(57)【要約】【課題】実際の口腔内のバイオフィルム、中でも、デンチャーバイオフィルムを想定したインビトロバイオフィルムモデル用の菌体組成物を提供することである。本発明の目的はさらに、バイオフィルム形成予防・治療剤の有効成分の候補物質の開発において、候補物質のバイオフィルム形成抑制能のプレ評価に有用なインビトロバイオフィルムモデル用の菌体組成物を提供することである。【解決手段】ストレプトコッカス属細菌、ベイヨネラ属細菌、アクチノマイセス属細菌、プレボテラ属細菌、ナイセリア属細菌、フソバクテリア属細菌、及びカンジダ属真菌の菌体を含む、インビトロバイオフィルムモデル用の菌体組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ストレプトコッカス属細菌、ベイヨネラ属細菌、アクチノマイセス属細菌、プレボテラ属細菌、ナイセリア属細菌、フソバクテリア属細菌、及びカンジダ属真菌の菌体を含む、インビトロバイオフィルムモデル用の菌体組成物。
【請求項２】
下記（１）〜（７）からなる群より選ばれる少なくとも１つを満たす、請求項１に記載の菌体組成物。
（１）ストレプトコッカス属細菌がストレプトコッカス・ゴルドニー及びストレプトコッカス・ミュータンスのいずれかを少なくとも含むこと
（２）ベイヨネラ属細菌がベイヨネラ・パルビュラを少なくとも含むこと
（３）アクチノマイセス属細菌がアクチノマイセス・ネスランディを少なくとも含むこと
（４）プレボテラ属細菌がプレボテラ・インターメディアを少なくとも含むこと
（５）ナイセリア属細菌がナイセリア・サブフラーバを少なくとも含むこと
（６）フソバクテリア属細菌がフソバクテリウム・ヌクレアタムを少なくとも含むこと
（７）カンジダ属真菌がカンジダ・アルビカンス及びカンジダ・グラブラータのいずれかを少なくとも含むこと
【請求項３】
インビトロデンチャーバイオフィルムモデル用である、請求項１又は２に記載の菌体組成物。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の菌体組成物を含有する、インビトロバイオフィルム。
【請求項５】
ストレプトコッカス属細菌、ベイヨネラ属細菌、アクチノマイセス属細菌、プレボテラ属細菌、ナイセリア属細菌、フソバクテリア属細菌、及びカンジダ属真菌の菌体量の合計を１００質量％としたとき、以下の（ａ）〜（ｆ）からなる群より選ばれる少なくとも１つを満たす、請求項４に記載のインビトロバイオフィルム。
（ａ）ストレプトコッカス属細菌及びベイヨネラ属細菌の合計菌体量の構成比が４５〜５５質量％であること
（ｂ）アクチノマイセス属細菌の菌体量の構成比が３０〜４０質量％であること
（ｃ）プレボテラ属細菌の菌体量の構成比が１〜１０質量％であること
（ｄ）ナイセリア属細菌の菌体量の構成比が１〜１０質量％であること
（ｅ）フソバクテリア属細菌の菌体量の構成比が１〜１０質量％であること
（ｆ）カンジダ属真菌の含有量が０．１〜１質量％であること
【請求項６】
付着用担体上に付着している、請求項４又は５に記載のインビトロバイオフィルム。
【請求項７】
付着用担体が有機材料製である、請求項６に記載のインビトロバイオフィルム。
【請求項８】
ストレプトコッカス属細菌、ベイヨネラ属細菌、アクチノマイセス属細菌、プレボテラ属細菌、ナイセリア属細菌、フソバクテリア属細菌、及びカンジダ属真菌の菌体を含有する、インビトロバイオフィルム形成用菌体組成物。
【請求項９】
以下の（Ａ）〜（Ｇ）からなる群より選ばれる少なくとも１つを満たす、請求項８に記載のインビトロバイオフィルム形成用菌体組成物。
（Ａ）ストレプトコッカス属細菌の菌体含有量が１×１０4ｃｆｕ／ｍＬ以上１×１０8ｃｆｕ／ｍＬ以下であること
（Ｂ）ベイヨネラ属細菌の菌体含有量が１×１０4ｃｆｕ／ｍＬ以上１×１０8ｃｆｕ／ｍＬ以下であること
（Ｃ）アクチノマイセス属細菌の菌体含有量が１×１０6ｃｆｕ／ｍＬ以上１×１０10ｃｆｕ／ｍＬ以下であること
（Ｄ）プレボテラ属細菌の菌体含有量が１×１０5ｃｆｕ／ｍＬ以上１×１０11ｃｆｕ／ｍＬ以下であること
（Ｅ）ナイセリア属細菌の菌体含有量が１×１０5ｃｆｕ／ｍＬ以上１×１０11ｃｆｕ／ｍＬ以下であること
（Ｆ）フソバクテリウム属細菌の菌体含有量が１×１０4ｃｆｕ／ｍＬ以上１×１０8ｃｆｕ／ｍＬ以下であること
（Ｇ）カンジダ属真菌の菌体含有量が１．１×１０4ｃｆｕ／ｍＬ以上１．１×１０8ｃｆｕ／ｍＬ以下であること
【請求項１０】
請求項８又は９に記載のインビトロバイオフィルム形成用菌体組成物を含むインビトロバイオフィルム作製用のキット。
【請求項１１】
請求項８又は９に記載のインビトロバイオフィルム形成用菌体組成物を含む、被験サンプルのインビトロバイオフィルム形成抑制能評価用のキット
【請求項１２】
付着用担体を更に含む請求項１０又は１１に記載のキット。
【請求項１３】
ストレプトコッカス属細菌、ベイヨネラ属細菌、アクチノマイセス属細菌、プレボテラ属細菌、ナイセリア属細菌、フソバクテリア属細菌、及びカンジダ属真菌を付着用担体と共に培養することを含むインビトロバイオフィルムの製造方法。
【請求項１４】
ストレプトコッカス属細菌、ベイヨネラ属細菌、アクチノマイセス属細菌、プレボテラ属細菌、ナイセリア属細菌、フソバクテリア属細菌、及びカンジダ属真菌を付着用担体及び被験サンプルとともに培養すること、及び
インビトロバイオフィルムの形成の程度を確認すること、
を含む、被験サンプルのバイオフィルム形成抑制能の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インビトロバイオフィルムモデル用菌体組成物及びその用途に関し、詳しくは菌体組成物、インビトロバイオフィルム、その製造方法、インビトロバイオフィルム形成抑制能の評価方法、インビトロバイオフィルム作製用のキット、インビトロバイオフィルム形成抑制能評価用のキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
高齢化に伴い、義歯装着者数は、増加傾向にある。義歯に生育する細菌及び真菌は、高齢者特有の疾患の原因となり得ること、中でもＣａｎｄｉｄａ属真菌は、義歯性口内炎の原因菌であることが報告されている。Ｃａｎｄｉｄａ属真菌は、口腔内細菌と共に、義歯表面にバイオフィルムを形成して生育し、疾患の原因となる。そのため、疾患の予防においては、バイオフィルムの制御が重要である。
【０００３】
バイオフィルムを制御する有効成分の探索及び評価手段として、従来の動物実験やヒトでの臨床試験の他に、１種又は２種以上の細菌を利用するインビトロ評価系が提案されている。インビトロ評価系によれば、動物実験のような倫理的問題及び動物とヒトの口腔内環境の相違に起因する問題を解消できる。また、ヒトでの臨床試験のような被験者への多大な負担が解消でき、費用及び時間の節約も期待できる。
【０００４】
インビトロ評価系としては、インビトロバイオフィルムモデルが検討されている。カンジダ属真菌を利用するインビトロバイオフィルムとしては例えば、カンジダ属真菌のみ、又はカンジダ属真菌とストレプトコッカス属細菌の２菌種を、スクロース、血清存在下で培養して得られるインビトロバイオフィルムモデル、１１菌種を用いた義歯性のバイオフィルムモデルが報告されている（非特許文献１〜３）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】白井ら，老年歯科医学，１９，３（２００４）１５６−６０「各種義歯洗浄剤のバイオフィルム形成Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓに対する除去効果」（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｊｓｔａｇｅ．ｊｓｔ．ｇｏ．ｊｐ／ａｒｔｉｃｌｅ／ｊｓｇ１９８７／１９／３／１９＿１５６／＿ｐｄｆ／−ｃｈａｒ／ｊａ）
