(57)【要約】      （修正有）【課題】細胞免疫療法を介して免疫応答を付与かつ／または増強するための、核酸、ベクター、宿主細胞、方法、および組成物の提供。【解決手段】キメラ受容体を発現するように遺伝子改変された、ＣＤ８＋セントラルメモリーＴ細胞を単独またはＣＤ４＋Ｔ細胞と組み合わせて養子移入することによって行う細胞免疫療法。いくつかの実施形態において、前記遺伝子改変宿主細胞は、リガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチド、カスタマイズされたスペーサー領域を含むポリヌクレオチド、膜貫通ドメインを含むポリヌクレオチド、および細胞内シグナル伝達ドメインを含むポリヌクレオチドを含む核酸を含む。いくつかの実施形態においては、前記リガンド結合ドメインはＣＤ１７１に結合する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
キメラ受容体の核酸配列であって、
ａ）ＣＤ１７１と結合かつ／または相互作用するリガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチド；
ｂ）特定の長さを有する最適化されたポリペプチドスペーサーをコードするポリヌクレオチド；
ｃ）膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチド；および
ｄ）細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチド
を含むキメラ受容体の核酸配列。
【請求項２】
前記リガンド結合ドメインが抗体フラグメントである、請求項１に記載のキメラ受容体の核酸配列。
【請求項３】
前記リガンド結合ドメインが一本鎖可変フラグメントである、請求項２に記載のキメラ受容体の核酸配列。
【請求項４】
前記スペーサーが、１５アミノ酸長以下であり、かつ１アミノ酸長以上または２アミノ酸長以上である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のキメラ受容体の核酸配列。
【請求項５】
前記スペーサーが、アミノ酸配列X1PPX2Pを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のキメラ受容体の核酸配列。
【請求項６】
前記スペーサー領域が、ヒト抗体のヒンジ領域の一部を含む、請求項５に記載のキメラ受容体の核酸配列。
【請求項７】
前記細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ−４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、ＬＦＡ−１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３およびこれらの組み合わせからなる群から選択される共刺激ドメインと、ＣＤ３ζ全体またはその一部とを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のキメラ受容体の核酸配列。
【請求項８】
前記細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ζの一部と４−１ＢＢの一部とを含む、請求項７に記載のキメラ受容体の核酸配列。
【請求項９】
マーカー配列をコードする核酸をさらに含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載のキメラ受容体の核酸配列。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のキメラ受容体の核酸配列によってコードされるキメラ受容体ポリペプチド。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の単離されたキメラ受容体の核酸配列を含む発現ベクター。
【請求項１２】
請求項１１に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１３】
ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞およびバルクＣＤ８＋Ｔ細胞からなる群から選択される細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔリンパ球である、請求項１２に記載の宿主細胞。
【請求項１４】
前記細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔリンパ球がセントラルメモリーＴ細胞であり、該セントラルメモリーＴ細胞がＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋およびＣＤ８＋である、請求項１３に記載の宿主細胞。
【請求項１５】
ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞およびバルクＣＤ４＋Ｔ細胞からなる群から選択されるＣＤ４＋Ｔヘルパーリンパ球である、請求項１２に記載の宿主細胞。
【請求項１６】
前記ＣＤ４＋ヘルパーリンパ球がナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞であり、該ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞が、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋およびＣＤ４＋であり、かつＣＤ４５ＲＯ−である、請求項１５に記載の宿主細胞。
【請求項１７】
薬学的に許容される添加剤中に、請求項１２〜１６および３１〜３１のいずれか一項に記載の宿主細胞を含む組成物。
【請求項１８】
請求項１３または１４に記載の宿主細胞と請求項１５または１６に記載の宿主細胞とを含む組成物。
【請求項１９】
請求項１２〜１６、３０および３１のいずれか一項に記載の宿主細胞を製造する方法であって、
ａ）長さの異なるキメラ受容体をコードする複数の核酸を含む、請求項１〜９および１１のいずれか一項に記載のキメラ受容体をコードする核酸のライブラリーを提供すること；ｂ）単離された個別のＴリンパ球集団に前記複数の核酸のそれぞれを導入し、各Ｔリンパ球集団をインビトロで増殖させること；
ｃ）腫瘍を有する動物モデルに各遺伝子改変Ｔリンパ球集団を投与し、各遺伝子改変Ｔリンパ球集団が抗腫瘍応答を有するかどうかを判定すること；ならびに
ｄ）抗腫瘍応答を示すキメラ受容体をコードする核酸を選択すること
を含む方法。
【請求項２０】
前記キメラ受容体をコードする選択された前記核酸を宿主細胞に導入することをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１２〜１６、３０および３１のいずれか一項に記載の宿主細胞を製造する方法であって、
ａ）ＣＤ４５ＲＡ−、ＣＤ４５ＲＯ＋およびＣＤ６２Ｌ＋の表現型を有するリンパ球集団に請求項１〜９のいずれか一項に記載の核酸配列または請求項１１に記載の発現ベクターを導入すること；ならびに
ｂ）抗ＣＤ３および／または抗ＣＤ２８と少なくとも１つの恒常性サイトカインとの存在下において、前記リンパ球を、細胞移入における使用に十分な数に達するまで培養することを含む方法。
【請求項２２】
前記リンパ球が、ＣＤ８＋またはＣＤ４＋である、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
ＣＤ１７１を発現しているがんまたは固形腫瘍の治療または抑制における、請求項１２〜１６、３０および３１のいずれか一項に記載の宿主細胞または請求項１７もしくは１８に記載の組成物の使用。
【請求項２４】
前記がんが神経芽腫である、請求項２３に記載の使用。
【請求項２５】
前記固形腫瘍が、乳がん、脳がん、大腸がん、腎臓がん、膵臓がんおよび卵巣がんからなる群から選択される、請求項２３に記載の使用。
【請求項２６】
がんまたは腫瘍を有する対象において細胞免疫療法を行う方法であって、請求項１７もしくは１８に記載の組成物または請求項１２〜１６に記載の宿主細胞を該対象に投与することを含む方法。
【請求項２７】
前記がんが神経芽腫である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記腫瘍が、乳がん、脳がん、大腸がん、腎臓がん、膵臓がんおよび卵巣がんからなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記リガンドに応答したＴ細胞の増殖および／またはサイトカインの産生が対照のキメラ受容体よりも増強するように前記スペーサーが最適化されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
Ｔ細胞前駆細胞である、請求項１２に記載の宿主細胞。
【請求項３１】
造血幹細胞である、請求項１２に記載の宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、2014年4月10日に出願された米国仮特許出願61/977,751号、2014年4月30日に出願された米国仮特許出願61/986,479号、2014年10月2日に出願された米国仮特許出願62/058,973号、2014年12月5日に出願された米国仮特許出願62/088,363号、2014年12月9日に出願された米国仮特許出願62/089,730号および2014年12月11日に出願された米国仮特許出願62/090,845号に係る優先権を主張するものである。前記出願の開示は、参照によりその全体が明示的に本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表に関する情報
本願は電子形式の配列表とともに出願されたものである。この配列表は、SCRI-065WO_SEQUENCE_LISTING.TXTのファイル名で2014年4月1日に作成された114kbのファイルとして提供されたものである。この電子形式の配列表に記載された情報は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００３】
本出願は生物医学の分野に関し、具体的には、細胞免疫療法における使用のための方法および組成物に関し、がん治療に有用な方法および組成物を含む。より具体的には、本発明の実施形態は、腫瘍標的受容体で改変されたＴ細胞を含む細胞免疫療法を行うための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００４】
合成キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するようにＴ細胞が遺伝子改変されるがん免疫療法へのアプローチは、ヒト早期臨床治験の主題として注目されている。ＣＤ１９特異的またはＣＤ１９標的ＣＡＲ Ｔ細胞を用いた治療は、急性リンパ芽球性白血病や非ホジキンリンパ腫などのＢ細胞系悪性腫瘍患者で劇的な抗腫瘍作用が認められているが、固形腫瘍を有する患者において同様の応答を得るには様々な問題がある。現在、がん患者におけるＣＡＲリダイレクトＴ細胞養子療法の開発および臨床試験は、大部分が経験則に基づいており、腫瘍体積の大きく難治性の腫瘍を有し、既に様々な治療を受けた患者を扱うことがある第Ｉ相臨床治験の実施に大きく影響する様々な技術的パラメータによる制約を受ける。様々な細胞製品に関連する厳密に定義可能なパラメータとしては、Ｔリンパ球サブセットの組成と、Ｔリンパ球の抗腫瘍活性を最大限に引き出す効果を発揮するためのＣＡＲシグナル伝達の調整との２つが挙げられる。いくつかの実施形態において、ＣＡＲ発現セントラルメモリーＴ細胞の治療活性を調査したところ、幹細胞に似た特徴を有するＴ細胞レパートリーが抗原を経験して安定な成分を発現することによって、養子移入後に長期間にわたって生存することの可能な機能的メモリーニッチが再局在することが示された。免疫磁気選択を利用してCD45RO+CD62L+TCM細胞を濃縮することによって抗CD19 CAR発現細胞を作製し、臨床的に評価した。
【０００５】
ＣＤ１９発現Ｂ細胞悪性腫瘍を標的とすることからさらに一歩進んだ当技術分野における課題としては、忍容可能なon-target off-tumor toxicityを有するＣＡＲ Ｔ細胞によって容易に認識される腫瘍細胞表面上標的分子を特定して詳しく調査することが挙げられる。しかしながら、このような表面分子が特定されたとしても、ＣＤ４ Ｔ細胞およびＣＤ８ Ｔ細胞の活性化と適合するように新規ＣＡＲのシグナル伝達作用を調節する過程において満足のいく結果は得られていない。ＣＡＲの開発にとって重要であると一般に考えられているパラメータとしては、標的分子とＣＡＲ抗原結合ドメイン（典型的には抗体であるｓｃＦｖが挙げられるが、これに限定されない）との親和性、および細胞内ドメインのシグナル伝達モジュールが挙げられる。
【０００６】
治療活性において重要な役割を果たす成分を特定してキメラ受容体を設計する方法を見出すこと、特異的抗原を標的とするキメラ受容体を増強または向上すること、ならびにインビボにおける生存および有効性を向上させることの可能な遺伝的改変および養子移入を実施することの可能な細胞集団と特定することが必要とされている。このような要求は、本明細書に記載の実施形態を参照することによって達成することができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）により再標的化されたＴ細胞免疫療法が白血病患者およびリンパ腫患者において治療効果を示していることから、固形腫瘍においても同様な臨床応答を達成することができる方法および組成物が必要とされている。ＣＡＲの開発は、場合によっては、たとえばインビトロでの実験結果などに基づいて、Ｔ細胞の機能を最大限に引き出すことが可能な構築物を選択することに偏ってしまうことがある。ＣＡＲの様々な細胞外スペーサーと細胞質シグナル伝達ドメインバリアントとを組み合わせることによって、ＣＤ８＋ＣＴＬの活性化度を調節し、それによって腫瘍細胞の溶解およびサイトカインの分泌を促すことができる。本明細書に記載の研究では、上述のようなインビトロアッセイにおいて最も高い活性を示したＣＡＲ構築物は、インビボにおいて最も低い抗腫瘍活性を示したが、これに対して、適切なシグナル伝達強度に調節されたＣＡＲは腫瘍の不活性化および／または根絶を媒介した。ＣＡＲを繰り返し誘導したことによって、過度に活性なＣＡＲを発現するＣＴＬが高感受性となり活性化誘導細胞死（ＡＩＣＤ）を起こしたことが認められた。これは、おそらく、ＦａｓＬの発現が増強されたことによると考えられる。ＡＩＣＤを制限することを目的として、たとえば、細胞外スペーサーと細胞質シグナル伝達モジュールの特性を別々に変化させることなどによって、これらの部分を組み合わせることによりＣＡＲを調節すると、固形腫瘍に対する臨床活性の増強または改善を促すことができる。本明細書においては、抗原結合ドメインと膜貫通ドメインとを連結する細胞外スペーサーの様々な特徴（たとえば、スペーサーの長さなど）が、ＣＡＲ媒介性のＴ細胞の機能に及ぼす影響を述べている。いくつかの実施形態においては、ＣＡＲスペーサーは、ＣＡＲ発現細胞（たとえばＴ細胞）と標的細胞（たとえば腫瘍細胞）との間における生物物理学的なシナプス距離を調節し、かつ／または生物物理学的な伝達を増強もしくは改善することを目的として選択され、これによって、たとえば、免疫細胞（たとえばＴ細胞）の活性化に適合し、かつ／または免疫細胞（たとえばＴ細胞）の活性化に最適なシナプス距離を達成することができる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本明細書に記載の実施形態は、ＣＤ１７１（Ｌ１−ＣＡＭ）上の腫瘍選択的エピトープを標的とすることができ、かつ／またはこのエピトープに特異的であるＣＡＲの作用を増強することが可能な細胞外スペーサーの長さと細胞内シグナル伝達成分とを選択することに関し、ＣＤ１７１（Ｌ１−ＣＡＭ）上の腫瘍選択的エピトープは、モノクローナル抗体であるＣＥ７によって認識され、第一世代のＣＡＲとして臨床パイロット試験において評価されているものである。ＣＡＲリダイレクトエフェクター細胞の作用を分析するためのインビトロ機能的アッセイを使用したところ、第二世代および第三世代の細胞内シグナル伝達ドメインを使用した場合のスペーサーの長さに基づいたエフェクター作用の強度に順位があることが分かった。一実施形態においては、機能的に最も強力な構成のＣＡＲ発現細胞の活性化誘導細胞死（ＡＩＣＤ）に起因して、インビボでのＣＡＲ Ｔ細胞の作用とインビトロでのＣＡＲ Ｔ細胞の作用との間に著しい不整合が見られた。これらの実施形態によって、固形腫瘍のためのＣＡＲ Ｔ細胞免疫療法の開発において調査の必要な臨床関連パラメータが明らかとなった。新規ｓｃＦｖと標的分子との組み合わせによって、腫瘍細胞の細胞膜から距離が変わることを考慮に入れると、構築物ごとにＣＡＲのスペーサーを調節することが必要であり、様々な長さのスペーサーバリアントのライブラリーを実際に試験することよってこのような調節を行うことができると考えられる。
【０００９】
一態様において、本発明の開示は、腫瘍に特異的な遺伝子改変免疫細胞集団、たとえば、腫瘍に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットまたはＣＤ４＋Ｔ細胞サブセットを単独または組み合わせて使用した養子移入などによる細胞免疫療法によって媒介される免疫応答を付与かつ／または増強する方法および組成物に関する。また、本発明の開示は、キメラ受容体の核酸配列、該核酸を含むベクターおよび宿主細胞、ならびに該核酸によってコードされるキメラ受容体を提供する。このようなキメラ受容体をコードする前記核酸配列は、通常、様々なモジュール部分と連結されており、該モジュール部分は、切断して他のモジュール部分と置換することによって前記キメラ受容体のカスタマイズを行うことができ、それによって、効率的な細胞の活性化および特異的な標的分子または該分子上のエピトープの認識を標的とし、かつ／またはこれらの細胞活性化または認識に特異的なキメラ受容体を得ることができる。
【００１０】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現細胞を使用した養子免疫療法は、がんの治療、緩和および／または増殖抑制に有用であると考えられる。いくつかの実施形態においては、ＣＤ１７１（Ｌ１ＣＡＭ）抗原のエピトープを標的とするＣＡＲを使用する。このようなＣＡＲ構築物は、ＣＤ１７１発現細胞を有する任意の疾患、障害または悪性腫瘍の治療、緩和または抑制に有用である。いくつかの実施形態においては、前記疾患または障害は、ＣＤ１７１（Ｌ１ＣＡＭ）を発現するがんまたは腫瘍である。いくつかの実施形態においては、ＣＤ１７１を発現する前記がんは神経芽腫（ＮＢ）である。ＣＤ１７１は、高リスク型ＮＢの１００％において発現される。ＣＤ１７１を発現するその他のがんとしては、黒色腫、子宮頸がん、卵巣がん、子宮がん、膵臓がん、大腸がん、腎臓がんおよび神経膠芽腫が挙げられる。
【００１１】
Ｌ１ＣＡＭとしても知られているＣＤ１７１は、２００ｋＤａの膜貫通型糖タンパク質である。ＣＤ１７１は、軸索誘導および細胞遊走に関与する神経細胞接着分子であり、治療抵抗性がんに関与することが強く示唆されている。ＣＤ１７１は認識分子の免疫グロブリンスーパーファミリーに属しており、他の接着分子（たとえば、ラミニン、インテグリン、プロテオグリカン、ＣＤ２４など）とのヘテロフィリック相互作用に関与している。いくつかの実施形態において、ＣＤ１７１は、主に腫瘍細胞表面に見出されるエピトープを含むか、実質的にこのエピトープからなるか、またはこのエピトープからなる。いくつかの実施形態においては、このエピトープは、グルコシル化ＣＤ１７１の細胞外ドメインに見出され、グルコシル化されていないＣＤ１７１には見られない。いくつかの実施形態においては、このエピトープはＣＥ７とも呼ばれ、ＣＥ７と呼ばれる抗体によって認識される。
【００１２】
神経芽腫は、幼少期に生じる頭蓋外固形腫瘍として最も一般的に見られる。神経芽腫は、神経芽細胞（多能性交感神経細胞）から生じる交感神経系の胚性悪性腫瘍である。発達期の胚において、神経芽細胞は陥入し、脳脊髄幹に沿って移動し、交感神経節や副腎髄質などの部位に定着する。神経芽細胞の分布するパターンと、原発性神経芽腫が発症する部位との間には相関性が見られる。年齢、病期、および腫瘍細胞において見られる生物学的特徴は予後因子として重要であり、リスク分類および治療の決定に使用されている。神経芽腫患者における転帰の差異には著しいものがある。低リスク型および中間リスク型の神経芽腫患者は、良好な予後および転帰を示す。これに対して、高リスク型の神経芽腫患者は、あらゆる治療を行っても、その転帰は不良である。残念なことに、生後１８ヶ月以上の患者の約７０％〜８０％において腫瘍の転移が見られ、通常、リンパ節、肝臓、骨および骨髄に転移する。高用量療法を行い、次いで自己骨髄移植や幹細胞移植による治療を行ったとしても、完治するのは高リスク型患者の半数以下である。したがって、本明細書に記載のＣＡＲ形質導入されたリンパ球は、対象における神経芽腫の治療、緩和または抑制に有用である。
【００１３】
いくつかの実施形態においては、ＣＤ１７１に対するＣＡＲは、ＣＡＲまたはＣＡＲ発現細胞のインビボ活性、生存および／または持続性を増強する構成要素を含む。いくつかの実施形態においては、リガンド結合ドメインは、抗体またはその抗原結合フラグメントを含み、該抗体またはその抗原結合フラグメントは、正常細胞よりも腫瘍細胞において見出されることが多いＣＤ１７１上のエピトープなどの、ＣＤ１７１上のエピトープを標的とし、かつ／またはこのエピトープと特異的に結合する。別の実施形態においては、スペーサー領域が含まれ、該スペーサー領域は短い細胞外スペーサーである。いくつかの実施形態においては、細胞内シグナル伝達ドメインは、単一の共刺激ドメインおよび単一の細胞内シグナル伝達を含むが、その他のシグナル伝達ドメインは含んでいない。
【００１４】
いくつかの実施形態は、キメラ受容体の核酸配列であって、
リガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチド、ポリペプチドスペーサーをコードするポリヌクレオチド、膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチド、および細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチドを含み、
該リガンドが、がんまたは腫瘍細胞上で発現されている分子であることを特徴とするキメラ受容体の核酸配列、ならびに／または
該核酸配列によってコードされるキメラ受容体に関する。
いくつかの実施形態において、前記スペーサーは、前記リガンド結合ドメインと前記膜貫通ドメインとをつないでおり、すなわち前記リガンド結合ドメインと前記膜貫通ドメインとを隔てている。いくつかの実施形態においては、前記ポリペプチドスペーサーはヒンジ領域を含み、該ヒンジ領域としては、たとえば抗体分子に由来するヒンジ領域、たとえばアミノ酸配列X1PPX2Pを含むヒンジ領域が挙げられる。このようなヒンジ領域は他のアミノ酸配列に連結されていてもよく、該他のアミノ酸配列としては、１つ以上の抗体定常領域が挙げられ、たとえばＩｇ ＦｃのＣＨ２領域およびＣＨ３の領域が挙げられ、たとえば、Ｉｇ ＦｃのＣＨ３領域のみからなる配列が挙げられるが、これらに限定されない。驚くべきことに、スペーサー領域の長さを個々の標的分子に応じてカスタマイズすることによって、腫瘍または標的細胞の認識を向上することができ、かつ／またはエフェクター機能を向上することができ、かつ／または（特にインビボにおける）前記受容体を発現する細胞の持続を向上することができることが分かった。
【００１５】
いくつかの実施形態において、前記スペーサーの長さは、２２９アミノ酸長、２００アミノ酸長、１５０アミノ酸長、１２０アミノ酸長、１１９アミノ酸長、１００アミノ酸長、５０アミノ酸長、４０アミノ酸長、３０アミノ酸長、２０アミノ酸長、１９アミノ酸長、１８アミノ酸長、１７アミノ酸長、１６アミノ酸長、１５アミノ酸長、１４アミノ酸長、１３アミノ酸長もしくは１２アミノ酸長もしくはこれらのアミノ酸長未満であり（かつ１アミノ酸長以上または２アミノ酸長以上であり）、または前記長さのいずれか２つによって定義される範囲にある長さである。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーの長さは、１５アミノ酸長または１２アミノ酸長である。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、短いスペーサー、中程度の長さ（本明細書において「中間の長さ」とも呼ぶ）のスペーサー、または長いスペーサーである。いくつかの実施形態においては、前記短いスペーサー、中程度の長さのスペーサーまたは長いスペーサーは、表７および表８に示すような短いスペーサー、中程度の長さのスペーサー、長いスペーサーである。
【００１６】
いくつかの実施形態において、前記リンカーの長さは、前記キメラ受容体が結合する抗原のエピトープと、腫瘍細胞などの標的細胞の形質膜表面との距離によって決定されるか、この距離の影響を受ける。
【００１７】
いくつかの実施形態においては、ＣＤ１７１に対するＣＡＲは、１５アミノ酸長以下（かつ１アミノ酸長以上または２アミノ酸長以上）の短いスペーサー領域をコードするポリヌクレオチドを含み、該スペーサーの長さは、たとえば、１５アミノ酸長、１４アミノ酸長、１３アミノ酸長もしくは１２アミノ酸長、または１５アミノ酸長、１４アミノ酸長、１３アミノ酸長、１２アミノ酸長、１１アミノ酸長、１０アミノ酸長、９アミノ酸長、８アミノ酸長、７アミノ酸長、６アミノ酸長、５アミノ酸長、４アミノ酸長、３アミノ酸長もしくは２アミノ酸長、またはこれらの長さのいずれか２つによって定義される範囲にある長さである。いくつかの実施形態において、前記短いスペーサーはアミノ酸配列X1PPX2Pを含むか、実質的にこの配列からなるか、またはこの配列からなる。いくつかの実施形態においては、ＣＥ７によって認識されるＣＤ１７１のエピトープに対するＣＡＲ、または形質膜表面からの距離がこのエピトープと同等なＣＤ１７１のエピトープに対するＣＡＲは、１００アミノ酸長未満、５０アミノ酸長未満、４０アミノ酸長未満、２０アミノ酸長未満、１５アミノ酸長未満または１２アミノ酸長未満のスペーサー領域を含み、該スペーサー領域は、たとえば、１５アミノ酸長以下（かつ１アミノ酸長以上または２アミノ酸長以上）の短いスペーサー領域であり、該スペーサー領域は、たとえば、１５アミノ酸長、１４アミノ酸長、１３アミノ酸長もしくは１２アミノ酸長であり、または１１アミノ酸長、１０アミノ酸長、９アミノ酸長、８アミノ酸長、７アミノ酸長、６アミノ酸長、５アミノ酸長、４アミノ酸長、３アミノ酸長もしくは２アミノ酸長であり、またはこれらの長さのいずれか２つによって定義される範囲にある長さである。
【００１８】
本発明の開示の別の態様は、単離されたキメラ受容体の核酸配列であって、リガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチド、ポリペプチドスペーサーをコードするポリヌクレオチド、膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチド、および１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチドを含み、前記リガンドが、腫瘍持異抗原、またはリンパ球による認識、不活性化および／もしくは排除を媒介するのに適切な標的細胞集団に発現しているその他の分子であること、前記ポリペプチドスペーサーがカスタマイズされた長さをする最適化されたスペーサーであることを特徴とするキメラ受容体の核酸配列を提供する。また、本発明の開示は、本明細書に記載の単離されたキメラ受容体を含む発現ベクターおよび宿主細胞を包含する。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、前記リガンドに応答したＴ細胞の増殖および／またはサイトカインの産生が対照のキメラ受容体よりも増強するように最適化されている。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞はＴ細胞前駆細胞である。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は造血幹細胞である。
【００１９】
本発明の開示の別の態様は、キメラ受容体ポリペプチドであって、リガンド結合ドメイン、ポリペプチドスペーサー、膜貫通ドメイン、および１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインを含み、前記リガンドが、腫瘍持異抗原、または標的細胞集団上で発現されており、標的化することによってリンパ球による認識および排除を媒介することが可能なその他の分子であること、前記ポリペプチドスペーサーが、１５アミノ酸長以下（かつ１アミノ酸長以上または２アミノ酸長以上）であり、たとえば、１５アミノ酸長、１４アミノ酸長、１３アミノ酸長、１２アミノ酸長、１１アミノ酸長、１０アミノ酸長、９アミノ酸長、８アミノ酸長、７アミノ酸長、６アミノ酸長、５アミノ酸長、４アミノ酸長、３アミノ酸長もしくは２アミノ酸長、またはこれらの長さのいずれか２つによって定義される範囲にある長さを有することを特徴とするキメラ受容体ポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態において、前記ポリペプチドスペーサーは、アミノ酸配列X1PPX2Pを含むヒンジ領域を含む。
【００２０】
別の態様では、本発明の開示は、腫瘍特異的かつサブセット特異的な遺伝子改変ＣＤ４＋発現Ｔ細胞の養子移入などによる細胞免疫療法によって媒介される免疫応答を付与かつ／または増強する組成物であって、前記ＣＤ４＋発現Ｔ細胞が、ＣＤ８＋発現Ｔ細胞に能力を付与し、かつ／またはＣＤ８＋発現Ｔ細胞の能力を増強することによって、抗腫瘍反応を維持し、腫瘍特異的な増殖を増加させかつ／または最大限にすることを特徴とする組成物を提供する。いくつかの実施形態においては、本明細書に記載されているように、前記ＣＤ４＋発現Ｔ細胞は、キメラ受容体の核酸配列および／またはキメラ受容体ポリペプチドを発現するように遺伝子改変されている。
【００２１】
別の一態様では、本発明の開示は、腫瘍特異的かつサブセット特異的な遺伝子改変ＣＤ８＋発現Ｔ細胞の養子移入などによる細胞免疫療法によって媒介される免疫応答を付与かつ／または増強する組成物を提供する。いくつかの実施形態においては、本明細書に記載されているように、前記ＣＤ８＋発現Ｔ細胞は、キメラ受容体の核酸配列および／またはキメラ受容体ポリペプチドを発現する。
【００２２】
別の一実施形態において、本発明の態様は、養子細胞免疫療法のための組成物であって、
免疫応答を付与かつ／または増強するための遺伝子改変ＣＤ８＋発現細胞傷害性Ｔリンパ球製剤、および／または遺伝子改変ヘルパーＴリンパ球製剤を含み、
前記細胞傷害性Ｔリンパ球製剤がＣＤ８＋発現Ｔ細胞を含み、該ＣＤ８＋発現Ｔ細胞が、前記疾患または障害に関連するリガンドに結合するリガンド結合ドメイン、カスタマイズされたスペーサー領域、膜貫通ドメイン、およびＴ細胞受容体またはその他の受容体の細胞内シグナル伝達ドメイン（たとえば共刺激ドメインなど）を含むキメラ受容体を発現すること、
前記ヘルパーＴリンパ球製剤がＣＤ４＋発現Ｔ細胞を含み、該ＣＤ４＋発現Ｔ細胞が、前記疾患または障害に関連する前記リガンドを標的としかつ／または該リガンドに特異的な抗体可変ドメイン、カスタマイズされたスペーサー領域、膜貫通ドメイン、および１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ受容体を発現することを特徴とする組成物を提供する。
【００２３】
いくつかの実施形態においては、本発明の開示は、患者において（ＮＢなどの）がんを治療、改善もしくは抑制する方法、患者において（ＮＢなどの）がんの進行および／もしくは転移を抑制するもしくは遅延させる方法、患者の体内に存在する（ＮＢなどの）腫瘍細胞もしくはがん細胞を抑制もしくは低減する方法、ならびに／またはＣＤ１７１発現細胞を含む標的集団の抑制もしくは低減を必要とする患者において、該標的集団を抑制または低減する方法を提供する。これらの方法は、細胞性免疫応答を提供する遺伝子改変細胞傷害性Ｔリンパ球製剤を前記対象または前記患者に投与することを含み、該細胞傷害性Ｔリンパ球製剤はキメラ受容体を有するＣＤ８＋発現Ｔ細胞を含み、該キメラ受容体が、リガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチド、ポリペプチドスペーサーをコードするポリヌクレオチド、膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチドおよび１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチドによってコードされること、前記リガンドが、腫瘍持異抗原、またはリンパ球による認識および／もしくは排除を媒介するのに適切な標的細胞集団に発現しているその他の分子（たとえばＣＤ１７１）であること、前記ポリペプチドスペーサーがカスタマイズされた長さを有すること、前記スペーサーによって、Ｔ細胞の増殖、インビボでの細胞活動および／または（たとえばインビボでの）サイトカイン産生が対照キメラ受容体よりも増強されることを特徴とする。
【００２４】
いくつかの実施形態において、前記リガンド結合ドメインは、前記疾患または障害に関連するリガンドを標的とすることができ、かつ／または該リガンドに特異的な細胞外抗体可変ドメインである。
一実施形態は、遺伝子改変ヘルパーＴリンパ球製剤を含み、
該ヘルパーＴリンパ球製剤がキメラ受容体を有するＣＤ４＋発現Ｔ細胞を含み、該キメラ受容体が、リガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチド、ポリペプチドスペーサーをコードするポリヌクレオチド、膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチドおよび１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチドを含むこと、
前記リガンドが、腫瘍持異抗原、腫瘍標的抗原、またはリンパ球による認識および／もしくは排除を媒介するのに適切な標的細胞集団に発現しているその他の分子であること、
前記ポリペプチドスペーサーがカスタマイズされた長さを有すること、
前記スペーサーによって、Ｔ細胞の増殖、インビボでの細胞活動および／またはサイトカイン産生が対照キメラ受容体よりも増強されることを特徴とする。
いくつかの実施形態においては、リガンド結合ドメインは、抗体またはその抗原結合フラグメントを含み、該抗体またはその抗原結合フラグメントは、正常細胞よりも腫瘍細胞において見出されることが多いＣＤ１７１のエピトープを標的とし、かつ／またはこのエピトープに特異的に結合することができる。別の実施形態においては、スペーサー領域は短い細胞外スペーサーを含む。いくつかの実施形態においては、シグナル伝達ドメインは、単一のシグナル伝達ドメインを含んでおり、その他のシグナル伝達ドメインは含んでいない。
【００２５】
いくつかの実施形態においては、前記遺伝子改変ＣＤ８＋発現細胞集団および前記遺伝子改変ＣＤ４＋発現細胞集団を共投与する。いくつかの実施形態においては、前記Ｔ細胞は自己由来Ｔ細胞または同種異系Ｔ細胞である。本明細書に記載の方法の様々な変法も可能である。たとえば、前記ＣＤ４＋発現Ｔ細胞および前記ＣＤ８＋発現Ｔ細胞によって発現されるキメラ受容体は、同じものであっても異なるものであってもよい。
【００２６】
別の一実施形態は、養子免疫療法組成物の製造方法であって、
細胞性免疫応答を誘導し、かつ抗原反応性のキメラ受容体を発現する、該キメラ受容体により改変された腫瘍特異的または腫瘍標的なＣＤ８＋発現細胞傷害性Ｔリンパ球製剤を得ること、および／または
改変ナイーブヘルパーＴ細胞または改変メモリーＣＤ４＋発現ヘルパーＴ細胞を得ることを含み、
前記遺伝子組換え細胞傷害性Ｔリンパ球製剤が、リガンド結合ドメイン、カスタマイズされた長さを有するポリペプチドスペーサー、膜貫通ドメインおよび１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ受容体を有するＣＤ８＋発現Ｔ細胞を含むこと、
前記リガンドが、腫瘍持異抗原、腫瘍標的抗原、またはリンパ球による認識および排除を媒介するのに適切な標的細胞集団に発現しているその他の分子であること、
前記スペーサーによって、Ｔ細胞の増殖、インビボでの細胞活動および／またはサイトカイン産生が対照キメラ受容体よりも増強されること、
前記遺伝子組換えヘルパーＴリンパ球製剤が、リガンド結合ドメイン、カスタマイズされた長さをする最適化されたポリペプチドスペーサー、膜貫通ドメイン、および１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ受容体を有するＣＤ４＋発現細胞を含むこと、ならびに
前記リガンドが、腫瘍持異抗原、腫瘍標的抗原、またはリンパ球による認識および排除を媒介するのに適切な標的細胞集団に発現しているその他の分子であることを特徴とする方法に関する。
いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、前記リガンドに応答したＴ細胞の増殖および／またはサイトカインの産生が対照のキメラ受容体よりも増強するように最適化されている。いくつかの実施形態においては、リガンド結合ドメインは、抗体またはその抗原結合フラグメントを含み、該抗体またはその抗原結合フラグメントは、正常細胞よりも腫瘍細胞において見出されることが多いＣＤ１７１のエピトープを標的とし、かつ／またはこのエピトープと特異的に結合する。別の実施形態においては、スペーサー領域は短い細胞外スペーサーを含み、該スペーサー領域は、たとえば、１５アミノ酸長以下（かつ１アミノ酸長以上または２アミノ酸長以上）であり、たとえば、１５アミノ酸長、１４アミノ酸長、１３アミノ酸長もしくは１２アミノ酸長であり、または１１アミノ酸長、１０アミノ酸長、９アミノ酸長、８アミノ酸長、７アミノ酸長、６アミノ酸長、５アミノ酸長、４アミノ酸長、３アミノ酸長もしくは２アミノ酸長であり、またはこれらの長さのいずれか２つによって定義される範囲にある長さを有する。いくつかの実施形態においては、シグナル伝達ドメインは、単一のシグナル伝達ドメインを含んでおり、その他のシグナル伝達ドメインは含んでいない。
【００２７】
さらに、いくつかの実施形態は、キメラ受容体をコードする核酸に関する。
いくつかの実施形態では、前記核酸は、
ａ）ＣＤ１７１を標的としかつ／またはＣＤ１７１に結合するリガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチド、
ｂ）前記リガンド結合ドメインと膜貫通ドメインとをつなぐポリペプチドスペーサーをコードするポリヌクレオチド、
ｃ）膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチド、および
ｄ）細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチド
を含み、
免疫細胞集団において前記キメラ受容体を発現させることによって、該免疫細胞の経時生存率および／または経時持続性が向上すること、ならびに
ＣＤ１７１を発現する腫瘍を有する対象に投与すると、ＣＤ１７１と接触し、かつ／または、前記ポリペプチドスペーサーよりも長いポリペプチドスペーサーを有する対照キメラ受容体を発現させた場合よりも増強された治療効果が発揮されることを特徴とする。
いくつかの実施形態においては、前記経時生存率の上昇および／または前記経時持続性の向上が、前記キメラ受容体を発現する細胞をＣＤ１７１発現細胞に複数回、連続して暴露させることを含むインビトロでのストレステストアッセイで測定される抗原誘導細胞死が相対的に低下することを含み、かつ／または前記経時生存率の上昇および／または前記経時持続性の向上が、ＣＤ１７１を発現する腫瘍を有する対象に投与した後にインビボにおける細胞の持続性が向上することを含み、かつ／または前記長いポリペプチドスペーサーが、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍または１０倍の長さを有する。いくつかの実施形態においては、前記リガンド結合ドメインは抗体フラグメントである。いくつかの実施形態においては、前記リガンド結合ドメインは一本鎖可変フラグメントである。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、１５アミノ酸長以下（かつ１アミノ酸長以上または２アミノ酸長以上）である。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、２００アミノ酸長、１５０アミノ酸長、１００アミノ酸長、５０アミノ酸長もしくは２０アミノ酸長もしくはこれらのアミノ酸長以下（かつ１アミノ酸長以上または２アミノ酸長以上）またはこれらの長さのいずれか２つによって定義される範囲にある長さである。
【００２８】
いくつかの実施形態は、キメラ受容体の核酸配列であって、
ａ）ＣＤ１７１を特異的標的としかつ／またはＣＤ１７１に特異的に結合するリガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチド、
ｂ）１００アミノ酸長未満（かつ１アミノ酸長以上または２アミノ酸長以上）の長さを有し、前記リガンド結合ドメインと前記キメラ受容体の膜貫通ドメインをつなぐポリペプチドスペーサーをコードするポリヌクレオチド、ならびに
ｃ）前記キメラ受容体の膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチド、および前記キメラ受容体の細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチド
を含むキメラ受容体の核酸配列に関する。
いくつかの実施形態においては、前記スペーサーはアミノ酸配列X1PPX2Pを含み、ここで、X1およびX2はそれぞれ独立して任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態においては、X1および／またはX2はシステインである。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、１５アミノ酸長未満（かつ１アミノ酸長以上または２アミノ酸長以上）である。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、１２アミノ酸長、１３アミノ酸長、１４アミノ酸長もしくは１５アミノ酸長、またはこれらの長さのいずれか２つによって定義される範囲にある長さである。いくつかの実施形態においては、前記スペーサー領域は、ヒト抗体のヒンジ領域の一部を含む。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、EPKSCDKTHTCPPCP（配列番号１７）、ERKCCVECPPCP（配列番号１８）、ELKTPLGDTHTCPRCP(EPKSCDTPPPCPRCP)3（配列番号１９）、ESKYGPPCPSCP（配列番号２０）、ESKYGPPCPPCP（配列番号２１）、YGPPCPPCP（配列番号５１）、KYGPPCPPCP（配列番号５２）、またはEVVKYGPPCPPCP（配列番号５３）を含むか、実質的にこれらの配列のいずれかからなるか、これらの配列のいずれかからなる。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、ESKYGPPCPSCP（配列番号２０）、ESKYGPPCPPCP（配列番号２１）、YGPPCPPCP（配列番号５１）、KYGPPCPPCP（配列番号５２）、またはEVVKYGPPCPPCP（配列番号５３）からなるか、実質的にこれらの配列のいずれかからなる。いくつかの実施形態においては、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ−４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、ＬＦＡ−１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３およびこれらの組み合わせからなる群から選択される共刺激ドメインと、ＣＤ３ζ全体またはその一部とを含む。いくつかの実施形態においては、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζの一部と４−１ＢＢの一部とを含む。いくつかの実施形態においては、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、別の共刺激分子の細胞内領域を含んでおらず、かつ／または、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＯＸ−４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、ＬＦＡ−１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＮＫＧ２ＣおよびＢ７−Ｈ３からなる群から選択される分子の細胞内シグナル伝達領域を含んでおらず、かつ／またはＣＤ２８の細胞内シグナル伝達領域を含んでいない。いくつかの実施形態においては、前記キメラ受容体の核酸配列は、マーカー配列をコードする核酸をさらに含む。
【００２９】
いくつかの実施形態においては、キメラ受容体の核酸配列であって、
ａ）ＣＤ１７１を標的とし、かつ／またＣＤ１７１と結合するリガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチド；
ｂ）特定の長さを有する最適化されたポリペプチドスペーサーをコードするポリヌクレオチド；
ｃ）膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチド；および
ｄ）細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチド
を含むキメラ受容体の核酸配列が提供される。
いくつかの実施形態においては、前記リガンド結合ドメインは抗体フラグメントである。いくつかの実施形態においては、前記リガンド結合ドメインは一本鎖可変フラグメントである。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、１５アミノ酸長以下（かつ１アミノ酸長以上または２アミノ酸長以上）である。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、アミノ酸配列X1PPX2Pを含む。いくつかの実施形態においては、前記スペーサー領域は、ヒト抗体のヒンジ領域の一部を含む。いくつかの実施形態においては、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ−４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、ＬＦＡ−１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３およびこれらの組み合わせからなる群から選択される共刺激ドメインと、ＣＤ３ζ全体またはその一部とを含む。いくつかの実施形態においては、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζの一部と４−１ＢＢの一部とを含む。いくつかの実施形態においては、前記キメラ受容体の核酸配列は、マーカー配列をコードする核酸をさらに含む。
【００３０】
いくつかの実施形態においては、キメラ受容体の核酸配列によってコードされるキメラ受容体ポリペプチドが提供される。
いくつかの実施形態においては、前記キメラ受容体の核酸配列は、
ａ）ＣＤ１７１を標的とし、かつ／またＣＤ１７１と結合するリガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチド；
ｂ）特定の長さを有する最適化されたポリペプチドスペーサーをコードするポリヌクレオチド；
ｃ）膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチド；および
ｄ）細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチド
を含む。
いくつかの実施形態においては、前記リガンド結合ドメインは抗体フラグメントである。いくつかの実施形態においては、前記リガンド結合ドメインは一本鎖可変フラグメントである。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、１５アミノ酸長以下（かつ１アミノ酸長以上または２アミノ酸長以上）である。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、アミノ酸配列X1PPX2Pを含む。いくつかの実施形態においては、前記スペーサー領域は、ヒト抗体のヒンジ領域の一部を含む。いくつかの実施形態においては、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ−４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、ＬＦＡ−１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３およびこれらの組み合わせからなる群から選択される共刺激ドメインと、ＣＤ３ζ全体またはその一部とを含む。いくつかの実施形態においては、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζの一部と４−１ＢＢの一部とを含む。いくつかの実施形態においては、前記キメラ受容体の核酸配列は、マーカー配列をコードする核酸をさらに含む。
【００３１】
いくつかの実施形態においては、単離されたキメラ受容体核酸配列を含む発現ベクターが提供される。
いくつかの実施形態においては、前記キメラ受容体の核酸配列は、
ａ）ＣＤ１７１を標的とし、かつ／またＣＤ１７１と結合するリガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチド；
ｂ）特定の長さを有する最適化されたポリペプチドスペーサーをコードするポリヌクレオチド；
ｃ）膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチド；および
ｄ）細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチド
を含む。
いくつかの実施形態においては、前記リガンド結合ドメインは抗体フラグメントである。いくつかの実施形態においては、前記リガンド結合ドメインは一本鎖可変フラグメントである。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、１５アミノ酸長以下（かつ１アミノ酸長以上または２アミノ酸長以上）である。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、アミノ酸配列X1PPX2Pを含む。いくつかの実施形態においては、前記スペーサー領域は、ヒト抗体のヒンジ領域の一部を含む。いくつかの実施形態においては、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ−４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、ＬＦＡ−１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３およびこれらの組み合わせからなる群から選択される共刺激ドメインと、ＣＤ３ζ全体またはその一部とを含む。いくつかの実施形態においては、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζの一部と４−１ＢＢの一部とを含む。いくつかの実施形態においては、前記キメラ受容体の核酸配列は、マーカー配列をコードする核酸をさらに含む。
【００３２】
いくつかの実施形態においては、発現ベクターを含む宿主細胞が提供される。いくつかの実施形態においては、前記発現ベクターは、単離されたキメラ受容体核酸配列を含む。
いくつかの実施形態においては、前記キメラ受容体の核酸配列は、
ａ）ＣＤ１７１を標的とし、かつ／またＣＤ１７１と結合するリガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチド；
ｂ）特定の長さを有する最適化されたポリペプチドスペーサーをコードするポリヌクレオチド；
ｃ）膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチド；および
ｄ）細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチド
を含む。
いくつかの実施形態においては、前記リガンド結合ドメインは抗体フラグメントである。いくつかの実施形態においては、前記リガンド結合ドメインは一本鎖可変フラグメントである。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、１５アミノ酸長以下（かつ１アミノ酸長以上または２アミノ酸長以上）である。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、アミノ酸配列X1PPX2Pを含む。いくつかの実施形態においては、前記スペーサー領域は、ヒト抗体のヒンジ領域の一部を含む。いくつかの実施形態においては、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ−４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、ＬＦＡ−１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３およびこれらの組み合わせからなる群から選択される共刺激ドメインと、ＣＤ３ζ全体またはその一部とを含む。いくつかの実施形態においては、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζの一部と４−１ＢＢの一部とを含む。いくつかの実施形態においては、前記キメラ受容体の核酸配列は、マーカー配列をコードする核酸をさらに含む。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞およびバルクＣＤ８＋Ｔ細胞からなる群から選択される細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔリンパ球である。いくつかの実施形態においては、前記ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球は、セントラルメモリーＴ細胞であり、該セントラルメモリーＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋およびＣＤ８＋である。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞およびバルクＣＤ４＋Ｔ細胞からなる群から選択されるＣＤ４＋Ｔヘルパーリンパ球である。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞およびバルクＣＤ４＋Ｔ細胞からなる群から選択されるＣＤ４＋Ｔヘルパーリンパ球である。いくつかの実施形態においては、前記ＣＤ４＋ヘルパーリンパ球は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞であり、該ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋およびＣＤ４＋であり、かつＣＤ４５ＲＯ−である。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞はＴ細胞前駆細胞である。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は造血幹細胞である。
【００３３】
いくつかの実施形態においては、薬学的に許容される添加剤中に宿主細胞を含む組成物が提供される。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は発現ベクターを含む。いくつかの実施形態においては、前記発現ベクターは単離されたキメラ受容体核酸配列を含む。
いくつかの実施形態においては、前記キメラ受容体の核酸配列は、
ａ）ＣＤ１７１を標的とし、かつ／またＣＤ１７１と結合するリガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチド；
ｂ）特定の長さを有する最適化されたポリペプチドスペーサーをコードするポリヌクレオチド；
ｃ）膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチド；および
ｄ）細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチド
を含む。
いくつかの実施形態においては、前記リガンド結合ドメインは抗体フラグメントである。いくつかの実施形態においては、前記リガンド結合ドメインは一本鎖可変フラグメントである。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、１５アミノ酸長以下（かつ１アミノ酸長以上または２アミノ酸長以上）である。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、アミノ酸配列X1PPX2Pを含む。いくつかの実施形態においては、前記スペーサー領域は、ヒト抗体のヒンジ領域の一部を含む。いくつかの実施形態においては、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ−４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、ＬＦＡ−１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３およびこれらの組み合わせからなる群から選択される共刺激ドメインと、ＣＤ３ζ全体またはその一部とを含む。いくつかの実施形態においては、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζの一部と４−１ＢＢの一部とを含む。いくつかの実施形態においては、前記キメラ受容体の核酸配列は、マーカー配列をコードする核酸をさらに含む。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞およびバルクＣＤ８＋Ｔ細胞からなる群から選択される細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔリンパ球である。いくつかの実施形態においては、前記ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球は、セントラルメモリーＴ細胞であり、該セントラルメモリーＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋およびＣＤ８＋である。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞およびバルクＣＤ４＋Ｔ細胞からなる群から選択されるＣＤ４＋Ｔヘルパーリンパ球である。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞およびバルクＣＤ４＋Ｔ細胞からなる群から選択されるＣＤ４＋Ｔヘルパーリンパ球である。いくつかの実施形態においては、前記ＣＤ４＋ヘルパーリンパ球は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞であり、該ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋およびＣＤ４＋であり、かつＣＤ４５ＲＯ−である。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞はＴ細胞前駆細胞である。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は造血幹細胞である。いくつかの実施形態においては、前記組成物は、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞およびバルクＣＤ８＋Ｔ細胞からなる群から選択されるＣＤ８＋Ｔ細胞傷害性リンパ球、またはＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋およびＣＤ８＋のセントラルメモリーＴ細胞を含み、前記組成物は別の宿主細胞をさらに含み、該宿主細胞は、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋およびＣＤ８＋のセントラルメモリーＴ細胞であるか、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞およびバルクＣＤ４＋Ｔ細胞からなる群から選択されるＣＤ４＋Ｔヘルパーリンパ球であるか、あ���いはＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４＋、およびＣＤ４５ＲＯ−のナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞である。
