(57)【要約】      （修正有）【課題】ＥＧＦＲｖＩＩＩに対する新規抗体またはその抗原結合断片の提供。【解決手段】ＥＧＦＲｖＩＩＩ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｖａｒｉａｎｔ  ＩＩＩ）に対する抗体またはその抗原結合断片、それをコードする核酸、前記核酸を含むベクター、前記ベクターで形質転換された細胞、前記抗体またはその抗原結合断片の製造方法、その癌予防または治療用組成物、癌診断用組成物および癌診断用キット。【選択図】図１
2020195398.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＥＧＦＲｖＩＩＩ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏ
ｒ  Ｖａｒｉａｎｔ  ＩＩＩ）に結合する抗体またはその抗原結合断片であって、前記抗
体またはその抗原結合断片は、配列番号１の配列を有するＥＧＦＲｖＩＩＩのエピトープ
に結合することを特徴とする抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２】
配列番号２の配列を有するＣＤＲ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉ
ｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）Ｈ１、配列番号３の配列を有するＣＤＲＨ２、及び配列番号４
の配列を有するＤＲＨ３を含む重鎖可変領域と、
配列番号５の配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号６の配列を有するＣＤＲＬ２、及び配
列番号7の配列をＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域と、を含むことを特徴とする請求項１に
記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３】
配列番号８〜１５の配列で構成された群から選択された一つ以上の配列を有する骨格領
域（ＦＲ）を含むことを特徴とする請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４】
配列番号１６の配列を有する重鎖可変領域を含むことを特徴とする請求項１に記載の抗
体またはその抗原結合断片。
【請求項５】
配列番号１７の配列を有する軽鎖可変領域を含むことを特徴とする請求項１に記載の抗
体またはその抗原結合断片。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸。 
【請求項７】
配列番号１８または配列番号１９の配列を有することを特徴とする請求項６に記載の核
酸。
【請求項８】
請求項６に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項９】
請求項８に記載の発現ベクターで形質転換された細胞。
【請求項１０】
下記の段階を含む請求項１〜５のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片の製造
方法:
（ａ） 請求項９に記載の細胞を培養する段階；および 
（ｂ）前記培養された細胞から抗体またはその抗原結合断片を回収する段階。
【請求項１１】
請求項１〜５のいずれかに記載の抗体を有効性分として含む癌の予防または治療用組成
物。
【請求項１２】
前記癌は、肺癌、大腸癌、胃癌、腎臓癌、前立腺癌、乳癌、膠芽細胞腫、および卵巣癌
で構成された群から選択されることを特徴とする請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
請求項１〜５のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片を含む癌診断用組成物。
【請求項１４】
請求項１３に記載の癌診断用組成物を含む癌診断用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒ
ｅｃｅｐｔｏｒ  Ｖａｒｉａｎｔ  ＩＩＩ）に対する抗体またはその抗原結合断片、それ
をコードする核酸、前記核酸を含むベクター、前記ベクターで形質転換された細胞、前記
抗体またはその抗原結合断片の製造方法、それを含む癌予防または治療用組成物、癌診断
用組成物および癌診断用キットに関する。 
【背景技術】
【０００２】
癌治療のための単クローン抗体の使用が、かなりの成功を収めている。抗体薬物結合体
は、リンパ種や固形癌の治療のために強く且つ新しい治療のオプションとなっており、近
年、免疫調節抗体も臨床でかなりの成功を収めている。治療抗体の開発は、癌血清学、タ
ンパク質エンジニアリング技術とその作用、抵抗性の機序、および免疫システムと癌細胞
との相互作用についての深い理解を土台にする。
【０００３】
ヒト癌の細胞の表面で発現される抗原の定義は、正常組織に比べて過発現されるか、突
然変異および選択的に発現される広範囲な目標物を意味する。核心的な問題は、抗体に基
づく治療法に適切な抗原を同定することである。このような治療剤は、抗原や受容体の機
能（すなわち、刺激剤または拮抗剤としての機能）の変化を媒介し、ＦｃとＴ細胞の活性
化によって免疫システムを調節し、特定の抗原を目標とする抗体に結合される特定の薬物
の伝達によりその効能を発揮する。抗体薬物動態学（ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ
）、作用機能、サイズと免疫刺激性を変化させ得る分子技術が、新しい抗体を基にした治
療法の開発において核心的な要素として登場している。癌患者を対象とした治療抗体の臨
床試験で得られた証拠は、目標抗原と抗体の親和性および結合性、抗体構造の選択、治療
的アプローチ（信号伝逹の遮断や免疫作用機能）を含む、最適化された抗体を選択するた
めのアプローチの重要性を強調している。
【０００４】
これに関連して、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を抗原とする抗体に関する研究が行
われている。ＥＧＦＲは、癌原遺伝子（ｐｒｏｔｏ‐ｏｎｃｏｇｅｎｅ）ｃ‐ｅｒｂ  Ｂ
の１７０キロダルトンの膜リポタンパク質産物である。ＥＧＦＲ遺伝子の配列は知られて
いる。ＥＧＦＲ遺伝子は、元々鳥類の赤芽球症（ａｖｉａｎ  ｅｒｙｔｈｒｏｂｌａｓｔ
ｏｓｉｓ）ウイルスで同定されたｅｒｂＢ腫瘍遺伝子の細胞相同体（ｈｏｍｏｌｏｇ）で
ある。遺伝子の増幅による前記腫瘍遺伝子の活性化は、多様なヒト腫瘍で観察されている
。
【０００５】
ＥＧＦＲは、多様な類型のヒト固形腫瘍に対して過発現される。ＥＧＦＲの過発現は、
一部の肺、乳房、結腸、胃、脳、膀胱、頭頸部、卵巣、腎臓、および前立腺癌腫で観察さ
れた。上皮成長因子（ＥＧＦ）および形質転換成長因子‐α（ＴＧＦ‐α）は、ＥＧＦＲ
に結合して細胞増殖および腫瘍成長を誘導することが明らかになっている。また、サイズ
変異体ＥＧＦＲ遺伝子および増幅がいくつかのヒト癌で報告されたこともある。
【０００６】
ＥＧＦＲ変異体は、ＥＧＦＲ遺伝子の増幅によって伴われる遺伝子の再配列によって誘
発される。次のような８つの主要ＥＧＦＲ変異体が知られている：（ｉ）ＥＧＦＲｖＩは
、ＥＧＦＲの細胞外ドメインが殆ど欠如しており、（ｉｉ）ＥＧＦＲｖＩＩは、ＥＧＦＲ
の細胞外ドメインで８３ａａインフレーム（ｉｎ‐ｆｒａｍｅ）欠失で構成されており、
（ｉｉｉ）ＥＧＦＲｖＩＩＩは、ＥＧＦＲの細胞外ドメインで２６７ａａインフレーム欠
失で構成されており、（ｉｖ）ＥＧＦＲｖＩＶは、ＥＧＦＲの細胞質ドメインに欠失を含
んでおり、（ｖ）ＥＧＦＲｖＶは、ＥＧＦＲの細胞質ドメインに欠失を含んでおり、（ｖ
ｉ）ＥＧＦＲ．ＴＤＭ／２‐７は、ＥＧＦＲの細胞外ドメインにエキソン２‐７の複製を
含んでおり、（ｖｉｉ）ＥＧＦＲ．ＴＤＭ／１８‐２５は、ＥＧＦＲの細胞外ドメインに
エキソン１８‐２６の複製を含んでおり、（ｖｉｉｉ）ＥＧＦＲ．ＴＤＭ／１８‐２６は
、ＥＧＦＲのチロシンキナーゼにエキソン１８‐２６の複製を含んでいる。また、エキソ
ン１１および１４の接合部で新規なヒスチジン残基を導入する第２欠失を有する稀な第２
のＥＧＦＲｖＩＩＩ突然変異体（ＥＧＦＲｖＩＩＩ／Δ１２‐１３）がある。
【０００７】
ＥＧＦＲｖＩＩＩは、ヒト癌で最も通常に発生する上皮成長因子（ＥＧＦ）の変異体で
あって、膠芽細胞腫（ＧＢＭ）患者の約３０％の患者で発現され、正常組織では発現され
ない。かかるＥＧＦＲ受容体の変異体は、リガンド独立的な方式により構造的信号化（ｓ
ｉｇｎａｌｉｎｇ）によって腫瘍の進行に寄与する。 
【０００８】
腫瘍の形成を潜在的に誘導する遺伝子の突然変異や再配列は、多くの癌で同定されるこ
とができる。癌発生タンパク質が、癌幹細胞に連関された経路に寄与し得るという結果が
発表されている。このように変形された遺伝子の生産物は、癌幹細胞を同定し潜在的に目
標化するのに使用可能であるということの証拠を提示している。実際に、このような主な
突然変異は癌細胞の全体にわたって存在し、特定の癌細胞亜型にのみ存在するのではない
ため、かかるアプローチは容易な方法ではない。したがって、突然変異タンパク質は、癌
幹細胞で何かの直接的な役割をするのではなく、腫瘍の成長を一般的に潜在化させる。さ
らに、殆どの変形されたタンパク質は細胞内部に存在する。
【０００９】
突然変異タンパク質と癌幹細胞との相関関係は明確ではない。膠芽細胞腫腫瘍は、遺伝
子の再配列と増幅によって発現されるＥＧＦＲ変形体であるＥＧＦＲｖＩＩＩをよく発現
すると知られている。常にチロシンりん酸化部位が活性化された形態で存在するため、強
い腫瘍形成性（ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃｉｔｙ）の特性を示す。しかし、このような変形
にもかかわらず、ＥＧＦＲｖＩＩＩの発現は制限的である。癌幹細胞で、ＥＧＦＲｖＩＩ
ＩはＣＤ１３３とともに高く発現されており、ＥＧＦＲｖＩＩＩ＋／ＣＤ１３３＋細胞は
高い再生と腫瘍開始能を有する。ＥＧＦＲｖＩＩＩ＋細胞は幹／前駆体マーカーとともに
連関されているのに対し、分化マーカーはＥＧＦＲｖＩＩＩ‐細胞で発見された。ＥＧＦ
ＲｖＩＩＩの発現は、正常の細胞培養では損失されたが、腫瘍球体培養では維持され、ま
た、培養された細胞はＥＧＦＲｖＩＩＩ＋／ＣＤ１３３＋を同時発現して再生され、腫瘍
開始能力を有する。
【００１０】
ＥＧＦＲｖＩＩＩを過発現する癌を治療するために、ＥＧＦＲｖＩＩＩに高い親和力で
結合して癌細胞の成長を阻害できる抗‐ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体が求められている。
【００１１】
従来、ＥＧＦＲに特異的に結合するセツキシマブ（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）などのような
抗体治療剤が開発されている。しかし、このような抗体治療剤は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ突然
変異癌細胞に対する抗原特異性が非常に劣り、癌細胞成長抑制能を示さないという問題が
あった。
【００１２】
このような背景技術の下で、本出願の発明者らは、ＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的に結合す
る坑癌治療用抗体を開発するために努力した。その結果、本発明者らは、ファージディス
プレイ技術を用いて、ＥＧＦＲｖＩＩＩに高い親和力で結合する抗‐ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗
体を開発し、このような抗‐ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体が癌細胞の移動を著しく抑えることが
できることを確認し、本発明を完成した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の目的は、ＥＧＦＲｖＩＩＩに対する新規抗体またはその抗原結合断片を提供す
