(57)【要約】【課題】非腫瘍細胞を攻撃することなく癌細胞を死滅させる／溶解する細胞を設計するために、健康な組織では発現しない癌細胞に特異的な抗原を選択する方法を提供すること【解決手段】腫瘍細胞及び非腫瘍細胞を含む細胞試料を提供すること、並びに細胞組織と、蛍光部分及び抗原認識部分を含む接合体（以下「接合体」と呼ぶ）とを接触させるステップ、細胞組織から結合していない接合体を取り出し、そして最初の接合体の蛍光部分により発光した蛍光放射線により接合体に結合した細胞を検出するステップ、接合体の蛍光部分により発光した蛍光放射線を消すステップを繰り返すことにより特徴付けられる、腫瘍細胞で曝された１つ以上の標的抗原に特異的なキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）を含む細胞を提供するための方法【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍細胞及び非腫瘍細胞を含む細胞試料を提供すること、及び
−  細胞組織と、蛍光部分及び抗原認識部分を含む接合体とを接触させるステップ
−  細胞組織から結合していない接合体を取り出し、そして最初の接合体の蛍光部分により発光した蛍光放射線により接合体に結合した細胞を検出するステップ
−  接合体の蛍光部分により発光した蛍光を消すステップ
を繰り返すことにより特徴付けられる、腫瘍細胞で曝された１つ以上の標的抗原に特異的なキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）を含む細胞を提供するための方法であって、
その際、接合体は、蛍光部分と異なる抗原を認識する抗原認識部分とを含み、
異なる抗原を認識する抗原認識部分を備えた少なくとも２個の接合体を同定するまで、腫瘍細胞と非腫瘍細胞とを識別するための組み合わせを可能にし、かつ
キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）として、同定された少なくとも２個の抗原認識部分を細胞に提供する、前記方法。
【請求項２】
キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）を含む細胞が、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、又は他の細胞に結合することによって誘発される場合に他の細胞を破壊するように設計された細胞からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
少なくとも２個の抗原認識部分が、ＡＮＤ型、ＯＲ型又はＮＯＴ型として提供されることを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
少なくとも２個の抗原認識部分が、ＡＤＡＰＴＥＲ型として提供されることを特徴とする、請求項１から３までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）の抗原認識部分としてビオチンを含む細胞を提供し、かつ同定される少なくとも２つの抗原認識部分と抗ビオチン部分との接合体を提供し、そして前記接合体と前記細胞とを接合することによって、キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）として同定された少なくとも２つの抗原認識部分を細胞に提供することを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
第一のキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）の抗原認識部分としてビオチン及び第二のキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）の抗原認識部分として第二のエピトープを含む細胞を提供し、かつ同定される少なくとも２つの抗原認識部分と抗ビオチン部分及び第二の部分との接合体を提供して前記接合体と前記細胞とを接合することによって、キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）として同定された少なくとも２つの抗原認識部分を細胞に提供することを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
抗原認識部分を備えた少なくとも２つの接合体が、腫瘍細胞の少なくとも２０％及び非腫瘍細胞の５％未満を結合することを特徴とする、請求項１から６までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
抗原認識部分を備えた少なくとも２つの接合体が、細胞試料の非腫瘍細胞よりも、少なくとも１０倍高く腫瘍細胞を結合すること特徴を特徴とする、請求項１から７までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
蛍光部分により発光される蛍光放射線を、接合体の酵素による分解によって消光することを特徴とする、請求項１から８までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
蛍光部分により発光される蛍光放射線を、放射線によって消光することを特徴とする、請求項１から８までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１から１０までのいずれか１項に記載の方法により得られる細胞集団。
【請求項１２】
