(57)【要約】【課題】エタノールアミンリン酸（ＰＥＡ）を測定する方法を提供する。【解決手段】Ｏ−ホスホエタノールアミンホスホリアーゼ（Phosphoethanolamine Phospho-Lyase）を作用させて、ＰＥＡからアンモニア、アセトアルデヒドおよびリン酸を生成する段階、金属イオンおよび当該金属イオンの還元イオンと錯体を形成することができるキレート試薬を作用させる段階、およびキレート試薬による発色を検出する段階を含む、方法。【選択図】図１
2020054249.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中のエタノールアミンリン酸（ＰＥＡ）を測定する方法であって、
（ａ）サンプル中のリン酸を除去する段階、
（ｂ）段階（ａ）で得られたサンプルにＯ−ホスホエタノールアミンホスホリアーゼ（Phosphoethanolamine Phospho-Lyase）を作用させて、サンプルに含まれるＰＥＡからアンモニア、アセトアルデヒドおよびリン酸を生成する段階、
（ｃ）段階（ｂ）で得られたサンプルに酵素を作用させて、サンプルに含まれるリン酸からＮＡＤＨ２を生成する段階、
（ｄ）段階（ｃ）で得られたサンプルに金属イオンおよび当該金属イオンの還元イオンと錯体を形成することができるキレート試薬を作用させる段階、および
（ｅ）段階（ｄ）で得られたサンプル中のキレート試薬による発色を検出する段階
を含む、方法。
【請求項２】
段階（ｄ）において、金属イオンが三価の鉄（Ｆｅ３＋）イオンであり、金属イオンの還元イオンが二価の鉄（Ｆｅ２＋）イオンである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
段階（ｄ）がクエン酸、Ｌ−酒石酸、シュウ酸、スルホサリチル酸またはニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）を含む条件下で行われる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
段階（ｄ）がＬ−酒石酸またはニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）を含む条件下で行われる、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
段階（ｄ）において、キレート試薬がNitroso-PSAP、Nitro-PAPS、5-Br-PAPSまたは5-Br-PSAAである、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
段階（ｃ）が、
（ｃ−１）リン酸にイノシンおよびプリンヌクレオチドホスホリラーゼを作用させて、ヒポキサンチンを生成する段階、
（ｃ−２）ヒポキサンチンにキサンチン脱水素酵素を作用させて、尿酸を生成する段階、
（ｃ−３）尿酸にウリカーゼを作用させて、過酸化水素を生成する段階、
（ｃ−４）過酸化水素にメタノールまたはエタノールおよびカタラーゼを作用させて、ホルムアルデヒドまたはアセトアルデヒドを生成する段階、および
（ｃ−５）ホルムアルデヒドまたはアセトアルデヒドにＮＡＤおよびホルムアルデヒド脱水素酵素を作用させて、ＮＡＤＨ２を生成する段階
を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
段階（ａ）が、サンプル中のリン酸、ヒポキサンチン、尿酸および過酸化水素を酵素で除去する段階である、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
サンプルが生体試料サンプルである、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
サンプルが、全血、血清、または血漿サンプルである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
対象がうつ病に罹患しているかどうかを判定するための方法であって、
（ａ）請求項１〜９のいずれかに記載の方法により、対象由来のサンプル中のＰＥＡを測定する段階；および
（ｂ）サンプル中のＰＥＡが１．５μｍｏｌ／Ｌ未満である場合に、対象がうつ病に罹患していると判定する段階
を含む、方法。
【請求項１１】
Ｏ−ホスホエタノールアミンホスホリアーゼを含む、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法を実施するためのキット。
【請求項１２】
