(57)【要約】      （修正有）【課題】非ヒト動物における豚丹毒菌の感染を効果的に防御でき、しかも安全性の高い新規な豚丹毒菌、および該豚丹毒菌を用いたワクチン組成物を提供すること。【解決手段】グルタミン酸からプロリンを合成する経路に関連する酵素または１−ピロリン−３−ヒドロキシ−５−カルボキシレートからプロリンを合成する経路に関連する酵素をコードするプロリン合成関連遺伝子が遺伝子破壊されていることにより、前記遺伝子の機能が低下または欠損されていることを特徴とする豚丹毒菌プロリン合成関連遺伝子欠損株。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルタミン酸からプロリンを合成する経路に関連する酵素または１−ピロリン−３−ヒドロキシ−５−カルボキシレートからプロリンを合成する経路に関連する酵素をコードするプロリン合成関連遺伝子が遺伝子破壊されていることにより、前記遺伝子の機能が低下または欠損されていることを特徴とする豚丹毒菌プロリン合成関連遺伝子欠損株。
【請求項２】
前記プロリン合成関連遺伝子をコードする塩基配列を構成する少なくとも１つ以上の塩基が置換または欠失している請求項１に記載の豚丹毒菌プロリン合成関連遺伝子欠損株。
【請求項３】
プロリン合成関連遺伝子がｐｒｏＡ、ｐｒｏＢおよびｐｒｏＣからなる群より選ばれる１つ以上である請求項１または２記載の豚丹毒菌プロリン合成関連遺伝子欠損株。
【請求項４】
豚丹毒菌プロリン合成関連遺伝子欠損株が、豚丹毒菌藤沢株（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｐｐｈａｔｈｉａｅ  Ｆｕｊｉｓａｗａ）の変異株であるＥＲｐｒｏＡ株（ＮＩＴＥ  Ｐ−０２７６９）、ＥＲｐｒｏＢ株（ＮＩＴＥ  Ｐ−０２７７０）、ＥＲｐｒｏＣ株（ＮＩＴＥ  Ｐ−０２７７１）、ＥＲｐｒｏＡＢ株（ＮＩＴＥ  Ｐ−０２７７２）またはＥＲｐｒｏＡＢＣ株（ＮＩＴＥ  Ｐ−０２７７３）である請求項１〜３のいずれかに記載の豚丹毒菌プロリン合成関連遺伝子欠損株。
【請求項５】
非ヒトの動物における豚丹毒菌に関連する疾患の治療または予防に使用するためのワクチン組成物であって、
請求項１〜４のいずれかに記載の豚丹毒菌プロリン合成関連遺伝子欠損株を含むことを特徴とするワクチン組成物。
【請求項６】
非ヒトの動物における疾患の治療または予防のための医薬組成物を製造するための、請求項１〜４のいずれかに記載の豚丹毒菌プロリン合成関連遺伝子欠損株の使用。
【請求項７】
前記豚丹毒菌弱毒株がワクチンベクターである請求項６に記載の豚丹毒菌プロリン合成関連遺伝子欠損株の使用。
【請求項８】
前記豚丹毒菌弱毒株が、豚丹毒菌以外の外来異種抗原を発現するよう形質転換されている請求項６に記載の豚丹毒菌プロリン合成関連遺伝子欠損株の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は豚丹毒菌プロリン合成関連遺伝子欠損株に関する。詳しくは、本発明は、豚丹毒菌プロリン合成関連遺伝子欠損株ならびに動物の感染予防用ワクチンとしての使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
豚丹毒は豚丹毒菌（エリシペロスリクス・ルシオパシエ菌  Erysipelothrix rhusiopathiae）の感染によって起こる人畜共通感染症である。前記豚丹毒菌は、豚、イノシシのほか、ヒトを含む哺乳類、鳥類に感染することが確認されている。中でも、名称のとおり、豚の疾病を引き起こす細菌として有名で、豚丹毒は世界中の養豚地帯で発生している。豚丹毒の経過は甚急性で致死率も高く、慢性経過をとった場合は関節炎を惹起し、保菌豚となることがある。出荷豚がと畜検査で陽性となった場合、その個体は全廃棄となり経済損失は極めて大きい。また、豚丹毒菌がヒトに感染した場合、敗血症や関節炎を発症させることも知られており、豚丹毒菌は、家畜衛生のみならず、公衆衛生面からも重要な細菌と位置づけられている。
【０００３】
