(57)【要約】【課題】高価な試薬を用いることなく簡便な操作により、植物試料に含まれるＲＮＡからｃＤＮＡを製造する方法を提供する。【解決手段】下記工程（１）〜（２）：（１）還元剤を１０ｍＭ以上の濃度で含む破砕溶液中で植物試料を破砕する破砕工程、並びに（２）前記破砕物、及び逆転写酵素を含む、体積が３μＬ以上の溶液中で逆転写反応を行う逆転写工程を含み、前記植物試料又は前記破砕物からの核酸の精製を行わない、ｃＤＮＡの製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程（１）〜（２）：
（１）還元剤を１０ｍＭ以上の濃度で含む破砕溶液中で植物試料を破砕する破砕工程、並びに
（２）前記破砕物、及び逆転写酵素を含む、体積が３μＬ以上の溶液中で逆転写反応を行う逆転写工程
を含み、前記植物試料又は前記破砕物からの核酸の精製を行わない、
ｃＤＮＡの製造方法。
【請求項２】
前記破砕溶液中の還元剤の濃度が１０〜１０００ｍＭである、請求項１に記載のｃＤＮＡの製造方法。
【請求項３】
前記破砕溶液のｐＨが５．２〜８．５である、請求項１又は２に記載のｃＤＮＡの製造方法。
【請求項４】
前記還元剤がＤＴＴ、２−メルカプトエタノール、グルタチオン、水素化ホウ素ナトリウム、シアン化水素化ホウ素ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、次亜硫酸ナトリウム、ピロ亜硫酸カリウム、チオ硫酸ナトリウム、アスコルビン酸、１−チオグリセロール、システイン、トリブチルホスフィン、アミノエタンチオール、及びトリス２−カルボキシエチルホスフィンからなる群から選択される１以上である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のｃＤＮＡの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｃＤＮＡの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物の遺伝子発現を調べるための一般的な手法として、ＲＴ−ｑＰＣＲやＲＮＡ−Ｓｅｑが用いられている。これらの手法は定量性や網羅性に優れており、理学・農学・医学の幅広い分野で使用されている。
【０００３】
ＲＴ−ｑＰＣＲやＲＮＡ−Ｓｅｑを行うためには、その前段階として生体試料からＲＮＡを抽出・精製する必要がある。特に、植物試料には多糖類等の夾雑物が多く含まれるため、植物試料由来からＲＮＡを取得する際には特に厳密なＲＮＡ抽出を行う必要がある。近年、ＲＴ−ｑＰＣＲやＲＮＡ−Ｓｅｑに必要な費用が低下しているのに対し、ＲＮＡの抽出・精製には依然として一検体あたり五百円から千円ほどの費用が必要であり、その低減が求められている。
【０００４】
ＲＮＡはＲＮａｓｅ（ＲＮＡ分解酵素）により極めて容易に分解されてしまうので、高品質なＲＮＡを得るためには生体由来のＲＮａｓｅを阻害・除去することも必要である。ＲＮａｓｅを阻害する方法としては、乾熱滅菌、グアニジン塩酸塩による処理、ＲＮａｓｅを特異的に阻害するタンパク質（ＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ等）の添加等が知られている。しかし、乾熱滅菌ではＲＮａｓｅだけではなくＲＮＡも分解されてしまう。グアニジン塩酸塩は、ＲＮＡ調整後に使用する逆転写酵素等の酵素の反応も阻害してしまう。ＲＮａｓｅを特異的に阻害するタンパク質は一般に高価である。
【０００５】
ＲＮＡ抽出・精製を省略して、組織破砕液から直接逆転写を行うことができれば、ＲＮＡの抽出・精製にかかるコストを削減できる。そのためには、ＲＮＡ精製後の逆転写反応に用いる酵素を阻害しないＲＮＡ調製溶液を開発する必要がある。しかし、逆転写酵素とＲＮａｓｅはいずれもタンパク質であるため、逆転写酵素は阻害することなくＲＮａｓｅを阻害することは容易ではない。
【０００６】
特許文献１は、顕微鏡下で観察しながら、スライドガラス上で単一細胞に含まれる核酸を増幅する方法を開示している。しかし、動物由来の培養細胞を顕微鏡下で観察しながら増幅するため、生体試料を含有する液体の総液量はごく微量である。該方法は遺伝子発現量の定量を目的としたものではないため、得られたＲＮＡをＲＴ−ｑＰＣＲやＲＮＡ−Ｓｅｑに用いることはできない。
【０００７】
特許文献２は、固定生体試料からのＲＮＡおよびＤＮＡの並行単離・精製方法を開示している。しかし、固定生体試料からの単離・精製であるため、固定生体試料破砕液から直接逆転写を行うことはできない。非特許文献１は還元剤がＲＮａｓｅを阻害することを記載しているが、多様な夾雑物を含む組織破砕液中で還元剤がＲＮａｓｅを阻害できるか不明であり、また、逆転写酵素への影響も不明である。非特許文献２は、還元剤を含むバッファー中で動物由来の培養細胞からＲＮＡを精製する方法を開示している。しかし、この方法を、細胞壁を有する植物細胞同士が強固に結合した植物試料に適用できるかどうかは不明である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００９−２０７３９２号公報
【特許文献２】特表２０１３−５２０１８７号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｃｈｅｎ，Ｚ．，Ｌｉｎｇ，Ｊ．＆  Ｇａｌｌｉｅ，Ｄ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ（２００４）５５：８３．
