(57)【要約】【課題】より小さな基板を用いても検出可能な遺伝子数を多くすることのできるＤＮＡチップを提供する。【解決手段】本実施形態の塩基配列検出チップは、基板上に互いに離間して設けられた複数の第１電極群であって、各第１電極群は離間して配置された複数の第１電極を有し、各第１電極はレーストラックまたは楕円の平面形状を有し、各第１電極群内の前記複数の第１電極は長軸が互いに平行となるように並列して配置される、複数の第１電極群と、各第１電極に対応して設けられ、対応する第１電極に固定され、塩基配列を有するプローブと、を備えている。【選択図】図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板上に互いに離間して設けられた複数の第１電極群であって、各第１電極群は離間して配置された複数の第１電極を有し、各第１電極はレーストラックまたは楕円の平面形状を有し、各第１電極群内の前記複数の第１電極は長軸が互いに平行となるように並列して配置される、複数の第１電極群と、
各第１電極に対応して設けられ、対応する第１電極に固定され、塩基配列を有するプローブと、
を備えた塩基配列検出チップ。
【請求項２】
基板上に互いに離間して設けられた複数の第１電極群であって、各第１電極群は同心円上に離間して配置された複数の第１電極を有し、各第１電極は前記同心円の外周に向かって広がる扇型の平面形状を有する、複数の第１電極群と、
各第１電極に対応して設けられ、対応する第１電極に固定され、塩基配列を有するプローブと、
を備えた塩基配列検出チップ。
【請求項３】
各第１電極群内の前記複数の第１電極は、同じ塩基配列を有するプローブが固定される請求項１または２記載の塩基配列検出チップ。
【請求項４】
前記複数の第１電極は、第１電極群毎に異なる塩基配列を有するプローブが固定される請求項１乃至３のいずれかに記載の塩基配列検出チップ。
【請求項５】
前記基板上に設けられた第２電極であって、前記第２電極と前記複数の第１電極との間に電圧が印加されることにより前記基板に電流を供給するための第２電極と、
前記基板上に設けられた第３電極であって、前記第３電極と前記複数の第１電極との間の電圧が所定の電圧特性となるように制御するための第３電極と、
を更に備えた請求項１乃至４のいずれかに記載の塩基配列検出チップ。
【請求項６】
前記複数の第１電極群は、第１乃至第４部分に分割され、前記第２部分は前記第１部分と前記第４部分との間に配置され、前記第３部分は前記第２部分と前記第４部分との間に配置され、
前記第２電極は２つの部分に分割され、
前記第２電極の一方の部分はＵ字形状を有し、前記第２電極の前記一方の部分は一端が前記第１部分の一方の端部に近接して設けられ、他端が前記第１部分の前記一方の端部と同じ側にある前記第２部分の一方の端部に近接して設けられ、
前記第２電極の他方の部分はＵ字形状を有し、前記第２電極の前記他方の部分は一端が前記第３部分の一方の端部に近接して設けられ、他端が前記第３部分の前記一方の端部と同じ側にある前記第４部分の一方の端部に近接して設けられ、
前記第３電極はＵ字形状を有し、前記第３電極は一端が前記第２部分の他方の端部に近接して設けられ、他端が前記第４部分の他方の端部に近接して設けられる請求項５記載の塩基配列検出チップ。
【請求項７】
前記基板上に設けられ、前記複数の第１電極群における前記複数の第１電極にそれぞれ接続される複数の第１端子と、
前記基板上に設けられ、前記第２電極に接続される第２端子と、
前記基板上に設けられ、前記第３電極に接続される第３端子と、
を更に備えた請求項５または６記載の塩基配列検出チップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の実施形態は、塩基配列検出チップに関する。
【背景技術】
【０００２】
電流検出型ＤＮＡ配列検出チップが知られている。この電流検出型ＤＮＡ配列検出チップは、基板上に設けられた複数の電極上に既知の塩基配列を有するＤＮＡプローブが少なくとも１個配置された構成を有している。異なる電極上には異なる塩基配列のＤＮＡプローブが配置される。
【０００３】
しかし、従来の電流検出型ＤＮＡ配列検出チップにおいては、基板上に設けられる電極の個数が少なく、検出可能な遺伝子数（異なるＤＮＡプローブの数）が少なかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第４７２９０３０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本実施形態は、より小さな基板を用いても検出可能な遺伝子数を多くすることのできる塩基配列検出チップを提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本実施形態による塩基配列検出チップは、基板上に互いに離間して設けられた複数の第１電極群であって、各第１電極群は離間して配置された複数の第１電極を有し、各第１電極はトラックまたは楕円の平面形状を有し、各第１電極群内の前記複数の第１電極は長軸が互いに平行となるように並列して配置される、複数の第１電極群と、各第１電極に対応して設けられ、対応する第１電極に固定され、塩基配列を有するプローブと、を備えている。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】図１（ａ）乃至（ｃ）は、ＤＮＡプローブと検査するＤＮＡが相補的であることを説明する図。
【図２】図２（ａ）乃至２（ｄ）は塩基配列検出チップを説明する図。
【図３】図３（ａ）、３（ｂ）は塩基配列検出チップから検出される酸化電流の測定結果の一例を示す波形図。
【図４】三電極法を用いて電流検出を行う塩基配列検出チップの断面図。
