(57)【要約】      （修正有）【課題】正確かつ効率的に所望の塩基配列を有する２本鎖ＤＮＡ断片を製造する方法の提供。【解決手段】（１）２本鎖ＤＮＡ断片の鎖の一部に相当するセンスオリゴヌクレオチド１とアンチセンスオリゴヌクレオチド２からなるｎ個（ｎが４以上）のオリゴヌクレオチドペアを用意し、オリゴヌクレオチドペアをｍ個（ｍが４以上ｎ以下）の反応系に分け、各反応系が等濃度の各種オリゴヌクレオチドペアを含み、各反応系とＤＮＡポリメラーゼ及びｄＮＴＰとを混合し、（２）工程（１）の反応混合液を用いてＰＣＲを行い、（３）工程（２）のＰＣＲ後のｍ個の反応混合液をｐ個（ｐが２以上ｍ未満）ずつ等量混合しＰＣＲを行い、混合されるｐ個の反応混合液には隣接する反応産物が存在し、（４）工程（３）で得られた反応混合液に、２本鎖ＤＮＡ断片の完全長を増幅できるプライマーセットを添加し、ＰＣＲを行う工程からなる、二重非対称ＰＣＲ（ＤＡ−ＰＣＲ）。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
所望の塩基配列を有する２本鎖ＤＮＡ断片を、二重非対称ＰＣＲ（ＤＡ−ＰＣＲ）により製造する方法であって、
（１）それぞれが前記２本鎖ＤＮＡ断片のセンス鎖の一部に相当するｎ個（ｎが４以上の整数である）のオリゴヌクレオチド（センスオリゴヌクレオチド）と、それぞれが前記２本鎖ＤＮＡ断片のアンチセンス鎖の一部に相当するｎ個のオリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチド）とからなるｎ個のオリゴヌクレオチドペアを用意し、前記ｎ個のオリゴヌクレオチドペアをｍ個（ｍが４以上ｎ以下の整数である）の反応系に分け、それぞれの反応系が等濃度の前記各種オリゴヌクレオチドペアを含み、それぞれの反応系とＤＮＡポリメラーゼ及びｄＮＴＰとを混合し、ｍ個の反応混合液を調製する工程と、
（２）前記工程（１）の反応混合液を用いて、それぞれＰＣＲを行う工程と、
（３）前記工程（２）のＰＣＲ後のｍ個の反応混合液をｐ個（ｐが２以上ｍ未満の整数である）ずつ等量混合し、ＰＣＲを行う工程であって、前記混合されるｐ個の反応混合液には隣接する反応産物が存在する、工程と
（４）前記工程（３）で得られた反応混合液に、前記２本鎖ＤＮＡ断片の完全長を増幅できるプライマーセットを添加し、ＰＣＲを行う工程と
を備え、
前記複数種のセンスオリゴヌクレオチド及び前記複数種のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、前記２本鎖ＤＮＡ断片のセンス鎖及びアンチセンス鎖に対応させて整列した場合、隣接する前記センスオリゴヌクレオチド同士又は隣接する前記アンチセンスオリゴヌクレオチド同士は互いに連続せず、交互に隣接する前記センスオリゴヌクレオチドと前記アンチセンスオリゴヌクレオチドとが隣接する末端部において相補的な塩基配列を有する領域（重複領域）を有し、交互に隣接する前記センスオリゴヌクレオチド及び前記アンチセンスオリゴヌクレオチドによって、前記２本鎖ＤＮＡ断片の全配列がカバーされ、端から順に交互に隣接する前記センスオリゴヌクレオチドと前記アンチセンスオリゴヌクレオチドをオリゴヌクレオチドペアとする、
方法。
【請求項２】
工程（３）を２回以上繰り返して行う、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（２）及び（３）におけるＰＣＲ反応は、異なるＰＣＲプロフィールサイクル数を有する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
工程（３）におけるＰＣＲプロフィールサイクル数が、工程（２）におけるＰＣＲプロフィールサイクル数よりも大きい、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
工程（３）を２回以上繰り返して行う場合、工程（３）におけるＰＣＲプロフィールサイクル数が、工程（３）が繰り返される順に大きい、請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
工程（３）を２回以上繰り返して行う場合、工程（３）におけるＰＣＲプロフィールサイクル数が、工程がされる順に倍数で増加する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
工程（２）において、ＰＣＲが、９４〜９８℃で２０〜６０秒間及び７０〜７５℃で５〜６０秒間のＰＣＲプロフィールを２〜２０サイクル繰り返す、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
工程（３）において、ＰＣＲが、９４〜９８℃で２０〜６０秒間、５０〜８０℃で５〜６０秒間及び７０〜７５℃で２０〜６０秒間のＰＣＲプロフィールを２〜２０サイクル繰り返す、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
工程（４）において、ＰＣＲが、９４〜９８℃で５〜１０秒間、５０〜８０℃で５〜１５秒間及び７０〜７５℃で５〜３０秒間のＰＣＲプロフィールを２〜３０サイクル繰り返す、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ＤＮＡポリメラーゼが、Ｐｆｕポリメラーゼ、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅからなる群より選ばれるＤＮＡポリメラーゼである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２本鎖ＤＮＡ断片を製造する方法に関し、特にＤＡ−ＰＣＲ法による２本鎖ＤＮＡ断片を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡ合成技術によって、分子生物学者は調べたい遺伝子を塩基単位で設計することが可能になった。遺伝子合成は、異種遺伝子発現、ワクチンの開発、遺伝子治療や分子工学を含む組換えＤＮＡ技術の多くの分野で重要なツールとなっている。例えば、細胞に含まれるＤＮＡを操作することで、スパイダーシルク、がん治療、生分解性プラスチック、ディーゼル燃料等が作られている。
【０００３】
天然あるいは人工のＤＮＡ配列をアセンブルし、遺伝子を合成する様々な方法が用いられている。例えば、完全長分子の両方の鎖の完全な配列をカバーする、互いに２０ｎｔ重複する長さ４０ｎｔのオリゴヌクレオチドを使用し、Ｏｖｅｒｌａｐ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ＰＣＲ（オーバーラップ伸長ＰＣＲ：ＯＥ−ＰＣＲ）により完全長分子を作製し、２つの外側プライマーを用いたＰＣＲにより完全長分子を増幅する方法が知られている（非特許文献１）。
【０００４】
また、Ｄｕａｌ  Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃａｌ  ＰＣＲ（二重非対称ＰＣＲ：ＤＡ−ＰＣＲ）とＯＥ−ＰＣＲを組み合わせた、容易に自動化でき、単純で、再現性があり、誤差の少ない、低コストの遺伝子の合成方法が報告されている（非特許文献２）。この方法においては４つの連続して隣接するオリゴヌクレオチド毎に、外側の２つのオリゴヌクレオチドを内側のオリゴヌクレオチドの５倍モル過剰で一緒に混合し、ＤＡ−ＰＣＲを行うことを特徴としている。
【０００５】
その改良法として、複数の等濃度の交互に重複領域を有するセンスオリゴヌクレオチド及びアンチセンスオリゴヌクレオチドを混合しＰＣＲを行った後で、２本鎖ＤＮＡ断片の完全長を増幅できるプライマーセットを添加し、さらにＰＣＲを行うという２段階二重非対称ＰＣＲが提案されている（特許文献１、未公開）。この方法によって、一度により多数の隣接したオリゴヌクレオチドをＤＡ−ＰＣＲで連結し、効率的にＤＮＡを合成することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特願第２０１７−１６３１６８号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Stemmer WPら、Gene. 1995 Oct 16;164(1):49-53.
