(57)【要約】【課題】  分子量が増大した天然ゴムの製造が可能な天然ゴムの製造方法、分子量が増大した天然ゴムの産生が可能な形質転換植物を提供する。【解決手段】  ゴム産生植物Ａ由来のシス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を、ゴム産生植物Ｂに導入し、形質転換植物Ｃを調製する工程と、形質転換植物Ｃにより天然ゴムを産生する工程とを含み、ゴム産生植物Ａが産生する天然ゴムの分子量が、前記遺伝子が導入される前のゴム産生植物Ｂが産生する天然ゴムの分子量に比べて大きいことを特徴とする天然ゴムの製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゴム産生植物Ａ由来のシス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を、ゴム産生植物Ｂに導入し、形質転換植物Ｃを調製する工程と、
形質転換植物Ｃにより天然ゴムを産生する工程とを含み、
ゴム産生植物Ａが産生する天然ゴムの分子量が、前記遺伝子が導入される前のゴム産生植物Ｂが産生する天然ゴムの分子量に比べて大きいことを特徴とする
天然ゴムの製造方法。
【請求項２】
前記シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子が、Ｈｅｖｅａ属、Ｆｉｃｕｓ属、Ｔａｒａｘａｃｕｍ属、又はＰａｒｔｈｅｎｉｕｍ属に属する植物由来のシス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子である請求項１記載の天然ゴムの製造方法。
【請求項３】
前記シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子が、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、ロシアンタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ  ｋｏｋｓａｇｈｙｚ）、又はグアユール（Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ  ａｒｇｅｎｔａｔｕｍ）由来のシス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子である請求項１記載の天然ゴムの製造方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の天然ゴムの製造方法により得られた天然ゴムと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、前記混練物から生タイヤを成形する生タイヤ成形工程、及び前記生タイヤを加硫する加硫工程を含む空気入りタイヤの製造方法。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれかに記載の天然ゴムの製造方法により得られた天然ゴムと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、前記混練物から生ゴム製品を成形する生ゴム製品成形工程、及び前記生ゴム製品を加硫する加硫工程を含むゴム製品の製造方法。
【請求項６】
ゴム産生植物Ａ由来のシス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子が、ゴム産生植物Ｂに導入され、
ゴム産生植物Ａが産生する天然ゴムの分子量が、前記遺伝子が導入される前のゴム産生植物Ｂが産生する天然ゴムの分子量に比べて大きいことを特徴とする形質転換植物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、天然ゴムの製造方法、形質転換植物、空気入りタイヤの製造方法、及びゴム製品の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、工業用ゴム製品に用いられている天然ゴムは、トウダイグサ科のパラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）や桑科植物のインドゴムノキ（Ｆｉｃｕｓ  ｅｌａｓｔｉｃａ）などのゴム産生植物を栽培し、その植物体が有する乳管細胞で天然ゴムを生合成させ、該天然ゴムを植物から手作業により採取することにより得られる。
【０００３】
現在、工業用ゴム製品に用いられている天然ゴムは、パラゴムノキをほぼ唯一の採取源としている。パラゴムノキは東南アジアや南米などの限られた地域でのみ生育可能な植物である。更に、パラゴムノキは、植樹からゴムの採取が可能な成木になるまでに７年程度を要し、また、天然ゴムを採取できる期間は２０〜３０年に限られる。今後、開発途上国を中心に天然ゴムの需要の増大が見込まれているが、上述の理由によりパラゴムノキによる天然ゴムの大幅な増産は困難である。そのため、天然ゴム資源の枯渇が懸念されており、パラゴムノキの成木以外の安定的な天然ゴムの供給源やパラゴムノキにおける天然ゴムの生産効率の改善が望まれている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明者らが鋭意検討した結果、パラゴムノキ以外のゴム産生植物が産生する天然ゴムは、パラゴムノキが産生する天然ゴムに比べて物性が劣ることが明らかとなった。そして、この原因について鋭意検討した結果、ゴム産生植物の種類によって産生できる天然ゴムの分子量がおおよそ決まっていること、更には、パラゴムノキ以外のゴム産生植物が産生する天然ゴムが、パラゴムノキが産生する天然ゴムに比べて分子量が小さいため、パラゴムノキ以外のゴム産生植物が産生する天然ゴムは、パラゴムノキが産生する天然ゴムに比べて物性が劣ることが判明した。すなわち、本発明者らの検討の結果、パラゴムノキ以外のゴム産生植物を安定的な天然ゴムの供給源として使用するためには、又は、より良好な物性を有する天然ゴムを得るためには、ゴム産生植物により産生される天然ゴムの分子量を増大させる必要があることが明らかとなった。
本発明は、本発明者らが見出した前記課題を解決し、分子量が増大した天然ゴムの製造が可能な天然ゴムの製造方法、分子量が増大した天然ゴムの産生が可能な形質転換植物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
天然ゴムは、イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）を基本単位とし、シス−１，４−ポリイソプレン構造をとっており、天然ゴムの生合成にはその構造からシス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）が関係していると考えられている。
本発明者らが、鋭意検討した結果、ＣＰＴ遺伝子の転写量を増減させても産生される天然ゴムの分子量に変動は見られなかった。一方、産生する天然ゴムの分子量が大きいゴム産生植物由来のＣＰＴ遺伝子を、産生する天然ゴムの分子量が小さいゴム産生植物に導入することにより、当該形質転換植物が産生する天然ゴムの分子量が増大することを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、ゴム産生植物Ａ由来のシス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を、ゴム産生植物Ｂに導入し、形質転換植物Ｃを調製する工程と、
形質転換植物Ｃにより天然ゴムを産生する工程とを含み、
ゴム産生植物Ａが産生する天然ゴムの分子量が、上記遺伝子が導入される前のゴム産生植物Ｂが産生する天然ゴムの分子量に比べて大きいことを特徴とする
天然ゴムの製造方法に関する。以降、この発明を本発明の第１の発明とし、第１の本発明とも称する。
【０００６】
上記シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子が、Ｈｅｖｅａ属、Ｆｉｃｕｓ属、Ｔａｒａｘａｃｕｍ属、又はＰａｒｔｈｅｎｉｕｍ属に属する植物由来のシス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子であることが好ましい。
【０００７】
上記シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子が、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、ロシアンタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ  ｋｏｋｓａｇｈｙｚ）、又はグアユール（Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ  ａｒｇｅｎｔａｔｕｍ）由来のシス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子であることが好ましい。
