(57)【要約】【課題】本発明は、ランダム配列を含むプライマーを用いた核酸増幅において、非特異的な増幅産物の生成を抑制することを課題とする。【解決手段】標的核酸のヌクレオチド配列をシーケンシングする方法であって、ＵＩＤを標的核酸に付し、前記ＵＩＤが付された前記標的核酸をＰＣＲを使って増幅することによってアンプリコンのプールを調製する工程；及び前記ＵＩＤと標的核酸を含むアンプリコンをシーケンシングする工程を含み、ここで、前記ＵＩＤのヌクレオチド配列は、ランダムヌクレオチド（Ｎ）と、所定ヌクレオチドとの両方を含むヌクレオチド配列である、前記方法により課題を解決する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸のヌクレオチド配列をシーケンシングする方法であって、
ＵＩＤを標的核酸に付し、前記ＵＩＤが付された前記標的核酸をＰＣＲを使って増幅することによってアンプリコンのプールを調製する工程；及び
前記ＵＩＤと前記標的核酸を含むアンプリコンをシーケンシングする工程
を含み、
ここで、前記ＵＩＤのヌクレオチド配列は、ランダムヌクレオチド（Ｎ）と、所定ヌクレオチドとの両方を含むヌクレオチド配列である、
前記方法。
【請求項２】
前記ＵＩＤの５’末端のヌクレオチドがランダムヌクレオチド（Ｎ）であり、前記ＵＩＤの５’末端のヌクレオチドがランダムヌクレオチド（Ｎ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＵＩＤが、複数の所定ヌクレオチドを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＵＩＤが、ランダムヌクレオチド（Ｎ）と、所定ヌクレオチド（Ａ）からなり、所定ヌクレオチド（Ａ）は、塩基としてアデニンを含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ＵＩＤが、ランダムヌクレオチド（Ｎ）と、所定ヌクレオチド（Ｇ）からなり、所定ヌクレオチド（Ｇ）は、塩基としてグアニンを含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ＵＩＤが、ランダムヌクレオチド（Ｎ）と、所定ヌクレオチド（Ｔ）からなり、所定ヌクレオチド（Ｔ）は、塩基としてチミンを含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ＵＩＤが、ランダムヌクレオチド（Ｎ）と、所定ヌクレオチド（Ｃ）からなり、所定ヌクレオチド（Ｃ）は、塩基としてシトシンを含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ＵＩＤのヌクレオチドの６％から９０％が所定ヌクレオチドである、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ＵＩＤのヌクレオチド数がＺヌクレオチド（ｎｔ）であるとき、前記ＵＩＤが、１  ｎｔからＺ／２  ｎｔの所定配列を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＵＩＤの長さが、４  ｎｔ以上である、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＵＩＤの長さが、１００  ｎｔ以下である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＵＩＤが、所定ヌクレオチド（Ｇ）を含まない、請求項１から４、６及び７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
標的核酸をシーケンシングするために、ＵＩＤを標的核酸に付すためのプライマーであって、前記プライマーはＵＩＤを含み、
ここで、前記ＵＩＤのヌクレオチド配列は、ランダムヌクレオチド（Ｎ）と、所定ヌクレオチドとの両方を含むヌクレオチド配列である、
前記プライマー。
【請求項１４】
請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法のためのプライマーの使用であって、
前記プライマーはＵＩＤを含み、
ここで、前記ＵＩＤのヌクレオチド配列は、ランダムヌクレオチド（Ｎ）と、所定ヌクレオチドとの両方を含むヌクレオチド配列である、
前記使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸配列の解析方法、プライマー、及びプライマーの使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ランダム配列を含むプライマーでアンプリコンを生成し、当該アンプリコンの配列を解析する技術が知られている。
【０００３】
例えば、特許文献１（ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．２０１５／０３６１４９２  Ａ１）には、ｕｎｉｑｕｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ  （ＵＩＤ）配列を使用してＤＮＡ小断片に存在する変異をシーケンサーで同定するＳａｆｅ−Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍが開示されている。
特許文献２（ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．２０１８／０５１２７７  Ａ１）には、「ヘアピン  バーコード  プライマー」を使って、ＰＣＲのプレアンプリフィケーションステップにおいて、標的核酸にバーコード配列を挿入する方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許出願公開第2015/0361492号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第2018/051277 A1号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
特許文献１のＵＩＤや、特許文献２のバーコードはランダム配列である。本発明者らは、ランダム配列をタグとして含むプライマーを用いたＰＣＲにおいてプライマーダイマーなどの非特異的な増幅産物が生じることを発見した。非特異的な増幅産物も配列解析の対象（Ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ  ｒｅａｄｓ）となるため、シーケンシングの非効率化を招き得る。
【０００６】
特許文献２に記載のヘアピン  バーコード  プライマーは、プレアンプリフィケーションステップの間、プライマーにヘアピンループ構造をとらせることにより、ＵＩＤにアクセスできなくさせ、ＵＩＤが他のプライマーと結合することを防ぎ非特異的な増幅反応を抑制しようとする方法である。しかし、この方法は、プレアンプリフィケーションステップのヘアピンループ構造を維持する必要があるため、プレアンプリフィケーションステップの増幅条件が限定されてしまうという課題がある。また、ヘアピン構造を維持できるような塩基配列を用いる必要があり、配列の設計に大きな制約がある。
【０００７】
本発明は、ランダム配列を含むプライマーを用いた核酸増幅において、非特異的な増幅産物の生成を抑制することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明のある実施形態は、標的核酸のヌクレオチド配列をシーケンシングする方法に関する。前記方法は、ＵＩＤを標的核酸に付し、前記ＵＩＤが付された前記標的核酸をＰＣＲを使って増幅することによってアンプリコンのプールを調製する工程；及び
前記ＵＩＤと標的核酸を含むアンプリコンをシーケンシングする工程を含む。ここで、前記ＵＩＤのヌクレオチド配列は、ランダムヌクレオチド（Ｎ）と、所定ヌクレオチドとの両方を含むヌクレオチド配列である。
【０００９】
本発明のある実施形態は、標的核酸をシーケンシングするために、ＵＩＤを標的核酸に付すためのプライマーに関する。前記プライマーはＵＩＤを含む。ここで、前記ＵＩＤのヌクレオチド配列は、ランダムヌクレオチド（Ｎ）と、所定ヌクレオチドとの両方を含むヌクレオチド配列である。
【００１０】
本発明のある実施形態は、前記方法のためのプライマーの使用に関する。前記プライマーはＵＩＤを含む。ここで、ＵＩＤのヌクレオチド配列は、ランダムヌクレオチド（Ｎ）と、所定ヌクレオチドとの両方を含むヌクレオチド配列である。
