(57)【要約】【課題】信頼性が高い核酸の解析方法を提供する。【解決手段】（１）核酸染色された試料から取得されたデータを分析して、前記試料中のターゲットの存在の有無を確認する工程と、（２）前記工程（１）において、ターゲットの存在が確認された場合、前記データを取得した試料から核酸を抽出して、前記核酸を解析する工程と、を有する、核酸の解析方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）核酸染色された試料から取得されたデータを分析して、前記試料中のターゲットの存在の有無を確認する工程と、
（２）前記工程（１）において、ターゲットの存在が確認された場合、前記データを取得した試料から核酸を抽出して、前記核酸を解析する工程と、
を有する、核酸の解析方法。
【請求項２】
前記データが前記核酸染色された細胞の数および各細胞の核酸量を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記工程（１）において、前記ターゲットの核酸量がコントロールの核酸量と異なることにより、前記ターゲットの存在を確認する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記データの取得を、フローサイトメトリにより行う、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記核酸の解析を、シークエンサー法、ＤＮＡマイクロアレイ法、デジタルＰＣＲ法およびリアルタイムＰＣＲ法からなる群から選択される方法で行う、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
所定の割合以上のターゲットを含む前記試料から核酸を抽出する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記工程（２）において、前記試料からターゲットを分取して、前記分取したターゲットから核酸を抽出することを有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記抽出された核酸を増幅することをさらに有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記ターゲットが、腫瘍細胞、真菌、細菌およびウイルスの少なくとも一つを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記試料が、体液および生体組織の少なくとも一つから単離された細胞の細胞浮遊液である、請求項１〜９いずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記工程（１）の前に、対象から得られた試料を、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、４’，６−ジアミジン−２’−フェニルインドールジハイドロクロライド（ＤＡＰＩ）、ＤＲＡＱ５（Ｄｅｅｐ  Ｒｅｄ  Ａｎｔｈｒａｑｕｉｎｏｎｅ  ５）、７−ＡＡＤ（７−ａｍｉｎｏ−ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ  Ｄ）、ヘキスト３３３４２、メチレンブルー、ヘマトキシリンおよびチオニンからなる群から選択される核酸染色色素で染色して、前記核酸染色された試料を調製することを有する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸の解析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、病理標本の作製が行われた後に細胞検査士や病理医によって組織切片による病理診断が行われている。標本の作製、細胞検査士および病理医による診断には熟練した技術が必要であり、技術の差により診断結果に違いが生じる場合がある。また、組織を摘出してから診断を行うまでには、組織を固定、切片を作製、染色といった手技が必要であり、細胞検査士、病理医等を一定時間拘束することになる。そこで、診断までの手技を自動化することが求められている。
【０００３】
また、腫瘍の部位や術式によっては、手術中に、摘出した組織が腫瘍であるのか正常組織であるのかを判別することが必要である。この判別には細胞診断や凍結切片による迅速診断が行われているが、通常の病理診断と比較して、より高度な技術と診断精度が要求される。したがって、術中に摘出した組織が腫瘍であるのか否かの診断を自動でより客観的に且つ迅速に行う装置が開発されれば、病理医にとって非常に有用である。
【０００４】
