(57)【要約】      （修正有）【課題】癌治療の潜在的標的をスクリーニングする方法の提供。【解決手段】候補遺伝子をノックダウン又はノックアウトした改変Ｔ細胞を作製し、非改変Ｔ細胞と改変Ｔ細胞を放射線照射した腫瘍に由来する腫瘍微小環境に接触させた後に、改変Ｔ細胞の増殖、細胞周期の活性化、細胞死の阻害、サイトカイン産生、及び細胞傷害性活性からなる群から選択される活性を非改変Ｔ細胞と比較すること（インビトロ）、あるいは放射線照射を受けた腫瘍を有する非ヒト試験対象に注射した後の非改変Ｔ細胞と改変Ｔ細胞の増殖活性又は抗腫瘍活性を比較すること（インビボ）により癌治療の標的遺伝子を同定する。【選択図】図１
2020054361.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌治療の標的遺伝子を同定するインビトロ方法であって、非改変T細胞の活性及び改変T
細胞の活性を測定することであって；該非改変T細胞及び該改変T細胞が、それぞれ放射線
照射を受けた腫瘍を有する対象に由来する腫瘍微小環境と接触しており；該改変T細胞が
候補遺伝子をノックダウン又はノックアウトされている、前記測定することを含み、ここ
で該改変T細胞を該非改変T細胞と比較した際に、該活性が増加している場合に、該候補遺
伝子を癌治療の標的遺伝子として同定し、かつ該活性が、増殖、細胞周期の活性化、細胞
死の阻害、サイトカイン産生、及び細胞傷害性活性からなる群から選択される、前記方法
。
【請求項２】
それぞれ放射線照射を受けていない腫瘍を有する対象に由来する腫瘍微小環境と接触し
た、前記非改変T細胞の活性及び前記改変T細胞の活性を測定することをさらに含み；ここ
で該非改変T細胞及び該改変T細胞における活性が実質的に同じである、請求項1記載の方
法。
【請求項３】
癌治療の標的遺伝子を同定するインビボ方法であって、
(i) 非改変T細胞及び改変T細胞を放射線照射を受けた腫瘍を有する非ヒト試験対象に注
射することであって；該改変T細胞が、候補遺伝子をノックダウン又はノックアウトされ
ている、前記注射すること、並びに
(ii) 該非ヒト試験対象における該非改変T細胞の活性及び該改変T細胞の活性を測定す
ることであって、該活性が、増殖活性又は抗腫瘍活性である、前記測定すること、を含み
、
ここで、該改変T細胞を該非改変T細胞と比較した際に、該活性が増加している場合に、
該候補遺伝子を癌治療の標的遺伝子として同定する、前記方法。
【請求項４】
前記改変T細胞が参照T細胞である、請求項3記載の方法。
【請求項５】
前記非改変T細胞及び前記改変T細胞を、放射線照射を受けていない試験対象に注射する
ことをさらに含み、ここで該放射線照射を受けていない試験対象において該改変T細胞を
該非改変T細胞と比較した際に、前記活性が実質的に同じである、請求項3又は4記載の方
法。
【請求項６】
前記対象が、1 Gy〜20 Gyの線量で、腫瘍を標的とした放射線を受けている、請求項1〜
5のいずれか1項記載の方法。
【請求項７】
前記活性が：
(i) 注射されたT細胞の蓄積により測定される増殖活性；
(ii) 腫瘍細胞の死又は腫瘍サイズの低下により測定される抗腫瘍活性；又は
(iii) 試験対象の生存の増加により測定される抗腫瘍活性である、請求項3〜6のいずれ
か1項記載の方法。
【請求項８】
前記試験対象がマウスであり、好ましくは該マウスが二腫瘍マウスであり、一方の腫瘍
のみが標的化された放射線を受けている、請求項3〜7のいずれか1項記載の方法。
【請求項９】
前記活性が、放射線照射を受けていない腫瘍のサイズの低下により測定される抗腫瘍活
性である、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
癌治療の標的遺伝子を同定するインビトロプールスクリーニング方法であって、
(i) 異なる遺伝学的改変を有するT細胞の初期集団を調製することであって、それぞれ
のT細胞が多くとも1つの候補遺伝子をノックダウン又はノックアウトされている、前記調
製すること；及び
(ii) 該T細胞の初期集団をある期間にわたり放射線照射を受けた腫瘍を有する対象に由
来する腫瘍微小環境と接触させて、T細胞の選択された集団を産生すること、を含み、
ここで、該T細胞の選択された集団においてノックダウン又はノックアウトされている
該候補遺伝子を、癌治療の該標的遺伝子であると同定する、前記インビトロプールスクリ
ーニング方法。
【請求項１１】
癌治療の標的遺伝子を同定するインビボプールスクリーニング方法であって、
(i) 異なる遺伝学的改変を有するT細胞の初期集団を調製することであって、それぞれ
のT細胞が多くとも1つの候補遺伝子をノックダウン又はノックアウトされている、前記調
製すること；及び
(ii) 該T細胞の初期集団を放射線照射を受けた腫瘍を有する非ヒト試験対象に注射する
ことであって、該T細胞の初期集団がT細胞の選択された集団を産生する、前記注射するこ
と、を含み、
ここで、該T細胞の選択された集団においてノックダウン又はノックアウトされている
該候補遺伝子を、癌治療の該標的遺伝子であると同定する、前記インビボプールスクリー
ニング方法。
【請求項１２】
前記候補遺伝子が：
(i) 転写活性化様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）を用いること；
(ii) CAS9（CRISPR）を用いること；又は
(iii) shRNAライブラリにT細胞を感染させること（任意に、該shRNAライブラリはレン
チウイルスベクターライブラリである）、により、前記改変T細胞又は前記T細胞の初期集
団においてノックダウン又はノックアウトされている、請求項1〜11のいずれか1項記載の
方法。
【請求項１３】
前記T細胞又は前記初期集団のT細胞が：
(i) ナイーブT細胞；
(ii) CD8+ T細胞；又は
(iii) マウスから単離されたもの（任意に該マウスは野生型であり、又はマウスにおい
て天然には存在しない抗原に対して特異的なT細胞受容体を発現するように遺伝子操作さ
れており、任意に該抗原はオボアルブミンである）、である、請求項1〜11のいずれか1項
記載の方法。
【請求項１４】
前記T細胞又は前記T細胞の初期集団が標識されており、任意に該標識がカルボキシフル
オレセインスクシンイミジルエステル（CFSE）である、請求項1〜11のいずれか1項記載の
方法。
【請求項１５】
前記T細胞の選択された集団を前記試験対象の試料から単離することをさらに含み、任
意に
(i) 前記試料が腫瘍試料であり（任意に該腫瘍試料が標的化された放射線を受けたもの
であり、若しくは該試験対象が二腫瘍モデルであり、かつ該腫瘍試料が標的化された放射
線を受けたものでない）；又は
(ii) 該試料が非腫瘍試料である（任意に非腫瘍組織試料が脾臓試料若しくはリンパ節
試料である）、請求項10〜13のいずれか1項記載の方法。
【請求項１６】
前記T細胞の選択された集団においてノックダウン又はノックアウトされている前記候
補遺伝子を、該T細胞の選択された集団から単離されたゲノムDNAのNGSにより同定する、
請求項10〜13のいずれか1項記載の方法。
【請求項１７】
前記初期集団のそれぞれのT細胞が多くとも1つの候補遺伝子に対するshRNAを有し、か
つ前記T細胞の初期集団と比較して、前記T細胞の選択された集団において該候補遺伝子に
対する該shRNAが富化されている場合に、該候補遺伝子を癌治療の標的遺伝子であると同
定し、任意に：
(i) 非腫瘍組織試料と比較して、腫瘍試料から取得した該T細胞の選択された集団にお
いて、該候補遺伝子に対する該shRNAが富化されている場合に、該候補遺伝子を癌治療の
標的遺伝子であると同定し；
(ii) 該非腫瘍組織試料と比較して、該腫瘍試料において該候補遺伝子に対する該shRNA
が2倍超富化されている場合に、該候補遺伝子を標的遺伝子として同定し；又は
(iii) 該非腫瘍組織試料と比較して、該腫瘍試料において該候補遺伝子に対する該shRN
Aが3倍超、4倍超、5倍超、10倍超、15倍超、若しくは20倍超富化されている場合に、該候
補遺伝子を標的遺伝子として同定する、請求項12の(iii)記載の方法。
【請求項１８】
前記T細胞の選択された集団におけるshRNAをNGSにより定量化することを含む、請求項1
7記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（1. 分野）
本明細書では、癌治療の潜在的標的を同定するための方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
（2. 背景）
腫瘍微小環境は、腫瘍に浸潤し、免疫反応を抑制する機能を果たす骨髄系由来サプレッ
サー細胞（「MDSC」）及び制御性T細胞（「T-reg」）が存在するために、本質的に抑制的
である。さらに、T細胞及び抗原提示細胞（APC）上にある種の抑制性分子が発現すること
により、効果的な免疫反応が制限される場合がある。放射線は、腫瘍細胞のアポトーシス
、老化、オートファジーの誘導を通じ、抗腫瘍効果を仲介する。放射線は、癌治療の標的
としての役割を果たし得る因子を通じ、腫瘍微小環境を調節し得る。従って、これらの因
子をスクリーニングし、これらの因子を標的とすることにより癌を治療する方法は、未検
討ではあるが必要なことである。本件開示に関して提供される方法は、これらの必要を満
たし、かつ他の関連する利点を提供する。
【発明の概要】
【０００３】
（3. 概要）
本明細書では、放射線処置と組合わせたT細胞抑制アッセイを用い、癌治療の標的を同
定するインビトロハイスループットスクリーニング方法を提供する。
【０００４】
また、本明細書では、放射線処置と組合わせたT細胞抑制アッセイを用い、癌治療の標
的を同定するインビトロスクリーニング方法であって、細胞培養において発現させた標的
プールを用いてアッセイを実施する、前記方法を提供する。
【０００５】
また、本明細書では、腫瘍を移植した対象における放射線処置と組合わせたT細胞抑制
アッセイを用い、癌治療の標的を同定するインビボスクリーニング方法を提供する。
【０００６】
ある実施態様において、本明細書で提供するインビトロ及びインビボスクリーニング方
法は、組合わせで使用することができ、例えば、本明細書で提供するインビトロ方法に続
き、該インビトロ方法から同定された候補遺伝子を用いて、本明細書で提供するインビボ
方法を順次実施することができる。
【０００７】
（3.1. 定義）
本明細書で使用される冠詞「1つの（a）」、「1つの（an）」、及び「該（the）」は、
別途明記されない限り、1又は複数のその冠詞の文法上の目的を指す。例として、T細胞と
は、1つのT細胞又は複数のT細胞を指す。
【０００８】
本明細書で使用される用語「癌」又は「癌の」は、別途明記されない限り、通常対象に
おける調節の効かなくなった細胞成長を特徴とする生理的状態を指す。癌の例には、これ
らに限定はされないが、血液癌及び固形腫瘍がある。
【０００９】
本明細書で使用される用語「治療する」、「治療すること」、及び「治療」は、別途明
記されない限り、癌患者に関して使用されるときは、癌の重症度を低下させるか、又は癌
の進行を遅延若しくは減速させる行為を指し、(a) 癌の成長を阻害する又は癌の発達を停
止させること、及び(b) 癌を退行させる又は癌の存在に関連する1以上の症状を遅滞させ
若しくは最小限にとどめることを含む。癌治療には、1つの治療又は2以上の異なる種類の
治療の組合わせを含めることができ、それには外科手術、化学療法、放射線療法、標的化
療法、及び免疫療法などがある。
【００１０】
放射線療法は、癌細胞を損傷させ、又は殺傷するために強力なエネルギーのビームを使
用する、癌治療の一種である。放射線療法では、X線、陽子、又は他の種類のエネルギー
を使用することができる。多くの場合、放射線療法とは、外部照射療法のことをいう。こ
の種の放射の間、患者の体外の装置によって高エネルギーのビームが生成され、該装置に
より該ビームは腫瘍を目指して正確な位置に狙い撃たれる。他の種類の放射線療法、例え
ば密封小線源療法においては、放射線の供給源は患者の体内にも設置することができる。
【００１１】
本明細書で使用される用語「対象」又は「患者」は、別途明記されない限り、治療、観
察、及び/又は実験の目的となる動物を指す。「動物」には、脊椎動物及び無脊椎動物、
例えば魚類、甲殻類、爬虫類、鳥類、及び特に、哺乳動物がある。「哺乳動物」には、こ
れらに限定はされないが、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、イヌ、ネコ、ヒツジ、
ヤギ、ウシ、ウマ、並びに霊長類、例えばサル、チンパンジー、類人猿、及びヒトがある
。対象とは、インビボの試験又は実験に使用するための動物のことを指してもよい。また
、試験又は実験の対象とは、「試験対象」を指すことができる。
【００１２】
本明細書で使用される用語「腫瘍を有する対象」は、別途明記されない限り、その体内
に腫瘍又は腫瘍細胞を有する対象を指す。これらの腫瘍細胞は対象にとって外的なものと
し、実験目的で対象に接種することができる。腫瘍を有する対象は、複数の腫瘍を有する
ことができる。本明細書で使用される用語「二腫瘍モデル」は、別途明記されない限り、
腫瘍を有する動物が少なくとも2つの腫瘍を有する動物モデルを指し、ここで2つの腫瘍は
離れた位置にある。2つの腫瘍は互いに体の反対側にあってもよい。離れた位置にある2つ
の腫瘍は同程度のサイズ、又は同じサイズであってもよい。該二腫瘍モデルは例えば、放
射線に関する研究で使用することができる。
【００１３】
本明細書で使用される用語「放射線照射を受けた対象」は、別途明記されない限り、放
射線を受けた対象を指す。放射線は、腫瘍を標的とした放射線とすることができる。二腫
瘍モデルにおいて、放射線照射を受けた対象とは、2つの離れた腫瘍の一方にのみ放射線
を受けた対象のことを指してもよい。本明細書で使用される用語「放射線照射を受けてい
ない対象」は、別途明記されない限り、放射線を受けていない対象を指す。「放射線照射
を受けていない対象」及び「放射線照射を受けた対象」は、放射線照射の前後の同じ対象
のことを指してもよい。また、「放射線照射を受けていない対象」及び「放射線照射を受
けた対象」は、放射線の効果を調べるための並行試験で使用された2体の試験対象のこと
を指してもよい。並行試験におけるそのような試験対象は、同じ遺伝学的背景を有し、か
つ/又は放射線以外については同じ処置を受けた対象とすることができる。
【００１４】
本明細書で使用される用語「遺伝子」は、別途明記されない限り、適切な調節又は制御
配列の制御下におかれた際にインビトロ又はインビボで転写され（DNAの場合）、ポリペ
プチドへと翻訳される（mRNAの場合）核酸分子を指す。遺伝子の境界は、5'（アミノ）末
端の開始コドン及び3'（カルボキシ）末端の翻訳終止コドンによって決定される。遺伝子
には、これらに限定はされないが、原核生物又は真核生物のmRNAに由来するcDNA、原核生
物又は真核生物のDNAに由来するゲノムDNA配列、及び実に合成DNA配列さえも含み得る。
転写終結配列は通常、遺伝子配列に対し3'側の位置にある。
【００１５】
本明細書で使用される用語「候補遺伝子」は、別途明記されない限り、本明細書で提供
するスクリーニング方法に付される遺伝子を指す。候補遺伝子は、放射線処置との組合わ
せにおけるT細胞の免疫反応の調節へのその遺伝子の関与を評価するためにノックアウト
又はノックダウンすることができる。スクリーニングの結果に応じ、「候補遺伝子」又は
「候補遺伝子」にコードされるタンパク質を癌治療の適当な潜在的標的として同定する。
【００１６】
本明細書で使用される用語「標的遺伝子」は、別途明記されない限り、癌治療の標的と
しての役割を果たし得る遺伝子を指す。「標的遺伝子」は、本明細書で開示する方法によ
り、候補遺伝子から同定できる。
【００１７】
本明細書で使用される用語「ノックアウト」は、別途明記されない限り、遺伝子に関し
て使用される場合、示された遺伝子の発現が、完全に又はほぼ完全に消滅することを意味
する。細胞又は組織でノックアウトされた示された遺伝子の発現は、その細胞又は組織に
おける通常の発現レベルと比較して、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％
、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％低下し得る。幾つかの
実施態様において、細胞中でノックアウトされた遺伝子の発現レベルは、当技術分野で公
知の遺伝子発現検出についての通常の手段を用いては検出不可能である。
【００１８】
本明細書で使用される用語「ノックダウン」は、別途明記されない限り、遺伝子に関し
て使用される場合、示された遺伝子の発現が顕著に減少することを意味する。細胞又は組
織でノックダウンされた示された遺伝子の発現は、その細胞又は組織における通常の発現
レベルと比較して、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％
、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、又は少なくとも90％低下する。幾
つかの実施態様において、細胞又は組織でノックダウンされた遺伝子の発現レベルは、細
胞又は組織における遺伝子の通常の発現レベルと比較して、少なくとも50％低下する。
【００１９】
本明細書で使用される用語「単離する」は、別途明記されない限り、示された目的物が
通常存在する天然の設定中に存在する少なくとも1つの構成要素から該目的物を分離する
過程を指す。用語「単離する」は、細胞又は細胞集団に関して使用される場合、対象の体
から該細胞又は細胞集団を含む試料を取得する過程、及び/あるいは他の細胞から、又は
該細胞若しくは細胞集団を含む試料中の他の内容物から、細胞又は細胞集団を分離する過
程を指し得る。
【００２０】
本明細書で使用される用語「接触する」は、別途明記されない限り、細胞に関して使用
される場合、細胞が示された物質と相互作用し得、かつ/又はそのような物質の存在によ
って影響を受け得るように、該細胞を該物質のごく近傍に置く過程を指す。接触は一時的
又は一過性とすることができる。また、接触はある期間、又は永続的に持続させることが
できる。例えば、T細胞をサプレッサー細胞と接触させることは、T細胞及びサプレッサー
細胞が、インビトロ容器中で一緒に培養され、ここで該細胞はそれらの表面上の受容体分
子が互いに相互作用することができるほど十分にごく近傍にある過程を指し得る。接触は
、インビトロ培養を継続する限り持続し得る。また、T細胞をサプレッサー細胞と接触さ
せることは、該T細胞を、注射されるT細胞と相互作用するであろうサプレッサー細胞を有
する対象に、注射する過程を指し得る。そのような接触は、一過性とすることができる。
【００２１】
本明細書で使用される用語「ベクター」は、別途明記されない限り、DNA又はRNA配列（
例えば、外来遺伝子）を、それによって宿主細胞に導入することができ、その結果導入さ
れた配列の発現（例えば、転写及び/又は翻訳）が促進され、又は組換え若しくは他のメ
カニズムにより標的遺伝子がノックダウン若しくはノックアウトされる媒体を指す。ベク
ターには、プラスミド、ファージ、ウイルス、及びシュードウイルスなどがある。
【００２２】
本明細書で使用される用語「トランスフェクション」には、別途明記されない限り、外
因的核酸分子を宿主細胞に導入するための任意の手段、例えばこれらに限定はされないが
、吸着、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、及びリポフェクションな
どを含むことを意図している。
【００２３】
本明細書で使用される用語「T細胞」は、別途明記されない限り、胸腺で成熟を完了さ
せ、免疫系において体内の特定の異物抗原の識別、並びに他の免疫細胞の活性化及び活性
解除を含む、様々な役割を有する種類の白血球を指す。T細胞は機能に基づいて細胞傷害
性T細胞、ヘルパーT細胞（Th）、及び制御性T細胞（Treg）を含む、いくつかのサブタイ
プを有する。細胞表面上のマーカーの差別化された発現は、T細胞の多様な性質及び機能
の有益な手がかりを提供し、T細胞又は特定のサブタイプのT細胞の単離に有用なツールと
しての役割を果たし得る。例えば、T細胞はフローサイトメトリーによりCD3+細胞を選択
することによって単離することができる。表面マーカーに加え、異なるサブタイプのT細
胞は、大きく異なる機能及びサイトカイン分泌プロファイルも有し得る。例えば、CD8+細
胞傷害性T細胞は、感染した標的細胞をパーフォリン、グランザイム、及びグラニュリシ
ンの放出を通じて破壊し、対してCD4+ヘルパーT細胞は、細胞傷害性活性をほとんど有さ
ず、他の白血球、例えばB細胞、マクロファージ、好酸球、又は好中球に作用するサイト
カインを分泌する。トレグ(Treg)は、エフェクターT細胞のサブセットに結合してそのサ
