(57)【要約】      （修正有）【課題】ベクターに搭載された遺伝子の一過的な高発現及び当該発現後のベクターの迅速な除去を可能とする改良されたマイナス鎖RNAウイルスベクター、及び、その利用の提供。【解決手段】マイナス鎖RNAウイルスベクターが持つP蛋白質にdegronを付加することにより、ベクター導入後に搭載遺伝子の高レベルの発現を一過的に誘導しつつ、その後、degronに依存して迅速にベクターを除去する。特に、温度感受性P蛋白質にdegronを付加した場合、細胞にベクターを感染後、２週間以内にベクターは検出限界以下にまで除去される。本発明は、リプログラミング因子等の転写因子を標的細胞において一過的に発現させ、その後、迅速にベクターを除去する際に有用であり、細胞治療や再生医療における応用が期待される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイナス鎖RNAウイルスベクターであって、該ウイルスのP蛋白質にdegronを付加するようにP遺伝子が改変されたベクター。
【請求項２】
該P蛋白質に温度感受性変異を含む、請求項１に記載のベクター。
【請求項３】
該温度感受性変異がL511F変異を含む、請求項２に記載のベクター。
【請求項４】
該温度感受性変異がD433A、R434A、およびK437Aを含む、請求項２または３に記載のベクター。
【請求項５】
該ウイルスのL蛋白質にL1361CおよびL1558Iの変異を含む、請求項１から４のいずれかに記載のベクター。
【請求項６】
DegronがmTOR degron、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）degron、PEST、TetR degron、およびauxin-inducible degron（AID）からなる群より選択される、請求項１から５のいずれかに記載のベクター。
【請求項７】
DegronがmTOR degronである、請求項１から５のいずれかに記載のベクター。
【請求項８】
DegronがPESTである、請求項１から５のいずれかに記載のベクター。
【請求項９】
DegronがDHFR degronである、請求項１から５のいずれかに記載のベクター。
【請求項１０】
DegronがTetR degronである、請求項１から５のいずれかに記載のベクター。
【請求項１１】
少なくとも１つの外来遺伝子を搭載する、請求項１から１０のいずれかに記載のベクター。
【請求項１２】
該外来遺伝子が、degronが付加された蛋白質をコードする、請求項１１に記載のベクター。
【請求項１３】
該外来遺伝子がコードする蛋白質に付加されたdegronが、P蛋白質に付加されているdegronとは異なるdegronである、請求項１２に記載のベクター。
【請求項１４】
少なくとも２つの外来遺伝子を搭載し、それぞれの外来遺伝子がコードする蛋白質に、互いに異なるdegronが付加されている、請求項１から１３のいずれかに記載のベクター。
【請求項１５】
マイナス鎖RNAウイルスがパラミクソウイルスである、請求項１から１４のいずれかに記載のベクター。
【請求項１６】
パラミクソウイルスがセンダイウイルスである、請求項１５に記載のベクター。
【請求項１７】
マイナス鎖RNAウイルスベクターの除去を促進するための方法であって、請求項１から１６のいずれかに記載のベクターを用いることを特徴とする方法。
【請求項１８】
温度を上昇して培養して除去を促進する工程を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
35〜39℃で培養して除去を促進する工程を含む、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１から１６のいずれかに記載のベクターの製造方法であって、該ベクターのゲノムRNAまたはその相補鎖をコードする核酸を、いずれもdegronが付加されていないNP、PおよびL蛋白質の存在下で発現させる工程を含む方法。
【請求項２１】
請求項１から１６のいずれかに記載のベクターを用いることを特徴とする、搭載遺伝子の発現量を制御する方法。
【請求項２２】
搭載遺伝子が転写因子をコードする、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
多能性幹細胞の作製において使用される、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１３または１４に記載のベクターを用いることを特徴とする、ベクターの除去のタイミングとは独立に、外来遺伝子の発現を制御する方法。
【請求項２５】
マイナス鎖RNAウイルスまたはマイナス鎖RNAウイルスベクターの除去を促進する方法であって、該ウイルスまたはベクターを、請求項１から１６のいずれかに記載のベクターと共感染させる工程を含む、方法。
【請求項２６】
請求項１から１６のいずれかに記載のベクターを含む、マイナス鎖RNAウイルスまたはマイナス鎖RNAウイルスベクターの除去促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は改良されたマイナス鎖RNAウイルスベクターに関する。より具体的には、Degronを付加したP蛋白質を含むマイナス鎖RNAウイルスベクターおよびその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
センダイウイルス（SeV）ベクターなどのマイナス鎖RNAウイルスベクターは細胞質型RNAウイルスベクター（発現の全段階が細胞質で行われるベクター）であることから、in vivoで使用しても、搭載遺伝子が宿主染色体へ組み込まれて遺伝毒性を生じる心配は全くない。また、in vitroとin vivoの両方において高い遺伝子導入、発現効率が得られることや、in vitroでは長期持続発現が可能であることなど、いくつもの優れた性能を有している。そのためSeVベクターは、多能性幹細胞の作製、遺伝子治療・遺伝子ワクチン、あるいは抗体産生や機能解析への応用など遺伝子導入ベクターとして広く応用・利用されている（特許文献1、2、非特許文献1、2）。
【０００３】
これまでSeVベクターのP蛋白質を欠損することによる一過性の発現（特許文献3、非特許文献3）や非複製型のベクター（特許文献4）、P蛋白質やL蛋白質への温度感受性変異挿入と温度シフトによるSeVベクターの除去（特許文献1、2）、L蛋白をコードするSeVゲノムへのmir-302標的配列付加やsiRNAの添加によるSeVベクターの除去が報告されている（特許文献5）。しかし、P蛋白質の欠損ベクターは搭載遺伝子の低発現と短い発現期間が課題であり（SeVベクターの高発現能力が損なわれている）、従来の温度感受性変異ベクターは除去に時間を要すること（39℃での数日間培養）が課題であった。尚、mir-302は細胞種ごとに発現が異なるため汎用的な方法ではなく、siRNAは遺伝子導入の効率と阻害効率に影響される方法である。
【０００４】
一方、蛋白質不安定化配列であるdegronとしては特許文献6〜13が知られており、SeVベクターの搭載遺伝子（gene of interest; GOI）の蛋白質にdegronを付加した例はあるが（非特許文献4）、SeVベクターのウイルス蛋白質にdegronを付加した例は無く、また、ベクターの除去を促進することを課題としたものでもない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開WO2010/008054
【特許文献２】国際公開WO2012/029770
【特許文献３】国際公開WO2008/133206
【特許文献４】国際公開WO2008/007581
【特許文献５】国際公開WO2012/063817
【特許文献６】US2009/0215169
【特許文献７】US2012/0178168
【特許文献８】国際公開WO2007/032555
【特許文献９】国際公開WO99/54348
【特許文献１０】国際公開WO2004/025264
【特許文献１１】特開2009-136154
【特許文献１２】特開2011-101639
【特許文献１３】国際公開WO2010/125620
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Bitzer M, et al., J Gene Med. (2003) 5, 543-553
【非特許文献２】Griesenbach U, et al., Curr Opin Mol Ther. (2005) 7, 346-352
【非特許文献３】Abe T, et al. Exp Hematol. (2011) 39, 47-54
【非特許文献４】Nishimura, K. et al. Stem Cell Reports. (2014) 3, 915-929
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、マイナス鎖RNAウイルスのP蛋白質にdegronが付加されたマイナス鎖RNAウイルスベクター、該ベクターの製造方法、およびその使用を提供することを課題とする。また本発明は、マイナス鎖RNAウイルスのP蛋白質にdegronが付加されたマイナス鎖RNAウイルスベクターを使用する、ベクターの除去を促進する方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、マイナス鎖RNAウイルスベクターの遺伝子発現能力を維持しつつ、ベクターの除去速度を改善する方法の探索を行った。
マイナス鎖RNAウイルスベクターを用いて一過性発現を行うために、本発明者らは当初、P遺伝子の欠損ベクターの使用を試みた。しかし作製したベクターを細胞に導入してレポーター蛋白質の発現を調べたところ、P蛋白質を発現しないHeLa細胞ではレポーター蛋白質の発現が確認できなかった。非特許文献3においてもP遺伝子欠損ベクターからの搭載遺伝子の発現は、P遺伝子を欠失していないベクターに比べて1/10以下であることが報告されている。また特許文献4の非複製型SeVベクターは十分な遺伝子発現量を得るために、高タイター、あるいはヘルパーベクターの存在を必要とし、生産効率も低い。一方、特許文献2に記載のTS12骨格やTS15骨格は感染細胞の培養条件を39℃で7日間培養を行うことにより、SeVベクターの除去を行っているが、37℃では除去により長い時間を必要とし、SeVベクター感染からアルカリホスファターゼ陽性のコロニーが得られるまでに28日間が経過している。また、iPS細胞は細胞増殖も速く、ベクターも除去されやすいと想定されるにも関わらずベクターがすぐに除去されないということは、HeLa細胞のような一般的な細胞株では、ベクターの除去により長い時間を必要とすると考えられる。
【０００９】
このような課題に対して、本発明者らは、SeVベクターのウイルス蛋白質にdegronを付加することにより、SeVベクターの除去を促進できるのではないかと考えた。そこで本発明者らはまず、SeVベクターのウイルス蛋白質の中で、degronによるベクターの除去を促進するのに最も適していると思われたL蛋白質にdegronを付加することでSeVベクターの除去を試みた。ところがL蛋白質にdegronを付加すると、組み換えウイルスの再構成効率や生産効率に悪影響が生じたことに加え、degronを介した不安定化の誘導により生じるベクターからの遺伝子発現レベルの変化が小さく、L蛋白質にdegronを付加することで導入遺伝子の発現やベクターの除去を効果的に制御するのは困難であった。
【００１０】
そこで本発明者らは、SeVのP蛋白質にdegronを付加する実験を行った。その結果、P蛋白質にdegronを付加した場合に、ベクターの導入直後の導入遺伝子の発現は非常に高いレベルを達成できる一方で、その後、迅速にベクターが除去されるという極めて優れた特性が発揮されることを見出した。P蛋白質ではなくGOI蛋白質にdegronを付加した場合は、GOIの発現レベルを1/10程度にしか低下できなかったのに対し、P蛋白質にdegronを付加した本発明のベクターを用いた場合は、GOIの発現レベルは劇的に低下することが判明した。特に、P蛋白質にmTOR degron、DHFR degron、PEST、TetR degron、およびそれらの変異体などのdegronを付加することで、37℃におけるSeVベクターの除去を促進し、GOIの発現量をゼロにまで低下させることに成功した。
【００１１】
SeVベクターの除去促進はAzami-Greenなどのレポーター遺伝子を搭載したベクターにおいて確認されただけでなく、転写因子遺伝子を搭載したiPS細胞作製用のSeVベクターにおいても有用であることが確認された。これにより、iPS細胞の作製における細胞のリプログラミングや細胞の分化誘導などにおいて、目的の転写因子等を細胞内で一過的に高発現させ、その後、ベクターを速やかに除去することが可能となるため、本発明のベクターは、再生医療や細胞治療等における細胞の形質改変に有用な遺伝子発現ベクターとなることが期待できる。
【００１２】
すなわち、本発明は、マイナス鎖RNAウイルスベクターのP蛋白質にdegronが付加されたマイナス鎖RNAウイルスベクター、およびその利用等に関し、より具体的には下記の発明を提供するものである。
〔１〕  マイナス鎖RNAウイルスベクターであって、該ウイルスのP蛋白質にdegronを付加するようにP遺伝子が改変されたベクター。
〔２〕  該P蛋白質に温度感受性変異を含む、〔１〕に記載のベクター。
〔３〕  該温度感受性変異がL511F変異を含む、〔２〕に記載のベクター。
〔４〕  該温度感受性変異がD433A、R434A、およびK437Aを含む、〔２〕または〔３〕に記載のベクター。
〔５〕  該ウイルスのL蛋白質にL1361CおよびL1558Iの変異を含む、〔１〕から〔４〕のいずれかに記載のベクター。
〔６〕  DegronがmTOR degron、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）degron、PEST、TetR degron、およびauxin-inducible degron（AID）からなる群より選択される、〔１〕から〔５〕のいずれかに記載のベクター。
〔７〕  DegronがmTOR degronである、〔１〕から〔５〕のいずれかに記載のベクター。
〔８〕  DegronがPESTである、〔１〕から〔５〕のいずれかに記載のベクター。
〔９〕  DegronがDHFR degronである、〔１〕から〔５〕のいずれかに記載のベクター。
〔１０〕  DegronがTetR degronである、〔１〕から〔５〕のいずれかに記載のベクター。
〔１１〕  少なくとも１つの外来遺伝子を搭載する、〔１〕から〔１０〕のいずれかに記載のベクター。
〔１２〕  該外来遺伝子が、degronが付加された蛋白質をコードする、〔１１〕に記載のベクター。
〔１３〕  該外来遺伝子がコードする蛋白質に付加されたdegronが、P蛋白質に付加されているdegronとは異なるdegronである、〔１２〕に記載のベクター。
〔１４〕  少なくとも２つの外来遺伝子を搭載し、それぞれの外来遺伝子がコードする蛋白質に、互いに異なるdegronが付加されている、〔１〕から〔１３〕のいずれかに記載のベクター。
〔１５〕  マイナス鎖RNAウイルスがパラミクソウイルスである、〔１〕から〔１４〕のいずれかに記載のベクター。
〔１６〕  パラミクソウイルスがセンダイウイルスである、〔１５〕に記載のベクター。
〔１７〕  マイナス鎖RNAウイルスベクターの除去を促進するための方法であって、〔１〕から〔１６〕のいずれかに記載のベクターを用いることを特徴とする方法。
〔１８〕  温度を上昇して培養して除去を促進する工程を含む、〔１７〕に記載の方法。
〔１９〕  35〜39℃で培養して除去を促進する工程を含む、〔１７〕または〔１８〕に記載の方法。
〔２０〕  〔１〕から〔１６〕のいずれかに記載のベクターの製造方法であって、該ベクターのゲノムRNAまたはその相補鎖をコードする核酸を、いずれもdegronが付加されていないNP、PおよびL蛋白質の存在下で発現させる工程を含む方法。
〔２１〕  〔１〕から〔１６〕のいずれかに記載のベクターを用いることを特徴とする、搭載遺伝子の発現量を制御する方法。
〔２２〕  搭載遺伝子が転写因子をコードする、〔２１〕に記載の方法。
〔２３〕  多能性幹細胞の作製において使用される、〔２１〕または〔２２〕に記載の方法。
〔２４〕  〔１３〕または〔１４〕に記載のベクターを用いることを特徴とする、ベクターの除去のタイミングとは独立に、外来遺伝子の発現を制御する方法。
〔２５〕  マイナス鎖RNAウイルスまたはマイナス鎖RNAウイルスベクターの除去を促進する方法であって、該ウイルスまたはベクターを、〔１〕から〔１６〕のいずれかに記載のベクターと共感染させる工程を含む、方法。
〔２６〕  〔１〕から〔１６〕のいずれかに記載のベクターを含む、マイナス鎖RNAウイルスまたはマイナス鎖RNAウイルスベクターの除去促進剤。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、P蛋白質にdegronを付加することで、ベクターの除去を有意に促進させることが可能となる。高い遺伝子発現量と速やかなベクター除去が両立され、培養を高温で行うことなく転写因子の発現調節やiPS細胞の作製におけるベクター除去促進効果が得られる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】P遺伝子欠失ベクターはP蛋白質発現細胞を用いないと十分な遺伝子発現が得られないことを示す図である。親株の細胞（HeLa細胞）では蛍光が検出されないが、P発現細胞ではSeV18+GFP/dPの感染によりGFPの蛍光が観察される。
【図２】GOI蛋白質にdegronを付加したDD-AzamiGreen（ddAG）搭載SeVベクターにおけるddAGの発現調節を示す図である。DD-tagのみでは基底発現を抑えることが出来ないことを示している。
【図３】ddAG搭載SeVベクターにおけるddAGの搭載位置の効果を示す図である。ddAGの搭載位置をF位からHNL位へと後ろに移すことでシグナル・ノイズ比が上昇したが、基底発現は依然として観察された。すなわちDD-tagとGOI搭載位置を組み合わせても基底発現を抑えることが出来ないことを示している。
【図４】d1、d2、d4のPEST配列の評価を示す図である。HNL位にd1、d2、d4GFPを搭載して比較すると蛍光の強さはd4＞d2＞d1であった。
【図５】d2ddAG、d4ddAG搭載SeVベクターの評価を示す図である。d2、d4のPEST配列とDD-tagを組み合わせてもGOI蛋白質の基底発現を抑えることが出来ないことを示している。
【図６】d2ddAGおよびd2ddgRFPの発現調節を示す図である。DD-tagおよびDDG-tagをベクターに同時搭載し、独立に制御されることを示した。d2ddAGおよびd2ddgRFPは、Shield1あるいはtrimethprime（TMP）により独立に制御された。
【図７】TetRAGの発現調節を示す図である。TetR-tagがDOXにより制御されることを示した。d2tetRAG搭載SeVベクターからのd2tetRAGの発現は、DOXの添加により誘導された。
【図８】AGaidの発現調節を示す図である。AGaid搭載SeVベクターからのAGaidの発現はAuxinの添加により制御された。
【図９】P蛋白質にdegronを付加したBFP搭載SeV18+/PddTSΔFの発現調節を示す図である。BFP-PddをBHK細胞に感染後、Shield1除去によりBFPの蛍光は減弱した（ImageJで画像解析し、18%に減弱を確認）。
【図１０】L蛋白質にdegronを付加したBFP搭載SeV18+/LddTSΔFの発現調節を示す図である。BFP-LddをiPS細胞に感染後、BFPの蛍光は観察されたが、蛍光シグナルは弱く、Shield1除去によるBFPの蛍光変化はほとんど見られなかった。これはLddが機能しないことを示している。
【図１１】DD-tagをそれぞれP蛋白質のC末端およびN末端に付加したPddおよびddPの分解評価を示す図である。PddおよびddPは、どちらも速やかに分解されている。
【図１２】SeV18+TIR1(HNL)d2AG/PaidTSΔFの発現調節を示す図である。d2AG-Paidを搭載するSeVベクターをHeLa細胞に感染させ、IAAの添加によりd2AGの減弱が観察されることを確認した。
【図１３】SeV18+d2AG/PddTS15ΔFの除去促進をFACSにより示す図である。d2AG-PddTS15は37℃に温度上昇後、day7で蛍光が消失するのに対し、従来の温度感受性ベクターは一部の細胞においてday21でも蛍光の残存が観察される。また、35℃におけるd2AG-PddTS15はdegronが付加されているにもかかわらず、従来のベクター（TS15）よりも高い蛍光値を示している。すなわちPddTS15を搭載するSeVベクターは、従来のベクター（TS15）に比べて発現量が高く、かつ除去が促進されていることを示している。
【図１４】SeV18+d2AG/PddTS15ΔFの除去促進をSeV抗体染色により示す図である。d2AG-PddTS15は37℃に温度上昇後、day14でSeV抗体陰性であった。それに対して従来のTS15ベクターはday14でSeV抗体陽性である。
【図１５】SeV18+d2AG/PddTS15ΔFの発現調節および除去促進を35〜39℃で示す図である。DD-tagを付加した温度感受性Pでは、35〜39℃で搭載遺伝子の発現低下が観察され、37〜39℃で搭載遺伝子の消失を観察した。
【図１６】SeV18+d2AG/PddgTS15ΔFの発現調節および除去促進を示す図である。(a) DDG-tagを付加した温度感受性Pでは、TMPの除去により、37℃で搭載遺伝子の発現低下が観察された。(b) TMPの除去により、35〜39℃でも搭載遺伝子の発現低下および消失が観察された。
【図１７】SeV18+d2AG/PtetRTS15ΔFの発現調節および除去促進を35〜39℃で示す図である。TetR-tagを付加した温度感受性Pでは、35〜39℃で搭載遺伝子の発現低下および消失が観察された。DD-tagが35℃で発現するのに対し、TetR-tagでは発現の消失が観察された。
【図１８】SeV18+d2AG/d4PTS15ΔFの発現調節および除去促進を35〜39℃で示す図である。PEST配列のd4を付加した温度感受性Pでは、35〜39℃で搭載遺伝子の発現低下が観察され、37〜39℃で搭載遺伝子の消失を観察した。
【図１９】SeV18+d2AG/d2PTS12ΔFおよびSeV18+d2AG/PddTS15ΔFの除去促進を示す図である。温度感受性PにPEST配列あるいはDD-tagを付加することで、従来のTS12ベクターと比較して、38.5℃で搭載遺伝子の除去促進あるいは消失が観察された。
【図２０】SeV18+d2AG/d2PTS15ΔFおよびSeV18+d2AG/d4PTS15ΔFの発現調節および除去促進を示す図である。温度感受性PにPEST配列を付加し、37℃で搭載遺伝子の発現低下および消失が観察された。
【図２１】SeV18+d2AG/d2PTS15ΔFおよびSeV18+d2AG/d4PTS15ΔFの発現調節および除去促進をFACSにより示す図である。温度感受性PにPEST配列を付加することで、37℃で搭載遺伝子の発現低下が観察された。また、35℃におけるd2AG-d2PTS15はdegronが付加されているにもかかわらず、従来のベクター（TS15）と同等の蛍光値を示している。
【図２２】SeV18+d2AG/d2PTS15ΔFの除去促進をFACSにより示す図である。d2AG-d2PTS15は37℃に温度上昇後、day7で蛍光が消失するのに対し、従来の温度感受性ベクターは一部の細胞においてday21でも蛍光の残存が観察される。また、35℃におけるd2AG-d2PTS15はdegronが付加されているにもかかわらず、従来のベクター（TS15）と同等の蛍光値を示している。すなわちPEST配列を付加したP蛋白質を含むベクターは、従来のベクター（TS15）と発現量が同等で、かつ除去が促進されていることを示している。