そこで、特許文献１には、単離・細胞核染色された細胞を計測して蛍光強度のヒストグラムを取得し、ヒストグラムのデータから正常細胞よりも蛍光強度の強い領域に分布する強領域細胞数を求め、この強領域細胞数とヒストグラムに基づいてがんの悪性度を判定する細胞解析装置及び細胞解析方法が開示されている（例えば、特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１２−０４７５９４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
特許文献１が開示する細胞解析装置および細胞解析方法によれば、ヒストグラムとその蛍光強度の強い領域に分布する細胞数とに基づいてがんの悪性度を判定することができる。しかし、より高精度の情報を得るために、細胞の解析情報に加えて、信頼性が高い核酸の解析情報が求められている。
【０００７】
そこで本発明では、信頼性が高い核酸の解析方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記の課題に鑑み鋭意検討を行った。その結果、
（１）核酸染色された試料から取得されたデータを分析して、前記試料中のターゲットの存在の有無を確認する工程と、
（２）前記工程（１）において、ターゲットの存在が確認された場合、前記データを取得した試料から核酸を抽出して、前記核酸を解析する工程と、
を有する、核酸の解析方法によって、上記課題が解決されることを見出し、本発明の完成に至った。
【発明の効果】
【０００９】
本発明では、信頼性が高い核酸の解析方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、実施例におけるフローサイトメトリの結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明の一形態に係る実施の形態を説明する。本発明は、以下の実施の形態のみには限定されない。
【００１２】
本明細書において、範囲を示す「Ｘ〜Ｙ」は「Ｘ以上Ｙ以下」を意味する。また、特記しない限り、操作および物性等の測定は室温（２０〜２５℃）／相対湿度４０〜５０％ＲＨの条件で測定する。
【００１３】
本発明の一形態は、
（１）核酸染色された試料から取得されたデータを分析して、前記試料中のターゲットの存在の有無を確認する工程と、
（２）前記工程（１）において、ターゲットの存在が確認された場合、前記データを取得した試料から核酸を抽出して、前記核酸を解析する工程と、
を有する、核酸の解析方法に関する。
【００１４】
本形態に係る核酸の解析方法では、データを取得した試料そのものから核酸を抽出することで、試料（例えば細胞）の解析情報に加えて、核酸の解析情報を得ることができる。そのため、より信頼性の高い情報を得ることができる。
【００１５】
また、本形態に係る核酸の解析方法では、核酸を抽出する試料が核酸解析の対象であることを確認してから、核酸の解析を行うことができる。そのため、核酸の解析のやり直しのようなロスを減らすことができる。
【００１６】
本形態に係る核酸の解析方法において、核酸染色された試料からデータを取得する方法は、特に制限されず、フローサイトメトリ、イメージサイトメトリなどの従来公知の方法を適宜選択して使用することができる。データの取得およびターゲットの存在の有無の確認を迅速に行うことができるとの観点から、工程（１）において、データの取得をフローサイトメトリにより行うことが好ましい。
【００１７】
以下、本形態に係る核酸の解析方法を実施するための好ましい一実施形態について、核酸染色された試料のデータの取得をフローサイトメトリにより行う場合を例に挙げて具体的に説明する。しかし、本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載に基づいて定められるべきであり、下記の具体的な実施形態のみには限定されない。
【００１８】
（工程（１））
工程（１）では、核酸染色された試料から取得されたデータを分析して、前記試料中のターゲットの存在の有無を確認する。
【００１９】
本形態に係る試料は、細胞および／またはウイルスを含む。本形態に係る試料は、２種以上の細胞および／またはウイルスを含んでもよい。また、本形態に係る試料は、後述のターゲットだけではなく、ターゲット以外の細胞および／またはウイルスを含んでもよい。
【００２０】
本形態に係る試料が由来する対象としては、特に制限されず、細菌、古細菌などの原核生物；動物、植物、真菌、原生生物などの真核生物；ＤＮＡウイルス、ＲＮＡウイルスなどのウイルスが挙げられる。対象は、好ましくは真核生物であり、より好ましくは動物であり、特に好ましくは哺乳動物である。