イトカイン分泌を妨げることを含む、いくつかのメカニズムによってT細胞機能を抑制す
る。
【００２４】
別途明記されない限り、T細胞は任意の種類のT細胞とすることができ、かつ任意の発達
段階のものとすることができ、これには、これらに限定はされないが、CD4+/CD8+二重陽
性T細胞、CD4+ヘルパーT細胞（例えば、Th1及びTh2細胞）、CD8+ T細胞（例えば、細胞傷
害性T細胞）、末梢血単核球（PBMC）、末梢血白血球（PBL）、腫瘍浸潤性リンパ球（TIL
）、メモリーT細胞、ナイーブT細胞、制御性T細胞（regulator T cells）、及びガンマデ
ルタT細胞（γδT細胞）などが含まれる。ヘルパーT細胞の追加の種類には、Th3、Th17、
Th9、又はTfh細胞などの細胞がある。メモリーT細胞の追加の種類には、セントラルメモ
リーT細胞（TCM細胞）及びエフェクターメモリーT細胞（TEM細胞及びTEMRA細胞）などの
細胞がある。
【００２５】
本明細書で使用される用語「非改変T細胞」は、別途明記されない限り、試験又はスク
リーニング中の候補遺伝子に関して遺伝学的に改変されていないT細胞を指す。非改変T細
胞は、野生型T細胞とすることができる。また、非改変T細胞は、対照遺伝子が遺伝学的に
改変された参照T細胞とすることができる。例えば、参照T細胞は、対照遺伝子、例として
LacZに対するshRNAを担持するウイルスベクターに感染したT細胞とすることができる。非
改変T細胞は、動物対象由来の血液試料などの天然の供給源から直接単離し、又はT細胞株
をインビトロ培養することによって取得することができる。また、非改変T細胞は、分化
を誘導することによりインビトロで多能性細胞から分化させることもできる。
【００２６】
本明細書で使用される用語「改変T細胞」は、別途明記されない限り、遺伝子操作され
たT細胞を指す。改変T細胞は、野生型T細胞と比較して、遺伝子を過剰発現又は過小発現
することができる。改変T細胞は、候補遺伝子をノックダウン又はノックアウトされ得る
。改変T細胞集団は、異なる遺伝学的な改変を有するT細胞集団とすることができる。例え
ば、改変T細胞集団は、野生型T細胞と比較して、多くとも1つの遺伝子がノックダウン又
はノックアウトされた、それぞれ異なる遺伝学的特徴を有し得る。
【００２７】
本明細書で使用される用語「活性」は、別途明記されない限り、T細胞の細胞活動を指
す。該活性は、増殖活性とすることができ、該増殖活性は、細胞周期活性化の増進、細胞
死の抑制、（例えば、アポトーシスの抑制）、及び/又は細胞増殖を促進する任意の他の
活性とすることができる。また、該活性は、細胞傷害性活性又はサイトカイン産生活性な
どを含むエフェクターT細胞の免疫とすることができる。また、活性は一般に抗腫瘍活性
とすることができ、該抗腫瘍活性は、例えば、腫瘍サイズの低下又は腫瘍を有する対象の
生存率の増加によって測定することができる。
【００２８】
本明細書で使用される用語「サプレッサー細胞」は、別途明記されない限り、T細胞活
性を抑制する細胞集団を指す。例えば、サプレッサー細胞は、T細胞集団を抑制すること
ができる。また、サプレッサー細胞は、T細胞によって誘発される自然免疫反応を阻害し
又はこれに拮抗することができる。「サプレッサー細胞」には、これらに限定はされない
が、制御性T細胞（Treg）及び骨髄系由来サプレッサー細胞（MDSC）がある。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
（4. 図面の簡単な説明）
以下の図面は本明細書の一部を形成し、かつ本発明の特定の態様をさらに説明するため
に含まれる。本発明は、本明細書で提示する具体的な実施態様の詳細な説明と組合わせて
、これらの図面の1以上を参照することにより、よりよく理解することができる。
【００３０】
【図１】図1は、放射線による免疫調節因子のためのshRNAスクリーニングの例示的なワークフローを示している。示されているように、このワークフローは、陰性対照を有するshRNAライブラリを調製すること；0日目にB6マウスのそれぞれ脚及び脇腹に1.5×105個のB16-Ova細胞を皮内注射すること；6日目にOT-1 T細胞を単離すること；8日目にOT-1 T細胞をThy1.1をコードするshRNAライブラリに感染させること；10日目に12 Gyで脚の腫瘍（5 mm）に放射線照射すること；11日目にOT-1 T細胞（5×106個）を感染させるという養子移入を実施すること；18日目に脾臓、リンパ節、及び流出領域リンパ節由来の腫瘍からT細胞を採取すること；FACSでThy 1.1+ T細胞を選別すること；並びにPCR、NGS、及びデータデコンボリューションによりThy 1.1+ T細胞についてゲノムDNAをアッセイすること、を含む。また、腫瘍サイズは2日ごとに測定する。
【００３１】
【図２】図2は、組み込まれたshRNAのPCR増幅のための例示的なネステッドプライマーセットを示している。示されているように、第1のPCRプライマー（294 bp）は、
【化１】
2020054361.tif 000003
とすることができ、第2のPCRプライマー（124 bp）は、
【化２】
2020054361.tif 000004
とすることができる。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
（5. 詳細な説明）
本明細書では、癌治療の遺伝子標的を同定するためのインビトロ及びインビボスクリー
ニング方法を提供する。特定の理論に制限されることなく、いくつかの因子が腫瘍細胞の
免疫抑制的微小環境に寄与し、そのような因子は、これに限定はされないが、腫瘍を標的
とした放射線を含む放射線によって調節され得ると考えられている。従って、本明細書で
は、単独で、又は放射線療法との組合わせで癌治療において使用するための遺伝子標的と
しての役割を果たすそのような因子のインビトロ及びインビボスクリーニング方法を提供
する。幾つかの実施態様において、本明細書では、非改変T細胞の活性及び改変T細胞の活
性を測定することによる癌治療のための標的遺伝子を同定する方法を提供し；ここで非改
変T細胞及び改変T細胞を、それぞれ放射線照射を受けた腫瘍を有する対象由来のサプレッ
サー細胞と接触させ；かつ改変T細胞は候補遺伝子をノックダウン又はノックアウトされ
ている。続いて、改変T細胞を非改変T細胞と比較した際に、活性が増加している場合、候
補遺伝子を癌治療のための標的遺伝子として同定する。
【００３３】
幾つかの例において、放射線により、腫瘍細胞は免疫抑制的因子のさらなる活性化及び
/又は上方調節をもたらし得る「ストレス」状態に置かれ得る。従って、本明細書では、
放射線処置によって活性化され、かつ/又は上方調節される免疫抑制因子である標的遺伝
子のスクリーニング方法も提供する。放射線は腫瘍微小環境に明確に限定され得るため、
放射線が、T細胞と相互作用してT細胞の抑制を誘導する、対象となる標的の上方調節を引
き起こすことに起因する、腫瘍内のあらゆる混乱が、本明細書に記載のスクリーニングア
プローチを使用して明らかにされ得る。該方法は、免疫抑制の仲介における同定された標
的遺伝子の機能の検証を、さらに含むことができる。
【００３４】
幾つかの例において、放射線は、アブスコパル効果、すなわち原発性腫瘍への標的化さ
れた放射線が、それによって放射線の範囲外の離れた部位で抗腫瘍反応を誘導する生理的
プロセスをもたらすことができる。アブスコパル効果は少なくとも部分的に、腫瘍抗原の
T細胞への提示の増進、並びに局所及び全身性免疫反応を刺激するサイトカイン及び他の
炎症誘発性因子の放出を伴い得る。従って、本明細書ではまた、アブスコパル効果に関与
する遺伝子標的のスクリーニング方法を提供する。本明細書で開示する方法によって同定
される遺伝子標的は、腫瘍微小環境の免疫抑制的性質に寄与する因子となり得る。
【００３５】
癌細胞を破壊するために免疫系を活性化する免疫療法は一般に、幾つかの例において免
疫系に対する通常のチェックを遮断することに起因する全身毒性をもたらし得る。また、
本明細書では、単独で標的化された場合には全身性の免疫活性化をもたらさないが、放射
線療法と組合わせて使用した場合に顕著な抗腫瘍免疫を誘発することができる因子のスク
リーニング方法を提供する。従って、これらの遺伝子因子を標的化する薬剤は、アブスコ
パル効果を模倣し、又は増進し、放射線療法の治療効果を向上させ、かつ潜在的な免疫関
連副作用の低下を有し得る。
【００３６】
腫瘍を有する対象における抗腫瘍反応のための免疫調節剤は、少なくとも部分的に、T
細胞の活動を抑制し得る標的遺伝子を阻害することにより、免疫系を活性化することがで
きる。
【００３７】
（5.1 スクリーニング方法）
本明細書では、非改変T細胞の活性及び改変T細胞の活性を測定することによって癌治療
の標的遺伝子を同定する方法であって；非改変T細胞及び改変T細胞を、それぞれ腫瘍微小
環境と接触させ；かつ改変T細胞が候補遺伝子をノックダウン又はノックアウトされてお
り；改変T細胞を非改変T細胞と比較した場合に活性が増加するならば、候補遺伝子を癌治
療の標的遺伝子として同定する、前記方法を提供する。
【００３８】
本明細書では、非改変T細胞の活性及び改変T細胞の活性を測定することにより、癌治療
の標的遺伝子を同定する方法であって；非改変T細胞及び改変T細胞を、それぞれサプレッ
サー細胞と接触させ；改変T細胞が候補遺伝子をノックダウン又はノックアウトされてお
り；改変T細胞を非改変T細胞と比較した場合に活性が増加するならば、候補遺伝子を癌治
療の標的遺伝子として同定する、前記方法を提供する。
【００３９】
幾つかの実施態様において、本明細書で開示する方法において測定される活性は、増殖
活性とすることができる。幾つかの実施態様において、増殖活性は、細胞周期の活性化に
より測定され、ここで細胞周期活性化の増進は、細胞増殖活性の増加を示す。幾つかの実
施態様において、増殖活性は細胞死阻害によって測定され、ここで細胞死の低下は細胞増
殖活性の増加を示す。幾つかの実施態様において、増殖活性はアポトーシスの阻害によっ
て測定され、ここでアポトーシスの低下は、細胞増殖活性の増加を示す。
【００４０】
従って、本明細書では、非改変T細胞の増殖活性及び改変T細胞の増殖活性を測定するこ
とによって癌治療の標的遺伝子を同定する方法であって；非改変T細胞及び改変T細胞を、
それぞれサプレッサー細胞又は腫瘍微小環境と接触させ；改変T細胞が候補遺伝子をノッ
クダウン又はノックアウトされており；改変T細胞が非改変T細胞と比較して高い増殖活性
を有する場合に、候補遺伝子を癌治療の標的遺伝子として同定する、前記方法を提供する
。
【００４１】
幾つかの実施態様において、本明細書で開示する方法において測定される活性は、エフ
ェクターT細胞の免疫とすることができる。幾つかの実施態様において、本明細書で開示
する方法において測定される活性は、細胞傷害性活性である。幾つかの実施態様において
、本明細書で開示する方法において測定される活性は、サイトカイン産生活性である。幾
つかの実施態様において、本明細書で開示する方法において測定される活性は、抗腫瘍活
性である。
【００４２】
従って、本明細書では、非改変T細胞の免疫及び改変T細胞の免疫性を測定することによ
って癌治療の標的遺伝子を同定する方法であって；非改変T細胞及び改変T細胞を、それぞ
れサプレッサー細胞又は腫瘍微小環境と接触させ；改変T細胞が候補遺伝子をノックダウ
ン又はノックアウトされており；改変T細胞が非改変T細胞と比較して高い免疫性を有する
場合に、候補遺伝子を癌治療の標的遺伝子として同定する、前記方法を提供する。
【００４３】
本明細書では、非改変T細胞の細胞傷害性活性及び改変T細胞の細胞傷害性活性を測定す
ることにより癌治療の標的遺伝子を同定する方法であって；非改変T細胞及び改変T細胞を
、それぞれサプレッサー細胞又は腫瘍微小環境と接触させ；改変T細胞が候補遺伝子をノ
ックダウン又はノックアウトされており；改変T細胞が非改変T細胞と比較して高い細胞傷
害性活性を有する場合に、候補遺伝子を癌治療の標的遺伝子として同定する、前記方法を
提供する。
【００４４】
また、本明細書では、非改変T細胞のサイトカイン産生活性及び改変T細胞のサイトカイ
ン産生活性を測定することによって癌治療の標的遺伝子を同定する方法であって；非改変
T細胞及び改変T細胞を、それぞれサプレッサー細胞又は腫瘍微小環境と接触させ；改変T
細胞が候補遺伝子をノックダウン又はノックアウトされており；改変T細胞が非改変T細胞
と比較して高いサイトカイン産生活性を有する場合に、候補遺伝子を癌治療の標的遺伝子
として同定する、前記方法を提供する。
【００４５】
また、本明細書では、非改変T細胞の抗腫瘍活性及び改変T細胞の抗腫瘍活性を測定する
ことによって癌治療の標的遺伝子を同定する方法であって；非改変T細胞及び改変T細胞を
、それぞれサプレッサー細胞又は腫瘍微小環境と接触させ；改変T細胞が候補遺伝子をノ
ックダウン又はノックアウトされており；改変T細胞が非改変T細胞と比較して高い抗腫瘍
活性を有する場合に、候補遺伝子を癌治療の標的遺伝子として同定する、前記方法を提供
する。
【００４６】
幾つかの実施態様において、本明細書に記載の方法は、供給源からT細胞を取得するこ
とをさらに含む。本明細書で提供する方法は、非改変T細胞及び改変T細胞を調製すること
をさらに含み得る。幾つかの実施態様において、供給源は対象由来の試料である。幾つか
の実施態様において、供給源は、インビトロで培養された細胞株である。
【００４７】
幾つかの実施態様において、本明細書に記載の方法は、それぞれ放射線照射を受けた腫
瘍を有する対象及び放射線照射を受けていない腫瘍を有する対象の両方に由来する腫瘍微
小環境と接触させた非改変T細胞の活性及び改変T細胞の活性を測定することを含み；ここ
でT細胞を放射線照射を受けた腫瘍を有する対象の腫瘍微小環境と接触させた際に、T細胞
を放射線照射を受けていない腫瘍を有する対象の腫瘍微小環境と接触させた場合よりも、
改変T細胞を非改変T細胞と比較した際の活性の増加がより顕著である場合に、候補遺伝子
を標的遺伝子として同定する。幾つかの実施態様において、それぞれ放射線照射を受けて
いない腫瘍を有する対象の腫瘍微小環境と接触させた、非改変T細胞及び改変T細胞の活性
は、実質的に同じである。
【００４８】
幾つかの実施態様において、本明細書に記載の方法は、放射線照射を受けていない腫瘍
を有する対象由来のサプレッサー細胞の第1の集団と、放射線照射を受けた腫瘍を有する
対象由来のサプレッサー細胞の第2の集団を使用することを含む。該方法は、それぞれサ
プレッサー細胞の第1の集団と接触させた改変T細胞を非改変T細胞と比較した際の活性の
増加を測定すること、及び／または、それぞれサプレッサー細胞の第2の集団と接触させ
た改変T細胞を非改変T細胞と比較した際の活性の増加を測定することを含み得；ここでT
細胞をサプレッサー細胞の第2の集団と接触させた際に、T細胞をサプレッサー細胞の第1
の集団と接触させた際よりも増加が顕著である場合、候補遺伝子を標的遺伝子として同定
する。幾つかの実施態様において、T細胞をサプレッサー細胞の第1の集団と接触させた場
合、改変T細胞及び非改変T細胞を比較した際の活性は実質的に同じであるが、T細胞をサ
プレッサー細胞の第2の集団と接触させた場合、活性は改変T細胞においてより高くなる。
【００４９】
幾つかの実施態様において、本明細書に記載の方法において使用されるT細胞は、動物
対象から直接取得した試料から単離する。試料は、血液試料とすることができる。血液試
料は、全血試料、部分精製血液試料、又は末梢血試料とすることができる。また、試料は
骨髄試料とすることができる。T細胞は、その表面マーカーによって試料から単離するこ
とができる。幾つかの実施態様において、本明細書に記載の方法で使用されるT細胞は、C
D3+細胞である。幾つかの実施態様において、本明細書に記載の方法で使用されるT細胞は
、CD8+細胞である。幾つかの実施態様において、T細胞は、CD4+細胞である。幾つかの実
施態様において、T細胞は、ナイーブT細胞である。幾つかの実施態様において、T細胞は
、ナイーブCD8+ T細胞である。幾つかの実施態様において、T細胞は、ナイーブCD4+ T細
胞である。幾つかの実施態様において、T細胞は、CD4+/CD8+二重陽性T細胞である。幾つ
かの実施態様において、T細胞は、PBMCである。幾つかの実施態様において、T細胞は、PB
Lである。幾つかの実施態様において、T細胞は、TILである。幾つかの実施態様において
、T細胞は、メモリーT細胞である。幾つかの実施態様において、T細胞は、ガンマデルタT
細胞である。幾つかの実施態様において、T細胞は、Th3、Th17、Th9、又はTfh細胞である
。幾つかの実施態様において、T細胞は、TCM細胞、TEM細胞、又はTEMRA細胞である。また
、T細胞は本明細書で言及された、又はそうでなければ当技術分野で公知の特定の種類のT
細胞の任意の組合わせとすることができる。
【００５０】
幾つかの実施態様において、T細胞は、対象から単離する。対象は、哺乳動物とするこ
とができる。幾つかの実施態様において、T細胞は、マウスから単離する。マウスは、野
生型マウス又は遺伝子操作されたマウスとすることができる。幾つかの実施態様において
、マウスをT細胞受容体を発現するように遺伝子操作する。T細胞受容体は、マウスにおい
て天然には存在しない抗原に特異的なものとすることができる。幾つかの実施態様におい
て、抗原は、オボアルブミンとすることができる。幾つかの実施態様において、対象は、
オボアルブミンに特異的なT細胞受容体を発現するように遺伝子操作されたマウスとする
ことができる。
【００５１】
幾つかの実施態様において、本明細書では、非改変CD8+ T細胞の活性及び改変CD8+ T細
胞の活性を測定することによって、癌治療の標的遺伝子を同定する方法であって；非改変
CD8+ T細胞及び改変CD8+ T細胞を、それぞれサプレッサー細胞と接触させ；改変CD8+ T細
胞は、候補遺伝子をノックダウン又はノックアウトされており；改変CD8+ T細胞において
、非改変CD8+ T細胞と比較して活性が増加している場合、候補遺伝子を癌治療の標的遺伝
子として同定する、前記方法を提供する。
【００５２】
幾つかの実施態様において、T細胞を、幹細胞又は前駆細胞からの分化の誘導によって
産生する。幹細胞又は前駆細胞は、造血幹細胞又は造血前駆細胞とすることができる。ま
た、幹細胞又は前駆細胞は、誘導された多能性幹細胞とすることができる。
【００５３】
非改変T細胞は、本明細書に記載の、又はそうでなければ当技術分野で公知の方法を用
いて遺伝学的に改変して、改変T細胞を産生することができる。幾つかの実施態様におい
て、T細胞は、shRNAを含むウイルスベクターへの感染によって、候補遺伝子をノックアウ
ト又はノックダウンされるように改変されている。幾つかの実施態様において、非改変T
細胞は、対照遺伝子をノックアウト又はノックダウンされた参照T細胞である。一実施態
様において、ウイルスベクターは、レンチウイルス由来のベクターである。幾つかの実施
態様において、ウイルスベクターは、SMARTベクター、GIPZ、TRIPZ、又はTRCレンチウイ
ルスshRNAベクター（GE Dharmacon）である。幾つかの実施態様において、単離T細胞にお
ける遺伝子を、転写活性化様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）を用いることにより、
ノックアウト又はノックダウンする。幾つかの実施態様において、単離T細胞における遺
伝子を、CAS9（CRISPR）を用いることによりノックアウト又はノックダウンする。当業者
であれば理解するように、本明細書に記載の、又はそうでなければ当技術分野で公知のT
細胞の遺伝学的調節のための任意の方法を、本明細書に記載のスクリーニング方法におい
て使用することができる。
【００５４】
幾つかの実施態様において、非改変T細胞をインビトロで増殖させてから、本明細書に
記載の遺伝学的改変又はスクリーニング方法に付する。幾つかの実施態様において、改変
T細胞をインビトロで増殖させてから、本明細書に記載のスクリーニング方法に付する。
【００５５】
一実施態様において、本明細書に記載の方法において使用されるT細胞は、標識される
。幾つかの実施態様において、T細胞は蛍光物質により標識される。幾つかの実施態様に
おいて、T細胞は、ミクロンサイズの粒子により標識される。幾つかの実施態様において
、T細胞は、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（CFSE）により標識さ
れる。幾つかの実施態様において、T細胞は、ミクロンサイズの酸化鉄粒子（MPIO）によ
り標識される。幾つかの実施態様において、T細胞は、磁性ナノ粒子により標識される。T
細胞を標識するための様々な方法が、当技術分野で周知されている。
【００５６】
候補遺伝子は、T細胞のゲノム中に天然に存在する任意の遺伝子とすることができる。
