(57)【要約】【課題】  酵素を用いて、鋳型に依存せずに一本鎖DNAを合成する新規な手段を提供する。【解決手段】  鋳型の非存在下、DNAポリメラーゼの存在下で、一本鎖DNAを合成する方法であって、DNAポリメラーゼが、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ以外のDNAポリメラーゼであることを特徴とする一本鎖DNAの合成方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
鋳型の非存在下、DNAポリメラーゼの存在下で、一本鎖DNAを合成する方法であって、DNAポリメラーゼが、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ以外のDNAポリメラーゼであることを特徴とする一本鎖DNAの合成方法。
【請求項２】
DNAポリメラーゼが、Aファミリーに属するDNAポリメラーゼであることを特徴とする請求項１に記載の一本鎖DNAの合成方法。
【請求項３】
DNAポリメラーゼが、5′→3′エキソヌクレアーゼ活性が低いもしくは活性を持たないDNAポリメラーゼであることを特徴とする請求項１又は２に記載の一本鎖DNAの合成方法。
【請求項４】
DNAポリメラーゼが、好熱菌由来のDNAポリメラーゼであることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか一項に記載の一本鎖DNAの合成方法。
【請求項５】
（１）DNAポリメラーゼ、モノ又はオリゴヌクレオチド、及び3′-OHを不活性化したデオキシリボヌクレオチド三リン酸を共存させ、モノ又はオリゴヌクレオチドに、3′-OHを不活性化したデオキシリボヌクレオチドを付加する工程、（２）モノ又はオリゴヌクレオチドに付加したデオキシリボヌクレオチドの3′-OHを活性化する工程、及び（３）モノ又はオリゴヌクレオチドに付加しなかったデオキシリボヌクレオチド三リン酸を除去する工程を含む一本鎖DNAの合成方法であって、DNAポリメラーゼが、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ以外のDNAポリメラーゼであることを特徴とする一本鎖DNAの合成方法。
【請求項６】
DNAポリメラーゼが、Aファミリーに属するDNAポリメラーゼであることを特徴とする請求項５に記載の一本鎖DNAの合成方法。
【請求項７】
DNAポリメラーゼが、5′→3′エキソヌクレアーゼ活性が低いもしくは活性を持たないDNAポリメラーゼであることを特徴とする請求項５又は６に記載の一本鎖DNAの合成方法。
【請求項８】
DNAポリメラーゼが、好熱菌由来のDNAポリメラーゼであることを特徴とする請求項５乃至７のいずれか一項に記載の一本鎖DNAの合成方法。
【請求項９】
3′-OHを不活性化したデオキシリボヌクレオチド三リン酸が、3′-OHを保護基により保護したデオキシリボヌクレオチド三リン酸であることを特徴とする請求項５乃至８のいずれか一項に記載の一本鎖DNAの合成方法。
【請求項１０】
3′-OHを不活性化したデオキシリボヌクレオチド三リン酸が、デオキシリボヌクレオチド三リン酸をDNAポリメラーゼと結合させることにより3′-OHを不活性化したデオキシリボヌクレオチド三リン酸であることを特徴とする請求項５乃至８のいずれか一項に記載の一本鎖DNAの合成方法。
【請求項１１】
モノ又はオリゴヌクレオチドが、固体担体に固定されていることを特徴とする請求項５乃至１０のいずれか一項に記載の一本鎖DNAの合成方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、鋳型の非存在下で、酵素により一本鎖DNAを合成する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ゲノム解読技術がこの20年ほどで急速に発展し、低価格・短時間で実施できるようになり、生物の研究や医学・工学利用において広く用いられるようになった。次の段階として、ゲノム解読で得た情報にもとづいてゲノムを全合成する技術は、現在、国際的な開発競争が繰り広げられている。百万塩基長を超えるゲノムDNAを人工的に作製する際のDNA断片をアセンブルする技術は開発が進んでいるが、DNA断片の元になる一本鎖DNAを合成する技術は有機化学合成に依存しており、この数十年のあいだ大きな進展がみられない。百から二百塩基長程度の一本鎖DNAを合成するのが限界であり、コストが高く、合成の正確性も不十分という問題を抱えているため、低価格・短時間で実施できるゲノム全合成を実現する上で大きな障壁となっている。