前記豚丹毒の予防にはワクチンが有効で、現在、豚丹毒菌小金井６５−０．１５株が使用されている。この株はアクリフラビンを含む培地で継代を重ねることで得られた弱毒株であるが、この弱毒化の機構は不明である。
一方、食肉検査所において、豚丹毒として廃棄される豚の関節からは、豚丹毒菌小金井６５−０．１５株が分離される事例が多く報告されている。本発明者らが解析したところ、このワクチンを利用する農場にて豚団毒を発症した株から分離された株の６５％（１０１／１５５株）は小金井６−０．１５株であり、そのうち４株はマーカーとされるアクリフラビン耐性を消失していた（非特許文献１）。また、豚丹毒菌小金井６５−０．１５株の弱毒化の機構は、前記のとおり不明であるため、強毒株復帰への懸念がある。事実、本発明者らは、野外臨床分離菌の解析を基に、豚丹毒菌小金井６５−０．１５株の強毒化に関わると考えられる病原性復帰変異が起こることを明らかにしている（非特許文献２、３）。
【０００４】
したがって、豚丹毒菌小金井６５−０．１５株にかわる、より安全なワクチン用株が求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】白岩ら、J.  Vet  Med Sci, vol79(4) 2017, 669-701
【非特許文献２】下地ら、「豚丹毒菌生ワクチン Koganei 65-0.15株の弱毒化機構の解析」、第１５７回日本獣医学会抄録  379頁
【非特許文献３】小川ら、「豚丹毒菌生ワクチン Koganei 65-0.15株の強毒化に関わる遺伝子の同定」、第８８回日本細菌学会総会抄録、173頁）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、非ヒト動物における豚丹毒菌の感染を効果的に防御でき、しかも安全性の高い新規な豚丹毒菌、および該豚丹毒菌を用いたワクチン組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、長年、豚丹毒菌の感染と発病機構について研究をしているが、豚丹毒菌の発育に必要なプロリンの合成経路に関連する３遺伝子（ｐｒｏＡ、ｐｒｏＢ、ｐｒｏＣ）を欠損させることで、弱毒化した安全な株を新たに作製することに成功し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明の要旨は、
〔１〕グルタミン酸からプロリンを合成する経路に関連する酵素または１−ピロリン−３−ヒドロキシ−５−カルボキシレートからプロリンを合成する経路に関連する酵素をコードするプロリン合成関連遺伝子が遺伝子破壊されていることにより、前記遺伝子の機能が低下または欠損されていることを特徴とする豚丹毒菌プロリン合成関連遺伝子欠損株、
〔２〕前記プロリン合成関連遺伝子をコードする塩基配列を構成する少なくとも１つ以上の塩基が置換または欠失している前記〔１〕に記載の豚丹毒菌プロリン合成関連遺伝子欠損株、
〔３〕プロリン合成関連遺伝子がｐｒｏＡ、ｐｒｏＢおよびｐｒｏＣからなる群より選ばれる１つ以上である前記〔１〕または〔２〕記載の豚丹毒菌プロリン合成関連遺伝子欠損株、
〔４〕豚丹毒菌プロリン合成関連遺伝子欠損株が、豚丹毒菌藤沢株（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｐｐｈａｔｈｉａｅ  Ｆｕｊｉｓａｗａ）の変異株であるＥＲｐｒｏＡ株（ＮＩＴＥ  Ｐ−０２７６９）、ＥＲｐｒｏＢ株（ＮＩＴＥ  Ｐ−０２７７０）、ＥＲｐｒｏＣ株（ＮＩＴＥ  Ｐ−０２７７１）、ＥＲｐｒｏＡＢ株（ＮＩＴＥ  Ｐ−０２７７２）またはＥＲｐｒｏＡＢＣ株（ＮＩＴＥ  Ｐ−０２７７３）である前記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の豚丹毒菌プロリン合成関連遺伝子欠損株、
〔５〕非ヒトの動物における豚丹毒菌に関連する疾患の治療または予防に使用するためのワクチン組成物であって、
前記〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の豚丹毒菌プロリン合成関連遺伝子欠損株を含むことを特徴とするワクチン組成物、
