(57)【要約】【課題】本発明は、簡便に高品質な受精卵の精製が出来る方法および該方法に使用するためのカラムを提供することを目的とする。【解決手段】媒精液を密度勾配液の液柱に添加する工程、および液柱を静置することで受精卵を分離する工程を含む、受精卵の精製方法によって達成される。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
媒精液を密度勾配液の液柱に添加する工程、および液柱を静置することで受精卵を分離する工程を含む、受精卵の精製方法。
【請求項２】
受精卵を分離する工程が、受精卵を密度勾配液の液柱で沈降させて周辺組織から分離する工程を含む、請求項１に記載の精製方法。
【請求項３】
変質が起こる前に受精卵を液柱から排出する工程をさらに含む、請求項１または２に記載の精製方法。
【請求項４】
液柱が、少なくとも周辺組織の沈降速度を遅延させる濃度の密度勾配液を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
液柱が、変質が起こる前に受精卵が液柱下部まで沈降し得る１または複数の濃度の密度勾配液を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
液柱が、変質が起こる前に周辺組織が液柱下部まで沈降しない１または複数の濃度の密度勾配液を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
密度勾配液の少なくとも液柱下部の濃度が、受精卵だけを通過または保持できる濃度である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
液柱の上端が、さらに油性液層を有し、添加が油性液層に対して行われる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法に使用するためのカラムであって、媒精液を投入する投入口おび分離された受精卵を排出する排出口を備えた、前記カラム
【請求項１０】
請求項９に記載のカラムの製造方法であって、密度勾配液をカラムへ充填する工程を含む、前記製造方法。
【請求項１１】
充填する工程が、カラムの排出口から密度勾配液を充填する工程である、請求項１０に記載のカラムの製造方法。
【請求項１２】
充填した密度勾配液を凍結する工程をさらに含む、請求項１０に記載のカラムの製造方法。
【請求項１３】
請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の製造方法によって製造されたカラム。
【請求項１４】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法により精製された受精卵。
【請求項１５】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法により精製された受精卵に遺伝子を導入する工程を含む、遺伝子改変生物の作成方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、受精卵の精製方法および当該方法を用いた受精卵精製装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から畜産分野では、優良な形質を持った家畜を安定的に生産するために人工受精、体外受精、初期胚の凍結保存および胚移植等の生殖工学の基盤技術の開発が進められてきた。また、これらの基盤技術を遺伝子工学と組み合わせ、動物個体の遺伝子操作を可能とする発生工学が発展し、これによりヒトや動物の発生や分化に伴う諸現象が解明されてきた。
【０００３】
近年、これらの分野で培われた知識や技術を生殖医療分野に応用した生殖補助技術が、ヒト不妊治療において重要な役割を担っている。またＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術やＣｐｆ１技術など正確かつ容易に遺伝子を編集できるゲノム編集技術が開発され、かかる技術が医学研究や動植物育種の分野に利用されはじめている。さらにヒト臓器を動物体内で作成するための研究に使用する目的で動物性集合胚を作成することが日本政府に容認され、このように広範な分野において様々な動物種に由来する受精卵を利用する機会が増加している（非特許文献１〜４）。
【０００４】
しかしながら、種によっては、排卵の頻度が低く、排卵数が少なく、また受精率が低いものも存在することや、また新たな品種を作成する場合、導入した遺伝的形質にのみに着目する観点から受精卵間の品質を同一にする必要があり、これらのことから従来よりも高い水準で高品質の受精卵を安定して得ることが求められている。
【０００５】
一般的に、卵胞から採取した卵母細胞（卵子）は、透明体および１０００個以上の卵丘細胞に囲まれた卵丘細胞−卵母細胞複合体（ＣＯＣ）を形成しており、卵丘細胞の周りにはヒアルロン酸を主成分とするマトリクスが存在する。媒精により卵子の透明体に精子が到達すると、精子の頭部から各種プロテアーゼが放出され、これによりＣＯＣが崩壊する。したがって、受精後の媒精液には、受精卵とともに多数の卵丘細胞や粘度の高いマトリクスなどの周辺組織が含まれることになる（非特許文献５）。
【０００６】
このような受精後の媒精液から、周辺組織を除き、受精卵のみを分離するために、これまで媒精液中に存在する受精卵を目視にて判別し、口からの吸引力を使ったマウスピペットを利用して受精卵を吸引採取した後洗浄して精製する方法や、媒精液を遠心分離に複数回供し、周辺組織を除去して受精卵を精製する方法が開発されてきた（非特許文献６）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】假屋、西日本畜産学会報， 2005, 48:5-9,
【非特許文献２】Sato et al,. Biol Direct. 2016 Mar 31;11(1)
【非特許文献３】Hashimoto et al,. Sci Rep. 2015; 5: １１３１５
【非特許文献４】特定胚の取扱いに関する指針の改正について，文部科学省研究振興局ライフサイエンス課  生命倫理・安全対策室，平成３１年３月１日
【０００８】
【非特許文献５】蛋白質  酵素  核酸， 2005, Vol50, No.11:1405-1411
【非特許文献６】熊本大学，マウス生殖工学マニュアル，体外受精，２０１６年３月１６日更新
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、粘度の高い周辺組織を含む媒精液から受精卵を判別し、マウスピペットにより首尾よく吸引採取し、洗浄するには熟練した手技が必要である。また、遠心分離を利用した精製方法では複数回、緩衝液等を添加し、上清等の除去等を繰り返す必要がある。このような操作は、煩雑であり、また時間も要するため、簡便に受精卵を採取する方法が望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究するなかで、従来の受精卵の精製方法は、その過程で吸引や加圧操作を要するところ、実は、かかる操作によって受精卵が損傷し、これによって生残率や発生率などの受精卵の品質が低下することを見出した。そのため、このようにして得られた受精卵は、損傷の程度も異なっており、かかる受精卵から発生した個体の形質が、遺伝的形質に起因するものか、受精卵の分離操作に起因するものか不明であり、このような精製技術では広範な分野に適用し得る高品質な受精卵を安定して得られないとの知見を得た。吸引や加圧操作せずに、簡便に高品質な受精卵を精製するための研究を進めるなかで、本発明者は、媒性液の中で受精卵が著しく大きな粒径と密度を持つことを見出し、媒精液を密度勾配液の液柱に静置して沈降させると、媒精液から受精卵だけが分離されることを見出し、さらに研究を続け、本発明を完成させるに至った。
【００１１】
すなわち、本発明に下記に掲げるものに関する：