【非特許文献２】Lei Youngら、Nucleic Acids Research,2004,Vol.32,No.7 e59
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明者らは、特許文献１に記載の方法は、従来のＤＡ−ＰＣＲにおいては、一度に多数の連続して隣接するオリゴヌクレオチドを用いることができるが、一つの反応系に混合させたオリゴヌクレオチドの数が多くなると、エラーが起こる確率が上り、非特異的配列が増え、所望の２本鎖ＤＮＡ断片を製造する効率は落ちることがあることを見出した。
【０００９】
したがって本発明は、ＤＡ−ＰＣＲにおいて、正確かつ効率的に所望の塩基配列を有する２本鎖ＤＮＡ断片を製造できる方法を提供することを目的する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、目的とする２本鎖ＤＮＡ断片に対応した、複数の等濃度の交互に重複領域を有するセンスオリゴヌクレオチド及びアンチセンスオリゴヌクレオチドを、二つ以上の反応系に分け、それぞれＰＣＲを行うステップ１、１の反応系の反応混合液と当該反応産物と交互に隣接した反応産物が存在する反応系の反応混合液とを混合し、さらにＰＣＲを行うステップ２を１回以上繰り返した後、２本鎖ＤＮＡ断片の完全長を増幅できるプライマーセットを添加し、ＰＣＲを行うステップ３を行う、という多段階二重非対称ＰＣＲによって、エラーを抑えて、正しい配列を増やし、正確かつ効率的にＤＮＡを合成する方法を見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は、以下の各発明に関する。
［１］
所望の塩基配列を有する２本鎖ＤＮＡ断片を、二重非対称ＰＣＲ（ＤＡ−ＰＣＲ）により製造する方法であって、
（１）それぞれが上記２本鎖ＤＮＡ断片のセンス鎖の一部に相当するｎ個（ｎが４以上の整数である）のオリゴヌクレオチド（センスオリゴヌクレオチド）と、それぞれが上記２本鎖ＤＮＡ断片のアンチセンス鎖の一部に相当するｎ個のオリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチド）とからなるｎ個のオリゴヌクレオチドペアを用意し、上記ｎ個のオリゴヌクレオチドペアをｍ個（ｍが４以上ｎ以下の整数である）の反応系に分け、それぞれの反応系が等濃度の上記各種オリゴヌクレオチドペアを含み、それぞれの反応系とＤＮＡポリメラーゼ及びｄＮＴＰとを混合し、ｍ個の反応混合液を調製する工程と、
（２）上記工程（１）の反応混合液を用いて、それぞれＰＣＲを行う工程と、
（３）上記工程（２）のＰＣＲ後のｍ個の反応混合液をｐ個（ｐが２以上ｍ未満の整数である）ずつ等量混合し、ＰＣＲを行う工程であって、上記混合されるｐ個の反応混合液には隣接する反応産物が存在する、工程と
（４）上記工程（３）で得られた反応混合液に、上記２本鎖ＤＮＡ断片の完全長を増幅できるプライマーセットを添加し、ＰＣＲを行う工程と
を備え、
上記複数種のセンスオリゴヌクレオチド及び上記複数種のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、上記２本鎖ＤＮＡ断片のセンス鎖及びアンチセンス鎖に対応させて整列した場合、隣接する上記センスオリゴヌクレオチド同士又は隣接する上記アンチセンスオリゴヌクレオチド同士は互いに連続せず、交互に隣接する上記センスオリゴヌクレオチドと上記アンチセンスオリゴヌクレオチドとが隣接する末端部において相補的な塩基配列を有する領域（重複領域）を有し、交互に隣接する上記センスオリゴヌクレオチド及び上記アンチセンスオリゴヌクレオチドによって、上記２本鎖ＤＮＡ断片の全配列がカバーされ、端から順に交互に隣接する上記センスオリゴヌクレオチドと上記アンチセンスオリゴヌクレオチドをオリゴヌクレオチドペアとする、
方法。
［２］
工程（３）を２回以上繰り返して行う、［１］の方法。
［３］
工程（２）及び（３）におけるＰＣＲ反応は、異なるＰＣＲプロフィールサイクル数を有する、［１］又は［２］の方法。
［４］
工程（３）におけるＰＣＲプロフィールサイクル数が、工程（２）におけるＰＣＲプロフィールサイクル数よりも大きい、［１］〜［３］のいずれかの方法。
［５］
工程（３）を２回以上繰り返して行う場合、工程（３）におけるＰＣＲプロフィールサイクル数が、工程（３）が繰り返される順に大きい、［２］〜［４］のいずれかの方法。
［６］
工程（３）を２回以上繰り返して行う場合、工程（３）におけるＰＣＲプロフィールサイクル数が、工程がされる順に倍数で増加する、［１］〜［５］のいずれかの方法。
［７］
工程（２）において、ＰＣＲが、９４〜９８℃で２０〜６０秒間及び７０〜７５℃で５〜６０秒間のＰＣＲプロフィールを２〜２０サイクル繰り返す、［１］〜［６］のいずれかの方法。
［８］
工程（３）において、ＰＣＲが、９４〜９８℃で２０〜６０秒間、５０〜８０℃で５〜６０秒間及び７０〜７５℃で２０〜６０秒間のＰＣＲプロフィールを２〜２０サイクル繰り返す、［１］〜［７］のいずれかの方法。
［９］
工程（４）において、ＰＣＲが、９４〜９８℃で５〜１０秒間、５０〜８０℃で５〜１５秒間及び７０〜７５℃で５〜３０秒間のＰＣＲプロフィールを２〜３０サイクル繰り返す、［１］〜［８］のいずれかの方法。
［１０］
ＤＮＡポリメラーゼが、Ｐｆｕポリメラーゼ、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅからなる群より選ばれるＤＮＡポリメラーゼである、［１］〜［９］のいずれかの方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の多段階二重非対称ＰＣＲによって、エラーを抑えて、正しい配列を増やし、正確かつ効率的にＤＮＡを合成することができる。さらに、各ステップにおけるＰＣＲプロフィールサイクル数が順に大きくなることによって、より効率的にＤＮＡを合成することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の多段階二重非対称ＰＣＲ（ＤＡ−ＰＣＲ）法を図示したものである。
【図２】配列番号８１に記載の塩基配列を有するｐＵＣ１１８プラスミドＤＮＡの構造を示す図である。
【図３】配列番号８１に記載の塩基配列を有する所望の２本鎖ＤＮＡを製造するためのオリゴヌクレオチドの設計を示す図である。所望の２本鎖ＤＮＡのセンス鎖の全配列を示し、下線部はセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列を示し、陰影部はアンチセンスオリゴヌクレオチドに相補的な配列を示す。
【図４】実施例及び比較例のパターンＡ〜Ｃを示す図である。
【図５】実施例のパターンＤ〜Ｅを示す図である。
【図６】実施例１〜４及び比較例１のＤＡ−ＰＣＲの結果を示す図である。
【図７】実施例５のＤＡ−ＰＣＲの結果を示す図である。
【図８】実施例６のＤＡ−ＰＣＲの結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の一実施形態の所望の塩基配列を有する２本鎖ＤＮＡ断片を、二重非対称ＰＣＲ（ＤＡ−ＰＣＲ）により製造する方法は、
（１）それぞれが上記２本鎖ＤＮＡ断片のセンス鎖の一部に相当するｎ個（ｎが４以上の整数である）のオリゴヌクレオチド（センスオリゴヌクレオチド）と、それぞれが上記２本鎖ＤＮＡ断片のアンチセンス鎖の一部に相当するｎ個のオリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチド）とからなるｎ個のオリゴヌクレオチドペアを用意し、上記ｎ個のオリゴヌクレオチドペアをｍ個（ｍが４以上ｎ以下の整数である）の反応系に分け、それぞれの反応系が等濃度の上記各種オリゴヌクレオチドペアを含み、それぞれの反応系とＤＮＡポリメラーゼ及びｄＮＴＰとを混合し、ｍ個の反応混合液を調製する工程と、
（２）上記工程（１）の反応混合液を用いて、それぞれＰＣＲを行う工程と、