【図５】塩基配列検出チップの電流検出系の一例を示す図。
【図６】第１実施形態による塩基配列検出チップを示す平面図。
【図７】第１実施形態に係る作用電極群における作用電極の形状および配列の一例を示す図。
【図８】図８（ａ）、８（ｂ）はそれぞれ第１実施形態および比較例に係る作用電極群における作用電極の形状および配列を示す図。
【図９】第１実施形態に係る作用電極群における作用電極の形状および配列の他の例を示す図。
【図１０】塩基配列検出装置の外形を示す斜視図。
【図１１】塩基配列検出装置の構成を示す斜視図。
【図１２】塩基配列検出装置の上面図。
【図１３】バルブＮＯＶの断面図。
【図１４】図１４（ａ）、１４（ｂ）はバルブＮＣＶの構成を説明する図。
【図１５】塩基配列検出装置の流路モデルを示す図。
【図１６】塩基配列検出装置の増幅流路を示す図。
【図１７】図１７（ａ）乃至１７（ｅ）は、塩基配列検出装置の動作を説明する図。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
以下、図面を参照して本発明の実施形態について説明する。
【０００９】
（基本原理）
本実施形態の塩基配列検出チップについて説明する前に、塩基配列検出チップの基本原理について説明する。
【００１０】
この塩基配列検出チップは、塩基配列、例えばＤＮＡまたはＲＮＡの塩基配列を検出するものである。ＤＮＡは、Ａ（アデニン）、Ｔ（チミン）、Ｇ（グアニン）、Ｃ（シトシン）の４つの塩基から構成され、２本鎖状になっている。２本鎖状では、塩基Ａと塩基Ｔ、および塩基Ｇと塩基Ｃという特定の組み合わせで結合する。ＲＮＡは、Ａ（アデニン）、Ｕ（ウラシル）、Ｇ（グアニン）、Ｃ（シトシン）の４つの塩基から構成される。以下の説明では、ＤＮＡの検出を例にとって説明するが、ＲＮＡでも同様にして検出することができる。
【００１１】
ＤＮＡの断片は簡単に合成できるので、塩基配列検出チップでは、配列がわかっているＤＮＡを合成して１本鎖にしたＤＮＡをプローブとして基板上に固定する。検査するＤＮＡも一本鎖にし、基板上に固定されたＤＮＡプローブと反応させる。検体の検査するＤＮＡの配列がＤＮＡプローブの配列と相補的であれば、結合して２本鎖になる。例えば、図１（ａ）に示すようにＤＮＡプローブがＴＡＧＡＣの順序で配列されているときに、検査するＤＮＡがＡＴＣＴＧの順序で配列されていれば（図１（ｂ））、配列は互いに相補的である。図１（ｃ）に示すこれらの一本鎖のＤＮＡが結合して２本鎖になることをハイブリダイゼーションという。
【００１２】
図２（ａ）に示すように、塩基配列検出チップ５００は、例えばガラスまたはシリコンからなる基板５１０上に複数の電極５２０を離間して設け、各電極５２０上に異なる配列のＤＮＡプローブ５３０を固定した構成を有する。この塩基配列検出チップ５００上に、検査するＤＮＡの配列を含む試薬を流す。検査するＤＮＡの配列と相補的な配列を有するＤＮＡプローブ５３０が塩基配列検出チップ５００上に存在すれば、検査するＤＮＡ５４０は、この検査するＤＮＡ５４０の配列と相補的な配列を有するＤＮＡプローブ５３０と反応してハイブリダイゼーションを生じる（図２（ｂ）、２（ｃ））。しかし、検査するＤＮＡの配列と相補的な配列を有するＤＮＡプローブを塩基配列検出チップ５００が有していない場合は、ハイブリダイゼーションは生じない。上記試薬を塩基配列検出チップ５００上に流した後洗浄する。その後、挿入剤５５０を含む試薬（溶液）を塩基配列検出チップ５００上に流す。すると、ハイブリダイゼーションが生じた２本鎖のＤＮＡプローブ５３０に挿入剤５５０が結合する。この状態で塩基配列検出チップ５００に電圧を印加すると、ハイブリダイゼーションが生じた２本鎖のＤＮＡプローブ５３０が固定された電極５２０に、挿入剤５５０の酸化電流が流れる（図２（ｄ））。
【００１３】
この酸化電流、すなわちハイブリダイゼーションが生じた電極からの信号の一例を図３（ａ）に示し、ハイブリダイゼーションが生じない電極からの信号の一例を図３（ｂ）に示す。図３（ａ）からわかるように、塩基配列検出チップ５００に印加する電圧を増加していくと、５００ｍＶ程度の電圧で酸化電流が急に大きく上昇している。これに対して、ハイブリダイゼーションが生じない電極からの信号値は、塩基配列検出チップ５００に印加する電圧が５００ｍＶ程度になると若干上昇するが、図３（ａ）に示す場合に比べて上昇度は小さい。このように、どの電極から電流が検出されたかを判別することにより、検査するＤＮＡの配列を知ることができる。
【００１４】
（電流検出）
次に、塩基配列検出チップ５００の電流検出の一例について図４および図５を参照して説明する。この電流検出は、例えば三電極法を用いて行う。この三電極法が用いられる塩基配列検出チップ５００においては、例えば図４に示すように、基板５１０上に、作用電極５２０と、カウンタ電極５２２と、参照電極５２４とが設けられている。作用電極５２０、カウンタ電極５２２、および参照電極５２４は互いに離間して設けられる。作用電極５２０には同一の配列を有するＤＮＡプローブ５３０が少なくとも１個（図４では３個）固定され、基板５１０上に設けられた端子Ｗと接続される。なお、説明を簡単にするために、作用電極５２０は１個しか示していないが、一般に複数個設けられる。カウンタ電極５２２は基板５１０上に設けられた端子Ｃに接続され、参照電極５２４は基板５１０上に設けられた端子Ｒに接続される。
【００１５】
このように構成された塩基配列検出チップ５００の電流検出系の一例を図５に示す。図５に示す電流検出系６００は、カウンタ電極５２２の入力に対して参照電極５２４の電圧をフィードバックさせることにより、基板５１０内の電極および溶液などの各種条件の変動によらずに溶液中に所望の電圧を印加するポテンショスタットである。