＜１＞  媒精液を密度勾配液の液柱に添加する工程、および液柱を静置することで受精卵を分離する工程を含む、受精卵の精製方法。
＜２＞  受精卵を分離する工程が、受精卵を密度勾配液の液柱で沈降させて周辺組織から分離する工程を含む、＜１＞に記載の精製方法。
＜３＞  変質が起こる前に受精卵を液柱からさらに排出する工程を含む、＜１＞または＜２＞に記載の精製方法。
＜４＞  液柱が、少なくとも周辺組織の沈降速度を遅延させる濃度の密度勾配液を含む、＜１＞〜＜３＞のいずれか一項に記載の方法。
＜５＞  液柱が、変質が起こる前に受精卵が液柱下部まで沈降し得る１または複数の濃度の密度勾配液からなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
＜６＞  液柱が、変質が起こる前に周辺組織が液柱下部まで沈降しない（１または複数の）濃度の密度勾配液からなる、＜１＞〜＜５＞のいずれか一項に記載の方法。
＜７＞  密度勾配液の少なくとも液柱下部の濃度が、受精卵だけを通過または保持できる濃度である、＜１＞〜＜６＞のいずれか一項に記載の方法。
＜８＞  液柱の上端が、さらに油性液層を有し、添加が油性液層に対して行われる、＜１＞〜＜７＞のいずれか一項に記載の方法。
＜９＞  ＜１＞〜＜８＞のいずれか一項に記載の方法に使用するためのカラムであって、媒精液を投入する投入口おび分離された受精卵を排出する排出口を備えた、前記カラム
＜１０＞  ＜９＞に記載のカラムの製造方法であって、密度勾配液をカラムへ充填する工程を含む、前記製造方法。
＜１１＞  充填する工程が、カラムの排出口から密度勾配液を充填する工程である、＜１０＞に記載のカラムの製造方法。
＜１２＞  充填した密度勾配液を凍結する工程をさらに含む、＜１０＞に記載のカラムの製造方法。
＜１３＞  ＜１０＞〜＜１２＞のいずれか一項に記載の製造方法によって製造されたカラム。
＜１４＞  ＜１＞〜＜８＞のいずれか一項に記載の方法により精製された受精卵。
＜１５＞    ＜１＞〜＜８＞のいずれか一項に記載の方法により精製された受精卵に遺伝子を導入する工程を含む、遺伝子改変生物の作成方法。
【００１２】
［１］  受精後の媒精液を密度勾配液に添加し、静置する工程を含む、受精卵の分離方法。
［２］  遠心分離する工程を含まない、請求項１に記載の方法。
［３］  さらに媒精液の結合を緩くする工程を含む、［１］または［２］に記載の方法。
［４］  密度勾配液が、分離に供する媒精液中の受精卵の密度よりも低い密度であって、周辺組織よりも高い密度部分を有する、［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［５］  密度勾配液が、パーコール液またはマンニトール液である、［１］〜［４］のいずれかに記載の方法。
［６］  受精卵が、動物由来の受精卵である、［１］〜［５］のいずれか一項に記載の方法。
［７］  動物が、哺乳動物である、［６］に記載の方法。
［８］  哺乳動物が、ヒト、サル、ラット、モルモット、イヌ、ネコ、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシおよびウマからなる群から選択される、［７］に記載の方法。
［９］  静置する工程が、１０〜６０分である、［１］〜［８］のいずれかに記載の方法。
［１０］  ［１］〜［９］に記載の方法により分離された受精卵。
［１１］  ［１］〜［９］に記載の方法により分離された受精卵に遺伝子を導入する工程を含む、遺伝子改変生物の作成方法。
［１２］  遺伝子の導入が、エレクトロポーレーション、ウイルスベクター、マイクロインジェクション、パーティクルガンおよびリポフェクションからなる群から選択される［１１］に記載の方法。
［１３］  密度勾配液を充填し受精卵の分離用カラムであって、
受精後の媒精液を投入する投入口および
分離した受精卵を排出する排出口を備える、前記カラム。
［１４］  排出口側の密度勾配液が、分離に供する媒精液中の受精卵の密度と同等または低い密度であって、周辺組織よりも高い密度部分を有する、［１３］に記載のカラム。
［１５］  密度勾配液がパーコールまたはマンニトールである、［１３］または［１４］に記載のカラム。
［１６］  ［１４］〜［１５］に記載のカラムを備える、受精卵分離／精製装置または遺伝子導入装置。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、熟練した手技や煩雑な操作を要さずに簡便に受精卵を精製することが出来る。さらに本発明の精製方法は、短時間で、その操作の過程で吸引や加圧も要することがないため受精卵に損傷を与えない。したがって、受精卵の生残率、発生率が高く、これまでにない高い品質の受精卵を提供することができる。さらに、本発明によれば、このような高い品質の受精卵を精製する際に特別な技術を要さず、作業者によって品質が変動することがないため、品質が安定した受精卵を提供することができる。そのうえ、大量の受精卵を一度に精製することが可能である。したがって、高品質の受精卵を大量に安定して提供することができる。また、特殊な装置を要さずに受精卵の分離が出来るため、医療や畜産の現場を含む広範な研究、産業分野で低コストかつ高品質な受精卵を安定して提供することが出来る。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、上端に油性液層を持つ密度勾配の液柱へ媒精液を添加する態様を示す模式図である。
【図２】図２は、液柱を静置することで受精卵を分離する工程を説明する模式図である。
【図３】図３は、実施例１において受精卵の精製に使用したカラムの模式図である。
【図４】図４は、媒精液と実施例１で精製した受精卵を示す。
【図５】図５は、実施例７（１）〜（４）で作製したカラムと各カラムで精製した際の結果を示す模式図である。図の（１）〜（４）は実施例７における番号と対応している。
【図６】図６は、実施例７（５）において、凍結して積層したパーコール液充填カラムの製造過程を示す。充填したパーコール液を凍結し、凍結されたパーコール層に異なる濃度のパーコールをさらに充填し、再度凍結した。これを繰り返してパーコール層を積層した。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明を詳細に説明する。
本明細書において別様に定義されない限り、本明細書で用いる全ての技術用語および科学用語は、当業者が通常理解しているものと同じ意味を有する。本明細書中で参照する全ての特許、出願および他の出版物や情報は、その全体を参照により本明細書に援用する。また本明細書において参照された出版物と本明細書の記載に矛盾が生じた場合は、本明細書の記載が優先されるものとする。
【００１６】
本発明は、媒精液を密度勾配液の液柱に添加する工程、および静置して分離する工程を含む受精卵の精製方法に関する。本発明者は、媒精液を密度勾配液に添加して密度勾配液の液柱に静置すると、液柱で受精卵、卵丘細胞、精子およびマトリクスなどを含む媒精液から、受精卵を簡便かつ容易に分離できることを見出した。
【００１７】
本発明において「媒精」とは、卵子が存在する媒質中に精子を添加することであり、「媒精液」とは、媒精によって生じた受精卵を含む液体を指す。媒精液は、受精卵ならびに卵丘細胞、精子およびマトリクスなどの周辺組織を含む。媒精液は、媒精によって直接生じた媒精液の他、受精卵と周辺組織の少なくとも一部が含まれた液体であれば限定されずに、媒精液を培地や緩衝液で希釈した液体や、媒精液または液体を振盪、攪拌、超音波、タンパク質分解酵素処理など任意の処理を加えた液体も含まれる。
【００１８】
本発明の「沈降」とは、静置状態の液体中で受精卵、周辺組織などの粒子が自由落下することを指す。「液体中で粒子が自由落下する」とは、粒子の自重だけで沈降することであり、典型的には液体下方からの吸引や、遠心分離による強制的な沈降は含まれない。
【００１９】