さらに金属を含む、請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
金属が三価の鉄である、請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
さらにクエン酸、Ｌ−酒石酸、シュウ酸、スルホサリチル酸またはニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、およびNitroso-PSAP、Nitro-PAPS、5-Br-PAPSまたは5-Br-PSAAを含む、請求項１１〜１３のいずれかに記載のキット。
【請求項１５】
コンピュータに、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法を実行させるためのプログラム。
【請求項１６】
請求項１５に記載のプログラムを保存したコンピュータで読み取り可能な記録媒体。
【請求項１７】
請求項１１〜１４のいずれかに記載のキットを含む、または請求項１５に記載のプログラムが組み込まれた、ＰＥＡを測定するための装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キレート試薬による発色を検出する段階を含む、サンプル中に存在するエタノールアミンリン酸（ＰＥＡ）を測定する方法、その方法を実施するためのキット、その方法を実行させるためのプログラム、そのプログラムを保存したコンピュータで読み取り可能な記録媒体、およびそのキットを含む、またはそのプログラムが組み込まれた、ＰＥＡを測定するための装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
うつ病は気分障害の一種であり、その主な症状は「抑うつ気分」と「興味・喜びの喪失」である。日本の医療機関に対する調査によると、２００８年のうつ病の患者数は７０万人以上とされている。また、２０１４年の厚生労働省の調査によると、気分障害（感情障害）患者数は１１２．２万人であり、患者数が増加してきている。しかし、うつ病の診断は、患者の精神面についての医師や心理士の主観、または患者自身の主観や申告に依存する面が大きく、そのため、客観的な判断がなされているとは言い難い。そこで、うつ病を客観的に診断するため、治療の経過を観察するため、および予後を予測するために、近年、患者の体液中の成分をうつ病の診断の目安として用いる試みがなされている。
【０００３】
従来、うつ病の予測マーカーとして、体液中のトリプトファンまたはその分解物、あるいは特定の遺伝子の発現量などを用いることが報告されていたが（特許文献１、２）、本発明者らは以前に、血液中のエタノールアミンリン酸（ＰＥＡ）がうつ病を診断するためのバイオマーカーとして有用であることを見出した（特許文献３、４）。ＰＥＡ濃度の測定値は、うつ病の客観的な診断や経過観察に有用であるとされている（非特許文献１）。本発明者らはさらに、γ−アミノブチルアミノ基転移酵素（ＧａｂＴ）を用いてＰＥＡからアセトアルデヒド、リン酸、およびアンモニアを生成させることにより、サンプル中のＰＥＡを測定する方法を開発した（特許文献５）。本発明者らはまた、ＰＥＡからアセトアルデヒド、リン酸、およびアンモニアを生成させる前に、アンモニアおよび／またはリン酸を除去することによって、ＰＥＡをより正確に測定する方法を開発した（特許文献６）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２００６／１０５９０７号
【特許文献２】特開２００８−２５３２５８号公報
【特許文献３】国際公開第２０１１／０１９０７２号
【特許文献４】国際公開第２０１６／０４７６７７号
【特許文献５】特許第５６８８１６３号明細書
【特許文献６】国際公開第２０１８／０６２２０４号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Noriyuki Kawamura, et al., “Plasma metabolome analysis of patients with major depressive disorder”, Psychiatry clin. neurosci. Volume72, Issue5, 349-361, 2018
