(57)【要約】【課題】唾液中のプロテアーゼ活性を測定する方法の提供。【解決手段】唾液を、プロテアーゼによって消化されることにより発光又は発色を生じさせるプロテアーゼ活性測定用試薬と接触させた後、生じた発光又は発色の強度に基づいて、前記唾液のプロテアーゼ活性を測定する、唾液のプロテアーゼ活性の測定方法、及び、当該唾液のプロテアーゼ活性の測定方法によって、被験動物から採取された唾液のプロテアーゼ活性を測定し、当該測定結果に基づいて前記被験動物の口腔内の細菌の活動量を評価する、口腔内細菌の活動量の評価方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
唾液を、プロテアーゼによって消化されることにより発光又は発色を生じさせるプロテアーゼ活性測定用試薬と接触させた後、生じた発光又は発色の強度に基づいて、前記唾液のプロテアーゼ活性を測定する、唾液のプロテアーゼ活性の測定方法。
【請求項２】
前記プロテアーゼ活性測定用試薬が、プロテアーゼにより消化されることによってルシフェリンが産生されるルシフェリン誘導体と、ＡＴＰと、ルシフェラーゼと、を含む、請求項１に記載の唾液のプロテアーゼ活性の測定方法。
【請求項３】
前記ルシフェラーゼが、野生型甲虫ルシフェラーゼに変異が導入された変異型甲虫ルシフェラーゼである、請求項２に記載の唾液のプロテアーゼ活性の測定方法。
【請求項４】
前記ルシフェラーゼが、野生型甲虫ルシフェラーゼの発光強度よりも大きい発光強度を有する変異型甲虫ルシフェラーゼである、請求項３に記載の唾液のプロテアーゼ活性の測定方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の唾液のプロテアーゼ活性の測定方法によって、被験動物から採取された唾液のプロテアーゼ活性を測定し、当該測定の結果に基づいて前記被験動物の口腔内の細菌の活動量を評価する、口腔内細菌の活動量の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、唾液のプロテアーゼ活性を、発色反応や発光反応を利用して測定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物を検出する方法の一つとして、検出対象の微生物が産生する酵素の活性を測定する方法がある。酵素活性を利用することにより、微生物自体を培養して同定する方法よりもより短時間で微生物を検出することができる。例えば、特許文献１には、患者の口腔からのサンプルの細菌が産生する酵素を検出することにより、歯周病を診断する方法及びそのキットが開示されている。
【０００３】
酵素活性の測定方法としては、発色検査法が広く用いられている。当該方法は、微生物の存在が疑われている試料に、微生物が産生する酵素により発色物質を産生する発色性基質を混合して所定時間反応させ、産生された発色物質の量を比色定量する方法である。その他、ゼラチン等のプロテアーゼ基質を支持体上に形成された薄膜とし、当該薄膜に消化痕を形成させることによってプロテアーゼ活性を測定する方法もある。例えば、特許文献２には、ガラス等の平板上に例えば組織又は細胞などの生体試料をのせ、その上にプロテアーゼ基質薄膜を密着させることにより、プロテアーゼ基質がプロテアーゼの作用により分解しても生体試料が脱落せず、基質の分解と生体試料中の細胞核などの観察を同時に確実に行うことができる方法が開示されている。ただし、細胞のインキュベートや染色と染色された細胞の測定は、専用の設備を要し、またある程度の時間も必要である。
【０００４】
一方で、甲虫ルシフェラーゼは、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、マグネシウムイオン及び酸素の存在下でホタルルシフェリンの酸化を触媒し、これを発光させる酵素である。そのため、甲虫ルシフェラーゼ及びこれを用いたルシフェリン−ルシフェラーゼ発光反応は、ＡＴＰを指標として検体中の微生物の検出を目的とする検査、例えば、微生物汚染ＡＴＰ検査やエンドトキシン発光検査に広く利用されている。
【０００５】
