(57)【要約】【課題】環境ストレス下、特に高浸透圧環境下での栽培が可能となるように、植物体の高浸透圧耐性を向上させるための方法を提供する。【解決手段】植物体のＡＴ１Ｇ２６３００遺伝子又はそのホモログ遺伝子がコードするタンパク質の機能を抑制又は阻害する、植物体の高浸透圧耐性向上方法、及びＡＴ１Ｇ２６３００遺伝子又はそのホモログ遺伝子がコードするタンパク質の機能が抑制又は阻害された、植物体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物体のＡＴ１Ｇ２６３００遺伝子又はそのホモログ遺伝子がコードするタンパク質の機能を抑制又は阻害する、植物体の高浸透圧耐性向上方法。
【請求項２】
前記タンパク質の細胞外領域に結合することによって、前記タンパク質による浸透圧調節機能を抑制又は阻害する物質を、前記植物体の根に接触させる、請求項１に記載の植物体の高浸透圧耐性向上方法。
【請求項３】
前記物質が、１種若しくは２種以上の微生物、又はこれらの分泌物質である、請求項２に記載の植物体の高浸透圧耐性向上方法。
【請求項４】
前記物質を含む水溶液に、前記植物体の根の少なくとも一部を浸漬させる工程を含む、請求項２又は３に記載の植物体の高浸透圧耐性向上方法。
【請求項５】
ＡＴ１Ｇ２６３００遺伝子又はそのホモログ遺伝子がコードするタンパク質の機能の抑制をＡＴ１Ｇ２６３００遺伝子又はそのホモログ遺伝子の発現を抑制することによって行う、又は前記タンパク質の機能の阻害をＡＴ１Ｇ２６３００遺伝子又はそのホモログ遺伝子の発現を阻害することによって行う、請求項１に記載の植物体の高浸透圧耐性向上方法。
【請求項６】
前記植物体に対して、ＡＴ１Ｇ２６３００遺伝子若しくはそのホモログ遺伝子を欠損させる、又は、ＡＴ１Ｇ２６３００遺伝子若しくはそのホモログ遺伝子にその機能を低下させる変異を導入する、請求項１又は５に記載の植物体の高浸透圧耐性向上方法。
【請求項７】
前記植物体が、双子葉植物である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の植物体の高浸透圧耐性向上方法。
【請求項８】
前記植物体が、単子葉植物である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の植物体の高浸透圧耐性向上方法。
【請求項９】
前記植物体が、イネ科の植物、ナス科の植物、アブラナ科の植物、ウリ科の植物、ブドウ科の植物、ミカン科の植物、バラ科の植物、マメ科の植物、ハス科の植物、ゴマ科の植物、アカザ科の植物、ヤシ科の植物、バショウ科の植物、アオイ科の植物、フトモモ科の植物、及びフウチョウソウ科の植物より選ばれる１種の植物である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の植物体の高浸透圧耐性向上方法。
【請求項１０】
前記植物体が、イネ、トウモロコシ、モロコシ、コムギ、オオムギ、ライムギ、ヒエ、アワ、トマト、ナス、パプリカ、ピーマン、ジャガイモ、タバコ、シロイヌナズナ、セイヨウアブラナ、ナズナ、ダイコン、キャベツ、紫キャベツ、メキャベツ、ハクサイ、チンゲンサイ、ケール、クレソン、小松菜、ブロッコリー、カリフラワー、カブ、ワサビ、マスタード、キュウリ、ニガウリ、カボチャ、メロン、スイカ、ブドウ、レモン、オレンジ、ネーブルオレンジ、グレープフルーツ、ミカン、ライム、スダチ、ユズ、シイクワシャー、タンカン、リンゴ、サクラ、ウメ、モモ、イチゴ、ビワ、アンズ、プラム、プルーン、アーモンド、ナシ、洋ナシ、ラズベリー、ブラックベリー、カシス、クランベリー、ブルーベリー、ダイズ、インゲンマメ、エンドウマメ、ソラマメ、エダマメ、リョクトウ、ヒヨコマメ、ハス、ゴマ、ホウレンソウ、ビート、テンサイ、キヌア、ヒユ、アマランサス、ケイトウ、ナツメヤシ、アブラヤシ、ココヤシ、アサイー、バナナ、バショウ、マニラアサ、ワタ、オクラ、ユーカリ、フウチョウソウ 、及びセイヨウフウチョウソウより選ばれる１種の植物である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の植物体の高浸透圧耐性向上方法。
【請求項１１】
ＡＴ１Ｇ２６３００遺伝子又はそのホモログ遺伝子がコードするタンパク質の機能が抑制又は阻害された、植物体。
【請求項１２】
