(57)【要約】【課題】顕著に優れた抗腫瘍効果を示し、副作用の少ない新規な癌治療方法の提供。【解決手段】エピトープ４連結ペプチドと免疫チェックポイント分子調節剤を併用投与することを特徴とする抗腫瘍剤を提供する。また、ＳＡＲＴ２由来のヒト腫瘍抗原エピトープペプチド及びヒトＨＬＡ−Ａ２４を共発現した細胞の提供により、ヒトにおける抗腫瘍効果を評価することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＡＲＴ２由来のヒト腫瘍抗原エピトープペプチドをコードするポリヌクレオチド及びヒトＨＬＡ−Ａ２４のα１及びα２領域をコードするポリヌクレオチドを導入した細胞。
【請求項２】
以下の（ａ）〜（ｅ）から選択されるポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号５で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号５で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号５で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２９で示される塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号２９で示される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチド；
及び以下の（ｆ）〜（ｊ）から選択されるポリヌクレオチド：
（ｆ）配列番号３０で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｇ）配列番号３０で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｈ）配列番号３０で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｉ）配列番号３１で示される塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｊ）配列番号３１で示される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチド；
を導入した細胞。
【請求項３】
以下の（ｋ）〜（ｏ）から選択されるポリヌクレオチド： 
（ｋ）配列番号３２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｌ）配列番号３２で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｍ）配列番号３２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｎ）配列番号３３で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｏ）配列番号３３で示される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチド；
及び以下の（ｐ）〜（ｔ）から選択されるポリヌクレオチド：
（ｐ）配列番号３４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｑ）配列番号３４で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｒ）配列番号３４で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｓ）配列番号３５で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｔ）配列番号３５で示される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチド；
を導入した細胞。
【請求項４】
ＳＡＲＴ２由来のヒト腫瘍抗原エピトープペプチドの抗腫瘍効果を評価するための、請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項５】
エピトープ４連結ペプチド及び／又は免疫チェックポイント分子調節剤の抗腫瘍効果を評価するための細胞であって、
該エピトープ４連結ペプチドが、
配列番号５で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ５）と、
配列番号１で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ１）、配列番号２で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ２）、配列番号４で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ４）、配列番号６で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ６）、配列番号７で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ７）、配列番号８で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ８）、配列番号９で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ９）、配列番号１０で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ１０）、配列番号１３で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ１３）、配列番号１５で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ１５）、配列番号１７で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ１７）及び配列番号１８で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ１８）からなる群より選択される３個のエピトープペプチドが、
リンカーを介してそれぞれ連結されてなり、親水性アミノ酸からなるペプチド配列を更に有していてもよい、エピトープ４連結ペプチドであって、以下の（１）〜（３）より選択されるいずれか一つの特徴：
（１）Ｃ末端がＰＥＰ２である（ただし、Ｎ末端にＰＥＰ７及びＰＥＰ８をＮ末端側からリンカーを介して隣り合ってこの順で含むものを除く）；
（２）Ｃ末端がＰＥＰ４である；
（３）Ｃ末端がＰＥＰ１０である；
を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞を用いたＳＡＲＴ２由来のヒト腫瘍抗原エピトープペプチドの抗腫瘍効果を評価するための方法であって、以下の（Ｉ）及び（ＩＩ）の工程：
（Ｉ）ＳＡＲＴ２由来のヒト腫瘍抗原エピトープペプチドを、ヒトＨＬＡ−Ａ２４遺伝子ノックインの非免疫不全非ヒト動物に投与する工程、及び
（ＩＩ）請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞を、ヒトＨＬＡ−Ａ２４遺伝子ノックインの非免疫不全非ヒト動物に移植する工程、
を含む、上記の方法。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞を用いたエピトープ４連結ペプチド及び／又は免疫チェックポイント分子調節剤の抗腫瘍効果を評価するための方法であって、以下の（Ｉ）及び（ＩＩ）の工程：
（Ｉ）エピトープ４連結ペプチド及び／又は免疫チェックポイント分子調節剤を、ヒトＨＬＡ−Ａ２４遺伝子ノックインの非免疫不全非ヒト動物に投与する工程、及び
（ＩＩ）請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞を、ヒトＨＬＡ−Ａ２４遺伝子ノックインの非免疫不全非ヒト動物に移植する工程、
を含み、該エピトープ４連結ペプチドが、
配列番号５で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ５）と、
配列番号１で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ１）、配列番号２で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ２）、配列番号４で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ４）、配列番号６で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ６）、配列番号７で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ７）、配列番号８で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ８）、配列番号９で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ９）、配列番号１０で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ１０）、配列番号１３で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ１３）、配列番号１５で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ１５）、配列番号１７で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ１７）及び配列番号１８で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ１８）からなる群より選択される３個のエピトープペプチドが、
リンカーを介してそれぞれ連結されてなり、親水性アミノ酸からなるペプチド配列を更に有していてもよい、エピトープ４連結ペプチドであって、以下の（１）〜（３）より選択されるいずれか一つの特徴：
（１）Ｃ末端がＰＥＰ２である（ただし、Ｎ末端にＰＥＰ７及びＰＥＰ８をＮ末端側からリンカーを介して隣り合ってこの順で含むものを除く）；
（２）Ｃ末端がＰＥＰ４である；
（３）Ｃ末端がＰＥＰ１０である；
を有する、上記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＨＬＡ−Ａ拘束性にＣＴＬ誘導能を有するペプチドを４つ連結してなるＣＴＬエピトープ４連結ペプチドと免疫チェックポイント分子調節剤とを用いたがん化学療法に関する。本発明はまた、本発明のがん化学療法の効果を評価するために好適に利用することができる、ＳＡＲＴ２由来のヒト腫瘍抗原エピトープペプチド及びヒトＨＬＡ−Ａ２４を共発現した細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
がんペプチドワクチン療法は、長い間がんの新たな治療法として待望されている治療法である。しかしながら、ヒト腫瘍抗原におけるエピトープペプチドが同定可能になった１９９０年から、がんペプチドワクチン臨床研究が世界中で実施されているが、治療成績は非常に限定的であるのが現状である（非特許文献１）。
【０００３】
がんペプチドワクチン療法では、がん細胞表面において抗原ペプチドを提示する主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）を、エピトープ特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の細胞受容体（ＴＣＲ）が認識し、ＣＴＬががん細胞を傷害することで効果を発揮する。ヒトにおけるＭＨＣはヒト白血球抗原（ＨＬＡ）と呼ばれ、ＨＬＡの型は非常に多型性を示すことが知られている。そのため、特定のＨＬＡ型を対象としたがんペプチドワクチンの開発が実施されてきた。しかしながら、がんワクチンの対象となるＨＬＡ型は限定的であり、対象外のＨＬＡ型を有する患者はがんペプチドワクチンの恩恵を受けることができない問題点がある。さらには治療開始前にＨＬＡ型検査を要すことが、治療の開始時期を遅延させ、患者負担を増大させる一因となっている。以上より、ＨＬＡ型検査を必要とせず、全てのがん患者に適応可能ながんペプチドワクチンの開発・研究が望まれていた。
この課題を解決するために、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ２４、ＨＬＡ−Ａ２６若しくはＨＬＡ−Ａ３スーパータイプのいずれか１つ又は複数のＨＬＡ型にＣＴＬ誘導能を示す様々なＣＴＬエピトープペプチドを連結したＣＴＬエピトープ４連結ペプチドが報告されている（特許文献１）。
【０００４】
また近年、免疫細胞の抑制・活性化に関わる分子機構が明らかとなってきた。Ｔ細胞における免疫応答は、ＴＣＲによるシグナルと補助シグナルによって制御されている。補助シグナルには、ＴＣＲを介したシグナルをそれぞれ正と負に調節するｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎシグナルとｃｏｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎシグナルが存在し、Ｔ細胞の免疫反応を制御している。がん細胞はこの仕組みを利用し、抗原特異的なＴ細胞の活性化を抑制することで、Ｔ細胞の免疫疲弊状態を誘導している。近年、ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎシグナルの強化やｃｏｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎシグナルのブロックによって、がん患者の生体内における抗腫瘍免疫応答を増強し、腫瘍の免疫逃避を制御することはがん治療に有効であると考えられており、ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ分子或いはｃｏｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ分子を標的としたがん免疫療法が種々提案されている（非特許文献２）。例えば、ＰＤ−１とそのリガンド（ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２）の結合を阻害することによりＴ細胞を活性化する免疫チェックポイント分子調節剤としてニボルマブが悪性黒色腫等の治療に用いられている（非特許文献２、非特許文献３）。
【０００５】
しかしながら、ＣＴＬエピトープ４連結ペプチドとこのような免疫チェックポイント分子調節剤とを組み合わせることによる抗腫瘍効果に対する増強効果は示されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２０１５／０６０２３５号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．，１０（９）：９０９−１５（２００４）
【非特許文献２】Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ．，１２（４）：２５２−６４（２０１２）
【非特許文献３】Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３６６（２６）：２４４３−５４（２０１２）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ＣＴＬエピトープ４連結ペプチドと免疫チェックポイント分子調節剤とを併用投与することにより、顕著に優れた抗腫瘍効果を示し、副作用の少ない新規な癌治療方法を提供することを課題とする。また、ヒトにおける抗腫瘍剤の効果を評価するために好適に用いることができる、ＳＡＲＴ２由来のヒト腫瘍抗原エピトープペプチド及びヒトＨＬＡ−Ａ２４を共発現した細胞を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
そこで本発明者は、ＣＴＬエピトープ４連結ペプチドと、免疫チェックポイント分子調節剤である抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体とを併用投与して抗腫瘍効果を検討したところ、単独で薬剤を使用するよりも、重篤な副作用を発症させることなく、抗腫瘍効果が顕著に増強することを見出した。さらに、ＳＡＲＴ２由来のヒト腫瘍抗原エピトープペプチド及びヒトＨＬＡ−Ａ２４を共発現した細胞を樹立し、当該細胞に対するヒト腫瘍抗原エピトープペプチドの抗腫瘍効果を評価できる方法を確立した。
【００１０】
すなわち、本発明は、以下の発明を提供するものである。
〔１〕免疫チェックポイント分子調節剤と併用するための、リンカーを介して連結された４個のＣＴＬエピトープペプチドを含むエピトープ４連結ペプチドを有効成分として含有することを特徴とする抗腫瘍剤であって、
該エピトープ４連結ペプチドが、
配列番号５で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ５）と、
配列番号１で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ１）、配列番号２で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ２）、配列番号４で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ４）、配列番号６で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ６）、配列番号７で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ７）、配列番号８で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ８）、配列番号９で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ９）、配列番号１０で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ１０）、配列番号１３で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ１３）、配列番号１５で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ１５）、配列番号１７で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ１７）及び配列番号１８で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ１８）からなる群より選択される３個のエピトープペプチドが、
リンカーを介してそれぞれ連結されてなり、親水性アミノ酸からなるペプチド配列を更に有してもよい、エピトープ４連結ペプチドであって、以下の（１）〜（３）より選択されるいずれか一つの特徴：
（１）Ｃ末端がＰＥＰ２である（ただし、Ｎ末端にＰＥＰ７及びＰＥＰ８をＮ末端側からリンカーを介して隣り合ってこの順で含むものを除く）；
（２）Ｃ末端がＰＥＰ４である；
（３）Ｃ末端がＰＥＰ１０である；
を有する、上記抗腫瘍剤。
〔２〕上記エピトープ４連結ペプチドに含まれるエピトープペプチドが、
ＰＥＰ５、
ＰＥＰ６、
ＰＥＰ９、及び
ＰＥＰ２、ＰＥＰ４及びＰＥＰ１０からなる群より選択される１個のエピトープペプチド、
から構成され、上記エピトープ４連結ペプチドのＣ末端がＰＥＰ２、ＰＥＰ４又はＰＥＰ１０である、〔１〕に記載の抗腫瘍剤。
〔３〕エピトープ４連結ペプチドが、以下より選択される配列からなる、〔１〕又は〔２〕に記載の抗腫瘍剤：
・ＰＥＰ５−（Ｌ）−ＰＥＰ９−（Ｌ）−ＰＥＰ６−（Ｌ）−ＰＥＰ４；
・ＰＥＰ５−（Ｌ）−ＰＥＰ９−（Ｌ）−ＰＥＰ６−（Ｌ）−ＰＥＰ２；又は、
・ＰＥＰ５−（Ｌ）−ＰＥＰ９−（Ｌ）−ＰＥＰ６−（Ｌ）−ＰＥＰ１０；
なお、式中「（Ｌ）」はリンカーを示す。
〔４〕リンカーがアミノ酸リンカーである、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の抗腫瘍剤。
〔５〕アミノ酸リンカーが、アルギニンを２個連結したアルギニンダイマー、又はアルギニンを３個連結したアルギニントリマーである、〔４〕に記載の抗腫瘍剤。
〔６〕親水性アミノ酸からなるペプチド配列が、Ｎ末端に連結され、かつアルギニンを３個連結したアルギニントリマー、又はアルギニンを４個連結したアルギニンテトラマーからなる、〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の抗腫瘍剤。
〔７〕エピトープ４連結ペプチドが、配列番号２４、配列番号２５、又は配列番号２６である、〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の抗腫瘍剤。
〔８〕免疫チェックポイント分子調節剤が、ＰＤ−１経路アンタゴニスト、ＩＣＯＳ経路アゴニスト、ＣＴＬＡ−４経路アンタゴニスト及びＣＤ２８経路アゴニストからなる群より選ばれる少なくとも１種である、〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載の抗腫瘍剤。
〔９〕免疫チェックポイント分子調節剤が、ＰＤ−１経路アンタゴニスト及びＣＴＬＡ−４経路アンタゴニストからなる群より選ばれる少なくとも１種である、〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載の抗腫瘍剤。
