(57)【要約】【課題】本発明は、微生物を用いた方法により、過剰の硫化水素を発生させずに硫化物を生成させて重金属イオンを不溶化する方法および該方法に用いる微生物群を提供することを目的とする。【解決手段】本発明は、少なくとも下記（Ａ）〜（Ｄ）の細菌を含むチオ硫酸塩還元微生物群を用いて、好気条件下で、重金属イオンを不溶化する方法に関する。（Ａ）Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌（Ｂ）Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ属細菌（Ｃ）Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ属細菌（Ｄ）Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌【選択図】図２
2020054302.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも下記（Ａ）〜（Ｄ）の細菌を含むチオ硫酸塩還元微生物群を用いて、好気条件下で、重金属イオンを不溶化する方法。
（Ａ）Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌
（Ｂ）Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ属細菌
（Ｃ）Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ属細菌
（Ｄ）Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌
【請求項２】
ｐＨ５〜８の条件下で重金属イオンを不溶化する、請求項１に記載の重金属イオンの不溶化方法。
【請求項３】
硫黄源としてチオ硫酸又はその塩を用いる、請求項１または２に記載の重金属イオンの不溶化方法。
【請求項４】
少なくとも以下の（ａ）〜（ｄ）の細菌を含み、且つ、好気条件下で硫黄源としてチオ硫酸又はその塩を用いて硫化物を生成させて重金属イオンを不溶化する微生物群。
（ａ）１６ＳｒＲＮＡ遺伝子が配列番号１の塩基配列を有するＬｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌
（ｂ）１６ＳｒＲＮＡ遺伝子が配列番号２の塩基配列を有するＳｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ属細菌
（ｃ）１６ＳｒＲＮＡ遺伝子が配列番号３の塩基配列を有するＯｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ属細菌
（ｄ）１６ＳｒＲＮＡ遺伝子が配列番号４の塩基配列を有するＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、重金属イオン不溶化方法に関し、詳しくは微生物群を利用した重金属イオン不溶化方法および該微生物群に関する。
【背景技術】
【０００２】
重金属汚染水等の工場廃棄物による土壌汚染の問題は世界的に深刻であり、特に中国ではその深刻さが近年顕在化している。中国政府は２０１６年５月に土壌汚染防治行動計画（土１０条）を交付し、規制物質種、法責任、重点監視企業リストを毎年公開している。市場の拡大により、中国全土の１６％は浄化が必要であり、完全浄化には毎年１兆円で、１００年かかると想定されている（非特許文献１）。
【０００３】
土壌汚染を浄化する方法としては、例えば、土壌の掘削と洗浄による物理的処理、またはオンサイトで微生物や植物を活用して土壌を浄化する生物的処理が挙げられる。物理的処理はコストがかかるが、生物的処理はコストが抑えられるという利点がある。
【０００４】
また、土壌汚染を浄化する方法として、硫化ナトリウム等の添加により地下水中に溶け出す重金属イオンを揚水なども含めて、硫化物を生成させて不溶化する硫化物法が有効であるとされている。しかしながら、硫化物法には、強烈な臭気を発生させ、硫化水素の毒性および腐食性が問題となるとともに、硫化物を酸性条件下に置くと硫化水素が発生するという問題がある。また、添加する硫化剤が過剰になると処理時に有害な硫化水素ガスを発生し、また処理が不安定化するという問題もある。
【０００５】
