(57)【要約】      （修正有）【課題】核酸を細菌に送達することができる、治療用細菌ファージ、改変ファージを作製するための系、組成物および方法、ならびに、核酸を細菌に送達するための該改変ファージの使用の提供。【解決手段】少なくとも１つの治療用配列、および、インビボで少なくとも１種の標的細菌に付着するように設計された受容体結合蛋白質を含む、ファージ由来の粒子であって、少なくとも１つの治療用配列が、標的細菌中で発現してよく、発現した治療用配列が標的細菌にとって非致死性である、ファージ由来の粒子。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの治療用配列；および
インビボで、少なくとも１種の標的細菌に付着するように設計された受容体結合蛋白質
を含む、ファージ由来の粒子であって、少なくとも１つの治療用配列が、標的細菌中で発現してよく、発現した治療用配列が標的細菌にとって非致死性である、
ファージ由来の粒子。
【請求項２】
標的細菌が消化管内にある、請求項１記載のファージ粒子。
【請求項３】
標的細菌が気道内にある、請求項１記載のファージ粒子。
【請求項４】
標的細菌が皮膚上にある、請求項１記載のファージ粒子。
【請求項５】
非複製性である、請求項１記載のファージ粒子。
【請求項６】
治療用配列がＤＮＡおよび/またはＲＮＡ配列である、請求項１記載のファージ粒子。
【請求項７】
標的細菌中で発現することのできる、少なくとも１種の異種性核酸配列を含み、発現した該異種性核酸配列が標的細菌に対して非致死性であるファージ粒子であって、非複製性である、ファージ粒子。
【請求項８】
異種性の核酸配列がＤＮＡおよび/またはＲＮＡであってよい、請求項７記載のファージ粒子。
【請求項９】
異種性の核酸配列が、治療用産物の発現および標的化のための調節配列をコードする、請求項７記載のファージ粒子。
【請求項１０】
ファージ粒子が、パッケージング細胞株においてのみ形成し得るように、ファージ遺伝子が欠損している、パッケージングされた治療用ファージゲノムを含む、請求項７記載のファージ粒子であって、核酸配列がパッケージングされた治療用ファージゲノム中に自家性カセットとして存在する、ファージ粒子。
【請求項１１】
ＲＮＡが、非限定的に、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡまたはマイクロＲＮＡのような調節ＲＮＡ配列をコードする、請求項８記載のファージ粒子。
【請求項１２】
ＲＮＡが、調節ＲＮＡの前駆体をコードする、請求項８記載のファージ粒子。
【請求項１３】
複数の外来性核酸配列をさらに含む、請求項７記載のファージ粒子。
【請求項１４】
異種性の核酸配列が、標的細菌中で転写および/または翻訳されたときに、治療効果を奏する、請求項７記載のファージ粒子。
【請求項１５】
異種性核酸配列が、グラム陽性またはグラム陰性である標的細菌中で発現および/または翻訳されることができる、請求項７記載のファージ粒子。
【請求項１６】
異種性核酸配列が、環境中の毒性産物を治療することができる産物をコードする、請求項７記載のファージ粒子。
【請求項１７】
廃棄物の汚染または毒を除くために、ファージ粒子を廃水または産業廃棄物または副生成物に適用し、該ファージ粒子を標的細菌と共投与してよい、請求項１６記載のファージ粒子の適用。
【請求項１８】
異種性核酸配列が、前駆物質を産業製品へと代謝することができる産物をコードする、請求項７記載のファージ粒子。
【請求項１９】
請求項１８記載のファージ粒子の適用であって、該ファージ粒子が、代謝産物の産生または産生の改善のために、産業または環境物質に適用される、ファージ粒子の適用。
【請求項２０】
異種性の核酸配列が、病原体に対する耐性を与えることができる少なくとも１種の産物をコードする、請求項７記載のファージ粒子。
【請求項２１】
ファージ粒子が植物病原体または有害生物の処置のために、植物または土壌に適用される、請求項７記載のファージ粒子の適用。
【請求項２２】
ファージ粒子が病原体を伝達することのできる昆虫に間接的にまたは直接的に適用される、請求項７記載のファージ粒子の適用であって、該ファージ粒子が該昆虫中の感染物質の複製サイクルを妨げる産物をコードする少なくとも１種の遺伝子を含む、ファージ粒子の適用。
【請求項２３】
異種性核酸配列が、治療用エレメント（調節配列を含む）の標的細菌のゲノムへの安定した組み込みを促進することができる少なくとも１つのエレメントをコードする、請求項７記載のファージ粒子。
【請求項２４】
標的細菌中で発現することができおる非溶菌性核酸配列を含む非溶菌性ファージ粒子を含む組成物であって、ファージの子孫を独立して産生することのできない、組成物。
【請求項２５】
標的細菌を認識するためのエレメントも含み、該核酸配列が、ファージ粒子が標的細菌に送達されたときに発現する、請求項１９記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権の主張
本出願は、２０１４年１月２９日に出願された先の米国仮出願第61，933，032号に基づいて優先権を主張する、２０１４年１０月１３日に出願された先の米国仮出願第62，063，031号に基づいて優先権を主張する、２０１４年１２月６日に出願された米国仮出願第62/088，073号に基づく優先権を主張するものであり、これらの出願の内容は、その全体が引用により本明細書中に包含される。
【０００２】
本発明は、核酸を細菌に送達することができる、治療用細菌ファージ、改変ファージを作製するための系、組成物および方法、ならびに、核酸を細菌に送達するための該改変ファージの使用に関する。この点について、遺伝情報を細胞に送達し、該細胞を治療剤の製造用にプログラムできることは、ヒトの健康、工業生産、農業生産、生物工学および化粧品を含む種々の適用に受け入れられる強力な手段である。
【背景技術】
【０００３】
ヒトおよび動物の合成生物学は、疾患を治療し、かつライフスタイルを回復させる能力が劇的に改善している。ヒトにおいて、合成生物学は、がんのような致命的な疾患の治療、新規ワクチンの開発および特定の細胞機能および代謝を調節する意図で、細胞医療および再生医療に適用されている。農業の分野において、作物の生産量を向上させる可能性について、従来の適用が議論され始めている。かかる適用は、また、合成生物技術を用いて、世界に食物を提供する上で有用であり得る。
【０００４】
細菌は、全ての生物体の必須の部分である。原生生物からヒトまでの全ての植物および動物は、複雑な微生物群衆と近接な相関関係にある。例えば、共生細菌フローラ（マイクロバイオームと称する）は、ヒトの体の全細胞の約９０％を構成する。細菌は、腸、粘膜組織および皮膚ならびに、体内の他の環境に存在する。共生微生物の変化は、いくつかの疾患、例えば糖尿病、過敏性腸症候群、肥満およびがんと関連している。反芻動物では、植物の細胞壁バイオマスを蛋白質および脂肪酸に変換するのに複雑なマイクロバイオームが必須であり、コンパニオン動物は、病態に影響を及ぼす高度に複雑な微生物消化管生態系を示す。同様に、植物は、相利共生微生物と、広範囲の関係を示し、これにより、栄養交換が行われる。
【０００５】
過去数十年間、ヒトの体とそこに共生する多数の微生物の関係（すなわち、ヒトマイクロバイオーム）を理解するために、多くの研究が行われてきた。共生微生物は、ヒト細胞に９：１の比率で数で勝っており、ヒトの多くの生物プロセス、例えば食物消化、代謝調節、生物バリアの統合性、神経機能および免疫系の調節における重要な役割により、多くの関心を集めている。特定の細菌集団は、ヒトの体の特定の領域および特定の組織、例えば皮膚、消化管、気道、生殖系および口腔粘膜と関連しており、ヒト細胞および組織と直接接触している半連続的な層を形成する。これらの集団は、そのようなものとして、治療介入の一等地であるニッチを占有し得る。
【０００６】
複雑な微生物群衆は、土壌および水の中で、壊死物質の分解、炭素および硫黄のような無機質の循環への寄与および、植物の成長に重要である、土壌の窒素富化といった、環境中の必須の役割を果たしていることが明らかになっている。
【０００７】