〔６〕非ヒトの動物における疾患の治療または予防のための医薬組成物を製造するための、前記〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の豚丹毒菌プロリン合成関連遺伝子欠損株の使用、
〔７〕前記豚丹毒菌弱毒株がワクチンベクターである前記〔６〕に記載の豚丹毒菌プロリン合成関連遺伝子欠損株の使用、
〔８〕前記豚丹毒菌弱毒株が、豚丹毒菌以外の外来異種抗原を発現するよう形質転換されている前記〔６〕に記載の豚丹毒菌プロリン合成関連遺伝子欠損株の使用
に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の豚丹毒菌プロリン合成関連遺伝子欠損株は、その弱毒化の機構が明らかであり、しかもＰＣＲ法等で野外株と容易に識別できる遺伝子マーカーを持つことから、安全性に優れたワクチン用株として使用することができる。
また、外来異種抗原を発現させたワクチンベクターとしても使用することが可能である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明の豚丹毒菌プロリン合成関連遺伝子欠損株（以下、本発明の豚丹毒菌という）は、グルタミン酸からプロリンを合成する経路に関連する酵素または１−ピロリン−３−ヒドロキシ−５−カルボキシレートからプロリンを合成する経路に関連する酵素をコードするプロリン合成関連遺伝子が遺伝子破壊されていることにより、前記遺伝子の機能が低下または欠損されていることを特徴とする豚丹毒菌である。
【００１１】
豚丹毒菌においてはグルタミン酸およびプロリン代謝経路は公知であり、例えば、ＫＥＧＧKyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）パスウェイマップに記載されている。
そして、前記グルタミン酸からプロリンを合成する経路に関連する酵素について、前記１−ピロリン−３−ヒドロキシ−５−カルボキシレートからプロリンを合成する経路に関連する酵素としては、グルタメート５−キナーゼ（glutamate 5-kinase）（ＥＣ２．７.２．１１）、グルタメート−５−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（glutamate-5-semialdehyde dehydrogenase）（ＥＣ１．２．１．４１）などが挙げられている。
前記１−ピロリン−３−ヒドロキシ−５−カルボキシレートからプロリンを合成する経路に関連する酵素としては、プロリンオキシダーゼピロリン−５−カルボキシレートレダクターゼ（pyrroline-5-carboxylate reductase）（ＥＣ１．５．１．２）などが挙げられる。
【００１２】
前記酵素をコードするゲノムＤＮＡについても公知であり、例えば、豚丹毒菌藤沢株（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ  ｓｔｒ．  Ｆｕｊｉｓａｗａ）のゲノムＤＮＡにコードされている。
例えば、グルタメート５−キナーゼの遺伝子については、例えば、生命システム情報統合データベースであるＫＥＧＧにおいて、「Ｋ００９３１」としてエントリーされており、その遺伝子については「ｐｒｏＢ」として公知の塩基配列を指す。
グルタメート−５−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼの遺伝子については、ＫＥＧＧにおいて、「Ｋ００１４７」としてエントリーされており、その遺伝子については「ｐｒｏＡ」として公知の塩基配列を指す。
プロリンオキシダーゼピロリン−５−カルボキシレートレダクターゼの遺伝子については、ＫＥＧＧにおいて、「Ｋ００２８６」エントリーされており、その遺伝子については「ｐｒｏＣ」として公知の塩基配列を指す。
【００１３】
本発明の豚丹毒菌は、親株となる豚丹毒菌において、プロリン合成関連遺伝子であるｐｒｏＡ、ｐｒｏＢ、ｐｒｏＣのいずれか１つ以上の遺伝子が欠損していることによって、菌体内におけるｐｒｏＡ、ｐｒｏＢ、ｐｒｏＣの発現能が、低下または完全に失活している形質転換株をいう。