生物的処理としては、例えば、嫌気性微生物による硫化物の生成が一般的である。非特許文献２には、絶対嫌気性条件下における硫酸還元菌による硫化水素生成を利用した硫化物法が開示されている。また、非特許文献３には、同化的硫酸還元に関わる遺伝子を組換えシステインを過剰生産させた大腸菌を用いてカドミウムを除去したことが開示されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】みずほ総研、『中国の環境市場動向と「ビジネスモデル構築」への処方箋』、２０１６年
【非特許文献２】Hoa T.Q. Kieu, et al., water research 45 (2011) p.3863-3870
【非特許文献３】CLIFFORD L. WANG, et al., APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, Oct. 2000, p. 4497-4502
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、非特許文献２に記載の方法のように、嫌気性微生物による方法には、嫌気性微生物が産生する特有の臭いが発生するとともに、硫化水素の毒性および腐食性が問題となる。また、非特許文献３に記載の方法は、絶対嫌気条件の必要が無いことを利点とされているが、遺伝子組換え生物を用いているため、実用性に乏しいと考えられる。
【０００８】
したがって、本発明は、上記のような従来技術の課題を踏まえ、微生物を用いた方法により、過剰の硫化水素を発生させずに硫化物を生成させて重金属イオンを不溶化する方法および該方法に用いる微生物群を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、特定の細菌を含むチオ硫酸塩還元微生物群を用いることにより、過剰の硫化水素の産生を抑えた硫化物生成が可能となり、嫌気性微生物が産生する特有の臭いを発生させずに、重金属イオンを不溶化できることを見出し、本発明を完成させた。
【００１０】
すなわち本発明は、以下の通りである。
１．少なくとも下記（Ａ）〜（Ｄ）の細菌を含むチオ硫酸塩還元微生物群を用いて、好気条件下で、重金属イオンを不溶化する方法。
（Ａ）Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌
（Ｂ）Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ属細菌
（Ｃ）Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ属細菌
（Ｄ）Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌
２．ｐＨ５〜８の条件下で重金属イオンを不溶化する、前記１に記載の重金属イオンの不溶化方法。
３．硫黄源としてチオ硫酸又はその塩を用いる、前記１または２に記載の重金属イオンの不溶化方法。
４．少なくとも以下の（ａ）〜（ｄ）の細菌を含み、且つ、好気条件下で硫黄源としてチオ硫酸又はその塩を用いて硫化物を生成させて重金属イオンを不溶化する微生物群。
（ａ）１６ＳｒＲＮＡ遺伝子が配列番号１の塩基配列を有するＬｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌
（ｂ）１６ＳｒＲＮＡ遺伝子が配列番号２の塩基配列を有するＳｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ属細菌
（ｃ）１６ＳｒＲＮＡ遺伝子が配列番号３の塩基配列を有するＯｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ属細菌
（ｄ）１６ＳｒＲＮＡ遺伝子が配列番号４の塩基配列を有するＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌
【発明の効果】
【００１１】
本発明の方法によれば、特定の細菌を含むチオ硫酸塩還元微生物群を用いることにより、硫化水素を発生させずに硫化物を生成させて重金属イオンを不溶化することができ、揚水した汚染水を反応装置内で処理し、重金属を除去する浄化方法を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１（ａ）〜（ｆ）は、微生物群から分離した２種の細菌の重金属イオンの除去能を示す図である。
