１．３の活性をモデュレーションする。
【００１９】
特定の態様では、Ｔ細胞からのカリウムイオンの流出は、パッチクランプアッセイ法で測定された場合に、１０−７M以下、好ましくは１０−８M以下、より好ましくは１０−９M以下、又は更に１０−１０M以下のＩＣ５０値で阻害された。
【００２０】
さらに、天然毒で観察されたのとは逆に（天然毒は、ファミリーメンバーの内の１つに対する高い選択性を欠く傾向にある）、本発明の免疫グロブリンは、他の関連するＫｖイオンファミリーメンバーの１０００倍を超える選択性で、Ｋｖ１．３に対する高い特異性が示された。またしたがって、本発明は、Ｋｖ１．３のＥＬ１細胞外ループに特異的に結合する免疫グロブリンに関し、免疫グロブリンは、Ｋｖ１．３の活性をモデュレーションし、及び／又は、阻害することについて、他の関連するＫｖイオンチャネルファミリーメンバーより、１０倍超、１００倍超、好ましくは１０００倍超、及び更に、最大１００００倍以上の選択性を有する。
【００２１】
一態様において、本発明の免疫グロブリンは、配列番号：１〜６４、４９５、４９８〜５１３、及び５２３〜５４０のいずれか１つと比較して、その配列内に同じ数のアミノ酸を有し、配列番号：１〜６４、４９５、４９８〜５１３、及び５２３〜５４０のいずれか１つと比較して、８９％以上の配列同一性を有する、８位〜１０６位（Ｋａｂａｔナンバリングに従った）のアミノ酸配列を有する。
【００２２】
別の態様では、本発明の免疫グロブリンは、配列番号：６５〜１２３のいずれか１つと比較して、その配列内に同じ数のアミノ酸を有し、配列番号：６５〜１２３のいずれか１つと比較して、８９％以上の配列同一性を有する、８位〜１０６位（Ｋａｂａｔナンバリングに従った）のアミノ酸配列を有する。
【００２３】
好ましい態様では、本発明の免疫グロブリンは、ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４の構造を有し、ここで、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、本明細書で定義された通りである。ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４は、フレームワーク配列である。したがって、本発明は、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）と、３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）とから（本質的に）なり、ここで、
ｉ）ＣＤＲ１が、
ａ）配列番号：１８１〜２１０、又は
ｂ）配列番号：１８２のアミノ酸配列に対して、４、３、２、もしくは１つのアミノ酸差を有するアミノ酸配列
からなる群より選択され、
及び／又は
ｉｉ）ＣＤＲ２が、
ｃ）配列番号：２６８〜２８９及び配列番号：５４１〜５５５、又は
ｄ）配列番号：２６９のアミノ酸配列に対して、３、２、もしくは１つのアミノ酸差を有するアミノ酸配列
からなる群より選択され、
及び／又は
ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、
ｅ）配列番号：３９３〜４１５、又は
ｆ）配列番号：３９７のアミノ酸配列に対して、３、２、もしくは１つのアミノ酸差を有するアミノ酸配列
からなる群より選択される、免疫グロブリンに関する。
【００２４】
本発明の好ましい免疫グロブリンは、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）と、３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）とから（本質的に）なり、ここで、
ｉ）ＣＤＲ１が、
ａ）配列番号：１８１〜２１０、又は
ｂ）配列番号：１８２のアミノ酸配列に対して、４、３、２、もしくは１つのアミノ酸差を有するアミノ酸配列、ここで、
−１位において、Ｇが、ＬもしくはＲに変更されており、
−２位において、Ｌが、Ｆ、Ｐ、もしくはＩに変更されており、
−３位において、Ｌが、ＰもしくはＦに変更されており、
−４位において、Ｆが、Ｓ、ＬもしくはＩに変更されており、
−５位において、Ｓが、ＩもしくはＲに変更されており、
−６位において、Ｒが、Ｃ、Ａ、Ｐ、Ｖ、もしくはＬに変更されており、
−７位において、Ｎが、Ｈ、Ｐ、Ｉ、Ｍ、Ｙ、Ｔ、もしくはＤに変更されており、
−８位において、Ｓが、Ｔ、Ｒ、もしくはＩに変更されており、
−９位において、Ａが、ＶもしくはＴに変更されており、及び／又は
−１０位において、Ｇが、Ｓ、Ｒ、もしくはＶに変更されている、
からなる群より選択され、
及び／又は
ｉｉ）ＣＤＲ２が、
ｃ）配列番号：２６８〜２８９及び配列番号：５４１〜５５５、又は
ｄ）配列番号：２６９のアミノ酸配列に対して、４、３、２、もしくは１つのアミノ酸差を有するアミノ酸配列、ここで、
−１位において、Ｒが、ＧもしくはＣに変更されており、
−２位において、Ｉが、Ｖ、Ｔ、Ｓ、もしくはＬに変更されており、
−３位において、Ｒが、ＧもしくはＬに変更されており、
−４位において、Ｍが、Ｓ、Ｒ、Ａ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｐ、Ｑ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、Ｉ、もしくはＴに変更されており、
−５位において、Ｇが、Ｖ、Ｓ、もしくはＴに変更されており、
−７位において、Ｓが、Ｇ、Ｃ、Ｄ、もしくはＥに変更されており、及び／又は
−８位において、Ｉが、Ｔ、Ｍ、もしくはＲに変更されている、
からなる群より選択され、
及び／又は
ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、
ｅ）配列番号：３９３〜４１５、又は
ｆ）配列番号：３９７のアミノ酸配列に対して、３、２、もしくは１つのアミノ酸差を有するアミノ酸配列、ここで、
−１位において、Ｗが、Ｇに変更されており、
−３位において、Ｅが、Ｔ、Ｋ、Ｇ、ＡもしくはＩに変更されており、
−４位において、Ｇが、ＥもしくはＤに変更されており、
−５位において、Ｆが、Ａ、Ｌ、Ｖ、Ｙ、Ｔ、もしくはＳに変更されており、
−６位において、Ｙが、ＦもしくはＤに変更されており、
−７位において、Ｅが、ＧもしくはＫに変更されており、
−８位において、Ｙが、ＳもしくはＨに変更されており、及び／又は
−９位において、Ｗが、Ｓ、Ｇ、もしくはＣに変更されている、
からなる群より選択される。
【００２５】
特に、本発明の免疫グロブリンは、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）と、３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）とから（本質的に）なり、ここで、
ｉ）ＣＤＲ１が、
ａ）配列番号：１８１〜１８５、又は
ｂ）配列番号：１８２のアミノ酸配列に対して、２もしくは１つのアミノ酸差を有するアミノ酸配列、ここで、
−６位において、Ｒが、ＡもしくはＶに変更されており、及び／又は
−９位において、Ａが、Ｖに変更されている、
からなる群より選択され、
及び／又は
ｉｉ）ＣＤＲ２が、
ｃ）配列番号：２６８〜２７１、５４１、及び５４９、又は
ｄ）配列番号：２６９のアミノ酸配列に対して、４、３、２、もしくは１つのアミノ酸差を有するアミノ酸配列、ここで、
−２位において、Ｉが、Ｌに変更されており、
−４位において、Ｍが、Ｓ、Ｑ、Ａ、もしくはＴに変更されており、
−５位において、Ｇが、ＳもしくはＴに変更されており、及び／又は
−８位において、Ｉが、Ｔに変更されている、
からなる群より選択され、
及び／又は
ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、
ｅ）配列番号：３９３〜３９８、又は
ｆ）配列番号：３９７のアミノ酸配列に対して、４、３、２、もしくは１つのアミノ酸差を有するアミノ酸配列、ここで、
−３位において、Ｅが、ＴもしくはＩに変更されており、
−４位において、Ｇが、Ｅに変更されており、
−５位において、Ｆが、Ａに変更されており、及び／又は
−８位において、Ｙが、Ｈに変更されている、
からなる群より選択される。
【００２６】
別の態様では、本発明は、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）と、３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）とから（本質的に）なり、ここで、
ｉ）ＣＤＲ１が、
ａ）配列番号：２１１〜２２６、又は
ｂ）配列番号：２１４のアミノ酸配列に対して、３、２、もしくは１つのアミノ酸差を有するアミノ酸配列
からなる群より選択され、
及び／又は、
ｉｉ）ＣＤＲ２が、
ｃ）配列番号：２９０〜３０９、又は
ｄ）配列番号：３０３のアミノ酸配列に対して、４、３、２、もしくは１つのアミノ酸差を有するアミノ酸配列
からなる群より選択され、
及び／又は
ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、
ｅ）配列番号：４１６〜４３５、又は
ｆ）配列番号：４２２のアミノ酸配列に対して、４、３、２、もしくは１つのアミノ酸差を有するアミノ酸配列
からなる群より選択される、免疫グロブリンに関する。
【００２７】
好ましい免疫グロブリンは、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）と、３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）とから（本質的に）なり、ここで、
ｉ）ＣＤＲ１が、
ａ）配列番号：２１１〜２２６、又は
ｂ）配列番号：２１４のアミノ酸配列に対して、３、２、もしくは１つのアミノ酸差を有するアミノ酸配列、ここで、
−１位において、Ｇが、Ｒ、Ａ、Ｖ、Ｓ、もしくはＫに変更されており、
−３位において、Ｔが、Ｎに変更されており、
−４位において、Ｆが、Ｌに変更されており、
−６位において、Ｎが、Ｓに変更されており、
−７位において、Ｆが、Ｙに変更されており、
−８位において、Ｇが、Ａに変更されており、及び／又は
−９位において、Ｍが、Ｖに変更されている、
からなる群より選択され、
及び／又は
ｉｉ）ＣＤＲ２が、
ｃ）配列番号：２９０〜３０９、又は
ｄ）配列番号：３０３のアミノ酸配列に対して、４、３、２、もしくは１つのアミノ酸差を有するアミノ酸配列、ここで、
−１位において、Ａが、Ｔに変更されており、
−２位において、Ｉが、Ｖに変更されており、
−５位において、Ｔが、ＳもしくはＡに変更されており、
−６位において、Ｇが、ＮもしくはＡに変更されており、
−７位において、Ｇが、ＳもしくはＲに変更されており、
−８位において、Ｈが、ＲもしくはＹに変更されており、
−９位において、Ｔが、ＩもしくはＫに変更されており、及び／又は
−１０位において、Ｙが、Ｆに変更されている、
からなる群より選択され、
及び／又は
ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、
ｅ）配列番号：４１６〜４３５、又は
ｆ）配列番号：４２２のアミノ酸配列に対して、４、３、２、もしくは１つのアミノ酸差を有するアミノ酸配列、ここで、
−４位において、Ｆが、ＹもしくはＳに変更されており、
−５位において、Ｇが、Ｄに変更されており、
−６位において、Ｄが、Ｇに変更されており、
−７位において、Ｇが、Ｄに変更されており、
−８位において、Ｔが、Ａに変更されており、
−９位において、Ｙが、Ｓに変更されており、
−１０位において、Ｙが、Ｆに変更されており、
−１２位において、Ｑが、Ｅに変更されており、
−１４位において、Ａが、Ｎ、Ｔ、Ｉ、もしくはＲに変更されており、
−１７位において、Ｄが、ＮもしくはＧに変更されており、及び／又は
−１８位において、Ｆが、Ｌに変更されている、
からなる群より選択される。
【００２８】
好ましい態様では、本発明の免疫グロブリンは、
−ＣＤＲ１が配列番号：１８２であり、ＣＤＲ２が配列番号：２６９であり、ＣＤＲ３が配列番号：３９７であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：１８２であり、ＣＤＲ２が配列番号：２６９であり、ＣＤＲ３が配列番号：３９４であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：１８１であり、ＣＤＲ２が配列番号：２６８であり、ＣＤＲ３が配列番号：３９３であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：１８１であり、ＣＤＲ２が配列番号：２６８であり、ＣＤＲ３が配列番号：３９５であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：１８１であり、ＣＤＲ２が配列番号：２６８であり、ＣＤＲ３が配列番号：３９６であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：１８１であり、ＣＤＲ２が配列番号：２７０であり、ＣＤＲ３が配列番号：３９３であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：１８３であり、ＣＤＲ２が配列番号：２６８であり、ＣＤＲ３が配列番号：３９３であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：１８４であり、ＣＤＲ２が配列番号：２６８であり、ＣＤＲ３が配列番号：３９３であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：１８５であり、ＣＤＲ２が配列番号：２７１であり、ＣＤＲ３が配列番号：３９８であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：１８２であり、ＣＤＲ２が配列番号：５４１であり、ＣＤＲ３が配列番号：３９４であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：１８２であり、ＣＤＲ２が配列番号：５４１であり、ＣＤＲ３が配列番号：３９７であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：１８２であり、ＣＤＲ２が配列番号：５４９であり、ＣＤＲ３が配列番号：３９４であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：１８２であり、ＣＤＲ２が配列番号：５４９であり、ＣＤＲ３が配列番号：３９７であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２１４であり、ＣＤＲ２が配列番号：３０３であり、ＣＤＲ３が配列番号：４２２であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２１１であり、ＣＤＲ２が配列番号：２９０であり、ＣＤＲ３が配列番号：４１６であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２１２であり、ＣＤＲ２が配列番号：２９１であり、ＣＤＲ３が配列番号：４１７であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２１３であり、ＣＤＲ２が配列番号：２９２であり、ＣＤＲ３が配列番号：４１８であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２１３であり、ＣＤＲ２が配列番号：２９３であり、ＣＤＲ３が配列番号：４１８であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２１４であり、ＣＤＲ２が配列番号：２９４であり、ＣＤＲ３が配列番号：４１８であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２１５であり、ＣＤＲ２が配列番号：２９５であり、ＣＤＲ３が配列番号：４１７であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２１６であり、ＣＤＲ２が配列番号：２９６であり、ＣＤＲ３が配列番号：４１９であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２１３であり、ＣＤＲ２が配列番号：２９５であり、ＣＤＲ３が配列番号：４１８であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２１４であり、ＣＤＲ２が配列番号：２９５であり、ＣＤＲ３が配列番号：４１８であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２１１であり、ＣＤＲ２が配列番号：２９７であり、ＣＤＲ３が配列番号：４２０であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２１５であり、ＣＤＲ２が配列番号：２９８であり、ＣＤＲ３が配列番号：４２１であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２１７であり、ＣＤＲ２が配列番号：２９９であり、ＣＤＲ３が配列番号：４２２であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２１１であり、ＣＤＲ２が配列番号：２９８であり、ＣＤＲ３が配列番号：４１８であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２１２であり、ＣＤＲ２が配列番号：２９１であり、ＣＤＲ３が配列番号：４２３であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２１２であり、ＣＤＲ２が配列番号：３００であり、ＣＤＲ３が配列番号：４１８であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２１４であり、ＣＤＲ２が配列番号：３０１であり、ＣＤＲ３が配列番号：４１８であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２１５であり、ＣＤＲ２が配列番号：３００であり、ＣＤＲ３が配列番号：４２４であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２１１であり、ＣＤＲ２が配列番号：３０２であり、ＣＤＲ３が配列番号：４１６であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２１８であり、ＣＤＲ２が配列番号：２９１であり、ＣＤＲ３が配列番号：４２５であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２１８であり、ＣＤＲ２が配列番号：２９１であり、ＣＤＲ３が配列番号：４２６であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２１３であり、ＣＤＲ２が配列番号：３０３であり、ＣＤＲ３が配列番号：４２２であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２１８であり、ＣＤＲ２が配列番号：２９１であり、ＣＤＲ３が配列番号：４１７であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２１９であり、ＣＤＲ２が配列番号：２９６であり、ＣＤＲ３が配列番号：４２７であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２１３であり、ＣＤＲ２が配列番号：３０４であり、ＣＤＲ３が配列番号：４２８であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２２０であり、ＣＤＲ２が配列番号：３０５であり、ＣＤＲ３が配列番号：４１６であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２１３であり、ＣＤＲ２が配列番号：３０３であり、ＣＤＲ３が配列番号：４２１であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２２０であり、ＣＤＲ２が配列番号：２９６であり、ＣＤＲ３が配列番号：４２９であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２２１であり、ＣＤＲ２が配列番号：３０５であり、ＣＤＲ３が配列番号：４１６であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２２２であり、ＣＤＲ２が配列番号：３０５であり、ＣＤＲ３が配列番号：４３０であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２１３であり、ＣＤＲ２が配列番号：３０６であり、ＣＤＲ３が配列番号：４１８であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２２３であり、ＣＤＲ２が配列番号：３０３であり、ＣＤＲ３が配列番号：４２２であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２１５であり、ＣＤＲ２が配列番号：２９８であり、ＣＤＲ３が配列番号：４３１であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２２０であり、ＣＤＲ２が配列番号：２９６であり、ＣＤＲ３が配列番号：４３２であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２２４であり、ＣＤＲ２が配列番号：３００であり、ＣＤＲ３が配列番号：４１８であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２２０であり、ＣＤＲ２が配列番号：３０７であり、ＣＤＲ３が配列番号：４３３であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２２５であり、ＣＤＲ２が配列番号：３００であり、ＣＤＲ３が配列番号：４１８であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２２６であり、ＣＤＲ２が配列番号：３０８であり、ＣＤＲ３が配列番号：４３４であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２１２であり、ＣＤＲ２が配列番号：２９５であり、ＣＤＲ３が配列番号：４１７であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２１３であり、ＣＤＲ２が配列番号：３０１であり、ＣＤＲ３が配列番号：４２６であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２１２であり、ＣＤＲ２が配列番号：３０５であり、ＣＤＲ３が配列番号：４１７であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２１７であり、ＣＤＲ２が配列番号：３０５であり、ＣＤＲ３が配列番号：４２２であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２１５であり、ＣＤＲ２が配列番号：２９８であり、ＣＤＲ３が配列番号：４３５であり；及び
−ＣＤＲ１が配列番号：２１３であり、ＣＤＲ２が配列番号：３０９であり、ＣＤＲ３が配列番号：４１８である、ポリペプチドからなる群より選択される。
【００２９】
本発明の免疫グロブリンは、軽鎖可変ドメイン配列（例えば、ＶＬ配列）と、重鎖可変ドメイン配列（例えば、ＶＨ配列）とから選択される、免疫グロブリンシングル可変ドメインから（本質的に）なることができる。本発明の免疫グロブリンは、従来の４本鎖抗体から得られた重鎖可変ドメイン配列と、重鎖抗体から得られた重鎖可変ドメイン配列とから選択される、免疫グロブリンシングル可変ドメインから（本質的に）なることができる。本発明の免疫グロブリンは、ドメイン抗体（又は、ドメイン抗体として使用するのに適したアミノ酸）、シングルドメイン抗体（又は、シングルドメイン抗体として使用するのに適したアミノ酸）、「ｄＡｂ」（又は、ｄＡｂとして使用するのに適したアミノ酸）、ナノボディ、ＶＨＨ配列、ラクダ化ＶＨ配列、又は親和性成熟により得られたＶＨＨ配列から選択される、免疫グロブリンシングル可変ドメインから（本質的に）なることができる。好ましい態様では、本発明の免疫グロブリンは、部分的に又は完全にヒト化ナノボディ、例えば、部分的に又は完全にヒト化ＶＨＨから（本質的に）なる。
【００３０】
本発明の好ましい免疫グロブリンは、配列番号：１〜１２３、４９５、４９８〜５１３、及び５２３〜５４０のいずれか、又は、配列番号：１〜１２３、４９５、４９８〜５１３、及び５２３〜５４０のいずれかに対して、８０％超、好ましくは９０％超、より好ましくは９５％超、例えば、９９％以上の（本明細書で定義された）配列同一性を有する免疫グロブリンから選択される。
【００３１】
また、本発明は、配列番号：１〜１２３、４９５、４９８〜５１３、及び５２３〜５４０を有する少なくとも１つの免疫グロブリンシングル可変ドメインのＫｖ１．３への結合をクロスブロックし、及び／又は、配列番号：１〜１２３、４９５、４９８〜５１３、及び５２３〜５４０を有する少なくとも１つの免疫グロブリンシングル可変ドメインにより、Ｋｖ１．３に結合するのをクロスブロックされる、Ｋｖ１．３に対する免疫グロブリンに関する。
【００３２】
本発明により提供される免疫グロブリンは、好ましくは、（本明細書で定義された）本質的に単離された状態又はポリペプチド（「本発明のポリペプチド」とも呼ばれる）の一部の状態にある。同ポリペプチドは、１つ以上の本発明の免疫グロブリンを含むか、又は、同免疫グロブリンから（本質的に）なり、場合により、１つ以上の更なる免疫グロブリンを更に含むことができる（場合により、全て、１つ以上の適切なリンカーを介して連結している）。
【００３３】
とりわけ、本発明は、少なくとも２つの本発明の免疫グロブリンを含むか、又は、同免疫グロブリンから本質的になり、ここで、前記少なくとも２つの免疫グロブリンは、同じか又は異なることができ、ここで、前記少なくとも２つの免疫グロブリンは、互いに直接連結しており、又は、互いにリンカーを介して連結している、多価ポリペプチドを提供する。適切なリンカーは、配列番号：４７９〜４９４を有するリンカーからなる群より選択することができるが、これらに限定されない。
【００３４】
好ましい態様では、本発明は、配列番号：４５１〜４７３、４９６〜４９７、及び５１４〜５２２のいずれかから選択される上記で定義された多価ポリペプチド、又は、配列番号：４５１〜４７３、４９６〜４９７、及び５１４〜５２２のいずれかに対して、８０％超の配列同一性を有するポリペプチドに関する（表Ａ−３を参照のこと）。
【００３５】
別の態様では、本発明は、１つ以上の本発明の免疫グロブリン又はポリペプチド（又は、それらの適切なフラグメント）を含むか、又は、これらから（本質的に）なり、場合により、１つ以上のペプチドリンカーを介して連結している、１つ以上の他の基、残基、部分、又は結合ユニットを更に含む場合がある、化合物又は構築物（本明細書において、それぞれ「本発明の化合物」又は「本発明の構築物」とも呼ばれる）に関する。本明細書における更なる開示から当業者に明らかとなるであろうように、このような更なる基、残基、部分、又は結合ユニットは、更なる機能性を本発明の免疫グロブリン（及び／又は、本発明の免疫グロブリンが存在する化合物、構築物、もしくはポリペプチド）に提供してもよいし、又は、提供しなくてもよく、本発明の免疫グロブリンの特性を修飾してもよいし、又は、修飾しなくてもよい。
【００３６】
本発明の具体的な一態様では、本発明の化合物又は本発明の構築物は、対応する本発明の免疫グロブリン又はポリペプチドと比較して、延長した半減期を有することができる。このような化合物又は構築物の一部の好ましく、非限定的な例は、本明細書における更なる開示に基づいて、当業者に明らかとなるであろうし、例えば、その半減期を（例えば、ペグ化により）延長するように化学的に修飾されている本発明の免疫グロブリン又はポリペプチド；血清タンパク質（例えば、血清アルブミン）に結合するための少なくとも１つの付加的結合部位を含む本発明の免疫グロブリン又はポリペプチド；又は、本発明の免疫グロブリン又はポリペプチドの半減期を延長する少なくとも１つの部分に連結している少なくとも１つの本発明の免疫グロブリン又はポリペプチドを含む本発明の免疫グロブリン又はポリペプチドを含むであろう。
【００３７】
このような半減期延長部分を含む本発明の免疫グロブリン又はポリペプチドの例は、本明細書における更なる開示に基づいて、当業者に明らかとなるであろうし、例えば、１つ以上の本発明の免疫グロブリン又はポリペプチドが１つ以上の血清タンパク質もしくはそのフラグメント（例えば、（ヒト）血清アルブミンもしくはその適切なフラグメント）、又は、血清タンパク質に結合することができる１つ以上の結合ユニット（血清アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）又は血清免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ）に結合することができる、ドメイン抗体、ドメイン抗体として使用するのに適したアミノ酸、シングルドメイン抗体、シングルドメイン抗体として使用するのに適したアミノ酸、「ｄＡｂ」、ｄＡｂとして使用するのに適したアミノ酸、ナノボディ、ＶＨＨ配列、ヒト化ＶＨＨ配列、もしくはラクダ化ＶＨ配列等、本明細書で言及された更なる説明及び参考文献が参照される）に適切に連結しているポリペプチド；本発明の免疫グロブリン又はポリペプチドがＦｃ部分（例えば、ヒトＦｃ）又はその適切な部分もしくはフラグメントに連結しているポリペプチド；又は、１つ以上の本発明の免疫グロブリン又はポリペプチドが血清タンパク質に結合することができる１つ以上の小型タンパク質又はペプチド（例えば、制限されず、国際公開公報第９１／０１７４３号、同第０１／４５７４６号、同第０２／０７６４８９号で記載されたタンパク質及びペプチド）に適切に連結しているポリペプチドを含むが、これらに限定されない。
【００３８】
一般的には、延長した半減期を有する本発明の化合物又は構築物は、対応する本発明の免疫グロブリン又はポリペプチド自体の半減期より、好ましくは、少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも２倍、例えば、少なくとも５倍、例えば、少なくとも１０倍又は２０倍超の半減期を有する。
【００３９】
好ましく、非限定的な態様では、本発明のこのような化合物又は構築物は、対応する本発明の免疫グロブリン又はポリペプチド自体と比較して、１時間超、好ましくは２時間超、より好ましくは６時間超、例えば、１２時間超、又は更に、２４、４８、もしくは７２時間超延長した血清半減期を有する。
【００４０】
別の好ましく、非限定的な態様では、本発明のこのような化合物又は構築物は、少なくとも約１２時間、好ましくは少なくとも２４時間、より好ましくは少なくとも４８時間、更により好ましくは少なくとも７２時間以上のヒトにおける血清半減期を示す。例えば、本発明の化合物又はポリペプチドは、少なくとも５日（例えば、約５〜１０日）、好ましくは少なくとも９日（例えば、約９〜１４日）、より好ましくは少なくとも約１０日（例えば、約１０〜１５日）、又は少なくとも約１１日（例えば、約１１〜１６日）、より好ましくは少なくとも約１２日（例えば、約１２〜１８日以上）、又は１４日超（例えば、約１４〜１９日）の半減期を有することができる。
【００４１】
好ましい態様では、本発明は、配列番号：４６１〜４７３、４９６〜４９７、及び５１４〜５２２のいずれかから選択される上記で定義された化合物もしくは構築物、又は、配列番号：４６１〜４７３、４９６〜４９７、及び５１４〜５２２のいずれかに対して、８０％超の配列同一性を有する化合物もしくは構築物に関する（表Ａ−３を参照のこと）。
【００４２】
また、本発明は、本発明の免疫グロブリン、ポリペプチド、化合物、及び／又は構築物をコードする、核酸又はヌクレオチド配列に関する。また、このような核酸は、本明細書において、「本発明の核酸」とも呼ばれるであろうし、例えば、本明細書で更に記載されたように、遺伝子構築物の形態にあることができる。またしたがって、本発明は、遺伝子構築物の形態にある核酸又はヌクレオチド配列に関する。
【００４３】
本発明の免疫グロブリン、ポリペプチド、化合物、及び／又は構築物をコードする核酸は、本発明の多価ポリペプチドをコードする核酸を得るように連結していることができる。またしたがって、本発明は、本発明の多価ポリペプチドをコードする遺伝子構築物の製造のための、本発明の免疫グロブリン、ポリペプチド、化合物、及び／又は構築物をコードする核酸又はヌクレオチド配列の使用に関する。
【００４４】
さらに、本発明は、本発明の免疫グロブリン、ポリペプチド、化合物、及び／又は構築物を発現する（又は、適切な環境下において、発現可能な）、及び／又は、本発明の核酸を含有する、ホスト又はホスト細胞に関する。このようなホスト又はホスト細胞の一部の好ましく、非限定的な例は、本明細書における更なる説明から明らかとなるであろう。
【００４５】
さらに、本発明は、少なくとも１つの本発明の免疫グロブリン、ポリペプチド、化合物、及び／もしくは構築物、ならびに／又は、少なくとも１つの本発明の核酸、ならびに場合により、それ自体公知の、すなわち、本組成物の意図した使用に応じたこのような組成物の１つ以上の更なる成分を含有するか、又は、これらを含む組成物に関する。このような組成物は、例えば、（本明細書で記載された）医薬組成物又は獣医学的組成物であることができる。このような組成物の一部の好ましく、非限定的な例は、本明細書における更なる説明から明らかとなるであろう。
【００４６】
さらに、本発明は、本明細書で記載された免疫グロブリン、ポリペプチド、化合物、及び／もしくは構築物、核酸、ホスト細胞、ならびに組成物を製造するための方法に関する。本発明の免疫グロブリン、ポリペプチド、化合物、及び／もしくは構築物、核酸、ホスト細胞、ならびに組成物を製造するための方法は、下記：
ａ）適切なホスト又はホスト生物中において、又は、別の適切な発現系において、本発明の核酸もしくはヌクレオチド配列、又は、本発明の遺伝子構築物を発現させる工程と、場合により続けて、
ｂ）このようにして得られた本発明の免疫グロブリン、ポリペプチド、化合物、及び／又は構築物を単離し、及び／又は、精製する工程とを含むことができる。
【００４７】
さらに、本発明は、本明細書で記載された免疫グロブリン、ポリペプチド、化合物、及び／もしくは構築物、核酸、ホスト細胞、ならびに組成物の用途及び使用、ならびに、Ｋｖ１．３関連疾患、障害、又は症状の予防及び／又は治療のための方法に関する。一部の好ましく、非限定的な用途及び使用は、本明細書における更なる説明から明らかとなるであろう。
【００４８】
本発明の免疫グロブリン、ポリペプチド、化合物、及び／もしくは構築物、ならびに組成物は、Ｔ細胞からのカリウムイオンの流出を減少させ、及び／又は、阻害するのに使用することができる。
【００４９】
本発明の免疫グロブリン、ポリペプチド、化合物、及び／もしくは構築物、ならびに組成物は、Ｔ細胞の活性化及び／又は増殖を阻害する、及び／又は、ブロックするのに使用することができる。
【００５０】
本発明の免疫グロブリン、ポリペプチド、化合物、及び／もしくは構築物、ならびに組成物は、活性化されたＴ細胞を阻害する、及び／又は、ブロックするのに使用することができる。
【００５１】
本発明の免疫グロブリン、ポリペプチド、化合物、及び／もしくは構築物、ならびに組成物は、Ｔ細胞媒介性疾患の予防及び／又は治療に使用することができる。
【００５２】
本発明の免疫グロブリン、ポリペプチド、化合物、及び／もしくは構築物、ならびに組成物は、自己免疫疾患の予防及び／又は治療に使用することができる。
【００５３】
また、本発明の免疫グロブリン、ポリペプチド、化合物、及び／もしくは構築物、ならびに組成物は、Ｋｖ１．３関連疾患、障害、又は症状の予防及び／又は治療に使用することができる。Ｋｖ１．３関連疾患、障害、又は症状に感受性の患者群は、当業者に明らかであろうし、例えば、多発性硬化症、関節リウマチ、１型糖尿病、２型糖尿病、乾癬、炎症性腸疾患、接触媒介性皮膚炎、乾癬性関節炎、喘息、アレルギー、再狭窄、全身性硬化症、線維症、強皮症、糸球体腎炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、シェーグレン症候群、アルツハイマー病、炎症性骨吸収、全身性エリテマトーデス、潰瘍性大腸炎、肥満、移植片対宿主疾患、移植拒絶、血管炎、抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）関連血管炎（ＡＡＶ）、ブドウ膜炎、及び遅延型過敏を含む（が、これらに限定されない）。
【００５４】
またしたがって、本発明は、多発性硬化症、関節リウマチ、１型糖尿病、２型糖尿病、乾癬、炎症性腸疾患、接触媒介性皮膚炎、乾癬性関節炎、喘息、アレルギー、再狭窄、全身性硬化症、線維症、強皮症、糸球体腎炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、シェーグレン症候群、アルツハイマー病、炎症性骨吸収、全身性エリテマトーデス、潰瘍性大腸炎、肥満、移植片対宿主疾患、移植拒絶、血管炎、抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）関連血管炎（ＡＡＶ）、ブドウ膜炎、及び遅延型過敏の内の少なくとも１つにおける、Ｋｖ１．３関連疾患、障害、又は症状の予防及び／又は治療のための方法であって、それを必要とする対象に、薬学活性量の、本発明の免疫グロブリン、ポリペプチド、化合物、及び／もしくは構築物、ならびに本発明の組成物の内の少なくとも１つを投与することを含む方法に関する。
【００５５】
また、本発明は、多発性硬化症、関節リウマチ、１型糖尿病、２型糖尿病、乾癬、炎症性腸疾患、接触媒介性皮膚炎、乾癬性関節炎、喘息、アレルギー、再狭窄、全身性硬化症、線維症、強皮症、糸球体腎炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、シェーグレン症候群、アルツハイマー病、炎症性骨吸収、全身性エリテマトーデス、潰瘍性大腸炎、肥満、移植片対宿主疾患、移植拒絶、血管炎、抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）関連血管炎（ＡＡＶ）、ブドウ膜炎、及び遅延型過敏の内の少なくとも１つにおける、Ｋｖ１．３関連疾患、障害、又は症状の予防及び／又は治療のための医薬組成物の製造における、ならびに／又は、本明細書で記載された１つ以上の方法における使用のための、本発明の免疫グロブリン、ポリペプチド、化合物、及び／もしくは構築物、又は、本発明の組成物の使用に関する。
【００５６】
また、本発明は、多発性硬化症、関節リウマチ、１型糖尿病、２型糖尿病、乾癬、炎症性腸疾患、接触媒介性皮膚炎、乾癬性関節炎、喘息、アレルギー、再狭窄、全身性硬化症、線維症、強皮症、糸球体腎炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、シェーグレン症候群、アルツハイマー病、炎症性骨吸収、全身性エリテマトーデス、潰瘍性大腸炎、肥満、移植片対宿主疾患、移植拒絶、血管炎、抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）関連血管炎（ＡＡＶ）、ブドウ膜炎、及び遅延型過敏の内の少なくとも１つにおける、Ｋｖ１．３関連疾患、障害、又は症状の予防及び／又は治療のための、本発明の免疫グロブリン、ポリペプチド、化合物、及び／もしくは構築物、又は、本発明の組成物に関する。
【００５７】
本ポリペプチド及び組成物の他の態様、利点、用途、及び使用は、本明細書における更なる開示から明らかとなるであろう。複数の文献が、この明細書のテキスト全体を通して引用されている。前記又は下記を問わず、本明細書で引用された文献（全ての特許、特許出願、科学刊行物、製造メーカーの仕様書、説明書等を含む）はそれぞれ、その全体が参照により組み入れられる。本明細書において、本発明が、従来の発明のために、このような開示に新規性が認められないことを認めると、解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】図１：Ｋｖ１．３タンパク質における１つのカリウムチャネルサブユニットの平面膜トポロジー。構造的に、Ｋｖ１．３チャネルは、４つの同一のサブユニットの四量体として存在する。各サブユニットは、６つの膜貫通ドメインＳ１〜Ｓ６から構成され、Ｓ５〜Ｓ６領域は、Ｋ＋孔を形成している。これらの６つの膜貫通ドメインは、ＥＬ１〜ＥＬ３と呼ばれる３つの細胞外ループにより互いに連結している。Ｎ末端及びＣ末端は両方とも、細胞膜の細胞質側に存在している。
【図２】図２Ａ〜２Ｂ：集団又は単独の細胞モードのいずれかにおいて、自動パッチクランプIonFlux（商標）システムに加えられる電圧プロトコールの略図。Ｋｖ１．３カリウム電流を、３０秒毎に、ＶＨ−８０mVから＋４０mVへの脱分極パルスにより引き出した（Ａ）。分析に使用されたデータ点は、指定されたカーソル間の面積から得られる、正規化された平均持続電流振幅（Ｉｓｕｓｔａｉｎｅｄ）を表わす（Ｂ）。
【図３】図３Ａ〜３Ｆ：ＣＨＯ細胞（黒三角）及び親ＣＨＯ細胞（黒丸）上に発現させたヒトＫｖ１．３における一価抗Ｋｖ１．３ナノボディ（Ａ：Ａ０１９４００００３；Ｂ：Ａ０１９４００９Ｇ０９）の滴定。カニクイザルＫｖ１．３（Ｃ及びＤ；親ＣＨＯ細胞は、黒丸として示され、カニクイザルＫｖ１．３  ＣＨＯ細胞は、黒四角として示される）及びラットＫｖ１．３（Ｅ及びＦ；親ＣＨＯ細胞は、黒四角として示され、カニクイザルＫｖ１．３  ＣＨＯ細胞は、黒丸として示される）に対する、抗Ｋｖ１．３ナノボディ（Ｃ及びＥ：Ａ０１９４００００３；Ｄ及びＦ：Ａ０１９４００９Ｇ０９）の希釈系列における異種間結合。ＭＣＦ値（平均チャネル蛍光）を、ナノボディ濃度に対してプロットする。
【図４】図４Ａ〜４Ｃ：ＣＨＯ細胞上に発現させたカニクイザルＫｖ１．３に対する放射性ラベルされたマルガトキシンの結合における、一価抗Ｋｖ１．３ナノボディ（Ａ：Ａ０１９４００００３；Ｂ：無関係のナノボディ（四角）、及びＡ０１９４００９Ｇ０９（黒丸））又はペプチドトキシンＳｈＫ（Ｃ）の効果。１分当たりのカウント（cpm）値を、ナノボディ濃度に対してプロットする。抗Ｋｖ１．３ナノボディは両方とも、１５０pM Ｉ１２５マルガトキシンのカニクイザルＫｖ１．３への結合を完全にブロックする。バックグラウンド（ＢＧ）を、Ｉ１２５マルガトキシンを加えなかった場合の対照条件とする。
【図５】図５Ａ〜５Ｂ：ＨＥＫ２９３Ｈ中で安定的に発現させたヒトＫｖ１．３チャネルに対する、一価ナノボディＡ０１９４００９Ｇ０９の用量依存効果。Ｋｖ１．３電流を、IonFlux（商標）システムを使用し、（図２Ａで示されたように）３０秒の時間間隔での脱分極電圧プロトコールを使用して、自動集団パッチクランプにより記録した。Ａ０１９４００９Ｇ０９を、各濃度の連続的な１２０秒間のかん流により、同じ細胞集団に対して、連続的にアプライした。代表的なＫｖ１．３電流トレース（Ａ）は、ヒトＫｖ１．３チャネルの阻害について、明確な用量依存阻害性効果及び相関濃度応答曲線を示す。正規化された平均Ｉｓｕｓｔａｉｎｅｄとして測定されたものを、（Ｂ）に表わす。
【図６】図６Ａ〜６Ｂ：ＨＥＫ２９３Ｈ中で安定的に発現させたヒトＫｖ１．３チャネルに対する、一価ナノボディＡ０１９４００２０Ａ０６の用量依存効果。Ｋｖ１．３電流を、IonFlux（商標）システムを使用し、（図２Ａで示されたように）３０秒の時間間隔での脱分極電圧プロトコールを使用して、自動集団パッチクランプにより記録した。Ａ０１９４００２０Ａ０６を、各濃度の連続的な１２０秒間のかん流により、同じ細胞集団に対して、連続的にアプライした。代表的なＫｖ１．３電流トレース（Ａ）は、ヒトＫｖ１．３チャネルの阻害について、明確な用量依存阻害性効果及び相関濃度応答曲線を示す。正規化された平均Ｉｓｕｓｔａｉｎｅｄとして測定されたものを、（Ｂ）に表わす。
【図７】図７Ａ〜７Ｂ：選択した一価ナノボディの洗浄中における電流の回復。Ｋｖ１．３を安定的に発現させたＨＥＫ２９３Ｈ細胞を、単回での高用量のナノボディ（３００nM）で１２０秒間かん流して、定常状態での阻害を達成し、その後に、細胞外バッファーで少なくとも５分間かん流した。Ｋｖ１．３電流を、IonFlux（商標）システムを使用し、３０秒の時間間隔での脱分極電圧プロトコールを使用して、自動集団パッチクランプにより記録した。細胞を洗浄した後に記録したＫｖ１．３電流を、対照Ｋｖ１．３に重ねた。阻害からのほぼ完全な回復を観察することができた（Ａ）。安定性の理由及び比較のために、Ｋｖ１．３電流も、自動単独細胞パッチクランプにより記録した。予測された通り、阻害性効果を、一価ナノボディＡ０１９４００９Ｇ０９について反転させることができた（Ｂ）。
【図８】図８Ａ〜８Ｂ：自動パッチクランプIonWorksシステムにおいて、試験化合物のアプライ前後に、各ウェルに加えられた電圧プロトコールの略図。Ｋｖ１．３カリウム電流を、繰り返しのゲーティング電圧コマンドプロトコールにより引き出した。Ｋ＋電流を、３Hzで１５回（Ｐ１〜Ｐ１５）加えた、保持電位−８０mVから＋５０mVへの、１００m秒の脱分極ステップのトレインにより喚起した（Ａ）。分析に使用されたデータ点は、Ｐ１における指定されたカーソル間の面積から得られる、正規化された平均持続電流振幅（Ｉｓｕｓｔａｉｎｅｄ）を表わす（Ｂ）。
【図９】図９Ａ〜９Ｃ：ＣＨＬ細胞中で安定的に発現させたヒトＫｖ１．３チャネルに対する、例示濃度４１２pM（Ａ）及び１００nM（Ｂ）での、Ａ０１９４００９Ｇ０９の用量依存効果。Ｋｖ１．３電流を、実施例４で記載されたように、IonWorksシステムにおける繰り返しのゲーティング電圧コマンドプロトコールを使用して、自動集団パッチクランプにより記録した。記録を、（化合物添加前の）対照条件において行った。ついで、Ａ０１９４００９Ｇ０９を、同一のパルストレインを使用する２回目の測定前に、６〜７分間インキュベーションした。正規化された平均Ｉｓｕｓｔａｉｎｅｄとして測定されたヒトＫｖ１．３チャネルの阻害についての相関濃度応答曲線を、（Ｃ）に表わす。
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｃ：低濃度（Ａ）及び高濃度（Ｂ）でのＡ０１９４００００３のＫｖ１．３電流トレース。正規化された平均Ｉｓｕｓｔａｉｎｅｄとして測定されたヒトＫｖ１．３チャネルの阻害についての相関濃度応答曲線を、（Ｃ）に表わす。
【図１１】図１１Ａ〜１１Ｄ：ＯＫＴ３による刺激後のＣＣＲ７−ＣＤ４５ＲＡ−  Ｔ細胞によるＩＦＮγ生成（Ａ及びＢ）及びＣＤ２５発現（Ｃ及びＤ）の、一価抗Ｋｖ１．３ナノボディ及びＳｈＫによる阻害［Ａ：Ａ０１９４００００３（白丸）及びＡ０１９４００９Ｇ０９（黒丸）；Ｂ：Ａ０１９４０２０Ａ０６（黒丸）；Ｃ：Ａ０１９４００９Ｇ０９（黒丸）及びＳｈＫ（白四角）；Ｄ：Ａ０１９４０２０Ａ０６（黒丸）］。ＩＦＮγリードアウトについて、ＩＦＮγ濃度（pg/mL）を、ナノボディ濃度に対してプロットする。ＣＤ２５発現の測定について、ＭＣＦ値（平均チャネル蛍光）を、ナノボディ濃度に対してプロットする。細胞を刺激しない場合の対照条件を、「ｎｏ  ｓｔｉｍ」により示す。
【図１２】図１２Ａ〜１２Ｄ：ＣＨＯ細胞上に発現させたヒト、カニクイザル、及びラットＫｖ１．３に対する多価ナノボディの希釈系列の結合。Ａ：Ａ０１９４００００４；Ｂ：Ａ０１９４０００１３；Ｃ：Ａ０１９４０００１４；Ｄ：Ａ０１９４０００１５；黒丸：親ＣＨＯ細胞に対する結合；黒四角：カニクイザルＫｖ１．３  ＣＨＯ細胞に対する結合；上向き黒三角：ラットＫｖ１．３に対する結合、及び下向き黒三角：ヒトＫｖ１．３  ＣＨＯ細胞に対する結合。ＭＣＦ値（平均チャネル蛍光）を、ナノボディ濃度に対してプロットする。
【図１３】図１３Ａ〜１３Ｅ：カニクイザルＫｖ１．３を発現させたＣＨＯに対する放射性ラベルされたマルガトキシンの結合における、多価抗Ｋｖ１．３ナノボディの効果。Ａ：Ａ０１９４０００１３（黒三角）及びラベルされていないマルガトキシン（黒四角）；Ｂ：Ａ０１９４００００４（黒四角）；Ｃ：Ａ０１９４０００１２（黒四角）及びＡ０１９４０００１４（黒三角）；Ｄ：Ａ０１９４０００１５（黒丸）及びラベルされていないマルガトキシン（黒四角）；Ｅ：Ａ０１９４０００３２（黒四角）。１分当たりのカウント（cpm）値を、ナノボディ濃度に対してプロットする。
【図１４】図１４Ａ〜１４Ｃ：ＨＥＫ２９３Ｈ中で安定的に発現させたヒトＫｖ１．３チャネルに対する、二価Ａ０１９４００００９の用量依存効果。Ｋｖ１．３電流を、図２Ａで記載されたように、IonFlux（商標）システムにおいて、３０秒の時間間隔での脱分極電圧プロトコールを使用して、自動集団パッチクランプにより記録した。Ａ０１９４００００９を、各濃度の連続的な１２０秒間のかん流により、同じ細胞集団に対して、連続的にアプライした。Ａ０１９４００００９のＫｖ１．３電流トレースを、（Ａ）に示す。正規化された平均Ｉｓｕｓｔａｉｎｅｄとして測定されたヒトＫｖ１．３チャネルの阻害についての相関濃度応答曲線を、（Ｂ）に表わす。Ａ０１９４００００９の洗浄中における電流の回復を、（Ｃ）に示す。
【図１５】図１５Ａ〜１５Ｃ：ＨＥＫ２９３Ｈ中で安定的に発現させたヒトＫｖ１．３チャネルに対する、二重抗原結合性Ａ０１９４０００１２の用量依存効果。Ｋｖ１．３電流を、図２Ａで記載されたように、IonFlux（商標）システムにおいて、３０秒の時間間隔での脱分極電圧プロトコールを使用して、自動集団パッチクランプにより記録した。Ａ０１９４０００１２を、各濃度の連続的な１２０秒間のかん流により、同じ細胞集団に対して、連続的にアプライした。Ａ０１９４０００１２のＫｖ１．３電流トレースを、（Ａ）に示す。正規化された平均Ｉｓｕｓｔａｉｎｅｄとして測定されたヒトＫｖ１．３チャネルの阻害についての相関濃度応答曲線を、（Ｂ）に表わす。Ａ０１９４０００１０（＝Ａ０１９４０００１２）の洗浄中における電流の回復を、（Ｃ）に示す。
【図１６】図１６Ａ〜１６Ｃ：ＨＥＫ２９３Ｈ中で安定的に発現させたヒトＫｖ１．３チャネルに対する、二重抗原結合性Ａ０１９４０００１４の用量依存効果。Ｋｖ１．３電流を、図２Ａで記載されたように、IonFlux（商標）システムにおいて、３０秒の時間間隔での脱分極電圧プロトコールを使用して、自動集団パッチクランプにより記録した。Ａ０１９４０００１４を、各濃度の連続的な１２０秒間のかん流により、同じ細胞集団に対して、連続的にアプライした。Ａ０１９４０００１４のＫｖ１．３電流トレースを、（Ａ）に示す。正規化された平均Ｉｓｕｓｔａｉｎｅｄとして測定されたヒトＫｖ１．３チャネルの阻害についての相関濃度応答曲線を、（Ｂ）に表わす。Ａ０１９４０００１４の洗浄中における電流の回復を、（Ｃ）に示す。
【図１７−２２】図１７Ａ〜１７Ｃから図２２Ａ〜２２Ｃ：ＣＨＬ細胞中で安定的に発現させたヒトＫｖ１．３チャネルに対する、多価ナノボディの用量依存効果。Ｋｖ１．３電流を、図８で記載されたように、IonWorksシステムにおいて、繰り返しのゲーティング電圧コマンドプロトコールを使用して、自動集団パッチクランプにより記録した。記録を、（化合物添加前の）対照条件において行った。ついで、ナノボディを、同一のパルストレインを使用する２回目の測定前に、６〜７分間インキュベーションした。多価ナノボディＡ０１９４００００４、Ａ０１９４００００９、Ａ０１９４０００１２、Ａ０１９４０００１４、Ａ０１９４０００１５、及びＡ０１９４０００３２の代表的なＫｖ１．３電流トレースをそれぞれ、図１７Ａ〜１７Ｂから２２Ａ〜２２Ｂに示す。正規化された平均Ｉｓｕｓｔａｉｎｅｄとして測定されたヒトＫｖ１．３チャネルの阻害についての相関濃度応答曲線をそれぞれ、図１７Ｃ〜２２Ｃに表わす。
【図２３】図２３Ａ〜２３Ｆ：抗ＣＤ３による刺激後のＣＣＲ７−ＣＤ４５ＲＡ−  Ｔ細胞によるＩＦＮγ生成（Ａ、Ｂ、及びＣ）及びＣＤ２５発現（Ｄ、Ｅ、及びＦ）の、多価抗Ｋｖ１．３ナノボディ及びＳｈｋによる阻害（Ａ及びＤ：Ａ０１９４０００１３（白丸）及びＳｈＫ（黒四角）；Ｂ及びＥ：Ａ０１９４０００１２（白丸）及びＡ０１９４０００１４（黒四角）；Ｃ及びＦ：Ａ０１９４０００１５（黒四角））。ＩＦＮγリードアウトについて、ＩＦＮγ濃度（pg/mL）を、ナノボディ濃度に対してプロットする。ＣＤ２５発現の測定について、ＭＣＦ値（平均チャネル蛍光）を、ナノボディ濃度に対してプロットする。細胞を刺激しない場合の対照条件を、「ｎｏ  ｓｔｉｍ」により示す。
【図２４】図２４Ａ〜２４Ｂ：ＨＥＫ２９３Ｈ細胞上に発現させた、ＷＴ  Ｋｖ１．３（Ｂ）及びＫｖ１．３  ＥＬ１変異体（Ａ）に対するアギトキシン−ＴＡＭＲＡの結合を評価するヒストグラム。ＦＡＣＳ結合実験において得られたカウントを、アギトキシン−ＴＡＭＲＡの蛍光強度に対してプロットする。このヒストグラムは、両構築物がその機能性を示すアギトキシンに結合することを示す。
【図２５】図２５：ＨＥＫ２９３Ｈ細胞上に発現させたヒトＫｖ１．３に結合させるために、飽和濃度のＦＡＭラベルされたＳｈＫと競合させた、一価ナノボディ（Ａ０１９４００００３（黒丸）；Ａ０１９４００９Ｇ０９（黒三角）、無関係のナノボディ（白丸））及びＳｈＫ化合物（黒チェック）の希釈系列。ＭＣＦ値（平均チャネル蛍光）を、ナノボディ濃度に対してプロットする。
【図２６】図２６Ａ〜２６Ｄ：アルブミン結合ナノボディ（Ａｌｂ１１）を種々の位置に含む半減期延長二価構築物によるＣＨＯ細胞上に発現させたカニクイザルＫｖ１．３に対する結合。Ａ０１９４０００２８（Ａ及びＣ；中央にＡｌｂ１１）及びＡ０１９４０００２４（Ｂ及びＤ；Ｃ末端にＡｌｂ１１）は両方とも、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の不存在下において（Ａ及びＢ）、ＨＳＡの存在下において（Ｃ及びＤ）、ＣＨＯ細胞上に発現させたカニクイザルＫｖ１．３に同様に結合する。活性は、わずかに低下する。ＭＣＦ値（平均チャネル蛍光）を、ナノボディ濃度に対してプロットする。
【図２７】図２７Ａ〜２７Ｃ：ＨＥＫ２９３Ｈ中で安定的に発現させたヒトＫｖ１．３チャネルに対する、三価Ａ０１９４０００２９の用量依存効果。Ｋｖ１．３電流を、図２Ａで記載されたように、IonFlux（商標）システムにおいて、３０秒の時間間隔での脱分極電圧プロトコールを使用して、自動集団パッチクランプにより記録した。Ａ０１９４０００２９を、各濃度の連続的な１２０秒間のかん流により、同じ細胞集団に対して、連続的にアプライした。Ａ０１９４０００２９のＫｖ１．３電流トレースを、（Ａ）に示す。正規化された平均Ｉｓｕｓｔａｉｎｅｄとして測定されたヒトＫｖ１．３チャネルの阻害についての相関濃度応答曲線を、（Ｂ）に表わす。Ａ０１９４０００２９の洗浄中における電流の回復を、（Ｃ）に示す。
【図２８】図２８：ＨＳＡの不存在下（黒四角）及び存在下（黒丸）における、半減期延長二価Ａ０１９４０００２９ナノボディ構築物とＩ１２５マルガトキシンとの競合。カニクイザルＫｖ１．３を、ＣＨＯ細胞上に発現させた。１分当たりのカウント（cpm）値を、ナノボディ濃度に対してプロットする。バックグラウンド（ＢＧ）を、Ｉ１２５マルガトキシンを加えなかった場合の対照条件とし、ＨＳＡの存在下（上向き黒三角）及び不存在下（下向き黒三角）において評価した。
【図２９】図２９Ａ〜２９Ｂ：ＨＳＡの不存在下（黒丸）及び存在下（黒四角）における、Ａ０１９４０００２４ナノボディ構築物の希釈系列の存在下での、抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）による刺激後のＣＣＲ７−ＣＤ４５ＲＡ−  Ｔ細胞によるＩＦＮγ生成（Ａ）及びＣＤ２５発現（Ｂ）。ＩＦＮγリードアウトについて、ＩＦＮγ濃度（pg/mL）を、ナノボディ濃度に対してプロットする。ＣＤ２５発現の測定について、ＭＣＦ値（平均チャネル蛍光）を、ナノボディ濃度に対してプロットする。細胞を刺激しない場合の対照条件を、「ｎｏ  ｓｔｉｍ」により示す。
【図３０】図３０Ａ〜３０Ｂ：Ａ０１９４０００２９ナノボディ構築物（黒丸）及びＳｈＫトキシン（黒四角）の希釈系列による、抗ＣＤ３刺激ヒトＰＢＭＣ中でのＩＦＮγ生成の阻害（Ａ）。同じナノボディ及びトキシンは、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８で同時刺激されたヒトＰＢＭＣ中でのＩＦＮγ生成を阻害しない（Ｂ）。ＩＦＮγ濃度（pg/mL）を、ナノボディ又はトキシンの濃度に対してプロットする。細胞を刺激しない場合の対照条件を、「ｎｏ  ｓｔｉｍ」により示す。
【図３１】図３１Ａ〜３１Ｄ：ＣＨＬ細胞中で安定的に発現させたヒトＫｖ１．３チャネルの活性化の電圧依存におけるＡ０１９４０００２９の効果。Ｋｖ１．３電流を、従来の平面パッチクランプにより記録した。重畳電流トレースを、３０秒間隔での、保持電位−８０mVから１０mVステップで＋５０mVへの、５００m秒脱分極パルスにより、１０nM Ａ０１９４０００２９の不存在下（Ｂ）及び存在下（Ｃ）において引き出した。電圧プロトコールの模式図を、図３１Ａに提供する。分析に使用されたデータ点は、Ｂにおいて示されたように（矢印）、ピーク電流振幅（Ｉｐｅａｋ）を表わす。コンダクタンスを、実施例１０で記載されたように算出し、それらの各最大コンダクタンス（Ｇｍａｘ）で正規化し、加えられた脱分極電圧に対してプロットした（Ｄ）。ボルツマン式を、（実施例１０で記載されたように）曲線に当て嵌めるのに使用した。
【図３２】図３２Ａ〜３２Ｂ：ＣＨＬ細胞中で安定的に発現させたヒトＫｖ１．３チャネルにおけるＫｖ１．３電流の会合及び洗浄におけるＡ０１９４０００２９の効果。Ｋｖ１．３電流を、従来の平面パッチクランプにより、繰り返しのゲーティング電圧コマンドプロトコールを使用して記録した。電流を、１５秒毎の、−８０mVから＋４０mVへの試験パルスにより喚起した。この試験パルス期間を、２０m秒（Ａ）又は２００m秒（Ｂ）のいずれかとした。記録を、対照条件（化合物添加前）及び、１０nM Ａ０１９４０００２９の３〜５分のインキュベーション中に行い、続けて、化合物を洗浄した。ついで、ピーク及び持続電流振幅を、種々の時点に対してプロットした。
【図３３】図３３Ａ〜３３Ｂ：ＣＨＬ細胞中で安定的に発現させたヒトＫｖ１．３チャネルにおけるＫｖ１．３電流の会合及び洗浄におけるＡ０１９４０００２９の効果。Ｋｖ１．３電流を、従来の平面パッチクランプにより、繰り返しのゲーティング電圧コマンドプロトコールを使用して記録した。電流を、１５秒毎の、−８０mVから＋４０mVへの２００m秒の試験パルスにより喚起した。記録を、対照条件（化合物添加前）及び、１０nM Ａ０１９４０００２９の３〜５分のインキュベーション中に行い、続けて、化合物を洗浄した。ナノボディインキュベーションのこの期間中に、細胞を、−８０mV（Ａ）又は−４０mV（Ｂ）のいずれかの保持電位で保持した。ついで、ピーク及び持続電流振幅を、種々の時点に対してプロットした。
【図３４】図３４Ａ〜３４Ｃ：ＣＨＬ細胞中で安定的に発現させたヒトＫｖ１．３チャネルでのＫｖ１．３電流の不活性化からの回復におけるＡ０１９４０００２９の効果。Ｋｖ１．３電流を、従来の平面パッチクランプにより記録した。２つのインターパルス電位（−８０mV及び−５０mV；Ｃ）からの不活性化の回復を、（Ａで示された）標準的な可変間隔ギャップパルスプロトコールを使用して測定した。−８０mVから＋４０mVへの最初の１秒パルス（Ｐ１）に続けて、０．５〜３０秒の間隔後に、−８０mVから＋４０mVへの２回目のパルスを１５０m秒間した（Ｐ２）。１０nM Ａ０１９４０００２９の不存在下及び存在下における代表的なトレースを、Ｂに提供する。％  回復を算出し（以下を参照のこと）、パルス間隔に対してプロットして、不活性化の回復を示した（Ｃ）。
【数１】
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【図３５】図３５Ａ〜３５Ｄ：自動パッチクランプIonWorksシステムにおいて、試験化合物のアプライ前後に、各ウェルに加えられた電圧プロトコールの略図。Ｋｖ１．５及びＫｖ１．６カリウム電流を、繰り返しのゲーティング電圧コマンドプロトコールにより引き出した。Ｋ＋電流を、３Hzで１５回（Ｐ１〜Ｐ１５）加えた、保持電位−８０mVから＋５０mVへの１００m秒の脱分極ステップのトレインにより喚起した（Ａ）。分析に使用されたデータ点は、Ｐ１における指定されたカーソル間の面積から得られる、正規化された平均持続電流振幅（Ｉｓｕｓｔａｉｎｅｄ）を表わす（Ｂ）。ｈＥＲＧ電流を、０３Hzにおいて、ＶＨ−７０mVから＋４０mVで１秒間、ついで、−３０mVで１秒間、そして、ＶＨ−７０mVに戻す、５回のパルスのパルストレインにより引き出した（Ｃ）。分析に使用されたデータ点は、パルスＰ５からのテールステップにおいて指定されたカーソル間の面積から得られる、正規化された平均ピーク電流振幅（Ｉｐｅａｋ）を表わす（Ｄ）。
【図３６】図３６Ａ〜３６Ｄ：ヒトＫｖ１．３、Ｋｖ１．５、Ｋｖ１．６、及びｈＥＲＧ  Ｋ＋チャネルにおける、選択されたナノボディの比較薬理学。図３５で記載されたように、IonWorksシステムでの繰り返しのゲーティング電圧コマンドプロトコールを使用して、Ｋｖ１．３及びＫｖ１．５の電流を、自動集団パッチクランプ（ＰＰＣ）により記録し、Ｋｖ１．６及びｈＥＲＧ  Ｋ＋の電流を、単独パッチクランプモード（ＨＴ）において記録した。記録を、対照条件（化合物添加前）に行った。ついで、ナノボディを、６〜７分間インキュベーションし、その後、同一のパルスプロトコールを使用して、２回目の測定を行った。得られた濃度応答相関を、Ｋｖ１．５、Ｋｖ１．６、ｈＥＲＧ、及びＫｖ１．３それぞれについて、Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤに示す。全ての選択されたナノボディは、Ｋｖ１．３に対して、試験した他のＫ＋チャネルより、顕著な（すなわち、１０００倍超の）選択性を表わす。試験した最も高い濃度（すなわち、１μM）での最大阻害は、全ての他のチャネルにおいて、５０％未満であった。