【非特許文献２】Ｗａｎｇ  Ｘ，Ｔｅｆｅｒｅｄｅｇｎｅ  Ｂ，Ｓｈａｔｚｋｅｓ  Ｋ，Ｔｕ  Ｗ，Ｍｕｒａｔａ  Ｈ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５１３（２０１６）２１−２７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、高価な試薬を用いることなく簡便な操作により、植物試料に含まれるＲＮＡからｃＤＮＡを製造する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、還元剤が逆転写酵素を阻害しない一方でＲＮａｓｅを阻害し、植物試料又は前記破砕物からの核酸の精製を行うことなく植物試料に含まれるＲＮＡからの逆転写を可能とすることを見出し、本発明を完成した。
【００１２】
すなわち、本発明は、下記工程（１）〜（２）：
（１）還元剤を１０ｍＭ以上の濃度で含む破砕溶液中で植物試料を破砕する破砕工程、並びに
（２）前記破砕物、及び逆転写酵素を含む、体積が３μＬ以上の溶液中で逆転写反応を行う逆転写工程
を含み、前記植物試料又は前記破砕物からの核酸の精製を行わない、ｃＤＮＡの製造方法に関する。
【００１３】
前記破砕溶液中の還元剤の濃度が１０〜１０００ｍＭであることが好ましい。
【００１４】
前記破砕溶液のｐＨが５．２〜８．５であることが好ましい。
【００１５】
前記還元剤がＤＴＴ、２−メルカプトエタノール、グルタチオン、水素化ホウ素ナトリウム、シアン化水素化ホウ素ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、次亜硫酸ナトリウム、ピロ亜硫酸カリウム、チオ硫酸ナトリウム、アスコルビン酸、１−チオグリセロール、システイン、トリブチルホスフィン、アミノエタンチオール、及びトリス２−カルボキシエチルホスフィンからなる群から選択される１以上であることが好ましい。
【発明の効果】
【００１６】
本発明のｃＤＮＡの製造方法は、高価な試薬を用いることなく簡便な操作により、植物試料に含まれるＲＮＡからｃＤＮＡを製造することを可能とする。本発明は、多検体に対する、安価な遺伝子発現計測を実現する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１Ａ】本発明の方法で製造されたｃＤＮＡの定量結果を示す。
【図１Ｂ】ｑＰＣＲのｍｅｌｔｉｎｇ  ｃｕｒｖｅを示す。
【図２】本発明の方法で製造されたｃＤＮＡと、精製工程を経て得られたｃＤＮＡの定量結果の相関性を示す。
【図３Ａ】還元剤によるＲＮＡの分解の阻害を示す。
【図３Ｂ】還元剤によるＲＮＡの分解の阻害を示す。
【図３Ｃ】還元剤によるＲＮＡの分解の阻害を示す。
【図３Ｄ】還元剤によるＲＮＡの分解の阻害を示す。
【図４】逆転写反応への、還元剤の影響を示す。
【図５】組織破砕液を用いた直接逆転写における、還元剤の影響を示す。
【図６Ａ】還元剤によるＲＮＡの分解の阻害を示す。
【図６Ｂ】還元剤によるＲＮＡの分解の阻害を示す。
【図６Ｃ】還元剤によるＲＮＡの分解の阻害を示す。
【図６Ｄ】還元剤によるＲＮＡの分解の阻害を示す。
【図７】逆転写反応への、還元剤の影響を示す。
【図８Ａ】還元剤によるＲＮＡの分解の阻害を示す。
【図８Ｂ】還元剤によるＲＮＡの分解の阻害を示す。
【図８Ｃ】還元剤によるＲＮＡの分解の阻害を示す。
【図８Ｄ】還元剤によるＲＮＡの分解の阻害を示す。
【図８Ｅ】還元剤によるＲＮＡの分解の阻害を示す。
【図９】逆転写反応への、還元剤の影響を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
＜＜ｃＤＮＡの製造方法＞＞
本発明のｃＤＮＡの製造方法は、下記工程（１）〜（２）：
（１）還元剤を１０ｍＭ以上の濃度で含む破砕溶液中で植物試料を破砕する破砕工程、並びに
（２）前記破砕物、及び逆転写酵素を含む、体積が３μＬ以上の溶液中で逆転写反応を行う逆転写工程
を含み、前記植物試料又は前記破砕物からの核酸の精製を行わないことを特徴とする。
【００１９】
＜植物試料＞
植物試料は、核酸を含み、遺伝子発現解析の対象となり得る試料であれば特に限定されない。植物種としてはイネ、シロイヌナズナ、コムギ、ダイズ、ポプラ等が挙げられる。
【００２０】
植物試料の組織や部位も特に限定されず、例えば種子、葉、根、実生が挙げられる。また、植物試料は培養細胞であってもよい。その他、環境核酸解析のために、培養培地、土壌、海水、バイオフィルム等も、植物試料を含むものであれば用いることができる。植物試料の形態は液体状、固体状のいずれであってもよい。植物試料の凍結物であってもよい。破砕溶液に含まれる植物試料の体積は０．１〜５０体積／体積％が好ましく、０．１〜３０体積／体積％がより好ましい。
【００２１】
＜破砕工程＞
本発明における「破砕」とは、細胞膜を破壊して細胞の内容物を漏出させることをいう。植物試料が組織である場合、種類の異なる複数の細胞を含んだまま組織を破壊し、さらに細胞膜を破壊して細胞の内容物を漏出させることをいう。植物試料の破砕方法の具体例としては、ボルテックスミキサーによる混合、ガラスビーズ処理、超音波処理等、組織や細胞の破砕に通常採用されている方法が挙げられ、当業者であれば細胞や組織の種類に応じて適宜選択可能である。また、破砕後に水不溶成分を除去するために遠心分離やろ過を行ってもよい。植物試料に含まれる核酸の分解を避けるため、破砕は４〜３０℃の範囲で行うことが好ましい。
【００２２】
植物試料の破砕時のｐＨは５．２〜８．５が好ましく、７．０〜８．０がより好ましい。植物試料の破砕は緩衝液中で行うことが好ましく、緩衝液としてはＴｒｉｓ、ＨＥＰＥＳ、ＴＡＥ、ＴＢＥ等が挙げられる。
【００２３】
＜還元剤＞