本発明において「受精卵」とは、限定されず、受精卵、初期発生胚（例えば２細胞期胚から胚盤胞期などの胚）を含む。本明細書において「周辺組織」とは、媒精液に含まれる受精卵以外の粒子であり、典型的には、卵丘細胞、精子およびマトリクスなどを含む。
【００２０】
本発明に用いられる受精卵は、媒精後に受精卵を分離する必要があれば、特に限定されるものではないが、例えば、哺乳類、両生類、爬虫類、鳥類、魚類などの受精卵であってよい。分離操作により品質が劣化しやすい観点から、哺乳類の受精卵が好ましい。哺乳類は、特に限定されずに、例えば、ヒトの他、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウサギ等の家畜類、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、サル等の実験動物類、ネコやイヌ等のペット類、野生動物等を含む。マウスピペットや遠心分離操作等の吸引操作または圧力によって生残率または発生率の低下の影響を受け易い観点から、実験動物類の受精卵が好ましく、マウスまたはラットが特に好ましい。
【００２１】
本発明で用いられる「密度勾配液」は、細胞分離の技術分野において、密度勾配を形成するために用いる媒体（本明細書において単に、「媒体」とも言う）を含有する液体であり、典型的には、細胞分離用の密度勾配用媒体を含有する液体である。このような密度勾配液としては、限定されずに、パーコール含有液（ＰｅｒｃｏｌｌまたはＰｅｒｃｏｌｌ  ＰＬＵＳ）などの修飾コロイドシリカ含有液、マンニトール含有液、スクロース含有液またはフィコール（登録商標Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅなど）含有液などのショ糖含有液、 Ｉｏｄｉｘａｎｏｌ（商標ＯｐｔｉＰｒｅｐ）含有液、Ｎｙｃｏｄｅｎｚ（登録商標）含有液または塩化セシウム含有液などが挙げられる。受精卵への安全性の観点から、パーコール含有液、マンニトール含有液、スクロース含有液またはフィコール含有液などのショ糖含有液が好ましく、受精卵精製後の密度勾配液を容易に洗浄できる観点からパーコール含有液が特に好ましい。
【００２２】
本発明に用いられる「密度勾配液の液柱」とは、このような密度勾配液を有する液柱である。本発明の「密度勾配液の液柱」の密度勾配液は、必ずしも勾配を有している必要はなく、単一の媒体濃度（本明細書において単に「濃度」とも言う）を持つ密度勾配液であってもよいし、異なる濃度の密度勾配液が重層された、すなわち異なる密度を有する密度勾配液であってもよい。異なる密度を持つ密度勾配液は、最も密度が低い密度勾配液が、密度勾配液の上端に存在し、最も密度が高い密度勾配液が、密度勾配液の下端に存在することになる。異なる濃度を持つ密度勾配液の勾配は、連続密度勾配でも不連続密度勾配（本明細書において不連続密度勾の各層を「不連続層」とも言う）であってもよい。受精卵の洗浄度を高める観点から、不連続層が好ましい。密度勾配液の作成方法は、細胞分離の技術分野の定法を利用することができる。
【００２３】
本発明の「密度勾配液の液柱」は、上端に密度勾配液以外の液体層を有していてよい。このような液体としては、受精卵の品質に悪影響をもたらさなければ限定されずに、緩衝液、培養液、等張液など任意の水性液であってよい。密度勾配液は、水性液と比較して、密度が高いことから、密度勾配液が液柱の下端側に存在し、水性液が液柱の上端側に存在することとなる。このような水性液が、密度勾配液の液柱の上端に存在することで、液柱に添加された媒精液は、水性液中で希釈され、および／または拡散し、これによって密度勾配液への沈降に先立って、媒精液中の受精卵と周辺組織との間の結合を緩くすることができる。そのため密度勾配液に受精卵が沈降する際に周辺組織がより分離されやすくなる。したがって、本発明の密度勾配液の液柱は、上端側に水性液を有することが好ましい。
することができる。
【００２４】
本明細書では、水性液を０％の密度勾配液、例えば、０％パーコール濃度のパーコール液とも言う。水性液と密度勾配液（例えばパーコール濃度５％の密度勾配液）からなる密度勾配液の液柱を２層の密度勾配液とも表現し、例えば０％および５％のパーコール濃度の不連続層からなるパーコール液とも言う。また当該液柱の５％のパーコール濃度の層を密度勾配液層と言うこともある。
【００２５】
密度勾配液以外の液体層として、水性液の上端側に、または水性液の代りに、油性液層を有していてもよい。このような油性液層が存在することで、密度勾配液の液柱に媒精液を添加する際に生じる密度勾配液の液柱の層構造の攪乱を防ぐことができる。したがって、本発明の密度勾配液の液柱は、水性溶液層のさらに上端側に油性液層を持つことが好ましい。油性液としては、水溶性液体よりも密度が低く、受精卵の品質に悪影響をもたらさなければ限定されずに、水性液体よりも密度が低いミネラルオイル、オリーブオイルなどが挙げられる。
【００２６】
本発明の「媒精液を密度勾配液の液柱に添加する工程」は、媒精液をピペットなどを使用して、密度勾配液の液柱に添加する工程である。添加する工程は、液柱の密度勾配液の層構造を攪乱しないように添加することが好ましい。このような添加方法としては、液柱へ縦方向の攪乱が生じない添加方法であれば限定されずに、例えば、密度勾配液の液柱が充填されたカラムの内面や、液柱に挿入されたガラス棒を添わせて添加したり、密度勾配液の液柱の上端の油性液層中に媒精液を添加する方法などが挙げられる。カラムの投入口の内面に沿わせる方法としては、下端がカラムの投入口に連結された漏斗を使用することができる。
【００２７】
密度勾配液の液柱が、上端に油性液層を持つ態様における媒精液の添加を図１に説明する。図１は、上端に油性液層を持つ密度勾配液の液柱が、カラム１に充填されており、ピペットを投入口２から油性液層の中へ挿入し、油性液層中に媒精液を添加している。油性液層中に添加された媒精液は、油性液層中を沈降して、油性液層の下端で、密度勾配層へ衝撃を与えることなく、密度勾配液に拡散する。このように油性液層に媒精液を添加することで、本発明で使用する密度勾配液の液柱（例えば０％、１％および５％からなるパーコール濃度の不連続層を持つ液柱）が、通常の遠心分離で使用する不連続層と比較して液柱を構成する密度勾配液層の密度差が著しく小さくても、媒精液の添加時の層構造の攪乱を防ぎ、安定した層構造を維持できる。このような油性液層への媒精液の添加は、油性液層中に媒精液を添加する以外に、油性液に挿入されたガラス棒を添わせて添加したり、下端がカラムの投入口に連結された漏斗を使用することができる。本態様において、ガラス棒や漏斗は表面に油膜を有していることが好ましい。
【００２８】
一態様において、本発明は、さらに媒精液中の受精卵と周辺組織の結合を低下させる工程を含んでよい。本発明の方法は、媒精液を密度勾配液の液柱に添加し、液柱を静置することで受精卵を分離する工程を含むところ、添加前に媒精液中の受精卵と周辺組織の結合を低下させることで、沈降時に受精卵と周辺組織が分離されやすくなるため分離能や分離速度が向上する。媒精液の結合を低下させる方法は、受精卵の品質に影響を与えないものであれば限定されず、適切な培地または緩衝液の添加、振盪、超音波、タンパク質分解酵素処理またはこれらの組み合わせにより、動物種に応じて当業者は任意に選択することができる。緩衝液の添加または短時間の振盪が、受精卵の品質を損なわずに、受精卵と周辺組織の結合を低下できることから好ましい。このような緩衝液は、これに限定されるものではないが、０．３％ＢＳＡ含有緩衝液が好ましい。振盪の場合、これに限定されるものではないが、チューブに入れた媒精液をボルテックスで０．１〜０．３秒振盪することが好ましい。
【００２９】
本発明は、媒精液が添加された密度勾配液の液柱を静置することで受精卵を分離する工程を含む。密度勾配液の液柱を静置することで分離する工程は、密度勾配液の液柱中で受精卵と周辺組織を沈降させ、それによって受精卵を周辺組織から分離する工程である。したがって、一態様において、本発明は受精卵を密度勾配液の液柱で沈降させて周辺組織から分離する工程である。