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従来のＰＥＡを測定する方法は、質量分析装置、例えばキャピラリー質量分析装置を使用する。しかしながら、質量分析装置は高価であり、通常の施設、例えば一般的な病院または医療機関ではこのような装置を用いて分析を行うことができない。また、従来の酵素的ＰＥＡ測定法は感度が十分でない。そのため、通常の施設で一般的に使用されている機器、例えば生化学自動分析装置によって、簡便かつ高感度にＰＥＡを測定することができる方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、Ｏ−ホスホエタノールアミンホスホリアーゼ（Phosphoethanolamine Phospho-Lyase）を作用させて、ＰＥＡからアンモニア、アセトアルデヒドおよびリン酸を生成する段階、酵素を作用させて、リン酸から還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ２）を生成する段階、金属イオンおよび当該金属イオンの還元イオンと錯体を形成することができるキレート試薬を作用させる段階、およびキレート試薬による発色を検出する段階を含む、サンプル中のエタノールアミンリン酸（ＰＥＡ）を測定する方法を見いだし、本発明を完成させるに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は以下を提供する：
［１］サンプル中のエタノールアミンリン酸（ＰＥＡ）を測定する方法であって、
（ａ）サンプル中のリン酸を除去する段階、
（ｂ）段階（ａ）で得られたサンプルにＯ−ホスホエタノールアミンホスホリアーゼ（Phosphoethanolamine Phospho-Lyase）を作用させて、サンプルに含まれるＰＥＡからアンモニア、アセトアルデヒドおよびリン酸を生成する段階、
（ｃ）段階（ｂ）で得られたサンプルに酵素を作用させて、サンプルに含まれるリン酸からＮＡＤＨ２を生成する段階、
（ｄ）段階（ｃ）で得られたサンプルに金属イオンおよび当該金属イオンの還元イオンと錯体を形成することができるキレート試薬を作用させる段階、および
（ｅ）段階（ｄ）で得られたサンプル中のキレート試薬による発色を検出する段階
を含む、方法；
［２］段階（ｄ）において、金属イオンが三価の鉄（Ｆｅ３＋）イオンであり、金属イオンの還元イオンが二価の鉄（Ｆｅ２＋）イオンである、［１］に記載の方法；
［３］段階（ｄ）がクエン酸、Ｌ−酒石酸、シュウ酸、スルホサリチル酸またはニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）を含む条件下で行われる、［１］または［２］に記載の方法；
［４］段階（ｄ）がＬ−酒石酸またはニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）を含む条件下で行われる、［１］〜［３］のいずれかに記載の方法；
［５］段階（ｄ）において、キレート試薬がNitroso-PSAP、Nitro-PAPS、5-Br-PAPSまたは5-Br-PSAAである、［１］〜［４］のいずれかに記載の方法；
［６］段階（ｃ）が、
（ｃ−１）リン酸にイノシンおよびプリンヌクレオチドホスホリラーゼを作用させて、ヒポキサンチンを生成する段階、
（ｃ−２）ヒポキサンチンにキサンチン脱水素酵素を作用させて、尿酸を生成する段階、
（ｃ−３）尿酸にウリカーゼを作用させて、過酸化水素を生成する段階、
（ｃ−４）過酸化水素にメタノールまたはエタノールおよびカタラーゼを作用させて、ホルムアルデヒドまたはアセトアルデヒドを生成する段階、および
（ｃ−５）ホルムアルデヒドまたはアセトアルデヒドにＮＡＤおよびホルムアルデヒド脱水素酵素を作用させて、ＮＡＤＨ２を生成する段階
を含む、［１］〜［５］のいずれかに記載の方法；
［７］段階（ａ）が、サンプル中のリン酸、ヒポキサンチン、尿酸および過酸化水素を酵素で除去する段階である、［１］〜［６］のいずれかに記載の方法；
［８］サンプルが生体試料サンプルである、［１］〜［７］のいずれかに記載の方法；
［９］サンプルが、全血、血清、または血漿サンプルである、［８］に記載の方法；
［１０］対象がうつ病に罹患しているかどうかを判定するための方法であって、
（ａ）［１］〜［９］のいずれかに記載の方法により、対象由来のサンプル中のＰＥＡを測定する段階；および
（ｂ）サンプル中のＰＥＡが１．５μｍｏｌ／Ｌ未満である場合に、対象がうつ病に罹患していると判定する段階
を含む、方法；
［１１］Ｏ−ホスホエタノールアミンホスホリアーゼを含む、［１］〜［１０］のいずれかに記載の方法を実施するためのキット；
［１２］さらに金属を含む、［１１］に記載のキット；
［１３］金属が三価の鉄である、［１２］に記載のキット；