【図２３】P蛋白質にdegronを付加したベクターの除去が促進されていることをPCRで示した図である。d2AG-PddTS15およびd2AG-d2PTS15は37℃に温度上昇後、day21でSeVが検出されないのに対し、従来のTS15でSeVの残存が検出された。
【図２４】P蛋白質にdegronを付加したベクターの除去が促進されていることをリアルタイムPCRで示した図である。SeVのリアルタイムPCRにおいて、d2PTS15およびPddTS15はday21で検出されなくなった。それに対して、従来ベクターのTS15では徐々に減っているがday21でも残存を確認した。PddTS15のday3の値はTS15に比べ30倍以上高い値を示した。
【図２５】P蛋白質にdegronを付加したベクターに転写因子を搭載してiPS細胞が作製されることをアルカリホスファターゼ染色により示した図である。CytoTune-iPS 2.0と同様にd2P、Pdd、Pddg、PtetRでもALP陽性コロニーを確認した。
【図２６】P蛋白質にdegronを付加したベクターを用いて作製したiPS細胞からのベクター除去促進をSeV抗体染色により示した図である。d2PはP=2（継代2回目）でSeV抗体染色陰性であった。
【図２７】P蛋白質にdegronを付加したベクターを用いて作製したiPS細胞からのベクター除去促進をリアルタイムPCRにより示した図である。d2PはP=3（継代3回目）においてSeVが検出されなくなった。
【図２８】P蛋白質にdegronを付加したベクター（d2P）を用いて作製したiPS細胞の未分化マーカー発現およびベクターが除去されたことをPCRにより示した図である。d2PにおいてCytoTune-iPS 2.0同様にNANOGおよびTERTの発現を確認した。またSeV除去も確認した。
【図２９】誘導したiPS細胞の3胚葉形成能を示す図である。実施例22（図28）で得られたiPS細胞をNOD-scidマウスに移植し、テラトーマの3胚葉形成能を観察した。
【図３０】P蛋白質にdegronを付加したベクター（Pdd、Pddg、PtetR）を用いて作製したiPS細胞の未分化マーカー発現およびベクターが除去されたことをPCRにより示した図である。Pdd, Pddg, PteRにおいてCytoTune-iPS 2.0同様にNANOGおよびTERTの発現を確認した。またSeV除去も確認した。
【図３１】P蛋白質にdegronを付加したベクターを従来のベクターと共感染させることにより除去を促進することを示した図である。TS15単独に比べPtetRを共感染させることでd2AGの蛍光は60%に低下した。一方、TS15ベクターの感染量を倍にすることで、d2AGの蛍光は118%に増加した。
【図３２】N末端側を削ったP蛋白質における遺伝子発現を示した図である。N末端側を削ったP蛋白をHeLa細胞に発現させ、GFP/dPを感染させた。N末端側を削ってもP蛋白質は機能することができる。
【図３３】様々なマイナス鎖RNAウイルスベクターにおける本発明の効果を確認した図である。センダイウイルス（SeV）、麻疹ウイルス（MeV）、ニューカッスル病ウイルス（NDV）、パラインフルエンザウイルス2（PIV2）、水疱性口内炎ウイルス（VSV）のP蛋白にdegronとHalo-tagを付加し、実施例11と同様にdegronによりベクターが除去されるかを確認した。その結果、薬剤除去1時間後にほとんど分解されていることを確認した。
【図３４ａ】外来遺伝子の独立発現制御を示す図である。P蛋白質にdegronを付加した本発明のベクターに、異なるdegronで制御される２つの外来遺伝子を挿入した。各遺伝子の発現は、ベクターとは独立して制御可能である。
【図３４ｂ】外来遺伝子の独立発現制御を示す図である。P蛋白質にdegronを付加した本発明のベクターに、異なるdegronで制御される２つの外来遺伝子を挿入した。各遺伝子の発現は、ベクターとは独立して制御可能である。
【図３５】P蛋白質にdegronを付加したDGFP搭載SeV18+/PddΔFの発現調節を示す図である。DGFP-Pdd/dFをHeLa細胞に感染後、Shield1非添加によりDGFPの蛍光は減弱した（MetaMorphで画像解析し、40%に減弱を確認）。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明は、マイナス鎖RNAウイルスのP蛋白質にdegronを付加されたマイナス鎖RNAウイルスベクター、ベクターの製造方法、ベクターの使用、およびベクターの除去促進方法等を提供する。
【００１６】
マイナス鎖RNAウイルスベクターとは、マイナス鎖（ウイルス蛋白質をアンチセンスにコードしている鎖）のRNAをゲノムとして含むウイルスに由来するウイルスベクターである。マイナス鎖RNAはネガティブ鎖RNAとも呼ばれる。本発明においては、特に一本鎖マイナス鎖RNAウイルス（非分節型（non-segmented）マイナス鎖RNAウイルスとも言う）が例示できる。一本鎖ネガティブ鎖RNAウイルスとは、一本鎖ネガティブ鎖（すなわちマイナス鎖）RNAをゲノムに有するウイルスを言う。このようなウイルスとしては、パラミクソウイルス（Paramyxoviridae; Paramyxovirus, Morbillivirus, Rubulavirus, および Pneumovirus属等を含む）、ラブドウイルス（Rhabdoviridae; Vesiculovirus, Lyssavirus, および Ephemerovirus属等を含む）、フィロウイルス（Filoviridae）などの科に属するウイルスが含まれ、分類学上モノネガウイルス目(Mononegavirales)に属している（ウイルス 第57巻 第１号、pp29-36、2007; Annu. Rev. Genet. 32, 123-162, 1998; Fields virology fourth edition, Philadelphia, Lippincott-Raven, 1305-1340, 2001; Microbiol. Immunol. 43, 613-624, 1999; Field Virology, Third edition pp. 1205-1241, 1996）。
【００１７】
本発明において好ましいマイナス鎖RNAウイルスベクターとしては、パラミクソウイルスベクターおよびラブドウイルスベクターが挙げられる。本発明においてパラミクソウイルスとはパラミクソウイルス科（Paramyxoviridae）に属するウイルスまたはその誘導体を指す。パラミクソウイルス科は、非分節型ネガティブ鎖RNAをゲノムに持つウイルスのグループの1つで、パラミクソウイルス亜科（Paramyxovirinae）（レスピロウイルス属（パラミクソウイルス属とも言う）、ルブラウイルス属、およびモービリウイルス属を含む）およびニューモウイルス亜科（Pneumovirinae）（ニューモウイルス属およびメタニューモウイルス属を含む）を含む。パラミクソウイルス科ウイルスに含まれるウイルスとして、具体的にはセンダイウイルス(Sendai virus)、ニューカッスル病ウイルス(Newcastle disease virus)、おたふくかぜウイルス(Mumps virus)、麻疹ウイルス(Measles virus)、RSウイルス(Respiratory syncytial virus)、牛疫ウイルス(rinderpest virus)、ジステンパーウイルス(distemper virus)、サルパラインフルエンザウイルス（SV5）、ヒトパラインフルエンザウイルス1, 2, 3型等が挙げられる。より具体的には、例えば Sendai virus (SeV)、human parainfluenza virus-1 (HPIV-1)、human parainfluenza virus-3 (HPIV-3)、phocine distemper virus (PDV)、canine distemper virus (CDV)、dolphin molbillivirus (DMV)、peste-des-petits-ruminants virus (PDPR)、measles virus (MeV)、rinderpest virus (RPV)、Hendra virus (Hendra)、Nipah virus (Nipah)、human parainfluenza virus-2 (HPIV-2)、simian parainfluenza virus 5 (SV5)、human parainfluenza virus-4a (HPIV-4a)、human parainfluenza virus-4b (HPIV-4b)、mumps virus (Mumps)、およびNewcastle disease virus (NDV) などが含まれる。ラブドウイルスとしては、ラブドウイルス科(Rhabdoviridae)の水疱性口内炎ウイルス(Vesicular stomatitis virus)、狂犬病ウイルス(Rabies virus)等が含まれる。
【００１８】
本発明のウイルスは、好ましくはパラミクソウイルス亜科（レスピロウイルス属、ルブラウイルス属、およびモービリウイルス属を含む）に属するウイルスまたはその誘導体であり、より好ましくはレスピロウイルス属（genus Respirovirus）（パラミクソウイルス属（Paramyxovirus）とも言う）に属するウイルスまたはその誘導体である。誘導体には、ウイルスによる遺伝子導入能を損なわないように、ウイルス遺伝子が改変されたウイルス、および化学修飾されたウイルス等が含まれる。本発明を適用可能なレスピロウイルス属ウイルスとしては、例えばヒトパラインフルエンザウイルス1型（HPIV-1）、ヒトパラインフルエンザウイルス3型（HPIV-3）、ウシパラインフルエンザウイルス3型（BPIV-3）、センダイウイルス(Sendai virus; マウスパラインフルエンザウイルス1型とも呼ばれる)、麻疹ウイルス、サルパラインフルエンザウイルス（SV5）、およびサルパラインフルエンザウイルス10型（SPIV-10）などが含まれる。本発明においてパラミクソウイルスは、最も好ましくはセンダイウイルスである。
【００１９】
マイナス鎖RNAウイルスは、一般に、エンベロープの内部にRNAとタンパク質からなる複合体（リボヌクレオプロテイン; RNP）を含んでいる。RNPに含まれるRNAはマイナス鎖RNAウイルスのゲノムである（−）鎖（ネガティブ鎖）の一本鎖RNAであり、この一本鎖RNAが、NPタンパク質、Pタンパク質、およびLタンパク質と結合し、RNPを形成している。このRNPに含まれるRNAがウイルスゲノムの転写および複製のための鋳型となる（Lamb, R.A., and D. Kolakofsky, 1996, Paramyxoviridae: The viruses and their replication. pp.1177-1204. In Fields Virology, 3rd edn. Fields, B. N., D. M. Knipe, and P. M. Howley et al. (ed.), Raven Press, New York, N. Y.）。
【００２０】
マイナス鎖RNAウイルスの「NP、P、M、F、HN、およびL遺伝子」とは、それぞれヌクレオキャプシド、ホスホ、マトリックス、フュージョン、ヘマグルチニン-ノイラミニダーゼ、およびラージタンパク質をコードする遺伝子のことを指す。ヌクレオキャプシド（NP）タンパク質は、ゲノムRNAに結合し、ゲノムRNAが鋳型活性を有するために不可欠なタンパク質である。一般に、NP遺伝子は「N遺伝子」と表記されることもある。ホスホ（P）タンパク質は、RNAポリメラーゼの小サブユニットであるリン酸化タンパク質である。マトリックス（M）タンパク質は、ウイルス粒子構造を内側から維持する機能を果たす。フュージョン（F）タンパク質は、宿主細胞への侵入にかかわる膜融合タンパク質であり、ヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ（HN）タンパク質は宿主細胞との結合にかかわるタンパク質である。ラージ（L）タンパク質は、RNAポリメラーゼの大サブユニットである。上記各遺伝子は個々の転写制御ユニットを有し、各遺伝子から単独のmRNAが転写され、タンパク質が転写される。P遺伝子からは、Pタンパク質以外に、異なるORFを利用して翻訳される非構造タンパク質（C）と、Pタンパク質mRNAを読み取り途中のRNA編集により作られるタンパク質（V）が翻訳される。例えばパラミクソウイルス亜科に属する各ウイルスにおける各遺伝子は、一般に、3'から順に、次のように表記される。
レスピロウイルス属 N P/C/V M F HN - L
ルブラウイルス属 N P/V M F HN (SH) L
モービリウイルス属 N P/C/V M F H - L
【００２１】
例えばセンダイウイルスの各遺伝子の塩基配列のデータベースのアクセッション番号は、N遺伝子については M29343, M30202, M30203, M30204, M51331, M55565, M69046, X17218、P遺伝子については M30202, M30203, M30204, M55565, M69046, X00583, X17007, X17008、M遺伝子については D11446, K02742, M30202, M30203, M30204, M69046, U31956, X00584, X53056、F遺伝子については D00152, D11446, D17334, D17335, M30202, M30203, M30204, M69046, X00152, X02131、HN遺伝子については D26475, M12397, M30202, M30203, M30204, M69046, X00586, X02808, X56131、L遺伝子については D00053, M30202, M30203, M30204, M69040, X00587, X58886を参照のこと。またその他のウイルスがコードするウイルス遺伝子を例示すれば、N遺伝子については、CDV, AF014953; DMV, X75961; HPIV-1, D01070; HPIV-2, M55320; HPIV-3, D10025; Mapuera, X85128; Mumps, D86172; MeV, K01711; NDV, AF064091; PDPR, X74443; PDV, X75717; RPV, X68311; SeV, X00087; SV5, M81442; および Tupaia, AF079780、P遺伝子については、CDV, X51869; DMV, Z47758; HPIV-l, M74081; HPIV-3, X04721; HPIV-4a, M55975; HPIV-4b, M55976; Mumps, D86173; MeV, M89920; NDV, M20302; PDV, X75960; RPV, X68311; SeV, M30202; SV5, AF052755; および Tupaia, AF079780、C遺伝子については CDV, AF014953; DMV, Z47758; HPIV-1, M74081; HPIV-3, D00047; MeV, ABO16162; RPV, X68311; SeV, AB005796; および Tupaia, AF079780、M遺伝子については CDV, M12669; DMV Z30087; HPIV-1, S38067; HPIV-2, M62734; HPIV-3, D00130; HPIV-4a, D10241; HPIV-4b, D10242; Mumps, D86171; MeV, AB012948; NDV, AF089819; PDPR, Z47977; PDV, X75717; RPV, M34018; SeV, U31956; および SV5, M32248、F遺伝子については CDV, M21849; DMV, AJ224704; HPN-1, M22347; HPIV-2, M60182; HPIV-3, X05303, HPIV-4a, D49821; HPIV-4b, D49822; Mumps, D86169; MeV, AB003178; NDV, AF048763; PDPR, Z37017; PDV, AJ224706; RPV, M21514; SeV, D17334; および SV5, AB021962、HN（HまたはG）遺伝子については CDV, AF112189; DMV, AJ224705; HPIV-1, U709498; HPIV-2. D000865; HPIV-3, AB012132; HPIV-4A, M34033; HPIV-4B, AB006954; Mumps, X99040; MeV, K01711; NDV, AF204872; PDPR, X74443; PDV, Z36979; RPV, AF132934; SeV, U06433; および SV-5, S76876 、L遺伝子についてはCDV, AF014953; DMV, AJ608288; HPIV-1, AF117818; HPIV-2, X57559; HPIV-3, AB012132; Mumps, AB040874; MeV, K01711; NDV, AY049766; PDPR, AJ849636; PDV, Y09630; RPV,Z30698; およびSV-5, D13868が例示できる。但し、各ウイルスは複数の株が知られており、株の違いにより上記に例示した以外の配列からなる遺伝子も存在する。これらのいずれかの遺伝子に由来するウイルス遺伝子を持つセンダイウイルスベクターは、本発明のベクターとして有用である。また、P蛋白質に関してはその機能部位がC末端側のN結合部位、L結合部位、オリゴマー形成部位を含む領域であり（SeVの場合はP蛋白質のC末端側の320-568）（Blanchard L. et al., Virology. (2004) 319, 201-211.）、本発明のP蛋白質は少なくともこの領域を含むものが好ましい。例えば本発明のベクターは、上記のいずれかのウイルス遺伝子のコード配列（SeVのP遺伝子に関しては例えばC末端側の配列でもよく、例えば479番目〜568番目のアミノ酸配列または320番目〜568番目のアミノ酸配列）と、90％以上、好ましくは95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、または99％以上の同一性を持つ塩基配列を含む。また、本発明のベクターは、例えば上記のいずれかのウイルス遺伝子のコード配列がコードするアミノ酸配列（SeVのP蛋白質に関しては例えばC末端側の配列でもよく、例えば479番目〜568番目のアミノ酸配列または320番目〜568番目のアミノ酸配列）と、90％以上、好ましくは95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、または99％以上の同一性を持つアミノ酸��列をコードする塩基配列を含む。また、本発明のベクターは、例えば上記のいずれかのウイルス遺伝子のコード配列がコードするアミノ酸配列（SeVのP遺伝子に関しては例えばC末端側の配列でもよく、例えば479番目〜568番目のアミノ酸配列または320番目〜568番目のアミノ酸配列）において、10個以内、好ましくは9個以内、8個以内、7個以内、6個以内、5個以内、4個以内、3個以内、2個以内、または1個のアミノ酸が置換、挿入、欠失、および/または付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする塩基配列を含む。このようなベクターがコードするP蛋白質にdegronが付加されるように改変されたベクターは、本発明のベクターとして好適である。
【００２２】
なお本明細書に記載した塩基配列およびアミノ酸配列などのデータベースアクセッション番号が参照された配列は、例えば本願の出願日および優先日における配列を参照するものであって、本願の出願日および優先日のいずれ時点における配列としても特定することができ、好ましくは本願の出願日における配列として特定される。各時点での配列はデータベースのリビジョンヒストリーを参照することにより特定することができる。
【００２３】
また本発明のマイナス鎖RNAウイルスは、天然株、野生株、変異株、ラボ継代株、および人為的に構築された株などに由来してもよい。例えばセンダイウイルスZ株が挙げられる（Medical Journal of Osaka University Vol.6, No.1, March 1955 p1-15）。つまり、当該ウイルスは天然から単離されたウイルスと同様の構造を持つウイルスベクターであっても、遺伝子組み換えにより人為的に改変したウイルスであってもよい。例えば、野生型ウイルスが持ついずれかの遺伝子に変異や欠損があるものであってよい。例えば、ウイルスのエンベロープ蛋白質または外殻蛋白質をコードする少なくとも１つの遺伝子に変異または欠損を有するウイルスを好適に用いることができる。このようなウイルスベクターは、例えば感染細胞においてはゲノムを複製することはできるが、感染性ウイルス粒子を形成できないウイルスベクターである。このような伝播能欠損型のウイルスベクターは、周囲に感染を拡大する懸念がないので安全性が高い。例えば、Fおよび/またはHNなどのエンベロープ蛋白質またはスパイク蛋白質をコードする少なくとも１つの遺伝子、あるいはそれらの組み合わせが含まれていないマイナス鎖RNAウイルスを用いることができる（WO00/70055 および WO00/70070; Li, H.-O. et al., J. Virol. 74(14) 6564-6569 (2000)）。ゲノム複製に必要な蛋白質（例えば N、P、およびL蛋白質）をゲノムRNAにコードしていれば、感染細胞においてゲノムを増幅することができる。欠損型ウイルスを製造するには、例えば、欠損している遺伝子産物またはそれを相補できる蛋白質をウイルス産生細胞において外来的に供給する（WO00/70055 および WO00/70070; Li, H.-O. et al., J. Virol. 74(14) 6564-6569 (2000)）。また、欠損するウイルス蛋白質を完全に相補することなく、非感染性のウイルス粒子（VLP）としてウイルスベクターを回収する方法も知られている（WO00/70070）。また、ウイルスベクターをRNP（例えば N、L、P蛋白質、およびゲノムRNAからなるRNP）として回収する場合は、エンベロープ蛋白質を相補することなくベクターを製造することができる。
【００２４】
本発明のウイルスは、天然のウイルスに限定されず、例えば人工的に作製したウイルスも含まれる。例えば本発明のウイルスには、コドンを最適化するために核酸配列に変異を導入したものや、キメラウイルス（例えば同種ウイルス間のキメラ、および他種ウイルス間のキメラウイルス (例えばPIVとSeVのキメラなど) を含む）なども含まれる（J. Virol. 1995, 849-855）。
【００２５】
また本発明においてN、L、P蛋白質などのウイルス蛋白質は、導入細胞において遺伝子を発現する機能を保持する限り野生型でなくてもよい。例えばタグなどのペプチドを適宜付加した改変蛋白質や、コドンを改変した蛋白質や、機能を失わないように野生型蛋白質のアミノ酸配列の一部を欠失させた蛋白質などを適宜用いることができる。本発明において、N、L、P蛋白質には、そのような改変蛋白質や欠失型蛋白質も包含される。例えば、P蛋白質はC末端の一部があれば、その他の領域はウイルスベクターの発現に必須ではない。
【００２６】