【００３０】
本発明において、受精卵を密度勾配液の液柱で沈降させて周辺組織から分離する工程は、密度勾配液の液柱における受精卵と周辺組織の沈降速度の差を利用することができる。
密度勾配液の液柱で沈降させると、周辺組織と比較して受精卵のほうが速く沈降するため、受精卵が液柱下部に分離されることとなる。液柱の下部において受精卵が沈降した後、周辺組織の沈降前に液柱下部から受精卵を排出すれば、洗浄度の高い受精卵を得ることが出来る。本明細書において、「液柱の下部」とは、液柱の下端側１／２、１／３、１／４、１／５、１／６、１／７、１／８または１／１０の範囲であってよい。
【００３１】
本発明は、変質が起こる前に受精卵を液柱からさらに排出する工程を含んでよい。当該工程は、受精卵を密度勾配液の液柱に沈降させて、周辺組織から分離する工程によって、先に沈降した受精卵の変質が起こる前に液柱から排出する工程である。排出する工程は、受精卵を液柱下端から沈降させて排出してもよいし、液柱下部の密度勾配液を排出し、その中に含まれる受精卵を回収してもよい。受精卵は、ピペット等による吸引や遠心分離などの僅かな接触や圧力でも発生率が低下するところ、本発明は、媒精液の添加以降、分離する工程および排出する工程で、受精卵を吸引する工程を含まないか、または、遠心分離する工程を実質的に含まない。
【００３２】
「遠心分離する工程を実質的に含まない」とは、遠心分離する工程を全く含まないか、または受精卵の品質に影響を与えない程度の遠心分離する工程を含む工程である。受精卵の品質に影響を与えない程度の遠心分離とは、例えば×２０ｇ以下、×１０ｇ以下または×５ｇ以下であってよい。好ましくは遠心分離する工程を全く含まない。このため、本発明の精製方法は、従来のピペット等による吸引や遠心分離など用いる方法と比較して、高い生残率を有する。
「変質」とは、発生率または生残率の低下など受精卵の品質が悪化することを言う。「変質が起こる前」の受精卵は、２ｃｅｌｌ発生率として、６０％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上であってよく、Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ発生率として、６０％以上、４５％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上の受精卵である。「変質が起こる」時間としては、密度勾配液の液柱へ媒精液を添加してから例えば１５分、３０分、４０分、５０分、６０分、７０分、８０分又は９０分であってよく、添加から３０分経経過前に排出することが好ましく、２０分経過前が好ましい。変質が起こる前に、分離された受精卵を、液柱下部から排出することによって、発生率または生残率を維持し、洗浄度が高い受精卵を回収することができる。
【００３３】
本発明の一態様において、密度勾配液の液柱は、少なくとも周辺組織の沈降速度を遅延させる濃度の密度勾配液を含んでいればよい。このような濃度としては、受精卵の沈降速度を遅延させる濃度であることが好ましい。様々な動物種において、周辺組織に含まれる卵丘細胞の直径は、受精卵の直径に比べて約１／８〜１／１０のサイズであり、周辺組織に含まれるマトリクスは受精卵に比べて極めて密度が低い。このような粒径が小さいか、または密度が低い周辺組織は、受精卵の沈降よりもさらに遅延して沈降するから、受精卵の沈降速度を遅延させる濃度にすることで受精卵と周辺組織の沈降速度差を大きくすることができる。受精卵と周辺組織の沈降速度差が大きくなることで、液柱下部において受精卵が沈降した後、周辺組織の沈降前に液柱下部からの受精卵の排出が容易にでき、洗浄度の高い受精卵を得ることが出来る。
【００３４】
一態様において、受精卵の沈降を遅延させる濃度とは、例えば、媒体を含まない緩衝液と比較して、液柱の密度勾配液へ受精卵を添加してから、液柱の下端まで沈降する時間が２倍以上、４倍以上、６倍以上、８倍以上、１０倍以上、１４倍以上、２０倍以上、３０倍以上、５０倍以上、１００倍以上遅延する濃度あってよい。このように受精卵の沈降が遅延する濃度にすることで、受精卵の沈降速度と比較して、周辺組織の沈降速度を、５倍以上、１０倍以上、２０倍以上、３０倍以上、５０倍以上、１００倍以上、２００倍以上、３００倍以上、５００倍以上、１０００倍以上遅延させることができる。
【００３５】
一態様において、本発明の密度勾配液の液柱は、変質が起こる前に受精卵が液柱下部まで沈降し得る１または複数の濃度の密度勾配液からなってよい。品質が高い受精卵が得られる観点から、好ましくは、液柱下端まで沈降し得る１または複数の濃度の密度勾配液からなっている。このような液柱にすることで生残率、発生率の高い受精卵の分離が可能になる。液柱は、好ましくは、変質が起こる前に周辺組織が液柱下部まで沈降しない１または複数の濃度の密度勾配液からなる。別の表現としては、液柱が、変質が起こる前に、受精卵だけが液柱下部に沈降し得る１または複数の濃度の密度勾配液からなってよい。受精卵の洗浄度が高くなる観点から、好ましくは、変質が起こる前に受精卵だけが液柱下端まで沈降し得るまたは１または複数の濃度の密度勾配液からなる。このような濃度にすることで、周辺組織が混入せずに生残率、発生率の高い受精卵の分離が可能になる。      
【００３６】
このような密度勾配液の濃度を決定する方法としては、限定されずに、異なる濃度の密度勾配液で作製した複数の液柱（例えば１％、３％、５％、７％、１０％の単一濃度からなる５本のパーコール液）に、それぞれ同量の媒精液を添加し、予め定めた変質が起こる前の時間、例えば１５分沈降させた後、液柱の下部から密度勾配液を排出し、当該排出した液のなかに含まれる受精卵数および受精卵の洗浄度を測定することにより、受精卵数および洗浄度が最も高かかったもの選択すればよい。かかる密度勾配液の濃度が、受精卵の変質が起こる前に受精卵だけが液柱下部に沈降し得る濃度である。さらに洗浄度を高めるためには、選択した濃度よりも薄い濃度の任意の数の密度勾配層を液柱に設け、受精卵の変質が起こる前に受精卵だけが液柱下部まで沈降するように設計すればよい。
「受精卵だけ」とは、液柱下部または下端を通じてか回収された受精卵の洗浄度が６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％、９５％以上、９７％以上であることを指す。
【００３７】
動物種にかかわらず、受精卵の粒径と密度は周辺組織の受精卵の粒径と比較して、著しく大きいため特定の動物種で設定した密度勾配液の濃度を、他の動物種でも使用できる。他の動物種の受精卵が、特定の動物種の受精卵よりも粒径または密度が大きければ、受精卵を排出するタイミングを早くすればよいし、他の動物種の受精卵が特定の動物種の受精卵よりも粒径または密度が小さければ、受精卵を排出するタイミングを遅くすればよい。排出するタイミングを変えずに他の動物種の受精卵を分離する場合、上述した、受精卵の変質が起こる前に受精卵だけが液柱下部に沈降し得る濃度の決定方法を使用して、動物種に応じて密度勾配液の濃度を変えてもよい。
【００３８】
本発明に用いられる液柱は、これに限定されるものではないが、例えばパーコール含有液としては、０％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％の濃度から選択される１または２以上の濃度を使用した１層または２以上の層からなる密度勾配液、または、上記の濃度範囲の連続勾配液からなる密度勾配液であってよい。一態様において本発明の方法は、パーコール液の濃度としては、層の数に関係なく液柱の下部が３％〜９％、４〜７％、４．５〜６％、好ましくは５％の濃度であればよい。
【００３９】