【００２１】
哺乳動物としては、例えば霊長類、実験用動物、家畜、ペット等が挙げられ特に限定されない。哺乳動物の具体的な例としては、例えばヒト、サル、ラット、マウス、ウサギ、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコなどが挙げられ、好ましくはヒトである。
【００２２】
本形態に係る試料は、好ましくは生体試料である。生体試料としては、例えば動物由来の体液、生体組織、細胞および細胞抽出成分等が挙げられる。体液の例としては、血液、腹水、体腔液、尿、汗、脊髄液等が挙げられる。生体組織の例としては、脳組織、脾臓組織、リンパ節組織、腎臓組織、肺組織、心臓組織、肝臓組織、神経組織、大腸組織、胃組織、食道組織、口腔組織、乳腺組織、子宮組織、泌尿器組織、軟部組織、骨組織、造血器組織等が挙げられる。
【００２３】
工程（１）において、データをフローサイトメトリにより取得する場合、試料は、細胞および／またはウイルスの浮遊液である。本形態に係る核酸の解析方法は、病理診断において好適に使用できる。したがって、一実施形態では、本形態に係る試料は、体液および生体組織の少なくとも一つから単離された細胞の細胞浮遊液である。
【００２４】
工程（１）では、核酸染色された試料を使用する。核酸は、ＤＮＡであっても、ＲＮＡであってもよい。核酸染色された試料の調製方法は、特に制限されず、従来公知の知見（例えば、特開２０１０−２０４０８６号公報など）を適宜参照することができる。
【００２５】
例えば、生体組織から単離された細胞の細胞浮遊液を調製する。細胞浮遊液は、従来公知の方法により調製することができる。例えば、生体組織を含む緩衝液をピペッティングする方法、フローサイトメーター前処理装置（例えば、和研薬株式会社製メディマシーン）を使用する方法などが挙げられる。調製した細胞浮遊液に適量の核酸染色色素を添加して、５〜１５分間室温でインキュベートすることで、核酸を染色することができる。必要に応じて、細胞浮遊液に界面活性剤、ヌクレアーゼなどを添加してもよい。また、細胞浮遊液は、核酸染色前または染色後に、夾雑物、細胞の凝集塊などを除去するために、メッシュでろ過してもよい。
【００２６】
核酸染色色素としては、特に制限されず、従来公知の色素を使用することができる。核酸染色色素は、好ましくは蛍光色素である。核酸染色色素の例としては、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、４’，６−ジアミジン−２’−フェニルインドールジハイドロクロライド（ＤＡＰＩ）、ＤＲＡＱ５（Ｄｅｅｐ  Ｒｅｄ  Ａｎｔｈｒａｑｕｉｎｏｎｅ  ５）、７−ＡＡＤ（７−ａｍｉｎｏ−ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ  Ｄ）、ヘキスト３３３４２、メチレンブルー、ヘマトキシリン、チオニンなどが挙げられる。
【００２７】
界面活性剤の例としては、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｘ−１１４（ダウケミカル社）、Ｉｇｅｐａｌ（登録商標）  ＣＡ−６３０（シグマアルドリッチ社）などが挙げられる。
【００２８】
緩衝液の例としては、クエン酸、コハク酸、酒石酸、リンゴ酸等の有機酸、およびその塩類等を含有する溶液等；グリシン、タウリン、アルギニン等のアミノ酸類；塩酸、硝酸、硫酸、リン酸、ホウ酸、酢酸等の無機酸、およびその塩類等を含有する溶液等が挙げられる。
【００２９】
一実施形態において、本形態に係る核酸の解析方法は、工程（１）の前に、対象から得られた試料を、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、４’，６−ジアミジン−２’−フェニルインドールジハイドロクロライド（ＤＡＰＩ）、ＤＲＡＱ５（Ｄｅｅｐ  Ｒｅｄ  Ａｎｔｈｒａｑｕｉｎｏｎｅ  ５）、７−ＡＡＤ（７−ａｍｉｎｏ−ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ  Ｄ）、ヘキスト３３３４２、メチレンブルー、ヘマトキシリンおよびチオニンからなる群から選択される核酸染色色素で染色して、核酸染色された試料を調製することを有することができる。
【００３０】
上述のとおり、工程（１）では、データの取得をフローサイトメトリにより行うことが好ましい。フローサイトメトリは、蛍光標識または未標識の細胞などを大きさ、光散乱様式、蛍光などの因子について定量的に解析し、その情報に基づいて特定の細胞などを迅速に選択分離する方法である。