無傷の（Ｉｎｔａｃｔ）細胞では、ＲＮａｓｅが膜等により隔離され、ＲＮＡが非特異的な分解を受けることはない。しかし、細胞を破砕するとＲＮａｓｅの隔離も失われてしまい、露出したＲＮａｓｅがＲＮＡを極めて容易に分解し、高品質なＲＮＡを得ることができない。本発明では、破砕工程で用いる破砕溶液中に還元剤を含むことを特徴とする。還元剤はＲＮａｓｅを不活性化し、植物試料の破砕時のＲＮＡの分解を回避する。
【００２４】
還元剤は、他の分子を還元させることのできる物質であれば特に限定されない。例えば、ＤＴＴ、２−メルカプトエタノール、グルタチオン、水素化ホウ素ナトリウム、シアン化水素化ホウ素ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、次亜硫酸ナトリウム、ピロ亜硫酸カリウム、チオ硫酸ナトリウム、アスコルビン酸、１−チオグリセロール、システイン、トリブチルホスフィン、アミノエタンチオール、トリス２−カルボキシエチルホスフィンが挙げられる。この中でも、還元力や入手容易性の観点から、ＤＴＴ、２−メルカプトエタノールが好ましい。
【００２５】
タンパク質のシステイン残基同士でのジスルフィド結合や、チオール化したＤＮＡの末端での重合反応を防止する（脱保護）目的で、ＤＴＴなどの還元剤を１ｍＭ以下の濃度で各種緩衝液に添加することが一般的であるが、本発明では、脱保護に用いる濃度の概ね１０倍以上の濃度の還元剤を用いる。したがって、破砕溶液において還元剤の濃度は１０ｍＭ以上である。１０ｍＭ以上であれば特に限定されず、植物試料の酸化還元状態も勘案して決定すればよいが、１０〜１０００ｍＭが好ましく、３０〜４００ｍＭがより好ましい。このうち、還元剤としてＤＴＴを用いる場合には１０〜１００ｍＭが好ましく、３０〜１００ｍＭがより好ましい。還元剤として２−メルカプトエタノールを用いる場合には１０〜８００ｍＭが好ましく、１０〜５００ｍＭがより好ましく、５０〜４００ｍＭがさらに好ましい。還元剤の濃度が１０ｍＭ未満ではＲＮａｓｅを阻害することができず植物試料に含まれるＲＮＡが分解されるおそれがある。還元剤の濃度が１０００ｍＭを超えると破砕溶液中で還元剤が析出する可能性がある。
【００２６】
還元剤は破砕工程で用いる必要があるが、ＲＮＡを継続的にＲＮａｓｅから防御するためには、破砕工程に加えて逆転写工程でも用いることが好ましい。この場合、破砕工程で添加した還元剤をそのまま逆転写工程で用いてもよい。また、逆転写工程において新たに還元剤を追加してもよい。逆転写工程において還元剤を用いる場合、逆転写反応溶液中の還元剤の濃度は、１０〜１０００ｍＭが好ましく、３０〜４００ｍＭがより好ましい。還元剤としてＤＴＴを用いる場合には１０〜１００ｍＭが好ましく、３０〜１００ｍＭがより好ましい。還元剤として２−メルカプトエタノールを用いる場合には１０〜８００ｍＭが好ましく、１０〜５００ｍＭがより好ましく、５０〜４００ｍＭがさらに好ましい。
【００２７】
破砕溶液のｐＨは５．２〜８．０が好ましく、７．０〜８．０がより好ましい。また、植物試料を破砕するときの温度は４〜４０℃が好ましく、４〜２５℃がより好ましい。
【００２８】
＜逆転写工程＞
逆転写工程では、破砕工程で得られた破砕物に含まれるＲＮＡを鋳型として逆転写反応を行い、当該ＲＮＡに相補的な配列を持つＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を得る。逆転写反応溶液は、破砕工程で得られた破砕物、還元剤、逆転写酵素を含む。逆転写反応溶液に含まれる破砕物の体積は０．１〜５０体積／体積％が好ましく、０．１〜３０体積／体積％がより好ましい。
【００２９】
逆転写反応溶液の体積は３μＬ以上であるが、３〜５００μＬが好ましく、３〜１００μＬが好ましく、５〜２０μＬが好ましい。本発明におけるｃＤＮＡの製造方法は、人間の手により行ってもよく、機械により行ってもよいが、いずれの場合でも逆転写反応溶液の体積が３μＬ未満では定量的なピペッティングが困難となる可能性がある。
【００３０】
＜逆転写酵素＞
逆転写酵素は、ＲＮＡを鋳型として、当該ＲＮＡに相補的な配列を有するＤＮＡを合成可能な酵素であれば特に限定されない。例えば、トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）やモロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）に由来する逆転写酵素が挙げられる。
【００３１】
逆転写反応溶液のｐＨは５．２〜８．５が好ましく、７．０〜８．０がより好ましい。
【００３２】
逆転写反応溶液は、破砕工程で得られた破砕物、還元剤、逆転写酵素の他に、逆転写プライマー、緩衝剤、ｄＮＴＰを含むことが好ましい。
【００３３】
逆転写プライマーとして、標的ＲＮＡに相補的な配列を有するポリヌクレオチドを用いることができる。例えば特定のｍＲＮＡに相補的なｃＤＮＡを得るために、当該ｍＲＮＡのＯＲＦの３’末端に相補的な配列を有するポリヌクレオチドを用いることができる。或いは、３’末端にｐｏｌｙ（Ａ）配列を有するｍＲＮＡに相補的なｃＤＮＡを得るために、ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）配列を有するポリヌクレオチドを用いることができる。
【００３４】
逆転写工程において、標的ＲＮＡに相補的な配列の５’末端側に、タグ配列を含む逆転写プライマーを用いると、逆転写反応産物は、標的ＲＮＡに相補的なｃＤＮＡの５’末端にタグ配列を有することとなる。タグ配列としては、標的ＲＮＡに非相補的な配列等が挙げられ、当該ｃＤＮＡのみを特異的に解析する際に利用可能である。
