(57)【要約】      （修正有）【課題】細胞の生存率を向上させることができる継代補助装置及び継代操作方法の提供。【解決手段】複数の収容部１にそれぞれ収容された細胞に対して継代作業を行う際の剥離工程を実行する、継代補助装置。培養上清除去工程実行部１１と、試薬反応工程実行部１３と、培地供給工程実行部１４と、培地攪拌工程実行部１５と、懸濁液回収工程実行部１６と、温調機構４とを備え、温調機構４は、少なくとも試薬反応工程実行部１３が試薬反応工程を実行している時間、各収容部１内が、細胞の活性が保持され試薬が適切に反応する温度になるように加熱する、継代補助装置。【選択図】図１
2020150843.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の収容部にそれぞれ収容された細胞に対して継代作業を行う際の剥離工程を実行するための継代補助装置であって、
溶液を分取・滴下する分注機構と、
細胞を培養するための容器を保持する容器保持部と、
前記容器を温調するための温調機構と、
前記複数の収容部からそれぞれ細胞を残して培地を除去する培養上清除去工程を実行するための培養上清除去工程実行部と、
前記培養上清除去工程が実行された後の各収容部に試薬を供給し、各収容部に対する細胞の接着タンパクの結合を切断させる試薬反応工程を実行するための試薬反応工程実行部と、
前記試薬反応工程が実行された後の各収容部に培地を供給する培地供給工程を実行するための培地供給工程実行部と、
前記培地供給工程が実行された後の各収容部内の培地を攪拌することにより、培地中に細胞が混合された懸濁液を生成する培地攪拌工程を実行する培地攪拌工程実行部と、
前記培地攪拌工程が実行された後の各収容部から懸濁液を回収する懸濁液回収工程を実行する懸濁液回収工程実行部と、
前記温調機構は、少なくとも前記試薬反応工程実行部が前記試薬反応工程を実行している時間、各収容部内が、細胞の活性が保持され試薬が適切に反応する温度になるように加熱する温調機構とを備えることを特徴とする継代補助装置。
【請求項２】
前記細胞の活性が保持され試薬が適切に反応する温度が、３３〜３８℃であることを特徴とする請求項１に記載の継代補助装置。
【請求項３】
少なくとも前記培地供給工程、前記培地攪拌工程及び前記懸濁液回収工程が、前記収容部ごとに一連の工程で実行されることにより、当該一連の工程が各収容部に対して順次実行されることを特徴とする請求項１又は２に記載の継代補助装置。
【請求項４】
前記培養上清除去工程が実行された後の各収容部に洗浄液を供給し、所定時間経過後に洗浄液を除去することにより、細胞を洗浄する洗浄工程を実行する洗浄工程実行部をさらに備え、
前記試薬反応工程は、前記洗浄工程が実行された後の各収容部に試薬を供給するものであり、
少なくとも前記培養上清除去工程及び前記洗浄工程が、前記収容部ごとに一連の工程で実行されることにより、当該一連の工程が各収容部に対して順次実行されることを特徴とする請求項１又は２に記載の継代補助装置。
【請求項５】
各収容部に対する前記一連の工程が、前記収容部ごとに待ち時間を生じることなく順次実行されることを特徴とする請求項３又は４に記載の継代補助装置。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の継代補助装置を用いて、複数の収容部にそれぞれ収容された細胞に対して継代作業を行う際の剥離工程を実行するための継代操作方法であって、
前記複数の収容部からそれぞれ細胞を残して培地を除去する培養上清除去工程と、
前記培養上清除去工程が実行された後の各収容部に試薬を供給し、所定時間経過後に試薬を除去することにより、各収容部に対する細胞の接着タンパクの結合を切断させる試薬反応工程と、
前記試薬反応工程が実行された後の各収容部に培地を供給する培地供給工程と、
前記培地供給工程が実行された後の各収容部内の培地を攪拌することにより、培地中に細胞が混合された懸濁液を生成する培地攪拌工程と、
前記培地攪拌工程が実行された後の各収容部から懸濁液を回収する懸濁液回収工程と、
少なくとも前記試薬反応工程が実行されている時間、各収容部内が、細胞の活性が保持され試薬が適切に反応する温度になるように加熱する温調工程とを含むことを特徴とする継代操作方法。
【請求項７】
前記細胞の活性が保持され試薬が適切に反応する温度が、３３〜３８℃であることを特徴とする請求項６に記載の継代操作方法。
