(57)【要約】      （修正有）【課題】複数の単位ＤＮＡのモル数がより揃えられた単位ＤＮＡ組成物の調製方法及びＤＮＡ連結体の作製方法の提供。【解決手段】単位ＤＮＡ組成物の調製方法は、付加配列が連結された複数の単位ＤＮＡを該単位ＤＮＡの種類毎に含む溶液を準備する工程と、各々の溶液の準備後、単位ＤＮＡに付加配列が連結された状態で、各々の溶液中の単位ＤＮＡの濃度を測定し、その結果に基づいて、各々の溶液を分取して、各々の溶液中の単位ＤＮＡのモル数を互いに同一に近づける工程と、を有する。ＤＮＡ連結体の作製方法は、単位ＤＮＡ組成物を調製する工程と、ベクターＤＮＡを準備する工程と、調製後の溶液中の付加配列が連結された単位ＤＮＡから制限酵素を用いて各々の付加配列を除去する工程と、除去工程後、ベクターＤＮＡ及び各々の単位ＤＮＡを互いに連結する工程とを有する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
付加配列が連結された複数の単位ＤＮＡを該単位ＤＮＡの種類毎に含む溶液を準備する工程と、
前記各々の溶液の準備後、前記単位ＤＮＡに付加配列が連結された状態で、前記各々の溶液中の単位ＤＮＡの濃度を測定し、その結果に基づいて、前記各々の溶液を分取して、各々の溶液中の単位ＤＮＡのモル数を互いに同一に近づける工程と、を有する単位ＤＮＡ組成物の調製方法。
【請求項２】
前記付加配列が連結された単位ＤＮＡが環状構造を有し、前記付加配列が複製開始点を有するプラスミドＤＮＡ配列である請求項１記載の単位ＤＮＡ組成物の調製方法。
【請求項３】
前記単位ＤＮＡの各々の塩基長と、各々の単位ＤＮＡに連結された付加配列の塩基長との合計長さの分布の標準偏差が、平均の前記合計長さに対して±２０％以内である請求項１又は２記載の単位ＤＮＡ組成物の調製方法。
【請求項４】
前記各々の単位ＤＮＡに連結された付加配列の平均塩基長が、前記単位ＤＮＡの平均塩基長の２倍以上である、請求項１から３いずれか記載の単位ＤＮＡ組成物の調製方法。
【請求項５】
前記単位ＤＮＡの各々の長さが１６００ｂｐ以下である請求項１から４いずれか記載の単位ＤＮＡ組成物の調製方法。
【請求項６】
前記単位ＤＮＡは、該単位ＤＮＡによって構成される集積ＤＮＡを含むＤＮＡ連結体を作製するために用いられるものであり、
前記単位ＤＮＡを含む溶液を準備する工程は、前記集積ＤＮＡの配列の塩基長を前記単位ＤＮＡの種類の数で割った場合に各々の塩基長が等しくなるように、前記集積ＤＮＡを等分した位置にある配列近傍の非回文配列を境界として、端部に非回文配列を有する前記単位ＤＮＡを設計する工程を含む、請求項１から５いずれか記載の単位ＤＮＡ組成物の調製方法。
【請求項７】
宿主微生物中で有効な複製開始点を含むベクターＤＮＡと集積ＤＮＡとからなる集積ＤＮＡユニットを、１を超えて含む微生物細胞形質転換用ＤＮＡ連結体の作製方法であって、
請求項１から６いずれかに記載の方法によって、単位ＤＮＡ組成物を調製する工程と、
前記ベクターＤＮＡを準備する工程と、
調製後の前記溶液中の付加配列が連結された単位ＤＮＡから制限酵素を用いて各々の付加配列を除去する工程と、
前記除去工程後、前記ベクターＤＮＡ及び前記各々の単位ＤＮＡを互いに連結する工程と、を有し、
前記ベクターＤＮＡ及び前記各々の単位ＤＮＡは互いに順序を保ったまま繰り返し連結し得る構造を有し、
前記集積ＤＮＡは、前記各々の単位ＤＮＡが互いに連結したＤＮＡからなる、ＤＮＡ連結体の作製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、単位ＤＮＡ組成物の調製方法及びＤＮＡ連結体の作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ゲノムレベルの長鎖ＤＮＡの構築等を目的とする、ＤＮＡ合成技術の開発が盛んに行われている。ＤＮＡの合成技術としては、化学合成ＤＮＡやＰＣＲ法により増幅した単位ＤＮＡを集積する技術が知られている。しかし、化学合成ＤＮＡの合成過程や、ＰＣＲ法においては、合成されたＤＮＡにランダムに変異が導入されることが知られている。そのため、遺伝子集積においては、最終段階までのいずれかの段階で必ずＤＮＡの配列を確認し、望ましい配列のものを選択する過程が必要となる。
【０００３】
塩基配列の確認のためには、通常、サンガー法を用いた自動蛍光シーケンサーによって塩基配列決定をするが、この方法によると、１回の塩基配列決定で連続８００塩基程度の長さ塩基配列を確認することが可能である。化学合成やＰＣＲ法により合成した単位ＤＮＡを遺伝子集積前に塩基配列に確認する場合、塩基配列決定の回数が少なければ、時間的、金銭的コストを削減できることになる。そのため、遺伝子集積に用いる化学合成やＰＣＲ法により合成した単位ＤＮＡは、短い方が好ましい。
【０００４】
しかしながら、遺伝子集積に用いる単位ＤＮＡが短いと、多くの単位ＤＮＡを集積する必要がある。
【０００５】
現在、複数の単位ＤＮＡを集積する方法の１つとして、枯草菌のプラスミド形質転換系を利用した遺伝子集積法（ＯＧＡＢ法）が知られている。例えば、特許文献１には、ＯＧＡＢ法を用いた枯草菌細胞形質転換用プラスミドＤＮＡの作製方法が開示されている。
【０００６】
ＯＧＡＢ法では、プラスミド分子間で相同組み換えすることにより１つのＤＮＡ分子中に複数のプラスミドの単位が存在する、いわゆるマルチマープラスミドを用いる。ＯＧＡＢ法によると、形質転換用のＤＮＡ分子は、環状のＤＮＡである必要はなく、同じ方向にプラスミドの１単位と、集積に用いる各単位ＤＮＡとが繰り返し現れるようにタンデムリピート状になっていれば、プラスミドの形質転換は可能である。
【０００７】
ＯＧＡＢ法では、上記のとおり、タンデムリピート状にライゲーションされたＤＮＡ分子を調製する必要があるため、複数の単位ＤＮＡを使用する場合、これらとプラスミドとを連結する必要がある。しかし、単位ＤＮＡの種類が多くなるほど、これらを連結してタンデムリピートを作製するのが困難になり、多数の単位ＤＮＡを連結させるためには、ライゲーション時の各単位ＤＮＡのモル比を１に近づけることが望ましい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特許第４４７９１９９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、現実に各単位ＤＮＡのモル数を精密に制御することは困難である。これは、ＳＹＢＲＧｅｅｎＩ等の蛍光の二本鎖ＤＮＡインターカレーターを利用したＤＮＡ測定法では、測定時の蛍光物質の退色等により分子数を±２０％程度の再現性でしか測定することができないことがその一因である。また、これらの測定方法は、ＤＮＡの単位体積当たりの重量を測定するものであるが、ＯＧＡＢ法では、単位体積あたりのモル数を基準に単位ＤＮＡ量を算出するため、上記測定方法による測定値のＤＮＡの重量からモル濃度への変換が必要となる。そのため、単位ＤＮＡ分子の長さの分布が広い場合には、同じモル数のＤＮＡ分子であっても、重量が単位ＤＮＡの長さに比例し、特に重量の測定値が数倍以上異なる場合は、測定値に基づいて算出される値に大きな誤差が含まれる場合が多い。上記特許文献１の方法においても、各単位ＤＮＡのモル比が１となるように調整することが試みているが、各単位ＤＮＡの長さの分布が広いため、厳密にモル比を制御することができない。
【００１０】
本発明は以上の実情に鑑みてなされたものであり、複数の単位ＤＮＡのモル数がより揃えられた単位ＤＮＡ組成物の調製方法及びＤＮＡ連結体の作製方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、各単位ＤＮＡのそれぞれに付加配列が連結した状態で、単位ＤＮＡのモル数を測定することによって、測定結果における誤差が少なくなることを見出し、本発明を完成するに至った。本発明は、より具体的には以下のようなものを提供する。
【００１２】
（１）付加配列が連結された複数の単位ＤＮＡを該単位ＤＮＡの種類毎に含む溶液を準備する工程と、
前記各々の溶液の準備後、前記単位ＤＮＡに付加配列が連結された状態で、前記各々の溶液中の単位ＤＮＡの濃度を測定し、その結果に基づいて、前記各々の溶液を分取して、各々の溶液中の単位ＤＮＡのモル数を互いに同一に近づける工程と、を有する単位ＤＮＡ組成物の調製方法。
【００１３】
（２）前記付加配列が連結された単位ＤＮＡが環状構造を有し、前記付加配列が複製開始点を有するプラスミドＤＮＡ配列である（１）記載の単位ＤＮＡ組成物の調製方法。
【００１４】
（３）前記単位ＤＮＡの各々の塩基長と、各々の単位ＤＮＡに連結された付加配列の塩基長との合計長さの分布の標準偏差が、平均の前記合計長さに対して±２０％以内である（１）又は（２）記載の単位ＤＮＡ組成物の調製方法。
【００１５】
（４）前記各々の単位ＤＮＡに連結された付加配列の平均塩基長が、前記単位ＤＮＡの平均塩基長の２倍以上である、（１）から（３）いずれか記載の単位ＤＮＡ組成物の調製方法。
【００１６】
（５）前記単位ＤＮＡの各々の長さが１６００ｂｐ以下である（１）から（４）いずれか記載の単位ＤＮＡ組成物の調製方法。
【００１７】
（６）前記単位ＤＮＡは、該単位ＤＮＡによって構成される集積ＤＮＡを含むＤＮＡ連結体を作製するために用いられるものであり、
前記単位ＤＮＡを含む溶液を準備する工程は、前記集積ＤＮＡの配列の塩基長を前記単位ＤＮＡの種類の数で割った場合に各々の塩基長が等しくなるように、前記集積ＤＮＡを等分した位置にある配列近傍の非回文配列を境界として、端部に非回文配列を有する前記単位ＤＮＡを設計する工程を含む、（１）から（５）いずれか記載の単位ＤＮＡ組成物の調製方法。
【００１８】
（７）宿主微生物中で有効な複製開始点を含むベクターＤＮＡと集積ＤＮＡとからなる集積ＤＮＡユニットを、１を超えて含む微生物細胞形質転換用ＤＮＡ連結体の作製方法であって、
（１）から（６）いずれかに記載の方法によって、単位ＤＮＡ組成物を調製する工程と、
前記ベクターＤＮＡを準備する工程と、
調製後の前記溶液中の付加配列が連結された単位ＤＮＡから制限酵素を用いて各々の付加配列を除去する工程と、
前記除去工程後、前記ベクターＤＮＡ及び前記各々の単位ＤＮＡを互いに連結する工程と、を有し、
前記ベクターＤＮＡ及び前記各々の単位ＤＮＡは互いに順序を保ったまま繰り返し連結し得る構造を有し、
前記集積ＤＮＡは、前記各々の単位ＤＮＡが互いに連結したＤＮＡからなる、ＤＮＡ連結体の作製方法。
【００１９】
（８）集積ユニットを構成する単位ＤＮＡの数と集積ユニットの数との積で表される標的連結数のＤＮＡ断片の収率と、該ＤＮＡ断片の濃度の変動係数との関係式に基づいて、前記連結工程における前記ベクターＤＮＡ及び前記各々の単位ＤＮＡの濃度の変動係数を調節する工程を含む、（７）記載のＤＮＡ連結体の作製方法。
【００２０】
（９）前記制限酵素は、タイプＩＩ制限酵素である（７）又は（８）記載のＤＮＡ連結体の作製方法。
【００２１】
（１０）前記除去工程の前に、調製後の単位ＤＮＡを含む溶液のうち、２種以上の単位ＤＮＡを含む溶液を混合する工程を更に有する、（７）から（９）いずれかに記載のＤＮＡ連結体の作製方法。
【００２２】
（１１）前記除去工程後、前記連結工程の前に、前記制限酵素を失活させる工程を更に有する、（７）から（１０）いずれかに記載のＤＮＡ連結体の作製方法。
【００２３】
（１２）前記微生物が枯草菌である（７）から（１１）いずれか記載のＤＮＡ連結体の作製方法。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、複数の単位ＤＮＡのモル数がより揃えられた単位ＤＮＡ組成物の調製方法及びＤＮＡ連結体の作製方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】本発明の一実施例に係るベクターＤＮＡを示す図である。
【図２】本発明の実施例１における単位ＤＮＡのうち、第１０断片の同義語コドン変異体の構造を示す図である。
【図３】本発明の実施例１における単位ＤＮＡのうち、第０１断片又は第２１断片を含む粗プラスミドと、該粗プラスミドの精製後の高純度プラスミドの制限酵素処理後の電気泳動の写真を示す図である。
【図４】本発明の実施例１における精製後の単位ＤＮＡを含むプラスミドのうち、ＢｂｓＩで処理するグループと、ＡａｒＩで処理するグループと、ＢｓｍＢＩで処理するグループについて、それぞれの制限酵素により一括で処理した後の電気泳動の写真を示す図である。
【図５】本発明の実施例１における精製後の単位ＤＮＡを含むプラスミドのうち、ＢｂｓＩで処理するグループと、ＡａｒＩで処理するグループと、ＢｓｍＢＩで処理するグループについて、それぞれの制限酵素により一括で制限酵素処理し、各グループを統合した後の電気泳動の写真を示す図である。
【図６】本発明の実施例１における単位ＤＮＡを含むプラスミドのうち、ＢｂｓＩで処理するグループと、ＡａｒＩで処理するグループと、ＢｓｍＢＩで処理するグループについて、それぞれの制限酵素により一括で処理し、各グループを統合した後の、サイズ分画前後の、各単位ＤＮＡの分子数の分布を示す図である。
【図７】本発明の実施例１における単位ＤＮＡを含むプラスミドのうち、ＢｂｓＩで処理するグループと、ＡａｒＩで処理するグループと、ＢｓｍＢＩで処理するグループについて、それぞれの制限酵素により一括で処理し、各グループを統合した後の、サイズ分画前後の、各単位ＤＮＡの分子数の変化率を示す図である。
【図８】本発明の実施例１における、単位ＤＮＡとベクターＤＮＡとをライゲーションした後の電気泳動の写真を示す図である。
【図９】本発明の実施例１における、単位ＤＮＡとベクターＤＮＡとをライゲーションした後のＤＮＡ連結体を枯草菌に形質転換した後に、該形質転換後の複数の枯草菌からプラスミドを抽出し、該プラスミドを制限酵素処理した後の電気泳動の写真を示す図である。
【図１０】本発明の実施例１における、形質転換後の複数の枯草菌からプラスミドを抽出し、該プラスミドを制限酵素処理した後の電気泳動の写真の結果から、目的とする集積ＤＮＡを含む枯草菌のクローンを選別し、制限酵素処理を行った後の電気泳動の写真を示す図である。
【図１１】本発明の実施例１における、選別された集積ＤＮＡがラムダファージＤＮＡのプラークを形成したことを示す図である。
【図１２】本発明の実施例１における、選別された集積ＤＮＡのゲノムと、野生型ラムダファージをＡｖａＩで制限酵素処理を行った後の写真を示す図である。
【図１３】本発明の実施例２における、精製後の単位ＤＮＡを含むプラスミドをＡａｒＩにより一括で制限酵素処理した後の電気泳動の写真を示す図である。
【図１４】本発明の実施例２における、単位ＤＮＡとベクターＤＮＡとをライゲーションした後の電気泳動の写真を示す図である。
【図１５】本発明の実施例２における、単位ＤＮＡとベクターＤＮＡとをライゲーションした後のＤＮＡ連結体を枯草菌に形質転換した後に、該形質転換後の複数の枯草菌からプラスミドを抽出し、該プラスミドを制限酵素処理した後の電気泳動の写真を示す図である。
【図１６】本発明の実施例２における、形質転換後の複数の枯草菌からプラスミドを抽出し、該プラスミドを制限酵素処理した後の電気泳動の写真の結果から、目的とする集積ＤＮＡを含む枯草菌のクローンを選別し、制限酵素処理を行った後の電気泳動の写真を示す図である。
【図１７】試験例１において用いた（Ａ）〜（Ｈ）のＤＮＡの電気泳動の写真を示す図である。