【０００８】
本発明はまた、上記天然ゴムの製造方法により得られた天然ゴムと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、上記混練物から生タイヤを成形する生タイヤ成形工程、及び上記生タイヤを加硫する加硫工程を含む空気入りタイヤの製造方法に関する。
【０００９】
本発明はまた、上記天然ゴムの製造方法により得られた天然ゴムと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、上記混練物から生ゴム製品を成形する生ゴム製品成形工程、及び上記生ゴム製品を加硫する加硫工程を含むゴム製品の製造方法に関する。
【００１０】
本発明はまた、ゴム産生植物Ａ由来のシス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子が、ゴム産生植物Ｂに導入され、
ゴム産生植物Ａが産生する天然ゴムの分子量が、上記遺伝子が導入される前のゴム産生植物Ｂが産生する天然ゴムの分子量に比べて大きいことを特徴とする形質転換植物に関する。以降、この発明を本発明の第２の発明とし、第２の本発明とも称する。
【発明の効果】
【００１１】
第１の本発明によれば、ゴム産生植物Ａ由来のシス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を、ゴム産生植物Ｂに導入し、形質転換植物Ｃを調製する工程と、形質転換植物Ｃにより天然ゴムを産生する工程とを含み、ゴム産生植物Ａが産生する天然ゴムの分子量が、上記遺伝子が導入される前のゴム産生植物Ｂが産生する天然ゴムの分子量に比べて大きいことを特徴とする天然ゴムの製造方法であるので、分子量が増大した天然ゴムの製造が可能となる。
【００１２】
第１の本発明の空気入りタイヤの製造方法は、第１の本発明の天然ゴムの製造方法により得られた天然ゴムと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、上記混練物から生タイヤを成形する生タイヤ成形工程、及び上記生タイヤを加硫する加硫工程を含む空気入りタイヤの製造方法であるので、分子量が増大した天然ゴムから空気入りタイヤを製造するため、良好な性能を有する空気入りタイヤを製造することができる。
【００１３】
第１の本発明のゴム製品の製造方法は、第１の本発明の天然ゴムの製造方法により得られた天然ゴムと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、上記混練物から生ゴム製品を成形する生ゴム製品成形工程、及び上記生ゴム製品を加硫する加硫工程を含むゴム製品の製造方法であるので、分子量が増大した天然ゴムからゴム製品を製造するため、良好な性能を有するゴム製品を製造することができる。
【００１４】
第２の本発明の形質転換植物は、ゴム産生植物Ａ由来のシス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子が、ゴム産生植物Ｂに導入され、ゴム産生植物Ａが産生する天然ゴムの分子量が、上記遺伝子が導入される前のゴム産生植物Ｂが産生する天然ゴムの分子量に比べて大きいことを特徴とする形質転換植物であるので、分子量が増大した天然ゴムの産生が可能な形質転換植物を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】天然ゴムの生合成経路の一部を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本明細書においては、第１の本発明と第２の本発明を合わせて本発明ともいう。第１の本発明は、第２の本発明の形質転換植物を用いた天然ゴムの製造方法、空気入りタイヤの製造方法、ゴム製品の製造方法であるため、以下において、第１の本発明を説明することにより、第２の本発明を説明したこととなる。
【００１７】
第１の本発明の天然ゴムの製造方法は、ゴム産生植物Ａ由来のシス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を、ゴム産生植物Ｂに導入し、形質転換植物Ｃを調製する工程と、
形質転換植物Ｃにより天然ゴムを産生する工程とを含み、
ゴム産生植物Ａが産生する天然ゴムの分子量が、上記遺伝子が導入される前のゴム産生植物Ｂが産生する天然ゴムの分子量に比べて大きいことを特徴とする。
第２の本発明の形質転換植物は、ゴム産生植物Ａ由来のシス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子が、ゴム産生植物Ｂに導入され、ゴム産生植物Ａが産生する天然ゴムの分子量が、前記遺伝子が導入される前のゴム産生植物Ｂが産生する天然ゴムの分子量に比べて大きいことを特徴とする。
なお、本明細書において、シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子をＣＰＴ遺伝子とも記載する。
【００１８】
上述の通り、本発明者らは、ＣＰＴ遺伝子の転写量を増減させても産生される天然ゴムの分子量に変動は見られない一方、産生する天然ゴムの分子量が大きいゴム産生植物由来のＣＰＴ遺伝子を、産生する天然ゴムの分子量が小さいゴム産生植物に導入することにより、当該形質転換植物が産生する天然ゴムの分子量が増大することを見出した。すなわち、算出される天然ゴムの分子量はＣＰＴの量ではなく、ＣＰＴの性質に依存する可能性が高い。つまり、産生する天然ゴムの分子量が大きいゴム産生植物由来のＣＰＴは、産生する天然ゴムの分子量が小さいゴム産生植物由来のＣＰＴに比べて、イソプレン鎖を延長させる能力が高いことを見出した。
【００１９】
例えば、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）由来の天然ゴムの重量平均分子量は、Ｊ．Ｒｕｂｂ．Ｒｅｓ．，２（３），１５０−１５９によると、６．８×１０５〜３．０×１０６であり、レタス（Ｌａｃｔｕｃａ  ｓａｔｉｖａ）由来の天然ゴムの重量平均分子量は、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ６７（２００６）２５９０−２５９６によると、１．３×１０６である。ここで、両文献より、パラゴムノキが産出する天然ゴムは、二峰性（高分子量成分と低分子量成分を含む）の分子量分布であるのに対し、レタスの産出する天然ゴムは単峰性の分子量分布で低分子量（ピークトップ１．３×１０６）成分のみであり、パラゴムノキが産出する天然ゴムの重量平均分子量は６．８×１０５〜３．０×１０６であるものの、二峰性（双山）の分子量分布であるため、高分子量側の成分は明らかに、レタスが産出する天然ゴムよりも分子量が大きいことは明らかである。すなわち、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）が産出する天然ゴムの分子量はレタス（Ｌａｃｔｕｃａ  ｓａｔｉｖａ）が産出する天然ゴムの分子量より大きい。そして、本発明者らは、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）由来のＣＰＴ遺伝子を、レタス（Ｌａｃｔｕｃａ  ｓａｔｉｖａ）に導入して形質転換植物（形質転換されたレタス）を調製し、調製した形質転換植物により天然ゴムを産生することにより、形質転換前のレタスが産生する天然ゴムよりも分子量が増大した天然ゴムの製造が可能となることを見出した。これは、産生する天然ゴムの分子量が大きいゴム産生植物由来のＣＰＴは、産生する天然ゴムの分子量が小さいゴム産生植物由来のＣＰＴに比べて、イソプレン鎖を延長させる能力が高いためである。
【００２０】
以上の通り、産生する天然ゴムの分子量が大きいゴム産生植物Ａ由来のＣＰＴ遺伝子を、産生する天然ゴムの分子量がゴム産生植物Ａよりも小さいゴム産生植物Ｂに導入して形質転換植物Ｃを調製し、該形質転換植物Ｃにより天然ゴムを産生することにより、分子量が増大した天然ゴムの製造が可能となる。そして、分子量が増大した天然ゴムは、分子量が増大したことに起因して、良好な性能（例えば、耐摩耗性、引張強度、破壊強度、低発熱性等）を有するため、良好な性能を有するゴム製品（例えば、空気入りタイヤ）を製造することができる。
【００２１】