【請求項８】
少なくとも前記培地供給工程、前記培地攪拌工程及び前記懸濁液回収工程が、前記収容部ごとに一連の工程で実行されることにより、当該一連の工程が各収容部に対して順次実行されることを特徴とする請求項６又は７に記載の継代操作方法。
【請求項９】
前記培養上清除去工程が実行された後の各収容部に洗浄液を供給し、所定時間経過後に洗浄液を除去することにより、細胞を洗浄する洗浄工程をさらに含み、
前記試薬反応工程は、前記洗浄工程が実行された後の各収容部に試薬を供給するものであり、
少なくとも前記培養上清除去工程及び前記洗浄工程が、前記収容部ごとに一連の工程で実行されることにより、当該一連の工程が各収容部に対して順次実行されることを特徴とする請求項６又は７に記載の継代操作方法。
【請求項１０】
各収容部に対する前記一連の工程が、前記収容部ごとに待ち時間を生じることなく順次実行されることを特徴とする請求項８又は９に記載の継代操作方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複数の収容部にそれぞれ収容された接着細胞に対して継代を行う際の剥離工程を実行するための継代補助装置及び継代操作方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
接着細胞を培養する工程において、その細胞を長期的に維持したり、細胞数を増加させたりする場合には継代と呼ばれる作業が行われる（例えば、下記特許文献１参照）。継代とは、培養中の細胞を新しい容器に移し替える作業であり、例えば細胞が培養容器底面を覆い尽くし、接着可能な場所が存在しなくなった場合に行われる。
【０００３】
接着細胞の継代を行う際には、その前段階として、収容部から細胞を回収するための剥離工程が行われる。剥離工程には、例えば培養上清除去工程、洗浄工程、試薬反応工程、培地供給工程、培地攪拌工程及び懸濁液回収工程などが含まれ、以下のような手順で行われる。
【０００４】
培養される接着細胞は、収容部の底面に接着している。この状態で、まず、収容部から培養上清が除去されることにより（培養上清除去工程）、収容部内に細胞だけが残された状態となる。その後、収容部に洗浄液が供給され、所定時間経過後に洗浄液が除去されることにより、細胞が洗浄される（洗浄工程）。そして、収容部に特定の試薬が供給され、所定時間経過後に試薬が除去されることにより、収容部の底面に対する細胞の接着タンパクの結合が切断される（試薬反応工程）。
【０００５】
このようにして、収容部の底面に対する細胞の接着タンパクの結合が切断された後、収容部に培地が供給され（培地供給工程）、その後に収容部内の培地が攪拌されることにより（培地攪拌工程）、細胞が収容部底面から剥離し、培地中に細胞が混合された懸濁液が生成される。そして、収容部から懸濁液が回収され（懸濁液回収工程）、その懸濁液が別の収容部へと移し替えられる。
【０００６】
複数の収容部にそれぞれ細胞が収容され、各収容部内の培地に対して継代作業を行う際には、一般的に、上記のような各工程が複数の収容部に対して順次行われる。図５Ａは、複数の収容部に対して培養上清除去工程、洗浄工程及び試薬反応工程を行う際のタイミングチャートの従来例である。図５Ｂは、複数の収容部に対して培地供給工程、培地攪拌工程及び懸濁液回収工程を行う際のタイミングチャートの従来例である。
【０００７】
図５Ａに示すように、各収容部に対して培養上清除去工程が順次行われ、全ての収容部に対する培養上清除去工程が完了した後に、各収容部に対して洗浄工程が順次行われる。洗浄工程には、各収容部に洗浄液を供給する洗浄液供給工程と、所定時間経過後に各収容部から洗浄液を除去する洗浄液除去工程とが含まれる。洗浄液供給工程は、各収容部に対して順次行われ、全ての収容部に対する洗浄液供給工程が完了した後に、各収容部に対して洗浄液除去工程が順次行われる。そして、洗浄工程が完了した収容部から順に、試薬反応工程が開始される。試薬反応工程は、各収容部において並行で行われる。
【０００８】
各収容部において試薬反応工程が完了すると、図５Ｂに示すように、各収容部に対して培地供給工程が順次行われ、全ての収容部に対する培地供給工程が完了した後に、各収容部に対して培地攪拌工程が順次行われる。そして、全ての収容部に対する培地攪拌工程が完了した後に、各収容部に対して懸濁液回収工程が順次行われる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第２０１５／１６６８４５号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
