(57)【要約】      （修正有）【課題】簡易な設備で製造可能であり、かつ培養後に所望の形状を有する細胞塊が取得可能な細胞培養器具およびその製造方法を提供する。【解決手段】細胞培養基材を含む細胞培養基材層１１を有し、前記細胞培養基材層は、細胞が接着可能な細胞接着領域１１ａと、細胞の接着が阻害される細胞接着阻害領域１１ｂとを有し、前記細胞接着阻害領域は前記細胞培養基材の変性物を含む、細胞培養器具。また、その製造方法を開示する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養基材を含む細胞培養基材層を有し、
前記細胞培養基材層は、細胞が接着可能な細胞接着領域と、細胞の接着が阻害される細胞接着阻害領域とを有し、
前記細胞接着阻害領域は、前記細胞培養基材の変性物を含む、細胞培養器具。
【請求項２】
光を熱に変換可能な光熱変換層を有し、
前記細胞培養基材層は、前記光熱変換層上に配置される、請求項１記載の細胞培養器具。
【請求項３】
前記細胞培養基材層と前記光変換層との接触を遮断する遮断層を有し、
前記遮断層は、前記光熱変換層上に配置され、
前記細胞培養基材層は、前記遮断層上に配置される、請求項２記載の細胞培養器具。
【請求項４】
前記光熱変換層は、光を吸収する色素構造を含んだポリマーを含む、請求項２または３記載の細胞培養器具。
【請求項５】
前記細胞接着領域は、未変性の細胞培養基材を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の細胞培養器具。
【請求項６】
前記細胞培養基材は、細胞外基質である、請求項１から５のいずれか一項に記載の細胞培養器具。
【請求項７】
前記細胞培養基材は、タンパク質またはそのペプチド断片である、請求項１から６のいずれか一項に記載の細胞培養器具。
【請求項８】
前記細胞培養基材は、ラミニンまたはその断片である、請求項１から７いずれか一項に記載の細胞培養器具。
【請求項９】
細胞培養基材を含む細胞培養基材層を有する細胞培養器具に光を照射し、前記細胞培養基材を変性させ、細胞接着阻害領域を形成する阻害領域形成工程を含む、細胞培養器具の製造方法。
【請求項１０】
前記細胞培養器具は、光を熱に変換可能な光熱変換層を有し、
前記細胞培養基材層は、前記光熱変換層上に配置され、
前記阻害領域形成工程において、前記光熱変換層に前記光を照射する、請求項９記載の製造方法。
【請求項１１】
前記細胞培養器具は、前記細胞培養基材層と前記光変換層との接触を遮断する遮断層を有し、
前記遮断層は、前記光熱変換層上に配置され、
前記細胞培養基材層は、前記遮断層上に配置される、請求項１０記載の製造方法。
【請求項１２】
前記光は、赤外光であり、
前記阻害領域形成工程において、前記細胞培養基材層に前記赤外光を照射する、請求項９から１１のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１３】
前記阻害領域形成工程において、前記細胞培養基材の温度が、５０℃以上となるように、前記光を照射する、請求項９から１２のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１４】
前記阻害領域形成工程前において、前記細胞培養基材は、未変性の細胞培養基材である、請求項９から１３のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１５】
前記光は、レーザ光である、請求項９から１４のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１６】
前記細胞培養基材は、細胞外基質である、請求項９から１５のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１７】
前記細胞培養基材は、タンパク質またはそのペプチド断片である、請求項９から１６のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１８】
前記細胞培養基材は、ラミニンまたはその断片である、請求項９から１７いずれか一項に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養器具および細胞培養器具の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
培養した細胞塊を所望の形状に加工する場合、培養後の細胞塊を所望の形状に切断する等の処理または予め培養後の細胞塊が所望の形状となるように、細胞培養器具を加工することが行なわれている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開平０３−００７５７６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
特許文献１の製造方法では、フォトリソグラフィ法により細胞培養器具の表面パターニングすることにより、培養後の細胞塊が所望の形状となるように、細胞培養器具を加工している。しかしながら、フォトリソグラフィ法を実施する場合、フォトマスクの形成装置、露光装置等の多種多様な製造設備が必要となる。
【０００５】
そこで、本発明は、簡易な設備で製造可能であり、かつ培養後に所望の形状を有する細胞塊が取得可能な細胞培養器具およびその製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
前記目的を達成するために、本発明の細胞培養器具（以下、「培養器具」ともいう）は、細胞培養基材を含む細胞培養基材層を有し、
前記細胞培養基材層は、細胞が接着可能な細胞接着領域と、細胞の接着が阻害される細胞接着阻害領域とを有し、
前記細胞接着阻害領域は、前記細胞培養基材の変性物を含む。
【０００７】
本発明の細胞培養器具の製造方法（以下、「製造方法」ともいう）は、細胞培養基材を含む細胞培養基材層を有する細胞培養器具に光を照射し、前記細胞培養基材を変性させ、細胞接着阻害領域を形成する阻害領域形成工程を含む。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の細胞培養器具は、簡易な設備で製造可能であり、かつ培養後に所望の形状を有する細胞塊が取得可能である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、実施形態１の培養器具の構成の一例を示す模式図であり、（Ａ）は、実施形態１の培養器具の模式斜視図であり、（Ｂ）は、（Ａ）におけるＩ−Ｉ方向からみた実施形態１の培養器具の模式断面図であり、（Ｃ）は、実施形態１の培養器具の平面図である。
【図２】図２は、実施形態１の培養器具の製造方法の一例を示す模式図である。
【図３】図３は、実施形態２の培養器具の構成の一例を示す模式図であり、（Ａ）は、実施形態２の培養器具の模式斜視図であり、（Ｂ）は、（Ａ）におけるII−II方向からみた実施形態２の培養器具の模式断面図であり、（Ｃ）は、実施形態２の培養器具の平面図である。
【図４】図４は、実施形態２の培養器具の製造方法の一例を示す模式図である。
【図５】図５は、実施形態３の培養器具の構成の一例を示す模式図であり、（Ａ）は、実施形態３の培養器具の模式斜視図であり、（Ｂ）は、（Ａ）におけるII−II方向からみた実施形態３の培養器具の模式断面図であり、（Ｃ）は、実施形態３の培養器具の平面図である。
【図６】図６は、実施形態３の培養器具の製造方法の一例を示す模式図である。
【図７】図７は、実施形態４の培養器具の構成の一例を示す模式図であり、（Ａ）は、実施形態４の培養器具の模式斜視図であり、（Ｂ）は、（Ａ）におけるII−II方向からみた実施形態４の培養器具の模式断面図であり、（Ｃ）は、実施形態４の培養器具の平面図である。
【図８】図８は、実施形態４の培養器具の製造方法の一例を示す模式図である。
【図９】図９は、実施形態４の培養器具の構成の他の例を示す模式図であり、（Ａ）は、実施形態４の他の例の培養器具の模式斜視図であり、（Ｂ）は、（Ａ）におけるII−II方向からみた他の例の培養器具の模式断面図であり、（Ｃ）は、実施形態４の他の例の培養器具の平面図である。
【図１０】図１０は、実施例１における細胞培養基材層の一例を示す模式図である。
【図１１】図１１は、実施例１における培養後の細胞を示す写真である。
【図１２】図１２は、実施例１における培養後の細胞を示す写真である。
【図１３】図１３は、実施例２におけるレーザ光の照射部における温度分布を示す写真である。
【図１４】図１４は、実施例３における培養後の細胞を示す写真である。
【図１５】図１５は、実施例４における培養後のｉＰＳ細胞の写真であり、（Ａ）は、ディッシュ全面の画像の写真であり、（Ｂ）は、拡大写真である。
【図１６】図１６は、実施例５における細胞処理の結果を示す図であり、（Ａ）は、細胞培養器具におけるレーザ光の照射部を示す模式図であり、（Ｂ）は、培養器具全体の培養後の細胞を示す写真であり、（Ｃ）は、（Ｂ）の写真における培養器具の中心領域の拡大写真である。
【図１７】図１７は、実施例６における培養後のｉＰＳ細胞の写真であり、（Ａ）は、細胞培養器具におけるレーザ光の照射部を示す模式図であり、（Ｂ）は、培養後の細胞を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明において、「細胞」は、例えば、単離された細胞、細胞から構成される細胞塊、組織、または臓器を意味する。前記細胞は、例えば、培養細胞でもよいし、生体から単離した細胞でもよい。また、前記細胞塊、組織または臓器は、例えば、前記細胞から作製した細胞塊、細胞シート、組織または臓器でもよいし、生体から単離した細胞塊、組織または臓器でもよい。前記細胞は、細胞外基質（細胞外マトリックス）依存的に接着する細胞が好ましい。
【００１１】
以下、本発明の細胞培養器具および細胞培養器具の製造方法について、図面を参照して詳細に説明する。ただし、本発明は、以下の説明に限定されない。なお、以下の図１〜図１７において、同一部分には、同一符号を付し、その説明を省略する場合がある。また、図面においては、説明の便宜上、各部の構造は適宜簡略化して示す場合があり、各部の寸法比等は、実際とは異なり、模式的に示す場合がある。また、各実施形態は、特に言及しない限り、互いにその説明を援用できる。
【００１２】
（実施形態１）
