(57)【要約】【課題】  現行のＤＮＡ鑑定法では識別不可能な、鎖長は等しくても塩基配列が異なるＤＮＡマーカーの識別、微量ＤＮＡを用いたＤＮＡマーカーの識別、分解されたＤＮＡを用いたＤＮＡマーカーの識別を、同一個体由来のＤＮＡが含まれているかどうか、を塩基配列でＤＮＡマーカーの一致、不一致を求め、ＤＮＡ鑑定の判断材料として提供することを目的とする。【手段】  ＤＮＡシーケンサーで決定したＤＮＡマーカーの塩基配列を検体間で比較し、塩基配列でＤＮＡマーカーの一致、不一致を求めることを特徴とする。【選択図】  図５
2020054271.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ターゲットＤＮＡとサンプルＤＮＡが同一個体に由来するＤＮＡであるかどうか鑑定する方法であって、以下の工程を含むことを特徴とするＤＮＡ鑑定方法、
（１）ターゲットＤＮＡのＤＮＡフラグメントの塩基配列を決定する工程、
（２）工程（１）で塩基配列を決定したＤＮＡフラグメントから、ＤＮＡマーカーもしくはその一部の塩基配列を含むＤＮＡフラグメントを抽出する工程、
（３）工程（２）で抽出されたＤＮＡフラグメントを、塩基配列に基づいて同一ローカス毎のグループ（ローカスグループ）に分ける工程、
（４）工程（３）で分けられたローカスグループ毎に、ローカスグループ内で共通部分の塩基配列が一致するＤＮＡフラグメントをサブグループとして分け、サブグループの中で最長のＤＮＡフラグメントをサブグループ代表フラグメントとして選択する工程、
（５）サンプルＤＮＡのＤＮＡフラグメントの塩基配列を決定する工程、
（６）工程（５）で塩基配列を決定したＤＮＡフラグメントから、ＤＮＡマーカーもしくはその一部の塩基配列を含むＤＮＡフラグメントを抽出する工程、
（７）工程（６）で抽出されたＤＮＡフラグメントを、塩基配列に基づいて同一ローカス毎のグループ（ローカスグループ）に分ける工程、
（８）工程（７）で分けられたローカスグループ毎に、ローカスグループ内で共通部分の塩基配列が一致するＤＮＡフラグメントをサブグループとして分け、サブグループの中で最長のＤＮＡフラグメントをサブグループ代表フラグメントとして選択する工程、
（９）工程（４）で選択されたターゲットＤＮＡのサブグループ代表フラグメントと工程（８）で選択されたサンプルＤＮＡのサブグループ代表フラグメントを、ローカス毎に比較する工程、
（１０）工程（９）の比較の結果からターゲットＤＮＡとサンプルＤＮＡに同一ＤＮＡが存在するか、ローカス毎に求める工程。
【請求項２】
工程（９）において、工程（４）で選択されたターゲットＤＮＡのサブグループ代表フラグメントと工程（８）で選択されたサンプルＤＮＡのサブグループ代表フラグメントの塩基配列を、サブグループ総当たりでローカス毎に比較することを特徴とする請求項１に記載のＤＮＡ鑑定方法。
【請求項３】
工程（９）において、二つのサブグループ代表フラグメントの短い方のＤＮＡフラグメントの鎖長全域の塩基配列に基づいて、サブグループ代表フラグメントを比較することを特徴とする請求項２に記載のＤＮＡ鑑定方法。
【請求項４】
工程（４）及び工程（８）において、ローカス中のＤＮＡフラグメントを同一塩基配列ごとにサブグループにすることで、サブグループ数が２以上のとき、複数個体のＤＮＡが混在している可能性があることを求めることができる請求項１に記載のＤＮＡ鑑定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分解されたＤＮＡで個体識別可能なＤＮＡ鑑定方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
警察で使用されているＤＮＡ鑑定では、反復回数に個体差のある短鎖縦列反復配列ＳＴＲ（short tandem repeat）を含む領域を選択してＤＮＡマーカーとして個体識別に使用しており、複数のＳＴＲ領域（ローカス）を用いることにより、個体差の検出率を高めている。このために利用するローカスの領域と数は地域により異なり、現在日本では、AmpFlSTR Identifiler PCR Amplification Kit（Thermo Fisher Scientific）によって増幅される１６か所のローカスが用いられている（非特許文献１）が、間もなく２４カ所のローカスを用いるGlobalFiler PCR Amplification Kit（Thermo Fisher Scientific）に変更がなされるとのことである（非特許文献２）。
【０００３】
具体的な鑑定作業としては、サンプルから抽出したＤＮＡのＤＮＡマーカーのローカス毎に固有のプライマーセットを用いてＰＣＲによりＤＮＡ増幅を行い、その増幅産物の電気泳動を行う。その結果、増幅されたＤＮＡフラグメントの種類数と相対的泳動距離を合わせたＤＮＡマーカーのパターンをローカス毎に比較することにより、識別している。
【０００４】
通常、ヒトのゲノムは二倍体で、１つのローカスは２つの対立遺伝子（アリル）を持ち、それらはそれぞれ父及び母から独立に由来する。同一ローカスにおいて、父母のそれぞれに由来するアリルのＳＴＲの反復回数が異なる場合、ＳＴＲ解析では２種の鎖長のＤＮＡフラグメントが検出される。同一ローカスにおいて、父母のそれぞれに由来するアリルのＳＴＲの反復回数が同じ場合は、ＳＴＲ解析で１種の鎖長のみのＤＮＡフラグメントが検出される。
【０００５】
上記の事実を考慮し、例えば、容疑者のＤＮＡマーカーのパターンと犯人のＤＮＡマーカーのパターンがすべてのローカスで同じであれば、容疑者が犯人と同一である確率が高いと鑑定する。
【０００６】
精度の高いＤＮＡ鑑定を行うためには、鑑定の検出感度と精度を確保するに足る種類と量のＤＮＡマーカーを確保する必要があるが、犯罪捜査等の場面では、しばしば、現行の方法でＤＮＡ鑑定を行うために十分な量の検体を確保することが難しい場合や、環境条件によって劣化が進んだ状態の検体しか得られない場合がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】AmpFlSTR Identifiler PCR Amplification Kit User Guide,  Thermo Fisher Scientific
【非特許文献２】GlobalFiler PCR Amplification Kit User Guide, Thermo Fisher Scientific
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
現行の電気泳動結果によるＤＮＡマーカーのパターンの識別法には、図１のバンドのラダーパターンにより識別するゲル電気泳動法と、図２の波形のパターンにより識別するキャピラリー電気泳動法がある。いずれも、ＤＮＡフラグメントの鎖長の違いを利用して同一検体中のバンドや波形を分離し、生成したパターンを識別する方式で、検体毎にＤＮＡフラグメントの塩基配列が異なっていても鎖長が同じであれば、同一のバンドや波形として識別されるため、相違が検出できないという問題がある。
【０００９】
また、犯罪捜査の場面でしばしば発生するような劣悪な環境中では、ＤＮＡはランダムな位置で切断され、次第により短いＤＮＡフラグメントへと分解される。このような状態のＤＮＡを現行法でＰＣＲ増幅しても、ＤＮＡマーカーのパターンは検出できない。
【００１０】
この理由を以下に説明する。
まず図３(1)のような構造を持つＤＮＡマーカーのローカス1の１つのアリルについて考える。
【００１１】
図３(2)のような分解されていないＤＮＡを鋳型としてＤＮＡマーカーのローカス1をＰＣＲ増幅すると、ローカス領域の両端に設定した2種のプライマー1及び2の塩基配列を両端に含むローカス領域全域の両方向のＤＮＡストランド（フラグメント1a1及びフラグメント1b1）が対数増殖し、鋳型となる元のＤＮＡ量が十分存在すれば、電気泳動によりバンドや波形を検出できる量の二本鎖ＤＮＡフラグメントが生成される。もう一つのアリルや他の全てのローカスについても同様に、鋳型となる元のＤＮＡ量が十分存在すれば、電気泳動によりバンドや波形を検出できる量の二本鎖ＤＮＡフラグメントが生成され、全ローカスのＤＮＡマーカーパターンが決定できる。
【００１２】