【図２】図２（ａ）〜（ｃ）は、それぞれ初期ｐＨを６および７として、各重金属イオンの除去率を評価した結果を示す。
【図３】図３（ａ）〜（ｃ）は、培養系へのチオ硫酸の添加の有無による、重金属イオンの除去率の変化を示す図である。図３（ａ）はチオ硫酸含有金属培地を用いた培養系、図３（ｂ）はチオ硫酸非含有金属培地を用いた培養系、図３（ｃ）は対照系（植菌無し）の結果を示す。
【図４】図４（ａ）および（ｂ）は、培養系にバッファーを添加して、各重金属イオンの除去率を評価した結果を示す。図４（ａ）はｐＨ６．０リン酸バッファーを添加した結果であり、図４（ｂ）はｐＨ６．０ＭＥＳバッファーを添加した結果である。
【図５】図５は、１バッチ中のｐＨ、重金属（Ｃｕ、Ｃｄ、Ｚｎ）イオン濃度について経時変化を観察した結果を示す。
【図６】図６（ａ）〜（ｄ）は、ＳｔｒａｉｎＡ、ＣおよびＤ並びに集積系（微生物群）による重金属イオンの除去率を評価した結果を示す。
【図７】図７（ａ）〜（ｃ）は硫化水素のスペクトルの有無を示す図であり、図７（ａ）はコントロール、図７（ｃ）は、集積培養容器上部の気体のマススペクトルである。
【図８】図８（ａ）および（ｂ）はメチルメルカプタンのスペクトルを示す。図８（ａ）は試料のマススペクトルであり、図８（ｂ）は日東分析センター所有の標準マススペクトルである。
【図９】図９（ａ）および（ｂ）はアセトンのスペクトルを示す。図９（ａ）は試料のマススペクトルであり、図９（ｂ）は日東分析センター所有の標準マススペクトルである。
【図１０】図１０（ａ）および（ｂ）は、クロロホルムのスペクトルを示す。図１０（ａ）は試料のマススペクトルであり、図１０（ｂ）は日東分析センター所有の標準マススペクトルである。
【図１１】図１１（ａ）および（ｂ）はジメチルジスルフィドのスペクトルを示す。図１１（ａ）は試料のマススペクトルであり、図１１（ｂ）は日東分析センター所有の標準マススペクトルである。
【図１２】図１２（ａ）および（ｂ）はジメチルトリスルフィドのスペクトルを示す。図１２（ａ）は試料のマススペクトルであり、図１２（ｂ）は日東分析センター所有の標準マススペクトルである。
【図１３】図１３は、微生物群の解析から得られた系統樹を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
【００１４】
本発明者らは、実施例において後述するように、鉱山跡地付近の土壌を採取し、硫黄源としてチオ硫酸を用いて好気条件下で培養を行い、除去対象の重金属を銅、カドミウム、亜鉛として、金属除去能が認められた培養系をさらに集積培養した。その結果として、金属除去能に優れた微生物群を見出し、該微生物群を用いて重金属イオンを不溶化するための方法を確立した。
【００１５】
本発明において、「チオ硫酸塩還元細菌」とは、チオ硫酸塩から硫化物を生成することのできる細菌をいう。また、「チオ硫酸塩還元微生物群」とは、チオ硫酸塩から硫化物を生成することのできる微生物群をいう。
【００１６】
［微生物群］
本発明に係る微生物群は、チオ硫酸塩還元作用を有し、少なくとも下記（Ａ）〜（Ｄ）の細菌を含む。
（Ａ）Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌
（Ｂ）Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ属細菌
（Ｃ）Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ属細菌
（Ｄ）Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌
【００１７】
前記（Ａ）〜（Ｄ）の細菌はチオ硫酸塩還元細菌であることが好ましく、より好ましくは好気性のチオ硫酸塩還元細菌である。前記（Ａ）Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌は、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子が配列番号１の塩基配列と同一又は実質的に同一の領域を有することが好ましい。前記（Ｂ）Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ属細菌は、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子が配列番号２の塩基配列と同一又は実質的に同一の領域を有することが好ましい。