(57)【要約】      （修正有）【課題】トランスグルタミナーゼの同定および特徴づけのための系および方法、ならびにその基質および使用を提供する。【解決手段】微生物トランスグルタミナーゼを第１の基質および第２の基質に曝露するステップであって、第１の基質が、ペプチド配列ＹＲＹＲＱ（配列番号１）と少なくとも８０％配列同一性を有するアシル供与タグを含み、第２の基質が、ペプチド配列ＲＹＥＳＫ（配列番号２）と少なくとも８０％配列同一性を有するアミン供与タグを含む、ステップ、ならびに第１の基質と第２の基質を架橋するステップであって、それにより、アシル供与タグとアミノ供与タグの間にイソペプチド結合を形成する、ステップを含む、微生物トランスグルタミナーゼの存在下でイソペプチド結合を形成する方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物トランスグルタミナーゼを第１の基質および第２の基質に曝露するステップであって、前記第１の基質が、ペプチド配列ＹＲＹＲＱ（配列番号１）と少なくとも８０％配列同一性を有するアシル供与タグを含み、前記第２の基質が、ペプチド配列ＲＹＥＳＫ（配列番号２）と少なくとも８０％配列同一性を有するアミン供与タグを含む、ステップ、ならびに
前記第１の基質と前記第２の基質を架橋するステップであって、それにより、アシル供与タグとアミノ供与タグの間にイソペプチド結合を形成する、ステップ
を含む、微生物トランスグルタミナーゼの存在下でイソペプチド結合を形成する方法。
【請求項２】
微生物トランスグルタミナーゼがカツネリア・アルビダ微生物トランスグルタミナーゼ（配列番号６）と少なくとも８０％配列同一性を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第１の基質と第２の基質を架橋するステップが、アシル供与タグのγ−カルボキサミド基とアミノ供与タグのε−アミノ基の間にイソペプチド結合を形成する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
第１の基質および第２の基質のうちの少なくとも１つが検出可能な標識を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
検出可能な標識が、ビオチン部分、蛍光色素、ルテニウム標識、放射標識、および化学発光標識から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
アシル供与タグがペプチド配列ＡＰＲＹＲＱＲＡＡ（配列番号２４）を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
第１の基質の第２の基質への架橋が少なくとも約７０％の収率で達成される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記収率が約３０分以内に達成される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
カツネリア・アルビダ微生物トランスグルタミナーゼ（配列番号６）と少なくとも８０％配列同一性を有する、精製された微生物トランスグルタミナーゼを含む、微生物トランスグルタミナーゼの存在下でイソペプチド結合を形成するためのキット。
【請求項１０】
ペプチド配列ＹＲＹＲＱ（配列番号１）と少なくとも８０％配列同一性を有するアシル供与タグを含む第１の基質およびペプチド配列ＲＹＥＳＫ（配列番号２）と少なくとも８０％配列同一性を有するアミン供与タグを含む第２の基質のうちの１つをさらに含む、請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
第１の基質および第２の基質の少なくとも１つが検出可能な標識を含む、請求項１０に記載のキット。
【請求項１２】
検出可能な標識が、ビオチン部分、蛍光色素、ルテニウム標識、放射標識、および化学発光標識から選択される、請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
アシル供与タグがペプチド配列ＡＰＲＹＲＱＲＡＡ（配列番号２４）を有する、請求項１０に記載のキット。
【請求項１４】
第１の基質および第２の基質のうちの他方の１つをさらに含む、請求項１０に記載のキット。
【請求項１５】
カツネリア・アルビダ微生物トランスグルタミナーゼ（配列番号６）と少なくとも８０％配列同一性を有する、単離された微生物トランスグルタミナーゼを含む、イソペプチド結合を形成するための酵素。
【請求項１６】
単離された微生物トランスグルタミナーゼがアンモニウムの存在下で発現し、単離される、請求項１５に記載の酵素。
【請求項１７】
アンモニウムが少なくとも約１０μＭの濃度で存在する、請求項１６に記載の酵素。
【請求項１８】
式Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５を有するアミノ酸配列を含む、トランスグルタミナーゼについてのアシル供与基質であって、Ｘａａが任意のアミノ酸であり、Ｘａａ３、Ｘａａ４、およびＸａａ５のうちの少なくとも１個がグルタミンであり、Ｘａａ４およびＸａａ５のうちの１個がアルギニンであり、前記アミノ酸配列が、グルタミンと連続的に隣接した少なくとも１個のアルギニンを含み、アルギニン、グルタミン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンから選択される、前記アミノ酸配列におけるアミノ酸の総数が少なくとも４個である、アシル供与基質。
【請求項１９】
Ｘａａ５と、Ｘａａ１、Ｘａａ２、およびＸａａ３の少なくとも１個とがアルギニンである、請求項１８に記載のアシル供与基質。
【請求項２０】
式Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５を有するアミノ酸配列を含む、トランスグルタミナーゼについてのアミン供与基質であって、Ｘａａが任意のアミノ酸であり、前記アミノ酸配列が少なくとも１個のリジンを含み、Ｘａａ１およびＸａａ２のうちの１個がチロシンおよびアルギニンから選択され、アルギニン、セリン、チロシン、およびリジンから選択される、前記アミノ酸配列におけるアミノ酸の総数が少なくとも３個である、アミン供与基質。
【請求項２１】
Ｘａａ４およびＸａａ５のうちの１個がリジンである、請求項２０に記載のアミン供与基質。
【請求項２２】
アミノ酸配列が２個以下のアミノ酸リジンを含む、請求項２０に記載のアミン供与基質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
[0001]本出願は、２０１４年１２月１９日に出願され、「トランスグルタミナーゼ基質の同定およびその使用」と題する米国仮特許出願第６２／０９４，４９５号、および２０１５年１１月２５日に出願され、「トランスグルタミナーゼ種の同定および特徴づけのための系および方法」と題する米国仮特許出願第６２／２６０，１６２号に基づき、その利益を主張し、それらは参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
連邦政府支援の研究に関する言明
[0002]適用なし。
【背景技術】
【０００３】
[0003]本開示は、一般的に、トランスグルタミナーゼおよびその基質の同定、より具体的には、カツネリア・アルビダ（Ｋｕｔｚｎｅｒｉａ  ａｌｂｉｄａ）由来の微生物トランスグルタミナーゼの発見および特徴づけに関する。
【０００４】
[0004]酵素活性および特異性の詳細を解明することは、酵素の生理学的機能を理解するために、および酵素により触媒される反応を生物工学的に適用するために重要である。例えば、トランスグルタミナーゼは、関連酵素の大きなファミリーに属し、微生物および哺乳類のトランスグルタミナーゼが含まれる。トランスグルタミナーゼは、グルタミン残基のγ−カルボキサミド基とリジン残基のε−アミノ基の間にイソペプチド結合を形成することにより２つのポリペプチド鎖またはペプチド鎖の間の架橋を触媒する。トランスグルタミナーゼ活性および特異性の詳細を解明することは、トランスグルタミナーゼにより触媒される架橋反応の生物工学的な適用、例えば、標識化、タグ付け、多タンパク質複合体形成などのためのタンパク質の修飾に重要である。
【０００５】
[0005]今まで、微生物トランスグルタミナーゼは、それの小さいサイズ、ロバストな性能、安定性、およびその酵素の活性がカルシウム非依存性であるために、最も研究されたトランスグルタミナーゼ酵素である。いくつかの研究により、様々な種類の長いアルキルアミンがトランスグルタミナーゼのリジン基質の代わりになり得、かつ単純なジペプチドのグルタミン−グリシンがグルタミン基質としての役割を果たし得ることが示されている。トランスグルタミナーゼのリジンおよびグルタミン基質のこれらの発見は、トランスグルタミナーゼ活性についての様々な試験、およびトランスグルタミナーゼを用いるタンパク質の修飾のための実践的なアッセイを開発するのに役立っている。しかしながら、既知および新規のトランスグルタミナーゼの同定および特徴づけにおいていくつかの課題がまだなお生じ得る。一つの課題は、イソペプチド結合形成のための特定のトランスグルタミナーゼの特異性が、特定の適用にとって広すぎ、または狭すぎ得ることである。もう一つの課題は、同じ、または類似した基質特異性を有するトランスグルタミナーゼが、直交性標識化ストラテジーなどに有用でない可能性があることである。さらに別の課題は、特徴づけられていない、またはあまり特徴づけられていないトランスグルタミナーゼの基質の同定である。まだなお他の課題は、起源、特異性、活性、安定性など、およびそれらの組み合わせなどの、所定のトランスグルタミナーゼに関連した因子に依存して生じ得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
[0006]本発明は、トランスグルタミナーゼの同定および特徴づけのための系および方法、ならびにその基質および使用を提供することにより前述の欠点を克服する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
[0007]本開示の一態様によれば、微生物トランスグルタミナーゼの基質タグは、ペプチド配列ＹＲＹＲＱ（配列番号１）と少なくとも８０％配列同一性を有するアシル供与タグ、およびペプチド配列ＲＹＥＳＫ（配列番号２）と少なくとも８０％配列同一性を有するアミン供与タグのうちの１つを含む。
【０００８】
[0008]一態様において、微生物トランスグルタミナーゼは、カツネリア・アルビダ微生物トランスグルタミナーゼ（配列番号６）と少なくとも８０％配列同一性を有する。
[0009]別の態様において、基質タグは検出可能な標識をさらに含む。
【０００９】
[0010]別の態様において、検出可能な標識は、ビオチン部分、蛍光色素、ルテニウム標識、放射標識、および化学発光標識から選択される。
[0011]別の態様において、アシル供与タグは、ペプチド配列ＡＰＲＹＲＱＲＡＡ（配列番号２４）を有する。
【００１０】
[0012]本開示の別の態様によれば、微生物トランスグルタミナーゼの存在下でイソペプチド結合を形成する方法は、微生物トランスグルタミナーゼを第１の基質および第２の基質に曝露するステップであって、前記第１の基質が、ペプチド配列ＹＲＹＲＱ（配列番号１）と少なくとも８０％配列同一性を有するアシル供与タグを含み、かつ前記第２の基質が、ペプチド配列ＲＹＥＳＫ（配列番号２）と少なくとも８０％配列同一性を有するアミン供与タグを含む、ステップ、ならびに前記第１の基質と前記第２の基質を架橋するステップであって、それにより、アシル供与タグとアミノ供与タグの間にイソペプチド結合を形成する、ステップを含む。
【００１１】
[0013]一態様において、微生物トランスグルタミナーゼは、カツネリア・アルビダ微生物トランスグルタミナーゼ（配列番号６）と少なくとも８０％配列同一性を有する。
[0014]別の態様において、第１の基質と第２の基質を架橋するステップが、アシル供与タグのγ−カルボキサミド基とアミノ供与タグのε−アミノ基の間にイソペプチド結合を形成する。
【００１２】
[0015]別の態様において、第１の基質および第２の基質のうちの少なくとも１つは、検出可能な標識を含む。
[0016]別の態様において、検出可能な標識は、ビオチン部分、蛍光色素、ルテニウム標識、放射標識、および化学発光標識から選択される。
【００１３】
[0017]別の態様において、アシル供与タグは、ペプチド配列ＡＰＲＹＲＱＲＡＡ（配列番号２４）を有する。
[0018]別の態様において、第１の基質の第２の基質への架橋は、少なくとも約７０％の収率で達成される。
【００１４】
[0019]別の態様において、前記収率は約３０分以内に達成される。
[0020]本開示の別の態様によれば、微生物トランスグルタミナーゼの存在下でイソペプチド結合を形成するためのキットは、カツネリア・アルビダ微生物トランスグルタミナーゼ（配列番号６）と少なくとも８０％配列同一性を有する、精製された微生物トランスグルタミナーゼを含む。
【００１５】
[0021]一態様において、キットは、ペプチド配列ＹＲＹＲＱ（配列番号１）と少なくとも８０％配列同一性を有するアシル供与タグを含む第１の基質およびペプチド配列ＲＹＥＳＫ（配列番号２）と少なくとも８０％配列同一性を有するアミン供与タグを含む第２の
基質のうちの１つをさらに含む。
【００１６】
[0022]別の態様において、第１の基質および第２の基質のうちの少なくとも１つは、検出可能な標識を含む。
[0023]別の態様において、検出可能な標識は、ビオチン部分、蛍光色素、ルテニウム標識、放射標識、および化学発光標識から選択される。
【００１７】
[0024]別の態様において、アシル供与タグはペプチド配列ＡＰＲＹＲＱＲＡＡ（配列番号２４）を有する。
[0025]別の態様において、キットは、第１の基質および第２の基質のうちの他方の１つをさらに含む。
【００１８】
[0026]本開示の別の態様によれば、イソペプチド結合を形成するための酵素は、カツネリア・アルビダ微生物トランスグルタミナーゼ（配列番号６）と少なくとも８０％配列同一性を有する、精製された微生物トランスグルタミナーゼを含む。
【００１９】
[0027]一態様において、単離された微生物トランスグルタミナーゼは、アンモニウムの存在下で発現し、かつ単離される。
[0028]別の態様において、アンモニウムは、少なくとも約１０μＭの濃度で存在する。
【００２０】
[0029]本開示の別の態様によれば、トランスグルタミナーゼについてのアシル供与基質は、式Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５を有するアミノ酸配列を含み、Ｘａａが任意のアミノ酸であり、Ｘａａ３、Ｘａａ４、およびＸａａ５のうちの少なくとも１個がグルタミンであり、Ｘａａ４およびＸａａ５のうちの１個がアルギニンであり、前記アミノ酸配列が、グルタミンと連続的に隣接した少なくとも１個のアルギニンを含み、アルギニン、グルタミン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンから選択される、前記アミノ酸配列におけるアミノ酸の総数が少なくとも４個である。
【００２１】
[0030]一態様において、Ｘａａ５と、Ｘａａ１、Ｘａａ２、およびＸａａ３のうちの少なくとも１個とがアルギニンである。
[0031]本開示の別の態様によれば、トランスグルタミナーゼについてのアミン供与基質は、式Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５を有するアミノ酸配列を含み、Ｘａａが任意のアミノ酸であり、前記アミノ酸配列が少なくとも１個のリジンを含み、Ｘａａ１およびＸａａ２のうちの１個がチロシンおよびアルギニンから選択され、アルギニン、セリン、チロシン、およびリジンから選択される、前記アミノ酸配列におけるアミノ酸の総数が少なくとも３個である。
【００２２】
[0032]一態様において、Ｘａａ４およびＸａａ５のうちの１個はリジンである。
[0033]別の態様において、アミノ酸配列は２個以下のアミノ酸リジンを含む。
[0034]本発明の前述を始めとする態様および利点は、以下の説明から明らかだろう。その説明において、本明細書の一部を形成する添付の図面が参照され、かつ例示として本発明の好ましい実施形態が示されている。しかしながら、そのような実施形態は、必ずしも本発明の完全な範囲を表すわけではなく、したがって、本発明の範囲を解釈するために特許請求の範囲および本明細書が参照される。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】[0035]本開示によるトランスグルタミナーゼ種の同定および特徴づけのための方法の実施形態を例示する概略図である。