ＡＴＰの検出における甲虫ルシフェラーゼの利用性を高めるために、これまで様々な変異型甲虫ルシフェラーゼが作製されてきた。そのような変異型甲虫ルシフェラーゼとしては、熱安定性が向上したもの(例えば、特許文献３参照）、基質親和性が向上したもの（例えば、特許文献４参照）、発光波長が変化したもの（例えば、特許文献５参照）、発光の持続性が向上したもの（例えば、特許文献６参照）、界面活性剤耐性を有するもの（例えば、特許文献７参照）、発光強度が向上したもの（例えば、特許文献８参照）、塩化ナトリウムによる発光阻害の影響を受けにくいもの（例えば、特許文献９参照）等が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２００７−５１９９２３号公報
【特許文献２】特開２００３−７９３９５号公報
【特許文献３】特許第３０４８４６６号公報
【特許文献４】特表２００１−５１８７９９号公報
【特許文献５】特許第２６６６５６１号公報
【特許文献６】特開２０００−１９７４８４号公報
【特許文献７】特開平１１−２３９４９３号公報
【特許文献８】特開２００７−９７５７７号公報
【特許文献９】特開２０１７−２２５３７２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本来、ヒト等の動物の唾液中にはプロテアーゼは含まれていないが、口腔内細菌はプロテアーゼを産生している。本発明は、唾液中のプロテアーゼ活性を測定する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、前記目的を達成するべく鋭意研究したところ、プロテアーゼ認識部位を含むオリゴペプチドで誘導されたルシフェリン誘導体とＡＴＰとルシフェラーゼを含む反応溶液に唾液を添加したところ、唾液中のプロテアーゼによってルシフェリンが産生され、ルシフェリン−ルシフェラーゼ発光反応によって発光が生じること、この発光の強度が、唾液中のプロテアーゼの量に依存することを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００９】
すなわち、本発明に係る唾液のプロテアーゼ活性の測定方法、及び口腔内細菌の活動量の評価方法は、下記［１］〜［５］である。
［１］  唾液を、プロテアーゼによって消化されることにより発光又は発色を生じさせるプロテアーゼ活性測定用試薬と接触させた後、生じた発光又は発色の強度に基づいて、前記唾液のプロテアーゼ活性を測定する、唾液のプロテアーゼ活性の測定方法。
［２］  前記プロテアーゼ活性測定用試薬が、プロテアーゼにより消化されることによってルシフェリンが産生されるルシフェリン誘導体と、ＡＴＰと、ルシフェラーゼと、を含む、前記［１］の唾液のプロテアーゼ活性の測定方法。
［３］  前記ルシフェラーゼが、野生型甲虫ルシフェラーゼに変異が導入された変異型甲虫ルシフェラーゼである、前記［２］の唾液のプロテアーゼ活性の測定方法。
［４］  前記ルシフェラーゼが、野生型甲虫ルシフェラーゼの発光強度よりも大きい発光強度を有する変異型甲虫ルシフェラーゼである、前記［３］の唾液のプロテアーゼ活性の測定方法。
［５］  前記［１］〜［４］のいずれかの唾液のプロテアーゼ活性の測定方法によって、被験動物から採取された唾液のプロテアーゼ活性を測定し、当該測定結果に基づいて前記被験動物の口腔内の細菌の活動量を評価する、口腔内細菌の活動量の評価方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明に係る唾液のプロテアーゼ活性の測定方法により、唾液中のプロテアーゼ活性を比較的簡便かつ定量的に測定することができる。また、唾液中のプロテアーゼは口腔内細菌が産生するものであり、当該測定方法により、口腔内細菌の活動量を評価することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】参考例１において作製された、トリプシンのプロテアーゼ活性（ＢＡＥＥ  Ｕ／ｍＬ）と発光強度値との関係を示す検量線を示した図である。
【図２】参考例２において、トリプシンとプロテアーゼ活性測定用試薬を混合した各反応溶液の発光量の経時的変化を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
［唾液のプロテアーゼ活性の測定方法］