【図３７】図３７：２，４−ジニトロフルオロベンゼン（ＤＮＦＢ）誘導遅延型過敏（ＤＴＨ）のラットモデルにおける、抗Ｋｖ１．３ナノボディの有効性を試験するための試験設計。
【図３８】図３８：２，４−ジニトロフルオロベンゼン（ＤＮＦＢ）誘導遅延型過敏のラットモデルにおける、種々の処置群（ｎ＝１０匹のラット／群）の耳の膨潤応答。媒体、参照化合物ＳｈＫ（１０μg/kg）、半減期延長抗Ｋｖ１．３ナノボディＡ０１９４０００２９（１０５μg/kg）、又は非半減期延長抗Ｋｖ１．３ナノボディＡ０１９４０００３２（６９．３μg/kg）のいずれかの２回の皮下注射を、チャレンジに先立つ１２時間及び１時間において、又は、Ａ０１９４０００２９（１０５μg/kg）の１回のｓ．ｃ．注射を、チャレンジ前１時間において、動物に受けさせた。デキサメタゾン（Ｄｅｘ）を、ポジティブ対照群として、チャレンジ後１時間及び６時間で局所投与した（０．７５mg/耳）。データを、平均±標準偏差として表わす。＃ｐ＜０．０５  ｖｓ．媒体群。
【図３９】図３９：２，４−ジニトロフルオロベンゼン（ＤＮＦＢ）誘導遅延型過敏のラットモデルにおける、種々の処置群（ｎ＝１０匹のラット／群）の耳の膨潤応答。媒体、参照化合物ＳｈＫ（１００μg/kg）、又は半減期延長抗Ｋｖ１．３ナノボディＡ０１９４０００２９（１．０５mg/kg又は５．２５mg/kg）のいずれかの２回の皮下注射を、チャレンジに先立つ１２時間及び１時間で、動物に受けさせた。デキサメタゾン（Ｄｅｘ）を、ポジティブ対照群として、チャレンジ後１時間及び６時間で局所投与した（０．７５mg/耳）。データを、平均±標準偏差として表わす。ａ：ｐ＜０．０５  ｖｓ．媒体群；ｂ：ＳｈＫ群と比較して非劣性；ｃ：ＳｈＫ群と比較して優れている。
【図４０】図４０：ＤＮＦＢによるチャレンジ後の種々の時点での、個々の動物におけるＡ０１９４０００２９の血漿薬物動態プロファイル。
【図４１】図４１：収量推定のための、Ａ０１９４０００７１、Ａ０１９４０００７２、Ａ０１９４０００７３、Ａ０１９４０００７４、及びＡ０１９４０００３１のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。ゲノム中にナノボディ発現カセットを１コピー含有する（Ｌｏｗ）、又は、２コピー以上の数を有する（Ｈｉｇｈ）Pichiaクローンを生成した。種々のクローンからの同量の上清を、１２％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて、インスタントブルー染色を使用して比較した。
【発明を実施するための形態】
【００５９】
定義
特に断りない限り、使用される全ての用語は、当業者に明らかであろう、当技術分野におけるその通常の意味を有する。例えば、標準的な参考書、例えば、Sambrook et al.（Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd.Ed.) Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）、F. Ausubel et al.（Current protocols in molecular biology, Green Publishing and Wiley Interscience, New York, 1987）、Lewin（Genes II, John Wiley & Sons, New York, N.Y., 1985）、Old et al.（Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering (2nd edition) University of California Press, Berkeley, CA, 1981）；Roitt et al.（Immunology (6th. Ed.) Mosby/Elsevier, Edinburgh, 2001）、Roitt et al.（Roitt’s Essential Immunology (10th Ed.) Blackwell Publishing, UK, 2001）、及びJaneway et al.（Immunobiology (6th Ed.) Garland Science Publishing/Churchill Livingstone, New York, 2005）、ならびに、本明細書で引用された一般的な背景技術が参照される。
【００６０】
特に断りない限り、具体的に詳細に記載されていない全ての方法、工程、技術、及び操作は、当業者に明らかなように、それ自体公知の方法で行うことができ、行われている。例えば、再度、本明細書で言及された標準的な参考書及び一般的な背景技術、ならびにその背景技術で引用された更なる参考文献、ならびに、例えば、下記のレビュー、Presta（Adv. Drug Deliv. Rev.  58 (5-6): 640-56, 2006）、Levin and Weiss （Mol. Biosyst.  2(1): 49-57, 2006）、Irving et al.（J. Immunol. Methods 248(1-2): 31-45, 2001）、Schmitz et al.（Placenta 21 Suppl. A: S106-12, 2000）、Gonzales et al.（Tumour Biol. 26(1): 31-43, 2005）が参照される。これらのレビューには、タンパク質操作、例えば、親和性成熟についての技術、及び、タンパク質、例えば、免疫グロブリンの特異性及び他の所望の特性を改善するための他の技術が記載されている。
【００６１】
本明細書で使用する場合、（例えば、「免疫グロブリン配列」、「抗体配列」、「可変ドメイン配列」、「ＶＨＨ配列」、又は「タンパク質配列」等の用語における）「配列」という用語は、一般的には、より限定された解釈を必要とする文脈が存在しない限り、関連するアミノ酸配列及びそれをコードする核酸又はヌクレオチド配列の両方を含むと理解されたい。
【００６２】
アミノ酸残基は、標準的な３文字又は１文字アミノ酸コードに従って示されるであろう。国際公開公報第０８／０２００７９号の第４８頁における表Ａ−２が参照される。
【００６３】
核酸又はアミノ酸は、例えば、その核酸又はアミノ酸が得られた反応媒体又は培養培地と比較して、通常それらが前記供給源又は培地中で、会合している少なくとも１つの他の成分、例えば、別の核酸、別のタンパク質／ポリペプチド、別の生体成分もしくは巨大分子、又は少なくとも１つの汚染物、不純物、もしくは少量成分から分離されている場合、「（本質的に）単離されている（状態に）」あると考えられる。特に、核酸又はアミノ酸は、それらが少なくとも２倍、特に少なくとも１０倍、とりわけ少なくとも１００倍、及び最大１０００倍以上に精製されている場合、「（本質的に）単離されている」と考えられる。「（本質的に）単離された状態に」ある核酸又はアミノ酸は、好ましくは、適切な技術、例えば、適切なクロマトグラフ技術、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用して決定された場合、本質的に均一である。
【００６４】
ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列が、別のヌクレオチド配列又はアミノ酸配列をそれぞれ「含む」か、又は、別のヌクレオチド配列又はアミノ酸配列から「本質的になる」と言われる場合、これは、後者のヌクレオチド配列又はアミノ酸配列が、最初に言及されたヌクレオチド配列又はアミノ酸配列それぞれに包含されていることを意味することができる。ただし、より通常には、これは、一般的には、最初に言及されたヌクレオチド配列又はアミノ酸配列は、その配列内に、ヌクレオチド又はアミノ酸残基のストレッチをそれぞれ含むことを意味する。同ストレッチは、最初に言及された配列が実際に生成又は取得された方法（例えば、本明細書で記載された任意の適切な方法によることができる）に関わらず、後者の配列と同じヌクレオチド配列又はアミノ酸配列をそれぞれ有する。非限定的な例において、本発明のポリペプチドが免疫グロブリンシングル可変ドメインを含むと言われる場合、これは、前記免疫グロブリンシングル可変ドメイン配列が、本発明のポリペプチドの配列に包含されていることを意味する。ただし、より通常には、これは、一般的には、前記本発明のポリペプチドが生成又は取得された方法に関わらず、本発明のポリペプチドが、その配列内に、免疫グロブリンシングル可変ドメインの配列を含有することを意味する。また、核酸又はヌクレオチド配列が、別のヌクレオチド配列を含むと言われる場合、最初に言及された核酸又はヌクレオチド配列は、好ましくは、それらが発現生成物（例えば、ポリペプチド）中に発現される場合、後者のヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列が前記発現生成物の一部を形成する（すなわち、後者のヌクレオチド配列が、最初に言及されたより大きい核酸又はヌクレオチド配列と同じ読み枠にある）ようにである。
【００６５】
「から本質的になる」は、本発明の方法に使用される免疫グロブリンシングル可変ドメインが、本発明のポリペプチドと正確に同じであるか、又は、免疫グロブリンシングル可変ドメインのアミノ末端、カルボキシ末端、もしくはアミノ末端及びカルボキシ末端の両方に付加された、限られた数のアミノ酸残基、例えば、１〜２０個のアミノ酸残基、例えば、１〜１０個のアミノ酸残基、及び好ましくは、１〜６個のアミノ酸残基、例えば、１、２、３、４、５、もしくは６個のアミノ酸残基を有する、本発明のポリペプチドに対応するかのいずれかを意味する。
【００６６】
２つ以上のヌクレオチド配列を比較する目的で、第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列との間の「配列同一性」の割合を、［第２のヌクレオチド配列中の対応する位置におけるヌクレオチドに同一の第１のヌクレオチド配列中のヌクレオチド数］を、［第１のヌクレオチド配列中のヌクレオチドの総数］で割り、［１００％］を掛けることにより算出することができる。ここで、第１のヌクレオチド配列と比較して、第２のヌクレオチド配列中のヌクレオチドの各欠失、挿入、置換、又は付加は、１つのヌクレオチド（位置）における差と考えられる。あるいは、２つ以上のヌクレオチド配列間の配列同一性の度合いは、配列アライメント用の公知のコンピュータアルコリズム、例えば、NCBI Blast v2.0を使用し、標準的な設定を使用して算出することができる。配列同一性の度合いを決定するための幾つかの他の技術、コンピュータアルコリズム、及び設定は、例えば、国際公開公報第０４／０３７９９９号、欧州特許第０９６７２８４号、同第１０８５０８９号、国際公開公報第００／５５３１８号、同第００／７８９７２号、同第９８／４９１８５号、及びドイツ国特許第２３５７７６８号に記載されている。通常、上記概説された算出法に従って、２つのヌクレオチド配列間の「配列同一性」の割合を決定する目的で、ヌクレオチドの数が多い方のヌクレオチド配列が、「第１の」ヌクレオチド配列として扱われるであろう。他方のヌクレオチド配列が、「第２の」ヌクレオチド配列として扱われるであろう。
【００６７】
２つ以上のアミノ酸配列を比較する目的で、第１のアミノ酸配列と第２のアミノ酸配列との間の「配列同一性」の割合（本明細書において、「アミノ酸同一性」とも呼ばれる）を、［第２のアミノ酸配列中の対応する位置におけるアミノ酸残基に同一の第１のアミノ酸配列中のアミノ酸残基数］を、［第１のアミノ酸配列中のアミノ酸残基の総数］で割り、［１００％］を掛けることにより算出することができる。ここで、第１のアミノ酸配列と比較して、第２のアミノ酸配列中のアミノ酸残基の各欠失、挿入、置換、又は付加は、１つのアミノ酸残基（位置）における差、すなわち、本明細書で定義された「アミノ酸差」と考えられる。あるいは、２つのアミノ酸配列間の配列同一性の度合いは、公知のコンピュータアルコリズム、例えば、ヌクレオチド配列についての配列同一性の度合いを決定するために上記で言及されたものを使用し、再度、標準的な設定を使用して算出することができる。通常、上記概説された算出法に従って、２つのアミノ酸配列間の「配列同一性」の割合を決定する目的で、アミノ酸残基の数が多い方のアミノ酸配列が、「第１の」アミノ酸配列として扱われるであろう。他方のアミノ酸配列が、「第２の」アミノ酸配列として扱われるであろう。
【００６８】
また、２つのアミノ酸配列間の配列同一性の度合いの決定において、当業者は、いわゆる「保存的」アミノ酸置換を考慮することができる、同置換は、一般的には、アミノ酸残基が類似する化学的構造の別のアミノ酸残基により置き換えられており、ポリペプチドの機能、活性、又は他の生物学的特性にほとんど又は本質的に影響を及ぼさない、アミノ酸置換として説明することができる。このような保存的アミノ酸置換は、例えば、国際公開公報第０４／０３７９９９号、ドイツ国特許第３３５７６８号、国際公開公報第９８／４９１８５号、同第００／４６３８３号、及び同第０１／０９３００号から、当技術分野において周知である。また、このような置換の（好ましい）種類及び／又は組み合わせは、国際公開公報第０４／０３７９９９号及び同第９８／４９１８５号ならびにこれらの文献で引用された更なる参考文献からの適切な技術に基づいて選択することができる。
【００６９】
このような保存的置換は、好ましくは、下記グループ（ａ）〜（ｅ）内の１つのアミノ酸が同じグループ内の別のアミノ酸残基により置換されている、置換である。（ａ）小型の脂肪族、非極性又はわずかに極性の残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、及びＧｌｙ；（ｂ）極性で負に荷電した残基及びその（非荷電の）アミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、及びＧｌｎ；（ｃ）極性の正に荷電した残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ、及びＬｙｓ；（ｄ）大型の脂肪族、非極性の残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、及びＣｙｓ；ならびに（ｅ）芳香族残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、及びＴｒｐ。特に好ましい保存的置換は、下記の通りである。ＡｌａからＧｌｙ又はＳｅｒへ；ＡｒｇからＬｙｓへ；ＡｓｎからＧｌｎ又はＨｉｓへ；ＡｓｐからＧｌｕへ；ＣｙｓからＳｅｒへ；ＧｌｎからＡｓｎへ；ＧｌｕからＡｓｐへ；ＧｌｙからＡｌａ又はＰｒｏへ；ＨｉｓからＡｓｎ又はＧｌｎへ；ＩｌｅからＬｅｕ又はＶａｌへ；ＬｅｕからＩｌｅ又はＶａｌへ；ＬｙｓからＡｒｇ、Ｇｌｎ、又はＧｌｕへ；ＭｅｔからＬｅｕ、Ｔｙｒ、又はＩｌｅへ；ＰｈｅからＭｅｔ、Ｌｅｕ、又はＴｙｒへ；ＳｅｒからＴｈｒへ；ＴｈｒからＳｅｒへ；ＴｒｐからＴｙｒへ；ＴｙｒからＴｒｐへ；及び／又は、ＰｈｅからＶａｌ、Ｉｌｅ、又はＬｅｕへ。
【００７０】
また、本明細書で記載されたポリペプチドに適用される任意のアミノ酸置換は、Schulz et al.（「Principles of Protein Structure」, Springer-Verlag, 1978）により開発された異なる種の相同タンパク質間のアミノ酸変異頻度の分析、Chou and Fasman（Biochemistry 13: 211, 1974；Adv. Enzymol., 47: 45-149, 1978）により開発された構造形成電位の分析、ならびに、Eisenberg et al.（Proc. Natl. Acad Sci. USA 81: 140-144, 1984）、Kyte and Doolittle（J. Molec. Biol. 157: 105-132, 1981）及びGoldman et al.（Ann. Rev. Biophys. Chem. 15: 321-353, 1986）により開発されたタンパク質中の疎水性パターンの分析に基づくこともできる。全ての参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。ナノボディの一次、二次、及び三次構造の情報は、本明細書中の説明及び上記で引用された一般的な背景技術において提供される。また、この目的で、ラマ由来のＶＨＨドメインの結晶構造は、例えば、Desmyter et al.（Nature Structural Biology, 3: 803, 1996）、Spinelli et al.（Natural Structural Biology, 3: 752-757, 1996）、及びDecanniere et al.（Structure, 7 (4): 361, 1999）により提供される。従来のＶＨドメインがＶＨ／ＶＬ界面を形成する一部のアミノ酸残基についての更なる情報及びこれらの位置における可能性のあるラクダ化置換は、上記で引用された従来技術に見出すことができる。
【００７１】
アミノ酸配列及び核酸配列は、それらが、その全長にわたって（上記で定義された）１００％配列同一性を有する場合、「正確に同じ」であると言われる。
【００７２】
２つのアミノ酸を比較する場合、「アミノ酸差」という用語は、第２の配列と比較して、第１の配列の位置における１つのアミノ酸残基の挿入、欠失、又は置換を意味する。２つのアミノ酸配列は、１つ、２つ、又はそれ以上のこのようなアミノ酸差を含有することができると理解される。とりわけ、本発明のアミノ酸配列及び／又はポリペプチドにおいて、「アミノ酸差」という用語は、ａ）、ｃ）、又はｅ）それぞれのＣＤＲ配列と比較して、ｂ）、ｄ）、又はｆ）で特定されたＣＤＲ配列の位置における１つのアミノ酸残基の挿入、欠失、又は置換を意味する。ｂ）、ｄ）、及びｆ）のＣＤＲ配列は、ａ）、ｃ）、又はｅ）それぞれのＣＤＲ配列と比較して、１、２、３、又は最大４つのこのようなアミノ酸差を含有することができる。
【００７３】
「アミノ酸差」は、本発明のポリペプチドの特性を改善するか、又は、本発明のポリペプチドの所望の特性又は所望の特性のバランスもしくは組み合わせを少なくとも後退させ過ぎないかのいずれかである、１、２、３、又は最大４つの置換、欠失、もしくは挿入のいずれか、又はそれらの任意の組み合わせであることができる。これに関連して、得られた本発明のポリペプチドは、１つ以上のＣＤＲ配列を含み、１、２、３、もしくは最大４つの置換、欠失、もしくは挿入を含まないポリペプチドと比較して、同じ、ほぼ同じ、又は、より高い親和性で、少なくともＫｖ１．３に結合すべきである。前記親和性は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により測定される場合のものである。
【００７４】
これに関連して、ｂ）、ｄ）、及び／又はｆ）のアミノ酸配列は、ａ）、ｃ）、及び／又はｅ）それぞれのアミノ酸配列から、それ自体公知の親和性成熟の１つ以上の技術を使用する親和性成熟により得られたアミノ酸配列であることができる。
【００７５】
例えば、本発明のポリペプチドを発現させるのに使用されるホスト生物に応じて、このような欠失及び／又は置換は、当業者の能力の範囲内にあるであろうように、翻訳後修飾のための１つ以上の部位（例えば、１つ以上のグリコシル化部位）が除去されるような方法において設計することができる。
【００７６】
本明細書で使用する場合、「ナノボディファミリー」、「ＶＨＨファミリー」、又は「ファミリー」は、同一の長さを有し（すなわち、それらは、その配列内に同じ数のアミノ酸を有する）、８位〜１０６位（Ｋａｂａｔナンバリングに従った）のアミノ酸配列が８９％以上のアミノ酸配列同一性を有する、ナノボディ及び／又はＶＨＨ配列のグループを意味する。
【００７７】
「エピトープ」及び「抗原性決定基」という用語は、互換的に使用することができ、抗原結合分子、例えば、免疫グロブリン、従来の抗体、本発明の免疫グロブリンシングル可変ドメイン及び／又はポリペプチドにより、及びとりわけ、前記分子の抗原結合部位により認識される巨大分子、例えば、ポリペプチド又はタンパク質の一部を意味する。エピトープは、免疫グロブリンのための最小結合部位を定義するため、免疫グロブリンの特異性のターゲットを表わす。
【００７８】
エピトープを認識する抗原結合分子（例えば、免疫グロブリン、従来の抗体、本発明の免疫グロブリンシングル可変ドメイン及び／又はポリペプチド）の一部は、「パラトープ」と呼ばれる。
【００７９】
特定のエピトープ、抗原、又はタンパク質（又は、その少なくとも一部、フラグメント、もしくはエピトープ）に「結合する」もしくは「特異的に結合する」ことができ、これらに対して「親和性を有する」、及び／又は、これらに対する「特異性を有する」ポリペプチド（例えば、本発明の免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリンシングル可変ドメイン、ポリペプチド、又は一般的に、その抗原結合分子もしくはフラグメント）は、前記エピトープ、抗原、もしくはタンパク質に「対する」又は「向けられる」と言われ、又は、このようなエピトープ、抗原、もしくはタンパク質に対する「結合」分子であり、又は、「抗」エピトープ、「抗」抗原、又は「抗」タンパク質（例えば、「抗」Ｋｖ１．３）であると言われる。
【００８０】
「特異性」という用語は、国際公開公報第０８／０２００７９号の第５３〜５６頁における段落ｎ）においてそれに与えられた意味を有し、そこで言及されたように、特定の抗原結合分子又は抗原結合タンパク質（例えば、本発明の免疫グロブリンシングル可変ドメイン及び／又はポリペプチド）が結合することができる、数多くの種類の抗原又は抗原性決定基を意味する。抗原結合タンパク質の特異性は、国際公開公報第０８／０２００７９号（参照により本明細書に組み入れられる）の第５３〜５６頁で記載されたように、親和性及び／又は結合活性に基づいて決定することができる。また、国際公開公報第０８／０２００７９号の第５３〜５６頁には、抗原結合分子（例えば、本発明の免疫グロブリンシングル可変ドメイン及び／又はポリペプチド）と適切な抗原との間の結合を測定するための一部の好ましい技術も記載されている。典型的には、抗原結合タンパク質（例えば、本発明の免疫グロブリンシングル可変ドメイン及び／又はポリペプチド）は、１０−５〜１０−１２モル／リットル以下、及び好ましくは、１０−７〜１０−１２モル／リットル以下、及びより好ましくは、１０−８〜１０−１２モル／リットルの解離定数（ＫＤ）で（すなわち、１０５〜１０１２リットル／モル以上、及び好ましくは、１０７〜１０１２リットル／モル以上、及びより好ましくは、１０８〜１０１２リットル／モルの会合定数（ＫＡ）で）、その抗原に結合するであろう。１０−４モル／リットルより大きい任意のＫＤ値（又は、１０４M−１より小さい任意のＫＡ値）は、一般的には、非特異的結合を示すと考えられる。好ましくは、本発明の一価ポリペプチドは、５００nM未満、好ましくは２００nM未満、より好ましくは１０nM未満、例えば、１０〜５nM以下等の親和性で、所望の抗原に結合するであろう。抗原又は抗原性決定基に対する抗原結合タンパク質の特異的結合は、例えば、スキャッチャード分析及び／又は競合的結合アッセイ法、例えば、放射性免疫アッセイ法（ＲＩＡ）、酵素免疫アッセイ法（ＥＩＡ）、及びサンドイッチ競合アッセイ法を含む、それ自体公知の任意の適切な方法、及び、当技術分野においてそれ自体公知のその種々の変形例、ならびに、本明細書で言及された他の技術において決定することができる。当業者に明らかであろうように、そして、国際公開公報第０８／０２００７９号の第５３〜５６頁で記載されたように、解離定数は、実際又は見かけの解離定数であることができる。解離定数を決定するための方法は、当業者に明らかであろうし、例えば、国際公開公報第０８／０２００７９号の第５３〜５６頁で言及された技術を含む。
【００８１】
免疫グロブリンシングル可変ドメイン及び／又はポリペプチドは、この免疫グロブリンシングル可変ドメイン及び／又はポリペプチドが第２のターゲット又は抗原に結合する親和性よりも、少なくとも１０倍、例えば、少なくとも１００倍、及び好ましくは、少なくとも１０００倍、及び最大１００００倍以上の親和性（上記された通り、ＫＤ値、ＫＡ値、Ｋｏｆｆ速度、及び／又はＫｏｎ速度と適切に表現される）で、これらが第１の抗原に結合する場合、第２のターゲット又は抗原と比較して、第１のターゲット又は抗原に特異的であると言われる。例えば、免疫グロブリンシングル可変ドメイン及び／又はポリペプチドは、前記免疫グロブリンシングル可変ドメイン及び／又はポリペプチドが第２のターゲット又は抗原に結合するＫＤよりも、少なくとも１０倍小さい、例えば、少なくとも１００倍小さい、及び好ましくは、少なくとも１０００倍小さい、例えば、１００００倍小さい、又は更に小さいＫＤ値で、第１のターゲット又は抗原に結合することができる。好ましくは、免疫グロブリンシングル可変ドメイン及び／又はポリペプチドが、第２のターゲット又は抗原と比較して、第１のターゲット又は抗原に「特異的」である場合、この免疫グロブリンシングル可変ドメイン及び／又はポリペプチドは、前記第１のターゲット又は抗原に（本明細書で定義されたように）対するが、前記第２のターゲット又は抗原には対しない。
【００８２】
「（クロス）ブロックする」、「（クロス）ブロックされる」、「（クロス）ブロックすること」、「競合的に結合すること」、「（クロス）競合する」、「（クロス）競合すること」、及び「（クロス）競合」という用語は、本明細書において互換的に使用され、他の免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリンシングル可変ドメイン、ポリペプチド、又は結合剤の所定のターゲットへの結合と干渉する、免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリンシングル可変ドメイン、ポリペプチド、又は他の結合剤の能力を意味する。免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリンシングル可変ドメイン、ポリペプチド、又は他の結合剤が、ターゲットに対する別のものの結合と干渉可能である程度、及び、それが本発明に基づいてクロスブロックすると言うことができるかは、競合結合アッセイ法を使用して決定することができる。特に適切な定量的クロスブロックアッセイ法は、実施例に記載されており、例えば、細胞上に発現させたＫｖ１．３による蛍光標識細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）結合アッセイ法を含む。（クロス）ブロックの程度は、（低下した）チャネル蛍光により測定することができる。
【００８３】
下記に、免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリンシングル可変ドメイン、ポリペプチド、又は他の結合剤が、本発明に基づいてクロスブロックするか、又は、クロスブロック可能であるかを決定するのに適したＦＡＣＳアッセイ法が、一般的に記載される。このアッセイ法は、本明細書で記載された免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリンシングル可変ドメイン、ポリペプチド、又は他の結合剤のいずれかにより使用することができる。ＦＡＣＳ機器（FACS Canto；Becton Dickinson）が、製造メーカーの推奨に則して操作される。
【００８４】
Ｋｖ１．３との結合について、２つの結合剤（例えば、２つの免疫グロブリンシングル可変ドメイン及び／又はナノボディ等）間の「（クロス）ブロック」又は「（クロス）競合」を評価するために、ＦＡＣＳ競合実験を、ヒトＫｖ１．３を過剰発現している細胞（例えば、ＣＨＯ細胞又はＨＥＫ２９３Ｈ細胞等）、及び、バックグラウンド細胞株としての親細胞を使用して行うことができる。例えば、モノクローナル抗FLAG（登録商標）M2抗体（Sigma-Aldrich, cat# F1804）、モノクローナル抗Ｃ−ｍｙｃ抗体（Sigma-Aldrich, cat# WH0004609M2）、モノクローナル抗ＨＩＳ  ＴＡＧ抗体（Sigma-Aldrich, cat# SAB1305538）（それぞれ、異なってラベルされている）を含む、種々の検出試薬を使用することができる。広い範囲の蛍光体を、フローサイトメトリーにおけるラベルとして使用することができる（例えば、ＰＥ（Ｒ−フィコエリスリン）、７−アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）、アクリジンオレンジ、種々の形態のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、ＡｍＣｙａｎ、アミノクマリン、ＡＰＣ  Ｃｙ５、ＡＰＣ  Ｃｙ７、ＡＰＣ−Ｈ７、ＡＰＣ／Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０、ＡｓＲｅｄ２、Ａｚａｍｉ−グリーン、Ａｚｕｒｉｔｅ、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ  Ｃ５−セラミド、ＢＣＥＣＦ−ＡＭ、Ｂｉｓ−オキソノール  ＤｉＢＡＣ２（３）、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ、カルセイン、カルセイン  ＡＭ、Ｃａｒｏｘｙ−Ｈ２ＤＣＦＤＡ、カスケードブルー、カスケードイエロー、セルトラッカーグリーン、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣＦＳＥ、クロモマイシン  Ａ３、ＣＭ−Ｈ２ＤＣＦＤＡ、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ３Ｂ、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、ＣｙＰｅｔ、ＤＡＦ−ＦＭ、ＤＡＦ−ＦＭ  ジアセタート、ＤＡＰＩ、ＤＣＦＨ（２’７’ジクロロジヒドロフルオレセイン）、ＤＨＲ、ジヒドロカルセイン  ＡＭ、ジヒドロローダミン、ジヒドロチジウム、ＤｉＬＣ１（５）、ＤｉＯＣ６（３）、ＤｉＯＣ７（３）、ｄＫｅｉｍａ−レッド、ＤＲＡＱ５、Ｄｒｏｎｐａ−グリーン、種々の形態のＤｓＲｅｄ  ｄＴｏｍａｔｏ、種々の形態のＤｙＬｉｇｈｔ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢｉｏＰａｒｔｉｃｌｅｓ  ＡＦ４８８、Ｅ２−クリムゾン、Ｅ２−オレンジ、ＥＢＦＰ２、ＥＣＦＰ、種々の形態のｅＦｌｕｏｒ、ＥＧＦＰ、ＥＧＦＰ＊、Ｅｍｅｒａｌｄ、ｅｑＦＰ６５０、ｅｑＦＰ６７０、ＥＲ−トラッカーブルー−ホワイト  ＤＰＸ、エチジウムブロマイド、Ｅｘｐｒｅｓｓ２、ＥＹＦＰ、Ｆｃ  ＯｘｙＢｕｒｓｔ  グリーン、Ｆｃ  ＯｘｙＢｕｒｓｔ  グリーン  １２３、ＦＩＴＣ、Ｆｌｕｏ−３、Ｆｌｕｏ−４、フルオレセイン、Ｆｕｒａ−２、Ｆｕｒａ−レッド、ＧＦＰｕｖ、Ｈ２ＤＣＦＤＡ、ＨｃＲｅｄ１、ヘキストブルー（３３２５８）、ヘキストレッド（３３３４２）、ヒドロキシクマリン、ＨｙＰｅｒ、Ｉｎｄｏ−１、Ｉｎｄｏ−１  ブルー（Ｌｏｗ  Ｃａ２＋）、Ｉｎｄｏ−１  バイオレット（Ｈｉｇｈ  Ｃａ２＋）、ｉＲＦＰ、Ｊ−Ｒｅｄ、ＪＣ−１、ＪＣ−９、Ｋａｔｕｓｈｋａ（ＴｕｒｂｏＦＰ６３５）、Ｋａｔｕｓｈｋａ２  Ｋｕｓａｂｉｒａ−オレンジ、ＬＤＳ  ７５１、リサミン−ローダミン  Ｂ、種々の形態のＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ、ルシファーイエロー、ルシファーイエロー  ＣＨ、Ｌｙｓｏ  トラッカ��ブルー、Ｌｙｓｏ  トラッカーグリーン、Ｌｙｓｏ  トラッカーレッド、ｍＡｍｅｒｔｒｉｎｅ、Ｍａｒｉｎａブルー、ｍＢａｎａｎａ、ｍＣＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、メトキシクマリン、ｍＨｏｎｅｙＤｅｗ、Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ−シアン、Ｍｉｔｈｒａｍｙｃｉｎ、Ｍｉｔｏ  トラッカーディープレッド、Ｍｉｔｏ  トラッカーグリーン、Ｍｉｔｏ  トラッカーオレンジ、Ｍｉｔｏ  トラッカーレッド、ＭｉｔｏＦｌｕｏｒ  グリーン、ｍＫａｔｅ（ＴａｇＦＰ６３５）、ｍＫａｔｅ２、ｍＫｅｉｍａ、ｍＫｅｉｍａ−レッド、ｍＫＯ、ｍＫＯｋ、ｍＮｅｐｔｕｎｅ、モノクロロビマン、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＯｒａｎｇｅ２、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＰｌｕｍ、ｍＲＦＰ１、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｍＴａｒｑｕｏｉｓｅ、ｍＴＦＰ１、ｍＴＦＰ１（Ｔｅａｌ）、ＮＢＤ、ＯｘｙＢｕｒｓｔ  グリーン  Ｈ２ＤＣＦＤＡ、ＯｘｙＢｕｒｓｔ  グリーン  Ｈ２ＨＦＦ  ＢＳＡ、パシフィックブルー、ＰＥ（Ｒ−フィコエリスリン）、ＰＥ  Ｃｙ５、ＰＥ  Ｃｙ５．５、ＰＥ  Ｃｙ７、ＰＥ  テキサスレッド、ＰＥ−Ｃｙ５  コンジュゲート、ＰＥ−Ｃｙ７  コンジュゲート、ＰｅｒＣＰ（ペリジニンクロロフィルタンパク質）、ＰｅｒＣＰ  Ｃｙ５．５、ＰｈｉＹＦＰ、ＰｈｉＹＦＰ−ｍ、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、種々の形態のＱｄｏｔ、Ｒｅｄ  ６１３、ＲＦＰ  Ｔｏｍａｔｏ、Ｒｈｏｄ−２、Ｓ６５Ａ、Ｓ６５Ｃ、Ｓ６５Ｌ、Ｓ６５Ｔ、一重項酸素センサーグリーン、Ｓｉｒｉｕｓ、ＳＮＡＲＦ、Ｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒ  ＧＦＰ、ＳＹＴＯＸ  ブルー、ＳＹＴＯＸ  グリーン、ＳＹＴＯＸ  オレンジ、Ｔ−サファイア、ＴａｇＢＦＰ、ＴａｇＣＦＰ、ＴａｇＧＦＰ、ＴａｇＲＦＰ、ＴａｇＲＦＰ６５７、ＴａｇＹＦＰ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、テキサスレッド、チアゾールオレンジ、ＴＭＲＥ、ＴＭＲＭ、Ｔｏｐａｚ、ＴＯＴＯ−１、ＴＯ−ＰＲＯ−１、ＴＲＩＴＣ、ＴＲＩＴＣ  ＴｒｕＲｅｄ、ＴｕｒｂｏＦＰ６０２、ＴｕｒｂｏＦＰ６３５、ＴｕｒｂｏＧＦＰ、ＴｕｒｂｏＲＦＰ、ＴｕｒｂｏＹＦＰ、Ｖｅｎｕｓ、Ｖｙｂｒａｎｔ  ＣｙｃｌｅＤｙｅ  バイオレット、野生型ＧＦＰ、Ｘ−ローダミン、Ｙ６６Ｆ、Ｙ６６Ｈ、Ｙ６６Ｗ、ＹＯＹＯ−１、ＹＰｅｔ、ＺｓＧｒｅｅｎ１、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１、Ｚｙｍｏｓａｎ  Ａ  ＢｉｏＰａｒｔｉｃｌｅｓ  ＡＦ４８８（http://www.thefcn.org/flow-fluorochromesを更に参照のこと））。蛍光体又は単に「ｆｌｕｏｒｓ」は、典型的には、Ｋｖ１．３を認識する抗体（例えば、免疫グロブリンシングル可変ドメイン及び／又はナノボディ）、又は、検出試薬として使用される抗体に付着させる。種々のコンジュゲート抗体、例えば、Alexa Fluor（登録商標）、DyLight（登録商標）、ローダミン、ＰＥ、ＦＩＴＣ、及びＣｙ３にコンジュゲートした抗体等を利用できる（が、これらに限定されない）。各蛍光体は、特徴的なピークの励起及び発光波長を有する。使用することができるラベルの組み合わせは、蛍光体を励起させるのに使用されるランプ又はレーザの波長及び利用できる検出器により決まるであろう。
【００８５】
Ｋｖ１．３への結合について、２つの試験結合剤（Ａ及びＢと呼ぶ）間の競合を評価するために、コールド（ラベルを何ら含まない）結合剤Ａの希釈系列が、ラベルされた結合剤Ｂ＊と共に、（例えば、２０００００個の）細胞に加えられる。試験混合物中の結合剤Ｂ＊の濃度は、細胞上に発現させたＫｖ１．３上の結合部位を容易に飽和させるのに十分高くあるべきである。細胞上に発現させたＫｖ１．３上のその結合剤に対する結合部位を飽和させる結合剤Ｂ＊の濃度は、Ｋｖ１．３細胞における結合剤Ｂ＊の滴定系列及び結合についてのＥＣ５０値の決定により決定することができる。飽和濃度で作用させるために、結合剤Ｂ＊を、ＥＣ５０濃度の１００倍で使用することができる。
【００８６】
細胞と結合剤Ａ及び結合剤Ｂ＊の混合物とのインキュベーションと、細胞洗浄との後に、リードアウトを、ＦＡＣＳにおいて行うことができる。第１のゲートを、散乱プロファイルから決定されるように、インタクト細胞に設定し、チャネル蛍光の総量を記録する。
【００８７】
また、結合剤Ｂ＊の別の溶液も調製する。この溶液中の結合剤Ｂ＊は、（結合剤Ａ及びＢ＊を含む）試験混合物と、同じバッファー及び同じ濃度であるべきである。この別の溶液も、細胞に加える。インキュベーション及び細胞洗浄後、リードアウトを、ＦＡＣＳにおいて行うことができる。第１のゲートを、散乱プロファイルから決定されるように、インタクト細胞に設定し、チャネル蛍光の総量を記録する。
【００８８】
結合剤Ｂ＊の別の溶液と共にインキュベーションされた細胞についての蛍光と比較して、結合剤Ａ及びＢ＊の混合物と共にインキュベーションされた細胞についての蛍光の減少は、結合剤Ａが細胞上に発現させたＫｖ１．３に対する結合について、結合剤Ｂ＊による結合を（クロス）ブロックすることを示す。
【００８９】
本発明のクロスブロックする免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリンシングル可変ドメイン、ポリペプチド、又は他の結合剤は、上記ＦＡＣＳクロスブロックアッセイ法において、このアッセイ法中に、第２の免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリンシングル可変ドメイン、ポリペプチド、又は他の結合剤の存在下で、記録された蛍光が、（別々にラベルされた免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリンシングル可変ドメイン、ポリペプチド、又は他の結合剤について測定された）最大蛍光の８０％〜０．１％（例えば、８０％〜４％）、具体的には、最大蛍光の７５％〜０．１％（例えば、７５％〜４％）、及びより具体的には、最大蛍光の７０％〜０．１％（例えば、７０％〜４％）であるように、Ｋｖ１．３に結合するであろうものである（まさに、上記で定義された通り）。
【００９０】
また、Ｋｖ１．３への結合について、２つの試験結合剤（Ａ＊及びＢ＊と呼ぶ）間の競合を、それぞれ異なる蛍光体でラベルされている両結合剤を、Ｋｖ１．３発現細胞に加えることにより評価することもできる。インキュベーション及び細胞洗浄後、リードアウトを、ＦＡＣＳにおいて行うことができる。ゲートを、各蛍光体について設定し、チャネル蛍光の総量を記録する。蛍光体の内の１つの蛍光の減少及び／又は不存在は、細胞上に発現させたＫｖ１．３に対する結合について、結合剤による（クロス）ブロックを示す。
【００９１】
本明細書で定義されたように、ターゲットに対する免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリンシングル可変ドメイン、ポリペプチド、又は他の結合剤が（クロス）ブロックし、（クロス）ブロック可能であり、競合的に結合し、又は、（クロス）競合的であるかどうかを決定するための他の方法は、例えば、Xiao-Chi Jia et al.（Journal of Immunological Methods 288: 91-98, 2004）、Miller et al.（Journal of Immunological Methods365: 118-125, 2011）、及び／又は本明細書で記載された方法（例えば、実施例７を参照のこと）に記載されている。
【００９２】
アミノ酸配列は、これらの種々の抗原又は抗原性決定基に対して（本明細書で定義されたように）特異的である場合、２種類の抗原又は抗原性決定基（例えば、哺乳類の２つの異なる種からの血清アルブミン、例えば、ヒト血清アルブミン及びカニクイザル血清アルブミン等、例えば、哺乳類の異なる種からのＫｖ１．３、例えば、ヒトＫｖ１．３、カニクイザルＫｖ１．３、及びラットＫｖ１．３等）に対して、「クロス反応性」であると言われる。
【００９３】
本発明の文脈において、「モデュレーションすること」又は「モデュレーションするために」は、一般的には、適切なｉｎ  ｖｉｔｒｏ、細胞内、又はｉｎ  ｖｉｖｏアッセイ法（例えば、本明細書で記載されたもの）を使用して測定された場合、Ｋｖ１．３の活性を低下させ、又は、阻害することを意味する。特に、「モデュレーションすること」又は「モデュレーションするために」は、適切なｉｎ  ｖｉｔｒｏ、細胞内、又はｉｎ  ｖｉｖｏアッセイ法（例えば、本明細書で記載されたもの）を使用して測定された場合、同じアッセイ法において、同じ条件下であるが、本発明の免疫グロブリン又はポリペプチドが存在しない、Ｋｖ１．３の活性と比較して、少なくとも１％、好ましくは少なくとも５％、例えば、少なくとも１０％又は少なくとも２５％で、例えば、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、もしくは９０％以上で、Ｋｖ１．３の活性を低下させ、又は、阻害するか、あるいは、Ｋｖ１．３の活性を向上させるかのいずれかを意味することができる。
【００９４】
また、「モデュレーションすること」は、Ｋｖ１．３が関与する（又は、その基質、リガンド、もしくは経路、例えば、そのシグナル伝達経路もしくは代謝経路及びその関連する生物学的又は生理学的効果が関与する）、１つ以上の生物学的もしくは生理学的メカニズム、効果、応答、機能、経路、又は活性に関する変化に影響を与えることも意味することができる。再度、当業者に明らかであろうように、このような作用は、任意の適切な方法において、及び／又は、それ自体公知の任意の適切なアッセイ法（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、及び通常、細胞内又はｉｎ  ｖｉｖｏアッセイ法）、例えば、本明細書で記載されたアッセイ法、又は、本明細書で引用された従来技術において決定することができる。特に、作用は、同じアッセイ法において、同じ条件下であるが、本発明の免疫グロブリン又はポリペプチドが存在しない、生物学的又は生理学的活性と比較して、少なくとも１％、好ましくは少なくとも５％、例えば、少なくとも１０％又は少なくとも２５％で、例えば、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、もしくは９０％以上で、意図した生物学的又は生理学的活性がそれぞれ向上又は低下するようにであることができる。
【００９５】
モデュレーションすることは、例えば、Ｔ細胞からのカリウムイオンの流出を減少させる、及び／又は、阻害することを含むことができる。モデュレーションは、Ｔ細胞の活性化及び／又は増殖の低下及び／又は阻害を含むことができる。モデュレーションは、（望ましくない）免疫応答の減少、阻害、及び／又はサプレッションを含むことができる。
【００９６】
本発明で使用する場合、「アロステリックモデュレーション」、「アロステリックにモデュレーションすること」、「アロステリックモデュレーター」という用語は、Ｋｖ１．３の活性における間接的なモデュレーションを意味する。アロステリックモデュレーターは、Ｋｖ１．３チャネルを物理的にブロックせず、むしろ、Ｋｖ１．３の活性に直接は関与しないＫｖ１．３における部位に結合する。通常、アロステリックモデュレーターは、Ｋｖ１．３のタンパク質構造内のコンフォーメーション変化を誘導し、同変化が、最終的に、孔チャネルに構造的応力をも与えることができる。つぎに、これが、孔の閉塞をもたらし、イオンチャネルが非機能性状態（停止又は不活性な状態）になり、及び／又は、イオンチャネルを非機能性状態に維持することができる。
【００９７】
本明細書で使用する場合、本発明のポリペプチドの「活性」という用語は、生じるその特定の効果に必要とされる本発明のポリペプチド量の関数である。この活性は、単純に、そのポリペプチドについてのＩＣ５０の逆関数として測定される。この活性は、Ｋｖ１．３の機能をモデュレーションし、及び／又は、部分的にもしくは完全に阻害する前記本発明のポリペプチドの能力を意味する。とりわけ、この活性は、Ｔ細胞からのカリウムイオンの流出を減少させ、又は更に、完全に阻害する、前記ポリペプチドの能力を意味することができる。また、この活性は、Ｔ細胞の増殖を阻害し、及び／又は、Ｔ細胞の活性化をサプレッションして、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける特定の免疫応答の阻害をもたらす、前記ポリペプチドの能力を意味することができる。
【００９８】
この活性は、当技術分野において公知であるか、又は、本明細書で記載された任意の適切なアッセイ法により測定することができる。制限されず、種々のイオンチャネルのスクリーニング技術が、例えば、Dabrowski et al.（CNS & Neurological Disorders Drug Targets 7: 122, 2008）、Lu and An（Comb. Chem. High Throughput Screen. 11:185-94, 2008）及びZheng et al.（Assay Drug Dev. Technol. 2: 543-52, 2004）により記載されている。活性アッセイ法は、イオン流出アッセイ法（Hanson et al. Br. J. Pharmacol. 126: 1707-16, 1999；Wang et al. Assay Drug Dev. Technol. 2: 525-34, 2004；Weaver et al. J. Biomol. Screen. 9: 671-7, 2004）、放射性リガンド結合試験（Felix et al. Biochemistry 38: 4922-30, 1999；Knaus et al. Biochemistry 34: 13627-13634, 1995；Helms et al. Biochemistry. 36: 3737-44, 1997）、蛍光染料アッセイ法、電気生理学、例えば、電圧クランプ（Huxley, Trends Neurosci. 25: 553-8, 2002）、及び特に、パッチクランプ（Hamill et al. Pflugers Archiv European Journal of Physiology 391: 85-100, 1981）もしくは、そのハイスループット版（Southan and Clark, Methods Mol. Biol. 565: 187-208, 2009）（PatchXpress（Molecular Devices； Ghetti et al. Methods Mol. Biol. 403: 59-69, 2007）、Qpatch及びQpatch HTX（Sophion；Mathes et al. Comb. Chem. High Throughput Screen. 12: 78-95, 2009；Korsgaard et al. Comb. Chem. High Throughput Screen. 12: 51-63, 2009）、PatchLiner（Nanion；Farre et al. Comb. Chem. High Throughput Screen 12: 24-37, 2009）、IonWorks（登録商標） HT、IonWorks（登録商標） Quattro、及びIonFlux（商標）システム（Molecular Devices；Jow et al. J Biomol. Screen. 12: 1059-67, 2007；Dale et al. Mol. Biosyst. 3: 714-22, 2007）を含む）、Ｔ細胞活性化アッセイ法（Nguyten et al. Molecular Pharmacology50: 1672-1679, 1996；Hanson et al. Br. J. Pharmacol. 126: 1707-1716, 1999）、及び／又は、ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイ法、例えば、Diabetes-prone Biobreeding Worchesterラット（Beeton et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 103: 17414-9, 2006）、アレルギー性接触皮膚炎のラットモデル（Azam et al. J. Invest. Dermatol. 127: 1419-29, 2007）、及びＴ細胞媒介性皮膚移植片拒絶の動物モデル（Ren et al. PLoS One 3:e4009, 2008）を含む（が、これらに限定されない）。
【００９９】
対照的に、本発明のポリペプチドの「有効性」は、飽和ポリペプチド濃度におけるそれ自体の効果の最大強度を測る。有効性は、本発明のポリペプチドから達成可能な最大応答を示す。有効性は、所望の（治療的）効果を生じさせるポリペプチドの能力を意味する。
【０１００】
本発明のポリペプチドの「半減期」は、一般的には、国際公開公報第０８／０２００７９号の第５７頁における段落ｏ）に記載されたように定義することができ、同文献で言及されたように、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、例えば、本来のメカニズムによるポリペプチドの分解及び／又はポリペプチドのクリアランスもしくは隔離により、ポリペプチドの血清濃度が、５０％に低下するのに掛かる時間を意味する。本発明のポリペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期は、それ自体公知の任意の方法において、例えば、薬物動態分析により決定することができる。適切な技術は、当業者に明らかであろうし、例えば、一般的には、国際公開公報第０８／０２００７９号の第５７頁における段落ｏ）で記載された通りであることができる。また、国際公開公報第０８／０２００７９号の第５７頁における段落ｏ）で言及されたように、半減期は、ｔ１／２アルファ、ｔ１／２ベータ、及び曲線下面積（ＡＵＣ）等のパラメータを使用して表現することができる。例えば、標準的な参考書、例えば、Kenneth et al（Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists, John Wiley & Sons Inc, 1986）及びM Gibaldi and D Perron（「Pharmacokinetics」 Marcel Dekker, 2nd Rev. Edition, 1982）が参照される。また、「半減期を延長させる」又は「延長した半減期」という用語も、国際公開公報第０８／０２００７９号の第５７頁における段落ｏ）で定義されており、特に、ｔ１／２アルファ及び／もしくはＡＵＣ又は両方の延長を伴うか、又は、同延長を伴わないかのいずれかで、ｔ１／２ベータの延長を意味する。
【０１０１】
特に断りない限り、「免疫グロブリン」及び「免疫グロブリン配列」という用語は、重鎖抗体又は従来の４本鎖抗体を意味するように本明細書で使用されるかに関わらず、全長抗体、その個々の鎖と、その全ての部分、ドメイン、又はフラグメント（抗原結合ドメイン又はフラグメント、例えば、ＶＨＨドメイン又はＶＨ／ＶＬドメインそれぞれを含むが、これらに限定されない）との両方を含む一般的な用語として使用される。
【０１０２】
本明細書で使用する場合、（ポリペプチド又はタンパク質の）「ドメイン」という用語は、タンパク質の残り部分とは独立して、その三次構造を保持する能力を有する、折り畳まれたタンパク質構造を意味する。一般的には、ドメインは、タンパク質の個別的な機能性を担い、多くの場合、タンパク質及び／又はドメインの残り部分の機能を損なうことなく、他のタンパク質に付加することができ、除去することができ、又は移すことができる。
【０１０３】
本明細書で使用する場合、「免疫グロブリンドメイン」という用語は、抗体鎖（例えば、従来の４本鎖抗体又は重鎖抗体の鎖等）の球状領域、又は、このような球状領域から本質的になるポリペプチドを意味する。免疫グロブリンドメインは、抗体分子に特有の免疫グロブリンフォールドを保持していることを特徴とする。同免疫グロブリンフォールドは、２つのベータシート中に配置され、場合により、保存的なジスルフィド結合により安定化された、約７固の逆平行ベータストランドの二層のサンドイッチからなる。
【０１０４】
本明細書で使用する場合、「免疫グロブリン可変ドメイン」という用語は、４つの「フレームワーク領域」から本質的になる、免疫グロブリンドメインを意味する。同フレームワーク領域は、当技術分野において、及び、本明細書において、それぞれ以下のように呼ばれる。「フレームワーク領域１」又は「ＦＲ１」、「フレームワーク領域２」又は「ＦＲ２」、「フレームワーク領域３」又は「ＦＲ３」、及び「フレームワーク領域４」又は「ＦＲ４」。これらのフレームワーク領域は、３つの「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」により中断される。同相補性決定領域は、当技術分野において、及び、本明細書において、それぞれ以下のように呼ばれる。「相補性決定領域１」又は「ＣＤＲ１」、「相補性決定領域２」又は「ＣＤＲ２」、及び「相補性決定領域３」又は「ＣＤＲ３」。このため、免疫グロブリン可変ドメインにおける全体的な構造又は配列は、下記：ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４のように示すことができる。免疫グロブリン可変ドメインは、抗原結合部位を有することにより、抗原に対して抗体に特異性を付与する。
【０１０５】
「免疫グロブリンシングル可変ドメイン」という用語は、「シングル可変ドメイン」と互換的に使用され、抗原結合部位がシングル可変ドメイン上に存在し、及び、同シングル可変ドメインにより形成されている分子を定義する。この定義により、免疫グロブリンシングル可変ドメインは、２つの免疫グロブリン、特に、２つの可変ドメインが相互作用して、抗原結合部位を形成している、「従来の」免疫グロブリン又はそのフラグメントとは別物と設定されている。典型的には、従来の免疫グロブリンでは、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）は相互作用して、抗原結合部位を形成している。この場合には、ＶＨ及びＶＬの両方における相補性決定領域（ＣＤＲ）は、抗原結合部位に関与するであろう。すなわち、合計６個のＣＤＲが、抗原結合部位の形成に関与するであろう。
【０１０６】
上記定義の観点において、従来の４本鎖抗体（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、又はＩｇＥ分子；当技術分野において公知）又は、このような従来の４本鎖抗体から得られた、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、例えば、ジスルフィド結合ＦｖもしくはｓｃＦｖフラグメント、又はダイアボディ（全て、当技術分野において公知）の抗原結合ドメインは、通常、免疫グロブリンシングル可変ドメインとは認識されないであろう。これらの場合には、抗原の各エピトープに対する結合は、通常、１つの（シングル）免疫グロブリンドメインにより生じず、一対の（会合した）免疫グロブリンドメイン、例えば、軽鎖及び重鎖可変ドメインにより、すなわち、免疫グロブリンドメインのＶＨ−ＶＬペアにより生じるであろうためである。同ＶＨ−ＶＬペアは、各抗原のエピトープに共同で結合する。
【０１０７】
対照的に、免疫グロブリンシングル可変ドメインは、更なる免疫グロブリン可変ドメインと対合することなく、抗原のエピトープに特異的に結合可能である。免疫グロブリンシングル可変ドメインの結合部位は、シングルＶＨ／ＶＨＨ又はＶＬドメインにより形成される。したがって、免疫グロブリンシングル可変ドメインの抗原結合部位は、３つ以下のＣＤＲにより形成される。
【０１０８】
また、シングル可変ドメインは、１つの抗原結合ユニットを形成可能である限り、軽鎖可変ドメイン配列（例えば、ＶＬ配列）もしくはその適切なフラグメント、又は、重鎖可変ドメイン配列（例えば、ＶＨ配列もしくはＶＨＨ配列）もしくはその適切なフラグメントであることができる（すなわち、機能性抗原結合ユニットがシングル可変ドメインから本質的になることにより、シングル抗原結合ドメインが、機能性抗原結合ユニットを形成するために、別の可変ドメインと相互作用する必要がない）。
【０１０９】
本発明の一実施態様では、免疫グロブリンシングル可変ドメインは、重鎖可変ドメイン配列（例えば、ＶＨ配列）である。より具体的には、免疫グロブリンシングル可変ドメインは、従来の４本鎖抗体から得られた重鎖可変ドメイン配列、又は、重鎖抗体から得られた重鎖可変ドメイン配列であることができる。
【０１１０】
例えば、免疫グロブリンシングル可変ドメインは、（シングル）ドメイン抗体（又は、（シングル）ドメイン抗体として使用するのに適したアミノ酸）、「ｄＡｂ」もしくはｄＡｂ（又は、ｄＡｂとして使用するのに適したアミノ酸）、又はナノボディ（本明細書で定義された通りであり、ＶＨＨを含むがこれに限定されない）；他のシングル可変ドメイン、又はそのいずれか１つの任意の適切なフラグメントであることができる。
【０１１１】
特に、免疫グロブリンシングル可変ドメインは、（本明細書で定義された）Nanobody（登録商標）又はその適切なフラグメントであることができる［注記：Nanobody（登録商標）、Nanobodies（登録商標）、及びNanoclone（登録商標）は、Ablynx N.V.の登録商標である］。ナノボディの一般的な説明については、以下の更なる説明及び本明細書で引用された従来技術、例えば、国際公開公報第０８／０２００７９号（第１６頁）に記載された従来技術等が参照される。
【０１１２】
「ＶＨＨドメイン」は、ＶＨＨ、ＶＨＨドメイン、ＶＨＨ抗体フラグメント、及びＶＨＨ抗体としても公知であり、元々、「重鎖抗体」（すなわち、「軽鎖欠損抗体」；Hamers-Casterman et al. Nature 363: 446-448, 1993）の抗原結合免疫グロブリン（可変）ドメインとして説明されてきた。「ＶＨＨドメイン」という用語は、これらの可変ドメインを、従来の４本鎖抗体に存在する重鎖可変ドメイン（本明細書において、「ＶＨドメイン」又は「ＶＨドメイン」と呼ばれる）、及び、従来の４本鎖抗体に存在する軽鎖可変ドメイン（本明細書において、「ＶＬドメイン」又は「ＶＬドメイン」と呼ばれる）と区別するために選択されてきた。ＶＨＨ及びナノボディの更なる説明について、Muyldermansによるレビュー文献（Reviews in Molecular Biotechnology 74: 277-302, 2001）及び下記特許出願が参照される。下記特許出願は、一般的な背景技術として言及される。Vrije Universiteit Brusselの国際公開公報第９４／０４６７８号、同第９５／０４０７９号、及び同第９６／３４１０３号；Unileverの国際公開公報第９４／２５５９１号、同第９９／３７６８１号、同第００／４０９６８号、同第００／４３５０７号、同第００／６５０５７号、同第０１／４０３１０号、同第０１／４４３０１号、欧州特許第１１３４２３１号、及び国際公開公報第０２／４８１９３号；the Vlaams Instituut voor Biotechnologie（VIB）の国際公開公報第９７／４９８０５号、同第０１／２１８１７号、同第０３／０３５６９４号、同第０３／０５４０１６号、及び同第０３／０５５５２７号；Algonomics N.V.及びAblynx N.V.の国際公開公報第０３／０５０５３１号；the National Research Council of Canadaによる国際公開公報第０１／９０１９０号；the Institute of Antibodiesによる国際公開公報第０３／０２５０２０号（＝欧州特許第１４３３７９３号）；ならびに、Ablynx N.V.による国際公開公報第０４／０４１８６７号、同第０４／０４１８６２号、同第０４／０４１８６５号、同第０４／０４１８６３号、同第０４／０６２５５１号、同第０５／０４４８５８号、同第０６／４０１５３号、同第０６／０７９３７２号、同第０６／１２２７８６号、同第０６／１２２７８７号、及び同第０６／１２２８２５号、ならびに、Ablynx N.V.により更に公表された特許出願。また、これらの出願で言及された更なる従来技術、及び特に、国際公開公報第０６／０４０１５３号の第４１〜４３頁で言及された参考文献の列記も参照される。同列記及び参考文献は、参照のより本明細書に組み入れられる。これらの参考文献で記載されたように、ナノボディ（特に、ＶＨＨ配列及び部分的にヒト化されたナノボディ）は、特に、１つ以上のフレームワーク配列中に、１つ以上の「ホールマーク残基」の存在により特徴決定することができる。ナノボディのヒト化及び／又はラクダ化、ならびに、他の修飾、部分、もしくはフラグメント、誘導体、又は「ナノボディ融合」、多価構築物（一部の非限定的な例のリンカー配列を含む）、ならびに、ナノボディの半減期を延長する種々の修飾、ならびに、その調製を含むナノボディの更なる記載は、例えば、国際公開公報第０８／１０１９８５号及び同第０８／１４２１６４号に見出すことができる。ナノボディの更なる一般的な説明については、本明細書で引用された従来技術、例えば、国際公開公報第０８／０２００７９号（第１６頁）に記載された従来技術等が参照される。