本発明の豚丹毒菌としては、前記ｐｒｏＡ、ｐｒｏＢ、ｐｒｏＣのいずれか１つの遺伝子が欠損している株、前記ｐｒｏＡおよびｐｒｏＢの遺伝子が欠損している株、前記ｐｒｏＡおよびｐｒｏＣの遺伝子が欠損している株、前記ｐｒｏＢおよびｐｒｏＣの遺伝子が欠損している株、前記ｐｒｏＡ、ｐｒｏＢおよびｐｒｏＣの遺伝子がすべて欠損している株が含まれる。
【００１４】
前記親株として用いる豚丹毒菌は、例えば、農場、食肉検査所などの野外より分離された豚丹毒菌および市販されている豚丹毒菌のいずれでもよいが、特に限定はない。
【００１５】
前記ｐｒｏＡ、ｐｒｏＢまたはｐｒｏＣの機能を欠損させる方法としては、遺伝子組換法による遺伝子破壊、突然変異法による機能欠損の誘導などが挙げられる。例えば、操作性がよく、ｐｒｏＡ、ｐｒｏＢまたはｐｒｏＣの機能を欠損させる効率がよい観点から、インフレーム・デリーション法を用いて、ｐｒｏＡ、ｐｒｏＢまたはｐｒｏＣをコードしている塩基配列の上下流域の遺伝子をｐｒｏＡ、ｐｒｏＢまたはｐｒｏＣを除去した形で繋ぎ合わせたり、ｐｒｏＡ、ｐｒｏＢまたはｐｒｏＣをコードしている塩基配列の一部を除いて繋ぎ合わせたりして、得られた遺伝子断片を豚丹毒菌の菌体内に導入して、前記豚丹毒菌が有する染色体と前記遺伝子断片とをホモロガス・リコンビネーションで置き換える方法などが挙げられる。
なお、前記インフレーム・デリーション法、豚丹毒菌の菌体内に外来遺伝子を導入する方法、豚丹毒菌の菌体内で染色体と外来遺伝子とをホモロガス・リコンビネーションさせる方法などについては、公知の方法に従えばよい。
【００１６】
前記遺伝子組換法による遺伝子破壊には、公知の方法を用いることができる。例えば、ｐｒｏＡ、ｐｒｏＢまたはｐｒｏＣをコードする塩基配列の断片もしくはその上流・下流の領域とマーカー遺伝子とを組み合わせたＤＮＡ断片をベクターに組み込み、プロトプラスト−ＰＥＧ法やエレクトロポレーション法などによってベクターを親株の豚丹毒菌に取り込ませ、相同組換えによって当該ＤＮＡ断片を親株の豚丹毒菌のゲノム中に導入する方法などを挙げられる。ＤＮＡ断片を親株の豚丹毒菌細胞中に取り込ませる他の方法としては、パーティクルガン法、アグロバクテリウム法、マイクロインジェクション法などが挙げられる。
【００１７】
遺伝子組換法によって所期の遺伝子が豚丹毒菌に導入されたことを確認する方法としては、公知の方法を用いることができる。例えば、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法等を用いて、目的とする遺伝子座がマーカーによって置換されていることを確認する必要がある。また、所期の遺伝子を導入する際に、親株として栄養要求性の突然変異株を、マーカー遺伝子として当該栄養要求性を補償するような機能を持つ遺伝子を用い、形質転換後に栄養要求性培地上で正常に生育した株を選抜する方法なども挙げられる。
【００１８】
また、前記変異導入法としては、公知の処理方法を用いることができ、紫外線、イオンビーム、放射線等を照射させる物理的方法、エチルメタンスルホネート、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、亜硝酸、アクリジン色素等の変異剤を用いる化学的方法がある。特に好ましくは、イオンビーム、紫外線を照射させる方法を挙げることができる。
【００１９】
前記のような遺伝子破壊法、または変異導入法によってｐｒｏＡ、ｐｒｏＢまたはｐｒｏＣの機能が低下または欠損されている株をスクリーニングする方法としては、選抜した候補株からゲノムＤＮＡを抽出し、シークエンス解析で確認する方法などを挙げることができる。他の方法としては、コロニーハイブリダイゼーション法等を利用することができる。
【００２０】
前記ｐｒｏＡ、ｐｒｏＢまたはｐｒｏＣの遺伝子が欠損していることの確認は、シークエンス等の公知の方法で行うことができる。具体的には、本発明においてｐｒｏＡ、ｐｒｏＢまたはｐｒｏＣをコードする塩基配列を構成する少なくとも１つ以上の塩基が置換または欠失していれば酵素活性を失活しているとする。置換または欠失されている塩基の数については、特に限定はない。