前記（Ｃ）Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ属細菌は、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子が配列番号３の塩基配列と同一又は実質的に同一の領域を有することが好ましい。前記（Ｄ）Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌は、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子が配列番号４の塩基配列と同一又は実質的に同一の領域を有することが好ましい。ここで、「実質的に同一」とは、例えば、その領域の配列の相同性が９８％以上、好ましくは９９％以上、さらに好ましくは９９．５％以上の場合をそれぞれいう。
【００１８】
本発明に係るチオ硫酸塩還元微生物群（以下、本発明に係る微生物群と略す。）における前記（Ａ）Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌の占める割合は、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子クローンの割合として、３５〜５５％が好ましく、より好ましくは４０〜５０％である。また、本発明に係る微生物群における前記（Ｂ）Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ属細菌の占める割合は、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子クローンの割合として、２０〜４０％が好ましく、より好ましくは２５〜３５％である。本発明に係る微生物群における前記（Ｃ）Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌の占める割合は、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子クローンの割合として、１５〜３５％が好ましく、より好ましくは２０〜３０％である。本発明に係る微生物群における前記（Ｄ）Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ属細菌の占める割合は、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子クローンの割合として、２．５〜５．５％が好ましく、より好ましくは３．５〜４．５％である。
【００１９】
本発明に係る微生物群は、重金属イオンを不溶化する活性を有する。本発明において、「重金属」とは、銅、亜鉛、カドミウム、ニッケル等をいい、少なくとも銅、亜鉛、カドミウムを含み、かつイオン状に存在するものを意味する。また、「重金属イオンを不溶化する」とは、重金属イオンを含む汚染物に微生物群を作用させることにより、硫化物を生成させて、汚染物に含まれる重金属イオンを不溶化することをいう。
【００２０】
本発明に係る微生物群は、実施例において後述するように、既存の鉱山跡地付近の土壌等の重金属汚染土壌から集積することができる。好ましい集積方法としては、例えば、重金属の汚染土壌を種として、硫黄源としてチオ硫酸又はその塩を含有し、且つ重金属イオンを含有させた培地（以下、金属培地とも略す。）を培養液として培養し、重金属イオンの除去活性を示した系についてさらに集積を継続する方法が挙げられる。
【００２１】
金属培地におけるチオ硫酸又はその塩の濃度は、重金属イオンを不溶化する活性を有する微生物群が得られやすい点で、５００〜１５００ｍｇ／Ｌが好ましく、８００〜１０００ｍｇ／Ｌがより好ましい。金属培地における重金属イオンの濃度としては、例えば、Ｃｕ２＋が１〜３ｍＭ、Ｃｄ２＋が１〜３ｍＭ、Ｚｎ２＋が１〜３ｍＭであることが好ましい。金属培地のその他の成分としては、例えば、ニトリロ三酢酸、トリプチケースソイブロス培地が挙げられる。
【００２２】
本発明に係る微生物群は、下記条件にて、重金属イオンを含有する培養液にて培養後、ＩＣＰ−ＡＥＳ分析（高周波誘導結合プラズマ発光分光分析法）により測定した金属除去率が、培養前と比較して、５０〜１００％であることが好ましく、より好ましくは８０〜１００％である。
