(57)【要約】【課題】全ゲノム中の点変異数が少ないｉＰＳ細胞を製造する方法、ｉＰＳ細胞樹立過程における点変異を抑制する方法、及び全ゲノム中の点変異数が抑制されたｉＰＳ細胞を提供すること。【解決手段】全ゲノム中の点変異数２００以下及び全点変異におけるトランスバージョン点変異の存在比率２０〜５０％の誘導多能性幹細胞の製造方法であって、ヒト急性Ｔ細胞性白血病細胞由来細胞株（ＲＣＢ３０５２）と比較して細胞中の活性酸素種の量が１／４以下の体細胞、赤血球の前駆細胞、巨核球の前駆細胞、及び巨核球赤芽系前駆細胞よりなる群から選択される少なくとも１つの体細胞を前記誘導多能性幹細胞に誘導する工程を含む方法。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
全ゲノム中の点変異数２００以下及び全点変異におけるトランスバージョン点変異の存在比率２０〜５０％の誘導多能性幹細胞の製造方法であって、ヒト急性Ｔ細胞性白血病細胞由来細胞株（ＲＣＢ３０５２）と比較して細胞中の活性酸素種の量が１／４以下の体細胞、赤血球の前駆細胞、巨核球（血小板）の前駆細胞、及び巨核球赤芽系前駆細胞よりなる群から選択される少なくとも１つの体細胞を前記誘導多能性幹細胞に誘導する工程を含む方法。
【請求項２】
前記誘導多能性幹細胞が、全ゲノム中のトランスバージョン点変異数及びトランジション点変異数がいずれも８０個以下の誘導多能性幹細胞である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
ヒト急性Ｔ細胞性白血病細胞由来細胞株（ＲＣＢ３０５２）と比較して細胞中の活性酸素種の量が１／４以下の細胞、赤血球の前駆細胞、巨核球の前駆細胞、及び巨核球赤芽系前駆細胞よりなる群から選択される少なくとも１つの細胞を末梢血液よりも含有比率が高い状態で含有する試料を前記末梢血液から調製する工程、及び前記試料における前記細胞を誘導多能性幹細胞に誘導する工程を含む誘導多能性幹細胞を製造する方法。
【請求項４】
前記体細胞又は前記調製された細胞が自家細胞であり、前記誘導多能性幹細胞が自家移植用である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項５】
誘導多能性幹細胞の点変異を抑制する方法であって、ヒト急性Ｔ細胞性白血病細胞由来細胞株（ＲＣＢ３０５２）と比較して細胞中の活性酸素種の量が１／４以下の体細胞、赤血球の前駆細胞、巨核球の前駆細胞、及び巨核球赤芽系前駆細胞よりなる群から選択される少なくとも１つの体細胞を用いる方法。
【請求項６】
全ゲノム中のトランスバージョン点変異数及びトランジション点変異数をいずれも８０個以下に抑制する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
全ゲノム中の点変異数２００以下及び全点変異におけるトランスバージョン点変異の存在比率２０〜５０％の誘導多能性幹細胞。
【請求項８】
全ゲノム中のトランスバージョン点変異数及びトランジション点変異数がいずれも８０個以下の誘導多能性幹細胞である、請求項７に記載の誘導多能性幹細胞。
【請求項９】
請求項７又は８に記載の誘導多能性幹細胞を、全細胞数のうち１５％以上の存在比率で含有する細胞集団。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全ゲノム中の点変異数が少ない誘導多能性幹細胞（以下、「ｉＰＳ細胞」ともいう。）を製造する方法、ｉＰＳ細胞樹立過程における点変異を抑制する方法、及び全ゲノム中の点変異数が抑制されたｉＰＳ細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
ｉＰＳ細胞は、特定の３種又は４種の遺伝子（ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、及びｃ−ＭＹＣ）を体細胞に導入し、ヒトの場合ｂＦＧＦの存在下で培養することにより製造することができる旨が開示されている（例えば、特許文献１、２等）。
最近、ｉＰＳ細胞において、点変異等の「ゲノム変異」が将来の癌化等の原因となる可能性が指摘されている。
【０００３】
非特許文献１には、ｉＰＳ細胞誘導過程において、デノボコピー数変異及び点変異が生じる旨、及び、抗酸化剤の添加によりデノボコピー数変異の発生は抑制し得る一方、点変異の発生は抗酸化剤の添加では抑制し得ない旨、開示されている。即ち、ｉＰＳ細胞誘導過程におけるデノボコピー数変異は酸化ストレスが原因であるものの、点変異の原因は酸化ストレスではない旨の仮説が開示されている。
なお、酸化ストレスとは、細胞内における活性酸素種による酸化作用と、抗酸化物質等による抗酸化作用とのバランスとして定義され、例えば、酸化ストレスが小さいことは、活性酸素種による酸化作用に対して抗酸化作用が強く、酸化反応を防止ないし還元反応を亢進することと知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第４４１１３６３号公報
【特許文献２】特許第５０９８０２８号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｊｕｎｆｅｎｇ  Ｊｉら．Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｒｅｄｕｃｅｓ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ａｂｅｒｒａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．；Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ；Ｖｏｌ．２；４４−５１；Ｊａｎｕａｒｙ  １４，２０１４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、上記従来技術の問題点に鑑み、全ゲノム中の点変異数が少ないｉＰＳ細胞を製造する方法、ｉＰＳ細胞樹立過程における点変異を抑制する方法、及び全ゲノム中の点変異数が抑制されたｉＰＳ細胞の提供を目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上述のように、非特許文献１では、ｉＰＳ細胞誘導過程における点変異の発生は抗酸化剤の添加では抑制し得ず、点変異の原因は活性酸素種による酸化ストレスではない旨の仮説が開示されている。
