(57)【要約】【課題】特に種の保存や生体防御等に関する難発現性タンパク質の発現方法及び精製方法を提供することを課題とする。【解決手段】GST，またはHSP90にRescission配列付加後，IL-12等のサイトカインを，GST，またはHSP90融合タンパク質として発現させ，Rescission配列と言うHuman rhino virusに存在するprotease (PreScission protease)で切断後，SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて目的タンパク質バンドをゲルから切り出し，Protein eluterにより，ゲルからタンパク質を溶出することによって種の保存や生体防御等に関するタンパク質を発現させることができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
分子シャペロンHSP90のC末端側及び難発現性タンパク質の間にPreScission酵素切断配列を挿入することを特徴とする難発現性タンパク質発現ベクター。
【請求項２】
グルタチオン  S-トランスフェラーゼ及び難発現性タンパク質の間にPreScission酵素切断配列を挿入することを特徴とする難発現性タンパク質発現ベクター。
【請求項３】
難発現性タンパク質は、ヒトインターロイキン-12,ヒトインターフェロンγ,又はヒトβディフェンシン-2であることを特徴とする請求項１又は２記載の難発現性タンパク質発現ベクター。
【請求項４】
分子シャペロンHSP90のC末端側及び難発現性タンパク質の間にPreScission酵素切断配列を挿入した難発現性タンパク質発現ベクターを大腸菌にトランスフェクションすることにより前記HSP90と前記難発現性タンパク質との融合タンパク質を得ることができる融合タンパク質の精製方法。
【請求項５】
グルタチオン  S-トランスフェラーゼ及び難発現性タンパク質の間にPreScission酵素切断配列を挿入した難発現性タンパク質発現ベクターを大腸菌にトランスフェクションすることにより前記グルタチオン  S-トランスフェラーゼと前記難発現性タンパク質との融合タンパク質を得ることができる融合タンパク質の精製方法。
【請求項６】
難発現性タンパク質は、ヒトインターロイキン-12,ヒトインターフェロンγ,又はヒトβディフェンシン-2であることを特徴とする請求項４又は５記載の融合タンパク質の精製方法。
【請求項７】
分子シャペロンHSP90のC末端側及び難発現性タンパク質の間にPreScission酵素切断配列を挿入した難発現性タンパク質発現ベクターを大腸菌にトランスフェクションすることにより前記HSP90と前記難発現性タンパク質との融合タンパク質を得る工程と、
前記融合タンパク質をPreScission酵素で切断する工程とを含み、
前記切断により難発現性タンパク質を得ることができる難発現性タンパク質の精製方法。
【請求項８】
グルタチオン  S-トランスフェラーゼ及び難発現性タンパク質の間にPreScission酵素切断配列を挿入した難発現性タンパク質発現ベクターを大腸菌にトランスフェクションすることにより前記グルタチオン  S-トランスフェラーゼと前記難発現性タンパク質との融合タンパク質を得る工程と、
前記融合タンパク質をPreScission酵素で切断する工程とを含み、
前記切断により難発現性タンパク質を得ることができる難発現性タンパク質の精製方法。
【請求項９】
難発現性タンパク質は、ヒトインターロイキン-12,ヒトインターフェロンγ,又はヒトβディフェンシン-2であることを特徴とする請求項７又は８記載の難発現性タンパク質の精製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は,例えばサイトカインや抗菌性ペプチドなどの難発現性タンパク質を発現させるための発現方法及び精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質の発現と精製は，最近は大腸菌を用いるのが一般的である。特許文献１には，難発現性タンパク質としてヒトインターロイキン-2を発現する方法が記載される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特許第５１４８８７９号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし，種の保存や生体防御等に関するタンパク質は，発現するとは限らない。これまでインターロイキン-12等の定量にはマウス等を用いた動物実験が主流であった。また，ELISA等，抗体を用いた測定法もあるものの，用いる抗体の特異性に問題があると，何を測定しているのか解らない状況にある。そのため，免疫抗原としてのサイトカインや抗菌ペプチドを大腸菌を用いて組換えタンパク質として発現させ，精製しようと試みるものの，サイトカインや抗菌ペプチドは大腸菌では発現せず，また，発現・精製の報告も無い。