〔１０〕免疫チェックポイント分子調節剤がＰＤ−１経路アンタゴニストである、〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載の抗腫瘍剤。
〔１１〕ＰＤ−１経路アンタゴニストが、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体及び抗ＰＤ−Ｌ２抗体からなる群より選ばれる少なくとも１種である、〔８〕〜〔１０〕のいずれかに記載の抗腫瘍剤。
〔１２〕ＰＤ−１経路アンタゴニストが、抗ＰＤ−１抗体及び抗ＰＤ−Ｌ１抗体からなる群より選ばれる少なくとも１種である、〔８〕〜〔１０〕のいずれかに記載の抗腫瘍剤。
〔１３〕抗ＰＤ−１抗体がニボルマブ又はペムブロリズマブであり、抗ＰＤ−Ｌ１抗体がアテゾリズマブ、デュルバルマブ又はアベルマブである、〔１１〕又は〔１２〕に記載の抗腫瘍剤。
〔１４〕ＣＴＬＡ−４経路アンタゴニストが抗ＣＴＬＡ−４抗体である、〔８〕又は〔９〕に記載の抗腫瘍剤。
〔１５〕抗ＣＴＬＡ−４抗体がイピリムマブ又はトレメリムマブである、〔１４〕に記載の抗腫瘍剤。
〔１６〕免疫チェックポイント分子調節剤を投与された癌患者を治療するための、エピトープ４連結ペプチドを有効成分として含有する抗腫瘍剤であって、
該エピトープ４連結ペプチドが、
配列番号５で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ５）と、
配列番号１で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ１）、配列番号２で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ２）、配列番号４で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ４）、配列番号６で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ６）、配列番号７で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ７）、配列番号８で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ８）、配列番号９で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ９）、配列番号１０で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ１０）、配列番号１３で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ１３）、配列番号１５で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ１５）、配列番号１７で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ１７）及び配列番号１８で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ１８）からなる群より選択される３個のエピトープペプチドが、
リンカーを介してそれぞれ連結されてなり、親水性アミノ酸からなるペプチド配列を更に有していてもよい、エピトープ４連結ペプチドであって、以下の（１）〜（３）より選択されるいずれか一つの特徴：
（１）Ｃ末端がＰＥＰ２である（ただし、Ｎ末端にＰＥＰ７及びＰＥＰ８をＮ末端側からリンカーを介して隣り合ってこの順で含むものを除く）；
（２）Ｃ末端がＰＥＰ４である；
（３）Ｃ末端がＰＥＰ１０である；
を有する、上記抗腫瘍剤。
〔１７〕エピトープ４連結ペプチドを投与された癌患者を治療するための、免疫チェックポイント分子調節剤からなる抗腫瘍剤であって、
該エピトープ４連結ペプチドが、
配列番号５で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ５）と、
配列番号１で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ１）、配列番号２で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ２）、配列番号４で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ４）、配列番号６で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ６）、配列番号７で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ７）、配列番号８で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ８）、配列番号９で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ９）、配列番号１０で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ１０）、配列番号１３で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ１３）、配列番号１５で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ１５）、配列番号１７で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ１７）及び配列番号１８で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ１８）からなる群より選択される３個のエピトープペプチドが、
リンカーを介してそれぞれ連結されてなり、親水性アミノ酸からなるペプチド配列を更に有していてもよい、エピトープ４連結ペプチドであって、以下の（１）〜（３）より選択されるいずれか一つの特徴：
（１）Ｃ末端がＰＥＰ２である（ただし、Ｎ末端にＰＥＰ７及びＰＥＰ８をＮ末端側からリンカーを介して隣り合ってこの順で含むものを除く）；
（２）Ｃ末端がＰＥＰ４である；
（３）Ｃ末端がＰＥＰ１０である；
を有し、該免疫チェックポイント分子調節剤が、ＰＤ−１経路アンタゴニスト、ＩＣＯＳ経路アゴニスト、ＣＴＬＡ−４経路アンタゴニスト及びＣＤ２８経路アゴニストからなる群より選ばれる少なくとも１種である、上記抗腫瘍剤。
〔１８〕エピトープ４連結ペプチドと、免疫チェックポイント分子調節剤を組み合わせてなる組合せ製剤であって、
該エピトープ４連結ペプチドが、
配列番号５で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ５）と、
配列番号１で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ１）、配列番号２で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ２）、配列番号４で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ４）、配列番号６で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ６）、配列番号７で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ７）、配列番号８で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ８）、配列番号９で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ９）、配列番号１０で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ１０）、配列番号１３で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ１３）、配列番号１５で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ１５）、配列番号１７で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ１７）及び配列番号１８で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ１８）からなる群より選択される３個のエピトープペプチドが、
リンカーを介してそれぞれ連結されてなり、親水性アミノ酸からなるペプチド配列を更に有していてもよい、エピトープ４連結ペプチドであって、以下の（１）〜（３）より選択されるいずれか一つの特徴：
（１）Ｃ末端がＰＥＰ２である（ただし、Ｎ末端にＰＥＰ７及びＰＥＰ８をＮ末端側からリンカーを介して隣り合ってこの順で含むものを除く）；
（２）Ｃ末端がＰＥＰ４である；
（３）Ｃ末端がＰＥＰ１０である；
を有する、該組合せ製剤。
〔１９〕エピトープ４連結ペプチドを有効成分とする、免疫チェックポイント分子調節剤の抗腫瘍効果を増強するための抗腫瘍効果増強剤であって、
該エピトープ４連結ペプチドが、
配列番号５で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ５）と、
配列番号１で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ１）、配列番号２で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ２）、配列番号４で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ４）、配列番号６で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ６）、配列番号７で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ７）、配列番号８で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ８）、配列番号９で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ９）、配列番号１０で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ１０）、配列番号１３で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ１３）、配列番号１５で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ１５）、配列番号１７で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ１７）及び配列番号１８で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ１８）からなる群より選択される３個のエピトープペプチドが、
リンカーを介してそれぞれ連結されてなり、親水性アミノ酸からなるペプチド配列を更に有していてもよい、エピトープ４連結ペプチドであって、以下の（１）〜（３）より選択されるいずれか一つの特徴：
（１）Ｃ末端がＰＥＰ２である（ただし、Ｎ末端にＰＥＰ７及びＰＥＰ８をＮ末端側からリンカーを介して隣り合ってこの順で含むものを除く）；
（２）Ｃ末端がＰＥＰ４である；
（３）Ｃ末端がＰＥＰ１０である；
である、抗腫瘍効果増強剤。
〔２０〕リンカーを介して連結された４個のＣＴＬエピトープペプチドを含むエピトープ４連結ペプチドと、免疫チェックポイント分子調節剤とを有効成分として含有することを特徴とする抗腫瘍剤であって、
該エピトープ４連結ペプチドが、
配列番号５で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ５）と、
配列番号１で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ１）、配列番号２で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ２）、配列番号４で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ４）、配列番号６で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ６）、配列番号７で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ７）、配列番号８で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ８）、配列番号９で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ９）、配列番号１０で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ１０）、配列番号１３で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ１３）、配列番号１５で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ１５）、配列番号１７で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ１７）及び配列番号１８で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ１８）からなる群より選択される３個のエピトープペプチドが、
リンカーを介してそれぞれ連結されてなり、親水性アミノ酸からなるペプチド配列を更に有していてもよい、エピトープ４連結ペプチドであって、以下の（１）〜（３）より選択されるいずれか一つの特徴：
（１）Ｃ末端がＰＥＰ２である（ただし、Ｎ末端にＰＥＰ７及びＰＥＰ８をＮ末端側からリンカーを介して隣り合ってこの順で含むものを除く）；
（２）Ｃ末端がＰＥＰ４である；
（３）Ｃ末端がＰＥＰ１０である；
を有する、上記抗腫瘍剤。
〔２１〕エピトープ４連結ペプチドと使用説明書を含むキット製剤であって、当該使用説明書には、がん患者に対して、エピトープ４連結ペプチドと免疫チェックポイント分子調節剤が併用投与されることが記載されていることを特徴とするキット製剤であって、
該エピトープ４連結ペプチドが、
配列番号５で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ５）と、
配列番号１で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ１）、配列番号２で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ２）、配列番号４で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ４）、配列番号６で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ６）、配列番号７で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ７）、配列番号８で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ８）、配列番号９で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ９）、配列番号１０で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ１０）、配列番号１３で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ１３）、配列番号１５で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ１５）、配列番号１７で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ１７）及び配列番号１８で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ１８）からなる群より選択される３個のエピトープペプチドが、
リンカーを介してそれぞれ連結されてなり、親水性アミノ酸からなるペプチド配列を更に有していてもよい、エピトープ４連結ペプチドであって、以下の（１）〜（３）より選択されるいずれか一つの特徴：
（１）Ｃ末端がＰＥＰ２である（ただし、Ｎ末端にＰＥＰ７及びＰＥＰ８をＮ末端側からリンカーを介して隣り合ってこの順で含むものを除く）；
（２）Ｃ末端がＰＥＰ４である；
（３）Ｃ末端がＰＥＰ１０である；
を有する、上記キット製剤。
〔２２〕ＳＡＲＴ２由来のヒト腫瘍抗原エピトープペプチドをコードするポリヌクレオチド及びヒトＨＬＡ−Ａ２４のα１及びα２領域をコードするポリヌクレオチドを導入した細胞。
〔２３〕以下の（ａ）〜（ｅ）から選択されるポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号５で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号５で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号５で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２９で示される塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号２９で示される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチド；
及び以下の（ｆ）〜（ｊ）から選択されるポリヌクレオチド：
（ｆ）配列番号３０で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｇ）配列番号３０で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｈ）配列番号３０で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｉ）配列番号３１で示される塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｊ）配列番号３１で示される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチド；
を導入した細胞。
〔２４〕以下の（ｋ）〜（ｏ）から選択されるポリヌクレオチド：
（ｋ）配列番号３２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｌ）配列番号３２で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｍ）配列番号３２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｎ）配列番号３３で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｏ）配列番号３３で示される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチド；
及び以下の（ｐ）〜（ｔ）から選択されるポリヌクレオチド：
（ｐ）配列番号３４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｑ）配列番号３４で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｒ）配列番号３４で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｓ）配列番号３５で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｔ）配列番号３５で示される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチド；
を導入した細胞。
〔２５〕ＳＡＲＴ２由来のヒト腫瘍抗原エピトープペプチドの抗腫瘍効果を評価するための、〔２２〕〜〔２４〕のいずれかに記載の細胞。
〔２６〕エピトープ４連結ペプチド及び／又は免疫チェックポイント分子調節剤の抗腫瘍効果を評価するための細胞であって、
該エピトープ４連結ペプチドが、
配列番号５で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ５）と、
配列番号１で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ１）、配列番号２で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ２）、配列番号４で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ４）、配列番号６で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ６）、配列番号７で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ７）、配列番号８で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ８）、配列番号９で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ９）、配列番号１０で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ１０）、配列番号１３で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ１３）、配列番号１５で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ１５）、配列番号１７で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ１７）及び配列番号１８で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ１８）からなる群より選択される３個のエピトープペプチドが、
