(57)【要約】      （修正有）【課題】免疫受容体をコードする２以上の遺伝子又は遺伝子産物を回収する方法、更に、発現細胞のライブラリを作製する方法、上記ライブラリをスクリーニングする方法を提供する。【解決手段】２以上の遺伝子又は遺伝子産物は所定のソース細胞中に含まれ、下記の各工程を含む。ａ）ソース細胞をｍＲＮＡ捕捉部位と共にマイクロリアクターに封入する工程、ｂ）前記マイクロリアクター内で前記細胞を溶解し、細胞ｍＲＮＡを該マイクロリアクターのルーメン内に放出させ、これを前記ｍＲＮＡ捕捉部位に結合させる工程、ｃ）前記ｍＲＮＡ捕捉部位に結合したｍＲＮＡを逆転写して対応するｃＤＮＡ遺伝子産物を得る工程、ｄ）免疫受容体のサブユニットをコードする２以上の遺伝子産物を含むコンストラクトを作製する工程、及びｅ）前記ＰＣＲ産物をプラスミドベクターにクローニングして２シストロン性又は多シストロン性の発現コンストラクトを得る工程。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
２つ以上のサブユニットを有する免疫受容体コードする２以上の遺伝子又は遺伝子産物、又はｃＤＮＡを回収する方法であって、前記２以上の遺伝子又は遺伝子産物は所定のソース細胞中に含まれ、下記の各工程を含む上記方法。
ａ）ソース細胞をｍＲＮＡ捕捉部位と共にマイクロリアクターに封入する工程、
ｂ）前記マイクロリアクター内で前記細胞を溶解し、細胞ｍＲＮＡを該マイクロリアクターのルーメン内に放出させ、これを前記ｍＲＮＡ捕捉部位に結合させる工程、
ｃ）前記ｍＲＮＡ捕捉部位に結合したｍＲＮＡを逆転写して対応するｃＤＮＡ遺伝子産物を得る工程、
ｄ）前記免疫受容体のサブユニットをコードする２以上の遺伝子産物を含むコンストラクトを作製する工程、及び
ｅ）前記ＰＣＲ産物をプラスミドベクターにクローニングして２シストロン性又は多シストロン性の発現コンストラクトを得る工程。
【請求項２】
工程ｃ）の後に、前記免疫受容体のサブユニットをコードする２以上の遺伝子産物を含むコンストラクトを増幅する工程を更に有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程ｃ）の後に、下記の各工程を更に含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
（ｉ）ｍＲＮＡ捕捉部位における逆転写によるｃＤＮＡ合成をモニタする工程、及び
（ｉｉ）凝集したｍＲＮＡ捕捉部位を除去する工程。
【請求項４】
工程ｄ）における前記免疫受容体のサブユニットをコードする２以上の遺伝子産物を含むコンストラクトの作製が、オーバーラップ・エクステンションＰＣＲによるｃＤＮＡの増幅により達成される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記コンストラクトを増幅する工程がネスティッドＰＣＲの使用を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
調節エレメントをＰＣＲ産物に挿入する工程を更に含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記マイクロリアクターが、工程ｂ）、工程ｃ）、又は工程ｄ）の後に溶解又は破壊される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
工程ｂ）の後、前記ｍＲＮＡ捕捉部位が適当なプライマーと少なくとも１種類のポリメラーゼとを用いて乳化される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記免疫受容体が、少なくとも２つのサブユニットを有する抗体、又は少なくとも２つのサブユニットを有するＴ細胞受容体である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記免疫受容体が、治療目的のタンパク、診断又は科学研究目的のタンパク、又は産業目的のタンパクである、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
発現細胞のライブラリを作製する方法であって、前記ライブラリにおいて各細胞は、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法で回収された、免疫受容体のサブユニットをコードする２以上の遺伝子又は遺伝子産物を発現可能であり、下記の各工程を含む、上記の方法。
ｇ）２シストロン性又は多シストロン性発現コンストラクトを用いて発現細胞をトランスフェクトする工程、及び
ｈ）上記発現細胞をマイクロリアクターに封入する工程。
【請求項１２】
工程ｈ）における封入の前に、トランスフェクトされた細胞がタンパク発現が可能な条件下でインキュベートされる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
所定のターゲット分子に特異性を示す免疫受容体を発現する１種類の細胞について、請求項１２に記載の方法で作製された発現細胞のライブラリをスクリーニングする方法であって、下記の工程の少なくとも１つを含む上記の方法。
ｉ）マイクロリアクター内に侵入し、そこに含まれる発現細胞によって発現される免疫受容体に結合できる標識化ターゲットを用いる工程、及び／又は
ｊ）マイクロリアクターから既に流出し、今や上清中に存在する発現細胞によって発現される免疫受容体を、マイクロリアクター培養物の逐次分画と組み合わせて検出する工程。
【請求項１４】
請求項１〜１０，１１及び／又は１２〜１３の何れかに記載した工程を含む方法。
【請求項１５】
上記ｍＲＮＡ捕捉部位が、ビーズ又は粒子、好ましくは磁性ビーズ又は粒子である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記ｍＲＮＡ捕捉部位が、その表面に結合したオリゴｄＴ−ＤＮＡ配列を含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
上記２シストロン性又は多シストロン性発現ベクターが、ＩＲＥＳ（内部リボソーム侵入部位）配列との組み合わせを伴う、又は伴わない２Ａペプチド結合多シストロン性ベクターである、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
各マイクロリアクターが１個のソース細胞を含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記マイクロリアクターが、
・ハイドロゲル形成ポリマー、好ましくはポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロリド）、ポリ（エチレンイミン）、ポリリジン、ポリアクリルアミド及び／又はアクリル酸、
・セルロース誘導体、好ましくはカルボキシメチルセルロース及びセルロースエステル、及び／又は
・多糖類、好ましくはアガロース、アルギン酸（alginates）、カラギーナン、ペクチン酸(pectinates)及び／又はキトサン、
から成る群より選択される材料を含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記マイクロリアクターが、水／油（water/oil）エマルジョン中の水滴として形成される、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記マイクロリアクターが、１０μｍ以上１０００μｍ以下の直径ヲ有する、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記マイクロリアクターが、０．５２ｐｌ以上５２３ｎｌ以下の容量を有する、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
前記マイクロリアクターが楕円体形状を有する、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
前記ソース細胞が細胞のコレクションに由来するものであり、前記コレクションンのメンバーが、異なる免疫受容体用の遺伝子産物を含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
前記ソース細胞が、未成熟又は成熟したＢ細胞又はＴ細胞から成る群より選択される哺乳類細胞である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
前記ソース細胞は１種以上のドナーから採取される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
前記免疫受容体のサブユニットをコードする２以上の遺伝子又は遺伝子産物が、
・Ｉｇ重鎖遺伝子（ＶＤＪ再構成）及びＩｇ軽鎖遺伝子（ＶＪ再構成）、又は
・ＴＣＲα鎖遺伝子（再構成）及びＴＣＲβ鎖遺伝子（再構成）
である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
・Ｉｇ定常Ｈサブドメイン及び／又はＩｇ定常Ｌサブドメイン、又は
・ＴＣＲα鎖及びＴＣＲβ鎖
をコードするｃＤＮＡをＰＣＲ産物中に挿入する工程を更に含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
前記免疫受容体が疾患の治療又は診断に用いられる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
前記疾患がヒト又は動物の疾患である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記疾患が、
・新生物疾患
・神経変性疾患
・感染症
・免疫介在性疾患、及び／又は
・心血管疾患
から成る群より選択される少なくとも１つである、請求項２９又は３０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は免疫受容体をコードする２以上の遺伝子又は遺伝子産物を回収する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ライブラリ又は天然資源由来のタンパクをコードする遺伝子は、治療、診断、科学研究又は商業目的に利用できる様、単離される場合がある。このことは、特に免疫受容体に当てはまる。
【０００３】
Ｔ細胞及びＢ細胞によってコードされる免疫受容体は、体細胞組換えと呼ばれるプロセスにより生殖細胞系の遺伝子断片のファミリーから組み立てられ、異なる受容体を発現する個々の細胞となる。これらの細胞はその後、親和性成熟と呼ばれる体細胞変異プロセスを経て、さらに免疫受容体の多様性を増大化させている。
【０００４】
かかる免疫受容体がそれをコードする２以上の遺伝子又は遺伝子産物を持つ場合（例えば、抗体とＴ細胞受容体の様に、双方の遺伝子産物が受容体の抗原結合容量に共同的に寄与している場合）、後者が或る適切な発現系内に発現された時に生成したタンパクの本来の正しい機能を保証する上で、これら２以上の遺伝子又は遺伝子産物の当初の対合の維持が重要な鍵となる。
【０００５】
この様な現象は、例えば或る個体のアンチボディオームから個々の免疫グロブリンをコードする各遺伝子を回収する上で極めて重要である。ここで、天然のＢ細胞に見られる様な当初の免疫グロブリンの重鎖と軽鎖（ＩｇＨ＋ＩｇＬ）との対合の維持が、個々の抗体の正しい組換えコピーを産生し、その機能性を保証する上で重要である。ＩｇＨ及びＩｇＬは２つの異なる遺伝子の産物であり、双方共、或る抗体の特異性を決定するのに必要である。各Ｂ細胞は個別のＩｇＨ＋ＩｇＬの組合せを発現しており、これによって固有の抗体特異性を備えている。
【０００６】
別の例としてＴ細胞受容体−融合タンパクが挙げられる。これは、Ｔ細胞受容体から誘導され、アルファ鎖とベータ鎖（α鎖とβ鎖）から成り、機能性のためには両者の正しい対合が同様に必要とされる。
【０００７】
ヒトＢ細胞から免疫グロブリン遺伝子を単離し、様々な種類のモノクローナル抗体を生成する組換え方法はファージ・ディスプレイを始め種々知られているが、これらの方法では免疫グロブリンの重鎖と軽鎖がランダムに対合する。
【０００８】
抗体クローニング法には、当初の免疫グロブリンの重鎖と軽鎖との対合の情報が、多様性の源として選択したドナーから単離されたＢ細胞内に存在するかの様に保たれる、という特有の利点がある。特に、これら標準的（オーセンティック） な抗体は、生体内の選別プロセスを経て宿主に有害な作用を及ぼすおそれのある特異性を既に失っているものと考えられる。
【０００９】
更に、同族の（cognate）ＩｇＨ対合及びＩｇＬ対合を有する抗体は、親Ｂ細胞のオリジナルの特異性を示すことに加え、ランダムに対合したＩｇＨとＩｇＬとから成る抗体に比べて、より高い安定性、より高い発現性、その他の好ましい物理化学的性質を備えている。これら好ましい性質は、スクリーニングや大量生産に際して重要である。
【００１０】
モノクローナル抗体を特にヒトＢ細胞から得ようとする試みは、これまで様々なＢ細胞クローニング技術で行われている。ここで、Ｂ細胞は刺激されて、分割(divide)し、及び／又は抗体を産生するが、或る目的の抗体を産生する単独のＢ細胞、又はＢ細胞の混合物を同定するためには、上記のような産生が必要である。目的の抗体を発現するＢ細胞クローンの同定は限界希釈クローニング等の細胞クローニング法 、又は、細胞刺激と、分子クローニング工程とそれに続く公知の適当な方法により組み換え的に発現された抗体を用いる反復スクリーニング法とを組み合わせた方法で行われる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
ハイブリドーマ技術等の細胞クローニング法は、クローニング効率が１％未満と低い場合が多く、目的の抗体が非常に大量のＢ細胞により発現されている場合（感染時やワクチン接種後など）のみ有効である。しかし、これは厳しい制限である。なぜなら抗体は、Ｂ細胞数に富む状態を生み出せる感染その他の条件には関与しない標的に対して産生されるものと一般に考えられているからである。その例は、免疫介在疾患、神経変性疾患、又はがんに見られる。
【００１２】
したがって、例えばＢ細胞の提供から標準的な抗体レパートリーの分子クローニングを行う技術は、単一細胞レベルで実施できることが必要である。これまでのところ、１０万種以上もの異なる抗体特異性に対する完全アンチボディオームを十分なスループットで、且つ現実的なコストと所要時間で実施できる単一Ｂ細胞からの抗体の分子クローニングは、未だ実現されていない。