上記実施形態によれば、ランダム配列を含むプライマーを用いた核酸増幅において、非特異的な増幅産物の生成を抑制することができる。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によると、非特異的な増幅産物の生成を抑制することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】（Ａ）ランダム配列を含むフォワードプライマーに、リバースプライマーが非特異的に結合したことを示す模式図である。このためＯｆｆ−ｔａｒｇｅｔ  ｒｅａｄｓが増幅される。（Ｂ）本開示の課題解決手段を示す図である。黒丸はランダムヌクレオチドを示す。グレーの丸は所定ヌクレオチドを示す。
【図２】標的核酸の例を示す図である。
【図３】（Ａ）ＵＩＤを結合させた標的核酸を調製するためのフォワードプライマーの構成の一例を示す図である。（Ｂ）ＵＩＤを結合させた標的核酸を調製するためのスペーサーを含むプライマーの構成の一例を示す図である。（Ｃ）ＵＩＤを結合させた標的核酸を調製するためのスペーサーを含むフォワードプライマーの構成の一例を示す図である。（Ｄ）リバースプライマーの構成の一例を示す図である。（Ｅ）ＵＩＤを結合させた標的核酸を調製するためのフォワードプライマーの構成の一例を示す図である。本例はプライマーの５’末端側にユニバーサルプライマー部位を有する。（Ｆ）ＵＩＤを結合させた標的核酸を調製するためのスペーサーを含むフォワードプライマーの構成の一例を示す図である。本例はプライマーの５’末端側にユニバーサルプライマー部位を有する。（Ｇ）ＵＩＤを結合させた標的核酸を調製するためのスペーサーを含むフォワードプライマーの構成の一例を示す図である。本例はプライマーの５’末端側にユニバーサルプライマー部位を有する。（Ｈ）リバースプライマーの構成の一例を示す図である。本例はプライマーの５’末端側にユニバーサルプライマー部位を有する。
【図４】ＵＩＤを含むプライマーの配列例を示す。
【図５】標的核酸とＵＩＤを含むプライマー及びリバースプライマーとのアニーリングの例を示す図である。（Ａ）は標的核酸のアンチセンス鎖とＵＩＤを含むプライマーのアニーリングの例を示す。（Ｂ）は、標的核酸のセンス鎖とのリバースプライマーのアニーリングの例を示す。
【図６】タグ化された標的核酸の構造の一例を示す図である。（Ａ）はユニバーサルプライマーを含まずＵＩＤを含むプライマーを使った場合に産生されるタグ化された標的核酸の例である。（Ｂ）はユニバーサルプライマーとＵＩＤを含むプライマーを使った場合に調製されるタグ化された標的核酸の例である。
【図７】ＵＩＤを含むプライマー及びリバースプライマーの別の例を示す図である。（Ａ）はアダプター部位と、ユニバーサルプライマー部位と、ＵＩＤを含むプライマーの例である。（Ｂ）はアダプター部位と、ユニバーサルプライマー部位と、ＵＩＤを含むリバースプライマーの例である。（Ｃ）はアダプター部位を含むユニバーサルプライマーと、ＵＩＤを含むプライマーを使った場合に調製されるアダプターを含むタグ化された標的核酸の例である。
【図８】Ｐｌａｓｍａ−Ｓａｆｅ−Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ技術の特徴を示す。
【図９】標的核酸配列解析装置の構成を示す図である。（ａ）は標的核酸配列解析装置とシーケンシング装置が独立した構成となっている例である。（ｂ）は標的核酸配列解析装置とシーケンシング装置が一体化した構成となっている例である。
【図１０】標的核酸配列解析装置のハードウェアの構成の概略を示す図である。
【図１１】標的核酸配列解析装置の処理の一例を示すフローチャートである。
【図１２】シーケンシング装置の処理の一例を示すフローチャートである。
【図１３】標的領域の配列の決定方法を示すフローチャートである。
【図１４】アキュレート処理を示すフローチャートである。
【図１５】ｎｏｒｍａｌ  ＵＩＤ配列をＵＩＤとするタグ化プライマー、ｓｐｌｉｔＵＩＤ１配列をＵＩＤとするタグ化プライマー、及びｓｐｌｉｔＵＩＤ２配列をＵＩＤとするタグ化プライマーのそれぞれを用いてＵＩＤ−ＰＣＲを行ったＳＭＡＤ４のアンプリコンについてＮＧＳ解析を行った場合のアーチファクトリードの割合を示す。
【図１６】表１に示す各タグ化プライマーとリバースプライマーを用いてＵＩＤ−ＰＣＲを行い、その産物に対してユニバーサルプライマーを用いてＷＢＣ−ＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物を電気泳動した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本明細書及び図面において用いられる略語は以下の意味を有する。
ＵＩＤ：ｕｎｉｑｕｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ
ＴＮ：標的核酸
ＴＳ：タグ部位
ｕ−ＰＳ１：第１のユニバーサルプライマー部位
ｔ−ＰＳ１：第１の標的特異的プライマー部位
ｕ−ＰＳ２：第２のユニバーサルプライマー部位
ｔ−ＰＳ２：第２の標的特異的プライマー部位
ＡＳ１：第１のアダプター部位
ＡＳ２：第２のアダプター部位
ｓｐ１：第１のスペーサー部位
ｓｐ２：第２のスペーサー部位
ｃ−ＴＳ：タグ部位の相補鎖
ｃ−ｕ−ＰＳ１：第１のユニバーサルプライマー部位の相補鎖
ｃ−ｔ−ＰＳ１：第１の標的特異的プライマー部位の相補鎖
ｃ−ｕ−ＰＳ２：第２のユニバーサルプライマー部位の相補鎖
ｃ−ｔ−ＰＳ２：第２の標的特異的プライマー部位の相補鎖
ｃ−ＡＳ１：第１のアダプター部位の相補鎖
ｃ−ＡＳ２：第２のアダプター部位の相補鎖
Ｔ：塩基部分がチミンであり、糖部分がデオキシリボースであるヌクレオチド
Ｕ：塩基部分がウラシルであり、糖部分がデオキシリボースであるヌクレオチド
Ａ：塩基部分がアデニンであり、糖部分がデオキシリボースであるヌクレオチド
Ｇ：塩基部分がグアニンであり、糖部分がデオキシリボースであるヌクレオチド
Ｃ：塩基部分がシトシン、糖部分がデオキシリボースであるヌクレオチド
Ｎ：ランダムヌクレオチド
なお、ヌクレオチドの略語は、ＩＵＰＡＣ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｃｏｄｅに従う。
【００１４】
また、単位「ｎｔ」は、以下の説明において配列の長さすなわちヌクレオチド数を意味する。
【００１５】
ＵＩＤとは、プライマーオリゴヌクレオチドの一部の領域であり、複数のランダムヌクレオチドを含む。当業界では、プライマーオリゴヌクレオチド中のランダム配列はｕｎｉｑｕｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ（ＵＩＤ）、バーコード、ランダムバーコード、モレキュラーバーコードなどと呼ばれ、本明細書ではこれらは全て同じ意味を有する。
【００１６】
従来法において使用されるｕ−ＰＳ１、ＵＩＤ（黒丸はＡ、Ｔ、Ｇ及びＣから選択されるいずれかのランダムヌクレオチドを示す）（以下、ランダム配列におけるヌクレオチドは「Ｎ」で表す）及びｔ−ＰＳ１を含むタグ化プライマーは、ＰＣＲによる増幅の際、ｕ−ＰＳ２とｔ−ＰＳ２を含むリバースプライマーと非特異的に結合し、プライマーダイマー等の非特異的な増幅産物を生じるという課題があった。図１（Ａ）は、ランダム配列を含むフォワードプライマーに、リバースプライマーが非特異的に結合したことを示す模式図である。なお、ランダム配列を含むフォワードプライマー同士が非特異結合を生じることもあり得る。
【００１７】
本発明は、図１（Ｂ）に示すように、ＵＩＤ配列に所定のヌクレオチド（グレーの丸で表す。グレーの丸はＡ、Ｔ、Ｇ及びＣから選択されるいずれかの所定ヌクレオチドを示す）を挿入するか、ＵＩＤ配列の一部を所定ヌクレオチドで置換することにより、タグ化プライマーとリバースプライマーとの非特異的な増幅反応を抑制する。すなわち、タグ化プライマー内のＵＩＤは、Ｎと、Ａ，Ｔ，Ｇ又はＣとが混在する。ランダム配列は、予め配列を決められないため、他のＤＮＡ分子との非特異結合を抑制できない。しかし、ランダム配列中に予め決められたヌクレオチドを含有させることにより、ランダム配列のみからなるＵＩＤに比べて、非特異的に形成される水素結合数を減らすことができると考えられる（図１（Ｂ）参照）。
【００１８】
［１．標的核酸配列の決定方法］
標的核酸配列の決定方法は、標的核酸（ｔａｒｇｅｔ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）の核酸配列を決定する。標的核酸配列の決定方法は、ＵＩＤを付した、あるいはＵＩＤを含むタグ配列を使ったシーケンシングに適用され得る。
【００１９】