【非特許文献２】Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｏｒａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２５（２０１０）３８４−９０“Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｂｉｏｆｉｌｍ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ  ｏｆ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｎ  ｖａｒｉｏｕｓ  ｄｅｎｔａｌ  ｍａｔｅｒｉａｌ  ｓｕｒｆａｃｅｓ”
【非特許文献３】Ｓｈｅｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．７、Ａｒｔｉｃｌｅ  ９１２（２０１６）“Ｖｉａｂｌｅ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａｎ  Ｅｌｅｖｅｎ  Ｓｐｅｃｉｅｓ  Ｏｒａｌ  Ｐｏｌｙｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｂｉｏｆｉｌｍ”（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｍｃ／ａｒｔｉｃｌｅｓ／ＰＭＣ４９０２０１１／ｐｄｆ／ｆｍｉｃｂ−０７−００９１２．ｐｄｆ）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、従来技術のように、カンジダ菌のみあるいはカンジダ属真菌とストレプトコッカス属細菌の２菌種のインビトロバイオフィルム、実際の口腔内には長時間存在しない量のスクロース、血清存在下で培養して作製されたインビトロバイオフィルムは、実環境との間に乖離が生じていることが懸念される。また、前記１１菌種から得られるインビトロバイオフィルムモデルは、その調製において、多数の菌を３群に分け多段階方式による（ある群を培養してバイオフィルムを形成させた後他の群を順次添加して培養を続ける）ことから、操作の煩雑さ、バイオフィルム中の菌の存在状態（各菌が（層状に）局在化）の実環境との乖離が懸念される。また、多段階添加であるため、バイオフィルム形成抑制評価ツールとしてのプレバイオフィルムモデル処方には適していないという問題もある。
【０００７】
本発明の目的は、実際の口腔内のバイオフィルム、中でも、義歯の表面に形成されるバイオフィルム（以下、デンチャーバイオフィルムと言う）を想定したインビトロバイオフィルムモデル用の菌体組成物を提供することである。本発明の目的はさらに、バイオフィルム形成予防・治療剤の有効成分の候補物質の開発において、候補物質のバイオフィルム形成抑制能のプレ評価に有用なインビトロバイオフィルムモデル用の菌体組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、下記の〔１〕〜〔１４〕を提供する。
〔１〕ストレプトコッカス属細菌、ベイヨネラ属細菌、アクチノマイセス属細菌、プレボテラ属細菌、ナイセリア属細菌、フソバクテリア属細菌、及びカンジダ属真菌の菌体を含む、インビトロバイオフィルムモデル用の菌体組成物。
〔２〕下記（１）〜（７）からなる群より選ばれる少なくとも１つを満たす、〔１〕に記載の菌体組成物。
（１）ストレプトコッカス属細菌がストレプトコッカス・ゴルドニー及びストレプトコッカス・ミュータンスのいずれかを少なくとも含むこと
（２）ベイヨネラ属細菌がベイヨネラ・パルビュラを少なくとも含むこと
（３）アクチノマイセス属細菌がアクチノマイセス・ネスランディを少なくとも含むこと
（４）プレボテラ属細菌がプレボテラ・インターメディアを少なくとも含むこと
（５）ナイセリア属細菌がナイセリア・サブフラーバを少なくとも含むこと
（６）フソバクテリア属細菌がフソバクテリウム・ヌクレアタムを少なくとも含むこと
（７）カンジダ属真菌がカンジダ・アルビカンス及びカンジダ・グラブラータのいずれかを少なくとも含むこと
〔３〕インビトロデンチャーバイオフィルムモデル用である、〔１〕又は〔２〕に記載の菌体組成物。
〔４〕〔１〕〜〔３〕のいずれか１項に記載の菌体組成物を含有する、インビトロバイオフィルム。
〔５〕ストレプトコッカス属細菌、ベイヨネラ属細菌、アクチノマイセス属細菌、プレボテラ属細菌、ナイセリア属細菌、フソバクテリア属細菌、及びカンジダ属真菌の菌体量の合計を１００質量％としたとき、以下の（ａ）〜（ｆ）からなる群より選ばれる少なくとも１つを満たす、〔４〕に記載のインビトロバイオフィルム。
（ａ）ストレプトコッカス属細菌及びベイヨネラ属細菌の合計菌体量の構成比が４５〜５５質量％であること
（ｂ）アクチノマイセス属細菌の菌体量の構成比が３０〜４０質量％であること
（ｃ）プレボテラ属細菌の菌体量の構成比が１〜１０質量％であること
（ｄ）ナイセリア属細菌の菌体量の構成比が１〜１０質量％であること
（ｅ）フソバクテリア属細菌の菌体量の構成比が１〜１０質量％であること
（ｆ）カンジダ属真菌の含有量が０．１〜１質量％であること
〔６〕付着用担体上に付着している、〔４〕又は〔５〕に記載のインビトロバイオフィルム。
〔７〕付着用担体が有機材料製である、〔６〕に記載のインビトロバイオフィルム。
〔８〕ストレプトコッカス属細菌、ベイヨネラ属細菌、アクチノマイセス属細菌、プレボテラ属細菌、ナイセリア属細菌、フソバクテリア属細菌、及びカンジダ属真菌の菌体を含有する、インビトロバイオフィルム作製用又はインビトロバイオフィルム形成抑制評価用のインビトロバイオフィルム形成用菌体組成物。
〔９〕以下の（Ａ）〜（Ｇ）からなる群より選ばれる少なくとも１つを満たす、〔８〕に記載のインビトロバイオフィルム形成用菌体組成物。
（Ａ）ストレプトコッカス属細菌の菌体含有量が１×１０4ｃｆｕ／ｍＬ以上１×１０8ｃｆｕ／ｍＬ以下であること
（Ｂ）ベイヨネラ属細菌の菌体含有量が１×１０4ｃｆｕ／ｍＬ以上１×１０8ｃｆｕ／ｍＬ以下であること
（Ｃ）アクチノマイセス属細菌の菌体含有量が１×１０6ｃｆｕ／ｍＬ以上１×１０10ｃｆｕ／ｍＬ以下であること
（Ｄ）プレボテラ属細菌の菌体含有量が１×１０5ｃｆｕ／ｍＬ以上１×１０11ｃｆｕ／ｍＬ以下であること
（Ｅ）ナイセリア属細菌の菌体含有量が１×１０5ｃｆｕ／ｍＬ以上１×１０11ｃｆｕ／ｍＬ以下であること
（Ｆ）フソバクテリウム属細菌の菌体含有量が１×１０4ｃｆｕ／ｍＬ以上１×１０8ｃｆｕ／ｍＬ以下であること
（Ｇ）カンジダ属真菌の菌体含有量が１．１×１０4ｃｆｕ／ｍＬ以上１．１×１０8ｃｆｕ／ｍＬ以下であること
〔１０〕〔８〕又は〔９〕に記載のインビトロバイオフィルム形成用菌体組成物及び付着用担体を含むインビトロバイオフィルム作製用のキット。
〔１１〕〔８〕又は〔９〕に記載のインビトロバイオフィルム形成用菌体組成物及び付着用担体を含む、被験サンプルのインビトロバイオフィルム形成抑制能評価用のキット。
〔１２〕付着用担体が有機材料製である〔１０〕又は〔１１〕に記載のキット。
〔１３〕ストレプトコッカス属細菌、ベイヨネラ属細菌、アクチノマイセス属細菌、プレボテラ属細菌、ナイセリア属細菌、フソバクテリア属細菌、及びカンジダ属真菌を付着用担体と共に培養することを含むインビトロバイオフィルムの製造方法。
〔１４〕ストレプトコッカス属細菌、ベイヨネラ属細菌、アクチノマイセス属細菌、プレボテラ属細菌、ナイセリア属細菌、フソバクテリア属細菌、及びカンジダ属真菌を付着用担体及び被験サンプルとともに培養すること、及び