【図１８】試験例１において用いた（Ａ）〜（Ｈ）のＤＮＡが形質転換された枯草菌コンピテントセルの形質転換体出現数を示すグラフである。
【図１９】シミュレーション１の各遺伝子集積規模における、単位ＤＮＡ断片濃度のバラつきＣＶ（％）と、各単位ＤＮＡ断片の相対量の関係を示すグラフである。（ａ）は、６断片集積についてのグラフを示し、（ｂ）は、１３断片集積についてのグラフを示し、（ｃ）は２６断片についてのグラフを示し、（ｄ）は５１断片集積についてのグラフを示す。
【図２０】シミュレーション１の６断片集積において、ＣＶ＝２０％である場合における、Ｎ（１ライゲーション産物に含まれる単位ＤＮＡの数）と、ライゲーション産物分子数との関係を示すグラフである。
【図２１】(ａ)は、シミュレーション１における指数分布曲線へのフィッティングから導き出した、単位ＤＮＡ断片の濃度のバラつきＣＶ（％）についてのλ関数のグラフであり、（ｂ）は、仮想ライゲーション産物のＮ値の平均値から求めた、単位ＤＮＡ断片の濃度のバラつきＣＶ（％）についてのλ関数のグラフである。
【図２２】シミュレーション１におけるλファージゲノム再構成の実験において得られた集積体のうち、＃１、＃２、＃５、＃７、＃８、＃９、＃１０、＃１１についてのミスライゲーションサイトを示す図である。
【図２３】シミュレーション１における、λファージゲノムの再構成の実験におけるＣＶ＝６．６％の断片数のバラつきの単位ＤＮＡ５１断片のライゲーション産物についてのパルスフィールドゲル電気泳動の写真を示す図である。
【図２４】シミュレーション１における、実際のライゲーションした効率と、ライゲーションシミュレーションによるライゲーション効率とを比較したグラフである。（ａ）は、ライゲーション可能数９５％のシミュレーションと比較したグラフを、（ｂ）は、ライゲーション可能数９６％のシミュレーションと比較したグラフを、（ｃ）は、ライゲーション可能数９７％のシミュレーションと比較したグラフを、（ｄ）は、ライゲーション可能数９８％のシミュレーションと比較したグラフを、（ｅ）は、ライゲーション可能数９９％のシミュレーションと比較したグラフを、（ｆ）は、ライゲーション可能数１００％のシミュレーションと比較したグラフを、それぞれ示す。
【図２５】一般式ｆ（Ｎ）＝０．００５８＊ＣＶ（％）＊ｅｘｐ（−０．０５８＊ＣＶ（％）＊Ｎ）を用いて得られた、シミュレーション１の各遺伝子集積規模における、単位ＤＮＡ濃度断片のバラつきＣＶ（％）と、各単位ＤＮＡ断片の相対量の関係を示すグラフである。
【図２６】一般式ｆ（Ｎ）＝０．００５８＊ＣＶ（％）＊ｅｘｐ（−０．００５８＊ＣＶ（％）＊Ｎ）を用いて得られた、単位ＤＮＡ断片の濃度のバラつきと１ライゲーション産物の平均単位ＤＮＡ断片数との関係を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
以下、本発明の実施形態について説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２７】
＜単位ＤＮＡ組成物の調製方法＞
本発明の単位ＤＮＡ組成物の調製方法は、付加配列が連結された複数の単位ＤＮＡを該単位ＤＮＡの種類毎に含む溶液を準備する工程と、各々の溶液の準備後、単位ＤＮＡに付加配列が連結された状態で、各々の溶液中の単位ＤＮＡの濃度を測定し、その結果に基づいて、各々の溶液を分取して、各々の溶液中の単位ＤＮＡのモル数を互いに同一に近づける工程とを有する。本明細書において、「単位ＤＮＡ」の種類は、それぞれの塩基配列毎に区別する。また、「単位ＤＮＡ」には、制限酵素認識部位を付加したものと、付加していないもののいずれも含むものとする。
【００２８】
本発明においては、単位ＤＮＡを含む溶液において、それぞれの単位ＤＮＡの濃度を測定する際に、それぞれの単位ＤＮＡには、付加配列が連結されている。すると、付加配列が連結されている分、溶液の濃度の測定時においては塩基配列の長さの分布が小さくなる。そのため、測定結果に基づいて算出される各単位ＤＮＡのモル数の誤差が少なくなる。よって、この測定結果に基づいて各々の溶液を分取し、各々の溶液中の単位ＤＮＡのモル数を互いに同一となるように調整することによって、各々の溶液中のモル比を１に近づけやすい。なお、上記測定する「溶液中の単位ＤＮＡの濃度」とは、単位ＤＮＡのモル濃度を指す。溶液中の単位ＤＮＡのモル濃度を測定する方法は、特に限定されないが、例えば、溶液中の単位ＤＮＡの質量％を測定し、測定された溶液中の単位ＤＮＡの質量％の数値から、溶液中の単位ＤＮＡのモル濃度を算出してもよい。溶液中の単位ＤＮＡのモル濃度を測定する方法は、ＤＮＡ重量濃度を±２０％以内の正確さで測定可能な手段を用いて測定するのが好ましく、より具体的には、微量分光光度計による紫外線吸収スペクトルを用いるのが好ましい。
【００２９】
付加配列が連結された単位ＤＮＡを含む溶液を準備する工程は、特に限定されず、例えば、単位ＤＮＡを準備し、その後に付加配列を単位ＤＮＡに連結することによって行ってよい。
【００３０】
単位ＤＮＡの準備は、予め合成されたものを用いることにより行ってもよく、また、単位ＤＮＡを作製することによって行ってもよい。単位ＤＮＡは従来の公知の方法によって作製でき、例えば、ポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）や化学合成により作製することができる。また、単位ＤＮＡに制限酵素認識配列を付加する場合は、例えば、鋳型ＤＮＡ上の塩基配列に各突出末端を生成する制限酵素認識配列を付加したプライマーを用い、ＰＣＲにより作製するか、あるいは、予め末端に任意の突出配列を生成するように制限酵素認識配列を組み込んで化学合成を行うことによって作製することができる。作製した単位ＤＮＡは、従来の公知の方法により塩基配列を確認することができ、例えば、単位ＤＮＡをプラスミドに組みこみ、サンガー法を用いた自動蛍光シーケンサーによって塩基配列決定をすることによって確認することができる。
【００３１】
付加配列は、特に限定されず、直鎖状ＤＮＡであってもよく、環状のプラスミドであってもよい。環状のプラスミドＤＮＡ配列を使用すると、付加配列が連結された単位ＤＮＡが環状構造を有するため、例えば、大腸菌等の宿主に形質転換することができる。
【００３２】
プラスミドＤＮＡの種類は、特に限定されないが、形質転換した宿主中でプラスミドＤＮＡを複製するためには、プラスミドＤＮＡ配列が複製開始点を有するのが好ましい。具体的には、大腸菌の高コピープラスミドベクターであるｐＵＣ１９、又はその派生プラスミドが好ましい。また、付加配列が連結されたＤＮＡ間の長さの分布を小さくし、より単位ＤＮＡのモル数を互いに同一に近づけることができる点で、全ての単位ＤＮＡが同一種類のプラスミドベクターにクローニングされていることが好ましい。
【００３３】
単位ＤＮＡへの付加配列の連結は、例えば、ＤＮＡリガーゼを用いたライゲーションにより行ってもよく、プラスミドＤＮＡに連結する場合は、ＴＡクローニング法により行ってもよい。
【００３４】
単位ＤＮＡの各々の塩基長と、各々の単位ＤＮＡに連結された付加配列の塩基長との合計長さの分布の標準偏差は、特に限定されないが、少ない方が、溶液中のＤＮＡの濃度の測定結果に基づいて算出される各単位ＤＮＡのモル数の誤差が少なくなるので、各々の溶液中の単位ＤＮＡのモル数を互いにより同一近づけることができる。具体的には、各々の単位ＤＮＡに連結された付加配列の塩基長との合計長さの分布の標準偏差は、平均の合計長さに対して±２０％以内であるのが好ましく、±１５％以内であるのがより好ましく、±１０％以内であるのがより一層好ましく、±５％以内であるのが更に好ましく、±１％以内であるのがなお更に好ましく、±０．５％以内であるのが最も好ましい。
【００３５】
各々の単位ＤＮＡに連結された付加配列の平均塩基長は、特に限定されないが、単位ＤＮＡの平均塩基長と比較して長い方が、溶液中のＤＮＡの濃度の測定結果に基づいて算出される各単位ＤＮＡのモル数の誤差が少なくなるので、各々の溶液中の単位ＤＮＡのモル数を互いにより同一近づけることができる。具体的には、各々の単位ＤＮＡに連結された付加配列の平均塩基長は、単位ＤＮＡの平均塩基長に対して、２倍以上であるのが好ましく、５倍以上であるのが更に好ましく、１０倍以上であるのが更に好ましく、２０倍以上であるのが最も好ましい。また、単位ＤＮＡに連結された付加配列の平均塩基長が長すぎると、付加配列が連結された単位ＤＮＡの操作を行いにくくなる。そのため、各々の単位ＤＮＡに連結された付加配列の平均塩基長は、単位ＤＮＡの平均塩基長に対して、１００００倍以下（具体的には、５０００倍以下、３０００倍以下、１０００倍以下、５００以下、２５０以下、１００倍以下等）等であるのが好ましい。
【００３６】
単位ＤＮＡの各々の長さは、特に限定されないが、単位ＤＮＡの塩基配列を確認する際に、塩基配列決定の回数が少ない方が、時間的、金銭的コストを削減できることになるのが好ましい。そのため、単位ＤＮＡの各々の長さは、短い方が好ましく、具体的には、１６００ｂｐ以下であるのが好ましく、１２００ｂｐ以下であるのが更に好ましい。特に、サンガー法を用いた自動蛍光シーケンサーによって塩基配列決定をする場合、１回の塩基配列決定で連続８００塩基程度の長さ塩基配列を確認することが可能であるので、単位ＤＮＡの各々の長さは、８００ｂｐ以下（具体的には、６００ｂｐ以下、５００ｂｐ以下、４００ｂｐ以下、２００ｂｐ以下、１００ｂｐ以下等）であるのが最も好ましい。このように、単位ＤＮＡの各々の長さが短いと、これを後述するＤＮＡ連結体の作製に用いる場合、多数の単位ＤＮＡを必要とする。しかし、本発明の方法で調製した単位ＤＮＡを用いると、後述のとおり、多数の単位ＤＮＡの連結が可能である。また、単位ＤＮＡの各々の長さが短すぎると、単位ＤＮＡ数が多くなり、作業効率が落ちる。そのため、単位ＤＮＡの各々の長さは、２０ｂｐ以上であるのが好ましく、３０ｂｐ以上であるのがより好ましく、５０ｂｐ以上であるのが更に好ましい。
【００３７】
本発明の調製方法により、単位ＤＮＡ組成物の用途は、特に限定されないが、本発明の方法により調製方法によって調製された単位ＤＮＡ組成物は、該単位ＤＮＡによって構成される集積ＤＮＡを含むＤＮＡ連結体を作製するために用いることができる。本発明の方法により調製方法によって調製された単位ＤＮＡ組成物を用い、後述の方法によりＤＮＡ連結体を作製した場合、多くの単位ＤＮＡ（例えば５０種以上）を連結することができる。これは、本発明の方法により調製方法によって調製された単位ＤＮＡ組成物において、各々の単位ＤＮＡのモル数がより正確に同一に近いためであると考えられる。
【００３８】
本発明において、単位ＤＮＡを含む溶液を準備する工程は、単位ＤＮＡを設計する工程を含んでもよい。単位ＤＮＡの設計は、特に限定されないが、例えば、単位ＤＮＡ組成物を、集積ＤＮＡを含むＤＮＡ連結体を作製するために用いる場合、集積ＤＮＡの配列の塩基長を単位ＤＮＡの種類の数で割った場合に各々の塩基長が等しくなるように、集積ＤＮＡを等分した位置にある配列近傍の非回文配列を境界として行ってもよい。このように単位ＤＮＡの設計を行った場合、それぞれの単位ＤＮＡの長さが略同一の長さとなる。そのため、後述のＤＮＡ連結体の作製に用いる場合、制限酵素により付加配列を除去した後の電気泳動後のサイズ分画において、略同一の位置のバンドとして現れるため、１回のサイズ分画で単位ＤＮＡを回収でき、作業効率が向上する点で好ましい。「集積ＤＮＡを等分した位置にある配列近傍」は、特に限定されないが、塩基配列の長さから適宜設定してもよい。例えば、各々の単位ＤＮＡの塩基長が１０００ｂｐである場合、「集積ＤＮＡを等分した位置」から、１００ｂｐ以内（具体的には、９０ｂｐ以内、８０ｂｐ以内、７０ｂｐ以内、６０ｂｐ以内、５０ｂｐ以内、３０ｂｐ以内、２０ｂｐ以内、１０ｂｐ以内、５ｂｐ以内等）であってもよい。
【００３９】
また、上記のとおりに単位ＤＮＡの設計を行う場合、目的とする集積ＤＮＡを含むＤＮＡ連結体の作製を行う場合、単位ＤＮＡの端部に非回文配列（パリンドローム配列でない配列）を有するように設計するのが好ましい。このように設計された単位ＤＮＡは、その非回文配列を突出配列にした場合、後述の互いに順序を保ったまま繰り返し連結し得る構造となる。
【００４０】
＜ＤＮＡ連結体の作製方法＞
本発明は、ＤＮＡ連結体の作製方法も包含する。本発明のＤＮＡ連結体の作製方法は、上述の方法による、単位ＤＮＡ組成物を調製する工程と、ベクターＤＮＡを準備する工程と、調製後の溶液中の付加配列が連結された単位ＤＮＡから制限酵素を用いて各々の付加配列を除去する工程と、除去工程後、ベクターＤＮＡ及び各々の単位ＤＮＡを互いに連結する工程と、を有する。
【００４１】
ＤＮＡ連結体は、集積ＤＮＡユニットを１を超えて含み、微生物細胞形質転換用である。集積ＤＮＡユニットは、ベクターＤＮＡと集積ＤＮＡとからなる。ＤＮＡ連結体の集積ＤＮＡユニット数は、１超であれば特に限定されないが、形質転換効率を上げるためには、好ましくは１．５以上であり、より好ましくは２以上であり、更に好ましくは３以上であり、最も好ましくは４以上である。
【００４２】
ベクターＤＮＡは、形質転換の対象となる宿主微生物中で有効な複製開始点を含む。ベクターＤＮＡは、ＤＮＡ連結体が形質転換されうる微生物中で、ＤＮＡの複製を可能とする配列を有するものであれば、特に限定されず、例えば、後述するＢａｃｉｌｌｕｓ属細菌（枯草菌）中で有効な複製開始点の配列が挙げられる。枯草菌中で有効な複製開始点の配列は、特に限定されないが、例えば、θ型の複製機構を有するものとしては、ｐＴＢ１９（Ｉｍａｎａｋａ，Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｉ．  １３０，  １３９９−１４０８．  （１９８４））やｐＬＳ３２（Ｔａｎａｋａ，  Ｔ  ａｎｄ  Ｏｇｒａ，  Ｍ．  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ４２２，  ２４３−２４６．  （１９９８））、ｐＡＭβ１（Ｓｗｉｎｆｉｅｌｄ，  Ｔ．  Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｅｎｅ  ８７，  ７９−９０．  （１９９０））等のプラスミドに含まれる複製開始点等の配列が挙げられる。
【００４３】
集積ＤＮＡは、上述の各々の単位ＤＮＡが互いに連結したＤＮＡからなる。本発明におけるＤＮＡとは、クローニングの対象となるＤＮＡであり、その種類や大きさは特に限定されない。具体的には、原核生物、真核生物、ウイルス等の天然由来配列、人工設計配列等であってよい。本発明の方法においては、上述のとおり、プラスミド上に多数の単位ＤＮＡを連結できるので、塩基長の長いＤＮＡを用いるのが好ましい。塩基長の長いＤＮＡとしては、例えば、一連の代謝経路を構成する遺伝子群や、ファージ等のゲノムＤＮＡ全体又はゲノムＤＮＡの一部分等が挙げられる。
【００４４】
