(57)【要約】      （修正有）【課題】ゲンジボタル（Ｌｕｃｉｏｌａ  ｃｒｕｃｉａｔａ）に由来する核酸を特異的に増幅できる新規な技術の提供。【解決手段】ミトコンドリアＤＮＡ中のシトクロームオキシダーゼサブユニットＩ（ＣＯ１）配列の所定領域を特異的に増幅することができる、第１のプライマーと第２のプライマーと、からなる、ゲンジボタルに由来する核酸を増幅するためのプライマーセット。プライマーセットを用いて、任意の試料から抽出された核酸を鋳型とする核酸増幅反応を行う核酸増幅工程と、核酸増幅反応による増幅産物を解析する解析工程とを含む、ゲンジボタルの検出方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１の塩基配列を含む第１のプライマーと、配列番号２の塩基配列を含む第２のプライマーと、からなる、ゲンジボタルに由来する核酸を増幅するためのプライマーセット。
【請求項２】
請求項１に記載のプライマーセットを用いて、任意の試料から抽出された核酸を鋳型とする核酸増幅反応を行う核酸増幅工程と、
前記核酸増幅反応による増幅産物を解析する解析工程と、
を含む、ゲンジボタルの検出方法。
【請求項３】
請求項１に記載のプライマーセットを含む、ゲンジボタルの検出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プライマーセット、ゲンジボタルの検出方法、及びゲンジボタルの検出キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ゲンジボタル（学名：Ｌｕｃｉｏｌａ  ｃｒｕｃｉａｔａ）は、日本に生息する水生ボタルの１種である。ゲンジボタルは清浄な水質で生育するため、豊かな環境の指標生物として注目されている。
【０００３】
環境中に特定の生物が生育しているかを同定する方法としては、核酸増幅反応（ポリメラーゼ連鎖反応等）を用いた方法が知られる。例えば、特許文献１及び２には、このような方法を用いることで特定の微生物を検出する方法が提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１５−１３９４４２号公報
【特許文献２】特開２０１１−２１７６９５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、ゲンジボタルを特異的に検出できる技術は十分に確立されていない。
【０００６】
本発明は、上記の状況に鑑みてなされたものであり、ゲンジボタルに由来する核酸を特異的に増幅できる新規な技術の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、核酸増幅反応において、ゲンジボタルのミトコンドリアＤＮＡにおける所定領域を増幅するプライマーセットを用いることで上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。具体的に、本発明は以下を提供する。
【０００８】
（１）  配列番号１の塩基配列を含む第１のプライマーと、配列番号２の塩基配列を含む第２のプライマーと、からなる、ゲンジボタルに由来する核酸を増幅するためのプライマーセット。
【０００９】
（２）  （１）に記載のプライマーセットを用いて、任意の試料から抽出された核酸を鋳型とする核酸増幅反応を行う核酸増幅工程と、
前記核酸増幅反応による増幅産物を解析する解析工程と、
を含む、ゲンジボタルの検出方法。
【００１０】
（３）  （１）に記載のプライマーセットを含む、ゲンジボタルの検出キット。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、ゲンジボタルに由来する核酸を特異的に増幅できる新規な技術が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ゲンジボタルの成虫体から抽出したＤＮＡの希釈系列を用いた検量線を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明の実施形態について詳細に説明するが、本発明はこれに特に限定されない。