ここで、本明細書において、ゴム産生植物Ａが産生する天然ゴムの分子量が、前記遺伝子が導入される前のゴム産生植物Ｂが産生する天然ゴムの分子量に比べて大きいとは、ゴム産生植物Ａが産生する天然ゴムの重量平均分子量が、前記遺伝子が導入される前のゴム産生植物Ｂが産生する天然ゴムの重量平均分子量に比べて大きいことを意味するものではなく、ゴム産生植物Ａが産生する天然ゴムのうち最も分子量の大きい成分の分子量が、前記遺伝子が導入される前のゴム産生植物Ｂが産生する天然ゴムのうち最も分子量の大きい成分の分子量に比べて大きいことを意味する。
【００２２】
よって、２種のゴム産生植物のうち、どちらが、それぞれ、ゴム産生植物Ａ、Ｂに該当するかを決定するためには、それぞれのゴム産生植物が産生する天然ゴムのうち最も分子量の大きい成分同士を対比し、より分子量の大きい成分を産出するゴム産生植物をゴム産生植物Ａと決定する。
【００２３】
本発明が適用可能なゴム産生植物としては、特に限定されず、例えば、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）等のＨｅｖｅａ属；ノゲシ（Ｓｏｎｃｈｕｓ  ｏｌｅｒａｃｅｕｓ）、オニノゲシ（Ｓｏｎｃｈｕｓ  ａｓｐｅｒ）、ハチジョウナ（Ｓｏｎｃｈｕｓ  ｂｒａｃｈｙｏｔｕｓ）等のＳｏｎｃｈｕｓ属；セイタカアワダチソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ  ａｌｔｉｓｓｉｍａ）、アキノキリンソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ  ｖｉｒｇａｕｒｅａ  ｓｕｂｓｐ．  ａｓｉａｔｉｃａ）、ミヤマアキノキリンソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ  ｖｉｒｇａｕｒｅａ  ｓｕｂｓｐ．  ｌｅｉｐｃａｒｐａ）、キリガミネアキノキリンソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ  ｖｉｒｇａｕｒｅａ  ｓｕｂｓｐ．  ｌｅｉｐｃａｒｐａ  ｆ．  ｐａｌｕｄｏｓａ）、オオアキノキリンソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ  ｖｉｒｇａｕｒｅａ  ｓｕｂｓｐ．  ｇｉｇａｎｔｅａ）、オオアワダチソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ  ｇｉｇａｎｔｅａ  Ａｉｔ．  ｖａｒ．  ｌｅｉｏｐｈｙｌｌａ  Ｆｅｒｎａｌｄ）等のＳｏｌｉｄａｇｏ属；ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ）、シロタエヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｒｇｏｐｈｙｌｌｕｓ）、ヘリアンサス・アトロルベンス（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｔｒｏｒｕｂｅｎｓ）、ヒメヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｄｅｂｉｌｉｓ）、コヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｄｅｃａｐｅｔａｌｕｓ）、ジャイアントサンフラワー（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｇｉｇａｎｔｅｕｓ）等のＨｅｌｉａｎｔｈｕｓ属；タンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ）、エゾタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ  ｖｅｎｕｓｔｕｍ  Ｈ．Ｋｏｉｄｚ）、シナノタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ  ｈｏｎｄｏｅｎｓｅ  Ｎａｋａｉ）、カントウタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ  ｐｌａｔｙｃａｒｐｕｍ  Ｄａｈｌｓｔ）、カンサイタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）、セイヨウタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ  Ｗｅｂｅｒ）、ロシアンタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ  ｋｏｋｓａｇｈｙｚ）、Ｔａｒａｘａｃｕｍ  ｂｒｅｖｉｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｍ等のＴａｒａｘａｃｕｍ属；イチジク（Ｆｉｃｕｓ  ｃａｒｉｃａ）、インドゴムノキ（Ｆｉｃｕｓ  ｅｌａｓｔｉｃａ）、オオイタビ（Ｆｉｃｕｓ  ｐｕｍｉｌａ  Ｌ．）、イヌビワ（Ｆｉｃｕｓ  ｅｒｅｃｔａ  Ｔｈｕｍｂ．）、ホソバムクイヌビワ（Ｆｉｃｕｓ  ａｍｐｅｌａｓ  Ｂｕｒｍ．ｆ．）、コウトウイヌビワ（Ｆｉｃｕｓ  ｂｅｎｇｕｅｔｅｎｓｉｓ  Ｍｅｒｒ．）、ムクイヌビワ（Ｆｉｃｕｓ  ｉｒｉｓａｎａ  Ｅｌｍ．）、ガジュマル（Ｆｉｃｕｓ  ｍｉｃｒｏｃａｒｐａ  Ｌ．ｆ．）、オオバイヌビワ（Ｆｉｃｕｓ  ｓｅｐｔｉｃａ  Ｂｕｒｍ．ｆ．）、ベンガルボダイジュ（Ｆｉｃｕｓ  ｂｅｎｇｈａｌｅｎｓｉｓ）等のＦｉｃｕｓ属；グアユール（Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ  ａｒｇｅｎｔａｔｕｍ）、アメリカブクリョウサイ（Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ  ｈｙｓｔｅｒｏｐｈｏｒｕｓ）、ブタクサ（Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ  ｈｙｓｔｅｒｏｐｈｏｒｕｓ）等のＰａｒｔｈｅｎｉｕｍ属；レタス（Ｌａｃｔｕｃａ  ｓａｔｉｖａ）、ベンガルボダイジュ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）等が挙げられる。
【００２４】
そして、上記手法に沿って、ゴム産生植物が産生する天然ゴムの分子量を考慮し、ゴム産生植物Ａ、Ｂとして使用するゴム産生植物を決定すればよい。
【００２５】
ゴム産生植物Ａとしては、産生する天然ゴムの分子量が大きいゴム産生植物を使用すればよく、例えば、Ｈｅｖｅａ属、Ｆｉｃｕｓ属、Ｔａｒａｘａｃｕｍ属、又はＰａｒｔｈｅｎｉｕｍ属に属する植物が好ましく、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、ロシアンタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ  ｋｏｋｓａｇｈｙｚ）、又はグアユール（Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ  ａｒｇｅｎｔａｔｕｍ）がより好ましい。
なかでも、ゴム産生植物Ａとしては、Ｈｅｖｅａ属、又はＴａｒａｘａｃｕｍ属に属する植物が好ましく、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）又は、ロシアンタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ  ｋｏｋｓａｇｈｙｚ）がより好ましい。
【００２６】
ゴム産生植物Ｂとしては、産生する天然ゴムの分子量がゴム産生植物Ａよりも小さいゴム産生植物であればよく、特に限定されない。例えば、レタスが挙げられる。
一方、元々産生する天然ゴムの分子量が大きいゴム産生植物をゴム産生植物Ｂとして使用することにより、より分子量が大きい天然ゴムの製造が可能となるという理由から、ゴム産生植物Ｂとしては、Ｈｅｖｅａ属、又はＴａｒａｘａｃｕｍ属に属する植物が好ましく、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）又は、ロシアンタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ  ｋｏｋｓａｇｈｙｚ）がより好ましい。
【００２７】
ここで、ゴム産生植物Ｂとして、Ｔａｒａｘａｃｕｍ属に属する植物（好ましくはロシアンタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ  ｋｏｋｓａｇｈｙｚ））を用いる場合は、ゴム産生植物Ａとして、例えば、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）を使用すればよい。