本発明に係る唾液のプロテアーゼ活性の測定方法（以下、「本発明に係るプロテアーゼ活性測定方法」ということがある。）は、唾液を、プロテアーゼによって消化されることにより発光又は発色を生じさせるプロテアーゼ活性測定用試薬と接触させた後、生じた発光又は発色の強度に基づいて、唾液のプロテアーゼ活性を測定する。唾液中のプロテアーゼ活性が強いほど、生じた発光又は発色の強度は強くなる。すなわち、唾液中のプロテアーゼ活性の強度と発光又は発色の強度は比例関係にある。このため、反応により生じた発光又は発色の強度から、唾液中のプロテアーゼ活性の強さ、ひいては唾液中のプロテアーゼの含有量を定量的に測定することができる。また、プロテアーゼ反応は非常に迅速であるため、本発明に係るプロテアーゼ活性測定方法は、非常に迅速に、極めて短時間で実施することができる。
【００１３】
本発明において使用されるプロテアーゼ活性測定用試薬は、プロテアーゼによって消化されることにより発光又は発色を生じさせる試薬である。当該試薬としては、例えば、プロテアーゼによって消化されることにより、発光物質又は発色物質を産生する物質が挙げられる。また、当該試薬としては、プロテアーゼによって消化されることにより、発光反応又は発色反応の基質を産生する物質と、当該基質を用いた発光反応又は発色反応に必要なその他の物質とを含んでいてもよい。
【００１４】
プロテアーゼによる消化によって発光物質を産生する物質としては、プロテアーゼ認識部位を含むペプチドが連結した発光物質のペプチド誘導体であって、当該ペプチドがプロテアーゼによって消化される前には発光しておらず、プロテアーゼによって消化されてはじめて遊離された発光物質が発光する物質が挙げられる。ここで、ペプチドは、オリゴペプチドであってもよく、タンパク質（ポリペプチド）であってもよい。
【００１５】
本発明において使用されるプロテアーゼ活性測定用試薬に含まれるペプチド誘導体としては、いずれかのプロテアーゼが認識するプロテアーゼ認識部位を含むペプチドの誘導体であればよい。例えば、特定の微生物又は微生物群が比較的特異的に産生するプロテアーゼによって消化されるプロテアーゼ認識部位を含むペプチドの誘導体を用いることにより、当該特定の微生物又は微生物群のプロテアーゼ活性を測定することができる。一方で、多種多様な微生物にプロテアーゼによって消化されるプロテアーゼ認識部位を含むペプチドの誘導体を用いることにより、試料に含まれているプロテアーゼの全活性を測定することができる。プロテアーゼによって消化されるプロテアーゼ認識部位としては、公知のプロテアーゼ認識部位又はその改変配列の中から、活性を測定する目的のプロテアーゼに合わせて適宜選択して用いることができる。本発明において使用されるプロテアーゼ活性測定用試薬に含まれるペプチド誘導体としては、口腔内細菌が産生するプロテアーゼが認識するプロテアーゼ認識部位を含むペプチドの誘導体を用いることが好ましい。
【００１６】
プロテアーゼ認識部位を含むペプチドが連結した発光物質のペプチド誘導体としては、感度に優れることから、蛍光物質のペプチド誘導体が好ましい。当該蛍光物質としては、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミン、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）等の公知の蛍光物質やその改変体を用いることができる。プロテアーゼ認識部位を含むペプチドが連結した蛍光物質のペプチド誘導体としては、例えば、カゼイン等のプロテアーゼ基質となるタンパク質に１分子当たり多数の蛍光物質を結合させた誘導体が挙げられる。当該誘導体では、濃度消光によって蛍光を発していないか、発する蛍光が遊離の蛍光物質に比べて顕かに小さい。その他、メチルクマリンアミド（ＭＣＡ）やアミノトリフルオロメチルクマリン（ＡＦＣ）にプロテアーゼ認識部位を含むペプチドが連結したペプチド誘導体であって、プロテアーゼ消化によって蛍光物質であるアミノメチルクマリン（ＡＭＣ）を産生するペプチド誘導体も、本発明において使用されるプロテアーゼ活性測定用試薬として用いることができる。
【００１７】
プロテアーゼ認識部位を含むペプチドが連結した発色物質のペプチド誘導体としては、ペプチド誘導体では発色せず、プロテアーゼ消化によってはじめて発色するペプチド誘導体であってもよく、ペプチド誘導体とプロテアーゼ消化後の遊離の状態で色が異なる発色物質のペプチド誘導体であってもよい。このような発色物質のペプチド誘導体としては、例えば、ｐＮＡ（パラニトロアニリド）等のペプチド誘導体が挙げられる。