【００１３】
本発明の１つの目的は、免疫受容体をコードする２以上の遺伝子又は遺伝子産物の回収を容易化することである。
【００１４】
本発明の他の目的は、そのタンパク質が治療、診断、科学研究又は産業目的に用いる際に有用である２以上の遺伝子又は遺伝子産物でコードされている免疫受容体を送達する方法を提供することである。
【００１５】
本発明の更に他の目的は、そのタンパク質が、所望の抗原との結合能以外の性質によるバイアスを全く、或いは少なくとも最小限しか受けない、２以上の遺伝子又は遺伝子産物でコードされている免疫受容体を産生し得る方法を提供することである。
【００１６】
本発明の更に他の目的は、免疫受容体をコードする２以上の遺伝子又は遺伝子産物の単一細胞内における当初の対合を、単離中にも維持できる様にすることにある。
【００１７】
本発明の更に他の目的は、２以上の遺伝子又は遺伝子産物、又はそのｍＲＮＡでコードされる免疫受容体の発現能を有する細胞ライブラリのスクリーニングにおいて、そのスループットを高めることにある。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明を詳述するに先立ち、以下に述べる装置や方法は変更される場合があり、したがって本発明は、ここに述べる装置類の特定の部材や方法の各工程に限定されないことを断っておく。また、ここで用いる用語は特定の実施例を既述する目的のみに用い、発明を限定する意図は何ら無いものとする。更に、明細書本文と特許請求の範囲において単数形で記載される名詞は、その文脈中で明示されない断り単数及び／又は複数の意味で用いるものとする。更にまた、パラメータの範囲が数値限定されている場合、その範囲はその両端の数値を含むものとする。
【００１９】
本発明の一側面によれば、２つ以上のサブユニットを有する免疫受容体をコードする２以上の遺伝子又は遺伝子産物、又はｃＤＮＡを回収する方法であって、上記２以上の遺伝子又は遺伝子産物は単一のソース細胞に含有される方法が提供される。該方法は以下の各工程、即ち
ａ）ソース細胞をｍＲＮＡ捕捉部位と共にマイクロリアクターに封入する工程、
ｂ）上記マイクロリアクター内で上記細胞を溶解し、細胞ｍＲＮＡを該マイクロリアクターのルーメン内に放出させ、これを上記ｍＲＮＡ捕捉部位に結合させる工程、
ｃ）上記ｍＲＮＡ捕捉部位に結合したｍＲＮＡを逆転写して対応するｃＤＮＡ  遺伝子産物を得る工程、
ｄ）上記免疫受容体のサブユニットをコードする上記２以上の遺伝子産物を含むコンストラクトを作製する工程、
ｅ）上記ＰＣＲ産物をプラスミド・ベクターにクローニングして２シストロン性又は多シストロン性の発現コンストラクトを得る工程、
を含む。
【００２０】
このようにして、或るソース細胞集団の免疫受容体をコードする複数のｃＤＮＡを含むプラスミド・ライブラリが作製される。
【００２１】
本明細書中で述べる「免疫受容体」とは、２つ以上のサブユニットを持ち、或るターゲット分子、好ましくはタンパクに特異的に結合することができるタンパクを示す語である。かかる免疫受容体とは、例えば重鎖と軽鎖を持つ抗体であり、或いはアルファ鎖とベータ鎖を持つＴ細胞受容体である。
【００２２】
本明細書中で述べる「ターゲット分子」とは、治療、診断、解析、科学研究、又は産業目的等のために免疫受容体が作製される際の標的となる分子を包含する。ターゲット分子には、ペプチド、タンパク、糖タンパク，炭水化物、核酸、タンパク−核酸複合体、低分子、特に受容体タンパク、サイトカイン、タンパク凝集体（特にβアミロイド、タウタンパク又はα−シヌクレイン等の病理学的凝集体）、ＭＨＣ−抗原性ペプチド複合体等のタンパク複合体、及び構造タンパクが包含される。
【００２３】
本明細書中で述べる「或るターゲット分子に対する特異性」とは、免疫受容体が或るターゲットとは反応するが、その他とは反応しない能力を指す。特異性は化学組成、物理力、及び結合部位の分子構造に依存する。
【００２４】
本明細書中で述べる「ソース細胞」とは、免疫受容体又はそのｍＲＮＡを発現する能力を有する細胞、即ち、免疫受容体をコードする遺伝子の供給源となる細胞を指す。これは例えば天然物、例えばドナーから単離される細胞または細胞のコレクションに関するものでもよく、これらは例えばドナー由来であって互いに異なる抗体をコードする複数のＢ細胞であってよい。同様に、ソース細胞はドナー由来であって互いに異なるＴ細胞受容体をコードする複数のＴ細胞であってよい。
【００２５】
したがって、上記抗体又はＴ細胞受容体をコードする２以上の遺伝子又は遺伝子産物又はｃＤＮＡは、更に将来の使用に備えて回収されるものである。
【００２６】
本明細書中で述べる「マイクロリアクター」とは、上記ソース細胞を３次元的に封入できる物理的な構造物である。好ましい実施態様において、このマイクロリアクターは楕円体形状を有し、自由浮遊型であり、微小環境内又は微小流体環境内で取り扱うことができる。
【００２７】
本明細書中で述べる「ｍＲＮＡの逆転写」とは、とりわけ逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲとも言う）を指し、１本鎖ｍＲＮＡテンプレートが２本鎖ＤＮＡ（ｃＤＮＡと呼ばれることもある）に転写される。
【００２８】
ここで重要なことは、この方法では２つ以上のサブユニットを有する免疫受容体をコードする２以上の遺伝子又は遺伝子産物を同時に回収できることである。したがって、２以上のサブユニットの特異的な組合せが、本発明の主題であるプロセス全体を通じて維持される。このことは、例えば互いに特異的な軽鎖と重鎖とから成る 免疫グロブリン系抗体に当てはまり、これら各鎖の特異的対合は各抗体が正しく機能する上で必須である。本発明者らはこの性質を本発明の特異的な利点と考えている。なぜなら、従来のどの方法も重鎖と軽鎖の特異的対合を維持することができず、抗体を機能不全に陥らせる可能性があるからである。
【００２９】
上記ソース細胞は細胞ライブラリ等の細胞コレクション、及び／又はドナー等の天然物から単離された細胞のコレクションに由来する細胞でもよい。好ましい実施例において、このコレクション又はライブラリは、１００万種類までの細胞（したがって１００万種類までの抗体をコードできる）を含むことができる。
【００３０】
免疫受容体の異なるサブユニットをコードするｍＲＮＡは、まず捕捉部位への付着により空間的に連結し、続いてオーバーラップ・エクステンションＰＣＲにより物理的に結合するという事実、及び／又は、ＰＣＲ産物が、免疫受容体の異なるサブユニットをコードする２以上のｃＤＮＡを含む２シストロン性又は多シストロン性発現コンストラクトにクローニングされるという事実により、２以上の遺伝子又は遺伝子産物が一緒に処理されて回収され、２つ以上のサブユニットの上記の特異的な組合せがプロセス全体を通じて保持される。
【００３１】
オーバーラップ・エクステンションＰＣＲ（以下、ｏｅＰＣＲと称する）は、ＰＣＲの一変法である。この手法は、小さな ＤＮＡ断片を大きなポリヌクレオチドに結合させる為に用いられる (Embletonら、１９９２）。
【００３２】
多くのＰＣＲ反応におけると同様、１本のヌクレオチドの増幅には２つのプライマーを用いる（両端に１本ずつ）。２つのＤＮＡ分子を連結するには、連結させたい端部にそれぞれ特殊なプライマーを用いる。即ち、各分子について、連結させたい端部におけるプライマーは、その５’オーバーハングがもう一方の分子に対して相補的となる構造を有している。アニーリングに引き続き複製が開始すると、ＤＮＡは連結の相手の分子に対して相補的な新しい配列を作りながら伸長する。２つのＤＮＡ分子の増幅が臨界濃度に達すると、これら２つの別々の遺伝子は２つの相補的なプライマー配列がアニールした場所で対合する。
【００３３】
導入された相補的オーバーラップ配列はヘテロ２本鎖を伸長させるためのプライマーとして機能し、これら２つの配列を融合する。これらのヘテロ２本鎖は２つのプライマーをアニールすると、新たに形成されたヘテロ２本鎖の自由端（連結プロセスに関与しない部分）で更に増幅される。
【００３４】
所望により追加の増幅工程を、２つの別々の遺伝子の各自由端に対して特異的なネスティッド(nested)プライマーを用いる２回目のＰＣＲにおいて実施する。
【００３５】
この方法は、制限エンドヌクレアーゼ（又はリガーゼ）を必要としない点で、他の遺伝子連結方法に優る。したがって、ｏｅＰＣＲによれば、ｍＲＮＡ捕捉マトリクス・ビーズ上の２つの別々の遺伝子の単なる「空間的配位」が共有結合へと変化し（confirmation /transformation）、 １本のヘテロ２本鎖ＤＮＡが形成される。
【００３６】
好ましくは、工程ｃ）の後に追加の品質管理工程を行い、この工程でｍＲＮＡ捕捉部位へのｍＲＮＡの結合の均一性を評価してもよい。特に好ましい実施態様において、この捕捉部位にはｍＲＮＡが結合しておらず、２つ以上の該部位の凝集物はこの工程で除去される。
【００３７】
好ましい指標に照らせば、３０％以上のｍＲＮＡ捕捉部位にｍＲＮＡが結合しており、より好ましくは４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、最も好ましくは９０％以上のＲＮＡ捕捉部位にｍＲＮＡが結合している。
【００３８】
好ましくは、工程ｄ）の後に、追加の品質管理工程を行い、この工程で異なるサブユニットをコードする２以上の遺伝子又は遺伝子産物の分布均一性を評価してもよい。好ましい指標に照らせば、３０％以上のｍＲＮＡ捕捉部位がクローン化可能な増幅産物（ｃＤＮＡ）を含む。より好ましくは４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、最も好ましくは９０％以上のｍＲＮＡ捕捉部位がクローン化可能な増幅産物を含む。
【００３９】
好ましくは、工程ｄ）の後に、追加の品質管理工程を行い、対合したＩｇＨ遺伝子及びＩｇＬ遺伝子の多様性を、例えば結合したサブユニット又は遺伝子の代表的なサンプルのシーケンス解析でそれぞれ調べることにより、交差汚染率を評価してもよい。好ましい指標に照らせば、後者は３５％以下である。交差汚染率は、より好ましくはクローン化可能な増幅産物を含むｍＲＮＡ捕捉部位の３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、最も好ましくは５％以下である。
【００４０】
工程ｃ）では、ｍＲＮＡを捕捉し逆転写の準備を行う（prime）為の核酸分子の選択は、例えばｍＲＮＡ捕捉部位によって支配される。実施態様によっては、後者はオリゴｄＴプライマー又はランダムヘキサマープライマーなどの、或る細胞の全ｍＲＮＡに対して相補的である特異的な捕捉能を示す核酸配列を示す場合がある。
【００４１】
他の実施態様において、ｍＲＮＡの捕捉と逆転写の準備に用いられる核酸分子を、特定のｍＲＮＡだけが転写される様に、例えば、或る免疫グロブリンのＨＣとＬＣをコードするｍＲＮＡのみが転写される様に、設計してもよい。
【００４２】
好ましい実施態様によれば、本発明の方法は工程ｃ）の後に、免疫受容体のサブユニットをコードする２以上の遺伝子産物を含むコンストラクトを増幅する工程を備えてもよい。
【００４３】
こうした目的には、特異的なＰＣＲプライマーが用いられる。例えば、或る抗体をコードするコンストラクトを増幅するには、Ｖ（Ｄ）Ｊ再構成（軽鎖ｃＤＮＡ遺伝子産物が下流側に続くと想定）後、再編成（Ｖ（Ｄ）Ｊ再編成）免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖ｃＤＮＡの可変領域（ｖ領域）に特異的なプライマーを用いることができる。この目的に適した特異的ＰＣＲプライマーは、例えばWardemannら (2003)が報告している。
【００４４】
工程ｃ）の後には同様に品質管理工程を追加することが好ましく、その工程は下記の各工程、即ち
（ｉ）ｍＲＮＡ捕捉部位におけるｃＤＮＡ合成をモニタする工程、及び
（ｉｉ）凝集したｍＲＮＡ捕捉部位を除去する工程、
を含んでよい。
【００４５】
この手法によれば、ＨＣ／ＬＣ対合の中断に繋がりかねない異なるマイクロリアクターに由来する２つ以上のｍＲＮＡ捕捉部位間のクロストークを排除することができる。
【００４６】
ｍＲＮＡ捕捉部位におけるｃＤＮＡの合成のモニタリングは、例えば逆転写ＲＴ−ＰＣＲで用いられる方法と同様の方法で行うことができ、この場合のＲＴ−ＰＣＲの進行は、例えば一端に蛍光レポーター、他端にクエンチャーを有し、マトリクスに結合するＤＮＡプローブを用いてモニタされる。
【００４７】
本発明の他の好ましい実施態様によれば、工程ｄ）で上述した免疫受容体のサブユニットをコードする２以上の遺伝子産物を含むコンストラクトの作製は、オーバーラップ・エクステンションＰＣＲでｃＤＮＡを増幅することで達成できる。
【００４８】
本発明の他の好ましい実施態様によれば、コンストラクトを増幅する工程はネスティッド（nested）ＰＣＲ（以下、ｎＰＣＲとも称する）の使用を含む。
【００４９】
この手法によれば、工程ｅ）で上述した様に、増幅されたＰＣＲ産物を供給することでクローニング用に十分量のｃＤＮＡのコピーが利用可能となるのみならず、適切な制限部位を導入し十分な特異性を与えることにより、免疫受容体のサブユニットをコードする２以上の遺伝子産物のみを増幅することができる。
【００５０】
ネスティッドＰＣＲは、予期されないプライマー結合部位の増幅による生成物における非特異的結合を減ずることを目的とした、ポリメラーゼ連鎖反応の一変法である。ポリメラーゼ連鎖反応そのものは、温度介在性ＤＮＡポリメラーゼを介したＤＮＡサンプルの増幅に用いられるプロセスである。この産物は配列決定や解析に用いることができ、多くの遺伝子研究室において重要な役割を担っている他、科学捜査その他のヒト遺伝学的案件におけるＤＮＡ鑑定にも利用されている。従来のＰＣＲでは、ターゲットＤＮＡの両末端に対して相補的なプライマーが必要であった。しかし、これらプライマーがＤＮＡの正しくない領域に結合し、予想外の産物が生成するという共通の問題があった。ネスティッドポリメラーゼ連鎖反応では２組のプライマーが、２回連続して行われるポリメラーゼ連鎖反応の中で用いられる。２番目の組は、最初のＰＣＲラン産物中に含まれる二次ターゲットを増幅するための物である。
【００５１】