上述のように、特定の環境ニッチ内で、多様かつ複雑な細菌群衆が発見されている。例えば、ヒトの腸内は、腸微生物叢（またはマイクロバイオーム）と称される、非常に複雑、多様で広大な微生物群衆を有する。該ヒト腸微生物叢は、１０１４個の細菌および古細菌からなると推定されている。全体として、腸微生物叢は、ヒトホストゲノムの１５０倍の遺伝子を含んでいると推定されている。ホストに対する実質的に有益な機能への寄与とは別に、この特有で、独立した生態系は、例えば本発明に記載するファージ遺伝子療法の標的として、ホストと生理学的および病理学的に相互作用する、大きな潜在的な可能性を有する。これは、ヒトの皮膚および粘膜の微生物叢、ならびに、動物、植物および環境（水および土壌）に特異的な微生物叢にもあてはまる。
【０００８】
最も一般的な定義において、ファージは、細菌に感染するウイルスである。細菌感染の処置のためのファージの使用（ファージ療法として知られる）が知られている。例えば、ファージは、医学的および産業的な目的の両方、ならびに、遺伝子発見および蛋白質発現の研究のために、抗菌標的感染剤として、抗菌療法および生物工学で用いられている。この点において、該ファージ療法は、病原性の細菌感染を処置するための、バクテリオファージの治療的な使用である。慣用的なファージは、慣用的な抗生物質に応答しない細菌感染を治療的に処置するのに用いられている。この処置は、病原性または標的細菌にファージを感染させること、ファージの複製経路の溶菌サイクルを介して該細菌を破壊することにより、該細菌を除くことを伴う。抗菌目的の該細菌ファージの作製および利用の慣用的な方法が開発され、主にロシアおよび欧州で用いられている。
【０００９】
ファージは、種々の原核生物および真核生物系の研究に用いられており、現在の分子生物学の基本概念の多くは、ファージの遺伝学の研究の結果である。ファージは、多量の異種性の核酸の挿入を適応させることができるため、遺伝子導入物質のクローニングおよび発現の理想的な媒体である。実際に、ファージの産業的および生物工学的な適用がいくつか知られている。生物工学における主要な適用としては、バクテリアファージの、核酸または遺伝的「ライブラリー」スクリーニング、配列決定用の一本鎖ＤＮＡの作製（ＤＮＡ配列決定技術における進歩に伴って有用性が廃れた）およびファージディスプレイのための使用が挙げられる。慣用的な技術は、組換えファージの、複製能および、それ自体またはヘルパーファージの補助により増幅し得る感染性粒子の形成能に依存する。
【００１０】
例えば、ファージディスプレイは、蛋白質を、それをコードする遺伝情報と結びつけるためにバクテリオファージを用いる、蛋白質−蛋白質、蛋白質−ペプチド、および蛋白質−ＤＮＡ相互作用の研究のための研究技術である。この技術では、所望の蛋白質をコードする遺伝子を、ファージコート蛋白質遺伝子に挿入し、これにより、該ファージが、該蛋白質の遺伝子をその内側に含むと同時に、該蛋白質を外側に「ディスプレイ」し、遺伝子型と表現型の関係が示される。これらの、ディスプレイしているファージを、ディスプレイされている蛋白質と他の分子の間に存在する可能性がある相互作用を検出するために、他の蛋白質、ペプチドまたはＤＮＡ配列についてスクリーニングしてよい。この方法により、インビトロ選択と称されるプロセスにより蛋白質の大きいライブラリーをスクリーニングし、増幅させることができる。該ディスプレイファージは、特定の細菌を標的とするように設計されているのではなく、一連の蛋白質との間に存在する可能性のある相互作用を決定するように設計されているに過ぎない。例えば、ファージディスプレイ技術の適用には、蛋白質の機能または作用機序を決定するための、該蛋白質の相互作用パートナーの決定 (該蛋白質は、細胞、組織または器官の全てのコード配列からなるＤＮＡライブラリーとともに、固定化ファージ「ベイト」として用いられる)が挙げられる。
【００１１】
また、遺伝子置換を介して、または新規の遺伝子または調節核酸エレメントを導入することにより、細胞を直接標的化し、リプログラミングすることにより、ヒト疾患の処置の治療的な見込みが得られることは留意すべきである。合成生物学は、革新的な核酸ベースの介入、例えば蛋白質薬剤、ワクチンおよび遺伝子治療剤の作製および投与に不可欠な手段となっている。核酸療法には治療上の広い可能性があるにもかかわらず、安定性、薬物動態、細胞内標的到達性および標的組織の特異性に関する効果的な送達および、臨床的な有用性に大きな制限が存在する。これらの制限を克服するために、多くの異なる方法、例えば種々の核酸封入戦略、核酸の細胞への導入のための機械的および電気的な技術およびウイルスベースの送達系がとられている。いくつかは動物モデルでは成功しているにもかかわらず、ヒトにおける使用は、短期的および長期的な有効性および安全性、免疫原性、挿入変異誘発の危険性、核酸サイズの制限および費用により妨げられている。したがって、インビボで、ヒト疾患の処置のために治療用核酸を、効率的、安全かつ利用可能な方法で送達することができる新規な送達媒体が、切実かつ顕著に必要とされている。
【００１２】
しかしながら、先行技術において、個体、動物、または環境に関係のある天然の微生物叢内の標的細菌に発現させる特定の核酸および遺伝物質の送達媒体としてのバクテリオファージ（ファージ）の使用は全く見られない。本発明の種々の態様に記載するファージの使用は、真核細胞における遺伝子の標的送達および発現のために用いられるアデノウイルスおよびレンチウイルスベクターのような、哺乳類のウイルスベースの遺伝子療法ベクターと同等のものであるが、本発明は、原核細胞における遺伝子および遺伝子産物の発現に関する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の局面は、ヒトホストとマイクロバイオームの間の共生関係を、核酸治療剤の送達に利用している。一の態様において、治療蛋白質およびＲＮＡ分子を、特定の疾患に最も重要な部位においてインビボで発現させるために細菌をプログラムするために、核酸を有効に送達するための新規なプラットホーム技術を開示する。この手法は、従来の手法よりも治療剤の局所的な濃度が高く、全身性効果/オフターゲット効果を低下/最小化させる。現在のワクチンよりもより有効で、より安全であり、製造がより安価である新規のワクチンの作製のために、粘膜表面に関連する細菌を利用してもよい。さらに、本態様を、ヒトにおける病態または微生物の病原性に関連する、微生物とヒトホストの間の重要な相互作用を調節するために、細菌代謝および遺伝子発現の調節因子を送達するのに用いてよい。
【００１４】
本発明の他の態様は、核酸治療剤の送達および治療用遺伝子の発現のための、生物体のマイクロバイオーム内の特定の細菌を標的とするように操作された、繊維状バクテリオファージプラットホームに基づく生物粒子に関する。該バクテリオファージ由来のナノ粒子 (ＢＮＰ) は、インビボの特定の細菌を標的とする。該ＢＮＰは、所望の治療用遺伝子をコードする核酸を保有し、該遺伝子は、送達されると、該標的細菌で発現する。この態様は、真核細胞への核酸送達のための従来の手法とは異なり、ヒト疾患の処置のための核酸送達の方法として、「微生物遺伝子療法」を用いる。この態様は、また、抗菌目的のために、溶菌性ファージを用いる従来のファージ療法とも異なる。本発明の送達プラットホームは、細菌を殺すのではなく；インビボで治療用の核酸を発現させるために生細菌を利用し、該共生生物体を、部位特異的な治療用「工場」とするものである。これは、特定の療法に最も有意義な生物部位に治療用核酸を送達し、それにより、所望する治療剤の局所的な濃度を上昇させ、全身への作用を低下させるという利点を有する。例えば、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を用いてプログラムしたＢＮＰを構築し、インビトロおよびインビボで、ペプチド治療剤をコードする核酸送達のモデルとして特徴付けられてよい。
【００１５】
本発明の他の局面により、例えばヒト消化管、気管および皮膚に関連のある特定の種類の細菌への、柔軟で、拡大縮小が可能であり、調整可能な遺伝子カーゴの送達が可能になる。細菌の種類としては、例えば、肺の緑膿菌（Pseudomonas）、皮膚上のブドウ球菌（Staphylococcus）および消化管内の大腸菌（Escherichia coli）が挙げられる。