植物体のＡＴ１Ｇ２６３００遺伝子又はそのホモログ遺伝子がコードするタンパク質の機能を抑制又は阻害する、高浸透圧耐性植物体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物体の高浸透圧耐性を向上させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、世界各国における人口増加による食糧生産量の増大により、大量の農業用水が必要とされ、水不足が深刻な問題となっている。農作物の高浸透圧耐性を高めることにより、より少量の水での栽培を可能にすることができ、乾燥地域でも栽培可能となることが期待できる。
【０００３】
植物の高浸透圧耐性を高める方法としては、遺伝子組換え技術を用いて、高浸透圧耐性機構に関与する遺伝子を導入する方法が挙げられる。例えば、植物細胞内にオスモライト（プロリンやベタイン）を蓄積させることによって浸透圧に対する耐性を獲得している塩生植物が存在している。このオスモライトを蓄積させる遺伝子を導入した組み換え植物は、高浸透圧耐性を獲得していることが報告されている。
【０００４】
遺伝子組換え技術を使用せずに植物の耐乾燥性（高浸透圧耐性）を高める方法としては、植物体へ保水性を付与する効果を有する薬剤や微生物を植物体に投与する方法が検討されてきている。耐乾燥性付与効果を有する薬剤としては、例えば、ピラバクチン（例えば、非特許文献１参照。）や植物ホルモンのストリゴラクトン等が知られている。また、高浸透圧耐性付与効果を有する微生物としては、例えば、コマモナス（Comamonas）属菌（例えば、特許文献１参照。）が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１７−１７６１２８号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Park et al., Science，2009，vol.324(5930), p.1068-1071.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、高浸透圧環境下での栽培が可能となるように、植物体の高浸透圧耐性を向上させるための方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は鋭意研究した結果、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）において、機能が未同定であったＡＴ１Ｇ２６３００遺伝子を欠損した変異体では、耐浸透圧形質を向上させる共生微生物群による高浸透圧耐性向上効果が得られないことを見出し、本発明を完成させた。
【０００９】
本発明に係る植物体の高浸透圧耐性向上方法等は、下記［１］〜［１２］である。
［１］  植物体のＡＴ１Ｇ２６３００遺伝子又はそのホモログ遺伝子がコードするタンパク質の機能を抑制又は阻害する、植物体の高浸透圧耐性向上方法。
［２］  前記タンパク質の細胞外領域に結合することによって前記タンパク質による浸透圧調節機能を抑制又は阻害する物質を、前記植物体の根に接触させる、前記［１］の植物体の高浸透圧耐性向上方法。
［３］  前記物質が、１種若しくは２種以上の微生物、又はこれらの分泌物質である、前記［２］の植物体の高浸透圧耐性向上方法。
［４］  前記物質を含む水溶液に、前記植物体の根の少なくとも一部を浸漬させる工程を含む、前記［２］又は［３］の植物体の高浸透圧耐性向上方法。
［５］  ＡＴ１Ｇ２６３００遺伝子又はそのホモログ遺伝子がコードするタンパク質の機能の抑制をＡＴ１Ｇ２６３００遺伝子又はそのホモログ遺伝子の発現を抑制することによって行う、又は前記タンパク質の機能の阻害をＡＴ１Ｇ２６３００遺伝子又はそのホモログ遺伝子の発現を阻害することによって行う、前記［１］の植物体の高浸透圧耐性向上方法。
［６］  前記植物体に対して、ＡＴ１Ｇ２６３００遺伝子若しくはそのホモログ遺伝子を欠損させる、又はＡＴ１Ｇ２６３００遺伝子若しくはそのホモログ遺伝子にその機能を低下させる変異を導入する、前記［１］又は［５］の植物体の高浸透圧耐性向上方法。
［７］  前記植物体が、双子葉植物である、前記［１］〜［６］のいずれかの植物体の高浸透圧耐性向上方法。
［８］  前記植物体が、単子葉植物である、前記［１］〜［６］のいずれかの植物体の高浸透圧耐性向上方法。