本発明の他の好ましい実施態様によれば、本発明の方法は更に、ｃＤＮＡの発現を助ける調節エレメントをＰＣＲ産物中に導入する工程を含む。この調節エレメントとは、例えば開裂部位、シグナル・ペプチド、又はプロモーターである。
【００５２】
本発明の他の好ましい実施態様によれば、上記マイクロリアクターは工程ｂ）、工程ｃ）、又は工程ｄ）の後に溶解又は破壊される。
【００５３】
マイクロリアクターがアルギン酸から成る場合（本明細書に記載の通り）、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を加えて媒質中の２価陽イオン（例えばＣａ２＋）の力価を下げることで、これを溶解できる。ここで、アルギン酸は、そのゲル様状態を保つことが必要である。或いは、アルギン酸（alginates）を消化する酵素、アルギナーゼを用いてもよい。
【００５４】
アルギナーゼはβ−Ｄ−マンヌロン酸残基を含む多糖類の開裂を触媒するポリ（β−Ｄ−マンヌロン酸）リアーゼ であり、末端に４−デオキシ−α−Ｌ−エリスロ−ヘキサ−４−エノピラヌロノシル基を有するオリゴ糖を産する。アルギナーゼはリアーゼのファミリーに属し、その系統名はポリ（β−Ｄ−１，４−マンヌロニド）リアーゼである。他にも、アルギン酸リアーゼＩ、アルギン酸リアーゼ、アルギナーゼＩ、アルギナーゼＩＩ等の常用名がある。
【００５５】
ｍＲＮＡ捕捉部位は或るソース細胞の全ｍＲＮＡを捕捉することができるので、注目する免疫受容体のサブユニットをコードする２以上の遺伝子又は遺伝子産物、又はｃＤＮＡの細胞特異的な対合を確認する決定工程は、細胞性の全ｍＲＮＡがｍＲＮＡ捕捉部位に結合するのとほぼ同時に達成される。前述した様に、この特異的な対合は、注目する個々の免疫受容体が正しく機能する上で必須である。
【００５６】
ところで、マイクロリアクターの溶解（但し、注目する免疫受容体のサブユニットをコードする２以上の遺伝子又は遺伝子産物、又はｃＤＮＡの細胞特異的な対合の喪失はない）の最も早いタイミングは、工程ｂ）の後である。その理由は、全ての細胞性ｍＲＮＡ（注目する免疫受容体をコードするｍＲＮＡを含む）が、そこに存在するｍＲＮＡ捕捉部位に捕捉されることになるからである。
【００５７】
好ましくは、マイクロリアクター１個当たり、１個以上１００個以下のｍＲＮＡ捕捉部位が用いられる。より好ましくは、マイクロリアクター１個当たり、５個以上５０個以下のｍＲＮＡ捕捉部位が用いられる。
【００５８】
実施態様によっては、この後の各工程、即ち（ｉ）ｍＲＮＡ捕捉部位に結合したｍＲＮＡを逆転写して対応するｃＤＮＡ遺伝子産物を得る工程（工程ｃ）、（ｉｉ）免疫受容体のサブユニットをコードする２以上の遺伝子産物を含むコンストラクトを作製する工程（工程ｄ）、及び／又は（ｉｉｉ）ＰＣＲ産物をプラスミドベクターにクローニングして２シストロン性又は多シストロン性の発現コンストラクトを得る工程（工程ｅ）は、溶液中で行うことができる。即ち、マイクロリアクターの外部で、注目する免疫受容体のサブユニットをコードする２以上の遺伝子又は遺伝子産物、又はｃＤＮＡの特異的対合が失われるおそれの無い状態で、行うことができる。
【００５９】
或いは他の実施態様において、これらの各工程の一部または全てをマイクロリアクター中で行ってもよい。
【００６０】
本発明の他の好ましい実施態様において、工程ｂ）の後、ｍＲＮＡ捕捉部位は適当なプライマーと少なくとも１種類のポリメラーゼとを用いて乳化される。
【００６１】
この目的の為、ｍＲＮＡ捕捉部位（例えば、ポリ（ｄＴ）結合磁性ビーズ）にアニールされたｍＲＮＡを回収し、洗浄し、プライマー、逆転写酵素及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼで乳化してＲＴ−ＰＣＲを行い、その後必要に応じてｏｅＰＣＲを行うことが好ましい。
【００６２】
この様なプロセスは、例えば細胞性ｍＲＮＡを捕捉したポリ（ｄＴ）結合磁性ビーズを磁性ラック上でペレット化することで実現でき、その後洗浄と再懸濁を行う。ビーズは次に適当なＲＴ−ＰＣＲ混合物中に懸濁させ、得られた懸濁物を油相を満たした撹拌槽に投入する。生成した乳化物を適当なＰＣＲプレート又はチューブに注入し、サーマルサイクラーに収容する。
【００６３】
本発明の他の好ましい実施態様において、免疫受容体は少なくとも２つのサブユニットを有する抗体か、又は少なくとも２つのサブユニットを有するＴ細胞受容体である。抗体においては、サブユニットは重鎖と軽鎖である一方、Ｔ細胞受容体様抗体においては、サブユニットはアルファ鎖とベータ鎖である。
【００６４】
本明細書中で述べる「抗体」とは、基本的に免疫グロブリン概念に基づく免疫受容体を指すものとする。ソース細胞、即ち免疫受容体の発現能を有する細胞から単離された時点では、この抗体はまだ当初のＩｇ型（ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、及び／又はＩｇＭ）を有している。好ましくは、これは既述のスクリーニング・プロセスの対象となる型でもあり、該プロセスでは発現細胞のライブラリをスクリーニングすることで、或る１つのターゲット分子に特異性を有する１つの免疫受容体を発現する１種類の細胞を検出する。
【００６５】
但しこれは、その後治療、診断、解析、科学研究または産業目的に用いられるこの免疫受容体がこの型を維持していることを意味するものではない。該免疫受容体はｓｃＦｖ、Ｆａｂ、及び／又はＦ（ａｂ）などの断片や誘導体として存在してもよい。同様に、その後、治療、診断、解析、科学研究または産業目的に用いられるこの免疫受容体は新しい抗体型を有していてもよく、この型としては二重又は三重特異性抗体コンストラクト、ダイアボディ（Diabody）、ラクダ科動物抗体（Camelid Antibody）、ドメイン抗体、ｓｃＦｖｓから成る２本鎖を持つ２価のホモダイマー、ＩｇＡ（Ｊ鎖と分泌成分とで連結された２つのＩｇＧ構造）、サメ抗体、新世界霊長類フレームワークと非新世界霊長類ＣＤＲとから成る抗体、ＣＨ３＋ＶＬ＋ＶＨを含む二量化コンストラクト、及び抗体コンジュゲート（毒素、サイトカイン、放射性同位体又は標識物質と結合した抗体又は断片又は誘導体等）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００６６】
当初のＩｇ型を保ち所定の標的に対する特異性を有することが判明している所定の抗体を、如何にして上述のような断片や誘導体に、又は上述の新しい抗体型に翻訳するかは、当業者の知る所である。
【００６７】
別の好ましい型として、「リバースキメラ型」が挙げられる。これは、本発明の方法で得たヒト抗体からヒト可変領域を単離し、これを非ヒト定常領域（例えばネズミ定常領域）に融合したものである。特定の診断、解析、科学研究又は診断用途において、非ヒト抗体（特にネズミ抗体やウサギ抗体）を用いる解析手順、組織学的手順、スクリーニング手順等のインフラがひと通り整備されている場合、或いは標識化抗マウス抗体を標的特異的検出抗体（即ち、ネズミであって、ネズミＦｃ領域を有する）の標識化に用いる場合に、このリバースキメラ型は特段の威力を発揮する。この様な環境では、完全なヒト検出抗体はその他の環境に適合しない場合がある。
【００６８】
本発明の方法で得たヒト可変領域から作られたリバースキメラ型は、本発明の長所 （重鎖と軽鎖の対合が維持されることによる優れた結合能）と、従来の標準的な解析手順、組織学的手順、スクリーニング手順への産生抗体の適合性とを合体させたものである。
【００６９】
かかるリバースキメラはキメラ抗体と同様に作製することができ、例えばBoulianneら (1984) やMorrissonら (1984)が論じている確率された組換え法によって作製可能である。
【００７０】
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）はＴリンパ球の表面に見られる分子である。Ｔ細胞受容体は、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子に結合した抗原の認識をつかさどる。Ｔ細胞受容体は通常、アルファ（α）鎖とベータ（β）鎖という２つの異なるタンパク鎖から成る（但し、５％のＴリンパ球では、Ｔ細胞受容体はガンマ（γ）鎖とデルタ（δ）鎖から成る）。
【００７１】
ＴＣＲが抗原性標的及びＭＨＣと結合すると、Ｔリンパ球は関連酵素、共同受容体、特化したアダプター分子、及び活性化または放出された転写因子が関与する一連の生化学的事象を通じて活性化される。
【００７２】
組換えＴ細胞受容体融合タンパクは近年、ペプチドと主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）との複合体として細胞表面に存在するペプチド抗原に狙いを定める手段であることが明らかになった。
【００７３】
この目的のため、例えばＴＣＲを免疫刺激因子に融合させることで、Ｔ細胞受容体の可溶性変異体を作製することができる。これら融合タンパクは、元々存在する細胞内抗原に狙いを定める為に用いることができる。この様な細胞内抗原は、他の標的療法、特に抗体によっては感知されない。この手法によれば、癌特異的抗原に特化したＴ細胞受容体の可溶性変異体を用いて種々の癌を標的とすることができる (Cardら、2004)。
【００７４】
本発明の他の好ましい実施態様において、上記免疫受容体は治療用タンパク（例えば、疾患の治療用又は予防用にヒト又は動物被験体に用いられるタンパク）、診断又は科学研究用タンパク（例えば、被験物質の検出に用いられるタンパク）、又は商業用タンパク（例えば、 所定の化合物の単離や生成等、工業プロセスで用いられるタンパク）である。
【００７５】
本発明の他の側面によれば、発現細胞のライブラリを作製する方法が提供される。上記ライブラリの各細胞は、請求項１に記載の方法で回収された、免疫受容体のサブユニットをコードする２以上の遺伝子又は遺伝子産物を発現させることができる。本方法は下記の工程、即ち
ｇ）２シストロン性又は多シストロン性発現コンストラクトを用いて発現細胞をトランスフェクションする工程、及び
ｈ）上記発現細胞をマイクロリアクターに封入する工程、
を含む。
【００７６】
上述した通り、これらマイクロリアクターは基本的にソース細胞、即ち注目する免疫受容体又はそのｍＲＮＡを発現させる能力のある細胞 に用いたものと同様である。但し、好ましい一実施態様において、発現細胞はカプセル化後に膨張するので、これらマイクロリアクターはより大きなサイズであっても良い。
【００７７】
これらの発現細胞は、治療用、診断用、解析用、科学研究用又は産業用タンパクの異種発現に通常用いられる細胞であることが好ましい。ここで「発現細胞」の語は、細菌細胞 (大腸菌等)、 真菌細胞（ピキア、アスペルギルス、サッカロミセス、 シゾサッカロミセス、ハンゼヌラ、Arxula、トリコデルマ等）、哺乳類細胞（ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨＥＫ、ＨｅＬａ、３Ｔ３、ＮＳＯ又はＨｅｐＧ２、ＰＥＲ．Ｃ６等）、又は昆虫細胞を包含する意味である。
【００７８】
本発明において、「ソース細胞」及び「発現細胞」とは互いに異なる別物であることに注意を要する。ソース細胞は、所定のタンパクをコードする 遺伝子の供給源となる細胞を意味し、例えばドナー等の天然物から単離される単独の細胞、又は細胞のコレクションである。
【００７９】
これに対し「発現細胞」とは、上記免疫受容体を発現させるための本発明の方法に実際に用いられる細胞であり、免疫受容体を大量に取得し、使用する前に免疫受容体を精製するためのものである。
【００８０】
工程ｇ）では、各発現細胞に２シストロン性又は多シストロン性発現コンストラクトが１つだけトランスフェクションされることが好ましい。これは、当業者には良く知られた限界希釈法で達成されることが好ましい。
【００８１】
同様に工程ｈ）では、各マイクロリアクターに発現細胞が１個だけ封入されることが好ましい。これは、１００％より遙かに少ない細胞数、例えば細胞数の１０％又は細胞数の３０％に形質移入が行われるように細胞当たりのウイルス粒子数を決定することで達成されることが好ましい（限界希釈法）。
【００８２】
封入された発現細胞は、タンパク発現、及び／又は細胞増殖が進行する条件下で培養されることが好ましい。
【００８３】
好ましい一実施態様において、工程ｈ）における封入の前に、トランスフェクションされた細胞をタンパク発現が可能な条件下でインキュベートすることが好ましい。この実施態様によれば、機能不全を来した細胞や導入遺伝子（例えば、マーカー遺伝子（蛍光マーカー／表面マーカー）と結合された免疫受容体）を発現しない細胞を選別除去することができる。
【００８４】
工程ｇ）又は工程ｈ）の後には品質管理工程を追加的に行うことが好ましく、この工程で感染細胞が、機能的な抗体を発現できるか否かをチェックする。
【００８５】
本発明の他の側面によれば、前述の方法で作製された発現細胞のライブラリをスクリーニングする方法が提供される。この方法は、所定のターゲット分子に特異性を示す免疫受容体を発現する１種類の細胞（又はマイクロリアクター内に存在するその純系の子孫）を検出する方法であり、該方法は下記の工程の少なくとも１つを含む。
ｉ）マイクロリアクター内に侵入し、そこに含まれる発現細胞によって発現される免疫受容体に結合できる標識化ターゲットを用いる工程、及び
ｊ）マイクロリアクターから既に流出し現在は上清中に存在する発現細胞によって発現される免疫受容体を、マイクロリアクター培養物の逐次分画で検出する工程、
の少なくとも１つを含む。
【００８６】
後者に関しては、本発明で意味するところの免疫受容体を検出できる樹立されたスクリーニング技術を用いることができる。
【００８７】
前者に関しては、マイクロリアクター内の免疫受容体の濃度は、上清液体中の濃度よりも早くピーク・レベルに達するので、この様な免疫受容体の保持時間をスクリーニングに利用することができる。この場合、マイクロリアクター内で抗体特異性の検出を行う前に、洗浄工程を設けてマイクロリアクターを取り巻く上清液体中の免疫受容体濃度を低下させる。蛍光標識抗原と結合して染色陽性となったマイクロリアクターを選別し、例えば更なる確認の為のスクリーニング用にそのまま残すか、又は破壊して抗体反応性／特異的な細胞クローンの更なる成長、又はモノクローナル抗体の産生に用いる。
【００８８】