リンカーを介してそれぞれ連結されてなり、親水性アミノ酸からなるペプチド配列を更に有していてもよい、エピトープ４連結ペプチドであって、以下の（１）〜（３）より選択されるいずれか一つの特徴：
（１）Ｃ末端がＰＥＰ２である（ただし、Ｎ末端にＰＥＰ７及びＰＥＰ８をＮ末端側からリンカーを介して隣り合ってこの順で含むものを除く）；
（２）Ｃ末端がＰＥＰ４である；
（３）Ｃ末端がＰＥＰ１０である；
を有する、〔２２〕〜〔２４〕のいずれかに記載の細胞。
〔２７〕〔２２〕〜〔２４〕のいずれかに記載の細胞を用いたＳＡＲＴ２由来のヒト腫瘍抗原エピトープペプチドの抗腫瘍効果を評価するための方法であって、以下の（Ｉ）及び（ＩＩ）の工程：
（Ｉ）ＳＡＲＴ２由来のヒト腫瘍抗原エピトープペプチドを、ヒトＨＬＡ−Ａ２４遺伝子ノックインの非免疫不全非ヒト動物に投与する工程、及び
（ＩＩ）〔２２〕〜〔２４〕のいずれかに記載の細胞を、ヒトＨＬＡ−Ａ２４遺伝子ノックインの非免疫不全非ヒト動物に移植する工程、
を含む、上記の方法。
〔２８〕〔２２〕〜〔２４〕のいずれかに記載の細胞を用いたエピトープ４連結ペプチド及び／又は免疫チェックポイント分子調節剤の抗腫瘍効果を評価するための方法であって、以下の（Ｉ）及び（ＩＩ）の工程：
（Ｉ）エピトープ４連結ペプチド及び／又は免疫チェックポイント分子調節剤を、ヒトＨＬＡ−Ａ２４遺伝子ノックインの非免疫不全非ヒト動物に投与する工程、及び
（ＩＩ）〔２２〕〜〔２４〕のいずれかに記載の細胞を、ヒトＨＬＡ−Ａ２４遺伝子ノックインの非免疫不全非ヒト動物に移植する工程、
を含み、該エピトープ４連結ペプチドが、
配列番号５で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ５）と、
配列番号１で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ１）、配列番号２で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ２）、配列番号４で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ４）、配列番号６で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ６）、配列番号７で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ７）、配列番号８で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ８）、配列番号９で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ９）、配列番号１０で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ１０）、配列番号１３で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ１３）、配列番号１５で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ１５）、配列番号１７で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ１７）及び配列番号１８で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ１８）からなる群より選択される３個のエピトープペプチドが、
リンカーを介してそれぞれ連結されてなり、親水性アミノ酸からなるペプチド配列を更に有していてもよい、エピトープ４連結ペプチドであって、以下の（１）〜（３）より選択されるいずれか一つの特徴：
（１）Ｃ末端がＰＥＰ２である（ただし、Ｎ末端にＰＥＰ７及びＰＥＰ８をＮ末端側からリンカーを介して隣り合ってこの順で含むものを除く）；
（２）Ｃ末端がＰＥＰ４である；
（３）Ｃ末端がＰＥＰ１０である；
を有する、上記方法。
【００１１】
〔２９〕リンカーを介して連結された４個のＣＴＬエピトープペプチドを含むエピトープ４連結ペプチド、免疫チェックポイント分子調節剤、及び薬学的に許容される担体を含む腫瘍の予防及び／又は治療のための医薬組成物であって、
該エピトープ４連結ペプチドが、
配列番号５で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ５）と、
配列番号１で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ１）、配列番号２で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ２）、配列番号４で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ４）、配列番号６で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ６）、配列番号７で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ７）、配列番号８で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ８）、配列番号９で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ９）、配列番号１０で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ１０）、配列番号１３で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ１３）、配列番号１５で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ１５）、配列番号１７で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ１７）及び配列番号１８で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ１８）からなる群より選択される３個のエピトープペプチドが、
リンカーを介してそれぞれ連結されてなり、親水性アミノ酸からなるペプチド配列を更に有してもよい、エピトープ４連結ペプチドであって、以下の（１）〜（３）より選択されるいずれか一つの特徴：
（１）Ｃ末端がＰＥＰ２である（ただし、Ｎ末端にＰＥＰ７及びＰＥＰ８をＮ末端側からリンカーを介して隣り合ってこの順で含むものを除く）；
（２）Ｃ末端がＰＥＰ４である；
（３）Ｃ末端がＰＥＰ１０である；
を有する、上記組成物。
〔３０〕リンカーを介して連結された４個のＣＴＬエピトープペプチドを含むエピトープ４連結ペプチドを、予防及び／又は治療に有効な量で患者に投与する工程を含む、免疫チェックポイント分子調節剤と組み合わせて腫瘍を予防及び／又は治療する方法であって、該エピトープ４連結ペプチドが、
配列番号５で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ５）と、
配列番号１で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ１）、配列番号２で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ２）、配列番号４で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ４）、配列番号６で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ６）、配列番号７で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ７）、配列番号８で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ８）、配列番号９で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ９）、配列番号１０で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ１０）、配列番号１３で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ１３）、配列番号１５で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ１５）、配列番号１７で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ１７）及び配列番号１８で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ１８）からなる群より選択される３個のエピトープペプチドが、
リンカーを介してそれぞれ連結されてなり、親水性アミノ酸からなるペプチド配列を更に有してもよい、エピトープ４連結ペプチドであって、以下の（１）〜（３）より選択されるいずれか一つの特徴：
（１）Ｃ末端がＰＥＰ２である（ただし、Ｎ末端にＰＥＰ７及びＰＥＰ８をＮ末端側からリンカーを介して隣り合ってこの順で含むものを除く）；
（２）Ｃ末端がＰＥＰ４である；
（３）Ｃ末端がＰＥＰ１０である；
を有する、上記方法。
〔３１〕上記エピトープ４連結ペプチドを、上記免疫チェックポイント分子調節剤の投与前、上記免疫チェックポイント分子調節剤の投与と同時、又は上記免疫チェックポイント分子調節剤の投与後に患者に投与する、〔３０〕記載の方法。
〔３２〕上記免疫チェックポイント分子調節剤の抗腫瘍効果の増強のための、〔３０〕記載の方法。
〔３３〕免疫チェックポイント分子調節剤と併用して腫瘍の予防及び／又は治療に使用するための、リンカーを介して連結された４個のＣＴＬエピトープペプチドを含むエピトープ４連結ペプチドであって、該エピトープ４連結ペプチドが、
配列番号５で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ５）と、
配列番号１で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ１）、配列番号２で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ２）、配列番号４で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ４）、配列番号６で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ６）、配列番号７で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ７）、配列番号８で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ８）、配列番号９で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ９）、配列番号１０で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ１０）、配列番号１３で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ１３）、配列番号１５で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ１５）、配列番号１７で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ１７）及び配列番号１８で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ１８）からなる群より選択される３個のエピトープペプチドが、
リンカーを介してそれぞれ連結されてなり、親水性アミノ酸からなるペプチド配列を更に有してもよい、エピトープ４連結ペプチドであって、以下の（１）〜（３）より選択されるいずれか一つの特徴：
（１）Ｃ末端がＰＥＰ２である（ただし、Ｎ末端にＰＥＰ７及びＰＥＰ８をＮ末端側からリンカーを介して隣り合ってこの順で含むものを除く）；
（２）Ｃ末端がＰＥＰ４である；
（３）Ｃ末端がＰＥＰ１０である；
を有し、免疫チェックポイント分子調節剤の投与の前、免疫チェックポイント分子調節剤の投与と同時、又は免疫チェックポイント分子調節剤の投与の後に投与される、上記エピトープ４連結ペプチド。
〔３４〕エピトープ４連結ペプチドが、配列番号２４、配列番号２５、又は配列番号２６である、〔３３〕に記載のエピトープ４連結ペプチド。
〔３５〕免疫チェックポイント分子調節剤がＰＤ−１経路アンタゴニストである、〔３３〕又は〔３４〕のいずれかに記載のエピトープ４連結ペプチド。
〔３６〕ＰＤ−１経路アンタゴニストが、抗ＰＤ−１抗体及び抗ＰＤ−Ｌ１抗体からなる群より選ばれる少なくとも１種である、〔３３〕〜〔３５〕のいずれかに記載のエピトープ４連結ペプチド。
〔３７〕抗ＰＤ−１抗体がニボルマブ又はペムブロリズマブであり、抗ＰＤ−Ｌ１抗体がアテゾリズマブ、デュルバルマブ又はアベルマブである、〔３３〕〜〔３６〕のいずれかに記載のエピトープ４連結ペプチド。
〔３８〕上記免疫チェックポイント分子調節剤の抗腫瘍効果を増強するために使用される、上記エピトープ４連結ペプチド。
〔３９〕患者における腫瘍を予防及び／又は治療する方法における使用のための、同時に、又は別個に患者に投与されるエピトープ４連結ペプチド及び免疫チェックポイント分子調節剤であって、該エピトープ４連結ペプチドが、リンカーを介して連結された４個のＣＴＬエピトープペプチドを含み、かつ
配列番号５で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ５）と、
配列番号１で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ１）、配列番号２で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ２）、配列番号４で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ４）、配列番号６で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ６）、配列番号７で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ７）、配列番号８で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ８）、配列番号９で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ９）、配列番号１０で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ１０）、配列番号１３で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ１３）、配列番号１５で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ１５）、配列番号１７で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ１７）及び配列番号１８で表されるエピトープペプチド（ＰＥＰ１８）からなる群より選択される３個のエピトープペプチドが、
リンカーを介してそれぞれ連結されてなり、親水性アミノ酸からなるペプチド配列を更に有してもよい、エピトープ４連結ペプチドであって、以下の（１）〜（３）より選択されるいずれか一つの特徴：
（１）Ｃ末端がＰＥＰ２である（ただし、Ｎ末端にＰＥＰ７及びＰＥＰ８をＮ末端側からリンカーを介して隣り合ってこの順で含むものを除く）；
（２）Ｃ末端がＰＥＰ４である；
（３）Ｃ末端がＰＥＰ１０である；
を有する、上記エピトープ４連結ペプチド及び免疫チェックポイント分子調節剤。
【００１２】
本発明は更に、以下の態様にも関する。
・免疫チェックポイント分子調節剤の抗腫瘍効果を増強するための、上記で表されるエピトープ４連結ペプチドの使用。
・免疫チェックポイント分子調節剤の抗腫瘍効果増強剤を製造するための、上記で表されるエピトープ４連結ペプチドの使用。
・腫瘍を予防及び／又は治療する際に同時に、逐次的に、又は間隔をあけて使用するための組み合わせ製剤としての、上記で表されるエピトープ４連結ペプチドと、免疫チェックポイント分子調節剤とを含む製品。
【００１３】
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2018-124894号の開示内容を包含する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の抗腫瘍剤によれば、副作用の発症を抑えつつ、高い抗腫瘍効果（特に、腫瘍縮小効果、腫瘍増殖遅延効果（延命効果））を奏する癌治療を行うことが可能である。ひいては、癌患者の長期間の生存をもたらす。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ＣＴＬエピトープ４連結ペプチドＴＰＶ０７のＨＰＬＣのクロマトグラムを示す。
【図２】ＣＴＬエピトープ４連結ペプチドＴＰＶ０８のＨＰＬＣのクロマトグラムを示す。
【図３】ＣＴＬエピトープ４連結ペプチドＴＰＶ０７のマススペクトルを示す。
【図４】ＣＴＬエピトープ４連結ペプチドＴＰＶ０８のマススペクトルを示す。
【図５】ａ：ＥＬ４．Ａ２４／ＳＡＲＴ２９３−１０１細胞株をマウスに移植した場合の腫瘍体積変化を示す。ｂ：Ｂ１６Ｆ１０．Ａ２４／ＳＡＲＴ２９３−１０１細胞株をマウスに移植した場合の腫瘍体積変化を示す。
【図６】Ｂ１６Ｆ１０．Ａ２４／ＳＡＲＴ２９３−１０１細胞株を移植したマウスモデルにおける腫瘍増殖に対するＴＰＶ０６＋抗マウスＰＤ−１抗体の併用効果を示す。
【図７】Ｂ１６Ｆ１０．Ａ２４／ＳＡＲＴ２９３−１０１細胞株を移植したマウスモデルにおける腫瘍増殖に対するＴＰＶ０６＋抗マウスＰＤ−Ｌ１抗体の併用効果を示す。
【図８】Ｂ１６Ｆ１０．Ａ２４／ＳＡＲＴ２９３−１０１細胞株を移植したマウスモデルにおける腫瘍増殖に対するＴＰＶ０７＋抗マウスＰＤ−１抗体の併用効果を示す。
【図９】Ｂ１６Ｆ１０．Ａ２４／ＳＡＲＴ２９３−１０１細胞株を移植したマウスモデルにおける腫瘍増殖に対するＴＰＶ０８＋抗マウスＰＤ−１抗体の併用効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、エピトープ４連結ペプチドと、免疫チェックポイント分子調節剤（例えば、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体）を併用投与することを特徴とする抗腫瘍剤、抗腫瘍効果増強剤、キット製剤及びこれらの剤の使用、腫瘍治療方法、並びに、抗腫瘍効果増強方法に関する。
【００１７】
本発明においてＣＴＬエピトープ４連結ペプチド（本明細書中においてエピトープ４連結ペプチドとも記載する）は、同一及び／又は異なる腫瘍抗原分子由来のＣＴＬエピトープペプチドから選ばれる４つのペプチドを、リンカーを介して直鎖状に連結して１分子としたペプチドを意味する。
【００１８】
腫瘍抗原分子由来のＣＴＬエピトープペプチドとしては、以下のようなものが知られている。
ＫＬＶＥＲＬＧＡＡ（配列番号１、本明細書において「ＰＥＰ１」と記載する、例えば国際公開第２００ｌ／０ｌ１０４４号）；
ＡＳＬＤＳＤＰＷＶ（配列番号２、本明細書において「ＰＥＰ２」と記載する、例えば国際公開第２００２／０１０３６９号）；
ＡＬＶＥＦＥＤＶＬ（配列番号３、本明細書において「ＰＥＰ３」と記載する、例えば国際公開第２００２／０１０３６９号）；
ＬＬＱＡＥＡＰＲＬ（配列番号４、本明細書において「ＰＥＰ４」と記載する、例えば国際公開第２０００／１２７０１号）；
ＤＹＳＡＲＷＮＥＩ（配列番号５、本明細書において「ＰＥＰ５」と記載する、例えば特開平１１−３１８４５５号）；
ＶＹＤＹＮＣＨＶＤＬ（配列番号６、本明細書において「ＰＥＰ６」と記載する、例えば国際公開第２０００／１２７０１号）；
ＬＹＡＷＥＰＳＦＬ（配列番号７、本明細書において「ＰＥＰ７」と記載する、例えば特開２００３−０００２７０号）；
ＤＹＬＲＳＶＬＥＤＦ（配列番号８、本明細書において「ＰＥＰ８」と記載する、例えば国際公開第２００１／０１１０４４号）；
ＱＩＲＰＩＦＳＮＲ（配列番号９、本明細書において「ＰＥＰ９」と記載する、例えば国際公開第２００８／００７７１１号）；
ＩＬＥＱＳＧＥＷＷＫ（配列番号１０、本明細書において「ＰＥＰ１０」と記載する、例えば国際公開第２００９／０２２６５２号）；
ＶＩＱＮＬＥＲＧＹＲ（配列番号１１、本明細書において「ＰＥＰ１１」と記載する、例えば国際公開第２００９／０２２６５２号）；
ＫＬＫＨＹＧＰＧＷＶ（配列番号１２、本明細書において「ＰＥＰ１２」と記載する、例えば国際公開第１９９９／０６７２８８号）；