一態様において本発明の液柱は、パーコールが０％および３〜８％、または、０．５〜２％と４〜６％の濃度である２層からなってよく、好ましくは１％と５％であってよい。液柱は、パーコールが０％、０．５〜３％、３〜８％の濃度である３層の濃度からなってよく、パーコールが０％、１％、５％の濃度からなることが好ましい。本発明には、このようなパーコールの密度勾配液が含まれる。
【００４０】
本発明に用いられる液柱は、これに限定されるものではないが、例えばマンニトール含有液として、０％〜５．０％、０．５％〜３．５％または１．５％〜３．０％の濃度から選択される１または２以上の濃度を使用して１層または２以上の層からなる密度勾配液、または、これらの濃度範囲の連続勾配液からなる密度勾配液であってよい。一態様において本発明の方法は、マンニトールとしては、層の数に関係なく液柱の下部が１％〜５％、１．５〜４％、１．８〜２．５％、好ましくは２％の濃度であればよい。当業者であれば含まれるマンニトールの所定の含有量を算出可能である。
【００４１】
高い洗浄度の受精卵を得る観点から、液柱は、マンニトールが、０％および１．５％〜４％の濃度である２層からなってよく、０％、０．５％〜１％および１．５％〜４％の濃度のである３層からなってよい。マンニトールが０％、０．５％および２％の濃度である３層からなることが好ましい。本発明の密度勾配液は、輸送または保存に好適に使用できる観点から凍結されていてもよい。当該密度勾配液は本発明の方法に好ましく用いられる。
【００４２】
液柱の長さは、これに限定されるものではないが１ｃｍ〜１００ｃｍ、２ｃｍ〜４０ｃｍ、３ｃｍ〜３０ｃｍでよく、受精卵の生残率または発生率を維持しえる程度の時間で静置分離させる観点から３ｃｍ〜２０ｃｍが好ましく、液柱を受精卵精製装置に組み込む観点から、３ｃｍ〜１５ｃｍが好ましい。
【００４３】
液柱を静置することで受精卵を分離する工程の温度は、特に限定されないが、媒精液中の受精卵が高品質を維持できれば、限定されずに、例えば、２５℃〜３９℃、３０℃〜３８℃、３２℃〜３７．５℃、または３３℃〜３７℃であってよく、好ましくは３７℃である。
液柱を静置することで受精卵を分離する工程の時間は、３分〜６０分程度、１０分〜６０分程度、５分〜５０分程度、７分〜４０分程度、１０〜３０分程度、１５分〜３０分程度であればよく、変質をより抑える観点から１０〜３０分程度が好ましい。
受精卵が沈降している間、適当な時間、例えば、５分毎に媒精液をタッピング等して混合してもよい。かかる工程は、インキュベーター内で行なってもよいし、温度条件や静置時間など設定可能な受精卵の精製装置などを使用してもよい。
【００４４】
本発明の別の態様において、少なくとも液柱下部の濃度が、受精卵だけを通過または保持できる濃度にすることができる。かかる密度勾配液の濃度（密度）は、周辺組織よりも高い密度であり、受精卵の密度よりも低いまたは同等の密度であればよい。このような密度にすることで、周辺組織が液柱下部に沈降することがなく、受精卵のみが液柱下部まで沈降可能となる。液柱下部における密度勾配液の濃度が、受精卵の密度よりも低ければ、受精卵のみが液柱下端から排出され、液柱下部における密度勾配液の濃度が、受精卵の密度と同等であれば、受精卵のみが保持された下部層ごと排出することで、受精卵を回収できる。
【００４５】
以下に、本発明の受精卵を分離する工程を図２の模式図を使用して説明するが、本発明はこれに限定して解釈されない。
【００４６】
図２（Ａ）は、密度勾配液を含まない緩衝液Ｗがカラム１に充填されている。カラム１の投入口２から媒精液を添加すると、密度と粒径の大きい受精卵Ｆが先に液柱下部Ｘに沈降するが、周辺組織Ｄに含まれるマトリクス（黒点で示す）や卵丘細胞（灰色の球で示す）もすぐに液柱下部Ｘまで沈降するため液柱下部Ｘから受精卵だけを分離することができない。
【００４７】
（Ｂ）は、単一濃度（単層）の密度勾配液（Ｉ）からなる液柱がカラム１に充填されている。密度勾配液（Ｉ）は、１％のパーコール濃度である。
【００４８】
一般的に液体中の粒子の沈降速度は、次の式で表される。
【数１】
2020150941.tif 000003
ｖｓ：沈降速度；［ｃｍ／ｓ］
Ｄｐ：粒子径；［ｃｍ］
ρｐ：粒子の密度；［ｇ／ｃｍ３］
ρｆ：流体の密度；［ｇ／ｃｍ３］
ｇ：重力加速度；［ｃｍ／ｓ２］
η：流体の粘度；［ｇ／（ｃｍ・ｓ）］
【００４９】
この式から分かるように、沈降速度は、液体と粒子の密度差と、粒子径の２乗に比例して増加する関係にある。ここで、（Ｂ）の密度勾配液（Ｉ）における周辺組織および受精卵の沈降状態を、（Ａ）の緩衝液Ｗにおける周辺組織および受精卵の沈降状態と比較すると、（Ｂ）の密度勾配液（Ｉ）は、緩衝液Ｗに比べて密度が高いため、受精卵および周辺組織の沈降速度が低下するが、その際に、受精卵と比較して粒子径と密度が小さい周辺組織のほうが、沈降速度の低下の影響をより強く受けることになる。したがって、緩衝液Ｗで沈降させた場合と比較して、受精卵および周辺組織の沈降速度が低下するだけでなく、受精卵と周辺組織の沈降速度の差が大きくなる。そのため、密度勾配液（Ｉ）で媒精液を沈降させると、液柱の下部Ｘに受精卵が沈降した時点では、周辺組織は、依然として下部Ｘの上方に存在する状態を作りだすことができる。
【００５０】
このように密度勾配液を利用して、受精卵が、排出口３を通じて液密に連結された回収部５まで沈降した後、周辺組織が排出口３へ沈降する前に開閉部４を閉口することで、回収部５に受精卵だけを排出して回収することができる。排出口３と回収部５が、液密に連結されていない場合は、下部Ｘに受精卵が沈降するまでは開閉部４の閉口状態を維持し、下部Ｘまで受精卵が沈降した後、周辺組織の沈降前に開閉部４を開口して、下部Ｘの密度勾配液ごと回収部５へ排出することで受精卵を回収することができる。
【００５１】
（Ｃ）は、（Ｉ）および（ＩＩ）の層を持つ密度勾配液の液柱がカラム１に充填されている。（Ｉ）および（ＩＩ）は、１％および５％パーコール濃度の密度勾配液の層である。カラム１の投入口２から媒精液を添加すると、（Ｉ）の層を沈降した周辺組織のうち、（ＩＩ）の層よりも密度が低い周辺組織Ｄの一部のマトリクスが、（Ｉ）の層に保持される。すなわち、（ＩＩ）の層がマトリクスのフィルターとして働いている。ここで、（Ｃ）の（ＩＩ）の層における周辺組織および受精卵の沈降状態を、（Ｂ）の（Ｉ）における周辺組織および受精卵の沈降状態と比較すると、（Ｃ）の（ＩＩ）の層は、（Ｂ）の（Ｉ）と比べて密度が高いため、やはり受精卵および周辺組織の沈降速度が低下するが、その際に、受精卵と比較して粒子径と密度が小さい周辺組織のほうが、沈降速度の低下の影響をより強く受けることになるから、（Ｃ）の（ＩＩ）の層は（Ｂ）の（Ｉ）と比べて受精卵と周辺組織の沈降速度の差をより大きく増幅することができる。
【００５２】
そのため、（ＩＩ）の層で媒精液を沈降させると、液柱の下部Ｘに受精卵が沈降した時点では、周辺組織Ｄは、（Ｂ）の（Ｉ）と比べてさらに液柱の上方に存在することになる。
（Ｄ）は、（Ｃ）と同じ液柱であり、（Ｃ）から所定の時間経過後の受精卵Ｆおよび周辺組織Ｄの挙動を示すものである。数多くの受精卵Ｆが、回収部５まで沈降しているが、周辺組織Ｄの卵丘細胞は沈降速度が遅いため（Ｃ）の状態から殆ど沈降していないことが分かる。（Ｂ）と同じように、回収部５まで受精卵Ｆが沈降した後、周辺組織Ｄの沈降前に開閉部４を閉口することで回収部５に受精卵Ｆだけを排出して回収してもよいし、排出口３と回収部５が、液密に連結されていない場合は、下部Ｘに受精卵が沈降するまでは開閉部４の閉口状態を維持し、下部Ｘまで受精卵が沈降した後、周辺組織Ｄの沈降前に開閉部４を開口して、下部Ｘの密度勾配液ごと回収部５へ排出することで受精卵を回収することができる。
このように密度勾配液の濃度を高くすることで、受精卵Ｆと周辺組織Ｄの沈降速度の差をより大きく増幅させたり、一部の周辺組織が通過できない層を設けることで、より高い洗浄度で受精卵を回収できる。また、上記説明でわかるとおり、本発明の精製方法は、媒精液の添加以降から受精卵の回収まで吸引、加圧、接触など受精卵に損傷をもたらす操作が一切ない。また、回収部にエレクトロポレーション装置へ接続される流路を設ければ、同じように受精卵に損傷をもたらすことなく遺伝子導入が可能となるため一連の操作を自動化できる。
