(57)【要約】【課題】新生物を処置するための新規な治療戦略を提供する。【解決手段】本発明は、一般的に、免疫細胞活性化活性を有する抗原結合受容体（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）、および免疫抑制活性を有する抗原（例えば、ＣＤ４７、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、およびそのリガンド）に結合する単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を発現し、それによって、抗原の免疫抑制活性を減少または除去する、免疫応答性細胞（例えば、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、制御性Ｔ細胞）を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権主張
この出願は、２０１３年２月２６日に出願された米国仮出願第６１／７６９，５４３号（この内容は、その全体が参考として本明細書に援用される）への優先権を主張する。
【０００２】
助成金の情報
この発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈから助成金番号ＣＡ９５１５２、ＣＡ１３８７３８、ＣＡ０５９３５０およびＣＡ０８７４８の下、政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
緒言
本発明は、癌および病原体に対する免疫応答を増強するための方法および組成物を提供する。本発明は、免疫調節分子の導入されたリガンドを発現するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であり得る抗原受容体を有する免疫応答性細胞に関する。特定の実施形態において、これら操作された免疫応答性細胞は、抗原指向性があり、免疫抑制に耐性があり、および／または増強された免疫活性化特性を有する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
現在、利用可能な治療法があるにもかかわらず、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病、および非ホジキンリンパ腫を含む大多数の成人Ｂ細胞悪性腫瘍は、不治である。遺伝子操作された自系Ｔ細胞を用いる養子療法は、メラノーマや無痛性のＢ細胞悪性腫瘍において治療的有効性の証拠を示してきた。そのような抗原に特異的な、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と名付けられた、人工的Ｔ細胞受容体をコードする遺伝子の導入を通じて、Ｔ細胞を、腫瘍関連抗原を標的にするように改変してもよい。免疫療法は、癌の処置を提供する可能性を有する標的治療である。
【０００５】
しかしながら、悪性腫瘍細胞は、免疫抑制性の微小環境を作り、自己を免疫認識および除去から保護するように順応する。この「過酷な（ｈｏｓｔｉｌｅ）」腫瘍微小環境が、標的Ｔ細胞治療などの、免疫応答の刺激に関する処置の方法を困難なものにしている。したがって、新形成を処置するための新規な治療戦略が緊急に必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、一般的に、免疫細胞活性化活性を有する抗原結合受容体（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）、および免疫抑制活性を有する抗原（例えば、ＣＤ４７、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、およびそのリガンド）に結合する単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を発現し、それによって、抗原の免疫抑制活性を減少または除去する、免疫応答性細胞（例えば、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、制御性Ｔ細胞）を提供する。
【０００７】
本発明はさらに、免疫細胞活性化活性を有する抗原結合受容体（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）、および免疫刺激性または炎症誘発性活性を有する抗原（例えば、ＣＤ２８、ＯＸ−４０、４−１ＢＢ、ＣＤ４０およびそのリガンド）に結合する単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を発現し、それによって、抗原の免疫刺激活性を増強する、免疫応答性細胞（例えば、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、制御性Ｔ細胞）を提供する。
【０００８】
本発明はさらに、免疫細胞活性化活性を有する抗原結合受容体（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）、およびＣＤ４０Ｌ、例えば、外因性のＣＤ４０Ｌ（細胞自身から生じる内因性のＣＤ４０Ｌに対して、直接的もしくは（例えば、ＣＤ４０Ｌをコードする核酸配列を含むネイキッド核酸のベクターを介して）間接的に細胞に導入されたＣＤ４０Ｌ）を発現し、それによって、抗原の免疫刺激活性を増強する、免疫応答性細胞（例えば、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、制御性Ｔ細胞）を提供する。
【０００９】
したがって、本発明は、そのような免疫応答性細胞を用いる、新形成、感染症、および他の病理的状態を処置するための方法を提供する。
【００１０】
ある局面において、本発明は、単離された免疫応答性細胞であって、抗原に結合し、その結合が免疫応答性細胞を活性化する抗原認識受容体、および免疫抑制活性または免疫刺激活性を有するポリペプチドに結合する可溶性単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む単離された免疫応答性細胞を提供する。
【００１１】
別の局面において、本発明は、被験体において新形成を処置または防止する方法であって、該方法は、第一抗原に結合し、その結合が免疫応答性細胞を活性化する抗原認識受容体、および免疫抑制活性または免疫刺激活性を有するポリペプチドに結合する可溶性単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む有効量の免疫応答性細胞を被験体に投与することを含み、それによって、被験体において、新形成を処置または防止する方法を提供する。非限定的ないくつかの実施形態では、抗原認識受容体は、ＣＡＲである。
【００１２】
別の局面において、本発明は、被験体において腫瘍負荷を減少させる方法であって、該方法は、第一抗原に結合し、その結合が免疫応答性細胞を活性化する抗原認識受容体、および免疫抑制活性または免疫刺激活性を有するポリペプチドに結合する可溶性単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む有効量の免疫応答性細胞を被験体に投与することを含み、それによって、被験体において腫瘍細胞死を誘導する方法を提供する。さらに別の局面において、本発明は、新形成を有する被験体の生存を延ばす方法であって、該方法は、第一抗原に結合し、その結合が免疫応答性細胞を活性化する抗原認識受容体、および免疫抑制活性または免疫刺激活性を有するポリペプチドに結合する可溶性単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む有効量の免疫応答性細胞を被験体に投与することを含み、それによって、被験体の生存を延ばす方法を提供する。非限定的ないくつかの実施形態では、抗原認識受容体は、ＣＡＲである。
【００１３】
種々の非限定的な実施形態では、本発明は、被験体において、癌細胞に応答して免疫活性化サイトカイン産生を増加させる方法であって、癌細胞の抗原に結合する抗原認識受容体を有し、さらに外因性のＣＤ４０Ｌを発現する免疫応答性細胞を被験体に投与することを含む方法を提供する。特定の非限定的な実施形態では、免疫活性化サイトカインは、ＩＬ−１２である。非限定的ないくつかの実施形態では、抗原認識受容体は、ＣＡＲである。
【００１４】
種々の非限定的な実施形態では、本発明は、被験体において、病原体に応答して免疫活性化サイトカイン産生を増加させる方法であって、病原体の抗原に結合する抗原認識受容体を有し、さらに外因性のＣＤ４０Ｌを発現する免疫応答性細胞を被験体に投与することを含む方法を提供する。特定の非限定的な実施形態では、免疫活性化サイトカインは、ＩＬ−１２である。非限定的ないくつかの実施形態では、抗原認識受容体は、ＣＡＲである。
【００１５】
種々の非限定的な実施形態では、本発明は、被験体において、癌細胞に対するＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞応答を増大させる方法であって、癌細胞の抗原に結合する抗原認識受容体を有し、さらに外因性のＣＤ４０Ｌを発現する免疫応答性細胞を被験体に投与することを含む方法を提供する。非限定的ないくつかの実施形態では、抗原認識受容体は、ＣＡＲである。
【００１６】
種々の非限定的な実施形態では、本発明は、被験体において、病原体に対するＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞応答を増大させる方法であって、病原体の抗原に結合する抗原認識受容体を有し、さらに外因性のＣＤ４０Ｌを発現する免疫応答性細胞を被験体に投与することを含む方法を提供する。非限定的ないくつかの実施形態では、抗原認識受容体は、ＣＡＲである。
【００１７】
種々の非限定的な実施形態では、本発明は、癌を有する被験体において、樹状細胞成熟を促進する方法であって、癌の細胞の抗原に結合する抗原認識受容体を有し、さらに外因性のＣＤ４０Ｌを発現する免疫応答性細胞を被験体に投与することを含む方法を提供する。非限定的ないくつかの実施形態では、抗原認識受容体は、ＣＡＲである。
【００１８】
種々の非限定的な実施形態では、本発明は、病原体によって引き起こされる疾患を有する被験体において、樹状細胞成熟を促進する方法であって、病原体の抗原に結合する抗原認識受容体を有し、さらに外因性のＣＤ４０Ｌを発現する免疫応答性細胞を被験体に投与することを含む方法を提供する。非限定的ないくつかの実施形態では、抗原認識受容体は、ＣＡＲである。
【００１９】
さらに別の局面において、本発明は、被験体において新形成を処置または防止する方法であって、該方法は、第一抗原に結合し、その結合が免疫応答性細胞を活性化する抗原認識受容体を有し、外因性のＣＤ４０Ｌを発現する有効量の免疫応答性細胞を被験体に投与することを含み、それによって、被験体において新形成を処置または防止する方法を提供する。非限定的ないくつかの実施形態では、抗原認識受容体は、ＣＡＲである。
【００２０】
別の局面において、本発明は、被験体において腫瘍負荷を減少させる方法であって、該方法は、第一抗原に結合し、その結合が免疫応答性細胞を活性化する抗原認識受容体を有し、外因性のＣＤ４０Ｌを発現する有効量の免疫応答性細胞を被験体に投与することを含み、それによって、被験体において腫瘍細胞死を誘導する方法を提供する。さらに別の局面において、本発明は、新形成を有する被験体の生存を伸ばす方法であって、該方法は、第一抗原に結合し、その結合が免疫応答性細胞を活性化する抗原認識受容体を有し、外因性のＣＤ４０Ｌを発現する有効量の免疫応答性細胞を被験体に投与することを含み、それによって、被験体の生存を延ばす方法を提供する。
【００２１】
さらにまた別の局面においては、本発明は、血液の癌の処置を必要とする被験体において、血液の癌を処置する方法であって、該方法は、ＣＤ１９に結合し、その結合が免疫応答性細胞を活性化する抗原認識受容体、ならびにＣＤ４７、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４およびそのリガンドの１以上に結合する可溶性単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む治療的に有効な量のＴ細胞を被験体に投与することを含み、それによって、被験体において血液の癌を処置する方法を提供する。非限定的ないくつかの実施形態では、抗原認識受容体は、ＣＡＲである。
【００２２】
さらにまた別の局面においては、本発明は、血液の癌の処置を必要とする被験体において、血液の癌を処置する方法であって、該方法は、ＣＤ１９に結合し、その結合が免疫応答性細胞を活性化する抗原認識受容体を有し、外因性のＣＤ４０Ｌを発現する治療的に有効な量のＴ細胞を被験体に投与することを含み、それによって、被験体において血液の癌を処置する方法を提供する。非限定的ないくつかの実施形態では、抗原認識受容体は、ＣＡＲである。
【００２３】
ある局面において、本発明は、抗原特異的免疫応答性細胞を産生する方法であって、該方法は、免疫応答性細胞に、免疫抑制活性または免疫刺激活性を有するポリペプチドに結合する単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）をコードする核酸配列を導入することを含み、免疫応答性細胞は、抗原に結合する抗原認識受容体を含む、方法を提供する。非限定的ないくつかの実施形態では、抗原認識受容体は、ＣＡＲである。
【００２４】
ある局面において、本発明は、抗原特異的免疫応答性細胞を産生する方法であって、該方法は、免疫応答性細胞に、ＣＤ４０Ｌをコードする核酸配列を導入することを含み、免疫応答性細胞は、抗原に結合する抗原認識受容体を含む、方法を提供する。非限定的ないくつかの実施形態では、ＣＤ４０Ｌをコードする核酸配列は、操作可能にプロモーターエレメントに構成的に連結しているか、または、ベクター中に任意に含まれる免疫応答性細胞中に誘発可能に発現している。非限定的ないくつかの実施形態では、抗原認識受容体は、ＣＡＲである。非限定的ないくつかの実施形態では、本発明は、ＣＡＲをコードする配列およびＣＤ４０Ｌをコードする配列を含む核酸であって、それぞれは任意に操作可能にプロモーターエレメントに構成的に連結しているか、または、免疫応答性細胞中に誘発可能に発現している核酸を提供する。前記核酸は、任意にベクター中に含まれていてもよい。ある局面において、本発明は、抗原に結合する抗原認識受容体をコードする核酸配列と、免疫抑制活性または免疫刺激活性を有するポリペプチドに結合する可溶性単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）をコードする核酸配列を含むベクターを提供する。非限定的ないくつかの実施形態では、抗原認識受容体は、ＣＡＲである。
【００２５】
ある局面において、本発明は、抗原に結合する抗原認識受容体をコードする核酸配列と、ＣＤ４０Ｌをコードする核酸配列を含むベクターを提供する。非限定的ないくつかの実施形態では、抗原認識受容体は、ＣＡＲである。ある特定の非限定的な実施形態では、本発明は、抗ＣＤ１９  ＣＡＲ（１９２８ｚ）−をコードする核酸およびＣＤ４０Ｌ−をコードする核酸を含有するレトロウイルスベクターを提供する。
【００２６】
関連する局面において、本発明は、有効量の、本明細書に記載の本発明のいずれかの局面に記載の免疫応答性細胞を、薬学的に許容され得る賦形剤中に含む医薬組成物を提供する。別の関連する局面において、本発明は、新形成を処置するための医薬組成物であって、有効量の、本明細書に記載の本発明のいずれかの局面に記載の腫瘍抗原特異的Ｔ細胞を、薬学的に許容され得る賦形剤中に含む医薬組成物を提供する。
【００２７】
追加的局面において、本発明は、新形成、病原体感染、自己免疫障害、または同種異系移植片を処置するためのキットであって、抗原に結合し、免疫応答性細胞を活性化する抗原認識受容体と、免疫抑制活性または免疫刺激活性を有するポリペプチドに結合する可溶性単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を有する免疫応答性細胞を含むキットを提供する。非限定的ないくつかの実施形態では、抗原認識受容体は、ＣＡＲである。いくつかの特定の実施形態において、キットは、新形成、病原体感染、自己免疫障害、または同種異系移植片を有する被験体を処置するために上記細胞を使用するための説明書をさらに含む。
【００２８】
追加的局面において、本発明は、新形成、病原体感染、自己免疫障害、または同種異系移植片を処置するためのキットであって、抗原に結合し、免疫応答性細胞を活性化する抗原認識受容体を有し、外因性のＣＤ４０Ｌを発現する免疫応答性細胞を含むキットを提供する。非限定的ないくつかの実施形態では、抗原認識受容体は、ＣＡＲである。いくつかの特定の実施形態において、キットは、新形成、病原体感染、自己免疫障害、または同種異系移植片を有する被験体を処置するために上記細胞を使用するための説明書をさらに含む。
【００２９】
追加的局面において、本発明は、新形成、病原体感染、自己免疫障害、または同種異系移植片を処置するためのキットであって、処置されるべき新形成、病原体感染、自己免疫障害、または同種異系移植片の抗原を認識するＣＡＲをコードする核酸、および免疫抑制活性または免疫刺激活性を有するポリペプチドに結合する可溶性単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）をコードする核酸を含むキットを提供する。任意に一方または双方の核酸は、ベクターに含まれていてもよく、それらは、同じベクター（バイシストロニック）でもよいし別個のベクターでもよい。ＣＡＲをコードする核酸および／またはｓｃＦｖをコードする核酸は、それぞれ操作可能にプロモーターに連結していてもよく、そのプロモーターは同じであってもよいし、異なっていてもよい。いくつかの特定の実施形態において、キットは、新形成、病原体感染、自己免疫障害、または同種異系移植片を有する被験体を処置するために上記細胞を使用するための説明書をさらに含む。
【００３０】
追加的局面において、本発明は、癌を処置するためのキットであって、癌の抗原を認識するＣＡＲをコードする核酸、および免疫抑制活性または免疫刺激活性を有するポリペプチドに結合する可溶性単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）をコードする核酸を含むキットを提供する。任意に一方または双方の核酸は、ベクターに含まれていてもよく、それらは、同じベクター（バイシストロニック）でもよいし別個のベクターでもよい。ＣＡＲをコードする核酸および／またはｓｃＦｖをコードする核酸は、それぞれ操作可能にプロモーターに連結していてもよく、そのプロモーターは同じであってもよいし、異なっていてもよい。いくつかの特定の実施形態において、キットは、癌を有する被験体を処置するために上記細胞を使用するための説明書をさらに含む。
【００３１】
追加的局面において、本発明は、癌または病原体が媒介する障害を処置するためのキットであって、癌または病原体の抗原を認識するＣＡＲをコードする核酸、および免疫抑制活性または免疫刺激活性を有するポリペプチドに結合する可溶性単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）をコードする核酸を含むキットを提供する。任意に一方または双方の核酸は、ベクターに含まれていてもよく、それらは、同じベクター（バイシストロニック）でもよいし別個のベクターでもよい。ＣＡＲをコードする核酸および／またはｓｃＦｖをコードする核酸は、それぞれ操作可能にプロモーターに連結していてもよく、そのプロモーターは同じであってもよいし、異なっていてもよい。いくつかの特定の実施形態において、キットは、癌または障害を有する被験体を処置するために上記細胞を使用するための説明書をさらに含む。追加的局面において、本発明は、癌または病原体が媒介する障害の処置のためのキットであって、癌または病原体の抗原を認識するＣＡＲをコードする核酸、およびＣＤ４０Ｌをコードする核酸を含むキットを提供する。任意に一方または双方の核酸は、ベクターに含まれていてもよく、それらは、同じベクター（バイシストロニック）でもよいし別個のベクターでもよい。ＣＡＲをコードする核酸および／またはＣＤ４０Ｌをコードする核酸は、それぞれ操作可能にプロモーターに連結していてもよく、そのプロモーターは同じであってもよいし、異なっていてもよい。いくつかの特定の実施形態において、キットは、癌または障害を有する被験体を処置するために上記細胞を使用するための説明書をさらに含む。
【００３２】
本明細書に記載される局面のいずれかの種々の実施形態では、細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、制御性Ｔ細胞、ヒト胚性幹細胞、およびそこからリンパ系細胞が分化され得る多能性幹細胞からなる群より選択される。本明細書に記載される局面のいずれかの種々の実施形態では、免疫応答性細胞は、自系である。
【００３３】
本明細書に記載される局面のいずれかの種々の実施形態では、抗原認識受容体は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。本明細書に記載される局面のいずれかの種々の実施形態では、抗原認識受容体は、外因性または内因性である。本明細書に記載される局面のいずれかの種々の実施形態では、抗原認識受容体は、組み換え的に発現する。本明細書に記載される局面のいずれかの種々の実施形態では、抗原認識受容体は、ベクターから発現される。本明細書に記載される局面のいずれかの種々の実施形態では、抗原認識受容体の細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤζ鎖、ＣＤ３ζ鎖、ＣＤ９７、ＣＤ１１ａ−ＣＤ１８、ＣＤ２、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＣＤ１５４、ＣＤＳ、ＯＸ４０、４−ＩＢＢ、ＣＤ２８シグナル伝達ドメイン、その一部、またはその組み合わせである。非限定的ないくつかの実施形態では、抗原認識受容体は、ＣＤ２８、４−ＩＢＢ、および／またはＣＤ３ζ鎖の少なくとも一部を、抗原結合部分とともに含むＣＡＲ（例えば、Ｚｈｏｎｇら、２０１０，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒ．１８（２）：４１３−４２０参照）である。非限定的ないくつかの実施形態では、抗原認識受容体は、Ｋｏｈｎら、２０１１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒ．１９（３）：４３２−４３８）に記載のＣＡＲであり、そこでは任意に抗原結合部分は、別の腫瘍抗原または病原体抗原に結合するアミノ酸配列と置換されている。種々の実施形態において、細胞は、組み換えまたは１９２８ｚもしくは４Ｈ１１２８ｚである内因性の抗原受容体を発現する。
【００３４】
本明細書に記載される局面のいずれかの種々の実施形態では、抗原は、腫瘍抗原または病原体抗原である。本明細書に記載される局面のいずれかの種々の実施形態では、腫瘍抗原は、ＣＤ１９、ＭＵＣ１６、ＭＵＣ１、ＣＡｌＸ、ＣＥＡ、ＣＤＳ、ＣＤ７、ＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５６、ＣＤ７４、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染細胞抗原、ＥＧＰ−２、ＥＧＰ−４０、ＥｐＣＡＭ、ｅｒｂ−Ｂ２，３，４、ＦＢＰ、胎児性アセチルコリン受容体、葉酸受容体−α、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＥＲ−２、ｈＴＥＲＴ、ＩＬ−１３Ｒ−ａ２、κ−軽鎖、ＫＤＲ、ＬｅＹ、Ｌ１細胞接着分子、ＭＡＧＥ−Ａ１、メソテリン、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳ０−１、腫瘍胎児抗原（ｈ５Ｔ４）、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＴＡＧ−７２、ＶＥＧＦ−Ｒ２、またはＷＴ−１の１以上である。いくつかの特定の実施形態において、抗原は、ＣＤ１９またはＭＵＣ１６である。前記抗原に特異的に結合するアミノ酸配列は、当該技術分野において公知であり、当該技術分野において公知の方法によって、調製し得る。例としては、免疫グロブリン、免疫グロブリンの可変領域（例えば、可変フラグメント（「Ｆｖ」）もしくは二価の可変フラグメント（「Ｆａｂ」））、単鎖抗体などが挙げられる。
【００３５】
本明細書に記載される局面のいずれかの種々の実施形態では、可溶性ｓｃＦｖは、分泌されるものである。本明細書に記載される局面のいずれかの種々の実施形態では、ｓｃＦｖは、ベクターから発現される。本明細書に記載される局面のいずれかの種々の実施形態では、免疫抑制性のポリペプチドは、ＣＤ４７、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、およびそのリガンドのうちの１以上である。本明細書に記載される局面のいずれかの種々の実施形態では、免疫刺激性ポリペプチドは、ＣＤ２８、ＯＸ−４０、４−１ＢＢ、およびそのリガンドのうちの１以上である。本明細書に記載される局面のいずれかの種々の実施形態では、可溶性ｓｃＦｖは、免疫応答性細胞の免疫応答を増強する。
【００３６】
本明細書に記載される局面のいずれかの種々の実施形態では、免疫応答性細胞は、サイトカインを分泌する。本明細書に記載される局面のいずれかの種々の実施形態では、サイトカインは、ベクターから発現される。本明細書に記載される局面のいずれかの種々の実施形態では、本発明の免疫応答性細胞を含有する医薬組成物は、サイトカインを含有する。本明細書に記載される局面のいずれかの種々の実施形態では、本発明の免疫応答性細胞は、サイトカインとともに投与される。本明細書に記載される局面のいずれかの種々の実施形態では、サイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬｌ５、ＩＬ２１、顆粒球マクロファージ・コロニー刺激因子、アルファ、ベータ、もしくはガンマインターフェロンおよびエリスロポイエチンのうちの１以上である。
【００３７】
本明細書に記載される局面のいずれかの種々の実施形態では、方法は、被験体において腫瘍細胞の数を減少させ、腫瘍の大きさを減少させ、腫瘍を根絶させ、被験体において、腫瘍負荷を減少させる、および／または、被験体において、腫瘍負荷を根絶する。
【００３８】
本発明が用いられ得る、新生物の例としては、白血病（例えば、急性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄球性白血病、急性骨髄芽球性白血病、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄単球性白血病、急性単球性白血病、急性赤白血病、慢性白血病、慢性骨髄球性白血病、慢性リンパ性白血病）、真性赤血球増加症、リンパ腫（ホジキン病、非ホジキン病）、ヴァルデンシュトレームマクログロブリン血症、重鎖病、ならびに固形腫瘍、例えば肉腫および癌腫（例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌腫、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌腫、基底細胞癌腫、腺癌腫、汗腺癌腫、脂腺癌腫、乳頭癌腫、乳頭状腺癌腫、嚢胞腺癌腫、髄様癌腫、気管支原性癌腫、腎細胞癌腫、肝臓癌、ナイル腺管癌腫（ｎｉｌｅ  ｄｕｃｔ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、絨毛癌腫、セミノーマ、胎児性癌腫、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、子宮癌、精巣癌、肺癌腫、小細胞肺癌腫、膀胱癌腫、上皮癌腫、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、神経鞘腫、髄膜腫、メラノーマ、神経芽細胞腫および網膜芽細胞腫）が挙げられるが、それらに限定されない。
【００３９】
本明細書において記載される局面のいずれかの種々の非限定的な実施形態では、新形成は、血液の癌、Ｂ細胞白血病、多発性骨髄腫、リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、および卵巣癌のうちの１以上である。いくつかのある特定の実施形態では、血液の癌は、Ｂ細胞白血病、多発性骨髄腫、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病、および非ホジキンリンパ腫うちの１以上である。いくつかの特定の実施形態において、新形成は、Ｂ細胞白血病であり、抗原は、ＣＤ１９であり、かつ、免疫抑制活性を有するポリペプチドは、ＣＤ４７、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、およびそのリガンドのうちの１以上である。いくつかの特定の実施形態において、新形成は、多発性骨髄腫であり、抗原は、ＣＤ１９であり、かつ、免疫抑制活性を有するポリペプチドは、ＣＤ４７、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、およびそのリガンドのうちの１以上である。いくつかの特定の実施形態において、新形成は、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）であり、抗原は、ＣＤ１９であり、かつ、免疫抑制活性を有するポリペプチドは、ＣＤ４７、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、およびそのリガンドのうちの１以上である。いくつかの特定の実施形態において、新形成は、慢性リンパ性白血病であり、抗原は、ＣＤ１９であり、かつ、免疫抑制活性を有するポリペプチドは、ＣＤ４７、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、およびそのリガンドのうちの１以上である。いくつかの特定の実施形態において、新形成は、非ホジキンリンパ腫であり、抗原は、ＣＤ１９であり、かつ、免疫抑制活性を有するポリペプチドは、ＣＤ４７、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、およびそのリガンドのうちの１以上である。いくつかの特定の実施形態において、新形成は、卵巣癌であり、抗原は、ＭＵＣ１６であり、かつ、免疫抑制活性を有するポリペプチドは、ＣＤ４７、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、およびそのリガンドのうちの１以上である。
【００４０】
定義
別に定める場合を除き、本明細書で用いる技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。以下の参照文献は、本発明に用いられる用語の多くの一般的定義を有するスキルの１つを提供するものである：Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（第２版、１９９４）；Ｔｈｅ  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｗａｌｋｅｒ編、１９８８）；Ｔｈｅ  Ｇｌｏｓｓａｒｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，第５版、Ｒ．Ｒｉｅｇｅｒら（編）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ（１９９１）；およびＨａｌｅ  ＆  Ｍａｒｈａｍ，Ｔｈｅ  Ｈａｒｐｅｒ  Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９１）。本明細書中で用いる場合、別に定める場合を除き、下記の語は、以下に記した意味を有するものとする。