［培養条件］
・好気条件：回転振盪１２０ｒｐｍ
・培養温度：２８℃
・培養時間：１８時間
・培養スケール：２０ｍＬ
・培養開始時の細菌数：１０６個／ｍＬ
・培養液：２ｍＭ  Ｃｕ２＋、２ｍＭ  Ｃｄ２＋、２ｍＭ  Ｚｎ２＋、５ｍＭ  Ｎａ２Ｓ２Ｏ３、５ｍＭ  ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、１００ｍＭ  ＭＥＳ）を含有するＴＳＢ培地
・培養開始時：ｐＨ６
【００２３】
［重金属イオンを不溶化する方法］
以下に、集積した微生物群を用いて重金属イオンを不溶化する方法について説明する。本発明の方法は、硫化水素の産生を抑えた硫化物生成が可能であるとともに、嫌気性微生物が産生する特有の臭いを発生させないことから、バイオスティミュレーションまたはバイオオーグメンテーションによる原位置の浄化方法に好適である。ここで、「バイオスティミュレーション」とは、汚染現場に土着の有効な浄化微生物を栄養塩等の注入で活性化することをいう。また、「バイオオーグメンテーション」とは、研究室等にて分離・保存している外来の浄化微生物を汚染現場に導入することをいう。
【００２４】
本発明の方法により重金属イオンを不溶化する対象としては、例えば、工業廃液、工業廃水、工業廃棄物及び汚染土壌が挙げられる。本発明に係る微生物群を作用させるための方法としては、対象の形態に適した方法を選択可能であり、例えば、添加、散布、混合などが挙げられる。微生物群の適用量は任意に設定可能であり、予備実験を通じて対象に適した適用量を設定できる。微生物群の適用方法としては、例えば、本発明に係る微生物群を支持体に固定化又は担持させた状態で培養系に適用してもよい。
【００２５】
本発明の方法による重金属イオンの不溶化は、過剰の硫化水素の発生を抑制する点から、好気条件下で行うことが好ましい。本発明において、「好気条件」とは、通気、振盪、および撹拌等の酸素供給手段によって酸素が培養系に供給される培養条件をいう。
【００２６】
本発明の方法による重金属イオンの不溶化は、硫黄源としてチオ硫酸又はその塩を用いることが好ましく、チオ硫酸又はチオ硫酸塩のいずれか一方のみを用いてもよいし、これらの双方を用いてもよい。
【００２７】
チオ硫酸塩としては、培地中でチオ硫酸イオンを遊離可能であることを限度として特に制限されないが、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩；アンモニウム塩等が挙げられる。これらのチオ硫酸塩は、１種単独で使用してもよく、また２種以上を組み合わせて使用してもよい。これらのチオ硫酸塩の中でも、好ましくはアルカリ金属塩、更に好ましくはナトリウム塩が挙げられる。
【００２８】
硫黄源としてチオ硫酸又はその塩を用いる場合、チオ硫酸又はその塩の培地中の濃度は培地の種類や培養方式等に応じて適宜設定すればよいが、例えば、好ましくは１〜１０ｍＭ、より好ましくは３〜８ｍＭ、さらに好ましくは５〜６ｍＭが挙げられる。
【００２９】
本発明の方法による重金属イオンの不溶化は、微生物の活性の点から、２０〜６５℃が好ましく、２５〜５０℃が好ましく、２８〜４０℃がより好ましい。また、本発明の方法におけるｐＨ条件としては、５〜８であることが好ましく、より好ましくは６〜７である。
【実施例】
【００３０】
以下、本発明を実施例によりさらに説明するが、本発明は下記例に制限されるものではない。
【００３１】
［試料及び方法］
（１）土壌試料
土壌試料は、兵庫県朝来市生野町の鉱山跡地付近における表層３０ｃｍから採取した。本土壌に蒸留水を加え、スラリー状化した。
【００３２】
（２）重金属イオン除去率の分析方法
培養物および金属培地中に含まれる重金属イオンの量は日立ハイテクサイエンス社製ＩＣＰ発光分析装置（ＩＣＰ−ＡＥＳ分析）により測定した。培養物中に含まれる重金属イオンの量を金属培地中の該重金属イオンの量で除した値を１から引き、百分率で表した数値を重金属イオンの除去率とした。
【００３３】
試験例１．微生物群の集積