【００１６】
このポテンショスタット６００は、作用電極５２０に対する参照電極の電圧がある所定の特性に設定されるようにカウンタ電極５２２の電圧を変化させ、挿入剤による酸化電流を電気化学的に測定する。
【００１７】
作用電極５２０は、ＤＮＡプローブ５３０が固定された電極で、塩基配列検出チップ内の反応電流を検出する電極である。カウンタ電極５２２は、作用電極５２０との間に所定の電圧を印加して塩基配列検出チップ内に電流を供給する電極である。参照電極５２４は、参照電極５２４と作用電極５２０との間の電圧を所定の電圧特性となるように制御するべく、この参照電極５２４の電圧をカウンタ電極５２２にフィードバックさせる電極である。これにより、カウンタ電極５２２による電圧が制御され、塩基配列検出チップ内の各種検出条件に左右されない精度の高い酸化電流の検出を行うことができる。
【００１８】
電極間を流れる電流を検出するための電圧パターンを発生する電圧パターン発生回路６１０が配線６１２ｂを介して参照電極５２４の参照電圧制御用の反転増幅器６１２の反転入力端子に接続される。
【００１９】
この電圧パターン発生回路６１０は、図示しない塩基配列検出制御装置の制御機構から入力されるデジタル信号をアナログ信号に変換して電圧パターンを発生させる回路であり、ＤＡ変換器を備えている。
【００２０】
配線６１２ｂには抵抗Ｒｓが接続されている。反転増幅器６１２は、非反転入力端子が接地され、出力端子が配線６０２ａに接続されている。反転増幅器６１２の反転入力端子側の配線６１２ｂと出力端子側の配線６０２ａは配線６１２ａで接続されている。この配線６１２ａには、フィードバック抵抗Ｒｆ’およびスイッチＳＷｆからなる保護回路６２０が設けられている。
【００２１】
配線６０２ａは端子Ｃに接続されている。端子Ｃは、塩基配列検出チップ５００上のカウンタ電極５２２に接続されている。カウンタ電極５２２が複数設けられている場合には、それぞれに対して並列に端子Ｃが接続される。これにより、１つの電圧パターンにより複数のカウンタ電極に同時に電圧を印加することができる。配線６０２ａには、端子Ｃへの電圧印加のオンオフ制御を行うスイッチＳＷ０が設けられる。
【００２２】
反転増幅器６１２に設けられた保護回路６２０により、カウンタ電極５２２に過剰な電圧が印加されない構成となっている。したがって、電流検出時に過剰な電圧がカウンタ電極に５２２に印加され、溶液が電気分解されてしまうことにより、所望の挿入剤の酸化電流の検出に影響を及ぼすことが無く、安定した測定を行うことが可能となる。
【００２３】
端子Ｒは配線６０３ａにより電圧フォロア増幅器６１３の非反転入力端子に接続される。この電圧フォロア増幅器６１３の反転入力端子は、電圧フォロア増幅器６１３の出力端子に接続された配線６１３ｂと、配線６１３ａにより短絡している。配線６１３ｂには抵抗Ｒｆが設けられており、この抵抗Ｒｆは一端が配線５１３ｂに接続され、他端が抵抗Ｒｓと、配線６１２ａと配線６１２ｂとの交点との間に接続される。これにより、電圧パターン発生回路６１０により生成される電圧パターンに、参照電極５２４の電圧をフィードバックさせた電圧反転増幅器６１２に入力させ、このような電圧を反転増幅した出力に基づきカウンタ電極５２２の電圧を制御する。
【００２４】
端子Ｗは配線６０１ａによりトランス・インピーダンス増幅器６１１の反転入力端子に接続される。このトランス・インピーダンス増幅器６１１は、非反転入力端子が接地され、出力端子が配線６１１ｂに接続されるとともに配線６１１ａを介して反転入力端子に接続される。配線６１１ａには抵抗Ｒｗが設けられている。このトランス・インピーダンス増幅器６１１の出力側の端子Ｏの電圧をＶｗ、電流をＩｗとすると、Ｖｗ＝Ｉｗ×Ｒｗとなる。この端子Ｏから得られる電気化学信号は、図示しない塩基配列検出制御装置の制御機構に出力される。
【００２５】
作用電極５２０は、複数個あるため、端子Ｗおよび端子Ｏは作用電極５２０のそれぞれに対応して複数個設けられる。複数の端子Ｏからの出力は後述する信号切換部により切り換えられ、ＡＤ変換されることにより、各作用電極からの電気化学信号をデジタル値として取得することができる。なお、端子Ｗおよび端子Ｏの間のトランス・インピーダンス増幅器６１１等の回路は、複数の作用電極で共有してもよい。この場合、配線６０１ａに複数の端子Ｗからの配線を切り換えるための信号切換部を備えればよい。
【００２６】
このような構成のポテンショスタット６００を用いて、塩基配列検出チップの電流測定は、以下のように行われる。
１．まず、ポテンショスタット６００を用いて作用電極５２０の電位を参照電極５２４の電位に対して一定にする。
２．作用電極５２０は、この電極５２０上で挿入剤を電気分解する。
３．作用電極５２０で電気分解を維持するために必要な電流は、カウンタ電極５２２から流れる電流Ｉｃである。
４．このとき、ポテンショスタット６００は作用電極５２０とカウンタ電極５２２との間に流れる電流を正確に測定する。すなわち、参照電極５２４には電流はほとんど流れない。
【００２７】
（第１実施形態）
次に、第１実施形態による塩基配列検出チップ５００を図６に示す。この実施形態の塩基配列検出チップ５００は、固相基板５１０上に４０組の作用電極群５２０１〜５２０４０と、カウンタ電極５２２ａ、５２２ｂと、参照電極５２４とを備えている。カウンタ電極５２２ａ、５２２ｂはそれぞれ図面上でＣＥと表示され、参照電極５２４はＲＥと表示されている。固相基板５１０は、例えば、ガラス基板またはシリコン基板から形成される。
【００２８】