（３）上記工程（２）のＰＣＲ後のｍ個の反応混合液をｐ個（ｐが２以上ｍ未満の整数である）ずつ等量混合し、ＰＣＲを行う工程であって、上記混合されるｐ個の反応混合液には隣接する反応産物が存在する、工程と
（４）上記工程（３）で得られた反応混合液に、上記２本鎖ＤＮＡ断片の完全長を増幅できるプライマーセットを添加し、ＰＣＲを行う工程と
を備える。
【００１５】
ここで、２本鎖ＤＮＡ断片とは、対象とするＤＮＡの断片であって、例えば、対象とするＤＮＡがタンパク質をコードする２本鎖ＤＮＡであった場合、そのＤＮＡの一部分に相当する２本鎖ＤＮＡ断片をいい、対象とするＤＮＡがプラスミドのような２本鎖環状ＤＮＡであった場合、そのＤＮＡの一部分に相当する２本鎖ＤＮＡ断片をいう。対象とするＤＮＡが、本発明の改良ＤＡ−ＰＣＲ法で合成できる程度の短い配列であった場合、当該ＤＮＡ自体が２本鎖ＤＮＡ断片に含まれる。
【００１６】
工程（１）
工程（１）において、まず所望の塩基配列を有する２本鎖ＤＮＡ断片に対応したオリゴヌクレオチドを用意する。オリゴヌクレオチドは、それぞれが２本鎖ＤＮＡ断片のセンス鎖の一部に相当する複数種のセンスオリゴヌクレオチド、及び、それぞれが２本鎖ＤＮＡ断片のアンチセンス鎖の一部に相当する複数種のアンチセンスオリゴヌクレオチドからなり、センスオリゴヌクレオチド及びアンチセンスオリゴヌクレオチドを、２本鎖ＤＮＡ断片のセンス鎖及びアンチセンス鎖に対応させて整列した場合、隣接するセンスオリゴヌクレオチド同士又は隣接するアンチセンスオリゴヌクレオチド同士は互いに連続せず、交互に隣接するセンスオリゴヌクレオチドとアンチセンスオリゴヌクレオチドとが隣接する末端部において相補的な塩基配列を有する領域（重複領域）を有する（図１）。センスオリゴヌクレオチド１及びアンチセンスオリゴヌクレオチド２は、２本鎖ＤＮＡ断片のセンス鎖又はアンチセンス鎖の末端に相当するオリゴヌクレオチドだけは、片方の末端に重複領域３を有し、２本鎖ＤＮＡ断片のセンス鎖又はアンチセンス鎖の末端に相当するオリゴヌクレオチド以外のオリゴヌクレオチドは両末端に重複領域を有する。また、オリゴヌクレオチドは、重複領域以外の部分（以下、「ギャップ」と呼ぶ。図１中の符号４）も有する。
【００１７】
オリゴヌクレオチドの設計に際し、所望の塩基配列を有する２本鎖ＤＮＡ断片を、重複領域及びギャップを有する、２５〜９０ｂｐ、好ましくは５０〜６５ｂｐの長さに分断することによって、それぞれの分断した断片に相当するセンスオリゴヌクレオチド又はアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計する。
【００１８】
センスオリゴヌクレオチド又はアンチセンスオリゴヌクレオチドが２５〜９０ｎｔ、又は５０〜６５ｎｔの長さを有してよく、一の末端の重複領域が５〜２２ｎｔ、１０〜２２ｎｔ、１５〜２２ｎｔ、又は１８〜２２ｎｔの長さがあればよい。ギャップは１０〜５０ｎｔ、２０〜５０ｎｔ、３０〜５０ｎｔ、又は２８〜４７ｎｔの長さを有してよい。
【００１９】
交互に隣接するセンスオリゴヌクレオチド及びアンチセンスオリゴヌクレオチドによって、２本鎖ＤＮＡ断片の全配列がカバーされる（図１）。ここで、「全配列がカバーされる」とは、センス鎖単独又はアンチセンス鎖単独で見た場合、すべての塩基配列に相当するオリゴヌクレオチドがないものの、センス鎖に相当するセンスオリゴヌクレオチドがない領域は、アンチセンス鎖に相当するアンチセンスオリゴヌクレオチドがあり、その逆も成立することによって、全配列に鋳型となるオリゴヌクレオチドが含まれることをいう。
【００２０】
上記で設計したオリゴヌクレオチドは通常の公知の方法で合成し、調製することができる。また、合成受託業者に委託して調製してもよい。
【００２１】
センスオリゴヌクレオチドとアンチセンスオリゴヌクレオチドとは同じ数（ｎ）であり、ｎは４以上の整数であればよく、ｎは目的とする２本鎖ＤＮＡ断片の長さとその配列の特性によって変動し得る。ｎはｍの倍数であることが好ましく、例えばｍが４〜１０のいずれかの整数である場合、ｎは４〜１０の倍数であることが好ましい。
【００２２】
端から順に交互に隣接するセンスオリゴヌクレオチドとアンチセンスオリゴヌクレオチドをオリゴヌクレオチドペアといい、オリゴヌクレオチドペアがｎ個ある。工程（１）においてｎ個のオリゴヌクレオチドペアをｍ個（ｍが４以上ｎ以下の整数である）の反応系に分ける。ｎ個のオリゴヌクレオチドペアをｍ個の反応系に均等に分けることが好ましく、そのため、ｎがｍの倍数であることが好ましい。１つの反応系には、少なくとも１個のオリゴヌクレオチドペアを含み、複数のオリゴヌクレオチドペアを含んでよい。
【００２３】
反応系の数ｍは、４以上ｎ以下の任意の整数であればよく、好ましくはｎ未満の整数である。また、ｎ個のオリゴヌクレオチドペアをｍ個の反応系に均等に分けられるように、ｍはｎの約数、例えばｎ／（２〜２０）の整数であってよく、例えば、ｎ／２、ｎ／３、ｎ／４、ｎ／５、ｎ／８、ｎ／１０等の整数であってよい。また、工程（３）でｍの反応系をｐ個ずつ均等に混合する（ｐが同じである場合）ためには、ｍはｐの倍数であることが好ましい。例えばｐが２〜５のいずれかの整数である場合、ｍは２の倍数、３の倍数、４の倍数、又は５の倍数であることが好ましい。
【００２４】
反応系の分け方は、より具体的に、例えば図４のパターンＢ及びパターンＣの上段に示すように、所望のＤＮＡ断片を複数の断片に分断して、それぞれの断片に対応するオリゴヌクレオチドペアを１つの反応系に入れるように分けることができる。この場合は、工程（２）のＰＣＲを行った後、１つの反応系において、分断した断片の長さを有する最長のＤＮＡ断片を含む様々のＤＮＡ断片を得ることができる。
【００２５】
反応系の分け方はまた、図５のパターンＤ及びＥの上段に示すように、１つの反応系に隣接するオリゴヌクレオチドペアを入れないように分けることができる。隣接するオリゴヌクレオチドペアとは、一方のオリゴヌクレオチドペア中のセンスオリゴヌクレオチド又はアンチセンスオリゴヌクレオチドが、他方のオリゴヌクレオチドペア中のセンスオリゴヌクレオチド又はアンチセンスオリゴヌクレオチドと隣接するオリゴヌクレオチドペア同士をいう。この場合は、工程（２）のＰＣＲを行った後、１つの反応系において、最長それぞれのオリゴヌクレオチドペアによってカバーする断片の長さを有する様々のＤＮＡ断片を得ることができる。また、１つの反応系に複数の隣接しないオリゴヌクレオチドペアが入っている場合、当該反応系に含まれる複数の隣接しないオリゴヌクレオチドペアにそれぞれ隣接するオリゴヌクレオチドペアを１つの反応系にいれることが好ましい。この場合、次の工程において反応系を混合するときに、隣接するオリゴヌクレオチドペアの存在によって、ＤＮＡ断片が伸長しやすくなる。
【００２６】
工程（１）において、それぞれの反応系が等濃度の複数種のオリゴヌクレオチドペアを含み、それぞれの反応系と、ＤＮＡポリメラーゼ及びｄＮＴＰとを混合し、ｍ個の反応混合液を調製する。等濃度とは、それぞれのオリゴヌクレオチドがおよそ同じモル濃度で添加されることをいい、全く同じモル濃度であってもよく、例えば、基準モル濃度に対して０．８〜１．２倍の濃度範囲において異なる濃度であってもよく、０．９〜１．１倍の濃度範囲において異なる濃度であってもよい。各オリゴヌクレオチドの基準モル濃度は例えば、０．０５〜５００ｐｍｏｌ／μｌ、０．０５〜５０ｐｍｏｌ／μｌ、又は０．０５〜１０ｐｍｏｌ／μｌであってよい。
【００２７】