【００１４】
＜プライマーセット＞
本発明のプライマーセットは、ゲンジボタル（学名：Ｌｕｃｉｏｌａ  ｃｒｕｃｉａｔａ）に由来する核酸を増幅するためのプライマーセットであり、以下の２つのプライマーからなる。
（１）配列番号１の塩基配列（５’−  ＧＴＣＣＴＣＡＧＴＡＧＡＣＣＴＹＧＣＡ  −３’）を含む第１のプライマー
（２）列番号２の塩基配列（５’−  ＧＧＴＣＡＡＡＡＧＴＴＡＴＴＣＣＧＡＧＧＧ  −３’）を含む第２のプライマー
【００１５】
本発明のプライマーセットは、核酸増幅反応において用いられ、ゲンジボタルのミトコンドリアＤＮＡ中、シトクロームオキシダーゼサブユニットＩ（ＣＯ１）配列の所定領域を特異的に増幅することができる。本発明のプライマーセットを用いた核酸増幅反応で得られる増幅産物の塩基配列長は、通常、約１１９ｂｐである。ただし、核酸増幅反応時に生じる非特異的な塩基の侵入（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）や欠失（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）等により、この値は前後する場合がある。
【００１６】
本発明のプライマーセットを用いて増幅される核酸は、ＤＮＡである。
【００１７】
本発明のプライマーセットを構成するプライマーは、オリゴヌクレオチドの合成法として知られる任意の方法によって合成できる。
【００１８】
（第１のプライマー）
配列番号１の塩基配列を含む第１のプライマー（以下、単に「第１のプライマー」ともいう。）は、核酸増幅反応におけるフォワードプライマー（センスプライマー）に相当する。第１のプライマーは、配列番号１の塩基配列からなるものであってもよく、配列番号１の塩基配列の５’末端及び／又は３’末端に、計１〜３０塩基が付加されたものであってもよい。配列番号１の塩基配列に付加される塩基は、ゲンジボタルのＣＯ１の塩基配列や、得られるプライマーのＴｍ予測値等に基づき適宜設計できる。
【００１９】
第１のプライマーは、好ましくは配列番号１の塩基配列からなる。
【００２０】
（第２のプライマー）
配列番号２の塩基配列を含む第２のプライマー（以下、単に「第２のプライマー」ともいう。）は、核酸増幅反応におけるリバースプライマー（アンチセンスプライマー）に相当する。第２のプライマーは、配列番号２の塩基配列からなるものであってもよく、配列番号２の塩基配列の５’末端及び／又は３’末端に、計１〜３０塩基が付加されたものであってもよい。配列番号２の塩基配列に付加される塩基は、ゲンジボタルのＣＯ１の塩基配列や、得られるプライマーのＴｍ予測値等に基づき適宜設計できる。
【００２１】
第２のプライマーは、好ましくは配列番号２の塩基配列からなる。
【００２２】
＜ゲンジボタルの検出方法＞
本発明の検出方法は、本発明のプライマーセットを用いて、任意の試料から抽出された核酸を鋳型とする核酸増幅反応を行う核酸増幅工程と、該核酸増幅反応による増幅産物を解析する解析工程と、を含む。
【００２３】
（核酸増幅工程）
核酸増幅工程は、任意の試料から抽出された核酸を鋳型として、本発明のプライマーセットを用いて核酸増幅反応を行い、ゲンジボタルのＣＯ１の所定領域の増幅産物を得る工程である。鋳型となる核酸は、通常、ＤＮＡである。
【００２４】
本発明において「任意の試料」としては、特に限定されないが、任意の環境（水辺地、飼育槽等）から、任意の方法で採取された試料を用いることができる。このような試料としては、例えば、水、土壌、底泥、排泄物、死骸（成虫、幼虫等）、脱皮ガラ、蛹室、卵等が挙げられる。
【００２５】