［９］  前記植物体が、イネ科の植物、ナス科の植物、アブラナ科の植物、ウリ科の植物、ブドウ科の植物、ミカン科の植物、バラ科の植物、マメ科の植物、ハス科の植物、ゴマ科の植物、アカザ科の植物、ヤシ科の植物、バショウ科の植物、アオイ科の植物、フトモモ科の植物、及びフウチョウソウ科の植物より選ばれる１種の植物である、前記［１］〜［６］のいずれかの植物体の高浸透圧耐性向上方法。
［１０］  前記植物体が、イネ、トウモロコシ、モロコシ、コムギ、オオムギ、ライムギ、ヒエ、アワ、トマト、ナス、パプリカ、ピーマン、ジャガイモ、タバコ、シロイヌナズナ、セイヨウアブラナ、ナズナ、ダイコン、キャベツ、紫キャベツ、メキャベツ（プチヴェール）、ハクサイ、チンゲンサイ、ケール、クレソン、小松菜、ブロッコリー、カリフラワー、カブ、ワサビ、マスタード、キュウリ、ニガウリ、カボチャ、メロン、スイカ、ブドウ、レモン、オレンジ、ネーブルオレンジ、グレープフルーツ、ミカン、ライム、スダチ、ユズ、シイクワシャー、タンカン、リンゴ、サクラ、ウメ、モモ、イチゴ、ビワ、アンズ、プラム（スモモ）、プルーン、アーモンド、ナシ、洋ナシ、ラズベリー、ブラックベリー、カシス、クランベリー、ブルーベリー、ダイズ、インゲンマメ、エンドウマメ、ソラマメ、エダマメ、リョクトウ、ヒヨコマメ、ハス（レンコン）、ゴマ、ホウレンソウ、ビート、テンサイ、キヌア、ヒユ、アマランサス、ケイトウ、ナツメヤシ、アブラヤシ、ココヤシ、アサイー、バナナ、バショウ、マニラアサ、ワタ、オクラ、ユーカリ、フウチョウソウ 、及びセイヨウフウチョウソウより選ばれる１種の植物である、前記［１］〜［６］のいずれかの植物体の高浸透圧耐性向上方法。
［１１］  ＡＴ１Ｇ２６３００遺伝子又はそのホモログ遺伝子がコードするタンパク質の機能が抑制又は阻害された、植物体。
［１２］  植物体のＡＴ１Ｇ２６３００遺伝子又はそのホモログ遺伝子がコードするタンパク質の機能を抑制又は阻害する、高浸透圧耐性植物体の製造方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明に係る植物体の高浸透圧耐性向上方法により、元々高浸透圧耐性が低い植物体の高浸透圧耐性を向上させることができる。よって、当該方法により高浸透圧耐性が向上された植物体は、浸透圧が比較的高い環境下でも栽培できるようになる。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明に係る植物体の高浸透圧耐性向上方法は、植物体のＡＴ１Ｇ２６３００遺伝子又はそのホモログ遺伝子がコードするタンパク質の機能を抑制又は阻害することを特徴とする。ＡＴ１Ｇ２６３００遺伝子は、ＢＳＤ  ｄｏｍａｉｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎをコードするシロイヌナズナの遺伝子である。以下、ＡＴ１Ｇ２６３００遺伝子又はそのホモログ遺伝子がコードするタンパク質を「ＢＳＤＣｐ」と表し、ＡＴ１Ｇ２６３００遺伝子及びそのホモログ遺伝子をまとめて「ＢＳＤＣｐ遺伝子」と表すことがある。後記実施例に記載されているように、ＢＳＤＣｐ遺伝子に変異が導入され、ＢＳＤＣｐの機能が阻害された変異体では、耐浸透圧形質を向上させる共生微生物群による高浸透圧耐性向上効果が得られない。ＢＳＤＣｐは、植物体の根に発現している細胞膜の膜タンパク質であり、植物体の浸透圧耐性に関与していることは、本発明者らによってはじめて見いだされた知見である。
【００１２】
例えば、ＡＴ１Ｇ２６３００遺伝子のホモログ遺伝子のうち、パラログ遺伝子としては、ＡＴ１Ｇ６９０３０．１遺伝子（Arabidopsis thaliana）が挙げられる。ＡＴ１Ｇ２６３００遺伝子のオーソログ遺伝子としては、例えば、Brachypodium distachyon (Purple false brome)、Chlamydomonas reinhardtii (Chlamydomonas)、Glycine max (Soybean)、Oryza sativa (Rice)、Physcomitrella patens (Moss)、Populus trichocarpa (Black Cottonwood)、Solanum lycopersicum (Tomato)、Sorghum bicolor (Sorghum)、及びVitis vinifera (Grape)等において保存されている。
【００１３】