るところにある。
【００１４】
本発明の他の目的は、前記抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸を提供すると
ころにある。
【００１５】
本発明のさらに他の目的は、前記核酸を含むベクター、前記ベクターで形質転換された細
胞 、および前記抗体またはその抗原結合断片の製造方法を提供するところにある。
【００１６】
本発明のさらに他の目的は、前記抗体またはその抗原結合断片を含む癌の予防または治療
用組成物を提供するところにある。
【００１７】
本発明のさらに他の目的は、前記抗体またはその抗原結合断片を含む癌診断用組成物およ
びこれを含む癌診断用キットを提供するところにある。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
前記目的を達成するために、本発明は、ＥＧＦＲｖＩＩＩに対する抗体またはその抗原
結合断片であって、前記抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１の配列を有するＥＧ
ＦＲｖＩＩＩのエピトープに結合することを特徴とする抗体またはその抗原結合断片を提
供する。
【００１９】
本発明はまた、前記抗体またはその抗原結合断片の重鎖可変領域をコードする核酸を提
供する。
【００２０】
本発明はまた、前記核酸を含むベクターを提供する。 
【００２１】
本発明はまた、前記ベクターで形質転換された細胞を提供する。
【００２２】
本発明はまた、（ａ）前記細胞を培養するステップと、（ｂ）前記培養された細胞から
抗体またはその抗原結合断片を回収するステップと、を含む、前記抗体またはその抗原結
合断片の製造方法を提供する。
【００２３】
本発明はまた、前記抗体またはその抗原結合断片を有効性分として含む癌の予防または
治療用組成物を提供する。
【００２４】
本発明はまた、前記抗体またはその抗原結合断片を含む癌診断用組成物を提供する。
【００２５】
本発明はまた、前記癌診断用組成物を含む癌診断用キットを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】患者由来細胞のＥＧＦＲｖＩＩＩの突然変異および発現程度をＲＴ‐ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）およびウエスタンブロット（ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ）法により確認した結果を示したものである。
【図２】ＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的なｓｃＦｖ抗体断片をファージディスプレイスクリーニングする過程を示したものである。
【図３】膠芽細胞腫（ＧＢＭ）患者の細胞を用いたＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体の選別結果および配列分析結果を示したものである。
【図４】Ｂ４Ａ３抗体とセツキシマブのＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ペプチドに対する結合能を確認した結果を示したものである。
【図５】Ｂ４Ａ３抗体とセツキシマブのＥＧＦＲ組換えタンパク質に対する結合能を確認した結果を示したものである。
【図６】Ｂ４Ａ３抗体とセツキシマブのＥＧＦＲｖＩＩＩ組換えタンパク質に対する結合能を確認した結果を示したものである。
【図７】Ｂ４Ａ３抗体とＥＧＦＲ対照群抗体で染色し、Ｂ４Ａ３抗体のＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的結合能をＳＤＳ‐ＰＡＧＥにより確認した結果を示したものである。
【図８】ＥＧＦＲおよびＥＧＦＲｖＩＩＩの発現パターンを確認するためにウエスタンブロットを行った結果を示したものである。
【図９】抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ｓｃＦｖのＥＧＦＲｖＩＩＩに対する細胞結合様相を分析するためにＦＡＣＳ分析を行った結果を示したものである。
【図１０】正常細胞でＢ４Ａ３抗体（ＩｇＧ１）の結合様相を確認した結果を示したものである。
【図１１】ＥＧＦＲｖＩＩＩのみを発現するｖＩＩＩ３５２Ｔ１でＢ４Ａ３抗体（ＩｇＧ１）の結合様相を確認した結果を示したものである。
【図１２】Ｂ４Ａ３抗体にサポリン接合抗体を結合し、ＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的抗体‐サポリン接合抗体の複合体が、ＥＧＦＲｖＩＩＩ発現患者の細胞に効果的に細胞内在化されるとともに、細胞毒性を誘導することを確認した結果を示したものである。
【図１３】Ｂ４Ａ３抗体の親和度を定量化した結果を示したものである。
【図１４】Ｂ４Ａ３抗体のＥＧＦＲおよびＥＧＦＲｖＩＩＩに対する親和度の定量のために組換えＥＧＦＲおよびＥＧＦＲｖＩＩＩを製造するためのベクターを示したものである。
【図１５】Ｂ４Ａ３の癌細胞成長抑制能をＩｎ‐ｖｉｖｏで確認した結果を示したものである。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
他の方式で定義されない限り、本明細書において使用されたあらゆる技術的・科学的用
語は、本発明が属する技術分野に熟練した専門家によって通常理解されるものと同じ意味
を有する。通常、本明細書において使用された命名法及び以下で詳述する實驗方法は、本
技術分野において周知であり、しかも汎用されるものである。
【００２８】
一観点において、本発明は、ＥＧＦＲｖＩＩＩに対する抗体またはその抗原結合断片に
関し、前記抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１の配列を有するＥＧＦＲｖＩＩＩ
のエピトープに結合することを特徴とする抗体またはその抗原結合断片に関する。
【００２９】
本発明者らは、種々の癌で発現されると知られているＥＧＦＲｖＩＩＩに結合する坑癌
治療用抗体を開発するために努力した。その結果、本発明者らは、ファージディスプレイ
技術を用いて、ＥＧＦＲｖＩＩＩに高い親和力で結合して細胞内に内在化する抗‐ＥＧＦ
ＲｖＩＩＩ抗体を製造し、このような抗‐ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体が癌細胞の移動を著しく
抑えることができることを確認した。
【００３０】
本明細書において「ＥＧＦＲｖＩＩＩ」は、ＭＲ１  ｓｃＦｖによって認識され、アミ
ノ末端付近の２‐７エキソンの８０１塩基対のインフレーム欠失によって特徴される上皮
成長因子受容体の突然変異型を意味する。ＥＧＦＲｖＩＩＩは、約５０〜６０％の膠芽細
胞腫（ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ）で高発現され、約７０〜８０％の乳房および卵巣癌腫
、および約１６％の非小細胞肺癌腫で存在するとされている。突然変異受容体は細胞表面
で発現され、欠失接合部で新しい腫瘍特異細胞表面エピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）を生成
する。
【００３１】
「エピトープ」とは、抗体に特異的に結合することができるタンパク質決定基を意味す
る。エピトープは、通常的に、アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的活性表面群から
なり、一般的に、特異的な３次元の構造特性ならびに特異的な電荷特性を有する。立体配
座エピトープおよび非立体配座エピトープは、変性溶媒の存在下で、立体配座エピトープ
への結合が失われるが、非立体配座エピトープへの結合は失われない点で区別される。本
発明は、配列番号１の配列を有するＥＧＦＲｖＩＩＩのエピトープに結合する抗体または
その抗原結合断片に関する。
【００３２】
本発明で使用される用語「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」とは、ＥＧＦＲｖＩＩＩに特異
的に結合する抗−ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体を意味する。本発明の範囲にはＥＧＦＲｖＩＩＩ
に特異的に結合する完全な抗体形態だけでなく、前記抗体分子の抗原結合断片も含まれる
。
【００３３】
完全型抗体は、二つの全長（ｆｕｌｌｌｅｎｇｔｈ）軽鎖および二つの全長重鎖を有す
る構造であり、それぞれの軽鎖は、重鎖とジスルフィド結合によって連結されている。重
鎖不変領域は、ガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）及びイプシ
ロン（ε）タイプを有して、サブクラスとしてガンマ１（γ１）、ガンマ２（γ２）、ガ
ンマ３（γ３）、ガンマ４（γ４）、アルファ１（α１）およびアルファ２（α２）を有
する。軽鎖不変領域はカッパ（κ）およびラムダ（λ）タイプを有する。
【００３４】
本発明の抗体は、単一クローン抗体、多特異的抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗
体、一本鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ジスルフ
ィド−結合Ｆｖｓ（ｓｄＦＶ）および抗−イディオタイプ（抗−Ｉｄ）抗体、または前記
抗体のエピトープ−結合断片などを含むが、これに限定されない。
【００３５】
抗体の抗原結合断片または抗体断片とは、抗原結合能力を有する断片を意味し、Ｆａｂ
、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びｓｃＦｖを含む。抗体断片の中Ｆａｂは、軽鎖及び重鎖
の可変領域と軽鎖の不変領域及び重鎖の一番目の不変領域（ＣＨ１ドメイン）を有する構
造で一つの抗原結合部位を有する。Ｆａｂ’は、重鎖ＣＨ１ドメインのＣ末端に一つ以上
のシステイン残基を含むヒンジ領域（ｈｉｎｇｅ  ｒｅｇｉｏｎ）を有する点でＦａｂと
差がある。Ｆ（ａｂ’）２抗体は、Ｆａｂ’のヒンジ領域のシステイン残基がジスルフィ
ド結合をなして生成される。Ｆｖは、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域だけを有している最
小の抗体断片として、Ｆｖ断片を生成する組換え技術は、ＰＣＴ国際公開特許出願ＷＯ８
８／１０６４９、 ＷＯ８８／１０６６３０、ＷＯ８８／０７０８５、ＷＯ８８／０７０
８６及びＷＯ８８／０９３４４に開示されている。二本鎖Ｆｖ（ｔｗｏ−Ｃｈａｉｎ ｖ
）は、非共有結合で重鎖可変部位と軽鎖可変部位が連結されていて、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦ
ｖ）は一般にペプチドリンカーを介して重鎖の可変領域と軽鎖の可変領域が共有結合で連
結されているされたり、またはＣ末端で直ちに連結されるため、二本鎖Ｆｖのようにダイ
マーのような構造を形成することができる。このような抗体断片は、タンパク質加水分解
酵素を利用して得ることができて（例えば、全抗体をパパインで制限切断してＦａｂを得
ることができて、ペプシンで切断すると、Ｆ（ａｂ’）２断片を得ることができる）、遺
伝子組み換え技術を介して製作することができる。
【００３６】
「Ｆｖ」断片は、完全な抗体認識および結合部位を含有する抗体断片である。このよう
な領域は、１個の重鎖可変ドメインと１個の軽鎖可変ドメインが、例えばｓｃＦｖで頑固
に事実上共有的に連合した二量体からなる。
【００３７】
「Ｆａｂ」断片は、軽鎖の可変および不変ドメインと、重鎖の可変および第１不変ドメ
イン（ＣＨ１）を含有する。Ｆ（ａｂ’）抗体断片は、一般にそれらの間にヒンジシステ
インによってそれらのカルボキシ末端近くに共有的に連結される一対のＦａｂ断片を含む
。
【００３８】
「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含む