【図２Ａ】[0036]カツネリア・アルビダＫＡＬＢ＿７４５６仮定上のタンパク質（上方の行）およびストレプトマイセス・モバラエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓ）微生物トランスグルタミナーゼ（下方の行）のＣｌｕｓｔａｌ  Ｏｍｅｇａバージョン１．２．１（Ｓｉｅｖｅｒｓら、２０１１  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ７：５３９）多配列アラインメントを示す図である。同一のアミノ酸残基は、アスタリスク（＊）により、類似の残基はコロン（：）によりマークされている。Ｓ．モバラエンシス微生物トランスグルタミナーゼ触媒性三つ組（Ｃｙｓ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ）の保存された残基は灰色で強調されている。
【図２Ｂ】[0037]ＰｒｏＰ  １．０（Ｄｕｃｋｅｒｔら、２００４  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  １７：１０７〜１１２）により決定された場合の、一般的な切断部位予想を含む、Ｋ．アルビダ由来の仮定上のトランスグルタミナーゼＫＡＬＢ＿７４５６のアミノ酸配列を示す図であり、予想されたシグナルペプチド配列（「ｓ」）とプロペプチド切断部位（「Ｐ」）の両方が示されている。
【図２Ｃ】[0038]ＰｒｏＰ  １．０により決定された場合のＫ．アルビダ由来の仮定上のトランスグルタミナーゼＫＡＬＢ＿７４５６についてのアミノ酸配列位置の関数としてプロペプチド切断可能性を示す棒グラフである。破線は、プロペプチド切断可能性閾値を示し、点線は、シグナルペプチドについて予想されたアミノ酸位置を示す。
【図３Ａ】[0039]Ｋ．アルビダ  トランスグルタミナーゼ（ＫａｌｂＴＧ）融合タンパク質についての発現プロフィールを示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの光学的画像である。アミノ末端の融合パートナーは、１〜７とナンバリングされたレーンペアにより示されているように、隣接レーンにおいてグループ化されている（１：８×Ｈｉｓタグ；２：ｄｓｂＡシグナルペプチド；３：ｏｍｐＴシグナルペプチド；４：大腸菌ＳｌｙＤ（ＥｃＳｌｙＤ）；５：２×ＥｃＳｌｙＤ；６：ＦｋｐＡ；７：マルトース結合タンパク質）。「Ｌ」とラベル付けされたレーンは、標準分子量ラダーで負荷された（値はｋＤａで示されている）。「Ｐ」および「Ｓ」とラベル付けされた個々のレーンは、それぞれ、大腸菌細胞可溶化物の不溶性画分（ペレット）および可溶性画分（上清）を表す。Ｈｉｓ−ＫａｌｂＴＧを表すクーマシーブルー染色タンパク質バンドは、レーンペア１においてアスタリスク（＊）でマークされている。
【図３Ｂ】[0040]２×ＳｌｙＤ融合タンパク質の発現および精製戦略の概略図である。２つの溶解感受性Ｄ（ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ−ｔｏ−ｌｙｓｉｓ  Ｄ）（ＳｌｙＤ）タンパク質部分とのＮ末端融合は、可溶性を与え、かつ活性化第Ｘ因子によって切断可能である。その酵素はさらに、プロペプチド配列のトリプシンでの切断により成熟する。
【図３Ｃ】[0041]ＫａｌｂＴＧのモジュラー精製を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの画像である。「Ｌ」とラベル付けされたレーンは、標準分子量ラダーで負荷された（値はｋＤａで示されている）。レーン１：最初のＮｉ＋−ＩＭＡＣ勾配溶出（０〜２５０ｍＭイミダゾール）からの２×ＳｌｙＤ−ＫａｌｂＴＧを含有する画分。レーン２：Ｎｉ＋−ＩＭＡＣ勾配溶出、オンカラム活性化第Ｘ因子消化、およびサイズ排除クロマトグラフィにより精製されたＫａｌｂＴＧプロ酵素。レーン３：活性化第Ｘ因子およびトリプシンでの連続的オンカラム消化後の２回目のＮｉ＋−ＩＭＡＣ勾配溶出（０〜２５０ｍＭイミダゾール）からの画分。レーン４：５０，０００分子量カットオフ（ＮＷＣＯ）膜により濾過されたレーン３の濃縮物。
【図４Ａ】[0042]ビオチン化アミン供与基質の存在下で５ｍｅｒペプチドアレイにおける複製物特性についてのＫａｌｂＴＧにより生じた蛍光シグナルデータ間の相関を示すｌｏｇ−ｌｏｇ散布図である。各データ点は、二連で合成された１４０万個の固有ペプチドのライブラリーからの１対の複製ペプチドを表す。最高蛍光シグナルを示す２２個のデータ点は、それらの個々の５ｍｅｒペプチド配列によってタグ付けされている。
【図４Ｂ】[0043]ビオチン化グルタミン供与基質（Ｚ−ＡＰＲＹＲＱＲＡＡＧＧＧ−ＰＥＧ−ビオチン）の存在下で５ｍｅｒペプチドアレイにおける複製物特性についてのＫａｌｂＴＧにより生じた蛍光シグナルデータ間の相関を示すｌｏｇ−ｌｏｇ散布図である。各データ点は、二連で合成された１４０万個の固有ペプチドのライブラリーからの１対の複製ペプチドを表す。最高蛍光シグナルを示す１７個のデータ点は、それらの個々の５ｍｅｒペプチド配列によってタグ付けされている。
【図５Ａ】[0044]ビオチン化アミン供与基質の存在下で５ｍｅｒペプチドアレイにおける複製物特性についてのＳ．モバラエンシスＭＴＧにより生じた蛍光シグナルデータ間の相関を示すｌｏｇ−ｌｏｇ散布図である。各データ点は、二連で合成された１４０万個の固有ペプチドのライブラリーからの１対の複製ペプチドを表す。図４ＡからのＫａｌｂＴＧにより生じた最高蛍光シグナルに対応する２２個のデータ点が、それらの個々の５ｍｅｒペプチド配列によってタグ付けされている。
【図５Ｂ】[0045]図４Ａからのタグ付きデータ点が取り除かれた、図５ＡのＳ．モバラエンシスＭＴＧにより生じた蛍光シグナルデータのプロットの図である。ＭＴＧにより生じた最高蛍光シグナルに対応する１６個のデータ点は、それらの個々の５ｍｅｒペプチド配列によってタグ付けされている。
【図５Ｃ】[0046]図４Ａからのタグ付きデータ点が取り除かれた、図４ＡのＫａｌｂＴＧにより生じた蛍光シグナルデータのプロットの図である。図５ＢからのＳ．モバラエンシスＭＴＧにより生じた最高蛍光シグナルに対応する１６個のデータ点が、それらの個々の５ｍｅｒペプチド配列によってタグ付けされている。
【図５Ｄ】[0047]ＧＬＤＨ共役アッセイにおいて、アミン供与基質カダベリン（１ｍＭ）の存在下で、様々な濃度のグルタミン供与基質Ｚ−ＧＧＧＤＹＡＬＱＧＧＧＧ（０〜１ｍＭ）およびＺ−ＧＧＧＹＲＹＲＱＧＧＧＧ（０〜１ｍＭ）について、３４０ｎｍ、３７℃でＮＡＤＨ酸化の速度を測定することにより得られる、Ｓ．モバラエンシスおよびＫａｌｂＴＧ活性のプロットの図である。
【図６Ａ】[0048]図６Ａは、Ｑタグ付きサーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳｌｙＤ部分のＣｙ３標識化についての実験の時間経過（左：明視野；右：Ｃｙ３蛍光）と対照データ（左：明視野；右：Ｃｙ３蛍光）の両方を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの一連の画像である。標識の６ｋＤａ分子量に対応する電気泳動移動度のシフトにより、および標識された種の蛍光シグナルにより、成功した単一標識化が観察される。データは、１０倍の標識過剰で実施された６０分間の時間経過についてと、５０倍の標識過剰との１８時間のインキュベーションについて、示されている。「Ｌ」とラベル付けされたレーンは、標準分子量ラダーを負荷された（値はｋＤａで示されている）。「−」および「＋」とラベル付けされたレーンは、Ｓ．モバラエンシスＭＴＧ  Ｑタグ（ＤＹＡＬＱ（配列番号２２））を含有するＳｌｙＤと、ＫａｌｂＴＧ（−）またはＳ．モバラエンシスＭＴＧ（＋）での対照反応を表す。
【図６Ｂ】[0049]図６Ｂは、６．２から９．０の間のｐＨ値についてのＫａｌｂＴＧ標識化効率のｐＨプロフィールを示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの一連の画像である（左：明視野；右：Ｃｙ３蛍光）。１５分間の反応時間後の最高標識化収率は、ｐＨ７．４において観察された。「Ｌ」とラベル付けされたレーンは、標準分子量ラダーを負荷された（値はｋＤａで示されている）。
【図６Ｃ】[0050]図６Ｃは、構築物ＹＲＹＲＱ−ＰＥＧ２７−（活性化第Ｘ因子切断部位）−ＰＥＧ２７−ＰＥＧ２７−ＤＹＡＬＱのＣｙ３およびＣｙ５蛍光標識での二重部位特異的機能付与を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの一連の画像である。各群（標識化１、２、および３）は、左から右に以下の順番で配置された、同じゲルレーンの３つの画像を含む：ｉ）明視野；ｉｉ）Ｃｙ３蛍光；およびｉｉｉ）Ｃｙ５蛍光。群１：ペプチド構築物と１０倍過剰のＣｙ３標識の混合物。群２：ＫａｌｂＴＧ酵素との３０分間のインキュベーション後の、ペプチド構築物と１０倍過剰のＣｙ３標識の混合物。群３：Ｓ．モバラエンシスＭＴＧ酵素およびＣｙ５標識が群２の組成物に加えられ、中間のブロッキングステップまたは精製ステップなしに、１５分間、インキュベートされた；二重標識された構築物は、ほぼ定量的収率で達成された。
【図７Ａ】[0051]図７Ａは、コアおよび活性部位領域における高い保存、ならびに周辺ループ領域における高い可変性を明らかにする、ＫａｌｂＴＧ（濃い灰色）およびＳ．モバラエンシスＭＴＧ（薄い灰色）の活性酵素構造の３次元アラインメントを示す図である。
【図７Ｂ】[0052]図７Ｂは、Ｓ．モバラエンシスＭＴＧと、よりコンパクトなＫａｌｂＴＧの両方の結合ポケットが、同じように、プロペプチド（リボン構造）によって占有され得ることを明示する、ＫａｌｂＴＧ（濃い灰色）およびＳ．モバラエンシスＭＴＧ（薄い灰色）の活性酵素構造の３次元表面オーバーレイを示す図である。
【図７Ｃ】[0053]図７Ｃは、基質リクルートメントを媒介するか、基質模倣体として行動するか、またはそれらの組み合わせのいずれかであると考えられる、２つの強く荷電した親水性ループを含む、ＫａｌｂＴＧ活性溝の形成への寄与体を明示する、３次元リボン構造を示す図である。２つの親水性ループは、それらの対応する配列（すなわち、ＮＨＥＥＰＲ（配列番号３）およびＹＲＹＲＡＲ（配列番号４））でラベルされている。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
[0054]上記で論じられているように、様々な状況において、それらの酵素の基本的な理解、およびそれらの酵素を含む生物工学的な適用の開発の両方を提供するために、酵素の活性および特異性の詳細を解明することは有用であり得る。例えば、治療用および診断用タンパク質の修飾のための通常の化学的な戦略は、部位特異性、結合安定性、化学量論的調節、またはそれらの組み合わせを欠いており、（例えば、治療剤の免疫反応性または安定性との）干渉を引き起こし得る不均一なコンジュゲートを生じる場合が多い。一態様において、新しい年の治療用および診断用試薬の工業的開発は、安定的かつ正確に部位特異的なコンジュゲーションを必要とする精緻な形式を大幅に増加させるだろうことは認識されている。したがって、確立された化学的な戦略に代わる、魅力的かつ費用効率が高いものを提供する新しい酵素的方法の必要性が存在する。
【００２５】
[0055]微生物トランスグルタミナーゼ（ＭＴＧ）は、１９８９年にＡｊｉｎｏｍｏｔｏ
Ｃｏ．，Ｉｎｃ．の研究者により初めて記載されたタンパク質−グルタミンγ−グルタミルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．３．２．１３）であり、多くの食品および生物工学的な適用においてタンパク質およびペプチドの架橋のために最も広く用いられている酵素群の一つである。ＭＴＧは、最初、生物体ストレプトマイセス・モバラエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓ）において発見され、後で、それから抽出された。ＭＴＧは、アシル基（例えば、グルタミン側鎖；アシル供与体）とアルキル−アミン（例えば、リジン側鎖；アミン供与体）の間の安定なイソペプチド結合の形成を触媒する。反応性アミン基の非存在下において、水との酵素的反応は、グルタミン側鎖の脱アミノをもたらす。細菌酵素は、Ｃａ２＋またはＧＴＰなどの補因子の添加なしで、かつ幅広い範囲のｐＨ、バッファー、および温度条件で働く。
【００２６】
[0056]天然基質特異性が非常にストリンジェントであるソルターゼＡとは対照的に、既知の（例えば、Ｓ．モバラエンシス由来の）ＭＴＧは、一般的に、基質分子に関して乱交雑な酵素であり、トランスグルタミナーゼバリアントの特異性はほとんど未知のままである。治療用抗体−薬物コンジュゲートの開発において最適な酵素としてＭＴＧを確立するために著しい科学的努力がなされてきたが、そのようなＭＴＧ媒介性免疫複合体の大規模の製造は、その酵素の低特異性によって阻まれている。
【００２７】
[0057]既知のＭＴＧ種は、主に、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）科またはバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）科を代表する。これらのＭＴＧ種は、非常に類似した一次アミノ酸構造および基質特異性を示す。全ての既知の活性ＭＴＧ種は、少なくとも約３８ｋＤａの分子量を示す。本来、架橋酵素であるため、既知のＭＴＧは、一般的に、アミン供与基質に対する幅広い基質特異性、およびアシル供与基質に対する相対的に低い特異性を示す。改善されたＭＴＧ基質のハイスループットスクリーニングについてのアプローチは、以前は、ファージパニングまたはｍＲＮＡディスプレイに限定されていた。最近開発された、アレイに基づくハイスループットスクリーニングアプローチは、Ｓ．モバラエンシスＭＴＧの基質を同定するのに成功しており（２０１４年１２月１９日に出願さ
れたＡｌｂｅｒｔらによる米国仮特許出願第６２／０９４，４９５号）、これを始めとするホモログ酵素の基質特異性のみが知られており、それにより、いかなるバイオ直交性コンジュゲーションアプローチ（例えば、２つ以上の異なる標識基質および２つ以上のトランスグルタミナーゼ種を用いる生体分子の同時標識）も妨げられている。したがって、新しいトランスグルタミナーゼ種の同定および特徴づけのためのハイスループットのアプローチの必要性が存在する。さらに、より高い活性、特異性、またはそれらの組み合わせを有する向上したトランスグルタミナーゼの必要性が存在する。さらに、目的のトランスグルタミナーゼについての特異的かつ固有の基質である、アシル供与タグ（例えば、グルタミンまたはＱタグ）およびアミン供与タグ（例えば、リジンまたはＫタグ）の必要性が存在する。
【００２８】
[0058]これらを始めとする課題は、トランスグルタミナーゼ種の同定および特徴づけのための系および方法で克服され得る。この目的を達成するために、本開示は、既知および未知の候補トランスグルタミナーゼ種の構造および生化学の特徴づけを提供する。本開示はさらに、候補トランスグルタミナーゼの組換え的産生の特徴づけ、高密度ペプチドアレイによる有望なトランスグルタミナーゼ基質のハイスループットスクリーニング、および新しく特徴づけられたトランスグルタミナーゼ種を用いる生体分子の半直交性コンジュゲーションを提供する。さらに別の態様において、本開示は、目的のトランスグルタミナーゼについての特異的かつ固有の基質であるアシル供与タグ（例えば、グルタミンまたはＱタグ）およびアミン供与タグ（例えば、リジンまたはＫタグ）を提供する。本明細書において、用語「タグ」は、タンパク質、ペプチド、小分子、検出可能な標識（例えば、蛍光色素）、オリゴヌクレオチド、非アミノ酸または非核酸ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）などの別の構造に移植、融合、コンジュゲート、または別の方法で付着することができる、１個または複数のアミノ酸または同様の分子を含む配列を指す。一態様において、付着の性質は、タグが基質である酵素によるタグへのアクセスを可能にするべきである。
【００２９】