細胞の培養は、温度が一定に保たれたインキュベータ内で行われる。継代作業の際には、培養された細胞がインキュベータの外部に移動され、上述のような剥離工程が行われた後、継代が行われる。そのため、剥離工程の際に収容部内の温度が低下し、細胞の生存率が低下するという問題があった。さらに、温度低下が生じた場合、インキュベータに戻してから必要な温度に上昇するまで長時間を要するため、インキュベータで保持される温度が必要な試薬反応工程では、温度低下の影響を著しく受け、細胞の生存率が低下する大きな原因となっていた。
【００１１】
また、各収容部において試薬反応工程が完了すると、各収容部の底面に対する細胞の接着タンパクの結合が切断されるが、その後の培地供給工程で各収容部に培地が供給されると、時間経過とともに細胞が各収容部の底面に再度接着してしまう。上記のように、各収容部に対して培地供給工程が順次行われ、全ての収容部に対する培地供給工程が完了した後に、各収容部に対して培地攪拌工程が順次行われる場合には、図５Ｂに点線で示すように、各収容部に培地が供給された後、各収容部に対して培地攪拌工程が開始されるまでの間に、待ち時間が発生する。この待ち時間の間に、各収容部の底面に細胞が再度接着してしまうため、その後に培地攪拌工程が行われたときに、再接着した細胞が無理やり剥離されることとなり、その結果、細胞の生存率が低下するという問題があった。加えて、図５Ｂの点線で示されるように、各収容部での待ち時間が異なるため、各収容部への影響に差が生じ、培養結果のばらつきの要因のひとつとなるという問題もあった。なお、図５Ｂにおける点線の長さは、待ち時間の長さ、すなわち各収容部の浸漬時間（静置時間）の長さを意味している。
【００１２】
本発明は、上記実情に鑑みてなされたものであり、細胞の生存率を向上させ、培養結果のばらつきを低減することができる継代補助装置及び継代操作方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
（１）本発明に係る継代補助装置は、複数の収容部にそれぞれ収容された細胞に対して継代作業を行う際の剥離工程を実行するための継代補助装置であって、分注機構と、容器保持部と、温調機構と、培養上清除去工程実行部と、試薬反応工程実行部と、培地供給工程実行部と、培地攪拌工程実行部と、懸濁液回収工程実行部とを備える。
【００１４】
前記分注機構は、溶液を分取・滴下する。前記容器保持部は、細胞を培養するための容器を保持する。前記温調機構は、前記容器を温調する。前記培養上清除去工程実行部は、前記複数の収容部からそれぞれ細胞を残して培地を除去する培養上清除去工程を実行する。前記試薬反応工程実行部は、前記培養上清除去工程が実行された後の各収容部に試薬を供給し、所定時間経過後に試薬を除去することにより、各収容部に対する細胞の接着タンパクの結合を切断させる試薬反応工程を実行する。前記培地供給工程実行部は、前記試薬反応工程が実行された後の各収容部に培地を供給する培地供給工程を実行する。前記培地攪拌工程実行部は、前記培地供給工程が実行された後の各収容部内の培地を攪拌することにより、培地中に細胞が混合された懸濁液を生成する培地攪拌工程を実行する。前記懸濁液回収工程実行部は、前記培地攪拌工程が実行された後の各収容部から懸濁液を回収する懸濁液回収工程を実行する。前記温調機構は、少なくとも前記試薬反応工程実行部が前記試薬反応工程を実行している時間、各収容部内が、細胞の活性が保持され試薬が適切に反応する温度になるように加熱する。
【００１５】
このような構成によれば、少なくとも試薬反応工程を実行している時間、各収容部内が、細胞の活性が保持され試薬が適切に反応する温度になるように加熱されるため、収容部内の温度が低下するのを防止することができる。これにより、温度低下に起因する試薬の反応不足を抑制することができるため、細胞の生存率が向上する。前記細胞の活性が保持され試薬が適切に反応する温度は、３３〜３８℃であることが好ましく、３７℃であればより好ましい。
【００１６】