インビトロバイオフィルムの形成の程度を確認すること、
を含む、被験サンプルのバイオフィルム形成抑制能の評価方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、従来よりも実際の口腔内のバイオフィルムにより近い組成のインビトロバイオフィルムモデル用の菌体組成物が形成される。本発明の菌体組成物は、デンチャーバイオフィルムを再現でき、被験サンプル（例えば、バイオフィルムの分散剤及び除去剤、並びに殺菌剤及び抗菌剤等の剤の有効成分候補物質）のバイオフィルム形成抑制能の評価に用いることができる。また、本発明の菌体組成物は、口腔分野等の幅広い分野で、バイオフィルム形成予防・治療剤の有効成分の候補物質の開発において、候補物質のバイオフィルム形成抑制能評価に用いることができる。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明をその好適な実施形態に即して詳細に説明する。
【００１１】
［インビトロバイオフィルムモデル］
本明細書においてインビトロバイオフィルムモデルとは、インビトロバイオフィルムに関する技術を包括的に表す用語である。すなわち、インビトロバイオフィルム（全体及び一部）のみならず、その前駆体（例えば、インビトロバイオフィルム製造用またはインビトロバイオフィルム形成抑制評価用に使用するためのインビトロバイオフィルム形成用菌体組成物、作製用・評価用キット等）を意味する。
【００１２】
［菌体組成物］
菌体組成物は、ストレプトコッカス属細菌、ベイヨネラ属細菌、アクチノマイセス属細菌、プレボテラ属細菌、ナイセリア属細菌、フソバクテリア属細菌、及びカンジダ属真菌に由来する。カンジダ属真菌と口腔内の特定の常在菌及び病原菌を組み合わせることにより、実際の口腔内のバイオフィルム、中でもデンチャーバイオフィルムに近い組成のインビトロバイオフィルムモデルに用いることができる。
【００１３】
［ストレプトコッカス属細菌］
ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌としては、例えば、ストレプトコッカス・ゴルドニー（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｄｏｎｉｉ）、ストレプトコッカス・オラーリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｒａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・ミティス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｔｉｓ）、ストレプトコッカス・サリバリウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ストレプトコッカス・サングイニイス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｎｇｕｉｎｉｓ）、ストレプトコッカス・クリスタタス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｒｉｓｔａｔｕｓ）、ストレプトコッカス・インターメディウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）、ストレプトコッカス・ソブリナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｏｂｒｉｎｕｓ）、ストレプトコッカス・ニューモニア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）が挙げられる。これらのうち、ストレプトコッカス・ゴルドニー、ストレプトコッカス・ミュータンスが好ましい。ストレプトコッカス属細菌は、１種を用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００１４】
［ベイヨネラ属細菌］
ベイヨネラ（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ）属細菌としては、例えば、ベイヨネラ・パルビュラ（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ  ｐａｒｖｕｌａ）、ベイヨネラ・ディスパー（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ  ｄｉｓｐａｒ）が挙げられる。これらのうち、ベイヨネラ・パルビュラが好ましい。ベイヨネラ属細菌は、１種を用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００１５】
［アクチノマイセス属細菌］
アクチノマイセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）属細菌としては、例えば、アクチノマイセス・ビスコーサス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｓｃｏｓｕｓ）、アクチノマイセス・ネスランディ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ）、アクチノマイセス・オーリス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｏｒｉｓ）、アクチノマイセス・イスラエリイ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｉｓｒａｅｌｉｉ）、アクチノマイセス・オドントリティカス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｏｄｏｎｔｏｌｙｔｉｃｕｓ）が挙げられる。これらのうち、アクチノマイセス・ネスランディが好ましい。アクチノマイセス属細菌は、１種を用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００１６】
［プレボテラ属細菌］
プレボテラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）属細菌としては例えば、プレボテラ・インターメディア（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）、プレボテラ・ブカエ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｂｕｃｃａｅ）、プレボテラ・デンタリス（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｄｅｎｔａｌｉｓ）、プレボテラ・ヘパリノリティカ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｈｅｐａｒｉｎｏｌｙｔｉｃａ）、プレボテラ・オラリス（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｏｒａｌｉｓ）、プレボテラ・オリス（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｏｒｉｓ）、プレボテラ・オウロラム（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｏｕｌｏｒｕｍ）、プレボテラ・ベロラリス（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｖｅｒｏｒａｌｉｓ）が挙げられる。これらのうち、プレボテラ・インターメディアが好ましい。プレボテラ属細菌は、１種を用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００１７】