【００１６】
他の態様において、本発明の送達プラットホームは、調節可能であり、種々の調節機構下にあり得る、種々の機能の、単一または複数の遺伝子をコードすることができ、種々の共生細菌種にその負荷を送達するために改変されていてよい。送達プラットホームは、治療用ＤＮＡおよびＲＮＡを送達するためにプログラムしてよく、治療用蛋白質の発現、ワクチン接種の戦略および、ヒトの健康および疾患に関連する細菌の生物学的経路の調節に幅広く適用される。
【００１７】
本発明の他の局面は、ＢＮＰが安定しており、多数の製剤に受け入れられるものであり、核酸配列に関して、負荷量に制約がないこと、および免疫原性に問題がないことを利用するものである。ファージ粒子の固有の高い安定性、作製が容易であること、およびこの送達プラットホームのモジュール性により、核酸治療剤を、ホストの戦略領域を標的として送達することが可能になる。
【００１８】
本発明の他の局面は、ヘルパーファージ配列を含む改変細菌および特定のファージミドによる、治療用ファージ粒子の作製方法に関する。ヘルパーファージ配列の有無にかかわらず、細菌は単独では、治療用ファージ粒子を作製することができない。同様に、治療用ファージをコードするファージミドは、単独で、該治療用ファージを作製することができない。特定の治療用ファージ粒子は、細菌が改変ヘルパーファージ配列とファージミドの両方で改変されている場合にのみ作製される。一の局面において、本発明の態様は、治療用ファージ粒子が、パッケージング細胞株においてのみ形成されるように、治療用ファージが、特定のファージ遺伝子を欠損しているという点において、ファージディスプレイと異なる。本発明の他の態様はまた、治療用遺伝子配列が、ファージ表面でのディスプレイのためのｐＩＩＩ蛋白質のコード配列のフレーム内ではなく、自家性の遺伝子カセットとしてファージミドに挿入されるという点において、ファージディスプレイ技術とは異なる。さらに、さらなる他の態様において、該治療用ファージ粒子は、核酸配列のインビボ（ホスト生物体）の特定の標的細菌または環境中の細菌に導入するための送達媒体として用いられる。
【００１９】
技術の適用は、配列のホストゲノムへの組み込みに依存するものではないが、本発明のさらに他の局面は、細菌ホストゲノムに組み込まれた、改変ヘルパーファージゲノム、例えば、非限定的には、大腸菌の繊維状Ｍ１３ヘルパーファージを含む安定な細菌ホスト株に関する。ヘルパーファージは、それ自体では複製およびパッケージングに必要な全ての遺伝子をコードしていないが、該ヘルパーファージを保有することができる細菌株に導入された場合に、感染性のファージ粒子にパッケージングされることができる繊維状ファージに、ｔｒａｎｓでパッケージング機能を提供するファージと定義される。改変ヘルパーファージ遺伝子をコードするプラスミドで細菌株を形質転換することにより、細菌ホスト株を作製する。該細菌株は、改変ヘルパーファージおよびファージミドがともに機能し、特定の治療用ファージ粒子を作製できる任意の細菌株であってよい。例示のために、大腸菌を細菌株の例として用いる。一の態様において、プラスミド中でコードされる改変ヘルパーファージは、次の性質：
１）非溶菌性であること；
２）治療用ファージミド配列によりｔｒａｎｓで提供される異種性のファージの複製およびパッケージングに必要なファージ酵素および核酸配列をコードしていること；
３）パッケージングシグナルを欠くこと；および
４）非抗生物質性の選択マーカーを有していてよいこと、を有する。
【００２０】
本発明の他の態様は、ファージミドに含まれる治療用ファージゲノムに関する。ファージミドは、細菌中でプラスミドとして複製することができ、ヘルパーファージを保有する細菌細胞中に存在するときに、コードされている配列の複製および、感染性のファージ粒子へのパッケージングを可能にする、ファージの複製起点およびパッケージングシグナルを含むファージ配列をコードするＤＢＡプラスミドと定義される。一の態様において、該ファージミド遺伝子は、以下の性質：
１）該ファージミドが、細菌またはファージのプロモーターの制御下で、治療用遺伝子配列をコードしていること；
２）ホストパッケージング株における複製のための複製起点（ｏｒｉ）；
３）標的細菌株の認識（ファージ受容体結合蛋白質（ＲＢＰ））、標的細菌ホストへの付着および侵入に必要なエレメントをコードするファージ構造遺伝子；
４）ヘルパーファージ機能による増幅およびパッケージングに必要なシグナル配列
を有し、
５）非抗生物質性の選択マーカー；治療用遺伝子配列に隣接するマルチクローニングサイト、遺伝子配列のモジュール組み合わせを可能にするファージの付着および調節エレメントを有していてよく；および/または
６）ファージを標的ホストゲノム中に組み込むのに必要な配列エレメントを含んでいてよい、遺伝子操作した、非複製性、非溶菌性のファージをコードする。
【００２１】
パッケージング細胞株を、ファージミド配列により形質転換することによる、ホストパッケージング細胞株と治療用ファージミドの組み合わせにより、ファージミドＤＮＡの合成および、特定の治療用遺伝子のための送達媒体として作用し得るバクテリオファージ粒子へのパッケージングが起こる。（改変）ホストパッケージング細菌細胞株と本ファージミドの組み合わせにより作製される治療用ファージは、１つ以上の重要な特徴、例えば、１−複製欠損；２−非溶菌性；３−外来性の遺伝物質の保有、を有する。この治療用バクテリオファージ粒子は、治療用ファージミド中でコードされるＲＢＰにより特定される、標的細菌が存在する治療部位に送達してよく、必要であれば、後述する治療適用の方法のいずれかにしたがって送達してよい。
【００２２】
本発明の他の態様は、治療用ファージの作製方法であって、ヘルパーファージ配列を含むように細菌を改変する工程、核酸配列を含むファージミドを用いる工程、および該改変細菌および該ファージミドがともに存在するときに、治療用ファージを作製する工程を含む、方法に関する。
【００２３】
一般的に、本発明の種々の局面および態様は、本発明の範囲内において可能である任意の方法で、組み合わせてよい。本発明とみなされる事項を、特に本明細書の末尾の特許請求の範囲において、具体的に挙げ、明確に記載する。
【００２４】
上述の、および他の本発明の特徴および利点は、添付の図と組み合わせた、下記の発明の詳細な説明から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】ヘルパーファージプラスミド１の構成を示す。
【図２】パッケージング細胞株（または改変細菌）２の例を示す。
【図３】ファージミド３の構成を示す。
【図４】治療用ファージ粒子４の構成を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
上述のように、改変細菌２は、（改変）ヘルパーファージ配列１ａを含む。該改変細菌２は、いくつかの方法、例えば分子生物学的な技術および細菌のトランスポゾン系を使用して作製し得る。特定のファージミド３は、ファージの感染性の配列(ｐＩＩＩ)、ファージパッケージングシグナルおよび所望の治療用遺伝子をコードするように構築されている。いずれの配列の発現も、誘導性のプロモーターの制御下にあってよい。
【００２７】
図１に示すように、該ヘルパーファージプラスミド１は、バクテリオファージのパッケージングおよび複製機能をコードする遺伝子を含むヘルパーファージの配列（カセットＩ）を含むが、パッケージングシグナルを欠損しており、ヘルパーファージゲノムのパッケージング(パッケージングシグナル配列)およびファージによる感染の特異性の決定因子であるコード配列 (ＲＢＰ)である、コンピテントファージ受容体結合蛋白質（ＲＢＰ）を欠損していてよい。ヘルパーファージプラスミド１は、例えば、異種性のファージ配列をｔｒａｎｓで複製およびパッケージングするのに必要な、Ｍ１３繊維状ヘルパーファージの配列または他のファージ配列またはその任意の組み合わせであってよい。ファージ蛋白質が、添加する刺激による活性化時にのみ発現するように、ヘルパーファージ遺伝子の発現は、誘導性のプロモーターに制御下にあってよい。他の態様において、ヘルパーファージ遺伝子の転写は、治療用ファージミド３（図３）中にコードされる蛋白質またはペプチドによってのみ活性化され得る。この場合、ホストパッケージング株の、治療用ファージミド３による形質転換により、ファージミド配列の複製およびパッケージングに必要なヘルパーファージ遺伝子が発現し、治療用ファージ粒子４が協調的に産生される（図４）。