請求項１から１０までのいずれか１項に記載の方法により得られる医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、適切なキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）を細胞に提供するための個体の健康な細胞ではなく癌細胞に曝された抗原を選択する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は、無秩序な細胞増殖を含む広範囲の疾患の群である。癌においては、細胞が制御不能に分裂及び成長して、悪性腫瘍を形成し、そして身体の近くの部分に浸潤する。癌は、リンパ系又は血流を介して身体のより遠い部位にも拡散することがある。
【０００３】
キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）の技術は、癌のための養子細胞免疫療法について見込みのあるアプローチを提供しうる。慣用的に、ＣＡＲは、ヒンジ及び膜貫通領域を介してＴ細胞シグナル伝達分子の細胞質ドメインに結合した腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に特異的な抗体の単鎖フラグメント可変（ｓｃＦｖ）を含む。
【０００４】
キメラ抗原レセプター（ＣＲＡ）をＴ細胞に導入することにより（以下ＣＡＲ Ｔ細胞という）、腫瘍細胞を「非自己細胞」として認識するように作成されたＴ細胞が生じ、したがって、免疫系が腫瘍細胞を根絶するのに役立つ。例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞は、標的細胞の表面分子と接触してＣＡＲ Ｔ細胞の活性化を引き起こし、そして標的細胞の溶解を導きうる。
【０００５】
しかしながら、効果的なＣＡＲ Ｔ細胞を開発することは、とりわけ以下の問題に直面している：
ｉ）１つの表面分子は十分に特異的ではない場合があり、非腫瘍細胞でも発現しうる（安全性の問題）
ｉｉ）表面分子は全ての腫瘍細胞で発現しておらず、生き延びた（逃れた）腫瘍細胞は再発につながる
ｉｉｉ）腫瘍細胞は表面分子の発現を遮断し、治療から逃れる
ｉｖ）抗原の発現レベル又は単一バインダーの親和性が、効率的なＴ細胞活性化を可能にするためには低すぎる
ｖ）腫瘍試料内及び腫瘍試料間での抗原発現の強い異種性が、腫瘍マーカー発現の個別化プロファイリング（動態学）を要求し、いくつかのマーカーは、同一のタイプからの腫瘍の腫瘍細胞の全てに出現するか又は全く出現しない。
【０００６】
前記問題に対処する潜在的な方法は、標的として１つより多い表面分子、すなわち、いわゆる所与の細胞で１つより多い標的を検出する「ＤＵＡＬ ＣＡＲ Ｔ細胞」を使用することである。
【０００７】
「ＤＵＡＬ ＣＡＲ Ｔ細胞」アプローチは、これまでに適切に確立されておらず、特に、より複雑な複数の標的の組み合わせが適切に腫瘍を攻撃する必要があり、この特定の組み合わせは１人より多くの又は数人の患者に適合する可能性が低くなる（治療の個別化が必要である）という事実をもたらす。さらに、最初の治療後に腫瘍がさらに成長する場合に、腫瘍をさらに根絶するためにＣＡＲの新しい組み合わせを見出す必要がある可能性が非常に高い。
【０００８】
さらに、患者個人について腫瘍マーカー発現の個別化した表現型決定を実施するために、ＣＡＲとＣＡＲ Ｔ細胞との組み合わせは、患者及び徴候により示される許容できる時間枠で開発される必要がある。臨床実践において、最適な時間枠は数週間である。
【０００９】
したがって、ＣＡＲ細胞に基づく癌についての任意の免疫療法の成功は、それぞれの腫瘍細胞に特異的な抗原の速く確実な選択に依存する。
【００１０】
細胞表面抗原の特定の群がヒト癌細胞で発現されるが、しかし非悪性細胞では発現されないか、又はより低いレベルで発現されることが見出されている。これらの抗原（「マーカー」とも呼ばれる）は、マーカーに特異的に結合するリガンドを介して、かかる癌細胞の逃避メカニズムを同定及び／又は印付け及び／又は破壊及び／又は無能化するために使用されうる。
【００１１】
したがって、本発明の目的は、非腫瘍細胞を攻撃することなく癌細胞を死滅させる／溶解する細胞を設計するために、健康な組織では発現しない癌細胞に特異的な抗原を選択する方法を提供することであった。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の第一の目的は、腫瘍細胞及び非腫瘍細胞を含む細胞試料を提供すること、及び
−  細胞組織と、蛍光部分及び抗原認識部分を含む接合体（以下「接合体」と呼ぶ）とを接触させるステップ
−  細胞組織から結合していない接合体を取り出し、そして最初の接合体の蛍光部分により発光した蛍光放射線により接合体に結合した細胞を検出するステップ
−  接合体の蛍光部分により発光した蛍光放射線を消すステップ
を繰り返すことにより特徴付けられる、腫瘍細胞で曝された１つ以上の標的抗原に特異的なキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）を含む細胞を提供するための方法であり、
その際、接合体は、蛍光部分と異なる抗原を認識する抗原認識部分とを含み、
異なる抗原を認識する抗原認識部分を備えた少なくとも２つの接合体を同定するまで、腫瘍細胞に結合するが本質的に非腫瘍細胞には結合せず、かつ
キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）として、同定された少なくとも２個の抗原認識部分、好ましくは２個、３個、４個もしくは５個の抗原認識部分を細胞又は細胞試料又は細胞集団に提供する。
【００１３】
キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）を含む細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、又は他の細胞に結合することによって誘発される場合に他の細胞を破壊する（溶解する）ように遺伝子操作された細胞からなる群から選択されうる。