【００３１】
工程（１）で使用できるフローサイトメーターは、特に制限されず、公知の機器を用いることができる。フローサイトメーターとしては、セルソーター（自動細胞解析分取装置）、セルアナライザー（自動細胞解析装置）、高分解能型セルアナライザー、高速型セルアナライザーなどが挙げられる。また、生体組織から核酸染色された細胞の細胞浮遊液を自動で調製できる機能を有するフローサイトメーター（例えば、日本光電工業株式会社製ＦＣＭ−２２００）を使用することができる。
【００３２】
工程（１）において使用可能なフローサイトメトリの具体的な手順については、特に制限されず、従来公知の知見（例えば、特開２０１２−４７５９４号公報、特開２０１４−２３４３９号公報など）を適宜参照することができる。また、フローサイトメトリは、フローサイトメーターの製造会社のプロトコルに従って、行うことができる。
【００３３】
フローサイトメトリにより、個々の細胞の蛍光発光、前方散乱光および側方散乱光に基づくデータを取得することができる。蛍光発光の強度（蛍光強度）は、核酸量を示す。前方散乱光の強度は、細胞の内部構造の複雑さを反映する。側方散乱光の強度は、細胞の大きさを反映する。これらのデータを用いて、粒度分布図（例えば単一パラメータヒストグラム）やプロット図（例えば２パラメータヒストグラム、スキャッタグラム、サイトグラム、ドットプロット、密度プロット、等高線図）などを作成することができる。試料中にターゲット以外のものが含まれている場合、目的とするターゲット集団に着目した解析を行うために、ゲート解析を行ってもよい。
【００３４】
工程（１）では、取得されたデータを分析することで、試料中のターゲットの存在の有無を確認する。
【００３５】
本形態に係る核酸の解析方法において、ターゲットは、核酸解析の対象となる細胞およびウイルスの少なくとも一つを含み、好ましくは腫瘍細胞、真菌、細菌およびウイルスの少なくとも一つを含み、より好ましくは腫瘍細胞および真菌の少なくとも一方を含み、特に好ましくは腫瘍細胞である。
【００３６】
腫瘍細胞は、良性腫瘍細胞であっても、悪性腫瘍細胞であってもよい。腫瘍細胞の例としては、脳腫瘍細胞、脾臓腫瘍細胞、リンパ節腫瘍細胞、腎臓腫瘍細胞、肺腫瘍細胞、肝臓腫瘍細胞、神経腫瘍細胞、大腸腫瘍細胞、胃腫瘍細胞、食道腫瘍細胞、口腔腫瘍細胞、乳腺腫瘍細胞、子宮腫瘍細胞、泌尿器腫瘍細胞、軟部組織腫瘍細胞、骨腫瘍細胞、造血器腫瘍細胞、循環癌細胞などが挙げられる。腫瘍細胞は、好ましくは脳腫瘍細胞である。
【００３７】
上述のとおり、フローサイトメトリにより、少なくとも個々の細胞の核酸量、内部構造の複雑さおよび細胞の大きさに関するデータを取得することができる。これらのデータを分析することで、試料中のターゲットの存在の有無を確認することができる。
【００３８】
分析に用いられるデータは、ターゲットに応じて、適宜選択することができる。例えば、ターゲットが腫瘍細胞である場合、縦軸を細胞数および横軸を蛍光強度とする単一パラメータヒストグラムを作成する。蛍光強度は、核酸に結合する核酸染色色素の量に比例する。よって、蛍光強度のピーク位置に基づいて、異常な染色体数を有する腫瘍細胞や増殖している腫瘍細胞の存在を確認することができる。この場合、染色体数が正常で増殖していない正常細胞をコントロールとして使用することができる。また、試料に含まれる正常細胞と腫瘍細胞との比率などの情報を得ることができる。このように、ターゲットの核酸量とコントロールの核酸量とが異なる場合、核酸量に基づいて、試料中のターゲットの存在を確認することができる。
【００３９】
よって、一実施形態では、工程（１）において、取得されるデータは、核酸染色された細胞の数および各細胞中の核酸量を含むことが好ましい。また、ターゲットの核酸量がコントロールの核酸量と異なることにより、前記ターゲットの存在を確認することが好ましい。
【００４０】
（工程（２））
工程（２）では、工程（１）において、ターゲットの存在が確認された場合、前記データを取得した試料から核酸を抽出して、核酸を解析する。本形態に係る核酸の解析方法では、工程（２）において、データを取得した試料そのものから核酸を抽出することを特徴とする。
【００４１】
核酸を抽出する試料は、工程（１）において、ターゲットが存在することを確認されている。また、試料に含まれるターゲットの数、ターゲットの割合などの情報を得ることができる。このように、本形態に係る核酸の解析方法では、工程（１）において得られた試料の解析情報に加えて、当該試料から抽出した核酸を解析することにより、核酸解析の信頼性をより高めることができる。さらに、データを取得した試料を使用することで、核酸解析のための前処理を簡便化することができる。