【００２８】
図１に示す該ヘルパーファージプラスミドは、また、該ヘルパーファージエレメントを保有する形質転換ホスト細菌株の選択を可能にする、非抗生物質性の選択マーカー（カセットＩＩ）をコードする。該選択マーカーは、毒素を含む増殖培地上での、形質転換細菌の複製に必要な、特定の抗毒素をコードしているか、または、必須の栄養素を欠損した培地上での形質転換細菌の増殖を可能にする代謝機能をコードしていてよい。後者の場合、ヘルパーファージ配列をコードするプラスミドを、栄養要求性のホスト株、例えば、ｇｌｙＡ遺伝子が欠失している大腸菌株に形質導入する。該ｇｌｙＡ遺伝子は、アミノ酸であるグリシンの生合成機能に関連する酵素である、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼをコードする。この株は、培養培地にグリシンを添加した場合、または、該株が機能性のｇｌｙＡ遺伝子を発現するプラスミドで形質転換されている場合にのみ増殖することができる。
【００２９】
この技術の適用は、配列のホストゲノムへの組み込みに依存するものではないが、図１に示すように、第三の構成要素(カセットＩＩＩ)も、プラスミドを細菌ホストゲノムに安定して組み込むために必要な配列をコードする、ヘルパーファージプラスミド１中に存在していてよい。これらの配列は、細菌のトランスポゾンのものであっても、または、ホストゲノムへの安定した組み込みを促進する、他の任意の遺伝子エレメントであってもよい。ヘルパーファージプラスミド１コンストラクト中のカセットＩＶは、ホスト細菌中の、プラスミド配列の増殖および増幅に必要なエレメント、例えば、大腸菌複製起点（Ｏｒｉ）および選択マーカーを含む。カセットＩＶの場合、該選択マーカーは、抗生物質耐性を付与するものであってよい。これらの配列は、一般的に市販されている細菌プラスミドのものであってよい。該配列中には、ファージおよび関連する遺伝子モジュールのクローニングおよび挿入に必要である、操作された、および内在性の、エンドヌクレアーゼ制限部位および、細菌およびファージ遺伝子発現の調節に必要な転写プロモーターおよびターミネーターが存在することが示唆される。
【００３０】
図２は、ヘルパーファージプラスミド１を用いた形質転換により作製されたパッケージング細胞株２の例（すなわち、ファージパッケージング株または細菌株）を示す。該細菌株は、細菌染色体中に組み込まれたヘルパーファージプラスミドを有する。該細菌株は、改変ヘルパーファージ配列１ａおよび特定のファージミド（図３）が、治療用ファージ粒子４（図４）を産生するように機能し得る任意の株であってよい。細菌株を選択し、選択成長培地上で培養することにより、遺伝子型を維持する。該細菌株自体は、感染性のファージ粒子を産生することができず、該ヘルパーファージ配列中１ａにパッケージングシグナルが欠損しているため、該ヘルパーファージ配列１ａは伝達を行うことができない。ヘルパーファージ配列１ａのホスト細菌への安定した組み込みにより、カセット１およびＩＩの、ホスト染色体への挿入が起こる。カセットＩおよびＩＩの挿入に必要な組換えにより、カセットＩＶの欠損が生じる。
【００３１】
図３は、ファージミド３コンストラクトの例を示す。該ファージミド３は、ヘルパーファージプラスミド１の存在下で、コードされたゲノムの合成およびパッケージングに必要なファージ配列（カセットＩ）を含む。これに関して、コードされているゲノムは、治療的な機能をコードしている。治療的な機能は、公知の治療効果であっても、または治験的治療であってもよい。一例において、グルテン不耐性（例えば、セリアック・スプルー病）の処置のために、グルテンを破壊する酵素（グルテナーゼ）をコードする遺伝子をファージミド３において用いてよい。この例において、該治療用ファージ４粒子（図４）は、腸内の細菌を標的とするものであってよい。腸内に導入されると、グルテナーゼ遺伝子を含む治療用ファージ粒子４は、腸内の標的細菌に感染し、それにより、体内の必要とされる部位において、該標的細菌に該酵素を作製および排出させる。ホスト細菌からの発現または排出のレベルを調節するため、または、該治療用産物が、発現および排出されると、生物バリア（例えば腸管腔）を通過するのを補助するために、任意の調節遺伝子を改変してよい。
【００３２】
本発明の治療用ファージ粒子４を用いて標的とし得る、口腔、鼻腔、皮膚等に関連する共生微生物が存在するため、適用は腸に限定されない。ヒトの頭皮は、頭皮の表皮上に連続的な層を形成する、興味深い多くの共生細菌（マイクロバイオーム）を有する。これらの共生細菌はまた、毛包および皮下組織と直接関連があることが明らかになっている。したがって、皮膚マイクロバイオームを含む細菌は、皮膚疾患の処置のための一等地を占めており、インビボ遺伝子療法の理想的な標的である。他の例として、毛包の細菌を、毛髪成長を促進する蛋白質をコードする、特定の治療用ファージ粒子４を用いて標的化してよい。
【００３３】
ファージミド３のファージ配列は、標的細菌においてファージの安定性を維持するのに寄与する遺伝子を含んでいてよい。維持遺伝子の例としては、形質導入ＤＮＡの安定性を補助する、Ｐ１ファージのＤＡＲ（Defense Against Restriction）遺伝子ｄａｒＡおよびｄａｒＢが挙げられる。Ｐ１ファージＤＮＡが、インビトロでタイプＩ制限酵素の適当な基質であっても、該Ｐ１ファージゲノムは、標的細菌中のタイプＩ制限系および修飾系から大きく保護される。この保護は、ファージの頭部に見られ、ＤＮＡとともにレシピエント細胞に注入される、ｄａｒＡおよびｄａｒＢ遺伝子の存在によるものである。治療配列は、ファージミド３コンストラクトのカセットＩＩにコードされており、標的細菌において、インビボで機能的である細菌またはファージのプロモーター（Ｐ２）の制御下において発現する。該プロモーターは、それぞれ、天然で構成的であっても、または、治療用遺伝子が、定常の割合で、または特定の環境刺激下でのみ発現するように、環境刺激により調節されていてもよい。治療用配列は、単一の遺伝子、複数の遺伝子、キメラ蛋白質、ＤＮＡ配列、または調節ＲＮＡ、例えば低分子干渉（ｓｉＲＮＡ）、ノンコーディングＲＮＡ、またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）または該調節ＲＮＡ分子の任意の前駆体をコードしていてよい。コードされる蛋白質は、該遺伝子産物の排出を補助するためのシグナルペプチド、および/または、治療適用に応じて、該遺伝子産物の送達、安定性および活性を補助する他の特定の配列を含んでいてよい。ファージミド３のカセットＩＩＩは、受容体結合蛋白質をコードする配列を含むが、それに限定されないファージ配列をコードし、治療用ファージ粒子４を用いた感染の標的とする、細菌の特異性および範囲を決定する。ファージミド３は、標的細菌のゲノムへの組み込みを促進するＤＮＡエレメントを含んでいてもよい。
【００３４】
例えば、Ｍ１３バクテリオファージのｇ３ｐは、３つの球状ドメインからなり：２つのＮ末端ドメインは、ファージの貫入および吸着に機能し、Ｃ末端ドメインは、ｇ３ｐをウイルス粒子に繋留させる。ｇ３ｐのこの構造/機能の関係は、慣用のファージディスプレイの開発および適用に用いられている。しかし、本プラットホーム治療用ファージミドでは、ｇ３ｐ Ｎ末端ドメインを、異種性の細菌の感染を特定するファージ配列で置換することにより、インビボでの生物学的に関連する部位において、核酸を該細菌に送達することができるＢＮＰを作製することができる。
【００３５】