【０１１３】
「ドメイン抗体」は、「Ｄａｂ」、「Domain Antibodies」、及び「dAb」としても公知であり（「Domain Antibodies」及び「dAb」という用語は、GlaxoSmithKline group of companiesの商標として使用される）、例えば、欧州特許第０３６８６８４号、Ward et al.（Nature 341: 544-546, 1989）、Holt et al.（Tends in Biotechnology 21: 484-490, 2003）、及び国際公開公報０３／００２６０９号、ならびに、例えば、同第０４／０６８８２０号、同第０６／０３０２２０号、同第０６／００３３８８号、及びDomantis Ltd.の他の公表された特許出願に記載されている。ドメイン抗体は、本質的に、ラクダ以外のほ乳類のＶＨ又はＶＬドメイン、特に、ヒトの４本鎖抗体に対応する。シングル抗原結合ドメイン（すなわち、それぞれＶＬ又はＶＨドメインと対合していない）としてエピトープに結合するために、このような抗原結合特性に特異的な選択は、例えば、ヒトシングルＶＨ又はＶＬドメイン配列のライブラリを使用することにより要求される。ドメイン抗体は、ＶＨＨと同様に、約１３〜約１６kDaの分子量を有し、完全にヒト配列から得られた場合、例えば、ヒトにおける治療的使用のためのヒト化を必要としない。
【０１１４】
また、哺乳類起源でないため、本発明の文脈においてほとんど好ましくはないが、シングル可変ドメインは、特定種のサメ（例えば、いわゆる、「ＩｇＮＡＲドメイン」、例えば、国際公開公報第０５／１８６２９号）から得ることができることにも留意されたい。
【０１１５】
このため、本発明の意味において、「免疫グロブリンシングル可変ドメイン」又は「シングル可変ドメイン」という用語は、非ヒトソース、例えば、ラクダから得られるポリペプチド、好ましくは、ラクダ重鎖抗体を含む。それらは、以前に記載されたように、ヒト化させることができる。さらに、この用語は、非ラクダソース、例えば、マウス又はヒトから得られたポリペプチドを含む。同ポリペプチドは、例えば、Davies and Riechmann（FEBS 339: 285-290, 1994；Biotechnol. 13: 475-479, 1995；Prot. Eng. 9: 531-537, 1996）及びRiechmann and Muyldermans（J. Immunol. Methods 231: 25-38, 1999）で記載されたように、ラクダ化されてきた。
【０１１６】
ＶＨＨドメインのアミノ酸残基は、Kabat et al.（「Sequence of proteins of immunological interest」, US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, Publication No. 91)により提供されるＶＨドメインについての一般的なナンバリングに従って、例えば、Riechmann and Muyldermans（J. Immunol. Methods 231: 25-38, 1999）の図２に示された、ラクダからのＶＨＨドメインに適用されるようにナンバリングされる。また、ＶＨドメインのアミノ酸残基をナンバリングするための別の方法は、ＶＨＨドメインに類似する方法において適用することができ、当技術分野において公知である。ただし、本説明、特許請求の範囲、及び図面においては、上記されたＶＨＨドメインに適用されるＫａｂａｔに従ったナンバリングが、特に断りない限り行われるであろう。
【０１１７】
ＶＨドメイン及びＶＨＨドメインについて当技術分野において周知であるように、各ＣＤＲ中のアミノ酸残基の総数は変動する場合があり、Ｋａｂａｔナンバリングにより示されたアミノ酸残基の総数に対応しない場合がある（すなわち、Ｋａｂａｔナンバリングに従った１つ以上の位置が、実際に配列に占められていない場合があり、又は、実際の配列が、Ｋａｂａｔナンバリングにより認められた数より多いアミノ酸残基を含有する場合がある）ことに留意されたい。このことは、一般的には、Ｋａｂａｔに従ったナンバリングは、実際の配列中のアミノ酸残基の実際のナンバリングに対応してもよいし、又は、対応しなくてもよいことを意味する。ＶＨドメイン及びＶＨＨドメイン中のアミノ酸残基の総数は、通常、１１０〜１２０個、多くの場合、１１２〜１１５個の範囲であるであろう。ただし、より短い又は長い配列も、本明細書で記載された目的に適している場合があることに留意されたい。
【０１１８】
また、ＣＤＲ領域の決定は、種々の方法に従って行うことができる。Ｋａｂａｔに従ったＣＤＲ決定では、ＶＨＨのＦＲ１は、１〜３０位におけるアミノ酸残基を含む。ＶＨＨのＣＤＲ１は、３１〜３５位におけるアミノ酸残基を含む。ＶＨＨのＦＲ２は、３６〜４９位におけるアミノ酸を含む。ＶＨＨのＣＤＲ２は、５０〜６５位におけるアミノ酸残基を含む。ＶＨＨのＦＲ３は、６６〜９４位におけるアミノ酸残基を含む。ＶＨＨのＣＤＲ３は、９５〜１０２位におけるアミノ酸残基を含む。ＶＨＨのＦＲ４は、１０３〜１１３位におけるアミノ酸残基を含む。
【０１１９】
ただし、本願において、ＣＤＲ配列を、Kontermann and Dubel（Eds., Antibody Engineering, vol 2, Springer Verlag Heidelberg Berlin, Martin, Chapter 3, pp. 33-51, 2010）に従って決定した。この方法によれば、ＦＲ１は、１〜２５位におけるアミノ酸残基を含む。ＣＤＲ１は、２６〜３５位におけるアミノ酸残基を含む。ＦＲ２は、３６〜４９位におけるアミノ酸を含む。ＣＤＲ２は、５０〜５８位におけるアミノ酸残基を含む。ＦＲ３は、５９〜９４位におけるアミノ酸残基を含む。ＣＤＲ３は、９５〜１０２位におけるアミノ酸残基を含む。ＦＲ４は、１０３〜１１３位（Ｋａｂａｔナンバリングに従った）におけるアミノ酸残基を含む。
【０１２０】
免疫グロブリンシングル可変ドメイン、例えば、ドメイン抗体及びナノボディ（ＶＨＨドメインを含む）は、ヒト化に供することができる。特に、ヒト化免疫グロブリンシングル可変ドメイン、例えば、ナノボディ（ＶＨＨドメインを含む）は、先の段落で一般的に定義された免疫グロブリンシングル可変ドメインであることができるが、同免疫グロブリンシングル可変ドメインには、（本明細書で定義された）ヒト化置換である、及び／又は、同置換に対応する、少なくとも１つのアミノ酸残基（及び特に、少なくとも１つのフレームワーク残基）が存在する。有用である可能性のあるヒト化置換は、天然のＶＨＨ配列のフレームワーク領域の配列を、１つ以上の密接に関連するヒトＶＨ配列の対応するフレームワーク配列と比較することにより確認することができる。その後に、このようにして決定された１つ以上の有用である可能性のあるヒト化置換（又はその組み合わせ）を、（本明細書で更に記載されたそれ自体公知の任意の方法において）前記ＶＨＨ配列に導入することができ、得られたヒト化ＶＨＨ配列を、ターゲットに対する親和性、安定性、発現の容易性及びレベル、ならびに／又は他の所望の特性について試験することができる。この方法において、過度の思考錯誤をすることなく、他の適切なヒト化置換（又はその適切な組み合わせ）を、本明細書における開示に基づいて、当業者により決定することができる。また、前述に基づいて、免疫グロブリンシングル可変ドメイン、例えば、ナノボディ（ＶＨＨドメインを含む）（のフレームワーク領域）を、部分的にヒト化させ、又は、完全にヒト化させることができる。
【０１２１】
また、免疫グロブリンシングル可変ドメイン、例えば、ドメイン抗体及びナノボディ（ＶＨＨドメイン及びヒト化ＶＨＨドメインを含む）は、１つ以上の改変を１つ以上のＣＤＲのアミノ酸配列に導入することによる親和性成熟に供することができる。同改変は、各親分子と比較した場合、得られた免疫グロブリンシングル可変ドメインのその各抗原に対する改善された親和性をもたらす。本発明の親和性成熟した免疫グロブリンシングル可変ドメイン分子は、当技術分野において公知の方法、例えば、Marks et al.（Biotechnology 10:779-783, 1992）、Barbas, et al.（Proc. Nat. Acad. Sci, USA 91: 3809-3813, 1994）、Shier et al.（Gene 169: 147-155, 1995）、Yelton et al.（Immunol. 155: 1994-2004, 1995）、Jackson et al.（J. Immunol. 154: 3310-9, 1995）、Hawkins et al.（J. MoI. Biol. 226: 889 896, 1992）、Johnson and Hawkins（Affinity maturation of antibodies using phage display, Oxford University Press, 1996）により記載された方法により調製することができる。
【０１２２】
また、免疫グロブリンシングル可変ドメイン、例えば、ドメイン抗体又はナノボディから開始するポリペプチドの設計／選択及び／又は調製のプロセスは、本明細書において、前記免疫グロブリンシングル可変ドメインを「フォーマットする」とも呼ばれる。ポリペプチドの一部を構成する免疫グロブリンシングル可変ドメインは、前記ポリペプチドを「フォーマットした」、又は、前記ポリペプチド「のフォーマット状態」にあると言われる。免疫グロブリンシングル可変ドメインをフォーマット化することができる方法の例及びこのようなフォーマットの例は、本明細書における開示に基づいて、当業者に明らかであろう。このようなフォーマットされた免疫グロブリンシングル可変ドメインは、本発明の更なる態様を構成する。
【０１２３】
例えば、１つ以上の免疫グロブリンシングル可変ドメインは、ポリペプチドの調製に、「結合ユニット」、「結合ドメイン」、又は「構築ブロック」（これらの用語は、互換的に使用される）として使用することができるが、これらに限定されない。同ポリペプチドは、場合により、結合ユニットとして機能することができる（すなわち、Ｋｖ１．３上の同じかもしくは別のエピトープに対する、及び／又は、Ｋｖ１．３以外の１つ以上の他の抗原、タンパク質、もしくはターゲットに対する）、１つ以上の更なる免疫グロブリンシングル可変ドメインを含有することができる。
【０１２４】
一価ポリペプチドは、１つの結合ユニット（例えば、免疫グロブリンシングル可変ドメイン等）のみを含むか、又は、これから本質的になる。２つ以上の結合ユニット（例えば、免疫グロブリンシングル可変ドメイン等）を含むポリペプチドは、本明細書において、「多価」ポリペプチドとも呼ばれるであろう。このようなポリペプチドに存在する結合ユニット／免疫グロブリンシングル可変ドメインは、本明細書において、「多価フォーマット」にあるとも呼ばれるであろう。例えば、「二価」ポリペプチドは、場合により、リンカー配列を介して連結している、２つの免疫グロブリンシングル可変ドメインを含むことができる。一方、「三価」ポリペプチドは、場合により、２つのリンカー配列を介して連結している、３つの免疫グロブリンシングル可変ドメインを含むことができる。一方、「四価」ポリペプチドは、場合により、３つのリンカー配列を介して連結している、４つの免疫グロブリンシングル可変ドメインを含むことができる、等である。
【０１２５】
多価ポリペプチドでは、２つ以上の免疫グロブリンシングル可変ドメインは、同じか又は異なることができ、同じ抗原もしくは抗原性決定基に対することができ（例えば、同じ部分もしくはエピトープ、又は、異なる部分もしくはエピトープに対することができ）、あるいは、異なる抗原もしくは抗原性決定基、又は、それらの任意の適切な組み合わせに対することができる。少なくとも２つの結合ユニット（例えば、免疫グロブリンシングル可変ドメイン等）を含有するポリペプチド（同ペプチドにおいて、少なくとも１つの結合ユニットは、第１の抗原（すなわち、Ｋｖ１．３）に対し、少なくとも１つの結合ユニットは、第２の抗原（すなわち、Ｋｖ１．３とは異なる抗原）に対する）は、「多重特異性」ポリペプチドとも呼ばれるであろう。このようなポリペプチドに存在する結合ユニット（例えば、免疫グロブリンシングル可変ドメイン等）は、本明細書において、「多重特異性フォーマット」にあるとも呼ばれるであろう。このため、例えば、本発明の「二重特異性」ポリペプチドは、第１の抗原（すなわち、Ｋｖ１．３）に対する少なくとも１つの免疫グロブリンシングル可変ドメインと、第２の抗原（すなわち、Ｋｖ１．３とは異なる抗原）に対する少なくとも１つの更なる免疫グロブリンシングル可変ドメインとを含むポリペプチドである。一方、本発明の「三重特異性」ポリペプチドは、第１の抗原（すなわち、Ｋｖ１．３）に対する少なくとも１つの免疫グロブリンシングル可変ドメインと、第２の抗原（すなわち、Ｋｖ１．３とは異なる抗原）に対する少なくとも１つ更なるの免疫グロブリンシングル可変ドメインと、第３の抗原（すなわち、Ｋｖ１．３及び第２の抗原の両方と異なる抗原）に対する少なくとも１つの更なる免疫グロブリンシングル可変ドメインとを含むポリペプチドである、等である。
【０１２６】
「多重抗原結合性ポリペプチド」、例えば、「二重抗原結合性ポリペプチド」又は「三重抗原結合性ポリペプチド」等は、それぞれが異なるパラトープを有する２つ以上の結合ユニットを含むか、又は、これらから本質的になる（本明細書で更に記載されるであろう、本発明の多価ポリペプチドのチャプターを参照のこと）。
【０１２７】
電位作動型Ｋｖ１．３カリウムチャネルの細胞外ループＥＬ１に結合する免疫グロブリン
本発明は、Ｋｖ１．３、好ましくは、ヒトＫｖ１．３に特異性を有し、及び／又は、これらに結合する、免疫グロブリン（本明細書において、「本発明の免疫グロブリン」とも呼ばれる）及び／又はポリペプチド（本明細書において、「本発明のポリペプチド」とも呼ばれる）を提供する。Ｋｖ１．３は、ＫＣＮＡ３、ＭＫ３、ＨＧＫ５、ＨＬＫ３、ＰＣＮ３、ＨＰＣＮ３、又はＨＵＫＩＩＩとしても公知であり、ヒトにおいて、ＫＣＮＡ３遺伝子（アクセッションＮｏ．Ｐ２２００１、ヒトＫＣＮＡ３）によりコードされるタンパク質である。同遺伝子は、染色体１ｐ１３．３に位置している。このため、本発明の免疫グロブリン及び／又はポリペプチドは、好ましくは、ヒトＫｖ１．３（配列番号：４７４）に結合する。
【０１２８】
本発明の一態様では、本発明の免疫グロブリン及び／又はポリペプチドは、Ｋｖ１．３の第１の細胞外ループＥＬ１に結合する。細胞外ループＥＬ１のアミノ酸配列は、膜貫通領域Ｓ１の後に始まり、Ｓ２で終わる。より具体的には、Ｋｖ１．３の細胞外ループＥＬ１は、配列番号：４７４の２５４位〜２９４位に広がる。
【０１２９】
本発明者らにより、驚くべきことに、Ｋｖ１．３のこの部分に結合する本発明の免疫グロブリン及び／又はポリペプチドは、Ｋｖ１．３における種々のモデュレーション活性、例えば、Ｋｖ１．３の部分的もしくは完全なブロック、Ｔ細胞活性化及び／もしくは増殖の阻害、ならびに／又は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける（望ましくない）免疫応答のサプレッションを示したことが観察された。加えて、これらの免疫グロブリンは、非常に改善された種間クロス反応性及び精巧な選択特性を示した。
【０１３０】
したがって、本発明は、カリウムチャネル３（Ｋｖ１．３）のＥＬ１細胞外ループに特異的に結合する免疫グロブリン及び／又はポリペプチドに関し、ここで、前記免疫グロブリンの前記ＥＬ１細胞外ループへの結合は、Ｋｖ１．３の活性をモデュレーションし、及び／又は、阻害する。Ｋｖ１．３の孔チャネルは、Ｋｖ１．３の細胞外領域ＥＬ３により構成されているため、ＥＬ１に結合し、更に、Ｋｖ１．３の活性をモデュレーションし、阻害し、及び／又は、ブロックする（すなわち、ＥＬ３と物理的に相互作用せず、及び／又は、ＥＬ３をブロックしない）免疫グロブリンの発見は、予期されないものであった。
【０１３１】
本発明の好ましい免疫グロブリン及び／又はポリペプチドは、免疫グロブリン（例えば、重鎖抗体、従来の４本酸抗体（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、又はＩｇＥ分子）、このような従来の４本鎖抗体から得られた、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、例えば、ジスルフィド結合ＦｖもしくはｓｃＦｖフラグメント、又はダイアボディ、その個々の鎖、ならびに、その全ての部分、ドメイン、又はフラグメント（抗原結合ドメイン又はフラグメント、例えば、免疫グロブリンシングル可変ドメインを含むが、これらに限定されない）、本発明の一価ポリペプチド、又は他の結合剤）を含む。
【０１３２】
本発明の免疫グロブリン及び／又はポリペプチドのＫｖ１．３への結合は、Ｋｖ１．３ターゲットのそのコンフォーメーションを保持する結合アッセイ法において測定することができる。典型的なアッセイ法は、Ｋｖ１．３を細胞表面（例えば、ＣＨＯ細胞（例えば、ＣＨＯ−Ｋ１）、ＨＥＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター肺（ＣＨＬ）細胞、Ｃａｋｉ細胞等）上に露出させるアッセイ法を含む（が、これに限定されない）。本発明の免疫グロブリン及び／又はポリペプチドのＫｖ１．３への結合を測定するための好ましいアッセイ法は、ＦＡＣＳアッセイ法、例えば、実施例で記載されたＦＡＣＳアッセイ法等である。ここで、本発明の免疫グロブリン及び／又はポリペプチドの、ＣＨＯ−Ｋ１細胞及び／又はＨＥＫ２９３Ｈ細胞上に発現させたＫｖ１．３への結合が決定される。本発明の免疫グロブリン及び／又はポリペプチドのＫｖ１．３への結合についての一部の好ましいＥＣ５０値は、本明細書における更なる説明及び実施例から明らかとなるであろう。
【０１３３】
このようなＦＡＣＳ結合アッセイ法において、本発明の免疫グロブリン及び／又はポリペプチドは、１０−８M以下、より好ましくは１０−９M以下、又は更に１０−１０M以下の、ヒトＫｖ１．３結合におけるＥＣ５０値を有することができる。例えば、このようなＦＡＣＳ結合アッセイ法において、本発明の免疫グロブリン及び／又はポリペプチドは、１０−１０M〜１０−８M、例えば、１０−９M〜１０−８M、又は１０−１０M〜１０−９Mの、ヒトＫｖ１．３結合におけるＥＣ５０値を有することができる。
【０１３４】
このようなＦＡＣＳ結合アッセイ法において、本発明の免疫グロブリン及び／又はポリペプチドは、１０−７M以下、好ましくは１０−８M以下、より好ましくは１０−９M以下、又は更に１０−１０M以下の、カニクイザルＫｖ１．３結合におけるＥＣ５０値を有することができる。例えば、このようなＦＡＣＳ結合アッセイ法において、本発明のポリペプチドは、１０−１０M〜１０−７M、例えば、１０−１０M〜１０−８M、１０−１０M〜１０−９Mの、カニクイザルＫｖ１．３結合におけるＥＣ５０値を有することができる。
【０１３５】
このようなＦＡＣＳ結合アッセイ法において、本発明の免疫グロブリン及び／又はポリペプチドは、１０−６M以下、好ましくは１０−７M以下、好ましくは１０−８M以下、より好ましくは１０−９M以下、又は更に１０−１０M以下の、ラットＫｖ１．３結合におけるＥＣ５０値を有することができる。例えば、このようなＦＡＣＳ結合アッセイ法において、本発明のポリペプチドは、１０−１０M〜１０−６M、例えば、１０−１０M〜１０−７M、１０−１０M〜１０−８M、１０−１０M〜１０−９Mの、ラットＫｖ１．３結合におけるＥＣ５０値を有することができる。
【０１３６】
本発明の免疫グロブリン及び／又はポリペプチドは、Ｋｖ１．３のＥＬ１に結合し、Ｋｖ１．３の機能をモデュレーションし、及び／又は、（部分的にもしくは完全に）阻害する。とりわけ、本発明の免疫グロブリン及び／又はポリペプチドは、Ｔ細胞の膜を脱分極し、及び／又は、Ｔ細胞からのカリウムイオンの流出を減少させ、もしくは更に、完全に阻害することができる。また、本発明の免疫グロブリン及び／又はポリペプチドは、Ｔ細胞の増殖を部分的にもしくは完全に阻害し、及び／又は、Ｔ細胞の活性化をサプレッションして、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける特定の免疫応答の阻害をもたらすことができる。
【０１３７】
とりわけ、本発明の免疫グロブリン及び／又はポリペプチドは、Ｋｖ１．３の機能を間接的に、すなわち、（本明細書で定義された）アロステリックモデュレーターとして、モデュレーションすることができる。例えば、本発明の免疫グロブリン及び／又はポリペプチドは、Ｋｖ１．３の孔チャネルの構造内のコンフォーメーション変化を誘導することができる。
【０１３８】
したがって、一態様において、本発明は、Ｋｖ１．３のＥＬ１細胞外ループに特異的に結合する免疫グロブリン及び／又はポリペプチドに関し、ここで、前記免疫グロブリン及び／又はポリペプチドの前記ＥＬ１細胞外ループへの結合は、Ｋｖ１．３の活性を、Ｋｖ１．３の活性のアロステリックモデュレーションにより、モデュレーションし、及び／又は、（部分的にもしくは完全に）阻害する。とりわけ、本発明の免疫グロブリン及び／又はポリペプチドは、Ｔ細胞の膜をアロステリックに脱分極し、及び／又はＴ細胞からのカリウムイオンの流出を減少させ、もしくは更に、完全に阻害することができる。また、本発明の免疫グロブリン及び／又はポリペプチドは、Ｔ細胞の増殖を阻害し、及び／又は、Ｔ細胞の活性化をサプレッションして、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける特定の免疫応答の阻害をもたらすことができる。
【０１３９】
カリウムイオンの流出のモデュレーション及び／又は阻害は、各種のイオンチャネルスクリーニング技術により決定することができる。同技術は、イオン流出アッセイ法、放射性リガンド結合試験、蛍光染料アッセイ法、及び電気生理学、例えば、電圧クランプ、及び特に、パッチクランプを含む（が、これらに限定されない）。種々のイオンチャネル技術の概説は、例えば、Dabrowski et al.（CNS & Neurological Disorders Drug Targets 7: 122, 2008）、Lu and An（Comb. Chem. High Throughput Screen. 11:185-94, 2008）、及びZheng et al.（Assay Drug Dev. Technol. 2: 543-52, 2004）により提供される。
【０１４０】
電圧クランプ（Huxley, Trends Neurosci. 25: 553-8, 2002）は、興奮性細胞の膜からのイオン電流を測定するのに使用される。この技術のパッチクランプの変形例（Hamill et al. Pflugers Archiv European Journal of Physiology 391: 85-100, 1981）により、細胞中の単独又は複数のイオンチャネルの研究が可能となる。
【０１４１】
よりハイスループットの電気生理学的プラットフォームは、中程度のスループットシステムからよりハイスループットのプラットフォームの範囲で開発されてきた（例えば、Southan and Clark, Methods Mol. Biol. 565: 187-208, 2009を参照のこと）。同プラットフォームは、PatchXpress（Molecular Devices; Ghetti et al. Methods Mol. Biol. 403: 59-69, 2007）、Qpatch及びQpatch HTX（Sophion; Mathes et al. Comb. Chem. High Throughput Screen. 12: 78-95, 2009；Korsgaard et al. Comb. Chem. High Throughput Screen. 12: 51-63, 2009）、PatchLiner（Nanion；Farre et al. Comb. Chem. High Throughput Screen 12: 24-37, 2009）、IonWorks（登録商標） HT、IonWorks（登録商標） Quattro、及びIonFlux（商標）システム（Molecular Devices；Jow et al. J Biomol. Screen. 12: 1059-67, 2007；Dale et al. Mol. Biosyst. 3: 714-22, 2007）を含む。これらのアッセイ法における本発明のポリペプチドについての一部の好ましいＩＣ５０値は、本明細書における更なる説明及び実施例から明らかとなるであろう。
【０１４２】
例えば、Ｋｖ１．３発現ＨＥＫ２９３Ｈ細胞を使用するIonFlux（商標）（Molecular Devices）において、本発明の免疫グロブリン及び／又はポリペプチドは、１０−７M以下、好ましくは１０−８M以下、より好ましくは１０−９M以下、又は更に１０−１０M以下の、ＩＣ５０値を有する。例えば、この自動パッチクランプアッセイ法において、本発明のポリペプチドは、１０−１０M〜１０−７M、１０−１０M〜１０−８M、１０−１０M〜１０−９M、例えば、１０−９M〜１０−７M、１０−９M〜１０−８M、１０−８M〜１０−７M、又は１０−１０M〜１０−９M等の、ＩＣ５０値を有することができる。
【０１４３】
したがって、本発明は、Ｋｖ１．３のＥＬ１細胞外ループに特異的に結合し、IonFlux（商標）（Molecular Devices）で測定された場合、１０−７M以下、好ましくは１０−８M以下、より好ましくは１０−９M以下、又は更に１０−１０M以下の活性で、カリウムイオンの流出の（アロステリック）モデュレーションにより、Ｋｖ１．３の活性をモデュレーションし、及び／又は、阻害する免疫グロブリン及び／又はポリペプチドに関する。
【０１４４】
例えば、Ｋｖ１．３発現チャイニーズハムスター肺（ＣＨＬ）細胞を使用するIonWorks（登録商標） Quattroにおいて、本発明の免疫グロブリン及び／又はポリペプチドは、１０−７M以下、好ましくは１０−８M以下、より好ましくは１０−９M以下、又は更に１０−１０M以下の、ＩＣ５０値を有する。例えば、このハイスループット平面かん流パッチクランプにおいて、本発明のポリペプチドは、１０−１０M〜１０−７M、１０−１０M〜１０−８M、１０−１０M〜１０−９M、例えば、１０−８M〜１０−７M、１０−９M〜１０−７M、又は１０−１０M〜１０−９M等の、ＩＣ５０値を有することができる。
【０１４５】
したがって、本発明は、Ｋｖ１．３のＥＬ１細胞外ループに特異的に結合する免疫グロブリン及び／又はポリペプチドに関し、ここで、前記免疫グロブリン及び／又はポリペプチドの前記ＥＬ１細胞外ループへの結合は、IonWorks（登録商標） Quattro（Molecular Devices）で測定された場合、１０−７M以下、好ましくは１０−８M以下、より好ましくは１０−９M以下、又は更に１０−１０M以下の活性で、カリウムイオンの流出の（アロステリック）モデュレーションにより、Ｋｖ１．３の活性を阻害する。
【０１４６】
また、本発明のポリペプチドによるＫｖ１．３のモデュレーション及び／又は阻害は、放射性リガンド結合試験においても評価することができる。トリチウム標識コレオリド（例えば、Ｃ２０〜２９−［３Ｈ］ジヒドロコレオリド（ｄｉＴＣ））によるＣＨＯ／Ｋｖ１．３細胞から調製された膜における部位のシングルクラスに対する結合試験は、Felix et al.（Biochemistry 38: 4922-30, 1999）により記載されている。Knaus et al.（Biochemistry 34: 13627-13634, 1995）には、例えば、ラット脳シナプス原形質膜における、モノヨードチロシニルマルガトキシン（１２５Ｉ−マルガトキシン）のヘテロ四量体Ｋｖチャネルへの結合が記載されている。Ｊｕｒｋａｔ細胞、ヒト白血球Ｔ細胞株、又は、シェーカー型電位作動型Ｋ＋チャネルであるＫ（Ｖ）１．３で安定的にトランスフェクションされたＣＨＯ細胞のいずれかから調製された原形質膜に対する１２５Ｉ−マルガトキシンの結合試験は、Helms et al.（Biochemistry. 36: 3737-44, 1997）により記載されている。本発明のポリペプチドによるＫｖ１．３に対する１２５Ｉ−マルガトキシン結合をブロックするのに、一部の好ましいＩＣ５０値は、本明細書における更なる説明及び実施例から明らかとなるであろう。
【０１４７】
本発明の免疫グロブリン及び／又はポリペプチドは、１０−８M以下、より好ましくは１０−９M以下、又は更に１０−１０M以下のＩＣ５０値で、１２５Ｉ−マルガトキシンのカニクイザルＫｖ１．３過剰発現ＣＨＯ細胞への結合をブロックすることができる。例えば、このような１２５Ｉ−マルガトキシンブロックアッセイ法では、本発明の免疫グロブリン及び／又はポリペプチドは、１０−１０M〜１０−８M、１０−１０M〜１０−９M、例えば、１０−９M〜１０−８M、又は１０−１０M〜１０−９M等の、ＩＣ５０値を有することができる。
【０１４８】
したがって、本発明は、Ｋｖ１．３のＥＬ１細胞外ループに特異的に結合する免疫グロブリン及び／又はポリペプチドに関し、ここで、前記免疫グロブリン及び／又はポリペプチドの前記ＥＬ１細胞外ループへの結合は、１０−８M以下、より好ましくは１０−９M以下、又は更に１０−１０M以下の活性で、１２５Ｉ−マルガトキシンのカニクイザルＫｖ１．３過剰発現ＣＨＯ細胞への結合をブロックする。
【０１４９】
本発明のポリペプチドによるＫｖ１．３のモデュレーション及び／又は阻害を測定するための他の流出アッセイ法は、Hanson et al.（Br. J. Pharmacol. 126: 1707-16, 1999）により記載された放射性ラベル８６ルビジウムによるハイスループット流出アッセイ法、Wang et al.（Assay Drug Dev. Technol. 2: 525-34, 2004）により記載された非放射性ルビジウム（Ｒｂ（＋））流出アッセイ法、及び蛍光系タリウム流出アッセイ法（Weaver et al. J. Biomol. Screen. 9: 671-7, 2004）を含む（が、これらに限定されない）。
【０１５０】
本発明のポリペプチドによるＴ細胞活性化及び／又は増殖の阻害は、Ｔ細胞活性化アッセイ法において測定することができる。Ｔ細胞活性化アッセイ法は、Nguyten et al.（Molecular Pharmacology 50: 1672-1679, 1996）及びHanson et al.（Br. J. Pharmacol. 126: 1707-1716, 1999）により記載されているが、これらに限定されない。本発明の一価ポリペプチドによるＴ細胞活性化及び／又は増殖の阻害のための一部の好ましいＩＣ５０値は、本明細書における更なる説明及び実施例から明らかとなるであろう。
【０１５１】
（実施例４．４及び５．５で記載された）抗ＣＤ３抗体であるＯＫＴ３により刺激されたＣＣＲ７−ＣＤ４５ＲＡ−  Ｔ細胞によるＴ細胞活性化アッセイ法において、本発明の免疫グロブリン及び／又はポリペプチドは、ＩＦＮガンマ生成の阻害について、１０−７M以下、好ましくは１０−８M以下、より好ましくは１０−９M以下、１０−１０M以下、又は更に１０−１１M以下のＩＣ５０値を有する。例えば、このＴ細胞活性化アッセイ法において、本発明の免疫グロブリン及び／又はポリペプチドは、１０−１１M〜１０−７M、１０−１１M〜１０−８M、１０−１１M〜１０−９M、例えば、１０−８M〜１０−７M、１０−１１M〜１０−９M、１０−１０M〜１０−９M、又は１０−１１M〜１０−１０M等のＩＣ５０値で、ＩＦＮガンマ生成を阻害する。
【０１５２】
したがって、本発明は、Ｋｖ１．３のＥＬ１細胞外ループに特異的に結合する免疫グロブリン及び／又はポリペプチドに関し、ここで、前記免疫グロブリン及び／又はポリペプチドの前記ＥＬ１細胞外ループへの結合は、（実施例４．４及び５．５で記載された）抗ＣＤ３抗体であるＯＫＴ３により刺激されたＣＣＲ７−ＣＤ４５ＲＡ−  Ｔ細胞によるＴ細胞活性化アッセイ法において測定された場合、１０−７M以下、好ましくは１０−８M以下、より好ましくは１０−９M以下、又は更に１０−１０M以下、又は更に１０−１１M以下の活性で、Ｔ細胞におけるＩＦＮガンマ生成を阻害する。
【０１５３】
（実施例４．４及び５．５で記載された）抗ＣＤ３抗体であるＯＫＴ３により刺激されたＣＣＲ７−ＣＤ４５ＲＡ−  Ｔ細胞によるこのＴ細胞活性化アッセイ法において、本発明の免疫グロブリン及び／又はポリペプチドは、ＣＤ２５アップレギュレーション阻害について、１０−７M以下、好ましくは１０−８M以下、より好ましくは１０−９M以下、１０−１０M以下、又は更に１０−１１M以下の、ＩＣ５０値を有する。例えば、このＴ細胞活性化アッセイ法において、本発明の免疫グロブリン及び／又はポリペプチドは、１０−１１M〜１０−７M、１０−１１M〜１０−８M、１０−１１M〜１０−９M、例えば、１０−８M〜１０−７M、１０−１１M〜１０−９M、１０−１０M〜１０−９M、又は１０−１１M〜１０−１０M等のＩＣ５０値で、ＣＤ２５のアップレギュレーションを阻害する。
【０１５４】
したがって、本発明は、Ｋｖ１．３のＥＬ１細胞外ループに特異的に結合する免疫グロブリン及び／又はポリペプチドに関し、ここで、前記免疫グロブリン及び／又はポリペプチドの前記ＥＬ１細胞外ループへの結合は、（実施例４．４及び５．５で記載された）抗ＣＤ３抗体であるＯＫＴ３により刺激されたＣＣＲ７−ＣＤ４５ＲＡ−  Ｔ細胞によるＴ細胞活性化アッセイ法において測定された場合、１０−７M以下、好ましくは１０−８M以下、より好ましくは１０−９M以下、又は更に１０−１０M以下、又は更に１０−１１M以下の活性で、Ｔ細胞におけるＣＤ２５のアップレギュレーションを阻害する。
【０１５５】
（実施例９で記載された）抗ＣＤ３抗体であるＯＫＴ３及び抗ＣＤ２８により刺激された抹消血単核球（ＰＢＭＣ）による細胞活性化アッセイ法において、本発明のポリペプチドは、ＩＦＮガンマ生成をブロックしない。
【０１５６】
したがって、本発明は、Ｋｖ１．３のＥＬ１細胞外ループに特異的に結合する免疫グロブリン及び／又はポリペプチドに関し、ここで、前記免疫グロブリン及び／又はポリペプチドの前記ＥＬ１細胞外への結合は、（実施例９で記載された）抗ＣＤ３抗体であるＯＫＴ３及び抗ＣＤ２８抗体により刺激された抹消血単核球（ＰＢＭＣ）による細胞活性化アッセイ法において、ＩＦＮガンマ生成をブロックしない。
【０１５７】
本発明のポリペプチドの免疫抑制効果は、ｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおいて、例えば、ラット、ブタ、及び／又は霊長類等において、更に評価することができる。Diabetes-prone Biobreeding Worchesterラットは、自己免疫性糖尿病についてのモデルとして使用されてきた（Beeton et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 103: 17414-9, 2006）。アレルギー性接触皮膚炎についてのラットモデル、乾癬についての動物モデルは、Azam et al.（J. Invest. Dermatol. 127: 1419-29, 2007）により記載されている。ヒトＴ細胞により再構成される免疫不全マウスは、Ｔ細胞媒介性皮膚移植片拒絶についての動物モデルとして使用されてきた（Ren et al. PLoS One 3:e4009, 2008）。例えば、実施例１２及び１３で記載されたアレルギー性接触皮膚炎についてのラットモデルにおいて、本発明のポリペプチドは、媒体に対して、それぞれ少なくとも約０．０８５〜０．１０２mm及び少なくとも約０．１４７〜０．１６４mmで、耳の厚みが増大するのを（顕著に）減少させる。
【０１５８】
したがって、本発明は、Ｋｖ１．３のＥＬ１細胞外ループに特異的に結合する免疫グロブリン及び／又はポリペプチドに関し、ここで、前記免疫グロブリン及び／又はポリペプチドの前記ＥＬ１細胞外ループへの結合は、実施例１２及び１３それぞれで記載されたアレルギー性接触皮膚炎についてのラットモデルにおいて、媒体に対して、少なくとも約０．０８５〜０．１０２mm及び少なくとも約０．１４７〜０．１６４mmで、耳の厚みが増大するのを減少させる。
【０１５９】
Ｋｖ１．３のＥＬ１細胞外ループに特異的に結合する免疫グロブリン及び／又はポリペプチドは、Ｋｖ１．３の活性をモデュレーションし、及び／又は、阻害することについて、他の関連するＫｖイオンチャネルファミリーメンバーより、１０００倍超、及び更に、最大１００００倍の選択性を示す。本発明の免疫グロブリン及び／又はポリペプチドによる選択的阻害は、例えば、各チャネルを阻害するのに必要とされる免疫グロブリン及び／又はポリペプチドの濃度を、Ｋｖ１．３を阻害するのに必要とされる免疫グロブリン及び／又はポリペプチドの濃度と比較することにより決定することができる。イオンチャネルファミリーメンバーは、ｈＥＲＧ、ＫＣａ３．１（ＳＫ４）、Ｋｖ４．３／ＫＣｈＩＰ２．２、Ｋｖ１．２、Ｋｖ１．４、Ｃａｖ１．３／ｂ３／ａ２ｄ１、Ｋｉｒ２．１、ＫＣａ２．２、ＫＣａ２．３、Ｋｖ７．２／Ｋｖ７．３、Ｋｖ１．１、Ｋｖ１．５、Ｋｖ３．４、Ｎａｖ１．１、Ｎａｖ１．２、及びＮａｖ１．６を含む。
【０１６０】
とりわけ、免疫グロブリン及び／又はポリペプチドは、Ｋｖ１．５、Ｋｖ１．６、及びｈＥＲＧより、１０００倍超、及び更に、最大１００００倍の選択性を示す。
【０１６１】
本発明の一価ポリペプチド
本発明は、Ｋｖ１．３のＥＬ１細胞外ループに結合するのに特に適したアミノ酸残基のストレッチ（配列番号：１８１〜２１０、配列番号：２６８〜２８９、配列番号：５４１〜５５５、配列番号：３９３〜４１５、及び配列番号：２１１〜２２６、配列番号：２９０〜３０９、配列番号：４１６〜４３５；表Ａ−２）を提供する。特に、本発明は、ヒトＫｖ１．３のＥＬ１細胞外ループに結合するアミノ酸残基のストレッチを提供し、ここで、前記ストレッチの前記ＥＬ１細胞外ループへの結合は、（上記されたように）Ｋｖ１．３の活性を阻害する。アミノ酸残基のこれらのストレッチは、特に、このストレッチが本発明のポリペプチドの抗原結合部位（の一部）を形成するような方法において、本発明のポリペプチド中に存在することができ、及び／又は、同ポリペプチド内に包含させることができる。アミノ酸残基のこれらのストレッチは、Ｋｖ１．３に対して生じた重鎖抗体又はＶＨＨ配列のＣＤＲ配列として生成されてきた。また、アミノ酸残基のこれらのストレッチは、本明細書において、「本発明のＣＤＲ配列」（すなわち、それぞれ「本発明のＣＤＲ１配列」、「本発明のＣＤＲ２配列」、及び「本発明のＣＤＲ３配列」）とも呼ばれる。
【０１６２】
ただし、本発明は、その最も広い意味において、アミノ酸残基のこれらのストレッチが本発明のポリペプチドをＫｖ１．３に（本明細書で定義された）特定の親和性及び活性で結合させる限りにおいて、アミノ酸残基のこれらのストレッチが本発明のポリペプチドにおいて有することができる、特定の構造的役割又は機能に限定されないことに留意されたい。このため、一般的には、本発明は、その最も広い意味において、特定の指定された親和性、結合活性、有効性、及び／又は活性で、Ｋｖ１．３に結合可能であり、本明細書で記載された1つ以上のＣＤＲ配列、特に、２つ以上のこのようなＣＤＲ配列の適切な組み合わせを含み、ポリペプチド全体がＫｖ１．３に結合可能な結合ドメイン及び／又は結合ユニットを形成するように、１つ以上の更なるアミノ酸配列を介して互いに適切に連結している、一価ポリペプチド（本明細書において、「本発明の一価ポリペプチド」とも呼ばれる）を提供する。ただし、本発明の一価ポリペプチドにおける１つのみのこのようなＣＤＲ配列の存在自体が、Ｋｖ１．３への結合能を有する本発明の一価ポリペプチドを提供するのに既に十分である場合があることにも留意されたい。例えば、再度、国際公開公報第０３／０５０５３１号に記載された、いわゆる「Expediteフラグメント」が参照される。
【０１６３】
具体的で、非限定的な態様では、本発明の一価ポリペプチドは、
ｉ）ＣＤＲ１配列：
ａ）配列番号：１８１〜２１０、又は
ｂ）配列番号：１８２のアミノ酸配列に対して、４、３、２、もしくは１つのアミノ酸差を有するアミノ酸配列
及び／又は
ｉｉ）ＣＤＲ２配列：
ｃ）配列番号：２６８〜２８９及び配列番号：５４１〜５５５、又は
ｄ）配列番号：２６９のアミノ酸配列に対して、４、３、２、もしくは１つのアミノ酸差を有するアミノ酸配列
及び／又は
ｉｉｉ）ＣＤＲ３配列：
ｅ）配列番号：３９３〜４１５、又は
ｆ）配列番号：３９７のアミノ酸配列に対して、３、２、もしくは１つのアミノ酸差を有するアミノ酸配列
からなる群より選択される、少なくとも１つのアミノ酸残基のストレッチを含むことができる。
【０１６４】
更なる態様では、本発明の一価ポリペプチドは、
ｉ）ＣＤＲ１配列：
ａ）配列番号：１８１〜２１０、又は
ｂ）配列番号：１８２のアミノ酸配列に対して、４、３、２、もしくは１つのアミノ酸差を有するアミノ酸配列、ここで、
−１位において、Ｇが、ＬもしくはＲに変更されており、
−２位において、Ｌが、Ｆ、Ｐ、もしくはＩに変更されており、
−３位において、Ｌが、ＰもしくはＦに変更されており、
−４位において、Ｆが、Ｓ、ＬもしくはＩに変更されており、
−５位において、Ｓが、ＩもしくはＲに変更されており、
−６位において、Ｒが、Ｃ、Ａ、Ｐ、Ｖ、もしくはＬに変更されており、
−７位において、Ｎが、Ｈ、Ｐ、Ｉ、Ｍ、Ｙ、Ｔ、もしくはＤに変更されており、
−８位において、Ｓが、Ｔ、Ｒ、もしくはＩに変更されており、
−９位において、Ａが、ＶもしくはＴに変更されており、及び／又は
−１０位において、Ｇが、Ｓ、Ｒ、もしくはＶに変更されている、
及び／又は
ｉｉ）ＣＤＲ２配列：
ｃ）配列番号：２６８〜２８９及び配列番号：５４１〜５５５、又は
ｄ）配列番号：２６９のアミノ酸配列に対して、４、３、２、もしくは１つのアミノ酸差を有するアミノ酸配列、ここで、
−１位において、Ｒが、ＧもしくはＣに変更されており、
−２位において、Ｉが、Ｖ、Ｔ、Ｓ、もしくはＬに変更されており、
−３位において、Ｒが、ＧもしくはＬに変更されており、
−４位において、Ｍが、Ｓ、Ｒ、Ａ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｐ、Ｑ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、Ｉ、もしくはＴに変更されており、
−５位において、Ｇが、Ｖ、Ｓ、もしくはＴに変更されており、
−７位において、Ｓが、Ｇ、Ｃ、Ｄ、もしくはＥに変更されており、及び／又は
−８位において、Ｉが、Ｔ、Ｍ、もしくはＲに変更されている
及び／又は
ｉｉｉ）ＣＤＲ３配列：
ｅ）配列番号：３９３〜４１５、又は
ｆ）配列番号：３９７のアミノ酸配列に対して、３、２、もしくは１つのアミノ酸差を有するアミノ酸配列、ここで、
−１位において、Ｗが、Ｇに変更されており、
−３位において、Ｅが、Ｔ、Ｋ、Ｇ、ＡもしくはＩに変更されており、
−４位において、Ｇが、ＥもしくはＤに変更されており、
−５位において、Ｆが、Ａ、Ｌ、Ｖ、Ｙ、Ｔ、もしくはＳに変更されており、
−６位において、Ｙが、ＦもしくはＤに変更されており、
−７位において、Ｅが、ＧもしくはＫに変更されており、
−８位において、Ｙが、ＳもしくはＨに変更されており、及び／又は
−９位において、Ｗが、Ｓ、Ｇ、もしくはＣに変更されている、
からなる群より選択される、少なくとも１つのアミノ酸残基のストレッチを含むことができる。
【０１６５】
更なる態様では、本発明の一価ポリペプチドは、
ｉ）ＣＤＲ１配列：
ａ）配列番号：１８１〜１８５、又は
ｂ）配列番号：１８２のアミノ酸配列に対して、２もしくは１つのアミノ酸差を有するアミノ酸配列、ここで、
−６位において、Ｒが、ＡもしくはＶに変更されており、及び／又は
−９位において、Ａが、Ｖに変更されている、
及び／又は
ｉｉ）ＣＤＲ２配列：
ｃ）配列番号：２６８〜２７１、５４１、及び５４９、又は
ｄ）配列番号：２６９のアミノ酸配列に対して、４、３、２、もしくは１つのアミノ酸差を有するアミノ酸配列、ここで、
−２位において、Ｉが、Ｌに変更されており、
−４位において、Ｍが、Ｓ、Ｑ、Ａ、もしくはＴに変更されており、
−５位において、Ｇが、ＳもしくはＴに変更されており、及び／又は
−８位において、Ｉが、Ｔに変更されている、
及び／又は
ｉｉｉ）ＣＤＲ３配列：
ｅ）配列番号：３９３〜３９８、又は
ｆ）配列番号：３９７のアミノ酸配列に対して、３、２、もしくは１つのアミノ酸差を有するアミノ酸配列、ここで、
−３位において、Ｅが、ＴもしくはＩに変更されており、
−４位において、Ｇが、Ｅに変更されており、
−５位において、Ｆが、Ａに変更されており、及び／又は
−８位において、Ｙが、Ｈに変更されている、
からなる群より選択される、少なくとも１つのアミノ酸残基のストレッチを含むことができる。
【０１６６】
更なる態様では、本発明の一価ポリペプチドは、
ｉ）ＣＤＲ１配列：
ａ）配列番号：２１１〜２２６、又は
ｂ）配列番号：２１４のアミノ酸配列に対して、３、２、もしくは１つのアミノ酸差を有するアミノ酸配列
及び／又は、
ｉｉ）ＣＤＲ２配列：
ｃ）配列番号：２９０〜３０９、又は
ｄ）配列番号：３０３のアミノ酸配列に対して、４、３、２、もしくは１つのアミノ酸差を有するアミノ酸配列
及び／又は
ｉｉｉ）ＣＤＲ３配列：
ｅ）配列番号：４１６〜４３５、又は
ｆ）配列番号：４２２のアミノ酸配列に対して、３、２、もしくは１つのアミノ酸差を有するアミノ酸配列
からなる群より選択される、少なくとも１つのアミノ酸残基のストレッチを含むことができる。
【０１６７】
更なる態様では、本発明の一価ポリペプチドは、
ｉ）ＣＤＲ１配列：
ａ）配列番号：２１１〜２２６、又は
ｂ）配列番号：２１４のアミノ酸配列に対して、３、２、もしくは１つのアミノ酸差を有するアミノ酸配列、ここで、
−１位において、Ｇが、Ｒ、Ａ、Ｖ、Ｓ、もしくはＫに変更されており、
−３位において、Ｔが、Ｎに変更されており、
−４位において、Ｆが、Ｌに変更されており、
−６位において、Ｎが、Ｓに変更されており、
−７位において、Ｆが、Ｙに変更されており、
−８位において、Ｇが、Ａに変更されており、及び／又は
−９位において、Ｍが、Ｖに変更されている、
及び／又は
ｉｉ）ＣＤＲ２配列：
ｃ）配列番号：２９０〜３０９、又は
ｄ）配列番号：３０３のアミノ酸配列に対して、４、３、２、もしくは１つのアミノ酸差を有するアミノ酸配列、ここで、
−１位において、Ａが、Ｔに変更されており、
−２位において、Ｉが、Ｖに変更されており、
−５位において、Ｔが、ＳもしくはＡに変更されており、
−６位において、Ｇが、ＮもしくはＡに変更されており、
−７位において、Ｇが、ＳもしくはＲに変更されており、
−８位において、Ｈが、ＲもしくはＹに変更されており、
−９位において、Ｔが、ＩもしくはＫに変更されており、及び／又は
−１０位において、Ｙが、Ｆに変更されている、
及び／又は
ｉｉｉ）ＣＤＲ３配列：
ｅ）配列番号：４１６〜４３５、又は
ｆ）配列番号：４２２のアミノ酸配列に対して、３、２、もしくは１つのアミノ酸差を有するアミノ酸配列、ここで、
−４位において、Ｆが、ＹもしくはＳに変更されており、
−５位において、Ｇが、Ｄに変更されており、
−６位において、Ｄが、Ｇに変更されており、
−７位において、Ｇが、Ｄに変更されており、
−８位において、Ｔが、Ａに変更されており、
−９位において、Ｙが、Ｓに変更されており、
−１０位において、Ｙが、Ｆに変更されており、
−１２位において、Ｑが、Ｅに変更されており、
−１４位において、Ａが、Ｎ、Ｔ、Ｉ、もしくはＲに変更されており、
−１７位において、Ｄが、ＮもしくはＧに変更されており、及び／又は
−１８位において、Ｆが、Ｌに変更されている、
からなる群より選択される、少なくとも１つのアミノ酸残基のストレッチを含むことができる。
【０１６８】
特に、本発明の一価ポリペプチドは、１つの抗原結合部位を含む一価ポリペプチドであることができ、ここで、前記抗原結合部位は、上記されたＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、及びＣＤＲ３配列（又は、それらの任意の組み合わせ）からなる群より選択される、少なくとも１つのアミノ酸残基のストレッチを含む。ただし、好ましい態様では、本発明の一価ポリペプチドは、本発明のＣＤＲ１配列、本発明のＣＤＲ２配列、及び／又は本発明のＣＤＲ３配列からなる群より選択される、１つより多い、例えば、２つ以上のアミノ酸残基のストレッチを含む。好ましくは、本発明の一価ポリペプチドは、本発明のＣＤＲ１配列、本発明のＣＤＲ２配列、及び／又は本発明のＣＤＲ３配列それぞれからなる群より選択される、３つのアミノ酸残基のストレッチを含む。本明細書において、本発明の一価ポリペプチドに好ましいと言及されるＣＤＲの組み合わせは、表Ａ−２に列記されている。
【０１６９】
本発明は、本発明の一価ポリペプチド（又は、それを発現させるのに使用される本発明の核酸）の起源には限定されず、又は、本発明の一価ポリペプチドもしくは核酸が生成され、又は、得られる（又は、生成されている、もしくは、得られている）方法にも限定されないことに、更に留意されたい。このため、本発明の一価ポリペプチドは、（任意の適切な種からの）天然の一価ポリペプチド、又は、合成もしくは半合成の一価ポリペプチドであることができる。
【０１７０】
またさらに、上記された１つ以上のＣＤＲを他の「スキャフォールド」上に「グラフト化」可能であることも、当業者に明らかであろう。同スキャフォールドは、ヒトスキャフォールド又は非免疫グロブリンスキャフォールドを含むが、これらに限定されない。このようなＣＤＲグラフト化に適したスキャフォールド及び技術は、当業者に明らかであろうし、当技術分野において周知である。例えば、米国特許第７，１８０，３７０号、国際公開公報第０１／２７１６０号、欧州特許第０６０５５２２号、同第０４６０１６７号、米国特許第７，０５４，２９７号、Nicaise et al.（Protein Science 13: 1882-1891, 2004）、Ewert et al.（Methods 34: 184-199, 2004）、Kettleborough et al.（Protein Eng. 4: 773-783, 1991）、O’Brien and Jones（Methods Mol. Biol. 207: 81-100, 2003）、Skerra（J. Mol. Recognit. 13: 167-187, 2000）、及びSaerens et al.（J. Mol. Biol. 352: 597-607, 2005）、ならびに本明細書で引用された更なる参考文献を参照のこと。例えば、マウス又はラットＣＤＲをヒトフレームワーク及びスキャフォールド上にグラフト化させるためのそれ自体公知の技術は、本発明の一価ポリペプチドについて本明細書で定義された１つ以上のＣＤＲ配列と、１つ以上のヒトフレームワーク領域又は配列とを含むキメラタンパク質を提供するのに類似する方法に使用することができる。アミノ酸配列を提示するのに適したスキャフォールドは、当業者に明らかであろうし、例えば、免疫グロブリンに基づく、もしくは、同免疫グロブリンから得られる結合スキャフォールド（すなわち、本明細書で既に記載された免疫グロブリン以外）、プロテインＡドメインから得られるタンパク質スキャフォールド（例えば、Affibodies（商標））、テンダミスタッド、フィブロネクチン、リポカリン、ＣＴＬＡ−４、Ｔ細胞レセプター、設計されたアンキリンリピート、avimer、ＰＤＺドメイン（Binz et al. Nat. Biotech., 23: 1257, 2005）、及びＤＮＡもしくはＲＮＡに基づく結合部分を含む。同結合部分は、ＤＮＡ又はＲＮＡアプタマーを含むが、これらに限定されない（Ulrich et al. Comb. Chem. High Throughput Screen 9: 619-32, 2006）。
【０１７１】
前記本発明の一価ポリペプチドにおいて、ＣＤＲは、更なるアミノ酸配列に連結していることができ、及び／又は、アミノ酸配列を介して互いに連結していることができる。ここで、前記アミノ酸配列は、好ましくは、フレームワーク配列であり、又は、フレームワーク配列として機能し、ＣＤＲを提示するためのスキャフォールドを共に形成するアミノ酸配列である。
【０１７２】
好ましく、非限定的な実施態様によれば、本発明の一価ポリペプチドは、少なくとも２つのフレームワーク配列に連結している、少なくとも３つのＣＤＲ配列を含み、ここで好ましくは、３つのＣＤＲ配列の内の少なくとも１つは、ＣＤＲ３配列であり、他の２つのＣＤＲ配列は、ＣＤＲ１又はＣＤＲ２配列であり、好ましくは、一方がＣＤＲ１配列であり、もう一方がＣＤＲ２配列である。具体的に好ましく、非限定的な一実施態様によれば、本発明の一価ポリペプチドは、ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４の構造を有し、ここで、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、本発明の一価ポリペプチドについて本明細書で定義された通りである。ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４は、フレームワーク配列である。本発明のこのような一価ポリペプチドにおいて、フレームワーク配列は、任意の適切なフレームワーク配列であることができ、適切なフレームワーク配列の例は、例えば、標準的な参考書ならびに本明細書で言及された更なる開示及び従来技術に基づいて、当業者に明らかであろう。
【０１７３】
したがって、本発明の一価ポリペプチドは、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）と、３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）とから本質的になり、ここで、
ｉ）ＣＤＲ１が、
ａ）配列番号：１８１〜２１０、又は
ｂ）配列番号：１８２のアミノ酸配列に対して、４、３、２、もしくは１つのアミノ酸差を有するアミノ酸配列
からなる群より選択され、
及び／又は
ｉｉ）ＣＤＲ２が、
ｃ）配列番号：２６８〜２８９及び配列番号：５４１〜５５５、又は
ｄ）配列番号：２６９のアミノ酸配列に対して、４、３、２、もしくは１つのアミノ酸差を有するアミノ酸配列
からなる群より選択され、
及び／又は
ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、
ｅ）配列番号：３９３〜４１５、又は
ｆ）配列番号：３９７のアミノ酸配列に対して、３、２、もしくは１つのアミノ酸差を有するアミノ酸配列
からなる群より選択される。
【０１７４】
特に、この好ましく、非限定的な態様によれば、本発明の一価ポリペプチドは、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）と、３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）とから本質的になり、ここで、
ｉ）ＣＤＲ１が、
ａ）配列番号：１８１〜２１０、又は
ｂ）配列番号：１８２のアミノ酸配列に対して、４、３、２、もしくは１つのアミノ酸差を有するアミノ酸配列
からなる群より選択され、
及び
ｉｉ）ＣＤＲ２が、
ｃ）配列番号：２６８〜２８９及び配列番号：５４１〜５５５、又は
ｄ）配列番号：２６９のアミノ酸配列に対して、４、３、２、もしくは１つのアミノ酸差を有するアミノ酸配列
からなる群より選択され、
及び
ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、
ｅ）配列番号：３９３〜４１５、又は
ｆ）配列番号：３９７のアミノ酸配列に対して、３、２、もしくは１つのアミノ酸差を有するアミノ酸配列
からなる群より選択される。
【０１７５】
更なる態様では、本発明の一価ポリペプチドは、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）と、３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）とから本質的になり、ここで、
ｉ）ＣＤＲ１が、
ａ）配列番号：１８１〜２１０、又は
ｂ）配列番号：１８２のアミノ酸配列に対して、４、３、２、もしくは１つのアミノ酸差を有するアミノ酸配列、ここで、
−１位において、Ｇが、ＬもしくはＲに変更されており、
−２位において、Ｌが、Ｆ、Ｐ、もしくはＩに変更されており、
−３位において、Ｌが、ＰもしくはＦに変更されており、
−４位において、Ｆが、Ｓ、ＬもしくはＩに変更されており、
−５位において、Ｓが、ＩもしくはＲに変更されており、
−６位において、Ｒが、Ｃ、Ａ、Ｐ、Ｖ、もしくはＬに変更されており、
−７位において、Ｎが、Ｈ、Ｐ、Ｉ、Ｍ、Ｙ、Ｔ、もしくはＤに変更されており、
−８位において、Ｓが、Ｔ、Ｒ、もしくはＩに変更されており、
−９位において、Ａが、ＶもしくはＴに変更されており、及び／又は
−１０位において、Ｇが、Ｓ、Ｒ、もしくはＶに変更されている、
からなる群より選択され、
及び／又は
ｉｉ）ＣＤＲ２が、
ｃ）配列番号：２６８〜２８９及び配列番号：５４１〜５５５、又は
ｄ）配列番号：２６９のアミノ酸配列に対して、４、３、２、もしくは１つのアミノ酸差を有するアミノ酸配列、ここで、
−１位において、Ｒが、ＧもしくはＣに変更されており、
−２位において、Ｉが、Ｖ、Ｔ、Ｓ、もしくはＬに変更されており、
−３位において、Ｒが、ＧもしくはＬに変更されており、
−４位において、Ｍが、Ｓ、Ｒ、Ａ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｐ、Ｑ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、Ｉ、もしくはＴに変更されており、
−５位において、Ｇが、Ｖ、Ｓ、もしくはＴに変更されており、
−７位において、Ｓが、Ｇ、Ｃ、Ｄ、もしくはＥに変更されており、及び／又は
−８位において、Ｉが、Ｔ、Ｍ、もしくはＲに変更されている、
からなる群より選択され、
及び／又は
ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、
ｅ）配列番号：３９３〜４１５、又は
ｆ）配列番号：３９７のアミノ酸配列に対して、３、２、もしくは１つのアミノ酸差を有するアミノ酸配列、ここで、
−１位において、Ｗが、Ｇに変更されており、
−３位において、Ｅが、Ｔ、Ｋ、Ｇ、ＡもしくはＩに変更されており、
−４位において、Ｇが、ＥもしくはＤに変更されており、
−５位において、Ｆが、Ａ、Ｌ、Ｖ、Ｙ、Ｔ、もしくはＳに変更されており、
−６位において、Ｙが、ＦもしくはＤに変更されており、
−７位において、Ｅが、ＧもしくはＫに変更されており、
−８位において、Ｙが、ＳもしくはＨに変更されており、及び／又は
−９位において、Ｗが、Ｓ、Ｇ、もしくはＣに変更されている、
からなる群より選択される。
【０１７６】
特に、この好ましく、非限定的な態様によれば、本発明の一価ポリペプチドは、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）と、３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）とから本質的になり、ここで、
ｉ）ＣＤＲ１が、
ａ）配列番号：１８１〜２１０、又は
ｂ）配列番号：１８２のアミノ酸配列に対して、４、３、２、もしくは１つのアミノ酸差を有するアミノ酸配列、ここで、
−１位において、Ｇが、ＬもしくはＲに変更されており、
−２位において、Ｌが、Ｆ、Ｐ、もしくはＩに変更されており、
−３位において、Ｌが、ＰもしくはＦに変更されており、
−４位において、Ｆが、Ｓ、ＬもしくはＩに変更されており、
−５位において、Ｓが、ＩもしくはＲに変更されており、
−６位において、Ｒが、Ｃ、Ａ、Ｐ、Ｖ、もしくはＬに変更されており、
−７位において、Ｎが、Ｈ、Ｐ、Ｉ、Ｍ、Ｙ、Ｔ、もしくはＤに変更されており、
−８位において、Ｓが、Ｔ、Ｒ、もしくはＩに変更されており、
−９位において、Ａが、ＶもしくはＴに変更されており、及び／又は
−１０位において、Ｇが、Ｓ、Ｒ、もしくはＶに変更されている、
からなる群より選択され、
及び
ｉｉ）ＣＤＲ２が、
ｃ）配列番号：２６８〜２８９及び配列番号：５４１〜５５５、又は
ｄ）配列番号：２６９のアミノ酸配列に対して、４、３、２、もしくは１つのアミノ酸差を有するアミノ酸配列、ここで、
−１位において、Ｒが、ＧもしくはＣに変更されており、
−２位において、Ｉが、Ｖ、Ｔ、Ｓ、もしくはＬに変更されており、
−３位において、Ｒが、ＧもしくはＬに変更されており、
−４位において、Ｍが、Ｓ、Ｒ、Ａ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｐ、Ｑ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、Ｉ、もしくはＴに変更されており、
−５位において、Ｇが、Ｖ、Ｓ、もしくはＴに変更されており、
−７位において、Ｓが、Ｇ、Ｃ、Ｄ、もしくはＥに変更されており、及び／又は
−８位において、Ｉが、Ｔ、Ｍ、もしくはＲに変更されている、
からなる群より選択され、
及び
ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、
ｅ）配列番号：３９３〜４１５、又は
ｆ）配列番号：３９７のアミノ酸配列に対して、３、２、もしくは１つのアミノ酸差を有するアミノ酸配列、ここで、
−１位において、Ｗが、Ｇに変更されており、
−３位において、Ｅが、Ｔ、Ｋ、Ｇ、ＡもしくはＩに変更されており、