本発明においてマイナス鎖RNAウイルスベクターは、当該ウイルスに由来するゲノム核酸を有し、該核酸に導入遺伝子を組み込むことにより、該遺伝子を発現させることができるベクターである。本発明においてマイナス鎖RNAウイルスベクターには、感染ウイルス粒子の他、ウイルスコア、ウイルスゲノムとウイルス蛋白質との複合体、または非感染性ウイルス粒子などからなる複合体であって、細胞に導入することにより搭載する遺伝子を発現する能力を持つ複合体が含まれる。
【００２７】
本発明のマイナス鎖RNAウイルス構造蛋白質にdegronが付加されたベクター（以下において、「本発明のベクター」と称す）は、（−）鎖一本鎖RNAに結合するタンパク質の分解が促進するように（−）鎖一本鎖RNAが改変されていることにより、ベクターの除去速度が亢進している。本発明において（−）鎖一本鎖RNAと結合するタンパク質とは、該（−）鎖一本鎖RNAと直接および/または間接に結合し、該（−）鎖一本鎖RNAと複合体を形成するタンパク質のことを言う。本発明の複合体には、マイナス鎖RNAウイルスに由来する（−）鎖一本鎖RNAおよびそれに結合するマイナス鎖RNAウイルスに由来するタンパク質（例えばNP、P、およびLタンパク質）からなる複合体が含まれる。本発明において、「マイナス鎖RNAウイルスに由来する」とは、マイナス鎖RNAウイルスの構成物（タンパク質、RNAを含む）がそのままの状態で、または一部を改変された状態であることを意味する。例えば、マイナス鎖RNAウイルスのタンパク質またはRNAを改変して調製されたタンパク質またはRNAは、「マイナス鎖RNAウイルスに由来する」タンパク質またはRNAである。本発明のベクターは、上記特徴を有する限り、その種類は問わない。例えば、本発明のベクターは、エンベロープタンパク質（F、HN、および M タンパク質）等を有し、ウイルス粒子の構造をとるウイルスベクターであってもよい。また、ウイルスエンベロープを有さない、RNP自体であるRNPベクターであってもよい。
【００２８】
マイナス鎖RNAウイルスにおいてNP,P,Lタンパク質は、（−）鎖一本鎖RNAと結合し、ゲノムRNA複製およびタンパク質発現に不可欠な機能を果たす（以下において、場合により、NP,P,Lタンパク質を、「ゲノムRNA結合タンパク質」と称す）。NPタンパク質は、ゲノムRNAと非常に強固に結合し、ゲノムRNAに鋳型活性を付与するタンパク質である。ゲノムRNAは、NPタンパク質との結合状態においてのみRNA合成の鋳型活性を有し、NPタンパク質と結合しない状態では鋳型活性は全く有しない。Pタンパク質はRNAポリメラーゼの小サブユニットとして、Lタンパク質はRNAポリメラーゼの大サブユニットとして、ゲノムRNAに結合する。そのためマイナス鎖RNAウイルスでは、NP、P、Lタンパク質のうち一つでも欠ければ、ゲノムRNA複製は起こらない。
【００２９】
このような本発明のベクターの態様は、（ａ）マイナス鎖RNAウイルス（−）鎖一本鎖RNAに結合するタンパク質であるNPタンパク質、Pタンパク質、およびLタンパク質から選択される、一以上のタンパク質にdegronを付加するように改変された、マイナス鎖RNAウイルスに由来する（−）鎖一本鎖RNA、（ｂ）NPタンパク質、Pタンパク質、およびLタンパク質、からなる複合体を含むことを特徴とする。すなわち改変された（−）鎖一本鎖RNAにコードされるゲノムRNA結合タンパク質（NPタンパク質、Pタンパク質、および/またはLタンパク質）は、degronが付加されるように改変されていることが好ましい。本発明のベクターは、改変された（−）鎖一本鎖RNA（ゲノムRNA）とNP、P、Lタンパク質からなる複合体（RNP）を含む、ウイルス粒子であってよい。本発明のベクターに含まれる（−）鎖一本鎖RNAは、少なくともPタンパク質にdegronを付加するように改変されている。本発明のベクターを宿主に感染させると、本発明のベクター中に含まれるNP、P、Lタンパク質の働きによって、ゲノムRNA中にコードされている遺伝子からタンパク質が発現する。しかし、温度感受性を強化されたPタンパク質にdegronを付加された本発明のベクターは温度上昇とdegronの不安定化によりPタンパク質の機能喪失が促進する。したがって、自己の複製であるウイルス粒子（ゲノムRNAならびにNP,P,およびLタンパク質を含む粒子）の形成が温度上昇とdegronの不安定化によって停止する。すなわち、本発明のベクターは、超温度感受性のウイルスベクターである。本発明のベクターに外来遺伝子を搭載させて宿主に感染させた場合には、外来遺伝子は宿主細胞内で発現するが、その後、温度上昇とdegronの不安定化を組み合わせることで、本発明のベクターから自己複製能を有するウイルス粒子の産生が停止し、細胞からのベクターの除去が促進され外来遺伝子の発現も停止する。
【００３０】
本発明のベクターのゲノムRNAにコードされている遺伝子は、ウイルス由来の遺伝子配列そのままであってもよいが、何らかの変異が導入されていてもよい。例えば、当業者であれば、各タンパク質の機能を損なわないような軽微な変異を、公知方法によってゲノムRNA上の各遺伝子に導入することができる。例えば、PCR法やカセット変異法等により部位特異的に変異を導入したり、化学試薬やランダムヌクレオチド等によりランダム変異を導入したりすることが可能である。
【００３１】
例えば、エンベロープ蛋白質やスパイク蛋白質において弱毒化変異や温度感受性変異を含む多数の変異が知られている。これらの変異蛋白質遺伝子を有するウイルスを本発明において好適に用いることができる。本発明においては、望ましくは細胞傷害性を減弱したベクターを用い得る。ベクターの細胞傷害性は、例えばベクター感染細胞からの乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）の放出を定量することにより測定することができる。LDH放出量が少ないほど細胞傷害性は低い。例えば細胞傷害性が野生型に比べ有意に減弱化したベクターを用いることができる。細胞傷害性の減弱化の程度は、例えば、ヒト由来 HeLa細胞（ATCC CCL-2）またはサル由来 CV-1細胞（ATCC CCL 70）にMOI（感染価） 3で感染させて、35〜37℃（例えば37℃）で３日間培養した培養液中のLDH放出量が野生型に比べ有意に低下したもの、例えば20％以上、25％以上、30％以上、35％以上、40％以上、または50％以上低下したベクターを用いることができる。また細胞傷害性を低下させる変異には、温度感受性変異も含まれる。
【００３２】
また温度感受性は、ウイルス宿主の通常の温度（例えば37℃ないし38℃）におけるウイルスの増殖速度または搭載遺伝子の発現レベルを測定することにより決定することができる。変異を有さないものに比べ、ウイルスの増殖速度および/または搭載遺伝子の発現レベルが低下するほど、温度感受性は高いと判断される。
【００３３】
本発明において用いられるウイルスベクターは、好ましくは少なくとも１つ、より好ましくは少なくとも２、３、４、５、またはそれ以上のウイルス遺伝子に欠失または変異を有する。欠失と変異は、各遺伝子に対して任意に組み合わせ導入してよい。ここで変異とは、機能低下型の変異または温度感受性変異であってよく、少なくとも37℃において、野生型に比べウイルスの増殖速度または搭載するいずれかの遺伝子の発現レベルを好ましくは1/2以下、より好ましくは1/3以下、より好ましくは1/5以下、より好ましくは1/10以下、より好ましくは1/20以下に低下させる変異である。このような改変ウイルスベクターを用いることは、特に宿主細胞における細胞傷害性を低減したり、ベクターの除去を促進したりできる点で有用であり得る。例えば本発明において好適に用いられるウイルスベクターは、少なくとも２つのウイルス遺伝子が、欠失または変異している。このようなウイルスには、少なくとも２つのウイルス遺伝子が欠失しているもの、少なくとも２つのウイルス遺伝子が変異しているもの、少なくとも１つのウイルス遺伝子が変異しており少なくとも１つのウイルス遺伝子が欠失しているものが含まれる。変異または欠失している少なくとも２つのウイルス遺伝子は、好ましくはエンベロープ構成蛋白質をコードする遺伝子である。例えば本発明のマイナス鎖RNAウイルスベクターは、少なくともF遺伝子を欠損していることが好ましく、より好ましくは、F遺伝子を欠失し、Mおよび／またはHN遺伝子をさらに欠失するか、Mおよび／またはHN遺伝子に変異（例えば温度感受性変異）をさらに有するベクターは、本発明において好適に用いられる。また、本発明において用いられるベクターは、より好ましくは、少なくとも３つのウイルス遺伝子（好ましくはエンベロープ構成蛋白質をコードする少なくとも３つの遺伝子；F, HN, およびM）が、欠失または変異している。このようなウイルスベクターには、少なくとも３つの遺伝子が欠失しているもの、少なくとも３つの遺伝子が変異しているもの、少なくとも１つの遺伝子が変異しており少なくとも２つの遺伝子が欠失しているもの、少なくとも２つの遺伝子が変異しており少なくとも１つの遺伝子が欠失しているものが含まれる。より好ましい態様を挙げれば、例えばF遺伝子を欠失し、MおよびHN遺伝子をさらに欠失するか、MおよびHN遺伝子に変異（例えば温度感受性変異）をさらに有するベクターは、本発明において好適に用いられる。また例えばF遺伝子を欠失し、MあるいはHN遺伝子をさらに欠失し、残るMあるいはHN遺伝子に変異（例えば温度感受性変異）をさらに有するベクターは、本発明において好適に用いられる。このような変異型のウイルスは、公知の方法に準じて作製することが可能である。
【００３４】
例えば、M遺伝子の温度感受性変異としては、センダイウイルスM蛋白質における69位（G69）、116位（T116）、および183位（A183）からなる群より任意に選択される部位、あるいはマイナス鎖RNAウイルスM蛋白質の相当部位のアミノ酸置換が挙げられる（Inoue, M. et al., J.Virol. 2003, 77: 3238-3246）。M蛋白質に上記の３つの部位のいずれか、好ましくは任意の２部位の組み合わせ、さらに好ましくは３つの部位全てのアミノ酸が他のアミノ酸に置換された変異M蛋白質をコードするゲノムを有するウイルスは、本発明において好適に用いられる。
【００３５】
アミノ酸変異は、側鎖の化学的性質の異なる他のアミノ酸への置換が好ましく、例えばBLOSUM62マトリックス（Henikoff, S. and Henikoff, J. G. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919）の値が３以下、好ましくは２以下、より好ましくは１以下、より好ましくは０のアミノ酸に置換する。具体的には、センダイウイルスM蛋白質であれば、G69、T116、およびA183を、それぞれGlu (E)、Ala (A)、およびSer (S) へ置換することができる。他のマイナス鎖RNAウイルスM蛋白質についても、相当部位のアミノ酸をそれぞれGlu (E)、Ala (A)、およびSer (S) へ置換することができる。また、麻疹ウイルス温度感受性株 P253-505（Morikawa, Y. et al., Kitasato Arch. Exp. Med. 1991: 64; 15-30）のM蛋白質の変異と相同な変異を利用することも可能である。変異の導入は、例えばオリゴヌクレオチド等を用いて、公知の変異導入方法に従って実施すればよい。
【００３６】
また、HN遺伝子の温度感受性変異としては、例えばセンダイウイルスのHN蛋白質の262位（A262）、264位（G264）、および461位（K461）からなる群より任意に選択される部位、あるいはマイナス鎖RNAウイルスHN蛋白質の相当部位のアミノ酸置換が挙げられる（Inoue, M. et al., J.Virol. 2003, 77: 3238-3246）。３つの部位のいずれか１つ、好ましくは任意の２部位の組み合わせ、さらに好ましくは３つの部位全てのアミノ酸が他のアミノ酸に置換された変異HN蛋白質をコードするゲノムを有するウイルスは、本発明において好適に用いられる。上記と同様に、アミノ酸の置換は、側鎖の化学的性質の異なる他のアミノ酸への置換が好ましい。好ましい一例を挙げれば、センダイウイルス HN蛋白質のA262、G264、およびK461を、それぞれThr (T)、Arg (R)、およびGly (G) へ置換する。他のマイナス鎖RNAウイルスM蛋白質についても、相当部位のアミノ酸をそれぞれThr (T)、Arg (R)、およびGly (G) へ置換することができる。また、例えば、ムンプスウイルスの温度感受性ワクチン株 Urabe AM9を参考に、HN蛋白質の464及び468番目のアミノ酸に変異導入することもできる（Wright, K. E. et al., Virus Res. 2000: 67; 49-57）。
【００３７】
また本発明のベクターは、P遺伝子および／またはL遺伝子に変異を有していてもよい。このような変異としては、具体的には、SeV P蛋白質の86番目のGlu（E86）の変異、SeV P蛋白質の511番目のLeu（L511）の他のアミノ酸への置換が挙げられる。他のマイナス鎖RNAウイルスP蛋白質についても相当部位の置換が挙げられる。上記と同様に、アミノ酸の置換は、側鎖の化学的性質の異なる他のアミノ酸への置換が好ましい。具体的には、86番目のアミノ酸のLysへの置換、511番目のアミノ酸のPheへの置換などが例示できる。またL蛋白質においては、SeV L蛋白質の1197番目のAsn（N1197）および／または1795番目のLys（K1795）の他のアミノ酸への置換、および他のマイナス鎖RNAウイルスL蛋白質の相当部位の置換が挙げられ、上記と同様に、アミノ酸の置換は、側鎖の化学的性質の異なる他のアミノ酸への置換が好ましい。具体的には、1197番目のアミノ酸のSerへの置換、1795番目のアミノ酸のGluへの置換などが例示できる。P遺伝子およびL遺伝子の変異は、持続感染性、２次粒子放出の抑制、または細胞傷害性の抑制の効果を顕著に高めることができる。さらに、エンベロープ蛋白質遺伝子の変異および／または欠損を組み合わせることで、これらの効果を劇的に上昇させることができる。またL遺伝子は、SeV L蛋白質の1214番目のTyr（Y1214）および／または1602番目のMet（M1602）の他のアミノ酸への置換、および他のマイナス鎖RNAウイルスL蛋白質の相当部位の置換が挙げられ、上記と同様に、アミノ酸の置換は、側鎖の化学的性質の異なる他のアミノ酸への置換が好ましい。具体的には、1214番目のアミノ酸のPheへの置換、1602番目のアミノ酸のLeuへの置換などが例示できる。以上に例示した変異は、任意に組み合わせることができる。
【００３８】
例えば、SeV M蛋白質の少なくとも69位のG、116位のT、及び183位のA、SeV HN蛋白質の少なくとも262位のA，264位のG，及び461位のK、SeV P蛋白質の少なくとも511位のL、SeV L蛋白質の少なくとも1197位のN及び1795位のKが、それぞれ他のアミノ酸に置換されており、かつF遺伝子を欠損または欠失するセンダイウイルスベクター、ならびに、細胞傷害性がこれらと同様またはそれ以下、および/または温度感受性がこれらと同様またはそれ以上のF遺伝子欠損または欠失センダイウイルスベクターは特に好適である。他のマイナス鎖RNAウイルスについても、相当部位を同様に置換し、F遺伝子を欠損または欠失するベクター、ならびに、細胞傷害性がこれらと同様またはそれ以下、および/または温度感受性がこれらと同様またはそれ以上のF遺伝子欠損または欠失ベクターが好ましい。具体的な置換例を例示すれば、例えばM蛋白質についてはG69E，T116A，及びA183Sの置換を、HN蛋白質についてはA262T，G264R，及びK461Gの置換を、P蛋白質についてはL511Fの置換を、そしてL蛋白質についてはN1197S及びK1795Eの置換を挙げることができる。
【００３９】
アミノ酸変異は、所望の他のアミノ酸への置換であってよいが、好ましくは、上記と同様に側鎖の化学的性質の異なるアミノ酸への置換である。例えばアミノ酸は、塩基性アミノ酸（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性アミノ酸 (例えばアスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電極性アミノ酸 (例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン)、非極性アミノ酸 (例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、β分岐アミノ酸 (例えばスレオニン、バリン、イソロイシン)、および芳香族アミノ酸 (例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)などのグループに分類することができるが、あるアミノ酸について、そのアミノ酸が属するグループのアミノ酸以外のアミノ酸に置換することなどが挙げられる。具体的には、塩基性アミノ酸であれは、酸性または中性アミノ酸への置換、極性アミノ酸であれは非極性アミノ酸への置換、20種の天然のアミノ酸の平均分子量より大きい分子量を持つアミノ酸であれば、その平均分子量より小さいアミノ酸への置換、逆にその平均分子量より小さいアミノ酸であれば、それより大きいアミノ酸への置換などが挙げられるが、それに限定されない。
【００４０】
また、L蛋白質の変異としては、SeV L蛋白質の942位（Y942）、1361位（L1361）、および1558位（L1558）から任意に選択される部位、あるいはマイナス鎖RNAウイルスL蛋白質の相当部位のアミノ酸の他のアミノ酸への置換も挙げられる。上記と同様に、アミノ酸の置換は、側鎖の化学的性質の異なる他のアミノ酸への置換が好ましい。具体的には、942番目のアミノ酸のHisへの置換、1361番目のアミノ酸のCysへの置換、1558番目のアミノ酸のIleへの置換などが例示できる。特に少なくとも942位または1558位が置換されたL蛋白質を好適に用いることができる。例えば1558位に加え、1361位も他のアミノ酸に置換された変異L蛋白質も好適である。また、942位に加え、1558位および/または1361位も他のアミノ酸に置換された変異L蛋白質も好適である。これらの変異により、L蛋白質の温度感受性を上昇させることができる。
またP蛋白質の変異としては、SeV P蛋白質の433位（D433）、434位（R434）、および437位（K437）から任意に選択される部位、あるいはマイナス鎖RNAウイルスP蛋白質の相当部位のアミノ酸の他のアミノ酸への置換が挙げられる。上記と同様に、アミノ酸の置換は、側鎖の化学的性質の異なる他のアミノ酸への置換が好ましい。具体的には、433番目のアミノ酸のAla (A) への置換、434番目のアミノ酸のAla (A) への置換、437番目のアミノ酸のAla (A) への置換などが例示できる。特にこれら３つの部位全てが置換されたP蛋白質を好適に用いることができる。これらの変異により、P蛋白質の温度感受性を上昇させることができる。
【００４１】
本発明のベクターに含まれ得る温度感受性変異はWO2012/029770、WO2010/008054、WO2003/025570に詳述されている。好ましくは、P蛋白質については少なくとも433位のD、434位のR、および437位のKの3箇所が、他のアミノ酸に置換された変異P蛋白質である。加えて、L蛋白質については少なくとも1558位のLが置換された変異L蛋白質（好ましくは少なくとも1361位のLも他のアミノ酸に置換された変異L蛋白質）をコードする、F遺伝子を欠損または欠失するセンダイウイルスベクター、ならびに、細胞傷害性がこれと同様またはそれ以下、および/または温度感受性がこれと同様またはそれ以上のF遺伝子を欠損または欠失するセンダイウイルスベクターも、本発明において好適に用いられる。各ウイルス蛋白質は、上記の変異以外に他のアミノ酸（例えば10以内、5以内、4以内、3以内、2以内、または1アミノ酸）に変異を有していてもよい。上記に示した変異を有するベクターは高い温度感受性を示す。
【００４２】
本発明のベクターに含まれるゲノムRNAは、エンベロープタンパク質遺伝子を全てコードしていてもよく、一部または全部のエンベロープタンパク質遺伝子をコードしていなくてもよい。ゲノムRNAにコードされるエンベロープタンパク質遺伝子（M遺伝子、F遺伝子、HN遺伝子）は野生型であってもよいが、温度感受性変異が導入されていてもよい。エンベロープタンパク質の温度感受性変異は、WO2012/029770、WO2010/008054、WO2003/025570に詳述されている。
【００４３】
ウイルスベクターを製造する際に、所望の外来性エンベロープ蛋白質をウイルス産生細胞で発現させることにより、これを含むウイルスベクターを製造することができる。このような蛋白質に特に制限はなく、哺乳動物細胞への感染能を付与する所望の接着因子、リガンド、受容体等の蛋白質が用いられる。具体的には、例えば水疱性口内炎ウイルス（vesicular stomatitis virus; VSV）のG蛋白質（VSV-G）を挙げることができる。VSV-G蛋白質は、任意のVSV株に由来するものであってよく、例えば Indiana血清型株（J. Virology 39: 519-528 (1981)）由来のVSV-G蛋白を用いることができるが、これに限定されない。本発明のウイルスベクターは、他のウイルス由来のエンベロープ蛋白質を任意に組み合わせて含むことができる。
【００４４】
本発明において温度感受性とは、低温 (例えば30〜36℃) に比べ、通常の細胞培養温度（例えば37〜38℃）において有意に活性が低下することである。より好ましくは、35℃に比べ、37℃において有意に活性が低下することをいう。例えば発現ベクターの場合、温度感受性ベクターとは、低温 (例えば30〜36℃) 下での発現量に比べ、通常の細胞培養温度（例えば37〜38℃）での発現量が有意に低いことを言う。例えば温度感受性ベクターの増殖速度または遺伝子発現レベルは、35℃に比べ37℃においては、例えば2/3以下、好ましくは1/2以下、より好ましくは1/3以下、より好ましくは1/5以下、より好ましくは1/10以下、より好ましくは1/20以下である。また温度感受性ベクターは、野生型蛋白質を持つベクターと比較して、37℃における増殖速度または遺伝子発現レベルが、例えば1/2以下、より好ましくは1/3以下、より好ましくは1/5以下、より好ましくは1/10以下、より好ましくは1/20以下である。例えばWO2012/029770、WO2010/008054に詳述のセンダイウイルスのTS 7（L蛋白質のY942H/L1361C/L1558I変異）、TS 12（P蛋白質のD433A/R434A/K437A変異）、TS 13（P蛋白質のD433A/R434A/K437A変異および L蛋白質のL1558I変異）、TS 14（P蛋白質のD433A/R434A/K437A変異および L蛋白質のL1361C）、TS 15（P蛋白質のD433A/R434A/K437A変異および L蛋白質のL1361C/L1558I）などの変異は、好ましい温度感受性変異である。
【００４５】
具体的なベクターを例示すれば、例えばM蛋白質にG69E, T116A, 及びA183Sの変異を、HN蛋白質にA262T, G264R, 及びK461Gの変異を、P蛋白質にL511F変異を、そしてL蛋白質にN1197S及びK1795E変異を持つF遺伝子欠失型センダイウイルスベクター（例えばZ strain）であってよく、このベクターにさらにTS 7、TS 12、TS 13、TS 14、またはTS 15の変異を導入したベクターはより好ましい。具体的には、SeV18+/TSΔF（WO2010/008054、WO2003/025570）やSeV(PM)/TSΔF、および、これらにさらにTS 7、TS 12、TS 13、TS 14、またはTS 15の変異を導入したベクターにおいて、P蛋白質にdegronを付加するように改変したベクターなどが挙げられるが、これらに限定されない。