集積ＤＮＡユニットは、ベクターＤＮＡや集積ＤＮＡ以外にも、必要に応じて適当な塩基配列を含んでもよく、含まなくてもよい。例えば、集積ＤＮＡに含まれる遺伝子を発現するためのプラスミドを作製する場合、プロモーター、オペレーター、アクチベーター、ターミネーター等の転写翻訳を制御する塩基配列を含んでもよい。枯草菌を宿所とした場合のプロモーターとしては、具体的には、ＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ  ｓ−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）で発現制御可能なＰｓｐａｃ（Ｙａｎｓｕｒａ，  Ｄ．  ａｎｄ  Ｈｅｎｎｅｒ，  Ｄ．  Ｊ．  Ｐｒｏ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ，  ＵＳＡ  ８１，  ４３９−４４３．（１９８４．））、あるいはＰｒプロモーター（Ｉｔａｙａ，  Ｍ．  Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ６３，  ６０２−６０４．  （１９９９））等が挙げられる。
【００４５】
ベクターＤＮＡ及び各々の単位ＤＮＡは、互いに順序を保ったまま繰り返し連結し得る構造を有する。本明細書において、「互いにその順序を保ったまま連結する」とは、集積ＤＮＡユニット上で隣り合う配列を有する単位ＤＮＡ又はベクターＤＮＡとがその順序及び向きを保って結合することをいう。また、「繰り返し連結する」とは、５’末端の塩基配列を有する単位ＤＮＡ又はベクターＤＮＡの５’末端と、３’末端の塩基配列を有する単位ＤＮＡ又はベクターＤＮＡの３’末端が結合することをいう。このような単位ＤＮＡとして、具体的には、例えば、断片の突出末端の塩基配列の相補性を利用して、お互いに順序を保ったまま繰り返し連結し得るような末端を有するものが挙げられる。この突出の構造は、非回分配列であれば、５’末端突出、３’末端突出の形状の違いも含めて、特に制限はない。
【００４６】
上記突出末端は、単位ＤＮＡから制限酵素を用いて各々の付加配列を除去する工程によって、作製されるのが好ましい。したがって、本発明の方法によりＤＮＡ連結体を作製する場合、単位ＤＮＡは、該制限酵素によって付加配列を除去するために、制限酵素認識配列を有するのが好ましい。ベクターＤＮＡの準備は、例えば、ベクターＤＮＡが、単位ＤＮＡとお互いに順序を保ったまま繰り返し連結するための突出末端を設けるように、制限酵素処理を行うことよってすることができる。
【００４７】
上述の付加配列の除去に用いる制限酵素は、特に限定されないが、好ましくはタイプＩＩ制限酵素、より好ましくはＡａｒＩ、ＢｂｓＩ、ＢｂｖＩ、ＢｃｏＤＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｓａＩ、ＢｓａＸＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｐＱＩ、ＢｔｇＺＩ、ＦｏｋＩ、ＳｆａＮＩ等の、認識配列の外側の定まった長さ離れた場所に任意の配列の突出末端を作製可能であるタイプＩＩＳ制限酵素である。タイプＩＩＳ制限酵素を用いると、単位ＤＮＡの突出末端が各連結部位で異なるものにできるため、その連結する順序が保たれる。また、ベクターＤＮＡの準備においても、単位ＤＮＡの準備と同様に、単位ＤＮＡとお互いに順序を保ったまま繰り返し連結するための突出末端を設けるように、タイプＩＩＳ制限酵素を用いて準備するのが好ましい。
【００４８】
各単位ＤＮＡについて、付加配列の除去に使用する制限酵素の種類毎にグループに分類した場合、除去工程の前に、各グループ毎に、２種以上の単位ＤＮＡを含む溶液を混合することができる。これにより、単位ＤＮＡ毎に制限酵素処理を行う必要がなく、制限酵素のグループ毎に一回で制限酵素処理ができ、更に、例えば電気泳動により単位ＤＮＡの分画を行う場合、一回の分画で単位ＤＮＡを回収可能であるので、作業の効率が向上する。また、複数の単位ＤＮＡのグループがある場合、グループ毎に分画を行い、単位ＤＮＡを回収した際に、グループ間で回収量に誤差が生じうるため、単位ＤＮＡ間で揃えられたモル数に誤差が生じうる。そのため、付加配列の除去に使用する制限酵素の種類毎にグループに分類した場合、そのグループは少ない方が好ましく、すなわち、付加配列の除去に使用する制限酵素の種類は少ない方が好ましい。よって、使用する制限酵素の種類は、好ましくは５種以下であり、より好ましくは３種以下であり、最も好ましくは１種である。すなわち、使用する制限酵素が一種であれば、全ての単位ＤＮＡを含む溶液を混合することができるので、作業の効率が飛躍的に向上し、更に、単位ＤＮＡ間で揃えられたモル数に誤差が生じにくい。なお、制限酵素は、略等モルの状態で混合されるので、このように混合したものを用いても、多数の単位ＤＮＡが連結可能である。
【００４９】
単位ＤＮＡにタイプＩＩＳ制限酵素認識配列を付加する場合、各単位ＤＮＡが有する配列を認識しないように、単位ＤＮＡの制限酵素認識配列の設計を行う。すなわち、あるタイプＩＩＳ制限酵素を用いようとした場合、そのタイプＩＩＳ制限酵素が一方の単位ＤＮＡの配列を認識しなくても、他方の単位ＤＮＡの配列を認識する場合、該他方の単位ＤＮＡについてはそのタイプＩＩＳ制限酵素とは異なるタイプＩＩＳ制限酵素を使用するように、それぞれの単位ＤＮＡの制限酵素認識配列の設計を行う。このように設計した場合、単位ＤＮＡ毎に使用するタイプＩＩＳ制限酵素が異なるが、このタイプＩＩＳ制限酵素の種類によって、単位ＤＮＡを上記グループの分類に使用できる。各単位ＤＮＡのいずれの配列も認識しないタイプＩＩＳ制限酵素があれば、その制限酵素認識配列を付加して単位ＤＮＡを設計することにより、１つのタイプＩＩＳ制限酵素によってまとめて単位ＤＮＡから付加配列を除去できる。
【００５０】
ベクターＤＮＡ及び各々の単位ＤＮＡを互いに連結する工程は、特に限定されないが、制限酵素処理を行った後に、制限酵素処理後の付加配列と単位ＤＮＡとを分画し、分画した単位ＤＮＡとベクターＤＮＡとＤＮＡリガーゼ等を用いて連結（ライゲーション）することにより行うことができる。これにより、微生物形質転換用ＤＮＡ連結体を作製することができる。なお、連結工程における単位ＤＮＡは、制限酵素認識配列が付加されていないものである。
【００５１】
付加配列と単位ＤＮＡとの分画法は、特に限定されないが、制限酵素処理後の各単位ＤＮＡのモル比率の関係が崩れない方法であるのが好ましく、具体的には、アガロースゲル電気泳動によるのが好ましい。
【００５２】
単位ＤＮＡとベクターＤＮＡとの連結方法は、特に限定されないが、ポリエチレングリコールと塩の存在下で行うことが好ましい。塩としては、より好ましくは、１価のアルカリ金属の塩である。より具体的には、１０％のポリエチレングリコール６０００と２５０ｍＭの塩化ナトリウムを含むライゲーション反応液で行うのが更に好ましい。また、各単位ＤＮＡのライゲーション反応液中の濃度は、特に限定されない、好ましくは、各々１ｆｍｏｌ／μｌ以上の濃度であるのが好ましい。ライゲーションの反応温度、時間は、特に限定されないが、好ましくは、３７℃で３０分以上である。なお、ライゲーション反応液中のベクターＤＮＡは、反応前にベクターＤＮＡを含む溶液のＤＮＡ濃度を測定し、単位ＤＮＡと等モルになるように調整するのが好ましい。
【００５３】
本発明に係るＤＮＡ連結体の調製方法は、集積ユニットを構成する単位ＤＮＡの数と集積ユニットの数との積で表される標的連結数のＤＮＡ断片の収率と、該ＤＮＡ断片の濃度の変動係数（以下、本明細書において「変動係数１」という）との関係式（以下、本明細書において「関係式」という）に基づいて、連結工程におけるベクターＤＮＡ及び各々の単位ＤＮＡの濃度の変動係数（以下、本明細書において「変動係数２」という）を調節する工程を含んでもよく、含まなくてもよいが、含むことが好ましい。なお、変動係数１は、関係式において便宜的に使用される変動係数であり、変動係数２は、実際の連結工程における単位ＤＮＡ及びベクターＤＮＡの濃度の変動係数である。この調節工程を含むことにより、連結工程において、所望の数の単位ＤＮＡの数（例えば、５０断片数の単位ＤＮＡ）を連結させることを試みる場合に、変動係数２を、上記関係式が示す範囲に調節することで、その連結を達成することができる。
【００５４】
標的連結数は、連結工程において連結させたい所望のＤＮＡ断片の数を指し、より具体的には、連結集積ユニットを構成する単位ＤＮＡの数と集積ユニットの数との積で表される。「標的連結数のＤＮＡ断片の収率」とは、連結に使用されるＤＮＡの全断片数に対する、連結後の集積ＤＮＡユニットを構成するＤＮＡの断片数の割合を意味する。
【００５５】
本発明に係る関係式は、標的連結数のＤＮＡ断片の収率と変動係数１との関係を示した式であり、例えば、コンピュータによるライゲーションシミュレーションから求めた式を使用することができる。より具体的には、関係式は、例えば変動係数１を０〜２０％の１％毎に変化させた単位ＤＮＡ断片集団（例えば、１０〜３０集団）において、ライゲーションシミュレーションを行い、ＤＮＡ連結体の単位ＤＮＡ断片数の分布（例えば、指数分布）を調べ、この分布に対するフィッティングカーブを作製し、そのフィッティングカーブを用いて、設定することができる。具体的なライゲーションシミュレーションに用いるツールとしては、特に限定されず、従来の公知の手段を用いることができるが、例えば、表計算ソフトＥｘｃｅｌ（登録商標）２００７のＶＢＡ（Ｖｉｓｕａｌ  Ｂａｓｉｃ  ｆｏｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）を用いることができ、これを用いてプロミングを行い、所要のアルゴリズムを設定することによって、シミュレーションを行うことができる。また、フィッテイングカーブは、例えば表計算ソフトＥｘｃｅｌ（登録商標）２００７ソフトウェアの指数近似曲線機能により作製することができる。関係式に基づく変動係数２の調整は、例えば、関係式を設計した後、所望のＤＮＡ断片の収率を関係式に代入し、連結時のＤＮＡ断片が算出された変動係数１になるように、連結前の各工程における操作を調整することによって行うことができる。その調整方法は、特に限定されないが、例えば、ベクターＤＮＡを準備する工程、単位ＤＮＡを調製する工程、ベクターＤＮＡ及び各々の単位ＤＮＡを互いに連結する工程等の各工程において、ベクターＤＮＡ又は各単位ＤＮＡの濃度を測定する場合、その測定に使用する測定機器（分光光度計、分光蛍光光度計、リアルタイムＰＣＲ装置等）を選択する際に、変動係数２が所望の変動係数となるように、予め測定誤差が判明している測定機器を選択してもよい。
【００５６】
変動係数２は、特に限定されないが、連結される際の単位ＤＮＡの濃度の誤差が少ない方が、より多くの単位ＤＮＡを連結することができる。このことから、変動係数２は、２０％以下であることが好ましく、１５％以下であることがより好ましく、１０％以下であることが更に好ましく、８％以下であることがより一層好ましく、５％以下であることが最も好ましい。
【００５７】
本発明のＤＮＡ連結体の調製方法は、除去工程後、連結工程の前に、制限酵素を失活させる工程を更に有してもよい。単位ＤＮＡ内部に、他の単位ＤＮＡの付加配列の切り離しに用いる制限酵素切断部位が存在すると、制限酵素失活前においては、付加配列を持つ単位ＤＮＡ集団を混合することが困難な関係にある。そのため、これらを統合することで一括して単位ＤＮＡの分画をすることができない。しかし、制限酵素を失活させることにより、失活後に、付加配列を持つ単位ＤＮＡ集団を統合することが可能であるため、一括して単位ＤＮＡの分画が可能である。これにより、連結工程の際に、より多くの集積ＤＮＡユニット含むＤＮＡ連結体を作製しやすくなり、結果として、枯草菌の形質転換を行いやすくなる。制限酵素の失活は、従来の公知の方法に行うことができ、例えば、フェノール・クロロフォルム処理により行うことができる。
【００５８】
形質転換の対象となる宿主微生物としては、自然形質転換能を有するものであれば、特に限定されない。自然形質転換能としては、例えば、ＤＮＡを取り込む際に一本鎖ＤＮＡに処理して取り込むもの等が挙げられる。具体的には、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属細菌、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ属細菌、及びＮｅｉｓｓｅｒｉａ属等が挙げられる。また、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌としては、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ（枯草菌）、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ（巨大菌）、Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（中度高熱菌）等が挙げられる。このうち最も好ましい微生物としては、自然形質転換能及び組換え能に優れた枯草菌が挙げられる。
【００５９】
本発明の方法により作製したＤＮＡ連結体は、微生物細胞の形質転換に使用することができるが、形質転換の対象とする微生物をコンピテントとする方法は、それぞれの微生物に適した公知の方法を選択することができる。具体的には、例えば、枯草菌の場合には、Ａｎａｇｎｏｓｔｏｐｏｕｌｏｕ，  Ｃ．  ａｎｄ  Ｓｐｉｚｉｚｅｎ，  Ｊ．  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，  ８１，  ７４１−７４６（１９６１）に記載の方法を用いることが好ましい。また、形質転換の方法もそれぞれの微生物に適した公知の方法を用いることができる。コンピテント細胞に与えるライゲーション産物の液量も特に制限はない。好ましくは、コンピテント細胞培養液に対し、１／２０の量から等量であり、より好ましくは、半量である。形質転換体からプラスミドを精製する方法としても公知の方法を用いることができる。
【００６０】
形質転換体から精製したプラスミドが集積ＤＮＡを有していることは、制限酵素切断により発生する断片のサイズパターンや、ＰＣＲ法、塩基配列決定法により確認することができる。また、挿入ＤＮＡが物質生産等の機能を有する場合は、その機能を検出することにより確認することが可能である。
【実施例】
【００６１】
以下に示す実施例により、本発明を更に具体的に説明するが、以下の実施例は本発明の一例を示すものに過ぎず、本発明の範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
【００６２】
（材料）
