(57)【要約】      （修正有）【課題】既存の抗体に対する低下した結合能を有する改変タンパク質およびペプチドの提供。【解決手段】改変タンパク質/ペプチド分子は、C末端付加、伸長またはタグおよび/または特定のアミノ酸置換を含むことができる。そのような改変分子(例えば融合物およびコンジュゲート)は、タンパク質、ペプチド、抗原結合分子、抗体または抗体フラグメント、例えば単一可変ドメイン、例えばヒト免疫グロブリン(抗体)単一可変ドメイン、およびまた、ラマまたはラクダなどの非ヒト起源由来の単一可変ドメイン、例えばnanobodyを含む。さらに、そのような改変C末端伸長および/またはアミノ酸置換された分子を含む使用、製剤、組成物に関し、また、これらの分子の製造および発現方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の改変:
(a) 1アミノ酸〜5アミノ酸のアミノ酸伸長を含むC末端伸長; または
(b) 少なくとも1つの置換が、P14A置換、P41A置換およびL108A置換から選択される置換である、1以上のアミノ酸フレームワーク置換
から選択される1以上の改変を含み、
かつ、無改変の単一免疫グロブリン可変ドメイン(dAb)と比較して既存のADAに対する低下した結合性を有する、
単一免疫グロブリン可変ドメイン(dAb)。
【請求項２】
該dAbが、ヒトVH、またはヒトVL dAbまたはラクダ科VHHから選択される、請求項１に記載の単一免疫グロブリン可変ドメイン(dAb)。
【請求項３】
1アミノ酸〜4アミノ酸のC末端伸長を含む、請求項１または２に記載の単一免疫グロブリン可変ドメイン(dAb)。
【請求項４】
該C末端伸長が、アラニンであるアミノ酸を含む、先行する請求項のいずれかに記載の単一免疫グロブリン可変ドメイン(dAb)。
【請求項５】
(i) 該単一免疫グロブリン可変ドメインがヒトVHまたはラクダ科VHHである場合、該C末端伸長は(a) A (b) AS、(c) AST (d) ASTK、(e) ASTKG (f) AAAまたは(g) Tから選択されるアミノ酸伸長を含むか、またはそれからなり; および(ii) 該単一免疫グロブリン可変ドメインがVカッパなどのヒトVLである場合、該C末端伸長は(a) AAA (b) A (c) TVおよび(d) Tから選択されるアミノ酸伸長を含むか、またはそれからなる、先行する請求項のいずれかに記載の単一免疫グロブリン可変ドメイン(dAb)。
【請求項６】
標的抗原に1価で結合する単一免疫グロブリン可変ドメイン(dAb)であって、以下のもの:
a.  該dAbが該抗原に5μM〜1pMの範囲のKDで結合するような、該標的抗原に特異的な3つの相補性決定(CDR)領域;
b.  4つのフレームワーク(FW)領域; および
c.  配列VTVS(S)nXまたはVEIKpRqXからなるC末端配列; および場合により
d.  ヒト生殖細胞系列フレームワーク配列と比較して14、41、108、110、または112位の1以上のアミノ酸置換
を含み、ここで:
nは0または1から独立して選択される整数を表し;
pおよびqは、それぞれ、pが1を表す場合、qは0または1であり、かつpが0を表す場合、qも0を表すように、0または1を表し;
Xは存在または不存在であり、かつ存在すれば、1〜5アミノ酸残基のアミノ酸伸長を表し;ただしXが不存在ならば;
i.  nは0であり、かつ/または末端がVTVS(S)nであるdAbは1以上の該アミノ酸置換を含み;
ii.pおよび/またはqは0であり、かつ/または末端がVEIKpRqであるdAbは1以上の該アミノ酸置換を含む、
単一免疫グロブリン可変ドメイン(dAb)。
【請求項７】
等価なdAbではXが不存在であり、n、pおよびqが1であり、かつアミノ酸置換が存在しないことを除いて同一の配列を有する等価なdAbより低い、抗薬物抗体に関する結合親和性および/またはアビディティーを有する、請求項６に記載の単一免疫グロブリン可変ドメイン。
【請求項８】
約10pMまたはそれ未満〜約50nMの範囲のKDを有する、請求項６に記載の単一免疫グロブリン可変ドメイン。
【請求項９】
ヒトVH dAb、ヒトVL dAb (例えばVカッパ)およびラクダ科VHHからなる群から選択される、請求項１〜８のいずれかに記載の単一免疫グロブリン可変ドメイン。
【請求項１０】
該1以上のアミノ酸置換が、P14A置換、P41A置換、L108A置換、T110A置換およびS112A置換からなる群から選択される、請求項１〜９のいずれかに記載の単一免疫グロブリン可変ドメイン。
【請求項１１】
Xが存在する、請求項６〜１０のいずれかに記載の単一免疫グロブリン可変ドメイン。
【請求項１２】
Xが1〜5アミノ酸の伸長である、請求項６〜１０のいずれかに記載の単一免疫グロブリン可変ドメイン。
【請求項１３】
Xが、アラニン残基を含むか、またはアラニン残基からなる1〜5アミノ酸の伸長である、請求項１１に記載の単一免疫グロブリン可変ドメイン。
【請求項１４】
Xが、A、AS、AST、ASTK、ASTKGからなる群から選択される伸長である、請求項１３に記載の単一免疫グロブリン可変ドメイン。
【請求項１５】
該C末端配列がVHまたはVHH dAbに関して配列VTVSSX、またはVカッパなどのVL dAbに関して配列VEIKRXからなり、かつXが1〜5アミノ酸のアミノ酸伸長である、請求項６〜１４のいずれかに記載の単一免疫グロブリン可変ドメイン。
【請求項１６】
(i) 該単一免疫グロブリン可変ドメインがヒトVHまたはラクダ科VHHである場合、該C末端伸長は(a) A (b) AS、(c) AST (d) ASTK、(e) ASTKG (f) AAAまたは(g) Tから選択されるアミノ酸伸長または、-S欠失であるC末端欠失を含み; または(ii) 該単一免疫グロブリン可変ドメインがVカッパなどのヒトVLである場合、該C末端伸長は(a) AAA (b) A (c) TVおよび(d) Tから選択されるアミノ酸伸長または、-R欠失であるC末端欠失を含む、請求項１〜１５のいずれかに記載の単一免疫グロブリン可変ドメイン。
【請求項１７】
TNFα、TNF受容体、TNF受容体1 (TNFR1)、VEGF、IL-1R、IL-6R、IL-4、IL-5、IL-13、DC-SIGN、ASGPR、アルブミン、フォンウィルブランド因子、フォンウィルブランド因子A1ドメインおよびTGFβR2から選択される標的に結合する、請求項１〜１６のいずれかに記載の単一免疫グロブリン可変ドメイン(dAb)。
【請求項１８】
標的がTNFR1であり、かつ(a) C末端に単一アラニンの伸長を有するDOM1h-131-206 dAb (図8a: 配列番号１６に示される); (b) C末端に単一アラニンの伸長およびP14Aフレームワーク突然変異を有するDOM1h-131-206 dAb (図8B: 配列番号１７に示される); (c) P14Aフレームワーク突然変異を有するDOM1h-131-206 dAb (図8c: 配列番号１８に示される); (d) ASTKG C末端伸長を有するDOM1h-131-206 dAb (図8d: 配列番号１９に示される); および(e) ASTKG C末端伸長およびP14Aフレームワーク突然変異を有するDOM1h-131-206 dAb (図8e: 配列番号２０に示される)として特定されるアミノ酸配列のいずれかから選択される、請求項１７に記載の単一免疫グロブリン可変ドメイン(dAb)。
【請求項１９】
標的がTNFR1であり、かつ無改変のdAbが、DOM1h-131-206 (図2a: 配列番号１に示される)、DOM 1h-131-511 (図2b: 配列番号２に示される)、DOM 1h-131-202 (図2c: 配列番号３に示される)として特定されるアミノ酸配列のいずれか1つと、100%、99.5%、99%、98%、97%、96%、95%、90%、85%または80%同一であるアミノ酸配列から選択される、請求項１〜５または請求項１７もしくは１８のいずれか一項に記載の単一免疫グロブリン可変ドメイン(dAb)。
【請求項２０】
dAbが追加の分子との融合物またはコンジュゲートとして存在する、先行する請求項のいずれかに記載の単一免疫グロブリン可変ドメイン(dAb)。
【請求項２１】
dAbが、追加のdAbもしくはタンパク質もしくはポリペプチドまたはそのフラグメント、半減期を延長できるかまたは追加の治療用分子もしくは活性分子であるタンパク質もしくはポリペプチドまたはそのフラグメント、PEG分子、抗体またはそのフラグメントまたはFc領域から選択される1以上の追加の分子との融合物またはコンジュゲートとして存在する、先行する請求項のいずれかに記載の単一免疫グロブリン可変ドメイン(dAb)。
【請求項２２】
dAbがmAbdAb分子として存在する、先行する請求項のいずれかに記載の単一免疫グロブリン可変ドメイン(dAb)。
【請求項２３】
dAbが直列型（in-line）融合物として存在する、先行する請求項のいずれかに記載の単一免疫グロブリン可変ドメイン(dAb)。
【請求項２４】
dAbがダンベル型で存在する、先行する請求項のいずれかに記載の単一免疫グロブリン可変ドメイン(dAb)。
【請求項２５】
先行する請求項のいずれかに記載の単一免疫グロブリン可変ドメイン(dAb)を、製薬的または生理学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤とともに含む医薬組成物。
【請求項２６】
治療方法または医療での使用のための、先行する請求項のいずれかに記載の単一可変ドメイン(dAb)、または請求項２５に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
副作用の予防方法での使用のための、先行する請求項のいずれかに記載の単一免疫グロブリン可変ドメイン、または請求項２５に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
XがYによって置換され、ここでYは、親和性タグ、mycタグ、FLAGタグまたはhisタグなどのタグ、PEG基などの化学修飾、または抗体のFc部分などのタンパク質からなる群から選択されることを特徴とする、副作用の予防方法での使用のための、請求項６で定義される単一免疫グロブリン可変ドメイン。
【請求項２９】
該dAbがその標的のアンタゴニストである、先行する請求項のいずれかに記載の単一免疫グロブリン可変ドメイン、または請求項２５に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
dAbの標的が受容体である、請求項１〜２４、または２６〜２９に記載の単一免疫グロブリン可変ドメイン、または請求項２５に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
該受容体が活性化時に二量体化する、請求項２９に記載の単一免疫グロブリン可変ドメインまたは医薬組成物。
【請求項３２】
該標的が重合体標的である、請求項１〜２４、または２６〜３０に記載の単一免疫グロブリン可変ドメイン、または請求項２５に記載の医薬組成物。
【請求項３３】
ADA結合を低下させるように改変された、先行する請求項のいずれかに記載の単一免疫グロブリン可変ドメイン(dAb)であって、該dAbが、(i) ここで記載したADAに対する結合を低下させるいかなる改変も含まないことを除いて該改変されたdAbと同一であるdAbアミノ酸配列の親和性の少なくとも50%の親和性で標的に結合する能力を維持し、および/または(ii) ADAに対する結合を低下させるいかなる改変も含まないことを除いて該改変されたdAbと同一であるdAbアミノ酸配列のレベルの少なくとも10%のレベルで発現される、単一免疫グロブリン可変ドメイン(dAb)。
【請求項３４】
医療での使用のための、先行する請求項のいずれかに記載の単一免疫グロブリン可変ドメイン。
【請求項３５】
炎症性疾患もしくは障害、または呼吸器疾患もしくは障害または肺疾患もしくは障害から選択される少なくとも1つの疾患または障害または症状の治療または予防に使用するための、請求項１８または１９に記載の単一免疫グロブリン可変ドメイン(dAb)、または請求項１８または１９に記載の(dAb)を含む医薬組成物。
【請求項３６】
dAbが、医療で使用するための、C末端に単一アラニンの伸長を有するDOM1h-131-206 dAb (図8a: 配列番号１６に示されるアミノ酸配列を有する)である、請求項１８に記載の単一免疫グロブリン可変ドメイン(dAb)。
【請求項３７】
dAbが、C末端に単一アラニンの伸長を有するDOM1h-131-206 dAb (図8a: 配列番号１６に示されるアミノ酸配列を有する)であり、かつ関節炎、乾癬、多発性硬化症、炎症性腸疾患(例えば)クローン病および潰瘍性大腸炎; または例えば、喘息、慢性閉塞性肺疾患、慢性気管支炎、慢性閉塞性気管支炎および肺気腫、肺炎症、慢性閉塞性肺疾患、喘息、肺炎、過敏性間質性肺炎、好酸球増加を伴う肺浸潤、環境性肺疾患、肺炎、気管支拡張症、嚢胞性線維症、間質性肺疾患、原発性肺高血圧症、肺血栓塞栓症、胸膜の障害、縦隔の障害、横隔膜の障害、低換気、過換気、睡眠時無呼吸、急性呼吸困難症候群、中皮腫、肉腫、移植片拒絶、移植片対宿主病、肺癌、アレルギー性鼻炎、アレルギー、石綿沈着症、アスペルギルス腫、アスペルギルス症、気管支拡張症、慢性気管支炎、肺気腫、エオシン好性肺炎、特発性肺線維症、侵襲性肺炎球菌疾患、インフルエンザ、非結核性マイコバクテリア、胸水、塵肺、ニューモシスチス症(pneumocytosis)、肺炎、肺放線菌症、肺胞タンパク症、肺炭疽、肺水腫、肺動脈塞栓、肺の炎症、肺組織球症X、肺高血圧症、肺ノカルジア症、肺結核、肺静脈閉塞性疾患、リウマチ様肺疾患、サルコイドーシス、およびウェゲナー肉芽腫症、および急性肺損傷(ALI)および急性呼吸困難症候群(ARDS)およびそれらの合併症から例えば選択される、呼吸器または肺の疾患または障害、から選択される少なくとも1つの疾患または障害または症状を治療または予防するための使用のための、請求項３６に記載の単一免疫グロブリン可変ドメイン(dAb)。
【請求項３８】
使用が、急性肺損傷(ALI)または急性呼吸困難症候群(ARDS)を治療または予防するための使用である、請求項３７に記載の使用のための単一免疫グロブリン可変ドメイン(dAb) (図8a: 配列番号１６に示されるアミノ酸配列を有する)。
【請求項３９】
急性肺損傷(ALI)または急性呼吸困難症候群(ARDS)を治療または予防するための医薬の製造における、請求項１８の単一免疫グロブリン可変ドメイン(dAb)の使用であって、dAbが、C末端に単一アラニンの伸長を有するDOM1h-131-206 dAb (図8a: 配列番号１６に示されるアミノ酸配列を有する)である、使用。
【請求項４０】
炎症性疾患もしくは障害、または呼吸器もしくは肺の疾患もしくは障害から選択される少なくとも1つの疾患または障害または症状の治療または予防方法であって、請求項１８〜１９のいずれか一項に記載のdAb、または請求項１８または１９に記載の(dAb)を含む医薬組成物の治療上または予防上有効量を、製薬的または生理学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤と組み合わせて被験体に投与することによる方法。
【請求項４１】
dAbが、C末端に単一アラニンの伸長を有するDOM1h-131-206 dAb (図8a: 配列番号１６に示されるアミノ酸配列を有する)である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
該少なくとも1つの疾患または障害または症状が請求項３７で特定される疾患または障害または症状のいずれか1つである、請求項４０〜４１のいずれかの方法。
【請求項４３】
該疾患が急性肺損傷(ALI)または急性呼吸困難症候群(ARDS)である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
該組成物またはdAbを、皮下、静脈内または筋肉内注射によって被験体に送達する、請求項４０〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
該組成物またはdAbを、非経口、経口、経直腸、経粘膜、眼球、肺または胃腸管送達によって被験体に送達する、請求項４０〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
請求項１〜３３のいずれか一項に記載の組成物またはdAbを含む、注射用、経口、吸入用または噴霧用製剤。
【請求項４７】
請求項１〜３３のいずれか一項に記載の組成物を含む、持続放出製剤。
【請求項４８】
請求項１〜３３のいずれか一項に記載の組成物を含む、凍結乾燥製剤。
【請求項４９】
請求項１〜３３のいずれか一項に記載の組成物を含む、送達デバイス。
【請求項５０】
噴霧器または吸入器である、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の組成物を含む送達デバイス。
【請求項５１】
請求項１〜２４のいずれかに記載のdAbをコードする、単離された核酸または組換え核酸。
【請求項５２】
請求項１３〜１４または請求項１８のいずれかに記載のdAbをコードする、単離された核酸または組換え核酸。
【請求項５３】
図9b (配列番号２２)に示される核酸配列を有し、かつ、単一アラニンの伸長を有するDOM1h-131-206 dAbをコードする、請求項５２に記載の単離された組換え核酸。
【請求項５４】
請求項５１〜５３のいずれか一項の核酸を含むベクター。
【請求項５５】
pave011であり、かつ配列番号２２の核酸を発現する、請求項５４に記載のベクター。
【請求項５６】
請求項５１〜５３のいずれかの核酸、または請求項５４〜５５のいずれかのベクターを含む宿主細胞。
【請求項５７】
E.coliであり、かつ請求項５５のベクターを発現する、請求項５６に記載の宿主細胞。
【請求項５８】
請求項１〜２４のいずれかに記載のdAbを含むポリペプチドの製造方法であって、該核酸またはベクターの発現に好適な条件下で請求項５６〜５７のいずれかの宿主細胞を維持し、それによりポリペプチドを製造するステップを含む方法。
【請求項５９】
該ポリペプチドが、C末端に単一アラニンの伸長を有するDOM1h-131-206として特定されるアミノ酸配列(配列番号１６)を有するdAbであり、かつ、配列番号２２の核酸を発現するpave011ベクターの発現に好適な条件下でE.coli宿主細胞を維持するステップを含む、請求項５８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、既存の抗体に対する低下した結合能を有する改変タンパク質およびペプチドに関する。そのような改変タンパク質/ペプチド分子は、C末端付加、伸長またはタグおよび/または特定のアミノ酸置換を含むことができる。そのような改変タンパク質/ペプチド分子(その融合物およびコンジュゲートを含む)は、抗原結合分子、例えば抗体、抗体フラグメント、および単一可変ドメイン、例えばヒト免疫グロブリン(抗体)単一可変ドメイン、さらにまた、ラマまたはラクダなどの非ヒト起源由来の単一可変ドメイン、例えばNanobodyTMを含むVHH (例えば特にWO 94/04678およびWO 95/04079に記載されているもの)を含むことができる。本発明は、さらに、そのような改変C末端伸長および/またはアミノ酸置換された分子を含む使用、製剤、組成物に関し、また、これらの分子の製造および発現方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景:
タンパク質、例えば宿主免疫グロブリンまたは免疫グロブリンフラグメントに結合することができる天然に存在する自己抗体がヒトに存在し、例えばリウマトイド因子(抗体のFc領域のエピトープに結合する)、抗イディオタイプ自己抗体(抗体可変/CDR領域に結合する)および抗ヒンジ自己抗体(FabフラグメントのIg定常ドメインのヒンジ領域に結合する)である。
【０００３】
これらの自己抗体は、ヒトおよび非ヒト霊長類の両者に存在する、Ig分子全体のエピトープに特異性を有する抗免疫グロブリン(Ig)自己抗体のポリクローナルレパートリーの部分であるかもしれない。インタクトのFcドメイン内のエピトープに結合する抗IgG自己抗体(すなわちリウマトイド因子(RF))に加えて、IgGの可変CDR領域に結合する抗イディオタイプ自己抗体、およびFabまたはF('Ab')2フラグメントのC末端ヒンジ領域の潜在性エピトープと反応する抗ヒンジ抗体の存在も観察されている。これらの異なる抗IgG自己抗体の機能的役割は不確かなままである。リウマトイド因子および抗ヒンジ自己抗体は特定の病的状態、例えば自己免疫および特定の感染に関連づけられているが、抗イディオタイプ抗体は特定の自己免疫疾患で自己抗体に対する保護を与えるかもしれない。さらにまた、これらの自己抗体が自己反応性B細胞の刺激をコントロールし、かつ外来抗原に対する免疫応答を調節する、抗IgG自己抗体の免疫調節性の役割が提唱されている。抗ヒンジ抗体は、切断型IgGと反応するがインタクトのIgGと反応しない抗IgG自己抗体である。正常ヒト集団でのその高い保有率は、おそらく細菌性または内因性プロテアーゼによるIgGの切断の結果としての、IgGフラグメントへの事前の曝露を示す。
【０００４】
内因性タンパク質(ナイーブ被験体に存在する)に結合するだけでなく、自己抗体は、治療のために被験体に投与されるタンパク質またはペプチドに結合することもできる。被験体に投与された治療用タンパク質およびペプチドなどの分子に結合する既存の抗体は、その効力に影響し、治療された患者での投与反応、過敏性、臨床反応の変化、ならびに分子の持続、排除または中和によるバイオアベイラビリティの変化を生じさせるかもしれない。しかし、一部の例では、他の例より、これらの抗体の存在は薬物療法中に重要ではない。
【０００５】
治療用タンパク質結合自己抗体および、薬物療法(例えば治療用タンパク質またはペプチドの投与)に応答して新たに形成された抗体は抗薬物抗体(ADA)と総称される。本明細書を通してADAが記載される場合、特に指定しない限り、発明者らは既存のADAに言及している。
【０００６】
VHおよびVLドメイン抗体は完全ヒトフレームワーク配列由来であり、in silico予測では、潜在的免疫原性ペプチドの顕著に低い発生率が報告されるが、これらのドメイン抗体はヒトで免疫原性である可能性があり、すなわちそれらはADAを誘発するかもしれず、かつそれらは配列依存的および配列非依存的要因の両者に応じて既存のADAに結合するかもしれない。
【０００７】
同様に、ラクダ科(Camelid)重鎖(VHH)由来のいくつかの単一dAbは臨床での研究中であり、過敏性または他の免疫媒介性の有害事象は報告されていないが、既存のADAに結合する可能性は残っている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ゆえに、被験体、特にヒト被験体)に投与された場合に既存のADAに対する低下した結合能を有するタンパク質、またはペプチド、例えば抗原結合分子を含む治療用分子を提供することは有益であり得る。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の要旨:
発明者らは、本明細書中で記載されるように、一部の健康なナイーブヒト被験体由来の血清中で、VHドメイン抗体およびVHH分子の両者に結合できる既存の抗VH自己抗体、ならびにVL分子に結合できる抗VL (例えばVカッパ(VK))自己抗体が存在することを示した。VH dAbに結合する既存のADAは、それらがIgGフラグメントに結合するが、インタクトのIgG上のin situで見出される同一配列に結合しない点において抗ヒンジ抗体と類似である。
【００１０】
本明細書中で記載されるように特異的イムノアッセイを開発し、ヒトにおけるVH dAb DOM1H-131-206 (配列番号１に示されるアミノ酸配列)に対する抗薬物抗体を検出することを確認した。60の健康なヒトドナー血清サンプルのパネルをアッセイでのバックグラウンド反応性に関してスクリーニングした。これらの被験体由来の血清サンプルの約45%が、DOM1H-131-206に結合できる検出可能な抗体を有することを決定した。この反応性は、VH dAbフレームワーク配列内のネオエピトープ、またはエピトープ群に特異的であるように思われる。その理由は、反応が種々の標的抗原に結合するdAbのVHフレームワークと交差反応性であるが完全ヒトIgGと交差反応性でなかったからである。VL dAbに対する既存のADAも健康なヒトドナー由来の血清サンプル中で観察されたが、VHより低い程度であった。
【００１１】
突然変異誘発アプローチを用いて、発明者らは、VHフレームワークへの改変がこれらの既存のADAの結合性を低下させるかどうかを判定した。このアプローチを使用して、発明者らはVH dAbフレームワークのC末端にエピトープをマップした。そして、発明者らは、VL、VHおよびVHH分子に対する既存の抗体の結合性を低下させるかまたは排除するために使用できるいくつかのアプローチを例証する。特に、発明者らは、dAb C末端の3次元コンフォメーションを変化させる改変、特にVHおよびVHH dAbのC末端セリン残基(すなわちKabat位113の残基)が重要であることを示した。さらにdAb C末端の3次元コンフォメーションは、追加のアミノ酸残基の付加(C末端伸長)および/またはVH dAbの14、41、108、110および112位の1以上の位置に存在するアミノ酸残基の置換によって変化させることができる。
【００１２】