この仮説に反し、本発明者らは、ｉＰＳ細胞に誘導される原料細胞である体細胞として酸化ストレスが小さい体細胞（具体的には、活性酸素種発生が少ない体細胞及び活性酸素種除去活性が高い体細胞よりなる群から選択される少なくとも一方の体細胞）を用いることでｉＰＳ細胞誘導過程の点変異を抑制し得ることを見出した。また、本発明者らは、抑制される点変異がトランスバージョン点変異（プリン塩基とピリミジン塩基との相互置換）とトランジション点変異（プリン塩基同士又はピリミジン塩基同士の相互置換）の双方であることを確認した。以上の知見に基づき、本発明を完成するに至った。
非特許文献１に記載のように、ｉＰＳ細胞誘導過程及びその後の数パッセージにおいて抗酸化剤を添加する方法では、ｉＰＳ細胞誘導過程の点変異を抑制するほどに十分な酸化ストレスの低減には至らなかったものと、本発明者らは、推測する。
【０００８】
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）全ゲノム中の点変異数２００以下及び全点変異におけるトランスバージョン点変異の存在比率２０〜５０％の誘導多能性幹細胞の製造方法であって、ヒト急性Ｔ細胞性白血病細胞由来細胞株（ＲＣＢ３０５２）と比較して細胞中の活性酸素種の量が１／４以下の体細胞、赤血球の前駆細胞、巨核球の前駆細胞、及び巨核球赤芽系前駆細胞よりなる群から選択される少なくとも１つの体細胞を前記誘導多能性幹細胞に誘導する工程を含む方法。
（２）前記誘導多能性幹細胞が、全ゲノム中のトランスバージョン点変異数及びトランジション点変異数がいずれも８０個以下の誘導多能性幹細胞である、（１）に記載の製造方法。
（３）ヒト急性Ｔ細胞性白血病細胞由来細胞株（ＲＣＢ３０５２）と比較して細胞中の活性酸素種の量が１／４以下の細胞、赤血球の前駆細胞、巨核球の前駆細胞、及び巨核球赤芽系前駆細胞よりなる群から選択される少なくとも１つの細胞を末梢血液よりも含有比率が高い状態で含有する試料を前記末梢血液から調製する工程、及び前記試料における前記細胞を誘導多能性幹細胞に誘導する工程を含む誘導多能性幹細胞を製造する方法。
（４）前記体細胞又は前記調製された細胞が自家細胞であり、前記誘導多能性幹細胞が自家移植用である、（１）〜（３）のいずれか１項に記載の製造方法。
（５）誘導多能性幹細胞の点変異を抑制する方法であって、ヒト急性Ｔ細胞性白血病細胞由来細胞株（ＲＣＢ３０５２）と比較して細胞中の活性酸素種の量が１／４以下の体細胞、赤血球の前駆細胞、巨核球の前駆細胞、及び巨核球赤芽系前駆細胞よりなる群から選択される少なくとも１つの体細胞を用いる方法。
（６）全ゲノム中のトランスバージョン点変異数及びトランジション点変異数をいずれも８０個以下に抑制する、（５）に記載の方法。
（７）全ゲノム中の点変異数２００以下及び全点変異におけるトランスバージョン点変異の存在比率２０〜５０％の誘導多能性幹細胞。
（８）全ゲノム中のトランスバージョン点変異数及びトランジション点変異数がいずれも８０個以下の誘導多能性幹細胞である、（７）に記載の誘導多能性幹細胞。
（９）上記（７）又は（８）に記載の誘導多能性幹細胞を、全細胞数のうち１５％以上の存在比率で含有する細胞集団。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、全ゲノム中の点変異（特に、トランスバージョン点変異数及びトランジション点変異数の両方）数が少ないｉＰＳ細胞を製造する方法、ｉＰＳ細胞樹立過程における点変異を抑制する方法、及び全ゲノム中の点変異数が抑制されたｉＰＳ細胞を提供することができる。
また、本発明によれば、全ゲノム中、挿入、欠失及び置換の総変異数が少ないｉＰＳ細胞を製造する方法、ｉＰＳ細胞樹立過程における、挿入、欠失及び置換の総変異を抑制する方法、及び全ゲノム中の、挿入、欠失及び置換の総変異が抑制されたｉＰＳ細胞を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】フローサイトメトリーによるコントロール細胞であるＪｕｒｋａｔ細胞と、赤芽球との活性酸素種量の比較を示す図である。
【図２】赤芽球から誘導した実施例のｉＰＳ細胞クローン１〜４における点変異数を示す図である。
【図３】赤芽球から誘導した実施例のｉＰＳ細胞クローン１〜１４における点変異数を示す図である。
【図４】実施例のｉＰＳ細胞クローン１〜４における点変異組成を示す図である。
【図５】赤芽球から誘導した実施例のｉＰＳ細胞クローン１〜１４における挿入、欠失及び置換の変異総数を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明の実施態様について詳細に説明するが、本発明は、以下の実施態様に何ら限定されるものではなく、本発明の目的の範囲内において、適宜変更を加えて実施することができる。
また、本明細書において、「〜」は特に断りがなければ以上から以下を表す。
【００１２】
≪ｉＰＳ細胞を製造する方法≫
本発明の第１の態様は、全ゲノム中の点変異数２００以下及び全点変異におけるトランスバージョン点変異の存在比率２０〜５０％のｉＰＳ細胞の製造方法であって、ヒト急性Ｔ細胞性白血病細胞由来細胞株（ＲＣＢ３０５２）（以下、単に「Ｊｕｒｋａｔ細胞」ともいう。）と比較して細胞中の活性酸素種の量が１／４以下の体細胞、赤血球の前駆細胞、巨核球の前駆細胞、及び巨核球赤芽系前駆細胞（ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｅ−ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ（ＭＥＰｓ）；赤血球及び巨核球に共通の前駆細胞）よりなる群から選択される少なくとも１つの体細胞を前記ｉＰＳ細胞に誘導する工程を含むｉＰＳ細胞を製造する方法である。
本発明の第２の態様は、Ｊｕｒｋａｔ細胞と比較して細胞中の活性酸素種の量が１／４以下の細胞、赤血球の前駆細胞、巨核球の前駆細胞、及び巨核球赤芽系前駆細胞よりなる群から選択される少なくとも１つの細胞を末梢血液よりも含有比率が高い状態で含有する試料を前記末梢血液から調製する工程、及び前記試料における前記細胞をｉＰＳ細胞に誘導する工程を含むｉＰＳ細胞を製造する方法である。
【００１３】
Ｊｕｒｋａｔ細胞は、一般的なＴ細胞としての性質を保持することから、Ｔ細胞関連の研究用細胞としてよく使用され得、一般的な体細胞の１つのモデル細胞となり得る。