なお「TSΔF」は、M蛋白質にG69E,T116A,及びA183Sの変異を、HN蛋白質にA262T,G264R,及びK461Gの変異を、P蛋白質にL511F変異を、そしてL蛋白質にN1197S及びK1795E変異を持ち、F遺伝子を欠失することを言う。
【００４６】
本発明においてdegronとは蛋白質に付加することにより該蛋白質を不安定化させるポリペプチドを言い、当業者にはよく知られている。Degronには、低分子との結合によって安定化する配列、低分子との結合によって不安定化する配列、低分子の有無に関わらず不安定化する配列が挙げられる。具体的にはmTOR蛋白として知られるFKBP12由来のDD-tag（US2009/0215169）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）由来のDDG-tag（US2012/0178168）、TetR変異体（WO2007/032555）、植物由来のauxin-inducible degron（AID）システム（WO2010/125620）、分解促進配列として知られるPEST配列（WO99/54348）、CL1（WO2004/025264）、カルパイン由来配列（特開2009-136154）、NDS（特開2011-101639）などが挙げられる。FKBP12はmammalian target of rapamycin (mTOR)として知られ、rapamycinやshield1などの低分子と結合することで安定化され、除去することで不安定化し、プロテアソームによって分解される。DHFRはtrimethoprimによって安定化し、TetR変異体はdoxycyclineによって安定化する。PEST配列はPro, Glu, Ser, Thrに富む配列であり、例えばmouse ornithine decarboxylase（mODC）のC末端側422-461を付加することで不安定化させることができる。PEST配列は蛋白質の半減期を調節しているが、所望の半減期短縮配列を用いることができる（Rechsteiner M, et al., Trends Biochem. Sci. 21, 267-271, 1996）。PEST配列は例えば両端が塩基性アミノ酸（H、KまたはR）で囲まれており、(i) P、(ii) DおよびE、または(iii) SおよびEを含みユビキチン化酵素E3と結合する配列であり、例えばGENETYXTM Ver.9（ゼネティックス社）により同定することができる。PESTと同様の効果が得られる配列としてCL1、カルパイン部分配列、NDSなどが挙げられる。AID配列は植物のユビキチンリガーゼであるTIR1とオーキシン（IAA）が結合することで不安定化される。
【００４７】
本発明においてはこれらのdegronをP蛋白質に付加することができ、好ましいdegronとしては、具体的にはmTOR degron、DHFR degron、TetR degron、PEST、およびAIDが挙げられる。なおこれらのdegronには天然の配列およびそれに由来するものが含まれる。特に好ましいdegronとしては、mTOR degron、DHFR degron、TetR degron、およびPESTが挙げられ、中でもAID配列以外のdegronが好適であり、具体的にはFKBP12 degron（DD）、DHFR degron（DDG）、TetR degron、およびmODC PESTが好ましい。PESTには天然の配列に由来するd2やその改変体であるd1やd4などが知られているが（WO99/54348）、これらはいずれもPESTに含まれ、本発明において使用することができる（実施例参照）。
【００４８】
以下に好ましいdegron配列の例を具体的に例示する。
mODC PEST配列（WO99/54348）
d2tag：mODC422-461：ACCESSION：P00860のC末端側422-461（配列番号：89）（DNA:配列番号：101）
d4tag：mODC422-461（T436A）（配列番号：90）
d1tag：mODC422-461（E428A/E430A/E431A）（配列番号：91）
また、WO99/54348に記載の他の変異体であってもよい。具体的には、WO99/54348に記載のMODC376-461、MODC376-456、およびMODC422-461 （配列番号：89）、ならびにMODC422-461 に対する変異配列であるP426A/P427A、P438A、E428A/E430A/E431A、E444A、S440A、S445A、T436A、D433A/D434A、D448A、およびそれらの組み合わせの変異を含むもの等が好適なPEST配列として例示できる。また、これらのアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸を置換、欠失および/または付加したアミノ酸配列を含み、蛋白質を不安定化させる活性を有するポリペプチドを用いてもよい。特に好ましい配列は、MODC422-461 （配列番号：89）およびその変異体mODC422-461（T436A）（配列番号：90）である。また、P438AやS440Aなども本発明において好適に使用することができる。
【００４９】
DD-tagの配列（US2012/0178168）
DD-tag：FKBP（L106P）：ACCESSION：NP_000792の変異体（F37V/L107P）（配列番号：93）（DNA:配列番号：102）
また、US2012/0178168に記載の他の変異体であってもよい。なお、US2012/0178168ではN末端側のMetを数えずにL106Pと表記しており、この変異はNP_000792のL107Pと同位置である。
具体的には、例えばACCESSION：NP_000792の2-108（FKBP2-108）（配列番号：92）、およびその変異体が挙げられ、変異体としてはF36V、F15S、V24A、H25R、E60G、L106P、D100G、M66T、R71G、D100N、E102G、K105I（いずれもN末端側のMetを数えず2番目のアミノ酸を1とした位置を表す）、およびそれらの組み合わせの変異を含むものが挙げられる。また、これらのアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸を置換、欠失および/または付加したアミノ酸配列を含み、蛋白質を不安定化させる活性を有するポリペプチドを用いてもよい。
【００５０】
DDG-tagの配列（US2012/0178168）
DDG-tag：DHFR（H12L/Y100I）：ACCESSION：B7MAH1 [UniParc]（配列番号：94）（DNA:配列番号：42） の変異体（R12L/G67S/Y100I）（配列番号：95）
また、US2012/0178168に記載の他の変異体であってもよい。具体的には、例えばDFHR蛋白質のアミノ酸配列（ACCESSION：B7MAH1、配列番号：94）、およびその変異体が挙げられ、変異体としてはN18T/A19V、F103L、Y100I、G121V、H12Y/Y100I、H12L/Y100I、R98H/F103S、M42T/H114R、I61F/T68S、およびそれらの組み合わせの変異を含むものが挙げられる。また、これらのアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸を置換、欠失および/または付加したアミノ酸配列を含み、蛋白質を不安定化させる活性を有するポリペプチドを用いてもよい。なお、1アミノ酸目のMetはなくてもよい。
【００５１】
TetR-tagの配列（WO2007/032555）
TetR-tag：TetR（R28Q/D95N/L101S/G102D）：ACCESSION：NP_941292（配列番号：96）（DNA:配列番号：80） の変異体（R28Q/D95N/L101S/G102D）（配列番号：97）
また、WO2007/032555に記載の他の変異体であってもよい。具体的には、例えばTetR蛋白質のアミノ酸配列（ACCESSION：NP_941292、配列番号：96）、およびその変異体が挙げられ、変異体としてはD95N、L101S、G102D、およびそれらの組み合わせの変異を含むものが挙げられる。さらにR28Qの変異を含んでもよい。また、これらのアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸を置換、欠失および/または付加したアミノ酸配列を含み、蛋白質を不安定化させる活性を有するポリペプチドを用いてもよい。なお、1アミノ酸目のMetはなくてもよい。
【００５２】
Degronをコードする核酸は、DNA合成により適宜作製することができる。また天然のdegron配列は、上記に示したdegron配列をコードするDNA（例えば配列番号：101、102、42、または80等を）またはその相補配列をプローブにして、ハイブリダイゼーション法をストリンジェントな条件下に行なうことにより分離することができる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、当業者であれば適宜選択することができる。例えば、25％ホルムアミド、より厳しい条件では50％ホルムアミド、4×SSC、50mM HEPES pH7.0、10×デンハルト溶液、20μg/ml変性サケ精子DNAを含むハイブリダイゼーション溶液中、42℃で一晩プレハイブリダイゼーションを行った後、42℃で一晩ハイブリダイゼーションを行う。その後の洗浄は、「1xSSC、0.1% SDS、37℃」程度で、より厳しい条件としては「0.5xSSC、0.1% SDS、42℃」程度で、さらに厳しい条件としては「0.2xSSC、0.1% SDS、65℃」または「0.1xSSC、0.1% SDS、65℃」程度の洗浄液および温度条件で実施することができる。このようなハイブリダイゼーション技術を利用して単離されるポリヌクレオチドやそれがコードするポリペプチドは、通常、プローブとしたポリヌクレオチドやそれがコードするポリペプチドと、それぞれ塩基配列およびアミノ酸配列において高い相同性を有する。高い相同性とは、少なくとも70％以上、さらに好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上、さらに好ましくは少なくとも95％以上、さらに好ましくは少なくとも97％以上（例えば、98％以上または99％以上）の配列の同一性を指す。配列の同一性は、例えば、Karlin and Altschul によるアルゴリズムBLAST (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, 1990、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877, 1993) によって決定することができる。このアルゴリズムに基づいて開発されたBLAST(Altschul et al. J. Mol. Biol.215:403-410, 1990)によって配列を解析する場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である(www.ncbi.nlm.nih.gov.)。アミノ酸配列を改変する場合、改変するアミノ酸は好ましくは1〜数アミノ酸であり、より好ましくは1〜10、1〜8、1〜5、1〜4、1〜3、または1〜2である。
【００５３】
Degronは、適宜P蛋白質の所望の位置に付加することができ、例えばP蛋白質のN末端またはC末端に付加することができる。P蛋白質のN末端に付加する場合であって、P蛋白質のコード領域中の核酸にコードされるC蛋白質の発現が阻害される場合は、ベクターからC蛋白質を別途、発現させればよい。P蛋白質として全長P蛋白質ではなく断片を用いる場合であって、C蛋白質のコード領域を含まない断片である場合は、N末端でもC末端でも任意の位置にdegronを付加することができる。本発明においてdegronは、好ましくはP蛋白質のC末端側に付加される。Degronが付加された改変P蛋白質は周知の方法により作製することができる。具体的には、P蛋白質をコードするウイルスゲノムの配列に、読み枠が一致するようにdegronをコードする配列を挿入すればよい。
【００５４】
なお上述の通り、P蛋白質は全長でなくても、適宜断片を用いることができる。P蛋白質として必須なのはC末端の一部だけであって、その他の領域はウイルスベクターの発現に必須ではない。P蛋白質は、具体的には、L蛋白質の結合部位とN蛋白質：RNAへの結合部位とを保持する断片であってもよい。L蛋白質の結合部位としては、例えばSeV P蛋白質の411番目〜445番目のアミノ酸配列が挙げられ、N蛋白質：RNA結合部位としては、例えばSeV P蛋白質（例えばaccession番号AAB06197.1, P04859.1, P14252.1, AAB06291.1, AAX07439.1, BAM62828.1, BAM62834.1, P04860.1, BAM62840.1, BAD74220.1, P14251.1, BAM62844.1, BAM62842.1, BAM62842.1, BAF73480.1, BAD74226.1, BAF73486.1, Q9DUE2.1, BAC79134.1, NP_056873.1, ABB00297.1等）の479番目〜568番目のアミノ酸配列が挙げられる。より具体的には、例えばSeV P蛋白質の320番目〜568番目のアミノ酸配列を含む断片は、本発明において機能的なP蛋白質として好適に用いることができる。欠失型のP蛋白質を用いることで、ベクターのサイズを小型化できると共に、宿主の免疫反応の影響も受けにくくなることが期待できる。
【００５５】
C蛋白質のコード領域を欠失するP蛋白質を用いる場合は、上述の通り、適宜C蛋白質を別途発現させてもよい。ここでC蛋白質には、C'、C、Y1、およびY2蛋白質が含まれる（Irie T. et al.,PLoS One. （2010）5:e10719.）。C蛋白質を発現させるには、C蛋白質のコード配列を適宜ベクター中に挿入すればよい。挿入位置に特に制限はないが、P蛋白質の直前（ゲノムにおけるP蛋白質のコード配列の3'側）あるいはP蛋白質の直後（ゲノムにおけるP蛋白質のコード配列の5'側）に挿入することができる。挿入にあたっては、適宜E-I-S配列を付加してよい。
【００５６】
本発明においてP蛋白質にdegronが付加されたベクター、特に温度感受性P蛋白質にdegronが付加されたベクターは、具体的にはP蛋白質にD433A/R434A/K437A変異を有し（WO2012/029770、WO2010/008054）、degronがDD-tag、DDG-tag、TetR-tag、mODCのPEST配列、あるいは分解速度が異なるその変異体である（WO99/54348）。より好ましくは温度感受性変異としてL蛋白質にL1361C/L1558I変異を有している。
【００５７】
本発明において低温培養とは、36.5℃より低い温度で培養することを言う。好ましくは低温培養とは、36.4℃未満、より好ましくは36.3℃、36.2℃、36.1℃、36℃、35.9℃、35.8℃、35.7℃、35.6℃、35.5℃、35.4℃、35.3℃、35.2℃、35.1℃、より好ましくは35℃より低い温度で培養することを言う。下限は例えば30℃、好ましくは31℃、より好ましくは32℃、33℃、または34℃である。また、本発明において約37℃とは、具体的には、36.5〜37.5℃、好ましくは36.6〜37.4℃、より好ましくは36.7℃〜37.3℃を言う。
【００５８】
本発明のベクターを導入し、目的の遺伝子を発現させた後は、degronの性質に合わせて適宜ベクターを除去することができる。例えばDDやDDG、TetR変異体などのようにリガンド制御性のdegron（ligand controllable degron）を用いる場合、Shield-1 などのリガンドを除去または添加することによりベクターの除去を促進することができる。また、mODCなどのようにリガンドがなくても機能を発揮するdegronであれば、ベクターを導入した細胞の培養を継続することによりベクターの除去を促進することができる。除去を開始してから除去されるまでの培養期間は適宜決定してよいが、本発明のベクターを用いれば、例えば4週間以内、3週間以内、2週間以内、または1週間以内、例えば20日以内、15日以内、10日以内、5日以内、または3日以内にベクターが除去される。当該培養期間は、例えば 3日〜3週間であり、または5日〜20日、5日〜2週間である。ウイルスの除去は、レポーター遺伝子の検出や、抗体やPCRを用いたウイルスの検出により、そのレベルがウイルス非導入細胞と同等のレベル（またはウイルス導入後の最大値に比べ1/100以下、好ましくは1/500以下、1/1000以下、または1/5000以下）にまで低下したことにより確認できる。
【００５９】
本発明において温度感受性P蛋白質にdegronが付加されたベクターの除去促進は、例えば35℃〜39℃で行うことができる。好ましくは36℃〜38.5℃、より好ましくは約37℃で行う。本発明においてベクターの除去が促進されるとは、このような条件において、degronを付加しないベクターに比べベクターの除去が有意に促進されることである。
【００６０】
本発明のマイナス鎖RNAウイルスベクターの製造は、公知の方法を利用して行えばよい。具体的な手順として、典型的には、（ａ）マイナス鎖RNAウイルスゲノムRNA（マイナス鎖）またはその相補鎖（プラス鎖）をコードするcDNAを、ウイルス粒子形成に必要なウイルス蛋白質（NP、P、およびL）を発現する細胞で転写させる工程、（ｂ）生成したウイルスを回収する工程、により製造することができる。ウイルスの形成に必要なウイルス蛋白質は、転写させたウイルスゲノムRNAから発現されてもよいし、ゲノムRNA以外から供給されてもよい。例えば、NP、P、およびL蛋白質をコードする発現プラスミドを細胞に導入して供給することができる。ゲノムRNAにおいてウイルスの形成に必要なウイルス遺伝子が欠損している場合は、そのウイルス遺伝子をウイルス産生細胞で別途発現させ、ウイルス形成を相補することもできる。ウイルス蛋白質やRNAゲノムを細胞内で発現させるためには、該蛋白質やゲノムRNAをコードするDNAを宿主細胞で機能する適当なプロモーターの下流に連結したベクターを宿主細胞に導入する。転写されたゲノムRNAは、ウイルス蛋白質の存在下で複製されビリオンが形成される。エンベロープ蛋白質などの遺伝子を欠損する欠損型ウイルスを製造する場合は、欠損する蛋白質またはその機能を相補できる他のウイルス蛋白質などをウイルス産生細胞において発現させることもできる。本発明においては、少なくともF遺伝子を欠失したベクターを好適に用いることができる。
【００６１】
本発明のベクターに含まれるゲノムRNAには、例えばP遺伝子にdegron配列が付加されているものであり、NP、P、およびLタンパク質の存在下でこのゲノムRNA（ポジティブ鎖またはネガティブ鎖）を転写させることにより、本発明のRNPを製造することができる。この際、degronが付加されていないP蛋白質（例えば野生型P蛋白質）を発現させることにより、ゲノムRNAにコードされるdegronが付加されたP蛋白質によるウイルス製造に対するネガティブな影響を防ぐことができる。RNPの形成は、例えばBHK-21またはLLC-MK2細胞などで行わせることができる。NP、P、およびLタンパク質の供給は、ウイルスベクターにより供給されるものでない限り、種々の方法により行うことができる。例えば、上述の通り各遺伝子をコードする発現ベクターを細胞に導入することにより行われ得る（実施例参照）。また、各遺伝子は宿主細胞の染色体に組み込まれていてもよい。RNPを形成させるために発現させる NP、P、およびL遺伝子は、ベクターのゲノムにコードされる NP、P、およびL遺伝子と完全に同一である必要はない。すなわち、これらの遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列は、RNPゲノムがコードするタンパク質のアミノ酸配列そのままでなくとも、ゲノムRNAと結合し、細胞内でゲノムへの転写複製活性を持つ限り、変異を導入してもよく、あるいは他のウイルスの相同遺伝子で代用してもよい。
【００６２】
エンベロープ蛋白質遺伝子の欠損ベクターの場合、細胞内でベクターを再構成させる時にF、HN、および/またはMタンパク質などのエンベロープ蛋白質を細胞で発現させれば、これらタンパク質がウイルスベクターに取り込まれ、感染性を保持するウイルスベクターを生産することができる。このようなベクターは、一度細胞に感染すると、細胞内RNPによりゲノムRNAからタンパク質を発現させることはできても、それ自身はP蛋白質に温度感受性変異とdegron配列が付加されているため、温度上昇とdegronの不安定化によりベクター除去が促進される。このようなベクターは、特に転写因子を搭載することで細胞の改変に極めて有用である。
【００６３】
本発明は、本発明のベクターの製造方法であって、該ベクターのゲノムRNAまたはその相補鎖をコードする核酸を、いずれもdegronが付加されていないNP蛋白質、P蛋白質、およびL蛋白質の存在下で発現させる工程を含む方法を提供する。すなわち本発明は、本発明のベクターの製造方法であって、該ベクターのゲノムRNAまたはその相補鎖をコードする核酸を、NP蛋白質、P蛋白質、およびL蛋白質の存在下で発現させる工程を含み、該NP蛋白質、P蛋白質、およびL蛋白質はdegronが付加されていないNP蛋白質、P蛋白質、およびL蛋白質である方法を提供する。このようにして製造されたウイルスベクターは、degronが付加されていないP蛋白質を含み、degronが付加されたP蛋白質をコードするウイルスベクターである。
【００６４】
例えば、本発明のマイナス鎖RNAウイルスの製造は、以下の従来の方法を利用して、degron付加するように改変したP蛋白質をコードするウイルスゲノムを発現させることにより実施することができる（WO97/16539; WO97/16538; WO00/70055; WO00/70070; WO01/18223; WO03/025570； WO2005/071092; WO2006/137517; WO2007/083644; WO2008/007581; Hasan, M. K. et al., J. Gen. Virol. 78: 2813-2820, 1997、Kato, A. et al., 1997, EMBO J. 16: 578-587 及び Yu, D. et al., 1997, Genes Cells 2: 457-466; Durbin, A. P. et al., 1997, Virology 235: 323-332; Whelan, S. P. et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 8388-8392; Schnell. M. J. et al., 1994, EMBO J. 13: 4195-4203; Radecke, F. et al., 1995, EMBO J. 14: 5773-5784; Lawson, N. D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 4477-4481; Garcin, D. et al., 1995, EMBO J. 14: 6087-6094; Kato, A. et al., 1996, Genes Cells 1: 569-579; Baron, M. D. and Barrett, T., 1997, J. Virol. 71: 1265-1271; Bridgen, A. and Elliott, R. M., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 15400-15404; Tokusumi, T. et al. Virus Res. 2002: 86; 33-38、Li, H.-O. et al., J. Virol. 2000: 74; 6564-6569）。またウイルスの増殖方法および組み換えウイルスの製造方法については、ウイルス学実験学 各論、改訂二版（国立予防衛生研究所学友会編、丸善、1982）も参照のこと。