【００２１】
前記のようにして得られる本発明の豚丹毒菌は、公知の遺伝子であるｐｒｏＡ、ｐｒｏＢ、ｐｒｏＣのいずれかの機能を欠損させるという弱毒化の機構が明らかであり、また遺伝子マーカーとして前記ｐｒｏＡ、ｐｒｏＢ、ｐｒｏＣを用い、ＰＣＲ法等でｐｒｏＡ、ｐｒｏＢ、ｐｒｏＣの全てが増幅されるか否かで、野外株と容易に識別できることから、安全性に優れたワクチンとして使用することができる。
なお、ＰＣＴ法などでｐｒｏＡ、ｐｒｏＢ、ｐｒｏＣを増幅する手法については、使用する装置のマニュアルに従って行えばよく、特に限定はない。
【００２２】
本発明の豚丹毒菌は、非ヒトの動物における豚丹毒菌に関連する疾患の治療または予防に使用するためのワクチン組成物に使用することができる。
【００２３】
前記ワクチン組成物では、本発明の豚丹毒菌を生ワクチンとして使用する。
【００２４】
本発明のワクチン組成物は、非ヒトの動物に投与することを目的とする。非ヒトの動物としては、ブタ、イノシシのほか、ニワトリ、七面鳥、イルカなどが挙げられるが特に限定はない。
【００２５】
本発明のワクチン組成物の非ヒトの動物への投与は、例えば、皮下、皮内、鼻腔内的、経気管支的又は経口的に当業者に公知の方法により行いうる。
【００２６】
また、前記ワクチン組成物は、本発明の豚丹毒菌と、溶媒とを含んでいればよい。
前記溶媒としては、水、生理食塩水、溶解液、グリコール、ポリグリコール、プロピレングリコール、ポリグリコールエーテル、ＤＭＳＯ、各種液体培地などが挙げられる。
また、必要に応じて、ラクトース、グルタメート、油性物質（鉱油、植物油、動物油）またはワックスを含んでもよい。
また、経口投与については、マンニトール、ラクトース、スターチ、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、滑石、セルロース、グルコース、スクロースおよび炭酸マグネシウムのような固体担体を用いてもよい。
前記成分の含有量としては、特に限定はない。
【００２７】
本発明のワクチン組成物の投与量は、非ヒトの動物の体重や齢、投与方法、使用目的等により変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。
【００２８】
本発明のワクチン組成物による作用には、豚丹毒菌種の感染経験の無い動物への予防的な投与によって、感染症の発症を阻害する作用が含まれる。
【００２９】
また、本発明の豚丹毒菌は、前記ワクチン組成物に加えて、治療または予防目的の疾患に対する有効成分を含有することで豚丹毒菌だけでなく、他の疾患の治療または予防するための医薬組成物を作製することができる。
前記有効成分としては、本発明の豚丹毒菌に悪影響を与えるものでなければよく、特に限定はない。
【００３０】
また、本発明の豚丹毒菌には、豚丹毒菌以外の外来異種抗原などを組み込んで発現させることでワクチンベクターとして使用することもできる。
【００３１】
前記外来異種抗原を本発明の豚丹毒菌で発現させる手段としては、例えば、特開２００２−１１９２８５号公報に記載の方法に準じて、所望の外来異種抗原をコードする遺伝子を豚丹毒菌のＳｐａＡ．１遺伝子の中央部に挟むようにして設計したキメラ遺伝子を作製し、このキメラ遺伝子を本発明の豚丹毒菌に形質転換する方法が挙げられる。
前記外来異種抗原としては、例えば、マイコプラズマ・ハイオニューモニエのP97抗原
などが挙げられるが、特に限定はない。
【００３２】
以上のようにして得られる本発明の豚丹毒菌は、常法の培養手段を用いることで、低コストで簡易に増殖させることができる。また、本発明の豚丹毒菌は非ヒトの動物に投与されると、前記動物体内の各部に定着し、その各部に導入された各種感染防御抗原を投与することができる。
さらに、本発明の豚丹毒菌は、生きている限り、定着している前記動物体内に感染防御抗原を供給し続けることが可能であるため、一度、豚丹毒菌を投与すれば所望の効果が奏される。