【００４１】
「免疫応答性細胞を活性化する」とは、細胞内でのシグナル伝達またはタンパク質発現の変化の誘導により、免疫応答を開始させることを意味する。例えば、ＣＤ３鎖がリガンド結合および免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ（ＩＴＡＭｓ）に応答して集まると、シグナル伝達カスケードが作られる。いくつかの特定の実施形態において、内因性のＴＣＲまたは外因性のＣＡＲが抗原に結合すると、結合された受容体（例えば、ＣＤ４またはＣＤ８、ＣＤ３γ／δ／ε／ζ等）の近くで、多くの分子の集合を含む、免疫シナプスの形成が起こる。この膜結合シグナル伝達分子の集合によって、ＣＤ３鎖内に含有されたＩＴＡＭモチーフがリン酸化する。このリン酸化は、ひいてはＴ細胞活性化経路を開始させ、最終的には、ＮＦ−κＢおよびＡＰ−１などの転写因子を活性化する。これら転写因子は、Ｔ細胞の全体的な遺伝子発現を惹起し、Ｔ細胞が媒介する免疫応答を開始させるために、主な制御性Ｔ細胞タンパク質の増殖および発現のためのＩＬ−２の産生を増加させる。「免疫応答性細胞を刺激する」は、頑強かつ持続性の免疫応答を起こすシグナルを意味する。種々の実施形態において、これは、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）活性化後に生じるか、または、受容体で付属的に媒介される。この受容体には、ＣＤ２８、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＯＸ４０、ＣＤ４０、およびＩＣＯＳが挙げられるが、それらに限定されない。特定の理論にとらわれるわけではないが、複数の刺激性シグナルを受信することは、頑強かつ長期のＴ細胞が媒介する免疫応答を展開するのに重要である。これらの刺激性シグナルを受信しなければ、Ｔ細胞は急速に阻害され、抗原に対して応答しなくなる。これらの共刺激シグナルの効果は変化し、部分的に理解されたままである一方、完全かつ持続的な根絶のための抗原に対して頑強に応答する、長寿命であり、増殖性があり、抗アポトーシス性を有するＴ細胞を生成するために、それらは概して遺伝子発現を増加させるものである。
【００４２】
本明細書中で用いる場合、用語「抗原認識受容体」は、抗原結合に反応して免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）を活性化することができる受容体を言う。抗原認識受容体の例としては、天然のＴ細胞受容体、もしくは内因性のＴ細胞受容体、または腫瘍抗原結合ドメインが、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）を活性化することができる細胞内シグナル伝達ドメインに融合しているキメラ抗原受容体が挙げられる。
【００４３】
本明細書中で用いる場合、用語「抗体」は、インタクトな抗体分子のみならず、免疫原結合能を保持する抗体分子のフラグメントをも意味する。そのようなフラグメントも当該技術分野において公知であり、インビトロおよびインビボの両方で常時用いられている。したがって、本明細書中で用いる場合、用語「抗体」は、インタクトな免疫グロブリン分子のみならず、公知の活性フラグメントであるＦ（ａｂ’）２およびＦａｂをも意味する。インタクトな抗体のＦｅフラグメントを欠くＦ（ａｂ’）２およびＦａｂフラグメントは、循環からより速く消失し、インタクトな抗体の非特異的組織結合が少なくあり得る（Ｗａｈｌら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２４：３１６−３２５（１９８３））。本発明の抗体は、全天然抗体、二重特異的抗体、キメラ抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、単鎖Ｖ領域フラグメント（ｓｃＦｖ）、融合ポリペプチド、および非従来型の抗体を含む。
【００４４】
本明細書中で用いる場合、用語「単鎖可変フラグメント」すなわち「ｓｃＦｖ」は、ＶＨ：：ＶＬヘテロダイマーを形成するよう共有結合している免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質である。重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）は、直接的に結合しているか、または、ＶＨのＮ−末端とＶＬのＣ末端、もしくはＶＨのＣ末端とＶＬのＮ−末端を結合する、ペプチドをコードするリンカーによって結合している（例えば、１０、１５、２０、２５アミノ酸）。リンカーは、通常、柔軟性のためのグリシン、ならびに、可溶性のためのセリンもしくはスレオニンに富んでいる。定常領域を除去し、かつリンカーを導入しているにもかかわらず、ｓｃＦｖタンパク質は、オリジナルの免疫グロブリンの特異性を維持する。Ｈｕｓｔｏｎら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：５８７９−５８８３、１９８８）により記載されているように、単鎖Ｆｖポリペプチド抗体は、ＶＨコード配列およびＶＬコード配列を含む核酸から発現され得る。米国特許第５，０９１，５１３号、第５，１３２，４０５号、および第４，９５６，７７８号；ならびに米国特許公開第２００５０１９６７５４号および２００５０１９６７５４号も参照されたい。阻害活性を有するアンタゴニストｓｃＦｖが記載されている（例えば、Ｚｈａｏら、Ｈｙｒｂｉｄｏｍａ（Ｌａｒｃｈｍｔ）２００８、２７（６）：４５５−５１；Ｐｅｔｅｒら、Ｊ．Ｃａｃｈｅｘｉａ  Ｓａｒｃｏｐｅｎｉａ  Ｍｕｓｃｌｅ、２０１２  Ａｕｇｕｓｔ  １２；Ｓｈｉｅｈら、Ｊ．Ｉｍｕｎｏｌ２００９、１８３（４）：２２７７−８５；Ｇｉｏｍａｒｅｌｌｉら、Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ、２００７、９７（６）：９５５−６３；Ｆｉｆｅ  ｅｔａ．、Ｊ．Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｓｔ、２００６、１１６（８）：２２５２−６１；Ｂｒｏｃｋｓら、Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９９７、３（３）：１７３−８４；Ｍｏｏｓｍａｙｅｒら、Ｔｈｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９５、２（１０：３１−４０）参照）。刺激性活性を有するアゴニストｓｃＦｖが記載されている（例えば、Ｐｅｔｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｉ  Ｃｈｅｒｎ、２００３、２５２７８（３８）：３６７４０−７；Ｘｉｅら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、１９９７、１５（８）：７６８−７１；Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒら、Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９７、１７（５−６）：４２７−５５；Ｈｏら、ＢｉｏＣｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ、２００３、１６３８（３）：２５７−６６参照）。
【００４５】
「親和性」は、結合力の尺度を意味する。理論にとらわれるわけではないが、親和性は、抗体結合部位と抗原決定因子との間の立体化学密着の密接性に、それらの接触面積の大きさに、および帯電した基と疎水基の分布に依存する。親和性はまた、用語「アビディティー（ａｖｉｄｉｔｙ）」を含む。それは、可逆的複合体形成後の抗原−抗体間の結合力を言う。抗原に対する抗体の親和性の計算方法は、当該技術分野において公知であり、それには、結合実験を使用して親和性を計算することを含む。機能的アッセイ（例えば、フローサイトメトリーアッセイ）の抗体活性もまた、抗体の親和性を反映している。抗体と親和性は、表現型的に特徴づけることができ、機能的アッセイ（例えば、フローサイトメトリーアッセイ）を用いて比較することができる。
【００４６】
本明細書中で用いる場合、用語「キメラ抗原受容体」すなわち「ＣＡＲ」は、免疫細胞を活性化または刺激することができる細胞内シグナル伝達ドメインに融合される抗原結合ドメインを示す。最も一般的には、ＣＡＲの細胞外の結合ドメインが、ネズミモノクローナル抗体またはヒト化モノクローナル抗体の可変重鎖および軽鎖領域の融合に由来する単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）から構成される。あるいは、ｓｃＦｖとして、Ｆａｂに由来するものを用いることもできる（抗体から取得するかわりに、例えば、Ｆａｂライブラリーから取得する）。種々の実施形態において、このｓｃＦｖは、膜貫通ドメインに融合し、その後細胞内シグナル伝達ドメインに融合する。「第１世代」のＣＡＲには、抗原が結合するとＣＤ３ζシグナルを単独で提供するものがある。「第２世代」のＣＡＲには、共刺激（例えば、ＣＤ２８またはＣＤ１３７）および活性化（ＣＤ３ζ）の両方を提供するものがある。「第３世代」のＣＡＲには、複数回の共刺激（例えば、ＣＤ２８およびＣＤ１３７）および活性化（ＣＤ３ζ）を提供するものがある。種々の実施形態において、ＣＡＲは、抗原に対して、高い親和性またはアビディティーを有するように選択される。
【００４７】
用語「免疫抑制活性」は、細胞（例えば、活性化された免疫応答性細胞）での、シグナル伝達またはタンパク質発現の変化の誘導による、免疫応答の減少を意味する。それらの結合を介して免疫応答を抑制する、または減少させることが知られているポリペプチドとしては、ＣＤ４７、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ならびにＳＩＲＰａ、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−１、およびＢ７−２といった、それらの対応するリガンドがある。そのようなポリペプチドは、腫瘍微小環境に存在し、新生物性細胞に対する免疫応答を阻害する。種々の実施形態において、免疫抑制性のポリペプチドおよび／またはそれらのリガンドの相互作用の、阻害、遮断、または拮抗によって、免疫応答性細胞の免疫応答が高められる。
【００４８】
用語「免疫刺激活性」は、細胞（例えば、活性化された免疫応答性細胞）での、シグナル伝達またはタンパク質発現の変化の誘導による、免疫応答の増加を意味する。免疫刺激活性は、炎症誘発活性を含んでもよい。それらの結合を介して免疫応答を刺激する、または増加させることが知られているポリペプチドとしては、ＣＤ２８、ＯＸ−４０、４−１ＢＢ、ならびに、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＯＸ−４０Ｌ、および４−１ＢＢＬといった、それらの対応するリガンドがある。そのようなポリペプチドは、腫瘍微小環境に存在し、新生物性細胞に対する免疫応答を活性化する。種々の実施形態において、炎症誘発性のポリペプチドおよび／またはそれらのリガンドの、促進、刺激、または作動によって、免疫応答性細胞の免疫応答が高められる。
【００４９】
「ＣＤ３ζポリペプチド」は、活性化および刺激性の活性を有するＮＣＢＩ参照番号：ＮＰ＿９３２１７０と、少なくとも８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９または１００％の同一性を有するタンパク質またはそのフラグメントを意味する。ＣＤ３ζの例として下記［配列番号：１］が挙げられる。
【００５０】
【化１】
2020054387.tif 000002
「ＣＤ３ζ核酸分子」は、ＣＤ３ζポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを意味する。
【００５１】
「ＣＤ２８ポリペプチド」は、刺激性の活性を有する、ＮＣＢＩ参照番号：ＮＰ＿００６１３０と、少なくとも８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９または１００％の同一性を有するタンパク質またはそのフラグメントを意味する。ＣＤ２８の例としては、下記［配列番号：２］がある。
【００５２】
【化２】
2020054387.tif 000003
「ＣＤ２８核酸分子」は、ＣＤ２８ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを意味する。
【００５３】
「ＣＤ４０Ｌポリペプチド」は、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００００６５，ＧｅｎＢａｎｋ参照番号ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＨ７４９５０．１と、少なくとも８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９または１００％の同一性を有するタンパク質、またはそのフラグメントを意味する。該タンパク質は、ＣＤ４０リガンド、または単離された健康なドナー末梢血単核球（ＰＢＭＣ）から、下記プライマーを用いてＰＣＲ増幅された核酸によりコードされたタンパク質である。
プライマー（１）５’−ＣＡＣＧＴＧＣＡＴＧＡＴＣＧＡＡＡＣＡＴＡＣＡＡＣＣＡＡＡＣＴＴＣＴＣＣＣＣＧＡＴＣＴＧＣ−‘３［配列番号：３］、および
プライマー（２）５’−ＣＴＣＧＡＧＧＧＡＴＣＣＴＣＡＧＡＧＴＴＴＧＡＧＴＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＡ−３’［配列番号：４］（図２２Ａ）。
【００５４】
「ＣＤ４０Ｌ核酸分子」は、ＣＤ４０Ｌポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを意味する。
【００５５】
「４−１ＢＢポリペプチド」は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）リガンドとして作用する、ＮＣＢＩ参照番号：Ｐ４１２７３もしくはＮＰ＿００１５５２と少なくとも８５、９０、９５、９６、９７、９８、２５９９または１００％の同一性を有するタンパク質、またはそのフラグメントを意味する。４−１ＢＢの例としては、下記がある［配列番号：５］。
【００５６】
【化３】
2020054387.tif 000004
「４−１ＢＢＬ核酸分子」は、４−１ＢＢＬポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを意味する。
【００５７】
「ＯＸ４０Ｌポリペプチド」は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）リガンドである、ＮＣＢＩ参照番号：ＢＡＢ１８３０４もしくはＮＰ＿００３３１７と少なくとも８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９または１００％の同一性を有するタンパク質、またはそのフラグメントを意味する［配列番号：６］。
【００５８】
【化４】
2020054387.tif 000005
「ＯＸ４０Ｌ核酸分子」は、ＯＸ４０Ｌポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを意味する。
【００５９】
「１９２８ｚ」は、下記の配列と少なくとも８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９または１００％の同一性を有するタンパク質を意味する。それは、アミノ酸１〜１８にＣＤＳリーダー配列を含み、かつ、ＣＤ１９と結合することができる［配列番号：７］。
【００６０】
【化５】
2020054387.tif 000006
ＣＤＳリーダー配列を含む、１９２８ｚポリペプチドをコードする核酸配列の例としては、下記［配列番号：８］がある。
【００６１】
【化６】
2020054387.tif 000007
「４Ｈ１１２８ｚ」は、下記の配列と少なくとも８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９または１００％の同一性を有するタンパク質を意味する。それは、アミノ酸１〜１８にＣＤＳリーダー配列を含み、かつ、ＭＵＣと結合することができる［配列番号：９］。
【００６２】
【化７】
2020054387.tif 000008
カッパリーダー配列を含む、４Ｈｌｌ２８ｚポリペプチドをコードする核酸配列の例としては、下記［配列番号：１０］がある。
【００６３】
【化８】
2020054387.tif 000009
「Ｂ６Ｈｌ２．２  ｓｃＦｖ」は、下記の配列と少なくとも８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９または１００％の同一性を有するタンパク質を意味する。それは、ＣＤ４７と結合することができる［配列番号：１１］。
【００６４】
【化９】
2020054387.tif 000010
「５Ｃ４  ｓｃＦｖ」は、下記の配列と少なくとも８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９または１００％の同一性を有するタンパク質を意味する。それは、ヒトＰＤ−１と結合することができる［配列番号：１２］。
【００６５】
【化１０】
2020054387.tif 000011
「Ｊ４３  ｓｃＦｖ」は、下記の配列と少なくとも８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９または１００％の同一性を有するタンパク質を意味する。それは、アミノ酸１〜２１にカッパリーダー配列を含み、かつ、ヒトＰＤ−１と結合することができる［配列番号：１３］。
【００６６】
【化１１】
2020054387.tif 000012
カッパリーダー配列を含む、Ｊ４３  ｓｃＦｖポリペプチドをコードする核酸配列の例としては、下記［配列番号：１４］がある。
【００６７】
【化１２】
2020054387.tif 000013
本発明の方法において有用な核酸分子には、本発明のポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするあらゆる核酸分子が含まれる。そのような核酸分子は、内因性の核酸配列と１００％同一である必要はないが、典型的には、実質的な同一性を示すであろう。内因性配列に対して「実質的な同一性」を有するポリヌクレオチドは、典型的には、二本鎖核酸分子の少なくとも一方の鎖とハイブリダイゼーションすることができる。「ハイブリダイゼーションする」とは、二本鎖分子を、様々なストリンジェントな条件のもとで、相補的ポリヌクレオチド配列（例えば、本明細書中に記載される遺伝子）またはその一部分の間で対形成させることを意味する（例えば、Ｗａｈｌ，Ｇ．Ｍ．およびＳ．Ｌ．Ｂｅｒｇｅｒ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：３９９；Ｋｉｍｍｅｌ，Ａ．Ｒ．（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：５０７参照）。
【００６８】
例えば、ストリンジェントな塩濃度は通常、約７５０ｍＭのＮａＣｌおよび７５ｍＭのクエン酸三ナトリウムよりも低く、好ましくは、約５００ｍＭのＮａＣｌおよび５０ｍＭのクエン酸三ナトリウムよりも低く、より好ましくは、約２５０ｍＭのＮａＣｌおよび２５ｍＭのクエン酸三ナトリウムよりも低い。低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーションを有機溶媒、例えば、ホルムアミドの非存在下で得ることができ、一方で、高ストリンジェントなハイブリダイゼーションは、少なくとも約３５％のホルムアミドの存在下で得ることができ、より好ましくは少なくとも約５０％のホルムアミドの存在下で得ることができる。ストリンジェントな温度条件は通常、少なくとも約３０℃の温度を含み、より好ましくは少なくとも約３７℃の温度を含み、最も好ましくは少なくとも約４２℃の温度を含む。様々なさらなるパラメーター、例えば、ハイブリダイゼーション時間、界面活性剤、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の濃度、および、キャリアＤＮＡを含むこと、または、キャリアＤＮＡを除くことなどが、当業者には周知である。様々なレベルのストリンジェンシーが、これらの様々な条件を必要に応じて組み合わせることによって達成される。１つの好ましい実施形態において、ハイブリダイゼーションが、３０℃で、７５０ｍＭのＮａＣｌ、７５ｍＭのクエン酸三ナトリウムおよび１％のＳＤＳにおいて行われる。１つのより好ましい実施形態において、ハイブリダイゼーションが、３７℃で、５００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのクエン酸三ナトリウム、１％のＳＤＳ、３５％のホルムアミドおよび１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）において行われる。１つの最も好ましい実施形態において、ハイブリダイゼーションが、４２℃で、２５０ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、１％のＳＤＳ、５０％のホルムアミドおよび２００μｇ／ｍｌのｓｓＤＮＡにおいて行われる。これらの条件に対する有用な変更を、当業者は容易に見出せるだろう。
【００６９】
ほとんどの適用について、ハイブリダイゼーションに続く洗浄工程もまた、ストリンジェンシーが異なるであろう。洗浄のストリンジェントな条件を塩濃度によって、また、温度によって定義することができる。上記のように、洗浄のストリンジェンシーを、塩濃度を低下させることによって、または、温度を上げることによって増大させることができる。例えば、洗浄工程のためのストリンジェントな塩濃度は、好ましくは、約３０ｍＭのＮａＣｌおよび３ｍＭのクエン酸三ナトリウムよりも低く、最も好ましくは、約１５ｍＭのＮａＣｌおよび１．５ｍＭのクエン酸三ナトリウムよりも低い。洗浄工程のためのストリンジェントな温度条件は、通常、少なくとも約２５℃の温度を含み、より好ましくは少なくとも約４２℃の温度を含み、一層より好ましくは少なくとも約６８℃の温度を含む。１つの好ましい実施形態において、洗浄工程は、２５℃で、３０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのクエン酸三ナトリウムおよび０．１％のＳＤＳにおいて行われる。１つのより好ましい実施形態において、洗浄工程は、４２℃で、１５ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのクエン酸三ナトリウムおよび０．１％のＳＤＳにおいて行われる。１つのより好ましい実施形態において、洗浄工程は、６８℃で、１５ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのクエン酸三ナトリウムおよび０．１％のＳＤＳにおいて行われる。これらの条件に対するさらなる様々なバリエーションを、当業者は容易に見出せるだろう。ハイブリダイゼーション技術が当業者には公知であり、例えば、ＢｅｎｔｏｎおよびＤａｖｉｓ（Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９６：１８０，１９７７）；ＧｒｕｎｓｔｅｉｎおよびＲｏｇｎｅｓｓ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７２：３９６１，１９７５）；Ａｕｓｕｂｅｌら（Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２００１）；ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ（Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９８７，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；ならびにＳａｍｂｒｏｏｋら，（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に記載されている。
【００７０】
「実質的に同一」とは、ポリペプチドまたは核酸分子が、参照アミノ酸配列（例えば、本明細書中に記載されるアミノ酸配列のいずれか１つ）または参照核酸配列（例えば、本明細書中に記載される核酸配列のいずれか１つ）に対して少なくとも５０％の同一性を示すことを意味する。好ましくは、そのような配列は、比較のために使用される配列に対して、アミノ酸レベルまたは核酸において、少なくとも６０％が同一であり、より好ましくは８０％または８５％が同一であり、より好ましくは、９０％、９５％または９９％までもが同一である。
【００７１】
配列同一性は、典型的には、配列分析ソフトウェア（例えば、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒ，１７１０  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｖｅｎｕｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．５３７０５のＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、ＢＬＡＳＴプログラム、ＢＥＳＴＦＩＴプログラム、ＧＡＰプログラムまたはＰＩＬＥＵＰ／ＰＲＥＴＴＹＢＯＸプログラム）を使用して測定される。そのようなソフトウェアは、相同性の度合いを、様々な置換、欠失および／または他の改変に対して割り当てることによって同一配列または類似配列を一致させる。保存的置換には、典型的には、下記の群の中での置換が含まれる：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リシン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン。同一性の程度を求めるための１つの例示的なアプローチにおいて、ＢＬＡＳＴプログラムを使用することができ、ｅ−３〜ｅ−１００の間における確率スコアにより、近い関係にある配列が示される。
【００７２】
「アナログ」とは、参照ポリペプチドまたは参照核酸分子の機能を有する構造的に関連するポリペプチドまたは核酸分子を意味する。
【００７３】
本明細書中で用いる場合、用語「リガンド」は、受容体に結合する分子を示す。具体的には、リガンドは別の細胞における受容体と結合し、これにより、細胞−細胞の認識および／または相互作用を可能にする。
【００７４】
本明細書中で用いる場合、用語「構成的発現」は、すべての生理学的条件のもとでの発現を示す。
【００７５】
「疾患」とは、細胞、組織または器官の正常な機能を損なうか、または、妨害する任意の状態または障害を意味する。疾患の例には、新形成、または、細胞の病原体感染が含まれる。
【００７６】
「有効量」とは、治療効果を有するために十分な量を意味する。ある実施形態では、「有効量」とは、新形成の継続した増殖、成長または転移（例えば、浸潤または移動）を阻止し、寛解させ、または阻害するために十分な量を意味する。
【００７７】
「内因性」とは、細胞または組織内で正常に発現される核酸分子またはポリペプチドを意味する。
【００７８】
「実施忍容性（ｅｎｆｏｒｃｉｎｇ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）」は、移植器官または組織を標的とする自己反応性細胞または免疫応答性細胞の活性を防止することを意味する。
【００７９】
「外因性」とは、細胞に内因的に存在しない核酸分子またはポリペプチド、あるいは、過剰発現したときに得られる機能的影響をもたらすために十分なレベルでは存在しない核酸分子またはポリペプチドを意味する。従って、用語「外因性」は、細胞において発現される任意の組換え核酸分子または組換えポリペプチド、例えば、外来、異種、ならびに、過剰発現された核酸分子およびポリペプチドを包含する。
【００８０】
「異種核酸分子またはポリペプチド」は、細胞または細胞から得たサンプル中に正常に存在しない核酸分子（例えば、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ、もしくはＲＮＡ分子）またはポリペプチドを意味する。この核酸は、別の生物由来でもよく、または、例えば、細胞またはサンプル中で正常に発現しないｍＲＮＡ分子であってもよい。
【００８１】
「免疫応答性細胞」は、免疫応答において機能する細胞、またはその祖先もしくは子孫を意味する。
【００８２】
「増加する」は、少なくとも５％正に変化することを意味する。変化は、５％、１０％、２５％、３０％、５０％、７５％、または１００％であってもよい。
【００８３】
「単離された細胞」は、自然界においてその細胞に付随する分子構成成分および／または細胞構成成分から分離される細胞を意味する。
【００８４】
用語「単離された」、「精製された」、または「生物学的に純粋な」は、ある材料について、その天然の状態において認められるようなその材料に通常伴う構成成分を様々な度合いで含まない材料を言う。「単離する」は、オリジナルの供給源または周囲環境からの分離度合いを意味する。「精製する」は、単離より高い分離度合いを意味する。「精製された」、または「生物学的に純粋な」タンパク質は、他の材料を十分には含まないため、不純物は、タンパク質の生物学的性質に著しく影響を及ぼすことはなく、または他の有害な結果を引き起こさない。すなわち、細胞性材料、ウイルス性材料、あるいは、組み換えＤＮＡ技術による産生の場合の培養培地、または化学的合成の場合の化学的前駆体もしくは他の化学材料を実質的に含まない場合、本発明の核酸もしくはペプチドは精製されているとする。精製および均質性は、典型的には、分析的化学技術、例えば、ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動または高性能液体クロマトグラフィーを用いて決定される。用語「精製された」は、核酸またはタンパク質が本質的に電気泳動ゲルの１つのバンドに生じることを示すことができる。改変、例えば、リン酸化もしくはグリコシル化が行われ得るタンパク質については、改変が異なれば、単離されるタンパク質が異なり得る。それらは、別個に精製することができる。
【００８５】
本明細書中で用いる場合、用語「腫瘍抗原結合ドメイン」は、腫瘍上に存在する特定の抗原決定基または１組の抗原決定基と特異的に結合することができるドメインを示す。
【００８６】
「薬剤を得る」におけるような用語「得る」は、薬剤（あるいは示された物質または材料）を購入すること、合成すること、または、そうでない場合には獲得することを含むことを意図する。
【００８７】