該候補遺伝子は、ヒト遺伝子とすることができる。また、該候補遺伝子は、モデル動物由
来の遺伝子とすることができる。また、例えば候補遺伝子は、マウスT細胞の遺伝子とす
ることができる。
【００５７】
幾つかの実施態様において、本明細書で提供するスクリーニング方法は、T細胞の初期
集団を調製することであって、shRNAライブラリに非改変T細胞を感染させることを含む、
前記調製することを含む。幾つかの実施態様において、shRNAライブラリはT細胞ゲノムの
全遺伝子をスクリーニングすることができるゲノムライブラリであり、これはウイルスベ
クターを含む。幾つかの実施態様において、shRNAライブラリはサブゲノムライブラリで
あり、これはT細胞ゲノムの遺伝子の選択を含む。幾つかの実施態様において、特定の構
造的/機能的特徴を有するあるタンパク質をコードする遺伝子を標的とするshRNAライブラ
リは、ウイルスベクターを含む。例示的なライブラリには、これらに限定はされないが、
Gタンパク質共役型受容体（GPCR）ライブラリ、腫瘍壊死因子受容体（TNFR）スーパーフ
ァミリーライブラリ、免疫グロブリンスーパーファミリー（IgSF）ライブラリ、転写調節
因子ライブラリ、キナーゼライブラリ、ホスファターゼライブラリ、血管形成ライブラリ
、細胞周期ライブラリ、アポトーシスライブラリ、及び/又はユビキチンリガーゼライブ
ラリがある。また、例示的なライブラリは、機能不全のT細胞で過剰発現又は過小発現す
ることが公知の遺伝子に重点を置いてもよい。例えば、候補遺伝子のライブラリは、T細
胞のアネルギー又は疲弊において過剰発現する遺伝子のライブラリとすることができる。
また、本明細書で開示する方法で使用するライブラリは、本明細書に記載の、又はそうで
なければ当技術分野で公知のライブラリの任意の組合わせとすることができる。
【００５８】
幾つかの実施態様において、サプレッサー細胞には、Treg細胞がある。幾つかの実施態
様において、サプレッサー細胞には、MDSCがある。幾つかの実施態様において、サプレッ
サー細胞には、Treg細胞及びMSDCの両方がある。幾つかの実施態様において、スクリーニ
ング方法はインビトロで実施され、サプレッサー細胞は、対象から単離することができる
。動物は、哺乳動物とすることができる。幾つかの実施態様において、サプレッサー細胞
は、マウスから単離することができる。幾つかの実施態様において、対象は、放射線照射
を受けた対象とすることができる。幾つかの実施態様において、対象は、放射線照射を受
けていない対象とすることができる。幾つかの実施態様において、サプレッサー細胞は、
放射線照射を受けたマウスに由来する。幾つかの実施態様において、サプレッサー細胞は
、放射線照射を受けていないマウスに由来する。幾つかの実施態様において、マウスは腫
瘍を有するマウスとすることができる。マウスは放射線照射を受けていない腫瘍を有する
マウスとすることができる。マウスは放射線照射を受けた腫瘍を有するマウスとすること
ができる。幾つかの実施態様において、対象は、少なくとも2つの腫瘍を有するマウスで
あり、ここで一方の腫瘍のみが除去線量の放射線を受けている。
【００５９】
幾つかの実施態様において、サプレッサー細胞は、血液試料から単離する。血液試料は
、全血試料、部分精製血試料、又は末梢血試料とすることができる。T細胞抑制アッセイ
のための試料から単離サプレッサー細胞を取得する方法は、当技術分野で周知されている
。幾つかの実施態様において、スクリーニング方法はインビボで実施され、サプレッサー
細胞は試験対象に天然に存在するサプレッサー細胞とすることができ、該サプレッサー細
胞には、Treg、MSDC、又はこれら両方も含み得る。対象は、放射線照射を受けた対象又は
放射線照射を受けていない対象とすることができる。
【００６０】
幾つかの実施態様において、サプレッサー細胞は放射線照射を受けていない腫瘍を有す
る対象に由来する。幾つかの実施態様において、サプレッサー細胞は放射線照射を受けた
腫瘍を有する対象に由来する。幾つかの実施態様において、放射線照射を受けた腫瘍を有
する対象は、腫瘍を標的とした放射線を受けている。幾つかの実施態様において、放射線
は、除去線量で施される。幾つかの実施態様において、放射線は、1 Gy〜45 Gy、5 Gy〜3
5 Gy、10 Gy〜25 Gy、1 Gy〜25 Gy、1 Gy〜20 Gy、又は5 Gy〜15 Gyの線量で施される。
幾つかの実施態様において、放射線は1 Gy〜20 Gyの線量で施される。幾つかの実施態様
において、放射線は1 Gy、2 Gy、3 Gy、4 Gy、5 Gy、6 Gy、7 Gy、8 Gy、9 Gy、10 Gy、1
1 Gy、12 Gy、13 Gy、14 Gy、15 Gy、16 Gy、17 Gy、18 Gy、19 Gy、20 Gy、25 Gy、30 G
y、35 Gy、40 Gy、又は45 Gyの線量で施される。幾つかの実施態様において、サプレッサ
ー細胞は、その原発性腫瘍を標的とした除去線量の放射線を受けた、腫瘍を有する対象に
由来する。
【００６１】
幾つかの実施態様において、腫瘍を有する対象は、1つの腫瘍を有する。幾つかの実施
態様において、腫瘍を有する対象は、2以上の腫瘍を有する。幾つかの実施態様において
、腫瘍を有する対象は二腫瘍モデルである。幾つかの実施態様において、2以上の腫瘍を
有する放射線照射を受けた腫瘍を有する対象は、その腫瘍の一方のみに標的化された放射
線を受けている。放射線を受ける腫瘍は、腫瘍を有する対象の原発性腫瘍とすることがで
きる。
【００６２】
幾つかの実施態様において、対象は、マウスとすることができる。マウスは、野生型マ
ウス又は遺伝子操作されたマウスとすることができる。幾つかの実施態様において、マウ
スはT細胞受容体を発現するように遺伝子操作される。T細胞受容体は、マウスにおいて天
然には存在しない抗原に対して特異的なものとすることができる。幾つかの実施態様にお
いて、抗原は、オボアルブミンとすることができる。幾つかの実施態様において、対象は
オボアルブミンに特異的なT細胞受容体を発現するように遺伝子操作されたマウスとする
ことができる。マウスは、腫瘍を有するマウスとすることができる。マウスは、放射線照
射を受けていない腫瘍を有するマウスとすることができる。マウスは、放射線照射を受け
た腫瘍を有するマウスとすることができる。幾つかの実施態様において、対象は少なくと
も2つの腫瘍を有するマウスであり、ここで1つの腫瘍が除去線量の放射線を受けている。
【００６３】
本明細書で提供するスクリーニング方法には、インビトロ方法及びインビボ方法がある
。当業者であれば、本明細書に記載の異なるインビトロ及びインビボ方法を、別個に又は
組合わせて使用することができることを理解するであろう。複数の方法の組合わせにより
同定した遺伝子標的は、より完全かつより正確である可能性を有し得る。さらに、本明細
書に記載の方法は、ハイスループット形式でのプールスクリーニングアッセイとすること
ができる。例えば、本明細書で提供するインビトロスクリーニング試験を実施して、まず
癌治療の標的としての役割を果たす候補遺伝子群を認定し、続いてそれらの有用性をさら
に裏付けるためのインビボ機能試験を実施することができる。
【００６４】
（5.1.3 インビボアッセイ）
幾つかの実施態様において、本明細書には、癌治療の標的遺伝子をスクリーニングする
インビボ方法を記載する。インビボアッセイは、試験対象について実施することができる
。試験対象は、動物モデルとすることができる。動物モデルは、二腫瘍モデルとすること
ができる。幾つかの実施態様において、動物モデルはマウスである。幾つかの実施態様に
おいて、動物モデルは腫瘍を有する動物モデルである。動物モデルは、腫瘍を有するマウ
スとすることができる。腫瘍を有するマウスは、放射線照射を受けていても、放射線照射
を受けていなくてもよい。幾つかの実施態様において、動物モデルは反対側に位置する2
つの腫瘍を有するマウスであり、該腫瘍のうちの一方にのみ除去線量の放射線を受けてい
る。
【００６５】
従って、本明細書では、癌治療の標的遺伝子を同定するインビボ方法であって、(i) 試
験対象に非改変T細胞又は改変T細胞を注射することであって、改変T細胞が候補遺伝子を
ノックダウン又はノックアウトされている、前記注射すること；及び(ii) 試験対象にお
ける非改変T細胞の活性及び改変T細胞の活性を測定することを含み、ここで改変T細胞を
非改変T細胞と比較した際に活性が増加する場合、候補遺伝子を癌治療の標的遺伝子とし
て同定する、前記方法を提供する。試験対象は、放射線照射を受けた試験対象とすること
ができる。試験対象は、放射線照射を受けていない試験対象とすることができる。幾つか
の実施態様において、放射線照射を受けた試験対象は、T細胞の注射の前に放射線を受け
る。幾つかの実施態様において、放射線照射を受けた試験対象は、T細胞の注射後である
が、活性を測定する前に、放射線を受ける。幾つかの実施態様において、非改変T細胞及
び改変T細胞は同じ試験対象に注射される。幾つかの実施態様において、非改変T細胞及び
改変T細胞は、別個の試験対象に注射される。幾つかの実施態様において、本明細書に記
載の方法において使用されるT細胞は、標識される。幾つかの実施態様において、非改変T
細胞は参照T細胞である。
【００６６】
幾つかの実施態様において、放射線照射を受けた腫瘍を有する対象は、腫瘍を標的とし
た放射線を受けている。幾つかの実施態様において、放射線は、除去線量で施す。幾つか
の実施態様において、放射線は、1 Gy〜45 Gy、5 Gy〜35 Gy、10 Gy〜25 Gy、1 Gy〜25 G
y、1 Gy〜20 Gy、又は5 Gy〜15 Gyの線量で施す。幾つかの実施態様において、放射線は
、1 Gy〜20 Gyの線量で施す。幾つかの実施態様において、放射線は、1 Gy、2 Gy、3 Gy
、4 Gy、5 Gy、6 Gy、7 Gy、8 Gy、9 Gy、10 Gy、11 Gy、12 Gy、13 Gy、14 Gy、15 Gy、
16 Gy、17 Gy、18 Gy、19 Gy、20 Gy、25 Gy、30 Gy、35 Gy、40 Gy、又は45 Gyの線量で
施す。幾つかの実施態様において、腫瘍を有する対象は、その腫瘍の一方のみに標的化さ
れた除去線量の放射線を受けている二腫瘍モデルである。
【００６７】
本明細書で開示するインビボスクリーニング方法において使用されるT細胞は、本明細
書に記載の、又はそうでなければ当技術分野で公知の方法で使用される任意の特定の種類
のT細胞とすることができる。例えば、幾つかの実施態様において、本明細書に記載の方
法で使用されるT細胞は、CD3+細胞である。幾つかの実施態様において、本明細書に記載
の方法で使用されるT細胞は、CD8+細胞である。幾つかの実施態様において、T細胞は、CD
4+細胞である。幾つかの実施態様において、T細胞は、ナイーブT細胞である。幾つかの実
施態様において、T細胞は、ナイーブCD8+ T細胞である。幾つかの実施態様において、T細
胞は、ナイーブCD4+ T細胞である。
【００６８】
幾つかの実施態様において、測定する工程は、試料を試験対象から取得することを含む
。試料は、腫瘍試料、組織試料、又は血液試料とすることができる。組織試料は、リンパ
節試料、脾臓試料、肝臓試料、又は腎臓試料とすることができる。リンパ節試料は、流入
領域リンパ節又は非流入領域リンパ節とすることができる。腫瘍試料は、放射線照射を受
けた腫瘍由来の試料とすることができる。また、腫瘍試料は、放射線照射を受けていない
腫瘍由来の試料とすることができる。放射線照射を受けていない腫瘍は、放射線照射を受
けた腫瘍を有する試験対象に由来してもよい。
【００６９】
幾つかの実施態様において、本明細書に記載のインビボスクリーニング方法は、放射線
照射を受けていない対象及び放射線照射を受けた対象を用いることを含む。該方法は、放
射線照射を受けていない対象に注射された改変T細胞を非改変T細胞と比較した際の活性の
増加を測定すること、及び／または、放射線照射を受けた対象に注射された改変T細胞を
非改変T細胞と比較した際の活性の増加を測定することを含み得；ここでT細胞を放射線照
射を受けた対象に注射した場合に、T細胞を放射線照射を受けていない対象に注射した場
合よりも増加が顕著であるならば、候補遺伝子を標的遺伝子として同定する。幾つかの実
施態様において、T細胞を放射線照射を受けていない対象に注射する場合の改変T細胞及び
非改変T細胞を比較した際に、T細胞の活性が実質的に同じであるが、T細胞を放射線照射
を受けた対象に注射した場合に非改変T細胞と比較して、改変T細胞において活性がより高
くなる。
【００７０】
幾つかの実施態様において、本明細書に記載のインビボ方法によって測定される活性は
、T細胞の増殖活性とすることができる。幾つかの実施態様において、本明細書に記載の
インビボ方法によって測定される活性は、T細胞の抗腫瘍活性とすることができる。T細胞
の増殖活性は、注射後の試験対象に注射されたT細胞の蓄積によって測定することができ
る。T細胞の蓄積は、注射から24時間後、注射から2日後、注射から3日後、注射から4日後
、注射から5日後、注射から6日後、注射から7日後、注射から8日後、注射から9日後、注
射から10日後、注射から11日後、注射から12日後、注射から13日後、注射から14日後、注
射から2.5週間後、注射から3週間後、注射から3.5週間後、注射から4週間後、注射から5
週間後、注射から6週間後、注射から7週間後、注射から2カ月後、注射から3カ月後、又は
それより長い期間の経過後に測定することができる。
【００７１】
対象におけるT細胞の蓄積は、当技術分野で公知の様々なアプローチによって測定する
ことができる。幾つかの実施態様において、注射されたT細胞の試験対象における蓄積は
、細胞サイトメトリー（cell cytometry）によって測定することができる。幾つかの実施
態様において、試験対象におけるT細胞の蓄積は、蓄積されたT細胞由来のゲノムDNAの次
世代配列決定法（NGS）によって測定することができる。
【００７２】
従って、本明細書では、癌治療の標的遺伝子を同定するインビボ方法であって、(i) 非
改変T細胞及び改変T細胞を試験対象に注射することであって、改変T細胞が候補遺伝子を
ノックダウン又はノックアウトされている、前記注射すること；及び(ii) 試験対象にお
ける非改変T細胞の蓄積及び改変T細胞の蓄積を測定することを含み、ここで非改変T細胞
と比較して、より多くの改変T細胞が蓄積されている場合に、候補遺伝子を癌治療の標的
遺伝子として同定する、前記方法を提供する。幾つかの実施態様において、非改変T細胞
は、参照T細胞である。試験対象は、マウスとすることができる。試験対象は、腫瘍を有
するものとすることができる。試験対象は、放射線照射を受けた腫瘍を有する試験対象と
することができる。幾つかの実施態様において、放射線照射を受けた試験対象は、T細胞
の注射の前に、放射線を受ける。幾つかの実施態様において、放射線照射を受けた試験対
象は、T細胞の注射の後であるが、活性を測定する前に放射線を受ける。幾つかの実施態
様において、非改変T細胞及び改変T細胞を、同じ試験対象に注射する。
【００７３】
幾つかの実施態様において、本明細書では、癌治療の標的遺伝子を同定するインビボ方
法であって、(i) 非改変T細胞及び改変T細胞を試験対象に注射することであって、改変T
細胞が、候補遺伝子をノックダウン又はノックアウトされている、前記注射すること；及
び(ii) 試験対象における腫瘍浸潤性非改変T細胞の数及び腫瘍浸潤性改変T細胞の数を測
定することを含み、ここで腫瘍浸潤性改変T細胞の数が腫瘍浸潤性非改変T細胞の数と比較
してより高い場合に、候補遺伝子を癌治療の標的遺伝子として同定する、前記方法を提供
する。幾つかの実施態様において、非改変T細胞は、参照T細胞である。試験対象は、腫瘍
を有するマウスとすることができる。試験対象は、放射線照射を受けた腫瘍を有する試験
対象とすることができる。幾つかの実施態様において、放射線照射を受けた試験対象は、
T細胞の注射の前に、放射線を受ける。幾つかの実施態様において、放射線照射を受けた
試験対象は、T細胞の注射の後であるが、活性を測定する前に放射線を受ける。幾つかの
実施態様において、非改変T細胞及び改変T細胞を、同じ試験対象に注射する。
【００７４】
幾つかの実施態様において、本明細書で提供する方法は、注射された試験対象由来のT
細胞から蓄積させた/増殖させた単離T細胞をさらに含む。この単離の工程は、試験対象か
ら試料を取得することを含み得る。試料は、腫瘍試料、血液試料、又は組織試料とするこ
とができる。腫瘍試料は、放射線照射を受けた腫瘍又は放射線照射を受けていない腫瘍由
来の試料とすることができる。放射線照射を受けていない腫瘍は、放射線照射を受けた腫
瘍を有する試験対象由来のものとすることができる。血液試料は末梢血、全血、又は部分
精製血の試料とすることができる。組織試料は、脾臓試料、又はリンパ節試料とすること
ができる。リンパ節試料は、流入領域リンパ節試料又は非流入領域リンパ節試料とするこ
とができる。
【００７５】
幾つかの実施態様において、本明細書に記載のインビボ方法によって測定される活性は
、注射されたT細胞の抗腫瘍活性とすることができる。抗腫瘍活性は、ある期間にわたる
腫瘍サイズの低下によって測定することができる。該期間は、24時間、2日、3日、4日、5
日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日、14日、2.5週間、3週間、3.5週間、4
週間、5週間、6週間、7週間、2カ月、3カ月、又はそれより長期とすることができる。
【００７６】
また、抗腫瘍活性は、試験対象集団の生存率によって測定することができる。従って、
本明細書では癌治療の標的遺伝子を同定するインビボ方法であって、(i) 非改変T細胞及
び改変T細胞を別個の試験対象に注射することであって、改変T細胞が、候補遺伝子をノッ
クダウン又はノックアウトされている、前記注射すること；及び(ii) 非改変T細胞を注射
された対象の腫瘍サイズ及び改変T細胞を注射された対象の腫瘍サイズを測定することを
含み、ここで改変T細胞を注射された試験対象において、非改変T細胞を注射された試験対
象と比較して腫瘍サイズの低下がより大きい場合、候補遺伝子を癌治療の標的遺伝子とし
て同定する、前記方法を提供する。幾つかの実施態様において、非改変T細胞は、参照T細
胞である。試験対象は、腫瘍を有するマウスとすることができる。試験対象は、放射線照
射を受けた腫瘍を有する試験対象とすることができる。幾つかの実施態様において、放射
線照射を受けた試験対象は、T細胞の注射の前に、放射線を受ける。幾つかの実施態様に
おいて、放射線照射を受けた試験対象は、T細胞の注射後であるが、腫瘍サイズを測定す
る前に、放射線を受ける。幾つかの実施態様において、試験対象は二腫瘍モデルであり、
ここで一方の腫瘍のみが標的化された放射線を受ける。幾つかの実施態様において、放射
線照射を受けた腫瘍のサイズを測定する。幾つかの実施態様において、放射線照射を受け
ていない腫瘍のサイズを測定する。
【００７７】
また、本明細書では、癌治療の標的遺伝子を同定するインビボ方法であって、(i) 非改
変T細胞及び改変T細胞を腫瘍を有する試験対象の集団に別個に注射することであって、改
変T細胞が、候補遺伝子をノックダウン又はノックアウトされている、前記注射すること
；及び(ii) 非改変T細胞を注射された腫瘍を有する対象の集団の生存率及び改変T細胞を
注射された腫瘍を有する対象の集団の生存率を測定することを含み、ここで改変T細胞を
注射された対象の集団において得られた生存率が、非改変T細胞を注射された対象の集団
と比較して高い場合に、候補遺伝子を癌治療の標的遺伝子として同定する、前記方法を提
供する。幾つかの実施態様において、非改変T細胞は、参照T細胞である。試験対象は、放
射線照射を受けた試験対象とすることができる。幾つかの実施態様において、放射線照射
を受けた試験対象は、T細胞の注射の前に放射線を受ける。幾つかの実施態様において、
放射線照射を受けた試験対象は、T細胞の注射の後に放射線を受ける。幾つかの実施態様
において、試験対象は二腫瘍モデルであり、ここで一方の腫瘍のみが標的化された放射線
を受ける。幾つかの実施態様において、試験対象は、マウスである。
【００７８】
幾つかの実施態様において、本明細書では、癌治療の標的を同定する方法であって：
(1) T細胞を対象から単離すること；
(2) 1組のT細胞を調製することであって、単離されたT細胞において候補遺伝子が選択
的にノックアウト又はノックダウンされている、前記調製すること；
(3) 試験対象の群のそれぞれに2つの腫瘍を移植することであって、2つの腫瘍を遠位に
移植する、前記移植すること；
(4) 第1群の試験対象（ここで、腫瘍は放射線によって処置されていない）、及び第2群
の試験対象（ここで、一方の腫瘍のみが放射線によって処置されている）を準備すること
；