が、これらのドメインは、単一ポリペプチド鎖内に存在する。Ｆｖポリペプチドは、ｓｃ
Ｆｖが抗原結合のために目的する構造を形成することができるようにするＶＨドメインと
ＶＬドメインの間にポリペプチドリンカーを追加で含むことができる。
【００３９】
一実施例で、本発明に係る抗体は、Ｆｖ形態（例えば、ｓｃＦｖ）であるか、完全な抗
体形態である。また、重鎖不変領域はガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デ
ルタ（δ）またはイプシロン（ε）中いずれか一つのイソタイプから選択され得る。例え
ば、不変領域は、ガンマ１（ＩｇＧ１）、ガンマ３（ＩｇＧ３）またはガンマ４（ＩｇＧ
４）である。軽鎖不変領域は、カッパまたはラムダ型であってもよい。
【００４０】
本明細書で使用される用語、「重鎖」とは、抗原に特異性を付与するための十分な可変
領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＨおよび３個の不変領域ドメイ
ンＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む全長重鎖およびこれの断片をいずれも意味する。ま
た、本明細書で使用される用語、「軽鎖」とは、抗原に特異性を付与するための十分な可
変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＬおよび不変領域ドメインＣ
Ｌを含む全長軽鎖およびこれの断片をいずれも意味する。
【００４１】
前記単一クローン抗体は、実質的に同質的抗体集団から収得した抗体、すなわち、集団
を占めている個々の抗体が微量で存在することができる可能な天然発生的突然変異を除い
ては同じであることを指し示す。単一クローン抗体は、高度に特異的であるため、単一抗
原部位に対抗して誘導される。
【００４２】
前記「ヒト化」形態の非−ヒト（例：ミューリン）抗体は、非−ヒト免疫グロブリンか
ら由来した最小配列を含有するキメラ抗体である。多くの場合、ヒト化抗体は、収容者の
超可変領域からの残基を目的する特異性、親和性および能力を保有している非−ヒト種（
供与者抗体）、例えば、マウス、ラット、ウサギまたは非−ヒト霊長類の超可変領域から
の残基で代替させたヒト免疫グロブリン（収容者抗体）である。
【００４３】
前記「ヒト抗体」とは、ヒト免疫グロブリンから由来する分子であって、相補性決定領
域、構造領域を含む抗体を構成するすべてのアミノ酸配列全体が、ヒト免疫グロブリンの
アミノ酸配列で構成されているものを意味する。
【００４４】
重鎖および／または軽鎖の一部が特別な種から由来したり特別な抗体部類または亜部類
に属する抗体内の相応する配列と同じだったりこれと相同性である一方、残りの鎖（等）
は、さらに他の種から由来したりさらに他の抗体部類または亜部類に属する抗体内の相応
する配列と同じだったりこれと相同性である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）だけでな
く目的する生物学的活性を示す前記抗体の断片が含まれる。
【００４５】
本願に使用されたような「抗体可変ドメイン」とは、相補性決定領域（ＣＤＲ；すなわ
ち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）、および骨格領域（ＦＲ）のアミノ酸配列を
含む抗体分子の軽鎖および重鎖部分を指し示す。ＶＨは、重鎖の可変ドメインを指し示す
。ＶＬは、軽鎖の可変ドメインを指し示す。
【００４６】
「相補性決定領域（ＣＤＲ；すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）」は、
抗原結合のために必要な存在である、抗体可変ドメインのアミノ酸残基を指し示す。各可
変ドメインは、典型的に、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として確認された３個のＣ
ＤＲ領域を有する。
【００４７】
「骨格領域（ＦＲ）」は、ＣＤＲ残基以外の可変ドメイン残基である。各可変ドメイン
は、典型的にＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４として確認された四つのＦＲを有する。
【００４８】
一実施例で、本発明は、下記の重鎖ＣＤＲ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔ
ｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）及び軽鎖ＣＤＲを含む抗体またはその抗原結合断片を
提供する: 配列番号２の配列を有するＣＤＲ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔ
ｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ） Ｈ１、配列番号３の配列を有するＣＤＲＨ２、及び
配列番号４の配列を有するＤＲＨ３を含む重鎖可変領域; 及び配列番号５の配列を有する
ＣＤＲＬ１、配列番号６の配列を有するＣＤＲＬ２、及び配列番号7の配列をＣＤＲＬ３
を含む軽鎖可変領域。
【００４９】
一実施例で、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、配列番号８〜１５の配列で構成
された群から選択された一つの配列を有する重鎖骨格領域（ＦＲ）を含む重鎖可変領域を
含んでもよく、具体的には、配列番号８〜１１の配列で構成された群から選択された一つ
の配列を有する重鎖骨格領域（ＦＲ）を含む重鎖可変領域を含んでもよい。
【００５０】
この場合、前記重鎖可変領域は、配列番号８の配列を有する重鎖ＦＲ１、配列番号９の
配列を有する重鎖ＦＲ２、配列番号１０の配列を有する重鎖ＦＲ３、または配列番号１１
の配列を有する重鎖ＦＲ４を含んでもよい。
【００５１】
また、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１２〜１５の配列で構成され
た群から選択された一つの配列を有する軽鎖ＦＲを含む軽鎖可変領域を含んでもよい。
【００５２】
この場合、前記軽鎖可変領域は、配列番号１２の配列を有する軽鎖ＦＲ１、配列番号１
３の配列を有する軽鎖ＦＲ２、配列番号１４の配列を有する軽鎖ＦＲ３、または配列番号
１５の配列を有する軽鎖ＦＲ４を含んでもよい。
【００５３】
一実施例で、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、 配列番号１６の配列を有する
重鎖可変領域及び/または配列番号１７の配列を有する軽鎖可変領域を含んでもよい。
【００５４】
「ファージディスプレイ」は、変異体ポリペプチドをファージ、例えば繊維状ファージ
粒子の表面上に外皮タンパク質の少なくとも一部との融合タンパク質としてディスプレイ
する技術である。ファージディスプレイの有用性は、無作為化タンパク質変異体の大きい
ライブラリーを対象にして、標的抗原と高親和度で結合する配列を迅速かつ効率よく分類
することができるとの事実にある。ペプチドおよびタンパク質ライブラリーをファージ上
にディスプレイするのは、特異的結合特性を有するポリペプチドを調べるために数百万個
のポリペプチドをスクリーニングするのに使用されてきた。
【００５５】
ファージディスプレイ技術は、特定リカンド（例：抗原）と結合する新規タンパク質を
生成および選別するための強力なツールを提供した。ファージディスプレイ技術を使用し
て、タンパク質変異体の大きいライブラリーを生成させて、標的抗原と高親和性で結合す
る配列を迅速に分類することができる。変異体ポリペプチドを暗号化する核酸をウイルス
性外皮タンパク質、例えば遺伝子ＩＩＩタンパク質または遺伝子ＶＩＩＩタンパク質を暗
号化する核酸配列と融合させる。タンパク質またはポリペプチドを暗号化する核酸配列を
遺伝子ＩＩＩタンパク質の一部を暗号化する核酸配列と融合させた１価ファージディスプ
レイシステムが開発された。１価ファージディスプレイシステムでは、遺伝子融合物が低
水準で発現されて野生型遺伝子ＩＩＩタンパク質も発現されて粒子感染性が維持される。
【００５６】
繊維状ファージ表面上におけるペプチドの発現とＥ．ｃｏｌｉのペリプラズムにおける
機能性抗体断片の発現を立証することが、抗体ファージディスプレイライブラリーを開発
するに当たり重要である。抗体または抗原結合性ポリペプチドのライブラリーは、多くの
方式、例えば無作為ＤＮＡ配列を挿入することによって単一遺伝子を変更させる方法また
は関連遺伝子系列をクローニングする方法で製造した。ライブラリーを対象として、目的
する特徴を伴った抗体または抗原結合性タンパク質の発現に関してスクリーニングするこ
とができる。
【００５７】
ファージディスプレイ技術は、目的する特徴を有する抗体を製造するための通常のハイ
ブリドーマおよび組換え方法に比べていくつかの利点を有している。このような技術は動
物を使用しなくても短時間で様々な配列を有する大きい抗体ライブラリーを生成させるこ
とができるようにする。ハイブリドーマの製造やヒト化抗体の製造は、数ヶ月の製造期間
を要することがある。また、免疫が全く求められないため、ファージ抗体ライブラリーは
、毒性や抗原性が低い抗原に対しても抗体を生成させることができる。さらにファージ抗
体ライブラリーを使用して新規な治療的抗体を生成および確認することができる。
【００５８】
ファージディスプレイライブラリーを使用して免疫させた、非−免疫させたヒト、生殖
細胞系列配列、または未感作Ｂ細胞Ｉｇレパートリー（ｒｅｐｅｒｔｏｒｙ）からヒト抗
体を生成させる技術を使用することができる。各種リンパ系組織を使用して、未感作また
は非免疫抗原結合性ライブラリーを製造することができる。
【００５９】
ファージディスプレイライブラリーから高親和性抗体を確認および分離できる技術は、
治療用新規抗体分離に重要である。ライブラリーから高親和性抗体を分離するのは、ライ
ブラリーの大きさ、細菌性細胞中における産生効率およびライブラリーの多様性に左右さ
れ得る。ライブラリーの大きさは、抗体または抗原結合性タンパク質の不適切なフォール
ディングと停止コドンの存在による非効率的産生によって減少される。細菌性細胞におけ
る発現は、抗体または抗原結合性ドメインが適切にフォールディングされない場合には抑
制され得る。発現は、可変／不変界面の表面や選別されたＣＤＲ残基における残基を交代
で突然変異させることによって改善させることができる。骨格領域の配列は、細菌性細胞
で抗体ファージライブラリーを生成させる場合に適切なフォールディングを提供するため
の一つの要素である。
【００６０】
高親和性抗体分離において、抗体または抗原結合性タンパク質の様々なライブラリーを
生成させることが重要である。ＣＤＲ３領域は、これらがたびたび抗原結合に参加するこ
とが明らかにされた。重鎖上のＣＤＲ３領域は、大きさ、配列および構造的立体形態面で
非常に多様であるため、これを利用して様々なライブラリーを製造することができる。
【００６１】
また、各位置で２０個のアミノ酸全てを使用して可変重鎖および軽鎖のＣＤＲ領域を無
作為化することによって多様性を発生させることができる。２０個全てのアミノ酸を使用
すると多様性が大きい変異体抗体配列が生成されて、新規な抗体を確認する機会が増加す
る。
【００６２】
本発明の抗体または抗体断片は、ＥＧＦＲｖＩＩＩを特異的に認識できる範囲内で、本
明細書に記載された本発明の抗−ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体の配列だけでなく、これの生物学
的均等物も含むことができる。例えば、抗体の結合親和度および／またはその他生物学的
特性をより改善させるために、抗体のアミノ酸配列に追加的な変化を与えることができる
。このような変形は、例えば、抗体のアミノ酸配列残基の欠失、挿入および／または置換
を含む。このようなアミノ酸変異は、アミノ酸の側鎖置換体の相対的類似性、例えば、疏
水性、親水性、電荷、大きさなどに基づいて起きる。アミノ酸の側鎖置換体の大きさ、形