−４位において、Ｇが、ＥもしくはＤに変更されており、
−５位において、Ｆが、Ａ、Ｌ、Ｖ、Ｙ、Ｔ、もしくはＳに変更されており、
−６位において、Ｙが、ＦもしくはＤに変更されており、
−７位において、Ｅが、ＧもしくはＫに変更されており、
−８位において、Ｙが、ＳもしくはＨに変更されており、及び／又は
−９位において、Ｗが、Ｓ、Ｇ、もしくはＣに変更されている、
からなる群より選択される。
【０１７７】
更なる態様では、本発明の一価ポリペプチドは、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）と、３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）とから本質的になり、ここで、
ｉ）ＣＤＲ１が、
ａ）配列番号：１８１〜１８５、又は
ｂ）配列番号：１８２のアミノ酸配列に対して、２もしくは１つのアミノ酸差を有するアミノ酸配列、ここで、
−６位において、Ｒが、ＡもしくはＶに変更されており、及び／又は
−９位において、Ａが、Ｖに変更されている、
からなる群より選択され、
及び／又は
ｉｉ）ＣＤＲ２が、
ｃ）配列番号：２６８〜２７１、５４１、及び５４９、又は
ｄ）配列番号：２６９のアミノ酸配列に対して、４、３、２、もしくは１つのアミノ酸差を有するアミノ酸配列、ここで、
−２位において、Ｉが、Ｌに変更されており、
−４位において、Ｍが、Ｓ、Ｑ、Ａ、もしくはＴに変更されており、
−５位において、Ｇが、ＳもしくはＴに変更されており、及び／又は
−８位において、Ｉが、Ｔに変更されている、
からなる群より選択され、
及び／又は
ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、
ｅ）配列番号：３９３〜３９８、又は
ｆ）配列番号：３９７のアミノ酸配列に対して、３、２、もしくは１つのアミノ酸差を有するアミノ酸配列、ここで、
−３位において、Ｅが、ＴもしくはＩに変更されており、
−４位において、Ｇが、Ｅに変更されており、
−５位において、Ｆが、Ａに変更されており、及び／又は
−８位において、Ｙが、Ｈに変更されている、
からなる群より選択される。
【０１７８】
特に、この好ましく、非限定的な態様によれば、本発明の一価ポリペプチドは、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）と、３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）とから本質的になり、ここで、
ｉ）ＣＤＲ１が、
ａ）配列番号：１８１〜１８５、又は
ｂ）配列番号：１８２のアミノ酸配列に対して、２もしくは１つのアミノ酸差を有するアミノ酸配列、ここで、
−６位において、Ｒが、ＡもしくはＶに変更されており、及び／又は
−９位において、Ａが、Ｖに変更されている、
からなる群より選択され、
及び
ｉｉ）ＣＤＲ２が、
ｃ）配列番号：２６８〜２７１、５４１、及び５４９、又は
ｄ）配列番号：２６９のアミノ酸配列に対して、４、３、２、もしくは１つのアミノ酸差を有するアミノ酸配列、ここで、
−２位において、Ｉが、Ｌに変更されており、
−４位において、Ｍが、Ｓ、Ｑ、Ａ、もしくはＴに変更されており、
−５位において、Ｇが、ＳもしくはＴに変更されており、及び／又は
−８位において、Ｉが、Ｔに変更されている、
からなる群より選択され、
及び
ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、
ｅ）配列番号：３９３〜３９８、又は
ｆ）配列番号：３９７のアミノ酸配列に対して、３、２、もしくは１つのアミノ酸差を有するアミノ酸配列、ここで、
−３位において、Ｅが、ＴもしくはＩに変更されており、
−４位において、Ｇが、Ｅに変更されており、
−５位において、Ｆが、Ａに変更されており、及び／又は
−８位において、Ｙが、Ｈに変更されている、
からなる群より選択される。
【０１７９】
更なる態様では、本発明の一価ポリペプチドは、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）と、３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）とから本質的になり、ここで、
ｉ）ＣＤＲ１が、
ａ）配列番号：２１１〜２２６、又は
ｂ）配列番号：２１４のアミノ酸配列に対して、３、２、もしくは１つのアミノ酸差を有するアミノ酸配列
からなる群より選択され、
及び／又は、
ｉｉ）ＣＤＲ２が、
ｃ）配列番号：２９０〜３０９、又は
ｄ）配列番号：３０３のアミノ酸配列に対して、４、３、２、もしくは１つのアミノ酸差を有するアミノ酸配列
からなる群より選択され、
及び／又は
ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、
ｅ）配列番号：４１６〜４３５、又は
ｆ）配列番号：４２２のアミノ酸配列に対して、３、２、もしくは１つのアミノ酸差を有するアミノ酸配列
からなる群より選択される。
【０１８０】
特に、この好ましく、非限定的な態様によれば、本発明の一価ポリペプチドは、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）と、３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）とから本質的になり、ここで、
ｉ）ＣＤＲ１が、
ａ）配列番号：２１１〜２２６、又は
ｂ）配列番号：２１４のアミノ酸配列に対して、３、２、もしくは１つのアミノ酸差を有するアミノ酸配列
からなる群より選択され、
及び
ｉｉ）ＣＤＲ２が、
ｃ）配列番号：２９０〜３０９、又は
ｄ）配列番号：３０３のアミノ酸配列に対して、４、３、２、もしくは１つのアミノ酸差を有するアミノ酸配列
からなる群より選択され、
及び
ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、
ｅ）配列番号：４１６〜４３５、又は
ｆ）配列番号：４２２のアミノ酸配列に対して、３、２、もしくは１つのアミノ酸差を有するアミノ酸配列
からなる群より選択される。
【０１８１】
更なる態様では、本発明の一価ポリペプチドは、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）と、３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）とから本質的になり、ここで、
ｉ）ＣＤＲ１が、
ａ）配列番号：２１１〜２２６、又は
ｂ）配列番号：２１４のアミノ酸配列に対して、３、２、もしくは１つのアミノ酸差を有するアミノ酸配列、ここで、
−１位において、Ｇが、Ｒ、Ａ、Ｖ、Ｓ、もしくはＫに変更されており、
−３位において、Ｔが、Ｎに変更されており、
−４位において、Ｆが、Ｌに変更されており、
−６位において、Ｎが、Ｓに変更されており、
−７位において、Ｆが、Ｙに変更されており、
−８位において、Ｇが、Ａに変更されており、及び／又は
−９位において、Ｍが、Ｖに変更されている、
からなる群より選択され、
及び／又は
ｉｉ）ＣＤＲ２が、
ｃ）配列番号：２９０〜３０９、又は
ｄ）配列番号：３０３のアミノ酸配列に対して、４、３、２、もしくは１つのアミノ酸差を有するアミノ酸配列、ここで、
−１位において、Ａが、Ｔに変更されており、
−２位において、Ｉが、Ｖに変更されており、
−５位において、Ｔが、ＳもしくはＡに変更されており、
−６位において、Ｇが、ＮもしくはＡに変更されており、
−７位において、Ｇが、ＳもしくはＲに変更されており、
−８位において、Ｈが、ＲもしくはＹに変更されており、
−９位において、Ｔが、ＩもしくはＫに変更されており、及び／又は
−１０位において、Ｙが、Ｆに変更されている、
からなる群より選択され、
及び／又は
ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、
ｅ）配列番号：４１６〜４３５、又は
ｆ）配列番号：４２２のアミノ酸配列に対して、３、２、もしくは１つのアミノ酸差を有するアミノ酸配列、ここで、
−４位において、Ｆが、ＹもしくはＳに変更されており、
−５位において、Ｇが、Ｄに変更されており、
−６位において、Ｄが、Ｇに変更されており、
−７位において、Ｇが、Ｄに変更されており、
−８位において、Ｔが、Ａに変更されており、
−９位において、Ｙが、Ｓに変更されており、
−１０位において、Ｙが、Ｆに変更されており、
−１２位において、Ｑが、Ｅに変更されており、
−１４位において、Ａが、Ｎ、Ｔ、Ｉ、もしくはＲに変更されており、
−１７位において、Ｄが、ＮもしくはＧに変更されており、及び／又は
−１８位において、Ｆが、Ｌに変更されている、
からなる群より選択される。
【０１８２】
特に、この好ましく、非限定的な態様によれば、本発明の一価ポリペプチドは、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）と、３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）とから本質的になり、ここで、
ｉ）ＣＤＲ１が、
ａ）配列番号：２１１〜２２６、又は
ｂ）配列番号：２１４のアミノ酸配列に対して、３、２、もしくは１つのアミノ酸差を有するアミノ酸配列、ここで、
−１位において、Ｇが、Ｒ、Ａ、Ｖ、Ｓ、もしくはＫに変更されており、
−３位において、Ｔが、Ｎに変更されており、
−４位において、Ｆが、Ｌに変更されており、
−６位において、Ｎが、Ｓに変更されており、
−７位において、Ｆが、Ｙに変更されており、
−８位において、Ｇが、Ａに変更されており、及び／又は
−９位において、Ｍが、Ｖに変更されている、
からなる群より選択され、
及び
ｉｉ）ＣＤＲ２が、
ｃ）配列番号：２９０〜３０９、又は
ｄ）配列番号：３０３のアミノ酸配列に対して、４、３、２、もしくは１つのアミノ酸差を有するアミノ酸配列、ここで、
−１位において、Ａが、Ｔに変更されており、
−２位において、Ｉが、Ｖに変更されており、
−５位において、Ｔが、ＳもしくはＡに変更されており、
−６位において、Ｇが、ＮもしくはＡに変更されており、
−７位において、Ｇが、ＳもしくはＲに変更されており、
−８位において、Ｈが、ＲもしくはＹに変更されており、
−９位において、Ｔが、ＩもしくはＫに変更されており、及び／又は
−１０位において、Ｙが、Ｆに変更されている、
からなる群より選択され、
及び
ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、
ｅ）配列番号：４１６〜４３５、又は
ｆ）配列番号：４２２のアミノ酸配列に対して、３、２、もしくは１つのアミノ酸差を有するアミノ酸配列、ここで、
−４位において、Ｆが、ＹもしくはＳに変更されており、
−５位において、Ｇが、Ｄに変更されており、
−６位において、Ｄが、Ｇに変更されており、
−７位において、Ｇが、Ｄに変更されており、
−８位において、Ｔが、Ａに変更されており、
−９位において、Ｙが、Ｓに変更されており、
−１０位において、Ｙが、Ｆに変更されており、
−１２位において、Ｑが、Ｅに変更されており、
−１４位において、Ａが、Ｎ、Ｔ、Ｉ、もしくはＲに変更されており、
−１７位において、Ｄが、ＮもしくはＧに変更されており、及び／又は
−１８位において、Ｆが、Ｌに変更されている、
からなる群より選択される。
【０１８３】
具体的な一態様では、本発明の一価ポリペプチドは、
−ＣＤＲ１が配列番号：１８２であり、ＣＤＲ２が配列番号：２６９であり、ＣＤＲ３が配列番号：３９７であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：１８２であり、ＣＤＲ２が配列番号：２６９であり、ＣＤＲ３が配列番号：３９４であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：１８１であり、ＣＤＲ２が配列番号：２６８であり、ＣＤＲ３が配列番号：３９３であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：１８１であり、ＣＤＲ２が配列番号：２６８であり、ＣＤＲ３が配列番号：３９５であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：１８１であり、ＣＤＲ２が配列番号：２６８であり、ＣＤＲ３が配列番号：３９６であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：１８１であり、ＣＤＲ２が配列番号：２７０であり、ＣＤＲ３が配列番号：３９３であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：１８３であり、ＣＤＲ２が配列番号：２６８であり、ＣＤＲ３が配列番号：３９３であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：１８４であり、ＣＤＲ２が配列番号：２６８であり、ＣＤＲ３が配列番号：３９３であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：１８５であり、ＣＤＲ２が配列番号：２７１であり、ＣＤＲ３が配列番号：３９８であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：１８２であり、ＣＤＲ２が配列番号：５４１であり、ＣＤＲ３が配列番号：３９４であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：１８２であり、ＣＤＲ２が配列番号：５４１であり、ＣＤＲ３が配列番号：３９７であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：１８２であり、ＣＤＲ２が配列番号：５４９であり、ＣＤＲ３が配列番号：３９４であり；及び
−ＣＤＲ１が配列番号：１８２であり、ＣＤＲ２が配列番号：５４９であり、ＣＤＲ３が配列番号：３９７である、
アミノ酸配列からなる群より選択される。
【０１８４】
更なる態様では、本発明の一価ポリペプチドは、
−ＣＤＲ１が配列番号：２１４であり、ＣＤＲ２が配列番号：３０３であり、ＣＤＲ３が配列番号：４２２であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２１１であり、ＣＤＲ２が配列番号：２９０であり、ＣＤＲ３が配列番号：４１６であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２１２であり、ＣＤＲ２が配列番号：２９１であり、ＣＤＲ３が配列番号：４１７であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２１３であり、ＣＤＲ２が配列番号：２９２であり、ＣＤＲ３が配列番号：４１８であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２１３であり、ＣＤＲ２が配列番号：２９３であり、ＣＤＲ３が配列番号：４１８であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２１４であり、ＣＤＲ２が配列番号：２９４であり、ＣＤＲ３が配列番号：４１８であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２１５であり、ＣＤＲ２が配列番号：２９５であり、ＣＤＲ３が配列番号：４１７であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２１６であり、ＣＤＲ２が配列番号：２９６であり、ＣＤＲ３が配列番号：４１９であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２１３であり、ＣＤＲ２が配列番号：２９５であり、ＣＤＲ３が配列番号：４１８であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２１４であり、ＣＤＲ２が配列番号：２９５であり、ＣＤＲ３が配列番号：４１８であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２１１であり、ＣＤＲ２が配列番号：２９７であり、ＣＤＲ３が配列番号：４２０であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２１５であり、ＣＤＲ２が配列番号：２９８であり、ＣＤＲ３が配列番号：４２１であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２１７であり、ＣＤＲ２が配列番号：２９９であり、ＣＤＲ３が配列番号：４２２であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２１１であり、ＣＤＲ２が配列番号：２９８であり、ＣＤＲ３が配列番号：４１８であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２１２であり、ＣＤＲ２が配列番号：２９１であり、ＣＤＲ３が配列番号：４２３であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２１２であり、ＣＤＲ２が配列番号：３００であり、ＣＤＲ３が配列番号：４１８であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２１４であり、ＣＤＲ２が配列番号：３０１であり、ＣＤＲ３が配列番号：４１８であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２１５であり、ＣＤＲ２が配列番号：３００であり、ＣＤＲ３が配列番号：４２４であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２１１であり、ＣＤＲ２が配列番号：３０２であり、ＣＤＲ３が配列番号：４１６であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２１８であり、ＣＤＲ２が配列番号：２９１であり、ＣＤＲ３が配列番号：４２５であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２１８であり、ＣＤＲ２が配列番号：２９１であり、ＣＤＲ３が配列番号：４２６であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２１３であり、ＣＤＲ２が配列番号：３０３であり、ＣＤＲ３が配列番号：４２２であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２１８であり、ＣＤＲ２が配列番号：２９１であり、ＣＤＲ３が配列番号：４１７であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２１９であり、ＣＤＲ２が配列番号：２９６であり、ＣＤＲ３が配列番号：４２７であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２１３であり、ＣＤＲ２が配列番号：３０４であり、ＣＤＲ３が配列番号：４２８であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２２０であり、ＣＤＲ２が配列番号：３０５であり、ＣＤＲ３が配列番号：４１６であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２１３であり、ＣＤＲ２が配列番号：３０３であり、ＣＤＲ３が配列番号：４２１であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２２０であり、ＣＤＲ２が配列番号：２９６であり、ＣＤＲ３が配列番号：４２９であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２２１であり、ＣＤＲ２が配列番号：３０５であり、ＣＤＲ３が配列番号：４１６であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２２２であり、ＣＤＲ２が配列番号：３０５であり、ＣＤＲ３が配列番号：４３０であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２１３であり、ＣＤＲ２が配列番号：３０６であり、ＣＤＲ３が配列番号：４１８であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２２３であり、ＣＤＲ２が配列番号：３０３であり、ＣＤＲ３が配列番号：４２２であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２１５であり、ＣＤＲ２が配列番号：２９８であり、ＣＤＲ３が配列番号：４３１であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２２０であり、ＣＤＲ２が配列番号：２９６であり、ＣＤＲ３が配列番号：４３２であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２２４であり、ＣＤＲ２が配列番号：３００であり、ＣＤＲ３が配列番号：４１８であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２２０であり、ＣＤＲ２が配列番号：３０７であり、ＣＤＲ３が配列番号：４３３であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２２５であり、ＣＤＲ２が配列番号：３００であり、ＣＤＲ３が配列番号：４１８であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２２６であり、ＣＤＲ２が配列番号：３０８であり、ＣＤＲ３が配列番号：４３４であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２１２であり、ＣＤＲ２が配列番号：２９５であり、ＣＤＲ３が配列番号：４１７であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２１３であり、ＣＤＲ２が配列番号：３０１であり、ＣＤＲ３が配列番号：４２６であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２１２であり、ＣＤＲ２が配列番号：３０５であり、ＣＤＲ３が配列番号：４１７であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２１７であり、ＣＤＲ２が配列番号：３０５であり、ＣＤＲ３が配列番号：４２２であり；
−ＣＤＲ１が配列番号：２１５であり、ＣＤＲ２が配列番号：２９８であり、ＣＤＲ３が配列番号：４３５であり；及び
−ＣＤＲ１が配列番号：２１３であり、ＣＤＲ２が配列番号：３０９であり、ＣＤＲ３が配列番号：４１８である、アミノ酸配列からなる群より選択される。
【０１８５】
上記されたＣＤＲを有する本発明の代表的なポリペプチドは、表Ａ−２に示される。
【０１８６】
一態様において、一価ポリペプチドは、配列番号：１〜６４、４９５、４９８〜５１３、及び５２３〜５４０のいずれか１つと比較して、その配列内に同じ数のアミノ酸を有する。別の態様では、一価ポリペプチドは、配列番号：１〜６４、４９５、４９８〜５１３、及び５２３〜５４０のいずれか１つと比較して、８９％以上の配列同一性を有する、８位〜１０６位（Ｋａｂａｔナンバリングに従った）のアミノ酸配列を有する。好ましくは、一価ポリペプチドは、配列番号：１〜６４、４９５、４９８〜５１３、及び５２３〜５４０のいずれか１つと比較して、その配列内に同じ数のアミノ酸を有し、一価ポリペプチドは、配列番号：１〜６４、４９５、４９８〜５１３、及び５２３〜５４０のいずれか１つと比較して、８９％以上の配列同一性を有する、８位〜１０６位（Ｋａｂａｔナンバリングに従った）のアミノ酸配列を有する。別の好ましい態様では、一価ポリペプチドは、ファミリー１２に属し、例えば、配列番号：１〜６４、４９５、４９８〜５１３、及び５２３〜５４０のいずれか１つから選択される一価ポリペプチドである。
【０１８７】
一態様において、一価ポリペプチドは、配列番号：６５〜１２３のいずれか１つと比較して、その配列内に同じ数のアミノ酸を有する。別の態様では、一価ポリペプチドは、配列番号：６５〜１２３のいずれか１つと比較して、８９％以上の配列同一性を有する、８位〜１０６位（Ｋａｂａｔナンバリングに従った）のアミノ酸配列を有する。好ましくは、一価ポリペプチドは、配列番号：６５〜１２３のいずれか１つと比較して、その配列内に同じ数のアミノ酸を有し、一価ポリペプチドは、配列番号：６５〜１２３のいずれか１つと比較して、８９％以上の配列同一性を有する、８位〜１０６位（Ｋａｂａｔナンバリングに従った）との間のアミノ酸配列を有する。別の好ましい態様では、一価ポリペプチドは、ファミリー１に属し、例えば、配列番号：６５〜１２３のいずれか１つから選択される一価ポリペプチドである。アミノ酸残基の１つ以上の上記で特定されたストレッチを含む一価ポリペプチドは、Ｋｖ１．３の機能をモデュレーションし、及び／又は、部分的にもしくは完全に阻害することができる。とりわけ、本発明のこれらのポリペプチドは、Ｔ細胞の膜を脱分極し、及び／又は、Ｔ細胞からのカリウムイオンの流出を減少させ、もしくは更に、完全に阻害することができる。また、本発明のこれらのポリペプチドは、Ｔ細胞の増殖を阻害し、及び／又は、Ｔ細胞の活性化をサプレッションして、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける特定の免疫応答の阻害をもたらすことができる。
【０１８８】
特定の一態様では、本発明のポリペプチドは、Ｋｖ１．３の機能を間接的に、すなわち、（本明細書で定義された）アロステリックモデュレーターとして、モデュレーションする。より具体的には、本発明のポリペプチドは、Ｋｖ１．３孔の構造内のコンフォーメーション変化を誘導することができる。
【０１８９】
本発明のポリペプチドのＫｖ１．３への結合は、Ｋｖ１．３ターゲットのコンフォーメーションを保存する結合アッセイ法において測定することができる。典型的なアッセイ法は、Ｋｖ１．３を細胞表面（例えば、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター肺（ＣＨＬ）細胞、Ｃａｋｉ細胞等）上に露出させたアッセイ法を含む（が、これに限定されない）。本発明のポリペプチドのＫｖ１．３への結合を測定するのに好ましいアッセイ法は、ＦＡＣＳアッセイ法、例えば、実施例で記載されたＦＡＣＳアッセイ法等である。ここで、本発明のポリペプチドの、ＣＨＯ−Ｋ１細胞及び／又はＨＥＫ２９３Ｈ細胞上に発現させたＫｖ１．３への結合が決定される。本発明のポリペプチドのＫｖ１．３への結合についての一部の好ましいＥＣ５０値は、本明細書における更なる説明及び実施例から明らかとなるであろう。
【０１９０】
このようなＦＡＣＳ結合アッセイ法において、本発明の一価ポリペプチドは、１０−８M以下、より好ましくは１０−９M以下、又は更に１０−１０M以下の、ヒトＫｖ１．３結合におけるＥＣ５０値を有することができる。例えば、このようなＦＡＣＳ結合アッセイ法において、本発明の一価ポリペプチドは、１０−９M〜１０−８MのヒトＫｖ１．３結合におけるＥＣ５０値を有することができる。
【０１９１】
このようなＦＡＣＳ結合アッセイ法において、本発明の一価ポリペプチドは、１０−７M以下、好ましくは１０−８M以下、より好ましくは１０−９M以下、又は更に１０−１０M以下の、カニクイザルＫｖ１．３結合におけるＥＣ５０値を有することができる。例えば、このようなＦＡＣＳ結合アッセイ法において、本発明の一価ポリペプチドは、１０−１０M〜１０−７M、例えば、１０−９M〜１０−８Mの、カニクイザルＫｖ１．３結合におけるＥＣ５０値を有することができる。
【０１９２】
このようなＦＡＣＳ結合アッセイ法において、本発明の一価ポリペプチドは、１０−６M以下、好ましくは１０−７M以下、好ましくは１０−８M以下、より好ましくは１０−９M以下、又は更に１０−１０M以下の、ラットＫｖ１．３結合におけるＥＣ５０値を有することができる。例えば、このようなＦＡＣＳ結合アッセイ法において、本発明の一価ポリペプチドは、１０−１０M〜１０−６M、例えば、１０−７M〜１０−６Mの、ラットＫｖ１．３結合におけるＥＣ５０値を有することができる。
【０１９３】
カリウムイオンの流出のモデュレーション及び／又は阻害は、各種のイオンチャネルスクリーニング技術により決定することができる。同技術は、イオン流出アッセイ法、放射性リガンド結合試験、蛍光染料アッセイ法、及び電気生理学、例えば、電圧クランプ、及び特に、パッチクランプを含む（が、これらに限定されない）。種々のイオンチャネル技術の概説は、例えば、Dabrowski et al.（CNS & Neurological Disorders Drug Targets 7: 122, 2008）、Lu and An（Comb. Chem. High Throughput Screen. 11:185-94, 2008）及びZheng et al.（Assay Drug Dev. Technol. 2: 543-52, 2004）により提供される。
【０１９４】
電圧クランプ（Huxley, Trends Neurosci. 25: 553-8, 2002）は、興奮性細胞の膜からのイオン電流を測定するのに使用される。この技術のパッチクランプの変形例（Hamill et al. Pflugers Archiv European Journal of Physiology 391: 85-100, 1981）により、細胞中の単独又は複数のイオンチャネルの研究が可能となる。
【０１９５】
よりハイスループットの電気生理学的プラットフォームは、中程度のスループットシステムからよりハイスループットのプラットフォームの範囲で開発されてきた（例えば、Southan and Clark, Methods Mol. Biol. 565: 187-208, 2009を参照のこと）。同プラットフォームは、PatchXpress（Molecular Devices; Ghetti et al. Methods Mol. Biol. 403: 59-69, 2007）、Qpatch及びQpatch HTX（Sophion; Mathes et al. Comb. Chem. High Throughput Screen. 12: 78-95, 2009；Korsgaard et al. Comb. Chem. High Throughput Screen. 12: 51-63, 2009）、PatchLiner（Nanion；Farre et al. Comb. Chem. High Throughput Screen 12: 24-37, 2009）、IonWorks（登録商標）HT、IonWorks（登録商標）Quattro、及びIonFlux（商標）システム（Molecular Devices；Jow et al. J Biomol. Screen. 12: 1059-67, 2007；Dale et al. Mol. Biosyst. 3: 714-22, 2007）を含む。これらのアッセイ法における本発明のポリペプチドについての一部の好ましいＩＣ５０値は、本明細書における更なる説明及び実施例から明らかとなるであろう。
【０１９６】
例えば、Ｋｖ１．３発現ＨＥＫ２９３Ｈ細胞を使用するIonFlux（商標）（Molecular Devices）において、本発明の一価ポリペプチドは、１０−７M以下、好ましくは１０−８M以下、より好ましくは１０−９M以下、又は更に１０−１０M以下の、ＩＣ５０値を有する。例えば、この自動パッチクランプアッセイ法において、本発明の一価ポリペプチドは、１０−１０M〜１０−７M、１０−１０M〜１０−８M、１０−１０M〜１０−９M、例えば、１０−９M〜１０−７M等の、ＩＣ５０値を有することができる。
【０１９７】
例えば、Ｋｖ１．３発現チャイニーズハムスター肺（ＣＨＬ）細胞を使用するIonWorks（登録商標）Quattro（Molecular Devices）において、本発明の一価ポリペプチドは、１０−７M以下、好ましくは１０−８M以下、より好ましくは１０−９M以下、又は更に１０−１０M以下の、ＩＣ５０値を有する。例えば、このハイスループット平面かん流パッチクランプにおいて、本発明の一価ポリペプチドは、１０−１０M〜１０−７M、１０−１０M〜１０−８M、１０−１０M〜１０−９M、例えば、１０−８M〜１０−７M等の、ＩＣ５０値を有することができる。とりわけ、ファミリー１２に属する一価ポリペプチドは、IonWorks（登録商標）Quattro（Molecular Devices）において、１０−８M〜１０−７MのＩＣ５０値を有することができる。
【０１９８】
また、本発明のポリペプチドによるＫｖ１．３のモデュレーション及び／又は阻害は、放射性リガンド結合試験においても評価することができる。トリチウム標識コレオリド（例えば、Ｃ２０〜２９−［３Ｈ］ジヒドロコレオリド（ｄｉＴＣ））によるＣＨＯ／Ｋｖ１．３細胞から調製された膜における部位のシングルクラスに対する結合試験は、Felix et al.（Biochemistry 38: 4922-30, 1999）により記載されている。Knaus et al.（Biochemistry 34: 13627-13634, 1995）には、例えば、ラット脳シナプス原形質膜における、モノヨードチロシニルマルガトキシン（１２５Ｉ−マルガトキシン）のヘテロ四量体Ｋｖチャネルへの結合が記載されている。Ｊｕｒｋａｔ細胞、ヒト白血球Ｔ細胞株、又は、シェーカー型電位作動型Ｋ＋チャネルＫ（Ｖ）１．３で安定的にトランスフェクションされたＣＨＯ細胞のいずれかから調製された原形質膜に対する１２５Ｉ−マルガトキシンの結合試験は、Helms et al.（Biochemistry. 36: 3737-44, 1997）により記載されている。本発明のポリペプチドによるＫｖ１．３に対する１２５Ｉ−マルガトキシン結合をブロックすることについての、一部の好ましいＩＣ５０値は、本明細書における更なる説明及び実施例から明らかとなるであろう。
【０１９９】
本発明の一価ポリペプチドは、１０−８M以下、より好ましくは１０−９M以下、又は更に１０−１０M以下のＩＣ５０値で、１２５Ｉ−マルガトキシンのカニクイザルＫｖ１．３過剰発現ＣＨＯ細胞への結合をブロックすることができる。例えば、このような１２５Ｉ−マルガトキシンブロックアッセイ法では、本発明の一価ポリペプチドは、１０−１０M〜１０−８M、例えば、１０−９M〜１０−８M等の、ＩＣ５０値を有することができる。
【０２００】
本発明のポリペプチドによるＫｖ１．３のモデュレーション及び／又は阻害を測定するための他の流出アッセイ法は、Hanson et al.（Br. J. Pharmacol. 126: 1707-16, 1999）により記載された放射性ラベル８６ルビジウムによるハイスループット流出アッセイ法、Wang et al.（Assay Drug Dev. Technol. 2: 525-34, 2004）により記載された非放射性ルビジウム（Ｒｂ（＋））流出アッセイ法、及び蛍光系タリウム流出アッセイ法（Weaver et al. J. Biomol. Screen. 9: 671-7, 2004）を含む（が、これらに限定されない）。
【０２０１】
本発明のポリペプチドによるＴ細胞活性化及び／又は増殖の阻害は、Ｔ細胞活性化アッセイ法において測定することができる。Ｔ細胞活性化アッセイ法は、Nguyten et al.（Molecular Pharmacology 50: 1672-1679, 1996）及びHanson et al.（Br. J. Pharmacol. 126: 1707-1716, 1999）により記載されているが、これらに限定されない。本発明の一価ポリペプチドによるＴ細胞活性化及び／又は増殖の阻害のための一部の好ましいＩＣ５０値は、本明細書における更なる説明及び実施例から明らかとなるであろう。
【０２０２】
（実施例４．４及び５．５で記載された）抗ＣＤ３抗体であるＯＫＴ３により刺激されたＣＣＲ７−ＣＤ４５ＲＡ−  Ｔ細胞によるＴ細胞活性化アッセイ法において、本発明の一価ポリペプチドは、ＩＦＮガンマ生成の阻害について、１０−７M以下、好ましくは１０−８M以下、より好ましくは１０−９M以下、１０−１０M以下、又は更に１０−１１M以下の、ＩＣ５０値を有する。例えば、このＴ細胞活性化アッセイ法において、本発明の一価ポリペプチドは、１０−１１M〜１０−７M、１０−１１M〜１０−８M、１０−１１M〜１０−９M、例えば、１０−８M〜１０−７M等のＩＣ５０値で、ＩＦＮガンマ生成を阻害する。とりわけ、ファミリー１２に属する一価ポリペプチドは、１０−８M〜１０−７MのＩＣ５０値で、ＩＦＮガンマ生成を阻害することができる。
【０２０３】
（実施例４．４及び５．５で記載された）抗ＣＤ３抗体であるＯＫＴ３により刺激されたＣＣＲ７−ＣＤ４５ＲＡ−  Ｔ細胞によるこのＴ細胞活性化アッセイ法において、本発明の一価ポリペプチドは、ＣＤ２５アップレギュレーション阻害について、１０−７M以下、好ましくは１０−８M以下、より好ましくは１０−９M以下、１０−１０M以下、又は更に１０−１１M以下の、ＩＣ５０値を有する。例えば、このＴ細胞活性化アッセイ法において、本発明の一価ポリペプチドは、１０−１１M〜１０−７M、１０−１１M〜１０−８M、１０−１１M〜１０−９M、例えば、１０−８M〜１０−７M等のＩＣ５０値で、ＣＤ２５のアップレギュレーションを阻害する。とりわけ、ファミリー１２に属する一価ポリペプチドは、１０−８M〜１０−７MのＩＣ５０値で、ＣＤ２５のアップレギュレーションを阻害することができる。
【０２０４】
また、本発明は、配列番号：１〜１２３、４９５、４９８〜５１３、及び５２３〜５４０のアミノ酸配列の内の少なくとも１つに対して、少なくとも８０％のアミノ酸同一性（又は、本明細書で定義された配列同一性）、好ましくは少なくとも８５％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも９０％のアミノ酸同一性、例えば、９５％以上のアミノ酸同一性、又は更に、（本質的に）１００％のアミノ酸同一性を有する一価ポリペプチドに関する。
【０２０５】
１つの具体的で、非限定的な態様では、本発明の一価ポリペプチドは、免疫グロブリンフォールドを含む一価ポリペプチド、又は、適切な条件（例えば、生理学的条件）下において、免疫グロブリンフォールドを（すなわち、折り畳むことにより）形成可能な一価ポリペプチドであることができる。特に、Halaby et al.によるレビュー（J. Protein Eng. 12: 563-71, 1999）が参照される。好ましくは、免疫グロブリンフォールドを形成するように適切に折り畳まれた場合、アミノ酸残基のストレッチは、Ｋｖ１．３結合のための抗原結合部位を適切に形成することができる。したがって、好ましい態様では、本発明の一価ポリペプチドは、免疫グロブリン、例えば、免疫グロブリンシングル可変ドメイン等である。
【０２０６】
したがって、フレームワーク配列は、好ましくは、免疫グロブリンフレームワーク配列又は、免疫グロブリンフレームワーク配列から（例えば、配列最適化、例えば、ヒト化又はラクダ化により）得られたフレームワーク配列（の適切な組み合わせ）である。例えば、フレームワーク配列は、免疫グロブリンシングル可変ドメイン、例えば、軽鎖可変ドメイン（例えば、ＶＬ配列）及び／又は重鎖可変ドメイン（例えば、ＶＨ配列）から得られたフレームワーク配列であることができる。特に好ましい一態様では、フレームワーク配列は、ＶＨＨ配列から得られたフレームワーク配列（ここで、前記フレームワーク配列は、場合により、部分的に又は完全にヒト化されていることができる）のいずれかであるか、又は（本明細書で定義された）ラクダ化されている従来のＶＨ配列である。
【０２０７】
フレームワーク配列は、好ましくは、本発明の一価ポリペプチドが、免疫グロブリンシングル可変ドメイン、例えば、ドメイン抗体（又は、ドメイン抗体として使用するのに適したアミノ酸配列）、シングルドメイン抗体（又は、シングルドメイン抗体として使用するのに適したアミノ酸）、「ｄＡｂ」（又は、ｄＡｂとして使用するのに適したアミノ酸）、ナノボディ（登録商標）、ＶＨＨ配列、ヒト化ＶＨＨ配列、ラクダ化ＶＨ配列、又は親和性成熟により得られたＶＨＨ配列であるようにであることができる。再度、適切なフレームワーク配列は、例えば、標準的な参考書ならびに本明細書で言及された更なる開示及び従来技術に基づいて、当業者に明らかであろう。
【０２０８】
特に、本発明の一価ポリペプチドに存在するフレームワーク配列は、本発明の一価ポリペプチドがナノボディであるように、（国際公開公報第０８／０２００７９号（表Ａ−３〜Ａ−８）で定義された）１つ以上のホールマーク残基を含有することができる。このようなフレームワーク配列（の適切な組み合わせ）の一部の好ましく、非限定的な例は、本明細書における更なる開示から明らかとなるであろう（例えば、表Ａ−２を参照のこと）。一般的には、ナノボディ（特に、ＶＨＨ配列及び部分的にヒト化されたナノボディ）は、特に、（例えば、国際公開公報第０８／０２００７９号、第６１頁２４行目〜第９８頁３行目に更に記載されたように）１つ以上のフレームワーク配列中における、１つ以上の「ホールマーク残基」の存在により特徴付けることができる。
【０２０９】
とりわけ、ナノボディは、ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４の（一般）構造を有する免疫グロブリン及び／又はポリペプチドであることができ、ここで、ＦＲ１〜ＦＲ４はそれぞれ、フレームワーク領域１〜４を意味し、ここで、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３はそれぞれ、相補性決定領域１〜３を意味する。同ナノボディは、
ｉ）配列番号：１〜１２３又は４９５（表Ａ−１を参照のこと）のアミノ酸配列の内の少なくとも１つに対して、少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有し、ここで、アミノ酸同一性の度合いを決定する目的で、ＣＤＲ配列を形成するアミノ酸残基は無視される。これに関して、表Ａ−２も参照される。同表には、配列番号：１〜１２３又は４９５（表Ａ−１を参照のこと）の免疫グロブリンシングル可変ドメインの、フレームワーク１配列（配列番号：１２４〜１８０）、フレームワーク２配列（配列番号：２２７〜２６７）、フレームワーク３配列（配列番号：３１０〜３９２）、及びフレームワーク４配列（配列番号：４３６〜４５０）が列記されている。又は
ｉｉ）表Ａ−２で示されたフレームワーク配列の組み合わせ、
及びここで、
ｉｉｉ）好ましくは、Ｋａｂａｔナンバリングに従った１１、３７、４４、４５、４７、８３、８４、１０３、１０４、及び１０８位における１つ以上のアミノ酸残基は、国際公開公報第０８／０２００７９号の表Ａ−３〜表Ａ−８で言及されたホールマーク残基から選択される。
【０２１０】
また、本発明は、数多くの配列最適化免疫グロブリンシングル可変ドメインも提供する。
【０２１１】
特に、配列最適化免疫グロブリンシングル可変ドメインは、先の段落において免疫グロブリンシングル可変ドメインについて、一般的に定義されるが、（本明細書で定義された）ヒト化置換である、及び／又は、同ヒト化置換に対応する少なくとも１つのアミノ酸残基が存在する（及び特に、少なくとも１つのフレームワーク残基中に）、アミノ酸配列であることができる。一部の好ましく、非限定的なヒト化置換（及びその適切な組み合わせ）は、本明細書における開示に基づいて、当業者に明らかとなるであろう。付加的に又は代替的に、他の有用である可能性があるヒト化置換は、天然のＶＨＨ配列のフレームワーク領域の配列を、１つ以上の密接に関連するヒトＶＨ配列の対応するフレームワーク配列と比較することにより確認することができる。その後に、このようにして決定された１つ以上の有用である可能性のあるヒト化置換（又はその組み合わせ）を、（本明細書で更に記載されたそれ自体公知の任意の方法において）前記ＶＨＨ配列に導入することができ、得られたヒト化ＶＨＨ配列を、ターゲットに対する親和性、安定性、発現の容易性及びレベル、ならびに／又は他の所望の特性について試験することができる。この方法において、過度の思考錯誤をすることなく、他の適切なヒト化置換（又はその適切な組み合わせ）を、本明細書における開示に基づいて、当業者により決定することができる。また、前述に基づいて、免疫グロブリンシングル可変ドメイン（のフレームワーク領域）を、部分的にヒト化させ、又は、完全にヒト化させることができる。
【０２１２】
また、本発明は、改善された発現及び／又は安定性試験中の保存に基づく向上した安定性を示すことができる、数多くの配列最適化免疫グロブリンシングル可変ドメインも提供する。本発明のアミノ酸配列は、低下したＮ末端のピログルタミン酸翻訳後修飾を示すため、向上した生成物の安定性を有することができる。加えて、本発明のアミノ酸配列は、その対応する親アミノ酸配列と比較して、他の改善された特性、例えば、より少ない免疫原性、（ＫＤ値（実際もしくは見かけ）、ＫＡ値（実際もしくは見かけ）、ｋｏｎ速度、及び／又はｋｏｆｆ速度、あるいは本明細書で更に記載されたＩＣ５０値として適切に測定され及び／又は表現される）Ｋｖ１．３についての改善された結合特性、Ｋｖ１．３についての改善された親和性及び／又は改善された結合活性、ならびに／又はＫｖ１．３をブロックするための改善された有効性及び／又は活性を示すことができる。
【０２１３】
本発明の一部の特に好ましい配列最適化免疫グロブリンシングル可変ドメインは、配列番号：１〜１２３又は４９５の免疫グロブリンシングル可変ドメインの配列最適化変異体である。中でも、配列番号：４９８〜５１３又は５２３〜５４０のアミノ酸配列が、一部の特に好ましい例である。
【０２１４】
このため、本発明の一部の他の好ましい免疫グロブリンシングル可変ドメインは、Ｋｖ１．３に対して（本明細書で更に定義されたように）結合することができ、
ｉ）配列番号：１〜１２３もしくは４９５の免疫グロブリンシングル可変ドメインの内の１つの配列最適化変異体であり、及び／又は
ｉｉ）配列番号：１〜１２３もしくは４９５の免疫グロブリンシングル可変ドメインの内の少なくとも１つ、及び／又は、配列番号：４９８〜５１３もしくは５２３〜５４０（表Ａ−９を参照のこと）の免疫グロブリンシングル可変ドメインの内の少なくとも１つに対して、少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有し［ここで、アミノ酸同一性の度合いを決定する目的で、ＣＤＲ配列を形成するアミノ酸残基は無視される。これに関して、表Ａ−２も参照される。同表には、配列番号：１〜１２３、４９５、４９８〜５１３、又は５２３〜５４０（表Ａ−１及び表Ａ−９を参照のこと）の免疫グロブリンシングル可変ドメインの、フレームワーク１配列（配列番号：１２４〜１８０ならびに配列番号：５５６及び５５９）、フレームワーク２配列（配列番号：２２７〜２６７）、フレームワーク３配列（配列番号：３１０〜３９２及び配列番号：５５７〜５５８）、及びフレームワーク４配列（配列番号：４３６〜４５０）が列記されている］、及び／又は
ｉｉｉ）表Ａ−２で示されたフレームワーク配列の組み合わせを有する。
及びここで、
ｉｖ）好ましくは、Ｋａｂａｔナンバリングに従った１１、３７、４４、４５、４７、８３、８４、１０３、１０４、及び１０８位における１つ以上のアミノ酸残基は、国際公開公報第０８／０２００７９号の表Ａ−３〜表Ａ−８で言及されたホールマーク残基から選択されるナノボディである。
【０２１５】
また、本発明の免疫グロブリン（及び特に、免疫グロブリンシングル可変ドメイン）は、下記同時係属中の米国仮出願で記載された、特定の変異／アミノ酸残基を含有することもできる。全て、発明の名称「改善された免疫グロブリン可変ドメイン」：２０１４年５月１６日付けの米国仮出願第６１／９９４５５２号、２０１４年６月１８日付けの同第６１／０１４，０１５号、２０１４年８月２１日付けの同第６２／０４０，１６７号、及び２０１４年９月８日付けの同第６２／０４７，５６０号（全て、Ablynx N.V.に譲渡）。
【０２１６】
特に、本発明の免疫グロブリン（及び特に、免疫グロブリンシングル可変ドメイン）は、（ｉ）１１２位にＫもしくはＱ、又は、（ｉｉ）１１位におけるＶとの組み合わせで、１１０位にＫもしくはＱ、又は、（ｉｉｉ）８９位にＴ、又は、（ｉｖ）１１０位におけるＫもしくはＱとで、８９位にＬ、又は（ｖ）１１位にＶ及び８９位にＬ、又は（ｉ）〜（ｖ）の任意の適切な組み合わせを適切に含有することができる。
【０２１７】
前記同時係属中の米国仮出願にも記載されたように、本発明の免疫グロブリンが、上記（ｉ）〜（ｖ）の内の１つ（又はそれらの適切な組み合わせ）に基づく変異を含有する場合、
−１１位におけるアミノ酸残基は、好ましくは、Ｌ、Ｖ、又はＫから選択され（最も好ましくは、Ｖであり）、及び
−１４位におけるアミノ酸残基は、好ましくは、Ａ又はＰから適切に選択され、及び
−４１位におけるアミノ酸残基は、好ましくは、Ａ又はＰから適切に選択され、及び
−８９位におけるアミノ酸残基は、好ましくは、Ｔ、Ｖ、又はＬから適切に選択され、及び
−１０８位におけるアミノ酸残基は、好ましくは、Ｑ又はＬから適切に選択され、及び
−１１０位におけるアミノ酸残基は、好ましくは、Ｔ、Ｋ、又はＱから適切に選択され、及び
−１１２位におけるアミノ酸残基は、好ましくは、Ｓ、Ｋ又はＱから適切に選択される。
【０２１８】
前記同時係属中の米国仮出願で言及されたように、前記変異は、いわゆる「既存の抗体」の本発明の免疫グロブリン及び化合物への結合を妨げる、又は、減少させるのに有効である。またこの目的で、本発明の免疫グロブリンは、（場合により、前記変異との組み合わせにおいて）Ｃ末端伸長（Ｘ）ｎ［同伸長中、ｎは、１〜１０、好ましくは、１〜５、例えば、１、２、３、４、又は５（及び好ましくは、１又は２、例えば、１）であり、各Ｘは、（好ましくは、天然の）アミノ酸残基であり、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、又はイソロイシン（Ｉ）から独立して選択され、好ましくは、これらからなる群より独立して選択される］を含有することができる。これについて、再度、前記米国仮出願及び国際公開公報第１２／１７５７４１号が参照される。特に、本発明の免疫グロブリンは、本発明の免疫グロブリンがそれを含むタンパク質、ポリペプチド、又は他の化合物もしくは構築物のＣ末端を形成する場合、このようなＣ末端伸長を含有することができる（再度、前記米国仮出願及び国際公開公報第１２／１７５７４１号で更に記載された通り）。
【０２１９】
このような変異及び／又はこのようなＣ末端伸長を含有する本発明の免疫グロブリンの一部の特に好ましく、非限定的な例は、配列番号：４９６〜４９７及び５１４〜５４０に提供される。
【０２２０】
好ましい態様では、本発明は、配列番号：１〜１２３、４９５、４９８〜５１３、及び５２３〜５４０のいずれかから選択される免疫グロブリン又は一価ポリペプチドを提供する。
【０２２１】
また、本発明は、配列番号：１〜１２３、４９５、４９８〜５１３、及び５２３〜５４０を有する少なくとも１つの免疫グロブリンのＫｖ１．３への結合をクロスブロックし、及び／又は、配列番号：１〜１２３、４９５、４９８〜５１３、及び５２３〜５４０を有する少なくとも１つのポリペプチドにより、Ｋｖ１．３に結合するのをクロスブロックされる、Ｋｖ１．３に対する一価ポリペプチド及び／又は免疫グロブリンシングル可変ドメインに関する。
【０２２２】
さらに、本発明は、本発明の一価ポリペプチドにより、とりわけ、配列番号：１〜１２３、４９５、４９８〜５１３、及び５２３〜５４０を有する一価ポリペプチドにより結合されるのと同じエピトープに結合する、Ｋｖ１．３に対する一価ポリペプチド及び／又は免疫グロブリンシングル可変ドメインに関する。
【０２２３】
特定の態様では、本発明は、ファミリー１２に属する本発明の一価ポリペプチドにより、とりわけ、配列番号：１〜６４、４９５、４９８〜５１３、及び５２３〜５４０を有する一価ポリペプチドにより結合されるのと同じエピトープに結合する、Ｋｖ１．３に対する一価ポリペプチド及び／又は免疫グロブリンシングル可変ドメインに関する。
【０２２４】
別の特定の態様では、本発明は、ファミリー１に属する本発明の一価ポリペプチドにより、とりわけ、配列番号：６５〜１２３を有する一価ポリペプチドにより結合されるのと同じエピトープに結合する、Ｋｖ１．３に対する一価ポリペプチド及び／又は免疫グロブリンシングル可変ドメインに関する。
【０２２５】
再度、このような一価ポリペプチドは、任意の適切な方法において、任意の適切なソースから得られる、免疫グロブリン、例えば、免疫グロブリンシングル可変ドメインであることができ、例えば、（すなわち、ラクダ科の適切な種からの）天然のＶＨＨ配列、又は、合成もしくは半合成のアミノ酸配列であることができる。同アミノ酸配列は、（本明細書で定義された）「ヒト化」ナノボディ又はＶＨＨ配列、（本明細書で定義された）「ラクダ化」免疫グロブリン配列（及び特に、ラクダ化重鎖可変ドメイン配列）、及び、（例えば、合成、ランダム、又は天然の免疫グロブリン配列から開始する）親和性成熟、ＣＤＲグラフト化、ベニアリング、種々の免疫グロブリン配列から得られたフラグメントの組み合わせ、オーバーラッププライマーを使用するＰＣＲアッセンブリ等の技術、及び、当業者に周知の免疫グロブリン配列を操作するための類似する技術、又は、本明細書で更に記載された前述のいずれかの任意の適切な組み合わせ等の技術により得られたナノボディを含むが、これらに限定されない。また、免疫グロブリンがＶＨＨ配列を含む場合、前記免疫グロブリンは、本明細書で更に記載されたように、１つ以上の更なる（部分的に又は完全に）ヒト化された本発明の免疫グロブリンを提供するために、適切にヒト化させることができる。同様に、免疫グロブリンが合成又は半合成の配列（例えば、部分的にヒト化された配列）を含む場合、前記免疫グロブリンは、場合により、再度、本明細書で記載されたように、再度、１つ以上の本発明の更に（部分的にもしくは完全に）ヒト化された免疫グロブリンを提供するために、更に適切にヒト化させることができる。
【０２２６】
本発明のこれらの一価ポリペプチド、及び特に、本発明のＣＤＲ配列を含む免疫グロブリンは、多価ポリペプチドの調製のための構築ブロック又は結合ユニットとして使用するのに特に適している。
【０２２７】
したがって、Ｋｖ１．３に結合する本発明の一価ポリペプチドは、本質的に（本明細書で定義されたように）単離された形態にあることができ、又は、本発明の一価ポリペプチドは、Ｋｖ１．３に結合する１つ以上の一価ポリペプチドを含むか、又は、同ポリペプチドから本質的になることができ、場合により、１つ以上の更なるアミノ酸配列（全て、場合により、１つ以上の適切なリンカーを介して連結している）を更に含むことができる、タンパク質もしくはポリペプチドの一部を形成することができる。また、本発明は、１つ以上の本発明の一価ポリペプチド（又はその適切なフラグメント）を含むか、又は、これらから本質的になる、タンパク質又はポリペプチドに関する。
【０２２８】
このため、１つ以上の本発明の一価ポリペプチドは、全て本明細書で記載された、本発明の一価、多価、又は多重抗原結合性のポリペプチドをそれぞれ提供するために、このようなタンパク質又はポリペプチド中において、結合ユニット又は構築ブロックとして使用される。またこのため、本発明は、１つの本発明の一価ポリペプチドを含むか、又は、同ポリペプチドから本質的になる、一価構築物であるポリペプチドに関する。またこのため、本発明は、２つ以上の本発明の一価ポリペプチドを含むか、又は、同ポリペプチドから本質的になる、多価ポリペプチド、例えば、二価又は三価ポリペプチド等であるポリペプチドに関する（多価及び多重特異性ポリペプチドについては、１つ以上のＶＨＨドメイン及びその調製物を含有する。Conrath et al.（J. Biol. Chem. 276: 7346-7350, 2001）ならびに、例えば、国際公開公報第９６／３４１０３号、同第９９／２３２２１号、及び同第２０１０／１１５９９８号も参照される）。
【０２２９】
本発明の多価ポリペプチド
さらに、本発明は、Ｋｖ１．３、好ましくはヒトＫｖ１．３に対する少なくとも１つの免疫グロブリンシングル可変ドメイン（又はその適切なフラグメント）と、１つの更なる免疫グロブリンシングル可変ドメインとを含むか、又は、これらから（本質的に）なる、多価ポリペプチド（本明細書において、「本発明の多価ポリペプチド」とも呼ばれる）に関する。
【０２３０】
特に好ましい態様では、本発明の多価ポリペプチドは、Ｋｖ１．３に対する２つ以上の免疫グロブリンシングル可変ドメインを含むか、又は、これらから本質的になる。２つ以上の免疫グロブリンシングル可変ドメインは、場合により、１つ以上のペプチドリンカーを介して連結していることができる。
【０２３１】
本発明の多価ポリペプチドにおいて、２つ以上の免疫グロブリンシングル可変ドメイン又はナノボディは、同じか又は異なることができ、同じ抗原もしくは抗原性決定基に対する（例えば、同じ部分もしくはエピトープに対する、又は、異なる部分もしくはエピトープに対する）ことができ、あるいは、異なる抗原もしくは抗原性決定基、又は、それらの任意の適切な組み合わせに対することができる。例えば、本発明の二価ポリペプチドは、（ａ）２つの同一の免疫グロブリンシングル可変ドメイン又はナノボディ、（ｂ）タンパク質又は抗原の第１の抗原性決定基に対する第１の免疫グロブリンシングル可変ドメイン又はナノボディと、第１の免疫グロブリンシングル可変ドメイン又はナノボディとは異なる、前記タンパク質又は抗原の同じ抗原性決定基に対する第２の免疫グロブリンシングル可変ドメイン又はナノボディ、（ｃ）タンパク質又は抗原の第１の抗原性決定基に対する第１の免疫グロブリンシングル可変ドメイン又はナノボディと、前記タンパク質又は抗原の別の抗原性決定基に対する第２の免疫グロブリンシングル可変ドメイン又はナノボディ、又は、（ｄ）第１のタンパク質又は抗原に対する第１の免疫グロブリンシングル可変ドメイン又はナノボディと、第２のタンパク質又は抗原（すなわち、前記第１の抗原とは異なる）に対する第２の免疫グロブリンシングル可変ドメイン又はナノボディを含むことができる。同様に、本発明の三価ポリペプチドは、例えば、（ａ）３つの同一の免疫グロブリンシングル可変ドメイン又はナノボディ、（ｂ）抗原の第１の抗原性決定基に対する２つの同一の免疫グロブリンシングル可変ドメイン又はナノボディと、同じ抗原の異なる抗原性決定基に対する第３の免疫グロブリンシングル可変ドメイン又はナノボディ、（ｃ）抗原の第１の抗原性決定基に対する２つの同一の免疫グロブリンシングル可変ドメイン又はナノボディと、前記第１の抗原とは異なる第２の抗原に対する第３の免疫グロブリンシングル可変ドメイン又はナノボディ、（ｄ）第１の抗原の第１の抗原性決定基に対する第１の免疫グロブリンシングル可変ドメイン又はナノボディと、前記第１の抗原の第２の抗原性決定基に対する第２の免疫グロブリンシングル可変ドメイン又はナノボディと、前記第１の抗原とは異なる第２の抗原に対する第３の免疫グロブリンシングル可変ドメイン又はナノボディ、又は、（ｅ）第１の抗原に対する第１の免疫グロブリンシングル可変ドメイン又はナノボディと、前記第１の抗原とは異なる第２の抗原に対する第２の免疫グロブリンシングル可変ドメイン又はナノボディと、前記第１及び第２の抗原とは異なる第３の抗原に対する第３の免疫グロブリンシングル可変ドメイン又はナノボディを含むが、これらに限定されない。
【０２３２】
少なくとも２つの免疫グロブリンシングル可変ドメイン及び／又はナノボディを含有し、ここで、少なくとも１つの免疫グロブリンシングル可変ドメイン又はナノボディが、第１の抗原に対し（すなわち、Ｋｖ１．３に対し）、少なくとも１つの免疫グロブリンシングル可変ドメイン又はナノボディが、第２の抗原（すなわち、Ｋｖ１．３とは異なる）に対する、本発明のポリペプチドは、本発明の「多重特異性」ポリペプチドとも呼ばれるであろう。このようなポリペプチドに存在する免疫グロブリンシングル可変ドメイン又はナノボディは、本明細書において、「多重特異性フォーマット」にあるとも呼ばれるであろう。このため、例えば、本発明の「二重特異性」ポリペプチドは、第１の抗原（すなわち、Ｋｖ１．３）に対する少なくとも１つの免疫グロブリンシングル可変ドメイン又はナノボディと、第２の抗原（すなわち、Ｋｖ１．３とは異なる）に対する少なくとも１つの更なる免疫グロブリンシングル可変ドメイン又はナノボディとを含むポリペプチドである。一方、本発明の「三重特異性」ポリペプチドは、第１の抗原（すなわち、Ｋｖ１．３）に対する少なくとも１つの免疫グロブリンシングル可変ドメイン又はナノボディと、第２の抗原（すなわち、Ｋｖ１．３とは異なる）に対する少なくとも１つの更なる免疫グロブリンシングル可変ドメイン又はナノボディと、第３の抗原（すなわち、Ｋｖ１．３及び第２の抗原の両方と異なる）に対する少なくとも１つの更なる免疫グロブリンシングル可変ドメイン又はナノボディとを含むポリペプチドである。
【０２３３】
したがって、一態様において、その最も単純な形態では、本発明の多価ポリペプチドは、Ｋｖ１．３に対する第１の免疫グロブリンシングル可変ドメイン又はナノボディと、Ｋｖ１．３に対する同一の第２の免疫グロブリンシングル可変ドメイン又はナノボディとを含み、ここで、前記第１及び第２の免疫グロブリンシングル可変ドメイン又はナノボディは、場合により、（本明細書で定義された）リンカー配列を介して連結していることができる、本発明の二価ポリペプチドである。その最も単純な形態において、本発明の多価ポリペプチドは、Ｋｖ１．３に対する第１の免疫グロブリンシングル可変ドメイン又はナノボディと、Ｋｖ１．３に対する同一の第２の免疫グロブリンシングル可変ドメイン又はナノボディと、Ｋｖ１．３に対する同一の第３の免疫グロブリンシングル可変ドメイン又はナノボディとを含み、ここで、前記第１、第２、及び第３の免疫グロブリンシングル可変ドメイン又はナノボディは、場合により、１つ以上、及び特に、２つのリンカー配列を介して連結していることができる、本発明の三価ポリペプチドであることができる。