本実施形態は、細胞培養器具および細胞培養器具の製造方法の一例である。図１は、実施形態１の培養器具１００の構成を示す模式図であり、（Ａ）は、培養器具１００の模式斜視図であり、（Ｂ）は、（Ａ）におけるＩ−Ｉ方向からみた培養器具１００の模式断面図であり、（Ｃ）は、培養器具１００の平面図である。図１に示すように、培養器具１００は、細胞培養基材層１１と、容器１２とを有する。細胞培養基材層１１は、細胞が接着可能な細胞接着領域１１ａと、細胞の接着が阻害される細胞接着阻害領域１１ｂとを有する。細胞培養基材層１１において、細胞接着領域１１ａは、４つの略円状の領域として形成されている。また、細胞培養基材層１１において、細胞接着阻害領域１１ｂは、細胞接着領域１１ａ以外の領域として形成されている。容器１２は、底面１２ａと、側壁１２ｂとを有する。細胞培養基材層１１は、底面１２ａの上に積層されている。
【００１３】
細胞培養基材層１１は、細胞培養基材を含む層である。前記細胞培養基材は、例えば、細胞の培養時に細胞の足場となる物質を意味する。前記細胞培養基材は、例えば、細胞外基質（細胞外マトリックス）または細胞の足場としての機能を有する物質があげられる。前記細胞外基質は、例えば、エラスチン；エンタクチン；I型コラーゲン、II型コラーゲン、III型コラーゲン、IV型コラーゲン、Ｖ型コラーゲン、VII型コラーゲン等のコラーゲン；テネイシン；フィブリリン；フィブロネクチン；ラミニン；ビトロネクチン（Vitronectin）；コンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸、デルマタン硫酸等の硫酸化グルコサミノグリカンと、コアタンパク質とから構成されるプロテオグリカン；コンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸、デルマタン硫酸、ヒアルロン酸等のグルコサミノグリカン；Synthemax（登録商標、ビトロネクチン誘導体）、Matrigel（登録商標、ラミニン、IV型コラーゲン、ヘパリン硫酸プロテオグリカン、エンタクチン／ニドゲン等の混合物）等があげられ、好ましくは、ラミニンである。前記ラミニンは、例えば、ラミニン１１１、ラミニン１２１、ラミニン２１１、ラミニン２１３、ラミニン２２２、ラミニン３１１（ラミニン３Ａ１１）、ラミニン３３２（ラミニン３Ａ３２）、ラミニン３２１（ラミニン３Ａ２１）、ラミニン３Ｂ３２、ラミニン４１１、ラミニン４２１、ラミニン４２３、ラミニン５２１、ラミニン５２２、ラミニン５２３等があげられる。なお、各ラミニンにおける３つの数字は、先頭からそれぞれ、α鎖、β鎖、およびγ鎖の構成サブユニットの名前である。具体例として、ラミニン１１１は、α１鎖、β１鎖、およびγ１鎖から構成される。また、ラミニン３Ａ１１は、α３Ａ鎖、β１鎖、およびγ１鎖から構成される。前記細胞培養基材は、前記タンパク質のペプチド断片または前記糖鎖の断片を含んでもよい。具体例として、前記タンパク質のペプチド断片は、例えば、ラミニンの断片があげられる。前記ラミニンの断片（フラグメント）は、例えば、前述のラミニンの断片があげられ、具体例として、ラミニン211-E8、ラミニン311-E8、ラミニン411-E8、ラミニン511-E8があげられる。前記ラミニン211-E8は、ラミニンのα２鎖、β１鎖、およびγ１鎖の断片から構成される。前記ラミニン311-E8は、ラミニンのα３鎖、β１鎖、およびγ１鎖の断片から構成される。前記ラミニン411-E8は、ラミニンのα４鎖、β１鎖、およびγ１鎖の断片から構成される。前記ラミニン511-E8は、例えば、ラミニンのα５鎖、β１鎖、およびγ１鎖の断片から構成される。
【００１４】
前記細胞培養基材は、光照射により、直接または間接的に変性する。前記直接的な変性は、例えば、前記光照射により、前記細胞培養基材の構造が変化することにより生じる。前記間接的な変性は、例えば、照射された光が他のエネルギーに変換され、前記他のエネルギーにより、前記細胞培養基材の構造が変化することにより生じる。前記他のエネルギーは、例えば、熱である。この場合、前記細胞培養基材は、前記光照射により生じた熱により変性する。
【００１５】
実施形態１の培養器具１００において、細胞培養基材層１１は、１層であるが、複数層であってもよい。この場合、細胞との接触面（図１（Ａ）において、上側）を形成する細胞培養基材層１１が、細胞接着領域１１ａと、細胞接着阻害領域１１ｂとを有することが好ましい。
【００１６】
細胞培養基材層１１は、前記細胞培養基材に加え、他の成分を含んでもよい。前記他の成分は、例えば、緩衝剤、塩、成長因子（細胞増殖因子）、サイトカイン、ホルモン等があげられる。
【００１７】
本実施形態の培養器具１００において、細胞培養基材層１１は、底面１２ａの上面のみに配置（形成）されているが、本発明はこれに限定されない。細胞培養基材層１１は、例えば、前記細胞と接触可能な領域に配置されればよく、培養器具１００において、底面１２ａの上面に代えて、または加えて、側壁１２ｂの内周面に配置されてもよい。また、細胞培養基材層１１は、前記細胞と接触可能な領域の一部に形成されてもよいし、全部に形成されてもよい。前者の場合、細胞培養基材層１１は、細胞培養時において、容器１２の底面１２ａ上に形成されることが好ましい。
【００１８】
細胞接着領域１１ａは、細胞培養基材層１１において、前記細胞が接着可能な領域である。前記細胞培養基材は、例えば、未変性の状態において、前記細胞と接着可能である。このため、細胞接着領域１１ａは、例えば、前記細胞培養基材を未変性の状態で含む領域、すなわち、未変性の細胞培養基材を含む領域ということもできる。細胞接着領域１１ａに含まれる細胞培養基材は、その一部または全部が未変性の状態である。前記細胞培養基材の一部が未変性の状態の場合、例えば、細胞接着領域１１ａにおける細胞培養基材の５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上が、未変性の状態である。前記細胞培養基材における未変性の状態または変性状態の細胞培養基材の割合は、例えば、細胞接着領域１１ａを回収し、得られた回収物について、非変性電気泳動（native PAGE）を実施し、バンド位置の変化に基づき、決定できる。また、細胞接着領域１１ａは、例えば、後述の製造方法において、光を照射していない領域ということもできる。本実施形態において、前記細胞培養基材は、光照射により、直接または間接的に変性し、前記細胞との接着能が低下する。このため、細胞接着領域１１ａは、未変性の状態の細胞培養基材を含む。ただし、本発明は、これに限定されず、前記細胞培養基材は、未変性の状態で細胞との接着が阻害され、光照射により、直接または間接的に変性し、前記細胞との接着能が向上してもよい。この場合、細胞接着領域１１ａは、変性状態の細胞培養基材を含む。また、前記細胞培養基材は、光照射により、直接または間接的に変性することにより、前記細胞と接着可能となる。
【００１９】
本実施形態において、細胞接着領域１１ａは、細胞培養基材層１１における略円状の領域として形成されているが、本発明はこれに限定されない。細胞接着領域１１ａの形状は、任意の形状とでき、使用者が求める形状に応じて適宜設計できる。また、本実施形態において、細胞培養基材層１１に形成される細胞接着領域１１ａの数は、４つであるが、本発明はこれに限定されない。細胞接着領域１１ａの数は、１つでもよいし、２つ以上でもよい。
【００２０】
細胞接着阻害領域１１ｂは、前記細胞の接着が阻害される領域である。前述のように、前記細胞培養基材は、例えば、未変性の状態において、前記細胞と接着可能である。このため、細胞接着阻害領域１１ｂは、例えば、前記細胞培養基材を変性状態で含む領域、すなわち、前記細胞培養基材の変性物を含む領域ということもできる。前記変性物は、例えば、光分解物、熱変性物等があげられる。細胞接着阻害領域１１ｂに含まれる細胞培養基材は、その一部または全部が変性状態である。前記細胞培養基材の一部が変性状態の場合、例えば、細胞接着阻害領域１１ｂにおける細胞培養基材の５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上が、変性状態である。また、細胞接着阻害領域１１ｂは、例えば、後述の製造方法において、光を照射した領域ということもできる。細胞接着阻害領域１１ｂは、例えば、細胞接着領域１１ａと比較して、前記細胞の接着が低下している領域である。具体的には、細胞接着阻害領域１１ｂは、例えば、単位面積あたりの細胞の接着数が、細胞接着領域１１ａにおける単位面積あたりの細胞の接着数と比較して、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上、好ましくは、１００％低下している。前記単位面積あたりの細胞数の接着数は、例えば、各領域における細胞培養基材の状態以外の条件を同一とした試験により取得する。前記試験に用いる細胞は、ｉＰＳ細胞（induced pluripotent stem cells）が好ましい。この場合、前記試験における培養条件は、ｉＰＳ細胞が未分化状態を維持する条件である。本実施形態において、前記細胞培養基材は、光照射により、直接または間接的に変性し、前記細胞との接着能が低下する。このため、細胞接着阻害領域１１ｂは、変性状態の細胞培養基材を含む。ただし、本発明は、これに限定されず、前記細胞培養基材は、未変性の状態で細胞との接着が阻害され、光照射により、直接または間接的に変性し、前記細胞との接着能が向上してもよい。この場合、細胞接着阻害領域１１ｂは、未変性の状態の細胞培養基材を含む。また、前記細胞培養基材は、光照射を実施しない状態で、前記細胞の接着を阻害する。
【００２１】
容器１２は、前記細胞を培養可能である。容器１２において、底面１２ａと、側壁１２ｂとで囲まれた空間が、前記細胞を培養可能な領域（細胞培養領域）であり、例えば、ウェルということもできる。容器１２は、細胞培養容器があげられ、具体例として、ディッシュ、プレート、フラスコ（細胞培養フラスコ）等があげられる。容器１２の大きさ、容積、材質、接着処理の有無等は、培養器具１００で培養する細胞の種類および量に応じて適宜決定できる。
【００２２】
容器１２は、前記細胞培養領域を１つ有するが、複数有してもよい。後者の場合、容器１２は、例えば、複数のウェルを有するということもできる。また、後者の場合、複数の細胞培養領域のうち、いずれか１つに細胞培養基材層１１が形成されてもよいし、複数に細胞培養基材層１１が形成されてもよいし、全てに細胞培養基材層１１が形成されてもよい。すなわち、容器１２は、複数のウェルのうち、いずれか１ウェル、２ウェル以上または全てのウェルに細胞培養基材層１１が形成されてもよい。