【００１４】
腫瘍細胞の一部のみが同定又は攻撃される場合でさえも腫瘍が破壊されうるために、同定された接合体は全ての腫瘍細胞に結合する必要はない。好ましくは、本発明の方法は、異なる抗原を認識する抗原認識部分を備えた少なくとも２つの接合体を同定し、腫瘍細胞の少なくとも１％、より好ましくは少なくとも１０％及び最も好ましくは少なくとも３０％に結合するまで実施される。
【００１５】
接合体が０％の非腫瘍細胞に結合するように所望される場合に、一定量の非腫瘍細胞を標的とすることが治療に容認できる。好ましくは、本発明の方法は、少なくとも異なる抗原を認識する抗原認識部分を備えた少なくとも２つの接合体を同定し、いくつかのタイプの組織又は器官の腫瘍細胞に及び非腫瘍細胞の最大１０％、より好ましくは最大５％及び最も好ましくは最大１％に結合するまで実施される。「いくつかのタイプの組織又は器官」という用語は、例えば膵臓又は肝臓をいう。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の方法は、異なる抗原を認識する抗原認識部分を備えた２つの接合体の１セット以上の、及び続いてキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）として抗原認識部分と同定された少なくとも２つを有する１つ以上の異なる細胞の急速な同定を可能にする。１セットより多くの接合体及び１つより多くのＣＡＲ細胞を提供することは、腫瘍細胞を破壊し、及び／又は腫瘍細胞を標的として抗原を下方制御して標的を逃れる機会が高まる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）の一般的なドメインを示す。
【図２】図２は、キメラ抗原レセプターの一般的な構造概念を示す。
【図３】図３は、ＡＮＤ論理を提供するＣＡＲ−Ｔ細胞の機能の概略図を示す。
【図４】図４は、ＮＯＴ論理を提供するＣＡＲ−Ｔ細胞の機能の概略図を示す。
【図５】図５は、膵臓癌細胞で発現されるマーカーを検出するための蛍光部分及び抗原認識部分を含む複数の接合体での１つ及び同一の膵臓癌標本の染色を示す。
【図６】図６は、健康な組織ではなく特異的に膵臓癌細胞を標識化するマーカーの組み合わせを検出するための、膵臓癌細胞及び健康な組織での選択マーカーの比較標識化を示す。
【図７】図７は、潜在的な標的候補を同定するための高悪性度漿液性卵巣癌の標識化を示す。
【図８】図８は、健康な組織ではなく特異的に卵巣癌細胞を標識化するマーカーの組み合わせを検出するための、高悪性度漿液性卵巣癌及び健康な組織での選択マーカーの比較発現分析を示す。
【００１８】
定義
「キメラ抗原レセプター」又は「ＣＡＲ」という用語は、異なる源に由来する新たな特異性を備えた遺伝子操作された細胞をいう。
【００１９】
「腫瘍」という用語は、「新生物」として医学的に公知である。全ての腫瘍が癌性であるわけではなく、良性腫瘍は隣接組織に浸潤せず、かつ身体全体に拡散しない。本発明の方法は、新生物及び良性腫瘍の双方に適用されうる。
【００２０】
「癌」という用語は、無秩序な細胞成長を伴う疾患の広範な群をいう。癌において、細胞（癌性細胞）は、制御不能に分裂及び成長して、悪性腫瘍を形成し、そして身体の近くの部位に浸潤する。癌は、リンパ系又は血流を介して身体のより遠い部位にも拡散することがある。
【００２１】
抗体のようなリガンドの、それらの断片の又はＣＡＲの抗原結合ドメインに関する「バインダー」又は「特異的に結合」又は「〜に特異的な」という用語は、特定の抗原を認識し結合するが、実質的に試料中で他の分子を認識せず又は結合しない抗原結合ドメインをいう。１つの種からの抗原に特異的に結合する抗原結合ドメインは、他の種からの抗原にも結合してよい。この異種間反応は、特異的な抗原結合ドメインの定義に反しない。抗原に特異的に結合する抗原結合ドメインは、その抗原の異なる対立遺伝子の形（対立遺伝子バリアント、スプライスバリアント、アイソフォーム等）にも結合してもよい。この交差反応は、特異的な抗原結合ドメインの定義に反しない。
【００２２】
本明細書において使用される「遺伝子操作された細胞」及び「遺伝的に改変された細胞」という用語は、互換可能に使用できる。これらの用語は、細胞又はその子孫の遺伝型又は表現型を順に改変する外来遺伝子又は核酸配列を含むこと及び／又は発現することを意味する。特に、これらの用語は、天然の状態でこれらの細胞中で発現されないペプチド又はタンパク質を安定して又は一過性で発現するために当業者に周知の組換え法により操作された細胞、好ましくはＴ細胞をいう。例えば、Ｔ細胞は、それらの細胞表面で、人工的な構築物、例えばキメラ抗原レセプターを発現するために遺伝子操作される。例えば、ＣＡＲをコードする配列は、レトロウイルスベクター又はレンチウイルスベクターを使用して細胞中に送達されてよい。
【００２３】
本明細書において使用される「標的」という用語は、抗原結合ドメイン、例えば抗体又はＣＡＲの抗原結合ドメインによって特異的に認識されるべき細胞に関連する抗原又はエピトープをいう。抗体認識のための抗原又はエピトープは、細胞表面に結合することができるが、分泌され、細胞外膜の一部であり、又は細胞から脱落されてもよい。
【００２４】
本明細書において使用される「抗体」という用語は、当業者に周知の方法により作出されてよいポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体及びそれらの断片をいう。抗体は、任意の種、例えばマウス、ラット、ヒツジ、ヒトのものであってよい。治療目的のために、非ヒト抗原結合断片が使用されるべきである場合に、当業者に公知の任意の方法によりヒト化することができる。抗体は、改変された抗体（例えば、オリゴマー、縮小された抗体、酸化された抗体、及び標識した抗体）であってもよい。