(5) T細胞を第1群からの対象に移入し、腫瘍の低下を評価すること；並びに
(6) T細胞を第2群からの対象に移入し、放射線によって処置されていない腫瘍の低下を
評価すること、を含み、
【００７９】
ここで、工程(6)において観察された腫瘍の低下が、工程(5)において観察された低下よ
りも大きい場合、T細胞においてノックアウト若しくはノックダウンされた遺伝子、又は
それによってコードされたタンパク質を、癌治療の標的として同定する、前記方法を提供
する。
【００８０】
一実施態様において、対象はマウスである。別の実施態様において、マウスはトランス
ジェニックマウスである。別の実施態様において、マウスは、抗原特異的T細胞のモノク
ローナル集団を産生することにより、T細胞免疫反応を増強するように操作されたトラン
スジェニックマウスである。
【００８１】
一実施態様において、試験対象の第2群における腫瘍は、1 Gy〜45 Gy、5 Gy〜35 Gy、1
0 Gy〜25 Gy、1 Gy〜25 Gy、1 Gy〜20 Gy、又は5 Gy〜15 Gyの線量の放射線によって処置
されている。一実施態様において、線量は、1 Gy〜20 Gyである。
【００８２】
一実施態様において、単離されたT細胞における遺伝子は、shRNAを含むウイルスベクタ
ーにT細胞を感染させることにより、ノックアウト又はノックダウンされている。一実施
態様において、ウイルスベクターは、レンチウイルスに由来するベクターである。別の実
施態様において、単離されたT細胞における遺伝子は、転写活性化様エフェクターヌクレ
アーゼ（TALEN）を用いることによってノックアウト又はノックダウンされている。別の
実施態様において、単離されたT細胞における遺伝子は、CAS9（CRISPR）を用いることに
よってノックアウト又はノックダウンされている。
【００８３】
（5.1.2 インビトロアッセイ）
幾つかの実施態様において、本明細書には、癌治療の標的遺伝子のスクリーニングのた
めのインビトロ方法を記載する。インビトロアッセイは、T細胞抑制アッセイとすること
ができる。インビトロアッセイには、サプレッサー細胞と共にT細胞を培養することを含
み得る。幾つかの実施態様において、本明細書で提供する方法は、サプレッサー細胞を対
象から単離することをさらに含む。対象は、放射線照射を受けた対象又は放射線照射を受
けていない対象とすることができる。
【００８４】
従って、幾つかの実施態様において、本明細書では癌治療の標的遺伝子をスクリーニン
グするためのインビトロ方法であって、(a) 非改変T細胞及びサプレッサー細胞；並びに(
b) 改変T細胞及びサプレッサー細胞を別個に培養することであって；改変T細胞が、候補
遺伝子をノックダウン又はノックアウトされている、前記培養すること；並びに非改変T
細胞の活性及び改変T細胞の活性を測定することを含み、ここで改変T細胞を非改変T細胞
と比較した際に活性が増加している場合、候補遺伝子を癌治療の標的遺伝子として同定す
る、前記方法を提供する。幾つかの実施態様において、非改変T細胞は、参照T細胞である
。該方法には、単離サプレッサー細胞を準備することを含み得る。サプレッサー細胞は、
対象由来の試料から単離することができる。対象は、マウスとすることができる。試料は
、血液試料とすることができる。サプレッサー細胞は、その表面マーカーに基づいて単離
することができる。
【００８５】
T細胞及びサプレッサー細胞は、ある期間にわたって培養することができる。該期間は
、30分、1時間、2時間、3時間、4時間、5時間、6時間、7時間、8時間、9時間、10時間、1
2時間、14時間、16時間、18時間、20時間、22時間、24時間、2日、3日、4日、5日、6日、
7日、又はそれより長期とすることができる。
【００８６】
幾つかの実施態様において、T細胞は、種々のT細胞対サプレッサー細胞比のサプレッサ
ー細胞の存在下、抗CD3及び抗CD28を用いて活性化される。幾つかの実施態様において、T
細胞は、抗CD3及び抗CD28を用いて活性化される。幾つかの実施態様において、該方法は
、約10:1、5:1、2:1、1:1、1:2、又は1:5の比でT細胞及びサプレッサー細胞を培養するこ
とを含む。幾つかの実施態様において、該方法は、約1:1の比でT細胞及びサプレッサー細
胞を培養することを含む。
【００８７】
一実施態様において、本明細書に記載の方法において使用されるT細胞は、標識される
。幾つかの実施態様において、T細胞は、蛍光物質により標識される。幾つかの実施態様
において、T細胞は、ミクロンサイズの粒子により標識される。幾つかの実施態様におい
て、T細胞は、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（CFSE）により標識
される。幾つかの実施態様において、T細胞は、ミクロンサイズの酸化鉄粒子（MPIO）に
より標識される。幾つかの実施態様において、T細胞は、磁性ナノ粒子により標識される
。T細胞を標識するための様々な方法が、当技術分野で周知されている。
【００８８】
インビトロスクリーニング方法では、これらに限定はされないが、増殖、細胞周期の活
性化、細胞死、サイトカイン産生、及び/又は細胞傷害性活性を含む活性を測定すること
ができる。
【００８９】
本明細書で提供するサプレッサー細胞（例えば、Treg及びMDSC）によるT細胞の抑制は
、当技術分野で周知されている様々な方法を用いてアッセイすることができる。そのよう
な方法には、これらに限定はされないが、それぞれ全体が引用により本明細書に組み込ま
れている、Dolcettiらの文献、Current Protocols of Immunology, 14.17.1-14.17.25 (2
010); Bayneらの文献、Cold Spring Harb Protoc, doi: 10.1101/pdb.prot077214 (2013)
; Kruisbeekらの文献、Current Protocols in Immunology, 3.12.1-3.12.20 (2004); 及
びCollisonらの文献、Methods Mol Biol. 707: 21-37 (2011)に記載の方法がある。
【００９０】
幾つかの実施態様において、サプレッサー細胞には、Treg細胞を含む。幾つかの実施態
様において、サプレッサー細胞には、MDSCを含む。幾つかの実施態様において、サプレッ
サー細胞には、Treg細胞及びMSDCの両方を含む。幾つかの実施態様において、スクリーニ
ング方法はインビトロで実施され、サプレッサー細胞は、対象から単離することができる
。動物は、哺乳動物とすることができる。幾つかの実施態様において、サプレッサー細胞
は、マウスから単離することができる。幾つかの実施態様において、対象は、放射線照射
を受けた対象とすることができる。幾つかの実施態様において、対象は、放射線照射を受
けていない対象とすることができる。幾つかの実施態様において、サプレッサー細胞は、
放射線照射を受けたマウスに由来する。幾つかの実施態様において、サプレッサー細胞は
、放射線照射を受けていないマウスに由来する。
【００９１】
幾つかの実施態様において、本明細書に記載のインビトロスクリーニング方法は、放射
線照射を受けていない腫瘍を有する対象から単離した、サプレッサー細胞の第1の集団、
及び放射線照射を受けた腫瘍を有する対象から単離した、サプレッサー細胞の第2の集団
を使用することを含む。該方法は、それぞれサプレッサー細胞の第1の集団と共に培養し
た改変T細胞を非改変T細胞と比較した際の活性の増加を測定すること、及び／または、そ
れぞれサプレッサー細胞の第2の集団と共に培養した改変T細胞を非改変T細胞と比較した
際の活性の増加を測定することを含み得；ここでT細胞をサプレッサー細胞の第2の集団と
共に培養した場合に、T細胞をサプレッサー細胞の第1の集団と共に培養した場合よりも増
加が顕著であるならば、候補遺伝子を標的遺伝子として同定する。幾つかの実施態様にお
いて、T細胞をサプレッサー細胞の第1の集団と共に培養した場合、改変T細胞及び非改変T
細胞を比較した際にT細胞の活性は実質的に同じであるが、T細胞をサプレッサー細胞の第
2の集団と共に培養した場合、非改変T細胞と比較して、改変T細胞においてT細胞の活性は
より高くなる。
【００９２】
幾つかの実施態様において、本明細書では、T細胞の細胞周期の活性化を試験すること
により、癌治療の標的遺伝子をスクリーニングするインビトロ方法を提供する。該方法は
、(a) 非改変T細胞及びサプレッサー細胞；並びに(b) 改変T細胞及びサプレッサー細胞を
別個に培養することであって；改変T細胞が、候補遺伝子をノックダウン又はノックアウ
トされている、前記培養すること；並びに非改変T細胞の細胞周期の活性化、及び改変T細
胞の細胞周期の活性化を測定することを含み得、ここで非改変T細胞と比較して、改変T細
胞において細胞周期の活性化が増進される場合、候補遺伝子を癌治療の標的遺伝子として
同定する。幾つかの実施態様において、細胞周期の活性化は、T細胞のDNAへの3[H]-チミ
ジンの取り込みによって測定する。幾つかの実施態様によって、非改変T細胞は、参照T細
胞である。幾つかの実施態様において、該方法は、T細胞を抗CD3及び抗CD28を用いて活性
化させることを含む。
【００９３】
幾つかの実施態様において、本明細書では、T細胞の細胞死を試験することにより、癌
治療の標的遺伝子をスクリーニングするインビトロ方法を提供する。幾つかの実施態様に
おいて、該方法は、T細胞を抗CD3及び抗CD28を用いて活性化させることを含む。該方法は
、(a) 非改変T細胞及びサプレッサー細胞；並びに (b) 改変T細胞及びサプレッサー細胞
を別個に培養することであって；改変T細胞が、候補遺伝子をノックダウン又はノックア
ウトされている、前記培養すること；並びに非改変T細胞の細胞死、及び改変T細胞の細胞
死を測定することを含み得、ここで非改変T細胞と比較して、改変T細胞において細胞死が
低下する場合、候補遺伝子を癌治療の標的遺伝子として同定する。幾つかの実施態様によ
って、非改変T細胞は、参照T細胞である。
【００９４】
細胞死は、アポトーシス、有糸分裂細胞死、及び壊死であり得る。幾つかの実施態様に
おいて、本明細書で提供する方法では、アポトーシスを測定する。幾つかの実施態様にお
いて、本明細書で提供する方法では、アポトーシス有糸分裂細胞死（apoptosis mitotic 
cell death）を測定する。幾つかの実施態様において、本明細書で提供する方法では、壊
死を測定する。市販のキットを用いた細胞死を測定するための様々なアッセイが、当技術
分野で公知である。幾つかの実施態様において、細胞死は、カスパーゼアッセイによって
測定する。幾つかの実施態様において、細胞死は、DNA断片化又は鎖切断によって測定す
る。幾つかの実施態様において、細胞死は、細胞サイトメトリーによって測定する。幾つ
かの実施態様において、細胞死は、ELISAによって測定する。
【００９５】
他の実施態様において、本明細書では、抗原特異的な活性化に反応するT細胞エフェク
ター機能の発達を評価する方法を提供する。インビトロでの抗原特異的刺激によって誘発
されるT細胞の細胞傷害性活性を評価することにより、エフェクター細胞の機能的細胞溶
解能を評価することが可能となる。幾つかの実施態様において、小さな改変を入れるだけ
で同種異系抗原刺激又は抗原特異的誘発のいずれかを評価することができる。ある実施態
様において、51Cr放出による細胞溶解活性の評価を使用して、アッセイの簡便性を保ち、
かつ研究者が多くの変形及び希少な細胞集団を用いて研究することを可能にしながら、T
細胞特異的なエフェクター機能及び免疫調節細胞によるその調節/阻害を調べることがで
きる。クロム放出アッセイにより、より詳細な機能的情報が提供され得る。
【００９６】
ある実施態様において、溶解単位（lytic unit）変換は、抑制性細胞不在時の内部対照
に対して正規化された抑制の程度を測定するものであり、結果のより有用な表現を提供し
、異なる実験からの結果を比較し、平均化することを可能とする。L.U.の評価は、増殖ア
ッセイ又は単一エフェクター対標的比細胞傷害値よりも有効な測定であるが、それは該評
価が機能的活性（培養物の細胞溶解性活性）及び細胞増殖（それぞれの培養物において回
収される細胞数）の両方の推定を含むためである。
【００９７】
幾つかの実施態様において、抗原は、標的細胞に天然には存在しないタンパク質である
。一実施態様において、抗原は、オボアルブミンである。
【００９８】
幾つかの実施態様において、本明細書では、T細胞のサイトカイン産生を試験すること
により、癌治療の標的遺伝子をスクリーニングするためのインビトロ方法を提供する。幾
つかの実施態様において、該方法は、T細胞を抗CD3及び抗CD28を用いて活性化することを
含む。該方法は、(a) 非改変T細胞及びサプレッサー細胞； 並びに(b) 改変T細胞及びサ
プレッサー細胞を別個に培養することであって；改変T細胞が、候補遺伝子をノックダウ
ン又はノックアウトされている、前記培養すること；並びに非改変T細胞のサイトカイン
の産生、及び改変T細胞のサイトカインの産生を測定することを含み得、ここで非改変T細
胞と比較して、改変T細胞においてサイトカインの産生が増進される場合、候補遺伝子を
癌治療の標的遺伝子として同定する。幾つかの実施態様において、本明細書に記載の方法
で測定されるサイトカインには、インターフェロン（IFN）-γ、腫瘍壊死因子（TNF）-α
、インターロイキン（IL）-2、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、又は
これらの任意の組合わせがある。サイトカインの産生を試験するための様々な方法が、当
技術分野で公知である。例えば、サイトカインは、免疫ブロッティング（IB）アッセイ、
免疫蛍光（IF）アッセイ、FACS、ELISA、又は細胞内サイトカイン染色法（ICS）によって
測定することができる。サイトカインの産生を試験するためのキットも、市販されている
。
【００９９】
一実施態様において、本明細書では、癌治療の標的を同定する方法であって：
(1) T細胞を対象から単離すること；
(2) 第1組のT細胞（ここで、単離されたT細胞には改変を加えない）及び第2組のT細胞
（ここで、単離されたT細胞において候補遺伝子が選択的にノックアウト又はノックダウ
ンされている）を準備すること；
(3) 第1組のT細胞を腫瘍を有する対象から単離されたサプレッサー細胞と接触させ（こ
こで、腫瘍は放射線によって処置されていない）、かつ試料におけるT細胞抑制の程度を
決定すること；
(4) 第1組のT細胞を腫瘍を有する対象から単離されたサプレッサー細胞と接触させ（こ
こで、腫瘍は放射線によって処置されている）、かつ試料におけるT細胞抑制の程度を決
定すること；
(5) 第2組のT細胞を腫瘍を有する対象から単離されたサプレッサー細胞と接触させ（こ
こで、腫瘍は放射線によって処置されている）、かつ試料におけるT細胞抑制の程度を決
定すること；
(6) 工程(3)と比較した、工程(4)におけるT細胞抑制の低下を決定すること；
(7) 工程(3)と比較した、工程(5)におけるT細胞抑制の低下を決定すること；並びに
(8) 工程(6)において決定された低下の差を、工程(7)において決定された低下の差と比
較すること、を含み、
ここで、工程(7)で決定したT細胞抑制の低下の差が、工程(6)において決定した低下よ
りも大きい場合、T細胞においてノックアウト若しくはノックダウンされた遺伝子、又は
それによってコードされたタンパク質を、癌治療の標的として同定する、前記方法を提供
する。
【０１００】
一実施態様において、対象は、マウスである。
【０１０１】
別の実施態様において、マウスは特定の抗原特異性を有するT細胞受容体を有するよう
に遺伝子操作されている。別の実施態様において、抗原は、マウスにおいて天然には存在
しないタンパク質である。別の実施態様において、抗原は、オボアルブミンである。
【０１０２】
一実施態様において、T細胞は標識される。別の実施態様において、T細胞は、カルボキ
シフルオレセインスクシンイミジルエステル（CFSE）で標識される。
【０１０３】
一実施態様において、腫瘍は、除去線量の放射線で処置されている。別の実施態様にお
いて、腫瘍は、1 Gy〜45 Gy、5 Gy〜35 Gy、10 Gy〜25 Gy、1 Gy〜25 Gy、1 Gy〜20 Gy、
又は5 Gy〜15 Gyの線量の放射線で処置されている。一実施態様において、腫瘍は、1 Gy
〜20 Gyの線量の放射線で処置されている。
【０１０４】
一実施態様において、単離されたT細胞において候補遺伝子を、shRNAを含むウイルスベ
クターにT細胞を感染させることによってノックアウト又はノックダウンさせる。一実施
態様において、ウイルスベクターは、レンチウイルス由来のベクターである。幾つかの実
施態様において、ウイルスベクターは、SMARTベクター、GIPZ、TRIPZ、又はTRCレンチウ
イルスshRNAベクター（GE Dharmacon）である。別の実施態様において、単離されたT細胞
において遺伝子を、転写活性化様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）を用いることによ
ってノックアウト又はノックダウンさせる。別の実施態様において、単離されたT細胞に
おいて遺伝子を、CAS9（CRISPR）を用いることによってノックアウト又はノックダウンさ
せる。
【０１０５】
一実施態様において、T細胞抑制は、T細胞の増殖をモニタリングすることによって評価
する。一実施態様において、T細胞の増殖は、抗CD3＋抗CD28の存在下で評価する。一実施
態様において、T細胞の増殖は、3[H]-チミジンの取り込みによって決定する。別の実施態
様において、増殖は、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（CFSE）で標
識されたT細胞のフローサイトメトリー分析によって決定する。
【０１０６】
一実施態様において、T細胞抑制は、T細胞の細胞傷害性活性の測定によって評価する。
一実施態様において、細胞傷害性活性は、抗原特異的刺激によって誘発される。一実施態
様において、抗原は、オボアルブミンである。
【０１０７】
一実施態様において、該方法はアレイ化形式のハイスループット設定で実施される。
【０１０８】
ある実施態様において、本明細書で提供するのは、癌治療の標的を同定する方法であっ
て：
(1) T細胞を対象から単離すること；
(2) T細胞を、第1の細胞培養物において腫瘍を有する対象から単離したサプレッサー細
胞と共培養することであって、腫瘍が放射線で処置されていない、前記共培養すること；
(3) T細胞を、第2の細胞培養物において腫瘍を有する対象由来のサプレッサー細胞と共
培養することであって、腫瘍が放射線で処置されている、前記共培養すること； 
(4) 一連の候補遺伝子のノックダウン又はノックアウトを導入するように設計されたウ
イルスベクターに、第1及び第2の培養物を感染させ、かつさらに細胞を培養すること；並
びに
(5) 培養物中の特定の遺伝子コンストラクトの相対レベルを決定すること、を含み、
ここで、第1の培養物と比較して第2の培養物において高レベルであると決定される遺伝
子コンストラクト、又はそれによってコードされたタンパク質を、標的であると同定する
、前記方法である。
【０１０９】
一実施態様において、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。
【０１１０】
別の実施態様において、特定の遺伝子コンストラクトの相対レベルは、ベクターを配列
決定することにより決定する。一実施態様において、配列決定法は、次世代配列決定法で
ある。
【０１１１】
当業者であれば、本明細書で提供するスクリーニング方法が、本明細書に記載の、又は
そうでなければ当技術分野で公知のインビトロアッセイと任意に組合わせて、1種以上のT
細胞活性を測定することを含み得ることを理解するであろう。
【０１１２】
（5.1.3 プールアッセイ）
また、本明細書では、癌治療の標的遺伝子を同定するためのハイスループットプールス
クリーニング方法を提供する。該プールスクリーニング方法は、i) 異なる遺伝学的改変
を有するT細胞の初期集団を調製することであって、それぞれのT細胞が1つの候補遺伝子
をノックダウン又はノックアウトされている、前記調製すること；及び(ii) T細胞の初期
集団をある期間にわたり腫瘍微小環境と接触させて、T細胞の選択された集団を産生する
こと、を含み得るものであり、ここでT細胞の選択された集団においてノックダウン又は
ノックアウトされている候補遺伝子を、癌治療の該標的遺伝子であると同定する。幾つか
の実施態様において、初期集団中のそれぞれのT細胞は、多くとも1つの候補遺伝子をノッ
クダウン又はノックアウトされている。
【０１１３】
また、本明細書では、癌治療の標的遺伝子を同定するためのハイスループットプールス