【００２３】
培養器具１００を光学顕微鏡等により観察に供する場合、本発明の培養器具は、実施形態１の培養器具１００のように、その底面１２ａの外周部、すなわち、底面１２ａの側壁１２ｂ側に細胞接着阻害領域１１ｂを形成することが好ましく、前記外周部において、前記光学顕微鏡等により観察した際に適切な観察像が得られない領域（例えば、メニスカスが生じる領域）に、細胞接着阻害領域１１ｂを形成することがより好ましい。細胞接着阻害領域１１ｂをこのような位置に形成することにより、培養器具１００を用いて細胞を培養する際に、光学顕微鏡等により適切な観察像が得られない領域において、播種した細胞が目的外の細胞に分化することを防止できる。このため、このような培養器具１００によれば、例えば、細胞の管理が容易になる。
【００２４】
本実施形態において、容器１２は、蓋を含んでもよい。前記蓋は、例えば、容器１２の容器１２の上面を着脱可能に覆うことができる。前記蓋は、例えば、底面１２ａと対向するように配置される。前記蓋は、例えば、前記細胞培養容器の蓋があげられる。
【００２５】
本実施形態において、培養器具１００の細胞培養基材層１１は、細胞接着領域１１ａおよび細胞接着阻害領域１１ｂを含むが、細胞接着領域１１ａのみ、または細胞接着阻害領域１１ｂのみから構成されてもよい。
【００２６】
本実施形態の培養器具１００を用いた細胞の培養方法は、例えば、前記細胞の種類に応じて、公知の培養方法により実施できる。また、前記培養方法における培養条件、培地等は、前記細胞の種類に応じて、適宜決定できる。
【００２７】
つぎに、培養器具１００の製造方法について、図２に基づき説明する。図２は、培養器具１００の製造方法の一例を示す模式図である。本実施形態の培養器具１００の製造方法では、未変性の細胞培養基材を用いて、細胞培養基材層１１を形成する。そして、本実施形態の製造方法では、形成された細胞培養基材層１１に対して、光を照射することにより、細胞接着阻害領域１１ｂが形成される。
【００２８】
まず、本実施形態の製造方法は、図２（Ａ）に示すように、容器１２を準備する（準備工程）。容器１２は、市販品を購入してもよいし、自家調製してもよい。
【００２９】
つぎに、本実施形態の製造方法は、図２（Ｂ）に示すように、容器１２の底面１２ａ上に、前記細胞培養基材を含む細胞培養基材層１１を形成する（基材層形成工程）。これにより、本実施形態の製造方法は、細胞培養基材層１１を有する容器１２を準備できる。本実施形態の製造方法において、細胞培養基材層１１の形成に用いる細胞培養基材は、未変性の状態の細胞培養基材である。また、前記細胞培養基材は、未変性の状態において、前記細胞と接着可能である。このため、図２（Ｂ）に示すように、形成後の細胞培養基材層１１は、細胞接着領域１１ａから構成される。細胞培養基材層１１は、例えば、公知の膜形成方法により形成でき、具体例として、塗布法、印刷法（スクリーン法）、蒸着法、スパッタリング法、キャスト法、スピンコート法等により実施できる。前記細胞培養基材がタンパク質等の生体高分子の場合、細胞培養基材層１１の形成方法は、前記細胞培養基材の変性を抑制できることから、塗布法が好ましい。この場合、細胞培養基材層１１は、例えば、未変性の細胞培養基材を含む溶媒を容器１２の内部、より具体的には、容器１２の底面１２ａと接触するように導入し、静置することに形成してもよい。前記溶媒は、例えば、水性溶媒があげられ、好ましくは、水である。静置時間は、例えば、３０分〜１日である。静置時の温度は、例えば、４〜４０℃である。前記細胞培養基材がラミニン511-E8であり、コーティング濃度が０．５μｇ／ｃｍ２の場合、前記静置時間は、例えば、１時間以上であり、静置時の温度は、約３７℃（３５〜３９℃）である。そして、前記静置後、前記基材層形成工程では、前記未変性の細胞培養基材を含む溶媒を除去する。前記溶媒の除去後、容器１２は、その内部を、前記細胞培養基材を含まない溶媒で洗浄してもよい。
【００３０】
つぎに、本実施形態の製造方法は、図２（Ｃ）に示すように、細胞培養基材層１１を有する容器１２（細胞培養器具）に光Ｌを照射し、前記細胞培養基材を変性させ、細胞接着阻害領域１１ｂを形成する（阻害領域形成工程）。より具体的には、前記阻害領域形成工程では、細胞培養基材層１１に光Ｌを照射し、前記細胞培養基材を変性させ、細胞接着阻害領域１１ｂを形成する。光Ｌは、細胞培養基材層１１に焦点があうように制御されることが好ましい。前記阻害領域形成工程において、細胞培養基材層１１上には、前記溶媒が存在することが好ましい。本実施形態の製造方法において、前記細胞培養基材は、例えば、未変性の状態において、前記細胞と接着可能である。このため、光Ｌは、細胞接着阻害領域１１ｂを形成する領域に対して照射される。光Ｌの波長は、例えば、紫外光（例えば、１０〜３６０ｎｍまたは１０〜３４０ｎｍ）、可視光（例えば、３６０〜７６０ｎｍまたは３８０ｎｍ〜７４０ｎｍ）、または赤外光（例えば、７６０ｎｍ〜１０００μｍまたは７８０〜１０００μｍ）である。具体例として、前記細胞培養基材がラミニン511-E8であり、細胞培養基材層１１に水が積層されている場合、光Ｌは、例えば、赤外光であり、好ましくは、赤外光において水が吸収する波長または波長領域である。前記水が吸収する波長は、例えば、１４７０ｎｍである。前記光は、細胞接着阻害領域１１ｂを精密に形成できることから、レーザ光が好ましい。光Ｌのスポット径（ビーム幅）は、例えば、光Ｌのエネルギー量に応じて適宜設定でき、光Ｌのエネルギー量が相対的に少ない場合、スポット径は、相対的に小さく設定し、光Ｌのエネルギー量が相対的に多い場合、スポット径は、相対的に大きく設定する。光Ｌのスポット径は、例えば、１０〜２００μｍである。光Ｌのエネルギー量（出力）は、例えば、細胞培養基材層１１における光Ｌの照射部の細胞培養基材が変性するエネルギー量であり、前記細胞培養基材の種類に応じて、適宜設定できる。光Ｌのエネルギー量は、細胞培養基材層１１に積層する細胞が致死する温度が好ましく、具体例として、細胞培養基材層１１における光Ｌの照射部の細胞培養基材の温度が、５０℃以上、６０℃以上、７０℃以上、８０℃以上、９０℃以上、好ましくは、１００℃以上、１１０℃以上、１２０℃以上となるエネルギー量である。前記温度の上限は、例えば、２００℃である。前記細胞培養基材の温度は、例えば、後述の実施例２の方法に準じて測定できる。光Ｌの走査速度は、例えば、スポット径および光Ｌのエネルギー量に応じて適宜設定でき、スポット径の単位面積当たり光エネルギー量が相対的に低い場合、光Ｌの走査速度は相対的に遅く設定し、スポット径の単位面積当たり光エネルギー量が相対的に高い場合、光Ｌの走査速度は相対的に速く設定する。具体例として、光Ｌの走査速度は、例えば、１００ｍｍ／秒以下である。光Ｌが赤外線レーザ（１４５０ｎｍ）であり、スポット径が７５μｍであり、光Ｌの走査速度が、５ｍｍ／秒以下である場合、光Ｌのエネルギー量は、約０．６Ｗ（０．４〜０．８Ｗ）である。
【００３１】
そして、本実施形態の製造方法は、図２（Ｄ）に示すように、培養器具１００が製造される。本実施形態の製造方法において、前記細胞培養基材は、未変性の状態において、前記細胞と接着可能であるため、前記阻害領域形成工程では、光Ｌを、細胞接着阻害領域１１ｂを形成する領域に対して照射される。ただし、本発明はこれに限定されず、前記阻害領域形成工程では、光Ｌは、細胞接着領域１１ａを形成する領域に対して照射されてもよい。この場合は、前記細胞培養基材は、変性状態において、前記細胞と接着可能である。
【００３２】
本実施形態によれば、細胞培養基材層１１における細胞接着領域１１ａおよび細胞接着阻害領域１１ｂの形状および大きさ（面積）を、任意の形状および大きさとできる。このため、本実施形態の培養器具１００によれば、細胞接着領域１１ａおよび細胞接着阻害領域１１ｂの形状および大きさを制御することにより、細胞の培養時に、得られた細胞塊の形状および大きさを使用者が希望する形状および大きさとすることができる。すなわち、本実施形態の培養器具１００によれば、培養後に所望の形状を有する細胞塊が取得可能である。本実施形態の培養器具１００は、細胞外基質依存的に接着する細胞について、培養後に所望の形状を有する細胞塊を取得するのに特に好適に使用できる。また、前記細胞培養時において、得られる細胞塊の形状および大きさは、前記細胞の分化誘導の重要な要因となっている。本実施形態の培養器具１００によれば、細胞接着領域１１ａおよび細胞接着阻害領域１１ｂの形状および大きさを制御できるため、培養対象の細胞に対して、所望の細胞への分化を誘導できる。また、本実施形態の培養器具１００は、レーザ光の照射装置等の光照射装置のみで製造できる。このため、本実施形態の培養器具１００は、簡易な設備で製造可能である。これらの効果は、後述の各実施形態においても同様である。
【００３３】
（実施形態２）
本実施形態は、細胞培養器具および細胞培養器具の製造方法の他の例である。図３は、実施形態２の培養器具２００の構成を示す模式図であり、（Ａ）は、培養器具２００の模式斜視図であり、（Ｂ）は、（Ａ）におけるII−II方向からみた培養器具２００の模式断面図であり、（Ｃ）は、培養器具２００の平面図である。図２に示すように、培養器具２００は、実施形態１の培養器具１００の構成に加えて、光熱変換層１３を含む。光熱変換層１３は、細胞培養基材層１１と底面１２ａとの間に配置されている。すなわち、光熱変換層１３および細胞培養基材層１１は、底面１２ａに対してこの順番で積層されている。この点を除き、実施形態２の培養器具２００の構成は、実施形態１の培養器具１００の構成と同様であり、その説明を援用できる。
【００３４】