本発明においては、Ｊｕｒｋａｔ細胞は、原料細胞となる細胞ないし細胞集団における個々の細胞中の活性酸素種の量を相対的に定量化するための対照（コントロール）として使用する。
【００１４】
本発明において、細胞中の活性酸素種の量は、ジヒドロローダミン１２３を上記細胞を含む溶液中に予め添加し、フローサイトメトリーにより個々の細胞の標識量を定量して算出した量である。
【００１５】
本発明は、一般的な体細胞（例えば、Ｊｕｒｋａｔ細胞）と比較して、細胞中の活性酸素種の量が少ない（具体的には、１／４以下）体細胞、赤血球の前駆細胞、巨核球の前駆細胞、及び巨核球赤芽系前駆細胞よりなる群から選択される少なくとも１つの体細胞を原料細胞として用いてｉＰＳ細胞に誘導することにより、全ゲノム中の点変異数が少ない（具体的には、点変異数２００以下及びトランスバージョン点変異の存在比率２０〜５０％）ｉＰＳ細胞を製造することができる。その理由は、ｉＰＳ細胞樹立過程における、トランスバージョン点変異及びトランジション点変異の両方の点変異の原因が活性酸素種等の酸化ストレスによるＤＮＡ損傷であるとの本発明者らの推定に基づいている。
【００１６】
本発明によれば、好ましくは全ゲノム中の点変異数１８０以下（より好ましくは点変異数１６０以下、更に好ましくは点変異数１５０以下）のｉＰＳ細胞を製造することができる。
また、本発明によれば、全点変異におけるトランスバージョン点変異の存在比率が、２０〜５０％（好ましくは２５〜４５％）のｉＰＳ細胞を製造することができる。
また、本発明によれば、全ゲノム中、本手法にて測定した挿入変異、欠失変異及び置換変異の総数を１０以下（好ましくは９以下、より好ましくは８以下）のｉＰＳ細胞を製造することができる。
【００１７】
上記体細胞中の活性酸素種の量としては、Ｊｕｒｋａｔ細胞に対して１／５以下が好ましく、１／６以下がより好ましい。
上記体細胞中の活性酸素種の量の下限値としては、特に制限はないが、Ｊｕｒｋａｔ細胞に対して、例えば、１／１００以上が挙げられ、１／５０以上であってもよく、１／２０以上であってもよく、理想的には、体細胞中に活性酸素種を含まないことが好ましい。
【００１８】
本発明において、Ｊｕｒｋａｔ細胞に対して細胞中の活性酸素種の量が少ない（例えば、１／４以下）体細胞としては、例えば、Ｊｕｒｋａｔ細胞と比べて酸化ストレスが小さい体細胞、すなわちＪｕｒｋａｔ細胞と比べて活性酸素種発生が少ない体細胞及び活性酸素種除去活性が高い体細胞よりなる群から選択される少なくとも一方の体細胞が挙げられ、上記体細胞は任意の組織の細胞（例えば、骨髄細胞、血液細胞、リンパ細胞等）であってもよく、具体的には、赤血球の前駆細胞、巨核球の前駆細胞、巨核球赤芽系前駆細胞等が挙げられるが（Ｓｈｉｎｏｈａｒａ  Ａ，Ｉｍａｉ  Ｙ，Ｎａｋａｇａｗａ  Ｍ，Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｔ，Ｉｃｈｉｋａｗａ  Ｍ，Ｋｕｒｏｋａｗａ  Ｍ．Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｏｘｙｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｍａｒｋ  ａｎｄ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｔｈｅ  ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｅ−ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｆａｔｅ  ｏｆ  ｃｏｍｍｏｎ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ．  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．２０１４  Ｆｅｂ；３２（２）：５４８−５７．ｄｏｉ：１０．１００２／ｓｔｅｍ．１５８８．）、本発明はこれらに限定されるものではない。
上記活性酸素種の量が少ない体細胞、赤血球の前駆細胞、巨核球の前駆細胞、及び巨核球赤芽系前駆細胞よりなる群から選択される少なくとも１つの体細胞としては、ヒトを含む任意の哺乳類動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ヒツジ、ウマ、サルなど）に由来してよく、ヒト由来が好ましい。
【００１９】
第１の態様において、原料細胞として、Ｊｕｒｋａｔ細胞と比較して細胞中の活性酸素種の量が少ない（例えば、１／４以下）体細胞、赤血球の前駆細胞、巨核球の前駆細胞、及び巨核球赤芽系前駆細胞よりなる群から選択される少なくとも１つの体細胞を全細胞数のうち、好ましくは１５％以上、より好ましくは３０％以上、更に好ましくは６０％以上、特に好ましくは７０％以上の存在比率で含有する、理想的には上記細胞のみを含有する細胞集団を使用することができる。
全細胞数のうちの上記細胞の存在比率の上限値としては特に制限はないが、例えば、１００％以下、９９％以下、９５％以下、９０％以下等が挙げられる。
【００２０】
第２の態様は、上記活性酸素種の量が１／４以下の細胞、赤血球の前駆細胞、巨核球の前駆細胞、及び巨核球赤芽系前駆細胞よりなる群から選択される少なくとも１つの細胞を末梢血液よりも含有比率が高い状態で含有する試料を末梢血液から調製することを特徴とする。
第２の態様における活性酸素種量の測定方法としては、第１の態様と同様である。
末梢血液は、骨髄液に比べると採取の侵襲性が低い点で好ましい一方、活性酸素種の量が１／４以下の細胞の含有量が必ずしも多くはない。しかし、本態様では、末梢血液を原料としつつ、活性酸素種の量が１／４以下の細胞の含有量を高めた試料を誘導工程に用いるので、低侵襲性および点変異の少ないｉＰＳ細胞の高収量のバランスを図りやすい。この利点は、自家移植において特に好ましい。
第２の態様における活性酸素種の量が少ない（例えば、１／４以下）上記細胞としては、第１の態様において例示した細胞と同様の細胞が挙げられる。
末梢血液よりも含有比率が高い状態としては、上記細胞の含有比率が末梢血液よりも１．５倍以上高い状態が好ましく、末梢血液よりも２倍以上高い状態がより好ましく、末梢血液よりも７倍以上高い状態が更に好ましい。上記細胞の含有比率の上限値としては特に制限はないが、末梢血液に対して、１万倍以下、１千倍以下、１００倍以下、５０倍以下等が挙げられる。