【００２８】
使用可能なシス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質は、イソプレノイド化合物の鎖長をｃｉｓ型に延長する反応を触媒する酵素であれば特に限定されない。具体的には、例えば、植物では、図１に示すような天然ゴム生合成経路によって天然ゴムが生合成されるが、当該経路のうち、ＣＰＴファミリー蛋白質は、図１中の点線の枠で囲まれた部分の反応を触媒する酵素と考えられている。ＣＰＴファミリー蛋白質の特徴としては、Ｃｉｓ  ＩＰＰＳ  ｄｏｍａｉｎ（ＮＣＢＩ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ｃｄ００４７５）に含まれるアミノ酸配列を有することである。
【００２９】
本明細書において、イソプレノイド化合物とは、イソプレン単位（Ｃ５Ｈ８）を有する化合物を意味する。また、ｃｉｓ型イソプレノイドは、イソプレン単位がシス型に結合したイソプレノイド化合物を有する化合物であり、例えば、ｃｉｓ−ファルネシル二リン酸、ウンデカプレニル二リン酸、天然ゴムなどが挙げられる。
【００３０】
上記ＣＰＴファミリー蛋白質としては、パラゴムノキ由来のＣＰＴ（ＨＲＴ１、ＨＲＴ２、ＣＰＴ３〜５）、レタス由来のＣＰＴ１〜３、Ｔａｒａｘａｃｕｍ  ｂｒｅｖｉｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｍ由来のＣＰＴ１〜３、グアユール（Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ  ａｒｇｅｎｔａｔｕｍ）由来のＣＰＴ１〜４などが挙げられる。
【００３１】
上記ＣＰＴファミリー蛋白質の具体例としては、下記［１］が挙げられる。
［１］配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
【００３２】
また、蛋白質は、元のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含む場合であっても本来持つ機能を有する場合があることが知られている。従って、上記ＣＰＴファミリー蛋白質の具体例としては、下記［２］も挙げられる。
［２］配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含む配列からなり、かつイソプレノイド化合物の鎖長をｃｉｓ型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質
【００３３】
なお、上記ＣＰＴファミリー蛋白質としての機能を維持するためには、配列番号２で表されるアミノ酸配列において、好ましくは１若しくは複数個のアミノ酸、より好ましくは１〜５８個のアミノ酸、更に好ましくは１〜４４個のアミノ酸、更により好ましくは１〜２９個のアミノ酸、特に好ましくは１〜１５個のアミノ酸、最も好ましくは１〜６個のアミノ酸、より最も好ましくは１〜３個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含むアミノ酸配列であることが好ましい。
【００３４】
アミノ酸置換の例としては、保存的置換が好ましく、具体的には以下のカッコ内のグループ内での置換が挙げられる。例えば、（グリシン、アラニン）（バリン、イソロイシン、ロイシン）（アスパラギン酸、グルタミン酸）（アスパラギン、グルタミン）（セリン、トレオニン）（リジン、アルギニン）（フェニルアラニン、チロシン）である。
【００３５】
また、蛋白質は、元のアミノ酸配列と配列同一性の高いアミノ酸配列を有する蛋白質も同様の機能を有する場合があることが知られている。従って、上記ＣＰＴファミリー蛋白質の具体例としては、下記［３］も挙げられる。
［３］配列番号２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつイソプレノイド化合物の鎖長をｃｉｓ型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質
【００３６】
なお、上記ＣＰＴファミリー蛋白質としての機能を維持するためには、配列番号２で表されるアミノ酸配列との配列同一性は、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上である。
【００３７】
本明細書において、アミノ酸配列や塩基配列の配列同一性は、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ［Ｐｒｏ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９０，  ５８７３（１９９３）］やＦＡＳＴＡ［Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，  １８３，  ６３  （１９９０）］を用いて決定することができる。
【００３８】
上記酵素活性を有する蛋白質であることを確認する方法としては、例えば、従来公知の方法を用いることができ、例えば、大腸菌などを用いて、目的の蛋白質をコードする遺伝子を導入した形質転換体により、目的蛋白質を発現させ、目的蛋白質の機能の有無をそれぞれの活性測定法により、活性測定等を行う方法が挙げられる。
【００３９】
上記ＣＰＴファミリー蛋白質をコードする遺伝子（ＣＰＴ遺伝子）は、ＣＰＴファミリー蛋白質をコードし、発現させてＣＰＴファミリー蛋白質を産出できるものであれば特に制限されない。
ＣＰＴ遺伝子としては、上記既知のＣＰＴファミリー蛋白質をコードするＣＰＴ遺伝子であってもよく、未知のＣＰＴファミリー蛋白質をコードするＣＰＴ遺伝子であってもよい。
未知のＣＰＴファミリー蛋白質をコードするＣＰＴ遺伝子を用いる場合は、公知の手法により、例えば、既知のＣＰＴ遺伝子の塩基配列の一部をプローブとして用いて、スクリーニングすることにより、ＣＰＴファミリー蛋白質をコードするＤＮＡを特定し、単離すればよい。ＤＮＡ分子をプローブとして用いて、目的とするＤＮＡ分子を単離する方法については、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ｐｒｅｓｓ（１９８９）等に記載されている。
また、この際に、プローブとして用いる既知のＣＰＴ遺伝子として、ゴム産生植物以外の生物由来のＣＰＴファミリー蛋白質（例えば、シロイヌナズナ由来のＡｔＣＰＴ１〜９、大腸菌由来のウンデカプレニルリン酸合成酵素（ＵＰＰＳ）、マイクロコッカス属菌由来のウンデカプレニル二リン酸合成酵素（ＵＰＳ）、酵母由来のＲＥＲ２、タバコ由来のＤＤＰＳ、マウス由来のＤＤＰＳ、ヒト由来のＨＤＳなど）をコードするＣＰＴ遺伝子を使用してもよい。
【００４０】
シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子としては、産生する天然ゴムの分子量が大きいゴム産生植物由来のＣＰＴ遺伝子を使用すればよく、例えば、Ｈｅｖｅａ属、Ｆｉｃｕｓ属、Ｔａｒａｘａｃｕｍ属、又はＰａｒｔｈｅｎｉｕｍ属に属する植物由来のＣＰＴ遺伝子が好ましく、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、ロシアンタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ  ｋｏｋｓａｇｈｙｚ）、又はグアユール（Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ  ａｒｇｅｎｔａｔｕｍ）由来のＣＰＴ遺伝子がより好ましい。
なかでも、ＣＰＴ遺伝子としては、Ｈｅｖｅａ属、又はＴａｒａｘａｃｕｍ属に属する植物由来のＣＰＴ遺伝子が好ましく、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）又は、ロシアンタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ  ｋｏｋｓａｇｈｙｚ）由来のＣＰＴ遺伝子がより好ましい。
【００４１】
ＣＰＴ遺伝子の具体例としては、下記［１］又は［２］が挙げられる。
［１］配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ
［２］配列番号１で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつイソプレノイド化合物の鎖長をｃｉｓ型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
【００４２】