反応混合液としては、オリゴヌクレオチドペア以外に、例えば、非特許文献２に記載のＰｆｕポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）及びｄＮＴＰをｐｆｕ緩衝液（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ９．０、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ硫酸マグネシウム、６ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１％トリトンＸ−１００、０．１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ）を含むものを用いてもよく、オリゴヌクレオチドを市販の反応液、例えば、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）Ｍａｘ  Ｐｒｅｍｉｘ（タカラバイオ株式会社）に添加して用いてもよい。また、例えば非特許文献２に記載の、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）Ｍａｘ  Ｐｒｅｍｉｘに、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＨＳ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、２ｍＭ  Ｍｇ２＋、各０．４ｍＭ  ｄＮＴＰが含有する反応液に、オリゴヌクレオチドを添加したものを用いてもよい。
【００２８】
具体的な反応混合液としては、例えば、反応液ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）Ｍａｘ  Ｐｒｅｍｉｘ  ２５μｌに、上記混合オリゴヌクレオチドを１μｌ、超純水２４μｌを添加（全量５０μｌ）した反応混合液をあげることができる。
【００２９】
工程（２）
本発明において、工程（２）のＰＣＲと工程（３）のＰＣＲと工程（４）のＰＣＲを合わせて多段階の二重非対称ＰＣＲ（ＤＡ−ＰＣＲ）という場合があり、また、この場合は、工程（２）、（３）、（４）のＰＣＲをそれぞれステップ１、ステップ２、ステップ３という場合がある（図１）。工程（２）、すなわち、ステップ１において、工程（１）の反応混合液を用いて、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（ポリメラーゼ連鎖反応：ＰＣＲ）を行う。ステップ１のＰＣＲは、以下の条件により行われるが、それに限らず行うことが可能である。
【００３０】
反応条件は、通常のＰＣＲ条件を用いることができるが、アニーリングを行う条件としては、通常のアニーリング温度の条件であってもよく、高めのアニーリング温度の条件であってもよい。また、アニーリングを省略してもよい。
【００３１】
アニーリングを省略した条件としては、９４〜９８℃で２０〜６０秒間、７０〜７５℃で５〜６０秒間のＰＣＲプロフィールを繰り返す条件をあげることができる。上記ＰＣＲプロフィールを、２〜２０サイクル、５〜２０サイクル、１０〜２０、又は１５〜２０サイクル繰り返してよい。
【００３２】
アニーリングを省略しない条件としては、９４〜９８℃で２０〜６０秒間、５０〜８０℃で５〜６０秒間、７０〜７５℃で２０〜６０秒間のＰＣＲプロフィールを繰り返す条件をあげることができる。上記ＰＣＲプロフィールを、２〜２０サイクル、５〜２０サイクル、１０〜２０サイクル、又は１５〜２０サイクル繰り返してよい。
【００３３】
ステップ１の反応を行った後に、このステップ１反応混合液を精製することなくそのまま使用して、工程（３）のステップ２のＰＣＲを行う。また、必要に応じて、例えば、図４のパターンＢの上から２段目に示すように、工程（３）のステップ２のＰＣＲを行う前に、同じ反応系を含む反応混合液同士を混合して、工程（２）を１回以上繰り返してもよい。
【００３４】
工程（３）
工程（３）（ステップ２）は、工程（２）のＰＣＲ後のｍ個の反応混合液をｐ個（ｐが２以上ｍ未満の整数である）ずつ等量混合し、ＰＣＲを行うことを含み、混合されるｐ個の反応混合液には隣接する反応産物が存在する。工程（３）を２回以上繰り返して行ってもよい。
【００３５】
ここで、ｐが２以上ｍ未満の整数であればよく、それぞれの混合後の反応混合液に含まれる混合前の反応混合液の数ｐは同じであっても異なっていてもよく、同じであることが好ましい。ｐが同じである場合、ｍ個の反応混合液をｐ個ずつ均等に混合することが好ましく、この場合、ｐはｍの約数、例えば、ｍ／２、ｍ／３、ｍ／４、又はｍ／５の整数であることが好ましい。
【００３６】
反応混合液を混合する際に、隣接する反応産物が存在するｐ個の反応混合液を選ぶ。反応産物とは、それぞれの反応混合液を用いてＰＣＲを行うことによって得られた産物であり、様々ＤＮＡ断片が含まれ得、その最長の長さは、含まれるオリゴヌクレオチドペアによってカバーされる最長の長さになる。隣接する反応産物とは、当該最長のＤＮＡ断片が隣接するもの同士であることをいう。隣接する反応産物が存在するｐ個の反応混合液を用いて、ＰＣＲを行う場合、増加した長さを有する連結したオリゴヌクレオチドの混合体を得ることができる。この場合の最長の長さは、含まれるオリゴヌクレオチドペアによってカバーされる最長の長さになる。
【００３７】
隣接する反応産物が存在するｐ個の反応混合液の選び方は、より具体的に、例えば図４のパターンＢの上から３段目に示すように、また、図４のパターンＣ、図５のパターンＤ及びＥの上から２段目に示すように、工程（２）のＰＣＲを行った後、最長のＤＮＡ断片同士が隣接する隣の反応混合液を選ぶのが好ましい。また、ここで「等量混合」とは、反応物質、すなわち、オリゴヌクレオチドペア、ＤＮＡポリメラーゼ及びｄＮＴＰが反応混合液における最終濃度が「等量」、すなわち、等濃度であるように混合することを意味する。
【００３８】
図５に示したように、ｎ個のオリゴヌクレオチドペアがｍ個の反応系に均等に分けられ、また、ｍ個の反応系が均等にｐ個ずつ混合されることが好ましいが、反応系又は反応混合液によって数ｎ又は数ｐが異なっていてもよい。均等に分けなくても、また、均等に混合しなくても、オリゴヌクレオチドペア等の反応物質の最終濃度が等量であるように合わせていればよい。例えばｍが７である場合、２つずつ混合した系（ｐ＝２）を２つと、３つずつ混合した系（ｐ＝３）を１つにしてもよい。
【００３９】
工程（３）におけるＰＣＲの反応条件は、通常のＰＣＲ条件を用いることができるが、アニーリングを行う条件を高めに設定もしくは省略する条件をあげることができる。例えば、工程（２）と同様な条件により行われるが、それに限らず行うことが可能です。例えば、ステップ２でのＰＣＲの反応条件は、９４〜９８℃で２０〜６０秒間、５０〜８０℃で５〜６０秒間及び７０〜７５℃で２０〜６０秒間のＰＣＲプロフィールを、２〜３５サイクル、５〜３５サイクル、１０〜２５サイクル、又は１５〜２０サイクル繰り返してよい。
【００４０】
ステップ２の反応を行った後に、このステップ２反応混合液を精製することなくそのまま使用して、工程（４）のステップ３のＰＣＲを行う。また、必要に応じて、工程（３）を２回以上繰り返して行ってもよい。その場合は、最終的にすべての反応混合液が混合されるまで繰り返して行うのが好ましい。工程（３）を２回以上繰り返し、反応混合液を均等にｐ個ずつ混合できない場合、反応混合液によって数ｐが異なっていてもよい。この際、オリゴヌクレオチドペア等の反応物質の最終濃度が等量であるように合わせればよい。
【００４１】
工程（２）及び工程（３）におけるＰＣＲ反応は、異なるＰＣＲプロフィールサイクル数を有することが好ましく、工程（３）のサイクル数が工程（２）のサイクル数よりも大きいことが好ましく、工程（３）を２回以上繰り返して行う場合、工程（３）におけるＰＣＲプロフィールサイクル数を、工程（３）が繰り返される順に大きくするのが好ましい。すなわち、後の工程のほうがより大きいサイクル数を有することが好ましい。
【００４２】
工程（４）
工程（４）（ステップ３）は、工程（３）で得られた反応混合液に、２本鎖ＤＮＡ断片の完全長を増幅できるプライマーセットを添加し、ＰＣＲを行うことを含む。
【００４３】