該ヘルパーファージプラスミド１が改変細菌に挿入されると、ファージミド３の補助により、特異的な治療用ファージ粒子４が作製される。図４は、ファージミド３を、パッケージング細胞株２（すなわち細菌株）に導入することによる、治療用ファージ粒子４の作製を示す。治療用遺伝子配列および受容体結合蛋白質をコードする、ファージミド３コンストラクトを用いたパッケージング細胞株２の形質転換により、治療用ファージ粒子４が作製される。該治療用ファージ粒子４は、治療用ファージの尾部の繊維を構成している認識結合蛋白質により決定されるように、標的細菌に感染するために、インビボで、種々の経路（すなわち、局所、経口、吸入、膣内、直腸、眼内または他の既知適用経路）により送達し得る。標的細菌の感染により、治療用ファージ粒子４の送達および治療用遺伝子配列の発現が引き起こされる。治療用ファージ粒子４はまた、病原体の伝達をすることができる昆虫ベクターに適用して、（直接的または間接的に）環境に適用してもよい。この適用は、例えば、蚊ホスト内でのマラリアまたはデングウイルスの複製サイクルを妨げる産物をコードする１種以上の遺伝子を含む、治療用ファージ粒子４の使用を含む。
【００３６】
治療用ファージ粒子４は、例えば、非溶菌性および、独立した複製を維持することができないといった、いくつかの特性を有していてよい。溶菌性は、その原因となっている遺伝子の変異または欠失により抑止することができる。同様に、細菌中でのファージ複製を維持する遺伝子を、遺伝物質の欠損または変異によりサイレンシングする。治療用ファージ粒子４をインビボで使用できることは、留意すべきことである。治療用ファージ粒子４は、任意の細菌に特異的なものであっても、または、ある範囲の細菌に感染することができるものであってもよく、特異性により、送達部位、すなわち、皮膚微生物、毛包内の微生物、上部腸管、下部腸管、十二指腸、膣環境、またはヒトもしくは動物の他の任意な特異的な部位における微生物に特異的なファージが決定される。
【００３７】
一の態様において、治療用ファージ粒子４を、ホスト生物体（ヒト、動物または植物）のマイクロバイオーム、または環境（例えば土壌）内の特定の細菌に感染させるのに使用する。他の態様において、治療用ファージ粒子４の適用を、生菌調製物、局所適用、または他の適当な適用手法の形態での、標的細菌の使用と組み合わせる。
【００３８】
例えば、局所適用を支持する試験データが、治療用ファージ４の局所適用および、標的とするレポーター遺伝子のマウス皮膚上での発現により示されている。この試験データは、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）配列を特異的に含む、治療用ファージ粒子４を作製するために、２−プラスミド系を構築することにより集めた。ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ) により、ＧＦＰ配列を有する治療用ファージ粒子４の作製を確認した。ＧＦＰを保有する治療用ファージ粒子４を、ＧＦＰをマウス皮膚上の非蛍光細菌に送達するのに用いた。
【００３９】
より具体的には、試験データでは、バクテリオファージナノ粒子（ＢＮＰ）プラットホームは、治療用のファージミドおよび繊維状のファージパッケージングプラスミドからなる。治療用ファージミドは、標的細菌および、作製に用いる大腸菌の両方において複製可能なモジュラーシャトルプラスミドであり、治療用核酸を保有する。さらに、治療用プラスミド（plasgemid）は、繊維状ファージの複製起点、特定の細菌を標的とするためのキメラＭ１３ファージｇ３ｐ蛋白質および、ファージミドｓｓＤＮＡの複製およびＢＮＰへの取り込みに必要なパッケージングシグナルを含む。該パッケージングプラスミドは、バクテリオファージ粒子の複製および集合に必要な配列をコードするが、ファージの複製起点、パッケージングシグナルおよびｇ３ｐ遺伝子を含まない。２つのプラスミドの組み合わせにより、ファージミドＤＮＡ配列のみを含み、パッケージングプラスミドを含まないＢＮＰが作製される。実験室データにより、インビトロおよびインビボにおける、レポーター遺伝子の大腸菌への送達が示された。治療用ファージミドは、Ｍ１３バクテリオファージに基づいて、ＧＦＰ ｃＤＮＡ、ＯＲＩ、ｇ３ｐおよびパッケージングシグナル配列を保有するように操作されている。該パッケージングプラスミドは、Ｍ１３バクテリオファージの複製および集合に必要な配列をコードする。ＢＮＰは、２つのプラスミドを、コンピテントセルであるＤＨ５ａに共形質導入することにより作製し、ＰＥＧ沈殿により精製した。ＧＦＰ−プログラムＢＮＰの個々の調製物を調製し、大腸菌の形質導入に用いた。最初に、ファージミド配列がＢＮＰに選択的にパッケージングされていることを確認するために、個々の調製物をＰＣＲによりアッセイした。次いで、大腸菌Ｋ１２細胞を、６種類のＧＦＰ−プログラムＢＮＰで形質導入し、選択培地（治療用ファージミド選択のためのカナマイシン）上に播種し、ＢＮＰで形質導入された細菌のみを増殖させた。フローサイトメトリーにより解析すると、形質導入された細菌は、強い緑色の蛍光シグナルを示し、パッケージングした遺伝情報の送達および発現が示される。Ｂａｌｂ/Ｃマウスの皮膚剥離モデルを、インビボでのＢＮＰの核酸カーゴの送達能を試験するのに用いた。軽度に皮膚剥離した後、大腸菌を皮膚に適用し、ＢＮＰまたはビヒクル単独（ＴＢＳ）を局所的に加えた。インビトロで、ＧＦＰ−プログラムＢＮＰを形質導入した大腸菌を、陽性対照として皮膚に適用した。適用の２４時間後に皮膚から抽出した細菌において、ＵＶイメージングおよびフローサイトメトリーにより局所適用した領域におけるＧＦＰ発現を調べた。ＢＮＰの投与を受けたマウスのみが、陽性対照と同様の、皮膚上の蛍光シグナルおよび、フローサイトメトリーによる、抽出細菌におけるＧＦＰ発現を示した。このことにより、ＢＮＰは遺伝子カーゴの大腸菌へのインビボでの送達を成功裏になし得ることが確認された。
【００４０】
治療用ファージ粒子４は、単一または多機能の蛋白質、ペプチド、核酸、例えばｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡまたは他の想定される治療上の価値のある任意の分子をコードし得る配列４ａを含む。該治療用遺伝子４ａは、蛋白質、ペプチド、デコイ、抗体および他の任意の治療上関連する分子（産物と称する）をコードしていてよい。コードされる治療用産物は、感染した細菌ホストから分泌されるように設計しても、または、感染したホストの表面に発現するように設計しても、または、標的細菌ホストの特定の生物経路に影響を及ぼすように設計してもよい。該治療用産物は、分泌されて、真核および/または原核標的細胞の表現型に影響を及ぼしてよい。表現型の変化は、生物的な効果または複数の効果を生じる任意の変更を意図している。該治療用産物は、ホスト細菌細胞または真核細胞の内部の生物経路に影響を及ぼしてもよい。該治療用産物は、ホスト細胞膜の表面に露出しており、非分泌性であってもよい。該治療用産物は、天然のものであっても、または、核酸物質の分子生物学的な技術、例えばクローニング、変異導入、組換えまたはシャッフリングにより得られる組み換え体であってもよい。該治療用産物は、非治療用であり、原核細胞および真核細胞の表現型の変化、例えば、皮膚の日焼け、歯のホワイトニングまたは匂いの抑制（感覚または作製）をもたらすものであってよい。治療用産物は、また、免疫応答の誘発または免疫慣用をうみだすことによって、免疫系に影響を及ぼすものであってもよい。
【００４１】
上述のように、治療用ファージ粒子４は、特定の細菌株を標的としていてよく、および/または、治療用ファージ粒子４が、広範囲の細菌を標的としていてよい。特異性は、キャプシドおよび組換えｐＩＩＩ、または、１ファージ株由来であるか、または、２以上のファージ株由来の混合組み合わせであるか、または、ファージと、粒子の標的生物体への付着および侵入を促進する任意のペプチドまたは蛋白質との混合物であってよい。治療用ファージ粒子４は、適当な任意の医薬製剤、例えば、軟膏剤、ゲル剤、パッチ剤、ローション剤、シャンプー、飲料または凍結乾燥ファージを用いて、１以上の送達経路、例えば、経口、局所、非経口、粘膜を用いて送達してよく、徐放送達用に製剤されていてよい。該医薬製剤は、適当な細菌特異性を有する１つのファージ株または複数の細菌株を標的とするために２つ以上のファージ株を含んでいてよい。