【０２３４】
別の態様では、本発明の多価ポリペプチドは、Ｋｖ１．３に対する第１の免疫グロブリンシングル可変ドメイン又はナノボディと、第２の抗原に対する第２の免疫グロブリンシングル可変ドメイン又はナノボディとを含み、ここで、前記第１及び第２の免疫グロブリンシングル可変ドメイン又はナノボディは、場合により、（本明細書で定義された）リンカー配列を介して連結していることができる、本発明の二重特異性ポリペプチドであることができる。また一方、本発明の多価ポリペプチドは、Ｋｖ１．３に対する第１の免疫グロブリンシングル可変ドメイン又はナノボディと、第２の抗原に対する第２の免疫グロブリンシングル可変ドメイン又はナノボディと、第３の抗原に対する第３の免疫グロブリンシングル可変ドメイン又はナノボディとを含み、ここで、前記第１、第２、及び第３の免疫グロブリンシングル可変ドメイン又はナノボディは、場合により、１つ以上、及び特に、２つのリンカー配列を介して連結していることができる、本発明の三重特異性ポリペプチドであることもできる。
【０２３５】
好ましい態様では、本発明のポリペプチドは、三価の二重特異性ポリペプチドである。本発明の三価の二重特異性ポリペプチドは、その最も単純な形態において、Ｋｖ１．３に対する２つの同一の免疫グロブリンシングル可変ドメイン又はナノボディと、別の抗原（例えば、血清アルブミン）に対する第３の免疫グロブリンシングル可変ドメイン又はナノボディとを含み、ここで、前記第１、第２、及び第３の免疫グロブリンシングル可変ドメイン又はナノボディは、場合により、１つ以上、及び特に、２つのリンカー配列を介して連結していることができる、（本明細書で定義された）本発明の三価ポリペプチドであることができる。本発明の特に好ましい三価の二重特異性ポリペプチドは、本明細書で記載された実施例及び表Ａ−３で示されたものである。
【０２３６】
別の態様では、本発明のポリペプチドは、二重特異性ポリペプチドである。本発明の二重特異性ポリペプチドは、その最も単純な形態において、Ｋｖ１．３に対する免疫グロブリンシングル可変ドメイン又はナノボディと、別の抗原に対する第２の免疫グロブリンシングル可変ドメイン又はナノボディとを含み、ここで、前記第１及び第２の免疫グロブリンシングル可変ドメイン又はナノボディは、場合により、リンカー配列を介して連結していることができる、（本明細書で定義された）本発明の二重特異性ポリペプチドであることができる。
【０２３７】
更なる態様では、本発明のポリペプチドは、多重抗原結合性ポリペプチド（本明細書において、「本発明の多重抗原結合性ポリペプチド」とも呼ばれる）、例えば、（ａ）「本発明の二重抗原結合性ポリペプチド」又は「本発明の三重抗原結合性ポリペプチド」等である。本明細書で使用する場合、「多重抗原結合性」（抗原）結合分子又は「多重抗原結合性」ポリペプチドという用語は、少なくとも２つ（すなわち、２つ以上）の免疫グロブリンシングル可変ドメインを含み、ここで、「第１の」免疫グロブリンシングル可変ドメインは、Ｋｖ１．３に対し、「第２の」免疫グロブリンシングル可変ドメインは、Ｋｖ１．３に対し、ここで、これらの「第１」及び「第２」の免疫グロブリンシングル可変ドメインは、異なるパラトープを有する、ポリペプチドを意味するものである。したがって、多重抗原結合性ポリペプチドは、Ｋｖ１．３に対する２つ以上の免疫グロブリンシングル可変ドメインを含むか、又は、これらから本質的になり、ここで、少なくとも１つの「第１の」免疫グロブリンシングル可変ドメインは、Ｋｖ１．３上の第１のエピトープに対し、少なくとも１つの「第２の」免疫グロブリンシングル可変ドメインは、Ｋｖ１．３上の第１のエピトープとは異なるＫｖ１．３上の第２のエピトープに対する。
【０２３８】
好ましい態様では、本発明のポリペプチドは、二重抗原結合性ポリペプチドである。本明細書で使用する場合、「二重抗原結合性」（抗原）結合分子又は「二重抗原結合性」ポリペプチドという用語は、Ｋｖ１．３に対する「第１の」免疫グロブリンシングル可変ドメインと、Ｋｖ１．３に対する「第２の」免疫グロブリンシングル可変ドメインとを含み、ここで、これらの「第１」及び「第２」の免疫グロブリンシングル可変ドメインは、異なるパラトープを有する、ポリペプチドを意味するものである。したがって、二重抗原結合性ポリペプチドは、Ｋｖ１．３に対する２つ以上の免疫グロブリンシングル可変ドメインを含むか、又は、これらから本質的になり、ここで、「第１の」免疫グロブリンシングル可変ドメインは、Ｋｖ１．３上の第１のエピトープに対し、「第２の」免疫グロブリンシングル可変ドメインは、Ｋｖ１．３上の第１のエピトープとは異なるＫｖ１．３上の第２のエピトープに対する。
【０２３９】
別の更なる態様では、本発明のポリペプチドは、三重抗原結合性ポリペプチドである。本明細書で使用する場合、「三重抗原結合性」（抗原）結合分子又は「三重抗原結合性」ポリペプチドという用語は、Ｋｖ１．３に対する「第１の」免疫グロブリンシングル可変ドメインと、Ｋｖ１．３に対する「第２の」免疫グロブリンシングル可変ドメインと、Ｋｖ１．３に対する「第３の」免疫グロブリンシングル可変ドメインとを含み、ここで、これらの「第１」、「第２」、及び「第３」の免疫グロブリンシングル可変ドメインは、異なるパラトープを有する、ポリペプチドを意味するものである。したがって、三重抗原結合性ポリペプチドは、Ｋｖ１．３に対する３つ以上の免疫グロブリンシングル可変ドメインを含むか、又は、これらから本質的になり、ここで、「第１の」免疫グロブリンシングル可変ドメインは、Ｋｖ１．３上の第１のエピトープに対し、「第２の」免疫グロブリンシングル可変ドメインは、Ｋｖ１．３上の第１のエピトープとは異なるＫｖ１．３上の第２のエピトープに対し、「第３の」免疫グロブリンシングル可変ドメインは、Ｋｖ１．３上の第１及び第２のエピトープとは異なるＫｖ１．３上の第３のエピトープに対する。
【０２４０】
本発明の多価ポリペプチドに存在する２つ以上の免疫グロブリンシングル可変ドメインは、軽鎖可変ドメイン配列（例えば、ＶＬ配列）又は重鎖可変ドメイン配列（例えば、ＶＨ配列）からなることができ、この免疫グロブリンシングル可変ドメインは、従来の４本鎖抗体から得られる重鎖可変ドメイン配列、又は、重鎖抗体から得られる重鎖可変ドメイン配列からなることができる。好ましい態様では、この免疫グロブリンシングル可変ドメインは、ドメイン抗体（又は、ドメイン抗体として使用するのに適したアミノ酸）、シングルドメイン抗体（又は、シングルドメイン抗体として使用するのに適したアミノ酸）、「ｄＡｂ」（又は、ｄＡｂとして使用するのに適したアミノ酸）、ナノボディ（登録商標）（ＶＨＨを含むが、これに限定されない）、ヒト化ＶＨＨ配列、ラクダ化ＶＨ配列、又は親和性成熟により得られたＶＨＨ配列からなる。２つ以上の免疫グロブリンシングル可変ドメインは、部分的にもしくは完全にヒト化されたナノボディ、又は、部分的にもしくは完全にヒト化されたＶＨＨからなることができる。本発明の好ましい態様では、本発明の多価ポリペプチドに包含される免疫グロブリンシングル可変ドメインは、本明細書で定義された１つ以上の本発明の一価ポリペプチドである。
【０２４１】
本発明の好ましい態様では、本発明の多重抗原結合性（好ましくは、二重抗原結合性又は三重抗原結合性）ポリペプチドに存在する第１の免疫グロブリンシングル可変ドメイン及び第２の免疫グロブリンシングル可変ドメインは、Ｋｖ１．３に対する結合について互いに（クロス）競合せず、また、異なるファミリーに属する。したがって、本発明は、２つ以上の免疫グロブリンシングル可変ドメインを含み、ここで、各免疫グロブリンシングル可変ドメインは、異なるファミリーに属する、多重抗原結合性（好ましくは、二重抗原結合性）ポリペプチドに関する。一態様において、本発明のこの好ましい多重抗原結合性（好ましくは、二重抗原結合性）ポリペプチドの第１の免疫グロブリンシングル可変ドメインは、本発明のこの好ましい多重抗原結合性（好ましくは、二重抗原結合性）ポリペプチドの第２の免疫グロブリンシングル可変ドメインのＫｖ１．３への結合をクロスブロックせず、及び／又は、第１の免疫グロブリンシングル可変ドメインは、第２の免疫グロブリンシングル可変ドメインにより、Ｋｖ１．３に結合するのをクロスブロックされない。別の態様では、本発明のこの好ましい多重抗原結合性（好ましくは、二重抗原結合性）ポリペプチドの第１の免疫グロブリンシングル可変ドメインは、本発明のこの好ましい多重抗原結合性（好ましくは、二重抗原結合性）ポリペプチドの第２の免疫グロブリンシングル可変ドメインのＫｖ１．３への結合をクロスブロックし、及び／又は、第１の免疫グロブリンシングル可変ドメインは、第２の免疫グロブリンシングル可変ドメインにより、Ｋｖ１．３に結合するのをクロスブロックされる。
【０２４２】
本発明の多重抗原結合性（例えば、二重抗原結合性又は三重抗原結合性）ポリペプチドに存在する免疫グロブリンシングル可変ドメインの好ましい組み合わせは、下記のいずれかを包含することができる。
−第１の免疫グロブリンシングル可変ドメインは、配列番号：１〜６４、４９５、４９８〜５１３、及び５２３〜５４０［ファミリー１２］を有する免疫グロブリンシングル可変ドメインの内の少なくとも１つのＫｖ１．３への結合をクロスブロックし、及び／又は、配列番号：１〜６４、４９５、４９８〜５１３、及び５２３〜５４０［ファミリー１２］を有する免疫グロブリンシングル可変ドメインの内の少なくとも１つにより、Ｋｖ１．３に結合するのをクロスブロックされ、ならびに、第２の免疫グロブリンシングル可変ドメインは、配列番号：６５〜１２３［ファミリー１］を有する免疫グロブリンシングル可変ドメインの内の少なくとも１つのＫｖ１．３への結合をクロスブロックし、及び／又は、配列番号：６５〜１２３［ファミリー１］を有する免疫グロブリンシングル可変ドメインの内の少なくとも１つにより、Ｋｖ１．３に結合するのをクロスブロックされ、
−第１の免疫グロブリンシングル可変ドメインは、配列番号：６５〜１２３［ファミリー１］を有する免疫グロブリンシングル可変ドメインの内の少なくとも１つのＫｖ１．３への結合をクロスブロックし、及び／又は、配列番号：６５〜１２３［ファミリー１］を有する免疫グロブリンシングル可変ドメインの内の少なくとも１つにより、Ｋｖ１．３に結合するのをクロスブロックされ、ならびに、第２の免疫グロブリンシングル可変ドメインは、配列番号：１〜６４、４９５、４９８〜５１３、及び５２３〜５４０［ファミリー１２］を有する免疫グロブリンシングル可変ドメインの内の少なくとも１つのＫｖ１．３への結合をクロスブロックし、及び／又は、配列番号：１〜６４、４９５、４９８〜５１３、及び５２３〜５４０［ファミリー１２］を有する免疫グロブリンシングル可変ドメインの内の少なくとも１つにより、Ｋｖ１．３に結合するのをクロスブロックされ、
−第１の免疫グロブリンシングル可変ドメインは、配列番号：１〜６４、４９５、４９８〜５１３、及び５２３〜５４０［ファミリー１２］を有する免疫グロブリンシングル可変ドメインの内の少なくとも１つのＫｖ１．３への結合をクロスブロックし、及び／又は、配列番号：１〜６４、４９５、４９８〜５１３、及び５２３〜５４０［ファミリー１２］を有する免疫グロブリンシングル可変ドメインの内の少なくとも１つにより、Ｋｖ１．３に結合するのをクロスブロックされ、ならびに、第２の免疫グロブリンシングル可変ドメインは、配列番号：１〜６４、４９５、４９８〜５１３、及び５２３〜５４０［ファミリー１２］を有する免疫グロブリンシングル可変ドメインの内の少なくとも１つのＫｖ１．３への結合をクロスブロックし、及び／又は、配列番号：１〜６４、４９５、４９８〜５１３、及び５２３〜５４０［ファミリー１２］を有する免疫グロブリンシングル可変ドメインの内の少なくとも１つにより、Ｋｖ１．３に結合するのをクロスブロックされ、
−第１の免疫グロブリンシングル可変ドメインは、配列番号：６５〜１２３［ファミリー１］を有する免疫グロブリンシングル可変ドメインの内の少なくとも１つのＫｖ１．３への結合をクロスブロックし、及び／又は、配列番号：６５〜１２３［ファミリー１］を有する免疫グロブリンシングル可変ドメインの内の少なくとも１つにより、Ｋｖ１．３に結合するのをクロスブロックされ、ならびに、第２の免疫グロブリンシングル可変ドメインは、配列番号：６５〜１２３［ファミリー１］を有する免疫グロブリンシングル可変ドメインの内の少なくとも１つのＫｖ１．３への結合をクロスブロックし、及び／又は、配列番号：６５〜１２３［ファミリー１］を有する免疫グロブリンシングル可変ドメインの内の少なくとも１つにより、Ｋｖ１．３に結合するのをクロスブロックされ、
−第１の免疫グロブリンシングル可変ドメインは、配列番号：１〜６４、４９５、４９８〜５１３、及び５２３〜５４０［ファミリー１２］により結合されるのと同じエピトープに結合し、第２の免疫グロブリンシングル可変ドメインは、配列番号：６５〜１２３［ファミリー１］により結合されるのと同じエピトープに結合し、
−第１の免疫グロブリンシングル可変ドメインは、配列番号：６５〜１２３［ファミリー１］により結合されるのと同じエピトープに結合し、第２の免疫グロブリンシングル可変ドメインは、配列番号：１〜６４、４９５、４９８〜５１３、及び５２３〜５４０［ファミリー１２］により結合されるのと同じエピトープに結合し、
−第１の免疫グロブリンシングル可変ドメインは、配列番号：１〜６４、４９５、４９８〜５１３、及び５２３〜５４０［ファミリー１２］により結合されるのと同じエピトープに結合し、第２の免疫グロブリンシングル可変ドメインは、配列番号：１〜６４、４９５、４９８〜５１３、及び５２３〜５４０［ファミリー１２］により結合されるのと同じエピトープに結合し、又は
−第１の免疫グロブリンシングル可変ドメインは、配列番号：６５〜１２３［ファミリー１］により結合されるのと同じエピトープに結合し、第２の免疫グロブリンシングル可変ドメインは、配列番号：６５〜１２３［ファミリー１］により結合されるのと同じエピトープに結合する。
【０２４３】
更なる態様では、本発明は、配列番号：１〜１２３、４９５、４９８〜５１３、及び５２３〜５４０のいずれか１つにより結合されるのと同じエピトープに結合する、Ｋｖ１．３に対する２つ以上の免疫グロブリンシングル可変ドメインを含む、多重抗原結合性（好ましくは、二重抗原結合性）ポリペプチドに関する。
【０２４４】
異なる機能的プロファイルを示す種々のファミリー（１及び１２）が、本発明の一価ポリペプチドの中から特定されてきた（表Ａ−４及びＡ−５を参照のこと）。したがって、本発明は、２つ以上の免疫グロブリンシングル可変ドメインを含み、ここで、各免疫グロブリンシングル可変ドメインは、本明細書で定義された異なるファミリーに属する、多重抗原結合性ポリペプチドに関する。
【０２４５】
本発明のこれらの多重抗原結合性（好ましくは、二重抗原結合性）ポリペプチドに使用するのに好ましい免疫グロブリンシングル可変ドメインは、ファミリー１及び１２に属する、本発明の一価ポリペプチドである（表Ａ−１及び表Ａ−９を参照のこと）。本発明の特に好ましい二重抗原結合性ポリペプチドは、本明細書に記載された実施例及び表Ａ−３に示されたものである。
【０２４６】
したがって、本発明の多重抗原結合性（例えば、二重抗原結合性又は三重抗原結合性）ポリペプチドに存在し、ファミリー１及び１２に属する免疫グロブリンシングル可変ドメインの好ましい組み合わせは、下記のいずれかを包含することができる。
−第１の免疫グロブリンシングル可変ドメインは、ファミリー１２に属し、第２の免疫グロブリンシングル可変ドメインは、ファミリー１に属し、
−第１の免疫グロブリンシングル可変ドメインは、ファミリー１に属し、第２の免疫グロブリンシングル可変ドメインは、ファミリー１２に属し、
−第１の免疫グロブリンシングル可変ドメインは、ファミリー１に属し、第２の免疫グロブリンシングル可変ドメインは、ファミリー１に属し、
−第１の免疫グロブリンシングル可変ドメインは、ファミリー１２に属し、第２の免疫グロブリンシングル可変ドメインは、ファミリー１２に属し、
−第１の免疫グロブリンシングル可変ドメインは、配列番号：１〜６４、４９５、４９８〜５１３、及び５２３〜５４０のいずれか１つと比較して、その配列内に同じ数のアミノ酸を有し、配列番号：１〜６４、４９５、４９８〜５１３、及び５２３〜５４０のいずれか１つと比較して、８９％以上の配列同一性を有する、８位〜１０６位（Ｋａｂａｔナンバリングに従った）のアミノ酸配列を有し、第２の免疫グロブリンシングル可変ドメインは、配列番号：６５〜１２３のいずれか１つと比較して、その配列内に同じ数のアミノ酸を有し、配列番号：６５〜１２３のいずれか１つと比較して、８９％以上の配列同一性を有する、８位〜１０６位（Ｋａｂａｔナンバリングに従った）のアミノ酸配列を有し、
−第１の免疫グロブリンシングル可変ドメインは、配列番号：６５〜１２３のいずれか１つと比較して、その配列内に同じ数のアミノ酸を有し、配列番号：６５〜１２３のいずれか１つと比較して、８９％以上の配列同一性を有する、８位〜１０６位（Ｋａｂａｔナンバリングに従った）のアミノ酸配列を有し、第２の免疫グロブリンシングル可変ドメインは、配列番号：１〜６４、４９５、４９８〜５１３、及び５２３〜５４０のいずれか１つと比較して、その配列内に同じ数のアミノ酸を有し、配列番号：１〜６４、４９５、４９８〜５１３、及び５２３〜５４０のいずれか１つと比較して、８９％以上の配列同一性を有する、８位〜１０６位（Ｋａｂａｔナンバリングに従った）のアミノ酸配列を有し、
−第１の免疫グロブリンシングル可変ドメインは、配列番号：６５〜１２３のいずれか１つと比較して、その配列内に同じ数のアミノ酸を有し、配列番号：６５〜１２３のいずれか１つと比較して、８９％以上の配列同一性を有する、８位〜１０６位（Ｋａｂａｔナンバリングに従った）のアミノ酸配列を有し、第２の免疫グロブリンシングル可変ドメインは、配列番号：６５〜１２３のいずれか１つと比較して、その配列内に同じ数のアミノ酸を有し、配列番号：６５〜１２３のいずれか１つと比較して、８９％以上の配列同一性を有する、８位〜１０６位（Ｋａｂａｔナンバリングに従った）のアミノ酸配列を有し、又は
−第１の免疫グロブリンシングル可変ドメインは、配列番号：１〜６４、４９５、４９８〜５１３、及び５２３〜５４０のいずれか１つと比較して、その配列内に同じ数のアミノ酸を有し、配列番号：１〜６４、４９５、４９８〜５１３、及び５２３〜５４０のいずれか１つと比較して、８９％以上の配列同一性を有する、８位〜１０６位（Ｋａｂａｔナンバリングに従った）のアミノ酸配列を有し、第２の免疫グロブリンシングル可変ドメインは、配列番号：６５〜１２３のいずれか１つと比較して、その配列内に同じ数のアミノ酸を有し、配列番号：１〜６４、４９５、４９８〜５１３、及び５２３〜５４０のいずれか１つと比較して、８９％以上の配列同一性を有する、８位〜１０６位（Ｋａｂａｔナンバリングに従った）のアミノ酸配列を有する。
【０２４７】
本発明の多価ポリペプチドは、Ｋｖ１．３の機能をモデュレーションし、及び／又は、部分的にもしくは完全に阻害することができる。とりわけ、本発明の多価ポリペプチドは、Ｔ細胞の膜を脱分極し、及び／又は、Ｔ細胞からのカリウムイオンの流出を減少させ、又は更に、完全に阻害することができる。また、本発明の多価ポリペプチドは、Ｔ細胞の増殖を阻害し、及び／又は、Ｔ細胞の活性化をサプレッションして、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける特定の免疫応答の阻害をもたらすことができる。
【０２４８】
特定の一態様では、本発明の多価ポリペプチドは、Ｋｖ１．３の機能を間接的に、すなわち、（本明細書で定義された）アロステリックモデュレーターとして、モデュレーションする。より具体的には、本発明の多価ポリペプチドは、Ｋｖ１．３の孔の構造内のコンフォーメーション変化を誘導することができる。
【０２４９】
本発明の多価ポリペプチドのＫｖ１．３への結合は、Ｋｖ１．３ターゲットのコンフォーメーションを保存する結合アッセイ法において測定することができる。典型的なアッセイ法は、Ｋｖ１．３を細胞表面（例えば、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター肺（ＣＨＬ）細胞等）上に露出させるアッセイ法を含む（が、これらに限定されない）。本発明の多価ポリペプチドのＫｖ１．３への結合を測定するのに好ましいアッセイ法は、ＦＡＣＳアッセイ法、例えば、実施例で記載されたＦＡＣＳアッセイ法等である。ここで、本発明の多価ポリペプチドの、ＣＨＯ−Ｋ１細胞及び／又はＨＥＫ２９３Ｈ細胞上に発現させたＫｖ１．３への結合が決定される。本発明の多価ポリペプチドのＫｖ１．３への結合についての一部の好ましいＥＣ５０値は、本明細書における更なる説明及び実施例から明らかとなるであろう。
【０２５０】
このようなＦＡＣＳ結合アッセイ法において、本発明の多価ポリペプチドは、１０−８M以下、より好ましくは１０−９M以下、又は更に１０−１０M以下の、ヒトＫｖ１．３結合におけるＥＣ５０値を有することができる。例えば、このようなＦＡＣＳ結合アッセイ法において、本発明の免疫グロブリン及び／又はポリペプチドは、１０−１０M〜１０−８M、例えば、１０−９M〜１０−８M又は１０−１０M〜１０−９Mの、ヒトＫｖ１．３結合におけるＥＣ５０値を有することができる。とりわけ、ファミリー１２に属する２つ以上の一価ポリペプチドを含む本発明の多価ポリペプチドは、１０−１０M〜１０−８M、例えば、１０−１０M〜１０−９Mの、ヒトＫｖ１．３結合におけるＥＣ５０値を有することができる。異なるファミリーに属する２つの一価ポリペプチド（例えば、ファミリー１に属する１つの一価ポリペプチド及びファミリー１２に属する１つの一価ポリペプチド）を含む本発明の二重抗原結合性ポリペプチドは、１０−１０M〜１０−８M、例えば、１０−１０M〜１０−９Mの、ヒトＫｖ１．３結合におけるＥＣ５０値を有することができる。ファミリー１に属する２つ以上の一価ポリペプチドを含む本発明の多価ポリペプチドは、１０−１０M〜１０−８M、例えば、１０−９M〜１０−８Mの、ヒトＫｖ１．３結合におけるＥＣ５０値を有することができる。
【０２５１】
このようなＦＡＣＳ結合アッセイ法において、本発明の多価ポリペプチドは、１０−７M以下、好ましくは１０−８M以下、より好ましくは１０−９M以下、又は更に１０−１０M以下の、カニクイザルＫｖ１．３結合におけるＥＣ５０値を有することができる。例えば、このようなＦＡＣＳ結合アッセイ法において、本発明の多価ポリペプチドは、１０−１０M〜１０−７M、例えば、１０−１０M〜１０−９MのカニクイザルＫｖ１．３結合におけるＥＣ５０値を有することができる。
【０２５２】
このようなＦＡＣＳ結合アッセイ法において、本発明の多価ポリペプチドは、１０−６M以下、好ましくは１０−７M以下、好ましくは１０−８M以下、より好ましくは１０−９M以下、又は更に１０−１０M以下の、ラットＫｖ１．３結合におけるＥＣ５０値を有することができる。例えば、このようなＦＡＣＳ結合アッセイ法において、本発明の多価ポリペプチドは、１０−１０M〜１０−８M、例えば、１０−１０M〜１０−９M又は１０−９M〜１０−８Mの、ラットＫｖ１．３結合におけるＥＣ５０値を有することができる。とりわけ、ファミリー１２に属する２つ以上の一価ポリペプチドを含む本発明の多価ポリペプチドは、１０−１０M〜１０−８M、例えば、１０−１０M〜１０−９Mの、ラットＫｖ１．３結合におけるＥＣ５０値を有することができる。異なるファミリーに属する２つの一価ポリペプチド（例えば、ファミリー１に属する１つの一価ポリペプチド及びファミリー１２に属する１つの一価ポリペプチド）を含む本発明の二重抗原結合性ポリペプチドは、１０−１０M〜１０−８M、例えば、１０−１０M〜１０−９Mの、ラットＫｖ１．３結合におけるＥＣ５０値を有することができる。ファミリー１に属する２つ以上の一価ポリペプチドを含む本発明の多価ポリペプチドは、１０−１０M〜１０−８M、例えば、１０−９M〜１０−８Mの、ラットＫｖ１．３結合におけるＥＣ５０値を有することができる。
【０２５３】
カリウムイオンの流出のモデュレーション及び／又は阻害は、各種のイオンチャネルスクリーニング技術により決定することができる。同技術は、イオン流出アッセイ法、放射性リガンド結合試験、蛍光染料アッセイ法、及び電気生理学、例えば、電圧クランプ、及び特に、パッチクランプを含む（が、これらに限定されない）。種々のイオンチャネル技術の概説は、例えば、Dabrowski et al.（CNS & Neurological Disorders Drug Targets 7: 122, 2008）、Lu and An（Comb. Chem. High Throughput Screen. 11:185-94, 2008）、及びZheng et al.（Assay Drug Dev. Technol. 2: 543-52, 2004）により提供される。
【０２５４】
電圧クランプ（Huxley, Trends Neurosci. 25: 553-8, 2002）は、興奮性細胞の膜からのイオン電流を測定するのに使用される。この技術のパッチクランプの変形例（Hamill et al. Pflugers Archiv European Journal of Physiology 391: 85-100, 1981）により、細胞中の単独又は複数のイオンチャネルの研究が可能となる。
【０２５５】
よりハイスループットの電気生理学的プラットフォームは、中程度のスループットシステムからよりハイスループットのプラットフォームの範囲で開発されてきた（例えば、Southan and Clark, Methods Mol. Biol. 565: 187-208, 2009を参照のこと）。同プラットフォームは、PatchXpress（Molecular Devices; Ghetti et al. Methods Mol. Biol. 403: 59-69, 2007）、Qpatch及びQpatch HTX（Sophion; Mathes et al. Comb. Chem. High Throughput Screen. 12: 78-95, 2009；Korsgaard et al. Comb. Chem. High Throughput Screen. 12: 51-63, 2009）、PatchLiner（Nanion；Farre et al. Comb. Chem. High Throughput Screen 12: 24-37, 2009）、IonWorks（登録商標）HT、IonWorks（登録商標）Quattro、及びIonFlux（商標）システム（Molecular Devices；Jow et al. J Biomol. Screen. 12: 1059-67, 2007；Dale et al. Mol. Biosyst. 3: 714-22, 2007）を含む。これらのアッセイ法における本発明のポリペプチドについての一部の好ましいＩＣ５０値は、本明細書における更なる説明及び実施例から明らかとなるであろう。
【０２５６】
例えば、Ｋｖ１．３発現ＨＥＫ２９３Ｈ細胞を使用するIonFlux（商標）（Molecular Devices）において、本発明の多価ポリペプチドは、１０−７M以下、好ましくは１０−８M以下、より好ましくは１０−９M以下、又は更に１０−１０M以下の、ＩＣ５０値を有する。例えば、この自動パッチクランプアッセイ法において、本発明の多価ポリペプチドは、１０−１０M〜１０−７M、１０−１０M〜１０−８M、１０−１０M〜１０−９M、例えば、１０−９M〜１０−８M、１０−８M〜１０−７M、又は１０−１０M〜１０−９M等の、ＩＣ５０値を有することができる。とりわけ、ファミリー１２に属する２つ以上の一価ポリペプチドを含む本発明の多価ポリペプチドは、IonFlux（商標）（Molecular Devices）において、１０−１０M〜１０−７M、例えば、１０−１０M〜１０−９Mの、ＩＣ５０値を有することができる。異なるファミリーに属する２つの一価ポリペプチド（例えば、ファミリー１に属する１つの一価ポリペプチド及びファミリー１２に属する１つの一価ポリペプチド）を含む本発明の二重抗原結合性ポリペプチドは、IonFlux（商標）（Molecular Devices）において、１０−１０M〜１０−７M、例えば、１０−９M〜１０−７Mの、ＩＣ５０値を有することができる。
【０２５７】
例えば、Ｋｖ１．３発現チャイニーズハムスター肺（ＣＨＬ）細胞を使用するIonWorks（登録商標） Quattro（Molecular Devices）において、本発明の多価ポリペプチドは、１０−７M以下、好ましくは１０−８M以下、より好ましくは１０−９M以下、又は更に１０−１０M以下の、ＩＣ５０値を有する。例えば、このハイスループット平面かん流パッチクランプにおいて、本発明の多価ポリペプチドは、１０−１０M〜１０−７M、１０−１０M〜１０−８M、１０−１０M〜１０−９M、例えば、１０−９M〜１０−８M、１０−８M〜１０−７M、又は１０−１０M〜１０−９M等の、ＩＣ５０値を有することができる。とりわけ、ファミリー１２に属する２つ以上の一価ポリペプチドを含む本発明の多価ポリペプチドは、IonWorks（登録商標） Quattro（Molecular Devices）において、１０−１０M〜１０−７M、例えば、１０−１０M〜１０−９Mの、ＩＣ５０値を有することができる。異なるファミリーに属する２つの一価ポリペプチド（例えば、ファミリー１に属する１つの一価ポリペプチド及びファミリー１２に属する１つの一価ポリペプチド）を含む本発明の二重抗原結合性ポリペプチドは、IonWorks（登録商標） Quattro（Molecular Devices）において、１０−１０M〜１０−７M、例えば、１０−９M〜１０−７Mの、ＩＣ５０値を有することができる。
【０２５８】
また、本発明の多価ポリペプチドによるＫｖ１．３のモデュレーション及び／又は阻害は、放射性リガンド結合試験においても評価することができる。トリチウム標識コレオリド（例えば、Ｃ２０〜２９−［３Ｈ］ジヒドロコレオリド（ｄｉＴＣ））によるＣＨＯ／Ｋｖ１．３細胞から調製された膜における部位のシングルクラスに対する結合試験は、Felix et al.（Biochemistry 38: 4922-30, 1999）により記載されている。Knaus et al.（Biochemistry 34: 13627-13634, 1995）には、例えば、ラット脳シナプス原形質膜における、モノヨードチロシニルマルガトキシン（１２５Ｉ−マルガトキシン）のヘテロ四量体Ｋｖチャネルへの結合が記載されている。Ｊｕｒｋａｔ細胞、ヒト白血球Ｔ細胞株、又は、シェーカー型電位作動型Ｋ＋チャネルで安定的にトランスフェクションされたＣＨＯ細胞のいずれかから調製された原形質膜に対する１２５Ｉ−マルガトキシンの結合試験は、Helms et al.（Biochemistry. 36: 3737-44, 1997）により記載されている。本発明の多価ポリペプチドによるＫｖ１．３に対する１２５Ｉ−マルガトキシン結合のブロックについての、一部の好ましいＩＣ５０値は、本明細書における更なる説明及び実施例から明らかとなるであろう。
【０２５９】
本発明の多価ポリペプチドは、１０−８M以下、より好ましくは１０−９M以下、又は更に１０−１０M以下のＩＣ５０値で、１２５Ｉ−マルガトキシンのカニクイザルＫｖ１．３過剰発現ＣＨＯ細胞への結合をブロックすることができる。例えば、このような１２５Ｉ−マルガトキシンブロックアッセイ法では、本発明の多価ポリペプチドは、１０−１０M〜１０−８M、例えば、１０−１０M〜１０−９M等の、ＩＣ５０値を有することができる。
【０２６０】
本発明の多価ポリペプチドによるＫｖ１．３のモデュレーション及び／又は阻害を測定するための他の流出アッセイ法は、Hanson et al.（Br. J. Pharmacol. 126: 1707-16, 1999）により記載された放射性ラベル８６ルビジウムによるハイスループット流出アッセイ法、Wang et al.（Assay Drug Dev. Technol. 2: 525-34, 2004）により記載された非放射性ルビジウム（Ｒｂ（＋））流出アッセイ法、及び蛍光系タリウム流出アッセイ法（Weaver et al. J. Biomol. Screen. 9: 671-7, 2004）を含む（が、これらに限定されない）。
【０２６１】
本発明の多価ポリペプチドによるＴ細胞活性化及び／もしくは増殖の阻害は、Ｔ細胞活性化アッセイ法において測定することができる。Ｔ細胞活性化アッセイ法は、Nguyten et al.（Molecular Pharmacology 50: 1672-1679, 1996）及びHanson et al.（Br. J. Pharmacol. 126: 1707-1716, 1999）により記載されているが、これらに限定されない。本発明の多価ポリペプチドによるＴ細胞活性化及び／又は増殖の阻害のための一部の好ましいＩＣ５０値は、本明細書における更なる説明及び実施例から明らかとなるであろう。
【０２６２】
（実施例４．４及び５．５で記載された）抗ＣＤ３抗体であるＯＫＴ３により刺激されたＣＣＲ７−ＣＤ４５ＲＡ−  Ｔ細胞によるＴ細胞活性化アッセイ法において、本発明のポリペプチドは、ＩＦＮガンマ生成の阻害について、１０−７M以下、好ましくは１０−８M以下、より好ましくは１０−９M以下、１０−１０M以下、又は更に１０−１１M以下の、ＩＣ５０値を有する。例えば、このＴ細胞活性化アッセイ法において、本発明のポリペプチドは、１０−１１M〜１０−７M、１０−１１M〜１０−８M、１０−１１M〜１０−９M、例えば、１０−１１M〜１０−９M、１０−１０M〜１０−９M、又は１０−１１M〜１０−１０MのＩＣ５０値で、ＩＦＮガンマ生成を阻害する。とりわけ、ファミリー１２に属する２つ以上の一価ポリペプチドを含む本発明の多価ポリペプチドは、１０−１０M〜１０−９M、例えば、１０−１１M〜１０−１０MのＩＣ５０値で、ＩＦＮガンマ生成を阻害することができる。異なるファミリーに属する２つの一価ポリペプチド（例えば、ファミリー１に属する１つの一価ポリペプチド及びファミリー１２に属する１つの一価ポリペプチド）を含む本発明の二重抗原結合性ポリペプチドは、１０−１１M〜１０−９M、例えば、１０−１０M〜１０−９MのＩＣ５０値で、ＩＦＮガンマ生成を阻害することができる。
【０２６３】
（実施例４．４及び５．５で記載された）抗ＣＤ３抗体であるＯＫＴ３により刺激されたＣＣＲ７−ＣＤ４５ＲＡ−  Ｔ細胞によるこのＴ細胞活性化アッセイ法において、本発明の多価ポリペプチドは、ＣＤ２５アップレギュレーション阻害について、１０−７M以下、好ましくは１０−８M以下、より好ましくは１０−９M以下、１０−１０M以下、又は更に１０−１１M以下の、ＩＣ５０値を有する。例えば、このＴ細胞活性化アッセイ法において、本発明の多価ポリペプチドは、１０−１１M〜１０−７M、１０−１１M〜１０−８M、１０−１１M〜１０−９M、例えば、１０−１１M〜１０−９M、１０−１０M〜１０−９M、又は１０−１１M〜１０−１０M等のＩＣ５０値で、ＣＤ２５のアップレギュレーションを阻害する。
【０２６４】
（実施例９で記載された）抗ＣＤ３抗体であるＯＫＴ３及び抗ＣＤ２８により刺激された抹消血単核球（ＰＢＭＣ）による細胞活性化アッセイ法において、本発明の多価ポリペプチドは、ＩＦＮガンマ生成をブロックしない。
【０２６５】
本発明の多価ポリペプチドの免疫抑制効果は、ｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおいて、例えば、ラット、ブタ、及び／又は霊長類等において、更に評価することができる。Diabetes-prone Biobreeding Worchesterラットは、自己免疫性糖尿病についてのモデルとして使用されてきた（Beeton et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 103: 17414-9, 2006）。アレルギー性接触皮膚炎のラットモデル、乾癬についての動物モデルは、Azam et al.（J. Invest. Dermatol. 127: 1419-29, 2007）により記載されている。ヒトT細胞により再構成される免疫不全マウスは、Ｔ細胞媒介性皮膚移植片拒絶についての動物モデルとして使用されてきた（Ren et al. PLoS One 3:e4009, 2008）。例えば、実施例１２及び１３で記載されたアレルギー性接触皮膚炎についてのラットモデルにおいて、本発明のポリペプチドは、媒体に対して、それぞれ少なくとも約０．０８５〜０．１０２mm及び少なくとも約０．１４７〜０．１６４mmで、耳の厚みが増大するのを（顕著に）減少させる。
【０２６６】
さらに、本発明の多価ポリペプチドは、劇的に改善された種間クロス反応性及び活性を証明した。本発明の多価ポリペプチドは、密接に関連するイオンチャネル（例えば、ｈＥＲＧ、ＫＣａ３．１（ＳＫ４）、Ｋｖ４．３／ＫＣｈＩＰ２．２、Ｋｖ１．２、Ｋｖ１．４、Ｃａｖ１．３／ｂ３／ａ２ｄ１、Ｋｉｒ２．１、ＫＣａ２．２、ＫＣａ２．３、Ｋｖ７．２／Ｋｖ７．３、Ｋｖ１．１、Ｋｖ１．５、Ｋｖ３．４、Ｎａｖ１．１、Ｎａｖ１．２、及びＮａｖ１．６等）より、１０００倍超、及び更に、最大１００００倍の（本明細書で定義された）選択性を有する。より具体的には、多価ポリペプチドは、Ｋｖ１．３の活性をモデュレーションし、及び／又は、阻害することについて、他の関連するＫｖイオンチャネルファミリーメンバーより、１０００倍超、及び更に、最大１００００倍の選択性を示す。本発明の多価ポリペプチドによる選択的阻害は、例えば、各チャネルを阻害するのに必要とされるポリペプチド濃度を、Ｋｖ１．３を阻害するのに必要とされるポリペプチド濃度と比較することにより決定することができる。とりわけ、多価ポリペプチドは、Ｋｖ１．５、Ｋｖ１．６、及びｈＥＲＧより、１０００倍超、及び更に、最大１００００倍の選択性を示す。
【０２６７】
本発明の化合物、構築物、及び／又はポリペプチド
本発明の一価ポリペプチド及び本発明の多価ポリペプチドは、１つ以上の他の基、残基、部分、又は結合ユニットを更に含んでもよいし、又は、含まなくてもよい（これらの一価ポリペプチド及び多価ポリペプチドは全て（更なる基、残基、部分、又は結合ユニットの有無を問わず）、「本発明の化合物」、「本発明の構築物」、及び／又は「本発明のポリペプチド」と呼ばれる）。存在する場合、このような更なる基、残基、部分、又は結合ユニットは、更なる機能性を免疫グロブリンシングル可変ドメイン（及び／又は、免疫グロブリンシングル可変ドメインが存在しているポリペプチド）に提供してもよいし、又は、提供しなくてもよいし、免疫グロブリンシングル可変ドメインの特性を修飾してもよいし、又は、修飾しなくてもよい。
【０２６８】
例えば、このような更なる基、残基、部分、又は結合ユニットは、ポリペプチドが（融合）タンパク質又は（融合）ポリペプチドであるように、１つ以上の更なるアミノ酸配列であることができる。好ましく、非限定的な態様では、前記１つ以上の他の基、残基、部分、又は結合ユニットは、免疫グロブリンである。更により好ましくは、前記１つ以上の他の基、残基、部分、又は結合ユニットは、ドメイン抗体、ドメイン抗体として使用するのに適したアミノ酸、シングルドメイン抗体、シングルドメイン抗体として使用するのに適したアミノ酸、「ｄＡｂ」、ｄＡｂとして使用するのに適したアミノ酸、ナノボディ（例えば、ＶＨＨ、ヒト化ＶＨＨ、又はラクダ化ＶＨ配列等）からなる群より選択される免疫グロブリンシングル可変ドメインである。
【０２６９】
上記されたように、異なる抗原特異性を有する更なる結合ユニット、例えば、免疫グロブリンシングル可変ドメインは、多重特異性ポリペプチドを形成するのに連結させることができる。２つ以上の特異性、二重特異性、三重特異性等の免疫グロブリンシングル可変ドメインを組み合わせることにより、構築物を形成することができる。例えば、本発明のポリペプチドは、Ｋｖ１．３に対する、１つ、２つ、又はそれ以上の免疫グロブリンシングル可変ドメインと、別のターゲットに対する１つの免疫グロブリンシングル可変ドメインとを含むことができる。このような構築物及び当業者が容易に想到することができるその修飾物は全て、本明細書で使用する場合、「本発明の化合物、本発明の構築物、及び／又は本発明のポリペプチド」という用語に包含される。
【０２７０】
上記された化合物、構築物、及び／又はポリペプチドにおいて、１つ、２つ、又はそれ以上の免疫グロブリンシングル可変ドメインと、１つ以上の基、残基、部分、又は結合ユニットとは、互いに直接連結していることができ、及び／又は、１つ以上の適切なリンカーもしくはスペーサーを介して連結していることができる。例えば、１つ以上の基、残基、部分、又は結合ユニットがアミノ酸配列である場合、リンカーも、得られたポリペプチドが融合（タンパク質）又は融合（ポリペプチド）であるように、アミノ酸配列であることができる。
【０２７１】
１つ以上の更なる基、残基、部分、又は結合ユニットは、任意の適切な及び／又は所望のアミノ酸配列であることができる。更なるアミノ酸配列は、本発明のポリペプチドの（生物学的）特性を変更し、改変し、又は他の方法で同特性に影響を及ぼしてもよいし、又は、これらをしなくてもよく、本発明のポリペプチドに更なる機能性を加えてもよいし、又は、加えなくてもよい。好ましくは、更なるアミノ酸配列は、このアミノ酸配列が１つ以上の所望の特性又は機能性を本発明のポリペプチドに付与するようにである。
【０２７２】
このようなアミノ酸配列の例は、当業者に明らかであろうし、一般的に、従来の抗体及びそのフラグメント（ＳｃＦｖ及びシングルドメイン抗体を含むが、これらに限定されない）に基づくペプチド融合物に使用される全てのアミノ酸配列を含むことができる。例えば、Holliger and Hudsonによるレビュー（Nature Biotechnology 23: 1126-1136, 2005）が参照される。
【０２７３】
例えば、このようなアミノ酸配列は、本発明のポリペプチド自体と比較して、半減期を延長し、溶解性又は吸収性を向上させ、免疫原性又は毒性を低減し、望ましくない副作用を除去し、又は、減弱させ、ならびに／又は、本発明の化合物、構築物、及び／又はポリペプチドに、他の有利な特性を付与し、及び／又は、これらの望ましくない特性を低下させる、アミノ酸配列であることができる。このようなアミノ酸配列の一部の非限定的な例は、血清タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン（例えば、国際公開公報第００／２７４３５号を参照のこと）又はハプテン分子（例えば、循環性抗体により認識されるハプテン、例えば、国際公開公報第９８／２２１４１号を参照のこと）である。
【０２７４】
本発明の具体的な一態様では、対応する本発明のポリペプチドと比較して、延長した半減期を有するポリペプチドが調製される。このような半減期延長部分を含む本発明のポリペプチドの例は、例えば、免疫グロブリンシングル可変ドメインが１つ以上の血清タンパク質又はそのフラグメント（例えば、（ヒト）血清アルブミン又はその適切なフラグメント）、又は、血清タンパク質（例えば、血清タンパク質（例えば、血清タンパク質（例えば、血清アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン））、血清免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ）、トランスフェリン、又は、国際公開公報第０４／００３０１９号で列記された１つ以上の他の血清タンパク質に結合することができるドメイン抗体、ドメイン抗体として使用するのに適したアミノ酸、シングルドメイン抗体、シングルドメイン抗体として使用するのに適したアミノ酸、「ｄＡｂ」、ｄＡｂとして使用するのに適したアミノ酸、ナノボディ、ＶＨＨ配列、ヒト化ＶＨＨ配列、又はラクダ化ＶＨ配列等）に結合することができる１つ以上の結合ユニットに適切に連結しているポリペプチド；免疫グロブリンシングル可変ドメインがＦｃ部分（例えば、ヒトＦｃ）又はその適切な部分もしくはフラグメントに連結しているポリペプチド；又は、１つ以上の免疫グロブリンシングル可変ドメインが血清タンパク質に結合することができる１つ以上の小型タンパク質又はペプチド（例えば、国際公開公報第９１／０１７４３号、同第０１／４５７４６号、又は同第０２／０７６４８９号で記載されたタンパク質又はペプチドであるが、これらに限定されない）に適切に連結しているポリペプチドを含むが、これらに限定されない。国際公開公報第０３／００２６０９号及び同第０４／００３０１９号で記載されたｄＡｂ、ならびにHarmsen et al.（Vaccine 23: 4926-42, 2005）；欧州特許第０３６８６８４号、ならびに、Ablynx N.V.による国際公開公報第０８／０２８９７７号、同第０８／０４３８２１号、同第０８／０４３８２２号、ならびに同第０８／０６８２８０号も参照される。
【０２７５】
本発明の具体的で、非限定的な態様によれば、本発明のポリペプチドは、Ｋｖ１．３に対する１つ以上の本発明の免疫グロブリンシングル可変ドメイン及び／又は一価ポリペプチド以外にも、ヒト血清アルブミンに対する少なくとも１つの免疫グロブリンシングル可変ドメインを含有することができる。ヒト血清アルブミンに対するこれらの免疫グロブリンシングル可変ドメインは、上記で引用されたAblynx N.V.による出願（例えば、国際公開公報第０４／０６２５５１号を参照のこと）に一般的に記載された通りであることができる。延長した半減期を提供し、本発明のポリペプチドに使用することができる一部の特に好ましいナノボディは、国際公開公報第０６／１２２７８７号で開示されたナノボディＡＬＢ−１〜ＡＬＢ−１０（表ＩＩ及びＩＩＩを参照のこと）を含む。これらの内、ＡＬＢ−８（国際公開公報第０６／１２２７８７号において、配列番号：６２）と、国際公開公報第２０１２／１７５４００号で開示されたナノボディ（国際公開公報第２０１２／１７５４００号において、配列番号：１〜１１）と、同時係属中の米国仮出願第６２／０４７，５６０号、発明の名称「改善された免疫グロブリン可変ドメイン」（出願日：２０１４年９月８日、譲受人：Ablynx N.V.）で開示された配列番号：１０９を有するナノボディとが特に好ましい。
【０２７６】
本発明のポリペプチドは、例えば、２つのＫｖ１．３に対する本発明の免疫グロブリンシングル可変ドメイン、好ましくは、一価ポリペプチドと、（ヒト）血清アルブミンに対する第３の免疫グロブリンシングル可変ドメインとを含み、ここで、前記第１、第２、及び第３の免疫グロブリンシングル可変ドメインは、場合により、１つ以上の、及び特に、２つのリンカー配列を介して連結していることができる、三価の二重特異性ポリペプチドであることができる。
【０２７７】
具体的な一態様によれば、１つ以上の本発明のポリペプチドは、１つ以上の定常ドメイン（例えば、Ｆｃ部分の一部として／Ｆｃ部分を形成するのに使用することができる２つ又は３つの定常ドメイン）、１つ以上のエフェクター機能を本発明のポリペプチドに付与し、及び／又は、１つ以上のＦｃレセプターに結合する能力を付与することができるＦｃ部分及び／又は１つ以上の抗体の部分、フラグメント、もしくはドメインに（場合により、適切なリンカー又はヒンジ領域を介して）連結していることができる。例えば、この目的で、１つ以上の更なるアミノ酸配列は、（本明細書で記載された）重鎖抗体、及びより好ましくは、従来のヒト４本鎖抗体等からの抗体の１つ以上のＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインを含むことができ、及び／又は、例えば、ＩｇＧから（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４から）、ＩｇＥから、又は別のヒトＩｇ、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、もしくはＩｇＭから、Ｆｃ領域（の一部）を形成することができる。例えば、国際公開公報第９４／０４６７８号には、ラクダＶＨＨドメイン又はそのヒト化誘導体を含む重鎖抗体（すなわち、ナノボディ）が記載されている。同重鎖抗体では、それぞれナノボディならびにＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む（ＣＨ１ドメインは含まない）２つの重鎖からなる免疫グロブリンを提供するために、ラクダＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインがヒトＣＨ２及びＣＨ３ドメインにより置き換えられている。同免疫グロブリンは、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインにより提供されるエフェクター機能を有し、何らの軽鎖の存在なしに機能することができる。エフェクター機能を提供するために、本発明のポリペプチドに適切に連結することができる他のアミノ酸配列は、当業者に明らかであろうし、所望のエフェクター機能に基づいて選択することができる。例えば、国際公開公報第０４／０５８８２０号、同第９９／４２０７７号、同第０２／０５６９１０号、及び同第０５／０１７１４８号、ならびに前記Holliger and Hudsonによるレビュー、ならびに国際公開公報第０９／０６８６２８号が参照される。また、本発明のポリペプチドのＦｃ部分への連結は、対応する本発明のポリペプチドと比較して、延長した半減期をももたらすこともできる。一部の出願について、生物学的に顕著なエフェクター機能を何ら有さずに、延長した半減期を付与するＦｃ部分及び／又は定常ドメイン（すなわち、ＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメイン）の使用が、適切である場合があり、又は更に好ましい場合がある。１つ以上の本発明のポリペプチドと１つ以上の定常ドメインとを含み、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける延長した半減期を有する他の適切な構築物は、当業者に明らかであろうし、例えば、場合により、リンカー配列を介して、ＣＨ３ドメインに連結しているポリペプチドを含むことができる。一般的には、延長した半減期を有する任意の融合タンパク質又は誘導体は、好ましくは、腎臓での吸収についてのカットオフ値である５０kDより大きい分子量を有するであろう。
【０２７８】
別の具体的で、非限定的な態様では、本発明のポリペプチドは、（すなわち、従来の４本鎖抗体に本来生じる定常ドメインと比較して）二量体に自己会合する低下した傾向を有する（又は、本質的にその傾向がない）天然、合成、又は半合成の定常ドメイン（又は、その類似物、変異体、変異、部分、もしくはフラグメント）に（場合により、適切なリンカー又はヒンジ領域を介して）連結していることができる。このような単量体（すなわち、自己会合していない）Ｆｃ鎖変異体又はそのフラグメントは、当業者に明らかであろう。例えば、Helm et al.（J. Biol. Chem. 271: 7494, 1996）には、本発明のポリペプチド鎖に使用することができる単量体Ｆｃ鎖変異体が記載されている。
【０２７９】
また、このような単量体Ｆｃ鎖変異体は、好ましくは、（それらが得られるＦｃ部分に応じて）相補又は関連するＦｃレセプターに結合可能でもあるようにであり、及び／又は、それらが得られるＦｃ部分の一部もしくは全てのエフェクター機能をも有する（又は、低下したレベルで、意図した用途に適してもいる）ようにである。あるいは、本発明のこのようなポリペプチド鎖において、単量体Ｆｃ鎖は、ポリペプチド鎖に延長した半減期を付与するのに使用することができる。この場合、単量体Ｆｃ鎖は、エフェクター機能を有さない又は本質的に有さないこともできる。
【０２８０】
一般的には、延長した半減期を有する本発明のポリペプチドは、好ましくは、対応する本発明の免疫グロブリンシングル可変ドメイン又はポリペプチド自体の半減期より、少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも２倍、例えば、少なくとも５倍、例えば、少なくとも１０倍、又は２０倍超の半減期を有する。
【０２８１】
一般的には、延長した半減期を有する本発明のポリペプチドは、好ましくは、対応する本発明の免疫グロブリンシングル可変ドメイン又はポリペプチド自体の半減期と比較して、１時間超、好ましくは２時間超、より好ましくは６時間超、例えば、１２時間超、又は更に、２４、４８、もしくは７２時間超延長した半減期を有する。
【０２８２】
別の好ましく、非限定的な態様では、本発明のこのようなポリペプチドは、少なくとも約１２時間、好ましくは少なくとも２４時間、より好ましくは少なくとも４８時間、更により好ましくは少なくとも７２時間以上のヒトにおける血清半減期を示す。例えば、本発明のポリペプチドは、少なくとも５日（例えば、約５〜１０日）、好ましくは少なくとも９日（例えば、約９〜１４日）、より好ましくは少なくとも約１０日（例えば、約１０〜１５日）、又は少なくとも約１１日（例えば、約１１〜１６日）、より好ましくは少なくとも約１２日（例えば、約１２〜１８日以上）、又は１４日超（例えば、約１４〜１９日）の半減期を有することができる。
【０２８３】
更なるアミノ酸残基は、本発明のポリペプチドの他の（生物学的）特性を変更し、改変し、又は他の方法で同特性に影響を及ぼしてもよいし、又は、これらをしなくてもよく、本発明のポリペプチドに更なる機能性を加えてもよいし、又は、加えなくてもよい。例えば、このようなアミノ酸残基は、
ａ）例えば、異種ホスト細胞又はホスト生物中での発現の結果として、Ｎ末端メチオニン残基を含むことができる。
ｂ）（例えば、本発明のポリペプチドを発現させるのに使用されるホスト細胞に応じて、本発明のポリペプチドのプレフォーム、プロフォーム、又はプレプロフォームを提供するために）合成中にホスト細胞からポリペプチドを分泌させるシグナル配列又はリーダー配列を形成することができる。適切な分泌リーダーペプチドは、当業者に明らかであろうし、本明細書で更に記載された通りであることができる。通常、このようなリーダー配列は、ポリペプチドのＮ末端に連結しているであろう。ただし、本発明は、その最も広い意味において、これに限定されない。
ｃ）例えば、前記配列又は残基に対する親和性技術を使用して、ポリペプチドの精製を可能にし、又は、容易にする「タグ」、例えば、アミノ酸配列又は残基を形成することができる。その後、前記配列又は残基は、ポリペプチドを提供するために（例えば、化学的又は酵素的開裂により）除去することができる（この目的で、このタグは、場合により、アミノ酸配列又はポリペプチド配列に、開裂性リンカー配列を介して連結していることができ、又は、開裂性モチーフを含有していることができる）。このような残基の一部の好ましく、非限定的な例は、複数のヒスチジン残基、グルタチオン残基、及びｍｙｃ−タグ、例えば、ＡＡＡＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＮＧＡＡ（配列番号：２０６）である。
ｄ）官能化されている、及び／又は、官能基の付着のための部位として機能することができる１つ以上のアミノ酸残基であることができる。適切なアミノ酸残基及び官能基は、当業者に明らかであろうし、本発明のポリペプチドの誘導体について本明細書で言及されたアミノ酸残基及び官能基を含むが、これらに限定されない。
【０２８４】
本発明の多価ポリペプチドは、一般的には、本発明の多価ポリペプチドを提供するために、少なくとも、本発明の免疫グロブリンシングル可変ドメイン及び／又は一価ポリペプチドを、１つ以上の本発明の更なる免疫グロブリンシングル可変ドメイン及び／又は一価ポリペプチドに、場合により、１つ以上の適切なリンカーを介して、適切に連結させる工程を含む方法により調製することができる。また、本発明のポリペプチドは、少なくとも、本発明のポリペプチドをコードする核酸を提供する工程と、前記核酸を適切な方法において発現させる工程と、発現された本発明のポリペプチドを回収する工程とを、一般的に含む方法により調製することができる。このような方法は、それ自体公知の方法において行うことができる。同方法は、例えば、本明細書で更に記載された方法及び技術に基づいて、当業者に明らかであろう。
【０２８５】
本発明の多価ポリペプチドを調製するための方法は、少なくとも、２つ以上の本発明の免疫グロブリンシングル可変ドメイン及び／又は一価ポリペプチドと、例えば、１つ以上のリンカーとを、適切な方法において互いに連結させる工程を含むことができる。本発明の免疫グロブリンシングル可変ドメイン及び／又は一価ポリペプチド（及びリンカー）は、当技術分野において公知であり、本明細書で更に記載された任意の方法により連結させることができる。好ましい技術は、多価ポリペプチドを発現する遺伝子構築物を調製するための、本発明の免疫グロブリンシングル可変ドメイン及び／又は一価ポリペプチド（及びリンカー）をコードする核酸配列の連結を含む。アミノ酸又は核酸を連結させるための技術は、当業者に明らかであろう。再度、標準的な参考書、例えば、上記で言及されたSambrook et al.及びAusubel et al.ならびに以下の実施例が参照される。
【０２８６】
またしたがって、本発明は、本発明の多価ポリペプチドの製造における、本発明の免疫グロブリンシングル可変ドメイン及び／又は一価ポリペプチドの使用に関する。多価ポリペプチドを製造するための方法は、本発明の免疫グロブリンシングル可変ドメイン及び／又は一価ポリペプチドを、少なくとも１つの本発明の更なる免疫グロブリンシングル可変ドメイン及び／又は一価ポリペプチドに、場合により、１つ以上のリンカーを介して連結させることを含むであろう。ついで、本発明の免疫グロブリンシングル可変ドメイン及び／又は一価ポリペプチドは、２つ（例えば、二価ポリペプチドにおいて）、３つ（例えば、三価ポリペプチドにおいて）、４つ（例えば、四価において、）、又はそれ以上（例えば、多価ポリペプチドにおいて）の結合ユニットを含む多価ポリペプチドの提供及び／又は調製において、結合ドメイン又は結合ユニットとして使用される。これに関して、本発明の免疫グロブリンシングル可変ドメイン及び／又は一価ポリペプチドは、２つ、３つ、４つ、又はそれ以上の結合ユニットを含む本発明の多価、例えば、二価、三価、又は四価ポリペプチドの提供及び／又は調製において、結合ドメイン又は結合ユニットとして使用することができる。
【０２８７】
またしたがって、本発明は、多価ポリペプチドの製造における、（本明細書で記載された）本発明の免疫グロブリンシングル可変ドメイン及び／又は、特に一価ポリペプチドの使用に関する。多価ポリペプチドを製造するための方法は、本発明の免疫グロブリンシングル可変ドメイン及び／又は一価ポリペプチドを、少なくとも１つの本発明の更なる免疫グロブリンシングル可変ドメイン及び／又は一価ポリペプチドに、場合により、１つ以上のリンカーを介して連結させることを含むであろう。
【０２８８】
本発明の多価ポリペプチドに使用するのに適したスペーサー又はリンカーは、当業者に明らかであろうし、一般的には、アミノ酸配列を連結させるために当技術分野において使用される、任意のリンカー又はスペーサーであることができる。好ましくは、前記リンカー又はスペーサーは、薬学的使用を意図したポリペプチドを構築するのに使用するのに適している。
【０２８９】
一部の特に好ましいスペーサーは、抗体フラグメント又は抗体ドメインを連結させるために、当技術分野において使用されるスペーサー及びリンカーを含む。これらは、上記で引用された一般的な背景技術において言及されたリンカー、及び例えば、ダイアボディ又はＳｃＦｖフラグメントを構築するために、当技術分野において使用されるリンカーを含む（これに関して、ダイアボディ及びＳｃＦｖフラグメントでは、使用されるリンカー配列は、適切なＶＨ及びＶＬドメインを互いに完全な抗原結合部位を形成させる、長さ、ある程度のフレキシビリティ、及び他の特性を有するべきであるが、本発明のポリペプチドに使用されるリンカーの長さ又はフレキシビリティは、特に制限されないことに留意されたい。各免疫グロブリンシングル可変ドメイン自体が完全な抗原結合部位を形成するためである）。
【０２９０】
例えば、リンカーは、適切なアミノ酸配列、及び特に、１〜５０個のアミノ酸配列、好ましくは１〜３０個、例えば、１〜１０個のアミノ酸残基であることができる。このようなアミノ酸配列の一部の好ましい例は、ｇｌｙ−ｓｅｒリンカー、例えば、国際公開公報第９９／４２０７７号に記載された、（ｇｌｙｘｓｅｒｙ）ｚ等（例えば、（ｇｌｙ４ｓｅｒ）３又は（ｇｌｙ３ｓｅｒ２）３）、（例えば、国際公開公報第９４／０４６７８号に記載された）ヒンジ様領域、例えば、天然の重鎖抗体のヒンジ領域又は類似する配列を含む。
【０２９１】
一部の他の特に好ましいリンカーは、表Ａ−８で言及されており、中でも、ＧＳ３５（配列番号：４８９）が特に好ましい。
【０２９２】
他の適切なリンカーは、一般的には、有機化合物又はポリマー、特に、薬学的使用のためのタンパク質に使用するのに適したものを含む。例えば、ポリ（エチレングリコール）部分が、抗体ドメインを連結させるのに使用されてきた。例えば、国際公開公報第０４／０８１０２６号を参照のこと。
【０２９３】
使用されるリンカーの長さ、フレキシビリティの度合い、及び／又は他の特性が、本発明の最終的なポリペプチドの特性に幾らかの影響を有する場合がある（重要ではないが、ＳｃＦｖフラグメントに使用されるリンカーには普通のことである）ことは、本発明の範囲内に包含される。同特性は、Ｋｖ１．３又は１つ以上の他の抗原に対する親和性、特異性、又は結合活性を含むが、これらに限定されない。本明細書における開示に基づいて、当業者は、場合により、過度の思考錯誤をすることなく、本発明の具体的なポリペプチドに使用するのに最適なリンカーを決定することができるであろう。