光熱変換層１３は、光を熱に変換可能な層である。光熱変換層１３は、例えば、光を熱に変換可能な分子（光熱変換分子）を含む。前記光熱変換分子は、例えば、後述の培養容器２００の製造方法において照射する光Ｌの波長を吸収する色素構造（発色団）を含んだポリマー（高分子）により構成することが好ましい。前記光熱変換分子は、容器１２へのコーティングが容易であることが好ましい。光Ｌを吸収する色素構造は、例えば、アゾベンゼン、ジアリールエテン、スピロピラン、スピロオキサジン、フルギド、ロイコ色素、インジゴ、カロチノイド（カロテン等）、フラボノイド（アントシアニン等）、キノイド（アントラキノン等）等の有機化合物の誘導体があげられる。前記ポリマーを構成する骨格は、例えば、アクリル系ポリマー、ポリスチレン系ポリマー、ポリオレフィン系ポリマー、ポリ酢酸ビニルやポリ塩化ビニル、ポリオレフィン系ポリマー、ポリカーボネート系ポリマー、エポキシ系ポリマー等があげられる。具体例として、前記光熱変換分子は、例えば、下記式（１）で表される、ポリ［メチルメタクリラート−ｃｏ−（ジスパースイエロー  ７  メタクリラート）］（（Ｃ５Ｈ８Ｏ２）ｍ（Ｃ２３Ｈ２０Ｎ４Ｏ２）ｎ）があげられる。下記式（１）において、ポリマーにおけるアゾベンゼンの構造は、無置換のアゾベンゼンの他、ニトロ基、アミノ基、メチル基等で修飾した様々なバリエーションの構造を採用してもよい。下記式（１）において、ｍおよびｎは、モル百分率である。ｍとｎとの総和は、例えば、１００モル％である。前記ｍおよびｎは、例えば、同じでもよいし、異なってもよい。光熱変換層１３は、例えば、１種類の光熱変換分子を含んでもよいし、複数種類の光熱変換分子を含んでもよい。
【化１】
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【００３５】
実施形態２の培養器具２００において、光熱変換層１３は、１層であるが、複数層であってもよい。この場合、細胞培養基材層１１と底面１２ａとの間に、複数層の光熱変換層１３が配置されることが好ましい。また、実施形態２の培養器具２００において、光熱変換層１３は、細胞培養基材層１１と接触するように配置されているが、接触しないように配置されてもよい。この場合、光熱変換層１３と細胞培養基材層１１とは、熱的に接続されていればよい。具体的には、光熱変換層１３と細胞培養基材層１１との間には、光熱変換層１３で生じた熱を細胞培養基材層１１に伝導する熱伝導層が形成されている。前記熱伝導層は、例えば、金属等の熱伝導率の高い分子を含む。
【００３６】
光熱変換層１３は、前記光熱変換分子に加え、他の成分を含んでもよい。前記他の成分は、例えば、ポリマーの硬化剤、未重合のモノマー等があげられる。
【００３７】
本実施形態の培養器具２００において、光熱変換層１３は、底面１２ａの上面のみに配置（形成）されているが、本発明はこれに限定されない。光熱変換層１３は、例えば、細胞培養基材層１１と隣接するように配置されればよく、例えば、容器１２内に形成されてもよい。この場合、光熱変換層１３は、容器１２の底面の上面に形成されることが好ましい。
【００３８】
本実施形態の培養器具２００において、光熱変換層１３は、底面１２ａの上面のみに配置（形成）されているが、本発明はこれに限定されない。光熱変換層１３は、例えば、細胞培養基材層１１と熱的に接続されるように配置されればよく、培養器具２００において、底面１２ａの上面に代えて、または加えて、側壁１２ｂの内周面に配置されてもよい。また、光熱変換層１３は、細胞培養基材層１１の一部と熱的に接続されるように形成されてもよいし、全部と熱的に接続されるように形成されてもよい。前者の場合、光熱変換層１３は、細胞培養時において、容器１２の底面１２ａ上に形成されることが好ましい。
【００３９】
容器１２は、前記細胞培養領域を１つ有するが、複数有してもよい。後者の場合、容器１２は、例えば、複数のウェルを有するということもできる。また、後者の場合、複数の細胞培養領域のうち、いずれか１つに細胞培養基材層１１および光熱変換層１３が形成されてもよいし、複数に細胞培養基材層１１および光熱変換層１３が形成されてもよいし、全てに細胞培養基材層１１および光熱変換層１３が形成されてもよい。すなわち、容器１２は、複数のウェルのうち、いずれか１ウェル、２ウェル以上または全てのウェルに細胞培養基材層１１および光熱変換層１３が形成されてもよい。
【００４０】
本実施形態において、培養器具２００の細胞培養基材層１１は、細胞接着領域１１ａおよび細胞接着阻害領域１１ｂを含むが、細胞接着領域１１ａのみ、または細胞接着阻害領域１１ｂのみから構成されてもよい。
【００４１】
つぎに、培養器具２００の製造方法について、図４に基づき説明する。図４は、培養器具２００の製造方法の一例を示す模式図である。本実施形態の培養器具２００の製造方法では、光熱変換層１３上に、未変性の細胞培養基材を用いて、細胞培養基材層１１を形成する。そして、本実施形態の製造方法では、光熱変換層１３に対して、光を照射することで、光熱変換層１３により光が熱に変換される。このため、本実施形態の製造方法では、光熱変換層１３において発生した熱により、熱が発生した領域と隣接する細胞培養基材層１１における細胞培養基材が変性し、細胞接着阻害領域１１ｂが形成される。
【００４２】
まず、本実施形態の製造方法は、図４（Ａ）に示すように、容器１２を準備する（準備工程）。容器１２は、前述のように、市販品を購入してもよいし、自家調製してもよい。
【００４３】
つぎに、本実施形態の製造方法は、図４（Ｂ）に示すように、容器１２の底面１２ａ上に、前記光熱変換分子を含む光熱変換層１３を形成する（変換層形成工程）。光熱変換層１３は、例えば、公知の膜形成方法により形成でき、具体例として、塗布法、印刷法（スクリーン法）、蒸着法、スパッタリング法、キャスト法、スピンコート法等により実施できる。具体的には、光熱変換層１３は、例えば、前記色素構造含有ポリマーを含む原料液、または前記色素構造含有ポリマーを溶剤に溶解させた原料液を、スピンコート法、キャスト法等により容器１２の内部、より具体的には、容器１２の底面１２ａと接触させるように導入し、硬化することにより形成できる。前記溶剤は、例えば、１，２−ジクロロエタン、メタノール等の有機溶剤があげられる。
【００４４】
つぎに、本実施形態の製造方法は、図４（Ｃ）に示すように、光熱変換層１３上に、前記細胞培養基材を含む細胞培養基材層１１を形成する（基材層形成工程）。これにより、本実施形態の製造方法は、細胞培養基材層１１および光熱変換層１３を有する容器１２を準備できる。本実施形態の製造方法において、細胞培養基材層１１の形成に用いる細胞培養基材は、未変性の状態の細胞培養基材である。また、前記細胞培養基材は、未変性の状態において、前記細胞と接着可能である。このため、図４（Ｃ）に示すように、形成後の細胞培養基材層１１は、細胞接着領域１１ａから構成される。細胞培養基材層１１は、例えば、公知の膜形成方法により形成でき、具体例として、塗布法、印刷法（スクリーン法）、蒸着法、スパッタリング法、キャスト法、スピンコート法等により実施できる。前記細胞培養基材がタンパク質等の生体高分子の場合、細胞培養基材層１１の形成方法は、前記細胞培養基材の変性を抑制できることから、塗布法が好ましい。この場合、細胞培養基材層１１は、例えば、未変性の細胞培養基材を含む溶媒を容器１２の内部に導入し、静置することに形成してもよい。前記溶媒は、例えば、水性溶媒があげられ、好ましくは、水である。前記未変性の細胞培養基材を含む溶媒の静置時間および静置時の温度等は、前記実施形態１の説明を援用できる。そして、前記静置後、前記基材層形成工程では、前記未変性の細胞培養基材を含む溶媒を除去する。前記溶媒の除去後、容器１２は、その内部を、前記細胞培養基材を含まない溶媒で洗浄してもよい。
【００４５】
つぎに、本実施形態の製造方法は、図４（Ｄ）に示すように、細胞培養基材層１１および光熱変換層１３を有する容器１２（細胞培養器具）に光Ｌを照射し、前記細胞培養基材を変性させ、細胞接着阻害領域１１ｂを形成する（阻害領域形成工程）。具体的には、前記阻害領域形成工程では、光熱変換層１３に光Ｌを照射する、より具体的には、光熱変換層１３に合焦した状態で光Ｌを照射する。光熱変換層１３は、前述のように、光を熱に変換する光熱変換分子を含む。このため、光Ｌを照射された光熱変換層１３は、照射された光Ｌが含む光エネルギーを熱エネルギーに変換する。すると、光熱変換層１３において、光Ｌが照射された領域の温度上昇が生じ、さらに、細胞培養基材層１１における、光Ｌが照射された領域と隣接する領域の温度が上昇し、細胞培養基材層１１における前記細胞培養基材の構造が変化する。これにより、前記阻害領域形成工程では、前記細胞培養基材を変性させ、細胞接着阻害領域１１ｂを形成する。光Ｌは、光熱変換層１３に焦点があうように制御されることが好ましい。前記阻害領域形成工程において、細胞培養基材層１１上には、前記溶媒が存在することが好ましい。本実施形態の製造方法において、前記細胞培養基材は、例えば、未変性の状態において、前記細胞と接着可能である。このため、光Ｌは、細胞接着阻害領域１１ｂを形成する領域と対応（隣接）する光熱変換層１３の領域に対して照射される。より具体的には、光Ｌは、図４（Ｄ）において、細胞接着阻害領域１１ｂを形成する領域の直下に存在する、光熱変換層１３の対応する領域に対して照射される。
【００４６】
光Ｌの波長は、光熱変換層１３が含む光熱変換分子の吸収波長に応じて適宜設定できる。光Ｌの波長は、例えば、前記紫外光、前記可視光、または前記赤外光である。具体例として、前記式（１）のポリマーの場合、光Ｌの波長は、例えば、３９０〜４２０ｎｍである。前記光は、細胞接着阻害領域１１ｂを精密に形成できることから、レーザ光が好ましい。光Ｌのスポット径（ビーム幅）は、例えば、光Ｌのエネルギー量に応じて適宜設定でき、光Ｌのエネルギー量が相対的に少ない場合、スポット径は、相対的に小さく設定し、光Ｌのエネルギー量が相対的に多い場合、スポット径は、相対的に大きく設定する。光Ｌのスポット径は、例えば、１０〜２００μｍである。光Ｌのエネルギー量（出力）は、例えば、光熱変換層１３における光Ｌの照射部と対応（隣接）する細胞培養基材層１１の細胞培養基材が変性するエネルギー量であり、前記細胞培養基材の種類および前記光熱変換分子の種類に応じて、適宜設定できる。光Ｌのエネルギー量は、細胞培養基材層１１に積層する細胞が致死する温度が好ましく、具体例として、細胞培養基材層１１における光Ｌの照射部の細胞培養基材の温度が、５０℃以上、６０℃以上、７０℃以上、８０℃以上、９０℃以上、好ましくは、１００℃以上、１１０℃以上、１２０℃以上となるエネルギー量である。前記温度の上限は、例えば、２００℃である。前記阻害領域形成工程では、光熱変換層１３の温度が、例えば、前記細胞培養基材の温度の例示となるように、光Ｌを照射してもよい。光Ｌの走査速度は、例えば、スポット径および光Ｌのエネルギー量に応じて適宜設定でき、スポット径の単位面積当たり光エネルギー量が相対的に低い場合、光Ｌの走査速度は相対的に遅く設定し、スポット径の単位面積当たり光エネルギー量が相対的に高い場合、光Ｌの走査速度は相対的に速く設定する。具体例として、光Ｌの走査速度は、例えば、１００ｍｍ／秒以下である。光Ｌが可視光レーザ（４０５ｎｍ）であり、スポット径が４５μｍであり、光Ｌの走査速度が、８０ｍｍ／秒である場合、光Ｌのエネルギー量は、約０．５Ｗ（０．３〜０．７Ｗ）である。