ＲＬＱＥＷＣＳＶＩ（配列番号１３、本明細書において「ＰＥＰ１３」と記載する、例えば国際公開第２００２／０１０３６９号）；
ＩＬＧＥＬＲＥＫＶ（配列番号１４、本明細書において「ＰＥＰ１４」と記載する、例えば国際公開第２００２／０１０３６９号；
ＤＹＶＲＥＨＫＤＮＩ（配列番号１５、本明細書において「ＰＥＰ１５」と記載する、例えば国際公開第２００５／０７１０７５号）；
ＨＹＴＮＡＳＤＧＬ（配列番号１６、本明細書において「ＰＥＰ１６」と記載する、例えば国際公開第２００１／０１１０４４号）；
ＮＹＳＶＲＹＲＰＧＬ（配列番号１７、本明細書において「ＰＥＰ１７」と記載する、例えば特開２００３−０００２７０号）；
ＲＹＬＴＱＥＴＮＫＶ（配列番号１８、本明細書において「ＰＥＰ１８」と記載する、例えば国際公開第２００５／１１６０５６号）
【００１９】
下記の表１に、ＣＴＬエピトープペプチドＰＥＰ１〜ＰＥＰ１８の由来となるタンパク質の情報を記載する。これらのタンパク質は、腫瘍組織において高発現することが報告されている。
【００２０】
【表１】
2020150950.tif 000002
【００２１】
本発明のＣＴＬエピトープ４連結ペプチドは、上記ＣＴＬエピトープペプチドのうち特定の１３種類（配列番号１で表されるペプチド「ＰＥＰ１」、配列番号２で表されるペプチド「ＰＥＰ２」、配列番号４で表されるペプチド「ＰＥＰ４」、配列番号５で表されるペプチド「ＰＥＰ５」、配列番号６で表されるペプチド「ＰＥＰ６」、配列番号７で表されるペプチド「ＰＥＰ７」、配列番号８で表されるペプチド「ＰＥＰ８」、配列番号９で表されるペプチドを「ＰＥＰ９」、配列番号１０で表されるペプチド「ＰＥＰ１０」、配列番号１３で表されるペプチド「ＰＥＰ１３」、配列番号１５で表されるペプチド「ＰＥＰ１５」、配列番号１７で表されるペプチド「ＰＥＰ１７」及び配列番号１８で表されるペプチド「ＰＥＰ１８」）から選択される４種類のＣＴＬエピトープペプチドがリンカーを介して直鎖状に連結したペプチドであり、各ＣＴＬエピトープペプチドに特異的なＣＴＬを３つ以上誘導、及び／又は、活性化することができる。なお、ＣＴＬエピトープペプチドに特異的な誘導を直接的に評価しなくても、イムノプロテアソームによる切断実験（国際公開第２０１５／０６０２３５号等）により、当該エピトープペプチドに特異的なＣＴＬ誘導の有無について判断することができる。
【００２２】
本発明において、エピトープ４連結ペプチドは、
配列番号５で表されるペプチド「ＰＥＰ５」と、
配列番号１で表されるペプチド「ＰＥＰ１」、配列番号２で表されるペプチド「ＰＥＰ２」、配列番号４で表されるペプチド「ＰＥＰ４」、配列番号６で表されるペプチド「ＰＥＰ６」、配列番号７で表されるペプチド「ＰＥＰ７」、配列番号８で表されるペプチド「ＰＥＰ８」、配列番号９で表されるペプチド「ＰＥＰ９」、配列番号１０で表されるペプチド「ＰＥＰ１０」、配列番号１３で表されるペプチド「ＰＥＰ１３」、配列番号１５で表されるペプチド「ＰＥＰ１５」、配列番号１７で表されるペプチド「ＰＥＰ１７」及び配列番号１８で表されるペプチド「ＰＥＰ１８」からなる群より選択される３つのペプチドが、
リンカーを介してそれぞれ連結されてなる、
ペプチドである。
【００２３】
本発明において、ＰＥＰ１、ＰＥＰ２、ＰＥＰ４、ＰＥＰ５、ＰＥＰ６、ＰＥＰ７、ＰＥＰ８、ＰＥＰ９、ＰＥＰ１０、ＰＥＰ１３、ＰＥＰ１５、ＰＥＰ１７、及びＰＥＰ１８の各アミノ酸配列において、一又は複数のアミノ酸が置換、挿入、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、元のペプチドと同等又はそれ以上のＣＴＬ誘導能及び／又は免疫グロブリン産生誘導能を有するペプチドも、「ＣＴＬエピトープペプチド」として使用することができる。ここで「複数」とは２〜３個、好ましくは２個である。このようなペプチドとしては、例えば、元のアミノ酸と類似した特性を有するアミノ酸で置換された（すなわち、保存的アミノ酸置換により得られた）ペプチドが挙げられる。
【００２４】
「元のペプチドと同等又はそれ以上のＣＴＬ誘導能及び／又は免疫グロブリン産生誘導能を有するペプチド」であるか否かは、例えば、国際公開第２０１５／０６０２３５号パンフレットに記載の方法に準じて評価することができる。前記方法を用いて評価する場合、ＣＴＬ誘導能は、一又は複数のアミノ酸が置換、挿入、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有する試験ペプチドを予め投与したマウス由来の細胞、同系マウス由来の抗原提示細胞及び試験ペプチドを添加したウェルにおけるＩＦＮ−γ産生細胞の数を指標とし、得られたΔ値の判定結果（陽性（１０≦Δ＜１００）、中陽性（１００≦Δ＜２００）、強陽性（２００≦Δ））が同等又はそれ以上であれば、元のペプチドと同等又はそれ以上のＣＴＬ誘導能を有するペプチドであると判断できる。この場合、元のペプチドが「陽性」であり、一又は複数のアミノ酸が置換、挿入、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するペプチドも「陽性」であれば同等と判断する。また、免疫グロブリン産生誘導能は、試験ペプチドを投与したマウス血清中のＣＴＬエピトープ特異的ＩｇＧ抗体価を指標とし、得られたＩｇＧ抗体価の増加（ｆｏｌｄ）の測定結果（２＜ｆｏｌｄ＜１０、１０≦ｆｏｌｄ＜１００、１００≦ｆｏｌｄ）が同等又はそれ以上であれば、同等又はそれ以上の免疫グロブリン産生誘導能を有するペプチドであると判断できる。この場合、元のペプチドの測定結果が「２＜ｆｏｌｄ＜１０」の範囲内であり、一又は複数のアミノ酸が置換、挿入、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するペプチドの測定結果も「２＜ｆｏｌｄ＜１０」の範囲内であれば同等と判断する。
【００２５】
本発明において、リンカーは、ＣＴＬエピトープ４連結ペプチドが生体に投与された際に切断され、連結されたＣＴＬエピトープペプチドが個々に分離されることを可能とするものであればよく、例えば、エステル結合、エーテル結合、アミド結合、糖鎖リンカー、ポリエチレングリコールリンカー、アミノ酸リンカーなどが挙げられる。アミノ酸リンカーとして用いられるアミノ酸配列としては、アルギニンダイマー（ＲＲ）、アルギニントリマー（ＲＲＲ）、アルギニンテトラマー（ＲＲＲＲ）、リジンダイマー（ＫＫ）、リジントリマー（ＫＫＫ）、リジンテトラマー（ＫＫＫＫ）、グリシンダイマー（ＧＧ）、グリシントリマー（ＧＧＧ）、グリシンテトラマー（ＧＧＧＧ）、グリシンペンタマー（ＧＧＧＧＧ）、グリシンヘキサマー（ＧＧＧＧＧＧ）、アラニン−アラニン−チロシン（ＡＡＹ）、イソロイシン−ロイシン−アラニン（ＩＬＡ）、アルギニン−バリン−リジン−アルギニン（ＲＶＫＲ）等が例示され、好ましくはアルギニンダイマー（ＲＲ）又はアルギニントリマー（ＲＲＲ）であり、より好ましくはアルギニンダイマー（ＲＲ）である。エピトープ連結ペプチドにおいて使用されるリンカーは当分野において知られており、当業者であれば適宜選択して使用することができる。
【００２６】
本発明のエピトープ４連結ペプチドにおいて、選択されるＣＴＬエピトープペプチド、及びその連結順序は、所定の組合せ及び所定の連結順序で合成したエピトープ４連結ペプチドをヒトＨＬＡ−Ａ発現トランスジェニックマウスに投与し、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて各ＣＴＬエピトープペプチド特異的なＣＴＬ誘導の有無を評価し決定することができる。  ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて各ＣＴＬエピトープペプチド特異的なＣＴＬ誘導の有無を評価する方法は、例えば、国際公開第２０１５／０６０２３５号パンフレットに記載の方法に準じて評価することができる。選択されるＣＴＬエピトープペプチド、及びその連結順序は、当該方法を用いて、少なくとも３種以上、好ましくは４種のＣＴＬエピトープペプチドについて、各ＣＴＬエピトープペプチドに特異的なＣＴＬの誘導が見られたＣＴＬエピトープペプチド、及びその連結順序に決定することができる。
【００２７】
本発明のエピトープ４連結ペプチドは、好ましくは、以下の（１）〜（３）より選択されるいずれか１つの特徴を有する：
（１）Ｃ末端がＰＥＰ２である（ただし、Ｎ末端にＰＥＰ７及びＰＥＰ８をＮ末端側からリンカーを介して隣り合ってこの順で含むものを除く）；
（２）Ｃ末端がＰＥＰ４である；
（３）Ｃ末端がＰＥＰ１０である。
【００２８】
従って、好ましくは、本発明のエピトープ４連結ペプチドは、
配列番号５で表されるペプチド「ＰＥＰ５」と、
配列番号１で表されるペプチド「ＰＥＰ１」、配列番号２で表されるペプチド「ＰＥＰ２」、配列番号４で表されるペプチド「ＰＥＰ４」、配列番号６で表されるペプチド「ＰＥＰ６」、配列番号７で表されるペプチド「ＰＥＰ７」、配列番号８で表されるペプチド「ＰＥＰ８」、配列番号９で表されるペプチド「ＰＥＰ９」、配列番号１０で表されるペプチド「ＰＥＰ１０」、配列番号１３で表されるペプチド「ＰＥＰ１３」、配列番号１５で表されるペプチド「ＰＥＰ１５」、配列番号１７で表されるペプチド「ＰＥＰ１７」及び配列番号１８で表されるペプチド「ＰＥＰ１８」からなる群より選択される３つのペプチドが、
リンカーを介してそれぞれ連結されてなり、以下の（１）〜（３）より選択されるいずれか一つの特徴を有するペプチド：
（１）Ｃ末端がＰＥＰ２である（ただし、Ｎ末端にＰＥＰ７及びＰＥＰ８をＮ末端側からリンカーを介して隣り合ってこの順で含むものを除く）；
（２）Ｃ末端がＰＥＰ４である；
（３）Ｃ末端がＰＥＰ１０である。
【００２９】
より好ましくは、本発明のエピトープ４連結ペプチドは、配列番号５で表されるペプチド「ＰＥＰ５」、配列番号６で表されるペプチド「ＰＥＰ６」及び配列番号９で表されるペプチド「ＰＥＰ９」と、
配列番号２で表されるペプチド「ＰＥＰ２」、配列番号４で表されるペプチド「ＰＥＰ４」及び配列番号１０で表されるペプチド「ＰＥＰ１０」からなる群より選択される１つのペプチドが、
リンカーを介してそれぞれ連結されてなり、Ｃ末端がＰＥＰ２、ＰＥＰ４、又はＰＥＰ１０である。
【００３０】
より好ましくは、本発明のエピトープ４連結ペプチドは、以下より選択される配列からなるペプチドである：
・ＰＥＰ５−（Ｌ）−ＰＥＰ６−（Ｌ）−ＰＥＰ９−（Ｌ）−ＰＥＰ４；
・ＰＥＰ９−（Ｌ）−ＰＥＰ５−（Ｌ）−ＰＥＰ６−（Ｌ）−ＰＥＰ４；
・ＰＥＰ６−（Ｌ）−ＰＥＰ５−（Ｌ）−ＰＥＰ９−（Ｌ）−ＰＥＰ４；
・ＰＥＰ６−（Ｌ）−ＰＥＰ９−（Ｌ）−ＰＥＰ５−（Ｌ）−ＰＥＰ４；
・ＰＥＰ９−（Ｌ）−ＰＥＰ６−（Ｌ）−ＰＥＰ５−（Ｌ）−ＰＥＰ４；
・ＰＥＰ５−（Ｌ）−ＰＥＰ９−（Ｌ）−ＰＥＰ６−（Ｌ）−ＰＥＰ４；
・ＰＥＰ５−（Ｌ）−ＰＥＰ９−（Ｌ）−ＰＥＰ６−（Ｌ）−ＰＥＰ２；又は、
・ＰＥＰ５−（Ｌ）−ＰＥＰ９−（Ｌ）−ＰＥＰ６−（Ｌ）−ＰＥＰ１０。
なお、式中「（Ｌ）」はリンカーを示す。
【００３１】
より好ましくは、本発明のエピトープ４連結ペプチドは、以下より選択される配列からなるペプチドである：
・ＰＥＰ５−（Ｌ）−ＰＥＰ９−（Ｌ）−ＰＥＰ６−（Ｌ）−ＰＥＰ４；
・ＰＥＰ５−（Ｌ）−ＰＥＰ９−（Ｌ）−ＰＥＰ６−（Ｌ）−ＰＥＰ２；又は、
・ＰＥＰ５−（Ｌ）−ＰＥＰ９−（Ｌ）−ＰＥＰ６−（Ｌ）−ＰＥＰ１０。
なお、式中「（Ｌ）」はリンカーを示す。
【００３２】
より好ましくは、本発明のエピトープ４連結ペプチドは、リンカーがアルギニンダイマーである、以下より選択される配列で表されるペプチド：
・ＰＥＰ５−ＲＲ−ＰＥＰ９−ＲＲ−ＰＥＰ６−ＲＲ−ＰＥＰ４（配列番号２４、本明細書においてＴＰＶ０６と記載する）；
・ＰＥＰ５−ＲＲ−ＰＥＰ９−ＲＲ−ＰＥＰ６−ＲＲ−ＰＥＰ２（配列番号２５、本明細書においてＴＰＶ０７と記載する）；又は、
・ＰＥＰ５−ＲＲ−ＰＥＰ９−ＲＲ−ＰＥＰ６−ＲＲ−ＰＥＰ１０（配列番号２６、本明細書においてＴＰＶ０８と記載する）
であり、
より好ましくは、本発明のエピトープ４連結ペプチドは、配列番号２４で表されるペプチドＴＰＶ０６である。
【００３３】
本発明の態様の１つにおいて、エピトープ４連結ペプチドは、好ましくは、以下の表２に示す配列番号１９〜２８より選択される配列で表されるペプチドである。
【００３４】
【表２】
2020150950.tif 000003
【００３５】
より好ましくは、エピトープ４連結ペプチドは、上記表２に挙げたものから選択される、以下のペプチド：
・ＴＰＶ０１（配列番号１９）；
・ＴＰＶ０２（配列番号２０）；
・ＴＰＶ０３（配列番号２１）；
・ＴＰＶ０４（配列番号２２）；
・ＴＰＶ０５（配列番号２３）；又は、
・ＴＰＶ０６（配列番号２４）；
である。
【００３６】
また、本発明において、エピトープ４連結ペプチドは２種以上使用されても良く、例えば、２種、３種、４種又はそれ以上のエピトープ４連結ペプチドを別個に、または混合して使用しても良く、３種のエピトープ４連結ペプチドを混合して使用するのが好ましい。  エピトープ４連結ペプチドを２種以上使用する場合、本発明のエピトープ４連結ペプチドが少なくとも１種含まれていれば、残りの１種以上は本発明のエピトープ４連結ペプチドであっても良いし、例えば国際公開第２０１５／０６０２３５号に記載のもののようなエピトープ４連結ペプチドであっても良い。配列番号２４で表されるペプチドと国際公開第２０１５／０６０２３５号に記載のＣＴＬエピトープ４連結ペプチドを１種以上使用するのが好ましく、配列番号２４で表されるペプチドと国際公開第２０１５／０６０２３５号に記載のエピトープ４連結ペプチドを２種使用するのがより好ましく、配列番号２４で表されるペプチド、配列番号４４で表されるペプチド（ＴＰＶ０１１：ＰＥＰ１５−ＲＲ−ＰＥＰ１８−ＲＲ−ＰＥＰ１−ＲＲ−ＰＥＰ１０）及び配列番号４５で表されるペプチド（ＴＰＶ０１２：ＲＲＲＲ−ＰＥＰ７−ＲＲ−ＰＥＰ１３−ＲＲ−ＰＥＰ８−ＲＲ−ＰＥＰ２）の３種類を混合して使用するのがさらにより好ましい。
【００３７】
本発明のＣＴＬエピトープ４連結ペプチドは、さらに親水性アミノ酸からなるペプチド配列を有することができる。当該ペプチド配列は、ＣＴＬエピトープ４連結ペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端に付加することができ、好ましくはＮ末端に付加する。当該ペプチド配列は、アルギニン、ヒスチジン、リジン、トレオニン、チロシン、セリン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、及びグルタミン酸からなる群から選択される１〜１５個、好ましくは２〜１０個、さらに好ましくは３〜５個の親水性アミノ酸からなるものを選択することができる。例えば当該ペプチド配列として、アルギニントリマー（ＲＲＲ）やアルギニンテトラマー（ＲＲＲＲ）を利用することができ、このようなペプチド配列が付加されたＣＴＬエピトープ４連結ペプチドとしては、ＲＲＲ−ＴＰＶ０６、ＲＲＲＲ−ＴＰＶ０６、ＴＰＶ０６−ＲＲＲ、ＴＰＶ０６−ＲＲＲＲ、ＲＲＲ−ＴＰＶ０７、ＲＲＲＲ−ＴＰＶ０７、ＴＰＶ０７−ＲＲＲ、ＴＰＶ０７−ＲＲＲＲ、ＲＲＲ−ＴＰＶ０８、ＲＲＲＲ−ＴＰＶ０８、ＴＰＶ０８−ＲＲＲ、ＴＰＶ０８−ＲＲＲＲ、ＫＫＫ−ＴＰＶ０６、ＫＫＫＫ−ＴＰＶ０６、ＴＰＶ０６−ＫＫＫ、ＴＰＶ０６−ＫＫＫＫ、ＫＫＫ−ＴＰＶ０７、ＫＫＫＫ−ＴＰＶ０７、ＴＰＶ０７−ＫＫＫ、ＴＰＶ０７−ＫＫＫＫ、ＫＫＫ−ＴＰＶ０８、ＫＫＫＫ−ＴＰＶ０８、ＴＰＶ０８−ＫＫＫ、ＴＰＶ０８−ＫＫＫＫ、ＨＨＨ−ＴＰＶ０６、ＨＨＨＨ−ＴＰＶ０６、ＴＰＶ０６−ＨＨＨ、ＴＰＶ０６−ＨＨＨＨ、ＨＨＨ−ＴＰＶ０７、ＨＨＨＨ−ＴＰＶ０７、ＴＰＶ０７−ＨＨＨ、ＴＰＶ０７−ＨＨＨＨ、ＨＨＨ−ＴＰＶ０８、ＨＨＨＨ−ＴＰＶ０８、ＴＰＶ０８−ＨＨＨ、ＴＰＶ０８−ＨＨＨＨ、ＲＲＫＫ−ＴＰＶ０６、ＲＫＲＫ−ＴＰＶ０６、ＲＨＲＨ−ＴＰＶ０６、ＲＲＨＨ−ＴＰＶ０６、ＫＫＨＨ−ＴＰＶ０６、ＫＨＫＨ−ＴＰＶ０６等が例示され、好ましくはＲＲＲ−ＴＰＶ０６、ＲＲＲＲ−ＴＰＶ０６、ＲＲＲ−ＴＰＶ０７、ＲＲＲＲ−ＴＰＶ０７、ＲＲＲ−ＴＰＶ０８、ＲＲＲＲ−ＴＰＶ０８、ＫＫＫ−ＴＰＶ０６、ＫＫＫＫ−ＴＰＶ０６、ＫＫＫ−ＴＰＶ０７、ＫＫＫＫ−ＴＰＶ０７、ＫＫＫ−ＴＰＶ０８、ＫＫＫＫ−ＴＰＶ０８、ＨＨＨ−ＴＰＶ０６、ＨＨＨＨ−ＴＰＶ０６、ＨＨＨ−ＴＰＶ０７、ＨＨＨＨ−ＴＰＶ０７、ＨＨＨ−ＴＰＶ０８、ＨＨＨＨ−ＴＰＶ０８、ＲＲＫＫ−ＴＰＶ０６、ＲＫＲＫ−ＴＰＶ０６、ＲＨＲＨ−ＴＰＶ０６、ＲＲＨＨ−ＴＰＶ０６、ＫＫＨＨ−ＴＰＶ０６、ＫＨＫＨ−ＴＰＶ０６であり、さらに好ましくはＲＲＲ−ＴＰＶ０６（ＴＰＶ０９）、ＲＲＲＲ−ＴＰＶ０６（ＴＰＶ１０）、ＲＲＲ−ＴＰＶ０７、ＲＲＲＲ−ＴＰＶ０７、ＲＲＲ−ＴＰＶ０８、ＲＲＲＲ−ＴＰＶ０８であり、最も好ましくはＲＲＲ−ＴＰＶ０６（ＴＰＶ０９）、ＲＲＲＲ−ＴＰＶ０６（ＴＰＶ１０）である。
【００３８】
親水性アミノ酸からなる当該ペプチド配列が付加されたペプチドは、水性溶媒への溶解度が向上することが知られている（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：３８，３０２−３１１（２０１２）、特開２００６−１８８５０７）。本発明のＣＴＬエピトープ４連結ペプチドに当該ペプチド配列を付加することによって、水性溶媒へのＣＴＬエピトープ４連結ペプチドの溶解度を向上することができる。
【００３９】
本発明の「親水性アミノ酸からなるペプチド配列を更に有していてもよい、エピトープ４連結ペプチド」は、好ましくはＮ末端に親水性アミノ酸からなるペプチド配列を有していてもよいＣＴＬエピトープ４連結ペプチドであり、より好ましくはＮ末端にアルギニン、ヒスチジン及びリジンからなる群から選択される３〜５個の親水性アミノ酸からなるペプチド配列を有していてもよいＣＴＬエピトープ４連結ペプチドであり、より好ましくはＮ末端にアルギニントリマー（ＲＲＲ）又はアルギニンテトラマー（ＲＲＲＲ）を有していてもよいＣＴＬエピトープ４連結ペプチドであり、より好ましくは親水性アミノ酸からなるペプチド配列を有さないＣＴＬエピトープ４連結ペプチドである。
【００４０】
なお、本発明のＣＴＬエピトープ４連結ペプチドは、例えば、国際公開第２０１５／０６０２３５号パンフレットに記載の方法に準じて合成することができる。
【００４１】
本発明における免疫チェックポイント分子調節剤は、免疫チェックポイント分子に作用し癌患者の生体内における抗腫瘍免疫応答を誘導させ、腫瘍の免疫逃避を制御する作用を有するものである。
従って、免疫チェックポイント分子調節剤として、免疫チェックポイント分子を標的にした物質を用いることができる。免疫チェックポイント分子としては、例えば、Ｂ７  ｆａｍｉｌｙ（Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２等）、ＣＤ２８  ｆａｍｉｌｙ（ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１等）、ＴＮＦ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ（４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ等）、ＴＮＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ（４−１ＢＢ、ＯＸ４０等）分子が挙げられ、これらは、刺激性の共刺激分子であるｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ分子と、抑制性の共刺激分子であるｃｏｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ分子に大きく分類されている。
【００４２】
本発明で好適に使用可能な免疫チェックポイント分子調節剤としては、ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ分子の機能を促進する物質、或いはｃｏｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ分子の機能を抑制する物質が挙げられる。より具体的には、免疫チェックポイント分子調節剤としては、例えば、ＰＤ−１経路アンタゴニスト、ＩＣＯＳ経路アゴニスト、ＣＴＬＡ−４経路アンタゴニスト、ＣＤ２８経路アゴニスト、ＢＴＬＡ経路アンタゴニスト、４−１ＢＢ経路アゴニスト等が挙げられる。
【００４３】
本発明において、免疫チェックポイント分子調節剤は、好ましくはＰＤ−１経路アンタゴニスト、ＩＣＯＳ経路アゴニスト、ＣＴＬＡ−４経路アンタゴニスト及びＣＤ２８経路アゴニストからなる群より選ばれる少なくとも１種であり、より好ましくはＰＤ−１経路アンタゴニスト、ＣＴＬＡ−４経路アンタゴニスト及びＣＤ２８経路アゴニストからなる群より選ばれる少なくとも１種であり、より好ましくはＰＤ−１経路アンタゴニスト及びＣＴＬＡ−４経路アンタゴニストからなる群より選ばれる少なくとも１種であり、副作用抑制の観点から、さらにより好ましくはＰＤ−１経路アンタゴニストである。
【００４４】
ＰＤ−１経路アンタゴニストは、Ｔ細胞上に発現するＰＤ−１や、そのリガンドであるＰＤ−Ｌ１又はＰＤ−Ｌ２による免疫抑制シグナルを阻害するものであり、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＰＤ−Ｌ２抗体、ＰＤ−１細胞外ドメイン、ＰＤ−Ｌ１細胞外ドメイン、ＰＤ−Ｌ２細胞外ドメイン、ＰＤ−１−Ｉｇ（ＰＤ−１細胞外ドメインとイムノグロブリン（Ｉｇ）のＦＣ領域との融合タンパク質）、ＰＤ−Ｌ１−Ｉｇ、ＰＤ−Ｌ２−Ｉｇ、ＰＤ−１  ｓｉＲＮＡ、ＰＤ−Ｌ１  ｓｉＲＮＡ、ＰＤ−Ｌ２  ｓｉＲＮＡ等が挙げられる。ＰＤ−１経路アンタゴニストとして、好ましくは抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、又は抗ＰＤ−Ｌ２抗体であり、より好ましくは抗ＰＤ−１抗体、又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。なかでも、特に好ましくは抗ＰＤ−１抗体である。