具体的には、末梢血液よりも含有比率が高い状態において、上記試料は上記細胞を全細胞数のうち、好ましくは１５％以上、より好ましくは３０％以上、更に好ましくは６０％以上、特に好ましくは７０％以上の存在比率で含有してよい。
上記試料における上記細胞の含有比率の上限値としては特に制限はないが、例えば、全細胞数のうち１００％以下、９５％以下、９０％以下、８５％以下等が挙げられる。
【００２１】
第２の態様において、末梢血液から調製される、上記活性酸素種の量が少ない（例えば、１／４以下）細胞、赤血球の前駆細胞、巨核球の前駆細胞、及び巨核球赤芽系前駆細胞よりなる群から選択される少なくとも１つの細胞を末梢血液よりも含有比率が高い状態で含有する試料としては、末梢血液中に存在していた上記細胞そのものを含有する試料であっても、末梢血液中に存在していた上記細胞から増殖（好ましくは、適切な培養液ないし培地にて選択的に増殖（エクスパンド）、より好ましくは、分化させることなくエクスパンド）させた細胞（つまり、それ自体は末梢血液に存在していなかった細胞）を含有する試料であってもよい。
上記活性酸素種の量が少ない（例えば、１／４以下）細胞を末梢血液よりも含有比率が高い状態で含有する試料を調製する方法としては特に制限はなく、分取せずに適切な培養液ないし培地にて目的の細胞（例えば、上記活性酸素種の量が少ない細胞）のみを選択的に増殖（いわゆるエクスパンド、好ましくは分化させることなくエクスパンド）させる方法、フローサイトメトリー、エルトリエーション、抗体／ビーズ分離等の任意の方法、又はそれら方法の組み合わせによる分取が挙げられる。
【００２２】
例えば、上記活性酸素種の量が少ない（例えば、１／４以下）細胞、赤血球の前駆細胞、巨核球の前駆細胞、及び巨核球赤芽系前駆細胞よりなる群から選択される少なくとも１つの細胞を、セルソーター機能を有するフローサイトメーターにより、分取して調製することが好ましい。これによりリアルタイムに目的の細胞集団（本発明においては、上記活性酸素種の量が少ない（例えば、１／４以下）細胞、赤血球の前駆細胞、巨核球の前駆細胞、及び巨核球赤芽系前駆細胞よりなる群から選択される少なくとも１つの細胞を末梢血液よりも含有比率が高い状態で含む領域）を分取することができる。
より具体的には、上述のように細胞内の活性酸素種に反応して標識及び定量し得る試薬を上記細胞を含む溶液中に予め添加し、フローサイトメトリーにより個々の細胞の標識量を定量して算出した１細胞毎の活性酸素種量と、同様の方法により算出したＪｕｒｋａｔ細胞の活性酸素種量の平均値とを比較してＪｕｒｋａｔ細胞の活性酸素種量の平均値の１／４以下の細胞を、セルソーター機能を有するフローサイトメーター等により分取して調製することができる。
本発明において、実施の都度、上記方法により定量された細胞中の活性酸素種の量（上記細胞が細胞集団である場合には、活性酸素種量の平均値）と、同様の方法により定量されたＪｕｒｋａｔ細胞中の活性酸素種の量（上記Ｊｕｒｋａｔ細胞がＪｕｒｋａｔ細胞集団である場合には、活性酸素種量の平均値）とを比較して活性酸素種の量が少ない（例えば、１／４以下）細胞を調製してもよい。
また、活性酸素種の量（上記細胞が細胞集団である場合には、活性酸素種量の平均値）が小さいことと直接または間接に相関性を有することが既知のパラメータ（例えばバイオマーカー）に基づき、活性酸素種の量が少ない（例えば、１／４以下）細胞を分取してもよい。
【００２３】
フローサイトメトリーに使用するフローサイトメーターとしてはＦＡＣＳ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｅｒ；Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）、より具体的には、ＦＡＣＳＡｒｉａＩＩ、ＦＡＣＳＡｒｉａ  ＩＩＩ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）等を用いることができる。
ソーティング（ＦＡＣＳ）データの解析は、ＦＡＣＳＤｉｖａ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）、ＦｌｏｗＪｏ（ツリースター社製）等を用いて行い得る。
エルトリエーションとは、持続的な逆流のエルトリエーションが、細胞を複数の画分に分割する技術である。
抗体／ビーズ分離は、（免疫）磁性活性化細胞分類（ＭＡＣＳ）によって行われる。ＭＡＣＳは、細胞を血液等から選択的に分離するための広く利用される技術である。
例えば、特定のマーカーについて陽性の細胞は、ＡｕｔｏＭＡＣＳで上記特定のマーカーのＭＡＣＳビーズを用いてソートすることができる。
【００２４】
（上記ｉＰＳ細胞に誘導する工程）
上記細胞を上記ｉＰＳ細胞に誘導する方法としては、核初期化因子を上記細胞に導入して上記細胞を初期化して上記ｉＰＳ細胞に誘導する方法が挙げられる。
上記核初期化因子としては、ＯＣＴファミリー遺伝子、ＫＬＦファミリー遺伝子、及びＭＹＣファミリー遺伝子の各遺伝子産物の組み合わせが挙げられ、上記の３種の遺伝子に加えてＳＯＸファミリー遺伝子の遺伝子産物をも更に含むことが万能性の獲得のために好ましい。
ＯＣＴファミリー遺伝子としては、例えば、ＯＣＴ３／４（ＰＯＵ５Ｆ１）、ＯＣＴ１Ａ、及びＯＣＴ６などを挙げることができる。ＫＬＦファミリー遺伝子としては、ＫＬＦ１、ＫＬＦ２、ＫＬＦ４、及びＫＬＦ５などを挙げることができる。ＭＹＣファミリー遺伝子としては、ｃ−ＭＹＣ、Ｎ−ＭＹＣ、及びＬ−ＭＹＣなどを挙げることができる。
また、ＭＹＣファミリー遺伝子の遺伝子産物はサイトカインで置き換えることができる場合がある。サイトカインとしては、例えば、ＳＣＦ又はｂＦＧＦなどが好ましいが、これらに限定されることはない。
【００２５】
ＳＯＸファミリー遺伝子としては、例えば、ＳＯＸ１、ＳＯＸ３、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１５、ＳＯＸ１７、及びＳＯＸ１８、好ましくはＳＯＸ２を挙げることができる。少なくともＯＣＴファミリー遺伝子（例えばＯＣＴ３／４）、ＫＬＦファミリー遺伝子（例えばＫＬＦ４）、ＭＹＣファミリー遺伝子（例えばｃ−ＭＹＣ）、及びＳＯＸファミリー遺伝子（例えばＳＯＸ２）の４種の遺伝子の遺伝子産物の組み合わせを含む核初期化因子は初期化の効率の観点から好ましい。
核初期化因子は、例えば、ＥＣＡＴ１、ＥＳＧ１、ＤＮＭＴ３Ｌ、ＥＣＡＴ８、ＧＤＦ３、ＳＯＸ１５、ＥＣＡＴ１５−１、ＦＴＨＬ１７、ＳＡＬＬ４、ＲＥＸ１、ＵＴＦ１、ＳＴＥＬＬＡ、ＳＴＡＴ３、及びＧＲＢ２からなる群から選ばれる１種以上の遺伝子の遺伝子産物を含んでいてもよい。