試料からの核酸の抽出方法としては、特に限定されないが、従来知られた核酸抽出方法を採用できる。例えば、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（例えば、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（質量比）＝２５：２４：１）溶液や、市販のキットを用いて核酸抽出を行ってもよい。
【００２６】
抽出した核酸は、ろ過等により、適宜濃縮してもよい。
【００２７】
核酸増幅反応としては、従来知られた核酸増幅方法を採用できる。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）等が挙げられる。
【００２８】
核酸増幅反応においては、本発明のプライマーセット及び鋳型となる核酸とともに、緩衝剤、４種の塩基（ｄＮＴＰ）、酵素（ＤＮＡポリメラーゼ等）、プローブ等を用いることができる。
【００２９】
核酸増幅反応の条件は、用いる酵素の種類等に応じて適宜設定でき、通常、温度及び時間を適切に設定し、変性、アニーリング、及び伸張からなるサイクルを繰り返して行われる。
【００３０】
核酸増幅反応によって得られた増幅産物は適宜精製してもよい。
【００３１】
（解析工程）
核酸増幅反応によって、ゲンジボタルのＣＯ１の所定領域を特異的に増幅することができる。例えば、ゲンジボタル以外の生物（ヘイケボタル等）に由来する核酸を用いても、核酸増幅反応によって目的の増幅産物（通常は約１１９ｂｐ）は得られない。かかる点を利用し、核酸増幅工程で得られた増幅産物が、ゲンジボタルのＣＯ１の所定領域の増幅産物であるかの解析を行うことで、ゲンジボタルの検出を行うことができる。
【００３２】
本発明において「ゲンジボタルを検出する」とは、解析対象である試料を採取した地にゲンジボタルが存在していたかを判定することを意味する。例えば、解析工程において、目的の増幅産物（通常は約１１９ｂｐ）が得られれば（又は得られなければ）、その試料を採取した地にゲンジボタルが存在していた（又は存在しなかった）と判定できる。さらに、解析工程において増幅産物を定量することで、試料を採取した地におけるゲンジボタルの生息数を推定し得る。
【００３３】
増幅産物の解析方法としては、目的とする増幅産物の存否の判定や、増幅産物の配列の特定や、増幅産物中の核酸（ＤＮＡ等）の定量等ができる任意の方法を採用できる。このような方法としては、電気泳動法、塩基配列のシークエンス解析、定量ＰＣＲ等が挙げられる。
【００３４】
電気泳動法は、増幅産物をアガロースゲル等で電気泳動後、ゲル染色することで、目的の増幅産物（通常は約１１９ｂｐ）の存否を判定する方法である。
【００３５】
シークエンス解析は、増幅産物の塩基配列を特定する方法である。シークエンス解析の方法としては、サンガー法や次世代シーケンサーを用いた手法等が挙げられる。このように特定された塩基配列を、塩基配列データベース（例えば、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ）を用いて照会し、ゲンジボタルの塩基配列との配列同一性が高ければ（例えば、配列同一性が好ましくは９５〜１００％、より好ましくは９７〜１００％であれば）、目的とする増幅産物が得られたことがわかる。
【００３６】
定量ＰＣＲ（リアルタイムＰＣＲ等）は、蛍光プローブや、ＳＹＢＲグリーンを用いて、核酸増幅反応と同時に蛍光強度を測定して増幅産物を定量する方法である。このような方法は、核酸増幅工程と解析工程とが同時に行われる方法に相当する。定量ＰＣＲにおいて用いられる好ましい蛍光プローブとしては、Ｈｙｐｅｒｃｏｏｌ法（日本遺伝子研究所）によって修飾されたものが挙げられる。
【００３７】