【００３４】
いくつかの実施形態においては、宿主細胞の製造方法であって、
ａ）長さの異なるキメラ受容体をコードする複数の核酸を含む、キメラ受容体をコードする核酸のライブラリーを提供すること；
ｂ）単離された個別のＴリンパ球集団に前記複数の核酸のそれぞれを導入し、各Ｔリンパ球集団をインビトロで増殖させること；
ｃ）腫瘍を有する動物モデルに各遺伝子改変Ｔリンパ球集団を投与し、各遺伝子改変Ｔリンパ球集団が抗腫瘍効果を有するかどうかを判定すること；ならびに
ｄ）抗腫瘍効果を示すキメラ受容体をコードする核酸を選択すること
を含む方法が提供される。
いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は発現ベクターを含む。いくつかの実施形態においては、前記発現ベクターは単離されたキメラ受容体核酸配列を含む。
いくつかの実施形態においては、前記キメラ受容体の核酸配列は、
ａ）ＣＤ１７１を標的とし、かつ／またＣＤ１７１と結合するリガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチド；
ｂ）特定の長さを有する最適化されたポリペプチドスペーサーをコードするポリヌクレオチド；
ｃ）膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチド；および
ｄ）細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチド
を含む。
いくつかの実施形態においては、前記リガンド結合ドメインは抗体フラグメントである。いくつかの実施形態においては、前記リガンド結合ドメインは一本鎖可変フラグメントである。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、１５アミノ酸長以下（かつ１アミノ酸長以上または２アミノ酸長以上）である。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、アミノ酸配列X1PPX2Pを含む。いくつかの実施形態においては、前記スペーサー領域は、ヒト抗体のヒンジ領域の一部を含む。いくつかの実施形態においては、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ−４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、ＬＦＡ−１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３およびこれらの組み合わせからなる群から選択される共刺激ドメインと、ＣＤ３ζ全体またはその一部とを含む。いくつかの実施形態においては、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζの一部と４−１ＢＢの一部とを含む。いくつかの実施形態においては、前記キメラ受容体の核酸配列は、マーカー配列をコードする核酸をさらに含む。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞およびバルクＣＤ８＋Ｔ細胞からなる群から選択される細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔリンパ球である。いくつかの実施形態においては、前記ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球は、セントラルメモリーＴ細胞であり、該セントラルメモリーＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋およびＣＤ８＋である。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞およびバルクＣＤ４＋Ｔ細胞からなる群から選択されるＣＤ４＋Ｔヘルパーリンパ球である。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞およびバルクＣＤ４＋Ｔ細胞からなる群から選択されるＣＤ４＋Ｔヘルパーリンパ球である。いくつかの実施形態においては、前記ＣＤ４＋ヘルパーリンパ球は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞であり、該ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋およびＣＤ４＋であり、かつＣＤ４５ＲＯ−である。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞はＴ細胞前駆細胞である。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は造血幹細胞である。
いくつかの実施形態においては、前記キメラ受容体の核酸配列は、
ａ）ＣＤ１７１を標的とし、かつ／またＣＤ１７１と結合するリガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチド；
ｂ）特定の長さを有する最適化されたポリペプチドスペーサーをコードするポリヌクレオチド；
ｃ）膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチド；および
ｄ）細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチド
を含む。
いくつかの実施形態においては、前記リガンド結合ドメインは抗体フラグメントである。いくつかの実施形態においては、前記リガンド結合ドメインは一本鎖可変フラグメントである。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、１５アミノ酸長以下（かつ１アミノ酸長以上または２アミノ酸長以上）である。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、アミノ酸配列X1PPX2Pを含む。いくつかの実施形態においては、前記スペーサー領域は、ヒト抗体のヒンジ領域の一部を含む。いくつかの実施形態においては、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ−４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、ＬＦＡ−１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３およびこれらの組み合わせからなる群から選択される共刺激ドメインと、ＣＤ３ζ全体またはその一部とを含む。いくつかの実施形態においては、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζの一部と４−１ＢＢの一部とを含む。いくつかの実施形態においては、前記キメラ受容体の核酸配列は、マーカー配列をコードする核酸をさらに含む。いくつかの実施形態においては、前記方法は、前記キメラ受容体をコードする選択された前記核酸を宿主細胞に導入することをさらに含む。
【００３５】
いくつかの実施形態においては、請求項のいずれか一項に記載の宿主細胞を製造する方法であって、
ａ）ＣＤ４５ＲＡ−、ＣＤ４５ＲＯ＋およびＣＤ６２Ｌ＋の表現型を有するリンパ球集団に核酸または発現ベクターを導入すること；ならびに
ｂ）抗ＣＤ３および／または抗ＣＤ２８と少なくとも１つの恒常性サイトカインとの存在下において、前記リンパ球を、細胞移入における使用に十分な数に達するまで培養すること
を含む方法が提供される。
いくつかの実施形態においては、前記発現ベクターは、単離されたキメラ受容体核酸配列を含む。
いくつかの実施形態においては、前記キメラ受容体の核酸配列は、
ａ）ＣＤ１７１を標的とし、かつ／またＣＤ１７１と結合するリガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチド；
ｂ）特定の長さを有する最適化されたポリペプチドスペーサーをコードするポリヌクレオチド；
ｃ）膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチド；および
ｄ）細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチド
を含む。
いくつかの実施形態においては、前記リガンド結合ドメインは抗体フラグメントである。いくつかの実施形態においては、前記リガンド結合ドメインは一本鎖可変フラグメントである。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、１５アミノ酸長以下（かつ１アミノ酸長以上または２アミノ酸長以上）である。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、アミノ酸配列X1PPX2Pを含む。いくつかの実施形態においては、前記スペーサー領域は、ヒト抗体のヒンジ領域の一部を含む。いくつかの実施形態においては、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ−４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、ＬＦＡ−１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３およびこれらの組み合わせからなる群から選択される共刺激ドメインと、ＣＤ３ζ全体またはその一部とを含む。いくつかの実施形態においては、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζの一部と４−１ＢＢの一部とを含む。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞およびバルクＣＤ８＋Ｔ細胞からなる群から選択される細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔリンパ球である。いくつかの実施形態においては、前記ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球は、セントラルメモリーＴ細胞であり、該セントラルメモリーＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋およびＣＤ８＋である。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞およびバルクＣＤ４＋Ｔ細胞からなる群から選択されるＣＤ４＋Ｔヘルパーリンパ球である。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞およびバルクＣＤ４＋Ｔ細胞からなる群から選択されるＣＤ４＋Ｔヘルパーリンパ球である。いくつかの実施形態においては、前記ＣＤ４＋ヘルパーリンパ球は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞であり、該ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋およびＣＤ４＋であり、かつＣＤ４５ＲＯ−である。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞はＴ細胞前駆細胞である。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は造血幹細胞である。いくつかの実施形態においては、前記キメラ受容体の核酸配列は、マーカー配列をコードする核酸をさらに含む。いくつかの実施形態においては、前記リンパ球はＣＤ８＋またはＣＤ４＋である。
【００３６】
いくつかの実施形態においては、ＣＤ１７１を発現するがんまたは固形腫瘍を治療するための、請求項に記載の宿主細胞または組成物の使用が提供される。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は発現ベクターを含む。いくつかの実施形態においては、前記発現ベクターは、単離されたキメラ受容体核酸配列を含む。
いくつかの実施形態においては、前記キメラ受容体の核酸配列は、
ａ）ＣＤ１７１を標的とし、かつ／またＣＤ１７１と結合するリガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチド；
ｂ）特定の長さを有する最適化されたポリペプチドスペーサーをコードするポリヌクレオチド；
ｃ）膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチド；および
ｄ）細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチド
を含む。
いくつかの実施形態においては、前記リガンド結合ドメインは抗体フラグメントである。いくつかの実施形態においては、前記リガンド結合ドメインは一本鎖可変フラグメントである。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、１５アミノ酸長以下（かつ１アミノ酸長以上または２アミノ酸長以上）である。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、アミノ酸配列X1PPX2Pを含む。いくつかの実施形態においては、前記スペーサー領域は、ヒト抗体のヒンジ領域の一部を含む。いくつかの実施形態においては、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ−４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、ＬＦＡ−１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３およびこれらの組み合わせからなる群から選択される共刺激ドメインと、ＣＤ３ζ全体またはその一部とを含む。いくつかの実施形態においては、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζの一部と４−１ＢＢの一部とを含む。いくつかの実施形態においては、前記キメラ受容体の核酸配列は、マーカー配列をコードする核酸をさらに含む。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞およびバルクＣＤ８＋Ｔ細胞からなる群から選択される細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔリンパ球である。いくつかの実施形態においては、前記ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球は、セントラルメモリーＴ細胞であり、該セントラルメモリーＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋およびＣＤ８＋である。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞およびバルクＣＤ４＋Ｔ細胞からなる群から選択されるＣＤ４＋Ｔヘルパーリンパ球である。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞およびバルクＣＤ４＋Ｔ細胞からなる群から選択されるＣＤ４＋Ｔヘルパーリンパ球である。いくつかの実施形態においては、前記ＣＤ４＋ヘルパーリンパ球は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞であり、該ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋およびＣＤ４＋であり、かつＣＤ４５ＲＯ−である。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞はＴ細胞前駆細胞である。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は造血幹細胞である。いくつかの実施形態においては、薬学的に許容される添加剤中に宿主細胞を含む前記組成物が提供される。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は発現ベクターを含む。いくつかの実施形態においては、前記発現ベクターは単離されたキメラ受容体核酸配列を含む。
いくつかの実施形態においては、前記キメラ受容体の核酸配列は、
ａ）ＣＤ１７１を標的とし、かつ／またＣＤ１７１と結合するリガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチド；
ｂ）特定の長さを有する最適化されたポリペプチドスペーサーをコードするポリヌクレオチド；
ｃ）膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチド；および
ｄ）細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチド
を含む。
いくつかの実施形態においては、前記リガンド結合ドメインは抗体フラグメントである。いくつかの実施形態においては、前記リガンド結合ドメインは一本鎖可変フラグメントである。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、１５アミノ酸長以下（かつ１アミノ酸長以上または２アミノ酸長以上）である。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、アミノ酸配列X1PPX2Pを含む。いくつかの実施形態においては、前記スペーサー領域は、ヒト抗体のヒンジ領域の一部を含む。いくつかの実施形態においては、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ−４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、ＬＦＡ−１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３およびこれらの組み合わせからなる群から選択される共刺激ドメインと、ＣＤ３ζ全体またはその一部とを含む。いくつかの実施形態においては、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζの一部と４−１ＢＢの一部とを含む。いくつかの実施形態においては、前記キメラ受容体の核酸配列は、マーカー配列をコードする核酸をさらに含む。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞およびバルクＣＤ８＋Ｔ細胞からなる群から選択される細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔリンパ球である。いくつかの実施形態においては、前記ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球は、セントラルメモリーＴ細胞であり、該セントラルメモリーＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋およびＣＤ８＋である。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞およびバルクＣＤ４＋Ｔ細胞からなる群から選択されるＣＤ４＋Ｔヘルパーリンパ球である。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞およびバルクＣＤ４＋Ｔ細胞からなる群から選択されるＣＤ４＋Ｔヘルパーリンパ球である。いくつかの実施形態においては、前記ＣＤ４＋ヘルパーリンパ球は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞であり、該ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋およびＣＤ４＋であり、かつＣＤ４５ＲＯ−である。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞はＴ細胞前駆細胞である。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は造血幹細胞である。いくつかの実施形態においては、前記組成物は、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞およびバルクＣＤ８＋Ｔ細胞からなる群から選択されるＣＤ８＋Ｔ細胞傷害性リンパ球、またはＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋およびＣＤ８＋のセントラルメモリーＴ細胞を含み、前記組成物は別の宿主細胞をさらに含み、該宿主細胞は、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋およびＣＤ８＋のセントラルメモリーＴ細胞であるか、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞およびバルクＣＤ４＋Ｔ細胞からなる群から選択されるＣＤ４＋Ｔヘルパーリンパ球であるか、ま���はＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４＋、およびＣＤ４５ＲＯ−のナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態においては、前記がんは神経芽腫である。いくつかの実施形態においては、前記固形腫瘍は、乳がん、脳がん、大腸がん、腎臓がん、膵臓がんおよび卵巣がんからなる群から選択される。
【００３７】
いくつかの実施形態においては、がんまたは腫瘍を有する対象において細胞免疫療法を行う方法であって、組成物または宿主細胞を該対象に投与することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は発現ベクターを含む。いくつかの実施形態においては、前記発現ベクターは、単離されたキメラ受容体核酸配列を含む。
いくつかの実施形態においては、前記キメラ受容体の核酸配列は、
ａ）ＣＤ１７１を標的とし、かつ／またＣＤ１７１と結合するリガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチド；
ｂ）特定の長さを有する最適化されたポリペプチドスペーサーをコードするポリヌクレオチド；
ｃ）膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチド；および
ｄ）細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチド
を含む。
いくつかの実施形態においては、前記リガンド結合ドメインは抗体フラグメントである。いくつかの実施形態においては、前記リガンド結合ドメインは一本鎖可変フラグメントである。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、１５アミノ酸長以下（かつ１アミノ酸長以上または２アミノ酸長以上）である。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、アミノ酸配列X1PPX2Pを含む。いくつかの実施形態においては、前記スペーサー領域は、ヒト抗体のヒンジ領域の一部を含む。いくつかの実施形態においては、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ−４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、ＬＦＡ−１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３およびこれらの組み合わせからなる群から選択される共刺激ドメインと、ＣＤ３ζ全体またはその一部とを含む。いくつかの実施形態においては、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζの一部と４−１ＢＢの一部とを含む。いくつかの実施形態においては、前記キメラ受容体の核酸配列は、マーカー配列をコードする核酸をさらに含む。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞およびバルクＣＤ８＋Ｔ細胞からなる群から選択される細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔリンパ球である。いくつかの実施形態においては、前記ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球は、セントラルメモリーＴ細胞であり、該セントラルメモリーＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋およびＣＤ８＋である。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞およびバルクＣＤ４＋Ｔ細胞からなる群から選択されるＣＤ４＋Ｔヘルパーリンパ球である。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞およびバルクＣＤ４＋Ｔ細胞からなる群から選択されるＣＤ４＋Ｔヘルパーリンパ球である。いくつかの実施形態においては、前記ＣＤ４＋ヘルパーリンパ球は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞であり、該ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋およびＣＤ４＋であり、かつＣＤ４５ＲＯ−である。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞はＴ細胞前駆細胞である。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は造血幹細胞である。いくつかの実施形態においては、薬学的に許容される添加剤中に宿主細胞を含む前記組成物が提供される。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は発現ベクターを含む。いくつかの実施形態においては、前記発現ベクターは単離されたキメラ受容体核酸配列を含む。
いくつかの実施形態においては、前記キメラ受容体の核酸配列は、
ａ）ＣＤ１７１を標的とし、かつ／またＣＤ１７１と結合するリガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチド；
ｂ）特定の長さを有する最適化されたポリペプチドスペーサーをコードするポリヌクレオチド；
ｃ）膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチド；および
ｄ）細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチド
を含む。
いくつかの実施形態においては、前記リガンド結合ドメインは抗体フラグメントである。いくつかの実施形態においては、前記リガンド結合ドメインは一本鎖可変フラグメントである。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、１５アミノ酸長以下（かつ１アミノ酸長以上または２アミノ酸長以上）である。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、アミノ酸配列X1PPX2Pを含む。いくつかの実施形態においては、前記スペーサー領域は、ヒト抗体のヒンジ領域の一部を含む。いくつかの実施形態においては、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ−４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、ＬＦＡ−１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３およびこれらの組み合わせからなる群から選択される共刺激ドメインと、ＣＤ３ζ全体またはその一部とを含む。いくつかの実施形態においては、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζの一部と４−１ＢＢの一部とを含む。いくつかの実施形態においては、前記キメラ受容体の核酸配列は、マーカー配列をコードする核酸をさらに含む。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞およびバルクＣＤ８＋Ｔ細胞からなる群から選択される細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔリンパ球である。いくつかの実施形態においては、前記ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球は、セントラルメモリーＴ細胞であり、該セントラルメモリーＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋およびＣＤ８＋である。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞およびバルクＣＤ４＋Ｔ細胞からなる群から選択されるＣＤ４＋Ｔヘルパーリンパ球である。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞およびバルクＣＤ４＋Ｔ細胞からなる群から選択されるＣＤ４＋Ｔヘルパーリンパ球である。いくつかの実施形態においては、前記ＣＤ４＋ヘルパーリンパ球は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞であり、該ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋およびＣＤ４＋であり、かつＣＤ４５ＲＯ−である。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞はＴ細胞前駆細胞である。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は造血幹細胞である。いくつかの実施形態においては、前記組成物は、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞およびバルクＣＤ８＋Ｔ細胞からなる群から選択されるＣＤ８＋Ｔ細胞傷害性リンパ球、またはＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋およびＣＤ８＋のセントラルメモリーＴ細胞を含み、前記組成物は別の宿主細胞をさらに含み、該宿主細胞は、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋およびＣＤ８＋のセントラルメモリーＴ細胞であるか、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞およびバルクＣＤ４＋Ｔ細胞からなる群から選択されるＣＤ４＋Ｔヘルパーリンパ球であるか、あ���いはＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４＋、およびＣＤ４５ＲＯ−のナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態においては、前記がんは神経芽腫である。いくつかの実施形態においては、前記腫瘍は、乳がん、脳がん、大腸がん、腎臓がん、膵臓がんおよび卵巣がんからなる群から選択される。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、前記リガンドに応答したＴ細胞の増殖および／またはサイトカインの産生が対照のキメラ受容体よりも増強するように最適化されている。
【００３８】
別の一実施形態は、キメラ受容体の核酸配列によってコードされたキメラ受容体ポリペプチドに関する。
いくつかの実施形態においては、前記キメラ受容体の核酸配列は、
ａ）ＣＤ１７１を特異的標的としかつ／またはＣＤ１７１に特異的に結合するリガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチド、
ｂ）１００アミノ酸長未満（かつ１アミノ酸長以上または２アミノ酸長以上）の長さを有し、前記リガンド結合ドメインと前記キメラ受容体の膜貫通ドメインをつなぐポリペプチドスペーサーをコードするポリヌクレオチド、ならびに
ｃ）前記キメラ受容体の膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチド、および前記キメラ受容体の細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチド
を含む。
いくつかの実施形態においては、前記スペーサーはアミノ酸配列X1PPX2Pを含み、ここで、X1およびX2はそれぞれ独立して任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態においては、X1および／またはX2はシステインである。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、１５アミノ酸長未満（かつ１アミノ酸長以上または２アミノ酸長以上）である。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、１２アミノ酸長、１３アミノ酸長、１４アミノ酸長もしくは１５アミノ酸長、またはこれらの長さのいずれか２つによって定義される範囲にある長さである。いくつかの実施形態においては、前記スペーサー領域は、ヒト抗体のヒンジ領域の一部を含む。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、EPKSCDKTHTCPPCP（配列番号１７）、ERKCCVECPPCP（配列番号１８）、ELKTPLGDTHTCPRCP(EPKSCDTPPPCPRCP)3（配列番号１９）、ESKYGPPCPSCP（配列番号２０）、ESKYGPPCPPCP（配列番号２１）、YGPPCPPCP（配列番号５１）、KYGPPCPPCP（配列番号５２）、またはEVVKYGPPCPPCP（配列番号５３）を含むか、実質的にこれらの配列のいずれかからなるか、これらの配列のいずれかからなる。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、ESKYGPPCPSCP（配列番号２０）、ESKYGPPCPPCP（配列番号２１）、YGPPCPPCP（配列番号５１）、KYGPPCPPCP（配列番号５２）、またはEVVKYGPPCPPCP（配列番号５３）からなるか、実質的にこれらの配列のいずれかからなる。いくつかの実施形態においては、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ−４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、ＬＦＡ−１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３およびこれらの組み合わせからなる群から選択される共刺激ドメインと、ＣＤ３ζ全体またはその一部とを含む。いくつかの実施形態においては、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζの一部と４−１ＢＢの一部とを含む。いくつかの実施形態においては、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、別の共刺激分子の細胞内領域を含んでおらず、かつ／または、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＯＸ−４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、ＬＦＡ−１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＮＫＧ２ＣおよびＢ７−Ｈ３からなる群から選択される分子の細胞内シグナル伝達領域を含んでおらず、かつ／またはＣＤ２８の細胞内シグナル伝達領域を含んでいない。いくつかの実施形態においては、前記キメラ受容体の核酸配列は、マーカー配列をコードする核酸をさらに含む。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーを提供することによって、前記リガンドに応答したＴ細胞の増殖および／またはサイトカインの産生が対照のキメラ受容体よりも増強される。
【００３９】
別の一実施形態は、キメラ受容体の核酸配列を含む発現ベクターに関する。
いくつかの実施形態では、前記キメラ受容体の核酸配列は、
ａ）ＣＤ１７１を特異的標的としかつ／またはＣＤ１７１に特異的に結合するリガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチド、
ｂ）１００アミノ酸長未満（かつ１アミノ酸長以上または２アミノ酸長以上）の長さを有し、前記リガンド結合ドメインと前記キメラ受容体の膜貫通ドメインをつなぐポリペプチドスペーサーをコードするポリヌクレオチド、ならびに
ｃ）前記キメラ受容体の膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチド、および前記キメラ受容体の細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチド
を含む。
いくつかの実施形態においては、前記スペーサーはアミノ酸配列X1PPX2Pを含み、ここで、X1およびX2はそれぞれ独立して任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態においては、X1および／またはX2はシステインである。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、１５アミノ酸長未満（かつ１アミノ酸長以上または２アミノ酸長以上）である。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、１２アミノ酸長、１３アミノ酸長、１４アミノ酸長もしくは１５アミノ酸長、またはこれらの長さのいずれか２つによって定義される範囲にある長さである。いくつかの実施形態においては、前記スペーサー領域は、ヒト抗体のヒンジ領域の一部を含む。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、EPKSCDKTHTCPPCP（配列番号１７）、ERKCCVECPPCP（配列番号１８）、ELKTPLGDTHTCPRCP(EPKSCDTPPPCPRCP)3（配列番号１９）、ESKYGPPCPSCP（配列番号２０）、ESKYGPPCPPCP（配列番号２１）、YGPPCPPCP（配列番号５１）、KYGPPCPPCP（配列番号５２）、またはEVVKYGPPCPPCP（配列番号５３）を含むか、実質的にこれらの配列のいずれかからなるか、これらの配列のいずれかからなる。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、ESKYGPPCPSCP（配列番号２０）、ESKYGPPCPPCP（配列番号２１）、YGPPCPPCP（配列番号５１）、KYGPPCPPCP（配列番号５２）、またはEVVKYGPPCPPCP（配列番号５３）からなるか、実質的にこれらの配列のいずれかからなる。いくつかの実施形態においては、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ−４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、ＬＦＡ−１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３およびこれらの組み合わせからなる群から選択される共刺激ドメインと、ＣＤ３ζ全体またはその一部とを含む。いくつかの実施形態においては、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζの一部と４−１ＢＢの一部とを含む。いくつかの実施形態においては、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、別の共刺激分子の細胞内領域を含んでおらず、かつ／または、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＯＸ−４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、ＬＦＡ−１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＮＫＧ２ＣおよびＢ７−Ｈ３からなる群から選択される分子の細胞内シグナル伝達領域を含んでおらず、かつ／またはＣＤ２８の細胞内シグナル伝達領域を含んでいない。いくつかの実施形態においては、前記キメラ受容体の核酸配列は、マーカー配列をコードする核酸をさらに含む。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーを提供することによって、前記リガンドに応答したＴ細胞の増殖および／またはサイトカインの産生が対照のキメラ受容体よりも増強される。
【００４０】
いくつかの実施形態においては、発現ベクターを含む宿主細胞が提供される。いくつかの実施形態においては、前記発現ベクターはキメラ受容体の核酸配列を含む。
いくつかの実施形態においては、前記キメラ受容体の核酸配列は、
ａ）ＣＤ１７１を特異的標的としかつ／またはＣＤ１７１に特異的に結合するリガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチド、
ｂ）１００アミノ酸長未満（かつ１アミノ酸長以上または２アミノ酸長以上）の長さを有し、前記リガンド結合ドメインと前記キメラ受容体の膜貫通ドメインをつなぐポリペプチドスペーサーをコードするポリヌクレオチド、ならびに
ｃ）前記キメラ受容体の膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチド、および前記キメラ受容体の細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチド
を含む。
いくつかの実施形態においては、前記スペーサーはアミノ酸配列X1PPX2Pを含み、ここで、X1およびX2はそれぞれ独立して任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態においては、X1および／またはX2はシステインである。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、１５アミノ酸長未満（かつ１アミノ酸長以上または２アミノ酸長以上）である。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、１２アミノ酸長、１３アミノ酸長、１４アミノ酸長もしくは１５アミノ酸長、またはこれらの長さのいずれか２つによって定義される範囲にある長さである。いくつかの実施形態においては、前記スペーサー領域は、ヒト抗体のヒンジ領域の一部を含む。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、EPKSCDKTHTCPPCP（配列番号１７）、ERKCCVECPPCP（配列番号１８）、ELKTPLGDTHTCPRCP(EPKSCDTPPPCPRCP)3（配列番号１９）、ESKYGPPCPSCP（配列番号２０）、ESKYGPPCPPCP（配列番号２１）、YGPPCPPCP（配列番号５１）、KYGPPCPPCP（配列番号５２）、またはEVVKYGPPCPPCP（配列番号５３）を含むか、実質的にこれらの配列のいずれかからなるか、これらの配列のいずれかからなる。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、ESKYGPPCPSCP（配列番号２０）、ESKYGPPCPPCP（配列番号２１）、YGPPCPPCP（配列番号５１）、KYGPPCPPCP（配列番号５２）、またはEVVKYGPPCPPCP（配列番号５３）からなるか、実質的にこれらの配列のいずれかからなる。いくつかの実施形態においては、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ−４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、ＬＦＡ−１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３およびこれらの組み合わせからなる群から選択される共刺激ドメインと、ＣＤ３ζ全体またはその一部とを含む。いくつかの実施形態においては、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζの一部と４−１ＢＢの一部とを含む。いくつかの実施形態においては、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、別の共刺激分子の細胞内領域を含んでおらず、かつ／または、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＯＸ−４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、ＬＦＡ−１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＮＫＧ２ＣおよびＢ７−Ｈ３からなる群から選択される分子の細胞内シグナル伝達領域を含んでおらず、かつ／またはＣＤ２８の細胞内シグナル伝達領域を含んでいない。いくつかの実施形態においては、前記キメラ受容体の核酸配列は、マーカー配列をコードする核酸をさらに含む。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞傷害性リンパ球である。いくつかの実施形態においては、前記ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球は、セントラルメモリーＴ細胞であり、該セントラルメモリーＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋およびＣＤ８＋である。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞およびバルクＣＤ４＋Ｔ細胞からなる群から選択されるＣＤ４＋Ｔヘルパーリンパ球である。いくつかの実施形態においては、前記ＣＤ４＋ヘルパーリンパ球は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞であり、該ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋および／もしくはＣＤ４＋であり、かつ／またはＣＤ４５ＲＯ−である。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーを提供することによって、前記リガンドに応答したＴ細胞の増殖および／またはサイトカインの産生が対照のキメラ受容体よりも増強される。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞はＴ細胞前駆細胞である。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は造血幹細胞である。
【００４１】
いくつかの実施形態においては、宿主細胞を含む組成物が提供される。いくつかの実施形態においては、前記組成物は、発現ベクターを含む宿主細胞を含む。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞はＴ細胞前駆細胞である。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は造血幹細胞である。いくつかの実施形態においては、前記発現ベクターはキメラ受容体の核酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、前記キメラ受容体の核酸配列は、
ａ）ＣＤ１７１を特異的標的としかつ／またはＣＤ１７１に特異的に結合するリガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチド、
ｂ）１００アミノ酸長未満（かつ１アミノ酸長以上または２アミノ酸長以上）の長さを有し、前記リガンド結合ドメインと前記キメラ受容体の膜貫通ドメインをつなぐポリペプチドスペーサーをコードするポリヌクレオチド、ならびに
ｃ）前記キメラ受容体の膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチド、および前記キメラ受容体の細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチド
を含む。
いくつかの実施形態においては、前記スペーサーはアミノ酸配列X1PPX2Pを含み、ここで、X1およびX2はそれぞれ独立して任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態においては、X1および／またはX2はシステインである。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、１５アミノ酸長未満（かつ１アミノ酸長以上または２アミノ酸長以上）である。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、１２アミノ酸長、１３アミノ酸長、１４アミノ酸長もしくは１５アミノ酸長、またはこれらの長さのいずれか２つによって定義される範囲にある長さである。いくつかの実施形態においては、前記スペーサー領域は、ヒト抗体のヒンジ領域の一部を含む。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、EPKSCDKTHTCPPCP（配列番号１７）、ERKCCVECPPCP（配列番号１８）、ELKTPLGDTHTCPRCP(EPKSCDTPPPCPRCP)3（配列番号１９）、ESKYGPPCPSCP（配列番号２０）、ESKYGPPCPPCP（配列番号２１）、YGPPCPPCP（配列番号５１）、KYGPPCPPCP（配列番号５２）、またはEVVKYGPPCPPCP（配列番号５３）を含むか、実質的にこれらの配列のいずれかからなるか、これらの配列のいずれかからなる。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、ESKYGPPCPSCP（配列番号２０）、ESKYGPPCPPCP（配列番号２１）、YGPPCPPCP（配列番号５１）、KYGPPCPPCP（配列番号５２）、またはEVVKYGPPCPPCP（配列番号５３）からなるか、実質的にこれらの配列のいずれかからなる。いくつかの実施形態においては、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ−４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、ＬＦＡ−１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３およびこれらの組み合わせからなる群から選択される共刺激ドメインと、ＣＤ３ζ全体またはその一部とを含む。いくつかの実施形態においては、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζの一部と４−１ＢＢの一部とを含む。いくつかの実施形態においては、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、別の共刺激分子の細胞内領域を含んでおらず、かつ／または、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＯＸ−４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、ＬＦＡ−１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＮＫＧ２ＣおよびＢ７−Ｈ３からなる群から選択される分子の細胞内シグナル伝達領域を含んでおらず、かつ／またはＣＤ２８の細胞内シグナル伝達領域を含んでいない。いくつかの実施形態においては、前記キメラ受容体の核酸配列は、マーカー配列をコードする核酸をさらに含む。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞傷害性リンパ球である。前記組成物の実施形態のいくつかにおいては、前記宿主細胞は、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞またはバルクＣＤ８＋Ｔ細胞から実質的になるＣＤ８＋細胞集団、またはこれらの細胞のいずれかが濃縮されたＣＤ８＋細胞集団を含む。いくつかの実施形態においては、前記ＣＤ８＋細胞集団は、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋およびＣＤ８＋のＣＤ８＋セントラルメモリーＴ細胞から実質的になるか、またはこの細胞が濃縮されたものである。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞およびバルクＣＤ４＋Ｔ細胞からなる群から選択されるＣＤ４＋Ｔヘルパーリンパ球から実質的になるＣＤ４＋細胞集団、またはこれらの細胞から選択されるＣＤ４＋Ｔヘルパーリンパ球が濃縮されたＣＤ４＋細胞集団を含む。いくつかの実施形態においては、前記ＣＤ４＋細胞集団は、実質的にＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４＋、およびＣＤ４５ＲＯ−のナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞からなるか、この細胞が濃縮されたものである。いくつかの実施形態においては、前記ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球は、セントラルメモリーＴ細胞であり、該セントラルメモリーＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋およびＣＤ８＋である。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞およびバルクＣＤ４＋Ｔ細胞からなる群から選択されるＣＤ４＋Ｔヘルパーリンパ球である。いくつかの実施形態においては、前記ＣＤ４＋ヘルパーリンパ球は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞であり、該ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋および／もしくはＣＤ４＋であり、かつ／またはＣＤ４５ＲＯ−である。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞はＴ細胞前駆細胞である。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は造血幹細胞である。
【００４２】
別の一実施形態においては、宿主細胞および薬学的に許容される添加剤を含む組成物が提供される。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は発現ベクターを含む。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞はＴ細胞前駆細胞である。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は造血幹細胞である。いくつかの実施形態においては、前記発現ベクターはキメラ受容体の核酸配列を含む。
いくつかの実施形態においては、前記キメラ受容体の核酸配列は、
ａ）ＣＤ１７１を特異的標的としかつ／またはＣＤ１７１に特異的に結合するリガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチド、
ｂ）１００アミノ酸長未満（かつ１アミノ酸長以上または２アミノ酸長以上）の長さを有し、前記リガンド結合ドメインと前記キメラ受容体の膜貫通ドメインをつなぐポリペプチドスペーサーをコードするポリヌクレオチド、ならびに
ｃ）前記キメラ受容体の膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチド、および前記キメラ受容体の細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチド
を含む。
いくつかの実施形態においては、前記スペーサーはアミノ酸配列X1PPX2Pを含み、ここで、X1およびX2はそれぞれ独立して任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態においては、X1および／またはX2はシステインである。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、１５アミノ酸長未満（かつ１アミノ酸長以上または２アミノ酸長以上）である。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、１２アミノ酸長、１３アミノ酸長、１４アミノ酸長もしくは１５アミノ酸長、またはこれらの長さのいずれか２つによって定義される範囲にある長さである。いくつかの実施形態においては、前記スペーサー領域は、ヒト抗体のヒンジ領域の一部を含む。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、EPKSCDKTHTCPPCP（配列番号１７）、ERKCCVECPPCP（配列番号１８）、ELKTPLGDTHTCPRCP(EPKSCDTPPPCPRCP)3（配列番号１９）、ESKYGPPCPSCP（配列番号２０）、ESKYGPPCPPCP（配列番号２１）、YGPPCPPCP（配列番号５１）、KYGPPCPPCP（配列番号５２）、またはEVVKYGPPCPPCP（配列番号５３）を含むか、実質的にこれらの配列のいずれかからなるか、これらの配列のいずれかからなる。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、ESKYGPPCPSCP（配列番号２０）、ESKYGPPCPPCP（配列番号２１）、YGPPCPPCP（配列番号５１）、KYGPPCPPCP（配列番号５２）、またはEVVKYGPPCPPCP（配列番号５３）からなるか、実質的にこれらの配列のいずれかからなる。いくつかの実施形態においては、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ−４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、ＬＦＡ−１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３およびこれらの組み合わせからなる群から選択される共刺激ドメインと、ＣＤ３ζ全体またはその一部とを含む。いくつかの実施形態においては、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζの一部と４−１ＢＢの一部とを含む。いくつかの実施形態においては、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、別の共刺激分子の細胞内領域を含んでおらず、かつ／または、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＯＸ−４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、ＬＦＡ−１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＮＫＧ２ＣおよびＢ７−Ｈ３からなる群から選択される分子の細胞内シグナル伝達領域を含んでおらず、かつ／またはＣＤ２８の細胞内シグナル伝達領域を含んでいない。いくつかの実施形態においては、前記キメラ受容体の核酸配列は、マーカー配列をコードする核酸をさらに含む。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞傷害性リンパ球である。いくつかの実施形態においては、前記ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球は、セントラルメモリーＴ細胞であり、該セントラルメモリーＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋および／またはＣＤ８＋である。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞およびバルクＣＤ４＋Ｔ細胞からなる群から選択されるＣＤ４＋Ｔヘルパーリンパ球である。いくつかの実施形態においては、前記ＣＤ４＋ヘルパーリンパ球は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞であり、該ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋および／もしくはＣＤ４＋であり、かつ／またはＣＤ４５ＲＯ−である。いくつかの実施形態においては、前記組成物は、発現ベクターを含む宿主細胞を含む。いくつかの実施形態においては、前記発現ベクターはキメラ受容体の核酸配列を含む。