形質転換の対象となる微生物細胞として枯草菌を使用した。枯草菌としては、ＲＭ１２５株（Ｕｏｚｕｍｉ，  Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｉ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．，  １５２，  ６５−６９（１９７７））と、その派生株のＢＵＳＹ９７９７株を用いた。枯草菌で複製可能なベクターＤＮＡとして、ｐＧＥＴ１１８（Ｋａｎｅｋｏ，  Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３１，  ｅ１１２  （２００３））を用い、後述のとおりに構築したｐＧＥＴＳ１１８−ＡａｒＩ−ｐＢＲ（配列番号１を参照）、ｐＧＥＴＳ１５１−ｐＢＲ（配列番号２を参照）を使用した。集積ＤＮＡとしては、ラムダファージＤＮＡ（東洋紡社製）（配列番号３を参照）と、後述するメバロン酸経路人工オペロン（配列番号４を参照）を用いた。単位ＤＮＡを組み込んだプラスミドＤＮＡを有する大腸菌の選択には、抗生物質カルベニシリン（和光純薬工業社）を用いた。枯草菌の選択には、抗生物質テトラサイクリン（シグマ社）を用いた。タイプＩＩＳ制限酵素は、ＡａｒＩ（Ｔｈｅｒｍｏ社）、ＢｂｓＩ（ＮＥＢ社）、ＢｓｍＢＩ（ＮＥＢ社）、ＳｆｉＩ（ＮＥＢ社）を用いた。制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、ＰｖｕＩＩ、Ｔ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅは、タカラバイオ社製のものを使用した。大腸菌のプラスミド構築用の一般的なライゲーションには、Ｔａｋａｒａ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  （Ｍｉｇｈｔｙ）（タカラバイオ社）を用いた。単位ＤＮＡ調製用のＰＣＲ反応には、東洋紡社製のＫＯＤ  ｐｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを使用した。プラスミドにクローニングされたＤＮＡの塩基配列決定のためのコロニーＰＣＲには、タカラバイオ社製のＥｘ−Ｔａｑ  ＨＳを用いた。単位ＤＮＡを組み込む付加配列であるプラスミドＤＮＡとしては、ｐＭＤ−１９（ｓｉｍｐｌｅ）（タカラバイオ社）を用いた。環状プラスミド精製用酵素Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｓａｆｅは、ＥＰＩＣＥＮＴＥＲ社製のものを使用した。電気泳動用アガロースゲルは、ＤＮＡ電気泳動用の低融点アガロースゲルである２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ  ａｇａｒｏｓｅ（シグマ社）、又はＵｌｔｒａＰｕｒｅ  Ａｇａｒｏｓｅ（インビトロジェン社）を使用した。制限酵素の失活には、フェノール：クロロフォルム：イソアミルアルコール  ２５：２４：１と、ＴＥ飽和フェノール（８−キノリノール含有）は、ナカライテスク社製のものを使用した。ラムダターミアーゼは、ＥＰＩＣＥＮＴＥＲ社製のものを使用した。ラムダファージのパッケージングには、アジレント・テクノロジーズ社のＧｉｇａｐａｃｋ  ＩＩＩ  Ｐｌｕｓ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｅｘｔｒａｃｔを用いた。リゾチームは和光純薬工業社製のものを使用した。ＬＢ培地の培地成分及び寒天には、ベクトンディッキントン社製のものを使用した。ＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ  ｓ−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）は、和光純薬工業社製のものを使用した。上記以外の他の全ての培地成分及び生化学試薬は、和光純薬工業社製のものを使用した。特記以外のプラスミドの構築には、大腸菌ＤＨ５α株、ＪＭ１０９株又はＴＯＰ１０株のいずれかを使用した。構築したプラスミドの大腸菌からの少量精製には、キアゲン社のＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒ���ｐ  Ｋｉｔを用い、大量精製には、同社のＱＩＡｆｉｌｔｅｒ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔを用いた。酵素反応液からのＤＮＡのクリーンアップには、キアゲン社のＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｃｌｅａｎｕｐ  Ｋｉｔ、又はキアゲン社のＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いた。通常のアガロースゲル電気泳動で分離して得られたゲルブロックを精製する場合は、キアゲン社のＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いた。超微量分光光度計は、Ｔｈｅｒｍｏ社のｎａｎｏ−ｄｒｏｐ  ２０００を用いた。塩基配列決定には、アプライドバイオシステムズ社製の蛍光自動シーケンサーの３１３０ｘｌジェネティックアナライザーを用いた。他の一般的なＤＮＡの操作については、標準プロトコール（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９８９））にしたがって行った。枯草菌の形質転換とプラスミド抽出は、既法のとおり行った（Ｔｓｕｇｅ，  Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３１，  ｅ１３３．（２００３））。
【００６３】
（集積に用いたベクターＤＮＡの構築）
ラムダファージＤＮＡの集積に用いたベクターＤＮＡであるｐＧＥＴＳ１１８−ＡａｒＩ−ｐＢＲ（配列番号１）は、大腸菌のＦ因子の複製開始点ｏｒｉＳと、枯草菌で機能する複製開始点ｒｅｐＡを有する大腸菌―枯草菌間シャトルプラスミドベクターｐＧＥＴＳ１１８（Ｋａｎｅｋｏ,  ｅｔ.  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ３１，ｅ１１２．  （２００３）.）を元に多段階の過程を経て構築されたプラスミドであり、図１に示す構造である。集積遺伝子のクローニングサイトは、２つのＡａｒＩ切断部位間となっており、集積の際に取り除くこの２つのＡａｒＩ切断部位間には、大腸菌中でのベクターの取得を容易にする目的で大腸菌の多コピープラスミドのｐＢＲ３２２の複製開始点と、アンピシリン耐性遺伝子が導入されている。また、ｐＧＥＴＳ１１８内部のテトラサイクリン耐性遺伝子中に存在する天然のＡａｒＩ切断部位については、テトラサイクリン耐性遺伝子（ｔｅｔＬ）のアミノ酸配列に影響を与えないような１塩基の変異を導入することにより認識部位を消失させた。メバロン酸経路人工オペロンの集積に用いたベクターＤＮＡであるｐＧＥＴＳ１５１−ｐＢＲ（配列番号２）は、上述のｐＧＥＴＳ１１８−ＡａｒＩ−ｐＢＲのＤＮＡを鋳型に、３組のプライマーＰａｒｔＡ（５’−ＴＡＧＧＧＴＣＴＣＡａａｇｃｇｇｃｃｇｃａａｇｃｔｔ−３’（配列番号５を参照）と５‘−ＴＡＧＧＧＴＣＴＣＡＧＣｇｇｃｃａａｇａａｇｇｃｃ−３’（配列番号６を参照））、ＰａｒｔＢ（５’−ＴＡＧＧＧＴＣＴＣＡｃｃＧＣＣＣＴＴＣＣＣＧＧＴＣＧＡＴＡＴ−３’（配列番号７を参照）と５’−ＴＡＧＧＧＴＣＴＣＡｔａＴＴＡＧＣＴＴＡＡＴＴＧＴＴＡＴＣＣＧＣＴＣＡＣＡＡＴＴＣＣ−３’（配列番号８を参照））、ＰａｒｔＣ（５’−ＴＡＧＧＧＴＣＴＣＡＡＡｔａａｃｔｇｇａａａａａａｔｔａｇｔｇｔｃｔｃａｔｇｇｔｔｃｇ−３’（配列番号９を参照）と５’−ＴＡＧＧＧＴＣＴＣＡｇｃｔｔａａｇｔｇｇｔｇｇｇｔａｇｔｔｇａｃｃ−３’（配列番号１０を参照））により増幅した断片を連結することにより作製したベクターＤＮＡであり、元のプラスミドに比較して大腸菌中でしか機能しない遺伝子領域（ｃａｔ〜ｏｒｉＳ間、ｐａｒＡ〜ｐａｒＣ間）を除去している（図１）。このベクターＤＮＡは、遺伝子を集積した際には、枯草菌中でしか複製できないが、遺伝子集積においては、ｐＧＥＴＳ１１８−ＡａｒＩ−ｐＢＲと同一の性質を示す。これらのプラスミド溶液約１０μｌ（５μｇ相当）に、滅菌水２９μｌ、制限酵素に付属する１０×Ｂｕｆｆｅｒ＿ｆｏｒ＿ＡａｒＩを５μｌと、同じく制限酵素に付属する切断活性化用の５０×Ｏｌｉｇｏｎｃｌｅｏｔｉｄｅを１μｌ、制限酵素ＡａｒＩ（Ｔｈｅｒｍｏ社）５μｌを添加し３７℃で２時間反応を行った。得られた液体を、低融点アガロースゲル電気泳動により分離後、ベクター本体の約１５ｋｂの断片（ｐＧＥＴＳ１１８−ＡａｒＩ−ｐＢＲの場合）、又は４．３ｋｂの断片（ｐＧＥＴＳ１５１−ｐＢＲの場合）をゲルから切り出し、目的のベクターＤＮＡを精製し、２０μｌのＴＥに溶解した。ベクターＤＮＡの濃度の測定は、このＴＥ溶液１μｌを取り、超微量分光光度計により測定することにより行った。
【００６４】
（単位ＤＮＡ分割領域の設定）
４塩基の突出の多様性は、４の４乗で、２５６とおり存在する。これらのうち本発明に使用する突出配列を以下の基準で選定した。まず、パリンドロームとなる全１６配列（グループ０）（ＡＡＴＴ，ＡＴＡＴ，ＴＡＴＡ，ＴＴＡＡ，ＣＣＧＧ，ＣＧＣＧ，ＧＣＧＣ，ＧＧＣＣ，ＡＣＧＴ，ＡＧＣＴ，ＴＣＧＡ，ＴＧＣＡ，ＣＡＴＧ，ＣＴＡＧ，ＧＡＴＣ，ＧＴＡＣ）は、これらの配列の相補配列も同一配列となり、同一種断片同士の連結が可能となるため、本発明では使用できない為除外した。残りの２４０配列については、一方の配列（例えば、ＣＣＴＡ）に対して、その相補配列（ＴＡＧＧ）を包含するため、ＤＮＡ連結に使用可能な突出配列の組み合わせは理論上、２４０÷２＝１２０組合せである。これらのうち、ＧＣ含量の違いとそのＧＣ塩基の出現順序の違いから、以下の基準で突出組合せのグループ化を行った。
【００６５】
（グループＩ）突出がＡとＴのみからなる突出６組合せ（ＡＡＡＡ／ＴＴＴＴ，ＴＡＡＡ／ＴＴＴＡ，ＡＴＡＡ／ＴＴＡＴ，ＡＡＴＡ／ＴＡＴＴ，ＡＡＡＴ／ＡＴＴＴ，ＡＴＴＡ／ＴＡＡＴ）。
（グループＩＩ）ＡとＴの合計が３個でＣとＧの合計が１個となる全３２組合せ（ＣＡＡＡ／ＴＴＴＧ，ＡＣＡＡ／ＴＴＧＴ，ＡＡＣＡ／ＴＧＴＴ，ＡＡＡＣ／ＧＴＴＴ，ＧＡＡＡ／ＴＴＴＣ，ＡＧＡＡ／ＴＴＣＴ，ＡＡＧＡ／ＴＣＴＴ，ＡＡＡＧ／ＣＴＴＴ，ＣＡＡＴ／ＡＴＴＧ，ＡＣＡＴ／ＡＴＧＴ，ＡＡＣＴ／ＡＧＴＴ，ＡＡＴＣ／ＧＡＴＴ，ＧＡＡＴ／ＡＴＴＣ，ＡＧＡＴ／ＡＴＣＴ，ＡＡＧＴ／ＡＣＴＴ，ＡＡＴＧ／ＣＡＴＴ，ＣＡＴＡ／ＴＡＴＧ，ＡＣＴＡ／ＴＡＧＴ，ＡＴＣＡ／ＴＧＡＴ，ＡＴＡＣ／ＧＴＡＴ，ＧＡＴＡ／ＴＡＴＣ，ＡＧＴＡ／ＴＡＣＴ，ＡＴＧＡ／ＴＣＡＴ，ＡＴＡＧ／ＣＴＡＴ，ＣＴＴＡ／ＴＡＡＧ，ＴＣＴＡ／ＴＡＧＡ，ＴＴＣＡ／ＴＧＡＡ，ＴＴＡＣ／ＧＴＡＡ，ＧＴＴＡ／ＴＡＡＣ，ＴＧＴＡ／ＴＡＣＡ，ＴＴＧＡ／ＴＣＡＡ，ＴＴＡＧ／ＣＴＡＡ）。
（グループＩＩＩ）ＡとＴの合計が２つでＣとＧの合計が２つとなる全５２組合せ中パリンドロームの８組合せを除く４４組合せ（ＡＡＣＣ／ＧＧＴＴ，ＡＡＣＧ／ＣＧＴＴ，ＡＡＧＣ／ＧＣＴＴ，ＡＡＧＧ／ＣＣＴＴ，ＡＣＡＣ／ＧＴＧＴ，ＡＣＡＧ／ＣＴＧＴ，ＡＣＣＡ／ＴＧＧＴ，ＡＣＣＴ／ＡＧＧＴ，ＡＣＧＡ／ＴＣＧＴ，ＡＣＴＣ／ＧＡＧＴ，ＡＣＴＧ／ＣＡＧＴ，ＡＧＡＣ／ＧＴＣＴ，ＡＧＡＧ／ＣＴＣＴ，ＡＧＣＡ／ＴＧＣＴ，ＡＧＧＡ／ＴＣＣＴ，ＡＧＴＣ／ＧＡＣＴ，ＡＧＴＧ／ＣＡＣＴ，ＡＴＣＣ／ＧＧＡＴ，ＡＴＣＧ／ＣＧＡＴ，ＡＴＧＣ／ＧＣＡＴ，ＡＴＧＧ／ＣＣＡＴ，ＣＡＡＣ／ＧＴＴＧ，ＣＡＡＧ／ＣＴＴＧ，ＣＡＣＡ／ＴＧＴＧ，ＣＡＧＡ／ＴＣＴＧ，ＣＡＴＣ／ＧＡＴＧ，ＣＣＡＡ／ＴＴＧＧ，ＣＣＴＡ／ＴＡＧＧ，ＣＧＡＡ／ＴＴＣＧ，ＣＧＴＡ／ＴＡＣＧ，ＣＴＡＣ／ＧＴＡＧ，ＣＴＣＡ／ＴＧＡＧ，ＣＴＧＡ／ＴＣＡＧ，ＣＴＴＣ／ＧＡＡＧ，ＧＡＡＣ／ＧＴＴＣ，ＧＡＣＡ／ＴＧＴＣ，ＧＡＧＡ／ＴＣＴＣ，ＧＣＡＡ／ＴＴＧＣ，ＧＣＴＡ／ＴＡＧＣ，ＧＧＡＡ／ＴＴＣＣ，ＧＧＴＡ／ＴＡＣＣ，ＧＴＣＡ／ＴＧＡＣ，ＧＴＧＡ／ＴＣＡＣ，ＴＣＣＡ／ＴＧＧＡ）。
（グループＩＶ）ＡとＴの合計が１個でＣとＧの合計が３個となる全３２組合せ中、ＣとＧが３連続で並ばない全１６組合せ（ＣＡＣＣ／ＧＧＴＧ，ＣＣＡＣ／ＧＴＧＧ，ＣＴＣＣ／ＧＧＡＧ，ＣＣＴＣ／ＧＡＧＧ，ＣＡＣＧ／ＣＧＴＧ，ＣＣＡＧ／ＣＴＧＧ，ＣＴＣＧ／ＣＧＡＧ，ＣＣＴＧ／ＣＡＧＧ，ＣＡＧＣ／ＧＣＴＧ，ＣＧＡＣ／ＧＴＣＧ，ＣＴＧＣ／ＧＣＡＧ，ＣＧＴＣ／ＧＡＣＧ，ＧＡＧＣ／ＧＣＴＣ，ＧＧＡＣ／ＧＴＣＣ，ＧＴＧＣ／ＧＣＡＣ，ＧＧＴＣ／ＧＡＣＣ）。
（グループＶ）ＡとＴの合計が１個でＣとＧの合計が３個となる全３２組合せ中、ＣとＧが３連続する全１６組合せ（ＡＣＣＣ／ＧＧＧＴ，ＣＣＣＡ／ＴＧＧＧ，ＴＣＣＣ／ＧＧＧＡ，ＣＣＣＴ／ＡＧＧＧ，ＡＣＣＧ／ＣＧＧＴ，ＣＣＧＡ／ＴＣＧＧ，ＴＣＣＧ／ＣＧＧＡ，ＣＣＧＴ／ＡＣＧＧ，ＡＣＧＣ／ＧＣＧＴ，ＣＧＣＡ／ＴＧＣＧ，ＴＣＧＣ／ＧＣＧＡ，ＣＧＣＴ／ＡＧＣＧ，ＡＧＧＣ／ＧＣＣＴ，ＧＧＣＡ／ＴＧＣＣ，ＴＧＧＣ／ＧＣＣＡ，ＧＧＣＴ／ＡＧＣＣ）。
（グループＶＩ）突出がＣとＧのみからなる全６組合せ（ＣＣＣＣ／ＧＧＧＧ，ＧＣＣＣ／ＧＧＧＣ，ＣＧＣＣ／ＧＧＣＧ，ＣＣＧＣ／ＧＣＧＧ，ＣＣＣＧ／ＣＧＧＧ，ＣＧＧＣ／ＧＣＣＧ）。
【００６６】
以上に分割したグループの中から、実施例１及び２では、ベクターＤＮＡと単位ＤＮＡとの境界をグループ１から選んだ。また、単位ＤＮＡ間の境界は、グループＩＩＩ（４４組合せ）とグループＩＶ（１６組合せ）の合計６０の突出組合せを候補に選定した。各突出組合せの指定は、集積対象の配列の完成塩基配列をまず決定してから、この全長を等分する理想分割境界を設定した。以下、実施例１で用いた塩基配列を具体例に挙げて説明する。
【００６７】
実施例１では、ラムダファージゲノム全長４８５０２ｂｐにｃｏｓサイト１６ｂｐと集積に必要な突出配列４ｂｐを付加した４８５２２ｂｐを再構成の対象とした。以下の表１は、実施例１における集積ＤＮＡの理想分割単位、実際の分割単位及び突出塩基配列を示す表である。集積用プラスミドベクターを除く単位ＤＮＡを５０個のほぼ同一のサイズに分割して準備し、これらを連結することで再構成を試みた。全５０個の断片は、理想的には均等な長さになるように分割することが望ましいが、集積対象の配列に一切の塩基の変更を導入しないためには、元から存在する配列に依存して集積に用いる４塩基の５’末端突出を作製する必要がある。しかしながら、全ての理想的な分割境界上に上記記載の突出配列が過不足なく存在する可能性は０に等しく、理想的な分割境界で単位ＤＮＡを等分割することは不可能である。本実施例では、出来るだけ理想的な分割単位に近い長さとなるように、突出組合せの割り当てシミュレーションを行った。まず、全長（４８５２２ｂｐ）を５０で割って得られる９７０ｂｐを理想分割単位とし、絶対塩基番号の小さい領域の単位ＤＮＡから第０１断片、第０２断片、第０３断片、…、第５０断片と命名した。この理想分割境界の絶対位置（すなわち、９７０と９７１塩基の間、１９４０と１９４１塩基の間、２９１０と２９１１塩基の間、…、４７５３０と４７５３１塩基の間）の位置からこの理想分割境界を中心に、４塩基、６塩基、８塩基、１０塩基、１２塩基、１４塩基、１６塩基、１８塩基、２０塩基、２２塩基、２４塩基と順次左右に１塩基ずつ拡大して、上記の突出候補となる４塩基配列の存在の有無を調べた。具体的な一例を挙げて説明する（表１）。第０１断片と第０２断片の理想分割境界は、９７０と９７１塩基の間である。この理想分割境界を中心とした１６塩基（９６３塩基から９８８塩基までの塩基配列５‘−ＡＴＧＣＴＧＣＴＧＧＧＴＧＴＴＴ−３’）については、上記突出組合せ候補が７個（ＡＣＡＣ／ＧＴＧＴ，ＡＧＣＡ／ＴＧＣＴ，ＡＴＧＣ／ＧＣＡＴ，ＣＡＣＣ／ＧＧＴＧ，ＣＡＧＣ／ＧＣＴＧ，ＣＣＡＧ／ＣＴＧＧ，ＣＴＧＣ／ＧＣＡＧ）存在する。この操作を指定した幅で抜き出した全４９本の理想分割単位周辺の塩基配列に対して、その内部に最低１つでも突出候補の配列が存在するか否かを調べた。その結果、抜き出しの幅を２４ｂｐまで拡大すると全ての抜き出し塩基配列について最低１個は突出候補の４塩基が存在することが確認された。各配列に存在する突出候補からの特定の突出の選抜は、まず、上記のように突出組合せ候補の総数が少ない抜き出し配列から、全抜き出し配列中での出現頻度の低い突出組合せ配列から優先的に割り当てるようにすることで、全ての分割単位に対して唯一となる突出組合せを割り振った。