【０００３】
上記の問題を克服するために、酵素を利用した一本鎖DNA合成も検討されてきたが、一般に、DNAポリメラーゼは鋳型に依存せずにDNAを合成する能力を持たないと考えられてきた。
【０００４】
ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（terminal deoxynucleotidyl transferase、以下、「TdT」と略す場合がある。）と呼ばれるDNAポリメラーゼのXファミリーに分類される特殊な酵素については、鋳型に依存せずにプライマーへヌクレオチドを連結して一本鎖DNAを合成することが知られており、主にこの酵素を用いた研究が数十年にわたり行われてきた（非特許文献１及び非特許文献２）
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Michael A. Jensen and Ronald W. Davis, Biochemistry 2018, 57, 1821-1832
【非特許文献２】Sebastian Palluk et al., Nature Biotechnology 2018, 36(7), 645-650
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記のように、TdTを用いた研究が以前から行われてきたが、未だに実用的な一本鎖DNAの合成は実現されていない。
【０００７】
本発明は、このような背景の下になされたものであり、酵素を用いて、鋳型に依存せずに一本鎖DNAを合成する新規な手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、遺伝子工学で広く使用されている、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ以外のDNAポリメラーゼが、鋳型に依存せずに一本鎖DNAを合成できることを見出し、この知見に基づき、本発明を完成した。
【０００９】
即ち、本発明は、〔１〕〜〔１１〕を提供する。
〔１〕鋳型の非存在下、DNAポリメラーゼの存在下で、一本鎖DNAを合成する方法であって、DNAポリメラーゼが、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ以外のDNAポリメラーゼであることを特徴とする一本鎖DNAの合成方法。
【００１０】
〔２〕DNAポリメラーゼが、Aファミリーに属するDNAポリメラーゼであることを特徴とする〔１〕に記載の一本鎖DNAの合成方法。
【００１１】
〔３〕DNAポリメラーゼが、5′→3′エキソヌクレアーゼ活性が低いもしくは活性を持たないDNAポリメラーゼであることを特徴とする〔１〕又は〔２〕に記載の一本鎖DNAの合成方法。
【００１２】
〔４〕DNAポリメラーゼが、好熱菌由来のDNAポリメラーゼであることを特徴とする〔１〕乃至〔３〕のいずれかに記載の一本鎖DNAの合成方法。
【００１３】
〔５〕（１）DNAポリメラーゼ、モノ又はオリゴヌクレオチド、及び3′-OHを不活性化したデオキシリボヌクレオチド三リン酸を共存させ、モノ又はオリゴヌクレオチドに、3′-OHを不活性化したデオキシリボヌクレオチドを付加する工程、（２）モノ又はオリゴヌクレオチドに付加したデオキシリボヌクレオチドの3′-OHを活性化する工程、及び（３）モノ又はオリゴヌクレオチドに付加しなかったデオキシリボヌクレオチド三リン酸を除去する工程を含む一本鎖DNAの合成方法であって、DNAポリメラーゼが、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ以外のDNAポリメラーゼであることを特徴とする一本鎖DNAの合成方法。