いくつかの実施形態においては、前記キメラ受容体の核酸配列は、
ａ）ＣＤ１７１を特異的標的としかつ／またはＣＤ１７１に特異的に結合するリガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチド、
ｂ）１００アミノ酸長未満（かつ１アミノ酸長以上または２アミノ酸長以上）の長さを有し、前記リガンド結合ドメインと前記キメラ受容体の膜貫通ドメインをつなぐポリペプチドスペーサーをコードするポリヌクレオチド、ならびに
ｃ）前記キメラ受容体の膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチド、および前記キメラ受容体の細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチド
を含む。
いくつかの実施形態においては、前記スペーサーはアミノ酸配列X1PPX2Pを含み、ここで、X1およびX2はそれぞれ独立して任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態においては、X1および／またはX2はシステインである。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、１５アミノ酸長未満（かつ１アミノ酸長以上または２アミノ酸長以上）である。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、１２アミノ酸長、１３アミノ酸長、１４アミノ酸長もしくは１５アミノ酸長、またはこれらの長さのいずれか２つによって定義される範囲にある長さである。いくつかの実施形態においては、前記スペーサー領域は、ヒト抗体のヒンジ領域の一部を含む。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、EPKSCDKTHTCPPCP（配列番号１７）、ERKCCVECPPCP（配列番号１８）、ELKTPLGDTHTCPRCP(EPKSCDTPPPCPRCP)3（配列番号１９）、ESKYGPPCPSCP（配列番号２０）、ESKYGPPCPPCP（配列番号２１）、YGPPCPPCP（配列番号５１）、KYGPPCPPCP（配列番号５２）、またはEVVKYGPPCPPCP（配列番号５３）を含むか、実質的にこれらの配列のいずれかからなるか、これらの配列のいずれかからなる。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、ESKYGPPCPSCP（配列番号２０）、ESKYGPPCPPCP（配列番号２１）、YGPPCPPCP（配列番号５１）、KYGPPCPPCP（配列番号５２）、またはEVVKYGPPCPPCP（配列番号５３）からなるか、実質的にこれらの配列のいずれかからなる。いくつかの実施形態においては、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ−４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、ＬＦＡ−１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３およびこれらの組み合わせからなる群から選択される共刺激ドメインと、ＣＤ３ζ全体またはその一部とを含む。いくつかの実施形態においては、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζの一部と４−１ＢＢの一部とを含む。いくつかの実施形態においては、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、別の共刺激分子の細胞内領域を含んでおらず、かつ／または、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＯＸ−４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、ＬＦＡ−１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＮＫＧ２ＣおよびＢ７−Ｈ３からなる群から選択される分子の細胞内シグナル伝達領域を含んでおらず、かつ／またはＣＤ２８の細胞内シグナル伝達領域を含んでいない。いくつかの実施形態においては、前記キメラ受容体の核酸配列は、マーカー配列をコードする核酸をさらに含む。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞傷害性リンパ球である。前記組成物の実施形態のいくつかにおいては、前記宿主細胞は、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞またはバルクＣＤ８＋Ｔ細胞から実質的になるＣＤ８＋細胞集団、またはこれらの細胞のいずれかが濃縮されたＣＤ８＋細胞集団を含む。いくつかの実施形態においては、前記ＣＤ８＋細胞集団は、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋および／またはＣＤ８＋のＣＤ８＋セントラルメモリーＴ細胞から実質的になるか、またはこの細胞が濃縮されたものである。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞およびバルクＣＤ４＋Ｔ細胞からなる群から選択されるＣＤ４＋Ｔヘルパーリンパ球から実質的になるＣＤ４＋細胞集団、またはこれらの細胞から選択されるＣＤ４＋Ｔヘルパーリンパ球が濃縮されたＣＤ４＋細胞集団を含む。いくつかの実施形態においては、前記ＣＤ４＋細胞集団は、実質的にＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４＋、および／またはＣＤ４５ＲＯ−のナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞からなるか、この細胞が濃縮されたものである。いくつかの実施形態においては、前記ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球は、セントラルメモリーＴ細胞であり、該セントラルメモリーＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋およびＣＤ８＋である。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞およびバルクＣＤ４＋Ｔ細胞からなる群から選択されるＣＤ４＋Ｔヘルパーリンパ球である。いくつかの実施形態においては、前記ＣＤ４＋ヘルパーリンパ球は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞であり、該ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋および／もしくはＣＤ４＋であり、かつ／またはＣＤ４５ＲＯ−である。いくつかの実施形態においては、前記組成物は宿主細胞を含み、該宿主細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞傷害性リンパ球、またはＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋および／もしくはＣＤ８＋のセントラルメモリーＴ細胞であるＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球であり、前記組成物は別の宿主細胞をさらに含み、該宿主細胞は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞およびバルクＣＤ４＋Ｔ細胞からなる群から選択されるＣＤ４＋Ｔヘルパーリンパ球、またはＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４＋、および／もしくはＣＤ４５ＲＯ−のナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞であるＣＤ４＋ヘルパーリンパ球である。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞はＴ細胞前駆細胞である。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は造血幹細胞である。
【００４３】
別の一実施形態においては、インビトロにおいて宿主細胞を製造する方法が提供される。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は発現ベクターを含む。いくつかの実施形態においては、前記発現ベクターはキメラ受容体の核酸配列を含む。
いくつかの実施形態においては、前記キメラ受容体の核酸配列は、
ａ）ＣＤ１７１を特異的標的としかつ／またはＣＤ１７１に特異的に結合するリガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチド、
ｂ）１００アミノ酸長未満（かつ１アミノ酸長以上または２アミノ酸長以上）の長さを有し、前記リガンド結合ドメインと前記キメラ受容体の膜貫通ドメインをつなぐポリペプチドスペーサーをコードするポリヌクレオチド、ならびに
ｃ）前記キメラ受容体の膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチド、および前記キメラ受容体の細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチド
を含む。
いくつかの実施形態においては、前記スペーサーはアミノ酸配列X1PPX2Pを含み、ここで、X1およびX2はそれぞれ独立して任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態においては、X1および／またはX2はシステインである。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、１５アミノ酸長未満（かつ１アミノ酸長以上または２アミノ酸長以上）である。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、１２アミノ酸長、１３アミノ酸長、１４アミノ酸長もしくは１５アミノ酸長、またはこれらの長さのいずれか２つによって定義される範囲にある長さである。いくつかの実施形態においては、前記スペーサー領域は、ヒト抗体のヒンジ領域の一部を含む。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、EPKSCDKTHTCPPCP（配列番号１７）、ERKCCVECPPCP（配列番号１８）、ELKTPLGDTHTCPRCP(EPKSCDTPPPCPRCP)3（配列番号１９）、ESKYGPPCPSCP（配列番号２０）、ESKYGPPCPPCP（配列番号２１）、YGPPCPPCP（配列番号５１）、KYGPPCPPCP（配列番号５２）、またはEVVKYGPPCPPCP（配列番号５３）を含むか、実質的にこれらの配列のいずれかからなるか、これらの配列のいずれかからなる。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、ESKYGPPCPSCP（配列番号２０）、ESKYGPPCPPCP（配列番号２１）、YGPPCPPCP（配列番号５１）、KYGPPCPPCP（配列番号５２）、またはEVVKYGPPCPPCP（配列番号５３）からなるか、実質的にこれらの配列のいずれかからなる。いくつかの実施形態においては、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ−４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、ＬＦＡ−１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３およびこれらの組み合わせからなる群から選択される共刺激ドメインと、ＣＤ３ζ全体またはその一部とを含む。いくつかの実施形態においては、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζの一部と４−１ＢＢの一部とを含む。いくつかの実施形態においては、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、別の共刺激分子の細胞内領域を含んでおらず、かつ／または、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＯＸ−４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、ＬＦＡ−１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＮＫＧ２ＣおよびＢ７−Ｈ３からなる群から選択される分子の細胞内シグナル伝達領域を含んでおらず、かつ／またはＣＤ２８の細胞内シグナル伝達領域を含んでいない。いくつかの実施形態においては、前記キメラ受容体の核酸配列は、マーカー配列をコードする核酸をさらに含む。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞傷害性リンパ球である。いくつかの実施形態においては、前記ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球は、セントラルメモリーＴ細胞であり、該セントラルメモリーＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋および／またはＣＤ８＋である。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞およびバルクＣＤ４＋Ｔ細胞からなる群から選択されるＣＤ４＋Ｔヘルパーリンパ球である。いくつかの実施形態においては、前記ＣＤ４＋ヘルパーリンパ球は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞であり、該ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋および／もしくはＣＤ４＋であり、かつ／またはＣＤ４５ＲＯ−である。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞傷害性リンパ球である。いくつかの実施形態においては、前記ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球は、セントラルメモリーＴ細胞であり、該セントラルメモリーＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋および／またはＣＤ８＋である。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞およびバルクＣＤ４＋Ｔ細胞からなる群から選択されるＣＤ４＋Ｔヘルパーリンパ球である。いくつかの実施形態においては、前記ＣＤ４＋ヘルパーリンパ球は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞であり、該ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋および／もしくはＣＤ４＋であり、かつ／またはＣＤ４５ＲＯ−である。
いくつかの実施形態においては、前記方法は、
ａ）ライブラリーに含まれる複数の核酸がそれぞれキメラ受容体をコードし、各核酸によってコードされたキメラ受容体の長さがそれぞれ異なる核酸ライブラリーを提供すること、
ｂ）個別のＴリンパ球集団に前記複数の核酸のそれぞれを導入し、各Ｔリンパ球集団をインビトロで増殖させて、複数の遺伝子改変Ｔリンパ球集団を得ること、
ｃ）腫瘍を有する動物モデルに各遺伝子改変Ｔリンパ球集団を投与し、抗腫瘍効果の測定値を評価すること、ならびに
ｄ）インビトロおよび／または動物モデルにおいて抗腫瘍効果を示すキメラ受容体をコードする核酸を選択すること
を含む。
いくつかの実施形態においては、前記キメラ受容体の核酸配列は、
ａ）ＣＤ１７１を特異的標的としかつ／またはＣＤ１７１に特異的に結合するリガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチド、
ｂ）１００アミノ酸長未満（かつ１アミノ酸長以上または２アミノ酸長以上）の長さを有し、前記リガンド結合ドメインと前記キメラ受容体の膜貫通ドメインをつなぐポリペプチドスペーサーをコードするポリヌクレオチド、ならびに
ｃ）前記キメラ受容体の膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチド、および前記キメラ受容体の細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチド
を含む。
いくつかの実施形態においては、前記スペーサーはアミノ酸配列X1PPX2Pを含み、ここで、X1およびX2はそれぞれ独立して任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態においては、X1および／またはX2はシステインである。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、１５アミノ酸長未満（かつ１アミノ酸長以上または２アミノ酸長以上）である。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、１２アミノ酸長、１３アミノ酸長、１４アミノ酸長もしくは１５アミノ酸長、またはこれらの長さのいずれか２つによって定義される範囲にある長さである。いくつかの実施形態においては、前記スペーサー領域は、ヒト抗体のヒンジ領域の一部を含む。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、EPKSCDKTHTCPPCP（配列番号１７）、ERKCCVECPPCP（配列番号１８）、ELKTPLGDTHTCPRCP(EPKSCDTPPPCPRCP)3（配列番号１９）、ESKYGPPCPSCP（配列番号２０）、ESKYGPPCPPCP（配列番号２１）、YGPPCPPCP（配列番号５１）、KYGPPCPPCP（配列番号５２）、またはEVVKYGPPCPPCP（配列番号５３）を含むか、実質的にこれらの配列のいずれかからなるか、これらの配列のいずれかからなる。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、ESKYGPPCPSCP（配列番号２０）、ESKYGPPCPPCP（配列番号２１）、YGPPCPPCP（配列番号５１）、KYGPPCPPCP（配列番号５２）、またはEVVKYGPPCPPCP（配列番号５３）からなるか、実質的にこれらの配列のいずれかからなる。いくつかの実施形態においては、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ−４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、ＬＦＡ−１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３およびこれらの組み合わせからなる群から選択される共刺激ドメインと、ＣＤ３ζ全体またはその一部とを含む。いくつかの実施形態においては、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζの一部と４−１ＢＢの一部とを含む。いくつかの実施形態においては、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、別の共刺激分子の細胞内領域を含んでおらず、かつ／または、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＯＸ−４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、ＬＦＡ−１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＮＫＧ２ＣおよびＢ７−Ｈ３からなる群から選択される分子の細胞内シグナル伝達領域を含んでおらず、かつ／またはＣＤ２８の細胞内シグナル伝達領域を含んでいない。いくつかの実施形態においては、前記キメラ受容体の核酸配列は、マーカー配列をコードする核酸をさらに含む。いくつかの実施形態においては、前記複数の核酸は発現ベクターをコードする。いくつかの実施形態においては、前記発現ベクターはキメラ受容体の核酸配列を含む。
いくつかの実施形態においては、前記キメラ受容体の核酸配列は、
ａ）ＣＤ１７１を特異的標的としかつ／またはＣＤ１７１に特異的に結合するリガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチド、
ｂ）１００アミノ酸長未満（かつ１アミノ酸長以上または２アミノ酸長以上）の長さを有し、前記リガンド結合ドメインと前記キメラ受容体の膜貫通ドメインをつなぐポリペプチドスペーサーをコードするポリヌクレオチド、ならびに
ｃ）前記キメラ受容体の膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチド、および前記キメラ受容体の細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチド
を含む。
いくつかの実施形態においては、前記スペーサーはアミノ酸配列X1PPX2Pを含み、ここで、X1およびX2はそれぞれ独立して任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態においては、X1および／またはX2はシステインである。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、１５アミノ酸長未満（かつ１アミノ酸長以上または２アミノ酸長以上）である。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、１２アミノ酸長、１３アミノ酸長、１４アミノ酸長もしくは１５アミノ酸長、またはこれらの長さのいずれか２つによって定義される範囲にある長さである。いくつかの実施形態においては、前記スペーサー領域は、ヒト抗体のヒンジ領域の一部を含む。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、EPKSCDKTHTCPPCP（配列番号１７）、ERKCCVECPPCP（配列番号１８）、ELKTPLGDTHTCPRCP(EPKSCDTPPPCPRCP)3（配列番号１９）、ESKYGPPCPSCP（配列番号２０）、ESKYGPPCPPCP（配列番号２１）、YGPPCPPCP（配列番号５１）、KYGPPCPPCP（配列番号５２）、またはEVVKYGPPCPPCP（配列番号５３）を含むか、実質的にこれらの配列のいずれかからなるか、これらの配列のいずれかからなる。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、ESKYGPPCPSCP（配列番号２０）、ESKYGPPCPPCP（配列番号２１）、YGPPCPPCP（配列番号５１）、KYGPPCPPCP（配列番号５２）、またはEVVKYGPPCPPCP（配列番号５３）からなるか、実質的にこれらの配列のいずれかからなる。いくつかの実施形態においては、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ−４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、ＬＦＡ−１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３およびこれらの組み合わせからなる群から選択される共刺激ドメインと、ＣＤ３ζ全体またはその一部とを含む。いくつかの実施形態においては、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζの一部と４−１ＢＢの一部とを含む。いくつかの実施形態においては、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、別の共刺激分子の細胞内領域を含んでおらず、かつ／または、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＯＸ−４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、ＬＦＡ−１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＮＫＧ２ＣおよびＢ７−Ｈ３からなる群から選択される分子の細胞内シグナル伝達領域を含んでおらず、かつ／またはＣＤ２８の細胞内シグナル伝達領域を含んでいない。いくつかの実施形態においては、前記キメラ受容体の核酸配列は、マーカー配列をコードする核酸をさらに含む。いくつかの実施形態においては、前記方法は、前記キメラ受容体をコードする選択された前記核酸を宿主細胞に導入することをさらに含む。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞はＴ細胞前駆細胞である。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は造血幹細胞である。
【００４４】
いくつかの実施形態においては、抗原を標的とするキメラ受容体をインビトロにおいて選択する方法であって、
複数の核酸を含み、各核酸によってコードされるキメラ受容体の長さがそれぞれ異なり、各キメラ受容体が前記抗原を標的とし、かつ／または該抗原に特異的に結合することを特徴とする複数の細胞集団と、抗原を発現するドナー細胞とを連続して複数回インキュベートすること、
前記複数の細胞集団のそれぞれの増殖、活性化、および／または生存を評価すること、ならびに
前記評価に基づいてキメラ受容体を選択することを含む方法が提供される。
いくつかの実施形態において、前記連続した複数回のインキュベーションは、少なくとも３回のインキュベーションを含み、各回のインキュベーション後に前記細胞集団を回収する。いくつかの実施形態においては、前記評価は、前記連続した複数回のインキュベーションを行った後に、各集団における細胞の生存、生存数または生存率（％）を検出することによって行い、別の複数の細胞集団よりも生存、生存数または生存率（％）が増加している集団によって発現されるキメラ受容体が選択される。いくつかの実施形態においては、前記複数の細胞集団と前記抗原を発現する細胞とのインキュベーションにおける、各回のインキュベーション開始時の比率は１：１である。いくつかの実施形態においては、様々な長さの前記複数のキメラ受容体は、様々な長さのスペーサーを含み、各スペーサーは、キメラ受容体の抗原結合ドメインと膜貫通ドメインとをつないでおり；かつ／または様々な長さの前記複数のキメラ受容体は、細胞内共刺激ドメインの数が異なるキメラ受容体を含み、各細胞内ドメインはそれぞれ別の天然の共刺激分子に由来している。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞はＴ細胞前駆細胞である。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は造血幹細胞である。
【００４５】
別の実施形態において、インビトロにおいて宿主細胞を製造する方法であって、
ＣＤ４５ＲＡ−、ＣＤ４５ＲＯ＋および／またはＣＤ６２Ｌ＋の表現型を有するリンパ球集団に前記核酸または前記発現ベクターを導入すること；ならびに
抗ＣＤ３および／または抗ＣＤ２８と少なくとも１つの恒常性サイトカインとの存在下において、前記リンパ球を、細胞移入における使用に十分な数に達するまで培養すること
を含む方法が提供される。
いくつかの実施形態においては、上述したように、前記宿主細胞は発現ベクターを含む。いくつかの実施形態においては、上述したように、前記発現ベクターはキメラ受容体の核酸配列を含む。
いくつかの実施形態においては、前記キメラ受容体の核酸配列は、
ａ）ＣＤ１７１を特異的標的としかつ／またはＣＤ１７１に特異的に結合するリガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチド、
ｂ）１００アミノ酸長未満（かつ１アミノ酸長以上または２アミノ酸長以上）の長さを有し、前記リガンド結合ドメインと前記キメラ受容体の膜貫通ドメインをつなぐポリペプチドスペーサーをコードするポリヌクレオチド、ならびに
ｃ）前記キメラ受容体の膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチド、および前記キメラ受容体の細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチド
を含む。
いくつかの実施形態においては、前記スペーサーはアミノ酸配列X1PPX2Pを含み、ここで、X1およびX2はそれぞれ独立して任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態においては、X1および／またはX2はシステインである。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、１５アミノ酸長未満（かつ１アミノ酸長以上または２アミノ酸長以上）である。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、１２アミノ酸長、１３アミノ酸長、１４アミノ酸長もしくは１５アミノ酸長、またはこれらの長さのいずれか２つによって定義される範囲にある長さである。いくつかの実施形態においては、前記スペーサー領域は、ヒト抗体のヒンジ領域の一部を含む。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、EPKSCDKTHTCPPCP（配列番号１７）、ERKCCVECPPCP（配列番号１８）、ELKTPLGDTHTCPRCP(EPKSCDTPPPCPRCP)3（配列番号１９）、ESKYGPPCPSCP（配列番号２０）、ESKYGPPCPPCP（配列番号２１）、YGPPCPPCP（配列番号５１）、KYGPPCPPCP（配列番号５２）、またはEVVKYGPPCPPCP（配列番号５３）を含むか、実質的にこれらの配列のいずれかからなるか、これらの配列のいずれかからなる。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、ESKYGPPCPSCP（配列番号２０）、ESKYGPPCPPCP（配列番号２１）、YGPPCPPCP（配列番号５１）、KYGPPCPPCP（配列番号５２）、またはEVVKYGPPCPPCP（配列番号５３）からなるか、実質的にこれらの配列のいずれかからなる。いくつかの実施形態においては、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ−４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、ＬＦＡ−１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３およびこれらの組み合わせからなる群から選択される共刺激ドメインと、ＣＤ３ζ全体またはその一部とを含む。いくつかの実施形態においては、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζの一部と４−１ＢＢの一部とを含む。いくつかの実施形態においては、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、別の共刺激分子の細胞内領域を含んでおらず、かつ／または、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＯＸ−４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、ＬＦＡ−１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＮＫＧ２ＣおよびＢ７−Ｈ３からなる群から選択される分子の細胞内シグナル伝達領域を含んでおらず、かつ／またはＣＤ２８の細胞内シグナル伝達領域を含んでいない。いくつかの実施形態においては、前記キメラ受容体の核酸配列は、マーカー配列をコードする核酸をさらに含む。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞傷害性リンパ球である。いくつかの実施形態においては、前記ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球は、セントラルメモリーＴ細胞であり、該セントラルメモリーＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋および／またはＣＤ８＋である。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞およびバルクＣＤ４＋Ｔ細胞からなる群から選択されるＣＤ４＋Ｔヘルパーリンパ球である。いくつかの実施形態においては、前記ＣＤ４＋ヘルパーリンパ球は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞であり、該ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋および／もしくはＣＤ４＋であり、かつ／またはＣＤ４５ＲＯ−である。
いくつかの実施形態においては、前記キメラ受容体の核酸配列は、
ａ）ＣＤ１７１を特異的標的としかつ／またはＣＤ１７１に特異的に結合するリガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチド、
ｂ）１００アミノ酸長未満（かつ１アミノ酸長以上または２アミノ酸長以上）の長さを有し、前記リガンド結合ドメインと前記キメラ受容体の膜貫通ドメインをつなぐポリペプチドスペーサーをコードするポリヌクレオチド、ならびに
ｃ）前記キメラ受容体の膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチド、および前記キメラ受容体の細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチド
を含む。
いくつかの実施形態においては、前記スペーサーはアミノ酸配列X1PPX2Pを含み、ここで、X1およびX2はそれぞれ独立して任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態においては、X1および／またはX2はシステインである。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、１５アミノ酸長未満（かつ１アミノ酸長以上または２アミノ酸長以上）である。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、１２アミノ酸長、１３アミノ酸長、１４アミノ酸長もしくは１５アミノ酸長、またはこれらの長さのいずれか２つによって定義される範囲にある長さである。いくつかの実施形態においては、前記スペーサー領域は、ヒト抗体のヒンジ領域の一部を含む。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、EPKSCDKTHTCPPCP（配列番号１７）、ERKCCVECPPCP（配列番号１８）、ELKTPLGDTHTCPRCP(EPKSCDTPPPCPRCP)3（配列番号１９）、ESKYGPPCPSCP（配列番号２０）、ESKYGPPCPPCP（配列番号２１）、YGPPCPPCP（配列番号５１）、KYGPPCPPCP（配列番号５２）、またはEVVKYGPPCPPCP（配列番号５３）を含むか、実質的にこれらの配列のいずれかからなるか、これらの配列のいずれかからなる。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、ESKYGPPCPSCP（配列番号２０）、ESKYGPPCPPCP（配列番号２１）、YGPPCPPCP（配列番号５１）、KYGPPCPPCP（配列番号５２）、またはEVVKYGPPCPPCP（配列番号５３）からなるか、実質的にこれらの配列のいずれかからなる。いくつかの実施形態においては、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ−４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、ＬＦＡ−１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３およびこれらの組み合わせからなる群から選択される共刺激ドメインと、ＣＤ３ζ全体またはその一部とを含む。いくつかの実施形態においては、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζの一部と４−１ＢＢの一部とを含む。いくつかの実施形態においては、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、別の共刺激分子の細胞内領域を含んでおらず、かつ／または、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＯＸ−４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、ＬＦＡ−１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＮＫＧ２ＣおよびＢ７−Ｈ３からなる群から選択される分子の細胞内シグナル伝達領域を含んでおらず、かつ／またはＣＤ２８の細胞内シグナル伝達領域を含んでいない。いくつかの実施形態においては、前記キメラ受容体の核酸配列は、マーカー配列をコードする核酸をさらに含む。いくつかの実施形態においては、前記リンパ球はＣＤ８＋またはＣＤ４＋である。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞はＴ細胞前駆細胞である。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は造血幹細胞である。
【００４６】
いくつかの実施形態においては、ＣＤ１７１を発現するがんまたは固形腫瘍の治療または抑制における、宿主細胞または組成物の使用が提供される。いくつかの実施形態においては、前記がんは神経芽腫である。いくつかの実施形態においては、前記固形腫瘍は、乳がん、脳がん、大腸がん、腎臓がん、膵臓がんおよび卵巣がんからなる群から選択される。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は本明細書に記載の発現ベクターを含む。いくつかの実施形態においては、前記発現ベクターはキメラ受容体の核酸配列を含む。
いくつかの実施形態においては、前記キメラ受容体の核酸配列は、
ａ）ＣＤ１７１を特異的標的としかつ／またはＣＤ１７１に特異的に結合するリガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチド、
ｂ）１００アミノ酸長未満（かつ１アミノ酸長以上または２アミノ酸長以上）の長さを有し、前記リガンド結合ドメインと前記キメラ受容体の膜貫通ドメインをつなぐポリペプチドスペーサーをコードするポリヌクレオチド、ならびに
ｃ）前記キメラ受容体の膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチド、および前記キメラ受容体の細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチド
を含む。
いくつかの実施形態においては、前記スペーサーはアミノ酸配列X1PPX2Pを含み、ここで、X1およびX2はそれぞれ独立して任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態においては、X1および／またはX2はシステインである。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、１５アミノ酸長未満（かつ１アミノ酸長以上または２アミノ酸長以上）である。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、１２アミノ酸長、１３アミノ酸長、１４アミノ酸長もしくは１５アミノ酸長、またはこれらの長さのいずれか２つによって定義される範囲にある長さである。いくつかの実施形態においては、前記スペーサー領域は、ヒト抗体のヒンジ領域の一部を含む。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、EPKSCDKTHTCPPCP（配列番号１７）、ERKCCVECPPCP（配列番号１８）、ELKTPLGDTHTCPRCP(EPKSCDTPPPCPRCP)3（配列番号１９）、ESKYGPPCPSCP（配列番号２０）、ESKYGPPCPPCP（配列番号２１）、YGPPCPPCP（配列番号５１）、KYGPPCPPCP（配列番号５２）、またはEVVKYGPPCPPCP（配列番号５３）を含むか、実質的にこれらの配列のいずれかからなるか、これらの配列のいずれかからなる。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、ESKYGPPCPSCP（配列番号２０）、ESKYGPPCPPCP（配列番号２１）、YGPPCPPCP（配列番号５１）、KYGPPCPPCP（配列番号５２）、またはEVVKYGPPCPPCP（配列番号５３）からなるか、実質的にこれらの配列のいずれかからなる。いくつかの実施形態においては、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ−４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、ＬＦＡ−１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３およびこれらの組み合わせからなる群から選択される共刺激ドメインと、ＣＤ３ζ全体またはその一部とを含む。いくつかの実施形態においては、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζの一部と４−１ＢＢの一部とを含む。いくつかの実施形態においては、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、別の共刺激分子の細胞内領域を含んでおらず、かつ／または、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＯＸ−４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、ＬＦＡ−１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＮＫＧ２ＣおよびＢ７−Ｈ３からなる群から選択される分子の細胞内シグナル伝達領域を含んでおらず、かつ／またはＣＤ２８の細胞内シグナル伝達領域を含んでいない。いくつかの実施形態においては、前記キメラ受容体の核酸配列は、マーカー配列をコードする核酸をさらに含む。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞傷害性リンパ球である。いくつかの実施形態においては、前記ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球は、セントラルメモリーＴ細胞であり、該セントラルメモリーＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋および／またはＣＤ８＋である。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞およびバルクＣＤ４＋Ｔ細胞からなる群から選択されるＣＤ４＋Ｔヘルパーリンパ球である。いくつかの実施形態においては、前記ＣＤ４＋ヘルパーリンパ球は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞であり、該ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋および／もしくはＣＤ４＋であり、かつ／またはＣＤ４５ＲＯ−である。いくつかの実施形態においては、組成物は宿主細胞を含む。いくつかの実施形態においては、本明細書に記載したように、前記組成物は、発現ベクターを含む宿主細胞を含む。いくつかの実施形態においては、本明細書に記載したように、前記発現ベクターはキメラ受容体の核酸配列を含む。
いくつかの実施形態においては、前記キメラ受容体の核酸配列は、
ａ）ＣＤ１７１を特異的標的としかつ／またはＣＤ１７１に特異的に結合するリガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチド、
ｂ）１００アミノ酸長未満（かつ１アミノ酸長以上または２アミノ酸長以上）の長さを有し、前記リガンド結合ドメインと前記キメラ受容体の膜貫通ドメインをつなぐポリペプチドスペーサーをコードするポリヌクレオチド、ならびに
ｃ）前記キメラ受容体の膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチド、および前記キメラ受容体の細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチド
を含む。
いくつかの実施形態においては、前記スペーサーはアミノ酸配列X1PPX2Pを含み、ここで、X1およびX2はそれぞれ独立して任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態においては、X1および／またはX2はシステインである。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、１５アミノ酸長未満（かつ１アミノ酸長以上または２アミノ酸長以上）である。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、１２アミノ酸長、１３アミノ酸長、１４アミノ酸長もしくは１５アミノ酸長、またはこれらの長さのいずれか２つによって定義される範囲にある長さである。いくつかの実施形態においては、前記スペーサー領域は、ヒト抗体のヒンジ領域の一部を含む。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、EPKSCDKTHTCPPCP（配列番号１７）、ERKCCVECPPCP（配列番号１８）、ELKTPLGDTHTCPRCP(EPKSCDTPPPCPRCP)3（配列番号１９）、ESKYGPPCPSCP（配列番号２０）、ESKYGPPCPPCP（配列番号２１）、YGPPCPPCP（配列番号５１）、KYGPPCPPCP（配列番号５２）、またはEVVKYGPPCPPCP（配列番号５３）を含むか、実質的にこれらの配列のいずれかからなるか、これらの配列のいずれかからなる。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、ESKYGPPCPSCP（配列番号２０）、ESKYGPPCPPCP（配列番号２１）、YGPPCPPCP（配列番号５１）、KYGPPCPPCP（配列番号５２）、またはEVVKYGPPCPPCP（配列番号５３）からなるか、実質的にこれらの配列のいずれかからなる。いくつかの実施形態においては、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ−４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、ＬＦＡ−１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３およびこれらの組み合わせからなる群から選択される共刺激ドメインと、ＣＤ３ζ全体またはその一部とを含む。いくつかの実施形態においては、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζの一部と４−１ＢＢの一部とを含む。いくつかの実施形態においては、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、別の共刺激分子の細胞内領域を含んでおらず、かつ／または、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＯＸ−４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、ＬＦＡ−１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＮＫＧ２ＣおよびＢ７−Ｈ３からなる群から選択される分子の細胞内シグナル伝達領域を含んでおらず、かつ／またはＣＤ２８の細胞内シグナル伝達領域を含んでいない。いくつかの実施形態においては、前記キメラ受容体の核酸配列は、マーカー配列をコードする核酸をさらに含む。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞傷害性リンパ球である。前記組成物の実施形態のいくつかにおいては、前記宿主細胞は、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞またはバルクＣＤ８＋Ｔ細胞から実質的になるＣＤ８＋細胞集団、またはこれらの細胞のいずれかが濃縮されたＣＤ８＋細胞集団を含む。いくつかの実施形態においては、前記ＣＤ８＋細胞集団は、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋およびＣＤ８＋のＣＤ８＋セントラルメモリーＴ細胞から実質的になるか、またはこの細胞が濃縮されたものである。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞およびバルクＣＤ４＋Ｔ細胞からなる群から選択されるＣＤ４＋Ｔヘルパーリンパ球から実質的になるＣＤ４＋細胞集団、またはこれらの細胞から選択されるＣＤ４＋Ｔヘルパーリンパ球が濃縮されたＣＤ４＋細胞集団を含む。いくつかの実施形態においては、前記ＣＤ４＋細胞集団は、実質的にＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４＋、およびＣＤ４５ＲＯ−のナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞からなるか、この細胞が濃縮されたものである。いくつかの実施形態においては、前記ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球は、セントラルメモリーＴ細胞であり、該セントラルメモリーＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋およびＣＤ８＋である。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞およびバルクＣＤ４＋Ｔ細胞からなる群から選択されるＣＤ４＋Ｔヘルパーリンパ球である。いくつかの実施形態においては、前記ＣＤ４＋ヘルパーリンパ球は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞であり、該ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋および／もしくはＣＤ４＋であり、かつ／またはＣＤ４５ＲＯ−である。いくつかの実施形態においては、前記組成物は、薬学的に許容される添加剤中に宿主細胞を含む。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞はＴ細胞前駆細胞である。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は造血幹細胞である。
【００４７】
いくつかの実施形態においては、がんまたは腫瘍を有する対象において細胞免疫療法を行う方法であって、請求項に記載の組成物または宿主細胞を該対象に投与することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態においては、前記がんは神経芽腫である。いくつかの実施形態においては、前記腫瘍は、乳がん、脳がん、大腸がん、腎臓がん、膵臓がんおよび卵巣がんからなる群から選択される。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は本明細書に記載の発現ベクターを含む。いくつかの実施形態においては、本明細書に記載したように、前記発現ベクターはキメラ受容体の核酸配列を含む。
いくつかの実施形態においては、前記キメラ受容体の核酸配列は、
ａ）ＣＤ１７１を特異的標的としかつ／またはＣＤ１７１に特異的に結合するリガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチド、
ｂ）１００アミノ酸長未満（かつ１アミノ酸長以上または２アミノ酸長以上）の長さを有し、前記リガンド結合ドメインと前記キメラ受容体の膜貫通ドメインをつなぐポリペプチドスペーサーをコードするポリヌクレオチド、ならびに
ｃ）前記キメラ受容体の膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチド、および前記キメラ受容体の細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチド
を含む。
いくつかの実施形態においては、前記スペーサーはアミノ酸配列X1PPX2Pを含み、ここで、X1およびX2はそれぞれ独立して任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態においては、X1および／またはX2はシステインである。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、１５アミノ酸長未満（かつ１アミノ酸長以上または２アミノ酸長以上）である。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、１２アミノ酸長、１３アミノ酸長、１４アミノ酸長もしくは１５アミノ酸長、またはこれらの長さのいずれか２つによって定義される範囲にある長さである。いくつかの実施形態においては、前記スペーサー領域は、ヒト抗体のヒンジ領域の一部を含む。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、EPKSCDKTHTCPPCP（配列番号１７）、ERKCCVECPPCP（配列番号１８）、ELKTPLGDTHTCPRCP(EPKSCDTPPPCPRCP)3（配列番号１９）、ESKYGPPCPSCP（配列番号２０）、ESKYGPPCPPCP（配列番号２１）、YGPPCPPCP（配列番号５１）、KYGPPCPPCP（配列番号５２）、またはEVVKYGPPCPPCP（配列番号５３）を含むか、実質的にこれらの配列のいずれかからなるか、これらの配列のいずれかからなる。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、ESKYGPPCPSCP（配列番号２０）、ESKYGPPCPPCP（配列番号２１）、YGPPCPPCP（配列番号５１）、KYGPPCPPCP（配列番号５２）、またはEVVKYGPPCPPCP（配列番号５３）からなるか、実質的にこれらの配列のいずれかからなる。いくつかの実施形態においては、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ−４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、ＬＦＡ−１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３およびこれらの組み合わせからなる群から選択される共刺激ドメインと、ＣＤ３ζ全体またはその一部とを含む。いくつかの実施形態においては、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζの一部と４−１ＢＢの一部とを含む。いくつかの実施形態においては、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、別の共刺激分子の細胞内領域を含んでおらず、かつ／または、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＯＸ−４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、ＬＦＡ−１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＮＫＧ２ＣおよびＢ７−Ｈ３からなる群から選択される分子の細胞内シグナル伝達領域を含んでおらず、かつ／またはＣＤ２８の細胞内シグナル伝達領域を含んでいない。いくつかの実施形態においては、前記キメラ受容体の核酸配列は、マーカー配列をコードする核酸をさらに含む。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞傷害性リンパ球である。いくつかの実施形態においては、前記ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球は、セントラルメモリーＴ細胞であり、該セントラルメモリーＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋および／またはＣＤ８＋である。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞およびバルクＣＤ４＋Ｔ細胞からなる群から選択されるＣＤ４＋Ｔヘルパーリンパ球である。いくつかの実施形態においては、前記ＣＤ４＋ヘルパーリンパ球は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞であり、該ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋および／もしくはＣＤ４＋であり、かつ／またはＣＤ４５ＲＯ−である。いくつかの実施形態においては、組成物は宿主細胞を含む。いくつかの実施形態においては、前記組成物は、発現ベクターを含む宿主細胞を含む。いくつかの実施形態においては、前記発現ベクターはキメラ受容体の核酸配列を含む。
いくつかの実施形態においては、前記キメラ受容体の核酸配列は、
ａ）ＣＤ１７１を特異的標的としかつ／またはＣＤ１７１に特異的に結合するリガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチド、