本発明は、ゆえに、無改変分子と比較して(既存の) ADAに対する低下した結合能を有し、かつ被験体、例えばヒト被験体への治療または予防のための投与に好適な改変分子を提供する。低下した結合能とは、分子が既存のADAに、低下した親和性または低下したアビディティーで結合することを意味する。そのような分子は、タンパク質、またはペプチド、例えば抗原結合タンパク質、例えば抗体、抗体フラグメント、および単一可変ドメイン、例えばヒト免疫グロブリン(抗体)単一可変ドメイン(VHまたはVL)、およびまた、ラマまたはラクダ科などの非ヒト起源由来の単一可変ドメイン、例えばNanobodyTMを含むラクダ科VHH (例えば特にWO 94/04678およびWO 95/04079に記載されているもの)を含む。該分子は、(a) C末端付加、伸長、欠失またはタグ、および/または(b) 1以上のアミノ酸フレームワーク置換から選択される1以上の改変を含む。
【００１３】
さらに、本明細書中に記載の改変分子およびこれらの改変分子を含む医薬組成物は、無改変分子、例えば既存のADA結合性を低下させるC末端伸長、付加、欠失またはタグおよび/または他のフレームワーク改変を含まない無改変dAbより高い安全性プロファイルを有しかつ少ない副作用しか有さないことが可能である。同様に、本明細書中に記載の改変分子の投与またはこれらの改変分子(既存のADAに対する低下した結合能を有する)を含む医薬組成物の投与は、改変された免疫原性を生じさせ、かつ改善された効力および改善された安全性プロファイルを生じさせることもでき、かつ例えば無改変分子、例えばdAbに対する自己抗体を発生しているかもしれない患者への反復投薬に好都合に使用することができる。
【００１４】
ゆえに、本発明の第1の態様では、(a) 1アミノ酸〜5アミノ酸のアミノ酸伸長を含むC末端伸長; または(b) 少なくとも1つの置換がP14A置換、P41A置換およびL108A置換から選択される置換である1以上のアミノ酸フレームワーク置換から選択される1以上の改変を含む単一免疫グロブリン可変ドメイン(dAb)を提供する。
【００１５】
一実施形態では、1〜4アミノ酸のC末端伸長を提供する。別の実施形態では、該C末端伸長は、アラニンであるアミノ酸を含み、無改変の単一免疫グロブリン可変ドメイン(dAb)と比較して既存のADAに対する低下した結合性を有する。
【００１６】
別の態様では、C末端伸長は、1〜15アミノ酸、例えば1〜8アミノ酸または1、1〜2、1〜3、1〜4、1〜5、1〜6、1〜7アミノ酸の伸長であってよい。特に、アラニン残基を含む1〜8アミノ酸、または1、1〜2、1〜3、1〜4、1〜5、1〜6、1〜7アミノ酸の伸長、例えば単一アラニン伸長、またはAS、AST、ASTK、ASTKG、ASTKGP伸長であってよい。特に、1〜5アミノ酸の伸長または1〜4アミノ酸の伸長を提供する。改変された単一免疫グロブリン可変ドメインはアミノ酸欠失を含むこともできる。単一免疫グロブリン可変ドメイン(dAb)は、ヒトVH、またはヒトVL dAbまたはラクダ科VHHから選択することができる。C末端伸長は、dAbのC末端との直接融合物またはコンジュゲートとして存在させてよい。
【００１７】
別の態様では、本発明は、(i) 該dAbがヒトVHまたはラクダ科VHHであり、かつ該C末端伸長が(a) A (b) AS、(c) AST (d) ASTK、(e) ASTKG (f) AAAまたは(g) Tから選択されるアミノ酸伸長を含む; および(ii) 該dAbがヒトVL (例えばVカッパ)であり、かつ該C末端伸長が(a) AAA、(b) A (c) TV (d) Tから選択されるアミノ酸伸長を含む、単一免疫グロブリン可変ドメイン(dAb)を提供する。
【００１８】
本発明はまた、標的抗原に1価で結合する単一免疫グロブリン可変ドメイン(dAb)であって、以下のもの:
(a) 該dAbが該抗原に5マイクロモル濃度〜1ピコモル濃度の範囲のKDで結合するような、該標的抗原に特異的な3つの相補性決定(CDR)領域;
(b) 4つのフレームワーク(FW)領域; および
(c) 配列VTVS(S)nXまたはVEIKpRqXからなるC末端配列; および場合により
(d) ヒト生殖細胞系列フレームワーク配列と比較して14、41、108、110、または112位の1以上のアミノ酸置換を含み
ここで:
nは0または1から独立して選択される整数を表し;
pおよびqは、それぞれ、pが1を表す場合、qは0または1であり、かつpが0を表す場合、qも0を表すように、0または1を表し;
Xは存在または不存在であり、かつ存在すれば、1〜8アミノ酸残基のアミノ酸伸長を表し;
ただしXが不存在ならば;
(i) nは0であり、かつ/または末端がVTVS(S)nであるdAbは1以上の該アミノ酸置換を含み;
(ii) pおよび/またはqは0であり、かつ/または末端がVEIKpRqXであるdAbは1以上の該アミノ酸置換を含む、
単一免疫グロブリン可変ドメインを提供する。
【００１９】
KDは平衡解離定数を表す。当業者はKDの数値が小さいほど、結合が強いことを認識する。
【００２０】
この態様の一実施形態では、該dAbは、約10pM〜約50nMの範囲のKDで該抗原に結合する。
【００２１】
この態様の一実施形態では、該単一免疫グロブリン可変ドメイン(dAb)は、等価なdAbより低い抗薬物抗体(ADA)に関する結合親和性および/またはアビディティーを有し、ここで該等価なdAbはXが不存在であり、n、pおよびqが1であり、かつアミノ酸置換が存在しないことを除いて該単一免疫グロブリン可変ドメインと同一の配列を有する。
【００２２】
別の実施形態では、該単一免疫グロブリン可変ドメインは、該C末端配列が配列VTVSSXからなるドメインである。
【００２３】
別の実施形態では、該単一免疫グロブリン可変ドメインは、該C末端配列が配列VEIKRXからなるドメインである。
【００２４】
別の実施形態では、該単一免疫グロブリン可変ドメインは、P14A置換、P41A置換、L108A置換、T110A置換およびS112A置換からなる群から選択される1以上のアミノ酸置換を有する。
【００２５】
一実施形態では、Xが存在し、かつそれが1〜8アミノ酸または1、1〜2、1〜3、1〜4、1〜5、1〜6、1〜7アミノ酸の伸長であり、特にアラニン残基を含む1〜8アミノ酸、または1、1〜2、1〜3、1〜4、1〜5、1〜6、1〜7アミノ酸の伸長、例えば単一アラニン伸長、またはAS、AST、ASTK、ASTKG、ASTKGP伸長である。
【００２６】
別の実施形態では、該dAbはVH、またはVL dAbまたはラクダ科VHHである。
【００２７】
さらに別の態様では、本発明はまた、本明細書中で記載されるように改変されてADAに対する結合性が低下している、本明細書中に記載の無改変の単一免疫グロブリン可変ドメイン(dAb)配列(例えば配列番号１〜６、１０〜１３)のいずれか1つであるアミノ酸配列を提供し、それは例えば、Xが存在し、かつXが1〜8アミノ酸の伸長、特にアラニン残基を含む1〜8アミノ酸の伸長、例えば単一アラニン伸長、またはAS、AST、ASTK、ASTKG、ASTKGP伸長であり、かつ/または該単一免疫グロブリン可変ドメインが1以上のアミノ酸置換を有し、ここで該1以上のアミノ酸置換が、P14A置換、P41A置換、L108A置換、T110A置換およびS112A置換からなる群から選択されるように改変されている、本明細書中に記載の無改変の単一免疫グロブリン可変ドメイン配列である。
【００２８】
一実施形態では、本発明は、ヒトVHまたはラクダ科VHHであり、かつ該C末端伸長が(a) AS、(b) AST (c) ASTK、(d) ASTKG (e) AAAまたは(f) Tまたは(g) ASTKGPから選択されるアミノ酸伸長を含み、かつ/または末端がVTVS(S)nであるdAbからのアミノ酸欠失が存在し、かつ該欠失が-S欠失である、単一免疫グロブリン可変ドメインを提供する。
【００２９】
別の実施形態では、本発明は、ヒトVL、例えばVカッパであり、かつ該C末端伸長が、(a) AAA (b) A (c) TVおよび(d) Tから選択されるアミノ酸伸長を含み、かつ/または末端がVEIKRであるdAbからのアミノ酸欠失が存在し、かつ該欠失が-R欠失である、単一免疫グロブリン可変ドメインを提供する。
【００３０】
本発明の以前の態様の別の一実施形態では、VL dAbのC末端配列がVEIKRAAAまたはVEIKRTである場合、抗体の単鎖Fc領域によって分離された2つのdAbを含み、ここで各dAbがVEGFに結合可能である抗原結合構築物が排除される。
【００３１】
一態様では、本明細書中に記載のようにADAに対する結合性を低下させるように改変されたdAb (例えばVH、VL、例えばVカッパおよびVHH)は、等価であるが無改変の単一免疫グロブリン可変ドメイン(dAb)配列のKDの150%またはそれ以上(例えば200%、250%、300%、350%、400%、450%、500%、550%、600%、650%またはそれ以上)である、ADAに対する結合性のKDを有する。本発明はまた、低下したADA結合性を有するように、本明細書中に記載のように改変されたdAbを提供し、該dAbは、実施例2に記載の確認アッセイを使用して測定された場合にADAに対する低下した結合性を有し、かつここで該改変dAbは、約98%〜100%のシグナル阻害を有するコントロールdAbと比較して、90%未満、例えば80%未満、例えば70%未満、例えば60%未満、例えば50%未満、例えば40%未満、例えば30%未満、例えば20%未満、例えば10%未満であるシグナル阻害の平均%を有し、該コントロール(無改変) dAbは同一または類似の配列を有するが、ADA結合性を低下させるように改変されていない。
【００３２】
本発明はまた、治療方法での使用、例えば副作用を予防する方法での使用のための本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン(dAb)を提供する。この使用は、dAbが標的、例えばTNFα、TNF受容体、TNF受容体1 (TNFR1)、VEGF、IL-1R、IL-6R、IL-4、IL-5、IL-13、DC-SIGN、ASGPR、アルブミン、およびTGFβR2から選択される標的のアンタゴニストである場合に特に有益である。一実施形態では、標的は、受容体、または特に多量体である受容体または活性化時に二量体化する受容体、例えばTNF受容体である。別の実施形態では、ADAに対する低下した結合性を有するように、本明細書中に記載のように改変されたdAbは、反復投薬を含む治療計画で使用することができる。
【００３３】
本発明は、標的がTNFR1である単一免疫グロブリン可変ドメイン(dAb)を提供し、それは、(a) C末端に単一アラニンの伸長を有するDOM1h-131-206 dAb (配列番号１６) ; (b) C末端に単一アラニンの伸長およびP14Aフレームワーク突然変異を有するDOM1h-131-206 dAb (配列番号１７); (c) P14Aフレームワーク突然変異を有するDOM1h-131-206 dAb (配列番号１８); (d) ASTKG C末端伸長を有するDOM1h-131-206 dAb (配列番号１９); および(e) ASTKG C末端伸長およびP14Aアミノ酸フレームワーク突然変異を有するDOM1h-131-206 dAb (配列番号２０)として特定されるアミノ酸配列のいずれかから選択されるdAbである。本発明はまた、DOM1h-131-206 (配列番号１)、DOM 1h-131-511 (配列番号２)、DOM 1h-131-202 (配列番号３)として特定されるアミノ酸配列のいずれか1つに対して、100%、99.5%、99%、98%、97%、96%、95%、90%、85%または80%同一である配列から選択される(無改変) dAbを提供し、それは任意の包含、例えば、ADAに対する結合性を低下させる本明細書中に記載の改変のいずれか、例えば単一アラニンC末端伸長をさらに含む。
【００３４】
本発明のdAbは、本明細書中で記載されるか、または本明細書中に記載の分子の部分である、dAbアミノ酸配列のいずれか1つ(またはそのようなdAb配列に対して、100%、99.5%、99%、98%、97%、96%、95%、90%、85%または80%同一であるアミノ酸配列)、例えば、本明細書中の実施例のいずれかに記載のdAbのいずれか1つを含み、それは例えばADAに対する結合性を低下させるための本明細書中に記載の任意の改変、例えばC末端アラニン伸長を含む。本発明はまた、ADAに対する結合性を低下させるための本明細書中に記載の改変のいずれかを含む上記dAb配列を含む本明細書中(例えば実施例)に記載の分子のいずれかを含み、そのような分子は、例えば、実施例12のVh-Vk dAb-Fc-dAbのいずれか1つ、または本明細書に記載の、例えば本明細書中の実施例に記載のmAbdAbのいずれかであってよい。
【００３５】
ゆえに、本発明は、抗IL13 dAb、例えば(a) DOM10h-53-567 (配列番号１３)または(b) DT04-H-033 (配列番号１２)として特定されるアミノ酸配列のいずれか1つに対して、100%、99.5%、99%、98%、97%、96%、95%、90%、85%または80%同一であるアミノ酸配列を有するdAbを提供し; 該アミノ酸配列は、ADAに対する結合性を低下させる本明細書中に記載の改変のいずれか、例えば単一アラニンC末端伸長をさらに含む。
【００３６】
本発明はまた、抗TNFR1dAb、例えば、DOM1h-574-208 (配列番号１０)として特定されるアミノ酸配列に対して、100%、99.5%、99%、98%、97%、96%、95%、90%、85%または80%同一であるアミノ酸配列を有するdAbを提供し; それは、ADAに対する結合性を低下させる本明細書中に記載の改変のいずれか、例えば単一アラニンC末端伸長をさらに含む。
【００３７】
本発明はまた、抗TNFR1dAb-VL融合物、例えば、DOM1h-574-208-VL融合物(配列番号１１)として特定されるアミノ酸配列に対して、100%、99.5%、99%、98%、97%、96%、95%、90%、85%または80%同一であるアミノ酸配列を有する融合物を提供し; それは、ADAに対する結合性を低下させる本明細書中に記載の改変のいずれか、例えば融合分子のC末端に存在する単一(または３残基)アラニン伸長をさらに含む。
【００３８】
本発明はまた、ADAに対する結合性を低下させる本明細書中に記載の改変のいずれかをさらに含む抗IL13mAb: IL-4 VカッパdAbであるmAbdAbを提供し; 例えばmAbdAbは、mAb-VL '735重鎖分子(配列番号３０)として特定されるアミノ酸配列に対して、100%、99.5%、99%、98%、97%、96%、95%、90%、85%または80%同一であるアミノ酸配列を有する重鎖配列; および'735軽鎖配列(配列番号３１)として特定される軽鎖配列を含むことができ; それは、ADAに対する結合性を低下させる本明細書中に記載の改変のいずれか、例えば単一(または３残基)アラニン伸長をさらに含む。
【００３９】
本発明はまた、本明細書中に記載のようにADAに対する結合性を低下させるように改変されたmAb-VL 15014と表される抗IL13mAb: IL-4 VカッパdAbであるmAbdAbを提供し: ここでmAbdAbは(a) 配列番号３２として特定されるアミノ酸配列に対して、100%、99.5%、99%、98%、97%、96%、95%、90%、85%または80%同一であるアミノ酸配列を有する重鎖-リンカー-Vカッパ配列; および(b) 配列番号３３として特定されるアミノ酸配列に対して、100%、99.5%、99%、98%、97%、96%、95%、90%、85%または80%同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖配列を含む。
【００４０】
本発明はまた、本明細書中に記載のようにADAに対する結合性を低下させるように改変されたmAb-VL 15019と表される抗IL13mAb: IL-4 VカッパdAbであるmAbdAbを提供し: ここでmAbdAbは(a) 配列番号３４として特定されるアミノ酸配列に対して、100%、99.5%、99%、98%、97%、96%、95%、90%、85%または80%同一であるアミノ酸配列を有する重鎖-リンカー-Vカッパ配列; および(b) 配列番号３５として特定されるアミノ酸配列に対して、100%、99.5%、99%、98%、97%、96%、95%、90%、85%または80%同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖配列を含む。
【００４１】
本発明はまた、本明細書中に記載のようにADAに対する結合性を低下させるように改変されたmAb-VL 15020と表される抗IL13mAb: IL-4 VカッパdAbであるmAbdAbを提供し: ここでmAbdAbは(a) 配列番号３６として特定されるアミノ酸配列に対して、100%、99.5%、99%、98%、97%、96%、95%、90%、85%または80%同一であるアミノ酸配列を有する重鎖-リンカー-Vカッパ配列; および(b) 配列番号３７として特定されるアミノ酸配列に対して、100%、99.5%、99%、98%、97%、96%、95%、90%、85%または80%同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖配列を含む。
【００４２】
本発明はまた、本明細書中に記載のようにADAに対する結合性を低下させるように改変されたmAb-VL 15021と表される抗IL13mAb: IL-4 VカッパdAbであるmAbdAbを提供し: ここでmAbdAbは(a) 配列番号３８として特定されるアミノ酸配列に対して、100%、99.5%、99%、98%、97%、96%、95%、90%、85%または80%同一であるアミノ酸配列を有する重鎖-リンカー-Vカッパ配列; および(b) 配列番号３９として特定されるアミノ酸配列に対して、100%、99.5%、99%、98%、97%、96%、95%、90%、85%または80%同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖配列を含む。
【００４３】
本発明はまた、ADAに対する結合性を低下させるための本明細書中に記載の改変のいずれかを有するVHH配列、例えば、配列番号７〜９として特定されるアミノ酸配列のいずれか1つに対して、100%、99.5%、99%、98%、97%、96%、95%、90%、85%または80%同一であるアミノ酸配列を有するVHHを提供する。
【００４４】
本発明はまた、本発明のdAbのいずれか1つをコードする核酸、例えば本明細書中に記載の核酸のいずれか1つ、例えば図９(配列番号２１〜２３)または図１０(配列番号２４〜２９)に示される核酸配列のいずれか1つを提供する。一実施形態では、本発明は、C末端に単一アラニンの伸長を有するDOM1h-131-206 dAbをコードする核酸(配列番号２２)、該核酸(配列番号２２)を含むベクターを提供し、また、該核酸(配列番号２２)を発現する宿主細胞、例えばE.coli宿主細胞、または配列番号２２を発現するベクター、例えばPave011 (Fujifilm Diosynth製)を提供する。また、C末端に単一アラニンの伸長を有するDOM1h-131-206 dAbの製造方法であって、伸長されたdAbの発現に好適な条件下で核酸(配列番号２２)をコードするベクター、例えばPave011 (または核酸)を含む宿主細胞、例えばE.coliを維持し、それによりポリペプチドを製造するステップを含む方法を提供する。
【００４５】
本発明のdAbは他の分子との融合物またはコンジュゲートとして存在させることもできる。
【００４６】
本開示の至る所で記載される本発明の他の実施形態では、本発明の融合物中での「dAb」の使用の代わりに、熟練した当業者(skilled addressee)は、その標的に結合するdAbのCDRを含み、かつそのフレームワークが、ADAに対する結合性を低下させるための本明細書中に記載の改変を含む、ドメインを使用できることが考慮される。
【００４７】
また、本発明の任意の態様または実施形態に記載のdAbを、例えば製薬的または生理学的に許容される担体(群)、賦形剤(群)または希釈剤(群)と組み合わせて含む医薬組成物を提供する。
【００４８】
本発明はさらに、治療または医療のための本発明のdAbの使用および疾患または障害を治療または予防するための使用を提供する。例えば低下したADA結合性を有する抗TNFR1 dAb、例えばADA結合性を低下させるために本明細書中に記載のように改変されたDOM1h-131-206 dAb (例えば図８ａ〜８ｅに示されるアミノ酸配列: 配列番号１６〜２０を有するもの)である。
【００４９】
一態様では、本発明は、例えば炎症性疾患もしくは障害または呼吸器もしくは肺の疾患もしくは障害、例えば急性肺損傷(ALI)および急性呼吸困難症候群(ARDS)およびその合併症を治療または予防するために治療または医療でまたは医薬として使用するための、C末端アラニン伸長を有するDOM1h-131-206 dAb (配列番号１６)の使用を提供する。
【００５０】
本発明はまた、低下したADA結合性を有する本発明のdAbをコードする核酸ならびにこれらの核酸を含むベクターおよび宿主細胞を提供する。また、本発明のdAbの製造方法であって、宿主細胞、例えばE.coliなどの微生物宿主細胞中でコードベクターおよび核酸を発現させるステップを含む方法を提供する。
【００５１】
別の態様では、本発明は、低下したADA結合性を有する本発明のdAbを含む製剤、例えば肺送達用の噴霧製剤を提供する。また、本発明のdAb、例えば抗TNFR1 dAbのいずれか1つ、例えば図８ａ〜８ｅに示されるアミノ酸配列: 配列番号１６〜２０を有するもの、例えばC末端アラニン伸長を有するDOM1h-131-206 dAb (配列番号１６)を含む噴霧器または吸入デバイスを提供する。
【００５２】
別の態様では、本発明は、炎症性皮膚障害、例えば乾癬を治療するための、無改変のDOM1h-131-206 dAb (配列番号１)またはADA結合性を低下させるように本明細書中に記載のいずれかの方法で改変されたDOM1h-131-206 dAb、例えばC末端に単一アラニンの伸長を有するDOM1h-131-206 dAb (配列番号１６)を提供する。
【００５３】
本開示の別の態様は、ヒトの乾癬の治療方法であって、(a) 乾癬を有するヒトを特定するステップ; および(b) 治療上有効量のドメイン抗体(例えば無改変のDOM1h-131-206 dAb (配列番号１)またはADA結合性を低下させるように本明細書中に記載のいずれかの方法で改変されたDOM1h-131-206 dAb、例えばC末端に単一アラニンの伸長を有するDOM1h-131-206 dAb (配列番号１６)を、乾癬を有するヒトの乾癬プラークに投与するステップを含み、それにより乾癬を治療する、方法である。
【００５４】
本開示の別の態様は、乾癬の治療での使用のためのドメイン抗体であり、乾癬の治療での使用のためのドメイン抗体の使用に関する投与計画でもある。ドメイン抗体は、無改変のDOM1h-131-206 dAb (配列番号１)またはADA結合性を低下させるように本明細書中に記載のいずれかの方法で改変されたDOM1h-131-206 dAb、例えばC末端に単一アラニンの伸長を有するDOM1h-131-206 dAb (配列番号１６)であってよい。
【００５５】
別の態様では、本発明はまた、ツールmAb (例えば実施例19に記載され、図６に記載のアミノ酸配列: 配列番号１４および１５を有するツールmAb)を提供する。ツールmAbは、標準マウスモノクローナル抗体テクノロジーを使用して作製した。すなわちマウスをDOM 1H-131-206 (配列番号１)で免疫化し、脾臓を回収し、ハイブリドーマセルラインを作製し、抗体を発現するハイブリドーマをクローニングし、標準的技術を使用して、得られた抗体を単離し、配列決定した。ツールmAbは、VH dAbフレームワークに結合し、それによりADAに対するVH dAbの結合性を低下させるものである。ゆえに、ツールmAbは、ヒト抗VH ADAと類似の、VHフレームワーク上のエピトープに結合すると思われる。ゆえに、ツールmAbは有用であり、例えば、改変dAb (VH、VHH)を試験するため、およびdAbに対するどの改変がツールmAbに対するdAbの結合性を妨げるかまたは低下させるかを決定するために使用することができる。ツールmAbに対する結合性を妨げるVH dAbの改変はまた、ADAに対するVH dAbの結合性を妨げるかまたは低下させる。ゆえに、本発明は、ツールmAbに対する結合性を妨げるかまたは低下させるように(例えば本明細書中に記載の改変のいずれかによって)改変された任意のdAbを提供する。本発明はまた、dAb、例えば改変dAb (例えば(VH、VHH)、例えば本明細書中に記載の任意のもの、例えば本明細書中に記載されるようなTNFR1 dAb)を試験するため、および例えばADAに対する低下した結合性を有するものを決定するためのアッセイでの、ツールmAb (例えば実施例19に記載され、実施例19およびさらに図６に記載のアミノ酸配列: 配列番号１４および１５を有するツールmAb)の使用方法を提供する。一態様では、dAb (例えば(VH、VHH)は、本明細書中に記載のツールmAbに対する結合性を低下させ、かつ、改変されていない等価なdAb配列のKDの150%またはそれ以上(例えば200%、250%、300%、350%、400%、450%、500%、550%、600%、650%またはそれ以上)であるツールmAbに対する結合性のKDを有するように改変される。本発明はまた、このスクリーニングアッセイによって特定される任意のdAbを提供する。
【００５６】
別の態様では、本発明はまた、組織サンプルまたは血漿サンプル中にどれだけの量のdAb (例えばVH、VHH)が存在するかを定量するアッセイ方法での、ツールmAb (例えば実施例19に記載され、かつ図６に記載のアミノ酸配列: 配列番号１４および１５を有するツールmAb)の使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】図１は健康なヒト被験体のパネルの血清中の既存の抗薬物抗体の頻度を示す。