【００２５】
本明細書において使用される「キラー細胞」という用語は、他の細胞、例えば癌細胞を死滅させる／破壊する／溶解することができる細胞をいう。最も頻繁に、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞及びマクロファージが、キラー細胞として使用されうる。
【００２６】
本明細書において使用される「遺伝子操作されたキラー細胞」という用語は、標的細胞の特異的な死滅を可能にするために遺伝的に改変されたキラー細胞、例えばそれぞれの標的を発現する腫瘍細胞を死滅させるために標的に対してＣＡＲで改変させた細胞をいう。
【００２７】
発明の詳細な説明
本発明の方法は、接合体の適したセットの急速な同定、続いて細胞試料の腫瘍細胞を破壊するための適切なＣＡＲ細胞の急速な遺伝子操作を可能にする。腫瘍細胞及び非腫瘍細胞を含む細胞試料は、好ましくは同一の患者からの同一の組織又は器官に由来する。
【００２８】
細胞試料中で腫瘍細胞及び非腫瘍細胞を識別するために、当業者、例えば病理学者は、細胞試料に腫瘍が含まれているかどうか、含まれている場合に細胞試料のどの部分かを、公知の基準又は腫瘍学における専門家に従って決定してよい。かかる基準は、例えば、Ａｒｂｅｉｔｓｇｅｍｅｉｎｓｃｈａｆｔ ｄｅｒ Ｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔｌｉｃｈｅｎ Ｍｅｄｉｚｉｎｉｓｃｈｅｎ Ｆａｃｈｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔｅｎ（ＡＷＭＦ）によって出版されたガイドラインであり、例えば細胞、組織構造、倍数性、バイオマーカー発現（例えばＨｅｒ２、ｐ５３、ＢＲＡＣ１、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ等）の形態を含んでよい。
【００２９】
そして、細胞試料を複数のバインダーと接触させて認識パターンを特徴付け、腫瘍細胞に特異的なバインダー及び非腫瘍細胞に特異的なバインダーを選択する。したがって、同定されたバインダーを、後で特定されるようにその後の治療に使用できる。
【００３０】
異なる方法において、異なる抗原を認識する抗原認識部分を備えた少なくとも２つの接合体は、細胞試料の腫瘍細胞の少なくとも２０％及び非腫瘍細胞の５％未満に結合する。好ましくは、異なる抗原を認識する抗原認識部分を備えた少なくとも２つの接合体は、細胞試料の腫瘍細胞の少なくとも５０％及び非腫瘍細胞の５％未満に結合する。より好ましくは、異なる抗原を認識する抗原認識部分を備えた少なくとも２つの接合体は、細胞試料の腫瘍細胞の少なくとも７０％及び非腫瘍細胞の５％未満に結合する。
【００３１】
他の変法において、抗原認識部分を備えた少なくとも２つの接合体が、細胞試料の非腫瘍細胞よりも、少なくとも１０倍、好ましくは少なくとも５０倍、より好ましくは少なくとも１００倍多い腫瘍細胞を破壊することにより特徴付けられる。
【００３２】
本発明の方法は、実質的に非腫瘍細胞ではなく腫瘍細胞に結合する、異なる抗原を認識する抗原認識部分を備えた少なくとも２つの接合体を同定することを含む。
【００３３】
ＣＡＲが少なくとも２つの抗原認識部分を備える場合に、ＣＡＲは、種々の論理ゲートで実施するためのトリガーとなってよい。論理ゲートは、「ＡＮＤ」型、「ＮＯＴ」型、「ＯＲ」型のＣＡＲ細胞として文献に記載されている。後により詳細に開示されるように、本発明の方法において、少なくとも２つの抗原認識部分は、ＡＮＤ型、ＯＲ型又はＮＯＴ型として提供され、かつ／又は抗原認識部分を有する少なくとも２つはＡＤＡＰＴＥＲ型として提供される。これら全ての変法における少なくとも２つの抗原認識部分は、キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）として提供される。
【００３４】
キメラ抗体レセプター（ＣＡＲ）
図１及び２において一般的に示したように、キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）は、抗原結合ドメインを含む細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含んでよい。細胞外ドメインは、リンカーにより膜貫通ドメインに連結されてよい。細胞外ドメインは、シグナルペプチドにも連結されてもよい。
【００３５】
「シグナルペプチド」という用語は、細胞内のタンパク質の輸送及び局在化を、例えばある細胞小器官（例えば小胞体）及び／又は細胞表面に向けるペプチド配列をいう。
【００３６】
「抗原結合ドメイン」という用語は、抗原に特異的に結合する（それにより、抗原を含む細胞を標的にすることができる）ＣＡＲの領域をいう。本発明により得られるＣＡＲは、１つ以上の抗原結合ドメインを含んでよい。一般的に、ＣＡＲの抗原結合ドメインは細胞外である。抗原結合ドメインは、抗体又はそれらの断片を含んでよい。抗原結合ドメインは、例えば、完全長重鎖、Ｆａｂ断片、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片、二価単鎖抗体又は二重抗体を含んでよい。所与の抗原に特異的に結合する任意の分子、例えば天然に生じるレセプター由来のアフィボディ又はリガンド結合ドメインが、抗原結合ドメインとして使用されうる。しばしば、抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖである。通常、ｓｃＦｖにおいて、免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖の可変域は、可動性リンカーにより融合されて、ｓｃＦｖを形成する。かかるリンカーは、例えば「（Ｇ4／Ｓ1）3−リンカー」であってよい。