しかし、図３(3)のように劣悪な環境等により分解されたＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った場合、結果として生成する当該ローカスの当該アリルのＤＮＡフラグメント群は、図４のローカス1の例に示すように、下記１）から３）の様々なＤＮＡフラグメントの混合物となる。なお、図中の各フラグメントの太さは、ＰＣＲ反応後の各々のフラグメント量をイメージとして表している。
【００１３】
１）2種のプライマー配列を両端に持ちＤＮＡが分解されていないローカス1のアリル１のＤＮＡは、通常、劣化した検体から抽出されたＤＮＡのうち極めて少数であり、それらが対数増殖しても、バンドや波形で明確に識別可能な量のＤＮＡフラグメントは得られない。
【００１４】
２）ＤＮＡの分解による切断の位置は通常ランダムで、図４の分解されたＤＮＡ(1)及びＤＮＡ(2)で示すようにＤＮＡ分子ごとに異なる。これらのＤＮＡフラグメントのうちで、2種のプライマーのうちいずれかの塩基配列を含む一本鎖ＤＮＡフラグメント（フラグメント1a1及びフラグメント1c2）については、それらの相補鎖を鋳型とするＤＮＡの伸長反応が起こるため、ＰＣＲのサイクル数に比例してそれらの一本鎖ＤＮＡフラグメント数は増加する。この結果、2種のプライマーのうちいずれかの塩基配列を含む一本鎖ＤＮＡフラグメントのＰＣＲ産物としては、それぞれの鋳型となるＤＮＡの切断位置により、ＰＣＲサイクル数分増加した異なる鎖長の一本鎖ＤＮＡフラグメント（フラグメント1a1及びフラグメント1c2）の混合物が得られる。しかし、それぞれの一本鎖フラグメント量は極めて少なく、また一本鎖は様々な立体構造を取るため同じ鎖長でも電気泳動距離が一定しない。この結果、いずれの一本鎖ＤＮＡフラグメントも、バンドや波形で明確に識別することはできない。
【００１５】
３）ＤＮＡマーカーのローカスのプライマー配列より内側に両端をもつように切断されたＤＮＡフラグメントは、プライマー結合配列を持たないため、フラグメント数は全く増加せず、バンドや波形としての検出はできない。
【００１６】
もう一つのアリルや他の全てのローカスについても同様に、様々なＤＮＡフラグメントの混合物が生成する。
【００１７】
1つの検体から抽出したＤＮＡを鋳型として全ローカスのマルチプレックスＰＣＲを行うと、上記の全てのローカスのＰＣＲ産物の混合物となる様々な鎖長のＤＮＡフラグメント群が生成される。これを電気泳動すると、ゲル電気泳動で明確なバンドは認められず、ＤＮＡ量に応じた濃さのスメア像が得られたり、キャピラリー電気泳動では多数の弱いシグナルの重なりが続く解析不能なパターンが得られたりする結果となり、ＤＮＡ鑑定はできないという問題もある。
【００１８】
本発明では、これらの問題を解決するため、ＤＮＡの塩基配列を読み取り、同じＤＮＡ鎖長で塩基配列が異なるＤＮＡマーカーの識別、及び微量しかないＤＮＡでのＤＮＡマーカーの識別、並びに分解されたＤＮＡを用いたＤＮＡマーカーの識別で、ＤＮＡ鑑定を行うために、ターゲットＤＮＡとサンプルＤＮＡに同じＤＮＡが存在するか、求めることを特徴としている。
【００１９】
また、ＤＮＡシーケンサーは近年技術的進歩が著しく、極めて微量のＤＮＡから大量の塩基配列データを取得することが可能なため、このような機材を使用してＤＮＡマーカーの塩基配列データを取得することにより、ＤＮＡマーカーの識別ができる様になることを特徴としている。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明においては、上記分解されたＤＮＡと、1回の実験で大量の塩基配列を読み取れるＤＮＡシーケンサーを用いる。
【００２１】
ここで得られたＤＮＡマーカーの塩基配列を検体間で比較してＤＮＡ鑑定を行うことにより、同一鎖長のＤＮＡマーカーのフラグメントでも塩基配列が異なるものを識別できる様になることを特徴としている。
【００２２】
さらに、分解されたＤＮＡを検体として用いる場合でも、ローカスの途中で切断されたＤＮＡフラグメントの部分的なＤＮＡについて、検体間で部分的なＤＮＡ鎖長及び／又は塩基配列を比較解析することにより、ＤＮＡマーカーの識別ができる様になることを特徴としている。
【００２３】
そして上記のようにして得られた検体毎ローカス毎のＤＮＡマーカーの一覧及びそれら相互の比較結果をまとめた一覧表を作成することにより、現状のＤＮＡ鑑定法では検出・識別ができないような、同一鎖長でも異なるＤＮＡマーカー塩基配列を持つ個体の識別、極めて微量しかない検体のＤＮＡマーカーによる個体の識別、分解されたＤＮＡしか得られない検体のＤＮＡマーカーによる個体の識別に有用なＤＮＡマーカー解析の情報を提供できる様になることを特徴としている。
【００２４】
また、上述のようにヒトは二倍体生物であるため、例えば犯人の検体で３種以上の塩基配列を含むＤＮＡマーカーが検出されれば、その検体は複数個体由来の混合物である可能性が出てくる。
【００２５】
トリソミー個体のように一部のローカスに3つのアリルを持つヒト個体が存在することは否定できないが、ヒトのＤＮＡ鑑定用のＤＮＡマーカーの複数のローカスが3倍体になることは通常ないため、複数のローカスで3つ以上のサブグループが検出された場合には、サンプル検体には複数個体由来のＤＮＡが混在している可能性をより強く提示できる。
【００２６】
一方、特定のＤＮＡマーカーについて2つのアリルの塩基配列が全く同じホモ接合体である個体の場合、当該ＤＮＡマーカーについては1種類の塩基配列しか検出されない。このため例えば、2個体由来のＤＮＡが混在する検体中において、2個体のそれぞれが当該ＤＮＡマーカーについてホモ接合体で2個体の持つ塩基配列が異なっている場合や、3個体の混合検体のうち2個体が当該ＤＮＡマーカーについてそれぞれ異なるホモ接合体で、第3の個体がそれら2個体のそれぞれの塩基配列と一致する塩基配列を持つヘテロ接合体である場合等では、当該ＤＮＡマーカーのローカスに属するサブグループは2つになる場合もある。従って、サブグループが2つの場合であっても、検体に複数個体由来のＤＮＡが混在していることもあり得る。
【００２７】
このように当該ＤＮＡマーカーのサブグループが2つの場合、その検体が1個体に由来するＤＮＡのみを含むのか、複数個体由来のＤＮＡの混合物であるのかを区別することは困難である。しかし、鑑定用のＤＮＡマーカーを複数用いることにより、他のＤＮＡマーカーで3種以上の塩基配列を含むＤＮＡマーカーが検出される可能性があり、その結果によって、複数個体由来のＤＮＡが混在する可能性が提示できる。
【００２８】
そこでこの検体毎ローカス毎のＤＮＡマーカーの一覧及びそれら相互の比較結果をまとめた一覧表を用いることにより、検体間のみならず同一検体中の個体の識別、すなわち、同一検体中に複数の個体由来のＤＮＡが含まれているかどうか、及び2つの検体（例えば容疑者（群）の検体と犯人（群）の検体）に同一個体由来のＤＮＡが含まれているかどうかを鑑定するための情報を提供できるようになることも、特徴としている。
【００２９】
本発明は、以下の〔１〕〜〔４〕を包含するものである。
〔１〕ターゲットＤＮＡとサンプルＤＮＡが同一個体に由来するＤＮＡであるかどうか鑑定する方法であって、以下の工程を含むことを特徴とするＤＮＡ鑑定方法、
（１）ターゲットＤＮＡのＤＮＡフラグメントの塩基配列を決定する工程、
（２）工程（１）で塩基配列を決定したＤＮＡフラグメントから、ＤＮＡマーカーもしくはその一部の塩基配列を含むＤＮＡフラグメントを抽出する工程、
（３）工程（２）で抽出されたＤＮＡフラグメントを、塩基配列に基づいて同一ローカス毎のグループ（ローカスグループ）に分ける工程、
（４）工程（３）で分けられたローカスグループ毎に、ローカスグループ内で共通部分の塩基配列が一致するＤＮＡフラグメントをサブグループとして分け、サブグループの中で最長のＤＮＡフラグメントをサブグループ代表フラグメントとして選択する工程、
（５）サンプルＤＮＡのＤＮＡフラグメントの塩基配列を決定する工程、
（６）工程（５）で塩基配列を決定したＤＮＡフラグメントから、ＤＮＡマーカーもしくはその一部の塩基配列を含むＤＮＡフラグメントを抽出する工程、
（７）工程（６）で抽出されたＤＮＡフラグメントを、塩基配列に基づいて同一ローカス毎のグループ（ローカスグループ）に分ける工程、
（８）工程（７）で分けられたローカスグループ毎に、ローカスグループ内で共通部分の塩基配列が一致するＤＮＡフラグメントをサブグループとして分け、サブグループの中で最長のＤＮＡフラグメントをサブグループ代表フラグメントとして選択する工程、