ここでいう「ハイブリダイズする」とは、特定の塩基配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡの一部にＤＮＡがハイブリダイズする工程である。したがって、該特定の塩基配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡの一部の塩基配列は、ノーザンまたはサザンブロット解析のプローブとして有用であるか、またはＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）解析のオリゴヌクレオチドプライマーとして使用できる長さのＤＮＡであってもよい。プローブとして用いるＤＮＡとしては、少なくとも１００塩基以上、好ましくは２００塩基以上、より好ましくは５００塩基以上のＤＮＡをあげることができるが、少なくとも１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上のＤＮＡであってもよい。
【００４３】
ＤＮＡのハイブリダイゼーション実験の方法はよく知られており、例えばモレキュラー・クローニング第２版、第３版（２００１年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，  ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ（１９９４）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｍａｎｕａｌ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  ｐｒｅｓｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）に記載の他、多数の他の標準的な教科書に従ってハイブリダイゼーションの条件を決定し、実験を行うことができる。
【００４４】
上記のストリンジェントな条件とは、例えばＤＮＡを固定化したフィルターとプローブＤＮＡとを５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％の硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｌの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で４２℃で一晩、インキュベートした後、例えば約６５℃の０．２×ＳＳＣ溶液中で該フィルターを洗浄する条件をあげることができるが、より低いストリンジェント条件を用いることもできる。ストリンジェントな条件の変更は、ホルムアミドの濃度調整（ホルムアミドの濃度を下げるほど低ストリンジェントになる）、塩濃度および温度条件の変更により可能である。低ストリンジェント条件としては、例えば６×ＳＳＣＥ（２０×ＳＳＣＥは、３ｍｏｌ／ｌの塩化ナトリウム、０．２ｍｏｌ／ｌのリン酸二水素ナトリウム、０．０２ｍｏｌ／ｌのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）、０．５％のＳＤＳ、３０％のホルムアミド、１００μｇ／ｌの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で、３７℃で一晩インキュベートした後、５０℃の１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液を用いて洗浄する条件をあげることができる。また、さらに低いストリンジェントな条件としては、上記した低ストリンジェント条件において、高塩濃度（例えば５×ＳＳＣ）の溶液を用いてハイブリダイゼーションを行った後、洗浄する条件をあげることができる。
【００４５】
上記した様々な条件は、ハイブリダイゼーション実験のバックグラウンドを抑えるために用いるブロッキング試薬を添加、または変更することにより設定することもできる。上記したブロッキング試薬の添加は、条件を適合させるために、ハイブリダイゼーション条件の変更を伴ってもよい。
【００４６】
上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、例えばＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡ等のプログラムを用いて、上記パラメータに基づいて計算したときに、配列番号１で表される塩基配列と少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡをあげることができる。
【００４７】
上記したＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡが、所定の酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡであることを確認する方法としては、従来公知の方法を用いることができ、例えば、大腸菌などを用いて、目的の蛋白質をコードする遺伝子を導入した形質転換体により、目的蛋白質を発現させ、目的蛋白質の機能の有無をそれぞれの活性測定法により、活性測定等を行う方法が挙げられる。
【００４８】
また、上記蛋白質のアミノ酸配列及び塩基配列を同定する方法は、従来公知の方法を用いることができ、例えば、生育する植物から、Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出し、必要に応じてｍＲＮＡを精製し、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成する。次に目的蛋白質に相当する既知の蛋白質のアミノ酸配列をもとに、縮重プライマーを設計し、ＲＴ−ＰＣＲを行い、部分的にＤＮＡ断片の増幅を行い、部分的に配列を同定する。次いで、ＲＡＣＥ法などを行い、全長の塩基配列及びアミノ酸配列を同定する。ＲＡＣＥ法（Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄｓ法）とは、ｃＤＮＡの塩基配列が部分的に把握されているときに、その既知領域の塩基配列情報を基にＰＣＲを行って、ｃＤＮＡ末端までの未知領域をクローニングする方法で、ｃＤＮＡライブラリーの作製を経ずに、ＰＣＲ法によって全長のｃＤＮＡをクローニングすることができる方法である。
なお、縮重プライマーは、上記目的蛋白質と共通性の高い配列部位を有する植物由来の配列から作製することが好ましい。
また、上記蛋白質をコードする塩基配列が既知の場合には、その知られている塩基配列から開始コドンを含むプライマー及び終止コドンを含むプライマーを設計し、合成したｃＤＮＡを鋳型にしてＲＴ−ＰＣＲを行うことで全長の塩基配列及びアミノ酸配列を同定することができる。
【００４９】
（形質転換植物調製工程）
次に、ゴム産生植物Ａ由来のシス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を、ゴム産生植物Ｂに導入し、形質転換植物Ｃを調製する工程（形質転換植物調製工程）について説明する。
【００５０】
上記手法に沿って、ゴム産生植物が産生する天然ゴムの分子量を考慮し、ゴム産生植物Ａ、Ｂとして使用するゴム産生植物を決定すれば、当業者であれば、形質転換植物調製工程を実施できる。
ゴム産生植物Ａ、Ｂを決定した後、ゴム産生植物Ａ由来のＣＰＴ遺伝子が未知のＣＰＴ遺伝子である場合は、上記手法に沿って、ＣＰＴファミリー蛋白質をコードするＤＮＡを特定し、ＣＰＴ遺伝子を単離すればよい。
そして、公知の方法に従って、ゴム産生植物Ａ由来のＣＰＴ遺伝子をゴム産生植物Ｂに導入し、形質転換植物Ｃを調製すればよい。
【００５１】
以下において、上記形質転換植物の作製方法について簡単に説明するが、このような形質転換植物は従来公知の方法により作製することができる。
【００５２】
形質転換には、ＣＰＴ遺伝子の塩基配列を含むベクター（ＣＰＴ含有ベクター）を用いればよい。このようなベクターをゴム産生植物に導入して形質転換を行うことにより、当該ベクターに含まれるＣＰＴ遺伝子が発現し、当該植物において生産される天然ゴムの分子量を増大させることが可能となる。すなわち、ＣＰＴ含有ベクターをゴム産生植物に導入することにより、イソプレン鎖を延長させる能力が高いＣＰＴファミリー蛋白質を発現するように形質転換された形質転換植物が得られる。そして、当該形質転換植物では、イソプレン鎖を延長させる能力が高いＣＰＴファミリー蛋白質が発現することにより、当該植物において生産される天然ゴムの分子量を増大させることが可能となる。
【００５３】