これらの遺伝子はいずれもヒトを含む哺乳類動物において共通して存在する遺伝子であり、上記遺伝子産物を利用するためには、任意の哺乳類動物由来（例えばマウス、ラット、ウシ、ヒツジ、ウマ、サルなどの哺乳類動物由来）の遺伝子を用いることが可能である。また、野生型の遺伝子産物のほか、数個（例えば１〜１０個、好ましくは１〜６個、より好ましくは１〜４個、さらに好ましくは１〜３個、特に好ましくは１又は２個）のアミノ酸が置換、挿入、及び／又は欠失した変異遺伝子産物であって、野生型の遺伝子産物と同様の機能を有する遺伝子産物も利用可能である。例えば、ｃ−ＭＹＣの遺伝子産物としては野生型のほか安定型（Ｔ５８Ａ）などを用いてもよい。他の遺伝子産物についても同様である。
核初期化因子に含まれる遺伝子産物は、例えば上記遺伝子から産生されるタンパク質自体のほか、該タンパク質とその他のタンパク質又はペプチドなどとの融合遺伝子産物の形態であってもよい。
なお、核初期化因子を確認する手段としては、例えば、国際公開ＷＯ２００５／８０５９８に記載された核初期化因子のスクリーニング方法を利用することができる。当業者は上記刊行物を参照することにより核初期化因子をスクリーニングし、核初期化因子の存在及び作用を確認することができる。
【００２６】
核初期化因子を用いて体細胞からｉＰＳ細胞を調製する方法は特に限定されず、体細胞及びｉＰＳ細胞が増殖可能な環境において核初期化因子が体細胞と接触可能であれば、いかなる方法を採用してもよい。例えば、核初期化因子に含まれる遺伝子産物を培地中に添加してもよく、あるいは核初期化因子を発現可能な遺伝子を含むベクターを用いて該遺伝子を体細胞に導入するなどの手段を採用してもよい。このようなベクターを用いる場合には、ベクターに２種以上の遺伝子を組み込んでそれぞれの遺伝子産物を体細胞において同時に発現させてもよい。
ベクターとしては、エピソーマルベクター、センダイウイルスベクター、レトロウイルスベクター等が挙げられ、エピソーマルベクターが好ましい。
初期化すべき体細胞において核初期化因子に含まれる遺伝子産物の１種又は２種以上がすでに発現されている場合には、核初期化因子から該遺伝子産物を除くこともできるが、このような態様も本発明の範囲に包含されることは言うまでもない。
【００２７】
本発明によれば、好ましくは全ゲノム中のトランジション点変異数が８０個以下のｉＰＳ細胞を製造することができる。
本発明によれば、好ましくは全ゲノム中のトランスバージョン点変異数が８０個以下（より好ましくは７０個以下）のｉＰＳ細胞を製造することができる。
第１の態様及び第２の態様は、点変異が少ないｉＰＳ細胞を取得しやすいことから、ｉＰＳ細胞バンクの構築に寄与し得る。
また、第１の態様及び第２の態様は、必要に応じてエクスパンド等を行なうことにより、少量の少ない原料細胞からでも点変異が少ないｉＰＳ細胞を取得しやすいことから、他家移植に依らない患者本人由来ｉＰＳ細胞の自家移植に利用し得る。つまり上記体細胞又は上記調製された細胞を自家細胞とし、製造されるｉＰＳ細胞を自家移植用とすることができる。
【００２８】
≪ｉＰＳ細胞の点変異を抑制する方法≫
本発明の第３の態様は、ｉＰＳ細胞の点変異を抑制する方法であって、Ｊｕｒｋａｔ細胞と比較して細胞中の活性酸素種の量が１／４以下の体細胞、赤血球の前駆細胞、巨核球の前駆細胞、及び巨核球赤芽系前駆細胞よりなる群から選択される少なくとも１つの体細胞を用いる方法である。
Ｊｕｒｋａｔ細胞と比較して細胞中の活性酸素種の量が１／４以下の体細胞、赤血球の前駆細胞、巨核球の前駆細胞、及び巨核球赤芽系前駆細胞よりなる群から選択される少なくとも１つの体細胞を調製する方法については上述の通りである。
第３の態様によれば、全ゲノム中のトランジション点変異数を８０個以下に抑制することができる。
第３の態様によれば、全ゲノム中のトランスバージョン点変異数を８０個以下（より好ましくは７０個以下）に抑制することができる。
【００２９】
≪ｉＰＳ細胞及び細胞集団≫
本発明の第４の態様は、全ゲノム中の点変異数２００以下及び全点変異におけるトランスバージョン点変異の存在比率２０〜５０％のｉＰＳ細胞である。
第４の態様において、「全ゲノム中の点変異数２００以下及び全点変異におけるトランスバージョン点変異の存在比率２０〜５０％のｉＰＳ細胞」を、造腫瘍性細胞の存在比を低減する観点から、全細胞数のうち１５％以上の存在比率で含有する細胞集団が好ましい。上記細胞を３０％以上の存在比率で含有する細胞集団がより好ましく、上記細胞を６０％以上の存在比率で含有する細胞集団が更に好ましく、上記細胞を７０％以上の存在比率で含有する細胞集団が特に好ましい。
全細胞数のうちの上記細胞の存在比率の上限値としては特に制限はないが、例えば、１００％以下、９９％以下、９５％以下、９０％以下等が挙げられる。
第４の態様において、全ゲノム中のトランジション点変異数が８０個以下であることが好ましい。
全ゲノム中のトランスバージョン点変異数も８０個以下（より好ましくは７０個以下）であることが好ましい。
第４の態様に係るｉＰＳ細胞の製造方法としては特に制限はないが、第１又は第２の態様に係る製造方法により製造することができる。
第４の態様に係るｉＰＳ細胞は、他家移植用であってもよいが、変異が少ない高品質のｉＰＳ細胞として、ｉＰＳ細胞バンクの細胞を用いない自家移植用として期待され得る。
【実施例】
【００３０】
以下、実施例を示して本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲は、これらの実施例に限定されるものではない。
【００３１】
以下、ある１名（以下、「ドナー１」ともいう。）のヒト臍帯血からエクスパンド（赤芽球を優先的に増殖させる培地にて培養）した赤芽球（赤血球の前駆細胞）を使用した。
【００３２】
＜コントロール細胞であるＪｕｒｋａｔ細胞と、赤芽球との活性酸素種量の比較＞
ヒト臍帯血からエクスパンドした赤芽球を１μＭのジヒドロローダミン１２３を含有するＰＢＳにて染色し、細胞内活性酸素種量をＦＡＣＳを用いて測定した。
また、コントロール細胞としてのＪｕｒｋａｔ細胞についても細胞内活性酸素種量をＦＡＣＳを用いて測定した。結果を図１（ａ）に示す。図１（ｂ）は、（ａ）における細胞内活性酸素種量の平均値をグラフ化した図である。
図１に示した結果から明らかなように、Ｊｕｒｋａｔ細胞と比べて、赤芽球中の細胞内活性酸素種量は１／４以下であることが分かる。