ｂ）１００アミノ酸長未満（かつ１アミノ酸長以上または２アミノ酸長以上）の長さを有し、前記リガンド結合ドメインと前記キメラ受容体の膜貫通ドメインをつなぐポリペプチドスペーサーをコードするポリヌクレオチド、ならびに
ｃ）前記キメラ受容体の膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチド、および前記キメラ受容体の細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチド
を含む。
いくつかの実施形態においては、前記スペーサーはアミノ酸配列X1PPX2Pを含み、ここで、X1およびX2はそれぞれ独立して任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態においては、X1および／またはX2はシステインである。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、１５アミノ酸長未満（かつ１アミノ酸長以上または２アミノ酸長以上）である。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、１２アミノ酸長、１３アミノ酸長、１４アミノ酸長もしくは１５アミノ酸長、またはこれらの長さのいずれか２つによって定義される範囲にある長さである。いくつかの実施形態においては、前記スペーサー領域は、ヒト抗体のヒンジ領域の一部を含む。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、EPKSCDKTHTCPPCP（配列番号１７）、ERKCCVECPPCP（配列番号１８）、ELKTPLGDTHTCPRCP(EPKSCDTPPPCPRCP)3（配列番号１９）、ESKYGPPCPSCP（配列番号２０）、ESKYGPPCPPCP（配列番号２１）、YGPPCPPCP（配列番号５１）、KYGPPCPPCP（配列番号５２）、またはEVVKYGPPCPPCP（配列番号５３）を含むか、実質的にこれらの配列のいずれかからなるか、これらの配列のいずれかからなる。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、ESKYGPPCPSCP（配列番号２０）、ESKYGPPCPPCP（配列番号２１）、YGPPCPPCP（配列番号５１）、KYGPPCPPCP（配列番号５２）、またはEVVKYGPPCPPCP（配列番号５３）からなるか、実質的にこれらの配列のいずれかからなる。いくつかの実施形態においては、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ−４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、ＬＦＡ−１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３およびこれらの組み合わせからなる群から選択される共刺激ドメインと、ＣＤ３ζ全体またはその一部とを含む。いくつかの実施形態においては、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζの一部と４−１ＢＢの一部とを含む。いくつかの実施形態においては、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、別の共刺激分子の細胞内領域を含んでおらず、かつ／または、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＯＸ−４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、ＬＦＡ−１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＮＫＧ２ＣおよびＢ７−Ｈ３からなる群から選択される分子の細胞内シグナル伝達領域を含んでおらず、かつ／またはＣＤ２８の細胞内シグナル伝達領域を含んでいない。いくつかの実施形態においては、前記キメラ受容体の核酸配列は、マーカー配列をコードする核酸をさらに含む。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞傷害性リンパ球である。前記組成物の実施形態のいくつかにおいては、前記宿主細胞は、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞またはバルクＣＤ８＋Ｔ細胞から実質的になるＣＤ８＋細胞集団、またはこれらの細胞のいずれかが濃縮されたＣＤ８＋細胞集団を含む。いくつかの実施形態においては、前記ＣＤ８＋細胞集団は、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋および／またはＣＤ８＋のＣＤ８＋セントラルメモリーＴ細胞から実質的になるか、またはこの細胞が濃縮されたものである。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞およびバルクＣＤ４＋Ｔ細胞からなる群から選択されるＣＤ４＋Ｔヘルパーリンパ球から実質的になるＣＤ４＋細胞集団、またはこれらの細胞から選択されるＣＤ４＋Ｔヘルパーリンパ球が濃縮されたＣＤ４＋細胞集団を含む。いくつかの実施形態においては、前記ＣＤ４＋細胞集団は、実質的にＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４＋、および／またはＣＤ４５ＲＯ−のナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞からなるか、この細胞が濃縮されたものである。いくつかの実施形態においては、前記ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球は、セントラルメモリーＴ細胞であり、該セントラルメモリーＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋および／またはＣＤ８＋である。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞およびバルクＣＤ４＋Ｔ細胞からなる群から選択されるＣＤ４＋Ｔヘルパーリンパ球である。いくつかの実施形態においては、前記ＣＤ４＋ヘルパーリンパ球は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞であり、該ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋および／もしくはＣＤ４＋であり、かつ／またはＣＤ４５ＲＯ−である。いくつかの実施形態においては、前記組成物は、薬学的に許容される添加剤をさらに含む。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞はＴ細胞前駆細胞である。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は造血幹細胞である。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】末梢血単核細胞からのセントラルメモリーＴ細胞の単離を示す。Ａ）は、ＣＤ４マーカーおよびＣＤ８マーカーを有する細胞をプレソーティングしたフローサイトメトリープロファイルを示す。Ｂ）は、ＣＤ８を有する細胞をソーティングした後のフローサイトメトリープロファイルを示す。Ｃ）は、ＣＤ８＋細胞集団からＣＤ４５ＲＡ陽性細胞を除去した後のフローサイトメトリープロファイルを示す。Ｄ）は、ＣＤ８が濃縮され、ＣＤ４５ＲＡが除去され、ＣＤ４５ＲＯが濃縮され、かつＣＤ６２Ｌが濃縮された細胞集団のフローサイトメトリープロファイルを示す。
【００４９】
【図２Ａ】短いスペーサー、中程度の長さのスペーサーまたは長いスペーサーを有するＣＡＲ構築物で形質導入されたＣＤ８セントラルメモリー細胞のフローサイトメトリープロファイルを示す。抗CD171 CARの発現はＦ（ａｂ）結合性抗体で検出する。各パネルの挿入図は、ＣＤ８を発現し、かつ各構築物中に存在する末端切断型ＥＧＦＲを発現する細胞の、各細胞集団におけるパーセンテージを示す。パネル１は、Mock感染細胞であり、Ｆ（ａｂ）もＥＧＦＲｔも発現していない。パネル２は、ＣＤ８、ＥＧＦＲｔおよびＦ（ａｂ）の発現によって測定した短い構築物の発現量を示す。パネル３は、ＣＤ８、ＥＧＦＲｔおよびＦ（ａｂ）の発現によって測定した中程度の長さを有する構築物の発現量を示す。パネル４は、ＣＤ８、ＥＧＦＲｔおよびＦ（ａｂ）の発現によって測定した長い構築物の発現量を示す。ＣＤ８細胞における各構築物の発現量は、これらの構築物が短いスペーサー（パネル２）を有するのか、中程度の長さのスペーサー（パネル３）を有するのか、あるいは長いスペーサー（パネル４）を有するのかに関係なく同程度であった。
【００５０】
【図２Ｂ】抗ＣＤ３ζ鎖抗体を使用したウエスタンブロットを示す。短いスペーサー、中程度の長さのスペーサーまたは長いスペーサーを有する構築物の発現は、形質導入されたＣＤ８細胞において同程度であったことが示されている。レーン２は短い構築物の発現を示す。レーン３は中程度の長さの構築物の発現を示す。レーン４は長い構築物の発現を示す。
【００５１】
【図２Ｃ】Mock感染ＣＤ８細胞（●）、短いスペーサー（■）を有する構築物で形質導入されたＣＤ８細胞、中程度の長さのスペーサー（▲）を有する構築物で形質導入されたＣＤ８細胞、または長いスペーサー（▼）を有する構築物で形質導入されたＣＤ８細胞について、SK-N-BE2神経芽腫細胞株（Be2）または対照細胞株TMLに対する細胞溶解活性を分析した結果を示す（EBVにより形質転換されたTMLCLは、過去の報告に従って（Pelloquin F, Lamelin JP, Lenoir GM. In vitro cell dev biol 1986; 22(12):689-694）PBMCから作製した）。パネル１は、これらのＣＤ８細胞が対照細胞株TMLに対して細胞溶解活性を有していないことを示す。挿入図は、対照TML細胞株がCD171を発現していないことを示す。パネル２は、長い構築物（▼）で形質導入された細胞は、中程度の長さの構築物（▲）または短い構築物（■）で形質導入された細胞よりも効果的にCD171発現神経芽腫細胞を殺傷することを示す。挿入図は、神経芽腫細胞株Be2がCD171を発現していることを示す。パネル３は、ＣＤ３（Ｏｋｔ３）抗原を標的とすることができ、かつ／またはこの抗原に特異的なＣＤ８細胞を各構築物で形質導入した後、このＣＤ８細胞と対照TML細胞とをインキュベートしたところ、構築物が含まれていたにもかかわらず、ＣＤ３と標的することができかつ／またはＣＤ３に特異的なこのエフェクター細胞によって対照TML細胞が殺傷されたことを示す。
【００５２】
【図２Ｄ】短いスペーサーを有する構築物、中程度の長さのスペーサーを有する構築物または長いスペーサーを有する構築物で形質導入されたＣＤ８細胞をBe2神経芽腫細胞または対照TMLと接触させた場合の、該ＣＤ８細胞によるサイトカインの産生を示す。パネル１は、長いスペーサーで形質導入されたＣＤ８細胞（Ｌ）をBe2神経芽腫細胞と接触させると、このＣＤ８細胞（Ｌ）は、中程度の長さのスペーサーで形質導入されたＣＤ８細胞（Ｉ）や短いスペーサーで形質導入されたＣＤ８細胞（Ｓ）よりも多量のＩＦＮ−γを産生したことを示す。パネル２は、長いスペーサーで形質導入されたＣＤ８細胞（Ｌ）をBe2神経芽腫細胞と接触させると、このＣＤ８細胞（Ｌ）は、中程度の長さのスペーサーで形質導入されたＣＤ８細胞（Ｉ）や短いスペーサーで形質導入されたＣＤ８細胞（Ｓ）よりも多量のＩＬ−２を産生したことを示す。パネル３は、長いスペーサーで形質導入されたＣＤ８細胞（Ｌ）をBe2神経芽腫細胞と接触させると、このＣＤ８細胞（Ｌ）は、中程度の長さのスペーサーで形質導入されたＣＤ８細胞（Ｉ）や短いスペーサーで形質導入されたＣＤ８細胞（Ｓ）よりも多量のＴＮＦ−αを産生したことを示す。
【００５３】
【図２Ｅ】神経芽腫の頭蓋内異種移植腫瘍ＮＳＧマウスモデルにおける腫瘍生存期間および腫瘍細胞の増殖を示す。左のグラフでは、短い構築物で形質導入されたＣＤ８細胞により治療されたマウスの標識神経芽腫細胞（一番下の線）は、長い構築物で形質導入されたＣＤ８細胞により治療されたマウス（上から二番目の線）や偽形質導入Ｔ細胞により治療された対照マウス（一番上の線）と比較して、標識の発現がほとんど見られなかった。右のグラフは、短いスペーサー領域、中程度の長さのスペーサー領域または長いスペーサー領域で形質導入されたＣＤ８細胞による治療を行った後の、神経芽腫異種移植片を有するマウスの生存期間を示す。短いスペーサーを有する構築物で形質導入されたＣＤ８細胞で治療したマウス（一番上の線）は、中程度の長さのスペーサー（二番目の線）または長いスペーサー（上から三番目の線）を有する構築物で形質導入されたＣＤ８細胞で治療したマウスよりもはるかに長期間にわたって生存した。
【００５４】
【図２Ｆ】長いスペーサーを有する構築物で形質導入されたＣＤ８細胞により治療したマウスでは、腫瘍内のＣＤ３＋細胞の数が多かったことを示す。
【００５５】
【図２Ｇ】長いスペーサーを有する構築物で形質導入されたＣＤ８細胞により治療されたマウスでは、カスパーゼ３の腫瘍内発現量が多かったことを示す。
【００５６】
【図３】図３Ａ、図３Ｂおよび図３Ｃは、２４時間にわたって腫瘍細胞に暴露させた後（１回目）の形質導入ＣＡＲ Ｔ細胞の活性化状態および生存能；１回目の細胞培養物からＴ細胞を回収し、新しい培地に移して、さらに２４時間培養した後（２回目）の形質導入ＣＡＲ Ｔ細胞の活性化状態および生存能；２回目の細胞培養物からＴ細胞を回収し、新しい培地に移して、さらに２４時間培養した後（３回目）の形質導入ＣＡＲ Ｔ細胞の活性化状態および生存能を示す。各段階に移行する際に、生存Ｔ細胞の数は、種々のＴ細胞株間で同じ細胞数とした。
【００５７】
【図３Ａ】各段階に移行する際に、長いスペーサー領域（Ｌ）を有する構築物で形質導入されたＣＤ８細胞は、短いスペーサー（Ｓ）を有する構築物で形質導入されたＣＤ８細胞よりも、活性化されたＣＤ２５／ＣＤ６９細胞表面マーカーを有する細胞の割合（％）が高かったことを示す。
【００５８】
【図３Ｂ】長いスペーサー領域（▼）または中程度の長さのスペーサー領域（▲）を有する構築物で形質導入されたＣＤ８細胞は、短いスペーサー（■）を有する構築物で形質導入されたＣＤ８細胞よりも、死細胞の割合（％）が多かったことを示す（上から２つの線）。
【００５９】
【図３Ｃ】長いスペーサー領域または中程度の長さのスペーサー領域を有する構築物で形質導入されたＣＤ８細胞は、短いスペーサーを有する構築物で形質導入されたＣＤ８細胞よりも、より多くのＦａｓＲの発現を腫瘍細胞において誘導したことを示す。
【００６０】
【図４】図４Ａ、図４Ｂ、図４Ｃ、図４Ｄ、図４Ｅおよび図４Ｆは、短いスペーサー領域とＣＤ２８由来のさらなる細胞内シグナル伝達領域とを有するＣＡＲ構築物で形質導入されたＣＤ８セントラルメモリーＴ細胞を示す。このように構成されたＣＡＲ構築物は、ＣＤ２８由来の共刺激シグナル伝達領域および４−１ＢＢ由来の共刺激シグナル伝達領域、ならびにＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む。
【００６１】
【図４Ａ】CD28cyto/4-1BB共刺激ドメインを有するＣＡＲ構築物または4-1BB共刺激ドメインを有する構築物で形質導入されたＣＤ８セントラルメモリー細胞のフローサイトメトリープロファイルを示す。抗CD171 ＣＡＲの発現はＦ（ａｂ）結合性抗体で検出する。各パネルの挿入図は、CD8を発現し、かつ各構築物中に存在する末端切断型ＥＧＦＲを発現する細胞の、各細胞集団におけるパーセンテージを示す。パネル１は、Mock感染細胞であり、Ｆ（ａｂ）もＥＧＦＲｔも発現していない。パネル２は、ＣＤ８、ＥＧＦＲｔおよびＦ（ａｂ）の発現によって測定した4-1BB共刺激ドメインを有する短い構築物の発現量を示す。パネル３は、ＣＤ８、ＥＧＦＲｔおよびＦ（ａｂ）の発現によって測定したCD28cyto/4-1BB共刺激ドメインを有する短い構築物の発現量を示す。ＣＤ８細胞における各構築物の発現量は同程度であった。
【００６２】
【図４Ｂ】短いスペーサー、4-1BB共刺激ドメインおよびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む構築物で形質導入されたＣＤ８細胞、ならびに、短いスペーサー、CD28cyto共刺激ドメイン、4-1BB共刺激ドメインおよびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む構築物で形質導入されたＣＤ８細胞について、SK-N-BE2神経芽腫細胞株（Be2）に対する細胞溶解活性を分析した結果を示す。グラフは、CD28cyto共刺激ドメインを有する構築物で形質導入された細胞（一番上の線、◆）は、CD28cytoを含んでいない構築物で形質導入された細胞（上から２番目の線、▼）よりも効果的にCD171発現神経芽腫細胞を殺傷することを示す。
【００６３】
【図４Ｃ】形質導入されたＴ細胞をBe2神経芽腫細胞または対照TMLと接触させた場合の、該形質導入Ｔ細胞によるサイトカインの産生を示す。短いスペーサー、4-1BB共刺激ドメインおよびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む構築物で形質導入されたＣＤ８細胞、または短いスペーサー、CD28cyto共刺激ドメイン、4-1BB共刺激ドメインおよびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む構築物で形質導入されたＣＤ８細胞を、Be2細胞またはTML細胞と接触させる。グラフは、CD28cyto共刺激ドメインを含む構築物で形質導入されたＣＤ８細胞（CD28cyto）をBe2細胞と接触させると、このＣＤ８細胞（CD28cyto）は、CD28cyto共刺激ドメインを含んでいない構築物で形質導入されたＣＤ８細胞（4-1BB）よりも多量のＩＦＮ−γを産生したことを示す。
【００６４】
【図４Ｄ】神経芽腫の頭蓋内異種移植腫瘍ＮＳＧマウスモデルにおける腫瘍生存期間および腫瘍細胞の増殖を示す。グラフは、短いスペーサー、4-1BB共刺激ドメインおよびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む構築物で形質導入されたＣＤ８細胞（4-1BB）、または短いスペーサー、CD28cyto共刺激ドメイン、4-1BB共刺激ドメインおよびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む構築物で形質導入されたＣＤ８細胞（CD28cyto）による治療を行った後の、神経芽腫異種移植片を有するマウスの生存期間を示す。CD28cyto共刺激ドメインを含んでいない構築物で形質導入されたＣＤ８細胞（4-1BB）で治療したマウスは、CD28cyto共刺激ドメインを含む構築物で形質導入された細胞（CD28cyto）で治療したマウスよりも生存期間が延長した。
【００６５】
【図４Ｅ】２４時間にわたって腫瘍細胞に暴露させた後（１回目）の形質導入ＣＡＲ Ｔ細胞の活性化状態および生存能；１回目の細胞培養物からＴ細胞を回収し、新しい培地に移して、さらに２４時間培養した後（２回目）の形質導入ＣＡＲ Ｔ細胞の活性化状態および生存能；２回目の細胞培養物からＴ細胞を回収し、新しい培地に移して、さらに２４時間培養した後（３回目）の形質導入ＣＡＲ Ｔ細胞の活性化状態および生存能を示す。グラフは、CD28cyto共刺激ドメインを有する構築物で形質導入されたＣＤ８細胞（CD28cyto）は、CD28cyto共刺激ドメインを含んでいない構築物で形質導入されたＣＤ８細胞（4-1BB）よりも、活性化されたCD25/CD69細胞表面マーカーを有する細胞の割合（％）が高かったことを示す。
【００６６】
【図４Ｆ】CD28cyto共刺激ドメインを有する構築物で形質導入されたＣＤ８細胞（▲）は、CD28cyto共刺激ドメインを含んでいない構築物で形質導入されたＣＤ８細胞（■）よりも、死細胞の割合（％）が高かったことを示す。
【００６７】
【図５】Ce7scFv-IgG4hinge-CH2-CH3-CD28tm/4-1BB-ζ-T2A-EGFRt-epHIV7（長い構築物）の配列（配列番号５４）を示す。波線は、この構築物の各成分のコード配列の開始と終了を示す。
【００６８】
【図６】Ce7scFv-IgG4hinge-CH2-CH3-CD28tm/4-1BB-ζ-T2A-EGFRt-epHIV7（長い構築物）の配列を含むプラスミドマップを示す。
【００６９】
【図７】CE7scFv-IgG4hinge-CH3-CD28tm/4-1BB-ζ-T2A-EGFRt-epHIV7（中程度の長さの構築物）の配列（配列番号５５）を示す。波線は、この構築物の各成分のコード配列の開始と終了を示す。
【００７０】
【図８】CE7scFv-IgG4hinge-CH3-CD28tm/4-1BB-ζ-T2A-EGFRt-epHIV7（中程度の長さの構築物）の配列を含むプラスミドマップを示す。
【００７１】
【図９】CE7scFv-IgG4hinge-CD28tm/4-1BB-ζ-T2A-EGFRt-epHIV7（短い構築物）の配列（配列番号５６）を示す。波線は、この構築物の各成分のコード配列の開始と終了を示す。
【００７２】
【図１０】CE7scFv-IgG4hinge-CD28tm/4-1BB-ζ-T2A-EGFRt-epHIV7（短い構築物）の配列をコードするプラスミドマップを示す。
【００７３】
【図１１】２つの共刺激ドメインを有する構築物であるCE7scFv-IgG4hinge-CD28tm/cyto-4-1BB-ζ-T2A-EGFRt-epHIV7（短い構築物）の配列（配列番号５７）を示す。波線は、この構築物の各成分のコード配列の開始と終了を示す。
【００７４】
【図１２】２つの共刺激ドメインを有する構築物であるCE7scFv-IgG4hinge-CD28tm/cyto-4-1BB-ζ-T2A-EGFRt-epHIV7（短い構築物）の配列を含むプラスミドマップを示す。
【００７５】
【図１３】図１３Ａ〜図１３Ｈは、ＣＡＲの細胞外スペーサーによって、ＣＤ８＋発現ＣＴＬの抗腫瘍エフェクター作用を調節できることを示す。図１３Ａは、CD171特異的かつ／または標的２Ｇ−ＣＡＲ細胞外ドメインスペーサーバリアントの概略図を示す。図１３Ｂは、ヒトＣＤ８＋ＴＥ（ＣＭ）の細胞表面における２Ｇ ＳＳ、２Ｇ ＭＳまたは２Ｇ ＬＳスペーサーバリアントの発現を抗マウスＦＡＢにより検出した結果、およびヒトＣＤ８＋ＴＥ（ＣＭ）の細胞表面におけるＥＧＦＲｔの発現をセツキシマブにより検出した結果を示す。図１３Ｃは、ＣＤ３−ζ特異的ウエスタンブロットで検出した２Ｇ−ＣＡＲの発現レベルを示す。図１３Ｄは、CD171＋Be2神経芽腫腫瘍細胞との共培養をＥ：Ｔ比＝１：１で行った場合の、２Ｇ−ＣＡＲにより誘導されたホスホＥＲＫ発現レベルを示す（各条件あたりｎ≧３）。図１３Ｅは、図１３Ｄと同様にして腫瘍細胞と共培養を行った場合の、２Ｇ−ＣＡＲの活性化により誘導されたＣＤ１３７の表面発現を示す。図１３Ｆは、４時間クロム放出アッセイによって測定された、スペーサーバリアントを有する２Ｇ−ＣＡＲ ＣＴＬの抗腫瘍溶解活性を示す。ＳＳ ２Ｇ−ＣＡＲ ＣＴＬと比較して、Ｅ：Ｔ比＝１０：１におけるＬＳスペーサーおよびＭＳスペーサーの特異的溶解性が何倍であったかを示した。図１３Ｇは、２Ｇ−ＣＡＲ ＣＴＬと腫瘍細胞（Be2）を混合培養した場合のサイトカイン分泌刺激を示す（各条件あたり、ｎ≧５）。ＳＳ ２Ｇ−ＣＡＲと比較して、サイトカインの産生が何倍であったかを示した。図１３Ｈでも同様である。
【００７６】
【図１４】図１４Ａ〜図１４Ｈは、ＣＡＲスペーサー依存的なＣＴＬのインビトロにおける機能的作用とインビボにおける抗腫瘍活性とに負の相関が見られることを示す。図１４Ａは、神経芽腫の頭蓋内異種移植片ＮＳＧマウス治療モデルの概略、および定位移植後の＋６日目におけるffLuc+Be2腫瘍のバイオフォトニックシグナルを示す。図１４Ｂは、腫瘍内注入された2G-CAR CD8+TE(CM)スペーサーバリアントに対するBe2腫瘍のバイオフォトニックシグナル応答を示す（マウス１群あたりｎ＝６）。ＬＳ ２Ｇ−ＣＡＲ群は、腫瘍による苦痛からマウスを解放するため２０日目に安楽死させた。図１４Ｃは、図１４Ｂにおいて治療を行った群のカプラン・マイヤー生存曲線を示す。図１４Ｄは、腫瘍関連症状の進行時における腫瘍内２Ｇ−ＣＡＲ Ｔ細胞の定量を示す。ヒトＣＤ３＋細胞を計数することによってＴ細胞密度を求め、４０ｈｐｆあたりの総細胞数として報告した（個々の腫瘍分析を代表するデータを示す）。図１４Ｅは、頭蓋内注射したBe2異種移植片を有するＮＳＧマウスを２Ｇ−ＣＡＲ ＣＴＬにより治療し、ＩＨＣ／ＩＦ検査を行った場合の、ＮＳＧマウスからの腫瘍の検索の時系列を示す。図１４Ｆ１および図１４Ｆ２は、共局在させたＳＳ ２Ｇ−ＣＡＲ ＣＴＬにおけるＣＤ３、Ｋｉ６７および活性化型カスパーゼ３の共染色を示す、腫瘍および対側半球の典型的なＩＦ像を示す。図１４Ｇは、腫瘍内移植の３日後において持続していた２Ｇ−ＣＡＲスペーサーバリアントＣＴＬのＩＦ定量を示す。Ｎ数は、図１４Ｄと同様に、４０ｈｐｆあたりのヒトＣＤ３＋総細胞数である。図１４Ｈは、グランザイムＢ（左パネル）、Ｋｉ６７（中央のパネル）および活性化型カスパーゼ３（右パネル）を共発現するＣＤ３＋Ｔ細胞のパーセンテージを示す（ｎ＝平均細胞数／４０ｈｐｆ、２匹の移植マウスの分析から得られた値を示す）。
【００７７】
【図１５】図１５Ａ〜図１５Ｈは、インビトロにおいて抗原への暴露を繰り返すことによって、ＣＡＲスペーサーの長さに依存してＦａｓＬ媒介性ＡＩＣＤの程度が様々に変化することを示す。図１５Ａは、腫瘍細胞による反復刺激を実施した場合の、ＣＡＲ Ｔ細胞の機能および生存能を分析するためのインビトロにおけるストレステストアッセイの概要を示す。図１５Ｂは、２Ｇ−ＣＡＲの移動を連続して複数回行った後に残存していた生存fLuc+Be2腫瘍細胞の定量を示す（腫瘍生存能（％）＝３つの独立した実験の平均値）。図１５Ｃは、エフェクター細胞：刺激細胞の比（Ｅ：Ｓ）＝１：１においてBe2細胞との共培養を連続して複数回行った後の、CD25およびCD69の表面発現をフローサイトメトリーで定量した結果を示す（CD25+CD69+値（％）＝２つの独立した実験の平均値）。図１５Ｄは、各回の培養後における、Guava Viacountアッセイによる２Ｇ−ＣＡＲ Ｔ細胞の生存率の測定を示す。死滅したＴ細胞の割合（％）は図１５Ｃと同様にして得た。図１５Ｅは、Be2とともに８時間共培養を行う前および共培養を行った後におけるFasL+2G-CAR CTLの頻度を示す（Ｅ：Ｓ＝１：１、各データ点は独立した実験に由来する）。図１５Ｆは、MS 2G-CARスペーサーバリアントとの共培養およびLS 2G-CARスペーサーバリアントとの共培養を行った際のFasL mRNAの転写をrt-qPCRにより測定し、β−アクチンに対して正規化して求めた誘導倍率をSS 2G-CAR CTLと比較した結果を示す（５つの独立した実験の平均値）。図１５Ｇは、Be2との共培養を１６時間行った後の活性化型カスパーゼ３＋２Ｇ−ＣＡＲ ＣＴＬの頻度を示す（Ｅ：Ｓ＝１：１、測定値＝４つの独立した実験の平均値）。図１５Ｈは、３回目の培養の後のLS 2G-CAR CTLにおけるアポトーシス誘導に対するFasまたはFasLのsiRNAノックダウンの影響を示す。３つの独立した実験で行ったGuava Viacountアッセイによって平均生存率を求めた（「１＋」の条件はMockを使用してエレクトロポレーションを行ったＴ細胞を示し、「ｓｃｒ」条件はスクランブルｓｉＲＮＡを示す）。
【００７８】
【図１６】図１６Ａ〜図１６Ｆは、第三世代のＣＤ２８：４−１ＢＢ：ζ細胞内ドメインを介した共刺激の増強によって、増強されたエフェクター機能効果がインビトロで得られることを示す。図１６Ａは２Ｇ−ＣＡＲの構成と３Ｇ−ＣＡＲの構成を比較した概略図を示す。図１６Ｂは、ヒトＣＤ８＋ＴＥ（ＣＭ）の細胞表面における２Ｇ−ＣＡＲ（ＳＳ）の発現および３Ｇ−ＣＡＲ（ＳＳ）の発現を抗マウスＦＡＢにより検出して比較した結果、ならびにヒトＣＤ８＋ＴＥ（ＣＭ）の細胞表面におけるＥＧＦＲｔの発現をセツキシマブにより検出した結果示す。図１６Ｃは、ＣＤ３−ζ特異的ウエスタンブロットで検出した２Ｇ−ＣＡＲ（ＳＳ）および３Ｇ−ＣＡＲ（ＳＳ）の発現レベルを示す。図１６Ｄは、腫瘍細胞との共培養を行った場合の、２Ｇ−ＣＡＲ（ＳＳ）の活性化により誘導されたＣＤ１３７の表面発現と３Ｇ−ＣＡＲ（ＳＳ）の活性化により誘導されたＣＤ１３７の表面発現との比較を示す。図１６Ｅは、４時間クロム放出アッセイによって測定された、２Ｇ−ＣＡＲ（ＳＳ）ＣＴＬの抗腫瘍溶解活性と３Ｇ−ＣＡＲ（ＳＳ）ＣＴＬの抗腫瘍溶解活性との比較を示す。ＳＳ−２Ｇ ＣＴＬと比較して、Ｅ：Ｔ比＝１０：１におけるＳＳ−３Ｇ ＣＴＬの特異的溶解性が何倍であったかを示した（３つの独立した実験の平均値）。図１６Ｆは、２Ｇ−ＣＡＲ（ＳＳ）ＣＴＬと腫瘍細胞（Be2）を共培養した場合のサイトカイン分泌刺激と、３Ｇ−ＣＡＲ（ＳＳ）ＣＴＬと腫瘍細胞（Be2）を共培養した場合のサイトカイン分泌刺激との比較を示す（１条件あたり、ｎ≧６）。図１６Ｅと同様に、２Ｇ−ＣＡＲ（ＳＳ）と比較して、サイトカイン産生が何倍であったかを示した。
【００７９】
【図１７】図１７Ａ〜図１７Ｄは、3G-CAR(SS)CTLはインビボにおいて抗腫瘍活性の増強を示さないことを示す。図１７Ａは、Be2を移植したＮＳＧマウスを2G-CAR(SS)CTLで治療した場合と3G-CAR(SS)CTLで治療した場合とを比較したカプラン・マイヤー生存曲線を示す（１群あたりｎ＝５〜６、偽形質導入ＣＴＬ対照を黒色で示した）。図１７Ｂは、図１７Ａと同様にして治療したSK-N-DZ移植マウスのカプラン・マイヤー生存曲線を示す。図１７Ｃは、養子移入の３日後における2G-CAR(SS)T細胞の腫瘍内での持続性と3G-CAR(SS)T細胞の腫瘍内での持続性との比較を示す。Ｎ数は、別個に得られた２つ腫瘍試料の４０ｈｐｆあたりのＣＤ３＋細胞の数である。図１７Ｄは、図１７Ｃで示した、グランザイムＢ ＣＤ３＋ＣＴＬ（左パネル）および活性化型カスパーゼ３＋CD3+CTL（右パネル）のＩＦ検出を示す。
【００８０】
【図１８】図１８Ａ〜図１８Ｅは、インビトロにおいて繰り返し抗原に暴露させた場合、短い細胞外ドメインスペーサーを有するＣＡＲの細胞内シグナル伝達によって、ＦａｓＬ媒介性ＡＩＣＤに様々な変化が生じたことを示す。図１８Ａは、Ｅ：Ｓ比＝１：１においてBe2細胞との共培養を連続して複数回行った後、CD25およびCD69の表面発現をフローサイトメトリーで定量し、2G-CAR(SS)CTLと3G-CAR(SS)CTLとで比較した結果を示す（CD25+CD69+値（％）は、２回の独立した実験の平均値として得た）。図１８Ｂは、各回の腫瘍との共培養後にGuava ViacountアッセイによるＴ細胞の生存率の測定を行い、2G-CAR(SS)T細胞の生存率と3G-CAR(SS)T細胞の生存率とを比較した結果を示す。死滅したＴ細胞の割合（％）は前記と同様にして得た。図１８Ｃは、Ｅ：Ｓ比＝１：１で、Be2細胞ともに８時間共培養を行う前および共培養を行った後におけるFasL+2G-CAR(SS)CTLの頻度とFasL+3G-CAR(SS)CTLの頻度との比較を示す（各データ点は、2G-CARスペーサーバリアントあたり５つの独立した実験に由来する）。図１８Ｄは、2G-CAR(SS)CTLまたは3G-CAR(SS)CTLを共培養した際の、FasL mRNAの転写をrt-qPCRにより測定し、β−アクチンに対して正規化して求めた誘導倍率を2G-CAR(SS)CTLと3G-CAR(SS)CTLとで比較した結果を示す（５つの独立した実験の平均値）。図１８Ｅは、Ｅ：Ｓ比＝１：１においてBe2との共培養を１６時間行った後の、細胞質ゾル内の活性化型カスパーゼ３＋2G-CAR(SS)CTLの頻度と細胞質ゾル内の活性化型カスパーゼ３＋3G-CAR(SS)CTLとの比較を示す（４つの独立した実験の平均値）。図１８Ｃと同様にして、FasL+CD3+CTL（図１８Ｄ）および活性化型カスパーゼ３＋CD3+CTL（図１８Ｅ）を示す。
【００８１】
【図１９】図１９Ａ〜図１９Ｃは、様々なスペーサーバリアント２Ｇ−ＣＡＲを有するレンチウイルスで形質導入した後に増殖させ、単離された種々のCD45RO+CD62L+ヒトＴｃｍでの表現型の類似性を示す。図１９Ａは、実験で使用する前に行った、CD8 TCMの単離、形質導入および拡大培養の時系列を示す。図１９Ｂは、PBMCからのCD8+TCM細胞（CD45RO+CD62L+）の免疫磁気単離方法およびその純度を示す。図１９Ｃは、実験に使用した際の、2G-CARの種々のスペーサーバリアントで形質導入されたCD8+TE(CM)の表現型を示す。
【００８２】
【図２０】図２０Ａ〜図２０Ｄは、CD171lowのSK-N-DZヒト神経芽腫異種移植片に対するCD171特異的かつ／または標的2G-CARスペーサーバリアントCD8+TE(CM)CTLのインビトロおよびインビボにおける抗腫瘍活性を示す。図２０Ａは、４時間クロム放出アッセイ（ＣＲＡ）におけるSK-N-DZに対する2G-CARスペーサーバリアントの溶解作用を示す。図２０Ｂは、スペーサーバリアント2G-CAR CTLのSK-N-DZに対するＩＦＮ−γ分泌刺激を示す。図２０Ｃは、腫瘍内注入された2G-CAR(SS、MSまたはLS)CD8+TE(CM)に対するSK-N-DZ腫瘍のバイオフォトニックシグナル応答を示す（１群あたりｎ＝５）。図２０Ｄは、治療を行った群のカプラン・マイヤー生存曲線を示す。
【００８３】
【図２１】siRNAノックダウン後のFasおよびFasLの発現を示す。パネルＡは、スクランブル（scr）siRNAで処理したLS 2G-CAR CTLと比較した、FasのsiRNAノックダウン後におけるFas+LS 2G-CAR CTLの頻度を示す（Fas＋値（％）は４つの独立した実験の平均値である）。パネルＢは、パネルＡにおけるFasのsiRNAノックダウン後のFasL+LS 2G-CAR CTLの頻度を示す。
【発明を実施するための形態】
【００８４】
特に記載がない限り、本明細書で使用されている技術用語および科学用語はいずれも、本発明が属する技術分野における当業者によって一般的に理解される意味を有すると見なされる。
【００８５】
本明細書に記載の「活性化」は、検出可能な細胞増殖、サイトカイン産生、細胞表面マーカーの発現（たとえばＣＤ６９やＣＤ２５など）、または検出可能なエフェクター機能を誘導するように、Ｔ細胞が十分に刺激されている状態を指す。
【００８６】
本明細書に記載の「活性化誘導細胞死」は、Ｔ細胞が活性化されているものの、２世代を超えて増殖することはできず、かつアポトーシスマーカーを発現していることを指す。
【００８７】
「本明細書に記載の「抗原」または「Ａｇ」は、免疫応答を引き起こす分子を指す。この免疫応答は、抗体産生もしくは特異的な免疫担当細胞の活性化、またはこれらの両方を包含してもよい。抗原が組換え技術により作製、合成および産生可能であること、または生体サンプルから得ることができることは容易に理解される。そのような生体サンプルとしては、組織サンプル、腫瘍サンプル、細胞または体液が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８８】
本明細書に記載の「抗腫瘍効果」は、腫瘍体積の減少、腫瘍細胞数の減少、転移巣の減少、余命の延長、またはがん症状と関連した種々の生理学的症候の減少によって示される生物学的効果を指す。また、「抗腫瘍効果」は再発の減少または再発までの時間の延長によって示すことができる。
【００８９】
本明細書に記載の「キメラ受容体」は、抗体配列または他のタンパク質配列に由来するリガンド結合ドメインを含む合成設計された受容体を指し、該リガンド結合ドメインは、上記疾患または障害に関連する分子と結合し、Ｔ細胞受容体またはその他の受容体の細胞内シグナル伝達ドメイン（たとえば共刺激ドメイン）の１つ以上とスペーサードメインを介して連結されている。キメラ受容体は、人工Ｔ細胞受容体、キメラＴ細胞受容体、キメラ免疫受容体、あるいはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）とも呼ぶことができる。ＣＡＲは、任意の特異性を免疫受容体細胞に付与することが可能な遺伝子改変受容体である。研究者によっては、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、抗体または抗体フラグメント、スペーサー、シグナル伝達ドメインおよび膜貫通領域を含むものであると考えられている。しかしながら、ＣＡＲの様々な成分すなわちドメイン（たとえばエピトープ結合領域（たとえば、抗体フラグメント、ｓｃＦｖまたはそれらの一部）、スペーサー、膜貫通ドメインおよび／またはシグナル伝達ドメインなど）は改変されており、この改変によって驚くべき効果が得られたことから、本明細書に開示されている実施形態のいくつかにおいてはＣＡＲの構成要素は個々に独立している。ＣＡＲが様々な特徴を有することから、たとえば、特定のエピトープに対しての結合親和性がさらに強くなることがある。
【００９０】
本明細書に記載の「共刺激ドメイン」は、たとえばＴＣＲ／ＣＤ３複合体のＣＤ３ζ鎖によって提供される一次シグナルに加えて、活性化、増殖、分化、サイトカイン分泌などの（ただしこれらに限定されない）Ｔ細胞応答を媒介するシグナルをＴ細胞に提供するシグナル伝達部分を指す。共刺激ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３などの分子全体、および／またはＣＤ８３と特異的に結合するもしくはＣＤ８３を標的とするリガンド全体、またはこれらの分子やリガンドの一部を含んでいてもよいが、これらに限定されない。いくつかの実施形態においては、共刺激ドメインは、他の細胞内メディエーターと相互作用することによって、活性化、増殖、分化、サイトカイン分泌などの細胞応答を媒介する細胞内シグナル伝達ドメインである。
【００９１】
本明細書において「コードする」は、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡなどのポリヌクレオチド中の特定のヌクレオチド配列が、特定のアミノ酸配列などの別の巨大分子を合成する際にテンプレートとして機能する特性を指す。したがって、ある遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写および翻訳がなされた結果、細胞または他の生物系においてタンパク質が産生された場合、その遺伝子はタンパク質をコードすると言える。「ポリペプチドをコードする核酸配列」は、同じアミノ酸配列をコードするあらゆる縮重ヌクレオチド配列を包含する。
【００９２】
本明細書に記載の「細胞傷害性Ｔリンパ球」（ＣＴＬ）は、表面上にＣＤ８を発現するＴリンパ球（たとえば、ＣＤ８＋発現Ｔ細胞（ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＣＤ８ Ｔ細胞とも呼ばれ、これらの用語は同じ意味で用いられる））を指す。いくつかの実施形態において、そのような細胞は、抗原を経験したことのある「メモリー」Ｔ細胞（ＴＭ細胞）であることが好ましい。上記と同様に、ＣＤ４＋発現Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ４ Ｔ細胞とも呼ばれ、これらの用語は同じ意味で用いられる。
【００９３】
本明細書に記載の「セントラルメモリー」Ｔ細胞（または「ＴＣＭ」）は、抗原を経験したＣＴＬであり、ナイーブ細胞と比較して、その表面上にＣＤ６２ＬまたはＣＣＲ−７、および／またはＣＤ４５ＲＯを発現するが、ＣＤ４５ＲＡを発現していないか、ＣＤ４５ＲＡの発現が低下しているＣＴＬを指す。いくつかの実施形態において、セントラルメモリー細胞は、ナイーブ細胞と比較して、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ１２７、ＣＤ４５ＲＯ、および／もしくはＣＤ９５の発現が陽性であり、かつ／またはＣＤ５４ＲＡの発現が低下している。
【００９４】
本明細書に記載の「エフェクターメモリー」Ｔ細胞（または「ＴＥＭ」）は、抗原を経験したＴ細胞であり、セントラルメモリー細胞と比較して、その表面上にＣＤ６２Ｌを発現していないか、ＣＤ６２Ｌの発現が低下しており、ナイーブ細胞と比較して、ＣＤ４５ＲＡを発現していないか、ＣＤ４５ＲＡの発現が低下しているＴ細胞を指す。いくつかの実施形態において、エフェクターメモリー細胞は、ナイーブ細胞またはセントラルメモリー細胞と比較して、ＣＤ６２Ｌおよび／またはＣＣＲ７の発現が陰性であり、ＣＤ２８および／またはＣＤ４５ＲＡの発現が陽性であっても陰性であってもよい。
【００９５】
本明細書に記載の「ナイーブ」Ｔ細胞は、抗原を経験していないＴリンパ球であり、セントラルメモリー細胞またはエフェクターメモリー細胞と比較して、ＣＤ６２Ｌおよび／もしくはＣＤ４５ＲＡを発現しており、かつ／またはＣＤ４５ＲＯを発現していないＴリンパ球を指す。いくつかの実施形態において、ナイーブＣＤ８＋Ｔリンパ球は、ナイーブＴ細胞の表現型マーカーの発現によって特徴付けられ、ナイーブＴ細胞の表現型マーカーとしては、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ１２７、および／またはＣＤ４５ＲＡが挙げられる。
【００９６】
本明細書に記載の「エフェクター」Ｔ細胞または「ＴＥ」Ｔ細胞は、抗原を経験した細胞傷害性Ｔリンパ球であり、セントラルメモリー細胞またはナイーブＴ細胞と比較して、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、および／もしくはＣＤ２８を発現していないか、またはＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、および／もしくはＣＤ２８の発現が低下しており、かつ／またはグランザイムＢ陽性および／またはパーフォリンに陽性であるＴリンパ球を指す。
【００９７】
本明細書に記載の「Ｔ細胞前駆細胞」は、胸腺へと遊走して、Ｔ細胞前駆細胞となり得るリンパ球前駆細胞を指し、Ｔ細胞前駆細胞はＴ細胞受容体を発現しない。すべてのＴ細胞は、骨髄中の造血幹細胞に由来する。造血幹細胞由来の造血前駆細胞（リンパ球系前駆細胞）は胸腺に移行し、細胞分裂により増殖し、未熟な胸腺細胞の大集団を作り出す。最も初期の胸腺細胞はＣＤ４もＣＤ８も発現せず、したがって、ダブルネガティブ（ＣＤ４−ＣＤ８−）細胞に分類される。これらは成長により発達し、ダブルポジティブ胸腺細胞（ＣＤ４＋ＣＤ８＋）となり、最終的にシングルポジティブ（ＣＤ４＋ＣＤ８−またはＣＤ４−ＣＤ８＋）胸腺細胞に成熟して、その後、胸腺から末梢組織に放出される。
【００９８】
胸腺細胞の約９８％は、胸腺での発達過程においてポジティブ選択およびネガティブ選択により選抜されずに死滅し、残りの２％が生存して胸腺を去り、成熟した免疫担当Ｔ細胞になる。
【００９９】
Ｔ細胞前駆細胞は、ダブルネガティブ（ＤＮ）段階においては主に機能的β鎖を産生し、ダブルポジティブ（ＤＰ）段階では主に機能的α鎖を産生し、その結果、最終的に機能性αβ Ｔ細胞受容体を産生する。４つのＤＮ段階（ＤＮ１、ＤＮ２、ＤＮ３およびＤＮ４）を経て胸腺細胞が発達するに従って、Ｔ細胞はインバリアントα鎖を発現するが、β鎖の遺伝子は再編成される。再編成されたβ鎖がインバリアントα鎖と対を為すことに成功した場合、β鎖の再編成を止めるシグナルが産生され（さらに、もう一方のアレルが抑制され）、細胞の増殖が起こる。これらのシグナルが産生されるには、この前駆ＴＣＲが細胞表面上に発現されていなければならないが、これらのシグナル自体は前駆ＴＣＲに結合するリガンドに依存する。このように発達した胸腺細胞はその後、ＣＤ４およびＣＤ８の両方を発現し、α鎖が選択されるダブルポジティブ（ＤＰ）段階を経る。再編成β鎖がシグナル伝達を全くもたらさない場合（たとえば、インバリアントα鎖との対合ができなかった結果）、この細胞は無視され（シグナル伝達を受けることなく）、死滅すると考えられている。
【０１００】
本明細書に記載の「造血幹細胞」または「ＨＳＣ」は、骨髄系細胞に分化しうる前駆細胞であり、該骨髄系細胞としては、たとえば、マクロファージ、単球、マクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球／血小板、樹状細胞およびリンパ系細胞（たとえば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞など）が挙げられる。ＨＳＣは３種の幹細胞が存在する異種細胞集団であり、これらの幹細胞は血液中のリンパ系子孫細胞と骨髄系子孫細胞との比（Ｌ／Ｍ）により識別される。
【０１０１】
本明細書に記載の「標的とする」「標的」は、分子が特異性を示すリガンドに結合する能力を指す。「特異的」または「特異性」は、結合パートナーに対するリガンドの特性、あるいはリガンドに対する結合パートナーの特性を指すことができ、結合に特異的な相補的形状、電荷性および疎水性が挙げられる。結合に関与する特異性としては、立体特異性、領域選択性、および化学選択性が挙げられる。
【０１０２】
本明細書において、混合物中の特定の細胞種の量について述べる際に使用される「濃縮された」および「除去された」という用語は、細胞の混合物中において「濃縮された」細胞種の数を増加させる方法もしくは工程で細胞混合物を処理すること、または細胞の混合物中の「除去された」細胞の数を低減させる方法もしくは工程で細胞混合物を処理することを指す。したがって、濃縮工程に付された細胞の由来に応じて、混合物または組成物において、「濃縮された」細胞は（細胞数で）全体の６０％、７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％以上を占めていてもよく、かつ「除去された」細胞は（細胞数で）全体の４０％、３０％、２０％、１０％、５％もしくは１％以下を占めていてもよい。
【０１０３】
本明細書に記載の「エピトープ」は、抗体、Ｔ細胞および／またはＢ細胞を含む免疫系によって認識される抗原または分子の一部を指す。エピトープは、通常、少なくとも７つのアミノ酸を有し、線状であっても高次構造を有していてもよい。
【０１０４】
本明細書において開示される種々のポリペプチドについて述べる際に使用される「単離された」という用語は、ポリペプチドまたは核酸が本来存在する環境にある他の成分から同定、分離かつ／または回収されたポリペプチドまたは核酸を意味する。単離されたポリペプチドまたは核酸は、これらが本来関連する他の成分を全く含まないことが好ましい。単離されたポリペプチドまたは核酸が本来存在する環境にある不純物としては、典型的には、該ポリペプチドまたは核酸の診断用途または治療用途を妨害するような物質であり、たとえば、酵素、ホルモンおよび他のタンパク性の溶質または非タンパク性の溶質が挙げられる。
【０１０５】
本明細書に記載の「細胞内シグナル伝達ドメイン」は、リンパ球を活性化する分子（ここでは、キメラ受容体分子）の１つ以上のドメイン全体またはその一部を指す。そのような分子の細胞内ドメインは、細胞メディエーターと相互作用することによってシグナルを媒介し、増殖、分化、活性化、およびその他のエフェクター機能をもたらす。いくつかの実施形態において、そのような分子として、ＣＤ２８、ＣＤ３、もしくは４−１ＢＢの全体もしくはその一部、またはそれらの組み合わせが挙げられる。細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激ドメインを包含する。
【０１０６】
本明細書に記載の「リガンド」は、別の物質と特異的に結合して複合体を形成し、かつ／または別の物質を標的とする物質を指す。リガンドとしては、抗原上のエピトープ、受容体に結合する分子、基質、阻害物質、ホルモン、および活性化物質が挙げられる。本明細書に記載の「リガンド結合ドメイン」は、リガンドに結合する物質またはその一部を指す。リガンド結合ドメインとしては、抗体の抗原結合部分、受容体の細胞外ドメイン、および酵素の活性部位が挙げられる。
【０１０７】
本明細書に記載の「作動可能に連結される」は、制御配列と異種核酸配列との間の機能的な連結を指し、これは該異種核酸配列の発現をもたらす。たとえば、第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的に関係して配置されている場合、該第１の核酸配列は該第２の核酸配列と作動可能に連結されていると言える。たとえば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合、該プロモーターは該コード配列に作動可能に連結されていると言える。通常、作動可能に連結されるＤＮＡ配列は連続しており、２つのタンパク質コード領域の連結が必要とされる場合、これらは同じリーディングフレーム内に存在する。
【０１０８】
本明細書に記載のキメラ受容体ポリペプチド配列における「アミノ酸配列同一性（％）」は、リガンド結合ドメイン、スペーサー、膜貫通ドメイン、および／またはリンパ球活性化ドメインそれぞれの参照配列中のアミノ酸残基と一致している候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。このアミノ酸配列同一性は、配列同一性（％）の最大値を算出するため、必要に応じて配列をアラインしてギャップを挿入した後に算出され、保存的置換を配列同一性としては考慮しない。アミノ酸配列同一性（％）を決定するためのアラインメントは、当技術分野の範囲にある種々の方法で行うことができ、たとえば、一般公開されているコンピュータソフトウェア、たとえばBLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2、またはMegalign（DNASTAR）ソフトウェアを用いて実施することができる。
【０１０９】
当業者であれば、アラインメントを測定するのに適切なパラメータを決定することができ、このようなパラメータとしては、比較される複数の配列の全長にわたってアラインメントを最大とするのに必要な任意のアルゴリズムが挙げられる。たとえば、WU-BLAST-2コンピュータープログラム［Altschul et al., Methods in Enzymology, 266:460-480 (1996)］を用いてアミノ酸配列同一性（％）を算出するには、いくつかの検索パラメータを用いるが、それらのほとんどはデフォルト値に設定されている。デフォルト値に設定されないパラメータ（すなわち調整可能なパラメータ）は、overlap span=1, overlap fraction=0.125, word threshold (T) =11およびscoring matrix=BLOSUM62と設定される。アミノ酸配列同一性（％）は、（ａ）WU-BLAST-2によって決定された、表２に示した参照キメラ受容体配列のポリペプチドアミノ酸配列すべてまたは各配列と、目的の比較アミノ酸配列との間で一致したアミノ酸残基の数を、（ｂ）目的のポリペプチドのアミノ酸残基の総数で割ることによって決定される。
【０１１０】
本明細書に記載の「キメラ受容体のバリアントのポリヌクレオチド」または「キメラ受容体のバリアントの核酸配列」は、以下に定義されるように、表５、７、９、または１１に示したポリヌクレオチド配列またはそれに由来する特定のフラグメントと少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の核酸配列同一性を有する、ポリペプチドをコードする核酸分子を指す。表１に示したポリヌクレオチド酸配列またはその特定のフラグメントとしては、たとえば、抗原結合ドメインをコードするポリヌクレオチド、スペーサードメインをコードするポリヌクレオチド、膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチド、および／またはリンパ球刺激ドメインをコードするポリヌクレオチドが挙げられる。通常、ポリヌクレオチドのキメラ受容体バリアントまたはそのフラグメントは、表５、７、９、または１１に示した核酸配列またはそれに由来するフラグメントと少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも８１％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも８２％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも８３％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも８４％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも８５％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも８６％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも８７％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも８％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも８９％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも９０％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも９１％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも９２％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも９３％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも９４％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも９６％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも９７％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも９８％の核酸配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも９９％の核酸配列同一性を有する。バリアントは、自体が由来するヌクレオチド配列を包含しない。これは、遺伝コードの縮重によるものであり、当業者であれば、表５、７、９、または１１のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の核酸配列同一性を有する様々なキメラ受容体バリアントのポリヌクレオチドを容易に認識するであろう。
【０１１１】
「実質的に精製された」は、他の分子種を実質的に含んでいない分子、または他の細胞種を実質的に含んでいない細胞を指す。また、「実質的に精製された細胞」は、天然の状態において通常関連する他の細胞種から分離された細胞を指す。場合によっては、実質的に精製された細胞の集団は、均質な細胞集団を指すこともある。
【０１１２】
正常細胞上の腫瘍抗原または他の分子の存在に関して述べる際に使用される「実質的に存在しない」という用語は、腫瘍抗原または他の分子を有する正常細胞のパーセンテージおよび／または正常細胞上の腫瘍抗原の密度を指す。いくつかの実施形態において、「実質的に存在しない」は、腫瘍細胞または他の疾患細胞に存在する細胞の数または抗原の量と比較して、腫瘍抗原または他の分子が正常細胞の５０％未満に存在し、かつ／または正常細胞上の腫瘍抗原の密度が５０％未満であることを意味する。
【０１１３】
本明細書に記載の「Ｔ細胞」または「Ｔリンパ球」は、どのような哺乳動物から得られたものであってもよく、霊長類から得られたものであることが好ましく、該哺乳動物としては、サル、イヌおよびヒトが挙げられる。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞はレシピエント対象と同種異系（同種であるが異なるドナーに由来するもの）である。いくつかの実施形態においては、Ｔ細胞は自己由来である（ドナーとレシピエントは同じである）。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は同質遺伝子型である（ドナーとレシピエントは異なるが、一卵性双生児である）。
【０１１４】
「特異的」または「特異性」は、結合パートナーに対するリガンドの特性、あるいはリガンドに対する結合パートナーの特性を指すことができ、結合に特異的な相補的形状、電荷性および疎水性が挙げられる。結合に関与する特異性としては、立体特異性、領域選択性、および化学選択性が挙げられる。
【０１１５】
いくつかの実施形態において、スペーサーは、リガンドに特異的であると説明される。リガンドに特異的なスペーサーは、リガンド結合ドメインとその特異的リガンドまたは標的リガンドとの結合または標的化を増強することが可能な特定の長さを有する特異的なポリペプチドであり、結合または標的化が増強された結果、該スペーサーは、該リガンドに応答して、対照のキメラ受容体よりも増強されたＴ細胞増殖および／またはサイトカインの産生を提供する。
【０１１６】
本明細書において「標的とする」とは、外来性標的に特有の部分、たとえば、タンパク質のエピトープなどを認識することを指す。「標的とする」は、タンパク質の特定の領域に結合すること、またはタンパク質の特定の領域を認識することを指すこともでき、このようなタンパク質の特定の領域を抗原と呼ぶこともできる。標的抗体は、類似の抗原性部位を認識することもでき、これによって、抗体は、別のタンパク質の類似した抗原性部位と反応する能力を持つことができ、その結果、交差反応性を示す抗体が得られる。
【０１１７】
「細胞活性」は、特定の細胞集団の、液性応答、細胞に基づく免疫応答、細胞性応答、成熟化経路、成長経路および／または応答性を指すことができる。いくつかの実施形態において、スペーサーを含むキメラ抗原受容体が提供される。いくつかの実施形態において、前記スペーサーは、Ｔ細胞の増殖を増強または改善すること、インビボでの細胞活性を増強かつ／もしくは低減させること、ならびに／またはサイトカインを産生させることを目的として提供される。
【０１１８】
キメラ受容体の核酸配列、ならびに該核酸を含むベクターおよび宿主細胞が提供される。キメラ受容体の核酸配列は、いくつかのモジュール部分を含み、これらのモジュール部分は切断して別のモジュール部分と置換することができ、このようにして特定の標的分子を標的とするキメラ受容体をカスタマイズすることができる。本開示において、そのようなモジュー部分の１つは、スペーサー成分として提供される。驚くべきことに、キメラ受容体を発現するように改変されたＴ細胞のインビボでの有効性は、スペーサー領域の長さによる影響を受け、スペーサー領域の長さは、治療活性を増強することを目的として個々の標的分子に対してカスタマイズできることが見出された。
【０１１９】
一態様では、キメラ受容体を設計するための方法および核酸構築物が提供され、該キメラ受容体は、特にインビボにおいて、腫瘍認識が対照のキメラ受容体よりも増強または向上されており、もしくは前記リガンドに応答したＴ細胞の増殖および／またはサイトカインの産生が対照のキメラ受容体よりも増強されており、かつ／または該キメラ受容体が抗原に特異的に結合するか、該受容体が抗原を標的とすることによって、該キメラ受容体を有する細胞が、対照のキメラ受容体を有する細胞よりも向上された生存を示す。
【０１２０】
いくつかの実施形態において、対照のキメラ受容体は、１つ以上の改変がスペーサーにおいてなされていることを除いて、目的とするキメラ受容体と同一であるキメラ受容体である。該スペーサーにおける１つ以上の改変とは、たとえば、該ポリペプチドスペーサーが、前記受容体のリガンド結合ドメイン（たとえば、抗体フラグメント）および前記受容体の膜貫通部分および／または細胞内領域とを連結されていることを指す。
たとえば、いくつかの実施形態において、対照のキメラ受容体は、長さまたは配列が異なるスペーサーを有すること以外は、目的とする受容体と同一であり、たとえば、目的とするキメラ受容体のスペーサーよりも、対照のキメラ受容体のスペーサーが長く、たとえば、目的とするキメラ受容体のスペーサーのアミノ酸長の少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍または１０倍であることが挙げられる。
【０１２１】
いくつかの実施形態において、核酸のライブラリーが提供され、ライブラリーに含まれる各核酸によってコードされるスペーサー領域は、配列および／または長さが異なっている。ライブラリーに含まれる各核酸を使用して、キメラ受容体の核酸構築物を形成することができ、インビボ（動物モデル）および／またはインビトロにおいて試験することによって、リガンドに応答した腫瘍認識が増強または改善され、かつリガンドに応答したＴ細胞増殖および／またはサイトカインの産生が増強されたスペーサーを選択することができる。