定量ＰＣＲにおいて、本発明のプライマーセットとともに用いることができる好ましいプローブとして、配列番号３に記載された塩基配列（５’−  ＡＴＡＧＴＴＧＡＧＡＴＧＡＡＡＴＴＲＡＣＴＧＣＣＣＣＴＡＡＡ  −３’）を含むものが挙げられる。このプローブには、５’末端側に蛍光物質が付加され、３’末端側にクエンチャーが付加されていてもよい。このような蛍光プローブとして、例えば、「５’−  ＦＡＭ−ＡＴＡＧＴＴＧＡＧＡＴＧＡＡＡＴＴＲＡＣＴＧＣＣＣＣＴＡＡＡ−ＢＨＱ  −３’」（「ＦＡＭ」は、蛍光物質であるフルオレセインを意味し、「ＢＨＱ」は、ブラックホールクエンチャーを意味する。）が挙げられる。
【００３８】
本発明の検出方法によってゲンジボタルの検出を行うことで、試料を採取した地のホタルの生息有無や、ホタルが蛹化した場所、ホタルの産卵有無を推定することができる。さらには、試料を採取した地がホタルの生育に適しているかを評価することもできる。
【００３９】
＜ゲンジボタルの検出キット＞
上記のとおり、本発明のプライマーセットは、核酸増幅反応を用いる系において、ゲンジボタルに由来する核酸を特異的に増幅できる。そのため、本発明のプライマーセットは、ゲンジボタルの検出キットに好適に含めることができる。ゲンジボタルの検出キットには、本発明のプライマーセットとともに、ＤＮＡ抽出用試薬、核酸増幅反応（ＰＣＲ等）用試薬、核酸増幅反応産物の検出用試薬等が含まれていてもよい。
【実施例】
【００４０】
以下に、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００４１】
＜試験１＞
本試験では、本発明のプライマーセットを用いた定量ＰＣＲによる、各種試料中のゲンジボタルＤＮＡの検出可能性を検証した。なお、本例で用いたプローブは、Ｈｙｐｅｒｃｏｏｌ法（日本遺伝子研究所）を用いて設計した。
【００４２】
（１）試料の準備
試料として、以下のものを用意した。
（試料１−１）ゲンジボタルの成虫体の死骸（２個体）
（試料１−２）ゲンジボタルの成虫体の脱皮ガラ
（試料１−３）ゲンジボタルの幼虫体の死骸
（試料１−４）ゲンジボタルの幼虫体の糞
（試料１−５）ゲンジボタルを飼育した水槽から採取した水（異なる２つの水槽から採取した）
（試料１−６）ゲンジボタルが生息していることが確認された野外地から採取した水（互いに離れた３地点から採取した）
（試料１−７）トビケラ（学名：Ｔｒｉｃｈｏｐｔｅｒａ）の幼虫体の死骸
（試料１−８）カワゲラ（学名：Ｐｌｅｃｏｐｔｅｒａ）の成虫体の死骸
（試料１−９）滅菌蒸留水
【００４３】
なお、上記試料のうち水試料（試料１−５、１−６、１−９）は、滅菌処理を行った１Ｌの採水瓶を用いて採取後、アスピレーターを用いて吸引ろ過したものである。ろ過には、０．２μｍのセルロースアセテート製滅菌済みのろ紙（アドバンテック社製）を使用した。
【００４４】
（２）試料からのＤＮＡ抽出−１
以下の方法により、各水試料（試料１−５、１−６、１−９）からＤＮＡを抽出した。
【００４５】
（２−１）ＤＮＡ抽出バッファーの調製
以下の組成を有するＤＮＡ抽出バッファーを調製した。
表１に記載された組成を有するＤＮＡ抽出バッファー：１００ｍＬ
２０％  ＳＤＳ（ｐＨ７．２）：５０ｍＬ
イソプロパノール：５００ｍＬ
３Ｍ  酢酸ナトリウム：１００ｍＬ
ＴＥバッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）：１００ｍＬ
７．５Ｍ酢酸カリウム：５０ｍＬ
フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（質量比＝２５：２４：１）溶液：５００ｍＬ
７０％  エタノール水溶液：５００ｍＬ
プロテイナーゼＫ溶液：２５ｍＬ
【００４６】
【表１】
2020195346.tif 000002
【００４７】
（２−２）ＤＮＡの抽出
ろ紙を入れた１５ｍＬ遠沈管に１０ｍＬのＤＮＡ抽出バッファーを添加し、懸濁した。懸濁後、プロテイナーゼＫ  ０．５ｍｇ相当を添加し、３７℃、３０分間インキュベートした。インキュベート後、ＳＤＳ（２０％）を１ｍＬ添加し、６５℃、９０分間撹拌しながら、さらにインキュベートした。