本明細書において用いられる「リンカー」は、２以上のポリペプチドまたは核酸を互いに結合するように共有結合する官能基（例えば、化学物質もしくはポリペプチド）を意味する。本明細書において用いられる「ペプチドリンカー」は、２つのタンパク質をカップリングさせる（例えば、ＶＨドメインとＶＬドメインをカップリングさせる）のに使用される、１以上のアミノ酸を意味する。本発明において使用されるリンカー配列の例としては、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ［配列番号５１］がある。
【００８８】
「調節する」とは、正または負に変えることを意味している。例示的な調節には、１％、２％、５％、１０％、２５％、５０％、７５％または１００％の変化が含まれる。
【００８９】
「新形成」とは、細胞または組織の病理学的増殖、および、他の組織または器官へのその後続の移動または浸潤によって特徴づけられる疾患を意図している。新形成の成長は典型的には制御されず、進行性であり、また、正常な細胞の分裂増殖を誘発しない条件、または、正常な細胞の分裂増殖の停止を引き起こす条件のもとで生じる。新形成は、様々な細胞タイプ、組織または器官、例えば膀胱、骨、脳、乳房、軟骨、神経膠、食道、卵管、胆嚢、心臓、腸、腎臓、肝臓、肺、リンパ節、神経組織、卵巣、膵臓、前立腺、骨格筋、皮膚、脊髄、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、気管、尿生殖路、尿管、尿道、子宮および膣からなる群より選択される器官、あるいは、その組織または細胞タイプ（これらに限定されない）を冒し得る。新形成は、肉腫、癌腫または形質細胞腫（形質細胞の悪性腫瘍）などの癌を含む。
【００９０】
「病原体」とは、疾患を引き起こし得るウイルス、細菌、真菌、寄生虫または原生動物を意味する。
【００９１】
ウイルスの例としては、レトロウイルス科（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、ＨＩＶ−１（これはまた、ＨＤＴＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶＥまたはＨＴＬＶ−ＩＩＩ／ＬＡＶ、あるいは、ＨＩＶ−ＩＩＩとしても示される）、および、ＨＩＶ−ＬＰのような他の単離体のような、ヒト免疫不全ウイルス）；ピコルナウイルス科（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス；エンテロウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス）；カルシウイルス科（Ｃａｌｃｉｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、胃腸炎を引き起こす菌株）；トガウイルス科（Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス）；フラビリダエ（Ｆｌａｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、デングウイルス、脳炎ウイルス、黄熱ウイルス）；コロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、コロナウイルス）；ラブドウイルス科（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）；フィロウイルス科（Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、エボラウイルス）；パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、パラインフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス）；オルトミクソウイルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、インフルエンザウイルス）；ブンガビリダエ（Ｂｕｎｇａｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、ハンターンウイルス、ブンガ（ｂｕｎｇａ）ウイルス、フレボウイルスおよびナイロ（Ｎａｉｒａ）ウイルス）；アレナウイルス科（Ａｒｅｎａ  ｖｉｒｉｄａｅ）（出血熱ウイルス）；レオウイルス科（Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、レオウイルス、オルビウイルスおよびロタウイルス）；ビルナウイルス科（Ｂｉｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）；ヘパドナウイルス科（Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ）（Ｂ型肝炎ウイルス）；パルボウイルス科（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａ）（パルボウイルス）；パポーバウイルス科（Ｐａｐｏｖａｖｉｒｉｄａｅ）（乳頭腫ウイルス、ポリオーマウイルス）；アデノウイルス科（Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ）（ほとんどのアデノウイルス）；ヘルペスウイルス科（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）（１型および２型の単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス）；ポックスウイルス科（Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ）（痘瘡ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス）；およびイリドウイルス科（Ｉｒｉｄｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、アフリカブタコレラウイルス）；ならびに未分類ウイルス（例えば、デルタ型肝炎の媒介因子（これは、Ｂ型肝炎ウイルスの欠損サテライトであると考えられる）、非Ａ非Ｂ肝炎の媒介因子（クラス１＝体内感染型；クラス２＝非経口感染型（すなわち、Ｃ型肝炎）、ノーウォークウイルスおよび関連ウイルス、ならびに、アストロウイルス）が挙げられるが、それらに限定されない。
【００９２】
細菌の例としては、パスツレラ属（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）、連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）菌種およびサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）の菌種が含まれる。感染性細菌の具体的な例としては、限定されないが、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉｓ、Ｂｏｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ  ｓｐｓ）の菌種（例えば、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、Ｍ．ｋａｎｓａｉｉ、Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、リステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（Ａ群連鎖球菌）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ（Ｂ群連鎖球菌）、連鎖球菌属（ビリダンス群）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｏｖｉｓ、連鎖球菌属（嫌気性菌種）、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、病原性カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｒａｃｉｓ）、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｒｓ）、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、Ｐａｓｔｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｓｐ．）、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ、梅毒トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｉｕｍ）、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐｅｒｔｅｎｕｅ、レプトスピラ属（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）、リケッチア属（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、およびイスラエル放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｉｓｒａｅｌｌｉ）が挙げられるが、それらに限定されない。
【００９３】
「受容体」とは、１以上のリガンドと選択的に結合する細胞膜上に存在するポリペプチドまたはその一部を意味する。
【００９４】
「減少する」は、少なくとも５％負に変化することを意味する。変化は、５％、１０％、２５％、３０％、５０％、７５％、または１００％であってもよい。
【００９５】
「認識する」とは、標的と選択的に結合することを意味する。ウイルスを認識するＴ細胞は典型的には、そのウイルスによって発現される抗原に結合する受容体を発現する。
【００９６】
「参照」または「対照」は、比較の基準を意味する。例えば、ＣＡＲおよびｓｃＦｖを発現する細胞によるｓｃＦｖ−抗原結合のレベルは、対応するＣＡＲのみを発現する細胞におけるｓｃＦｖ−抗原結合のレベルと比較され得る。
【００９７】
「分泌される」とは、ポリペプチドが、小胞体、ゴルジ装置を通って、また一時的に細胞原形質膜に融合する小胞として、分泌経路を介して細胞から放出され、細胞外へタンパク質を放出することを意味する。
【００９８】
「シグナル配列」または「リーダー配列」は、分泌経路への進入を指示する新たに合成されるタンパク質のＮ−末端に存在するペプチド配列（５、１０、１５、２０、２５、３０アミノ酸長）を意味する。リーダー配列の例としては、カッパリーダー配列：
ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧＤ  ［配列番号：１５］（ヒト）、
ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧＤ  ［配列番号：１６］（マウス）、およびＣＤＳリーダー配列：ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰ  ［配列番号：１７］が含まれる。
【００９９】
「可溶性」は、水性環境で自由に拡散し得るポリペプチドを意味する（例えば、非膜結合）。
【０１００】
「特異的に結合する」とは、本発明のポリペプチドを自然に含むサンプル、例えば、生物学的サンプルにおいて、目的とする生物分子（例えば、ポリペプチド）を認識し、かつ、これに結合するが、他の分子を実質的に認識し、かつ、これと結合することはないポリペプチドまたはそのフラグメントを意味する。
【０１０１】
本明細書中で用いる場合、用語「腫瘍抗原」は、正常細胞もしくは非ＩＳ新生物性細胞と比較して、独自に、または差次的に、腫瘍細胞上で発現する抗原（例えば、ポリペプチド）を言う。本発明によれば、腫瘍抗原は、抗原認識受容体（例えば、ＣＤ１９、ＭＵＣＩ）を介して免疫応答を活性化または誘導することができる、または受容体−リガンド結合（例えば、ＣＤ４７、ＰＤ−Ｌｌ／Ｌ２、Ｂ７．１／２）を介して免疫応答を抑制することができる腫瘍によって発現される、あらゆるポリペプチドを含む。
【０１０２】
「ウイルス抗原」とは、免疫応答を誘導することができるウイルスによって発現されるポリペプチドを意味する。
【０１０３】
用語「含む」（「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」）「含んでいる」（「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」）は、米国特許法においてそれらに認められる幅広い意味を有することが意図され、「含む」（「ｉｎｃｌｕｄｅ」、「含んでいる」（「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」）などを意味することができる。
【０１０４】
本明細書中で用いる場合、「処置」は、処置されている個体または細胞の疾患経過を変化させようとすることにおける臨床的介入をいい、予防のために、または、臨床病理学の経過中において、そのどちらかで行うことができる。処置の治療効果は、疾患の発生または再発を防止すること、兆候の緩和、疾患の何らかの直接的または間接的な病理学的結果の軽減、転移を防止すること、疾患進行の速度を低下させること、疾患状態の寛解または一時的緩和、および、一時的な軽減または改善された予後が含まれるが、それらに限定されない。疾患または障害の進行を防止することによって、処置は、罹患している被験体または診断された被験体、あるいは、障害を有することが疑われる被験体において障害に起因する悪化を防止することができるが、処置により、障害のリスクがあるまたは障害を有することが疑われる被験体における障害の発症または傷害の兆候の発症が防止されることもあり得る。
【０１０５】
本明細書中で用いる場合、用語「被験体」は脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを示す。
【０１０６】
本明細書中で用いる場合、用語「免疫無防備状態」は、免疫不全を有する被験体を示す。そのような被験体は、日和見感染症、すなわち、免疫系が健全である人では通常、疾患を引き起こさないが、免疫系が良好に機能しないか、または、免疫系が抑制された人々を冒し得る生物によって引き起こされる感染症に非常に罹りやすい。
【０１０７】
本発明の他の局面が下記の開示において記載され、これらは本発明の範囲内である。
【０１０８】
下記の詳細な説明は、本発明を記載された具体的な実施形態に限定するために意図されるのではなく、例として示されるものであり、添付されている図面と併せて理解することができる。
例えば、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
単離された免疫応答性細胞であって、以下：
１）抗原と結合する抗原認識受容体であって、上記結合は、上記免疫応答性細胞を活性化する、抗原認識受容体；および
２）免疫抑制活性または免疫刺激活性を有するポリペプチドに結合する可溶性単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、
を含む、単離された免疫応答性細胞。
（項目２）
上記抗原が、腫瘍抗原または病原体抗原である、項目１に記載の単離された免疫応答性細胞。
（項目３）
上記可溶性ｓｃＦｖが分泌されるものである、項目１に記載の単離された免疫応答性細胞。
（項目４）
上記抗原認識受容体が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、項目１〜３のいずれか１項に記載の単離された免疫応答性細胞。
（項目５）
上記抗原認識受容体が、外因性または内因性である、項目１〜４のいずれか１項に記載の単離された免疫応答性細胞。
（項目６）
上記抗原認識受容体が、組み換え的に発現される、項目１〜５のいずれか１項に記載の単離された免疫応答性細胞。
（項目７）
上記抗原認識受容体が、ベクターから発現される、項目１〜６のいずれか１項に記載の単離された免疫応答性細胞。
（項目８）
上記ｓｃＦｖが、ベクターから発現される、項目１〜７のいずれか１項に記載の単離された免疫応答性細胞。
（項目９）
上記細胞が、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、制御性Ｔ細胞、ヒト胚性幹細胞、および多能性幹細胞であって、上記多能性幹細胞からリンパ系細胞が分化され得る、多能性幹細胞からなる群より選択される、項目１〜８のいずれか１項に記載の単離された免疫応答性細胞。
（項目１０）
上記免疫応答性細胞が、自系のものである、項目１〜９のいずれか１項に記載の単離された免疫応答性細胞。
（項目１１）
上記抗原が、ＣＤ１９、ＭＵＣ１６、ＭＵＣｌ、ＣＡｌＸ、ＣＥＡ、ＣＤＳ、ＣＤ７、ＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５６、ＣＤ７４、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染細胞抗原、ＥＧＰ−２、ＥＧＰ−４０、ＥｐＣＡＭ、ｅｒｂ−Ｂ２，３，４、ＦＢＰ、胎児性アセチルコリン受容体、葉酸受容体−ａ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＥＲ−２、ｈＴＥＲＴ、ＩＬ−１３Ｒ−ａ２、Ｋ−軽鎖、ＫＤＲ、ＬｅＹ、Ｌ１細胞接着分子、ＭＡＧＥ−Ａ１、メソテリン、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳ０−１、腫瘍胎児抗原（ｈ５Ｔ４）、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＴＡＧ−７２、ＶＥＧＦ−Ｒ２、またはＷＴ−１からなる群より選択される腫瘍抗原である、項目１〜１０のいずれか１項に記載の単離された免疫応答性細胞。
（項目１２）
上記免疫抑制性ポリペプチドが、ＣＤ４７、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、およびそのリガンドからなる群より選択される、項目１〜１１のいずれか１項に記載の単離された免疫応答性細胞。
（項目１３）
上記免疫刺激性ポリペプチドが、ＣＤ２８、ＯＸ−４０、４−１ＢＢ、およびそのリガンドからなる群より選択される、項目１〜１１のいずれか１項に記載の単離された免疫応答性細胞。
（項目１４）
上記抗原が、ＣＤ１９またはＭＵＣ１６である、項目１〜１３のいずれか１項に記載の単離された免疫応答性細胞。
（項目１５）
上記抗原認識受容体の細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ζ鎖、ＣＤ９７、ＣＤ１１ａ−ＣＤ１８、ＣＤ２、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＣＤ１５４、ＣＤＳ、ＯＸ４０、４−１ＢＢ、ＣＤ２８シグナル伝達ドメイン、またはその組み合わせである、項目１〜１４のいずれか１項に記載の単離された免疫応答性細胞。
（項目１６）
上記細胞が、１９２８ｚまたは４Ｈ１１２８ｚである組み換えまたは内因性の抗原受容体を発現する、項目１〜１５のいずれか１項に記載の単離された免疫応答性細胞。
（項目１７）
上記可溶性ｓｃＦｖが、上記免疫応答性細胞の免疫応答を増強する、項目１〜１６のいずれか１項に記載の単離された免疫応答性細胞。
（項目１８）
被験体において腫瘍負荷を減少させる方法であって、上記方法は、第一抗原に結合する抗原認識受容体であって、上記結合は、免疫応答性細胞を活性化する、抗原認識受容体、および免疫抑制活性または免疫刺激活性を有するポリペプチドに結合する可溶性単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む有効量の免疫応答性細胞を投与することを含み、それによって上記被験体において腫瘍細胞死を誘導する、方法。
（項目１９）
上記方法が、腫瘍細胞の数を減少させる、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
上記方法が、腫瘍サイズを小さくする、項目１８に記載の方法。
（項目２１）
上記方法が、上記被験体において腫瘍を根絶させる、項目１８に記載の方法。
（項目２２）
新形成を有する被験体の生存を増大させる方法であって、上記方法は、第一抗原に結合する抗原認識受容体であって、上記結合が免疫応答性細胞を活性化する、抗原認識受容体、および免疫抑制活性または免疫刺激活性を有するポリペプチドに結合する可溶性単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む有効量の免疫応答性細胞を投与することを含み、それによって上記被験体において新形成を処置または防止する、方法。
（項目２３）
上記新形成が、血液の癌、Ｂ細胞白血病、多発性骨髄腫、リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、および卵巣癌からなる群より選択される、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
上記新形成が、Ｂ細胞白血病であり、上記抗原が、ＣＤ１９であり、かつ、免疫抑制活性を有する上記ポリペプチドが、ＣＤ４７、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、およびそのリガンドのうちの１以上である、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
上記新形成が、多発性骨髄腫であり、上記抗原が、ＣＤ１９であり、かつ、免疫抑制活性を有する上記ポリペプチドが、ＣＤ４７、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、およびそのリガンドのうちの１以上である、項目２３に記載の方法。
（項目２６）
上記新形成が、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）であり、上記抗原が、ＣＤ１９であり、かつ、免疫抑制活性を有する上記ポリペプチドが、ＣＤ４７、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、およびそのリガンドのうちの１以上である、項目２３に記載の方法。
（項目２７）
上記新形成が、慢性リンパ性白血病であり、上記抗原が、ＣＤ１９であり、かつ、免疫抑制活性を有する上記ポリペプチドが、ＣＤ４７、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、およびそのリガンドのうちの１以上である、項目２３に記載の方法。
（項目２８）
上記新形成が、非ホジキンリンパ腫であり、上記抗原が、ＣＤ１９であり、かつ、免疫抑制活性を有する上記ポリペプチドが、ＣＤ４７、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、およびそのリガンドのうちの１以上である、項目２３に記載の方法。
（項目２９）
上記新形成が、卵巣のものであり、上記抗原が、ＭＵＣ１６であり、かつ、免疫抑制活性を有する上記ポリペプチドが、ＣＤ４７、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、およびそのリガンドのうちの１以上である、項目２３に記載の方法。
（項目３０）
上記可溶性ｓｃＦｖが分泌されるものである、項目２２〜２９のいずれか１項に記載の方法。
（項目３１）
上記ｓｃＦｖが、ベクターから発現される、項目２２〜３０のいずれか１項に記載の方法。
（項目３２）
上記可溶性ｓｃＦｖが、上記免疫応答性細胞の免疫応答を増強する、項目２２〜３１のいずれか１項に記載の方法。
（項目３３）
上記抗原認識受容体が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、項目２２〜３２のいずれか１項に記載の方法。
（項目３４）
上記抗原認識受容体が、外因性または内因性である、項目２２〜３３のいずれか１項に記載の方法。
（項目３５）
上記抗原認識受容体が、組み換え的に発現される、項目２２〜３４のいずれか１項に記載の方法。
（項目３６）
上記抗原認識受容体が、ベクターから発現される、項目２２〜３５のいずれか１項に記載の方法。
（項目３７）
上記細胞が、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、制御性Ｔ細胞、ヒト胚性幹細胞、および多能性幹細胞であって、上記多能性幹細胞からリンパ系細胞が分化され得る、多能性幹細胞からなる群より選択される、項目２２〜３６のいずれか１項に記載の方法。
（項目３８）
上記方法が、上記被験体において腫瘍負荷を減少させる、または根絶させる、項目２２〜３７のいずれか１項に記載の方法。
（項目３９）
抗原特異的免疫応答性細胞を産生するための方法であって、上記方法は、免疫応答性細胞に、免疫抑制活性または免疫刺激活性を有するポリペプチドに結合する単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）をコードする核酸配列を導入することを含み、上記免疫応答性細胞が、抗原に結合する抗原認識受容体を含む、方法。
（項目４０）
上記可溶性ｓｃＦｖが分泌されるものである、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
上記ｓｃＦｖが、ベクターから発現される、項目３９または４０に記載の方法。
（項目４２）
上記可溶性ｓｃＦｖが、上記免疫応答性細胞の免疫応答を増強する、項目３９〜４１のいずれか１項に記載の方法。
（項目４３）
上記免疫抑制性ポリペプチドが、ＣＤ４７、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、およびそのリガンドからなる群より選択される、項目３９〜４２のいずれか１項に記載の方法。
（項目４４）
上記免疫刺激性ポリペプチドが、ＣＤ２８、ＯＸ−４０、４−１ＢＢ、およびそのリガンドからなる群より選択される、項目３９〜４２のいずれか１項に記載の方法。
（項目４５）
上記抗原認識受容体が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、項目３９〜４４のいずれか１項に記載の方法。
（項目４６）
上記抗原認識受容体が、外因性または内因性である、項目３９〜４５のいずれか１項に記載の方法。
（項目４７）
上記抗原認識受容体が、組み換え的に発現される、項目３９〜４６のいずれか１項に記載の方法。
（項目４８）
上記抗原認識受容体が、ベクターから発現される、項目３９〜４７のいずれか１項に記載の方法。
（項目４９）
上記細胞が、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、制御性Ｔ細胞、ヒト胚性幹細胞、および多能性幹細胞であって、上記多能性幹細胞からリンパ系細胞が分化され得る、多能性幹細胞からなる群より選択される、項目３９〜４８のいずれか１項に記載の方法。
（項目５０）
上記抗原認識受容体の細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ζ鎖、ＣＤ９７、ＣＤ１１ａ−ＣＤ１８、ＣＤ２、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＣＤ１５４、ＣＤＳ、ＯＸ４０、４−１ＢＢ、ＣＤ２８シグナル伝達ドメイン、またはその組み合わせである、項目３９〜４９のいずれか１項に記載の方法。
（項目５１）
血液の癌の処置を必要とする被験体において、血液の癌を処置する方法であって、上記方法は、ＣＤ１９に結合する抗原認識受容体であって、上記結合は免疫応答性細胞を活性化する、抗原認識受容体、ならびにＣＤ４７、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４およびそのリガンドの１以上に結合する可溶性単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む治療的に有効な量のＴ細胞を上記被験体に投与することを含み、それによって上記被験体において血液の癌を処置する、方法。
（項目５２）
上記血液の癌が、Ｂ細胞白血病、多発性骨髄腫、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病、および非ホジキンリンパ腫からなる群より選択される、項目５１に記載の方法。
（項目５３）
抗原に結合する抗原認識受容体をコードする核酸配列と、免疫抑制活性または免疫刺激活性を有するポリペプチドに結合する可溶性単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）をコードする核酸配列とを含む、ベクター。
（項目５４）
有効量の、項目１〜１８のいずれか１項に記載の免疫応答性細胞を、薬学的に許容され得る賦形剤中に含む医薬組成物。
（項目５５）
新形成を処置するための医薬組成物であって、有効量の、項目１〜１８のいずれか１項に記載の腫瘍抗原特異的Ｔ細胞を、薬学的に許容され得る賦形剤中に含む、医薬組成物。（項目５６）
新形成、病原体感染、自己免疫障害、または同種異系移植片を処置するためのキットであって、上記キットは、抗原に結合し、免疫応答性細胞を活性化する抗原認識受容体と、免疫抑制活性または免疫刺激活性を有するポリペプチドに結合する可溶性単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む免疫応答性細胞を含む、キット。
（項目５７）
上記キットが、新形成、病原体感染、自己免疫障害、または同種異系移植片を有する被験体を処置するために上記細胞を使用するための説明書をさらに含む、項目５６に記載のキット。
（項目５８）
免疫細胞活性化活性を有する抗原結合受容体および外因性のＣＤ４０Ｌを発現する免疫応答性細胞。
（項目５９）
上記抗原結合受容体が、キメラ抗原受容体である、項目５８に記載の免疫応答性細胞。（項目６０）
上記キメラ抗原受容体が、腫瘍抗原を認識する、項目５９に記載の免疫応答性細胞。
（項目６１）
上記免疫応答性細胞が、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、および制御性Ｔ細胞からなる群より選択される、項目５８〜６０のいずれかに記載の免疫応答性細胞。
（項目６２）
被験体において癌細胞または病原体に応答して免疫活性化サイトカイン産生を増加させる方法であって、上記癌細胞または上記病原体の抗原にそれぞれ結合する抗原認識受容体を有し、さらに外因性のＣＤ４０Ｌを発現する免疫応答性細胞を上記被験体に投与することを含む、方法。
（項目６３）
上記抗原結合受容体が、キメラ抗原受容体である、項目６２に記載の方法。
（項目６４）
上記キメラ抗原受容体が、癌抗原を認識する、項目６３に記載の方法。
（項目６５）
上記免疫応答性細胞が、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、および制御性Ｔ細胞からなる群より選択される、項目６２〜６４のいずれか１項に記載の方法。
（項目６６）
上記サイトカインが、ＩＬ−１２である、項目６２〜６５のいずれか１項に記載の方法。
（項目６７）