【０００５】
この発明は、特に種の保存や生体防御等に関する難発現性タンパク質を発現させるためのベクター及び難発現性タンパク質の精製方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
第１の発明は、分子シャペロンHSP90のC末端側及び難発現性タンパク質の間にPreScission酵素切断配列を挿入することを特徴とする難発現性タンパク質発現ベクターに関する。
【０００７】
第２の発明は、グルタチオン  S-トランスフェラーゼ及び難発現性タンパク質の間にPreScission酵素切断配列を挿入することを特徴とする難発現性タンパク質発現ベクターに関する。
【０００８】
第１の発明及び第２の発明における難発現性タンパク質は、ヒトインターロイキン-12,ヒトインターフェロンγ,又はヒトβディフェンシン-2であってもよい。
【０００９】
第３の発明は、分子シャペロンHSP90のC末端側及び難発現性タンパク質の間にPreScission酵素切断配列を挿入した難発現性タンパク質発現ベクターを大腸菌にトランスフェクションすることにより前記HSP90と前記難発現性タンパク質との融合タンパク質を得ることができる融合タンパク質の精製方法に関する。
【００１０】
第４の発明は、グルタチオン  S-トランスフェラーゼ及び難発現性タンパク質の間にPreScission酵素切断配列を挿入した難発現性タンパク質発現ベクターを大腸菌にトランスフェクションすることにより前記グルタチオン  S-トランスフェラーゼと前記難発現性タンパク質との融合タンパク質を得ることができる融合タンパク質の精製方法に関する。
【００１１】
第３の発明及び第４の発明における難発現性タンパク質は、ヒトインターロイキン-12,ヒトインターフェロンγ,又はヒトβディフェンシン-2であってもよい。
【００１２】
第５の発明は、分子シャペロンHSP90のC末端側及び難発現性タンパク質の間にPreScission酵素切断配列を挿入した難発現性タンパク質発現ベクターを大腸菌にトランスフェクションすることにより前記HSP90と前記難発現性タンパク質との融合タンパク質を得る工程と、前記融合タンパク質をPreScission酵素で切断する工程とを含み、前記切断により難発現性タンパク質を得ることができる難発現性タンパク質の精製方法に関する。
【００１３】
第６の発明は、グルタチオン  S-トランスフェラーゼ及び難発現性タンパク質の間にPreScission酵素切断配列を挿入した難発現性タンパク質発現ベクターを大腸菌にトランスフェクションすることにより前記グルタチオン  S-トランスフェラーゼと前記難発現性タンパク質との融合タンパク質を得る工程と、前記融合タンパク質をPreScission酵素で切断する工程とを含み、前記切断により難発現性タンパク質を得ることができる難発現性タンパク質の精製方法に関する。
【００１４】
第５及び第６の発明における難発現性タンパク質は、ヒトインターロイキン-12,ヒトインターフェロンγ,又はヒトβディフェンシン-2であってもよい。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により，GST，またはHSP90にRescission配列付加後，IL-12等のサイトカインを，GST，またはHSP90融合タンパク質として発現させ，Rescission配列と言うHuman rhino virusに存在するprotease (PreScission protease)で切断後，SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて目的タンパク質バンドをゲルから切り出し，Protein eluterにより，ゲルからタンパク質を溶出することによって種の保存や生体防御等に関するタンパク質を発現させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】目的タンパク質をGST融合タンパク質として発現する方法の概念図。
【図２】pGEX5x-3のマップ。
【図３】目的タンパク質をHSP90融合タンパク質として発現する方法の概念図。
【図４】pColdIのマップ。
【図５】pET-15bベクターにヒトIFN-γ全長遺伝子を組み込んだマップ。
【図６】大腸菌によるIL-12p35のSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動による発現確認の結果。
【図７】GST融合IFN-γ，IL-12のSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動による発現確認の結果。
【図８】pGEX5x-3-GST-Prescission-IL-12のPreScission proteaseによる切断結果であってSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動によるもの。