【００４７】
そして、本実施形態の製造方法は、図４（Ｅ）に示すように、培養器具２００が製造される。本実施形態の製造方法において、前記細胞培養基材は、未変性の状態において、前記細胞と接着可能であるため、前記阻害領域形成工程では、光Ｌを、細胞接着阻害領域１１ｂを形成する領域と隣接する光熱変換層１３に対して照射される。ただし、本発明はこれに限定されず、前記阻害領域形成工程では、光Ｌは、細胞接着領域１１ａを形成する領域と隣接する光熱変換層１３に対して照射されてもよい。この場合は、前記細胞培養基材は、変性状態において、前記細胞と接着可能である。
【００４８】
本実施形態では、光熱変換層１３を利用して、効率よく光エネルギーを熱エネルギーに変換できる。このため、本実施形態では、細胞培養基材層１１において、光熱変換層１３の光Ｌが照射された領域と隣接する領域の細胞培養基材を効率よく変性できる。このため、本実施形態によれば、本実施形態の培養器具２００を効率よく製造できる。
【００４９】
（実施形態３）
本実施形態は、細胞培養器具および細胞培養器具の製造方法の他の例である。図５は、実施形態３の培養器具３００の構成を示す模式図であり、（Ａ）は、培養器具３００の模式斜視図であり、（Ｂ）は、（Ａ）におけるII−II方向からみた培養器具３００の模式断面図であり、（Ｃ）は、培養器具３００の平面図である。図５に示すように、培養器具３００は、実施形態２の培養器具２００の構成において、光熱変換層１３が底面１２ａの一部に形成されている。また、培養器具３００は、細胞接着領域１１ａの一部が、底面１２ａと接触している。この点を除き、実施形態３の培養器具３００の構成は、実施形態２の培養器具２００の構成と同様であり、その説明を援用できる。
【００５０】
つぎに、培養器具３００の製造方法について、図６に基づき説明する。図６は、培養器具３００の製造方法の一例を示す模式図である。本実施形態の培養器具３００の製造方法では、容器１２の底面１２ａの一部と接触するように、光熱変換層１３を形成する。つぎに、光熱変換層１３上および光熱変換層１３が形成されていない底面１２ａ上に未変性の細胞培養基材を用いて、細胞培養基材層１１を形成する。そして、本実施形態の製造方法では、光熱変換層１３に対して、光を照射することで、光熱変換層１３により光が熱に変換する。このため、本実施形態の製造方法では、光熱変換層１３において発生した熱により、熱が発生した領域と隣接する細胞培養基材層１１における細胞培養基材が変性し、細胞接着阻害領域１１ｂが形成される。
【００５１】
まず、本実施形態の製造方法は、図６（Ａ）に示すように、容器１２を準備する（準備工程）。容器１２は、前述のように、市販品を購入してもよいし、自家調製してもよい。
【００５２】
つぎに、本実施形態の製造方法は、図６（Ｂ）に示すように、容器１２の底面１２ａ上に、前記光熱変換分子を含む光熱変換層１３を形成する（変換層形成工程）。本実施形態の製造方法では、底面１２ａの全面に光熱変換層１３を形成せず、底面１２ａの一部に光熱変換層１３を形成する。前記光熱変換層１３を形成する領域は、所望の領域とでき、具体的には、細胞接着領域１１ａの形状に応じて適宜設計できる。具体例として、前記光熱変換層１３を形成する領域は、例えば、細胞接着領域１１ａでない領域、すなわち、細胞接着阻害領域１１ｂと略同形状となるように設計できる。このように、前記光熱変換層１３を形成する領域を細胞接着阻害領域１１ｂと略同形状となるように設計することで、例えば、後述の阻害領域形成工程において、容器１２の底面１２ｂ全面に対して光Ｌを照射することにより、細胞接着阻害領域１１ｂを一度で形成できる。このため、本実施形態の製造方法によれば、本実施形態の培養器具３００を短時間で製造できる。光熱変換層１３の形成方法は、実施形態２における変換層形成工程の説明を援用できる。
【００５３】
つぎに、本実施形態の製造方法は、図６（Ｃ）に示すように、光熱変換層１３上および底面１２ａ上に、実施形態２における基材層形成工程と同様にして、前記細胞培養基材を含む細胞培養基材層１１を形成する（基材層形成工程）。これにより、本実施形態の製造方法は、細胞培養基材層１１および光熱変換層１３を有する容器１２を準備できる。
【００５４】
つぎに、本実施形態の製造方法は、図６（Ｄ）に示すように、細胞培養基材層１１および光熱変換層１３を有する容器１２（細胞培養器具）に光Ｌを照射し、前記細胞培養基材を変性させ、細胞接着阻害領域１１ｂを形成する（阻害領域形成工程）。具体的には、前記阻害領域形成工程では、光熱変換層１３に光Ｌを照射する、より具体的には、光熱変換層１３に合焦した状態で光Ｌを照射する。光熱変換層１３は、前述のように、光を熱に変換する光熱変換分子を含む。このため、光Ｌを照射された光熱変換層１３は、照射された光Ｌが含む光エネルギーを熱エネルギーに変換する。すると、光熱変換層１３において、光Ｌが照射された領域の温度上昇が生じ、さらに、細胞培養基材層１１における、光Ｌが照射された領域と隣接する領域の温度が上昇し、細胞培養基材層１１における前記細胞培養基材の構造が変化する。これにより、前記阻害領域形成工程では、前記細胞培養基材を変性させ、細胞接着阻害領域１１ｂを形成する。前記阻害領域形成工程において、細胞培養基材層１１上には、前記溶媒が存在することが好ましい。本実施形態の製造方法において、光熱変換層１３は、細胞接着阻害領域１１ｂを形成する領域と対応（隣接）するように形成されている。このため、本実施形態の製造方法において、光Ｌは、底面１２ａの全面に一度に照射してもよいし、底面１２ａの一部に照射し、照射領域を変更することにより、底面１２ａの全面を照射してもよいが、本実施形態の培養器具３００を短時間で製造できることから、前者が好ましい。光Ｌの照射条件は、前記実施形態２における光Ｌの照射条件の説明を援用できる。
【００５５】
そして、本実施形態の製造方法は、図６（Ｅ）に示すように、培養器具３００が製造される。本実施形態の製造方法において、前記細胞培養基材は、未変性の状態において、前記細胞と接着可能であるため、前記阻害領域形成工程では、光Ｌを、細胞接着阻害領域１１ｂを形成する領域と隣接する光熱変換層１３に対して照射される。ただし、本発明はこれに限定されず、細胞接着領域１１ａを形成する領域と隣接するように光熱変換層１３を形成し、前記阻害領域形成工程では、光Ｌは、細胞接着領域１１ａを形成する領域と隣接する光熱変換層１３に対して照射されてもよい。この場合は、前記細胞培養基材は、変性状態において、前記細胞と接着可能である。
【００５６】
本実施形態では、光熱変換層１３の形成領域を利用して、予め細胞接着阻害領域１１ｂの形成領域を規定できる。このため、本実施形態では、阻害領域形成工程において、光Ｌを底面１２ａの全面に照射し、細胞接着阻害領域１１ｂを一度に形成できる。このため、本実施形態によれば、本実施形態の培養器具３００を短時間で製造できる。
【００５７】
（実施形態４）
本実施形態は、細胞培養器具および細胞培養器具の製造方法の他の例である。図７は、実施形態４の培養器具４００の構成を示す模式図であり、（Ａ）は、培養器具４００の模式斜視図であり、（Ｂ）は、（Ａ）におけるII−II方向からみた培養器具４００の模式断面図であり、（Ｃ）は、培養器具４００の平面図である。図７に示すように、培養器具４００は、実施形態２の培養器具２００の構成において、光熱変換層１３と、細胞培養基材層１１との間に、遮断層１４が形成されている。この点を除き、実施形態４の培養器具４００の構成は、実施形態２の培養器具２００の構成と同様であり、その説明を援用できる。実施形態４の培養器具４００では、光熱変換層１３上に、遮断層１４が積層されているため、細胞培養基材層１１上で培養されている細胞と光熱変換層１３との間には、遮断層１４が介在する。このため、実施形態４の培養器具４００によれば、光熱変換層１３と細胞との接触を回避可能であり、これにより、例えば、光熱変換層１３の形成に用いた溶剤または光熱変換ポリマーに未結合の側鎖（例えば、前述の色素構造等）もしくは未重合のモノマーの細胞に対する影響を抑制できる。
【００５８】
遮断層１４は、細胞培養基材層１１と光変換層１３との接触を遮断する。遮断層１４は、細胞培養基材層１１と光変換層１３との接触を遮断または遮蔽可能であるため、遮蔽層または隔離層ということもできる。また、遮断層１４は、光熱変換層１３を容器１２との空間に封止するため、封止層ということもできる。さらに、遮断層１４は、光熱変換層１３で生じた熱を細胞培養基材層１１に伝導可能であるため、熱伝導層ということもできる。
【００５９】
本実施形態の培養器具４００において、光熱変換層１３で生じた熱は、遮断層１４を介して、細胞培養基材層１１に伝導される。このため、遮断層１４は、細胞培養基材層１１と光熱変換層１３とを熱的に接続している。前記熱的な接続は、例えば、遮断層１４の厚みを調整することにより実施してもよいし、遮断層１４に、金属等の熱伝導率の高い分子を含有させることにより実施してもよい。
【００６０】
遮断層１４は、例えば、容器１２を形成する材料と同様の材料から形成できる。具体例として、遮断層１４は、例えば、ポリスチレン等のポリスチレン系ポリマー、ポリメチルペンテン、ポリカーボネート等のポリカーボネート系ポリマー、ＰＥＴ、ポリプロピレン等のポリプロピレン系ポリマー、シクロオレフィンポリマー、ポリイミド等のポリイミド系ポリマー等のプラスチック；ガラス；石英；シリコーン樹脂；セルロース系材料；等から形成できる。
【００６１】
遮断層１４の表面は、例えば、細胞培養基材層１１との接着性を向上するための処理を行なってもよい。前記処理は、例えば、遮断層１４の細胞培養領域側表面を親水化する処理があげられる。具体例として、前記処理は、例えば、プラズマ処理等があげられる。
【００６２】
つぎに、培養器具４００の製造方法について、図８に基づき説明する。図８は、培養器具４００の製造方法の一例を示す模式図である。本実施形態の培養器具４００の製造方法では、遮断層１４に、光熱変換層１３を形成する（変換層形成工程）。つぎに、本実施形態の培養器具４００の製造方法では、光熱変換層１３および遮断層１４を備える容器１２を形成する（容器形成工程）。さらに、本実施形態の製造方法では、遮断層１４上に、未変性の細胞培養基材を用いて、細胞培養基材層１１を形成する（基材層形成工程）。そして、本実施形態の製造方法では、光熱変換層１３に対して、光を照射することで、光熱変換層１３により光が熱に変換される。このため、本実施形態の製造方法では、光熱変換層１３において発生した熱が、遮断層１４を伝導し、熱が発生した領域と隣接する細胞培養基材層１１における細胞培養基材が変性し、細胞接着阻害領域１１ｂが形成される。