被験体において癌細胞または病原体に対するＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞応答を増大させる方法であって、上記癌細胞または上記病原体の抗原にそれぞれ結合する抗原認識受容体を有し、さらに外因性のＣＤ４０Ｌを発現する免疫応答性細胞を上記被験体に投与することを含む、方法。
（項目６８）
上記抗原結合受容体が、キメラ抗原受容体である、項目６７に記載の方法。
（項目６９）
上記キメラ抗原受容体が、癌抗原を認識する、項目６８に記載の方法。
（項目７０）
上記免疫応答性細胞が、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、および制御性Ｔ細胞からなる群より選択される、項目６７〜６９のいずれかに記載の方法。
（項目７１）
癌を有するかまたは病原体によって引き起こされる疾患を有する被験体において樹状細胞成熟を増大させる方法であって、上記癌細胞または上記病原体の抗原にそれぞれ結合する抗原認識受容体を有し、さらに外因性のＣＤ４０Ｌを発現する免疫応答性細胞を上記被献体に投与することを含む、方法。
（項目７２）
上記抗原結合受容体が、キメラ抗原受容体である、項目７１に記載の方法。
（項目７３）
上記キメラ抗原受容体が、癌抗原を認識する、項目７２に記載の方法。
（項目７４）
上記免疫応答性細胞が、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、および制御性Ｔ細胞からなる群より選択される、項目７１〜７３のいずれかに記載の方法。
（項目７５）
被験体において腫瘍負荷を減少させる方法であって、第一抗原に結合する抗原認識受容体であって、上記結合は免疫応答性細胞を活性化する、抗原認識受容体を有し、そして外因性のＣＤ４０Ｌを発現する有効量の免疫応答性細胞を上記被験体に投与することを含み、それによって上記被験体において腫瘍細胞死を誘導する、方法。
（項目７６）
新形成を有する被験体の生存を延ばす方法であって、上記方法は、第一抗原に結合する抗原認識受容体であって、上記結合は免疫応答性細胞を活性化する、抗原認識受容体を有し、そして外因性のＣＤ４０Ｌを発現する有効量の免疫応答性細胞を上記被験体に投与することを含み、それによって上記被験体の生存を延ばす、方法。
（項目７７）
被験体において新形成を処置または防止する方法であって、上記方法は、第一抗原に結合する抗原認識受容体であって、上記結合は免疫応答性細胞を活性化する、抗原認識受容体を有し、そして外因性のＣＤ４０Ｌを発現する有効量の免疫応答性細胞を上記被験体に投与することを含み、それによって上記被験体において新形成を処置または防止する、方法。
（項目７８）
ＣＡＲをコードする配列およびＣＤ４０Ｌをコードする配列を含む核酸であって、それぞれ任意に操作可能にプロモーターエレメントに連結している、核酸。
（項目７９）
ベクターに含まれる、項目７８に記載の核酸。
（項目８０）
上記ベクターがウイルスである、項目７９に記載の核酸。
（項目８１）
新形成、病原体感染、自己免疫障害、または同種異系移植片を処置するためのキットであって、処置されるべき上記新形成、上記病原体、上記自己免疫障害、または上記移植片の抗原を認識するＣＡＲをコードする核酸、および免疫抑制活性または免疫刺激活性を有するポリペプチドに結合する可溶性単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）をコードする核酸を含む、キット。
（項目８２）
癌を処置するためのキットであって、上記癌の抗原を認識するＣＡＲをコードする核酸、および免疫抑制活性または免疫刺激活性を有するポリペプチドに結合する可溶性単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）をコードする核酸を含む、キット。
（項目８３）
癌または病原体が媒介する障害を処置するためのキットであって、上記癌または上記病原体の抗原を認識するＣＡＲをコードする核酸、および免疫抑制活性または免疫刺激活性を有するポリペプチドに結合する可溶性単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）をコードする核酸を含む、キット。
（項目８４）
癌または病原体が媒介する障害を処置するためのキットであって、上記癌または上記病原体の抗原を認識するＣＡＲをコードする核酸、およびＣＤ４０Ｌをコードする核酸を含む、キット。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】図１は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を単独で、または分泌可能なｓｃＦｖ（例えば、αＰＤ−１、αＰＤ−Ｌｌ、αＣＴＬＡ−４、またはαＣＤ４７）とともに発現するように改変されたＴ細胞を示す図である。キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を単独で発現するように改変されたＴ細胞を過酷な腫瘍微小環境内で抑制させる。特定の理論にとらわれるわけではないが、これらの細胞を分泌可能なｓｃＦｖを発現させて、免疫抑制性シグナル伝達を遮断すべくさらに改変すると、腫瘍微小環境を調節し、抑制因子に抵抗する能力ゆえ、抗腫瘍機能が改善した。
【図２】図２Ａおよび２Ｂは、分泌可能な抗ＣＤ−４７  ｓｃＦｖ構築物の構造を示す図である。図２Ａは、カッパ（κ）リーダー配列を含ませてこのタンパク質の移出をすることができるようにデザインされた分泌可能な抗ＣＤ−４７  ｓｃＦｖの構造を示す図である。可変重鎖（ＶＨ）と軽鎖（ＶＬ）がセリン−グリシンリンカー（Ｇ４Ｓ）によって連結され、ｓｃＦｖを検出するためにｍｙｃ−タグペプチドが含まれた。図２Ｂは、分泌可能なｓｃＦｖが、図示されているようなＰ２Ａエレメントを用いて１９２８ｚ  ＣＡＲ構築物に連結されたことを示す図である。
【図３】図３は、カッパリーダー配列［配列番号：１８］に操作可能に連結したＢ６Ｈｌ２．２  ｓｃＦｖ配列を示す図である。Ｂ６Ｈｌ２．２ハイブリドーマの可変重鎖（ＶＨ）配列および可変軽鎖（ＶＬ）配列をカッパリーダー配列、ｃ−ｍｙｃタグでＰＣＲ増幅し、セリン−グリシンリンカーで結合した。核酸配列およびアミノ酸の翻訳を示す。
【図４】図４は、ＣＤＳリーダー配列［配列番号：１９］に操作可能に連結したＢ６Ｈｌ２．２  ｓｃＦｖ配列を示す図である。Ｂ６Ｈｌ２．２ハイブリドーマの可変重鎖（ＶＨ）配列および可変軽鎖（ＶＬ）配列をＣＤＳリーダー配列、ｃ−ｍｙｃタグでＰＣＲ増幅し、セリン−グリシンリンカーで結合した。核酸配列およびアミノ酸の翻訳を示す。
【図５】図５は、１９２８ｚ−２Ａ−Ｂ６Ｈｌ２．２（カッパリーダー）構築物［配列番号：２０］の核酸配列を示す図である。Ｂ６Ｈｌ２．２  ｓｃＦｖ配列をＣＤ１９標的１９２８ｚ  ＣＡＲで発現させるため、ＳＦＧ発現ベクターにクローニングした。図示するように、Ｐ２Ａエレメントを用いて２つのエレメントを結合した。
【図６】図６は、４Ｈｌｌ２８ｚ−２Ａ−Ｂ６Ｈｌ２．２（カッパリーダー）構築物［配列番号：２１］の核酸配列を示す図である。Ｂ６Ｈｌ２．２  ｓｃＦｖ配列をＭＵＣ−ＣＤ標的４Ｈｌｌ２８ｚキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）で発現させるため、ＳＦＧ発現ベクターにクローニングした。図示するように、Ｐ２Ａエレメントを用いて２つのエレメントを結合した。
【図７Ａ】図７Ａおよび７Ｂは、１９２８−２Ａ−Ｂ６Ｈｌ２．２  ２９３Ｇｌｖ９パッケージ細胞の生成を示す図である。ウイルス性パッケージ細胞を、１９２８ｚ−２Ａ−Ｂ６Ｈｌ２．２または１９２８ｚベクターを用いて生成した。図７Ａは、１９２８ｚ  ＣＡＲの発現に基づく、２つのクローン、すなわち、クローン５およびクローン６の選択を示す図である。それは対照１９２８ｚ  ２９３Ｇｌｖ９細胞に匹敵した。ＣＡＲ発現は、フローサイトメトリーおよび１２ｄｌｌ抗体での染色によって判定した。図７Ｂは、１９２８ｚまたは１９２８ｚ−２Ａ−Ｂ６Ｈｌ２．２パッケージ細胞からの上清を、ＣＤ４７＋腫瘍細胞、Ｎａｌｍ−６およびＲａｊｉとともにインキュベートし、その腫瘍細胞を洗浄し、抗ＣＤ４７で染色した場合の実験を示す図である。１９２８ｚ−２Ａ−Ｂ６Ｈｌ２．２上清中でインキュベートした腫瘍細胞（複数の青のライン）は、１９２８ｚ上清を用いたインキュベーション（黒のライン）と比較して、抗ＣＤ４７結合を減少させた。Ｂ６Ｈｌ２．２ハイブリドーマ細胞からの上清を対照（赤のライン）として使用した。
【図７Ｂ】図７Ａおよび７Ｂは、１９２８−２Ａ−Ｂ６Ｈｌ２．２  ２９３Ｇｌｖ９パッケージ細胞の生成を示す図である。ウイルス性パッケージ細胞を、１９２８ｚ−２Ａ−Ｂ６Ｈｌ２．２または１９２８ｚベクターを用いて生成した。図７Ａは、１９２８ｚ  ＣＡＲの発現に基づく、２つのクローン、すなわち、クローン５およびクローン６の選択を示す図である。それは対照１９２８ｚ  ２９３Ｇｌｖ９細胞に匹敵した。ＣＡＲ発現は、フローサイトメトリーおよび１２ｄｌｌ抗体での染色によって判定した。図７Ｂは、１９２８ｚまたは１９２８ｚ−２Ａ−Ｂ６Ｈｌ２．２パッケージ細胞からの上清を、ＣＤ４７＋腫瘍細胞、Ｎａｌｍ−６およびＲａｊｉとともにインキュベートし、その腫瘍細胞を洗浄し、抗ＣＤ４７で染色した場合の実験を示す図である。１９２８ｚ−２Ａ−Ｂ６Ｈｌ２．２上清中でインキュベートした腫瘍細胞（複数の青のライン）は、１９２８ｚ上清を用いたインキュベーション（黒のライン）と比較して、抗ＣＤ４７結合を減少させた。Ｂ６Ｈｌ２．２ハイブリドーマ細胞からの上清を対照（赤のライン）として使用した。
【図８Ａ】図８Ａおよび８Ｂは、１９２８ｚ−２Ａ−Ｂ６Ｈｌ２．２ヒト末梢血Ｔ細胞の生成を示す図である。ヒト末梢血Ｔ細胞を１９２８ｚまたは１９２８ｚ−２Ａ−Ｂ６Ｈｌ２．２パッケージ細胞からの上清を用いて形質導入した。図６Ａは、１２ｄ１１抗体を用いたＣＡＲ発現および蛍光タグを付けた抗ｃ−ｍｙｃタグ抗体で染色した結合抗ＣＤ４７  ｓｃＦｖのフローサイトメトリーの解析を示す図である。図６Ｂは、抗ＣＤ４７  ｓｃＦｖがＣＤ４７を遮断する能力を示す図である。抗ＣＤ４７抗体でＴ細胞を染色することによって判定した。１９２８ｚ−２Ａ−Ｂ６Ｈｌ２．２  Ｔ細胞は、１９２８ｚ  Ｔ細胞（赤のライン）と比較して、抗ＣＤ４７結合（青のライン）を減少させた。Ｂ６Ｈｌ２．２ハイブリドーマ上清中でインキュベートした１９２８ｚ  Ｔ細胞を対照（黒のライン）として使用した。
【図８Ｂ】図８Ａおよび８Ｂは、１９２８ｚ−２Ａ−Ｂ６Ｈｌ２．２ヒト末梢血Ｔ細胞の生成を示す図である。ヒト末梢血Ｔ細胞を１９２８ｚまたは１９２８ｚ−２Ａ−Ｂ６Ｈｌ２．２パッケージ細胞からの上清を用いて形質導入した。図６Ａは、１２ｄ１１抗体を用いたＣＡＲ発現および蛍光タグを付けた抗ｃ−ｍｙｃタグ抗体で染色した結合抗ＣＤ４７  ｓｃＦｖのフローサイトメトリーの解析を示す図である。図６Ｂは、抗ＣＤ４７  ｓｃＦｖがＣＤ４７を遮断する能力を示す図である。抗ＣＤ４７抗体でＴ細胞を染色することによって判定した。１９２８ｚ−２Ａ−Ｂ６Ｈｌ２．２  Ｔ細胞は、１９２８ｚ  Ｔ細胞（赤のライン）と比較して、抗ＣＤ４７結合（青のライン）を減少させた。Ｂ６Ｈｌ２．２ハイブリドーマ上清中でインキュベートした１９２８ｚ  Ｔ細胞を対照（黒のライン）として使用した。
【図９−１】図９Ａ〜９Ｃは、１９２８ｚ−２Ａヒト末梢血Ｔ細胞を示す図である。フローサイトメトリーを行って、１９２８ｚおよび１９２８ｚ−２Ａ−Ｂ６Ｈｌ２．２  Ｔ細胞の表現型の特徴を確認した。図９Ａは、１９２８ｚおよび１９２８ｚ−２ＡＴ細胞が、同等のＣＤ４：ＣＤ８率のＴ細胞、活性化マーカーＣＤ６９およびＣＤ２５の同等の発現を有していたことを示す図である。１９２８ｚ  Ｔ細胞は、１９２８ｚ−２Ａ−Ｂ６Ｈｌ２．２  Ｔ細胞と比較してＣＤ６２Ｌの発現を増加させた。図９Ｂは、１９２８ｚ  Ｔ細胞および１９２８ｚ−２Ａ−Ｂ６Ｈｌ２．２  Ｔ細胞がサイトカインを分泌する能力を示す図である。３Ｔ３（ＣＤ１９＋／Ｂ７．１＋）ａＡＰＣｓ細胞とゴルジ輸送阻害剤、ゴルジプラグおよびゴルジストップとともにインキュベートした後、フローサイトメトリーを行って評価した。１９２８ｚ  Ｔ細胞および１９２８ｚ−２Ａ−Ｂ６Ｈｌ２．２  Ｔ細胞は、３Ｔ３（ＣＤ１９＋／Ｂ７．１＋）細胞での刺激後、同等のレベルのＩＬ−２およびＩＦＮｇを産生した。図９Ｃは、Ｒａｊｉ腫瘍細胞を用いた標準的な５１クロム放出アッセイによって評価したところ、１９２８ｚ  Ｔ細胞および１９２８ｚ−２Ａ−Ｂ６Ｈ１２．２  Ｔ細胞が同等の細胞溶解性能を有することを示している。
【図９−２】図９Ａ〜９Ｃは、１９２８ｚ−２Ａヒト末梢血Ｔ細胞を示す図である。フローサイトメトリーを行って、１９２８ｚおよび１９２８ｚ−２Ａ−Ｂ６Ｈｌ２．２  Ｔ細胞の表現型の特徴を確認した。図９Ａは、１９２８ｚおよび１９２８ｚ−２ＡＴ細胞が、同等のＣＤ４：ＣＤ８率のＴ細胞、活性化マーカーＣＤ６９およびＣＤ２５の同等の発現を有していたことを示す図である。１９２８ｚ  Ｔ細胞は、１９２８ｚ−２Ａ−Ｂ６Ｈｌ２．２  Ｔ細胞と比較してＣＤ６２Ｌの発現を増加させた。図９Ｂは、１９２８ｚ  Ｔ細胞および１９２８ｚ−２Ａ−Ｂ６Ｈｌ２．２  Ｔ細胞がサイトカインを分泌する能力を示す図である。３Ｔ３（ＣＤ１９＋／Ｂ７．１＋）ａＡＰＣｓ細胞とゴルジ輸送阻害剤、ゴルジプラグおよびゴルジストップとともにインキュベートした後、フローサイトメトリーを行って評価した。１９２８ｚ  Ｔ細胞および１９２８ｚ−２Ａ−Ｂ６Ｈｌ２．２  Ｔ細胞は、３Ｔ３（ＣＤ１９＋／Ｂ７．１＋）細胞での刺激後、同等のレベルのＩＬ−２およびＩＦＮｇを産生した。図９Ｃは、Ｒａｊｉ腫瘍細胞を用いた標準的な５１クロム放出アッセイによって評価したところ、１９２８ｚ  Ｔ細胞および１９２８ｚ−２Ａ−Ｂ６Ｈ１２．２  Ｔ細胞が同等の細胞溶解性能を有することを示している。
【図９−３】図９Ａ〜９Ｃは、１９２８ｚ−２Ａヒト末梢血Ｔ細胞を示す図である。フローサイトメトリーを行って、１９２８ｚおよび１９２８ｚ−２Ａ−Ｂ６Ｈｌ２．２  Ｔ細胞の表現型の特徴を確認した。図９Ａは、１９２８ｚおよび１９２８ｚ−２ＡＴ細胞が、同等のＣＤ４：ＣＤ８率のＴ細胞、活性化マーカーＣＤ６９およびＣＤ２５の同等の発現を有していたことを示す図である。１９２８ｚ  Ｔ細胞は、１９２８ｚ−２Ａ−Ｂ６Ｈｌ２．２  Ｔ細胞と比較してＣＤ６２Ｌの発現を増加させた。図９Ｂは、１９２８ｚ  Ｔ細胞および１９２８ｚ−２Ａ−Ｂ６Ｈｌ２．２  Ｔ細胞がサイトカインを分泌する能力を示す図である。３Ｔ３（ＣＤ１９＋／Ｂ７．１＋）ａＡＰＣｓ細胞とゴルジ輸送阻害剤、ゴルジプラグおよびゴルジストップとともにインキュベートした後、フローサイトメトリーを行って評価した。１９２８ｚ  Ｔ細胞および１９２８ｚ−２Ａ−Ｂ６Ｈｌ２．２  Ｔ細胞は、３Ｔ３（ＣＤ１９＋／Ｂ７．１＋）細胞での刺激後、同等のレベルのＩＬ−２およびＩＦＮｇを産生した。図９Ｃは、Ｒａｊｉ腫瘍細胞を用いた標準的な５１クロム放出アッセイによって評価したところ、１９２８ｚ  Ｔ細胞および１９２８ｚ−２Ａ−Ｂ６Ｈ１２．２  Ｔ細胞が同等の細胞溶解性能を有することを示している。
【図１０】図１０Ａおよび１０Ｂは、１９２８ｚ−２Ａ−Ｂ６Ｈ１２．２  Ｔ細胞の抗腫瘍有効性を示す図である。１９２８ｚ−２Ａ−Ｂ６Ｈ１２．２  Ｔ細胞のインビボ抗腫瘍有効性を、前臨床ＳＣＩＤベージュマウスモデルを用いて調べた。マウスに、１×ｌ０６のＮａｌｍ−６−ホタルルシフェラーゼ＋腫瘍細胞を静脈から接種させ、次いで、５．７×ｌ０６  ＣＡＲ＋１９２８ｚ、１９２８ｚ−２Ａ−Ｂ６Ｈ１２．２または対照卵巣癌標的４Ｈ１１２８ｚ−２Ａ−Ｂ６Ｈ１２．２  Ｔ細胞を用いて処置した。これも、静脈から接種させることにより行った。図１０Ａは、未処置マウス、１９２８ｚまたは４Ｈ１１２８ｚ−２Ａ−Ｂ６Ｈ１２．２処置マウスと比較して、１９２８ｚ−２Ａ−Ｂ６Ｈ１２．２  Ｔ細胞で処置したマウスの生存率が高かったことを示している。図１０Ｂは、生物発光イメージングを用いて腫瘍の進行をモニターしたところ、未処置マウス、１９２８ｚまたは４Ｈ１１２８ｚ−２Ａ−Ｂ６Ｈ１２．２  Ｔ細胞処置マウスと比較して、１９２８ｚ−２Ａ−Ｂ６Ｈ１２．２処置マウスは腫瘍負荷を減少させたことを示している。
【図１１】図１１は、カッパリーダー配列［配列番号：２２］に操作可能に連結した５Ｃ４  ｓｃＦｖ配列を示す図である。５Ｃ４抗体クローンの可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）配列を、カッパリーダー配列、ｃ−ｍｙｃタグを用いてデザインし、セリン−グリシンリンカーを用いて接合した。その核酸配列およびアミノ酸翻訳を示す。
【図１２】図１２は、１９２８ｚ−２Ａ−５Ｃ４（カッパリーダー）構築物の核酸配列を示す［配列番号：２３］。５Ｃ４  ｓｃＦｖ配列を、ＣＤ１９標的１９２８ｚ  ＣＡＲで発現させるため、ＳＦＧ発現ベクターにクローニングした。Ｐ２Ａエレメントを用いて、２つのエレメントを、図示したように結合した。
【図１３】図１３は、４Ｈ１１２８ｚ−２Ａ−５Ｃ４（カッパリーダー）構築物の核酸配列を示す［配列番号：２４］。５Ｃ４  ｓｃＦｖを、ＭＵＣ−ＣＤ−標的４Ｈ１１２８ｚ  ＣＡＲで発現させるため、ＳＦＧ発現ベクターにクローニングした。Ｐ２Ａエレメントを用いて、２つのエレメントを、図示したように結合した。
【図１４】図１４は、１９２８ｚ−２Ａ−５Ｃ４（カッパリーダー）２９３Ｇｌｖ９細胞の生成を示す図である。１９２８ｚ−２Ａ−５Ｃ４を用いてウイルス性パッケージ細胞を生成した。２つのクローン、すなわち、クローンＡ６およびクローンＢ６は、１９２８ｚ  ＣＡＲの発現に基づいて選択した。それは対照１９２８ｚ  ２９３Ｇｌｖ９細胞に匹敵した。ＣＡＲ発現は、フローサイトメトリーおよび１２ｄｌｌ抗体での染色によって判定した。
【図１５】図１５は、１９２８ｚ−２Ａ−５Ｃ４（カッパリーダー）ヒト末梢血Ｔ細胞の生成を示す図である。ヒト末梢血Ｔ細胞を１９２８ｚまたは１９２８ｚ−２Ａ−５Ｃ４パッケージ細胞からの上清を用いて形質導入した。フローサイトメトリーを用いて、１２ｄ１１抗体を用いたＣＡＲ発現および蛍光タグを付けた抗ｃ−ｍｙｃタグ抗体での染色を用いた結合抗ＣＤ４７  ｓｃＦｖの解析を行った。
【図１６Ａ】図１６は、３Ｔ３（ＣＤ１９＋／Ｂ７．１＋）、ＲａｊｉおよびＮａｌｍ−６細胞でのＰＤ−Ｌ１発現を示す図である。フローサイトメトリーを用いて、ＰＤ−Ｌｌを発現するように形質導入された、３Ｔ３（ＣＤ１９＋／Ｂ７．１＋）、ＲａｊｉおよびＮａｌｍ−６細胞でのＰＤ−Ｌ１発現を判定した。形質導入された細胞は、対照の形質導入されていない細胞と比較して、有意なレベルのＰＤ−Ｌ１を発現した。円で示した群を分類して実験に用いた。
【図１６Ｂ】図１６は、３Ｔ３（ＣＤ１９＋／Ｂ７．１＋）、ＲａｊｉおよびＮａｌｍ−６細胞でのＰＤ−Ｌ１発現を示す図である。フローサイトメトリーを用いて、ＰＤ−Ｌｌを発現するように形質導入された、３Ｔ３（ＣＤ１９＋／Ｂ７．１＋）、ＲａｊｉおよびＮａｌｍ−６細胞でのＰＤ−Ｌ１発現を判定した。形質導入された細胞は、対照の形質導入されていない細胞と比較して、有意なレベルのＰＤ−Ｌ１を発現した。円で示した群を分類して実験に用いた。
【図１６Ｃ】図１６は、３Ｔ３（ＣＤ１９＋／Ｂ７．１＋）、ＲａｊｉおよびＮａｌｍ−６細胞でのＰＤ−Ｌ１発現を示す図である。フローサイトメトリーを用いて、ＰＤ−Ｌｌを発現するように形質導入された、３Ｔ３（ＣＤ１９＋／Ｂ７．１＋）、ＲａｊｉおよびＮａｌｍ−６細胞でのＰＤ−Ｌ１発現を判定した。形質導入された細胞は、対照の形質導入されていない細胞と比較して、有意なレベルのＰＤ−Ｌ１を発現した。円で示した群を分類して実験に用いた。
【図１７】図１７は、１９２８ｚ細胞および１９２８ｚ−２Ａ−５Ｃ４  Ｔ細胞の増殖を示す図である。１９２８ｚ  Ｔ細胞および１９２８ｚ−２Ａ−５Ｃ４  Ｔ細胞を、３Ｔ３（ＣＤ１９＋／Ｂ７．１＋）または３Ｔ３（ＣＤ１９＋／Ｂ７．１＋／ＰＤ−Ｌ１＋）とともにインキュベートし、Ｔ細胞の増殖を、トリパンブルーを用いてモニターし、ＣＡＲ発現をフローサイトメトリーによって判定した。増殖およびＣＡＲ発現は、３Ｔ３（ＣＤ１９＋／Ｂ７．１＋）細胞上で増殖された細胞のそれと相関を示していた。
【図１８−１】図１８は、マウスカッパリーダー配列に操作可能に連結したＪ４３  ｓｃＦｖ配列［配列番号：２５］を示す図である。Ｊ４３抗体クローンの可変重鎖（ＶＨ）配列および可変軽鎖（ＶＬ）配列を、マウスカッパリーダー配列、ｃ−ｍｙｃタグを用いてデザインし、セリン−グリシンリンカーを用いて結合した。配列およびアミノ酸の翻訳を示す。
【図１８−２】図１８は、マウスカッパリーダー配列に操作可能に連結したＪ４３  ｓｃＦｖ配列［配列番号：２５］を示す図である。Ｊ４３抗体クローンの可変重鎖（ＶＨ）配列および可変軽鎖（ＶＬ）配列を、マウスカッパリーダー配列、ｃ−ｍｙｃタグを用いてデザインし、セリン−グリシンリンカーを用いて結合した。配列およびアミノ酸の翻訳を示す。
【図１９】図１９は、１９ｍ２８ｍｚｉＲＥＳＪ４３（マウスカッパリーダー）構築物の核酸配列［配列番号：２６］を示す図である。Ｊ４３  ｓｃＦｖをＣＤ１９標的１９ｍ２８ｍｚ  ＣＡＲで発現させるため、ＳＦＧ発現ベクターにクローニングした。図示するように、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）エレメントを用いて２つのエレメントを結合した。
【図２０】図２０は、４Ｈ１１ｍ２８ｍｚｉＲＥＳＪ４３（マウスカッパリーダー）構築物の核酸配列［配列番号：２７］を示す図である。Ｊ４３  ｓｃＦｖを、ＭＵＣ−ＣＤ標的４Ｈ１１ｍ２８ｍｚＣＡＲで発現させるため、ＳＦＧ発現ベクターにクローニングした。図示するように、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）エレメントを用いて２つのエレメントを結合した。
【図２１】図２１は、ＣＡＲ  Ｔ細胞を遺伝子改変して、ｓｃＦｖ分子（「武装化（ａｒｍｏｒｅｄ）ＣＡＲ  Ｔ細胞」）を発現させて、「過酷な」腫瘍微小環境を克服するための戦略を示す図である。免疫制御機能を有するアンタゴニストｓｃＦｖを分泌するようにＣＡＲ＋Ｔ細胞を改変してもよい。ＣＡＲの同族抗原に対する活性化後（１）、武装化ＣＡＲ改変Ｔ細胞を、阻害性ＰＤ−１  Ｔ細胞受容体に拮抗するｓｃＦｖを融合されたＣＡＲ改変Ｔ細胞上および抗腫瘍エフェクター機能を高める内因性の抗腫瘍Ｔ細胞上の両方で分泌するよう誘導し（２）、阻害性ＣＴＬＡ−４  Ｔ細胞受容体に拮抗するｓｃＦｖを融合されたＣＡＲ改変Ｔ細胞上および抗腫瘍エフェクター機能を高める内因性の抗腫瘍Ｔ細胞上の両方で分泌するよう誘導し（３）、あるいは、腫瘍細胞上で発現したＣＤ４７受容体に拮抗するｓｃＦｖを分泌するよう誘導し、宿主の生来の抗腫瘍免疫応答による認識に対して腫瘍細胞を覆う状況（ｃｌｏａｋｉｎｇ）を逆転し、宿主マクロファージによる腫瘍の認識と根絶を導いてもよい。
【図２２−１】図２２Ａ〜２２ＤはヒトＴ細胞によるＣＤ４０Ｌの構成的発現を示す図である。（Ａ）は、ヒトＣＤ４０Ｌベクターをコードするレトロウイルス構築物の概略図である。ＬＴＲは、長末端繰り返し；ＳＤは、スプライスドナー、ＳＡはスプライスアクセプター；Ψは、パッケージエレメントである。（Ｂ）は、レトロウイルス遺伝子転送後のＣＤ４＋およびＣＤ８＋ＣＤ４０Ｌ−改変Ｔ細胞のフローサイトメトリーを示す図である。ここで、ｘ軸は、ＡＰＣコンジュゲート抗ヒトＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）を示す。（Ｃ）は、モック形質導入Ｔ細胞と比較して、ＣＤ４０Ｌ改変Ｔ細胞の増殖が増強されていることを示す図である。（Ｄ）は、モック形質導入Ｔ細胞と比較して、ＣＤ４０Ｌ改変Ｔ細胞の、可溶性ＣＤ４０Ｌ（ｓＣＤ４０Ｌ）、ＩＦＮ−γ、およびＧＭ−ＣＳＦの分泌が増強されていることを示す図である。すべての結果は、少なくとも３つの別個の実験の代表である（＊は、統計学的有意性を示す）。
【図２２−２】図２２Ａ〜２２ＤはヒトＴ細胞によるＣＤ４０Ｌの構成的発現を示す図である。（Ａ）は、ヒトＣＤ４０Ｌベクターをコードするレトロウイルス構築物の概略図である。ＬＴＲは、長末端繰り返し；ＳＤは、スプライスドナー、ＳＡはスプライスアクセプター；Ψは、パッケージエレメントである。（Ｂ）は、レトロウイルス遺伝子転送後のＣＤ４＋およびＣＤ８＋ＣＤ４０Ｌ−改変Ｔ細胞のフローサイトメトリーを示す図である。ここで、ｘ軸は、ＡＰＣコンジュゲート抗ヒトＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）を示す。（Ｃ）は、モック形質導入Ｔ細胞と比較して、ＣＤ４０Ｌ改変Ｔ細胞の増殖が増強されていることを示す図である。（Ｄ）は、モック形質導入Ｔ細胞と比較して、ＣＤ４０Ｌ改変Ｔ細胞の、可溶性ＣＤ４０Ｌ（ｓＣＤ４０Ｌ）、ＩＦＮ−γ、およびＧＭ−ＣＳＦの分泌が増強されていることを示す図である。すべての結果は、少なくとも３つの別個の実験の代表である（＊は、統計学的有意性を示す）。
【図２２−３】図２２Ａ〜２２ＤはヒトＴ細胞によるＣＤ４０Ｌの構成的発現を示す図である。（Ａ）は、ヒトＣＤ４０Ｌベクターをコードするレトロウイルス構築物の概略図である。ＬＴＲは、長末端繰り返し；ＳＤは、スプライスドナー、ＳＡはスプライスアクセプター；Ψは、パッケージエレメントである。（Ｂ）は、レトロウイルス遺伝子転送後のＣＤ４＋およびＣＤ８＋ＣＤ４０Ｌ−改変Ｔ細胞のフローサイトメトリーを示す図である。ここで、ｘ軸は、ＡＰＣコンジュゲート抗ヒトＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）を示す。（Ｃ）は、モック形質導入Ｔ細胞と比較して、ＣＤ４０Ｌ改変Ｔ細胞の増殖が増強されていることを示す図である。（Ｄ）は、モック形質導入Ｔ細胞と比較して、ＣＤ４０Ｌ改変Ｔ細胞の、可溶性ＣＤ４０Ｌ（ｓＣＤ４０Ｌ）、ＩＦＮ−γ、およびＧＭ−ＣＳＦの分泌が増強されていることを示す図である。すべての結果は、少なくとも３つの別個の実験の代表である（＊は、統計学的有意性を示す）。
【図２３Ａ】図２３Ａおよび２３Ｂは、ＣＤ４０Ｌ−改変Ｔ細胞によるＣＤ４０＋腫瘍細胞の強化された免疫原性を示す図である。（Ａ）は、共刺激分子（ＣＤ８０およびＣＤ８６）、接着分子（ＣＤ５４、ＣＤ５８、およびＣＤ７０）、ＨＬＡ分子（ＨＬＡクラスＩおよびＨＬＡ−ＤＲ）、ならびにＦａｓ死受容体（ＣＤ９５）のＤＯＨＨ２腫瘍細胞株上でのアップレギュレーションを示すフローサイトメトリーを示す図である。同じドナーからのモック形質導入Ｔ細胞を用いた培養（グレー線）と比較してＣＤ４０Ｌ改変Ｔ細胞を用いて共培養した後のもの（実線）を示している。（Ｂ）ＣＤ４０Ｌ改変Ｔ細胞を用いて共培養後、ＣＤ４０−腫瘍（ＮＡＬＭ６が示されている）は、表現型の変化を示していない。すべての結果は、少なくとも３つの別個の実験の代表である。
【図２３Ｂ】図２３Ａおよび２３Ｂは、ＣＤ４０Ｌ−改変Ｔ細胞によるＣＤ４０＋腫瘍細胞の強化された免疫原性を示す図である。（Ａ）は、共刺激分子（ＣＤ８０およびＣＤ８６）、接着分子（ＣＤ５４、ＣＤ５８、およびＣＤ７０）、ＨＬＡ分子（ＨＬＡクラスＩおよびＨＬＡ−ＤＲ）、ならびにＦａｓ死受容体（ＣＤ９５）のＤＯＨＨ２腫瘍細胞株上でのアップレギュレーションを示すフローサイトメトリーを示す図である。同じドナーからのモック形質導入Ｔ細胞を用いた培養（グレー線）と比較してＣＤ４０Ｌ改変Ｔ細胞を用いて共培養した後のもの（実線）を示している。（Ｂ）ＣＤ４０Ｌ改変Ｔ細胞を用いて共培養後、ＣＤ４０−腫瘍（ＮＡＬＭ６が示されている）は、表現型の変化を示していない。すべての結果は、少なくとも３つの別個の実験の代表である。
【図２４Ａ】図２４Ａおよび２４Ｂは、自系ＣＤ４０Ｌ改変Ｔ細胞によるＣＬＬ細胞の強化された免疫原性を示す図である。（Ａ）レトロウイルスベクターを含有するＣＤ４０Ｌを用いた、レトロウイルス遺伝子輸送後の、患者由来ＣＤ４０Ｌ−改変Ｔ細胞のフローサイトメトリーを示す図である。ｘ軸は、ＡＰＣコンジュゲート抗ヒトＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）を示す。（Ｂ）は、共刺激分子（ＣＤ８０およびＣＤ８６）、接着分子（ＣＤ５４、ＣＤ５８、およびＣＤ７０）ＨＬＡ（ＨＬＡクラスＩおよびＨＬＡ−ＤＲ）、ならびにＦａｓ死受容体（ＣＤ９５）のＣＬＬ細胞上でのアップレギュレーションを示すフローサイトメトリーを示す図である。同じドナーからのモック形質導入Ｔ細胞を用いた培養（グレー線）と比較して、自系ＣＤ４０Ｌ−改変Ｔ細胞を用いて共培養した後のもの（実線）を示している。すべての結果は、少なくとも３つの別個の実験の代表である。
【図２４Ｂ】図２４Ａおよび２４Ｂは、自系ＣＤ４０Ｌ改変Ｔ細胞によるＣＬＬ細胞の強化された免疫原性を示す図である。（Ａ）レトロウイルスベクターを含有するＣＤ４０Ｌを用いた、レトロウイルス遺伝子輸送後の、患者由来ＣＤ４０Ｌ−改変Ｔ細胞のフローサイトメトリーを示す図である。ｘ軸は、ＡＰＣコンジュゲート抗ヒトＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）を示す。（Ｂ）は、共刺激分子（ＣＤ８０およびＣＤ８６）、接着分子（ＣＤ５４、ＣＤ５８、およびＣＤ７０）ＨＬＡ（ＨＬＡクラスＩおよびＨＬＡ−ＤＲ）、ならびにＦａｓ死受容体（ＣＤ９５）のＣＬＬ細胞上でのアップレギュレーションを示すフローサイトメトリーを示す図である。同じドナーからのモック形質導入Ｔ細胞を用いた培養（グレー線）と比較して、自系ＣＤ４０Ｌ−改変Ｔ細胞を用いて共培養した後のもの（実線）を示している。すべての結果は、少なくとも３つの別個の実験の代表である。
【図２５Ａ】図２５Ａおよび２５ＢはＣＤ４０Ｌ改変Ｔ細胞によるＩＬ−１２の分泌および単球由来樹状細胞（ｍｏＤＣ）の成熟を示す図である。（Ａ）は、ＩＬ−１２ｐ７０分泌の上昇を示す別個の３ドナーからのｍｏＤＣとＣＤ４０Ｌ改変Ｔ細胞間の共培養（２４時間）のための培養培地のサイトカイン分析を示す。（Ｂ）は、ＣＤ４０Ｌ改変Ｔ細胞との共培養後の成熟を示すｍｏＤＣのフローサイトメトリーを示す。すべての結果は、少なくとも３つの別個の実験の代表である。
【図２５Ｂ】図２５Ａおよび２５ＢはＣＤ４０Ｌ改変Ｔ細胞によるＩＬ−１２の分泌および単球由来樹状細胞（ｍｏＤＣ）の成熟を示す図である。（Ａ）は、ＩＬ−１２ｐ７０分泌の上昇を示す別個の３ドナーからのｍｏＤＣとＣＤ４０Ｌ改変Ｔ細胞間の共培養（２４時間）のための培養培地のサイトカイン分析を示す。（Ｂ）は、ＣＤ４０Ｌ改変Ｔ細胞との共培養後の成熟を示すｍｏＤＣのフローサイトメトリーを示す。すべての結果は、少なくとも３つの別個の実験の代表である。
【図２６Ａ】図２６Ａ〜２６Ｃは、ＣＡＲ／ＣＤ４０Ｌベクターを用いた、ヒトＴ細胞の効率的な形質導入が、細胞傷害性を高めたことを示す図である。（Ａ）は、１９２８ｚ−ＩＲＥＳ−ＣＤ４０ＬおよびＰｚ１−ＩＲＥＳ−ＣＤ４０Ｌ遺伝子を含有するレトロウイルス構築物の概略図である。ＬＴＲは、長末端繰り返し；ＳＤは、スプライスドナー、ＳＡはスプライスアクセプター；Ψは、パッケージエレメントである。ＣＤ８は、ＣＤ８リーダー配列を示す。ｓｃＦｖは、単鎖可変フラグメント、ＶＨおよびＶＬは、可変重鎖および軽鎖、ＴＭは、膜貫通ドメインを示す。（Ｂ）は、１９−２８ｚ／ＣＤ４０Ｌベクターを発現するように形質導入されたヒトＴ細胞のＦＡＣＳ分析（刺激前）で、引き続きインビボ実験に用いられるＡＡＰＣ（ＣＤ１９およびＣＤ８０を発現するＮＩＨ  ３Ｔ３線維芽細胞；１９２８／ＣＤ４０Ｌ  Ｔ細胞が示されている）上での共培養後、ＣＡＲ／ＣＤ４０Ｌの発現が増強されている。ｘ軸は、ＰＥコンジュゲート１９２８ｚ  ＣＡＲ特異性抗体（１９ｅ３）；ｙ軸は、ＡＰＣコンジュゲート抗ヒトＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）を示す。（Ｃ）は、標準的な５１Ｃｒ放出アッセイによって判定されたように、１９−２８ｚ  Ｔ細胞と比較したとき、１９−２８ｚ／４０Ｌ  Ｔ細胞では、ＤＯＨＨ２腫瘍細胞を溶解する能力が有意に増加していた。すべての結果は、少なくとも３つの別個の実験の代表である（＊は、統計学的有意性を示す）。