（９）工程（４）で選択されたターゲットＤＮＡのサブグループ代表フラグメントと工程（８）で選択されたサンプルＤＮＡのサブグループ代表フラグメントを、ローカス毎に比較する工程、
（１０）工程（９）の比較の結果からターゲットＤＮＡとサンプルＤＮＡに同一ＤＮＡが存在するか、ローカス毎に求める工程。
【００３０】
〔２〕工程（９）において、工程（４）で選択されたターゲットＤＮＡのサブグループ代表フラグメントと工程（８）で選択されたサンプルＤＮＡのサブグループ代表フラグメントの塩基配列を、サブグループ総当たりでローカス毎に比較することを特徴とする〔１〕に記載のＤＮＡ鑑定方法。
【００３１】
〔３〕工程（９）において、二つのサブグループ代表フラグメントの短い方のＤＮＡフラグメントの鎖長全域の塩基配列に基づいて、サブグループ代表フラグメントを比較することを特徴とする〔２〕に記載のＤＮＡ鑑定方法。
【００３２】
〔４〕工程（４）及び工程（８）において、ローカス中のＤＮＡフラグメントを同一塩基配列ごとにサブグループにすることで、サブグループ数が２以上のとき、複数個体のＤＮＡが混在している可能性があることを求めることができる〔１〕に記載のＤＮＡ鑑定方法。
【発明の効果】
【００３３】
上記のように構成された本発明の方法によれば、１）鎖長は等しくても塩基配列が異なるＤＮＡマーカーの識別、２）微量ＤＮＡを用いたＤＮＡマーカーの識別、３）分解されたＤＮＡを用いたＤＮＡマーカーの識別、４）同一検体中の複数個体の混在の検出用資料の提供、及び、５）2つの検体に同一個体由来のDNAが含まれているかどうかの鑑定用資料の提供が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】分解されていないＤＮＡのゲル電気泳動結果の例を示す図。
【図２】分解されていないＤＮＡのキャピラリー電気泳動結果の例を示す図。
【図３】ＤＮＡマーカーのフラグメントを示す図。
【図４】分解されたＤＮＡマーカーのローカスのＰＣＲ産物を示す図。
【図５】ＤＮＡマーカーの大量塩基配列データに基づく塩基配列比較の流れを示す図。
【図６】検体から抽出したＤＮＡのローカス1を含む塩基配列のうちローカスサブグループ１に属する塩基配列群とその共通部分、及び共通部分を持つ最長の塩基配列の例を示す図。
【図７】分解されたＤＮＡの全マーカーフラグメント塩基配列群データベース作成のフローを示す図。
【図８】全マーカーフラグメント塩基配列群データベースからＤＮＡマーカー塩基配列群への選抜を示す図。
【図９】検体別のＤＮＡマーカー塩基配列群データベースへの選抜フローを示す図。
【図１０】ＳＴＲのＤＮＡマーカー塩基配列群の比較解析を示す図。
【図１１】ＰＣＲありの場合のターゲットとサンプルの比較例模式図
【図１２】分解されたＤＮＡのマーカー含有フラグメント塩基配列群データベース作成のフロー（ＰＣＲなし）を示す図。
【図１３】検体ＤＮＡのマーカー含有フラグメント塩基配列群データベースからＤＮＡマーカー塩基配列群への選抜（ＰＣＲなし）を示す図。
【図１４】検体別のＤＮＡマーカー塩基配列群データベースへの選抜フロー（ＰＣＲなし）を示す図。
【図１５】ＤＮＡマーカー塩基配列群の比較解析  （ＰＣＲなし）を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
以下、図５に従って、本発明を詳細に説明する。
本発明のＤＮＡ鑑定方法は、ＤＮＡマーカー比較表に基づいて行うことができる。このＤＮＡマーカー比較表は、ターゲットＤＮＡとサンプルＤＮＡに同一個体由来のＤＮＡが含まれているかどうかを鑑定するために、両者のＤＮＡマーカーのパターンの比較結果を表にするものであって、下記の工程（Ａ）〜（Ｌ）を含む方法によって作成できる。
【００３６】
工程（Ａ）では、ＤＮＡシーケンサーを用いて、ターゲットＤＮＡのＤＮＡマーカーのローカスを含めた塩基配列群を決定し、それら全てを登録したデータベースを作成する。なお、本工程の前の準備工程として、ＰＣＲ反応による検体ＤＮＡの増幅工程や、Adaptaseテクノロジー（Swift Bioscience）等による1本鎖ＤＮＡへのアダプター付加工程など、ＤＮＡシーケンサーを用いてより大量の塩基配列データを精度高く得るための工程が追加される場合もある。
【００３７】
ＤＮＡマーカーは特に限定されず、例えば、ＳＴＲを含むものであってもよく、ＳＴＲのような反復配列を含まないものであってもよい。また、ＤＮＡマーカーは、個体間で塩基配列の違いがみられる配列を含むものであってもよい。ＳＴＲを含むＤＮＡマーカーのローカスとしては、例えば、AmpFlSTR Identifiler PCR Amplification Kit（Applied Biosystems社製）によって増幅される１６か所のローカスを挙げることができる。
【００３８】
鑑定の対象とするＤＮＡマーカーのローカスは一つだけであってもよいが、二つ以上であることが好ましい。ＤＮＡマーカーのローカスが二つ以上である場合、マルチプレックスＰＣＲを行える設定が可能であることが好ましい。
【００３９】
塩基配列を決定する方法は特に限定されないが、1回の実験で大量の塩基配列データを取得できる次世代ＤＮＡシーケンサー又は次々世代ＤＮＡシーケンサーを用いて行うのが好ましい。
【００４０】
工程（Ｂ）では、工程（Ａ）で登録した塩基配列群から、ＤＮＡマーカー及び／又はその一部分の塩基配列を含むすべての塩基配列を抽出する。
【００４１】
工程（Ｃ）では、工程（Ｂ）で抽出された塩基配列を、ローカス毎のグループ（ローカスグループ）に分ける。
【００４２】
工程（Ｄ）では、工程（Ｃ）で作成されたそれぞれのローカスグループ内で、共通部分の塩基配列が一致する塩基配列毎に、サブグループ（ローカスサブグループ）に分ける。
【００４３】
工程（Ｅ）では、工程（Ｄ）で作成されたそれぞれのローカスサブグループ内で最長の塩基配列（ローカスサブグループ代表塩基配列）を選択する。ローカスサブグループ内の最長の塩基配列の考え方は図６に示すとおりである。
【００４４】
工程（Ｆ）では、ＤＮＡシーケンサーを用いて、サンプルＤＮＡのＤＮＡマーカーのローカスを含めた塩基配列を決定し、それら全てを登録したデータベースを作成する。
【００４５】
工程（Ｇ）では、工程（Ｆ）で登録した塩基配列群から、ＤＮＡマーカー及び／又はその一部分の塩基配列を含むすべての塩基配列を抽出する。
【００４６】
工程（Ｈ）では、工程（Ｇ）で抽出されたＤＮＡフラグメントを、ローカス毎のグループ（ローカスグループ）に分ける。
【００４７】
工程（Ｉ）では、工程（Ｈ）で作成されたそれぞれのローカスグループ内で、共通部分の塩基配列が一致する塩基配列毎に、サブグループ（ローカスサブグループ）に分ける。
【００４８】
工程（Ｊ）では、工程（Ｉ）で作成されたそれぞれのローカスサブグループ内で最長の塩基配列（ローカスサブグループ代表塩基配列）を選択する。ローカスサブグループ内の最長の塩基配列の考え方は図６に示すとおりである。
【００４９】
工程（Ｋ）では、工程（Ｅ）で選択されたローカス代表塩基配列と工程（Ｊ）で選択されたローカスサブグループ代表塩基配列を、ターゲットＤＮＡとサンプルＤＮＡの対応するローカスグループ内のローカスサブグループ間で、それぞれ総当たりで比較する。
【００５０】
工程（Ｌ）では、工程（Ｋ）で行ったターゲットとサンプルの全てのローカスサブグループ代表塩基配列の比較結果を一覧表（表２）にまとめる。
【００５１】
比較の結果、ターゲットＤＮＡとサンプルＤＮＡの対応するローカスサブグループにおいて、ターゲットＤＮＡのローカスサブグループ代表塩基配列とサンプルＤＮＡのローカスサブグループ代表塩基配列の共通部分に不一致が存在する場合は、それらのローカスサブグループは不一致であると判定することができる。共通部分の考え方は図６で示した考え方と同様である。
【００５２】
塩基配列の一致又は不一致の判定は、どのような方法でおこなってもよいが、ＤＮＡマーカーのローカスがＳＴＲを含む場合は、後述する表１に示すように、ＤＮＡフラグメントの長さ及び塩基配列に基づいて行うことが好ましい。一方、ＤＮＡマーカーのローカスがＳＴＲを含まない場合は、二つのＤＮＡフラグメントの短い方のＤＮＡフラグメントの鎖長全体の塩基配列に基づいて行うことが好ましい。
【００５３】
工程（Ａ）〜（Ｅ）はターゲットＤＮＡに関する工程であり、工程（Ｆ）〜（Ｊ）はサンプルＤＮＡに関する工程である。工程（Ａ）〜（Ｅ）と工程（Ｆ）〜（Ｊ）は、同時並行的に行ってもよく、また、一方を先に行い、他方を後に行ってもよい。