標的核酸配列の決定方法は、標的核酸を含むポリヌクレオチドを鋳型核酸として産生したＵＩＤを含むアンプリコンのライブラリ（以下、単に「アンプリコンのプール」ともいう）を調製する工程Ａと、アンプリコンをシーケンシングする工程Ｂとを含む。また、任意の工程として同じＵＩＤの配列を有する配列情報を用いて標的領域の真の配列を決定する工程Ｃを含んでいてもよい。
【００２０】
標的核酸配列の決定方法は、さらに、標的核酸の配列情報を出力する工程を含んでもよい。
【００２１】
以下、各工程について詳細に説明する。
【００２２】
［１−１．工程Ａ：アンプリコンのプールの調製］
【００２３】
標的核酸は、解析対象となるＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、トランスポゾンＤＮＡ等に由来する）の全長、又はフラグメント、ＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ、リボゾーマルＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ  ＲＮＡ等に由来する）の全長、又はフラグメントを含む。標的核酸は、例えば遺伝子名で表されてもよく、Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ等に記載されているＧＥＮＥ  ＩＤ、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＮＯ．、Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ＩＤ、Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  Ｌｏｃｕｓ  Ｎｏ．、Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ＳＮＰ  （ｒｅｆＳＮＰ）  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｒｅｐｏｒｔ  ＩＤ等で示されてもよい。
【００２４】
標的核酸は、核酸サンプルに含まれる。核酸試料は、生体由来の試料であり得る。核酸試料の例として、血液、血清、血漿、リンパ液、腹水、骨髄液、乳頭分泌液、腫瘍細胞が産生した液体、唾液などを挙げることができる。
【００２５】
アンプリコンのプールの調製は、好適には、ＰＣＲにより行われる。アンプリコンのプールは、例えば、（１）標的核酸をＵＩＤを含むプライマーを用いたＰＣＲで増幅することにより調製し得る（ＵＩＤ付加及び増幅工程）。また、別の態様として、アンプリコンのプールは、（２）ユニバーサルプライマー部位と、ＵＩＤを含むタグ部位を有するタグ化プライマーを用いた第１のＰＣＲで標的核酸を増幅し（タグ化工程）、ユニバーサルプライマーを用いた第２のＰＣＲでタグ化された標的核酸を増幅すること（増幅工程）により調製し得る。
【００２６】
１つの実施形態において、アンプリコンのプールの調製は、生体由来の標的核酸を含むサンプル；ＵＩＤを含むタグ化プライマーを含む試薬；ポリメラーゼやｄＮＴＰなどのＰＣＲに必要な材料を混合することによって行われる。標的核酸のヌクレオチド配列およびＵＩＤを含むアンプリコンが作製される。
【００２７】
上記（１）の場合、プライマーとして少なくともＵＩＤを含むプライマーが用いられる。ＰＣＲサイクル数は特に限定されないが、好ましくは１０〜５０サイクル、より好ましくは２０〜４０サイクルである。当該ＰＣＲの前に、ＵＩＤを含まないプライマーを用いて標的核酸のプレ増幅を行ってもよい。ＵＩＤを含まないプライマーは、標的領域に特異的なプライマーであってもよいし、ランダムプライマーであってもよい。
【００２８】
上記（２）の場合は少なくとも２度のＰＣＲ反応を行う。第１のＰＣＲにより、標的領域にＵＩＤが付与されたＤＮＡを生成することができる。第１のＰＣＲが完了した後、反応産物の少なくとも一部と、ユニバーサルプライマーと、ポリメラーゼとを混合して第２のＰＣＲを行うことができる。第１のＰＣＲのサイクル数及び第２のＰＣＲのサイクル数は特に限定されない。第１のＰＣＲサイクル数は好ましくは５〜２０サイクル、より好ましくは１０〜１５サイクルである。第２のＰＣＲサイクル数は好ましくは１０〜３０サイクル、より好ましくは１５〜２５サイクルである。第１のＰＣＲの前に、タグ部位を含まないプライマーを用いてプレ増幅を行ってもよい。タグ部位を含まないプライマーは、標的領域に特異的なプライマーであってもよいし、ランダムプライマーであってもよい。
【００２９】
以下、図２から図７を用いて、ＵＩＤを含むプライマー又はユニバーサルプライマー部位とＵＩＤとを含むタグ部位を有するタグ化プライマーを用いたアンプリコンのプールの調製等の例について具体的に説明する。
【００３０】
図２に示される標的核酸は、標的領域を含むポリヌクレオチドと、相補的なポリヌクレオチドからなる二本鎖ポリヌクレオチドである。標的核酸は一本鎖であってもよい。
【００３１】
標的核酸の例は、解析対象のサンプルから抽出されたＤＮＡ、ＤＮＡライブラリ、解析対象のサンプルから抽出されたＲＮＡを逆転写して得られたｃＤＮＡ、これらを濃縮・精製したＤＮＡである。抽出およびＤＮＡの濃縮は商業的に入手可能な製品を使用して行うことができる。
【００３２】
ＵＩＤは、フォワードプライマー及び／又はリバースプライマーに含まれる。図３にＵＩＤを含むフォワードプライマーとＵＩＤを含まないリバースプライマーの例を示す。
【００３３】
上記（１）の実施形態に使用されるフォワードプライマーとリバースプライマーの例を図３（Ａ）から図３（Ｄ）に示す。図３（Ａ）に示すプライマーは、ＵＩＤを結合させた標的核酸を調製するためのフォワードプライマーの構成の一例である。この例では、５’側にＵＩＤを含み、３’側に第１の標的特異的プライマー部位（ｔ−ＰＳ１）を含む。ｔ−ＰＳ１は、標的核酸を特異的に増幅するプライマーとして機能する。図３（Ｂ）は、ＵＩＤを結合させた標的核酸を調製するためのスペーサーを含むプライマーの構成の一例である。この例では、５’側にＵＩＤを含み、３’側にｔ−ＰＳ１を含み、ＵＩＤとｔ−ＰＳ１の間に第１のスペーサー（ｓｐ−１）を含む。図３（Ｃ）は、ＵＩＤを結合させた標的核酸を調製するためのスペーサーを含むフォワードプライマーの構成の一例である。この例では、５’側に第２のスペーサー（ｓｐ−２）を含み、３’側にｔ−ＰＳ１を含み、ｓｐ−２とｔ−ＰＳ１の間にＵＩＤを含む。図３（Ｄ）は、ＵＩＤを含まないリバースプライマーの構成の一例を示す図である。
【００３４】
上記（２）の実施形態に使用されるフォワードプライマーとリバースプライマーの例を図３（Ｅ）から図３（Ｈ）に示す。本実施形態では、プライマーは、ユニバーサルプライマー部位を含み得る。図３（Ｅ）は、ＵＩＤを結合させた標的核酸を調製するためのフォワードプライマーの構成の一例を示す図である。本例はプライマーの５’末端側に第１のユニバーサルプライマー部位（ｕ−ＰＳ１）を含み、３’側にｔ−ＰＳ１を含み、ｕ−ＰＳ１とｔ−ＰＳ１の間にＵＩＤを含む。図３（Ｆ）は、ＵＩＤを結合させた標的核酸を調製するためのスペーサーを含むフォワードプライマーの構成の一例を示す図である。この例では、本例はプライマーの５’末端側から、ｕ−ＰＳ１、ＵＩＤ、ｓｐ１、ｔ−ＰＳ１を含む。図３（Ｇ）は、ＵＩＤを結合させた標的核酸を調製するためのスペーサーを含むフォワードプライマーの構成の一例を示す図である。本例はプライマーの５’末端側から、ｕ−ＰＳ１、ｓｐ２、ＵＩＤ、ｔ−ＰＳ１を含む。（Ｈ）リバースプライマーの構成の一例を示す図である。本例はプライマーの５’末端側に第２のユニバーサルプライマー部位（ｕ−ＰＳ２）を有する。ｕ−ＰＳ１及びＵＩＤを含む部分、ｕ−ＰＳ１、ＵＩＤ及びｓｐ１の部分、またはｕ−ＰＳ１、ｓｐ２及びＵＩＤの部分をタグ部位ともいう。
【００３５】
ＵＩＤの配列の長さは、試料中の標的核酸の分子数に応じて決定することができる。標的核酸の分子数が少量の場合は、ＵＩＤ中のランダムヌクレオチドの数も少なくてよい。通常、ＵＩＤの長さ（ランダムヌクレオチド数と所定ヌクレオチド数の合計）は３ヌクレオチド以上であり、好ましくは５ヌクレオチド以上である。ＵＩＤの長さの上限は、特に限定されないが、増幅効率やシーケンサーで解析されるリード長を考慮すると通常１２０ｎｔ以下であり、好ましくは１００ｎｔ以下である。
【００３６】