【００５３】
本発明は、回収された受精卵を任意の緩衝液または培地培地で洗浄する工程を含む。
緩衝液または培地としては、限定されずに、例えば、ＫＳＯＭ培地やＯｐｔｉＭＥＭ培地、Ｍ２培地、Ｍ１６培地、Ｗｈｉｔｔｅｎ’ｓ培地、ｍＷＭ培地、ＨＴＦ培地、ＣＺＢ培地など受精卵の品質に悪影響を与えないものであればよい。本工程は、混入した周辺組織や密度勾配液を洗浄し、受精卵に遺伝子を導入する際の導入効率やその再現性において有利な効果を有する。
【００５４】
本発明に用いられる密度勾配液の液柱は、媒精液を投入する投入口および受精卵を排出する排出口を備えるカラムに充填して使用することができる。投入口と排出口は、カラムの上部または下部に存在していれば特に限定されないが、媒精液と受精卵の投入および排出を簡便にする観点から、カラムの上端および下端に開口した投入口および排出口が好ましい。市販品で使用し得るカラムとしては、５−１０ｍｌチップ、１−２５ｍｌピペット、５−５０ｍｌシリンジ、点滴チューブなどが挙げらる。
カラムは液柱下部に受精卵沈降後、周辺組織沈降前に排出口を閉じる、または開ける必要があることから簡便に開閉可能な弁を有していることが好ましい。弁は「開」と「閉」の２位置を切り換えるものであればよく、手動で操作できる手動の開閉弁（ボールバルブやコックなど）でもよいし、電気信号などで自動で操作できる自動の開閉弁（例えば、電磁弁）でもよい。市販品で使用し得るものとしては、上記のチップ、シリンジ、などにチューブを介してまたは直接ストップコックなどを接続して使用することもできるし、翼付静注射器を使ってもよい。
【００５５】
本発明の方法を使用することにより、排出口から排出された受精卵を回収すればよいため、遠心分離等のように遠沈管の容器底面に精製された受精卵をピペット等を使用して吸引する必要がなく、受精卵に損傷を与えないことから、より高品質な受精卵を得ることができる。さらに、カラムの排出口から排出された密度勾配液を含む受精卵を、例えば洗浄液または培養液を含む別の容器に流入するように設計した流路を設けることで、受精卵を損傷することなく洗浄または希釈することができる。このように目的に応じて、任意にインキュベーターや遺伝子導入装置に受精卵が流入し得る流路を設けることで、精製した受精卵を損傷することなく連続的に操作し得る。したがって、本発明の方法は、精製操作の自動化に適している。また複数のカラムを使用することにより、一度に大量の受精卵を精製できる有利な効果がある。密度勾配液の液量は、選択した容器により当業者が適宜選択することができる。
【００５６】
カラムのサイズおよび使用する密度勾配液の量は、一度の精製で液柱に添加する受精卵の量に応じて変化させることが好ましい。一度の精製で液柱に添加する受精卵として、例えばマウスの受精卵の場合、２００個以内であれば、カラムのサイズとして内径８〜１５ｍｍ×長さ５０ｍｍ〜９０ｍｍのカラムに、０％、０．５〜３％、３〜８％の３層のパーコール濃度からなる不連続層が、それぞれ０％：０〜２ｍｌ、０．５〜３％：１〜３ｍｌ、３〜８％：１〜３ｍｌ充填されていればよく、好ましくは、０％：１ｍｌ、０．５〜３％：２ｍｌ、３〜８％：２ｍｌ充填され、さらに好ましくは０％：３ｍｌ、１％：３ｍｌ、５％：３ｍｌ充填されている。このような密度勾配液の液柱が充填されたカラムを、本発明に使用すると、２００個以内の受精卵であれば、７０％、８０％、９０％以上、９３％以上、９５％、９８％以上、好ましくは１００％の洗浄度を持つ受精卵を採取することができる。
【００５７】
一度の精製で液柱に添加する受精卵として、例えばマウスの受精卵の場合、４００個以内であれば、内径１３〜２４ｍｍ×長さ９０ｍｍ〜１２０ｍｍのカラムに、０％、０．５〜３％、３〜８％の３層のパーコール濃度からなる不連続層に、それぞれ０％：２〜４ｍｌ、０．５〜３％：２〜４ｍｌ、３〜８％：２〜４ｍｌを充填されていればよく、好ましくは、０％：３ｍｌ、０．５〜３％：３ｍｌ、３〜８％：３ｍｌ充填され、さらに好ましくは、０％：３ｍｌ、１％：３ｍｌ、５％：３ｍｌ充填されている。このような密度勾配液の液柱が充填されたカラムを、本発明の方法に使用すると、４００個以内の受精卵であれば６０％以上、７０％以上、８０％、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％、好ましくは１００％の洗浄度を持つ受精卵を採取することができる。
【００５８】
本発明のカラムは、手動で分離するために使用しても、かかる工程を自動化した受精卵分離／精製装置または遺伝子導入装置に組み込んで使用してもよい。受精卵分離／精製装置としては、これに限定されるものではないが、例えば、任意に受精後の媒精液を振盪する振盪部、密度勾配液を充填した受精卵の分離用カラム部、および任意に洗浄部を備えてよい。遺伝子導入装置としてはこれに限定されるものではないが、上述した受精卵分離／精製装置の構成部分のほかに、任意にエレクトロポーレーション、ウイルスベクター、マイクロインジェクション、パーティクルガンおよびリポフェクションからなる群から選択される遺伝子導入をするための遺伝子導入部を備えてよい。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム、Ｃａｓ３システム、Ｃｐｆ１システム、ＭＡＤ７システム、ＣＲＩＳＰＲ  Ｔｙｐｅ  Ｉ−Ｄシステム（Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄを含む）、ＰＰＲ、ＺＦＮまたはＴＡＬＥＮなど当該技術分野において知られた任意のゲノム編集因子を導入してよい。
【００５９】
本発明は、本発明の方法によって精製された受精卵を含む。本発明の方法によって精製された受精卵は、生残率または発生率が高く、受精卵間の品質の偏りが少ない。本発明の方法によって精製された受精卵は、通常の受精卵を用いて行なわれる任意の処理、例えば、これに限定されるものではないが、培養、ドナー動物への移植、凍結または遺伝子の導入、動画撮影（Ｔｉｍｅ−ｌａｐｓ等）、組織学切片、抗体染色、in situ hybridization、ＤＮＡ抽出、ＲＮＡ抽出のために用いることができる。
【００６０】
本発明は、本発明の方法により精製された受精卵に遺伝子を導入する工程を含む遺伝子改変生物の作成方法が提供される。発明の方法により精製された受精卵は、発生率または発生率が高く、分離後の試料に含まれる周辺組織が少ないため、遺伝子の導入効率および再現性が高い。
【００６１】
本発明は、密度勾配液を充填したカラムの製造方法であって、カラムの排出口から密度勾配液を充填する工程を含んでよい。カラムの排出口から低濃度の密度勾配液を積層することで、層構造がより強固に保たれた密度勾配液が充填されたカラムが製造し得る。特に層構造が破壊されやすいカラムに充填する際に有利に使用できる。
【００６２】
本発明は、カラムの製造方法であって、カラムに密度勾配液を充填する工程を含む。一態様においては、充填する工程が、カラムの排出口から密度勾配液を充填する工程を含んでよい。カラムの排出口から低濃度の密度勾配液を積層することで、層構造がより強固に保たれた密度勾配液が充填されたカラムが製造し得る。特に層構造が破壊されやすい形状の例えば、幅が太いカラムに充填する際に有利に使用できる。
【００６３】