【００３５】
逆転写反応溶液に含まれる緩衝剤としては、Ｔｒｉｓ、ＨＥＰＥＳ、ＴＡＥ、ＴＢＥ、ＰＢＳ等が挙げられる。
【００３６】
逆転写反応の温度および時間は、標的ＲＮＡの長さや逆転写プライマーの長さにより適宜決定することができ、例えば６５℃、１０分間での反応が挙げられる。逆転写反応にはＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ等の既存のキットを用いることもでき、この際には、当該キットで推奨されている緩衝液、温度、時間により逆転写反応を行うことができる。
【００３７】
＜核酸の精製＞
本発明では逆転写反応時に還元剤を含むことにより、還元剤がＲＮａｓｅを阻害するので、ＲＮＡが植物試料に元々含まれているＲＮａｓｅにより分解されることを防止できる。また、適切な濃度の還元剤は逆転写酵素を阻害しない。よって、植物試料の破砕から逆転写反応までの間に、還元剤やＲＮａｓｅを除去する必要はなく、核酸の精製を行う必要はない。ここで、核酸の精製としてはフェノール処理等のタンパク質変性処理、エタノール沈殿等の核酸沈殿処理、核酸吸着担体を用いた核酸の精製等が挙げられる。
【００３８】
＜＜ｃＤＮＡの製造キット＞＞
上述のｃＤＮＡの製造方法に用いるためのキットは、還元剤、逆転写酵素を含む。また、還元剤、逆転写酵素に加えて、逆転写プライマー、緩衝剤を含んでいてもよい。還元剤、逆転写酵素、逆転写プライマー、緩衝剤は、いずれもｃＤＮＡの製造方法に関して記載したものを用いることができる。
【００３９】
本発明のｃＤＮＡの製造方法、およびキットは、植物組織、植物の培養細胞等に適用できる。製造されたｃＤＮＡは、さまざまな遺伝子発現解析に用いることができる。ｃＤＮＡの具体的な用途としては、ｑＰＣＲやＲＮＡ−Ｓｅｑなどによる遺伝子発現の定量が挙げられる。特に、対象とする遺伝子特異的なプライマーを用いたｔａｒｇｅｔＲＮＡ−Ｓｅｑ（＊１）では、遺伝子発現量の定量のために必要な検体あたりのシークエンスデータ量が少ないため、Ｄｉｒｅｃｔ−ｌｙｓａｔｅ逆転写との組み合わせが有用であり（Ｄｉｒｅｃｔ−ｌｙｓａｔｅ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ＲＮＡ−Ｓｅｑ：Ｄｅｌｔａ−ｓｅｑ）、１検体当たり数百円で、遺伝子の発現量を網羅的に定量できる。
（＊１）Ｂｌｏｍｑｕｉｓｔ  ＴＭ，  Ｃｒａｗｆｏｒｄ  ＥＬ，  Ｌｏｖｅｔｔ  ＪＬ，  Ｙｅｏ  Ｊ，  Ｓｔａｎｏｓｚｅｋ  ＬＭ，  Ｌｅｖｉｎ  Ａ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ＲＮＡ−Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｗｉｔｈ  Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ−ＰＣＲ  Ａｍｐｌｉｃｏｎ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ．  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．  ２０１３；８．  ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００７９１２０
【実施例】
【００４０】
（１）還元剤による逆転写反応の検証
（実施例１）イネの最上位展開葉を凍結破砕した。Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）を９０ｍＭ、ＤＴＴを１００ｍＭ含む緩衝溶液６００μＬに、凍結破砕物を約５０ｍｇ添加した。その後、ボルテックスミキサーによって混和することで組織破砕液を調製した。イネの最上位展開葉の凍結破砕からボルテックスミキサーによる混和までは全て氷上で行った。
【００４１】
組織破砕液を１６，０００×ｇで５分間遠心分離し、水不溶成分を沈殿させた。遠心分離後の上清を、純水で１〜１５０倍に希釈して希釈系列を作製した。
【００４２】
組織破砕液の上清の希釈系列を鋳型として、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅを用いて、逆転写反応を行いｃＤＮＡを製造した。メーカープロトコールで推奨されている逆転写反応液へのＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒの添加は行わなかった。逆転写反応液の全量２０μＬのうち、鋳型のＲＮＡ溶液（組織破砕液の上清の希釈液）は１５μＬであり、ＤＴＴの最終濃度は０．５〜７５ｍＭであった。逆転写反応は６５℃、１０分間で行い、下記の塩基配列のプライマーを用いた。下記の塩基配列中、ＮはＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃのいずれかを表し、ＶはＡ、Ｇ、Ｃのいずれかを表す。
逆転写プライマー：５’−ＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴＧＣＧＴＣＴＡＣＧＴＧＡＣＴＧＧＡＧＴＴＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＮＮＮＮＮＮＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＶ−３’
【００４３】