［ナイセリア属細菌］
ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）属細菌としては、例えば、ナイセリア・サブフラーバ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｓｕｂｆｌａｖａ）、ナイセリア・デニトリフィカンス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、ナイセリア・フラベセンス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）、ナイセリア・ミュコーサ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｕｃｏｓａ）、ナイセリア・シッカ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｓｉｃｃａ）が挙げられる。これらのうち、ナイセリア・サブフラーバが好ましい。ナイセリア属細菌は、１種を用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００１８】
［フソバクテリウム属細菌］
フソバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌としては、例えば、フソバクテリウム・ヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）、フソバクテリウム・ゴニディアフォーマンス（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｏｎｉｄｉａｆｏｒｍａｎｓ）が挙げられる。これらのうち、フソバクテリウム・ヌクレアタムが好ましい。フソバクテリウム属細菌は、１種を用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００１９】
［カンジダ属真菌］
カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属真菌としては、例えば、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ・グラブラータ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ）、カンジダ・クルーセイ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｋｒｕｓｅｉ）、カンジダ・パラプシローシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）が挙げられる。これらのうち、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・グラブラータが好ましい。カンジダ属真菌は、１種を用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００２０】
菌体組成物は、上記した各菌の菌体を含めばよく、他の菌種を含んでもよい。他の菌種は特に限定されないが、デンチャーバイオフィルム又は口腔内の細菌叢を構成する菌であることが好ましく、例えば、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ属細菌、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌、Ｒｏｔｈｉａ属細菌、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ属細菌、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ属細菌、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ属細菌、Ｌａｕｔｒｏｐｉａ属細菌、Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ属細菌、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ属細菌、Ｋｉｎｇｅｌｌａ属細菌、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ属細菌、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属細菌が挙げられる。菌体は生菌体であることが好ましい。
【００２１】
［菌体組成物の組成］
菌体組成物の組成は、特に限定されない。一例を挙げると、ストレプトコッカス属細菌、ベイヨネラ属細菌、アクチノマイセス属細菌、プレボテラ属細菌、ナイセリア属細菌、フソバクテリア属細菌、及びカンジダ属真菌の菌体量の合計を１００質量％としたとき、インビトロバイオフィルムを構成する各菌体の構成比は、以下のいずれかのうちの１つ以上を満たすことが好ましく、全てを満たすことが好ましい。これにより、菌体組成物は、インビトロバイオフィルムとして好ましく用いることができる：
ストレプトコッカス属細菌及びベイヨネラ属細菌の合計菌体量の構成比が好ましくは４０質量％以上、特に４５質量％以上であること、又は６０質量％以下、特に５５質量％以下であること、より好ましくは４０〜６０質量％、特に４５〜５５質量％であること、
アクチノマイセス属細菌の菌体量の構成比が好ましくは２５質量％以上、特に３０質量％以上であること、又は５０質量％以下、特に４０質量％以下であること、より好ましくは２５〜５０質量％、特に３０〜４０質量％であること、
プレボテラ属細菌の菌体量の構成比が好ましくは０．５質量％以上、特に１質量％以上であること、又は１５質量％以下、特に１０質量％以下であること、より好ましくは０．５〜１５質量％、特に１〜１０質量％であること、
ナイセリア属細菌の菌体量の構成比が好ましくは０．５質量％以上、特に１質量％以上であること、又は１５質量％以下、特に１０質量％以下であること、より好ましくは０．５〜１５質量％、特に１〜１０質量％であること、
フソバクテリア属細菌の菌体量の構成比が好ましくは０．１質量％以上、特に１質量％以上であること、又は１５質量％以下、特に１０質量％以下であること、より好ましくは０．１〜１５質量％、特に１〜１０質量％であること、及び
カンジダ属真菌の菌体量の構成比が好ましくは０．１質量％以上であること、又は５質量％以下、特に１質量％以下であること、より好ましくは０．１〜５質量％、特に０．１〜１質量％であること。
【００２２】
上記菌体構成比は、２種以上の菌において満たすことが好ましく、全ての菌が満たすことがより好ましい。これにより菌体組成物は、インビトロバイオフィルムとして好適であり、中でもデンチャーバイオフィルムに近い組成を有するインビトロデンチャーバイオフィルムとして用いることができる。上記菌体構成比は、デンチャーバイオフィルムの各細菌が属する門の細菌構成比（例えば以下の文献）を参照して推定した構成比である。
・ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，１０（９），２０１５（ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１３７７１７）
Ｔｈｅ  Ｏｒａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ  ｏｆ  Ｄｅｎｔｕｒｅ  Ｗｅａｒｅｒｓ  Ｉs  Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｄ  ｂｙ  Ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｄｅｎｔｉｔｉｏｎ.