上記ＣＰＴ含有ベクターとしては、一般的に植物の形質転換用ベクターとして知られているベクターに、ＣＰＴ遺伝子の塩基配列を従来公知の方法により挿入することで作製することができる。ＣＰＴ含有ベクターを作製するために使用することができるベクターとしては、例えば、ｐＢＩ系のベクターや、ｐＧＡ４８２、ｐＧＡＨ、ｐＢＩＧなどのバイナリーベクター、ｐＬＧＶ２３Ｎｅｏ、ｐＮＣＡＴ、ｐＭＯＮ２００などの中間系プラスミド、ＧＡＴＥＷＡＹカセットを含むｐＨ３５ＧＳなどが挙げられる。
【００５４】
上記ＣＰＴ含有ベクターは、ＣＰＴ遺伝子の塩基配列を含む限り、その他の塩基配列を含んでいてもよい。通常、ベクターにはこれらの塩基配列に加えて、ベクター由来の配列が含まれており、更に、プロモーター配列、制限酵素認識配列、スペーサ―配列、マーカー遺伝子の配列、レポーター遺伝子の配列などが含まれる。
【００５５】
上記ＣＰＴ含有ベクターとしては、プロモーターに、ＣＰＴ遺伝子を機能的に連結させた塩基配列を含むベクターが好ましい。
【００５６】
プロモーターとしては、植物細胞中で機能するものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター、イネアクチン１プロモーター、ノパリン合成酵素遺伝子プロモーター、タバコモザイクウィルスの３５Ｓプロモーター、イネ由来アクチン遺伝子プロモーター、ユビキチンプロモーター等を用いることができる。
【００５７】
プロモーターとしては、乳管特異的に遺伝子を発現させるプロモーター活性を有するプロモーターが好ましい。
乳管特異的に遺伝子を発現させるプロモーター活性を有するプロモーターとしては、Ｒｕｂｂｅｒ  Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ（ＲＥＦ）をコードする遺伝子のプロモーター、Ｓｍａｌｌ  Ｒｕｂｂｅｒ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＳＲＰＰ）をコードする遺伝子のプロモーター、Ｈｅｖｅｉｎ２．１（ＨＥＶ２．１）をコードする遺伝子のプロモーター、ＭＹＣ１  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ（ＭＹＣ１）をコードする遺伝子のプロモーターが挙げられる。
【００５８】
なお、本明細書において、プロモーターが乳管特異的に遺伝子を発現させるプロモーター活性を有するとは、所望の遺伝子を当該プロモーターと機能的に連結させて植物に導入した場合に、当該所望の遺伝子が乳管で特異的に発現されるように遺伝子発現を制御する活性を有することを意味する。ここで、乳管特異的に遺伝子が発現するとは、当該遺伝子が植物中、乳管以外の部位では全く又はほとんど発現せず、当該遺伝子が実質的に乳管でのみ専ら発現しているといえる状態を意味する。また、遺伝子をプロモーターと機能的に連結させるとは、当該プロモーターの制御を受けるように、当該プロモーターの下流に当該遺伝子配列を連結することを意味する。
【００５９】
上記マーカー遺伝子としては、例えば、カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ブレオマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子が挙げられる。また、上記レポーター遺伝子は、植物体中での発現部位を確認するために導入するものであり、例えば、ルシフェラーゼ遺伝子、ＧＵＳ（βグルクロニダーゼ）遺伝子、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）、ＲＦＰ（赤色蛍光タンパク質）等が挙げられる。
【００６０】
ＣＰＴ含有ベクターをゴム産生植物（カルスや、培養細胞、スフェロプラスト、プロトプラストといった植物細胞を含む）に導入する方法としては、植物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を用いる方法（特開昭５９−１４０８８５号公報、特開昭６０−７００８０号公報、国際公開第９４／００９７７号）、エレクトロポレーション法（特開昭６０−２５１８８７号公報）、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法（特許第２６０６８５６号、特許第２５１７８１３号）等を挙げることができる。中でも、アグロバクテリウムを用いる方法（アグロバクテリウム法）を用いてＣＰＴ含有ベクターを植物に導入して形質転換植物（形質転換植物細胞）を作製することが好ましい。
【００６１】
以上の方法等により、ゴム産生植物Ａ由来のシス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子が、ゴム産生植物Ｂに導入された形質転換植物（形質転換植物細胞）が得られる。なお、上記形質転換植物は、上述の方法で得られた形質転換植物細胞のみならず、その子孫又はクローン、さらにそれらを継代させて得られる子孫植物の全てを含む概念である。一旦、ＣＰＴ含有ベクターが導入された形質転換植物細胞が得られれば、該形質転換植物細胞から有性生殖、無性生殖、組織培養、細胞培養、細胞融合等により子孫又はクローンを得ることが可能である。また、該形質転換植物細胞やその子孫あるいはクローンから繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、不定芽、不定胚、カルス、プロトプラスト等）を得て、それらを基に該形質転換植物を量産することも可能である。
【００６２】
形質転換植物細胞から植物体（形質転換植物）を再生する方法としては、例えば、ユーカリでは土肥らの方法（特願平１１−１２７０２５号公報）、イネではＦｕｊｉｍｕｒａらの方法（Ｆｕｊｉｍｕｒａら（１９９５），  Ｐｌａｎｔ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｌｅｔｔ．，ｖｏｌ．２：ｐ７４−）、トウモロコシではＳｈｉｌｌｉｔｏらの方法（Ｓｈｉｌｌｉｔｏら（１９８９），  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．７：ｐ５８１−）、ジャガイモではＶｉｓｓｅｒらの方法（Ｖｉｓｓｅｒら（１９８９），  Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，ｖｏｌ．７８：ｐ５８９−）、シロイヌナズナではＡｋａｍａらの方法（Ａｋａｍａら（１９９２），  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．，ｖｏｌ．１２：ｐ７−）が知られており、当業者であれば、これらを参照して形質転換植物細胞から植物体を再生できる。
【００６３】
再生した植物体において、周知の手法を用いることで、目的の蛋白質遺伝子の発現を確認することが出来る。例えば、目的の蛋白質の発現をウエスタンブロット解析すればよい。
【００６４】
上記形質転換植物から種子を得る方法としては、例えば、形質転換植物を適当な培地において発根させ、その発根体を水分含有の土を入れたポットに移植する。適当な栽培条件下で生育させ、最終的に種子を形成させて、該種子を得る。また、種子から植物体を得る方法としては、例えば、前記のようにして得られた形質転換植物由来の種子を、水分含有の土に播種し、適当な栽培条件下で生育させることにより植物体を得ることができる。
【００６５】
（天然ゴム生産工程）
次に、形質転換植物Ｃにより天然ゴムを産生する工程（天然ゴム生産工程）について説明する。
【００６６】
形質転換植物調製工程により得られた形質転換植物Ｃでは、イソプレン鎖を延長させる能力が高いＣＰＴファミリー蛋白質が発現することにより、当該植物において生産される天然ゴムの分子量を増大させることが可能となっている。そのため、形質転換植物Ｃを生育させることにより、形質転換植物Ｃにより天然ゴムを産生することができ、分子量が増大した天然ゴムの製造が可能となる。
【００６７】
具体的には、形質転換植物調製工程で得られた形質転換植物細胞、形質転換植物細胞から得られたカルス、該カルスから再分化した細胞等を適当な培地で培養したり、形質転換植物細胞から再分化した形質転換植物、該形質転換植物から得られた種子から得られた植物体等を適当な栽培条件下で生育させたりすることにより、形質転換植物Ｃにより天然ゴムを産生することができ、分子量が増大した天然ゴムの製造が可能となる。
【００６８】
細胞内、培地、ラテックス等に含まれる天然ゴムは、必要に応じて、公知の方法により、分離、精製すればよい。
【００６９】
上記形質転換植物から得られる天然ゴムは、例えば、上記形質転換植物からラテックスを採取し、採取したラテックスを以下の固化工程に供することにより得られる。