工程（３）の反応混合液には、工程（３）で得られた増加した長さを有する連結したオリゴヌクレオチドの混合体を含む。この反応混合液に、上記連結したオリゴヌクレオチドの混合体が、所望の塩基配列を有する２本鎖ＤＮＡ断片の完全長まで連結した場合に想定される両末端の塩基配列に相当し、ＰＣＲにより上記連結したオリゴヌクレオチドの混合体から所望の塩基配列を有する２本鎖ＤＮＡ断片を増幅することのできるプライマーセット、すなわち、フォーワードプライマー（プライマーＦ）とリバースプライマー（プライマーＲ）とのプライマーセットを添加し、工程（４）の反応混合液とする。
【００４４】
具体的な反応混合液としては、例えば、工程（１）の反応混合液としてＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）Ｍａｘ  Ｐｒｅｍｉｘを使用する場合には、ステップ２の反応混合液１０μｌに、１０ｐｍｏｌ／μｌのプライマーＦとプライマーＲをそれぞれ１μｌ、さらに、必要に応じてＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）Ｍａｘ  Ｐｒｅｍｉｘを２５μｌ、蒸留水１３μｌを添加（全量５０μｌ）した反応混合液をあげることができる。
【００４５】
ステップ３でのＰＣＲの反応条件は９４〜９８℃で５〜１０秒間、５０〜８０℃で５〜１５秒間、７０〜７５℃で５〜３０秒間のＰＣＲプロフィールを、２〜３０サイクル、５〜３０サイクル、１０〜３０サイクル、又は１５〜３０サイクル繰り返してよい。
【００４６】
工程（４）におけるＰＣＲ反応は、工程（２）及び（３）におけるＰＣＲ反応とは、異なるＰＣＲプロフィールサイクル数を有することが好ましく、工程（４）のサイクル数が工程（２）及び（３）のサイクル数よりも大きいことが好ましく、工程（２）、工程（３）（工程（３）を２回以上繰り返して行う場合、それぞれの工程（３））、及び工程（４）におけるＰＣＲプロフィールサイクル数は、後の工程においてより大きいのが好ましい。さらに、各工程を繰り返して行う際、サイクル数が倍増するのがより好ましい。
【００４７】
所望のＤＮＡ断片の有する塩基配列が、対象とするＤＮＡの有する塩基配列を、連結したオリゴヌクレオチドの混合体で網羅している場合には、対象とする２本鎖ＤＮＡを取得することができる。
【００４８】
任意工程
（５）Ｏｖｅｒｌａｐ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ＰＣＲ（オーバーラップ伸長ＰＣＲ：ＯＥ−ＰＣＲ）
【００４９】
工程（４）のＰＣＲで得られた反応生成物が、所望の２本鎖ＤＮＡ断片以外に、所望の２本鎖ＤＮＡ断片の部分断片も含み得る。これらのＤＮＡの部分断片を精製し、ＯＥ−ＰＣＲを行うことにより、対象とする２本鎖ＤＮＡを取得することができる。また、ＯＥ−ＰＣＲを行うことによって、得られた所望の２本鎖ＤＮＡ断片をさらに別の所望の２本鎖ＤＮＡ断片と連結することもできる。
【００５０】
反応生成物の精製は、上記工程（４）で得られた反応生成物毎に行ってもよく、また、等量の反応生成物を混合した後に精製を行ってもよい。精製は、反応生成物と等容量のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）で抽出し、３倍量のエタノールで沈殿させることにより行うことができる。
【００５１】
また、市販の精製システムを利用してもよい。このような精製システムとして、例えば、Ｗｉｚａｒｄ（商標登録）  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社）をあげることができる。
【００５２】
精製したＤＮＡの部分断片を用いて、非特許文献３に記載の方法に準じてＯＥ−ＰＣＲを行うことができる。ＯＥ−ＰＣＲを行うための反応液としては非特許文献２記載の、Ｐｆｕポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）及びｄＮＴＰをｐｆｕ緩衝液（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ９．０、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ硫酸マグネシウム、６ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１％トリトンＸ−１００、０．１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ）中に含む反応液を用いることができる。また、市販の反応液、例えば、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）Ｍａｘ  Ｐｒｅｍｉｘ（タカラバイオ株式会社）を用いてもよい。
【００５３】
具体的な反応混合液としては、Ｗｉｚａｒｄ（商標登録）  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社）で別々に精製したＤＮＡの部分断片を鋳型ＤＮＡとして使用する場合には、精製したＤＮＡの部分断片を１μｌずつ、これらＤＮＡの部分断片が連結した場合に想定される両末端の塩基配列に相当し、ＰＣＲにより上記所望の塩基配列を有するＤＮＡ断片を増幅することのできるプライマーセットである、プライマーＦ（１０ｐｍｏｌ／μｌ）とプライマーＲ（１０ｐｍｏｌ／μｌ）をそれぞれ１μｌ、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）Ｍａｘを２５μｌ、超純水を最終容量５０μｌとなるように添加したものをあげることができる。
【００５４】
ＯＥ−ＰＣＲの条件は９４〜９８℃で２０〜６０秒間、５５〜８０℃で５〜６０秒間、７０〜７５℃で３０〜１２０秒間のＰＣＲプロフィールを、２〜３０サイクル、５〜３０サイクル、１０〜３０サイクル、又は１５〜３０サイクル繰り返してよい。
【００５５】
（６）完全長ＤＮＡの増幅
上記（４）又は（５）のＰＣＲで得られた対象とする塩基配列を有する２本鎖ＤＮＡは、下記通常のＰＣＲにより増幅することができる。
【００５６】
すなわち、ＰＣＲの反応生成物（１μｌ）、２００μＭ  ｄＮＴＰ、５Μ  ｐｆｕポリメラーゼ及び対象とする塩基配列を有する２本鎖ＤＮＡ断片を増幅できる、最も外側のプライマーセットを含む５０μｌの１×ｐｆｕ緩衝液中で、下記条件のＰＣＲを行うことにより増幅することができる。
【００５７】
ＰＣＲの条件は９４〜９８℃で２０〜６０秒間、５５〜８０℃で２０〜６０秒間、７０〜７５℃で６０〜１２０秒間のＰＣＲプロフィールを、２〜３０サイクル、５〜３０サイクル、１０〜３０サイクル、又は１５〜３０サイクル繰り返してよい。
【００５８】
最終ＰＣＲ産物はキャピラリー電気泳動によって確認することができる。
【実施例】
【００５９】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００６０】
（１）オリゴヌクレオチドの設計及び調製
配列番号８１に記載の塩基配列を有するｐＵＣ１１８プラスミドＤＮＡ（図２）を合成するためのオリゴヌクレオチドの設計及び調製を行った。
配列番号８１の５’末端の１〜６０番目の塩基配列に相当する配列番号１（センス鎖）
配列番号８１の５’末端から４１〜１００番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号２（アンチセンス鎖）
配列番号８１の５’末端の８３〜１４２番目の塩基配列に相当する配列番号３（センス鎖）
配列番号８１の５’末端から１２５〜１８４番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号４（アンチセンス鎖）
配列番号８１の５’末端の１６３〜２２２番目の塩基配列に相当する配列番号５（センス鎖）
配列番号８１の５’末端から２０１〜２６０番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号６（アンチセンス鎖）
配列番号８１の５’末端の２４３〜３０２番目の塩基配列に相当する配列番号７（センス鎖）