上記（１）で調製した土壌１ｇ（湿重量）を２０ｍｌの金属培地（ＴＳＢ培地；２ｍＭ  Ｃｕ２＋、２ｍＭ  Ｃｄ２＋、２ｍＭ  Ｚｎ２＋、１０ｍＭ  Ｎａ２Ｓ２Ｏ３、１０ｍＭ  ＮＴＡ、１０ｍＭ  リン酸バッファー）（ｐＨ７．０）を添加し、多孔質シリコンゴム栓で封じたガラス瓶内で、好気条件下で２８℃にて回転振盪培養（１２０ｒｐｍ）した。５日間の培養の後、金属除去率を算出し、銅の除去率が４１．９％を示した培養物について、１％（ｖ／ｖ）を更に金属培地（２０ｍｌのＴＳＢ培地に２ｍＭ  Ｃｕ２＋、２ｍＭ  Ｃｄ２＋、２ｍＭ  Ｚｎ２＋、６、１０または１５ｍＭ  Ｎａ２Ｓ２Ｏ３、１０または２０ｍＭ  ＮＴＡ、１０ｍＭ  リン酸バッファーを添加）（ｐＨ７．０）に植え継ぎ、４〜６日間培養する連続継代培養を行い、このうち重金属イオンの除去活性を維持した培養物についてさらに集積を継続した。その結果４日間の培養で重金属（Ｃｕ）イオンの除去率が３２％である微生物群が得られた。
【００３４】
試験例２．微生物群からの菌の分離
試験例１で得られた微生物群を９０ｍｍシャーレのアガー培地（ＴＳＢ培地に２ｍＭ  Ｃｕ２＋、２ｍＭ  Ｃｄ２＋、２ｍＭ  Ｚｎ２＋、６ｍＭ  Ｎａ２Ｓ２Ｏ３、１０ｍＭ  ＮＴＡ、１．５質量％の寒天粉末を添加）に植菌して培養することによりコロニーを形成させて２種の菌を分離した。分離した２種の菌をＳｔｒａｉｎ１およびＳｔｒａｉｎ２とし、各菌を表１に示す金属培地（２０ｍｌのＴＳＢ培地に２ｍＭ  Ｃｕ２＋、２ｍＭ  Ｃｄ２＋、２ｍＭ  Ｚｎ２＋、０、６、１０または１５ｍＭ  Ｎａ２Ｓ２Ｏ３、１０ｍＭ  ＮＴＡ、１０ｍＭ  リン酸バッファーを添加）（ｐＨ７．０）に植え継ぎ、好気条件下で２８℃にて回転振盪培養（１２０ｒｐｍ）した。４日間培養し、重金属（Ｃｕ）イオンの除去率を確認した。結果を図１（ａ）〜（ｆ）に示す。
【００３５】
【表１】
2020054302.tif 000003
【００３６】
図１（ａ）〜（ｆ）に示すように、分離した２種の菌の重金属（Ｃｕ）イオン除去率は集積系と比較して大幅に低下した。この結果から、試験例１で得られた微生物群は、単菌ではなく集積系であることにより、高い重金属イオン除去率を示す可能性が示唆された。
【００３７】
試験例３．重金属イオン除去率のｐＨ条件依存性についての検討
対象重金属をＣｕ、Ｃｄ、Ｚｎとし、硫黄源をチオ硫酸ナトリウムとして、重金属イオン除去率に対するｐＨ条件の影響を確認した。試験例１で得られた微生物群を、チオ硫酸含有金属培地（ｐＨ７．０）２０ｍＬに植え継ぎ、好気条件下で２８℃にて、４日間回転振盪培養（１２０ｒｐｍ）した。得られた培養物から２００μＬを下記の２つの系に分けてチオ硫酸含有金属培地に植え継ぎ、好気条件下で２８℃にて、４日間回転振盪培養（１２０ｒｐｍ）した。
（Ｄ）ｐＨ６．０のチオ硫酸含有金属培地を用いた培養系
（Ｅ）ｐＨ７．０のチオ硫酸含有金属培地を用いた培養系
【００３８】
各系について、培養前後の培地または培養物における溶存金属濃度を測定し、各重金属イオンの除去率を評価した。結果を図２（ａ）〜（ｃ）に示す。
【００３９】
図２（ａ）〜（ｃ）に示すように、各重金属イオンの除去率はｐＨ７．０よりもｐＨ６．０の方が大きくＺｎはｐＨ７．０では除去率が低かった。なお、初期ｐＨが６．０である（Ｄ）系について培養後のｐＨは７．１であり、初期ｐＨが７．０である（Ｅ）系について培養後のｐＨは８．５であった。
【００４０】
試験例４．硫黄源の影響についての検討
対象重金属をＣｕ、Ｃｄ、Ｚｎとし、硫黄源をチオ硫酸ナトリウム、培地ｐＨを６．０として、重金属イオン除去率に対する硫黄源の効果を確認した。試験例１で得られた微生物群を、チオ硫酸を含有する金属培地（２０ｍｌのＴＳＢ培地に１ｍＭ  Ｃｕ２＋、１ｍＭ  Ｃｄ２＋、１ｍＭ  Ｚｎ２＋、５ｍＭ  Ｎａ２Ｓ２Ｏ３、５ｍＭ  ＮＴＡ、１０ｍＭ  リン酸バッファーを添加。以下、チオ硫酸含有金属培地とも略す。）に植え継ぎ、好気条件下で２８℃にて、４日間回転振盪培養（１２０ｒｐｍ）した。得られた培養物から２００μＬをチオ硫酸含有金属培地に植え継ぎ、好気条件下で２８℃にて、４日間回転振盪培養（１２０ｒｐｍ）した。
【００４１】
その後、得られた培養物を用いて、下記（Ａ）〜（Ｃ）の３つの系に分けて評価した。
（Ａ）チオ硫酸含有金属培地を用いた培養系；チオ硫酸を含有する金属培地（２０ｍｌのＴＳＢ培地に表２に示す組成となるように各成分を添加した培地）に培養物２００μＬを植菌し、好気条件下で２８℃にて、４日間回転振盪培養（１２０ｒｐｍ）。
（Ｂ）チオ硫酸非含有金属培地を用いた培養系；チオ硫酸を含有しない金属培地（２０ｍｌのＴＳＢ培地に表２に示す組成となるように各成分を添加した培地）に培養物２００μＬを植菌し、好気条件下で２８℃にて、４日間回転振盪培養（１２０ｒｐｍ）。