【００４２】
該治療用ファージ粒子４は、代謝症候群の処置、口腔衛生、化粧品、ワクチン接種、免疫寛容、蛋白質補充治療剤、農業および産業製品、または、想定される他の適当な治療的または美容的適用に用いてよい。
【００４３】
例えば、該治療用ファージ粒子４を、例えば、産業的な、化学薬品漏出または産業廃棄物における、毒または環境汚染を除くために、環境（土壌または水）に適用してよい。該治療用ファージ粒子４は、また、廃棄物の汚染または毒を除くために、廃水または産業廃棄物または副生成物に適用してよい。この態様において、該治療用ファージ粒子４を、標的細菌と共投与してよい。さらに他の態様において、代謝産物の産生または産生の改善のために、該治療用ファージ粒子４を、産業用または環境物質、非限定的には、例えば、農業産物または食品廃棄物に適用してよい。
【００４４】
本発明の他の局面は、ワクチンの送達に関する。慣用的なワクチンの大部分は、筋肉内または皮下注射により投与され、ホルモン応答を誘発し、広範囲の疾患に対する有効な保護をもたらすことに着目している。しかし、この送達方法は、いくつかの重要な病原体に対するワクチン接種に不適切である。ワクチン接種後の、疾患の保護において、ホルモン応答および細胞応答が、ともに重要な役割を果たすことは明らかになっている。いくつかの場合において、経鼻および肺ワクチン接種が、ホルモンおよび細胞の両方の保護免疫応答誘発において、注射よりも有効であることが示されている。経口、経鼻、直腸または膣内経路を介する粘膜免疫化により、保護的な粘膜免疫応答が最も効率的に誘発される。しかし、粘膜分泌の希釈、粘液ゲル中での捕捉、プロテアーゼおよびヌクレアーゼによる不活化および、上皮バリアによる排除のような、粘膜ワクチンの設計に関連する課題が存在する。これは、粘膜投与には、かなり多量のワクチンが必要になり得ることを意味する。
【００４５】
この点について、治療用ファージ粒子４を、ワクチン送達の改善に使用し得る。該治療用ファージ粒子４を、上気道、肺または腸内の細菌を標的とし、適当な抗原および/または免疫調節因子を発現し、Ｔおよび/またはＢ細胞応答を引き起こすようにプログラムした遺伝子を送達するのに用いる。この場合、標的細菌は、付近の免疫細胞により認識され、免疫応答を誘発する、抗原蛋白質および/または免疫調節因子を発現し、排出する。これにより、共生細菌とリンパ節が近接な関係であることにより、より強い免疫応答がもたらされる。この方法は、免疫系のホルモン性および細胞性部分の両方を成立させるという利点を有する。
【００４６】
例示的な例として、インビトロおよびインビボで大腸菌に特異的であるバクテリオファージナノ粒子の構築および特性決定について、次に詳述する。この例において、大腸菌σ−７０構成的プロモーターの制御下においてルシフェラーゼレポーター遺伝子をコードするＢＮＰを作製するために、合成生物学および標準の分子技術を用いる。レポーターファージミドおよびＭ１３パッケージングプラスミドで形質転換した大腸菌ＤＨ５ａＴ１ｒ細胞を、２ＸＴＹ培地中で培養してよく、粒子は、培養培地からＰＥＧ沈殿させる。
【００４７】
他の例示的な例として、インビトロおよびインビボで緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）に特異的なバクテリオファージナノ粒子の構築および特性決定について、次に詳述する。シュードモナス繊維状ファージｐｆ１ (ＯＲＦ４３７)またはｐｆ３ (ＯＲＦ４８３) 由来のＮ末端配列およびＭ１３のＣ末端ドメインからなる、ｇ３ｐマイナーコート蛋白質キメラをコードする２つの治療用シャトルファージミドを、それぞれ、ＰＡＫ 繊毛(pili)との相互作用を介して、緑膿菌株ＰＡＫに特異的であるか、または、ＲＰ４ 繊毛との相互作用を介して、ＰＡＯ１に特異的であるファージ粒子を構成するように操作してよい。治療用ファージミドはまた、緑膿菌中でプラスミドを複製させ、維持するのに必要な、Ｏｒｉ１６００およびＲｅｐ蛋白質を、大腸菌中のファージ粒子の産生に必要なエレメントとともに含んでいてよい。ルシフェラーゼの発現は、大腸菌の構成的σ７０プロモーターの制御下にあり、該プロモーターは、プロモーターをＯＮにするカナマイシンととともに存在する場合に、シュードモナス中で活性になる。
【００４８】
他の例示的な例として、インビトロおよびインビボにおける、グラム陽性生物モデルとしての、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）に特異的なバクテリオファージナノ粒子の構築および特性決定について、次に詳述する。治療用ファージ粒子４を、ブドウ球菌における複製のために改変し、黄色ブドウ球菌への感染用にキメラｇ３ｐを調整する。鼻孔および上気道における皮膚上の広い分布により、黄色ブドウ球菌をＰＯＣ研究のためのグラム陽性生物のモデルとして選択する。ファージディスプレイを用いて、治療用ファージミドのｇ３ｐ配列を、黄色ブドウ球菌に結合するように調整する。ファージディスプレイスクリーニングのための配列は、公開されているブドウ球菌ファージのファージ尾部の繊維領域および溶解素分子のブドウ球菌該膜結合ドメインに基づいている。キメラｇ３ｐ配列を特定すると、ブドウ球菌複製エレメントと、コドン最適化ルシフェラーゼを発現させるブドウ球菌構成的プロモーターとを含む治療用ファージ粒子４にサブクローニングする。大腸菌とブドウ球菌の間のシャトルプラスミドの制限性を回避するために、ＳＡ８０Ｂ大腸菌細胞 (Lucigen)中で、治療用ファージ粒子４を増幅させてよく、ＢＮＰを作製する。
【００４９】
治療用ファージ粒子４は、疾患に関連するマイクロバイオームの検出用の診断キットの開発に用いてよい。例えば、該ファージは、罹患している間のマイクロバイオームの変化に伴う、特定の細菌の質的および量的な変化を検出することができる。該ファージ診断キットは、体液ならびに組織を使用することができる。該診断機能は、イメージングに適当な蛋白質、例えば蛍光蛋白質をコードする遺伝情報を保有するファージを用いることにより達成される。
【００５０】
同様に、治療用ファージ粒子４を、インビボで、イメージング目的で直接用いることができる。一例として、マイクロバイオーム内で、特定の細菌に対する嗜好性について、プレバイオティクスおよびプロバイオティクスの有効性を評価することができる。経口、局所、エアロゾル、非経口および他の適当な方法で、該ファージをインビボ投与することができる。該ファージが標的とする細菌から、イメージング蛋白質が発現することにより、インビボイメージングが可能になる。
【００５１】
また、治療用ファージ粒子４は、インビボで、免疫調節蛋白質をコードする核酸の送達に使用してよい。これに関して、緑膿菌は、重要な日和見性の病原体である。嚢胞性線維症（ＣＦ）患者では、その異常な気道上皮により、肺における長期間の細菌のコロニー形成が可能になる。持続性の感染、異常粘膜および局所的な炎症の組み合わせにより、最終的に、肺不全および死亡に至る。ＣＦ患者は、炎症を抑制するために、例えば全身性のコルチコイドのような剤による処置を頻繁に受けるが、かかる療法には重大な有害事象が見られる。インターロイキン (ＩＬ)−１０は、ＣＦで発現が減少する、重要な免疫調節サイトカインである [47]。ＩＬ−１０は、炎症性応答を制限して終結させ、いくつかの免疫細胞、例えばＴ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、抗原提示細胞、脂肪細胞および顆粒球の分化および増殖を調節する。さらに、ＩＬ−１０は、感染性および非感染性粒子を、炎症を制限しながら除去するのに有用な免疫刺激性を媒介することが示されている。ＩＬ−１０/ＩＬ−１０受容体系は、新規の治療標的と考えられており、組換えヒトＩＬ−１０は、現在、多数の適応症、例えば関節リウマチ、炎症性腸疾患、乾癬、臓器移植および慢性Ｃ型肝炎の臨床試験において試験されている。炎症部位への局所送達は、この経路の全身標的化よりも有利である。したがって、部位特異的なＩＬ−１０の発現のためのインビボ核酸送達方法は、治療上の広い利点を有する。治療用ファージ粒子４（例えばｐｆ３シュードモナスファージミド）は、緑膿菌ＰＡＯ１で分泌形態のＩＬ−１０を発現させるのに使用し得る。