【００３３】
＜赤芽球のｉＰＳ細胞への誘導＞
ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃ−ＭＹＣ、ＬＩＮ２８発現用エピソーマルベクターとして、米国非営利団体Ａｄｄｇｅｎｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ／Ｌｉｎｚｈａｏ  Ｃｈｅｎｇ）より入手可能なｐＥＢ−Ｃ５を使用した。
２×１０6個の赤芽球に１０μｇのｐＥＢ−Ｃ５をエレクトロポレーション法（Ｔ−０１６プログラム；ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒＩＩｂ  Ａｍａｘａ社製）で細胞に導入し、幹細胞因子（ＳＣＦ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）５０ｎｇ／ｍｌ、インターロイキン３（ＩＬ−３；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）１０ｎｇ／ｍｌ、エリスロポエチン（ヒトエリスロポエチン製剤エスポー；協和発酵キリン社製）２Ｕ／ｍｌ、インスリン様成長因子（ＩＧＦ−１；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）４０ｎｇ／ｍｌ、デキサメサゾン（Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ；ＳＩＧＭＡ社製）１μＭ、ホロ−トランスフェリン（ｈｏｌｏ−ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ；Ｒ＆Ｄ社製）１００μｇ／ｍｌを補充した無血清培地（５０％ＩＭＤＭ；Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ社製、５０％Ｈａｍ’ｓＦ−１２；Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ社製、１％Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ−ｓｅｌｅｎｉｕｍ−Ｘ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ；Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ社製、１％Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｌｉｐｉｄ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ；Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ社製、４．４５ｍＭ  Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ；Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ社製、５０μｇ／ｍｌＬ−ａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ；ＳＩＧＭＡ社製、５ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン；ナカライテスク社製、２００μＭ  １−ｔｈｉｏｇｌｙｃｅｒｏｌ；ＳＩＧＭＡ社製）で１２ウェルプレート１ウェルへ播種した。遺伝子導入細胞は、培養後２日目に回収し、１０％ウシ血清；Ｈｙｃｌｏｎｅ社製、５０Ｕ／ｍｌペニシリン・５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン；Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ社製を添加したＤＭＥＭでフィーダー細胞上へ播種（実施例のｉＰＳ細胞クローン５のみフィーダー細胞上ではなく、ビトロネクチン上へ播種）、２４時間培養を行った後、０．２５ｍＭ 酪酸ナトリウム（ＮａＢ；Ｍｅｒｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を含むＥ８培地（ヒト胚性幹細胞培地；Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ社製）に換えた。遺伝子を導入して９日目から、ＭＥＦをＥ８培地で培養したコンディションド培地に０．２５ｍＭ  ＮａＢ、ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ；Ｒｅｐｒｏｃｅｌｌ社製）１０ｎｇ／ｍｌを補充した培地で培養を継続した。遺伝子を導入してから２〜３週間後にＥＳＣ様コロニー形態を呈する新しく形成されたコロニーを採取し、それぞれ、ｉＰＳ細胞のクローン１〜５とした（以下、「実施例のｉＰＳ細胞クローン１〜５」ともいう。）。
上記ドナー１とは異なる３名（以下、それぞれ、「ドナー２」、「ドナー３」、「ドナー４」ともいう。）由来の臍帯血からエクスパンドした赤芽球を使用し、上記ドナー１の場合と同様に、ｉＰＳ細胞への誘導を行い、ドナー２由来のｉＰＳ細胞のクローン６〜８、ドナー３由来のｉＰＳ細胞のクローン９〜１１、ドナー３由来のｉＰＳ細胞のクローン１２〜１４をそれぞれ得た。（以下、「実施例のｉＰＳ細胞クローン６〜１４」ともいう。）。
【００３４】
＜ｉＰＳ細胞における点変異の同定＞
上記得られた実施例のｉＰＳ細胞クローン１〜４について、ＨｉＳｅｑ（登録商標）Ｘ（イルミナ社製）を用いたペアエンド法（−）による全ゲノムシークエンス解析によって全ゲノムにおける点変異を同定した。
具体的には、赤芽球から誘導して上記得られたｉＰＳ細胞クローン１〜４及び親体細胞についてヒトのリファレンス配列（ｈｇ１９）にＣＬＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ（Ｆｉｌｇｅｎ）を用いてマッピングを行い、Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｖａｒｉａｎｔｓ（ＳＮＶｓ）を同定後、下記の条件で候補を絞り込んだ（Ｓｕｇｉｕｒａ  Ｍ．ら，Ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｏｉｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｒｉｓｅ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｉｎｉｔｉａｌ  ｓｔａｇｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅｓｅ  ｃｅｌｌｓ．；Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ．２０１４  Ｊａｎｕａｒｙ  ２；２（１）：５２−６３．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｓｔｅｍｃｒ．２０１３．１１．００６．）。