［１４］さらにクエン酸、Ｌ−酒石酸、シュウ酸、スルホサリチル酸またはニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、およびNitroso-PSAP、Nitro-PAPS、5-Br-PAPSまたは5-Br-PSAAを含む、［１１］〜［１３］のいずれかに記載のキット；
［１５］コンピュータに、［１］〜［１０］のいずれかに記載の方法を実行させるためのプログラム；
［１６］［１５］に記載のプログラムを保存したコンピュータで読み取り可能な記録媒体；
［１７］［１１］〜［１４］のいずれかに記載のキットを含む、または［１５］に記載のプログラムが組み込まれた、ＰＥＡを測定するための装置。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、キレート試薬による発色を検出することによってサンプル中のエタノールアミンリン酸（ＰＥＡ）を測定する方法、その方法を実施するためのキット、その方法を実行させるためのプログラム、そのプログラムを保存したコンピュータで読み取り可能な記録媒体、およびそのキットを含む、またはそのプログラムが組み込まれた、ＰＥＡを測定するための装置等が提供される。
【００１０】
したがって、本発明の方法等を使用することによって、質量分析装置を使用せずに、通常の施設、例えば一般的な病院または医療機関にて一般的に使用されている機器、例えば生化学自動分析装置によって、簡便かつ高感度にＰＥＡを測定することができる。
【００１１】
生化学自動分析装置によって、本発明の方法を使用することによって、大量の試料を迅速に、例えば１テスト約１０分で測定することが可能である。
【００１２】
また、本発明の方法のリン酸からＮＡＤＨ２を生成する段階として、１モルのリン酸から複数モルのＮＡＤＨ２を生成する段階を使用することによって、増感したキレート試薬による発色を検出して、より高感度にＰＥＡを測定することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、上図（第一反応：内因性無機りんの除去）がサンプル中のリン酸を除去する段階、ならびに、下図（第二反応：エタノールアミンリン酸のリン酸測定）がＯ−ホスホエタノールアミンホスホリアーゼ（Phosphoethanolamine Phospho-Lyase）を作用させて、ＰＥＡからアンモニア、アセトアルデヒドおよびリン酸を生成する段階、酵素を作用させて、サンプルに含まれるリン酸からＮＡＤＨ２を生成する段階、および金属イオンおよび当該金属イオンの還元イオンと錯体を形成することができるキレート試薬を作用させる段階の例示的な測定法を示す。
【図２】図２は、吸光度（５７０ｎｍ）に基づくエタノールアミンリン酸の検量線を示す。
【図３】図３は、鉄三価イオンの保護キレート試薬と補酵素ＮＡＤＨによる鉄二価イオンへの還元力能力を示す。
【図４】図４は、鉄三価イオンと二価イオンに対する保護キレート試薬の安定度定数比とＮＡＤＨ還元力の比較を示す。安定度定数比０．４７〜０．５６が最も効率的に還元力を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
一つの実施態様では、本発明は、サンプル中のエタノールアミンリン酸（ＰＥＡ）を測定する方法に関する。当該方法は、（ａ）サンプル中のリン酸を除去する段階、（ｂ）段階（ａ）で得られたサンプルにＯ−ホスホエタノールアミンホスホリアーゼ（Phosphoethanolamine Phospho-Lyase）を作用させて、サンプルに含まれるＰＥＡからアンモニア、アセトアルデヒドおよびリン酸を生成する段階、（ｃ）段階（ｂ）で得られたサンプルに酵素を作用させて、サンプルに含まれるリン酸からＮＡＤＨ２を生成する段階、（ｄ）段階（ｃ）で得られたサンプルに金属イオンおよび当該金属イオンの還元イオンと錯体を形成することができるキレート試薬を作用させる段階、および（ｅ）段階（ｄ）で得られたサンプル中のキレート試薬による発色を検出する段階を含む。
【００１５】
本明細書で用いる場合、「ＰＥＡを測定する」とは、サンプル中にＰＥＡが存在することを確認し、その量を測定することだけでなく、サンプル中にＰＥＡが存在しない（すなわち、ＰＥＡの量が検出限界以下である）ことを確認することも包含する。
【００１６】
段階（ａ）では、リン酸を除去する公知の手段および方法のいずれを用いてもよい。リン酸を除去する方法の例として、酵素法および沈殿法が挙げられるが、これらに限定されない。リン酸を除去する手段および方法については、例えば、国際公開第２０１８／０６２２０４号（特許文献６）に記載されている。
【００１７】