（２）前記継代補助装置において、少なくとも前記培地供給工程、前記培地攪拌工程及び前記懸濁液回収工程が、前記収容部ごとに一連の工程で実行されることにより、当該一連の工程が各収容部に対して順次実行されることが好ましい。
【００１７】
このような構成によれば、少なくとも培地供給工程、培地攪拌工程及び懸濁液回収工程が、収容部ごとに一連の工程で実行されるため、図４Ｂに示すように、各収容部に培地が供給された後、各収容部に対して培地攪拌工程が開始されるまでの間に、待ち時間が発生しない。これにより、各収容部に培地が供給された後に、各収容部の底面に細胞が再度接着するのを防止することができる。したがって、培地攪拌工程が行われたときに、各収容部の底面に対して再接着した細胞が無理やり剥離されるといったことがないため、細胞の生存率が向上する。
【００１８】
（３）前記継代補助装置は、洗浄工程実行部をさらに備えていてもよい。前記洗浄工程実行部は、前記培養上清除去工程が実行された後の各収容部に洗浄液を供給し、所定時間経過後に洗浄液を除去することにより、細胞を洗浄する洗浄工程を実行する。前記試薬反応工程は、前記洗浄工程が実行された後の各収容部に試薬を供給する。この場合、少なくとも前記培養上清除去工程及び前記洗浄工程が、前記収容部ごとに一連の工程で実行されることにより、当該一連の工程が各収容部に対して順次実行されることが好ましい。
【００１９】
このような構成によれば、少なくとも培養上清除去工程及び洗浄工程が、収容部ごとに一連の工程で実行されるため、その後に行われる試薬反応工程における前記所定時間を収容部ごとに個別に管理することができる。これにより、前記所定時間のばらつきを抑制することができる。
【００２０】
（４）前記継代補助装置において、各収容部に対する前記一連の工程が、前記収容部ごとに待ち時間を生じることなく順次実行されることが好ましい。
【００２１】
このような構成によれば、収容部ごとに順次実行される一連の工程が、間に待ち時間を生じることなく実行されるため、剥離工程に要する時間を短縮することができる。加えて、各収容部に対して実施される作業工程が、時間的にも同内容とすることが可能になり、各収容部の細胞への影響のばらつきを抑制することができる。
【００２２】
（５）本発明に係る継代操作方法は、前記継代補助装置を用いて、複数の収容部にそれぞれ収容された細胞に対して継代作業を行う際の剥離工程を実行するための継代操作方法であって、培養上清除去工程と、試薬反応工程と、培地供給工程と、培地攪拌工程と、懸濁液回収工程と、温調工程とを含む。
【００２３】
前記培養上清除去工程では、前記複数の収容部からそれぞれ細胞を残して培地を除去する。前記試薬反応工程では、前記培養上清除去工程が実行された後の各収容部に試薬を供給し、所定時間経過後に試薬を除去することにより、各収容部に対する細胞の接着タンパクの結合を切断させる。前記培地供給工程では、前記試薬反応工程が実行された後の各収容部に培地を供給する。前記培地攪拌工程では、前記培地供給工程が実行された後の各収容部内の培地を攪拌することにより、培地中に細胞が混合された懸濁液を生成する。前記懸濁液回収工程では、前記培地攪拌工程が実行された後の各収容部から懸濁液を回収する。前記温調工程では、少なくとも前記試薬反応工程が実行されている時間、各収容部内が、細胞の活性が保持され試薬が適切に反応する温度になるように加熱する。
【００２４】
（６）前記継代操作方法において、少なくとも前記培地供給工程、前記培地攪拌工程及び前記懸濁液回収工程が、前記収容部ごとに一連の工程で実行されることにより、当該一連の工程が各収容部に対して順次実行されることが好ましい。
【００２５】
（７）前記継代操作方法は、洗浄工程をさらに含んでいてもよい。前記洗浄工程では、前記培養上清除去工程が実行された後の各収容部に洗浄液を供給し、所定時間経過後に洗浄液を除去することにより、細胞を洗浄する。前記試薬反応工程では、前記洗浄工程が実行された後の各収容部に試薬を供給する。この場合、少なくとも前記培養上清除去工程及び前記洗浄工程が、前記収容部ごとに一連の工程で実行されることにより、当該一連の工程が各収容部に対して順次実行されることが好ましい。
【００２６】
（８）前記継代操作方法において、各収容部に対する前記一連の工程が、前記収容部ごとに待ち時間を生じることなく順次実行されることが好ましい。
【発明の効果】
【００２７】