【図２−１】図２は、(a) (無改変) DOM 1H-131-206 (配列番号１)  (b) (無改変) DOM 1H-131-511 (配列番号２)  (c) (無改変) DOM 1H-131-202 (配列番号３)として特定される無改変の抗TNFR1 dAb; および以下のように特定されるVHH配列: (d) 二重特異性型であり、WO2010100135に記載のようにGGGGSGGGSによってヒト血清アルブミン結合モジュールに連結されたIL6R結合モジュールを有する(配列番号４)、(e) 二重特異性型であり、WO2010077422に記載のようにGGGGSGGGSをリンカーとして使用してTNF結合モジュールに連結された血清アルブミン結合モジュールに連結されたTNF結合モジュールを有する(配列番号５)、(f) WO2009115614A2に示されるように、Ala-Ala-Alaリンカーによって連結された2個の同一モジュールを含む二価の単一特異性型であり、各モジュールはフォンウィルブランド因子のA1ドメインに結合できるdAbである(配列番号６)、(g) Clone VHH2(d)は二重特異性型であり、WO2010100135に記載のようにGGGGSGGGSによってヒト血清アルブミン結合モジュールに連結されたIL6R結合モジュールを有し、アラニン伸長を有する(配列番号７)  (h) 二重特異性型、WO2010077422に記載のようにGGGGSGGGSをリンカーとして使用してTNF結合モジュールに連結された血清アルブミン結合モジュールに連結されたTNF結合モジュールを有し、アラニン伸長を有する(配列番号８)  (i) WO2009115614A2に示されるように、Ala-Ala-Alaリンカーによって連結された2個の同一モジュールを含む二価の単一特異性型であり、各モジュールはフォンウィルブランド因子のA1ドメインに結合できるdAbであり、アラニン伸長を有する(配列番号９)  (j) DOM 1H-574-208 (配列番号１０)  (k) DOM 1H-574-208 - VL融合物(配列番号１１)  (l) DT04-H-033 (配列番号１２) ; (m) Dom10h-53-567 (配列番号１３)、のアミノ酸配列を示す。
【図２−２】図２の続きである。
【図２−３】図２の続きである。
【図３】図３は、DOM1H-131-206のモデル結晶構造を示し、突然変異させた場合にADA結合に影響する残基が強調表示されている。表面残基のモデリングを行い、得られた突然変異体を、既存のADAに対する結合に関してADAアッセイでスクリーニングした(例えば実施例2に記載の通り)。14および「C-term(C末端)」と表示される残基は、突然変異させた場合にADA結合に強い影響を有することが見出され、112、110、108および41と表示される残基は、突然変異させた場合にADA結合に中程度の影響を有することが見出され、13、11、91、43、44、83および84と表示される残基は、突然変異させた場合にADA結合に弱い影響を有することが見出された。
【図４】図４は、VHHクローン2(d)、2(e)および2(f)への単一アラニンアミノ酸残基伸長の付加によって引き起こされるADAに対する結合の抑止を示す。
【図５】図５は、VH dAbまたはVL dAbまたはこれらのdAbを含む分子のADAに対する結合のレベルを示す。
【図６】図６ａおよび６ｂはツールmAb (M2.3G10.1G06)のアミノ酸配列を示し、図６ａは軽鎖配列(配列番号１４)を示し; 図６ｂは重鎖配列を示す。図中、CDRを下線で示す(配列番号１５)。
【図７】図７は、一連の既存の抗VH ADAシグナルを有する被験体由来の血清サンプルの存在下での競合アッセイシグナル(x軸)を示す。既存の抗VH adaを有する一連のヒトドナー由来の血清は、DOM 1H-131-206に対する結合に関して抗VH mAb M2.3G10.1G06と競合し、競合アッセイシグナルの阻害が生じる。
【図８】図８は、(a) 単一アラニンの伸長を有するDOM1h-131-206 dAb (配列番号１６); (b) 単一アラニンの伸長およびP14Aフレームワーク突然変異を有するDOM1h-131-206 dAb (配列番号１７); (c) P14Aフレームワーク突然変異を有するDOM1h-131-206 dAb (配列番号１８); (d) ASTKG C末端伸長を有するDOM1h-131-206 dAb (配列番号１９); および(e) ASTKG C末端伸長およびP14Aフレームワーク突然変異を有するDOM1h-131-206 dAb (配列番号２０)として特定される、改変TNFR1 dAbのアミノ酸配列を示す。
【図９】図９は、TNFR1 dAb: (a) DOM1h-131-206 dAb (配列番号２１) (b) C末端に単一アラニンの伸長を有するDOM1h-131-206 dAb (配列番号２２) (c) ASTKGのC末端伸長を有するDOM1h-131-206 dAb (配列番号２３)の核酸配列を示す。
【図１０−１】図１０は、(a) 図２ｄに示されるアミノ酸配列を有するVHH配列(配列番号２４) (b) 図２ｅに示されるアミノ酸配列を有するVHH配列(配列番号２５); (c) 図２ｆに示されるアミノ酸配列を有するVHH配列(配列番号２６)、(d) 単一アラニンの伸長を有する、GGGGSGGGSによってヒト血清アルブミン結合モジュールに連結されたIL6R結合モジュールを有する、二重特異性型であるVHH配列(配列番号２７)、(e) 単一アラニンの伸長をさらに含む、２ｅに示されるアミノ酸配列を有するVHH配列(配列番号２８)、(f) 単一アラニンの伸長をさらに含む、２ｆに示されるアミノ酸配列を有するVHH配列(配列番号２９)をコードする核酸配列を示す。
【図１０−２】図１０の続きである。
【図１１−１】図１１は、mAb:VL dAb (IL-13mAb: IL-4VカッパdAb分子): (a) mAb-VL '735分子(IL-13mAb: IL-4VカッパdAb) (配列番号３０および３１)、(b) mAb-VL 150154 (配列番号３２および３３)、(c) mAb-VL 15019 (配列番号３４および３５)、(d) ) mAb-VL 15020 (配列番号３６および３７)、(e) mAb-VL 15021 (配列番号３８および３９)のアミノ酸配列を示す。
【図１１−２】図１１の続きである。
【図１１−３】図１１の続きである。
【図１２−１】図１２は、(a) DMS30045: DOM15-26-597 dAb N-(VEPKSSDKリンカー) & C末端K-044-085 dAb ((TGLDSP)x4) (配列番号４０)、(b) DMS30046: DMS1576およびC末端K-044-085 dAb ((TGLDSP)x4) (配列番号４１)、(c) DMS30047 (改変C末端を含む) : DOM15-26-597 dAb N-(VEPKSSDKリンカー) & C末端K-044-085 dAbマイナスC末端R ((TGLDSP)x4) (配列番号４２)、(d) DMS30048 (改変C末端を含む): DOM15-26-597 dAb N-(VEPKSSDKリンカー) & C末端K-044-085 dAb +A ((TGLDSP)x4) (配列番号４３)、(e) DMS30049 (改変C末端を含む): DOM15-26-597 dAb N-(VEPKSSDKリンカー) & C末端K-044-085 dAb +AAA ((TGLDSP)x4) (配列番号４４)、(f) DMS30050 (改変C末端を含む): DOM15-26-597 dAb N-(VEPKSSDKリンカー) & C末端K-044-085 dAb +T ((TGLDSP)x4) (配列番号４５)、(g) DMS30051 (改変C末端を含む): DMS1576およびC末端K-044-085 dAbマイナスC末端R ((TGLDSP)x4) (配列番号４６)、(h) DMS30052 (改変C末端を含む): DMS1576およびC末端K-044-085 dAb +A ((TGLDSP)x4) (配列番号４７)、(i) DMS30053 (改変C末端を含む): DMS1576およびC末端K-044-085 dAb +AAA ((TGLDSP)x4) (配列番号４８)、(j) DMS30054 (改変C末端を含む): DMS1576およびC末端K-044-085 dAb +T ((TGLDSP)x4) (配列番号４９)のアミノ酸配列を示す。
【図１２−２】図１２の続きである。
【図１２−３】図１２の続きである。
【図１２−４】図１２の続きである。
【発明を実施するための形態】
【００５８】
発明の詳細な説明:
本明細書中では、本発明は、明瞭かつ簡潔な明細書の記載を可能にするよう、実施形態を参照して記載されている。本発明から逸脱することなく、実施形態を種々に組み合わせるかまたは分離できることが意図されており、理解されるべきである。
【００５９】
特に指定されない限り、本明細書中で使用されるすべての技術用語および科学用語は、当技術分野(例えば、細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、ハイブリダイゼーション技術および生化学)の当業者によって共通に理解される意義と同一の意義を有する。分子的、遺伝的および生化学的方法(一般にSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.およびAusubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4th Ed, John Wiley & Sons, Inc.、該文献は参照によりここに組み入れられる、を参照のこと)および化学的方法の標準的技術を使用する。
【００６０】
親和性は、単一結合部位での、ある分子、例えば本発明の抗原結合タンパク質の、別の分子、例えばその標的抗原に対する結合の強度である。抗原結合タンパク質のその標的に対する結合親和性は標準平衡法(例えば酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)またはラジオイムノアッセイ(RIA))、またはキネティクス(例えばBIACORETM分析)によって測定することができる。
【００６１】
本明細書中で使用される用語「エピトープ」とは、抗原結合タンパク質、例えばdAbの特定の結合ドメインと接触する抗原の部分を表す。エピトープは直線状または立体構造/不連続エピトープである。立体構造または不連続エピトープは、他の配列によって分離されたアミノ酸残基を含み、すなわち抗原の一次配列における連続配列ではない。残基はペプチド鎖の異なる領域由来であるかもしれないが、それらは抗原の3次元構造において近接している。多量体抗原の場合、立体構造または不連続エピトープは、異なるペプチド鎖由来の残基を含むことができる。エピトープ内に含まれる具体的な残基は、コンピュータモデリングプログラムによって、またはX線結晶構造解析などの当技術分野で公知の方法によって得られる3次元構造によって決定することができる。
【００６２】
dAbコンジュゲートとは、共有結合または非共有結合、好ましくは共有結合によって追加の分子が化学的にコンジュゲートされているdAbを含む組成物を表す。そのような共有結合は、ペプチド結合によるものであるか、または他の手段、例えば改変された側鎖を介するものであるかもしれない。非共有結合は直接的(例えば、静電気的相互作用、疎水的相互作用)または間接的(例えば、相補的結合パートナー(例えば、ビオチンおよびアビジン)の非共有結合による結合、ここで一方のパートナーは共有結合によって薬物に取り付けられ、かつ相補的結合パートナーは共有結合によってdAbTMに取り付けられる)である。相補的結合パートナーが用いられる場合、結合パートナーの一方を共有結合によって直接または好適なリンカー部分を通して薬物に取り付け、かつ相補的結合パートナーを共有結合によって直接または好適なリンカー部分を通してdAbTMに取り付けることができる。
【００６３】
本明細書中で使用されるdAb融合物とは、dAbおよびポリペプチド薬物を含む融合タンパク質を表す。dAbおよびポリペプチド薬物は単一の連続ポリペプチド鎖の個別の部分(成分)として存在させる。
【００６４】
本明細書中で使用される「フラグメント」とは、ポリペプチドに関して使用される場合、天然に存在するポリペプチドの全体のアミノ酸配列の部分と同一であるが全体とは同一でないアミノ酸配列を有するポリペプチドである。フラグメントは「独立」であるか、または大きいポリペプチド内に含まれ、それらは単一の大きいポリペプチドの単一の連続領域として、その部分または領域を形成する。
【００６５】
本明細書中で使用される用語mAbdAbとは、別の結合ドメイン、特に単一可変ドメイン、例えばドメイン抗体に連結されたモノクローナル抗体を表す。mAbdAbは少なくとも2つの抗原結合部位を有し、その少なくとも1つはドメイン抗体由来であり、かつ少なくとも1つは対になるVH/VLドメイン由来である。そのようなmAbdAbは例えばWO 2009/068649に記載される。
【００６６】
本明細書中で使用される「ペプチド」とは、ペプチド結合によってともに連結された約2〜約50アミノ酸を表す。本明細書中で使用される「ポリペプチド」または「タンパク質」とは、ペプチド結合によってともに連結された少なくとも約50アミノ酸を表す。ポリペプチドおよびタンパク質は一般に三次構造を含み、機能ドメインにフォールディングする。
【００６７】
本明細書中で使用される用語「抗体の単鎖Fc領域」とは、IgG、例えばIgG1、IgG2、IgG3、iGG4またはIgG4PE、またはIgA抗体の単一重鎖Fc領域を表す。単一重鎖Fc領域は、1以上のCH1、CH2およびCH3定常領域抗体ドメイン、例えば3つの定常領域抗体ドメインすべてまたはCH2およびCH3ドメインのみを含むことができる。1以上のCH1、CH2およびCH3定常領域抗体ドメインを含むことに加えて、抗体の単一重鎖FC領域は、抗体のヒンジ領域(通常CH1とCH2ドメインの間に見出されるそのような領域)をさらに含むことができる。
【００６８】
本明細書中で使用される「機能的」とは、生物学的活性、例えば特異的結合活性を有するポリペプチドまたはペプチドを説明する。例えば、用語「機能的ポリペプチド」には、その抗原結合部位によって標的抗原に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントが含まれる。
【００６９】
本明細書中で使用される「標的リガンド」とは、ポリペプチドまたはペプチドと特異的または選択的に結合するリガンドを表す。例えば、ポリペプチドが抗体、その抗原結合フラグメント、または免疫グロブリン単一可変ドメインである場合、標的リガンドは任意の所望の抗原またはエピトープであってよい。標的抗原に対する結合は、ポリペプチドまたはペプチドが機能的であることに依存する。
【００７０】
本明細書中で使用される抗体とは、IgG、IgM、IgA、IgDまたはIgEまたはフラグメント(例えば、Fab、F(ab')2、Fv、ジスルフィド結合Fv、scFv、閉構造多重特異性抗体、ジスルフィド結合scFv、二重特異性抗体)を表し、天然に抗体を生産する任意の種由来であるか、または組換えDNAテクノロジーによって創出されたかにかかわらず; 血清、B細胞、ハイブリドーマ、トランスフェクトーマ(transfectomas)、酵母または細菌から単離されたかにかかわらない。
【００７１】
表現「免疫グロブリン単一可変ドメイン」とは、他のV領域またはドメインと無関係に抗原またはエピトープに特異的に結合する抗体可変ドメイン(VH、VHH、VL)を表す。免疫グロブリン単一可変ドメインは、他の可変領域または可変ドメインを伴う型(例えば、ホモ-またはヘテロ-多量体)で存在させることができ、ここで他の領域またはドメインは単一免疫グロブリン可変ドメインによる抗原結合に必要とされない(すなわち免疫グロブリン単一可変ドメインは追加の可変ドメインと無関係に抗原に結合する)。「ドメイン抗体」または「dAb」は、該用語が本明細書中で使用される場合、「免疫グロブリン単一可変ドメイン」と同一である。「単一免疫グロブリン可変ドメイン」は、該用語が本明細書中で使用される場合、「免疫グロブリン単一可変ドメイン」と同一である。「単一抗体可変ドメイン」は、該用語が本明細書中で使用される場合、「免疫グロブリン単一可変ドメイン」と同一である。免疫グロブリン単一可変ドメインは、一実施形態では、ヒト抗体可変ドメインであるが、それには、他の種、例えばげっ歯類(例えば、WO 00/29004、該文献の開示内容は参照によりその全体がここに組み入れられる、に開示される)、テンジクザメおよびラクダ科VHH dAb由来の単一抗体可変ドメインも含まれる。ラクダ科VHHは、天然に軽鎖を欠いている重鎖抗体を生産する、ラクダ、ラマ、アルパカ、ヒトコブラクダ、およびグアナコを含む種由来の免疫グロブリン単一可変ドメインポリペプチドである。VHHはヒト化することができる。また、完全にヒトではないように改変されているヒトdAbは本発明の範囲内であり、例えば凝集を低下させるように作製された、ラクダ科モチーフである同残基の突然変異を含む改変である。
【００７２】
無改変の免疫グロブリン単一可変ドメイン(すなわち無改変dAb)、例えば標的に結合するdAbはフレームワーク構造内の3つの相補性決定領域(CDR)を含む。天然に存在する免疫グロブリン鎖の遺伝学では、V領域はCDR3の開始部分で終結し、CDR3の残りはDおよびJ領域によって提供される(V-D-J融合物が得られる)が、本発明の目的では、dAbはCDR3の全体を含み、そのC末端のフレームワーク4残基で終結する。VH dAbはそのC末端の残基LVTVSSで終結する。VHH dAbはそのC末端の残基VTVSSで終結する。VL dabはそのC末端のVEIKRで終結する。
【００７３】
「改変dAb」は、dAb C末端の3次元コンフォメーションを変化させる改変をさらに有する本明細書中に記載のdAbである。改変dAbには、本明細書中で開示されるC末端付加、伸長またはタグおよび/または特定のアミノ酸置換を含むdAbが含まれる。
【００７４】
本発明はまた、抗薬物抗体に関して、等価なdAb (またはdAbを含む分子)より低い結合親和性および/またはアビディティーを有する(例えば、それは150%またはそれ以上(例えば、等価な配列のKDの200%、250%、300%、350%、400%、450%、500%、550%、600%、650%またはそれ以上)である、ADAに対する結合のKDを有する)、上記の単一免疫グロブリン可変ドメイン(またはdAbを含む分子、例えばmAbdAb)を提供し、該等価なdAbは、Xが不存在であり、n、pおよびqが1であり、かつフレームワーク突然変異が存在しないことを除いて同一の配列を有する。これは、dAb、例えばDOM 1H-131-206 (配列番号１)は、伸長されて、X、例えばC末端単一アラニン伸長を含むように改変されるか、またはC末端セリンが除去されるように改変されるか、または1以上の残基14、41、108、110および/または112のフレームワーク中の置換によって改変される(またはそのような改変の任意の組み合わせによって改変される)と、そのような改変をいずれも含まないDOM 1H-131-206 (配列番号１)より低い結合親和性および/またはアビディティーで抗薬物抗体(ADA)に結合することを意味する。これは表面プラズモン共鳴を使用して、例えば標準的技術を使用するBiacore TMで決定することができる。当業者はKD値が低いほど、結合が強いことを理解する。
【００７５】
本発明はまた、低下したADA結合性を有するように本明細書中に記載のように改変されたdAbを提供し、それは、実施例2に記載の確認アッセイを使用して測定された場合にADAに対する低下した結合性を有し、かつここで該改変dAbは、約98%〜100%のシグナル阻害を有するコントロールdAbと比較して、90%未満、例えば80%未満、例えば70%未満、例えば60%未満、例えば50%未満、例えば40%未満、例えば30%未満、例えば20%未満、例えば10%未満であるシグナル阻害の平均%を有し、該コントロール(無改変) dAbは同一または類似の配列を有するが、ADA結合性を低下させるように改変されていない。
【００７６】
既存のADAは、薬物が投与されることになっている被験体中にすでに存在するADAである。既存のADAはナイーブ被験体(すなわち薬物が以前に一度も投与されていない被験体)に存在することもある。
【００７７】
「ドメイン」は、タンパク質の残りと無関係に三次構造を有する折り畳まれたタンパク質構造である。一般に、ドメインはタンパク質の個別の機能的特性を担い、多くの場合、タンパク質の残りおよび/またはドメインの残りの機能を喪失させずに、付加するか、除去するか、または他のタンパク質に移すことができる。「単一抗体可変ドメイン」は、抗体可変ドメインに典型的な配列を含む折り畳まれたポリペプチドドメインである。したがって、それには、完全抗体可変ドメインおよび改変された可変ドメイン、例えば、1以上のループが、抗体可変ドメインに典型的でない配列によって置換されているもの、または、切断されているかまたはN-もしくはC-末端伸長を含む抗体可変ドメイン、ならびに完全長ドメインの少なくとも結合活性および特異性を保持する可変ドメインの折り畳まれたフラグメントが含まれる。
【００７８】
本明細書中で使用される用語「用量」とは、すべて一度に(単位用量)、または規定の時間間隔にわたって2回以上の投与で被験体に投与される融合物またはコンジュゲートの量を表す。例えば、用量は、1日(24時間)(一日量)、2日、1週間、2週間、3週間または1か月以上の経過にわたって(例えば、単回投与によって、または2回以上の投与によって)被験体に投与される融合物またはコンジュゲートの量を表すことができる。投与間の間隔は任意の所望の時間量であってよい。
【００７９】
「1価」とは、1エピトープに対する結合を意味する。
【００８０】
用語「半減期」とは、in vivoで、例えば天然メカニズムによる分解および/またはクリアランスまたは隔離のせいで、融合物またはコンジュゲートの血清または血漿濃度が50%減少するためにかかる時間を表す。本発明の組成物はin vivoで安定化され、分解および/またはクリアランスまたは隔離に抵抗する血清アルブミン分子、例えばヒト血清アルブミン(HSA)への結合によってその半減期は増加する。これらの血清アルブミン分子は天然に存在するタンパク質であり、それ自身がin vivoで長い半減期を有する。分子の半減期は、半減期を増加させる分子に特異的でない類似の分子より長い期間、in vivoでその機能的活性が持続するならば、増加する。
【００８１】
本明細書中で使用される「流体力学的サイズ」とは、水性溶液中の分子の拡散に基づく分子(例えば、タンパク質分子、リガンド)の見かけのサイズを表す。拡散、すなわち溶液中のタンパク質の移動を処理してタンパク質の見かけのサイズを得ることができ、ここでサイズはタンパク質粒子の「ストークス半径」または「流体力学的半径」によって与えられる。タンパク質の「流体力学的サイズ」は質量および形状(コンフォメーション)の両者に依存し、同一分子量を有する2つのタンパク質はタンパク質の全体のコンフォメーションに基づいて異なる流体力学的サイズを有することがある。
【００８２】
2配列間の「ホモロジー」または「同一性」または「類似性」(該用語は本明細書中で交換可能に使用される)の計算は以下のように実施する。最適な比較のために配列をアライメントする(例えば、最適なアライメントのために第1および第2のアミノ酸または核酸配列の一方または両方にギャップを導入することができ、かつ非相同配列を比較目的では無視することができる)。一実施形態では、比較目的でアライメントされる参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも30%、または少なくとも40%、または少なくとも50%、または少なくとも60%、または少なくとも70%、80%、90%、100%である。そして、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置のアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第1配列のある位置に、第2配列の対応する位置と同一のアミノ酸残基またはヌクレオチドが存在する場合、分子は該位置で同一である(本明細書中で使用されるように、アミノ酸または核酸「ホモロジー」はアミノ酸または核酸「同一性」と等価である)。2配列間の同一性パーセントは、配列によって共有される同一の位置の数の関数であり、2配列の最適なアライメントのために導入する必要があるギャップの数、および各ギャップの長さを考慮に入れる。本明細書中で定義されるアミノ酸およびヌクレオチド配列アライメントおよびホモロジー、類似性または同一性は、アルゴリズムBLAST 2 Sequencesを使用し、デフォルトパラメータを使用して、処理および決定することができる(Tatusova, T. A. et al., FEMS Microbiol Lett, 174:187-188 (1999)。
【００８３】
本発明は、本明細書中に記載の本発明の組成物をコードする単離された核酸および/または組換え核酸に関する。
【００８４】
本明細書中で「単離された」と称される核酸は、その元の環境中(例えば、細胞中または核酸の混合物、例えばライブラリー中)の他の物質(例えば、他の核酸、例えばゲノムDNA、cDNAおよび/またはRNA)から分離されている核酸である。単離された核酸はベクター(例えばプラスミド)の部分として単離することができる。
【００８５】