【００１４】
〔６〕DNAポリメラーゼが、Aファミリーに属するDNAポリメラーゼであることを特徴とする〔５〕に記載の一本鎖DNAの合成方法。
【００１５】
〔７〕DNAポリメラーゼが、5′→3′エキソヌクレアーゼ活性が低いもしくは活性を持たないDNAポリメラーゼであることを特徴とする〔５〕又は〔６〕に記載の一本鎖DNAの合成方法。
【００１６】
〔８〕DNAポリメラーゼが、好熱菌由来のDNAポリメラーゼであることを特徴とする〔５〕乃至〔７〕のいずれかに記載の一本鎖DNAの合成方法。
【００１７】
〔９〕3′-OHを不活性化したデオキシリボヌクレオチド三リン酸が、3′-OHを保護基により保護したデオキシリボヌクレオチド三リン酸であることを特徴とする〔５〕乃至〔８〕のいずれかに記載の一本鎖DNAの合成方法。
【００１８】
〔１０〕3′-OHを不活性化したデオキシリボヌクレオチド三リン酸が、デオキシリボヌクレオチド三リン酸をDNAポリメラーゼと結合させることにより3′-OHを不活性化したデオキシリボヌクレオチド三リン酸であることを特徴とする〔５〕乃至〔８〕のいずれかに記載の一本鎖DNAの合成方法。
【００１９】
〔１１〕モノ又はオリゴヌクレオチドが、固体担体に固定されていることを特徴とする〔５〕乃至〔１０〕のいずれか一項に記載の一本鎖DNAの合成方法。
【発明の効果】
【００２０】
本発明は、酵素を用いて、鋳型に依存せずにDNAを合成する新規な方法を提供する。この方法は、長鎖の一本鎖DNA合成を低価格・短時間で実現することが期待される。長鎖一本鎖DNAの合成法は、ゲノム全合成のみならず、これまで短鎖の一本鎖DNA合成に依存していた生物工学・合成生物学手法のコスト・時間を大きく削減し得るもので、医薬品開発、化成品開発、医療技術開発において実用化の需要が高い。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】一本鎖DNA合成を示す原子間力顕微鏡像。高さ（Zスケール）を5 nmで固定して表示している。走査範囲は200 nm、走査速度は1 fpsとした。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、本発明を詳細に説明する。
（Ａ）一本鎖DNAの合成方法
本発明の一本鎖DNAの合成方法は、鋳型の非存在下、DNAポリメラーゼの存在下で、一本鎖DNAを合成する方法であって、DNAポリメラーゼが、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ以外のDNAポリメラーゼであることを特徴とするものである。
【００２３】
本発明の一本鎖DNAの合成方法は、鋳型となるDNAを用いない点に特徴があり、それ以外は、DNAポリメラーゼを用いた通常のDNA合成法と同様に行うことができる。
【００２４】
DNAポリメラーゼは、TdT以外のDNAポリメラーゼであれば特に限定されず、例えば、Xファミリー（TdTを含むファミリー）以外のファミリーに属するDNAポリメラーゼを使用することができる。より具体的には、Aファミリー、Bファミリー、Cファミリー、Dファミリー、Eファミリー、Yファミリー、又はRTファミリーに属するDNAポリメラーゼを使用することができる。これらの中でも、Aファミリーに属するDNAポリメラーゼを使用することが好ましい。Aファミリーに属するDNAポリメラーゼとしては、T7 DNAポリメラーゼ、ミトンコンドリアのDNAポリメラーゼγ、大腸菌由来のDNAポリメラーゼI、テルムス・アクウァーティクス（Thermus aquaticus）由来のpol I、バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）由来のpol Iなどを挙げることができる。
【００２５】