後者に関しては、マイクロリアクター培養物を沈降させるか又は遠心することでマイクロリアクターを取り巻く上清を回収し、これを直接分析して目的の機能又は他の性質を備えた免疫受容体の存在を確認する。
【００８９】
各例において、個々の発現細胞に発現する免疫受容体が標識化ターゲットに対する特異性を備えていれば、個々の実験結果は陽性（「当たり」）である。 
【００９０】
ターゲットを標識化するための標識は、放射性同位体、酵素、発光体、蛍光体、燐光体、金属含有粒子 (例えば、金含有粒子）、Ｘ線濃厚物(X-ray dense entity)、抗体等から成るものであってよい。適切な標識は、もっぱら当業者が適宜に選択し得るものである。
【００９１】
本発明には３通りの方法（サブステップとも称する）が含まれると理解され、これらは共通の発明の思想によって相互に関連付けられるものである。その方法とは即ち、（ｉ）或る免疫受容体をコードする２以上の遺伝子又は遺伝子産物、又はｃＤＮＡを回収する方法、（ｉｉ）回収された遺伝子、又は遺伝子産物、又はｃＤＮＡに基づいて発現細胞のライブラリを作製する方法、及び（ｉｉｉ）かかる発現細胞のライブラリをスクリーニングする方法、である。
【００９２】
これら３方法は各々単独で成立するが、好ましい実施態様において、本発明の方法はサブステップ（ｉ）と（ｉｉ）、（ｉｉ）と（ｉｉｉ）、又は（ｉ）〜（ｉｉｉ）を含んでよい。
【００９３】
本発明の他の好ましい実施態様によれば、上記ＲＮＡ捕捉部位はビーズ又は粒子であり、好ましくは磁性ビーズ又は粒子である。このｍＲＮＡ捕捉部位は、その表面にオリゴｄＴ−ＤＮＡ配列を結合していることが好ましい。
【００９４】
ここで、オリゴｄＴ−ＤＮＡ配列を含む磁性ビーズが好ましい。この種のビーズの一例として、Dynabeads（登録商標）Oligo (dT)25がLife Technologies社より市販されている。オリゴｄＴビーズは、メッセンジャーＲＮＡのｐｏｌｙ−Ａ末端と、ビーズ表面に結合されたオリゴｄＴ配列との塩基対に頼るものである。従って、オリゴｄＴ ビーズは所定の細胞のｍＲＮＡ全体を回収するのに用いられる。アニーリング後に、バイアルを磁石上に置き、ｍＲＮＡを結合したビーズをチューブの側面に濃縮する。不要な夾雑物を含む上清を捨てる。この手順は全ＲＮＡの調製やその他の精製工程を一切必要とせず、１５分以内に完了することができる。ビーズ表面に結合したオリゴｄＴは、ｍＲＮＡの捕捉に利用できると共に、第一鎖ｃＤＮＡ合成における逆転写酵素のプライマーとして働く。
【００９５】
本発明の他の好ましい実施態様によれば、上記２シストロン性又は多シストロン性発現ベクターは、ＩＲＥＳ（内部リボソーム侵入部位）配列を伴う、又は伴わない２Ａペプチド結合多シストロン性ベクターである。
【００９６】
２Ａペプチド結合多シストロン性ベクターは、例えばSzymczakら (2004)が論じている。当業者であれば、他の適当な２シストロン性又は多シストロン性の発現も本発明の範囲に包含され、それ以上の進歩性を要することなく本発明の文脈内で使用可能であることが、容易に理解できるであろう。
【００９７】
本発明で述べるところのマイクロリアクターを調製するための材料と方法は、当業者によく知られている。ａ）適正なサイズのカプセルを作製することができ、且つ ｂ）高度に単分散されたカプセルを作製することができれば、基本的にいずれの方法を用いてもよい。
【００９８】
更に、好ましい実施態様において用いられる材料は、ａ）該材料の存在下で用いた全て又は一部の反応物質に対して所望の透過性を示すカプセルを作製することができ、ｂ）その存在下で採用した全ての反応条件に対して安定なカプセルを作製することができ、且つｃ）カプセル構造内で進行する酵素反応に対する阻害効果が全く無いか、あっても少ない様な、材料である。細胞（単数又は複数）、及び／又は（改変か増幅の少なくとも一方を受けた）核酸（単数又は複数）は、カプセルが溶解されるまでカプセルから離脱できないことは自明である。
【００９９】
本発明の方法を実施するにあたり、用いるカプセル材料は、カプセル構造内で進行する増幅反応又はシーケンス反応などの酵素反応に対して阻害効果が全く無いか、あっても少ない材料とすることが必要であろう。増幅反応やシーケンス反応に対して適切に低い阻害効果を示すカプセル材料は、先に列挙した通りである。封入した細胞を増殖させ得るカプセル材料は数多くある。また、あらゆる反応条件に対して安定なカプセル材料を用いることが更に好ましい。このカプセルは、例えば細胞成長、細胞溶解、インビトロ増幅、或いはＤＮＡシーケンシングに由来する化学的、物理的、機械的ストレスによって分解しないことが好ましい。好ましいカプセル材料については後述する。
【０１００】
より好ましくは、本発明の実施に用いられるマイクロリアクターは、Serp ら (2000)   が論じている単一液滴の形成方法に従って生成される。良好な結果が得られる他の手法として、フローフォーカシング技術 (Cellena（登録商標）、Ingeniatrics Tecnologias 社、スペイン国セビリア）；Gomez-Herreros ら (2012)；  Martinez ら (2012)  が論じているミクロ流体デバイスに内蔵されたフローフォーカシング・ノズル、エマルジョン重合法(One Cell Systems社、米国)；及びPruse ら (1998) が論じているジェットカッター技術が挙げられる。
【０１０１】
本発明で用いられるカプセルは、用いられる反応物質の一部又は全てを透過させ得るポアサイズを有することが好ましい。本発明の方法を実施するに当たり、細胞増殖、異化産物の除去、増幅、標識化、及び／又はシーケンシングに必要な数多くの反応物質、及び精製を支援する反応物質に対して透過性を有するカプセル材料を用いることが好ましい。
【０１０２】
本発明の他の好ましい実施態様において、各マイクロリアクターは１種類のソース細胞、例えば１種類のＢ細胞又は１種類のＴ細胞を含む。マイクロリアクター１個当たりの細胞数は「占有度」（ＤＯＯ）とも呼ばれる。本実施態様では、単一細胞ＲＴ−ＰＣＲを実際に行ってｍＲＮＡを回収する。本実施態様に特有の利点は、前述の如く本法が、２つ以上のサブユニットを持つタンパクの該サブユニットをコードする２以上の遺伝子又は遺伝子産物を１種類の細胞から同時に回収できる一方法である、ということである。
【０１０３】
しかしながら単一細胞ＲＴ−ＰＣＲは、ライブラリ等の細胞コレクションの一部、又はヒト・ドナーから提供されたＢ細胞等の単一種類の細胞からタンパクのサブユニットをコードする２以上の遺伝子又は遺伝子産物を回収する用途や、これに基づいて発現細胞のライブラリを作製する用途にはこれまで用いられて来なかった。それは、単一細胞ＲＴ−ＰＣＲを高スループットな諸方法と組み合わせることが出来なかったからである。
【０１０４】
このため、単一細胞ＲＴ−ＰＣＲは、２つ以上のサブユニットを持つタンパクの該サブユニットをコードする２以上の遺伝子又は遺伝子産物を回収するプロセスのボトルネックと考えられてきた。
【０１０５】
但し、各マイクロリアクターがソース細胞を１個だけ含むことを特徴とする、好ましい本実施態様は、発現細胞の封入に用いられるマイクロリアクターには当てはまらない。
【０１０６】
ソース細胞、好ましくは１個のソース細胞を封入するのに用いられるマイクロリアクターは、所謂フィーダー細胞を含んでもよい。フィーダー細胞とは免疫受容体またはそのｍＲＮＡの発現能を持たない細胞であるが、溶解されると、ｍＲＮＡ捕捉体の飽和を助ける非免疫受容体関連ｍＲＮＡを送達することができる。
【０１０７】
好ましくは、上記マイクロリアクターは、
・ハイドロゲル形成ポリマー、好ましくはポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロリド）、ポリ（エチレンイミン）、ポリリジン、ポリアクリルアミド及び／又はアクリル酸、
・セルロース誘導体、好ましくはカルボキシメチルセルロース及びセルロースエステル，
及び／又は
・多糖類、好ましくはアガロース、アルギン酸、カラギーナン、ペクチン酸及び／又はキトサン、
からなる群より選択される材料を含む。
【０１０８】
この種のマイクロリアクターは以下、「ナノリットルリアクター」（ＮＬＲ）と称する場合があるが、これらの容量は必ずしもナノリットルのオーダーである必要はなく、これより大きい場合も小さい場合もある。
【０１０９】
特に好ましい一実施態様において、上記マイクロリアクターは２価又は３価の金属陽イオンで架橋されたアルギン酸ハイドロゲルを含む。アルギン酸を含むマイクロリアクターは、酵素や抗体等の球体構造物、或いは短鎖ＤＮＡ（プライマー）が容易に通過できる。ＰＣＲ産物などの長い糸状のＤＮＡ分子の通過速度は、ずっと遅い。従って、単一細胞に由来するＰＣＲ産物が、マイクロリアクター内で一時的に固定されることになる。アルギン酸を含むマイクロリアクターは更に、高スループットの解析やフローサイトメトリーによる選別にも供することができる。このアルギン酸カプセル材料はアルギン酸カルシウム、バリウム及び／又はストロンチウムを含むことが一層好ましい。 アルギン酸バリウムとアルギン酸ストロンチウムから成る各マイクロカプセルが、ＰＣＲ反応に必要なポリメラーゼに対して極めて低い阻害能を示したことは驚くべき知見であった。従って、アルギン酸バリウムとアルギン酸ストロンチウムは、アルギン酸カルシウムに比べて優れた増幅を可能とするであろう。
【０１１０】
アルギン酸ビーズの作製と、その中に細胞を封入するプロセスは、例えばアルギン酸と封入すべき細胞との混合物を使用して、ポリマー・チューブ製のマイクロノズルを通じて導入することを含む。ビーズの直径は、ノズルの形状とスピン周波数（５〜２８Ｈｚ）に応じて適宜調節することができる。ビーズを、マイクロノズルから空気層のギャップを通して標準的なラボラトリ・チューブに入れた硬化剤（例えばＣａＣｌ２溶液）へ向けて噴射する。
【０１１１】
好ましい別の実施態様において、上記マイクロリアクターは水／油エマルジョン中の水滴として形成される。以下、このタイプのマイクロリアクターを「エマルジョン液滴」とも称する。
【０１１２】
この様なマイクロリアクターは、例えばBiorad社から市販されているQX100TM Droplet DigitalTM ＰＣＲシステムを用いて作製することができる。この装置内では、サンプルと液滴形成用オイルとが８チャンネル液滴発生器カートリッジにロードされる。液滴ウェルを減圧し、フローフォーカシング・ノズルを通じてサンプルとオイルとを吸引し、ここで単分散液滴が形成される。
【０１１３】
上記の議論は、（ｉ）ソース細胞の封入、又は或る免疫受容体をコードする２以上の遺伝子又は遺伝子産物又はｃＤＮＡの回収に用いられるマイクロリアクター、並びに（ｉｉ）発現細胞の封入に用いられるマイクロリアクターの双方に関連し、 いずれの場合もマイクロリアクターは 、水／油エマルジョン中の水滴として形成することができ、或いはハイドロゲル形成ポリマー、セルロース誘導体及び／又は多糖類（アガロース、アルギン酸、カラギーナン、ペクチン酸及び／又はキトサンなど）から形成することができる。
【０１１４】
但し、好ましい一実施態様によれば、（ｉ）の用途に用いられるマイクロリアクターは水／油エマルジョン中の水滴として形成され、一方（ｉｉ）の用途に用いられるマイクロリアクターは、ハイドロゲル形成ポリマー、セルロース誘導体及び／又は多糖類（アガロース、アルギン酸、カラギーナン、ペクチン酸及び／又はキトサンなど）から形成される。
【０１１５】
本発明の他の好ましい実施態様によれば、上記マイクロリアクターは、１０μｍ以上１０００μｍ以下の直径を有する。
【０１１６】
本発明の他の好ましい実施態様によれば、上記マイクロリアクターは、０．５２ｐｌ以上５２３ｎｌ以下の容量を有する。
【０１１７】
より好ましくは、（ｉ）の用途に用いられる上記マイクロリアクターは０．５ｎｌ以上、５ｎｌ以下の容量を有し、（ｉｉ）の用途に用いられる上記マイクロリアクターは２５ｎｌ以上、１５０ｎｌ以下の容量を有する。
【０１１８】
但し、好ましい一実施態様において、（ｉ）の用途に用いられる上記マイクロリアクターは、水／油エマルジョン中の水滴として形成される一方、 （ｉｉ）の用途に用いられる上記マイクロリアクターは、ハイドロゲル形成ポリマー、セルロース誘導体及び／又は多糖類（アガロース、アルギン酸、カラギーナン、ペクチン酸及び／又はキトサンなど）から形成される。但し、好ましくは、ソース細胞の封入に用いられるマイクロリアクターは、発現細胞を封入するマイクロリアクターよりも小さくすることができる。
【０１１９】
下記の表に、本発明で用いられるマイクロリアクターの様々なサブタイプの概要を示す。
【０１２０】
【表１】
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【０１２１】
本発明の更に他の好ましい実施態様によれば、上記マイクロリアクターは楕円体形状を有する。
【０１２２】
本発明の他の好ましい実施態様によれば、上記ソース細胞は異なる免疫受容体用の遺伝子産物を含む細胞メンバーのコレクションに由来する。上記ソース細胞は、未成熟又は成熟したＢ細胞又はＴ細胞から成る群より選択される哺乳類細胞であることが好ましい。
【０１２３】
本実施態様において、上記細胞のコレクションは成熟B細胞、例えばメモリーＢ細胞のコレクションである。このコレクションとは、異なるドナーから提供されたＢ細胞ドネーション（donations）でコンパイルされたコレクション、或いは又、所定のドナーから得られた全Ｂ細胞のコレクション、そのフラクション、又は少なくともそれ自体でアンチボディオーム（当該ドナーの成熟Ｂ細胞全体でコードされる抗体の完全一式）を構成するもの、又はそのフラクションである。
【０１２４】
未成熟Ｂ細胞、成熟Ｂ細胞とは、内部で既にＶＤＪ組換えとＶＪ組換えとが完了しているタイプのＢ細胞である。このことは、これらの細胞がランダムに結合したvariable、joining、diverse の各遺伝子断片を既に有しており、固有の重鎖（ＶＤＪ）と固有の軽鎖（ＶＪ）をコードする固有の組換え遺伝子が得られていることを意味する。
【０１２５】