本明細書中で「組換え」と称される核酸は、例えば、制限酵素、相同組換え、ウイルスなどを使用するベクターまたは染色体へのクローニングなどの人工組換えに基づく方法などの組換えDNA方法論によって製造された核酸、およびポリメラーゼ連鎖反応法(PCR)を使用して作製された核酸である。
【００８６】
本発明はまた、本明細書中に記載の本発明の組成物、例えばADAに対する結合性を低下させるように改変されたdAbをコードする核酸(群)を含む(1以上の)組換え核酸または発現構築物を含む組換え宿主細胞、例えば哺乳類または微生物宿主細胞に関する。また、本明細書中に記載の本発明の組成物の製造方法であって、融合ポリペプチドの発現に適切な条件下で本発明の組換え宿主細胞、例えば哺乳類または微生物宿主細胞を維持するステップを含む方法を提供する。該方法は、所望であれば、融合物を単離または回収するステップをさらに含むことができる。
【００８７】
例えば、本発明の分子をコードする核酸分子(すなわち1以上の核酸分子)を好適な宿主細胞に導入して、選択された宿主細胞に適切な任意の方法(例えば、形質転換、トランスフェクション、エレクトロポレーション、感染)を使用して組換え宿主細胞を創出することができ、核酸分子(群)が1以上の発現調節エレメントに作動可能に連結される(例えば、ベクター中、細胞でのプロセシングによって創出される構築物中、宿主細胞ゲノムへの組込み)ようにすることができる。得られた組換え宿主細胞は、発現に好適な条件下(例えば、誘導物質の存在下、好適な動物中、適切な塩、成長因子、抗生物質、栄養補給剤、などが補充された好適な培地中)で維持することができ、それによりコードペプチドまたはポリペプチドが生産される。所望であれば、コードペプチドまたはポリペプチドを(例えば、動物、宿主細胞、培地、乳から)単離または回収することができる。このプロセスはトランスジェニック動物の宿主細胞中の発現を包含する(例えば、WO 92/03918, GenPharm Internationalを参照のこと)。
【００８８】
本明細書中に記載の本発明の分子は、例えば化学合成によってまたは任意の他の好適な方法によって、好適なin vitro発現系で製造することもできる。
【００８９】
本明細書中で記載されかつ例証されるように、本発明の分子は、概して、その標的リガンドに高親和性で結合する。
【００９０】
本発明の分子、例えばADAに対する低下した結合性を有する改変dAbは、E. coliまたはピキア種(Pichia species)(例えば、P. pastoris)で発現させることができる。一実施形態では、dAbをE. coliまたはピキア種(例えばP. pastoris); または哺乳類細胞培養物(例えばCHO、またはHEK 293細胞)で分泌させる。本明細書中に記載の分子は、E. coliまたはピキア種または哺乳類細胞で発現させて分泌させることができるが、それらは、E. coliまたはピキア種を用いない合成化学的方法または生物学的製造方法などの任意の好適な方法を使用して製造することもできる。一実施形態では、本発明のdAb、例えば本明細書中に記載のTNFR1 dAbをコードする核酸を好適な発現ベクター、例えばPave011 (Fujifilm Diosynth製)にクローニングし、E.coliなどの微生物ベクターで発現させることができる。
【００９１】
本発明の一実施形態では、ADAに対する結合を妨げるようにdAb、例えばVH、VLまたはVHHを改変し、該改変がC末端に存在するタグを含むようにすることができる。このタグは、該分子との融合物またはコンジュゲートとして存在させることができる。タグは、当技術分野で公知の任意のタグであってよく、例えば親和性タグ、例えばmycタグ、FLAGタグ、hisタグ、化学修飾、例えばPEG、またはタンパク質ドメイン、例えば抗体Fcドメインであってよい。特に、本発明は、本明細書中でさらに定義される副作用を減少させる方法での使用のための、タグ、化学修飾またはタンパク質ドメインで伸長された本発明の分子を提供する。
【００９２】
別の実施形態では、本発明はまた、既存のADAの結合性を低下させる改変フレームワークを含む分子、例えばdAb (例えばVHまたはVLまたはVHH)、例えば位置14、41、108、110、または112の任意の位置でアミノ酸置換を含むdAb (例えばVHH、VHまたはVL)を提供する。例えばこれらの置換は、P14A、P14K、P14Q、P14T、P41A、L108A、L108 Q、T110AおよびS112Aから選択される1以上の改変であってよい。
【００９３】
本実施形態の一態様では、dAb (例えばVHH、VHまたはVL)は、P14A、P14K、P14Q、P14T、P41A、L108A、T110AおよびS112Aから選択される1以上の改変を含み; かつ上記C末端伸長、付加、欠失またはタグのいずれかをさらに含むことができる。
【００９４】
一実施形態では、P14A、P14K、P14Q、P14T P41A、L108A、T110AおよびS112Aから選択される1以上の改変を含むdAb (例えばVHH、VHまたはVL)はまた、(a) アラニン、または(b) AS、AST、ASTK、ASTKG、またはASTKGPから選択される伸長を含むかまたはそれからなるアミノ酸配列から選択されるdAbのC末端でのアミノ酸伸長を含む。さらに、本明細書中に記載のdAb分子およびこれらの分子を含む医薬組成物は副作用の予防または減少に有用である。dAbによる抗薬物抗体の結合は、結びついた2つのdAbを生じさせるかもしれない。一部の状況では、これは安全上の懸念を生じさせる。例えば、dAbの標的が受容体または多量体標的であるならば、2つのdAbの結びつきは2つの標的を結びつける。これは、予想外の薬理学的影響を生じさせるかもしれず、例えば受容体の二量体化によって例えばアンタゴニズムよりもアゴニズムを生じさせるかもしれない。ゆえに本発明は、副作用を予防する方法での本発明の分子の使用を提供する。予防とは、本発明の分子の使用が、改変されていない等価な分子と比較して、既存の抗薬物抗体の結合を完全または部分的レベルまで抑止することを意味する。ADAの結合の低下は、望ましくない薬理効果のレベルを減少させる。ゆえに、本発明の分子は、無改変分子、例えば既存のADA結合性を低下させるC末端伸長、付加、欠失またはタグおよび/または他のフレームワーク改変を含まない無改変dAbより高い安全性プロファイルを有しかつ少ない副作用しか有さないことが可能である。同様に、本明細書中に記載の改変分子の投与またはこれらの改変分子(既存のADAに対する低下した結合能を有する)を含む医薬組成物の投与は、改変された免疫原性を生じさせることができ、その理由は、無改変の分子がADAに結合すると、それらは免疫複合体を形成し、そのような免疫複合体は免疫応答を引き起こすかもしれないからである。さらに、本明細書中に記載の改変分子の投与またはこれらの改変分子を含む医薬組成物の投与はまた、改善された効力および改善された安全性プロファイルをもたらし、例えば、無改変分子に対する自己抗体を生じさせるかもしれない患者への反復投薬に好都合に使用することができる。さらに、本発明のdAb分子は、有害反応のリスクがある被験体を排除するためにADA力価に関してプレスクリーニングする必要なく患者集団に投与することができる。副作用の予防のための分子の使用の関連で、本発明はまた、XがYによって置換され、ここでYがタグ、例えば親和性タグ、mycタグ、FLAGタグまたはhisタグ、化学修飾、例えばPEG基、またはタンパク質、例えば抗体のFc部分からなる群から選択される、本明細書中で定義される単一免疫グロブリン可変ドメインの使用を提供する。
【００９５】
本発明はまた、本発明の分子、またはXが上で定義されるYによって置換されている本発明の分子の投与による治療計画において副作用を予防するかまたは減少させる方法を提供する。また、ADAに対するその結合性を低下させかつ副作用を減少させるための本明細書中に記載の分子の改変方法を提供する。
【００９６】
本発明はまた、本明細書中に記載の改変分子を含む組成物、例えば改変VHH、VHまたはVLを含む組成物を提供する。そのような組成物は、他の分子、例えば他のタンパク質、抗体分子または抗体フラグメントとの融合物またはコンジュゲートとして存在する改変分子を含むことができる。例えばdAbを構成変換した(formatted)dAbとして存在させることができ(例えばdAbを例えばWO 2008/149148に記載のdAb-fc融合物またはコンジュゲートとして存在させることができ)るか、またはmAbdAb (WO 2009/068649に記載の通り)として存在させることができるか、または半減期を延長させるタンパク質またはポリペプチド、例えば追加のdAb、例えば血清アルブミンに結合するdAb (AlbudAbTM)または例えばポリエチレングリコール(polyethyleneglygol) PEGまたは追加の治療用もしくは活性分子との融合物またはコンジュゲートとしてdAbを存在させる。この実施形態では、治療用分子(群)は、dAb (例えばVHH、VHまたはVL)との融合物またはコンジュゲートとして存在する場合、dAbのC末端伸長またはdAbのN末端のいずれかに連結することができる。一実施形態では、1以上の治療用分子をdAbのN末端の融合物(またはコンジュゲート)として存在させる。
【００９７】
一実施形態では、低下したADA結合能を有する本発明のdAb (およびまた、dAbを含む分子、例えばやはり本発明の部分であるmAbdAb)は高親和性で標的リガンドに結合し、例えばそれらは、BiacoreTMを使用して表面プラズモン共鳴によって測定された場合に5マイクロモル濃度〜約1 pM、例えば約500 nM〜約10 pM例えば約200nM〜約10pM、例えば50nM〜約10pM例えば約10nm〜約10pMの範囲のKDを有することができる。一実施形態では、該分子は約10nM〜約10〜30pMのKDを有することができ、例えばそれはADAに対する低下した結合性を有し、かつ約10〜30pM例えば約20pMのKDを有するTNFR1 dAbであってよい。
【００９８】
一実施形態では、低下したADA結合能を有する本発明のdAb (およびまた、dAbを含む分子、例えばやはり本発明の部分であるmAbdAb)は、ADAに対する結合性を低下させるように本明細書中に記載のように改変されていない同一または類似のアミノ酸配列のdAbによって示される発現レベルの少なくとも3%、例えば5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%である発現レベルを有することができる。別の実施形態では、低下したADA結合能を有する本発明の分子(例えばdAbおよびdAbを含む分子、例えばmAbdAb)は、少なくとも0.1g/リットルの発現レベルを有することができる。
【００９９】
一実施形態では、低下したADA結合能を有する本発明のdAb (およびまた、dAbを含む分子、例えばやはり本発明の部分であるmAbdAb)は、ADAに対する結合性を低下させるように本明細書中に記載のように改変されていない同一または類似のアミノ酸配列のdAbのKDより約50倍高い(またはそれ以上) (すなわちdAbは50分の1の能力である)、例えば約40倍高い、約30倍高い、約20倍高い、約10倍高い、約5倍高い、約4倍高い、その標的抗原に対する結合のKDを有する。一実施形態では、低下したADA結合能を有する本発明のdAb (およびまた、dAbを含む分子、例えばやはり本発明の部分であるmAbdAb)は、ADAに対する結合性を低下させるように本明細書中に記載のように改変されていない同一または類似のアミノ酸配列のdAbのKDと比較して、本質的に同一(例えば約2倍〜2分の1)か、または2分の1より低い、その標的抗原に対するKDを有する。
【０１００】
本発明はさらに、そのようなC末端が伸長されかつ/または改変された分子を含む使用、製剤、組成物に関し、また、これらの分子の製造および発現方法に関する。
【０１０１】
一実施形態では、本発明は、任意の上記C末端改変を有しかつ、TNFα、TNFR1、VEGF、IL-1R、IL-6R、IL-4、IL-5、IL-13、DC-SIGN、ASGPR、アルブミン、およびTGFβR2から選択される標的に結合するdAb (VH、VL、またはVHH)を提供する。
【０１０２】
一実施形態では、本発明は、WO 2007/049017 (例えば2H-131-511と称される抗TNFR1 dAbまたはこれに対して少なくとも80%同一(例えば85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、100%同一)であるdAb)、WO 2008/149144 (例えば、1h-131-201、1h-131-202、1h-131-203、1h-131-204、1h-131-205から選択される抗TNFR1 dAbまたはこれに対して少なくとも80%同一(例えば85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、100%同一)であるdAb)およびWO 2008/149148 (該文献の開示内容は参照により明示的にここに組み入れられる)のいずれかで記載または開示されるdAb、例えば、該文献中の任意の抗TNFR1 dAbを提供し; 該dAbはADAに対する結合親和性および/またはアビディティーを低下させるための本明細書中に記載の改変の少なくとも1つ、例えば任意の上記C末端改変および/または任意の上記アミノ酸置換および/または欠失をさらに含む。
【０１０３】
別の実施形態では、本発明は、WO 2007/049017、WO 2008/149144、およびWO 2008/149148のいずれかで記載また開示される無改変dAb (例えば任意の上記dAb配列)を提供し、そして該dAbを、例えばP14A、P14K、P14Q、P14T P41A、L108A、T110AおよびS112Aフレームワーク突然変異から選択される1以上のフレームワーク改変を含むように改変し、かつそれはさらにまた、場合により、本明細書中に記載の任意のC末端改変を含むことができる。一例では、無改変dAbは、WO 2007/049017、WO 2008/149144、およびWO 2008/149148のいずれかで記載または開示される任意の抗TNFR1dAb配列であってよい。一実施形態では、無改変の抗TNFR1 dAb配列は、DOM1h-131-206 (WO 2008/149148で開示される)、DOM 1h-131-511 (WO 2007/049017および2008/149144で開示される)およびDOM 1h-131-202 (WO 2008/149144で開示される)として特定されるdAb配列に対して少なくとも80% (例えば85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、100%)同一であるものであってよい。
【０１０４】
別の実施形態では、本発明は、WO 2008/149147で記載または開示されるVEGF dAb、例えば15-26-593と称されるdAb (WO 2008/149147の図５に示されるアミノ酸配列)(該文献の開示内容は参照により明示的にここに組み入れられる)を提供し、該dAbは、ADAに対する結合親和性および/またはアビディティーを低下させるための本明細書中に記載の任意の改変、例えば任意の上記C末端改変および/または任意の上記アミノ酸置換および/または欠失をさらに含む。
【０１０５】
無改変dAbのアミノ酸配列は以下の通りである。
【０１０６】
2020054374.tif 000002
別の実施形態では、本発明は、以下の配列から選択される改変VHH dAbを提供する。
【０１０７】
2020054374.tif 000003
2020054374.tif 000004
別の実施形態では、本発明は、TNFR1に結合し、かつ以下のアミノ酸配列から選択される改変DOM1h-131-206 dAbを提供する。
【０１０８】
2020054374.tif 000005
本発明はまた、本明細書中に記載の分子をコードする核酸、例えば上記抗TNFR1 dAbをコードする核酸を提供する。また、これらの核酸を含む宿主細胞、例えば非胚性宿主細胞、例えば原核生物または真核生物宿主細胞、例えばE. coliまたは酵母宿主細胞または哺乳類細胞を提供する。
【０１０９】
本発明はさらに、ヒト血清中のADAに対する低下した結合性を有する(例えばヒト血清中の既存のADAに結合しない) dAbであって、ADAが結合するdAb上のエピトープがマスクされている(すなわち該エピトープは、例えば結合を妨げるように別の分子によってカバーまたはマスクされているか、または結合を妨げるようにその立体配座が変化していて、もはやADAに対する結合に利用可能でない) dAbを提供する。dAb上のエピトープは、ADA結合を低下させるための本明細書中に記載の任意の改変、例えばdAbのC末端への化学物質の付加または本明細書中に記載のフレームワーク置換、または欠失によってマスクすることができる。dAbのC末端に付加される化学物質は、伸長(例えばアミノ酸伸長)またはタグであってよく、また、それは化学修飾、例えばペグ化またはアミド化であってよい。C末端に対する改変は、ADAに結合するdAb上のエピトープのコンフォメーションを直接的または間接的に変化させ、それによりADAに対するdAbの結合能を低下させる改変であってよい。
【０１１０】
当業者は、本明細書中に記載の分子、例えばdAbの製造時に、特に使用されるセルラインおよび分子、例えばdAbの特定のアミノ酸配列に応じて、翻訳後修飾が生じるかもしれないことを認識する。例えば、これには、特定のリーダー配列の切断、種々のグリコシル化およびリン酸化パターンでの種々の糖部分の付加、脱アミド、酸化、ジスルフィド結合スクランブリング(disulfide bond scrambling)、異性化、C末端リシンクリッピング、およびN末端グルタミン環化が含まれる。本発明は、1以上の翻訳後修飾に付された、すなわちそれを受けた、そのような分子、例えばdAbの使用を包含する。ゆえに、本発明のdAbには、例えば以下に記載されるような翻訳後修飾を受けたdAbが含まれる。定常領域中の保存された位置での抗体のグリコシル化は抗体機能、特にエフェクター機能に顕著な影響を有することが知られている。例えば、Boyd et al. (1996) Mol. Immunol. 32: 1311-1318を参照のこと。1以上の糖鎖が付加、置換、欠失または改変されている本発明の抗原結合タンパク質のグリコシル化変異体が想定される。アスパラギン-X-セリンまたはアスパラギン-X-スレオニンモチーフの導入は、酵素による糖鎖の取り付けのための潜在的部位を創出し、したがって抗体のグリコシル化を操作するために使用することができる。Raju et al. (2001) Biochemistry 40: 8868-8876では、ベータ-1, 4-ガラクトシルトランスフェラーゼ(beta-1, 4-galactosyltransferace)および/またはアルファ, 2,3シアリルトランスフェラーゼを使用する再ガラクトシル化(regalactosylation)および/または再シアリル化(resialylation)の過程を経てTNFR-IgGイムノアドヘシンの末端シアリル化(sialyation)が増加した。末端シアリル化の増加は免疫グロブリンの半減期を増加させると考えられる。抗体は、ほとんどの糖タンパク質と共通して、典型的に、グリコフォームの混合物として生産される。この混合物は、抗体が真核生物、特に哺乳類細胞で生産された場合に特に発生する。特定のグリコフォームを製造する種々の方法が開発されている。Zhang et al. (2004) Science 303: 371: Sears et al. (2001) Science 291: 2344; Wacker et al. (2002) Science 298: 1790; Davis et al. (2002) Chem. Rev. 102: 579; Hang et al. (2001) Acc. Chem. Res 34: 727を参照のこと。本明細書中に記載の抗体(例えばIgGアイソタイプ、例えばIgG1の抗体)は特定数(例えば7以下、例えば5以下、例えば2または1)のグリコフォーム(群)を含むことができる。脱アミドは、主にアスパラギン(N)をイソアスパラギン酸およびアスパラギン酸(D)に約3:1の比で変換する酵素反応である。ずっと低い程度に、類似の様式でグルタミン残基で脱アミドが生じうる。CDRでの脱アミドは、分子の電荷の変化を生じさせるが、典型的に、抗原結合の変化を生じさせず、PK/PDにも影響しない。酸化は製造および保存中に(すなわち酸化条件の存在下で)生じることがあり、活性酸素分子種によって直接的にまたは酸化的ストレスの二次副産物との反応によって間接的に誘発される、共有結合によるタンパク質の改変を生じさせる。酸化は、主にメチオニン残基で生じるが、時折、トリプトファンおよび遊離システイン残基で生じうる; ジスルフィド結合スクランブリングは製造中および塩基性保存条件で生じることがある。特定の状況下で、ジスルフィド結合は切断されるかまたは間違って形成され、不対システイン残基(-SH)が生じることがある���これらの遊離(不対)スルフヒドリル(-SH)はシャフリングを促進することがある。異性化は、典型的に、製造、精製、および保存(酸性pHで)中に生じ、通常、化学過程を経てアスパラギン酸がイソアスパラギン酸に変換される時に生じる。重鎖および/または軽鎖中のN末端グルタミンはピログルタミン酸(pGlu)を形成する可能性がある。ほとんどのpGlu形成は製造バイオリアクター中で生じるが、処理および保存条件のpHおよび温度に応じて非酵素的に形成されることがある。pGlu形成は組換えmAbの主要な分解経路の1つとされる。C末端リシンクリッピングはカルボキシペプチダーゼによって触媒される酵素反応であり、組換えmAbにおいて一般に観察される。この過程のバリエーションには、一方または両方の重鎖からのリシンの除去が含まれる。リシンクリッピングは生物活性に影響しないようであり、mAbエフェクター機能に影響を有さない。
【０１１１】
本発明はさらに、直接融合物として存在するアミノ酸伸長を含む本発明の分子の製造方法であって、本発明の融合物をコードする組換え核酸および/または構築物を含む宿主細胞、例えば上記宿主細胞を該組換え核酸の発現に好適な条件下で維持し、それにより融合物を製造するステップを含む方法を提供する。
【０１１２】
本発明はまた、本発明の改変分子を含む医薬組成物を提供する。本発明はさらに、医療での使用、例えば疾患または症状または障害の例えば治療または予防での使用のための本発明の医薬組成物を提供し、それは治療上有効量の本発明の医薬組成物を該個体に投与するステップを含む。一般に、本発明の分子は、薬理学的または生理学的に適切な担体とともに、精製された形で利用される。典型的に、これらの担体には、水性またはアルコール性/水性溶液、エマルジョンまたは懸濁液が含まれ、いずれも生理食塩水および/または緩衝媒体を含む。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース、デキストロースならびに塩化ナトリウムおよび乳酸加リンガー液が含まれる。好適な生理学的に許容される補助剤は、ポリペプチド複合体を懸濁液中で維持するために必要ならば、増粘剤、例えばカルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ゼラチンおよびアルギナートから選択することができる。静脈内ビヒクルには、液体および栄養補給液および電解質補給液、例えばリンガーデキストロースベースのものが含まれる。保存剤および他の添加物、例えば抗菌剤、酸化防止剤、キレート剤および不活性ガスを存在させることもできる(Mack (1982) Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Edition)。種々の好適な製剤を使用することができ、それには持続放出製剤が含まれる。
【０１１３】
本発明はまた、本明細書中に記載の患者または被験体のような、疾患または障害を有する患者または被験体を(治療的または予防的に)治療する方法であって、治療上有効量の本発明の医薬組成物を該個体に投与するステップを含む方法を提供する。
【０１１４】
本発明の医薬組成物は、単独で、または他の分子または部分、例えばポリペプチド、治療用タンパク質および/または分子(例えば、他のタンパク質(抗体を含む)、ペプチド、または小分子薬物と組み合わせて投与することができる。
【０１１５】
本発明はまた、炎症性疾患または障害、例えば乾癬、関節炎、多発性硬化症、炎症性腸疾患(例えば)クローン病および潰瘍性大腸炎; または例えば、慢性閉塞性肺疾患、慢性気管支炎、慢性閉塞性気管支炎および肺気腫、肺炎(lung inflammation)、慢性閉塞性肺疾患、喘息、肺炎(pneumonia)、過敏性間質性肺炎、好酸球増加を伴う肺浸潤、環境性肺疾患、肺炎、気管支拡張症、嚢胞性線維症、間質性肺疾患、原発性肺高血圧症、肺血栓塞栓症、胸膜の障害、縦隔の障害、横隔膜の障害、低換気、過換気、睡眠時無呼吸、急性呼吸困難症候群、中皮腫、肉腫、移植片拒絶、移植片対宿主病、肺癌、アレルギー性鼻炎、アレルギー、石綿沈着症、アスペルギルス腫、アスペルギルス症、気管支拡張症、慢性気管支炎、肺気腫、エオシン好性肺炎、特発性肺線維症、侵襲性肺炎球菌疾患、インフルエンザ、非結核性マイコバクテリア、胸水、塵肺、ニューモシスチス症(pneumocytosis)、肺炎、肺放線菌症、肺胞タンパク症、肺炭疽、肺水腫、肺動脈塞栓、肺の炎症、肺組織球症X、肺高血圧症、肺ノカルジア症、肺結核、肺静脈閉塞性疾患、リウマチ様肺疾患、サルコイドーシス、およびウェゲナー肉芽腫症および急性肺損傷(ALI)およびまた、急性呼吸困難症候群(ARDS)およびそれらの合併症、例えば急性腎損傷から選択される、例えば呼吸器または肺の疾患または障害の治療での使用のための、本明細書中に記載のように改変された抗TNFR1 VHまたはVL dAb、例えば本明細書中に記載の抗TNFR1 VHまたはVL dAb、または本明細書中に記載のように改変された抗TNFR1 VHHドメインを含む本発明の医薬組成物を提供する。