・ｍＳｐｈｅｒｅ，１（６），２０１６（ｄｏｉ：１０．１１２８／ｍＳｐｈｅｒｅ．００２１５−１６）
Ｔｈｅ  Ｄｅｎｔｕｒｅ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｏｒａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ  ｉｎ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ．
【００２３】
菌体組成物に含まれる菌体は、生菌体が好ましい。菌体は前培養を経ていてもよい。前培養の条件（例、培地、培養温度、培養時間）は、それぞれの菌体に適した条件であればよい。
【００２４】
［インビトロバイオフィルム形成用菌体組成物、播種菌量］
本明細書において、インビトロバイオフィルム形成用菌体組成物は、インビトロバイオフィルム作製用、又はインビトロバイオフィルム形成抑制評価用に供される菌体組成物である。インビトロバイオフィルム形成用菌体組成物は、それ自体がインビトロバイオフィルムではないが、培養後にインビトロバイオフィルムを形成する培養未完了の組成物である。これにより、インビトロバイオフィルム形成用菌体組成物は、インビトロバイオフィルム作製用の出発材料として用いることができる。また、被験サンプルのバイオフィルム形成抑制能の評価用材料として用いることができる。
インビトロバイオフィルム形成用菌体組成物は、ストレプトコッカス属細菌、ベイヨネラ属細菌、アクチノマイセス属細菌、プレボテラ属細菌、ナイセリア属細菌、フソバクテリア属細菌、及びカンジダ属真菌の菌体を含む。インビトロバイオフィルム形成用菌体組成物中の播種時の菌量（播種菌量）は、上記６種のうち１種又は２種以上の菌の播種菌量が以下の範囲を満たすことが好ましく、すべての播種菌量が以下の範囲を満たすことが好ましい。なお、播種菌量は、インビトロバイオフィルム形成用菌体組成物中の培地１ｍＬあたりの菌体含有量（単位：コロニーフォーミングユニット（ｃｆｕ））である。
ストレプトコッカス属細菌の播種菌量は、好ましくは１×１０4ｃｆｕ／ｍＬ以上、より好ましくは１×１０5ｃｆｕ／ｍＬ以上である。上限は好ましくは１×１０8ｃｆｕ／ｍＬ以下、より好ましくは１０7ｃｆｕ／ｍＬ以下である。従って、好ましくは１×１０4〜１×１０8ｃｆｕ／ｍＬ、より好ましくは１×１０5〜１×１０7ｃｆｕ／ｍＬである。
【００２５】
ベイヨネラ属細菌の播種菌量は、好ましくは１×１０4ｃｆｕ／ｍＬ以上、より好ましくは１×１０5ｃｆｕ／ｍＬ以上である。上限は好ましくは１×１０8ｃｆｕ／ｍＬ以下、より好ましくは１０7ｃｆｕ／ｍＬ以下である。従って、好ましくは１×１０4〜１×１０8ｃｆｕ／ｍＬ、より好ましくは１×１０5〜１×１０7ｃｆｕ／ｍＬである。
【００２６】
アクチノマイセス属細菌の播種菌量は、好ましくは１×１０6ｃｆｕ／ｍＬ以上、より好ましくは１×１０7ｃｆｕ／ｍＬ以上である。上限は好ましくは１×１０10ｃｆｕ／ｍＬ以下、より好ましくは１×１０9ｃｆｕ／ｍＬ以下である。従って、好ましくは１×１０6〜１×１０10ｃｆｕ／ｍＬ、より好ましくは１×１０7〜１×１０9ｃｆｕ／ｍＬである。
【００２７】
プレボテラ属細菌の播種菌量は、好ましくは１×１０5ｃｆｕ／ｍＬ以上、より好ましくは５×１０6ｃｆｕ／ｍＬ以上である。上限は好ましくは１×１０11ｃｆｕ／ｍＬ以下、より好ましくは５×１０8ｃｆｕ／ｍＬ以下である。従って、好ましくは１×１０5〜１×１０11ｃｆｕ／ｍＬ、より好ましくは５×１０6〜５×１０8ｃｆｕ／ｍＬである。
【００２８】
ナイセリア属細菌の播種菌量は、好ましくは１×１０5ｃｆｕ／ｍＬ以上、より好ましくは５×１０6ｃｆｕ／ｍＬ以上である。上限は、好ましくは１×１０11ｃｆｕ／ｍＬ以下、より好ましくは５×１０8ｃｆｕ／ｍＬ以下である。従って、好ましくは１×１０5〜１×１０11ｃｆｕ／ｍＬ、より好ましくは５×１０6〜５×１０8ｃｆｕ／ｍＬである。
【００２９】
フソバクテリウム属細菌の播種菌量は、好ましくは１×１０4ｃｆｕ／ｍＬ以上、より好ましくは１×１０5ｃｆｕ／ｍＬ以上である。上限は、好ましくは１×１０8ｃｆｕ／ｍＬ以下、より好ましくは１×１０7ｃｆｕ／ｍＬ以下である。従って、好ましくは１×１０4〜１×１０8ｃｆｕ／ｍＬ、より好ましくは１×１０5〜１×１０7ｃｆｕ／ｍＬである。
【００３０】
カンジダ属真菌の播種菌量は、好ましくは１．１×１０4ｃｆｕ／ｍＬ以上、より好ましくは５．５×１０4ｃｆｕ／ｍＬ以上である。上限は、好ましくは１．１×１０8ｃｆｕ／ｍＬ以下、より好ましくは５．５×１０6ｃｆｕ／ｍＬ以下である。従って、好ましくは１．１×１０4〜１．１×１０8ｃｆｕ／ｍＬ、より好ましくは５．５×１０4〜５．５×１０6ｃｆｕ／ｍＬである。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの播種菌量は、好ましくは１×１０4ｃｆｕ／ｍＬ以上、より好ましくは５×１０4ｃｆｕ／ｍＬ以上である。上限は、好ましくは１×１０8ｃｆｕ／ｍＬ以下、より好ましくは５×１０6ｃｆｕ／ｍＬ以下である。従って、好ましくは１×１０4〜１×１０8ｃｆｕ／ｍＬ、より好ましくは５×１０4〜５×１０6ｃｆｕ／ｍＬである。Ｃ．ｇｌａｂｌａｔａの播種菌量は、好ましくは１×１０3ｃｆｕ／ｍＬ以上、より好ましくは５×１０3ｃｆｕ／ｍＬ以上である。上限は、好ましくは１×１０7ｃｆｕ／ｍＬ以下、より好ましくは５×１０5ｃｆｕ／ｍＬ以下である。従って、好ましくは１×１０3〜１×１０7ｃｆｕ／ｍＬ、より好ましくは５×１０3〜５×１０5ｃｆｕ／ｍＬである。
【００３１】
上述のインビトロバイオフィルム形成用菌体組成物（通常は、液状組成物）を培養することにより、上述の好ましい菌体組成を有するインビトロバイオフィルムを得ることができる。あるいは、バイオフィルム形成抑制剤と共に培養しバイオフィルム形成の有無を試験することにより、バイオフィルム形成抑制効果を評価することができる。例えば、培養後にバイオフィルムが形成されなければバイオフィルム形成抑制効果が高く、形成された場合は効果が低いと評価できる。
【００３２】
菌体組成物は、さらに培地を含んでもよい。インビトロバイオフィルム形成用菌体組成物の場合、通常は培地を含む。培地は、通常の栄養培地であればよく、液体培地及び固体培地の何れでもよいが、液体培地が好ましい。培地が含み得る炭素源としては、例えば、グルコース、スクロース、フラクトース、マルトース、マンノース、でんぷんが挙げられ、グルコースが好ましい。グルコースの含有量は、０．０１〜０．０８質量％が好ましい。窒素源としては、例えば、ペプトン、プロテオースペプトン、トリプトン、酵母エキスが挙げられる。プロテオースペプトンの含有量は１〜２０質量％であればよく、好ましくは２〜５質量％である。無機塩類としては、例えば、塩化カリウム、リン酸水素２カリウム、リン酸２水素カリウム、塩化ナトリウム、硫酸アンモニウム、硫酸マグネシウム、酢酸カリウムが挙げられる。その他の成分としては、ビタミン、血液成分、抗生物質が挙げられる。培地としては例えば、ＢＭＭ（Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｍｕｃｉｎ）培地が挙げられ、ＢＭＭ培地が好ましい。これにより、口腔内の環境に近い条件で各菌を培養することができ、実際のバイオフィルムの組成に近いインビトロバイオフィルムモデルを実現できる。ＢＭＭ培地は、プロテオースペプトン：トリプトン：イーストエキス：ムチン：ヘミン：ビタミンＫ：ＫＣｌ：システイン＝５：２．５：２．５：６．２５：０．００５：０．００１：１．２５：０．２５（例、特開２００３−１１６５１６号公報）を含み得る。