【００６８】
【表１】
2020167997.tif 000002
【００６９】
（実施例１、５０の単位ＤＮＡ及びベクターＤＮＡの集積によるラムダファージの点突然変異体の作製）
＜ラムダファージ＞
ラムダファージは、大腸菌に感染するバクテリオファージで、分子生物学的に最も良く研究されているファージである。ゲノムは全長４８５０２ｂｐの二本鎖ＤＮＡからなり、全ての塩基配列が明らかになっている。また、様々な変異体の存在も明らかになっている。本実施例では、１ｋｂ程度の短い単位ＤＮＡからラムダファージ点突然変異体の作製を行うことを試みた。
【００７０】
＜ラムダファージゲノムの分断化デザイン＞
ラムダファージは、東洋紡社製のλｐｈａｇｅＤＮＡを使用した。本製品は、ｃｏｓサイトで直鎖状になっている。ファージゲノムの全長の塩基配列を調べたところ、データベースに登録されている塩基配列（アクセッションナンバーＪ０２４５９．１）に対して６か所（ｇ．１３８ｄｅｌＧ，ｇ．１４２６６＿１４２６７ｉｎｓＧ，ｇ．３７５８９Ｃ＞Ｔ，ｇ．３７７４３Ｃ＞Ｔ，ｇ．４３０８２Ｇ＞Ａ，ｇ．４５３５２Ｇ＞Ａ）が異なっていた（配列番号３）（配列番号３の全長は、上記４８５２２ｐｂに更にもう一方の突出末端４塩基を含む全長４８５２６ｂｐ）。得られた塩基配列を用いて、全長４８５２２ｂｐ（ｃｏｓサイトの重複を含む）をほぼ均等の長さに分割するために、理想分割境界を９７０ｂｐ毎に設定し、上述の（単位ＤＮＡ分割領域の設定方法）により行った結果、表１に示す切断部位の右側４塩基により構成される５’末端突出が単位ＤＮＡ集団中でそれぞれ特異的になるように割り振ることができた。
【００７１】
＜突出を生成する制限酵素の種類の選定＞
４塩基の任意の突出配列を生成するタイプＩＩＳ制限酵素には、ＡａｒＩ（５’−ＣＡＣＣＴＧＣ（Ｎ）４／−３’，５’−／（Ｎ）８ＧＣＡＧＧＴＧ−３’）、ＢｂｓＩ（５’−ＧＡＡＧＡＣ（Ｎ）２／−３’，５’−／（Ｎ）６ＧＴＣＴＴＣ−３’）、ＢｂｖＩ（５’−ＧＣＡＧＣ（Ｎ）８／−３’，５’−／（Ｎ）１２ＧＣＴＧＣ−３’）、ＢｃｏＤＩ（５’−ＧＴＣＴＣＮ／−３’，５’−／（Ｎ）５ＧＡＧＡＣ−３’）、ＢｆｕＡＩ（５’−ＡＣＣＴＧＣ（Ｎ）４／−３’，５’−／（Ｎ）８ＧＣＡＧＧＴ−３’）、ＢｓａＩ（５’−ＧＧＴＣＴＣＮ／−３’，５’−／（Ｎ）５ＧＡＧＡＣＣ−３’）、ＢｓｍＡＩ（ＢｃｏＤＩのイソジマー）、ＢｓｍＢＩ（５’−ＣＧＴＣＴＣＮ／−３’，５’−／（Ｎ）５ＧＡＧＡＣＧ−３’）、ＢｓｍＦＩ（５’−ＧＧＧＡＣ（Ｎ）１０／−３’，５’−／（Ｎ）１４ＧＴＣＣＣ−３’）、ＢｓｐＭＩ（ＢｆｕＡＩのイソジマー）、ＢｔｇＺＩ（５’−ＧＣＧＡＴＧ（Ｎ）１０／−３’，５’−／（Ｎ）１４ＣＡＴＣＧＣ−３’）、ＦｏｋＩ（５’−ＧＧＡＴＧ（Ｎ）９／−３’５’−／（Ｎ）１３ＣＡＴＣＣ−５’）、ＳｆａＮＩ（５’−ＧＣＡＴＣ（Ｎ）９／−３’，５’−／（Ｎ）１３ＧＡＴＧＣ−５’）等が挙げられる。これらの制限酵素のうち、遺伝子断片をサブクローニングするために使用する大腸菌プラスミドベクター（ｐＭＤ１９，Ｓｉｍｐｌｅ，ＴＡＫＡＲＡ）に存在しないか、あるいは、存在しても発生する断片の大きさが理想分割単位よりも十分に大きい断片と十分に小さい断片とを発生させる制限酵素を調べたところ、全く切断サイトのないものが、５種類（ＡａｒＩ，ＢｂｓＩ，ＢｆｕＡＩ，ＢｓｍＦＩ，ＢｔｇＺＩ）と、ベクター内部に認識配列が存在するが、理想分割単位よりも十分に大きい断片と十分に小さい断片とを発生させる制限酵素１種類（ＢｓｍＢＩ）とが存在し、合計６種類の候補が存在した。これらの候補の制限酵素サイトについて、第０１断片から第５０断片のラムダファージ全体に対してその制限酵素サイトの分布を調べたところ、ＡａｒＩは１２か所、ＢｂｓＩは２４か所、ＢｆｕＡＩは４１か所、ＢｓｍＦＩは３８か所、ＢｔｇＺＩは４５か所、ＢｓｍＢＩは１４か所であり、いずれの制限酵素についても、ラムダファージゲノムに存在しない制限酵素認識部位はなかった。そこで、単位ＤＮＡ毎に内部を切断しない制限酵素をそれぞれ選択して用いることにした。使用する制限酵素の種類を出来るだけ少なくするために制限酵素の組合せを検討したところ、ＢｂｓＩ、ＡａｒＩ、ＢｓｍＢＩの３種類のみの使用で十分であることを確認した。各単位ＤＮＡの切り出しに用いるタイプＩＩＳ制限酵素の割り振りは、以下のようになった。
ＢｂｓＩで切断するグループは、第０１〜０８・１２・１６〜２２・２４・２７・２８・３３〜３９・４３・４５〜５０断片の合計３３断片、ＡａｒＩで切断するグループは、第０９〜１１・１３・２３・２５．３０・３２・４４断片の合計９断片、ＢｓｍＢＩで切断するグループは、第１４・１５・２６・２９・３１・４０〜４２断片の合計８断片とした。
【００７２】
＜遺伝子断片のクローニング＞
第０１断片から第５０断片までの全５０断片については、ＰＣＲ法を用いてラムダファージゲノム全長から増幅した。まず、上記で決定した突出組合せ間のＤＮＡ配列を増幅するためのプライマーの５’末端に上記で決定した制限酵素認識部位を望ましい突出を切り出す位置に付加し、更に５’末端にＴＡＧの配列を付加したプライマーを使用した。これらのプライマー組を用いて、ラムダファージゲノム全長から指定領域のＤＮＡ断片を増幅した。ＰＣＲの反応条件は、１反応（５０μｌ）につき、ＫＯＤ  Ｐｌｕｓ１０×ｂｕｆｆｅｒ  Ｖｅｒ．２５μｌ、２５ｍＭ  ＭｇＳＯ４３μｌ、ｄＮＴＰ（２ｍＭ  ｅａｃｈ）５μｌ、ＫＯＤ  Ｐｌｕｓ（１ｕｎｉｔ／μｌ）１μｌ、ラムダファージＤＮＡ（ＴＯＹＯＢＯ）４８ｐｇ、プライマー（ＦプライマーとＲプライマーのそれぞれ）１５ｐｍｏｌ、滅菌水を添加して作製し、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）により、以下のプログラムにより行った。
【００７３】
９４℃で２ｍｉｎインキュベーション後、９８℃で１０ｓ、５５℃で３０ｓ、６８℃で１ｍｉｎを１サイクルとしてこれを３０サイクル行い、その後に６８℃で７ｍｉｎインキュベートした。増幅した単位ＤＮＡは、２ｍｇ／ｍｌのクリスタルバイオレッド（和光純薬工業社）を含む１×ＴＡＥバッファー（ナカライテスク社製の「トリス−酢酸−ＥＤＴＡ緩衝原液（５０倍濃縮）ｐＨ８．３（ａｔ  ２５℃）」をｍｉｌｌｉＱ水で５０倍に希釈して作製）で作製した１％アガロースゲル（ＵｌｔｒａＰｕｒｅ  Ａｇａｒｏｓｅ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で、電気泳動装置（ｉ−ＭｙＲｕｎ．ＮＣ，  コスモバイオ）を用いて印加電圧を１００Ｖとし、１０ｍｉｎの泳動時間により分離後、泳動ゲル中の目的のＤＮＡのバンドをカミソリにより２００ｍｇ程度のゲル断片として回収した。このゲル断片からＣｏｎｃｅｒｔ  Ｒａｐｉｄ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ライフテクノロジーズ社）を用いて単位ＤＮＡを精製した。具体的には、ゲル断片にその重量の３倍容のＬ１  Ｂｕｆｆｅｒを添加して、４５℃のプロックインキュベーターで１０ｍｉｎ程度溶解し、その溶液を付属のスピンカラムカートリッジ（２ｍｌ遠心チューブにスピンカラムを装着した物）に添加し、２０，０００×ｇ、１ｍｉｎ遠心してフロースルーを捨てた後、そのスピンカラムに７５０μｌのＬ２  Ｂｕｆｆｅｒを添加して２０，０００×ｇ、１ｍｉｎ遠心してフロースルーを捨てた。スピンカラム中に残存しているＬ２  Ｂｕｆｆｅｒ等の残渣をより確実に取り除く目的でカラムを再度２０，０００×ｇ、１ｍｉｎ遠心後、それまでに使用していた２ｍｌ遠心チューブを捨てて、新しい１．５ｍｌ遠心チューブにスピンカラムを移した。そのスピンカラムに３０μｌのＴＥバッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）を添加して２ｍｉｎ放置後、２０，０００×ｇ、１ｍｉｎ遠心することで、ＤＮＡ溶液を回収した。この回収ＤＮＡは、使用まで−２０℃で保存した。得られた単位ＤＮＡは、以下に示すＴＡクローニング法により大腸菌プラスミドベクター中にクローニングした。
【００７４】
単位ＤＮＡ溶液８μｌに、ＴＡＫＡＲＡ社のＰＣＲ反応用酵素Ｅｘ−Ｔａｑに付属する１０×Ｅｘ−Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ  １μｌ、１００ｍＭ  ｄＡＴＰ  ０．５μｌ、Ｅｘ−Ｔａｑ  ０．５μｌを添加して、６５℃で１０ｍｉｎ恒温することで、単位ＤＮＡの３‘末端にＡの突出を付加した。この単位ＤＮＡ溶液１μｌに、ＴＡＫＡＲＡ社のｐＭＤ１９−Ｓｉｍｐｌｅ  １μｌと滅菌水３μｌとを混合し、ＴＡＫＡＴＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ（Ｍｉｇｈｔｙ）Ｍｉｘ  ５μｌを加え、１６℃で３０ｍｉｎ恒温した。このライゲーション溶液５μｌを５０μｌの大腸菌ＤＨ５αのケミカルコンピテントセルに添加して、氷上で１５ｍｉｎ恒温後、４２℃で３０ｓｅｃ熱ショックを与え、２ｍｉｎ氷上で放置後、ＬＢ培地を２００μｌ添加して、３７℃で１ｈ恒温後、カルベニシリン（１００μｇ／ｍｌ）と１．５％寒天とを含むＬＢプレートに塗抹し、３７℃で終夜培養することによりプラスミドの形質転換体を得た。得られたコロニーを、ＰＣＲ用鋳型ＤＮＡ調製試薬（シカジーニアスＤＮＡ調製試薬、関東化学社）を用いて調製した。具体的には、試薬キット内の試薬ａと試薬ｂとを１：１０の比率で混合した溶液を２．５μｌ用意し、これにプレート上のコロニーをつまようじで少量採取したものを懸濁後、７２℃、６ｍｉｎ処理し、その後９４℃で３ｍｉｎ処理した。得られた液体に、ＴＡＫＡＲＡ  Ｅｘ−Ｔａｑ用１０×酵素２．５μｌ、２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ溶液  ２μｌ、１０ｐｍｏｌ／μｌのＭ１３Ｆプライマー０．２５μｌ、１０ｐｍｏｌ／μｌのＭ１３Ｒプライマー０．２５μｌ、滅菌水１７μｌ、Ｅｘ−ＴａｑＨＳ  ０．５μｌを添加して、９４℃、５ｍｉｎインキュベーション後、９８℃で２０ｓｅｃ、５５℃で３０ｓｅｃ、７２℃で１ｍｉｎを１サイクルとして、３０サイクル行うことでＤＮＡを増幅し、このＰＣＲ産物の塩基配列を調べることで、望ましい配列と完全に一致するかどうか調べた。最終的に全てのクローンから正しい配列が得られた。この過程で、第１０断片について得られた変異体の１つに、遺伝子Ｖのコード領域内の同義語置換変異体（ｇ．９５１５Ｇ＞Ｃ）が存在した。この変異により、ファージゲノム中に制限酵素ＡｖａＩ認識部位が新たに出現する（図２）。本実施例においては、構築したファージが人為的に作製されたものであることを明確に示す目的で、第１０断片については、野生型ではなく、この同義語置換変異体（ｇ．９５１５Ｇ＞Ｃ）を用いることにした。
【００７５】
＜単位ＤＮＡを有するプラスミドの高純度精製＞
望ましい配列を有する第０１〜５０の断片をクローンするプラスミドを有する大腸菌形質転換体全５０種類をそれぞれ５０ｍｌの１００μｇ／ｍｌのカルベニシリン入りＬＢ培地において３７℃、１２０ｓｐｍで一晩終夜培養し、得られた菌体を、ＱＩＡｆｉｌｔｅｒ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ（キアゲン社）を用い、精製した。得られた粗プラスミド溶液５０μｌに、５μｌの３Ｍ酢酸カリウム−酢酸緩衝液（ｐＨ５．２）と、１２５μｌのエタノールを添加して、２００００×ｇで１０ｍｉｎ遠心し、ＤＮＡをエタノール沈殿させ、得られた沈殿を７０％エタノールでリンスした後、残渣を取り除き、５０μｌのＴＥ（ｐＨ８．０）に再溶解した。濃度測定のためにこの粗プラスミド溶液１μｌをとり、超微量分光光度計（ＮＤ−２０００、サーモ社）で、ＤＮＡ濃度を測定した。この時点で粗プラスミド溶液のＤＮＡ量は、概ね０．５〜４μｇ／μｌであった。測定値を参考に、各粗プラスミド溶液から、５μｇのＤＮＡを１．５ｍｌチューブに採取し、これに全体積が５０μｌになるように滅菌水を添加した。これにＰｌａｓｍｉｄ  Ｓａｆｅ（エピセンタ社）の１０×反応バッファーを６μｌ、２５ｍＭ  ＡＴＰ溶液を２．４μｌ、Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｓａｆｅ酵素溶液を２μｌ添加して混合し、プログラマブルブロックインキュベーターであるＢＩ−５２６Ｔ（ＡＳＴＥＣ社）により、３７℃で１ｈ恒温し、続いて酵素失活のために７５℃、３０ｍｉｎ恒温した。得られた溶液を、ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（キアゲン社）により精製した。本キット精製最終段階では、カラムに吸着したＤＮＡをキット付属の溶出バッファーではなく、２５μｌのＴＥバッファー（ｐＨ８．０）により溶出することで、高純度プラスミド溶液を得た。精製前後の第０１断片を有するプラスミドと、第２１断片を有するプラスミドとを用いＤＮＡ電気泳動を行い（ＵｌｔｒａＰｕｒｅ  Ａｇａｒｏｓｅ、インビトロジェン社）、目的断片（単位ＤＮＡ）が組み込まれていることを確認した（図３）。
【００７６】
＜単位ＤＮＡを有するプラスミドの精密濃度調整と等モル統合＞
得られたＤＮＡ溶液を再度、超微量分光光度計で測定することで、高純度プラスミド溶液の濃度を求めた。各サンプルの濃度は、理論上の最大値の２００ｎｇ／μｌに対して粗プラスミド溶液の精製度合を反映しておおよそ１００ｎｇ／μｌ〜２００ｎｇ／μｌの範囲になった。測定結果に基づいて各プラスミド溶液１５μｌを１．５ｍｌチューブにとり、それぞれの溶液に、それぞれのプラスミドが１００ｎｇ／μｌの濃度になるようにＴＥを添加し、得られた高純度プラスミド溶液を再度、超微量分光光度計で濃度を測定すると、目標値の１００ｎｇ／μｌに対して数パーセント程度の範囲でズレが存在したので、各高純度プラスミドについて、５００ｎｇのＤＮＡの体積量を小数点以下２ケタのμｌの精度で計算し、この体積量（約５μｌ）でそれぞれのＤＮＡ溶液を分取し、後の切り出しに用いる制限酵素の種類別（ＢｂｓＩグループ、ＡａｒＩグループ、ＢｓｍＢＩグループ）に、それぞれの単位ＤＮＡのモル数が略等モルになるように統合した。
【００７７】
＜制限酵素による等モル統合プラスミドの一括切断＞
統合した等モルプラスミド溶液の合計体積は、ＢｂｓＩグループが約１６５μｌ、ＡａｒＩグループが約４５μｌ、ＢｓｍＢＩグループが約４０μｌとなった。各グループに２倍の滅菌水を添加して、それぞれ４９５、１３５、１２０μｌの高純度プラスミド溶液を得て、制限酵素の種類毎に以下のように切断した。
【００７８】
ＢｂｓＩグループは、１０×ＮＥＢｂｕｆｆｅｒ♯２を５５μｌと、制限酵素ＢｂｓＩ（ＮＥＢ社）２７．５μｌを添加し、全約５７７μｌを３７℃で２ｈ反応させた。ＡａｒＩグループは、制限酵素に付属する１０×Ｂｕｆｆｅｒ＿ｆｏｒ＿ＡａｒＩを１５μｌと、同じく制限酵素に付属する切断活性化用の５０×Ｏｌｉｇｏｎｃｌｅｏｔｉｄｅを３μｌ、制限酵素ＡａｒＩ（Ｔｈｅｒｍｏ社）７．５μｌを添加し、全約１６０μｌを３７℃で２ｈ反応させた。ＢｓｍＢＩグループは、１０×ＮＥＢＢｕｆｆｅｒ♯３を１３．３μｌと、制限酵素ＢｓｍＢＩ（ＮＥＢ社）を６．３μｌ添加し、全約１４０μｌを５５℃で２ｈ反応させた。２ｈ経過後、各サンプルから等モルの関係を損なわないように、すなわち、ＢｂｓＩグループからは３３μｌ、ＡａｒＩグループからは９μｌ、ＢｓｍＢＩグループからは８μｌのプラスミド溶液を採取し、そのうちの５μｌをＤＮＡ電気泳動により、各制限酵素でプラスミドが切断されていることを確認した（図４）。