１）親体細胞に検出されたＳＮＶｓを除外、２）ｄｂＳＮＰ１３０；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ＳＮＰ／を除外、３）ホモポリマー、シンプルリピート配列等アライメントエラーを生じる可能性が高い箇所を除外、４）兄弟クローン（クローン１〜１４のこと）に検出されたＳＮＶｓを除外、５）点変異アリル頻度が３５％未満、６５％より大きいものを除外。
結果を図２に示す。
【００３５】
図２は、赤芽球から誘導した実施例のｉＰＳ細胞クローン１〜４における全ゲノム点変異数を示す図である。
図２において、比較として、Ｃｈｅｎｇ，Ｌ．ら（Ｌｏｗ  ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｂｙ  ｎｏｎｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ（２０１２）Ｍａｒ  ２；１０（３），３３７−３４４．）の方法により造血幹細胞からエピソーマルベクターを用いて誘導して得られたｉＰＳ細胞ＢＣ１、ＢＣＴ１、Ｅ１における全ゲノム点変異数も示す。
【００３６】
上記ｉＰＳ細胞ＢＣ１、ＢＣＴ１及びＥ１について、より詳細には、１種類の成人骨髄細胞集団から骨髄ＣＤ３４（＋）細胞集団と骨髄ＣＤ３４（−）接着細胞集団（間葉系幹細胞集団）とを採取後、それぞれ、下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のようにして樹立したｉＰＳ細胞である。
（ｉ）ｉＰＳ細胞ＢＣ１は、上記得られた骨髄ＣＤ３４（＋）細胞集団を５つの核初期化因子を発現する単一のエピソーマルベクター（ｐＥＢ−Ｃ５）とともに４日培養することにより樹立したｉＰＳ細胞である（Ｃｈｏｕ，Ｂ．Ｋ．，Ｍａｌｉ，Ｐ．，Ｈｕａｎｇ，Ｘ．，Ｙｅ，Ｚ．，Ｄｏｗｅｙ，Ｓ．Ｎ．，Ｒｅｓａｒ，Ｌ．Ｍ．Ｓ．，Ｚｏｕ，Ｃ．，Ｚｈａｎｇ，Ｙ．Ａ．，Ｔｏｎｇ，Ｊ．，ａｎｄ  Ｃｈｅｎｇ，Ｌ．（２０１１）．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｉＰＳ  ｃｅｌｌ  ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  ａ  ｎｏｎ−ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｆｒｏｍ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ｕｎｉｑｕｅ  ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎｄ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２１，５１８−５２９．）。
（ｉｉ）ｉＰＳ細胞ＢＣＴ１は、エピソーマルベクター（ｐＥＢ−Ｃ５）とともに、ＳＶ４０ラージＴ抗原（ＳＶ４０−ＬＴ）を一時的に発現する追加のエピソーマルベクター（ｐＥＢ−Ｃ５）を加えること以外はｉＰＳ細胞ＢＣ１と同様の操作により上記骨髄ＣＤ３４（＋）細胞集団から樹立したｉＰＳ細胞である。
（ｉｉｉ）ｉＰＳ細胞Ｅ１は、上記得られた骨髄ＣＤ３４（−）接着細胞集団をＭａｌｉ，Ｐ．，Ｃｈｏｕ，Ｂ．Ｋ．，Ｙｅｎ，Ｊ．，Ｙｅ，Ｚ．，Ｚｏｕ，Ｊ．，Ｄｏｗｅｙ，Ｓ．，Ｂｒｏｄｓｋｙ，Ｒ．Ａ．，Ｏｈｍ，Ｊ．Ｅ．，Ｙｕ，Ｗ．，Ｂａｙｌｉｎ，Ｓ．Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）．Ｂｕｔｙｒａｔｅ  ｇｒｅａｔｌｙ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅｓ．  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２８，７１３−７２０．及び上記Ｃｈｏｕ，Ｂ．Ｋ．らに記載の方法によりエピソーマルベクターとともに培養することにより樹立したｉＰＳ細胞である。なお、後述するｉＰＳ細胞Ｅ２についても同様である。
【００３７】
同様に、比較として、Ｂｈｕｔａｎｉら（Ｗｈｏｌｅ−ｇｅｎｏｍｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｂｕｒｄｅｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｒｅｅ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄｓ．  Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ．  ２０１６  Ｆｅｂ  １９；７：１０５３６．）の方法により得られた下記（ｉ）及び（ｉｉ）のｉＰＳ細胞における全ゲノム点変異数も示す。
（ｉ）ヒト皮膚線維芽細胞（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｃｅｌｌ  Ｃａｔａｌｏｇ  ｎｕｍｂｅｒ  ２３００）からｍＲＮＡを用いて「Ｔｈｅ  Ｓｔｅｍｇｅｎｔ  ｍＲＮＡ  Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  Ｋｉｔ  ｃａｔａｌｏｇ  ｎｕｍｂｅｒ  ００−００７１」の製造者説明書に従って誘導したｉＰＳ細胞Ｍ１〜Ｍ３