【００６５】
本発明のベクターは上記に加えてP蛋白質の活性が低下しているため、好ましくはP発現細胞を用いて製造を行う。F遺伝子を欠損するベクターの場合は、P蛋白質とF蛋白質を発現する細胞（PF発現細胞）を用いて製造を行えばよい（本実施例参照）。
【００６６】
本発明のベクターは、所望の遺伝子を搭載することができる。搭載する遺伝子に特に制限はなく、所望の外来遺伝子（ベクターがもともと持っていない遺伝子）を搭載することができる。搭載する外来遺伝子の数に特に制限はなく、1個、2個、またはそれ以上搭載することができる。外来遺伝子が蛋白質をコードする場合は、当該蛋白質に適宜degronを付加することができる。本発明のベクターのP蛋白質に付加したdegronとは異なるdegronを付加することにより、外来遺伝子がコードする蛋白質の発現を、ベクターの除去とは独立に制御することができる（実施例26、27）。例えばP蛋白質に、温度で発現を制御できるdegronを付加し、外来遺伝子がコードする蛋白質に、化合物等で発現を制御できるdegronを付加しておくことができる。具体的には、例えばP蛋白質にPEST配列またはddタグを付加し、外来遺伝子がコードする蛋白質に、shield1等で制御できるddタグまたはtrimethoprim等で制御できるddgタグを付加することができる。また、例えば2つの外来遺伝子を搭載する場合、それぞれの外来遺伝子がコードする蛋白質には、互いに異なるdegronを付加しておけば、それら2つの外来蛋白質のそれぞれの発現を、ベクターとは独立に制御することが可能である。具体的には、例えばP蛋白質にPEST配列またはddタグを付加し、2つの外来遺伝子がコードする蛋白質に、それぞれ、ddタグ、およびddgタグを付加しておくことにより、2つの外来遺伝子の発現を独立して制御することができる。本発明は、これらのベクターを用いて、ベクターの除去のタイミングとは独立に外来遺伝子の発現を制御する方法にも関する。このようなベクターは、特に転写因子や細胞の分化調節因子等の蛋白質を発現する際の発現調節に有用である。
【００６７】
本発明のベクターにおいて、外来遺伝子は、一般に、いずれかのウイルス遺伝子（例えばNP, P, M, F, HN, または L）の直前（ゲノムの3'側）または直後（ゲノムの5'側）に挿入することができる。外来遺伝子は、適宜センダイウイルスS（Start）配列とE（End）配列で挟まれていてよい。S配列は転写を開始させるシグナル配列であり、E配列で転写が終結する。S配列とE配列で挟まれた領域は、１つの転写単位となる。ある遺伝子のE配列と次の遺伝子のS配列の間は、適宜スペーサーとなる配列（介在配列；intervening sequence）を挿入することができる。
【００６８】
S配列としては、マイナス鎖RNAウイルスの所望のS配列を用いることができるが、例えばセンダイウイルスであれば 3'-UCCCWVUUWC-5'（W= AまたはU; V= A, C, またはG）（配列番号：1）の配列を好適に用いることができる。特に 3'-UCCCAGUUUC-5'（配列番号：2）、3'-UCCCACUUAC-5'（配列番号：3）、および 3'-UCCCACUUUC-5'（配列番号：4）が好ましい。これらの配列は、プラス鎖をコードするDNA配列で表すとそれぞれ 5'-AGGGTCAAAG-3'（配列番号：5）、5'-AGGGTGAATG-3'（配列番号：6）、および 5'-AGGGTGAAAG-3'（配列番号：7）である。マイナス鎖RNAウイルスベクターのE配列としては、例えばセンダイウイルスであれば 3'-AUUCUUUUU-5'（プラス鎖をコードするDNAでは 5'-TAAGAAAAA-3'）が好ましい。I配列は、例えば任意の3塩基であってよく、具体的には 3'-GAA-5'（プラス鎖DNAでは 5'-CTT-3'）を用いればよい。
【００６９】
本発明のベクターは転写因子等のリプログラミング因子をコードする遺伝子を搭載することで、当該ベクターを多能性幹細胞作製に適用することができ、その時のベクター除去を促進することが可能である。例えばWO2012/029770、WO2010/008054においてcMYCは温度感受性のTS15ベクターに搭載されているが、これを本発明のベクターに搭載して置き換えることでKLF4、OCT4、SOX2、cMYCを用いて多能性幹細胞を作製する際のベクター除去を促進することが可能である。多能性幹細胞を作製する際に用いる転写因子はL-MYC、Glis1、Lin28、NANOGなど上記の分子以外を用いてもよい。ベクターに搭載する転写因子遺伝子は適宜改変することができる。例えば野生型c-MYCにa378g、t1122c、t1125c、a1191g、および a1194g からなる群より選択される１つ以上、好ましくは２以上、３以上、４以上、または５つ全ての変異を導入することにより、ベクターから遺伝子を安定して高発現させることが可能となる（例えばWO2010/008054の配列番号：45）。
【００７０】
本発明において多能性幹細胞とは、動物の胚盤胞期の胚の内部細胞塊より作られる幹細胞またはそれと類似した表現型を有する細胞を言う。具体的には、本発明において誘導される多能性幹細胞は、ES様細胞の指標であるアルカリホスファターゼを発現する細胞である。ここでES様細胞とは、ES細胞と類似した性質および/または形態を有する多能性幹細胞を言う。また好ましくは、多能性幹細胞は、培養することにより、細胞質に比べ核の容量の比率が高い細胞からなる扁平なコロニーを形成する。培養は、適宜フィーダーと共に培養してもよい。またMEFなどの培養細胞が数週間で増殖が停止するのに対し、多能性幹細胞は長期間の継代が可能であり、例えば3日ごとの継代で15回以上、好ましくは20回以上、25回以上、30回以上、35回以上、または40回以上継代しても、増殖性が失われないことにより確認することができる。また多能性幹細胞は、好ましくは内在性のNANOGを発現する。また多能性幹細胞は、好ましくはTERTを発現し、テロメラーゼ活性（テロメリックリピート配列を合成する活性）を示す。また多能性幹細胞は、好ましくは三胚葉（内胚葉、中胚葉、外胚葉）に分化する能力（例えばテラトーマ形成および／または胚様体形成において確認できる）を持つ。より好ましくは、多能性幹細胞は、胚盤胞に移植することにより生殖系列キメラを生成する。Germline transmissionが可能な多能性幹細胞は、germline-competentな多能性幹細胞と言う。これらの表現型の確認は、周知の方法により実施することができる（WO2007/69666; Ichisaka T et al., Nature 448(7151):313-7, 2007）。また本発明のベクターに分化誘導因子遺伝子を搭載させ、未分化細胞や幹細胞等に導入して所望の細胞や組織を分化させることもできる。
【００７１】
本発明のベクターの導入により製造された細胞は、様々な組織や細胞に分化させるために有用であり、所望の試験、研究、診断、検査、治療等において用いることができる。例えば誘導した幹細胞は、幹細胞療法において利用されることが期待される。例えば患者から採取した体細胞を用いて初期化（reprogramming）を誘導し、その後、分化誘導して得られる体性幹細胞やその他の体細胞を患者に移植することができる。細胞の分化誘導の方法は特に限定されず、例えばレチノイン酸処理や、様々な増殖因子・サイトカイン処理、ホルモンによる処理により分化を誘導することができる。また得られた細胞は、所望の薬剤や化合物の効果を検出するために使用することができ、これを通して薬剤や化合物のスクリーニングを実施することが可能である。本発明は、医学的用途および非医学的用途のために用いることができ、メディカルおよび非メディカルの態様において有用である。例えば本発明は、治療、手術、および/または診断、あるいは非治療、非手術、および/または非診断の目的に用いることができる。
【００７２】
ベクターを導入する細胞に特に制限はなく、分化した体細胞でもよく、造血幹細胞、神経幹細胞、間葉系幹細胞、肝幹細胞、皮膚表皮幹細胞といった体性幹細胞や生殖幹細胞でもよい。また細胞は、例えば胚、胎児、新生児、子供、成人または老人の細胞に由来してよい。また、動物の由来は特に制限はなく、ヒトおよび非ヒト霊長類（サルなど）、マウス、ラットなどのげっ歯類、およびウシ、ブタ、ヤギなどの非げっ歯類を含む哺乳動物等が含まれる。
【００７３】
本発明のベクターは、ベクターを細胞に導入３日後におけるベクターからの遺伝子発現またはベクター量に比べ、さらに37℃で培養した場合、それぞれベクターからの遺伝子発現またはベクター量は、その後、1週間の培養で、例えば1/5以下、好ましくは1/8以下、好ましくは1/10以下、1/20以下、1/30以下、または1/50以下に低下し、2週間の培養で、例えば1/10以下、好ましくは1/20以下、好ましくは1/30以下、1/50以下、1/100以下、1/150以下、1/200以下、1/300以下、1/500以下、1/1000以下、または検出限界以下に低下する。また本発明のベクターは、ベクターを細胞に導入後、37℃で培養した場合、ベクターからのレポーター蛋白質の発現量は、1週間または2週間の培養において、P蛋白質にdegronを付加せず、レポーター蛋白質自体にdegronを付加した場合のレポーター蛋白質の発現量に比べ有意に低く、具体的には、例えば2/3以下、好ましくは1/2以下、好ましくは1/3以下、1/5以下、1/8以下、好ましくは1/10以下、1/20以下、1/30以下、または1/50以下である。細胞は、例えばHeLa細胞（ATCC CCL-2）、BHK-21細胞（JCRB9020）、CHO細胞、293細胞、BJ細胞（ATCC CRL-2522）等が挙げられるが、好ましくはHeLa細胞で測定される。
【００７４】
また本発明は、本発明のマイナス鎖RNAウイルスベクターを他のマイナス鎖RNAウイルスベクターと共感染する工程を含む、当該他のマイナス鎖RNAウイルスベクターの除去を促進する方法に関する。当該他のマイナス鎖RNAウイルスベクターは、本発明のマイナス鎖RNAウイルスベクターと同種のマイナス鎖RNAウイルスのベクターである限り特に制限はなく、野生型マイナス鎖RNAウイルスベクターや、遺伝子欠損または遺伝子改変されたマイナス鎖RNAウイルスベクターであってもよい。本発明において、本発明のマイナス鎖RNAウイルスベクターは、感染細胞において自身の除去を促進するだけでなく、共存する他のマイナス鎖RNAウイルスベクターの除去をも促進することが見いだされた。すなわち本発明のベクターは、本発明ベクター自身および当該ベクターに搭載されている遺伝子の除去を促進するために有用であるだけでなく、共存する他のマイナス鎖RNAウイルスやマイナス鎖RNAウイルスベクターならびに当該ベクターに搭載されている遺伝子の除去を促進するためにも有用である。
【００７５】
すなわち本発明は、本発明のマイナス鎖RNAウイルスベクターを、他のマイナス鎖RNAウイルスまたは他のマイナス鎖RNAウイルスベクターと共感染させる工程を含む、該他のマイナス鎖RNAウイルスまたは他のマイナス鎖RNAウイルスベクターの除去を促進する方法を提供する。共感染は、細胞内で共存する期間があればよく、同時に感染させる必要はない。初めに他のマイナス鎖RNAウイルスまたは他のマイナス鎖RNAウイルスベクターを細胞に感染させ、それを除去する必要が生じたときに本発明のベクターを感染させることもできる。
【００７６】
また本発明は、本発明のマイナス鎖RNAウイルスベクターを含む、マイナス鎖RNAウイルスまたはマイナス鎖RNAウイルスベクターの除去促進剤を提供する。また本発明は、本発明のマイナス鎖RNAウイルスベクターを含む、マイナス鎖RNAウイルスベクターで導入する遺伝子の除去促進剤を提供する。また本発明は、マイナス鎖RNAウイルスベクターおよび/またはマイナス鎖RNAウイルスベクターで導入する遺伝子の除去促進における、本発明のマイナス鎖RNAウイルスベクターの使用を提供する。また本発明は、マイナス鎖RNAウイルスベクターおよび/またはマイナス鎖RNAウイルスベクターで導入する遺伝子の除去促進剤の製造における、本発明のマイナス鎖RNAウイルスベクターの使用を提供する。本発明のベクターを用いて、本発明のベクターの搭載遺伝子の発現を制御できることに加え、他のマイナス鎖RNAウイルスベクターの搭載遺伝子の発現も制御することが可能となる。例えばShield-1 などの低分子リガンドで不安定化を制御できるdegronを用いれば、本発明のベクターを共感染させておくことで、所望のタイミングでリガンドを添加または除去したときに、本発明のベクターだけでなく、degronを持たないマイナス鎖RNAウイルスベクターをも除去することが可能となる。
【実施例】
【００７７】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。また、本明細書中に引用された文献およびその他の参照は、すべて本明細書の一部として組み込まれる。
【００７８】
＜本発明で用いた外来遺伝子を保持するセンダイウイルスベクターの作製＞
本発明で用いた外来遺伝子を保持するセンダイウイルスベクターの作製方法を以下に示す。尚、本発明において「18+」とはNP遺伝子の前にGOIを挿入することを表し、「(PM)」とは、P遺伝子とM遺伝子の間にGOIを挿入することを表し、「(F)」とはF遺伝子の代わり（M遺伝子とHN遺伝子の間）にGOIを挿入することを表し、「(HNL)」とは、HN遺伝子とL遺伝子の間にGOIを挿入することを表す。また本発明において「TS」とは、M蛋白質にG69E,T116A,およびA183S の変異を、HN蛋白質にA262T,G264R, およびK461Gの変異を、P蛋白質にL511F変異を、そしてL 蛋白質にN1197SおよびK1795E変異を持つことを表し、「ΔF」とは、F遺伝子を欠失していることを表す。例えばNP遺伝子の前にGOIを挿入するTS変異を有するF遺伝子欠失型センダイウイルスベクターはSeV18+/TSΔFと記載する。GOIの挿入に用いた制限酵素は特に断りがなければNotIである。また、TS12とはP蛋白に上記のTS変異に加えてD433A、R434A、およびK437Aの変異を含み、TS15とは上記のTS12変異に加えてL蛋白にL1361CおよびL1558Iの変異を含むセンダイウイルスベクターである。但しこれらは例示であって、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００７９】
1）pEB-Pベクターの構築
pSeV(TDK)（WO2005/071092）由来のP遺伝子を NotIで消化したpEBMulti-Hyg（和光純薬工業社）にクローニングし、pEB-Pを得た。
【００８０】
2）DD-Azami Green（ddAG）搭載SeV(F)/TSΔFベクターの構築
phmAG（Amalgaam有限会社）よりAzami Green（AG）を鋳型にXhoI-AG-F  （5’- ATATCTCGAGCTATGGTGAGCGTGATCA -3’）（配列番号：8）およびEcoRI-AG-R  （5’- ATATGAATTCGCGGCCGCGATGAACT -3’）（配列番号：9）のプライマーを用いてPCR反応を行った。このPCR産物をXhoIおよびEcoRIで消化（37℃で一晩）し、得られたDNA断片を、DD-tag配列（配列番号：93）を含むpPTuner（クロンテック）にクローニングし、pPTuner-ddAGを得た。このpPTuner-ddAGを鋳型にNotI-ddAG-F（5’- ATATGCGGCCGCACCATGGGAGTGCAGGTGGA -3’）（配列番号：10）およびEcoRI-AG-R（配列番号：9）のプライマーを用いてPCR反応を行った。このPCR産物をNotIで消化し、得られたDNA断片をpSeV(F)/TSΔFのNotIサイトにクローニングし、pSeV(F)ddAG/TSΔFを得た。pSeV(F)ddAG/TSΔFベクターの転写産物から作製したセンダイウイルスをSeV(F)ddAG/TSΔFと称す。
【００８１】
3）DD-Azami Green（ddAG）搭載SeV(HNL)/TSΔFベクターの構築
上記ddAGをSeV(HNL)/TSΔFのNotIサイトにクローニングし、pSeV(HNL)ddAG/TSΔFを得た。pSeV(HNL)ddAG/TSΔFベクターの転写産物から作製したセンダイウイルスをSeV(HNL)ddAG/TSΔFと称す。
【００８２】
4）pSeV18+/PLmutTSΔFの構築
pSeV18+/TSΔFを鋳型にBamHI-P-F  （5’- ATATGGATCCAGTTCACGCGGCCGCA -3’）（配列番号：11）およびXhoI-P-R  （5’- ATATCTCGAGTCGGTGCAGGCCTTTA -3’）（配列番号：12）のプライマーを用いてPCR反応を行った。このPCR産物をBamHIおよびXhoIで消化し、得られたDNA断片をpBlueScript II-SK+（ストラタジーン社）にクローニングし、pBS-Pを得た。このpBS-Pを鋳型にPmut-F1  （5’- GGATCATACGGCGCGCCAAGGTACTTG -3’）（配列番号：13）、Pmut-R1  （5’- CAAGTACCTTGGCGCGCCGTATGATCC -3’）（配列番号：14）、Pmut-F2  （5’- CAACTAGATCCTGCAGGAGGCATCCTAC -3’）（配列番号：15）、およびPmut-R2  （5’- GTAGGATGCCTCCTGCAGGATCTAGTTG -3’）（配列番号：16）のプライマーを用いてPCR反応を行い、P遺伝子の上流にAscIサイトを、P遺伝子の下流にSbfIサイトを導入し、pBS-Pmutを得た。次にpSeV18+TSΔFを鋳型にBamHI-L-F（5’- ATATGGATCCGTACGATCGCAGTCCACCAT -3’）（配列番号：17）およびXhoI-L-R（5’- ATATCTCGAGCAGCTAGCTCAACTGA -3’）（配列番号：18）のプライマーを用いてPCR反応を行った。このPCR産物をBamHIおよびXhoIで消化し、得られたDNA断片をpBlueScript II-SK+にクローニングし、pBS-Lを得た。このpBS-Lを鋳型にLmut-F（5’- GTGAATGGGAGGCCGGCCATAGGTC -3’）（配列番号：19）およびLmut-R（5’- GACCTATGGCCGGCCTCCCATTCAC -3’）（配列番号：20）のプライマーを用いてPCR反応を行い、L遺伝子の上流にFseIサイトを導入し、pBS-Lmutを得た。次にpSeV18+/TSΔFをSalIおよびPvuIで消化し、pBS-Lmut をPvuIおよびKpnIで消化し、pBlueScript II-SK+にクローニングし、pBS-LmutSeVを得た。次にpBS-LmutSeVをNheIおよびSalIで消化し、pSeV18+/TSΔFにクローニングし、pSeV18+/LmutTSΔFを得た。次にpSeV18+/LmutTSΔFをNotI、NheI、およびStuIで消化し、pBS-PmutをNotIおよびStuIで消化し、これらのDNA断片を接合し、pSeV18+/PLmutTSΔFを得た。
【００８３】
5）BFP搭載SeV18+/LddTSΔFベクターの構築
pSeV18+/TSΔFを鋳型にXhoI-L-F（5’- ATATCTCGAGTCACTAAAGAGT -3’）（配列番号：21）およびHindIII-L-R（5’- ATATAAGCTTCGAGCTGTCATATGGCT -3’）（配列番号：22）のプライマーを用いてPCR反応を行った。このPCR産物をXhoIおよびHindIIIで消化し、XhoI-L断片を得た。次にpPTunerを鋳型にHindIII-dd-F（5’- ATATAAGCTTCACCGGTCGGGAGTGCAGGTGGAAA -3’）（配列番号：23）およびKpnI-dd-R1（5’- ATATGGTACCCTATTCCAGTTCTAGAAGCTCCACATCGA -3’）（配列番号：24）のプライマーを用いてPCR反応を行った。このPCR産物をHindIIIおよびKpnIで消化し、dd-KpnI断片を得た。これらのXhoI-L断片とdd-KpnI断片をpBlueScript II-SK+にクローニングし、pBS-XhoI-Lddを得た。次にpBS-XhoI-Lddを鋳型にXhoI-L-F（配列番号：21）およびKpnI-Ldd-R2（5’- ATATGGTACCGCCTATTCCAGTTCTAG -3’）（配列番号：25）のプライマーを用いてPCR反応を行った。このPCR産物をXhoIおよびKpnIで消化し、pSeV18+/PLmutTSΔFにクローニングし、pSeV18+/LddTSΔFを得た。次にTagBFP（Evrogen社）をpCI-neo（プロメガ社）にクローニングして得たpCI-BFP-EISをNotIで消化し、pSeV18+/LddTSΔFにクローニングし、pSeV18+BFP/LddTSΔFを得た。pSeV18+BFP/LddTSΔFベクターの転写産物から作製したセンダイウイルスをSeV18+BFP/LddTSΔFと称す。
【００８４】
6）BFP搭載SeV18+/PddTSΔFベクターの構築
pSeV18+/LddTSΔFを鋳型にAscI-Pdd-F（5’- ATATGGCGCGCCAAGGTACTTGATCCG -3’）（配列番号：26）およびHindIII-Pdd-R（5’- ATATAAGCTTGTTGGTCAGTGACTC -3’）（配列番号：27）のプライマーを用いてPCR反応を行った。このPCR産物をAscIおよびHindIIIで消化し、AscI-P断片を得た。次にpSeV18+/LddTSΔFを鋳型にHindIII-dd-F（配列番号：23）およびSbfI-Pdd-R（5’- ATATCCTGCAGGATCTATTCCAGTTCTAG -3’）（配列番号：28）のプライマーを用いてPCR反応を行った。このPCR産物をHindIIIおよびSbfIで消化し、Pdd-SbfI断片を得た。これらのAscI-P断片およびPdd-SbfI断片をpSeV18+/PLmutTSΔFにクローニングし、pSeV18+/PddTSΔFを得た。次にpCI-BFP-EISをNotIで消化し、pSeV18+/PddTSΔFにクローニングし、pSeV18+BFP/PddTSΔFを得た。pSeV18+BFP/PddTSΔFベクターの転写産物から作製したセンダイウイルスをSeV18+BFP/PddTSΔFと称す。
【００８５】
7）d1GFP, d2GFP, d4GFP搭載SeV(HNL)/TSΔFベクターの構築
半減期を調節することが知られているmODCのPEST配列（WO99/54348）をGFPに付加し、半減期の異なるd1GFP、d2GFP、d4GFPを作製した。mODCのPEST配列であるmODC422-461をd2（配列番号：89）、mODC422-461に半減期を短くするためのE428A/E430A/E431A変異を加えたものをd1（配列番号：91）、mODC422-461に半減期を長くするためのT436A変異を加えたものをd4（配列番号：90）と称する。