【００１８】
本発明において使用されるプロテアーゼ活性測定用試薬としては、生物発光の発光基質のペプチド誘導体と、当該発光反応に必要な他の成分を含むものであってもよい。中でも、感度が良好であることから、ルシフェリン−ルシフェラーゼ発光反応の発光基質であるルシフェリンにプロテアーゼ認識部位を含むペプチドが連結したルシフェリン誘導体と、ＡＴＰと、ルシフェラーゼと、を含むものが好ましい。プロテアーゼ消化によってルシフェリンを産生するルシフェリン誘導体としては、例えば、ルシフェリンのフェノール性水酸基又はカルボキシル基にプロテアーゼ認識部位を含むペプチドを結合させた誘導体が挙げられる。
【００１９】
プロテアーゼ活性測定用試薬に含まれるルシフェラーゼとしては、ルシフェラーゼ活性を有するタンパク質であればよく、野生型甲虫ルシフェラーゼであってもよく、野生型甲虫ルシフェラーゼのルシフェラーゼ活性を有する領域に変異が導入された変異型甲虫ルシフェラーゼであってもよい。変異型甲虫ルシフェラーゼとしては、例えば、特許文献３〜９に記載されている変異型甲虫ルシフェラーゼが挙げられる。また、野生型甲虫ルシフェラーゼや変異型甲虫ルシフェラーゼのルシフェラーゼ活性を有する領域のＮ末端やＣ末端に、各種タグが付加された酵素であってもよい。前記タグとしては、例えば、ヒスチジンタグ、ＨＡ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）タグ、Ｍｙｃタグ、及びＦｌａｇタグ等の組換えタンパク質の発現・精製において汎用されているタグを用いることができる。
【００２０】
本発明及び本願明細書において、「野生型甲虫ルシフェラーゼ」とは、北米ホタル（Photinus pyralis）ルシフェラーゼ（配列番号１）、ヘイケホタル（Luciola lateralis）ルシフェラーゼ（配列番号２）、ゲンジホタル（Luciola cruciata）ルシフェラーゼ（配列番号３）、東ヨーロッパホタル（Luciola mingrelica）ルシフェラーゼ、ツチホタル（Lampyris noctiluca）ルシフェラーゼ、ヒカリコメツキムシ（Pyrophorus plagiophthalamus）ルシフェラーゼ（配列番号４）等が挙げられる。なお、各種の野生型甲虫ルシフェラーゼのアミノ酸配列は、データベース（例えば、EMBL-EBI Database（http://www.ebi.ac.uk/queries/））で検索することができる。
【００２１】
本発明において用いられるルシフェラーゼとしては、野生型甲虫ルシフェラーゼよりも塩化ナトリウムによる発光阻害の影響を受けにくい変異型甲虫ルシフェラーゼであることが好ましい。塩化ナトリウムによる発光阻害の影響を受けにくい変異型甲虫ルシフェラーゼとは、具体的には、塩化ナトリウム非含有溶液中における発光強度を１００％とした場合の、０．９質量％の塩化ナトリウム溶液中における発光強度の相対値（［０．９質量％の塩化ナトリウム溶液中における発光強度］／［塩化ナトリウム非含有溶液中における発光強度］×１００）（％）（以下、「残存活性（％）」という。）が高い変異型甲虫ルシフェラーゼを意味する。本発明において用いられる変異型甲虫ルシフェラーゼのルシフェラーゼ活性は、残存活性が５０％以上であることが好ましく、６０％以上であることがより好ましく、７０％以上であることがさらに好ましく、８０％以上であることがよりさらに好ましく、９０％以上であることが特に好ましい。
【００２２】
塩化ナトリウムによる発光阻害の影響を受けにくい変異型甲虫ルシフェラーゼとしては、例えば、野生型甲虫ルシフェラーゼをコードするアミノ酸配列において、少なくとも下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）からなる群より選択される１種以上の変異を有しているものが挙げられる（特許文献９参照。）。
（ａ）野生型北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列における２８８位のバリンに相当するアミノ酸が、イソロイシン、ロイシン、又はフェニルアラニンである変異。
（ｂ）野生型北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列における３７６位のロイシンに相当するアミノ酸が、プロリンである変異。