【００３３】
菌体組成物は、菌体及び培地以外の他の成分を含んでもよい。他の成分としては例えば、菌から分泌される代謝物、菌体組成物調製時の培養に用いられる（例えば、培地成分、生体成分）、必要に応じて行われる前培養の培地成分が挙げられる。
【００３４】
［菌体組成物の用途］
菌体組成物は、インビトロバイオフィルムモデルに関し様々な用途にて有用である。例えば、インビトロバイオフィルムそのものだけでなく、インビトロバイオフィルム作製用、形成抑制評価用のインビトロバイオフィルム形成用菌体組成物として用いることができる。即ち、菌体組成物は、被験サンプルのバイオフィルム形成抑制能のプレ評価、バイオフィルム形成抑制剤の有効成分の選抜、バイオフィルムの構造の解析、バイオフィルム形成プロセスの解析、等の用途にも用いることができる。
【００３５】
［インビトロバイオフィルム］
インビトロバイオフィルムは、バイオフィルムの分散剤及び除去剤並びに殺菌剤及び抗菌剤等の剤の有効成分候補物質の評価に有用である。
本明細書においてインビトロバイオフィルムは、生体に生じるバイオフィルム（例えば、口腔内バイオフィルム、好ましくはデンチャーバイオフィルム）を人工的に再現したモデルである。インビトロバイオフィルムは、菌体組成物を含めばよく、好ましくは、ストレプトコッカス属細菌、ベイヨネラ属細菌、アクチノマイセス属細菌、プレボテラ属細菌、ナイセリア属細菌、フソバクテリア属細菌、及びカンジダ属真菌の菌体量の合計を１００質量％としたとき各菌体の構成比が上述のインビトロバイオフィルムを構成する各菌体の好ましい範囲を満たす菌体組成物である。インビトロバイオフィルムは通常、付着用担体上に形成される。インビトロバイオフィルムは、必要に応じて任意成分（例えば、保存剤、安定剤等の公知の添加剤）をさらに含んでもよい。
【００３６】
［付着用担体（担体）］
バイオフィルム付着用担体の材料は、菌体が付着（接着、吸着）でき、菌体組成物の組成、培養に影響を与えない材料であればよく、義歯用材料が好ましい。これにより、義歯用のインビトロバイオフィルムモデルとして用いることができる。義歯用材料としては、有機材料が好ましく、合成樹脂がより好ましく、熱可塑性樹脂がさらに好ましい。熱可塑性樹脂としては例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、アクリル樹脂（ポリメタクリル酸メチル（以下、ＰＭＭＡ））、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリ塩化ビニル、ポリエチレンテレフタレート、ポリアセタール、ポリスチレン；これらを構成するモノマーを構成単位の一部とする共重合体、例えば、エチレン−プロピレン共重合体、エチレン−ブテン共重合体、アクリロニトリル−スチレン共重合体、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン共重合体（ＡＢＳ）等が挙げられ、ＰＭＭＡ、ポリカーボネート、ポリアミドが好ましく、ＰＭＭＡがより好ましい。担体は、通常、固体であり、取扱いに差し支えない形状であればよく、例えば、板状体（シート、フィルム、プレート）、義歯（特に義歯床）の少なくとも一部が挙げられる。
【００３７】
［インビトロバイオフィルムの製造方法］
インビトロバイオフィルムの製造方法は特に限定されないが、ストレプトコッカス属細菌、ベイヨネラ属細菌、アクチノマイセス属細菌、プレボテラ属細菌、ナイセリア属細菌、フソバクテリア属細菌、及びカンジダ属真菌を含む上述のインビトロバイオフィルム形成用菌体成物をバイオフィルム付着用担体と共に培養することを含む方法が好ましい。
【００３８】
培養条件は、特に限定されず、バッチ法でも連続培養法でもよい。培養時間は、通常は３時間〜３０日間、好ましくは６時間〜７２時間、より好ましくは２４時間〜４８時間である。培養は、好気条件及び嫌気条件のいずれでもよく、好気条件が好ましい。好気条件の場合の酸素濃度は、通常３〜８０％、好ましくは１６〜２５％、より好ましくは１９〜２２％である。培養温度は、３６〜３８℃が好ましい。
【００３９】
［他の添加成分］
培養時には、インビトロバイオフィルム形成用菌体組成物及び付着用担体以外の他の成分を添加してもよい。他の成分は、生体成分を含むことが好ましい。生体成分としては、例えば、細胞外マトリックス成分（例、コラーゲン、ムチン）、ペプチド断片、合成ペプチド（例、ポリ−Ｌ−リジン）、唾液、血清が挙げられ、唾液が好ましい。生体成分は、インビトロバイオフィルム製造の際に予め担体の表面にコーティングされていることが好ましい。これにより、担体上に、実際のバイオフィルムに近い組成を有するインビトロバイオフィルムを形成できる。
【００４０】
［容器］
培養は、インビトロバイオフィルム形成用菌体組成物と必要に応じて用いられる付着用担体及び他の成分を収容し得る容器内で行ってもよい。容器の材料、サイズは、収容物を保持できるサイズであれば特に限定されない。容器としては例えばシャーレ、マルチプレート、その他の微生物培養に一般的に用いられる容器が挙げられる。容器の材料としては、例えばガラス、ポリスチレン等の透明の材料が挙げられる。
【００４１】
インビトロバイオフィルムは、通常、付着用担体上に形成されるので、付着用担体及び必要に応じて用いる容器と共に、インビトロバイオフィルムモデルとしてそのまま利用できる。インビトロバイオフィルムが担体上に形成されたかどうかの確認は、例えば、バイオフィルムを常法に従いクリスタルバイオレット染色し、色素吸収を測定する方法が挙げられる。実施例のように、染色後に吸光度（Ａ５９５）を測定して、測定値が０．４以上であれば、インビトロバイオフィルムが形成されたと判定できる。
【００４２】
［バイオフィルム形成抑制能の評価方法］
上述のインビトロバイオフィルム形成用菌体組成物を用いて、被験サンプルのバイオフィルム形成抑制能（例、バイオフィルムの形成阻害能）を評価できる。評価方法としては例えば、（手順１）インビトロバイオフィルム形成用菌体組成物を付着用担体及び被験サンプルとともに培養すること、及び、（手順２）インビトロバイオフィルムの形成の程度を確認することを含む方法が挙げられる。バイオフィルムの形成量が少ないほど、形成抑制効果が高いと評価することができる。
【００４３】
（手順１）において、被験サンプルを培養系に添加するほかは、上述のインビトロバイオフィルム製造方法の手順と同様に行えばよい。被験サンプルの添加時期は培養開始前であることが好ましい。例えば、担体に被験サンプルを添加し、次にインビトロバイオフィルム形成用菌体組成物を添加して培養を開始することができる。また、被験サンプルとインビトロバイオフィルム形成用菌体組成物を混合して担体に添加し培養を開始することもできる。被験サンプルは、食品原料、食品添加物、化粧品原料、医薬部外品添加物、医薬部外品や医薬品の有効成分でもよく、特に限定されない。
【００４４】
（手順２）は、コントロールサンプルにおけるインビトロバイオフィルムの形成量と、サンプルにおけるインビトロバイオフィルムの形成量の差（例えば、実施例に記載された式で算出されるバイオフィルム形成抑制率）を確認して、判断できる。コントロールサンプルの調整は、被験サンプルを添加しないほかは（手順１）と同様に行えばよい。上記形成量の差を定量化することで、２以上のサンプルどうしの抑制能の差を比較してもよい。
【００４５】
［インビトロバイオフィルム作製用のキット］
インビトロバイオフィルム形成用菌体組成物及び必要に応じて付着用担体を含むキットは、インビトロバイオフィルム作製に利用できる。インビトロバイオフィルムの作製の手順については、インビトロバイオフィルムの製造方法に関し述べたのと同様である。キットはさらに、培養容器、培養環境（温度、時間、酸素量）を調整するためのセンサーを含んでいてもよい。