pSeV18+GFP/TS7ΔF(WO2010/008054; WO2012/029770)を鋳型にNotI-GFP-F（5’- ATTGCGGCCGCCAAGGTTCACTTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCG -3’）（配列番号：29）、NotI-GFP-R1（5’- CCGGCGGGAAGCCATGGCTAAGCTTCTTGTACAGCTCGTCC -3’）（配列番号：30）、NotI-GFP-R2（5’- GGCGCTCTCCTGGGCACAAGACATGGGCAGCGTGCCATCATCCTGGGCGGCCACGGCCGGCGGGAAGCCA -3’）（配列番号：31）、NotI-GFP-R3（5’- CTACACATTGATCCTAGCAGAAGCACAGGCTGCAGGGTGGCGGTCCATGGCGCTCTCCTGGGCACAAGAC -3’）（配列番号：32）、およびNotI-GFP-R4（5’- ATATGCGGCCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGCTACACATTGATCCTAGCAGAAGC -3’）（配列番号：33）のプライマーを用いてPCR反応を行った。このPCR産物をNotIで消化し、得られたDNA断片をpSeV(HNL)/TSΔFにクローニングし、pSeV(HNL)d1GFP/TSΔFを得た。次にpSeV18+GFP/TS7ΔFを鋳型にNotI-GFP-F（配列番号：29）、NotI-GFP-R1（配列番号：30）、NotI-GFP-R3（配列番号：32）、NotI-GFP-R4（配列番号：33）およびNotI-GFP-R5（5’- GGCGCTCTCCTGGGCACAAGACATGGGCAGCGTGCCATCATCCTGCTCCTCCACCTCCGGCGGGAAGCCA -3’）（配列番号：34）のプライマーを用いてPCR反応を行った。このPCR産物をNotIで消化し、得られたDNA断片をpSeV(HNL)/TSΔFにクローニングし、pSeV(HNL)d2GFP/TSΔFを得た。次にpSeV18+GFP/TS7ΔFを鋳型にNotI-GFP-F（配列番号：29）、NotI-GFP-R1（配列番号：30）、NotI-GFP-R3（配列番号：32）、NotI-GFP-R4（配列番号：33）およびNotI-GFP-R6（5’- GGCGCTCTCCTGGGCACAAGACATGGGCAGGGCGCCATCATCCTGCTCCTCCACCTCCGGCGGGAAGCCA -3’）（配列番号：35）のプライマーを用いてPCR反応を行った。このPCR産物をNotIで消化し、得られたDNA断片をpSeV(HNL)/TSΔFにクローニングし、pSeV(HNL)d4GFP/TSΔFを得た。pSeV(HNL)d1GFP/TSΔF、pSeV(HNL)d2GFP/TSΔF、およびpSeV(HNL)d4GFP/TSΔFベクターの転写産物から作製したセンダイウイルスをSeV(HNL)d1GFP/TSΔF、SeV(HNL)d2GFP/TSΔF、およびSeV(HNL)d4GFP/TSΔFと称す。
【００８６】
8）d1AG, d2AG, d4AG搭載SeV(HNL)/TSΔFベクターの構築
pSeV18+AG/TSΔFを鋳型にAG-F1（5’- ACAAGAGAAAAAACATGTATGG -3’）（配列番号：36）およびAG-R1（5’- CCATGGCTAAGCTTCTTGGCCTGGCTGGGC -3’）（配列番号：37）のプライマーを用いてPCR反応を行い、AG断片を得た。次にpSeV(HNL)d1GFP/TSΔFを鋳型にAG-F2（5’- GCCCAGCCAGGCCAAGAAGCTTAGCCATGG -3’）（配列番号：38）およびAG-R2（5’- GATAACAGCACCTCCTCCCGACT -3’）（配列番号：39）のプライマーを用いてPCR反応を行い、d1断片を得た。次にpSeV(HNL)d2GFP/TSΔFを鋳型にAG-F2（配列番号：38）およびAG-R2（配列番号：39）のプライマーを用いてPCR反応を行い、d2断片を得た。次にpSeV(HNL)d4GFP/TSΔFを鋳型にAG-F2（配列番号：38）およびAG-R2（配列番号：39）のプライマーを用いてPCR反応を行い、d4断片を得た。次にAG断片、d1、d2、およびd4断片を鋳型にAG-F1（配列番号：36）およびAG-R2（配列番号：39）のプライマーを用いてPCR反応を行った。これらのPCR産物をNotIで消化し、得られたDNA断片をpSeV(HNL)/TSΔFにクローニングし、pSeV(HNL)d1AG/TSΔF、pSeV(HNL)d2AG/TSΔF、およびpSeV(HNL)d4AG/TSΔFを得た。pSeV(HNL)d1AG/TSΔF、pSeV(HNL)d2AG/TSΔF、およびpSeV(HNL)d4AG/TSΔFベクターの転写産物から作製したセンダイウイルスをSeV(HNL)d1AG/TSΔF、SeV(HNL)d2AG/TSΔF、およびSeV(HNL)d4AG/TSΔFと称す。
【００８７】
9）d1ddAG、d2ddAG、d4ddAG搭載SeV(HNL)/TSΔFベクターの構築
pSeV(F)ddAG/TSΔFを鋳型にddAG-F1（5’- ATCAGAGACCTGCGACAA -3’）（配列番号：40）およびAG-R1（配列番号：37）のプライマーを用いてPCR反応を行い、ddAG-F断片を得た。次にpSeV(HNL)d1GFP/TSΔFを鋳型にAG-F2（配列番号：38）およびddAG-R（5’- CTGGATAGAGTATGTCAGAAGGGTTTTG -3’）（配列番号：41）のプライマーを用いてPCR反応を行い、d1ddAG-R断片を得た。次にddAG-F断片およびd1ddAG-R断片を鋳型にAG-F1（配列番号：36）およびddAG-R（配列番号：41）のプライマーを用いてPCR反応を行い、d1ddAG断片を得た。次にpSeV(HNL)d2GFP/TSΔFを鋳型にAG-F2（配列番号：38）およびddAG-R（配列番号：41）のプライマーを用いてPCR反応を行い、d2ddAG-R断片を得た。次にddAG-F断片およびd2ddAG-R断片を鋳型にAG-F1（配列番号：36）およびddAG-R（配列番号：41）のプライマーを用いてPCR反応を行い、d2ddAG断片を得た。次にpSeV(HNL)d4GFP/TSΔFを鋳型にAG-F2（配列番号：38）およびddAG-R（配列番号：41）のプライマーを用いてPCR反応を行い、d2ddAG-R断片を得た。次にddAG-F断片およびd2ddAG-R断片を鋳型にAG-F1（配列番号：36）およびddAG-R（配列番号：41）のプライマーを用いてPCR反応を行い、d4ddAG断片を得た。次にこれらのPCR産物をNotIで消化し、得られたDNA断片をpSeV(HNL)/TSΔFにクローニングし、pSeV(HNL)d1ddAG/TSΔF、pSeV(HNL)d2ddAG/TSΔF、およびpSeV(HNL)d4ddAG/TSΔFを得た。pSeV(HNL)d1ddAG/TSΔF、pSeV(HNL)d2ddAG/TSΔF、およびpSeV(HNL)d4ddAG/TSΔFベクターの転写産物から作製したセンダイウイルスをSeV(HNL)d1ddAG/TSΔF、SeV(HNL)d2ddAG/TSΔF、およびSeV(HNL)d4ddAG/TSΔFと称す。
【００８８】
10）SeV(HNL)d2ddgRFP/TSΔFベクターの構築
人工遺伝子合成により合成したecDHFR配列（配列番号：42）（Biomatik社）（US2012/0178168の配列をコドン改変した）を鋳型にddg-F（5’- ATTAACCCTCACTAAAGGGA -3’）（配列番号：43）およびddg-R（5’- CCTTAGACACTCGCCGCTCCAGAATCTC -3’）（配列番号：44）のプライマーを用いてPCR反応を行い、DDG-tag（配列番号：95）を含むddg断片を得た。次にTagRFP（Evrogen社）を搭載したSeV18+RFP/TSΔFを鋳型にRFP-F（5’- GAGCGGCGAGTGTCTAAGGGCGAAGAGCTG -3’）（配列番号：45）およびRFP-R（5’- GGCTAAGCTTATTAAGTTTGTGCCCCAG -3’）（配列番号：46）のプライマーを用いてPCR反応を行い、RFP断片を得た。次にpSeV(HNL)d2AG/TSΔFを鋳型にd2-F（5’- CAAACTTAATAAGCTTAGCCATGGCTTCCC -3’）（配列番号：47）およびddAG-R（配列番号：41）のプライマーを用いてPCR反応を行い、d2RFP断片を得た。次にddg断片、RFP断片、およびd2RFP断片を鋳型にddg-F（配列番号：43）およびddAG-R（配列番号：41）のプライマーを用いてPCR反応を行った。このPCR産物をNotIで消化し、得られたDNA断片をpSeV(HNL)/TSΔFにクローニングし、pSeV(HNL)d2ddgRFP/TSΔFを得た。pSeV(HNL)d2ddgRFP/TSΔFの転写産物から作製したセンダイウイルスをSeV(HNL)d2ddgRFP/TSΔFと称す。
【００８９】
11）SeV(PM)d2ddgRFP(HNL)d2ddAG/TS12ΔFベクターの構築
pSeV(HNL)d2ddgRFP/TSΔFをNotIで消化し、d2ddgRFP をSeV(PM)/TS12ΔFにクローニングし、SeV(PM)d2ddgRFP/TS12ΔFを得た。次にpSeV(HNL)d2ddAG/TSΔFをNotIで消化し、d2ddAGをpSeV(HNL)/TS12ΔFにクローニングし、pSeV(HNL)d2ddAG/TS12ΔFを得た。次にSeV(PM)d2ddgRFP/TS12ΔFおよびpSeV(HNL) d2ddAG/TS12ΔFをPacIおよびNheIで消化、接合し、pSeV(PM)d2ddgRFP(HNL)d2ddAG/TS12ΔFを得た。pSeV(PM)d2ddgRFP(HNL)d2ddAG/TS12ΔFの転写産物から作製したセンダイウイルスをSeV(PM)d2ddgRFP(HNL)d2ddAG/TS12ΔFと称す。
【００９０】
12）SeV18+TIR1(HNL)AGaid/TSΔFベクターの構築
人工遺伝子合成により合成したTIR1配列（配列番号：48）（Biomatik社）（WO2010/125620の配列をコドン改変した）を搭載したpBMH-TIR1をNotIで消化し、pSeV18+/TSΔFにクローニングし、pSeV18+TIR1/TSΔFを得た。次にpSeV(HNL)AG/TSΔFを鋳型にAGaid-F（5’- TAACTGACTAGCAGGCTTGTCG -3’）（配列番号：49）、AGaid-R1（5’- CACTGGTGGCCATCCCACAACTTGACTACCTCCACCTCCGCTTCCACCTCCACCACTCTTGGCCTGACTC -3’）（配列番号：50）、AGaid-R2（5’- CTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGCTACTTTCTATATGATCTCACTGGTGGCCATCCC -3’）（配列番号：51）、およびAGaid-R3（5’- CTGCGGCCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTC -3’）（配列番号：52）のプライマーを用いてPCR反応を行い、AID配列（accession番号AY117183の244-282 (配列番号：98)、およびAAM51258の82-94 (配列番号：99)）を含む断片を増幅した。なお上記プライマーは、天然のAID配列（accession番号AY117183の244-282）にサイレント変異（g264aおよびccgg276-279taga；配列番号：100）が導入されるよう設計されている。このPCR産物をNotIで消化し、得られたDNA断片をpSeV(HNL)/TSΔFにクローニングし、pSeV(HNL)AGaid/TSΔFを得た。次にpSeV18+TIR1/TSΔFおよびpSeV(HNL)AGaid/TSΔFをSphIおよびAatIで消化し、接合し、pSeV18+TIR1(HNL)AGaid/TSΔFを得た。pSeV18+TIR1(HNL)AGaid/TSΔFの転写産物から作製したセンダイウイルスをSeV18+TIR1(HNL)AGaid/TSΔFと称す。
【００９１】
13）SeV18+TIR1(HNL)d2AG/PaidTSΔFベクターの構築
pSeV18+/PLmutTSΔFを鋳型にPaid-F（5’- CTGCAACCCATGGAGATGAAGG -3’）（配列番号：53）、Paid-R1（5’- CTGGTGGCCATCCCACAACTTGACTACCTCCACCTCCGCTTCCACCTCCACCACTGTTGGTCAGTGACTC -3’）（配列番号：54）、およびPaid-R2（5’- TATACCTGCAGGATCTACTTTCTATATGATCTCACTGGTGGCCATCCCAC -3’）（配列番号：55）のプライマーを用いてPCR反応を行った。このPCR産物をAscIおよびSbfIで消化し、得られたDNA断片をpSeV18+/PLmutTSΔFにクローニングし、pSeV18+/PaidTSΔFを得た。次にpBMH-TIR1をNotIで消化し、pSeV18+/PaidTSΔFにクローニングし、pSeV18+TIR1/PaidTSΔFを得た。次にpSeV18+TIR1/PaidTSΔFをStuIおよびAatII、pSeV(HNL)d2AG/TSΔFをStuI、NheI、およびAatII、pSeV(HNL)d2AG/TSΔFをNheIおよびAatIIで消化し、これらを接合し、pSeV18+TIR1(HNL)d2AG/PaidTSΔFを得た。pSeV18+TIR1(HNL)d2AG/PaidTSΔFの転写産物から作製したセンダイウイルスをSeV18+TIR1(HNL)d2AG/PaidTSΔFと称す。
【００９２】
14）SeV18+TIR1(HNL)d2AG/LaidTSΔFベクターの構築
pSeV18+/TSΔFを鋳型にLaid-F（5’- ATCACTGCTAGATCTGTGCTGC -3’）（配列番号：56）、Laid-R1（5’- GGTGGCCATCCCACAACTTGACTACCTCCACCTCCGCTTCCACCTCCACCACTCGAGCTGTCATATGGC -3’）（配列番号：57）、Laid-R2（5’- CTAATTACTACTTTCTATATGATCTCACTGGTGGCCATCCCACAACTTGACTAC -3’）（配列番号：58）、およびLaid-R3（5’- TATAGGTACCGCGGAGCTTCGATCGTTCTGCACGATAGGGACTAATTACTACTTTCTATATGATC -3’）（配列番号：59）のプライマーを用いてPCR反応を行った。このPCR産物をNheIおよびKpnIで消化し、得られたDNA断片をpSeV18+TIR1/TSΔFにクローニングし、pSeV18+TIR1/LaidTSΔFを得た。次にpSeV18+TIR1/LaidTSΔFをSphI、NheI、およびSalIで消化し、pSeV(HNL)d2AG/TSΔFをSphI、NheI、およびXhoIで消化し、これらを接合し、pSeV18+TIR1(HNL)d2AG/LaidTSΔFを得た。pSeV18+TIR1(HNL)d2AG/LaidTSΔFの転写産物から作製したセンダイウイルスをSeV18+TIR1(HNL)d2AG/LaidTSΔFと称す。
【００９３】
15）SeV18+/PddTS15ΔFベクターの構築
pSeV18+/TS15ΔFを鋳型にAscI-Pdd-F（配列番号：26）および HindIII-Pdd-R（配列番号：27）のプライマーを用いてPCR反応を行った。この断片をAscIおよびHindIIIで消化し、AscI-Pts15断片を得た。次にこのAscI-Pts15断片およびSbfI-Pdd断片をpSeV18+/PLmutTSΔFにクローニングし、pSeV18+/Pts15ddTSΔFを得た。次にpSeV18+/Pts15ddTSΔFおよびpSeV18+/TS15ΔFをKpnIおよびNheIで消化し、これらを接合し、pSeV18+/PddTS15ΔFを得た。pSeV18+/PddTS15ΔFにBFPおよびGFPを搭載し、pSeV18+BFP/PddTS15ΔFおよびpSeV18+GFP/PddTS15ΔFを得た。pSeV18+BFP/PddTS15ΔFおよびpSeV18+GFP/PddTS15ΔFの転写産物から作製したセンダイウイルスをSeV18+BFP/PddTS15ΔFおよびSeV18+GFP/PddTS15ΔFと称す。
【００９４】
16）SeV18+/ddPTS15ΔFベクターの構築
pSeV18+/TS15ΔFを鋳型にddPts15-F1（5’- ATTCTCGAGGATCAAGATGCCTTCATTC -3’）（配列番号：60）およびddPts15-R2（5’- AATAAGCTTCTAGTTGGTCAGTGACTC -3’）（配列番号：61）のプライマーを用いてPCR反応を行った。この断片をXhoIおよびHindIIIで消化し、pPTunerにクローニングし、pPTuner-Pts15を得た。次にpSeV18+/TS15ΔFを鋳型にddPts15-F2（5’- ATTGGCGCGCCAAGGTACTTGATCCGTAG -3’）（配列番号：62）およびddPts15-R2（5’- CACCTGCACTCCCATGCGGTAAGTGTAGC -3’）（配列番号：63）のプライマーを用いてPCR反応を行い、AscI-ddPts15を得た。次にpPTuner-Pts15を鋳型にddPts15-F3（5’- GCTACACTTACCGCATGGGAGTGCAGGTG -3’）（配列番号：64）およびddPts15-R3（5’- AATCCTGCAGGTGATGATCTAGTTGGTCAGTGACTC -3’）（配列番号：65）のプライマーを用いてPCR反応を行い、ddPts15-SbfIを得た。次にAscI-ddPts15およびddPts15-SbfIを鋳型にddPts15-F2（配列番号：62）およびddPts15-R3（配列番号：65）のプライマーを用いてPCR反応を行い、AscI-ddPts15-SbfIを得た。次にAscI-ddPts15-SbfIをAscIおよびSbfIで消化し、pSeV18+/PLmutTSΔFにクローニングし、pSeV18+/ddPts15TSΔFを得た。次にpSeV18+/ddPts15TSΔFおよびpSeV18+/TS15ΔFをKpnIおよびNheIで消化し、これらを接合し、pSeV18+/ddPTS15ΔFを得た。pSeV18+/ddPTS15ΔFにBFPおよびGFPを搭載し、pSeV18+BFP/ddPTS15ΔFおよびpSeV18+GFP/ddPTS15ΔFを得た。pSeV18+BFP/ddPTS15ΔFおよびpSeV18+GFP/ddPTS15ΔFの転写産物から作製したセンダイウイルスをSeV18+BFP/ddPTS15ΔFおよびSeV18+GFP/ddPTS15ΔFと称す。
【００９５】
17）pPdd-HaloおよびpddP-Haloベクターの構築
pRL-TK（プロメガ社）を鋳型にHSVp-F（5’- ATATAGATCTAAATGAGTCTTCGGACCTCG -3’）（配列番号：66）およびHSVp-R（5’- ATATGCTAGCTTAAGCGGGTCGCTGCAG -3’）（配列番号：67）のプライマーを用いてPCR反応を行い、HSV promoterを得た。HSV promoterをBglIIおよびNheIで消化し、pCI-neo（プロメガ社）にクローニングし、pHSV-neoを得た。次にpFN21A HaloTag（プロメガ社）を鋳型にHaloTag-F1（5’- TCTGTACTTTCAGAGCGATAACGATGGATCCGAAATCGGTACTGGC -3’）（配列番号：68）、HaloTag-R（5’- GCGGCCGCTTAACCGGAAATCTCGAGCGTC -3’）（配列番号：69）、およびHaloTag-F2（5’- GCTAGCATATGGTACCCCAACCACTGAGGATCTGTACTTTCAGAGCG -3’）（配列番号：70）のプライマーを用いてPCR反応を行い、pGEM-T Easy（プロメガ社）にクローニングし、pGEM-HaloTagを得た。次にpSeV18+/ddPTS15ΔFを鋳型にddP-Halo-F（5’- ATATGCTAGCATGGGAGTGCAGGTGGAAAC -3’）（配列番号：71）およびddP-Halo-R（5’- ATATGGTACCCTAGTTGGTCAGTGACTC -3’）（配列番号：72）のプライマーを用いてPCR反応を行った。得られたPCR産物をNheIおよびKpnIで消化し、pGEM-HaloTagにクローニングし、pGEM-ddP-Haloを得た。得られたpGEM-ddP-HaloをNheIおよびNotIで消化し、pHSV-neoにクローニングし、pHSV-ddP-Haloを得た。次にpSeV18+/PddTS15ΔFを鋳型にPdd-Halo-F（5’- ATATGCTAGCATGGATCAAGATGCCTTC -3’）（配列番号：73）およびKpnI-dd-R1（配列番号：24）のプライマーを用いてPCR反応を行った。得られたPCR産物をNheIおよびKpnIで消化し、pGEM-HaloTagにクローニングし、pGEM-Pdd-Haloを得た。得られたpGEM-Pdd-HaloをNheIおよびNotIで消化し、pHSV-neoにクローニングし、pHSV-Pdd-Haloを得た。
【００９６】
18）d1AG, d2AG, d4AG搭載SeV18+/PddTS15ΔFベクターの構築
pSeV18+/PLmutTSΔF の18+位にAGが搭載されたpSeV18+AG/PLmutTSΔFを鋳型にAG-F1（配列番号：36）および AG-R1（配列番号：37）のプライマーを用いてPCR反応を行い、dAG断片を得た。次にpSeV(HNL)d1GFP/TSdF を鋳型にAG-F2（配列番号：38）およびdAG-R2（5’- CAAAACCCTTCTGACATACTCTATCCAG -3’）（配列番号：74）のプライマーを用いてPCR反応を行い、d1断片を得た。次にdAG断片およびd1断片を鋳型にAG-F1（配列番号：36）およびdAG-R2（配列番号：74）のプライマーを用いてPCR反応を行い、得られたd1AG断片をpBlueScript II-SK+にクローニングし、pBS-d1AGを得た。次にpSeV(HNL)d2GFP/TSdF を鋳型にAG-F2（配列番号：38）およびdAG-R2（配列番号：74）のプライマーを用いてPCR反応を行い、d2断片を得た。次にdAG断片およびd2断片を鋳型にAG-F1（配列番号：36）およびdAG-R2（配列番号：74）のプライマーを用いてPCR反応を行い、得られたd2AG断片をpBlueScript II-SK+にクローニングし、pBS-d2AGを得た。次にpSeV(HNL)d4GFP/TSdF を鋳型にAG-F2（配列番号：38）およびdAG-R2（配列番号：74）のプライマーを用いてPCR反応を行い、d4断片を得た。次にdAG断片およびd4断片を鋳型にAG-F1（配列番号：36）およびdAG-R2（配列番号：74）のプライマーを用いてPCR反応を行い、得られたd4AG断片をpBlueScript II-SK+にクローニングし、pBS-d4AGを得た。次にpBS-d1AG、pBS-d2AG、およびpBS-d4AG をNotIで消化し、pSeV18+/PddTS15ΔFにクローニングし、pSeV18+d1AG/PddTS15ΔF、pSeV18+d2AG/PddTS15ΔF、およびpSeV18+d4AG/PddTS15ΔFを得た。pSeV18+d1AG/PddTS15ΔF、pSeV18+d2AG/PddTS15ΔF、およびpSeV18+d4AG/PddTS15ΔFの転写産物から作製したセンダイウイルスをSeV18+d1AG/PddTS15ΔF、SeV18+d2AG/PddTS15ΔF、およびSeV18+d4AG/PddTS15ΔFと称す。
【００９７】