【００７９】
＜アガロースゲル電気泳動による５０個の単位ＤＮＡの一括分画と精製＞
確認後、各グループに等量のフェノール・クロロフォルム・イソアミルアルコール（２５：２４：１）（ナカライテスク社）を添加し、よく混合することで制限酵素を失活した。ここで各グループのフェノール・クロロフォルム・イソアミルアルコール（２５：２４：１）混合物を１つのチューブに統合したのち、遠心分離（２０，０００×ｇ、１０ｍｉｎ）によりフェノール相と水相に分離し、水相（約９００μｌ）を別の１．５ｍｌチューブに回収した。ここに１−ブタノール（和光純薬工業社）を５００μｌ添加し、よく混合し、遠心分離（２０，０００×ｇ、１ｍｉｎ）により分離し、水分を飽和した１−ブタノールを取り除くという操作を水相の体積が４５０μｌ以下になるまで繰り返すことで、水相の体積を減少させた。これに、３Ｍ酢酸カリウム−酢酸緩衝液（ｐＨ５．２）を５０μｌと、エタノール９００μｌを添加し、遠心分離（２０，０００×ｇ、１０ｍｉｎ）することにより、ＤＮＡを沈殿させ、これを７０％エタノールでリンスして、２０μｌのＴＥに溶解した。これに電気泳動用の１０×Ｄｙｅを２μｌ添加し、その全量を０．７％の低融点アガロースゲル（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ  Ａｇａｒｏｓｅ  ＴｙｐｅＶＩＩ，シグマ社）で、１×ＴＡＥ（Ｔｒｉｓ−Ａｃｅｔａｔｅ−ＥＤＴＡ  Ｂｕｆｆｅｒ）バッファー存在下で、汎用アガロースゲル電気泳動装置（ｉ−ＭｙＲｕｎ．Ｎ  核酸用電気泳動システム、コスモバイオ社）で、３５Ｖ（約２Ｖ／ｃｍ）の電圧を印加し、４ｈ泳動することにより第０１〜５０断片とプラスミドベクターとを分離した（図５）。この電気泳動ゲルを、１μｇ／ｍｌの臭化エチジウム（シグマ社）を含む１×ＴＡＥバッファー１００ｍｌで３０ｍｉｎ染色し、長波長の紫外線（３６６ｍｎ）で照らすことにより可視化することで、第０１〜５０断片がなすバンド（約１ｋｂ付近）をカミソリで切り出し、１．５ｍｌチューブに回収した。回収した低融点アガロースゲル（約３００ｍｇ程度）に、１×ＴＡＥバッファーを添加することにより全体積を約７００μｌとし、これを６５℃で１０ｍｉｎ恒温することにより、ゲルを溶解した。得られたゲル溶液に、５００μｌの１−ブタノールを添加し、遠心分離（２０，０００×ｇ、１ｍｉｎ）により水相とブタノール相を分離し、水飽和ブタノールを捨てることを水相の体積が４５０μｌ以下になるまで繰り返した。得られた液体に、５０μｌの３Ｍ酢酸カリウム−酢酸緩衝液（ｐＨ５．２）と、９００μｌのエタノールを添加して、遠心分離（２０，０００×ｇ、１ｍｉｎ）によりＤＮＡの沈殿を得て、これを７０％エタノールでリンスした後に、２０μｌのＴＥに溶解した。そのうちの１μｌを取り、超微量分光光度計で濃度を測定した。
【００８０】
サイズ分画前後の各グループのモル数を確認するために、定量ＰＣＲを行った。図６はサイズ分画前後の、各単位ＤＮＡの分子数の分布を示し、図７は、各単位ＤＮＡの分子数の変化率を示す。これにより、５０個の断片が、略等モル比率であることと、モル比を損なわずに回収されていることが確認された。
【００８１】
＜遺伝子集積＞
第０１〜５０断片の等モル混合物のＤＮＡ重量濃度は、９８ｎｇ／μｌであり、合計塩基配列は４８，５２２ｂｐで、一方ベクターＤＮＡ（ｐＧＥＴＳ１１８−ＡａｒＩ／ＡａｒＩ）は、１９０ｎｇ／μｌで全長は１５，１３９ｂｐである。この長さの重量の比率にしたがって、両ＤＮＡの等モル混合物を得るために、第０１〜５０断片の等モル混合物６．２１μｌに対して、ベクターＤＮＡを１．００μｌの比率で混合した。得られた等モル混合溶液７．２μｌに２×ライゲーションバッファーを８．２μｌ添加し、全体を３７℃で５ｍｉｎ間恒温した後、１μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｔａｋａｒａ）を添加して、３７℃で４ｈ恒温した。その一部を取って電気泳動することにより、ライゲーションされていることを確認した（図８）。これを８μｌ新しいチューブに採取し、枯草菌コンピテントセルを１００μｌ添加し、３７℃で３０ｍｉｎダックローターで回転培養した。その後、３００μｌのＬＢ培地を添加して、３７℃で１ｈダックローターで回転培養し、その後、培養液を１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリン入りＬＢプレートに広げ、３７℃で一晩培養した。コロニーは、２５０個得られた。
【００８２】
＜形質転換体のプラスミド構造確認＞
ランダムに１２株のコロニーを選択して、２ｍｌの１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリン入りＬＢ培地で一晩培養し、内部のプラスミドのコピー数を増幅するためにＩＰＴＧを終濃度１ｍＭとなるように添加して更に３７℃で３ｈ培養した。得られた菌体からプラスミドを抽出して、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＳｆｉＩによるダブルダイジェスチョンし、電気泳動により確認したところ、１２株中４株について望ましい切断パターンを示した（図９）。この４株については、塩化セシウムーエチジウムブロマイド密度勾配超遠心法によりプラスミドを大量調製し、プラスミドの構造を１３種類の制限酵素を行った後、電気泳動により確認したところ、いずれも予想される断片と一致した（図１０）。更に、本プラスミドのベクター部分を除く全領域について塩基配列決定したところ、４株のプラスミドとも予想塩基配列と完全に一致した。
【００８３】
＜集積遺伝子の機能確認＞
４株のプラスミドについて、ラムダファージとしての機能を確認するために、プラーク形成能の確認を以下のように行った。まず、♯３、♯４、♯６、♯１２の各集積プラスミドをラムダターミアーゼ（Ｌａｍｂｄａ  ｔｅｒｍｉｎａｓｅ，Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ社）により切断することで、ベクターと集積遺伝子部分に分割し、これをラムダパッケージングエキストラクト（Ｇｉｇａｐａｃｋ  ＩＩＩ  Ｐｌｕｓ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｅｘｔｒａｃｔ、アジレント・テクノロジー社）に添加した。これを大腸菌（ＶＣＳ２５７株）に感染させて、ＬＢプレートに広げ３７℃で一晩培養したところ、プラークが確認された。得られたプラークの形状は、並行して行ったＴＯＹＯＢＯ社製ラムダファージＤＮＡで得られるものと同様の形態であることが確認された（図１１）。各プラスミドから得られたプラークからファージＤＮＡを精製し、制限酵素ＡｖａＩで切断することにより導入した変異が存在するかどうかを確認したところ、図１２に示すようにＴＯＹＯＢＯ社製ラムダファージＤＮＡとは異なる切断パターンを示し、全てのファージに予定どおりＡｖａＩサイトが存在していることを確認した。これにより、第０１〜５０断片の全５０断片を集積して作製したラムダファージゲノムが塩基配列とプラーク形成能においてともに完全であることが確認された。
【００８４】
これらの結果より、ラムダファージＤＮＡを構成する５０の単位ＤＮＡと、ベクターＤＮＡ（ｐＧＥＴＳ１１８−ＡａｒＩ／ＡａｒＩ）との合計５１のＤＮＡ断片を連結できたことが示された。
【００８５】
（実施例２、５５の単位ＤＮＡ及びベクターＤＮＡの集積によるメバロン酸経路人工オペロンの構築）
イソプレンの単位を骨格として持つ物質のイソプレノイドには、多くの物質が知られているが、これらはイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）という共通の材料から合成される。解糖系からＩＰＰに至る経路には２つの経路、すなわち、メバロン酸経路と非メバロン酸経路とが存在することが知られており、１つの生物の中に両経路を有する生物も存在するが、大腸菌には非メバロン酸経路しか存在しない。大腸菌のＩＰＰ生産能を増強する目的で、真核生物である酵母のメバロン酸経路の一部の遺伝子について、大腸菌のコドン使用頻度に適合した人工遺伝子の構築を、合成ＤＮＡ断片から集積することにより作製することを試みた。
【００８６】
＜人工メバロン酸オペロンの配列設計＞
酵母のメバロン酸経路の前半部分となるアセチルＣｏＡ〜メバロン酸までの代謝経路に必要な３つの遺伝子（ＥＲＧ１０（１．２ｋｂ）、ＥＲＧ１３（１．５ｋｂ）、ＨＭＧ１（３．２ｋｂ））を大腸菌のコドン使用頻度に基づいてコドンを変換した３つの人工遺伝子を並べた人工オペロン（５，９５１ｂｐ）（配列番号４）（ただし配列番号４の全長は、突出に用いる４塩基の配列を含む５，９５５ｐｂ）の作製を試みた。酵母遺伝子の大腸菌コドンへの変換は、酵母の同義語コドン中で、酵母全遺伝子中の出現頻度に順位を付け、同様に大腸菌の同義語コドン中で大腸菌全遺伝子中の出現頻度の順位を付け、同じ順位の者同士で変換することにより行った。
【００８７】
＜単位ＤＮＡの設計＞
同義語コドン変換を行った５，９５１ｂｐのＤＮＡ配列について、実施例１と同様にこれを切断しない制限酵素サイトを検索したところ、制限酵素ＡａｒＩの認識配列がなく、ＡａｒＩでは切断されないことが判明したので、全てのクローンはＡａｒＩを利用して調製することにした。全長５，９５１ｂｐを５５個の断片に分割すると、平均１０８ｂｐの断片となるので、この大きさを理想分割単位とし、この分割単位近傍で特定の配列（ＡとＴの合計が２つでＣとＧの合計が２つとなる全５２組合せ中パリンドロームの８組合せを除く４４組合せ（前述のグループＩＩＩ）と、ＡとＴの合計が１個でＣとＧの合計が３個となる全３２組合せ中、ＣとＧが３連続しない全１６組合せ（前述のグループＩＶ）との合計６０種類）のうち全ての理想分割単位でいずれか１種類の配列が出現するかどうかを調べたところ、理想分割単位から±７ｂｐの範囲で何れか一種の特定配列が出現することが判明した。これを元に全長を５５個の９８〜１１５ｂｐの断片に分割した。表２は、実施例２における集積ＤＮＡの分割単位及び突出塩基配列を示す表である。なお、メバロン酸遺伝子群と遺伝子集積ベクターの境界については、ＡとＴからのみなる突出（ＡＴＴＡとＡＡＡＡ）を利用した。
【００８８】
【表２】
2020167997.tif 000003
【００８９】
＜合成ＤＮＡによる単位ＤＮＡの作製＞
分割して得られた各断片は、Ｒｏｓｓｉらの方法（Ｒｏｓｓｉ，  Ｊ．Ｊ．，  ａｎｄ  Ｉｔａｋｕｒａ，  Ｋ．  １９８２．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２５７，  ９２２６−９２２９（１９８２））により、８０塩基の化学合成ＤＮＡ２本により作製した。具体的には、２つの化学合成ＤＮＡが３’末端で数１０ｂｐがハイブリダイズするようにし、５’末端には、ＡａｒＩ切断部位よりも５’末端側に上記で設計した突出がＡａｒＩ消化により出現するように認識部位を付加した。これらの２つの合成ＤＮＡのハイブリダイゼーションと続く鋳型依存的伸長反応の結果得られる二本鎖の単位ＤＮＡをＰＣＲ法により増幅するために、両末端のＡａｒＩ認識部位にハイブリダイズするように作製したＰＣＲプライマー１種類の計３種類のＤＮＡを添加して、ＰＣＲの反応によりＡａｒＩの切断サイトに囲まれた単位ＤＮＡを得て、これをＴＡクローニング法により、大腸菌プラスミドベクターｐＭＤ１９に連結し、大腸菌に形質転換することによりクローニングした。これをシーケンシングすることにより各断片について塩基配列の望ましいクローンを選択した。
【００９０】
＜単位ＤＮＡを有するプラスミドの等モル混合＞
得られた望ましいクローンを持つ大腸菌５５株を培養し、Ｐｌａｓｍｉｄ  ｍｉｎｉ−ｐｒｅｐ（ＱＩＡＧＥＮ社）によりそれぞれから粗プラスミド溶液５０μｌを得た。これから各１μｌを取り超微量分光光度計によりＤＮＡ濃度を測定したところ、８２〜１８０ｎｇ／μｌであった。概ね各５μｇのプラスミドを取りＰｌａｓｍｉｄ  Ｓａｆｅにより処理し、酵素の熱失活後、Ｍｉｎｉ−ｅｌｕｔｅ  ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）により精製して、２５μｌの高純度プラスミド溶液を得た。このうちの１μｌを超微量分光光度計により濃度を測定したところ、１０８〜２１３ｎｇ／μｌの濃度であった。ここから各々２０μｌの高純度プラスミド溶液を別のチューブに取り、このチューブに各プラスミドの濃度が計算上１００ｎｇ／μｌになるようにＴＥを添加して希釈した。この精製プラスミド溶液を再度微量分光光度計で濃度を算出し、この濃度に基づいて各高純度プラスミドの重量が５００ｎｇになる体積量を小数点以下２ケタのμｌの精度で算出し、その体積量（約５μｌ）をそれぞれのプラスミド溶液から分取し、を一本のチューブにプールした。合計で約２７５μｌの等モルプラスミド混合溶液に２倍溶の滅菌水と１３７．５μｌの１０×Ｂｕｆｆｅｒ＿ｆｏｒ＿ＡａｒＩと、６７．５μｌの制限酵素ＡａｒＩを添加して、３７℃で一晩反応させた。
【００９１】
＜５５個の単位ＤＮＡの一括サイズ分画＞
この反応液に等量のフェノール・クロロフォルム・イソアミルアルコール（２５：２４：１）を添加してＡａｒＩを失活させた後、遠心し、その上清をエタノール沈殿により精製して、沈殿を２０μｌのＴＥに溶解した。これに電気泳動用の色素としてキシレンシアノールを添加して、２．５％アガロースゲルでＴＡＥをバッファーとして１００Ｖで、３０分間電気泳動することにより、ベクターＤＮＡのｐＭＤ１９とインサートの単位ＤＮＡとを分離した（図１３）。泳動したゲルをカミソリで分割し、その一部をエチジウムブロマイドで染色し、目的の５５個の等モル混合断片のバンドの位置を確認しながら、無染色のゲルから目的のＤＮＡのバンドを切り出した。
【００９２】
＜等モル単位ＤＮＡ集団の精製＞
得られたゲル断片からＤＮＡの精製は、ＭｉｎｉＥｌｕｔｅ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて以下に示すように行った。
【００９３】
ゲルの体積を重量により測定後、その体積の１５倍容のＣＧ  Ｂｕｆｆｅｒを添加して、５０℃で１０ｍｉｎ恒温することによりゲルを溶解した。そこに、ゲルの体積の５倍容のイソプロピルアルコールを添加して、付属のカラムにその液体を入れて遠心することによりカラムにＤＮＡを吸着させた。このカラムを５００μｌのＣＧ  Ｂｕｆｆｅｒを添加して遠心することにより洗浄後、更に、ＰＥ  Ｂｕｆｆｅｒを７５０μｌ添加して遠心することにより洗浄した。完全に残渣を取り除くために１回遠心後、このカラムに、１０μｌのＴＥバッファーを添加後遠心することにより５５断片の単位ＤＮＡが略等モルの混合溶液を得た。
【００９４】
＜等モル単位ＤＮＡ混合溶液への複製開始点を有するＤＮＡの添加＞
このＤＮＡ濃度を超微量分光光度計により濃度測定を行ったところ、２０ｎｇ／μｌであった。並行して調製したｐＧＥＴ１５１／ＡａｒＩの濃度は、６７ｎｇ／μｌであったので、これらの長さの比率（５９５５ｂｐ：４３０６ｂｐ）を考慮に入れて４．６３：１の比率になるように５５断片等モル混合溶液とｐＧＥＴＳ１５１／ＡａｒＩとを混合した。