[0059]本開示の一実施形態において、ハイスループットのアレイに基づいたスクリーニングアプローチを用いて、これまで知られていなかった、生物体カツネリア・アルビダ由来のトランスグルタミナーゼ種を同定し、組換え的に発現させ、精製し、特徴づけた。Ｋ．アルビダ  トランスグルタミナーゼは、それのアレイで決定された基質配列に対して高い選択性および基質特異性を示すことが決定されたが、Ｓ．モバラエンシス酵素の基質配列とは弱くのみ反応し、または全く反応しない。したがって、Ｋ．アルビダ  トランスグルタミナーゼは、Ｓ．モバラエンシス酵素とバイオ直交性であると言うことができる。別の態様において、Ｋ．アルビダ  トランスグルタミナーゼは、全ての以前に記載されたＭＴＧ種（例えば、Ｓ．モバラエンシスＭＴＧは約３８ｋＤａである）より驚くほど低い分子量（約３０ｋＤａ）を示し、製造および酵素標識のためには優位を意味する。さらに、Ｋ．アルビダ  トランスグルタミナーゼは、全ての現在知られたタンパク質と比較して、明確に異なる一次アミノ酸構造を有した。全体的に見れば、これらの性質により、Ｋ．アルビダ  トランスグルタミナーゼは、非限定的に、生体分子の様々な標識分子との、多用途で、費用効率が高く、かつ部位特異的なコンジュゲーションを含め、幅広い範囲の適用にとって非常に魅力的なものとなっている。Ｋ．アルビダ  トランスグルタミナーゼが有効であり得る追加または代替の適用には、治療用抗体−薬物コンジュゲーションまたはインビトロでの診断用の化学発光抗体の作製が挙げられる。
【００３０】
[0060]一態様において、トランスグルタミナーゼの組換え的産生により引き起こされるいくつかの課題は、本開示の実施形態の実行を通して克服され得る。図１に関して、トランスグルタミナーゼを同定し、かつ特徴づける方法１００は、候補トランスグルタミナーゼを同定するステップ１０２を含む。ステップ１０２は、さらなる研究のために候補トランスグルタミナーゼを同定するための既知の、または疑われるトランスグルタミナーゼ種
のホモログについての検索を含み得る。一つの例示的な実施形態において、トランスグルタミナーゼは、微生物トランスグルタミナーゼ（例えば、ストレプトベルティシリウム種（Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐ．）トランスグルタミナーゼ、カツネリア種トランスグルタミナーゼ、ストレプトマイセス種など）または哺乳類トランスグルタミナーゼであり得る。酵素が哺乳類トランスグルタミナーゼである実施形態において、哺乳類トランスグルタミナーゼは、例えば、ヒト第ＸＩＩＩ因子Ａトランスグルタミナーゼ、ヒト第ＸＩＩＩ因子Ｂトランスグルタミナーゼ、第ＸＩＩＩ因子トランスグルタミナーゼ、ケラチノサイトトランスグルタミナーゼ、組織型トランスグルタミナーゼ、上皮トランスグルタミナーゼ、前立腺トランスグルタミナーゼ、神経細胞トランスグルタミナーゼ、ヒトトランスグルタミナーゼ５、およびヒトトランスグルタミナーゼ７からなる群から選択され得る。
【００３１】
[0061]既知の、または疑われる候補トランスグルタミナーゼのホモログについての検索は、１つまたは複数の検索ツールまたはデータベースの使用を含み得る。一つの適切なツールには、全米バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ＮＣＢＩ）からのタンパク質基本的局所アラインメント検索ツール（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）（タンパク質ＢＬＡＳＴ）が挙げられる。タンパク質ＢＬＡＳＴツールは、既知の、または疑われるトランスグルタミナーゼ種の配列を供給され得、その配列は、様々なデータベースから入手することができる。一つの例のデータベースは、ユニバーサルタンパク質カタログ（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃａｔａｌｏｇ）（ＵｎｉＰｒｏｔ）である。しかしながら、他のデータベースが、ＵｎｉＰｒｏｔに加えて、またはそれの代替として、用いられ得る。一態様において、タンパク質ＢＬＡＳＴを用いる場合、期待値（Ｅ値）の閾値は、検索の結果を狭めるために選択され得る。一例において、約１０−８未満のＥ値を選択することは有用であり得る。別の例において、約１０−１０未満のＥ値を選択することは有用であり得る。さらに別の例において、約１０−１２未満のＥ値を選択することは有用であり得る。
【００３２】
[0062]ステップ１０２は、アラインメントツールでのトランスグルタミナーゼ配列の配列アラインメントの実行をさらに含み得る。一つの例のアラインメントツールは、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｏｍｅｇａ  １．２．１ツール（Ｓｉｅｖｅｒｓら、２０１１、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ７：５３９）が挙げられる。アラインメントツールは、パーセント同一性マトリックス値を提供することができ、（知られている場合には）触媒活性残基の潜在的保存を同定することができ、またはそれらの組み合わせを提供することができる。ステップ１０２において用いることができる他のツールには、トランスグルタミナーゼのプロペプチド配列およびシグナル配列を予想するためのＴｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＤｅｎｍａｒｋからのＰｒｏＰ  １．０サーバー（Ｄｕｃｋｅｒｔら、２００４、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ  ＆  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  １７（１）：１０７〜１１２）が挙げられる。一態様において、候補トランスグルタミナーゼは、既知のトランスグルタミナーゼに対して少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、またはそれ以上の類似性を有し得る。さらに、候補トランスグルタミナーゼは、酵素の構造および機能が保存されている可能性があることを示す、既知の、または疑われるトランスグルタミナーゼに対しての少なくとも１個または複数の活性部位残基の保存により、特徴づけることができる。
【００３３】
[0063]前述のツールの１つまたは複数の使用によりステップ１０２において収集された情報は、ステップ１０４における発現および精製のために推定または既知のトランスグルタミナーゼ配列から候補トランスグルタミナーゼを選択するために用いることができる。一態様において、ステップ１０４は、候補トランスグルタミナーゼ種についての発現条件
を迅速にスクリーニングすることを含み得る。スクリーニングのための一つの適切な方法には、断片交換システムを用いる、宿主生物体における可溶性細胞質またはペリプラズム発現のために設計された１つまたは複数の発現ベクターへの候補トランスグルタミナーゼの遺伝子挿入断片の挿入が挙げられる（Ｇｅｅｒｔｓｍａら、２０１１  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５０（１５）：３２７２〜３２７８）。スクリーニングするための他の方法もまた用いられ得る。
【００３４】
[0064]ステップ１０４はさらに、予想された電気泳動移動度で完全長タンパク質の発現の証拠を同定する最初のスクリーニングを含み得る。完全長の活性のある候補トランスグルタミナーゼタンパク質の不十分な、または全くない発現が観察された場合、候補トランスグルタミナーゼ配列は、機能性酵素の発現の見込みを向上させるためにシャペロン（例えば、ＳｌｙＤ）と融合することができる。候補トランスグルタミナーゼの発現は、異なるインキュベーション時間、インキュベーション温度、誘導物質濃度、誘導時間、培地型、培地体積など、およびそれらの組み合わせを選別することによりさらに最適化することができる。
【００３５】
[0065]一般的に、多くの実行可能な精製および発現戦略が方法１００のステップ１０４に用いることができることは、認識されているだろう。一実施形態において、候補トランスグルタミナーゼ配列を、モジュラー発現構築物に組み込むことができる。ステップ１０４に用いられる例の発現構築物は、シャペロンモジュール、プロテアーゼ切断部位モジュール、精製タグモジュール、検出モジュールなど、およびそれらの組み合わせを含むことができる。例えば、発現構築物は、トランスグルタミナーゼ−シャペロン融合タンパク質を生じるように配置された１つまたは複数のＳｌｙＤシャペロンモジュール、発現後の様々なモジュールの分離のためにトランスグルタミナーゼ配列に隣接した１つまたは複数のプロテアーゼ切断部位モジュール、および発現したタンパク質の１つまたは複数のセグメントの回収のための１つもしくは複数の８×ヒスチジンタグまたは他の精製モジュールを含み得る。プロテアーゼ切断部位モジュールを含む発現構築物について、発現したタンパク質は、１つまたは複数のプロテアーゼで処理されて、活性化タンパク質を生じることができる。例えば、発現したタンパク質は、活性化第Ｘ因子プロテアーゼ、トリプシンプロテアーゼ、トロンビンプロテアーゼ、または別の同様のプロテアーゼで処理されて、任意のシャペロンタンパク質、プロペプチド配列、精製タグなどを、発現した候補トランスグルタミナーゼから切断することができる。
【００３６】
[0066]選択されたトランスグルタミナーゼタンパク質の産生について、一部もしくは全部の推定シグナルおよびプロペプチド配列を含み、またはそれらを含まない候補トランスグルタミナーゼをコードする遺伝子配列を、特定の宿主生物体（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））における発現のためにコドン最適化し、かつ化学合成することができる。発現は、例えば、Ｇｒｅｅｎら、２０１２、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓに記載されているような、標準分子生物学プロトコールに従って実施することができる。
【００３７】
[0067]方法１００の次のステップ１０６において、ステップ１０４で発現し、かつ精製された候補トランスグルタミナーゼを、アシル供与配列、アミン供与配列、または両方を含む有望な基質を同定するために基質ライブラリーに対してスクリーニングする。一態様において、基質ライブラリーは、マスクレス（ｍａｓｋｌｅｓｓ）アレイ合成によりアレイにおいて合成された複数のペプチド特性を含み得る（２０１４年１２月１９日に出願されたＡｌｂｅｒｔらによる米国特許公開第２０１５／０１８５２１６号）。ペプチド特性は、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、他の分子構成要素など、およびそれらの組み合わせから調製することができる。さらに、ペプチドは、直鎖状、環状、または拘束性（大環状
分子）の形であり得る。
【００３８】
[0068]本明細書で用いられる場合、用語「ペプチド」、「オリゴペプチド」、または「ペプチド結合剤（peptide binder）」は、（隣接アミノ酸残基のカルボキシル基とアミノ基の間のペプチド結合により連結された）直鎖型か、環状型か、または拘束性（例えば、「大環状分子」）型のいずれかで配置され得る、アミノ酸で構成された有機化合物を指す。用語「ペプチド」または「オリゴペプチド」はまた、より短いポリペプチド、すなわち、５０個未満のアミノ酸残基で構成される有機化合物を指す。本明細書で用いられる場合、大環状分子（または拘束性ペプチド）は、約５００ダルトン〜約２，０００ダルトンのペプチドなどの環状小分子を記載するためにそれの慣習的意味で用いられる。
【００３９】
[0069]用語「天然アミノ酸」は、典型的にはタンパク質内に見出され、かつタンパク質生合成に用いられる２０個のアミノ酸、加えて、翻訳中タンパク質に取り込まれ得る他のアミノ酸（例えば、ピロリジンおよびセレノシステインなど）のうちの１個を指す。２０個の天然アミノ酸は、ヒスチジン、アラニン、バリン、グリシン、ロイシン、イソロイシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、グルタミン、アスパラギン、スレオニン、アルギニン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、システイン、メチオニン、およびリジンを含む。
【００４０】
[0070]用語「非天然アミノ酸」は、標準遺伝暗号によってコードされ、または翻訳中、タンパク質に取り込まれるものの中にはない有機化合物を指す。したがって、非天然アミノ酸には、例えば、非限定的に、アミノ酸のＤ−アイソステレオマー（ｉｓｏｓｔｅｒｅｏｍｅｒ）、アミノ酸のβ−アミノアナログ、ホモシトルリン、ホモアルギニン、ヒドロキシプロリン、ホモプロリン、オルニチン、４−アミノ−フェニルアラニン、シクロヘキシルアラニン、α−アミノイソ酪酸、Ｎ−メチル−アラニン、Ｎ−メチル−グリシン、ノルロイシン、Ｎ−メチル−グルタミン酸、ｔｅｒｔ−ブチルグリシン、α−アミノ酪酸、ｔｅｒｔ−ブチルアラニン、２−アミノイソ酪酸、α−アミノイソ酪酸、２−アミノインダン−２−カルボン酸、セレノメチオニン、デヒドロアラニン、ランチオニン、γ−アミノ酪酸、およびアミン窒素がモノアルキル化またはジアルキル化されているそれらの誘導体などのアミノ酸またはアミノ酸の類似体が挙げられる。
【００４１】
[0071]引き続き図１に関して、方法１００のステップ１０８は、上位のアミン供与基質配列、アシル供与基質配列、または両方を基質ライブラリーから同定することを含む。一態様において、候補トランスグルタミナーゼのライブラリー基質への活性を、１つまたは複数の直接的または共役的アッセイを用いて測定することができる。一般的に、直接アッセイは、酵素反応の反応物（例えば、基質、補因子など）および生成物（例えば、イソペプチド結合、脱アミド化基質など）の測定を含む。例えば、分光光度法を用いて、時間とともに、反応物または生成物に関連した吸光度の変化を測定することにより酵素反応の経過を追跡することができる。酵素反応が１つもしくは複数の直接アッセイ測定の使用に繋がらない場合、または直接アッセイに加えて、もしくはそれの代替として、共役アッセイを用いることができる。共役アッセイの場合、目的の酵素反応の生成物が、もう一つの、より容易に測定される二次反応の基質として用いることができる。共役アッセイの例には、目的の酵素反応における生成物または反応物として関与するＮＡＤＰ（Ｈ）およびＮＡＤ（Ｈ）などの補因子を含む酸化還元反応の測定が挙げられる。トランスグルタミナーゼにより触媒される反応の場合、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＬＤＨ）依存性酸化共役アッセイが実行され得る。ＧＬＤＨアッセイの一つの例は、架橋基質としてβ−カゼイン、およびＮＡＤＰＨのＧＬＤＨ酸化による脱アミドの検出を含む。とりわけ、多数（例えば、１００万個より多い）の基質を並行して調べるためにハイスループットスクリーニング形式と適合するアッセイを選択することは有用であり得る。
【００４２】
[0072]前述の直接的または間接的アッセイの一つを用いて、ステップ１０８は、候補トランスグルタミナーゼにより認識される特異的配列またはモチーフを同定するためのペプチド基質アレイの使用を含み得る。例えば、何百万個の固有のペプチドとビオチン化アミン供与体との間でのアミド基転移反応は、１つまたは複数のアレイにおいて並行して定量化することができ、最高のシグナルアウトプットを有するペプチド（すなわち、上位の基質）の配列を決定することができる。その後、方法１００の次のステップ１１０において、上位の基質を再合成し、（アレイ上または溶液中の）スタンドアロンアッセイにおいてトランスグルタミナーゼ活性を試験することができる。したがって、ステップ１１０は、ステップ１０８で同定された上位基質の存在下での候補トランスグルタミナーゼの特徴づけを含む。
【００４３】
[0073]候補トランスグルタミナーゼの特徴づけは、特異性、選択性、親和性、活性などのパラメータの決定を含み得る。さらに、２つ以上の候補トランスグルタミナーゼは直交性について特徴づけることができる。ここで、候補トランスグルタミナーゼの同じ基質に作用する能力を同定することができる。２つの異なるトランスグルタミナーゼが同じ（１つまたは複数の）基質に作用することができない場合、その２つの異なるトランスグルタミナーゼは直交性であると言うことができる。しかしながら、２つの異なるトランスグルタミナーゼが、同じ基質のうちの１つまたは複数に作用することができるが、異なる程度の活性で作用する場合、その２つの異なるトランスグルタミナーゼは、半直交性であると言うことができる。一態様において、ペプチド基質アレイは、全ての実行可能な５−ｍｅｒペプチド配列についての読み取りを一度に示すことができる。したがって、基質ライブラリーから収集されたデータを用いて、各候補トランスグルタミナーゼについての基質特異性における違いを、直交性、半直交性、および非直交性トランスグルタミナーゼの同定のために同定することができる。
【００４４】