【０１１６】
本発明はまた、任意の上記の特定の疾患または障害の治療のための医薬品の製造における、本明細書中に記載のように改変された抗TNFR1 dAb (VH、VLまたはVHH)を含む本発明の医薬組成物の使用を提供する。
【０１１７】
本発明はまた、任意の上記炎症性疾患もしくは障害または呼吸器もしくは肺の疾患もしくは障害の治療、診断または予防での使用のための、本明細書中に記載の任意の組成物の使用に関する。本発明はまた、任意の上記炎症性疾患もしくは障害または呼吸器もしくは肺の疾患もしくは障害を予防または軽減するための、本明細書中に記載の任意の組成物の予防的な使用に関する。
【０１１８】
本明細書中に記載の抗TNFR1 dAb、例えばC末端アラニン伸長を有するDOM 1H-131-206を含む組成物は、予防的および/または治療的処置のために投与することができ、「治療上有効量」として投与される。この用量を達成するために必要な量は、疾患の重症度および患者自身の免疫系の全般的状態に依存するが、一般に、体重1 kgあたり0.005〜5.0 mgのdAbの範囲であり、0.05〜2.0 mg/kg/用量の用量が通常使用される。予防的な適用では、疾患を予防するか、阻害するか、またはその発症を遅延させる(例えば、寛解または静止状態を持続させるか、または急性期を予防する)ための類似またはわずかに少ない用量を使用することができる。熟練した臨床家は、疾患を治療、抑制または予防するために適切な投薬間隔を決定することができる。本明細書中に記載の抗TNFR1 dAbが慢性炎症性疾患を治療、抑制または予防するために投与される場合、1日あたり4回まで、毎週2回、毎週1回、隔週に1回、月1回、または隔月に1回、例えば、約10μg/kg〜約80 mg/kg、約100μg/kg〜約80 mg/kg、約1 mg/kg〜約80 mg/kg、約1 mg/kg〜約70 mg/kg、約1 mg/kg〜約60 mg/kg、約1 mg/kg〜約50 mg/kg、約1 mg/kg〜約40 mg/kg、約1 mg/kg〜約30 mg/kg、約1 mg/kg〜約20 mg/kg、約1 mg/kg〜約10 mg/kg、約10μg/kg〜約10 mg/kg、約10μg/kg〜約5 mg/kg、約10μg/kg〜約2.5 mg/kg、約1 mg/kg、約2 mg/kg、約3 mg/kg、約4 mg/kg、約5 mg/kg、約6 mg/kg、約7 mg/kg、約8 mg/kg、約9 mg/kgまたは約10 mg/kgの用量で投与することができる。特定の実施形態では、慢性炎症性疾患を治療、抑制または予防するために、隔週に1回または月1回、約10μg/kg〜約10 mg/kg (例えば、約10μg/kg、約100μg/kg、約1 mg/kg、約2 mg/kg、約3 mg/kg、約4 mg/kg、約5 mg/kg、約6 mg/kg、約7 mg/kg、約8 mg/kg、約9 mg/kgまたは約10 mg/kg)の用量で抗TNFR1 dAbを投与することができる。
【０１１９】
本明細書中に記載の組成物を使用して実施される治療または療法は、治療前に存在する症状と比較して、またはそのような組成物で治療されていない個体(ヒトまたはモデル動物)での症状または他の好適なコントロールと比較して、1以上の症状または徴候が(例えば、少なくとも10%または臨床評価スケールで少なくとも1ポイント)減少または軽減すれば、「有効」とされる。症状は、明らかに、治療される疾患または障害の正確な性質に依存して変動するが、通常の熟練した臨床家または技術者は症状を測定することができる。
【０１２０】
同様に、本明細書中に記載の組成物を使用して実施される予防は、組成物で治療されていない類似の個体(ヒトまたは動物モデル)の症状と比較して、1以上の症状または徴候の発症または重症度が遅延、減少または消失すれば、「有効」である。
【０１２１】
本発明の分子は、例えば、PEG基、血清アルブミン、トランスフェリン、トランスフェリン受容体または少なくともそのトランスフェリン結合部分、抗体Fc領域の取り付け、または抗体ドメインへのコンジュゲートによって、半減期をさらに延長するために大きい流体力学的サイズを有するようにさらに構成変換することができる。例えば、血清アルブミンに結合するdAbは、抗体の大きい抗原結合フラグメントとして構成変換(例えば、Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab')2、IgG、scFvとして構成変換)することができる。
【０１２２】
特定の実施形態では、本発明は、例えばC末端伸長および/またはP14Aフレームワーク突然変異によって本発明にしたがって改変された第1のdAbおよび、第1のdAbと同じかまたは異なる結合特異性を有する第2のdAbおよび、任意で、多重特異性リガンドの場合に、追加のdAbを含む、二重特異性リガンドまたは多重特異性リガンドを含む、本発明に基づく組成物を提供する。第2のdAb (または追加のdAb)は、場合により、異なる標的に結合することができ、かつ、場合により、本発明に基づくC末端伸長および/またはP14Aフレームワーク突然変異を含むこともできる。
【０１２３】
一態様では、本発明は、非経口投与、例えば皮下、筋肉内または静脈内注射、吸入、経鼻送達、経粘膜(transmucossal)送達、経口送達、患者の胃腸管への送達、経直腸送達または眼球送達による送達のための、本発明の分子および組成物を提供する。一態様では、本発明は、皮下注射、吸入、静脈内送達、経鼻送達、経粘膜送達、経口送達、患者の胃腸管への送達、経直腸送達、経皮または眼球送達による送達のための医薬品の製造における本発明の分子および組成物の使用を提供する。
【０１２４】
一態様では、本発明は、皮下注射、肺送達、静脈内送達、経鼻送達、経粘膜送達、経口送達、患者の胃腸管への送達、経直腸または眼球送達による患者への送達のための方法であって、薬剤的に有効量の本発明の分子を患者に投与するステップを含む方法を提供する。
【０１２５】
一態様では、本発明は、本発明の分子を含む、経口、注射用、吸入用、噴霧用製剤を提供する。
【０１２６】
製剤は、錠剤、丸剤、カプセル、液体またはシロップの剤形であってよい。
【０１２７】
用語「被験体」または「個体」とは、本明細書中で、動物、例えば哺乳類を含むと定義され、それには、非限定的に、霊長類(例えばヒト)、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、ラット、マウスまたは他のウシ、ヒツジ、ウマ、イヌ、ネコ、げっ歯類またはマウス種が含まれる。
【０１２８】
本発明はまた、本発明の分子および組成物を被験体(例えばヒト患者)に投与する際に使用するためのキットであって、本発明の分子または組成物、薬物送達デバイスおよび、場合により、使用説明書を含むキットを提供する。該組成物は製剤、例えば凍結乾燥製剤または徐放製剤として提供することができる。特定の実施形態では、薬物送達デバイスは、シリンジ、吸入器、鼻内または眼球投与デバイス(例えば、噴霧器(mister)、点眼または点鼻器(eye or nose dropper))、および無針注射デバイスからなる群から選択される。
【０１２９】
本発明の分子および組成物を保存のために凍結乾燥し、使用前に好適な担体中で再構成することができる。任意の好適な凍結乾燥方法(例えば、スプレー乾燥、ケーキ乾燥)および/または再構成技術を使用することができる。当業者は、凍結乾燥および再構成が種々の程度の抗体活性の損失を生じさせる可能性があることおよび使用量を調節して補填する必要があるかもしれないことを理解する。特定の実施形態では、本発明は、本明細書中に記載の凍結乾燥(フリーズドライ)組成物を含む組成物を提供する。好ましくは、凍結乾燥(フリーズドライ)組成物は、再水和時に、その活性(例えば血清アルブミンへの結合活性)の約20%未満、または約25%未満、または約30%未満、または約35%未満、または約40%未満、または約45%未満、または約50%未満を失う。活性は、凍結乾燥される前に組成物の効果を生じさせるために必要とされる組成物量である。組成物の活性は、凍結乾燥前に任意の好適な方法を使用して決定することができ、損失活性の量を決定するために再水和後に同法を使用して活性を決定することができる。
【０１３０】
本発明はまた、本発明の分子を含む持続放出または徐放製剤を提供し、そのような持続放出製剤は、例えばヒアルロン酸、ミクロスフェアまたはリポソームおよび他の製薬的または薬理学的(pharmacalogically)に許容される担体、賦形剤および/または希釈剤と組み合わせて本発明の分子を含むことができる。
【０１３１】
一態様では、本発明は、本発明の分子、および製薬的または生理学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤を含む医薬組成物を提供する。
【０１３２】
一実施形態では、本発明は、ADAに対する低下した結合性を有する本発明の改変TNFR1 dAb、例えば、ADAに対する結合性を低下させるための本明細書中に記載の改変を有する改変DOM1h-131-206 dAbを提供する。例えば本発明は、例えば疾患または障害を治療するため、例えば呼吸器疾患または障害、例えばCOPD、ALIまたはARDSを治療するための使用のための例えば医薬組成物として、C末端に単一アラニンの伸長を有するDOM1h-131-206 dAb (配列番号１６)を提供する。C末端に単一アラニンの伸長を有するDOM1h-131-206 dAb (配列番号１６)(またはC末端に単一アラニンの伸長を有するDOM1h-131-206 dAbを含む医薬組成物)は、呼吸器疾患または障害、例えばCOPD、ALIまたはARDSを治療するために使用される場合、注射(例えば皮下、静脈内または筋肉内注射)によって被験体、例えばヒト被験体に投与することができ、あるいは、肺投与、例えば標準的噴霧器を使用する噴霧によって、または吸入、例えば標準的吸入デバイスを使用することによって被験体、例えばヒト被験体に投与することができる。本発明はさらに、低下したADA結合性を有する本発明の改変TNFR1 dAb、例えばC末端に単一アラニンの伸長を有するDOM1h-131-206 dAb (配列番号１６)を含む持続放出および/または凍結乾燥製剤を提供する。また、本発明の改変TNFR1 dAb、例えばC末端核酸の単一アラニンの伸長を有するDOM1h-131-206 dAb (配列番号２２)を含む送達デバイス、例えば吸入または噴霧デバイスを提供する。
【０１３３】
一態様では、本発明は、炎症性皮膚障害、例えば乾癬を治療するための、無改変のDOM1h-131-206 dAb (配列番号１)または、ADA結合性を低下させるための本明細書中に記載の任意の方法で改変されたDOM1h-131-206 dAb、例えばC末端に単一アラニンの伸長を有するDOM1h-131-206 dAb (配列番号１６)を提供し、また、乾癬の治療でのドメイン抗体の使用に関する、以下に記載の任意の投与計画を提供する。乾癬の治療に有用なドメイン抗体は、この受容体に関する天然のヒトTNF-アルファリガンドと同一のヒトTNFR1のドメインを選択的に標的にし、かつTNFR1の特異的、競合的アンタゴニストであるが、TNFR2の特異的、競合的アンタゴニストではなく、TNFR1に対するTNF-アルファの結合およびTNFR1を経由するこのリガンドのシグナル伝達を妨げる。そのようなドメイン抗体は、本明細書中で開示されるようにADAに対する結合性を低下させるように改変されている任意の抗TNFR1 dAbを含むことができる。特に、ドメイン抗体は、ヒトドメイン抗体、例えば配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するDOM1h-131-206、配列番号１６に示されるアミノ酸配列を有するC末端アラニンを有するDOM1h-131-206、または本明細書中に記載のようにADA結合性を低下させるための改変(すなわち、本明細書中で開示される、ADAに対する結合性を低下させるための任意の改変)を受けるDOM1h-131-206 dAb (配列番号１)であるかもしれない。ドメイン抗体は、例えば100 mgまたは例えば40mgのドメイン抗体の凍結乾燥物を含むバイアル中で提供することができる。凍結乾燥物は、スクロース、グリシン、リン酸二水素ナトリウムおよびポリソルベート80を含むことができる。このドメイン抗体凍結乾燥物をまず、5 mLの滅菌水中で再構成し、次いで滅菌水、または別の製薬的に許容される希釈剤で希釈して、20mg/mL、5mg/mL、および1mg/mLのドメイン抗体を含む医薬組成物を作製することができる。
【０１３４】
ドメイン抗体を使用して、乾癬を有すると特定されるヒト患者を治療することができる。特に、ドメイン抗体を使用して、1または2のプラーク領域を有する慢性軽度、中等度、または重度の、安定なプラークタイプ乾癬を有すると特定されるヒト患者を治療することができる。National Psoriasis Foundationによれば、軽度のプラークタイプ乾癬はヒト患者の体表面積の3%未満に影響し、中等度のプラークタイプ乾癬はヒト患者の体表面積の3%〜10%に影響し、重度の乾癬はヒト患者の体表面積の10パーセント以上に影響する。例えば、Krajacic, 6 (5) Supplement 6, Biotechnology Healthcare, December 2009 and National Psoriasis Foundation, About Psoriasis:  Statisticsを参照のこと。評価の基準として、ヒト患者の手のひらは患者の体表面積の約1%とされる。乾癬の重症度は、別法として、4つの基準: 発赤、肥厚、鱗状の特性(scaliness)および表面積の関与量に基づくFredriksonによって報告される分類方式の使用によってPsoriasis Area and Severity Indexにしたがって決定することもできる。例えば、Fredrickson, 157 Dermatologica 238 (1978)を参照のこと。治療される乾癬性プラークは、ドメイン抗体が最初に投与される時に、断層撮影測定によって評価されると、少なくとも200μmの同等の浸潤肥厚を有する。ヒト患者は、腕、大腿または体幹に安定なプラーク(群)を有する慢性プラークタイプ乾癬を有する男性または女性被験体である。これらのヒト患者は約18〜約70歳である。ヒト患者は14〜26歳ならびに14歳以上であることもある。
【０１３５】
これらのヒト患者に乾癬性プラーク内への注射によってドメイン抗体を投与することができる。特に、プラークの表皮および表在性真皮を標的にする深さで乾癬性プラーク内に注射することによって、20mg/mL、5mg/mL、または1mg/mLのドメイン抗体を含む医薬組成物100μLを投与することができる。
【０１３６】
28日の治療期間中、週1回、5mg/mLのドメイン抗体を含む医薬組成物100μLを乾癬性プラーク内に注射する治療プロトコールにしたがって、乾癬性プラークを有するヒト患者にドメイン抗体を投与することができる。そのような治療プロトコールでは、患者に医薬組成物を4回投与し、各投与期間にドメイン抗体0.5 mgを投与し、28日の治療期間中に総用量2 mgのドメイン抗体を投与する。これは、例えば、28日にわたる治療プロトコールで、患者に、1日目にドメイン抗体0.5 mgを含む1回目の注射液100μLを投与し、8日目に2回目のそのような注射液を投与し、15日目に3回目のそのような注射液を投与し、かつ22日目に4回目のそのような注射液を投与することを意味する。この治療プロトコールでは、ドメイン抗体用量(例えば、ドメイン抗体0.5 mgを含む注射液100μL)をmg/患者に基づいて投与する。
【０１３７】
また、28日の治療期間中、週1回、20 mg/mLのドメイン抗体を含む医薬組成物100μLを乾癬性プラーク内に注射する治療プロトコールにしたがって、乾癬性プラークを有するヒト患者にドメイン抗体を投与することができる。そのような治療プロトコールでは、患者に医薬組成物を4回投与し、各投与期間にドメイン抗体2 mgを投与し、28日の治療期間中に総用量8 mgのドメイン抗体を投与する。これは、例えば、28日にわたる治療プロトコールで、患者に、1日目にドメイン抗体2 mgを含む1回目の注射液100μLを投与し、8日目に2回目のそのような注射液を投与し、15日目に3回目のそのような注射液を投与し、かつ22日目に4回目のそのような注射液を投与することを意味する。この治療プロトコールでは、ドメイン抗体用量(例えば、ドメイン抗体2 mgを含む注射液100μL)をmg/患者に基づいて投与する。
【０１３８】
また、28日の治療期間中、週2回、5 mg/mLのドメイン抗体を含む医薬組成物100μLを乾癬性プラーク内に注射する治療プロトコールにしたがって、乾癬性プラークを有するヒト患者にドメイン抗体を投与することができる。そのような治療プロトコールでは、患者に医薬組成物を8回投与し、各投与期間にドメイン抗体0.5 mgを投与し、28日の治療期間中に総用量4 mgのドメイン抗体を投与する。これは、例えば、28日にわたる治療プロトコールで、患者に、1日目にドメイン抗体0.5 mgを含む1回目の注射液100μLを投与し、4日目に2回目のそのような注射液を投与し、8日目に3回目のそのような注射液を投与し、11日目に4回目のそのような注射液を投与し、15日目に5回目のそのような注射液を投与し、18日目に6回目のそのような注射液を投与し、22日目に7回目のそのような注射液を投与し、かつ25日目に8回目のそのような注射液を投与することを意味する。この治療プロトコールでは、ドメイン抗体用量(例えば、ドメイン抗体0.5 mgを含む注射液100μL)をmg/患者に基づいて投与する。
【０１３９】
また、28日の治療期間中、週1回、1 mg/mLのドメイン抗体を含む医薬組成物100μLを乾癬性プラーク内に注射する治療プロトコールにしたがって、乾癬性プラークを有するヒト患者にドメイン抗体を投与することができる。そのような治療プロトコールでは、患者に医薬組成物を4回投与し、各投与期間にドメイン抗体0.1 mgを投与し、28日の治療期間中に総用量0.4 mgのドメイン抗体を投与する。これは、例えば、28日にわたる治療プロトコールで、患者に、1日目にドメイン抗体0.1 mgを含む1回目の注射液100μLを投与し、8日目に2回目のそのような注射液を投与し、15日目に3回目のそのような注射液を投与し、かつ22日目に4回目のそのような注射液を投与することを意味する。この治療プロトコールでは、ドメイン抗体用量(例えば、ドメイン抗体0.1 mgを含む注射液100μL)をmg/患者に基づいて投与する。
【０１４０】
WO 2008/149148は、無改変のDOM1h-131-206 dAbを試験し、単離し、かつ製造する方法を記載し、そのような方法は、ADAに対する低下した結合性を有する本発明の改変TNFR1 dAb、例えばC末端に単一アラニンの伸長を有するDOM1h-131-206 dAb (配列番号１６)に適用可能であり、この開示内容(試験し、単離し、かつ製造する方法を含む)はここに組み入れられる。
【０１４１】
下記の追加の実施形態1〜36では、本発明は以下のものを提供する。
【０１４２】
1.  単一免疫グロブリン可変ドメイン(dAb) (例えばVH、VLまたはVHH)であって、例えば、標的に結合し、以下の改変:
(a) C末端付加、伸長またはタグ
(b) 少なくとも1つの置換が、P14A置換、P41A置換およびL108A置換から選択される置換である、1以上のアミノ酸フレームワーク置換
から選択される1以上の改変を含み;
かつ、無改変の単一免疫グロブリン可変ドメイン(dAb)と比較して既存のADAに対する低下した結合性を有する、
単一免疫グロブリン可変ドメイン。
【０１４３】
2.  該dAbが、ヒトVH、またはVL dAbまたはラクダ科VHHから選択される、上記1に記載の単一免疫グロブリン可変ドメイン(dAb)。
【０１４４】
3.  少なくとも1アミノ酸のC末端伸長を含む、1または2に記載の単一免疫グロブリン可変ドメイン(dAb)。
【０１４５】
4.  該C末端伸長が1アミノ酸〜約6アミノ酸のアミノ酸伸長を含む、3に記載の単一免疫グロブリン可変ドメイン(dAb)。
【０１４６】
5.  該C末端伸長が、アラニンであるアミノ酸を含む、3または4に記載の単一免疫グロブリン可変ドメイン(dAb)。
【０１４７】
6.  該C末端伸長が、アラニンである単一アミノ酸からなる、5に記載の単一免疫グロブリン可変ドメイン(dAb)。
【０１４８】
7.  該C末端伸長が、(a) AS、(b) AST (c) ASTK、(d) ASTKG、または(e) ASTKGPから選択されるアミノ酸伸長を含む、請求項5に記載の単一免疫グロブリン可変ドメイン(dAb)。
【０１４９】
8.  C末端が、親和性タグ、mycタグ、FLAGタグ、hisタグ、化学修飾、例えばPEG、またはタンパク質ドメイン、例えば抗体Fcドメインから選択されるタグを有する、1〜2のいずれかに記載の単一免疫グロブリン可変ドメイン(dAb)。
【０１５０】
9.  該dAbがVH dAbであり、かつP14Aフレームワーク置換をさらに含む、6に記載の単一免疫グロブリン可変ドメイン(dAb)。
【０１５１】
10.  該dAbがVH dAbであり、かつP14Aフレームワーク置換をさらに含む、7に記載の単一免疫グロブリン可変ドメイン(dAb)。
【０１５２】
11.  TNFα、TNFR1、VEGF、IL-1R、IL-6R、IL-4、IL-5、IL-13、DC-SIGN、ASGPR、アルブミン、TGFβR2から選択される標的に結合する、先行する請求項のいずれかに記載の単一免疫グロブリン可変ドメイン(dAb)。
【０１５３】
12.  (a) 単一アラニンの伸長を有するDOM1h-131-206 dAb (配列番号１６) (b) 単一アラニンの伸長およびP14Aフレームワーク突然変異を有するDOM1h-131-206 dAb (配列番号１７) (c) P14Aフレームワーク突然変異を有するDOM1h-131-206 dAb (配列番号１８) (d) ASTKG C末端伸長を有するDOM1h-131-206 dAb (配列番号１９) (e) ASTKG C末端伸長およびP14Aフレームワーク突然変異を有するDOM1h-131-206 dAb (配列番号２０)として特定されるアミノ酸配列から選択される、11に記載の単一免疫グロブリン可変ドメイン(dAb)。
【０１５４】
13.  標的がTNFR1であり、かつ無改変のdAbが、DOM1h-131-206 (配列番号１)、DOM 1h-131-511 (配列番号２)、DOM 1h-131-202 (配列番号３)として特定されるアミノ酸に対して、100%、95%、90%、85%または80%同一であるアミノ酸配列から選択される、11または12に記載の単一免疫グロブリン可変ドメイン(dAb)。
【０１５５】
14.  dAbが追加の分子との融合物またはコンジュゲートとして存在する、先行する請求項のいずれかに記載の単一免疫グロブリン可変ドメイン(dAb)。
【０１５６】
15.  dAbが、追加のdAb、例えば半減期を延長するか、または追加の治療用分子または活性分子である、タンパク質またはポリペプチドまたはそのフラグメント；PEG分子、抗体またはそのフラグメント、例えばFc領域から選択される1以上の追加の分子との融合物またはコンジュゲートとして存在する、14に記載の単一免疫グロブリン可変ドメイン(dAb)。
【０１５７】
16.  dAbがmAbdAb分子として存在する、15に記載の単一免疫グロブリン可変ドメイン(dAb)。
【０１５８】
17.  先行する項のいずれかに記載の単一免疫グロブリン可変ドメイン(dAb)を、製薬的または生理学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤とともに含む医薬組成物。
【０１５９】
18.  追加の治療用物質または活性物質を含む、17に記載の医薬組成物。
【０１６０】
19.  抗TNFR1 dAbを含む、17または18に記載の医薬組成物。
【０１６１】
20.  12〜13のいずれか一項に記載の抗TNFR1 dAbを含む、19に記載の医薬組成物。
【０１６２】
21.  医療での使用のための、請求項1〜16のいずれかに記載の単一免疫グロブリン可変ドメイン(dAb)または17〜20のいずれかに記載の組成物。
【０１６３】
22.  19〜20のいずれか一項に記載の組成物または11〜13に記載のdAbの治療上または予防上有効量を被験体に投与することによって、炎症性疾患もしくは障害または呼吸器もしくは肺の疾患もしくは障害から選択される少なくとも1つの疾患または障害または症状を治療または予防する方法。
【０１６４】
23.  該少なくとも1つの疾患または障害または症状が、乾癬、関節炎、多発性硬化症、炎症性腸疾患(例えば)クローン病および潰瘍性大腸炎; または例えば、慢性閉塞性肺疾患、慢性気管支炎、慢性閉塞性気管支炎および肺気腫、肺炎、慢性閉塞性肺疾患、喘息、肺炎、過敏性間質性肺炎、好酸球増加を伴う肺浸潤、環境性肺疾患、肺炎、気管支拡張症、嚢胞性線維症、間質性肺疾患、原発性肺高血圧症、肺血栓塞栓症、胸膜の障害、縦隔の障害、横隔膜の障害、低換気、過換気、睡眠時無呼吸、急性呼吸困難症候群、中皮腫、肉腫、移植片拒絶、移植片対宿主病、肺癌、アレルギー性鼻炎、アレルギー、石綿沈着症、アスペルギルス腫、アスペルギルス症、気管支拡張症、慢性気管支炎、肺気腫、エオシン好性肺炎、特発性肺線維症、侵襲性肺炎球菌疾患、インフルエンザ、非結核性マイコバクテリア、胸水、塵肺、ニューモシスチス症(pneumocytosis)、肺炎、肺放線菌症、肺胞タンパク症、肺炭疽、肺水腫、肺動脈塞栓、肺の炎症、肺組織球症X、肺高血圧症、肺ノカルジア症、肺結核、肺静脈閉塞性疾患、リウマチ様肺疾患、サルコイドーシス、およびウェゲナー肉芽腫症および急性肺損傷(ALI)、および急性呼吸困難症候群(ARDS)およびそれらの合併症から選択される、例えば呼吸器または肺の疾患または障害から選択される、22の方法。