ＵＩＤは、複数のランダムヌクレオチド（Ｎ）と、所定ヌクレオチドとの両方を含む。所定ヌクレオチドは、所定ヌクレオチド（Ａ）、所定ヌクレオチド（Ｔ）、所定ヌクレオチド（Ｕ）、所定ヌクレオチド（Ｇ）および所定ヌクレオチド（Ｃ）からなる群より選択される少なくとも１を含む。すなわち、ＵＩＤ内において、ランダムヌクレオチドと所定ヌクレオチドは混在する。ＵＩＤが全てランダムヌクレオチドにより構成される場合は、配列が予測できないため、他のプライマー分子等と非特異的に結合する配列が生じる可能性がある。しかし、予め非特異が生じにくい所定ヌクレオチドを挿入することにより、他のプライマー分子等との非特異結合を抑制し得る。例えば、あるプライマー分子のＵＩＤにおいて、５’末端から５番目に所定ヌクレオチドとして「Ａ」を含む場合、他のプライマー分子でも同じ場所はＡとなる。したがって、これらのプライマー分子は少なくとも５’末端から５番目において非特異的な結合は生じにくくなる。本明細書では、アデニン塩基を含む所定ヌクレオチドを、所定ヌクレオチド（Ａ）と表記し、チミン塩基を含む所定ヌクレオチドを、所定ヌクレオチド（Ｔ）と表記し、ウラシル塩基を含む所定ヌクレオチドを、所定ヌクレオチド（Ｕ）と表記し、シトシン塩基を含む所定ヌクレオチドを、所定ヌクレオチド（Ｃ）と表記し、グアニン塩基を含む所定ヌクレオチドを、所定ヌクレオチド（Ｇ）と表記する。
【００３７】
ＵＩＤは、試料に含まれる標的核酸の分子ごとに付与される。これによりアンプリコンの配列が試料中のどの分子に由来するかを識別することができる。この場合、ランダム配列は好ましくは、ＵＳ２０１５／０３６１４９２Ａ１に記載のｕｎｉｑｕｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ  （ＵＩＤ）であり得る。ＵＳ２０１５／０３６１４９２Ａ１は参照として本明細書に組み込まれる。
【００３８】
所定ヌクレオチドは、プライマー合成の際に予め種類が決定されている。アンプリコンのプールを調製する際は、合成に十分な量のプライマーが反応系に添加される。ＵＩＤのヌクレオチド配列中のＮはプライマー分子ごとに異なるが、所定ヌクレオチドは、プライマー分子の間で同一となるよう設計される。例えば、ＵＩＤがフォワードプライマーに付与されている場合であって、５’末端から１〜４番目及び６〜１０番目がランダム配列であり、５番目が「Ａ」の場合、全てのフォワードプライマー分子の５番目のヌクレオチドは「Ａ」である。
【００３９】
ランダムヌクレオチドと所定ヌクレオチドのＵＩＤにおける位置は、ＰＣＲ時の非特異的な増幅産物の生成を抑制できれば特に限定されない。ＵＩＤの５’末端と３’末端は、いずれもランダムヌクレオチドである。所定ヌクレオチドの数は、ＵＩＤのヌクレオチド数をＺｎｔとしたとき、（Ｚ／２）ｎｔを超えない範囲において、１ｎｔ以上、２ｎｔ以上、３ｎｔ以上、４ｎｔ以上、５ｎｔ以上、６ｎｔ以上、７ｎｔ以上、８ｎｔ以上、９ｎｔ以上、１０ｎｔ以上、１１ｎｔ以上、１２ｎｔ以上、１３ｎｔ以上、１４ｎｔ以上、１５ｎｔ以上、１６ｎｔ以上、１７ｎｔ以上、１８ｎｔ以上、１９ｎｔ以上、２０ｎｔ以上、２１ｎｔ以上、２２ｎｔ以上、２３ｎｔ以上、２４ｎｔ以上、２５ｎｔから適宜選択することができる。好ましくは３ｎｔ以上である。これらの数値は適宜組み合わせて一定の範囲を構成してもよい。例えば、所定ヌクレオチドの数の範囲として１ｎｔから２５ｎｔ、好ましくは３ｎｔから２５ｎｔを挙げることができる。
【００４０】
また、別の態様として、ＵＩＤのヌクレオチド数Ｘｎｔを１００％としたときに、ＵＩＤにおける所定ヌクレオチドが占める割合は、６％以上、約６．６（１／１５）％以上、約７．１（１／１４）％以上、約１３．７（２／１５）％以上、約１７．６（３／１７）％以上、約２２．２（４／１８）％以上、約２６．３（５／１９）％以上、３０（６／２０）％以上、約３３．３（７／２１）％以上、約３６．４（８／２２）％以上、約３９．１（９／２３）％以上、約４１．７（１０／２４）％以上、４４（１１／２５）％以上、約４６．２（１２／２６）％以上、約４６．２（１３／２７）％以上、５０（１４／２８）％から適宜選択することができる。これらの数値は適宜組み合わせて一定の範囲を構成してもよい。例えば、所定ヌクレオチドの割合の範囲として６％から９０％、好ましくは６％から５０％、より好ましくは約１７．６（３／１７）％から５０％を挙げることができる。
【００４１】
ＵＩＤが所定ヌクレオチドを２ｎｔ以上含む場合、所定ヌクレオチドはＵＩＤに連続して存在していても不連続で存在していてもよい。
【００４２】
所定ヌクレオチドは、Ｔ又はＵ、Ａ、Ｇ、及びＣから選択されるヌクレオチドであれば制限されない。好ましくはＴ、Ａ、及びＣから選択されるヌクレオチドであり、より好ましくは、Ｔ、及びＡから選択されるヌクレオチドである。ＴとＡとの結合は、ＧとＣとの結合よりも弱いため、非特異結合抑制の観点から好ましい。
【００４３】
ＵＩＤが複数の所定ヌクレオチドを含む場合、好ましい実施形態では、所定ヌクレオチドＡと所定ヌクレオチドＴとは混在しない。別の好ましい実施形態では、所定ヌクレオチドＧと所定ヌクレオチドＣとは混在しない。より好ましい実施形態では、ＵＩＤにおける所定ヌクレオチドが全てＡである。別のより好ましい実施形態では、ＵＩＤにおける所定ヌクレオチドが全てＴである。別のより好ましい実施形態では、ＵＩＤにおける所定ヌクレオチドが全てＣである。別のより好ましい実施形態では、ＵＩＤにおける所定ヌクレオチドが全てＧである。この構成により、プライマー同士の結合をさらに抑制することができる。
【００４４】
図３（Ｂ）、図３（Ｃ）、図３（Ｆ）、図３（Ｇ）に示されるフォワードプライマーは、第１のスペーサー部位（ｓｐ１）又は第２のスペーサー部位（ｓｐ２）を含む。スペーサー部位はＴ、Ｕ、Ａ、Ｃ及びＧから選択される１以上のヌクレオチドを含みうる。好ましくは、スペーサー部位は、２ｎｔ、３ｎｔ、４ｎｔ、又は５ｎｔであり得る。スペーサー部位に含まれるヌクレオチドが２ｎｔ以上の場合、各ヌクレオチドは同じであっても異なっていてもよい。ｓｐ１とｓｐ２は、ＵＩＤの５’端と３’端にそれぞれ連続していても良い。
【００４５】
図４にＵＩＤの配列の例を示す。図４において「Ｎ」はランダムヌクレオチドを示す。図４では、所定ヌクレオチド「Ｘ」が「Ａ」である場合を例としている。「ＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ（配列番号７）」はｕ−ＰＳ１を示し、「ＴＣＴＴＡＡＡＡＧＧＴＣＴＴＴＧＡＴＴＴＧＣＧ（配列番号８）」はｔ−ＰＳ１を示す。配列番号１で示されるタグ化プライマーは、１４ｎｔからなるランダム配列の真ん中に７ｎｔの所定ヌクレオチドを含む例である。配列番号２で示されるタグ化プライマーは、１４ｎｔからなるランダム配列の真ん中に５ｎｔの所定ヌクレオチドを含む例である。配列番号３で示されるタグ化プライマーは、１４ｎｔからなるランダム配列の真ん中に３ｎｔの所定ヌクレオチドを含む例である。配列番号４で示されるタグ化プライマーは、１４ｎｔからなるランダム配列の後ろ側の７ｎｔにおいて、ランダムヌクレオチド７ｎｔと所定ヌクレオチド７ｎｔが交互に存在する例である。配列番号５で示されるタグ化プライマーは、１４ｎｔのランダムヌクレオチドの２ｎｔ、又は３ｎｔ置きに所定ヌクレオチド１ｎｔが存在する例である。配列番号６で示されるタグ化プライマーは、配列番号５で示されるタグ化プライマーにおいて、ＵＩＤとｔ−ＰＳ１の間にｓｐ１（ここでは下線を引いたＧＧＧで例示される）が存在する例である。
【００４６】
図３（Ｄ）に示すリバースプライマーは、第２の標的特異的プライマー部位（ｔ−ＰＳ２）を含む。リバースプライマーは、ｔ−ＰＳ２の５’側に第２のユニバーサルプライマー部位（ｕ−ＰＳ２）等を含んでいてもよい。リバースプライマーは、５’側から順に、ｕ−ＰＳ２及びｔ−ＰＳ２を含む例である。ｔ−ＰＳ２は、標的配列の３’側の配列の一部に相補的な配列を有する。
【００４７】
ユニバーサルプライマー部位は、シーケンシングに使用するユニバーサルプライマーと同じ配列を含む部位であり得る。ここで、「ユニバーサルプライマー」は、ＵＩＤの配列及び標的核酸の配列にかかわらず、アンプリコンを増幅することのできるプライマーである。ユニバーサルプライマー部位の配列としては、公知の配列を用いることができ、例えば、Ｍ１３ファージ由来の配列、Ｉｌｌｕｍｉｎａ，  Ｉｎｃ．から提供されているｉＸ配列及びｉＹ配列を挙げることができる。ＵＩＤは、各アンプリコンを識別するための配列を含む部位であり、好適には標的領域やユニバーサルプライマー部位には存在しない配列である。
【００４８】
ユニバーサルプライマー部位配列の長さは、特に制限されないが、５〜２５ｎｔ程度である。
【００４９】
標的特異的プライマー部位配列の長さは、鋳型核酸とアニーリングできる限り制限されない。例えば、５〜５０ｎｔ、好ましくは１０〜３０ｎｔ程度である。標的特異的プライマー部位配列の長さについては、「ｍ」で表す場合がある。ｍは正の整数である。標的特異的プライマー部位配列は、標的核酸にハイブリダイズし、プライマーとして機能する限り、標的配列に完全に相補的である必要はない。例えば、１ｎｔ、２ｎｔ、又は３ｎｔ程度、標的配列と相補的でなくともよい。