【００５４】
以下に、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００５５】
犯罪捜査におけるＤＮＡ鑑定は、多くの場合、犯人のものと思われる検体から抽出されたＤＮＡ（ターゲットＤＮＡ）と、容疑者の検体から抽出されたＤＮＡ（サンプルＤＮＡ）の、複数のＤＮＡマーカーの各々を、ターゲットＤＮＡとサンプルＤＮＡの間でＤＮＡフラグメントの鎖長と数のパターン比較を実施することにより行う。
【００５６】
本発明は、図５に示すように、塩基配列比較によるＤＮＡマーカー比較データの全体像作成を、１）ＤＮＡシーケンサーで読み取ったターゲットのＤＮＡフラグメントの塩基配列群及びサンプルのＤＮＡフラグメントの塩基配列群各々のデータベースを作成する塩基配列データベース作成工程、２）１）からのＤＮＡマーカー及び／又はその一部の塩基配列を抽出するマーカー配列抽出行程、３）２）で選択した塩基配列のローカス毎のグループを作成するローカスグループ作成工程、４）３）で作成した各々のローカスグループ内で、共通部分が一致する塩基配列を持つローカスサブグループの作成工程、５）４）で作成した各々のローカスサブグループ内で最長のＤＮＡフラグメントを選択するローカスサブグループ代表塩基配列選択工程、６）ＤＮＡマーカーのローカス毎に、ターゲットＤＮＡ及びサンプルＤＮＡについて、５）で抽出したローカスサブグループ代表塩基配列同士を比較する比較工程、及び、７）ターゲットＤＮＡとサンプルＤＮＡのローカス毎の全てのローカスサブグループ代表塩基配列の比較結果を一覧表にまとめる表作成工程という処理で構成する。
【００５７】
ＰＣＲによるＤＮＡマーカーのＤＮＡ増幅を用いた場合の本発明の構成を図７で説明する。このＰＣＲ反応は、ＤＮＡマーカーの両端にそれぞれ位置する1ペア2種類のプライマー配列からの伸長反応であるため、指数関数的に、あるいはＰＣＲサイクル数に比例して増加するＤＮＡフラグメントは全て、その５‘端に、2種類のプライマー配列の内1種類の塩基配列又は少なくともその一部の塩基配列を有する。
〔実施例１〕  ＤＮＡシーケンサーで読み取ったターゲット検体及びサンプル検体のＤＮＡフラグメントの塩基配列群からのＤＮＡマーカー塩基配列群データベース作成（事前工程にＰＣＲを含む場合）
【００５８】
まず、準備工程として、ＤＮＡ鑑定を行う２つの検体（ターゲット及びサンプル）から抽出したＤＮＡそれぞれ（ターゲットＤＮＡ及びサンプルＤＮＡ）を鋳型として、ＤＮＡマーカーの全ローカスについてマルチプレックスＰＣＲを行い、この結果生じる全てのローカスのＰＣＲ産物を含むＤＮＡマーカーＰＣＲ産物群を、ターゲットＤＮＡおよびサンプルＤＮＡの各々について得る。なお、これらのフラグメント群には、ＰＣＲの鋳型として使用したターゲット又はサンプルのＤＮＡのうちで、いずれのローカス部位でもないためＰＣＲ増幅の対象とならなかった部位のＤＮＡも混入している（図７上段の図に相当）。これらターゲット及びサンプルの全てのＤＮＡフラグメントについて、1回の実験で大量の塩基配列データを得られるＤＮＡシーケンサーを用いて塩基配列を決定し、その情報のすべてを、図７の中段に示すように、検体ＤＮＡ毎のＤＮＡマーカーＰＣＲ産物の塩基配列群としてデータベースに登録する。
【００５９】
次に、これらの塩基配列の全てを、ＤＮＡ鑑定用のＤＮＡマーカーの全ローカスの塩基配列と照合し、いずれかのローカスの全体又は一部に相当する塩基配列を抽出して、ターゲットＤＮＡ又はサンプルＤＮＡの全マーカーフラグメント塩基配列群としてデータベースに登録する（図７下段の図に相当）。
【００６０】
続いて、図８上段から中段の図のように、登録された塩基配列の中から、ＤＮＡマーカーのローカス毎に、2種のプライマー配列のいずれか又は両方を含む塩基配列のみを抽出し、それらをローカス毎及びプライマー毎にグループに分類して、ターゲット又はサンプルのローカス・プライマー別塩基配列群のデータベースを作成する。
【００６１】
さらに、検体毎に、同一ローカス、同一プライマーのグループ内で、当該グループに属する塩基配列を相互に比較し、共通部分の塩基配列が一致する塩基配列同士を集めてサブグループを作成する。この図８の処理を図９に沿って説明する。
【００６２】
（０１０）ＤＮＡマーカーのローカス1から処理を開始するため、ローカス番号の初期値としてN＝１を設定する。
【００６３】
（０２０）プライマー番号1の塩基配列が含まれる塩基配列から処理するため、プライマー番号の初期値としてP＝１を設定する。
【００６４】
（０３０）図８の全マーカーフラグメント塩基配列群からローカス番号1でプライマー番号1の塩基配列が存在する塩基配列を全て抽出する。
【００６５】
（０４０）抽出した塩基配列のグループにローカス番号Nとプライマー番号Pからなる名称を与える。（例えばN=1、P=2なら012など）ローカス番号N及びプライマー番号Pは、ＤＮＡ鑑定用のＤＮＡマーカーにローカスやプライマーの番号が設定されていればそれに従って、また、設定されていなければゲノム上の位置順に従うなどわかりやすい順番で与える。これにより、図8中段の図のように、検体毎のローカス・プライマー別塩基配列群のデータベースができる。
【００６６】
（０５０）（０４０）で作成した塩基配列のグループNP毎に、当該グループに属する全ての塩基配列を相互に比較し、共通部分が一致する塩基配列同士を集めてサブグループを形成する。検体に含まれる個体が単一であれば、同一ローカスの同一プライマーグループ内のサブグループ数は、ヒト個体が通常は二倍体であることを反映して、通常2以下となる。検体に含まれる個体が複数であれば、同一ローカスの同一プライマーグループ内のサブグループ数は、3以上となる場合がある。
【００６７】
（０６０）サブグループを作成した検体がターゲットであるかサンプルであるかを、後の作業で区別する必要が出てくる。作業中の検体がターゲットであれば（０７０）に進み、ターゲットのサブグループであることが分かる名称を与える。作業中の検体がサンプルであれば（０８０）に進んでサンプルのサブグループであることが分かる名称を与える。
【００６８】
（０７０）作業対象がターゲット検体の塩基配列の場合は、（０５０）で作成した同一ローカスの同一プライマーのグループに含まれる全てのサブグループにそれぞれサブグループ番号Uを1から順番に与える。さらに、検体がターゲットであることを明示するため最初にTを加えたサブグループ名TNPU（例えばN=1、P=2、U=1ならT0121）を、それぞれのサブグループに与える。
【００６９】
（０８０）作業対象がサンプル検体の塩基配列の場合は、（０５０）で作成した同一ローカスの同一プライマーのグループに含まれる全てのサブグループにそれぞれサブグループ番号Vを1から順番に与える。さらに、検体がサンプルであることを明示するため最初にSを加えたサブグループ名SNPV（例えばN=1、P=2、V=1ならS0121）を、それぞれのサブグループに与える。
【００７０】
（０９０）（０７０）および（０８０）で名称を与えられた塩基配列のサブグループを、グループ構造を維持したままで、対応する検体（ターゲット又はサンプル）のＤＮＡマーカー塩基配列群データベースに移動する。
【００７１】
（１００）次に、同じローカスの異なるプライマー配列Ｐについて（０３０）〜（０９０）の作業を行う必要の有無を判断する必要がある。一つのローカスには2種のプライマー配列が存在するため、現状のプライマー番号が1または2のいずれかを判別する。1の場合は（１２０）へ行ってプライマー番号をP=2に設定換えし、（０３０）からの行程を繰り返す。2の場合は（１１０）へ行く。
【００７２】
（１１０）ＤＮＡ鑑定用のＤＮＡマーカーのローカスは通常複数あり、それら全てについて上記の作業を行うため、現在のローカス番号Nより大きいローカス番号の有無を判断する必要がある。現在のローカス番号Nより大きいローカス番号が存在する場合は（１３０）へ行き、ローカス番号NをN+1に設定を換えて、（０２０）に戻る。現在のローカス番号Nより大きいローカス番号がなければ、作業を終了する。
【００７３】
ここまでの処理により、図８下段の図に示すように、ＤＮＡマーカーのプライマー塩基配列を含む塩基配列が、ローカス毎、及びプライマー配列毎、さらに共通部分が同一塩基配列のサブグループ毎にグループを作った状態で、検体毎のＤＮＡマーカー塩基配列群のデータベースに登録されたことになる。