【００４５】
また、ＣＴＬＡ−４経路アンタゴニストは、Ｔ細胞上に発現するＣＴＬＡ−４や、そのリガンドであるＢ７−１（ＣＤ８０）やＢ７−２（ＣＤ８６）による免疫抑制シグナルを阻害するものであり、抗ＣＴＬＡ−４抗体、ＣＴＬＡ−４細胞外ドメイン、ＣＴＬＡ−４−Ｉｇ、抗Ｂ７−１（ＣＤ８０）抗体、又は抗Ｂ７−２（ＣＤ８６）抗体、ＣＴＬＡ−４  ｓｉＲＮＡ等が挙げられる。ＣＴＬＡ−４経路アンタゴニストとして、好ましくは抗ＣＴＬＡ−４抗体、ＣＴＬＡ−４細胞外ドメイン、ＣＴＬＡ−４−Ｉｇ、抗Ｂ７−１（ＣＤ８０）抗体、又は抗Ｂ７−２（ＣＤ８６）抗体であり、より好ましくは抗ＣＴＬＡ−４抗体、又はＣＴＬＡ−４−Ｉｇである。なかでも、特に好ましくは抗ＣＴＬＡ−４抗体である。
【００４６】
これらの抗体は、免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＹ等）、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）、シングルドメイン抗体、Ｄｉａｂｏｄｙ等（Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６：３４３−３５７，２００６）が挙げられ、これらはヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、マウス抗体、ラマ抗体、ニワトリ抗体等のモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体が挙げられる。
好ましくは、ヒト化ＩｇＧモノクローナル抗体又はヒトＩｇＧモノクローナル抗体である。
【００４７】
本発明における抗ＰＤ−１抗体としては、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、セミプリマブ（Ｃｅｍｉｐｌｉｍａｂ）又はスパルタリズマブ（Ｓｐａｒｔａｌｉｚｕｍａｂ）等が挙げられ、ニボルマブ又はペムブロリズマブが好ましい。
本発明における抗ＰＤ−Ｌ１抗体としては、アテゾリズマブ、デュルバルマブ又はアベルマブ等が挙げられ、アテゾリズマブ、デュルバルマブ又はアベルマブが好ましい。
本発明における抗ＣＴＬＡ−４抗体としては、イピリムマブ又はトレメリムマブ等が挙げられ、イピリムマブが好ましい。
本発明におけるＣＴＬＡ−４−Ｉｇとしては、アバタセプト等が挙げられ、好ましくはアバタセプトである。
【００４８】
これらの抗体は、通常公知の抗体作製方法により製造できる。
また、抗ＰＤ−１抗体は、ニボルマブ又はペムブロリズマブとして、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、アテゾリズマブ、デュルバルマブ又はアベルマブとして、抗ＣＴＬＡ−４抗体は、イピリムマブ又はトレメリムマブとして、ＣＴＬＡ−４−Ｉｇは、アバタセプトとして既に販売され、また販売予定であり、これを用いることもできる。
【００４９】
本発明において、２種以上の免疫チェックポイント分子調節剤を用いる場合、例えば、抗ＰＤ−１抗体や抗ＣＴＬＡ−４抗体を併用して用いることもできるし、ＰＤ−１及びＣＴＬＡ−４の両方に結合可能な二重特異性抗体を用いることもできる。二重特異性抗体としては、例えば、ＸｍＡｂ２０７１７（ＰＤ−１×ＣＴＬＡ−４）が挙げられる。
【００５０】
本発明において使用されるエピトープ４連結ペプチドのヒトにおける推奨用量は、単独投与の場合、エピトープ４連結ペプチド１種あたり３〜９ｍｇ／ｂｏｄｙ／ｄａｙの範囲である。本発明において、エピトープ４連結ペプチドの投与日における１日あたりの投与量としては、エピトープ４連結ペプチドによる免疫チェックポイント分子調節剤の抗腫瘍効果の増強効果の観点から、エピトープ４連結ペプチドを単独で投与する場合における推奨用量の５０〜２００％が好ましく、８０〜１２０％がより好ましく、１００％が特に好ましい。
【００５１】
従って、ヒトにおける推奨用量が３ｍｇ／ｂｏｄｙ／ｄａｙである場合、投与量はエピトープ４連結ペプチド１種あたり１．５〜６ｍｇ／ｂｏｄｙ／ｄａｙが好ましく、２．４〜３．６ｍｇ／ｂｏｄｙ／ｄａｙがより好ましく、３ｍｇ／ｂｏｄｙ／ｄａｙが特に好ましい。また、ヒトにおける推奨用量が９ｍｇ／ｂｏｄｙ／ｄａｙである場合、投与量はエピトープ４連結ペプチド１種あたり４．５〜１８ｍｇ／ｂｏｄｙ／ｄａｙが好ましく、７．２〜１０．８ｍｇ／ｂｏｄｙ／ｄａｙがより好ましく、９ｍｇ／ｂｏｄｙ／ｄａｙが特に好ましい。
【００５２】
本発明において、免疫チェックポイント分子調節剤の投与日における１日あたりの投与量としては、エピトープ４連結ペプチドによる免疫チェックポイント分子調節剤の抗腫瘍効果の増強作用の観点から、免疫チェックポイント分子調節剤を単独で投与する場合における推奨用量の５０〜１００％が好ましく、１００％がより好ましい。
【００５３】
具体的には、ニボルマブを単独で投与する場合の推奨用量は、日本において承認を受けた投与量である１回２ｍｇ/ｋｇ（体重）又は１回３ｍｇ/ｋｇ（体重）であることから、本発明におけるニボルマブの投与日における１日あたりの投与量は、１回１〜３ｍｇ/ｋｇ（体重）が好ましく、より好ましくは１回２ｍｇ/ｋｇ（体重）又は１回３ｍｇ/ｋｇ（体重）である。
【００５４】
ペムブロリズマブを単独で投与する場合の推奨用量は、日本において承認を受けた投与量である１回２ｍｇ/ｋｇ（体重）又は１回２００ｍｇであることから、本発明におけるペムブロリズマブの投与日における１日あたりの投与量は、１回１〜２ｍｇ/ｋｇ（体重）又は１回１００〜２００ｍｇが好ましく、より好ましくは１回２ｍｇ/ｋｇ（体重）又は１回２００ｍｇである。
【００５５】
アテゾリズマブを単独で投与する場合の推奨用量は、日本において承認を受けた投与量である１回１２００ｍｇであることから、本発明におけるアテゾリズマブの投与日における１日あたりの投与量は、１回６００〜１２００ｍｇが好ましく、より好ましくは１回１２００ｍｇである。
【００５６】
アベルマブ又はデュルバルマブを単独で投与する場合の推奨用量は、米国において承認を受けた投与量である１回１０ｍｇ/ｋｇ（体重）であることから、本発明におけるアベルマブ又はデュルバルマブの投与日における１日あたりの投与量は、１回５〜１０ｍｇ/ｋｇ（体重）が好ましく、より好ましくは１回１０ｍｇ/ｋｇ（体重）である。
【００５７】
イピリムマブを単独で投与する場合の推奨用量は、日本において承認を受けた投与量である１回３ｍｇ/ｋｇ（体重）であることから、本発明におけるイピリムマブの投与日における１日あたりの投与量は、１回１．５〜３ｍｇ/ｋｇ（体重）が好ましく、より好ましくは１回３ｍｇ/ｋｇ（体重）である。
【００５８】
なお、本発明において「推奨用量」とは、臨床試験などにより決定された、重篤な副作用を発症せずに安全に使用できる範囲で、最大の治療効果をもたらす投与量でありうる。具体的には、日本独立行政法人医薬品医療機器総合機構（ＰＭＤＡ；Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ａｇｅｎｃｙ）、米国食品医薬品局（ＦＤＡ；Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）、欧州医薬品庁（ＥＭＡ；Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ  Ａｇｅｎｃｙ）等の公的機関や団体により承認・推奨・勧告され、添付文書・インタビューフォーム・治療ガイドライン等に記載された投与量が挙げられ、ＰＭＤＡ、ＦＤＡ又はＥＭＡのいずれかの公的機関により承認された投与量が好ましい。
【００５９】
本発明の抗腫瘍剤の投与スケジュールは、癌種や病期等に応じて適宜選択しうる。
エピトープ４連結ペプチドの場合は、１週間に１回投与する工程を３回（１日目、８日目、１５日目に１日１回）繰り返す計２１日間を１サイクルとした投与スケジュールが好ましい。また、３サイクル目以降は、１日目に投与し２０日間の休薬を行う計２１日間を１サイクルとした投与スケジュール（３週間に１回投与する方法）が好ましい。
【００６０】
ニボルマブの場合は、２週間又は３週間間隔で投与する投与スケジュールが好ましい。
ペムブロリズマブ、アテゾリズマブ又はイピリムマブの場合は、３週間間隔で投与する投与スケジュールが好ましい。
アベルマブ又はデュルバルマブの場合は、２週間間隔で投与する投与スケジュールが好ましい。
【００６１】
本発明の抗腫瘍剤の１日の投与回数は、癌種や病期等に応じて適宜選択しうる。
エピトープ４連結ペプチド、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ又はイピリムマブの場合は、１日１回が好ましい。
本発明のエピトープ４連結ペプチド及び免疫チェックポイント分子調節剤の投与順序は、癌種や病期等に応じて適宜選択しうるが、どちらを先に投与しても、同時に投与しても構わない。ここで両剤を同時に投与しない場合、両剤の投与間隔は、抗腫瘍効果の増強効果を奏するかぎり適宜選択しうるが、１〜２１日が好ましく、１〜１４日がより好ましく、１〜７日が特に好ましい。本発明のエピトープ４連結ペプチド及び免疫チェックポイント分子調節剤の投与順序は、エピトープ４連結ペプチドを先に投与するのが好ましい。
【００６２】
本発明において対象となる腫瘍は、抗腫瘍効果の増強効果を奏する範囲であれば特に制限されないが、好ましくはエピトープ４連結ペプチドが抗腫瘍効果を発揮する腫瘍であり、より好ましくはＬｃｋ、ＷＨＳＣ２、ＳＡＲＴ２、ＳＡＲＴ３、ＭＲＰ３、ＵＢＥ２Ｖ、ＥＧＦＲ、又はＰＴＨｒＰ陽性の悪性腫瘍であり、より好ましくはＳＡＲＴ２陽性の悪性腫瘍である。
【００６３】
本発明の対象となる癌としては、具体的には、脳腫瘍、頭頚部癌、消化器癌（食道癌、胃癌、十二指腸癌、肝臓癌、胆道癌（胆嚢・胆管癌など）、膵臓癌、小腸癌、大腸癌（結腸直腸癌、結腸癌、直腸癌など）、消化管間質腫瘍など）、肺癌（非小細胞肺癌、小細胞肺癌）、乳癌、卵巣癌、子宮癌（子宮頚癌、子宮体癌など）、腎癌、尿路上皮癌（膀胱癌、腎盂癌、尿管癌）、前立腺癌、皮膚癌、原発不明癌等が挙げられる。なお、ここで癌には、原発巣のみならず、他の臓器（肝臓など）に転移した癌をも含む。このうち、抗腫瘍効果の観点から、頭頸部癌、消化器癌、肺癌、腎癌、尿路上皮癌、皮膚癌が好ましく、消化器癌、肺癌、尿路上皮癌、皮膚癌がより好ましく、肺癌、尿路上皮癌が特に好ましい。また、本発明の抗腫瘍剤は、腫瘍を外科的に摘出した後に再発防止のために行われる術後補助化学療法に用いるものであっても、腫瘍を外科的に摘出するために事前行われる術前補助化学療法であってもよい。
【００６４】
本発明において、エピトープ４連結ペプチド、及び免疫チェックポイント分子調節剤は、各有効成分の投与形態や投与スケジュールに基づき、各有効成分を複数の剤形に分けて製剤化してもよく、一つの剤形にまとめて製剤化（すなわち、配合剤として製剤化）してもよい。また、各製剤を併用に適した１個のパッケージにまとめて製造販売してもよく、また各製剤を別個のパッケージに分けて製造販売してもよい。
【００６５】
本発明の抗腫瘍剤の投与形態としては特に制限は無く、治療目的に応じて適宜選択でき、具体的には経口剤（錠剤、被覆錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤など）、注射剤、坐剤、貼付剤、軟膏剤等が例示できる。
エピトープ４連結ペプチド、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体及び抗ＣＴＬＡ−４抗体の投与形態としては、上記の投与形態が挙げられ、好ましくは注射剤である。
【００６６】
本発明における抗腫瘍剤は、エピトープ４連結ペプチドについても免疫チェックポイント分子調節剤についてもその投与形態に応じて、薬学的に許容される担体を用いて、通常公知の方法により調製することができる。斯かる担体としては、通常の薬剤に汎用される各種のもの、例えば賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、安定化剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤等を例示できる。
【００６７】
本発明はまた、癌患者に対する免疫チェックポイント分子調節剤の抗腫瘍効果を増強するためのエピトープ４連結ペプチドを有効成分として含む抗腫瘍効果増強剤に関する。当該抗腫瘍効果増強剤は、上記抗腫瘍剤の製剤形態を有する。
【００６８】
本発明はまた、免疫チェックポイント分子調節剤を投与された癌患者を治療するためのエピトープ４連結ペプチドを含む抗腫瘍剤に関する。当該抗腫瘍剤は、上記の製剤形態を有する。
本発明はまた、エピトープ４連結ペプチドを投与された癌患者を治療するための免疫チェックポイント分子調節剤を含む抗腫瘍剤に関する。当該抗腫瘍剤は、上記の製剤形態を有する。
【００６９】
「治療」には、腫瘍を外科的に摘出した後に再発防止のために行われる術後補助化学療法、腫瘍を外科的に摘出するために事前に行われる術前補助化学療法が包含される。
【００７０】
本発明はまた、癌患者に対する免疫チェックポイント分子調節剤と併用することを特徴とする、エピトープ４連結ペプチドを含む抗腫瘍剤に関する。当該抗腫瘍剤は、上記の製剤形態を有する。
本発明はまた、癌患者に対するエピトープ４連結ペプチドと併用することを特徴とする、免疫チェックポイント分子調節剤を含む抗腫瘍剤に関する。当該抗腫瘍剤は、上記の製剤形態を有する。
【００７１】
本発明はまた、エピトープ４連結ペプチドを含む抗腫瘍剤と、癌患者に対してエピトープ４連結ペプチドと免疫チェックポイント分子調節剤が併用投与されることを記載した使用説明書を含むキット製剤に関する。
ここで「使用説明書」とは、上記投与量が記載されたものであればよく、法的拘束力の有無を問わないが、上記投与量が推奨されているものが好ましい。具体的には、添付文書、パンフレット等が例示される。また、使用説明書を含むキット製剤とは、キット製剤のパッケージに使用説明書が印刷・添付されているものであっても、キット製剤のパッケージに抗腫瘍剤とともに使用説明書が同封されているものであってもよい。
【００７２】
一方、本発明者等のグループは、非ヒト動物において、ヒト又は非ヒト由来のβ２ミクログロブリン、ＨＬＡクラスＩのα１及びα２領域、並びにヒト又は非ヒト由来のＭＨＣクラスＩのα３領域が連結した人工キメラ遺伝子を発現させる技術を確立し、ＨＬＡクラスＩを発現する非ヒト動物の作製に成功している（国際公開第２０１５／０５６７７４号）。
【００７３】
上記の非ヒト動物を用いることで、非ヒト動物において、ヒトにおける免疫応答を再現することが可能となる。すなわち、上記非ヒト動物における抗原提示細胞は、ＨＬＡクラスＩのα１及びα２領域を発現するため、これと結合しうるヒト腫瘍抗原エピトープペプチドを提示することができる。
【００７４】
本発明者は更に、ヒトＨＬＡ−Ａ２４とＳＡＲＴ２由来のヒト腫瘍抗原エピトープペプチドとを共発現させることで、エピトープ４連結ペプチドの投与によるＣＴＬ誘導の効果を評価できることを見出した。例えば、マウス腫瘍由来の培養細胞に対してヒトＨＬＡ−Ａ２４とＳＡＲＴ２由来のヒト腫瘍抗原エピトープペプチドとを共発現させ、上記の非ヒト動物に移植させることで、ＳＡＲＴ２由来のヒト腫瘍抗原エピトープペプチドを提示する腫瘍を増殖させることができる。
【００７５】
すなわち、本発明は、ＳＡＲＴ２由来のヒト腫瘍抗原エピトープペプチドをコードするポリヌクレオチド、及びヒトＨＬＡ−Ａ２４の特にα１及びα２領域をコードするポリヌクレオチドを導入した細胞を提供するものである。ここで、ＳＡＲＴ２由来のヒト腫瘍抗原エピトープペプチドは、ＰＥＰ５を含むことが好ましく、従って、当該細胞へはＰＥＰ５をコードするポリヌクレオチドを導入することが好ましい。
【００７６】
本発明者は、上記の非ヒト動物において、ＨＬＡ−Ａ２４とＰＥＰ５とを共発現する腫瘍の生着に成功し、この系により、本発明の抗腫瘍剤等の評価が可能であることを実証した。
従って、本発明は、ＳＡＲＴ２由来のヒト腫瘍抗原エピトープペプチドをコードするポリヌクレオチド及びヒトＨＬＡ−Ａ２４のα１及びα２領域をコードするポリヌクレオチドを導入した細胞（以下、「本発明の細胞」とも称する）に関する。
【００７７】
ＳＡＲＴ２は、先に記載した通り、腫瘍組織において高発現することが報告されているタンパク質の１種である。樹状細胞等の抗原提示細胞において、ＨＬＡ−Ａ２４型のＨＬＡ分子と結合して提示されうるＳＡＲＴ２由来のヒト腫瘍抗原エピトープペプチドとして、上記のＰＥＰ５が挙げられる。ペプチドＰＥＰ５のアミノ酸配列は配列番号５に、ペプチドＰＥＰ５をコードするポリヌクレオチド配列は配列番号２９に示す。
【００７８】
本明細書において、「ＳＡＲＴ２由来のヒト腫瘍抗原エピトープペプチドをコードするポリヌクレオチド」は、好ましくは、以下の（ａ）〜（ｅ）から選択されるポリヌクレオチド： 
（ａ）配列番号５で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号５で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号５で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２９で示される塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号２９で示される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチド；
であり、より好ましくは、以下の（ａ）〜（ｅ）から選択されるポリヌクレオチド： 
（ａ）配列番号５で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号５で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（ただし、アミノ酸の付加はＮ末端側への付加に限る）；
（ｃ）配列番号５で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２９で示される塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号２９で示される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチド；
であり、より好ましくは、前記（ａ）又は（ｄ）から選択されるポリヌクレオチドである。
【００７９】
本明細書において、「配列番号５で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド」は、シグナル配列が付加した配列であっても良い。好ましくは、「配列番号５で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド」は、配列番号５で示されるアミノ酸配列のＮ末端側にシグナル配列である１０〜３０個のアミノ酸が付加したポリペプチドであり、より好ましくはシグナル配列である１５〜２５個のアミノ酸が付加したポリペプチドであり、より好ましくは配列番号３２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
【００８０】
同様に、本明細書において、「配列番号５で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチド」は、シグナル配列が付加した配列であっても良い。好ましくは、配列番号５で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列のＮ末端側にシグナル配列である１０〜３０個のアミノ酸が付加したポリペプチドであり、より好ましくはシグナル配列である１５〜２５個のアミノ酸が付加したポリペプチドであり、より好ましくは配列番号３２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
【００８１】
同様に、本明細書において、「配列番号５で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド」は、シグナル配列が付加した配列であっても良い。好ましくは、配列番号５で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列のＮ末端側にシグナル配列である１０〜３０個のアミノ酸が付加したポリペプチドであり、より好ましくはシグナル配列である１５〜２５個のアミノ酸が付加したポリペプチドであり、より好ましくは配列番号３２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
【００８２】
同様に、本明細書において、「配列番号２９で示される塩基配列を含むポリヌクレオチド」は、シグナル配列をコードする塩基配列が付加した配列であっても良い。好ましくは、配列番号２９で示される塩基配列の５’末端側にシグナル配列をコードする３０〜９０塩基が付加したポリヌクレオチドであり、より好ましくはシグナル配列をコードする４５〜７５塩基が付加したポリヌクレオチドであり、より好ましくは配列番号３３で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
【００８３】