【００６３】
まず、本実施形態の製造方法は、図８（Ａ）に示すように、遮断層１４を準備する（遮断層準備工程）。遮断層１４は、市販品を購入してもよいし、自家調製してもよい。遮断層１４は、例えば、フィルム、基板等を使用することができる。
【００６４】
つぎに、本実施形態の製造方法は、図８（Ｂ）に示すように、遮断層１４の一面に、前記光熱変換分子を含む光熱変換層１３を形成する（変換層形成工程）。光熱変換層１３は、例えば、公知の膜形成方法により形成でき、具体例として、塗布法、印刷法（スクリーン法）、蒸着法、スパッタリング法、キャスト法、スピンコート法等により実施できる。具体的には、光熱変換層１３は、例えば、前記色素構造含有ポリマーを含む原料液、または前記色素構造含有ポリマーを溶剤に溶解させた原料液を、スピンコート法、キャスト法等により遮断層１４と接触させ、硬化することにより形成できる。前記溶剤は、例えば、１，２−ジクロロエタン、メタノール等の有機溶剤があげられる。
【００６５】
さらに、本実施形態の培養器具は、図８（Ｃ）に示すように、光熱変換層１３および遮断層１４を備える容器１２を形成する（容器形成工程）。前記容器形成工程は、例えば、容器１２の底面に、光熱変換層１３および遮断層１４の積層体を配置することにより実施してもよいし、光熱変換層１３および遮断層１４の積層体を用いて、フィルムインサート成型等の射出成型を用いて容器１２を成型することにより実施してもよい。
【００６６】
つぎに、本実施形態の製造方法は、図８（Ｄ）に示すように、遮断層１４上に、前記細胞培養基材を含む細胞培養基材層１１を形成する（基材層形成工程）。これにより、本実施形態の製造方法は、細胞培養基材層１１、光熱変換層１３、および遮断層１４を有する容器１２を準備できる。本実施形態の製造方法において、細胞培養基材層１１の形成に用いる細胞培養基材は、未変性の状態の細胞培養基材である。また、前記細胞培養基材は、未変性の状態において、前記細胞と接着可能である。このため、図８（Ｄ）に示すように、形成後の細胞培養基材層１１は、細胞接着領域１１ａから構成される。細胞培養基材層１１は、例えば、公知の膜形成方法により形成でき、具体例として、塗布法、印刷法（スクリーン法）、蒸着法、スパッタリング法、キャスト法、スピンコート法等により実施できる。前記細胞培養基材がタンパク質等の生体高分子の場合、細胞培養基材層１１の形成方法は、前記細胞培養基材の変性を抑制できることから、塗布法が好ましい。この場合、細胞培養基材層１１は、例えば、未変性の細胞培養基材を含む溶媒を容器１２の内部に導入し、静置することに形成してもよい。前記溶媒は、例えば、水性溶媒があげられ、好ましくは、水である。前記未変性の細胞培養基材を含む溶媒の静置時間および静置時の温度等は、前記実施形態１の説明を援用できる。そして、前記静置後、前記基材層形成工程では、前記未変性の細胞培養基材を含む溶媒を除去する。前記溶媒の除去後、容器１２は、その内部を、前記細胞培養基材を含まない溶媒で洗浄してもよい。
【００６７】
つぎに、本実施形態の製造方法は、図８（Ｅ）に示すように、細胞培養基材層１１、光熱変換層１３、および遮断層１４を有する容器１２（細胞培養器具）に光Ｌを照射し、前記細胞培養基材を変性させ、細胞接着阻害領域１１ｂを形成する（阻害領域形成工程）。具体的には、前記阻害領域形成工程では、光熱変換層１３に光Ｌを照射する、より具体的には、光熱変換層１３に合焦した状態で光Ｌを照射する。光熱変換層１３は、前述のように、光を熱に変換する光熱変換分子を含む。このため、光Ｌを照射された光熱変換層１３は、照射された光Ｌが含む光エネルギーを熱エネルギーに変換する。すると、光熱変換層１３において、光Ｌが照射された領域の温度上昇が生じ、さらに、遮断層１４における光Ｌが照射された領域と隣接する領域の温度上昇が生じる。そして、細胞培養基材層１１における、遮断層１４の温度上昇が生じている領域と隣接する領域の温度上昇が生じ、細胞培養基材層１１における前記細胞培養基材の構造が変化する。これにより、前記阻害領域形成工程では、前記細胞培養基材を変性させ、細胞接着阻害領域１１ｂを形成する。光Ｌは、光熱変換層１３に焦点があうように制御されることが好ましい。前記阻害領域形成工程において、細胞培養基材層１１上には、前記溶媒が存在することが好ましい。本実施形態の製造方法において、前記細胞培養基材は、例えば、未変性の状態において、前記細胞と接着可能である。このため、光Ｌは、細胞接着阻害領域１１ｂを形成する領域と対応する（直下の）光熱変換層１３の領域に対して照射される。より具体的には、光Ｌは、図８（Ｅ）において、細胞接着阻害領域１１ｂを形成する領域の直下に存在する、光熱変換層１３の対応する領域に対して照射される。
【００６８】
そして、本実施形態の製造方法は、図８（Ｆ）に示すように、培養器具４００が製造される。本実施形態の製造方法において、前記細胞培養基材は、未変性の状態において、前記細胞と接着可能であるため、前記阻害領域形成工程では、光Ｌを、細胞接着阻害領域１１ｂを形成する領域と対応する光熱変換層１３に対して照射される。ただし、本発明はこれに限定されず、前記阻害領域形成工程では、光Ｌは、細胞接着領域１１ａを形成する領域と対応する（直下の）光熱変換層１３に対して照射されてもよい。この場合は、前記細胞培養基材は、変性状態において、前記細胞と接着可能である。
【００６９】
本実施形態の培養器具４００では、遮断層１４を足場として、光熱変換層１３を形成しているが、本実施形態の培養器具４００は、これに限定されず、他の足場層に対して、光熱変換層１３を形成してもよい。図９に、光熱変換層１３を他の足場層である支持体層１５に形成する他の例を示す。図９は、実施形態４の他の例の培養器具５００の構成を示す模式図であり、（Ａ）は、培養器具５００の模式斜視図であり、（Ｂ）は、（Ａ）におけるII−II方向からみた培養器具５００の模式断面図であり、（Ｃ）は、培養器具５００の平面図である。図９に示すように、培養器具５００は、実施形態４の培養器具４００の構成において、光熱変換層１３と、底面１２ａとの間に、支持体層１５が形成されている。この点を除き、他の例の培養器具５００の構成は、実施形態４の培養器具４００の構成と同様であり、その説明を援用できる。
【００７０】
支持体層１５は、光熱変換層１３を形成する足場となる層であり、例えば、基材または基材層ということもできる。支持体層１５は、光熱変換層１３を形成可能な支持体であればよく、例えば、シート状または板状の支持体があげられる。具体例として、支持体層１５は、ポリスチレン等のポリスチレン系ポリマー、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリイミド等のポリイミド系ポリマー、ポリカーボネート等のポリカーボネート系ポリマー、もしくはポリオレフィン等のポリオレフィン系ポリマー等の樹脂製フィルム、薄膜、またはプレート；ガラス基板等の板状またはフィルム状のガラス；等があげられる。前記ガラス製の支持体としては、例えば、スライドグラス、プレパラート等を用いてもよい。
【実施例】
【００７１】
次に、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、下記実施例により制限されない。市販の試薬は、特に示さない限り、それらのプロトコルに基づいて使用した。
【００７２】
［実施例１］
本発明の製造方法により、本発明の細胞培養器具を製造できること、および本発明の細胞培養器具を用いて、培養後の細胞塊の形状および大きさを制御できることを確認した。
【００７３】
３５ｍｍ（直径）ディッシュ（ＩＷＡＫＩ社製、Cat. No.: 3000-035）を用いて、図３と類似する培養器具２００を製造した。まず、前記式（１）で表されるポリマーにおいて、側鎖の色素構造を修飾したポリマーを、１，２−ジクロロエタン、メタノール等に溶解し、原料液を調製した。得られた原料液を、前記ディッシュにスピンコート法により塗布することにより、光熱変換層１３を形成した。
【００７４】
つぎに、光熱変換層１３を有するディッシュに対して、０．２μＬのｉＭａｔｒｉｘ（株式会社ニッピ社製）を、１．５ｍＬのＰＢＳに希釈した希釈液を用い、添付のプロトコルにしたがって、細胞培養基材層１１を形成した。なお、ｉＭａｔｒｉｘは、未変性の状態で、細胞と接着可能なラミニン511-E8を含む。このため、細胞培養基材層１１は、細胞接着領域１１ａから構成されている。
【００７５】
得られたディッシュの光熱変換層１３に焦点をあわせ、細胞処理装置（LiLACK、型式  CPD-017、片岡製作所製）を用いて、下記レーザ光照射条件１でレーザ光を照射した。これにより、ラミニン511-E8を変性させ、細胞接着領域１１ａを細胞接着阻害領域１１ｂに変換することにより、図１０に示すように、略円状または略正方形状の細胞接着領域１１ａを形成した。また、各細胞接着領域１１ａは、左から、直径１ｍｍの略円状、一辺１ｍｍの略正方形状、直径３ｍｍの略円状、および一辺３ｍｍの略正方形状とした。照射中のレーザ出力は、パワーメータを用いて測定した。
【００７６】
（レーザ光照射条件１）
波長：４０５ｎｍ
レーザ出力：０．５Ｗ
レーザの走査速度：８０ｍｍ／秒
スポット径：４５μｍ
【００７７】
前記レーザ光照射後、ディッシュに、培養液に懸濁したｉＰＳ細胞（１２３１Ａ３株）を、３５ｍｍ（直径）ディシュにおいて、１×１０４細胞／１．５ｍＬ懸濁液／Dishとなるように播種した。前記培養液は、Stemfit（登録商標）AK02（味の素社製）を使用した。そして、３７℃、５％ＣＯ２の湿潤条件下で、７日間培養した。前記培養液は、２日毎に、等量の新たな培養液と交換した。そして、培養後のディッシュについて、その全面を、前記細胞処理装置の位相差顕微鏡を用いてタイリング撮影し、ディッシュ全面の画像を作製した。また、図１０に示す細胞接着領域１１ａのパターンに代えて、細胞接着領域１１ａの形状が文字列（ｉＰＳ）となるようにした以外は、同様にして培養およびディッシュ全面の画像を作製した。これらの結果を図１１および１２に示す。
【００７８】