【００５２】
治療用ファージ粒子４は、また、インビボで、ＲＮＡベースの核酸治療剤の送達に使用し得る。シュードモナスにおける細菌遺伝子発現の調節および、生物界間のＲＮＡｉのためにｓｈＲＮＡを真核細胞へ送達するために大腸菌をプログラムするために、ｓｉＲＮＡをコードする遺伝子の送達および発現のためにＢＮＰを開発し得る。調節ＲＮＡの使用は、従来の小分子療法が成功していない多くの疾患の新規の処置として大きな注目を集めている。近年の臨床試験において、翻訳後遺伝子サイレンシング(ＰＴＧＳ) における治療用リボザイム、アパタマーおよび低分子干渉ＲＮＡ (ｓｉＲＮＡ) の使用により、ＲＮＡベースの核酸療法の広い可能性および有用性が示されている。しかしながら、ＲＮＡの効率的な送達は、ＲＮＡ分子に固有の重要な生物学的および生物物理学的障害、例えば不安定性、潜在的な免疫原性および、合成の、または生物ベースの送達ビヒクルが必要であることにより、妨げられている。しかし、細菌遺伝子発現の調節およびｓｈＲＮＡの哺乳類細胞への送達のためにＲＮＡベースの核酸治療剤をマイクロバイオームに効率的に送達するために、治療用ファージ粒子４を調整することができる。
【００５３】
これについて、ｓＲＮＡ (Small RNA)が、細菌のシグナル伝達および代謝に存在し、調節機能を果たすことが知られている。原核ｓＲＮＡと、その標的ｍＲＮＡとの間の相互作用は配列特異的であり、細菌シャペロンにより媒介され、通常、標的遺伝子翻訳の抑制を引き起こす。共生生物自体とホスト細胞の間のクロストークは、健常な恒常状態を維持するのに機能する。マイクロバイオームの健常状態の破壊(腸内菌共生バランス失調) は、多数の病態と関連しており、天然のマイクロバイオームにおける微生物の遺伝子発現および代謝の変化の結果であり得る。細菌遺伝子発現の調節のために、ＲＮＡベースの核酸治療剤を、マイクロバイオームに有効に送達するために、バクテリオファージナノ粒子技術を調整してよい。
【００５４】
他の例において、治療用ファージ粒子４は、口腔内のジンジバリス菌（Porphyromonas gingivalis）に核酸を送達するためにも使用し得る。背景として、口腔および歯周部の疾患および関連する異常の処置は、医療負担の重要な部分を占めるものであり、これらの症状が機能的および心理的に衰弱をもたらすものであることが示されている。歯肉炎は、大人の人口において高い疾病率を示す、慢性的な炎症性疾患である。それにより、典型的には、歯を支持する構造、例えば歯肉およびその根底にある歯槽骨の破壊が引き起こされ、それは、有害な全身健康状態、例えば、粥状動脈硬化、糖尿病、関節リウマチ、および不都合な妊娠結果（adverse pregnancy outcomes）と関連している。歯周炎の１つの特徴は、好中球の巨大な集積であり、それにより、該疾患は、免疫系の不均衡と関連している。口腔マイクロバイオームの構成要素であるジンジバリス菌は、ヒトの歯周炎と長く関連があり、近年の研究により、ジンジバリス菌は、微生物腸内菌共生バランス失調および炎症促進応答を引き起こす重要な生物であることが示されている。全体的に、ジンジバリス菌は、微生物群全体の成長および発展を変化させる方法で、ホストの防御を損なうことにより、通常は恒常的であるホストとの関係に破壊的な変化を引き起こす。ジンジバリス菌と免疫系細胞、例えば樹状細胞とのクロストークにより、炎症促進性のＴ細胞をリクルートすることができる。さらに、ジンジバリス菌は、Ｔｈ１をリクルートするケモカインの産生ならびに、インターフェロンＩＦＮγの産生を阻害する。非可逆性の組織損傷が、最終的には炎症性のホスト応答により誘発されるものであることから、歯周病の従来の処置、例えば歯石除去、歯根計画、抗生物質の使用および外科的な選択肢は、該疾患を処置するのに十分ではなく、ホストシグナル経路を標的とする戦略を考慮する必要があることが示される。薬理的な抗炎症介入は、動物およびヒトにおける歯周病の進行の予防および遅延化に有効であった。しかし、該療法の副作用プロファイルにより、非ステロイド性抗炎症剤を用いることはできなかった。該疾患の処置に加えて、歯周病治療の直面する課題は、疾患の結果として損失した歯周病組織の再生である。成長因子は、細胞および組織の成長に伝わる細胞外環境を確立するものであるため、口腔組織の発達、成熟、維持および修復に重要である。
【００５５】
この点について、ｇ３ｐのＮ末端ドメインを、ジンジバリス菌への吸収および感染を特定する配列に置換することにより、インビボで核酸を細菌に送達することができるバクテリオファージ粒子が作製される。ＦｉｍＡ線毛を発現するジンジバリス菌への、ＢＮＰの特異的な吸収および侵入を促進するｇ３ｐ配列の特定に、２工程の方法を用いることができる。ジンジバリス菌線毛（fimbriae）は、大腸菌表面の線毛（pili）と同等である。ジンジバリス菌線毛は、付着性の線維状の付属器であり、ジンジバリス菌が細菌とホスト間の相互作用ならびに他の細菌との相互作用の殆ど全てに関与するための主要な病原性因子である。ヒトにおいて、線毛保有ジンジバリス菌は、歯周ポケットでの検出が容易であり、重度の歯周付着喪失部位では、非線毛保有株より頻繁に見られる。すなわち、ＦｉｍＡを発現するジンジバリス菌株は、歯周病の制御および処置における、有効な微生物遺伝子療法の候補である。
【００５６】
工程１において、ジンジバリス菌ＦｉｍＡを発現するように改変した大腸菌を用いたファージディスプレイを、バクテリオファージ粒子をジンジバリス菌に吸収させるための、ｇ３ｐ配列の選択および増幅に用いる。タイプＩＦｉｍＡを、ジンジバリス菌 ＡＴＣＣ ３３２７７からＰＣＲにより増幅し、緑膿菌ＥｓｔＡ (ＮＣＢＩアクセス番号ＡＦ００５０９１)由来の膜貫通シグナルを、組換え蛋白質を大腸菌表面にディスプレイするためのアンカーモチーフとしてコードする大腸菌ｐＥＴ発現ベクターにサブクローニングする。大腸菌ＢＬ２１ (ＤＥ３) 細胞(Ｆ−、ｏｍｐＴ)を、タイプＩＦｉｍＡ発現プラスミドを用いて形質転換し、表面に発現するジンジバリス菌タイプＩＦｉｍＡの誘導性の発現のための安定した細胞株を作製した。ファージディスプレイベクターｆＡＤＬ−１を、ｇ３ｐ Ｎ２ドメイン中に無作為に変異誘発したＤＩＩを有するＰＩＩＩをコードするように改変する (ｆＡＤＬ−１−ｍＮ２)。変異ＤＩＩ−Ｎ２配列を含む遺伝子ブロックを合成し、ｆＡＤＬ−１ベクター中に入れる。該ｆＡＤＬ−１−ｍＮ２プラスミドおよび、変異ＰＩＩＩを発現するファージのプールを、エレクトロコンピテントなＦ１−大腸菌ＴＧ１ ＤＵＯで増殖させる。ファージ粒子を、タイプＩ ＦｉｍＡ発現細胞に感染させるのに使用し、ファージを感染細胞内で増幅させ、該細胞から精製する。精製したファージからｓｓＤＮＡを単離し、ｇ３ｐ Ｎ２の配列を決定する。
【００５７】
工程２において、ジンジバリス菌タイプＩ ＦｉｍＡへの吸収をもたらす、特定したｇ３ｐ Ｎ２配列を、大腸菌(プラスミドＤＮＡの複製およびＢＮＰの産生のため) およびジンジバリス菌の両方で複製可能なファージミドシャトルベクター中にサブクローニングする。該シャトルファージミドは、大腸菌上での増殖のための配列に加えて、ジンジバリス菌のための最小複製起点および、ｐＴＯ−１プラスミド由来のエリスロマイシン耐性カセット、ジンジバリス菌プロモーターの転写制御下のルシフェラーゼレポーター遺伝子および、ｇ３ｐのＮ１ドメインのＮ末端領域に無作為化変異を含むキメラｇ３ｐを含む（図５参照）。大腸菌ＴＧ１ ＤＵＯ細胞に、シャトルファージミドおよび、Ｍ１３パッケージングベクター（クロラムフェニコール[ｃａｔ]耐性カセットを含む）を共形質導入し、形質転換したＴＧ１ ＤＵＯを、カナマイシンおよびクロラムフェニコールを添加した２ＸＴＹ中で選択し増殖させる。ＰＥＧ沈殿により、培養培地からファージ粒子を単離し、濃縮する。感染したジンジバリス菌を、エリスロマイシンを含むＴＳＡ血液寒天培地上に播種し、単一コロニー単離体から精製したプラスミドを、ジンジバリス菌 ＡＴＣＣ ３３２７７に感染させるｇ３ｐ配列の決定のために配列決定する。特定したｇ３ｐ配列を、コドンを最適化したナノルシフェラーゼ（ｎＬｕｃ）レポーター遺伝子[ＲＥＦ]をコードするシャトルファージミド中にサブクローニングし、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を用いてプログラムしたＢＮＰを大腸菌内で構築し、ペプチド治療剤をコードする核酸をジンジバリス菌にインビトロおよびインビボで送達するために特性決定する。