【００７４】
なお、上記の処理により、プライマー番号の小さい条件で抽出された塩基配列は、（０４０）の処理により元の塩基配列群のデータベースからは削除されるため、両端に2種のプライマーの塩基配列を持つ完全長のＤＮＡマーカーの塩基配列は、プライマー番号1をもつグループに分類される。
【００７５】
この作業を、ＤＮＡ鑑定を行う2つの検体のそれぞれについて行い、ターゲット検体のＤＮＡマーカー塩基配列群及びサンプル検体のＤＮＡマーカー塩基配列群の２つのデータベースを作成する。
【００７６】
本実施例では、ローカス毎のいずれかのプライマーの塩基配列を含むフラグメントの塩基配列を抽出したが、ターゲット検体又はサンプル検体のＤＮＡマーカー塩基配列群のデータベースを作成する際の塩基配列の抽出方法としては、プライマーの塩基配列全体ではなくその一部の塩基配列を含むフラグメントの塩基配列を抽出する方法や、ローカス毎の塩基配列の全体又は一部の塩基配列を含むフラグメントの塩基配列を抽出する方法などの選択も可能であり、またこれらの方法に限られない。
【００７７】
〔実施例２〕  ＳＴＲをもつＤＮＡマーカーの代表塩基配列の比較表作成のフロー（事前工程にＰＣＲを含む場合）
この処理は、上記で作成したターゲット検体のＤＮＡマーカー塩基配列群及びサンプル検体のＤＮＡマーカー塩基配列群の２つのデータベースを用いて行う。ここで行う処理を、図１０に沿って説明する。
【００７８】
（１００）ＤＮＡマーカーのローカス1から処理を開始するため、ローカス番号の初期値としてN=1を設定する。
【００７９】
（２００）プライマー1の塩基配列が存在する塩基配列から処理するため、プライマー番号の初期値としてP=1を設定する。
【００８０】
（３００）ターゲットのサブグループ１から処理を開始するため、サブグループ番号の初期値としてU=1を設定する。
【００８１】
（４００）ターゲットのＤＮＡマーカー塩基配列群のデータベースの中から、サブグループ番号UのＤＮＡマーカー塩基配列のグループを選択する。
【００８２】
（５００）選択したＤＮＡマーカー塩基配列のサブグループは、5'端がプライマーの塩基配列Pで始まる同じ塩基配列を持ち、相互に共通な部分の塩基配列が等しい様々な鎖長のＤＮＡマーカー塩基配列のグループである。このグループの中で相互にＤＮＡ鎖長を比較し、最長のＤＮＡマーカー塩基配列をローカスサブグループ代表塩基配列TRNPUとする。（たとえばTR0112など）
【００８３】
（６００）サンプルのサブグループ１から処理を開始するため、サブグループ番号の初期値としてV=1を設定する。
【００８４】
（７００）サンプルのＤＮＡマーカー塩基配列群のデータベースの中から、サブグループ番号VのＤＮＡマーカー塩基配列のグループを選択する。
【００８５】
（８００）選択したＤＮＡマーカー塩基配列のサブグループは、5'端がプライマーの塩基配列Pで始まる同じ塩基配列を持ち、相互に共通な部分の塩基配列が等しい様々な鎖長のＤＮＡマーカー塩基配列のグループである。このグループの中で相互にＤＮＡ鎖長を比較し、最長のＤＮＡマーカー塩基配列をローカスサブグループ代表塩基配列SRNPVとする。（たとえばSR0212など）
【００８６】
（９００）TRNPUとSRNPVの塩基配列を、下表の通り比較する。比較する塩基配列名称のNとPは、ターゲットとサンプルで常に一致している。
【表１】
2020054271.tif 000003
【００８７】
（１０００）サンプルの同一ローカス、同一プライマー配列のグループ内の全てのサブグループに対して（７００）〜（９００）の工程を行う必要があるため、同一ローカス、同一プライマー配列のグループ内の他のサブグループの有無を判断する。他にサブグループが存在する場合は（１５００）に行ってサンプルのサブグループ番号VをV+1に設定換えし、（７００）〜（９００）の作業を繰り返す。他にサブグループが存在しない場合は（１２００）に行く。
【００８８】
（１１００）ターゲットの同一ローカス、同一プライマー配列のグループ内の全てのサブグループに対しても（４００）〜（１０００）の工程を行う必要があるため、同一ローカス、同一プライマー配列のグループ内の他のサブグループの有無を判断する。他にサブグループが存在する場合は（１６００）に行ってターゲットのサブグループ番号UをU+1に設定換えし、（４００）〜（１０００）の作業を繰り返す。他にサブグループが存在しない場合は（１２００）に行く。
【００８９】
（１２００）次に、同じローカスの異なるプライマー配列Ｐについて（３００）〜（１１００）の作業を行う必要の有無を判断する必要がある。一つのローカスには2種のプライマー配列が存在するため、現状のプライマー番号が1または2のいずれかを判別する。1の場合は（１７００）へ行ってプライマー番号をP=2に設定換えし、（３００）からの行程を繰り返す。2の場合は（１３００）へ行く。
【００９０】
（１３００）全ローカスの処理が完了したかチェックする。完了していない場合は次のローカスの処理をするために（１８００）へ行き、ローカス番号NをN+1に設定を換えて、（２００）からの行程を繰り返す。完了した場合は（１４００）へ行く。
【００９１】
（１４００）全てのローカスサブグループ毎に、TRNPUとSRNPVの塩基配列の比較結果の一覧表をたとえば下記のように作成し（表２）、完成したら終了とする。
【００９２】
表２は、ターゲット及びサンプルがそれぞれ単一個体を含む検体である場合の例の一部を示している。この表の元となる模式図を図１１に示す。
【表２】
2020054271.tif 000004
【００９３】
図１１の例において、ターゲットは、ローカス１のＤＮＡマーカーについては、プライマー番号１及び２にそれぞれ2種のサブグループ、ローカス２のＤＮＡマーカーについてはプライマー番号１及び２にそれぞれ1種のサブグループを持つ検体である。一方で、サンプルは、ローカス１のＤＮＡマーカーについてはプライマー番号１及び２にそれぞれ2種のサブグループ、ローカス２についてもプライマー番号１及び２にそれぞれ2種のサブグループを持つ検体である。図１０の命名法に従って、ターゲットのローカス１、プライマー番号１のグループにおけるローカスサブグループ１の代表塩基配列１はTR0111、ローカスサブグループ２の代表塩基配列２はTR0112、サンプルのローカス１、プライマー番号１のグループにおけるローカスサブグループ１の代表塩基配列１はSR0111、ローカスサブグループ２の代表塩基配列２はSR0112であり、TR0121、TR0122、SR0121、SR0122が、ローカス番号１、プライマー番号２のターゲットおよびサンプルのローカスサブグループ毎の代表塩基配列となる。以下同様に、ローカス２のターゲットにはTR0211とTR0221、サンプルにはSR0211、SR0212、SR0221、SR0222がそれぞれ含まれる。
【００９４】
これに基づいてローカス番号とプライマー番号が一致するグループ内でターゲットとサンプルの比較を行う。たとえば、ローカス番号1、プライマー番号１のグループについては、TR0111とSR0111、TR0111とSR0112、TR0112とSR0111,TR0112とSR0112の4通りの比較を行い、表１に従って比較の結論を出し、表２右端のローカスサブグループ代表塩基配列の比較結果の当て嵌まるそれぞれの欄に結論を記入する。この作業をすべてのローカスサブグループ代表塩基配列について行い、表２を完成する。
【００９５】
表2は、ターゲット及びサンプルがどちらも1検体のみを含む場合の例であるため、各ローカスのプライマー毎のサブグループ数は通常1又は2のいずれかの場合しかない。しかし、一つの検体の同一ローカス、同一プライマーのグループに含まれるサブグループが3以上になる場合には、前述のように、複数個体由来のＤＮＡが混在する検体である可能性がある。そのような検体について表2と同様の表を作成すれば、ターゲット及びサンプルのどちらかまたは両方の検体について、サブグループ数が3以上含まれるローカスはどれなのか、また同一ローカス、同一プライマーのサブグループ数が３以上となる頻度はどれくらいか、ということも、一目でわかるようになる。例を表３に示した。
【表３】
2020054271.tif 000005
【００９６】