インキュべート後、６０００ｇ、１０分間、室温（１５℃）で遠心した。遠心後に得られた上清を２本の１５ｍＬ遠沈管に等量になるように分注し、上清と等量のイソプロパノール、及び上清の１０分の１量の３Ｍ酢酸Ｎａを添加し、撹拌した。撹拌後、１０，０００ｇ、１５分間、４℃で遠心した。
遠心後、上清をデカンテーションで捨てた。デカンテーション後、残った沈殿にＴＥバッファーを２００μＬずつ添加し、懸濁した。懸濁後の試料を１．５ｍＬマイクロチューブに回収し、７．５Ｍ  酢酸カリウムを最終濃度０．５Ｍとなるように添加し混合した。混合後、４℃、５分間でインキュベートした。
インキュベート後、１５，０００ｒｐｍ、２０分間、４℃で遠心した。
遠心後、上清を２．０ｍＬマイクロチューブに移し、上清と等量のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（質量比＝２５：２４：１）溶液を添加した。添加後、１０秒間ボルテックス撹拌し、さらに、１５，０００ｒｐｍ、１０分間、４℃で遠心した。
遠心後、上清のみを１．５ｍＬのマイクロチューブにピペットで移した。上清と等量のイソプロパノール、及び上清の１０分の１量の３Ｍ酢酸ナトリウムを添加し、撹拌した。撹拌後、１５，０００ｒｐｍ、１５分間、４℃で遠心した。
遠心後、上清をデカンテーションで捨て、冷やした４００μＬ  ７０％エタノール水溶液を添加し、撹拌した。その後、１５０００ｒｐｍ、５分間、４℃遠心した。沈殿物を吸わないようにピペットで上清を除き、沈殿を乾燥させた。
乾燥後、ＴＥバッファーを３０μＬ添加し、撹拌してペレットを溶解させ、ＤＮＡ抽出液を得て、これを−２０℃で冷凍庫で保存した。
【００４８】
（３）試料からのＤＮＡ抽出−２
商品名「ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  Ｓｏｉｌ用キット」（マッハライ・ナーゲル社製）を用いて、各昆虫体由来試料（試料１−１、１−２、１−３、１−４、１−７、１−８）からＤＮＡを抽出した。
【００４９】
（４）定量ＰＣＲ
上記（２）及び（３）で抽出したＤＮＡを用いて、ＴａｑＭａｎ  ｐｒｏｂｅ法による定量ＰＣＲを表２に示す条件で行った。なお、表２に記載された「プローブ」において、「ＦＡＭ」は、蛍光物質であるフルオレセインを意味し、「ＢＨＱ」は、ブラックホールクエンチャーを意味する。
【００５０】
【表２】
2020195346.tif 000003
【００５１】
（５）結果
図１に、試料１−１より抽出したＤＮＡの希釈系列（０．１〜０．０００００１倍）を用いた検量線を示す。図１中、Ｃｔ値は、検量線を設定するプログラム（使用機器「ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ２．０」に内蔵されたもの）を用いて算出した最適値である。図１においては、Ｃｔ値が低いほど、試料中のＤＮＡ量が多いことを意味する。
また、表３に、試料１−１の上記希釈系列、及び、試料１−２乃至１−９より採取したＤＮＡの希釈系列（０．１又は０．０１倍）を用いた結果を示す。なお、表３中、「Ｎ．Ｄ．」は、Ｃｔ値が高すぎ、値を特定できなかったこと（つまり、試料中にＤＮＡがほぼ含まれていないこと）を意味する。
【００５２】
【表３】
2020195346.tif 000004
【００５３】
図１及び表３に示されるとおり、本発明のプライマーセットを用いた定量ＰＣＲにより、ゲンジボタル由来のＤＮＡ試料（試料１−１乃至１−６）を、いずれも良好に増幅することができた。
【００５４】
他方、ゲンジボタルに由来しないＤＮＡ試料（試料１−７乃至１−９）は、本発明のプライマーセットを用いた定量ＰＣＲにより増幅されなかった。このことから、本発明のプライマーセットを用いた定量ＰＣＲにより、ゲンジボタル由来のＤＮＡ試料を特異的に増幅できることがわかった。