【００５０】
図５は、標的核酸とＵＩＤを含むフォワードプライマー及びリバースプライマーとのアニーリングの例を示す図である。図５（Ａ）は、ＴＮにフォワードプライマーとして機能するＵＩＤを含むプライマーがハイブリダイズする例である。図５（Ｂ）は、ＴＮにリバースプライマーがハイブリダイズする例である。アニーリングした後は、公知の方法にしたがって、ＤＮＡポリメラーゼを使って伸長反応を行うことができる。
【００５１】
伸長反応によって生成されるタグ化標的核酸の構造の一例を図６に示す。図６（Ａ）は、図３（Ａ）に示すフォワードプライマーと図３（ｄ）に示すリバースプライマーによって生成されたＵＩＤを付加された標的核酸の例である。図６（Ｂ）は、図３（Ｅ）に示すフォワードプライマーと図３（Ｈ）に示すリバースプライマーによって生成されたＵＩＤを付加されたタグ化標的核酸の例である。ＵＩＤを付加された標的核酸又はタグ化標的核酸を、例えばＰＣＲ法で増幅することにより、アンプリコンのプールを調製する。アンプリコンは、相補鎖と結合した二本鎖状態であることが一般的である。
【００５２】
この例では、アンプリコンは図６（Ａ）、及び図６（Ｂ）に示される下側のストランドである。アンプリコンは、３’側からｃ−ｕ−ＰＳ１、ＵＩＤ、ＴＮ及びｕ−ＰＳ２を含む。ｃ−ｔ−ＰＳ１及びｔ−ＰＳ２はＴＮ内に位置する。アンプリコン相補鎖は、５’側からｕ−ＰＳ１、ＵＩＤ、ＴＮ、およびｃ−ｕ−ＰＳ２を含む。ｔ−ＰＳ１及びｃ−ｔ−ＰＳ２はＴＮ内に位置する。
【００５３】
タグ化プライマー及びリバースプライマーの別の例を図７（Ａ）、及び図７（Ｂ）に示す。図７（Ａ）に示すタグ化プライマーは、５’末端側に第１のアダプター部位（ＡＳ１）を含む。アンプリコンを固相に固定するために用いられ得る。図７（Ｂ）に示すリバースプライマーは、５’側に第２のアダプター部位（ＡＳ２）を含む。これらのアダプター部位は、固相（フローセル、ビーズなど）上でアンプリコンのシーケンシングを行う場合に、用いられる。例えば、固相上にアダプター部位に相補的な配列を予め固定することができる。アダプター部位を含むプライマーを用いて調製されたアンプリコンはその両端にアダプター部位を有するため、固相上にアンプリコンを固定することができる。アダプター部位を含むプライマーを用いたアンプリコン合成は、アダプター部位が末端に付加されていることを除き、図２から図６と同様である。
【００５４】
伸長反応によって生成されるタグ化標的核酸の構造の一例を図７（ｃ）に示す。図７（ｃ）は、図７（Ａ）に示すフォワードプライマーと図７（Ｂ）に示すリバースプライマーによって生成されたＵＩＤを付加された標的核酸の例である。タグ化標的核酸を、例えばＰＣＲ法で増幅することにより、アンプリコンのプールを調製する。アンプリコンは、相補鎖と結合した二本鎖状態であることが一般的である。
【００５５】
この例では、アンプリコンは図７（Ｃ）に示される下側のストランドである。アンプリコンは、３’側からｃ−ＡＳ１、ｃ−ｕ−ＰＳ１、ＵＩＤ、ＴＮ、ｕ−ＰＳ２及びｃ−ＡＳ２を含む。ｃ−ｔ−ＰＳ１及びｔ−ＰＳ２はＴＮ内に位置する。アンプリコン相補鎖は、５’側からＡＳ１、ｕ−ＰＳ１、ＵＩＤ、ＴＮ、ｃ−ｕ−ＰＳ２及びＡＳ２を含む。ｔ−ＰＳ１及びｃ−ｔ−ＰＳ２はＴＮ内に位置する。
【００５６】
［１−２．工程Ｂ：シーケンシング］
工程Ｂにおいて、アンプリコンをシーケンシングする。このシーケンシングにより標的領域の配列情報（ｒｅａｄ）が取得される。配列情報は、シーケンサーにおいて各ヌクレオチドを示す情報として検出した蛍光シグナル、イオン等をＡ、Ｇ、Ｔ、Ｃそれぞれのヌクレオチド情報に変換し、検出した順番（昇順）に並べた情報である。通常、配列情報は５’側から取得される。シーケンシングには通常シーケンサー（自動配列解析装置）が用いられる。シーケンサーは、アンプリコンから配列情報を取得できる限り制限されず、公知の装置を使用することができる。シーケンサーは、次世代シーケンサーが好ましい。次世代シーケンサーとしては、例えば、イルミナ社（サンディエゴ、ＣＡ）のＭｉＳｅｑ（登録商標）、ＨｉＳｅｑ（登録商標）、ＮｅｘｔＳｅｑ（登録商標）、ＭｉｎｉＳｅｑ（登録商標）、ＮｏｖａＳｅｑ（登録商標）；サーモ・フィッシャー社（ウォルサム、ＭＡ）のＩｏｎ  Ｐｒｏｔｏｎ（登録商標）、Ｉｏｎ  ＰＧＭ（登録商標）；ロシュ社（バーゼル、スイス）のＧＳ  ＦＬＸ  ＋（登録商標）、ＧＳ  Ｊｕｎｉｏｒ（登録商標）等が挙げられる。
【００５７】
例えば、イルミナ社のシーケンサーは、Ｂｒｉｄｇｅ  ＰＣＲ法とＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓという手法との組み合わせにより、フローセル上で膨大な数の標的領域のポリヌクレオチドを増幅させ、その増幅産物のシーケンシングを行うことができる。
【００５８】
シーケンシングプライマーとしてｃ−ｕ−ＰＳ１に結合するユニバーサルプライマーが用いられ得る。これによると、ＵＩＤ及びＴＲを含む配列の情報を取得することができる。また、ｃ−ｕ−ＰＳ２に結合するユニバーサルプライマーを用いてｃ−ＴＲ及びＵＩＤの相補配列を含む配列の情報を取得することもできる。
【００５９】
［１−３．工程Ｃ：標的領域の配列の決定］
上記工程Ｂにおいて取得された配列情報を用いて標的領域の真の配列を決定する工程Ｃをさらに行ってもよい。
【００６０】
ＰＣＲやシーケンシングなどのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける操作で生じる塩基配列の変化（エラー）は、一般的にＰＣＲエラーやシーケンシングエラーと呼ばれ、鋳型となった標的核酸の配列には存在しない配列である。
【００６１】
本工程では、上記工程Ｂにおいて取得された配列情報が、標的核酸の配列を反映しているか、すなわち標的領域の配列が真の配列であるか否かを決定する。
【００６２】
標的領域の配列が真の配列であるか否かは、例えば、ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．  ２０１５−０３６１４９２  Ａ１の技術により判別することができる。
【００６３】
具体的には、配列情報に含まれるＵＩＤ配列により、上記１−１．で述べたように、各アンプリコンの由来を識別することができる。図８に例示するように、上述のＵＩＤをランダム配列として使用する場合には、ＤＮＡ試料中に存在する複数コピーの標的核酸（この例では標的核酸に含まれる標的領域の種類は１つである。）の標的領域から標的核酸ごとに異なったＵＩＤ配列と所定ヌクレオチドを含むインデックス配列が付加された娘分子が調製される（図８：Ｓｔｅｐ  Ａ１）。次に、ＵＩＤ配列が付加された娘分子をユニバーサルプライマーを使ってＰＣＲで増幅することによって、アンプリコンのプールを調製する（図８：Ｓｔｅｐ  Ａ２）。このようにして調製されたアンプリコンのプールには、ＵＩＤ配列が付加された娘分子それぞれを鋳型として増幅されたアンプリコンが含まれる。図８に示される工程Ａは、上記１−１．で述べた工程Ａに対応する。
【００６４】
次に、各アンプリコンのシーケンシングを行う。図８に示される工程Ｂは、上記１−２．で述べた工程Ｂに対応する。
【００６５】
次に図８の工程Ｃにおいて、標的領域の真の配列を決定する。具体的には図８の工程Ｃ１において同じＵＩＤ配列を有する配列情報を決定する。ＵＩＤ配列が付加された1つの１分子から増幅されたすべての娘分子の配列情報は、全て同じＵＩＤ配列を有する。同じＵＩＤ配列を有するアンプリコンのグループを「ファミリー」と称し、同じＵＩＤ配列を有する個々のアンプリコンを「メンバー」と称する。同じＵＩＤ配列を有するか否かは、配列情報の５’末端側のあらかじめ決められた長さの配列情報を比較することにより行うことができる。
【００６６】
次に、図８の工程Ｃ２において、ファミリーの配列情報を用いて標的領域の配列が真の配列であるか否かの判定を行う。
【００６７】
図８の工程Ｃ２では、はじめにこの同一ファミリー内で配列情報の比較（アラインメント）を行う。このアラインメントによって、配列情報内の各ポジションにおいて所定値以上のコンセンサス率を示すヌクレオチドを標的領域のヌクレオチドと判定する。この判定を配列情報の全ポジションで行い、標的領域の全配列のａｃｃｕｒａｔｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅを決定する。これにより、ＰＣＲエラー、シーケンシングエラー等が排除される。一般的に、ＰＣＲエラー、シーケンシングエラー等はファミリー内で０〜数％であり、ファミリー内でマジョリティとなりにくいためである。