クリーニング方法を提供する。プールスクリーニング方法は、i) 異なる遺伝学的改変を
有するT細胞の初期集団を調製することであって、それぞれのT細胞が1つの候補遺伝子を
ノックダウン又はノックアウトされている、前記調製すること；及び(ii) T細胞の初期集
団をある期間にわたりサプレッサー細胞と接触させて、T細胞の選択された集団を産生す
ること、を含み得、ここでT細胞の選択された集団においてノックダウン又はノックアウ
トされている候補遺伝子を、癌治療の該標的遺伝子であると同定する。幾つかの実施態様
において、初期集団中のそれぞれのT細胞は、多くとも1つの候補遺伝子をノックダウン又
はノックアウトされている。
【０１１４】
本明細書で開示するプールスクリーニング方法において使用されるT細胞は、本明細書
に記載の、又はそうでなければ当技術分野で公知の方法で使用される任意の特定の種類の
T細胞とすることができる。例えば、幾つかの実施態様において、本明細書に記載の方法
で使用されるT細胞は、CD3+細胞である。幾つかの実施態様において、本明細書に記載の
方法で使用されるT細胞は、CD8+細胞である。幾つかの実施態様において、T細胞は、CD4+
細胞である。幾つかの実施態様において、T細胞は、ナイーブT細胞である。幾つかの実施
態様において、T細胞は、ナイーブCD8+ T細胞である。幾つかの実施態様において、T細胞
は、ナイーブCD4+ T細胞である。
【０１１５】
幾つかの実施態様において、T細胞は、対象から単離する。該対象は、哺乳動物とする
ことができる。幾つかの実施態様において、該T細胞は、マウスから単離する。マウスは
、野生型マウス又は遺伝子操作されたマウスとすることができる。幾つかの実施態様にお
いて、マウスをT細胞受容体を発現するように遺伝子操作する。T細胞受容体は、マウスに
おいて天然には存在しない抗原に特異的なものとすることができる。幾つかの実施態様に
おいて、抗原は、オボアルブミンとすることができる。幾つかの実施態様において、対象
は、オボアルブミンに特異的なT細胞受容体を発現するように遺伝子操作されたマウスと
することができる。
【０１１６】
一実施態様において、本明細書に記載の方法において使用されるT細胞は、標識される
。幾つかの実施態様において、T細胞は蛍光物質により標識される。幾つかの実施態様に
おいて、T細胞は、ミクロンサイズの粒子により標識される。幾つかの実施態様において
、T細胞は、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（CFSE）により標識さ
れる。幾つかの実施態様において、T細胞は、ミクロンサイズの酸化鉄粒子（MPIO）によ
り標識される。幾つかの実施態様において、T細胞は、磁性ナノ粒子により標識される。T
細胞を標識するための様々な方法が、当技術分野で周知されている。
【０１１７】
T細胞の選択された集団は、T細胞の初期集団の増殖によって生じる。T細胞の増殖を増
加させる遺伝学的改変を有するT細胞は、T細胞の選択された集団中に蓄積される。従って
、T細胞の選択された集団においてノックダウン又はノックアウトされた候補遺伝子は、
これらの遺伝子を標的化することにより、腫瘍を有する対象におけるT細胞の増殖を増進
することができることを示す。幾つかの実施態様において、腫瘍を有する対象は、放射線
照射を受けた腫瘍を有する対象とすることができる。
【０１１８】
幾つかの実施態様において、T細胞の選択された集団においてノックダウン又はノック
アウトされた候補遺伝子は、T細胞の選択された集団から単離されたゲノムDNAのNGSによ
って同定する。
【０１１９】
幾つかの実施態様において、T細胞の初期集団を調製することは、shRNAライブラリで非
改変T細胞を感染させることを含む。幾つかの実施態様において、shRNAライブラリはT細
胞ゲノムの全遺伝子をスクリーニングすることができるゲノムライブラリであり、これは
ウイルスベクターを含む。幾つかの実施態様において、shRNAライブラリはサブゲノムラ
イブラリであり、これはT細胞ゲノムの遺伝子の選択を含む。幾つかの実施態様において
、特定の構造的/機能的特徴を有するあるタンパク質をコードする遺伝子を標的とするshR
NAライブラリは、ウイルスベクターを含む。例示的なライブラリには、これらに限定はさ
れないが、Gタンパク質共役型受容体（GPCR）ライブラリ、腫瘍壊死因子受容体（TNFR）
スーパーファミリーライブラリ、免疫グロブリンスーパーファミリー（IgSF）ライブラリ
、転写調節因子ライブラリ、キナーゼライブラリ、ホスファターゼライブラリ、血管形成
ライブラリ、細胞周期ライブラリ、アポトーシスライブラリ、及び/又はユビキチンリガ
ーゼライブラリがある。また、例示的なライブラリは、機能不全のT細胞で過剰発現又は
過小発現することが公知の遺伝子に重点を置いてもよい。例えば、候補遺伝子のライブラ
リは、T細胞のアネルギー又は疲弊において過剰発現する遺伝子のライブラリとすること
ができる。また、本明細書で開示する方法で使用するライブラリは、本明細書に記載の、
又はそうでなければ当技術分野で公知のライブラリの任意の組合わせとすることができる
。
【０１２０】
幾つかの実施態様において、shRNAライブラリは、対照shRNA、例えばLacZ shRNAを含み
得る。
【０１２１】
幾つかの実施態様において、T細胞の初期集団の調製は、転写活性化様エフェクターヌ
クレアーゼ（TALEN）を用いることを含む。幾つかの実施態様において、T細胞の初期集団
を調製することは、CAS9（CRISPR）を用いることを含む。幾つかの実施態様において、T
細胞の初期集団を調製することは、shRNAライブラリにT細胞を感染させることを含む。幾
つかの実施態様において、shRNAライブラリは、レンチウイルスベクターライブラリであ
る。
【０１２２】
幾つかの実施態様において、本明細書に記載のプールスクリーニング方法は、インビト
ロ方法とすることができ、ここで接触させる工程は、初期T細胞集団をサプレッサー細胞
と共にインビトロ培養することを含む。幾つかの実施態様において、サプレッサー細胞は
、放射線照射を受けた腫瘍を有する対象から単離することができる。幾つかの実施態様に
おいて、サプレッサー細胞は、放射線照射を受けていない腫瘍を有する対象から単離する
ことができる。
【０１２３】
幾つかの実施態様において、T細胞は、種々のT細胞対サプレッサー細胞比のサプレッサ
ー細胞の存在下、抗CD3及び抗CD28を用いて活性化される。幾つかの実施態様において、T
細胞は、抗CD3及び抗CD28を用いて活性化される。幾つかの実施態様において、該方法は
、約10:1、5:1、2:1、1:1、1:2、又は1:5の比でT細胞及びサプレッサー細胞を培養するこ
とを含む。幾つかの実施態様において、該方法は、1:1の比でT細胞及びサプレッサー細胞
を培養することを含む。
【０１２４】
幾つかの実施態様において、サプレッサー細胞は放射線照射を受けた腫瘍を有する対象
に由来する。幾つかの実施態様において、サプレッサー細胞は放射線照射を受けていない
腫瘍を有する対象に由来する。
【０１２５】
従って、本明細書では、癌治療の標的遺伝子を同定するためのインビトロハイスループ
ットプールスクリーニング方法を提供する。該インビトロプールスクリーニング方法は、
i) 異なる遺伝学的改変を有するT細胞の初期集団を調製することであって、それぞれのT
細胞が候補遺伝子をノックダウン又はノックアウトされている、前記調製すること；及び
(ii) T細胞の初期集団をある期間にわたりサプレッサー細胞と共に培養して、T細胞の選
択された集団を産生すること、を含み得るものであり、ここでT細胞の選択された集団に
おいてノックダウン又はノックアウトされている候補遺伝子を、癌治療の標的遺伝子であ
ると同定する。幾つかの実施態様において、初期集団中のそれぞれのT細胞は、多くとも1
つの候補遺伝子をノックダウン又はノックアウトされている。幾つかの実施態様において
、該方法は、放射線照射を受けた腫瘍を有する対象から、サプレッサー細胞を単離するこ
とをさらに含む。幾つかの実施態様において、該方法は、放射線照射を受けていない腫瘍
を有する対象から、サプレッサー細胞を単離することをさらに含む。
【０１２６】
幾つかの実施態様において、T細胞及びサプレッサー細胞を培養するための期間は、24
時間、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日、14日、2.5
週間、3週間、3.5週間、4週間、5週間、6週間、7週間、2カ月、3カ月、又はそれより長期
とすることができる。
【０１２７】
当業者であれば理解するように、上記の節に記載のインビトロスクリーニング方法の任
意の変形も、これらのインビトロプールスクリーニング方法に適用される。
【０１２８】
幾つかの実施態様において、本明細書に記載のプールスクリーニング方法は、インビボ
方法とすることができ、ここで接触させる工程は、腫瘍を有する試験対象にT細胞の初期
集団を注射することを含む。従って、本明細書では、癌治療の標的遺伝子を同定するため
のインビボハイスループットプールスクリーニング方法を提供する。該インビボプールス
クリーニング方法は、i) 異なる遺伝学的改変を有するT細胞の初期集団を調製することで
あって、それぞれのT細胞が多くとも1つの候補遺伝子をノックダウン又はノックアウトさ
れている、前記調製すること；及び(ii) T細胞の初期集団をサプレッサー細胞と共に腫瘍
を有する試験対象に注射して、T細胞の選択された集団を産生すること、を含み得、ここ
でT細胞の選択された集団においてノックダウン又はノックアウトされている候補遺伝子
を、癌治療の標的遺伝子であると同定する。
【０１２９】
試験対象は、動物モデルとすることができる。動物モデルは、二腫瘍モデルとすること
ができる。幾つかの実施態様において、該動物モデルは、マウスである。腫瘍を有するマ
ウスは、放射線照射を受けていても、放射線照射を受けていなくてもよい。幾つかの実施
態様において、動物モデルは、二腫瘍モデルである。幾つかの実施態様において、動物モ
デルは、2つの腫瘍を体の反対側の位置に有するマウスであり、該腫瘍の一方のみが除去
線量の放射線を受けている。
【０１３０】
また、該方法は、T細胞の選択されたプールを注射後に対象から単離することを含み得
る。T細胞の選択されたプールは、試験対象の試料から単離することができる。該試料は
、腫瘍試料、血液試料、又は組織試料とすることができる。腫瘍試料は、放射線照射を受
けた腫瘍又は放射線照射を受けていない腫瘍からの試料とすることができる。血液試料は
、末梢血、全血、又は部分精製血の試料とすることができる。組織試料は、脾臓試料、又
はリンパ節試料とすることができる。リンパ節試料は、流入領域リンパ節試料又は非流入
領域リンパ節試料とすることができる。
【０１３１】
幾つかの実施態様において、該方法は、試験対象からT細胞の選択された集団を、注射
から24時間後、注射から2日後、注射から3日後、注射から4日後、注射から5日後、注射か
ら6日後、注射から7日後、注射から8日後、注射から9日後、注射から10日後、注射から11
日後、注射から12日後、注射から13日後、注射から14日後、注射から2.5週間後、注射か
ら3週間後、注射から3.5週間後、注射から4週間後、注射から5週間後、注射から6週間後
、注射から7週間後、注射から2カ月後、注射から3カ月後又はそれより長い期間の経過後
に単離することを含む。
【０１３２】
対象におけるT細胞の選択された集団は、当技術分野で公知の様々なアプローチによっ
て測定することができる。幾つかの実施態様において、試験対象における注射されたT細
胞の蓄積は、細胞サイトメトリーによって測定することができる。幾つかの実施態様にお
いて、試験対象におけるT細胞の蓄積は、蓄積されたT細胞由来のゲノムDNAの次世代配列
決定法（NGS）によって測定することができる。
【０１３３】
幾つかの実施態様において、初期集団のそれぞれのT細胞は多くとも1つの候補遺伝子に
対するshRNAを有し、T細胞の初期集団と比較してT細胞の選択された集団において候補遺
伝子に対するshRNAが富化する場合に、候補遺伝子を癌治療の標的遺伝子であると同定す
る。これらの標的遺伝子がノックダウン又はノックアウトされているT細胞は、TCRによる
腫瘍抗原の認識とは無関係に増殖が増進され得る。幾つかの実施態様において、候補遺伝
子は、T細胞の初期集団と比較して、T細胞の選択された集団において約2倍、約3倍、約4
倍、約5倍、約6倍、約7倍、約8倍、約9倍、約10倍、約12倍、約15倍、約20倍、約25倍、
約30倍、約35倍、約40倍、約45倍、又は約50倍富化される。幾つかの実施態様において、
候補遺伝子は、T細胞の初期集団と比較して、T細胞の選択された集団において少なくとも
2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍、少なくとも6倍、少なくとも7倍、
少なくとも8倍、少なくとも9倍、少なくとも10倍、少なくとも12倍、少なくとも15倍、少
なくとも20倍、少なくとも25倍、少なくとも30倍、少なくとも35倍、少なくとも40倍、少
なくとも45倍、少なくとも50倍、又はそれ以上に富化される。
【０１３４】
腫瘍中でのT細胞の増殖を復帰させるshRNAは、腫瘍中で富化させ得るが、他の組織、例
えば二次リンパ性器官（例えば、脾臓）では富化させ得ない。従って、幾つかの実施態様
において、非腫瘍組織試料と比較して、腫瘍試料から取得したT細胞の選択された集団に
おいて候補遺伝子に対するshRNAが富化する場合、候補遺伝子を癌治療の標的遺伝子であ
ると同定する。腫瘍試料は、放射線照射を受けた腫瘍、又は放射線照射を受けていない腫
瘍に由来する試料とすることができる。組織試料は、二次リンパ性器官試料、例えば、脾
臓試料又はリンパ節試料とすることができる。リンパ節試料は、流入領域リンパ節試料又
は非流入領域リンパ節試料とすることができる。
【０１３５】
幾つかの実施態様において、候補遺伝子は、非腫瘍組織試料と比較して、腫瘍試料にお
いて約2倍、約3倍、約4倍、約5倍、約6倍、約7倍、約8倍、約9倍、約10倍、約12倍、約15
倍、約20倍、約25倍、約30倍、約35倍、約40倍、約45倍、又は約50倍富化される。幾つか
の実施態様において、候補遺伝子は、T細胞の初期集団と比較して、T細胞の選択された集
団において少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍、少なくとも
6倍、少なくとも7倍、少なくとも8倍、少なくとも9倍、少なくとも10倍、少なくとも12倍
、少なくとも15倍、少なくとも20倍、少なくとも25倍、少なくとも30倍、少なくとも35倍
、少なくとも40倍、少なくとも45倍、少なくとも50倍、又はそれ以上に富化される。
【０１３６】
幾つかの実施態様において、T細胞の選択された集団におけるshRNAの定量化は、NGSの
使用を含み得る。
【０１３７】
当業者であれば理解するように、上記の節に記載のインビボスクリーニング方法の任意
の変形はまた、これらのインビボプールスクリーニング方法に適用される。
【０１３８】
当業者であれば理解するように、本明細書に記載のプールスクリーニング方法はまた、
そこで同定される標的遺伝子を裏付ける機能的試験をさらに含むことができる。
【０１３９】
（5.2 T細胞における候補遺伝子のノックアウト又はノックダウン）
幾つかの実施態様において、T細胞機能の調節における特定のタンパク質の不存在を、
放射線と組合わせた際の効果を評価するために、候補遺伝子をT細胞においてノックアウ
ト又はノックダウンさせる。遺伝子編集のための当技術分野で公知の任意の従来法を、本
明細書で提供する方法と関連させて利用することができる。
【０１４０】
（5.2.1 RNAiベースのノックアウト又はノックダウン）
候補遺伝子のノックアウト又はノックダウン（「サイレンシング」と総称される）は、
様々な細胞系において、化学合成された、又はインビトロ転写された低分子干渉RNA（siR
NA）、並びにPCRベース又はDNAベクターベースの低分子ヘアピン型RNA（shRNA）を用いて
達成することができる。細胞においてshRNAの発現を駆動するいくつかのプロモーターが
報告されており、これにはRNAポリメラーゼIIIベースのプロモーターであるU6及びH1、並
びにRNAポリメラーゼIIプロモーターであるCMVがある。さらに、本明細書で提供するshRN
A分子をT細胞特異的プロモーターに作用可能に連結させて、T細胞特異的なshRNA分子のタ
ーゲティングを実現し、それによって候補遺伝子のサイレンシングを達成することができ
る。
【０１４１】
ある実施態様において、本明細書では、候補遺伝子のRNA干渉による遺伝子サイレンシ
ング方法を提供する。該方法は、そのコンストラクトの送達を予定している細胞種（例え
ば、T細胞）において活性なプロモーターを用いてshRNAの発現を駆動する、干渉（サイレ
ンシング）RNAをコードするコンストラクトの作製を含む。
【０１４２】
本明細書で提供する方法で使用するshRNAコンストラクトには、候補遺伝子を対象とし
、候補遺伝子をコードする核酸分子の発現の調節に使用するための短いヌクレオチド区間
が存在する。候補遺伝子の阻害は、候補遺伝子をコードする1以上の標的核酸分子とハイ
ブリッド形成するオリゴマー化合物を提供することによって実現される。
【０１４３】
アンチセンス技術の背景にある原理は、標的核酸とハイブリッド形成するアンチセンス
化合物が、転写又は翻訳などの遺伝子発現活動を調節することである。この配列特異性に
より、アンチセンス化合物は、標的の確認及び遺伝子機能決定のツールとしてきわめて魅
力的なものとなる。
【０１４４】
特定の理論に制限されることなく、候補遺伝子のサイレンシングの作用メカニズムには
、shRNA化合物と標的核酸とのハイブリッド形成が関与する。ここで、ハイブリッド形成
の結果又は効果は、標的の分解又は標的の占有であり、例えば候補遺伝子の転写又はスプ
ライシングを含む細胞機構の停止がこれに付随する。
【０１４５】
アンチセンス化合物がハイブリッド形成してもなお標的の切断が誘発されない、占有ベ
ースのアンチセンスメカニズムの例には、これらに限定はされないが、翻訳の阻害、スプ
ライシングの調節、ポリA部位の選択の調節、及び調節性RNA構造の崩壊がある。細胞を非
切断的事象を介して作用するアンチセンス化合物と接触させることによる、mRNA標的のプ
ロセシングの調節を通じて、細胞の挙動を制御する方法は、例えば米国特許第6,210,892
号及び米国公開第20020049173号に記載されている。
【０１４６】
一般に、shRNAのセンス配列は約19〜約22ヌクレオチドの長さ（例えば、約19、20、21
、又は22ヌクレオチド）であり、アンチセンス配列は約19〜約22ヌクレオチドの長さ（例
えば、約19、20、21、又は22ヌクレオチド）であり、かつループ領域は約3〜約19ヌクレ
オチドの長さ（例えば、約3〜約19ヌクレオチド）である。幾つかの実施態様において、
センス及びアンチセンス配列は同じ長さであり、すなわちshRNAは対称なヘアピンを形成
する。他の実施態様において、センス又はアンチセンス鎖はその相補的な鎖よりも短くて
もよく、非対称のヘアピンを形成してもよい。幾つかの実施態様において、センス及びア
ンチセンス配列間の塩基対形成は厳密である。他の実施態様において、配列間のいくぶん
のミスマッチは許容される場合があり、又は例えば2つの鎖の間の水素結合強度を減少さ
せるのに望ましい場合がある。また、幾つかの実施態様において、shRNA分子は化学的に
修飾され得る5'末端リン酸基を含むことができる。さらに、shRNA分子のループ部分には
、例えば、ヌクレオチド、非ヌクレオチド、リンカー分子、及びコンジュゲート分子など
を含むことができる。
【０１４７】
任意の適当なベクターを候補遺伝子のRNAiサイレンシングに関して使用することができ
る。例としては、これらに限定はされないが：ウイルスベースのベクター、例えばアデノ
ウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス、及びレトロウイルスベクター；並びに
プラスミドベースのベクター及び他のベクター、例えばバキュロウイルス、ファージ、フ
ァージミド、コスミド、フォスミド（phosmids）、細菌人工染色体、P1ベースの人工染色
体、酵母プラスミド、及び酵母人工染色体がある。
【０１４８】
一実施態様において、ベクターはウイルスベクターである。別の実施態様において、ウ
イルスベクターはレンチウイルスベクターである。
【０１４９】
shRNA発現ベクターの送達は、標的細胞への投与によるものでも、所望の標的細胞（複
数可）又は組織への導入を可能にする任意の他の手段、例えばトランスフェクション又は
形質導入によるものでもよい。
【０１５０】
（5.2.2 TALENベースのノックアウト又はノックダウン）