【０２９４】
また、（例えば、本発明のポリペプチドの誘導体について本明細書で記載されたように）使用されるリンカーが、１つ以上の他の好ましい特性又は機能性を、本発明のポリペプチドに付与し、ならびに／又は、誘導体の形成及び／もしくは官能基の付着のための１つ以上の部位を提供することも、本発明の範囲内である。例えば、１つ以上の荷電アミノ酸残基を含有するリンカーは、改善された親水性を提供することができる。一方、小型のエピトープ又はタグを形成し、又は、含有するリンカーは、検出、特定、及び／又は精製の目的に使用することができる。再度、本明細書における開示に基づいて、当業者は、場合により、過度の思考錯誤をすることなく、本発明の具体的なポリペプチドに使用するのに最適なリンカーを決定することができるであろう。
【０２９５】
最後に、２つ以上のリンカーが本発明のポリペプチドに使用される場合、これらのリンカーは、同じでも又は異なってもよい。再度、本明細書における開示に基づいて、当業者は、場合により、過度の思考錯誤をすることなく、本発明の具体的なポリペプチドに使用するのに最適なリンカーを決定することができるであろう。
【０２９６】
通常、発現及び生成の容易性のために、本発明のポリペプチドは、線状ポリペプチドであろう。ただし、本発明は、その最も広い意味において、それに限定されない。例えば、本発明のポリペプチドは、３つ以上のアミノ酸配列又はナノボディを含み、３つ以上の「アーム」を有するリンカーの使用により連結させることができる。この各アームは、「星型構築物」を提供するために、アミノ酸配列又はナノボディに連結している。ただし、通常はほとんど好ましくはないが、環状構築物も使用することができる。
【０２９７】
本発明の免疫グロブリン又はポリペプチドを含み、タグ又は他の機能性部分、例えば、トキシン、ラベル、放射性化合物等を更に含む、化合物、構築物、及び／又はポリペプチドも、本発明に包含される。
【０２９８】
あるいは、更なる基、残基、部分、又は結合ユニットは、例えば、それ自体が生物学的及び／又は薬理学的に活性であってもよく、又は、そうでなくてもよい、化学基、残基、部分であることができる。例えば、このような基は、本発明のポリペプチドの「誘導体」を提供するために、１つ以上の本発明の免疫グロブリンシングル可変ドメイン又は一価ポリペプチドに連結していることができるが、これに限定されない。
【０２９９】
またしたがって、本発明は、その最も広い意味において、本発明のポリペプチドの誘導体である化合物、構築物、及び／又はポリペプチドも含む。このような誘導体は、一般的には、本発明のポリペプチド及び／又は本発明のポリペプチドを形成する１つ以上のアミノ酸残基の修飾により、及び特に、化学的及び／又は生物学的（例えば、酵素的）修飾により得ることができる。
【０３００】
このような修飾の例及びこのような方法で修飾することができるポリペプチド配列内（すなわち、タンパク質骨格上、ただし好ましくは、側鎖上のいずれか）のアミノ酸残基の例、このような修飾を導入するのに使用することができる方法及び技術、ならびにこのような修飾の可能性のある使用及び利点は、当業者に明らかであろう（Zangi et al., Nat Biotechnol 31(10):898-907, 2013も参照のこと）。
【０３０１】
例えば、このような修飾は、１つ以上の官能基、残基、又は部分、特に、１つ以上の所望の特性又は機能性を本発明のポリペプチドに付与する1つ以上の官能基、残基、又は部分の、本発明のポリペプチド内又は同ポリペプチド上への（例えば、共有結合による、又は、任意の他の適切な方法における）導入を含むことができる。このような官能基の例は、当業者に明らかであろう。
【０３０２】
例えば、このような修飾は、本発明のポリペプチドの半減期を延長させ、溶解性及び／又は吸収性を向上させ、本発明のポリペプチドの免疫原性及び／又は毒性を低下させ、本発明のポリペプチドの望ましくない副作用を除去し、又は、減弱させ、ならびに／又は、本発明のポリペプチドに他の有利な特性を付与し、及び／又は、本発明のポリペプチドの望ましくない特性を低下させる、１つ以上の官能基、又は、前述のものの２つ以上の任意の組み合わせの（例えば、共有結合による、又は、任意の他の適切な方法における）導入を含むことができる。このような官能基の例及びそれらを導入するための技術の例は、当業者に明らかであろうし、一般的には、上記で引用された一般的な背景技術で言及された全ての官能基及び技術、ならびに、薬学的タンパク質の修飾、及び特に、抗体又は抗体フラグメント（ＳｃＦｖ及びシングルドメイン抗体を含む）の修飾にそれ自体公知の官能基及び技術を含むことができる。これについては、例えば、Remington（Pharmaceutical Sciences, 16th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1980）が参照される。再度、当業者に明らかであろうように、このような官能基は、例えば、本発明のポリペプチドに直接（例えば、共有的に）、又は場合により、適切なリンカーもしくはスペーサーを介して連結していることができる。
【０３０３】
具体的な一例は、本発明のポリペプチドがその半減期を延長するのに、（例えば、ペグ化により）化学的に修飾されている、本発明の誘導体ポリペプチドである。これは、半減期を延長させ、及び／又は、薬学的タンパク質の免疫原性を低下させるのに最も広く使用される技術の１つであり、適切な薬理学的に許容し得るポリマー、例えば、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）又はその誘導体（例えば、メトキシポリ（エチレングリコール）又はｍＰＥＧ）の付着を含む。一般的には、任意の適切な形態のペグ化、例えば、抗体及び抗体フラグメント（（シングル）ドメイン抗体及びＳｃＦｖを含むが、これらに限定されない）について当技術分野において使用されるペグ化を使用することができる。例えば、Chapman（Nat. Biotechnol. 54: 531-545, 2002）、Veronese and Harris（Adv. Drug Deliv. Rev. 54: 453-456, 2003）、Harris and Chess（Nat. Rev. Drug. Discov. 2: 214-221, 2003）、及び国際公開公報第０４／０６０９６５号が参照される。タンパク質のペグ化のための種々の試薬も、例えば、Nektar Therapeutics, USAから市販されている。
【０３０４】
好ましくは、部位特異的ペグ化が、特に、システイン残基を介して使用される（例えば、Yang et al.（Protein Engineering 16: 761-770, 2003）を参照のこと）。例えば、この目的で、ＰＥＧは、本発明のポリペプチドに本来生じるシステイン残基に付着することができる。本発明のポリペプチドを、ＰＥＧを付着させるための１つ以上のシステイン残基を適切に導入するために、修飾させることができ、又は、ＰＥＧを付着させるための１つ以上のシステイン残基を含むアミノ酸配列を、本発明のポリペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端に融合させることができる。全て、それ自体当業者に公知のタンパク質操作の技術を使用する。
【０３０５】
好ましくは、本発明のポリペプチドについて、５０００超、例えば、１０，０００超、及び２００，０００未満、例えば、１００，０００未満、例えば、２０，０００〜８０，０００の分子量を有するＰＥＧが使用される。
【０３０６】
別の通常ほとんど好ましくはない修飾は、本発明のポリペプチドを発現させるのに使用されるホスト細胞に応じて、Ｎ連結又はＯ連結グリコシル化を、通常、翻訳と同時及び／又は翻訳後修飾の一部として含む。
【０３０７】
更に別の修飾は、ラベルされた本発明のポリペプチドの意図した使用に応じて、１つ以上の検出ラベル又は他のシグナル生成基もしくは部分の導入を含むことができる。それらを付着させ、使用し、検出するのに適切なラベル及び技術は、当業者に明らかであろうし、例えば、蛍光ラベル（例えば、フルオレセイン、イソチオシアネート、ローダミン、フィコエリスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド、及びフルオレスカミン、ならびに蛍光金属、例えば、１５２Ｅｕ又はランタニドシリーズからの他の金属）、リン光ラベル、化学発光ラベル、又は生物発光ラベル（例えば、ルミナール、イソルミナール、テロマティック（theromatic）アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、オキサラートエステル、ジオキセタン、又はＧＦＰ及びその類似物）、放射性同位体（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３２Ｐ、３５Ｓ、１４Ｃ、５１Ｃｒ、３６Ｃｌ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅ、及び７５Ｓｅ）、金属、金属キレート、又は金属性カチオン（例えば、金属性カチオン、例えば、９９ｍＴｃ、１２３Ｉ、１１１Ｉｎ、１３１Ｉ、９７Ｒｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、及び６８Ｇａ又はｉｎ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、もしくはｉｎ  ｓｉｔｕでの診断及び画像化に使用するのに特に適した他の金属もしくは金属性カチオン、例えば、（１５７Ｇｄ、５５Ｍｎ、１６２Ｄｙ、５２Ｃｒ、及び５６Ｆｅ））、ならびに発色団及び酵素（例えば、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、デルタ−Ｖ−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、アルファ−グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ビオチンアビジンペルオキシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−ＶＩ−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ、及びアセチルコリンエステラーゼ）を含むが、これらに限定されない。他の適切なラベルは、当業者に明らかであろうし、例えば、ＮＭＲ又はＥＳＲ分光法を使用して検出することができる部分を含む。
【０３０８】
本発明のこのようにラベルされたポリペプチドは、例えば、具体的なラベルの選択に応じて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏ、又はｉｎ  ｓｉｔｕアッセイ法（それ自体公知の免疫アッセイ法、例えば、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＥＩＡ、及び他の「サンドイッチアッセイ法」等を含む）ならびにｉｎ  ｖｉｖｏ診断及び画像化目的に使用することができる。
【０３０９】
当業者に明らかであろうように、別の修飾は、例えば、上記で言及された金属又は金属性カチオンの内の１つをキレートするキレート基の導入を含むことができる。適切なキレート基は、例えば、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）又はエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含むが、これらに限定されない。
【０３１０】
更に別の修飾は、特定の結合ペア、例えば、ビオチン−（ストレプト）アビジン結合ペアの一部である官能基の導入を含むことができる。このような官能基は、本発明のポリペプチドを、結合ペアの他の半分に結合している別のタンパク質、ポリペプチド、又は化合物に、すなわち、結合ペアの形成により連結させるのに使用することができる。例えば、本発明のポリペプチドを、ビオチンにコンジュゲートさせ、アビジン又はストレプトアビジンにコンジュゲートしている別のタンパク質、ポリペプチド、化合物、又は担体に連結させることができる。例えば、本発明のこのようにコンジュゲートしたポリペプチドは、例えば、検出シグナル生成剤がアビジン又はストレプトアビジンにコンジュゲートしている診断システムにおいて、レポーターとして使用することができる。また、このような結合ペアは、例えば、本発明のポリペプチドを、薬学的目的に適した担体を含む担体に結合させるのに使用することもできる。１つの非限定的な例は、Cao and Suresh（Journal of Drug Targeting 8: 257, 2000）により記載されたリポソーム製剤である。また、このような結合ペアは、治療活性剤を本発明のポリペプチドに連結させるのにも使用することができる。
【０３１１】
他の可能性のある化学的及び酵素的修飾は、当業者に明らかであろう。また、このような修飾は、（例えば、機能−活性相関を試験する）調査目的でも導入することができる。例えば、Lundblad and Bradshaw（Biotechnol. Appl. Biochem. 26: 143-151, 1997）が参照される。
【０３１２】
好ましくは、化合物、構築物、ポリペプチド、及び／又は誘導体は、それらが、（本明細書で更に記載された、ＫＤ値（実際もしくは見かけ）、ＫＡ値（実際もしくは見かけ）、Ｋｏｎ速度、及び／又はＫｏｆｆ速度、あるいはＩＣ５０値として適切に測定され及び／又は表現される）本明細書で定義された（すなわち、本発明のポリペプチドについて定義された）親和性で、Ｋｖ１．３に結合するようにである。また、このような誘導体は、通常、本明細書で定義されたＫｖ１．３ブロック性能及び／又は活性も有するであろう。
【０３１３】
また、本発明のこのような化合物、構築物、及び／又はポリペプチド、ならびにそれらの誘導体は、（本明細書で定義されたように）本質的に単離された形態にあることができる。
【０３１４】
さらに、本発明は、本明細書で記載された化合物、構築物、ポリペプチド、核酸、ホスト細胞、及び組成物を製造するための方法に関する。
【０３１５】
本発明のポリペプチド及び核酸は、本明細書における更なる記載から当業者に明らかとなるであろうように、それ自体公知の方法において調製することができる。例えば、本発明のポリペプチドは、抗体の調製、及び特に、抗体フラグメント（（シングル）ドメイン抗体及びＳｃＦｖフラグメントを含むが、これらに限定されない）の調製についてそれ自体公知の任意の方法において調製することができる。ポリペプチド及び核酸を製造するための一部の好ましく、非限定的な方法は、本明細書で記載された方法及び技術を含む。
【０３１６】
本発明のポリペプチドを製造するための方法は、下記の、
−適切なホスト細胞又はホスト生物（本明細書において、「本発明のホスト」とも呼ばれる）中、又は、別の適切な発現系における、前記本発明のポリペプチドをコードする核酸（本明細書において、「本発明の核酸」とも呼ばれる）の発現工程と、場合により続けて、
−このようにして得られた本発明のポリペプチドを単離し、及び／又は、精製する工程とを含むことができる。
【０３１７】
特に、このような方法は、
−本発明のホストを、前記本発明のホストが少なくとも１つの本発明のポリペプチドを発現し、及び／又は、生成するような条件下において、培養し、及び／又は、維持する工程と、場合により続けて、
−このようにして得られた本発明のポリペプチドを単離し、及び／又は、精製する工程とを含むことができる。
【０３１８】
またしたがって、本発明は、本発明のポリペプチドをコードする核酸又はヌクレオチド配列（「本発明の核酸」とも呼ばれる）に関する。本発明の核酸は、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡの形態にあることができ、好ましくは、二本鎖ＤＮＡの形態にある。例えば、本発明のヌクレオチド配列は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ（例えば、意図したホスト細胞又はホスト生物中での発現に特に適合したコドン利用を有するＤＮＡ）であることができる。
【０３１９】
本発明の一態様によれば、本発明の核酸は、本明細書で定義されたように、本質的に単離された形態にある。また、本発明の核酸は、ベクター、例えば、プラスミド、コスミド、又はＹＡＣ等の形態にあることもでき、これらの中に存在することができ、及び／又は、これらの一部であることができる。再度、ベクター、例えば、プラスミド、コスミド、又はＹＡＣ等は、本質的に単離された形態にあることができる。
【０３２０】
本発明の核酸は、それ自体公知の方法において、本明細書で提供された本発明のポリペプチドについての情報に基づいて調製し、もしくは、得ることができ、及び／又は、適切な天然ソースから単離することができる。また、当業者に明らかであろうように、本発明の核酸を調製するために、本発明の免疫グロブリンシングル可変ドメイン又は一価ポリペプチドをコードする複数のヌクレオチド配列、例えば、少なくとも２つの核酸と、例えば、１つ以上のリンカーをコードする核酸とが互いに、適切な方法において連結していることができる。
【０３２１】
本発明の核酸を収集するための方法は、当業者に明らかであろうし、例えば、自動ＤＮＡ合成、部位特異的変異誘発、２つ以上の天然及び／又は合成配列（又は、２つ以上のそれらの部分）の組み合わせ、トランケートされた発現生成物の発現をもたらす変異の導入、（例えば、適切な制限酵素を使用して容易に消化し、及び／又は、ライゲーションすることができるカセット及び／又は領域を作製するための）１つ以上の制限部位の導入、ならびに／又は、１つ以上の「ミスマッチ」プライマーを使用するＰＣＲ反応による変異の導入を含むことができる。これら及び他の技術は、当業者に明らかであろう。再度、標準的な参考書、例えば、上記で言及されたSambrook et al.及びAusubel et al.ならびに以下の実施例が参照される。
【０３２２】
また、本発明の核酸は、当業者に明らかであろうように、遺伝子構築物の形態にあることができ、同遺伝子構築物中に存在することができ、及び／又は、同遺伝子構築物の一部であることができる。このような遺伝子構築物は、一般的には、場合により、遺伝子構築物のそれ自体公知の１つ以上のエレメント、例えば、１つ以上の適切なレギュラトリーエレメント（例えば、適切なプロモーター、エンハンサー、ターミネーター等）及び本明細書で言及された遺伝子構築物の更なるエレメント等に連結している、少なくとも１つの本発明の核酸を含む。少なくとも１つの本発明の核酸を含むこのような遺伝子構築物は、本明細書において、「本発明の遺伝子構築物」とも呼ばれるであろう。
【０３２３】
本発明の遺伝子構築物は、ＤＮＡ又はＲＮＡであることができ、好ましくは、二本鎖ＤＮＡである。また、本発明の遺伝子構築物は、意図したホスト細胞又はホスト生物のトランスフォーメーションに適した形態、意図したホスト細胞のゲノムＤＮＡ内への組み込みに適した形態、又は、意図したホスト生物中での独立した複製、維持、及び／又は遺伝に適した形態にあることもできる。例えば、本発明の遺伝子構築物は、ベクター、例えば、プラスミド、コスミド、ＹＡＣ、ウイルスベクター、又はトランスポゾン等の形態にあることができる。特に、ベクターは、発現ベクター、すなわち、（例えば、適切なホスト細胞、ホスト生物、及び／又は発現系中において）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ  ｖｉｖｏにおける発現を提供することができるベクターであることができる。
【０３２４】
好ましく、非限定的な実施態様では、本発明の遺伝子構築物は、
ａ）少なくとも１つの本発明の核酸（この核酸は下記に操作可能に連結している）
ｂ）１つ以上のレギュラトリーエレメント、
例えば、プロモーター、及び場合により、適切なターミネーター、及びまた場合により、
ｃ）それ自体公知の遺伝子構築物の１つ以上の更なるエレメントを含む。ここで、「レギュラトリーエレメント」、「プロモーター」、「ターミネーター」、及び「操作可能に連結している」という用語は、（本明細書で更に記載された）当技術分野におけるその通常の意味を有する。ここで、遺伝子構築物に存在する前記「更なるエレメント」は、例えば、３’−又は５’−ＵＴＲ配列、リーダー配列、選択マーカー、発現マーカー／レポーター遺伝子、及び／又は、トランスフォーメーションもしくは組み込みを容易にし、又は、これら（の効率）を向上させることができるエレメントであることができる。このような遺伝子構築物のためのこれら及び他の適切なエレメントは、当業者に明らかであろうし、例えば、使用される構築物の種類、意図したホスト細胞又はホスト生物、対象となる本発明のヌクレオチド配列を（例えば、構成的、一時的、又は誘導性発現により）発現させる方法、及び／又は、使用されるトランスフォーメーション技術により決めることができる。例えば、抗体及び抗体フラグメント（（シングル）ドメイン抗体及びＳｃＦｖフラグメントを含むが、これらに限定されない）の発現及び生成のためのそれ自体公知のレギュラトリー配列、プロモーター、及びターミネーターは、本質的に類似する方法において使用することができる。
【０３２５】
好ましくは、本発明の遺伝子構築物において、前記少なくとも１つの本発明の核酸と、前記レギュラトリーエレメント、及び場合により、前記１つの以上の更なるエレメントとは互いに、「操作可能に連結」している。これにより、一般的には、それらは互いに、機能的関連にあることを意味する。例えば、プロモーターは、前記プロモーターがコード配列の転写及び／又は発現を開始し、又は、その他の方法で制御／レギュレーションすることができる場合（ここで、前記コード配列は、前記プロモーター「の制御下」にあると理解されたい）、コード配列に「操作可能に連結」していると考えられる。一般的には、２つのヌクレオチド配列が操作可能に連結している場合、それらは、同じ方向にあるであろうし、また通常、同じ読み枠にもあるであろう。また、それらは、通常、本質的に隣接しているであろう。ただし、これが、必要とされない場合もある。
【０３２６】
好ましくは、本発明の遺伝子構築物におけるレギュラトリーエレメント及び更なるエレメントは、それらがその意図した生物学的機能を意図したホスト細胞又はホスト生物中において提供可能なようにである。
【０３２７】
例えば、プロモーター、エンハンサー、又はターミネーターは、意図したホスト細胞又はホスト生物中において、「操作可能である」べきである。操作可能とは、（例えば）前記プロモーターがヌクレオチド配列（例えば、それに（本明細書で定義されたように）操作可能に連結しているコード配列）の転写及び／又は発現を開始し、又は、他の方法で制御／レギュレーションすることができるべきであることを意味する。
【０３２８】
一部の特に好ましいプロモーターは、本明細書で言及されたホスト細胞中における発現についてそれ自体公知のプロモーター、及び特に、細菌細胞中における発現用のプロモーター、例えば、本明細書で言及されたもの、及び／又は実施例で使用されたものを含むが、これらに限定されない。
【０３２９】
選択マーカーは、本発明のヌクレオチド配列で（成功して）トランスフォーメーションされているホスト細胞及び／又はホスト生物が（成功して）トランスフォーメーションされていないホスト細胞／生物と区別できるように、すなわち、適切な選択条件下においてであるべきである。このようなマーカーの一部の好ましく、非限定的な例は、抗生物質（例えば、カナマイシン又はアンピシリン）に対する抵抗性を提供する遺伝子、温度抵抗性を提供する遺伝子、又はホスト細胞もしくはホスト生物をトランスフォーメーションされていない細胞又は生物の生存に必須の、培地中の特定の因子、化合物、及び／又は（食餌）成分の不存在下で維持させることができる遺伝子である。
【０３３０】
リーダー配列は、意図したホスト細胞又はホスト生物中において、所望の翻訳後修飾を可能にし、及び／又は、転写されたｍＲＮＡを細胞の所望の部分又はオルガネラに向けるようにであるべきである。また、リーダー配列は、発現生成物を前記細胞から分泌させることもできる。また、リーダー配列は、ホスト細胞又はホスト生物中で操作可能な任意のプロ配列、プレ配列、又はプレプロ配列であることができる。リーダー配列は、細菌細胞中での発現には必要でない場合がある。例えば、抗体又は抗体フラグメント（シングルドメイン抗体及びＳｃＦｖフラグメントを含むが、これらに限定さない）の発現及び生成についてそれ自体公知のリーダー配列は、本質的に類似する方法において使用することができる。
【０３３１】
発現マーカー又はレポーター遺伝子は、ホスト細胞又はホスト生物中において、遺伝子構築物（に存在する遺伝子又はヌクレオチド配列）の発現を検出できるようにであるべきである。また、発現マーカーは、場合により、例えば、細胞の特定部分もしくはオルガネラに、及び／又は、多細胞生物の特定細胞、組織、器官、もしくは部分に、発現した生成物を局在させることもできる。また、このようなレポーター遺伝子は、本発明のアミノ酸配列又はポリペプチドを含むタンパク質融合物としても発現させることができる。一部の好ましく、非限定的な例は、蛍光タンパク質、例えば、ＧＦＰを含む。
【０３３２】
適切なプロモーター、ターミネーター、及び更なるエレメントの一部の好ましく、非限定的な例は、本明細書で言及されたホスト細胞中での発現に使用することができるもの、及び特に、細菌細胞中での発現に適したもの、例えば、本明細書で言及されたもの、及び／又は以下の実施例で使用されたものを含む。本発明の遺伝子構築物に存在し／使用することができるプロモーター、選択マーカー、リーダー配列、発現マーカー、及び更なるエレメント、例えば、ターミネーター、転写及び／又は翻訳エンハンサー、及び／又は組込み因子の一部の（更なる）非限定的な例については、一般的な参考書、例えば、上記されたSambrook et al.及びAusubel et al.、ならびに、国際公開公報第９５／０７４６３号、同第９６／２３８１０号、同第９５／０７４６３号、同第９５／２１１９１号、同第９７／１１０９４号、同第９７／４２３２０号、同第９８／０６７３７号、同第９８／２１３５５号、米国特許第７，２０７，４１０号、同第５，６９３，４９２号、ならびに欧州特許第１０８５０８９号で提供された例が参照される。他の例は、当業者に明らかであろう。また、上記引用された一般的な背景技術及び本明細書で引用された更なる参考文献も参照される。
【０３３３】
本発明の遺伝子構築物は、一般的には、本発明のヌクレオチド配列を、上記された１つ以上の更なるエレメントに、例えば、一般的な参考書、例えば、上記されたSambrook et al.及びAusubel et al.で記載された技術を使用して、適切に連結させることにより、提供することができる。
【０３３４】
多くの場合、本発明の遺伝子構築物は、本発明のヌクレオチド配列を、それ自体公知の適切な（発現）ベクター中に挿入することにより得られるであろう。適切な発現ベクターの一部の好ましく、非限定的な例は、以下の実施例で使用されたもの及び本明細書で言及されたものである。
【０３３５】
本発明の核酸及び／又は本発明の遺伝子構築物は、ホスト細胞又はホスト生物をトランスフォーメーションする、すなわち、本発明のポリペプチドを発現及び／又は生成するのに使用することができる。適切なホスト又はホスト細胞は、当業者に明らかであろうし、例えば、任意の適切な真菌、原核生物もしくは真核生物の細胞もしくは細胞株、又は任意の適切な真菌、原核生物もしくは（非ヒト）真核生物、例えば、
−細菌株（グラム陰性株、例えば、Escherichia coli株;Proteus株、例えば、Proteus mirabilis株；Pseudomonas株、例えば、Pseudomonas fluorescens株；ならびに、グラム陽性株、例えば、Bacillus株、例えば、Bacillus subtilis株もしくはBacillus brevis株、Streptomyces株、例えば、Streptomyces lividans株；Staphylococcus株、例えば、Staphylococcus carnosus株；及びLactococcus株、例えば、Lactococcus lactis株を含むが、これらに限定されない）；
−真菌細胞（Trichoderma種、例えば、Trichoderma reesei；Neurospora種、例えば、Neurospora crassa；Sordaria種、例えば、Sordaria macrospora；Aspergillus種、例えば、Aspergillus nigerもしくはAspergillus sojae；又は、他の糸状菌、からの細胞を含むが、これらに限定されない）；
−酵母細胞（Saccharomyces種、例えば、Saccharomyces cerevisiae種；Schizosaccharomyces種、例えば、Schizosaccharomyces pombe種；Pichia種、例えば、Pichia pastoris種もしくはPichia methanolica種；Hansenula種、例えば、Hansenula polymorpha種；Kluyveromyces種、例えば、Kluyveromyces lactis種；Arxula種、例えば、Arxula adeninivorans種；Yarrowia種、例えば、Yarrowia lipolytica種、からの細胞を含むが、これらに限定されない）；
−両生類細胞又は細胞株、例えば、Xenopus oocytes；
昆虫由来細胞又は細胞株、例えば、lepidopteraから得られた細胞／細胞株（Spodoptera SF9及びSf21細胞又はDrosophilaから得られた細胞／細胞株、例えば、Schneider及びKc細胞を含むが、これらに限定さない）；
−植物又は植物細胞、例えば、tobacco植物；ならびに／又は
−哺乳類細胞又は細胞株、例えば、ヒトから得られた細胞又は細胞株、哺乳類からの細胞又は細胞株（ＣＨＯ細胞（例えば、ＣＨＯ−Ｋ１細胞）、ＢＨＫ細胞、及びヒト細胞又は細胞株、例えば、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、Ｃａｋｉ、及びＨＥＫ２９３Ｈ細胞を含むが、これらに限定されない）；
ならびに、抗体及び抗体フラグメント（（シングル）ドメイン抗体及びＳｃＦｖフラグメントを含むが、これらに限定されない）の発現及び生成についてそれ自体公知の他のホスト細胞又は（非ヒト）ホストを含むことができる。これらは、当業者に明らかであろう。また、上記で引用された一般的な背景技術ならびに、例えば、国際公開公報第９４／２９４５７号、同第９６／３４１０３号、同第９９／４２０７７号、Frenken et al.（Res Immunol. 149: 589-99, 1998）、前記Riechmann and Muyldermans（1999）、van der Linden（J. Biotechnol. 80: 261-70, 2000）、Joosten et al.（Microb. Cell Fact. 2: 1, 2003）、Joosten et al.（Appl. Microbiol. Biotechnol. 66: 384-92, 2005）、ならびに本明細書で引用された更なる参考文献も参照される。
【０３３６】
また、本発明のポリペプチドは、例えば、国際公開公報第９４／０２６１０号、同第９５／２２６１８号、及び米国特許第７，００４，９４０号、国際公開公報第０３／０１４９６０号、Cattaneo and Biocca（「Intracellular Antibodies: Development and Applications」 Landes and Springer-Verlag, 1997）及びKontermann（Methods 34: 163-170, 2004）で記載された、いわゆる「細胞内抗体」として発現させることができる。
【０３３７】
また例えば、本発明のポリペプチドは、トランスジェニック哺乳類の乳、例えば、ウサギ、ウシ、ヤギ、又はヒツジの乳（例えば、導入遺伝子を哺乳類に導入するための一般的な技術については、米国特許第６，７４１，９５７号、同第６，３０４，４８９号、及び同第６，８４９，９９２号を参照のこと）中、植物もしくは植物の一部（その葉、花、果実、種、根、又は茎を含むが、これらに限定されない）（例えば、タバコ、トウモロコシ、大豆、又はアルファルファ）中に、又は、例えば、カイコBombix moriのさなぎ中に生成することもできる。
【０３３８】
またさらに、本発明のポリペプチドは、細胞フリー発現系中において発現させ、及び／又は、生成することもできる。このような系の適切な例は、当業者に明らかであろう。一部の好ましく、非限定的な例は、小麦胚芽系、ウサギ網膜細胞ライゼート、E coli Zubay系における発現を含む。
【０３３９】
好ましくは、本発明において、（ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける）発現系、例えば、細菌発現系は、薬学的使用に適した形態における本発明のポリペプチドを提供するように使用される。再度、このような発現系は、当業者に明らかであろう。また、当業者に明らかであろうように、薬学的使用に適した本発明のポリペプチドは、ペプチド合成用の技術を使用して調製することができる。
【０３４０】
工業スケールでの生成のために、免疫グロブリンシングル可変ドメイン又は免疫グロブリンシングル可変ドメイン含有ポリペプチド治療剤の（工業的）生成に好ましい異種ホストは、大規模の発現／生成／発酵、及び特に、大規模の医薬発現／生成／発酵に適したE. coli, Pichia pastoris, S. cerevisiaeの株を含む。このような株の適切な例は、当業者に明らかであろう。また、このような株及び生成／発現系は、Biovitrum（Uppsala, Sweden）等の企業から市販されている。
【０３４１】
あるいは、哺乳類細胞株、特に、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、大規模の発現／生成／発酵、及び特に、大規模の医薬発現／生成／発酵に使用することができる。また再度、このような発現／生成系は、上記で言及された幾つかの企業から市販されている。
【０３４２】
具体的な発現系の選択は、一部において、特定の翻訳後修飾、より具体的には、グリコシル化のための要求により決まるであろう。グリコシル化が望ましい又は必要とされる免疫グロブリンシングル可変ドメイン含有リコンビナントタンパク質の生成は、発現されたタンパク質をグリコシル化する能力を有する哺乳類発現ホストの使用を必要とする。これに関して、得られたグリコシル化パターン（すなわち、付着した残基の種類、数、及び位置）が、発現に使用される細胞又は細胞株により決まるであろうことは、当業者に明らかであろう。好ましくは、ヒト細胞又は細胞株のいずれかが使用され（すなわち、本質的にヒトグリコシル化パターンを有するタンパク質をもたらし）、又は、本質的に及び／又は機能的にヒトグリコシル化と同じ、又は、少なくともヒトグリコシル化に類似する、グリコシル化パターンを提供することができる別のほ乳類細胞株が使用される。一般的には、原核生物ホスト、例えば、E. coliは、タンパク質をグリコシル化する能力を有していない。下等真核生物、例えば、酵母の使用は、通常、ヒトグリコシル化とは異なるグルコシル化パターンをもたらす。それでも、前述の全てのホスト細胞及び発現系は、得られる所望のポリペプチドに応じて、本発明に使用することができることを理解されたい。
【０３４３】
このため、本発明の非限定的な一実施態様によれば、本発明のポリペプチドはグリコシル化されている。本発明の別の非限定的な実施態様によれば、本発明のポリペプチドはグリコシル化されていない。
【０３４４】
本発明の好ましく、非限定的な一実施態様によれば、本発明のポリペプチドは、細菌細胞、特に大規模な医薬生成に適した細菌細胞、例えば、上記で言及された細胞株中で生成される。
【０３４５】
本発明の別の好ましく、非限定的な実施態様によれば、本発明のポリペプチドは、酵母細胞、特に大規模な医薬生成に適した酵母細胞、例えば、上記で言及された種の細胞中で生成される。
【０３４６】
本発明のさらに別の好ましく、非限定的な実施態様によれば、本発明のポリペプチドは、哺乳類細胞、特に、ヒト細胞又はヒト細胞株の細胞、及びとりわけ、大規模な医薬生成に適したヒト細胞又はヒト細胞株の細胞、例えば、上記で言及された細胞株中で生成される。
【０３４７】
ホスト細胞中での発現が本発明のポリペプチドを生成するのに使用される場合、本発明のポリペプチドは、細胞内（例えば、細胞質ゾル、ペリプラズム、又は封入体）のいずれかで生成し、ホスト細胞から単離し、場合により、さらに精製することができ、又は、細胞外（例えば、ホスト細胞が培養されている培地中）で生成し、ついで、培養培地から単離し、場合により、さらに精製することができる。真核生物のホスト細胞が使用される場合、細胞外生成が通常好ましい。これにより、得られたポリペプチドの更なる単離及び下流工程が相当容易になるためである。細菌細胞、例えば、上記で言及されたE. coli株は、わずかな分類のタンパク質、例えば、トキシン及びヘモリジンを除いて、通常は、細胞外にタンパク質を分泌しない。E. coliにおける分泌性生成は、内側膜からペリプラズム空間へのタンパク質の移行を意味する。ペリプラズム生成は、細胞質ゾル生成を上回る複数の利点を提供する。例えば、分泌された生成物のＮ末端アミノ酸配列は、特定のシグナルペプチダーゼによる分泌シグナル配列の開裂後には、天然の遺伝子生成物と同一であることができる。また、細胞質においてよりペリプラズムでは、プロテアーゼ活性が非常に低いと考えられる。加えて、タンパク質精製は、ペリプラズムにおけるコンタミタンパク質がより少ないため、より簡易である。別の利点は、正確なジスルフィド結合を形成することができることである。ペリプラズムは、細胞質より酸化的環境を提供するためである。E. coli中で過剰発現させたタンパク質は、多くの場合、不溶性凝集体、いわゆる、封入体で見出される。これらの封入体は、細胞質ゾル又はペリプラズムに局在する場合がある。生物学的活性なタンパク質のこれらの封入体からの回収は、変性／再フォールディングプロセスを必要とする。治療タンパク質を含む多くのリコンビナントタンパク質は、封入体から回収される。あるいは、当業者に明らかであろうように、所望のタンパク質、及び特に、本発明のポリペプチドを分泌させるために、遺伝子操作されている細菌のリコンビナント株を使用することができる。
【０３４８】
このため、本発明の非限定的な一実施態様によれば、本発明のポリペプチドは、細胞内で生成され、ホスト細胞から、及び特に、細菌細胞、又は、細菌細胞中の封入体から単離されたポリペプチドである。本発明の別の非限定的な実施態様によれば、本発明のポリペプチドは、細胞外で生成され、ホスト細胞が培養されている培地から単離されたポリペプチドである。
【０３４９】
これらのホスト細胞と共に使用するための一部の好ましく、非限定的なプロモーターは、
−E. coli中での発現について、ｌａｃプロモーター（及びその誘導体、例えば、ｌａｃＵＶ５プロモーター）、アラビノースプロモーター、ファージラムダの左側（ＰＬ）及び右側（ＰＲ）プロモーター、ｔｒｐオペロンのプロモーター、ハイブリッドｌａｃ／ｔｒｐプロモーター（ｔａｃ及びｔｒｃ）、Ｔ７プロモーター（より具体的には、Ｔ７ファージ遺伝子１０のプロモーター）、及び他のＴファージプロモーター、Ｔｎ１０テトラサイクリン抵抗性遺伝子のプロモーター、外因性レギュラトリーオペレーター配列の１つ以上のコピーを含む上記プロモーターの操作変異；
−S. cerevisiae中での発現について、構成的：ＡＤＨ１（アルコールデヒドロゲナーゼ１）、ＥＮＯ（エノラーゼ）、ＣＹＣ１（シトクロームｃ  イソ−１）、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ）、ＰＧＫ１（ホスホグリセラートキナーゼ）、ＰＹＫ１（ピルビン酸キナーゼ）；レギュレーション的：ＧＡＬ１，１０，７（ガラクトース代謝酵素）、ＡＤＨ２（アルコールデヒドロゲナーゼ２）、ＰＨＯ５（酸ホスファターゼ）、ＣＵＰ１（銅メタロチオネイン）；異種性：ＣａＭＶ（カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター）；
−Pichia pastoris中での発現について、ＡＯＸ１プロモーター（アルコールオキシダーゼＩ）；
哺乳類細胞中での発現について、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）最初期エンハンサー／プロモーター、プロモーターをＴｅｔリプレッサーによりレギュレーションすることができるような２つのテトラサイクリンオペレーター配列を含有するヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）最初期プロモーター変異、ヘルペス単純ウイルスチミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルスロングターミナルリピート（ＲＳＶ  ＬＴＲ）エンハンサー／プロモーター、ヒト、チンパンジー、マウス、もしくはラットからの伸長因子１α（ｈＥＦ−１α）プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＨＩＶ−１ロングターミナルリピートプロモーター、β−アクチンプロモーター；
を含む。
【０３５０】
これらのホスト細胞と共に使用するための一部の好ましく、非限定的なベクターは、
−哺乳類細胞中での発現用ベクター：pMAMneo（Clontech）、pcDNA3（Invitrogen）、pMC1neo（Stratagene）、pSG5（Stratagene）、EBO-pSV2-neo（ATCC 37593）、pBPV-1（8-2）（ATCC 37110）、pdBPV-MMTneo（342-12）（ATCC 37224）、pRSVgpt（ATCC37199）、pRSVneo（ATCC37198）、pSV2-dhfr（ATCC 37146）、pUCTag（ATCC 37460）、及び1ZD35（ATCC 37565）、ならびにウイルス系発現系、例えば、アデノウイルスに基づくもの；
−細菌細胞中での発現用ベクター：pETベクター（Novagen）及びpQEベクター（Qiagen）；
−酵母又は他の真菌細胞中での発現用ベクター：pYES2（Invitrogen）及びPichia発現ベクター（Invitrogen）；
−昆虫細胞中での発現用ベクター：pBlueBacII（Invitrogen）又は他のバキュロウイルスベクター；
−植物又は植物細胞中での発現用ベクター：例えば、カリフラワーモザイクウイルス又はタバコモザイクウイルスに基づくベクター、Agrobacteriumの適切な株、又はＴｉプラスミド系ベクター
を含む。
【０３５１】
これらのホスト細胞と共に使用するための一部の好ましく、非限定的な分泌配列は、
−細菌細胞、例えば、E. coli中での使用について、ＰｅｌＢ、Ｂｌａ、ＯｍｐＡ、ＯｍｐＣ、ＯｍｐＦ、ＯｍｐＴ、ＳｔＩＩ、ＰｈｏＡ、ＰｈｏＥ、ＭａｌＥ、Ｌｐｐ、ＬａｍＢ等；ＴＡＴシグナルペプチド、ヘモキシリンＣ末端分泌シグナル；
−酵母中での使用について、α−接合因子プレプロ配列、ホスファターゼ（ｐｈｏ１）、インベルターゼ（Ｓｕｃ）等；
−哺乳類細胞中での使用について、ターゲットタンパク質が真核生物起源のものである場合は本来のシグナル、マウスＩｇ  κ鎖  Ｖ−Ｊ２−Ｃシグナルペプチド；等を含む。
【０３５２】
本発明のホスト又はホスト細胞をトランスフォーメーションするのに適した技術は、当業者に明らかであろうし、意図したホスト細胞／ホスト生物及び使用される遺伝子構築物により決めることができる。再度、上記で言及された参考書及び特許出願が参照される。
【０３５３】
トランスフォーメーション後、本発明のヌクレオチド配列／遺伝子構築物により成功してトランスフォーメーションされたそれらのホスト細胞又はホスト生物を検出及び選択するための工程を行うことができる。これは、例えば、本発明の遺伝子構築物に存在する選択マーカーに基づく選択工程、又は、本発明のポリペプチドを、例えば、特定の抗体を使用して検出することを含む工程であることができる。
【０３５４】
トランスフォーメーションされたホスト細胞（同ホスト細胞は、安定した細胞株の形態にあることができる）又はホスト生物（同ホスト生物は、安定した変異株又は株の形態にあることができる）は、本発明の更なる態様を構成する。
【０３５５】
好ましくは、これらのホスト細胞又はホスト生物（及び、ホスト生物の場合には、少なくとも１つのその細胞、一部、組織、又は器官）は、本発明のポリペプチドを例えば、（適切な条件下において）発現し、又は、（少なくとも）発現可能であるようにである。また、本発明は、例えば、細胞分裂により又は有性もしくは無性生殖により得ることができる、本発明のホスト細胞又はホスト生物の更なる世代、子孫（progeny）、及び／又は子孫（offspring）も含む。
【０３５６】
本発明のポリペプチドの発現を生じる／得るために、トランスフォーメーションされたホスト細胞又はトランスフォーメーションされたホスト生物は、一般的には、（所望の）本発明のポリペプチドが発現され／生成されるような条件下において、維持し、保持し、及び／又は培養することができる。適切な条件は、当業者に明らかであろうし、通常、使用されるホスト細胞／ホスト生物、及び、本発明の（関連する）ヌクレオチド配列の発現を制御するレギュラトリーエレメントにより決まるであろう。再度、本発明の遺伝子構築物の段落において上記で言及された参考書及び特許出願が参照される。
【０３５７】
一般的には、適切な条件は、適切な培地の使用、食餌の適切な供給源及び／又は適切な栄養の存在、適切な温度の使用、及び場合により、（例えば、本発明のヌクレオチド配列が誘導性プロモーターの制御下にある場合）適切な誘導因子又は化合物の存在を含むことができる。これらは全て、当業者により選択することができる。再度、このような条件下において、本発明のポリペプチドは、構成的な方法において、一過性の方法において、又は、適切に誘導された場合にのみ発現させることができる。
【０３５８】
また、本発明のポリペプチドを、（本明細書で言及された）未成熟の形態で（まず）生成することができることが、当業者に明らかであろう。ついで、同未成熟の形態を、使用されるホスト細胞／ホスト生物に応じて、翻訳後修飾に供することができる。また再度、本発明のポリペプチドを、使用されるホスト細胞／ホスト生物に応じて、グリコシル化することができる。
【０３５９】
ついで、本発明のポリペプチドを、ホスト細胞／ホスト生物及び／又は、前記ホスト細胞もしくはホスト生物が培養された培地から、それ自体公知のタンパク質単離及び／又は精製技術、例えば、（調製用）クロマトグラフィー及び／又は電気泳動技術、差動的沈殿技術、親和性技術（例えば、本発明のポリペプチドに融合させた特定の開裂性アミノ酸配列を使用する）、及び／又は調製用免疫学的技術（すなわち、単離されたポリペプチドに対する抗体を使用する）を使用して、単離することができる。
【０３６０】
本発明の組成物
一般的には、薬学的使用のために、本発明の免疫グロブリン、ポリペプチド、化合物、及び／又は構築物は、少なくとも１つの本発明の免疫グロブリン、ポリペプチド、化合物、及び／又は構築物と、少なくとも１つの薬学的に許容し得る担体、希釈剤、もしくは賦形剤及び／又は補助剤と、場合により、１つ以上の更なる薬学活性ポリペプチド及び／又は化合物とを含む、医薬調製物又は組成物として配合することができる。非限定的な例により、このような製剤は、経口投与、非経口投与（例えば、静脈内、筋肉内、もしくは皮下注射、又は静脈内注入による）、局所投与、吸入による投与、皮膚パッチによる、インプラントによる、坐剤による投与等に適した形態にあることができる。ここで、非経口投与が好ましい。このように適切な剤形−同剤形は、投与方法に応じて固体、半固体、又は液体であることができる。そして、それらの調製に使用するための方法及び担体は、当業者に明らかであろうし、本明細書で更に記載されている。このような医薬調製物又は組成物は、一般的には本明細書において、「医薬組成物」と呼ばれるであろう。非ヒト生物に使用するための医薬調製物又は組成物は、一般的には本明細書において、「獣医学的組成物」と呼ばれるであろう。
【０３６１】
このため、更なる態様では、本発明は、少なくとも１つの本発明の免疫グロブリン、少なくとも１つの本発明のポリペプチド、少なくとも１つの本発明の化合物、少なくとも１つの本発明の構築物、又は少なくとも１つの本発明の核酸と、少なくとも１つの適切な担体、希釈剤、もしくは賦形剤（すなわち、薬学的使用に適した）と、及び場合により、１つ以上の更なる活性物質とを含有する医薬組成物に関する。特定の態様では、本発明は、少なくとも１つの配列番号：１〜１２３、４５１〜４７３、及び４９５〜５４０と、少なくとも１つの適切な担体、希釈剤、又は賦形剤（すなわち、薬学的使用に適した）と、場合により、１つ以上の更なる活性物質とを含有する医薬組成物に関する。
【０３６２】
一般的には、本発明の免疫グロブリン、ポリペプチド、化合物、及び／又は構築物は、それ自体公知の任意の適切な方法で配合し、投与することができる。例えば、上記で引用された一般的な背景技術（及び特に、国際公開公報第０４／０４１８６２号、同第０４／０４１８６３号、同第０４／０４１８６５号、同第０４／０４１８６７号、及び同第０８／０２００７９号）ならびに、標準的な参考書、例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Company, USA (1990)、Remington, the Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, Lippincott Williams and Wilkins (2005)、又はthe Handbook of Therapeutic Antibodies (S. Dubel, Ed.), Wiley, Weinheim, 2007（例えば、第２５２〜２５５頁を参照のこと）が参照される。
【０３６３】
本発明の免疫グロブリン、ポリペプチド、化合物、及び／又は構築物は、従来の抗体及び抗体フラグメント（ＳｃＦｖ及びダイアボディを含む）及び他の薬学活性タンパク質について、それ自体公知の任意の方法において配合し、投与することができる。これらを調製するためのこのような配合及び方法は、当業者に明らかであろうし、例えば、非経口投与（例えば、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、管腔内、動脈内、又はくも膜下腔内の投与）又は局所（経皮又は皮内）投与に適した調製物を含む。
【０３６４】
非経口投与用の調製物は、例えば、注入又は注射に適した無菌の液剤、懸濁剤、分散剤、又は乳剤であることができる。このような調製物に適した担体又は希釈剤は、例えば、国際公開公報第０８／０２００７９号の第１４３頁で言及されたものを含むが、これに限定されない。通常、水溶剤又は懸濁剤が好ましいであろう。
【０３６５】
また、本発明の免疫グロブリン、ポリペプチド、化合物、及び／又は構築物は、遺伝子治療から公知の送達方法を使用して投与することができる。例えば、米国特許第５，３９９，３４６号を参照のこと。同文献は、その遺伝子治療送達法について、参照により組み入れられる。遺伝子治療法の送達を使用して、まず、本発明の免疫グロブリン、ポリペプチド、化合物、及び／又は構築物をコードする遺伝子でトランスフェクションされた細胞を、組織特異的プロモーターにより、ターゲットである特定の器官、組織、移植片、腫瘍、又は細胞に、更にトランスフェクションさせることができ、細胞内局在発現のためのシグナル及び安定化配列により、更にトランスフェクションさせることができる。
【０３６６】
このため、本発明の免疫グロブリン、ポリペプチド、化合物、及び／又は構築物は、薬学的に許容し得る媒体、例えば、不活性な希釈剤又は吸収可能な可食担体との組み合わせにおいて、例えば、経口で全身投与することができる。それらは、硬又は軟シェルゼラチンカプセル剤に封入することができ、錠剤に圧縮することができ、又は、患者の食餌の食品に直接包含させることができる。経口での治療的投与について、本発明の免疫グロブリン、ポリペプチド、化合物、及び／又は構築物は、１つ以上の賦形剤と組み合わせることができ、経口摂取錠、バッカル錠、トローチ錠、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、ウエハー剤等の形態で使用することができる。このような組成物及び調製物は、少なくとも０．１％の本発明の免疫グロブリン、ポリペプチド、化合物、及び／又は構築物を含有するべきである。組成物及び調製物中のその割合は、当然、変動させることができ、都合良く、所定の単位剤形の重量の約２〜約６０％であることができる。このような治療的に有用な組成物中の本発明の免疫グロブリン、ポリペプチド、化合物、及び／又は構築物の量は、有効用量レベルが得られるであろうようにである。
【０３６７】
また、錠剤、トローチ剤、丸剤、カプセル剤等は、バインダー、賦形剤、崩壊剤、滑材、及び甘味料又は香味料、例えば、国際公開公報第０８／０２００７９号の第１４３〜１４４頁で言及されたものを含有することもできる。単位剤形がカプセル剤である場合、この単位剤形は、上記種類の材料に加えて、液状担体、例えば、植物油又はポリエチレングリコールを含有することができる。種々の他の材料は、コーティングとして存在することができ、又は、固体の単位剤形の物理的形態を他の方法で修飾するのに存在することができる。例えば、錠剤、丸剤、又はカプセル剤は、ゼラチン、ロウ、シェラック、又は糖等でコーティングすることができる。シロップ剤又はエリキシル剤は、本発明の免疫グロブリン、ポリペプチド、化合物、及び／又は構築物と、甘味料としてのショ糖又はフルクトース、保存剤としてのメチル及びプロピルパラベン、染料及び香味料、例えば、チェリー及びオレンジ風味とを含有することができる。当然、任意の単位剤形を調製するのに使用される任意の材料は、薬学的に許容し得るべきであり、利用される量において実質的に非毒性であるべきである。加えて、本発明の免疫グロブリン、ポリペプチド、化合物、及び／又は構築物は、持続放出調製物及び装置内に包含させることができる。
【０３６８】
また、経口投与用の調製物及び製剤は、本発明の構築物を胃環境に抵抗性にすることができ、腸に通過させるように腸溶コーティングを設けることができる。より一般的には、経口投与用の調製物及び製剤は、消化管の任意の所望の部分への送達のために、適切に配合することができる。加えて、適切な坐剤は、消化管内への送達に使用することができる。
【０３６９】
また、本発明の免疫グロブリン、ポリペプチド、化合物、及び／又は構築物は、静脈内もしくは腹腔内に、又は、注入もしくは注射によっても投与することができる。特定の例は、国際公開公報第０８／０２００７９号の第１４４及び１４５頁又は国際特許出願第ＥＰ２０１０／０６２９７５号（文書全体）に更に記載された通りである。
【０３７０】
局所投与について、本発明の免疫グロブリン、ポリペプチド、化合物、及び／又は構築物は、純粋な形態、すなわち、これらが液状である場合、塗布することができる。ただし、一般的には、組成物又は製剤としてのそれらを、皮膚科学的に許容し得る担体との組み合わせで皮膚に投与するのが望ましいであろう。同担体は、固体でも又は液体でもよい。特定の例は、国際公開公報第０８／０２００７９号の第１４５頁で更に記載された通りである。
【０３７１】
本発明の免疫グロブリン、ポリペプチド、化合物、及び／又は構築物の有用な用量は、そのｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性及び動物モデルにおけるｉｎ  ｖｉｖｏ活性を比較することにより決定することができる。マウス及び他の動物における有効用量をヒトに外挿するための方法は、当技術分野において公知である。例えば、米国特許第４，９３８，９４９号を参照のこと。
【０３７２】
一般的には、液体組成物、例えば、ローション剤中における本発明の免疫グロブリン、ポリペプチド、化合物、及び／又は構築物の濃度は、約０．１〜２５ｗｔ％、好ましくは、約０．５〜１０ｗｔ％であろう。半固体又は固体組成物、例えば、ゲル剤又は粉末剤中における濃度は、約０．１〜５ｗｔ％、好ましくは、約０．５〜２．５ｗｔ％であろう。
【０３７３】
処置に使用するのに必要とされる本発明の免疫グロブリン、ポリペプチド、化合物、及び／又は構築物の量は、選択される特定の免疫グロブリン、ポリペプチド、化合物、及び／又は構築物によるだけでなく、投与経路、処置される症状の性質、ならびに患者の年齢及び症状によっても変動するであろうし、最終的には、主治医又は臨床医の裁量においてであろう。また、本発明の免疫グロブリン、ポリペプチド、化合物、及び／又は構築物の用量は、ターゲットとなる細胞、腫瘍、組織、移植片、又は器官に応じても変動する。
【０３７４】
所望の用量を、単回投与又は適切な間隔で、例えば、１日当たりに２、３、４回以上の部分投与として投与される分割投与において、都合良く提供することができる。部分投与自体は、例えば、数多くの別々の大ざっぱに間隔を空けた投与で、更に分割することができる。
【０３７５】
投与計画は、長期間にわたる毎日の処置を含むことができる。「長期間」は、少なくとも２週間、及び好ましくは、数週間、数か月、又は数年の期間を意味する。この投与範囲に必要な修飾は、当業者により、本明細書における教示から通常の思考錯誤のみを使用して決定することができる。Remington’s Pharmaceutical Sciences (Martin, E.W., ed. 4), Mack Publishing Co., Easton, PAを参照のこと。また、用量は、任意の合併症のイベントにおいて個々の臨床医により調整することもできる。
【０３７６】
本発明の免疫グロブリン、ポリペプチド、化合物、及び／又は構築物の使用
さらに、本発明は、本明細書で記載された免疫グロブリン、ポリペプチド、化合物、及び／又は構築物、核酸、ホスト細胞、ならびに組成物の用途及び使用、ならびに、Ｋｖ１．３関連疾患、障害、又は症状の予防及び／又は治療のための方法に関する。一部の好ましく、非限定的な用途及び使用は、本明細書における更なる記載から、明らかとなるであろう。
【０３７７】
本発明の免疫グロブリン、ポリペプチド、化合物、及び／又は構築物は、一般的には、Ｋｖ１．３の活性をモデュレーションし、例えば、Ｋｖ１．３の活性を部分的にもしくは完全に阻害し、又は、部分的にもしくは完全にブロックするのに使用することができる。特に、本発明の免疫グロブリン、ポリペプチド、化合物、及び／又は構築物は、適切なアッセイ法、例えば、本明細書で記載されたアッセイ法により測定された場合、本発明の免疫グロブリン、ポリペプチド、化合物、及び／又は構築物の不存在におけるＫｖ１．３の活性と比較して、少なくとも１％、好ましくは少なくとも５％、例えば、少なくとも１０％又は少なくとも２５％、好ましくは少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、もしくは少なくとも９０％以上、例えば、１００％で、この活性を低下させるように、Ｋｖ１．３の活性をモデュレーションすることができる。
【０３７８】
一態様において、本発明の免疫グロブリン、ポリペプチド、化合物、及び／又は構築物は、適切なアッセイ法、例えば、本明細書で記載されたアッセイ法により測定された場合、本発明の免疫グロブリン、ポリペプチド、化合物、及び／又は構築物の不存在におけるＫｖ１．３孔チャネルからのイオン流と比較して、少なくとも１％、好ましくは少なくとも５％、例えば、少なくとも１０％又は少なくとも２５％、好ましくは、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、もしくは少なくとも９０％以上、例えば、１００％で、Ｋｖ１．３からのイオン流を減少させることができる。
【０３７９】
別の態様では、本発明は、少なくとも１つのＫｖ１．３関連疾患、障害、又は症状の予防及び／又は治療のための方法であって、それを必要とする対象に、薬学活性量の、本発明の免疫グロブリン、本発明のポリペプチド、本発明の化合物、本発明の構築物、及び／又は、それらを含む医薬組成物を投与することを含む方法に関する。
【０３８０】
本発明の文脈において、「予防及び／又は治療」という用語は、疾患を予防及び／又は治療することを含むだけでなく、一般的には、疾患の開始を予防すること、疾患の進展を遅延させ、又は、逆転させること、疾患に関連する１つ以上の兆候の開始を予防もしくは遅延させること、疾患に関連する１つ以上の兆候を減少させ及び／もしくは緩和すること、疾患及び／又はそれに関連する任意の兆候の重症度及び／もしくは期間を減少させること、ならびに／又は、疾患及び／もしくはそれに関連する任意の兆候の重症度の更なる悪化を予防すること、疾患により生じる任意の生理学的傷害を予防し、減少させ、もしくは逆転させること、及び一般的には、処置される患者に有益である任意の薬理学的作用も含む。
【０３８１】
処置される対象は、任意の恒温動物であることができるが、特に哺乳類であり、とりわけ、ヒトである。当業者に明らかであろうように、処置される対象は、特に、本明細書で言及された疾患、障害、及び症状を患うか、又は、これらのリスクを有するヒトであろう。
【０３８２】