【００３７】
ＣＡＲの膜貫通ドメインは、例えば４−１ＢＢ、ＣＤ８及び／又はＣＤ２８の膜貫通ドメインの配列を含んでよい。さらに、ＣＤ２８、ＣＤ１３７又はＣＤ３ゼータの細胞内シグナル伝達ドメインの配列を含む活性化細胞内シグナル伝達ドメインが存在してよい。
【００３８】
活性化細胞内シグナル伝達ドメインの代わりに、ＰＤ１又はＣＴＬＡ４のような細胞内シグナル伝達ドメインの配列を有する細胞内シグナル伝達ドメインを阻害するＣＡＲを含んでよい。
【００３９】
この実施形態の好ましい変法において、キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）は、追加の抗原結合ドメイン又は追加のＣＡＲを有さないＣＤ２０に特異的な抗原結合ドメインを含み、該抗原結合ドメインは、１つの膜貫通ドメイン及び１つ以上のシグナル伝達ドメインに接合している。この変法は図２Ａにおける例により示される。
【００４０】
場合により、抗原結合ドメインは、ＣＡＲが使用される種と同一の種に由来することが有益である。例えば、ＣＡＲがヒトにおいて治療的に使用することが計画されている場合に、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、ヒトもしくはヒト化抗体又はそれらの断片を含むことが有益でありうる。ヒトもしくはヒト化抗体又はそれらの断片は、当業者に周知の種々の方法により製造されることができる。
【００４１】
本明細書において使用される「スペーサー」又は「ヒンジ」という用語は、抗原結合ドメインと膜貫通ドメインとの間にある親水性領域をいう。本発明により同定されるＣＡＲは、細胞外スペーサードメインを含んでよいが、しかしかかるスペーサーを省略することも可能である。スペーサーは、抗体もしくはそれらの断片のＦｃ断片、抗体もしくはそれらの断片のヒンジ領域、抗体のＣＨ２もしくはＣＨ３領域、アクセサリータンパク質、人工スペーサー配列、又はそれらの組み合わせを含んでよい。スペーサーの著名な例は、ＣＤ８アルファヒンジである。
【００４２】
ＣＡＲの膜貫通ドメインは、かかるドメインのための任意の所望の天然源又は合成源に由来しうる。供給源が天然である場合に、ドメインは、任意の膜結合タンパク質又は膜貫通タンパク質に由来してよい。
【００４３】
本発明のＣＡＲの細胞質ドメイン又は細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲが発現される免疫細胞の少なくとも１つの通常のエフェクター機能の活性化に関与する。「エフェクター機能」は、細胞の特殊化された機能を意味し、例えば、Ｔ細胞におけるエフェクター機能は、細胞溶解活性又はヘルパー活性であってよく、これはサイトカインの分泌を含む。細胞内シグナル伝達ドメインは、エフェクター機能シグナルを伝達し、本発明のＣＡＲを発現する細胞に特殊化された機能を果たすように指示するタンパク質の部分をいう。細胞内シグナル伝達ドメインは、エフェクター機能シグナルを伝達するために十分な所与のタンパク質の細胞内シグナル伝達ドメインの任意の完全又は切断部分を含んでよい。
【００４４】
ＣＡＲにおいて使用するための細胞内シグナル伝達ドメインの著名な例は、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）の細胞質配列、及び抗原レセプターの会合（ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ）に続いてシグナル伝達を開始するために共同作用するコレセプターを含む。
【００４５】
少なくとも２つの抗原結合ドメインを有するＣＡＲについて、抗原結合ドメインは異なる機能を有してよい。本発明の方法は、「ＡＮＤ」型、「ＮＯＴ」型、「ＯＲ」型のＣＡＲ細胞として提供されうる腫瘍治療に適した新たなＣＡＲ細胞についての開発時間を縮める。
【００４６】
本発明の一実施形態において、ＣＡＲ細胞は活性化されるのみであり、すなわち、双方の抗原結合ドメインがそのそれぞれの抗原に結合した場合にのみシグナルドメインのシグナルが誘発される。かかるＣＡＲ細胞を、以降「ＡＮＤ−ＣＡＲ」という。「ＡＮＤ−ＣＡＲ」細胞の抗原結合ドメインは、本発明の方法により、例えば、全くないか又は多くても１つが健康な細胞で発現されている腫瘍細胞に存在する２つの抗原を同定することにより同定されてよい。図３（Ｔｒａｎｓｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２０１６；５（Ｓ１）：Ｓ６１−Ｓ６５において出版されている）は、ＡＮＤ−ＣＡＲが、健康な細胞（ｉ）及び（ｉｉ）により不活性化されるが、しかし腫瘍細胞（ｉｉｉ）により活性化される様子を示す。
【００４７】
本発明の他の実施形態において、ＣＡＲ細胞は活性化されるのみであり、すなわち、１つの抗原結合ドメインがそのそれぞれの抗原に結合し、かつ他には結合しない場合にのみ、シグナルドメインのシグナルが誘発される。かかるＣＡＲ細胞を、以降「ＮＯＴ−ＣＡＲ」という。「ＮＯＴ−ＣＡＲ」細胞の抗原結合ドメインは、本発明の方法により、例えば、１つのみが腫瘍細胞で発現されている健康な細胞に存在する２つの抗原を同定することにより同定されてよい。図４（Ｔｒａｎｓｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２０１６；５（Ｓ１）：Ｓ６１−Ｓ６５において出版されている）は、ＮＯＴ−ＣＡＲが、健康な細胞（ｉ）により不活性化されるが、しかし腫瘍細胞（ｉｉ）により活性化される様子を示す。
【００４８】