【０１６５】
24.  該疾患がALIであり、かつ該dAbが請求項13に記載のdAbであるか、または該医薬組成物が請求項13に記載のdAbを含む、23に記載の方法。
【０１６６】
25.  該組成物またはdAbを、皮下、静脈内または筋肉内注射によって被験体に送達する、22〜24のいずれか一項に記載の方法。
【０１６７】
26.  該組成物またはdAbを、非経口、経口、経直腸、経粘膜、眼球、肺または胃腸管送達によって被験体に送達する、22〜24のいずれか一項に記載の方法。
【０１６８】
27.  1〜20のいずれか一項に記載の組成物またはdAbを含む、注射用、経口、吸入用または噴霧用製剤。
【０１６９】
28.  請求項1〜20のいずれか一項に記載の組成物を含む、持続放出製剤。
【０１７０】
29.  1〜20のいずれか一項に記載の組成物を含む、凍結乾燥製剤。
【０１７１】
30.  1〜20のいずれか一項に記載の組成物を含む、送達デバイス。
【０１７２】
31.  噴霧器または吸入器である、1〜20のいずれか一項に記載の組成物を含む送達デバイス。
【０１７３】
32.  1〜16のいずれかに記載のdAbをコードする、単離された核酸または組換え核酸。
【０１７４】
33.  12〜13のいずれかに記載のdAbをコードする、単離された核酸または組換え核酸。
【０１７５】
34.  32または33の核酸を含むベクター。
【０１７６】
35.  請求項32もしくは33の核酸または34のベクターを含む宿主細胞。
【０１７７】
36.  1〜16のいずれかに記載のdAbを含むポリペプチドの製造方法であって、該核酸またはベクターの発現に好適な条件下で35の宿主細胞を維持し、それによりポリペプチドを製造するステップを含む方法。
【０１７８】
37.  無改変dAbのKDの150%またはそれ以上(例えば200%、250%、300%、350%、400%、450%、500%、550%、600%、650%またはそれ以上)のKDでADAに結合する、1〜16に記載のdAb。
【０１７９】
本発明はまた、1b〜25bとして列挙される以下の実施形態を提供する。
【０１８０】
1b.  ADAが結合するdAb上のエピトープがマスクされている、ヒト血清中の既存のヒトADAに結合しない(か、または該ADAに対して低下した結合性を有する)単一免疫グロブリン可変ドメイン(dAb)。
【０１８１】
2b.  エピトープがマスクされていない等価な配列のKDの150%またはそれ以上(例えば200%、250%、300%、350%、400%、450%、500%、550%、600%、650%またはそれ以上)の、ADAに対する結合のKDを有する、上記1bに記載のdAb。
【０１８２】
3b.  以下の改変:
a.  C末端への化学物質の付加; および/または
b.  1以上のフレームワーク置換(群); および/または
c.  1以上の欠失
によってエピトープがマスクされている、1b〜2bに記載のdAb。
【０１８３】
4b.  化学物質が、1以上のアミノ酸(群)、C末端タグ、または化学修飾、例えばペグ化またはアミド化を含む、3bに記載のdAb。
【０１８４】
5b.  (a)、(b)および/または(c)が、エピトープに対する直接的なコンフォメーション上の影響を有するか、エピトープに対する間接的なコンフォメーション上の影響を有するか、かつ/またはエピトープを立体的に妨害する、3bまたは4bに記載のdAb。
【０１８５】
6b.  該エプトープが
d.  C末端のKabat残基113とオーバーラップし; かつ/または
e.  Kabat残基14、41、108、110、112および113とオーバーラップし; かつ/または
f.  表面露出Kabat残基14、41、108、110、112および113、およびこれらの位置から5オングストローム以内の任意の他の残基を含み; かつ/または
g.  フレームワーク4、およびフレームワーク1と2のβストランド間のループを含む、
先行する項のいずれかに記載のdAb。
【０１８６】
7b.ヒト生殖細胞系列フレームワーク配列と比較してKabat位置14、41、108、110、または112での1以上のアミノ酸置換を含む、先行する実施形態1b〜6bのいずれかに記載のdAb。
【０１８７】
8b.以下の1以上の残基: Kabat残基14、41、108、110および/または112で非ヒト配列を有する、ヒト化単一免疫グロブリン可変ドメイン(dAb)。
【０１８８】
9b.該1以上の位置のアミノ酸残基がアラニン残基である、7bまたは8bに記載のdAb。
【０１８９】
10b.dAbのC末端へのアミノ酸伸長の提供によって該マスキングを達成する、先行する実施形態1b〜9bのいずれかに記載のdAb。
【０１９０】
11b.該伸長が1〜8アミノ酸の範囲である、10bに記載のdAb。
【０１９１】
12b.該伸長がアラニン残基を含む、10bまたは11bに記載のdAb。
【０１９２】
13b.該伸長が単一アラニン残基からなる、12bに記載のdAb。
【０１９３】
14b.該伸長が、AS、AST、ASTK、ASTKG、およびASTKGPからなる群から選択される、12bに記載のdAb。
【０１９４】
15b.該dAbがVHまたはVLまたはVHH dAbである、1b〜14bのいずれかに記載のdAb。
【０１９５】
16b.dAbが結合する標的が、TNFα、TNFR1、VEGF、IL-1R、IL-6R、IL-4、IL-5、IL-13、DC-SIGN、ASGPR、アルブミン、およびTGFβR2である、1b〜15bのいずれかに記載のdAb。
【０１９６】
17b.(a) 単一アラニンの伸長を有するDOM1h-131-206 dAb (配列番号１６); (b) 単一アラニンの伸長およびP14Aフレームワーク突然変異を有するDOM1h-131-206 dAb (配列番号１７) (c) P14Aフレームワーク突然変異を有するDOM1h-131-206 dAb (配列番号１８); (d) ASTKG C末端伸長を有するDOM1h-131-206 dAb (配列番号１９); および(e) ASTKG C末端伸長およびP14Aフレームワーク突然変異を有するDOM1h-131-206 dAb (配列番号２０)として特定されるアミノ酸配列から選択される、16bに記載の単一免疫グロブリン可変ドメイン(dAb)。
【０１９７】
18b.標的がTNFR1であり、かつ無改変のdAbが、DOM1h-131-206 (配列番号１)、DOM 1h-131-511 (配列番号２)、DOM 1h-131-202 (配列番号３)として特定されるアミノ酸に対して、100%、95%、90%、85%または80%同一である配列から選択される、16bまたは17bに記載の単一免疫グロブリン可変ドメイン(dAb)。
【０１９８】
19b.ヒト血清中の既存のヒトADAに結合する、単一免疫グロブリン可変ドメイン(dAb)上のエピトープをマスクする方法であって、エピトープを改変するステップを含む方法。
【０１９９】
20b.ヒト血清中の既存のヒトADAに対する単一免疫グロブリン可変ドメイン(dAb)の結合を低下させる方法であって、ADAが結合する、dAb上のエピトープをマスクするステップを含む方法。
【０２００】
21b.マスクされたエピトープを含むdAbが、エピトープがマスクされていないdAbのKDの150%またはそれ以上のKDを有するように、該マスキングがADAに対する結合の低下を生じさせる、19bまたは20bに記載の方法。
【０２０１】
22b.以下の改変:
h.  C末端への化学物質の付加; および/または
i.  1以上のフレームワーク置換(群); および/または
j.  1以上の欠失
によってエピトープをマスクする、19b〜21bのいずれかに記載の方法。
【０２０２】
23b.化学物質が、1以上のアミノ酸(群)、C末端タグ、または化学修飾、例えばペグ化もしくはアミド化を含む、22bに記載の方法。
【０２０３】
24b.(a)、(b)および/または(c)が、エピトープに対する直接的なコンフォメーション上の影響を有するか、エピトープに対する間接的なコンフォメーション上の影響を有するか、かつ/またはエピトープを立体的に妨害する、22bまたは23bに記載の方法。
【０２０４】
25b.該エピトープが
k.  C末端のKabat残基113とオーバーラップし;
l.  Kabat残基14、41、108、110、112および113とオーバーラップし; かつ/または
m.  表面露出Kabat残基14、41、108、110、112および113、およびこの表面から5オングストローム以内の任意の他の残基を含み; かつ/または
n.  フレームワーク4、およびフレームワーク1と2のβストランド間のループを含む、
上記19b〜24bのいずれかに記載の方法。
【０２０５】
下記の追加の実施形態1c〜15cでは、本発明は以下のものを提供する。
【０２０６】
1c.Kabat残基14および/または108で1以上のラクダ生殖細胞系列残基(群)を保持する、ヒト化VHH単一免疫グロブリン可変ドメイン。
【０２０７】
2c.残基14および/または108がヒト化されている等価な配列のKDの150%またはそれ以上(例えば200%、250%、300%、350%、400%、450%、500%、550%、600%、650%またはそれ以上)の、ヒト血清中のヒトADAに対する結合のKDを有する、上記1cに記載の単一免疫グロブリン可変ドメイン。
【０２０８】
3c.1以上のC末端アミノ酸が欠失している、1cまたは2cに記載の単一免疫グロブリン可変ドメイン。
【０２０９】
4c.1つのC末端アミノ酸が欠失している、3cに記載の単一免疫グロブリン可変ドメイン。
【０２１０】
5c.C末端付加、伸長またはタグを含む、1cまたは2cに記載の単一免疫グロブリン可変ドメイン。
【０２１１】
6c.該付加、伸長またはタグが、1以上のアミノ酸(群)伸長、C末端タグ、または化学修飾、例えばペグ化またはアミド化からなる群から選択される、5cに記載の単一免疫グロブリン可変ドメイン。
【０２１２】
7c.該伸長が1〜8アミノ酸の範囲である、5cまたは6cに記載の単一免疫グロブリン可変ドメイン。
【０２１３】
8c.該伸長がアラニン残基を含む、7cに記載の単一免疫グロブリン可変ドメイン。
【０２１４】
9c.該伸長が単一アラニン残基からなる、8cに記載の単一免疫グロブリン可変ドメイン。
【０２１５】
10c.該伸長が、AS、AST、ASTK、ASTKG、ASTKGP、ASTKA、ASTKAPおよびASTKAPSからなる群から選択される、8cに記載の単一免疫グロブリン可変ドメイン。
【０２１６】
11c.以下の1以上の残基: Kabat残基41、110および/または112で非ヒト残基をさらに含む、先行する実施形態1c〜10cのいずれかに記載の単一免疫グロブリン可変ドメイン。
【０２１７】
12c.dAbが結合する標的が、TNFα、TNFR1、VEGF、IL-1R、IL-6R、IL-4、IL-5、IL-13、DC-SIGN、ASGPR、アルブミン、およびTGFβR2である、先行する実施形態のいずれかに記載の単一免疫グロブリン可変ドメイン。
【０２１８】
13c.ラクダ科VHH単一免疫グロブリン可変ドメインをヒト化する方法であって、Kabat残基: 14および/または108の1以上のラクダ生殖細胞系列残基(群)を保持するステップを含む方法。
【０２１９】
14c.既存のADAに対するラクダ科VHH単一免疫グロブリン可変ドメイン(dAb)の結合を低下させる方法であって、Kabat残基: 14および/または108のラクダ生殖細胞系列残基を保持するステップを含む方法。
【０２２０】
15c.14および/または108位にラクダ科残基を含むVHHが、これらの残基がヒト化されている等価な配列を有するVHHのKDの150%またはそれ以上の、ヒト血清中のヒトADAに対する結合のKDを有するように、該保持がADAに対する結合の低下を生じさせる、13cまたは14cに記載の方法。
【０２２１】
本明細書中で使用される用語dAbは登録商標であることに留意されたい。
【０２２２】
実施例:
【実施例１】
【０２２３】
実施例1:  DOM1H-131-206と称されるdAbに対する既存のADAを有する健康な被験体の頻度DOM1H-131-206 (VH)  ADAアッセイ手順
DOM1H-131-206 (配列番号１)をビオチンモルチャレンジ比8:1でビオチン化する。標識後、ビオチン化DOM1H-131-206 (配列番号１)をバッファー交換し、14mMリン酸ナトリウム、8.4%スクロース、0.35%グリシン、0.014%ポリソルベート80を含むpH 7.4の製剤バッファー中で保存する。
【０２２４】
DOM1H-131-206をSulfo-Tagモルチャレンジ比5:1でルテニウム標識する。標識後、Sulfo-TAG標識DOM1H-131-206をバッファー交換し、14mMリン酸ナトリウム、8.4%スクロース、0.35%グリシン、0.014%ポリソルベート80を含むpH 7.4の製剤バッファー中で保存する。
【０２２５】
抗薬物抗体(ADA)アッセイは、MSDTM ECL (電気化学発光(electrochemiluminescence))テクノロジープラットフォームで実施される架橋アッセイ(bridging assay)である。MSDTMテクノロジー(Meso scale Discovery, Matyland, USAから入手可能)は、ストレプトアビジンでコーティングされたマイクロタイタープレートのウェル内に設置された炭素電極とともにルテニウム金属キレートをECL標識として利用する。アッセイで使用される結合Sulfo-TagTMは化学発光シグナルを生じさせる。それは機器(Meso Scale Discovery SectorTM Imager 6000)によって電圧が適用された時にトリガーされる。得られた発光シグナルをECLTM単位で測定する。シグナル強度はサンプル中で検出される抗体の量に正比例する。陰性(正常なヒト血清; NHS)および陽性(PC; 正常なヒト血清中にスパイクされたマウス抗DOM1H-131-206イディオタイプ抗体)コントロールサンプル(QC)を各アッセイプレート上で実験した。
【０２２６】
アッセイ手順を概要を以下に記載する。
【０２２７】
1.  150μL/ウェルのPBS中のブロッキングカゼイン(1%)で室温(RT)で1〜2時間、MSDTMストレプトアビジンプレートをブロックする。洗浄せずにブロッカーを除去する。
【０２２８】
2.  1時間のプレインキュベーション後、0.1μg/mLビオチン化DOM1H-131-206 (薬物)、0.1μg/mLルテニウム標識("Sulfo-Tag"TM) DOM1H-131-206 (薬物)、およびアッセイ希釈液(PBS中の1%カゼイン)中の2%血清サンプルを含む均一混合物をMSDTMプレートに移し、RTで1時間±5分間インキュベートする。
【０２２９】
3.  次いでMSDプレートをPBSTで3回洗浄する。
【０２３０】
4.  150μL/ウェル読み取りバッファーを加え、プレートを読み取る。
【０２３１】
この特異的イムノアッセイの確認中に、60の健康なヒトドナー血清サンプルのパネルをアッセイでのバックグラウンド反応性に関してスクリーニングした。これらの被験体由来の血清サンプルの約45%は、ほとんどがIgGアイソタイプの、検出可能なVH反応性自己抗体を有し、それはDOM1H-131-206に結合可能であった(図１に示される結果)ことを決定した。
【０２３２】
遊離の未標識DOM1H-131-206は、このアッセイでADA結合に関して競合し、シグナル強度の減少を生じさせる(高い%シグナル阻害)。この「確認アッセイ」を使用して、改変バージョンのDOM1H-131-206および他の抗体ベースの分子がADA結合に関してDOM1H-131-206と競合するかどうか決定した。
【実施例２】
【０２３３】
実施例2:  DOM1h-131-206のVHフレームワークに対するアミノ酸置換
遊離の未標識DOM1H-131-206はADA結合に関して競合し、上記のようにDOM1H-131-206 ADAアッセイでのシグナル強度の減少を生じさせる。したがってこの「確認アッセイ」を使用して、試験物質、例えばDOM1H-131-206、改変バージョンのDOM1H-131-206、または他の抗体ベースの分子(「試験物質」)がDOM1H-131-206に対するADA結合を阻害するかどうか決定した。
【０２３４】
VHフレームワークに対するADAの結合が低下するかどうか研究するために、標準部位特異的変異誘発技術によってDOM1h-131-206のフレームワークにいくつかのアミノ酸置換および他の改変を施した。
【０２３５】
以下の方法(確認アッセイ)を使用して、置換を有する分子(試験物質)をアッセイした。
【０２３６】
DOM1H-131-206確認アッセイ手順(該手順はADA結合に関するVH dAbのスクリーニングに使用することができる):
1.  10μg/mLのDOM1H-131-206または他の試験物質、例えば改変dAbをアッセイ希釈液(PBS中の1%カゼイン)中の4% ADA陽性ヒト血清とRTで1時間±5分間プレインキュベートする。
【０２３７】
2.  150μL/ウェルのPBS中のブロッキングカゼイン(1%)で室温(RT)で1〜2時間、MSDTMストレプトアビジンプレートをブロックする。洗浄せずにブロッカーを除去する。
【０２３８】
3.  マイクロタイターアッセイプレートで、ADA陽性ヒト血清サンプルおよび10μg/mL試験物質、例えば改変dAbを含むサンプルをアッセイ希釈液(PBS中の1%カゼイン)中のビオチン化DOM1H-131-206 (配列番号１) (薬物)およびルテニウム標識("Sulfo-Tag"TM) DOM1H-131-206 (配列番号１) (薬物)の均一混合物に加えて、終濃度が2% ADA陽性ヒト血清、0.1μg/mLビオチン化DOM1H-131-206 (配列番号１) (薬物)および0.1μg/mLルテニウム標識("Sulfo-Tag"TM) DOM1H-131-206 (配列番号１) (薬物)であるようにし、RTで1時間±5分間インキュベートする。
【０２３９】
4.  1時間のインキュベーション後、ブロックされたMSDプレートにアッセイサンプルを移し、プレートをRTで暗所で1時間±5分間インキュベートする。
【０２４０】
5.  次いでMSDTMプレートをPBSTで3回洗浄する。
【０２４１】
6.  150μL/ウェルの読み取りバッファーを加え、プレートを読み取る。
【０２４２】
異なる親クローンを用いる各実験(表1に示される結果)で、10人のADA陽性被験体由来のヒト血清サンプルを上記確認アッセイ(実施例2)で試験した: 結果を、(全体の)平均のシグナル阻害%およびさらに、ADA結合を有する被験体%の両者として表1bに示す。シグナルの阻害%が低いほど、少ない改変化合物しかADAに結合できなかった。シグナル阻害%の約40.5%のカットオフは無視できるADA結合を示すと解した。
【０２４３】
確認アッセイを使用して、以下の位置: P14A、P41A、L108Qでのアミノ酸置換は、抗原結合の効力、すなわち実施例5cに示されるTNFR1親和性アッセイ手順を使用して決定されるTNFR1に対する結合を保持しながら、DOM1H-131-206に対する既存のADA結合を顕著に低下させる(表1に示される結果)ことを決定した。
【実施例３】
【０２４４】
実施例3:  DOM1H-131-206のVHフレームワークに対するアミノ酸伸長
VHフレームワークのC末端の改変がADA結合を低下させるかどうか決定するために、標準部位特異的変異誘発技術によってフレームワークにいくつかのC末端改変を施した。上記実施例2に記載の「確認アッセイ」を使用して、置換を有する分子(試験物質)をアッセイした。結果を下記表1に示す。
【０２４５】
試験されたC末端DOM1H-131-206または他の分子の伸長はまた、既存のADA結合を顕著に低下させた(表1、表2)。同様に、上記実施例2に記載の「確認アッセイ」を使用して表2に示される結果を得た。これは、伸長A、AS、AST、ASTK、ASTKG、ASTKGP、AAA、および試験されたすべてのより長い伸長によって例証される。ヒト化されていないVHHクローンは一般にADAに対する低レベルの結合性を有する。
【表１】
2020054374.tif 000006
【表２】
2020054374.tif 000007
【０２４６】
FLAGタグの配列はNature Biotechnology 1988, Vol 16, pp1204-1210に見出せる。
【０２４７】
留意すべきは、(平均) 40%のシグナル阻害(または40%未満のシグナル阻害)は無視できるADA結合を示すと解されることである。
【実施例４】
【０２４８】
実施例4:  DOM1H-131-206のVHフレームワークに対するアミノ酸置換およびC末端伸長の組み合わせ
VHフレームワークのアミノ酸置換およびC末端の改変の組み合わせがADA結合を低下させるかどうか決定するために、標準部位特異的変異誘発技術によってフレームワークにいくつかのC末端改変および/またはアミノ酸置換を施した。上記実施例2に記載の「確認アッセイ」を使用して置換を有する分子をアッセイした。結果を下記表3に示す。
【表３】
2020054374.tif 000008
【実施例５】
【０２４９】
実施例5aおよび5b:  DOM1H-131-206 C末端伸長の親和性
既存のADAの結合を低下させるDOM1H-131-206への改変がこのdAbの、その標的であるヒトTNFR1に対する親和性に任意の変化を生じさせるかどうか決定するためにさらに研究を行った。
【０２５０】
実施例5a:  ELISAによるDOM1H-131-206突然変異体のTNFR1結合の評価
DOM 1H-131-206の改変変異体(試験dAb)がヒトTNFR1に結合する能力をELISAによって測定した。既存のADA結合を低下させることが示されるフレームワーク突然変異およびC末端改変が、概して、親DOM1H-131-206 dAbと比べて同等の、TNFR1に対する結合を示すことが観察された。例外はASTKGPのC末端伸長を有するDOM1H-131-206であり、親dAb DOM1H-131-206と比べて約5分の1の、TNFR1結合に関するEC50を有した。
【０２５１】
TNFR1 ELISA結合アッセイプロトコール:
1.  組換えヒトTNFR1-Fc (R&D Systems)を96ウェルELISAプレートに炭酸-重炭酸バッファーpH9.4 (Pierce)中0.1μg/mLの終濃度で加える。
【０２５２】
2.  4℃で一晩インキュベートした後、洗浄バッファー(洗浄バッファー- 0.1% Tween-20/PBS)で3回およびPBSで3回の洗浄によって過剰TNFR1:Fcを除去する。
【０２５３】
3.  PBS中の1% BSAで室温で1時間、プレートをブロックする。上記のように洗浄することによってブロックを除去し、次いでアッセイ希釈液(0.1% BSA + 0.05% Tween-20/PBS)中で希釈された試験dAbサンプルをプレートに加え、室温で1時間インキュベートする。
【０２５４】
4.  上記のように洗浄した後、アッセイ希釈液中1:1000希釈のポリクローナルウサギ抗ヒトIg (Vh特異的)を加え、室温で1時間インキュベートする。
【０２５５】
5.  上記のように洗浄した後、マウス抗ウサギHRPコンジュゲート抗体をアッセイ希釈液中1:10,000希釈で加え、室温で1時間インキュベートする。
【０２５６】
6.  上記のように洗浄した後、100uLのSureBlue TMB基質を各ウェルに加える。十分な青色が発色したら、100μLの1M HClで酵素反応を停止し、プレートを450nmで読み取る。
【０２５７】
7.  濃度を吸光度値に対してプロットすることによって各試験dAbの用量反応曲線を作製する。Graphpad Prismを使用してTNFR1に対するdAb結合のEC50値を決定する。
【表４ａ】
2020054374.tif 000009
【表４ｂ】
2020054374.tif 000010
【表４ｃ】
2020054374.tif 000011
【０２５８】
実施例4b:  BiacoreTMを使用するTNFR1親和性アッセイ手順
C末端A伸長を有する改変DOM1H-131-206 dAbの親和性を、BiacoreTM T100を使用する表面プラズモン共鳴によって測定した。抗ヒトIgG抗体をCM4チップに固定し、この表面に約60相対単位のレベルまでヒトTNFR1:Fcを捕捉した。バッファー中で終濃度25nM〜0.024nM (4倍希釈範囲)に希釈された試験物質をTNFR1:Fc上に注射した。作製された結合曲線を、0nM試験物質曲線を使用して二重参照し、データを1:1結合モデルにフィッティングして、キネティックデータを作製した。カニクイザルTNFR1に対する試験物質の結合を同方法で測定した。結合速度論データを下記表4dに示す。
【０２５９】
結論として、改変(すなわちC末端Aが付加されている)および無改変TNFR1dAbの結合速度論は同等である。
【表４ｄ】
2020054374.tif 000012
【実施例６】
【０２６０】
実施例6:  DOM1H-131-206 C末端伸長の薬物動態
既存のADAの結合を低下させるDOM1H-131-206への改変がこのdAbの薬物動態に任意の変化を生じさせるかどうか決定するためにさらに研究を行った。
【０２６１】
薬物動態学的手順