上記ｃＤＮＡを純水によって２０倍に希釈した溶液から、ＫＡＰＡ  ＳＹＢＲ  Ｆａｓｔ  ｑＰＣＲとＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）  ４８０  Ｓｙｓｔｅｍ  ＩＩによりｑＰＣＲを行った。ｑＰＣＲには下記のＯｓ０３ｇ０８３６０００遺伝子特異的プライマーを用いて増幅した。ｑＰＣＲの結果を図１Ａ〜Ｂに示す。
フォワードプライマー：５’−ＧＴＧＴＧＴＣＧＧＴＡＣＴＴＴＣＧＴＣＧ−３’
リバースプライマー：５’−ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴ−３’
【００４４】
図１Ａにおいて、縦軸はＰＣＲのＣｔ値（反応の蛍光シグナル強度が閾値を超えるサイクル数）、横軸は希釈倍率を示す。逆転写反応及びｑＰＣＲは定量的に行われているので、ＰＣＲのシグナル強度は組織破砕液に含まれていた産生されたｃＤＮＡの量を反映している。ＰＣＲのシグナル強度はｑＰＣＲに用いた組織破砕液の量に相関することが示された。また、図１Ｂのｍｅｌｔｉｎｇ  ｃｕｒｖｅ解析から、ｉｎｐｕｔのｌｙｓａｔｅ量によらず、同じ長さのＰＣＲ産物が得られており、非特異的なＰＣＲ産物の生成は抑制されていることが確認された。以上より、還元剤の存在下では、夾雑物を多く含む組織破砕液から、核酸の精製工程を経なくてもＲＮＡを定量的に回収できることが示された。
【００４５】
（２）Ｄｉｒｅｃｔ−ｌｙｓａｔｅ逆転写反応の検証
（実施例２）シロイヌナズナの実生約３０ｍｇに対して、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）を９０ｍＭ、ＤＴＴを１００ｍＭ含む緩衝溶液３００μＬを添加し、ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ  ＩＩとガラスビーズを用いて組織破砕液を調製した。組織破砕は氷上で行った。
【００４６】
この組織破砕液を鋳型として、実施例１と同じ方法で逆転写反応を行った。逆転写反応産物を用いて、Ｌａｓｙ−Ｓｅｑ法（＊２）によりＲＮＡ−Ｓｅｑライブラリーを調製し、ＭｉＳｅｑ及びＭｉＳｅｑ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ  ｖ３（１５０サイクル）を用いて、ＲＮＡ−Ｓｅｑによる全ｍＲＮＡ量測定を実施した。結果を図２に示す。
（＊２）Ｌａｓｙ−Ｓｅｑ法：Ｋａｍｉｔａｎｉ  Ｍ，  Ｋａｓｈｉｍａ  Ｍ，  Ｔｅｚｕｋａ  Ａ，  Ｎａｇａｎｏ  ＡＪ．  Ｌａｓｙ−Ｓｅｑ：  ａ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ＲＮＡ−Ｓｅｑ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｐｌａｎｔ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ｆｌｕｃｔｕａｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ．  ｂｉｏＲｘｉｖ．  ２０１８
【００４７】
（比較例１）実施例２と同じ方法で組織破砕液を調製し、ＡＭＰｕｒｅＸＰｂｅａｄｓにより核酸を精製した。精製済ＲＮＡ溶液を鋳型として実施例１と同じ方法で逆転写反応を行った。逆転写反応産物を用いて、Ｌａｓｙ−Ｓｅｑ法によりＲＮＡ−Ｓｅｑライブラリーを調製し、ＲＮＡ−Ｓｅｑによる全ｍＲＮＡ量測定を実施した。結果を図２に示す。
【００４８】
図２の各ドットは一つの遺伝子に対応し、縦軸は実施例２におけるｍＲＮＡ量、横軸は比較例１におけるｍＲＮＡ量を示す。ｌｏｇ２ｒｐｍはＲＮＡ−Ｓｅｑによって得られたリードカウントを補正した値である。実施例２と比較例１の間には高い相関がみられ（ピアソン相関係数０．９７８）、実施例２では核酸の精製工程を経なくてもＲＮＡを定量的に回収できることが示された。
【００４９】
また、一部の遺伝子については実施例２において比較例１よりも高い発現量が観察された。これらはＡＴ１Ｇ０７６００．１遺伝子（１３８塩基長）、ＡＴ５Ｇ４１０１０．１遺伝子（１８７塩基長）等の発現産物であり、長さが約７０〜７００塩基長と短いため、比較例２ではＡＭＰｕｒｅＸＰｂｅａｄｓにより回収できなかったと考えられる。核酸の精製工程を経ない本発明の方法によればこれらの低分子ＲＮＡに由来するｃＤＮＡを定量的に製造できる。
【００５０】
（３）還元剤によるＲＮａｓｅ阻害
（参考例１）イネの最上位展開葉を凍結破砕した。Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）を１００ｍＭ含む緩衝溶液６００μＬに凍結破砕物を約５０ｍｇ添加した。その後、ボルテックスミキサーによって混和することで組織破砕液を調製し、直後にＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ  ｂｅａｄｓにより組織破砕液からＲＮＡを精製した。精製されたＲＮＡをＡｇｉｌｅｎｔ２１００バイオアナライザーとＡｇｉｌｅｎｔ  ＲＮＡ６０００  ｎａｎｏキットにより電気泳動し、ＲＮＡの分解度を評価した。電気泳動の結果を図３Ａに示す。
【００５１】
（参考例２）
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）を９０ｍＭ、ＤＴＴを１００ｍＭ含む緩衝溶液６００μＬに、イネの最上位展開葉の凍結破砕物を約５０ｍｇ添加したこと以外は参考例１と同じ操作を行い、組織破砕液を調製し、ＲＮＡを精製して分解度を評価した。電気泳動の結果を図３Ｂに示す。
【００５２】