表3においては、ターゲット検体のローカス番号１には、プライマー番号１，２共に2つのサブグループが存在する。プライマーは通常、１と２のペアで1つのアリルのＤＮＡフラグメントを規定するものであり、2倍体生物であるヒトのアリルは通常2つであることを考慮すると、ターゲット検体に含まれる個体数は１であると考えて矛盾はない。一方、サンプル検体のローカス番号１には、プライマー番号１，２共、3つのサブグループが存在するため、上述のように、サンプル検体は複数個体の混合検体である可能性が考えられる。さらに当該一覧表の中で、複数のローカスで3つ以上のサブグループが検出された場合には、サンプル検体には複数個体由来のＤＮＡが混在している可能性が、より強く示唆される。
【００９７】
このように、ローカスサブグループ代表塩基配列の比較結果表を提供することで、検体中に複数個体由来のＤＮＡが混在する可能性があることが分る。
【００９８】
さらに、複数個体由来のＤＮＡが混在する検体と単一個体のＤＮＡのみが含まれる検体、または複数個体由来のＤＮＡが混在する検体同士について、表３のようなローカスサブグループ代表塩基配列の比較結果表を作成すると、比較する検体の両方に共通する個体のＤＮＡが含まれている可能性も提示できる。
【００９９】
従って、ローカスサブグループ代表塩基配列の比較結果表により、１）鎖長は等しくても塩基配列が異なるＤＮＡマーカーの識別、２）微量ＤＮＡを用いたＤＮＡマーカーの識別、３）分解されたＤＮＡを用いたＤＮＡマーカーの識別、４）同一検体中の複数個体の混在の検出用資料の提供、及び、５）2つの検体に同一個体由来のＤＮＡが含まれているかどうか、ＤＮＡ鑑定を行う判断材料となる。
【０１００】
次に、ＰＣＲによるＤＮＡマーカーのＤＮＡ増幅を用いない場合の本発明の構成を図１２および図１３で説明する。
【０１０１】
〔実施例３〕  ＤＮＡシーケンサーで読み取ったターゲット検体及びサンプル検体のＤＮＡフラグメントの塩基配列群からのＤＮＡマーカー塩基配列群データベース作成（事前工程にＰＣＲを含まない場合）
ターゲット検体及び／又はサンプル検体から抽出したＤＮＡは、任意の部位で切断されて分解された様々な鎖長のＤＮＡフラグメントの混合物である（図１２上段の図に相当）。これら全てのＤＮＡフラグメントについて、1回の実験で大量の塩基配列データを得られるＤＮＡシーケンサーを用いて塩基配列を決定し、その情報のすべてを、図１２の中段に示すように、検体毎のＤＮＡの塩基配列群としてデータベースに登録する。
【０１０２】
次に、これらの塩基配列の全てを、ＤＮＡ鑑定用のＤＮＡマーカーの全ローカスの塩基配列と照合し、いずれかのローカスの全体又は一部に相当する塩基配列部分を含む塩基配列を抽出して、ターゲットＤＮＡ又はサンプルＤＮＡのマーカー含有フラグメント塩基配列群としてデータベースに登録する（図１２下段の図に相当）。
【０１０３】
続いて、図１３上段から中上段の図のように、検体ＤＮＡのマーカー含有フラグメント塩基配列群に登録された塩基配列のそれぞれから、含有するＤＮＡマーカーの塩基配列に相当する部分だけを抽出して、検体ＤＮＡの全マーカーフラグメント塩基配列群としてデータベースに登録する。（図１３中上段の図）
【０１０４】
登録された全マーカーフラグメント塩基配列群をローカス毎のグループに分類して、検体毎に作成したローカス別塩基配列群のデータベースに、グループを保持したまま移動する。（図１３中上段から中下段の図）
【０１０５】
続いて、移動されたローカス別塩基配列群の同一ローカスのグループに属するすべての塩基配列を相互比較し、共通部分の配列が一致するもの同士のサブグループを作成して、このサブグループ構成を保持したままで、検体毎に作成したターゲットまたはサンプルのＤＮＡマーカー塩基配列群のデータベースに移動する。（図１３中下段から下段の図）上記の図１３の処理を、図１４に沿って説明する。
【０１０６】
（０１０）図１３最上段のターゲットＤＮＡまたはサンプルＤＮＡのマーカー含有フラグメント塩基配列群のデータベースに登録された塩基配列の全てについて、ＤＮＡ鑑定用のＤＮＡマーカー全てと塩基配列を比較し、いずれかのＤＮＡマーカーの塩基配列の全域または一部分に相当する部分の塩基配列だけを全て抽出する。
【０１０７】
（０２０）（０１０）で抽出した塩基配列の全てを、対応するターゲットＤＮＡまたはサンプルＤＮＡの全マーカーフラグメント塩基配列群のデータベースに移動する。
【０１０８】
（０３０）移動した塩基配列群のそれぞれの塩基配列について、その配列が相当するＤＮＡ鑑定用のＤＮＡマーカーのローカス毎にグループ化し、ＤＮＡ鑑定用のＤＮＡマーカーにローカス番号が設定されていればそれに従って、また、設定されていなければゲノム上の位置順に従うなどわかりやすい順番で、ローカス毎にローカス番号Nを名称として与える。全ての塩基配列がローカス毎にグループ化され、それぞれのローカスグループにローカス番号が与えられたら、グループ構造を保持したままで、全塩基配列を検体毎のローカス別塩基配列群のデータベースに移動する。
【０１０９】
（０４０）ＤＮＡマーカーのローカス1から処理を開始するため、ローカス番号の初期値としてN＝１を設定する。
【０１１０】
（０５０）（０３０）で作成したローカスグループ毎に、当該グループに属する全ての塩基配列を相互に比較し、共通部分が一致する塩基配列同士を集めてサブグループを形成する。前述のように、検体に含まれる個体が単一であれば、同一ローカスの同一プライマーグループ内のサブグループ数は、ヒト個体が通常は二倍体であることを反映して、通常2以下となる。検体に含まれる個体が複数であれば、同一ローカスの同一プライマーグループ内のサブグループ数は、3以上となる場合がある。
【０１１１】
（０６０）サブグループを作成した検体がターゲットであるかサンプルであるかを、後の作業で区別する必要が出てくる。作業中の検体がターゲットであれば（０７０）に進み、ターゲットのサブグループであることが分かる名称を与える。作業中の検体がサンプルであれば（０８０）に進んでサンプルのサブグループであることが分かる名称を与える。
【０１１２】
（０７０）作業対象がターゲット検体の塩基配列の場合は、（０５０）で作成した同一ローカスのグループに含まれる全てのサブグループにそれぞれサブグループ番号Uを1から順番に与える。さらに、検体がターゲットであることを明示するため最初にTを加えたサブグループ名TNU（例えばN=1、U=1ならT011）を、それぞれのサブグループに与える。
【０１１３】
（０８０）作業対象がサンプル検体の塩基配列の場合は、（０５０）で作成した同一ローカスのグループに含まれる全てのサブグループにそれぞれサブグループ番号Vを１から順番に与える。さらに、検体がサンプルであることを明示するため最初にSを加えたサブグループ名SNV（例えばN=1、V=1ならS011）を、それぞれのサブグループに与える。
【０１１４】
（０９０）（０７０）および（０８０）で名称を与えられた塩基配列のサブグループを、グループ構造を維持したままで、対応する検体（ターゲット又はサンプル）のＤＮＡマーカー塩基配列群データベースに移動する。
【０１１５】
（１００）ＤＮＡ鑑定用のＤＮＡマーカーのローカスは通常複数あり、それら全てについて上記の作業を行うため、現在のローカス番号Nより大きいローカス番号の有無を判断する必要がある。現在のローカス番号Nより大きいローカス番号が存在する場合は（１１０）へ行き、ローカス番号NをN+1に設定を換えて、（０５０）に戻る。現在のローカス番号Nより大きいローカス番号がなければ、作業を終了する。
【０１１６】
ここまでの処理により、図８下段の図に示すように、ＤＮＡマーカーの塩基配列の全長又は一部分を含む塩基配列が、ローカス毎、及び共通部分が同一塩基配列のサブグループ毎にグループを作った状態で、検体毎のＤＮＡマーカー塩基配列群のデータベースに登録されたことになる。
【０１１７】
この作業を、ＤＮＡ鑑定を行う2つの検体のそれぞれについて行い、ターゲット検体のＤＮＡマーカー塩基配列群及びサンプル検体のＤＮＡマーカー塩基配列群の２つのデータベースを作成する。
【０１１８】
本実施例では、まずＤＮＡマーカー鑑定用の全ローカスの塩基配列のいずれかを含む塩基配列を全て抽出した後にローカス毎のフラグメントの塩基配列またはその一部を抽出したが、最初からローカス毎の塩基配列のいずれか又はその一部の配列のみを抽出してもよく、またこれらの方法に限られない。
【０１１９】
〔実施例４〕  ＤＮＡマーカーの代表塩基配列の比較によるＤＮＡ鑑定のフロー（ＰＣＲを行わない場合）