[0074]方法１００のステップ１１０はさらに、候補トランスグルタミナーゼの、タンパク質基質に部位特異的標識化を実施する能力の特徴づけを含み得る。一態様のアッセイにおいて、ステップ１０８で同定された上位の基質配列は、ステップ１１０において、アレイ上と溶液中の両方でさらに分析することができる。候補トランスグルタミナーゼの様々な基質との交差反応性を定量化するために実験をまた実施することができる。一態様において、タンパク質スキャフォールドが標識化アプローチに有用であり得、エピトープ（すなわち、基質配列）含有ループを、結合剤または酵素への提示のためにスキャフォールド上に移植することができるからである。スキャフォールドの使用を含む一つのアプローチは、２０１２年５月４日に出願されたＡｎｄｒｅｓらによる国際特許出願公開第２０１２／１５０３２１号に記載されている。例のスキャフォールドは、有利には、エピトープ含有ループを移植するための部位として１つまたは複数のＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）ドメインを含み得る。
【００４５】
[0075]候補トランスグルタミナーゼでのスキャフォールドタンパク質の標識化は、様々な条件下で達成することができる。標識化実験について様々であり得る因子には、基質のトランスグルタミナーゼ酵素に対する比率、１つの基質の別の基質に対する比率、標識時間、ｐＨなどが挙げられる。とりわけ、基質は、１つまたは複数のアミン供与またはアシル供与基質配列を含む任意のペプチド、タンパク質、または他の構造を指す。例の基質には、アシル供与またはアミン供与基質配列が移植されているスキャフォールドタンパク質、アシル供与またはアミン供与基質配列にコンジュゲートした、または別の方法で会合させた検出可能な標識、孤立したアシル供与またはアミン供与基質配列など、およびそれらの組み合わせが挙げられる。標識率は、光学的（明視野、蛍光）検出と組み合わせたドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）などの標準技術を用いて時間とともに測定することができる。例えば、第１の基質は、１つまたは複数の検出可能な標識を含み得る。第１の基質の第２の基質（例えば、タンパク質スキャフォールド）への架橋は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上での分子量シフトを同定し、その後、ゲル内の標識を検出することにより分析することができる。
【００４６】
[0076]本開示の実施形態と共に用いられる標識には、トランスグルタミナーゼ基質と組み合わせることができる任意の適切な標識が挙げられる。適切な標識の例には、蛍光標識、化学発光標識、放射標識、（例えば、「クリック（ｃｌｉｃｋ）」ケミストリーを組み入れた）化学的標識、ハプテン、毒素など、およびそれらの組み合わせが挙げられる。より一般的には、適切な標識は、標識が、トランスグルタミナーゼの、標識された基質に作用する能力を排除しない点において、トランスグルタミナーゼの少なくとも１つの基質（例えば、アシル供与基質またはアミン供与基質）と適合性である。さらに、適切な標識は、非標識トランスグルタミナーゼ基質に対して検出可能であるシグナルを生じ得る。本明細書における任意の適切な実施形態に用いられる検出可能な標識の具体的な例は、フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド、フィコエリトリン、オレゴングリーン（例えば、オレゴングリーン４８８、オレゴングリーン５１４など）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ４８８、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ６４７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇｏｎ）、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ７、ビオチン、ルテニウム、ＤｙＬｉｇｈｔ蛍光剤（例えば、非限定的に、ＤｙＬｉｇｈｔ  ６８０を含む）、ＣＷ  ８００、トランスシクロオクテン、テトラジン、メチルテトラジンなどを含み得る。ハプテンの例には、ビオチン、ジゴキシゲニン、ジニトロフェニルなどが挙げられる。毒素の例には、アマトキシン（例えば、アマニチン）、マイタンシノイドなどが挙げられる。
【００４７】
[0077]いくつかの実施形態において、ステップ１１０はさらに、トランスグルタミナーゼの性質のさらなる洞察をもたらすための、トランスグルタミナーゼの３次元（３Ｄ）結晶構造の同定および特徴づけを含み得る。トランスグルタミナーゼの結晶構造は、１つまたは複数の基質、補因子などの存在下または非存在下で表され得る。結晶構造の分析は、トランスグルタミナーゼの性質を向上させるための部位特異的突然変異誘発についての可能な位置に関する洞察を与えることができる。特定の基質配列との候補トランスグルタミナーゼの結晶化によってさらに、トランスグルタミナーゼと基質配列の間の相互作用が明らかにされて、トランスグルタミナーゼの性質を特定の適用に合わせるための、トランスグルタミナーゼおよび基質配列の一方または両方への改変の情報がもたらされ得る。さらに、結晶構造の分析は、アレイに基づいた基質発見の信頼性の、独立した確認としての役割を果たし得る（実施例５参照）。
【００４８】
[0078]方法１００のステップ１１２において、ステップ１０８で同定され、かつステップ１１０で特徴づけられた基質配列は、選択された候補トランスグルタミナーゼの下流での適用に用いられるように選択される。一般的に、特定のアシル供与またはアミン供与基質配列は、所定のトランスグルタミナーゼに固有であり得る。したがって、所定の適用について、まずトランスグルタミナーゼを選択し、その後、１つまたは複数の基質配列を選択することが有用であり得る。特異性および選択性が重要である適用（例えば、２つ以上のトランスグルタミナーゼでの直交性標識化）について、ステップ１１２は、選択されたトランスグルタミナーゼにより特異的かつ選択的に標識される基質配列を選択することを含み得る。しかしながら、他の適用が、１つより多いトランスグルタミナーゼにより作用され得る基質配列を選択することから利益を得る場合がある。基質はまた、より速い、またはより遅い反応時間を達成することが有用である場合、トランスグルタミナーゼの特定の活性度を達成するように選択することができる。選択された基質配列をさらに適合させるために、ステップ１１２の後に、方法１００は、スクリーニングの追加のラウンドとして、ステップ１０６に戻ることができる。この場合、選択された基質は、ペプチドアレイ上でのスクリーニングの次のラウンドにおいて、伸長、成熟などを行うことができる。ペプチド配列の伸長および成熟のための例の方法は、２０１４年１２月１９日に出願されたＡｌｂｅｒｔらによる米国特許公開第２０１５／０１８５２１６号に記載されている。
【００４９】
[0079]さらに他の実施形態において、乱交雑性トランスグルタミナーゼ活性での部位特異的標識化を提供することが有用であり得る。乱交雑性トランスグルタミナーゼは、その基質が組換え的に産生されない場合、標識部位および標識比率が調節することができ、または手近の適用にとって決定的に重要というわけではない場合など、有用であり得る。乱交雑性トランスグルタミナーゼでの標識化の一例は、脱グリコシルまたはグリコシル化ＩｇＧへのペイロードのコンジュゲーションである。しかしながら、非特異的活性を有するトランスグルタミナーゼは、狭い範囲の可能な適用に限定され得る。したがって、他の状況において、特定の基質または同様の基質群のみに対して特異的活性を有するトランスグルタミナーゼを提供することが有用であり得る。
【００５０】
[0080]要約すれば、方法１００は、１つまたは複数の候補トランスグルタミナーゼを１つまたは複数の対応する基質と共に同定し、かつ特徴づけるために用いることができる。仮定上の、または既知のトランスグルタミナーゼを発現させ、基質ライブラリーにおいてスクリーニングして、所望のトランスグルタミナーゼ活性を誘発する予備的な基質配列を同定することができる。その後、上位の基質を選択し、任意で反復様式で精巧にすることができ、それにより、様々な適用に実行され得るトランスグルタミナーゼ−基質の組み合わせを生じる。
［実施例］
【実施例１】
【００５１】
Ｋ．アルビダ微生物トランスグルタミナーゼの同定
[0081]抗体−薬物コンジュゲートのような部位特異的コンジュゲーションアプローチのための実行可能かつロバストな、酵素による工業規模の方法を確立することにより、結合酵素への高い需要が生じる。いくつかある因子の中でも、そのようなアプローチが高い反応速度、コンジュゲーション効率、および基質特異性を有することが有用であり得る。さらに、そのようなアプローチが製造において経済的であり、分子量が小さい酵素、補因子に依存しない酵素など、およびそれらの組み合わせを含むことが有用であり得る。新しい微生物トランスグルタミナーゼの発見のために、言及された判定基準を全て満たし得る、この酵素のホモログの検索を、クエリとしてＳ．モバラエンシスのタンパク質−グルタミンγ−グルタミルトランスフェラーゼのアミノ酸配列を用いて実施した。これは、細菌Ｋ．アルビダＤＳＭ  ４３８７０由来の仮定上の遺伝子産物ＫＡＬＢ＿７４５６をもたらし、その細菌は、２０１４年に配列決定された芽胞形成性グラム陽性細菌である（Ｒｅｂｅｔｓら、２０１４  ＢＭＣ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １５：８８５）。
【００５２】
[0082]ＮＣＢＩタンパク質ＢＬＡＳＴツールのウェブインターフェイスを用いて、ストレプトマイセス・モバラエンシスのＭＴＧに類似した配列を検索した。Ｓ．モバラエンシス  タンパク質−グルタミンγ−グルタミルトランスフェラーゼのアミノ酸配列（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ８１４５３）をクエリとして入力した。Ｓ．モバラエンシス  タンパク質−グルタミンγ−グルタミルトランスフェラーゼのアミノ酸配列は以下の通りである：
【００５３】
【化１】
2020195397.tif 000003
【００５４】
１０−１０未満のＥ値およびＳ．モバラエンシスＭＴＧより短いポリペプチド配列について結果を手作業でスクリーニングすることにより、細菌株カツネリア・アルビダＤＳＭ
４３８７０由来の仮定上の遺伝子産物ＫＡＬＢ＿７４５６（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＨＩ００８１４．１；ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｗ５ＷＨＹ８）がもたらされた。遺伝子産物ＫＡＬＢ＿７４５６のアミノ酸配列は以下の通りである：
【００５５】
【化２】
2020195397.tif 000004
【００５６】
[0083]Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｏｍｅｇａ  １．２．１でのＳ．モバラエンシス配列とＫ．アルビダ配列の配列アラインメントは、パーセント同一性マトリックスにおいて３２％の値を生じ、Ｓ．モバラエンシスＭＴＧの触媒活性残基（Ｐ８１４５３ナンバリング（配列番号５）に基づいたＣ１４０、Ｒ３３１、およびＨ３５０）の保存を同定した。Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＤｅｎｍａｒｋからのＰｒｏＰ  １．０サーバーを用いて、仮定上のＫ．アルビダ  微生物トランスグルタミナーゼのプロペプチドおよびシグナル配列を予想した。唯一の予想されたプロペプチド切断部位は、ＶＡＡＰＴＰＲ／ＡＰであり、それは、閾値より上のスコア（０．５１３）を有し、アミノ酸ＲとＡの間のスラッシュのマークは、予想された切断部位を示す。
【００５７】
[0084]Ｓ．モバラエンシス遺伝子産物（配列番号５）とＫ．アルビダ遺伝子産物（配列番号６）の一次構造の比較により、３０％類似性が示され、活性部位残基の明確な保存があり（図２Ａ）、酵素の構造および機能が保存されている可能性があることを示す。完全なＫ．アルビダ遺伝子産物は、Ｓ．モバラエンシスＭＴＧより有意に小さく、Ｋ．アルビダ遺伝子産物は、３０．１ｋＤａの計算された分子量に相当する。Ｓ．モバラエンシスＭＴＧは不活性なプロ酵素として産生され、細胞外プロテアーゼによりプロセシングされて、３８ｋＤａの活性型を生じるため、同様の活性化機構が、仮定上のＫ．アルビダＭＴＧについて予想され、ＰｒｏＰ  １．０サーバーを用いて、そのタンパク質のＮ末端領域においてシグナル配列およびプロペプチド配列についての確率を分析した（図２Ｂおよび図２Ｃ）。配列ＶＡＡＰＴＰＲ／ＡＰは、唯一の予想されたプロペプチド切断部位であり、切断が、フォワードスラッシュによって示されているように、アミノ酸のアルギニンとプロリンの間で起こる。配列ＶＡＡＰＴＰＲ／ＡＰは、Ｓ．モバラエンシスＭＴＧにおけるディスパーゼ部位ＳＡＧＰＳＦＲ／ＡＰと対応するが、推測的には、フェニルアラニンが酵素認識モチーフにおける必要とされる残基であるため、ディスパーゼ反応性をもたない。さらに、ＰｒｏＰ  １．０サーバーによってシグナルペプチドが予想され、高確率の切断部位ＧＬＰＴＬＩＡ／ＴＴを有した。しかしながら、予想されたシグナルペプチド切断部位は、有意により長いＳ．モバラエンシスＭＴＧプレ配列または他の既知のシグナルペプチドと配列類似点を有しない。予想されたシグナルペプチドおよびプロペプチドの切断部位に基づいて、成熟Ｋ．アルビダ  トランスグルタミナーゼ、プロ酵素、およびプレプロ酵素の分子量は、それぞれ、２６．４ｋＤａ、２７．７ｋＤａ、および３０．１ｋＤａであると計算された。
【実施例２】
【００５８】
ＫａｌｂＴＧの組換え的産生のための並行的構築物評価
[0085]仮定上のＫ．アルビダ  トランスグルタミナーゼ（ＫａｌｂＴＧ）について発現条件を迅速にスクリーニングするために、本発明者らは、断片交換システム（Ｇｅｅｒｔｓｍａら、２０１１  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５０（１５）：３２７２〜３２７８）を用いて、大腸菌における可溶性細胞質またはペリプラズム発現のために設計された複数の発現ベクターに合成遺伝子挿入断片を挿入した。
【００５９】
[0086]５ｍｌ規模における最初のスクリーニングにより、完全長ＫａｌｂＴＧ融合体の予想された電気泳動移動度を有するタンパク質が発現したこと、およびタンデムＳｌｙＤシャペロンとの融合（Ｓｃｈｏｌｚら、２００５  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３４５（５）：１２２９〜１２４１）が、試験された構築物の全ての間で最大量の可溶性タンパク質を生じたことの明らかな証拠が提供された（図３Ａ）。この構築物の発現を、異なるインキュベーション時間および温度、イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）誘導物質濃度および誘導時間、培地型および体積をスクリーニングすることによりさらに最適化した。図３Ｂおよび図３Ｃに関して、選択された融合構築物のモジュラー性質により、連続的な精製ステップとタンパク質切断ステップの組み合わせによる、ＳｌｙＤ融合タンパク質、プロ酵素、および活性化酵素が提供された。発現構築物２００は、Ｎ末端から始めて、２つの連続的ＳｌｙＤシャペロン２０２、活性化第Ｘ因子プロテアーゼ切断部位（Ｃ１）、ＫａｌｂＴＧプロペプチド２０４、トリプシンプロテアーゼ切断部位（Ｃ２）、ＫａｌｂＴＧ酵素２０６、および８×ヒスチジンタグ２０８を含んだ。ＳｌｙＤシャペロン２０２は、活性化第Ｘ因子プロテアーゼ２１０で、発現構築物２００から切断される。さらに、プロペプチド２０４は、トリプシンプロテアーゼ２１２で、ＫａｌｂＴＧ酵素２０６から切断されて、ＫａｌｂＴＧ構築物２００の活性化型を生じる。精製および活性化された酵素は、４℃で、および複数回の凍結融解サイクルにわたって、安定した状態を保った。精製および活性化された酵素の融点は、示差走査熱量測定法（ＤＳＣ）を用いて４８．９℃であると決定された。本明細書に記載された方法が、多くの実行可能な精製戦略の一つを代表することは認識されているだろう。さらに、記載された並行的クローニングアプローチが、効率的かつ経済的な様式で、異なる構築物および実験室規模での製造過程の再評価を可能にする。
【００６０】