（参考例３）シロイヌナズナの実生を約３０ｍｇ用いて実施例２と同じ操作を行い、組織破砕液を調製し、２２℃にて一時間静置した後、参考例１と同様にＲＮＡを精製して分解度を評価した。電気泳動の結果を図３Ｃに示す。
【００５３】
（参考例４）シロイヌナズナの実生を約３０ｍｇ用いて、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）を９０ｍＭ、ＤＴＴを１００ｍＭ含む緩衝溶液３００μＬ内で破砕を行った以外は実施例２と同じ操作を行い、組織破砕液を調製し、２２℃にて一時間静置した後、参考例２と同様にＲＮＡを精製して分解度を評価した。電気泳動の結果を図３Ｄに示す。
【００５４】
図３Ａ〜Ｄにおいて、横軸がＲＮＡの長さを、縦軸はＲＮＡの量を示す。還元剤を含まない緩衝溶液で調製された参考例１、３の組織破砕液ではＲＮＡの分解によるＲＮＡ断片（１００〜１８００ｎｔ）の増加が確認された（図３Ａ、Ｃ）。これに対し、還元剤を含む緩衝溶液で調製された参考例２、４の組織破砕液ではＲＮＡの分解はみられず、高品質のＲＮＡが得られた（図３Ｂ、Ｄ）。
【００５５】
（４）還元剤の逆転写反応への影響
（参考例５）イネの最上位展開葉からＭａｘｗｅｌｌ（登録商標）  １６  ＬＥＶ  Ｐｌａｎｔ  ＲＮＡ  Ｋｉｔを用いてｔｏｔａｌ  ＲＮＡを精製した。このＲＮＡを鋳型として、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅを用いて、逆転写反応を行いｃＤＮＡを製造した。メーカープロトコールで推奨されている逆転写反応液へのＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒの添加は行わなかった。ＤＴＴの最終濃度は一般的な逆転写反応に用いられる５ｍＭであった。逆転写反応は６５℃、１０分間で行い、下記の塩基配列の逆転写プライマーを用いた。
逆転写プライマー：５’−ＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴＧＣＧＴＣＴＡＣＧＴＧＡＣＴＧＧＡＧＴＴＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＮＮＮＮＮＮＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＶ−３’
フォワードプライマー：５‘−ＧＴＧＴＧＴＣＧＧＴＡＣＴＴＴＣＧＴＣＧ−３’
リバースプライマー：５’−ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴ−３’
【００５６】
得られたｃＤＮＡ溶液を鋳型として、ＫＡＰＡ  ＳＹＢＲ  Ｆａｓｔ  ｑＰＣＲとＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）  ４８０  Ｓｙｓｔｅｍ  ＩＩによりｑＰＣＲを行った。ｑＰＣＲにはＯｓ０３ｇ０８３６０００遺伝子特異的プライマーを用いて増幅した。その結果を図４に示す。
【００５７】
（参考例６〜１１）ｔｏｔａｌ  ＲＮＡに、ＤＴＴを最終濃度が１０ｍＭ（参考例６）、１００ｍＭ（参考例７）、２−メルカプトエタノールを最終濃度が１％（約１２８ｍＭ）（参考例８）、２．５％（参考例９）、５％（参考例１０）となるように添加した以外は参考例５と同じ操作を行った。また、Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡにおけるＤＮＡの混入の可能性を排除するために、逆転写反応を行わない以外は参考例５と同じ操作を行った（参考例１１）。ｑＰＣＲの結果を図４に示す。
【００５８】
図４中、Ｃｔ値は、ｑＰＣＲ反応におけるＰＣＲ産物の量が閾値を超えたサイクル数を示す。ｎ＝３であり、結果を箱ひげ図で示す。参考例５〜１０では、還元剤の濃度に幅があるが、同程度のＯｓ０３ｇ０８３６０００のｃＤＮＡが検出された。このことから、適切な濃度の還元剤は逆転写反応を阻害しないことが確認された。参考例１１ではｃＤＮＡの検出量が極めて少量であった。
【００５９】
（５）還元剤の逆転写反応への影響
（参考例１２〜１６）シロイヌナズナの実生約３０ｍｇに対して、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）を９０ｍＭを含む緩衝溶液（参考例１２）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）を９０ｍＭとＤＴＴ１０ｍＭを含む緩衝溶液（参考例１３）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）を９０ｍＭとＤＴＴ５０ｍＭを含む緩衝溶液（参考例１４）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）を９０ｍＭとＤＴＴ１００ｍＭを含む緩衝溶液（参考例１５）、又はＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）を９０ｍＭと２−メルカプトエタノール２．５％を含む緩衝溶液（参考例１６）を、それぞれ３００μＬ添加し、ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ  ＩＩとガラスビーズを用いて組織破砕液を調製した。ＲＮＡの安定性を検証するため、組織破砕液を２２℃にて一時間静置した後、組織破砕液を鋳型として、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅを用いて、逆転写反応を行いｃＤＮＡを製造した。メーカープロトコールで推奨されている逆転写反応液へのＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒの添加は行わなかった。