（ｃ）野生型北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列における４５５位のグルタミン酸に相当するアミノ酸が、バリン、アラニン、セリン、ロイシン、イソロイシン、又はフェニルアラニンである変異。
（ｄ）野生型北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列における４８８位のグルタミン酸に相当するアミノ酸が、バリン、アラニン、セリン、ロイシン、イソロイシン、又はフェニルアラニンである変異。
【００２３】
野生型甲虫ルシフェラーゼが北米ホタルルシフェラーゼでない場合は、当該野生型甲虫ルシフェラーゼのアミノ酸配列における、「北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列のＸ位のアミノ酸に相当するアミノ酸」は、アミノ酸配列の相同性解析ソフト（例えば、Micro GenieTM（ベックマン社製））等を用いて、当該野生型甲虫ルシフェラーゼ及び北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列を最もホモロジーが高くなるようにアラインメントした場合に、「北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列のＸ位のアミノ酸」に対応する位置にあるアミノ酸を意味する。
【００２４】
本発明において用いられるルシフェラーゼとしては、野生型甲虫ルシフェラーゼの発光強度よりも大きい発光強度を有する変異型甲虫ルシフェラーゼであることも好ましい。なかでも、変異型甲虫ルシフェラーゼのうち、ルシフェラーゼ活性が、野生型甲虫ルシフェラーゼのルシフェラーゼ活性の１１０％以上であるものが好ましく、１２０％以上であるものが好ましく、１５０％以上であるものがより好ましく、１８０％以上であるものがさらに好ましく、２００％以上であるものがよりさらに好ましい。このような変異型甲虫ルシフェラーゼとしては、例えば、特許文献８に記載の変異型甲虫ルシフェラーゼが挙げられる。
【００２５】
本発明及び本願明細書において、甲虫ルシフェラーゼの「発光強度」とは、特に断らない限り、ルシフェリン−ルシフェラーゼ発光反応におけるピーク時の発光強度、すなわち、当該甲虫ルシフェラーゼを、ＡＴＰ、２価金属イオン及び酸素の存在下でホタルルシフェリンと反応させた場合におけるピーク時の発光強度を意味する。なお、「発光強度」が大きいほど、当該甲虫ルシフェラーゼのルシフェラーゼ活性が強いと判断することができる。
【００２６】
また、ルシフェリン−ルシフェラーゼ発光反応の反応溶液が「塩化ナトリウム非含有溶液」であるとは、塩化ナトリウムを配合せずに調製された反応溶液であることを意味する。残存活性を算出するためのルシフェリン−ルシフェラーゼ発光反応を行う際の「塩化ナトリウム非含有溶液」と「０．９質量％の塩化ナトリウム溶液」は、塩化ナトリウム以外の組成は全て同一であり、反応温度や時間等の反応条件も揃えて行う。
【００２７】
なお、アミノ酸配列同士の配列同一性（相同性）は、２つのアミノ酸配列を、対応するアミノ酸が最も多く一致するように、挿入及び欠失に当たる部分にギャップを入れながら並置し、得られたアラインメント中のギャップを除くアミノ酸配列全体に対する一致したアミノ酸の割合として求められる。アミノ酸配列同士の配列同一性は、当該技術分野で公知の各種相同性検索ソフトウェアを用いて求めることができる。
【００２８】
プロテアーゼ活性測定用試薬に含まれるルシフェラーゼとしては、北米ホタル等の甲虫から抽出したタンパク質であってもよく、遺伝子組換え技術によって産生された組換えタンパク質であってもよい。また、ペプチド合成によって合成されたタンパク質であってもよい。組換えタンパク質の場合、一般的に、宿主となる微生物を形質転換して得られた形質転換体を培養して組換えタンパク質を産生させる。本発明において用いられるルシフェラーゼとしては、当該形質転換体の培養物から組換えタンパク質を、当業者に周知の方法、例えば、遠心分離により培養物から形質転換体を回収し、これに対して凍結融解処理、超音波破砕処理、又はリゾチーム等の溶菌酵素による処理を行うことにより、形質転換体から回収することができる。なお、甲虫ルシフェラーゼの組換えタンパク質は、溶液の状態で回収してもよい。更に、回収された甲虫ルシフェラーゼ（粗酵素）は、例えば、硫安沈澱、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を各々単独で、又は適宜組み合わせて実施することにより、精製することができる。