（Ｃ）対照系（植菌無し）；培養物を植菌しないチオ硫酸含有金属培地を好気条件下で２８℃にて、４日間回転振盪（１２０ｒｐｍ）。
【００４２】
【表２】
2020054302.tif 000004
【００４３】
各系について、培養前後の培地または培養物における溶存金属濃度を測定し、各重金属イオンの除去率を評価した。結果を図３（ａ）〜（ｃ）に示す。
【００４４】
図３（ａ）〜（ｃ）に示すように、硫黄源としてチオ硫酸を用いることにより、チオ硫酸非含有培養系および植菌をしていない対照系と比較して、各重金属イオンの除去率が向上することがわかった。
【００４５】
試験例５．重金属イオン除去率に対するバッファーの影響についての検討
試験例１で得られた微生物群の培養物２００μＬを、チオ硫酸を含有する金属培地に植菌し、初期培地のｐＨを６．０として、下記２つの系に分けてチオ硫酸含有金属培地に植え継ぎ、好気条件下で２８℃にて、回転振盪培養（１２０ｒｐｍ）し、４〜６日間毎に植え継ぎした。
（Ｆ）１０ｍＭのリン酸バッファー（シグマ・アルドリッチ社製リン酸水素二カリウム、リン酸二水素カリウム）を含有する、ｐＨ６．０のチオ硫酸含有金属培地に植菌する培養系
（Ｇ）１００ｍＭのＭＥＳバッファー（シグマ・アルドリッチ社製２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸 ナトリウム塩）を含有する、ｐＨ６．０のチオ硫酸含有金属培地に植菌する培養系
【００４６】
各系について、培養前後の培地または培養物における溶存金属濃度を測定し、各重金属イオンの除去率を評価した。結果を図４（ａ）および（ｂ）に示す。
【００４７】
図４（ａ）および（ｂ）に示すように、リン酸バッファーを含有する培地を用いた系と比較して、ＭＥＳバッファーを含有する培地を用いた系は、Ｃｄイオンの除去率が高かった。また、培養後の培地のｐＨは、リン酸バッファーを添加した系ではｐＨ７．５〜８．０であり、ＭＥＳバッファーを添加した系ではｐＨ７．２〜７．５であった。この結果から、微生物群による重金属イオンの除去に際し、培地のｐＨを低く保つためには、ＭＥＳバッファーを含有する培地が好ましいことが分かった。
【００４８】
試験例６．１バッチ中の経時変化の解析
試験例１で得られた微生物群の培養物２００μＬを、チオ硫酸を含有する金属培地に植菌し、初期培地のｐＨを６．０として、好気条件下で２８℃にて、６日間回転振盪培養（１２０ｒｐｍ）した。１バッチ中のｐＨ、金属（Ｃｕ、Ｃｄ、Ｚｎ）イオン濃度について経時変化を観察した結果を図５に示す。
【００４９】
図５に示すように、Ｃｕ、Ｃｄ、Ｚｎの順に、微生物群による除去が生じることがわかった。また、培養時間の経過に伴い、ｐＨが上昇することがわかった。この結果から、培養系における緩衝液の濃度を高めることにより、重金属イオンの除去率の向上を図ることができるものと考えられた。
【００５０】
試験例７．微生物群からの硫化物形成細菌の単離
微生物群からの硫化物形成細菌を単離し、その重金属イオン除去能を評価した。試験例５（Ｇ）で得られた微生物群の培養物を１０６倍希釈でチオ硫酸および金属類を含むアガー培地（ＴＳＢ培地に２ｍＭ  Ｃｕ２＋、２ｍＭ  Ｃｄ２＋、２ｍＭ  Ｚｎ２＋、６ｍＭ  Ｎａ２Ｓ２Ｏ３、１０ｍＭ  ＮＴＡ、１００ｍＭ  ＭＥＳ、１．５質量％の寒天粉末を添加）に塗布した。その結果、表３に示す形状の４種のコロニーＡ〜Ｄが得られた。各コロニーから得た細菌をＳｔｒａｉｎＡ〜Ｄとする。
【００５１】
集積系から菌株を単離し、その金属除去性能を評価した。２４時間の前培養後、１％を本培養液に植種した。前培養液はＣｕ２＋、Ｚｎ２＋、Ｃｄ２＋  各１ｍＭ、ＮＴＡ  ５ｍＭ、チオ硫酸  ５ｍＭ、ＭＥＳ  １００ｍＭを含むＴＳＢ培地を用い、ｐＨは６．０のものを使用した。一方、本培養液はＣｕ２＋、Ｚｎ２＋、Ｃｄ２＋  各１ｍＭ、ＮＴＡ  ５ｍＭ、チオ硫酸  ５ｍＭ、ＭＥＳ  １００ｍＭを含むＴＳＢ培地を用い、ｐＨは６．０のものを使用した。９６時間の培養後、培養液中に溶解している各金属の濃度を測定し、金属除去率を評価した。
【００５２】
なお、ＳｔｒａｉｎＢは前培養の段階で増殖が確認されず、その後も寒天培地からコロニーを添加しても増殖が確認されなかった。したがって、ＳｔｒａｉｎＡ、ＣおよびＤ並びに集積系（微生物群）の金属除去率を評価した。これらの金属除去率を図６（ａ）〜（ｄ）に示す。