【実施例】
【００３３】
以下、実施例において本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
【００３４】
（実施例１）豚丹毒菌プロリン合成関連遺伝子欠損株ＥＲｐｒｏＡ株（ＮＩＴＥ  Ｐ−０２７６９）の作製
ｐｒｏＡをコードする塩基配列の上下流域の遺伝子を、インフレーム・デリーション法によって、ｐｒｏＡ遺伝子の３１番目から１２０３番目の塩基（１１７３ｂｐ）を欠損させた形でつなぎ合わせ、得られた遺伝子断片を豚丹毒菌の菌体内にエレクトロポレーション法を用いて導入することにより、豚丹毒菌の染色体とその遺伝子断片がホモロガス・リコンビネーションで置き換わった株を作製した。
インフレーム・デリーション法は、具体的には、Appl Environ Microbiol. 2004, 70(11):6887-6891 に記載の手順に基づいておこなった。
なお、遺伝子断片は、ｐｒｏＡの上下流域の断片をそれぞれＰＣＲ法により増幅し、それらを結合させた形の遺伝子断片をさらにテンプレートとしてＰＣＲを行うことにより得た。なお、ＰＣＲの条件は、添付のマニュアルに従った。
豚丹毒菌としては、豚丹毒菌Ｆｕｊｉｓａｗａ株を用いた。
また、前記遺伝子断片がホモロガス・リコンビネーションで置き換わった株の確認は、ｐｒｏＡの上下流に設計したプライマーを用いてＰＣＲを行い、その遺伝子断片の配列をシークエンスにより確認することで行った。
【００３５】
得られたＥＲｐｒｏＡ株について、シークエンスにより遺伝子配列を確認したところ、親株であるＦｕｊｉｓａｗａ株ではｐｒｏＡを有していたのに対して、ＥＲｐｒｏＡ株では、ｐｒｏＡの当該領域が欠損していることを確認した。
したがって、ＥＲｐｒｏＡ株は、ｐｒｏＡが遺伝子破壊されていることにより、この遺伝子の機能が欠損されている豚丹毒菌であることがわかった。
なお、前記シークエンスには、Applied Biosystems 社製「3130xl Genetic Analyzer」を用いた。
【００３６】
なお、豚丹毒菌（エリシペロスリクス・ルシオパシエ）である前記ＥＲｐｒｏＡ株は、本件出願人が、２０１８年８月２３日付けにて独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物センターに寄託し、受託番号「ＮＩＴＥ  Ｐ−０２７６９」が付されている。
【００３７】
（実施例２）豚丹毒菌プロリン合成関連遺伝子欠損株ＥＲｐｒｏＢ株（ＮＩＴＥ  Ｐ−０２７７０）の作製
ｐｒｏＢをコードする塩基配列の上下流域の遺伝子を、インフレーム・デリーション法によって、ｐｒｏＢ遺伝子の３１番目から８２２番目の塩基（７９２ｂｐ）を欠損させた形でつなぎ合わせ、得られた遺伝子断片を豚丹毒菌の菌体内にエレクトロポレーション法を用いて導入することにより、豚丹毒菌の染色体とその遺伝子断片がホモロガス・リコンビネーションで置き換わった株を作製した。
作製手法については、ｐｒｏＢを標的とした以外は実施例１と同様の手順で行ったため、詳細は省略する。
なお、豚丹毒菌（エリシペロスリクス・ルシオパシエ）である前記ＥＲｐｒｏＢ株は、本件出願人が、２０１８年８月２３日付けにて独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物センターに寄託し、受託番号「ＮＩＴＥ  Ｐ−０２７７０」が付されている。
【００３８】
（実施例３）豚丹毒菌プロリン合成関連遺伝子欠損株ＥＲｐｒｏＣ株（ＮＩＴＥ  Ｐ−０２７７１）の作製
ｐｒｏＣをコードする塩基配列の上下流域の遺伝子を、インフレーム・デリーション法によって、ｐｒｏＣ遺伝子の３１番目から７４４番目の塩基（７１４ｂｐ）を欠損させた形でつなぎ合わせ、得られた遺伝子断片を豚丹毒菌の菌体内にエレクトロポレーション法を用いて導入することにより、豚丹毒菌の染色体とその遺伝子断片がホモロガス・リコンビネーションで置き換わった株を作製した。
作製手法については、ｐｒｏＣを標的とした以外は実施例１と同様の手順で行ったため、詳細は省略する。