本発明に係る植物体の高浸透圧耐性向上方法において、機能が抑制又は阻害されるＢＳＤＣｐとしては、ＢＳＤＣｐとしての機能を保持している物であれば特に限定されるものではない。本発明に係る植物体の高浸透圧耐性向上方法において、機能を抑制又は阻害するＢＳＤＣｐとしては、野生型の植物体内に存在している野生型のＢＳＤＣｐであってもよく、突然変異によって生じたＢＳＤＣｐ変異体であってもよく、紫外線照射処理等の各種変異処理によって変異が導入されたＢＳＤＣｐ変異体であってもよく、遺伝子改変技術等によって改変されたＢＳＤＣｐ改変体であってもよい。例えば、保有するＢＳＤＣｐが、野生型のＢＳＤＣｐに各種の改変処理を施してＢＳＤＣｐによる浸透圧調整機能が増強又は減弱されているＢＳＤＣｐ改変体である植物体であっても、本発明に係る植物体の高浸透圧耐性向上方法を行うことによって高浸透圧耐性を向上させることができる。
【００１４】
植物体が本来有しているＢＳＤＣｐの機能を抑制又は阻害させる方法としては、特に限定されるものではなく、ＢＳＤＣｐの発現量を低減させる方法であってもよく、ゲノムＤＮＡ中のＢＳＤＣｐ遺伝子に変異を導入して機能が低下したＢＳＤＣｐ変異体を発現させる手法であってもよく、ＢＳＤＣｐの細胞内シグナル伝達を阻害する方法であってもよい。
【００１５】
植物体の高浸透圧耐性を向上させるために当該植物体が保有するＢＳＤＣｐの発現量を低減させる場合、低減後の植物体のＢＳＤＣｐの発現量は、低減前の植物体のＢＳＤＣｐの発現量を１００％とした場合に、９０％以下、好ましくは８０％以下、より好ましくは６０％以下、さらに好ましくは５０％以下、よりさらに好ましくは３０％以下、特に好ましくは０％（完全に発現していない状態）になるようにすることが好ましい。植物体のＢＳＤＣｐの発現量は、ＲＴ−ＰＣＲ法等の当該技術分野でタンパク質の発現量を測定する際に用いられる各種方法で測定することができる。植物体の高浸透圧耐性を向上させるために当該植物体が保有するＢＳＤＣｐの機能を低下させる場合、低下後の植物体のＢＳＤＣｐの機能は、低下前の植物体のＢＳＤＣｐの機能を１００％とした場合に、９０％以下、好ましくは８０％以下、より好ましくは６０％以下、さらに好ましくは５０％以下、よりさらに好ましくは３０％以下、特に好ましくは０％（完全に機能を失った状態）となるようにすることが好ましい。
【００１６】
ＢＳＤＣｐの発現量を低減させる方法としては、ゲノムＤＮＡを改変する方法であってもよく、ＲＮＡ干渉のようにゲノムＤＮＡを改変しない方法であってもよい。ゲノムＤＮＡを改変してＢＳＤＣｐの発現量を低減させる方法としては、ＢＳＤＣｐ遺伝子を削除する方法、ＢＳＤＣｐ遺伝子にナンセンス変異を導入する方法、ＢＳＤＣｐ遺伝子のプロモーター配列等の発現調節配列を改変する方法等が挙げられる。ＢＳＤＣｐの機能が低下又は欠損する変異としては、例えば、ＢＳＤＣｐの細胞外領域にあるリガンド結合部位に、リガンドとの親和性を低下させる変異が挙げられる。
【００１７】
ゲノムＤＮＡ中のＢＳＤＣｐ遺伝子領域を改変する方法としては、相同組換えを利用して、ＢＳＤＣｐ遺伝子領域の全部又は一部を、別のＤＮＡ断片に置換する方法が汎用されている。例えば、ＢＳＤＣｐ遺伝子をコードする領域を、他の遺伝子をコードするＤＮＡ断片に置換したり、変異を導入したＢＳＤＣｐの変異遺伝子をコードするＤＮＡ断片に置換することによって、ＢＳＤＣｐ遺伝子を欠損させたり、野生型のＢＳＤＣｐにかえて変異型のＢＳＤＣｐを発現させることができる。相同組換えに求められる塩基配列の相同性（配列同一性）は、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上である。なお、相同組換え法による遺伝子操作法は既に多くの植物で確立されている。例えば、相同組換えにより置換するＤＮＡ断片を含む形質転換用ベクターを、高浸透圧耐性を向上させる目的の植物体のカルスに導入して形質転換体を作製し、得られた形質転換体を分化させることによってＢＳＤＣｐ遺伝子領域が改変されたゲノムＤＮＡを有する植物体が得られる。未分化のカルスは、常法により調製することができる。また、形質転換用ベクターとしては、直鎖状ＤＮＡであってもよく、プラスミドであってもよい。カルス等の植物細胞へのベクターの導入は、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法、ポリエチレングリコール法、電気穿孔法（エレクトロポーレーション）、リポソーム法、リン酸カルシウム沈殿法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法など当業者に公知の種々の方法を用いることができる。