【０１２２】
いくつかの実施形態においては、キメラ受容体の核酸配列は、腫瘍抗原であるリガンドに結合するリガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチド、ならびにカスタマイズおよび最適化されたポリペプチドスペーサーをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、前記リガンドに応答したＴ細胞の増殖および／またはサイトカインの産生が対照のキメラ受容体よりも増強するように最適化されている。
【０１２３】
キメラ受容体の設計は、腫瘍の種類、腫瘍上に存在する標的抗原または標的分子、標的分子に対する抗体の親和性、抗原結合ドメインに必要とされるフレキシビリティ、および／または細胞内シグナル伝達ドメインに応じてカスタマイズすることができる。いくつかの実施形態において、様々なキメラ受容体構築物をインビトロモデルおよびインビボモデルにおいて試験し、前記受容体で改変されたＴ細胞が、免疫不全マウス体内の腫瘍細胞を殺傷する能力を有するかどうか、および養子移入後に増殖して持続できるかどうかを判断する。
【０１２４】
標的分子が対象の腫瘍細胞上に存在するかどうかに応じて、その標的分子に特異的に結合し、かつ／または該標的分子を標的とするリガンド結合ドメインをキメラ受容体に付加する。いくつかの実施形態において、対象の腫瘍細胞は、細胞表面の腫瘍分子によって特徴付けられる。標的分子は、対象の特定の腫瘍細胞において存在することが明らかとなっていることに基づいて選択されうる。いくつかの実施形態において、主として腫瘍細胞に見出されるが、正常組織では実質的に見出されない細胞表面分子である標的分子またはそのエピトープが選択される。いくつかの実施形態において、標的である細胞表面分子上のエピトープに結合する抗体が選択される。いくつかの実施形態において、前記標的分子はＣＤ１７１である。いくつかの実施形態において、キメラ受容体は、ＣＥ７として知られている抗体によって認識されるＣＤ１７１上のエピトープに特異的に結合し、かつ／もしくはこのエピトープを標的とし、かつ／またはＣＤ１７１のエピトープまたは別の抗原のエピトープに特異的に結合し、かつ／またはこのエピトープを標的とし、この別の抗原のエピトープは、ＣＤ１７１＋細胞の細胞膜表面から同じ距離または同程度の距離にある。いくつかの実施形態において、前記抗原は、ＣＤ１７１とよく似た大きさまたは長さの細胞外領域を有しており、この場合、これに応じて、類似したキメラ受容体の構成が適切である。
【０１２５】
さらに、標的細胞上のリガンドのＴ細胞による認識を増強または向上させるために、前記キメラ受容体のスペーサー領域を様々に変化させてもよい。いくつかの実施形態においては、スペーサードメインは、１５アミノ酸長以下（かつ１アミノ酸長以上または２アミノ酸長以上）の短いスペーサードメインから選択され、該短いスペーサードメインは、たとえば、１５アミノ酸長、１４アミノ酸長、１３アミノ酸長、１２アミノ酸長、１１アミノ酸長、１０アミノ酸長、９アミノ酸長、８アミノ酸長、７アミノ酸長、６アミノ酸長、５アミノ酸長、４アミノ酸長、３アミノ酸長もしくは２アミノ酸長、またはこれらの長さのいずれか２つによって定義される範囲にあるアミノ酸長である。いくつかの実施形態においては、スペーサードメインは、１１９アミノ酸長以下（かつ１アミノ酸長以上または２アミノ酸長以上）の中程度の長さのスペーサードメインから選択され、該中程度の長さのスペーサードメインは、たとえば、１１９アミノ酸長、１１５アミノ酸長、１１０アミノ酸長、１００アミノ酸長、９５アミノ酸長、９０アミノ酸長、８５アミノ酸長、８０アミノ酸長、７５アミノ酸長、７０アミノ酸長、６５アミノ酸長、６０アミノ酸長、５５アミノ酸長、５０アミノ酸長、４５アミノ酸長、４０アミノ酸長、３５アミノ酸長、３０アミノ酸長、２５アミノ酸長、２０アミノ酸長もしくは１５アミノ酸長、またはこれらの長さのいずれか２つによって定義される範囲にあるアミノ酸長である。いくつかの実施形態においては、スペーサードメインは、２２９アミノ酸長以下（かつ１アミノ酸長以上または２アミノ酸長以上）の長いスペーサーから選択され、該中程度の長さのスペーサードメインは、たとえば、２２９アミノ酸長、２２５アミノ酸長、２２０アミノ酸長、２１５アミノ酸長、２１０アミノ酸長、２０５アミノ酸長、２００アミノ酸長、１９５アミノ酸長、１９０アミノ酸長、１８５アミノ酸長、１８０アミノ酸長、１７５アミノ酸長、１７０アミノ酸長、１６５アミノ酸長、１６０アミノ酸長、１５５アミノ酸長、１５０アミノ酸長、１４５アミノ酸長、１４０アミノ酸長、１３５アミノ酸長、１３０アミノ酸長、１２５アミノ酸長もしくは１２０アミノ酸長、またはこれらの長さのいずれか２つによって定義される範囲にあるアミノ酸長である。いくつかの実施形態においては、スペーサーは、Ｆｃ受容体のヒンジ領域または遺伝子組換えされたヒンジ領域である。いくつかの実施形態においては、スペーサー領域は、ＣＨ２もしくはＣＨ３またはこれらの両方とヒンジ領域とを組み合わせたものである。いくつかの実施形態においては、スペーサーは、アミノ酸配列X1PPX2Pを含む。別の一実施形態では、スペーサー領域は、完全長Ｆｃ受容体を含まず、かつ／またはＣＨ２ドメインおよび／もしくはＣＨ３ドメインを含んでいない。そのような実施形態のいくつかでは、前記スペーサーは抗体ヒンジ領域を含んでいる。
【０１２６】
キメラ受容体のインビボにおける有効性を増強するため、主要な細胞内シグナル伝達ドメインと共刺激性の細胞内シグナル伝達ドメインとの様々な組み合わせが使用される場合がある。いくつかの実施形態において、キメラ受容体の様々な構築物をインビボ動物モデルにおいて試験して、腫瘍に対する殺傷性を調べることができる。いくつかの実施形態において、共刺激性の細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８およびその改変体、４−１ＢＢおよびその改変体、ならびに／またはそれらの組み合わせからなる群から選択される。他の共刺激ドメイン、たとえばＯＸ４０などを組み込んでもよい。いくつかの実施形態において、前記受容体の共刺激性細胞内シグナル伝達領域は、単一の共刺激分子（たとえば、４−１ＢＢ単独、またはＣＤ２８単独など）に由来する細胞内ドメインを単独で含み、別の共刺激分子に由来するドメインをさらに含んでいない。
【０１２７】
いくつかの実施形態において、キメラ受容体で改変された細胞（たとえば、ＣＤ１７１特異的かつ／または標的キメラ受容体で改変された細胞、たとえば、ソーティングにより精製されたＣＤ８＋セントラルメモリーＴ細胞から調製された細胞傷害性Ｔ細胞）を、ＣＤ４＋キメラ受容体で改変された細胞（たとえば、ＣＤ１７１特異的かつ／または標的キメラ受容体で改変されたＴ細胞）の存在下または非存在下で投与する。いくつかの実施形態において、腫瘍特異的または腫瘍標的ＣＤ４＋発現Ｔ細胞は、抗腫瘍反応性を発揮し、インビトロおよびインビボにおいて腫瘍特異的ＣＤ８＋発現Ｔ細胞を補助する。具体的な実施形態において、腫瘍特異的または腫瘍標的ＣＤ４＋発現Ｔ細胞、またはナイーブサブセットまたはセントラルメモリーサブセットから選択されたＣＤ４＋発現Ｔ細胞は、単独またはＣＤ８＋ＴＣＭと組み合わせて使用される。
【０１２８】
いくつかの実施形態において、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ発現細胞を使用した養子免疫療法は、がんの治療または抑制に有用である。いくつかの実施形態においては、ＣＤ１７１（Ｌ１ＣＡＭ）抗原のエピトープを標的とするＣＡＲを調製する。このようなＣＡＲ構築物は、ＣＤ１７１（Ｌ１ＣＡＭ）を発現するがんの治療または抑制に有用である。いくつかの実施形態においては、ＣＤ１７１を発現するがんは神経芽腫（ＮＢ）である。ＣＤ１７１は、高リスク型ＮＢの１００％において発現される。ＣＤ１７１を過剰発現すると考えられている他のがんとしては、黒色腫、子宮頸がん、卵巣がん、子宮がん、膵臓がん、大腸がん、腎臓がんおよび神経膠芽腫が挙げられる。
【０１２９】
本発明の開示は、養子免疫療法において使用するためのリンパ球の形質転換または形質導入に有用なキメラ受容体核酸配列を提供する。いくつかの実施形態において、前記核酸は、前記核酸の構成要素を容易に置換できる様々なモジュール部分を含む。本発明の開示の範囲をなんら限定するものではないが、哺乳動物細胞においてインビボ効果および効率的な発現を達成するために、各腫瘍抗原に対するキメラ受容体の構成要素はカスタマイズすることが望ましいと考えられる。たとえば、特定の一実施形態において、ＣＥ７に対する抗体によって認識されるエピトープと同一もしくは類似したエピトープや、ＣＤ１７１上のエピトープ、形質膜表面からの相対距離が同じであるその他の抗原などの、ＣＤ１７１ Ｌ１ＣＡＭエピトープに結合するｓｃＦＶ含有キメラ受容体の効果を得ることを目的として、１５アミノ酸長以下（かつ１アミノ酸長以上または２アミノ酸長以上）のスペーサーが使用される。いくつかの実施形態においては、本明細書に記載したように、発現ベクターはキメラ核酸を含む。前記キメラ受容体のこれらの核酸全体によってコードされるポリペプチド、およびこれらの核酸の一部によってコードされるポリペプチドも本発明に包含される。
【０１３０】
いくつかの実施形態において、前記キメラ受容体の核酸配列は、リガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、前記リガンド結合ドメインは、ＣＤ１７１に特異的に結合し、かつ／もしくはＣＤ１７１を標的とし、または特定の腫瘍に発現されているＣＤ１７１エピトープに結合し、かつ／もしくはこのエピトープを標的とする。いくつかの実施形態においては、前記リガンド結合ドメインは抗体またはそのフラグメントである。抗体またはその結合フラグメントをコードする核酸配列は容易に決定することができる。特定の実施形態においては、前記ポリヌクレオチドは、ＣＤ１７１ （Ｌ１ＣＡＭ）と特異的に結合しかつ／またはＣＤ１７１ （Ｌ１ＣＡＭ）を標的とする一本鎖Ｆｖをコードする。典型的な抗体は抗体ＣＥ７である。抗体ＣＥ７由来ｓｃＦｖをコードする典型的な核酸配列を図５に示す。その他の抗体の配列は、当業者に知られており、当業者によって容易に決定される。
【０１３１】
腫瘍抗原は、免疫応答を誘発する腫瘍細胞によって産生されるタンパク質である。本発明のリガンド結合ドメインは、治療または抑制されるがんの種類に応じて選択され、腫瘍抗原またはその他の腫瘍細胞表面分子を標的としてもよい。対象由来の腫瘍サンプルは、特定のバイオマーカーまたは細胞表面マーカーの存在について特性を評価してもよい。たとえば、対象由来の神経芽腫細胞は、ＣＤ１７１（Ｌ１ＣＡＭ）の存在について評価される。他のがんまたは腫瘍細胞も、ＣＤ１７１（Ｌ１ＣＡＭ）の存在について評価され、本明細書に記載の組成物で治療または抑制することができる。いくつかの実施形態において、標的分子は、腫瘍細胞上に存在する細胞表面分子であり、正常組織上に実質的に存在しないか、またはその発現が重要視されない正常組織に制限されている。
【０１３２】
キメラ受容体の標的となりうる腫瘍細胞表面分子を同定した後、この標的分子のエピトープを選択し、その特性を評価する。Ｌ１ＣＡＭは、ニューロンの細胞接着に関与する細胞膜分子である。Ｌ１ＣＡＭはいくつかのドメインを有し、１〜１９番目のアミノ酸からなるシグナルペプチド、３５〜１２５番目のアミノ酸からなるＩｇ様Ｃ２ １型、１３９〜２２６番目のアミノ酸からなるＩｇ様Ｃ２ ２型、２４０〜３２８番目のアミノ酸からなるＩｇ様Ｃ２ ３型、３３３〜４２０番目のアミノ酸からなるＩｇ様Ｃ２ ４型、４２５〜５０７番目のアミノ酸からなるＩｇ様Ｃ２ ５型、５１８〜６０７番目のアミノ酸からなるＩｇ様Ｃ２ ６型、６１５〜７１２番目のアミノ酸からなるフィブロネクチンIII型１、７１７〜８１０番目のアミノ酸からなるフィブロネクチンIII型２、８１４〜９１６番目のアミノ酸からなるフィブロネクチンIII型３、９２０〜１０１５番目のアミノ酸からなるフィブロネクチンIII型４、１０１６〜１１１５番目のアミノ酸からなるフィブロネクチンIII型５を含む。これらのドメインのいずれにおいてもエピトープを見出すことができる。特性が評価されているエピトープの１つはＣＥ７エピトープとして知られている。ＣＥ７エピトープは、正常な組織よりも腫瘍細胞において高頻度に見出されるエピトープである。いくつかの実施形態において、健常な細胞よりも腫瘍細胞において高頻度に見出されるＣＤ１７１エピトープが選択される。
【０１３３】
腫瘍細胞表面分子と特異的に結合しかつ／またはこの分子を標的とする抗体は、モノクローナル抗体を得る方法、ファージディスプレイ法、ヒト抗体もしくはヒト化抗体を製造する方法、またはヒト抗体を得るために遺伝子改変されたトランスジェニック動物もしくはトランスジェニック植物を用いる方法を用いて製造することができる。部分的に合成した抗体または全合成抗体のファージディスプレイライブラリーが入手可能であり、このライブラリーから、標的分子に結合することができる抗体またはそのフラグメントをスクリーニングすることができる。ヒト抗体のファージディスプレイライブラリーも入手可能である。いくつかの実施形態において、抗体は、腫瘍細胞表面分子に特異的に結合しかつ／または該分子を標的とし、ウシ血清アルブミンやその他の無関係な抗原などの非特異的成分とは交差反応しない。前記抗体をコードするアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列を同定した後、これらの配列を単離し、かつ／または配列決定することができる。
【０１３４】
抗体または抗原結合フラグメントとしては抗体の全体またはその一部が挙げられ、該抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、合成抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体、ミニボディ、および線状抗体が挙げられる。「抗体フラグメント」は、完全な抗体の一部を含み、好ましくは完全な抗体の抗原結合領域または可変領域であり、これらは容易に調製することができる。抗体フラグメントとしては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメント；二機能性抗体；線状抗体；単鎖抗体分子；および抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体が挙げられる。様々な抗ＣＤ１７１抗体が知られており、市販品として入手可能である。
【０１３５】
いくつかの実施形態においては、特定の単一の腫瘍細胞表面分子に結合する様々な抗体を多数単離されることがあり、これらの特性を評価することができる。いくつかの実施形態においては、前記抗体は、標的分子のエピトープに対する特異性に基づいて、かつ／または標的分子のエピトープを標的とするかどうかに基づいて特徴が表される。また、場合によっては、エピトープに対する抗体の親和性に基づいて、同じエピトープに結合する抗体が選択されうる。いくつかの実施形態において、前記抗体は少なくとも１ｍＭの親和性を有し、５０ｎＭ未満の親和性を有することが好ましい。いくつかの実施形態においては、別の抗体よりもエピトープに対する親和性が高い抗体が選択される。たとえば、同じエピトープに結合する対照の抗体と比較して、親和性が少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、または少なくとも５０倍である抗体が選択される。
【０１３６】
いくつかの実施形態においては、リガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチドは、スペーサー領域をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態においては、リガンド結合ドメインをコードする前記ポリヌクレオチドは、該コード配列の５’末端および／または３’末端に１つ以上の制限酵素部位をさらに有していてもよく、これによって、リガンド結合ドメインをコードする前記ポリヌクレオチドを切断することが容易となり、該ポリヌクレオチドとは別の抗原をコードするか、あるいは別の結合特性を有するリガンド結合ドメインをコードする別のポリヌクレオチドと置換することが容易となる。たとえば、制限部位ＮｈｅＩを前記リーダー配列の上流にコードし、かつヒンジ領域内の３’末端にＲｓｒＩＩを配置することよって、キメラ受容体ベクターに所望のｓｃＦｖをサブクローニングすることが可能となる。いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、哺乳類細胞における発現を目的としてコドン最適化されている。
【０１３７】
いくつかの実施形態において、リガンド結合ドメインをコードする前記ポリヌクレオチドは、シグナルペプチドに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態において、該シグナルペプチドは、顆粒球コロニー刺激因子のシグナルペプチドである。ＣＤ８αなどの他のシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドを利用することもできる。
【０１３８】
いくつかの実施形態において、リガンド結合ドメインをコードする前記ポリヌクレオチドは、プロモーターに作動可能に連結されている。哺乳類細胞において前記キメラ抗原受容体の発現を可能とするプロモーターが選択される。特定の一実施形態においては、前記プロモーターは伸長因子プロモーター（ＥＦ−１）である。好適なプロモーターの別の例として、前初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター配列が挙げられる。しかしながら、他の構成的プロモーター配列を使用してもよく、たとえば、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）の初期プロモーター、マウス乳がんウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の長末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、ＭｕＭｏＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスのプロモーター、エプスタイン・バールウイルスの前初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスのプロモーター、およびヒト遺伝子のプロモーター（たとえば、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、クレアチンキナーゼプロモーターなどが挙げられるが、これらに限定されない）が挙げられるが、これらに限定されない。誘導性プロモーターを使用してもよい。誘導性プロモーターとしては、メタロチオネインプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーターおよびテトラサイクリンプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。リガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチドの特定の態様を図５に示すが、これは、ＣＤ１７１上のエピトープであるＣｅ７に特異的に結合し、かつ／またはＣｅ７を標的とする抗体に由来するｓｃＦｖである。
【０１３９】
いくつかの実施形態において、前記キメラ受容体の核酸配列は、スペーサー領域をコードするポリヌクレオチドを含む。驚くべきことに、キメラ受容体を発現するように改変されたＴ細胞のインビボでの有効性は、スペーサー領域の長さによる影響を受け、スペーサー領域の長さは、腫瘍または標的細胞の認識を最適化することを目的として個々の標的分子に対してカスタマイズできることが見出された。いくつかの実施形態において、前記キメラ受容体の核酸配列は、スペーサー領域をコードするポリヌクレオチドのライブラリーから選択された、カスタマイズ可能なされたスペーサー領域をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、スペーサーの長さは、エピトープの位置、エピトープに対する抗体の親和性、ならびに／またはキメラ受容体を発現するＴ細胞が抗原認識に応答してインビトロおよび／またはインビボで増殖する能力に基づいて選択される。
【０１４０】
スペーサー領域は、典型的には、キメラ受容体のリガンド結合ドメインと膜貫通ドメインとの間に位置する。いくつかの実施形態において、スペーサー領域は、前記リガンド結合ドメインに柔軟性を持たせ、かつリンパ球において高レベル発現を可能とする。２２９アミノ酸長のスペーサードメインを有するＣＤ１７１特異的かつ／または標的キメラ受容体のインビボでの抗腫瘍活性は、１５アミノ酸長以下（かつ１アミノ酸長以上または２アミノ酸長以上）の短いスペーサー領域を有するＣＤ１７１特異的かつ／または標的キメラ受容体よりも低かった。
【０１４１】
いくつかの実施形態において、スペーサー領域は、少なくとも１０〜２２９アミノ酸長、１０〜２００アミノ酸長、１０〜１７５アミノ酸長、１０〜１５０アミノ酸長、１０〜１２５アミノ酸長、１０〜１１５アミノ酸長、１０〜１００アミノ酸長、１０〜７５アミノ酸長、１０〜５０アミノ酸長、１０〜４０アミノ酸長、１０〜３０アミノ酸長、１０〜２０アミノ酸長、もしくは１０〜１５アミノ酸長であるか、またはこれらのアミノ酸長のいずれか２つによって定義される範囲にある長さを有する。いくつかの実施形態においては、スペーサー領域は、１５アミノ酸長以下であり（かつ１アミノ酸長以上または２アミノ酸長以上であり）、１１９アミノ酸長以下であり（かつ１アミノ酸長以上または２アミノ酸長以上であり）、または２２９アミノ酸長以下である（かつ１アミノ酸長以上または２アミノ酸長以上である）。
【０１４２】
いくつかの実施形態において、前記スペーサー領域は、免疫グロブリン様分子のヒンジ領域に由来する。いくつかの実施形態において、スペーサー領域は、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ３、またはヒトＩｇＧ４に由来するヒンジ領域の全体またはその一部もしくはその改変バリアントを含み、１つ以上のアミノ酸置換を含んでいてもよい。前記ヒンジ領域の典型的な配列を表６に示す。いくつかの実施形態においては、前記ヒンジ領域の一部は、重鎖可変領域とコアとの間に存在するアッパーヒンジ領域のアミノ酸配列、およびポリプロリン領域を含むコアヒンジ領域のアミノ酸配列を含む。通常、アッパーヒンジ領域は、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個のアミノ酸を有する。いくつかの実施形態において、前記スペーサー領域は、アミノ酸配列X1PPX2P（配列番号１）を含む。いくつかの実施形態において、X1は、システイン、グリシンまたはアルギニンであり、X2は、システインまたはトレオニンである。
【０１４３】
いくつかの実施形態において、二量体化などの望ましくない構造間の相互作用を回避するため、ヒンジ領域の配列は１つ以上のアミノ酸が改変されていてもよい。特定の一実施形態において、前記スペーサー領域は、表１または表６に示すような、ＩｇＧ４に由来する改変されたヒトヒンジ領域の一部を含む。改変されたＩｇＧ４ヒンジ領域の一部をコードするポリヌクレオチドの典型的な配列を表１に示す。いくつかの実施形態において、ヒンジ領域は、表１または表６に示したヒンジ領域のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９２％、９５％または１００％の配列同一性を有していてもよい。特定の一実施形態において、ＩｇＧ４に由来するヒトヒンジ領域の一部は、コアヒンジ領域のアミノ酸配列においてＣＰＳＰがＣＰＰＣに置換されている。
【０１４４】
いくつかの実施形態において、前記ヒンジ領域の全体またはその一部は、免疫グロブリンの定常領域の１つ以上と組み合わされる。たとえば、ヒンジ領域の一部は、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインまたはそれらのバリアントの全体またはその一部と組み合わせてもよい。いくつかの実施形態において、前記スペーサー領域は、完全長Ｆｃ受容体であるＣＤ８αに由来する４７〜４８アミノ酸長のヒンジ領域配列および／またはＣＤ２８分子の細胞外部分からなるスペーサー領域を含んでいない。
【０１４５】
いくつかの実施形態において、短いスペーサー領域は、１５アミノ酸長以下であり（かつ１アミノ酸長以上または２アミノ酸長以上であり）、かつＩｇＧ４のヒンジ領域配列またはそのバリアントの全体もしくはその一部を含む。中程度の長さのスペーサー領域は、１１９アミノ酸長以下であり（かつ１アミノ酸長以上または２アミノ酸長以上であり）、かつＩｇＧ４のヒンジ領域配列またはそのバリアントの全体またはその一部と、ＣＨ３領域またはそのバリアントの全体またはその一部とを含む。長いスペーサーは、２２９アミノ酸長以下であり（かつ１アミノ酸長以上または２アミノ酸長以上であり）、かつＩｇＧ４のヒンジ領域配列またはそのバリアントの全体またはその一部と、ＣＨ２領域またはそのバリアントの全体またはその一部と、ＣＨ３領域またはそのバリアントの全体またはその一部とを含む。
【０１４６】
スペーサー領域をコードするポリヌクレオチドは、アミノ酸配列に基づいて合成法または組換え法により容易に作製することができる。いくつかの実施形態においては、スペーサー領域をコードするポリヌクレオチドは、膜貫通領域をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態において、スペーサー領域をコードする前記ポリヌクレオチドは、該コード配列の５’末端および／または３’末端に１つ以上の制限酵素部位をさらに有していてもよく、これによって、該ポリヌクレオチドを切断して、別のスペーサー領域をコードする別のポリヌクレオチドと置換することが容易となる。いくつかの実施形態において、前記スペーサー領域をコードする前記ポリヌクレオチドは、哺乳類細胞、好ましくはヒト細胞における発現を目的としてコドン最適化されている。
【０１４７】
いくつかの実施形態においては、ポリヌクレオチドライブラリーが提供され、このライブラリーに含まれるポリヌクレオチドは、様々なスペーサー領域をコードする。いくつかの実施形態において、前記スペーサー領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４に由来するヒンジ領域配列またはその一部、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４に由来するヒンジ領域配列とＣＨ２領域またはそのバリアントの全体またはその一部との組み合わせ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４に由来するヒンジ領域配列とＣＨ３領域またはそのバリアントの全体またはその一部との組み合わせ、ならびにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４に由来するヒンジ領域配列とＣＨ２領域もしくはそのバリアントおよびＣＨ３領域もしくはそのバリアントの全体またはその一部との組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、短いスペーサー領域は、１５アミノ酸長以下であり（かつ１アミノ酸長以上もしくは２アミノ酸長以上である）改変ＩｇＧ４ヒンジ配列であり、中程度の長さの配列は、１１９アミノ酸長以下であり（かつ１アミノ酸長以上もしくは２アミノ酸長以上である）、ＣＨ３配列を備えたＩｇＧ４ヒンジ配列（配列番号４９）であるか、または２２９アミノ酸長以下であり（かつ１アミノ酸長以上もしくは２アミノ酸長以上である）、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域を備えたＩｇＧ４ヒンジ配列である。
【０１４８】
いくつかの実施形態においては、キメラ受容体のためのスペーサー領域を選択する方法が提供される。驚くべきことに、いくつかのキメラ受容体構築物は、インビトロにおいては効果的にＴ細胞を活性化し、この活性化されたＴ細胞によって腫瘍細胞を効果的に殺傷したが、インビボでは効果的にＴ細胞を活性化せず効果的に腫瘍細胞を殺傷しなかった。さらに、キメラ受容体で改変されたＴ細胞の副作用として、活性化誘導細胞死を起こす細胞が増えたり、またはインビボでのサイトカインの増加を引き起こす場合がある。
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、
スペーサー領域のみが異なる複数のキメラ受容体核酸配列を提供すること、
各キメラ受容体核酸配列を個別のＴリンパ球集団に導入すること、
前記個別のリンパ球集団をインビトロで増殖させること、
各リンパ球集団を、腫瘍を有する動物に導入して、Ｔ細胞において発現させたときの各キメラ受容体の抗腫瘍作用を測定すること、および
他のキメラ受容体により改変された他の個別のリンパ球集団と比較して抗腫瘍作用を提供するキメラ受容体を選択すること
を含む。
【０１４９】
様々な腫瘍動物モデルが知られている。抗腫瘍作用の測定は、腫瘍体積の減少を特定すること、ならびに動物の死を測定すること、遺伝子改変Ｔ細胞のインビボでの持続性を測定すること、遺伝子改変Ｔ細胞の活性化を測定すること（たとえば、ＣＤ２５および／またはＣＤ６９の発現の増強を検出することよって測定できる）、および／またはインビボでの遺伝子改変Ｔ細胞の増殖を測定することによって行うことができる。いくつかの実施形態において、これらのパラメータの１つ以上を測定したときに、インビボにおいて最も良好な抗腫瘍作用を提供するキメラ受容体が選択される。抗腫瘍作用の欠如は、インビボで遺伝子改変リンパ球が持続できないこと、動物の死、カスパーゼ−３の誘導増強によって測定されるアポトーシスの増強、および／または遺伝子改変リンパ球の増殖の低下から判断することができる。
【０１５０】
いくつかの実施形態においては、インビトロおよび／またはインビボにおいて細胞の少なくとも３０％が２世代を超えて増殖することが可能となるキメラ受容体が選択される。別の実施形態のいくつかにおいては、７２時間以内に細胞の少なくとも５０％において活性化誘導細胞死を引き起こすキメラ受容体は選択されない。
【０１５１】
いくつかの実施形態においては、スペーサー領域のみが異なる複数のキメラ受容体核酸配列の提供は、キメラ受容体構築物を提供することを含み、該キメラ受容体構築物は、リガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチド、第１のポリペプチドスペーサーをコードするポリヌクレオチド、膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチド、および１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチドを含み、前記リガンドが、腫瘍持異抗原および／もしくは腫瘍標的抗原、またはリンパ球による認識および排除を媒介するのに適切な標的細胞集団に発現しているその他の分子であること、ならびに該第１ポリペプチドスペーサーのコード配列が５’末端および３’末端に公知の制限部位を有することを特徴とする。
【０１５２】
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、様々なスペーサー領域をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを提供することをさらに含む。典型的な構築物を図５、図７および図９に示す。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、スペーサー領域をコードするポリヌクレオチドを、別のスペーサー領域をコードするポリヌクレオチドで置換し、該別のスペーサー領域を有するキメラ受容体核酸配列を形成させることをさらに含む。この方法を繰り返し行うことによって、任意の個数の様々なキメラ受容体核酸配列を形成することができ、この場合、これらキメラ受容体核酸配列のスペーサー領域はそれぞれ異なっている。いくつかの実施形態において、キメラ受容体の核酸配列はスペーサー領域のみが互いに異なっている。
【０１５３】
いくつかの実施形態において、前記キメラ受容体の核酸配列は、膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチドを含む。該膜貫通ドメインは、前記キメラ受容体を膜につなぎ止める役割を果たす。いくつかの実施形態において、他からの作用を必要とせずに、前記キメラ受容体中のドメインのうちの１つと関連し合う膜貫通ドメインが用いられる。場合によっては、前記キメラ受容体中のこのようなドメインが、同じまたは異なる表面膜タンパク質に由来する様々な膜貫通ドメインに結合することを回避できるようなアミノ酸置換に基づいて前記膜貫通ドメインを選択してもよく、あるいはこのようなアミノ酸置換によって前記膜貫通ドメインを改変してもよく、これによって、前記受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限にすることができる。
【０１５４】
該膜貫通ドメインは、天然由来であってもよく、合成由来であってもよい。天然由来である場合、前記膜貫通ドメインは、膜結合型タンパク質であっても膜貫通型タンパク質であってもよく、これらのタンパク質はどのようなものであってもよい。膜貫通領域は、Ｔ細胞受容体のα鎖、β鎖もしくはζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７および／またはＣＤ１５４の膜貫通領域を少なくとも含む。特定の一実施形態において、前記膜貫通ドメインは、表１に示すＣＤ２８膜貫通ドメインのアミノ酸配列を含む。ＣＤ２８膜貫通ドメインをコードする典型的なポリヌクレオチド配列を表１（配列番号５）に示す。
【０１５５】
膜貫通ドメインは、合成されたものであってもよく、天然の膜貫通ドメインのバリアントであってもよい。いくつかの実施形態において、合成膜貫通ドメインまたは膜貫通ドメインのバリアントは、主に疎水性残基、たとえば、ロイシンおよびバリンを含む。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、表１または表３に示す膜貫通ドメインと、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは１００％のアミノ酸配列同一性を有してもいてもよい。膜貫通ドメインのバリアントは、Kyte Doolittle法により算出された疎水性スコアが少なくとも５０であることが好ましい。
【０１５６】
膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチドは、合成法または組換え法により容易に作製することができる。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチドは、細胞内シグナル伝達領域をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインをコードする前記ポリヌクレオチドは、該コード配列の５’末端および／または３’末端に１つ以上の制限酵素部位をさらに有していてもよく、これによって、膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチドを切断して、別の膜貫通ドメインをコードする別のポリヌクレオチドと置換することが容易となる。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインをコードする前記ポリヌクレオチドは、哺乳類細胞における発現を目的としてコドン最適化されている。
【０１５７】
いくつかの実施形態において、前記キメラ受容体の核酸配列は、細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチドを含む。該細胞内シグナル伝達ドメインが存在することによって、前記キメラ受容体を発現する形質導入細胞が腫瘍細胞上に発現されたリガンドに結合すると、該形質導入細胞の１つの機能が活性化される。いくつかの実施形態において、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、１つ以上の共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態において、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、前記形質導入細胞の少なくとも１つの機能を活性化する細胞内シグナル伝達ドメインの一部および／またはそのバリアントである。
【０１５８】
本開示のキメラ受容体に用いられる細胞内シグナル伝達ドメインとしては、ＣＤ３ζ鎖の細胞内配列、および／またはキメラ受容体が結合するとこれと協同してシグナル伝達を開始する補助受容体の細胞内配列、これらの配列の任意の誘導体またはバリアント、ならびに同じ機能を有する任意の合成配列が挙げられる。Ｔ細胞の活性化は、２種類の細胞内シグナル伝達配列によって媒介されると考えられており、これらの２種類の細胞内シグナル伝達配列は、抗原依存性一次活性化を開始し、かつＴ細胞受容体様シグナルを提供する細胞内シグナル伝達配列（一次細胞内シグナル伝達配列）と、抗原非依存性に、二次シグナルまたは共刺激シグナルを提供する細胞内シグナル伝達配列（二次細胞内シグナル伝達配列）とである。刺激性に作用する一次細胞内シグナル伝達配列は、受容体チロシン活性化モチーフすなわちＩＴＡＭとして知られるシグナル伝達モチーフを含んでいてもよい。一次細胞内シグナル伝達配列を含有するＩＴＡＭとしては、ＣＤ３ζ、ＦｃＲγ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、および／またはＣＤ６６ｄに由来するものが挙げられる。いくつかの実施形態において、前記一次シグナル伝達細胞内ドメインは、表１に示す配列を有するＣＤ３ζと少なくとも８０％、８５％、９０％もしくは９５％の配列同一性を有していてもよい。いくつかの実施形態において、ＣＤ３ζのバリアントは、表５に示すＩＴＡＭ領域を少なくとも１つ、２つもしくは３つ、またはこれらのＩＴＡＭ領域をすべて有する。
【０１５９】
好ましい実施形態において、前記キメラ受容体の前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを単独で、あるいは他の任意の所望される単一または複数の細胞内ドメインと組み合わせて含むように設計することができる。たとえば、前記キメラ受容体の前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζ鎖および共刺激シグナル伝達領域を含んでいてもよい。
【０１６０】
前記共刺激シグナル伝達領域は、共刺激分子の前記細胞内ドメインを含む、キメラ受容体の一部分を指す。共刺激分子は、抗原に対するリンパ球の応答に必要とされる抗原受容体やそのリガンド以外の細胞表面分子である。そのような分子としては、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、およびＢ７−Ｈ３、ならびに／またはＣＤ８３と特異的に結合し、かつ／もしくはＣＤ８３を標的とするリガンドが挙げられる。いくつかの実施形態においては、前記共刺激シグナル伝達ドメインは、表３に示すＣＤ２８の細胞内ドメインまたは表４に示す配列を有する４−１ＢＢと少なくとも８０％、８５％、９０％もしくは９５％のアミノ酸配列同一性を有していてもよい。いくつかの実施形態においては、前記ＣＤ２８細胞内ドメインのバリアントは、１８６〜１８７番目のアミノ酸がＬＬからＧＧに置換されている。
【０１６１】
キメラ受容体に複数存在する細胞内シグナル伝達配列は、ランダムな順序または指定された順序で互いに連結されていてもよい。これらの細胞内シグナル伝達配列は、短いオリゴペプチドリンカーまたは短いポリペプチドリンカーによって連結されていてもよく、これらのリンカーは２〜１０アミノ酸長であることが好ましい。一実施形態において、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζのシグナル伝達ドメインまたはそのバリアントの全体または一部と、ＣＤ２８のシグナル伝達ドメインまたはそのバリアントの全体またはその一部とを含む。別の実施形態においては、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζのシグナル伝達ドメインまたはそのバリアントの全体またはその一部と、４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインまたはそのバリアントの全体またはその一部とを含む。さらに別の実施形態においては、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζのシグナル伝達ドメインまたはそのバリアントの全体またはその一部と、ＣＤ２８のシグナル伝達ドメインまたはそのバリアントの全体または一部と、４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインまたはそのバリアントの全体またはその一部とを含む。特定の一実施形態における、ＣＤ３ζのバリアントと４−１ＢＢの細胞内シグナル伝達ドメインの一部とを含む前記細胞内シグナル伝達ドメインのアミノ酸配列を表１に示す。典型的な核酸配列を表１に示す。
【０１６２】
いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチドは、ＣＤ３ζドメインの一部に連結された４−１ＢＢの細胞内ドメインを含む。別の実施形態のいくつかにおいて、細胞内シグナル伝達ドメインは、単一の共刺激ドメインのみを含み、二重共刺激ドメイン（たとえば、4-1BB共刺激ドメインとCD28cytoの組み合わせなど）を含んでいない。
【０１６３】
いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチドは、４−１ＢＢの細胞内ドメインに連結されたＣＤ２８ドメインを含み、この４−１ＢＢの細胞内ドメインはさらにＣＤ３ζドメインの一部に連結されている。この細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチドを図１１に示す。細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチドは、アミノ酸配列に基づいて合成法または組換え法により容易に作製することができる。いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインをコードする前記ポリヌクレオチドは、該コード配列の５’末端および／または３’末端に１つ以上の制限酵素部位をさらに有していてもよく、これによって、細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチドを切断して、別の細胞内シグナル伝達ドメインをコードする別のポリヌクレオチドと置換することが容易となる。いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインをコードする前記ポリヌクレオチドは、哺乳類細胞、好ましくはヒト細胞における発現を目的としてコドン最適化されている。
【０１６４】
いくつかの実施形態においては、キメラ受容体の核酸配列は、マーカーをコードするポリヌクレオチド配列をさらに含んでいてもよい。マーカー配列は、形質導入細胞の選択および／または形質導入細胞の同定を可能とする細胞表面発現マーカーをコードすることが好ましい。いくつかの実施形態においては、前記マーカー配列は、リンカー配列をコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。いくつかの実施形態においては、前記リンカー配列は切断可能なリンカー配列である。
【０１６５】
複数の種類の異なるマーカー配列を用いることができる。通常、マーカー配列は、形質導入細胞の選択および／または検出を可能にする機能特性を有する。いくつかの実施形態において、前記マーカー配列は、ヒトリンパ球の形質導入に適合している。
【０１６６】
このポジティブ選択可能なマーカーは、導入された宿主細胞において、該遺伝子を持つ細胞のポジティブ選択を可能にする表現型を優位に発現する遺伝子であってもよい。このような遺伝子は当技術分野において公知であり、具体的には、ハイグロマイシンＢに対する耐性を与えるハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｈｐｈ）、抗生物質であるＧ４１８に対する耐性をコードするＴｎ５由来のアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｅｏまたはａｐｈ）、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子、アデノシンデアミナーゼ遺伝子（ＡＤＡ）、および／または多剤耐性（ＭＤＲ）遺伝子などが挙げられる。
【０１６７】
いくつかの実施形態においては、キメラ受容体の核酸配列は、マーカーをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。いくつかの実施形態においては、前記マーカー配列は、末端切断型上皮成長因子受容体をコードし、これは細胞表面に発現される。前記末端切断型上皮成長因子受容体をコードする典型的なポリヌクレオチドを表１に示す。いくつかの実施形態においては、前記マーカーをコードする前記ポリヌクレオチドは、リンカー配列をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されている。特定の一実施形態において、表１に示すように、前記リンカー配列は、切断可能なリンカー配列であるＴ２Ａである。Ｔ２Ａリンカーをコードする典型的なポリヌクレオチド配列を表１に示す。
【０１６８】
マーカーをコードするポリヌクレオチドは、アミノ酸配列に基づいて合成法または組換え法により容易に作製することができる。いくつかの実施形態において、マーカーをコードするポリヌクレオチドは、細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態において、マーカーをコードする前記ポリヌクレオチドは、該コード配列の５’末端および／または３’末端に１つ以上の制限酵素部位をさらに有していてもよく、これによって、マーカーをコードするポリヌクレオチドを切断して、別のマーカーをコードする別のポリヌクレオチドと置換することが容易となる。いくつかの実施形態において、マーカーをコードする前記ポリヌクレオチドは、哺乳類細胞における発現を目的としてコドン最適化されている。
【０１６９】
本明細書に記載の組成物は、ＣＤ４＋Ｔリンパ球および／またはＣＤ８＋Ｔリンパ球を提供する。Ｔリンパ球は、公知の技術によって回収することができ、フローサイトメトリーおよび／または免疫磁気選択のような、抗体との親和性結合などの公知の技術によって濃縮または除去することができる。濃縮工程および／または除去工程を行った後、公知の技術によって所望のＴリンパ球をインビトロで増殖させることができ（このような公知技術としては、たとえばRiddellらに付与された米国特許第6,040,177号に記載の技術が挙げられるが、これに限定されない）、当業者であればこれらの変法も容易に使用することができる。いくつかの実施形態では、前記Ｔ細胞は患者から得られた自己由来Ｔ細胞である。
【０１７０】
たとえば、所望のＴ細胞集団またはＴ細胞亜集団の増殖は、増殖前のＴリンパ球集団をインビトロにおいて培地に添加すること、非分裂末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）などのフィーダー細胞を該培地に添加すること（たとえば、添加後の細胞集団が、増殖培養される最初の集団中の各Ｔリンパ球１個あたり、少なくとも５個、１０個、２０個、または４０個またはそれ以上のＰＢＭＣフィーダー細胞を含むような比率で加える）、および該培地を（たとえばＴ細胞数の増加に十分な時間にわたって）インキュベートすることによって行ってもよい。前記非分裂フィーダー細胞は、γ線が照射されたＰＢＭＣフィーダー細胞を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、細胞分裂を防ぐため、3000〜3600radのγ線を前記ＰＢＭＣに照射する。培地にＴ細胞またはフィーダー細胞を添加する順序は必要に応じて入れ替えてもよい。典型的には、Ｔリンパ球の増殖に適した温度などの条件下で培養物をインキュベートすることができる。ヒトＴリンパ球を増殖させるための温度としては、たとえば、通常、少なくとも２５℃、好ましくは少なくとも３０℃、より好ましくは３７℃である。
【０１７１】
増殖させたＴリンパ球としては、ヒト腫瘍または病原体上に存在する抗原に特異的であってもよいＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）およびＣＤ４＋ヘルパーＴリンパ球が挙げられる。前記増殖方法は、ＥＢＶで形質転換された非分裂リンパ芽球様細胞（ＬＣＬ）をフィーダー細胞として加える工程をさらに含んでもよい。6000〜10,000radのγ線をＬＣＬに照射してもよい。前記ＬＣＬフィーダー細胞は任意の適切な量で提供することができ、たとえば、ＬＣＬフィーダー細胞と増殖開始時のＴリンパ球との比は少なくとも１０：１であってもよい。前記増殖方法は、（たとえば、少なくとも０．５ｎｇ／ｍｌの濃度で）抗ＣＤ３抗体および／または抗ＣＤ２８抗体を培地に加える工程をさらに含んでもよい。前記増殖方法は、ＩＬ−２および／またはＩＬ−１５を培地に加える工程をさらに含んでもよい（ＩＬ−２の濃度は、たとえば、少なくとも１０ユニット／ｍｌである）。Ｔリンパ球を単離し、増殖を行う前または増殖を行った後に、細胞傷害性Ｔリンパ球およびヘルパーＴリンパ球をそれぞれ、ナイーブＴ細胞亜集団、メモリーＴ細胞亜集団、およびエフェクターＴ細胞亜集団にソートすることができる。
【０１７２】
ＣＤ８＋Ｔ細胞は、標準的な方法を用いることによって得ることができる。いくつかの実施形態において、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞、およびエフェクターメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞それぞれと関連する細胞表面抗原を同定することによって、ナイーブ細胞、セントラルメモリー細胞、およびエフェクターメモリー細胞にさらにソートされる。いくつかの実施形態において、メモリーＴ細胞は、ＣＤ８＋末梢血リンパ球由来のＣＤ６２Ｌ＋サブセットおよびＣＤ６２Ｌ−サブセットの両方に存在する。ＰＢＭＣは、抗ＣＤ８抗体および抗ＣＤ６２Ｌ抗体で染色した後に、ＣＤ６２Ｌ−ＣＤ８＋画分および／またはＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ８＋画分にソートされる。いくつかの実施形態において、セントラルメモリーＴＣＭの表現型マーカーの発現は、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ３、および／またはＣＤ１２７を含み、グランザイムＢおよび／またはＣＤ４５ＲＡは陰性であるか、低発現を示す。いくつかの実施形態において、セントラルメモリーＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、またはＣＤ８＋のＴ細胞である。いくつかの実施形態において、エフェクターＴＥは、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、および／またはＣＤ１２７が陰性であり、グランザイムＢおよび／またはパーフォリンは陽性である。いくつかの実施形態において、ナイーブＣＤ８＋Ｔリンパ球は、ナイーブＴ細胞の表現型マーカーの発現によって特徴付けられ、ナイーブＴ細胞の表現型マーカーとしては、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ１２７、および／またはＣＤ４５ＲＡが挙げられる。
【０１７３】
細胞または細胞集団が特定の細胞表面マーカーについて陽性であるかどうかは、該表面マーカーに特異的な抗体およびアイソタイプを一致させたコントロール抗体による染色を使用したフローサイトメトリーによって判定することができる。細胞集団において特定のマーカーが陰性であることは、アイソタイプコントロールと比べて特異的抗体で強く染まる細胞集団が見られないことを指し、陽性は、アイソタイプコントロールと比べて特異的抗体で均一染まる細胞集団が見られることを指す。いくつかの実施形態において、１つ以上のマーカーの発現の減少は、対照の細胞集団と比較して、平均蛍光強度の低下が1 log10であること、および／またはマーカーを発現する細胞のパーセンテージが細胞全体の少なくとも２０％に低下すること、細胞全体の少なくとも２５％に低下すること、細胞全体の少なくとも３０％に低下すること、細胞全体の少なくとも３５％に低下すること、細胞全体の少なくとも４０％に低下すること、細胞全体の少なくとも４５％に低下すること、細胞全体の少なくとも５０％に低下すること、細胞全体の少なくとも５５％に低下すること、細胞全体の少なくとも６０％に低下すること、細胞全体の少なくとも６５％に低下すること、細胞全体の少なくとも７０％に低下すること、細胞全体の少なくとも７５％に低下すること、細胞全体の少なくとも８０％に低下すること、細胞全体の少なくとも８５％に低下すること、細胞全体の少なくとも９０％に低下すること、細胞全体の少なくとも９５％に低下すること、もしくは細胞全体の少なくとも１００％に低下すること、もしくは２０〜１００％の範囲の任意のパーセンテージに低下することを指す。いくつかの実施形態において、細胞集団が１つ以上のマーカーについて陽性であることは、対照の細胞集団と比較して、マーカーを発現する細胞のパーセンテージが細胞全体の少なくとも５０％であること、細胞全体の少なくとも５５％であること、細胞全体の少なくとも６０％であること、細胞全体の少なくとも６５％であること、細胞全体の少なくとも７０％であること、細胞全体の少なくとも７５％であること、細胞全体の少なくとも８０％であること、細胞全体の少なくとも８５％であること、細胞全体の少なくとも９０％であること、細胞全体の少なくとも９５％であること、もしくは細胞全体の少なくとも１００％であること、または５０〜１００％の範囲の任意のパーセンテージであることを指す。
【０１７４】
ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞は、細胞表面抗原を有する細胞集団を同定することによって、ナイーブ細胞、セントラルメモリー細胞、およびエフェクター細胞にソートされる。ＣＤ４＋リンパ球は、標準的な方法によって得ることができる。いくつかの実施形態において、ナイーブＣＤ４＋Ｔリンパ球は、ＣＤ４５ＲＯ−、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、および／またはＣＤ４＋のＴ細胞である。いくつかの実施形態において、セントラルメモリーＣＤ４＋細胞は、ＣＤ６２Ｌ＋および／またはＣＤ４５ＲＯ＋である。いくつかの実施形態において、エフェクターＣＤ４＋細胞は、ＣＤ６２Ｌ−および／またはＣＤ４５ＲＯ＋である。
【０１７５】
いくつかの実施形態において、抗原特異的なＣＤ４＋集団およびＣＤ８＋集団は、ナイーブＴリンパ球または抗原特異的Ｔリンパ球を抗原で刺激することによって得ることができる。たとえば、サイトメガロウイルス抗原に対して特異的なＴ細胞株またはＴ細胞クローンは、サイトメガロウイルス抗原に感染した対象からＴ細胞を単離し、インビトロにおいてサイトメガロウイルス抗原で該細胞を刺激することによって作製することができる。ナイーブＴ細胞を使用してもよい。Ｔ細胞応答を誘導するための標的として使用する、腫瘍細胞に由来する抗原の数は特に限定されない。いくつかの実施形態において、本発明の養子細胞免疫療法組成物は、固形腫瘍、血液悪性腫瘍、乳がん、または黒色腫を含む疾患または障害の治療に有用である。
【０１７６】
いくつかの実施形態においては、本発明の開示による免疫療法に使用する前記Ｔ細胞に機能性遺伝子を導入することが望ましい場合がある。たとえば、単一の遺伝子または複数の遺伝子をＴ細胞に導入することによって、体内に移入された該Ｔ細胞の生存能および／または機能を向上することができ、それによって治療法の有効性を向上または改善することができる。あるいは、上記単一または複数の遺伝子を導入することによって、遺伝子マーカーを提供することができ、この遺伝子マーカーを利用することによって、インビボにおける生存Ｔ細胞および／または移行Ｔ細胞の選択および／または評価が可能となる。
あるいは、上記単一または複数の遺伝子をＴ細胞に導入することによって、たとえば、インビボにおいてネガティブセレクションにより除去されるように該Ｔ細胞を改変することができ、それによって免疫療法の安全性を向上または改善することができる。このような方法は、Lupton S. D. et al., Mol. and Cell Biol., 11:6 (1991)；およびRiddell et al., Human Gene Therapy 3:319-338 (1992)に記載されている。さらに、LuptonらによるPCT/US91/08442およびPCT/US94/05601も参照されたいが、これらの文献では、ドミナントポジティブ型の選択マーカーとネガティブ選択マーカーとを融合させた選択可能な二機能性融合遺伝子の使用について述べられている（これらの文献は参照によってその全体が本明細書に明示的に組み込まれる）。このような二機能性融合遺伝子の使用は、公知の技術（たとえば、Riddellらに付与された米国特許第6,040,177号の１４〜１７段落を参照されたい）、または本明細書の記載を元に当業者によって容易に理解されうる上記技術の変法によって実施することができる。
【０１７７】
いくつかの実施形態においては、本明細書に記載されているように、Ｔ細胞はキメラ受容体で改変される。いくつかの実施形態において、前記Ｔ細胞は、処置を受ける対象から得られ、別の実施形態においては、前記リンパ球は同種異系のヒトドナー、好ましくは健常ヒトドナーから得られる。好ましくは、本明細書に記載の、キメラ抗原受容体を含むＴ細胞は、（ヒトにおいて天然に製造される）胸腺細胞に由来するか、あるいは、遺伝子操作された前駆細胞（たとえば、ｉＰＳ細胞など）由来の細胞に由来する。
【０１７８】
いくつかの実施形態において、キメラ受容体は、本明細書に記載されているように、腫瘍細胞の表面分子と特異的に結合しかつ／またはこの表面分子を標的とするリガンド結合ドメイン、ポリペプチドスペーサー領域、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、前記リガンド結合ドメインは、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）に由来する一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）である。ＣＤ２８共刺激ドメインおよび／または４−１ＢＢ共刺激ドメインをＣＤ３ζ鎖に融合することによって、前記キメラ受容体を介して共刺激シグナルを提供することもできる。キメラ受容体は特異的であり、かつ／またはＨＬＡとは無関係に細胞表面分子を標的とする。したがって、ＨＬＡによる制限や腫瘍細胞におけるＨＬＡの低レベル発現などの、ＴＣＲによる認識に関連する制限事項には縛られない。
【０１７９】
いくつかの実施形態において、ＣＤ４＋Ｔリンパ球集団およびＣＤ８＋Ｔリンパ球集団のそれぞれに導入されるキメラ受容体は同じでも異なっていてもよい。いくつかの実施形態においては、これらの細胞集団のそれぞれに導入されるキメラ受容体のリガンド結合ドメインは、腫瘍細胞上または感染細胞上の同じリガンドに特異的に結合し、これらのリガンドを標的とする。前記細胞シグナル伝達モジュールもそれぞれ異なっていてもよい。いくつかの実施形態においては、前記ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞の前記細胞内シグナル伝達ドメインは、前記ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞の前記細胞内シグナル伝達ドメインと同一のものである。別の実施形態では、前記ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞の前記細胞内シグナル伝達ドメインは、前記ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞の前記細胞内シグナル伝達ドメインと異なるものである。