一実施形態では、リン酸を除去するために、酵素法および沈殿法が併用される。これらの方法を併用することで、より確実にリン酸を除去することができる。
【００１８】
上述のとおり、本発明のＰＥＡを測定する方法は、段階（ａ）として、サンプルからリン酸を除去する段階を含む。リン酸は天然に存在し得るため、サンプル中にこれらが既に存在している可能性が高い。また、サンプル取得段階で、これらがサンプル中に混入する可能性もある。したがって、上記式（１）の反応を実施する前にサンプル中に存在しているリン酸を除去することにより、正確かつ高感度に、ＰＥＡから生成したリン酸を検出することができる。
【００１９】
段階（ｂ）では、下記式（１）で示される加水分解反応が利用される。
【化１】
2020054249.tif 000003
【００２０】
この反応系では、あらゆる種由来のエタノールアミンリン酸ホスホリアーゼが用いられる。好ましい実施形態では、段階（ｂ）で用いられる酵素は、ヒト由来エタノールアミンリン酸ホスホリアーゼ（ＡＧＸＴ２Ｌ１）（配列番号１）である。
【００２１】
段階（ｂ）は、リン酸が実質的に存在しない環境（リン酸フリーの環境）下で実施される。段階（ｂ）の環境は、サンプル中のリン酸が完全に存在しない環境だけでなく、リン酸が検出限界以下である環境でもよい。
【００２２】
段階（ｃ）では、酵素を作用させてリン酸からＮＡＤＨ２を生成する１段階または複数段階の公知の任意の手段および方法を用いてよい。段階（ｃ）で使用される酵素は、リン酸からＮＡＤＨ２を生成することができる１つまたは複数の公知の任意の酵素である。
【００２３】
好ましい実施形態では、段階（ｃ）では、１モルのリン酸から複数モル、例えば、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５または１０モルのＮＡＤＨ２を生成する。好ましい実施形態では、段階（ｃ）では、１モルのリン酸から３または４モルのＮＡＤＨ２を生成する。
【００２４】
一実施形態では、段階（ｃ）では、下記式（２）で示される反応が利用される。
【化２】
2020054249.tif 000004
【００２５】
上記式（２）で示される反応が利用される場合、段階（ｃ）で使用される酵素は、イノシン、プリンヌクレオチドホスホリラーゼ、キサンチン脱水素酵素（キサンチンオキシダーゼ）、ウリカーゼ、メタノールまたはエタノール、カタラーゼ、およびホルムアルデヒド脱水素酵素を含む。この反応系では、１モルのリン酸から３モルのＮＡＤＨ２を生成する。別の実施形態では、段階（ｃ）では、上記式（２）中のイノシンを他のプリンヌクレオシド、例えばアデノシンまたはグアノシンで置き換えた反応が利用される。プリンヌクレオシドは、好ましくはイノシンである。
【００２６】
上記式（２）で示される反応が利用される場合、上記式（１）で得られるアセトアルデヒドをＮＡＤと反応させ、ＮＡＤＨ２を得る反応をさらに含んでもよい。例えば、段階（ｃ）では、下記式（３）で示される反応が利用される。
【化３】
2020054249.tif 000005
【００２７】
上記式（３）で示される反応が利用される場合、段階（ｃ）で使用される酵素は、イノシン、プリンヌクレオチドホスホリラーゼ、キサンチン脱水素酵素（キサンチンオキシダーゼ）、ウリカーゼ、メタノールまたはエタノール、カタラーゼ、およびホルムアルデヒド脱水素酵素およびアセトアルデヒド脱水素酵素を含む。この反応系では、１モルのリン酸から４モルのＮＡＤＨ２を生成する。別の実施形態では、段階（ｃ）では、上記式（３）中のイノシンを他のプリンヌクレオシド、例えばアデノシンまたはグアノシンで置き換えた反応が利用される。プリンヌクレオシドは、好ましくはイノシンである。
【００２８】
段階（ｄ）では、段階（ｃ）で得られたＮＡＤＨ２の還元力により還元される公知の任意の金属イオンおよび当該金属イオンの還元イオンと錯体を形成して、発色することができる公知の任意のキレート試薬が利用される。金属イオンは、例えば鉄イオン、コバルトイオンおよび銅イオンを含むが、これらに限定されない。還元される金属イオンは、例えば鉄三価イオン、コバルト三価イオンおよび銅二価イオンを含むが、これらに限定されない。還元され錯体を形成する金属イオンは、例えば鉄二価イオン、コバルト二価イオンおよび銅一価イオンを含むが、これらに限定されない。好ましくは、金属イオンは鉄イオンである。キレート試薬は、当業者が適宜選択することができる。キレート試薬は、例えばNitroso-PSAP（斎藤幹彦、堀口大吉、喜納兼勇：分析化学  30；635-639,1981）、Nitro-PAPS（大野典子、酒井忠雄：分析化学  46；937-942,1997）、5-Br-PAPSまたは5-Br-PSAAを含むが、これらに限定されない。