【００１８】
ＲＮＡ干渉は、植物体に、ＢＳＤＣｐ遺伝子のｃＤＮＡの部分領域（ＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）標的領域）のセンス鎖とアンチセンス鎖からなる二本鎖構造を有するｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）、ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ）又はｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏ  ＲＮＡ）を導入することにより実施できる。標的である植物細胞内において、ｓｉＲＮＡ等を生産させることができるＲＮＡｉ誘導ベクターを導入してもよい。ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、及びＲＮＡｉ誘導ベクターの作製は、標的とするＢＳＤＣｐ遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列情報から、常法により設計し製造することができる。また、ＲＮＡｉ誘導ベクターは、市販の各種ＲＮＡｉベクターの塩基配列に、ＲＮＡｉ標的領域の塩基配列を挿入することによって作製することもできる。ＲＮＡｉ誘導ベクターの導入は、前記形質転換用ベクターの導入と同様にして行うことができる。
【００１９】
ＢＳＤＣｐの細胞内シグナル伝達を阻害する方法としては、ＢＳＤＣｐのアンタゴニストを植物体の根の表面に接触させる方法であってもよい。ＢＳＤＣｐのアンタゴニストとは、ＢＳＤＣｐの細胞外領域に結合することによって、ＢＳＤＣｐを介した細胞内への情報伝達を阻害する物質を意味する。ゲノムＤＮＡを改変する必要がなく、処理がより簡便である点から、本発明に係る植物体の高浸透圧耐性向上方法としては、ＢＳＤＣｐのアンタゴニストを植物体の根の表面に接触させる方法が特に好ましい。
【００２０】
本発明において用いられるＢＳＤＣｐのアンタゴニストとしては、例えば、核酸、ペプチド、タンパク質、低分子化合物等であって、ＢＳＤＣｐの細胞外領域に結合することによって、ＢＳＤＣｐによる浸透圧調節機能を抑制又は阻害する物質が挙げられる。核酸、ペプチド、低分子化合物等であって、ＢＳＤＣｐの細胞外領域に結合する物質は、核酸、ペプチド、低分子化合物等のライブラリーに対して、ＢＳＤＣｐの細胞外領域の部分タンパク質と結合する物質をスクリーニングすることによって、当業者であれば容易に取得できる。例えば核酸の場合には、ＳＥＬＥＸ法のような、ランダムな核酸ライブラリーを用いて標的分子と特異的に結合するアプタマーをスクリーニングする方法により、ＢＳＤＣｐの細胞外領域に特異的に結合する核酸アプタマーを取得できる。スクリーニングを行う核酸、ペプチド、低分子化合物等のライブラリーは、公知の様々なライブラリーを用いることができる。ＢＳＤＣｐの細胞外領域に結合するタンパク質としては、例えば、ＢＳＤＣｐの細胞外領域を特異的に認識する抗体が挙げられる。抗体は常法により製造できる。
【００２１】
本発明において用いられるＢＳＤＣｐのアンタゴニストとしては、１種又は２種以上の微生物であってもよく、１種又は２種以上の微生物の分泌物質であってもよい。当該アンタゴニストが特定の微生物の分泌物質である場合には、当該微生物の培養上清をそのまま又はその粗精製物を、植物体の根の表面に接触させてもよい。
【００２２】
ＢＳＤＣｐのアンタゴニストを植物体の根の表面に接触させる方法としては、植物体の根の少なくとも一部を栽培用溶液に浸漬させた状態で栽培する水耕栽培の場合、栽培用溶液に代えて、ＢＳＤＣｐのアンタゴニストを含む処理用溶液に植物体の根の少なくとも一部を一定期間浸漬させることによって、当該アンタゴニストを植物体の根の表面のＢＳＤＣｐに結合させ、ＢＳＤＣｐの機能を阻害し、当該植物体の高浸透圧耐性を向上させる。処理用溶液の組成、特に塩の組成は、栽培用溶液と同じであってもよく、異なっていてもよい。また、栽培用溶液に直接ＢＳＤＣｐのアンタゴニストを混合させてもよい。植物体を土壌で栽培する場合には、植物体を植えた土壌を当該アンタゴニストを含む水溶液で湿らせてもよく、土壌中の根付近に当該アンタゴニストを含む顆粒を配置してもよい。