[0087]ＫａｌｂＴＧの産生について、推定シグナルとプロペプチドの両方を含み（ＫａｌｂＴＧｐｐ）、推定プロペプチドのみを含み（ｋａｌｂＴＧｔ３）、推定シグナルとプロペプチドを排除し（ｋａｌｂＴＧｔｌ）、または推定シグナルを排除し、かつプロペプチドの後に追加の活性化第Ｘ因子切断部位を挿入する（ｋａｌｂＴＧｔ２）、仮定上のＫ．アルビダ微生物トランスグルタミナーゼをコードする遺伝子配列を、大腸菌発現のためにコドン最適化し（Ｒｏｃｈｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｗｅｂ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅ）、化学合成し（ＧｅｎｅＡｒｔ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ）、断片交換（Ｆｘ）クローニング（Ｇｅｅｒｔｓｍａら、２０１１、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５０（１５）：３２７２〜３２７８）によって、２つのＮ末端の溶解感受性Ｄシャペロン部分（ＳｌｙＤ、ＵｎｉＰｒｏｔエントリーＰ０Ａ９Ｋ９、Ａｓｐｌ６５の後が切り詰められている（Ｓｃｈｏｌｚら、２００５、Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３４５（５）：１２２９〜１２４１））、その後にプロテアーゼ活性化第Ｘ因子切断部位を与え、かつＣ末端８×Ｈｉｓタグを与えるベクターにクローニングした。Ａｓｐ１６５の後を切り詰められたＳｌｙＤのアミノ酸配列は以下の通りである：
【００６１】
【化３】
2020195397.tif 000005
【００６２】
[0088]ベクターは、Ｔ５プロモーターによるＩＰＴＧ誘導性タンパク質発現を含み、アンピシリン耐性を与える、ＱｉａｇｅｎによるｐＱＥ−８０シリーズに基づいている。この研究において記載された全ての実験に用いられる発現構築物は、ＥｃＳｌｙＤ２−Ｘａ−ＫａｌｂＴＧｔ３−８ｘＨｉｓと名付けられた。さらに、最初の発現スクリーニングとして、８×Ｈｉｓタグ、ｄｓｂＡ、およびｏｍｐＴシグナルペプチド、単一のＳｌｙＤまたはＦｋｐＡシャペロン部分、ならびにマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）とのＮ末端融合を与えるベクターにおいて、断片交換クローニングを実施した。プラスミド調製、およびその発現プラスミドでのケミカルコンピテント大腸菌Ｂｌ２１  Ｔｕｎｅｒ細胞の形質転換を、標準分子生物学プロトコール（Ｇｒｅｅｎら、２０１２  「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）に従って実施した。
【００６３】
[0089]活性ＫａｌｂＴＧ酵素を調製するために、０．４リットルから１リットルの間のＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ（ＴＢ）培地に、大腸菌Ｂｌ２１  ＴｕｎｅｒにおけるＥｃＳｌｙＤ２−Ｘａ−ＫａｌｂＴＧｔ３−８ｘＨｉｓタグの一晩の培養物を１：５０の比で接種した。ＥｃＳｌｙＤ２−Ｘａ−ＫａｌｂＴＧｔ３−８ｘＨｉｓタグ発現構築物のアミノ酸配列は以下の通りであった：
【００６４】
【化４】
2020195397.tif 000006
【００６５】
細胞を、バッフル付振盪フラスコ内、３７℃、１８０ｒｍｐでインキュベートし、細胞密度が０．８〜１．２のＯＤ６００ｎｍに達した後、タンパク質発現を、１ｍＭ  ＩＰＴＧで誘導した。細胞を遠心分離（４℃で、７８７８ｘｇ、３０分間）によって収集した。上清を捨て、細胞ペレットを−８０℃で保存し、またはニッケル固定化金属アフィニティクロマトグラフィ（Ｎｉ＋−ＩＭＡＣ）のためにすぐに処理した。
【００６６】
[0090]その後のＥｃＳｌｙＤ２−Ｘａ−ＫａｌｂＴＧｔ３−８ｘＨｉｓのＮｉ＋−ＩＭＡＣ精製について、細胞ペレットを、３０〜５０ｍｌリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中にリゾチームおよびＤＮアーゼＩの存在下で再懸濁した。細胞を、２ｋバールでの高圧ホモジナイゼーションにより破壊した。細胞片を除去するために、懸濁液を遠心分離した（４℃で、１７，２１０ｘｇ、３０分間）。
【００６７】
[0091]細胞破壊に由来する上清を、０．４５μｍポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜を通して濾過し、５ｍｌ  Ｈｉｓ  Ｔｒａｐカラム上に負荷し、少なくとも５カラム体積のＰＢＳで洗浄し、Ｈｉｓタグ付きタンパク質を、ＰＢＳ中０ｍＭから２５０ｍＭまでのイミダゾールの直線的勾配で溶出した（３０ｍｌ、５ｍｌ／分）。吸光度２８０ｎｍにより同定されるようなタンパク質を含有する３ｍｌ画分を収集し、ＰＢＳ中に希釈し、ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ濃縮機により濃縮した（１００００ＭＷＣＯ；５０００ｘｇ、１５〜３０分間）。画分のタンパク質濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ（ＢｉｏＲａｄ、製造会社の使用説明書に従う）により決定した。試料あたり５〜１０μｇのタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｎｏｖｅｘ、製造会社の使用説明書に従う）によって分析した。精製されたタンパク質を２００μｌ体積に分注し、液体窒素内での短時間のインキュベーションを通して凍結し、−８０℃で保存した。
【００６８】
[0092]ＥｃＳｌｙＤ２−Ｘａ−ＫａｌｂＴＧｔ３−８ｘＨｉｓタグからＳｌｙＤシャペロンおよびプロペプチドを切断するために、そのタンパク質を、５ｍｌ  Ｈｉｓ  Ｔｒａｐカラムに固定化し、活性化第Ｘ因子、その後トリプシンで、オンカラム消化を実施した。５０μｇの全タンパク質あたり１マイクログラムの活性化第Ｘ因子をアプライし、１．５時間、カラム上でインキュベートした。プロテアーゼおよび切断されたＳｌｙＤを、ＰＢＳでカラムから洗い流した。
【００６９】
活性化第Ｘ因子消化後のＥｃＳｌｙＤ２−Ｘａ−ＫａｌｂＴＧｔ３−８ｘＨｉｓタグ発現構築物のアミノ酸配列は以下の通りであった：
【００７０】
【化５】
2020195397.tif 000007
【００７１】
トリプシン消化後、ＫａｌｂＴＧ酵素（ＫａｌｂＴＧｔ３）のアミノ酸配列は以下の通りであった：
【００７２】
【化６】
2020195397.tif 000008
【００７３】
ＫａｌｂＴＧの結晶構造分析について、Ｈｉｓタグ付きタンパク質を、活性化第Ｘ因子消化後、０〜２５０ｍＭ直線的イミダゾール勾配で溶出し、ポリッシングステップを、サイズ排除クロマトグラフィ（ＧＥ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ｐｇ  １６／６０、ＰＢＳ）を用いて実施した。あるいは、活性かつ純粋な酵素調製物を得るために、２００μｇ／ｍｌトリプシンをＨｉｓ  Ｔｒａｐカラムに加え、１５〜３０分間、インキュベートすることにより活性化を実施した。プロテアーゼおよび切断されたプロペプチドを、ＰＢＳでカラムから洗い流し、消化されたＫａｌｂＴＧを、上記と同じ様式で収集した。活性ＫａｌｂＴＧから高分子量の不純物を除去するために、酵素調製物を、ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ濃縮機により濾過した（５０，０００ＭＷＣＯ）。図３Ｃに示されているように、濾液を、活性についてＧＬＤＨ共役アッセイにより試験し、純度についてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。残りの濾液を、２００μｌアリコートに分け、液体窒素において凍結し、−８０℃で保存した。
【００７４】
[0093]活性ＫａｌｂＴＧ酵素の調製のためのアプローチの別の実施形態において、プラスミドｐＱＥ−ＥｃＳｌｙＤ２−Ｘａ−ＫａｌｂＴＧｔｌ−８Ｈ（ＣｏｌＥ１開始点；ＩＰＴＧ誘導性Ｔ５プロモーター）を有する大腸菌ＢＬ２１  Ｔｕｎｅｒを、Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ（酵母抽出物、Ｋ２ＨＰＯ４、ＮＨ４Ｃｌ、グリセリン、消泡剤、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、Ｈ３ＰＯ４、ＮａＯＨ）に類似し、かつ１リットルあたり追加の１ｇのＮＨ４Ｃｌを含有する１０Ｌ標準大腸菌発酵培地に接種した。ＥｃＳｌｙＤ２−Ｘａ−ＫａｌｂＴＧｔｌ−８ｘＨｉｓ構築物の配列は以下の通りであった：
【００７５】
【化７】
2020195397.tif 000009
【００７６】
ＥｃＳｌｙＤ２−Ｘａ−ＫａｌｂＴＧｔｌ−８ｘＨｉｓ構築物は、図３Ｂに図示された構築物と類似した（しかし、同一ではない）モジュラー組成を有し、一つの注目すべき違いは、ＥｃＳｌｙＤ２−Ｘａ−ＫａｌｂＴＧｔｌ−８ｘＨｉｓ構築物がＫａｌｂＴＧプロペプチド２０４及びトリプシンプロテアーゼ切断部位（Ｃ２）を削除することである。
【００７７】
[0094]４４のＯＤ６００に達するまで、発酵を３５℃で２６時間、行った。細胞を収集し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、および１０ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４を含有するバッファー中に再懸濁した。細胞を、８００バールでの高圧ホモジナイザーにより破壊した。生じた細胞抽出物を、１〜３％Ｐｏｌｙｍｉｎ−Ｇ２０で前処理し、その後、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＸＬカラム（強陰イオン交換マトリックス；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）におよそ３０ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度で負荷した。結合したタンパク質を、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、および１５０ｍＭ  ＮａＣｌで洗浄し、その後、１５０〜５００ｍＭ  ＮａＣｌの３０カラム体積勾配で溶出した。溶離液を、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１ｍＭ  ＤＴＴ、１０ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、５００ｍＭ  ＮａＣｌに対して透析し（１０ｋＤａ分子量カットオフ）、濃縮し、Ｎｉ−ＮＴＡカラムに負荷した。結合したＨｉｓタグ付きタンパク質を、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１ｍＭ  ＤＴＴ、１０ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、２５ｍＭイミダゾールで洗浄し、２５〜２００ｍＭイミダゾールの２０カラム体積勾配で溶出した。精製されたタンパク質を、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、および１０ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、ｐＨ８．０に対して透析し（１０ｋＤａ分子量カットオフ）、１．７７ｍｇ／ｍｌに濃縮し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＧＬＤＨ活性アッセイにより分析し、１０ｍｇアリコートとして−８０℃で凍結した。使用前に、（ＮＨ４）２ＳＯ４を、１０ｋＤａ分子量カットオフフィルターでの透析により除去した。活性化第Ｘ因子消化を、本明細書に記載されているように実施して、ＫａｌｂＴＧ構築物から２×ＳｌｙＤ部分を除去し、それにより、以下の配列を有するＫａｌｂＴＧ酵素（ＫａｌｂＴＧｔ１）を生じた：
【００７８】
【化８】
2020195397.tif 000010
【００７９】
[0095]ＥｃＳｌｙＤ２−Ｘａ−ＫａｌｂＴＧｔｌ−８ｘＨｉｓ構築物に由来したＫａｌｂＴＧ酵素を発現させるためにとられるアプローチの一態様は、ＫａｌｂＴＧ酵素の天然阻害剤であるアンモニウムイオンの供給源（すなわち、（ＮＨ４）２ＳＯ４またはＮＨ４Ｃｌ）の、発酵ブロスと精製バッファーの両方への添加を含む。アンモニウム（またはアンモニア）の使用は、プロペプチド配列の発現または下流での切断を必要とすることなく、ＫａｌｂＴＧ融合タンパク質の産生を可能にする。ＫａｌｂＴＧ酵素の自己触媒活性は、ＫａｌｂＴＧ酵素の適用前にアンモニウムイオンを除去するために用いられる最終の透析まで、（溶液中の塩化アンモニウムからの）アンモニウムイオンの存在により可逆的に阻害されている。驚くべきことに、塩化アンモニウムの使用を含む精製工程は、ＧＬＤＨアッセイにより測定された場合、ＫａｌｂＴＧ酵素活性の最高約９倍の増加をもたらし、それにより、ＫａｌｂＴＧ酵素を、現在市販されているＭＴＧと比較して非常に優位にさせている（実施例３、表４）。したがって、塩化アンモニウム、別のアンモニウム塩、または別のアンモニア供給源の存在下で、トランスグルタミナーゼを発現させ、精製し、または別に単離することは有用であり得る。
【００８０】
[0096]いくつかの実施形態において、対イオンが工程全体において中立的効果を生じる、アンモニウムの供給源を選択することは有用であり得る。例えば、アンモニウム対イオンが硫酸イオンである実験において、対イオンとしての塩素イオンの使用と比較して、発
現への負の影響が観察された。しかしながら、対イオンとしての硫酸イオンの使用は、精製ステップに関して負の効果をほとんど、あるいは全く生じ得ない。したがって、所定のトランスグルタミナーゼの発現および精製への対イオンの効果をまず、決定することは有用であり得る。さらに、所定のトランスグルタミナーゼの発現中または精製中のいずれかに存在するアンモニウムイオンの濃度は、様々であり得る。一実施形態において、アンモニウムは、少なくとも約１０μＭの濃度で存在し得る。別の実施形態において、アンモニウムは、少なくとも約１００μＭの濃度で存在し得る。さらに別の実施形態において、アンモニウムは、少なくとも約１ｍＭの濃度で存在し得る。なお別の実施形態において、アンモニウムは、少なくとも約１０ｍＭの濃度で存在し得る。
【実施例３】
【００８１】
トランスグルタミナーゼ基質発見のためのペプチドアレイの使用
[0097]Ｋ．アルビダ  トランスグルタミナーゼの有望なアシル供与基質およびアミン供与基質を同定するために、５ｍｅｒペプチドアレイにおけるハイスループットスクリーニングを実施した（図４Ａおよび４Ｂ）。ＳｌｙＤ融合型および成熟型のＫａｌｂＴＧ酵素のどちらについても少なくとも１．６５Ｕ／ｍｇの活性が、市販のアッセイにより確認された（Ｚｅｄｉｒａ  ＭＴＧ−ＡＮｉＴＡ−ＫＩＴ；そのキットと共に供給されたＭＴＧによる４．３Ｕ  ｍｇ−１およびＢＳＡでの０．０７Ｕ／ｍｇブランク値と比較して）。アッセイは、架橋基質としてβ−カゼインを用い、ＮＡＤＰＨのグルタミン酸デヒドロゲナーゼ依存性酸化により脱アミドを検出した。特異的認識モチーフを、マスクレスアレイ合成により調製されたペプチドアレイでＫａｌｂＴＧをアッセイすることにより、同定した（２０１４年１２月１９日に出願されたＡｌｂｅｒｔらによる米国特許公開第２０１５／０１８５２１６号）。１４０万個の固有の５ｍｅｒペプチドとビオチン化アミン供与体との間のアミド基転移反応を、２つのアレイ上で並行して定量化し、最も高いターンオーバーを有するペプチドの配列を決定した（図４Ａ）。９個の最良のペプチドを再合成し、スタンドアロン型ＧＬＤＨ共役アッセイにおいてＫａｌｂＴＧ活性について試験した。対応するアレイデータと並べた、ＧＬＤＨ共役アッセイの結果は、表１に示されている。配列ＭＬＡＱＧ（配列番号１３）についてのアレイシグナルは、この配列がアレイに含まれていなかったため、適用せず（ｎ．ａ．）と示されていることに留意されたい。同様に、バックグラウンドシグナルの測定は、アレイ上で実施された実験に対してだけ適用された。
【００８２】
【表１】
2020195397.tif 000011
【００８３】
[0098]ＫａｌｂＴＧ活性を、ペプチドアレイにおけるビオチン化アミン供与体の取り込み、ならびに９個の最高の性能を示した、アレイから選択されたグルタミン含有基質、および２個のＳ．モバラエンシスＭＴＧグルタミン含有基質の、それぞれ、１００μＭを用いるＧＬＤＨ共役アッセイにおけるアミン供与基質（５００μＭ）の存在下、３４０ｎｍ、３７℃におけるＮＡＤＨ酸化の速度を測定することにより得られた。上位のアレイから選択された基質とＧＬＤＨ共役アッセイにおけるそれらの性能との間に強い相関が観察されたが、ＫａｌｂＴＧは、好ましいＳ．モバラエンシスＭＴＧ基質ＤＹＡＬＱ（配列番号２２）およびＭＬＡＱＧ（配列番号１３）に関して活性を示さなかった。表１における上位の配列の試験により、上位の性能を示した５ｍｅｒ基質としてＹＲＹＲＱ（配列番号１）およびＲＹＲＱＲ（配列番号１４）が確認され、それぞれ、３．５２±０．０８ｐｍｏｌ  ＮＡＤＨ  ｓ−１および３．６０±０．１２ｐｍｏｌ  ＮＡＤＨ  ｓ−１のターンオーバー速度を有した。リジン含有基質ＹＫＹＲＱ（配列番号２０）は、ＧＬＤＨアッセイにおいて最高速度を示し（４．００±０．１８ｐｍｏｌ  ｓ−１）、理論に捕らわれるつもりはないが、リジン交差反応性により引き起こされる不自然な結果である可能性があり、したがって、さらなる分析において取り除かれた。驚くべきことに、５ｍｅｒ配列ＭＬＡＱＧ（配列番号１３）によって代表される、よく知られたＳ．モバラエンシスＭＴＧ認識モチーフＭＬＡＱＧＳ（配列番号２３）もＳ．モバラエンシスＭＴＧ基質ＤＹＡＬＱ（配列番号２２）も、活性を検出することができなかった。