【００２９】
本発明に係るプロテアーゼ活性測定方法において、測定に供される唾液は、いずれの動物から採取されたものであってもよい。当該動物としては、ヒトであってもよく、ヒト以外の動物であってもよい。非ヒト動物としては、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等の哺乳動物が挙げられる。また、唾液の採取方法は特に限定されるものではなく、唾液を直接収容容器に採取してもよく、うがい液を採取してもよく、口腔内で含むことで唾液を保持した綿等をそのまま測定に供してもよい。また、採取された唾液をそのまま測定に供してもよく、唾液中のプロテアーゼ活性を過度に損なわない限度において、前処理を行ってもよい。当該前処理としては、例えば、希釈処理等が挙げられる。
【００３０】
唾液とプロテアーゼ活性測定用試薬との接触は、例えば、両者を適当な溶媒に添加した反応溶液を調製し、得られた反応溶液を所定時間インキュベートすることによりプロテアーゼ反応を行うことができる。唾液を予め適当な溶媒で希釈しておき、これにプロテアーゼ活性測定用試薬を添加して混合してもよく、プロテアーゼ活性測定用試薬と溶媒を予め混合しておき、その後、唾液又はその希釈物をプロテアーゼ活性測定用試薬を含む溶液に混合してもよい。当該溶媒としては、唾液とプロテアーゼ活性測定用試薬の両方が溶解可能であって、プロテアーゼ活性や、発光強度又は発色強度に対してさほど影響を与えない溶媒であれば特に限定されるものではない。例えば、水、リン酸生理食塩水（ＰＢＳ）、ＨＥＰＥＳバッファー、トリスバッファー等が挙げられる。
【００３１】
唾液とプロテアーゼ活性測定用試薬を含む反応溶液の反応時間は、１分間〜３６時間が好ましく、５分間〜２４時間がより好ましく、５分間〜３０分間がさらに好ましい。また、反応溶液を調製直後に発光強度又は発色強度を測定してもよい。当該反応は、恒温装置内で行ってもよく、温度制御をしていない環境下（例えば、室温）で行ってもよい。恒温装置内で行う場合、反応温度は、２０〜４２℃が好ましく、２８〜３７℃がより好ましい。
【００３２】
反応の終了後、反応溶液の発光強度又は発色強度を測定する。当該測定は、例えば、マイクロプレートリーダーや生物化学発光測定装置等の市販の測定装置を用いて行うことができる。反応溶液の発光強度又は発色強度は、当該反応溶液中のプロテアーゼ反応により産生された発光物質又は発色物質の量に依存し、反応溶液内のプロテアーゼ量に依存する。このため、反応溶液内のプロテアーゼ量（ｕｎｉｔ／ｍＬ）と発光強度又は発色強度との関係を示す検量線に基づいて、当該反応溶液の発光強度値又は発色強度値から唾液に含まれているプロテアーゼ活性の強度を測定することができ、ひいては唾液に含まれている微生物の活動量を定量することができる。当該検量線は、予め作成されていたものを用いてもよく、検量線作成のための発光強度値を、目的の唾液の測定と同時に行ってもよい。検量線は、濃度既知の精製酵素を用いて、発光反応と同じ条件で行い、作製することができる。検量線作成に用いる精製酵素は、プロテアーゼ活性を測定する目的のプロテアーゼと同じであってもよく、トリプシン等の汎用されている酵素を用いてもよい。
【００３３】
［口腔内細菌の活動量の評価方法］
本発明に係る口腔内細菌の活動量の評価方法では、前記の唾液のプロテアーゼ活性の測定方法によって、被験動物から採取された唾液のプロテアーゼ活性を測定し、当該測定結果に基づいて当該被験動物の口腔内の細菌の活動量を評価する。当該動物としては、ヒトであってもよく、ヒト以外の動物であってもよい。非ヒト動物としては、前記で挙げられたものが例示できる。
【００３４】
評価に供される唾液は、安静時唾液であることが好ましい。安静時唾液とは、椅子等に座ってリラックスした状態で自然に口腔内に溜まる唾液である。中でも、食事の影響を抑えるため、食後の歯磨きをした後、１０〜６０分間経過時点に採取された安静時唾液であることが特に好ましい。
【００３５】