【図２６Ｂ】図２６Ａ〜２６Ｃは、ＣＡＲ／ＣＤ４０Ｌベクターを用いた、ヒトＴ細胞の効率的な形質導入が、細胞傷害性を高めたことを示す図である。（Ａ）は、１９２８ｚ−ＩＲＥＳ−ＣＤ４０ＬおよびＰｚ１−ＩＲＥＳ−ＣＤ４０Ｌ遺伝子を含有するレトロウイルス構築物の概略図である。ＬＴＲは、長末端繰り返し；ＳＤは、スプライスドナー、ＳＡはスプライスアクセプター；Ψは、パッケージエレメントである。ＣＤ８は、ＣＤ８リーダー配列を示す。ｓｃＦｖは、単鎖可変フラグメント、ＶＨおよびＶＬは、可変重鎖および軽鎖、ＴＭは、膜貫通ドメインを示す。（Ｂ）は、１９−２８ｚ／ＣＤ４０Ｌベクターを発現するように形質導入されたヒトＴ細胞のＦＡＣＳ分析（刺激前）で、引き続きインビボ実験に用いられるＡＡＰＣ（ＣＤ１９およびＣＤ８０を発現するＮＩＨ  ３Ｔ３線維芽細胞；１９２８／ＣＤ４０Ｌ  Ｔ細胞が示されている）上での共培養後、ＣＡＲ／ＣＤ４０Ｌの発現が増強されている。ｘ軸は、ＰＥコンジュゲート１９２８ｚ  ＣＡＲ特異性抗体（１９ｅ３）；ｙ軸は、ＡＰＣコンジュゲート抗ヒトＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）を示す。（Ｃ）は、標準的な５１Ｃｒ放出アッセイによって判定されたように、１９−２８ｚ  Ｔ細胞と比較したとき、１９−２８ｚ／４０Ｌ  Ｔ細胞では、ＤＯＨＨ２腫瘍細胞を溶解する能力が有意に増加していた。すべての結果は、少なくとも３つの別個の実験の代表である（＊は、統計学的有意性を示す）。
【図２６Ｃ】図２６Ａ〜２６Ｃは、ＣＡＲ／ＣＤ４０Ｌベクターを用いた、ヒトＴ細胞の効率的な形質導入が、細胞傷害性を高めたことを示す図である。（Ａ）は、１９２８ｚ−ＩＲＥＳ−ＣＤ４０ＬおよびＰｚ１−ＩＲＥＳ−ＣＤ４０Ｌ遺伝子を含有するレトロウイルス構築物の概略図である。ＬＴＲは、長末端繰り返し；ＳＤは、スプライスドナー、ＳＡはスプライスアクセプター；Ψは、パッケージエレメントである。ＣＤ８は、ＣＤ８リーダー配列を示す。ｓｃＦｖは、単鎖可変フラグメント、ＶＨおよびＶＬは、可変重鎖および軽鎖、ＴＭは、膜貫通ドメインを示す。（Ｂ）は、１９−２８ｚ／ＣＤ４０Ｌベクターを発現するように形質導入されたヒトＴ細胞のＦＡＣＳ分析（刺激前）で、引き続きインビボ実験に用いられるＡＡＰＣ（ＣＤ１９およびＣＤ８０を発現するＮＩＨ  ３Ｔ３線維芽細胞；１９２８／ＣＤ４０Ｌ  Ｔ細胞が示されている）上での共培養後、ＣＡＲ／ＣＤ４０Ｌの発現が増強されている。ｘ軸は、ＰＥコンジュゲート１９２８ｚ  ＣＡＲ特異性抗体（１９ｅ３）；ｙ軸は、ＡＰＣコンジュゲート抗ヒトＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）を示す。（Ｃ）は、標準的な５１Ｃｒ放出アッセイによって判定されたように、１９−２８ｚ  Ｔ細胞と比較したとき、１９−２８ｚ／４０Ｌ  Ｔ細胞では、ＤＯＨＨ２腫瘍細胞を溶解する能力が有意に増加していた。すべての結果は、少なくとも３つの別個の実験の代表である（＊は、統計学的有意性を示す）。
【図２７】図２７は、１９２８ｚ／ＣＤ４０Ｌ  Ｔ細胞注入後の腫瘍の根絶および長期生存を示す図である。ＣＡＲ改変Ｔ細胞を単回静脈内投与する２日前に、ＤＯＨＨ２腫瘍細胞を静脈内（ｉ．ｖ．）注射で接種したＳＣＩＤベージュマウスの生存率曲線である。対照Ｔ細胞のパネルと比較して（１９２８ｚ群、ｎ＝８；Ｐｚ１およびＰｚ１／４０Ｌ群、ｎ＝５）、１９２８ｚ／ＣＤ４０Ｌ  Ｔ細胞（ｎ＝１０）で処置したマウスにおいて、長期生存性が高められたことが確認された。すべての結果は、少なくとも２つの別個の実験の代表である（＊は、統計学的有意性を示す）。
【図２８】図２８は、ｓＣＤ４０ＬによるＣＤ４０＋腫瘍細胞の強化された免疫原性を示す図である。（Ａ）は、共刺激分子（ＣＤ８０）、接着分子（ＣＤ５４、ＣＤ５８、およびＣＤ７０）、ＨＬＡ（ＨＬＡクラスＩおよびＨＬＡ−ＤＲ）、ならびにＦａｓ死受容体の、ＤＯＨＨ２腫瘍細胞株上で、高いレベルのｓＣＤ４０Ｌを含有する条件培地（ＣＤ４０Ｌ改変Ｔ細胞培地）を用いた共培養後のアップレギュレーションを示すフローサイトメトリーを示す図である（実線）。高いレベルのｓＣＤ４０Ｌを含有しない培地（モック形質導入Ｔ細胞培地）を用いた場合（グレー線）と比較して示している。
【図２９】図２９は、１９２８ｚ／ＣＤ４０Ｌ  Ｔ細胞が、細胞傷害性の増加を実証したことを示す図である。標準的な５１Ｃｒ放出アッセイによって確認されたように、１９−２８ｚ  Ｔ細胞と比較したとき、１９−２８ｚ／４０Ｌ−Ｔ細胞では、Ｒａｊｉ腫瘍細胞の溶解能が有意に増加することを示している。
【発明を実施するための形態】
【０１１０】
（発明の詳細な説明）
本発明は、一般に、少なくとも、抗原認識受容体（例えば、ＴＣＲまたはＣＡＲ）および、（ｉ）免疫抑制性の抗原（例えば、αＰＤ−１、αＰＤ−Ｌｌ、αＣＴＬＡ−４、もしくはαＣＤ４７）に結合するｓｃＦｖ；（ｉｉ）免疫刺激性の抗原（例えば、αＣＤ２８、αＯＸ−４０、αＣＤ４０、もしくはα４−１ＢＢ）に結合するｓｃＦｖ、または（ｉｉｉ）ＣＤ４０Ｌのいずれかとの組み合わせを発現する、遺伝子的に改変された免疫応答性細胞（例えば、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）細胞）、ならびにそのような細胞を、抗原特異的免疫応答の増加が望ましい、新形成および他の病理的状態を処置するために使用する方法を提供する。本発明は、免疫抑制性の抗原（例えば、本明細書中に示すように、ＣＤ４７およびＰＤ−Ｌ１）に結合するｓｃＦｖが、免疫反応性細胞を活性化および刺激するのに有用であるという発見に少なくとも部分的に基づいている。特に、本発明のｓｃＦｖは、腫瘍微小環境における活性化された免疫反応性細胞の免疫応答の抑制を減少または防止する。悪性腫瘍細胞は、それ自身を免疫認識および除去から保護するための一連のメカニズムを作り出している。本アプローチは、腫瘍根絶のための、腫瘍微小環境内での免疫原性を提供し、従来の養子Ｔ細胞治療に対する有意な進歩を示している。
【０１１１】
腫瘍微小環境
腫瘍は、宿主の免疫応答に過酷な微小環境を有する。そしてそれは、悪性腫瘍細胞のそれ自身を免疫認識および除去から保護するための一連のメカニズムに関与する。この「過酷な腫瘍微小環境」は、浸潤性制御ＣＤ４＋Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、骨髄由来のサプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）、ＩＬ−１０およびＴＧＦ−βなどの免疫抑制性サイトカイン、および活性化されたＴ細胞により発現される免疫抑制性受容体（ＣＴＬＡ−４およびＰＤ−１）を標的とするリガンドの発現を含めた種々の免疫抑制因子を含む。これらの免疫抑制のメカニズムは、忍容性の維持および不適切な免疫応答の抑制において役割を果たす。しかしながら、腫瘍微小環境内で、これらのメカニズムは、有効な抗腫瘍免疫応答を防止する。まとめて、これらの免疫抑制因子は、標的とされた腫瘍細胞に出会うとすぐ、養子移入されたＣＡＲ改変Ｔ細胞の著しいアネルギーまたはアポトーシスのいずれかを惹起することができる。
【０１１２】
細胞傷害性Ｔ−リンパ球抗原４（ＣＴＬＡ−４）
ＣＴＬＡ−４は、活性化されたＴ細胞により発現される阻害性受容体である。それは、対応するリガンド（それぞれ、ＣＤ８０およびＣＤ８６；Ｂ７−１およびＢ７−２）によって連結されると、活性化されたＴ細胞の阻害またはアネルギーを媒介する。前臨床研究においても臨床研究においても、抗体の全身注入によるＣＴＬＡ−４遮断は、内因性の抗腫瘍応答を高めた。とはいえ、臨床の設定では、有意な予期できない毒性がある。特定の理論にとらわれるわけではないが、腫瘍を標的とするＣＡＲ改変Ｔ細胞による、アンタゴニストｓｃＦｖの送達により標的化されたＣＴＬＡ−４の遮断により、毒性を減少させることができ、かつ免疫抑制から保護される腫瘍を標的とするＴ細胞の「内因性」の群（ＣＡＲ  Ｔ細胞群）の代用薬を提供する。前臨床研究（例えば、Ｂ細胞悪性腫瘍および卵巣癌腫のヒト異種移植腫瘍モデルおよびネズミ腫瘍モデル）を用いて、ＣＡＲ改変Ｔ細胞群ならびに内因性の抗腫瘍免疫応答の両方に対するｓｃＦｖ分泌の効果を評価することができる。抗ＣＴＬＡ−４  ｓｃＦｖは、マウス抗マウスＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体を分泌する９Ｄ９ハイブリドーマ、またはハムスター抗マウスＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体を分泌する９Ｈｌ０ハイブリドーマから生成することができる。
【０１１３】
プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）
ＰＤ−１は、内因性のマクロファージおよび樹状細胞で発現した対応するリガンドＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２に結合して活性化されたＴ細胞の負の免疫レギュレータである。ＰＤ−Ｌ１のアップレギュレーションは１つのメカニズムであり、腫瘍細胞は宿主免疫系を回避し得る。また、前臨床の治験においても、最近公表された臨床治験においても、アンタゴニスト抗体によるＰＤ−１遮断は、内因性の宿主免疫系に媒介される抗腫瘍応答を誘導した。異種移植および同系ネズミ腫瘍モデルを用いることができる。そしてそれは、腫瘍を標的とするＣＡＲ改変Ｔ細胞により分泌されたアンタゴニスト抗ＰＤ−１  ｓｃＦｖが、これらのｓｃＦｖ分泌性ＣＡＲ改変Ｔ細胞の抗腫瘍有効性を高めることを示している。
【０１１４】
ＣＤ４７
ＣＤ４７は、広範な組織分布を有する膜タンパク質であり、その１つは最近の前臨床モデル（ｉｍｏｄｅｌｓ）において広範な腫瘍細胞をマクロファージ認識から保護することが示されている。これらのモデルでは、抗ＣＤ４７モノクローナル抗体を注入した結果、確立した腫瘍進行が減少した。換言すれば、腫瘍細胞上でのＣＤ４７遮断により、これらの腫瘍細胞を宿主マクロファージによる認識およびファゴサイトーシスにさらした。この抗原の発現が幾分ユビキタスであると仮定すれば、遮断抗体の全身注入により、毒性の標的が外れるかもしれない。また、標的送達のパラダイムを維持することで、ＣＡＲ改変Ｔ細胞によって、直接的に腫瘍微小環境に送達された同様に遮断する抗ＣＤ４７  ｓｃＦｖの分泌が、所望の抗腫瘍効果を惹起／増強する。この場合、適応宿主免疫系ではなく、むしろ先天的免疫系により媒介される。さらに、このアプローチは、新形成処置に限定されず、抗原特異性免疫応答の増加が望ましい広範囲の適用に受け入れられる。そのような適用としては、新形成の処置のみならず、免疫応答の病原体感染もしくは感染症に対する増強、および自己免疫もしくは同種異系移植片の背景における制御性Ｔ細胞の免疫忍容性の強化がある。
【０１１５】
ＣＤ４０Ｌ
ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ１５４）、すなわち腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）遺伝子スーパーファミリーに属するＩＩ型膜貫通タンパク質は、腫瘍特異的Ｔ細胞の機能を増強する可能性を有している。活性化されたＣＤ４＋  Ｔ細胞上で最初に同定され、広大な範囲の免疫、造血性の細胞、上皮細胞、内皮細胞、および平滑筋細胞において、ＣＤ４０Ｌの発現が誘導され得る。活性化されたＴ細胞において、ＣＤ４０Ｌは、すぐに発現し、６時間以内にピークに達し、その後、続く１２〜２４時間にわたって減少する。ＣＤ４０Ｌは、Ｂ細胞、マクロファージ、および樹状細胞（ＤＣ）を含めた種々の免疫細胞および非免疫細胞上で構成的に発現する同族受容体ＣＤ４０に結合する。重要なことに、ＣＤ４０はまた、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、ホジキンリンパ腫、鼻咽頭癌腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、メラノーマ、乳癌腫、卵巣癌腫、および子宮頸癌腫を含む、いくつかの血液学的および非血液学的悪性腫瘍において発現する。ＣＡＲ／ＣＤ４０Ｌ  Ｔ細胞が広範な悪性腫瘍において適用できることを示している。実施例６の後に記載した参考文献８〜１７を参照されたい。
【０１１６】
造血系細胞系譜
哺乳動物の造血（血液）細胞は、様々な生理学的活性を提供する。造血細胞は、リンパ系系譜、骨髄系系譜および赤血球系系譜に分けられる。リンパ系系譜は、Ｂ細胞、Ｔ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含み、抗体の産生、細胞免疫系の調節、血液における外来性病原体の検出、宿主にとって異物である細胞の検出などに備える。本明細書中で用いる場合、用語「Ｔ細胞」は、胸腺において成熟し、細胞媒介性免疫を主に担うリンパ球を示す。Ｔ細胞は適応免疫系に関与する。本明細書中で用いる場合、用語「ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞」は、細胞媒介性免疫の一部であり、かつ、先天性免疫応答の期間中に作用するリンパ球を示す。これは、標的細胞に対するその細胞傷害性効果を発揮するために事前の活性化を必要としない。細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ細胞またはキラーＴ細胞）は、感染を受けた体細胞または腫瘍細胞の死を誘導することができるＴリンパ球のサブセットである。
【０１１７】
本発明の方法において使用される細胞
本発明は、免疫応答性細胞を活性化する抗原認識受容体（例えば、ＴＣＲ、ＣＡＲ）と免疫抑制性の抗原（例えば、αＰＤ−１、αＰＤ−Ｌｌ、αＣＴＬＡ−４、またはαＣＤ４７）に結合するｓｃＦｖの組み合わせを発現する細胞、および免疫応答の増強が必要である、疾患を処置するためにかかる細胞を使用する方法を提供する。あるアプローチにおいては、新形成の処置または防止のために、腫瘍抗原特異的Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＣＴＬ細胞、またはその他の免疫応答性細胞を用いて、免疫抑制性の抗原と結合するｓｃＦｖを発現させる。例えば、ＣＤ１９を認識するキメラ抗原受容体１９２８ｚを発現するＴ細胞を、ＣＤ４７と結合するｓｃＦｖを発現するＴ細胞内で共発現させる。そのような細胞を、血液の癌（例えば、白血病、リンパ腫、および骨髄腫）を処置または防止するために、それを必要とするヒト被験体に投与する。別のアプローチにおいて、ウイルス抗原特異的なＴ細胞、ＮＫ細胞、ＣＴＬ細胞を、ウイルス疾患を処置するために使用することができる。例えば、第１ＣＭＶ抗原を認識するキメラ共刺激抗原受容体およびＰＤ−１に結合するｓｃＦｖを、ＣＭＶを処置するために、細胞傷害性Ｔリンパ球において共発現させる。
【０１１８】
患者自身のＴ細胞を、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と名付けられた、人工的Ｔ細胞受容体をコードする遺伝子の導入を通じて、腫瘍を標的とするように遺伝子改変してもよい。第１世代のＣＡＲは、典型的に、抗体由来抗原認識ドメイン、単一フラグメント長抗体（ｓｃＦｖ）からなり、可変膜貫通ドメインに融合され、Ｔ細胞受容体鎖の細胞質シグナル伝達ドメインに融合される。Ｃ鎖の近位のＣＤ２８、４−１ＢＢ、およびＯＸ−４０を含む、１または２の共刺激受容体シグナル伝達ドメインをさらに含ませて、ＣＡＲシグナル伝達を増強させることにより、第２および第３世代のＣＡＲがそれぞれもたらされる。
【０１１９】
腫瘍抗原特異的Ｔリンパ球（およびＮＫ細胞）
本発明の方法において使用することができるタイプの腫瘍抗原特異的ヒトリンパ球には、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するために遺伝子改変された末梢ドナーリンパ球（Ｓａｄｅｌａｉｎ，Ｍ．ら、２００３、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ３：３５−４５）、αおよびβヘテロダイマーを含む全長の腫瘍抗原認識Ｔ細胞受容体複合体を発現するために遺伝子改変された末梢ドナーリンパ球（Ｍｏｒｇａｎ，Ｒ．Ａ．ら、２００６、Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１４：１２６−１２９）、腫瘍生検物における腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）に由来するリンパ球培養物（Ｐａｎｅｌｌｉ，Ｍ．Ｃ．ら、２０００、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６４：４９５−５０４；Ｐａｎｅｌｌｉ，Ｍ．Ｃ．ら、２０００、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６４：４３８２−４３９２）、および人工抗原提示細胞（ＡＡＰＣ）またはパルス処理された樹状細胞を用いて選択的にインビトロで増殖された抗原特異的な末梢血白血球（Ｄｕｐｏｎｔ，Ｊ．ら、２００５、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６５：５４１７−５４２７；Ｐａｐａｎｉｃｏｌａｏｕ，Ｇ．Ａ．ら、２００３、Ｂｌｏｏｄ  １０２：２４９８−２５０５）が挙げられるが、それらに限定されない。Ｔ細胞は自系、あるいは同種であるか、またはインビトロでの遺伝子組み換え前駆細胞または幹細胞由来であってよい。好適な腫瘍抗原（抗原性ペプチド）はいずれも、本明細書中に記載される腫瘍関連の実施形態における使用に好適である。抗原の供給源には、様々な癌タンパク質が含まれるが、これらに限定されない。抗原を、ペプチドとして、あるいは、無傷のタンパク質またはその一部として発現させることができる。無傷のタンパク質またはその一部は野生型であってもよく、または、変異させることもできる。
【０１２０】
好適な抗原の例として、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）および前立腺幹細胞抗原（ＰＣＳＡ）がある。
【０１２１】
ウイルス抗原特異的Ｔリンパ球（およびＮＫ細胞）
例えば、免疫無防備状態の被験体における病原体感染または他の感染性疾患の処置において使用される好適な抗原には、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタイン・バールウイルス（ＥＢＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）およびインフルエンザウイルスに存在するウイルス抗原が挙げられるが、それらに限定されない。
【０１２２】
ＣＴＬの非精製供給源は、骨髄、胎児、新生児もしくは成人または他の造血系細胞供給源、例えば、胎児肝臓、末梢血または臍帯血のような、当該技術分野で公知の任意のものであってよい。様々な技術を、この細胞を分離するために用いることができる。例えば、負の選択方法により、非ＣＴＬを最初に除くことができる。ｍＡｂは、正および負の選択の両方のための特定の細胞系譜および／または分化段階に関連するマーカーを同定するために特に有用である。
【０１２３】
最終分化した細胞の大きな集団を比較的粗い分離によって最初に除くことができる。例えば、磁石ビーズ分離を、非常に多数の無関係な細胞を除くために最初に使用することができる。好ましくは、全造血系細胞の少なくとも約８０％、通常少なくとも７０％が細胞単離の前に除かれる。
【０１２４】
分離のための手法には、密度勾配遠心分離；リセッティング；細胞密度を変える粒子へのカップリング；抗体被覆された磁石ビーズによる磁気分離；アフィニティークロマトグラフィー；ｍＡｂに連結されるか、または、ｍＡｂとの併用で使用される細胞毒性剤（これには、補体および細胞毒素が含まれるが、これらに限定されない）；および、固体マトリックス、例えば、プレート、チップに結合された抗体によるパンニング、水簸法、または、任意の他の好都合な技術が含まれるが、これらに限定されない。
【０１２５】
分離および分析のための技術には、フローサイトメトリーが含まれるが、これに限定されない。この場合、フローサイトメトリーは様々な程度の精巧さを有することができ、例えば、複数のカラーチャンネル、低角度光散乱検出チャンネルおよび鈍角光散乱検出チャンネル、インピーダンスチャンネルを有することができる。
【０１２６】
細胞を、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）のような、死細胞と会合する色素を用いることによって、死細胞に対する選択をすることができる。好ましくは、細胞が、２％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）または０．２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む培地において、あるいは、任意の他の好適な、好ましくは無菌の等張性培地において回収される。
【０１２７】
従って、本発明は一般には、例えば、ウイルス特異的、または腫瘍特異的Ｔ細胞などの、第一抗原に結合して免疫応答性細胞を活性化する受容体、ならびに第二抗原に結合して、免疫応答性細胞を刺激する受容体を含む免疫応答性細胞を提供する。
【０１２８】
ベクター
免疫応答性細胞（例えば、Ｔ細胞、ＣＴＬ細胞、ＮＫ細胞）の遺伝子改変は、実質的に均質な細胞組成物に組換えＤＮＡ構築物を形質導入することによって達成できる。好ましくは、レトロウイルスベクター（ガンマ−レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターのどちらか）が、ＤＮＡ構築物を細胞に導入するために用いられる。例えば、抗原（例えば、腫瘍抗原もしくは変異体、またはそのフラグメント）に結合する受容体をコードするポリヌクレオチドを、レトロウイルスベクターにクローニングすることができ、発現を、その内因性プロモーターから、または、レトロウイルスの長末端反復から、または、目的とする標的細胞タイプに対して特異的なプロモーターから行わせることができる。非ウイルスベクターを同様に使用することもできる。
【０１２９】
腫瘍抗原特異的またはウイルス抗原特異的な細胞を提供するための細胞の最初の遺伝子改変のために、レトロウイルスベクターが一般には形質導入のために用いられるが、他の任意の好適なウイルスベクターまたは非ウイルス性送達系を使用することができる。少なくとも２つの共刺激リガンドを含む抗原提示複合体を含む細胞を提供するための細胞のその後の遺伝子改変のために、レトロウイルスによる遺伝子移入（形質導入）が同様に効果的であることが判明している。レトロウイルスベクターおよび適切なパッケージング系統の組合せもまた好適であり、この場合、カプシドタンパク質が、ヒト細胞に感染するために機能的である。様々な両種指向性のウイルス産生細胞株が知られており、これらには、ＰＡ１２（Ｍｉｌｌｅｒら、（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：４３１−４３７）；ＰＡ３１７（Ｍｉｌｌｅｒら、（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：２８９５−２９０２）；およびＣＲＩＰ（Ｄａｎｏｓら、（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：６４６０−６４６４）が含まれるが、これらに限定されない。両種指向性でない粒子もまた好適である（例えば、ＶＳＶＧエンベロープ、ＲＤ１１４エンベロープまたはＧＡＬＶエンベロープによる偽型粒子、および当該技術分野で公知の任意のもの）。
【０１３０】
形質導入の可能な方法には、細胞を、例えば、Ｂｒｅｇｎｉら、（１９９２）Ｂｌｏｏｄ  ８０：１４１８−１４２２の方法によって、産生細胞と直接に共培養すること、あるいは、例えば、Ｘｕら、（１９９４）Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔ．２２：２２３−２３０の方法、および、Ｈｕｇｈｅｓら、（１９９２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８９：１８１７の方法によって、適切な成長因子およびポリカチオンを用いて、または、それらを用いることなく、ウイルス上清単独または濃縮されたベクターストックと培養することも含まれる。
【０１３１】
他の形質導入用ウイルスベクターを、本発明の共刺激リガンドを免疫応答性細胞において発現させるために使用することができる。好ましくは、選択したベクターは、高い感染効率、ならびに安定な組込みおよび発現を示す（例えば、Ｃａｙｏｕｅｔｔｅら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ８：４２３−４３０，１９９７；Ｋｉｄｏら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １５：８３３−８４４，１９９６；Ｂｌｏｏｍｅｒら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７１：６６４１−６６４９，１９９７；Ｎａｌｄｉｎｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７２：２６３−２６７，１９９６；およびＭｉｙｏｓｈｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４：１０３１９，１９９７参照）。使用可能な他のウイルスベクターには、例えば、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクターおよびアデノ関連ウイルスベクター、ワクシニアウイルス、ウシ乳頭腫ウイルス、または、ヘルペスウイルス（例えば、エプスタイン・バールウイルスなど）が含まれる（同様にまた、例えば、下記文献のベクターを参照：Ｍｉｌｌｅｒ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １５−１４，１９９０；Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１２７５−１２８１，１９８９；Ｅｇｌｉｔｉｓら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：６０８−６１４，１９８８；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １：５５−６１，１９９０；Ｓｈａｒｐ，Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ，３３７：１２７７−１２７８，１９９１；Ｃｏｒｎｅｔｔａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３６：３１１−３２２，１９８７；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２６：４０１−４０９，１９８４；Ｍｏｅｎ，Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｌｌｓ  １７：４０７−４１６，１９９１；Ｍｉｌｌｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７：９８０−９９０，１９８９；ＬｅＧａｌ  Ｌａ  Ｓａｌｌｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：９８８−９９０、１９９３；およびＪｏｈｎｓｏｎ，Ｃｈｅｓｔ  １０７：７７Ｓ−８３Ｓ，１９９５）。レトロウイルスベクターが特によく開発され、臨床環境で使用されている（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２３：３７０，１９９０；Ａｎｄｅｒｓｏｎら、米国特許第５，３９９，３４６号）。
【０１３２】
非ウイルス法もまた、細胞におけるタンパク質の発現のために用いることができる。例えば、核酸分子は、核酸をリポフェクションの存在下で投与することによって（Ｆｅｉｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：７４１３，１９８７；Ｏｎｏら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １７：２５９，１９９０；Ｂｒｉｇｈａｍら、Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．２９８：２７８，１９８９；Ｓｔａｕｂｉｎｇｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １０１：５１２、１９８３）、核酸をアシアロオロソムコイド−ポリリシンコンジュゲート化の存在下で投与することによって（Ｗｕら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６３：１４６２１，１９８８；Ｗｕら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６４：１６９８５，１９８９）、または、外科的条件下での顕微注入によって（Ｗｏｌｆｆら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１４６５、１９９０）、細胞内に導入することができる。遺伝子移入のための他の非ウイルス的手段には、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥデキストラン、エレクトロポレーションおよびプロトプラス融合を使用するインビボでのトランスフェクションが含まれる。リポソームもまた、ＤＮＡを細胞内に送達するために潜在的に有益であり得る。正常な遺伝子を被験体の患部組織に移植することもまた、正常な核酸をエクスビボでの培養可能な細胞タイプ（例えば、自系または異種の初代細胞またはその子孫）に移入することによって達成することができ、その後、その細胞（またはその後代）が、標的化組織に注入されるか、または、全身に注入される。トランスポゼースまたは標的ヌクレアーゼ（例えば、ジンクフィンガー・ヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、またはＴＡＬＥヌクレアーゼ）を用いて、組み換え受容体も誘導させることができ、または取得することができる。ＲＮＡエレクトロポレーションによって、一過性発現を取得することもできる。
【０１３３】
