(57)【要約】【課題】  成熟組織の新たな製造方法を提供する。【解決手段】  本発明の成熟組織の製造方法は、多能性幹細胞由来の未熟テラトーマに、細胞分裂抑制剤を投与することによって、成熟組織を生成させる。前記細胞分裂抑制剤は、例えば、抗がん剤であり、具体例として、シスプラチンがあげられる。前記細胞分裂抑制剤の投与は、例えば、前記未熟テラトーマを有する免疫不全モデル動物への投与である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性幹細胞由来の未熟テラトーマに、細胞分裂抑制剤を投与することによって、成熟組織を生成させることを特徴とする成熟組織の製造方法。
【請求項２】
前記未熟テラトーマを有する免疫不全非ヒトモデル動物に、前記細胞分裂抑制剤を投与する、請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
前記免疫不全非ヒトモデル動物が、マウス、ラット、サル、ブタ、ウサギ、イヌ、およびヤギからなる群から選択された少なくとも一つである、請求項２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記細胞分裂抑制剤の存在下、前記未熟テラトーマを生体外で培養する、請求項１記載の製造方法。
【請求項５】
前記細胞分裂抑制剤が、抗がん剤である、請求項１から４のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項６】
前記細胞分裂抑制剤が、白金錯体製剤、代謝拮抗剤、アルキル化剤、抗がん性抗生物質、微小管作用薬、およびトポイソメラーゼ阻害剤からなる群から選択された少なくとも一つである、請求項１から５のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項７】
前記白金錯体製剤が、シスプラチン、カルボプラチン、およびオキサロプラチンからなる群から選択された少なくとも一つである、請求項６記載の製造方法。
【請求項８】
前記成熟組織が、脂肪、軟骨、唾液腺、毛嚢、筋肉、胃底腺、膵臓、骨、歯、肝臓、腎臓、目からなる群から選択された少なくとも一つである、請求項１から７のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項９】
請求項１から８のいずれか一項に記載の成熟組織の製造方法により、成熟組織を生成する工程を含むことを特徴とする臓器の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、成熟組織の製造方法、および臓器の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
再生医療における最終目的は、多能性幹細胞から臓器を分化させて、ヒトに移植することである。しかし、ＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞の研究は、広く行われているものの、現状、細胞レベルの分化が確認されるにとどまっており、組織レベルおよび臓器レベルでの分化には至っていない（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Kumar D, Anand T, Kues WA. Clinical potential of human-induced pluripotent stem cells : Perspectives of induced pluripotent stem cells. Cell Biol Toxicol. 2017;33:99-112.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そこで、本発明は、成熟組織の新たな製造方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
前記目的を達成するために、本発明の成熟組織の製造方法は、多能性幹細胞由来の未熟テラトーマに、細胞分裂抑制剤を投与することによって、成熟組織を生成させることを特徴とする。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、多能性幹細胞由来の未熟テラトーマに、細胞分裂抑制剤を投与することで、未投与の未熟テラトーマでは確認されない種類の成熟組織を製造することができる。このため、本発明は、再生医療において極めて有用な技術といえる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】図１は、実施例１において、ＥＳ細胞由来テラトーマを継代移植したマウスへのシスプラチン投与によるテラトーマの重量等の変化を平均値±標準偏差で示すグラフである。