【００５５】
＜試験２＞
本試験では、本発明のプライマーセットを用いた定量ＰＣＲによる増幅産物の解析を行った。
【００５６】
（１）試料の準備
試料として、以下のものを用意した。なお、試料２−３−１及び試料２−３−２は、それぞれ異なる地点から採取した水である。
（試料２−１）ゲンジボタルの成虫体
（試料２−２）ゲンジボタルを飼育した水槽から採取した水
（試料２−３−１）ゲンジボタルが生息していることが確認された野外地から採取した水−１
（試料２−３−２）ゲンジボタルが生息していることが確認された野外地から採取した水−２
（試料２−４）ヘイケボタル（学名：Ｌｕｃｉｏｌａ  ｌａｔｅｒａｌｉｓ）の成虫体
【００５７】
（２）試料からのＤＮＡ抽出
上記試料のうち水試料（試料２−２、２−３−１、２−３−２）は、上記「（１）試料の準備」と同様にろ過した後、上記「（２）試料からのＤＮＡ抽出−１」と同様にＤＮＡを抽出した。
【００５８】
上記試料のうち、成虫体試料（試料２−１、２−４）からは、商品名「ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  Ｉｎｓｅｃｔ用キット」（マッハライ・ナーゲル社製）を用いてＤＮＡを抽出した。
【００５９】
（３）定量ＰＣＲ
上記（２）で抽出したＤＮＡを用いて、ＴａｑＭａｎ  ｐｒｏｂｅ法による定量ＰＣＲを表４に示す条件で行い、ＰＣＲ増幅産物を得た。なお、試料２−１及び２−２からの抽出ＤＮＡのＰＣＲでは（定量ＰＣＲ用試薬組成−１）及び（反応サイクル−１）を採用した。試料２−３−１、２−３−２、及び２−４からの抽出ＤＮＡのＰＣＲでは（定量ＰＣＲ用試薬組成−２）及び（反応サイクル−２）を採用した。
【００６０】
なお、下記プライマー配列を用いて得られるＰＣＲ増幅産物は、通常は約１１９ｂｐである。
【００６１】
【表４】
2020195346.tif 000005
【００６２】
（４）ＰＣＲ増幅産物のシークエンス解析
上記（３）で得られたＰＣＲ増幅産物を電気泳動し、配列長さが１１７ｋｂ前後にあるバンドからＤＮＡを回収し、「ｉｌｌｕｓｔｒａ  ＥｘｏＳｔａｒ」（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて精製した。得られた精製ＤＮＡを、表５に示す条件でシークエンス解析した。シークエンス解析はサンガー法を用いた。
【００６３】
なお、試料２−４からはＰＣＲ増幅産物が得られなかったため、下記のシークエンス解析を行っていない。
【００６４】
【表５】
2020195346.tif 000006
【００６５】
（５）シークエンス解析の結果
各ＤＮＡ試料について特定された塩基配列について、塩基配列データベース（ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐｓ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ？ＰＡＧＥ＿ＴＹＰＥ＝ＢｌａｓｔＳｅａｒｃｈ））を用いて検索した。各塩基配列と最も配列同一性が高い塩基配列のアクセッション番号と、その配列同一性を表６に示す。
【００６６】
【表６】
2020195346.tif 000007
【００６７】
表６に示されるとおり、ゲンジボタル自体やその生育場所に関連する試料（すなわち、試料２−４以外）から抽出したＤＮＡのＰＣＲ増幅産物は、いずれもゲンジボタルの塩基配列と高い同一性を示した。このような結果は、ゲンジボタルに関連しない試料（試料２−４）では得られなかった。
【００６８】
以上のことから、本発明のプライマーセットは、ゲンジボタルに由来するＤＮＡを特異的に増幅でき、ゲンジボタルの検出に好適であることがわかった。
【図１】
2020195346.tif 000008
【配列表】
2020195346000001.app