【００８４】
[0099]ペプチドアレイにおける成熟の第２ラウンドにより、上位性能を示した９ｍｅｒ基質としてＡＰＲＹＲＱＲＡＡ（配列番号２４）がもたらされ、それを、その後、最適化リジン認識モチーフの発見のためにアシル供与体として働くようにビオチン化ペプチドとして再合成し、５ｍｅｒペプチドアレイに戻した（図４Ｂ）。再び、６個の最良のリジン含有ペプチドを再合成し、アシル供与体として最適化グルタミン認識配列ＹＲＹＲＱ（配列番号１）を含有するペプチドを用いて、ＫａｌｂＴＧ溶液中活性アッセイにおいて試験した（表２）。カダベリンについてのアレイシグナルの計算は、アレイからのカダベリンの除外により適用されなかった。
【００８５】
【表２】
2020195397.tif 000012
【００８６】
[0100]表２に関して、ＫａｌｂＴＧ活性は、ビオチン化グルタミン供与体の取り込み、ならびにｉ）６個の上位性能を示したアレイ選択のリジン基質、ｉｉ）カダベリン、およびｉｉｉ）好ましいＭＴＧリジン基質ＡＲＳＫＬ（配列番号３０）のそれぞれ１００μＭを用いるＧＬＤＨ共役アッセイにおける、グルタミン供与基質（２００μＭ）の存在下、３４０ｎｍ、３７℃でのＮＡＤＨ酸化の速度を測定することにより得られた。ＧＬＤＨア
ッセイにおける最高ターンオーバー（４．４７±０．１６ｐｍｏｌ  ＮＡＤＨ  ｓ−１）は、配列ＲＹＥＳＫ（配列番号２）に関して観察された。これは小さいが、カダベリン（３．５１±０．１２ｐｍｏｌ  ｓ−１）またはＡＲＳＫＬ（配列番号３０）（ペプチドアレイにおいて好ましいＭＴＧリジン供与体モチーフとして以前に確立されたペプチド）（３．８７±０．３１ｐｍｏｌ  ｓ−１）に対して有意な増加である。Ｓ．モバラエンシスＭＴＧ基質ペプチドＡＲＳＫＬ（配列番号３０）に関する追加の詳細は、２０１４年１２月１９日に出願されたＡｌｂｅｒｔらによる米国仮特許出願第６２／０９４，４９５号に見出すことができる。
【００８７】
[0101]ペプチドアレイの構築について、１，３６０，７３２個の固有の５ｍｅｒペプチドのライブラリーを、システインもメチオニンも、加えて、いかなるダイマーも、同じアミノ酸のより長い繰り返しも、ならびにＨＲ、ＲＨ、ＨＫ、ＫＨ、ＲＫ、ＫＲ、ＨＰ、およびＰＱ配列から選択されるジペプチドを含有するいかなるペプチドも除外する、１８個の天然アミノ酸の全ての組み合わせを用いることにより設計した。ライブラリーを、マスクレス光定方向ペプチドアレイ合成（ｍａｓｋｌｅｓｓ  ｌｉｇｈｔ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ
ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｒｒａｙ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）を用いることにより同じアレイにおいて二連で合成した。３：１の比を有するグリシンとセリンの混合物を用いることにより合成された３アミノ酸長リンカーに、各５ｍｅｒペプチドを、Ｎ末端およびＣ末端の両方において、隣接させた。
【００８８】
[0102]グルタミン含有基質に対するＫａｌｂＴＧ特異性を試験するために、Ｎ−（ビオチニル）カダベリンを、ペプチドアレイにおけるグルタミンペプチドをビオチン化するためのリジン基質の代替として用いた。ＫａｌｂＴＧ標識反応を、ＳｅｃｕｒｅＳｅａｌ（商標）チャンバー（Ｇｒａｃｅ  Ｂｉｏ−Ｌａｂｓ）において１２００μＬ  １００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８、１ｍＭ  ＤＴＴ、５０μΜ  Ｎ−（ビオチニル）カダベリン、０．２ｎｇ  μｌ−１  ＫａｌｂＴＧ中、３７℃で４５分間、行った。インキュベーション後、チャンバーを取り除き、アレイを、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．８、０．２Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中で、１分間、洗浄し、続いて、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ中で１分間、洗浄した。アレイに連結されたビオチンを、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１％アルカリ溶解性カゼイン、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０中の０．３μｇ  ｍｌ−１  Ｃｙ５−ストレプトアビジンで、室温で１時間、染色した。Ｃｙ５蛍光強度を、蛍光スキャナを用いて、２μｍの分解能および６３５ｎｍの波長で測定した。
【００８９】
[0103]リジン基質に対するＫａｌｂＴＧ特異性を試験するために、化学合成されたＺ−ＡＰＲＹＲＱＲＡＡＧＧＧ−ＰＥＧ−ビオチンのペプチド（配列ＡＰＲＹＲＱＲＡＡＧＧＧ（配列番号３１）を含む）を、リジン含有ペプチドをビオチン化するためのグルタミン含有基質として用いた。アレイビオチン化を上記のように、０．１ｎｇ  μｌ−１  ＫａｌｂＴＧ、０．８μΜペプチドを用いて、３７℃で１５分間、行った。ペプチドまたは他の同様の構築物の前の「Ｚ−」は、他に指定がない限り、カルボキシベンジル基を表すように本明細書で用いられることを留意されたい。
【００９０】
[0104]ペプチドアレイにおけるＳ．モバラエンシスＭＴＧ反応を、１０μΜ  Ｎ−（ビオチニル）カダベリンおよび０．１ｎｇ  μｌ−１  Ｓ．モバラエンシスＭＴＧを用いて、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８、１ｍＭ  ＤＴＴ中、３７℃で１５分間、行った。図４Ａに示されているように、ＫａｌｂＴＧで５ｍｅｒペプチドアレイにおいて同定された上位２２個のグルタミン供与基質は、（順不同で）ＦＲＱＲＧ（配列番号１８）、ＹＲＹＲＱ（配列番号１）、ＱＲＱＲＱ（配列番号１９）、ＦＲＱＲＱ（配列番号１６）、ＲＹＲＱＲ（配列番号１４）、ＲＱＲＱＲ（配列番号１７）、ＹＲＱＳＲ（配列番号３２）、ＹＫＹＲＱ（配列番号２０）、ＬＲＹＲＱ（配列番号３３）、ＹＲＱＲＡ（配列番号３４）、ＶＲＹＲＱ（配列番号３５）、ＱＲＱＴＲ（配列番号３６）、ＹＲＱＴＲ（配列番号３７）、ＰＲＹＲＱ（配列番号３８）、ＲＦＳＱＲ（配列番号３９），ＷＱＲＱＲ（配列番号４０）、ＱＹＲＱＲ（配列番号２１）、ＶＲＱＲＱ（配列番号４１）、ＲＹＴＱＲ（配列番号４２）、ＡＹＲＱＲ（配列番号４３）、ＹＱＲＱＲ（配列番号４４）、およびＲＹＳＱＲ（配列番号１５）であった。図４Ｂに示されているように、ＫａｌｂＴＧで５ｍｅｒペプチドアレイにおいて同定された上位１７個のリジン供与基質は、（順不同で）ＮＹＲＦＫ（配列番号４５）、ＹＱＫＷＫ（配列番号４６）、ＹＫＹＫＹ（配列番号４７）、ＲＷＫＦＫ（配列番号４８）、ＲＦＹＳＫ（配列番号４９）、ＹＫＹＡＫ（配列番号５０）、ＹＲＹＡＫ（配列番号５１）、ＲＹＳＹＫ（配列番号５２）、ＹＫＳＦＫ（配列番号５３）、ＹＫＳＷＫ（配列番号５４）、ＫＹＲＹＫ（配列番号５５）、ＹＫＹＮＫ（配列番号５６）、ＲＹＳＫＹ（配列番号２５）、ＲＹＥＳＫ（配列番号２）、ＰＹＫＹＫ（配列番号５７）、ＦＹＫＹＫ（配列番号５８）、およびＦＹＥＳＫ（配列番号５９）であった。ＭＴＧで同定され、かつ図５Ｂおよび５Ｃに示された１６個のグルタミン供与基質は、（順不同で）ＥＷＶＡＱ（配列番号６０）、ＥＷＡＬＱ（配列番号６１）、ＤＹＦＬＱ（配列番号６２）、ＤＹＡＬＱ（配列番号２２）、ＥＹＷＬＱ（配列番号６３）、ＤＷＡＬＱ（配列番号６４）、ＤＷＹＬＱ（配列番号６５）、ＤＹＷＬＱ（配列番号６６）、ＥＹＶＡＱ（配列番号６７）、ＤＹＶＡＱ（配列番号６８）、ＤＷＶＡＱ（配列番号６９）、ＥＹＶＬＱ（配列番号７０）、ＥＷＩＡＱ（配列番号７１）、ＷＹＡＬＱ（配列番号７２）、ＥＹＡＬＱ（配列番号７３）、およびＥＹＦＬＱ（配列番号７４）であった。
【実施例４】
【００９１】
成熟型グルタミン基質に対するＫａｌｂＴＧの特異性および半直交性コンジュゲーションへの適用
[0105]ペプチドアレイは、全ての実行可能な５ｍｅｒペプチドについての読み取りを一度に与えることができるため、単一のデータセットそれぞれは、酵素が基質特異性においてどのように異なるかを評価するのに十分である。上位のＫａｌｂＴＧグルタミン基質（図４Ａ）は、ＭＴＧで実施されたアレイにおけるシグナル分布（図５Ａ）の中央の場に見出された。比較により、上位の性能を示すＳ．モバラエンシスＭＴＧグルタミン含有基質（図５Ｂ）は、ＫａｌｂＴＧアレイにおいて相対的により低いシグナルを示した（図５Ｃ）。その２つのトランスグルタミナーゼ酵素が直交性グルタミン含有基質優先を有することを確認するため、および交差反応性の量を定量するために、両方の酵素の動態を、様々な濃度の基質ペプチドＺ−ＧＧＧＹＲＹＲＱＧＧＧＧおよびＺ−ＧＧＧＤＹＡＬＱＧＧＧＧの存在下で決定した（図５Ｄ）。とりわけ、Ｚコンジュゲート型基質は、ペプチド配列ＧＧＧＹＲＹＲＱＧＧＧＧ（配列番号７５）およびＧＧＧＤＹＡＬＱＧＧＧＧ（配列番号７６）を含んだ。Ｓ．モバラエンシスＭＴＧは、両方の基質に対して０．６〜０．９ｍＭ範囲内の類似したＫＭ値を示したが、ターンオーバーｋｃａｔは、好ましいＤＹＡＬＱ（配列番号２２）配列を含むＺ−ＧＧＧＤＹＡＬＱＧＧＧＧ基質に関して有意により高く（ＹＲＹＲＱ（配列番号１）に関しての０．９３ｓ−１に対して１．３９ｓ−１）、それぞれ、１．６４×１０３［Ｍ−１  ｓ−１］および１．４４×１０３［Ｍ−１  ｓ−１］の触媒効率（ｋｃａｔ  ＫＭ−１）を生じた（表３）。操作されたＳ．モバラエンシスＭＴＧ酵素と比較すると、ＫａｌｂＴＧは、基質結合効率（２ｍＭのＫＭ）がより低いが、ターンオーバー（１．９２ｓ−１のｋｃａｔ）がより高いように見え、０．８９×１０３［Ｍ−１  ｓ−１］のｋｃａｔ  ＫＭ−１となる。ＫａｌｂＴＧは、Ｓ．モバラエンシスＭＴＧ基質Ｚ−ＧＧＧＤＹＡＬＱＧＧＧＧに対して完全に非反応であるように見え、したがって、動態学的パラメータは、表３における「ｎ．ｄ．」により示されているように、決定することができなかった。
【００９２】
【表３】
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【００９３】
[0106]次に、アレイおよび溶液中データを適用して、タンパク質基質への部位特異的標識化を実施した。分子シャペロンＳｌｙＤは、エピトープ含有ループを結合剤または酵素への提示のためにＦＫＢＰドメイン上に移植することができるため、標識化アプローチにとって有用なスキャフォールドである（Ａｎｄｒｅｓらによる国際出願公開第ＷＯ２０１２／１５０３２１号）。サーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＦＫＢＰドメインおよびＫａｌｂＴＧ認識配列ＲＹＲＱＲ（配列番号１４）からなるキメラタンパク質を作製した。１０倍過剰量のＫａｌｂＴＧ  Ｋタグ−Ｃｙ３および７２：１の基質対酵素での標識化により、１５分後に、標識タンパク質種のおよそ７０％収率がもたらされた（図６Ａ）。この収率は、６０分間の時間経過にわたって一定のままであった。５０倍標識過剰量とのインキュベーションは、標識された種の収量をわずかに増加させただけであった。１３ｋＤａから１９ｋＤａへの分子量シフトがＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で観察され、それは単一の６ｋＤａ標識分子の取り込みにまさしく対応する。ＲＹＲＱＲ（配列番号１４）の代わりにＳ．モバラエンシスＭＴＧ配列ＤＹＡＬＱ（配列番号２２）を含有する、同様に構築されたＦＫＢＰドメインは、ＫａｌｂＴＧとインキュベートされた時、標識の取り込みを示さず（図６Ａ）、その反応がＫａｌｂＴＧ認識モチーフの部位に限定されること、およびＦＫＢＰドメインに内在する５個の他のグルタミンのいずれも認識されないことを示す。本発明者らはさらに、ｐＨ６．２、６．８、７．４、８．０、８．５、および９における標識化反応のｐＨ依存性をアッセイした（図６Ｂ）。１５分後の最高の標識化効率は、ｐＨ７．４で見出され、ｐＨ８．５およびそれより上においては活性が次第に低下した。これらの所見は、Ｓ．モバラエンシスＭＴＧの公表されたｐＨ優先度とよく一致する。
【００９４】
[0107]図６Ｃに関しては、ＫａｌｂＴＧの高い配列特異性を用いて、ＫａｌｂＴＧグルタミン含有モチーフとＳ．モバラエンシスＭＴＧグルタミン含有モチーフの両方を含む７ｋＤａ基質ペプチドのＹＲＹＲＱ（配列番号１）部位に６ｋＤａ  Ｃｙ３標識をコンジュゲートした。ＹＲＹＲＱ（配列番号１）部位を飽和させるために、反応を３０分間、実行した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析により、標識が単一の部位に組み込まれたことが確認された。その後、基質ペプチドを、Ｓ．モバラエンシスＭＴＧおよび６ｋＤａ  Ｃｙ５標識と１５分間、インキュベートした。これは、結果として、部位特異的に二重に標識されたコンジュゲートの形成を生じ、全ての単一標識された種が、二重標識された種に明らかに変換していた。これらの結果は、ＫａｌｂＴＧおよびＳ．モバラエンシスＭＴＧが、比類なき使用の容易さ、収率、および効率をもつ半直交性標識化系を構成することを確認する。したがって、ＫａｌｂＴＧは、治療的または診断的適用における目的の複雑なタンパク質コンジュゲートの工業規模の合成にとって有用であり得る。
【００９５】
[0108]ＧＬＤＨ共役アッセイについて、アレイアッセイにおいて選択されたＫａｌｂＴＧペプチドがまた、溶液反応における好ましい基質であるかどうかを決定するために、な
らびにＫａｌｂＴＧおよびＳ．モバラエンシスＭＴＧの様々な基質との交差反応性を定量するために、Ｓ．モバラエンシスＭＴＧ活性についての連続的グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＬＤＨ）共役アッセイ（Ｏｔｅｎｇ−Ｐａｂｉら、２０１３、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４４１（２）：１６９〜１７３参照）を適用した。
【００９６】
[0109]グルタミン基質評価について、アッセイを、透明な９６ウェルマイクロタイタープレートにおいて、２００ｍＭ  ＭＯＰＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ７．２中（ウェルあたり総体積２００μｌ）、５００μΜ  α−ケトグルタレート、リジン含有ペプチドの代わりとなるアミン供与基質として５００μΜまたは１ｍＭカダベリン、２Ｕ  ｍｌ−１のグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＬＤＨ）、５００μΜ  ＮＡＤＨ、および０ｍＭから１ｍＭの間の範囲の濃度のグルタミン含有基質ペプチド（Ｚ−ＧＧＧＱＲＷＲＱＧＧＧＧ、Ｚ−ＧＧＧＷＲＹＲＱＧＧＧＧ、Ｚ−ＧＧＧＹＲＹＲＱＧＧＧＧ、Ｚ−ＧＧＧＲＹＲＱＲＧＧＧＧ、Ｚ−ＧＧＧＲＹＳＱＲＧＧＧＧ、Ｚ−ＧＧＧＦＲＱＲＱＧＧＧＧ、Ｚ−ＧＧＧＲＱＲＱＲＧＧＧＧ、Ｚ−ＧＧＧＦＲＱＲＧＧＧＧＧ、Ｚ−ＧＧＧＱＲＱＲＱＧＧＧＧ、Ｚ−ＧＧＧＹＫＹＲＱＧＧＧＧ、Ｚ−ＧＧＧＱＹＲＱＲＧＧＧＧ、Ｚ−ＧＧＧＤＹＡＬＱＧＧＧＧ、またはＺ−ＧＧＧＭＬＡＱＧＳＧＧＧ）（ウェルあたり総体積２００μｌ）の存在下で実施した。とりわけ、Ｚコンジュゲート型ペプチドは、配列ＧＧＧＱＲＷＲＱＧＧＧＧ（配列番号７７）、ＧＧＧＷＲＹＲＱＧＧＧＧ（配列番号７８）、ＧＧＧＹＲＹＲＱＧＧＧＧ（配列番号７５）、ＧＧＧＲＹＲＱＲＧＧＧＧ（配列番号７９）、ＧＧＧＲＹＳＱＲＧＧＧＧ（配列番号８０）、ＧＧＧＦＲＱＲＱＧＧＧＧ（配列番号８１）、ＧＧＧＲＱＲＱＲＧＧＧＧ（配列番号８２）、ＧＧＧＦＲＱＲＧＧＧＧＧ（配列番号８３）、ＧＧＧＱＲＱＲＱＧＧＧＧ（配列番号８４）、ＧＧＧＹＫＹＲＱＧＧＧＧ（配列番号８５）、ＧＧＧＱＹＲＱＲＧＧＧＧ（配列番号８６）、ＧＧＧＤＹＡＬＱＧＧＧＧ（配列番号７６）、およびＧＧＧＭＬＡＱＧＳＧＧＧ（配列番号８７）を含んだ。
【００９７】