【００４６】
［バイオフィルム形成抑制能評価用のキット］
インビトロバイオフィルム形成用菌体組成物、培地、及び必要に応じて付着用担体を含むキットは、被験サンプルのバイオフィルム形成抑制能評価に用いることができる。被験サンプルのバイオフィルム形成抑制能の評価の手順については、バイオフィルム形成抑制能の評価方法に関し述べたのと同様である。キットはさらに、培養容器、培養環境（温度、時間、酸素量）を調整するためのセンサーを含んでいてもよい。
【００４７】
［インビトロバイオフィルムの形態、保存方法］
形成された直後のインビトロバイオフィルムは、通常、各菌の集合、代謝物を含む構成体であり、任意の添加成分（例えば、保存料）を含んでいてもよい。形成直後に使用してもよいし、保存後（例えば、凍結保存、冷蔵保存）に使用してもよい。保存にあたり、任意の処理を行ってもよく、任意の処理としては例えば、減圧濃縮、膜濃縮、凍結濃縮等の濃縮、真空乾燥、噴霧乾燥、凍結乾燥等の乾燥、冷蔵、冷凍が挙げられる。
本発明の菌体組成物は、デンチャーバイオフィルムを構成するカンジダ菌の他に複数の所定の口腔細菌をも含有し、従来のカンジダ菌含有インビトロバイオフィルムよりも実態に近いインビトロデンチャーバイオフィルムとして有用である。また、インビトロデンチャーバイオフィルム形成用菌体組成物として、デンチャーバイオフィルム形成抑制剤の性能評価に有用である。
【実施例】
【００４８】
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。以下の実施例は、本発明を好適に説明するためのものであって、本発明を限定するものではない。なお、物性値等の測定方法は、別途記載がない限り、上記に記載した測定方法である。
【００４９】
実験１：インビトロバイオフィルムモデルの作製（実施例１〜１７及び比較例１〜４）
（１）プレカルチャー
各細菌をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎより購入し、それぞれ以下の方法によりプレカルチャーを行った。
【００５０】
（１−１）アクチノマイセス属、ストレプトコッカス属、プレボテラ属、フソバクテリウム属細菌のプレカルチャー
以下の菌を用いた：
【００５１】
・Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｄｏｎｉｉ（以下、Ｓ．ｇｏｒｄｏｎｉｉ）ＡＴＣＣ１０５５８
・Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ（以下、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）ＡＴＣＣ２５１７５
・Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ（以下、Ａ．ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ）ＡＴＣＣ４３１４６
・Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ（以下、Ｐ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）ＡＴＣＣ４９０４６
・Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ（以下、Ｆ．ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）ＡＴＣＣ２３７２６
【００５２】
これらの菌を、５ｍｇ／Ｌのヘミン（Ｓｉｇｍａ社製）及び１ｍｇ／ＬのビタミンＫ（和光純薬工業社製）を含むトッドへヴィットブロス（Ｔｏｄｄ  Ｈｅｗｉｔｔ  Ｂｒｏｔｈ、Ｂｅｃｔｏｎ  ａｎｄ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（以下、ＢＤ）社製）培養液〔ＴＨＢＨＭ〕により培養した。
【００５３】
（１−２）ベイヨネラ属細菌のプレカルチャー
・Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ  ｐａｒｖｕｌａ（以下、Ｖ．ｐａｒｖｕｌａ）ＡＴＣＣ１７７４５は、１．２６％乳酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ社製）を含むトッドへヴィットブロス（ＢＤ社製）培養液により培養した。なお、培養は、３７℃で一晩嫌気培養（８０ｖｏｌ％窒素、１０ｖｏｌ％二酸化炭素、１０ｖｏｌ％水素）した。
【００５４】
（１−３）ナイセリア属細菌のプレカルチャー
・Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｓｕｂｆｌａｖａ（以下、Ｎ．ｓｕｂｆｌａｖａ）ＡＴＣＣ４９２７５は、培養液〔ＴＨＢＨＭ〕により、３７℃、好気条件下で培養した。
【００５５】
（１−４）カンジダ属真菌のプレカルチャー
以下の菌を用いた：
・カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ：  以下、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）ＡＴＣＣ  ＭＹＡ−２８７６
・カンジダ・グラブラータ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｌａｔａ  ：以下、Ｃ．ｇｌａｂｌａｔａ）ＡＴＣＣ９００３０
これらの菌は、ＹＰＤ培地（Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ  Ｐｅｐｔｏｎｅ  Ｄｅｘｔｒｏｓｅ  Ｂｒｏｔｈ、ＢＤ社製）により、２８℃、好気条件下で培養した。
【００５６】
（２）バイオフィルム作製
以下の手順により行った。
【００５７】
（２−１）インビトロバイオフィルム形成用菌体組成物の調製
前記（１）で説明した培養後の各菌を回収し、２．５×Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｍｕｃｉｎ（２．５×ＢＭＭ）に表１〜３に示す播種菌量（数値１は１×１０6ｃｆｕ／ｍＬに相当）の各菌を添加し、インビトロバイオフィルム形成用の混合菌液を調製した。２．５×Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍの組成及び一例として実施例１の混合菌液の菌組成を以下に示した。また、比較例１〜４では、それぞれいずれかの菌を添加しない混合菌液（表３）を調製した。
【００５８】
［２．５×ＢＭＭの１リットル中組成］
ムチン（Ｓｉｇｍａ）：      ６．２５ｇ
プロテオースペプトン（ＢＤ）：５ｇ
トリプトン（ＢＤ）：        ２．５ｇ
イーストエキス（ＢＤ）：    ２．５ｇ
ヘミン（Ｓｉｇｍａ）：      ５ｍｇ
ビタミンＫ（和光純薬工業）：１ｍｇ
ＫＣｌ（和光純薬工業）：    １．２５ｇ
システイン（和光純薬工業）：０．２５ｇ
グルコース（和光純薬工業）：０．５ｇ
【００５９】
［混合菌液の菌組成（実施例１の場合）］
・Ｓ．ｇｏｒｄｏｎｉｉ：    ５×１０6ｃｆｕ／ｍＬ
・Ｓ．ｍｕｔａｎｓ：        １×１０6ｃｆｕ／ｍＬ
・Ｖ．ｐａｒｖｕｌａ：      １×１０6ｃｆｕ／ｍＬ
・Ａ．ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ：５×１０8ｃｆｕ／ｍＬ