【００４２】
試料から核酸を抽出する方法は、特に制限されず、従来公知の知見を適宜参照することができる。例えば、細胞浮遊液を遠心分離して、上清を取り除き、得られた細胞成分を用いて、フェノール／クロロホルム抽出法などにより、核酸を抽出することができる。フェノール／クロロホルム抽出溶液から核酸を回収する方法としては、エタノール沈殿法を使用することができる。また、市販の核酸抽出キットを使用することができる。核酸抽出キットとしては、ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ＆  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）、Ｑｕｉｃｋ−ＤＮＡ  ｋｉｔ（Ｚｙｍｏｒｅｓｅａｒｃｈ社）などを使用できる。
【００４３】
抽出する核酸としては、ＤＮＡおよびＲＮＡのいずれであってもよく、核酸解析の目的に応じて適宜選択することができる。
【００４４】
抽出した核酸は、必要に応じて増幅を行ってもよい。核酸の増幅方法は、特に制限されず、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法などの従来公知の方法を用いることができる。
【００４５】
核酸を抽出する試料は、核酸解析の信頼性を向上させるため、所定の割合以上のターゲットを含むことが好ましい。よって、好ましい実施形態では、工程（２）において、所定の割合以上のターゲットを含む試料から核酸を抽出する。試料中のターゲットの割合は、核酸解析の目的に基づいて設定することができ、解析に十分な量の割合であればよい。例えば、ターゲットが腫瘍細胞である場合、試料における腫瘍細胞の含有率が３０％以上であることが好ましい（一般社団法人  日本病理学会  ゲノム診断用病理組織検体取扱い規程  平成３０年３月１日初版を参照）。
【００４６】
核酸を抽出する試料において、試料中のターゲット数が少なく、ターゲット数から予測される核酸量が少ない場合、工程（１）を複数回実行してもよい。ターゲットの存在が確認された複数の試料から充分量の核酸を抽出することで、信頼性が高い核酸の解析情報を得ることができる。
【００４７】
また、試料からターゲットを分取して、分取したターゲットから核酸を抽出してもよい。フローサイトメトリでは、セルソーターを用いることで、ターゲットとそれ以外とを選別することができる（ソーティング）。ソーティングを行うことで、ターゲットを選択的に回収できるため、信頼性が高い核酸の解析情報を得ることができる。よって、好ましい実施形態では、工程（２）において、データを取得した試料からターゲットを分取して、分取したターゲットから核酸を抽出することを有する。
【００４８】
試料から抽出された核酸を用いて、核酸を解析する。解析の領域は、特に制限されず、全ゲノム、遺伝子領域および非遺伝子領域のいずれであってもよい。解析の領域は、好ましくは遺伝子領域である。
【００４９】
核酸を解析する方法は、特に制限されず、従来公知の方法を使用することができる。一実施形態では、核酸の解析を、シークエンサー法、ＤＮＡマイクロアレイ法、デジタルＰＣＲ法およびリアルタイムＰＣＲ法からなる群から選択される方法で行う。
【００５０】
一実施形態では、シークエンサー法は、次世代シークエンサーを用いて行われる。
【００５１】
次世代シークエンサーとは、サンガー法を利用した蛍光キャピラリーシークエンサーである「第１世代シークエンサー」と対比させて用いられている用語であり、ＤＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡリガーゼによる逐次的ＤＮＡ合成法を用いて、数千万から数億のＤＮＡ断片に対して数十〜数千ｂｐのリード長の断片を網羅的に解析することによって超並列的に塩基配列を決定するための装置を意味する。次世代シークエンサーは、第２世代シークエンサー、第３世代シークエンサー、第４世代シークエンサーを含む。次世代シークエンサーでは、ジデオキシヌクレオチドを用いてＤＮＡポリメラーゼの伸長を止めるサンガー法を用いた第１世代シークエンサーと異なるシーケンシング原理が用いられている。このような原理として、合成シーケンシング法、パイロシーケンシング法、リガーゼ反応シーケンシング法などが挙げられる。