本発明によれば、収容部内の温度が低下することによる試薬の反応不足を抑制することができるため、細胞の生存率が向上する。また、少なくとも培地供給工程、培地攪拌工程及び懸濁液回収工程を収容部ごとに一連の工程で実行すれば、培地攪拌工程が行われたときに、各収容部の底面に対して再接着した細胞が無理やり剥離されるといったことがないため、細胞の生存率が向上する。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】本発明の一実施形態に係る継代補助装置の概略構成を示したブロック図である。
【図２】図１の継代補助装置により実行される各工程における具体的動作について説明するための図である。
【図３】図１の継代補助装置により実行される各工程における具体的動作について説明するための図である。
【図４Ａ】複数の収容部に対して培養上清除去工程、洗浄工程及び試薬反応工程を行う際のタイミングチャートである。
【図４Ｂ】複数の収容部に対して培地供給工程、培地攪拌工程及び懸濁液回収工程を行う際のタイミングチャートである。
【図５Ａ】複数の収容部に対して培養上清除去工程、洗浄工程及び試薬反応工程を行う際のタイミングチャートの従来例である。
【図５Ｂ】複数の収容部に対して培地供給工程、培地攪拌工程及び懸濁液回収工程を行う際のタイミングチャートの従来例である。
【図６】収容部の底面に対する細胞の接着タンパクの結合が切断された後、収容部に培地を供給してから培地攪拌工程が開始されるまでの静置時間と細胞の生存率との関係を示した図である。
【図７Ａ】試薬反応工程を実行している時間に収容部を３７℃に温調した場合（プレート加温）と、従来の培養作業時のように温度変化がある場合（コントロール）とで、それぞれ測定温度の経時的変化を示した図である。
【図７Ｂ】図７Ａのそれぞれの場合における細胞の生存率を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
１．継代補助装置の概略構成
図１は、本発明の一実施形態に係る継代補助装置の概略構成を示したブロック図である。この継代補助装置は、複数の収容部１にそれぞれ収容された細胞２１に対して継代を行う際の剥離工程を行うための装置である。
【００３０】
複数の収容部１は、皿部材３の上面に形成された複数の凹部により構成されている。図１では、３つの収容部１が示されているが、収容部１の数は任意である。また、１つの皿部材３に複数の収容部１が形成された構成に限らず、収容部１ごとに個別の皿部材が準備されてもよい。
【００３１】
各収容部１内の培養上清２では細胞が培養されている。細胞の培養の際には、皿部材３がインキュベータ（図示せず）内に設置されている。そして、細胞２１に対して継代を行う必要があるときには、皿部材３がインキュベータから取り出され、本実施形態に係る継代補助装置にセットされる。
【００３２】
この継代補助装置には、皿部材３を温調するための温調機構４が備えられている。インキュベータから取り出された皿部材３は、温調機構４にセットされることにより適切な温度で温調される。本実施形態では、温調機構４が、細胞を培養するための容器である皿部材３を保持する容器保持部を構成している。ただし、容器保持部とは別に温調機構４が構成されていてもよい。温調機構４には、皿部材３を加熱するためのヒータ（図示せず）が備えられている。このヒータの駆動を制御することにより、各収容部１内を設定された所定温度になるように加熱することができる。
【００３３】
継代を行う際に、その前段階として継代補助装置で行われる剥離工程には、例えば培養上清除去工程、洗浄工程、試薬反応工程、培地供給工程、培地攪拌工程及び懸濁液回収工程などが含まれる。これらの各工程は、皿部材３が温調機構４にセットされた状態のまま、各収容部１に対して行われる。
【００３４】
上記のような各工程では、各収容部１に対して、各種液体を供給したり、除去したりする動作が行われる。当該液体には、各収容部１に収容されている細胞２１を浸す培養上清２の他、新しい培地５、洗浄液６又は試薬７などが含まれる。培地５、洗浄液６及び試薬７は、液体貯留部８に予め貯留されている。
【００３５】