４０組の作用電極群５２０１〜５２０４０は、第１乃至第４の部分に分けられて配列される。第１の部分は１０組の作用電極群５２０１〜５２０１０からなり、図面上で左から右に向かって配列される。第２の部分は、１０組の作用電極群５２０１１〜５２０２０からなり、図面上で第１の部分の下方に配置されるとともに図面上で右から左に向かって配列される。第３の部分は、１０組の作用電極群５２０２１〜５２０３０からなり、図面上で第２の部分の下方に配置されるとともに図面上で左から右に向かって配列される。第４の部分は、１０組の作用電極群５２０３１〜５２０４０からなり、図面上で第３の部分の下方に配置されるとともに図面上で右から左に向かって配列される。
【００２９】
各作用電極群５２０ｉ（ｉ＝１，・・・,４０）には、離間して設けられた３つの作用電極を備えており、それぞれ番号３ｉ−２、３ｉ−１、３ｉが付けられている。例えば、作用電極群５２０１は、１、２、３の番号が付けられた作用電極を備え、作用電極群５２０１０は、２８、２９、３０の番号が付けられた作用電極を備えている。各作用電極群５２０ｉ（ｉ＝１，・・・,４０）の３個の作用電極には、同一のＤＮＡ配列を有するＤＮＡプローブが固定される。各作用電極は例えば金から形成される。
【００３０】
カウンタ電極５２２ａはＵ字形状を有しており、このＵ字形状の一端が第１の部分の作用電極群５２０１０に近接して配置され、Ｕ字形状の他端が第２の部分の作用電極群５２０１１に近接して配置される。カウンタ電極５２２ｂはＵ字形状を有しており、このＵ字形状の一端が第３の部分の作用電極群５２０３０に近接して配置され、Ｕ字形状の他端が第４の部分の作用電極群５２０３１に近接して配置される。
【００３１】
参照電極５２４は、Ｕ字形状を有しており、Ｕ字形状の一端が第２の部分の作用電極群５２０２０に近接して配置され、Ｕ字形状の他端が第３の部分の作用電極群５２０２１に近接して配置される。
【００３２】
また、基板５１０には、各作用電極群５２０ｉ（ｉ＝１，・・・,４０）の作用電極にそれぞれ電気的に接続される端子Ｗが設けられている。端子Ｗには、各作用電極群５２０ｉ（ｉ＝１，・・・,４０）の作用電極に対応して番号３ｉ−２、３ｉ−１、３ｉが付けられている。例えば、番号１、２、３の端子Ｗはそれぞれ、作用電極群５２０１の番号１、２、３の作用電極に電気的に接続し、番号１１８、１１９、１２０の端子Ｗはそれぞれ、作用電極群５２０４０の番号１１８、１１９、１２０の作用電極に電気的に接続する。
【００３３】
また、基板５１０には、Ｃ端子５２３ａ、５２３ｂと、Ｒ端子５２５ａ、５２５ｂと、Ｘ端子５２６と、Ｙ端子５２８ａ、５２８ｂと、複数の導通検出端子５８が更に設けられている。Ｃ端子５２３ａはカウンタ電極５２２ａに電気的に接続され、Ｃ端子５２３ｂはカウンタ電極５２２ｂに電気的に接続される。Ｒ端子５２５ａ、５２５ｂはそれぞれ参照電極５２４に接続される。Ｘ端子５２６ａ、５２６ｂは塩基配列検出チップ５００の両端に設けられ、これらの端子５２６ａ、５２６ｂ間に電圧を印加し、塩基配列検出チップ５００が導通しているか否かを検出する端子である。また、同様にＹ端子５２８ａ、５２８ｂは塩基配列検出チップ５００の両端に設けられ、これらの端子５２８ａ、５２８ｂ間に電圧を印加し、塩基配列検出チップ５００が導通しているか否かを検出する端子である。複数の導通検出端子５８０は、作用電極群５２０１〜５２０４０の作用電極に対応して設けられ、各導通検出端子５８０は、対応する作用電極に接続され、対応する作用電極に電気的に接続される端子Ｗとの間に電圧を印加することにより、上記対応する作用電極と上記端子Ｗとの間が導通するか否かを検出する。上記端子は、図６に示すように、作用電極群５２０ｉ（ｉ＝１，・・・,４０）を挟むように、図面上で上下の組みに分かれて設けられる。
【００３４】
塩基配列検出チップ５００は後述する塩基配列検出装置に装着される。装着された場合、作用電極群５２０１から作用電極５２０１０に向かって挿入剤を含む試薬が流れるように、第１の部分上に流路が形成される。また、カウンタ電極５２２ａ上にも、作用電極群５２０１０から作用電極５２０１１に向かって上記試薬が流れるように流路が形成される。作用電極群５２０１１から作用電極５２０２０に向かって上記試薬が流れるように、第２の部分上に流路が形成される。また、参照電極５２４上にも、作用電極群５２０２０から作用電極５２０２１に向かって上記試薬が流れるように流路が形成される。作用電極群５２０２１から作用電極５２０３０に向かって上記試薬が流れるように、第３の部分上に流路が形成される。また、カウンタ電極５２２ｂ上にも、作用電極群５２０３０から作用電極５２０３１に向かって上記試薬が流れるように流路が形成される。作用電極群５２０３１から作用電極５２０４０に向かって上記試薬が流れるように、第４の部分上に流路が形成される。これらの流路は、塩基配列検出チップ５００と、塩基配列検出装置のパッキンとによって形成される。
【００３５】
挿入剤を含む試薬は、第１の部分上の流路、カウンタ電極５２２ａ上の流路、第２の部分上の流路、参照電極５２４上の流路、第３の部分上の流路、カウンタ電極５２２ｂ上の流路、および第４の部分上の流路をこの順序で通過する。
【００３６】
図６においては、各作用電極群５２０ｉ（ｉ＝１，・・・，４０）の３個の作用電極は、上記試薬が流れる方向に沿って配列されている。
【００３７】
本実施形態の塩基配列検出チップ５００の各作用電極群５２０ｉ（ｉ＝１，・・・，４０）における３個の作用電極の一例を図７に示す。各作用電極５２０は、長方形の対向する１組の辺にそれぞれ半円を接続した、レーストラック（race track）形状を有している。なお、３個の作用電極５２０は楕円形状であってもよい。これら３個の作用電極５２０にそれぞれ、同一のＤＮＡ配列を有するＤＮＡプローブが固定される。これらのＤＮＡプローブは、上記同一のＤＮＡ配列を含む液を３個の作用電極５２０を含む作用電極群に滴下することによって、各作用電極５２０上に固定される。このとき、３個の作用電極５２０を含む範囲に上記液のスポット５２５が形成される。なお、各作用電極群における作用電極の個数は奇数であることが好ましい。これは、各作用電極群内の複数の作用電極には同一の配列を有するＤＮＡプロ−ブが固定され、各作用電極から検出される酸化電流の有無を多数決で決定するためである。