【０１８０】
いくつかの実施形態において、ＣＤ４Ｔリンパ球またはＣＤ８ Ｔリンパ球はそれぞれ、本明細書に記載の形質導入の前に、ナイーブ細胞、セントラルメモリー細胞、エフェクターメモリー細胞またはエフェクター細胞にソートすることができる。別の実施形態のいくつかにおいて、ＣＤ４Ｔリンパ球またはＣＤ８ Ｔリンパ球はそれぞれ、形質導入を行った後に、ナイーブ細胞、セントラルメモリー細胞、エフェクターメモリー細胞またはエフェクター細胞にソートすることができる。
【０１８１】
遺伝子送達のための組換え感染性ウイルス粒子を利用した様々な形質導入技術が開発されてきた。このような形質導入技術は、本発明のＴリンパ球を形質導入するためのアプローチとして現時点では好ましい。この形質導入技術に通常使用されるウイルスベクターとしては、シミアンウイルス４０、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルスベクター、および／またはレトロウイルスに由来するウイルスベクターが挙げられる。このように、遺伝子導入方法および発現方法としては様々なものが存在するが、このような方法は、哺乳類細胞に遺伝物質を導入して発現させることを本質的な機能とする。前記形質導入技術のいくつかは、造血細胞またはリンパ球に形質導入することを目的として使用され、このような形質導入技術としては、リン酸カルシウムトランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、組換えアデノウイルスによる感染、アデノ随伴ウイルスによる感染、および／またはレトロウイルスベクターによる感染が挙げられる。初代Ｔリンパ球の形質導入は、エレクトロポレーションおよびレトロウイルスまたはレンチウイルスの感染によって成功を収めている。
【０１８２】
レトロウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターを使用することによって、真核細胞への遺伝子導入を非常に効率的に行うことができる。さらに、レトロウイルスまたはレンチウイルスの組み込みは制御下で行うことができ、細胞１個あたり１コピーまたは数コピーの新しい遺伝情報を安定して組み込むことができる。
【０１８３】
いくつかの実施形態においては、ネガティブ選択可能な表現型を有する細胞のインビトロでの選択を可能にするポジティブマーカーをＴ細胞に導入すると有用である場合がある。このポジティブ選択可能なマーカーは、導入された宿主細胞において、該遺伝子を持つ細胞のポジティブ選択を可能にする表現型を優位に発現する遺伝子であってもよい。このような遺伝子は当技術分野において公知であり、具体的には、ハイグロマイシンＢに対する耐性を与えるハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｈｐｈ）、抗生物質であるＧ４１８に対する耐性をコードするＴｎ５由来のアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｅｏまたはａｐｈ）、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子、アデノシンデアミナーゼ遺伝子（ＡＤＡ）、および／または多剤耐性（ＭＤＲ）遺伝子などが挙げられる。
【０１８４】
Ｔリンパ球に形質を導入するため、当技術分野において公知の様々な方法を使用することができる。いくつかの実施形態においては、レンチウイルスベクターを用いて形質導入を行う。いくつかの実施形態においては、キメラ受容体をコードする発現ベクターを使用して、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞をそれぞれ別々に改変し、所定の集団を形成することができる。いくつかの実施形態においては、これらの細胞は、次いで、前述したナイーブ細胞の亜集団、セントラルメモリー細胞の亜集団、およびエフェクター細胞の亜集団のそれぞれに固有の細胞表面抗原でソートすることによって、これらの亜集団にソートされる。また、ＣＤ４＋Ｔ細胞集団およびＣＤ８＋Ｔ細胞集団は、それらのサイトカインプロファイルまたは増殖活動によって選択してもよい。たとえば、抗原で刺激した後の、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＴＮＦα、および／またはＩＦＮγなどのサイトカインの産生が、偽形質導入細胞や形質導入ＣＤ８＋細胞よりも増強されたＣＤ４＋Ｔリンパ球を選択することができる。別の実施形態において、ＩＬ−２および／またはＴＮＦαの産生が増強されたナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞またはセントラルメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞が選択される。同様に、偽形質導入ＣＤ８＋細胞よりもＩＦＮγの産生が増強されたＣＤ８＋細胞が選択される。
【０１８５】
いくつかの実施形態においては、抗原または腫瘍標的に応答して増殖するＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞が選択される。たとえば、抗原または腫瘍標的で刺激した場合に、偽物形質導入細胞よりも、活発に増殖するＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋形質導入細胞が選択される。いくつかの実施形態においては、抗原を有する細胞に対して細胞傷害性を示すＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞が選択される。いくつかの実施形態においては、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞よりも低い細胞傷害性を示すと予想される。
【０１８６】
好ましい一実施形態においては、特定の種類のがんについて確立されたインビボ動物モデルにおいて、このがんの腫瘍細胞を殺傷する能力を発揮する形質導入リンパ球（たとえばＣＤ８＋セントラルメモリー細胞）が選択される。そのような動物モデルは当業者に知られており、この動物モデルにヒトは包含されない。本明細書に記載されているように、リンパ球に形質導入されたキメラ受容体構築物は、インビトロで活性化され、腫瘍細胞を殺傷する能力を付与したとしても、そのキメラ受容体構築物のすべてが、インビボにおいて腫瘍細胞を殺傷する能力を付与するとは限らない。特に、いくつかの標的分子については、長いスペーサー領域を有するキメラ受容体構築物を含むＴ細胞は、短いスペーサー領域を有するキメラ受容体を含むＴ細胞よりも、インビボで腫瘍細胞を殺傷する効果が低かった。
【０１８７】
本開示は、本発明の組成物においてＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞の組み合わせを使用することを包含する。一実施形態において、キメラ受容体により形質導入されたＣＤ４＋細胞の組み合わせは、同じリガンドに特異的である形質導入キメラ受容体発現ＣＤ８＋細胞と組み合わせてもよく、あるいは異なる腫瘍リガンドに特異的でありかつ／または異なる腫瘍リガンドを標的とするＣＤ８＋Ｔ細胞と組み合わせてもよい。別の実施形態においては、形質導入キメラ受容体発現ＣＤ８＋細胞は、腫瘍上に発現された別のリガンドに特異的でありかつ／またはこのようなリガンドを標的とする形質導入キメラ受容体発現ＣＤ４＋細胞と組み合わせる。さらに別の実施形態においては、キメラ受容体で改変されたＣＤ４＋細胞とＣＤ８＋細胞とを組み合わせる。いくつかの実施形態においては、ＣＤ８＋細胞とＣＤ４＋細胞は、様々な比率で組み合わせることができ、たとえば、ＣＤ８＋とＣＤ４＋とを１：１の比率で組み合わせることができ、ＣＤ８＋とＣＤ４＋とを１０：１の比率で組み合わせることができ、ＣＤ８＋とＣＤ４＋とを１００：１の比率で組み合わせることができる。いくつかの実施形態においては、組み合わされた細胞集団は、インビトロおよび／またはインビボにおいて細胞増殖を試験し、細胞の増殖が見られる細胞比率を選択する。
【０１８８】
本明細書に記載されているように、本開示では、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞をさらに亜集団に分離することを包含し、たとえば、ナイーブ細胞集団、セントラルメモリー細胞集団およびエフェクターメモリー細胞集団などに分離される。本明細書に記載のように、いくつかの実施形態において、ナイーブＣＤ４＋細胞は、ＣＤ４５ＲＯ−、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４＋のＴ細胞である。いくつかの実施形態において、セントラルメモリーＣＤ４＋細胞は、ＣＤ６２Ｌ＋およびＣＤ４５ＲＯ＋である。いくつかの実施形態において、エフェクターＣＤ４＋細胞は、ＣＤ６２Ｌ−およびＣＤ４５ＲＯ＋である。これらの集団はそれぞれ別個にキメラ受容体で改変してもよい。
【０１８９】
形質導入を行った後および／またはキメラ受容体を有する細胞を選択した後、得られた各細胞集団は、ヒト対象中への少なくとも１回の注入に十分な数に達するまでインビトロにおいて増殖させることが好ましく、少なくとも１回の注入に十分な細胞数としては、典型的には、約１０４細胞／ｋｇ〜１０９細胞／ｋｇが挙げられる。いくつかの実施形態においては、前記形質導入細胞は、抗原を有する細胞、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８、およびＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、もしくはＩＬ−２１、またはそれらの組み合わせの存在下で培養される。
【０１９０】
ＣＤ４＋細胞の亜集団とＣＤ８＋細胞の亜集団とを組み合わせてもよい。特定の一実施形態においては、改変されたナイーブＣＤ４＋細胞またはセントラルメモリーＣＤ４＋細胞と、改変されたセントラルメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞とを組み合わせることによって、抗原を有する細胞（たとえば腫瘍細胞）に対して相乗的な細胞傷害性効果を提供する。
【０１９１】
本発明の開示は、本明細書に記載の遺伝子改変Ｔリンパ球製剤を含む養子細胞免疫療法組成物を提供する。
【０１９２】
いくつかの実施形態においては、前記Ｔリンパ球製剤は、キメラ受容体を有するＣＤ４＋Ｔ細胞を含み、該キメラ受容体は、本明細書に記載されているように、前記疾患または障害に関連するリガンドに特異的な細胞外抗体可変ドメイン、カスタマイズ可能なスペーサー領域、膜貫通ドメイン、およびＴ細胞受容体またはその他の受容体の細胞内シグナル伝達ドメインを含む。別の実施形態においては、養子細胞免疫療法組成物は、キメラ受容体により改変された腫瘍特異的ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球製剤をさらに含み、該細胞傷害性Ｔリンパ球製剤が、細胞性免疫応答を提供し、キメラ受容体を有するＣＤ８＋Ｔ細胞を含み、該キメラ受容体が、本明細書に記載されているように、前記疾患または障害に関連するリガンドに特異的な細胞外一本鎖抗体、カスタマイズ可能なスペーサー領域、膜貫通ドメイン、およびＴ細胞受容体の細胞内シグナル伝達ドメインを含むことを特徴とする。
【０１９３】
いくつかの実施形態においては、養子細胞免疫療法組成物は、キメラ受容体により改変された腫瘍特異的なＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球製剤、抗原反応性のキメラ受容体で改変されたナイーブＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞、および薬学的に許容される担体を含み、前記細胞傷害性Ｔリンパ球製剤が、細胞性免疫応答を提供し、キメラ受容体を有するＣＤ８＋Ｔ細胞を含み、該キメラ受容体が、前記疾患または障害に関連するリガンドを標的とすることができかつ／またはこのリガンドに特異的な細胞外一本鎖抗体、カスタマイズ可能なスペーサー領域、膜貫通ドメイン、およびＴ細胞受容体の細胞内シグナル伝達ドメインを含むこと、ならびに前記ナイーブＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞が、ＣＤ４５ＲＯ−ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞に由来することを特徴とする。
【０１９４】
別の実施形態においては、養子細胞免疫療法組成物は、抗原特異的かつ／または抗原標的ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球製剤と抗原反応性のキメラ受容体で改変されたナイーブＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞との組み合わせを含み、前記ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球製剤が、患者由来であり、細胞性免疫応答を提供すること、前記ナイーブＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞が、ＣＤ８＋Ｔリンパ球による免疫応答を増強すること、ならびに前記ヘルパーＴリンパ球製剤が、キメラ受容体を有するＣＤ４＋Ｔ細胞を含み、該キメラ受容体が、前記疾患または障害に関連する抗原を標的とすることができかつ／または該抗原に特異的な細胞外抗体可変ドメイン、カスタマイズ可能なスペーサー領域、膜貫通ドメイン、およびＴ細胞受容体の細胞内シグナル伝達ドメイン含むことを特徴とする。
【０１９５】
さらに別の一実施形態において、養子細胞免疫療法組成物は、抗原反応性キメラ受容体により改変したナイーブＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞含み、該ヘルパーＴリンパ球製剤が、前記ＣＤ８＋Ｔリンパ球による免疫応答を増強し、キメラ受容体を有するＣＤ４＋Ｔ細胞を含み、該キメラ受容体が、疾患または障害に関連するリガンドを標的とすることができかつ／または該リガンドに特異的な細胞外抗体可変ドメイン、カスタマイズ可能なスペーサー領域、膜貫通ドメイン、およびＴ細胞受容体の細胞内シグナル伝達ドメインを含むことを特徴とする。
【０１９６】
いくつかの実施形態においては、前記ＣＤ４＋Ｔヘルパーリンパ球は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞およびバルクＣＤ４＋Ｔ細胞からなる群から選択される。いくつかの実施形態においては、前記ＣＤ４＋ヘルパーリンパ球は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞であり、該ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ４５ＲＯ−Ｔ細胞、ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞、および／またはＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を含む。いくつかの実施形態においては、前記細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔリンパ球は、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞およびバルクＣＤ８＋Ｔ細胞からなる群から選択される。いくつかの実施形態においては、前記ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球は、セントラルメモリーＴ細胞であり、該セントラルメモリーＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞、ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。さらに別の実施形態では、前記ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球はセントラルメモリーＴ細胞であり、前記ＣＤ４＋ヘルパーＴリンパ球はナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞またはセントラルメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞である。
【０１９７】
本発明の開示は、養子免疫療法組成物の製造方法、および、疾患または障害を有する対象において細胞免疫療法を行うための、該組成物の使用、または疾患または障害を有する対象において組成物を使用して細胞免疫療法を行う方法を提供する。前記キメラ受容体により改変されたＴ細胞の増殖および持続性は、前記疾患または障害の動物モデルを使用し、前記細胞を投与し、移入された細胞の持続能力および／または増殖能力を算出することによって、測定することができる。別の実施形態において、増殖および活性化は、抗原を有する細胞を使用して複数回にわたって活性化することによって、インビトロで試験することができる。
【０１９８】
いくつかの実施形態においては、前記組成物の製造方法は、改変されたナイーブＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞を得ることを含み、前記改変されたヘルパーＴリンパ球製剤が、キメラ受容体を有するＣＤ４＋Ｔ細胞を含み、該キメラ受容体が、本明細書に記載されているように、腫瘍細胞の表面分子を標的とすることができかつ／または該分子に特異的なリガンド結合ドメイン、カスタマイズされたスペーサードメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含むことを特徴とする。
【０１９９】
別の一実施形態においては、前記方法は、改変されたＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞を得ることをさらに含み、前記改変された細胞傷害性Ｔリンパ球製剤が、キメラ受容体を有するＣＤ８＋細胞を含み、該キメラ受容体が、本明細書に記載されているように、腫瘍細胞の表面分子を標的とすることができかつ／または該分子に特異的なリガンド結合ドメイン、カスタマイズされたスペーサードメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含むことを特徴とする。
【０２００】
別の一実施形態においては、前記方法は、改変されたＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞を得ることを含み、前記改変された細胞傷害性Ｔリンパ球製剤が、キメラ受容体を有するＣＤ８＋Ｔ細胞を含み、該キメラ受容体が、本明細書に記載されているように、腫瘍細胞の表面分子を標的とすることができかつ／または該分子に特異的なリガンド結合ドメイン、カスタマイズされたスペーサードメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含むことを特徴とし、該方法は、前記改変されたＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞とＣＤ４＋ヘルパー細胞リンパ球製剤とを組み合わせることをさらに含む。
【０２０１】
キメラ受容体で改変されたＣＤ４＋細胞およびＣＤ８＋細胞の調製は、上記および実施例で説明したとおりである。抗原特異的Ｔリンパ球または抗原標的Ｔリンパ球は、疾患または障害を有する患者から得ることができ、また、抗原の存在下、インビトロにおいてＴリンパ球を刺激することによっても調製することができる。抗原特異性または抗原標的性によって選択されなかったＣＤ４＋Ｔリンパ球亜集団およびＣＤ８＋Ｔリンパ球亜集団も本明細書に記載の方法で単離することができ、前記製造方法に組み込むことができる。いくつかの実施形態においては、このような細胞集団の組み合わせは、細胞表面マーカーの均一性、すなわち少なくとも２世代にわたり増殖する能力を評価して、均一な細胞分化状態を有するかどうかを確認することができる。品質管理は、前記標的リガンドを発現する細胞株とキメラ受容体により改変されたＴ細胞とを共培養し、当技術分野で公知の細胞傷害アッセイ、増殖アッセイまたはサイトカイン産生アッセイを使用して、該キメラ受容体により改変されたＴ細胞が該細胞株を認識するかどうかを確認することによって実施することができる。前記キメラ受容体により改変されたＴ細胞の細胞分化状態および細胞表面マーカーは、フローサイトメトリーによって測定することができる。いくつかの実施形態において、前記ＣＤ８＋細胞の前記マーカーおよび細胞分化状態は、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ６９、ＣＤ２５、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ４５ＲＯおよび／またはＣＤ４５ＲＡを含む。いくつかの実施形態において、前記ＣＤ４＋細胞の前記マーカーおよび細胞分化状態は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ６９、ＣＤ２５、ＰＤ−１およびＣＴＬＡ−４ ＣＤ４５ＲＯおよび／またはＣＤ４５ＲＡを含む。
【０２０２】
いくつかの実施形態においては、キメラ受容体のためのスペーサー領域を選択する方法が提供される。驚くべきことに、いくつかのキメラ受容体構築物は、インビトロにおいては効果的にＴ細胞を活性化したが、インビボでは効果的にＴ細胞を活性化しなかった。
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、
スペーサー領域のみが異なる複数のキメラ受容体核酸配列を提供すること、
各キメラ受容体核酸配列を個別のＴリンパ球集団に導入すること、
前記個別のリンパ球集団をインビトロで増殖させること、
腫瘍を有する動物に各リンパ球集団を導入して、キメラ受容体で改変された各Ｔ細胞の抗腫瘍作用を測定すること、および
他のキメラ受容体で改変されたＴ細胞により改変された他の個別のリンパ球集団と比較して抗腫瘍作用を提供するキメラ受容体を選択すること
を含む。
【０２０３】
様々な腫瘍動物モデルが知られている。抗腫瘍作用の測定は、腫瘍体積の減少を特定すること、ならびに動物の死を測定すること、遺伝子改変Ｔ細胞のインビボでの持続性を測定すること、遺伝子改変Ｔ細胞の活性化を測定すること（たとえば、ＣＤ２５および／またはＣＤ６９の発現の増強を検出することよって測定できる）、および／またはインビボでの遺伝子改変Ｔ細胞の増殖を測定することによって行うことができる。いくつかの実施形態において、これらのパラメータの１つ以上を測定したときに、インビボにおいて最も良好な抗腫瘍作用を提供するキメラ受容体が選択される。抗腫瘍作用の欠如は、インビボで遺伝子改変リンパ球が持続できないこと、動物の死、カスパーゼ−３の誘導増強によって測定されるアポトーシスの増強、および／または遺伝子改変リンパ球の増殖の低下から判断することができる。
【０２０４】
いくつかの実施形態においては、スペーサー領域のみが異なる複数のキメラ受容体核酸配列の提供は、キメラ受容体構築物を提供することを含み、該キメラ受容体構築物は、リガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチド、第１のポリペプチドスペーサーをコードするポリヌクレオチド、膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチド、および細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチドを含み、前記リガンドが、腫瘍持異抗原もしくは腫瘍標的抗原（たとえばＣＤ１７１）、またはリンパ球による認識および排除を媒介するのに適切な標的細胞集団に発現しているその他の分子であること、ならびに該第１ポリペプチドスペーサーのコード配列が５’末端および３’末端に公知の制限部位を有することを特徴とする。
【０２０５】
いくつかの実施形態においては、本発明の開示は、がんを治療もしくは抑制する方法、がんの進行および／もしくは転移を抑制するもしくは遅延させる方法、腫瘍細胞もしくはがん細胞を抑制もしくは低減する方法、ならびに／またはＣＤ１７１発現細胞を含む標的集団の抑制もしくは低減を必要とする患者において、該標的集団を抑制または低減する方法を提供する。これらの方法は、細胞性免疫応答を提供する遺伝子改変細胞傷害性Ｔリンパ球製剤を上記の処置を必要とする対象または患者に投与することを含み、該細胞傷害性Ｔリンパ球製剤はキメラ受容体を有するＣＤ８＋Ｔ細胞を含み、該キメラ受容体が、リガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチド、ポリペプチドスペーサーをコードするポリヌクレオチド、膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチドおよび１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチドを含むこと、前記リガンドが、腫瘍持異抗原もしくは腫瘍標的抗原、またはリンパ球による認識および／もしくは排除を媒介するのに適切な標的細胞集団に発現しているその他の分子（たとえばＣＤ１７１）であること、前記ポリペプチドスペーサーがカスタマイズされた長さを有すること、前記スペーサーによって、Ｔ細胞の増殖、および／またはサイトカイン産生が対照キメラ受容体よりも増強されることを特徴とする。いくつかの実施形態においては、前記対象は、がんの抑制療法または治療法を必要とする対象として同定または選択されている。そのような選択または同定は、臨床評価または診断評価によって行うことができる。
【０２０６】
また、本発明の開示は、疾患または障害を有する対象において細胞免疫療法を行う方法であって、本明細書に記載のキメラ受容体を発現するリンパ球を含む組成物を投与することを含む方法を提供する。別の実施形態においては、前記方法は、遺伝子改変細胞傷害性Ｔリンパ球製剤および遺伝子改変ヘルパーＴリンパ球製剤を前記対象に投与することを含み、前記細胞傷害性Ｔリンパ球製剤が、細胞性免疫応答を提供し、かつキメラ受容体を有するＣＤ８＋Ｔ細胞を含み、該キメラ受容体が、本明細書に記載されているように、腫瘍細胞の表面分子を標的とすることができかつ／または該分子に特異的なリガンド結合ドメイン、カスタマイズされたスペーサードメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含むこと、ならびに前記ヘルパーＴリンパ球製剤が、腫瘍の直接認識を誘導するとともに、前記遺伝子改変細胞傷害性Ｔリンパ球製剤の細胞性免疫応答を媒介する能力を増強し、かつキメラ受容体を有するＣＤ４＋Ｔ細胞を含み、該キメラ受容体が、本明細書に記載されているように、腫瘍細胞の表面分子を標的とすることができかつ／または該分子に特異的なリガンド結合ドメイン、カスタマイズされたスペーサードメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含むことを特徴とする。いくつかの実施形態においては、前記対象は、がんの抑制療法または治療法を必要とする対象として同定または選択されている。そのような選択または同定は、臨床評価または診断評価によって行うことができる。
【０２０７】
本発明の開示の範囲をなんら限定するものではないが、インビボで持続し増殖することができるキメラ受容体保有改変Ｔ細胞集団を投与前に選択することによって、Ｔ細胞の用量を低減することができ、かつ治療活性をより均一なものとすることができると考えられる。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞の用量を少なくとも１０％、２０％、３０％、またはそれ以上低減することができる。Ｔ細胞の用量を低減することは、腫瘍崩壊症候群およびサイトカインストームのリスクの低減に有益だと考えられる。
【０２０８】
別の一実施形態では、疾患または障害を有する対象において細胞免疫療法を行う方法は、遺伝子改変ヘルパーＴリンパ球製剤を前記対象に投与することを含み、前記改変されたヘルパーＴリンパ球製剤が、キメラ受容体を有するＣＤ４＋Ｔ細胞を含み、該キメラ受容体が、本明細書に記載されているように、腫瘍細胞の表面分子を標的とすることができかつ／または該分子に特異的なリガンド結合ドメイン、カスタマイズされたスペーサードメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含むことを特徴とする。いくつかの実施形態においては、前記方法は、遺伝子改変細胞傷害性Ｔリンパ球製剤を前記対象に投与することをさらに含み、前記改変された細胞傷害性Ｔリンパ球製剤が、キメラ受容体を有するＣＤ８＋細胞を含み、該キメラ受容体が、本明細書に記載されているように、腫瘍細胞の表面分子を標的とすることができかつ／または該分子に特異的なリガンド結合ドメイン、カスタマイズされたスペーサードメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含むことを特徴とする。いくつかの実施形態においては、前記対象は、がんの抑制療法または治療法を必要とする対象として同定または選択されている。そのような選択または同定は、臨床評価または診断評価によって行うことができる。
【０２０９】
別の一実施形態は、疾患または障害を有する対象において細胞免疫療法を行う方法であって、前記対象の生体試料を分析して、前記疾患または障害に関連する標的分子（たとえばＣＤ１７１）の存在を検出すること、および本明細書に記載の養子免疫療法組成物を投与することを含み、前記キメラ受容体が、前記標的分子を標的とし、該標的分子に特異的に結合することを特徴とする方法に関する。いくつかの実施形態においては、前記対象は、がんの抑制療法または治療法を必要とする対象として同定または選択されている。そのような選択または同定は、臨床評価または診断評価によって行うことができる。
【０２１０】
いくつかの実施形態においては、前記ＣＤ４＋Ｔヘルパーリンパ球は、前記キメラ受容体の導入前に、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞およびバルクＣＤ４＋Ｔ細胞からなる群から選択される。特定の一実施形態においては、前記ＣＤ４＋ヘルパーリンパ球は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞であり、該ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ４５ＲＯ−Ｔ細胞、ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞、および／またはＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を含む。さらに別の実施形態においては、前記細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔリンパ球は、前記キメラ受容体の導入前に、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞およびバルクＣＤ８＋Ｔ細胞からなる群から選択される。特定の一実施形態においては、前記ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球は、セントラルメモリーＴ細胞であり、該セントラルメモリーＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞、ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。特定の一実施形態においては、前記ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球はセントラルメモリーＴ細胞であり、前記ＣＤ４＋ヘルパーＴリンパ球はナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態においては、前記対象は、がんの抑制療法または治療法を必要とする対象として同定または選択されている。そのような選択または同定は、臨床評価または診断評価によって行うことができる。
【０２１１】
いくつかの実施形態においては、前記ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞はいずれも、腫瘍特異的細胞表面分子に特異的に結合しかつ／またはこの表面分子を標的とする抗体重鎖ドメインを含むキメラ受容体で遺伝子改変されている。別の実施形態においては、前記ＣＤ８細胞傷害性Ｔ細胞の前記細胞内シグナル伝達ドメインは、前記ＣＤ４ヘルパーＴ細胞の前記細胞内シグナル伝達ドメインと同一のものである。さらに別の実施形態では、前記ＣＤ８細胞傷害性Ｔ細胞の前記細胞内シグナル伝達ドメインは、前記ＣＤ４ヘルパーＴ細胞の前記細胞内シグナル伝達ドメインと異なるものである。
【０２１２】
本明細書に記載の組成物を提供することが可能な対象は、通常、ヒトまたは他の霊長類の対象であり、たとえば、獣医学の対象となるサルおよび類人猿である。しかしながら、本発明の技術は、家畜（たとえば、ウマ、ブタ、ヒツジ、ウシおよびヤギなど）、愛玩動物（たとえば、イヌおよびネコなど）における使用も包含する。対象は雄性でも雌性でもよく、任意の適切な年齢であってもよく、たとえば、幼児、幼年者、若年者、成人、および高齢者の対象が挙げられる。
【０２１３】
本発明の方法は、たとえば、ＣＤ１７１を有するがん細胞または腫瘍細胞の治療または抑制に有用である。いくつかの実施形態において、ＣＤ１７１を有するがん細胞または腫瘍細胞としては、神経芽腫、黒色腫、子宮頸がん、卵巣がん、子宮がん、膵臓がん、大腸がん、腎臓がんおよび神経膠芽腫が挙げられる。
【０２１４】
前述のように製造されたキメラ抗原Ｔ細胞は、本発明の開示を踏まえ、当業者であれば容易に理解できる公知の技術またはその変法に従って、養子免疫療法のための方法および組成物において使用することができる。いくつかの実施形態において、前記Ｔ細胞の製剤化は、まず該細胞を培地から回収し、次いで該細胞を洗浄し、投与に適した培地および容器システム（「薬学的に許容され得る」担体）中において該細胞を治療有効量まで濃縮することによって行われる。適切な注入用培地は、任意の等張性培地製剤であってもよく、典型的には、生理食塩水、Normosol R（アボット）もしくはPlasma-Lyte A（バクスター）、５％デキストロース水溶液、または乳酸リンゲル液を使用することができる。前記注入用培地には、ヒト血清アルブミン、ウシ胎児血清、またはその他のヒト血清成分を添加してもよい。
【０２１５】
組成物中の細胞の治療有効量とは、少なくとも２つの細胞サブセット（たとえば、ＣＤ８＋セントラルメモリーＴ細胞の１つのサブセットとＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞の１つのサブセット）の量を指し、より典型的には、１０２個を超えかつ１０６個以下の細胞であり、または１０８個以下または１０９個以下の細胞であり、たとえば、１０８個または１０９個であってもよく、１０１０個を超える数の細胞であってもよい。細胞の数は、前記組成物の最終的な用途や、該組成物に含まれる細胞種などによって決定される。たとえば、特定の抗原を標的とするかつ／または特定の抗原に特異的な細胞が所望される場合、前記集団を占める該細胞の割合は７０％を超え、一般的には、８０％を超え、８５％を超え、あるいは前記集団全体の９０〜９５％を占める。本明細書に記載の用途において、前記細胞の量は通常１Ｌ以下であり、５００ｍｌ以下であってもよく、さらには２５０ｍｌ以下もしくは１００ｍｌ以下であってもよい。したがって、前記所望の細胞の密度は、典型的には、１０４細胞／ｍｌよりも大きく、通常１０７細胞／ｍｌよりも大きく、通常１０８細胞／ｍｌ以上である。臨床用途に適したこのような数の免疫細胞は、複数の注入に分割して投与してもよく、その累積投与量は１０６個、１０７個、１０８個、１０８個、１０９個、１０１０個、もしくは１０１１個の細胞、またはこれらの細胞数以上の細胞に相当する。
【０２１６】
いくつかの実施形態において、本発明のリンパ球は、個体に免疫を付与するために使用してもよい。「免疫」は、病原体の感染に対する応答またはリンパ球反応の標的となる腫瘍に対する応答に伴う１つ以上の身体症状を軽減することを意味する。前記細胞の投与量は、通常、病原体に対する免疫を備える正常個体の体内に存在する量の範囲内である。したがって、細胞は、通常、注入によって投与され、１回の注入あたり２個以上から少なくとも１０６個〜３×１０１０個までの範囲の数の細胞が投与され、少なくとも１０７個〜１０９個の細胞を注入することが好ましい。前記Ｔ細胞は、単回の注入によって、または特定の期間における複数回の注入によって投与してもよい。しかしながら、個体によって反応性が異なると考えられるため、注入する細胞の種類および細胞の量、ならびに注入の回数および複数回の注入を実施する期間は主治医によって決定され、日常的な検査によっても決定することができる。十分な量のＴリンパ球（細胞傷害性Ｔリンパ球および／またはヘルパーＴリンパ球を含む）の作製は、本明細書に例示したような、本発明による迅速な増殖方法を用いて容易に行うことができる。たとえば、Riddellらに付与された米国特許第6,040,177号の第１７段落を参照されたい（この文献は参照によりその全体が明示的に本明細書に組み込まれるさらなる）。
【０２１７】
いくつかの実施形態においては、本明細書に記載の組成物は、静脈内投与、腹腔内投与、腫瘍内投与、骨髄内投与、リンパ節内投与、かつ／または脳脊髄液内投与される。いくつかの実施形態において、キメラ受容体により遺伝子改変された前記組成物は、腫瘍部位に送達される。あるいは、本明細書に記載の組成物は、本発明の細胞を腫瘍または免疫コンパートメントに標的化させるとともに、肺などの部位を避けることが可能な化合物と組み合わせることができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組成物は、化学療法剤および／または免疫抑制剤とともに投与される。いくつかの実施形態においては、まず、本発明の免疫細胞以外の免疫細胞を抑制または殺傷する化学療法剤で患者を処置してから、本明細書に記載の組成物を投与する。場合によっては、化学療法を完全に省いてもよい。
【０２１８】
後述の実施例において、本発明をさらに説明する。
【実施例】
【０２１９】
以下の実施例は、任意の方法、形状または形態における本発明を説明する目的で記載され、本発明を明示的あるいは暗示的に限定するものではない。以下の実施例は、使用されうる形態として典型的なものであるが、当業者に知られているその他の方法、方法論または技術を代わりに使用することもできる。
【０２２０】
キメラ受容体で改変されたＴ細胞によるCD171の認識を最適化するための、スペーサードメインの長さのカスタマイズ
CD171分子は神経芽腫などの様々なヒト悪性腫瘍において発現されるが、CD171分子を標的とすることができ、かつ／またはCD171分子に特異的なキメラ受容体をいくつか構築した。これらのCD171特異的／標的キメラ受容体は、CD171特異的かつ／または標的scFVから設計したが、元となったこれらのscFVは、CD171上のエピトープであるCE7に特異的に結合し、かつ様々な長さの細胞外スペーサードメインを含むものであった。Ce7scFv-IgG4hinge-CH2-CH3-CD28tm/4-1BB-ζ-T2A-EGFRt-epHIV7（長い構築物）の配列（配列番号５４）を図５および図６に示す。CE7scFv-IgG4hinge-CH3-CD28tm/4-1BB-ζ-T2A-EGFRt-epHIV7（中程度の長さの構築物）の配列（配列番号５５）を図７および図８に示す。CE7scFv-IgG4hinge-CD28tm/4-1BB-ζ-T2A-EGFRt-epHIV7（短い構築物）の配列（配列番号５６）を図９および図１０に示す。２つの共刺激ドメインを有する構築物である、CE7scFv-IgG4hinge-CD28tm/cyto-4-1BB-ζ-T2A-EGFRt-epHIV7の配列（配列番号５７）を図１１および図１２に示す。CD171に特異的であり、かつ／またはCD171を標的とする各キメラ受容体を発現するＴ細胞が、CD171を発現する神経芽腫をインビトロで認識する能力、および免疫不全マウスに移植された神経芽腫の腫瘍細胞を排除する能力を分析した。
【０２２１】
ヒト対象
研究プロトコルに対するインフォームドコンセントを書面にて得た後、健常ドナーおよび患者から末梢血単核細胞（PBMC）を採取した。
【０２２２】
細胞株
SK-N-BE2神経芽腫細胞株（Be2）をAmerican Type Culture Collectionから得た。過去の報告に従って（Pelloquin F, Lamelin JP, Lenoir GM. In vitro cell dev biol 1986; 22(12):689-694）、ＥＢＶにより形質転換されたTMLCLをPBMCから作製した。
【０２２３】
イムノフェノタイピング
標識抗CD4 mAb、標識抗CD8 mAb、標識抗CD28 mAb、標識抗CD45RA mAb、標識抗CD62L mAbおよびアイソタイプを一致させたコントロール（BD Biosciences）を使用して、PBMCおよび細胞株を染色した。セントラルメモリーＴ細胞は、免疫磁気ビーズを使用して、CD8+Ｔ細胞を単離し、得られたCD8+細胞集団からCD45RA細胞を除去することによってPBMCから単離した。CD45RAが除去されたCD8+細胞は、図１に示すように、免疫磁気ビーズを使用してCD62L細胞を濃縮した。CD171特異的／標的キメラ受容体の表面発現は、ポリクローナルヤギ抗マウスIgG抗体（Fab特異的）（Jackson ImmunoResearch）を使用して分析した。フロー分析はFACSCanto（登録商標）にて行い、ソーティングおよび精製はFACSAria II（登録商標）（Becton Dickinson）にて行い、データ分析はFlowJo（登録商標）ソフトウエア（Treestar）を使用して行った。
【０２２４】
ベクターの構築およびキメラ受容体をコードするレンチウイルスの調製
CD171特異的かつ／または標的キメラ受容体は、CE7（CD171） mAbのVL鎖セグメントおよびVH鎖セグメントを使用して構築した（CE7の可変領域の配列は、図５、図７、図９および図１１に示す）。各scFvは、IgG4-Fc（Uniprotデータベース：P01861；表２）に由来するスペーサードメインに連結されており、このスペーサードメインは、「ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３」配列（長いスペーサー：２２９アミノ酸長）、「ヒンジ−ＣＨ３」配列（中程度の長さのスペーサー：１１９アミノ酸長）または「ヒンジ」のみの配列（短いスペーサー：１２アミノ酸長）のいずれかを含んでいた（表６）。これらのスペーサーはいずれも、天然型IgG4-Fcタンパク質の１０８番目のアミノ酸に相当するヒンジドメイン内の位置にS→P置換を有し、かつヒトCD28（Uniprot：P10747、表３）由来の膜貫通ドメイン（２７アミノ酸長）とシグナル伝達モジュールとに連結されており、このシグナル伝達モジュールは、（ｉ）ヒト4-1BB（Uniprot：Q07011、表４）の細胞内ドメイン（４２アミノ酸長）に連結され、かつ天然型のCD28タンパク質（表３）の１８６〜１８７番目にLL→GGの置換を有する、ヒトCD28の細胞内ドメイン（４１アミノ酸長）を含むか、あるいは（ii）ヒト4-1BBの細胞内ドメインを単独で含み、これらのいずれかを含む各シグナル伝達モジュールはヒトＣＤ３ζのアイソフォーム３（Uniprot：P20963、表５）の細胞内ドメイン（１１２アミノ酸長）に連結されていた。前記構築物は、T2Aリボソームスキップ要素（表１）およびtEGFR配列（表１）をキメラ受容体の下流にコードしていた。各導入遺伝子をコードするヒトコドン最適化ヌクレオチド配列を合成し（Life Technologies）、epHIV7レンチウイルスベクターにクローニングした。
【０２２５】
tEGFRをコードするレンチウイルスまたはCD171特異的／標的キメラ受容体は、パッケージングベクター（pCHGP-2、pCMV-Rev2およびpCMV-G）ならびにCalphos（登録商標）トランスフェクション試薬（Clonetch）を用いて、２９３Ｔ細胞において産生させた。
【０２２６】
CD171特異的／標的キメラ受容体を発現するＴ細胞株の作製
正常なドナーのPBMCからCD8+CD45RO-CD62L+セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）をソートし（図１参照）、抗CD3/CD28ビーズ（Life Technologies）で活性化し、３日目に１μｇ／ｍＬのポリブレン（Millipore）を添加したレンチウイルス上清（ＭＯＩ＝３）を加え８００×ｇ、３２℃で４５分間遠心分離して活性化させて形質導入した。最終濃度が５０Ｕ／ｍＬとなるように組換えヒトＩＬ−２を添加した、１０％ヒト血清および２ｍＭ Ｌ−グルタミンを含むＲＰＭＩ（ＣＴＬ培地）中で前記Ｔ細胞を増殖させた。ビオチン標識抗EGFR mAb（ImClone Systems）およびストレプトアビジンビーズ（Miltenyi）を使用して免疫磁気選択を行うことにより、各Ｔ細胞株のtEGFR+サブセットを濃縮した。
【０２２７】
細胞傷害性およびサイトカインの分泌
標的細胞（Be2細胞またはTML CL）を51Cr（PerkinElmer）で標識し、次いで洗浄することによって得られた標的細胞（１〜２×１０３個／ウェル）を、キメラ受容体で改変されたエフェクターＴ細胞とともに様々なエフェクター：標的比（Ｅ：Ｔ）において三連でインキュベートした。４時間のインキュベーションを行って細胞を特異的に溶解させた後、上清を回収してγ放射線を測定し、標準的な計算式を使用して細胞傷害性を算出した。サイトカインの分泌の分析においては、５×１０４個のＴ細胞と標的細胞とを、３０：１、１０：１、３：１または１：１のＥ：Ｔ比で三連のウェルに播種し、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−２をさらに添加し、２４時間インキュベーションし、回収した上清をELISAまたはマルチプレックスサイトカイン免疫アッセイ（Luminex）で測定した。
【０２２８】
NOD/SCID/γc-/-（NSG）マウスにおける実験
６〜８週齢の雌性NOD.Cg-Prkdcscid II2rgtm1Wjl/SzJ（NSG）マウスをJackson Laboratoryから入手するか、自家繁殖させた。０．２×１０６個の神経芽腫由来腫瘍細胞をマウスに頭蓋内注射し、７日後、２×１０６個のキメラ受容体保有改変Ｔ細胞または対照Ｔ細胞をマウスに頭蓋内注射した。バイオルミネセンスイメージングにより腫瘍の成長を画像化するため、ＰＢＳに再懸濁したルシフェリン基質（Caliper Life Sciences）をマウスに注射した（１５μｇ／ｇ体重）。マウスをイソフルランで麻酔し、Xenogen IVIS画像化システム（Caliper）をsmall binning modeまたはmedium binning modeおよび１秒〜１分間の取得時間の条件で使用して、ルシフェリン注射の１５分後に画像化を行い、サチュレーションを起こしていない画像を得た。Living Imageソフトウェア（Caliper）を使用してルシフェラーゼの活性を分析し、目的領域内（全身を含む）で光量子束を分析した。
【０２２９】
統計学的分析
Prism Software（GraphPad（登録商標））を使用して統計解析を行った。対応のある両側検定として、９５％の信頼区間でスチューデントのｔ検定を行い、ｐ＜０．０５のｐ値を有する結果を有意と見なした。生存の統計解析をログランク検定により行い、ｐ＜０．０５のｐ値を有する結果を有意と見なした。
【０２３０】
長いスペーサードメインを有するCD171特異的／標的キメラ受容体は優れた細胞傷害性およびサイトカイン分泌性をインビボにおいて付与する
CE7 scFvを使用して、CD171特異的かつ／または標的キメラ受容体を設計できることが報告されている（Park J et al. Molecular Therapy 2007, April 15(4):825-33）。このキメラ受容体は、インビトロにおいて、CD171発現腫瘍に対する特異的認識、および／またはCD171発現腫瘍の標的化を可能とするが、スペーサードメインを調整することによって、腫瘍認識およびＴ細胞のシグナル伝達が向上すると仮定された。これを踏まえて、「ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３」バリアント（２２９アミノ酸長、長いスペーサー）、「ヒンジ−ＣＨ３」バリアント（１１９アミノ酸長、中程度の長さのスペーサー）および「ヒンジ単独」バリアント（１２アミノ酸長、短いスペーサー）から選択されるスペーサードメインを有するキメラ受容体を構築した。これらの新規受容体に含まれていたCE7 scFv、4-1BBシグナル伝達モジュールおよびCD3ζシグナル伝達モジュールは同じものであった。導入遺伝子カセットは末端切断型ＥＧＦＲ（ｔＥＧＦＲ）を含んでおり、ｔＥＧＦＲは、キメラ受容体で改変されたＴ細胞を形質導入し、選択し、かつインビボで追跡するためのマーカーとして機能する。
【０２３１】
様々な長さのスペーサーを含む種々のCD171特異的／標的キメラ受容体またはｔＥＧＦＲ対照ベクターを、精製されたCD8+TCMに形質導入した。各キメラ受容体の表面発現をＦ（ａｂ）特異的抗体による染色によって確認した（図２Ａ）。ＣＤ３ζ特異的抗体を使用して、形質導入細胞をウエスタンブロットにより分析すると、短い構築物、中程度の長さの構築物および長い構築物の発現が示される（図２Ｂ）。短いスペーサードメイン、中程度の長さのスペーサードメインまたは長いスペーサードメインのそれぞれにおいて、Ｆ（ａｂ）およびＥＧＦＲｔは同程度の発現を示した。
【０２３２】
各CD171特異的／標的キメラ受容体を発現するように改変されたCD8+T細胞をインビトロでの機能について分析したところ、これらの受容体はいずれも、CD171を天然に発現するBe2細胞を特異的に溶解したが、対照としてのTML CLを認識しなかったことが示された（図２Ｃ）。長いスペーサードメインを有するCD171特異的／標的キメラ受容体を発現するＴ細胞の細胞溶解活性が最も高く、また、CD171を発現する腫瘍標的に対しては、腫瘍溶解活性の強度差（長いスペーサー＞＞中程度の長さのスペーサー＞＞短いスペーサー）が明らかとなった（図２Ｃ）。
【０２３３】
Be2細胞による刺激に応答したサイトカインの産生の定量分析では、各CD171特異的／標的キメラ受容体を発現するＴ細胞はいずれも、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−２を産生することが示された。細胞傷害性アッセイで認められたように、長いスペーサー構築物を有するＴ細胞は、腫瘍を認識してサイトカインの分泌を媒介する機能に優れていた（図２Ｄ）。
【０２３４】
CD171特異的かつ／または標的CARがインビボで活性を示すためには短い細胞外スペーサードメインが必要である
長いスペーサーを有するCD171特異的／標的キメラ受容体で改変されたＴ細胞によって発揮された優れたインビトロ活性が、インビボにおいても向上または改善された抗腫瘍活性として発揮されるかどうかは確認されていなかった。この疑問を解消するため、頭蓋内注射によって神経芽腫細胞を免疫不全ＮＳＧマウス群に接種した７日後に、短いスペーサー、中程度の長さのスペーサーまたは長いスペーサーを有するCD171特異的キメラ受容体発現CD8+Ｔ細胞を頭蓋内注射によって単回投与することによってマウスを治療した。対照マウスはｔＥＧＦＲ発現Ｔ細胞により治療するか、あるいは治療を実施しなかった。治療を行わなかったＮＳＧ／ＮＢマウスは、腫瘍を接種してから約４週間で神経芽腫を発症し、安楽死を余儀なくされた（図２Ｅ、右パネル）。
【０２３５】
短いスペーサーを有するCD171特異的／標的キメラ受容体発現Ｔ細胞により治療したマウス群では、すべてのマウスにおいて、腫瘍の退行および生存期間の延長または改善が認められた。短いスペーサーを有するCD171特異的／標的キメラ受容体発現Ｔ細胞により治療されたマウスにおける抗腫瘍性応答および生存期間は、長いスペーサーを有するCD171特異的／標的キメラ受容体発現Ｔ細胞により治療されたマウスよりも優れていた（図２Ｅ、右パネル）。また、ルシフェリン基質で標識した腫瘍細胞の総発光量の測定では、短いスペーサーまたは中程度の長さのスペーサーを有する構築物で形質導入されたＣＤ８細胞により治療されたマウスは、治療を行わなかったマウスや長いスペーサーを有する構築物で形質導入されたＣＤ８細胞により治療されたマウスよりも、大幅に低い発光量を示した（図２Ｅ、左パネル）。
【０２３６】
免疫組織化学分析では、長いスペーサーを有するCD171 CAR発現CD8 Tcmで治療したマウスから得た腫瘍は、Mock感染CD8 Tcmや、短いスペーサーまたは中程度の長さのスペーサーを有するCD171 CARを発現するCD8 Tcmで治療したマウスから得た腫瘍よりも、ＣＤ３＋細胞のパーセンテージが高かったことが示された（図２Ｆ）。Ki67の免疫組織化学分析では、CD8 Tcmが異なっていても差異は検出されなかったが、カスパーゼ３およびグランザイムＢの分析では、長いスペーサーを有するCD171 CARを発現するCD8 Tcmは、Ｔ細胞注射の３日後に、短いスペーサーまたは中程度の長さのスペーサーを発現するCD8 Tcmよりも高い発現量を示した（図２Ｇ）。
【０２３７】
長い細胞外スペーサードメインを有するCD171特異的かつ／または標的CARはさらに多くの活性化誘導細胞死を誘導した
長いスペーサードメインを有するCD171特異的／標的キメラ受容体発現Ｔ細胞のインビボにおける抗腫瘍活性が低かったことを説明する潜在的機構を明らかにするため、インビボではこのＴ細胞は腫瘍細胞によって効率的に活性化されなかったという可能性、あるいは、これとは逆に、インビボではこのＴ細胞は活性化誘導細胞死によって殺傷されたという可能性を検討した。
【０２３８】
短いスペーサー構築物、中程度の長さのスペーサー構築物または長いスペーサー構築物を有するCD171 CAR構築物で形質導入されたＣＤ８セントラルメモリー細胞を、インビトロで２４時間にわたって神経芽腫細胞に暴露させた（１回目）。ＣＤ８セントラルメモリー細胞を培養物から回収し、表現型を評価して、神経芽腫細胞とともにさらに２４時間インキュベートした（２回目）。ＣＤ８細胞を培養物から回収し、表現型を評価して、さらに神経芽腫細胞とともに２４時間培養した（３回目）。次いで、ＣＤ８細胞を培養物から回収し、表現型を評価した。
【０２３９】
各回の培養物から回収した細胞は、フローサイトメトリーを使用して活性化マーカーであるＣＤ２５およびＣＤ６９の発現について評価した。各回の培養物から回収した細胞における死細胞の割合（％）は、Guava Viacount試薬を使用して測定した。神経芽腫（ＮＢ）細胞は、１回目の培養後にＦａｓＲの発現を分析することによって測定した。
【０２４０】
実験の結果、腫瘍細胞との共培養を連続して行うことによって刺激を与えると、短いスペーサーを有するＣＡＲ発現細胞は、長いスペーサーを有するＣＡＲ発現細胞よりも弱い活性化および高い生存率を示した（３回目：CD25+CD69+細胞の割合（％）は、短いスペーサーでは４２％であったのに対して、長いスペーサーでは６６％であった（図３Ａ）；死細胞の割合（％）は、短いスペーサーでは１５％であったのに対して、長いスペーサーでは６０％であった（図３Ｂ））。長いスペーサーを有するＣＡＲ発現細胞は、短いスペーサーを有するＣＡＲ発現細胞よりも多くのＦａｓＲの発現を神経芽腫（ＮＢ）細胞において誘導した（図３Ｃ）。
【０２４１】
以上のデータから、長い細胞外スペーサードメインを有するCD171標的キメラ受容体は、他のスペーサードメインを有するCD171標的キメラ受容体と同等以上のエフェクター機能をインビトロで媒介するにもかかわらず、インビボにおいては高レベルの活性化誘導細胞死を誘導し、確立された神経芽腫を根絶できないということが実証された。
【０２４２】
CD171は、様々な癌腫の表面に発現するため、がん免疫療法の標的候補として関心を集めている。CD171特異的／標的キメラ受容体の設計および機能は、細胞外スペーサードメインを改変することによって向上または改善することができた。前記実験結果から、ヒンジのみを含む短いスペーサードメインを有するCD171標的ＣＡＲで形質導入されたセントラルメモリーＴ細胞は、ヒンジ−ＣＨ３スペーサードメイン（中程度の長さのスペーサー）またはヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３スペーサードメイン（長いスペーサー）を有するCD171標的ＣＡＲで形質導入されたＴ細胞と比較して、インビボ神経芽腫モデルの腫瘍根絶においてはるかに良好な成績を達成したことが示された。
【０２４３】
共刺激ドメインの改変
CD171分子は神経芽腫などの様々なヒト悪性腫瘍において発現されるが、CD171分子を標的とすることができるキメラ受容体、またはCD171分子に特異的なキメラ受容体をいくつか構築した。これらのCD171特異的／標的キメラ受容体は、CD171特異的かつ／または標的scFVから設計したが、元となったこれらのscFVは、CD171上のエピトープであるCE7に特異的に結合し、かつ短い細胞外スペーサードメインを含むものであった。作製した構築物のうち１つは、CD3ζドメインに連結された共刺激ドメイン4-1BBを含有し（4-1BB）、もう一方の構築物は、ＣＤ３ζに連結された4-1BBとCD28cytoとを含む二重共刺激ドメインを含有していた（CD28cyto）。２つの共刺激ドメインを有する構築物であるCE7scFv-IgG4hinge-CD28tm/cyto-4-1BB-ζ-T2A-EGFRt-epHIV7の配列を図１１および図１２に示す。CE7scFv-IgG4hinge-CD28tm/4-1BB-ζ-T2A-EGFRt-epHIV7（短い構築物）の配列を図９および図１０に示す。CD171に特異的な各キメラ受容体を発現するT細胞が、CD171を発現する神経芽腫をインビトロで認識する能力、および免疫不全マウスに移植された神経芽腫の腫瘍細胞を排除する能力を分析した。
【０２４４】
ヒト対象
研究プロトコルに対するインフォームドコンセントを書面にて得た後、健常ドナーおよび患者から末梢血単核細胞（PBMC）を採取した。
【０２４５】
細胞株
SK-N-BE2神経芽腫細胞株（Be2）をAmerican Type Culture Collectionから得た。過去の報告に従って（Pelloquin F, Lamelin JP, Lenoir GM. In vitro cell dev biol 1986; 22(12):689-694）、EBVにより形質転換されたTMLCLをPBMCから作製した。
【０２４６】
イムノフェノタイピング
標識抗CD4 mAb、標識抗CD8 mAb、標識抗CD28 mAb、標識抗CD45RA mAb、標識抗CD62L mAbおよびアイソタイプを一致させたコントロール（BD Biosciences）を使用して、PBMCおよび細胞株を染色した。セントラルメモリーT細胞は、免疫磁気ビーズを使用して、CD8+T細胞を単離し、得られたCD8+細胞集団からCD45RA細胞を除去することによってPBMCから単離した。CD45RAが除去されたCD8+細胞は、図1に示すように、免疫磁気ビーズを使用してCD62L細胞を濃縮した。CD171特異的／標的キメラ受容体の表面発現は、ポリクローナルヤギ抗マウスIgG抗体（Fab特異的）（Jackson ImmunoResearch）を使用して分析した。フロー分析はFACSCanto（登録商標）にて行い、ソーティングおよび精製はFACSAria II（登録商標）（Becton Dickinson）にて行い、データ分析はFlowJo（登録商標）ソフトウエア（Treestar）を使用して行った。
【０２４７】
ベクターの構築およびキメラ受容体をコードするレンチウイルスの調製