【図９】pGEX5x-3-GST-Prescission-IFN-γのPreScission proteaseによる切断結果であってSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動によるもの。
【図１０】pColdI-HSP90α-PS-IFN-γ, hBD-2のSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動による発現確認の結果。
【図１１】pColdI-HSP90α-PS-IFN-γ, hBD-2のPreScission proteaseによる切断結果であってSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動によるもの。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
難発現性タンパク質発現ベクター構築の概念図を図1〜図4に示す。図1は，目的タンパク質をグルタチオン S-トランスフェラーゼ (GST) 融合タンパク質として発現する方法の概念図である。図2に示すように，タンパク質発現ベクターであるpGEX5x-3にPreScission酵素切断配列を挿入したpGEX5x-3-GST-Prescission発現ベクターを構築した。pGEX5x-3-GST-Prescission 発現ベクターを用いて，ヒトインターロイキン-12 (IL-12)，またはヒトインターフェロンγ(IFN-γ) 全長遺伝子を挿入した。
【００１８】
図3に示すように，タンパク質発現ベクターであるpColdIのマルチクローニングサイトのNotI制限酵素切断部位に，NotI制限酵素サイト導入ヒトHSP90αを挿入し，その後ろにPreScission酵素切断配列を挿入したpColdI-HSP90-Prescission発現ベクターを構築した。
図4に示すように,pColdI-HSP90-Prescission発現ベクターを用いて，ヒトβディフェンシン (hBD-2)，またはヒトインターフェロンγ(IFN-γ) 全長遺伝子を挿入した。
【００１９】
Primerとして以下のものを用いた。
pCold-HSP90+PS Xba1 Fw Primer  （Tm値：57.4）
AGAAGTAGACTCTAGAATCCTTGAAGTCCTTTTTCAA
pCold-HSP90+BD-2 Not1 Rv primer   （Tm値：64.0）
ATTACCTAGGCGGCCGCTCATGGCTTTTTGCAGCATT
pCold-HSP90+IFN-γ Not1 Rv primer  （Tm値：65。2）
ATTACCTAGGCGGCCGCTTACTGGGATGCTCTTCGA
Tm値はGC法を用いて計算した。
【００２０】
＜タンパク質発現確認の条件＞
大腸菌株：OverExpress C41 pLysS，またはOverExpress C43 pLysSを使用した。pGEX5x-3-GST-Prescission 発現ベクターに組み込んだIFN-γ，またはIL-12pColdI-HSP90-Prescissionを発現ベクターに組み込み，OverExpress C43 pLysSにトランスフェクションした大腸菌株は，-80℃でGlycerol-Stockとして保存した。
hBD-2，またはIFN-γをOverExpress C41 pLysSにトランスフェクションした大腸菌株は，-80℃でGlycerol-Stockとして保存した。
【００２１】
2% LB培地10 mlに終濃度100μg/mlになる様，0.1 g/mlのアンピシリンを10μl添加した。-80℃のGlycerol-Stockの少量 (約50 ml)をLB培地に加え，37℃で16 h前培養した。翌日，培養液から500μlとり，2%LB培地20 mlに加えてOD値0.6まで37℃で培養した。その後、30 min，4℃でCold shock培養を行った。その際，IPTGをそれぞれ終濃度0, 0.1, 0.5, 1.0 mMになるように添加後，15℃で24 h培養を行い，4℃，12,000 xgで遠心分離し，菌体を採取し，10 mM Tris-HCl, pH 7.4緩衝液を菌体：緩衝液 (1 : 2) に懸濁し，超音波破砕装置で菌体を破砕した。
4℃，12,000 xgで遠心分離し，上清（可溶性画分）と沈殿（不溶性画分）に分離し，SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動で発現確認を行った。
【００２２】
＜pColdI-HSP90α-PS-BD-2のPS-Protease切断条件検討＞
pColdI-HSP90α-PS-BD-2のPS-Protease切断条件を，表1のように検討した。
【００２３】
【表１】
2020150800.tif 000002
【００２４】
＜結果＞
1. pET-15bベクターを用いた通常発現