このＢ細胞は、プラズマＢ細胞又はメモリーＢ細胞であることが好ましい。プラズマＢ細胞（プラズマ細胞、形質細胞、エフェクターＢ細胞とも言う）は既に抗原と接触して大量の抗体を産生・分泌している大型のＢ細胞であり、微生物に結合してこれを破壊し、食細胞に取り込まれ易くする他、補体系の活性化を支援する。プラズマＢ細胞は抗体ファクトリーと呼ばれることもある。この細胞の電子顕微鏡像を見ると、該細胞の細胞質中で抗体の合成をつかさどる粗面小胞体が、細胞質中に大量に存在しているのが解る。免疫応答を誘発した誘発物質を除去すると、この細胞はアポトーシスを起こす。アポトーシスは、生存に必要な種々のコロニー刺激因子との継続的な接触が中断することにより起こる。
【０１２６】
メモリーＢ細胞は、一次免疫応答の過程で遭遇する抗原に特異的な活性Ｂ細胞から形成される。メモリーＢ細胞は寿命が長く、同じ抗原との２度目の接触に速やかに反応することができる。
【０１２７】
Ｔ細胞、別名Ｔリンパ球は、細胞性免疫に主要な役割を果たすタイプのリンパ球である。Ｔ細胞はその表面にＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を有する点で、Ｂ細胞等の他のリンパ球と区別できる。Ｔ細胞には、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、メモリーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞の各種類が存在する。
【０１２８】
Ｂ細胞と同様、Ｔ細胞も胸腺細胞の発生過程で、免疫グロブリンに関して説明した事象と同様の規則的な組換え事象を基本的に同じ順番で経る。ＤからＪへの組換えは、まずＴＣＲのβ鎖で起こる。このプロセスは、６本のＪβ１セグメント中１本へのＤβ１遺伝子断片の接合か、又は７本のＪβ２セグメント中１本へのＤβ２遺伝子断片の接合を含む。ＤＪ組換えに引き続き、（同様にして）ＶβからＤβＪβへの組換えが起こる。新しく生成した複合体中、Ｖβ−Ｄβ−Ｊβ遺伝子断片同士の間にある遺伝子断片が全て削除され、定常域遺伝子（Ｖβ−Ｄβ−Ｊβ−Ｃβ）を持つ一次転写物が合成される。ｍＲＮＡ転写では何らかの介在配列がスプライシングにより除去され、ＴＣＲのＣβ鎖に対する完全長タンパクが翻訳される。このβ鎖の組換えに続き、ＴＣＲのα鎖の組換えが起こる。この組換えは、Ｉｇ軽鎖に関して上述したＶからＪへの組み換えに類似している。β鎖とα鎖との会合により形成されたαβ−ＴＣＲが、大多数のＴ細胞上に発現する。
【０１２９】
Ｔ細胞の特異性はＭＨＣ拘束型であるため、ＴＣＲはＭＨＣ分子の影響下で、主に細胞内プロセスを経た直鎖ペプチド抗原を認識する。この様式は、Ｂ細胞の認識モードと著しく異なっている。Ｂ細胞の認識モードでは、可溶化又は膜結合抗原がＭＨＣ分子の関与を何ら受けることなく、つまりそれらがＭＨＣと複合化することを必要とせずに、その同族抗体の三次元標的構造を認識する。従って、Ｔ細胞とＢ細胞とは特異的免疫系の根本的に異なる２通りの認識モードを示す。ＭＨＣ拘束型の抗原認識モードを示す抗体（TCR様抗体)は天然には存在しない様であるが、実験動物の過免疫で誘導することができる。但し、この様な特異性を、必要なレベルの特性と親和性を伴って広範な種類のペプチド−ＭＨＣ複合体に発生させることは、困難であった。
【０１３０】
本発明の他の好ましい実施態様によれば、ソース細胞は１種又は２種以上のドナーから採取される。このドナーはヒトドナーであることが好ましい。但し、ドナーはウサギ、マウス、ブタ、ラット、牛（cow）、及び非人類霊長類であってもよい。
【０１３１】
上記ドナーは、所定の疾患について軽度又は微弱な症状を呈しているか、病気の進行が遅れているか、或いはその疾病に対して耐性があると判明しているドナーであることがより好ましい。この様なドナーは、メモリーＢ細胞の様なソース細胞、即ち該疾患に対して治療的、予防的又は遅延的な効果を持ち得る抗体等の治療用タンパクをコードする細胞を保有している可能性が高い。かかるタンパクは癌介在型サイトカインの拮抗剤であり、或いは所定の病原体に結合し、或いは免疫応答に関与する受容体に結合するからである。
【０１３２】
本発明の他の好ましい実施態様において、タンパクのサブユニットをコードする上記２以上の遺伝子又は遺伝子産物は、免疫グロブリン（Ｉｇ）重鎖遺伝子（ＶＤＪ再構成）及び免疫グロブリン（Ｉｇ）軽鎖遺伝子（ＶＪ再構成）である。これらの遺伝子は、ＶＨ及びＶＬ、或いはκ遺伝子及びλ遺伝子、とも呼ばれる。
【０１３３】
或いは、タンパクのサブユニットをコードする上記２以上の遺伝子又は遺伝子産物は、ＴＣＲα鎖遺伝子（組換え）及びＴＣＲβ鎖遺伝子（組換え）である。
【０１３４】
本発明の他の好ましい実施態様において、上記方法は、Ｉｇ定常Ｈサブドメイン及び／又はＩｇ定常ＬサブドメインをコードするｃＤＮＡを上記ＰＣＲ産物中に挿入する工程を更に備える。
【０１３５】
或いは、上記方法は、ＴＣＲα鎖及びＴＣＲβ鎖をコードするｃＤＮＡを上記ＰＣＲ産物中に挿入する工程を更に備える。
【０１３６】
更に、上記免疫受容体は疾患の治療又は診断用に用いられることが好ましい。この疾患とはヒト又は動物の疾患であることが好ましく、新生物（neooplastic）疾患、神経変性疾患、感染症、免疫介在性疾患、及び／又は心血管疾患であることがより好ましい。
【０１３７】
新生物疾患は腫瘍、癌等の悪性疾患を包含する。免疫介在性疾患は自己免疫疾患を包含する。神経変性疾患は中枢神経系及び／又は末梢神経系の健全性に悪影響を及ぼす疾患を包含する。感染症は寄生虫、原生動物、原核生物、ウイルス、プリオン及び真菌に起因する疾患を包含する。免疫介在性疾患は免疫系の機能不全、例えば過活動や低活動を特徴とする疾患を包含する。心血管疾患は心血管系に悪影響を及ぼすあらゆる疾患、主に心疾患、脳や腎臓の血管疾患 、及び末梢動脈疾患を包含する。
【０１３８】
実施例及び図面の簡単な説明
本発明の更なる詳細、特徴、特定要件、利点はサブクレイムに開示されており、以下の各図面と実施例の例示的な記載は本発明の好ましい実施態様を示すものである。但し、これらの図面は本発明の範囲を限定するものとして捉えられるべきではない。
実験例
【０１３９】
ヒト被験者又は動物種からの完全抗体レパートリー（アンチボディオーム）の組換体ディスプレイ
ヒト・アンチボディオームの組換体ディスプレイの出発物質として、ヒト・メモリーＢ細胞を用いる。或る被験体のメモリーＢ細胞プールは抗体特性を維持しており、又おそらく前回の抗体との遭遇によって産生された抗体の数も維持している（McHeyzer-Williams and Ahmed (1999)、Bernasconi ら (2002)）。
【０１４０】
或いは、ヒト又は非ヒト由来の全てのタイプのＢ細胞、例えばプラズマ細胞、プレプラズマ細胞、Ｂ１−Ｂ細胞、及び未成熟Ｂ細胞又はハイブリドーマ細胞を、この手法によって処理することができる。
【０１４１】
１．ＮＬＲを用いたアンチボディオームｍＲＮＡの捕捉
１．１  ヒト・メモリーＢ細胞
メモリーＢ細胞は、セルソーティング（MoFlo XDPセルソーター、Beckman-Coulter社、スイス国ニヨン）により末梢血単核球細胞から単離した。選別基準としては、ｐａｎ−−Ｂ細胞マーカーＣＤ２２の発現と、未成熟B細胞のマーカーである表面ＩｇＭ、ＩｇＤの発現の消失とを組み合わせた。ＣＤ１９、ＣＤ２７などの表面マーカーの他の組み合わせを単独で、又は表面発現型ＩｇＧと組み合わせて用いることもできる。
【０１４２】
１．２  ナノリットルリアクター内へのメモリーＢ細胞とｍＲＮＡ捕捉マトリクス・ビーズの同時封入
ＣＤ２２−陽性且つＩｇＭ−、ＩｇＤ−、ＩｇＡ-陰性のＢ細胞１００，０００個を、ｍＲＮＡ捕捉Dynabeadsと共にＮＬＲに封入する。一方、QX100液滴発生器を用い、ヒトＩｇＧを発現する代替Ｂ細胞２０，０００個とｍＲＮＡ捕捉ダイナビーズ（Dynabeads）とを、エマルジョン液滴内で乳化する。
【０１４３】
１．２．１  ナノリットルリアクター内への抗体産生細胞とｍＲＮＡ捕捉マトリクスビーズの同時封入
占有度（ＤＯＯ）が１となる様に、抗体産生細胞をオリゴｄＴ結合Dynabeads５個と共に封入した（ＮＬＲ当たりＢ細胞１個、Dynabeads ５〜５０個）。
【０１４４】
抗体産生細胞２０，０００個を１．６ｍｌのカプセル化バッファに再懸濁し、０．５〜５×１０６個のｍＲＮＡ捕捉マトリクス・ビーズ (Dynabeads) を添加した。フィルタ除菌した２．５％アルギン酸溶液 (Pronova)６．４ｍｌを加え、穏やかに混合した。層流ジェット粉砕型のカプセル製造器を用い、このアルギン酸／細胞／磁性ビーズ懸濁液を直径１５０μｍのノズルから７００Ｈｚで処理した。
【０１４５】
ビーカー内で連続撹拌されている１００ｍｌの硬化液（hardening solution）中で液滴を集めた。このアルギン酸担体を１５分間安定化し、ＮＬＲを形成させた。ＮＬＲを硬化液からふるいを通して回収し、８０ｍｌのカプセル化バッファ中で２回洗浄した。ＮＬＲを４℃／ＲＴ（室温）にてカプセル化バッファ中に集め、大粒子選別を行って細胞の入っていないＮＬＲ及び２個以上の細胞が入っているＮＲＬを除去した。
【０１４６】
１．３  細胞の溶解とＮＬＲ内でのDynabeads 上へのｍＲＮＡの捕捉
ＮＬＲ懸濁液を５分間静置し、上清を吸引除去した。得られたＮＬＲを等容積の新しく調製した溶解バッファ中に穏やかに再懸濁し、室温、回転速度２０ｒｐｍで３０分間インキュベートし、細胞を完全に溶解させた。
【０１４７】
１．４  ＮＬＲの可溶化、洗浄及びｍＲＮＡ捕捉マトリクスの回収
溶解反応物を濾過してＮＬＲを回収し、カプセル化バッファで２回洗浄した。洗浄したＮＬＲにＥＤＴＡ溶液を加えて溶解し、キットに付属の磁気装置を用いてオリゴｄＴビーズを回収した。典型的には５〜３０％のDynabeadsがその表面にｍＲＮＡを結合していた。
【０１４８】
２．乳化液滴を用いたアンチボディオームｍＲＮＡの捕捉
本発明の他の好ましい実施態様では、マイクロリアクターの作製に油中水滴（water-in-oil）エマルジョンを用いる。油中水滴エマルジョンは、適当な界面活性剤の存在下で水相と油相を混合して形成する。
【０１４９】
上記油相は鉱物油、シリコーン油、Tegosoft DEC、Novec 7500、FC-40、FC-43、FC-70等の特殊溶剤、その他一般的なフッ素系油やこれらの混合物から成るものであってよい。界面活性剤としては、Triton X-100、Nonidet P-40 (NP-40)、Tween 80、Tween 40、Tween 20、ABIL EM 90、ABIL WE 09、ドデシル硫酸ナトリウム又はドデシル硫酸リチウム等の洗剤を用いることができ、又、Krytox等のフッ素系洗剤や、その他のパーフルオロポリエーテル（ＰＦＰＥ）系界面活性剤、これらの混合物も用いることができる。
【０１５０】
マイクロリアクターの安定化剤及びＰＣＲ反応促進剤として、数種類の添加剤を油中水滴（water-in-oil）エマルジョンの水相に添加してもよく、かかる添加剤は２−ピロリドン、ポリビニルピロリドン、ベタイン、ＤＭＳＯ、PEG8000、Pluronic F-68、グリセロール、ＢＳＡ、及び／又はゼラチンである。
【０１５１】
油中水滴エマルジョンの作製方法には幾通りかある。一実施態様において、 （ｉ）水／界面活性剤／油の混合物を、１個または数個のガラス・ビーズまたはスチール・ビーズと共に、或いはこれらを用いずに、ボルテックスに掛けて液滴を作製する。ビーズの平均直径は５ｍｍ、１ｍｍ、又は好ましくは４００ｎｍである。ボルテックスの代わりにTissueLyserミキサーをミルを用いれば、混合速度を調節することができ、周波数は１５〜１７Ｈｚで選択できる。
【０１５２】
他の実施態様において、（ｉｉ）ミクロ流体液滴生成装置（例えばBio-Rad社QX100TM Droplet DigitalTMPCR、Raindance 社RainDrop（登録商標）Digital PCR等）を用いて油中水滴エマルジョンを作製することができる。ここではミクロ流体チップを用いることにより、１ナノリットル・サイズや１ピコリットル・サイズの均一な油中水滴マイクロリアクターを作製することができる。
【０１５３】
油中水滴エマルジョン型の液滴を用いる場合、マイクロリアクターからｍＲＮＡ捕捉部位、ｃＤＮＡ又はＰＣＲ産物の回収は、有機溶媒を添加により達成してもよい。この有機溶媒はエタノール、１−プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、ヘキサノール、クロロホルム又はアセトニトリルであってよく、これら混合物、及び／又はこれらと水との混合物であってよい。プロセスはDiehlら (2006)が記載している。
【０１５４】
２．１  細胞の封入、細胞の溶解、ｍＲＮＡの捕捉及び逆転写