【００６０】
逆転写反応液の全量２０μＬのうち、鋳型のＲＮＡ溶液（組織破砕液の上清の希釈液）は１５μＬであり、還元剤の最終濃度は０ｍＭ（参考例１２）、ＤＴＴ７．５ｍＭ（参考例１３）、ＤＴＴ３７．５ｍＭ（参考例１４）、ＤＴＴ７５ｍＭ（参考例１５）、２−メルカプトエタノール２％（参考例１６）であった。逆転写反応は６５℃、１０分間で行い、下記の塩基配列のプライマーを用いた。
逆転写プライマー：５’−ＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴＧＣＧＴＣＴＡＣＧＴＧＡＣＴＧＧＡＧＴＴＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＮＮＮＮＮＮＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＶ−３’
【００６１】
上記ｃＤＮＡを純水によって１０倍に希釈した溶液から、ＫＡＰＡ  ＳＹＢＲ  Ｆａｓｔ  ｑＰＣＲとＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）  ４８０  Ｓｙｓｔｅｍ  ＩＩによりｑＰＣＲを行った。ｑＰＣＲには下記のＡＴ３Ｇ１８７８０遺伝子特異的プライマーを用いて増幅した。ｑＰＣＲの結果を図５に示す。
フォワードプライマー：５’−  ＣＴＴＧＣＡＣＣＡＡＧＣＡＧＣＡＴＧＡＡ−３’
リバースプライマー：５’−ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴ−３’
【００６２】
図５中、Ｃｔ値は、ｑＰＣＲ反応におけるＰＣＲ産物の量が閾値を超えたサイクル数を示す。ｎ＝３であり、結果は箱ひげ図で示されている。参考例１３〜１６では、参考例１２と比べて多量のＡＴ３Ｇ１８７８０  ｃＤＮＡが検出された。
【００６３】
（６）還元剤の存在下でのシロイヌナズナ試料の破砕と逆転写反応
（実施例３、比較例３）非特許文献２に記載のＣＬ  ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４、０．２５％  Ｉｇｅｐａｌ  ＣＡ−６３０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）に、ＤＴＴを最終濃度が１００ｍＭ（実施例３）、または１ｍＭ（比較例３）となるように添加した。この溶液４００μｌ中でシロイヌナズナの実生約３０〜５０ｍｇを破砕し、ｌｙｓａｔｅを作成した。その後、室温で１時間放置した後、ＡＭＰｕｒｅＸＰｂｅａｄｓによりＲＮＡの精製を行い、バイオアナライザーでＲＮＡの長さの分布を確認した。電気泳動の結果を図６Ａ〜Ｂに示す。
【００６４】
（比較例４）ＣｅｌｌＡｍｐ（ＴａＫａＲａ  Ｂｉｏ）のＣｅｌｌＡｍｐ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ  ４００μｌ中でシロイヌナズナの実生約３０〜５０ｍｇを破砕し、ｌｙｓａｔｅを作成した。その後、室温で１時間放置した後、ＡＭＰｕｒｅＸＰｂｅａｄｓによりＲＮＡの精製を行い、バイオアナライザーでＲＮＡの長さの分布を確認した。電気泳動の結果を図６Ｃに示す。
【００６５】
（比較例５）ＳｕｐｅｒＰｒｅｐ（ＴＯＹＯＢＯ）のＬｙｓｉｓ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ４００μｌ中でシロイヌナズナの実生約３０〜５０ｍｇを破砕し、ｌｙｓａｔｅを作成した。２３℃で５分間静置した後、ＳｕｐｅｒＰｒｅｐ（ＴＯＹＯＢＯ）のＳＴＯＰ  ｓｏｌｕｔｉｏｎを７６μｌと、ＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒを５μｌ添加した。その後、室温で１時間放置した後、ＡＭＰｕｒｅＸＰｂｅａｄｓによりＲＮＡの精製を行い、バイオアナライザーでＲＮＡの長さの分布を確認した。電気泳動の結果を図６Ｄに示す。
【００６６】
図６ＡにおいてｒＲＮＡの明確なピークが観察され、実施例３において高品質のＲＮＡが得られたことが示された。図６Ｂでは低濃度の還元剤を使用したが、ｒＲＮＡのピークは認められず、ＲＮＡが分解していた。比較例４〜５で用いた試薬は、動物由来の培養細胞からＲＮＡを精製する試薬であるが、これらの試薬を用いた図６Ｃ〜ＤではｒＲＮＡのピークは認められず、ＲＮＡが分解していた。
【００６７】
実施例３、比較例３〜５で得られたＲＮＡを鋳型として、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅを用いて逆転写反応を行いｃＤＮＡを製造した。メーカープロトコールで推奨されている逆転写反応液へのＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒの添加は行わなかった。ＤＴＴの最終濃度は一般的な逆転写反応に用いられる５ｍＭであった。逆転写反応は６５℃、１０分間で行い、下記の塩基配列の逆転写プライマーを用いた。
逆転写プライマー：５’−ＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴＧＣＧＴＣＴＡＣＧＴＧＡＣＴＧＧＡＧＴＴＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＮＮＮＮＮＮＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＶ−３’
【００６８】