【００３８】
上記３個の作用電極５２０は、挿入剤を含む試薬が流れる方向、図７上では左から右に向かう方向に沿って並列して配置される。各作用電極５２０は、試薬が流れる方向に短軸を有し、試薬が流れる方向と直交する方向に長軸を有する形状を有している。このように形状および配列とすることにより、図８（ａ）に示す比較例のように各作用電極５２０の形状が円である場合に比べて、図８（ｂ）に示す本実施形態のようにスポット５２５の直径を小さくすることが可能となるとともに隣接するスポット５２５の中心間距離も短くすること可能となる。これにより、塩基配列検出チップ５００上に作用電極群の個数を多く配列することができ、検出可能な遺伝子数を多くすることが可能となる。
【００３９】
また、更に、塩基配列検出チップ５００上に作用電極群の個数を多く配列するために、下記の（１）乃至（４）の条件を満たすことが望ましい。３個の作用電極５２０の全幅をａとし、各作用電極５２０の短軸幅および長軸幅をそれぞれｘおよびｙとし、３個の作用電極５２０のうち隣接する作用電極間の中心距離および最短距離をそれぞれ、ｂおよびｃとし、スポット５２５の半径をｒとする。
【００４０】
本実施形態においては、３個の作用電極５２０の全幅ａはスポット５２５の直径の９０％以下であることが望ましい。すなわち、
ａ＜１．８ｒ          （１）
の条件を満たすことが望ましい。この条件は、３個の作用電極５２０がスポット５２５内に配置されるための条件である。
【００４１】
また、
ｘ＜ｙ＜２ｘ          （２）
の条件を満たすことが望ましい。
【００４２】
また、
ｂ＝ｘ＋ｃ            （３）
の条件を満たすことが望ましい。
【００４３】
また、
ｃ＝０．５（ａ−３ｘ）＜０．５（１．８ｒ―３ｘ）      （４）
の条件を満たすことが望ましい。ただし、ｃは、作用電極５２０をパターニングする際のリソグラフィーの最小加工寸法より大きく、例えばｃ＞１０ｎｍである。（４）の条件は３個の作用電極５２０が重ならないための条件である。
【００４４】
次に、本実施形態の塩基配列検出チップ５００の各作用電極群５２０ｉ（ｉ＝１，・・・，４０）における３個の作用電極の他の例を図９に示す。この他の例においては、３個の作用電極５２０は同心円状に配列された扇形形状を有している。また、これらの３個の作用電極５２０は、それぞれの中心が正三角形の頂点に配置される。正三角形の頂点の１つはスポット５２５の横軸上でかつ挿入剤を含む試薬が流入する側（図９では左側）に位置している。
【００４５】
このように３個の作用電極５２０をそれぞれ扇形にしかつそれら作用電極５２０の中心を正三角形の頂点に配置することにより、スポット５２５の直径を小さくすることが可能となるとともに隣接するスポット５２５の中心間距離も短くすること可能となる。これにより、塩基配列検出チップ５００上に作用電極群の個数を多く配列することができ、検出可能な遺伝子数を多くすることが可能となる。
【００４６】
更に、塩基配列検出チップ５００上に作用電極群の個数を多く配列するために、下記の（５）乃至（６）の条件を満たすことが望ましい。３個の作用電極５２０の最大半径をａとし、３個の作用電極５２０のうち隣接する作用電極間の最短距離をｃとし、スポット５２５の半径をｒとする。
【００４７】
図９に示す他の例においては、３個の作用電極５２０の最大半径ａはスポット５２５の半径の９０％以下であることが望ましい。すなわち、
ａ＜０．９ｒ          （５）
の条件を満たすことが望ましい。この条件は、３個の作用電極５２０がスポット５２５内に配置されるための条件である。
【００４８】
また、
ｃ＜２ａ              （６）
の条件を満たすことが望ましい。ただし、ｃは、作用電極５２０をパターニングする際のリソグラフィーの最小加工寸法より大きく、例えばｃ＞１０ｎｍである。
【００４９】
以上説明したように、本実施形態によれば、より小さな基板を用いても作用電極の個数を多くすることができる。各作用電極群に対して互いに異なるＤＮＡ配列を有するＤＮＡプローブを固定すれば、検出可能な遺伝子数を多くすることができる。
【００５０】
（第１実施形態の塩基配列検出チップを搭載した塩基配列検出装置）
次に、第１実施形態の塩基配列検出チップを搭載して検体のＤＮＡ配列を検出する塩基配列検出装置の一例について説明する。塩基配列検出装置の外形図を図１０に示す。この塩基配列検出装置７００は、図１１に示すように、下プレート７１０と、パッキン７２０と、上プレート７３０と、カバー７４０と、キャップ７５０とを備えている。パッキン７２０は、下プレート７１０と、上プレート７３０との間に挿入される。カバー７４０は上プレート７３０に取り付けられる。キャップ７５０はヒンジによってカバー７４０に取り付けられる。下プレート７１０、上プレート７３０、カバー７４０、キャップ７５０は例えば透明なポリカーボネイト（ＰＣ）から形成され、パッキン７２０は例えば透明なエラストマーから形成される。
【００５１】
下プレート７１０は、周辺に沿って土手（bank）７１０ａが設けられ、この土手７１０ａの内側の表面は土手７１０ａより低くなっている。この土手７１０ａの内側に、開口７１０ｂが設けられている。この開口７１０ｂの周囲には、塩基配列検出チップ５００が載置され、支持するための支持部７１０ｂ１が設けられている。この支持部７１０ｂ１は、塩基配列検出チップ５００が支持部７１０ｂ１上に載置された場合に塩基配列検出チップ５００の上面が土手７１０ａの内側の表面より低くなるように、開口７１０ｂの底面側に設けられる。なお、パッキン７２０は、土手７１０ａの内側の領域を覆うように配置される。