DOM 1H-131-206およびC末端アラニン伸長を有するDOM 1H-131-206の全身性曝露をカニクイザルで測定した。5カニクイザルからなる別々の群に30分の静脈内注入によって試験物質を投薬した。投薬後48時間まで血漿サンプルを回収し、2種の試験物質のレベルをイムノアッセイによって測定した。簡潔に言えば、試験物質に特異的なビオチン化抗体をストレプトアビジンコーティング96ウェルマイクロタイタープレートに加え、その後、サル血漿サンプルを加えた。ジゴキシゲニン(Digoxiginin)標識ヒトTNFR1:Fcを加え、その後、セイヨウワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートされた抗ジゴキシゲニン抗体を加えた。最後に、TMB基質(R+D systemsから入手可能)を加え、試験物質標準曲線から比色定量シグナルを逆算することによって試験物質の量を決定した。
【０２６２】
静脈内注入後のカニクイザルでDOM-1H131-206をDOM-1H131-206 +Aと比較した場合に、性別平均全身性曝露パラメータの注目すべき(>2倍)変化は観察されなかった。発明者らは、C末端伸長の付加(+A)によるDOM1H-131-206の改変はdAbの薬物動態に影響しない(表5に示される)と結論づける。
【表５】
2020054374.tif 000013
【実施例７】
【０２６３】
実施例7a:  DOM1H-131-206変異体の発現
既存のADA結合を低下させるVHフレームワークの改変が抗TNFR1 dAbの発現に対して影響を有するかどうか決定するために、1リットル発酵容器での培養後に抗TNFR1 DOM1H 131-206 dAbの改変変異体のパネルの収率を親クローンと比較した。試験dAbはC末端伸長(+Aまたは+ASTKG)を含み、フレームワーク置換(P14A)を有するかまたは有さなかった。無改変DOM1H 131-206 (配列番号１)と同じE. Coli株で同じ微生物発現ベクター(pave011 (Avecia))を使用して試験dAbを発現させた。少量発現レベル(1L)で、C末端伸長+Aまたは+ASTKGを有するdAbの全収率は無改変の親クローンと同等であった。P14A置換およびC末端伸長(+Aまたは+ASTKG)を有するdAbの収率は無改変の親クローンと比較して低下した(表6a)。
【０２６４】
発現手順
微生物発現ベクター中のdAb構築物を発現するE. Coli細胞のバイアルを100ml振とうフラスコに播種することによって「種培養(seed expansion)」段階を完了した。
【０２６５】
約10時間の培養後、種フラスコを使用して、1L発酵槽に播種する。製造過程は、バッチ、フェッドバッチおよび誘導の3段階からなる。最初のバッチ相は約13時間続き、その期間、主要な炭素源であるグリセロールが枯渇するまで、37℃(最後の4時間で段階的に30℃に下げる)で培養物は指数関数的に増殖する。グリセロール枯渇の時点で、溶存酸素(DO)のスパイクが生じ、栄養供給が始まる(フェッドバッチ段階)。栄養供給開始の約5時間後(OD600が75の時点で)、培養物をIPTGによって誘導し(誘導段階)、過程のこの期間中に、生成物が作製され、培地中に放出される。誘導の約48時間後にバッチを停止させる。上清中のdAbの量をHPLCによって定量した。
【表６ａ】
2020054374.tif 000014
【０２６６】
この実験で得られる結論は以下の通りであった。
【０２６７】
(1)  DOM1H-131-206 +A、DOM1H-131-206 +ASTKGおよび野生型突然変異体は非常に良好なdAb発現を示した。
【０２６８】
最高力価は約3000mg/Lであった。
【０２６９】
(2)  DOM1H-131-206 P14 +A、およびDOM1H-131-206 p14 +ASTKG突然変異体は該過程でdAbを発現できなかった。
【０２７０】
(3)  概して、DOM1H-131-206 +AおよびDOM1H-131-206+ASTKGはdAb発現レベルに関して野生型と同等であった。
【０２７１】
実施例7b:  C末端アラニンを有するDOM1H-131-206の安定性
DOM 1H-131-206を検出するが、DOM 1H-131-206+Aに対して非常に弱い交差反応性である、DOM 1H-131-206に関する有効なイムノアッセイ(下に記載される)を使用して測定されるヒト血清、肺ホモジネートまたは肝臓ホモジネート中でのDOM 1H-131-206 +AのC末端アラニン伸長の安定性を測定した。これは、検出抗体M2.3G10.1G06がDOM 1H-131-206に強く結合するが、DOM 1H-131-206 +Aに不十分にしか結合しないという事実に起因する。該アッセイ形式では、捕捉試薬としてヒトTNFR1:Fcを使用し、したがってインタクトの機能的dAbに特異的であると考えられる。
【０２７２】
2μg/mLのDOM 1H-131-206 +Aでスパイクされた血漿はこのアッセイで約6.4ng/mLの読み取り値をもたらし、2μg/mLのGSK2862277でスパイクされたバッファーは11.3 ng/mLの読み取り値をもたらすことが観察された。ゆえに、DOM 1H-131-206アッセイでのDOM 1H-131-206 +Aの交差反応性は0.25〜0.5%の範囲であると見積もられた。
【０２７３】
変換を研究するために、ヒト全血、ヒト肺ホモジネート(タンパク質10mg/ml)、またはヒト肝臓ホモジネート(タンパク質10mg/ml)に1μg/mlのDOM 1H-131-206、DOM 1H-131-206 +Aまたはバッファー(薬物添加なし)のいずれかをスパイクした。0、3h、6hまたは24hのインキュベーション後、遠心分離によって血漿/上清を回収し、サンプルを凍結した後、有効なイムノアッセイ(動作範囲0.1〜10ng/ml)を使用してDOM 1H-131-206に関してアッセイした。
【０２７４】
24hにわたって、いずれのマトリックスにおいても、(DOM 1H-131-206の形成に応じて)イムノアッセイのシグナルを増加させることによって示される、DOM 1H-131-206 +AからDOM 1H-131-206への顕著な変換の証拠はなかった。これは、追加のC末端アラニンが、急速なタンパク質分解によって切断されやすいわけではないことを示唆する。
【０２７５】
DOM 11H-131-206の有効なイムノアッセイに関するプロトコール
ビオチン化抗VH mAb (M2.3G10.1G06)をアッセイバッファー(10 mM Tris、150 mM NaCl、0.1% BSA、0.1% Tween20、pH 7.5)中で希釈し、ニュートラアビジンコーティングプレート(Pierce)の各ウェルに終濃度10ng/mlで100μL加える。プレートを密封し、37℃で1時間インキュベートする。
【０２７６】
プレート洗浄器を使用して300μLの洗浄バッファー(10 mM Tris、150 mM NaCl、0.1% Tween 20、pH 7.5)で5回、マイクロタイタープレートを洗浄する。
【０２７７】
ウェルあたり100μLの標準、およびマトリックス中で希釈されたサンプルを加え、プレートを密封し、一定に振とうしながら37℃で約2時間インキュベートする。
【０２７８】
300μLの洗浄バッファーで5回、マイクロタイタープレートを洗浄する。
【０２７９】
ウェルあたり100μLのジゴキシゲニン標識hTNFR1:Fc (1:40,000)を加え、プレートを密封し、一定に振とうしながら37℃で約2時間インキュベートする。
【０２８０】
300μLの洗浄バッファーで5回、マイクロタイタープレートを洗浄する。
【０２８１】
ウェルあたり100μLのHRP標識マウス抗ジゴキシゲニン抗体(Abcam)(1:20,000)を加え、溶解、無菌シーリングテープでの密封、およびプレートを密封し、一定に振とうしながら37℃で約2時間インキュベートする。
【０２８２】
300μLの洗浄バッファーで5回、マイクロタイタープレートを洗浄する。
【０２８３】
ウェルあたり100μLのTMB基質(Thermo)を加え、一定に振とうしながら室温で約5分間、プレートをインキュベートする。
【０２８４】
ウェルあたり100μLのTMB基質停止液(Sigma)を加え、プレートリーダーを使用して各ウェルの450 nmの吸光度を読み取る。SMS2000を使用して標準曲線を1/x重みつき4パラメータロジスティックアルゴリズムにフィッティングし、未知のサンプルを曲線から補完する。
【０２８５】
実施例7c:  C末端アラニン伸長(+A)を有するDOM1H-131-206がTNFR1シグナル伝達を阻害する能力:
TNFαはNFκB経路を経由してシグナル伝達し、IL-8などの種々のサイトカインの分泌を生じさせる。刺激されていない細胞では、IL-8 mRNAは急速に分解される。しかし、TNFαの存在下では、NFκB経路の活性化がIL-8 mRNAの安定化を生じさせる。この安定化はmRNAの増加を生じさせ、IL-8分泌の誘発に寄与する。ゆえに、このアッセイで、分泌されるIL-8の誘発は、DOM1H-131-206またはDOM1H-131-206+A (すなわちC末端アラニン伸長)の、TNFR1シグナル伝達を阻害する能力にC末端伸長の付加が影響するかどうかを決定するはずである。これらの研究をヒトおよびカニクイザルセルラインで実施し、さらにヒトおよびカニクイザル全血で実施した。IC50値の比較により、既存のADA結合を低下させるDOM1H-131-206のC末端の伸長が、ヒトまたはカニクイザル細胞でTNFR1を介するシグナル伝達を阻害するDOM1H-131-206の能力に負に影響しない(表6b)ことが示される。
【０２８６】
ヒト肺線維芽細胞でのTNFα誘発性IL-8の阻害を測定するプロトコール
DOM1H-131-206またはDOM1H-131-206+AがヒトTNFR1に対するヒトTNFαの結合を妨げる能力およびIL-8分泌を阻害する能力を、ヒト肺線維芽細胞であるMRC-5細胞(ATCC)を使用して測定した。MRC-5細胞を試験サンプルと1時間インキュベートし、その後、TNFα(220pg/ml)を加えた。37℃および5% CO2で24時間のインキュベーション後、上清を回収し、-20℃で保存した後、組織培養サンプルに関する製造元のプロトコールにしたがってIL-8に関するMSDTMアッセイを実施した。アッセイ前に上清を同梱のキャリブレータ希釈液中で1:12希釈した。GraphPad Prismでカーブフィッティングを行い、IC50を決定した。
【０２８７】
A549細胞でのTNFα誘発性IL-8の阻害を測定するプロトコール
A549細胞を96ウェルプレートに2 x 104細胞/ウェルの密度で播種し、37℃および5% CO2で一晩インキュベートして接着させた。次いで、0.01nM〜1000nMの範囲の種々の濃度のDOM1H-131-206またはDOM1H-131-206+Aの存在下で1時間、細胞をインキュベートした。各濃度を2つのウェルで試験した。37℃および5% CO2で24時間のインキュベーション後、上清を回収し、-20℃で保存した後、組織培養サンプルに関する製造元のプロトコールにしたがってIL-8に関するMSDTMアッセイを実施した。アッセイ前に上清を同梱のキャリブレータ希釈液中で1:5希釈した。曲線をフィッティングし、XLFitを使用してIC50値を算出した。
【０２８８】
CYNOM-K1細胞でのTNFα誘発性IL-8の阻害を測定するプロトコール
100nMで出発する種々の濃度のDOM1H-131-206またはDOM1H-131-206+Aの存在下で1時間、CYNOM-K1細胞をインキュベートした。次いで終濃度1ng/mlのTNFαで刺激した。37℃および5% CO2で24時間のインキュベーション後、上清を回収し、-20℃で保存した後、組織培養サンプルに関する製造元のプロトコールにしたがってIL-8に関するMSDTMアッセイを実施した。アッセイ前に上清を同梱のキャリブレータ希釈液中で1:12希釈した。GraphPad Prismでカーブフィッティングを行い、IC50を決定した。
【０２８９】
ヒト全血でのTNFα誘発性IL-8の阻害を測定するプロトコール
健康なボランティアドナー(UK Human Tissue Actに準拠する適切な承認を有する)由来の血液をヘパリンナトリウム中に集めた。RPMI-1640培地(フェノールレッドなし)に1% BSAを加えることによってアッセイ培地を作製した。DOM1H-131-206またはDOM1H-131-206+AおよびVHダミーdAbを96ウェルプレートでアッセイ培地中で希釈し、血液添加後の終濃度が800nMになるようにし、1:2希釈〜0.01nMまで連続希釈した。ウェルあたり130μlの血液を加え、プレートを1時間インキュベート(37℃、5% CO2)して、TNFR1に結合させた。次いで、終濃度が10ng/mlになるようにアッセイ培地中で希釈された10μlのTNFαで血液サンプルを刺激した。各条件を2回試験した。さらに24時間のインキュベーション(37℃、5% CO2)後、ウェルあたり110μlのPBSを加えて、サンプルの容量を増加させ、次いでプレートシェーカーで500rpmで10分間攪拌し、1500 rpmで5分間遠心分離した。血漿を新しいプレートに移し、-80℃で保存した後、血清および血漿サンプルに関する製造元のプロトコールにしたがってIL-8 MSDTMアッセイを実施した。曲線をフィッティングし、XLFitを使用してIC50値を算出した。
【０２９０】
カニクイザル由来の全血でのLPS誘発性IL-8の阻害を測定するプロトコール
4カニクイザル由来の血液12mlをヘパリンナトリウム中に集めた。RPMI-1640培地(フェノールレッドなし)に1% BSAを加えることによってアッセイ培地を作製した。DOM1H-131-206またはDOM1H-131-206+AおよびVHダミーdAbを96ウェルプレートでアッセイ培地中で希釈し、15X終濃度にした。各濃度を3回試験した。ウェルあたり血液130μlを加え、プレートを1時間インキュベート(37℃、5% CO2)した後、終濃度が94ng/mlになるようにアッセイ培地中で希釈された10μlのLPSで刺激した。次いでプレートをさらに24時間インキュベート(37℃、5% CO2)した。インキュベーション後、ウェルあたり110μlのPBSを加えて、サンプルの容量を増加させ、次いでプレートシェーカーで500rpmで10分間攪拌し、2000 rpmで5分間遠心分離した。血漿を新しいプレートに移し、-80℃で保存した後、血清および血漿サンプルに関する製造元のプロトコールにしたがって実施されるヒトIL-8に関するMSDTMアッセイを使用してIL-8を測定した。アッセイで血漿は無希釈であった。曲線をフィッティングし、XLFitを使用してIC50値を算出した。
【表６ｂ−１】
2020054374.tif 000015
【０２９１】
実施例7d:  乾癬の治療のためのDOM1h-131-206ドメイン抗体の使用
本研究では、DOM1h-131-206ドメイン抗体(配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する)を利用し、ならびにこのドメイン抗体のげっ歯類オーソログを利用した。これらの分子を用いて得られたデータを使用して、本明細書中で開示されるように、DOM1h-131-206 (配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する)、または末端アラニンを有するDOM1h-131-206 ADAフィックス分子(ADA fix molecule)(配列番号１６に示されるアミノ酸配列を有する)、または任意のADAフィックス(すなわちADAに対するdAbの結合を低下させるための任意の改変)を含むDOM1h131206 ADAフィックス分子(ADA fixed molecule)の投与対象のヒト患者での乾癬、および乾癬性プラーク、の治療で使用するための本明細書中に記載の用量および治療プロトコールを選択した。
【０２９２】
例えば、カニクイザルを用いるin vivo研究で得られた薬物動態では、DOM1h-131-206ドメイン抗体(配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する)が2.4 mL/分/kgの血漿クリアランスを有することが示された。該血漿クリアランスはサルの糸球体ろ過率(GFR)と同等であり、約3時間の排出半減期をもたらす。このドメイン抗体の分布容積量は血管外容量におよそ等しい0.26 L/kgであり、中央/血漿区画の外側の分布を示唆した。DOM1h-131-206ドメイン抗体を血管外区画に投与すると(例えば肺に吸入させると)、観察される排出半減期には小さい変化しか存在せず、それは吸収速度を制限する速度論を反映する。
【０２９３】
さらにまた、マウスへのげっ歯類オーソログ(orthologue)である抗TNFR1 dAb ("Dom1m-15-12")の皮内投与後、さらに長い吸収の遅延が観察された。これは、皮内経路による投薬後のGFRと吸収速度クリアランスの間の大きい差異に起因したかもしれない。マウス血漿において観察された最終排出速度は約40分であり、静脈内送達後(約20分)より長かった。皮内送達後の血漿で観察された遅い排出速度(Ke)は、5〜7時間の最終排出速度(Ke 0.1〜0.14 h-1)を示す真皮組織PKによって裏づけられたが、明らかに延長された排出速度を駆動する用量のフラクションは小さい(0.5 %)と見積もられた。血漿への真皮吸収速度(Ka)はげっ歯類オーソログdAbを皮内投与するラット研究から規定され、比較的高速(Ka=4.1 h-1)であり、投薬の約1時間後に観測Tmaxを生じさせた。マウスと同等の皮膚からの排出速度を仮定すると、ラットの真皮区画内にドメイン抗体の10%が保持されると見積もられた。ゆえに、皮内注射後、DOM1h-131-206ドメイン抗体は皮膚の血管化組織(vascularized tissues)(例えば真皮)に分布し、そこで、血漿中に急速に抽出され、腎臓のろ過によって排出されるようである。初期分布および皮膚の組織を経由する吸収相は、血漿曝露が測定可能になる前の吸収の遅延時間に反映される。げっ歯類とヒト皮膚の間の解剖学的差異を考慮すると、ヒトでの吸収速度はより大きいと予測され、ひいてはDOM1h-131-206ドメイン抗体のより低い/測定できない血漿曝露を生じさせる。これは、ヒト血漿曝露の予測がげっ歯類研究で得られた観察に基づき、したがってヒトでの血漿曝露の控えめな見積もり値として役立つことを意味する。
【０２９４】
また、DOM1h-131-206ドメイン抗体(配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する)を2 mg/kgまでの静脈内注入(3時間までの持続時間)によって健康なボランティアに投与し、継続する試験では健康なボランティアでの吸入によって投与した。得られた薬物動態学的パラメータは、概して、カニクイザルでの前臨床データと非常に良好に一致した。静脈内投与後、クリアランスは0.6〜1.5 mL/分/kgの範囲(ヒトのGFR 約1.8 mL/分/kg)であり、得られた排出半減期は5時間であった。約0.3 L/kgの分布容積量は血管外容量と同等であった。DOM1h-131-206ドメイン抗体の血管外区画への急速な分布を、IV投与後の気管支肺胞洗浄測定(肺上皮被覆液)によって確認した。肺血管外液のレベルは、3時間の注入後、投薬開始から5時間の時点で測定された血漿レベルの約4〜14%であった。
【０２９５】
ヒトでの効力の予測は、真皮区画およびヒトin vitroセルラインデータ内の観測および予測曝露見積もり値に基づいて見積もられた。これらのin vitro系でのIC50範囲(8〜40 ng/mL)(種々の複雑さおよび細胞タイプ)を真皮区画内の標的底レベルとして使用し、本明細書中に記載のヒト患者での乾癬、および乾癬性プラーク、の治療のためのドメイン抗体用量および治療プロトコールの選択を容易にした。例えば、最悪の場合の全身性曝露を仮定して、ADA陽性被験体でアゴニズムが観察されたFTIH静脈内研究で達成された血漿曝露より低い血漿曝露を達成するために0.5 mgの出発用量を選択した。この最初の出発用量で、注射部位周囲の個別の領域(< 2 cm2表面積)内で、TNFR1が媒介するシグナル伝達が投薬直後に> 90 %のレベルまで阻害されることが予測される。経時的なTNFR1阻害は、真皮区画に送達され、保持され、次いで真皮区画から排出される薬物の量に依存する。最低(ラットでのように10 %真皮保持およびKe 0.1〜0.14 h-1)を仮定すると、DOM1h-131-206ドメイン抗体0.5 mgの皮内注射後最低3日間、レベルは> IC50 (注射/試験領域内)で維持されることが予測された。
【０２９６】
ドメイン抗体用量および治療プロトコールの選択のために、DOM1h-131-206ドメイン抗体の皮内投与後のヒト血漿曝露の予測を作製した。これらの予測では、皮内注射に関して達成される可能な限り高い曝露を仮定した。静脈内投与されたDOM1h-131-206ドメイン抗体から得られた実際のヒト血漿濃度-時間データを、固定吸収速度(げっ歯類真皮吸収からスケーリング)およびバイオアベイラビリティ100%のヒト真皮PKモデルで使用した。そして本明細書中に記載の最大ドメイン用量(群)および治療プロトコール(毎週2 mg + 隔週0.5 mg)に関するヒト血漿濃度-時間プロファイルを試験した。これは、投薬後30分以内に急速に予測ピーク血漿濃度がTmaxに達し、レベルが急速に落ちて24時間以内に現在の血漿アッセイの定量下限(0.1 ng/mL)未満のレベルになることを示した。この可能な限り高い曝露予測を使用しても、血漿中で、反復投薬を受けての蓄積は予測されない。しかし、この予測は可能な限り高い血漿曝露を代表し、曝露が予測よりかなり低い可能性があり、血漿曝露が測定できないほど低い可能性さえある。阻害の標的レベル(in vitro細胞ベースのアッセイに基づく)を使用して、本明細書中に記載の治療プロトコールにおける皮膚でのIC90 (投薬直後)またはIC50 (底値)レベルはそれぞれ30〜80 ng/mLまたは8〜40 n/mLの範囲であることが予測された。
【０２９７】
上記情報に基づいて、1回目の用量、最大1日量および累積用量、28日間に関する予測血漿曝露(CmaxおよびAUC)を前臨床安全性を越える安全域とともに下記表6bに示す。
【表６ｂ−２】
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【０２９８】
最後に、in vitro研究、in vivo研究および関連分析から得られた上記情報を使用して、ヒト患者の乾癬の治療に有用なドメイン抗体用量および治療プロトコールを選択した。
【０２９９】
本明細書中で開示される治療プロトコールにしたがうドメイン抗体の投与は乾癬の治療に有用である。例えば特定の治療プロトコールでの、乾癬を治療するためのドメイン抗体の効力を断層撮影によるプラークの測定および/または臨床評価によって確認することができる。
【０３００】
20 MHz高周波ソノグラフ(DUB USB, Taberna pro Medicum, Lueneburg)を使用して、断層撮影の高周波超音波に基づく測定を実施することができる。連続A-スキャンを構成し、皮膚のセクションとしてモニター上で表示することができる。方位分解能約200μmおよび距離分解能80μmが可能であり、好ましい。エコーパターンに応じて、表皮、真皮および皮下組織の成分を表示し、皮膚の厚みを正確に測定することが可能である。乾癬性プラーク部位での炎症性乾癬性浸潤はエントランスエコーの下の明らかに規定されるエコールーセントバンドとして観察される。エコールーセント乾癬性バンドの厚みをドメイン抗体の投与前およびドメイン抗体の投与後に測定し、記録することができる。この厚みはμm単位で測定することができる。ドメイン抗体の投与後にエコールーセント乾癬性バンドの厚みが減少すれば、例えば本明細書中で開示される治療プロトコールにしたがう、ドメイン抗体の投与がヒト患者の乾癬、および乾癬性プラーク、の治療に効果的であることを示す。例えば、Bangha et al., 9 Skin Pharmacol. 298 (1996)を参照のこと。
【０３０１】
ドメイン抗体が注射された、治療対象の乾癬性プラークと、治療対象の乾癬性プラークの近くの少なくとも1つの未治療プラークとの、クリニックでの比較によって決定される5ポイントスコアを使用して、臨床評価を実施することができる。この比較にしたがって、以下の臨床評価スコアを割り当てる(ドメイン抗体の1回目の投与前の臨床評価スコアは定義によって0である)。
【０３０２】
-1 =悪化
0 =変化なし(効果なし)
1 =軽微な改善
2 =明らかな改善だが完全治癒ではない
3 =完全治癒。
【０３０３】
したがって、これに基づいて、本明細書中で開示される治療プロトコールにしたがうドメイン抗体の投与後の臨床評価スコアの増加は、ヒト患者の乾癬、および乾癬性プラーク、の治療での効力を示す。
【実施例８】
【０３０４】
実施例8:  VHHクローンの単一アラニン伸長。
【０３０５】
実施例2で(DOM1H-131-206に関して)使用される確認アッセイを使用してVHHに対するADA結合を観察した。VHH配列を改変することによってADA結合の同等の阻害が達成されることを確認するために、図2 (d)、(e)および(f)に示されるアミノ酸配列を有する3種のVHHクローンを試験した。
【０３０６】
クローンVHH2(d)は二重特異性型であり、WO2010100135に記載のようにヒト血清アルブミン結合モジュールにGGGGSGGGSによって連結されたIL6R結合モジュールを有する。(アミノ酸配列は図2 d: 配列番号４に示される)。
【０３０７】
クローンVHH2(e)は二重特異性型であり、WO2010077422に記載のようにGGGGSGGGSをリンカーとして使用してTNF結合モジュールに連結された血清アルブミン結合モジュールに連結されたTNF結合モジュールを有する。(アミノ酸配列は図2 e: 配列番号５に示される)。