図１１は、図１０に示すパターンでレーザ光処理を行なったディッシュにおける培養後のｉＰＳ細胞の写真であり、（Ａ）は、ディッシュ全面の写真であり、（Ｂ）は、（Ａ）において、各細胞接着領域１１ａが、直径１ｍｍの略円状の場合の写真であり、（Ｃ）は、（Ａ）において、各細胞接着領域１１ａが、一辺１ｍｍの略正方形状の場合の写真である。図１１（Ａ）〜（Ｃ）において、矢印で示すように、略円状および略正方形状のいずれの形状においても、培養後のｉＰＳ細胞の外縁の形状は、培養前の細胞接着領域１１ａの外縁形状と一致した。また、図１１（Ａ）〜（Ｃ）において、矢印に示すように、細胞接着領域１１ａの大きさによらず、培養後のｉＰＳ細胞の外縁の形状は、培養前の細胞接着領域１１ａの外縁形状と一致した。
【００７９】
つぎに、細胞接着領域１１ａの形状が文字列（ｉＰＳ）となるようにした場合の結果を示す。図１２は、細胞接着領域１１ａの形状が文字列（ｉＰＳ）となるようにレーザ光処理を行なったディッシュにおける培養後のｉＰＳ細胞の写真である。図１２に示すように、培養後のｉＰＳ細胞の外縁の形状は、培養前の細胞接着領域１１ａの形状（文字列：ｉＰＳ）と一致した。
【００８０】
これらの結果から、本発明の製造方法により、本発明の細胞培養器具を製造できること、および本発明の細胞培養器具を用いて、培養後の細胞塊の形状および大きさを制御できることがわかった。
【００８１】
［実施例２］
本発明の製造方法において、光照射時の光熱変換層１３の温度を確認した。
【００８２】
前記実施例１と同様にして、光熱変換層１３および細胞培養基材層１１を有するディッシュを製造した。つぎに、得られたディッシュに対し、前記細胞処理装置を用いて、下記レーザ光照射条件２でレーザ光を照射した。なお、下記レーザ光照射条件２は、別途、レーザ光照射後に細胞が細胞培養基材層１１に接着できず、細胞接着時に照射した場合、照射箇所の細胞が致死することを確認している条件である。また、前記レーザ照射時に、光熱変換層１３におけるレーザ光の照射部の温度を、赤外線サーモグラフィーカメラ（InfReC H9000、日本アビオニクス製）および５μｍ顕微鏡レンズを用いて測定した（実施例）。赤外線サーモグラフィーカメラの測定波長は、２〜５．７μｍ、フレームレートは、２００Ｈｚ、シャッタースピードは、２１５μ秒とした。なお、レーザ光照射前の光熱変換層１３の温度は、約２９℃であった。また、コントロールは、光熱変換層１３および細胞培養基材層１１を形成せず、ディッシュ底面の温度を測定した以外は同様にして実施した。これらの結果を図１３に示す。
【００８３】
（レーザ光照射条件２）
波長：４０５ｎｍ
レーザ出力：０．３、０．４、０．５、０．６、または０．７Ｗ
レーザの走査速度：８０ｍｍ／秒
スポット径：４５μｍ
【００８４】
図１３は、光熱変換層１３におけるレーザ光の照射部の温度を示す写真である。図１３（Ａ）は、実施例の結果を示し、図１３（Ｂ）は、コントロールの結果を示す。また、図１３（Ａ）において、上段は、測定データのうち、３７℃以上の領域を示した写真であり、下段は、４２℃以上の領域を示した写真である。図１３（Ｂ）に示すように、光熱変換層１３を有さないディッシュの場合、ディッシュ底面の温度の上昇は生じなかった。他方、光熱変換層１３を有するディッシュの場合、レーザ照射により光熱変換層１３の温度が、レーザ出力依存的に上昇し、０．５Ｗ以上の出力において、照射部の最高温度は、１４０℃前後となった。さらに、光熱変換層１３におけるレーザ光の照射部の温度分布およびレーザ光照射後に細胞が接着可能な領域から、光熱変換層１３におけるレーザ光の照射部の温度が６０℃以上、好ましくは、１００℃または１１０℃となるように、レーザ光を照射することにより、細胞培養基材層１１における細胞培養基材を効率よく変性できることが分かった。
【００８５】
［実施例３］
本発明の製造方法により、本発明の細胞培養器具を製造できること、および本発明の細胞培養器具を用いて、培養後の細胞塊の形状および大きさを制御できることを確認した。
【００８６】
３５ｍｍ（直径）ディッシュを用いて、図１と類似する培養器具１００を製造した。具体的には、実施例１と同様にして、ｉＭａｔｒｉｘの希釈液を調製し、細胞培養基材層１１を形成した。
【００８７】
得られたディッシュの細胞基材層１１に焦点をあわせ、前記細胞処理装置を用いて、下記レーザ光照射条件３でレーザ光を照射した。これにより、ラミニン511-E8を変性させ、細胞接着領域１１ａを細胞接着阻害領域１１ｂに変換することにより、直径１ｍｍの略円状または一辺１ｍｍの略正方形状の細胞接着領域１１ａを形成した。また、照射中のレーザ出力は、パワーメータを用いて測定した。
【００８８】
（レーザ光照射条件３）
波長：１４５０ｎｍ
レーザ出力：０．６Ｗ
レーザの走査速度：５ｍｍ／秒以下
スポット径：７５μm
【００８９】
前記レーザ光照射後、ディッシュに、培養液に懸濁したｉＰＳ細胞（１２３１Ａ３株）を、３５ｍｍ（直径）ディシュにおいて、１×１０４細胞／１．５ｍＬ懸濁液／Dishとなるように播種した。前記培養液は、Stemfit（登録商標）AK02（味の素社製）を使用した。そして、３７℃、５％ＣＯ２の湿潤条件下で、１０日間培養した。前記培養液は、２日毎に、等量の新たな培養液と交換した。そして、培養後のディッシュについて、その全面を、前記細胞処理装置の位相差顕微鏡を用いて、細胞接着領域１１ａを撮像した。これらの結果を図１４に示す。
【００９０】
図１４は、培養後のｉＰＳ細胞の写真であり、（Ａ）は、直径１ｍｍの略円状の細胞接着領域１１ａの写真であり、（Ｂ）は、一辺１ｍｍの略正方形状の細胞接着領域１１ａの写真である。図１４（Ａ）および（Ｂ）において、略円状および略正方形状のいずれの形状においても、培養後のｉＰＳ細胞の接着面の外縁の形状は、培養前の細胞接着領域１１ａの外縁形状と一致した。また、図１４（Ａ）において矢印で示すように、一部のｉＰＳ細胞は、細胞接着領域１１ａの外縁部（破線）からはみ出し、かつめくれ上がっており、細胞接着阻害領域１１ｂには接着していなかった。
【００９１】
これらの結果から、本発明の製造方法により、本発明の細胞培養器具を製造できること、および本発明の細胞培養器具を用いて、培養後の細胞塊の形状および大きさを制御できることがわかった。
【００９２】
［実施例４］
本発明の製造方法により、本発明の細胞培養器具を製造できること、および本発明の細胞培養器具を用いて、培養後の細胞塊の形状および大きさを制御できることを確認した。
【００９３】
３５ｍｍ（直径）ディッシュを用いて、図３と類似する培養器具２００を前記実施例１と同様にして製造した。具体的には、実施例１と同様にして、光熱変換層１３を形成後、ｉＭａｔｒｉｘの希釈液を調製し、細胞培養基材層１１を形成した。
【００９４】
得られたディッシュの光熱変換層１３に焦点をあわせ、前記細胞処理装置を用いて、下記レーザ光照射条件４でレーザ光を照射した。これにより、ラミニン511-E8を変性させ、細胞接着領域１１ａを細胞接着阻害領域１１ｂに変換することにより、格子状の細胞接着領域１１ａを形成した。このため、各格子の内部は、細胞接着阻害領域１１ｂである。照射中のレーザ出力は、パワーメータを用いて測定した。
【００９５】
（レーザ光照射条件４）
波長：４０５ｎｍ
レーザ出力：０．５Ｗ
レーザの走査速度：８０ｍｍ／秒
スポット径：４５μｍ
【００９６】
前記レーザ光照射後、ディッシュに、培養液に懸濁したｉＰＳ細胞（１２３１Ａ３株）を、３５ｍｍ（直径）ディシュにおいて、１×１０５細胞／Dishとなるように播種した。前記培養液は、Stemfit（登録商標）AK02（味の素社製）を使用した。そして、３７℃、５％ＣＯ２の湿潤条件下で、１日間培養した。そして、培養後のディッシュについて、その全面を、前記細胞処理装置の位相差顕微鏡を用いてタイリング撮影し、ディッシュ全面の画像を作製した。これらの結果を図１５に示す。
【００９７】
図１５は、培養後のｉＰＳ細胞の写真であり、（Ａ）は、ディッシュ全面の画像の写真であり、（Ｂ）は、（Ａ）において矢印Ｘで示す囲った領域の拡大写真である。図１５（Ａ）および（Ｂ）に示すように、培養後のｉＰＳ細胞の接着面の外縁の形状は、格子状となっており、培養前の細胞接着領域１１ａの外縁形状と一致した。また、図１５（Ａ）および（Ｂ）に示すように、細胞接着阻害領域１１ｂである各格子の内部には細胞はほとんど接着していなかった。
【００９８】
これらの結果から、本発明の製造方法により、本発明の細胞培養器具を製造できること、および本発明の細胞培養器具を用いて、培養後の細胞塊の形状および大きさを制御できることがわかった。
【００９９】
［実施例５］
本発明の製造方法により、本発明の細胞培養器具を製造できること、および本発明の細胞培養器具を用いて、培養後の細胞塊の形状および大きさを制御できることを確認した。
【０１００】
３５ｍｍ（直径）ポリスチレンディッシュ（ＡＧＣテクノグラス社製）を用いて、図３と類似する培養器具２００を前記実施例１と同様にして製造した。具体的には、まず、実施例１と同様にして光熱変換層１３を形成した。つぎに、実施例１のｉＭａｔｒｉｘの希釈液に代えて、Laminin-521（rhLaminin-521、Thermo Fisher Scientific社製、Cat No. A29248）の希釈液を用い、添付のプロトコルにしたがって、０．５μｇ／ｃｍ２となるように希釈液を導入し、細胞培養基材層１１を形成した。なお、Laminin-521の希釈液は、Laminin-521を、カルシウムおよびマグネシウム含有ＤＰＳＢ（Dulbecco's phosphate-buffered saline、DPBS, calcium, magnesium、Thermo Fisher Scientific社製、Cat. No.: 14040141）で希釈し、調製した。
【０１０１】
得られたディッシュの光熱変換層１３に焦点をあわせ、前記細胞処理装置を用いて、下記レーザ光照射条件５で、図１６（Ａ）に示す形状となるようにレーザ光を照射した。これにより、Laminin-521を変性させ、細胞接着領域１１ａを細胞接着阻害領域１１ｂに変換することにより、格子状の細胞接着阻害領域１１ｂを形成した。このため、各格子の内部領域（約０．３ｍｍ×約０．３ｍｍの四角形状の領域）は、細胞接着領域１１ａである。照射中のレーザ出力は、パワーメータを用いて測定した。
【０１０２】
（レーザ光照射条件５）
波長：４０５ｎｍ
レーザ出力：０．５Ｗ
レーザの走査速度：８０ｍｍ／秒
スポット径：４５μｍ
ピッチ：０．３ｍｍ
【０１０３】