【図２】図２は、実施例１において、ｉＰＳ細胞由来テラトーマを継代移植したマウスへのシスプラチン投与によるテラトーマの重量等の変化を平均値±標準偏差で示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
＜成熟組織の製造方法＞
本発明の成熟組織の製造方法は、多能性幹細胞由来の未熟テラトーマに、細胞分裂抑制剤を投与することによって、成熟組織を生成させることを特徴とする。
【０００９】
本発明は、前記未熟テラトーマに前記細胞分裂抑制剤を投与することが特徴であって、その他の工程および条件は、何ら制限されない。
【００１０】
本発明において、「テラトーマ」は、胚が、３胚葉（内胚葉、中胚葉、および外胚葉）に分化した胚細胞性腫瘍であり、奇形種ともいう。前記テラトーマは、組織学上、悪性と良性とに分類され、悪性のテラトーマは、成熟成分（成熟組織）と未熟成分（未成熟組織）とから構成され、未熟テラトーマと呼ばれ、良性のテラトーマは、成熟成分（成熟組織）のみから構成され、成熟テラトーマと呼ばれる。前記テラトーマは、例えば、全体における未熟成分の割合によって、分化度を分類でき、グレード０は、前記成熟成分のみから構成される成熟テラトーマであり、グレード１、２、３は、前記成熟成分と前記未熟成分とを含み、グレードが上がるほど、前記未熟成分の割合が多くなる。
【００１１】
前記多能性幹細胞は、例えば、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、ｎｔＥＳ細胞等である。再生医療の分野において、前記多能性幹細胞を免疫不全モデル動物に移植すると、未熟テラトーマ（未熟奇形種）が形成されることが知られている。前記多能性幹細胞は、前記未熟テラトーマを形成するものであればよく、その種類は、特に制限されない。
【００１２】
前記免疫不全モデル動物の種類は、特に制限されず、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ヒツジ、ウマ、ネコ、ヤギ、サル、モルモット等の非ヒト哺乳動物等があげられる。前記免疫不全モデル動物への前記多能性幹細胞の移植方法は、特に制限されず、公知の方法により行える。
【００１３】
前記細胞分裂抑制剤は、細胞分裂を抑制できるものであればよく、その種類は特に制限されない。前記細胞分裂抑制剤としては、例えば、細胞分裂の抑制を利用する抗がん剤があげられ、具体例として、シスプラチン、カルボプラチン、オキサロプラチン等の白金錯体製剤、フルオロウラシル等の代謝拮抗剤、シクロフォスファミド等のアルキル化剤、ドキソルビシン等の抗がん性抗生物質、ビンカアルカロイドやタキサン等の微小管作用薬、イリノテカン等のトポイソメラーゼ阻害剤等があげられる。前記細胞分裂抑制剤は、例えば、いずれか一種類でもよいし、二種類以上を併用してもよい。
【００１４】
本発明においては、前記多能性幹細胞の移植により形成される未熟テラトーマを使用すればよい。このため、本発明は、例えば、生体内の前記未熟テラトーマに前記細胞分裂抑制剤を投与してもよいし、生体外で前記未熟テラトーマに前記細胞分裂抑制剤を投与してもよい。
【００１５】
前者の場合、例えば、前記未熟テラトーマを有する免疫不全モデル動物に、前記細胞分裂抑制剤を投与する。投与の方法は、特に制限されず、例えば、経口投与、非経口投与のいずれでもよく、また、前記未熟テラトーマが形成された箇所への局所投与でもよいし、非局所投与でもよい。前記非経口投与は、例えば、静脈注射、筋肉注射、皮下投与、直腸投与、経皮投与、腹腔内投与、および局所投与等があげられる。
【００１６】
前記細胞分裂抑制剤の生体への投与量は、特に制限されず、例えば、前記免疫不全モデル動物の種類、大きさ、前記細胞分裂抑制剤の種類等に応じて、適宜決定できる。具体例として、前記免疫不全モデル動物がマウスであり、皮下に前記多能性幹細胞の移植により形成された前記未熟テラトーマを有し、腹腔内にシスプラチンを注射する場合、例えば、投与期間は、週１回投与で４週間〜１２週間、１日あたりのシスプラチンの投与量合計は、２ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇであり、１日あたりの投与回数は、１回である。
【００１７】
後者の場合、例えば、前記免疫不全モデル動物から前記未熟テラトーマを取り出し、前記未熟テラトーマに、前記細胞分裂抑制剤を投与する。投与の方法は、特に制限されず、例えば、培地に前記未熟テラトーマを置き、前記培地に前記細胞分裂抑制剤を添加する。前記培地の種類は、特に制限されない。
【００１８】
前記未熟テラトーマに対する前記細胞分裂抑制剤の添加量は、特に制限されず、例えば、前記未熟テラトーマの大きさ、前記細胞分裂抑制剤の種類等に応じて、適宜決定できる。具体例として、前記未熟テラトーマに対する前記シスプラチンの添加量は、例えば、前記未熟テラトーマの体積１ｃｍ３あたり１μｇ〜１００μｇであり、１回の添加に対して１〜３０日の培養を行う。