【００５２】
塩基配列検出チップ５００が搭載されたときの塩基配列検出装置７００の上面図を図１２に示す。下プレート７１０の土手７１０ａの内側には、シリンジ部７１０ｃを形成する４つの窪み７１０ｃ１、７１０ｃ２、７１０ｃ３、７１０ｃ４が設けられている。窪み７１０ｃ１は、後述するようにパッキン７２０の膨らみとともにタンクを形成し、このタンク内に例えば検体のＤＮＡを含む液、すなわちサンプルが保存される。窪み７１０ｃ２はパッキン７２０の膨らみとともにタンクを形成し、このタンク内に例えば洗浄液が保存される。窪み７１０ｃ３には例えば挿入剤を含む試薬が保存される。窪み７１０ｃ４はパッキン７２０の膨らみとともにタンクを形成し、このタンク内に例えば洗浄液が保存される。窪み７１０ｃ１、７１０ｃ２、７１０ｃ３、７１０ｃ４のそれぞれの入口側には液を注入する注入部７１０ｄ１、７１０ｄ２、７１０ｄ３、７１０ｄ４が設けられ、これらの注入部７１０ｄ１、７１０ｄ２、７１０ｄ３、７１０ｄ４は、対応する窪み７１０ｃ１、７１０ｃ２、７１０ｃ３、７１０ｃ４と、下プレート７１０に設けられた流路となる溝で接続される。
【００５３】
窪み７１０ｃ１の入口側に空気抜き口７１０ｅ１が設けられ、窪み７１０ｃ２の出口側に空気抜き口７１０ｅ２が設けられ、窪み７１０ｃ３の出口側に空気抜き口７１０ｅ３が設けられ、窪み７１０ｃ４の出口側に空気抜き口７１０ｅ４が設けられている。
【００５４】
また、下プレート７１０の土手７１０ａの内側には、窪み７１０ｃ１、７１０ｃ２、７１０ｃ３、７１０ｃ４のそれぞれの出口側に設けられた常時閉のバルブＮＣＶと、サンプル内のＤＮＡを増幅する増幅流路７１０ｆと、増幅流路７１０ｆの入口部と出口部とに設けられ常時開のバルブＮＯＶと、廃液を塩基配列検出装置内に留めておくため廃液タンク７１１ｇ１、７１１ｇ２となる窪み７１０ｇ１、７１０ｇ２とが設けられている。廃液タンク７１１ｇ１、７１１ｇ２は、窪み７１０ｇ１、７１０ｇ２と、パッキン７２０と、上プレート７３０とによって形成される。
【００５５】
なお、バルブＮＣＶは下プレート７１０と、パッキン７２０と、カバー７４０とによって形成され、バルブＮＯＶは下プレート７１０とパッキン７２０とで形成される。バルブＮＣＶはシリンジ部７１０ｃに試薬等を保存するために用いられる。バルブＮＯＶは、ＤＮＡの増幅中に試薬等が移動しないように流路を閉鎖するために用いられる。
【００５６】
また、窪み７１０ｃ１、７１０ｃ２の出口側に設けられたバルブＮＣＶは、増幅流路７１０ｆの入口側に設けられたバルブＮＯＶと、下プレート７１０に形成された流路で接続される。窪み７１０ｃ３、７１０ｃ４の出口側に設けられたバルブＮＣＶは、パッキン７２０とで形成される塩基配列検出チップ５００上の流路の入口と、下プレート７１０に形成された流路によって接続される。増幅流路７１０ｆの出口側に設けられたバルブＮＯＶは、パッキン７２０とで形成される塩基配列検出チップ５００上の流路の入口と、下プレート７１０に形成された流路によって接続される。パッキン７２０とで形成される塩基配列検出チップ５００上の流路の出口は窪み７１０ｇ１と、下プレート７１０に形成された流路によって接続される。
【００５７】
図１１に示すように、パッキン７２０には、窪み７１０ｃ１、７１０ｃ２、７１０ｃ３、７１０ｃ４に対応する領域にそれぞれ、上プレート７３０に向かって凸のドーム状の膨らみが設けられ、この膨らみと対応する窪み７１０ｃ１、７１０ｃ２、７１０ｃ３、７１０ｃ４によって、シリンジ部７１０ｃのタンクが形成される。また、パッキン７２０は、バルブＮＣＶおよびバルブＮＯＶが形成される領域に、後述するように断面がチューブ構造を有し、このチューブ構造と下プレート７１０とによって流路を形成する。このチューブ構造に対応する下プレート７１０の領域は溝が形成されず、平坦となっている。また、下プレートに形成された流路用の溝を覆う、パッキン７２０の面は平坦となっている。パッキンの平坦な面と溝とにより流路が形成される。
【００５８】
また、パッキン７２０には、窪み７１０ｇ１，７１０ｇ２に対応する領域に開口が設けられるとともに、ＤＮＡチップ５００の端子（例えば図６に示す作用電極５２０に接続する端子Ｗ、カウンタ電極５２２に接続する端子Ｃ、参照電極５２４に接続する端子Ｒ等）が設けられている領域に対応して開口が設けられている。したがって、搭載される塩基配列検出チップ５００が図６に示すチップである場合には、開口は２個必要となる。
【００５９】
上プレート７３０には、パッキン７２０の膨らみに対応する領域に第１開口が設けられている。この第１開口を通して、図示しないＤＮＡ配列検出制御装置からロッドが延びてタンクの上面、すなわちパッキン７２０の膨らみの上面を押すことにより、タンクから液が流路に放出される。このとき、タンクの出口側に設けられているバルブＮＣＶは開状態にする。また、上プレート７３０には、塩基配列検出チップ５００の端子が設けられている領域に対応して第２開口が設けられている。第１開口が設けられている領域は、第２開口が設けられている領域に比べて上面の位置が低くなっている。この第１開口が設けられている領域にカバー７４０が取り付けられる。また、第１開口が設けられている領域には、バルブＮＣＶに対応する領域に開口が設けられている。
【００６０】