この処理は、上記で作成したターゲット検体のＤＮＡマーカー塩基配列群及びサンプル検体のＤＮＡマーカー塩基配列群の２つのデータベースを用いて行う。ここで行う処理を、図１５に沿って説明する。
【０１２０】
（１００）ＤＮＡマーカーのローカス1から処理を開始するため、ローカス番号の初期値としてN=1を設定する。
【０１２１】
（２００）ターゲット検体のサブグループ１から処理を開始するため、ターゲットのサブグループ番号の初期値としてU=1を設定する。
【０１２２】
（３００）ターゲット検体のＤＮＡマーカー塩基配列群のローカス番号NのＤＮＡマーカー塩基配列のグループの中からサブグループ番号UのＤＮＡマーカー塩基配列のグループを選択する。
【０１２３】
（４００）選択したターゲット検体のＤＮＡマーカー塩基配列のグループの中から最長の鎖長のＤＮＡマーカー塩基配列を選択し、これをローカスサブグループ代表塩基配列TRNUとする。（例えばローカス番号１、サブグループ番号１のローカスサブグループ代表塩基配列はTR011など）
【０１２４】
（５００）サンプル検体のサブグループ１から処理を開始するため、サンプルのサブグループ番号の初期値としてV=1を設定する。
【０１２５】
（６００）サンプル検体のＤＮＡマーカー塩基配列群のローカス番号NのＤＮＡマーカー塩基配列のグループの中からサブグループ番号VのＤＮＡマーカー塩基配列のグループを選択する。
【０１２６】
（７００）選択したサンプル検体のＤＮＡマーカー塩基配列のグループの中から最長の鎖長のＤＮＡマーカー塩基配列を選択し、これをローカスサブグループ代表塩基配列SRNVとする。（例えばローカス番号１、サブグループ番号１のローカスサブグル−プ代表塩基配列はSR011など）
【０１２７】
（８００）上記で選択したローカス代表塩基配列TRNU及びSRNVを表４に基づいて比較する。
【表４】
2020054271.tif 000006
【０１２８】
（９００）サンプル検体の同一ローカス、同一プライマー配列のグループ内の全てのサブグループに対して（６００）〜（８００）の工程を行う必要があるため、サンプル検体の同一ローカスのグループ内の他のサブグループの有無を判断する。他にサブグループが存在する場合は（１３００）に行ってサンプル検体のサブグループ番号VをV+1に設定換えし、（６００）〜（８００）の作業を繰り返す。他にサブグループが存在しない場合は（１０００）に行く。
【０１２９】
（１０００）ターゲット検体の同一ローカス、同一プライマー配列のグループ内の全てのサブグループに対しても（３００）〜（９００）の工程を行う必要があるため、ターゲット検体の同一ローカスのグループ内の他のサブグループの有無を判断する。他にサブグループが存在する場合は（１４００）に行ってターゲットのサブグループ番号UをU+1に設定換えし、（３００）〜（９００）の作業を繰り返す。他にサブグループが存在しない場合は（１１００）に行く。
【０１３０】
（１１００）全ローカスの処理が完了したかチェックする。完了していない場合は次のローカスの処理をするために（１５００）へ行き、ローカス番号NをN+1に設定を換えて、（２００）からの行程を繰り返す。完了した場合は（１２００）へ行く。
【０１３１】
（１２００）全てのローカスサブグループ毎に、TRNUとSRNVの塩基配列の比較結果の一覧表をたとえば下記のように作成し（表５）、完成したら終了とする。
【表５】
2020054271.tif 000007
【０１３２】
表５においては、ターゲット検体のローカス番号１には2つのサブグループが存在する。一方、サンプル検体のローカス番号１には、3つのサブグループが存在する。このため前述のように、サンプル検体には複数個体由来のＤＮＡが混在している可能性が考えられる。さらに、複数のローカスで3つ以上のサブグループが検出された場合には、この可能性をより強く提示できる。
【０１３３】
このように、ローカスサブグループ代表塩基配列の比較結果表を提供することで、検体中に複数個体由来のＤＮＡが混在する可能性があることがわかる。
【０１３４】
さらに、複数個体由来のＤＮＡが混在する検体と単一個体のＤＮＡのみが含まれる検体、または複数個体由来のＤＮＡが混在する検体同士について、表５のようなローカスサブグループ代表塩基配列の比較結果表を作成すると、比較する検体の両方に共通する個体のＤＮＡが含まれている可能性があることが分る。
【０１３５】
従って、ローカスサブグループ代表塩基配列の比較結果表により、１）鎖長は等しくても塩基配列が異なるＤＮＡマーカーの識別、２）微量ＤＮＡを用いたＤＮＡマーカーの識別、３）分解されたＤＮＡを用いたＤＮＡマーカーの識別、４）同一検体中の複数個体の混在の検出用資料の提供、及び、５）2つの検体に同一個体由来のDNAが含まれているかどうか、ＤＮＡ鑑定を行う判断材料となる。
【産業上の利用可能性】
【０１３６】
本発明はＤＮＡ鑑定に資するデータ表を提供するものなので、犯罪関連のヒトを対象とする分野のみならず、動植物の品種判定等のＤＮＡ鑑定に関連する産業分野においても利用可能である。
【図１】
2020054271.tif 000008
【図２】
2020054271.tif 000009
【図３】
2020054271.tif 000010
【図４】
2020054271.tif 000011
【図５】
2020054271.tif 000012
【図６】
2020054271.tif 000013
【図７】
2020054271.tif 000014
【図８】
2020054271.tif 000015
【図９】
2020054271.tif 000016
【図１０】
2020054271.tif 000017
【図１１】
2020054271.tif 000018
【図１２】
2020054271.tif 000019
【図１３】
2020054271.tif 000020
【図１４】
2020054271.tif 000021
【図１５】
2020054271.tif 000022
【手続補正書】
【提出日】令和1年8月20日(2019.8.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体間で塩基配列の違いがみられる配列を含むＤＮＡマーカーを用いて、ターゲットＤＮＡとサンプルＤＮＡが同一個体に由来するＤＮＡであるかどうか鑑定するための資料を提供する方法であって、以下の工程を含むことを特徴とするＤＮＡ鑑定用資料の提供方法、
（１）ターゲットＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡマーカーのローカスを増幅するプライマーを用いてＰＣＲを行った後、ＤＮＡフラグメントの塩基配列を決定する工程、
（２）工程（１）で塩基配列を決定したＤＮＡフラグメントから、ＤＮＡマーカーもしくはその一部の塩基配列を含むＤＮＡフラグメントを抽出する工程、
（３）工程（２）で抽出されたＤＮＡフラグメントを、塩基配列に基づいて同一ローカス毎のグループ（ローカスグループ）に分ける工程、
（４）工程（３）で分けられたローカスグループ毎に、ローカスグループ内で共通部分の塩基配列が一致するＤＮＡフラグメントをサブグループとして分け、サブグループの中で最長のＤＮＡフラグメントをサブグループ代表フラグメントとして選択する工程、
（５）サンプルＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡマーカーのローカスを増幅するプライマーを用いてＰＣＲを行った後、ＤＮＡフラグメントの塩基配列を決定する工程、
（６）工程（５）で塩基配列を決定したＤＮＡフラグメントから、ＤＮＡマーカーもしくはその一部の塩基配列を含むＤＮＡフラグメントを抽出する工程、
（７）工程（６）で抽出されたＤＮＡフラグメントを、塩基配列に基づいて同一ローカス毎のグループ（ローカスグループ）に分ける工程、
（８）工程（７）で分けられたローカスグループ毎に、ローカスグループ内で共通部分の塩基配列が一致するＤＮＡフラグメントをサブグループとして分け、サブグループの中で最長のＤＮＡフラグメントをサブグループ代表フラグメントとして選択する工程、
（９）工程（４）で選択されたターゲットＤＮＡのサブグループ代表フラグメントと工程（８）で選択されたサンプルＤＮＡのサブグループ代表フラグメントを、ローカス毎に比較する工程、
（１０）以下の（ａ）〜（ｇ）の判断基準に基づいて、ターゲットＤＮＡとサンプルＤＮＡに同一ＤＮＡが存在するか、ローカス毎に求める工程、