【００２９】
ＮＡＤＨ２の還元力は、二価分の還元力に相当する。よって、鉄三価イオン、コバルト三価イオンおよび銅二価イオンのような一価分還元される金属イオンが使用される場合、１分子のＮＡＤＨ２によって、２分子の錯体を形成する金属イオンを生成することができる。
【００３０】
一実施形態では、段階（ｄ）では、上記式（２）または（３）で示される反応が約ｐＨ７〜８前後で進行するため、アルカリ性で金属イオンと錯体を形成して発色することができるNitroso-PSAPやNitro-PAPSが、キレート試薬として使用される。Nitroso-PSAPやNitro-PAPSは、特に鉄二価イオンを高感度に検出することができる。
【００３１】
一実施形態では、段階（ｄ）は、クエン酸、Ｌ−酒石酸、シュウ酸またはニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）などのカルボン酸またはスルホサリチル酸などの芳香族酸を含む条件下で行われる。好ましい実施形態では、段階（ｄ）は、クエン酸、Ｌ−酒石酸、シュウ酸、スルホサリチル酸またはニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）を含む条件下で行われる。さらに好ましい実施形態では、段階（ｄ）は、Ｌ−酒石酸またはニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）を含む条件下で行われる。例えば、段階（ｄ）がカルボン酸または芳香族酸を含む条件下で行われるとき、鉄イオンが水酸化鉄となることを防止することができる。
【００３２】
段階（ｅ）では、段階（ｄ）で得られたサンプル中のキレート試薬による発色を検出する。発色の検出は、通常の施設で一般的に使用されている機器、例えば生化学自動分析装置によって行うことができる。検出される発色は、一般的に、使用されるキレート試薬に依存して変化する。当業者は、使用されるキレート試薬に依存して、発色を検出する通常の施設で一般的に使用されている機器、例えば生化学自動分析装置を適宜調整することができる。例えば、本発明の方法において、金属イオンとして鉄イオンを、キレート試薬としてNitro-PAPSを用いたとき、約５７０ｎｍの吸光度で発色を検出することができる。
【００３３】
一実施形態では、段階（ｃ）で、１モルのリン酸から複数モルのＮＡＤＨ２を生成する場合、段階（ｅ）は、複数倍の増感したキレート試薬による発色を検出することができる。上記式（２）で示される反応が利用される場合、１モルのリン酸から３モルのＮＡＤＨ２を生成することができ、段階（ｅ）は、３倍の増感したキレート試薬による発色を検出することができる。上記式（３）で示される反応が利用される場合、１モルのリン酸から４モルのＮＡＤＨ２を生成することができ、段階（ｅ）は、４倍の増感したキレート試薬による発色を検出することができる。
【００３４】
他の実施態様では、段階（ｄ）で、１分子のＮＡＤＨ２によって、２分子の錯体を形成する鉄イオン、コバルトイオン、銅イオンのような金属イオンが使用される場合、段階（ｅ）は、２倍の増感したキレート試薬による発色を検出することができる。
【００３５】
別の実施形態では、１モルのリン酸から複数モルのＮＡＤＨ２を生成する段階（ｃ）および１分子のＮＡＤＨ２によって２分子の錯体を形成する段階（ｄ）を組み合わせて、さらに増感したキレート試薬による発色を検出することができる。例えば、上記式（２）で示される反応および鉄イオン、コバルトイオン、銅イオンのような１分子のＮＡＤＨ２によって２分子の錯体を形成する段階（ｄ）が利用される場合、段階（ｅ）は、６倍の増感したキレート試薬による発色を検出することができる。例えば、上記式（３）で示される反応および鉄イオン、コバルトイオン、銅イオンのような１分子のＮＡＤＨ２によって２分子の錯体を形成する段階（ｄ）が利用される場合、段階（ｅ）は、８倍の増感したキレート試薬による発色を検出することができる。
【００３６】
一実施形態では、段階（ｅ）は、検出されたキレート試薬による発色からＰＥＡの濃度を決定することを含む。発色からＰＥＡの濃度を決定することは、公知の手段および方法のいずれを用いてもよい。例えば、キレート試薬による発色の吸光度とＰＥＡ濃度との検量線を用いて、ＰＥＡの濃度を決定することができる。
【００３７】