これまでに、多くの企業や研究機関などから、多様な次世代シークエンサーが提供されており、例えば、ＨｉＳｅｑ２５００（イルミナ株式会社）、ＭｉＳｅｑ（イルミナ株式会社）、５５００ｘｌ  ＳＯＬｉＤ（登録商標）（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）、Ｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｎ（登録商標）（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）、Ｉｏｎ  ＰＧＭ（登録商標）（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）、ＧＳ  ＦＬＸ＋（ロシュ・ダイアグノスティックス社）、ＭｉｎＩＯＮ（Ｏｘｆｏｒｄ  ＮＡＮＯＰＯＲＥ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）などが挙げられる。
【００５２】
次世代シークエンサーによる解析方法としては、付属説明書に従って実施することができる。
【００５３】
例えば、ターゲットが腫瘍細胞であり、遺伝子を解析する場合、次世代シークエンサーで得られた配列のデータは、Ｂｕｒｒｏｗｓ−Ｗｈｅｅｌｅｒ  Ａｌｉｇｎｅｒ（ＢＷＡ）アルゴリズムを使用して、既知のヒトゲノム配列へ配列データをマッピングすることができる。遺伝子を解析する手段としては、ＳＡＭｔｏｏｌｓ、ＢＥＤｔｏｏｌｓなどが挙げられる。これらの解析手段を用いて、遺伝子変異、遺伝子多型、染色体異常などを解析することができる。
【実施例】
【００５４】
以下、実施例を用いて本発明の実施形態をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲が下記の実施例に限定されるわけではない。
【００５５】
フローサイトメーターとしてＦＣＭ−２２００（日本光電工業株式会社製）を使用した。正常ブタ脳組織から３ｍｍ角程度の試料を採取した。採取した試料を用いて、製造会社のプロトコルに従って、フローサイトメトリを行った。なお、ブタ脳組織からの細胞単離および核酸染色は、専用試薬を使用して、ＦＣＭ−２２００により同時かつ自動で行われた。
【００５６】
フローサイトメトリの結果（取得細胞数、スキャッタグラムおよびＤＮＡヒストグラム）を図１に示す。
【００５７】
フローサイトメトリを行った後の試料（細胞浮遊液）を遠心分離（２００ｇ、３分間）して、上清を取り除き、細胞成分を回収した。
【００５８】
回収した細胞成分から、ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ＆  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、製造会社のプロトコルに従って、ＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡの濃度を、ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｏｎｅ（ＮＤ−ＯＮＥ−Ｗ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて測定した。
【００５９】
また、コントロールとして、試料を採取したものと同じ正常ブタ脳組織から、ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ＆  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、製造会社のプロトコルに従って、ＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡの濃度を、ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｏｎｅ（ＮＤ−ＯＮＥ−Ｗ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて測定した。
【００６０】
抽出した各ＤＮＡの最適量をシークエンサー（ＭｉｎＩＯＮ、Ｏｘｆｏｒｄ  ＮＡＮＯＰＯＲＥ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いてシークエンシングを行った。得られた塩基配列をＭｉｎＫＮＯＷ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて解析した。
【００６１】
解析の結果、核酸染色された試料とコントロール（核酸染色なしの試料）とでは、同等の解析精度であり、いずれも解析結果の正確率は、９０％程度であった。以上より、フローサイトメトリを行った核酸染色された試料を用いて核酸の解析が可能であることが分かる。
【図１】
2020195299.tif 000002