抗体発現細胞を回収し、細胞溶解バッファ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ８．３、５０ｍＭ  ＫＣｌ、５０ｍＭ  ＬｉＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  ＤＴＴ）で希釈して細胞濃度を ２×１０６個／ｍｌとした。オリゴｄＴ Dynabeads （Life Technologies社、カタログ番号 61006）を細胞溶解 バッファで１回洗浄し、ビーズをDynalマグネット（Life Technologies社、カタログ番号12321D）上に集め、上清を捨てた。細胞に磁性ビーズを加えて穏やかに混合し、２０μｌ当たりの最終含量を細胞数１５，０００、ビーズ数１８０，０００とした。混合物を氷浴上に保ち、QX100 液滴生成装置(Bio-Rad)へ移した。DG8TM カートリッジ(Bio-Rad)内でエマルジョン生成を開始する直前に、細胞／Dynabeads混合物にプロテイナーゼK (Applichem社、カタログ番号A4392) を最終濃度０．２ｍｇ／ｍｌとなる様に添加した。液滴はメーカーの説明にしたがって各２０μｌのサンプルを８本、同時調製した。 エマルジョンの油相には、Pico-SurfTM 2 （Novec 7500中、２％溶液）（Dolomite Microfluidics社、カタログ番号3200281）を用いた。８×４０μｌのエマルジョンをカートリッジから２本の１．５ｍｌ容の反応チューブへとピペットで移液した（各１６０μｌのエマルジョン含むチューブが２本できる）。封入された細胞（図６参照）を、ヒートブロック内で７０℃、１５分間インキュべートして溶解した。その後、サンプルを室温に置き、徐冷すした。この室温インキュベーションを１５分間行うことで、細胞から放出されたｍＲＮＡがオリゴｄＴ−Dynabeadsに結合し易くなった。次に、エマルジョンに１ｍｌのイソプロパノールを加えボルテックスに掛けて油相を破壊することにより、ｍＲＮＡを結合したオリゴｄＴビーズを回収した。得られた透明な溶液をスピンフィルター （Thermo Scientific社、カタログ番号F2517-5）の上部に置き、３５００ｒｃｆで３０秒間遠心した。通過画分を捨て、回収されたビーズを７０％エタノール中で１回洗浄した。オリゴｄＴ−Dynabeads をｍＲＮＡ精製キット (Life Technologies社、カタログ番号61006)のバッファＢ（３００μｌ）に再懸濁し、新しい１．５ｍｌ容の反応チューブに移液した。ビーズを磁気的に回収し、バッファを１００μｌの１倍濃度ＤＮａｓｅバッファに交換した。続いて２μｌのＲＮａｓｅフリーＤＮａｓｅＩ（NEB社、カタログ番号M0303S） を添加し、混合物を３７℃で１０分間インキュベートし、オリゴｄＴビーズに結合しているＤＮＡを消化した。１μｌの０．５Ｍ  ＥＤＴＡを添加して反応を停止した。ビーズをｍＲＮＡ精製キット（Life Technologies社、カタログ番号61006）のバッファＢ（３００μｌ）で２回洗浄し、続いてMaxima Reverse Transcriptase （Life Technologies社、カタログ番号EP0742）の１倍濃度のＲＴバッファ３００μｌで１回洗浄した。上清を捨て、ｍＲＮＡで被覆されたオリゴｄＴビーズを、０．５ｍＭ  ｄＮＴＰ、１倍濃度ＲＴバッファ、２０Ｕの RiboLock RNase インヒビタ（Thermo Scientific社、カタログ番号EO0381）及び２００Ｕの Maxima Reverse Transcriptase （Life Technologies社、カタログ番号EP0742）を含む逆転写酵素混合物中に再懸濁した。反応混合物を５５℃で１時間インキュベートした。その後、温度を５分間８５℃に上げることにより、反応を停止させた。ｃＤＮＡを共有結合させたオリゴｄＴビーズを磁気的に回収した。上清を捨て、ビー���を２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０中に再懸濁させ、次回使用時まで４℃で保存した。
【０１５５】
２．２  エマルジョン中でのオーバーラップ・エクステンションＰＣＲ
実験例２．１で上述の如く作製したｃＤＮＡビーズをオーバーラップ・エクステンションＰＣＲのテンプレートとして用い、抗体ＶＨとＶＬとをコードするＤＮＡ  配列を結合させた。１つの抗体に属する配列が正しく結合される様、又、配列間のクロストークが防止される様、このＰＣＲ反応は単一ビーズ・エマルジョン中で行った。これを実現するため、０．２５ｍＭ  ｄＮＴＰ、０．２５μＭの各プライマー（ＶＨ４、Ｖｋ２、ＣＨ、Ｃｋ１）、０．２５％  ｗ／ｖ  ＢＳＡ、２％  ｗ／ｖ プルロニックF-68、１倍濃度バッファＡ及び１Ｕの KAPA Robust HotStart Polymerase（Kapa Biosystems社、カタログ番号KK5515）を含むＰＣＲ反応混合物でビーズを希釈した。ビーズは実験例２．１．で上述した如く、QX100 液滴生成装置とPico-SurfTM-1 エマルジョン ・オイル（Dolomite Microfluidics社、カタログ番号3200211）を用いて乳化させた。得られたエマルジョンを０．２ｍｌ容のＰＣＲチューブに移し、ＰＣＲサーマルサイクラー（Peqlab社、peqSTAR 2x Thermocycler、カタログ番号95-07002) 中、下記の温度サイクルにしたがってＰＣＲ反応を進行させた。
・９５℃、３分
−５サイクル
・９５℃、１５秒（ｒａｍｐ（温度変化速度）１℃／秒）
・６２℃、１５秒（ｒａｍｐ１℃／秒）
・７２℃、１５秒（ｒａｍｐ１℃／秒）
−３０サイクル
・９５℃、１５秒（ｒａｍｐ０．５℃／秒）
・５７℃、１５秒（ｒａｍｐ０．５℃／秒）
・７２℃、１５秒（ｒａｍｐ０．５℃／秒）
−１サイクル
・７２℃、１０’
・８℃、無限時間
【０１５６】
ＰＣＲ反応終了後、ＴＥバッファ２０μｌとクロロホルム７０μｌを加え、ボルテックスに掛けてエマルジョンを破壊した。各サンプルを１４，０００ｒｃｆで２分間遠心して清澄化し、各サンプルの上相を新しいチューブに移した。ＤＮＡローディング・バッファを加え、各サンプルを調製用１．２％アガロースゲルで分析した。結合産物のサイズ約１１００ｂｐの位置にバンドが１本認められ（図６の１回目ＰＣＲを参照）。このバンドを切り出し、Qiagen MinEluteゲル抽出キット (カタログ番号28604) を用い、メーカーの説明に従ってゲルからDNAを精製した。
【０１５７】
２．３  ネスティッドＰＣＲ
実験例２．２で得られた精製済み結合ＰＣＲ産物を、抗体ＶＨ及びＶＬ特異的プライマーの２番目のセットを用いるＰＣＲ反応のテンプレートとして用いた。ここで、ＰＣＲ反応混合物は２５μｌ中に、２μｌのテンプレートＤＮＡ、０．２ｍＭのｄＮＴＰ、１倍濃度バッファＡ、０．２μＭの各ＪＨプライマー（ＪＨ１、ＪＨ２、ＪＨ３、ＪＨ４）、０．４μＭのＣｋ２、０．２５％  ｗ／ｖ  ＢＳＡ、１倍濃度バッファＡ及び１Ｕの KAPA Robust Hotstart Polymerase（Kapa Biosystems社、カタログ番号KK5515）の各成分を含んでいた。ＰＣＲ反応は実験例２で上述したサイクルプログラムに従って進行させた。得られたＰＣＲ断片を１．２％アガロースゲルで分析したところ、予想サイズ１０７０ｂｐの位置にバンドが１本だけ認められた（図６の２回目ＰＣＲを参照）。このＰＣＲ断片は、クローニングに使える結合ＩｇＨ＋ＩｇＬ抗体断片である。
【０１５８】
Meijer ら (2006)によるｏｅＰＣＲ用プライマー
VH4  tattcccatggcgcgccSAGGTGCAGCTGGTGGAG
CH   GACSGATGGGCCCTTGGTGG
VK2  ggcgcgccatgggaatagctagccGATGTTGTGATGACTCAGTCT
CK1  atatatatgcggccgcTTAACACTCTCCCCTGTTGAA
JH1  ggaggcgctcGAGACGGTGACCAGGGTGCC
JH2  ggaggcgctcGAGACGGTGACCATTGTCCC
JH3  ggaggcgctcGAGACGGTGACCAGGGTTCC
JH4  ggaggcgctcGAGACGGTGACCGTGGTCCC
CK2  accgcctccaccggcggccgcttaTTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTT
【０１５９】
３．ＮＬＲ封入単一Ｂ細胞からのＩｇＶＨ＋ＩｇＶＬの結合と増幅
本工程では、単一 Ｂ細胞の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖ｍＲＮＡをそれぞれ捕捉した単一オリゴｄＴ−Dynabeadsを、これに続くＰＣＲ反応でｃＤＮＡを合成するためのテンプレートとして用いた。このｃＤＮＡはビーズに共有結合で固定されているので、単一細胞内で進行しているかの様な正確な免疫グロブリンの重鎖と軽鎖の対合が、オリゴｄＴ− Dynabead 上でも維持される。続く工程では、オリゴｄＴ- Dynabeadsを乳化し、これを免疫グロブリン（Ｈ＋Ｌ）−オーバーラップ・エクステンションＰＣＲ（Ｉｇ−ｏｅＰＣＲ）に用いることで、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖とを連続的なポリヌクレオチド鎖に物理的に結合させた。
【０１６０】
３．１  ＰＣＲプライマーとポリメラーゼとを組み合わせた単一マトリクス・ビーズのエマルジョンＰＣＲ
ｃＤＮＡ複合化Dynabeadsを用いたエマルジョンＰＣＲを、Droplet DigitalTM ＰＣＲシステムの説明にしたがって実施した。簡単に述べると、ｃＤＮＡ複合化Dynabeadsとプライマー混合物とをｄＮＴＰ、バッファ及びキットに付属のＰＣＲ酵素と混合し、メーカーの説明に従ってQX200TM/QX100TM Droplet DigitalTMＰＣＲシステムを用いる液滴生成のための準備を行う。エマルジョン液滴の生成にこれらのサンプルを用い、続いてエマルジョンＰＣＲを実施した。Droplet DigitalTM ＰＣＲシステムのプロトコルに従って油相を除去し、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡとクロロホルム中で液滴を溶解した後、増幅産物を回収した。
【０１６１】
３．２  ＰＣＲプロコトルＡ
オリゴｄＴ−Dynabeadに結合したｃＤＮＡからの結合免疫グロブリンの可変重鎖及び軽鎖領域の増幅は、公知のＰＣＲプライマー・システム (Meijer et al. 2006) を用いたエマルジョンＰＣＲで２工程ＰＣＲプロトコルに従って行った。これによりhead-to-head配置の２つの免疫グロブリン鎖がリンカー配列で連結された。このリンカー配列は、後に双方向性プロモーターが挿入される制限部位を含んでいた。
【０１６２】
３．３  ＰＣＲプロトコルＢ
別法として、Ｖ重鎖領域とＶ軽鎖領域とがtail-to-haid 配置となるＰＣＲプライマー系を、免疫グロブリン重鎖と軽鎖との連結に用いた（詳細は図２参照）。これら免疫グロブリン特異的プライマーはWardemannら (2003)の方法で得られ、当該論文の内容は本明細書に明示的に組み込まれる。この方法の概要を図２に示す。図３は、Ｉｇ可変ＰＣＲについての例を示す。
【０１６３】
４．抗体発現ライブラリの作製
連結されたＩｇＨカセットとＩｇＬカセットのＰＣＲ断片を、適当な制限部位（ＰＣＲプロトコルＡではNotI/XhoI、ＰＣＲプロトコルＢではBSSHIIとBsiWI）を用いてアクセプタープラスミドベクターに大量にクローニングした。完全長免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の発現に必要なエレメントを全て提供できる、このアクセプタからベクターへの転換を、図４に示す。
【０１６４】
このアクセプタープラスミドベクターから、制限部位PmeI及びPacI を介して免疫グロブリン発現カセットを切り出し、レンチベクター導入ベクターに組み込む。このベクターは、ほ乳類プロモータ（ＣＭＶ）と、後端にマーカー遺伝子ＥＧＦＰが連結された内部リボソーム侵入部位とを有する。生成した３シストロン性抗体発現プラスミドを感染レンチベクター粒子を生成させるためのレンチベクター導入ベクター（Dullら、1998）として用い、この粒子をほ乳類細胞の形質移入に用いて抗体発現細胞へと転換させる。
【０１６５】
ライブラリのクローニングには、無制限クローニング法や無ライゲーション・クローニング法も用いることができる。これらの方法によれば、制限がある場合に遺伝子コンストラクトが望まない場所で切断され、短縮タンパクが発現してしまう危険を防止することができる (Gibson DG, Young L, Chuang RY, Venter JC, Hutchison CA 3rd, Smith HO. (2009).  "Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases". Nature Methods 6(5): 343-345.doi:10.1038/nmeth.1318. PMID19363495.  を参照）。
【０１６６】
５．発現
５．１  発現細胞のトランスフェクションのためのレンチベクター粒子の作製
レンチベクター粒子はDullら(1998)による手順に従い、所謂第３世代レンチベクター・パッケージング・システムを用いて作製した。
【０１６７】
５．２  発現細胞の形質移入
Dullら(1998)の方法に従い、レンチべクターを用いて標準ＣＨＯ  Ｋ１細胞に形質移入を行った。ＣＨＯ細胞１個につきレンチベクター粒子が１個だけ形質移入される様、感染多重度を細胞１個当たり０．５レンチベクター粒子に設定した。マーカー遺伝子ＧＦＰを用いてモニタしたところ、１０％以上の細胞に形質移入が行われたことがわかった。
【０１６８】
５．３  ＮＬＲ中への単一発現細胞の封入／高並列化クローン展開
３シストロン性抗体発現プラスミドでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を、サイトメーターソーターを用いてマーカー遺伝子（ＧＦＰ）の発現を陽性の選択のために使用して、占有度（ＤＯＯ）０．５にてＮＬＲに封入した。ＮＬＲを標準培地で培養し、ＮＬＲ中で細胞を増殖させた。
【０１６９】
４．４  占有度コントロール及び増殖調和化
カプセル化から１２時間後、ＮＬＲ培養物についてBiosorter で大粒子選別を行い、正の選択により単一の生存細胞を含み、且つＧＦＰ蛍光が陽性であるＮＬＲを全て採取した。これにより、細胞の入っていない空のＮＬＲと、異常な増殖速度によると思われる大量（例えば、他のＮＬＲの細胞数の平均値の１．５倍を超える数）の細胞を含むＮＬＲとを除外する。
【０１７０】
４．５  組換え抗体産生細胞の並列化クローン培養と、モノクローナル抗体の同定のためのスクリーニング
１種類の抗体産生細胞を含むＮＬＲを標準培地で培養し、生育する細胞クローンが産生する免疫グロブリンを（ｉ）ＮＬＲ内では蛍光標識化プローブ抗原等を用いて検出し、（ｉｉ）ＮＬＲを取り巻く培養上清中ではウェスタン・ブロッティング、ELISA、免疫組織化学的分析、機能分析等の常法により検出する。
【０１７１】
ＮＬＲ中の免疫グロブリン濃度は、上清中の濃度よりも早くピーク・レベルに達する。この様な免疫グロブリンの一時的な保持はスクリーニングに利用できる。即ち、抗体特異性をＮＬＲ内で検出する前に、ＮＬＲを取り巻く上清中の免疫グロブリン濃度を、洗浄工程を利用して希釈する。蛍光標識抗原によって染色陽性となったＮＬＲを選別し、追加確認の為のスクリーニング用にそのままの状態で残すか、又は破壊して抗原反応的／特異的な細胞クローンを生育させ、モノクローナル抗体を産生させる。
【０１７２】
抗体特異性をＮＬＲ内で検出する代わりに、発現細胞の上清を分析して、注目する抗体の存在を検出することができる。この方法によれば、注目する抗体のより複雑な性質、例えば生物活性、組織切片の染色等を分析することができる。
【０１７３】
従って、ＮＬＲ培養物の沈降又は遠心によって得られた、ＮＬＲを取り巻く上清を直接分析し、目的の機能又は他の性質を備えた抗体の存在を確認する。
【０１７４】