ポリヌクレオチド療法において使用されるｃＤＮＡ発現を、任意の好適なプロモーター（例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーターまたはメタロチオネインプロモーター）から指令することができて、また、いずれかの好適な哺乳動物制御性エレメントまたはイントロン（例、延長因子１ａエンハンサー／プロモーター／イントロン構造）によって調節することができる。例えば、所望により、特異的な細胞型における遺伝子発現を優先的に指令することが知られているエンハンサーを、核酸の発現を指令するために使用することができる。使用するエンハンサーには、組織特異的または細胞特異的なエンハンサーとして特徴づけられるエンハンサーが挙げられるが、それらに限定されない。あるいは、ゲノムクローンが治療構築物として使用される場合には、制御は同族の制御性配列によって媒介されてもよく、または、所望により、上記プロモーターまたは制御性エレメントのいずれかを含む、異種の供給源に由来する調節配列によって媒介されてもよい。
【０１３４】
得られる細胞は、その後、非改変細胞のための条件と類似する条件のもとで成長させることができ、それにより、改変細胞を様々な目的のために増殖し、使用することができる。
【０１３５】
ポリペプチドおよびアナログ
本発明はまた、ＣＤ１９、αＣＤ１９、ＣＤ２８、ＣＤ３ζ、４Ｈ１１２８ｚ、Ｂ６Ｈ１２．２  ｓｃＦｖ、５Ｃ４  ｓｃＦｖ、およびＪ４３  ｓｃＦｖのポリペプチドまたはそれらのフラグメントを含み、免疫応答性細胞で発現されるとき、それらの抗新生物活性を増強する様式で改変される（例えば、ヒト化モノクローナル抗体）。本発明は、アミノ酸配列または核酸配列を、配列の変化を起こすことによって最適化する方法を提供する。そのような修飾には、いくつかの変異、欠失、挿入または翻訳後改変が含まれてよい。本発明はさらに、本発明の任意の天然に存在するポリペプチドのアナログを含んでいる。アナログは、本発明の天然に存在するポリペプチドと、アミノ酸配列の違いによって、または、翻訳後改変によって、または、その両方によって異なる場合がある。本発明のアナログは一般には、本発明の天然に存在するアミノ酸配列のすべてまたは一部と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える同一性を示す。配列比較の長さは、少なくとも５、１０、１５または２０のアミノ酸残基であり、好ましくは少なくとも２５、５０または７５のアミノ酸残基であり、より好ましくは１００超のアミノ酸残基である。ここでも、同一性の程度を確認する１つの例示的な方法では、ＢＬＡＳＴプログラムを使用することができ、ｅ−３〜ｅ−１００の確率スコアにより、関連性の高い配列が示される。改変には、ポリペプチドのインビボおよびインビトロでの化学的誘導体化が含まれ、例えば、アセチル化、カルボキシル化、リン酸化またはグリコシル化が含まれる；そのような改変を、ポリペプチドの合成またはプロセシング、あるいは、その後に続く、単離された改変酵素による処理の期間中に生じさせることができる。アナログはまた、本発明の天然に存在するポリペプチドとは、一次配列における様々な修飾によって異なる場合がある。これらには、遺伝子変異体（天然型および誘導型の両方）（例えば、放射線照射または硫酸エタンメチルへの暴露によって、あるいは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版）、ＣＳＨ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９、またはＡｕｓｕｂｅｌら、前掲に記載されるような部位特異的変異誘発によるランダム変異から生じる変異体）が含まれる。Ｌ−アミノ酸以外の残基、例えば、Ｄ−アミノ酸または天然に存在しないアミノ酸または合成アミノ酸、例えば、ベータ（β）−アミノ酸またはガンマ（γ）−アミノ酸、を含有する環化されたペプチド、分子およびアナログもまた含まれる。
【０１３６】
全長のポリペプチドに加えて、本発明はまた、本発明のポリペプチドまたはペプチドドメインのいずれか１つのフラグメントを提供する。本明細書中で用いる場合、用語「フラグメント」は、少なくとも５個、１０個、１３個または１５個のアミノ酸を意味する。他のいくつかの実施形態において、フラグメントは、少なくとも２０個の連続するアミノ酸、少なくとも３０個の連続するアミノ酸、または少なくとも５０個の連続するアミノ酸であり、また、他の実施形態では、少なくとも６０個〜８０個、１００個、２００個、３００個またはそれを超える連続するアミノ酸である。本発明のフラグメントは、当業者に公知の方法によって産生することができ、または通常のタンパク質処理（例えば、生物学的活性のために必要としないアミノ酸の新生ポリペプチドからのアミノ酸の除去、あるいは選択的ｍＲＮＡスプライシング事象または選択的タンパク質処理事象によるアミノ酸の除去）からもたらされてもよい。
【０１３７】
非タンパク質アナログは、本発明のタンパク質の機能的活性を模倣するためにデザインされた化学構造を有する。そのようなアナログは本発明の方法に従って投与される。そのようなアナログは、元のポリペプチドの生理学的活性を超える場合がある。アナログデザインの方法は当該技術分野で周知であり、アナログの合成は、得られるアナログが免疫応答性細胞で発現されたとき、元のポリペプチドの抗新生物活性を増大するように化学構造を改変することによるかかる方法に従って実施できる。これらの化学的改変には、代替となるＲ基を置換すること、および基準ポリペプチドの特定の炭素原子における飽和度を変化させることが含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、タンパク質アナログはインビボでの分解に対して比較的耐性であり、これにより、投与時により長期に及ぶ治療効果がもたらされる。機能的活性を測定するためのアッセイには、下記の実施例において記載されるものが含まれるが、それらに限定されない。
【０１３８】
共刺激リガンド
少なくとも１つの共刺激リガンドとの相互作用により、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）の完全な活性化のために重要な抗原非特異的なシグナルがもたらされる。共刺激リガンドには、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）リガンド、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５またはＩＬ２１）、および、免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーリガンドが挙げられるが、それらに限定されない。腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）は、全身性炎症に関与するサイトカインであり、急性期反応を刺激する。その主要な役割は免疫細胞の調節にある。腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）リガンドは数多くの共通する特徴を共有している。これらのリガンドの大部分が、短い細胞質セグメントおよび比較的長い細胞外領域を含有するＩＩ型膜貫通タンパク質（細胞外Ｃ末端）として合成される。ＴＮＦリガンドには、神経成長因子（ＮＧＦ）、ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ４０Ｌ）／ＣＤ１５４、ＣＤ１３７Ｌ／４−１ＢＢＬ、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、ＣＤ１３４Ｌ／ＯＸ４０Ｌ／ＣＤ２５２、ＣＤ２７Ｌ／ＣＤ７０、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）、ＣＤ３０Ｌ／ＣＤ１５３、腫瘍壊死因子ベータ（ＴＮＦβ）／リンホトキシン−アルファ（ＬＴα）、リンホトキシン−ベータ（ＬＴβ）、ＣＤ２５７／Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）／Ｂｌｙｓ／ＴＨＡＮＫ／Ｔａｌｌ−１、グルココルチコイド誘導ＴＮＦ受容体リガンド（ＧＩＴＲＬ）、およびＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）、ＬＩＧＨＴ（ＴＮＦＳＦ１４）が挙げられるが、それらに限定されない。免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーは、細胞の認識プロセス、結合プロセスまたは接着プロセスに関与する細胞表面タンパク質および可溶性タンパク質の大きな一群である。これらのタンパク質は構造的特徴を免疫グロブリンと共有する。それらは免疫グロブリンドメイン（ｆｏｌｄ）を有する。免疫グロブリンスーパーファミリーリガンドには、ともにＣＤ２８に対するリガンドである、ＣＤ８０およびＣＤ８６が挙げられるが、それらに限定されない。
【０１３９】
投与
本発明の遺伝子改変免疫応答性細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＣＴＬ細胞またはそれらの祖先）を含む組成物を、新形成、病原体感染、または感染性疾患を処置するために被験体に全身的または直接的に提供することができる。１つの実施形態において、本発明の細胞が、目的とする器官（例えば、新形成に冒された器官）に直接に注入される。あるいは、遺伝子改変免疫応答性細胞を含む組成物が、例えば、循環系（例えば、腫瘍血管系）への投与によって、目的とする器官に間接的に提供される。増殖剤および分化剤を、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＣＴＬ細胞の産生をインビトロまたはインビボで増加させるために、細胞の投与前、投与中または投与後に提供することができる。
【０１４０】
改変細胞を、任意の生理学的に許容され得るビヒクル中で、通常の場合には血管内に投与することができるが、改変細胞を、骨、または、細胞が再生および分化のための適切な部位を見出し得る他の好都合な部位（例えば、胸腺）に導入してもよい。通常、少なくとも１×１０５個の細胞が投与され、これは最終的には１×１０１０個またはそれを超える個数に達する。本発明の遺伝子改変免疫応答性細胞は、精製された細胞集団を含むことができる。当業者は、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）のような、様々な周知の方法を使用して、集団における遺伝子改変免疫応答性細胞の割合を容易に決定することができる。遺伝子改変免疫応答性細胞を含む集団における純度の好ましい範囲は、約５０％〜約５５％、約５５％〜約６０％、および約６５％〜約７０％である。より好ましくは、純度は約７０％〜約７５％、約７５％〜約８０％、約８０％〜約８５％である；さらにより好ましくは、純度は、約８５％〜約９０％、約９０％〜約９５％、および約９５％〜約１００％である。投与量を、当業者は容易に調節することができる（例えば、純度の低下が、投与量の増大を必要とする場合がある）。細胞を注射、カテーテルなどによって導入することができる。所望により、様々な因子も含めることができ、これらには、インターロイキン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬｌＳ、ＩＬ２１、ならびに、それ以外のインターロイキン）、コロニー刺激因子（例えば、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦなど）、インターフェロン（例えば、ガンマ−インターフェロンなど）、および、エリスロポエチンが含まれるが、これらに限定されない。
【０１４１】
本発明の組成物には、遺伝子改変免疫応答性細胞またはその祖先と、薬学的に許容され得る担体とを含む医薬組成物が含まれる。投与は自系または異種であることが可能である。例えば、免疫応答性細胞または前駆体を一被験体から得て、同じ被験体に、または異なる適合し得る被験体に投与することができる。本発明の末梢血由来の免疫応答性細胞またはその子孫（例えば、インビボ、エクスビボまたはインビトロ由来）を、局所注入（カテーテル投与を含む）、全身注入、局所注入、静脈内注入または非経口投与によって投与することができる。本発明の治療用組成物（例えば、遺伝子改変免疫応答性細胞を含有する医薬組成物）を投与するとき、治療用組成物は一般には、単位投与量の注入可能な形態（溶液、懸濁液、乳濁液）に製剤化される。
【０１４２】
製剤化
遺伝子改変免疫応答性細胞を含む本発明の組成物は、都合良くは、選択されたｐＨに緩衝化されてよい無菌の液体調製物、例えば、等張水溶液、懸濁液、乳濁液、分散物または粘性組成物として与えることができる。液体調製物は通常、ゲル、他の粘性組成物および固体組成物より、調製することが容易である。加えて、液体組成物は、特に注射によって投与することが幾分より便利である。他方で、粘性組成物を、特定の組織とのより長い接触期間を提供するために、適切な粘度範囲内において配合することができる。液体組成物または粘性組成物は、例えば、水、生理食塩水、リン酸塩緩衝化生理食塩水、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液状ポリエチレングリコールなど）およびそれらの好適な混合物を含有する溶媒または分散用媒体であり得る担体を含むことができる。
【０１４３】
無菌の注射可能溶液を、本発明を実施する際に利用される遺伝子改変免疫応答性細胞を、所望の通り、その他の成分の様々な量とともに、適切な溶媒の必要とする量に配合することによって調製することができる。そのような組成物は、好適な担体、希釈剤、または賦形剤、例えば、無菌水、生理食塩水、グルコース、デキストロースなどとの混合であってよい。組成物はまた、凍結乾燥することができる。組成物は、所望の投与経路および調製物に依存して、様々な補助物質を含有できて、例えば、湿潤剤、分散剤または乳化剤（例えば、メチルセルロース）、ｐＨ緩衝化剤、ゲル化剤または粘度増強添加剤、保存剤、矯味矯臭剤、着色剤などを含有できる。標準的な教科書、例えば、“ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥ”，１７版、１９８５（これは参照により本明細書中に組み込まれる）などを、好適な調製物を、過度な実験を伴うことなく調製するために参考にすることができる。
【０１４４】
抗菌性保存剤、酸化防止剤、キレート剤、および緩衝剤を包含する、組成物の安定性および無菌性を高める様々な添加剤を加えることができる。微生物の作用を防止することを、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン類、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などによって保証することができる。注射可能医薬品形態の長期に及ぶ吸収を、吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン、の使用によってもたらすことができる。しかしながら、本発明により、使用する任意のビヒクル、希釈剤または添加剤は、遺伝子改変免疫応答性細胞またはその祖先との適合性を有していなければならない。
【０１４５】
組成物は等張性にしてもよい。すなわち、組成物は、血液および涙液と同じ浸透圧を有することができる。本発明の組成物の所望の等張性を、塩化ナトリウム、または他の薬学的に許容され得る作用物質（例えば、デキストロース、ホウ酸、酒石酸ナトリウム、プロピレングリコール、あるいは、他の無機溶質または有機溶質など）を使用して達成することができる。塩化ナトリウムが、特にナトリウムイオンを含有する緩衝液については好ましい。
【０１４６】
所望により、組成物の粘度を、薬学的に許容され得る増粘剤を使用して、選択されたレベルで維持することができる。容易かつ経済的に入手可能であり、また、共同して機能することが容易であるので、メチルセルロースが好ましい。他の好適な増粘剤には、例えば、キサンタンガム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボマーなどが挙げられる。増粘剤の好ましい濃度は、選択された作用物質に依存する。重要な点は、選択した粘度を達成するであろう量を使用することである。明白ではあるが、好適な担体および他の添加剤の選択は、正確な投与経路および具体的な投与形態、例えば、液体投与形態の性質（例えば、組成物が、溶液、懸濁液、ゲルまたは徐放性形態または液体充填形態のような、別の液体形態に配合されることになるかどうか）に依存する。
【０１４７】
組成物の構成成分が、化学的に不活性であるように選択されるべきであること、また本発明に記載されるような遺伝子改変免疫応答性細胞の生存性または効力に影響を及ぼさないことを、当業者は認識するだろう。このことは、化学および薬学の原理に熟知した当業者には何ら問題とならず、あるいは、様々な問題を、標準的な教科書を参照することによって、または、本開示、および、本明細書中に引用される文書から、（過度な実験を伴わない）簡単な実験によって容易に避けることができる。
【０１４８】
本発明の遺伝子改変免疫応答性細胞の治療的使用に関する１つの検討事項は、最適な効果を達成するために必要な細胞の量である。投与されるべき細胞の量は、治療されている被験体に対して変化する。１つの実施形態において、１０４個〜１０１０個の、１０５個〜１０９個の、または１０６個〜１０８個の本発明の遺伝子改変免疫応答性細胞がヒト被験体に投与される。より有効な細胞は、より小さな数でも投与され得る。一部の実施形態において、少なくとも約１×１０８個の、２×１０８個の、３×１０８個の、４×１０８個の、および５×１０８個の本発明の遺伝子改変免疫応答性細胞がヒト被験体に投与される。どのくらいが効果的な用量であると見なされるかを正確に決めることは、具体的な被験体のサイズ、年齢、性別、体重および状態を含めて、それぞれの被験体に対する個別的な要因に基づいてもよい。当業者は、投与量を本発明の開示および当該技術分野における知識から容易に確認することができる。
【０１４９】
当業者は、本発明の組成物における細胞、ならびに、所望による添加剤、ビヒクルおよび／または担体の量、また、本発明の方法において投与されるべき細胞、ならびに、所望による添加剤、賦形剤および／または担体の量を容易に決定することができる。典型的には、（活性な細胞（複数個の活性な細胞）および／または薬剤（複数の薬剤）に加えて）任意の添加剤が、０．００１〜５０％（重量）溶液の量でリン酸塩緩衝生理食塩水中に存在して、その有効成分が、約０．０００１ｗｔ％〜約５ｗｔ％、好ましくは約０．０００１ｗｔ％〜約１ｗｔ％、さらにより好ましくは、約０．０００１〜約０．０５ｗｔ％または約０．００１〜約２０ｗｔ％、好ましくは約０．０１〜約１０ｗｔ％、さらにより好ましくは、約０．０５〜約５ｗｔ％のように、マイクログラムからミリグラムの程度で存在する。当然のことではあるが、したがって、動物またはヒトに投与される任意の組成物について、および任意の特定の投与方法について、例えば好適な動物モデル（例えば、齧歯類、例えば、マウスなど）における致死量（ＬＤ）およびＬＤ５０を決定することによって、毒性を、並びに、好適な応答を誘発する、組成物（または複数の組成物）の投薬量、それにおける構成成分の濃度、および組成物（または複数の組成物）の投与時期を決定することが好ましい。そのような決定には、当業者の知識、本発明の開示および本明細書中に引用される文書からの過度な実験を必要としない。また、連続投与のための期間を、過度な実験を伴うことなく確認することができる。
【０１５０】
処置の方法
本明細書には、被験体における新形成を処置する方法が提供される。本明細書には、免疫無防備状態のヒト被験体のような被験体における病原体感染または他の感染性疾患を処置する方法も包含される。これらの方法は、所望の効果が現状の緩和または再発の防止であるならば、本発明のＴ細胞、ＮＫ細胞またはＣＴＬ細胞を、所望の効果に到達するための有効量で投与することを含む。処置のために、投与される量は、所望の効果を生じるための有効な量である。有効量を単回で、または一連の投与で提供できる。有効量をボーラス剤で、または連続灌流によって提供できる。
【０１５１】
「有効量」（または「治療的有効量」）は、処置において有益なまたは所望の臨床結果をもたらすために十分な量である。有効量を単回またはそれ以上の投与量で被験体に投与できる。処置に関して、有効量は、疾患の進行を緩和する、改善する、安定化する、反転する、または遅延するために、あるいは、疾患の病理的帰結を減少させるために十分な量である。有効量は、一般にケース・バイ・ケースで医師によって決定され、そしてそれは、当業者の技能の範囲内である。有効量に到達するための適切な用量を決定する際に、典型的にはいくつかの因子を考慮に入れる。これらの因子は、被験体の年齢、性別および体重、処置されている状態、状態の重篤度、ならびに、投与する抗原結合フラグメントの形態および有効濃度を含む。
【０１５２】
抗原特異的Ｔ細胞を使用する養子免疫療法について、典型的には１０６〜１０１０個（例えば、１０９個）の範囲の細胞用量を注入する。遺伝子改変細胞を宿主に投与してその後分化が生じることにより、Ｔ細胞は特異的な抗原に対して特異的に指向するよう誘導される。Ｔ細胞の「誘導」には、抗原特異的Ｔ細胞を、例えば、欠失またはアネルギーによって不活性化することが含まれてもよい。不活性化は、例えば自己免疫障害において、耐性を確立または再確立するために特に有用である。改変細胞は、当該技術分野で公知の任意の方法によって投与でき、静脈内、皮下、鼻腔内、腫瘍内、クモ膜下、胸膜内、腹腔内、および、胸腺への直接投与が挙げられるが、それらに限定されない。
【０１５３】
治療方法
本発明は、免疫応答の増大の必要のある被験体において、免疫応答を増大させるための方法を提供する。ある実施形態では、本発明は、被験体において、新形成を処置または防止する方法を提供する。本発明は、従来の治療的介入になじまない、血液の癌（例えば、白血病、リンパ腫、および骨髄腫）、または卵巣癌を有する被験体を処置するために特に有用な治療法を提供する。治療に対する好適なヒト被験体は、典型的には臨床基準により区別され得る２つの処置群を含む。「進行した疾患」または「高い腫瘍負荷」を有する被験体が、臨床的に測定可能な腫瘍を有する被験体である。臨床的に測定可能な腫瘍は、（例えば、触診、ＣＡＴスキャン、ソノグラム、マンモグラムまたはＸ線；それら自身ではこの集団を同定するには十分ではない、陽性の生化学的または組織病理学的マーカーによる）腫瘍の質量に基づいて検出可能な腫瘍である。本発明において具体的に例示される医薬組成物が、被験体の状態を緩和するという目的で、抗腫瘍応答を誘発するためにこれらの被験体に投与される。理想的には、結果として腫瘍質量の減少がもたらされるが、何らかの臨床的改善は利益となる。臨床的改善には、腫瘍のリスクまたは進行速度の低下、あるいは、病理的帰結の減少が含まれる。
【０１５４】
好適な被験体の第２群は、「アジュバント群」として当該技術分野で公知である。これは、新形成の病歴を有したことがあるが、別の治療法に対して応答性であった個体である。先の治療法には、限定されないが、外科的切除、放射線療法および従来の化学療法を含むことができた。結果的に、これらの個体は、臨床的に測定可能な腫瘍を何ら有していない。しかしながら、これらの個体は、最初の腫瘍部位の近くであるか、または、転移によるかのどちらかで、疾患進行のリスクがあることが疑われる。この群はさらに、高リスク個体および低リスク個体に細分化することができる。この細分化は、最初の処置の前または後で観測される特徴に基づいて行われる。これらの特徴は臨床技術分野で公知であり、それぞれの異なる新形成について適切に定義される。高リスクのサブグループの典型的な特徴は、腫瘍が隣接組織に浸潤しているか、またはリンパ節の関与を示す個体である。
【０１５５】
別の一群は、新形成に対する遺伝的素因を有しているが新形成の臨床的徴候を未だ明白に示していない群である。例えば、乳癌に関連する遺伝子突然変異について検査で陽性であるが未だ出産可能な年齢である女性は、防止的手術の実施に該当する程度にまで新形成が発生するのを防止するための処置において、本明細書中に記載される１つまたはそれ以上の抗原結合フラグメントの予防的受容を望むことができる。
【０１５６】
下記の新形成：神経膠芽細胞腫、メラノーマ、神経芽細胞腫、腺癌腫、神経膠腫、軟組織肉腫および様々な癌腫（前立腺癌および小細胞肺癌を含む）のいずれかを有するヒト新形成被験体が、特に適切な被験体である。好適な癌腫にはさらに、腫瘍学の分野で公知の任意のものが含まれ、これらには、星状膠細胞腫、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、乏突起神経膠腫、上衣腫、髄芽細胞腫、未分化神経外胚葉性腫瘍（ＰＮＥＴ）、軟骨肉腫、骨肉腫、膵管腺癌腫、小細胞肺腺癌腫および大細胞肺腺癌腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、扁平上皮癌腫、気管支肺胞癌腫、上皮腺癌、ならびに、それらの肝臓転移物、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、ヘパトーム、胆管癌腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、横紋筋肉腫、結腸癌腫、基底細胞癌腫、汗腺癌腫、乳頭癌腫、脂腺癌腫、乳頭状腺癌腫、嚢胞腺癌腫、髄様癌腫、気管支原性癌腫、腎細胞癌腫、胆管癌腫、絨毛癌腫、セミノーマ、胎児性癌腫、ウィルムス腫瘍、精巣腫瘍、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、白血病、多発性骨髄腫、ヴァルデンシュトレームマクログロブリン血症、ならびに、重鎖病、乳腫瘍（例えば、導管腺癌および小葉腺癌など）、子宮頸部の扁平上皮腺腫（ｓｑｕａｍｏｕｓ  ａｎｄ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）、子宮および卵巣の上皮癌腫、前立腺腺癌腫、膀胱の移行扁平上皮癌腫、Ｂ細胞リンパ腫およびＴ細胞リンパ腫（結節性およびびまん性）、形質細胞腫、急性白血病および慢性白血病、悪性メラノーマ、軟組織肉腫および平滑筋肉腫が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５７】
被験体は疾患の進行した形態を有し得、その場合、治療の目的には、疾患進行の緩和または逆行、および／あるいは、副作用の改善が含まれ得る。被験体は既に治療を受けている状態の病歴を有し得、その場合、治療の目的には典型的には、再発のリスクの低下または遅延が含まれる。
【０１５８】
したがって、本発明は、被験体において新形成を処置または防止する方法であって、該方法は、腫瘍抗原に結合し、かつ免疫応答性細胞を活性化する受容体（例えば、ＴＣＲ、ＣＡＲ）、および免疫抑制活性を有する抗原（例えば、ＣＤ４７、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、およびそのリガンド）に結合する単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）をコードするベクターを含む有効量の免疫応答性細胞を投与することを含む方法を提供する。ある実施形態では、新形成は、血液の癌（例えば、白血病、リンパ腫、および骨髄腫）、卵巣癌、前立腺癌、乳癌、膀胱癌、脳の癌、結腸癌、腸の癌、肝臓癌、肺癌、膵臓癌、前立腺癌、皮膚癌、胃癌、神経膠芽細胞腫、および咽喉癌からなる群より選択される。別の実施形態において、腫瘍抗原は、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、ＣＤＳ、ＣＤ７、ＣＤＩＯ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５６、ＣＤ７４、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８，サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染細胞の抗原（例えば、細胞表面抗原）、上皮グリコプロテイン−２（ＥＧＰ−２）、上皮グリコプロテイン−４０（ＥＧＰ−４０）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、受容体チロシン−プロテインキナーゼｅｒｂ−Ｂ２，３，４、葉酸塩結合タンパク質（ＦＢＰ）、胎児性アセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）、葉酸受容体−α、ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）、ガングリオシドＧ３（ＧＤ３）、ヒト上皮細胞増殖因子受容体２（ＨＥＲ−２）、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、インターロイキン−１３受容体サブユニットα−２（ＩＬ−１３Ｒα２）、κ−軽鎖、キナーゼ・インサート・ドメイン受容体（ＫＤＲ）、ルイス（Ｌｅｗｉｓ）Ｙ（ＬｅＹ）、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１ＣＡＭ）、メラノーマ抗原ファミリーＡ、１（ＭＡＧＥ−Ａ１）、ムチン１６（ＭＵＣ１６）、ムチン１（ＭＵＣ１）、メソテリン（ＭＳＬＮ）、ＮＫＧ２Ｄリガンド、癌精巣抗原ＮＹ−ＥＳ０−１、腫瘍胎児抗原（ｈ５Ｔ４）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、前立腺特異性膜抗原（ＰＳＭＡ）、腫瘍関連グリコプロテイン７２（ＴＡＧ−７２）、血管内皮成長因子Ｒ２（ＶＥＧＦ−Ｒ２）、またはウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ−１）のうちの１以上である。
【０１５９】
腫瘍抗原に結合し、かつ免疫応答性細胞を活性化する受容体（例えば、ＴＣＲ、ＣＡＲ）、および免疫抑制活性を有する抗原（例えば、ＣＤ４７、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、およびそのリガンド）に結合する単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）をコードするベクターの表面発現の結果として、養子移入されたヒトＴ細胞またはヒトＮＫ細胞には、腫瘍部位における増強された、選択的な細胞溶解活性が付与される。さらに、腫瘍またはウイルス感染へのそれらの局在化、および、それらの増殖の後、共刺激リガンドを発現するＴ細胞は、腫瘍部位またはウイルス感染部位を、生理学的な抗腫瘍応答または抗ウイルス応答に関与する広範囲の免疫細胞（腫瘍浸潤性のリンパ球、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、樹状細胞およびマクロファージ）のための伝導性の高い環境に変える。
【０１６０】
他のいくつかの実施形態において、本発明は、病原体感染（例えば、ウイルス感染、細菌感染、真菌感染、寄生虫感染または原生動物感染）を有する被験体を処置するための方法を提供する。本発明は、免疫無防備状態の被験体において免疫応答を増強するために特に有用である。本発明の方法を使用する処置の影響を受けやすい例示的なウイルス感染には、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタイン・バールウイルス（ＥＢＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）およびインフルエンザウイルスの感染が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６１】
従って、本発明は、被験体において病原体感染を処置または防止する方法であって、該方法は、本明細書中に記載されるような有効量の免疫応答性細胞を投与することを含む方法を提供する。