なお、上記形質転換植物からのラテックスの採取方法は特に制限されず、通常行われる方法を採用することができるが、例えば、植物の幹を傷つけてにじみ出る乳液を回収したり（タッピング）、根など形質転換植物の一部を切断し、切断した部分からにじみ出る乳液を回収したり、切断した組織を粉砕し、有機溶媒を用いて抽出して採取したりすることができる。
【００７０】
＜固化工程＞
上記採取されたラテックスは、固化工程に供される。固化する方法としては、特に限定されず、エタノール、メタノール、アセトン等の天然ゴムを溶解しない溶媒にラテックスを添加する方法やラテックスに酸を添加する方法等が挙げられる。固化工程を行うことにより、ラテックスからゴム（天然ゴム）を固形分として回収できる。得られたゴム（天然ゴム）は、必要に応じて乾燥してから使用すればよい。
【００７１】
なお、本明細書において、天然ゴムは、イソプレン単位（Ｃ５Ｈ８）で構成された重合体の総称である。また、本明細書において、イソプレノイドは、イソプレン単位（Ｃ５Ｈ８）を有する化合物を意味し、天然ゴムをも含む概念である。
【００７２】
（ゴム製品の製造方法）
第１の本発明のゴム製品の製造方法は、上記第１の本発明の天然ゴムの製造方法により得られた天然ゴムと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、上記混練物から生ゴム製品を成形する生ゴム製品成形工程、及び上記生ゴム製品を加硫する加硫工程を含むゴム製品の製造方法である。
【００７３】
ゴム製品としては、ゴム（好ましくは天然ゴム）を使用して製造できるゴム製品であれば特に限定されず、例えば、空気入りタイヤ、ゴムローラ、ゴム防舷材、手袋、医療用ゴムチューブ等が挙げられる。
【００７４】
ゴム製品が空気入りタイヤの場合、すなわち、第１の本発明のゴム製品の製造方法が第１の本発明の空気入りタイヤの製造方法の場合、上記生ゴム製品成形工程は、上記混練物から生タイヤを成形する生タイヤ成形工程に、上記加硫工程は、上記生タイヤを加硫する加硫工程に相当する。すなわち、第１の本発明の空気入りタイヤの製造方法は、上記天然ゴムの製造方法により得られた天然ゴムと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、上記混練物から生タイヤを成形する生タイヤ成形工程、及び上記生タイヤを加硫する加硫工程を含む空気入りタイヤの製造方法である。
【００７５】
＜混練工程＞
混練工程では、上記天然ゴムの製造方法により得られた天然ゴムと、添加剤とを混練して混練物を得る。
【００７６】
添加剤としては特に限定されず、ゴム製品の製造に用いられる添加剤を使用できる。例えば、ゴム製品が空気入りタイヤの場合、例えば、上記天然ゴム以外のゴム成分、カーボンブラック、シリカ、炭酸カルシウム、アルミナ、クレー、タルクなどの補強用充填剤、シランカップリング剤、酸化亜鉛、ステアリン酸、加工助剤、各種老化防止剤、オイルなどの軟化剤、ワックス、硫黄などの加硫剤、加硫促進剤等が挙げられる。
【００７７】
混練工程における混練は、オープンロール、バンバリーミキサー、密閉式混練機などのゴム混練装置を用いて行えばよい。
【００７８】
＜生ゴム製品成形工程（タイヤの場合は生タイヤ成形工程）＞
生ゴム製品成形工程では、混練工程により得られた混練物から生ゴム製品（タイヤの場合は生タイヤ）を成形する。
生ゴム製品の成形方法としては特に限定されず、生ゴム製品の成形に用いられる方法を適宜適用すればよい。例えば、ゴム製品が空気入りタイヤの場合、混練工程により得られた混練物を、各タイヤ部材の形状に合わせて押し出し加工し、タイヤ成型機上にて通常の方法にて成形し、各タイヤ部材を貼り合わせ、生タイヤ（未加硫タイヤ）を成形すればよい。
【００７９】
＜加硫工程＞
加硫工程では、生ゴム製品成形工程により得られた生ゴム製品を加硫することにより、ゴム製品が得られる。
生ゴム製品を加硫する方法としては特に限定されず、生ゴム製品の加硫に用いられる方法を適宜適用すればよい。例えば、ゴム製品が空気入りタイヤの場合、生ゴム製品成形工程により得られた生タイヤ（未加硫タイヤ）を加硫機中で加熱加圧して加硫することにより空気入りタイヤが得られる。
【実施例】
【００８０】
実施例に基づいて、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらのみに限定されるものではない。
【００８１】
（実施例１）
〔ＨｅｖｅａラテックスからのＴｏｔａｌ  ＲＮＡ抽出〕
パラゴムノキのラテックスからホットフェノール法により、Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。ラテックス６ｍＬに１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液６ｍＬ、１０％ＳＤＳ溶液１ｍＬを添加し、さらに６５℃で予温しておいた水飽和フェノールを１２ｍＬ添加した。６５℃で５分間インキュベートしたのち、ボルテックスで撹拌し、室温、７０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行った。遠心後、上清を新しいチューブに移し、フェノール：クロロホルム（１：１）溶液１２ｍＬを添加し、２分間振盪撹拌した。撹拌後、再度、室温、７０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行った後、上清を新しいチューブに移し、クロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）溶液１２ｍＬを添加し、２分間振盪撹拌した。撹拌後、再度、室温、７０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行った後、上清を新しいチューブに移し、３Ｍ酢酸ナトリウム溶液１．２ｍＬとイソプロパノール１３ｍＬを添加し、ボルテックスで撹拌した。Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを沈殿させるために、−２０℃で３０分間インキュベートした。インキュベート後、４℃、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を取除くことでＴｏｔａｌ  ＲＮＡの沈殿を回収した。回収したＴｏｔａｌ  ＲＮＡは７０％エタノールで２度洗浄したのち、ＲＮａｓｅ  ｆｒｅｅの水で溶解させた。
【００８２】
〔Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡからｃＤＮＡの合成〕
回収したＴｏｔａｌ  ＲＮＡをもとに、ｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡの合成はＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  １ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒa）の説明書に従って行った。
【００８３】
〔ｃＤＮＡからＣＰＴ遺伝子の取得〕
作製した１ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡを鋳型にＣＰＴ遺伝子の取得を行った。ＰＣＲはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ（ＴＯＹＯＢＯ）を使用し、説明書に従って行った。ＰＣＲは、９８℃で１０秒、５８℃で３０秒、６８℃で１分を１サイクルとして、３５サイクル行った。
ＣＰＴ遺伝子の取得は、プライマーとして、
プライマー１：５’−  ｔｔｔｇｇａｔｃｃｇａｔｇｇａａｔｔａｔａｃａａｃｇｇｔｇａｇａｇｇ−３’（配列番号３）
プライマー２：５’−  ｔｔｔｇｃｇｇｃｃｇｃｔｔａｔｔｔｔａａｇｔａｔｔｃｃｔｔａｔｇｔｔｔｃｔｃｃ−３’ （配列番号４）
を使用した。
【００８４】
上述の方法により、ＣＰＴ遺伝子（ＨＲＴ１）が得られた。得られた遺伝子について、その配列を同定し、全長の塩基配列及びアミノ酸配列を同定した。ＨＲＴ１の塩基配列を配列番号１に示した。ＨＲＴ１のアミノ酸配列を配列番号２に示した。
【００８５】
〔ベクターの構築〕
上記取得したＤＮＡ断片にｄＡ付加を行った後、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を利用してｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒに挿入し、ｐＧＥＭ−ＨＲＴ１を作製した。
【００８６】
〔大腸菌の形質転換〕