[0110]アミン基質評価について、アッセイ条件は、それぞれ１００μＭのアミン基質（Ｚ−ＧＧＧＲＹＳＫＹＧＧＧＧ、Ｚ−ＧＧＧＡＹＲＴＫＧＧＧＧ、Ｚ−ＧＧＧＲＹＲＳＫＧＧＧＧ、Ｚ−ＧＧＧＹＫＧＲＧＧＧＧＧ、Ｚ−ＧＧＧＲＹＧＫＳＧＧＧＧ、Ｚ−ＧＧＧＲＹＥＳＫＧＧＧＧ、Ｚ−ＧＧＧＰＧＲＹＫＧＧＧＧ、Ｚ−ＧＧＧＡＲＳＫＬＧＧＧＧ、またはカダベリン）および２００μＭのグルタミン供与体（Ｚ−ＧＧＧＹＲＹＲＱＧＧＧＧまたはＺ−ＧＧＧＤＹＡＬＱＧＧＧＧ）が用いられたことを除いて、グルタミン基質評価についてと同じであった。とりわけ、アミン基質は、配列ＧＧＧＲＹＳＫＹＧＧＧＧ（配列番号８８）、ＧＧＧＡＹＲＴＫＧＧＧＧ（配列番号８９）、ＧＧＧＲＹＲＳＫＧＧＧＧ（配列番号９０）、ＧＧＧＹＫＧＲＧＧＧＧＧ（配列番号９１）、ＧＧＧＲＹＧＫＳＧＧＧＧ（配列番号９２）、ＧＧＧＲＹＥＳＫＧＧＧＧ（配列番号９３）、ＧＧＧＰＧＲＹＫＧＧＧＧ（配列番号９４）、およびＧＧＧＡＲＳＫＬＧＧＧＧ（配列番号９５）を含んだ。
【００９８】
[0111]反応は、５μｇ  ｍｌ−１のＳ．モバラエンシスＭＴＧまたはＫａｌｂＴＧの添加によって開始され、ＮＡＤＨの酸化が、Ｂｉｏｔｅｋ  Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｈ４マイクロプレートリーダーを用いて、３４０ｎｍで６０分間、連続的に記録され、温度は３７℃に調節され、各測定前に短い振盪時間をとった。ＧＬＤＨがアンモニアのトランスグルタミナーゼ媒介性放出により飽和される短い遅滞期後、トランスグルタミナーゼターンオーバーに対応する、時間に対する吸光度の線形速度が観察され、ミカエリスメンテン速度分析に供した。１分あたりのミリ光学密度単位（ｍＯＤ  分−１）での吸光度の速度は、（ＮＡＤＨ標準曲線によりあらかじめ決定された）方程式１の式を用いて、ＮＡＤＨターンオーバーのモル速度（ｐｍｏｌ  ｓ−１）に変換された：
ターンオーバー速度＝｜吸光度速度｜＊１．１１１  （方程式１）
[0112]標識化アッセイについて、サーマス・サーモフィラス由来のシャペロンＳｌｙＤ（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ（ＵｎｉＰｒｏｔ）番号Ｑ５
ＳＬＥ７）を、ＫａｌｂＴＧについての標識化スキャフォールドとして用いた。ＳｌｙＤ配列は以下である：
【００９９】
【化９】
2020195397.tif 000014
【０１００】
ＫａｌｂＴＧグルタミン供与配列（Ｑタグ）をＳｌｙＤのＦＫＢＰ上に組換え的に移植し、以下のポリペプチド配列を生じた：
【０１０１】
【化１０】
2020195397.tif 000015
【０１０２】
８×ヒスチジンタグ付きタンパク質を、大腸菌Ｂｌ２１  Ｔｕｎｅｒにおいて産生し、標準Ｎｉセファロースに基づいた固定化金属イオンアフィニティおよびサイズ排除クロマトグラフィ（ＨｉｓＴｒａｐ、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により精製した。
【０１０３】
[0113]標識ペプチドを、（Ｎ末端からＣ末端に順に）「Ｚ」基（すなわち、カルボキシベンジル基）、トランスグルタミナーゼのリジン供与配列（Ｋタグ）、８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸（Ｏ２Ｏｃ）、ペプチド、およびＣｙ３またはＣｙ５蛍光色素を有するように化学合成した。標識ペプチドの一次化学構造は以下であった：
ＫａｌｂＴＧ  Ｋタグ−Ｃｙ３：
Ｚ−ＲＹＥＳＫＧ−Ｏ２Ｏｃ−ＥＵＥＵＥＵＥＵＥＵＥＵＥＵＥＵＥＵＥＵＥＵＥＵＥＵＥＵＥＵＥＵＥＵＥＵＥＵＥＵ−Ｃ（ｓＣｙ３−ＭＨ）−ＯＨ（５８６３．９ｇ／ｍｏｌ）、および
ＭＴＧ  Ｋタグ−Ｃｙ５：
Ｚ−ＲＳＫＬＧ−Ｏ２Ｏｃ−ＥＵＥＵＥＵＥＵＥＵＥＵＥＵＥＵＥＵＥＵＥＵＥＵＥＵＥＵＥＵＥＵＥＵＥＵＥＵＥＵ−Ｃ（Ｃｙ５−ＭＨ）−ＯＨ（５７２３．９ｇ／ｍｏｌ）
式中、Ｅはグルタメートであり、Ｕはβ−アラニンであり、Ｃ（ｓＣｙ３−ＭＨ）およびＣ（Ｃｙ５−ＭＨ）は、それぞれ、スルホ−Ｃｙ３マレイミドまたはＣｙ５マレイミドにより、合成後に修飾されたＣ末端システインを表す。
【０１０４】
[0114]直交性標識化実験について、ＫａｌｂＴＧ  ＱタグおよびＭＴＧ  Ｑタグの両方を含有する分子を、一次化学構造：Ｚ−ＧＧＧＹＲＹＲＱＧＧＧ−ＰＥＧ２７−ＧＩＥＧＲＧ−ＰＥＧ２７−ＰＥＧ２７−ＧＧＧＤＹＡＬＱＧＧ−ＯＨ（６６２０．６ｇ／ｍｏｌ）を有するように化学合成した。
【０１０５】
[0115]全てのペプチドを、市販の構成要素を用いて、０．２５ｎｍｏｌ規模で、標準フルオレニルメチルオキシカルボニル（ＦＭＯＣ）に基づいた固相ペプチド合成によって合成した。固相合成後、ペプチドを、９５％ＴＦＡ、２．５％トリイソプロピルシラン、および２．５％水の溶液で切断した。その後、ペプチドをジイソプロピルエーテルで沈殿させ、水／ＴＦＡアセトニトリルの勾配を用いるＣ１８系逆相高速液体クロマトグラフィ（
ＲＰ１８−ＨＰＬＣ）により精製した。色素標識化を、ペプチドのスルホ−Ｃｙ３マレイミド（Ｌｕｍｉｐｒｏｂｅ）およびＣｙ５マレイミド（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、それぞれとの反応により達成した。色素標識ペプチドの精製を、水／ＴＦＡ  アセトニトリル勾配を用いるＲＰ１８−ＨＰＬＣにより達成した。ペプチドのアイデンティティを、Ｋｉｎｅｔｅｘ  Ｃ１８  ２．６μｍ、５０×３ｍｍカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）を適用する液体クロマトグラフィ−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＲＳＬＣ−ＭＳＱｐｌｕｓシステム）により確認した。
【０１０６】
[0116]他に指示がない限り、標識化反応を、２００ｍＭ  ＭＯＰＳ  ｐＨ７．２および１ｍＭ  ＥＤＴＡ中７２μΜ基質タンパク質、７２０μΜ標識ペプチド、および１μΜトランスグルタミナーゼの存在下、３７℃で１５分間、実施した。ｐＨ依存性標識化プロフィールについて、２００ｍＭ  ＭＯＰＳ中、ｐＨ６．２、６．８、および７．４のそれぞれについて、または２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ中、ｐＨ８．０、８．５、および９．０について、実験を実施した。直交性標識化実験について、１．５μΜ  ＥｃＳｌｙＤ２−Ｘａ−ＫａｌｂＴＧｔ３−８ｘＨｉｓを、１００μΜ基質ペプチドおよび１ｍＭ  ＫａｌｂＴＧ  Ｋタグ−Ｃｙ３を含有する２０μｌの体積に加えた。３７℃で３０分間のインキュベーション後、１ｍＭ  ＭＴＧ  Ｋタグ−Ｃｙ５および１．５μＭ  Ｓ．モバラエンシスＭＴＧを加え、３７℃でさらに１５分間、インキュベートした。反応を、５０ｍＭ  ＴＣＡの添加によって停止した。試料を、インキュベーションステップ間に採取し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ゲル内蛍光法（ＢｉｏＲａｄ  ＣｈｅｍｉＤｏｃゲルドキュメンテーションシステム、Ｃｙ３およびＣｙ５  ＬＥＤならびにフィルターセット）により分析した。さらなる直交性標識化実験について、４．６５μΜ  ＥｃＳｌｙＤ２−Ｘａ−ＫａｌｂＴＧｔ３−８ｘＨｉｓを、３０２μΜ基質ペプチドおよび３．０２ｍＭ  ＫａｌｂＴＧ  Ｋタグ−Ｃｙ３（すなわち、ＫａｌｂＴＧについてのＣｙ３標識リジン基質）を含有する５０μｌの体積に加えた。３７℃で３０分間のインキュベーション後、混合物を、４００μｌバッファーの添加により希釈し、その後、５０μｌに濃縮した（１０ｋＤａ分子量カットオフスピンフィルター）。次に、３．０２ｍＭ  ＭＴＧ  Ｋタグ−Ｃｙ５（すなわち、Ｓ．モバラエンシスＭＴＧについてのＣｙ５標識リジン基質）および４．６５μΜ  Ｓ．モバラエンシスＭＴＧを加え、３７℃でさらに１５分間、インキュベートした。その反応を、５０μＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４の添加により停止した。その後、２μｇの活性化第Ｘ因子を加え、その混合物を、室温で２時間、インキュベートした。その反応を、５０ｍＭ  ＴＣＡの添加により停止した。その混合物を濾過し（０．２μｍスピンフィルター）、ＬＣ−ＭＳにより２１４ｎｍおよび３０５ｎｍにおけるＵＶ検出で分析した。
【０１０７】
[0117]２つの異なる構築物から調製され、かつ２つの異なる温度で保存されたＫａｌｂＴＧ酵素の活性を決定するためにさらなる実験を実施した。試験されたＫａｌｂＴＧｔ３（配列番号１０）酵素およびＫａｌｂＴＧｔ１（配列番号１２）酵素は、それぞれ、実施例３に記載されたＥｃＳｌｙＤ２−Ｘａ−ＫａｌｂＴＧｔ３−８ｘＨｉｓタグ構築物（配列番号８）およびＥｃＳｌｙＤ２−Ｘａ−ＫａｌｂＴＧｔｌ−８ｘＨｉｓタグ構築物（配列番号１１）から得られた。２つのＫａｌｂＴＧ酵素の活性を、４℃かまたは−２０℃のいずれかでの保存後、試験し、公表されたプロトコール（Ｏｔｅｎｇ−Ｐａｂｉら、２０１３、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４４１（２）：１６９〜１７３）に従って、市販のＳ．モバラエンシスＭＴＧの活性に対して比較した。特に、アッセイを、２００μｌの総体積において３７℃で実施した。アッセイ混合物は、ｐＨ７．４における、２００ｍＭ  ＭＯＰＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、および１ｍＭ  ＤＴＴを含んだ。さらに、α−ケトグルタレートおよびＮＡＤＨを５００μＭの濃度で、２Ｕ／ｍｌ  ＧＬＤＨおよび０．１μｇから１．０μｇの間のトランスグルタミナーゼ酵素の１つと共に加えた。グルタミン基質は２００μΜ  Ｚ−ＧＧＧＹＲＹＲＱＧＧＧＧ−ＯＨ（Ｚはカルボキシベンジル基を表す）であり、アミン供与体は１０ｍＭカダベリンであった。全てのデータは３連で収集され（マイクロタイタープレートにおける３ウェルの平均）、ベースライン活性（酵素を含まないバッファー）が引き算された。生じたデータは表４に示されている。
【０１０８】
【表４】
2020195397.tif 000016
【実施例５】
【０１０９】
ＫａｌｂＴＧの３Ｄ結晶構造の同定および特徴づけ
[0118]図７Ａ〜７Ｃに示されているように、Ｋ．アルビダ由来のＭＴＧの完全な構造のＳ．モバラエンシス由来のＭＴＧとのアラインメントは、ＫａｌｂＴＧの性質を知る上での手掛かりを与えた。一態様において、最初の１９個のＮ末端アミノ酸およびＣ末端の人工的なＧＧＧＳＧ−８×Ｈｉｓタグが乱され、それゆえに、構造において解明されなかった。ＫａｌｂＴＧの全体的な構造は、以前に記載されているような（Ｋａｓｈｉｗａｇｉら、２００２、Ｊ  Ｂｉｏ  Ｃｈｅｍ  ２７７（４６）：４４２５２〜４４２６０）Ｓ．モバラエンシスＭＴＧ構造と似ており、α＋βフォールディングクラスのディスク様形状を形成し、２つの複数ループ突出部が、活性部位溝を形成する。しかしながら、構造は、ＫａｌｂＴＧ構造に存在しない２つのαヘリックス（Ｋａｓｈｉｗａｇｉのナンバリングにおいてα４およびα５）、およびＫａｌｂＴＧにおいてより少ない疎水性残基を含む（それぞれ、ＡＦの代わりにＳＦ、およびＬＶの代わりにＱＶ）２つの小さいβストランド（β２およびβ４）の点で異なり、ＫａｌｂＴＧにおける全要素を９個のαヘリックスおよび６個のβストランドのみへと構築する。触媒性三つ組（Ｃｙｓ６４、Ａｓｐ２５５、Ｈｉｓ２７４）は、構造的に保存されている（ＫａｌｂＴＧオープンリーディングフレームの始めからナンバリングすると、Ｃｙｓ８２、Ａｓｐ２１１、Ｈｉｓ２２４）。しかしながら、ＫａｌｂＴＧ  Ｃｙｓ８２のチオール側鎖は、活性溝において、それのＳ．モバラエンシスＭＴＧ対応物より２．６Å、深く埋もれている。Ｓ．モバラエンシスＭＴＧ酵素前駆体の結晶構造（Ｙａｎｇら、２０１１、Ｊ  Ｂｉｏ  Ｃｈｅｍ  ２８６（９）：７３０１〜７３０７）は、活性溝が、Ｌ形プロペプチドによってしっかりと塞がれていることを示す。ＫａｌｂＴＧの結合ポケットは、Ｓ．モバラエンシスＭＴＧのプロペプチドと立体障害なしにアライメントすることができ、類似した酵素前駆体機構がＫａｌｂＴＧにおいて存在し得ることを示す（図７Ｂ）。驚くことに、Ｃｙｓ８２近くの活性溝を形成するループの１つが、アミノ酸配列ＹＲＹＲＡＲ（配列番号４）を提示し、その配列は、グルタミン側鎖を別にすれば、ペプチドアレイにおいて発見された好ましいＫａｌｂＴＧ基質（すなわち、上位の２つの５ｍｅｒペプチドはＹＲＹＲＱ（配列番号１）およびＲＹＲＱＲ（配列番号１４）であった；図７Ｃ）と同一である。したがって、結晶構造の分析は、基質配列の同定に関して、ペプチドアレイの信頼性の独立した確認としての役割を果たした。
【０１１０】
[0119]ＫａｌｂＴＧの結晶化および構造特徴づけについて、ＰＢＳ中のＫａｌｂＴＧを、８ｍｇ／ｍＬタンパク質の、０．２Ｍ酒石酸アンモニウム、２０％ＰＥＧ  ３３５０からなる非緩衝リザーバとの１：１混合によるシッティングドロップ（２００ｎＬ）蒸気拡散方法を用いて２２℃で結晶化した。結晶を、液体窒素における急速冷却の前に、２０％エチレングリコールを含有するリザーバ溶液において凍結保護した。データを、Ｐｉｌａｔｕｓ  ６Ｍ検出器を用いるＳＬＳビームラインＰＸ−ＩＩにおいて１００Ｋで収集し、ＸＤＳ（ＰＭＩＤ  ２０１２４６９２）で空間群Ｐ３において組み込み、スケーリングした。ｌ＝３ｎ鏡映は、＞９の１／δを有し、らせん軸の存在を可能性が低いものにする。Ｓｅｌｆ−Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ分析および双晶分析により、疑わしいデータ病理（ｄａｔａ  ｐａｈｏｌｏｇｉｅｓ）は明らかにされなかった。胞体積は、非対称ユニットにおける２つまたは３つのＫａｌｂＴＧ分子と一致し、それぞれ、３．５Å３／Ｄａおよび２．３Å３／ＤａのＭａｔｔｈｅｗｓパラメータを有した。データ収集統計は表５に要約されている。
【０１１１】
[0120]ＫａｌｂＴＧ（２２６残基）の構造を、検索モデルとしてＳ．モバラエンシス  トランスグルタミナーゼ（３５４残基、ＲＣＳＢタンパク質データバンク（ＰＤＢ）  ＩＤ  Ｎｏ．３ｉｕ０）を用いる分子置換法により決定した。完全Ｓ．モバラエンシスＴＧを用いる最初の試みは概ね不成功であり、理論によって制約されるつもりはないが、それらの酵素が非常に異なるサイズであるためである。その２つのトランスグルタミナーゼは、ＫａｌｂＴＧの全長に対して２８．２％配列同一性および３８．９％配列類似性を共有する。ループ領域を欠き、かつ疎水性コアまでトリミングされたＳ．モバラエンシスＴＧのバリアントは、２１３の対数尤度ゲイン（ｌｏｇ−ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ  ｇａｉｎ）（ＬＬＧ）で空間群Ｐ３において非対称ユニットで２つの分子について検索した場合、Ｐｈａｓｅｒ結晶学ソフトウェア（ＭｃＣｏｙら、２００７  Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ａｕｇ  １；４０（Ｐｔ  ４）：６５８〜６７４）で、ポテンシャル解を生じた。三方晶系空間群Ｐ３１およびＰ３２は、ｌ＝３ｎ鏡映の高い強度と一致して、解を生じなかった。そのモデルは、ＢＵＳＴＥＲ結晶学ソフトウェア（Ｂｌａｎｃら、２００４  Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ．Ｄ６０、２２１０〜２２２１）で４６％のＲｆｒｅｅまで精密化された。いくつかの二次構造要素が、電子密度マップにおいて可視化され、そのモデルに含まれ、その後、ＣＢＵＣＣＡＮＥＥＲおよびＲＥＦＭＡＣ５（Ｗｉｎｎら、２０１１  Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ．Ｄ６７、２３５〜２４２）における自動モデル構築および精密化の１０サイクルに供された。生じたモデルは全てのタンパク質残基を含有し、３０％のＲｆｒｅｅを有した。構造は、ＣＯＯＴ（Ｅｍｓｌｅｙら、２０１０  Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ．Ｄ６６、４８６〜５０１）において完成し、ＰＨＥＮＩＸ（Ａｄａｍｓら、２０１０  Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ．Ｄ６６、２１３〜２２１）で精密化された。モデル精密化統計は表５に収集されている。
【０１１２】
【表５】
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【０１１３】
[0121]表５に関して、最高分解能シェルについての統計は丸括弧内に示されている。
[0122]動的走査熱量（ＤＳＣ）測定を、参照としてＰＢＳを用い、ＶＰ−キャピラリＤＳＣ装置（ＭｉｃｒｏＣａｌ／ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）および９０℃  ｈ−１の走査速度で、２０℃から９０℃の温度範囲において実施した。