（ａ）ターゲットＤＮＡのサブグループ代表フラグメントとサンプルＤＮＡのサブグループ代表フラグメントが共に全長である場合であって、両フラグメントの全長も配列も同一の場合、両フラグメントは一致すると判断する、
（ｂ）ターゲットＤＮＡのサブグループ代表フラグメントとサンプルＤＮＡのサブグループ代表フラグメントが共に全長である場合であって、両フラグメントの全長が異なる場合、両フラグメントは一致しないと判断する、
（ｃ）ターゲットＤＮＡのサブグループ代表フラグメントが全長で、サンプルＤＮＡのサブグループ代表フラグメントが部分配列である場合であって、サンプルＤＮＡの全長が不明な場合、判定不能であると判断する（但し、両フラグメントの配列が一致しない場合は、両フラグメントは一致しないと判断する）、
（ｄ）ターゲットＤＮＡのサブグループ代表フラグメントが全長で、サンプルＤＮＡのサブグループ代表フラグメントが部分配列である場合であって、サンプルＤＮＡのサブグループ代表フラグメントが、ターゲットＤＮＡのサブグループ代表フラグメントよりも長い場合、両フラグメントは一致しないと判断する、
（ｅ）ターゲットＤＮＡのサブグループ代表フラグメントが部分配列で、サンプルＤＮＡのサブグループ代表フラグメントが全長である場合であって、ターゲットＤＮＡの全長が不明な場合、判定不能であると判断する（但し、両フラグメントの配列が一致しない場合は、両フラグメントは一致しないと判断する）、
（ｆ）ターゲットＤＮＡのサブグループ代表フラグメントが部分配列で、サンプルＤＮＡのサブグループ代表フラグメントが全長である場合であって、ターゲットＤＮＡのサブグループ代表フラグメントが、サンプルＤＮＡのサブグループ代表フラグメントよりも長い場合、両フラグメントは一致しないと判断する、
（ｇ）ターゲットＤＮＡのサブグループ代表フラグメントとサンプルＤＮＡのサブグループ代表フラグメントが共に部分配列である場合、判定不能であると判断する（但し、両フラグメントの配列が一致しない場合は、両フラグメントは一致しないと判断する）。
【請求項２】
工程（９）において、工程（４）で選択されたターゲットＤＮＡのサブグループ代表フラグメントと工程（８）で選択されたサンプルＤＮＡのサブグループ代表フラグメントの塩基配列を、サブグループ総当たりでローカス毎に比較することを特徴とする請求項１に記載のＤＮＡ鑑定用資料の提供方法。
【請求項３】
工程（９）において、二つのサブグループ代表フラグメントの短い方のＤＮＡフラグメントの鎖長全域の塩基配列に基づいて、サブグループ代表フラグメントを比較することを特徴とする請求項２に記載のＤＮＡ鑑定用資料の提供方法。
【請求項４】
工程（４）及び工程（８）において、ローカス中のＤＮＡフラグメントを同一塩基配列ごとにサブグループにすることで、サブグループ数が２以上のとき、複数個体のＤＮＡが混在している可能性があることを求めることができる請求項１に記載のＤＮＡ鑑定用資料の提供方法。
【手続補正書】
【提出日】令和1年11月14日(2019.11.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体間で塩基配列の違いがみられる配列を含むＤＮＡマーカーであって、ＳＴＲを含むＤＮＡマーカーを用いて、ターゲットＤＮＡとサンプルＤＮＡが同一個体に由来するＤＮＡであるかどうか鑑定するための資料を提供する方法であって、以下の工程を含むことを特徴とするＤＮＡ鑑定用資料の提供方法、
（１）ターゲットＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡマーカーのローカスを増幅するプライマーを用いてＰＣＲを行った後、ＤＮＡフラグメントの塩基配列を決定する工程、
（２）工程（１）で塩基配列を決定したＤＮＡフラグメントから、ＤＮＡマーカーもしくはその一部の塩基配列を含むＤＮＡフラグメントを抽出する工程、
（３）工程（２）で抽出されたＤＮＡフラグメントを、塩基配列に基づいて同一ローカス毎のグループ（ローカスグループ）に分ける工程、
（４）工程（３）で分けられたローカスグループ毎に、ローカスグループ内で共通部分の塩基配列が一致するＤＮＡフラグメントをサブグループとして分け、サブグループの中で最長のＤＮＡフラグメントをサブグループ代表フラグメントとして選択する工程、
（５）サンプルＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡマーカーのローカスを増幅するプライマーを用いてＰＣＲを行った後、ＤＮＡフラグメントの塩基配列を決定する工程、
（６）工程（５）で塩基配列を決定したＤＮＡフラグメントから、ＤＮＡマーカーもしくはその一部の塩基配列を含むＤＮＡフラグメントを抽出する工程、
（７）工程（６）で抽出されたＤＮＡフラグメントを、塩基配列に基づいて同一ローカス毎のグループ（ローカスグループ）に分ける工程、
（８）工程（７）で分けられたローカスグループ毎に、ローカスグループ内で共通部分の塩基配列が一致するＤＮＡフラグメントをサブグループとして分け、サブグループの中で最長のＤＮＡフラグメントをサブグループ代表フラグメントとして選択する工程、
（９）工程（４）で選択されたターゲットＤＮＡのサブグループ代表フラグメントと工程（８）で選択されたサンプルＤＮＡのサブグループ代表フラグメントを、ローカス毎に比較する工程、
（１０）以下の（ａ）〜（ｇ）の判断基準に基づいて、ターゲットＤＮＡとサンプルＤＮＡに同一ＤＮＡが存在するか、ローカス毎に求める工程、
（ａ）ターゲットＤＮＡのサブグループ代表フラグメントとサンプルＤＮＡのサブグループ代表フラグメントが共に全長である場合であって、両フラグメントの全長も配列も同一の場合、両フラグメントは一致すると判断する、
（ｂ）ターゲットＤＮＡのサブグループ代表フラグメントとサンプルＤＮＡのサブグループ代表フラグメントが共に全長である場合であって、両フラグメントの全長が異なる場合、両フラグメントは一致しないと判断する、
（ｃ）ターゲットＤＮＡのサブグループ代表フラグメントが全長で、サンプルＤＮＡのサブグループ代表フラグメントが部分配列である場合であって、サンプルＤＮＡの全長が不明な場合、判定不能であると判断する（但し、両フラグメントの配列が一致しない場合は、両フラグメントは一致しないと判断する）、
（ｄ）ターゲットＤＮＡのサブグループ代表フラグメントが全長で、サンプルＤＮＡのサブグループ代表フラグメントが部分配列である場合であって、サンプルＤＮＡのサブグループ代表フラグメントが、ターゲットＤＮＡのサブグループ代表フラグメントよりも長い場合、両フラグメントは一致しないと判断する、
（ｅ）ターゲットＤＮＡのサブグループ代表フラグメントが部分配列で、サンプルＤＮＡのサブグループ代表フラグメントが全長である場合であって、ターゲットＤＮＡの全長が不明な場合、判定不能であると判断する（但し、両フラグメントの配列が一致しない場合は、両フラグメントは一致しないと判断する）、
（ｆ）ターゲットＤＮＡのサブグループ代表フラグメントが部分配列で、サンプルＤＮＡのサブグループ代表フラグメントが全長である場合であって、ターゲットＤＮＡのサブグループ代表フラグメントが、サンプルＤＮＡのサブグループ代表フラグメントよりも長い場合、両フラグメントは一致しないと判断する、
（ｇ）ターゲットＤＮＡのサブグループ代表フラグメントとサンプルＤＮＡのサブグループ代表フラグメントが共に部分配列である場合、判定不能であると判断する（但し、両フラグメントの配列が一致しない場合は、両フラグメントは一致しないと判断する）。
【請求項２】
工程（９）において、工程（４）で選択されたターゲットＤＮＡのサブグループ代表フラグメントと工程（８）で選択されたサンプルＤＮＡのサブグループ代表フラグメントの塩基配列を、サブグループ総当たりでローカス毎に比較することを特徴とする請求項１に記載のＤＮＡ鑑定用資料の提供方法。
【請求項３】
工程（９）において、二つのサブグループ代表フラグメントの短い方のＤＮＡフラグメントの鎖長全域の塩基配列に基づいて、サブグループ代表フラグメントを比較することを特徴とする請求項２に記載のＤＮＡ鑑定用資料の提供方法。
【請求項４】
工程（４）及び工程（８）において、ローカス中のＤＮＡフラグメントを同一塩基配列ごとにサブグループにすることで、サブグループ数が２以上のとき、複数個体のＤＮＡが混在している可能性があることを求めることができる請求項１に記載のＤＮＡ鑑定用資料の提供方法。