逐次分画と得られた各画分の再分析により、注目する抗体クローンを産生した細胞を含む単一ＮＬＲを識別する。この分画については、標準的な細胞培養の手順をマイクロタイターフォーマットにスケールダウンした手順で行う。最長２４時間の培養期間後、上清を回収する。モノクローナル・プロデューサー細胞を含むＮＬＲは、最終段階でマイクロタイター・プレート内への単一ＮＬＲ沈着 （９６ウェル又は３８４ウェル／フォーマット）によって回収し、上清の回収と分析はより長い７２時間の培養期間後に行う。
【０１７５】
５．発現、及び注目する抗体を発現するクローン細胞系を回収するためのライブラリ・スクリーニング
注目する抗体を発現するＡＢ２発現細胞を単一細胞としてＮＬＲに封入し、このＮＬＲ３０個を、無関係の抗体を発現する発現細胞を含む２１０，０００個のＮＬＲ培養物に添加（スパイク）した。発現細胞のライブラリであるこのＮＬＲのバルク培養物は、完全培地で培養した（図６参照）。
【０１７６】
続いて、２１０，０３０個のＮＬＲをピペットで９６穴マイクロタイター・プレートに分画した（培養物の１回目分画）。この培養物を３日間保ち、細胞成長、抗体発現、及びＮＬＲ外の上清中への抗体分泌を進行させた。
【０１７７】
４日目に、９６ウェルの各々の培養上清５０μｌをＥＬＩＳＡでスクリーニングし、ＡＢ２抗原特異的抗体の存在を検出した。陽性の培養物は、図Ｅ２に示した様に同定された。一例として陽性ＮＬＲ培養物（Ｂｈ５）をクローン同定用に選択し、培養物Ｂｈ５の単一ＮＬＲをマイクロタイター・プレートに乗せ、さらに３日後、ＥＬＩＳＡによる２回目スクリーニングを行った。
【０１７８】
この結果、ウェルＥ４に単一ＮＬＲが認められ、ＡＢ２抗原に特異的なｍＡＢ  Ｈ５／Ｅ４を発現するクローン細胞系であることが解った（図７Ｂ参照）。
【０１７９】
６．使用装置及び材料一覧
・Biosorter 大粒子フローサイトメーター、 Union Biometrica社製、ベルギー国へール
・Nisco 層流ジェット粉砕型カプセル製造装置、Nisco Engineering AG社製、スイス国チューリヒ
・QX100/200 液滴精製装置、Bio-Rad社製、スイス国クルシエ
・アルギン酸、Pronova社製、ノルウェー国
・Dynabeads mRNA DIRECT Micro Kit、Life Technologies社製、スイス国バーゼル
・カプセル化バッファ： 0.9 % NaCl (w/v); 2.2 mM HEPES pH 7.4
・カプセル化バッファ：  (0.9 % NaCl (w/v); 2.2 mM HEPES pH 7.4)
・硬化剤溶液： 100 mM CaCl2, 13 mM HEPES pH 7.4
・ＮＬＲ溶解剤： 100mM EDTA
・細胞溶解バッファ／ＮＬＲ (100 mM Tris-HCl, pH 7.5; 500 mM LiCl; 5mM ジチオスレイトール; 0.1% ラウロイルサルコシン; 0.1% Tween20; 0.1% デオキシコール酸)
・免疫グロブリン特異的SmartFlare RNA検出プローブ、Millipore社製、スイス国ツーク
・Maxima RT、Thermo Scientific社製、スイス国ライナッハ
・ｏｅＰＣＲ用プライマー：  Meijers et al. (2006)  又はWardemann, et al. (2003)の方法で製造。Microsynth社製、スイス国バルガッハ
・５−プロパルギルアミノ-dCTP-Cy5、Jena Bioscience GmbH社製、ドイツ国イエナ
・dNTP、Thermo Scientific社製、スイス国ライナッハ
・ddPCR supermix、Bio Rad社製、スイス国クルシエ
・液滴生成オイル、Bio Rad社、スイス国クルシエ
・常法に従うプラスミドベクター内での分子クローニング
・エマルジョン液滴細胞溶解バッファ： 50 mM Tris-HCl pH 8.3, 50 mM KCl, 50 mM LiCl, 5 mM EDTA, 10 mM DTT, 0.2 mg/ml プロテイナーゼK
・RiboLock RNaseインヒビタ# EO0381、Thermo Fischer Scientific社製、スイス国 ライナッハ
・KAPA Robust Hotstart DNA ポリメラーゼ、KAPA Biosystems社製、KE5506, Axon lab、スイス国バーデン
・dNTP, NEB, Bioconcept社製、スイス国アルシュビル
・10% w/v Pluronic F68 # A1288,0100 水溶液、Applichem Axon lab社製、スイス国バーデン.
・Pico-Surf 1, 2% in Novec 7500 (# 3200211, Lot 211014, Dolomite, Valve Technology AG社製、スイス国ゲッティンゲン
・Pico-Surf 2, 2% in Novec 7500 (# 3100281, Lot 091014, Dolomite)
・peqSTAR 2x Thermocycler、Peqlab社製、# 95-07002
・アガロース、超高純度、Invitrogen社製、# 15510-027
・peqGREEN 染料、Peqlab社製、 # 37-5010、2万倍希釈にて使用
・1 kb DNA Ladder, NEB, Bioconcept社製、スイス国アルシュビル、# N3232S
・培地CHO-K1: 2mM グルタミン含有ハムズF12培地、10% FBS、Invitrogen社製、 スイス国ツーク
・ＥＬＩＳＡ用ペプチド抗原(ＡＢ２−抗原タンパク配列： stgdadgpggpgipdgpggn；無関係のコントロール用ペプチドタンパク配列： lpttmnyplwsqsyedssnq)  １ｍｇ単位未精製。Peptides&Elephants GmbH社製、ドイツ国ポツダム
・ELISAプレート： EIA/RIAプレート、96ウェル・ハーフエリア・プレート、平底 (Costar、Corning社製)
・コーティング・バッファ： 15mM Na2CO3, 30mM NaHCO3, pH 9.6
・洗浄バッファ： 0.05% Tween 含有PBS
・ブロッキング溶液：2% BSA、PBS溶液
・二次抗体：ヤギα−ヒトＩｇＧ  Ｆｃ−特異的 (Jackson Immuno社製、# 109-035-098)、0.5% BSA/PBSで４千倍希釈
・検出溶液： TMB (Sigma社製、# T2285) 30mMクエン酸で２０倍希釈、pH 4.1 (Sigma, # C2402)
・1M H2SO4 (AppliChem社製、# A2699)
【図面の簡単な説明】
【０１８０】
【図１】マイクロリアクターへの同時封入の顕微鏡写真  単一細胞 （Ｃ、写真では抗体と視認性向上のためのマーカー遺伝子ＧＦＰを発現している代替Ｂ細胞が見えている）とｍＲＮＡ捕捉マトリクスDynabeads (DB)とを含むマイクロリアクター（以下、「NanoLiter Reactor（ナノリットル・リアクター）」又は「ＮＬＲ」と称するが、これらのリアクターの中にはピコリットル・オーダーの容量を持つ物もある）。代替Ｂ細胞は、元のヒト・メモリーＢ細胞内のＩｇ発現レベルに合わせてＩｇＧ発現レベルを弱めた低活性化２シストロン性ヒトＩｇＧ発現カセットを持つレンチベクターを用い、ＣＨＯ−Ｋ１細胞に対して安定した形質転換を行うことで作製した。低活性化は、ＣＭＶ−プロモーター−ＥＧＦＰカセットの終止コドンの後ろに２シストロン性抗体発現カセットを連結することで達成した。ここで用いた代替Ｂ細胞は、Ｂ細胞又はＴ細胞の挙動を忠実に反映している。
【図２】免疫グロブリンＶ領域のＰＣＲ手順の概要図解１回目ＰＣＲ： オーバーラップ・エクステンションＰＣＲ（ｏｅＰＣＲ）により、免疫グロブリンの可変重鎖と軽鎖とを増幅し、Ｖ重鎖領域とＶ軽鎖領域とをtail-to-head配置になる様に連結する。ｏｅＰＣＲ用のリンカー・プライマーの構成は下記の通り。Ｉｇ可変重鎖：リンカー・プライマー 3’ SalI JH: tattcgcactgcgcggcGTCGACgc-(ＪＨファミリー特異的配列)Ｉｇ可変κ軽鎖：リンカー・プライマー 5’ XbaI Vk: gccgcgcagtgcgaataTCTAGAtgt-(FW1-V-κファミリー特異的配列)、リンカー・プライマー 5’ XbaI Vl: gccgcgcagtgcgaataTCTAGAtgt-(FW1-V-λファミリー特異的配列)使用した他のプライマーは、5'L(SP)-VH(1-6)、及び3'Cκ 543及び3'Cλ。大文字はＩｇＨの定常領域を与えるポリヌクレオチド・カセットの挿入に用いられる制限部位、後のタンパク分解的切断のための開裂部位、及び後のクローニング工程におけるＩｇκ／λの分泌のためのシグナル・ペプチドを示す（下記参照）。小文字はオーバーラップ・エクステンションＰＣＲにおいて重鎖コンストラクトと軽鎖コンストラクトとを連結するのに用いられるリンカー配列を示す。２回目ＰＣＲ：発現ベクターにおけるクローニングを容易化するため、ネスティッドＰＣＲ（ｎＰＣＲ）を実施して更に増幅を行い、制限部位をプライマーを介してＰＣＲ産物に挿入した。BSSHII 制限部位 (大文字)を含む５’プライマーを下記構成にしたがって使用した。 ５’  プライマー BSSHII VH-FW1： attttttttGCGCGCtgt-(FW1-V-重鎖ファミリー特異的配列)；３’  プライマー： the 3' BsiWI Jκ-プライマーをWardemann ら (2003)の記載にしたがって使用した。
【図３】カプセル化（単一）抗体発現細胞からの免疫グロブリン可変重鎖−軽鎖連結体の増幅  個体マトリクス結合ｃＤＮＡ（オリゴｄＴ−Dynabeads）を介して単一細胞から得られた可変重鎖及び軽鎖を、２工程ＰＣＲプロトコルに従って増幅した。（Ａ）１回目ＰＣＲで重鎖と軽鎖の可変領域を増幅した後、オーバーラップ・エクステンションを行い、オリゴＤＴ−Dynabeadsを結合したｃＤＮＡ上で単一チューブ／１段階反応を進行させた（レーン２）。コントロールとして、抗体を発現しない細胞を用いて同様の操作を行った（レーン１）。（Ｂ）１回目ＰＣＲ産物（２段目）について行った２回目 （ネスティッド）ＰＣＲ。抗体発現細胞に由来の免疫グロブリン重鎖−軽鎖連結体の存在が認められた（レーン２）が、コントロール細胞に由来のものは認められなかった（レーン１）。
【図４】３シストロン性抗体発現プラスミドを作製するためのクローニング工程の概要Ｉ．結合したＩｇＶＨ＋ＩｇＶＬ  ＰＣＲ産物を、免疫グロブリンのシグナル・ペプチドと Ｉｇκ／λの定常領域を与えるシャトル・ベクターに挿入する。ＩＩ．ＩｇＨの定常領域と、後のタンパク分解的切断の開裂部位と、Ｉｇκ／λの分泌のためのシグナル・ペプチドとを与えるポリヌクレオチド・カセットを、分子クローニングにより挿入する。ＩＩＩ．得られた２シストロン性発現カセットを分子クローニングによりレンチベクター導入ベクターへ挿入し、レンチベクター粒子の作製に用いられる最終的な３シストロン性発現ベクターを得る。
【図５】ナノリットルリアクター内におけるクローン増殖と、抗体産生の検出Ａ）単一ＣＨＯ発現細胞から生育したクローン細胞集団（ＣＣＣ）の、ナノリットルリアクター（ＮＬＲ）封入後８日目の様子。細胞は、封入に先立ち、３シストロン性抗体-ＥＧＦＰ−発現カセットをコードするレンチベクター粒子により形質転換した。Ｂ）クローン細胞集団（クローンＡＢ２）による抗体（完全ＩｇＧ）産生。ＮＬＲ内の液相から回収したプロテインＧ精製抗体のウェスタン・ブロット像。還元的条件で実施したＰＡＧＥにより、Ｉｇ重鎖とＩｇ軽鎖の発現が確認された。
【図６】免疫グロブリン重鎖及び軽鎖ｍＲＮＡの高スループット単一細胞ＲＴ−ＰＣＲＡ）細胞溶解前の、抗体発現細胞とｍＲＮＡ捕捉ビーズとを含む液滴（工程１：細胞の封入）。溶解バッファ中の細胞とオリゴｄＴ−DynabeadsとをPico-Surf2エマルジョン・オイルに封入した。液滴の容積は約１ｎｌである。画像は封入の直後で細胞溶解前の状態を示す。Ｂ）デジタル・ドロップレットＰＣＲの上流側におけるシングレットｃＤＮＡを連結した捕捉ビーズの蛍光活性化選別。四角の枠はシングレット連結ビーズの集団を示す。Ｃ）単一ビーズ・デジタル・ドロップレットＰＣＲにより、ＩｇＨとＩｇＬの両方を含む捕捉ビーズの大集団、即ち増幅された配列（点線の丸で囲んだ部分）の存在が示された。ＩｇＨ及びＩｇＬｃＤＮＡの存在は、いずれかのＩｇ鎖に特異的な減光フルオロフォアがＰＣＲ反応によって放出されることに基づいてモニタする（ＩｇＨ＝Ｙ軸、ＩｇＬ＝Ｘ軸）。ドロップレットＰＣＲは、QX100ドロップレット・アナライザを用いて解析した。Ｄ）オーバーラップ・エクステンションＰＣＲで、単一ｍＲＮＡ捕捉ビーズに由来するＩｇＨ−ＩｇＬ結合体が生成した様子。１回目ＰＣＲはエマルジョン液滴中で、２回目（ネスティッド）ＰＣＲはバルクで実施。
【図７】抗体発現細胞のライブラリを示すＮＬＲ培養物の増殖Ａ）単一のカプセル化発現細胞から成るＮＬＲ培養物の写真。Ｂ）１日目のバルクＮＬＲ培養物の一部を示す顕微鏡写真。Ｃ）培養４日目のＮＲＬの蛍光顕微鏡写真。ＧＦＰ陽性のクローン細胞集団（矢印）がＮＬＲ内に生育し、単一のカプセル化発現細胞がクローン増殖したことが解る。
【図８】注目するｍＡｂを発現するクローン細胞株の同定と単離Ａ）ＡＢ２発現細胞を含むＮＬＲ３０個を、無関係の発現細胞を含む３００倍以上の個数のＮＬＲと混合し、バルク培養物を９６ウェル・プレートの８０ウェルにプレーティングした。カプセル化とプレーティングの４日後に、ＮＬＲ培養物の上清液体をＡＢ２抗原特異的ＥＬＩＳＡで分析し、ＡＢ２陽性の培養ウェルを検出した。クローニングには「培養物Ｈ５」を選択した（矢印）。Ｂ）ＮＬＲの単数化とクローン細胞株Ｅ４の同定。バルク培養物Ｈ５から単一のＮＬＲを各培養ウェルにプレーティングした。３日後に上清液体をＡＢ２−ＥＬＩＳＡで分析したところ、ウェルＥ４が、ＡＢ２特異的モノクローナル抗体を発現するクローン細胞株の単離を実証するものとして同定された。ポジティブ・コントロール（＋）をウェルＡ１とＡ２内で実施した。
【０１８１】
参考文献
Embleton et al., Nucleic Acids Research, Vol. 20, No. 15, 3831 (1992)
Wardemann, et al., Science 301, 1374 (2003)