19）SeV18+d2AG/d2PTS15ΔFおよびSeV18+d2AG/d4PTS15ΔFベクターの構築
pSeV18+d2AG/TS15ΔFを鋳型にPaid-F（配列番号：53）、dP-R1（5’- CCATGGCTAAGCTTGTTGGTCAGTGACTC -3’）（配列番号：75）、dP-R2（5’- CCGGCGGGAAGCCATGGCTAAGCTTGTTGG -3’）（配列番号：76）、NotI-GFP-R5（配列番号：34）、 NotI-GFP-R3（配列番号：32）、およびdP-R5（5’- ATTCCTGCAGGATCTACACATTGATCCTAGCAGAAGC -3’）（配列番号：77）のプライマーを用いてPCR反応を行い、d2P断片を得た。次にd2P断片およびpSeV18+d2AG/PddTS15ΔFをAscIおよびSbfIで消化し、接合し、pSeV18+d2AG/d2PTS15ΔFを得た。次にpSeV18+d2AG/TS15ΔFを鋳型にPaid-F（配列番号：53）、dP-R1（配列番号：75）、dP-R2（配列番号：76）、NotI-GFP-R6（配列番号：35）、NotI-GFP-R3（配列番号：32）、およびdP-R5（配列番号：77）のプライマーを用いてPCR反応を行い、d4P断片を得た。次にd4P断片およびpSeV18+d2AG/PddTS15ΔFをAscIおよびSbfIで消化し、接合し、pSeV18+d2AG/d4PTS15ΔFを得た。pSeV18+d2AG/d2PTS15ΔFおよびpSeV18+d2AG/d4PTS15ΔFの転写産物から作製したセンダイウイルスをSeV18+d2AG/d2PTS15ΔFおよびSeV18+d2AG/d4PTS15ΔFと称す。
【００９８】
20）SeV18+d2AG/PddgTS15ΔFベクターの構築
pSeV(HNL)d2ddgRFP/TS/dFを鋳型にHindIII-ddg-F（5’- AATAAGCTTCACCGGTCGATCAGTCTGATTGCGG -3’）（配列番号：78）およびSbfI-ddg-R（5’- CTTCCTGCAGGATTATCTATCGCCGCTCCAGAATCTC -3’）（配列番号：79）のプライマーを用いてPCR反応を行い、HindIII およびSbfIで消化し、HindIII-ddg-SbfI断片を得た。次にpSeV18+d2AG/PddTS15ΔFのPddの代わりにPaidが挿入されたpSeV18+d2AG/PaidTS15ΔFをAscI、SbfI、HindIIIで消化し、AscI-P-HindIII断片を得た。次にHindIII-ddg-SbfI断片およびAscI-P-HindIII断片をAscIおよびSbfIで消化したpSeV18+d2AG/PaidTS15ΔFに接合し、pSeV18+d2AG/PddgTS15ΔFを得た。pSeV18+d2AG/PddgTS15ΔFの転写産物から作製したセンダイウイルスをSeV18+d2AG/PddgTS15ΔFと称す。
【００９９】
21）SeV(HNL) d2tetRAG/TSΔFベクターの構築
人工遺伝子合成により合成したTetR変異体配列（配列番号：80）（アミノ酸配列は配列番号：97）（FASMAC社）（WO2007/032555の配列をコドン改変した）を鋳型にNotI-tetR-F（5’- ATATGCGGCCGCCTTGCCACCATGTCTAGGCTGGACAAG -3’）（配列番号：81）およびtetR-R（5’- CACGCTCACAGACCCACTTTCACATTTAAG -3’）（配列番号：82）のプライマーを用いてPCR反応を行い、NotI-tetR断片を得た。次にpSeV18+d2AG/PddTS15dFを鋳型にd2AG-F（5’- GTGGGTCTGTGAGCGTGATCAAGCCCGAG -3’）（配列番号：83）およびAG-R2（配列番号：39）のプライマーを用いてPCR反応を行い、td2AG断片を得た。次にNotI-tetR断片およびtd2AG断片を鋳型にNotI-tetR-F（配列番号：81）およびAG-R2（配列番号：39）のプライマーを用いてPCR反応を行い、d2tetRAG断片を得た。次にd2tetRAG断片をpSeV(HNL)/TSΔFにクローニングし、pSeV(HNL) d2tetRAG/TSΔFを得た。pSeV(HNL) d2tetRAG/TSΔFの転写産物から作製したセンダイウイルスをSeV(HNL) d2tetRAG/TSΔFと称す。
【０１００】
22）d2AG搭載SeV18+/PtetRTS15ΔFベクターの構築
pSeV18+d2AG/PddTS15dFを鋳型にPaid-F（配列番号：53）およびdP-R7（5’- CAGCCTAGAGTTGGTCAGTGACTCTATGTC -3’）（配列番号：84）のプライマーを用いてPCR反応を行い、Ptet断片を得た。次にTetR変異体配列（配列番号：80）を鋳型にPtetR-F（5’- CTGACCAACTCTAGGCTGGACAAGAGTAAG -3’）（配列番号：85）およびPtetR-R（5’- ATATCCTGCAGGATCTAAGACCCACTTTCACATTTAAG -3’）（配列番号：86）のプライマーを用いてPCR反応を行い、tetR-SbfI断片を得た。次にPtet断片およびtetR-SbfI断片を鋳型にPaid-F（配列番号：53）およびPtetR-R（配列番号：86）のプライマーを用いてPCR反応を行い、PtetR断片を得た。次にPtetR断片をAscIおよびSbfIで消化したpSeV18+d2AG/TS15ΔFにクローニングし、pSeV18+d2AG/PtetRTS15ΔFを得た。pSeV18+d2AG/PtetRTS15ΔFの転写産物から作製したセンダイウイルスをSeV18+d2AG/PtetRTS15ΔFと称す。
【０１０１】
23）d2AG搭載SeV18+/TS12ΔF、SeV18+/d2PTS12ΔF、SeV18+/PddTS12ΔFベクターの構築
d2AGをpSeV18+/TS12ΔFにクローニングし、pSeV18+d2AG/TS12ΔFを得た。次にpSeV18+/TS12ΔF およびpSeV18+d2AG/d2PTS15ΔFをNheIおよびKpnIで消化し、接合し、pSeV18+d2AG/d2PTS12ΔFを得た。次にpSeV18+/TS12ΔF およびpSeV18+d2AG/PddTS15ΔFをNheIおよびKpnIで消化し、接合し、pSeV18+d2AG/PddTS12ΔFを得た。pSeV18+d2AG/TS12ΔF、pSeV18+d2AG/d2PTS12ΔF、およびpSeV18+d2AG/PddTS12ΔFの転写産物から作製したセンダイウイルスをSeV18+d2AG/TS12ΔF、SeV18+d2AG/d2PTS12ΔF、およびSeV18+d2AG/PddTS12ΔFと称す。
【０１０２】
24）cMYC搭載SeV(HNL)/d2PTS15ΔF、SeV(HNL)/PddTS15ΔF、SeV(HNL)/PddgTS15ΔF、SeV(HNL)/PtetRTS15ΔFベクターの構築
pSeV(HNL)AG/PaidTS15ΔFをAscIおよびSbfIで消化し、pSeV(HNL)AG/TS15ΔF(AscI/SbfI)断片を得た。次にpSeV18+d2AG/d2PTS15ΔF 、pSeV18+d2AG/PddTS15ΔF 、pSeV18+d2AG/PddgTS15ΔF 、およびpSeV18+d2AG/PtetRTS15ΔFをAscIおよびSbfIで消化し、d2P、Pdd、Pddg、PtetR断片を得た。次にこれらの接合を行い、pSeV(HNL)AG/d2PTS15ΔF 、pSeV(HNL)AG/PddTS15ΔF 、pSeV(HNL)AG/PddgTS15ΔF 、およびpSeV(HNL)AG/PtetRTS15ΔFを得た。次にpSeV(PM)KOS(HNL)cMYC/TSΔFをNotIで切断し、得られたcMYC断片をNotIで消化したpSeV(HNL)AG/d2PTS15ΔF 、pSeV(HNL)AG/PddTS15ΔF 、pSeV(HNL)AG/PddgTS15ΔF 、およびpSeV(HNL)AG/PtetRTS15ΔF にクローニングし、pSeV(HNL)cMYC/d2PTS15ΔF、pSeV(HNL)cMYC/PddTS15ΔF、pSeV(HNL)cMYC/PddgTS15ΔF、pSeV(HNL)cMYC/PtetRTS15ΔFを得た。pSeV(HNL)cMYC/d2PTS15ΔF、pSeV(HNL)cMYC/PddTS15ΔF、pSeV(HNL)cMYC/PddgTS15ΔF、pSeV(HNL)cMYC/PtetRTS15ΔFの転写産物から作製したセンダイウイルスをSeV(HNL)cMYC/d2PTS15ΔF、SeV(HNL)cMYC/PddTS15ΔF、SeV(HNL)cMYC/PddgTS15ΔF、SeV(HNL)cMYC/PtetRTS15ΔFと称す。
【０１０３】
25）pCAGGS-d144P、pCAGGS-d307P、pCAGGS-Pctベクターの構築
pSeV18+TSΔFを鋳型にNotI-SeV-Pd144-F（5’- ATATGCGGCCGCACCATGGGATATCCGAGA -3’）（配列番号：103）およびSeV-P-NotI-R（5’- ATATGCGGCCGCCTAGTTGGTCAGTGACTC -3’）（配列番号：104）のプライマーを用いてPCR反応を行い、NotI-Pd144断片を得た。pSeV18+TSΔFを鋳型にNotI-SeV-Pd307-F（5’- ATATGCGGCCGCACCATGGGTCTAGAGACC -3’）（配列番号：105）およびSeV-P-NotI-R（配列番号：104）のプライマーを用いてPCR反応を行い、NotI-Pd307断片を得た。pSeV18+TSΔFを鋳型にNotI-SeV-Pct-F（5’- ATATGCGGCCGCACCATGGGAGAGAACACA -3’）（配列番号：106）およびSeV-P-NotI-R（配列番号：104）のプライマーを用いてPCR反応を行い、NotI-Pct断片を得た。得られた断片をNotIで消化し、pCAGGS（Gene, vol.108, pp193-199, 1991）のEcoRIサイトにNotIリンカーを組み込んだプラスミドにクローニングし、pCAGGS-d144P、pCAGGS-d307P、pCAGGS-Pctを得た。
【０１０４】
26）pEB-SeV-Pdd-Halo、pEB-MeV-Pdd-Halo、pEB-NDV-Pdd-Halo、pEB-PIV2-Pdd-Halo、pEB-VSV-Pdd-Haloベクターの構築
人工遺伝子合成により合成したMeV（AIK-C）：ACCESSION：AF266286のP遺伝子（配列番号：107）（GENEWIZ社）、NDV（LaSota）：ACCESSION：AY845400のP遺伝子（配列番号：108）（GENEWIZ社）、PIV2：ACCESSION：M37748のP遺伝子（配列番号：109）（GENEWIZ社）、VSV（Indiana）：ACCESSION：FJ478454のP遺伝子（配列番号：110）（GENEWIZ社）をNheIおよびHindIIIで消化し、pHSV-Pdd-Haloにクローニングし、pHSV-MeV-Pdd-Halo、pHSV-NDV-Pdd-Halo、pHSV-PIV2-Pdd-Halo、pHSV-VSV-Pdd-Haloを得た。次にpHSV-Pdd-Haloとこれらのプラスミドを鋳型にそれぞれNotI-TKp-F（5’- ATATGCGGCCGCGCTTAAGCTAGCATG -3’）（配列番号：111）およびHaloTag-R（配列番号：69）のプライマーを用いてPCR反応を行い、NotIで消化し、pEBMulti-Hygクローニングし、pEB-SeV-Pdd-Halo、pEB-MeV-Pdd-Halo、pEB-NDV-Pdd-Halo、pEB-PIV2-Pdd-Halo、pEB-VSV-Pdd-Haloを得た。
【０１０５】
27）SeV(PM)ddgOFP(HNL)ddDGFP/d2PTS15ΔF およびSeV(PM)ddgOFP(HNL)ddDGFP/PddTS15ΔFベクターの構築
YukonOFP（DNA2.0社）を鋳型にNotI-OFP-F （5’- ATATGCGGCCGCTCGCCACCATGTCACTGTCTAAACAGGTG -3’）（配列番号：112）およびOFP-EIS-NotI-R （5’- ATATGCGGCCGCGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTTACTAGGTTTCCTTGACGTCCACGGTGAAAT -3’）（配列番号：113）のプライマーを用いてPCR反応を行い、NotIで消化し、pSeV18+TSΔFにクローニングし、pSeV18+OFP/TSΔFを得た。DasherGFP（DNA2.0社）を鋳型にNotI-DGFP-F （5’- ATAGCGGCCGCGACATGACTGCCCTGACCG -3’）（配列番号：114）およびDGFP-EIS-NotI-R （5’- TATGCGGCCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGTTACTGATAGGTATCGAGATCGAC -3’）（配列番号：115）のプライマーを用いてPCR反応を行い、NotIで消化し、pSeV18+TSΔFにクローニングし、pSeV18+DGFP/TSΔFを得た。次にpSeV(HNL)d2ddgRFP/TSΔFを鋳型にAGaid-F（配列番号：49）およびddgOFP-R（5’- TTAGACAGTGATCGCCGCTCCAGAATCTC -3’）（配列番号：116）のプライマーを用いてPCR反応を行い、ddgOFP-N断片を得た。pSeV18+OFP/TSΔFを鋳型にddgOFP-F（5’- GGAGCGGCGATCACTGTCTAAACAGGTGC -3’）（配列番号：117）およびEIS-NotI-2R（5’- CCTGCGGCCGCATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTC -3’）（配列番号：118）のプライマーを用いてPCR反応を行い、ddgOFP-EIS断片を得た。ddgOFP-N断片およびddgOFP-EIS断片を鋳型にddgOFP-F（配列番号：117）およびEIS-NotI-2R（配列番号：118）のプライマーを用いてPCR反応を行い、NotIで消化し、pSeV(PM)/d2PTS15ΔFにクローニングし、pSeV(PM)ddgOFP/d2PTS15ΔFを得た。次にpSeV18+BFP/PddTS15ΔFを鋳型にNotI-dd-F（5’- ATATGCGGCCGCGCCACCATGGGAGTGCAGGTGGAAACC -3’）（配列番号：119）およびddgOFP-R（5’- CGGTCAGGGCAGTTTCCAGTTCTAGAAGC -3’）（配列番号：120）のプライマーを用いてPCR反応を行い、ddDGFP-N断片を得た。pSeV18+DGFP/TSΔFを鋳型にddDGFP-F（5’- TCTAGAACTGGAAACTGCCCTGACCGAAGG -3’）（配列番号：121）およびAG-R2（配列番号：39）のプライマーを用いてPCR反応を行い、ddDGFP-EIS断片を得た。ddDGFP-N断片およびddDGFP-EIS断片を鋳型にddDGFP-F（配列番号：121）およびAG-R2（配列番号：39）のプライマーを用いてPCR反応を行い、NotIで消化し、pSeV(HNL)/d2PTS15ΔFにクローニングし、pSeV(HNL)ddDGFP/d2PTS15ΔFを得た。次にpSeV(PM)ddgOFP/d2PTS15ΔFをSalIおよびAseIで消化し、pSeV(HNL)ddDGFP/d2PTS15ΔFをAseIおよびNheIで消化し、pSeV(HNL)ddDGFP/d2PTS15ΔFをSalIおよびNheIおよびNotIで消化し、得られた(PM)ddgOFP断片および(HNL)ddDGFP断片およびpSeV-SalI-NheI断片を接合し、pSeV(PM)ddgOFP(HNL)ddDGFP/d2PTS15ΔFを得た。次にpSeV(PM)ddgOFP(HNL)ddDGFP/d2PTS15ΔFおよびSeV18+BFP/PddTS15ΔFをAscIおよびSbfIで消化し、接合し、pSeV(PM) ddgOFP(HNL)ddDGFP/PddTS15ΔFを得た。pSeV(PM)ddgOFP(HNL)ddDGFP/d2PTS15ΔFおよびpSeV(PM) ddgOFP(HNL)ddDGFP/PddTS15ΔFの転写産物から作製したセンダイウイルスをSeV(PM)ddgOFP(HNL)ddDGFP/d2PTS15ΔFおよびSeV(PM) ddgOFP(HNL)ddDGFP/PddTS15ΔFと称す。
【０１０６】
28）SeV18+DGFP/PddΔFベクターの構築
pSeV18+ΔFを鋳型にBamHI-P-F（配列番号：11）およびPmut-R1（配列番号：14）のプライマーを用いてPCR反応を行い、BamHI-PmutdF断片を得た。次にpSeV18+ΔFを鋳型にPmut-F1（配列番号：13）およびPmut-R2（配列番号：16）のプライマーを用いてPCR反応を行い、PmutdF断片を得た。次にpSeV18+ΔFを鋳型にPmut-F2（配列番号：15）およびXhoI-P-R（配列番号：12）のプライマーを用いてPCR反応を行い、PmutdF-XhoI断片を得た。次にBamHI-PmutdF断片、PmutdF断片およびPmutdF-XhoI断片を鋳型にBamHI-P-F（配列番号：11）およびXhoI-P-R（配列番号：12）のプライマーを用いてPCR反応を行い、得られたDNA断片をpBlueScript II-SK+にクローニングし、pBS-PmutdFを得た。次にpBS-PmutdFをNotI、StuI、およびXhoIで消化し、3878bp断片を得た。次にpSeV18+ΔFをNotIおよびNheIで消化し、6321bp断片を得た。次にpSeV18+ΔFをNotI、StuI、およびNheIで消化し、6161bp断片を得た。次に3878bp断片、6321bp断片、および6161bp断片を接合し、pSeV18+/PmutΔFを得た。次にpSeV18+ΔFを鋳型にAscI-Pdd-F（配列番号：26）および HindIII-Pdd-R（配列番号：27）のプライマーを用いてPCR反応を行い、この断片をAscIおよびHindIIIで消化し、AscI-PdF-HindIII断片を得た。次にpSeV18+BFP/PddTSΔFを鋳型にHindIII-dd-F（配列番号：23）およびSbfI-Pdd-R（配列番号：28）のプライマーを用いてPCR反応を行い、このPCR産物をHindIIIおよびSbfIで消化し、Pdd-SbfI断片を得た。これらのAscI-PdF-HindIII断片およびPdd-SbfI断片をpSeV18+/PmutΔFにクローニングし、pSeV18+/PddΔFを得た。次にpSeV18+DGFP/TSΔFをNotIで消化し、pSeV18+/PddΔFにクローニングし、pSeV18+DGFP/PddΔFを得た。pSeV18+DGFP/PddΔFベクターの転写産物から作製したセンダイウイルスをSeV18+DGFP/PddΔFと称す。
【０１０７】
[実施例1]
HeLa細胞を1x105 cells/wellで12well plateに播種し、Lipofectamine LTX（Life Technologies社）を用いてpEB-Pを遺伝子導入し、37℃でSeV18+GFP/TSΔP（WO2008/133206）をMOI=10で感染させ（day0）、day1で蛍光顕微鏡による観察を行った。蛍光顕微鏡はECLIPSE TE2000-U（株式会社ニコン）を用いた。その結果、pEB-Pを遺伝子導入した細胞ではSeV18+GFP/TSΔPの感染によって緑色蛍光が観察されたが、pEB-Pを遺伝子導入せずにSeV18+GFP/TSΔPのみを感染した細胞では緑色蛍光が観察されなかった（図1）。
【０１０８】
[実施例2]
HeLa細胞を1x105 cells/wellで12well plateに播種し、37℃でSeV(F)ddAG/TSΔF （ddAG）をMOI=10で感染させ（day0）、day1で1μMのShield1を添加し、5hr後に蛍光顕微鏡による観察およびFACSによる解析を行った。FACS はFACScalibur（BD Biosciences社）を用いた。その結果、Shield1を添加したddAG感染細胞では緑色蛍光が観察され、FACSでddAG+Shield1の強い蛍光が観察された。Shield1を添加しないddAGの蛍光は顕微鏡下で判別し辛いが、FACSではddAGを感染していないControl細胞と明瞭に判別される基底レベルの蛍光が観察された（図2）。
【０１０９】
[実施例3]
HeLa細胞に、37℃でSeV(HNL)ddAG/TSΔF（ddAG）をMOI=10で感染させ（day0）、day1で1μMのShield1を添加し、5hr後に蛍光顕微鏡による観察およびFACSによる解析を行った。その結果、Shield1を添加したddAG感染細胞では緑色蛍光が観察され、FACSでddAG+Shield1の強い蛍光が観察された。HNL位に搭載することによって、Shield1を添加しないddAGの蛍光は搭載位置がF位のSeV(F)ddAG/TSΔFに比べ低減したが、FACSではddAGを感染していないControl細胞と明瞭に判別される基底レベルの蛍光が観察された（図3）。
【０１１０】
[実施例4]
HeLa細胞に、37℃でSeV(HNL)d1GFP/TSΔF（d1GFP）、SeV(HNL)d2GFP/TSΔF（d2GFP）、SeV(HNL)d4GFP/TSΔF （d4GFP）、SeV(HNL)d1AG/TSΔF（d1AG）、SeV(HNL)d2AG/TSΔF（d2AG）、SeV(HNL)d4AG/TSΔF （d4AG）をMOI=10で感染させ（day0）、day2で蛍光顕微鏡による観察を行った。その結果、PEST配列をGFPやAGのC末端側に付加することで、蛍光の低下を観察した。d4GFP、d2GFP、d1GFPの中ではd4GFPの蛍光が強く、d1GFPの蛍光が弱かった（図4）。 d2AGおよびd4AGは蛍光顕微鏡下で観察可能であったが、d1AGは蛍光顕微鏡下での判別がし辛く、以降の試験にはd2およびd4を用いた。
【０１１１】
[実施例5]
HeLa細胞に、37℃でSeV(HNL)d2ddAG/TSΔF（d2ddAG）、SeV(HNL)d4ddAG/TSΔF （d4ddAG）をMOI=10で感染させ（day0）、day3で1μMのShield1を添加し、day5でFACSによる解析を行った。その結果、DD-tagに加えてPEST配列を組み合わせてSeVベクターのHNL位に搭載しても、Shield1非添加時にAGの蛍光はControl細胞と明瞭に判別される基底レベルの蛍光が観察された（図5）。
【０１１２】
[実施例6]
HeLa細胞に、37℃でSeV(PM)d2ddgRFP(HNL)d2ddAG/TS12ΔF（ddgRFP-ddAG）をMOI=10で感染させ（day0）、day2で1μMのShield1あるいは20μMのtrimethoprim（TMP）を添加し、6hr後に蛍光顕微鏡による観察を行った。その結果、Shield1を添加したddgRFP-ddAG感染細胞では緑色蛍光が観察され、TMPを添加したddgRFP-ddAG感染細胞では赤色蛍光が観察され、Shield1およびTMPを添加したddgRFP-ddAG感染細胞では緑色および赤色蛍光が観察され、SeVベクター上で独立制御が可能なことを観察した（図6）。
【０１１３】
[実施例7]
HeLa細胞に、35℃でSeV(HNL)d2tetRAG/TSΔF（d2tetRAG）をMOI=10で感染させ（day0）、day1で1.5μg/mLのdoxorubicin（DOX）を添加後、37℃へ細胞を移動、day3に蛍光顕微鏡による観察を行った。その結果、DOXを添加したd2tetRAG感染細胞では緑色蛍光を観察した（図7）。