CD171特異的かつ／または標的キメラ受容体は、CE7（CD171） mAbのVL鎖セグメントおよびVH鎖セグメントを使用して構築した（CE7の可変領域の配列は、図５、図７、図９および図１１に示す）。各scFvは、IgG4-Fc（Uniprotデータベース：P01861；表２）に由来するスペーサードメインに連結されており、このスペーサードメインは、「ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３」配列（長いスペーサー：２２９アミノ酸長）、「ヒンジ−ＣＨ３」配列（中程度の長さのスペーサー：１１９アミノ酸長）または「ヒンジ」のみの配列（短いスペーサー：１２アミノ酸長）のいずれかを含んでいた（表６）。これらのスペーサーはいずれも、天然型IgG4-Fcタンパク質の１０８番目のアミノ酸に相当するヒンジドメイン内の位置にS→P置換を有し、かつヒトCD28（Uniprot：P10747、表３）由来の膜貫通ドメイン（２７アミノ酸長）とシグナル伝達モジュールとに連結されており、このシグナル伝達モジュールは、（ｉ）ヒト4-1BB（Uniprot：Q07011、表４）の細胞内ドメイン（４２アミノ酸長）に連結され、かつ天然型のCD28タンパク質（表3）の１８６〜１８７番目にLL→GGの置換を有する、ヒトCD28の細胞内ドメイン（４１アミノ酸長）を含むか、あるいは（ii）ヒト4-1BBの細胞内ドメインを単独で含み、これらのいずれかを含む各シグナル伝達モジュールはヒトＣＤ３ζのアイソフォーム3（Uniprot：P20963、表５）の細胞内ドメイン（１１２アミノ酸長）に連結されていた。構築物のうち１つは、ヒト４−１ＢＢ（Unioprot：Q07011、配列番号１５）の細胞内ドメイン（４２アミノ酸長）を含む共刺激シグナル伝達モジュールを含んでおり、このヒト４−１ＢＢの細胞内ドメインは、さらにヒトＣＤ３ζのアイソフォーム３（Uniprot：P20963、配列番号１６）の細胞内ドメイン（１１２アミノ酸長）に連結されていた。作製された構築物はいずれも、T2Aリボソームスキップ要素（配列番号８）およびtEGFR配列（配列番号９）をキメラ受容体の下流にコードしていた。各導入遺伝子をコードするヒトコドン最適化ヌクレオチド配列を合成し（Life Technologies）、epHIV7レンチウイルスベクターにクローニングした。tEGFRをコードするレンチウイルスまたはCD171特異的／標的キメラ受容体は、パッケージングベクター（pCHGP-2、pCMV-Rev2およびpCMV-G）、ならびにCalphos（登録商標）トランスフェクション試薬（Clontech）を用いて、293T細胞において産生させた。
【０２４８】
CD171特異的／標的キメラ受容体を発現するＴ細胞株の作製
正常なドナーのPBMCからCD8+CD45RO-CD62L+セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）をソートし（図１参照）、抗CD3/CD28ビーズ（Life Technologies）で活性化し、３日目に１μｇ／ｍＬのポリブレン（Millipore）を添加したレンチウイルス上清（ＭＯＩ＝３）を加え８００×ｇ、３２℃で４５分間遠心分離して活性化させて形質導入した。最終濃度が５０Ｕ／ｍＬとなるように組換えヒトＩＬ−２を添加し、さらに最終濃度が１０ｎｇ／μｌとなるようにＩＬ−１５を添加した、１０％ヒト血清および２ｍＭ Ｌ−グルタミンを含むＲＰＭＩ（ＣＴＬ培地）中で前記Ｔ細胞を増殖させた。ビオチン標識抗EGFR mAb（ImClone Systems）およびストレプトアビジンビーズ（Miltenyi）を使用して免疫磁気選択を行うことにより、各Ｔ細胞株のtEGFR+サブセットを濃縮した。
【０２４９】
細胞傷害性およびサイトカインの分泌
標的細胞（Be2細胞またはTML CL）を51Cr（PerkinElmer）で標識し、次いで洗浄することによって得られた標的細胞（１〜２×１０３個／ウェル）を、キメラ受容体で改変されたエフェクターＴ細胞とともに、様々なエフェクター：標的比（Ｅ：Ｔ）において三連でインキュベートした。４時間のインキュベーションを行って細胞を特異的に溶解させた後、上清を回収してγ放射線を測定し、標準的な計算式を使用して細胞傷害性を算出した。サイトカインの分泌の分析においては、５×１０４個のＴ細胞と標的細胞とを、３０：１、１０：１、３：１または１：１のＥ：Ｔ比で三連のウェルに播種し、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−２をさらに添加し、２４時間インキュベーションし、回収した上清をELISAまたはマルチプレックスサイトカイン免疫アッセイ（Luminex）で測定した。
【０２５０】
NOD/SCID/γc-/-（NSG）マウスにおける実験
６〜８週齢の雌性のNOD.Cg-Prkdcscid II2rgtm1Wjl/SzJ（NSG）マウスをJackson Laboratoryから入手するか、自家繁殖させた。０．２×１０６個の神経芽腫由来腫瘍細胞をマウスに頭蓋内注射し、２×１０６個のキメラ受容体保有改変Ｔ細胞または対照Ｔ細胞をマウスに頭蓋内注射した。バイオルミネセンスイメージングにより腫瘍の成長を画像化するため、ＰＢＳに再懸濁したルシフェリン基質（Caliper Life Sciences）をマウスに注射した（１５μｇ／ｇ体重）。マウスをイソフルランで麻酔し、Xenogen IVIS画像化システム（Caliper）をsmall binning modeまたはmedium binning modeおよび１秒〜１分間の取得時間の条件で使用して、ルシフェリン注射の１５分後に画像化を行い、サチュレーションを起こしていない画像を得た。Living Imageソフトウェア（Caliper）を使用してルシフェラーゼの活性を分析し、目的領域内（全身を含む）で光量子束を分析した。
【０２５１】
統計学的分析
Prism Software（GraphPad（登録商標））を使用して統計解析を行った。対応のある両側検定として、９５％の信頼区間でスチューデントのｔ検定を行い、ｐ＜０．０５のｐ値を有する結果を有意と見なした。生存の統計解析をログランク検定により行い、ｐ＜０．０５のｐ値を有する結果を有意と見なした。
【０２５２】
短いスペーサー領域および２つの共刺激ドメインを有するCD171特異的／標的キメラ受容体は優れた細胞傷害性およびサイトカイン分泌性をインビボにおいて付与する
様々な共刺激ドメインを含むCD171特異的／標的キメラ受容体またはｔＥＧＦＲ対照ベクターを、精製されたCD8+TCMに形質導入した。各キメラ受容体の表面発現をＦ（ａｂ）特異的抗体による染色によって確認した（図４Ａ）。4-1BBを単一の共刺激ドメインとして含む構築物（パネル２）およびCD28cyto/4-1BBを共刺激ドメインとして含む構築物（パネル３）において、Ｆ（ａｂ）およびＥＧＦＲｔは同程度の発現を示した。各CD171特異的／標的キメラ受容体を発現するように改変されたCD8+T細胞をインビトロでの機能について分析したところ、これらの受容体はいずれも、CD171を天然に発現するＢｅ２細胞を特異的に溶解したが、対照としてのTML CLを認識しなかったことが示された（図４Ｂ）。CD28cyto/4-1BB共刺激ドメインを有するCD171特異的／標的キメラ受容体を発現するＴ細胞の方がより強力な細胞溶解活性を有していた。Be2細胞による刺激に応答したサイトカインの産生の定量分析では、各CD171特異的／標的キメラ受容体を発現するＴ細胞はいずれも、ＩＦＮ−γを産生することが示された。細胞傷害性アッセイで認められたように、CD28cyto/4-1BB共刺激ドメインを有する構築物は、腫瘍を認識してサイトカインの分泌を媒介する機能に優れていた（図４Ｃ）。
【０２５３】
CD28cyto/4-1BB共刺激ドメインを有するCD171特異的かつ／または標的CARの有効性はインビボにおいて低下した
CD28cyto/4-1BB共刺激ドメインを有するCD171特異的／標的キメラ受容体で改変されたＴ細胞によって発揮された優れたインビトロ活性が、インビボにおいても向上または改善された抗腫瘍活性として発揮されるかどうかは確認されていなかった。この疑問を解消するため、頭蓋内注射によって神経芽腫細胞を免疫不全ＮＳＧマウス群に接種した７日後に、短いスペーサー、中程度の長さのスペーサーまたは長いスペーサーを有するCD171特異的かつ／または標的キメラ受容体発現ＣＤ８＋Ｔ細胞を頭蓋内注射によって単回投与することによってマウスを治療した。対照マウスはｔＥＧＦＲ発現Ｔ細胞により治療するか、あるいは治療を実施しなかった。治療を行わなかったＮＳＧ／ＮＢマウスは、腫瘍を接種してから約４週間で神経芽腫を発症し、安楽死を余儀なくされた（図４Ｄ）。
【０２５４】
4-1BBを単一の共刺激ドメインとして含む構築物を有するCD171特異的／標的キメラ受容体発現Ｔ細胞により治療したマウス群では、すべてのマウスにおいて、腫瘍の退行および生存期間の改善が認められた。4-1BBを単一の共刺激ドメインとして含む構築物を有するCD171特異的／標的キメラ受容体発現Ｔ細胞により治療されたマウスにおける抗腫瘍性応答および生存期間は、CD28cyto/4-1BB共刺激ドメインを有するCD171特異的／標的キメラ受容体発現Ｔ細胞により治療されたマウスよりも優れていた（図４Ｄ）。
【０２５５】
長い細胞外スペーサードメインを有するCD171特異的かつ/または標的CARはさらに多くの活性化誘導細胞死を誘導した
CD28cyto/4-1BB共刺激ドメインを有するCD171特異的／標的キメラ受容体発現Ｔ細胞の抗腫瘍活性がインビボにおいて低下することを説明する潜在的機構を解明することを試みた。インビボではこのＴ細胞は腫瘍細胞によって効率的に活性化されなかったという可能性、あるいは、これとは逆に、インビボではこのＴ細胞は活性化誘導細胞死によって殺傷されたという可能性を検討した。
【０２５６】
CD28cyto/4-1BB共刺激ドメインまたは4-1BB共刺激ドメインを有するCD171 CAR構築物で形質導入されたＣＤ８セントラルメモリー細胞を、インビトロで２４時間にわたって神経芽腫細胞に暴露させた（１回目）。ＣＤ８セントラルメモリー細胞を培養物から回収し、表現型を評価して、神経芽腫細胞とともにさらに２４時間インキュベートした（２回目）。ＣＤ８細胞を培養物から回収し、表現型を評価して、さらに神経芽腫細胞とともに２４時間培養した（３回目）。次いで、ＣＤ８細胞を培養物から回収し、表現型を評価した。各回の培養物から回収した細胞は、フローサイトメトリーを使用して活性化マーカーであるＣＤ２５およびＣＤ６９の発現について評価した。各回の培養物から回収した細胞における死細胞の割合（％）は、Guava Viacount試薬を使用して測定した。
【０２５７】
実験の結果、腫瘍細胞との共培養を連続して行うことによって刺激を与えると、4-1BB共刺激ドメインのみを有するＣＡＲ細胞は、CD28cyto/4-1BB共刺激ドメインを有するＣＡＲ発現細胞と比較よりも弱い活性化および高い生存率を示した（３回目：CD25+CD69+細胞の割合（％）は、4-1BBのみでは４０％であったのに対して、CD28cyto/4-1BBでは６０％であった（図４Ｅ）；死細胞の割合（％）は、4-1BBのみでは２０％であったのに対して、CD28cyto/4-1BBでは４５％であった（図４Ｆ））。以上のデータから、CD28cyto/4-1BB二重共刺激ドメインを有するCD171標的キメラ受容体は、他のスペーサードメインを有するCD171標的キメラ受容体と同等以上のエフェクター機能をインビトロで媒介するにもかかわらず、インビボにおいては高レベルの活性化誘導細胞死を誘導し、確立された神経芽腫を根絶する能力が低下しているということが実証された。
【０２５８】
CD171特異的/標的キメラ受容体の設計および機能は、共刺激ドメインを改変することによって向上または改善することができた。前記実験結果から、4-1BBを単一の共刺激ドメインとして含むCD171標的ＣＡＲで形質導入されたセントラルメモリーT細胞は、CD28cyto/4-1BB二重共刺激ドメインを有するCD171標的ＣＡＲで形質導入されたＴ細胞よりも、インビボ神経芽腫モデルの腫瘍根絶においてはるかに良好な成績を達成したことが示された。
【０２５９】
インビトロおよびインビボにおいて細胞外スペーサーの長さおよび細胞内シグナル伝達ドメインがCD171標的ＣＡＲの能力に及ぼす影響
インビトロおよびインビボにおいて細胞外スペーサーの長さおよび細胞内シグナル伝達ドメインがCD171標的ＣＡＲの能力に及ぼす影響を評価した。インビトロでは、腫瘍細胞に連続して複数回暴露させる新規のＣＡＲ Ｔ細胞ストレステストと、標準的な分析法とを使用して、細胞傷害性、サイトカインの分泌、活性化状態および細胞死を分析することによって、細胞外スペーサーの長さおよび細胞内シグナル伝達ドメインの影響を評価した。各実験は、複数のドナーに由来するＴ細胞を使用して複数回実施し、最終的な分析では、集めたデータを用いるか、あるいは、試料を２回以上の反復測定した典型的な実験を行った。インビボ実験では、生体イメージングによる抗腫瘍活性の分析、生存期間の測定および免疫組織化学分析を行った。マウスを用いた実験では、１群あたり少なくとも２匹のマウスが含まれるように設定した。外れ値はすべてデータ分析に含んだ。
【０２６０】
ＣＡＲの構築およびレンチウイルスの作製
CE7（抗CD171）IgG2モノクローナル抗体由来のＶＬセグメントおよびＶＨセグメントが（Ｇ４Ｓ）３ペプチドを介して連結されたscFvを使用して、CD171特異的かつ／または標的ＣＡＲを以下のように構築した。まず、前記scFvをコドン最適化し、次いで、１２アミノ酸長（短いスペーサー（ＳＳ）／「ヒンジのみ」）、１１９アミノ酸長（中程度の長さのスペーサー（ＭＳ）／「ヒンジ−ＣＨ３」）または２２９アミノ酸長（長いスペーサー（ＬＳ）／「ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３」）に基づくヒトIgG4-Fc由来可変長スペーサードメインに連結させた。これらのスペーサーはいずれも、IgG4-Fcタンパク質の１０８番目のアミノ酸に相当するヒンジドメイン内の位置にＳ→Ｐ置換を有し、かつ、ヒトＣＤ２８の膜貫通ドメインとシグナル伝達モジュールとに連結されており、このシグナル伝達モジュールは、（ｉ）４−１ＢＢの細胞内ドメインのみ（２Ｇ ＣＡＲ）、または（ii）ＣＤ２８（変異型）の細胞内ドメインおよび４−１ＢＢの細胞内ドメイン（３Ｇ ＣＡＲ）を含み、これらのいずれかを含む各シグナル伝達モジュールは、自体のカルボキシル末端においてヒトＣＤ３ζの細胞内ドメインに融合されていた。構築物の作製に使用されたＣＤ２８細胞内ドメインの一部は、天然型ＣＤ２８タンパク質の１８６〜１８７番目に位置するＬＬ→ＧＧの置換を含んでいた。ＣＡＲバリアントをコードするｃＤＮＡクローンを、下流に位置するＴ２Ａリボソームスキップ要素および末端切断型ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲｔ）と連結させ、epHIV7レンチウイルスベクターにクローニングし、CD171-CARレンチウイルスを２９３Ｔ細胞において産生させた。
【０２６１】
リアルタイムＰＣＲ
製造者の説明書に従ってRNeasy Minikit（Qiagen）を使用して、Ｔ細胞から総ＲＮＡを抽出した。First Strand Kit（Life Technologies）を使用して逆転写を行うことによって、ｃＤＮＡを合成した。ＦａｓＬに対するリアルタイムプライマー（ＩＤＴ）およびCFX96リアルタイム検出システム（Biorad）とを使用して、特定の遺伝子のＲＮＡを定量した。アクチンをハウスキーピング遺伝子として使用した。CFX Managerソフトウェアバージョン３．０を使用してデータを分析した。
【０２６２】
タンパク質の発現
ウエスタンブロット（ＷＢ）を実施するため、Ｔ細胞を回収し、ＰＢＳで２回洗浄し、プロテアーゼ阻害剤（Millipore）中で溶解した。製造者の説明書に従って、ＳＤＳ／ＰＡＧＥを行い、抗ＣＤ２４７（ＣＤ３−ζ、BD Biosciences）を使用してウエスタンブロットを行うことによってタンパク質を分析した。Odyssey Infrared Imagerを使用してシグナルを検出し、Odyssey v2.0ソフトウエア（LI-COR）を使用してバンドの強度を定量した。
【０２６３】
フローサイトメトリー
イムノフェノタイピングは、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、およびＣＣＲ７のそれぞれに対する蛍光標識mAb（Biolegend）を用いて行った。Ｌ１ＣＡＭの細胞表面発現は、蛍光標識mAb（クローン０１４、Sino Biological）を使用して分析した。ＥＧＦＲｔの発現は、ビオチン化セツキシマブ（Bristol-Myers-Squibb）と蛍光標識ストレプトアビジン二次試薬とを使用して分析した。活性化と活性化誘導細胞死（ＡＩＣＤ）を評価するため、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ１３７、ＣＤ１７８（Ｆａｓリガンド）およびＣＤ９５（Ｆａｓ）のそれぞれに対する蛍光標識mAb（いずれもBiolegend）を使用した。カスパーゼ３の活性は、製造者のプロトコルに従ってCaspGlow（eBioscience）を使用して測定した。LSRFortessa（BD Biosciences）を用いてフロー分析を行い、FlowJoソフトウエア（Treestar）を使用してデータを分析した。
【０２６４】
CD171 CARを発現するＴ細胞株の作製
Seattle Children’s Research Instituteの施設内審査委員会によって承認された研究プロトコル（SCRI IRB#13795）に従ったインフォームドコンセントを書面にて得た後、健常ドナーからヘパリン添加全血サンプルを得た。フィコール（GE Healthcare Life Sciences）を使用した標準的なプロトコルによって末梢血単核細胞（PBMC）を単離し、製造者の説明書に従って免疫磁気マイクロビーズ（Miltenyi Biotec）を使用することによってCD8+CD45RO+CD62L+セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）を単離した。まず、CD8 T細胞単離キットおよびCD45RAビーズを使用したネガティブ選択によってCD8+CD45RO+細胞を得て、次いでCD62L細胞を濃縮し、ビーズ：細胞＝３：１の比率で抗CD3/CD28ビーズ（Life Technologies、Thermo Fisher Scientific）を使用して細胞を活性化し、３日目に１ｍｇ／ｍＬの硫酸プロタミン（APP Pharmaceuticals）を添加したレンチウイルス上清（感染多重度［ＭＯＩ］＝５）を加えて８００×ｇ、３２℃で３０分間遠心分離することによって形質導入した。最終濃度が５０Ｕ／ｍｌとなるように組換えヒトインターロイキン（ＩＬ）−２（Chiron Corporation）を添加し、さらに１０ｎｇ／μｌのＩＬ−１５（Miltenyi Biotec）を添加した、１０％熱不活化ウシ胎児血清（Atlas, Fort Collins, CO）および２ｍｍｏｌ／ＬのＬ−グルタミン（Cellgro）を含有するＲＰＭＩ（Cellgro）中でＴ細胞を増殖させた。ビオチン標識アービタックス（Bristol-Myers-Squibb）およびストレプトアビジンマイクロビーズ（Miltenyi）を用いた免疫磁気選択によって、各Ｔ細胞株のＥＧＦＲｔ＋サブセットを濃縮した。迅速培養プロトコルを使用してCD171 CAR Ｔ細胞およびMock対照Ｔ細胞を増殖させた（インビボアッセイに使用するＴ細胞はS1R2D14で凍結し、注射を実施する当日に解凍した）。
【０２６５】
細胞株
ＮＢ細胞株（Be2およびSK-N-DZ）をAmerican Type Culture Collection（ATCC）から入手した。ホタルルシフェラーゼ（ffLuc）遺伝子を含むレンチウイルスで形質導入し、ＧＦＰ陽性細胞のソーティングにより精製して、Be2 GFP-ffLuc_epHIV7およびSK-N-DZ GFP-ffLuc_epHIV7を得た。これらの細胞株をさらにCD19t-2A-IL2_pHIV7で形質導入し、CD19t細胞のソーティングにより精製して、ＩＬ−２分泌性神経芽腫細胞株を作製した。ＮＢ細胞株はいずれも、１０％熱不活化ウシ胎児血清および２ｍｍｏｌ／Ｌ Ｌ−グルタミンを添加したＤＭＥＭ（Cellgro）中で培養した。ＥＢＶにより形質転換されたリンパ芽球様細胞株（TMLCL）と、OKT3 mAbに由来する膜固定型ＣＤ３ε特異的scFvを発現するTMLCL（TMLCL-OKT3）は、１０％熱不活化ウシ胎児血清および２ｍｍｏｌ／Ｌ Ｌ−グルタミンを添加したRPMI1640中で培養した。
【０２６６】
ＣＡＲ Ｔ細胞受容体のシグナル伝達
１×１０６個のエフェクター細胞と標的細胞とを４〜８分間にわたって共培養した後、7-Plex T cell receptor signaling kit（Millipore）に従って細胞を処理し、Erk/MAPキナーゼ1/2の活性を測定した。Pierce BCAプロテインアッセイキット（Thermo Scientific）を使用してタンパク質濃度を測定した。
【０２６７】
インビトロＴ細胞アッセイ
クロム放出アッセイによる細胞傷害性の測定
標的細胞を51Cr（Perkin Elmer）で標識し、次いで洗浄することによって得られた標的細胞（５×１０３個／ウェル）を、Ｔ細胞（S1R2D12-14）とともに、様々なエフェクター：標的比（Ｅ：Ｔ）において三連でインキュベートした。４時間インキュベートした後、上清を回収し、Top Count NTX（Perkin Elmer）を使用してγ放射線を計測し、過去の報告に従って特異的な溶解を算出した。
【０２６８】
バイオフォトニックルシフェラーゼアッセイによる細胞傷害性の測定
GFP-ffLuc_epHIV7を含むＮＢ細胞株をエフェクター細胞とともにＥ：Ｔ比＝５：１で共培養した。前記と同様にして、１回目、２回目または３回目にわたってエフェクター細胞と腫瘍細胞とを接触させた。Ｔ細胞と接触させた後に生存していた腫瘍細胞数を評価するため、Ｄ−ルシフェリンを加え、５分後にIVIS Spectrum imaging System（Perkin Elmer）を使用して神経芽腫（ＮＢ）細胞からのバイオフォトンシグナルを測定した。
【０２６９】
サイトカインの放出
５×１０５個のＴ細胞（S1R2D12-14）を刺激細胞とともにＥ：Ｔ比＝２：１で播種し、２４時間培養した。Bio-plexサイトカインアッセイおよびBioplex-200システム（Bio-rad Laboratories）を使用して、上清中のＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−２を測定した。
【０２７０】
ストレステスト
連続して起こる抗原との遭遇を模倣するため、接着性標的細胞と新たに解凍した非接着性エフェクター細胞との共培養をＥ：Ｔ比＝１：１で行った。２４時間後（１回目）および４８時間後（２回目）に、Guava ViaCount Assay（Millipore）を使用してＴ細胞の生存率を評価し、非接着性エフェクター細胞を別の培地に移し、新しく用意した接着性標的細胞とともにＥ：Ｔ比＝１：１で培養した。１回目、２回目および３回目（７２時間）の培養後、Ｔ細胞を回収し、死細胞除去キット（Miltenyi）で処理して、さらに分析を行った。
【０２７１】
免疫組織化学分析
マウスを屠殺した後、脳を摘出し、１０％中性緩衝ホルマリン（Thermo）中で２４時間固定し、処理し、パラフィン包埋し、５μｍの切片に薄切した。Diva decloaker RTU（Biocare Medical）を使用して抗原の賦活化を行った。各一次抗体をブロッキング緩衝液で希釈することによって、１：１００希釈したラットモノクローナル抗ヒトＣＤ３（クローンCD3-12、AbD Serotec/Bio-rad）、１：２００希釈したマウスモノクローナル抗ヒトKi67（クローンMIB-1、Dako）、１：１００希釈したウサギポリクローナル抗ヒト切断型カスパーゼ−３（Biocare Medical）、１：２００希釈したウサギポリクローナル抗ヒトグランザイムＢ（Covance）を調製し、切片を各一次抗体とともに４℃で一晩インキュベートした。０．２％ＢＳＡを含むＰＢＳで１：５００に希釈した二次抗体（Life Technologies）とともに切片を室温で２時間インキュベートした。
【０２７２】
Nuanceマルチスペクトル画像化システム（Perkin Elmer）を備えたEclipse Ci正立落射蛍光顕微鏡（Nikon）を使用して、スライド標本から４０倍の倍率で画像を取得した。InForm分析ソフトウエア（Perkin Elmer）を使用して、画像データを分析した。
【０２７３】
NOD/SCID/γc-/-マウスにおける実験
SCRI IACUCによって承認されたプロトコルに従って、ＮＳＧマウス腫瘍モデルにおける実験を行った。
【０２７４】
ヒト神経芽腫の頭蓋内異種移植片ＮＳＧマウスモデル
NOD.Cg-PrkdcscidII2rgtm1Wjl/SzJ［NOD scid gamma（NSG）］成熟雄性マウスをJackson Laboratoryから入手するか、自家繁殖させた。０日目に、ブレグマから横へ２ｍｍ、前方向に０．５ｍｍの位置、かつ硬膜から２．５ｍｍの深さにおいて、IL-2分泌性ffLuc発現Be2腫瘍細胞またはSK-N-DZ腫瘍細胞２×１０５個をマウスの頭蓋内に注射（i.c.）した。次いで、７日後（治療応答モデル）または１４日後（ストレ試験モデル）に、ＣＡＲ改変CD8+ＴＥ（ＣＭ）２×１０６個をマウスに腫瘍内注射した。ストレステストモデルにおいては、Ｔ細胞注射の３日後にマウスを安楽死させ、脳を摘出し、免疫組織化学（ＩＨＣ）分析を行った。腫瘍成長の生物発光イメージングでは、Ｄ−ルシフェリン（Perkin Elmer）（４．２９ｍｇ／マウス）をマウスに腹腔内注射（i.p.）した。Ｄ−ルシフェリンを注射した１５分後にマウスをイソフルランで麻酔し、IVIS Spectrum Imaging System（Perkin Elmer）を使用して画像化を行った。Living Imageソフトウェア Version 4.3（Perkin Elmer）を使用してルシフェラーゼの活性を分析し、目的領域内で光量子束を分析した。
【０２７５】
統計学的分析
Prism Software（GraphPad）を使用して統計解析を行った。図の凡例に示したように、データは平均値±ＳＤまたは±ＳＥＭで示す。対応のない両側検定として、９５％の信頼区間でスチューデントのｔ検定を行い、０．０５未満のｐ値を有する結果を有意と見なした。生存の統計解析をログランク検定により行い、０．０５未満のｐ値を有する結果を有意と見なした。
【０２７６】
ＣＡＲによって誘導される細胞溶解性の強さおよびサイトカイン機能の強度はＣＡＲの細胞外スペーサーの長さを調節することによって段階的に増強することができる
ＣＡＲ発現Ｔ細胞と腫瘍細胞との間における生物物理学的なシナプスは、腫瘍細胞の表面の標的分子上のエピトープの位置から腫瘍細胞の細胞膜までの距離によって左右される。生物学的に活性なＣＡＲを作製するためには、ＣＡＲの細胞外スペーサーの長さを調節して、機能的なシグナル伝達シナプスを形成させることが重要であると仮定した。CD171特異的かつ／または標的ＣＡＲの細胞外スペーサーの長さによる影響を評価するため、ヒトＩｇＧ４のモジュールドメインを使用することによって、一連のスペーサーとして、「長いスペーサー（ＬＳ）」ＩｇＧ４のヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３、「中程度の長さのスペーサー（ＭＳ）」ＩｇＧ４のヒンジ−ＣＨ３の融合ドメイン、および「短いスペーサー（ＳＳ）」ＩｇＧ４のヒンジを構築した。各スペーサーバリアントはＣＤ２８の膜貫通ドメインに融合されており、このＣＤ２８膜貫通ドメインは、第二世代（２Ｇ）の４−１ＢＢ：ζの細胞内ドメインに融合されており、この４−１ＢＢ：ζの細胞内ドメインは、Ｔ２Ａリボソームスキップペプチドを介して細胞表面ＥＧＦＲｔタグに連結されていた（図１３Ａ）。精製されたCD8+CD45RO+CD62L+セントラルメモリー前駆細胞を免疫磁気選択することによって、スペーサーバリアントを有する一連のヒトCD8+セントラルメモリー由来2G-CAR+/EGFRt+エフェクターＴ細胞株（ＴＥ（ＣＭ））を作製した（図１９Ａおよび図１９Ｂ）。レンチウイルスを形質導入したＴＥ（ＣＭ）を増殖させた後、免疫磁気選択によってセツキシマブ陽性細胞を選択することによって、ＥＧＦＲｔの発現量が均一なＴＥ（ＣＭ）株を濃縮した（１８）。マウスＦ（ａｂ）およびＥＧＦＲに特異的な抗体を使用したフローサイトメトリー染色によって、各ＣＡＲスペーサーバリアントの表面発現レベルが同程度であることが確認され、ウエスタンブロットを用いて各Ｔ細胞株のＣＤ３ζを検出することによって定量されたタンパク質の発現量が同程度であることが確認された（図１３Ｂおよび図１３Ｃ）。
【０２７７】
２Ｇ−ＣＡＲにより誘導されたインビトロにおけるCD8+TE(CM)の活性化の強度がスペーサードメインの長さによって左右されるかどうかを実験結果から評価した。CD171＋ヒト神経芽腫（ＮＢ）腫瘍細胞で活性化すると、CD171特異的かつ／または標的2G-CAR(LS)CD8+TE(CM)は、CD171-CAR(SS)CD8+TE(CM)と比較して、ホスホＥＲＫの発現量が３．１倍であり（p=0.003)、CD137活性化マーカーを発現する細胞の割合が５．７倍であった（p=0.015）（図１３Ｄおよび図１３Ｅ）。2G-CAR(MS)によるホスホＥＲＫの発現およびＣＤ１３７の誘導は、2G-CAR（LS）および2G-CAR（SS）の中間であった。次に、スペーサーの長さによって、抗腫瘍細胞溶解活性の強度もＬＳ＞ＭＳ＞ＳＳの順位に調整されるかどうかを評価した。４時間クロム放出アッセイをおこなったところ、CD171＋NB標的細胞に対する溶解性も上記と同様にＬＳ＞ＭＳ＞ＳＳの強度を示すことが、CD171高発現Be2 NB細胞株およびCD171低発現SK-N-DZ NB細胞株において示された（図１３Ｆおよび図２０Ａ）。さらに、サイトカインの分泌活性化の増強も同じ強度順となり、2G-CAR（LS）は、2G-CAR（SS）と比較すると、ＩＦＮ−γの産生が８．４倍であり（p=0.003）、ＩＬ−２の産生が６．３倍であり（p<0.0001）、ＴＮＦ−αの産生が６．１倍であり（p=0.005）（図１３Ｇ）、2G-CAR(MS)は、2G-CAR（LS）と2G-CAR（SS）の中間であった。これらのデータから、ＣＡＲによって形成される生物物理学的なシナプスは、スペーサーの長さによって調節することができ、その結果、活性化および機能を段階的に増強することができることを明らかとなった。当技術分野において通常利用される標準的なＣＡＲの開発基準に基づくと、2G-CAR(LS)スペーサーバリアントは、臨床応用のための開発におけるリード候補物質であると考えられる。
【０２７８】
スペーサーにより調節されたＣＡＲリダイレクトＣＴＬのインビトロにおける機能強度はインビボにおける抗腫瘍活性と負の相関を示す
インビトロアッセイにおいて見られたＣＡＲシグナル伝達の有効性と、インビボにおける治療活性との関連性を明らかにするため、確立されたヒトＮＢ異種移植片を大脳半球に定位移植したＮＳＧマウスにおける養子移入実験を行った（図１４Ａ）。驚くべきことに、２Ｇ−ＣＡＲ（ＬＳ）の腫瘍内注射により治療したBe2腫瘍移植マウスは治療活性を何ら示さず、腫瘍接種の約３週間後に安楽死せざるを得なかった（図１４Ｂおよび図１４Ｃ）。これとは対照的に、2G-CAR(SS)CAR CD8+TE(CM)で治療したマウスでは腫瘍のバイオフォトニックシグナルが低下し、かつ生存期間が延長され、２Ｇ−ＣＡＲ（ＭＳ）バリアントで治療したマウスでは中程度のシグナルの低下および生存期間の延長が見られた（p=0.001；これらの種々の群における生存期間の中間値：ＬＳ＝２０日、Mock＝２１日、ＭＳ＝５９．５日、ＳＳ＝７６日）。SK-N-DZ腫瘍移植マウスは、ＳＳ＞ＭＳ＞ＬＳの順位の腫瘍応答性を示し、2G-CAR(SS)CD8+TE(CM)で治療したマウスでは一定しない腫瘍の排除および１００％の生存が見られた（図２０Ｃおよび図２０Ｄ）。移植腫瘍に直接注射された２Ｇ−ＣＡＲ（ＬＳ）リダイレクトＣＴＬは良好な結果を示せなかったが、グランザイムＢおよびＫｉ６７を発現する移入Ｔ細胞の腫瘍内密度は養子移入後の早期（３日目）のＩＨＣ分析から変化しなかったことから、２Ｇ−ＣＡＲ（ＬＳ）リダイレクトＣＴＬによるこの不良な結果は、養子移入後に生存することができず、移入部位で活性化されなかったためとは考えにくい（図１４Ｄ〜図１４Ｇ）。統計学的に有意ではなかったが（p=0.34）、活性化型カスパーゼ３が検出された2G-CAR(LS)CD8+TE(CM)の頻度は、2G-CAR(SS)CD8+TE(CM)の１２．１倍であった。これらのデータから、細胞外スペーサーのサイズに左右されるＣＡＲリダイレクトＴ細胞のインビトロでの抗腫瘍作用とインビボでの抗腫瘍治療活性との間には予想外の不整合があることが分かった。
【０２７９】
抗原に繰り返し暴露させると、活性化誘導細胞死が増強され、長いスペーサーを有する第二世代ＣＡＲが過剰に活性なシグナル伝達を起こす
４時間クロム放出アッセイ（ＣＲＡ）におけるインビトロでの細胞溶解性の活性化では、ＣＡＲ媒介性シグナル伝達の継続期間が限定されていたが、インビボ腫瘍モデルでは、腫瘍を根絶するためには活性化を繰り返し行うことが必要であると仮定した。したがって、特定のＣＡＲ構築物がインビトロ測定において良好なシグナル伝達作用を示したとしても、インビボでは優れたシグナル伝達能を示さないかもしれないと考えた。インビトロにおいて連続した繰り返し刺激を再現するため、ＣＡＲ Ｔ細胞と腫瘍細胞とを共培養した「ストレステスト」アッセイを考案した。このアッセイでは、各培養における生存Ｔ細胞：腫瘍細胞の比は１：１の一定比率に維持したまま、２４時間毎にＣＡＲ Ｔ細胞を回収し、腫瘍細胞が播種された培養ディッシュへの移動を繰り返し行う（図１５Ａ）。Be2は、ホタルルシフェラーゼを発現するように改変されており、連続した３回の移動において腫瘍細胞の殺傷を培養と同時に追跡するために利用した。種々の２Ｇ−ＣＡＲスペーサーバリアント細胞株を繰り返し活性化させると、それぞれ同様に３回目に抗腫瘍活性が消失した（図１５Ｂ）。さらに、各スペーサーバリアントを発現するエフェクター細胞を各回の培養後にフローサイトメトリー測定により分析すると、2G-CAR(LS)CD8+TE(CM)は、2G-CAR(SS)CD8+TE(CM)よりも、活性化マーカーであるＣＤ２５およびＣＤ６９を発現する細胞の頻度が高かったことが示された（１回目：７９．４％対４６．８％、p=0.007；２回目：７４．０％対４７．６％；３回目：６５．７％対４２．１％、p=0.037）（図１５Ｃ）。
【０２８０】
インビトロ分析を模倣した活性化マーカーのＬＳ＞ＭＳ＞ＳＳのアップレギュレーションパターンが培養初期の１回目の培養に見られたが、３回目の培養においては、ＬＳ／ＭＳ＞ＳＳで表されるＴ細胞生存率の低下が最も顕著であったことが認められた（３回目の死細胞の割合（％）は、ＬＳ：５８．７％、ＭＳ：６２．６％であったのに対して、ＳＳ：２１．１％であった、ＬＳとＳＳとの間のｐ値：p=0.024、ＭＳとＳＳとのｐ値：p=0.007）（図１５Ｄ）。繰り返し活性化させたことに伴う２Ｇ−ＣＡＲ（ＬＳ）ＣＴＬによるＴ細胞生存率の非対称的な低下が、過剰に起こったＡＩＣＤによるものであったことを実証するため、ＦａｓＬ−Ｆａｓ媒介性のＴ細胞同士による殺傷に注目して細胞死の機構を評価した。2G-CAR(LS)CD8+TE(CM)のＦａｓＬ表面発現が、短いスペーサーを有するＣＡＲ Ｔ細胞の４．８倍であり、中程度の長さのスペーサーを有するＣＡＲ Ｔ細胞の２．５倍であり、かつ2G-CAR(LS)CD8+TE(CM)のＦａｓＬ ｍＲＮＡ発現量が短いスペーサーを有するＣＡＲ Ｔ細胞の５．５倍であり、中程度の長さのスペーサーを有するＣＡＲ Ｔ細胞の３．３倍であったことから、腫瘍により誘導されたＣＡＲ活性化に依存するＦａｓＬのアップレギュレーションは、ＬＳ＞ＭＳ＞ＳＳの順位であったことが認められた。（長いスペーサーと短いスペーサーとの間のｐ値：p<0.0001およびp=0.002；長いスペーサーと中程度の長さのスペーサーの間のｐ値：p<0.0001およびp=0.016）（図１５Ｅおよび図１５Ｆ）。ＦａｓＬの発現を増強とＦａｓ媒介性アポトーシスとの関連性を確認するため、カスパーゼ３の活性を分析したところ、2G-CAR(LS)CD8+TE(CM)の切断型カスパーゼ３レベルは、2G-CAR(SS)CD8+TE(CM)の１３．２倍であったことが認められた（p<0.0001）（図１５Ｇ）。さらに、2G-CAR(LS)CD8+TE(CM)のＦａｓまたはＦａｓＬをｓｉＲＮＡノックダウンさせ、腫瘍に暴露したところ、３回目の培養後のＴ細胞生存率は増大し、１．４倍（Ｆａｓ）（p=0.005）および１．６倍（ＦａｓＬ）（p=0.0001）となった（図１５Ｈ）。ｓｉＲＮＡノックダウンによってＦａｓ／ＦａｓＬが低下したことを確認するため、2G-CAR(LS)CD8+TC(EM)におけるＦａｓ／ＦａｓＬの表面発現を評価したところ、スクランブルｓｉＲＮＡで処理した2G-CAR(LS)CD8+TC(EM)と比較して、Fas+CTLが９１．３％低下し（p<0.0001）、ＦａｓＬ＋ＣＴＬが８０．１％低下した（p<0.0001）（図２１Ａおよび図２１Ｂ）。これらのデータを考え合わせると、ＣＡＲスペーサーの長さを調節することによって、下流のシグナル伝達を調節することができ、この結果、抗腫瘍作用の強度が様々に変化するだけでなく、これと同調してＡＩＣＤに対する感受性も増大することが示された。最適なインビボ抗腫瘍活性を達成できるこれら２つのプロセスのバランスは、2G-CAR(LS)および2G-CAR(SS)の構造バリアントを比較した前記実験結果で示されたように、最も高いＣＡＲシグナル伝達作用を示すスペーサーの調節によっては必ずしも達成されないと考えられる。
【０２８１】
ＣＡＲの細胞内ドメイン成分を増強し、腫瘍への暴露を繰り返し行うことによって、短いスペーサーを有するＣＤ１７１−ＣＡＲバリアントのＡＩＣＤに対する感受性を高めることができる
第三世代のＣＡＲでは、２つの共刺激性細胞内ドメインモジュールとＣＤ３−ζ活性化モジュールとが連結されており、第三世代のＣＡＲは、細胞溶解性の強度およびサイトカイン産生レベルを、第二世代のＣＡＲよりも増強することが報告されている。ＣＤ２８の細胞内ドメインを2G 4-1BB:ζの細胞内ドメインに付加することによって、ＣＤ１７１特異的かつ／または標的３Ｇ−ＣＡＲを構築した（図１６Ａ）。2G-CAR(SS)または3G-CAR(SS)の発現レベルが同等なCD8+TE(CM)を、精製されたＴＣＭ前駆細胞からの免疫磁気選択によって得た（図１６Ｂおよび図１６Ｃ）。腫瘍に接触させた3G-CAR(SS)CD8+TE(CM)は、第二世代のCAR(SS)CD8+TE(CM)の８．４倍のＣＤ１３７発現誘導（p<0.0001）（図１６Ｄ）、１．３倍のＢｅ２標的細胞溶解活性（エフェクター細胞：標的細胞比＝１：１０、p=0.0001）（図１６Ｅ）、ならびに５．１倍のＩＬ−２分泌および２．５倍のＴＮＦ−α分泌（p<0.0001およびp=0.003）（図１６Ｆ）を示した。
【０２８２】
次に、短い細胞外スペーサーを有する３Ｇ細胞内ドメインの媒介によって増強されたＣＡＲによるＴ細胞活性化の向上が、ＡＩＣＤの増悪させることなくインビボでの抗腫瘍活性を選択的に増強することができるかどうかを評価した。驚くべきことに、Be2（図１７Ａ）およびSK-N-DZ（図１７Ｂ）に対する前記３Ｇ細胞内ドメイン媒介性抗腫瘍活性は、統計学的有意差はなかったものの、2G-CAR(SS)ドメインによるものよりも劣っていた。この知見は、養子移入の３日後に検出されたヒトＣＤ３＋Ｔ細胞密度が同程度であったことを踏まえると、短期間における腫瘍内でのＣＡＲ Ｔ細胞の持続性の違いによるものであるとは考えにくい（図１７Ｃ）。腫瘍内2G-CAR(SS)T細胞よりも3G-CAR(SS)T細胞の方がグランザイムＢ＋細胞の頻度が高かったが、活性化型カスパーゼ３を有する細胞も第三世代Ｔ細胞において増加しており、このことから、第三世代のＣＡＲは短い細胞外ドメインスペーサーを有していたにも関わらず、ＣＤ２８および４−１ＢＢの併用効果によって共刺激を増強し、この過剰刺激を介してＡＩＣＤを増強したことが示唆された（図１７Ｄ）。この現象は、インビトロでのストレステストアッセイを使用して2G-CAR(SS)T細胞と3G-CAR(SS)T細胞の作用を比較することによって確認することができた。各回の腫瘍刺激の後に、2G-CAR(SS)T細胞集団よりも3G-CAR(SS)T細胞集団においてCD25+CD69+T細胞が高頻度で見られ（図１８Ａ）、さらに、連続して複数回活性化させた後の死滅Ｔ細胞の頻度も高かった（図１８Ｂ）。ここでも、表面染色およびｍＲＮＡ含有量から、ＡＩＣＤの増強にはＦａｓＬの高発現が伴うことが確認され、これは、活性化型カスパーゼ３レベルの増強と一致していた（図１８Ｃ〜図１８Ｅ）。これらのデータから、細胞内シグナル伝達ドメインの組成に基づいてＣＡＲのシグナル伝達作用を過剰に調節すると、Ｔ細胞のＦａｓＬ媒介性ＡＩＣＤを増強することと相まって、調節された短いスペーサー構造に対して不利な影響を与えることが示された。
【０２８３】
ＣＡＲは、多重化されたシグナル伝達作用を媒介することができ、このシグナル伝達によって抗腫瘍性リダイレクトＴ細胞のエフェクター機能を誘導することができる。ＣＤ１９にリダイレクトされたＣＡＲ Ｔ細胞は、急性リンパ芽球性白血病患者において治療効果を示すことが確認されているにもかかわらず、このような合成受容体の生物物理学的な構造とその機能がどのように寄与しているのかは依然として完全には理解されてはいない。Ｔ細胞の効果的な抗腫瘍活性を固形腫瘍に適用するには、より厳密にＣＡＲを調節することが必要とされるであろうが、インビボにおいてＣＡＲの組成が抗腫瘍機能にどのような影響を及ぼすのかが限定的にしか理解されていないまま、経験則に基づいてＣＡＲを設計したとしても、ヒトへの臨床応用は成し遂げることはできない。本明細書では、細胞外スペーサーの長さを調整して細胞内シグナル伝達モジュールと組み合わせたときの効果に注目して、ヒトのセントラルメモリー由来ＣＤ８＋エフェクターＣＴＬを作製し、このＣＤ８＋エフェクターＣＴＬにおけるＣＡＲの構造とその機能について体系的に調査した。インビトロアッセイを使用してＣＡＲのシグナル伝達の強さを分析することによって、ＣＡＲの構造バリアントの有効性に順位があることが確認された。これらの分析の結果、インビボにおいて抗腫瘍活性を発揮することのできるＣＡＲシグナル伝達作用の強度範囲が明らかとなった。この範囲を上回ると増強されたＡＩＣＤによって抗腫瘍活性が低減されてしまう。
【０２８４】
ＣＡＲの設計は、今日にまでほとんど経験則に基づいて行われてきている。ＣＡＲの設計は、主として、活性化ドメイン（ＣＤ３複合体のζ鎖など）を含むＩＴＡＭに融合により連結された共刺激性受容体由来細胞内ドメインモジュールを組み合わせることによって、シグナル伝達作用を増強することに焦点が当てられてきた。第一世代、第二世代または第三世代のＣＡＲを発現するＣＴＬの機能の比較は、特定の研究室によって使用されてきた「ストック」の細胞外スペーサードメインを使用して行われることが多かった。研究されてきたＣＡＲは、ＩｇＧ全長から比較的短いＣＤ８αのヒンジやＣＤ２８の膜近接部分にまで多岐に及び、多くの研究室では、スペーサーの長さがＣＡＲのシグナル伝達およびその機能活性に対して及ぼす影響が研究されてきた。ＨＬＡクラスＩまたはＨＬＡクラスＩＩを有するペプチドと接触させた場合のＴｃＲとは異なり（Ｔ細胞の細胞膜と標的細胞の細胞膜との間の既知の生物物理学的な距離を定義するものであり、これらの細胞が接触することによって超分子活性化複合体（ＳＭＡＣ）が形成される）、ＣＡＲの場合は、標的分子の構造の大きさ、標的分子上のｓｃＦｖのエピトープの位置、ＣＡＲのスペーサーの長さによって、接触相手との立体的関係が決まる。ＣＡＲを介したＳＭＡＣの形成は、比較的あまり知られていないが、今日までの研究では、ＴｃＲ ＳＭＡＣのような規律性のある構造とは異なることが示唆されている。選択される抗原および抗体結合ドメインの大きさはそれぞれに特有であるが、ＣＡＲスペーサーは大きさの調整が可能であり、ＣＡＲスペーサーの大きさを調整することによって、ＣＡＲ Ｔ細胞と標的細胞との間に形成される直線的なシナプス距離を標準的な距離に調節することができる。通常は、標的分子の細胞表面上のエピトープは膜遠位部に位置するため、短いスペーサーを有するＣＡＲを用いたとしても、シナプス距離を縮めてシグナル伝達を形成することができない。しかし、本発明のＣＡＲスペーサーによって、Ｔ細胞と標的細胞との間の免疫シナプスに上述したような構造的特徴がもたらされるため、通常ＣＡＲが機能的に関与することのない距離を調節することができる。同様に、長いスペーサーを有するＣＡＲを用いた場合にのみシグナル伝達作用が見られる膜近位のＣＡＲ標的抗原エピトープも報告されている。
【０２８５】
まず、ＣＥ７ ｍＡｂに由来するＣＤ１７１特異的かつ／または標的ｓｃＦｖ結合ドメインを使用して、４−１ＢＢ：ζを有する第二世代ＣＡＲからのシグナル伝達作用に対して細胞外スペーサードメインの長さが及ぼす影響を評価した。様々なスペーサー、すなわち、ＩｇＧ４ヒンジを含む短いスペーサー、ヒンジ：ＣＨ３を含む中程度の長さのスペーサー、ＩｇＧ４ヒンジ全長：Ｆｃを含むスペーサーを作製して、スペーサーの長さを増加させたインビトロアッセイを実施したところ、シグナル伝達作用の段階的な強度の増強が見られた。予想外にも、確立された神経芽腫を実質脳内に定位移植して作製した異種移植片ＮＳＧマウスにおいてインビボ試験を行ったところ、腫瘍内注射したＣＡＲ ＣＤ８＋ＣＴＬの抗腫瘍作用は、スペーサーの長さとインビトロでの機能活性との間には負の相関が見られた（すなわち、ＳＳ＞ＭＳ＞＞ＬＳ）。Ｔ細胞の遊走がスペーサーにあたえる潜在的な影響やマウスＦｃ＋細胞との相互作用が生存期間に影響を与えることが考えられたため、これらの影響を除外するため、Ｔ細胞を腫瘍内に直接投与する経路を使用した。これらの知見を踏まえると、限られた継続時間において腫瘍細胞と１回のみ接触させた後に、ＣＡＲ Ｔ細胞の機能（すなわち、腫瘍細胞に対する溶解性、サイトカイン分泌性刺激、および増殖）を評価する一般なインビトロアッセイを行っても、インビボで固形腫瘍内において起こるような腫瘍への反復暴露が起こった場合にＣＡＲ Ｔ細胞がどのような挙動を示すのかは検出できないと仮定された。この仮定を効果的に評価するため、腫瘍細胞の数を一定としたまま、バイオフォトニックレポーター遺伝子を発現する腫瘍細胞にＣＡＲ Ｔ細胞を繰り返し暴露させるインビトロアッセイを考案した。この方法では、殺傷された腫瘍細胞をバイオフォトニックシグナルで定量することができ、各回の腫瘍との共培養の後で、回収されたＣＡＲ Ｔ細胞から、活性化状態、生存率およびカスパーゼ活性について詳しく調べることができる。インビトロにおいて腫瘍細胞に３回の反復暴露させた結果、２Ｇ−ＣＡＲ（ＬＳ）Ｔ細胞集団のうちアポトーシスを起こしたＴ細胞の頻度は、２Ｇ−ＣＡＲ（ＳＳ）Ｔ細胞と比較して不均衡な増加を示した。ＳＳ ＣＡＲと比較すると、増強されたＡＩＣＤは、ＬＳ ＣＡＲにより誘導されたＦａｓＬの発現増強および活性化型カスパーゼ３の発現と相関した。また、腫瘍細胞に暴露させる前に、ＦＡＳまたはＦａｓＬをｓｉＲＮＡノックダウンすると、ＬＳ ＣＡＲ Ｔ細胞におけるＡＩＣＤは低下した。これらのインビトロでの知見は、ＳＳ ＣＡＲ Ｔ細胞と比較して、ＬＳ ＣＡＲ Ｔ細胞が腫瘍異種移植片内で限定的にしか持続できないことと相関した。まとめると、これらのデータから、シグナルを伝達しない細胞外スペーサーは、ＣＡＲの設計における調節可能な要素であり、この細胞外スペーサーを調節することによって、シグナル伝達活性だけでなく、固形腫瘍におけるＣＡＲ Ｔ細胞の持続性にも影響を与えることが示された。
【０２８６】
４−１ＢＢζの第二世代（２Ｇ）ＣＡＲを使用した場合のスペーサーの長さとインビボでの生存率との関係を踏まえ、シグナル伝達作用を増強させた第三世代（３Ｇ）ＣＤ２８：４−１ＢＢ：ζ ＣＡＲ細胞内ドメインを使用した場合に短いスペーサーが遺伝子的に最適かどうかを評価した。いくつかの他の実験群における観測結果と一致して、インビトロで腫瘍により刺激すると、ＣＤ１７１特異的かつ／または標的３Ｇ−ＣＡＲ（ＳＳ）は、２Ｇ−ＣＡＲ（ＳＳ）と比較して、細胞溶解活性の増強およびサイトカイン合成の増強を刺激した。しかしながら、短いスペーサーを使用した３Ｇ−ＣＡＲのシグナル伝達作用が増強されたことによって、ＦａｓＬの発現も増強され、アポトーシスが亢進したことが、活性化型カスパーゼ３レベルの増加によって示され、細胞死の頻度が高まった。これに伴って、３Ｇ−ＣＡＲ（ＳＳ）Ｔ細胞のインビボ腫瘍内における生存率が低下し、３Ｇ−ＣＡＲ（ＳＳ）Ｔ細胞のインビボでの抗腫瘍作用が２Ｇ−ＣＡＲ（ＳＳ）よりも低下した。最初の抗原活性化の際にＣＤ２８はＴ細胞を共刺激し、ＮＦＡＴ制御下のｃＦＬＩＰｓｈｏｒｔの増加を介してＡＩＣＤを回避することによってＴ細胞の生存率を高めるが、過去の研究では、あらかじめ活性化させたＴ細胞をＣＤ２８で繰り返し共刺激すると、ＦａｓＬの発現が増強されてＴ細胞の生存率が低下し、ひいてはＡＩＣＤが増強することが報告されている。したがって、過去に報告されている臨床試験において、抗ＣＤ１９ ４−１ＢＢ：ζによる治療を受けた患者でのＴ細胞の持続期間が長期に及ぶことが多かったのに対して、抗ＣＤ１９ ＣＤ２８：ζＣＡＲ Ｔ細胞による治療を受けたＡＬＬ患者における該Ｔ細胞の持続期間が比較的短かったことは、抗ＣＤ１９ ＣＤ２８：ζＣＡＲ Ｔ細胞によって媒介されるＣＤ２８の反復シグナル伝達によるものであったのかどうかを検討することは興味深いと考えられる（２、３５）。まとめると、これらのデータから、ＣＡＲリダイレクトＴ細胞のインビボにおける作用は、最適化された長さを有する細胞外スペーサードメインと特定の細胞質シグナル伝達ドメイン組成との許容しうる組み合わせを同定できるかどうかに部分的に依存することが示された。さらに、インビトロアッセイでは、ＣＡＲ構築物を繰り返し活性化すると、初代ヒトＣＤ８＋ＣＴＬのＡＩＣＤを誘導する傾向があることが示された。これらの研究では、スペーサーの長さと細胞質シグナル伝達モジュールの選択による組み合わせ効果に基づいて、ＣＡＲを「過剰に調節」することには注意を要することが示された。
【０２８７】
腫瘍細胞の細胞膜からの標的分子のエピトープの位置に基づいて、どのようにＣＡＲを構築するべきかという原理に到達できるような予測構造モデルは得られていない。そのうえ、一般に使用されているインビトロバイオアッセイを代用したことから、ＣＡＲ Ｔ細胞による機能性抗腫瘍作用を最大限まで高め、かつＡＩＣＤを最小まで低下させることを確実に実行できるＣＡＲ組成を選択することはできなかった。本明細書に記載の研究では、インビトロでのストレステストアッセイを使用したＣＡＲ構造物ライブラリーのスクリーニングは、ＣＡＲの遺伝子合成に組み込むことが可能なさらなるパラメータとして有益でありうることが示された。遺伝子戦略によって、過剰に活性なＣＡＲ構築物のＡＩＣＤに対する感受性を低減することができると考えられ、たとえば、ｃＦＬＩＰまたはＴｏｓｏの強制過剰発現や、ベクターを使用した、ＦａｓＬまたはＦａｓをノックダウンさせるｓｉＲＮＡの合成によって達成できると考えられる。Ｔ細胞の感受性を操作してアポトーシスを引き起こさせるには、それ相応の厳密な安全性が必要とされ、たとえば、誘導可能な自殺構築物を含ませること、医師の監督下で導入遺伝子の発現を制御できること（たとえば小分子により調節される転写・翻訳制御システムなど）などが必要であろう。ＣＡＲを過剰に調節することによるさらなる二次的影響についても解明する必要があり、たとえば、ＰＤ−Ｌ１の存在下において、疲弊したＴ細胞の機能を向上することのできる阻害性受容体（ＰＤ−１など）の発現の増強を誘導することができる過剰に活性なＣＡＲの選択などについても解明されなければならない。実験データからは以下のことが示された。
１．）一般に用いられている機能的アッセイでは、最も高い機能活性を示す構築物を選択することに焦点が当てられていることから、このような機能的アッセイを使用すると、誤った構築物候補を選択してしまう可能性がある。
２．）ＣＡＲによりリダイレクトされたエフェクターＣＴＬの作用の調節には上限があり、それを超えてしまうと、ＣＡＲによる反復誘導が起こり、それによって増強されたＡＩＣＤによってエフェクター作用が打ち消されてしまう。
これらの結果から、短いスペーサーを有する、ＣＤ１７１特異的かつ／または標的ＣＡＲを、再発した神経芽腫／難治性の神経芽腫を有する小児における第Ｉ相試験にて評価すべきだと考える。
【０２８８】
さらなる実施形態
いくつかの実施形態では、キメラ受容体の核酸配列が提供される。
いくつかの実施形態では、前記キメラ受容体の核酸配列は、
ａ）ＣＤ１７１を標的としかつ／またはＣＤ１７１に結合するリガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチド；
ｂ）前記リガンドを標的とすることができかつ／または該リガンドに特異的であり、かつ特定の長さを有する最適化されたポリペプチドスペーサーをコードするポリヌクレオチド；
ｃ）膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチド；および
ｄ）細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチド
を含む。
いくつかの実施形態においては、前記リガンド結合ドメインは抗体フラグメントである。いくつかの実施形態においては、前記リガンド結合ドメインは一本鎖可変フラグメントである。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは１５アミノ酸長以下である。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、アミノ酸配列X1PPX2Pを含む。いくつかの実施形態においては、前記スペーサー領域は、ヒト抗体のヒンジ領域の一部を含む。いくつかの実施形態においては、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ−４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、ＬＦＡ−１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３およびこれらの組み合わせからなる群から選択される共刺激ドメインと、ＣＤ３ζ全体またはその一部とを含む。いくつかの実施形態においては、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζの一部と４−１ＢＢの一部とを含む。いくつかの実施形態においては、前記キメラ受容体の核酸配列は、マーカー配列をコードする核酸をさらに含む。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、前記リガンドに応答したＴ細胞の増殖および／またはサイトカインの産生が対照のキメラ受容体よりも増強するように最適化されている。
【０２８９】
いくつかの実施形態では、キメラ受容体ポリペプチドが提供される。いくつかの実施形態においては、前記キメラ受容体ポリペプチドは、キメラ受容体の核酸配列によってコードされる。
いくつかの実施形態では、前記キメラ受容体の核酸配列は、
ａ）ＣＤ１７１を標的としかつ／またはＣＤ１７１に結合するリガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチド；
ｂ）前記リガンドに特異的であり、かつ特定の長さを有する最適化されたポリペプチドスペーサーをコードするポリヌクレオチド；
ｃ）膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチド；および
ｄ）細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチド
を含む。
いくつかの実施形態においては、前記リガンド結合ドメインは抗体フラグメントである。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、前記リガンドに応答したＴ細胞の増殖および／またはサイトカインの産生が対照のキメラ受容体よりも増強するように最適化されている。いくつかの実施形態においては、前記リガンド結合ドメインは一本鎖可変フラグメントである。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、１５アミノ酸長以下（かつ１アミノ酸長以上または２アミノ酸長以上）である。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、アミノ酸配列X1PPX2Pを含む。いくつかの実施形態においては、前記スペーサー領域は、ヒト抗体のヒンジ領域の一部を含む。いくつかの実施形態においては、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ−４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、ＬＦＡ−１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３およびこれらの組み合わせからなる群から選択される共刺激ドメインと、ＣＤ３ζ全体またはその一部とを含む。いくつかの実施形態においては、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζの一部と４−１ＢＢの一部とを含む。いくつかの実施形態においては、前記キメラ受容体の核酸配列は、マーカー配列をコードする核酸をさらに含む。
【０２９０】
いくつかの実施形態においては、単離されたキメラ受容体核酸配列を含む発現ベクターが提供される。
いくつかの実施形態では、前記キメラ受容体の核酸配列は、
ａ）ＣＤ１７１を標的としかつ／またはＣＤ１７１に結合するリガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチド；
ｂ）前記リガンドに特異的であり、かつ特定の長さを有する最適化されたポリペプチドスペーサーをコードするポリヌクレオチド；
ｃ）膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチド；および
ｄ）細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチド
を含む。
いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、前記リガンドに応答したＴ細胞の増殖および／またはサイトカインの産生が対照のキメラ受容体よりも増強するように最適化されている。いくつかの実施形態においては、前記リガンド結合ドメインは抗体フラグメントである。いくつかの実施形態においては、前記リガンド結合ドメインは一本鎖可変フラグメントである。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、１５アミノ酸長以下（かつ１アミノ酸長以上または２アミノ酸長以上）である。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、アミノ酸配列X1PPX2Pを含む。いくつかの実施形態においては、前記スペーサー領域は、ヒト抗体のヒンジ領域の一部を含む。いくつかの実施形態においては、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ−４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、ＬＦＡ−１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３およびこれらの組み合わせからなる群から選択される共刺激ドメインと、ＣＤ３ζ全体またはその一部とを含む。いくつかの実施形態においては、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζの一部と４−１ＢＢの一部とを含む。いくつかの実施形態においては、前記キメラ受容体の核酸配列は、マーカー配列をコードする核酸をさらに含む。
【０２９１】
いくつかの実施形態では、宿主細胞が提供される。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は発現ベクターを含む。いくつかの実施形態においては、単離されたキメラ受容体核酸配列を含む前記発現ベクターが提供される。
いくつかの実施形態では、前記キメラ受容体の核酸配列は、
ａ）ＣＤ１７１を標的としかつ／またはＣＤ１７１に結合するリガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチド；
ｂ）前記リガンドに特異的であり、かつ特定の長さを有する最適化されたポリペプチドスペーサーをコードするポリヌクレオチド；