本発明は、カラムの製造方法であって、密度勾配液をカラムへ充填する工程および凍結する工程を含む。一態様において凍結された密度勾配液に、さらに異なる濃度の密度勾配液を添加する工程を含む。添加した密度勾配液を凍結することで先に添加した密度勾配液の層と、次に添加する密度勾配液の層とが物理的に混合されない状態を維持できるため、強固な層構造を持つ密度勾配液を充填したカラムが製造し得る。本発明の製造方法でカラムに充填される密度勾配液は、本発明の受精卵の精製方法で使用される密度勾配液の液柱であってよい。密度勾配液の液柱は上述した通りである。本発明の製造方法によって製造された密度勾配液が充填されたカラムは、凍結保存して例えば受精卵の精製に供する温度、例えば３７〜３８℃で解凍することで直ぐに使用することができる。当該製造方法で分離したカラムは洗浄度が高い。したがって、本発明の精製方法をより簡便に高い精度で実現できる。また長期冷凍保存しても密度勾配液の成分の品質および層構造が維持されているため本発明によって製造されたカラムの製造方法は、本発明の方法に使用するためのカラムに好適に用いることができる。
【００６４】
以下に本発明の具体的な実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの具体例に限定されるものではない。
【００６５】
【実施例】
【００６６】
１．パーコール液およびマンニトール液を使った受精卵精製方法
１２週齢の雄マウス（ｃ５７ＢＬ／６Ｎ（日本エスエルシー））１匹を解剖して、精巣上体から１００μｌのCARD FERTIUP精子前培養培地（九動）ドロップに精子を採取した。ｃ５７ＢＬ／６Ｎは日本エスエルシーから購入した。精子濃度は、９．５ｘ１０４精子／μｌであった。６週齢の雌マウス（ｃ５７ＢＬ／６Ｎ／ＳＬＣ）４匹を解剖し、卵管膨大部から８つの２００μｌＨＴＦ培地（九動）ドロップに計１８４個の卵子を採取した。採取した精子４μｌ（総精子数：３．８ｘ１０５精子）を、卵子の入ったそれぞれのＨＴＦ培地ドロップに加えて媒精後、３．５時間インキュベートし（ＣＯ２インキュベーターFORMA SERIES II WATER JACKET）、媒精液試料を作成した。
【００６７】
比較例１
３７℃のパーコール（GE Healthcare、17-0819-02）９ｍｌと１０ｘＭ２培地１ｍｌを混ぜ、GE Healthcare等で定義されている１００％パーコール１０ｍｌとした。これをＭ２培地で希釈し、２２．５％パーコール液（Ａ）を作成し、１５ｍｌチューブ（FALCON）に４．５ｍｌ入れた。当該チューブに、作成した媒精液試料を加え、次いで遠心分離に供した（３７℃、７００ｘｇ、５分、:遠心分離機、TOMY AX-511）。パーコール液上層２／３に存在する受精卵を採取し、これを新たな１５ｍｌチューブに入れ、Ｍ２培地で５倍希釈して４．５％パーコール液にして遠心分離に供した（３７℃、７００ｘｇ、５分）。次いで、遠心した１５ｍｌチューブの下層１ｍｌを残し、再度Ｍ２培地を４ｍｌ加えて１．１２％パーコール液にし、これを遠心分離に供し（３７℃、７００ｘｇ、５分）沈降した受精卵を回収した。受精卵の洗浄度をライカマイクロシステムM205C MZFLIII顕微鏡とライカDMC4500カメラにより撮影し解析・測定した。洗浄度は、操作後の培養液中の卵丘やフリーの精子がない領域の割合であり、熟練者がマウスピペットを用いた方法を１００％とした。なお、比較例１のパーコールによる受精卵の遠心分離を用いた精製に関して熟練者が行った。
【００６８】
実施例１
３７℃のパーコール（GE Healthcare、17-0819-02）９ｍｌと１０ｘＭ２培地１ｍｌを混ぜ、GE Healthcare等で定義されている１００％パーコール１０ｍｌを作製した。これをＭ２培地で希釈し、０％、１％および５％のパーコール液を作成した。翼付静注射器（テルモ）を付けた５ｍｌチップにパーコール液を１．５ｍｌずつ積層し、密度勾配層を作成した。作成した媒精液試料を当該チップへ投入し、３７℃、５．０％ＣＯ２で翼付静注射器の排出口を閉じた状態で３０分静置させた（ＣＯ２インキュベーターFORMA SERIES II WATER JACKET）。次いで、排出口を開放し、点滴チューブの排出口から排出された受精卵を回収しライカマイクロシステムM205C  MZFLIII顕微鏡とライカDMC4500カメラにより撮影し、洗浄度を解析・測定した。
【００６９】
その後比較例１および実施例１で得られた受精卵をＫＳＯＭ培地（九動）で培養した（３７℃、５．０％  ＣＯ２インキュベーターFORMA SERIES II WATER JAKET）。表１に比較例１および実施例１で得られた回収細胞数、受精卵の取りこぼし細胞数、２Ｃｅｌｌ細胞数、発生率、Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ細胞数、Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ発生率などを示す。
【表１】
2020150941.tif 000004
【００７０】
比較例１は、遠心チューブへ添加および回収を３回繰り返し行なう必要があったのに対して、実施例１は、媒精液をカラムに添加し３０分静置後に排出口を開放するだけで受精卵の回収が実現した。実施例１は比較例１に対して、同程度の洗浄度を有し、２Ｃｅｌｌ発生率およびＢｌａｓｔｏｃｙｓｔ発生率においてはいずれも比較例を上回り、発生に伴って、より高い発生率を維持できた。比較例１に対して、煩雑な操作を要さず、生存率および発生率においては良好な結果を有するものであった。したがって本発明の方法は、高品質な受精卵を安定して提供することが出来、従来のいずれの方法に対しても極めて少ないステップで分離することができるためハイスループットな受精卵分離／精製装置への組み込みにも適していることがわかった。
【００７１】
実施例２
９週齢の雄マウス（ｃ５７ＢＬ／６Ｎ）１匹を、解剖して、精巣上体から１００μｌのCARD FERTIUP精子前培養培地（九動）ドロップに精子を採取した。精子濃度は、６．４ｘ１０４精子／μｌであった。４週齢の雌マウス（ｃ５７ＢＬ／６Ｎ）５匹を解剖し、卵管膨大部から９つの２００μｌＨＴＦ培地（九動）ドロップに計３４０個の卵子を採取した。採取した精子４μｌ（総精子数：３．２ｘ１０５精子）を、卵子の入ったそれぞれのＨＴＦ培地ドロップに加えて媒精後、３．５時間インキュベートし、媒精液試料を作成した。
【００７２】
マンニトール（SIGMA、M1902）５ｇを４５ｇのＭ２培地で希釈し１０％マンニトールを作成した。かかるマンニトール液をＭ２培地で希釈し、０％、０．５％および２％のマンニトール液を作成し、５ｍｌチューブ（FALCON）に０％：１ｍｌ、０．５％および２％：２ｍｌずつ積層して密度勾配層を作成した。当該チューブに最終濃度０．３％ＢＳＡとなるように作成した媒精液試料を４００μｌ加え、３７℃、５．０％ＣＯ２にて３０分静置させた（ＣＯ２インキュベーターFORMA SERIES II WATER JACKET）。その後、下層２００μｌの受精卵を回収しライカマイクロシステムM205C MZFLIII顕微鏡とライカＤＭＣ４５００カメラにより撮影し、洗浄度を解析・測定した。
【００７３】
実施例３
実施例２の方法により作成したＢＳＡ無添加の媒精液試料を
ボルテックスで０．１秒振盪し、０％、１％および５％のパーコール液をＭ２培地で希釈し、０％、０．５％および２％のマンニトール液を作成し、５ｍｌチューブ（FALCON）に２ｍｌずつ積層して密度勾配層を作成し、実施例１と同じ条件で３０分静置させ分離し、洗浄度を解析・測定した。
【００７４】
表２に実施例２および実施例３で得られた回収細胞数、受精卵の取りこぼし細胞数、２Ｃｅｌｌ細胞数、発生率、Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ細胞数、Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ発生率などを示す。
【表２】
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【００７５】
実施例２および３のいずれも、取りこぼし細胞は０であり、洗浄度は９５％であった。したがって比較例１に対して、煩雑な操作を要さずに受精卵を分離することが出来、従来のいずれの方法に対しても極めて少ないステップで分離することができるためハイスループットな受精卵分離／精製装置への組み込みにも適していることがわかった。
【００７６】