【０１６２】
キット
本発明は、新形成、病原体感染、免疫障害または同種異系移植片を処置または防止するためのキットを提供する。ある実施形態では、キットは、活性化抗原受容体および免疫抑制活性を有する抗原に結合する単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む有効量の免疫応答性細胞を単位用量形態で含有する治療用または予防用組成物を含む。いくつかの特定の実施形態において、細胞はさらに、共刺激リガンドを含む。一部の実施形態において、キットは、治療用または予防用ワクチンを含有する減菌容器を含み、そのような容器は、ボックス、アンプル、ボトル、バイアル、チューブ、バッグ、ポーチ、ブリスターパックまたは当該技術分野で公知の他の好適な容器形態が可能である。そのような容器は、プラスチック、ガラス、ラミネート紙、金属ホイルまたは医薬を保持するために好適な他の材料で製造することができる。
【０１６３】
所望により、免疫応答性細胞は、新形成、病原体感染、免疫障害または同種異系移植片を有する、あるいはこれらを発症する危険性がある被験体に上記細胞を投与するための説明書と一緒に提供される。説明書は一般には、新形成、病原体感染、免疫障害または同種異系移植片の処置または防止のために組成物を使用することについての情報を含む。他のいくつかの実施形態において、説明書は下記のうちの少なくとも１つを含む：治療剤の説明；新形成、病原体感染、免疫障害または同種異系移植片、あるいは、それらの兆候を処置するまたは防止するための用量計画および投与；注意；警告；適応症；使用禁忌；過用量情報；有害反応；動物薬理学；臨床研究；および／または参考文献。説明書は、（存在するときには）容器に直接に印刷されるか、または容器に適用されるラベルとして、あるいは、容器内または容器とともに供給される別紙、パンフレット、カードまたはフォルダーとしてであってよい。
【実施例】
【０１６４】
本発明の実施では、別途示されない限り、当業者の範囲内である、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来の技術が用いられる。そのような技術は、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ”，第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，１９８９）；“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（Ｇａｉｔ，１９８４）；“Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ”（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，１９８７）；“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”“Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（Ｗｅｉｒ，１９９６）；”Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ”（ＭｉｌｌｅｒおよびＣａｌｏｓ，１９８７）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ａｕｓｕｂｅｌ，１９８７）；“ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ”，（Ｍｕｌｌｉｓ，１９９４）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（Ｃｏｌｉｇａｎ，１９９１）といった文献において十分に説明されている。これらの技術は本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの産生に適用することができ、また、そのようなものとして、本発明を組み立てる際に、また、本発明を実施する際に考慮することができる。特定の実施形態について特に有用な技術が下記の項において検討される。
【０１６５】
下記の実施例は、当業者に対して、本発明のアッセイ、スクリーニング、および治療方法をどのように組み立て、使用するかについての完全な開示および説明を提供するために記載されているものであり、これらの例示により本発明がこれに限定されるものではない。
【０１６６】
実施例１．キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）および抗ＳＣＤ４７  ｓｃＦｖを共発現するＴ細胞が腫瘍を根絶した
ヒトＣＤ４７と特異的に結合するｓｃＦｖを生成し、このｓｃＦｖおよび腫瘍抗原（ＣＤ１９）を認識するＣＡＲで改変されたヒト末梢血Ｔ細胞は、インビトロでの抗腫瘍有効性、ならびに前臨床モデルでの抗腫瘍有効性の上昇を示した。
【０１６７】
ＣＡＲ配列およびｓｃＦｖ配列を配列決定することによって確認しながら、１９２８ｚ−２Ａ−Ｂ６Ｈ１２．２を含む構築物（図１〜５）を生成した。さらに、卵巣癌抗原ＭＵＣ−ＣＤに特異的なＣＡＲを用いて対照構築物を生成し、４Ｈ１１２８ｚとした（図６）。カッパリーダー配列を用いた構築物のために、安定な産生細胞株を生成し、フローサイトメトリー（図７Ａ）で確認した。フローサイトメトリーに基づくアッセイにおいて、分泌された抗ＣＤ４７  ｓｃＦｖを含有するパッケージ細胞株からの上清は、ＣＤ４７抗体がＮａｌｍ−６腫瘍細胞およびＲａｊｉ腫瘍細胞に結合するのを妨げることができた。またパッケージ細胞からの上清とともにインキュベートした腫瘍細胞を、抗ｃ−ｍｙｃタグ抗体で染色し、ｓｃＦｖの結合を確認した（図７Ｂ）。
【０１６８】
パッケージ細胞を用いてヒト末梢血Ｔ細胞の形質導入を行った。形質導入効率は、ＣＡＲ発現のフローサイトメトリー分析によって確認した（図８Ａ）。分泌されたｓｃＦｖは、自己分泌機能が可能であった。抗ＣＤ４７抗体は、１９２８ｚ  Ｔ細胞と比較して、１９２８ｚ−２Ａ−Ｂ６Ｈ１２．２  Ｔ細胞への結合が減少した。抗ｃ−ｍｙｃタグ抗体での陽性染色は、結合されたｓｃＦｖを示した（図８Ｂ）。形質導入されたＴ細胞の表現型をフローサイトメトリーで調べたところ、１９２８ｚ−２Ａ−Ｂ６Ｈ１２．２細胞と１９２８ｚ  Ｔ細胞は、ＣＤ６２Ｌを除き、類似していることが示され、１９２８ｚ−２Ａ−Ｂ６Ｈ１２．２  Ｔ細胞上で減少していることがわかった（図９Ａ）。抗ＣＤ４７  ｓｃＦｖを産生するＴ細胞の機能を、マルチパラメータ・フローサイトメトリーおよび標準的な５１Ｃｒ放出アッセイを用いて調べた。１９２８ｚ  Ｔ細胞と比較したとき、１９２８ｚ−２Ａ−Ｂ６Ｈ１２．２  Ｔ細胞は、同等のサイトカイン産生と細胞傷害性機能を有することがわかった（図９Ｂおよび９Ｃ）。
【０１６９】
１９２８ｚ−２Ａ−Ｂ６Ｈ１２．２  Ｔ細胞がインビボで腫瘍に反応する能力を、前臨床ＳＣＩＤベージュマウスモデルを用いて調べた。ＳＣＩＤベージュマウスに、１×ｌ０６の、ホタルルシフェラーゼを発現するように改変されたＮａｌｍ−６腫瘍細胞を静脈注射し、３日後、マウスを５．７×１０６のＣＡＲ＋１９２８ｚまたは１９２８ｚ−２Ａ−Ｂ６Ｈｌ２．２または対照４Ｈｌｌ２８ｚ−２Ａ−Ｂ６Ｈｌ２．２  Ｔ細胞で同じく静脈注射により処置した。腫瘍の進行を臨床的に生物発光イメージングでモニターした。腫瘍を有するマウスの１９２８ｚ−２Ａ−Ｂ６Ｈｌ２．２  Ｔ細胞での処置は、１９２８ｚ  Ｔ細胞での処置に比べて、腫瘍の負荷を軽減し、腫瘍を有するマウスの生存率を高めた（図１０Ａおよび１０Ｂ）。
【０１７０】
実施例２．キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）および抗ヒトＰＤ−１  ｓｃＦｖを共発現するＴ細胞がＣＡＲの増殖を増加させ、発現を維持した
抗ＰＤ−１抗体からのＶＨ鎖およびＶＬ鎖に基づいて、抗ヒトＰＤ−１  ｓｃＦｖを生成した（クローン５Ｃ４）（米国特許第８，００８，４４９号）。５Ｃ４  ｓｃＦｖは、カッパリーダー配列、セリン−グリシンリンカー、およびｃ−ｍｙｃタグを含むようにデザインされた（図１１）。このｓｃＦｖ構築物をＳＦＧレトロウイルスバックボーンにクローニングし、１９２８ｚ−２Ａ−５Ｃ４および４Ｈ１１２８ｚ−２Ａ−５Ｃ４を生成させた（図１２および図１３）。ヒトＰＤ−１に結合する高親和性ｓｃＦｖを開発するために（例えば、１９２８ｚ／４Ｈ１１２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞内で発現させるために）、ヒト抗体ファージディスプレイライブラリーをスクリーニングして、ヒトＰＤ−１（および潜在的にマウスＰＤ−１）に特異的に結合するｓｃＦｖを決定した。
【０１７１】
安定な２９３Ｇｌｖ９パッケージ細胞株を産生させ、その１９２８ｚ  ＣＡＲおよび４Ｈ１１２８ｚ  ＣＡＲの発現をフローサイトメトリーで評価した（図１４）。これらのパッケージ細胞株からの上清を用いて、ヒト末梢血Ｔ細胞の形質導入を行った。形質導入効率は、フローサイトメトリー分析によって確認し、ＣＡＲ発現を検出した（図１５）。
【０１７２】
この抗ヒトＰＤ−１  ｓｃＦｖが、人工的抗原提示細胞（ａＡＰＣ）に応答してＴ細胞の増殖を増加させる能力を調べた。ＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍細胞および３Ｔ３  ａＡＰＣを研究のために生成した（図１６）。形質導入されたＴ細胞と３Ｔ３  ａＡＰＣ発現ヒトＣＤ１９、ヒトＢ７．１、およびヒトＰＤ−Ｌ１の共培養の後、１９２８ｚ−２Ａ−Ｃ４  Ｔ細胞は、１９２８ｚ  Ｔ細胞と比べて、ＣＡＲの増殖を増加させ、発現を維持した（図１７）。１９２８ｚ  ＣＡＲと抗ＰＤ１  ｓｃＦｖを共発現させるＴ細胞の表現型および抗腫瘍機能を、フローサイトメトリー、ルミネッツ（ｌｕｍｉｎｅｚ）サイトカイン分析研究、５１クロム放出アッセイ、およびＳＣＩＤベージュ前臨床モデルを用いて決定し、インビボで抗腫瘍機能を決定することができる。
【０１７３】
実施例３．キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）および抗マウスＰＤ−１  ｓｃＦｖの共発現は、マウスＴ細胞を刺激する
抗ＰＤ−１抗体クローンＪ４３からのＶＨおよびＶＬに基づいて、抗マウスＰＤ−１  ｓｃＦｖを生成した（米国特許第７，８５８，７４６号、Ｈｏｎｊｏら）。Ｊ４３  ｓｃＦｖは、マウスカッパ鎖リーダー配列、セリン−グリシンリンカー、およびｃ−ｍｙｃタグを含むようにデザインした（図１８）。このｓｃＦｖ構築物を、ヒトＣＤ１９、またはマウスＣ２８およびマウスＣＤ３ｚｅｔａを介してシグナル伝達を行うヒトＭＵＣ−ＣＤを標的とするＣＡＲを発現する、ＳＦＧレトロウイルスバックボーンにクローニングし、マウスＴ細胞を刺激した。前述したように、これらの構築物１９ｍ２８ｍｚ−ＩＲＥＳ−Ｊ４３（図１９）および４Ｈ１１ｍ２８ｍｚ−ＩＲＥＳ−Ｊ４３（図２０）を使用して、安定したＰｈｏｅｎｉｘパッケージ細胞株を生成し、一次ネズミ細胞を遺伝子的に改変する（Ｌｅｅら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０１１，７１（８）：２８７１）。マウス１９ｍ２８ｍｚ  Ｔ細胞および１９ｍ２８ｍｚ−ＩＲＥＳ−Ｊ４３  Ｔ細胞を、ヒトＣＤ１９およびマウスＰＤ−Ｌ１を発現するように改変されたＥＬ４胸線腫瘍細胞と共に培養し、生存性可能細胞の数およびＣＦＳＥ標識をモニターするために、マウスＴ細胞を増殖させる。
【０１７４】
ＭＵＣ−ＣＤ抗原を標的とする４Ｈ１１ｍ２８ｍｚ  ＣＡＲを発現するネズミＴ細胞について、ＭＵＣ−ＣＤおよびマウスＰＤ−Ｌ１を発現するように改変されたＩＤＳ腫瘍細胞に対する反応における機能を評価することができる（Ｃｈｅｋｍａｓｏｖａら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２０１０，１６：３５９４）。前述したように、ネズミＰＤ−１に結合するヒトｓｃＦｖを、ＳＦＧ−１９ｍ２８ｍｚベクター構築物および４Ｈ１１ｍ２８ｍｚベクター構築物にクローニングし、ネズミＴ細胞を改変するために用いる。ネズミＰＤ−１に結合するヒトｓｃＦｖを発現するように改変されたＴ細胞のインビボ抗腫瘍効果を評価するための同系モデルが入手可能である：Ｃ５７ＢＬ／６マウスの腹腔内に接種されるＩＤ８−ＭＵＣ−ＣＤ腫瘍細胞を用いた卵巣癌腫瘍モデル、およびマウスＣＤ１９のかわりにヒトＣＤ１９を発現する、ヒトＣＤ１９を発現するように改変されたＥＬ４胸線腫瘍細胞とともに接種されるトランスジェニックマウス（Ｐｅｇｒａｍら，Ｂｌｏｏｄ  ２０１２，１１９（１８）：４１３３）。したがって、その抗腫瘍効果は、免疫適格モデル中で評価でき、したがって、抗ＰＤ−１  ｓｃＦｖが腫瘍微小環境に及ぼす影響を評価することができる。
【０１７５】
実施例４．免疫細胞中でのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）およびアゴニストｓｃＦｖの共発現
ある実施形態では、本発明は、抗原結合受容体（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）、およびアゴニスト免疫刺激活性を有する抗原（例えば、ＣＤ２８、ＯＸ−４０、４−１ＢＢ、およびそのリガンド）に結合する単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を発現する免疫細胞を提供する。共刺激性分子４−１ＢＢを標的とするアゴニストｓｃＦｖを生成するため、３Ｈ３ハイブリドーマ細胞株を取得した（Ｓｈｕｆｏｒｄら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ、１９９７、１８６：４７−５５；Ｐｒｏｆｅｓｓｏｒ  Ｍｉｃｋ  Ｃｒｏｆｔ（（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）から提供を受けた）。共刺激性分子ＯＸ−４０を標的とするアゴニストｓｃＦｖを生成するため、ＯＸ−８６ハイブリドーマ細胞株を取得した（ａｌ−Ｓｈａｍｋｈａｎｉら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ１９９６、２６（８）：１６９５−９；Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（カタログ番号：９６１１０６０１））。ハイブリドーマｍＲＮＡは、ＱＩＡｇｅｎ  ＲＮＡｅａｓｙキットを用いて、製造元（ＱＩＡｇｅｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）の指示にしたがって、細胞から単離し、その後、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｐｒｏｔｏｓｃｒｉｐｔ  ＡＭＶ  Ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ合成キットを用い、製造元（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、ＭＡ、ＵＳＡ）の指示にしたがって、ｃＤＮＡを調製した。その後、以下の縮重プライマーを用いて、可変重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）をＰＣＲ増幅した。
【０１７６】
【化１３】
2020054387.tif 000014
ＶＨとＶＬをｓｃＦｖに組み立てるために、ＶＨ鎖およびＶＬ鎖、ならびにｃ−ｍｙｃタグおよびネズミＩｇカッパ鎖またはＣＤＳリーダー配列のＰＣＲ中に、セリン−グリシンリンカーを添加する。得られたポリヌクレオチドを、１９２８ｚキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする、既存のレトロウイルス発現ベクター（ＳＦＧバックボーン）にクローニングし、ＳＦＧ−１９２８ｚ−２Ａ−３Ｈ３または１９２８ｚ−２Ａ−ＯＸ８６を生成する。
【０１７７】
抗マウスＰＤ−１  Ｊ４３  ｓｃＦｖについて説明したように、安定したパッケージ細胞株を生成し、同様の養子Ｔ細胞移入ネズミモデルにおいて試験する。
【０１７８】
本明細書に示した結果は、ｓｃＦｖ分子を発現する遺伝子改変ＣＡＲ  Ｔ細胞（「武装化ＣＡＲ  Ｔ細胞」）が免疫応答性であること、「過酷な」腫瘍微小環境を克服することができること、したがって、新形成の処置において有効であることを示している。ＣＡＲ＋Ｔ細胞を、免疫制御機能を有するアンタゴニストｓｃＦｖを分泌するように改変する（図２１）。ＣＡＲの同族抗原に対する活性化後（１）、「武装化」ＣＡＲ改変Ｔ細胞を、阻害性ＰＤ−１  Ｔ細胞受容体に拮抗するｓｃＦｖを注入されたＣＡＲ改変Ｔ細胞上および抗腫瘍エフェクター機能を増強する内因性の抗腫瘍Ｔ細胞上で分泌するよう誘導してもよく（２）、阻害性ＣＴＬＡ−４  Ｔ細胞受容体に拮抗するｓｃＦｖを、注入されたＣＡＲ改変Ｔ細胞上および抗腫瘍エフェクター機能を増強する内因性の抗腫瘍Ｔ細胞上で、分泌するよう誘導してもよく（３）、あるいは、腫瘍細胞上に発現したＣＤ４７受容体に拮抗するｓｃＦｖを分泌するよう誘導し、宿主の先天的抗腫瘍免疫応答による認識に対する腫瘍細胞の覆いを逆転し、宿主マクロファージによる腫瘍の認識と根絶を導いてもよい。
【０１７９】
他に記載しない限り、本明細書に報告された結果は、下記の方法および材料を用いて取得した。
【０１８０】
抗ＣＤ４７  Ｂ６Ｈ１２．２  ｓｃＦｖの生成
Ｂ６Ｈ１２．２ハイブリドーマ細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，ＶＡ，ＵＳＡ；カタログ番号：ＨＢ−９７７１）から取得した。Ｂ６Ｈ１２．２  ｍＲＮＡは、ＱＩＡｇｅｎ  ＲＮＡｅａｓｙキットを用いて、製造元（ＱＩＡｇｅｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）の指示にしたがって、ハイブリドーマ細胞から単離し、ｃＤＮＡは、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｐｒｏｔｏｓｃｒｉｐｔ  ＡＭＶ  Ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ合成キットを用い、製造元（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、ＭＡ、ＵＳＡ）の指示にしたがって調製した。可変重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）は、カッパリーダー配列、セリン−グリシンリンカー、およびｃ−ｍｙｃタグを組み込むようにデザインしたプライマーを用いて（図１参照）、以下のようにＰＣＲ増幅した。
【０１８１】
【化１４】
2020054387.tif 000015
上記デザインに加え、ＣＤ８Ｌ配列を有するｓｃＦｖを生成し、ｓｃＦｖのＴ細胞からの移出のために効率的なリーダー配列を、以下の選択的なフォワードプライマーを用いて決定した。
【０１８２】
【化１５】
2020054387.tif 000016
ＶＨおよびＶＬ  ＰＣＲ生成物を、製造元（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＮＹ，ＵＳＡ）の指示にしたがって、ｐＣＲ２．１ＴＯＰＯにクローニングした。Ｍ１３Ｆ２およびＭ１３Ｒ２プライマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた配列決定は、ＭＳＫＣＣ  ＤＮＡシーケンシングコア施設により行われ、ＶＨおよびＶＬ生成物双方の配列を確認した。ＶＨおよびＶＬ  ＰＣＲ生成物、およびプライマー１または５および４を用いて、オーバーラッピングＰＣＲを行い、抗ＣＤ４７  ｓｃＦｖを生成した（図１参照）。
【０１８３】
抗ＣＤ４７  ｓｃＦｖ構築物を、１９２８ｚキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする、既存のレトロウイルス発現ベクター（ＳＦＧバックボーン）にクローニングし、ＳＦＧ−１９２８ｚ−２Ａ−Ｂ６Ｈｌ２．２を生成した。ＳＦＧ−１９２８ｚ−２Ａ−Ｂ６Ｈｌ２．２ＤＮＡを配列決定し、配列を確認した。
【０１８４】
ヒトＴ細胞のための安定したパッケージ細胞株の生成
安定したパッケージ細胞株を生成するため、リン酸カルシウム・トランスフェクション・キットを用いて、製造元（Ｐｒｏｍｅｇａ）の指示にしたがって、Ｈ２９細胞を、１０μｇのＳＦＧ−１９２８ｚ−２Ａ−Ｂ６Ｈｌ２．２  ＤＮＡとともに、一時的にトランスフェクトした。Ｈ２９上清からの上清を用いて、２９３Ｇｌｖ９細胞を形質導入した。次いでそれをサブクローニングして、安定したパッケージ細胞を生成した。２つのサブクローン（クローン５およびクローン６）の選択は、１９２８ｚ  ＣＡＲの発現と２９３Ｇｌｖ９上清がヒト末梢血Ｔ細胞を形質導入する能力に基づいて行った（１２ｄｌｌ抗体での染色後のフローサイトメトリーによって判定した）。ヒト末梢血Ｔ細胞の形質導入は、前述のように行った（Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００７，１３（１８Ｐｔｌ）：５４２６）。
【０１８５】
抗ＣＤ４７  ｓｃＦｖの産生／機能の評価
抗ＣＤ４７  ｓｃＦｖの１９２８ｚ−２Ａ−Ｂ６Ｈｌ２．２  ２９３Ｇｌｖ９および形質導入されたヒト末梢血Ｔ細胞からの産生を、これらの細胞の上清中で、ＣＤ４７＋腫瘍細胞（ＲａｊｉおよびＮａｌｍ−６）をインキュベートすることによって判定した。続いて腫瘍細胞を洗浄し、蛍光コンジュゲート抗ｃ−ｍｙｃタグ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，ＭＡ，ＵＳＡ）で染色し、腫瘍細胞に結合した上清由来のタンパク質を検出した。腫瘍細胞も蛍光コンジュゲート抗ＣＤ４７（クローンＢ６Ｈｌ２．２，ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で染色し、Ｂ６Ｈｌ２−ｓｃＦｖがＣＤ４７遮断する能力を検出した。
【０１８６】
インビボ養子移入モデル
マウスに、ホタルルシフェラーゼを発現するように改変したｌ×１０６のＮａｌｍ−６を静脈注射した（０日目）。３日目、マウスを５．７×１０６のＣＡＲ＋Ｔ細胞を同じく静脈から接種し、処置した。腫瘍の進行を、生物発光イメージングを用いて、前述のように臨床的にモニターした（Ｓａｎｔｏｓら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２００９，１５（３）：３３８）。
【０１８７】
５Ｃ４抗ヒトＰＤ−１  ｓｃＦｖの生成
ヒトＰＤ−１に特異的に結合する抗体、クローン５Ｃ４の配列を上記のように取得した。この配列をカッパリーダー配列、セリン−グリシンリンカー、およびｃ−ｍｙｃタグを含むように改変した。ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，図９）から購入した。このｓｃＦｖのＳＦＧレトロウイルスバックボーンへのクローニング、安定したパッケージ細胞の生成、ヒト末梢血Ｔ細胞の形質導入、および形質導入効率の評価は、上記のように達成した。
【０１８８】
抗ヒトＰＤ−１機能の評価
ＰＤ−１リガンドであるＰＤ−Ｌ１を、２００ｎｇ／ｍｌ組み換えヒトインターフェロン−ガンマ（ＲｎＤ  ｓｙｓｔｅｍｓ、ＭＮ、ＵＳＡ）中でインキュベートしたＳＫＯＶ３（ＡＴＣＣ）腫瘍細胞からＰＣＲ増幅した。ヒトＰＤ−Ｌ１の増殖に使用されたプライマーを以下に示す。
【０１８９】
【化１６】
2020054387.tif 000017
ヒトＰＤ−Ｌ１配列を、ＳＦＧレトロウイルスバックボーンにクローニングし、３Ｔ３細胞株、Ｒａｊｉ細胞株、およびＮａｌｍ−６細胞株に、前述のように形質導入した（Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、２００７，１３（１８Ｐｔ１）：５４２６）。細胞を抗ＰＤ−Ｌ１（クローンＭＩＨ１、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）で染色し、ＦＡＣＳソーティングしてＰＤ−Ｌ１を発現した細胞群の合計を確認した（図１４）。
【０１９０】
ヒト１９２８ｚ−２Ａ−５Ｃ４−および１９２８ｚ  Ｔ細胞を３Ｔ３（ＣＤ１９／Ｂ７．１／ＰＤ−Ｌ１）ａＡＰＣと培養し、生存可能な細胞の計数を、トリパンブルー色素排除試験法によって行った。そしてフローサイトメトリーを行い、ＣＡＲの発現を判定した。これは、３Ｔ３（ＣＤ１９／Ｂ７．１）ａＡＰＣを用いて培養した場合のＴ細胞の増殖と相関していた。
【０１９１】
抗マウスＰＤ−１−ｓｃＦｖの生成
ネズミＰＤ−１に特異的に結合する抗体、クローン名Ｊ４３、の配列を上記のように取得した。この配列をカッパ鎖リーダー配列およびｃ−ｍｙｃタグをセリン−グリシンリンカーと共に含むように改変し、ｓｃＦｖを形成させた。ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、図１６）から購入した。これを、ネズミＣＡＲをコードする既存のレトロウイルス発現ベクター（ＳＦＧ）にクローニングした。ここでは、シグナル伝達はマウスＣＤ２８およびＣＤ３ゼータ分子によって媒介される。それぞれＢ細胞および卵巣腫瘍を標的とするように１９ｍ２８ｍｚ−ＩＲＥＳ−Ｊ４３および４Ｈ１１ｍ２８ｍｚ−ＩＲＥＳ−Ｊ４３を生成した（図１７および１８）。
【０１９２】
抗マウスＰＤ−１機能の評価
ＰＤ−１リガンドであるＰＤ−Ｌ１を、Ｒｅｎｃａ腫瘍細胞（ＡＴＣＣ）からＰＣＲ増幅した。マウスＰＤ−Ｌ１の増幅に使用されたプライマーを以下に示す。
【０１９３】
【化１７】
2020054387.tif 000018
抗マウスＰＤ−１−ｓｃＦｖを、ＳＦＧレトロウイルスバックボーンにクローニングし、３Ｔ３  ａＡＰＣ細胞株、ＩＤＳ細胞株およびＥＬ４細胞株に形質導入した。抗ＰＤ−Ｌ１（クローンＭＩＨ１、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で染色した細胞をＦＡＣＳソーティングしてＰＤ−Ｌ１を発現した細胞群の合計を確認した。
【０１９４】
ＣＴＬクロム放出殺傷アッセイ
望ましい抗原を発現する標的Ｔ細胞を、５１Ｃｒで標識し、エフェクター：標的比を減少させて、Ｔ細胞と共培養した。４時間培養した後、上清を除去し、クロムから放出される放射能の測定に用いた。２５Ｔ細胞と培養したものでない標的細胞の背景放射能を差し引き、０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を用いて完全に溶解された標的細胞から測定した放射能で割ることによって、特異的溶解を判定した。
【０１９５】
実施例５．遮断ＣＤ４７によるＣＡＲ  Ｔ細胞治療の向上
Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の発現を介して腫瘍抗原を標的とするように遺伝子的に改変することができる。ＣＤ１９特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞の養子移入は、血液学的悪性腫瘍を有する患者の一部において臨床的有効性を示してきた。しかしながら、リンパ節腫脹の大きな慢性リンパ球性白血病患者は、ＣＡＲ  Ｔ細胞治療に対する反応は最適以下である。さらに、ＣＡＲ  Ｔ細胞治療は、臨床治験において、固形腫瘍に対する有効性を実証できていない。この実施例では、ＣＡＲ  Ｔ細胞の臨床的有効性を、ＣＡＲ  Ｔ細胞からのＣＤ４７遮断単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）の分泌を介した先天的な抗腫瘍免疫応答を取り入れることにより増強した。従前の研究では、腫瘍細胞上のＣＤ４７とマクロファージ上のＳＩＲＰａ間の相互作用の遮断が、腫瘍細胞のファゴサイトーシスを引き起こすことを示している。この効果を利用するために、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ（１９２８ｚ）を発現させ、ヒトＣＤ４７に特異的なｓｃＦｖを分泌させるべくＴ細胞を改変した。そして、Ｂ６Ｈ１２．２ハイブリドーマからクローニングした（１９２８ｚ／Ｂ６Ｈ１２．２  Ｔ細胞）。１９２８ｚ／Ｂ６Ｈ１２．２  Ｔ細胞は、ヒトＣＤ４７に特異的な機能的ｓｃＦｖを分泌することが示された。それは、ＣＡＲ媒介性のサイトカイン分泌、または細胞傷害性に、インビトロで影響を及ぼさなかった。１９２８ｚ  Ｔ細胞ではない、１９２８ｚ／Ｂ６Ｈ１２．２  Ｔ細胞からの上清は、マクロファージを刺激して、腫瘍細胞をインビトロで貪食させた。１９２８ｚ／Ｂ６Ｈ１２．２  Ｔ細胞の養子移入は、前臨床ネズミモデルにおいて、高い抗腫瘍効果を媒介し、Ｎａｌｍ６腫瘍を根絶させた。この新規な戦略は、ＣＡＲ  Ｔ細胞媒介効果、および腫瘍細胞の先天的な免疫細胞媒介性の破壊を組み合わせている。それは、ＣＡＲ  Ｔ細胞治療の抗腫瘍有効性を高めるものである。
【０１９６】
実施例６．構成的なＣＤ４０Ｌ発現を介したキメラ抗原受容体で改変されたＴ細胞の抗腫瘍有効性の増強
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する、遺伝子的に改変されたＴ細胞を用いた養子細胞治療は、Ｂ−ＡＬＬを有する患者にとって将来有望な治療である。しかしながら、大半の臨床治験において、ＣＡＲ−改変Ｔ細胞は、特に、Ｂ細胞低悪性腫瘍および固形腫瘍においては、有意な治療有益性を示せなかった。この実施例の章に示した実験において、我々は、Ｔ細胞を遺伝子操作して構成的にＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ１５４）を発現させることによって、ＣＡＲ改変Ｔ細胞の抗腫瘍有効性をさらに増強させる。構成的にＣＤ４０リガンドを発現させるように改変されたＴ細胞（ＣＤ４０Ｌ−改変Ｔ細胞）は、炎症誘発ＴＨ１サイトカインの増殖および分泌を増加させた。さらに、ＣＤ４０Ｌ−改変Ｔ細胞は、共刺激分子（ＣＤ８０およびＣＤ８６）、接着分子（ＣＤ５４、ＣＤ５８、およびＣＤ７０）、ＨＬＡ分子（クラスＩおよびＨＬＡ−ＤＲ）、ならびにＦａｓ死受容体（ＣＤ９５）の、腫瘍細胞表面上でのアップレギュレーションによって、ＣＤ４０＋腫瘍細胞の免疫原性を強化した。さらに、ＣＤ４０Ｌ改変Ｔ細胞は、成熟を誘導し、炎症誘発サイトカインＩＬ−１２の単球由来樹状細胞による分泌を刺激した。最終的に、全身性リンパ腫の異種間移植モデルにおいて、腫瘍を標的とするＣＡＲ／ＣＤ４０Ｌ  Ｔ細胞は、ＣＤ４０＋腫瘍に対する細胞傷害性を増加させ、腫瘍を有するマウスの生存を延ばした。これらの前臨床データは、ＣＤ４０Ｌを構成的に発現するようにさらに改変されたＣＡＲ  Ｔ細胞の臨床適用が期待される抗腫瘍有効性の増強と、臨床結果の改善を有することを裏付けるものである。
【０１９７】
材料と方法
細胞培養