各収容部１に対する液体の供給及び除去は、シリンジ９を用いて行われる。このシリンジ９は、溶液を分取・滴下する分注機構を構成している。シリンジ９には、接続部９１が備えられており、接続部９１の先端にチップ９２が着脱される。チップ９２の先端を液体中に挿入し、シリンジ９で吸引動作を行えば、チップ９２内に液体を吸引することができる。また、チップ９２内に液体を吸引した状態で、シリンジ９により吐出動作を行えば、チップ９２内の液体を吐出することができる。継代補助装置には複数のチップ９２が予めセットされており、必要に応じて接続部９１の先端のチップ９２が交換される。ただし、分注機構は、上記のような構成に限らず、例えば複数のシリンジ９を備えた構成などであってもよい。
【００３６】
継代補助装置には、温調機構４やシリンジ９などの動作を制御するための制御部１０が備えられている。制御部１０は、ＣＰＵ（Central Processing Unit）を含む。制御部１０は、ＣＰＵがプログラムを実行することにより、培養上清除去工程実行部１１、洗浄工程実行部１２、試薬反応工程実行部１３、培地供給工程実行部１４、培地攪拌工程実行部１５、懸濁液回収工程実行部１６及び温調制御部１７などとして機能する。制御部１０は、継代補助装置に備えられた構成に限らず、継代補助装置との間で通信可能なパーソナルコンピュータにより構成されていてもよい。
【００３７】
２．各工程における具体的動作
図２及び図３は、図１の継代補助装置により実行される各工程における具体的動作について説明するための図である。以下では、図１〜図３を参照しながら、各工程について具体的に説明する。
【００３８】
図２Ａに示すように、培養上清２中で培養された細胞２１は、収容部１の底面に接着している。この状態で、まず、培養上清除去工程実行部１１が、収容部１から細胞２１を残して培養上清２を除去する処理を行うことにより、培養上清除去工程が実行される。培養上清除去工程では、シリンジ９を用いて、収容部１内の培養上清２が吸引され、廃液口、もしくは廃液容器（図示せず）に排出される。これにより、収容部１内には細胞２１だけが残された状態となる（図２Ｂ参照）。
【００３９】
洗浄工程実行部１２は、収容部１内に残された細胞２１を洗浄する洗浄工程を実行するための処理を行う。洗浄工程では、シリンジ９を用いて、培養上清除去工程が実行された後の収容部１内に洗浄液６が供給される（図２Ｃ参照）。そして、所定時間経過後に、シリンジ９を用いて、収容部１内の洗浄液６が吸引され、廃液口、もしくは廃液容器に排出される。これにより、収容部１内の洗浄液６が、細胞２１に付着している夾雑物とともに除去されることにより（図２Ｄ参照）、細胞２１が洗浄される。
【００４０】
洗浄液６としては、例えばＰＢＳ（Phosphate Buffered Saline：リン酸緩衝生理食塩水）が用いられる。ただし、洗浄液６は、細胞２１に付着している夾雑物を除去するのに適した液体であれば、ＰＢＳに限らず、他の液体であってもよい。また、洗浄工程を省略することも可能である。
【００４１】
試薬反応工程実行部１３は、洗浄工程が実行された後の細胞２１に対して試薬反応工程を実行するための処理を行う。試薬反応工程では、シリンジ９を用いて、洗浄工程が実行された後の収容部１内に試薬７が供給される（図３Ａ参照）。そして、所定時間経過後に、シリンジ９を用いて、収容部１内の試薬７が吸引され、廃液口、もしくは廃液容器に排出される。上記所定時間が経過するまでの間、試薬７の作用により、収容部１の底面に対する細胞２１の接着タンパクの結合が切断される。したがって、収容部１内の試薬７が排液されたときには（図３Ｂ参照）、細胞２１が収容部１の底面に固着していない状態、又は、ほぼ固着していない状態となっている。ここで、「固着していない状態」とは、接着タンパクの分子的な結合が切れた状態を意味している。
【００４２】
試薬７としては、例えばトリプシンなどの酵素を含む溶液（トリプシンＥＤＴＡ溶液などの酵素液）が用いられる。この酵素の作用により、細胞２１と収容部１の底面とを接着するタンパクを切断することができる。試薬反応工程における上記所定時間は、例えば６〜１２分であり、より好ましくは１０分程度である。ただし、試薬７は、収容部１に対する細胞２１の接着タンパクの結合を切断するのに適した液体であれば、酵素液に限らず、他の液体であってもよい。
【００４３】
培地供給工程実行部１４は、収容部１に新しい培地５を供給する培地供給工程を実行するための処理を行う。培地供給工程では、シリンジ９を用いて、試薬反応工程が実行された後の収容部１内に培地５が供給される（図３Ｃ参照）。ただし、収容部１に新しい培地５を供給する前に、収容部１内に洗浄液６を供給し、所定時間経過後に収容部１内の洗浄液６をシリンジ９で吸引して排液することにより、洗浄工程が行われてもよい。