配列番号８１の５’末端から２８５〜３４４番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号８（アンチセンス鎖）
配列番号８１の５’末端の３２７〜３８５番目の塩基配列に相当する配列番号９（センス鎖）
配列番号８１の５’末端から３６８〜４２７番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号１０（アンチセンス鎖）
配列番号８１の５’末端の４０７〜４６６番目の塩基配列に相当する配列番号１１（センス鎖）
配列番号８１の５’末端から４４９〜５０８番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号１２（アンチセンス鎖）
配列番号８１の５’末端の４９０〜５４６番目の塩基配列に相当する配列番号１３（センス鎖）
配列番号８１の５’末端から５２９〜５８８番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号１４（アンチセンス鎖）
配列番号８１の５’末端の５７１〜６３０番目の塩基配列に相当する配列番号１５（センス鎖）
配列番号８１の５’末端から６１２〜６７１番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号１６（アンチセンス鎖）
配列番号８１の５’末端の６５１〜７０８番目の塩基配列に相当する配列番号１７（センス鎖）
配列番号８１の５’末端から６８７〜７４６番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号１８（アンチセンス鎖）
配列番号８１の５’末端の７２５〜７８４番目の塩基配列に相当する配列番号１９（センス鎖）
配列番号８１の５’末端から７６５〜８２２番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号２０（アンチセンス鎖）
配列番号８１の５’末端の８０１〜８６０番目の塩基配列に相当する配列番号２１（センス鎖）
配列番号８１の５’末端から８３９〜８９８番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号２２（アンチセンス鎖）
配列番号８１の５’末端の８７７〜９３６番目の塩基配列に相当する配列番号２３（センス鎖）
配列番号８１の５’末端から９１５〜９７４番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号２４（アンチセンス鎖）
配列番号８１の５’末端の９５３〜１０１０番目の塩基配列に相当する配列番号２５（センス鎖）
配列番号８１の５’末端から９８９〜１０４６番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号２６（アンチセンス鎖）
配列番号８１の５’末端の１０２９〜１０８８番目の塩基配列に相当する配列番号２７（センス鎖）
配列番号８１の５’末端から１０７１〜１１３０番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号２８（アンチセンス鎖）
配列番号８１の５’末端の１１１３〜１１７１番目の塩基配列に相当する配列番号２９（センス鎖）
配列番号８１の５’末端から１１５４〜１２１３番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号３０（アンチセンス鎖）
配列番号８１の５’末端の１１９２〜１２５１番目の塩基配列に相当する配列番号３１（センス鎖）
配列番号８１の５’末端から１２３４〜１２９３番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号３２（アンチセンス鎖）
配列番号８１の５’末端の１２７２〜１３３１番目の塩基配列に相当する配列番号３３（センス鎖）
配列番号８１の５’末端から１３１０〜１３６９番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号３４（アンチセンス鎖）
配列番号８１の５’末端の１３４８〜１４０６番目の塩基配列に相当する配列番号３５（センス鎖）
配列番号８１の５’末端から１３８７〜１４４６番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号３６（アンチセンス鎖）
配列番号８１の５’末端の１４２９〜１４８８番目の塩基配列に相当する配列番号３７（センス鎖）
配列番号８１の５’末端から１４７１〜１５３０番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号３８（アンチセンス鎖）
配列番号８１の５’末端の１５１０〜１５６９番目の塩基配列に相当する配列番号３９（センス鎖）
配列番号８１の５’末端から１５４８〜１６０７番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号４０（アンチセンス鎖）
配列番号８１の５’末端の１５８６〜１６４５番目の塩基配列に相当する配列番号４１（センス鎖）
配列番号８１の５’末端から１６２８〜１６８７番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号４２（アンチセンス鎖）
配列番号８１の５’末端の１６６６〜１７２５番目の塩基配列に相当する配列番号４３（センス鎖）
配列番号８１の５’末端から１７０４〜１７６３番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号４４（アンチセンス鎖）
配列番号８１の５’末端の１７４６〜１８０５番目の塩基配列に相当する配列番号４５（センス鎖）
配列番号８１の５’末端から１７８８〜１８４７番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号４６（アンチセンス鎖）
配列番号８１の５’末端の１８２７〜１８８５番目の塩基配列に相当する配列番号４７（センス鎖）
配列番号８１の５’末端から１８６７〜１９２６番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号４８（アンチセンス鎖）
配列番号８１の５’末端の１９０９〜１９６５番目の塩基配列に相当する配列番号４９（センス鎖）
配列番号８１の５’末端から１９４４〜２００３番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号５０（アンチセンス鎖）
配列番号８１の５’末端の１９８４〜２０４３番目の塩基配列に相当する配列番号５１（センス鎖）
配列番号８１の５’末端から２０２２〜２０８１番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号５２（アンチセンス鎖）
配列番号８１の５’末端の２０６３〜２１２２番目の塩基配列に相当する配列番号５３（センス鎖）
配列番号８１の５’末端から２１０５〜２１６４番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号５４（アンチセンス鎖）
配列番号８１の５’末端の２１４５〜２２０４番目の塩基配列に相当する配列番号５５（センス鎖）
配列番号８１の５’末端から２１８６〜２２４５番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号５６（アンチセンス鎖）
配列番号８１の５’末端の２２２４〜２２８３番目の塩基配列に相当する配列番号５７（センス鎖）
配列番号８１の５’末端から２２６２〜２３２１番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号５８（アンチセンス鎖）
配列番号８１の５’末端の２３０１〜２３６０番目の塩基配列に相当する配列番号５９（センス鎖）
配列番号８１の５’末端から２３４３〜２４０１番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号６０（アンチセンス鎖）