唾液のプロテアーゼ活性が大きいほど、当該唾液が採取された動物の口腔内の細菌の活動量が多いと評価される。このため、本発明に係る口腔内細菌の活動量の評価方法により、歯周病のような口腔内細菌が原因である疾患の罹患可能性を評価することもできる。例えば、被験動物から採取された唾液中のプロテアーゼ活性量が、予め設定された所定の閾値以上である場合には、当該被験動物の口腔内の細菌の活動量が大きい、すなわち、口腔内にかなりの量の細菌が存在しているか、又は口腔内の細菌の活動性が高いこと、このため、例えば、歯周病のような口腔内細菌の量が多いことや活動性が高いことに起因する疾患に罹患している可能性が高いと評価することができる。逆に、プロテアーゼ活性量が、予め設定された所定の閾値よりも少ない場合には、歯周病のような口腔内細菌の活動量が多いことに起因する疾患に罹患している可能性は低いと評価することができる。当該閾値は、例えば、歯周病等に罹患している患者群と健常者群に対してそれぞれ同じ条件でプロテアーゼ活性を測定し、得られた測定値に基づいて実験的に求めることができる。
【実施例】
【００３６】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００３７】
［参考例１］
ルシフェリン誘導体とＡＴＰと変異型甲虫ルシフェラーゼをプロテアーゼ活性測定用試薬とし、トリプシンを用いてプロテアーゼ活性量とルシフェリン−ルシフェラーゼ発光反応による発光強度との関係を表す検量線を作成した。
【００３８】
トリプシンは、トリプシン活性が３４８１８  ＢＡＥＥ  Ｕ／ｍＬである市販の精製酵素（Lot. SLBR6334V、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製）を、トリプシン原液２８７μＬに注射用水７１３μＬを入れてよく撹拌した。これを注射用水で１０倍希釈して得られた１００００  ＢＡＥＥ  Ｕ／ｍＬの溶液を、プロテアーゼ標準溶液として使用した。検量線作成のために、このプロテアーゼ標準溶液を、注射用水で０．０５、０．１、０．３、又は０．５  ＢＡＥＥ  Ｕ／ｍＬの活性強度に段階希釈した。
【００３９】
プロテアーゼ活性測定用試薬としては、ＢＬ（生物発光）試薬（Lot. 2018.06.19、東亜ディーケーケー社製）を用いた。当該ＢＬ試薬は、トリプシンによる認識部位を含むオリゴペプチドがルシフェリンのカルボキシル基に導入されたルシフェリン誘導体（BZ-Leu-Gly-Arg-Luciferin：BZはベンゾイル基を表す。）と、ＡＴＰと、変異型甲虫ルシフェラーゼ（配列番号５）を含む。当該変異型甲虫ルシフェラーゼは、野生型北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列における２８８位のバリンに相当するアミノ酸がイソロイシンである変異（前記変異（ａ））と、野生型北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列における４８８位のグルタミン酸に相当するアミノ酸がバリンである変異（前記変異（ｄ））を有する。
【００４０】
乾熱滅菌した１．５ｍＬ容ガラス試験管に、トリプシン希釈系列をそれぞれ２００μＬ入れ、ＢＬ試薬を試験管に投入し、３７℃で６分間インキュベートした後、生物化学発光測定装置（装置名：ルミニッツ、東亜ディーケーケー社製）でプロテアーゼ活性を測定した（高圧電源Ｈｉ：６５９．７Ｖ、高圧電源Ｌｏｗ：３９１．４Ｖ、撹拌回数：５回、データ取得間隔：０．１秒）。当該装置では、測定試料の発光量を測定している。発光量とプロテアーゼ活性（ＢＡＥＥ  Ｕ／ｍＬ）の関係を示す検量線は、当該装置に搭載されているソフトウェアによって計算された（高電圧一次式：０８２２−Ｐｒｏｔｅａｓｅ−ｓｉｎｇｌｅ−Ｈｉｇｈ）。
【００４１】
得られた検量線を図１に示す。図１において、０ ＢＡＥＥ Ｕ/ｍＬにおける発光強度値が０ではなかったのは、ＢＬ試薬中にもともと入っていた遊離ルシフェリンが原因と推察される。プロテアーゼ活性と発光強度値は、高い相関を示した。
【００４２】
［実施例１］
参考例１で用いたＢＬ試薬を用いて、唾液中のプロテアーゼ活性を測定した。
２名の被験者（被験者Ａ及びＢ）から、昼食後に歯磨きをし、その３０分ほど経過した後に、安静時唾液を１ｍＬ程度採取した。採取された唾液は、注射用水で１０倍又は１００倍希釈した。
【００４３】