本発明は、その生物学的もしくは薬理学的活性による、及び／又は、Ｋｖ１．３が関与する生物学的経路もしくはシグナル伝達による、Ｋｖ１．３に関連する少なくとも１つの疾患、障害、又は症状の予防及び／又は治療のための方法であって、それを必要とする対象に、薬学活性量の、本発明の免疫グロブリン、本発明のポリペプチド、本発明の化合物、本発明の構築物、及び／又は、それらを含む医薬組成物を投与することを含む方法に関する。特に、本発明は、Ｋｖ１．３、Ｋｖ１．３が関与するその生物学的もしくは薬理学的活性及び／又は生物学的経路もしくはシグナル伝達をモデュレーションすることにより予防及び／又は処置することができる、少なくとも１つの疾患、障害、及び症状の予防及び／又は治療のための方法であって、それを必要とする対象に、薬学活性量の、本発明の免疫グロブリン、本発明のポリペプチド、本発明の化合物、本発明の構築物、及び／又は、それらを含む医薬組成物を投与することを含む方法に関する。
【０３８３】
特に、前記薬学活性量は、Ｋｖ１．３、Ｋｖ１．３が関与するその生物学的もしくは薬理学的活性及び／又は生物学的経路もしくはシグナル伝達をモデュレーションするのに十分な量、ならびに／又は、Ｋｖ１．３、Ｋｖ１．３が関与するその生物学的もしくは薬理学的活性及び／又は生物学的経路もしくはシグナル伝達をモデュレーションするのに十分なレベルの、本発明の免疫グロブリン、本発明のポリペプチド、本発明の化合物、及び／もしくは本発明の構築物を、循環中に提供する量であることができる。
【０３８４】
また、本発明は、本発明の免疫グロブリン、本発明のポリペプチド、本発明の化合物、及び／もしくは本発明の構築物を、患者に投与することにより、予防及び／又は治療することができる、少なくとも１つの疾患、障害、及び／又は症状の予防及び／又は治療のための方法であり、それを必要とする対象に、薬学活性量の、本発明の免疫グロブリン、本発明のポリペプチド、本発明の化合物、本発明の構築物、及び／又は、それらを含む医薬組成物を投与することを含む方法に関する。
【０３８５】
とりわけ、本発明は、本明細書で列記された疾患、障害、及び症状からなる群より選択される少なくとも１つの疾患、障害、及び／又は症状の予防及び／又は治療のための方法であって、それを必要とする対象に、薬学活性量の、本発明の免疫グロブリン、本発明のポリペプチド、本発明の化合物、本発明の構築物、及び／又は、それらを含む医薬組成物を投与することを含む方法に関する。
【０３８６】
また、本発明は、Ｔ細胞からのカリウムイオンの流出を減少させ、及び／又は、阻害するための方法に関する。
【０３８７】
また、本発明は、Ｔ細胞の活性化及び／又は増殖を阻害する、及び／又は、ブロックするための方法に関する。
【０３８８】
また、本発明は、活性化されたＴ細胞を阻害する、及び／又は、ブロックするための方法に関する。
【０３８９】
また、本発明は、Ｔ細胞媒介性疾患の予防及び／又は治療のための方法に関する。
【０３９０】
また、本発明は、自己免疫疾患の予防及び／又は治療のための方法に関する。
【０３９１】
またとりわけ、本発明は、Ｔ細胞からのカリウムイオンの流出を減少させ、及び／又は、阻害するための方法であって、それを必要とする対象に、薬学活性量の、本発明の免疫グロブリン、本発明のポリペプチド、本発明の化合物、本発明の構築物、及び／又は、それらを含む医薬組成物を投与することを含む方法に関する。
【０３９２】
また、本発明は、Ｔ細胞の活性化及び／又は増殖を阻害する、及び／又は、ブロックするための方法であって、それを必要とする対象に、薬学活性量の、本発明の免疫グロブリン、本発明のポリペプチド、本発明の化合物、本発明の構築物、及び／又は、それらを含む医薬組成物を投与することを含む方法に関する。
【０３９３】
また、本発明は、活性化されたＴ細胞を阻害する、及び／又は、ブロックするための方法であって、それを必要とする対象に、薬学活性量の、本発明の免疫グロブリン、本発明のポリペプチド、本発明の化合物、本発明の構築物、及び／又は、それらを含む医薬組成物を投与することを含む方法に関する。
【０３９４】
また、本発明は、Ｔ細胞媒介性疾患の予防及び／又は治療のための方法であって、それを必要とする対象に、薬学活性量の、本発明の免疫グロブリン、本発明のポリペプチド、本発明の化合物、本発明の構築物、及び／又は、それらを含む医薬組成物を投与することを含む方法に関する。
【０３９５】
また、本発明は、自己免疫疾患の予防及び／又は治療のための方法であって、それを必要とする対象に、薬学活性量の、本発明の免疫グロブリン、本発明のポリペプチド、本発明の化合物、本発明の構築物、及び／又は、それらを含む医薬組成物を投与することを含む方法に関する。
【０３９６】
またとりわけ、本発明は、Ｔ細胞からのカリウムイオンの流出を減少させ、及び／又は、阻害するための方法であって、薬学活性量の、少なくとも１つの配列番号：１〜１２３、４５１〜４７３、及び４９５〜５４０、ならびに／又は、それらを含む医薬組成物を投与することを含む方法に関する。
【０３９７】
また、本発明は、Ｔ細胞の活性化及び／又は増殖を阻害する、及び／又は、ブロックするための方法であって、薬学活性量の、少なくとも１つの配列番号：１〜１２３、４５１〜４７３、及び４９５〜５４０、ならびに／又は、それらを含む医薬組成物を投与することを含む方法に関する。
【０３９８】
また、本発明は、活性化されたＴ細胞を阻害する、及び／又は、ブロックするための方法であって、薬学活性量の、少なくとも１つの配列番号：１〜１２３、４５１〜４７３、及び４９５〜５４０、ならびに／又は、それらを含む医薬組成物を投与することを含む方法に関する。
【０３９９】
また、本発明は、Ｔ細胞媒介性疾患の予防及び／又は治療のための方法であって、薬学活性量の、少なくとも１つの配列番号：１〜１２３、４５１〜４７３、及び４９５〜５４０、ならびに／又は、それらを含む医薬組成物を投与することを含む方法に関する。
【０４００】
また、本発明は、自己免疫疾患の予防及び／又は治療のための方法であって、薬学活性量の、少なくとも１つの配列番号：１〜１２３、４５１〜４７３、及び４９５〜５４０、ならびに／又は、それらを含む医薬組成物を投与することを含む方法に関する。
【０４０１】
特に、本発明は、多発性硬化症、関節リウマチ、１型糖尿病、２型糖尿病、乾癬、炎症性腸疾患、接触媒介性皮膚炎、乾癬性関節炎、喘息、アレルギー、再狭窄、全身性硬化症、線維症、強皮症、糸球体腎炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、シェーグレン症候群、アルツハイマー病、炎症性骨吸収、全身性エリテマトーデス、潰瘍性大腸炎、肥満、移植片対宿主疾患、移植拒絶、血管炎、抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）関連血管炎（ＡＡＶ）、ブドウ膜炎、及び遅延型過敏の予防及び／又は治療のための方法に関する。
【０４０２】
別の特定の態様では、本発明は、多発性硬化症、関節リウマチ、１型糖尿病、２型糖尿病、乾癬、炎症性腸疾患、接触媒介性皮膚炎、乾癬性関節炎、喘息、アレルギー、再狭窄、全身性硬化症、線維症、強皮症、糸球体腎炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、シェーグレン症候群、アルツハイマー病、炎症性骨吸収、全身性エリテマトーデス、潰瘍性大腸炎、肥満、移植片対宿主疾患、移植拒絶、血管炎、抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）関連血管炎（ＡＡＶ）、ブドウ膜炎、及び遅延型過敏の予防及び／又は治療のための方法であって、薬学活性量の、少なくとも１つの配列番号：１〜１２３、４５１〜４７３、及び４９５〜５４０、ならびに／又は、それらを含む医薬組成物を投与することを含む方法に関する。
【０４０３】
更なる態様では、本発明は、免疫療法、及び特に、受動免疫療法のための方法であって、本明細書で言及された疾患及び障害を患うか、又は、同疾患及び障害のリスクを有する対象に、薬学活性量の、本発明の免疫グロブリン、本発明のポリペプチド、本発明の化合物、本発明の構築物、及び／又は、それらを含む医薬組成物を投与することを含む方法に関する。
【０４０４】
上記方法において、本発明の免疫グロブリン、ポリペプチド、化合物、及び／もしくは構築物、ならびに／又は、それらを含む医薬組成物を、使用される具体的な医薬製剤又は組成物に応じて、任意の適切な方法で投与することができる。このため、本発明の免疫グロブリン、ポリペプチド、化合物、及び／もしくは構築物、ならびに／又は、それらを含む組成物を、再度、使用される具体的な医薬製剤又は組成物に応じて、例えば、経口、腹腔内（例えば、静脈内、皮下、筋肉内、又は、消化管を回避する他の投与経路により）、鼻内、経皮、局所に、座剤により、吸入により投与することができる。臨床医は、予防又は治療される疾患、障害、又は症状及び臨床医に周知の他の要因に応じて、このような投与に使用されるのに適した投与経路及び適した医薬製剤又は組成物を選択することができるであろう。
【０４０５】
本発明の免疫グロブリン、ポリペプチド、化合物、及び／もしくは構築物、ならびに／又は、それらを含む組成物が、予防又は治療される疾患、障害、又は症状を予防し、及び／又は、治療するのに適した処置計画に従って投与される。臨床医は、一般的には、予防又は治療される疾患、障害、又は症状、処置される疾患の重症度及び／もしくはその兆候の重症度、使用される本発明の具体的な免疫グロブリン、ポリペプチド、化合物、及び／もしくは構築物、使用される具体的な投与経路及び医薬製剤もしくは組成物、患者の年齢、性別、体重、食事、全身状態等の要因、ならびに、臨床医に周知の類似する要因に応じて、適切な処置計画を決定することができるであろう。
【０４０６】
一般的には、処置計画は、１つ以上の薬学的有効量又は用量における、１つ以上の本発明の免疫グロブリン、ポリペプチド、化合物、及び／もしくは構築物、又は、１つ以上のそれらを含む組成物の投与を含むであろう。投与される具体的な量又は用量は、再度、上記で引用された要因に基づいて、臨床医により決定することができる。
【０４０７】
一般的には、処置される具体的な疾患、障害、又は症状、使用される本発明の具体的な免疫グロブリン、ポリペプチド、化合物、及び／又は構築物、使用される具体的な投与経路及び具体的な医薬製剤又は組成物に応じて、臨床医は、適切な日量を決定することができるであろう。
【０４０８】
通常、上記方法において、本発明の免疫グロブリン、ポリペプチド、化合物、及び／又は構築物が使用されるであろう。ただし、２つ以上の本発明の免疫グロブリン、ポリペプチド、化合物、及び／又は構築物を組み合わせで使用するのは、本発明の範囲内である。
【０４０９】
本発明の免疫グロブリン、ポリペプチド、化合物、及び／又は構築物は、１つ以上の更なる薬学活性化合物との組み合わせ、又は、原理において、すなわち、組み合わせた処置計画として使用することができる。同処置計画は、相乗効果をもたらしてもよいし、又は、もたらさなくてもよい。
【０４１０】
再度、臨床医は、このような更なる化合物又は原理、及び、適切に組み合わせた処置計画を、上記で引用された要因及び臨床医の専門的な判断に基づいて、選択することができるであろう。
【０４１１】
特に、本発明の免疫グロブリン、ポリペプチド、化合物、及び／又は構築物は、本明細書で引用された疾患、障害、及び症状の予防及び／又は治療に使用されるか、又は、これらに使用することができる、他の薬学活性化合物又は原理との組み合わせで使用することができる。その結果として、相乗効果が得られてもよいし、又は、得られなくてもよい。このような化合物及び原理、ならびにそれらを投与するための経路、方法、及び医薬製剤又は組成物は、臨床医に明らかであろう。
【０４１２】
２つ以上の物質又は原理を組み合わせた処置計画の一部として使用する場合、それらを、同じ投与経路により、又は、異なる投与経路により、本質的に同じタイミング又は異なるタイミングで（例えば、本質的に、同時、連続的に、又は、交互の計画により）投与することができる。この物質又は原理を同時に同じ投与経路で投与する場合、それらを、当業者に明らかであろうように、別の医薬製剤もしくは組成物、又は、組み合わせた医薬製剤もしくは組成物の一部として投与することができる。
【０４１３】
また、２つ以上の活性物質又は原理を、組み合わせた処置計画の一部として使用する場合にも、各物質又は原理を、この化合物又は原理自体が使用されるのと同じ量で、同じ計画に従って、投与することができる。このように組み合わせた使用は、相乗効果をもたらしてもよいし、又は、もたらさなくてもよい。ただし、２つ以上の活性物質又は原理の組み合わせた使用により相乗効果がもたらされる場合、所望の治療効果も達成しながら、投与される物質又は原理の１つ、それ以上、又は全ての量を減らすこともできる場合がある。これは、それらがその有用な量で使用される場合、所望の薬理学的又は治療的効果も得ながら、例えば、１つ以上の物質又は原理の使用と関連する任意の望ましくない副作用を避け、制限し、又は低下させるのに有用であることができる。
【０４１４】
本発明で使用される処置計画の有効性は、臨床医に明らかであろうように、関与する疾患、障害、又は症状について、それ自体公知の任意の方法において決定し、及び／又は、同方法に従うことができる。また、臨床医は、該当する場合及びケースバイケースで、所望の治療効果を達成するため、望ましくない副作用を避け、制限し、もしくは低下させるために、及び／又は、一方で所望の治療効果の達成と一方で望ましくない副作用を避け、制限し、もしくは低下させるのとの間で適切なバランスを達成するために、特定の処置計画を変更し、又は、修飾することができるであろう。
【０４１５】
一般的には、処置計画は、所望の治療効果が達成されるまで、及び／又は、所望の治療効果が維持される限り、行われるであろう。再度、これは、臨床医により決定することができる。
【０４１６】
別の態様では、本発明は、Ｋｖ１．３に関連する少なくとも１つの疾患、障害、及び症状の予防及び／もしくは治療のための医薬組成物の製造における、ならびに／又は、本明細書で言及された１つ以上の処置方法における使用のための、本発明の免疫グロブリン、ポリペプチド、化合物、及び／又は構築物の使用に関する。
【０４１７】
また、本発明は、Ｋｖ１．３に関連する少なくとも１つの疾患、障害、及び症状の予防及び／もしくは治療のための医薬組成物の製造における、ならびに／又は、Ｋｖ１．３が関与するシグナル伝達経路ならびに／又は生物学的機能及び応答についての、ならびに／又は、本明細書で記載された１つ以上の方法に使用するための、本発明の免疫グロブリン、ポリペプチド、化合物、及び／又は構築物の使用に関する。
【０４１８】
また、本発明は、Ｋｖ１．３、その生物学的もしくは薬理学的活性、及び／又は、Ｋｖ１．３が関与する生物学的経路もしくはシグナル伝達をモデュレーションすることにより予防し、及び／又は、治療することができる、少なくとも１つの疾患又は障害の予防及び／又は治療のための医薬組成物の製造における、本発明の免疫グロブリン、ポリペプチド、化合物、及び／又は構築物の使用に関する。
【０４１９】
また、本発明は、本発明の免疫グロブリン、ポリペプチド、化合物、及び／又は構築物を患者に投与することにより、予防し、及び／又は、治療することができる、少なくとも１つの疾患、障害、又は症状の予防及び／又は治療のための医薬組成物の製造における、本発明の免疫グロブリン、ポリペプチド、化合物、及び／又は構築物の使用に関する。
【０４２０】
とりわけ、本発明は、Ｔ細胞からのカリウムイオンの流出を減少させ、及び／又は、阻害するための医薬組成物の製造における、本発明の免疫グロブリン、ポリペプチド、化合物、及び／又は構築物の使用に関する。
【０４２１】
また、本発明は、Ｔ細胞の活性化及び／又は増殖を阻害する、及び／又は、ブロックするための医薬組成物の製造における、本発明の免疫グロブリン、ポリペプチド、化合物、及び／又は構築物の使用に関する。
【０４２２】
また、本発明は、活性化されたＴ細胞を阻害する、及び／又は、ブロックするための医薬組成物の製造における、本発明の免疫グロブリン、ポリペプチド、化合物、及び／又は構築物の使用に関する。
【０４２３】
また、本発明は、Ｔ細胞媒介性疾患の予防及び／又は治療のための医薬組成物の製造における、本発明の免疫グロブリン、ポリペプチド、化合物、及び／又は構築物の使用に関する。
【０４２４】
また、本発明は、自己免疫疾患の予防及び／又は治療のための医薬組成物の製造における、本発明の免疫グロブリン、ポリペプチド、化合物、及び／又は構築物の使用に関する。
【０４２５】
とりわけ、本発明は、Ｋｖ１．３関連障害の予防及び／又は治療のための、及び特に、多発性硬化症、関節リウマチ、１型糖尿病、２型糖尿病、乾癬、炎症性腸疾患、接触媒介性皮膚炎、乾癬性関節炎、喘息、アレルギー、再狭窄、全身性硬化症、線維症、強皮症、糸球体腎炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、シェーグレン症候群、アルツハイマー病、炎症性骨吸収、全身性エリテマトーデス、潰瘍性大腸炎、肥満、移植片対宿主疾患、移植拒絶、血管炎、抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）関連血管炎（ＡＡＶ）、ブドウ膜炎、及び遅延型過敏の予防及び／又は治療のための医薬組成物の製造における、本発明の免疫グロブリン、ポリペプチド、化合物、及び／又は構築物の使用に関する。
【０４２６】
さらに、本発明は、少なくとも１つのＫｖ１．３関連疾患、障害、及び／又は症状の予防及び／又は治療に使用するための、本発明の免疫グロブリン、ポリペプチド、化合物、及び／もしくは構築物、又は、それらを含む医薬組成物に関する。
【０４２７】
さらに、本発明は、Ｋｖ１．３、その生物学的もしくは薬理学的活性、及び／又は、Ｋｖ１．３が関与する生物学的経路もしくはシグナル伝達に関連する少なくとも１つの疾患、障害、及び／又は症状の予防及び／又は治療に使用するための、本発明の免疫グロブリン、ポリペプチド、化合物、及び／もしくは構築物、又は、それらを含む医薬組成物に関する。
【０４２８】
さらに、本発明は、Ｋｖ１．３、その生物学的もしくは薬理学的活性、及び／又は、Ｋｖ１．３が関与する生物学的経路もしくはシグナル伝達をモデュレーションすることにより、予防し、及び／又は、治療することができる、少なくとも１つの疾患、障害、及び／又は症状の予防及び／又は治療に使用するための、本発明の免疫グロブリン、ポリペプチド、化合物、及び／もしくは構築物、又は、それらを含む医薬組成物に関する。
【０４２９】
また、本発明は、本発明の免疫グロブリン、ポリペプチド、化合物、及び／又は構築物を患者に投与することにより、予防し、及び／又は、治療することができる、少なくとも１つの疾患、障害、及び／又は症状の予防及び／又は治療に使用するための、本発明の免疫グロブリン、ポリペプチド、化合物、及び／もしくは構築物、又は、それらを含む医薬組成物に関する。またとりわけ、本発明は、Ｔ細胞からのカリウムイオンの流出を減少させ、及び／又は、阻害するのに使用するための、本発明の免疫グロブリン、ポリペプチド、化合物、及び／もしくは構築物、又は、それらを含む医薬組成物に関する。
【０４３０】
また、本発明は、Ｔ細胞の活性化及び／又は増殖を阻害する、及び／又は、ブロックするのに使用するための、本発明の免疫グロブリン、ポリペプチド、化合物、及び／もしくは構築物、又は、それらを含む医薬組成物に関する。
【０４３１】
また、本発明は、活性化されたＴ細胞を阻害する、及び／又は、ブロックするのに使用するための、本発明の免疫グロブリン、ポリペプチド、化合物、及び／もしくは構築物、又は、それらを含む医薬組成物に関する。
【０４３２】
また、本発明は、Ｔ細胞媒介性疾患の予防及び／又は治療に使用するための、本発明の免疫グロブリン、ポリペプチド、化合物、及び／もしくは構築物、又は、それらを含む医薬組成物に関する。
【０４３３】
また、本発明は、自己免疫疾患の予防及び／又は治療に使用するための、本発明の免疫グロブリン、ポリペプチド、化合物、及び／もしくは構築物、又は、それらを含む医薬組成物に関する。
【０４３４】
さらに、本発明は、多発性硬化症、関節リウマチ、１型糖尿病、２型糖尿病、乾癬、炎症性腸疾患、接触媒介性皮膚炎、乾癬性関節炎、喘息、アレルギー、再狭窄、全身性硬化症、線維症、強皮症、糸球体腎炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、シェーグレン症候群、アルツハイマー病、炎症性骨吸収、全身性エリテマトーデス、潰瘍性大腸炎、肥満、移植片対宿主疾患、移植拒絶、血管炎、抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）関連血管炎（ＡＡＶ）、ブドウ膜炎、及び遅延型過敏の予防及び／又は治療に使用するための、本発明の免疫グロブリン、ポリペプチド、化合物、及び／もしくは構築物、又は、それらを含む医薬組成物に関する。
【０４３５】
処置される対象は、任意の恒温動物であることができるが、特に哺乳類であり、とりわけ、ヒトである。獣医学用途において、処置される対象は、商業的目的で飼養されるか、又は、ペットとして飼われる任意の動物を含む。当業者に明らかであろうように、処置される対象は、特に、本明細書で言及された疾患、障害、及び症状を患うか、又は、これらのリスクを有するヒトであろう。
【０４３６】
再度、このような医薬組成物において、１つ以上の本発明の免疫グロブリン、ポリペプチド、化合物、及び／もしくは構築物、又は、それらをコードするヌクレオチド、ならびに／又は、それらを含む医薬組成物は、１つ以上の他の活性原理、例えば、本明細書で言及された原理と、適切に組み合わせることもできる。
【０４３７】
また、本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏもしくは細胞アッセイ法において）又はｉｎ  ｖｉｖｏ（例えば、単細胞もしくは多細胞生物、及び特に、哺乳類、及びとりわけ、ヒト、例えば、本発明の疾患、障害、もしくは症状のリスクを有するか、又は、これらを患っているヒト）のいずれかにおいて使用するための、組成物（例えば、本明細書で更に記載された医薬組成物又は調製物であるが、これらに限定されない）に関する。
【０４３８】
本発明の免疫グロブリン、ポリペプチド、化合物、及び／又は構築物は、関連する遅延型過敏（ＤＴＨ）ラットモデルにおける炎症作用を緩和する。そのモデルの作用に基づいて、本発明の免疫グロブリン、ポリペプチド、化合物、及び／又は構築物は、他のＫｖ１．３関連疾患の処置に有用であることができる。同疾患は、多発性硬化症、関節リウマチ、１型糖尿病、２型糖尿病、乾癬、炎症性腸疾患、接触媒介性皮膚炎、乾癬性関節炎、喘息、アレルギー、再狭窄、全身性硬化症、線維症、強皮症、糸球体腎炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、シェーグレン症候群、アルツハイマー病、炎症性骨吸収、全身性エリテマトーデス、潰瘍性大腸炎、肥満、移植片対宿主疾患、移植拒絶、血管炎、抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）関連血管炎（ＡＡＶ）、ブドウ膜炎、及び遅延型過敏を含むが、これらに限定されない。
【０４３９】
処置に対する言及は、特に断りない限り、確立された兆候の処置及び予防的処置の両方を含むと理解されたい。
【０４４０】
ここから、本発明は、下記の非限定的な好ましい態様、実施例、及び図面により更に説明されるであろう。
【０４４１】
本願の全体を通して引用された全ての参考文献（文献、発効された特許、公表された特許出願、及び同時継続中の特許出願を含む）の内容全体は、特に、上記で参照された教示について、参照により明示的に組み入れられる。
【実施例】
【０４４２】
実施例１：Ｋｖ１．３によるラマの免疫化、重鎖のみの抗体フラグメントレパートリーのクローニング、及びファージの調製
１．１  免疫化
倫理委員会（University Antwerp, Belgium）の承認後、３匹のラマ（llama glama）を、pVAX1−ヒトＫｖ１．３プラスミドベクター（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）（２×１５０μg/投与）で、２週間毎の間隔での５／８両側性皮内ｉｎ  ｖｉｖｏエレクトロポレーションによる標準的なプロトコールに従って免疫化した。６回目（１匹のラマについては５回目）の注射後に、ヒトＫｖ１．３を過剰発現しているＨＥＫ２９３Ｈ細胞（DSMZ, ACC 635）又はＣａｋｉ細胞（Nguyen et al., Adv Immunol 79: 261-296, 2001）（２Ｅ０７個／投与）の皮下注射を、ラマに１回受けさせた。細胞を、Ｄ−ＰＢＳに再懸濁させ、注射前に氷上に維持した。１匹の動物には、細胞ブースト後に、ヒトＫｖ１．３発現ＶＬＰ（Molecular Integral, INT-793A）も受けさせた。
【０４４３】
１．２  重鎖のみの抗体フラグメントレパートリーのクローニング及びファージの調製
各サブセットの最後の注射後に、重鎖抗体を生成するＢ細胞ソースとしての免疫組織を、免疫化させたラマから収集した。各サブセットの最後の注射後数日で収集した血液サンプルを、動物毎に収集した。血液サンプルから、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を、Ficoll-Hypaqueを使用し、製造メーカーの説明書（Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA）に従って調製した。ＰＢＬ及びリンパ節生検（ＬＮ）から、トータルＲＮＡを抽出した。同トータルＲＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲのための開始材料として使用して、ＶＨＨコードＤＮＡセグメントを増幅させた。各免疫化させたラマについて、ライブラリを、特定のサブセットの免疫化スケジュールから、すなわち、１種類の免疫化抗原後に得られたサンプルから単離したトータルＲＮＡをプールすることにより構築した。
【０４４４】
要するに、ＰＣＲ増幅ＶＨＨレパートリーを、ＶＨＨライブラリのファージディスプレイを容易にするように設計されたベクター内の特定の制限部位によりクローニングした。このベクターを、下流にナノボディクローニング部位を有するフレーム（pAX212）中に、アンピシリン又はカルベニシリンに対する抵抗性遺伝子と、ｌａｃプロモーターと、続けて、ｐＩＩＩタンパク質シグナルペプチドのコード配列とを含有するpUC119から得た。ＶＨＨコード配列を有するフレームにおいて、ベクターは、Ｃ末端３×ＦＬＡＧ及びＨｉｓ６タグならびにコリファージｐＩＩＩタンパク質をコードする。ファージを、標準的なプロトコールに従って調製し（例えば、国際公開公報第０４／０４１８６５号、同第０４／０４１８６３号、同第０４／０６２５５１号、同第０５／０４４８５８号、及び他の従来技術、ならびに、本明細書で引用されたAblynx N.V.により出願された出願を参照のこと）、ろ過滅菌後に、更なる使用のために、２０％ グリセロール中において、４℃又は−８０℃で保存した。
【０４４５】
実施例２：ファージディスプレイによるＫｖ１．３特異的ＶＨＨの選択
全てのラマから所得し、ファージライブラリとしてクローニングしたＶＨＨレパートリーを、選択条件の多様性を加える種々の選択戦略に使用した。変数には、ｉ）（種々の細胞バックグラウンド又はリポソーム／ＶＬＰ上での）Ｋｖ１．３の提示形式、ｉｉ）抗原提示法（細胞を使用する場合は溶液中、又は、ＶＬＰを使用する場合は、プレート上にコーティング）、ｉｉｉ）抗原濃度、ｉｖ）使用したオルソログ（ヒト又はカニクイザル）、及びｖ）選択ラウンド回数が含まれる。全ての固体コート相選択を、Maxsorp９６ウェルプレート（Nunc, Wiesbaden, Germany）において行った。
【０４４６】
選択を、下記のように行った。固相及び溶相選択フォーマットのためのＫｖ１．３抗原調製物を、複数の濃度で、上記されたように提示した。ファージライブラリとの２時間のインキュベーション、続けて、丁寧な洗浄後、結合したファージを、トリプシン（１mg/mL）で１５分間溶出した。トリプシンをファージ溶出に使用した場合、プロテアーゼ活性を、０．８mM プロテアーゼ阻害剤ＡＢＳＦを加えることにより、直ちに中和した。対照として、抗原を含まない選択を、平行して行った。
【０４４７】
ファージアウトプットを、E. coliに感染させるのに使用した。ついで、このE. coliを、次の選択ラウンド（ファージレスキュー）のためのファージを調製するのに使用した。また、ファージアウトプットを、E. coliに感染させるのにも使用した。ついで、このE. coliを、個々のＶＨＨクローンの分析のために、アガープレート（ＬＢ＋ｃａｒｂ＋グルコース２％）に播種した。特定のバインダーに対する選択アウトプットをスクリーニングするために、単独のクローンを、アガープレートから取り出し、９６ディープウェルプレート １mL中で増殖させた。ＬａｃＺ制御ＶＨＨ発現を、グルコースの不存在下において、ＩＰＴＧ（終濃度１mM）を加えることにより誘導した。ペリプラズム抽出物（容量約８０μＬ）を、標準的なプロトコールに従って調製した（例えば、国際公開公報第０３／０３５６９４号、同第０４／０４１８６５号、同第０４／０４１８６３号、同第０４／０６２５５１号、及び他の従来技術、ならびに、本明細書で引用されたAblynx N.V.により出願された出願を参照のこと）。
【０４４８】
実施例３：ペリプラズム抽出物のスクリーニング
３．１  フローサイトメトリーアッセイ法におけるＫｖ１．３結合ナノボディについてのスクリーニング
ペリプラズム抽出物を、自社製Ｋｖ１．３発現ＣＨＯ−Ｋ１及び／又はＨＥＫ２９３Ｈ細胞において使用する、ＦＡＣＳアッセイ法における細胞発現Ｋｖ１．３結合についてスクリーニングした。２×１０５個 細胞を、１：５希釈したペリプラズム抽出物中において、４℃で３０分間インキュベーションし、ついで、徹底的に洗浄した。次に、細胞を、１μg/mL モノクローナルANT-FLAG（登録商標）M2抗体（Sigma-Aldrich, cat# F1804）と共に、４℃で３０分間インキュベーションし、再度洗浄し、ヤギ抗マウスＰＥラベル抗体（１：１０００）と共に、４℃で３０分間インキュベーションした。サンプルを洗浄し、５nM ＴＯＰＲＯ３（Molecular Probes cat# T3605）を加えたＦＡＣＳバッファー（GibcoからのＤ−ＰＢＳ、Sigmaからの１０％ ＦＢＳ及びMerckからの０．０５％ アジ化ナトリウムを含む）中に再懸濁させた。ついで、細胞懸濁液を、ＦＡＣＳアレイにおいて分析した。ゲーティングを、生きたインタクトな細胞に、前方／側方散乱及びＴＯＰＲＯ３チャネル蛍光パラメータを使用して設定した。ナノボディに結合する無関係な特異性を含む対照実験について得られた値より高い生きた細胞のＰＥチャネルは、クローンが細胞株に結合したことを示唆した。加えて、親細胞株に結合しないことを確認した。
【０４４９】
３．２  電気生理学におけるＫｖ１．３阻害性ナノボディについてのスクリーニング
ペリプラズム抽出物を、Ｋｖ１．３発現ＨＥＫ２９３細胞を使用するIonFlux（商標）自動パッチクランプでの電位作動型カリウムチャネルＫｖ１．３における阻害性効果について、電気生理学的にスクリーニングした。電気生理学的な記録による、ヒトＫｖ１．３におけるペリプラズム抽出物のモデュレーション効果を評価するための完全な手順を、以下に提供する。
【０４５０】
IonFlux（商標）16
IonFlux（商標）（Molecular Devices）は、Well Plate Microfluidic（商標）技術、温度制御及び連続的なかん流及び電圧クランプと一体化された自動パッチクランプシステムである。IonFlux（商標）16は、１６個の並列の増幅器を有し、Society for Biomolecular Sciencesに準拠した９６ウェルのIonFluxプレートを使用する。このシステムにより、集団及び単独細胞のパッチクランプが可能となる。
【０４５１】
溶液及びナノボディの取扱い
細胞外溶液は、（mMで）：１３２ ＮａＣｌ、５．４ ＫＣｌ、１．８ ＣａＣｌ２、０．８ ＭｇＣｌ２、１０ ＨＥＰＥＳ、５ グルコース（ＮａＯＨによりｐＨ７．２及び２８５〜２９０mOsmolar）を含有した。細胞内溶液は、（mMで）：４０ ＫＦ、１００ ＫＣｌ、２ ＭｇＣｌ２、１０ ＨＥＰＥＳ、５ ＥＧＴＡ（ＣｓＯＨによりｐＨ７．４５及び３００〜３１５mOsmolar）を含有した。これらの溶液を、新鮮に調製し、４℃で１か月以内の間ストックし、使用前にろ過した。ペリプラズム抽出物を、細胞外溶液中で１：５希釈し、Ｖ底ディープウェル正方形ウェルプレート（Westburg, #AB0932）に移した。
【０４５２】
細胞調製
ヒトＫｖ１．３チャネルを安定的に発現しているＨＥＫ２９３Ｈ細胞を、自社で生成した。細胞を、Ｔ−１７５細胞培養フラスコ（Greinerbio-one, #660160）中で、１０％ ＦＢＳ（Sigma-Aldrich, #F7524）、１％ ペニシリン＋ストレプトマイシン（GIBCO, #15140-122）、１mg/mL Ｇ４１８（GIBCO, #10131-027）を含有する標準的な培養培地であるDMEM Glutamax（商標）（GIBCO, #31966）を使用して培養した。IonFlux（商標）16（Fluxion, Molecular Devices）に使用する前に、細胞を、２５，０００個/cm2又は１２，０００個/cm2の密度で、それぞれ２又は３日間播種した。収集前の最適な細胞コンフルエントを、８０％を超えないようにした。細胞を、Ｃａ２＋及びＭｇ２＋を含まないｄ−ＰＢＳ（Invitrogen, #14190）で２回洗浄し、トリプシン／ＥＤＴＡ０．２５％（Invitrogen, Cat 25200-056） ３mL、３７℃で５〜１０分間により剥がした。１０％ ＦＢＳを含有するDMEM Glutamax（商標）を、トリプシンよりトリガーされた酵素反応を不活性化させるのに加えた。その後、細胞ペレットを、ｄ−ＰＢＳ＋１０％ ＦＢＳ ２０mL中に再懸濁させ、２００×ｇで、５０mLのconical CELLSTAR（登録商標）チューブ（Greinerbio-one, #227-261）において、ＲＴで１０分間遠心分離した。細胞をカウントし（Casy TT, Roche）、１００万個/mLで懸濁させ、新たな５０mLのconical CELLSTAR（登録商標）チューブに移し、ＲＴで約２０分間穏やかに振とうした。１００万個の細胞を、２００×ｇで２分間遠心分離した。ペレットを、細胞外バッファー ５mL中に穏やかに再懸濁させ、２００×ｇにおいて２回目、２分間遠心分離した。最後に、ペレットを、細胞外バッファー ２０００μL中に再懸濁させ、IonFlux（商標）において直ちに試験した。
【０４５３】
IonFlux（商標）16法及びヒトＫｖ１．３アッセイ法
無菌の細胞培養グレード水 ２５０μLを、IonFlux９６ウェルプレートの出口ウェルを除く全てのウェルに、８チャネルマルチピペットを使用して分注した。プレートを洗浄する前に、プレートのリムに存在する過剰の水を拭き取った。指定したプレートを、IonFluxシステム内に挿入し、その後、標準的な水洗プロトコールに従って、４回洗浄した。洗浄後、プレートを空にした。ついで、入口ウェルに、細胞外バッファーを手作業で充填し、トラップウェルを細胞内バッファーで充填し、希釈したナノボディ又は選択的ペプチドを、化合物ウェルに配置した（２５０μL/ウェル）。その後、このプレートを、実際の実験前に、プレート特異的プロトコールに従ってプライミングした。集団プレート（Molecular Devices, #910-0098）について、１）トラップ及び化合物、５psiでｔ＝０〜１６０秒、及び、２psiでｔ＝１６０〜１７５秒、２）トラップ、化合物なし、２psiでｔ＝１７５〜１８０秒、ならびに３）メインチャネル、１psiでｔ＝０〜１６０秒及び０．３psiでｔ＝１６２〜１８０秒。単独細胞プレート（Molecular Devices, # 910-0100）について、１）トラップ、化合物なし、１１psiでｔ＝０〜３５０秒及び１．５psiでｔ＝６２５〜６３０秒、２）トラップ及び化合物、５psiでｔ＝３５０〜６００秒及び１．５psiでｔ＝６００〜６２５秒、ならびに３）メインチャネル、０．５psiでｔ＝０〜３５０秒及び１psiでｔ＝３５０〜６００秒及び０．３psiでｔ＝６００〜６２７秒。プライミング後、出口及び入口ウェルを空にし、調製した細胞懸濁液 ２５０μL（すなわち、約１００万個の細胞）を、指定したプレートの入口ウェル内に配置した。細胞の導入後、プレートを再度プライミングした。１）トラップ及び化合物、５psiでｔ＝０〜２０秒及び２psiでｔ＝２５〜５０秒、２）トラップ、化合物なし、２psiでｔ＝５０〜５５秒、ならびに３）メインチャネル、１psiでｔ＝０〜３０秒及び０．４psiでｔ＝３０〜５５秒。ついで、細胞を、メインチャネルに導入し、側面のトラップ部位において、トラッププロトコールによりトラップした。１）トラップ真空  ８mmHg、ｔ＝０〜７６秒、２）メインチャネル圧  ０．２psi、ｔ＝０〜２秒、続けて、１３回繰り返しの方形パルス  ０〜０．２psi、ベースライン期間  ４．５秒、及びパルス期間  ０．８秒、続けて、０．２psiで２秒間。細胞全体のアクセスを、下記破壊プロトコールを使用して、孔の上方で膜のパッチを破壊することにより達成した。１）破壊真空  ８mmHg、ｔ＝０〜１５秒、続けて、パルス方形パルス  ８〜１６mmHg、パルス期間  １０秒、及び続けて、５mmHgで１０秒間、ならびに２）メインチャネル圧  ０．１５psi、ｔ＝０〜３５秒。細胞全体を配置した後、実験の終了まで、真空圧を、５mmHgで維持し、メインチャネル圧を、０．１psiで維持した。まず、細胞を、２４０秒間透析し、その後、化合物を試験した。タイムコースプロトコールを、脱分極パルスプロトコールにより引き出されたカリウム電流における化合物の効果を評価するのに適用した。オフライン線形リークサブトラクションを行うのを可能にするために、細胞を、−８０mVで１０m秒間クランプし、ついで、−１００mVに５０m秒間過分極させ、−８０mVに３０m秒間再分極させた。その後、カリウム電流を、（図２Ａで示されたように）��０秒間隔での−８０mVから＋４０mVへの２５０m秒間の脱分極工程により喚起した。安定化期間後に、細胞外バッファーを、ネガティブ対照として、連続的に１２０秒間かん流し、続けて、ペリプラズム抽出物、種々の濃度のナノボディ、又は選択的ペプチドを連続的にかん流した。複数の細胞添加間の間隔を、１２０秒とした。阻害性応答を、室温（２１℃〜２４℃）において、各化合物について最低ｎ＝２で記録した。
【０４５４】
IonFluxデータ算入基準及びデータ分析
データ点を、以下の場合に許容した。
Ａ）自動集団パッチ
１）個々の膜抵抗量及び安定性を、データ取得中に５０MΩ超とした。
２）電流振幅量及び安定性を、ネガティブ対照後に＋４０mVで５nA超とした。
３）データ取得中に、上昇／降下  １０％未満
４）予想範囲内の標準的なＩＣ５０値
Ｂ）自動単独細胞パッチ
１）個々の膜抵抗量及び安定性を、データ取得中に５００MΩ超とした。
２）電流振幅量及び安定性を、ネガティブ対照後に＋４０mVで２００pA超とした。
３）データ取得中に、上昇／降下  １０％未満
４）予想範囲内の標準的なＩＣ５０値
【０４５５】
電流を、IonFluxソフトウェア（Fluxion Biosciences）を使用して測定し、化合物に対する曝露中に連続してモニターした。外れ値を除外して、失われた記録をフィルターした。測定電流を、化合物添加前に、平均持続電流補正振幅により正規化した（図２Ｂ）。電流阻害を、各化合物アプライの１２０秒後に残った応答により推定した。IonFluxソフトウェア（Fluxion Biosciences）、Microsoft Excel（Microsoft）、及びPrism 6（GraphPad Software）を、電流分析に使用した。
【０４５６】
３．３  Ｋｖ１．３発現細胞に結合する１２５Ｉ−マルガトキシンをブロックするナノボディについてのスクリーニング
ペリプラズム抽出物を、発現させたナノボディのブロック能を評価するために、放射性リガンド１２５Ｉ−マルガトキシン競合アッセイ法においてスクリーニングした。カニクイザルＫｖ１．３を、Ｋｖ１．３を過剰発現しているＣＨＯ細胞上で提示させた。
【０４５７】
マルガトキシンのＫｖ１．３を発現させた細胞への結合を検出するために、放射性ラベルトキシンを使用した（１２５Ｉ−マルガトキシン、ＭｇＴＸ、Perkin Elmer, NEX083）。アッセイ法を設定するために、まず、放射性ラベル１２５Ｉ−マルガトキシンの滴定系列を、ＣＨＯ−ｃｙＫｖ１．３及び親ＣＨＯ  Ｋ１細胞に行った。スクリーニングの最大感度を有するように、ＥＣ３０濃度（１５０pM）を、スクリーニング及びまたその後の競合、そして特徴決定に選択した。
【０４５８】
簡潔に、ペリプラズム抽出物 ３５μLを、１５０pM ラベルマルガトキシン（５０μL）及び、前日にポリ−Ｄ−リシンコート９６ウェルプレート（BD Biocoat, Cat354620）に、合計２００μLで播種した４００００個のＣＨＯ−ｃｙＫｖ１．３細胞に加えた。ＲＴでの２時間のインキュベーション後、細胞を、２回洗浄し、その後、リードアウトを、TopCount device（Perkin Elmer）において、１００μL/ウェル MicroScint-20（Perkin Elmer）により行った。
【０４５９】
参照化合物として、ＳｈＫ−１ａＪ（Smartox, #08SHK001）及びラベルされていないマルガトキシン（Alamone labs, Cat RTM-325）の希釈系列を含ませた。対照として、ペリプラズム抽出物中にナノボディが存在しないか、又は、公知の無関係のナノボディ及びサンプルを含み、過剰のコールドマルガトキシンを含ませた条件を採用した。各サンプルについて、％  ブロックを、アッセイウインドウを決定するための対照サンプルを使用して決定した。
【０４６０】
３．４  結論
フローサイトメトリースクリーニング、電気生理学アッセイ法、又は１２５Ｉ−マルガトキシン競合アッセイ法において正にスコアされたナノボディをスクリーニングした。対応するアミノ酸配列を、表Ａ−１に示す。クローンを、その配列全体に基づいて、配列ファミリーにクラスターした。Ｋｖ１．３バインダーの２種類のＢ細胞系統に属する２つの区別できるファミリー（ファミリー１及び１２）を特定した。対応するアライメントをそれぞれ、表Ａ−４及び表Ａ−５に提供する。
【０４６１】
実施例４：精製したナノボディの特徴決定
前記実施例３で記載されたスクリーニングから選択された結合／阻害性抗Ｋｖ１．３ナノボディを、更に精製し、特徴決定した。選択したナノボディを、３重のＦｌａｇ、Ｈｉｓ６タグ付きタンパク質として、E. coli TG1中で発現させた。発現を、１mM ＩＰＴＧの添加により誘導し、３７℃で４時間継続させた。細胞培養物のスピン後、ペリプラズム抽出物を、ペレットを凍結解凍することにより調製した。これらの抽出物を、開始材料として使用した。ナノボディを、ＩＭＡＣ及びサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により精製して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで評価した場合、純度９５％であった。
【０４６２】
４．１  抗Ｋｖ１．３ナノボディの、ＣＨＯ細胞上に発現させたヒト、カニクイザル、及びラットＫｖ１．３への結合
ファミリー１及び１２の２つの例示的な一価ナノボディのＣＨＯ細胞上に発現させたヒト、カニクイザル、及びラットＫｖ１．３への結合を、ＦＡＣＳにおいて、実施例３．１で概説されたように評価した。１μMから開始して１０pMまで低下させる抗Ｋｖ１．３ナノボディの希釈系列を、細胞にアプライした。対照として、親ＣＨＯ細胞株を含ませた（図３Ａ〜Ｆを参照のこと）。両ナノボディは、ヒト、カニクイザル、及びラットＫｖ１．３に明確に結合したが、後者に対してわずかに低い活性で結合した。用量応答曲線から得られたＥＣ５０値を、表Ｂ−１に示す。
【０４６３】
【表１】
2020195399.tif 000003
【０４６４】
４．２  ＣＨＯ細胞上に発現させたカニクイザルＫｖ１．３に対する１２５Ｉ−マルガトキシン結合の、一価抗Ｋｖ１．３ナノボディによる阻害
ナノボディによる放射性ラベルマルガトキシンに対するブロック能を、ヒト１２５Ｉ−ＭｇＴＸ競合アッセイ法において、ここでは、精製したナノボディ／トキシンの希釈系列をアプライした点以外は、実施例３．３で概説されたように評価した（図４Ａ〜Ｃ）。ＭｇＴＸのヒトＫｖ１．３への相互作用のブロックにおける、ナノボディ／トキシン（ShK,Smartox, #08SHK001）についてのＩＣ５０値を、表Ｂ−２に示す。
【０４６５】
【表２】
2020195399.tif 000004
【０４６６】
４．３  ヒトＫｖ１．３発現ＨＥＫ２９３Ｈ上での一価Ｋｖ１．３阻害性ナノボディの電気生理学的特徴決定
IonFlux（商標）
選択したナノボディを、Ｋｖ１．３発現ＨＥＫ２９３Ｈ細胞を使用するIonFlux（商標）自動パッチクランプにおいて、ヒトＫｖ１．３について電気生理学的に特徴決定した。ヒトＫｖ１．３についての精製したナノボディのモデュレーション効果を電気生理学的記録により評価するための手順を、前記実施例３．２に提供する。タイムコースプロトコールを、脱分極パルスプロトコールにより引き出されたカリウム電流におけるナノボディの活性（ＩＣ５０）を評価するのに適用した（図２Ａ）。安定化期後、細胞外バッファーを、ネガティブ対照として、１２０秒間連続的にかん流させ、続けて、種々の濃度のナノボディ又は選択的ｈＫｖ１．３チャネル阻害剤であるStichodactyla helianthus（ShK-1aj, Smartox, #08SHK001）を連続的にかん流させた。化合物濃度の複数回の添加間の間隔を、１２０秒とした。最大半値阻害濃度（ＩＣ５０）を、室温で、（特に断りない限り）７点の濃度応答曲線から、各濃度において最少ｎ＝２で算出した。
【０４６７】
「洗浄」実験において、単回の高用量（３００nM）を、１２０秒の間にアプライし、続けて、洗浄中の電流回復速度を評価するために、細胞外バッファーの連続的なかん流を少なくとも５分間行った。これらの実験において、集団及び単独両方の細胞における自動パッチクランプを、電流振幅を記録するのに使用した。
【０４６８】
測定電流を、（図２Ｂで示されたように）ナノボディ添加前の平均持続電流補正振幅により正規化した。電流阻害を、各ナノボディ濃度アプライの１２０秒後に残った応答により推定した。ついで、化合物濃度についてのＩＣ５０及び傾斜を、下記式：Ｙ＝底面＋（上面−底面）／１＋１０＾（（ＬｏｇＩＣ５０−Ｘ）＊傾斜））に当て嵌めた。IonFluxソフトウェア（Fluxion Biosciences）、Microsoft Excel（Microsoft）、及びPrism 6（GraphPad Software）を、ＩＣ５０値及び電流を分析し、提供するのに使用した。
【０４６９】
その結果から、ほぼ完全な電流の回復を伴う、選択したナノボディの用量依存阻害が示される。データを、以下の表Ｂ−３に提供する。典型的な実験を、図５〜７に示す。
【０４７０】
【表３】
2020195399.tif 000005
【０４７１】
IonWorks
選択したナノボディを、Ｋｖ１．３発現チャイニーズハムスター肺（ＣＨＬ）細胞を使用するIonWorks自動かん流パッチクランプにおいて、ヒトＫｖ１．３について電気生理学的に特徴決定した。ヒトＫｖ１．３についての精製したナノボディのモデュレーション効果を電気生理学的記録により評価するための手順を、以下に提供する。
【０４７２】
IonWork Quattro
IonWorks Quattro（Molecular Devices）を、膜電圧制御を提供し、化合物のスクリーニング及び特徴決定のための直接的な電気生理学的アッセイ法を提供する、第２の生成スクリーニング装置とする。この装置は、３８４ウェルPatchPlate（商標）基板を使用する、自動ハイスループット平面かん流パッチクランプである。
【０４７３】
溶液及びナノボディの取扱い
細胞外溶液は、（mMで）：１３８ ＮａＣｌ、２．７ ＫＣｌ、０．９ ＣａＣｌ２、０．５ ＭｇＣｌ２、８ Ｎａ２ＨＰＯ４、及び１．５ ＫＨ２ＰＯ４（ＮａＯＨによりｐＨ７．３及び２８５〜２９０mOsmolar）を含有した。細胞内溶液は、（mMで）：１００ Ｋ−グルコナート、４０ ＫＣｌ、３．２ ＥＧＴＡ、５ ＨＥＰＥＳ、及び３．２ ＭｇＣｌ２（ＫＯＨによりｐＨ７．３及び３００〜３１５mOsmolar）を含有した。これらの溶液を、新鮮に調製し、４℃で１か月以内の間ストックし、使用前にろ過した。選択したナノボディを、細胞外溶液中で直接希釈して、３μM サンプル溶液を得た。９６ウェルマスタープレートを、３μM サンプル溶液 ３００μLを移すことにより準備した。プレート希釈を行った（１：３）。Ｋｖ１．３アッセイ法について、各サンプル ５０μLを、３８４ウェルプレート（Costar polypropylene, # 3657）のカラムに移した。キニジン検量線を、媒体（ｌｏｗ）及びキニジン（ｈｉｇｈ：最終アッセイ濃度３００μM）対照に沿って含ませた。
【０４７４】
細胞調製
全長ヒトＫｖ１．３チャネルを安定的に発現しているチャイニーズハムスター肺（ＣＨＬ、Essen Bioscience）細胞株を、Ｔ−１７５細胞培養フラスコ（Greinerbio-one, #660160）中で、１０％ ＦＢＳ（HyClone, # SH3007103）、１％ 非必須アミノ酸（Invitrogen, #11140）、１％ ピルビン酸ナトリウム（Invitrogen, #C11360）、１％ ペニシリン＋ストレプトマイシン（Invitrogen, #C10378）、２００μg/mL Ｇ４１８（Invitrogen, #10131）、２０mM ＨＥＰＥＳ（Invitrogen, #15630-114）、及び２９mM ＫＣｌ（Sigma, #P5405）を含有する標準的な培養培地であるDMEM（Invitrogen, #41965）を使用して培養した。IonWorks（Essen Bioscience）に使用する前に、細胞を、２５，０００個/cm2又は１２，０００個/cm2の密度で、それぞれ２又は３日間播種した。収集前の最適な細胞コンフルエントを、５０〜８０％とした。細胞を、Ｃａ２＋及びＭｇ２＋を含まないＰＢＳ（GibCo, # 14190-094） ２０mLで洗浄し、トリプシン／ＥＤＴＡ０．２５％（GibCo, #25200-056） ２mL、３７℃で６分間により剥がした。細胞を、外側バッファー（GibCo, #14040） １０mLで希釈した。懸濁液を、１５mLの遠沈管に移し、２００×ｇで２分間遠心分離した。上清を除去し、ペレットを、細胞外バッファー ４．５mLで再懸濁させた。５mLのCorning Costar（登録商標）stripette（Sigma-Aldrich, #CLS4487）による約３回の滴定後に、更に７０回の滴定を、２００μLのピペットにより行った。細胞懸濁液（１mL当たりに３００〜５００万個の細胞密度）を、IonWorks内の細胞ボートに加えた。実験をした。
【０４７５】
IonWorks手順及びアッセイ法
IonWorks自動パッチクランプ電気生理学の基本原理は、Schroeder et al.（J Biomol Screen 8(1):50-64, 2003）に記載されている。そこで概説された実験では、Finkel et al.（J Biomol Screen 11(5):488-96, 2006）に記載された集団パッチクランプ（ＰＰＣ）構成が使用された。単独細胞モード（ＨＴ）または集団（ＰＰＣ）モードのいずれかを、Ｋｖイオンチャネルにより決まるアッセイ法に使用した。ＰＰＣモードにおいて、ウェル当たりに最大６４個の細胞からの電流の集合平均を記録した。
【０４７６】
かん流パッチクランプ構成を得るために、電気的アクセスを、内側溶液中に１００μg/mL アンホテリシン（Sigma, #A4888）を使用して達成した。最初に、細胞を、−８０mVで３０秒間保持した。３Hzパルス間隔での、１００m秒間の−８０mVから＋５０mVへの１５回の脱分極ステップ（Ｐ１〜Ｐ１５）のパルストレインを、（化合物添加前の）対照条件において行った。ついで、ナノボディを、６〜７分間インキュベーションし、その後、２回目の測定に、（図８Ａで示されたのと）同一のパルストレインを使用した。
【０４７７】
IonWorksデータ算入基準及びデータ分析
データ点を、下記のウェル及びプレートの品質管理基準に合致した場合に許容した。
１）個々のシール抵抗、化合物リードの前後において、２０MΩ超。
２）個々のピークＫｖ１．ｘ電流振幅  ５００pA超。
３）プレートＺ’値  ０．４超（測定された場合）。
４）プレート平均シール抵抗  ３０MΩ超。
５）プレート平均電流振幅  ０．５nA超。
６）予想範囲内の標準的なＩＣ５０値
【０４７８】
電流を、IonWorksソフトウェア  v.2.0.4.4.（Fluxion Biosciences）を使用して測定した。Ｋｖ１．３電流を、ゲーティングステップパルスＰ１における持続電流として測定した（図８Ｂ）。化合物の効果を、化合物の存在下における電流を化合物添加前の電流で割ることにより定量した。選択的ｈＫｖ１．３チャネル阻害剤であるＳｈＫ−１ａＪを、ｈＫｖ１．３アッセイ法における参照標準として使用した。一方、Ｋｖ１．５、Ｋｖ１．６、及びｈＥＲＧアッセイ法については、キニジンを使用した。ついで、％  阻害値を、下記等式を使用することにより正規化した。
【数２】
2020195399.tif 000006
【０４７９】
その後、Ｋｖ１．３データを、キニジンによりブロックされなかった少量（約１０％）の残留外向き膜電流の影響を取り除くために、最大ブロック対照に対して更に正規化した。IonWorksソフトウェア（Fluxion Biosciences）、Microsoft Excel（Microsoft）、及びPrism 6（GraphPad Software）を、ＩＣ５０値及び電流を分析し、提供するのに使用した。
【０４８０】
ナノボディＡ０１９４００９Ｇ０９の代表的なＫｖ１．３電流トレースから、最も高い試験用量におけるほぼ完全なブロックを伴って、強力な濃度依存阻害が証明される（図９Ａ及び９Ｂ）。正規化した平均Ｉｓｕｓｔａｉｎｅｄとして測定した、ヒトＫｖ１．３チャネルの阻害についての相関濃度応答曲線を、図９Ｃに表わす。
【０４８１】
ナノボディＡ０１９４００００３の代表的なＫｖ１．３電流トレースから、低濃度（例えば、１３０pM）でのパルス相互作用に対して減衰した累積パルス（図１０Ａ）及び高濃度（例えば、１００nM）での阻害性効果（図１０Ｂ）を伴って、Ｋｖ１．３イオンチャネルにおける二相性モデュレーション効果が証明される。正規化した平均Ｉｓｕｓｔａｉｎｅｄとして測定した、ヒトＫｖ１．３チャネルの阻害についての相関濃度応答曲線を、図１０Ｃに表わす。対応するＩＣ５０値を、表Ｂ−４に提供する。
【０４８２】
【表４】
2020195399.tif 000007
【０４８３】
４．４  抗ＣＤ３による刺激後のＣＣＲ７−ＣＤ４５ＲＡ−  Ｔ細胞のＩＦＮγ生成及びＣＤ２５発現の、一価抗Ｋｖ１．３ナノボディによる阻害
精製した抗Ｋｖ１．３ナノボディを、Ｔ細胞活性化アッセイ法において特徴決定した。まず、ヒトＴ細胞を、Buffy Coat blood（健康なボランティアから、Bloodbank Gent）から、RosetteSep（StemCell Technologies, #15061）を使用して収集し、続けて、Ficoll-Paque（商標）PLUS（GE Healthcare #17-1440-03）で濃縮した。ＣＣＲ７−ＣＤ４５ＲＡ−  Ｔ細胞を、Dynabeads Biotin Binder（Invitrogen #110.47）に加えて、ＣＤ４５ＲＡ（BD Bioscience #624008）及びＣＣＲ７（BD Bioscence #624009）に対するビオチン化抗体を使用するネガティブ選択により単離した。その後、集団の純度を、フローサイトメトリーアッセイ法において、抗ＣＤ３（eBioscience # 12-0037-73）、抗ＣＤ８（BD Bioscience #345775）、抗ＣＤ４（BD Bioscience #345771）、抗ＣＤ４５ＲＯ（BD Bioscience #555493）、抗ＣＤ４５ＲＡ（BD Bioscience # 550855）、抗ラットＩｇＧ（Jackson ImmunoResearch Laboratories #112-116-143）、抗ＣＤ１９（BD Bioscience #555413）、及び抗ヒトＣＣＲ７（R&D Systems #MAB197）ラベル抗体により確認した。
【０４８４】
ついで、単離されたＣＣＲ７−ＣＤ４５ＲＡ−  Ｔ細胞を、抗ＣＤ３（eBioscience 16-0037-85；５４０ng/mL）コートした９６ウェルプレート上で、２０００００個／ウェルの濃度において、抗Ｋｖ１．３抗体及びＳｈＫポジティブ対照（Smartox, #08SHK001）の希釈系列の不存在下又は存在下で刺激した。７２時間後、ＩＦＮガンマ生成を、検出としてのビオチン化抗ヒトＩＦＮγ（BD Bioscience, #554550）及びストレプトアビジン−ＨＲＰ（Dakocytomation #P0397）との組み合わせでＥＬＩＳＡ（BD Bioscence #551221）における抗ヒトＩＦＮγ抗体捕捉により測定した（図１１Ａ〜１１Ｂ）。
【０４８５】
また加えて、ＣＤ２５発現も、フローサイトメトリーにおいて、抗ＣＤ２５抗体（BD Pharmingen, cat 557138）を使用して測定した（図１１Ｃ〜１１Ｄ）。Ａ０１９４００００３ナノボディは、Ｔ細胞の刺激をブロックしなかった。一方、Ａ０１９４００９Ｇ０９及びＡ０１９４０２０Ａ０６は、応答を明確に阻害したが、ＳｈＫと比較してより低い活性であった。
【０４８６】
抗Ｋｖ１．３一価ナノボディの平均阻害性ＩＣ５０値を、表Ｂ−５に示す。
【０４８７】
【表５】
2020195399.tif 000008
【０４８８】
実施例５：多価Ｋｖ１．３ブロックナノボディの生成及びスクリーニング
５．１  二価及び三価の単特異性及び二重特異性フォーマットの構築
活性及び／又は有効性を向上させるために、二価及び三価の分子を、遺伝子操作により構築した。２つ又は３つのナノボディを互いに、３５ＧＳリンカーにより、構築ブロック間において、遺伝的に連結させ、その後、標準的な条件に従って、Pichia中で発現させた。種々の多価構築物を、表Ａ−６で列記されたように調製した。
【０４８９】
５．２  多価抗Ｋｖ１．３ナノボディの、ＣＨＯ細胞上に発現させたヒト、カニクイザル、及びラットＫｖ１．３への結合
二価及び三価の構築物のヒト、カニクイザル、及びラットＫｖ１．３への結合を、実施例４．１で概説されたように行い、図１２Ａ〜１２Ｄに表わす。データから、その一価カウンターパートと比較して、全てのターゲットについて、フォーマットした変異体の改善された結合が示される（図３を参照のこと）。用量応答曲線から得られたＥＣ５０値を、表Ｂ−６に示す。
【０４９０】
【表６】
2020195399.tif 000009
【０４９１】
５．３  ＣＨＯ細胞上に発現させたカニクイザルＫｖ１．３に対する１２５Ｉマルガトキシン結合の多価抗Ｋｖ１．３ナノボディによる阻害
カニクイザルＫｖ１．３に対するマルガトキシン結合の阻害を、実施例３．３及び実施例４．２で記載された種々のフォーマットについて調査した（図１３Ａ〜１３Ｅ）。抗Ｋｖ１．３ナノボディは、カニクイザルＫｖ１．３に対する、１５０pM Ｉ１２５マルガトキシンの結合を、完全にブロックした。バックグラウンド（ＢＧ）は、Ｉ１２５マルガトキシンを加えなかった対照条件とする。明確に改善された活性が、その一価カウンターパートと比較して観察された（図４）。得られたＩＣ５０値の概観を、表Ｂ−７に示す。
【０４９２】
【表７】
2020195399.tif 000010
【０４９３】
５．４  ヒトＫｖ１．３発現ＨＥＫ２９３Ｈ細胞及びＫｖ１．３発現ＣＨＬ細胞についての、多価Ｋｖ１．３阻害性ナノボディの電気生理学的特徴決定
IonFlux（商標）
選択したナノボディを、Ｋｖ１．３発現ＨＥＫ２９３Ｈ細胞を使用するIonFlux（商標）自動パッチクランプにおいて、ヒトＫｖ１．３について電気生理学的に特徴決定した。ヒトＫｖ１．３についての精製したナノボディのモデュレーション効果を電気生理学的記録により評価するための完全な手順を、実施例３．２及び４．３に提供する。タイムコースプロトコールを、脱分極パルスプロトコールにより引き出されたカリウム電流におけるナノボディの活性（ＩＣ５０）を評価するのに適用した（図２Ａ）。「洗浄」実験において、単回の高用量ナノボディ（３００nM）を、１２０秒の間にアプライし、続けて、洗浄中の電流回復速度を評価するために、細胞外バッファーの連続的なかん流を少なくとも５分間行った。これらの実験において、集団及び単独両方の細胞の自動パッチクランプを、電流振幅を記録するのに使用した。
【０４９４】
選択したナノボディＡ０１９４００００９、Ａ０１９４０００１２、及びＡ０１９４０００１４は、最も高い用量における部分的から完全なブロックを伴って、濃度依存阻害を生じさせた。電流の回復を、細胞外バッファーによる少なくとも５分の洗浄後に、観察することができなかった（図１４〜１６）。対応するＩＣ５０値を、表Ｂ−８に提供する。
【０４９５】
【表８】
2020195399.tif 000011
【０４９６】
IonWorks
選択したナノボディを、Ｋｖ１．３発現チャイニーズハムスター肺（ＣＨＬ）細胞を使用するIonWorks自動かん流パッチクランプにおいて、ヒトＫｖ１．３について電気生理学的に特徴決定した。ヒトＫｖ１．３についての精製したナノボディのモデュレーション効果を電気生理学的記録により評価するための手順を、実施例４．３に提供する。繰り返しのゲーティング電圧コマンドプロトコールを、ナノボディ活性（ＩＣ５０）を決定するのに利用した。Ｋｖ１．３電流を、１回目のゲーティングステップパルスＰ１における持続電流として測定した（図８を参照のこと）。
【０４９７】