【００６８】
所定値は、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％でありうる。好ましくは８０％、又は９０％である。
【００６９】
［１−４．変異検出方法］
標的核酸配列の決定方法は、上記の工程Ａ〜Ｃに加えて、変異検出工程Ｄを含んでいてもよい。本明細書において、「変異」とは、生体内において野生型配列の特定の塩基が、別の塩基に置き換わること、欠失すること、または挿入することを意味する。
【００７０】
工程Ｄにおいては、参照配列と、工程Ｃで解析された各ファミリーの配列情報とが比較される。参照配列は、標的領域の野生型の配列が用いられ得る。一部のファミリーの配列に参照配列と異なるヌクレオチドが存在する場合、この配列はサンプル中の変異型ＤＮＡに由来すると判断され得る。この場合、サンプルＤＮＡは変異を含むと判定することができる。参照配列と異なるヌクレオチドが存在しない場合、サンプルＤＮＡは変異を含まないと判定することができる。
【００７１】
参照配列としては、公開配列情報データベースに登録されている配列を用いることができる。公開配列情報データベースとしては、ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ（ウェブページ、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｒｅｆｓｅｑ／）、ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋ（ウェブページ、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｂａｎｋ／）、ＵＣＳＣ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒなどを使用することができる。また、参照配列として、公開されている既知の変異情報データベースに登録されている配列を用いてもよい。公開既知変異情報データベースとしては、ＣＯＳＭＩＣデータベース（ウェブページ、ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｇｅｎｅｔｉｃｓ／ＣＧＰ／ｃｏｓｍｉｃ／）、ＣｌｉｎＶａｒデータベース（ウェブページ、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｌｉｎｖａｒ／）、ｄｂＳＮＰ（ウェブページ、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＳＮＰ／）、ＨａｐＭａｐ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒ  ｒｅｌｅａｓｅ  ＃２８、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｖａｒｉａｔｉｏｎ  Ｂｒｏｗｓｅｒ（ウェブページ、ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｍｅｄ．ｋｙｏｔｏ−ｕ．ａｃ．ｊｐ／ＳｎｐＤＢ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）及び１０００  Ｇｅｎｏｍｅｓ（ウェブページ、ｗｗｗ．１０００ｇｅｎｏｍｅｓ．ｏｒｇ／）が挙げられる。
【００７２】
さらに、配列解析の結果を出力してもよい。出力方法は特に限定されず、例えば、解析結果をシーケンシング装置のモニタに表示してもよいし、他の端末へ送信してもよいし、紙にプリントアウトしてもよい。変異の検出結果を出力する場合は、変異の有無を出力してもよい。変異がある場合は、その変異についての解析結果の説明（変異の種類、変異の箇所など）を付してもよい。
【００７３】
別の実施形態では、上記の工程ＡおよびＢに加えて、工程Ｃ’およびＤ’を含む。工程Ｃ’は、工程Ｃ１および工程Ｃ２’を含む。工程Ｃ１は上記１−３で述べたとおりである。工程Ｃ２’においては、工程Ｂで得られたアンプリコンの各配列情報を参照配列と比較する。ファミリー内の各メンバーの配列情報と参照配列とのヌクレオチドの相違が決定される。ファミリー内で所定値よりも低い相違はＰＣＲやシーケンシングの際のエラーと判断し、所定値よりも高い相違は変異であると判断される。たとえば、あるファミリー内において、メンバーの９９％が１５Ｇ＞Ｃ、メンバーの１％が２６Ｃ＞Ｔ、メンバーの０．５％が３６Ｃ＞Ｇを有する場合、１５Ｇ＞Ｃは真の変異であり、２６Ｃ＞Ｔおよび３６Ｃ＞Ｇはエラーであると判定される。このファミリーは、１５Ｇ＞Ｃの変異を有するポリヌクレオチド分子から生成されたと判断される。この処理を全てのファミリーで行い、ファミリーごとに、変異型か野生型かが決定される。
【００７４】
工程Ｄ’ではファミリーの総数のうち、変異型のファミリーの割合が算出される。この割合を所定の閾値と比較し、閾値以上の場合は標的核酸が変異型であると判定され、閾値未満の場合は標的核酸が野生型であると判定される。たとえば、変異型ファミリーが７００００ファミリー検出され、野生型ファミリーが３００００ファミリー検出され、所定の閾値が３０％である場合、標的核酸が変異型であると判定される。
【００７５】
［２．プライマー、プライマーセット及びその使用］
本発明は、プライマー、プライマーセット及びこれらの使用を含む。一実施形態におけるプライマーは、上記１．で述べたタグ化プライマーであり、上記１．の説明は、ここに援用される。プライマーセットは、上記１．で述べたフォワードプライマー及びリバースプライマーを含み、上記１．の説明は、ここに援用される。これらの使用は、上記のプライマー又はプライマーセットの、標的核酸配列の決定方法のための使用であって、上記１．の説明は、ここに援用される。
【００７６】
［３．標的核酸配列解析装置］
［３−１．標的核酸配列解析装置］
［３−１−１．ハードウェアの構成］
標的核酸配列解析装置１０は、少なくとも処理部１０１と記憶部を備える。記憶部は、主記憶部１０２及び／又は補助記憶部１０４から構成される。標的核酸配列解析装置１０は、特許請求の範囲又は上記１に記載の方法を実現するための装置であってもよい。標的核酸配列解析装置１０及び標的核酸配列解析装置１０の動作に係る説明において、上記１で説明されている用語と共通する用語については、上記１の説明をここに援用する。
処理部１０１は、標的領域の配列を決定する。
【００７７】
図９及び図１０に、標的核酸配列解析装置１０の構成を示す。標的核酸配列解析装置１０は、入力部１１１と、出力部１１２と、記憶媒体１１３とに接続されていてもよい。また、標的核酸配列解析装置１０は、シーケンシングを行うシーケンシング装置３０と接続されていてもよい。標的核酸配列解析装置１０は、シーケンシング装置３０と直接又はネットワーク等を介して接続された、標的核酸配列決定システム５０を構成することもある（図９（ａ））。また、標的核酸配列解析装置１０とシーケンシング装置３０は、図９（ｂ）に示すように一体型であってもよい。
【００７８】
図１０に示すように、標的核酸配列解析装置１０において、処理部１０１と、主記憶部１０２と、ＲＯＭ（ｒｅａｄ  ｏｎｌｙ  ｍｅｍｏｒｙ）１０３と、補助記憶部１０４と、通信インタフェース（Ｉ／Ｆ）１０５と、入力インタフェース（Ｉ／Ｆ）１０６と、出力インタフェース（Ｉ／Ｆ）１０７と、メディアインターフェース（Ｉ／Ｆ）１０８は、バス１０９によって互いにデータ通信可能に接続されている。
【００７９】
処理部１０１は、ＣＰＵ、ＭＰＵ又はＧＰＵ等から構成される。処理部１０１が、補助記憶部１０４又はＲＯＭ１０３に記憶されているコンピュータプログラムを実行し、取得されるデータの処理を行うことにより、標的核酸配列解析装置１０が機能する。
【００８０】
ＲＯＭ１０３は、マスクＲＯＭ、ＰＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭなどによって構成され、処理部１０１により実行されるコンピュータプログラム及びこれに用いるデータが記録されている。ＲＯＭ１０３は、標的核酸配列解析装置１０の起動時に、処理部１０１によって実行されるブートプログラムや標的核酸配列解析装置１０のハードウェアの動作に関連するプログラムや設定を記憶する。
【００８１】
主記憶部１０２は、ＳＲＡＭ又はＤＲＡＭなどのＲＡＭ（Ｒａｎｄｏｍ  ａｃｃｅｓｓ  ｍｅｍｏｒｙ）によって構成される。主記憶部１０２は、ＲＯＭ１０３及び補助記憶部１０４に記録されているコンピュータプログラムの読み出しに用いられる。また、主記憶部１０２は、処理部１０１がこれらのコンピュータプログラムを実行するときの作業領域として利用される。