ＤｏＨＨ２、Ｒａｊｉ、およびＮＡＬＭ−６（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）腫瘍細胞株を、１０％熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸）緩衝剤、および２−メルカプトエタノール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加したＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）中に保持した。２９３ＧＰ−ＧＬＶ９レトロウイルス産生細胞株は、以前に記載されており、１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養した２９。ＮＩＨ−３Ｔ３人工抗原提示細胞（ＡＡＰＣ）を、前述のように１０％熱不活化ドナーウシ血清（ＤＣＳ）を添加したＤＭＥＭ中で培養した３０。ヒトＴ細胞を、Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｓｌｏａｎ−Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＭＳＫＣＣ）ＩＲＢ承認プロトコル９５−０５４のもと、製造元の指示に従ってＢＤ  Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ  ＣＰＴチューブ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて、健康なドナーの末梢血から単離した。患者Ｔ細胞とＣＬＬ細胞を、ＭＳＫＣＣ  ＩＲＢ−承認プロトコル０６−１３８のもと処置を受けている患者から取得した。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ＣｌｉｎＥｘＶｉｖｏ  ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて単離した。Ｔ細胞を、１０％ＦＢＳおよび２０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）が添加されたＲＰＭＩ  １６４０中で培養した。単球由来樹状細胞（ｍｏＤＣ）は、健康なドナーの組織培養の塑性的付着末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から取得し、１％プールヒトＡ／Ｂ血清、ＨＥＰＥＳ緩衝剤、２−メルカプトエタノール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、インターロイキン−４（ＩＬ−４；５００ＩＵ／ｍｌ−Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、および顆粒球−単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ；１０００ＩＵ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）が添加されたＲＰＭＩ  １６４０中で、前述のように培養した３１。すべての培地には、２ｍｍｏｌ／ＬのＬ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１００単位／ｍＬのペニシリン、および１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が添加されていた。
【０１９８】
レトロウイルス構築物の構築
ヒトＣＤ４０Ｌ  ｃＤＮＡを、単離された健康なドナーＰＢＭＣから、以下のプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。
プライマー（１）５’−ＣＡＣＧＴＧＣＡＴＧＡＴＣＧＡＡＡＣＡＴＡＣＡＡＣＣＡＡＡＣＴＴＣＴＣＣＣＣＧＡＴＣＴＧＣ−‘３  ［配列番号：３］、および
（２）５’−ＣＴＣＧＡＧＧＧＡＴＣＣＴＣＡＧＡＧＴＴＴＧＡＧＴＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＡ−３’［配列番号：４］（図２２Ａ）。
ヒトＣＤ４０Ｌをコードするガンマ−レトロウイルスベクターを、ＳＦＧベクターバックボーンを用いて構築した３２。１９２８ｚおよびＰｚ１（抗前立腺特異的膜抗原ＣＡＲ；抗ＰＳＭＡ）ＳＦＧ−ベクターの構築は、以前に記載されている３３，３４。１９２８ｚ−ＩＲＥＳ−４０ＬおよびＰｚ１−ＩＲＥＳ−４０Ｌガンマ−レトロウイルスベクターの構築は、オーバーラッピングＰＣＲを用いて行った（図２６Ａ）３５。
【０１９９】
ヒトＴ−リンパ球のレトロウイルス形質導入
安定した２９３ＧＰ−ＧＬＶ９レトロウイルス産生細胞株の生成およびヒトＴ細胞の遺伝子的改変は以前に記載されている２９，３６。Ｔ細胞形質導入については、単離された、健康なドナーのＰＢＭＣをフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）（２μｇ／ｍＬ）（Ｓｉｇｍａ）で活性化した。一方、患者由来Ｔ細胞は、製造元の推奨に従って、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ＣｌｉｎＥｘＶｉｖｏ  ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを用いて単離、活性化、および増殖した。以前に記載されているように、活性化されたＴ細胞を、レトロネクチンがコーティングされた非組織培養で処理したプレート上でレトロウイルス形質導入した３６。遺伝子移入は、７日目にフローサイトメトリーによって評価した。対照モック形質導入Ｔ細胞を、上清を空２９３ＧＰ−ＧＬＶ９細胞培養から誘導した以外は同様に、生成した。ＣＤ４０Ｌ改変Ｔ細胞の増殖は、ｇｕａｖａ（登録商標）ＶｉａＣｏｕｎｔ試薬（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を有するｇｕａｖａ（登録商標）ｅａｓｙＣｙｔｅ（登録商標）細胞カウンターを製造元の指示に従って用いて評価した。インビボ実験のための改変Ｔ細胞の増殖は、以前に記載されているように共刺激（ＣＤ８０）とともに標的抗原（ＣＤ１９またはＰＳＭＡ）を発現するように遺伝子操作されたＮＩＨ−３Ｔ３ネズミ線維芽細胞由来の繊維芽細胞ＡＡＰＣを用いて行った３０。
【０２００】
［共培養アッセイ］
腫瘍細胞（ＤＯＨＨ２、Ｒａｊｉ、Ｐｈ＋ＡＬＬ３．１、ＮＡＬＭ−６）を、ＣＤ４０Ｌ改変Ｔ細胞およびモック形質導入Ｔ細胞と、５：１の比率で共培養した。３日後にフローサイトメトリーを行い、腫瘍細胞の表現型を判定した。ｍｏＤＣｓ（２．５×１０５）を、自系ＣＤ４０Ｌ改変Ｔ細胞またはモック形質導入Ｔ細胞と１：５の比率で共培養し、２４時間後、組織培養上清を、ＩＬ−１２ｐ７０について、Ｌｕｍｉｎｅｘ  ＩＳ１００システム（下記参照）上で分析した。ｍｏＤＣも、ＣＤ４０Ｌ改変Ｔ細胞およびモック形質導入Ｔ細胞と５：１の比率で共培養し、２４時間後、フローサイトメトリーによって、ｍｏＤＣの表現型を分析した。
【０２０１】
［細胞傷害性アッセイ］
形質導入されたＴ細胞の細胞溶解能を、以前に記載のように、標準的な５１Ｃｒ放出アッセイを用いて判定した３４。
【０２０２】
［サイトカイン検出アッセイ］
組織培養上清におけるサイトカイン検出は、ＭＩＬＬＩＰＬＥＸヒトサイトカイン検出システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．）をＬｕｍｉｎｅｘ  ＩＳ１００システムおよびＩＳ  ２．３ソフトウェア（Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｃｏｒｐ．）と併せて製造元の指示にしたがって使用して、評価した。
【０２０３】
［フローサイトメトリー］
フローサイトメトリーは、ＦＡＣＳｃａｎサイトメータを用いて行い、ＦｌｏｗＪｏバージョン９．２ソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ）を用いてデータ解析を行った。ＣＡＲ発現は、ＣＡＲ特異的アメリカンハムスター・モノクローナル抗体１９Ｅ３（１９２８ｚ）ならびに１２Ｄ１１（１９２８ｚおよびＰｚ１、ＭＳＫＣＣモノクローナル抗体施設）を用いて検出した。ＣＤ４０Ｌの発現は、マウス抗ヒトＣＤ１５４（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて検出した。ヒトＴ細胞を、マウス抗ヒトＣＤ３（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ４、およびＣＤ８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて染色した。ｍｏＤＣｓは、マウス抗ヒトＣＤ１１ｂ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８３、およびＣＤ８６（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて染色した。ＤＯＨＨ２、Ｒａｊｉ、およびＮＡＬＭ６腫瘍細胞表現型は、マウス抗ヒトＣＤ１９、ＣＤ４０、ＣＤ５４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＨＬＡ−クラスＩおよびＨＬＡ−ＤＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＣＤ５８、ＣＤ７０、ならびにＣＤ９５（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて検出した。
【０２０４】
［ＣＡＲ  Ｔ細胞インビボ研究］
８〜１２週齢のＳＣＩＤ／Ｂｅｉｇｅ（ＣＢ１７．Ｃｇ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＬｙｓｔｂｇ−Ｊ／Ｃｒｌ）マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に、ＤＯＨＨ２腫瘍細胞（５ｘ１０５個の細胞）を静脈内注射により接種した。２日後、マウスに静脈から、形質導入Ｔ細胞（１ｘ１０７個のＣＡＲ  Ｔ細胞）を注入した。腫瘍の進行を臨床的にモニターし、疾患が臨床的に明らかになったとき（後肢の麻痺の発症または刺激に対する反応の低下）、マウスを安楽死させた。すべてのネズミ研究は、Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｓｌｏａｎ−Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ承認プロトコル（００−０５−０６５）にしたがって行った。
【０２０５】
［統計学的分析］
すべての解析は、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ５．０ソフトウェアを用いて計算し、生存性データは、ログ−ランク分析を用いて評価し、他のすべての解析は、マン・ウィットニーの検定（片側）を用いて行った。
【０２０６】
結果
ヒトＴ細胞によるＣＤ４０Ｌの構成的発現
まず、健康なドナーからのＴ細胞を、ＣＤ４０Ｌレトロウイルスベクターを用いて形質導入した（図２２Ａ）。Ｔ細胞のＣＤ４０Ｌ遺伝子によるレトロウイルス形質導入は、いつも≧４０％の遺伝子移入をもたらし、ＣＤ４＋細胞およびＣＤ８＋細胞の双方のサブセットにおいて、ＣＤ４０Ｌの安定した発現を伴う結果となった（図２２Ｂ）。ＣＤ４０Ｌ改変Ｔ細胞の増殖は、同じ３ドナーから発生したモック形質導入Ｔ細胞と比較して、有意に増加した（図２２Ｃ）。ＣＤ４０Ｌ改変Ｔ細胞からの組織培養培地を分析したところ、可溶性ＣＤ４０Ｌ（ｓＣＤ４０Ｌ）が予測通り有意に増加し、かつモック形質導入Ｔ細胞と比較したとき、炎症誘発サイトカインＩＦＮ−γおよびＧＭ−ＣＳＦの分泌が有意に増加することが示された（図２２Ｄ）。
【０２０７】
ＣＤ４０Ｌ改変Ｔ細胞は、ＣＤ４０＋腫瘍細胞株および患者由来のＣＬＬ細胞の双方の表現型を変える
ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ４０経路が腫瘍細胞の表現型を改変する能力を調べるために、ＣＤ４０＋Ｂ細胞腫瘍細胞とＣＤ４０Ｌ改変Ｔ細胞もしくはモック形質導入Ｔ細胞の共培養を行った。ＣＤ４０Ｌ改変Ｔ細胞を用いる培養は、共刺激分子（ＣＤ８０およびＣＤ８６）、接着分子（ＣＤ５４、ＣＤ５８、およびＣＤ７０）、ＨＬＡ分子（ＨＬＡクラスＩおよびＨＬＡ−ＤＲ）、ならびにＦａｓ死受容体（ＣＤ９５）のＤＯＨＨ２腫瘍細胞表面上でのアップレギュレーションを導いた（図２３Ａ）が、モック形質導入Ｔ細胞の培養ではそれはなかった。表現型の変化はまた、ＤＯＨＨ２腫瘍細胞を高いレベルのｓＣＤ４０Ｌを含有するＣＤ４０Ｌ−改変Ｔ細胞からの条件培地で培養する場合にも認められた（図２８）。腫瘍細胞上でのＣＤ４０発現が腫瘍細胞表現型を変えるのに必要であるかどうかを判定するために、ＣＤ４０−腫瘍細胞株（ＮＡＬＭ６）とＣＤ４０Ｌ−改変Ｔ細胞およびモック形質導入Ｔ細胞との共培養を行った。これらの研究は、腫瘍細胞表現型においてＣＤ４０Ｌ媒介性の変化を誘導するために腫瘍によるＣＤ４０発現の必要性を立証する表現型の変化をもたらさなかった（図２３Ｂ）。
【０２０８】
この効果を、臨床的に関連する設定においてさらに確認するために、我々は、ＣＬＬを有する患者由来のＣＤ４０Ｌ改変Ｔ細胞と、自系ＣＬＬ腫瘍細胞とを共培養した。ＣＬＬ患者由来Ｔ細胞のレトロウイルス形質導入は、いつも≧４０％の遺伝子移入をもたらし、ＣＤ４０Ｌ遺伝子の安定した発現を伴う結果となった（図２４Ａ）。この設定において、モック形質導入Ｔ細胞ではなく、この患者由来ＣＤ４０Ｌ改変Ｔ細胞は、自系ＣＬＬ細胞の表面上で、共刺激分子、接着分子、ＨＬＡ分子、ならびにＦａｓ死受容体のアップレギュレーションを行うことができることを示した（図２４Ｂ）。
【０２０９】
ＣＤ４０Ｌ改変Ｔ細胞は、ＩＬ−１２ｐ７０分泌を誘導し、ｍｏＤＣの成熟を媒介する。
【０２１０】
ＤＣ成熟および炎症誘発サイトカインＩＬ−１２の分泌におけるＣＤ４０Ｌの役割を仮定し、次に我々は、自系ｍｏＤＣと共培養した場合にＣＤ４０Ｌ改変Ｔ細胞が同じ効果を誘導し得るか否かを調べた。重要なことに、我々は、ＣＤ４０Ｌ改変Ｔ細胞が、別々の３ドナーからのｍｏＤＣおよび自系ＣＤ４０Ｌ改変Ｔ細胞を含有する共培養において、ＩＬ−１２ｐ７０の分泌を誘導することを見出した（図２５Ａ）。表面共刺激分子（ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８６、およびＣＤ８３）のアップレギュレーションによって判定されるように、ｍｏＤＣの成熟は、ＣＤ４０Ｌ改変Ｔ細胞との共培養後においても見出すことができたが、モック形質導入Ｔ細胞との共培養後においては認められなかった（図２５Ｂ）。
【０２１１】
Ｔ細胞による、ＣＡＲおよびＣＤ４０Ｌの双方の発現は、インビトロおよびインビボでの細胞傷害性を高める結果となる
次に我々は、Ｔ細胞が抗ＣＤ１９  ＣＡＲ（１９２８ｚ）およびＣＤ４０Ｌの両方を発現する能力を評価した。バイシストロニック・レトロウイルスベクターを用いた（１９２８ｚ／ＣＤ４０Ｌ；図２６Ａ）。Ｔ細胞の形質導入は、いつも≧４０％の１９２８ｚおよびＣＤ４０Ｌ（１９２８ｚ／ＣＤ４０Ｌ  Ｔ細胞；図２６Ｂ）双方の発現をもたらした。対照レトロウイルスベクターもまた、抗ＣＤ１９  ＣＡＲ（１９２８ｚ）および抗ＰＳＭＡ  ＣＡＲ（Ｐｚ１およびＰｚ１／ＣＤ４０Ｌ；図２６Ｂ）を含むように生成した。１９２８ｚ／ＣＤ４０Ｌ  Ｔ細胞のインビトロ抗腫瘍活性を評価するために、標準的な４時間の５１クロム放出アッセイを行った。ＣＤ４０Ｌの構成的発現は、１９２８ｚ  ＣＡＲのみを発現するように改変されたＴ細胞を含む対照Ｔ細胞のパネルと比較して、ＣＤ１９＋腫瘍細胞に対する１９２８ｚＴ細胞の溶解能を統計学的に高めた（図２６Ｃ）。他のＣＤ１９＋／ＣＤ４０＋腫瘍細胞株に対しても細胞傷害性が高められていた（図２９）。
【０２１２】
１９２８ｚ／ＣＤ４０Ｌ  Ｔ細胞のインビボでの抗腫瘍活性を調べるために、本発明者らは、全身性ＤＯＨＨ２リンパ腫の異種間移植モデルを使用した。全身性ＤＯＨＨ２腫瘍細胞は、ＳＣＩＤ／ベージュマウスにおけるＣＤ１９標的ＣＡＲ  Ｔ細胞治療に対して著明な難治性を示すことを、本発明者らは以前に観察している。ＣＡＲ−Ｔ細胞をＣＤ４０Ｌでさらに改変することで、このモデルにおける抗腫瘍有効性を高め得るか否かを評価するために、本発明者らは、全身性ＤＯＨＨ２腫瘍を有するＳＣＩＤ／ベージュマウスにＣＡＲ／ＣＤ４０Ｌ  Ｔ細胞を接種し、処置した。重要なことに、１９２８ｚ−Ｔ細胞での処置または対照Ｔ細胞（Ｐｚ１およびＰｚ１／ＣＤ４０Ｌ  Ｔ細胞）での処置と比較して、１９２８ｚ／ＣＤ４０Ｌ  Ｔ細胞での処置によって、生存率が高められ、１９２８ｚ／４０Ｌ  Ｔ細胞で処置したマウスの３０％において長期の生存率が認められた（図２７）。
【０２１３】
考察
ＣＡＲ  Ｔ細胞を用いる養子治療は、Ｂ細胞悪性腫瘍を有する患者にとって将来有望な臨床応答を示した２−４。これらの研究は、唯一の抗腫瘍エフェクター細胞としてのＣＡＲ  Ｔ細胞の効力を証明していた。しかしながら、このアプローチは、頑強な免疫抑制性腫瘍微小環境を有する腫瘍に対しては限定的にしか成功していなかった５。さらに、それらの現行形態では、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、標的抗原の消失後の腫瘍回避に応答することができることを実証されていなかった６。これらの限界を克服する１つの可能な方法は、Ｔ細胞の細胞溶解能／増殖を向上させ、腫瘍免疫原性を強化し、ＤＣ抗原提示／機能を向上させるべく努力する上で、ＣＤ４０Ｌの構成的発現を通してＣＡＲ  Ｔ細胞をさらに遺伝子操作することである。ＣＡＲ  Ｔ細胞の、ＣＤ４０Ｌの構成的発現を介した改変はまた、さらに内因性の免疫応答を活性化し、それによって抗腫瘍有効性を高め得る。
【０２１４】
Ｔ細胞によるＣＤ４０Ｌの構成的発現の役割を評価するため、本発明者らは、ＣＤ４０Ｌ遺伝子のみを含有するレトロウイルスベクターを最初に開発した。Ｔ細胞に形質導入したとき、ＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞のサブセットの両構成的発現が示されている（図２２Ｂ）。ＣＤ４＋Ｔ細胞との関連づけはより一般的であり、メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＣＤ４０Ｌ発現およびヘルパー機能は最近になって報告されたものである３７。ＣＤ４０Ｌ発現も炎症誘発ＴＨ１サイトカイン（ＩＦＮ−γおよびＧＭ−ＣＳＦ）のＴ細胞増殖および分泌を増加させることが知られている２１，２２。ＣＤ４０Ｌ改変Ｔ細胞は、炎症誘発サイトカインを分泌する能力を示しており、また同様に活性化されるが同じドナーからモック形質導入されたＴ細胞の場合と比較して、増殖を高めていた（図２２Ｃおよび２２Ｄ）。ＣＤ４０Ｌの構成的発現を通じたＴ細胞の武装化は、抗腫瘍機能／活性化を高める可能性を有する。
【０２１５】
ＨＬＡクラスＩ、共刺激分子および／または接着分子を含む細胞表面タンパク質のダウンレギュレーションは、免疫認識を避けるために、腫瘍によって採用されることが多い５，３８，３９。悪性腫瘍細胞表面上でのＦａｓ死受容体の消失により、アポトーシス耐性が生じることもある４０。これとは対照的に、ＣＤ４０Ｌは、悪性腫瘍細胞上で、ＣＤ４０と相互作用して、共刺激分子（ＣＤ８０およびＣＤ８６）、接着分子（ＣＤ５４、ＣＤ５８、およびＣＤ７０）、ＨＬＡ分子（ＨＬＡクラスＩおよびＨＬＡ−ＤＲ）のアップレギュレーションを媒介し、悪性Ｂ細胞腫瘍上で、Ｆａｓ／ＦａｓＬ経路を介して、アポトーシスを促進することができる４１，４２。ＣＤ４０Ｌ改変Ｔ細胞は、ＣＤ４０＋腫瘍細胞の表現型を改変し、これらの臨界表面タンパク質のアップレギュレーションを生じさせ、それによって、腫瘍細胞の免疫回避能を抑止する（図２）。ＣＤ４０−腫瘍細胞をＣＤ４０Ｌ改変Ｔ細胞を用いて共培養した場合、表現型の変化がなかったので、この作用は、腫瘍細胞によるＣＤ４０の発現に依存していた（図２３Ａ−Ｂ）。また、この作用は、ＣＬＬ患者由来の共培養されたＣＤ４０Ｌ改変Ｔ細胞が自系ＣＬＬ細胞の免疫原性を強化するより臨床的に関連性のある設定においても認められた（図２４Ａ−Ｂ）。この所見は、構成的なＣＤ４０Ｌ発現を介して自系悪性腫瘍細胞の免疫原性を強化するＴ細胞の保持された能力を示すものである。重要なことに、高レベルのｓＣＤ４０Ｌを含有する培地が類似の表現型の変化を導いたので、細胞間の接触は、腫瘍細胞表現型を改変するために必要なことではない（図２８）。ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ４０経路を介しての、癌細胞の免疫原性の強化は、内因性の抗腫瘍応答を誘導することが、ＣＤ４０Ｌをコードするアデノウイルスベクターを用いて形質導入された自系ＣＬＬ腫瘍細胞（Ａｄ−ＣＤ４０Ｌ、ＣＬＬ細胞）の注入を用いた、既に公表されているワクチンの研究において示されている２７，２８。ＣＤ４０Ｌを構成的に発現するようにさらに改変された腫瘍特異的Ｔ細胞の注入は、内因性の抗腫瘍反応を誘導する類似の能力を有し得る。この結果、内因性の抗腫瘍Ｔ細胞またはＮＫ細胞の動員を介してエピトープが広がり、それによって、単一標的抗原のダウンレギュレーションを介しての腫瘍回避の可能性を制限することになる。
【０２１６】
腫瘍微小環境内では、樹状細胞（ＤＣ）機能が妨げられる。通常、ＤＣは、成熟し、移動し、リンパ節内で抗原を提示する。それによって、悪性疾患または病原体の存在に対し免疫系の適応可能なアームを刺激する５。しかしながら、抑制的腫瘍微小環境にさらされたＤＣは、Ｔｒｅｇｓを誘導し、腫瘍特異的Ｔ細胞に耐性を示すという逆説的な機能を有する４３。これとは対照的に、ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ４０経路は、ＤＣ抗原の提示、炎症誘発サイトカインＩＬ−１２の産生を増大させて、ＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞傷害性機能を促進し得る１９，２０。アゴニストＣＤ４０抗体は、ＤＣを活性化し、ＣＤ８＋Ｔ細胞の応答を増大させ、それによってＣＤ４＋Ｔ細胞の助けを必要としないことが既に示されている２６。さらに、ＣＤ４０Ｌ−改変腫瘍特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＤＣの成熟を刺激し、養子移入されたＣＤ８＋Ｔ細胞の、腫瘍を有するマウスでの抗腫瘍反応を強化することが示されている４４。ＣＤ４０Ｌ改変Ｔ細胞がヒトＤＣの機能を強化する能力を試験するために、自系ｍｏＤＣを用いたインビトロ共培養実験を用いた。重要なことに、ＣＤ４０Ｌ改変Ｔ細胞は、ｍｏＤＣからのＩＬ−１２ｐ７０の分泌を刺激した（図２５Ａ−Ｂ）。本発明者らおよび他者が既に示しているようにＩＬ−１２は、Ｔ細胞増殖を高める能力、細胞傷害能を含めた、いくつかの免疫刺激機能を有する多面発現サイトカインであり、Ｔｒｅｇ抑制に対する耐性を媒介する７，４５。ＣＡＲ／４０Ｌ  Ｔ細胞がＤＣからのＩＬ−１２の産生を刺激する能力は、養子移入されたＣＡＲ−Ｔ細胞の改善された抗腫瘍効果への翻訳、ならびに、内因性の腫瘍特異的Ｔ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の動員および活性化への翻訳を行い得る。ＩＬ−１２産生を、腫瘍の近隣で促進させることによって、本発明者らは、ＩＬ−１２の全身への投与後に重大な毒性を示している従来の研究とは対照的に、最小のＩＬ−１２関連毒性を予測している。ＩＬ−１２産生の刺激に加えて、ＣＤ４０Ｌ改変Ｔ細胞は、ＤＣの成熟を促進する。これが、ＣＡＲ  Ｔ細胞の細胞傷害性の状況で、当然ＤＣ腫瘍抗原取り込みと、提示をさらに高める結果、内因性の抗腫瘍応答のエフェクターＴ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞による動員／活性化が行われる（図２５Ａ−Ｂ）。合わせて考えると、高められたＤＣ機能は、内因性の抗腫瘍免疫応答の動員を介して、当然遺伝子改変された腫瘍特異的Ｔ細胞の抗腫瘍有効性を高めるよう翻訳が行われることになる。
【０２１７】
ＣＡＲ  Ｔ細胞がＴ細胞の特異性の向きを変える能力は、多くの前臨床および臨床報告において実証されている１。本発明者らは、抗ＣＤ１９  ＣＡＲ（１９２８ｚ）およびＣＤ４０Ｌ遺伝子を含有するレトロウイルスベクターを開発した（図２８Ａ）。１９２８ｚおよびＣＤ４０Ｌの双方のＴ細胞による構成的発現は容易に達成できる（図２８Ｂ）。重要なことに、ＣＤ１９＋標的のパネルに対する１９２８ｚ／４０Ｌ  Ｔ細胞の細胞傷害性能力を試験したとき、本発明者らは、１９２８ｚ  ＣＡＲのみで改変したＴ細胞と比較して、細胞傷害性が増加していることに注目した（図２８Ｃ）。近年、Ｌａｕｒｉｎおよび同僚が、表面接着分子のＣＤ４０／ＩＬ−４依存性アップレギュレーション後、ＣＡＲ  Ｔ細胞による腫瘍細胞株に対する細胞傷害性が増加したことを報告している。それは、本発明者らの実験において認められた細胞傷害性の増加を説明することができる４６。インビボでのＣＡＲ／ＣＤ４０Ｌ  Ｔ細胞の能力を試験するために、攻撃的に変えられた濾胞性リンパ腫細胞株ＤＯＨＨ２を用いる異種間移植モデルを使用した。このモデルは、歴史的に、１９２８ｚ  Ｔ細胞による根絶に耐性を有する（図２７）。しかしながら、ＣＤ４０Ｌに加えられた改変により、本発明者らの１９２８ｚ／ＣＤ４０Ｌ  Ｔ細胞は、１９２８ｚ  Ｔ細胞のみで処置したマウスに比べて、腫瘍を有するマウスの生存を延ばし、１９２８ｚ／ＣＤ４０Ｌ  Ｔ細胞処置群において、３０％の長期生存という結果となっている（図２７）。このモデルは生存率の違いを証明する一方、ＳＣＩＤ／ベージュマウスによる免疫適格系の欠如により、このモデルは、ＣＡＲ  Ｔ細胞による構成的なＣＤ４０Ｌ発現が、確立した腫瘍の根絶において有し得る十分な有利性を調べるのに好適ではないものとなっている。本発明者らは、本発明者らのモデルにおいて高い抗腫瘍有効性を認めている一方、これが、ＣＤ４０Ｌ−改変ＣＡＲ  Ｔ細胞による内因性の免疫応答の動員／活性化を介してではなく、自己分泌／パラ分泌ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ経路によるＣＡＲ  Ｔ細胞の細胞傷害性の増強に関連すると思われる。腫瘍微小環境でのＣＡＲ  Ｔ細胞によるＣＤ４０Ｌの構成的発現、および内因性の抗腫瘍免疫応答の動員の完全な効果を調べるために、免疫適格同系腫瘍モデルを用いてもよい。ヒトＣＤ１９＋Ｂ細胞悪性腫瘍の免疫適格同系モデルが最近開発され、免疫適格系との関連で１９２８ｚ／ＣＤ４０Ｌ  Ｔ細胞を評価するために使用されている。
【０２１８】
ＣＤ４０Ｌの骨髄または胸腺細胞上での構成的発現が、ＣＤ４０Ｌ欠乏マウスに注入後、Ｔ−リンパ増殖性障害を引き起こすことが示されている４７。胸腺細胞の絶え間ないＣＤ４０Ｌ刺激後に胸腺内に生じたクローン群は、（ＣＤ４０Ｌ−改変細胞の挿入性の腫瘍形成ではなく）悪性変換に至ったかもしれない。本発明者らは、ＣＡＲ／ＣＤ４０Ｌ  Ｔ細胞の注入後、毒性が最小で、悪性の形質転換がないことに注目しており、悪性のＴ細胞変換に関する懸念を考慮すると、ｉＣａｓｐ９などの有効な自殺遺伝子が、望ましくはレトロウイルスベクター中に含まれ得る４８。
【０２１９】
【化１８】
2020054387.tif 000019
【０２２０】
【化１９】
2020054387.tif 000020
【０２２１】
【化２０】
2020054387.tif 000021
【０２２２】
【化２１】
2020054387.tif 000022
【０２２３】
【化２２】
2020054387.tif 000023
本発明の実施形態
前記の説明から、本発明を様々な用法および条件に合わせるために、変法および改変が、本明細書中に記載の本発明に対して行われてもよいことは明らかである。そのような実施形態もまた、以下の請求の範囲の範囲内である。
【０２２４】
本明細書中の変数の何らかの定義における構成要素の列挙の詳述では、その変数の定義が、列挙された構成要素のいずれか１つの構成要素として、または、列挙された構成要素の組合せ（または部分的組合せ）として含まれる。本明細書中に記載の実施形態は、その実施形態がいずれか１つの実施形態として、あるいは、いずれかの他の実施形態またはその一部分との組合せなどを包含している。
【０２２５】
本願のいくつかの主題は、米国特許出願第１２／５９３，７５１号に関し得る。これは２０１０年３月８日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／００４２５１号明細書の、米国特許法第３７１条に基づく米国国内段階移行の出願である。それは、２００７年３月３０日出願の米国仮特許出願第６０／９２１，１４４号の利益を主張し、その全内容は参照により本明細書中に組み込まれる。
【０２２６】
本明細書に記載のすべての特許および出版物は、あたかも独立した各特許および出版物が具体的かつ個別的に示されているものと同じくらいに、参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
2020054387.tif 000024
【図２】
2020054387.tif 000025
【図３】
2020054387.tif 000026
【図４】
2020054387.tif 000027
【図５】
2020054387.tif 000028
【図６】
2020054387.tif 000029
【図７Ａ】
2020054387.tif 000030
【図７Ｂ】
2020054387.tif 000031
【図８Ａ】
2020054387.tif 000032
【図８Ｂ】
2020054387.tif 000033
【図９−１】
2020054387.tif 000034
【図９−２】
2020054387.tif 000035
【図９−３】
2020054387.tif 000036
【図１０】
2020054387.tif 000037
【図１１】
2020054387.tif 000038
【図１２】
2020054387.tif 000039
【図１３】
2020054387.tif 000040
【図１４】
2020054387.tif 000041
【図１５】
2020054387.tif 000042
【図１６Ａ】
2020054387.tif 000043
【図１６Ｂ】
2020054387.tif 000044
【図１６Ｃ】
2020054387.tif 000045
【図１７】
2020054387.tif 000046
【図１８−１】
2020054387.tif 000047
【図１８−２】
2020054387.tif 000048
【図１９】
2020054387.tif 000049
【図２０】
2020054387.tif 000050
【図２１】
2020054387.tif 000051
【図２２−１】
2020054387.tif 000052
【図２２−２】
2020054387.tif 000053
【図２２−３】
2020054387.tif 000054
【図２３Ａ】
2020054387.tif 000055
【図２３Ｂ】
2020054387.tif 000056
【図２４Ａ】
2020054387.tif 000057
【図２４Ｂ】
2020054387.tif 000058
【図２５Ａ】
2020054387.tif 000059
【図２５Ｂ】
2020054387.tif 000060
【図２６Ａ】
2020054387.tif 000061
【図２６Ｂ】
2020054387.tif 000062
【図２６Ｃ】
2020054387.tif 000063
【図２７】
2020054387.tif 000064
【図２８】
2020054387.tif 000065
【図２９】
2020054387.tif 000066
【配列表】
2020054387000001.app
【外国語明細書】
2020054387000001.pdf