上記作製したＶｅｃｔｏｒを用いて大腸菌ＤＨ５αの形質転換を行い、形質転換体はアンピシリンとＸ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地上で培養し、青／白スクリーニング法によって目的遺伝子を導入した大腸菌の選別を行った。
【００８７】
〔プラスミドの抽出〕
目的遺伝子を含むプラスミドで形質転換された大腸菌は、ＬＢ液体培地上で３７℃で一晩培養したのち、菌体を回収し、プラスミドの回収を行った。プラスミドの回収はＦａｓｔ  Ｇｅｎｅプラスミドミニキット（日本ジェネティクス）を使用した。
回収したプラスミドに挿入された遺伝子の塩基配列に変異がないことをシークエンス解析により確認した。
【００８８】
〔レタス発現用ベクターの作製〕
上記〔ベクターの構築〕で獲得したｐＧＥＭ−ＨＲＴ１とレタス発現用ゲートウェイベクター（ｐＢＩ−ｐＬｓＵｂｉ−ＧＷ）をＬＲ反応（挿入反応）させ（２５℃、２時間）、ＣＰＴ含有ベクター（ｐＢＩ−ｐＬｓＵｂｉ−ＧＷ−ＨＲＴ１）を作製した。ここで、ｐＢＩ−ｐＬｓＵｂｉ−ＧＷは、ｐＢＩ−ＯＸ−ＧＷの３５Ｓプロモーターをレタスユビキチン（ＬｓＵｂｉ）プロモーターに置換したものである。
そして、作製したＣＰＴ含有ベクターについて、ｐＧＥＭ−ＨＲＴ１と同様の手法を用いて、プラスミドに挿入された遺伝子の塩基配列に変異がないことをシークエンス解析により確認した。
【００８９】
〔外植片の調製〕
レタス（タキイ種苗社製の品種カイザー）の種子を家庭用の漂白剤を５倍希釈した液に１５分間浸し、種子の表面を殺菌をした。その後、クリーンベンチ内で種子を滅菌水で３回すすいだ。そして、表面殺菌した種子はプラントボックスあたり２５粒を目安に発芽培地（ＭＳ培地＋２％ショ糖＋０．３％ゲルライト）に播種し、２５℃、１６時間明期／８時間暗期で５日間培養した。
【００９０】
〔アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の準備〕
グリセロールストックのＣＰＴ含有ベクター（ｐＢＩ−ｐＬｓＵｂｉ−ＧＷ−ＨＲＴ１）を導入したアグロバクテリウム（アグロバクテリウム・ツメファシエンス）を液体ＬＢ培地に移植して、２４時間程度液体浸盪培養した。培養が終了した後、遠心処理（３０００ｒｐｍ、５分）を行ってアグロバクテリウムを集菌し、上清を捨てた。感染培地（ＭＳ培地＋３％ショ糖＋０．１ｍＭアセトシリンゴン＋０．０１ｍＭメルカプトエタノール）を加えてアグロバクテリウムを再懸濁した後、６００ｎｍで測定した吸光度（ＯＤ６００）＝０．８程度に調整した。この菌液を形質転換に用いた。
【００９１】
〔アグロバクテリウムの感染〕
アグロバクテリウムを懸濁した感染培地（約４０ｍＬ）を滅菌シャーレに移した。そして、〔外植片の調製〕により得られた子葉を先端から５ｍｍずつ切断し、切った子葉を直接感染培地の中に落とすように投入し、５分程度静置した。
次に、感染培地に静置した子葉の切片を滅菌したキムタオルの上に静置し、子葉の切片に付着したアグロバクテリウムをキムタオルに吸着させた。
そして、キムタオルの上に静置した子葉の切片を、共存培養培地（ＭＳ培地＋３％ショ糖＋１ｍｇ／Ｌベンジルアデニン＋０．１ｍｇ／Ｌ  ナフタレン酢酸＋０．３％ゲルライト）に向軸面が培地に接するようにして置床した。約２５切片をシャーレに置床した後、シャーレをサージカルテープで封をして、２５℃暗黒下で３日間共存培養を行った。
【００９２】
〔カルス誘導と不定芽の誘導〕
共存培養後、子葉切片をカルス誘導培地（ＭＳ培地＋３％ショ糖＋０．１ｍｇ／Ｌベンジルアデニン（ＢＡ）＋０．１ｍｇ／Ｌナフタレン酢酸（ＮＡＡ）＋１００ｍｇ／Ｌカナマイシン＋３７５ｍｇ／Ｌ（１錠／Ｌ）オーグメンチン＋０．３％ゲルライト）に移植し、２５℃照明下（１６時間照明／８時間暗黒）で、１週間おきに培地を交換しながら３週間培養し、カルスを誘導しつつ、選抜を行った。
次に、カルスを形成した子葉切片を不定芽誘導培地（ＭＳ培地＋３％ショ糖＋０．０１ｍｇ／Ｌベンジルアデニン（ＢＡ）＋０．０５ｍｇ／Ｌナフタレン酢酸（ＮＡＡ）＋１００ｍｇ／Ｌ  カナマイシン＋３７５ｍｇ／Ｌ（１錠／Ｌ）オーグメンチン＋０．３％ゲルライト）に移植した。
不定芽誘導培地での培養中に不定芽が分化してくるので、不定芽（本葉）のサイズが１−２ｃｍ位の大きさになった段階で、カルスから不定芽をメスで切り離し、成長したカルスを発根選抜培地（ＭＳ培地＋３％ショ糖＋１００ｍｇ／Ｌカナマイシン＋３７５ｍｇ／Ｌ（１錠／Ｌ）オーグメンチン＋０．３％ゲルライト）に移植した。なお、不定芽誘導培地で２ヶ月程度培養を続けたが、成長したカルスの端が褐色に変色してきた段階で、変色した部分はメスで切り取り培養を続けた。
【００９３】
〔発根選抜と順化〕
発根選抜培地での培養は、１ヶ月程度培地を交換しないで行った。そして、根がある程度（５ｃｍ弱）伸長してきた段階で、成長した植物組織を培地から抜き取り、根を傷めないように気をつけながら、培地を取り除いた。
次に、成長した植物組織を培養土に移植した。移植した植物体はバットに入れ、ラップを用いて湿度を十分に保った。
順化を開始してから、３、４日おきにラップに穴を開けたり、フタをずらしたりして低湿度の環境に１０日くらいかけて馴らした。
その後、順化が完了した植物体を、２２℃、１６時間日長の条件下で、８週間培養土で栽培を行った。
【００９４】
〔導入遺伝子の確認〕
培養土で８週間栽培した植物体のＤＮＡを抽出してＰＣＲにより導入遺伝子の確認を行い、遺伝子の導入が確認できた個体のみ栽培を続けた。
【００９５】
［水耕栽培・抽苔］
遺伝子導入が確認できた個体に関しては、水耕栽培に移した。水耕栽培では、培養液としてＯＡＴハウス肥料シリーズ（ＯＡＴアグリオ株式会社）のＯＡＴハウス１号、２号、５号を３０：３０：１の割合で混合したものを使用した。また、抽苔を促すため、気温が１７℃以下にならない様、１７〜２２℃の温度範囲で栽培を行った。
【００９６】
〔天然ゴムの抽出〕
遺伝子の導入が確認できた個体（レタス）を６か月間水耕栽培で栽培し、茎、葉からラテックスを抽出し、抽出したラテックスをエタノールに浸漬した。得られた固形物をエタノールで洗浄し、天然ゴムを得た。
【００９７】
〔天然ゴムの重量平均分子量の測定〕
天然ゴムの分子量分布を下記の条件で測定した。結果を表１に示した。
測定前処理
（１）エタノールを取り除き、蒸発乾固させた。（６ｈ〜終夜）
（２）重量を測定し、０．１％になるようテトラヒドロフランを加え、静置した。（終夜）
（３）濾過後、測定を行った。
下記の条件（１）〜（７）でゲルパーミエーションクロマトグラフ（ＧＰＣ）法により、重量平均分子量（Ｍｗ）を測定した。
（１）装置：東ソー社製ＨＬＣ−８３２０ＧＰＣ
（２）分離カラム：東ソー社製ＴＳＫｇｅｌ  ＳＭ  ＨＺ−Ｈ
（３）測定温度：４０℃
（４）キャリア：テトラヒドロフラン
（５）流量：０．６ｍＬ／分
（６）検出器：示差屈折、ＵＶ
（７）分子量標準：標準ポリスチレン
【００９８】
（比較例１）
ＣＰＴ含有ベクター（ｐＢＩ−ｐＬｓＵｂｉ−ＧＷ−ＨＲＴ１）の代わりに、ｐＢＩ−ｐＬｓＵｂｉ−ＧＷ（ＣＰＴ非含有ベクター）を用いた点以外は実施例１と同様にして行った。
【００９９】
【表１】
2020195326.tif 000002
なお、表１中の重量平均分子量は、各例についてそれぞれ４回実施した際の重量平均分子量の平均値である。
【０１００】
表１より、ゴム産生植物Ａ（パラゴムノキ）由来のシス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を、ゴム産生植物Ｂ（レタス）に導入し、形質転換植物Ｃを調製する工程と、形質転換植物Ｃにより天然ゴムを産生する工程とを含み、ゴム産生植物Ａが産生する天然ゴムの分子量が、上記遺伝子が導入される前のゴム産生植物Ｂが産生する天然ゴムの分子量に比べて大きいことを特徴とする天然ゴムの製造方法により、分子量（重量平均分子量）が増大した天然ゴムの製造が可能となることが分かった。
また、ゴム産生植物Ａ（パラゴムノキ）由来のシス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子が、ゴム産生植物Ｂ（レタス）に導入され、ゴム産生植物Ａが産生する天然ゴムの分子量が、上記遺伝子が導入される前のゴム産生植物Ｂが産生する天然ゴムの分子量に比べて大きいことを特徴とする形質転換植物は、分子量（重量平均分子量）が増大した天然ゴムの産生が可能な形質転換植物であることが分かった。
【０１０１】
（配列表フリーテキスト）
配列番号１：パラゴムノキ由来のＨＲＴ１をコードする遺伝子の塩基配列
配列番号２：パラゴムノキ由来のＨＲＴ１のアミノ酸配列
配列番号３：プライマー１
配列番号４：プライマー２
【図１】
2020195326.tif 000003
【配列表】
2020195326000001.app