他の実施態様において、候補遺伝子は、転写活性化様エフェクターヌクレアーゼ（TALE
N）ベースの系を用いてサイレンシングすることができる。転写活性化様（TAL）エフェク
ター配列を集合させて、反復可変二残基（repeat variable-diresidue）（RVD）配列を組
み付けることにより、DNA標的に特異的に結合させることができる。TALエフェクター及び
ヌクレアーゼの融合タンパク質（TALEN）は、細胞DNAに標的化された二本鎖切断を加える
ことができ、該二本鎖切断は、細胞に特異的な遺伝学的改変を加えるために使用すること
ができる。TALENは、安定に改変された細胞を作出するのに有用であると報告されている
。
【０１５１】
標的DNA内部の特異的なヌクレオチド配列に結合するTALエフェクタードメインは、10以
上のDNA結合リピート、又は15以上のDNA結合リピートを含み得る。それぞれのDNA結合リ
ピートは標的DNA配列中の塩基対の認識を決定するRVDを含み得、ここでそれぞれのDNA結
合リピートは標的DNA配列中の1つの塩基対の認識に寄与し、かつここでRVDは：Cを認識す
るHD; Tを認識するNG; Aを認識するNI; G又はAを認識するNN; A又はC又はG又はTを認識す
るNS; C又はTを認識するN*（ここで、*はRVDの第2位のギャップを表す）; Tを認識するHG
; Tを認識するH*（ここで、*はRVDの第2位のギャップを表す）; Tを認識するIG; Gを認識
するNK; Cを認識するHA; Cを認識するND; Cを認識するHI; Gを認識するHN; Gを認識するN
A; G又はAを認識するSN; 及びTを認識するYGの1以上を含む。
【０１５２】
幾つかの実施態様において、TALENはエンドヌクレアーゼドメイン及び標的DNAに特異的
なTALエフェクターDNA結合ドメインを含み得、ここでDNA結合ドメインは複数のDNA結合リ
ピートを含み、それぞれのリピートは標的DNA中の塩基対の認識を決定するRVDを含み、こ
こでそれぞれのDNA結合リピートは標的DNA中の1つの塩基対の認識に寄与し、かつここで
、TALENは以下のRVD：Cを認識するHD; Tを認識するNG; Aを認識するNI; G又はAを認識す
るNN; A又はC又はG又はTを認識するNS; C又はTを認識するN*; Tを認識するHG; Tを認識す
るH*; Tを認識するIG; Gを認識するNK; Cを認識するHA; Cを認識するND; Cを認識するHI;
Gを認識するHN; Gを認識するNA; G又はAを認識するSN; 及びTを認識するYGの1以上を含
む。TALENは、以下のRVD：Cを認識するHA; Cを認識するND; Cを認識するHI; Gを認識する
HN; Gを認識するNA; G又はAを認識するSN; Tを認識するYG; 及びGを認識するNKの1以上、
並びに: Cを認識するHD; Tを認識するNG; Aを認識するNI; G又はAを認識するNN; A又はC
又はG又はTを認識するNS; C又はTを認識するN*; Tを認識するHG; Tを認識するH*; 及びT
を認識するIGの1以上を含み得る。エンドヌクレアーゼドメインは、II型制限エンドヌク
レアーゼ（例えば、FokI）に由来し得る。
【０１５３】
幾つかの実施態様において、細胞は、コンストラクトがそのゲノムに組み込まれないよ
うにして、一過的に形質転換させることができる。例えば、TALENのコード配列を含むプ
ラスミドベクターは、TALENのコード配列を発現するが、ベクターはゲノム中に安定に組
み込まれないようにして、細胞に導入することができる。一過的に形質転換された細胞は
通常、細胞分裂ごとに導入された核酸コンストラクトの一部又は全てを失い、その結果、
導入された核酸は十分な回数の細胞分裂の後に、娘細胞において検出できなくなる。しか
しながら、TALENのコード配列の発現は、ドナー配列及び内在の標的配列の間の相同組換
えを達成するのに十分であり得る。一過的に形質転換された細胞及び安定に形質転換され
た細胞の両方とも、本明細書で提供する方法において有用であり得る。
【０１５４】
ポリヌクレオチド及び/又は組換えベクターは、これらに限定はされないが、エレクト
ロポレーション、マイクロインジェクション、及び微粒子銃（biolistic）法を含む、当
技術分野で公知の任意の従来法を用いて宿主ゲノム中に導入することができる。さらに、
本明細書で提供する方法に関して、当技術分野で従来公知の任意の他の遺伝子導入及び形
質転換技術を使用することができる。そのような技術には、これらに限定はされないが、
カルシウム又はPEGによるプロトプラスト形質転換、エレクトロポレーションによって仲
介されるネイキッドDNAの取り込み、リポソームによって仲介されるトランスフェクショ
ン、エレクトロポレーション、ウイルスベクターによって仲介される形質転換、及び微粒
子銃（microprojectile bombardment）がある（それらの全てが引用により本明細書に組
み込まれている米国特許第5,538,880号、第5,204,253号、第5,591,616号、及び第6,329,5
71号を参照されたい）。幾つかの実施態様において、DNA修飾酵素（例えば、TALEN）は、
細胞に直接的に導入することができる。例えば、ポリペプチドは、機械的注入により、細
菌III型分泌装置を介する送達により、又はエレクトロポレーションにより、細胞に導入
することができる。
【０１５５】
幾つかの実施態様において、核酸結合（nucleic acid binding）は例えば、これらに限
定はされないが、トランスポザーゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リゾルバーゼ、
インベルターゼ、プロテアーゼ、DNAメチルトランスフェラーゼ、DNAデメチラーゼ、ヒス
トンアセチラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ、ヌクレアーゼ、転写リプレッサー、転写ア
クチベーター、転写調節因子動員、タンパク質核局在化シグナル、又は細胞取り込みシグ
ナルを含むエフェクタードメインと連結される。
【０１５６】
幾つかの実施態様において、エフェクタードメインは、これらに限定はされないが、ト
ランスポザーゼ活性、インテグラーゼ活性、リコンビナーゼ活性、リゾルバーゼ活性、イ
ンベルターゼ活性、プロテアーゼ活性、DNAメチルトランスフェラーゼ活性、DNAデメチラ
ーゼ活性、ヒストンアセチラーゼ活性、ヒストンデアセチラーゼ活性、ヌクレアーゼ活性
、核局在化シグナル活性、転写リプレッサー活性、転写アクチベーター活性、転写調節因
子動員活性、又は細胞取り込みシグナル伝達活性を含む活性を示すタンパク質ドメインで
ある。他の実施態様は、本明細書に記載の活性の任意の組合わせを含み得る。
【０１５７】
本明細書で提供する方法に関して、クローニングベクター及び発現ベクター、並びにウ
イルスベクター及び組み込みベクターを含む、任意の適当なベクターを使用することがで
きる。「発現ベクター」は、1以上の発現制御配列を含むベクターであり、「発現制御配
列」は、もう1つのDNA配列の転写及び/又は翻訳を制御及び調節するDNA配列である。適当
な発現ベクターには、これらに限定はされないが、プラスミド及び、例えばバクテリオフ
ァージ、バキュロウイルス、タバコモザイクウイルス、ヘルペスウイルス、サイトメガロ
ウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイ
ルスに由来するウイルスベクターがある。多くのベクター及び発現系が市販されている。
例として、組換えDNA技術で使用される一部のベクターにより、実体、例えばDNAセグメン
ト（例えば異種DNAセグメント、例として異種cDNAセグメント）を、標的細胞内に導入す
ることが可能となる。
【０１５８】
ベクターは、核酸断片の複製及びクローニングをもたらすために、1以上の制限エンド
ヌクレアーゼ認識部位（I型、II型、II型のいずれでもよい）を有し得る。該認識部位は
、ベクターの必須の生物学的機能を損することなく、配列をそこで確定可能に切断するこ
とができ、かつ核酸断片をそこに結合させ、又は挿入することができる。また、ベクター
は2つの核酸分子間での核酸配列の交換を可能にする、1以上の組換え部位を含み得る。ベ
クターは、例えばPCR用のプライマー部位、転写及び/又は翻訳の開始及び/又は調節部位
、組換えシグナル、レプリコン、並びに選択可能マーカーをさらに提供し得る。ベクター
は、ベクターにより形質転換された細胞の識別における使用に適当な、1以上の選択可能
マーカーをさらに含み得る。
【０１５９】
幾つかの実施態様において、所望の核酸配列、例えばTALEポリペプチドをコードするmR
NAの翻訳が要求される場合、ベクターはヌクレオチド配列の適切な翻訳に要求される配列
を含むこともできる。
【０１６０】
幾つかの実施態様において、発現ベクターは、「プラスミド」の形態であることが多く
、これは、ベクターの形態では染色体と結合しない環状二本鎖DNAループを指す。幾つか
の実施態様において、所与のTALEポリペプチドの全ての構成要素は、単一のベクターにコ
ードされ得る。例えば、幾つかの実施態様において、機能性のTALEポリペプチドに必要な
全ての構成要素を含む、又は含み得るベクターを、構築することができる。幾つかの実施
態様において、個々の構成要素（例えば、1以上のモノマーユニット及び1以上のエフェク
タードメイン）は、異なるベクターに別個にコードさせることができ、1以上の細胞に別
個に導入することができる。さらに、本明細書に記載の任意のベクターは、任意の位置又
は位置の組合わせに、構成要素配列、例えばエフェクタードメイン及び/又はTALEモノマ
ーユニットをコードする所定のTALEポリペプチドをそれ自体含むことができる。
【０１６１】
ベクターの例には、これらに限定はされないが、プラスミド、エピソーム、バクテリオ
ファージ、又はウイルスベクターがあり、そのようなベクターは、宿主細胞のゲノムへと
組み込まれるか、又は使用される特定の細胞系において自律的に複製することができる。
幾つかの実施態様において、使用するベクターはエピソームベクター、すなわち染色体外
で複製することのできる核酸であり、細菌、ウイルス、又はファージ由来の配列を含み得
る。他の実施態様において、ベクターは細菌プラスミド、バクテリオファージ、酵母エピ
ソーム、酵母染色体エレメント、及びウイルス、これらの組合わせに由来するベクター、
例えばプラスミド及びバクテリオファージの遺伝学的エレメント、コスミド及びファージ
ミドに由来するベクターに由来する。幾つかの実施態様において、ベクターは、プラスミ
ド、バクテリオファージ、細菌人工染色体（BAC）、又は酵母人工染色体（YAC）とするこ
とができる。ベクターは、一本鎖又は二本鎖DNA、RNA、又はファージベクターとすること
ができる。
【０１６２】
ウイルスベクターには、これらに限定はされないが、レトロウイルスベクター、例えば
レンチウイルスベクター又はガンマレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、
及びバキュロウイルスベクターがある。例えば、レンチウイルスベクターは、レンチウイ
ルス粒子の形態で使用することができる。また、同等の機能を果たす当業者に公知の他の
形態の発現ベクターを使用することができる。発現ベクターは、発現させる核酸配列にコ
ードされるポリペプチドの安定な又は一過性の発現に使用することができる。ベクターは
、自己複製する染色体外ベクター又は宿主ゲノムへと組み込まれるベクターとすることが
できる。一実施態様において、ベクターはゲノム組み込みベクター、すなわち「組み込み
ベクター」であり、宿主細胞、細胞系、又は非細胞系の染色体DNA又はRNAへと組み込まれ
得る。幾つかの実施態様において、TALEポリペプチド又は構成要素配列をコードする核酸
配列は、ベクター配列の構成要素と一緒に宿主細胞、細胞系、又は非細胞系の染色体DNA
又はRNAに組み込まれる。
【０１６３】
本明細書で提供する組換え発現ベクターは、宿主細胞内での核酸の発現に適当な形態の
TALE核酸を含むことができ、このことは、組み換え発現ベクター（複数可）が、発現に使
用する宿主細胞（複数可）に基づいて選択される、発現させるべき核酸配列に作用可能に
連結された1以上の調節配列を含むことを示唆する。
【０１６４】
（5.2.3 CRISPR/CAS9ベースのノックアウト又はノックダウン）
幾つかの実施態様において、候補遺伝子を、例えばその全体が引用により本明細書に組
み込まれているWiedenheftらの文献、Nature 482 (7385): 331-8 (2012)に記載の、規則
的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（Clustered Regularly Interspa
ced Short Palindromic Repeats）（CRISPR）/CAS9システムを用いてサイレンシングする
。
【０１６５】
簡潔に説明すると、Cas9タンパク質及び真核細胞の1以上の遺伝子産物をコードするDNA
分子のゲノム座位を標的とする1以上のガイドRNAを含む、操作された、プログラム可能な
、天然に存在しないCRISPR-Casシステムを準備し、Cas9タンパク質が1以上の遺伝子産物
をコードするDNA分子のゲノム座位を切断し、その結果、1以上の遺伝子産物の発現が変化
する（その全体が引用により本明細書に組み込まれている米国特許第8,697,359号を参照
されたい）。
【０１６６】
ベクターを、原核細胞又は真核細胞においてCRISPR転写物（例えば、核酸転写物、タン
パク質、又は酵素）を発現するように設計することができる。例えば、CRISPR転写物は、
大腸菌（Escherichia coli）などの細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクター
を用いて）、酵母細胞、又は哺乳動物細胞において発現させることができる。適当な宿主
細胞は、Goeddelの文献、「遺伝子発現技術：酵素学における方法（GENE EXPRESSION TEC
HNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY）」 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)
でさらに論じられている。あるいは、組換え発現ベクターは、例えばT7プロモーター調節
配列及びT7ポリメラーゼを用いて、インビトロで転写及び翻訳することができる。
【０１６７】
ベクターは、原核生物において導入し、増殖させることができる。幾つかの実施態様に
おいて、原核生物を使用して、真核細胞に導入すべきベクター、又は真核細胞に導入すべ
きベクターの作製における中間体ベクターとしてのベクターのコピーを増幅させる（例え
ば、ウイルスベクターパッケージングシステムの一部であるプラスミドの増幅）。幾つか
の実施態様において、原核生物を使用して、ベクターのコピーを増幅させ、1以上の核酸
を発現させて、例えば宿主細胞又は宿主生物に送達するための1以上のタンパク質の供給
源を準備する。
【０１６８】
幾つかの実施態様において、ベクターは、融合型発現ベクターである。そのようなベク
ターの例には、これらに限定はされないが、市販のベクター、例えば標的組換えタンパク
質にそれぞれグルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）、マルトースE結合タンパク質、
又はタンパク質Aを融合させるpGEX（Pharmacia Biotech社）、pMAL（New England Biolab
s）、及びpRIT5（Pharmacia, Piscataway, N.J.）がある。適当な誘導性非融合型大腸菌
（E. coli）発現ベクターの例には、これらに限定はされないが、pTrc（Amrannらの文献
、Gene 69:301-315 (1988)）及びpET 11d（Studierらの文献、「遺伝子発現技術；酵素学
における方法（GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY）」 185, Academi
c Press, San Diego, Calif. 60-89 (1990)）がある。
【０１６９】
幾つかの実施態様において、ベクターは、酵母発現ベクターである。そのようなベクタ
ーの例には、これらに限定はされないが、pYepSec1（Baldariらの文献、EMBO J. 6: 229-
234 (1987)）、pMFa（Kuijan及びHerskowitzの文献、1982. Cell 30: 933-943）、pJRY88
（Schultzらの文献、Gene 54: 113-123 (1987)）、pYES2（Invitrogen社, San Diego, Ca
lif.）、及びpicZ（Invitrogen社, San Diego, Calif.）がある。
【０１７０】
幾つかの実施態様において、ベクターは、哺乳動物発現ベクターである。そのようなベ
クターの例には、これらに限定はされないが、pCDM8（Seedの文献、Nature 329: 840 (19
87)）及びpMT2PC（Kaufmanらの文献、EMBO J. 6: 187-195 (1987)）がある。哺乳動物細
胞において使用する場合、発現ベクターの制御機能は、通常1以上の調節エレメントによ
って提供される。例えば、一般に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイル
ス2、サイトメガロウイルス、シミアンウイルス40、及び当技術分野で公知の他のものに
由来する。
【０１７１】
幾つかの実施態様において、調節エレメントは、CRISPRシステムの1以上のエレメント
の発現を駆動するように、CRISPRシステムの1以上のエレメントに作用可能に連結される
。CRISPR座位は、これらに限定はされないが、アエロピルム（Aeropyrum）、ピロバキュ
ラム（Pyrobaculum）、スルホロブス（Sulfolobus）、アーケオグロブス（Archaeoglobus
）、ハロアーキュラ（Halocarcula）、メタノバクテリウム（Methanobacteriumn）、メタ
ノコッカス（Methanococcus）、メタノサルシナ（Methanosarcina）、メタノピュルス（M
ethanopyrus）、パイロコッカス（Pyrococcus）、ピクロフィルス（Picrophilus）、テル
モプラズマ（Thernioplasnia）、コリネバクテリウム（Corynebacterium）、マイコバク
テリウム（Mycobacterium）、ストレプトマイセス（Streptomyces）、アクウィフェクス
（Aquifrx）、ポルフィロモナス（Porphvromonas）、緑色硫黄細菌（Chlorobium）、サー
マス（Thermus）、バチルス（Bacillus）、リステリア（Listeria）、ブドウ球菌（Staph
ylococcus）、クロストリジウム（Clostridium）、サーモアナエロバクター（Thermoanae
robacter）、マイコプラズマ（Mycoplasma）、紡錘菌（Fusobacterium）、アゾアルカス
（Azarcus）、クロモバクテリウム（Chromobacterium）、ナイセリア（Neisseria）、硝
化細菌（Nitrosomonas）、硫酸還元細菌（Desulfovibrio）、ジオバクター（Geobacter）
、マイクロコッカス（Myrococcus）、カンピロバクター（Campylobacter）、ウォリネラ
（Wolinella）、アシネトバクター（Acinetobacter）、エルウィニア（Erwinia）、大腸
菌類（Escherichia）、レジオネラ（Legionella）、メチロコッカス（Methylococcus）、
パスツレラ（Pasteurella）、フォトバクテリウム（Photobacterium）、サルモネラ（Sal
monella）、ザントモナス（Xanthomonas）、エルシニア（Yersinia）、トレポネーマ（Tr
eponema）、及びサーモトガ（Thermotoga）を含む40を超える原核生物において確認され
ている。
【０１７２】
幾つかの実施態様において、CRISPRシステムの1以上のエレメントは、第I種、第II種、
又は第III種のCRISPRシステムに由来する。幾つかの実施態様において、CRISPRシステム
の1以上のエレメントは、内在のCRISPRシステムを含む特定の生物、例えば化膿性レンサ
球菌（Streptococcus pyogenes）に由来する。
【０１７３】
通常、CRISPRシステムは、標的配列部位でのCRISPR複合体の形成を促進するエレメント
（内在性CRISPRシステムとの関連でプロトスペーサーとも呼ばれる）を特徴とする。用語
「標的配列」は、CRISPRシステムと関連して使用される場合、ガイド配列がそれと相補性