同様に、本明細書において、「配列番号２９で示される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチド」は、シグナル配列をコードする塩基配列が付加した配列であっても良い。好ましくは、配列番号２９で示される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列の５’末端側にシグナル配列をコードする３０〜９０塩基が付加したポリヌクレオチドであり、より好ましくはシグナル配列をコードする４５〜７５塩基が付加したポリヌクレオチドであり、より好ましくは配列番号３３で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
【００８４】
本発明の態様の１つにおいて、「ＳＡＲＴ２由来のヒト腫瘍抗原エピトープペプチドをコードするポリヌクレオチド」は、好ましくは、以下の（ｋ）〜（ｏ）から選択されるポリヌクレオチド：
（ｋ）配列番号３２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｌ）配列番号３２で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｍ）配列番号３２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｎ）配列番号３３で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｏ）配列番号３３で示される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチド；
であり、より好ましくは、以下の（ｋ）〜（ｏ）から選択されるポリヌクレオチド：
（ｋ）配列番号３２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｌ）配列番号３２で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（ただし、アミノ酸の付加はＮ末端側への付加に限る）；
（ｍ）配列番号３２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｎ）配列番号３３で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｏ）配列番号３３で示される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチド；
であり、より好ましくは、前記（ｋ）又は（ｎ）から選択されるポリヌクレオチドである。
【００８５】
なお、「ＳＡＲＴ２由来のヒト腫瘍抗原エピトープペプチド」は、配列番号５で示されるアミノ酸配列特異的なＣＴＬが認識できることが好ましい。
ここで、「配列番号５で示されるアミノ酸配列に特異的なＣＴＬが認識できる」とは、例えば、本発明の細胞と配列番号５で示されるアミノ酸配列に特異的なＣＴＬを用いた５１Ｃｒリリースアッセイ、ＥＬＩＳＡ法（例えば、ＩＦＮ−γの測定）やＥＬＩＳＰＯＴアッセイ（例えば、ＩＦＮ−γの測定）により確認できる。
【００８６】
本明細書において、「ヒトＨＬＡ−Ａ２４のα１及びα２領域をコードするポリヌクレオチド」は、好ましくは、以下の（ｆ）〜（ｊ）から選択されるポリヌクレオチド：
（ｆ）配列番号３０で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｇ）配列番号３０で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｈ）配列番号３０で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｉ）配列番号３１で示される塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｊ）配列番号３１で示される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチド；
であり、より好ましくは前記（ｆ）又は（ｉ）から選択されるポリヌクレオチドである。
【００８７】
本明細書において、「配列番号３０で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド」は、好ましくは配列番号３０で示されるアミノ酸配列のＮ末端側にβ２ミクログロブリンが付加し、Ｃ末端側にＭＨＣクラスＩのα３領域が付加したポリペプチドであり、より好ましくは配列番号３４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
【００８８】
本明細書において、「配列番号３０で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチド」は、好ましくは配列番号３０で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列のＮ末端側にβ２ミクログロブリンが付加し、Ｃ末端側にＭＨＣクラスＩのα３領域が付加したポリペプチドであり、より好ましくは配列番号３４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
【００８９】
本明細書において、「配列番号３０で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド」は、好ましくは配列番号３０で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列のＮ末端側にβ２ミクログロブリンが付加し、Ｃ末端側にＭＨＣクラスＩのα３領域が付加したポリペプチドであり、より好ましくは配列番号３４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
【００９０】
本明細書において、「配列番号３１で示される塩基配列を含むポリヌクレオチド」は、好ましくは配列番号３１で示される塩基配列の５’末端側にβ２ミクログロブリンをコードする塩基配列が付加し、３’末端側にＭＨＣクラスＩのα３領域をコードする塩基配列を付加したポリヌクレオチドであり、より好ましくは配列番号３５で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
【００９１】
本明細書において、「配列番号３１で示される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチド」は、好ましくは配列番号３１で示される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列の５’末端側にβ２ミクログロブリンをコードする塩基配列が付加し、３’末端側にＭＨＣクラスＩのα３領域をコードする塩基配列を付加したポリヌクレオチドであり、より好ましくは配列番号３５で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
【００９２】
本明細書において、「β２ミクログロブリン」は、ＭＨＣクラスＩ分子のβ鎖を構成するタンパク質をいう。本明細書において、「β２ミクログロブリン」は、ヒト又は非ヒト（マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ブタ、ウシ、ヒツジ等）由来のいずれであっても良く、好ましくはヒトβ２ミクログロブリン（本明細書中において「ｈβ２Ｍ」とも記載する）である。
【００９３】
本明細書において、「ヒトβ２ミクログロブリン」は、以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）から選択されるポリヌクレオチド：
（ｉ）配列番号３６で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｉｉ）配列番号３６で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加され、かつＭＨＣクラスＩのα鎖と複合体を形成することにより当該ＭＨＣクラスＩ特異的な抗原提示能を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ）配列番号３６で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有し、かつＭＨＣクラスＩのα鎖と複合体を形成することにより当該ＭＨＣクラスＩ特異的な抗原提示能を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
であり、好ましくは（ｉ）で表されるポリヌクレオチドである。
【００９４】
本明細書において、「ＭＨＣクラスＩのα３領域」は、ＣＴＬ表面に発現する補助レセプターであるＣＤ８分子との結合に関与するα３領域とそのＣ末端側に存在する膜貫通領域及び細胞内領域をいう。本明細書において、「ＭＨＣクラスＩのα３領域」は、ヒト又は非ヒト（マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ブタ、ウシ、ヒツジ等）由来のいずれであっても良く、好ましくはマウスＭＨＣクラスＩのα３領域（本明細書中において「ｍα３」とも記載する）である。
【００９５】
本明細書において、「マウスＭＨＣクラスＩのα３領域」は、以下の（ｉｖ）〜（ｖｉ）から選択されるポリヌクレオチド：
（ｉｖ）配列番号３７で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｖ）配列番号３７で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加され、かつＣＤ８分子結合能を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｖｉ）配列番号３７で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有し、かつＣＤ８分子結合能を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
であり、好ましくは（ｉｖ）で表されるポリヌクレオチドである。
【００９６】
本発明の態様の１つにおいて、本明細書において、「ヒトＨＬＡ−Ａ２４のα１及びα２領域をコードするポリヌクレオチド」は、好ましくは、以下の（ｐ）〜（ｔ）から選択されるポリヌクレオチド：
（ｐ）配列番号３４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｑ）配列番号３４で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｒ）配列番号３４で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｓ）配列番号３５で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｔ）配列番号３５で示される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチド；
であり、より好ましくは前記（ｐ）又は（ｓ）から選択されるポリヌクレオチドである。
【００９７】
なお、「ヒトＨＬＡ−Ａ２４のα１及びα２領域をコードするポリヌクレオチド」は、コードされたα１及びα２領域が配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを抗原として提示できることが好ましく、配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを抗原として提示でき、かつＣＤ８分子結合能を有することが好ましく、配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを抗原として提示でき、かつＣＤ８分子結合能を有し、さらにβ２ミクログロブリンがＭＨＣクラスＩのα鎖と複合体を形成することにより当該ＭＨＣクラスＩ特異的な抗原提示能を有するが好ましい。
これらの機能を有するかどうかは、例えば、本発明の細胞と配列番号５で示されるアミノ酸配列に特異的なＣＴＬを用いた５１Ｃｒリリースアッセイ、ＥＬＩＳＡ法（例えば、ＩＦＮ−γの測定）やＥＬＩＳＰＯＴアッセイ（例えば、ＩＦＮ−γの測定）により確認できる。
【００９８】
本発明の細胞の樹立に用いられる宿主細胞は、好ましくは動物由来の細胞株であり、動物に移植した場合に腫瘍を形成し得るものである。より好ましくは、宿主細胞はマウス由来の細胞株であり、マウスに移植した場合に腫瘍を形成し得るものである。宿主細胞によって形成される腫瘍は、限定するものではないが、例えばメラノーマやリンパ腫等の固形腫瘍とすれば、腫瘍の増殖及び退縮等の評価が容易であるため好ましい。宿主細胞として、好ましくはＢ１６Ｆ１０細胞である。
【００９９】
本発明の細胞の樹立に用いられる宿主細胞に、ＳＡＲＴ２由来のヒト腫瘍抗原エピトープペプチドをコードするポリヌクレオチド及びヒトＨＬＡ−Ａ２４のα１及びα２領域をコードするポリヌクレオチドを導入するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、導入する宿主の種類、導入方法等に応じて適宜選択できる。例えば、プラスミドＤＮＡベクター、ウイルスベクターが挙げられる。プラスミドＤＮＡベクターとしては、例えば、ｐＣＭＶ６（Ｏｒｉｇｅｎｅ）、ｐｉｇｇｙＢａｃ  Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ｐＣＡＧ（富士フイルム和光純薬）、ｐｃＤＮＡ３．１（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が挙げられる。また、ウイルスベクターとしては、例えば、ｐＭＸ（Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、ｐＬＶＳＩＮ（タカラバイオ）、ｐＡＡＶ（タカラバイオ）、ｐＡｄｅｎｏＸ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）が挙げられる。
【０１００】
当該ベクターを用いて宿主を形質転換するには、リポフェクション法、エレクトロポレーション法等を用いて行うことができる。得られた形質転換体は、資化しうる炭素源、窒素源、金属塩、ビタミン等を含む培地を用いて適当な条件下で培養すればよい。
【０１０１】
細胞が、ＳＡＲＴ２由来のヒト腫瘍抗原エピトープペプチドをコードするポリヌクレオチド及びヒトＨＬＡ−Ａ２４のα１及びα２領域をコードするポリヌクレオチドを導入した細胞であるかの確認は、例えば、ヒト腫瘍抗原エピトープペプチドをコードするポリヌクレオチド又はポリペプチド及びヒトＨＬＡ−Ａ２４のα１及びα２領域をコードするポリヌクレオチド又はポリペプチドの発現の検出方法を用い、その発現を指標として確認することができる。
【０１０２】
ＳＡＲＴ２由来のヒト腫瘍抗原エピトープペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現の検出方法は、例えば、ＰＥＰ５をコードするポリヌクレオチドを含む配列番号２９若しくは配列番号３３で示されるポリヌクレオチド、又は配列番号２９若しくは配列番号３３で示されるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするポリペプチドをプライマーとして用い、ノーザンブロッティング法、サザンブロッティング法、ＲＴ−ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、デジタルＰＣＲ法、ＤＮＡマイクロアレイ法、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法、シークエンス解析法など、通常慣用の検出法を用いることができる。
【０１０３】
ヒトＨＬＡ−Ａ２４のα１及びα２領域をコードするポリヌクレオチドの発現の検出方法は、例えば、ＨＬＡ−Ａ２４のα１及びα２領域のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む配列番号３１若しくは配列番号３５で示されるポリヌクレオチド、又は配列番号３１若しくは配列番号３５で示されるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドをプライマーとして用い、上記の通常慣用の検出法を用いることができる。
【０１０４】
当該プライマーは、配列番号２９若しくは配列番号３３で示されるポリヌクレオチド若しくは配列番号２９若しくは配列番号３３で示されるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドとして、通常公知の手法により作製される。また、配列番号３１若しくは配列番号３５で示されるポリヌクレオチド又は配列番号３１若しくは配列番号３５で示されるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドとして、通常公知の手法により作製される。当該プライマーの塩基数は、１０〜５０塩基、好ましくは１０〜４０塩基、より好ましくは１０〜３０塩基である。
【０１０５】
また、当該プライマーは、配列番号２９若しくは配列番号３３で示されるポリヌクレオチド若しくは配列番号２９若しくは配列番号３３で示されるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド又は配列番号３１若しくは配列番号３５で示されるポリヌクレオチド若しくは配列番号３１若しくは配列番号３５で示されるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズするものであれば、完全に相補的である必要は無い。かかるプライマーは、対応する塩基配列と比較して、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上の同一性を有するポリヌクレオチドであり、完全に相補的でポリヌクレオチドが最も好ましい。
【０１０６】
ＳＡＲＴ２由来のヒト腫瘍抗原エピトープペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現の検出方法に用いるプライマーは、好ましくは配列番号４２及び配列番号４３で示されるプライマーセットである。
【０１０７】
ＳＡＲＴ２由来のヒト腫瘍抗原エピトープペプチドをコードするポリペプチドの発現の検出方法は、例えば、配列番号５で示されるポリペプチドに特異的に結合する抗体を用いたＥＬＩＳＡ法、ウエスタンブロッティング法、フローサイトメトリー法又は免疫組織化学染色法など、通常慣用の検出方法を用いることができる。好ましくは、フローサイトメトリー法である。配列番号５で示されるポリペプチドに特異的に結合する抗体は、市販品を使用すること、又は通常公知の方法で作製することが可能である。
【０１０８】
ヒトＨＬＡ−Ａ２４のα１及びα２領域をコードするポリペプチドの発現の検出方法は、例えば、ＨＬＡ−Ａ２４のα１及びα２領域を含む配列番号３０若しくは配列番号３４で示されるポリペプチドに特異的に結合する抗体を用いたＥＬＩＳＡ法、ウエスタンブロッティング法、フローサイトメトリー法又は免疫組織化学染色法など、通常慣用の検出方法を用いることができる。好ましくは、フローサイトメトリー法である。配列番号３０若しくは配列番号３４で示されるポリペプチドに特異的に結合する抗体は、市販品を使用すること、又は通常公知の方法で作製することが可能である。市販品の抗体としては、例えば、ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｃｌｏｎｅ：Ｗ６／３２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、Ａｎｔｉ−ＨＬＡ−Ａ２４(Ｈｕｍａｎ)  ｍＡｂ（Ｃｌｏｎｅ：２２Ｅ１、ＭＢＬ）、Ａｎｔｉ−ＨＬＡ  Ａ抗体（Ｃｌｏｎｅ：ＥＰ１３９５Ｙ、Ａｂｃａｍ）が挙げられ、好ましくは、ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｃｌｏｎｅ：Ｗ６／３２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）である。なお、これらの抗体は、例えばａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｃｌｏｎｅ：Ｗ６／３２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）であれば、ＰＥでラベル化されたＰＥ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｃｌｏｎｅ：Ｗ６／３２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）やＦＩＴＣでラベル化されたＦＩＴＣ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｃｌｏｎｅ：Ｗ６／３２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）などのラベル化体もａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｃｌｏｎｅ：Ｗ６／３２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）に含まれる。
【０１０９】