配列番号８１の５’末端の２３８０〜２４３９番目の塩基配列に相当する配列番号６１（センス鎖）
配列番号８１の５’末端から２４２１〜２４８０番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号６２（アンチセンス鎖）
配列番号８１の５’末端の２４６３〜２５２２番目の塩基配列に相当する配列番号６３「（センス鎖）
配列番号８１の５’末端から２５０５〜２５６２番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号６４（アンチセンス鎖）
配列番号８１の５’末端の２５４１〜２６００番目の塩基配列に相当する配列番号６５（センス鎖）
配列番号８１の５’末端から２５７９〜２６３８番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号６６（アンチセンス鎖）
配列番号８１の５’末端の２６２０〜２６７９番目の塩基配列に相当する配列番号６７（センス鎖）
配列番号８１の５’末端から２６６１〜２７２０番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号６８（アンチセンス鎖）
配列番号８１の５’末端の２７００〜２７５９番目の塩基配列に相当する配列番号６９（センス鎖）
配列番号８１の５’末端から２７４１〜２８００番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号７０（アンチセンス鎖）
配列番号８１の５’末端の２７８１〜２８４０番目の塩基配列に相当する配列番号７１（センス鎖）
配列番号８１の５’末端から２８２２〜２８８１番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号７２（アンチセンス鎖）
配列番号８１の５’末端の２８６４〜２９２３番目の塩基配列に相当する配列番号７３（センス鎖）
配列番号８１の５’末端から２９０６〜２９６３番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号７４（アンチセンス鎖）
配列番号８１の５’末端の２９４６〜３００５番目の塩基配列に相当する配列番号７５（センス鎖）
配列番号８１の５’末端から２９８８〜３０４７番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号７６（アンチセンス鎖）
配列番号８１の５’末端の３０２７〜３０８６番目の塩基配列に相当する配列番号７７（センス鎖）
配列番号８１の５’末端から３０６５〜３１２２番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号７８（アンチセンス鎖）
配列番号８１の５’末端の３１０１〜３１６０番目の塩基配列に相当する配列番号７９（センス鎖）
配列番号８１の５’末端から３１４３〜３１６３番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号８０（アンチセンス鎖）
を設計し、それぞれ合成した（株式会社ファスマックに委託）。
【００６１】
配列番号８１に示す所望のＤＮＡのセンス鎖に相当する配列を有する５７〜６０ｎｔのセンスオリゴヌクレオチドと、交互に隣接するアンチセンス鎖に相当する配列を有する２１〜６０ｎｔのアンチセンスオリゴヌクレオチドとは、１８〜２２ｎｔの相補的な配列を有する重複領域を有し、当該領域においてハイブリダイズして隣接し、これらオリゴヌクレオチドが、交互に隣接することにより配列番号８１のＤＮＡの全配列をカバーする（図３）。図３は、所望のＤＮＡ断片のセンス鎖の全配列を示し、下線部はセンスオリゴヌクレオチドを示し、陰影部はアンチセンスオリゴヌクレオチドに相補的な配列を示す。
【００６２】
＜比較例１＞
上記８０種類のオリゴヌクレオチドを用いて、下記の（１）〜（４）の手順にしたがって、配列番号８１の配列を有する２本鎖ＤＮＡ断片の合成を試みた（図４、パターンＡ）。
（１）パターンＡの上段に示したように、配列番号１〜８０の塩基配列を有する８０種類のオリゴヌクレオチド（４０ペア））を等モル混合した溶液（１０ｐｍｏｌ／μｌ）２μｌに、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）Ｍａｘを１０μｌ、超純水を最終容量２０μｌとなるように添加し、反応混合液を調製した。上記反応混合液を８個作製し、それぞれ９８℃で１分加温した後、９８℃で１０秒間、５０℃で５秒間、７２℃で５秒間／ｋｂ（配列番号８１の長さに応じで）のＰＣＲプロフィールを、５サイクル繰り返し、さらに、７２℃で２分間反応させた。
（２）パターンＡの上から二段目に示したように、上記（１）で得られた８つの反応混合液を、２つずつ全量混合して４つの反応混合液にし、上記（１）の反応条件で反応させた。
（３）パターンＡの上から三段目及び下段に示したように、上記（２）の工程を２回繰り返した。すなわち、４つの反応混合液を２つずつ全量混合し２つの反応混合液にし、上記（１）の反応条件で反応させた後、得られた２つの反応混合液を全量混合し、上記（１）の反応条件で反応させた。
（４）上記（３）で得られた反応混合液から４μｌを取り、そこに、フォーワードプライマー（プライマーＦ）として配列番号２のオリゴＤＮＡ（１０ｐｍｏｌ／μｌ）を１μｌ、リバースプライマー（プライマーＲ）として配列番号８１のオリゴＤＮＡ（１０ｐｍｏｌ／μｌ）を１μｌ、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）Ｍａｘを１０μｌ、超純水を最終容量２０μｌとなるように添加し、反応混合液を調製し、９８℃で１分加温した後、９８℃で１０秒間、５０℃で５秒間、７２℃で３０秒間のＰＣＲプロフィールを、２５サイクル繰り返し、さらに、７２℃で２分間反応させた。
【００６３】
得られた反応混合液をキャピラリー電気泳動にて所望のＤＮＡ断片の有無を確認した。結果を図６（Ａ）のレーン１に示す。所望の位置にＤＮＡ断片のバンドを検出することができなかったため、本法によっては８０断片を連結することはできなかった。
【００６４】
＜実施例１＞
上記８０種類のオリゴヌクレオチドを用いて、下記の（１）〜（６）の手順にしたがって、配列番号１の配列を有する２本鎖ＤＮＡ断片の合成を試みた（図４、パターンＢ）。
（１）パターンＢの上段に示したように、配列番号１〜４０の塩基配列を有する４０種類のオリゴヌクレオチド（２０ペア）を等モルで混合した溶液（１０ｐｍｏｌ／μｌ）２μｌに、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）Ｍａｘを１０μｌ、超純水を最終容量２０μｌとなるように添加し、反応混合液を調製した。上記反応混合液を全部で４個を作製し、９８℃で１分加温した後、９８℃で１０秒間、５０℃で５秒間、７２℃で５秒間／ｋｂ（目的産物の長さに応じで）のＰＣＲプロフィールを、５サイクル繰り返し、さらに、７２℃で２分間反応させた。
（２）パターンＢの上から二段目に示したように、上記（１）で得られた４つの反応混合液を、２つずつ全量混合して２つの反応混合液にし、上記（１）の反応条件で反応させた。
（３）パターンＢの上から三段目に示したように、上記（２）の工程を１回繰り返した。すなわち、２つの反応混合液を全量混合し、上記（１）の反応条件で反応させた。
（４）配列番号４１〜８０の塩基配列を有する４０種類のオリゴヌクレオチドも上記（１）〜（３）と同じような調製し、反応させた。
（５）パターンＢの下段に示したように、上記反応させた（３）の反応混合液と（４）の反応混合液を全量混合し、上記（１）の反応条件で反応させた。
（６）上記（５）で得られた反応混合液から０.８μｌを取り、比較例１の（４）と同じようにＰＣＲを行った。
【００６５】
得られた反応混合液をキャピラリー電気泳動にて所望のＤＮＡ断片の有無を確認した。結果を図６（Ｂ）のレーン１に示した。目的とする位置にＤＮＡのバンドを検出することができた。本発明に準じた改良ＥＦＡ−ＰＣＲでは８０断片を連結することができた。