【００１９】
本発明によれば、前記未熟テラトーマを前記細胞分裂抑制剤で処理することによって、処理前の前記未熟テラトーマでは確認されなかった成熟組織が、組織学的に確認できるようになる。前記成熟組織は、例えば、脂肪、軟骨、唾液腺、毛嚢、筋肉、胃底腺、膵臓、骨、歯、肝臓、腎臓、目等である。
【００２０】
＜臓器の製造方法＞
つぎに、本発明の臓器の製造方法は、前記本発明の成熟組織の製造方法により、成熟組織を生成する工程を含むことを特徴とする。本発明の製造方法は、前記本発明の成熟組織の製造方法により成熟組織を生成することが特徴であって、その他の工程および条件は、何ら制限されない。
【００２１】
＜細胞分裂抑制剤の用途＞
本発明の成熟組織の製造促進剤は、前記細胞分裂抑制剤を含むことを特徴とする。本発明の製造促進剤は、例えば、前記本発明の成熟組織の製造方法に使用でき、前記本発明の製造方法の記載を援用できる。
【００２２】
本発明の臓器の製造促進剤は、前記細胞分裂抑制剤を含むことを特徴とする。本発明の製造促進剤は、例えば、前記本発明の臓器の製造方法に使用でき、前記本発明の製造方法の記載を援用できる。
【００２３】
本発明の各製造促進剤の剤型は、特に制限されず、例えば、投与形態に応じて適宜決定できる。前記剤型は、例えば、液体状、および固体状があげられる。投与が経口投与の場合、例えば、錠剤、被覆錠剤、丸剤、細粒剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、液剤、シロップ剤、乳剤、および懸濁剤等があげられる。投与が非経口投与の場合、前記剤型は、例えば、注射用製剤、および点滴用製剤等があげられる。経皮投与の場合、前記剤型は、例えば、貼付剤、塗布剤、軟膏、クリーム、およびローション等の外用薬があげられる。前記本発明の各製造促進剤は、例えば、必要に応じて、添加剤を含んでもよく、前記添加剤は、特に制限されず、例えば、基剤原料、賦形剤、着色剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、安定化剤、保存剤、および、香料等の矯味矯臭剤等があげられる。
【実施例】
【００２４】
つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、下記実施例により制限されない。市販の試薬は、特に示さない限り、それらのプロトコルに基づいて使用した。
【００２５】
［実施例１］
シスプラチン投与による効果をin vivoで確認した。
【００２６】
（１）マウスへのシスプラチン投与
ＥＳ細胞は、C57BL/6Jマウスから調製し、ｉＰＳ細胞(iPS -MEF-Ng-440A3)は、理研セルバンクより購入した。コンフルエンスに達したＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞をトリプシン処理し、リン酸緩衝生理食塩水(ＰＢＳ、ｐＨ７．４)で洗浄し、１ｍＬ  ＰＢＳに懸濁した。前記ＥＳ細胞懸濁液または前記ｉＰＳ細胞懸濁液(細胞数４×１０６、全量１００μＬ)を、それぞれ、５匹の１０週齢RAG2-/-マウス(三共ラボサービス)の背部および左大腿部に皮下注射した。そして、マウスを、動物室内のケージ(１ケージにつき５匹)に収容し、水および餌(ＦＲ−１、船橋農場)を自由に摂取させた。前記動物室は、温度制御（２１〜２５℃)および光制御(１２時間明期：１２時間暗期のサイクル、８００時間点灯)の環境とした。皮下注射から４週間後、皮下注射した部位、すなわちマウスの背部および左大腿部に長径約２０〜３０ｍｍのテラトーマが確認された。なお、これらのテラトーマは、未熟テラトーマであることが、組織学的に確認できた。
【００２７】
このマウスを屠殺し、テラトーマを取出し、径３ｍｍ程度の細片に細断して、それを新たに別のRAG2-/-マウスの背部または左大腿部に継代移植した。その継代移植されたマウスに、移植から約２週間後、移植部位、すなわち背部または左大腿部に、触れることが出来る腫瘤を確認した。その後、これらのマウスに、以下に示すようにシスプラチンを投与した。この時点から、所定期間（４週間または８週間）の間、シスプラチン（製品名シスプラチン点滴静注液「マルコ」１０ｍｇ／２０ｍＬ）をマウスに投与した。シスプラチンは、マウス体重を２０ｇ、投与量２．５ｍｇ／ｋｇまたは５ｍｇ／ｋｇと想定して、一匹あたり５０μｇ（低濃度）または１００μｇ（高濃度）を、週１回、腹腔内に、腹腔内注射により投与した。低濃度群、高濃度群、無投与群を、それぞれ５〜１０匹ずつ設定し、さらに各群を４週間投与群と８週間投与群に分割した。そして、前記所定期間の投与後に、マウスから腫瘤を切除し、重量、体積、壊死部の割合、成熟度の割合を確認した。体積（ｍｍ３）は、π／６×ｈｅｉｇｈｔ（ｍｍ）×ｗｉｄｔｈ（ｍｍ）×ｌｅｎｇｔｈ（ｍｍ）の式から計算した。壊死部の割合は、前記腫瘤をＨＥ染色し、１００倍視野でランダムに１０視野を選び、視野ごとに壊死領域を含んでいるかどうかを評価して、含まない場合は０、含む場合は１に分類し、１０視野の合計値を求めた。成熟度の割合は、前記腫瘤をＨＥ染色し、１００倍視野で壊死していない領域をランダムに１０視野選び、視野ごとに未熟成分と成熟成分のうちいずれが優位かを評価して、未熟成分が優位の場合は０、成熟成分が優位の場合は１に分類し、１０視野の合計値を求めた。