【００９５】
＜遺伝子集積＞
得られた等モル混合溶液５．６３μｌに２×ライゲーションバッファーを６．６３μｌ添加し、全体を３７℃、５ｍｉｎ間恒温した後、１μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｔａｋａｒａ）を添加して、３７℃で４ｈ恒温した。一部をとって電気泳動することにより、単位ＤＮＡとベクターＤＮＡがタンデムリピート状にライゲーションされているか否かを確認した（図１４）。ライゲーション後の溶液８μｌを別のチューブに採取し、これに枯草菌コンピテントセルを１００μｌ添加し、３７℃で３０ｍｉｎダックローターで回転培養した。その後、３００μｌのＬＢ培地を添加して、３７℃で１ｈダックローターで回転培養し、その後、培養液を１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリン入りＬＢプレートに広げた。
【００９６】
＜形質転換と集積体の構造確認＞
得られたコロニー１５４個から、ランダムに２４個のクローンを選択し、１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリン入りＬＢに植菌した。対数増殖期に終濃度１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加して、定常期まで培養後、プラスミドＤＮＡを抽出して制限酵素ＰｖｕＩＩで処理し、電気泳動により切断パターンを調べた（図１５）。その結果、２クローン（♯１０と＃２０）について予想される塩基配列と一致することが確認されたので、このプラスミドについて他の制限酵素処理を行い、電気泳動により詳細な構造確認を行ったところ、目的の構造と一致した（図１６）。このプラスミドについてシーケンシングすることで、最終的にクローン１０と２０は、設計とおりの塩基配列を有していたことを確認した。
【００９７】
これらの結果より、メバロン酸経路人工オペロンを構成する５５の単位ＤＮＡと、ベクターＤＮＡ（ｐＧＥＴＳ１５１−ｐＢＲ）との合計５６のＤＮＡ断片を連結できたことが示された。
【００９８】
以上より、本発明のＤＮＡ連結体の作製方法によると、５０以上のＤＮＡ断片を連結し得ることが確認された。このように、多数のＤＮＡ断片を連結できたのは、本発明の方法により調製方法によって調製された単位ＤＮＡ組成物において、各々の単位ＤＮＡのモル数がより正確に同一に近いためであると考えられる。
【００９９】
本発明の方法により調製方法によって調製された単位ＤＮＡ組成物において、各々の単位ＤＮＡのモル数がより正確に同一に近い理由は、以下のとおりに推察される。
【０１００】
上記実施例１、２では単位ＤＮＡを含む溶液において、それぞれの単位ＤＮＡの濃度を測定する際に、それぞれの単位ＤＮＡには、付加配列（具体的には環状プラスミドＤＮＡ）が連結されている。すると、単位ＤＮＡの種類間において、それぞれの塩基配列の長さの分布が大きくても、付加配列が連結されている分、溶液の濃度の測定時においては塩基配列の長さの分布が小さくなる。そのため、測定結果に基づいて算出される各単位ＤＮＡのモル数の誤差が少なくなる。これにより、この測定結果に基づいて各々の溶液を分取し、各々の溶液中の単位ＤＮＡのモル数を互いに同一となるように調整することによって、各々の溶液中のモル比を１に近づけやすくなり、より正確に、各々の単位ＤＮＡが略等モルになったものと推察される。
【０１０１】
また、実施例１において、単位ＤＮＡの各々の塩基長と、各々の単位ＤＮＡに連結された付加配列の塩基長との合計長さの分布の標準偏差は、３６９１．４±６．６ｂｐであり、平均の合計長さに対して±０．１８％である。実施例２において、単位ＤＮＡの各々の塩基長と、各々の単位ＤＮＡに連結された付加配列の塩基長との合計長さの分布の標準偏差は、２８２８．２±４．５ｂｐであり、平均の合計長さに対して±０．１６％である。実施例１、２では、該標準偏差が、平均の合計長さに対してこのように少ないため、溶液中のＤＮＡの濃度の測定結果に基づいて算出される各単位ＤＮＡのモル数の誤差がより少なくなったものと考えられる。
【０１０２】
各々の単位ＤＮＡに連結された付加配列の平均塩基長の単位ＤＮＡの平均塩基長に対する比は、実施例１では約２．７、実施例２では約２７である。このように、各々の単位ＤＮＡに連結された付加配列の平均塩基長が、単位ＤＮＡの平均塩基長と比較して長いため、溶液中のＤＮＡの濃度の測定結果に基づいて算出される各単位ＤＮＡのモル数の誤差が更に少なくなり、溶液中のＤＮＡの濃度の測定結果に基づいて算出される各単位ＤＮＡのモル数の誤差が更に少なくなったものと考えられる。
【０１０３】
また、実施例１、実施例２では、単位ＤＮＡの設計を集積ＤＮＡの配列の塩基長を単位ＤＮＡの種類の数で割った場合に各々の塩基長が等しくなるように、集積ＤＮＡを等分した位置にある配列近傍の非回文配列を境界として行ったため、このように単位ＤＮＡの設計を行った場合、それぞれの単位ＤＮＡの長さが略同一の長さとなった。そのため、制限酵素により付加配列を除去した後の電気泳動後のサイズ分画において、略同一の位置のバンドとして現れ、１回のサイズ分画で単位ＤＮＡを回収でき、作業効率が向上することが示された。
【０１０４】
上記実施例１では、付加配列の除去に使用する制限酵素の種類毎にグループに分類している（実施例１では３種類、実施例２では１種類）。そのため、除去工程の前に、各グループ毎に、２種以上の単位ＤＮＡを含む溶液を混合することができ、単位ＤＮＡ毎に制限酵素処理を行う必要がなく、制限酵素のグループ毎に、一回で制限酵素処理ができた。すなわち、これにより、ＤＮＡ連結体の作製の作業の効率が向上することが確認された。また、このように混合したものを用いても、上記のとおり、略等モルの状態で混合されるので、多数の単位ＤＮＡが連結可能であることが確認された。
【０１０５】
（試験例１  枯草菌プラスミドＤＮＡの形質転換において必要な集積ＤＮＡユニットの数の繰り返し単位の冗長性（リダンダンシー（ｒ））の確認）
枯草菌プラスミド形質転換において必要とされる、集積ＤＮＡユニットの数の繰り返し数（リダンダンシー）ｒを確認するために、以下の試験を行った。
【０１０６】
枯草菌において有効な複製開始点を有するプラスミドｐＧＥＴＳ１１８−ｔ０−Ｐｒ−ＳｆｉＩ−ｐＢＲ（配列番号１）を用いて、以下の（Ａ）〜（Ｈ）のＤＮＡを準備した。
【０１０７】
＜（Ａ）のＤＮＡの調製＞
（Ａ）のＤＮＡは、リダンダンシーｒ＝１の環状モノマープラスミドＤＮＡである。まず、ｐＧＥＴＳ１１８−ｔ０−Ｐｒ−ＳｆｉＩ−ｐＢＲを大腸菌に形質転換した。この形質転換体から得られるプラスミドは、（Ａ）のＤＮＡが主ではあるが、若干量の多量体（マルチマー）が含まれるので、これらを除去する目的で、このプラスミドを低融点アガロースゲル電気泳動によるＤＮＡサイズ分画により、モノマープラスミドＤＮＡの領域のみゲルより切り出し、精製することによって、（Ａ）のＤＮＡを調製した。
【０１０８】
＜（Ｂ）のＤＮＡの調製＞
（Ｂ）のＤＮＡは、リダンダンシーｒ＝１の直線上のモノマープラスミドＤＮＡである。この（Ｂ）のＤＮＡは、上記（Ａ）のＤＮＡを制限酵素ＢｌｐＩ（認識部位は（５’−ＧＣ／ＴＮＡＧＣ−３‘））により処理することで、調製した。
【０１０９】
＜（Ｃ）のＤＮＡの調製＞
（Ｃ）のＤＮＡは、リダンダンシーｒ＞１のタンデムリピートの直線状マルチマープラスミドＤＮＡである。上記（Ｂ）のＤＮＡを調製した際に使用したＢｌｐＩは、５‘末端に非パリンドロームの３塩基突出を形成する。よって、上記（Ｂ）のＤＮＡを、ＤＮＡリガーゼにより連結することによって、プラスミド単位が同一方向に連続した直線状マルチマープラスミドＤＮＡである（Ｃ）のＤＮＡを調製した。
【０１１０】
＜（Ｄ）のＤＮＡの調製＞
（Ｄ）のＤＮＡは、リダンダンシーｒ＝１の直線上のモノマープラスミドＤＮＡである。この（Ｄ）のＤＮＡは、上記（Ａ）のＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ（認識部位は（５’−Ｇ／ＡＡＴＴＣ−３‘である））により処理することで、調製した。
【０１１１】
＜（Ｅ）のＤＮＡの調製＞
（Ｅ）のＤＮＡは、部分的にリダンダンシーｒ＞１の部分を含む、上記（Ｄ）のＤＮＡがランダムな向きで連結した直線状マルチマープラスミドＤＮＡである。上記（Ｄ）のＤＮＡを調製した際に使用したＥｃｏＲＩは、５’末端にパリンドロームの３塩基突出を形成する。ＥｃｏＲＩで切断したプラスミドＤＮＡを連結すると、プラスミド単位が、ランダムな向きで連結したマルチマープラスミドＤＮＡを作製することが可能となる。（Ｅ）のＤＮＡは、上記（Ｄ）のＤＮＡを、ＤＮＡリガーゼにより連結することによって調製した。
【０１１２】
＜（Ｆ）のＤＮＡの調製＞
（Ｆ）のＤＮＡは、（Ａ）のＤＮＡを１か所のみ切断する制限酵素ＫａｓＩで切断し、脱リン酸化した後にその近傍のＢｌｐＩで切断したＤＮＡ断片と、（Ａ）のＤＮＡを１か所でのみ切断する制限酵素ＡｆｅＩで切断し、脱リン酸化した後にその近傍のＢｌｐＩで切断したＤＮＡとを等量混合した、ｒ≒１直鎖状準モノマー混合物である。この（Ｆ）の混合物中のいずれのＤＮＡ断片もリダンダンシーｒは、１を若干下回っている。
【０１１３】
＜（Ｇ）のＤＮＡの調製＞
（Ｇ）のＤＮＡは、上記（Ｆ）の２つのＤＮＡ断片をＤＮＡリガーゼにより連結することによって、ＢｌｐＩサイトのみで方向性を指定した連結されたリダンダンシーｒ＝１．９８の直線上の準ダイマープラスミドＤＮＡである。
【０１１４】
＜（Ｈ）のＤＮＡの調製＞
上記（Ｂ）と（Ｄ）は、互いに切断サイトが離れている。（Ｈ）のＤＮＡは、これら（Ｂ）と（Ｄ）のＤＮＡを等モルとなるように、連結せずに混合した混合物である。
【０１１５】
＜（Ａ）〜（Ｈ）のＤＮＡの枯草菌コンピテントセルへの形質転換＞
上記（Ａ）〜（Ｈ）のＤＮＡを、枯草菌コンピテントセルに形質転換して、得られたテトラサイクリン耐性株の出現数を指標に１μｇ当たりの形質転換体を求めた。（Ａ）〜（Ｈ）のＤＮＡはライゲーション反応の有無にかかわらず、ライゲーションバッファー中に溶解し、形質転換に用いた。（Ａ）〜（Ｈ）のＤＮＡの電気泳動の写真を図１７に示し、（Ａ）〜（Ｈ）のＤＮＡの枯草菌コンピテントセルの形質転換体出現数を、図１８に示す。なお、図１７の電気泳動写真において、（Ｃ）と（Ｅ）のＤＮＡは、様々なサイズのものがレーン上の広い範囲で分布しているため、バンドが判別しにくくなっている。また、図１７の「Ｇ」において、上のバンドが、リダンダンシーｒ＝１．９７の（Ｇ）のＤＮＡであり、下のバンドが、（Ｇ）のＤＮＡに混ざっていたリダンダンシーｒ＝０．９５のＤＮＡである。
【０１１６】
これらの結果から、Ａの環状ＤＮＡを除くと、形質転換体が得られたものは、ＤＮＡをライゲーションにより連結した（Ｃ）、（Ｅ）、（Ｇ）のＤＮＡのみであったことが確認された。これにより、リダンダンシーｒ＝１、又はｒ＜１の場合、仮に切断サイトが異なっており、切断サイトの配列を補完できる関係にある２種類の直線状プラスミド分子が混合していたとしても、形質転換体が得られないことが示され、少なくとも直線状のＤＮＡにおいては、最低限リダンダンシーは、ｒ＞１を満たす必要があることが示された。
【０１１７】
（シミュレーション１  ライゲーションシミュレーション）
＜ライゲーションシミュレーションアルゴリズムの設定＞
シミュレーションプログラミングは、表計算ソフトＥｘｃｅｌ（登録商標）２００７のＶＢＡを用いて行った。仮想ライゲーション中のＤＮＡ断片Ｆは、３つのパラメーターＦｉ（Ｎｉ，Ｌｉ，Ｒｉ）を用いて表現した。ここで、「ｉ」は断片識別番号を意味し、より具体的には、Ｅｘｃｅｌ上のｉ列セルを意味する。「Ｎ」は、仮想ライゲーション中のライゲーションＤＮＡ断片１分子中に含まれる単位ＤＮＡ断片数を示し、「Ｌ」はライゲーション産物の左側の突出末端の配列を任意の自然数で数値化したものを示し、「Ｒ」は、「Ｌ」と同じくライゲーション産物の右側の突出末端の配列を任意の自然数で数値化したものを示す。ここで、Ｌ＝Ｒである場合、２つの突出配列は相補関係にあり、Ｌ＝Ｒは、ライゲーション可能であることを定義する。ライゲーションのシミュレーションは以下のように行った。
【０１１８】
Ｆｉ（Ｎｉ，Ｌｉ，Ｒｉ）断片に対して、ｉ≠ｊを満たす乱数ｊを、ＲＡＮＤ（）メソッドにより発生される０〜１間の一様乱数にｍ（後述する）を掛けて、四捨五入で整数化することで発生させ、これによってＦｊ（Ｎｊ，Ｌｊ，Ｒｊ）断片を選択した。この２つ断片が連結可能かどうかを以下の判別式を用いた判別し、連結可能な場合は、断片のパラメーターを以下に示すように変更した。
【０１１９】
Ｌｉ＝Ｒｊを満たす場合、すなわち、Ｆｉの左末端とＦｊの右末端が連結可能な場合は、Ｆｉ（ｎｅｗ）（Ｎｉ（ｏｌｄ）＋Ｎｊ（ｏｌｄ），Ｌｊ（ｏｌｄ），Ｒｉ（ｏｌｄ））断片とＦｊ（ｎｅｗ）（０，０，０）断片に変換した。逆にＲｉ＝Ｌｊを満たす場合、すなわちＦｉ断片の右末端とＦｊ断片の左末端が連結可能な場合は、Ｆｉ（ｎｅｗ）（Ｎｉ（ｏｌｄ）＋Ｎｊ（ｏｌｄ），Ｌｉ（ｏｌｄ），Ｒｊ（ｏｌｄ））断片とＦｊ（ｎｅｗ）（０，０，０）断片を変換した。Ｌｉ≠ＲｊかつＲｉ≠Ｌｊの場合は、無変換（Ｆｉ（ｎｅｗ）（Ｎｉ（ｏｌｄ），Ｌｉ（ｏｌｄ），Ｒｉ（ｏｌｄ））断片かつＦｊ（ｎｅｗ）（Ｎｊ（ｏｌｄ），Ｌｊ（ｏｌｄ），Ｒｊ（ｏｌｄ））断片）とし、仮想ライゲーションは起きないものとした。仮想ライゲーションは、これらの計算をｉ＝１→ｍまで行ったものを１サイクルと定義した。ここでｍは、仮想ライゲーションサイクル中のＤＮＡ断片の総数を示す変数で、シミュレーション１サイクル目の場合は、初発の単位ＤＮＡ断片数の合計を意味する。仮想ライゲーション１サイクルを計算後、Ｅｘｃｅｌ２００７のＶＢＡコマンドのソート機能（Ｓｏｒｔメソッド）により、Ｌｉ値が降順になるようにＦｉ断片の並び変えを行うことで、Ｆ（０，０，０）断片以外のＦｉ断片の総数を数え、その総数を新しいｍとして挿入し、次のサイクルの仮想ライゲーションを行った。仮想ライゲーションサイクルは、相補関係にある突出断片が無くなり、これ以上仮想ライゲーションを行えない最小断片数ｍｍｉｎまで行った。ここでｍｍｉｎ値は、ライゲーション開始前の初発の単位ＤＮＡ断片の情報を用いて、以下の計算により求めた。
ｍｍｉｎ＝（総単位ＤＮＡ断片数）―（Ｌ＝Ｒを満たす関係にある２種類の単位ＤＮＡ断片のうち少ない単位ＤＮＡの断片数の、系全体における合計数）
【０１２０】
＜ライゲーションシミュレーション＞
６断片、１３断片、２６断片、５１断片集積までの各集積規模において、同一単位ＤＮＡ断片数の平均６４０で、０〜２０％の範囲で１％刻みに設定した変動係数（ＣＶ）を持つ仮想単位ＤＮＡ断片集団は以下のように作製した。
【０１２１】