【０１１４】
[実施例8]
HeLa細胞に、37℃でSeV18+TIR1(HNL)AGaid/TSΔF（TIR1-AGaid）をMOI=10で感染させ（day0）、day3でAuxinとしてnaphthalene acetic acid (NAA)を500μMあるいは2mM添加し、4hr後および1日後に蛍光顕微鏡および蛍光プレートリーダーによる観察を行った。蛍光プレートリーダーはInfinite F200（TECAN社）を用いた。その結果、TIR1-AGaidを感染させた細胞の蛍光はAuxin添加後4時間では低下が観察されず、1日後に79.5%（500μM）への低下を観察した（図8）。
【０１１５】
[実施例9]  PF発現細胞
PF発現細胞を得るために、F蛋白質を発現するLLC-MK2/F細胞（WO00/70070）にP遺伝子の導入を行った。LLC-MK2/F細胞にpCXN-P4C(-)をリン酸カルシウム法により遺伝子導入し、G418による選択を行い、P蛋白質およびF蛋白質を発現するLLC-MK2/PF細胞（PF発現細胞）を得た。得られたPF発現細胞にP遺伝子が欠損したSeV18+GFP/TSΔPを感染させ、蛍光顕微鏡下で緑色蛍光を観察し、P蛋白質が機能していることを確認した。また、ウェスタンブロット法によりP蛋白質およびF蛋白質の発現を確認した。本発明のP蛋白質にdegronが付加されたSeVベクターの生産には32℃でこのPF発現細胞を用いた。
【０１１６】
[実施例10]
BHK細胞に、37℃でSeV18+BFP/PddTSΔF（BFP-Pdd）を、あるいはBJ細胞由来のiPS細胞にSeV18+BFP/LddTSΔF（BFP-Ldd）をMOI=5で感染させ、1μMのShield1を添加し（day0）、day1でShield1を除去し、day5で観察した。その結果、Shield1を除去したBFP-Pdd感染細胞ではShield1を除去していないBFP-Pdd感染細胞に比較して青色蛍光が18%程度に減弱した（ImageJ（NIH）で画像解析）（図9）。それに対し、BFP-Lddの蛍光はShield1存在下でも弱く、発現調節も大きな変化は観察されなかった（図10）。L蛋白へのDD-tag付加はP蛋白へのDD-tag付加に比較してSeVベクターの再構成効率が低かった。さらに、P蛋白を発現するSeV生産細胞は容易に得られたが、L蛋白を発現するSeV生産細胞は容易に得られず、得られたとしてもそのSeV生産性は低かった。
【０１１７】
[実施例11]
HeLa細胞に、Lipofectamine LTX（Life Technologies社）を用いてpHSV-ddP-Halo およびpHSV-Pdd-Haloを遺伝子導入し、1μMのShield1存在下、FAM ligandで15分間パルスラベル後、蛍光の消失を指標にP蛋白の分解を蛍光顕微鏡で観察した。その結果、10分以内にP蛋白の分解が始まっており、P蛋白は5時間以内に分解されていることを観察した（図11）。DD-tagはP蛋白のN末端側およびC末端側のどちらに付加されていても同様の分解を示した。
【０１１８】
[実施例12]
PF発現細胞を用いてSeV18+BFP/PddTS15ΔF、SeV18+GFP/PddTS15ΔF SeV18+BFP/ddPTS15ΔF、およびSeV18+GFP/ddPTS15ΔFの再構成を試みた。その結果、P蛋白のC末端側にDD-tagが付加されたSeV18+BFP/PddTS15ΔFおよびSeV18+GFP/PddTS15ΔFは得られたが、P蛋白のN末端側にDD-tagが付加されたSeV18+BFP/ddPTS15ΔFおよびSeV18+GFP/ddPTS15ΔFは得られなかった。すなわち、C蛋白を供給せずにP蛋白のN末端側にDD-tagを付加することはSeVベクターの再構成効率を低下させることを示している。
【０１１９】
[実施例13]
HeLa細胞に、37℃でSeV18+TIR1(HNL)d2AG/PaidTSΔF（d2AG-Paid）あるいはSeV18+TIR1(HNL)d2AG/LaidTSΔF（d2AG-Laid）をMOI=5で感染し（day0）、day3でAuxinとしてindole-3-acetic acid (IAA)を500μM添加し、蛍光顕微鏡およびFACSにより観察した。その結果、d2AG-PaidはFACSで中央値の値が149.89から126.35へ減弱するという結果が得られたが（図12）、d2AG-Laidの発現調節に大きな変化は観察されなかった。d2AG-Paid L蛋白へのaid付加はP蛋白へのaid付加に比較してSeVベクターの再構成効率を低下させた。
【０１２０】
[実施例14]
HeLa細胞に、32℃でSeV18+d2AG/PddTS15ΔF（d2AG-PddTS15）、SeV18+d2AG/TS15ΔF（d2AG-TS15）をMOI=5で感染させ、1μMのShield1を添加し（-day3）、Shield1を除去・37℃に細胞移動をday0として、あるいはShield1を添加したまま35℃に細胞を移動、経時的な観察を行った。その結果、Shield1を除去・37℃のd2AG-PddTS15感染細胞ではday7で蛍光が消失し、35℃の条件ではd2AG-TS15よりも高い蛍光発現レベルを示した（図13）。それに対し37℃のd2AG-TS15はday21で蛍光が消失した細胞も観察されるが、蛍光発現の残存が観察された（図13）。day14でSeV抗体染色を行うと、37℃のd2AG-PddTS15はSeV抗体染色陰性、37℃のd2AG-TS15はSeV抗体染色陽性であった（図14）。d2AG-PddTS15を32℃で感染後、day2で35〜39℃に温度を上昇させ、感染からday5で観察したところ、35〜39℃で蛍光発現が低下し、37〜39℃で消失した（図15）。
【０１２１】
[実施例15]
HeLa細胞に、32℃でSeV18+d2AG/PddgTS15ΔF（d2AG-PddgTS15）をMOI=5で感染させ、20μMのtrimethoprim（TMP）を添加し（day0）、day3でTMPを除去・37℃に細胞を移動、あるいはTMPを添加したまま35℃に細胞を移動、経時的な観察を行った。その結果、TMPを除去・37℃のd2AG-PddgTS15感染細胞では感染からday6で蛍光の消失が観察された（図16 (a)）。搭載遺伝子の発現低下および消失は、35〜39℃で観察された（図16 (b)）。DD-tagが35℃で発現するのに対し、ddg-tagでは発現の消失が観察された。
【０１２２】
[実施例16]
HeLa細胞に、32℃でSeV18+d2AG/PtetRTS15ΔF（d2AG-PtetRTS15）をMOI=5で感染させ、1.5μg/mLのDOXを添加し（day0）、day2でDOXを除去・35〜39℃に細胞を移動し、感染からday5に観察を行った。その結果、35〜39℃で蛍光発現が低下および消失した（図17）。
【０１２３】
[実施例17]
HeLa細胞に、32℃でSeV18+d2AG/d4PTS15ΔF（d2AG-d4PTS15）をMOI=5で感染させ（day0）、day2で35〜39℃に細胞を移動し、感染からday5に観察を行った。その結果、35〜39℃で蛍光発現が低下し、37〜39℃で消失した（図18）。
【０１２４】
[実施例18]
HeLa細胞に、SeV18+d2AG/d2PTS12Δ（d2AG-d2PTS12）、SeV18+d2AG/PddTS12ΔF（d2AG-PddTS12）、およびSeV18+d2AG/TS12ΔF（d2AG-TS12）をMOI=5で感染させ（day0）（d2AG-PddTS12は感染時に1μMのShield1を添加）、day3でShield1を除去し、38.5℃に5日間培養後に37℃に細胞を移動するか、あるいは35℃に細胞を移動し（35℃のd2AG-PddTS12についてはShield1を添加したまま）、感染からday18に観察を行った（ぞれぞれ図19の「38.5℃(5day)」および「35℃」）。その結果、d2AG-TS12より先にd2AG-d2PTS12およびd2AG-PddTS12の蛍光発現の消失が促進され、d2AG-PddTS12はd2AG-d2PTS12より短期間に蛍光発現が消失した（図19）。
【０１２５】
[実施例19]
HeLa細胞に、32℃でSeV18+d2AG/d2PTS15Δ（d2AG-d2PTS15）、SeV18+d2AG/d4PTS15ΔF（d2AG-d4PTS15）、およびSeV18+d2AG/TS15ΔF（d2AG-TS15）をMOI=5で感染させ（day0）、day3で37℃に細胞を移動、あるいは35℃に細胞を移動、経時的な観察を行った。その結果、37℃のd2AG-d2P15およびd2AG-d4P15感染細胞ではday7で蛍光が消失し（図20）、day13のFACSでも蛍光の消失を確認した（図21）。それに対し37℃のd2AG-TS15はday13で蛍光の残存が観察された（図21）。Degronを付加しても35℃におけるd2AGの蛍光はdegronを付加していない従来のベクターと同等の値を示した（図21）。
【０１２６】
[実施例20]
HeLa細胞に、32℃でSeV18+d2AG/d2PTS15ΔF（d2AG-d2PTS15）およびSeV18+d2AG/TS15ΔF（d2AG-TS15）をMOI=5で感染させ（-day3）、37℃に細胞移動をday0とし、経時的な観察を行った。その結果、37℃のd2AG-d2PTS15感染細胞ではday7で蛍光が消失した（図22）。それに対し37℃のd2AG-TS15はday21で蛍光が消失した細胞も観察されるが、蛍光発現の残存が観察された。Degronを付加しても35℃におけるd2AGの蛍光はdegronを付加していない従来のベクターと同等の値を示した（図22）。
【０１２７】
[実施例21]
実施例14および20の細胞よりRNAを回収し、RT-PCRおよびリアルタイムPCRを行った。リアルタイムPCRはApplied Biosystems 7500 Fast（Life Technologies社）を用いた。SeVのPCRプライマーおよびbeta-ActinのPCRプライマーはWO2012/029770の配列を用いた。SeVのリアルタイムPCRプライマーはSeV-L  （5’- CCGTAGTAAGAAAAACTTAGGGTGA -3’）（配列番号：87）およびSeV-R  （5’- GATCCATGCGGTAAGTGTAGC -3’）（配列番号：88）を用いた。プローブはUniversal ProbeLibraryのProbe#3（Roche社）、GAPDHはHuman GAPD (GAPDH) Endogenous Control (VIC / MGB Probe, Primer Limited)（Life Technologies社）を用いた。day21のHeLa細胞において、d2AG-d2PTS15やd2AG-PddTS15のSeVバンド消失を観察したが、d2AG-TS15ではSeVバンドを観察した（図23）。同様にリアルタイムPCRにおいてもday21のd2AG-d2PTS15およびd2AG-PddTS15の消失を観察したが、day21のd2AG-TS15は残存していることを観察した（図24）。PddTS15のday14のRQを1として、d2PTS15およびPddTS15はday21で検出されなくなった。それに対して、従来ベクターのTS15では徐々に減っているがday21でも残存を確認した。PddTS15のday3はTS15のday3に比べ30倍以上高い値を示した。
【０１２８】
[実施例22]
BJ細胞にCytoTune-iPS 2.0（SeV(PM)KOS/TS12ΔF、SeV(HNL)cMYC/TS15ΔF、およびSeV18+KLF4/TSΔFの組み合わせで、Life Technologies社あるいは株式会社医学生物学研究所より入手可能）、あるいはCytoTune-iPS 2.0のcMYCをSeV(HNL)cMYC/d2PTS15ΔF（d2P-MYC）、SeV(HNL)cMYC/PddTS15ΔF（Pdd-MYC）、SeV(HNL)cMYC/PddgTS15ΔF（Pddg-MYC）、SeV(HNL)cMYC/PtetRTS15ΔF（PtetR-MYC）に置き換えて32℃で感染を行い（iPS細胞の作製方法についてはWO2012/029770、WO2010/008054に詳述、KOSおよびKLF4はMOI=5、cMYCはMOI=1）（day0）、day1で37℃に細胞を移動し、day6でMEF上に播種し、day28でアルカリホスファターゼ（ALP）染色を行った。ALP染色は1-Step NBT/BCIP（Thermo Scientific社）を使用した。37℃で細胞の継代を行い、継代ごとにSeV抗体染色およびTaqMan Sendai Assay ID: Mr04269880_mr（Life Technologies社）を用いたリアルタイムPCR、初期化マーカーであるNANOGおよびTERTのPCRを行った。NANOGおよびTERTのPCRプライマーはWO2012/029770の配列を用いた。その結果、全てのベクターにおいてALP陽性コロニーが形成されることを観察した（図25）。KOSおよびKLF4のMOI=10、d2P-MYCはMOI=5で感染させた場合のday30のALP陽性コロニーの出現効率は0.5%以上であった。SeV抗体染色を行った結果、P=2のCytoTune-iPS 2.0でSeV陽性細胞が観察される継代数でd2P-MYCのSeV抗体染色陰性を観察した（図26）。リアルタイムPCRの結果、P=1のCytoTune-iPS 2.0のRQが1であるのに対し、P=1のd2P-MYCは1/16以下、P=2のd2P-MYCは1/1500以下、P=3で検出されなくなり、CytoTune-iPS 2.0より早いタイミングで消失することを観察した（図27）。初期化マーカーのPCRの結果、P=3のd2P-MYCについては#3、#5、#6の3株で（図28）、Pdd-MYC、Pddg-MYC、およびPtetR-MYCについては各2株で、得られたiPS細胞のNANOG陽性、TERT陽性、SeV陰性を観察した（図29）。また、図28で得られたiPS細胞をNOD-scidマウスに移植したところ、テラトーマが形成され、ヘマトキシリン・エオシン染色を行い、三胚葉形成能を観察できた（図30）。
【０１２９】
[実施例23]
HeLa細胞にSeV18+d2AG/TS15ΔF（d2AG-TS15）およびSeV18+d2AG/PtetRTS15ΔF （d2AG-PtetRTS15）を感染させ（d2AG-PtetRTS15は1.5μg/mlのDOXを添加）（day0）、day2でDOXを除去・35℃に細胞を移動し、感染からday5に観察を行った。その結果、d2AG-TS15単独（TS15と表記）で感染させた場合に比べ、d2AG-PtetRTS15を共感染（TS15+PtetRと表記）させることでベクターの除去が60%に促進されたことを示している（図31）。それに対してd2AG-TS15の感染量を2倍に増やした細胞（TS15+TS15）ではd2AGの蛍光が118%に増加した。
【０１３０】
[実施例24]
HeLa細胞にTransIT-LT1（Mirus Bio社）を用いてpCAGGS-P4C(-)（WO2005/071085）、pCAGGS-d144P（d144P）、pCAGGS-d307P(d307P)、pCAGGS-Pct（Pct）を遺伝子導入し、37℃でSeV18+GFP/TSΔP（WO2008/133206）をMOI=10で感染させ（day0）、day1で蛍光顕微鏡による観察を行った。その結果、pCAGGS-Pを遺伝子導入した細胞と同様に、d144P、d307P、Pctを導入した細胞においてもSeV18+GFP/TSΔPの感染によって緑色蛍光が観察された（図32）。これはP蛋白のN末端側を削ってもP蛋白として機能していることを示している。
【０１３１】
[実施例25]
HeLa細胞に、TransIT-LT1（Mirus Bio社）を用いてpEB-SeV-Pdd-Halo、pEB-MeV-Pdd-Halo、pEB-NDV-Pdd-Halo、pEB-PIV2-Pdd-Halo、pEB-VSV-Pdd-Haloを遺伝子導入し、1μMのShield1存在下、TMR ligandで15分間パルスラベル後、蛍光の消失を指標にP蛋白の分解を蛍光顕微鏡で観察した。その結果、マイナス鎖RNAウイルスのP蛋白は1時間で急速に分解されていることが示された（図33）。SeVのP蛋白が1時間で12.1%に低下したのに対し、それぞれMeVは6.1%、NDVは6.8%、PIV2は10.2%、VSVは7.9%に低下していた。
【０１３２】
[実施例26]
BHK細胞に、32℃でSeV(PM)ddgOFP(HNL)ddDGFP/d2PTS15ΔF（ddgOFP-ddDGFP-d2PTS15）を感染させ（day0）、day2で1μMのShield1あるいは1μMのShield1および20μMのTMPを添加し、day3で蛍光顕微鏡による観察を行った。その結果、Shield1を添加したddgOFP-ddDGFP感染細胞では緑色蛍光が観察され、Shield1およびTMPを添加したddgOFP-ddDGFP-d2PTS15感染細胞では緑色蛍光および橙色蛍光が観察された（図34A）。
【０１３３】
[実施例27]
HeLa細胞に1μMのShield1を添加し、32℃でSeV(PM)ddgOFP(HNL)ddDGFP/PddTS15ΔF（ddgOFP-ddDGFP-PddTS15）をMOI=5で感染させ（day0）、day2で1μMのShield1あるいは1μMのShield1および20μMのTMPを添加し、day3で蛍光顕微鏡による観察を行った。蛍光観察後に、Shield1およびTMPを除去して37℃に細胞を移動した。その結果、Shield1を添加したddgOFP-ddDGFP-PddTS15感染細胞では緑色蛍光が観察され、Shield1およびTMPを添加したddgOFP-ddDGFP感染細胞では緑色蛍光および橙色蛍光が観察された。Shield1およびTMPを除去して37℃に細胞を移動した細胞では蛍光の消失が観察された（図34B）。これは複数の搭載遺伝子が薬剤により独立制御され、温度上昇によりベクターが除去されることを示している。
【０１３４】
[実施例28]
HeLa細胞に1μMのShield1を添加あるいは添加せずに、37℃でSeV18+DGFP/PddΔF（DGFP-Pdd/dF）をMOI=5で感染させ（day0）、day1で蛍光顕微鏡による観察を行い、蛍光画像をMetaMorph（Molecular Devices社）で画像解析を行った。その結果、Shield1を添加したDGFP-Pdd/dF感染細胞と比較してShield1を添加しなかったDGFP-Pdd/dF感染細胞では40%に蛍光の減弱が観察された（図35）。これは温度感受性変異を有していないベクターにおいても、P蛋白質にdegronを付加することで発現調節が可能なことを示している。
【産業上の利用可能性】
【０１３５】
本発明により、ベクター導入後に搭載遺伝子の高レベルの発現を誘導しつつ、その後、迅速にベクターを除去することが可能となった。本発明は、リプログラミング因子等の転写因子を標的細胞において一過的に発現させるために有用であり、細胞治療や再生医療における応用が期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４ａ】
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【図３４ｂ】
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【図３５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年7月27日(2020.7.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイナス鎖RNAウイルスベクターであって、該ウイルスのP蛋白質のC末端にdegronを付加するようにP遺伝子が改変されたベクターであって、当該degronによりベクターの消失を促進することを可能とする、ベクター。
【請求項２】
該P蛋白質にL511F変異を含む、請求項１に記載のベクター。
【請求項３】
該P蛋白質にD433A、R434A、およびK437A変異を含む、請求項１または２に記載のベクター。
【請求項４】
該ウイルスのL蛋白質にL1361CおよびL1558Iの変異を含む、請求項１から３のいずれかに記載のベクター。
【請求項５】
DegronがmTOR degron、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）degron、PEST、TetR degron、およびauxin-inducible degron（AID）からなる群より選択される、請求項１から４のいずれかに記載のベクター。
【請求項６】
Degronが配列番号：89〜97および99のいずれかのアミノ酸配列、または当該アミノ酸配列と90％以上の同一性を持つアミノ酸配列を含み、P蛋白質のC末端側に付加することにより該蛋白質を不安定化させる活性を有するポリペプチドである、請求項１から４のいずれかに記載のベクター。
【請求項７】
少なくとも１つの外来遺伝子を搭載する、請求項１から６のいずれかに記載のベクター。
【請求項８】
該外来遺伝子が、degronが付加された蛋白質をコードする、請求項７に記載のベクター。
【請求項９】
該外来遺伝子がコードする蛋白質に付加されたdegronが、P蛋白質に付加されているdegronとは異なるdegronである、請求項８に記載のベクター。
【請求項１０】
少なくとも２つの外来遺伝子を搭載し、それぞれの外来遺伝子がコードする蛋白質に、互いに異なるdegronが付加されている、請求項１から９のいずれかに記載のベクター。
【請求項１１】
マイナス鎖RNAウイルスがパラミクソウイルスである、請求項１から１０のいずれかに記載のベクター。
【請求項１２】
パラミクソウイルスがセンダイウイルスである、請求項１１に記載のベクター。
【請求項１３】
マイナス鎖RNAウイルスベクターの除去を促進するための方法であって、請求項１から１２のいずれかに記載のベクターを用いることを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法であって、該ベクターがコードするP蛋白質にD433A、R434A、およびK437A変異を含み、温度を上昇して培養して除去を促進する工程を含む、方法。
【請求項１５】
35〜39℃で培養して除去を促進する工程を含む、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１から１２のいずれかに記載のベクターの製造方法であって、該ベクターのゲノムRNAまたはその相補鎖をコードする核酸を、いずれもdegronが付加されていないNP、PおよびL蛋白質の存在下で発現させる工程を含む方法。
【請求項１７】
請求項１から１２のいずれかに記載のベクターを用いることを特徴とする、搭載遺伝子の発現量を制御する方法。
【請求項１８】
搭載遺伝子が転写因子をコードする、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
多能性幹細胞の作製において使用される、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
請求項９または１０に記載のベクターを用いることを特徴とする、ベクターの除去のタイミングとは独立に、外来遺伝子の発現を制御する方法。
【請求項２１】
マイナス鎖RNAウイルスまたはマイナス鎖RNAウイルスベクターの除去を促進する方法であって、該ウイルスまたはベクターを、請求項１から１２のいずれかに記載のベクターと共感染させる工程を含む、方法。
【請求項２２】
請求項１から１２のいずれかに記載のベクターを含む、マイナス鎖RNAウイルスまたはマイナス鎖RNAウイルスベクターの除去促進剤。