ｃ）膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチド；および
ｄ）細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチド
を含む。
いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、前記リガンドに応答したＴ細胞の増殖および／またはサイトカインの産生が対照のキメラ受容体よりも増強するように最適化されている。いくつかの実施形態においては、前記リガンド結合ドメインは抗体フラグメントである。いくつかの実施形態においては、前記リガンド結合ドメインは一本鎖可変フラグメントである。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、１５アミノ酸長以下（かつ１アミノ酸長以上または２アミノ酸長以上）である。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、アミノ酸配列X1PPX2Pを含む。いくつかの実施形態においては、前記スペーサー領域は、ヒト抗体のヒンジ領域の一部を含む。いくつかの実施形態においては、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ−４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、ＬＦＡ−１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３およびこれらの組み合わせからなる群から選択される共刺激ドメインと、ＣＤ３ζ全体またはその一部とを含む。いくつかの実施形態においては、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζの一部と４−１ＢＢの一部とを含む。いくつかの実施形態においては、前記キメラ受容体の核酸配列は、マーカー配列をコードする核酸をさらに含む。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞およびバルクＣＤ８＋Ｔ細胞からなる群から選択される細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔリンパ球である。いくつかの実施形態においては、前記ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球は、セントラルメモリーＴ細胞であり、該セントラルメモリーＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋および／またはＣＤ８＋である。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞およびバルクＣＤ４＋Ｔ細胞からなる群から選択されるＣＤ４＋Ｔヘルパーリンパ球である。いくつかの実施形態においては、前記ＣＤ４＋ヘルパーリンパ球は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞であり、該ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋および／もしくはＣＤ４＋であり、かつ／またはＣＤ４５ＲＯ−である。
【０２９２】
いくつかの実施形態では、組成物が提供される。いくつかの実施形態においては、前記組成物は、薬学的に許容される添加剤中に宿主細胞を含む。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は発現ベクターを含む。いくつかの実施形態においては、単離されたキメラ受容体核酸配列を含む前記発現ベクターが提供される。
いくつかの実施形態では、前記キメラ受容体の核酸配列は、
ａ）ＣＤ１７１を標的としかつ／またはＣＤ１７１に結合するリガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチド；
ｂ）前記リガンドに特異的であり、かつ特定の長さを有する最適化されたポリペプチドスペーサーをコードするポリヌクレオチド；
ｃ）膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチド；および
ｄ）細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチド
を含む。
いくつかの実施形態においては、前記リガンド結合ドメインは抗体フラグメントである。いくつかの実施形態においては、前記リガンド結合ドメインは一本鎖可変フラグメントである。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、１５アミノ酸長以下（かつ１アミノ酸長以上または２アミノ酸長以上）である。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、アミノ酸配列X1PPX2Pを含む。いくつかの実施形態においては、前記スペーサー領域は、ヒト抗体のヒンジ領域の一部を含む。いくつかの実施形態においては、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ−４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、ＬＦＡ−１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３およびこれらの組み合わせからなる群から選択される共刺激ドメインと、ＣＤ３ζ全体またはその一部とを含む。いくつかの実施形態においては、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζの一部と４−１ＢＢの一部とを含む。いくつかの実施形態においては、前記キメラ受容体の核酸配列は、マーカー配列をコードする核酸をさらに含む。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞およびバルクＣＤ８＋Ｔ細胞からなる群から選択される細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔリンパ球である。いくつかの実施形態においては、前記ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球は、セントラルメモリーＴ細胞であり、該セントラルメモリーＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋および／またはＣＤ８＋である。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞およびバルクＣＤ４＋Ｔ細胞からなる群から選択されるＣＤ４＋Ｔヘルパーリンパ球である。いくつかの実施形態においては、前記ＣＤ４＋ヘルパーリンパ球は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞であり、該ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋および／もしくはＣＤ４＋であり、かつ／またはＣＤ４５ＲＯ−である。いくつかの実施形態においては、前記組成物は宿主細胞を含み、該宿主細胞は、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞およびバルクＣＤ８＋Ｔ細胞からなる群から選択されるＣＤ８＋Ｔ細胞傷害性リンパ球、またはＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋および／もしくはＣＤ８＋のセントラルメモリーＴ細胞であるＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球であり、前記組成物は別の宿主細胞をさらに含み、該宿主細胞は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞およびバルクＣＤ４＋Ｔ細胞からなる群から選択されるＣＤ４＋Ｔヘルパーリンパ球、またはＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４＋、および／もしくはＣＤ４５ＲＯ−のナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞であるＣＤ４＋ヘルパーリンパ球である。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、前記リガンドに応答したＴ細胞の増殖および／またはサイトカインの産生が対照のキメラ受容体よりも増強するように最適化されている。
【０２９３】
いくつかの実施形態においては、インビトロにおいて宿主細胞を製造する方法が提供される。
いくつかの実施形態においては、インビトロにおいて宿主細胞を製造する前記方法は、
ａ）長さの異なるキメラ受容体をコードする複数の核酸を含む、キメラ受容体をコードする核酸のライブラリーを提供すること；
ｂ）単離された個別のＴリンパ球集団に前記複数の核酸のそれぞれを導入し、各Ｔリンパ球集団をインビトロで増殖させること；
ｃ）腫瘍を有する動物モデルに各遺伝子改変Ｔリンパ球集団を投与し、各遺伝子改変Ｔリンパ球集団が抗腫瘍効果を有するかどうかを判定すること；ならびに
ｄ）インビトロおよび／または動物モデルにおいて抗腫瘍効果を提供するキメラ受容体をコードする核酸を選択すること
を含む。
いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は発現ベクターを含む。いくつかの実施形態においては、単離されたキメラ受容体核酸配列を含む前記発現ベクターが提供される。
いくつかの実施形態では、前記キメラ受容体の核酸配列は、
ａ）ＣＤ１７１を標的としかつ／またはＣＤ１７１に結合するリガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチド；
ｂ）前記リガンドに特異的であり、かつ特定の長さを有する最適化されたポリペプチドスペーサーをコードするポリヌクレオチド；
ｃ）膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチド；および
ｄ）細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチド
を含む。
いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、前記リガンドに応答したＴ細胞の増殖および／またはサイトカインの産生が対照のキメラ受容体よりも増強するように最適化されている。いくつかの実施形態においては、前記リガンド結合ドメインは抗体フラグメントである。いくつかの実施形態においては、前記リガンド結合ドメインは一本鎖可変フラグメントである。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、１５アミノ酸長以下（かつ１アミノ酸長以上または２アミノ酸長以上）である。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、アミノ酸配列X1PPX2Pを含む。いくつかの実施形態においては、前記スペーサー領域は、ヒト抗体のヒンジ領域の一部を含む。いくつかの実施形態においては、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ−４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、ＬＦＡ−１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３およびこれらの組み合わせからなる群から選択される共刺激ドメインと、ＣＤ３ζ全体またはその一部とを含む。いくつかの実施形態においては、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζの一部と４−１ＢＢの一部とを含む。いくつかの実施形態においては、前記キメラ受容体の核酸配列は、マーカー配列をコードする核酸をさらに含む。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞およびバルクＣＤ８＋Ｔ細胞からなる群から選択される細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔリンパ球である。いくつかの実施形態においては、前記ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球は、セントラルメモリーＴ細胞であり、該セントラルメモリーＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋および／またはＣＤ８＋である。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞およびバルクＣＤ４＋Ｔ細胞からなる群から選択されるＣＤ４＋Ｔヘルパーリンパ球である。いくつかの実施形態においては、前記ＣＤ４＋ヘルパーリンパ球は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞であり、該ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋および／もしくはＣＤ４＋であり、かつＣＤ４５ＲＯ−である。いくつかの実施形態では、キメラ受容体をコードする前記核酸は発現ベクターを含む。いくつかの実施形態においては、前記発現ベクターは、単離されたキメラ受容体核酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、前記キメラ受容体の核酸配列は、
ａ）ＣＤ１７１を標的としかつ／またはＣＤ１７１に結合するリガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチド；
ｂ）前記リガンドに特異的であり、かつ特定の長さを有する最適化されたポリペプチドスペーサーをコードするポリヌクレオチド；
ｃ）膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチド；および
ｄ）細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチド
を含む。
いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、前記リガンドに応答したＴ細胞の増殖および／またはサイトカインの産生が対照のキメラ受容体よりも増強するように最適化されている。いくつかの実施形態においては、前記リガンド結合ドメインは抗体フラグメントである。いくつかの実施形態においては、前記リガンド結合ドメインは一本鎖可変フラグメントである。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、１５アミノ酸長以下（かつ１アミノ酸長以上または２アミノ酸長以上）である。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、アミノ酸配列X1PPX2Pを含む。いくつかの実施形態においては、前記スペーサー領域は、ヒト抗体のヒンジ領域の一部を含む。いくつかの実施形態においては、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ−４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、ＬＦＡ−１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３およびこれらの組み合わせからなる群から選択される共刺激ドメインと、ＣＤ３ζ全体またはその一部とを含む。いくつかの実施形態においては、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζの一部と４−１ＢＢの一部とを含む。いくつかの実施形態においては、前記キメラ受容体の核酸配列は、マーカー配列をコードする核酸をさらに含む。いくつかの実施形態においては、前記方法は、前記キメラ受容体をコードする選択された前記核酸を宿主細胞に導入することをさらに含む。
【０２９４】
いくつかの実施形態においては、インビトロにおいて宿主細胞を製造する方法が提供される。
いくつかの実施形態においては、該方法は、
ａ）ＣＤ４５ＲＡ−、ＣＤ４５ＲＯ＋および／またはＣＤ６２Ｌ＋の表現型を有するリンパ球集団にキメラ受容体核酸配列または発現ベクターを導入すること；ならびに
ｂ）抗ＣＤ３および／または抗ＣＤ２８と少なくとも１つの恒常性サイトカインとの存在下において、細胞移入に使用するのに十分な数に達するまで前記リンパ球を培養すること
を含む。
いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は発現ベクターを含む。いくつかの実施形態においては、単離されたキメラ受容体核酸配列を含む前記発現ベクターが提供される。
いくつかの実施形態では、前記キメラ受容体の核酸配列は、）ＣＤ１７１を標的としかつ／またはＣＤ１７１に結合するリガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチド；
ｂ）前記リガンドに特異的であり、かつ特定の長さを有する最適化されたポリペプチドスペーサーをコードするポリヌクレオチド；
ｃ）膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチド；および
ｄ）細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチド
を含む。
いくつかの実施形態においては、前記リガンド結合ドメインは抗体フラグメントである。いくつかの実施形態においては、前記リガンド結合ドメインは一本鎖可変フラグメントである。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、前記リガンドに応答したＴ細胞の増殖および／またはサイトカインの産生が対照のキメラ受容体よりも増強するように最適化されている。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、１５アミノ酸長以下（かつ１アミノ酸長以上または２アミノ酸長以上）である。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、アミノ酸配列X1PPX2Pを含む。いくつかの実施形態においては、前記スペーサー領域は、ヒト抗体のヒンジ領域の一部を含む。いくつかの実施形態においては、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ−４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、ＬＦＡ−１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３およびこれらの組み合わせからなる群から選択される共刺激ドメインと、ＣＤ３ζ全体またはその一部とを含む。いくつかの実施形態においては、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζの一部と４−１ＢＢの一部とを含む。いくつかの実施形態においては、前記キメラ受容体の核酸配列は、マーカー配列をコードする核酸をさらに含む。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞およびバルクＣＤ８＋Ｔ細胞からなる群から選択される細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔリンパ球である。いくつかの実施形態においては、前記ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球は、セントラルメモリーＴ細胞であり、該セントラルメモリーＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋および／またはＣＤ８＋である。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞およびバルクＣＤ４＋Ｔ細胞からなる群から選択されるＣＤ４＋Ｔヘルパーリンパ球である。いくつかの実施形態においては、前記ＣＤ４＋ヘルパーリンパ球は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞であり、該ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋および／もしくはＣＤ４＋であり、かつ／またはＣＤ４５ＲＯ−である。
いくつかの実施形態では、前記キメラ受容体の核酸配列は、
ａ）ＣＤ１７１を標的としかつ／またはＣＤ１７１に結合するリガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチド；
ｂ）前記リガンドに特異的であり、かつ特定の長さを有する最適化されたポリペプチドスペーサーをコードするポリヌクレオチド；
ｃ）膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチド；および
ｄ）細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチド
を含む。
いくつかの実施形態においては、前記リガンド結合ドメインは抗体フラグメントである。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、前記リガンドに応答したＴ細胞の増殖および／またはサイトカインの産生が対照のキメラ受容体よりも増強するように最適化されている。いくつかの実施形態においては、前記リガンド結合ドメインは一本鎖可変フラグメントである。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、１５アミノ酸長以下（かつ１アミノ酸長以上または２アミノ酸長以上）である。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、アミノ酸配列X1PPX2Pを含む。いくつかの実施形態においては、前記スペーサー領域は、ヒト抗体のヒンジ領域の一部を含む。いくつかの実施形態においては、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ−４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、ＬＦＡ−１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３およびこれらの組み合わせからなる群から選択される共刺激ドメインと、ＣＤ３ζ全体またはその一部とを含む。いくつかの実施形態においては、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζの一部と４−１ＢＢの一部とを含む。いくつかの実施形態においては、前記キメラ受容体の核酸配列は、マーカー配列をコードする核酸をさらに含む。いくつかの実施形態においては、前記発現ベクターは、単離されたキメラ受容体核酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、前記キメラ受容体の核酸配列は、
ａ）ＣＤ１７１を標的としかつ／またはＣＤ１７１に結合するリガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチド；
ｂ）前記リガンドに特異的であり、かつ特定の長さを有する最適化されたポリペプチドスペーサーをコードするポリヌクレオチド；
ｃ）膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチド；および
ｄ）細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチド
を含む。
いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、前記リガンドに応答したＴ細胞の増殖および／またはサイトカインの産生が対照のキメラ受容体よりも増強するように最適化されている。いくつかの実施形態においては、前記リガンド結合ドメインは抗体フラグメントである。いくつかの実施形態においては、前記リガンド結合ドメインは一本鎖可変フラグメントである。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは１５アミノ酸長以下である。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、アミノ酸配列X1PPX2Pを含む。いくつかの実施形態においては、前記スペーサー領域は、ヒト抗体のヒンジ領域の一部を含む。いくつかの実施形態においては、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ−４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、ＬＦＡ−１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３およびこれらの組み合わせからなる群から選択される共刺激ドメインと、ＣＤ３ζ全体またはその一部とを含む。いくつかの実施形態においては、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζの一部と４−１ＢＢの一部とを含む。いくつかの実施形態においては、前記キメラ受容体の核酸配列は、マーカー配列をコードする核酸をさらに含む。いくつかの実施形態においては、前記リンパ球はＣＤ８＋またはＣＤ４＋である。
【０２９５】
いくつかの実施形態においては、ＣＤ１７１を発現するがんまたは固形腫瘍の治療における、宿主細胞または組成物の使用が提供される。いくつかの実施形態においては、前記組成物は、薬学的に許容される添加剤中に宿主細胞を含む。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は発現ベクターを含む。いくつかの実施形態においては、単離されたキメラ受容体核酸配列を含む前記発現ベクターが提供される。
いくつかの実施形態では、前記キメラ受容体の核酸配列は、
ａ）ＣＤ１７１を標的としかつ／またはＣＤ１７１に結合するリガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチド；
ｂ）前記リガンドに特異的であり、かつ特定の長さを有する最適化されたポリペプチドスペーサーをコードするポリヌクレオチド；
ｃ）膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチド；および
ｄ）細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチド
を含む。
いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、前記リガンドに応答したＴ細胞の増殖および／またはサイトカインの産生が対照のキメラ受容体よりも増強するように最適化されている。いくつかの実施形態においては、前記リガンド結合ドメインは抗体フラグメントである。いくつかの実施形態においては、前記リガンド結合ドメインは一本鎖可変フラグメントである。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、１５アミノ酸長以下（かつ１アミノ酸長以上または２アミノ酸長以上）である。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、アミノ酸配列X1PPX2Pを含む。いくつかの実施形態においては、前記スペーサー領域は、ヒト抗体のヒンジ領域の一部を含む。いくつかの実施形態においては、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ−４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、ＬＦＡ−１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３およびこれらの組み合わせからなる群から選択される共刺激ドメインと、ＣＤ３ζ全体またはその一部とを含む。いくつかの実施形態においては、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζの一部と４−１ＢＢの一部とを含む。いくつかの実施形態においては、前記キメラ受容体の核酸配列は、マーカー配列をコードする核酸をさらに含む。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞およびバルクＣＤ８＋Ｔ細胞からなる群から選択される細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔリンパ球である。いくつかの実施形態においては、前記ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球は、セントラルメモリーＴ細胞であり、該セントラルメモリーＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋および／またはＣＤ８＋である。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞およびバルクＣＤ４＋Ｔ細胞からなる群から選択されるＣＤ４＋Ｔヘルパーリンパ球である。いくつかの実施形態においては、前記ＣＤ４＋ヘルパーリンパ球は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞であり、該ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋および／もしくはＣＤ４＋であり、かつ／またはＣＤ４５ＲＯ−である。いくつかの実施形態においては、前記組成物は宿主細胞を含み、該宿主細胞は、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞およびバルクＣＤ８＋Ｔ細胞からなる群から選択されるＣＤ８＋Ｔ細胞傷害性リンパ球、またはＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋および／もしくはＣＤ８＋のセントラルメモリーＴ細胞であるＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球であり、前記組成物は別の宿主細胞をさらに含み、該宿主細胞は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞およびバルクＣＤ４＋Ｔ細胞からなる群から選択されるＣＤ４＋Ｔヘルパーリンパ球、またはＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４＋、および／もしくはＣＤ４５ＲＯ−のナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞であるＣＤ４＋ヘルパーリンパ球である。いくつかの実施形態においては、���記宿主細胞は発現ベクターを含む。いくつかの実施形態においては、単離されたキメラ受容体核酸配列を含む前記発現ベクターが提供される。
いくつかの実施形態では、前記キメラ受容体の核酸配列は、
ａ）ＣＤ１７１を標的としかつ／またはＣＤ１７１に結合するリガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチド；
ｂ）前記リガンドに特異的であり、かつ特定の長さを有する最適化されたポリペプチドスペーサーをコードするポリヌクレオチド；
ｃ）膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチド；および
ｄ）細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチド
を含む。
いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、前記リガンドに応答したＴ細胞の増殖および／またはサイトカインの産生が対照のキメラ受容体よりも増強するように最適化されている。いくつかの実施形態においては、前記リガンド結合ドメインは抗体フラグメントである。いくつかの実施形態においては、前記リガンド結合ドメインは一本鎖可変フラグメントである。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、１５アミノ酸長以下（かつ１アミノ酸長以上または２アミノ酸長以上）である。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、アミノ酸配列X1PPX2Pを含む。いくつかの実施形態においては、前記スペーサー領域は、ヒト抗体のヒンジ領域の一部を含む。いくつかの実施形態においては、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ−４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、ＬＦＡ−１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３およびこれらの組み合わせからなる群から選択される共刺激ドメインと、ＣＤ３ζ全体またはその一部とを含む。いくつかの実施形態においては、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζの一部と４−１ＢＢの一部とを含む。いくつかの実施形態においては、前記キメラ受容体の核酸配列は、マーカー配列をコードする核酸をさらに含む。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞およびバルクＣＤ８＋Ｔ細胞からなる群から選択される細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔリンパ球である。いくつかの実施形態においては、前記ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球は、セントラルメモリーＴ細胞であり、該セントラルメモリーＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋および／またはＣＤ８＋である。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞およびバルクＣＤ４＋Ｔ細胞からなる群から選択されるＣＤ４＋Ｔヘルパーリンパ球である。いくつかの実施形態においては、前記ＣＤ４＋ヘルパーリンパ球は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞であり、該ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋および／もしくはＣＤ４＋であり、かつ／またはＣＤ４５ＲＯ−である。いくつかの実施形態においては、前記がんは神経芽腫である。いくつかの実施形態においては、前記固形腫瘍は、大腸がん、腎臓がん、膵臓がんおよび卵巣がんからなる群から選択される。
【０２９６】
いくつかの実施形態においては、がんまたは腫瘍を有する対象において細胞免疫療法を行う方法が提供される。いくつかの実施形態では、前記方法は組成物または宿主細胞を前記対象に投与することを含む。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は発現ベクターを含む。いくつかの実施形態においては、単離されたキメラ受容体核酸配列を含む前記発現ベクターが提供される。
いくつかの実施形態では、前記キメラ受容体の核酸配列は、
ａ）ＣＤ１７１を標的としかつ／またはＣＤ１７１に結合するリガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチド；
ｂ）前記リガンドに特異的であり、かつ特定の長さを有する最適化されたポリペプチドスペーサーをコードするポリヌクレオチド；
ｃ）膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチド；および
ｄ）細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチド
を含む。
いくつかの実施形態においては、前記リガンド結合ドメインは抗体フラグメントである。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、前記リガンドに応答したＴ細胞の増殖および／またはサイトカインの産生が対照のキメラ受容体よりも増強するように最適化されている。いくつかの実施形態においては、前記リガンド結合ドメインは一本鎖可変フラグメントである。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、１５アミノ酸長以下（かつ１アミノ酸長以上または２アミノ酸長以上）である。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、アミノ酸配列X1PPX2Pを含む。いくつかの実施形態においては、前記スペーサー領域は、ヒト抗体のヒンジ領域の一部を含む。いくつかの実施形態においては、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ−４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、ＬＦＡ−１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３およびこれらの組み合わせからなる群から選択される共刺激ドメインと、ＣＤ３ζ全体またはその一部とを含む。いくつかの実施形態においては、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζの一部と４−１ＢＢの一部とを含む。いくつかの実施形態においては、前記キメラ受容体の核酸配列は、マーカー配列をコードする核酸をさらに含む。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞およびバルクＣＤ８＋Ｔ細胞からなる群から選択される細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔリンパ球である。いくつかの実施形態においては、前記ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球は、セントラルメモリーＴ細胞であり、該セントラルメモリーＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋および／またはＣＤ８＋である。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞およびバルクＣＤ４＋Ｔ細胞からなる群から選択されるＣＤ４＋Ｔヘルパーリンパ球である。いくつかの実施形態においては、前記ＣＤ４＋ヘルパーリンパ球は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞であり、該ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋および／もしくはＣＤ４＋であり、かつ／またはＣＤ４５ＲＯ−である。いくつかの実施形態においては、前記組成物は、薬学的に許容される添加剤中に宿主細胞を含む。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は発現ベクターを含む。いくつかの実施形態においては、単離されたキメラ受容体核酸配列を含む前記発現ベクターが提供される。
いくつかの実施形態では、前記キメラ受容体の核酸配列は、
ａ）ＣＤ１７１を標的としかつ／またはＣＤ１７１に結合するリガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチド；
ｂ）前記リガンドに特異的であり、かつ特定の長さを有する最適化されたポリペプチドスペーサーをコードするポリヌクレオチド；
ｃ）膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチド；および
ｄ）細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチド
を含む。
いくつかの実施形態においては、前記リガンド結合ドメインは抗体フラグメントである。いくつかの実施形態においては、前記リガンド結合ドメインは一本鎖可変フラグメントである。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、１５アミノ酸長以下（かつ１アミノ酸長以上または２アミノ酸長以上）である。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーは、アミノ酸配列X1PPX2Pを含む。いくつかの実施形態においては、前記スペーサー領域は、ヒト抗体のヒンジ領域の一部を含む。いくつかの実施形態においては、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ−４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、ＬＦＡ−１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３およびこれらの組み合わせからなる群から選択される共刺激ドメインと、ＣＤ３ζ全体またはその一部とを含む。いくつかの実施形態においては、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζの一部と４−１ＢＢの一部とを含む。いくつかの実施形態においては、前記キメラ受容体の核酸配列は、マーカー配列をコードする核酸をさらに含む。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞およびバルクＣＤ８＋Ｔ細胞からなる群から選択される細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔリンパ球である。いくつかの実施形態においては、前記ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球は、セントラルメモリーＴ細胞であり、該セントラルメモリーＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋および／またはＣＤ８＋である。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞およびバルクＣＤ４＋Ｔ細胞からなる群から選択されるＣＤ４＋Ｔヘルパーリンパ球である。いくつかの実施形態においては、前記ＣＤ４＋ヘルパーリンパ球は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞であり、該ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋および／もしくはＣＤ４＋であり、かつ／またはＣＤ４５ＲＯ−である。いくつかの実施形態においては、前記組成物は宿主細胞を含み、該宿主細胞は、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞およびバルクＣＤ８＋Ｔ細胞からなる群から選択されるＣＤ８＋Ｔ細胞傷害性リンパ球、またはＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋および／もしくはＣＤ８＋のセントラルメモリーＴ細胞であるＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球であり、前記組成物は別の宿主細胞をさらに含み、該宿主細胞は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞およびバルクＣＤ４＋Ｔ細胞からなる群から選択されるＣＤ４＋Ｔヘルパーリンパ球、またはＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４＋、および／もしくはＣＤ４５ＲＯ−のナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞であるＣＤ４＋ヘルパーリンパ球である。いくつかの実施形態においては、前記がんは神経芽腫である。いくつかの実施形態においては、前記固形腫瘍は、大腸がん、腎臓がん、膵臓がんおよび卵巣がんからなる群から選択される。
表 1 典型的な配列
2020195380.tif 000002
2020195380.tif 000003
2020195380.tif 000004
表 2
典型的な配列 Uniprot P0861 IgG4-Fc (配列番号13)
2020195380.tif 000005
表 3
典型的な配列/Uniprot P10747 CD28(配列番号14)
2020195380.tif 000006
表 4
典型的な配列/Uniprot Q07011  4-1BB(配列番号15)
2020195380.tif 000007
表 5
典型的な配列/Uniprot P20963ヒトCD3ζアイソフォーム3 (配列番号16)
2020195380.tif 000008
表 6 典型的なヒンジ領域配列
ヒト IgG1  EPKSCDKTHTCPPCP (配列番号17)
ヒト IgG2 ERKCCVECPPCP (配列番号18)
ヒト IgG3 ELKTPLGDTHTCPRCP (EPKSCDTPPPCPRCP)3  (配列番号19)
ヒト IgG4 ESKYGPPCPSCP (配列番号20)
改変ヒト IgG4  ESKYGPPCPPCP  (配列番号21)
改変ヒト IgG4 YGPPCPPCP (配列番号51)
改変ヒト IgG4 KYGPPCPPCP (配列番号52)
改変ヒト IgG4 EVVKYGPPCPPCP (配列番号53)
表 7
中程度の長さのスペーサー IgG4ヒンジ-CH3 (配列番号 37)
2020195380.tif 000009
長いスペーサー IgG4ヒンジ-CH2-CH3 (配列番号 58)
2020195380.tif 000010
表 8
短いスペーサー (配列番号 21)
ヒンジスペーサー
ESKYGPPCPPCP
中程度の長さのスペーサー (配列番号 59)
ヒンジスペーサー
2020195380.tif 000011
【図１】
2020195380.tif 000012
【図２−１】
2020195380.tif 000013
【図２−２】
2020195380.tif 000014
【図２−３】
2020195380.tif 000015
【図２−４】
2020195380.tif 000016
【図２−５】
2020195380.tif 000017
【図２−６】
2020195380.tif 000018
【図２−７】
2020195380.tif 000019
【図２−８】
2020195380.tif 000020
【図２−９】
2020195380.tif 000021
【図３−１】
2020195380.tif 000022
【図３−２】
2020195380.tif 000023
【図４−１】
2020195380.tif 000024
【図４−２】
2020195380.tif 000025
【図４−３】
2020195380.tif 000026
【図４−４】
2020195380.tif 000027
【図５−１】
2020195380.tif 000028
【図５−２】
2020195380.tif 000029
【図５−３】
2020195380.tif 000030
【図５−４】
2020195380.tif 000031
【図５−５】
2020195380.tif 000032
【図５−６】
2020195380.tif 000033
【図５−７】
2020195380.tif 000034
【図５−８】
2020195380.tif 000035
【図５−９】
2020195380.tif 000036
【図６】
2020195380.tif 000037
【図７−１】
2020195380.tif 000038
【図７−２】
2020195380.tif 000039
【図７−３】
2020195380.tif 000040
【図７−４】
2020195380.tif 000041
【図７−５】
2020195380.tif 000042
【図７−６】
2020195380.tif 000043
【図７−７】
2020195380.tif 000044
【図７−８】
2020195380.tif 000045
【図７−９】
2020195380.tif 000046
【図８】
2020195380.tif 000047
【図９−１】
2020195380.tif 000048
【図９−２】
2020195380.tif 000049
【図９−３】
2020195380.tif 000050
【図９−４】
2020195380.tif 000051
【図９−５】
2020195380.tif 000052
【図９−６】
2020195380.tif 000053
【図９−７】
2020195380.tif 000054
【図９−８】
2020195380.tif 000055
【図１０】
2020195380.tif 000056
【図１１−１】
2020195380.tif 000057
【図１１−２】
2020195380.tif 000058
【図１１−３】
2020195380.tif 000059
【図１１−４】
2020195380.tif 000060
【図１１−５】
2020195380.tif 000061
【図１１−６】
2020195380.tif 000062
【図１１−７】
2020195380.tif 000063
【図１１−８】
2020195380.tif 000064
【図１２】
2020195380.tif 000065
【図１３−１】
2020195380.tif 000066
【図１３−２】
2020195380.tif 000067
【図１３−３】
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【図１３−４】
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【図１３−５】
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【図１３−６】
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【図１３−７】
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【図１３−８】
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【図１３−９】
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【図１３−１０】
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【図１３−１１】
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【図１３−１２】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１４−３】
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【図１４−４】
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【図１４−５】
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【図１４−６】
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【図１４−７】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１５−３】
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【図１５−４】
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【図１５−５】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１６−３】
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【図１６−４】
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【図１６−５】
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【図１６−６】
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【図１６−７】
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【図１６−８】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
2020195380.tif 000099
【図１７−３】
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【図１７−４】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１８−３】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
2020195380.tif 000106
【図１９−３】
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【図１９−４】
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【図１９−５】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２０−３】
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【図２１】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年7月16日(2020.7.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
キメラ受容体をコードする核酸であって、
ａ）ＣＤ１７１と結合または相互作用するリガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチド；
ｂ）配列番号２１または配列番号５９に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む１１９アミノ酸長以下のポリペプチドスペーサーをコードするポリヌクレオチド；
ｃ）膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチド；および
ｄ）細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチド
を含み、該キメラ受容体は、１１９アミノ酸長を超えるスペーサーを含む抗ＣＤ１７１キメラ受容体と比較して、神経芽細胞腫を有する対象の生存率および神経芽細胞腫の退行を高めるインビボ活性を有することを特徴とする核酸。
【請求項２】
前記スペーサーが配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
前記スペーサーが配列番号５９に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載の核酸。
【請求項４】
前記細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ−４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、ＬＦＡ−１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３およびこれらの組み合わせからなる群から選択される共刺激ドメインと、ＣＤ３ζの全体またはその一部とを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸によりコードされるキメラ受容体ポリペプチド。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸を含む宿主細胞であって、
ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞およびバルクＣＤ８＋Ｔ細胞からなる群から選択されるＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球、またはナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞およびバルクＣＤ４＋Ｔ細胞からなる群から選択されるＣＤ４＋ヘルパーＴリンパ球である、宿主細胞。
【請求項７】
前記細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔリンパ球がＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２ＬおよびＣＤ８陽性のセントラルメモリーＴ細胞である、請求項６に記載の宿主細胞。
【請求項８】
前記ＣＤ４＋ヘルパーＴリンパ球がＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ４陽性、ＣＤ４５ＲＯ陰性のナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞である、請求項６に記載の宿主細胞。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸を含み、Ｔ細胞前駆細胞または造血幹細胞である宿主細胞。
【請求項１０】
ＣＤ１７１を発現しているがんの治療または抑制において使用するための、請求項５〜９のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項１１】
前記がんが、乳がん、脳がん、大腸がん、腎臓がん、膵臓がん、卵巣がんおよび神経芽腫からなる群から選択される、請求項１０に記載の宿主細胞。
【請求項１２】
前記がんが脳がんである、請求項１１に記載の宿主細胞。
【請求項１３】
前記がんが神経芽腫である、請求項１１に記載の宿主細胞。
【請求項１４】
がんを有する対象の細胞免疫療法において使用するための、請求項６〜１０のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項１５】
前記がんが、乳がん、脳がん、大腸がん、腎臓がん、膵臓がん、卵巣がんおよび神経芽腫からなる群から選択される、請求項１４に記載の宿主細胞。
【請求項１６】
前記がんが脳がんである、請求項１５に記載の宿主細胞。
【請求項１７】
前記がんが神経芽腫である、請求項１５に記載の宿主細胞。
【請求項１８】
請求項６〜１７のいずれか一項に記載の宿主細胞と薬学的に許容される添加剤を含む医薬組成物。
【請求項１９】
請求項６〜１７のいずれか一項に記載の宿主細胞を製造する方法であって、
ａ）長さの異なるキメラ受容体をコードする複数の核酸を含むライブラリーを提供すること；
ｂ）単離された個別のＴリンパ球集団に前記複数の核酸のそれぞれを導入し、各Ｔリンパ球集団をインビトロで増殖させること；
ｃ）腫瘍を有する動物モデルに各遺伝子改変Ｔリンパ球集団を投与し、各遺伝子改変Ｔリンパ球集団が抗腫瘍応答を誘導するかどうかを判定すること；および
ｄ）抗腫瘍応答を誘導するキメラ受容体をコードする核酸を選択すること
を含む方法。
【請求項２０】
請求項６〜１７のいずれか一項に記載の宿主細胞を製造する方法であって、
ａ）ＣＤ４５ＲＡ−、ＣＤ４５ＲＯ＋およびＣＤ６２Ｌ＋の表現型を有するリンパ球集団に請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸を導入すること；ならびに
ｂ）抗ＣＤ３および／または抗ＣＤ２８と少なくとも１つの恒常性サイトカインとの存在下において、移入細胞としての使用に十分な数に達するまで培養することを含む方法。