DNAポリメラーゼは、5′→3′エキソヌクレアーゼ活性が低いか、もしくはこの活性を有しないものであることが好ましい。このようなDNAポリメラーゼとしては、大腸菌由来のDNAポリメラーゼＩのクレノウ断片（3′→5′エキソヌクレアーゼ活性を欠損させた変異体を含む）、バチルス・ステアロサーモフィラス由来の5′→3′エキソヌクレアーゼ欠損Bst DNAポリメラーゼ、バチルス・カルドテナックス（Bacillus caldotenax）由来の5′→3′エキソヌクレアーゼ欠損Bca DNAポリメラーゼなどを挙げることができる。
【００２６】
DNAポリメラーゼには、常温性DNAポリメラーゼ、中温性DNAポリメラーゼ、及び耐熱性DNAポリメラーゼがあるが、本発明においては、これらのいずれを使用してもよい。
【００２７】
DNAポリメラーゼは、どのような生物に由来するものであってもよく、それらの変異体であってもよいが、好熱菌由来のDNAポリメラーゼが好ましい。
【００２８】
DNAポリメラーゼは、市販のDNAポリメラーゼ、例えば、Bst DNA polymerase, Large fragment（New England Biolabs社）などを使用することができる。
【００２９】
DNA合成反応は、DNAポリメラーゼを含む反応液中で行う。反応液中のDNAポリメラーゼの濃度は特に限定されず、通常のDNA合成法における濃度と同様の濃度でよい。具体的には、0.005〜1.0 unit/μLとしてもよく、0.01〜0.5 unit/μLとしてもよく、0.025〜0.25 unit/μLとしてもよく、0.05〜0.2 unit/μLとしてもよい。
【００３０】
反応液は、dNTPを含む。dNTPは、4種類のdNTP（dATP、dCTP、dGTP、及びdTTP）を均等に含むもしくは異なる濃度で含む混合物を使用してもよいが、3種類のdNTPだけを使用してもよく、2種類のdNTPだけを使用してもよく、1種類のdNTPだけを使用してもよい。また、上記4種類のdNTP 以外の修飾dNTPを使用しても良い。DNA合成反応液中のdNTPの濃度は特に限定されず、通常のDNA合成法における濃度と同様の濃度でよい。具体的には、0.025〜2.5 mMとしてもよく、0.04〜1.2 mMとしてもよく、0.06〜0.6 mMとしてもよく、0.075〜0.3 mMとしてもよい。
【００３１】
反応液は、DNAポリメラーゼやdNTP以外の物質を含んでいてもよく、例えば、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウムなどの金属塩やDTTなどの還元剤を含んでいてもよい。
【００３２】
反応液は、pHを一定の値に保持するため、緩衝液であることが好ましい。緩衝液としては、通常のDNA合成法において使用されるものでよく、例えば、トリス塩酸緩衝液、トリシン緩衝液、リン酸ナトリウム緩衝液、リン酸カリウム緩衝液などを使用することができる。
【００３３】
反応液中にプライマーとして機能するモノ又はオリゴヌクレオチドが含まれていてもよく、また、含まれていなくてもよい。
【００３４】
反応温度は、使用するDNAポリメラーゼに応じて決めればよく、特定の温度には限定されないが、例えば、20〜95℃とすることができ、また、25〜75℃とすることができ、30〜55℃とすることができ、35〜45℃とすることができ、37〜42℃とすることもできる。
【００３５】
反応液のpHも特に限定されないが、例えば、pH5.0〜9.5とすることができ、pH6.0〜9.0とすることができ、pH6.8〜8.8とすることができ、pH7.4〜8.5とすることもできる。
【００３６】
（Ｂ）特定の配列を持つ一本鎖DNAの合成方法
TdTを用いて、特定の配列を持つ一本鎖DNAを合成することは、以前から行われていた（例えば、Michael A. Jensen and Ronald W. Davis, Biochemistry 2018, 57, 1821-1832、Sebastian Palluk et al., Nature Biotechnology 2018, 36(7), 645-650、特表2018-509177号公報、特表2017-514465号公報、特表2016-515391号公報、特表2001-520501号公報）。鋳型に依存せずに一本鎖DNAを合成可能なDNAポリメラーゼはTdTだけであると考えられていたが、上述のように他のDNAポリメラーゼも鋳型非依存的に一本鎖DNAを合成することが可能である。従って、TdTの代わりに、他のDNAポリメラーゼを用いて、特定の配列を持つ一本鎖DNAを合成することが可能であると考えられる。例えば、下記の工程（１）〜（３）を含む方法によって、特定の配列を持つ一本鎖DNAを合成できると考えられる。