を有するように設計された配列を指し、この場合、標的配列及びガイド配列間のハイブリ
ッド形成により、CRISPR複合体の形成が促進される。幾つかの実施態様において、完全な
相補性は必要でない場合があるが、それにはハイブリッド形成を起こし、CRISPR複合体の
形成を促進するのに十分な相補性が存在することが条件となる。
【０１７４】
標的配列は、任意のポリヌクレオチド、例えばDNA又はRNAポリヌクレオチドを含み得る
。幾つかの実施態様において、標的配列は細胞の核又は細胞質中に位置する。幾つかの実
施態様において、標的配列は真核細胞のオルガネラ、例えば、ミトコンドリア又はクロロ
プラストの内部に位置する。
【０１７５】
幾つかの実施態様において、ベクターは、1以上の挿入部位、例えば制限エンドヌクレ
アーゼ認識配列（「クローニング部位」とも呼ばれる）を含む。幾つかの実施態様におい
て、1以上の挿入部位（例えば、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、若しくはそれ以上又
は約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、若しくはそれ以上超の挿入部位）は、1以上のベク
ターの1以上の配列エレメントの上流及び/下流に位置する。幾つかの実施態様において、
ベクターはtracr mate配列の上流、及び任意にtracr mate配列に作用可能に連結された調
節エレメントの下流に挿入部位を含み、その結果、ガイド配列の挿入部位への挿入後、発
現に際し、ガイド配列により真核細胞におけるCRISPR複合体の標的配列への配列特異的な
結合が導かれる。幾つかの実施態様において、ベクターは、2以上の挿入部位を含み、そ
れぞれの挿入部位は、それぞれの部位でガイド配列の挿入が可能となるように、2つのtra
cr mate配列の間に位置している。そのような配置において、2以上のガイド配列は、単一
のガイド配列、2以上の異なるガイド配列、又はこれらの組合わせの2以上のコピーを含み
得る。複数の異なるガイド配列を使用する場合、単一の発現コンストラクトを使用して、
細胞内部でCRISPR活性を、複数の異なる対応する標的配列に差し向けることができる。例
えば、単一のベクターは、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20若しくはそれ以上
又は約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20若しくはそれ以上超のガイド配列を含む
ことができる。幾つかの実施態様において、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、若しく
はそれ以上又は約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、若しくはそれ以上超のそのようなガ
イド配列含有ベクターを提供し、任意に細胞に送達することができる。
【０１７６】
幾つかの実施態様において、ベクターは、CRISPR酵素、例えばCasタンパク質をコード
する酵素コード配列に作用可能に連結された調節エレメントを含む。Casタンパク質の例
には、これらに限定はされないが、Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7
、Cas8、Cas9（Csn1及びCsx12としても公知である)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、C
se2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr
5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、
Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、及びこれらの類似体又は誘導体がある。
【０１７７】
幾つかの実施態様において、CRISPR酵素はCas9であり、かつCas9とすることができる。
幾つかの実施態様において、CRISPR酵素は標的配列の位置で、例えば標的配列内及び/又
は標的配列の相補物内で一方又は両方の鎖の切断を導く。幾つかの実施態様において、CR
ISPR酵素は標的配列の最初又は最後のヌクレオチドから約1、2、3、4、5、6、7、8、9、1
0、15、20、25、50、100、200、500、又はそれ以上の塩基対以内で、一方又は両方の鎖の
切断を導く。幾つかの実施態様において、ベクターは対応する野生型酵素と比較して突然
変異の入ったCRISPR酵素をコードしており、その結果突然変異したCRISPR酵素は、標的配
列を含む標的ポリヌクレオチドの一方又は両方の鎖を切断する能力を欠く。
【０１７８】
幾つかの実施態様において、CRISPR酵素をコードする酵素コード配列は、特定の細胞、
例えば真核細胞における発現のためにコドンを最適化されている。真核細胞は、特定の生
物、例えばこれらに限定はされないが、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、又は非ヒ
ト霊長類を含む哺乳動物の細胞とすることができ、又はそれに由来することができる。コ
ドン最適化とは、対象とする宿主細胞における発現を増進するために、天然のアミノ酸配
列を維持しながら、その宿主細胞の遺伝子においてより高頻度に又は最も高頻度に使用さ
れるコドンで天然の配列の少なくとも1つのコドンを置換することにより、核酸配列を改
変する過程を指す。
【０１７９】
様々な種が、特定のアミノ酸のあるコドンについて特定の偏りを示す。コドンの偏り（
生物間のコドンの使い方の相違）は、メッセンジャーRNA（mRNA）の翻訳効率と相関する
ことが多く、該翻訳効率は、とりわけ翻訳されるコドンの特性及び特定の転移RNA（tRNA
）分子の利用可能性に依存すると考えられている。細胞中で選択されたtRNAが優勢である
ことは、一般にペプチド合成においてそのコドンが最も高頻度に使用されていることを反
映する。従って、コドン最適化に基づいて遺伝子を、所与の生物における最適な遺伝子発
現という目的に合わせることができる。
【０１８０】
ガイド配列は、任意の標的配列を標的化するように選択することができる。幾つかの実
施態様において、標的配列は細胞のゲノム内部の配列である。例示的な標的配列には、標
的ゲノムに特有の配列がある。例えば、化膿性レンサ球菌（S. pyogenes）のCas9につい
ては、ゲノム中の特有の標的配列は、形態
【化３】
2020054361.tif 000005
（ここで、
【化４】
2020054361.tif 000006
（Nは、A、G、T、又はCであり；かつXは、何でもよい）は、ゲノム中に1回出現する）のC
as9標的部位を含み得る。
【０１８１】
遺伝子編集のためのいくつかの市販のCRISPR/Cas9システムが、当技術分野で利用可能
である。任意のそのようなシステム、及びその任意の変形を、本明細書で提供する方法と
関連して使用することができる。
【０１８２】
（5.3 使用方法）
また、本明細書では、本明細書に記載のスクリーニング方法を用いて同定した遺伝子標
的の使用方法を提供する。例えば、本明細書では、本明細書に記載のスクリーニング方法
によって同定した標的遺伝子を阻害することにより、T細胞を活性化させる方法を提供す
る。幾つかの実施態様において、T細胞は腫瘍を有する対象において存在する。腫瘍を有
する対象は、本明細書に記載のスクリーニング方法によって同定した標的遺伝子を阻害す
る処置の前、それと同時に、又はその後に、腫瘍に標的化された放射線を受けることがで
きる。
【０１８３】
また、幾つかの実施態様において、本明細書では、本明細書に記載のスクリーニング方
法によって同定された標的遺伝子を阻害することにより、それを必要とする対象において
癌を治療する方法を提供する。また、幾つかの実施態様において、本明細書では、本明細
書に記載のスクリーニング方法によって同定された、標的遺伝子をノックダウン又はノッ
クアウトされたT細胞を用いたT細胞療法を施すことにより、それを必要とする対象におい
て癌を治療する方法を提供する。幾つかの実施態様において、該方法は、腫瘍を標的とし
た放射線療法を施すことをさらに含むことができる。
【実施例】
【０１８４】
（6. 実施例）
本明細書で提供する実施態様は、以下の実施例を参照することにより、より十分に理解
することができる。これらの実施例は本明細書で提供する医薬組成物及び剤形の例証を意
図するものであるが、いかなるようにも限定を意図するものではない。
【０１８５】
（6.1 実施例1：ハイスループットインビトロスクリーニング）
癌治療の標的、すなわちサプレッサー細胞の阻害メカニズムの調節に関与する分子を同
定するために、ナイーブT細胞を腫瘍を有さない遺伝子操作された、又は遺伝子操作され
ていないマウスから単離し、96ウェルプレートに入れる。ナイーブT細胞を、先に記載さ
れた、対象とするshRNAを含むレンチウイルスベクターを用いてT細胞を感染させることに
より、又はやはり先に記載の対象とする遺伝子をノックアウトすることができるシステム
、例えばTALEN若しくはCRISPR/CAS9システムを用いることにより、ノックダウン又はノッ
クアウトされた対象とする特定の遺伝子を含むように、操作する。特定の候補遺伝子のノ
ックダウン又はノックアウトは、1つのウェルで一回行う。
【０１８６】
安定な表現形を獲得させた後、2組のサプレッサー細胞：(1) 放射線照射を受けた動物
から単離したサプレッサー細胞；及び(2) 放射線照射を受けていない動物から単離したサ
プレッサー細胞を用いて、shRNAで処理したT細胞を抗原又は抗CD3＋抗CD28の存在下、サ
プレッサー細胞と共にインキュベートする。続いて、引用により本明細書に組み込まれて
いるDolcettiらの文献、Current Protocols in Immunlogy, 14.17.1-14.17.25 (2010)に
記載の手順と実質的に同様の手順を用いて、3[H]-チミジンの取り込みをモニタリングす
ることにより、T細胞の増殖を個々のウェル中で評価する。
【０１８７】
非標的対照shRNAで処理したT細胞においては、増殖が抑制されるのに対し、免疫反応を
負に調節する（阻害する）標的遺伝子の不活性化は、反応の増進（抑制の低下）をもたら
すことが期待される。さらに、T細胞及び/又は放射線照射を受けた動物から単離したサプ
レッサー細胞の反応を、T細胞及び/又は放射線照射を受けていない動物から単離したサプ
レッサー細胞の反応と対比させ、同じインビトロ抑制アッセイで比較する。放射線照射を
受けた動物から単離したサプレッサー細胞と組合わせた場合、T細胞反応の阻害に関与す
る遺伝子のノックアウト又はノックダウンを含む試料において、有意により良好なT細胞
の増殖（すなわち、T細胞の抑制の低下）が観察されると期待される。そのような遺伝子
を、癌治療の標的として、特に、それを阻害することにより潜在的にアブスコパル効果を
誘導することができる標的として同定する。
【０１８８】
（6.2 実施例2：プール内インビトロスクリーニング）
別のインビトロアプローチでは、96ウェルプレート中のアレイ化形式で行うのではなく
、サプレッサー細胞との共培養であるT細胞のプールとして行う点を除いて、先に記載さ
れたものと本質的に同じ方法を使用することができる。T細胞を候補遺伝子のノックダウ
ン又はノックアウトを仲介することができるベクターを有するレンチウイルスに感染させ
、厳密にただ一つの細胞がただ1つの弱められた遺伝子を有するものとする。それぞれの
遺伝子は、少なくとも500〜1000個の細胞を代表として有する。T細胞抑制アッセイを、抑
制的微小環境中で抑制を免れ、かつ増殖することができる任意の細胞が富化するように、
プールとして実施する。対象となるベクターを有する細胞はゲノム中に組み込んでおり、
従ってベクターの配列決定により、プール中のそれぞれのベクターの相対的表現が決定さ
れ、特定のベクターが少しでも多くの比率を占める（又は少ない比率を占める）ならば、
T細胞免疫への阻害効果における候補遺伝子の関与を評価することに決定する。
【０１８９】
（6.3 実施例3：アブスコパル効果を誘導するための標的のインビボスクリーニング）
候補遺伝子の機能、一部の例では、先に記載のインビトロアッセイからアブスコパル効
果の仲介因子として同定された候補遺伝子を、2つの腫瘍が動物において遠位に移植され
、一方の腫瘍のみが放射線照射を受けるインビボ系において試験する。放射線照射を受け
ていない腫瘍への抗腫瘍効果を測定する。遺伝子が放射線照射による免疫抑制反応を仲介
するのに重要であるならば、それをT細胞においてノックダウン又はノックアウトするこ
とにより、未処置の腫瘍の抗腫瘍効果が大きく増進する。
【０１９０】
ナイーブT細胞を野生型マウス又はTCRを操作されたマウスから単離し、先に記載のイン
ビトロプール内スクリーニングアプローチと同様の、プール化レンチウイルスアプローチ
を用いて対象となるレンチウイルスベクターで形質導入する。T細胞に対象となるベクタ
ーを安定形質導入した後、それぞれの遺伝子について500〜1000個を代表として、これら
の細胞を二つの腫瘍を有するマウスに注射して戻す。
【０１９１】
1組の動物について、2つの腫瘍の一方のみを、1〜20 Gyの単一の線量の放射線で放射線
照射する。第2の組の動物について、腫瘍に放射線照射を行わない。放射線照射に続く7〜
20日の期間の後、形質導入されたT細胞（これは、腫瘍を有する動物に由来する内在のT細
胞には発現しないか、又は細胞に導入されたベクターによって共発現される、細胞表面上
の特定のコンジェニックマーカーの発現によって識別することができる）を、流出領域リ
ンパ節、非流出領域リンパ節、脾臓、及び放射線照射を受けていない腫瘍から単離する。
【０１９２】
T細胞からゲノムDNAを抽出し、特定のベクターを増幅し、次世代配列決定法を用いて配
列決定する。アブスコパル効果の誘導に関与する候補遺伝子を含むT細胞は、増殖の増進
を示すと期待される。対象となる遺伝子がノックダウン又はノックアウトされ、かつ原発
性腫瘍が除去放射線照射の存在下にある場合にのみ、T細胞の活性化及び増殖が起こると
期待される。従って、反対側の腫瘍が放射線照射を受け、対象となる遺伝子がノックダウ
ンされた場合に、この活性化は未処置の腫瘍に浸潤するT細胞において、及び／または、
未処置の腫瘍の縮小において明白となるはずである。対照的に、放射線照射を受けていな
いマウスにおいては、T細胞の活性化は低く、又は無視できる程度であると予想される。
【０１９３】
（6.4 実施例4：インビボshRNAスクリーニング）
Gタンパク質共役型受容体（GPCR）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（TNFRSF
）、及び免疫グロブリンスーパーファミリーライブラリ（IgSF）を標的とする、二腫瘍マ
ウスモデルにおけるインビボスクリーニングを実施した。650個のshRNAの結果によって代
表される、全部で134個の候補遺伝子をスクリーニングした。ここで、これらのファミリ
ーのそれぞれの候補遺伝子につき4〜5個のshRNAを代表とした。いくつかの遺伝子につい
て、shRNAは初期T細胞集団と比較して、試験組織において多くの比率を占めていた。この
ことは、試験対象の一方の腫瘍が標的化された放射線を受けた場合、TCRによる腫瘍抗原
との認識とは無関係に、shRNAを組み込んでいるT細胞クローンの増殖が増進し、かつ該T
細胞クローンが蓄積することを示していた。従って、これらの遺伝子は、単独で又は放射
線との組合わせで、癌治療の標的として同定された。これらの同定された標的の妥当性は
、追加の試験によってさらに裏付けることができる。反対に、試験組織におけるshRNAの
選択的欠落を伴う遺伝子は、これらの遺伝子がT細胞の活性化及び阻害において重要な役
割を担う可能性が高いことを示唆する。
【０１９４】
（プール化shRNAライブラリの構築）
Gタンパク質共役型受容体（GPCR）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（TNFRSF
）、及び免疫グロブリンスーパーファミリーライブラリ（IgSF）を標的とする3つのshRNA
プールを、それぞれの標的遺伝子に対してサブクローニングされた4〜5個のshRNAによっ
て作製した。全てのshRNAコンストラクトを設計し、pLKO.3-Thy1.1にアニーリングされた
オリゴヌクレオチドを連結することにより、構築した。pLKO.3-Thy1.1は、マウスナイー
ブCD8+ T細胞において、レンチウイルス形質導入によりThy1.1及びshRNAを共発現するも
のである。それぞれのshRNAのプールには、21個の緑色蛍光タンパク質（GFP）、16個の赤
色蛍光タンパク質（RFP）、25個のルシフェラーゼ、及び20個のLacZを含む、82個の陰性
対照shRNAを含めた。
【０１９５】
（初代マウスナイーブCD8+ T細胞のレンチウイルス形質導入）
初代マウスナイーブCD8+ T細胞をマウスナイーブCD8+ T細胞単離キット（Miltenyi Bio
tec）を用いることによって、OT-1トランスジェニックマウス（C57BL/6-Tg（TcraTcrb）1
100Mjb/J, The Jackson laboratory）から単離し、低感染多重度（MOI）のレンチウイル
スのプールで形質導入した。レンチウイルスの形質導入の前に、単離されたナイーブCD8+
T細胞を完全RPMI培地（RPMI 1640、10％ FBS、20 mM HEPES、1 mM ピルビン酸ナトリウ
ム、0.05 mM 2-メルカプトエタノール、2 mM L-グルタミン、100 μg/mlストレプトマイ
シン及び100 μg/mlペニシリン）中のIL-7（5 ng/ml）及びIL 15（100 ng/ml）と共に48
時間培養した。CD8+ T細胞（ウェル当たり8×106細胞）を硫酸プロタミン（5 μg/ml）を
補充したレンチウイルスプールと共に、レトロネクチン試薬（5 μg/ml）でプレコートし
た6ウェルプレートに播種し、25〜50のMOIで遠心接種により感染させた。OT-I CD8+ T細
胞をIL-7（2.5 ng/ml）、IL-15（50 ng/ml）、及びIL-2（2 ng/ml）を含む完全RPMI培地
中でさらに培養し、その後レンチウイルス感染を行った。感染から48時間後、ウイルスの
感染性をThy1.1の発現によって調べた。Thy1.1の発現は、抗Thy1.1-PE抗体を用いたフロ
ーサイトメトリーによって分析した。
【０１９６】
（CD8+ T細胞の腫瘍を有するマウスへの養子移入による腫瘍の治療）
B16-Ova細胞（50 μl中1.5×105細胞）を雄性C57BL/6マウス（10週齢）への表皮注射に
より接種し、接種後3日ごとに腫瘍サイズを測定し、長さ×幅として計算した。9日目に、
脚及び脇腹に同程度のサイズの腫瘍を有する30頭の腫瘍を有するマウスを、非放射線照射
（非IR）及び放射線照射（IR）として2群に分けた。放射線照射群は、9日目にshepherdセ
シウム照射装置を用いてIRの右脚の腫瘍に12 Gyで処置した。11日目に、shRNAプールに感
染させたThy1.1陽性CD8+ T細胞を、感染後72時間にThy1.1を選択マーカーとして用いてPE
ポジティブ選択（EasySep（商標）PEポジティブ選択キット, Stem Cells Technologies）
により単離した。Thy1.1陽性度90％の単離されたCD8+ T細胞（200 ul中5×106細胞）を後
眼窩注射によってB16-Ova腫瘍を有するC57BL/6マウスに注射した。腫瘍サイズを移入後2
日ごとに測定し、長さ×幅として計算した。最長軸上に20 mm以上の腫瘍を有するマウス
は安楽死させた。
【０１９７】
（腫瘍を有する養子移入されたC57BL/6からThy1.1陽性のCD8+ T細胞を単離する）
リンパ球を、非IR及びIRマウスの脾臓、流入領域リンパ節、非流入領域リンパ節から単
離した。腫瘍に浸潤したリンパ球（TIL）を脚及び脇腹の腫瘍から精製し、B16-Ova腫瘍を
マウスから採取し、2％ FBSを含むPBSで洗浄した。腫瘍を2％ FBS、50 U/ml IV型コラゲ
ナーゼ（Invitrogen）、及び20 U/ml DNaseI（Roche）を含む15 ml RPMI中に再懸濁し、3
7℃で2時間インキュベートした。TILをLympholyte-M（Cedarlane Laboratories）を用い
ることによりさらに単離した。精製されたリンパ球を、抗Vα2-FITC抗体、抗Thy1.1-PE抗
体、抗β5V-PerCP抗体、抗CD45-APC抗体、及び抗CD8-eFlour450抗体を用いて蛍光標識し
た。shRNA発現Thy1.1陽性CD8+ T細胞（CD8+Vα2+Vβ5+Thy1.1+）をそれぞれの試料から、