（ｉｉ）ヒト皮膚線維芽細胞（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｃｅｌｌ  Ｃａｔａｌｏｇ  ｎｕｍｂｅｒ  ２３００）から複数の核初期化因子を含有するセンダイウイルスベクターを用いて「ＣｙｔｏＴｕｎｅ−ｉＰＳ  ２．０  Ｓｅｎｄａｉ  Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  Ｋｉｔ，Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｃａｔａｌｏｇ  ｎｕｍｂｅｒ  Ａ１３７８００１」の製造者説明書に従って誘導したｉＰＳ細胞Ｓ１〜Ｓ３
【００３８】
図２に示した結果から明らかなように、Ｃｈｅｎｇ，Ｌ．ら、Ｂｈｕｔａｎｉらに記載の従来法によるｉＰＳ細胞製造方法では、エピソーマルベクター、ｍＲＮＡ又はセンダイウイルスベクターを用いても全ゲノムにおける点変異数が３００個を超えることが分かる。
一方、特定の細胞から本発明の方法により誘導したｉＰＳ細胞クローン１〜４では、全ゲノムにおける点変異数が２００個以下であることが分かる。
【００３９】
新たに得られた実施例のｉＰＳ細胞クローン５〜１４についても点変異数を同定する観点から、実施例のｉＰＳ細胞クローン１〜１４について上記＜ｉＰＳ細胞における点変異の同定＞を追試した。結果を図３に示す。
図３は、赤芽球から誘導した実施例のｉＰＳ細胞クローン１〜１４における全ゲノム点変異数を示す図である。
図３において、Ｃｈｅｎｇ，Ｌ．らの方法により得られた上記ｉＰＳ細胞ＢＣ１、ＢＣＴ１、Ｅ１及びＥ２の塩基配列データ、並びに、Ｂｈｕｔａｎｉらの方法により得られた上記ｉＰＳ細胞Ｍ１〜Ｍ３及びＳ１〜Ｓ３の塩基配列データをそれぞれ公共データベースから取得し、上記＜ｉＰＳ細胞における点変異の同定＞に記載の方法により上記各塩基配列データを解析し、全ゲノム点変異数を算出して得たｉＰＳ細胞ＢＣ１、ＢＣＴ１、Ｅ１、Ｅ２、Ｍ１〜Ｍ３及びＳ１〜Ｓ３における全ゲノム点変異数も比較として示す。
【００４０】
図３に示した結果から明らかなように、図２に示した結果と同様に、Ｃｈｅｎｇ，Ｌ．ら、Ｂｈｕｔａｎｉらに記載の従来法によるｉＰＳ細胞製造方法では、エピソーマルベクター、ｍＲＮＡ又はセンダイウイルスベクターを用いても全ゲノムにおける点変異数が３００個を超えることが分かる。
一方、特定の細胞から本発明の方法により誘導したｉＰＳ細胞クローン１〜１４では、全ゲノムにおける点変異数が２００個以下であることが分かる。
【００４１】
＜点変異組成の決定＞
赤芽球から誘導した実施例のｉＰＳ細胞クローン１〜４における点変異組成（トランジション点変異及びトランスバージョン点変異の存在割合）の決定を行なった。
図４（ａ）は、赤芽球から誘導した実施例のｉＰＳ細胞クローン１〜４における点変異組成を示す図である。
図４（ｂ）において、比較として、Ｓｕｇｉｕｒａ  Ｍ．ら，Ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｏｉｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｒｉｓｅ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｉｎｉｔｉａｌ  ｓｔａｇｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅｓｅ  ｃｅｌｌｓ．；Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ．２０１４  Ｊａｎｕａｒｙ  ２；２（１）：５２−６３．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｓｔｅｍｃｒ．２０１３．１１．００６．に記載の方法により線維芽細胞から誘導したｉＰＳ細胞１１８、１１９、１３６（以下、「比較例のｉＰＳ細胞クローン１〜３」ともいう。）における点変異組成も示す。
図４（ｂ）に示した結果から明らかなように、比較例のｉＰＳ細胞クローン１〜３においていずれも、全点変異数（ＳＮＶｓ）が２００個を超え、トランジション点変異（ｔｓ）が８０個を超え、トランスバージョン点変異（ｔｖ）も１３０個以上であることが分かる。
一方、図４（ａ）に示した結果から明らかなように、特定の細胞から本発明の方法により誘導したｉＰＳ細胞クローン１〜４では、全点変異数が１５０個以下であり、トランジション点変異も８０個以下であり、トランスバージョン点変異も７０個以下であることが分かる。
したがって、本発明によれば、全点変異数を低減し、トランジション点変異も低減し、トランスバージョン点変異もバランスよく低減していることが分かる。
【００４２】
＜ｉＰＳ細胞における挿入・欠失・置換の同定＞
上記＜ｉＰＳ細胞における点変異の同定＞に用いたＨｉＳｅｑ（登録商標）Ｘ（イルミナ社製）を用いたペアエンドリードを、ヒトのリファレンス配列（ｈｇ１９）にＣＬＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ（Ｆｉｌｇｅｎ）を用いて、点変異の際とは異なる条件にてマッピングを行い（Ｌｅｎｇｔｈ  Ｆｒａｃｔｉｏｎ，０．５；Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ  Ｆｒａｃｔｉｏｎ，０．９７；Ｎｏｎ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｍａｔｃｈ  Ｈａｎｄｌｉｎｇ，Ｉｇｎｏｒｅ．）、ＩＮＤＥＬ同定後、ＳＮＶｓにおける絞り込み条件と同様の手法にて候補を絞り込んだ。最後に、アラインメント不良による偽陽性候補を目視確認にて除外した。
結果を図５に示す。
【００４３】
図５は、赤芽球から誘導した実施例のｉＰＳ細胞クローン１〜１４における挿入、欠失及び置換の変異総数を示す図である。
図５において、比較として、Ｃｈｅｎｇ，Ｌ．らの方法により造血幹細胞からエピソーマルベクターを用いて誘導して得られたｉＰＳ細胞ＢＣ１、ＢＣＴ１における全ゲノム中の挿入、欠失及び置換の変異総数も示す。
【００４４】
図５に示した結果から明らかなように、Ｃｈｅｎｇ，Ｌ．らに記載の従来法によるｉＰＳ細胞製造方法では、エピソーマルベクターを用いても全ゲノムにおける全ゲノム中の挿入、欠失及び置換の変異総数が１２個を超えることが分かる。
一方、特定の細胞から本発明の方法により誘導したｉＰＳ細胞クローン１〜１４では、全ゲノム中の挿入、欠失及び置換の変異総数が１０個以下であることが分かる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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