【００２３】
本発明において高浸透圧耐性を向上させる植物体としては、元々ゲノムＤＮＡ中にＢＳＤＣｐ遺伝子を有している植物であれば特に限定されるものではなく、被子植物であってもよく、裸子植物であってもよく、シダ類やコケ類であってもよい。また、単子葉植物であってもよく、双子葉植物であってもよい。具体的には、イネ、トウモロコシ、モロコシ、コムギ、オオムギ、ライムギ、ヒエ、アワ、ミナトカモジグサ等のイネ科の植物；トマト、ナス、パプリカ、ピーマン、ジャガイモ、タバコ等のナス科の植物；シロイヌナズナ、セイヨウアブラナ、ナズナ、ダイコン、キャベツ、紫キャベツ、メキャベツ（プチヴェール）、ハクサイ、チンゲンサイ、ケール、クレソン、小松菜、ブロッコリー、カリフラワー、カブ、ワサビ、マスタード等のアブラナ科の植物；キュウリ、ニガウリ、カボチャ、メロン、スイカ、等のウリ科の植物；ブドウ等のブドウ科の植物；レモン、オレンジ、ネーブルオレンジ、グレープフルーツ、ミカン、ライム、スダチ、ユズ、シイクワシャー、タンカン等のミカン科の植物；リンゴ、サクラ、ウメ、モモ、イチゴ、ビワ、アンズ、プラム（スモモ）、プルーン、アーモンド、ナシ、洋ナシ、ラズベリー、ブラックベリー、カシス、クランベリー、ブルーベリー等のバラ科の植物；ダイズ、インゲンマメ、エンドウマメ、ソラマメ、エダマメ、リョクトウ、ヒヨコマメ等のマメ科の植物；ハス（レンコン）等のハス科の植物；ゴマ等のゴマ科の植物；ホウレンソウ、ビート、テンサイ、キヌア、ヒユ、アマランサス、ケイトウ等のアカザ科の植物；ナツメヤシ、アブラヤシ、ココヤシ、アサイー等のヤシ科の植物；バナナ、バショウ、マニラアサ等のバショウ科の植物；ワタ、オクラ等のアオイ科の植物；ユーカリ等のフトモモ科の植物；フウチョウソウ 、セイヨウフウチョウソウ等のフウチョウソウ科の植物；ポプラ、ヤナギ等のヤナギ科の植物等が挙げられる。
【００２４】
本発明に係る植物体の高浸透圧耐性向上方法により、ＢＳＤＣｐの機能を抑制又は阻害する前の植物体よりも高浸透圧耐性を向上させた植物体を得ることができる。本発明に係る植物体の高浸透圧耐性向上方法では、高浸透圧耐性向上前の植物体の１０〜５０％しか生育できない程度の浸透圧環境下でも生育可能な程度にまで高浸透圧耐性を向上させられることが好ましく、高浸透圧耐性向上前の植物体の１０〜３０％しか生育できない程度の浸透圧環境下でも生育可能な程度にまで高浸透圧耐性を向上させられることがより好ましく、高浸透圧耐性向上前の植物体の１０％以下しか生育できない程度の浸透圧環境下でも生育可能な程度にまで高浸透圧耐性を向上させられることがさらに好ましい。
【００２５】
本発明に係る植物体の高浸透圧耐性向上方法により得られた植物体（高浸透圧耐性植物体）は、植物体の高浸透圧耐性が改善され、高浸透圧環境下でも生育が可能となる。ここで、「高浸透圧環境下」とは、根等の植物体の表面から植物体内に取り込まれる水分の浸透圧が、無菌状態では同じ生物種の植物体の生育率が７５％以下となる浸透圧である環境下を意味する。本発明に係る植物体の高浸透圧耐性向上方法としては、高浸透圧耐性向上前の植物体の７０％以下しか生育できない程度の浸透圧下でも生育可能な程度にまで高浸透圧耐性を向上させられることが好ましく、６０％以下しか生育できない程度の浸透圧下でも生育可能な程度にまで高浸透圧耐性を向上させられることがより好ましく、５０％以下しか生育できない程度の浸透圧下でも生育可能な程度にまで高浸透圧耐性を向上させられることがさらに好ましい。本発明に係る植物体の高浸透圧耐性向上方法としては、なかでも、高浸透圧耐性向上前の植物体の４０％以下しか生育できない程度の浸透圧下でも生育可能な程度にまで高浸透圧耐性を向上させられることが好ましく、高浸透圧耐性向上前の植物体の３０％以下しか生育できない程度の浸透圧下でも生育可能な程度にまで高浸透圧耐性を向上させられることがより好ましく、高浸透圧耐性向上前の植物体の２０％以下しか生育できない程度の浸透圧下でも生育可能な程度にまで高浸透圧耐性を向上させられることがさらに好ましく、高浸透圧耐性向上前の植物体の１０％以下しか生育できない程度の浸透圧下でも生育可能な程度にまで高浸透圧耐性を向上させられることがよりさらに好ましい。
【００２６】