および種類に対する分析によって、アルギニン、リジンとヒスチジンは共に正電荷を帯び
る残基で；アラニン、グリシンとセリンは、類似する大きさを有して；フェニルアラニン
、トリプトファンとチロシンは、類似する形を有することが分かる。従って、このような
考慮事項に基づいて、アルギニン、リジンとヒスチジン；アラニン、グリシンとセリン；
そしてフェニルアラニン、トリプトファンとチロシンは、生物学的に機能均等物といえる
。
【００６３】
変異を導入するに当たり、アミノ酸の疏水性インデックス（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ  
ｉｎｄｅｘ）が考慮され得る。各アミノ酸は、疏水性と電荷により疏水性インデックスが
付与されている: イソロイシン(+４．５); バリン(+４．２); ロイシン(+３．８); フェ
ニルアラニン(+２．８); システイン/システイン (+２．５); メチオニン(+1．９); アラ
ニン(+１．８); グリシン(-０．４); トレオニン(-0.7); セリン(-０．８); トリプトフ
ァン(-０．９); チロシン(-１．３); プロリン(-1.6); ヒスチジン (-３．２); グルタメ
ート(-３．５); グルタミン(-３．５); アスパルタート (-３．５); アスパラギン (-３
．５); リジン(-３．９); および アルギニン(-４．５)。
【００６４】
タンパク質の相互的な生物学的機能（ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を付与するに当たり、疏水性アミノ酸インデックスは大変重要であ
る。類似する疏水性インデックスを有するアミノ酸で置き換えてこそ類似の生物学的活性
を保有できることは公示された事実である。疏水性インデックスを参照して変異を導入さ
せる場合、好ましくは±２以内、より好ましくは±１以内、さらに好ましくは±０．５以
内の疏水性インデックス差を示すアミノ酸の間に置換を行う。
【００６５】
一方、類似する親水性値（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃｉｔｙ  ｖａｌｕｅ）を有するアミ
ノ酸の間の置換が均等な生物学的活性を有するタンパク質を招くことも周知である。米国
特許第４５５４１０１号に開示された通り、次の親水性値が各アミノ酸残基に付与されて
いる: アルギニン(+３．０); リジン(+３．０); アスパルタート(+３．０± １); グルタ
メート(+３．０±１); セリン(+０．３); アスパラギン(+０．２); グルタミン(+０．２)
; グリシン(0); トレオニン(-０．４); プロリン(-０．５±１); アラニン(-０．５); ヒ
スチジン(-０．５); システイン(-１．０); メチオニン(-１．３); バリン(-１．５); ロ
イシン(-１．８); イソロイシン (-１．８); チロシン(-2.3); フェニルアラニン(-２．
５); トリプトファン(-３．４)
【００６６】
上述した生物学的均等活性を有する変異を考慮するならば、本発明の抗体またはこれを
コードする核酸分子は、配列一覧に記載された配列と実質的な同一性（ｓｕｂｓｔａｎｔ
ｉａｌ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を示す配列も含むものと解釈される。前記の実質的な同一性
は、前記の本発明の配列と任意の他の配列を最大限対応するようにアラインして、当業界
で通常利用されるアルゴリズムを利用してアラインされた配列を分析した場合に、最小６
１％の相同性、より好ましくは７０％の相同性、よりさらに好ましくは８０％の相同性、
最も好ましくは９０％の相同性を示す配列を意味する。配列比較のためのアラインメント
方法は、当業界に公示されている。ＮＣＢＩ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅ
ｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）は、ＮＢＣＩなどからアクセス可能で、イ
ンターネット上でｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｍ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎおよびｔｂ
ｌａｓｔｘのような配列分析プログラムと連動されて利用することができる。ＢＬＳＡＴ
は、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／で接続可能である。この
プログラムを利用した配列相同性比較方法は、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏ
ｖ／ＢＬＡＳＴ／ｂｌａｓｔ＿ｈｅｌｐ．ｈｔｍｌで確認することができる。
【００６７】
他の観点において、本発明は、前記抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸に関
する。
【００６８】
本発明の抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸を分離して抗体またはその抗原
結合断片を組換え的に産生することができる。核酸を分離して、これを複製可能なベクタ
ー内に挿入して追加でクローニングしたり（ＤＮＡの増幅）または追加で発現させる。こ
れを基に、さらに他の観点において、本発明は前記核酸を含むベクターに関する。
【００６９】
「核酸」は、ＤＮＡ（ｇＤＮＡおよびｃＤＮＡ）およびＲＮＡ分子を包括的に含む意味
を有して、核酸で基本構成単位であるヌクレオチドは、自然のヌクレオチドだけでなく、
糖または塩基部位が変形された類似体（ａｎａｌｏｇｕｅ）も含む。本発明の重鎖および
軽鎖可変領域をコードする核酸の配列は変形され得る。前記変形は、ヌクレオチドの追加
、欠失、または非保存的置換または保存的置換を含む。
【００７０】
一実施例で、本発明に係る抗体またはその抗原結合部位中で可変領域をコードする核酸
は、配列番号１８または配列番号１９の配列を含んでもよい。この場合、重鎖可変領域を
コードする核酸は、配列番号１８の配列を含んでもよく、軽鎖可変領域をコードする核酸
は、配列番号１９の配列を含んでもよい。
【００７１】
本発明の核酸は、前記ヌクレオチド配列に対し実質的な同一性を示すヌクレオチド配列
も含むものと解釈される。実質的な同一性とは、本発明のヌクレオチド配列と任意の他の
配列を最大限対応するようにアラインして、当業界で通常利用されるアルゴリズムを利用
してアラインされた配列を分析した場合、最小８０％の相同性、より好ましくは９０％の
相同性、最も好ましくは最小９０％の相同性を示すヌクレオチド配列を意味する。
【００７２】
前記抗体を暗号化するＤＮＡは、通常の過程を使用して（例えば、抗体の重鎖と軽鎖を
暗号化するＤＮＡと特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによ
って）容易に分離または合成する。多くのベクターが入手可能である。ベクターの成分に
は、一般に次の中の一つ以上が含まれるが、それに制限されない：信号配列、複製基点、
一つ以上のマーカー遺伝子、増強因子要素、プロモーター、および転写終結配列。
【００７３】
本発明で使用する用語「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」とは、宿主細胞で目的遺伝子を発
現させるための手段として、プラスミドベクター; コスミドベクター; バクテリオファー
ジベクター; および アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクターおよびアデノ−
関連ウイルスベクターのようなウイルスベクターを含む。前記ベクターで抗体をコードす
る核酸は、プロモーターに作動的に連結されている。
【００７４】
用語「作動的に連結された（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）」とは、核酸発
現調節配列（例えば、プロモーター、シグナル配列、または転写調節因子結合位置のアレ
イ）と他の核酸配列との間の機能的な結合を意味して、これによって前記調節配列は、前
記他の核酸配列の転写および／または、解読を調節するようになる。
【００７５】
使用されるベクターが原核細胞を宿主とする場合には、転写を進行させることができる
強力なプロモーター（例えば、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｌａｃＵＶ５
プロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｐＲλプロモーター、ｐＲλプロモーター、 ｒａ
ｃ５プロモーター、ａｍｐプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ＳＰ６プロモーター、
ｔｒｐプロモーターおよびＴ７プロモーターなど) 、解読の開始のためのリボソーム結合
部位および転写／解読終結配列を含むことが一般的である。また、 例えば、ベクターが
真核細胞を宿主とする場合には、ほ乳動物細胞のゲノムから由来したプロモーター（例え
ば、メタロチオネインプロモーター、ヒトβ−アクチンプロモーター、ヒトヘモグロビン
プロモーターおよびヒト筋肉クレアチンプロモーター）またはほ乳動物ウイルスから由来
したプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．
５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ
ー、ＨＳＶのｔｋプロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、Ｈ
ＩＶの長い末端反復部（ＬＴＲ）プロモーター、モロニー（ｍｏｌｏｎｅｙ）ウイルスの
プロモーター、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）のプロモーターおよびラウス肉腫ウ
イルス（ＲＳＶ）のプロモーター）が利用でき、転写終結配列としてポリアデニル化配列
を一般的に有する。
【００７６】
場合により、ベクターは、それから発現される抗体の精製を容易にするために、他の配
列と融合されてもよい。融合される配列は、例えば、グルタチオンS-トランスフェラーゼ
(Pharmacia, USA) 、マルトース結合タンパク質（NEB, USA）、FLAG(IBI, USA) および6
x His(hexahistidine; Quiagen, USA) 等がある。
【００７７】
前記ベクターは、選択標識として当業界で通常使用される抗生剤耐性遺伝子を含み、例
えば、アンピシリン、ゲンタマイシン、カルベニシリン、クロラムフェニコール、ストレ
プトマイシン、カナマイシン、ジェネテシン、ネオマイシンおよびテトラサイクリンに対
する耐性遺伝子がある。
【００７８】
さらに他の観点においで、本発明は、上述したベクターで形質転換された細胞に関する
。 本発明の抗体形成させるために使用された細胞は原核生物、酵母または高等真核生物
細胞であってもよいが、これに制限されない。
【００７９】
本発明において、前記形質転換された細胞として、エシェリヒアコリ（Ｅｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、 バチルス・サブチルスおよびバチルス・チューリンゲンシスの
ようなバチルス属菌株、ストレプトミセス（Streptomyces）、 シュードモナス(Pseudomo
nas) （例えば、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）, プロテウス・ミラビ
リス(Proteus mirabilis) または スタフィロコッカス(Staphylococcus)（例えば、スタ
フィロコッカス・カルノーサス) (Staphylocus carnosus)のような原核宿主細胞を利用す
ることができる.