【００６６】
＜実施例２＞
上記８０種類のオリゴヌクレオチドを用いて、下記の（１）〜（４）の手順にしたがって、配列番号８１の配列を有する２本鎖ＤＮＡ断片の合成を試みた（図４、パターンＣ）。
（１）パターンＣの上段に示したように、配列番号１〜１０、配列番号１１〜２０、配列番号２１〜３０、配列番号３１〜４０、配列番号４１〜５０、配列番号５１〜６０、配列番号６１〜７０、又は配列番号７１〜８０の塩基配列を有する１０種類（５ペア）のオリゴヌクレオチドを等モルで混合した溶液（１０ｐｍｏｌ／μｌ）２μｌに、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）Ｍａｘを１０μｌ、超純水を最終容量２０μｌとなるように添加し、８つの反応混合液を調製した。それぞれの反応混合液を９８℃で１分加温した後、９８℃で１０秒間、５０℃で５秒間、７２℃で５秒間／ｋｂ（目的産物の長さに応じで）のＰＣＲプロフィールを、５サイクル繰り返し、さらに、７２℃で２分間反応させた。
（２）パターンＣの上から二段目に示したように、上記（１）で得られた８つの反応混合液を、隣同士の２つずつ全量混合して４つの反応混合液にし、上記（１）の反応条件で反応させた。
（３）パターンＣの上から三段目及び下段に示したように、上記（２）の工程を２回繰り返した。すなわち、上記（２）で得られた４つの反応混合液を、隣同士の２つずつ全量混合して２つの反応混合液にし、上記（１）の反応条件で反応させたのち、得られた２つの反応混合液を全量混合し、上記（１）の反応条件で反応させた。
（４）上記（４）で得られた反応混合液から４μｌ又は０．８μｌを取り、比較例１の（４）と同じようにＰＣＲを行った。
【００６７】
得られた反応混合液をキャピラリー電気泳動にて所望のＤＮＡ断片の有無を確認した。結果を図６（Ａ）のレーン２及び（Ｂ）のレーン２に示した。目的とする位置にＤＮＡのバンドを検出することができた。本発明に準じた改良ＥＦＡ−ＰＣＲでは８０断片を連結することができた。
【００６８】
＜実施例３＞
上記８０種類のオリゴヌクレオチドを用いて、下記の（１）〜（４）の手順にしたがって、配列番号８１の配列を有する２本鎖ＤＮＡ断片の合成を試みた（図５、パターンＤ）。
（１）パターンＤの上段に示したように、それぞれ１０種類のオリゴヌクレオチド（５ペア）を等モルで混合した溶液（１０ｐｍｏｌ／μｌ）２μｌに、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）Ｍａｘを１０μｌ、超純水を最終容量２０μｌとなるように添加し、８つの反応混合液を調製した。それぞれの反応混合液を９８℃で１分加温した後、９８℃で１０秒間、５０℃で５秒間、７２℃で５秒間／ｋｂ（目的産物の長さに応じで）のＰＣＲプロフィールを、５サイクル繰り返し、さらに、７２℃で２分間反応させた。
（２）パターンＤの上から二段目に示したように、上記（１）で得られた８つの反応混合液を、隣同士の２つずつ全量混合して４つの反応混合液にし、上記（１）の反応条件で反応させた。
（３）パターンＤの上から三段目及び下段に示したように、上記（２）の工程を２回繰り返した。すなわち、上記（２）で得られた４つの反応混合液を、隣同士の２つずつ全量混合して２つの反応混合液にし、上記（１）の反応条件で反応させたのち、得られた２つの反応混合液を全量混合し、上記（１）の反応条件で反応させた。
（４）上記（４）で得られた反応混合液から４μｌを取り、比較例１の（４）と同じようにＰＣＲを行った。
【００６９】
得られた反応混合液をキャピラリー電気泳動にて所望のＤＮＡ断片の有無を確認した。結果を図６（Ａ）のレーン３に示した。目的とする位置にＤＮＡのバンドを検出することができた。本発明に準じた改良ＥＦＡ−ＰＣＲでは８０断片を連結することができた。
【００７０】
＜実施例４＞
上記８０種類のオリゴヌクレオチドを用いて、下記の（１）〜（４）の手順にしたがって、配列番号８１の配列を有する２本鎖ＤＮＡ断片の合成を試みた（図５、パターンＥ）。
（１）パターンＤの上段に示したように、それぞれ１０種類のオリゴヌクレオチド（５ペア）を等モルで混合した溶液（１０ｐｍｏｌ／μｌ）２μｌに、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）Ｍａｘを１０μｌ、超純水を最終容量２０μｌとなるように添加し、８つの反応混合液を調製した。それぞれの反応混合液を９８℃で１分加温した後、９８℃で１０秒間、５０℃で５秒間、７２℃で５秒間／ｋｂ（目的産物の長さに応じで）のＰＣＲプロフィールを、５サイクル繰り返し、さらに、７２℃で２分間反応させた。
（２）パターンＥの上から二段目に示したように、上記（１）で得られた８つの反応混合液を、隣同士の２つずつ全量混合して４つの反応混合液にし、上記（１）の反応条件で反応させた。
（３）パターンＥの上から三段目及び下段に示したように、上記（２）の工程を２回繰り返した。すなわち、上記（２）で得られた４つの反応混合液を、隣同士の２つずつ全量混合して２つの反応混合液にし、上記（１）の反応条件で反応させたのち、得られた２つの反応混合液を全量混合し、上記（１）の反応条件で反応させた。
（４）上記（４）で得られた反応混合液から４μｌ又は０．８μｌを取り、比較例１の（４）と同じようにＰＣＲを行った。
【００７１】
得られた反応混合液をキャピラリー電気泳動にて所望のＤＮＡ断片の有無を確認した。結果を図６（Ａ）のレーン４及び（Ｂ）のレーン３に示した。目的とする位置にＤＮＡのバンドを検出することができた。本発明に準じた改良ＥＦＡ−ＰＣＲでは８０断片を連結することができた。
【００７２】
＜実施例５＞
実施例２（パターンＣ）において各ステップにおけるＰＣＲプロフィールのサイクル数がすべて５であったのに対して、実施例５では各ステップのサイクル数を変えて検討した（図７）。
（１）ＰＣＲプロフィールのサイクル数が２回であったことを除いて、実施例２の（１）と同じように、ＰＣＲを行った。
（２）ＰＣＲプロフィールのサイクル数が４回であったことを除いて、実施例２の（２）と同じように、ＰＣＲを行った。
（３）ＰＣＲプロフィールのサイクル数が６回であったことを除いて、実施例２の（３）と同じように、ＰＣＲを行った。
（４）ＰＣＲプロフィールのサイクル数が８回であったことを除いて、実施例２の（４）と同じように、ＰＣＲを行った。
【００７３】
その結果を図７に示した。左側（レーン１）は実施例２の結果であり、右側（レーン２）は実施例５の結果であった。反応を繰り返す順に、サイクル数が大きくなると、合成の効率が良くなった。また、データを示していないが、異なる量のオリゴヌクレオチドを含む反応混合液でも同じ効果が得られた。
【００７４】
＜実施例６＞
実施例２（パターンＣ）において各ステップにおけるＰＣＲプロフィールのサイクル数がすべて５であったのに対して、実施例６ではさらに各ステップのサイクル数を変えて検討した（図８）。
【００７５】
（１）〜（４）におけるＰＣＲプロフィールのサイクル数が図８に示した回数であったことを除いて、実施例２の（１）〜（４）と同じように、ＰＣＲを行った。
【００７６】
その結果を図８に示した。左側は実施例２の結果であり、右側の３つは実施例６の結果であった。反応を繰り返す順に、サイクル数が大きくなると、合成の効率が良くなった。さらに、サイクル数が倍に大きくなると、合成の効率がさらに良くなった。また、データを示していないが、異なる量のオリゴヌクレオチドを含む反応混合液でも同じ効果が得られた。
【符号の説明】
【００７７】
１…センスオリゴヌクレオチド、２…アンチセンスオリゴヌクレオチド、３…重複領域、４…ギャップ、５…フォーワードプライマー、６…リバースプライマー。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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