本発明に係る植物体の高浸透圧耐性向上方法としては、植物体の高浸透圧耐性を、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）濃度が１０質量％以上、好ましくは１２質量％以上、より好ましくは１５質量％以上に相当する浸透圧の環境下でも栽培可能な程度にまで改善できるものが好ましい。
【００２７】
本発明に係る植物体の高浸透圧耐性向上方法により得られた植物体は、浸透圧が高い栽培用溶液を用いた水耕栽培や、塩濃度が高い土壌を用いた土耕栽培により栽培することができる。例えば、本発明に係る植物体の高浸透圧耐性向上方法により、浸透圧が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）濃度が１０質量％以上、好ましくは１２質量％以上、より好ましくは１５質量％以上である水溶液に相当する浸透圧の栽培用溶液を用いた水耕栽培でも栽培可能な植物体を得られる場合がある。
【００２８】
高浸透圧耐性を向上させた植物体の栽培に用いる栽培用溶液としては、塩化ナトリウムや塩化マグネシウムを含むことが好ましい。また、当該栽培用溶液は、塩化ナトリウムや塩化マグネシウム以外にも、植物体の生育に必要な各種栄養成分を含有していることが好ましい。当該栄養成分は、栽培する植物体の種類に応じて適宜調整することができる。特に、窒素、リン、カリウム、カルシウム、マグネシウム、硫黄、鉄、マンガン、銅、モリブデン、ホウ素等の植物体の生育に必要な元素を塩類として含有していることが好ましい。その他、植物体の種類によっては、アルミニウムや珪素等の元素を塩類として含有する場合もある。また、植物体の生育段階に応じて栽培用溶液の組成を変更してもよい。
【００２９】
当該栽培用溶液としては、例えば、市販されている液肥に塩化ナトリウムをはじめとする不足の塩類を添加した溶液や、市販されている濃縮された液肥を、水に代えて海水で希釈した溶液を用いることができる。また、海水に、リン等の不足の塩類を適宜添加した溶液を用いることもできる。
【００３０】
高浸透圧耐性を向上させた植物体の水耕栽培は、一般的な水耕栽培方法によって行うことができる。例えば、比較的多量の栽培用溶液を栽培用槽にためる湛液型水耕法で行ってもよく、緩やかな傾斜を持つ平面上に培養液を少量ずつ流下させる薄膜水耕法で行ってもよい。
【実施例】
【００３１】
以下、実施例をもって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。
【００３２】
［実施例１］
シロイヌナズナにランダム変異を導入した変異体のライブラリー（アクティベーションタグライン種子カタログ：http://epd.brc.riken.jp/ja/resource/catalog_plantc/actic）のうち、合計３７プールセット（pss00001〜pss00009、pss00101〜pss00128）、すなわち推定３６，６５０のランダム変異系統集団に対して、シロイヌナズナの耐浸透圧形質を向上させる微生物群の共生下で高浸透圧耐性が低下している変異体をスクリーニングし、高浸透圧耐性向上に寄与している遺伝子を調べた。
【００３３】
＜シロイヌナズナ種子滅菌＞
種子プール（５０変異系統の種子を混合したもの）当たり約５０粒の種子を１．５ｍＬ容微小遠沈管に計りとり、以下の方法により滅菌を行なった。７０％エタノールを１ｍＬ加えて３０秒間転倒混和した後、微量遠心機にて１分間遠心（１５，０００ｒｐｍ）することで種子を沈殿分離し、上清を捨てた。次いで、当該種子を滅菌水１ｍＬでリンスした後、微量遠心機にて１分間遠心（１５，０００ｒｐｍ）して種子を沈殿分離し、上清を捨てた。当該種子の入った微小遠沈管に、約１ｍＬの殺菌液［ＭＳ（Murashige-Skoog）無機塩溶液に、２％（ｖ／ｖ）  ＰＰＭ（Plant Preservative Mixture、Plant Cell Technology社製）と０．００５％（ｖ/ｖ） Ｔｗｅｅｎ２０を添加した溶液］を分注し、種子が殺菌液に浸漬した状態で、冷暗所にて一晩処理した。その後、微量遠心機にて１分間遠心（１５，０００ｒｐｍ）して種子を沈殿分離し、上清を捨てた。沈殿させた種子を滅菌ろ紙上に広げ、余剰な水分を除去し、滅菌済み種子を得た。
【００３４】
滅菌済み種子を、２％（ｖ/ｖ） ＰＰＭを添加した１／２ＭＳ培地（ＭＳ培地を等量の水で希釈した液体培地）のゲル平板培地上に播種し、このゲル平板培地を少なくとも底部が１／２ＭＳ液体培地に接する状態として、２２℃、明期１６時間／暗期８時間の条件下で１４日間水耕栽培した。前記ゲル平板培地に支持された状態で育成されたシロイヌナズナ変異体の幼苗を、カルス誘導と浸透圧ストレス条件下での表現系調査に用いた。無菌播種した変異体５，７６０系統のうち、１，９３７系統の発芽、生長を確認した。