流路の延在する方向に直交する面で切断したバルブＮＯＶの断面を図１３に示す。図１３に示すように、バルブＮＯＶはチューブ構造７２０ａを有し、このチューブ構造７２０ａと下プレート７１０とによって常時開となるバルブとなる。バルブＮＯＶは、図示しないＤＮＡ配列検出制御装置からのロッド８１０により、パッキン７２０のチューブ構造を押しつぶすことにより流路を閉状態にする。なお、バルブＮＯＶが設けられている領域に対応する上プレート７３０の領域には、上記ロッド８１０が挿入される開口が設けられている。
【００６１】
図１４（ａ）に示すように、カバー７４０の裏面側には、バルブＮＣＶが設けられる位置に対応して、パッキン７２０のチューブ構造を押しつぶすためのロッド７４０ａが片持ち梁の先端に設けられており、このロッド７４０ａにより、バルブＮＣＶが常時閉状態となっている。このバルブＮＣＶは、図１４（ｂ）に示すように、塩基配列検出制御装置からのロッド８２０が上記片持ち梁を持ち上げることにより、バルブＮＣＶは開状態となり、パッキン７２０のチューブ構造からなる流路が開く。なお、なお、バルブＮＣＶが設けられている領域に対応する下プレート７１０の領域には、上記ロッド８２０が挿入される開口が設けられている。
【００６２】
図１５に、塩基配列検出装置７００の流路モデルを示す。検体のＤＮＡを含む液は、注入口７１０ｄ１から注入されてタンク７１１ｄ１に保存され、洗浄液は注入口７１０ｄ２から注入されてタンク７１１ｄ２に保存される。また、挿入剤を含む試薬は注入口７１０ｄ３から注入されてタンク７１１ｄ３に保存され、洗浄液は注入口７１０ｄ４から注入されてタンク７１１ｄ４に保存される。タンク７１１ｄ１、７１１ｄ２、７１１ｄ３、７１１ｄ４に貯まる空気を抜くための空気口７１１ｅ１、７１１ｅ２、７１１ｅ３、７１１ｅ４が設けられている。タンク７１１ｄ３からの試薬またはタンク７１１ｄ３からの洗浄液は、流路を通って塩基配列検出チップ５００上に形成される流路７１２の入口に流入する。このとき、試薬または洗浄液がパッキン７２０から漏れ出さないように、流路７１２の入口近傍では流路は一旦上側に持ち上がって水平の状態になり、その後、下側に下がって流路７１２の入口に接続する。この理由は、流路が水平の状態になる領域では、図１１からわかるように、下プレートは平坦となっており、この領域では、パッキン７２０はチューブ構造を有している。なお、廃液タンク７１１ｇ１、７１１ｇ２は流路によって接続され、タンク７１１ｇ１が満杯に近くになると、廃液タンク７１１ｇ２に廃液は移動するように構成されている。
【００６３】
なお、増幅流路７１０ｆは、図１６に示すように、流路内において等間隔で液が一時的貯まるウェル７１０ｆ１が複数個設けられている。このような構造を増幅流路７１０ｆが備えることにより、異なる複数のＤＮＡを増幅することが可能なマルチ増幅を行うことができることを本願発明者達によって見出された。なお、隣接するウェル７１０ｆ間の間隔は流路に沿って４ｍｍ以上であることが好ましい。
【００６４】
次に、塩基配列検出装置の動作について図１７（ａ）乃至図１７（ｅ）を参照して説明する。図１７（ａ）乃至１７（ｅ）は、図１５に示す流路モデルの平面図である。
【００６５】
まず、塩基配列検出装置７００のタンク７１１ｄ１、７１１ｄ２、７１１ｄ３、および７１１ｄ４にそれぞれ、検体の抽出されたＤＮＡを含む液（サンプル）、第１洗浄液、挿入剤を含む試薬、および第２洗浄液を注入する。この塩基配列検出装置７００を図示しない塩基配列検出制御装置に搭載する（図１７（ａ））。
【００６６】
続いて、塩基配列検出制御装置の制御機構によって、塩基配列検出装置７００におけるサンプルを保持しているタンク７１１ｄ１の出口側のバルブＮＣＶを開状態にする。その後、サンプルを保持しているタンク７１１ｄ１を、塩基配列検出制御装置のロッドによって押しつぶすことによって、サンプルを増幅流路７１０ｆに送る。サンプルが増幅流路７１０ｆに送り込まれた後、増幅流路７１０ｆの出入り口のバルブＮＯＶを閉状態にするとともに、塩基配列検出制御装置の加熱機構（例えば、ヒータ）によって、増幅流路７１０ｆを加熱し、サンプル内のＤＮＡに増幅反応を起こす（図１７（ｂ））。
【００６７】
次に、塩基配列検出制御装置のロッドによって、第１洗浄液が保存されているタンク７１１ｄ２の出口側のバルブＮＣＶを開状態にするとともに増幅流路７１０ｆの出入り口のバルブＮＯＶを開状態にする。続いて、タンク７１１ｄ２を、塩基配列検出制御装置のロッドによって押しつぶすことによって、第１洗浄液を増幅流路７１０ｆに送る。すると、増幅反応が生じたＤＮＡを含むサンプルは第１洗浄液により押し出されて、塩基配列検出チップ上に形成される流路７１２に流入する。サンプルが塩基配列検出チップ上に送られた後は、増幅流路７１０ｆの出入り口のバルブＮＯＶを閉状態にする。ここで、塩基配列検出制御装置の加熱冷却機構（例えば、ペルチェ素子）によって、塩基配列検出チップを加熱する。塩基配列検出チップのＤＮＡプローブの配列と相補的なＤＮＡ配列を、サンプル内のＤＮＡが有している場合には、流路７１２内においてハイブリダイゼーション反応が生じる（図１７（ｃ））。
【００６８】
次に、塩基配列検出制御装置の制御機構によって、第２洗浄液が保存されているタンク７１１ｄ２の出口側のバルブＮＣＶを開状態にする。続いて、タンク７１１ｄ４を、塩基配列検出制御装置のロッドによって押しつぶすことによって、第２洗浄液を流路７１２に送る。このとき、塩基配列検出制御装置によって、塩基配列検出チップを加熱する。これにより、塩基配列検出チップのＤＮＡプローブに吸着している非特異物を洗い流す。洗い流された非特異物は廃液タンク７１１ｇ１に送られる（図１７（ｄ））。
【００６９】
次に、塩基配列検出制御装置の制御機構によって、挿入剤を含む試薬が保存されているタンク７１１ｄ３の出口側のバルブＮＣＶを開状態にする。続いて、タンク７１１ｄ３を、塩基配列検出制御装置のロッドによって押しつぶすことによって、試薬を流路７１２に送る。このとき塩基配列検出チップおよび流路７１２は塩基配列検出制御装置の加熱冷却機構によって常温（例えば２５℃）に保持されている。