前記レーザ光照射後、ディッシュに、培養液に懸濁したｉＰＳ細胞（１２３１Ａ３株）を、３５ｍｍ（直径）ディシュにおいて、１×１０５細胞／１．５ｍＬ懸濁液／Dishとなるように播種した。前記培養液は、Ｅ８培地（Essential 8（商標）培地、Thermo Fisher Scientific社製、Cat. No.: A1517001）を使用した。そして、３７℃、５％ＣＯ２の湿潤条件下で、３日間培養した。前記培養液は、２日毎に、等量の新たな培養液と交換した。そして、培養後のディッシュについて、その全面を、前記細胞処理装置の位相差顕微鏡を用いてタイリング撮影し、ディッシュ全面の画像を作製した。これらの結果を図１６に示す。
【０１０４】
図１６は、細胞処理の結果を示す図であり、（Ａ）は、細胞培養器具におけるレーザ光の照射部を示す模式図であり、（Ｂ）は、培養器具全体の培養後の細胞を示す写真であり、（Ｃ）は、（Ｂ）の写真における培養器具の中心領域の拡大写真である。図１６（Ｂ）および（Ｃ）に示すように、格子状の細胞接着阻害領域１１ｂ上には、ｉＰＳ細胞が、接着していなかった。また、図１６（Ｃ）において矢印で示すように、格子状の細胞接着阻害領域１１ｂの内部の細胞接着領域１１ａ上には、ｉＰＳ細胞が、接着していた。
【０１０５】
これらの結果から、本発明の製造方法により、本発明の細胞培養器具を製造できること、および本発明の細胞培養器具を用いて、培養後の細胞塊の形状および大きさを制御できることがわかった。
【０１０６】
［実施例６］
本発明の製造方法により、本発明の細胞培養器具を製造できること、および本発明の細胞培養器具を用いて、培養後の細胞塊の形状および大きさを制御できることを確認した。
【０１０７】
３５ｍｍ（直径）ポリスチレンディッシュ（ＡＧＣテクノグラス社製）を用いて、図３と類似する培養器具２００を前記実施例１と同様にして製造した。具体的には、実施例１と同様にして、光熱変換層１３を形成した。つぎに、実施例１のｉＭａｔｒｉｘの希釈液に代えて、Matrigelの希釈液を用いて、細胞培養基材層１１を形成した。前記Matrigelの希釈液は、Matrigel（登録商標、Corning（登録商標）マトリゲル 基底膜マトリックス グロースファクター リデュースト、Corning社製、Cat. No.: 35623）を、DMEM培地（4.5g/L Glucose、Nacalai Tesque社製、Cat. No.: 08459-64）で50倍希釈し、調製した。
【０１０８】
得られたディッシュの光熱変換層１３に焦点をあわせ、前記細胞処理装置を用いて、下記レーザ光照射条件６で、図１７（Ａ）に示す形状となるようにレーザ光を照射した。これにより、Matrigel中のラミニンを変性させ、細胞接着領域１１ａを細胞接着阻害領域１１ｂに変換することにより、直線状の細胞接着阻害領域１１ｂを形成した。このため、直線間の領域は、細胞接着領域１１ａである。照射中のレーザ出力は、パワーメータを用いて測定した。
【０１０９】
（レーザ光照射条件６）
波長：４０５ｎｍ
レーザ出力：０．３Ｗ
レーザの走査速度：１０ｍｍ／秒
スポット径：４５μｍ
ピッチ：０．０３ｍｍ
【０１１０】
前記レーザ光照射後、ディッシュに、培養液に懸濁したｉＰＳ細胞（１２３１Ａ３株）を、３５ｍｍ（直径）ディシュにおいて、５×１０４細胞／１．５ｍＬ懸濁液／Dishとなるように播種した。前記培養液は、mTeSR（商標） Plus（STEMCELL technolocies社製、Cat. No.: 05825）を使用した。そして、３７℃、５％ＣＯ２の湿潤条件下で、７日間培養した。前記培養液は、２日毎に、等量の新たな培養液と交換した。そして、培養後のディッシュについて、その全面を、前記細胞処理装置の位相差顕微鏡を用いてタイリング撮影し、ディッシュ全面の画像を作製した。これらの結果を図１７に示す。
【０１１１】
図１７は、細胞処理の結果を示す図であり、（Ａ）は、細胞培養器具におけるレーザ光の照射部を示す模式図であり、（Ｂ）は、培養後の細胞を示す写真である。図１７（Ｂ）に示すように、直線状の細胞接着阻害領域１１ｂ上には、ｉＰＳ細胞が、接着しておらず、細胞接着領域１１ａ上には、ｉＰＳ細胞が、接着していた。
【０１１２】
これらの結果から、本発明の製造方法により、本発明の細胞培養器具を製造できること、および本発明の細胞培養器具を用いて、培養後の細胞塊の形状および大きさを制御できることがわかった。
【０１１３】
以上、実施形態を参照して本発明を説明したが、本発明は、上記実施形態に限定されるものではない。本発明の構成や詳細には、本発明のスコープ内で当業者が理解しうる様々な変更をすることができる。
【０１１４】
この出願は、２０１８年１０月１日に出願された日本出願特願２０１８−１８６９４０を基礎とする優先権を主張し、その開示のすべてをここに取り込む。
【０１１５】
＜付記＞
上記の実施形態および実施例の一部または全部は、以下の付記のように記載されうるが、以下には限られない。
（付記１）
細胞培養基材を含む細胞培養基材層を有し、
前記細胞培養基材層は、細胞が接着可能な細胞接着領域と、細胞の接着が阻害される細胞接着阻害領域とを有し、
前記細胞接着阻害領域は、前記細胞培養基材の変性物を含む、細胞培養器具。
（付記２）
光を熱に変換可能な光熱変換層を有し、
前記細胞培養基材層は、前記光熱変換層上に配置される、付記１記載の細胞培養器具。
（付記３）
前記細胞培養基材層と前記光変換層との接触を遮断する遮断層を有し、
前記遮断層は、前記光熱変換層上に配置され、
前記細胞培養基材層は、前記遮断層上に配置される、付記２記載の細胞培養器具。
（付記４）
前記光熱変換層は、光を吸収する色素構造を含んだポリマーを含む、付記２または３記載の細胞培養器具。
（付記５）
前記細胞接着領域は、未変性の細胞培養基材を含む、付記１から４のいずれかに記載の細胞培養器具。
（付記６）
前記細胞培養基材は、細胞外基質である、付記１から５のいずれかに記載の細胞培養器具。
（付記７）
前記細胞培養基材は、タンパク質またはそのペプチド断片である、付記１から６のいずれかに記載の細胞培養器具。
（付記８）
前記細胞培養基材は、ラミニンまたはその断片である、付記１から７いずれかに記載の細胞培養器具。
（付記９）
細胞培養基材を含む細胞培養基材層を有する細胞培養器具に光を照射し、前記細胞培養基材を変性させ、細胞接着阻害領域を形成する阻害領域形成工程を含む、細胞培養器具の製造方法。
（付記１０）
前記細胞培養器具は、光を熱に変換可能な光熱変換層を有し、
前記細胞培養基材層は、前記光熱変換層上に配置され、
前記阻害領域形成工程において、前記光熱変換層に前記光を照射する、付記９記載の製造方法。
（付記１１）
前記細胞培養器具は、前記細胞培養基材層と前記光変換層との接触を遮断する遮断層を有し、
前記遮断層は、前記光熱変換層上に配置され、
前記細胞培養基材層は、前記遮断層上に配置される、付記１０記載の製造方法。
（付記１２）
前記光熱変換層は、光を吸収する色素構造を含んだポリマーを含む、付記１０または１１記載の製造方法。
（付記１３）
前記光は、赤外光であり、
前記阻害領域形成工程において、前記細胞培養基材層に前記赤外光を照射する、付記９から１２のいずれかに記載の製造方法。
（付記１４）
前記阻害領域形成工程において、前記細胞培養基材の温度が、５０℃以上となるように、前記光を照射する、付記９から１３のいずれかに記載の製造方法。
（付記１５）
前記阻害領域形成工程前において、前記細胞培養基材は、未変性の細胞培養基材である、付記９から１４のいずれかに記載の製造方法。
（付記１６）
前記光は、レーザ光である、付記９から１５のいずれかに記載の製造方法。
（付記１７）
前記細胞培養基材は、細胞外基質である、付記９から１６のいずれかに記載の製造方法。
（付記１８）
前記細胞培養基材は、タンパク質またはそのペプチド断片である、付記９から１７のいずれかに記載の製造方法。
（付記１９）
前記細胞培養基材は、ラミニンまたはその断片である、付記９から１８いずれかに記載の製造方法。
（付記２０）
細胞培養基材を含む細胞培養基材層を有し、
前記細胞培養基材は、光照射により、細胞との接着性が変化する、細胞培養器具。
（付記２１）
前記細胞培養基材は、光照射により生じた熱により、前記細胞との接着性を変化される、付記２０記載の細胞培養器具。
（付記２２）
前記細胞培養基材は、前記細胞との接着が可能であり、光照射により、前記細胞との接着が阻害される、付記２０または２１記載の細胞培養器具。
（付記２３）
光を熱に変換可能な光熱変換層を有し、
前記細胞培養基材層は、前記光熱変換層上に配置される、付記２０から２２のいずれかに記載の細胞培養器具。
（付記２４）
前記光熱変換層は、光を熱に変換可能な光熱変換分子を含み、
前記光熱変換分子は、前記式（１）で表される、付記２３記載の細胞培養器具。
（付記２５）
前記細胞培養基材層と前記光変換層との接触を遮断する遮断層を有し、
前記遮断層は、前記光熱変換層上に配置され、
前記細胞培養基材層は、前記遮断層上に配置される、付記２３または２４記載の細胞培養器具。
（付記２６）
前記細胞培養基材は、細胞外基質である、付記２０から２５のいずれかに記載の細胞培養器具。
（付記２７）
前記細胞培養基材は、タンパク質またはそのペプチド断片である、付記２０から２６のいずれかに記載の細胞培養器具。
（付記２８）
前記細胞培養基材は、ラミニンまたはその断片である、付記２０から２７いずれかに記載の細胞培養器具。
（付記２９）
細胞培養器具を用いて、細胞を培養する培養工程を含み、
前記細胞培養器具は、付記１から８および２０から２８のいずれかに記載の細胞培養器具である、細胞の培養方法（細胞の製造方法）。
（付記３０）
前記培養工程後、前記細胞を回収する回収工程を含む、付記２９記載の培養方法（細胞の製造方法）。
【産業上の利用可能性】
【０１１６】
本発明の細胞培養器具は、簡易な設備で製造可能であり、かつ培養後に所望の形状を有する細胞塊が取得可能である。このため、本発明は、細胞、組織等の加工を行なう生命科学分野、医療分野等において、極めて有用である。
【符号の説明】
【０１１７】
１００、２００、３００、４００、５００  培養器具
１１            細胞培養基材層
１１ａ          細胞接着領域
１１ｂ          細胞接着阻害領域
１２            容器
１２ａ          底面
１２ｂ          側壁
１３            光熱変換層
１４            遮断層
１５            支持体層
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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