２．各精製方法での比較実験
実施例４および５
９週齢の雄マウス（ｃ５７ＢＬ／６Ｎ）１匹を、解剖して、精巣上体から１００μｌのCARD FERTIUP精子前培養培地（九動）ドロップに精子を採取した。精子濃度は、６．９ｘ１０４精子／μｌであった。４週齢の雌マウス（ｃ５７ＢＬ／６Ｎ／ＳＬＣ）６匹を解剖し、卵管膨大部から９つの２００μｌＨＴＦ培地（九動）ドロップに計３７０個の卵子を採取した。採取した精子４μｌ（総精子数：３．２ｘ１０５精子）を、卵子の入ったそれぞれのＨＴＦ培地ドロップに加えて媒精後、３．５時間インキュベートし、媒精液試料を作成した。これらの媒精液試料を６つのチューブに分注した。
【００７７】
比較例２および３では、初心者と熟練者でマウスピペットによって受精卵を精製した。比較例４および５では、初心者と熟練者が、比較例１の遠心分離を使用した方法で受精卵を精製した。実施例４および５では、実施例１で、５ｍｌチップにチップ上方からパーコールを１．５ｍｌずつ積層したのに代えて、内径１７ｍｍのチューブに排出口からパーコールを３ｍｌずつ注入して（実施例７（４）参照）、パーコール充填カラムを作製した以外は、実施例１と同じ手順で、初心者と熟練者が、静置分離によって受精卵を精製した。これらの精製に要した作業時間、受精卵の取りこぼし数、受精卵の発生率（２ｃｅｌｌ発生率、Ｂｌａｓｔｃｙｓｔ発生率）、洗浄度を比較した。結果を表３に示す。
【表３】
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【００７８】
比較例２および３のマウスピペットでは初心者は、熟練者に比べて３倍の作業時間を要し、受精卵の取りこぼしの差が１０％以上あり、さらに回収した受精卵の発生率も熟練者の約半分であった。比較例４および５の遠心分離を使用した精製方法では、熟練者に比べて初心者の作業時間が１０分長く、熟練者と初心者の間で受精卵の発生率も１０％以上の差があった。これら受精卵の精製方法では、作業者間で受精卵の品質が大きく変動することが分かった。
【００７９】
これに対して、実施例４および５の結果は、比較例３および５で（マウスピペットおよび遠心分離で）熟練者が行った精製における、取りこぼし数、受精卵の発生率、洗浄度を上回るものであった。さらに実施例４および５では、熟練者と初心者の間の回収細胞数、受精卵の取りこぼし数、発生率、洗浄度等の差が殆ど存在しなかった。このことから、本発明の受精卵の精製方法は、従来の方法に比べて高品質な受精卵を安定的に提供できることが分かった。
【００８０】
３．マウス系統での比較実験
実施例６
ＢＤＦ１、ｃ５７ＢＬ／Ｂ６Ｊおよびｃ５７ＢＬ／Ｂ６Ｎの３系統のマウスから、卵子を採取し、同系統のマウスから採取した精子と媒精して受精卵を得た。ＢＤＦ１、ｃ５７ＢＬ／Ｂ６Ｊは日本エスエルシーから購入した。これらの媒精液を遠心分離によって受精卵を精製する方法と（比較例６）、本発明の受精卵の精製方法に供した（実施例６）。
比較例６では比較例４と同じ手順でＢＤＦ１、ｃ５７ＢＬ／Ｂ６Ｊおよびｃ５７ＢＬ／Ｂ６Ｎの３系統のマウスから得られた媒精液を遠心分離にて精製した。実施例６では、同じ３系統のマウスから得られた媒精液を実施例１と同じ手順で精製した。比較例６及び実施例６は、ともに熟練者が行った。
結果を４に示す。表中のＢ６Ｎは、ｃ５７ＢＬ／Ｂ６Ｎを、Ｂ６Ｊは、ｃ５７ＢＬ／Ｂ６Ｊを、それぞれ示す。
【表４】
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【００８１】
比較例６および実施例６の両方で６ＢＤＦ１、ｃ５７ＢＬ／Ｂ６Ｎ、ｃ５７ＢＬ／Ｂ６Ｊの順で高い発生率の受精卵が得られた。また実施例６では、比較例６と比較して、いずれの系統でも高い発生率が得られることが明らかとなった。このことから、系統や動物種に関係なく、従来の受精卵の精製方法と比較して品質の高い受精卵を得られることが分かった。
【００８２】
３．大量精製用カラムの検討
実施例７
（１）．内径１０ｍｍ、長さ８０ｍｍのシリンジをカラムとして、上端の投入口から密度勾配液として５％パーコール液２ｍｌ、１％パーコール液２ｍｌ、０％パーコール液１ｍｌを順次添加して積層した。このパーコール液充填カラムを使用して、実施例１と同じ方法で約１５０個の受精卵を一度に添加して精製したところ９８％の洗浄率であった。
【００８３】
（２）．（１）で作製したカラムを使用して約２００〜３００個の受精卵を一度に添加して精製したところ、洗浄率が７５％にまで下がった。カラムを観察すると５％の層で受精卵が飽和して本来１％の層がある部分にまで混入していた。また、周辺組織も本来５％の層がある部分に多く沈降していた。大量の受精卵と周辺組織が各層において許容量を超え、密度勾配の層構造が破壊されたと考えられた。
【００８４】
（３）．各層の許容量が高いパーコール液の液柱を作製するために内径１７ｍｍ、長さ１０４ｍｍのシリンジをカラムとして、上端の投入口から密度勾配液として５％パーコール液３ｍｌ、１％パーコール液３ｍｌ、および、０％パーコール液３ｍｌを順次添加してパーコール液を積層したカラムを作製した。このパーコール液充填カラムを使用して、（２）と同じ約２００〜３００個の受精卵を一度に添加して精製したところ、洗浄率は７８％と、殆ど上がらなかった。内径が広いカラムを採用したことによって、各層の液柱の断面積が広がり、これによって積層する際に安定したパーコール液の層構造が保たれなかったことが予測された。
【００８５】
（４）．広い内径のカラム中で安定した層構造を持つパーコール液を作製するために、（３）と同じシリンジをカラムとして使用し、下端の排出口から、密度勾配液として０％パーコール液３ｍｌ、１％パーコール液３ｍｌ、および、５％パーコール液３ｍｌを順次注入して積層したパーコール液充填カラムを作製した。このカラムを使用して（３）と同じ約２００〜３００個の受精卵を一度に添加して精製したところ、洗浄率は９８％にまで上昇した。（３）では密度の高いパーコール液へ密度の低いパーコール液を上端から添加しおり、断面積が広い液柱を作製する場合、このような添加方法では添加時の衝撃によって、安定したパーコール液の層構造が保たれなかったが、下から注入すると衝撃なく積層できるためパーコール液の安定した層構造が形成されたことが洗浄率の上昇に寄与したと考えられた。したがって、排出口から充填することで洗浄度が高い密度勾配液が充填されたカラムを製造できる。
以上（１）〜（４）の結果の模式図を図５に示す。
【００８６】
（５）．さらに強い層構造を持つパーコール液を作製するために、（４）と同じカラムを使用してカラムの投入口から、密度勾配液として５％パーコール液３ｍｌを添加した後、−２０℃で凍結した。次いで、凍結された５％パーコール液へ１％パーコール液３ｍｌを添加して積層し、再度−２０℃で凍結した。次いで凍結された１％パーコール液へ０％パーコール液３ｍｌを添加して積層し凍結した。このようにして作製された凍結パーコール液が充填されたカラムを３７℃〜３８℃で１時間解凍し、（４）と同じ約２００〜３００個の受精卵を一度に添加して精製したところ、洗浄率は９９％にまで上昇した。より強い層構造が形成されたことが洗浄度向上の原因と予測される。また長期間保存しても高い洗浄率が維持された。このように密度勾配液としてパーコール液が充填されたカラムの製造過程を図６に示す。このようにして製造された密度勾配液が充填されたカラムは大量に作り置きができ、保存可能であるため自動精製装置へ組み込むカートリッジ用カラムとして有益である。
【００８７】
当業者は、本発明の精神から逸脱しない多数の様々な改変が可能であることを理解している。したがって、本明細書に記載された態様は例示にすぎず、これらが本発明の範囲を制限する意図をもって記載されたものではないことを理解すべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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