【００７０】
次に、塩基配列検出制御装置によって、塩基配列検出チップの端子（例えば図６に示す作用電極５２０に接続する端子Ｗ、カウンタ電極５２２に接続する端子Ｃ、参照電極５２４に接続する端子Ｒ等）に電圧を印加し、各作用電極からの電流を検出することにより、サンプル内のＤＮＡ配列の検出を行う。
【００７１】
以上説明したように、検出可能な遺伝子数を多くすることができる塩基配列検出装置を提供することができる。また、高価な試薬は、検出処理に必要な分だけタンクに保持するため、ＤＮＡ配列の検出を安価に行うことができる。
【００７２】
本発明のいくつかの実施形態を説明したが、これらの実施形態は、例として提示したものであり、発明の範囲を限定することは意図していない。これらの実施形態は、その他の様々な形態で実施されることが可能であり、発明の要旨を逸脱しない範囲で、種々の省略、置き換え、変更を行うことができる。これらの実施形態やその変形は、発明の範囲や要旨に含まれると同様に、特許請求の範囲に記載された発明とその均等の範囲に含まれるものである。
【符号の説明】
【００７３】
５００  塩基配列検出チップ
５１０  固相基板
５２０  電極（作用電極）
５２２  カウンタ電極
５２４  参照電極
５３０  ＤＮＡプローブ
５４０  検査されるＤＮＡ
５５０  挿入剤
６００  ポテンショスタット
Ｃ  端子
Ｒ  端子
Ｗ  端子
【図１】
2020054378.tif 000003
【図２】
2020054378.tif 000004
【図３】
2020054378.tif 000005
【図４】
2020054378.tif 000006
【図５】
2020054378.tif 000007
【図６】
2020054378.tif 000008
【図７】
2020054378.tif 000009
【図８】
2020054378.tif 000010
【図９】
2020054378.tif 000011
【図１０】
2020054378.tif 000012
【図１１】
2020054378.tif 000013
【図１２】
2020054378.tif 000014
【図１３】
2020054378.tif 000015
【図１４】
2020054378.tif 000016
【図１５】
2020054378.tif 000017
【図１６】
2020054378.tif 000018
【図１７】
2020054378.tif 000019
【手続補正書】
【提出日】令和1年12月25日(2019.12.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板上に互いに離間して設けられた複数の第１電極群であって、各第１電極群は離間して配置され面積が実質的に同じ複数の第１電極を有し、各第１電極はレーストラックの平面形状を有し、各第１電極群内の前記複数の第１電極は溶液が流れる方向に短軸を有し、前記溶液が流れる方向と直交する方向に長軸を有する、複数の第１電極群と、
各第１電極郡内の前記複数の第１電極に対応して設けられたプローブであって、同じ塩基配列を含む液が前記複数の第１電極を含む範囲に滴下されることによって形成されるスポットにより固定されたプローブと、
を備え、
前記複数の第１電極の前記溶液が流れる方向の長さは、前記スポットの直径の９０％以下である塩基配列検出チップ。
【請求項２】
前記複数の第１電極のそれぞれは、前記長軸の長さは前記短軸の長さよりも長くかつ前記短軸の長さの２倍よりも短い請求項１記載の塩基配列検出チップ。
【請求項３】
各第１電極群内の前記複数の第１電極は、奇数個である請求項１または２記載の塩基配列検出チップ。
【請求項４】
前記複数の第１電極は、第１電極群毎に異なる塩基配列を有するプローブが固定される請求項１乃至３のいずれかに記載の塩基配列検出チップ。
【請求項５】
前記基板上に設けられた第２電極であって、前記第２電極と前記複数の第１電極との間に電圧が印加されることにより前記基板に電流を供給するための第２電極と、
前記基板上に設けられた第３電極であって、前記第３電極と前記複数の第１電極との間の電圧が所定の電圧特性となるように制御するための第３電極と、
を更に備えた請求項１乃至４のいずれかに記載の塩基配列検出チップ。
【請求項６】
前記複数の第１電極群は、第１乃至第４部分に分割され、前記第２部分は前記第１部分と前記第４部分との間に配置され、前記第３部分は前記第２部分と前記第４部分との間に配置され、
前記第２電極は２つの部分に分割され、
前記第２電極の一方の部分はＵ字形状を有し、前記第２電極の前記一方の部分は一端が前記第１部分の一方の端部に近接して設けられ、他端が前記第１部分の前記一方の端部と同じ側にある前記第２部分の一方の端部に近接して設けられ、
前記第２電極の他方の部分はＵ字形状を有し、前記第２電極の前記他方の部分は一端が前記第３部分の一方の端部に近接して設けられ、他端が前記第３部分の前記一方の端部と同じ側にある前記第４部分の一方の端部に近接して設けられ、
前記第３電極はＵ字形状を有し、前記第３電極は一端が前記第２部分の他方の端部に近接して設けられ、他端が前記第４部分の他方の端部に近接して設けられる請求項５記載の塩基配列検出チップ。
【請求項７】
前記基板上に設けられ、前記複数の第１電極群における前記複数の第１電極にそれぞれ接続される複数の第１端子と、
前記基板上に設けられ、前記第２電極に接続される第２端子と、
前記基板上に設けられ、前記第３電極に接続される第３端子と、
を更に備えた請求項５または６記載の塩基配列検出チップ。