なお、豚丹毒菌（エリシペロスリクス・ルシオパシエ）である前記ＥＲｐｒｏＣ株は、本件出願人が、２０１８年８月２３日付けにて独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物センターに寄託し、受託番号「ＮＩＴＥ  Ｐ−０２７７１」が付されている。
【００３９】
（実施例４）豚丹毒菌プロリン合成関連遺伝子欠損株ＥＲｐｒｏＡＢ株（ＮＩＴＥ  Ｐ−０２７７２）の作製
ｐｒｏＡおよびｐｒｏＢをコードするそれぞれの塩基配列の上下流域の遺伝子を、インフレーム・デリーション法によって、ｐｒｏＢの３１番目からｐｒｏＡの１２０３番目の塩基まで、計２０１２ｂｐを除去した形でつなぎ合わせ、得られた遺伝子断片を豚丹毒菌の菌体内にエレクトロポレーション法を用いて導入することにより、豚丹毒菌の染色体とその遺伝子断片がホモロガス・リコンビネーションで置き換わった株を作製した。
作製手法については、ｐｒｏＡ、ｐｒｏＢを標的とした実施例１、２と同様の手順で行ったため、詳細は省略する。
なお、豚丹毒菌（エリシペロスリクス・ルシオパシエ）である前記ＥＲｐｒｏＡＢ株は、本件出願人が、２０１８年８月２３日付けにて独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物センターに寄託し、受託番号「ＮＩＴＥ  Ｐ−０２７７２」が付されている。
【００４０】
（実施例５）豚丹毒菌プロリン合成関連遺伝子欠損株ＥＲｐｒｏＡＢＣ株（ＮＩＴＥ  Ｐ−０２７７３）の作製
ｐｒｏＡ、ｐｒｏＢおよびｐｒｏＣをコードするそれぞれの塩基配列の上下流域の遺伝子を、インフレーム・デリーション法によって、ｐｒｏＢの３１番目からｐｒｏＡの１２０３番目の塩基までの計２０１２ｂｐおよびｐｒｏＣ遺伝子の３１番目から７４４番目の塩基（７１４ｂｐ）を欠損させた形の遺伝子断片を豚丹毒菌の菌体内にエレクトロポレーション法を用いて導入することにより、豚丹毒菌の染色体とその遺伝子断片がホモロガス・リコンビネーションで置き換わった株を作製した。
作製手法については、ｐｒｏＡ、ｐｒｏＢ、ｐｒｏＣを標的とした実施例１、２、３と同様の手順で行ったため、詳細は省略する。
なお、豚丹毒菌（エリシペロスリクス・ルシオパシエ）である前記ＥＲｐｒｏＡＢＣ株は、本件出願人が、２０１８年８月２３日付けにて独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物センターに寄託し、受託番号「ＮＩＴＥ  Ｐ−０２７７３」が付されている。
【００４１】
（試験例１）安全性試験
実施例１〜５で得られたＥＲｐｒｏＡ株、ＥＲｐｒｏＢ株、ＥＲｐｒｏＣ株、ＥＲｐｒｏＡＢ株、ＥＲｐｒｏＡＢＣ株をそれぞれ、２〜５匹のマウスに１×１０８ＣＦＵの量に調整して皮下接種した。その結果を表１に示す。
【００４２】
【表１】
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【００４３】
表１に示す結果より、ＥＲｐｒｏＡ株、ＥＲｐｒｏＢ株、ＥＲｐｒｏＣ株、ＥＲｐｒｏＡＢＣ株を接種したマウスはすべて生残していた。
また、ＥＲｐｒｏＡＢ株を接種したマウスも５匹中３匹は生残していた。
【００４４】
（試験例２）防御試験（ワクチン試験）
試験例１で生残したＥＲｐｒｏＡ株、ＥＲｐｒｏＢ株、ＥＲｐｒｏＣ株、ＥＲｐｒｏＡＢ株、ＥＲｐｒｏＡＢＣ株を接種したマウスに、１０３ＣＦＵ菌量の豚丹毒菌強毒株で攻撃した。その結果を表１に示す。なお、豚丹毒菌強毒株としては、豚丹毒菌Ｆｕｊｉｓａｗａ株を用いた。
【００４５】
表１に示す結果より、ＥＲｐｒｏＡ株、ＥＲｐｒｏＢ株、ＥＲｐｒｏＡＢ株、ＥＲｐｒｏＡＢＣ株を接種したマウスはすべて生残した。
また、ＥＲｐｒｏＣ株を接種したマウスも２匹中１匹は生残した。
以上の結果から、ＥＲｐｒｏＡ株、ＥＲｐｒｏＢ株、ＥＲｐｒｏＣ株、ＥＲｐｒｏＡＢ株、ＥＲｐｒｏＡＢＣ株は、安全性および防御誘導能に優れた株であることがわかる。
【受託番号】
【００４６】
ＮＩＴＥ  Ｐ−０２７６９、ＮＩＴＥ  Ｐ−０２７７０、ＮＩＴＥ  Ｐ−０２７７１、ＮＩＴＥ  Ｐ−０２７７２、ＮＩＴＥ  Ｐ−０２７７３