【００８２】
補助記憶部１０４は、ハードディスク、フラッシュメモリ等の半導体メモリ素子、光ディスク等によって構成される。補助記憶部１０４には、オペレーティングシステム及びアプリケーションプログラムなどの、処理部１０１に実行させるための種々のコンピュータプログラム及びコンピュータプログラムの実行に用いる各種設定データが記憶されている。補助記憶部１０４は、タグ化プライマー及びタグ化プライマーを構成する各部位の配列、タグ化プライマー及びタグ化プライマーを構成する各部位の配列の長さ、コンセンサス率の所定値等を記憶する。補助記憶部１０４は、シーケンシング装置３０から取得された配列情報を記憶してもよい。補助記憶部１０４は、ネットワークを介して取得された参照配列等を記憶してもよい。
【００８３】
通信Ｉ／Ｆ１０５は、ＵＳＢ、ＩＥＥＥ１３９４、ＲＳ−２３２Ｃなどのシリアルインタフェース、ＳＣＳＩ、ＩＤＥ、ＩＥＥＥ１２８４などのパラレルインタフェース、およびＤ／Ａ変換器、Ａ／Ｄ変換器などからなるアナログインタフェース、ネットワークインタフェースコントローラ（Ｎｅｔｗｏｒｋ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ：ＮＩＣ）等から構成される。通信Ｉ／Ｆ１０５は、処理部１０１の制御下で、シーケンシング装置３０又は他の外部機器からのデータを受信し、必要に応じて標的核酸配列解析装置１０が保存又は生成する情報を、シーケンシング装置３０又は外部に送信又は表示する。通信Ｉ／Ｆ１０５は、ネットワークを介してシーケンシング装置３０又は他の外部機器（図示せず、例えば他のコンピュータ、又はクラウドシステム）と通信を行ってもよい。
【００８４】
入力Ｉ／Ｆ１０６は、例えばＵＳＢ、ＩＥＥＥ１３９４、ＲＳ−２３２Ｃなどのシリアルインタフェース、ＳＣＳＩ、ＩＤＥ、ＩＥＥＥ１２８４などのパラレルインタフェース、およびＤ／Ａ変換器、Ａ／Ｄ変換器などからなるアナログインタフェースなどから構成される。入力Ｉ／Ｆ１０６は、入力部１１１から文字入力、クリック、音声入力等を受け付ける。受け付けた入力内容は、主記憶部１０２又は補助記憶部１０４に記憶される。
【００８５】
入力部１１１は、タッチパネル、キーボード、マウス、ペンタブレット、マイク等から構成され、標的核酸配列解析装置１０に文字入力又は音声入力を行う。入力部１１１は、標的核酸配列解析装置１０の外部から接続されても、標的核酸配列解析装置１０と一体となっていてもよい。
【００８６】
出力Ｉ／Ｆ１０７は、例えば入力Ｉ／Ｆ１０６と同様のインタフェースから構成される。出力Ｉ／Ｆ１０７は、処理部１０１が生成した情報を出力部１１２に出力する。出力Ｉ／Ｆ１０７は、処理部１０１が生成し、補助記憶部１０４に記憶した情報を、出力部１１２に出力する。
【００８７】
出力部１１２は、例えばディスプレイ、プリンタ等で構成され、シーケンシング装置３０から送信される測定結果及び標的核酸配列解析装置１０における各種操作ウインドウ、解析結果等を表示する。
【００８８】
メディアＩ／Ｆ１０８は、記憶媒体１１３に記憶された例えばアプリケーションソフト等を読み出す。読み出されたアプリケーションソフト等は、主記憶部１０２又は補助記憶部１０４に記憶される。また、メディアＩ／Ｆ１０８は、処理部１０１が生成した情報を記憶媒体１１３に書き込む。メディアＩ／Ｆ１０８は、処理部１０１が生成し、補助記憶部１０４に記憶した情報を、記憶媒体１１３に書き込む。
【００８９】
記憶媒体１１３は、フレキシブルディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、又はＤＶＤ−ＲＯＭ等で構成される。記憶媒体１１３は、フレキシブルディスクドライブ、ＣＤ−ＲＯＭドライブ、又はＤＶＤ−ＲＯＭドライブ等によってメディアＩ／Ｆ１０８と接続される。記憶媒体１１３には、コンピュータがオペレーションを実行するためのアプリケーションプログラム等が格納されていてもよい。
【００９０】
処理部１０１は、標的核酸配列解析装置１０の制御に必要なアプリケーションソフトや各種設定をＲＯＭ１０３又は補助記憶部１０４からの読み出しに代えて、ネットワークを介して取得してもよい。前記アプリケーションプログラムがネットワーク上のサーバコンピュータの補助記憶部内に格納されており、このサーバコンピュータに標的核酸配列解析装置１０がアクセスして、コンピュータプログラムをダウンロードし、これをＲＯＭ１０３又は補助記憶部１０４に記憶することも可能である。
【００９１】
また、ＲＯＭ１０３又は補助記憶部１０４には、例えば米国マイクロソフト社が製造販売するＷｉｎｄｏｗｓ（登録商標）などのグラフィカルユーザインタフェース環境を提供するオペレーションシステムがインストールされている。後述するコンピュータプログラムは、前記オペレーティングシステム上で動作するものとする。すなわち、標的核酸配列解析装置１０は、パーソナルコンピュータ等の汎用コンピュータであってもよい。
【００９２】
［３−１−２．シーケンシング装置の構成］
シーケンシング装置３０は、ヌクレオチド配列を解析できる限り制限されない。図１０に示すように、シーケンシング装置３０は、シーケンシング部３２の他、さらにアンプリコン調製部３１を備えていてもよい。シーケンシング装置３０は、次世代シーケンサーが好ましい。次世代シーケンサーとしては、上記１−２−２で述べた装置を例示することができる。
【００９３】
［３−１−３．標的核酸配列解析装置の動作］
図１１を用いて、標的核酸配列解析装置１０の動作の一例について説明する。以下の動作は、後述するコンピュータプログラムにしたがって処理部１０１が処理する。
【００９４】
処理部１０１は、例えばユーザが入力部１１１から入力した処理開始の指令にしたがって、シーケンシング装置３０において取得した配列情報を取得する（ステップＳ２０）。この時処理部１０１は、例えばユーザによる入力部１１１からの入力により、又はシーケンシング装置３０から配列情報を読み込む際に、サンプルを取得した被検者を識別するための識別番号（被検者ＩＤ）、サンプルの種別（血液、組織、ホルマリン固定・パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織）を識別するためのサンプル識別ＩＤ、標的核酸を識別するための識別番号（標的核酸識別ＩＤ）、標的領域を識別するための識別番号（標的領域識別ＩＤ）等を取得する。取得された配列情報及び識別ＩＤ等は、主記憶部１０２及び／又は補助記憶部１０４に記憶される。
【００９５】
処理部１０１は、図１１に示すステップＳ２０の前に、アンプリコン調製部３１に、図１２に示す、標的核酸からアンプリコンを調製させる処理（ステップＳ３０）を実行させてもよい。さらに、処理部１０１は、シーケンシング部３２にステップＳ３０で増幅された各アンプリコンをシーケンシングさせるための処理（ステップＳ３１）を、実行させてもよい。この場合、標的核酸は、ユーザによってシーケンシング装置３０にセットされる。また、ユーザによって入力部１１１から入力される処理開始の指令にしたがって、処理部は、ステップＳ３０を開始する。ステップＳ３１は、ユーザの処理開始の指令にしたがって開始してもよく、ステップＳ３０の終了に引き続き開始されてもよい。
【００９６】
次に、処理部１０１は、シーケンシングにより取得した配列情報を標的核酸配列解析装置１０に出力する（ステップＳ３２）。
【００９７】
上記１−３．で使用している用語と同じ用語については、その説明を本項の説明に援用する。
【００９８】
［３−２．その他の処理］
さらに処理部１０１は、図１１のステップＳ２１において図１３に示す標的領域の真の配列を決定する処理を行ってもよい。また、処理部１０１は、図１１のステップＳ２２において、図１４に示す標的配列に変異があるか否かの決定処理を行ってもよい。
【００９９】
図１３を用いて、標的領域の真の配列を決定する処理の例を具体的に説明する。処理部１０１は、図１１のステップＳ２１において標的領域の真の配列を決定する処理を行う。この処理において、処理部１０１は、はじめに同一ＵＩＤ配列を有するファミリー内の各メンバーについて配列情報の各ポジションのヌクレオチドを他のメンバーの同一ポジションにアラインメントする（ステップＳ６１１）。
【０１００】
次に、処理部１０１は、そのポジションのコンセンサス率を算出する（ステップＳ６１２）。
【０１０１】
処理部１０１は、ステップＳ６１２で算出されたコンセンサス率を、補助記憶部１０４に記憶されたコンセンサス率の所定値と比較し、コンセンサス率が所定値以上のヌクレオチドを標的領域のヌクレオチドと決定する（ステップＳ６１３）。
【０１０２】