【００２８】
シスプラチンを４週間投与した場合の結果を、図１および図２に示す。図１は、ＥＳ細胞由来テラトーマを継代移植したマウスの結果であり、図２は、ｉＰＳ細胞由来テラトーマを継代移植したマウスの結果である。各図において、（Ａ）は、重量（ｍｇ）、（Ｂ）は、体積（ｍｍ３）、（Ｃ）は、壊死部の割合、（Ｄ）は、成熟度の割合を示す。各図において、無処置は、シスプラチン未投与の群であり、低濃度は、シスプラチンの一回の投与量が５０μｇの群であり、高濃度は、シスプラチンの一回の投与量が１００μｇの群である。２群間の比較には、Studentのt検定を用い、３群間の比較には、Tukey-Kramer testを用いた。
【００２９】
図１および図２に示すように、ＥＳ細胞由来テラトーマまたはｉＰＳ細胞由来テラトーマを継代移植したマウスに対してシスプラチンを投与することによって、シスプラチン濃度に依存して、形成された腫瘤の重量および体積が減少し、壊死も減少し、成熟成分の割合が増加した。
【００３０】
また、図１および図２の結果について、スピアマンの相関分析により、重量、体積、壊死、および成熟度の割合の４項目の相関分析を行った。その結果、重量と体積とは、当然、相関するが、前記テラトーマを移植したマウスでは、壊死も、重量および体積と相関し、成熟度の割合は、重量、体積、および壊死と逆相関した。この結果から、腫瘍は、成熟することによって、むしろ壊死が減少するといえ、また、腫瘍が大きいほど壊死が多いことから、腫瘍増大に血流が追い付かないために壊死が生じたと考えられる。このため、テラトーマの未熟成分が壊死したために、成熟成分が増加したわけではないことがわかった。
【００３１】
（２）ＨＥ染色による組織観察
前記（１）において、所定期間（４週間または８週間）の投与後にマウスから切除した腫瘤について、ＨＥ染色を行った。その結果、各群について確認された未熟組織および成熟組織を、表１および表２に示す。未熟神経、線維組織、円柱上皮、重層扁平上皮は、どの腫瘤にも現れたので、これらは表から除外した。表１は、ＥＳ細胞由来テラトーマを移植したマウスの結果であり、表２は、ｉＰＳ細胞由来テラトーマを移植したマウスの結果である。なお、成熟した軟骨とは、軟骨小窩を伴うものとして判断し、成熟した唾液腺とは、粘液腺を含むものとして判断した。
【００３２】
【表１】
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【００３３】
【表２】
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【００３４】
前記表１および前記表２に示すように、シスプラチンを投与した群については、脂肪、軟骨、唾液腺、胃底腺、膵臓、筋肉、毛嚢等の成熟組織が確認できた。
【００３５】
（３）免疫染色による組織観察
前記（１）において、所定期間（８週間）の投与後にマウスから切除した腫瘤について、免疫染色を行った。その結果、以下のことがわかった。すなわち、シスプラチンの投与群においてのみ、免疫染色でｈ−Ｃａｌｄｅｓｍｏｎ陽性となる血管が現れた。また、前記投与群では、非投与群に比較して、Ｋｉ−６７陽性細胞の比率が低下した。未熟テラトーマの中でも、より成熟したものでは、ｈ−Ｃａｌｄｅｓｍｏｎ陽性となる血管の成熟が生じていること、また、Ｋｉ−６７陽性細胞の比率が低下することが知られているため、上記の結果から、シスプラチン投与によって、前記投与群では、より成熟した未熟テラトーマに変移し、組織分化が生じていることが裏付けられた。
【００３６】
以上、実施形態および実施例を参照して本発明を説明したが、本発明は、上記実施形態および実施例に限定されるものではない。本発明の構成や詳細には、本発明のスコープ内で当業者が理解しうる様々な変更をすることができる。
【産業上の利用可能性】
【００３７】
本発明によれば、多能性幹細胞由来の未熟テラトーマに、細胞分裂抑制剤を投与することで、未投与の未熟テラトーマでは確認されない種類の成熟組織を製造することができる。このため、本発明は、再生医療において極めて有用な技術といえる。
【図１】
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【図２】
2020167956.tif 000006