別の実施形態では、段階（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）および／または（ｅ）が同時に行われる。すなわち、各段階で必要な酵素、組成物、試薬、および／またはキットを同時に用いてもよい。段階（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）および／または（ｅ）を同時に行うことで、サンプルのロスを減らすことができ、より正確な測定が可能となる。
【００３８】
上記式（１）に示されるとおり、加水分解されるＰＥＡと、生成されるアセトアルデヒド、アンモニア、およびリン酸の比率は、ＰＥＡ：アセトアルデヒド：アンモニア：リン酸＝１：１：１：１である。このことから、生成されたリン酸の量を測定することで、元のサンプル中に存在していたＰＥＡの量を測定することができる。
【００３９】
さらに、段階（ａ）では、サンプルから段階（ｃ）によって生成される各物質を除去する段階を含むことができる。
【００４０】
例えば、段階（ｃ）として上記式（２）または式（３）で示される反応が利用される場合、段階（ａ）では、サンプルから上記式（２）または式（３）で示される反応によって生成されるヒポキサンチン、尿酸および／または過酸化水素を除去する段階を含むことができる。例えば、段階（ｃ）として上記式（２）または式（３）で示される反応が利用される場合、段階（ａ）では、あらゆる生物由来の、イノシン、プリンヌクレオチドホスホリラーゼ、キサンチン脱水素酵素（キサンチンオキシダーゼ）、ウリカーゼおよび／またはカタラーゼを使用することができる。図１に示されているように、例えば、過酸化水素は、カタラーゼで除去することができる。
【００４１】
別の実施形態では、段階（ａ）の前に、サンプルに上記式（１）で示される反応を触媒する任意の酵素、例えばＰＥＡリアーゼまたはγ−アミノブチルアミノ基転移酵素（ＧａｂＴ）を添加し、その酵素反応を実施する段階がさらに含まれてもよい。
【００４２】
別の実施態様では、本発明は、対象がうつ病に罹患しているかどうかを判定するための方法に関する。当該方法は、（ｉ）本発明のＰＥＡを測定する方法により、サンプル中のＰＥＡを測定する段階；および（ｉｉ）サンプル中のＰＥＡが１．５μｍｏｌ／Ｌ未満である場合に、対象がうつ病に罹患していると判定する段階を含む。
【００４３】
上述した本発明の方法で用いられるサンプルは、ＰＥＡを含む、または含んでいる可能性がある任意のサンプルである。かかるサンプルの例としては、全血、血清、血漿、組織、脳髄液、および尿などの生体試料サンプルが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、本発明で用いられるサンプルは全血、血清、または血漿サンプルであり、好ましくは血漿サンプルである。
【００４４】
他の実施形態では、本発明で用いられるサンプルは、後続の段階に適した状態にするために、事前に処理されていてもよい。例えば、本発明で用いられるサンプルは、抗凝固剤で事前に処理された全血または血漿サンプルである。抗凝固剤の例としては、ＥＤＴＡ、クエン酸、シュウ酸、フッ化ナトリウム、ヘパリンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４５】
別の実施態様では、本発明は、上述した本発明の方法を実施するためのキットに関する。一実施形態では、本発明のキットは、リン酸を除去する手段を含む。この手段の例として、本発明のキットは、Ｏ−ホスホエタノールアミンホスホリアーゼを含む。他の実施形態では、本発明のキットは、さらに金属を含む。例えば、金属は三価の鉄である。他の実施形態では、本発明のキットは、さらにクエン酸、Ｌ−酒石酸、シュウ酸、スルホサリチル酸またはニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、およびNitroso-PSAP、Nitro-PAPS、5-Br-PAPSまたは5-Br-PSAAを含む。
【００４６】
本発明のキットは、本発明の方法に用いられる任意の試薬を含んでもよい。また、測定の実施を簡便にするための適当な試薬、例えばサンプル希釈液、反応希釈液、バッファー、洗浄剤などを含んでもよい。通常、試薬は適切な容器に入れて提供される。またさらに、本発明の方法の実行に必要な説明書などの資材を含んでもよい。
【００４７】
一実施形態では、本発明のキットは、研究専用（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｕｓｅ  Ｏｎｌｙ：ＲＵＯ）キットである。他の実施形態では、本発明のキットは、調査専用（Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ  Ｕｓｅ  Ｏｎｌｙ：ＩＵＯ）キットである。別の実施形態では、本発明のキットは、臨床診断キットである。