FACSAria（BD Biosciences）を用いた蛍光活性化細胞選別（FACS）によって選別した。
【０１９８】
（Illumina MiSeq遺伝子分析装置を用いたディープシークエンシング）
収集した試料のゲノムDNAを単離し（DNeasy血液＆組織キット, QIAGEN）、該ゲノムDNA
は、ディープシークエンシングアッセイ用のshRNAカセット由来のPCRアンプリコンを生成
するための鋳型としての機能を果たした。それぞれのプール中のshRNAの代表を、Illumin
a製MiSeqを用いたディープシークエンシングによって分析した。データを、それぞれのプ
ールにおける対照shRNAの平均リードを用いて正規化した。
【０１９９】
（ディープシークエンシングデータの統計解析）
リードを、Bowtie2を用いて、プールshRNAライブラリのFASTAファイルにマッピングし
た。倍数変化の計算においてゼロで割ることを避けるため、1単位をそれぞれのクローン
の生のカウントに加えた。続いて、それぞれの試料について、カウントデータをその試料
の総リード数に対して正規化した。それぞれのクローンに対する正規化したリードカウン
トを、100万リード当たりのリード（「RPM」）として表した。正規化したリードカウント
は、倍数変化の計算に使用した。
【０２００】
以下の表1〜3に示されるように、134遺伝子（650個のshRNAクローン）を対象としたこ
のスクリーニングの間に、いくつかの遺伝子標的が同定された。例えば、2つの関連するs
hRNAクローンの発現レベルが、脚の腫瘍から取得したThy1.1陽性CD8+ T細胞において、そ
の脚の腫瘍に放射線照射を受けたマウス由来の脾臓から取得した細胞と比較して、2倍超
高かった22個の標的遺伝子を同定した。
表1：T細胞由来のshRNA発現の倍数差：非放射線照射脚腫瘍対非放射線照射脾臓
【表１】
2020054361.tif 000007
NR: 非放射線照射
NR-脚: 放射線照射を受けていない脚由来の腫瘍
NR-脾臓: 放射線照射を受けていないマウス由来の脾臓
*脚の腫瘍のみが放射線照射を受け、脇腹の腫瘍は放射線照射を受けていない
表2：T細胞由来のshRNA発現の倍数差：非放射線照射脇腹腫瘍対非放射線照射脾臓
2020054361.tif 000008
NR: 非放射線照射
NR-脚: 放射線照射を受けていない脚由来の腫瘍
NR-脾臓: 放射線照射を受けていないマウス由来の脾臓
*脚の腫瘍のみが放射線照射を受け、脇腹の腫瘍は放射線照射を受けていない
表3：T細胞由来のshRNA発現の倍数差：放射線照射脚腫瘍対脚腫瘍に放射線照射を受けた
脾臓
2020054361.tif 000009
R-脚: 放射線照射を受けた脚の腫瘍由来の腫瘍
R-脾臓: 脚の腫瘍に放射線照射を受けたマウス由来の脾臓
*脚の腫瘍のみが放射線照射を受け、脇腹の腫瘍は放射線照射を受けていない
【０２０１】
ある特定の実施態様の例が本明細書で提供されるが、当業者には、様々な変更及び改変
を加えることができることが明らかであろう。また、そのような改変は、本件開示の範囲
内にあるものとする。
本件出願は、以下の構成の発明を提供する。
（構成１）
癌治療の標的遺伝子を同定する方法であって、非改変T細胞の活性及び改変T細胞の活性
を測定することであって；該非改変T細胞及び該改変T細胞が、それぞれ放射線照射を受け
た腫瘍を有する対象に由来する腫瘍微小環境と接触しており；該改変T細胞が候補遺伝子
をノックダウン又はノックアウトされている、前記測定することを含み、ここで該改変T
細胞を該非改変T細胞と比較した際に、該活性が増加している場合に、該候補遺伝子を癌
治療の標的遺伝子として同定する、前記方法。
（構成２）
前記対象が、1 Gy〜20 Gyの線量で、腫瘍を標的とした放射線を受けている、構成1記載
の方法。
（構成３）
前記活性が、増殖、細胞周期の活性化、細胞死の阻害、サイトカイン産生、及び細胞傷
害性活性からなる群から選択される、構成1又は2記載の方法。
（構成４）
それぞれ放射線照射を受けていない腫瘍を有する対象に由来する腫瘍微小環境と接触し
た、前記非改変T細胞の活性及び前記改変T細胞の活性を測定することをさらに含み；ここ
で該非改変T細胞及び該改変T細胞における活性が実質的に同じである、構成1〜3のいずれ
か1項記載の方法。
（構成５）
癌治療の標的遺伝子を同定するインビボ方法であって、
(i) 非改変T細胞及び改変T細胞を放射線照射を受けた腫瘍を有する試験対象に注射する
ことであって；該改変T細胞が、候補遺伝子をノックダウン又はノックアウトされている
、前記注射すること、並びに
(ii) 該試験対象における該非改変T細胞の活性及び該改変T細胞の活性を測定すること
であって、該活性が、増殖活性又は抗腫瘍活性である、前記測定すること、を含み、
ここで、該改変T細胞を該非改変T細胞と比較した際に、該活性が増加している場合に、
該候補遺伝子を癌治療の標的遺伝子として同定する、前記方法。
（構成６）
前記改変T細胞が参照T細胞である、構成5記載の方法。
（構成７）
前記対象が、1 Gy〜20 Gyの線量で、腫瘍を標的とした放射線を受けている、構成5記載
の方法。
（構成８）
前記非改変T細胞及び前記改変T細胞を、放射線照射を受けていない試験対象に注射する
ことをさらに含み、ここで該放射線照射を受けていない試験対象において該改変T細胞を
該非改変T細胞と比較した際に、前記活性が実質的に同じである、構成5記載の方法。
（構成９）
前記活性が、注射されたT細胞の蓄積により測定される増殖活性である、構成5〜8のい
ずれか1項記載の方法。
（構成１０）
前記活性が、腫瘍細胞の死又は腫瘍サイズの低下により測定される抗腫瘍活性である、
構成5〜8のいずれか１項記載の方法。
（構成１１）
前記活性が、試験対象の生存の増加により測定される抗腫瘍活性である、構成5〜8のい
ずれか1項記載の方法。
（構成１２）
前記試験対象がマウスである、構成5〜11のいずれか1項記載の方法。
（構成１３）
前記マウスが二腫瘍マウスであり、一方の腫瘍のみが標的化された放射線を受けている
、構成12記載の方法。
（構成１４）
前記活性が、放射線照射を受けていない腫瘍のサイズの低下により測定される抗腫瘍活
性である、構成13記載の方法。
（構成１５）
前記T細胞がナイーブT細胞である、構成1〜14のいずれか1項記載の方法。
（構成１６）
前記T細胞がCD8+ T細胞である、構成1〜14のいずれか1項記載の方法。
（構成１７）
前記T細胞がマウスから単離されたものである、構成1〜14のいずれか1項記載の方法。
（構成１８）
前記マウスが野生型である、構成17記載の方法。
（構成１９）
前記マウスが、マウスにおいて天然には存在しない抗原に対して特異的なT細胞受容体
を発現するように遺伝子操作されている、構成17記載の方法。
（構成２０）
前記抗原がオボアルブミンである、構成19記載の方法。
（構成２１）
前記T細胞が標識されている、構成1〜20のいずれか1項記載の方法。
（構成２２）
前記標識がカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（CFSE）である、構成
21記載の方法。
（構成２３）
前記候補遺伝子が、shRNAによってノックダウン又はノックアウトされている、構成1〜
22のいずれか1項記載の方法。
（構成２４）
ウイルスベクターが、レンチウイルスベクターである、構成23記載の方法。
（構成２５）
前記候補遺伝子が、転写活性化様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）を用いることに
より、前記改変T細胞においてノックダウン又はノックアウトされている、構成1〜22のい
ずれか1項記載の方法。
（構成２６）
前記候補遺伝子が、CAS9（CRISPR）を用いることにより、前記改変T細胞においてノッ
クダウン又はノックアウトされている、構成1〜22のいずれか1項記載の方法。
（構成２７）
癌治療の標的遺伝子を同定するプールスクリーニング方法であって、
(i) 異なる遺伝学的改変を有するT細胞の初期集団を調製することであって、それぞれ
のT細胞が多くとも1つの候補遺伝子をノックダウン又はノックアウトされている、前記調
製すること；及び
(ii) 該T細胞の初期集団をある期間にわたり放射線照射を受けた腫瘍を有する対象に由
来する腫瘍微小環境と接触させて、T細胞の選択された集団を産生すること、を含み、
ここで、該T細胞の選択された集団においてノックダウン又はノックアウトされている
該候補遺伝子を、癌治療の該標的遺伝子であると同定する、前記プールスクリーニング方
法。
（構成２８）
癌治療の標的遺伝子を同定するインビボプールスクリーニング方法であって、
(i) 異なる遺伝学的改変を有するT細胞の初期集団を調製することであって、それぞれ
のT細胞が多くとも1つの候補遺伝子をノックダウン又はノックアウトされている、前記調
製すること；及び
(ii) 該T細胞の初期集団を放射線照射を受けた腫瘍を有する対象に注射することであっ
て、該T細胞の初期集団が該対象においてT細胞の選択された集団を産生する、前記注射す
ること、を含み、
ここで、該T細胞の選択された集団においてノックダウン又はノックアウトされている
該候補遺伝子を、癌治療の該標的遺伝子であると同定する、前記プールスクリーニング方
法。
（構成２９）
T細胞の初期集団を調製することが、転写活性化様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）
を用いることを含む、構成27又は28記載のプールスクリーニング方法。
（構成３０）
T細胞の初期集団を調製することが、CAS9（CRISPR）を用いることを含む、構成27又は2
8記載のプールスクリーニング方法。
（構成３１）
T細胞の初期集団を調製することが、shRNAライブラリにT細胞を感染させることを含む
、構成27又は28記載のプールスクリーニング方法。
（構成３２）
前記shRNAライブラリがレンチウイルスベクターライブラリである、構成31記載のプー
ルスクリーニング方法。
（構成３３）
前記初期集団のT細胞がナイーブT細胞である、構成27〜32のいずれか1項記載のプール
スクリーニング方法。
（構成３４）
前記初期集団のT細胞がCD8+ T細胞である、構成27〜33のいずれか1項記載のプールスク
リーニング方法。
（構成３５）
前記初期集団のT細胞がマウスから単離されたものである、構成27〜34のいずれか1項記
載のプールスクリーニング方法。
（構成３６）
前記マウスが野生型である、構成35記載のプールスクリーニング方法。
（構成３７）
前記マウスが、マウスにおいて天然には存在しない抗原に対して特異的なT細胞受容体
を発現するように遺伝子操作されている、構成35記載のプールスクリーニング方法。
（構成３８）
前記抗原がオボアルブミンである、構成37記載のプールスクリーニング方法。
（構成３９）
前記T細胞の初期集団が標識されている、構成27〜38のいずれか1項記載のプールスクリ
ーニング方法。
（構成４０）
前記標識がカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（CFSE）である、構成
39記載のプールスクリーニング方法。
（構成４１）
前記T細胞の選択された集団を前記試験対象の試料から単離することを含む、構成27〜4
0のいずれか1項記載のプールスクリーニング方法。
（構成４２）
前記試料が腫瘍試料である、構成41記載のプールスクリーニング方法。
（構成４３）
前記腫瘍試料が標的化された放射線を受けたものである、構成42記載のプールスクリー
ニング方法。
（構成４４）
前記試験対象が二腫瘍モデルであり、かつ前記腫瘍試料が標的化された放射線を受けた
ものでない、構成42記載のプールスクリーニング方法。
（構成４５）
前記試料が非腫瘍試料である、構成41記載のプールスクリーニング方法。
（構成４６）
前記非腫瘍組織試料が脾臓試料又はリンパ節試料である、構成45記載のプールスクリー
ニング方法。
（構成４７）
前記T細胞の選択された集団においてノックダウン又はノックアウトされている候補遺
伝子を、該T細胞の選択された集団から単離されたゲノムDNAのNGSにより同定する、構成2
7〜46のいずれか1項記載のプールスクリーニング方法。
（構成４８）
前記初期集団のそれぞれのT細胞が多くとも1つの候補遺伝子に対するshRNAを有し、か
つ前記T細胞の初期集団と比較して、前記T細胞の選択された集団において該候補遺伝子に
対する該shRNAが富化されている場合に、該候補遺伝子を癌治療の標的遺伝子であると同
定する、構成31〜46のいずれか1項記載のプールスクリーニング方法。
（構成４９）
非腫瘍組織試料と比較して、腫瘍試料から取得した前記T細胞の選択された集団におい
て、候補遺伝子に対する前記shRNAが富化されている場合に、該候補遺伝子を癌治療の標
的遺伝子であると同定する、構成48記載のプールスクリーニング方法。
（構成５０）
前記非腫瘍組織試料と比較して、前記腫瘍試料において候補遺伝子に対する前記shRNA
が2倍超富化されている場合に、該候補遺伝子を標的遺伝子として同定する、構成48記載
のプールスクリーニング方法。
（構成５１）
前記非腫瘍組織試料と比較して、前記腫瘍試料において候補遺伝子に対する前記shRNA
が3倍超、4倍超、5倍超、10倍超、15倍超、又は20倍超富化されている場合に、該候補遺
伝子を標的遺伝子として同定する、構成48記載のプールスクリーニング方法。
（構成５２）
前記T細胞の選択された集団におけるshRNAをNGSにより定量化することを含む、構成48
〜51のいずれか1項記載のプールスクリーニング方法。
（構成５３）
T細胞の、構成1〜52のいずれか1項において同定された前記標的遺伝子を阻害すること
により、該T細胞を活性化させる方法。
（構成５４）
前記T細胞が腫瘍を有する対象において存在する、構成53記載の方法。
（構成５５）
前記腫瘍を有する対象が放射線照射を受けている、構成54記載の方法。
（構成５６）
それを必要とする対象において癌を治療するための方法であって、構成1〜52のいずれ
か1項において同定された前記標的遺伝子を阻害することを含む、前記方法。
（構成５７）
それを必要とする対象において癌を治療するための方法であって、構成1〜52のいずれ
か1項において同定された前記標的遺伝子が、ノックダウン又はノックアウトされているT
細胞を用いて、前記対象にT細胞療法を施すことを含む、前記方法。
（構成５８）
前記対象に、腫瘍を標的とした放射線を施すことをさらに含む、構成56又は57記載の方
法。
【図１】
2020054361.tif 000010
【図２】
2020054361.tif 000011
【配列表】
2020054361000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年12月24日(2019.12.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌治療の標的遺伝子を同定するインビトロ方法であって、非改変T細胞の活性及び改変T細胞の活性を測定することであって；該非改変T細胞及び該改変T細胞が、それぞれサプレッサー細胞と接触しており；該改変T細胞が候補遺伝子をノックダウン又はノックアウトされている、前記測定することを含み、ここで、該改変T細胞を該非改変T細胞と比較した際に、該活性が増加している場合に、該候補遺伝子を癌治療の該標的遺伝子として同定する、前記方法。
【請求項２】
癌治療の標的遺伝子を同定するインビトロ方法であって、
(1) それぞれ放射線照射を受けていない腫瘍を有する対象に由来するサプレッサー細胞の第1の集団と接触させた改変T細胞を非改変T細胞と比較した際の活性の増加を測定すること；及び
(2) それぞれ放射線照射を受けた腫瘍を有する対象に由来するサプレッサー細胞の第2の集団と接触させた該改変T細胞を該非改変T細胞と比較した際の活性の増加を測定すること、を含み、
ここで、該改変T細胞がそれぞれ候補遺伝子をノックダウン又はノックアウトされており；かつ
工程(1)で測定した増加よりも工程(2)で測定した増加が顕著である場合、該候補遺伝子を該標的遺伝子として同定する、前記方法。
【請求項３】
癌治療の標的を同定する方法であって、
(1) 放射線照射を受けていない腫瘍を有する対象から単離されたサプレッサー細胞と接触させた非改変T細胞の活性の抑制の程度を測定すること；
(2) 放射線照射を受けた腫瘍を有する対象から単離されたサプレッサー細胞と接触させた非改変T細胞の該活性の抑制の程度を測定すること；
(3) 放射線照射を受けた腫瘍を有する対象から単離されたサプレッサー細胞と接触させた改変T細胞の該活性の抑制の程度を測定することであって、該改変T細胞において候補遺伝子はノックアウト又はノックダウンされている、前記測定すること；
(4) 工程(1)と比較した、工程(2)におけるT細胞活性抑制の低下を決定すること；
(5) 工程(1)と比較した、工程(3)におけるT細胞活性抑制の低下を決定すること；並びに
(6) 工程(4)において決定された低下の差を、工程(5)において決定された低下の差と比較すること、を含み、
ここで、工程(5)で決定したT細胞抑制の低下の差が、工程(4)において決定した低下よりも大きい場合、該T細胞においてノックアウト若しくはノックダウンされた該候補遺伝子、又は該候補遺伝子によってコードされたタンパク質を、癌治療の標的として同定する、前記方法。
【請求項４】
前記活性が、増殖、細胞周期の活性化、細胞死の阻害、サイトカイン産生、及び細胞傷害性活性からなる群から選択される、請求項1〜3のいずれか1項記載の方法。
【請求項５】
前記T細胞が前記サプレッサー細胞の存在下で活性化される、請求項1〜3のいずれか1項記載の方法。
【請求項６】
前記T細胞が抗CD3及び抗CD28を用いて活性化される、請求項4記載の方法。
【請求項７】
前記候補遺伝子が：
(i) 転写活性化様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）を用いて；
(ii) CAS9（CRISPR）を用いて；又は
(iii) shRNAにより、前記改変T細胞においてノックダウン又はノックアウトされている、請求項1〜6のいずれか1項記載の方法。
【請求項８】
癌治療の標的を同定するインビトロプールスクリーニング方法であって、
(1) T細胞の第1の集団を、第1の細胞培養物において第1の腫瘍を有する対象から単離したサプレッサー細胞と共培養することであって、該腫瘍が放射線で処置されていない、前記共培養すること；
(2) T細胞の第2の集団を、第2の細胞培養物において第2の腫瘍を有する対象に由来するサプレッサー細胞と共培養することであって、該腫瘍が放射線で処置されている、前記共培養すること；
(3) 一連の候補遺伝子のノックダウン又はノックアウトを導入するように設計された遺伝子コンストラクトを含むウイルスベクターに、第1及び第2の細胞培養物を感染させ、かつさらに該細胞を培養すること；並びに
(4) 第1及び第2の細胞培養物中の1以上の遺伝子コンストラクトの相対レベルを決定すること、を含み、
ここで、第1の培養物と比較して第2の培養物において高レベルで存在すると決定される1以上の遺伝子コンストラクトによってノックダウン又はノックアウトされた該候補遺伝子、又は該候補遺伝子によってコードされたタンパク質を、標的であると同定する、前記方法。
【請求項９】
前記ウイルスベクターが、レンチウイルスベクターである、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
前記1以上の遺伝子コンストラクトの相対レベルを前記ウイルスベクターを配列決定することにより、任意に次世代配列決定法により決定する、請求項8又は9記載の方法。
【請求項１１】
前記サプレッサー細胞を任意に血液試料又は腫瘍を有する対象から単離する、請求項1〜10のいずれか1項記載の方法。
【請求項１２】
前記T細胞が：
(i) ナイーブT細胞； 
(ii) CD8+ T細胞であるか；又は
(iii) マウスから単離され、ここで任意に該マウスは、野生型マウス又はマウスにおいて天然には存在しない抗原に特異的なT細胞受容体を発現するように遺伝子操作されたマウスとし、任意に該抗原を、オボアルブミンとする、請求項1〜11のいずれか1項記載の方法。
【請求項１３】
前記対象が、1 Gy〜20 Gyの線量で、腫瘍を標的とした放射線を受けている、請求項2〜12のいずれか1項記載の方法。
【請求項１４】
前記T細胞が標識され、任意に該標識がカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（CFSE）である、請求項1〜13のいずれか1項記載の方法。
【請求項１５】
前記サプレッサー細胞又はサプレッサー細胞の集団が、制御性T細胞（Treg）、骨髄系由来サプレッサー細胞（MDSC）、又はTreg及びMDSCの両方を含む、請求項1〜14のいずれか1項記載の方法。