T7発現システムはT7プロモーターを有するpET発現ベクターと，BL21(DE3)大腸菌株などのT7 RNAポリメラーゼ遺伝子が組み込まれたバクテリオファージλDE3の溶原菌を宿主として用いた，強力な発現システムである。BL21(DE3)大腸菌ゲノム中のlac UV5プロモーター支配下にあるT7 RNAポリメラーゼ遺伝子は，isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside (IPTG)添加により発現誘導される。発現したT7 RNAポリメラーゼは，pETベクターのT7プロモーターを認識し，T7プロモーター下流に導入された目的タンパク質配列を強力に発現させることが出来る。
【００２５】
図5は、大腸菌遺伝子組換えタンパク質発現系で最強のpET-15bベクターにヒトIFN-γ全長遺伝子を組み込んだものである。図6に発現の確認結果を示した。ヒトIFN-γは，発現していれば矢印付近にタンパク質バンドが見えるが，ヒトIFN-γは通常発現方法では全く発現しないことが判明した。ヒトhBD-2も全く発現しなかった。
【００２６】
2. pGEX5x-3-GST-Prescission-IFN-γ，IL-12の発現結果
図7に，GST融合IFN-γ，IL-12の発現結果を示す。どちらのタンパク質もGST-融合タンパク質として発現が確認された，ただし，封入体として不溶性画分の沈殿部分に検出された。
【００２７】
3. PreScission proteaseによる切断
pGEX5x-3-GST-Prescission-IL-12のPreScission proteaseによる切断結果を，図8に示した。
PreScission proteaseによる切断の結果， p35付近にタンパク質のバンドが検出されるとともに，切断されたGSTのタンパク質バンドが検出され，目的タンパク質の発現とプロテアーゼによる切断に成功した。pGEX5x-3-GST-Prescission-IFN-γのPreScission proteaseによる切断結果を，図9に示した。約20kDa付近に切断されたIFN-γが検出できた。
【００２８】
4. pColdI-HSP90α-PS-IFN-γ, hBD-2発現確認結果
本発明によるIFN-γとhBD-2の発現結果を図10に示した。両タンパク質は白抜きの三角印と黒塗りの三角印で示した位置の可溶性画分 (S) にIPTG濃度依存的に発現が確認出来た。また，プロテアーゼによる切断結果を図11に示した。約45kDa付近に切断が確認された。
【００２９】
遺伝子組換え技術により，ヒトを始めとする様々な生物種由来の有用タンパク質を大腸菌等の微生物を宿主として大量に生産することが可能となって久しい。しかしながら，大腸菌内で発現させたタンパク質は，不溶性かつ不活性な凝集体（inclusion body: 封入体）となる場合が多く（一説には封入体を形成する確率は75％にも達するといわれている），タンパク質の大量発現における最大の問題となっている。この問題を解決し，活性のあるタンパク質の大量調製を可能とすべく20年来様々な試みがなされて来た。代表的な手法として，以下のものがある。
【００３０】
1）分子シャペロンとの共発現
通常，細胞内で翻訳されたタンパク質は分子シャペロンの助けを借りて正しい立体構造を形成する。組換えタンパク質の大量調整時においては，この分子シャペロンが不足することが封入体形成の一因と考えられ，そこで分子シャペロンも同時に大量発現させてこれを補う。
2）発現宿主の検討
最も一般的な宿主である大腸菌の代わりに，酵母，昆虫や動物の培養細胞，カイコなどに目的タンパク質を生産させる。
3）試験管内でのタンパク質生産
遺伝子の転写から翻訳までの全てを試験管内で行う。ウサギの網状赤血球系，コムギ胚芽系などが知られており，キットとして販売もされている。
また，微生物などをいた遺伝子組換えによる生産では，抗菌ペプチドが持つ生
産宿主に対する抗菌活性などが問題となり，効率の良い生産が困難とされてきた。さらに，種の保存や生体防御に関すタンパク質の大腸菌による遺伝子組換え法では，発現が困難であることが報告されている。
【００３１】
本願発明において，従来法では発現しないタンパク質発現方法を2種類開発した。
GST融合タンパク質は，封入体に発現したが，封入体タンパク質は尿素等のタンパク質変性剤で可溶化し精製するため，本来の高次構造形成が難しく，タンパク質本来の生理機能が失われる場合が多い。しかし，目的タンパク質を電気泳動ゲルから溶出し，ウサギに免役することで特異抗体作製が可能となる。
一方，HSP90融合タンパク質は可溶性画分に発現するため，生理機能を有するタンパク質として，精製可能であり，生化学的解析が可能となる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2020150800.tif 000011
【図１０】
2020150800.tif 000012
【図１１】
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