本発明の細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの評価を可能とするために、非免疫不全非ヒト動物に移植した際に、非免疫不全非ヒト動物内で腫瘍を形成し、かつ自然退縮しないことが好ましい。当該細胞が自然退縮しないことを確認するための方法は、例えば、ヒトＨＬＡ−Ａ２４遺伝子ノックインマウス（国際公開第２０１５／０５６７７４号）の皮下に本発明の細胞を移植し、腫瘍径を測定することにより確認することができる。本発明の細胞は、非免疫不全非ヒト動物に移植した際に、少なくとも移植後２０日以上腫瘍径が退縮していないこと（腫瘍径が増加していること）が好ましい。また、ｉｎ  ｖｉｖｏ試験の期間中において、薬剤を投与していない群（コントロール群）で、移植した細胞が退縮していないこと（腫瘍径が増加していること）が確認できれば、自然退縮しない期間が２０日未満であっても本発明の細胞に含まれる。
【０１１０】
本発明において、非免疫不全非ヒト動物の「非免疫不全」とは、動物本来の免疫能又は改変された免疫能を有することをいい、従ってヌードマウス等の免疫不全動物は含まない。また、「非ヒト動物」は、β２ミクログロブリン遺伝子座を有し、外来遺伝子を導入できる動物であれば特に限定されるものではないが、好ましくは齧歯類であり、より好ましくはマウス又はラットであり、飼育及び操作上の点から特に好ましいのはマウスである。
【０１１１】
本発明はまた、ＳＡＲＴ２由来のヒト腫瘍抗原エピトープペプチドの抗腫瘍効果を評価するための本発明の細胞に関する。
【０１１２】
本発明はまた、エピトープ４連結ペプチド及び／又は免疫チェックポイント分子調節剤の抗腫瘍効果を評価するための本発明の細胞に関する。
【０１１３】
本発明はまた、本発明の細胞を用いたＳＡＲＴ２由来のヒト腫瘍抗原エピトープペプチドの抗腫瘍効果を評価するための方法に関する。当該方法は、本発明の細胞を移植したヒトＨＬＡ−Ａ２４遺伝子ノックインの非免疫不全非ヒト動物を用いて行うことが好ましい。ここで、ヒトＨＬＡ−Ａ２４遺伝子ノックインの非免疫不全非ヒト動物は、ヒトＨＬＡ−Ａ２４のα１及びα２領域を有する非免疫不全非ヒト動物であれば良く、国際公開第２０１５／０５６７７４号で開示されたヒトＨＬＡ−Ａ２４遺伝子ノックインマウス（Ｂ２ｍｔｍ２（ＨＬＡ−Ａ２４／Ｈ−２Ｄｂ／Ｂ２Ｍ）Ｔａｉマウス）が好ましい。
【０１１４】
当該方法において、移植する本発明の細胞の数は、適宜選択しうるが、ヒトＨＬＡ−Ａ２４遺伝子ノックインマウス（Ｂ２ｍｔｍ２（ＨＬＡ−Ａ２４／Ｈ−２Ｄｂ／Ｂ２Ｍ）Ｔａｉマウス）を用いる場合、１×１０５〜１×１０７細胞／ｂｏｄｙが好ましく、１×１０５〜５×１０５細胞／ｂｏｄｙがより好ましく、５×１０５細胞／ｂｏｄｙがより好ましい。また、当該方法におけるＳＡＲＴ２由来のヒト腫瘍抗原エピトープペプチドの１回あたりの投与量は、適宜選択しうるが、ヒトＨＬＡ−Ａ２４遺伝子ノックインマウス（Ｂ２ｍｔｍ２（ＨＬＡ−Ａ２４／Ｈ−２Ｄｂ／Ｂ２Ｍ）Ｔａｉマウス）を用いる場合、１０〜１０００μｇ／ｂｏｄｙが好ましく、１００〜１０００μｇ／ｂｏｄｙがより好ましく、３００μｇ／ｂｏｄｙがより好ましい。
【０１１５】
本発明の細胞を用いたＳＡＲＴ２由来のヒト腫瘍抗原エピトープペプチドの抗腫瘍効果の評価は、以下の工程を含む方法により行うことができる。
【０１１６】
すなわち、当該方法は、
（Ｉ）ＳＡＲＴ２由来のヒト腫瘍抗原エピトープペプチドを、ヒトＨＬＡ−Ａ２４遺伝子ノックインの非免疫不全非ヒト動物に投与する工程、及び
（ＩＩ）本発明の細胞を、ヒトＨＬＡ−Ａ２４遺伝子ノックインの非免疫不全非ヒト動物に移植する工程、
を含む方法により行うことができる。
【０１１７】
好ましくは、当該方法は、以下の（Ｉ）及び（ＩＩ）の工程を含む方法である。
（Ｉ）ＳＡＲＴ２由来のヒト腫瘍抗原エピトープペプチドを、ヒトＨＬＡ−Ａ２４遺伝子ノックインマウスに投与する工程、及び
（ＩＩ）本発明の細胞を、ヒトＨＬＡ−Ａ２４遺伝子ノックインマウスに移植する工程。
【０１１８】
より好ましくは、当該方法は、以下の（Ｉ）及び（ＩＩ）の工程を含む方法である。
（Ｉ）ＳＡＲＴ２由来のヒト腫瘍抗原エピトープペプチドを、ヒトＨＬＡ−Ａ２４遺伝子ノックインマウスに２回以上投与する工程、及び
（ＩＩ）上記工程（Ｉ）の後に、本発明の細胞を、ヒトＨＬＡ−Ａ２４遺伝子ノックインマウスに移植する工程。
【０１１９】
より好ましくは、当該方法は、以下の（Ｉ）及び（ＩＩ）の工程を含む方法である。
（Ｉ）ＳＡＲＴ２由来のヒト腫瘍抗原エピトープペプチドを、ヒトＨＬＡ−Ａ２４遺伝子ノックインマウスに３回以上投与する工程、及び
（ＩＩ）上記工程（Ｉ）の後に、本発明の細胞を、ヒトＨＬＡ−Ａ２４遺伝子ノックインマウスに移植する工程。
【０１２０】
本発明はまた、本発明の細胞を用いたエピトープ４連結ペプチド及び／又は免疫チェックポイント分子調節剤の抗腫瘍効果を評価するための方法に関する。当該方法は、本発明の細胞を移植したヒトＨＬＡ−Ａ２４遺伝子ノックインの非免疫不全非ヒト動物を用いて行うことが好ましい。ここで、ヒトＨＬＡ−Ａ２４遺伝子ノックインの非免疫不全非ヒト動物は、ヒトＨＬＡ−Ａ２４のα１及びα２領域を有する非免疫不全非ヒト動物であれば良く、国際公開第２０１５／０５６７７４号で開示されたヒトＨＬＡ−Ａ２４遺伝子ノックインマウス（Ｂ２ｍｔｍ２（ＨＬＡ−Ａ２４／Ｈ−２Ｄｂ／Ｂ２Ｍ）Ｔａｉマウス）が好ましい。
【０１２１】
当該方法において、移植する本発明の細胞の数は、適宜選択しうるが、ヒトＨＬＡ−Ａ２４遺伝子ノックインマウス（Ｂ２ｍｔｍ２（ＨＬＡ−Ａ２４／Ｈ−２Ｄｂ／Ｂ２Ｍ）Ｔａｉマウス）を用いる場合、１×１０５〜１×１０７細胞／ｂｏｄｙが好ましく、１×１０５〜５×１０５細胞／ｂｏｄｙがより好ましく、５×１０５細胞／ｂｏｄｙがより好ましい。また、当該方法におけるエピトープ４連結ペプチド１種あたりの１回あたりの投与量は、適宜選択しうるが、ヒトＨＬＡ−Ａ２４遺伝子ノックインマウス（Ｂ２ｍｔｍ２（ＨＬＡ−Ａ２４／Ｈ−２Ｄｂ／Ｂ２Ｍ）Ｔａｉマウス）を用いる場合、１０〜１０００μｇ／ｂｏｄｙが好ましく、１００〜１０００μｇ／ｂｏｄｙがより好ましく、３００μｇ／ｂｏｄｙがより好ましい。また、当該方法における免疫チェックポイント分子調節剤の１回あたりの投与量は、適宜選択しうるが、ヒトＨＬＡ−Ａ２４遺伝子ノックインマウス（Ｂ２ｍｔｍ２（ＨＬＡ−Ａ２４／Ｈ−２Ｄｂ／Ｂ２Ｍ）Ｔａｉマウス）を用いる場合、１０〜１０００μｇ／ｂｏｄｙが好ましく、３０〜５００μｇ／ｂｏｄｙがより好ましく、５０〜２００μｇ／ｂｏｄｙがより好ましい。
【０１２２】
本発明の細胞を用いたエピトープ４連結ペプチド及び／又は免疫チェックポイント分子調節剤の抗腫瘍効果を評価するための方法は、以下の工程を含みうる。
【０１２３】
すなわち、当該方法は、
（Ｉ）エピトープ４連結ペプチド及び／又は免疫チェックポイント分子調節剤を、ヒトＨＬＡ−Ａ２４遺伝子ノックインの非免疫不全非ヒト動物に投与する工程、及び
（ＩＩ）本発明の細胞を、ヒトＨＬＡ−Ａ２４遺伝子ノックインの非免疫不全非ヒト動物に移植する工程、
を含む方法により行うことができる。
【０１２４】
好ましくは、当該方法は、以下の（Ｉ）及び（ＩＩ）の工程を含む方法である。
（Ｉ）エピトープ４連結ペプチド及び／又は免疫チェックポイント分子調節剤を、ヒトＨＬＡ−Ａ２４遺伝子ノックインマウスに投与する工程、及び
（ＩＩ）本発明の細胞を、ヒトＨＬＡ−Ａ２４遺伝子ノックインマウスに移植する工程。
【０１２５】
より好ましくは、当該方法は、以下の（Ｉ）及び（ＩＩ）の工程を含む方法である。
（Ｉ）エピトープ４連結ペプチドを、ヒトＨＬＡ−Ａ２４遺伝子ノックインマウスに２回以上投与する工程、及び
（ＩＩ）上記工程（Ｉ）の後に、本発明の細胞を、ヒトＨＬＡ−Ａ２４遺伝子ノックインマウスに移植する工程。
【０１２６】
より好ましくは、当該方法は、以下の（Ｉ）〜（ＩＩＩ）の工程を含む方法である。
（Ｉ）エピトープ４連結ペプチドを、ヒトＨＬＡ−Ａ２４遺伝子ノックインマウスに３回以上投与する工程、
（ＩＩ）上記工程（Ｉ）の後に、本発明の細胞を、ヒトＨＬＡ−Ａ２４遺伝子ノックインマウスに移植する工程、及び
（ＩＩＩ）上記工程（Ｉ）の後に、免疫チェックポイント分子調節剤を、ヒトＨＬＡ−Ａ２４遺伝子ノックインマウスに投与する工程。
【０１２７】
本発明の方法において、エピトープ４連結ペプチドの抗腫瘍効果の評価は、以下の工程を含む方法により行うことができる。
【０１２８】
すなわち、当該方法は、
（Ｉ）エピトープ４連結ペプチドを、ヒトＨＬＡ−Ａ２４遺伝子ノックインの非免疫不全非ヒト動物に投与する工程、及び
（ＩＩ）本発明の細胞を、ヒトＨＬＡ−Ａ２４遺伝子ノックインの非免疫不全非ヒト動物に移植する工程、
を含む方法により行うことができる。
【０１２９】
好ましくは、当該方法は、以下の（Ｉ）及び（ＩＩ）の工程を含む方法である。
（Ｉ）エピトープ４連結ペプチドを、ヒトＨＬＡ−Ａ２４遺伝子ノックインマウスに投与する工程、及び
（ＩＩ）本発明の細胞を、ヒトＨＬＡ−Ａ２４遺伝子ノックインマウスに移植する工程。
【０１３０】
より好ましくは、当該方法は、以下の（Ｉ）及び（ＩＩ）の工程を含む方法である。
（Ｉ）エピトープ４連結ペプチドを、ヒトＨＬＡ−Ａ２４遺伝子ノックインマウスに２回以上投与する工程、及び
（ＩＩ）上記工程（Ｉ）の後に、本発明の細胞を、ヒトＨＬＡ−Ａ２４遺伝子ノックインマウスに移植する工程。
【０１３１】
より好ましくは、当該方法は、以下の（Ｉ）及び（ＩＩ）の工程を含む方法である。
（Ｉ）エピトープ４連結ペプチドを、ヒトＨＬＡ−Ａ２４遺伝子ノックインマウスに３回以上投与する工程、及び
（ＩＩ）上記工程（Ｉ）の後に、本発明の細胞を、ヒトＨＬＡ−Ａ２４遺伝子ノックインマウスに移植する工程。
【０１３２】
本発明において、免疫チェックポイント分子調節剤の抗腫瘍効果の評価は、以下の工程を含む方法により行うことができる。
【０１３３】
すなわち、当該方法は、
（Ｉ）免疫チェックポイント分子調節剤を、ヒトＨＬＡ−Ａ２４遺伝子ノックインの非免疫不全非ヒト動物に投与する工程、及び
（ＩＩ）本発明の細胞を、ヒトＨＬＡ−Ａ２４遺伝子ノックインの非免疫不全非ヒト動物に移植する工程、
を含む方法により行うことができる。
【０１３４】
好ましくは、当該方法は、以下の（Ｉ）及び（ＩＩ）の工程を含む方法である。
（Ｉ）免疫チェックポイント分子調節剤を、ヒトＨＬＡ−Ａ２４遺伝子ノックインマウスに投与する工程、及び
（ＩＩ）本発明の細胞を、ヒトＨＬＡ−Ａ２４遺伝子ノックインマウスに移植する工程。
【０１３５】
より好ましくは、当該方法は、以下の（Ｉ）及び（ＩＩ）の工程を含む方法である。
（Ｉ）免疫チェックポイント分子調節剤を、ヒトＨＬＡ−Ａ２４遺伝子ノックインマウスに投与する工程、及び
（ＩＩ）上記工程（Ｉ）と同日に、本発明の細胞を、ヒトＨＬＡ−Ａ２４遺伝子ノックインマウスに移植する工程。
【０１３６】
また、本発明において、エピトープ４連結ペプチド及び免疫チェックポイント分子調節剤の抗腫瘍効果の評価は、以下の工程を含む方法により行うことができる。
【０１３７】
すなわち、当該方法は、
（Ｉ）エピトープ４連結ペプチド及び免疫チェックポイント分子調節剤を、ヒトＨＬＡ−Ａ２４遺伝子ノックインの非免疫不全非ヒト動物に投与する工程、及び
（ＩＩ）本発明の細胞を、ヒトＨＬＡ−Ａ２４遺伝子ノックインの非免疫不全非ヒト動物に移植する工程、
を含む方法により行うことができる。
【０１３８】
好ましくは、当該方法は、以下の（Ｉ）及び（ＩＩ）の工程を含む方法である。
（Ｉ）エピトープ４連結ペプチド及び免疫チェックポイント分子調節剤を、ヒトＨＬＡ−Ａ２４遺伝子ノックインマウスに投与する工程、及び
（ＩＩ）本発明の細胞を、ヒトＨＬＡ−Ａ２４遺伝子ノックインマウスに移植する工程。
【０１３９】
より好ましくは、当該方法は、以下の（Ｉ）及び（ＩＩ）の工程を含む方法である。
（Ｉ）エピトープ４連結ペプチドを、ヒトＨＬＡ−Ａ２４遺伝子ノックインマウスに２回以上投与する工程、及び
（ＩＩ）上記工程（Ｉ）の後に、本発明の細胞を、ヒトＨＬＡ−Ａ２４遺伝子ノックインマウスに移植する工程。
【０１４０】
より好ましくは、当該方法は、以下の（Ｉ）〜（ＩＩＩ）の工程を含む方法である。
（Ｉ）エピトープ４連結ペプチドを、ヒトＨＬＡ−Ａ２４遺伝子ノックインマウスに３回以上投与する工程、
（ＩＩ）上記工程（Ｉ）の後に、本発明の細胞を、ヒトＨＬＡ−Ａ２４遺伝子ノックインマウスに移植する工程、及び
（ＩＩＩ）上記工程（Ｉ）の後に、免疫チェックポイント分子調節剤を、ヒトＨＬＡ−Ａ２４遺伝子ノックインマウスに投与する工程。
【０１４１】
上記の本発明の方法は、上記の工程の後に、エピトープ４連結ペプチド及び／又は免疫チェックポイント分子調節剤の抗腫瘍効果を評価する工程を含みうる。抗腫瘍効果は、例えば移植した細胞によって動物において増殖した腫瘍の増殖抑制、腫瘍の退縮及び消失、生存率の増大等を指標として評価することができる。
【０１４２】
「ＳＡＲＴ２由来のヒト腫瘍抗原エピトープペプチドの抗腫瘍効果」及び「エピトープ４連結ペプチドの抗腫瘍効果」の評価は、例えば、ヒトＨＬＡ−Ａ２４遺伝子ノックインマウスを用いて、ＳＡＲＴ２由来のヒト腫瘍抗原エピトープペプチド又はエピトープ４連結ペプチドをマウス皮下に３回投与後、本発明の細胞をマウス皮下に移植し、腫瘍径を測定することにより、抗腫瘍効果を示すかどうか確認することができる。
【０１４３】
「免疫チェックポイント分子調節剤の抗腫瘍効果」の評価は、例えば、ヒトＨＬＡ−Ａ２４遺伝子ノックインマウスを用いて、本発明の細胞の移植と同日に免疫チェックポイント分子調節剤をマウス静脈内又は腹腔内に投与し、腫瘍径を測定することにより、抗腫瘍効果を示すかどうか確認することができる。
【実施例】
【０１４４】
次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではなく、多くの変形が本発明の技術的思想内で当分野において通常の知識を有する者により可能である。
【０１４５】
尚、本発明の理解をより容易にするために、本明細書中で言及する配列番号２９〜４３についての説明を下記の表３に示す。
【０１４６】
【表３】
2020150950.tif 000004
【０１４７】
［実施例１  ペプチドの合成・精製］
エピトープ４連結ペプチドＴＰＶ０７及びＴＰＶ０８を、自動ペプチド合成機Ｐｒｅｌｕｄｅ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．）を用いて、９−フルオレニルメチル−オキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）法による固相ペプチド合成法にて合成した。すなわち、Ｗａｎｇ−ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ樹脂にα−アミノ基がＦｍｏｃ基で、側鎖官能基が一般的な保護基で保護されたアミノ酸を１−（メシチレン−２−スルホニル）−３−ニトロ−１，２，４−トリアゾール／Ｎ−メチルイミダゾール／ジクロロメタン条件により縮合し、樹脂へのＣ末端アミノ酸の担持を完了した。これにデブロッキング液（２０％  ピペリジン／Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ））を注入してＦｍｏｃ基を除去した後に、α−アミノ基がＦｍｏｃ基で、側鎖官能基が一般的な保護基で保護されたアミノ酸を１−［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］−５−クロロ−１Ｈ−ベンゾ−トリアゾリウム  ３−オキシド  ヘキサフルオロホスフェート（ＨＣＴＵ）／Ｎ−メチルモルホリン（ＮＭＭ）／ＤＭＦ条件によって縮合し、ジペプチドを合成した。デブロッキング液によるＦｍｏｃ基の脱保護とＨＣＴＵ／ＮＭＭ／ＤＭＦ条件によるアミノ酸の縮合操作を繰り返すことにより、目的とする配列を有するペプチドを合成した。保護ペプチド樹脂の合成完了後、脱保護溶液（２．５％  トリイソプロピルシラン、２．５％  水、２．５％１，２−エタンジチオール、９２．５％  トリフルオロ酢酸）を保護ペプチド樹脂に加えて、４時間反応することによってペプチド側鎖保護基の除去と共に、樹脂から遊離ペプチドを切り出した。樹脂をろ去し、得られたろ液を冷エーテルに添加することにより、ペプチドを沈澱として回収した。得られた各種合成ペプチドはＰｒｏｔｅｏｎａｖｉカラム（ＳＨＩＳＥＩＤＯ）にて溶媒系に０．１％  ＴＦＡ水溶液及びアセトニトリルを用いて精製した。最終精製ペプチドはＣＡＰＣＥＬＬ  ＰＡＫ  ＵＧ１２０カラム（ＳＨＩＳＥＩＤＯ）及びＨＰＬＣシステム（ＨＩＴＡＣＨＩ）により純度を確認した。また、ＥＳＩ−ＭＳシステム（Ｓｙｎａｐｔ  ＨＤＭＳ、ＷＡＴＥＲＳ）により分子量を確認し、凍結乾燥後冷温暗所にて保存し、以降に示す実施例に供した。
【０１４８】
ＴＰＶ０７及びＴＰＶ０８のマススペクトル（ＭＳ）分析により測定した分子量を表４に示す。さらにＴＰＶ０７及びＴＰＶ０８のＨＰＬＣのクロマトグラム及びＭＳを図１〜図４に示した。
【０１４９】
【表４】
2020150950.tif 000005
【０１５０】
ＴＰＶ０１〜ＴＰＶ０６、ＴＰＶ０９及びＴＰＶ１０は、例えば、国際公開第２０１５／０６０２３５号パンフレットに記載の方法に準じて合成することもできるし、上記に示したＴＰＶ０７及びＴＰＶ０８と同様の方法に準じて合成することもできる。いずれのペプチドも、純度９０％以上のものが得られた。
【０１５１】
［実施例２  Ｂ１６Ｆ１０.Ａ２４／ＳＡＲＴ２９３−１０１細胞株及びＥＬ４.Ａ２４／ＳＡＲＴ２９３−１０１細胞株の樹立］
国際公開第２０１５／０５６７７４号の実施例８に記載された方法でＢ２ｍｔｍ２（ＨＬＡ−Ａ２４／Ｈ−２Ｄｂ／Ｂ２Ｍ）Ｔａｉマウスを作製した。このマウスは、ヒトβ２ミクログロブリン、ＨＬＡ−Ａ２４のα１及びα２領域、及びマウスＭＨＣクラスＩのα３領域を連結して含む人工キメラタンパク質を発現することができる。
得られたマウスから脾臓を摘出し、スライドガラスにて脾臓をすり潰した後、ＢＤ  Ｐｈａｒｍ  Ｌｙｓｅ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて溶血を行うことで、単細胞懸濁液を調製した。得られた単細胞懸濁液よりＲＮＡｅａｓｙ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、ＲＮＡを抽出した。すなわち、1×１０６個の細胞に対し、Ｂｕｆｆｅｒ  ＲＬＴを３５０μL加えた後、ＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒスピンカラム（Ｑｉａｇｅｎ）に加えて遠心し（１５０００ｒｐｍ  ２分）、フロースルーを回収した。回収したＲＮＡ溶液に７０％エタノール水溶液３５０μＬを添加後、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉカラムに添加し、遠心した（１００００ｒｐｍ  １５秒）。さらにカラムをＢｕｆｆｅｒ  ＲＷ１  ３５０μＬにて洗浄後、ＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ  ＤＮａｓｅ  ｓｅｔ（Ｑｉａｇｅｎ）にてＤＮａｓｅ処理を行った。 カラムをＢｕｆｆｅｒ  ＲＷ１  ３５０μＬにて洗浄後、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔのプロトコールに従ってＲＮＡの精製を行った。精製後、ＲＮａｓｅ  Ｆｒｅｅ  Ｈ２Ｏ  ３０μＬを添加し、Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを回収した。
【０１５２】
得られたＴｏｔａｌ  ＲＮＡから、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ＲＴ−ＰＣＲ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、ｃＤＮＡを合成した。すなわち、Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  ２μｇを８μＬの精製水に懸濁し、オリゴ（ｄＴ）２０を１μＬ、１０ｍＭ  ｄＮＴＰを１μＬ加えてから、６５℃で５分間インキュベートした。氷上で２分間冷却した後、１０×  ＲＴ  ｂｕｆｆｅｒを２μＬ、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２を１μＬ、０．１Ｍ  ＤＴＴを２μＬ、ＲＮａｓｅＯＵＴ（４０Ｕ／μＬ）を１μＬ、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  ＲＴを１μＬ加えて混和した。５０℃で５０分間インキュベートした後、８５℃で５分間処理して反応を停止した。
【０１５３】
合成したｃＤＮＡをテンプレートとして、センスプライマーとしてＰｒｉｍｅｒ  １（ＴＣＡＡＧＣＴＴＡＡＣＴＡＧＣＡＴＧＧＣＣＧＴＣＡＴＧＧＣ：配列番号３８）、アンチセンスプライマーとしてＰｒｉｍｅｒ  ２（ＴＴＡＡＡＣＣＴＣＧＡＧＴＧＣＴＣＡＣＧＣＴＴＴＡＣＡＡＴＣＴＣＧＧＡＧＡＧＡ：配列番号３９）を用いて、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ｖｅｒ．２（東洋紡）によりＰＣＲ（９４℃で２分→９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、６８℃で２分を３０サイクル→６８℃で２分→４℃）を行い、配列番号３５で表される配列を有する、上記の人工キメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドを得た。増幅したポリヌクレオチドをＩｎＦｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて、ＰｉｇｇｙＢａｃ  Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に挿入することで、配列番号３５を有するプラスミドベクターＡを得た。
【０１５４】