【００４４】
培地攪拌工程実行部１５は、培地供給工程が実行された後の収容部１内の培地５を攪拌することにより、培地攪拌工程を実行するための処理を行う。収容部１内の細胞２１は、試薬反応工程により収容部１に対する接着タンパクの結合が切断されているため、培地攪拌工程では、攪拌による液流により収容部底面から剥離することで培地５中に細胞２１が混合され、懸濁液が生成される（図３Ｄ参照）。
【００４５】
懸濁液回収工程実行部１６は、培地攪拌工程が実行された後の収容部１から懸濁液を回収する懸濁液回収工程を実行するための処理を行う。懸濁液回収工程では、シリンジ９を用いて、収容部１内の懸濁液が吸引される。これにより、チップ９２内に懸濁液２２が吸引され（図３Ｅ参照）、その懸濁液２２が別の収容部へと移し替えられる。
【００４６】
温調制御部１７は、温調機構４の動作を制御することにより、収容部１内が所定温度になるように加熱するための温調工程を実行する。上記所定温度は、例えば３３〜３８℃であり、より好ましくは３７℃である。本実施形態では、培養上清除去工程から培地攪拌工程までの間、収容部１内が継続して加熱される。ただし、少なくとも試薬反応工程において、収容部１内に試薬７が供給されてから除去されるまでの間、収容部１内を加熱するような構成であればよい。
【００４７】
３．試薬反応工程前の各工程の実行手順
図４Ａは、複数の収容部１に対して培養上清除去工程、洗浄工程及び試薬反応工程を行う際のタイミングチャートである。洗浄工程には、上述の通り、各収容部１に洗浄液を供給する工程（洗浄液供給工程）と、所定時間経過後に各収容部１から洗浄液を除去する工程（洗浄液除去工程）とが含まれる。
【００４８】
図４Ａに示すように、本実施形態では、培養上清除去工程及び洗浄工程が、収容部１ごとに一連の工程で実行される。すなわち、１つの収容部１に対して培養上清除去工程及び洗浄工程を連続で実行した後、次の収容部１に対して培養上清除去工程及び洗浄工程を連続で実行するという処理が、複数の収容部１に対して繰り返し実行される。これにより、試薬反応工程前の一連の工程（培養上清除去工程及び洗浄工程）が各収容部１に対して順次実行される。
【００４９】
試薬反応工程前の各収容部１に対する一連の工程（培養上清除去工程及び洗浄工程）は、収容部１ごとに待ち時間を生じることなく順次実行される。すなわち、１つの収容部１に対する洗浄工程が完了した直後に、待ち時間を生じることなく、次の収容部１に対する培養上清除去工程が開始される。そして、洗浄工程が完了した収容部１から順に、試薬反応工程が開始される。試薬反応工程は、各収容部１において並行で行われる。
【００５０】
４．試薬反応工程後の各工程の実行手順
図４Ｂは、複数の収容部１に対して培地供給工程、培地攪拌工程及び懸濁液回収工程を行う際のタイミングチャートである。
【００５１】
図４Ｂに示すように、本実施形態では、培地供給工程、培地攪拌工程及び懸濁液回収工程が、収容部１ごとに一連の工程で実行される。すなわち、１つの収容部１に対して培地供給工程、培地攪拌工程及び懸濁液回収工程を連続で実行した後、次の収容部１に対して培地供給工程、培地攪拌工程及び懸濁液回収工程を連続で実行するという処理が、複数の収容部１に対して繰り返し実行される。これにより、試薬反応工程後の一連の工程（培地供給工程、培地攪拌工程及び懸濁液回収工程）が各収容部１に対して順次実行される。
【００５２】
試薬反応工程後の各収容部１に対する一連の工程（培地供給工程、培地攪拌工程及び懸濁液回収工程）は、収容部１ごとに待ち時間を生じることなく順次実行される。すなわち、１つの収容部１に対する懸濁液回収工程が完了した直後に、待ち時間を生じることなく、次の収容部１に対する培地供給工程が開始される。
【００５３】
５．作用効果
（１）本実施形態では、少なくとも図３Ａ及び図３Ｂに示した試薬反応工程を実行している時間（各収容部１内に試薬７が供給されてから除去されるまでの間）に、各収容部１内が、細胞２１の活性が保持され試薬７が適切に反応する温度になるように加熱されるため、細胞２１及び試薬７の温度が低下するのを防止することができる。これにより、温度低下に起因する試薬７との反応不足を抑制することができ、適切に細胞２１の接着タンパクを切断できるため、細胞２１の生存率が向上する。
【００５４】