本発明のさらに他の実施形態において、ＣＡＲ細胞は既に活性化されており、すなわち、２つの抗原結合ドメインのうち１つのみがそのそれぞれの抗原に結合した場合にシグナルドメインのシグナルが誘発される。かかるＣＡＲ細胞を、以降「ＯＲ−ＣＡＲ」という。「ＯＲ−ＣＡＲ」細胞の抗原結合ドメインは、本発明の方法により、例えば、健康な細胞ではなく、腫瘍細胞に存在する２つの抗原を同定することにより同定されてよい。
【００４９】
処理時間におけるさらなる短縮は、いわゆる「ＡＤＡＰＴＥＲ ＣＡＲ」技術を使用することにより達成されうる。「ＡＤＡＰＴＥＲ ＣＡＲ」細胞は、シグナル伝達ドメイン、膜貫通ドメイン及び抗原認識特性を有さないリンカードメインを含む。そして、このリンカードメインに、１つ以上の抗原認識部分が接合される（リンカー＋分子＝アダプター）。したがって、本発明による方法において、キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）として抗原認識部分を有する少なくとも２つを、ＡＤＡＰＴＥＲ型として提供してよい。
【００５０】
本発明の変法において、キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）の抗原認識部分としてビオチンを含む細胞を提供し、かつ同定される少なくとも２つの抗原認識部分と抗ビオチン部分との接合体を提供し、そして該接合体と該細胞とを接合することによって、キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）として同定された少なくとも２つの抗原認識部分を細胞に提供する。
【００５１】
本発明の他の変法において、第一のキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）の抗原認識部分としてビオチン及び第二のキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）の抗原認識部分として第二のエピトープを含む細胞を提供し、かつ同定される少なくとも２つの抗原認識部分と抗ビオチン部分及び第二の部分との接合体を提供し、そして前記接合体と前記細胞とを接合することによって、キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）として同定された少なくとも２つの抗原認識部分を細胞に提供する。
【００５２】
適したリンカーは、哺乳動物（ヒト）の体に存在しないか、又は哺乳動物（ヒト）の体中で天然に存在する抗体に対して低い親和性を有する分子である。例えば、適切なアダプター、例えば所望の接合した抗原認識部分に接合した抗ビオチン抗体により同定されるビオチン単位又は改変型ビオチンが適している。
【００５３】
「ＡＤＡＰＴＥＲ ＣＡＲ」技術は、国際出願番号第ＥＰ２０１７／０７７５４５号（PCT/EP2017/077545）において開示されており、ＣＡＲ細胞に結合したリンカーについて「リンカー／標識エピトープ」（ＬＬＥ）という用語を使用している。
【００５４】
好ましくは、ＬＬＥは、ＣＡＲを発現している細胞で治療することを意図した被験者に免疫反応を引き起こさない。これは、天然に生じるエピトープ認識分子に由来するＣＡＲの細胞外ＬＬＥ結合ドメインを使用して、リンカー部分を有さない内因性標識部分、すなわち被験者において天然に存在する分子（自己抗原）よりも高い選択性でＬＬＥが結合することにより達成できる。
【００５５】
例えば、ＣＡＲの細胞外ＬＬＥ結合ドメインは、前記の天然に生じる分子よりも少なくとも２倍、好ましくは少なくとも５倍、より好ましくは少なくとも１０倍高い親和性で、前記ＬＬＥに結合する。
【００５６】
「ＡＤＡＰＴＥＲ」ＣＡＲ細胞の場合に、リンカー単位及びアダプターを備えたＣＡＲ細胞が患者に並行して適用される。この実施形態の利点は、リンカーを有するＣＡＲ細胞が、同定された抗原認識部分とは無関係に製造されてよく、ゼロから開発される必要がないことである。アダプターのみが生じ、試験されるべきである。このアプローチは、従来の化学療法と同様に、治療の強度及び動態を制御することも可能である。
【００５７】
検出プロセス
複数の潜在的なバインダー又は接合体を調査するために、接合体の酵素による分解によって蛍光部分により発せられる蛍光放射線を消光することが好ましい。かかる接合体は、例えば、欧州特許公開番号第３０３７８２１号（EP3037821A1）、欧州特許出願番号第１６２０３６８９．１号（EP16203689.1）又は欧州特許出願番号第１６２０３６０７．３号（EP 16203607.3）において開示されている。
【００５８】
代わりに、蛍光部分により発せられる蛍光放射線を、放射線により消光する。
【００５９】
癌治療のための使用
本発明の方法により得られる細胞集団は、医薬組成物として、好ましくはヒト癌、特にヒト膵臓癌の治療方法において使用されてよい。
【００６０】
医薬組成物は、好ましくは、本発明の方法により得られるＣＡＲを発現する遺伝子操作した細胞集団を含む。本発明の変法において、医薬組成物は、癌の治療のために化学療法、放射線、又は免疫調節剤と組み合わせて使用される。
【００６１】