得られたｃＤＮＡ溶液を鋳型として、ＫＡＰＡ  ＳＹＢＲ  Ｆａｓｔ  ｑＰＣＲとＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）  ４８０  Ｓｙｓｔｅｍ  ＩＩによりｑＰＣＲを行った。ｑＰＣＲには下記のＡＴ３Ｇ１８７８０遺伝子特異的プライマーを用いて増幅した。ｑＰＣＲの結果を図７に示す。
フォワードプライマー：５‘−  ＣＴＴＧＣＡＣＣＡＡＧＣＡＧＣＡＴＧＡＡ−３’
リバースプライマー：５’−ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴ−３’
【００６９】
図７では、図６Ａ〜Ｄの結果に相関して、ＲＮＡの分解が少ない実施例３でＣｔ値が最小であった。実施例３では比較例３〜５と比較して２２〜２３倍多いｃＤＮＡの産生が可能であることが示された。
【００７０】
（７）還元剤の存在下でのイネ試料の破砕と逆転写反応
（実施例４〜５、比較例６）非特許文献２に記載のＣＬ  ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４、０．２５％  Ｉｇｅｐａｌ  ＣＡ−６３０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）に、ＤＴＴを最終濃度が１ｍＭ（比較例６）、１０ｍＭ（実施例４）、または１００ｍＭ（実施例５）となるように添加した。凍結イネ約５０ｍｇを破砕し、前記溶液４００μｌに加えて混和することでｌｙｓａｔｅを作成した。その後、室温で１時間放置した後、ＡＭＰｕｒｅＸＰｂｅａｄｓによりＲＮＡの精製を行い、バイオアナライザーでＲＮＡの長さの分布を確認した。電気泳動の結果を図８Ａ〜Ｃに示す。
【００７１】
（比較例７）シロイヌナズナの実生に代えて、凍結イネ約５０ｍｇを用いた以外は、比較例４と同じ操作を行った。電気泳動の結果を図８Ｄに示す。
【００７２】
（比較例８）シロイヌナズナの実生に代えて、凍結イネ約５０ｍｇを用いた以外は、比較例５と同じ操作を行った。電気泳動の結果を図８Ｅに示す。
【００７３】
図８Ａ〜ＢではｒＲＮＡとみられる明確なピークが観察され、高品質のＲＮＡが得られたことが示された。比較例６〜８の試薬を用いた図８Ｃ〜ＥではｒＲＮＡのピークは認められず、ＲＮＡが分解していた。
【００７４】
実施例５、比較例６〜８で得られたＲＮＡを鋳型として、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅを用いて逆転写反応を行いｃＤＮＡを製造した。メーカープロトコールで推奨されている逆転写反応液へのＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒの添加は行わなかった。ＤＴＴの最終濃度は一般的な逆転写反応に用いられる５ｍＭであった。逆転写反応は６５℃、１０分間で行い、下記の塩基配列の逆転写プライマーを用いた。
逆転写プライマー：５’−ＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴＧＣＧＴＣＴＡＣＧＴＧＡＣＴＧＧＡＧＴＴＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＮＮＮＮＮＮＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＶ−３’
【００７５】
得られたｃＤＮＡ溶液を鋳型として、ＫＡＰＡ  ＳＹＢＲ  Ｆａｓｔ  ｑＰＣＲとＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）  ４８０  Ｓｙｓｔｅｍ  ＩＩによりｑＰＣＲを行った。ｑＰＣＲには下記のＡＴ３Ｇ１８７８０遺伝子特異的プライマーを用いて増幅した。ｑＰＣＲの結果を図９に示す。
フォワードプライマー：５’−ＧＴＧＴＧＴＣＧＧＴＡＣＴＴＴＣＧＴＣＧ−３’
リバースプライマー：５’−ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴ−３’
【００７６】
図９では、図８Ａ〜Ｅの結果に相関して、ＲＮＡの分解が少ない実施例５でＣｔ値が最小であった。実施例５では比較例６〜８と比較して２２〜２３倍多いｃＤＮＡの産生が可能であることが示された。
【図１Ａ】
2020150937.tif 000002
【図１Ｂ】
2020150937.tif 000003
【図２】
2020150937.tif 000004
【図３Ａ】
2020150937.tif 000005
【図３Ｂ】
2020150937.tif 000006
【図３Ｃ】
2020150937.tif 000007
【図３Ｄ】
2020150937.tif 000008
【図４】
2020150937.tif 000009
【図５】
2020150937.tif 000010
【図６Ａ】
2020150937.tif 000011
【図６Ｂ】
2020150937.tif 000012
【図６Ｃ】
2020150937.tif 000013
【図６Ｄ】
2020150937.tif 000014
【図７】
2020150937.tif 000015
【図８Ａ】
2020150937.tif 000016
【図８Ｂ】
2020150937.tif 000017
【図８Ｃ】
2020150937.tif 000018
【図８Ｄ】
2020150937.tif 000019
【図８Ｅ】
2020150937.tif 000020
【図９】
2020150937.tif 000021
【配列表】
2020150937000001.app