【００８０】
但し、動物細胞に対する関心が最も大きく、有用な宿主細胞株の例は、COS-7、BHK、CH
O、CHOK1、DXB-11、DG-44、CHO/-DHFR、CV1、COS-7、HEK293、BHK, TM4、VERO、HELA、MD
CK、BRL 3A、W138、Hep G2、SK-Hep、MMT、TRI、MRC 5、FS4、T3、RIN、A549、PC12、K56
2、PER.C6、SP2/0、NS-0、U20SまたはＨＴ１０８０であってもよいが、これに制限されな
い。
【００８１】
さらに他の観点においで、本発明は、（ａ）前記細胞を培養するステップと、 （ｂ）
前記培養された細胞から抗体またはその抗原結合断片を回収するステップと、を含む、前
記抗体またはその抗原結合断片の製造方法に関する。
【００８２】
前記細胞は、各種培地で培養することができる。市販用培地を制限されることなく培養
培地として使用することができる。当業者に公示されているその他いずれの必須補充物が
適当な濃度で含まれてもよい。培養条件、例えば、温度、ｐＨなどが、発現のために選別
された宿主細胞と共にすでに使用されていて、これは当業者に明白である。
【００８３】
前記抗体またはその抗原結合断片の回収は、例えば遠心分離または、限外ろ過によって
不純物を除去して、その結果を、例えば、アフィニティークロマトグラフィーなどを利用
して精製することができる。さらにその他の精製技術、例えば陰イオンまたは、陽イオン
交換クロマトグラフィー、疏水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトク
ロマトグラフィーなどが使用され得る。
【００８４】
さらに他の観点においで、本発明は、前記抗体を有効性分として含む癌の予防または治
療用組成物に関する。
【００８５】
本発明は、例えば、（ａ）本発明に係るＥＧＦＲｖＩＩＩに対する抗体またはその抗原
結合断片の薬剤学的有効量；および（ｂ）薬剤学的に許容される担体を含む癌の予防また
は治療用薬剤学的組成物であってもよい。本発明はまた、患者に必要な有効な量で本発明
に係るＥＧＦＲｖＩＩＩに対する抗体またはその抗原結合断片を投与するステップを含む
癌の予防または治療方法に関する。
【００８６】
前記組成物は、上述した本発明の抗−ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体またはその抗原結合断片を
有効性分として利用するため、この両者に共通した内容は、その記載を省略する。
【００８７】
下記の実施例で立証された通り、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、ＥＧＦＲｖ
ＩＩＩに高い親和度で結合してＥＧＦＲｖＩＩＩを過発現する癌細胞の移動を抑制するこ
とができるので、癌の予防および治療に使用可能である。
【００８８】
「予防」とは、本発明に係る組成物の投与で癌を抑制させたり進行を遅延させるいずれ
の行為を意味し、「治療」とは、癌の発展の抑制、癌の軽減または癌の除去を意味する。
【００８９】
「ＥＧＦＲｖＩＩＩを過発現する癌」とは、同じ組織類型の非−癌性細胞と比較して有
意に高い水準でＥＧＦＲｖＩＩＩを癌細胞表面に有している癌を意味する。
【００９０】
前記組成物に採用される疾患である癌は、ＥＧＦＲｖＩＩＩを過発現する癌であり、例
えば、膠芽細胞腫、星状細胞腫、神経膠腫、神経芽細胞腫、睾丸癌、大腸癌、黒色腫、膵
臓癌、肺癌、乳癌、食道癌、卵巣癌、前立腺癌および扁平上皮癌等であってもよい。
【００９１】
さらに他の観点においで、本発明は、本発明に係るＥＧＦＲｖＩＩＩに対する抗体また
はその抗原結合断片を含む癌細胞の転移または浸潤を抑制するための組成物に関する。ま
た、本発明は、本発明に係るＥＧＦＲｖＩＩＩに対する抗体またはその抗原結合断片を処
理して癌細胞の転移または浸潤を抑制する方法に関する。 
【００９２】
本発明の組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は、製剤時に通常利用されるもの
として、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デン
プン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、
微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロ
ース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステ
アリン酸マグネシウム、およびミネラルオイルなどを含むが、これに限定されない。本発
明の組成物は、前記成分以外に潤滑剤、湿潤剤、甘味料、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存
剤などをさらに含むことができる。
【００９３】
本発明の薬剤学的組成物は、経口または非経口で投与することができる。非経口投与の
場合には、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、内皮投与、局所投与、鼻内投与
、肺内投与および直腸内投与などで投与することができる。
【００９４】
経口投与時、タンパク質またはペプチドは消化されるため、経口用組成物は、活性薬剤
をコーティングしたり、胃腸からの分解から保護されるように剤形化されるべきである。
また、薬剤学的組成物は、活性物質が標的細胞に移動することができる任意の装置によっ
て投与することができる。
【００９５】
本発明に係る組成物の適切な投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性
、病的状態、食べ物、投与時間、投与経路、排泄速度および反応感応性のうような要因に
よって多様であるが、通常の熟練した医師は、目的する治療または予防に効果的な投与量
を容易に決定及び処方することができる。本発明の薬学組成物の１日投与量は、０．００
０１〜１００ｍｇ／ｋｇである。 本明細書で用語「薬剤学的有効量」とは、癌を予防ま
たは治療するのに十分な量を意味する。
【００９６】
本発明の薬剤学組成物は当該発明が属する技術分野で通常の知識を有する者が容易に実
施できる方法により、薬剤学的に許容される担体及び／または賦形剤を利用して製剤化す
ることによって、単位容量形態で製造されるか、または多用量容器内に内含させて製造さ
れることができる。この時、剤形は、オイルまたは水性媒質中の溶液、懸濁液または乳化
液形態やエキス剤、散剤、坐剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤またはカプセル剤形態であっても
よく、分散剤または安定化剤を追加的に含んでもよい。
【００９７】
本発明の組成物は、個別治療剤として投与したり、他の治療剤と併用して投与されるこ
とができ、従来の治療剤とは順次または同時に投与されることができる。
【００９８】
さらに他の観点においで、本発明は、本発明に係るＥＧＦＲｖＩＩＩに対する抗体を含
む癌診断用組成物に関する。また、本発明は、本発明に係るＥＧＦＲｖＩＩＩに対する抗
体またはその抗原結合断片を処理して癌を診断する方法に関する。 
【００９９】
本発明によるＥＧＦＲｖＩＩＩに対する抗体を用いて、サンプルでのＥＧＦＲｖＩＩＩ
の発現水準を測定することで癌を診断することができる。発現水準は通常の免疫分析方法
により測定可能であり、前記ＥＧＦＲｖＩＩＩに対する抗体を用いた放射能免疫分析、放
射能免疫沈殿、免疫沈殿、免疫組織化学染色、ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ‐ｌｉｎｋｅｄ
ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂａｎｔ  ａｓｓａｙ）、キャプチャ‐ＥＬＩＳＡ、抑制または競
争分析、サンドイッチ分析、流動細胞分析（ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）、免疫蛍光
染色、および免疫親和性精製により測定可能であるが、これに限定されるものではない。
【０１００】
前記免疫分析過程による最終的な信号の強度を分析することで、癌を診断することがで
きる。すなわち、生物学的試料で本発明のマーカーのタンパク質が高発現され、信号が正
常生物学的試料（例えば、正常な胃組織、血液、血漿または血清）よりも強く出る場合に
は、癌と診断される。
【０１０１】
さらに他の観点においで、本発明は、前記癌診断用組成物を含む癌診断用キットに関す
る。本発明によるキットは、本発明によるＥＧＦＲｖＩＩＩに対する抗体を含み、試料と
抗体が反応することで発生する信号を分析することで、癌を診断することができる。この
際、前記信号は、抗体に結合された酵素、例えば、アルカリ性ホスファターゼ、β‐ガラ
クトシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、またはシトクロ
ムＰ４５０を含んでもよいが、これに制限されるものではない。この際、酵素に対する基
質は、酵素としてアルカリ性ホスファターゼが用いられる場合には、基質としてブロモク
ロロインドリルホスフェート（ＢＣＩＰ）、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）、ナ
フトール‐ＡＳ‐Ｂ１‐ホスフェート（ｎａｐｈｔｈｏｌ‐ＡＳ‐Ｂ１‐ｐｈｏｓｐｈａ
ｔｅ）、およびＥＣＦ（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｈｅｍｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）など
のような発色反応基質が用いられ、ホースラディッシュペルオキシダーゼが用いられる場
合には、クロロナフトール、アミノエチルカルバゾール、ジアミノベンジジン、Ｄ‐ルシ
フェリン、ルシゲニン（ビス‐Ｎ‐メチルアクリジニウムニトレート）、レゾルフィンベ
ンジルエーテル、ルミノール、アンプレックス（Ａｍｐｌｅｘ）レッド試薬（１０‐アセ
チル‐３，７‐ジヒドロキシフェノキサジン）、ＨＹＲ（ｐ‐ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａ
ｍｉｎｅ‐ＨＣｌ  ａｎｄ  ｐｙｒｏｃａｔｅｃｈｏｌ）、ＴＭＢ（ｔｅｔｒａｍｅｔｈ
ｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）、ＡＢＴＳ（２，２´‐Ａｚｉｎｅ‐ｄｉ［３‐ｅｔｈｙｌｂ
ｅｎｚｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ  ｓｕｌｆｏｎａｔｅ］）、ｏ‐フェニレンジアミン（ＯＰ
Ｄ）、およびナフトール／ピロニンが基質として用いられ、グルコースオキシダーゼが用
いられる場合には、ｔ‐ＮＢＴ（ｎｉｔｒｏｂｌｕｅ  ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ）、およ
びｍ‐ＰＭＳ（ｐｈｅｎｚａｉｎｅ  ｍｅｔｈｏｓｕｌｆａｔｅ）などのような基質が用
いられてもよいが、これに制限されるものではない。
【０１０２】
また、本発明によるキットは、検出可能な信号を発生させる標識を含んでもよく、前記
標識は、化学物質（例えば、ビオチン）、酵素（アルカリ性ホスファターゼ、β‐ガラク
トシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、およびシトクロムＰ４５０）、放射
能物質（例えば、Ｃ１４、Ｉ１２５、Ｐ３２、およびＳ３５）、蛍光物質（例えば、フル
オレシン）、発光物質、化学発光物質（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ）、およびＦ
ＲＥＴ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆ
ｅｒ）を含んでもよいが、これに制限されるものではない。
【０１０３】
癌診断のために用いられる酵素の活性の測定または信号の測定は、当業界に公知の様々
な方法により実施可能である。これにより、ＥＧＦＲｖＩＩＩの発現を定性的または定量
的に分析することができる。
【０１０４】
［実施例］
以下、本発明を実施例を挙げて詳述する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に
説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないことは当業者
において通常の知識を有する者にとって自明である。 
【０１０５】
実施例１．ＥＧＦＲｖＩＩＩの発現の確認
一般に、ファージディスプレイ法により抗体を選別するためには、標的抗原タンパク質
を免疫チューブ（Ｉｍｍｕｎｏｔｕｂｅ）に吸着させた後、組換えタンパク質に対して優
れた結合能を有する抗体のみをバイオパニング法を用いて選別する。但し、組換えタンパ
ク質は立体配座変化（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｃｈａｎｇｅ）現象が起こらない
ため、立体配座変化現象が起こる細胞の表面に発現されたタンパク質を用いて抗体を選別
すれば、抗原の配座変化を認知する抗体を開発することができる。そこで、本発明では、
ＥＧＦＲｖＩＩＩを有する膠芽細胞腫患者由来細胞を用いた細胞パニング法により、ＥＧ
ＦＲｖＩＩＩを特異的に認知する抗体を選別した。
【０１０６】
先ず、三星ソウル病院難治性癌事業団（Ｓａｍｓｕｎｇ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｃｅｎｔｅ
ｒ、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒ
ｃｈ）の脳組織バンク（Ｂｒａｉｎ  Ａｖａｔａｒ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｂａｎｋ）から、膠
芽細胞腫（Ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  Ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ）患者由来細胞（４３７、
４４８、４６４、６２６；ＮＴ３５２Ｔ１、６２６、７８０）の分譲を受けて実験を行っ
た。細胞パニング法を行う前に、分譲された患者由来細胞のＥＧＦＲｖＩＩＩの突然変異
および発現程度をＲＴ‐ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｐｏｌ
ｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）およびウエスタンブロット法により確
認した。
【０１０７】
その結果を図１に示した。図１から、６２６患者細胞の場合、ＲＮＡおよびタンパク質
状態でＥＧＦＲｖＩＩＩの発現が最も高いことを確認した。
【０１０８】
実施例２．ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体の選別結果および配列分析
抗体選別に関連して、合成ｓｃＦｖファージライブラリを用いて、ＥＧＦＲｖＩＩＩ特
異的なｓｃＦｖ抗体断片をファージディスプレイスクリーニングにより同定した。ファー
ジディスプレイスクリーニング過程は、図２のとおりである。
【０１０９】
詳細に、大腸菌宿主ＥＲ２５３７内に導入されている多様なヒト抗体遺伝子が挿入され
ているファージミド（ｐｈａｇｅｍｉｄ）ベクターをファージで回収するために、４個の
下位合成ｓｃＦｖファージライブラリサンプルを各４００ｍＬの培養培地（ＳＢ／ａｍｐ
ｉｃｉｌｌｉｎ／２％  ｇｌｕｃｏｓｅ）中に添加し、約２時間培養した。ＯＤ６００で
吸光度が０．５に達する際に培養された宿主細胞を５，０００ｇで２０分間遠心分離して
上層液を除去した後、４００ｍＬの２次培養培地（ＳＢ／ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）中に浮
遊させてから、１０１２  ｐｆｕ（ｐｌａｑｕｅ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ）のヘルパ
ー（ｈｅｌｐｅｒ）ファージ（ＶＣＳＭ１３）を添加して１時間再培養した。その後、カ
ナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）抗生剤（ヘルパーファージ中に導入された抗生剤遺伝
子）を７０μｇ／ｍＬの濃度で添加した後、３０℃、２２０ｒｐｍで一晩培養することで
、ファージライブラリが宿主細胞外に作製されるようにした。その後、培養物を遠心分離
させた上層液にＰＥＧ８０００（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  ８０００）
を添加し、４℃で２時間撹拌することで、ファージ粒子とＰＥＧ８０００がよく混合され
るようにした。１５０００ｇ、４℃で３０分間遠心分離して沈殿されたペレットをＰＢＳ
１ｍＬで浮遊させた後、１００００ｇ、４℃で遠心分離して上層液のみを得て、ファージ
ライブラリを回収した。各下位ライブラリから回収されたファージを計数するために、各
サンプルを希釈した後、さらに宿主細胞（ＥＲ２５３７）に感染させ、ＬＢ／ａｍｐｉｃ
ｉｌｌｉｎの固体培養培地で計数した。
【０１１０】
ファージディスプレイスクリーニングは、パニングを複数回繰り返すことで行った。計
数された下位ライブラリを約１．０ｘ１０１３ｐｆｕの水準になるようにまとめた後、Ｅ
ＧＦＲｖＩＩＩ抗原をノックダウン（ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ）させた６２６膠芽細胞腫患者
由来細胞に処理して４℃で１時間結合させ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗原がノックダウンされた
６２６患者細胞に結合していない上層液のみを回収した。これは、抗体ファージライブラ
リにおいて、ＥＧＦＲｖＩＩＩを除いた他の細胞膜タンパク質に結合するファージを除去
することで、ＥＧＦＲｖＩＩＩ外の非特異的な結合を防止するステップである。上層液の
みを回収した後、これを６２６（ＥＧＦＲｖＩＩＩ＋）患者由来細胞に処理して４℃で１
時間結合させた。冷たい完全培地を用いて細胞を５回洗浄して非特異的な結合を除去した
後、３７℃に移して３０分間培養することで、抗原‐抗体の複合体の受容体媒介細胞内在
化（Ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）を誘導した。冷たいＰＢＳを用いて細胞を洗浄し
、０．１Ｍのグリシン（Ｇｌｙｃｉｎｅ）バッファー（ｐＨ２．０）を用いて最終洗浄す
ることで、細胞の表面に結合されている細胞内在化されていないファージ粒子を除去した
。２Ｍのトリス（Ｔｒｉｓ）バッファー（ｐＨ８．０）を用いて中和を行い、１００ｍＭ
のＴＥＡ（Ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）０．５ｍｌを添加して１０分間静置して細胞を
溶解させた後、２Ｍのトリスバッファー（ｐＨ８．０）１ｍＬで中和させた。予めＥＲ２
５３７大腸菌をＯＤ６００＝０．５〜０．８で準備しておき、ＥＲ２５３７大腸菌培養液
８．５ｍＬに中和された回収ファージ溶液１．５ｍＬを混合した後、３７℃、１２０ｒｐ
ｍで１時間培養することで、回収したファージをＥＲ２５３７大腸菌に感染させ、これを
ＬＢ／ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎの固体培地で計数した。残留回収溶液は１５ｃｍのＬＢ／ａ
ｍｐｉｃｉｌｌｉｎ固体培地に塗抹して培養後、５ｍＬのＳＢ培養培地（５０％  ｇｌｙ
ｃｅｒｏｌ）を添加してコロニーを回収および保管（−８０℃）した。
【０１１１】
引き続くパニング回次のために保管された前回次のファージ溶液中の５０μＬを取り、
ファージ粒子の増幅作業を行った。宿主細胞に培養後のヘルパーファージ（ＶＣＳＭ１３
）を添加し、回収されたファージ粒子はＰＥＧ８０００を用いたＰＥＧ沈殿により準備さ
れた、これを用いて、次の回次のパニングを、前の回次のパニングと同様の方法により行
った。パニングは、６２６（ＥＧＦＲｖＩＩＩ＋）患者由来細胞に対して総４回次まで進
行され、ファージディスプレイスクリーニングの結果を図３および表１に示した。
【０１１２】
【表１】
2020195398.tif 000003
【０１１３】
細胞パニングの各回次毎に、６２６細胞に結合して細胞内在化した後に回収されたファ
ージ粒子と、細胞パニングに入れたファージ粒子との比率から回収率を測定した。患者由
来細胞のパニング回次が増加するにつれて、６２６細胞に入れたファージ粒子（Ｉｎｐｕ
ｔ）に対して回収されるファージ粒子（Ｏｕｔｐｕｔ）が増加することが確認され、これ
により、Ｔａｒｇｅｔ‐ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｂｉｎｄｅｒのｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ傾向を
確認した。６２６患者細胞に対する総４回の細胞パニングが終わった後、最終回次（４回
次）で回収されたファージ粒子は、宿主細胞（ＥＲ２５３７）への感染によってＬＢ／ａ
ｍｐｉｃｉｌｌｉｎプレートでコロニーとして確認された。
【０１１４】
このコロニーを取り、２００μＬのＳＢ／ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ培養培地が入った９６
ウェルプレートに、ウェル毎にそれぞれのコロニーを接種後、培養した（３７℃、〜３時
間）。その後、ｓｃＦｖ‐ｐＩＩＩタンパク質の発現を誘導するために、各ウェルに最終
濃度１ｍＭのＩＰＴＧを処理し、３０℃で一晩培養した。その後、培養プレートは、遠心
分離および上層液の除去後、各ウェル中の培養細胞のペリプラズム（ｐｅｒｉｐｌａｓｍ
）部位を回収するために、４℃に維持していた４０μＬのＴＥＳ溶液（２０％ｗ／ｖのｓ
ｕｃｒｏｓｅ、５０ｍＭのＴｒｉｓ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）を処理し、４℃で
３０分間静置した後、０．２ＸのＴＥＳ溶液６０μＬを処理して３０分間静置した。最終
的にプレートを遠心分離した後、上層液のみを回収し、ｓｃＦｖ‐ｐＩＩＩタンパク質を
小規模で生産した。
【０１１５】
一方、ＥＧＦＲｖＩＩＩタンパク質およびＢＳＡを１μｇ／ｍＬの濃度で９６ウェルプ
レートにコートし、３％の脱脂粉乳を用いてブロッキングした後、回収されたペリプラズ
ム部位中の２５μＬを取り、ＥＧＦＲｖＩＩＩおよびＢＳＡがコートされたプレートの各
ウェルに添加してから１時間結合させた。その後、ＴＢＳＴを用いて、３〜４回の洗浄過
程を経た後、ＨＲＰが結合された抗ＨＡ抗体（１２０１３８１９００１、Ｒｏｃｈｅ  Ｌ
ｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を１時間結合させた。その後、さらに洗浄および発色反応（Ｔ
ＭＢ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）を誘導した後、Ｏ．Ｄ４５０ｎｍでその値を測定した。任意
のｓｃＦｖ‐ｐＩＩＩをＥＧＦＲｖＩＩＩ抗原がコートされたプレートに処理して得たＯ
．Ｄ４５０ｎｍの値を、ＢＳＡ抗原がコートされたプレートに処理して得たＯ．Ｄ４５０
ｎｍの値で除算し、ＥＧＦＲｖＩＩＩに対する結合能を示すｓｃＦｖ候補群を選別した。
【０１１６】
７５２個のコロニーを分析した結果、２４個のクローン（結合能倍数＞３）がＥＧＦＲ
ｖＩＩＩに結合する様相を示し、Ｂ３Ｈ１、Ｂ４Ａ３の２つのクローンが、他の抗体クロ
ーンに比べて強く結合し、中でもＢ４Ａ３が最も高い結合能を示した。ＥＧＦＲｖＩＩＩ