治療されるべき癌は、造血組織系血液癌、骨髄異形成症候群、膵臓癌、頭頸部癌、皮膚腫瘍、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）における微小残存病変（ＭＲＤ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、肺癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、結腸癌、メラノーマもしくは他の血液学的癌、及び充実性腫瘍、又はそれらの任意の組み合わせを含んでよい。他の実施形態において、癌は、血液学的癌、例えば白血病（例えば慢性リンパ球白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ球白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、又は慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ））、リンパ腫（例えばマントル細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫又はホジキンリンパ腫）、又は多発性骨髄腫、又はそれらの任意の組み合わせを含む。さらに、癌は、口腔及び咽頭の癌（舌、口、咽頭、頭頸部）、消化器系の癌（食道、胃、小腸、結腸、直腸、肛門、肝臓、肝内胆管、胆嚢、膵臓）、呼吸器系の癌（喉頭、肺及び気管支）、骨及び関節の癌、軟組織の癌、皮膚の癌（メラノーマ、基底細胞癌及び扁平上皮癌）、小児腫瘍（神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、ユーイング肉腫）、中枢神経系の腫瘍（脳、星状細胞腫、グリア芽腫、神経膠腫）、並びに乳房、生殖器系（子宮頸部、子宮体、卵巣、外陰部、膣、前立腺、精巣、陰茎、子宮内膜）、泌尿器系（膀胱、腎臓及び腎盂、尿管）、眼及び眼窩、内分泌系（甲状腺）、並びに脳、並びに他の神経系の癌、又はそれらの任意の組み合わせを含む成人癌腫を含んでよい。
【００６２】
癌の治療は、開示された少なくとも１種の抗原又は標的分子として開示された抗原の任意の組み合わせを含む任意の方法を包含してよい。かかる方法は、例えば、抗原に結合し、この抗原を発現する癌性細胞の生存能力に影響を及ぼし、好ましくは癌性細胞を死滅させる作用剤での治療であってよい。その例は、既に開示されている腫瘍崩壊性ウイルス、ＢｉＴＥｓ（登録商標）、ＡＤＣＣ及びイムノトキシンである。
【００６３】
治療のために、被験体の免疫細胞、例えばＴ細胞を単離してよい。被験体は、前記癌に罹患していてよく、又は健康な被験体であってもよい。これらの細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで遺伝的に改変されて、本発明の１種以上のＣＡＲを発現する。これらの遺伝子操作された細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで活性化及び増加されてよい。細胞療法において、これらの遺伝子操作された細胞は、それを必要とするレシピエントに注入されてよい。これらの細胞は、医薬組成物（前記細胞＋製剤学的に認容性のキャリヤー）であってよい。注入された細胞は、レシピエントにおける開示された抗原の１種以上を発現する癌性細胞を死滅させる（又は癌性細胞の成長を少なくとも停止させる）ことができる。レシピエントは、細胞を得た同一の被験体であってよく（自己細胞療法）、又は同種の別の被験体からであってもよい（同種細胞療法）。
【００６４】
例えば、キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）として次の抗原認識部分を有する細胞が、ある癌のタイプを治療するために使用されてよい。
【００６５】
ａ）もっぱら腫瘍、例えば膵臓腫瘍のための陽性マーカーとしてＣＬＡ、ＴＳＰＡＮ８。
【００６６】
ｂ）健康な細胞からの腫瘍、例えば膵臓腫瘍を識別するための陽性マーカーとしてＣＬＡ及びＮＯＴマーカーとしてＣＤ４５。
【００６７】
ｃ）もっぱら腫瘍、例えば卵巣癌のための陽性マーカーとしてＥｐｃａｍ及びＣＤ９０。
【００６８】
ｄ）健康な細胞からの腫瘍、例えば乳癌を識別するための陽性マーカーとしてＳＳＥＡ４並びに陰性マーカーとしてＣＤ３４及びＣＤ１３３。
【実施例】
【００６９】
以下の実施例は、本発明のより詳細な説明を目的とするが、本発明はこれらの実施例に制限されない。
【００７０】
実施例１：膵臓癌（ＰａＣａ）細胞と非ＰａＣａ細胞との識別を可能にする組み合わせでの蛍光部分及び抗原認識部分を含む接合体の組み合わせの同定。
【００７１】
患者からの膵臓癌（ＰａＣａ）を、異なる抗体蛍光色素接合体での染色に続いて、画像化、及び脱染色により分析した。
【００７２】
ＰａＣａ試料の凍結切片を固定し、それぞれの標本を１０１個の蛍光標識した抗体及び核標識色素ＤＡＰＩで染色した（図５）。そのようにして得られた画像を、単一ピクセル及び分割細胞のレベルで抗原の定量化及びパターン認識について分析した。
【００７３】
潜在的な標的の選択を絞り込むために、同一の標本を抗ＥｐＣＡＭ＋（ＣＤ３２６）抗体蛍光色素接合体で染色した場合に観察されるパターンと同様の染色パターンを示した抗体接合体を選択した。ＥｐＣＡＭは、種々のヒト上皮組織及びカルシノーマに対するその発現についての分野において周知である。これは、図５において示されているように、例えばＣＬＡ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ３１８及びＴＳＰＡＮ８にあてはまった。
【００７４】
続いて、潜在的な標的の２０個の蛍光色素を接合した抗体、例えばＣＬＡ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ３１８及びＴＳＰＡＮ８を、同一の染色／画像化／脱染色プロセスで、１６個の健康な又は正常に近い（ＮＡＴ）組織に対してそれらの染色パターンを評価し、その結果を図６において示した。これを、対象の抗原のオフ腫瘍発現（off tumor expression）を評価して、標的候補の潜在的なオンターゲットオフ腫瘍毒性（on-target off-tumor toxicity）の予測を可能にするために実施した。この分析の例を、マーカーＣＬＡ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ３１８及びＴＳＰＡＮ８について図６ａ〜ｃにおいて示す。