【００５８】
一般的に、ＢＮＰは、ＦｉｍＡ蛋白質の抗原性の差異により、タイプＩ ＦｉｍＡジンジバリス菌株に特異的である。しかし、代替となるＦｉｍＡ蛋白質をコードするための大腸菌ＦｉｍＡ発現プラスミドを用いて、ＢＮＰの範囲を拡大するか、または、特定のＦｉｍＡ蛋白質に調整することができる。
【００５９】
該ＢＮＰを用いることにより、免疫調節蛋白質の有効な局所発現および歯周病と関連する炎症応答の低下のために、核酸治療剤をジンジバリス菌へ送達することができる。例えば、ＢＮＰは、ＩＬ−１０をジンジバリス菌へ送達するためのものであってよい。治療用ファージ粒子４は、ジンジバリス菌のＰＯＲ分泌系のためのシグナル配列を含む、コドン最適化ＩＬ−１０をコードする。ＩＬ−１０は、ＩＬ−１βおよびＴＮＦαの発現を含む炎症応答を制限し、終結させ、いくつかの免疫細胞の分化および増殖を調節し、感染性および非感染性粒子の除去に寄与する免疫刺激性を媒介する、免疫調節サイトカインである。ジンジバリス菌におけるＰＯＲ分泌系は、細胞質から内膜および外膜を通って、細菌外表面および細胞外空間にＣ末端ペプチドシグナルを含む物質を分泌するのに、チャネル複合体を用いる。ファージミドは、コドン最適化ｒＩＬ−１０を発現するか、または、Ｃ末端ＰＯＲ分泌シグナル (ＣＴＤ)をともに発現するように改変されている。ＣＴＤ ＰＯＲ分泌シグナルとともにｎＬｕｃを発現するファージミドは、対照として用いられるように操作されている。ｎＬｕｃは、ＡＴＰ非依存性の生物発光酵素である。
【００６０】
炎症部位への局所送達は、この経路の全身標的化よりも有利であり、ジンジバリス菌感染および、他の口腔適応症を含む歯周病、炎症性腸疾患および創傷治癒の全身標的化を超える治療上の利点を有する。ＰＯＲ分泌経路を用いることにより、蛋白質を周囲の細胞外空間に選択的に発現させることが可能となる。多くのグラム陰性細菌は、タイプ１分泌系を発現しており、該分泌系は１工程で、細胞質から内膜および外膜の両方を通過して細胞外空間へＣ末端ペプチドシグナルを含む物質を分泌するのに、３構成要素のチャネル複合体を用いる。ジンジバリス菌はＴ１ＳＳを保有しないが、上記の態様は、ＩＬ−１０のジンジバリス菌への送達を上回る適用を有する。
【００６１】
ＦｉｍＡジンジバリス菌遺伝子型を標的とするＢＮＰ範囲を拡張することができることは留意すべきことである。ＦｉｍＡ発現プラスミドは、ＦｉｍＡタイプＩＩ−Ｖのための配列をコードし、さらなるジンジバリス菌株の形質導入のためのＢＮＰ粒子の選択に用いてよい。ジンジバリス菌の形質導入のための広範性のＢＮＰを作製するために、該発現プラスミドは、ＦｉｍＡコンセンサス配列および、ＦｉｍＡ蛋白質間で相同である領域をコードするペプチドを発現してよい。さらに、ｓＲＮＡをコードする核酸配列を発現させてよい。ジンジバリス菌は、多数の病原性因子を保有し、該病原性因子は、ホスト免疫系との多くの相互作用とともに、その病原体としての効力を支持している。ジンジバリス菌はまた、種々の環境刺激に応答して、広範囲のｓＲＮＡを発現する。ｓＲＮＡの発現のためのＢＮＰを、毒原性因子を調節するのに用いてよい。
【００６２】
上記の発明の詳細な説明には、本発明がとり得る多くの形態を記載している。上述の例は、本発明の種々の局面のうちの、いくつかの可能な態様を例示するものに過ぎず、本発明および添付の図を読み、理解する当業者には、同等の変更および/または改変が起こり得ることは認識されるものである。具体的には、上述の構成要素（デバイス、システム等）の果たす種々の機能に関して、該構成要素を記載するのに用いる用語（「手段」に対する言及を含む）は、特にことわらない限り、本明細書に例示する実施例で特定の機能を果たす、本明細書に記載する構造と構造的に同等でなくても、本明細書に記載する構成要素の該機能を果たす任意の構成要素、例えば、ハードウェアまたはその組み合わせに相当することを意図するものである。
【００６３】
本発明の具体的な特徴は、いくつかの実施例のうちの１つについてしか例示および/または記載されていない場合もあるが、かかる特徴は、所望により、および、任意の特定のまたは具体的な適用に有利であるように、他の実施例の１つ以上の他の特徴と組み合わせてよい。さらに、単数形の要素または項目に対する言及は、特にことわらない限り、２つ以上のかかる要素または項目を含むことを意図するものである。また、本明細書および/または特許請求の範囲において、「含んでいる (including)」、「含む (includes)」、「有している(having)」、「有する(has)」、「とともに(with)」またはその変形の語が用いられる範囲において、該用語は、「含む(comprising)」という語と同様に、非排他的であることを意図するものである。
【００６４】
本発明は、好ましい態様について記載しているが、改変および変更が起こり得ることは、上述の発明な詳細の説明を読み、理解する際に当業者が認識することである。本発明は、かかる全ての改変および変更を含むものと解されることを意図するものである。本発明の範囲を定義することを意図するのは請求項のみであり、該請求項は全ての相当物を含む。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年9月24日(2020.9.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含む非溶菌性ファージ粒子：
（１）標的細菌中で機能的であるプロモーターの制御下にある少なくとも１つの機能性核酸配列、（２）標的細菌中でファージミドが複製するために必要な複製起点、および（３）標的細菌に付着して、標的細菌を標的細菌中のファージミド核酸配列の複製および少なくとも１つの機能性核酸配列の発現を可能にする非溶菌性ファージ粒子に感染させるように設計された受容体結合蛋白質をコードする核酸配列を含むが、該ファージ粒子の独立したパッケージングおよび複製機能に必要な核酸配列を欠損しているファージミド、ならびに、
標的細菌に付着するように設計された該受容体結合蛋白質。
【請求項２】
プロモーターが、標的細菌中で少なくとも１つの機能性核酸配列の発現レベルを調節する遺伝子である、請求項１に記載の非溶菌性ファージ粒子。
【請求項３】
少なくとも１つの機能性核酸配列が、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列である、請求項１または２に記載の非溶菌性ファージ粒子。
【請求項４】
少なくとも１つの機能性核酸配列が、蛋白質またはペプチドをコードする、請求項１〜３のいずれかに記載の非溶菌性ファージ粒子。
【請求項５】
少なくとも１つの機能性核酸配列が、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、およびマイクロＲＮＡからなる群から選択される調節ＲＮＡ配列をコードする、請求項１〜３のいずれかに記載の非溶菌性ファージ粒子。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の非溶菌性ファージ粒子を含む組成物。
【請求項７】
産業用または環境物質の代謝産物の産生または産生の改善のための、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
植物病原体または有害生物の処置のために植物または土壌に適用するための、請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
廃水、産業廃棄物または副生成物の汚染または毒を除くための、請求項６に記載の組成物。
【請求項１０】
受容体結合蛋白質が、哺乳類のマイクロバイオーム内の標的細菌に付着するように設計されている、請求項６に記載の組成物。
【外国語明細書】
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