抗原に特異的に高い結合能を示すＢ４Ａ３クローンの選別を完了し、Ｂ４Ａ３クローンの
アミノ酸配列を表２に示した。
【０１１７】
【表２】
2020195398.tif 000004
【０１１８】
実施例３．Ｂ４Ａ３抗体のＥＧＦＲｖＩＩＩに対する特異性およびエピトープの確認
ｓｃＦｖ抗体断片単独の結合力および機能を確認するために、タンパク質発現菌株（Ｔ
ＯＰ１０Ｆ´）を用いてＢ４Ａ３抗体断片を発現した。Ｂ４Ａ３  ｓｃＦｖタンパク質は
、Ｎｉ‐ＮＴＡ  ｂｅａｄを用いたＨｉｓ‐ｔａｇ精製過程を経て準備した。
【０１１９】
生産されたｓｃＦｖタンパク質を用いて、ＥＧＦＲｖＩＩＩに対する特異性を確認する
ために、ＥＧＦＲｖＩＩＩ突然変異のみが特異的に有するペプチド（ＬＥＥＫＫＧＮＹＶ
ＶＴＤＨＣ）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ組換えタンパク質、ＥＧＦＲ組換えタンパク質に対する
結合様相をＥＬＩＳＡにより確認した。その結果を図４から図６に示した。
【０１２０】
結合様相に対する比較抗体として、ＥＧＦＲ抗体として知られたセツキシマブを使用し
た。セツキシマブは、ＥＧＦＲタンパク質とＥＧＦＲｖＩＩＩタンパク質の両方に結合す
るが、これは、ＥＧＦＲタンパク質のドメインＩＩＩ（Ｌ２）に結合し、この部分はＥＧ
ＦＲｖＩＩＩタンパク質にも存在する部位であるためである。セツキシマブの場合、ＥＧ
ＦＲ組換えタンパク質とＥＧＦＲｖＩＩＩ組換えタンパク質には両方とも結合するが、Ｅ
ＧＦＲは有さずＥＧＦＲｖＩＩＩのみが特異的に有するＬＥＥＫＫＧＮＹＶＶＴＤＨＣ配
列には結合しないことを確認した。これは、セツキシマブがＥＧＦＲのＬ２ドメイン（ａ
ａ  ３１０‐４８０）をエピトープとして有するためであり、このドメインは、ＥＧＦＲ
とＥＧＦＲｖＩＩＩが共通的に有する領域である。しかし、Ｂ４Ａ３抗体の場合、ＥＧＦ
ＲｖＩＩＩ組換えタンパク質と、ＥＧＦＲｖＩＩＩのみが特異的に有するＬＥＥＫＫＧＮ
ＹＶＶＴＤＨＣ配列には結合するが、ＥＧＦＲ組換えタンパク質には殆ど結合しないこと
を確認した。このようなことから、Ｂ４Ａ３抗体断片は、ＥＧＦＲｖＩＩＩタンパク質の
Ｎ末端アミノ酸配列（残基 １‐１４）であるＬＥＥＫＫＧＮＹＶＶＴＤＨＣ（配列番号
１）をエピトープとして有することが確認された。
【０１２１】
さらに、ＥＬＩＳＡ法を用いて、ＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ペプチドおよびＥＧＦＲｖＩ
ＩＩ組換えタンパク質に対する抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ｓｃＦｖであるＢ４Ａ３の濃度によ
る結合能を測定した。３回繰り返して進行された上記のＥＬＩＳＡ結果に基づき、プリズ
ム（Ｐｒｉｓｍ）プログラムを用いて、非線形回帰分析方法により、Ｂ４Ａ３  ｓｃＦｖ
タンパク質のＥＧＦＲｖＩＩＩペプチドおよびＥＧＦＲｖＩＩＩ組換えタンパク質に対す
る概略的な標的結合能（ａｐｐａｒｅｎｔ  ａｆｆｉｎｉｔｙ）を確認した。その結果、
Ｂ４Ａ３  ｓｃＦｖは、ＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ペプチドに対しては平均的にそれぞれ０
．２７１５ｎＭ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ組換えタンパク質に対しては２．３４７ｎＭの概略的
な標的結合能を示すことを確認した。
【０１２２】
【表３】
2020195398.tif 000005
【０１２３】
Ｂ４Ａ３抗体断片（ｓｃＦｖ）がＥＧＦＲｖＩＩＩを特異的に認知できるか否かを確認
するために、ウエスタンブロットを行った。ＥＧＦＲｖＩＩＩ突然変異を有している膠芽
細胞腫患者細胞である６２６を溶解させて６２６患者細胞のタンパク質のみを確保した。
【０１２４】
６２６患者細胞のタンパク質３０μｇをＳＤＳ‐ＰＡＧＥゲルにロードした後、ＰＶＤ
Ｆ膜に移してから、１次抗体としてＢ４Ａ３抗体クローンとＥＧＦＲ対照群抗体（＃４２
６７、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）で染色して、
ＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的に結合することを確認した（図７）。
【０１２５】
実施例４．ＥＧＦＲｖＩＩＩ過発現細胞を用いた抗‐ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ｓｃＦｖの結
合能の確認
三星ソウル病院難治性癌事業団（Ｓａｍｓｕｎｇ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｃｅｎｔｅｒ、Ｉ
ｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）
の脳組織バンク（Ｂｒａｉｎ  Ａｖａｔａｒ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｂａｎｋ）から、膠芽細胞
腫（Ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  Ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ）患者由来細胞（ＮＴ３５２Ｔ１
、６２６、７８０）の分譲を受けて実験を行った。ＮＴ３５２Ｔ１の場合、ＥＧＦＲおよ
びＥＧＦＲｖＩＩＩのない細胞であって、ＥＧＦＲｖＩＩＩのみを発現する細胞を作製す
るために、ＥＧＦＲｖＩＩＩ過発現ベクターを導入してｖＩＩＩ３５２Ｔ１細胞を作製し
、後続実験で引き続き使用した。ＥＧＦＲおよびＥＧＦＲｖＩＩＩの発現パターンを確認
するために、それぞれの患者由来細胞を溶解させた後、３０μｇのタンパク質溶解物を用
いてウエスタンブロットを行い、その結果を図８に示した。１次抗体としてＥＧＦＲ  Ｒ
ａｂｂｉｔ  ｍＡｂ(#4267, Cell Signaling Technology, Inc.)、２次抗体としてはＡｎ
ｔｉ‐ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ、ＨＲＰ‐ｌｉｎｋｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ(#7074, Cell S
ignaling Technology, Inc.)を使用した。患者細胞のＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩの発現
パターンの確認結果を表４に示した。
【０１２６】
【表４】
2020195398.tif 000006
【０１２７】
膠芽細胞腫患者由来細胞を用いて抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ｓｃＦｖのＥＧＦＲｖＩＩＩに
対する細胞結合様相を分析するために、ＦＡＣＳ分析を行った。ＮＴ３５２Ｔ１患者細胞
の場合、ＥＧＦＲとＥＧＦＲｖＩＩＩの発現が殆どなかった。ＮＴ３５２Ｔ１患者細胞に
ＥＧＦＲｖＩＩＩを発現させたｖＩＩＩ３５２Ｔ１の場合、ＥＧＦＲｖＩＩＩタンパク質
のみが発現され、ＥＧＦＲは発現されなかった。６２６患者細胞はＥＧＦＲｖＩＩＩとＥ
ＧＦＲを両方とも有しており、７８０患者細胞は、ＥＧＦＲのみを発現する患者細胞であ
ってＥＧＦＲｖＩＩＩ突然変異を有していなかった。ＮＴ３５２Ｔ１（ＥＧＦＲ−／ＥＧ
ＦＲｖＩＩＩ−）、ｖＩＩＩ３５２Ｔ１（ＥＧＦＲ−／ＥＧＦＲｖＩＩＩ＋）、７８０（
ＥＧＦＲ＋／ＥＧＦＲｖＩＩＩ−）患者細胞を培養培地（ＮＢＡ）で培養した後、５ｘ１
０５数の細胞を各チューブ内に準備した。その後、４％のパラホルムアルデヒド（ｐａｒ
ａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）で固定させてから、遠心分離した後、ＦＡＣＳ分析溶液で
１回洗浄した。準備された細胞に、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ｓｃＦｖであるＢ４Ａ３  ｓｃ
Ｆｖを１μｇ処理した後、４℃で一晩培養することで、細胞に該当抗体断片が結合するよ
うに処置した。その後、非特異的に結合されたｓｃＦｖタンパク質をＦＡＣＳ溶液で２回
洗浄した後、蛍光（ＰＥ、ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）が結合された抗ＨＡ抗体（ｓｃ
‐８０５  ＰＥ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）を１
時間結合させた。さらにＦＡＣＳ溶液で洗浄した後、ＦＡＣＳ溶液５００μＬを追加して
ＦＡＣＳ分析を行った。結果として、図９を参照すると、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ｓｃＦｖ
であるＢ４Ａ３  ｓｃＦｖは、ＥＧＦＲｖＩＩＩのみを有しているｖＩＩＩ３５２Ｔ１患
者細胞に特異的な細胞結合能を示すことを確認した。ＥＧＦＲとＥＧＦＲｖＩＩＩを両方
とも有しないＮＴ３５２Ｔ１患者細胞と、ＥＧＦＲのみを有する７８０患者細胞には結合
しないことを確認した。このようなことから、同定されたＥＧＦＲｖＩＩＩ  ｓｃＦｖ抗
体断片は、実際に細胞膜に存在するＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞外部位に対する特異性を有する
ことが確認された。
【０１２８】
実施例５．抗‐ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ｓｃＦｖ特異性の確認
ＥＧＦＲを発現する正常細胞と、ＥＧＦＲｖＩＩＩを発現するｖＩＩＩ３５２Ｔ１細胞
を用いて、Ｂ４Ａ３  ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体の特異性を検証した。ＦＡＣＳ実験に使用さ
れたＢ４Ａ３抗体は、Ｂ４Ａ３  ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ１の形態に変換して使用した。ＥＧ
ＦＲのみを発現する正常細胞であるＥｐｉｄｅｒｍａｌ  ｃｅｌｌ［Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｅ
ｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ；Ｎｏｒｍａｌ、Ｈｕｍａｎ、Ａｄｕｌ
ｔ（ＡＴＣＣ    ＰＣＳ‐２００‐０１１ＴＭ）］は、ＡＴＣＣ社から購買して使用した
。ＦＡＣＳ実験は、上述の方法と同様の方法により行われ、１次抗体としてはセツキシマ
ブ、Ｂ４Ａ３  ＩｇＧを使用し、２次抗体としてはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８  Ｇ
ｏａｔ  Ａｎｔｉ‐Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用した。上記の結果に基づき、Ｂ４Ａ３抗体（ＩｇＧ１）は、
ＥＧＦＲｖＩＩＩのみを発現するｖＩＩＩ３５２Ｔ１に特異的に結合する（図１１）とと
もに、正常細胞では、対照抗体であるセツキシマブに比べて最小化された結合様相を示し
た（図１０）。正常細胞での最小化された結合能に基づき、Ｂ４Ａ３抗体は正常細胞で最
小化された毒性を示すはずであると考えられる。
【０１２９】
実施例６．薬物結合したＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体の細胞毒性
Ｂ４Ａ３抗体が標的細胞のＥＧＦＲｖＩＩＩ／ＥＧＦＲに特異的に結合して標的細胞内
へ内在化できる細胞内在化可能性およびＡｎｔｉｂｏｄｙ‐Ｄｒｕｇ  Ｃｏｎｊｕｇａｔ
ｅｓとしての適用可能性を検証するために、Ｂ４Ａ３抗体へのサポリン（Ｓａｐｏｒｉｎ