処理部１０１は、標的領域内の全てのポジションについてヌクレオチドを決定したかを判定し、標的領域内の全てのポジションについてヌクレオチドを決定していない場合には、ステップＳ６１１に戻り、標的領域内の全てのポジションについてヌクレオチドを決定するまで、ステップＳ６１１〜ステップＳ６１４を繰り返す。
【０１０３】
標的領域内の全てのポジションについてヌクレオチドが決定された時は、ステップＳ６１５に進み、標的領域のａｃｃｕｒａｔｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅを補助記憶部１０４等に記憶する。
【０１０４】
また、処理部１０１は、標的領域のａｃｃｕｒａｔｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅを出力部１１２に出力してもよい。
【０１０５】
図１４を用いて、標的領域の真の配列の中に変異があるか否かを判定する処理の例を具体的に説明する。処理部１０１は、図１１のステップＳ２１において決定された標的領域の真の配列の配列情報をその配列情報に対応する参照配列にマッピングする（ステップＳ６１）。参照配列は、上記１−４．で述べた通りである。参照配列は、補助記憶部１０４に記憶されていてもよいが、ネットワークを介して配列の決定時に取得してもよい。また、マッピングは、配列情報をネットワークを介して参照配列が記憶されているサーバ等に送って行ってもよい。
【０１０６】
処理部１０１は、マッピングを行うことにより前記配列情報を参照配列（変異情報データベースに登録されている変異配列を含む）と比較する。
【０１０７】
処理部１０１は、前記配列情報に変異配列が有るか否かを判定する（ステップＳ６２）。
【０１０８】
処理部１０１は、前記配列情報に変異配列がない場合には、標的領域は変異を有さないと判定する（ステップＳ６３）。また、変異配列が真の変異でない場合（ＮＯ）には、標的領域に変異がないと判定する（ステップＳ６４）。
【０１０９】
処理部１０１は、これらの標的領域の配列の決定結果を、補助記憶部１０４に記憶してもよく、出力部１１２に出力してもよい（ステップＳ６５）。出力先は、上記１−４．に記載した通り、シーケンシング装置のモニタ、他の端末、プリンタ等でありうる。
【０１１０】
［４．コンピュータプログラム］
コンピュータプログラムは、上記１に記載の標的核酸の配列決定方法を、標的核酸配列解析装置１０、標的核酸配列決定システム５０を制御するためのプログラムである。
【０１１１】
コンピュータプログラムは、上記３−１−２．及び３−３．で述べた、ステップＳ２０〜ステップＳ２１；ステップＳ３０、ステップＳ３１、ステップＳ２０〜ステップＳ２１；ステップＳ２０〜ステップＳ２２、ならびにステップＳ６０〜ステップＳ６５及びステップＳ６１１〜ステップＳ６１５；ステップＳ３０、ステップＳ３１、ステップＳ２０〜ステップＳ２２、ならびにステップＳ６０〜ステップＳ６５及びステップＳ６１１〜ステップＳ６１５を処理部１０１に実行させることにより標的核酸配列解析装置１０、標的核酸配列決定システム５０を制御する。
【０１１２】
コンピュータプログラムは、記憶媒体記憶されていてもよい。すなわち、前記コンピュータプログラムは、ハードディスク、フラッシュメモリ等の半導体メモリ素子、光ディスク等の記憶媒体に記憶される。また前記コンピュータプログラムは、クラウドサーバ等のネットワークで接続可能な記憶媒体に記憶されていてもよい。コンピュータプログラムは、ダウンロード形式の、又は記憶媒体に記憶されたプログラム製品であってもよい。
【０１１３】
前記記憶媒体へのプログラムの記憶形式は、前記提示装置が前記プログラムを読み取り可能である限り制限されない。前記記憶媒体への記憶は、不揮発性であることが好ましい。
【０１１４】
［５．実施例］
今回の解析に用いたフォワードプライマー（タグ化プライマー）の配列とリバースプライマーの配列を表１に示す。splitUID1からsplitUID9はＵＩＤに所定ヌクレオチドが挿入されている。表1のフォワードプライマーにおいて、５‘側に位置するCCTACACGACGCTCTTCCGATCT（配列番号７）はユニバーサルプライマーの結合する領域であり、シーケンシングプライマーの結合領域としても機能する。３’側に位置するTCTTAAAAGGTCTTTGATTTGCG（配列番号８）は標的核酸であるSMAD4遺伝子にハイブリダイズする領域である。表1のリバースプライマーにおいて、５’側に位置するTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT（配列番号９）はユニバーサルプライマーの結合する領域である。３’側に位置するTGCAGTAGCCGCCTGC（配列番号１０）は標的核酸であるSMAD4遺伝子にハイブリダイズする領域である。
【０１１５】
配列解析はイルミナ社の次世代シーケンサーMiSeq（登録商標）を用いて、SMAD4遺伝子について行った。
【０１１６】
【表１】
2020195378.tif 000003
【０１１７】
図15にUIDの配列が異なるタグ化プライマーを使用しNGSで解析した場合のアーチファクトリードの割合を示す。ここで、アーチファクトリードとは、標的領域の配列と異なる配列を含むリードであり、PCRにより非特異的に生成した副産物に由来すると考えられる。フォワードプライマーとして、normal UID配列をUIDとするプライマー、splitUID1配列をＵＩＤとするプライマー、又はsplitUID2配列をUIDとするプライマーを使用し、リバースプライマーとの間でUID-PCRを行った。このアンプリコンを鋳型としてユニバーサルプライマーを用いてWBC-PCRを行い増幅産物を得た。得られた増幅産物をDNA精製試薬 AMPure XPで一度だけ精製しNGSに供した。normal UIDを使用した場合、アーチファクトリードは70％近く含まれていた。一方所定ヌクレオチドをUIDに挿入したsplitUID1では、アーチファクトリードは１％以下であり、splitUID2ではアーチファクトリードは検出されなかった。
【０１１８】
図16に、表１に示す各タグ化プライマーとリバースプライマーを用いてUID-PCRを行い、そのアンプリコンに対してユニバーサルプライマーを用いてWBC-PCRを行うことによって得られたPCR産物を電気泳動した結果を示す。WtPISeqは鋳型DNAを加えて増幅したレーンを示し、NegKoは鋳型DNAを加えずに増幅したレーンを示す。NegKo で検出されるバンドはアーチファクトバンドとなる。iPSS0301(normal UID)は四角枠で示す部分に非特異的な増幅産物を示す強いバンドが検出された。一方、iPSS0802 (splitUID1)、iPSS0808 (splitUID2)、 iPSS0946 (splitUID3) 、iPSS0947 (splitUID4)、iPSS0951 (splitUID8)、 iPSS0952 (splitUID9)、 iPSS0956 (splitUID13)、及びiPSS0957 (splitUID14)では、アーチファクトバンドは検出されなかった。iPSS0948(splitUID5)、iPSS0949(splitUID6)、iPSS0950(splitUID7)、iPSS0953(splitUID10)、iPSS0958(splitUID15)ではアーチファクトバンドが検出されたものの、iPSS0301(normal UID)と比較して極めて弱いバンドとなった。
【０１１９】
以上の結果から、UIDにランダムヌクレオチド以外の所定ヌクレオチドを入れることは、非特異的な増幅産物の生成抑制に有用であることが示された。
【０１２０】
比較として、Stahlberg et al., Simple, multiplexed, PCR-based barcoding of DNA enables sensitive mutation detection in liquid biopsies using sequencing, Nucleic Acids Research, Volume 44, Issue 11, 20 June 2016, Page e105は、アーチファクトを生成した特許文献２で述べられたヘアピンバーコードを示す（Fig. 3B参照、 there are some peaks around 130-200 bp 周辺に非特異的な産物と考えられるいくつかのピークが認められる）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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