（２）本実施形態では、図４Ｂに示すように、少なくとも培地供給工程、培地攪拌工程及び懸濁液回収工程が、収容部１ごとに一連の工程で実行される。そのため、各収容部１に培地５が供給された後（図３Ｃ参照）、各収容部１に対して培地攪拌工程が開始されるまでの間に（図３Ｄ参照）、待ち時間が発生しない。これにより、各収容部１に培地５が供給された後に、各収容部１の底面に細胞２１が再度接着するのを防止することができる。したがって、培地攪拌工程が行われたときに、各収容部１の底面に対して再接着した細胞２１が無理やり剥離されるといったことがないため、細胞２１の生存率が向上する。
【００５５】
（３）本実施形態では、図４Ａに示すように、少なくとも培養上清除去工程及び洗浄工程が、収容部１ごとに一連の工程で実行される。そのため、その後に行われる試薬反応工程における所定時間（各収容部１内に試薬７が供給されてから除去されるまでの間）を収容部１ごとに個別に管理することができる。これにより、前記所定時間のばらつきを抑制することができる。
【００５６】
（４）本実施形態では、収容部１ごとに順次実行される一連の工程（図４Ａにおける培養上清除去工程及び洗浄工程、又は、図４Ｂにおける培地供給工程、培地攪拌工程及び懸濁液回収工程）が、間に待ち時間を生じることなく実行されるため、剥離工程に要する時間を短縮することができる。
【００５７】
５．生存率についての実験結果
図６は、収容部１の底面に対する細胞２１の接着タンパクの結合が切断された後、収容部１に培地を供給してから培地攪拌工程が開始されるまでの静置時間と細胞２１の生存率との関係を示した図である。この図６に示した実験結果によれば、静置時間がない場合の細胞２１の生存率と比較して、培地供給後に１ｍｉｎ静置してから培地攪拌工程を開始したときの細胞２１の生存率は５．１％低下し、培地供給後に５ｍｉｎ静置してから培地攪拌工程を開始したときの細胞２１の生存率は９．６％低下している。これは、時間経過とともに細胞２１が収容部１の底面に再度接着することによるものであり、静置時間はできるだけ短時間（例えば４０秒未満）であることが好ましい。
【００５８】
図７Ａは、試薬反応工程を実行している時間に収容部１を３７℃に温調した場合（プレート加温）と、従来の培養作業時のように温度変化がある場合（コントロール）とで、それぞれ測定温度の経時的変化を示した図である。また、図７Ｂは、図７Ａのそれぞれの場合における細胞２１の生存率を示した図である。図７Ａに示すように、収容部１を温調した場合には、収容部１の温度が２℃以内の温度差で保たれ、その結果、図７Ｂに示すように、細胞２１の生存率が従来よりも改善していることが確認できる。なお、収容部１の温調を行った場合（プレート加温）と温度変化がある場合（コントロール）の生存率の各データについてｔ検定を行った結果、ｐ＜０．０５となり、有意な差であることが確認できた。
【００５９】
６．変形例
以上の実施形態では、図４Ａにおける培養上清除去工程及び洗浄工程と、図４Ｂにおける培地供給工程、培地攪拌工程及び懸濁液回収工程が、いずれも一連の工程で収容部１ごとに実行されるような構成について説明した。しかし、このような構成に限らず、いずれか一方のみが一連の工程で収容部１ごとに実行されるような構成であってもよい。
【符号の説明】
【００６０】
１    収容部
２    培地
３    皿部材
４    温調機構
５    培地
６    洗浄液
７    試薬
８    液体貯留部
９    シリンジ
１０  制御部
１１  培養上清除去工程実行部
１２  洗浄工程実行部
１３  試薬反応工程実行部
１４  培地供給工程実行部
１５  培地攪拌工程実行部
１６  懸濁液回収工程実行部
１７  温調制御部
２１  細胞
２２  懸濁液
【図１】
2020150843.tif 000003
【図２】
2020150843.tif 000004
【図３】
2020150843.tif 000005
【図４Ａ】
2020150843.tif 000006
【図４Ｂ】
2020150843.tif 000007
【図５Ａ】
2020150843.tif 000008
【図５Ｂ】
2020150843.tif 000009
【図６】
2020150843.tif 000010
【図７Ａ】
2020150843.tif 000011
【図７Ｂ】
2020150843.tif 000012