）の結合により細胞毒性実験を行った。Ｂ４Ａ３抗体への毒性物質であるサポリンの結合
は、ＺＡＰ抗体内在化キット（ＺＡＰ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉ
ｏｎ  ｋｉｔ：Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）を
用いて行った。ＺＡＰ抗体内在化キットで提供する毒性物質サポリンは、抗‐ヒトＩｇＧ
‐ＩｇＧに結合された形態であって、ヒトＩｇＧであるＢ４Ａ３抗体に二次抗体の形態で
結合される。サポリンは単独で細胞内に入ることができず、標的抗原であるＥＧＦＲｖＩ
ＩＩにＢ４Ａ３ヒトＩｇＧ／サポリン接合抗‐ヒトＩｇＧ‐ＩｇＧの複合体が結合して細
胞内在化される。サポリンは、細胞内に放出され、リボソームを非活性化させる形態で細
胞毒性を誘導する。サポリン接合抗‐ヒトＩｇＧ‐ＩｇＧは、患者由来細胞などを含む一
般的な細胞の表面に結合されないため、それ自体では細胞毒性が発生しない。実験は、キ
ットの製造社から提供されるプロトコルに従って進行された。詳細に、９６ウェルの細胞
培養プレートに、ＥＧＦＲｖＩＩＩの発現がないＮＴ３５２Ｔ１患者細胞と、ＥＧＦＲｖ
ＩＩＩが発現されたｖＩＩＩ３５２Ｔ１患者細胞を、９０μｌ体積で５０００個／ウェル
分注した。翌日、Ｂ４Ａ３ヒトＩｇＧ／サポリン接合抗‐ヒトＩｇＧ‐ＩｇＧ結合体は細
胞培養培地に１０μｌ処理し、Ｂ４Ａ３抗体は、最高濃度１０ｎＭから１／１０ずつ希釈
して８つの濃度で、実験を３回繰り返して進行した。抗体特異的な細胞毒性であるかを確
認するために、サポリン単独処理群およびサポリン接合抗‐ヒトＩｇＧ‐ＩｇＧ処理群を
対照群として追加して実験を進行し、複合体およびサポリンなどを処理した後、７２時間
後に細胞成長を分析した。分析は、ＥＺ‐Ｃｙｔｏｘ  ｋｉｔ(WST based Cell Viabilit
y/Cytotoxicity Assay Kit)を用いて行い、発色試薬処理した後、２時間、３７℃でＣＯ
２培養器で培養した。その後、４５０ｎｍでＯＤ値を分析した。その結果、標的抗原であ
るＥＧＦＲｖＩＩＩを発現しないＮＴ３５２Ｔ１では、細胞毒性が発生しないことが確認
され、ｖＩＩＩ３５２Ｔ１患者細胞では、サポリン単独処理群およびサポリン接合抗‐ヒ
トＩｇＧ処理群では細胞毒性が発生しなかったが、Ｂ４Ａ３  ＩｇＧ／サポリン接合抗‐
ヒトＩｇＧ‐ＩｇＧ処理群では細胞毒性が確認された（図１２）。このようなことから、
Ｂ４Ａ３抗体のＡＤＣ（Ａｎｔｉｂｏｄｙ‐Ｄｒｕｇ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）としての
適用可能性が確認された。
【０１３０】
実施例７．Ｂ４Ａ３抗体のＥＧＦＲおよびＥＧＦＲｖＩＩＩに対する親和度の定量
Ｂ４Ａ３抗体のＥＧＦＲおよびＥＧＦＲｖＩＩＩに対する親和度を定量するために、Ｓ
ＰＲ（Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）に基づくＢｉａｃｏｒｅ
Ｔ２００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いた。抗
体の親和度の決定に使用した抗原であるＥＧＦＲｖＩＩＩ組換えタンパク質は自製し、ｗ
ｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇからＥＧＦＲ（Ｅｎｔｒｙ：Ｐ００５３３）配列に基づく
文献を参考して、ＥＧＦＲの細胞外ドメイン（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｏｍａｉ
ｎ）のアミノ酸配列において３０番から２９７番までのアミノ酸を除去した後、２９番と
２９８番が接する部位の間にグリシンアミノ酸を添加し、ｃ‐末端にＦｃタグ（ＩｇＧ１
ＣＨ２、ＣＨ３ドメインのＰｒｏ１１０‐Ｌｙｓ３３０）を添加したベクター（配列番
号２０、図１４）を作り、動物細胞(Expi293, Gibco)を用いて生産／精製して使用した。
ＥＧＦＲ組換えタンパク質としては、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎ  ＥＧＦＲ／
ＥｒｂＢ１  Ｆｃ  Ｃｈｉｍｅｒａ  Ｐｒｏｔｅｉｎ(R&D systems, 344-ER)を使用した
。
【０１３１】
詳細に、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００にＳｅｒｉｅｓ  Ｓ  Ｓｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ  Ｃ
Ｍ５（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＢＲ１００５３０）
を取り付け、Ａｍｉｎｅ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌ
ｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、 ＢＲ１０００５０）およびＨｕｍａｎ  Ｆａｂ  Ｃａｐｔ
ｕｒｅ  Ｋｉｔを用いて、製造社から提供されるマニュアルに従って行い、Ｈｕｍａｎ  
Ｆａｂ  Ｃａｐｔｕｒｅ  ＡｎｔｉｂｏｄｙをＳｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐの表面に固定した
。親和度を定量するために、Ｂ４Ａ３抗体をＨＢＳ−ＥＰ＋（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒ
ｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＢＲ１００６６９）に１０ｕｇ／ｍＬで希釈し、３０
μｌ／ｍｉｎで１２０秒間投入した後、安定化させ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗原をＨＢＳ−Ｅ
Ｐ＋（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＢＲ１００６６９）
に希釈して、０．２５ｎＭから２倍ずつ濃度を上げて２５６ｎＭまで、それぞれのサイク
ルで分析を行った。抗原の投入は、ＨＢＳ−ＥＰ＋に濃度に応じて希釈した後、３０ｕｌ
／ｍｉｎで１８０秒間結合させ、ＨＢＳ−ＥＰ＋溶液を３０ｕｌ／ｍｉｎで３６０秒間流
すことで解離させた。各濃度毎の分析が終了される度にグリシン２．０の再生バッファー
（ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、 ＢＲ１００３５５）を用いて直前ステップで使用された抗体と抗
原を除去し、次の分析を行った。この方法と同様にＥＧＦＲに対する親和度の定量を行い
、Ｂｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉ
ｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて抗原に対する抗体の親和度を定量した。
【０１３２】
Ｂ４Ａ３抗体は、ＥＧＦＲ組換えタンパク質には殆ど結合しないことがＳｅｎｓｏｒｇ
ｒａｍにより確認された。また、ＥＧＦＲｖＩＩＩ組換えタンパク質に対する結合定数は
５．６６１Ｘ１０４（１／Ｍｓ）であることが確認され、解離定数は２．４８０Ｘ１０−
４（１／ｓ）と分析された。これに基づき、Ｂ４Ａ３抗体は４．３８ｎＭの親和度でＥＧ
ＦＲｖＩＩＩに結合することを確認した（図１３）。
【０１３３】
実施例８．Ｂ４Ａ３抗体のＩｎ‐ｖｉｖｏモデル効能の評価
Ｂ４Ａ３抗体のＥＧＦＲおよびＥＧＦＲｖＩＩＩに対するＩｎ‐ｖｉｖｏ効能を確認す
るために、ＧＢＭ患者由来細胞のうちＮＳ０７‐４６４Ｔを使用した。ＮＳ０７‐４６４
Ｔは、ＥＧＦＲが過発現／増幅するとともに、ＥＧＦＲｖＩＩＩ突然変異を有しているＧ
ＢＭ患者由来細胞である。三星ソウル病院難治性癌事業団で分析した遺伝子データに基づ
き、ＥＧＦＲｖＩＩＩ突然変異細胞としてＮＳ０７‐４６４Ｔを選別し、三星ソウル病院
難治性癌事業団のバイオバンクから分譲を受け、ＲＴ‐ＰＣＲおよびウエスタンブロット
法によりＥＧＦＲｖＩＩＩの発現を確認した（図２）。ＮＳ０７‐４６４Ｔ患者細胞を用
いて皮下異種移植モデル（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔ  ｍｏｄｅｌ
）を作製し、約２６５ｍｍ３の大きさの腫瘍が形成された時にヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ、
Ｉ４５０６）、セツキシマブ（Ｍｅｒｃｋ）、Ｂ４Ａ３抗体を、それぞれ週２回、１０ｍ
ｇ／ｋｇで総４回投与した。群当たりのマウスは、ヒトＩｇＧ、セツキシマブの群はそれ
ぞれ５匹、Ｂ４Ａ３処理群は４匹であった。抗体を投与し始めた時点から１３日が経過し
た時に、ヒトＩｇＧを処理した群は１４２６．５ｍｍ３の腫瘍が形成された。セツキシマ
ブは１３日目に１２２８．５ｍｍ３の大きさの腫瘍が形成され、対照群に対する腫瘍形成
抑制能が１４％と確認された。Ｂ４Ａ３抗体は、投与１３日目に６９９．５ｍｍ３の腫瘍
が形成され、対照群に対する腫瘍形成抑制能が５１％と確認された。このようなことから
、Ｂ４Ａ３の、ＥＧＦＲｖＩＩＩ突然変異を有する患者由来細胞での卓越な坑癌効能が検
証された。
【産業上の利用可能性】
【０１３４】
本発明の特徴および利点をまとめると、次のとおりである:
（ｉ）本発明は、癌細胞の表面に発現されたＥＧＦＲｖＩＩＩに結合した後、細胞内に
内在化される抗‐ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体およびその医薬用途を提供する。
（ｉｉ）本発明の抗体は、ＥＧＦＲｖＩＩＩを発現する癌細胞の浸潤と転移を抑制する
。
（ｉｉｉ）本発明の抗体は、癌の治療または診断に用いられることができ、ＥＧＦＲｖ
ＩＩＩは癌細胞の表面に過発現される分子であるため、本発明の抗体を用いると、正常細
胞に与える影響を最小化しながら癌細胞のみを選択的にターゲットとすることができる。
【０１３５】
以上、本発明の内容の特定の部分を詳述したが、当業界における通常の知識を持った者
にとって、このような具体的な記述は単なる好適な実施態様に過ぎず、これにより本発明
の範囲が制限されることはないという点は明らかである。よって、本発明の実質的な範囲
は特許請求の範囲とこれらの等価物により定義されると言える。
【図１】
2020195398.tif 000007
【図２】
2020195398.tif 000008
【図３】
2020195398.tif 000009
【図４】
2020195398.tif 000010
【図５】
2020195398.tif 000011
【図６】
2020195398.tif 000012
【図７】
2020195398.tif 000013
【図８】
2020195398.tif 000014
【図９】
2020195398.tif 000015
【図１０】
2020195398.tif 000016
【図１１】
2020195398.tif 000017
【図１２】
2020195398.tif 000018
【図１３】
2020195398.tif 000019
【図１４】
2020195398.tif 000020
【図１５】
2020195398.tif 000021
【配列表】
2020195398000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年8月28日(2020.8.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
2020195398.tif 000022
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２】
2020195398.tif 000023
【外国語明細書】
2020195398000001.pdf