【００４８】
別の実施態様では、本発明は、コンピュータに、上述した本発明の方法を実行させるためのプログラムに関する。本発明のプログラムは、コンピュータで読み取り可能な記録媒体に記録させてもよく、装置に付属するコンピュータの記録媒体に記録してもよい。記録媒体の例としては、ハードディスク、ＣＤ、ＤＶＤ、ＵＳＢメモリ、およびフロッピー（登録商標）ディスクが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４９】
別の実施態様では、ＰＥＡを測定するための装置に関する。一実施形態では、本発明の装置は上述した本発明のキットを含む。別の実施形態では、本発明の装置に上述した本発明のプログラムが組み込まれている。
【００５０】
以下に実施例を示して本発明をさらに具体的かつ詳細に説明するが、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されると解すべきではない。
【実施例１】
【００５１】
リン酸除去
サンプルとして５μＬの血漿を用いた。サンプルに以下の表１に記載の１２０μＬの第一試薬を加え、サンプル中のリン酸、ヒポキサンチン、尿酸および過酸化水素を除去し、次に３７℃で５分後に、日立7180自動分析装置（製造業者：日立ハイテクノロジース）を使用して５７０ｎｍで吸光度（吸光度１）を測定した。
【表１】
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【実施例２】
【００５２】
ＰＥＡからのアンモニア、アセトアルデヒドおよびリン酸の生成、リン酸からＮＡＤＨ２の生成、およびキレート試薬による発色の検出
リン酸、ヒポキサンチン、尿酸および過酸化水素除去後の第一試薬が混合されたサンプルに、以下の表２に記載の６０μＬの第二試薬を加えた。次に３７℃で５分後に、日立7180自動分析装置（製造業者：日立ハイテクノロジース）を使用して５７０ｎｍで吸光度（吸光度２）を測定した。
【表２】
2020054249.tif 000007
【実施例３】
【００５３】
ＰＥＡ濃度の測定
０．６２５、３．２５、７．５０、１５．０、３０．０および６０．０μｍｏｌ／Ｌ濃度のＰＥＡを用いて、吸光度とＰＥＡ濃度との検量線を図３として作成した。得られた吸光度２から得られた吸光度１を容量補正して差し引き、酵素反応による吸光度の変化から図３を使用してＰＥＡ濃度を換算した。結果を以下の表３に示す。
【表３】
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【実施例４】
【００５４】
安定度定数
鉄三価イオン(Fe(III))は、鉄二価イオン(Fe(II))よりも、クエン酸、Ｌ−酒石酸、シュウ酸、スルホサリチル酸またはニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）と強固に配位する。鉄三価イオンは、アルカリ性で水酸化鉄となり、ＮＡＤＨ２による還元を妨げ得る。しかし、ＮＡＤＨで還元されて鉄二価イオンになると安定度定数は低下するため、Ｎｉｔｒｏｓｏ−ＰＳＡＰやＮｉｔｒｏ−ＰＡＰＳと配位子置換反応を起こして発色する。測定されたクエン酸、Ｌ−酒石酸、シュウ酸、スルホサリチル酸またはニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）での安定度定数比の結果を以下の表４に示す。
【表４】
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安定度定数の二価と三価の比が、０．４７〜０．５６で最もＮＡＤＨ２の還元力が伝達される。
【実施例５】
【００５５】
様々な条件下での、キレート試薬による作用および発色
様々な条件下での、鉄三価イオンの保護キレート試薬として上記第二試薬中のＬ−酒石酸の代わりにクエン酸、シュウ酸、スルホサリチル酸またはニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）を用いて、ＮＡＤＨ２による鉄二価イオンへの還元能力を実施例２と同様に、５７０ｎｍで吸光度（吸光度２）を測定した。次に、実施例３と同様に、ＰＥＡ濃度を換算した。結果を以下の表５に示す。
【表５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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