次いで、ＰＥＰ５をコードするポリヌクレオチドを得るために、上記で得られた配列番号３５を有するプラスミドベクターＡをテンプレートとして、アンチセンスプライマーとしてＰｒｉｍｅｒ  ３（ＣＴＣＡＡＡＴＴＴＣＡＴＴＣＣＡＧＣＧＧＧＣＡＣＴＧＴＡＧＴＣＴＧＣＣＣＡＧＧＴＣＴＧＧＧＴ：配列番号４０）、センスプライマーとしてＰｒｉｍｅｒ  ４（ＧＣＡＧＡＣＴＡＣＡＧＴＧＣＣＣＧＣＴＧＧＡＡＴＧＡＡＡＴＴＴＧＡＧＣＡＣＴＣＧＡＧＧＴＴＴＡＡ：配列番号４１）を用いて、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＧＸＬ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ）によりＰＣＲ（９８℃で１０秒、５５℃で１５秒、６８℃で６分を２５サイクル→６８℃で３分→４℃）を行った。その結果、ＰｉｇｇｙＢａｃ  Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ内にシグナル配列及びＰＥＰ５をコードする塩基配列を含む配列番号３３で示される塩基配列を有するプラスミドベクターＢを得た。
【０１５５】
上記で作製したプラスミドベクターＡ及びＢを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＬＴＸ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ＰＬＵＳ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、Ｓｕｐｅｒ  ＰｉｇｇｙＢａｃ  Ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と共に、マウスメラノーマ細胞株であるＢ１６Ｆ１０（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ＡＴＣＣ）に遺伝子導入を行った。遺伝子導入後、限界希釈法を用いて単一クローンの細胞を取得した。
【０１５６】
また、マウスリンパ腫細胞株であるＥＬ４（ＡＴＣＣ）に、Ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  Ｋｉｔ  Ｌ（Ｌｏｎｚａ）およびＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  Ｄｅｖｉｃｅ（Ｌｏｎｚａ）を用いて、上記で作製したプラスミドベクターＡ、Ｂ、及びＳｕｐｅｒ  ＰｉｇｇｙＢａｃ  Ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の遺伝子導入を行った。遺伝子導入後、限界希釈法を用いて単一クローンの細胞を取得した。
【０１５７】
取得した単一クローンの細胞を回収し、ＲＮＡｅａｓｙ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、ＲＮＡを抽出した。すなわち、５×１０５個の細胞に対し、Ｂｕｆｆｅｒ  ＲＬＴを３５０μL加えた後、ＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒスピンカラム（Ｑｉａｇｅｎ）に加えて遠心し（１５０００ｒｐｍ  ２分）、フロースルーを回収した。回収したＲＮＡ溶液に７０％エタノール水溶液３５０μＬを添加後、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉカラムに添加し、遠心した（１００００ｒｐｍ  １５秒）。さらにカラムをＢｕｆｆｅｒ  ＲＷ１  ３５０μＬにて洗浄後、ＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ  ＤＮａｓｅ  ｓｅｔ（Ｑｉａｇｅｎ）にてＤＮａｓｅ処理を行った。 カラムをＢｕｆｆｅｒ  ＲＷ１  ３５０μＬにて洗浄後、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔのプロトコールに従ってＲＮＡの精製を行った。精製後、ＲＮａｓｅ  Ｆｒｅｅ  Ｈ２Ｏ  ３０μＬを添加し、Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを回収した。
【０１５８】
得られたＲＮＡより、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＶＩＬＯ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、ｃＤＮＡを合成した。すなわち、Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  ２μｇを１４μＬのＤＰＥＣ−ｔｒｅａｔｅｄ  ｗａｔｅｒに懸濁し、５Ｘ  ＶＩＬＯ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘを４μＬ、１０×  ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘを２μＬ混合した。２５℃で１０分間、４２℃で６０分間インキュベートを行い、８５℃で５分間処理して反応を停止した。
【０１５９】
取得した単一クローンの細胞におけるＰＥＰ５をコードするポリヌクレオチドの発現を確認するために、合成したｃＤＮＡをテンプレートとして、センスプライマーとしてＰｒｉｍｅｒ  ５（ＡＴＧＧＣＣＧＴＣＡＴＧＧＣ：配列番号４２）、アンチセンスプライマーとしてＰｒｉｍｅｒ  ６（ＴＣＡＡＡＴＴＴＣＡＴＴＣＣＡＧＣＧ：配列番号４３）を用いて、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ｖｅｒ．２（東洋紡）によりＰＣＲ（９４℃で２分→９８℃で１０秒、５５℃で３０秒、６８℃で３０秒を３０サイクル→６８℃で１分→４℃）を行い、配列番号３３で示すポリヌクレオチド配列の増幅をアガロースゲル電気泳動にて確認した。遺伝子導入していないＢ１６Ｆ１０及びＥＬ４細胞では、配列番号３３で示す配列を有するポリヌクレオチドの増幅が確認できなかったのに対し、取得した単一クローンにおいては、配列番号３３で示す配列を有するポリヌクレオチドの増幅が確認でき、従ってプラスミドベクターＢの導入によるＰＥＰ５発現細胞の取得が確認された。
【０１６０】
また、取得した単一クローンの細胞におけるＨＬＡ分子の発現を解析するために、細胞をＰＥ  Ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｃｌｏｎｅ：Ｗ６／３２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）にて染色を行った。染色後、ＢＤ  ＦＡＣＳＶｅｒｓｅ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にて解析を行った。その結果、遺伝子導入していないＢ１６Ｆ１０及びＥＬ４細胞では、抗体の染色による蛍光強度の上昇が確認出来なかったのに対し、取得した単一クローンにおいては、抗体染色による蛍光強度の上昇が確認でき、プラスミドベクターＡの導入によるＨＬＡ−Ａ２４発現細胞の取得が確認された。
すなわち、取得された細胞は、ＨＬＡ−Ａ２４を発現すると共に、ＰＥＰ５も発現する細胞（Ｂ１６Ｆ１０.Ａ２４／ＳＡＲＴ２９３−１０１細胞及びＥＬ４.Ａ２４／ＳＡＲＴ２９３−１０１細胞）であることが確認された。
【０１６１】
［実施例３  Ｂ１６Ｆ１０.Ａ２４／ＳＡＲＴ２９３−１０１細胞株及びＥＬ４.Ａ２４／ＳＡＲＴ２９３−１０１細胞株の生着確認］
実施例２で得られたＢ１６Ｆ１０.Ａ２４／ＳＡＲＴ２９３−１０１細胞株及びＥＬ４.Ａ２４／ＳＡＲＴ２９３−１０１細胞株を、１０％ ＦＢＳを含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）培地を用いて、培養した。継代の際は、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータ中において、週２回、１：２５〜１：４０比率で継代した。
【０１６２】
９〜１１週齢のＢ２ｍｔｍ２（ＨＬＡ−Ａ２４／Ｈ−２Ｄｂ／Ｂ２Ｍ）Ｔａｉマウス右側腹部の皮下にＢ１６Ｆ１０.Ａ２４／ＳＡＲＴ２９３−１０１細胞株及びＥＬ４.Ａ２４／ＳＡＲＴ２９３−１０１細胞株を１×１０５細胞／０．１ｍＬずつ移植した。
移植後7日目より、デジマチックキャリパを用いて、腫瘍の長径及び短径を測定し、以下の式より腫瘍体積（ＴＶ）を算出した。
ＴＶ（ｍｍ３）＝長径（ｍｍ）×短径（ｍｍ）×短径（ｍｍ）／２
【０１６３】
結果を図５に示す。
図５ａに示すように、ＥＬ４.Ａ２４／ＳＡＲＴ２９３−１０１細胞株を移植した場合、一旦生着（増殖）が確認できたマウスもいたが、１３日目までにすべてのマウス（５匹）において自然退縮していることが確認された。一方、図５ｂに示すように、Ｂ１６Ｆ１０.Ａ２４／ＳＡＲＴ２９３−１０１細胞株を移植した場合、移植したすべてのマウス（１０匹）において移植後２０日を経過しても自然退縮せず、腫瘍として生着していることが確認された。すなわち、Ｂ１６Ｆ１０.Ａ２４／ＳＡＲＴ２９３−１０１細胞株のみがｉｎ  ｖｉｖｏ試験に使用可能であることが確認できた。
【０１６４】
［実施例４  Ｂ１６Ｆ１０.Ａ２４／ＳＡＲＴ２９３−１０１細胞株皮下移植モデルにおけるＴＰＶ０６と抗マウスＰＤ−１抗体との併用効果］
８週齢のＢ２ｍｔｍ２（ＨＬＡ−Ａ２４／Ｈ−２Ｄｂ／Ｂ２Ｍ）Ｔａｉマウスを、ランダムに各群１５匹ずつ割り付けた。群分けを実施した日をＤａｙ０とした。
エピトープ４連結ペプチドＴＰＶ０６を蒸留水（大塚製薬工場）に溶解して６ｍｇ／ｍＬのペプチド溶液を調製し、Ｂ  Ｂｒａｕｎ Ｉｎｊｅｋｔシリンジ（ビー・ブラウンエースクラップ）に充填した。別のシリンジに等量のＭｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ５１  ＶＧ（ＳＥＰＰＩＣ）を充填後、両シリンジをコネクタにて接続し、ペプチド溶液とＭｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ５１  ＶＧをよく混合することで、エマルジョンを調製した。また、媒体対照として、蒸留水と等量のＭｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ５１  ＶＧを混合したエマルジョンを調製した。これらをＢ２ｍｔｍ２（ＨＬＡ−Ａ２４／Ｈ−２Ｄｂ／Ｂ２Ｍ）Ｔａｉマウスの尾根部周辺の皮下に１００μＬずつ週１回、計３回投与した（Ｄａｙ０，７，１４）。
【０１６５】
抗マウスＰＤ−１抗体（ａｎｔｉ−ｍＰＤ−１  Ａｂ）はＧｏＩｎＶｉｖｏ  Ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＣＤ２７９（ＰＤ−１）（Ｃｌｏｎｅ：ＲＭＰ−１−１４、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を投与直前に１ｍｇ／ｍＬとなるようにＤ−ＰＢＳ（富士フイルム和光純薬）を用いて調製した。エマルジョンの最終投与より１週間後（Ｄａｙ２１）に、抗マウスＰＤ−１抗体を１００μｇ／ｂｏｄｙで、腹腔内投与した。
【０１６６】
Ｂ１６Ｆ１０.Ａ２４／ＳＡＲＴ２９３−１０１細胞株は１０％ ＦＢＳを含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）培地を用いて、培養した。Ｂ１６Ｆ１０.Ａ２４／ＳＡＲＴ２９３−１０１は、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータ中において、週２回、１：２５〜１：４０比率で継代した。
抗マウスＰＤ−１抗体の投与後の同日に（Ｄａｙ２１）、Ｄ−ＰＢＳ（富士フイルム和光純薬）を用いて調製した細胞懸濁液を、マウス右側腹部の皮下に５×１０５細胞／０．１ｍＬずつ移植した。
【０１６７】
Ｂ１６Ｆ１０.Ａ２４／ＳＡＲＴ２９３−１０１細胞株移植後７日目より、デジマチックキャリパを用いて、腫瘍の長径及び短径を測定し、以下の式より腫瘍体積（ＴＶ）を算出した。
ＴＶ（ｍｍ３）＝長径（ｍｍ）×短径（ｍｍ）×短径（ｍｍ）／２
【０１６８】
細胞移植後の腫瘍体積変化を図６に示すように、コントロール群と比較すると、ＴＰＶ０６及び抗マウスＰＤ−１抗体はいずれも、単独で腫瘍増殖抑制効果を有していたが、これらを併用すると、腫瘍増殖がより顕著に抑制された。
【０１６９】
細胞移植後１８日目の結果を下記表５に示す。表中のＴＶの値は各群の平均値を示す。  尚、相対腫瘍体積変化率（Ｔ／Ｃ）はＴＶから以下の式により算出した。
Ｔ／Ｃ（％）＝(各薬剤投与群の平均ＴＶ)／（コントロール群の平均ＴＶ)×１００
【０１７０】
また、動物用電子天秤を用いて体重を測定し、群分けを実施したＤａｙ０に測定した体重（ＢＷ０）及び細胞移植後１８日目の体重（ＢＷ）から体重変化率（ＢＷＣ）を以下の式により算出した。
体重変化率ＢＷＣ（％）＝（ＢＷ−ＢＷ０）／ＢＷ０×１００
【０１７１】
また、細胞移植後５７日目の腫瘍の無い（Ｔｕｍｏｒ  Ｆｒｅｅの）マウスの割合を以下の式により算出した。
Ｔｕｍｏｒ  Ｆｒｅｅ（％）＝（各群のＴｕｍｏｒ  Ｆｒｅｅのマウスの数）／（各群の試験に用いたマウスの数）×１００
【０１７２】
【表５】
2020150950.tif 000006
【０１７３】
細胞移植後１８日目において、ＴＰＶ０６群又は抗マウスＰＤ−１抗体の単独投与群及びＴＰＶ０６＋抗マウスＰＤ−１抗体の併用投与群は、コントロール群に比して、ＴＶが低値であり、抗腫瘍効果が示された。さらにＴＰＶ０６＋抗マウスＰＤ−１抗体の併用投与群は、ＴＰＶ０６群又は抗マウスＰＤ−１抗体群の単独薬剤群に比して、ＴＶ値が低値であり、より強い抗腫瘍効果が示された。さらに、細胞移植後５７日目において、ＴＰＶ０６＋抗マウスＰＤ−１抗体の併用投与群は、５３．３％のマウスがＴｕｍｏｒ  Ｆｒｅｅであった。さらに、ＴＰＶ０６＋抗マウスＰＤ−１抗体の併用投与群は、単独薬剤投与群に比して、細胞移植後５７日目において、生存率が向上していることが確認できた。
また、併用投与群の平均体重変化率は、ＴＰＶ０６又は抗マウスＰＤ−１抗体の単独薬剤群と比較して、毒性の増強を伴わないことを示すものであった。
【０１７４】
［実施例５  Ｂ１６Ｆ１０.Ａ２４／ＳＡＲＴ２９３−１０１細胞株皮下移植モデルにおけるＴＰＶ０６と抗マウスＰＤ−Ｌ１抗体との併用効果］
９週齢のＢ２ｍｔｍ２（ＨＬＡ−Ａ２４／Ｈ−２Ｄｂ／Ｂ２Ｍ）Ｔａｉマウスを、ランダムに各群１５匹ずつ割り付けた。群分けを実施した日をＤａｙ０とした。
【０１７５】
抗マウスＰＤ−１抗体の代わりに、抗マウスＰＤ−Ｌ１抗体を用いた以外は、実施例４と同様に行った。抗マウスＰＤ−Ｌ１抗体（ａｎｔｉ−ｍＰＤ−Ｌ１  Ａｂ）はＧｏＩｎＶｉｖｏ  Ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＣＤ２７４（Ｂ７−Ｈ１、ＰＤ−Ｌ１）（Ｃｌｏｎｅ：１０Ｆ．９Ｇ２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を投与直前に１ｍｇ／ｍＬとなるようにＤ−ＰＢＳ（富士フイルム和光純薬）を用いて調製した。エマルジョンの最終投与より１週間後（Ｄａｙ２１）に、抗マウスＰＤ−Ｌ１抗体を２００μｇ／ｂｏｄｙで、腹腔内投与した。
【０１７６】
細胞移植後の腫瘍体積変化を図７に示すように、コントロール群と比較すると、ＴＰＶ０６は単独で腫瘍増殖抑制効果を有していたが、抗マウスＰＤ−Ｌ１抗体では効果が認められなかった。しかしながら、ＴＰＶ０６と抗マウスＰＤ−Ｌ１抗体とを併用すると、腫瘍増殖がより顕著に抑制された。
細胞移植後１８日目の腫瘍体積、相対腫瘍体積変化率及び体重変化率（ＢＷＣ）、細胞移植後５７日目のＴｕｍｏｒ  Ｆｒｅｅのマウスの割合を下記表６に示す。
【０１７７】
【表６】
2020150950.tif 000007
【０１７８】
細胞移植後１８日目において、ＴＰＶ０６群の単独投与群及びＴＰＶ０６＋抗マウスＰＤ−Ｌ１抗体の併用投与群はコントロール群に比して、ＴＶが低値であり、抗腫瘍効果が示された。さらにＴＰＶ０６＋抗マウスＰＤ−Ｌ１抗体の併用投与群は、ＴＰＶ０６群及び抗マウスＰＤ−Ｌ１抗体群の単独薬剤群に比して、ＴＶ値が低値であり、より強い抗腫瘍効果が示された。さらに、細胞移植後５７日目において、ＴＰＶ０６＋抗マウスＰＤ−Ｌ１抗体の併用投与群は、６６．７％のマウスがＴｕｍｏｒ  Ｆｒｅｅであった。さらに、ＴＰＶ０６＋抗マウスＰＤ−Ｌ１抗体の併用投与群は、単独薬剤投与群に比して、細胞移植後５７日目において、生存率が向上していることが確認できた。
また、併用投与群の平均体重変化率は、ＴＰＶ０６又は抗マウスＰＤ−Ｌ１抗体の単独薬剤群と比較して、毒性の増強を伴わないことを示すものであった。
【０１７９】
［実施例６  Ｂ１６Ｆ１０.Ａ２４／ＳＡＲＴ２９３−１０１細胞株皮下移植モデルにおけるＴＰＶ０７又はＴＰＶ０８と抗マウスＰＤ−１抗体との併用効果］
９週齢のＢ２ｍｔｍ２（ＨＬＡ−Ａ２４／Ｈ−２Ｄｂ／Ｂ２Ｍ）Ｔａｉマウスを、ランダムに各群１５匹ずつ割り付けた。群分けを実施した日をＤａｙ０とした。
【０１８０】
エピトープ４連結ペプチドとして、ＴＰＶ０６の代わりにＴＰＶ０７又はＴＰＶ０８を用いた以外は、実施例４と同様に行った。なお、ＴＰＶ０７及びＴＰＶ０８は、ＴＰＶ０６同様、蒸留水（大塚製薬工場）を用いて、６ｍｇ／ｍＬに調製後、等量のＭｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ５１  ＶＧ（ＳＥＰＰＩＣ）と混合して調製したエマルジョンを投与し、本実施例では抗マウスＰＤ−１抗体単独投与群は含めなかった。
【０１８１】
細胞移植後の腫瘍体積変化を図８、図９に、細胞移植後１８日目の腫瘍体積、相対腫瘍体積変化率及び体重変化率（ＢＷＣ）、細胞移植後５６日目のＴｕｍｏｒ  Ｆｒｅｅのマウスの割合を表７に示す。
【０１８２】
【表７】
2020150950.tif 000008
【０１８３】
図８及び図９に示すように、コントロール群と比較すると、ＴＰＶ０７及びＴＰＶ０８はいずれも、単独で高い腫瘍増殖抑制効果を有していたが、これらを抗マウスＰＤ−１抗体と併用すると、腫瘍増殖がより顕著に抑制された。
また、表７に示すように、細胞移植後１８日目において、ＴＰＶ０７投与群又はＴＰＶ０８投与群の単独投与及びＴＰＶ０７＋抗マウスＰＤ−１抗体又はＴＰＶ０８＋抗マウスＰＤ−１抗体の併用投与群はコントロール群に比して、ＴＶが低値であり、抗腫瘍効果が示された。さらにＴＰＶ０７＋抗マウスＰＤ−１抗体の併用投与群は、ＴＰＶ０７の単独薬剤群に比して、ＴＶ値が低値であり、より強い抗腫瘍効果が示された。同様に、ＴＰＶ０８＋抗マウスＰＤ−１抗体の併用投与群は、ＴＰＶ０８の単独薬剤群に比して、ＴＶ値が低値であり、より強い抗腫瘍効果が示された。さらに、細胞移植後５６日目において、ＴＰＶ０７＋抗マウスＰＤ−１抗体の併用投与群は、８０．０％のマウスがＴｕｍｏｒ  Ｆｒｅｅであり、ＴＰＶ０８＋抗マウスＰＤ−１抗体の併用投与群は、４０．０％のマウスがＴｕｍｏｒ  Ｆｒｅｅであった。さらに、ＴＰＶ０７＋抗マウスＰＤ−１抗体及びＴＰＶ０８＋抗マウスＰＤ−１抗体の併用投与群は、単独薬剤投与群に比して、細胞移植後５６日目において、生存率が向上していることが確認できた。
また、併用投与群の平均体重変化率は、ＴＰＶ０７及びＴＰＶ０８の単独薬剤群と比較して、毒性の増強を伴わないことを示すものであった。
【０１８４】
［実施例７  Ｂ１６Ｆ１０.Ａ２４／ＳＡＲＴ２９３−１０１細胞株皮下移植モデルにおける３種混合エピトープ４連結ペプチド（ＴＰＶ０６、ＴＰＶ０１１及びＴＰＶ０１２）と抗マウスＰＤ−１抗体との併用効果］
９週齢のＢ２ｍｔｍ２（ＨＬＡ−Ａ２４／Ｈ−２Ｄｂ／Ｂ２Ｍ）Ｔａｉマウスを、ランダムに各群１５匹ずつ割り付けた。群分けを実施した日をＤａｙ０とした。
【０１８５】
ＴＰＶ０６の代わりに、ＴＰＶ０６と他の２種のエピトープ４連結ペプチド（ＴＰＶ０１１及びＴＰＶ０１２）の計３種を混合したエピトープ４連結ペプチドを用いた以外は、実施例４と同様の試験を実施した。
すなわち、コントロール群、３種混合エピトープ４連結ペプチド（ＴＰＶ０６、ＴＰＶ０１１及びＴＰＶ０１２）群、抗マウスＰＤ−１抗体群及び３種混合エピトープ４連結ペプチド（ＴＰＶ０６、ＴＰＶ０１１及びＴＰＶ０１２）＋抗マウスＰＤ−１抗体の併用投与群の試験を実施した。
なお、３種混合エピトープ４連結ペプチド（ＴＰＶ０６、ＴＰＶ０１１及びＴＰＶ０１２）は、ＴＰＶ０６、ＴＰＶ０１１及びＴＰＶ０１２がそれぞれ６ｍｇ／ｍＬ（すなわちペプチド総量として１８ｍｇ／ｍＬ）となるように、蒸留水（大塚製薬工場）を用いて調製し、等量のＭｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ５１  ＶＧ（ＳＥＰＰＩＣ）と混合して調製したエマルジョンを投与した。
【０１８６】
その結果、３種混合エピトープ４連結ペプチド（ＴＰＶ０６、ＴＰＶ０１１及びＴＰＶ０１２）＋抗マウスＰＤ−１抗体の併用投与群は、３種混合エピトープ４連結ペプチド（ＴＰＶ０６、ＴＰＶ０１１及びＴＰＶ０１２）群又は抗マウスＰＤ−１抗体の単独投与群に比して、細胞移植後５６日目において、生存率が向上していることが確認できた。
また、併用投与群の平均体重変化率は、単独薬剤群と比較して、毒性の増強を伴わないことを示すものであった。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。
【図１】
2020150950.tif 000009
【図２】
2020150950.tif 000010
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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