・Ｐ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ：１×１０8ｃｆｕ／ｍＬ
・Ｎ．ｓｕｂｆｌａｖａ：    １×１０8ｃｆｕ／ｍＬ
・Ｆ．ｎｕｃｌｅａｔｕｍ：  ５×１０5ｃｆｕ／ｍＬ
・Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ：    １×１０6ｃｆｕ／ｍＬ
・Ｃ．ｇｌａｂｌａｔａ：    １×１０5ｃｆｕ／ｍＬ
【００６０】
（２−２）担体の調製
フィルター滅菌した無刺激唾液を１時間処理して唾液コーティングした１０ｍｍ角アクリルレジン片（ＧＣ社製、アクロン、表面処理：♯１０００研磨）を２４穴マルチプレート（住友ベークライト社製）に設置した。
【００６１】
（２−３）担体への混合菌液添加
（２−２）で得られた担体に、（２−１）の混合菌液を１ｍＬ／ｗｅｌｌ播種し、３７℃、好気条件（酸素濃度：２１％）下で２４時間培養し、アクリルレジン片上にバイオフィルムを形成させた。
【００６２】
（３）バイオフィルム形成量の測定
以下の手順により行った。
（３−１）形成させたバイオフィルムをＰＢＳ（和光純薬工業社製）１ｍＬで２回洗浄した。
（３−２）４％パラホルムアルデヒド・りん酸緩衝液（和光純薬工業社製）にて１５分間固定し、１ｍＬのＰＢＳにて３回洗浄した。
（３−３）０．１％クリスタルバイオレット（和光純薬工業社製）液を添加して１５分間染色後、１ｍＬのＰＢＳにて３回洗浄した。
（３−４）３０％酢酸ナトリウムで１５分間インキュベートし、抽出液の吸光度を波長５９５ｎｍで測定し、吸光度によりバイオフィルム形成量（Ａ５９５）を評価した。評価基準は、以下のとおりとした。
【００６３】
［バイオフィルム形成量の評価基準］
○：吸光度が０．４以上
×：吸光度が０．４未満
【００６４】
（４）バイオフィルム中の構成菌数及び菌構成比率
形成させたバイオフィルムモデルに１ｍＬのＰＢＳを添加して超音波処理（２００μＡ、１０秒間）により分散し、各菌が選択的に生育する選択培地に塗抹して培養し、生えてくる菌コロニー数を計測することにより、培養液中の菌の生菌数及び菌構成比を測定した。測定条件は、以下のとおりとした。
【００６５】
Ｓ．ｇｏｒｄｏｎｉｉとＳ．ｍｕｔａｎｓは、ミティス・サリバリウス寒天培地（ＢＤ社製）で嫌気培養し、コロニー形態で判別し、カウントした。
Ｆ．ｎｕｃｌｅａｔｕｍとＶ．ｐａｒｖｕｌａは、ＣＶＥ寒天培地で嫌気培養し、コロニー形態で判別し、カウントした。
Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓとＣ．ｇｌａｂｌａｔａは、クロムアガーカンジダ寒天培地（ＢＤ社製）で好気培養し、コロニーの色で判別しカウントした（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ：緑色、Ｃ．ｇｌａｂｌａｔａ：紫色）。
Ａ．Ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉは１０ｍｇ／Ｌのコリスチン（和光純薬工業製）と馬脱繊血を含有するトッドへヴィットブロス（ＢＤ社製）寒天培地で好気培養し、コロニー数をカウントした。
Ｎ．ｓｕｂｆｌａｖａは０．５％の酵母エキス（ＢＤ社製）と３ｍｇ／Ｌのバンコマイシン（和光純薬工業製）を含有するＴｒｙｐｔｉｃａｓｅ  Ｓｏｙ  Ａｇａｒ（ＢＤ社製）培地で嫌気培養し、コロニー数をカウントした。
Ｐ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａはＫＭ寒天培地で嫌気培養し、コロニー数をカウントした。
【００６６】
ＫＭ寒天培地及びＣＶＥ寒天培地の組成を以下に示す。
【００６７】
［ＫＭ寒天培地の１リットル中組成］
Ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ  Ｓｏｙ  Ａｇａｒ（ＢＤ社製）：              ４０ｇ
ヘミン（Ｓｉｇｍａ社製）：                                          ５ｍｇ
ビタミンＫ（和光純薬工業社製）：                                    １ｍｇ
馬脱繊血：                                                        ５０ｍＬ
カナマイシン（Ｍｅｉｊｉ  Ｓｅｉｋａファルマ社製）２５０ｍｇ／ｍＬ：０．８ｍＬ
【００６８】
［ＣＶＥ寒天培地の１リットル中組成］
トリプチケースペプトン（ＢＤ社製）：                  １０ｇ
酵母エキス（ＢＤ社製）：                                ５ｇ
塩化ナトリウム（和光純薬工業社製）：                    ５ｇ
グルコース（和光純薬工業社製）：                        ２ｇ
Ｌ−トリプトファン（和光純薬工業社製）：                ０．２ｇ
寒天（和光純薬工業社製）：                            １５ｇ
馬脱繊血：                                            ５０ｍＬ
エリスロマイシン（Ｓｉｇｍａ社製）４ｍｇ／ｍＬ：        １ｍＬ
クリスタルバイオレット（和光純薬工業社製）５ｍｇ／ｍＬ：１ｍＬ
【００６９】
【表１】
2020167974.tif 000002
【００７０】
【表２】
2020167974.tif 000003
【００７１】
【表３】
2020167974.tif 000004
【００７２】
表１〜３の実施例で得られたインビトロデンチャーバイオフィルムは、デンチャーバイオフィルムを構成するカンジダ菌の他に複数の特定の口腔細菌を含有し、従来よりも実態に近いインビトロデンチャーバイオフィルムとして有用である。
【００７３】
実験２：バイオフィルム形成抑制の評価（実施例１のインビトロバイオフィルム形成用混合菌液使用）
２４穴マルチプレート（住友ベークライト社製）に設置した１０ｍｍ角アクリルレジン片（ＧＣアクロン、表面処理：♯１０００研磨）に対し、表４に記載した被験サンプル２−１（ＴｅｘＣａｒｅＳＲＮ−１７０：ＣＬＡＲＩＡＮＴ社製、１質量％水溶液）又は２−２（ラウリルジメチルアミノ酢酸ベタイン：日光ケミカルズ社製、１質量％水容液）  １ｍＬを添加し、５分間静置した。その後、滅菌蒸留水（ＤＷ）にて２回洗浄後、実験１（２）記載の方法、及び実施例１の播種用混合菌液を用いてバイオフィルムを形成させ、実験１（３）記載の方法でバイオフィルム形成量を求めた。被験サンプルを添加せず、ＤＷで２回洗浄し、同様にバイオフィルム形成させたものをコントロールとした。バイオフィルム形成抑制率は以下の式にて算出した。評価基準は、以下のとおりとした。結果を表４に示す。
【００７４】
［バイオフィルム形成抑制率］
バイオフィルム形成抑制率（％）＝（コントロールのバイオフィルム形成量−サンプル処置後のバイオフィルム形成量）／コントロールのバイオフィルム形成量×１００
【００７５】
［バイオフィルム形成抑制効果の評価基準］
Ａ：バイオフィルム形成抑制率５０％以上
Ｂ：バイオフィルム形成抑制率２５％以上５０％未満
Ｃ：バイオフィルム形成抑制率２５％未満
【００７６】
【表４】
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【００７７】
表４より、サンプル２−１及び２−２をそれぞれ添加した試験では、バイオフィルムの形成が抑制されたことが分かる。このことは、本発明のインビトロバイオフィルム形成用菌体組成物が、バイオフィルム、特にデンチャーバイオフィルムの形成抑制能の評価に用いることのできるインビトロバイオフィルムモデルとして有用であることを示している。