【００３５】
＜カルス誘導＞
枯死した植物体から十分量のゲノムＤＮＡを抽出することは困難であるため、浸透圧ストレス処理に先立ち、植物体の一部を切り取りカルス化して細胞を生存維持した。その後、表現型解析の結果をもとに、当該当植物体由来のカルスからＤＮＡを抽出した。
【００３６】
＜耐浸透圧形質を付与する微生物群存在下における、シロイヌナズナ変異体の耐浸透圧形質評価＞
シロイヌナズナの耐浸透圧形質を向上させる微生物群を培地に植菌し、２５℃にて１８時間程度振とう培養した。続いて、耐浸透圧形質評価用培地として、２０質量％  ＰＥＧを含む１／２ＭＳ液体培地４００ｍＬを滅菌済み容器に注ぎ入れ、前記微生物群の培養液を１／１，０００容量添加した。次いで、各シロイヌナズナ変異体の幼植物体を、地下部に浸透圧ストレスをかけた状態で１４日間育成した。幼植物体を支持しているゲル平板培地の底部が耐浸透圧形質評価用培地に接する状態にすることによって、幼植物体の地下部へ浸透圧ストレスをかけた。発芽して本葉を展開した後、浸透圧ストレスにより枯死したと推定されるシロイヌナズナ植物体を選抜し、当該植物体由来のカルスからゲノムＤＮＡを抽出した。
【００３７】
この結果、対照である野生株は、シロイヌナズナの耐浸透圧形質を向上させる微生物群との共存効果により、２０質量％  ＰＥＧ環境下でも生育したのに対して、１，９３７系統のシロイヌナズナ変異体のうちの幾つかの系統の変異体は、当該微生物群の共生下でも白化枯死した。この白化枯死した９５系統の変異体を、浸透圧耐性に関連する遺伝子に変異が導入された変異体として選抜した。
【００３８】
選抜した変異系統から誘導したカルスからゲノムＤＮＡを抽出し、ＴＡＩＬ−ＰＣＲ（thermal asymmetric interlaced PCR）解析及び次世代シーケンスによる塩基配列解析を行った。３ｒｄ ＰＣＲ産物を電気泳動した結果、各変異体に特異的なＤＮＡフラグメント６３点を切り出し、それらのＤＮＡ配列を解析した結果、シロイヌナズナ遺伝子領域に由来したものは４３点であった。さらに、配列解析により重複を除外し、浸透圧耐性に関連する２５の候補遺伝子を選抜した。
【００３９】
＜ＡＴ１Ｇ２６３００遺伝子欠損変異株の生育確認＞
２５の候補遺伝子の中から任意に選択されたＡＴ１Ｇ２６３００遺伝子が欠損されたＣＳ８０５３２９（SAILseq_109_DO3.0）株（The Arabidopsis Biological Resource Centerから購入）と対象としての野生型Ｃｏｌ−０株について、前記と同様の方法で種子を滅菌し、同様の条件で１４日間育苗した。次いで、乾燥処理として、養生した幼植物体を９６ウェルプレートごと、耐浸透圧形質評価用培地４００ｍＬで満たした滅菌済み容器上にセットし、地下部に浸透圧ストレスをかけた状態で１４日間育成した。なお、耐浸透圧形質評価用培地は、２０質量％  ＰＥＧを含む１／２ＭＳ液体培地を用いた。
【００４０】
＜画像解析＞
１４日間の育苗後、浸透圧ストレスをかける前の状態を真上から撮影した。次いで、浸透圧ストレス下での１４日間の生育の後、同様に植物体を真上から撮影した。得られた画像から画像解析ソフトウェアＩｍａｇｅＪを用いて葉の面積を測定し、一株当たりの葉の面積の平均を算出した。
【００４１】
測定結果を表１に示す。この結果、ＣＳ８０５３２９株は、野生型株Ｃｏｌ−０に対して、葉の伸長において有意な差を示した。
【００４２】
【表１】
2020150858.tif 000002
【００４３】
本実験で示すように、ＡＴ１Ｇ２６３００遺伝子が欠損した変異体では、耐浸透圧形質を付与する共生微生物群による植物体の高浸透圧耐性向上効果が抑えられ、浸透圧耐性が低下した。これらの結果から、ＡＴ１Ｇ２６３００遺伝子がコードしているＢＳＤＣｐは植物体の浸透圧耐性に関連する遺伝子であり、前記共生微生物群による植物体の高浸透圧耐性向上効果が奏されるためには、ＢＳＤＣｐの機能が重要な役割を果たしていること、特に、ＢＳＤＣｐが細胞膜の膜タンパク質であることから、前記共生微生物群がＢＳＤＣｐの細胞外領域に直接作用して細胞内へシグナルを伝達することが、植物体の高浸透圧耐性向上を引き起こすと予想された。