調製された希釈した唾液を、参考例１と同様にして、１．５ｍＬ容ガラス試験管に、それぞれ２００μＬ入れ、ＢＬ試薬を試験管に投入し、３７℃で６分間インキュベートした後、生物化学発光測定装置を用いて測定した。測定された発光強度値から参考例１で作製した検量線に基づいて、唾液のプロテアーゼ活性を調べた。被験者Ｂから採取された唾液は、１０倍希釈液では発光量が振り切れてしまっていたため、希釈率を１００倍にまで上げて再度測定した。結果を表１に示す。
【００４４】
【表１】
2020150830.tif 000002
【００４５】
図１の検量線から求めたプロテアーゼ活性を希釈率で除し、各被験者の唾液中のプロテアーゼ活性を求めた。この結果、各被験者の唾液中のプロテアーゼ活性は、被験者Ａが８．７４  ＢＡＥＥ  Ｕ／ｍＬ、被験者Ｂが１５１．３４  ＢＡＥＥ  Ｕ／ｍＬとなった。これらの結果から、ＢＬ試薬を用い、トリプシンを標準物質とした検量線を作成することによって、唾液中プロテアーゼの活性強度を定量的に測定できることが確認された。
【００４６】
［参考例２］
参考例１で使用したＢＬ試薬と、市販のプロテアーゼ活性測定用試薬（製品名：Ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ−Ｇｌｏ（登録商標）  Ａｓｓａｙｓ、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）（以下、「Ｐｒｏｍｅｇａ試薬」ということがある。）をそれぞれ用いて同じ条件で唾液中のプロテアーゼ活性を測定し、比較した。Ｐｒｏｍｅｇａ試薬は、ルシフェリン誘導体とＡＴＰと変異型甲虫ルシフェラーゼとを含み、ルシフェリン−ルシフェラーゼ発光反応のための試薬である。
【００４７】
参考例１で調製したプロテアーゼ標準溶液を、注射用水で０．１又は０．５  ＢＡＥＥ  Ｕ／ｍＬの活性強度に段階希釈した。
【００４８】
調製されたトリプシン希釈系列を、参考例１と同様にして、１．５ｍＬ容ガラス試験管に、それぞれ２００μＬ入れ、ＢＬ試薬を試験管に投入し、３７℃で６分間インキュベートした後、生物化学発光測定装置（装置名：４本試験機、東亜ディーケーケー社製）を用いて測定した。
【００４９】
一方で、乾熱滅菌した１．５ｍＬ容ガラス試験管に、トリプシン希釈系列をそれぞれ１００μＬ入れ、Ｐｒｏｍｅｇａ試薬１００μＬを試験管に投入し、ボルテックスミキサーで軽く撹拌して直ちに生物化学発光測定装置にセットしてプロテアーゼ活性測定を開始した（測定温度：３７℃、データ取得間隔：１秒）。
【００５０】
各反応溶液の発光量の経時的変化を図２に示す。図中、「ＢＬ（０．１）」、「ＢＬ（０．５）」は、参考例１で用いたＢＬ試薬と、それぞれ０．１又は０．５ＢＡＥＥ  Ｕ／ｍＬとのトリプシンを含む反応溶液の結果であり、「Ｐｒｏｍｅｇａ（０．１）」、「ＢＬ（０．５）」は、Ｐｒｏｍｅｇａ試薬と、それぞれ０．１又は０．５ＢＡＥＥ  Ｕ／ｍＬとのトリプシンを含む反応溶液の結果である。
【００５１】
図２に示すように、０．５ＢＡＥＥ  Ｕ／ｍＬとのトリプシンを含む反応溶液の場合、Ｐｒｏｍｅｇａ試薬を用いた場合、ピーク出現時間が約９分であり、ピーク時発光量が１，１８０であるのに対して、ＢＬ試薬を用いた場合、ピーク出現時間が約３分であり、ピーク時発光量が１０，７１８であった。このように、発光量は、ＢＬ試薬を用いた場合の方が大きく、両試薬のピークトップ時の発光量の大きさは、およそ９倍の差があることがわかった。両試薬はルシフェリン−ルシフェラーゼ発光反応のための試薬であるが、使用している変異型甲虫ルシフェラーゼが異なる。ＢＬ試薬で使用されている変異型甲虫ルシフェラーゼは、Ｐｒｏｍｅｇａ試薬で使用されている変異型甲虫ルシフェラーゼよりも、反応時間が短く、発光のピークが早く出現するため、測定時間が短く済む。また、発光量の絶対値が大きいため、検出感度が高いという利点がある。また、ＢＬ試薬はシリンジ封入凍結乾燥体が個包装アルミパックされた状態で市販されているため、試薬の使用期限が１１ヵ月と長く、個包装アルミパックから取り出すだけですぐに使用可能であるという利点もあった。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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