【００５３】
また、ＳｔｒａｉｎＡ〜Ｄについて、各々培養物からＤＮＡを抽出し、得られたＤＮＡを鋳型として１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を、Ｔ１００サーマルサイクラー（バイオ・ラッド社製）を用いたＰＣＲ法により増幅し、ＰＣＲ産物として増幅されたＤＮＡ断片を精製した。使用したＰＣＲプライマーの塩基配列を配列番号５および配列番号６に示す。得られた１６ＳｒＲＮＡの塩基配列を決定した結果、ＳｔｒａｉｎＡ〜Ｄの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子はそれぞれ配列表の配列番号１〜４に示される塩基配列を有することが分かった。また、得られた塩基配列をＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  （ＮＣＢI)が提供するＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いて解析した結果、ＳｔｒａｉｎＡ〜Ｄは、表３に示すＧｅｎｕｓ（属）に属する細菌であった。
【００５４】
【表３】
2020054302.tif 000005
【００５５】
図６（ａ）〜（ｄ）に示すように、ＳｔｒａｉｎＡ、ＣおよびＤは、集積系と比較して、重金属イオン除去能が低く、集積系とすることにより、比較的高い除去率が確認された。集積系ではこれらの菌の相互作用により、各重金属イオンが除去されたものと考えられる。
【００５６】
試験例８．硫化水素ガス発生の有無の確認
試験例１で得られた微生物群の培養物２００μＬを、チオ硫酸を含有する金属培地に植菌し、初期培地のｐＨを６として、好気条件下で２８℃にて、６日間回転振盪培養（１２０ｒｐｍ）した。
【００５７】
容器上部の気体をＧＣ−ＭＳにより分析した結果を図７（ａ）〜１３（ｂ）に示す。図７（ａ）〜（ｃ）は硫化水素のスペクトルの有無を示す図であり、図７（ａ）はコントロール、図７（ｃ）は、集積培養容器上部の気体のマススペクトルである。図８（ａ）および（ｂ）はメチルメルカプタン、図９（ａ）および（ｂ）はアセトン、図１０（ａ）および（ｂ）は、クロロホルム、図１１（ａ）および（ｂ）はジメチルジスルフィド、図１２（ａ）および（ｂ）はジメチルトリスルフィドのスペクトルを示す。
【００５８】
図８（ａ）〜（ｃ）に示すように、硫化水素ガスの発生は確認されなかった。一方、図９（ａ）〜図１２（ｂ）に示すように、メチルメルカプタン、ジメチルジスルフィドおよびジメチルトリスルフィドが確認された。
【００５９】
試験例９．微生物群解析から得られた微生物群の系統樹
試験例１で得られた微生物群の培養物について、メタゲノム解析を行った。メタゲノム解析は、ＦａｓｔＤＮＡ  ＳＰＩＮ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  Ｓｏｉｌ（キューバイオジーン社製）を用いて、当該解析装置のプロトコールに従い、微生物群の培養物からメタゲノムＤＮＡを抽出する工程；１６Ｓ  ｒＲＮＡのＶ４領域をＰＣＲにより増幅する工程；ＰＣＲ産物を定量する工程；増幅生成物を配列決定する工程；配列をバイオインフォマティクス的に解析する工程により行った。
【００６０】
１６ＳリボゾームＲＮＡ遺伝子のＶ４領域を増幅する工程は、ＰＣＲにより、配列番号７および８に示す塩基配列のプライマーを用いて行った。また、配列をバイオインフォマティクス的に解析する工程において、配列データの解析にはＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗソフトウェア、ＭＥＧＡソフトウェアを用いた。
【００６１】
結果を表４に示す。また、微生物群の解析から得られた系統樹を図１３に示す。
【００６２】
【表４】
2020054302.tif 000006
【００６３】
表４に示すように、試験例１で得られた微生物群に含まれる主要な構成細菌であるＳｔｒａｉｎＡ〜Ｄを単離できていることがわかった。
【図１】
2020054302.tif 000007
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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