【００３７】
工程（１）では、DNAポリメラーゼ、モノ又はオリゴヌクレオチド、及び3′-OHを不活性化したデオキシリボヌクレオチド三リン酸を共存させ、モノ又はオリゴヌクレオチドに、3′-OHを不活性化したデオキシリボヌクレオチドを付加する。
【００３８】
使用するDNAポリメラーゼは、鋳型非依存的に一本鎖DNAを合成可能なものであればよく、例えば、上記「（Ａ）一本鎖DNAの合成方法」の欄に記載したDNAポリメラーゼを使用することができる。
【００３９】
「3′-OHを不活性化したデオキシリボヌクレオチド三リン酸」とは、3′-OHに別のデオキシリボヌクレオチド三リン酸が結合できなくなるようにしたデオキシリボヌクレオチド三リン酸を意味する。このような3′-OHを不活性化したデオキシリボヌクレオチド三リン酸を使用することにより、工程（１）において、モノ又はオリゴヌクレオチドに二以上のデオキシリボヌクレオチドが付加するのを防ぎ、一つのデオキシリボヌクレオチドだけを付加することを可能にする。
【００４０】
3′-OHを不活性化する方法としては、例えば、3′-OHを保護基により保護する方法を挙げることができる。保護基としては、3′-OHへの結合を阻害でき、特定条件で脱保護可能なものであれば特に限定されない。TdTを用いたDNA合成法では、3′-O-メチル、3′-O-(2-ニトロベンジル）、3′-O-(2-シアノエチル）、3′-O-アリル、3′-O-アミノなどの保護基が用いられているが（Michael A. Jensen and Ronald W. Davis, Biochemistry 2018, 57, 1821-1832）、本発明においてもこれらの保護基を使用することができる。
【００４１】
3′-OHの不活性化は、保護基による保護に限定されず、例えば、3′-OHをそのままにし、デオキシリボヌクレオチド三リン酸の他の部分に物質を結合させ、その物質による立体障害などにより、3′-OHを不活性化してもよい。Sebastian Palluk et al., Nature Biotechnology 2018, 36(7), 645-650では、特定条件（DTT、365nmの光、ペプチダーゼ）で切断可能なリンカーを介し、デオキシリボヌクレオチド三リン酸をDNAポリメラーゼ（TdT）と結合させ、これにより、デオキシリボヌクレオチド三リン酸の3′-OHを不活性化しているが、本発明においても、同様の方法で、3′-OHを不活性化してもよい。
【００４２】
3′-OHを不活性化したデオキシリボヌクレオチド三リン酸は、特定の塩基を有する1種類のデオキシリボヌクレオチド三リン酸だけを使用する。
【００４３】
モノ又はオリゴヌクレオチドは、モノヌクレオチド、オリゴヌクレオチドのどちらでもよいが、通常は、オリゴヌクレオチドを使用する。TdTを用いたDNA合成法では、プライマーとして機能するオリゴヌクレオチドを使用してDNAの合成を行うが、本発明において使用するオリゴヌクレオチドも、このようなオリゴヌクレオチドと同様のものでよい。TdTを用いたDNA合成法では、ヌクレオチド数が20程度のオリゴヌクレオチドが通常使用されているが、本発明においても、これと同程度の長さのオリゴヌクレオチド（例えば、ヌクレオチド数が16〜24のオリゴヌクレオチドやヌクレオチド数が18〜22のオリゴヌクレオチド）、もしくはこれよりも短いヌクレオチド数が2〜15のオリゴヌクレオチド、これよりも長いヌクレオチド数が25〜45のオリゴヌクレオチド、ヌクレオチド数が46以上のオリゴヌクレオチドを使用することができる。
【００４４】
モノ又はオリゴヌクレオチドは固体担体に固定することが好ましい。固体担体は、TdTを用いたDNA合成法において通常使用されるものでよく、例えば、磁性ビーズ、ガラス、シリコンなどを挙げることができる。