Ｅｘｃｅｌの一様乱数コマンドＲＡＮＤ（）で発生させた各集積規模の数に相当する０〜１の乱数集団を発生させて、その乱数集団を平均値０、分散１に標準化した後、各標準化乱数に（断片平均値＊ＣＶ（％）／１００）を掛けた値に、断片数の平均値を加えることで、各仮単位ＤＮＡ断片集団を作製した。この乱数集団は、各集積規模の各ＣＶ（％）値について、独立した２０集団を作製し、それぞれの乱数集団に対して上記シミュレーションにより、ｍｍｉｎまで仮想ライゲーションを実施した。得られた２０個の各仮想ライゲーション断片を統合し、Ｎ値毎にライゲーション断片数を集計し、その（Ｎ値×ライゲーション断片数）が、ライゲーションに用いた単位ＤＮＡ断片総数に占める割合を求め、Ｎ値の大きい分子の値ほど下に来るように１００％積み上げグラフを作製した。そのグラフを、図１９に示す。この図１９は、初発の単位ＤＮＡ断片が最終的にどのような大きさのライゲーション産物中に取り込まれたのかについての分布を示す。図１９中、（ａ）は６断片集積についてのグラフを示し、（ｂ）は１３断片集積についてのグラフを示し、（ｃ）は２６断片についてのグラフを示し、（ｄ）は５１断片集積についてのグラフを示す。６断片集積の場合、ｎ＝６で、リダンダンシーｒ＝１となり、リダンダンシーｒ＜１領域は、右上の領域を示す。この結果から、６断片集積では、そのＣＶの値においてもほとんどの単位ＤＮＡ断片がリダンダンシーｒ＞１領域のＤＮＡ断片に取り込まれることが示され、逆に、５１断片集積においては、ＣＶが０％に近い領域を除き、ほとんどの領域がリダンダンシー１未満の領域であることが示された。
【０１２２】
＜ライゲーションシミュレーションからのライゲーション理論式の導出＞
上記のライゲーションシミュレーションの数値解析から、ライゲーションのメカニズムについて一般化された式を求めるにあたって、各集積規模の各ＣＶ値におけるライゲーション産物の分布のフィッティングカーブを算出可能か否かを検証した。６断片集積平均６４０断片の場合についての、ＣＶ＝２０％におけるライゲーション産物の単位ＤＮＡ断片含有数の分布を図２０に示す。図２０において、各リダンダンシー（０＜ｒ＜１、１＜ｒ＜２、２＜ｒ＜５、５＜ｒ＜１０）中の各棒グラフの模様は、各模様毎にそれぞれのリダンシーのＮをｒで割った際に区別される成分（６断片集積の場合、余りが０、１、２、３、４、５の６成分のうち、Ｎ値が０のため対数変換が出来ない余り０の成分を除いた５成分）の種類を示し、異なるリダンダンシーにおいて、同一の模様である棒グラフは、Ｎをｒで割った際に区別される成分が同一の種類であることを示す。また、図２０のグラフ中の線形近似曲線は、それぞれの模様の成分の種類毎に求められたものである。
【０１２３】
各Ｎ値に対するライゲーション産物の分子数のヒストグラムは、全体的にみるとＮ値増加に伴って指数減少傾向を示し、一見すると離散型確率分布の１種である幾何分布に近い分布を示した。しかしながら、このヒストグラムは、微視的には、遺伝子集積の規模数、あるいは１リダンダンシー（６断片集積の場合６）を周期とした周期的な構造を示し、特にＮ値が遺伝子集積規模の整数倍に相当する部分では、断片が全く現れないという特徴的構造を示した。この特徴は、幾何分布、あるいは、連続型確率分布と見なした場合の指数分布とは完全には一致しない。しかし、ライゲーション産物分子数軸を対数表示に変換し、その微視的周期構造の各成分、すなわち、Ｎを集積規模６で割った余りで区別される成分をそれぞれ各周期から取り出して、線形近似曲線を求めると極めて高い相関係数の２乗値（０．９４以上）を示すため、それぞれの成分が指数分布に近似しても問題はないものと考えられる。この分布は、図２０に示す６断片集積の濃度バラつきのＣＶが２０％である例以外の他の集積規模及び他のＣＶ値の例においても認められた。以後、本メカニズムをヒューリスティックに指数分布に近似できるものと仮定し、指数分布関数（ｆ（ｎ）＝λ＊ｅｘｐ（−λ＊ｎ））へのフィッティングを行った。
【０１２４】
具体的には、（１）まず、上記で述べた各集積規模のすべてのシミュレーションにおいて、Ｎを集積規模で割った余りで区別される成分それぞれについて、３周期程度の対数変換した分子数値から線形近似で得られる直線の傾きを−λとして求め、この値からλを算出した。（２）次に、指数分布関数においてはパラメーターλの逆数の１／λがｆ（Ｎ）の平均値となるため、２０の乱数集団におけるライゲーション産物のＮ値の平均を求め、この平均値の逆数から各ＣＶ（％）毎のλ（ＣＶ（％））を算出した。上記（１）及び（２）の結果を、横軸を単位ＤＮＡ断片の濃度バラつきのＣＶ（％）値、縦軸をλ値に設定してプロットすると、遺伝子集積規模に関わらず、全てのプロットが、ある原点を通る正比例の直線上に存在することが確認された。これらのプロットについてそれぞれ線形近似曲線を求め、そのグラフを図２１に示した。図１中、（ａ）は、上記（１）の３周期から求めた傾きλと、単位ＤＮＡ断片の濃度のバラツキとの関係を示したグラフであり、（ｂ）は、上記（２）のＮ値の平均値の逆数から求めたλと、単位ＤＮＡ断片の濃度のバラツキとの関係を示したグラフである。より精度の高い（２）より得られたこの線形近似曲線の一般式は、ｆ（Ｎ）＝０．００５８＊ＣＶ（％）＊ｅｘｐ（−０．００５８＊ＣＶ（％）＊Ｎ）であった。また、図２１から、λ＝０．００５８＊ＣＶ（％）に相関係数の２乗値が、０．９９という高い相関性で表現できることを見出した。よって、この一般式は、問題がないことが確認された。
【０１２５】
＜ライゲーションの反応速度の定性的解析＞
上記のライゲーションシミュレーションは、正規な突出組合せ同士のライゲーションが全て完了した状態を想定したものである。これに対し、実際に遺伝集積する際のライゲーション反応条件がどの程度シミュレーションの反応条件に近いのかを検討するために、ライゲーション反応のキネティックスを調べた。
【０１２６】
まず、実際に遺伝子集積する条件で行うライゲーション反応において、様々な反応時間でライゲーション産物をサンプリングし、実際にどの程度の割合で連結が行われるかをλファージ再構成の５１断片連結を用い、全ての５１の連結箇所について、定性解析を行った。ライゲーションに使用した単位ＤＮＡ断片の平均濃度は、約０．２ｆｍｏｌ／μｌであり、この単位ＤＮＡ断片の溶液にＴ４ＤＮＡリガーゼを添加してから、３７℃、０、１．２５、２．５、５、１０、２０、４０、８０、１６０、３２０分後に、それぞれの反応溶液の一部をサンプリングし、正規に連結される２つの単位ＤＮＡ断片の連結部分をまたいだＤＮＡが増幅されるように設計された定量ＰＣＲ用のプライマーセットと、各単位ＤＮＡ断片の内部のみが増幅されるように設計された定量ＰＣＲ用のプライマーゼットとを用いて、市販のλファージゲノムＤＮＡ（東洋紡）又は既に構築された集積プラスミドを制限酵素で切断し、直鎖化したＤＮＡの希釈系列を指標として、各断片のライゲーションの進捗度合いを調べた。その結果、本反応条件においては、どの連結部分においてもライゲーションが概ね１０分程度で終了しており、実際の４時間（２４０分）という反応時間においては、略完全にライゲーションが完了していることが確認された。また、十分に時間が経過した後（４０分以降）のほとんどの連結点の反応度合が、それぞれの単位ＤＮＡ断片の少ない方を基準とした値に対して略１の割合で存在することから、ライゲーションされたＤＮＡ断片は、ほとんどがそれぞれの正しい連結相手と連結していることが確認された。
【０１２７】
＜ミスライゲーション割合の推定＞
より詳細にライゲーションの状況を確認するために、上記のλファージゲノム再構成の実験において得られた集積体のうち、全塩基配列を完全決定した＃３、＃４、＃６、＃１２を除く全てのクローンについて（＃１、＃２、＃５、＃７、＃８、＃９、＃１０、＃１１）、誤った組み合わせでライゲーションされている箇所の同定を目的として塩基配列決定を行った。それぞれのクローンについてのミスライゲーションサイトを、図２２に示す。この結果から、＃１１クローンを除く７クローンについては、その内部に１個もしくは２個のミスライゲーションが存在していることが確認され、全てのミスライゲーションを同定できた。一方、＃１１クローンについては、集積ＤＮＡ内に同じ単位ＤＮＡ断片が繰り返し存在していることが確認され、完全な構造確認を行うことはできなかったが、全６か所のミスライゲーションサイトが存在していることが確認された。＃１１は、詳細な単位ＤＮＡ断片数が不明であるため、＃１１は除外して、全てのクローンのミスライゲーション出現頻度を算出した結果、連結点４６箇所に１箇所程度の割合でミスライゲーションが存在していることが確認され、２．２％程度という比較的低い割合でミスライゲーションが出現することが確認された。この結果は、上記の定量ＰＣＲの結果と矛盾しない結果であった。
【０１２８】
＜実際のライゲーション産物の大きさ分布とシミュレーションとの一致性の検証＞
上記ミスライゲーション割合の推定と、ライゲーションの反応速度の定性的解析の２つの検証によって、実際のライゲーション反応においては、４時間という十分な時間が経過した後では、略全てのライゲーションが完了しており、またミスライゲーションが生じる確率は少ないと推定された。そこで、初発の単位ＤＮＡ断片に濃度のバラつきが存在する実際の単位ＤＮＡ断片集団について、シミュレーションによって実際のライゲーション産物の大きさ分布が予測可能か否かを以下の方法で検証した。
【０１２９】
まず、定量ＰＣＲで７．５％のＣＶの単位ＤＮＡ断片濃度のバラつきが観測されたλファージゲノム再構成実験で用いた集団を材料に用いた。この定量ＰＣＲの観測値は、測定誤差としてＣＶ＝３．６％の数値を含むので、真の単位ＤＮＡ断片のバラつきのＣＶは、ＣＶ＝７．５％よりも低い可能性があると推測された。そこで、真の値として可能性のあるＣＶをシミュレーションによって求めた結果、真のＣＶが６．６％であった場合に、測定誤差のＣＶ＝３．６％により観測値がＣＶ＝７．５％となる可能性が推定された。そこで、この集団の真の単位ＤＮＡ断片のバラつきをＣＶ＝６．６％として、ＲＡＮＤ（）メソッドに用意した平均６４０断片、ＣＶ＝６．６％の条件を満たす、初発の単位ＤＮＡ断片５１種類のライゲーションのシミュレーションを行った。このシミュレーションにおいては、１００％の反応割合を示すｍｍｉｎのみならず、ライゲーション可能数９５％、９６％、９７％、９８％、９９％におけるライゲーションした際のｍ値について、それぞれ１００個の独立した乱数集団を準備し、それぞれ指定したｍ値まで反応を継続させた。得られたライゲーション産物の分布１００集団分を統合して、Ｆ（Ｎ，Ｌ，Ｒ）のパラメーターを利用して、単位ＤＮＡ断片各仮想ライゲーション産物のＤＮＡの長さをｂｐ単位で求めた。次に、ＣＶ＝６．６％の断片数のバラつきの存在するλファージゲノム再構成実験の実際の単位ＤＮＡ断片集団について、上記の「ライゲーションの反応速度の定性的解析」で述べたとおり、３７℃で４時間反応させ、反応後、ＣＨＥＦ型パルスフィールドゲル電気泳動装置（バイオクラフト社製）により、ＤＮＡの実際の分子量分布がどのようになるかを０．５×ＴＢＥ、５Ｖ／ｃｍ、３０ｓｅｃ周期の泳動条件で１６時間泳動した。その電気泳動の写真を図２３に示す。得られた電気泳動写真のＤＮＡ密度分布をＮＩＨｉｍａｇｅソフトウェアにより得て、得られた図に対してシミュレーションで得られた各ライゲーション効率における予想ＤＮＡ分布図を重ね合わせて比較した。その結果を、図２４に示す。図２４により、電気泳動によるＤＮＡの分子量分布が、９８％−１００％のライゲーション効率の場合の予想ＤＮＡ分布図と概ね一致したこと、特に最大の濃度を示す極大値の分子量が９８％のライゲーション効率と良好に一致することが確認された。これにより、シミュレーションの結果は、４時間のライゲーションの反応で略全てのライゲーションを完了し、２％程度のミスライゲーションは起こりうるものの、概ね全体のライゲーションの様子を再現できることが示された。
【０１３０】
＜ライゲーションシミュレーションの一般化＞
実際に集積に用いる単位ＤＮＡ断片は、濃度のバラつきが避けられないが、実際にはどの程度の単位ＤＮＡ断片の濃度のバラつきに抑えなければならないのかを、上記で求められた一般式ｆ（Ｎ）＝０．００５８＊ＣＶ（％）＊ｅｘｐ（−０．００５８＊ＣＶ（％）＊Ｎ）を用いて総括した図を、図２５に示す。現在の遺伝子集積実験では、概ねＤＮＡ濃度のバラつきがＣＶ（％）＝６．６程度であるが、図２５によると、ＣＶ（％）＝６．６の場合、５１断片の集積において、用いた単位ＤＮＡ断片の約４０％が、ｒ値が１より大きいライゲーション産物に取り込まれていることが示される。また、図２５によると、仮に、これの２倍の集積規模の１０２断片集団による新規な遺伝子集積を計画する場合、５１断片と同程度の集積効率を期待するなら、ＣＶ（％）＝３．３を実現する必要があることが示された。また、一般式ｆ（Ｎ）＝０．００５８＊ＣＶ（％）＊ｅｘｐ（−０．００５８＊ＣＶ（％）＊Ｎ）を用いて、単位ＤＮＡ断片の濃度のバラつきと１ライゲーション産物の平均単位ＤＮＡ断片数との関係を求めた。その結果を図２６に示す。これにより、一般式ｆ（Ｎ）＝０．００５８＊ＣＶ（％）＊ｅｘｐ（−０．００５８＊ＣＶ（％）＊Ｎ）を用いることで、ＣＶ（％）値による、１ライゲーション産物中の平均単位ＤＮＡ断片含有数を容易に推測することが可能となることが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年5月14日(2020.5.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
付加配列が連結された複数の単位ＤＮＡを該単位ＤＮＡの種類毎に含む溶液を準備する工程と、
前記各々の溶液の準備後、前記単位ＤＮＡに付加配列が連結された状態で、前記各々の溶液中の単位ＤＮＡの濃度を測定し、その結果に基づいて、前記各々の溶液を分取して、各々の溶液中の単位ＤＮＡのモル数を互いに同一に近づける工程と、を有する単位ＤＮＡ組成物の調製方法であって、
前記付加配列が連結された単位ＤＮＡが環状構造を有し、前記付加配列が複製開始点を有するプラスミドＤＮＡ配列であり、
前記単位ＤＮＡは、該単位ＤＮＡによって構成される集積ＤＮＡを含むＤＮＡ連結体を作製するために用いられるものであり、
前記単位ＤＮＡを含む溶液を準備する工程は、前記集積ＤＮＡの配列の塩基長を前記単位ＤＮＡの種類の数で割った場合に各々の塩基長が等しくなるように、前記集積ＤＮＡを等分した位置にある配列近傍の非回文配列を境界として、端部に非回文配列を有する前記単位ＤＮＡを設計する工程を含む、調製方法。
【請求項２】
前記単位ＤＮＡの各々の塩基長と、各々の単位ＤＮＡに連結された付加配列の塩基長との合計長さの分布の標準偏差が、平均の前記合計長さに対して±２０％以内である請求項１記載の単位ＤＮＡ組成物の調製方法。
【請求項３】
前記各々の単位ＤＮＡに連結された付加配列の平均塩基長が、前記単位ＤＮＡの平均塩基長の２倍以上である、請求項１又は２記載の単位ＤＮＡ組成物の調製方法。
【請求項４】
前記単位ＤＮＡの各々の長さが１６００ｂｐ以下である請求項１から３いずれか記載の単位ＤＮＡ組成物の調製方法。
【請求項５】
宿主微生物中で有効な複製開始点を含むベクターＤＮＡと集積ＤＮＡとからなる集積ＤＮＡユニットを、１を超えて含む微生物細胞形質転換用ＤＮＡ連結体の作製方法であって、
請求項１から４いずれかに記載の方法によって、単位ＤＮＡ組成物を調製する工程と、
前記ベクターＤＮＡを準備する工程と、
調製後の前記溶液中の付加配列が連結された単位ＤＮＡから制限酵素を用いて各々の付加配列を除去する工程と、
前記除去工程後、前記ベクターＤＮＡ及び前記各々の単位ＤＮＡを互いに連結する工程と、を有し、
前記ベクターＤＮＡ及び前記各々の単位ＤＮＡは互いに順序を保ったまま繰り返し連結し得る構造を有し、
前記集積ＤＮＡは、前記各々の単位ＤＮＡが互いに連結したＤＮＡからなる、ＤＮＡ連結体の作製方法。