【００７５】
前記実施例はこれらのマーカーがＰａＣａ試料で発現していることを示し、これらのマーカーが健康な組織でも発現するかどうかを調査した。例えば、ＣＤ３１８は、他にも結腸、肺及び肝臓の組織に見られる。したがって、単一マーカーとしてＣＤ３１８を使用してＣＡＲ Ｔ細胞を誘導することは、示された組織でオンターゲットオフ腫瘍毒性を生じる可能性が最も高くなる。
【００７６】
したがって、前記実験のデータを分析して、同一の膵臓癌標本で発現を示すが、同一の健康な組織標本では発現を示さないマーカーを見出した。図６ａ〜ｃに示すように、画像の視覚的比較又は生体情報分析によって、多くの組み合わせを同定できた。視覚的比較は、２種の画像が実質的に２種の異なる接合体の同一の発現パターンを示す場合に、それぞれのマーカーが、実質的に同一の細胞で発現していることを意味する。一方で、２種の画像が２種の異なる接合体について異なる発現パターンを示す場合には、それぞれのマーカーは、同一の細胞で発現していない。例えば、ＣＤ３１８及びＣＬＡは、健康な組織標本で複合発現を示さない。
【００７７】
最終的に、得られた標的候補を、１２個の異なるＰａＣａ試料及び１個のＰｒｏＣａ試料を使用して多数の患者試料アレイで試験して、これらのマーカーの組み合わせの適用性の広さを評価した。ここで、マーカーが大部分の膵臓癌で同時発現されることが示された。
【００７８】
まとめると、ＣＬＡ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ３１８及びＴＳＰＡＮ８は、健康な組織に影響を与える最小限のリスクで膵臓癌を根絶するＣＡＲ Ｔ細胞アプローチの候補として同定された。
【００７９】
実施例２：卵巣癌（ＯｖＣａ）細胞と非ＯｖＣａ細胞との識別を可能にする組み合わせでの蛍光部分及び抗原認識部分を含む接合体の組み合わせの同定。
【００８０】
新鮮凍結高悪性度漿液性卵巣癌切除体をスライスし、そしてアセトンで固定した。スクリーニングを、個々の生物学的試料の完全自動化された周期的蛍光イメージングを可能にする、新たなハイコンテンツイメージングプラットフォームを使用して実行した。蛍光部分に接合した２０個の抗原認識部分での２個のＯｖＣａ標本の連続染色は、多くの抗原の発現を示した。ヒト上皮組織及びカルシノーマの周知のマーカーであるＥｐＣＡＭ（ＣＤ３２６）に加えて、例えばＦＯＬＲ１、ＣＤ２２７、及びＣＤ３４０があった（図７）。
【００８１】
標的候補ＣＤ３２６、ＦＯＬＲ１、ＣＤ２２７、及びＣＤ３４０を、２つの独立した高悪性度漿液性卵巣癌切除試料及び健康なヒト組織試料（腎臓、肺、心臓、皮膚、及び結腸）（図８ａ）、並びに第三の独立した高悪性度漿液性卵巣癌切除試料及び健康なヒト組織試料（肝臓、膵臓、甲状腺、及び下垂体）（図８ｂ）でのそれらの発現レベルを比較することによって、染色／画像化／脱染色プロセスを使用して検証した。
【００８２】
データ分析及びさらなる同時染色により、提示した４つのマーカーが全てＯｖＣａ試料で発現したが、健康な組織でも発現していたことが明らかになった。しかしながら、健康な組織での発現は、ＯｖＣａ細胞の選択的な標識を得るために２つ以上のマーカーを組み合わせる可能性を少なくとも部分的に識別していることを見出した。例えば、ＣＤ２２７及びＦＯＬＲ１は、大部分のＯｖＣａ細胞での発現を双方とも示した。ＣＤ２２７は肝臓、肺及び膵臓でさらに顕著な発現を示したが、ＦＯＬＲ１は腎臓、肺及び皮膚で顕著な発現を示した。双方のマーカーを組み合わせて細胞の同時発現を調べた場合に、前記健康な組織は、実質的な割合の細胞で細胞の同時発現を全く示さなかったことを見出した。したがって、ＣＤ２２７とＦＯＬＲ１との組み合わせは、抗原ＣＤ２２７及びＦＯＬＲ１の双方がオンターゲットオフ腫瘍毒性と結合しないか又は結合が大幅に減少した場合にのみ活性化されるＣＡＲ Ｔ（ＡＮＤ ＣＡＲ Ｔ細胞）でＯｖＣａ細胞を根絶する選択肢がある。一方で、前記で概説したことと同様の分析を実施した場合に、例えばＦＯＬＲ１とポドプラニンの組み合わせが、ＯｖＣａのＮＯＴ ＣＡＲ Ｔ細胞治療の可能性をもたらすことを見出した。ＦＯＬＲ１はＯｖＣａ細胞だけでなく腎臓、肺及び皮膚でも発現するが、ポドプラニンはＯｖＣａ細胞でＦＯＬＲ１との細胞の同時発現を示さず、腎臓、肺及び皮膚で強く発現する。
【００８３】
したがって、ＦＯＬＲ１の検出によって活性化されるが、ポドプラニンの検出によって非活性化又は阻害されるＣＡＲ Ｔ細胞を使用することは、ＦＯＬＲ１が発現しないか、又はポドプラニンが発現するため、影響を受けない健康な細胞を残してＯｖＣａ細胞の効率的な死滅をもたらす。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図６−５】
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【図６−６】
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【図６−７】
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【図６−８】
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【図６−９】
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【図６−１０】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【外国語明細書】
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