【００４５】
この工程（１）における反応条件は、3′-OHを不活性化したデオキシリボヌクレオチドがモノ又はオリゴヌクレオチドに付加され得る条件であれば特に限定されず、例えば、上記「（Ａ）一本鎖DNAの合成方法」の欄に記載した反応条件と同じ条件でよい。
【００４６】
工程（２）では、モノ又はオリゴヌクレオチドに付加したデオキシリボヌクレオチドの3′-OHを活性化する。
【００４７】
「3′-OHを活性化する」とは、3′-OHに別のデオキシリボヌクレオチド三リン酸が結合できるようにするという意味である。
【００４８】
3′-OHの活性化は、3′-OHを不活性化させた方法に応じて決めればよい。例えば、3′-OHを保護基により保護することにより不活性化した場合は、脱保護すればよく、また、デオキシリボヌクレオチド三リン酸の3′-OH以外に物質を結合させすることにより不活性化した場合は、その物質を切り離せばよい。
【００４９】
工程（３）では、モノ又はオリゴヌクレオチドに付加しなかったデオキシリボヌクレオチド三リン酸を除去する。
【００５０】
この工程では、デオキシリボヌクレオチド三リン酸だけでなく、DNAポリメラーゼ、ピロリン酸塩、保護基（脱保護した場合）なども除去してもよい。モノ又はオリゴヌクレオチドが固定担体に固定されている場合は、洗浄により、これらの除去を効率的に行うことができる。
【００５１】
以上の工程（１）〜（３）を1回行うことにより、モノ又はオリゴヌクレオチドに1つのヌクレオチドが付加される。更に、工程（１）〜（３）を繰り返すと、繰り返し回数に応じた数のヌクレオチドが付加されていく。これにより、特定の配列を持つ一本鎖DNAを合成することができる。
【００５２】
モノ又はオリゴヌクレオチドから合成したDNAの切り離しは、TdTを用いたDNA合成法と同様に行うことができる。例えば、モノ又はオリゴヌクレオチドの3′末端の塩基をウラシルにし、DNAの合成が終了した段階で、ウラシルDNAグリコシラーゼ及びエンドヌクレアーゼVIIIを作用させることにより、合成したDNAを切り離すことができる。
【実施例】
【００５３】
以下に、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００５４】
〔観察条件〕
高速原子間力顕微鏡  NanoExplorer（株式会社生体分子計測研究所）とカンチレバー  USC-F1.2-k0.15（Nanoworld社)を用いて、室温（21℃）において液中ACモード形状像で観察した。解像度は200×200 ピクセルである。
【００５５】
〔実験方法〕
（１）1×NEBuffer2（50 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 10 mM Tris-HCl (pH7.9), 1 mM DTT）（New England Biolabs社）に、Bst DNA polymerase, Large fragment（New England Biolabs社）、dNTPs（New England Biolabs社）をそれぞれ終濃度0.1 unit/μL、0.15 mMとなるように加えたサンプルを調整した。
【００５６】
（２）37℃でインキュベートし、10〜20分ごとにサンプル1 μLを分取して、MilliQ水98 μLにNiCl2溶液1 μL（終濃度10 mM）とともに加えて混合した。
【００５７】
（３）マイカ基板にサンプル2 μLを滴下し、湿潤環境で10分間静置した後、MilliQ水10 μLで余剰分を洗浄し、MilliQ水中で観察した。
【００５８】
〔実験結果〕
インキュベート開始30 min後より、直径1 nm程度の繊維状の構造物（数百塩基長の1本鎖DNA）の生成が確認された（図１）。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
本発明は、DNAの合成法に関するものなので、DNAに関連する産業分野において利用可能である。
【図１】
2020150801.tif 000002