Boulianne et al., Nature 312, 643 - 646,(1984)
Morrisson et al., PNAS 82, 6851 - 6855 (1984)
Card et al., Cancer Immunol Immunother. Apr; 53(4):345-57 (2004)
Szymczak et al., Nat Biotechnol 22:589-594 (2004)
Serp et al., Biotechnology and Bioengineering, Vol. 70 (1) (2000)
Gomez-Herreros et al., Nucleic Acids Research, 40, 6508-6519 (2012)
Martinez et al. Macromol. Biosciences, 12, 946-951 (2012)
Pruse et al., Chem. Eng Technol.1998, 21(1):29-33
McHeyzer-Williams and Ahmed,  Curr. Opin. Immunol. 11, 172-179, (1999)
Bernasconi et al., Science 298, 2199-202 (2002)
Meijer et al., J Mol Biol. 358: 764-772 (2006)
Dull et al., J. Virol  72(11) (1998)
Diehl et al. Nature Methods, 3, 551-559 (2006)
【０１８２】
使用したプライマー
１回目ＰＣＲ
Ｉｇ可変重鎖：
フォワードプライマー:
1.  5' SP-VH1 ACAGGTGCCCACTCCCAGGTGCAG
2.  5' SP-VH3 AAGGTGTCCAGTGTGARGTGCAG
3.  5' SP-VH4/6 CCCAGATGGGTCCTGTCCCAGGTGCAG
4.  5' SP-VH5 CAAGGAGTCTGTTCCGAGGTGCAG
リバースプライマー：
5.  3'CHg1 adaptor-GTTGTCCACCTTGGTGTTGCTGG
6.  3' Cμ CH1 adaptor-GGGAATTCTCAGAGGAGACGA
Ｉｇ可変κ鎖：
フォワードプライマー：
7.  5' SP Vκ1/2 reverseadaptor-ATGAGGSTCCCYGCTCAGCTGCTGG
8.  5' SP Vκ3 reverseadaptor-CTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAG
9.  5' SP Vκ4 reverseadaptor-ATTTCTCTGTTGCTCTGGATCTCTG
リバースプライマー：
10.  3' Cκ 543 GTTTCTCGTAGTCTGCTTTGCTCA
ＩＧ可変λ鎖：
フォワードプライマー：
11.  5' SP Vλ1 reverseadaptor-GGTCCTGGGCCCAGTCTGTGCTG
12.  5' SP Vλ2 reverseadaptor-GGTCCTGGGCCCAGTCTGCCCTG
13.  5' SP Vλ3 reverseadaptor-GCTCTGTGACCTCCTATGAGCTG
14.  5' SP Vλ4/5 reverseadaptor-GGTCTCTCTCSCAGCYTGTGCTG
15.  5' SP Vλ6 reverseadaptor-GTTCTTGGGCCAATTTTATGCTG
16.  5' SP Vλ7 reverseadaptor-GGTCCAATTCYCAGGCTGTGGTG
17.  5' SP Vλ8 reverseadaptor-GAGTGGATTCTCAGACTGTGGTG
リバースプライマー：
18.  3' Cλ CACCAGTGTGGCCTTGTTGGCTTG
オーバーラップ・エクステンションＰＣＲ：
フォワードプライマー:
19.  5' BSSH2 VH1/5 CTGCAGCGCGCGTACAT TCCGAGGTGCAGCTGGTGCAG
20.  5' BSSH2 VH3 CTGCAGCGCGCGTACATTCTGAGGTGCAGCTGGTGGAG
21.  5' BSSH2 VH4 CTGCAGCGCGCGTACATTCCCAGGTGCAGCTGCAGGAG
22.  5' BSSH2 VH3-23 CTGCAGCGCGCGTACATTCTGAGGTGCAGCTGTTGGAG
23.  5' BSSH2 VH4-34 CTGCAGCGCGCGTACATTCCCAGGTGCAGCTACAGCAGTG
リバースプライマーs:
24.  3'BsiWI Jκ1/2/4 GCCACCGTACGTTTGATYTCCACCTTGGTC
25.  3'BsiWI Jκ3 GCCACCGTACGTTTGATATCCACTTTGGTC
26.  3'XhoICλ CTCCTCACTCGAGGGYGGGAACAGAGTG
ｏｅＰＣＲ リンカー・プライマー
Ｉｇ可変重鎖:
28.  3’ SalI JH tattcgcactgcgcggcGTCGACgc-(JHファミリー特異的配列)
Ｉｇ可変軽鎖:
29.  5’ XbaI Vk gccgcgcagtgcgaataTCTAGAtgt-(FW1-V-κファミリー特異的配列)
30.  5’ XbaI Vl gccgcgcagtgcgaataTCTAGAtgt-(FW1-V-λファミリー特異的配列)
ｎＰＣＲ
５’プライマー：
BSSHII VH-FW1 attttttttGCGCGCtgt-(FW1-V-重鎖ファミリー特異的配列）
３’プライマー
3' BsiWI Jκプライマー（下記の表を参照）
【０１８３】
本発明の実施に用いられる他のプライマー
太字は制限部位。
【０１８４】
【表２】
2020054355.tif 000003
【図１】
2020054355.tif 000004
【図２】
2020054355.tif 000005
【図３】
2020054355.tif 000006
【図４】
2020054355.tif 000007
【図５】
2020054355.tif 000008
【図６】
2020054355.tif 000009
【図７】
2020054355.tif 000010
【図８】
2020054355.tif 000011
【配列表】
2020054355000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年12月19日(2019.12.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のサブ工程を含む方法。
１Ａ：２つ以上のサブユニットを有する免疫受容体コードする２以上の遺伝子又は遺伝子産物、又はｃＤＮＡを回収する工程であって、前記２以上の遺伝子又は遺伝子産物は所定のソース細胞中に含まれ、下記の各工程を含む工程；
ａ）ソース細胞をｍＲＮＡ捕捉部位と共にマイクロリアクターに封入する工程であって、ｍＲＮＡ捕捉部位がビーズ又は粒子である、工程、
ｂ）前記マイクロリアクター内で前記細胞を溶解し、細胞ｍＲＮＡを該マイクロリアクターのルーメン内に放出させ、これを前記ｍＲＮＡ捕捉部位に結合させる工程、
ｃ）前記マイクロリアクターを溶解又は破壊し、前記ｍＲＮＡ捕捉部位に結合したｍＲＮＡを溶液中において逆転写して対応するｃＤＮＡ遺伝子産物を得る工程、
ｄ）前記免疫受容体のサブユニットをコードする２以上の遺伝子産物を含むコンストラクトをＰＣＲにより作製する工程、及び
ｅ）前記ＰＣＲ産物をプラスミドベクターにクローニングして２シストロン性又は多シストロン性の発現コンストラクトを得る工程；
ｅ’）このようにして所定のソース細胞集団の免疫受容体をコードするＰＣＲ産物を含むプラスミドライブラリーを作製する工程；
１Ｂ：発現細胞のライブラリを作製する工程であって、前記ライブラリにおいて各細胞は、回収された免疫受容体のサブユニットをコードする２以上の遺伝子又は遺伝子産物を発現可能であり、ライブラリーの作製は下記の各工程を含む、上記工程：
ｇ）工程ｅ）において得られた１以上の２シストロン性又は多シストロン性発現コンストラクトを用いて発現細胞をトランスフェクトする工程、及び
ｈ）上記発現細胞をマイクロリアクターに封入する工程。
【請求項２】
工程ｈ）における封入の前に、トランスフェクトされた細胞がタンパク発現が可能な条件下でインキュベートされる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
所定のターゲット分子に特異性を示す免疫受容体を発現する１種類の細胞について、請求項１又は２に記載の方法で作製された発現細胞のライブラリをスクリーニングする方法であって、下記の工程の少なくとも１つを含む上記の方法。
ｉ）マイクロリアクター内に侵入し、そこに含まれる発現細胞によって発現される免疫受容体に結合できる標識化ターゲットを用いる工程、及び／又は
ｊ）マイクロリアクターから既に流出し、今や上清中に存在する発現細胞によって発現される免疫受容体を、マイクロリアクター培養物の逐次分画と組み合わせて検出する工程。
【請求項４】
工程ｃ）の後に、前記免疫受容体のサブユニットをコードする２以上の遺伝子産物を含むコンストラクトを増幅する工程を更に有する、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
工程ｃ）の後に、下記の各工程を更に含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
（ｉ）ｍＲＮＡ捕捉部位における逆転写によるｃＤＮＡ合成をモニタする工程、及び
（ｉｉ）凝集したｍＲＮＡ捕捉部位を除去する工程。
【請求項６】
工程ｄ）における前記免疫受容体のサブユニットをコードする２以上の遺伝子産物を含むコンストラクトの作製が、オーバーラップ・エクステンションＰＣＲによるｃＤＮＡの増幅により達成される、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記コンストラクトを増幅する工程がネスティッドＰＣＲの使用を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
調節エレメントをＰＣＲ産物に挿入する工程を更に含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記免疫受容体が、少なくとも２つのサブユニットを有する抗体、又は少なくとも２つのサブユニットを有するＴ細胞受容体である、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記免疫受容体が、治療目的のタンパク、診断又は科学研究目的のタンパク、又は産業目的のタンパクである、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法
【請求項１１】
上記ｍＲＮＡ捕捉部位が、磁性ビーズ又は粒子である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ｍＲＮＡ捕捉部位が、その表面に結合したオリゴｄＴ−ＤＮＡ配列を含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
上記２シストロン性又は多シストロン性発現ベクターが、ＩＲＥＳ（内部リボソーム侵入部位）配列との組み合わせを伴う、又は伴わない２Ａペプチド結合多シストロン性ベクターである、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
各マイクロリアクターが１個のソース細胞を含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記マイクロリアクターが、
・ハイドロゲル形成ポリマー、好ましくはポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロリド）、ポリ（エチレンイミン）、ポリリジン、ポリアクリルアミド及び／又はアクリル酸、
・セルロース誘導体、好ましくはカルボキシメチルセルロース及びセルロースエステル、及び／又は
・多糖類、好ましくはアガロース、アルギン酸（alginates）、カラギーナン、ペクチン酸(pectinates)及び／又はキトサン、
から成る群より選択される材料を含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記マイクロリアクターが、水／油（water/oil）エマルジョン中の水滴として形成される、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記マイクロリアクターが、１０μｍ以上１０００μｍ以下の直径ヲ有する、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記マイクロリアクターが、０．５２ｐｌ以上５２３ｎｌ以下の容量を有する、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記マイクロリアクターが楕円体形状を有する、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記ソース細胞が細胞のコレクションに由来するものであり、前記コレクションンのメンバーが、異なる免疫受容体用の遺伝子産物を含む、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記ソース細胞が、未成熟又は成熟したＢ細胞又はＴ細胞から成る群より選択される哺乳類細胞である、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記免疫受容体のサブユニットをコードする２以上の遺伝子又は遺伝子産物が、
・Ｉｇ重鎖遺伝子（ＶＤＪ再構成）及びＩｇ軽鎖遺伝子（ＶＪ再構成）、又は
・ＴＣＲα鎖遺伝子（再構成）及びＴＣＲβ鎖遺伝子（再構成）
である、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
・Ｉｇ定常Ｈサブドメイン及び／又はＩｇ定常Ｌサブドメイン、又は
・ＴＣＲα鎖及びＴＣＲβ鎖
をコードするｃＤＮＡをＰＣＲ産物中に挿入する工程を更に含む、請求項１から２２のいずれか一項に記載の方法。
【外国語明細書】
2020054355000001.pdf