最大半値阻害濃度（ＩＣ５０）を、室温で、８点の濃度応答曲線から、各濃度においてｎ＝４で算出した。化合物の効果を、化合物の存在下における電流を化合物添加前の電流で割ることにより定量した。選択的ｈＫｖ１．３チャネル阻害剤であるＳｈＫ−１ａＪ（Smartox, #08SHK001）を、ｈＫｖ１．３アッセイ法における参照標準として使用した。ついで、％  阻害値を、実施例４．３で記載されたように正規化した。ついで、Ｋｖ１．３データを、ＳｈＫ−１ａＪによりブロックされなかった少量（約１０％）の残留外向き膜電流の影響を取り除くために、最大ブロック対照に対して更に正規化した。IonWorksソフトウェア  v.2.0.4.4.（Molecular devices）、Microsoft Excel（Microsoft）、及びPrism 6（GraphPad Software）を、ＩＣ５０値及び電流を分析し、提供するのに使用した。
【０４９８】
結果を、図１７〜２２に表わす。ナノボディＡ０１９４００００４のＫｖ１．３電流トレースから、低濃度（例えば、１３０pM）でのパルス相互作用に対して減衰した累積パルス（図１７Ａ）及び高濃度（例えば、１００nM）での阻害性効果（図１７Ｂ）を伴って、Ｋｖ１．３イオンチャネルにおける二相性モデュレーション効果が証明される。正規化した平均Ｉｓｕｓｔａｉｎｅｄとして測定した、ヒトＫｖ１．３チャネルの阻害についての相関濃度応答曲線を、図１７Ｃに表わす。
【０４９９】
多価ナノボディＡ０１９４００００９、Ａ０１９４０００１２、Ａ０１９４０００１４、Ａ０１９４０００１５、及びＡ０１９４０００３２の代表的なＫｖ１．３電流トレースから、最も高い試験用量における部分的から完全なブロックを伴って、濃度依存阻害が証明される（それぞれ、図１８Ａ〜１８Ｂから２２Ａ〜２２Ｂ）。正規化した平均Ｉｓｕｓｔａｉｎｅｄとして測定した、ヒトＫｖ１．３チャネルの阻害についての相関濃度応答曲線をそれぞれ、図１８Ｃ〜２２Ｃに表わす。ＩＣ５０値を、表Ｂ−９に提供する。
【０５００】
【表９】
2020195399.tif 000012
【０５０１】
５．５  抗ＣＤ３での刺激後のＣＣＲ７−ＣＤ４５ＲＡ−  Ｔ細胞によるＩＦＮγ生成及びＣＤ２５発現の、多価抗Ｋｖ１．３ナノボディによる阻害
抗ＣＤ３による刺激後のＣＣＲ７−ＣＤ４５ＲＡ−  Ｔ細胞活性化の阻害を、二価及び三価の構築物について評価した。同一のアッセイ法設定を、上記されたように使用した（実施例４．４を参照のこと）。得られた結果を、表Ｂ−１０及び図２３Ａ〜２３Ｆにまとめる。フォーマットされた二価（Ａ０１９４０００１３）及び三価（Ａ０１９４０００１５）ナノボディは、ＳｈＫと比較して類似する活性により、ＩＦＮγ分泌及びＣＤ２５発現を阻害した。二重抗原結合性ナノボディ（Ａ０１９４０００１２及びＡ０１９４０００１４）は、わずかに活性が低かった。
【０５０２】
【表１０】
2020195399.tif 000013
【０５０３】
実施例６：抗Ｋｖ１．３ナノボディの結合エピトープのマッピング
異なるＢ細胞系統に属するナノボディの結合エピトープを決定するために、抗Ｋｖ１．３ナノボディのＨＥＫ２９３Ｈ細胞上に発現させた変異Ｋｖ１．３構築物への結合を、フローサイトメトリーにおいて確認した。これらの変異体では、第１の細胞外ループ（ＥＬ１）が、無関係のアミノ酸ストレッチにより繰り返されていた。これらの構築物の発現を、蛍光ラベルアギトキシン（rAgitoxin-2-Cys-TAMRA（Alomone Labs #RTA-420-T））により、フローサイトメトリーにおいて評価した（図２４を参照のこと）。実験を、ＷＴヒトＫｖ１．３に代えてＫｖ１．３  ＥＬ１変異体を発現する細胞を使用したこと以外は、実施例４．１で概説したように行った。評価したサンプルからは、Ｋｖ１．３  ＥＬ１変異体に対して、検出可能な結合が示されなかった（データを示さず）。
【０５０４】
実施例７：アロステリック結合
トキシンであるＳｈＫとＫｖ１．３に結合するナノボディとの間の競合を評価するために、ＦＡＣＳ競合実験を、ヒトＫｖ１．３を過剰発現しているＨＥＫ２９３Ｈ細胞及びバックグラウンド細胞株として親ＨＥＫ２９３Ｈ細胞を使用して行った。検出試薬として、ＦＡＭラベルＳｈＫを使用した（6-FAM-AEEAc-Stichodactyla helianthus Neurotoxin（ShK）（Bachem, H-6088, 1046522, PRT00000366/01/01））。アッセイ法を設定するために、まず、ラベルされたＳｈｋ−ＦＡＭの滴定系列を、結合についてのＥＣ５０値を決定するために、ＨＥＫ２９３Ｈ  Ｋｖ１．３細胞において行った。アロステリック競合を決定するために、飽和濃度で作用させるように、ラベルされたＳｈＫ−ＦＡＭを、競合実験において、１００×ＥＣ５０濃度で使用した（７０nM）。
【０５０５】
簡潔に、ＳｈＫ又はナノボディの希釈系列を、ラベルされたトキシンと共に、９６ウェルプレート中の２０００００個の細胞に加えた。４℃での９０分のインキュベーション後、細胞を、３回洗浄した。その後、リードアウトを、FACS Canto（Becton Dickinson）において行った。まず、ゲートを、散乱プロファイルから決定されたインタクトな細胞について設定した。次に、死んだ細胞を、そのＴＯＰＲＯ染色による蛍光プロファイルにより、ゲーティングした（５nM、Molecular probes, T3605）。結果を、図２５に提供する。一価のＡ０１９４００００３及びＡ０１９４００９Ｇ０９のみが、ＦＡＭラベルされたＳｈＫのＫｖ１．３への結合を部分的にブロックした。一方、ラベルされていないＳｈＫは、結合を完全にブロックした。このことは、一価ナノボディが、ＳｈＫトキシンとアロステリックに競合することを示している。ＳｈＫのヒトＫｖ１．３への相互作用をブロックするナノボディについての％  阻害を、表Ｂ−１１に示す。
【０５０６】
【表１１】
2020195399.tif 000014
【０５０７】
実施例８：半減期延長の調査
ヒト血清アルブミンに結合するナノボディであるＡｌｂ１１を、フォーマットされた分子（国際公開公報第０６／１２２７８７号）のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を延長させるために、多価Ｋｖ１．３ナノボディに連結させた。種々の位置の異なる構成のナノボディを含む種々のフォーマットを調製した。調査したフォーマットの概観を、表Ａ−３に示す。
【０５０８】
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）のＡｌｂ１１ナノボディへの結合が、（多価）ナノボディの活性に影響を有する可能性があるため、半減期延長ナノボディを、ＨＳＡの存在下において、複数のアッセイ法で特徴決定した（例えば、以下の実施例８．３、８．４、及び８．５を参照こと）。
【０５０９】
８．１  ＦＡＣＳにおけるＡｌｂ１１ナノボディの位置の評価
実施例４．１で記載されたのと同様に、半減期延長抗Ｋｖ１．３ナノボディのＣＨＯ細胞上に発現させたカニクイザル及びラットＫｖ１．３への結合を、フローサイトメトリーアッセイ法において調査した（図２６Ａ〜２６Ｂ）。このアッセイ法において得られたＥＣ５０値を、表Ｂ−１２に列記する。
【０５１０】
８．２  自動パッチクランプ電気生理学を使用するＡｌｂ１１ナノボディの位置の評価
半減期（ＨＬＥ）延長ナノボディを、Ｋｖ１．３発現ＨＥＫ２９３Ｈ細胞を使用するIonFlux（商標）自動パッチクランプにおいて、ヒトＫｖ１．３について電気生理学的に特徴決定した。ヒトＫｖ１．３についての精製したナノボディのモデュレーション効果を電気生理学的記録により評価するための完全な手順を、実施例４．３及び５．４に提供する。タイムコースプロトコールを、（図２Ａで示されたように）脱分極パルスプロトコールにより引き出されたカリウム電流におけるナノボディの活性（ＩＣ５０）を評価するのに適用した。「洗浄」実験において、単回の高用量を、１２０秒の間にアプライし、続けて、細胞外バッファーの連続的なかん流を少なくとも５分間行った。これは、洗浄中の電流回復速度を評価するためである。この実験において、単独細胞自動パッチクランプを、電流振幅を記録するのに使用した。
【０５１１】
選択したナノボディは、最も高い用量での完全なブロックを伴って、濃度依存阻害を生じさせた（図２７Ａ〜２７Ｂ）。電流の回復を、細胞外バッファーによる少なくとも５分の洗浄後に、観察することができなかった（図２７Ｃ）。三価ナノボディＡ０１９４０００２９についてのＩＣ５０値は、３．８Ｅ−０９Mであった。
【０５１２】
８．３  結合ＦＡＣＳにおける活性についてのヒト血清アルブミンの影響
半減期延長ナノボディを、ＣＨＯ細胞上に発現させたカニクイザル及びラットＫｖ１．３に対する結合について、フローサイトメトリーアッセイ法において、実施例４．１で概説されたように評価した。加えて、ＨＳＡをＡｌｂ１１に結合させるために、ＨＳＡ（５０μM、Sigma, Cat A8763）を、アッセイ法中に使用した全ての試薬及びバッファーに加えた（図２６Ｃ〜２６Ｄ）。ＥＣ５０値を、表Ｂ−１２に示す。
【０５１３】
【表１２】
2020195399.tif 000015
【０５１４】
８．４  １２５Ｉマルガトキシン競合における活性についてのヒト血清アルブミンの影響
また、半減期延長ナノボディを、ＨＳＡの存在下における、ＣＨＯ細胞上に発現させたカニクイザルＫｖ１．３に対する１２５Ｉマルガトキシンの結合との競合についても、実施例４．２及び５．３で先に記載されたように評価した。まず、２５μM ＨＳＡ（Sigma, Cat A8763）の影響を、放射性ラベルＩ１２５マルガトキシンの結合について評価し、ＨＳＡがＩ１２５マルガトキシンの用量応答曲線に影響を及ぼさないことを確認した（データを示さず）。次に、比較のために、競合を、２５μM ＨＳＡ（Sigma, Cat A8763）の不存在下及び存在下において行った。図２８に表わされたデータから、ＨＳＡは構築物の活性に影響を及ぼさないことが示される。ＩＣ５０値を、表Ｂ−１３に示す。
【０５１５】
【表１３】
2020195399.tif 000016
【０５１６】
８．５  Ｔ細胞アッセイ法における半減期延長ナノボディの活性についてのヒト血清アルブミンの影響
また、半減期延長ナノボディを、実施例５．５で概説されたように、Ｔ細胞アッセイ法において試験した。ナノボディを、１０μM ＨＳＡ（Sigma, Cat A8763）の不存在下及び存在下の両方において試験した（図２９を参照のこと）。ＩＦＮγ及びＣＤ２５リードアウトの両方において得られたＩＣ５０値を、表Ｂ−１４に示す。
【０５１７】
【表１４】
2020195399.tif 000017
【０５１８】
８．６  表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）におけるヒト及びラットＨＳＡ結合
半減期延長フォーマットのヒト及びラット血清アルブミン（ＳＡ）への結合を、BIAcore T100機器でのＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）において評価した。比較のために、一価Ａｌｂ１１ナノボディも、ヒト及びラットＳＡに対する結合について試験した。
【０５１９】
簡潔に、ヒト及びラットＳＡ（Sigma; #8763及び#A6272）を、それぞれ３２０及び２９７８RUで、CM5チップに直接固定した。ついで、ナノボディを、種々の濃度（１．６nM〜１０００nM）で、１２０秒間注入し、９００秒間解離させた。結合曲線の評価を、BIAcore T100 Evaluation software V2.0.3を使用して行った。反応速度分析を、１：１相互作用モデル（ラングミュア結合）を当て嵌めることにより行った（Ｒｍａｘ＝グローバル；ＲＩ＝一定、オフセット＝０）。得られたＫＤ値を、表Ｂ−１５に見出すことができる。
【０５２０】
【表１５】
2020195399.tif 000018
【０５２１】
実施例９：抗ＣＤ２８及び抗ＣＤ３刺激後のヒトＰＢＭＣによるＩＦＮγ生成における、抗Ｋｖ１．３ナノボディの効果
抗Ｋｖ１．３阻害性ナノボディを、プレートに結合した抗ＣＤ３／ＣＤ２８刺激ＰＢＭＣによるサイトカイン分泌におけるその効果について評価した。ＳｈＫを、参照化合物として含ませた（図３０）。抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８によるＴ細胞の同時刺激は、急性感染中に遭遇する強力な免疫刺激を反映している。抗ＣＤ３による単独刺激は、むしろ、自己免疫疾患等の間における状態を再構成する中程度の免疫刺激を模倣している。
【０５２２】
簡潔に、まず、ＰＢＭＣを、Buffy Coat blood（健康なボランティアから、Bloodbank Gent）から、RosetteSep（StemCell Technologies, #15061）を使用して収集し、続けて、Ficoll-Paque（商標）PLUS（GE Healthcare #17-1440-03）で濃縮した。その後、集団の純度を、フローサイトメトリーアッセイ法において、抗ＣＤ３（eBioscience # 12-0037-73）、抗ＣＤ８（BD Bioscience #345775）、抗ＣＤ４（BD Bioscience #345771）、抗ＣＤ４５ＲＯ（BD Bioscience #555493）、抗ＣＤ４５ＲＡ（BD Bioscience # 550855）、及び抗ＣＤ１９（BD Bioscience #555413）蛍光ラベル抗体により確認した。ついで、単離したＰＢＭＣを、抗ＣＤ３（eBioscience 16-0037-85；５４０ng/ml）コートした９６ウェルプレート上で、２０００００個／ウェルの濃度において、抗ＣＤ２８（１μg/mL、Sanguin, M1650）ならびに抗Ｋｖ１．３ナノボディ及びＳｈＫ参照化合物の希釈系列の不存在下又は存在下で刺激した。７２時間後、ＩＦＮガンマ生成を、検出としてのビオチン化抗ヒトＩＦＮγ（BD Bioscience, #554550）及びストレプトアビジン−ＨＲＰ（Dakocytomation #P0397）との組み合わせでＥＬＩＳＡ（BD Bioscence #551221）における抗ヒトＩＦＮγ抗体捕捉により測定した。
【０５２３】
図３０に示されたように、抗Ｋｖ１．３ナノボディは、抗ＣＤ２８及び抗ＣＤ３刺激後におけるヒトＰＢＭＣのＩＦＮγ生成をブロックしなかったが、これらの初代細胞の抗ＣＤ３単独刺激の阻害を示す。
【０５２４】
実施例１０：従来の平面パッチクランプ電気生理学により測定されたＫｖ１．３イオンチャネルの電気生理学的特性（作用機序）についての抗Ｋｖ１．３阻害性ナノボディの効果
Ｋｖ１．３  Ｋ＋チャネルの電気生理学特性におけるＨＬＥナノボディＡ０１９４０００２９の効果を評価した。電流記録を、従来の平面パッチクランプ電気生理学により、過剰発現Ｋｖ１．３  ＣＨＬ細胞を使用して行った。この手順を、詳細な電圧コマンドプロトコールと共に、以下に提供する。
【０５２５】
溶液及びナノボディの取扱い
細胞外溶液は、（mMで）：１４０ ＮａＣｌ、５ ＫＣｌ、２ ＣａＣｌ２、１ ＭｇＣｌ２、１０ ＨＥＰＥＳ、１０ グルコース（ＮａＯＨによりｐＨ７．４及び３１０〜３３０mOsmolar）を含有した。細胞内溶液は、（mMで）：１４０ ＫＣｌ、１ ＭｇＣｌ２、２０ ＨＥＰＥＳ、１ ＥＧＴＡ（ＫＯＨによりｐＨ７．３及び２９５〜３１０mOsmolar）を含有した。これらの溶液をろ過し、４℃で６週間以内の間ストックした。１日毎の記録において、選択したナノボディのアリコートを、０．１％ ＢＳＡ（Sigma, #A4503）を含有する細胞外溶液希釈して、終濃度１０nMを与えた。
【０５２６】
細胞調製
全長ヒトＫｖ１．３チャネルを安定的に発現しているチャイニーズハムスター肺（ＣＨＬ、Essen Bioscience）細胞株を、Ｔ−１７５細胞培養フラスコ（Greinerbio-one, #660160）中で、１０％ ＦＢＳ（HyClone, # SH3007103）、１％ 非必須アミノ酸（Invitrogen, #11140）、１％ ピルビン酸ナトリウム（Invitrogen, #C11360）、１％ ペニシリン＋ストレプトマイシン（Invitrogen, #C10378）、２００μg/mL Ｇ４１８（Invitrogen, #10131）、２０mM ＨＥＰＥＳ（Invitrogen, #15630-114）、及び２９mM ＫＣｌ（Sigma, #P5405）を含有する標準的な培養培地であるDMEM（Invitrogen, #41965）を使用して培養した。収集前の最適な細胞コンフルエントを、５０〜８０％とした。細胞を、Ｃａ２＋及びＭｇ２＋を含まないＰＢＳ（GibCo, # 14190-094） ２０mLで洗浄し、トリプシン／ＥＤＴＡ０．２５％（GibCo, #25200-056） ２mL、３７℃で６分間により剥がした。細胞を、１０％ ＦＢＳ、１％ 非必須アミノ酸、１％ ピルビン酸ナトリウム、１％ ペニシリン＋ストレプトマイシン、２００μg/mL Ｇ４１８、２０mM ＨＥＰＥＳ、及び２９mM ＫＣｌを含有する標準的な培養培地 １０mLで希釈した。懸濁液を、１５mLの遠沈管に移し、２００×ｇで２分間遠心分離した。上清を除去し、ペレットを、上記されたのと同じ培地で再懸濁させた。細胞を、記録の１又は２日前に、２５，０００個/cm2又は１２，０００個/cm2の密度で、ポリ−Ｄ−リシンコートカバーガラス上に撒いた。
【０５２７】
従来の平面パッチクランプ電気生理学
ポリ−Ｄ−リシンコートカバーガラス上で増殖させたＫｖ１．３発現ＣＨＬ細胞を、細胞外溶液でかん流されている記録チャンバに入れ、Nikon Eclipse倒立顕微鏡において可視化した。電流を、標準的な細胞全体電圧クランプ技術（Hamill et al., Pflugers Arch 391:85-100, 1981）を使用し、室温において、Axopatch 200B増幅器を使用して記録し、digidata 1440A analogue-to-digital converter（Molecular Devices）を使用して、デジタルシグナルに変換し、５kHzでローパスベッセルフィルタし、１０kHzでデジタル化した。記録電極を、Sutter P-97水平ピペットプラーにおいてホウケイ酸ガラスピペットから引き出し、細胞内溶液で充填した時点で、２〜６Ωの抵抗を生じさせた。電圧クランプモードにおいて手動での吸引による密閉（１GΩ超）の形成後、−８０mVへのコマンド電圧設定及びピペットキャパシタンスを補償した。細胞膜を破り、補償循環を、キャパシタンス遷移及び８０〜８５％ 直列抵抗誤差を最少化するのに利用した（平均細胞全体キャパシタンス  １５±３ pF及び直列抵抗  ６．０±２．３MΩ；ｎ＝３６）。リーク電流を、pClamp10ソフトウェアにより提供されたＰ／４プロトコールを使用して差し引いた。膜電位を、接合部電位について補正しなかった（Clampex 10ソフトウェアにより測定した場合、４．１mV）。ナノボディメカニズムの作用を説明する電圧プロトコールの説明を、図中の凡例に提供する。サンプルを、加圧ソレノイドコントローラー（ALA Scientific Instruments, ALA-VM8/BPS-8バルブコントロールシステム）に接続され、記録細胞の近くに（約２００μm）配置したマイクロインジェクションニードルを使用してアプライした。正確な配置を、スイッチングに基づく細胞の小さな移動を観察することにより確認した。
【０５２８】
データ分析
活性化コンダクタンスプロットを、ボルツマン関数：ｇＫ／ｇＫ  ｍａｘ＝１／［１＋ｅｘｐ（Ｖ１／２−Ｖ／ｋ）］（同関数中、ｇＫは、最大コンダクタンス（ｇＫ  ｍａｘ）に関して正規化されたコンダクタンスであり、Ｖ１／２は、チャネルの半分が活性化される膜電位であり、ｋは、曲線の傾斜である）を使用して当て嵌めた。不活性化曲線の構築を可能にするために、電流を、−８０mVから＋４０mV（Ｉｍａｘ）への脱分極により生じる（Ｉ）に対して正規化し、コンディショニングパルス電位に対してプロットした。不活性化曲線を、ボルツマン関数：Ｉ／Ｉｍａｘ＝１／［１＋ｅｘｐ（Ｖ−Ｖ１／２）／ｋ］（同関数中、Ｖは、コンディショニングパルス電位であり、Ｖ１／２は、チャネルの半分が活性化される膜電位であり、ｋは、傾斜である）に従って当て嵌めた。電流振幅を、脱分極パルス中のピーク外向き膜電流又は電圧ステップの最後の５m秒の間に平均振幅として得られる持続電流のいずれかとして決定した。ナノボディ又は媒体対照の効果を、まず、インキュベーション期間の最後の処置の存在下におけるＫｖ１．３電流振幅を、添加前の対照期の最後におけるＫｖ１．３電流の振幅により割り、１００を掛けて、％  対照電流値を生成することにより定量した。％  阻害を、％  対照電流値を１００から差し引くことにより決定した。全てのデータ分析を、Axon pClamp10、Microsoft Excel v7.0及びGraphPad Prism v5.0を使用して行った。不活性化及び／又は阻害試験からの回復には、下記等式を利用する正規化された電流を使用した。
％  回復＝（Ｐ２ｐｅａｋ−Ｐ１ｓｕｓｔａｉｎｅｄ）／（Ｐ１ｐｅａｋ−Ｐ１ｓｕｓｔａｉｎｅｄ）×１００
［同等式中、Ｐ２ｐｅａｋは、試験パルスからの最大電流であり、Ｐ１ｓｕｓｔａｉｎｅｄは、コンディショニングパルスの最後における電流振幅であり、Ｐ１ｐｅａｋは、コンディショニングパルスからの最大電流である（図３４を参照のこと）。］
【０５２９】
電圧プロトコール及び結果
活性化の電圧依存性における効果を、ナノボディのアプライ前及びＡ０１９４０００２９の５分のインキュベーションでの電流電圧相関を決定することにより評価した。Ｋｖ電流を、３０秒間隔での保持電位−８０mVから１０mVステップでの＋５０mVへの脱分極パルス５００m秒により、１０nM Ａ０１９４０００２９の不存在下（図３１Ｂ）及び存在下（図３１Ｃ）において喚起した。電圧プロトコールの模式図を、図３１Ａに提供する。分析に使用したデータ点は、図３１Ｂに示されたピーク電流振幅（矢印）を表わす。ブロックの電圧依存性を決定するために、各試験電位におけるＩ−Ｖプロット及び僅かなブロックの算出を行った（データを示さず）。ボルツマン分析（Ｇ／Ｖ）を、活性化ゲーティングにおける効果を測定するのに行った。
【０５３０】
ＣＨＬ細胞中に安定的に発現させたヒトＫｖ１．３チャネルでのＫｖ１．３電流の会合及び洗浄におけるＡ０１９４０００２９の効果を評価するために、Ｋｖ１．３電流を、１５秒毎に−８０mVから＋４０mVへの試験パルスにより喚起した。ブロックの反応速度が活性化／不活性化の期間に依存するかどうかを決定するために、試験パルス期間を、２０m秒又は２００m秒のいずれかとした（図３２Ａ〜Ｂ）。記録を、対照条件（化合物添加前）及び１０nM Ａ０１９４０００２９の３〜５分のインキュベーション中において行い、続けて、化合物の洗浄を行った。ついで、ピーク及び持続電流振幅を、種々の時点に対してプロットした。加えて、不活性化の電圧依存性におけるＡ０１９４０００２９の効果を調査するために、細胞を、Ａ０１９４０００２９による３〜５分のインキュベーション中において、−８０mV又は−５０mVのいずれかで保持した。電流を、１５秒毎に−８０mVから＋４０mVへの試験パルス２００m秒により喚起した（図３３Ａ〜Ｂ）。ついで、ピーク及び持続電流振幅を、種々の時点に対してプロットした。
【０５３１】
１０nM Ａ０１９４０００２９のアプライは、チャネル活性化後の電流減衰を、顕著に増大させたが、活性化の電圧依存性を変えなかった（図３１Ｃ）。阻害性ナノボディＡ０１９４０００２９は、チャネルを繰り返しゲーティングさせた際に、Ｋｖ１．３電流の累積的ブロックを生じさせた。各パルス内において、初期ピーク及び持続電流両方の阻害が観察された。ただし、持続電流における効果の方が、急速であり、顕著であった。より短いパルスを利用した場合、ナノボディブロック効果の開始速度は、より遅かった。電流の回復は、細胞外バッファーによる洗浄後に観察することができなかった。阻害は、チャネル不活性化を必要としなかった（図３２）。種々のパルス期間を使用し、ナノボディインキュベーション中の電位を保持することにより、Ａ０１９４０００２９により誘導された阻害は、チャネルゲーティングに依存するのが明らかであることが示された（図３３）。
【０５３２】
２つのインターパルス電位（−８０mV及び−５０mV；図３４Ｃ）からの不活性化の回復を、（図３４Ａで示された）標準的な可変間隔ギャップパルスプロトコールを使用して測定した。−８０mVから＋４０mVへの最初の１秒パルス（Ｐ１）に続けて、０．５〜３０秒の間隔後に、−８０mVから＋４０mVへの１５０m秒間の２回目のパルス（Ｐ２）を行った。１０nM Ａ０１９４０００２９の不存在下及び存在下での代表的なトレースを、図３４Ｂに提供する。％  回復を、（上記されたように）算出し、不活性化の回復を示すために、パルス間隔に対してプロットした（図３４Ｃ）。Ａ０１９４０００２９の存在下において、不活性化及び阻害からの両方の回復を、インターパルス電位−８０mVを利用した場合に観察することができた。一方、インターパルス電位−５０mVを加えた際に、回復の減衰を検出することができた。このため、１０nM Ａ０１９４０００２９による阻害の軽減は、電圧依存性であることが明らかである（図３４）。
【０５３３】
実施例１１：自動パッチクランプ電気生理学により測定された、Ｋｖ１．３、Ｋｖ１．５、Ｋｖ１．６、及びＫｖ１１．１  Ｋ＋（ｈＥＲＧ）チャネルについての、Ｋｖ１．３阻害性ナノボディの比較薬理学
電気生理学記録を、全長Ｋｖ１．３、Ｋｖ１．５、及びｈＥＲＧ  Ｋ＋チャネルを発現しているチャイニーズハムスター肺（ＣＨＬ）細胞株、又は、Ｋｖ１．６  ｃＤＮＡで一過性にトランスフェクションされたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（ChanTest EZcells（商標） TT, #CT7220）で行った。ｈＥＲＧ及びＫｖ１．６用の単独細胞（ＨＴ）又はＫｖ１．３及びＫｖ１．５用の集団（ＰＰＣ）パッチクランプのいずれかを、かん流パッチクランプ構成において、IonWorks Quattro機器を使用して行った。より詳細な手順を、これらの実験で使用される細胞培養条件、細胞調製、細胞内及び細胞外溶液の粗製と共に、実施例４で説明する。ただし、凍結させたヒトＫｖ１．６−ＣＨＯ  EZcells（商標） TTを、３７℃の水浴中で、非常に素早く解凍し、５０mLのコニカルチューブに移した。１０％ ＦＢＳ（HyClone, # SH3007103）及び１％ ペニシリン＋ストレプトマイシン（Invitrogen, #C10378）を含有する増殖培地Ham’s/F12（GibCo, #31765-027） １０mL及び細胞を、２５０×ｇで５分間遠心分離した。ペレットを、新たな培地 ２０mLに新鮮に再懸濁させ、細胞クランプを分散させるように滴定した。細胞懸濁液（１mL当たりに３００万〜５００万個の密度）を、IonWorks内の細胞ボートに加えた。ついで、実験を開始した。
【０５３４】
更なる留意点：ｈＥＲＧ記録について、細胞内溶液は、（mM）：１４０ ＫＣｌ、１ ＭｇＣｌ２、１ ＥＧＴＡ、２０ ＨＥＰＥＳ（ＣｓＯＨによりｐＨ７．３及び３００〜３１５mOsmolar）を含有した。Ｋｖ１．３、Ｋｖ１．５、及びＫｖ１．６の電流を、対照条件（化合物添加前）における３Hzパルス間隔での、１００m秒間の−８０mVから＋５０mVへの１５回の脱分極ステップのパルストレインにより引き出した。ｈＥＲＧ電流を、３秒毎に、１秒間のＶＨ−７０mVから＋４０mVへ、ついで、１秒間の−３０mVへ、ついで、−７０mVへの５回のパルスのパルストレインにより引き出した。電圧プロトコールの模式図を、図３５に提供する。ついで、ナノボディを、同一のパルストレインを使用して、２回目の測定前に６〜７分間インキュベーションした。選択したナノボディを、８つの濃度において、濃度毎に最大４つのウェルで、繰り返しのゲーティング電圧コマンドにより試験した。
【０５３５】
データ点を、下記のウェル及びプレートの品質管理基準に合致した場合に許容した。
Ａ）Ｋｖ１．３及びＫｖ１．５
７）個々のシール抵抗、化合物添加前後のリードにおいて２０MΩ超
８）個々のピークＫｖ１．ｘ電流振幅  ５００pA超
９）プレートＺ’値  ０．４超（測定された場合）
１０）プレート平均シール抵抗  ３０MΩ超
１１）プレート平均電流振幅  ０．５nA超
１２）予想範囲内の標準的なＩＣ５０値
Ｂ）ｈＥＲＧ及びＫｖ１．６
１）個々のシール抵抗、化合物添加前後のリードにおいて５０MΩ超
２）個々のピークｈＥＲＧテール電流振幅  １５０pA超、又は、ピークＫｖ１．６外向き膜電流振幅  ４００pA超
３）プレート平均シール抵抗  １００MΩ超
４）プレート平均電流振幅  ０．３nA超
【０５３６】
まず、電流を、対照条件下、及び、ナノボディとの６〜７分のインキュベーション期間後に、同一のプロトコールを使用して測定した。Ｋｖ１．３、Ｋｖ１．５、及びＫｖ１．６電流を、１回目のゲーティングステップパルスＰ１及びパルス１５において、ピーク及び持続電流として測定した。ｈＥＲＧ電流を、（図３５で示したように）パルスＰ５からのテールステップにおけるピークにおいて測定した。化合物の効果を、化合物の存在下における電流を化合物添加前の電流で割ることにより定量した。ついで、この％  阻害値を、実施例４で記載されたように正規化した。ついで、Ｋｖ１．３及びＫｖ１．５のデータを、キニジンによりブロックされなかった少量（約１０％）の残留外向き膜電流の影響を取り除くために、最大ブロック対照に対して更に正規化した。Ｋｖ１．６については、小さい（平均電流０．２４nA）非特異的外向き膜電流を、全ての電流から分析前に差し引いた。
【０５３７】
チャネルを阻害するのに必要とされるナノボディ濃度の比較に基づいて、全ての選択したナノボディは、Ｋｖ１．５、Ｋｖ１．６、及びｈＥＲＧ  Ｋ＋チャネルに対するオフターゲット効果についての証拠なしに、Ｋｖ１．３について顕著な選択性（すなわち、１０００倍超）を表わした。試験した最も高い濃度（すなわち、１μM）での最大ブロックは、全ての他のチャネルにおいて、５０％未満であった（図３６）。
【０５３８】
実施例１２：遅延型過敏（ＤＴＨ）ラットモデルにおける抗Ｋｖ１．３ナノボディの評価
遅延型過敏（ＤＴＨ）反応は、皮膚ホーミングエフェクターメモリーＴ細胞により主に媒介される、皮下感作及び反応性ハプテン、例えば、２，４−ジニトロフルオロベンゼン（ＤＮＦＢ）によるチャレンジに対する応答におけるＴ細胞媒介性免疫の表現である（Azam P et al., J Invest Dermatol 127(6):1419-29, 2007；Matheu MP et al., Immunity 29(4):602-14, 2008）。電位作動型カリウムチャネルＫｖ１．３は、Ｔ細胞に発現しており、Ｔ細胞活性化（主に、エフェクターメモリーＴ細胞）を維持するのに重要である。
【０５３９】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの実証実験の目的で、ウィンスターラットにおけるＤＮＦＢ誘導性遅延型過敏についての抗Ｋｖ１．３ナノボディの有効性を評価した。ラットにおけるＤＴＨ応答を、下記のように引き出した（図３７を参照のこと）。０日目（開始時）及び１日目に、４：１  アセトン／オリーブ油中で調製した、１％（wt/vol） ＤＮＦＢ １００μLを、感作のために、毛を剃った背中に塗布した。５日目に、動物を、動物の右耳介の両側に、４：１  アセトン／オリーブ油中で調製した、０．５％（wt/vol） ＤＮＦＢ ５０μLでチャレンジした。動物（ｎ＝１０匹のラット／群）に、媒体、参照化合物であるＳｈＫ、又は抗Ｋｖ１．３ナノボディ（Ａ０１９４０００２９）のいずれかの、１回又は２回の皮下（ｓ．ｃ．）注射を、チャレンジ前１２時間及び／又は１時間で受けさせた。ポジティブ対照として、動物を、デキサメタゾンで処置した（局所、チャレンジ後１時間及び６時間において、０．７５mg）。ＤＮＦＢチャレンジ前５日において、右耳介のベースライン厚みを測定した。正味の耳膨潤応答を、チャレンジ後２４時間で、バネ負荷マイクロメーターにより測定した。
【０５４０】
実験結果を、図３８に示す。媒体処置対照動物は、０．２８０±０．０３７mmの右耳厚みにおける平均増大を示した。チャレンジ後１時間及び６時間にデキサメタゾンで処置（局所）したポジティブ対照群からのラットは、耳膨潤応答において、明らかな減少を示した（０．０２７±０．０１７mmの耳厚における平均増大）。１０μg/kg 参照化合物ＳｈＫの２回のｓ．ｃ．注射で処置したラットは、媒体に対して、耳膨潤応答の統計学的に有意な減少を示した（０．２１３±０．０１９mmの耳厚における平均増大）。また、３つのナノボディ処置群は、媒体処置動物に対して、耳膨潤における比較可能で、有意な減少を示した。（ｉ）１０５μg/kg 半減期延長抗Ｋｖ１．３ナノボディＡ０１９４０００２９の等モル用量の２回の注射（チャレンジ前１２時間及び１時間）で処置した動物は、０．１７８±０．０１３mmの耳厚における平均増大を示した。（ｉｉ）Ａ０１９４０００２９の１回のみの投与（１０５μg/kg、チャレンジ前１時間）で処置した動物は、同様の耳膨潤応答を示した（０．１８４±０．０３３mmの耳厚における平均増大）。（ｉｉｉ）６９．３μg/kg 非半減期延長抗Ｋｖ１．３ナノボディＡ０１９４０００３２の等モル用量の２回の注射（チャレンジ前１２時間及び１時間）で処置した動物は、０．１９５±０．０３８ｍｍの耳厚における平均増大を示した。３つのナノボディ処置群のいずれかの間、又は、ＳｈＫ処置群とナノボディ処置群との間において、統計学的有意差は存在しなかった。
【０５４１】
まとめると、抗Ｋｖ１．３ナノボディによる処置により、参照化合物ＳｈＫと比較して、等モル用量において、媒体群に対して、ラットにおけるＤＴＨ応答の有意な減少がもたらされた。これらの結果は、自己免疫疾患における、抗Ｋｖ１．３ナノボディの免疫抑制活性を強調している。
【０５４２】
実施例１３：遅延型過敏（ＤＴＨ）ラットモデルにおける、ｉｎ  ｖｉｖｏでの実証実験及びベンチマーク試験
ウィンスターラットにおけるＤＮＦＢ誘導性遅延型過敏についての抗Ｋｖ１．３ナノボディ（Ａ０１９４０００２９）のｉｎ  ｖｉｖｏでの有効性を評価し、抗Ｋｖ１．３ペプチドトキシンであるＳｈＫ（Stichodactyla toxin）と比較した。本試験を、同じＤＴＨモデルにおけるナノボディ及びＳｈＫの先に得られた結果（実施例１２を参照のこと）から得られた非劣性限度に基づいて、８０％能力で、ＳｈＫに対するナノボディの非劣性を証明するのに設計した。ラットにおけるＤＴＨ応答を、下記のように引き出した（図３７を参照のこと）。０日目（開始時）及び１日目に、４：１  アセトン／オリーブ油中で調製した、１％（wt/vol） ＤＮＦＢ １００μLを、感作のために、毛を剃った背中に塗布した。５日目に、動物を、動物の右耳介の両側に、４：１  アセトン／オリーブ油中で調製した、０．５％（wt/vol） ＤＮＦＢ ５０μLでチャレンジした。動物（ｎ＝１０匹のラット／群）に、媒体、ベンチマーク化合物であるＳｈＫ、又は抗Ｋｖ１．３ナノボディのいずれかの、２回の皮下（ｓ．ｃ．）注射を、チャレンジ前１２時間及び／又は１時間で受けさせた。ポジティブ対照として、動物を、デキサメタゾンで処置した（局所、チャレンジ後１時間及び６時間において、０．７５mg）。ＤＮＦＢチャレンジ前５日において、右耳介のベースライン厚みを測定した。正味の耳膨潤応答を、チャレンジ後２４時間で、バネ負荷マイクロメーターにより測定した。
【０５４３】
実験結果を、図３９に示す。媒体処置対照動物は、０．２６６±０．０２７mmの右耳厚における平均増大を示した。チャレンジ後１時間及び６時間にデキサメタゾンで処置（局所）したポジティブ対照群からのラットは、耳膨潤応答において、明らかな減少を示した（０．０１８±０．０１６mmの耳厚における平均増大）。１００μg/kg 参照化合物ＳｈＫの２回のｓ．ｃ．注射により、媒体に対して、耳膨潤応答の統計学的に有意な減少がもたらされた（０．１３６±０．０２４mmの耳厚における平均増大）。等モル用量のナノボディ（１．０５mg/kg）で処置したラットは、耳膨潤における比較可能で、有意な減少を示した（０．１２０±０．０２２mmの耳厚における平均増大）。この応答は、ベンチマークＳｈＫ群と比較して、統計学的に非劣性であった。一方、５倍高い用量のナノボディ（５．２５mg/kg）で処置したラットは、１００μg/kgでのベンチマークＳｈＫ群と比較して、耳膨潤応答を減少させるのにおける５％有意差レベルにおいて、統計学的な優位性を示した（０．１０２±０．０１４mmの耳厚における平均増大）。
【０５４４】
まとめると、これらの結果から、抗Ｋｖ１．３ナノボディがラットにおけるＤＴＨ応答の処置について、ＳｈＫと比較して優れていることが証明され、自己免疫疾患の処置についてのその免疫抑制活性が強調される。
【０５４５】
実施例１４：遅延型過敏（ＤＴＨ）ラットモデルにおける抗Ｋｖ１．３ナノボディの薬物動態
抗Ｋｖ１．３ナノボディＡ０１９４０００２９の薬物動態を、ウィンスターラットにおけるＤＮＦＢ誘導性遅延型過敏モデル（実施例１２及び実施例１３を参照のこと）において決定した。動物に、０．１０５、１．０５、又は５．２５mg/kg ナノボディを投与し、血漿を、ＤＮＦＢによるチャレンジ後の複数の時点で単離した（ｎ＝４）。血漿中の合計ナノボディ濃度を、酵素結合免疫吸着アッセイ法（ＥＬＩＳＡ）を使用して測定した。簡潔に、９６ウェルマイクロタイタープレート（Maxisorp, Nunc, Wiesbaden, Germany）を、５０μL/ウェル 自社で精製した抗ナノボディナノボディ（０．５μg/mL）により、４℃で一晩コートした。次に、プレートを吸引し、ＰＢＳ／１％ カゼインにより、室温で１時間ブロックした。プレートをＰＢＳ／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄した後、サンプルを、１／１０希釈し、希釈サンプル ５０μLを、６００rpmで振とうしながら、プレート上で、室温（ＲＴ）において１時間インキュベーションした。プレートを洗浄し、５０μL/ウェル 自社製のビオチン化抗ナノボディナノボディ（ＰＢＳ／０．１％ カゼイン中の０．０５μg/mL）を、振とうしながら、ＲＴで１時間加えた。ビオチン化抗ナノボディナノボディを、６００rpmで振とうしながら、５０μL/ウェル 西洋ワサビペルオキシダーゼ−（ＨＲＰ）ラベルストレプトアビジン（ＰＢＳ／０．１％ カゼイン中の１μg/mL）を、ＲＴで０．５時間添加することにより検出した。最後の洗浄工程後に、溶解性向上ＨＲＰ−基質である３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（esTMB, SDT, Brussels, Belgium） ５０μLを加えた。アッセイ法の検出限界（ＬＯＤ）を、９．７７ng/mLとした。
【０５４６】
図４０に、ＤＮＦＢによるチャレンジ後の種々の時点での個々の動物における、Ａ０１９４０００２９の血漿薬物動態プロファイルを示す。２重の測定の平均応答を報告する。報告された最も高い血漿濃度は、０．１０５mg/kg投与群（チャレンジ後１２時間）において、１４９．４ng/mL；１．０５mg/kg投与群（チャレンジ後１２時間）において、５６２９．３ng/mL；及び、５．２５mg/kg投与群（チャレンジ後８時間）において、１７２２７ng/mLであった。
【０５４７】
まとめると、これらのデータから、Ａ０１９４０００２９を投与した後の遅延型過敏ラットモデルにおける動物の曝露が確認され、この曝露は、用量依存性であることが証明される。
【０５４８】
実施例１５：抗Ｋｖ１．３ナノボディＡ０１９４００９Ｇ０９の配列最適化
１５．１  配列最適化：配列分析
親野生型ナノボディ配列を変異させて、ヒトＶＨ３−ＪＨ生殖系コンセンサス配列に、より同一なナノボディ配列を生成した。ナノボディとヒトＶＨ３−ＪＨ生殖系コンセンサスとの間で異なるフレームワーク領域の特定のアミノ酸を、タンパク質の構造、活性、及び安定性がインタクトに維持されるような方法において、ヒトカウンターパートに変異させた。Ａ０１９４００９Ｇ０９及びＡ０１９４０２０Ａ０６配列とＶＨ３−２３／ＪＨ５ヒト生殖系とのアライメントに基づいて、中でも、４つの下記変異体を生成した。Ａ０１９４０００７１、Ａ０１９４０００７２、Ａ０１９４０００７３、及びＡ０１９４０００７４（それぞれ配列番号：５１４〜５１７）。これらの変異体は、７つの変異：Ｌ１１Ｖ、Ａ１４Ｐ、Ｇ１９Ｒ、Ｔ６２Ｓ、Ａ７４Ｓ、Ｋ８３Ｒ、及びＶ８９Ｌ（Ｋａｂａｔに従ったナンバリング）を含む。これらの変異体において、５３位におけるメチオニンが、グルタミン（Ａ０１９４０００７１及びＡ０１９４０００７２）又はアラニン（Ａ０１９４０００７３及びＡ０１９４０００７４）により更に置換されていた。加えて、変異体Ａ０１９４０００７１及びＡ０１９４０００７３は、Ｓ９４Ｇ変異を有する。変異体Ａ０１９４０００７２及びＡ０１９４０００７４は、Ｔ９７Ｅ変異を有する。対応するアミノ酸配列を、表Ａ−３及び表Ａ−９に示す。
【０５４９】
１５．２  発現プロファイルにおける４つの選択したヒト化変異体の評価
クローニング、コピー数決定、及び発現分析
この実施例では、Pichia pastoris X33への、Invitrogen/RTCからの市販の系を使用する、ナノボディＡ０１９４０００７１、Ａ０１９４０００７２、Ａ０１９４０００７３、及びＡ０１９４０００７４のクローニング、そのコピー数決定、及び、振とうフラスコ中での生成及び供給されたバッチ発酵後の発現レベルを説明する。これらの三価ナノボディ中のサブユニットは、（ＧＧＧＧＳ）ｎリンカーによりヘッド−ｔｏ−テールで融合している。
【０５５０】
ナノボディＡ０１９４０００７１、Ａ０１９４０００７２、Ａ０１９４０００７３、及びＡ０１９４０００７４をコードする遺伝子を、Pichia発現用のgBlocks（登録商標）（Integrated DNA Technologies）を使用して合成した。ナノボディ配列を、ａＭＦシグナルペプチド配列（培地への分泌のためのsaccharomycesアルファ接合因子からのシグナルペプチド）の下流とし、この配列を含むフレーム内とした。pPICZaベクター中のナノボディを、ＡＯＸ１メタノール誘導性プロモーターの制御下とした。
【０５５１】
Ｘ−３３株のトランスフォーメーションを、「pPicZalphaA、B、及びC’についてのユーザーマニュアル」（version D, 110801, Manual part no. 25-0148; Invitrogen)及びMolecular Biology 2007（Humana Press Inc.）における方法に従って、得られた発現ベクターにより行った。クローンを、ゼオシン（zeocin）含有プレート上で選択した。クローンを、ランダムに取り出し、新たなゼオシンプレート上に画線した。ｑＰＣＲを行って、そのコピー数に従って、クローンを順位付けした。各ナノボディ構築物について、低及び高コピー数を有するクローンを、ｑＰＣＲコピー数スクリーニングアッセイ法に基づいて選択した。次に、各構築物の各クローンを、図４１に示されたように、振とうフラスコ中でのその発現レベルについて試験した。この図は、培地サンプルのＳＤＳ−Ｐａｇｅ分析後の関連する発現レベルを示す。各構築物のより多くのコピー数を有するクローンは、配列最適化フォーマット（Ａ０１９４０００７１〜７４）の場合において、より高い発現レベルを示した。親クローン（Ａ０１９４０００３１）については、逆相関が存在した。
【０５５２】
中規模（２Ｌ）での発酵による生成
種々の構築物を、複雑な培地を使用する２Ｌの発酵槽規模におけるその発現レベルについて、更に評価した。細胞のバイオマスを、第１のバッチ及びグリセロール供給バッチ期、続けて、ＭｅＯＨ誘導期の間に蓄積させた。その間に、ナノボディを、発酵培地中に分泌させた。５種類の構築物の推定された発現力価を、表Ｂ−１６に示す。挿入された配列最適化変異のセットにより、推定された収量は明らかに増大した。
【０５５３】
【表１６】
2020195399.tif 000019
【０５５４】
活性アッセイ法における４つの選択したヒト化変異体の特徴決定
変異体Ａ０１９４０００７１、Ａ０１９４０００７２、Ａ０１９４０００７３、及びＡ０１９４０００７４を、実施例４．４で記載されたＴ細胞活性化アッセイ法において、Ａ０１９４０００３１及びＳｈＫトキシンと比較した。導入された変異の影響を、抗ＣＤ３による刺激後のＣＣＲ７−ＣＤ４５ＲＡ−  Ｔ細胞のＩＦＮγ生成を阻害する能力について評価した。このアッセイ法を、ＨＳＡ（２．５μM）の存在下及び不存在下の両方において行った。ＩＣ５０値を、表Ｂ−１７に示す。特定の変異について明確な影響は、ＨＳＡの不存在下及び存在下の両方において見られなかった。
【０５５５】
【表１７】
2020195399.tif 000020
【０５５６】
表
【表１８】
2020195399.tif 000021
2020195399.tif 000022
2020195399.tif 000023
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2020195399.tif 000033
【０５５７】
【表１９】
2020195399.tif 000034
2020195399.tif 000035
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【０５５８】
【表２０】
2020195399.tif 000056
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【０５５９】
【表２１】
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2020195399.tif 000066
【０５６０】
【表２２】
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【０５６１】
【表２３】
2020195399.tif 000068
【０５６２】
【表２４】
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【０５６３】
【表２５】
2020195399.tif 000071
【０５６４】
【表２６】
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2020195399.tif 000074
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【０５６５】
均等物
先に記載された明細書は、当業者が本発明を実施するのを可能にするのに十分であると考えられる。本発明は、提供された実施例による範囲に限定されない。実施例は、本発明の特定の態様及び実施態様の例示として意図したものであるためである。他の機能的に同等の実施態様は、本発明の範囲内にある。本明細書で示され、記載されたものに加えて、本発明の種々の修飾が、前述の説明から当業者に明らかとなるであろうし、添付の特許請求の範囲の範囲に入るであろう。本発明の利点及び目的は、本発明の各実施態様に必ずしも包含される必要はない。
【図１】
2020195399.tif 000076
【図２】
2020195399.tif 000077
【図３−１】
2020195399.tif 000078
【図３−２】
2020195399.tif 000079
【図３−３】
2020195399.tif 000080
【図４】
2020195399.tif 000081
【図５】
2020195399.tif 000082
【図６】
2020195399.tif 000083
【図７】
2020195399.tif 000084
【図８】
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【図９】
2020195399.tif 000086
【図１０】
2020195399.tif 000087
【図１１−１】
2020195399.tif 000088
【図１１−２】
2020195399.tif 000089
【図１２−１】
2020195399.tif 000090
【図１２−２】
2020195399.tif 000091
【図１３−１】
2020195399.tif 000092
【図１３−２】
2020195399.tif 000093
【図１３−３】
2020195399.tif 000094
【図１４】
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【図１５】
2020195399.tif 000096
【図１６】
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【図１７】
2020195399.tif 000098
【図１８】
2020195399.tif 000099
【図１９】
2020195399.tif 000100
【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
2020195399.tif 000103
【図２３−１】
2020195399.tif 000104
【図２３−２】
2020195399.tif 000105
【図２３−３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６−１】
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【図２６−２】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
2020195399.tif 000113
【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５−１】
2020195399.tif 000119
【図３５−２】
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【図３６−１】
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【図３６−２】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年9月24日(2020.9.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
カリウムチャネル３（Ｋｖ１．３）のＥＬ１細胞外ループに特異的に結合する免疫グロブリンシングル可変ドメインであって、
該免疫グロブリンシングル可変ドメインは、パッチクランプアッセイ法で決定された場合に、Ｔ細胞からのカリウムイオンの流出を減少させるか又は完全に阻害すらすることにより、Ｋｖ１．３の活性をモデュレーションし、
該免疫グロブリンシングル可変ドメインは、
４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）と、３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）とから本質的になり、ここで、
ｉ）ＣＤＲ１が、
ａ）配列番号：１８１〜２１０、又は
ｂ）配列番号：１８２のアミノ酸配列に対して、４、３、２、もしくは１つのアミノ酸差を有するアミノ酸配列
からなる群より選択され、
及び
ｉｉ）ＣＤＲ２が、
ｃ）配列番号：２６８〜２８９及び配列番号：５４１〜５５５、又は
ｄ）配列番号：２６９のアミノ酸配列に対して、４、３、２、もしくは１つのアミノ酸差を有するアミノ酸配列
からなる群より選択され、
及び
ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、
ｅ）配列番号：３９３〜４１５、又は
ｆ）配列番号：３９７のアミノ酸配列に対して、３、２、もしくは１つのアミノ酸差を有するアミノ酸配列
からなる群より選択される、
免疫グロブリンシングル可変ドメイン。
【請求項２】
ｉ）ＣＤＲ１が、
ａ）配列番号：１８１〜２１０、又は
ｂ）配列番号：１８２のアミノ酸配列に対して、４、３、２、もしくは１つのアミノ酸差を有するアミノ酸配列、ここで、
−１位において、Ｇが、ＬもしくはＲに変更されており、
−２位において、Ｌが、Ｆ、Ｐ、もしくはＩに変更されており、
−３位において、Ｌが、ＰもしくはＦに変更されており、
−４位において、Ｆが、Ｓ、ＬもしくはＩに変更されており、
−５位において、Ｓが、ＩもしくはＲに変更されており、
−６位において、Ｒが、Ｃ、Ａ、Ｐ、Ｖ、もしくはＬに変更されており、
−７位において、Ｎが、Ｈ、Ｐ、Ｉ、Ｍ、Ｙ、Ｔ、もしくはＤに変更されており、
−８位において、Ｓが、Ｔ、Ｒ、もしくはＩに変更されており、
−９位において、Ａが、ＶもしくはＴに変更されており、及び／又は
−１０位において、Ｇが、Ｓ、Ｒ、もしくはＶに変更されている、
からなる群より選択され、
及び
ｉｉ）ＣＤＲ２が、
ｃ）配列番号：２６８〜２８９及び配列番号：５４１〜５５５、又は
ｄ）配列番号：２６９のアミノ酸配列に対して、４、３、２、もしくは１つのアミノ酸差を有するアミノ酸配列、ここで、
−１位において、Ｒが、ＧもしくはＣに変更されており、
−２位において、Ｉが、Ｖ、Ｔ、Ｓ、もしくはＬに変更されており、
−３位において、Ｒが、ＧもしくはＬに変更されており、
−４位において、Ｍが、Ｓ、Ｒ、Ａ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｐ、Ｑ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、Ｉ、もしくはＴに変更されており、
−５位において、Ｇが、Ｖ、Ｓ、もしくはＴに変更されており、
−７位において、Ｓが、Ｇ、Ｃ、Ｄ、もしくはＥに変更されており、及び／又は
−８位において、Ｉが、Ｔ、Ｍ、もしくはＲに変更されている、
からなる群より選択され、
及び
ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、
ｅ）配列番号：３９３〜４１５、又は
ｆ）配列番号：３９７のアミノ酸配列に対して、３、２、もしくは１つのアミノ酸差を有するアミノ酸配列、ここで、
−１位において、Ｗが、Ｇに変更されており、
−３位において、Ｅが、Ｔ、Ｋ、Ｇ、ＡもしくはＩに変更されており、
−４位において、Ｇが、ＥもしくはＤに変更されており、
−５位において、Ｆが、Ａ、Ｌ、Ｖ、Ｙ、Ｔ、もしくはＳに変更されており、
−６位において、Ｙが、ＦもしくはＤに変更されており、
−７位において、Ｅが、ＧもしくはＫに変更されており、
−８位において、Ｙが、ＳもしくはＨに変更されており、及び／又は
−９位において、Ｗが、Ｓ、Ｇ、もしくはＣに変更されている、
からなる群より選択される、
請求項１記載の免疫グロブリンシングル可変ドメイン。
【請求項３】
前記免疫グロブリンシングル可変ドメインが、
−ＣＤＲ１が配列番号：１８２であり、ＣＤＲ２が配列番号：５４９であり、ＣＤＲ３が配列番号：３９７である、ポリペプチド；
−ＣＤＲ１が配列番号：１８２であり、ＣＤＲ２が配列番号：２６９であり、ＣＤＲ３が配列番号：３９７である、ポリペプチド；
−ＣＤＲ１が配列番号：１８２であり、ＣＤＲ２が配列番号：２６９であり、ＣＤＲ３が配列番号：３９４である、ポリペプチド；
−ＣＤＲ１が配列番号：１８１であり、ＣＤＲ２が配列番号：２６８であり、ＣＤＲ３が配列番号：３９３である、ポリペプチド；
−ＣＤＲ１が配列番号：１８１であり、ＣＤＲ２が配列番号：２６８であり、ＣＤＲ３が配列番号：３９５である、ポリペプチド；
−ＣＤＲ１が配列番号：１８１であり、ＣＤＲ２が配列番号：２６８であり、ＣＤＲ３が配列番号：３９６である、ポリペプチド；
−ＣＤＲ１が配列番号：１８１であり、ＣＤＲ２が配列番号：２７０であり、ＣＤＲ３が配列番号：３９３である、ポリペプチド；
−ＣＤＲ１が配列番号：１８３であり、ＣＤＲ２が配列番号：２６８であり、ＣＤＲ３が配列番号：３９３である、ポリペプチド；
−ＣＤＲ１が配列番号：１８４であり、ＣＤＲ２が配列番号：２６８であり、ＣＤＲ３が配列番号：３９３である、ポリペプチド；
−ＣＤＲ１が配列番号：１８５であり、ＣＤＲ２が配列番号：２７１であり、ＣＤＲ３が配列番号：３９８である、ポリペプチド；
−ＣＤＲ１が配列番号：１８２であり、ＣＤＲ２が配列番号：５４１であり、ＣＤＲ３が配列番号：３９４である、ポリペプチド；
−ＣＤＲ１が配列番号：１８２であり、ＣＤＲ２が配列番号：５４１であり、ＣＤＲ３が配列番号：３９７である、ポリペプチド；及び
−ＣＤＲ１が配列番号：１８２であり、ＣＤＲ２が配列番号：５４９であり、ＣＤＲ３が配列番号：３９４である、ポリペプチド
の群より選択される、
請求項１又は２記載の免疫グロブリンシングル可変ドメイン。
【請求項４】
前記免疫グロブリンシングル可変ドメインが、ドメイン抗体、ドメイン抗体として使用するのに適した免疫グロブリン、シングルドメイン抗体、シングルドメイン抗体として使用するのに適した免疫グロブリン、ｄＡｂ、ｄＡｂとして使用するのに適した免疫グロブリン、ナノボディ、ＶＨＨ配列、ヒト化ＶＨＨ配列、ラクダ化ＶＨ配列、又は親和性成熟により得られたＶＨＨ配列から本質的になり、前記免疫グロブリンシングル可変ドメインが、配列番号１〜６４、４９５、４９８〜５１３及び５２３〜５４０を有する免疫グロブリン、並びに配列番号１〜６４、４９５、４９８〜５１３及び５２３〜５４０と９０％を超える配列同一性を有する免疫グロブリンからなる群より選択される、請求項１〜３のいずれか一項記載の免疫グロブリンシングル可変ドメイン。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項記載の１つ以上の免疫グロブリンシングル可変ドメインを含むか、又は、同免疫グロブリンシングル可変ドメインから本質的になる、ポリペプチド。
【請求項６】
前記ポリペプチドが、配列番号：４５１〜４７３、４９６〜４９７、及び５１４〜５２２を有するポリペプチド、並びに配列番号：４５１〜４７３、４９６〜４９７、及び５１４〜５２２に対して、８０％超の配列同一性を有するポリペプチドからなる群より選択される、請求項５記載のポリペプチド。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか一項記載の免疫グロブリンシングル可変ドメイン又は請求項５もしくは６記載のポリペプチドを含むか、又は、これらから本質的になる、化合物又は構築物であって、１つ以上のペプチドリンカーを介して連結されていてもよい１つ以上の他の基、残基、部分、又は結合ユニットを更に含む、化合物又は構築物。
【請求項８】
前記１つ以上の他の基、残基、部分、又は結合ユニットが、対応する請求項１〜４のいずれか一項記載の免疫グロブリンシングル可変ドメイン又は請求項５もしくは６記載のポリペプチドと比較して、延長した半減期を有するポリペプチドを提供する、請求項７記載の化合物又は構築物。
【請求項９】
延長した半減期を有する免疫グロブリンシングル可変ドメイン又はポリペプチドを提供する前記１つ以上の他の基、残基、部分、又は結合ユニットが、ポリエチレングリコール分子、血清タンパク質もしくはそのフラグメント、血清タンパク質に結合することができる結合ユニット、Ｆｃ部分、及び、血清タンパク質に結合することができる小型タンパク質又はペプチドからなる群より選択される、請求項８記載の化合物又は構築物。
【請求項１０】
前記化合物又は構築物が、配列番号：４６１〜４７３、４９６〜４９７、及び５１４〜５２２を有する化合物もしくは構築物、及び、配列番号：４６１〜４７３、４９６〜４９７、及び５１４〜５２２に対して、８０％超の配列同一性を有する化合物もしくは構築物からなる群より選択される、請求項９記載の化合物又は構築物。
【請求項１１】
発現ベクターに含まれていてもよい、請求項１〜４のいずれか一項記載の免疫グロブリンシングル可変ドメイン、請求項５もしくは６記載のポリペプチド、又は請求項７〜１０のいずれか一項記載の化合物もしくは構築物をコードする、核酸。
【請求項１２】
請求項１１記載の核酸を含む、ホスト又はホスト細胞。
【請求項１３】
請求項１〜４のいずれか一項記載の免疫グロブリンシングル可変ドメイン、請求項５もしくは６記載のポリペプチド、請求項７〜１０のいずれか一項記載の化合物もしくは構築物、又は請求項１１記載の核酸から選択される少なくとも１つを含む、組成物。
【請求項１４】
少なくとも１つの薬学的に許容し得る単体、希釈剤もしくは賦形剤及び／又は補助剤を更に含み、１つ以上の更なる薬学的に活性なポリペプチド及び／又は化合物を含んでいてもよい、医薬組成物である、請求項１３記載の組成物。
【請求項１５】
医薬として使用するための、請求項１３又は１４記載の組成物、請求項１〜４のいずれか一項記載の免疫グロブリンシングル可変ドメイン、請求項５又は６記載のポリペプチド、請求項７〜１０のいずれか一項記載の化合物又は構築物。
【請求項１６】
Ｔ細胞の活性化及び／又は増殖を阻害する並びに／或いはブロックするのに使用するための、請求項１５記載の組成物、免疫グロブリンシングル可変ドメイン、ポリペプチド、又は化合物もしくは構築物。
【請求項１７】
Ｋｖ１．３に関連する疾患、障害もしくは症状の治療又は予防に使用するための、請求項１５もしくは１６記載の組成物、請求項１〜４のいずれか一項記載の免疫グロブリンシングル可変ドメイン、請求項５もしくは６記載のポリペプチド、又は請求項７〜１０のいずれか一項記載の化合物もしくは構築物。
【請求項１８】
ａ）適切なホスト細胞又はホスト生物中において、又は、別の適切な発現系において、請求項１１記載の核酸配列を発現させる工程と、必要に応じてその後に、
ｂ）請求項１〜４のいずれか一項記載の免疫グロブリンシングル可変ドメイン又は請求項５もしくは６記載のポリペプチドを単離及び／又は精製する工程と
を少なくとも含む、
請求項１〜４のいずれか一項記載の免疫グロブリンシングル可変ドメイン又は請求項５もしくは６記載のポリペプチドを製造するための方法。
【外国語明細書】
2020195399000001.pdf