【実施例６】
【０１１４】
同定されたＫａｌｂＴＧペプチド基質特性の分析
[0123]表６および７に関して、本明細書で同定されたＫａｌｂＴＧペプチド基質の分析
により、それらの基質に共有される一連の特性が明らかにされた。
【０１１５】
【表６】
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【０１１６】
【表７】
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【０１１７】
[0124]まず、表６に関して、ＫａｌｂＴＧについてのアシル供与基質として同定された２２個の５ｍｅｒペプチド配列が、（Ｎ末端からＣ末端にナンバリングされた）アミノ酸位置を含む情報と共に一文字アミノ酸コード、および個々のアミノ酸（ＲおよびＱ）とアミノ酸群（Ｒ＋Ｑ、Ｆ＋Ｗ＋Ｙ、およびＲ＋Ｑ＋Ｆ＋Ｗ＋Ｙ）の両方についてのアミノ酸数を用いて列挙されている。一態様において、ＫａｌｂＴＧについて、データより、式Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５（式中、Ｘａａは任意のアミノ酸である）を有する５ｍｅｒアミノ酸配列を含むアシル供与基質は、概して、いくつかの設計ルールに従うことが明らかにされた。第１に、各５ｍｅｒ配列は、少なくとも１個のグルタミン（Ｑ）を含んだ。より具体的には、５ｍｅｒ配列の３番目、４番目、および５番目の位置（すなわち、Ｘａａ３、Ｘａａ４、およびＸａａ５）のうちの少なくとも１つがグルタミンであった。注目すべきことには、２個以上の隣接するグルタミンを有する配列は、概して、観察されなかった。しかしながら、３番目の位置および４番目の位置のそれぞれにグルタミンを含むいくつかの配列が、観察された。別の態様において、各５ｍｅｒ配列が少なくとも１個のアルギニン（Ｒ）を含むということが観察された。より具体的には、５ｍｅｒ配列の４番目の位置および５番目の位置（すなわち、Ｘａａ４およびＸａａ５）のうちの少なくとも１つがアルギニンであった。例えば、分析された２２個の配列のそれぞれについて、４番目の位置または５番目の位置のいずれか（しかし、両方ではない）においてアルギニンが見出された。さらに、５番目の位置がアルギニンである場合、少なくとも１個のさらなるアルギニンは、５ｍｅｒ配列の１番目、２番目、および３番目の位置（すなわち、Ｘａａ１、Ｘａａ２、およびＸａａ３）のうちの少なくとも１つに位置した。
【０１１８】
[0125]さらに別の態様において、５ｍｅｒ配列それぞれは、グルタミンに連続的に隣接した少なくとも１個のアルギニンを含んだ。例えば、５ｍｅｒ配列ＦＲＱＲＧ（配列番号８）は、２番目の位置と４番目の位置の両方に位置するアルギニンに隣接する３番目の位置にグルタミンを含み、一方、５ｍｅｒ配列ＹＲＹＲＱ（配列番号１）は、４番目の位置にアルギニン、その後、連続的に、５番目の位置にグルタミンを含む。５ｍｅｒ配列のそれぞれにおける少なくとも１個のアルギニンおよび少なくとも１個のグルタミンの存在に加えて、芳香族側鎖を有するアミノ酸（すなわち、フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシン）が５ｍｅｒ配列の多くにおいて存在することが見出された。特に、５ｍｅｒ配列のそれぞれにおけるアルギニン、グルタミン、フェニルアラニン、トリプトファン、またはチロシンにより占められる位置の総数は少なくとも４つであることが観察された（表６における最後の列  −  Ｒ＋Ｑ＋Ｆ＋Ｗ＋Ｙについてのアミノ酸数を参照）。例えば、５ｍｅｒ配列ＦＲＱＲＧ（配列番号８）は、アルギニン、グルタミン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンから選択されるアミノ酸によって占められる合計４つの位置について、グルタミン、２個のアルギニン、およびフェニルアラニンを含む。別の例において、５ｍｅｒ配列ＹＲＹＲＱ（配列番号１）は、アルギニン、グルタミン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンから選択されるアミノ酸によって占められる合計５つの位置について、２個のアルギニン、２個のフェニルアラニン、およびグルタミンを含む。とりわけ、芳香族アミノ酸を欠く５ｍｅｒ配列は、アルギニンおよびグルタミンから選択される合計少なくとも４個のアミノ酸を含む（例えば、ＱＲＱＲＱ（配列番号１９）、ＱＲＱＴＲ（配列番号３６））。
【０１１９】
[0126]表７に関して、ＫａｌｂＴＧについてのアミン供与基質として同定された２２個の５ｍｅｒペプチド配列が、（Ｎ末端からＣ末端にナンバリングされた）アミノ酸位置を含む情報と共に一文字アミノ酸コード、および個々のアミノ酸（Ｋ、Ｙ、Ｒ、Ｓ）とアミノ酸群（Ｋ＋Ｙ＋Ｒ＋Ｓ）の両方についてのアミノ酸数を用いて列挙されている。表６におけるアシル供与配列について得られたデータと同様に、ＫａｌｂＴＧについて、式Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５（式中、Ｘａａは任意のアミノ酸である）を有する５ｍｅｒアミノ酸配列を含むアミン供与基質が、概して、いくつかの設計ルールに従った。第１に、各５ｍｅｒ配列は少なくとも１個のリジン（Ｋ）を含んだ。より具体的には、各５ｍｅｒ配列の４番目の位置および５番目の位置のうちの少なくとも１つがリジンであり、ただし、唯一の例外が５ｍｅｒ配列ＹＫＧＲＧ（配列番号２９）であった。注目すべきことには、２個以上の隣接したリジンを有する配列は、概して、観察されなかった。合計２個のリジンを含むいくつかの５ｍｅｒ配列が観察されたが、２個より多いリジンを有する５ｍｅｒ配列は、分析された５ｍｅｒ配列の間では見出されなかった。別の態様において、たいていの５ｍｅｒ配列は少なくとも１個のチロシン（Ｙ）を含むことが観察されたが、表７における２２個の配列のうちのたった２個の例外が、ＲＷＫＦＫ（配列番号４８）およびＡＲＳＫＬ（配列番号３０）であった。
【０１２０】
[0127]表７における５ｍｅｒ配列に出現する、アミノ酸リジンおよびチロシンに次いで、最も頻繁に存在するアミノ酸は、アルギニンおよびセリンであり、少なくとも１個のアルギニンまたはセリンが、５ｍｅｒ配列の多くにおいて存在する。特に、５ｍｅｒ配列のそれぞれにおいてリジン、チロシン、アルギニン、またはセリンにより占められる位置の総数は少なくとも３つであることが観察された（表７における最後の列  −  Ｋ＋Ｙ＋Ｒ＋Ｓについてのアミノ酸数を参照）。例えば、５ｍｅｒ配列ＮＹＲＦＫ（配列番号４５）は、リジン、チロシン、アルギニン、およびセリンから選択されるアミノ酸によって占められる合計３つの位置について、チロシン、アルギニン、およびリジンを含む。別の例において、５ｍｅｒ配列ＲＹＲＳＫ（配列番号２７）は、リジン、チロシン、アルギニン、およびセリンから選択されるアミノ酸によって占められる合計５つの位置について、２個のアルギニン、チロシン、セリン、およびリジンを含む。
【０１２１】
[0128]注目すべきことには、全ての５ｍｅｒ配列は、リジン、チロシン、およびアルギニンかまたはセリンのいずれかから選択される合計少なくとも２個のアミノ酸を含んだ。例えば、ＡＲＳＫＬ（配列番号３０）は、１個のリジン、１個のアルギニン、１個のセリンを含み、チロシンを含まない。したがって、リジン、チロシン、およびアルギニンから選択されるアミノ酸の総数は２つであり、リジン、チロシン、およびセリンから選択されるアミノ酸の総数もまた２つである。もちろん、５ｍｅｒ配列ＡＲＳＫＬ（配列番号３０）における、リジン、チロシン、アルギニン、またはセリンによって占められる位置の総数は、上記で論じられているように、少なくとも３つである。関連した態様において、リジンと、アミノ酸チロシンおよびアルギニンのうちの少なくとも１個の両方を有する５ｍｅｒ配列は、リジン、チロシン、およびアルギニンから選択された合計少なくとも２個のアミノ酸を含んだ（例えば、ＡＲＳＫＬ（配列番号３０）、ＦＹＥＳＫ（配列番号５９））。さらに、５ｍｅｒ配列のそれぞれは、位置１および２（すなわち、Ｘａａ１およびＸａａ２）のうちの１つに少なくとも１個のチロシンまたはアルギニンを含んだ。
【０１２２】
[0129]図に示された概略的フローチャートは、全体的に、論理フローチャート図として示されている。それとして、描かれた順番およびラベル付けされたステップは、提示された方法の一実施形態を示す。図示された方法の１つもしくは複数のステップ、またはそれらの部分と、機能、論理、または効果において等価である他のステップおよび方法が想像され得る。加えて、図に用いられた形式および符合は、方法の論理的ステップを説明するために提供され、方法の範囲を限定するものではないと理解される。様々な矢印の型および線の型が用いられ得るが、それらは、対応する方法の範囲を限定するものではないと理解される。実際、いくつかの矢印または他のコネクターが、方法の論理的フローのみを示すために用いられ得る。例として、矢印は、描かれた方法の列挙されたステップ間の不特定な持続時間の待ち時間またはモニタリング時間を示し得る。加えて、特定の方法が起こる順番は、示された対応するステップの順番を厳密に守る場合もあるし、守らない場合もある。
【０１２３】
[0130]本発明は、同様の番号が同じ、または類似した要素を表す図を参照して、以下の説明においていくつかの様々な実施形態で提示されている。「一実施形態（ｏｎｅ  ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」、「１つの実施形態（ａｎ  ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」、または類似した言語への、この明細書を通じての言及は、その実施形態と関連して記載された特定の特徴、構造、または特性が、本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、この明細書を通じての、句「一実施形態において」、「１つの実施形態において」、および類似した言語の出現は、必ずしもではないが、全て、同じ実施形態を言及する。
【０１２４】
[0131]本発明の記載された特徴、構造、または特性は、任意の適切な様式で、１つまたは複数の実施形態において組み合わせられ得る。以下の説明において、多数の特定の詳細は、系の実施形態の完璧な理解を提供するために列挙される。しかしながら、系および方法はどちらも、特定化された詳細の１つもしくは複数を含まずに、または他の方法、成分、材料などと共に、実施され得ることを当業者は認識するだろう。他の例では、よく知られた構造、材料、または操作は、本発明の態様を曖昧にすることを避けるために、詳細には示されず、または記載されていない。したがって、前述の記載は、例示的であることを意図され、本発明の概念の範囲を限定しない。
【０１２５】
[0132]本出願に同定された各参考文献は、全体として参照により本明細書に組み込まれる。
＜態様＞
態様１．ペプチド配列ＹＲＹＲＱ（配列番号１）と少なくとも８０％配列同一性を有するアシル供与タグ、およびペプチド配列ＲＹＥＳＫ（配列番号２）と少なくとも８０％配列同一性を有するアミン供与タグのうちの１つを含む、微生物トランスグルタミナーゼについての基質タグ。
態様２．微生物トランスグルタミナーゼが、カツネリア・アルビダ（Ｋｕｔｚｎｅｒｉａ  ａｌｂｉｄａ）微生物トランスグルタミナーゼ（配列番号６）と少なくとも８０％配列同一性を有する、態様１に記載の基質タグ。
態様３．検出可能な標識をさらに含む、態様１に記載の基質タグ。
態様４．検出可能な標識が、ビオチン部分、蛍光色素、ルテニウム標識、放射標識、および化学発光標識から選択される、態様３に記載の基質タグ。
態様５．アシル供与タグがペプチド配列ＡＰＲＹＲＱＲＡＡ（配列番号２４）を有する、態様１に記載の基質タグ。
態様６．微生物トランスグルタミナーゼを第１の基質および第２の基質に曝露するステップであって、前記第１の基質が、ペプチド配列ＹＲＹＲＱ（配列番号１）と少なくとも８０％配列同一性を有するアシル供与タグを含み、前記第２の基質が、ペプチド配列ＲＹＥＳＫ（配列番号２）と少なくとも８０％配列同一性を有するアミン供与タグを含む、ステップ、ならびに
前記第１の基質と前記第２の基質を架橋するステップであって、それにより、アシル供与タグとアミノ供与タグの間にイソペプチド結合を形成する、ステップ
を含む、微生物トランスグルタミナーゼの存在下でイソペプチド結合を形成する方法。
態様７．微生物トランスグルタミナーゼがカツネリア・アルビダ微生物トランスグルタミナーゼ（配列番号６）と少なくとも８０％配列同一性を有する、態様６に記載の方法。
態様８．第１の基質と第２の基質を架橋するステップが、アシル供与タグのγ−カルボキサミド基とアミノ供与タグのε−アミノ基の間にイソペプチド結合を形成する、態様６に記載の方法。
態様９．第１の基質および第２の基質のうちの少なくとも１つが検出可能な標識を含む、態様６に記載の方法。
態様１０．検出可能な標識が、ビオチン部分、蛍光色素、ルテニウム標識、放射標識、および化学発光標識から選択される、態様９に記載の方法。
態様１１．アシル供与タグがペプチド配列ＡＰＲＹＲＱＲＡＡ（配列番号２４）を有する、態様６に記載の方法。
態様１２．第１の基質の第２の基質への架橋が少なくとも約７０％の収率で達成される、態様６に記載の方法。
態様１３．前記収率が約３０分以内に達成される、態様１２に記載の方法。
態様１４．カツネリア・アルビダ微生物トランスグルタミナーゼ（配列番号６）と少なくとも８０％配列同一性を有する、精製された微生物トランスグルタミナーゼを含む、微生物トランスグルタミナーゼの存在下でイソペプチド結合を形成するためのキット。
態様１５．ペプチド配列ＹＲＹＲＱ（配列番号１）と少なくとも８０％配列同一性を有するアシル供与タグを含む第１の基質およびペプチド配列ＲＹＥＳＫ（配列番号２）と少なくとも８０％配列同一性を有するアミン供与タグを含む第２の基質のうちの１つをさらに含む、態様１４に記載のキット。
態様１６．第１の基質および第２の基質の少なくとも１つが検出可能な標識を含む、態様１５に記載のキット。
態様１７．検出可能な標識が、ビオチン部分、蛍光色素、ルテニウム標識、放射標識、および化学発光標識から選択される、態様１６に記載のキット。
態様１８．アシル供与タグがペプチド配列ＡＰＲＹＲＱＲＡＡ（配列番号２４）を有する、態様１５に記載のキット。
態様１９．第１の基質および第２の基質のうちの他方の１つをさらに含む、態様１５に記載のキット。
態様２０．カツネリア・アルビダ微生物トランスグルタミナーゼ（配列番号６）と少なくとも８０％配列同一性を有する、単離された微生物トランスグルタミナーゼを含む、イソペプチド結合を形成するための酵素。
態様２１．単離された微生物トランスグルタミナーゼがアンモニウムの存在下で発現し、単離される、態様２０に記載の酵素。
態様２２．アンモニウムが少なくとも約１０μＭの濃度で存在する、態様２１に記載の酵素。
態様２３．式Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５を有するアミノ酸配列を含む、トランスグルタミナーゼについてのアシル供与基質であって、Ｘａａが任意のアミノ酸であり、Ｘａａ３、Ｘａａ４、およびＸａａ５のうちの少なくとも１個がグルタミンであり、Ｘａａ４およびＸａａ５のうちの１個がアルギニンであり、前記アミノ酸配列が、グルタミンと連続的に隣接した少なくとも１個のアルギニンを含み、アルギニン、グルタミン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンから選択される、前記アミノ酸配列におけるアミノ酸の総数が少なくとも４個である、アシル供与基質。
態様２４．Ｘａａ５と、Ｘａａ１、Ｘａａ２、およびＸａａ３の少なくとも１個とがアルギニンである、態様２３に記載のアシル供与基質。
態様２５．式Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５を有するアミノ酸配列を含む、トランスグルタミナーゼについてのアミン供与基質であって、Ｘａａが任意のアミノ酸であり、前記アミノ酸配列が少なくとも１個のリジンを含み、Ｘａａ１およびＸａａ２のうちの１個がチロシンおよびアルギニンから選択され、アルギニン、セリン、チロシン、およびリジンから選択される、前記アミノ酸配列におけるアミノ酸の総数が少なくとも３個である、アミン供与基質。
態様２６．Ｘａａ４およびＸａａ５のうちの１個がリジンである、態様２５に記載のアミン供与基質。
態様２７．アミノ酸配列が２個以下のアミノ酸リジンを含む、態様２５に記載のアミン供与基質。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【配列表】
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