【０３０８】
クローンVHH2(f)は、WO2009115614A2に示されるように、Ala-Ala-Alaリンカーによって連結された2つの同一モジュールを含み、各モジュールがフォンウィルブランド因子のA1ドメインに結合できるdAbである、二価の単一特異性型である。(アミノ酸配列は図2 f: 配列番号６に示される)。
【０３０９】
すべての上記3クローンを末端セリン残基へのC末端アラニンの付加によって改変し、実施例2のアッセイを使用して改変および無改変クローンを比較した。下記表7および図４に見られるように、結果は、単一アラニンアミノ酸残基によるC末端伸長がADA結合を低下させることを示す。
【表７】
2020054374.tif 000017
【実施例９】
【０３１０】
実施例9:  一連のVHおよびVL dAbベースの分子に対する既存のADAを有する健康な被験体の頻度
ADAアッセイ手順
DOM1H-131-206に関して実施例1に記載される手順と同様に、試験分子(DOM 1H-131-206 (配列番号１)、DOM 1H-131-206 + C末端アラニン伸長(配列番号１６)、mAb-VH (配列番号)、ペプチド-VL配列、VH-VL (配列番号１１)、'735分子(配列番号３０および３１)をビオチン化し、バッファー交換し、製剤バッファー中で保存した。また、これらの試験分子をルテニウム標識し、次いでバッファー交換し、製剤バッファー中で保存した。
【０３１１】
各分子に関する抗薬物抗体(ADA)は、上記のようにMSDTM ECL (電気化学発光)テクノロジープラットフォームで実施される架橋アッセイである。
【０３１２】
この実験で使用されるアッセイ手順の概要は以下の通りである。
【０３１３】
1.  150μL/ウェルのPBS中のブロッキングカゼイン(1%)で室温(RT)で1〜2時間、MSDTMストレプトアビジンプレートをブロックする。洗浄せずにブロッカーを除去する。
【０３１４】
2.  1時間のプレインキュベーション後、0.1μg/mLビオチン化試験分子、0.1μg/mLルテニウム標識("Sulfo-Tag"TM)試験分子、およびアッセイ希釈液(PBS中の1%カゼイン)中の2%血清サンプルを含む均一混合物をMSDTMプレートに移し、RTで1時間±5分間インキュベートする。
【０３１５】
3.  次いでMSDプレートをPBSTで3回洗浄する。
【０３１６】
4.  150μL/ウェルの読み取りバッファーを加え、プレートを読み取る。
【０３１７】
上記濃度およびインキュベーション時間はDOM1H-131-206分子に関して使用されたものである。
【０３１８】
厳密な濃度およびインキュベーション時間を最適化できることを当業者は理解する。例えばDOM1H-131-206 (および改変バージョン)は、例えばDOM10H-53-567またはペプチド-VL配列と比較してわずかに異なる濃度およびインキュベーション時間を有することができる。
【０３１９】
100の健康なヒトドナー血清サンプルのパネルをアッセイでの反応性に関してスクリーニングした。また、正常なヒト血清サンプル中で可変軽鎖(VL)、フレームワークに対する既存の抗体(ADA)を検出したが、VHおよびVHHドメインに対して以前に観察された規模および頻度より小さい規模および頻度であった(図４を参照のこと)。結果を図５に示す。図５では、Y軸はADAに対する結合のレベルを示す。VH dAbはADA結合の最高の発生率を有した。
【０３２０】
結論として、図５に示される結果は、DOM 1H-131-206に対する既存のADA結合のレベルおよびADAに対する改変DOM 1H -131-206の結合に関するC末端伸長の付加の影響を示す。また、mAbに融合させる(mAb-VH)と、VH dAbに対する既存のADA結合が観察されたことを図５から観察することもできる。図５はまた、Vカッパ(Vk) (VL) dAbに対する既存のADA結合が存在することを示し、示される例には、ペプチド:VL、VH-VL融合物およびmAb-VL融合物が含まれる。
【実施例１０】
【０３２１】
実施例10:  VLフレームワークのアミノ酸伸長
正常なヒト血清サンプル中でVL (VK)フレームワークに対する既存の抗体が、VHフレームワークに対して観察されるレベルより概して低レベルではあるが、やはり検出されたため(図５を参照のこと)、VH含有分子で証明されたように、VK dAbのC末端領域の改変が既存のADA結合を低下させるかどうか決定した。
【０３２２】
mAb:リンカー: VL分子('735と称される - この分子は"mAbdAb"であり - それはIL-13mAb:リンカー:IL-4 (vカッパ) dAbである)に基づいて、標準部位特異的変異誘発によって試験mAb:リンカー: VL分子のパネルを作製した。それは同一のVL dAb配列を含んだが、VL dAbの種々のC末端改変を有する。'15014'、'15019'、'15020'および'15021'と称されるこれらの試験物質を操作して、C末端伸長(+AAA、+Tまたは+TV)を有するようにするか、またはC末端欠失(-R)を有するようにした(下記表8に示される)。
【０３２３】
VH dAbに関して以前に記載される手順と同様に、下記「確認アッセイ」を使用して試験物質をアッセイした。個々の化合物が、標識されたアッセイ固有の化合物と、既存の抗体に対する結合に関して競合する能力を評価することによって化合物試験を実施した。アッセイシグナルの任意の能力低下を%阻害として報告した。該具体的アッセイに関してあらかじめ決定された確証カットポイント(confirmatory cutpoint)より大きい阻害パーセントレベルは、試験化合物がアッセイ固有の化合物と、抗VK抗体に対する結合に関して競合し、ゆえにアッセイ固有の化合物とエピトープ(群)を共有するかもしれないことを示唆する。
【０３２４】
Vカッパに対する既存のADAの頻度を測定するために使用される'735 ADA確認アッセイ手順:
1.  マイクロタイターアッセイプレートで、アッセイ希釈液(PBS中の1%カゼイン)中の2% ADA陽性血清サンプルを終濃度10μg/mLの'735または他の試験物質、例えば改変dAbとRTで1時間±5分間インキュベートする。
【０３２５】
2.  1時間のプレインキュベーション後、アッセイ希釈液(PBS中の1%カゼイン)中の0.05μg/mLのビオチン化'735および0.05μg/mLのルテニウム標識("Sulfo-Tag"TM) '735を含む均一混合物をアッセイプレートに加え、RTで一晩インキュベートする。
【０３２６】
3.  インキュベーション後、MSDプレートをPBSTで3回洗浄し、アッセイサンプルをMSDプレートに移し、RTで暗所で1時間±5分間プレートをインキュベートする。
【０３２７】
4.  次いでMSDTMプレートをPBSTで3回洗浄する。
【０３２８】
5.  150μL/ウェルの読み取りバッファーを加え、プレートを読み取る。
【０３２９】
これらの化合物スクリーニングの結果を表8に示す。試験されたすべてのC末端改変(+AAA、+T、+TVおよび-R)は'735確認アッセイでの阻害の低下を示した。これは、VH dAbと類似の様式でVL dAbのC末端改変が既存の抗体(ADA)の結合を除去することを示唆する。
【表８】
2020054374.tif 000018
【実施例１１】
【０３３０】
実施例11:  DOM10H-53-567 (抗IL-13 dAb)のVHフレームワークのアミノ酸伸長
抗TNFR1 VH dAbであるDOM 1H-131-206のC末端改変は既存のADA結合を低下させるため、C末端の改変が、異なるVH分子に対するADA結合を低下させるかどうかを決定した。標準部位特異的変異誘発技術によってDOM10H-53-567のVHフレームワークにC末端改変を施した。上記「確認アッセイ」を使用して、置換を有する分子(試験物質)をアッセイした。
【０３３１】
DOM10H-53-567のC末端の伸長もまた、既存のADA結合を顕著に低下させた(結果を下記表9に示す)。これは伸長A、AS、AST、ASTK、ASTKGおよびASTKGによって例証される。これらの改変は、下記IL-13 dAb活性アッセイによって確認されるように、DOM10H-53-567クローンがその標的抗原IL-13に結合して阻害する能力に負に影響しなかった。結果を表9bに示す。
【表９ａ】
2020054374.tif 000019
【０３３２】
IL-13 dAb活性アッセイプロトコール:
バイオアッセイを使用して、in vitroのHEKBlue-STAT6細胞での組換えヒトIL-13刺激アルカリホスファターゼ生産を阻害するDOM10H-53-567分子の変異体の能力を測定した。HEK-STAT6細胞(Invivogen) (STAT6依存性プロモーターのコントロール下で分泌型胚性アルカリホスファターゼ(SEAP)を発現する)を96ウェルプレートに播いた。濃度3ng/mLのヒトIL-13および希釈系列のDOM1-H-53-567分子を室温で1時間あらかじめ平衡化し、次いで37℃で24時間、細胞に加えた。インキュベーション後、Quanti-Blue (Invivogen)を添加し、640nmでの光学密度読み取り値を得ることによって、IL-13刺激の結果として細胞によって生産されたSEAPの上清濃度を測定した。Graphpad Prismを使用して用量反応曲線からIC50値を算出した。
【表９ｂ−１】
2020054374.tif 000020
【０３３３】
既存のADA結合を低下させるDOM10H-53-567のC末端の伸長は、DOM10H-53-567 dAbがその標的抗原(ヒトIL-13)に結合して阻害する能力に負に影響しなかった。
【実施例１２】
【０３３４】
実施例12a:  改変されたC末端を有する抗VEGF VH/Vk dAb-Fc-dAb分子のクローニング
Vk dAb部分のC末端に改変が施されているVh-Vk dAb-Fc-dAb: DMS30047-30054を、PCRによって変異体Vk dAb配列を作製し、次いでそれぞれDMS30045 (配列番号４０)およびDMS30046 (配列番号４１)に再クローニングすることによって操作して、改変哺乳類発現ベクターを作製した。DMS30045から: (i) C末端アルギニン残基を除去してDMS30047 (DMS30037 -R)を作製し、(ii) C末端アラニンを付加してDMS30048 (DMS30037 + Aである) (配列番号４３)を作製し、(iii) 3つのC末端アラニンを付加してDMS30049 (DMS30037 + AAA) (配列番号４４)を作製し、およびC末端スレオニンを付加してDMS30050 (DMS30037 + T) (配列番号４５)を作製した。DMS30046 (配列番号４１)から: (i) C末端アルギニン残基を除去してDMS30051 (DMS30038 -R) (配列番号４６)を作製し、(ii) C末端アラニンを付加してDMS30052 ((DMS30038 + A) (配列番号４７)を作製し、(iii) 3つのC末端アラニンを付加してDMS30053 (DMS30038 + AAA) (配列番号４８)を作製し、およびC末端スレオニンを付加してDMS30054 (DMS30038 + T) (配列番号４３)を作製した。
【０３３５】
上記分子の説明は以下の通りである。
【０３３６】
DMS30045: DOM15-26-597 dAb N-(VEPKSSDKリンカー) & C末端K-044-085 dAb ((TGLDSP)x4)、DMS30046: DMS1576およびC末端K-044-085 dAb ((TGLDSP)x4)、DMS30047 (改変C末端を含む) : DOM15-26-597 dAb N-(VEPKSSDKリンカー) & C末端K-044-085 dAbマイナスC末端R ((TGLDSP)x4)、DMS30048 (改変C末端を含む): DOM15-26-597 dAb N-(VEPKSSDKリンカー) & C末端K-044-085 dAb +A ((TGLDSP)x4)、DMS30049 (改変C末端を含む): DOM15-26-597 dAb N-(VEPKSSDKリンカー) & C末端K-044-085 dAb +AAA ((TGLDSP)x4)、DMS30050 (改変C末端を含む): DOM15-26-597 dAb N-(VEPKSSDKリンカー) & C末端K-044-085 dAb +T ((TGLDSP)x4)、DMS30051 (改変C末端を含む): DMS1576 & C末端K-044-085 dAbマイナスC末端R ((TGLDSP)x4)、DMS30052 (改変C末端を含む): DMS1576 & C末端K-044-085 dAb +A ((TGLDSP)x4)、DMS30053 (改変C末端を含む): DMS1576 & C末端K-044-085 dAb +AAA ((TGLDSP)x4)、DMS30054 (改変C末端を含む): DMS1576 & C末端K-044-085 dAb +T ((TGLDSP)x4) (該分子のアミノ酸配列は図１２および配列番号４０〜４９に示される)。
【０３３７】
実施例12B:  VEGF VK dAbダンベル分子であるDMS30037およびDMS30038のC末端領域の改変は既存の抗体に対する低下した結合性を有する
Vカッパに対する既存のADAの頻度を測定するために使用されるVカッパADA確認アッセイ手順:
1.  マイクロタイターアッセイプレートで、アッセイ希釈液(PBS中の1%カゼイン)中の10% ADA陽性血清サンプルを終濃度10μg/mLの試験物質、例えば改変dAbとRTで1時間±5分間インキュベートする。
【０３３８】
2.  1時間のプレインキュベーション後、アッセイ希釈液(PBS中の1%カゼイン)中の約0.025μg/mLのビオチン化dAb、約0.0125μg/mLのルテニウム標識("Sulfo-Tag"TM) dAb、および5% ADA陽性血清の終濃度で、ビオチン化VカッパdAb (無改変)およびルテニウム標識("Sulfo-Tag"TM) 'VカッパdAb (無改変)を含む均一混合物とともに、ADA陽性血清/試験物質をアッセイプレートに加える。プレートをRTで1時間±5分間インキュベートする。
【０３３９】
3.  150μL/ウェルのPBS中のブロッキングカゼイン(1%)で室温(RT)で1〜2時間、MSDTMストレプトアビジンプレートをブロックする。洗浄せずにブロッカーを除去する。
【０３４０】
4.  1時間のプレインキュベーション後、均一混合物をMSDTMストレプトアビジンアッセイプレートに加え、RTで1時間±5分間インキュベートする。
【０３４１】
5.  1時間のインキュベーション後、MSDプレートをPBSTで3回洗浄し、アッセイサンプルをMSDプレートに移し、RTで暗所で1時間±5分間プレートをインキュベートする。
【０３４２】
6.  次いでMSDTMプレートをPBSTで3回洗浄する。
【０３４３】
7.  150μL/ウェルの読み取りバッファーを加え、プレートを読み取る。
【０３４４】
確認アッセイでの厳密な濃度およびインキュベーション時間を最適化できることを当業者は理解する。例えば1H-131-206 (および改変バージョン)は、DOM10H-53-567と比較してわずかに異なる濃度およびインキュベーション時間を有することができる。
【０３４５】
これらの化合物スクリーニングの結果を下記表9Bに示す。VカッパdAbに関して試験されたすべてのC末端改変(+T、+A、+AAAおよび-R)は上記'697確認アッセイでの阻害の低下を示した。これは、Vh dAbと類似の様式でこれらのVカッパdAbのC末端改変が既存の抗体(ADA)の結合を低下させることを示唆する。
【表９ｂ−２】
2020054374.tif 000021
【実施例１３】
【０３４６】
実施例13 - 改変されたC末端を有する抗VEGF VH/Vk dAb-Fc-dAb分子の発現(DMS30047-30054)
上の実施例12aに記載の関連抗VEGF dAb-Fc-dAb分子をコードする発現プラスミドをHEK293 6E細胞に一過性にトランスフェクトし、本実施例中の下記方法を使用して500mlスケールで発現させて抗体フラグメント分子を製造した。通常、>30mg/上清1Lの発現レベルを達成した。
【０３４７】
哺乳類発現ベクター中、ヒトIgG1アイソタイプの一般Fc(generic Fc)のNまたはC末端にdAb配列をクローニングした。リンカー配列を使用してdAbをFcに連結した。N末端リンカーはAAAS、またはTVAAPSであり、C末端リンカーは((GS(TVAAPSGS)x3)、またはアルブミンドメイン3であった。
【実施例１４】
【０３４８】
実施例14  改変されたC末端を有する抗VEGF VH/Vk dAb-Fc-dAb分子の精製
上の実施例に関して記載されるように、dAb-Fc-dAb分子を上清からアフィニティー精製した。
【実施例１５】
【０３４９】
実施例15  改変されたC末端を有する抗VEGF Vh/Vk dAb-Fc-dAb分子のサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)による分子分析
次いで、精製された抗VEGF dAb-Fc-dAb分子の分子完全性、均質性および%純度をSDS-PAGEおよび分析用サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)によって分析した。そして、生物学アッセイでのさらなる分析の前に、SDS-PAGEおよびSECによって、該タンパク質は>95%純度の標的タンパク質であることを確認した。
【実施例１６】
【０３５０】
実施例16  改変されたC末端を有する抗VEGF Vh/Vk dAb-Fc-dAb分子の、BiacoreでのVEGFに対する結合
特定の抗VEGF dAb-Fc-dAb分子(小さいC末端改変を有する)の、VEGF165に関する結合親和性を、Biacore T100を使用する表面プラズモン共鳴(SPR)によって測定した。プロテインAを一級アミンカップリングによってC1チップ上に固定し、次いでこの表面を使用して抗VEGF構築物を捕捉した。ヒト組換えVEGF165 (HEK293細胞の一過性トランスフェクションから「組織内」調達)を、4倍希釈系列での32nM〜0.03125nMのアナライトとして使用した。すべての結合曲線をバッファー注射(すなわち0nM)で二重参照し、データをT100に固有の1:1モデルにフィッティングした。50mM NaOHを使用して再生を実施した。ランニングバッファーとしてHBS-EPを使用して37℃で動作を行った。得られたデータを表10A、10B & 10Cに示す。表10Aのデータから、DMS30037およびC末端で改変されたいくつかの変異体: DMS30037+A (DMS30048)、DMS30037+AAA (DMS30049)、およびDMS30037+T (DMS30050) (これらの分子についてのさらなる詳細に関しては実施例12aを参照のこと)の挙動はBiacoreで同等であるようであり、C末端改変は親と比較して効力を低下させないと思われる。
【０３５１】
追加のデータセットを表10Bに示す。表10Bでは、DMS30037およびDMS30038の両者の性能を、Biacoreにおいて、C末端で改変された変異体: DMS30037-R、(+R (DMS30047)と表示される、DMS30037+T (DMS30050)およびDMS30038-R、(+R (DMS30051)と表示される、およびベバシズマブ(アバスチン)と比較した。このデータセットでは、やはり、すべての分子の挙動はBiacoreで同等であるようであり、C末端改変は親と比較して効力を低下させないと思われる。アバスチンに関する曲線を考察すること以外に重要なデータは捕捉できなかった。追加のデータセットを表10Cに表示する。表10Cでは、分子DMS30037およびDMS30038を、C末端で改変された変異体: DMS30037-R、(DMS30047)、DMS30037+T (DMS30050)、DMS30038-R、(DMS30051)およびDMS30038+T (DMS30054)およびベバシズマブ(アバスチン)と比較した。やはり、すべてのdAb-Fc-dAb分子の挙動はBiacoreで同等であるようであり、C末端改変は親と比較して効力を低下させないと思われる。このデータセット、表10Cを参照のこと、では、ベバシズマブ(アバスチン)データは、解離速度(off-rate)が緊密過ぎるせいで適正に測定できなかった。
【表１０Ａ】
2020054374.tif 000022
【表１０Ｂ】
2020054374.tif 000023
【表１０Ｃ】
2020054374.tif 000024
【実施例１７】
【０３５２】
実施例17  改変されたC末端を有する抗VEGF Vh/Vk dAb-Fc-dAb分子のVEGF R2受容体結合アッセイ
本実施例で以下に記載されるように、変法、すなわちプレインキュベーションを行わない方法を使用するVEGF受容体2、(R2)、結合アッセイで、DMS30037およびDMS30038に基づくがC末端改変を有する抗VEGF_Vh/Vk dAb-Fc-dAb分子の効力を、野生型分子およびベバシズマブ(アバスチン)の両者と比較した。データを表11Aに示す。すべての試験されたdAb-Fc-dAb分子: DMS30037、DMS30037+T (DMS30050)、DMS30037-R (DMS30047)、DMS30038、DMS30038-R (DMS30051)は同等の効力を有するようであり、かつベバシズマブ(アバスチン)よりかなり強力であるようであった、表11A。アッセイで分子によって達成された最大阻害パーセンテージの差異はほとんどなかった。すべての分子は>93〜98%最大阻害を達成した(データは示していない)。
【０３５３】
同アッセイ形式でdAb-Fc-dAb: DMS30038、DMS30038+T、(DMS30050)およびDMS30038-R、(DMS30051)をベバシズマブ(アバスチン)と比較する追加のデータを作製した。データを表11Bに表示する。データから、DMS30038およびそのC末端変異体、(表11B)、は、RBAアッセイでのEC50値から判断される同等の効力を有し、この基準によってベバシズマブ(アバスチン)よりかなり強力であるようである。アッセイで分子によって達成された最大阻害パーセンテージの差異はほとんどなかった。すべての分子は>94%最大阻害を達成した(データは示していない)。
【０３５４】
VEGF R2受容体結合アッセイ:  VEGF受容体結合アッセイでベバシズマブ(アバスチン)の効力と比較して効力を分析した。このアッセイでは、VEGF R1またはVEGF R2に対するVEGF165の結合およびこの相互作用をブロックする試験分子の能力を測定する。MSD標準結合96ウェルプレート(L11XA-3)を重炭酸バッファー中の0.25μg/ml VEGF R1 (R&D Systems 321-FL)またはVEGF R2 (R&D 357-KD)(50μl/ウェル)でコーティングし、プレートシーラーでカバーし、4℃で一晩インキュベートした。翌日、MSDプレートをTris洗浄バッファーで3x 300μl/ウェルで洗浄し、組織のパッド上にブロッティングして、過剰の洗浄バッファーをウェルから除去した。次いでMSDプレートをPBS中の3% BSA (250μl/ウェル)でブロックし、振とう(750 RPM)しながら室温で1時間インキュベートした。MSDプレートを再洗浄し、次いで2x濃度の抗VEGF分子(25μl/ウェル)を加え、振とう(750 RPM)しながら室温で10分間インキュベートし、次いで、2x濃度のrhVEGF、25μl/ウェル、R&D Systems (293-VE/CF、バキュロウイルスを使用して昆虫細胞で作製)またはGSK「組織内」調達VEGF (HEK293哺乳類細胞から作製、表3Aを除いて後者のデータは示していない)を加えた。PBS中の0.1% BSAを使用して抗VEGF分子およびVEGFを調製した。抗VEGF分子をVEGFとプレインキュベートするステップを含む、最初のアッセイを実施した。室温で30分間、等量の2x濃度の抗VEGF分子を等量の2x濃度のVEGF (R&D、293-VE/CF)に加えることによってプレインキュベーションを調製した。使用される最終VEGF濃度は10ng/mlであった。VEGFなし、およびVEGFのみのコントロールも含めた。MSDプレートを振とう(750 RPM)しながら室温で2時間インキュベートし、その後、再洗浄し、次いでPBS中の1% BSA中の0.25μg/mlの検出試薬(50μL/ウェル、ヤギ抗ヒトVEGFビオチン化抗体- R&D Systems BAF293)を加え、振とう(750 RPM)しながら室温で1時間インキュベートした。MSDプレートを再洗浄し、次いでPBS中の1% BSA中の2μg/mlのストレプトアビジンsulfo-TAG (50μl/ウェル、MSD R32AD-1)を加え、振とう(750 RPM)しながら室温で30分間インキュベートした。MSD Sector Imager 6000での電気化学発光の測定前に、MSDプレートを洗浄し、150μl/ウェルの2x Read Buffer T (MSD R92TC-1)を加えた。GraphPad Prismを使用してカーブフィッティングおよびEC50計算を行った。試験抗VEGF分子およびベバシズマブ(アバスチン)がVEGFR1およびVEGFR2に対するVEGF結合を阻害する能力を上記のように測定した。
【０３５５】
変法:  VEGF受容体コーティングMSDプレートへの添加前に抗VEGF物質とVEGFをプレインキュベートしない第2のアッセイを実施した。R&D Systemsから調達したVEGF (293-VE/CF)のみを使用してこのアッセイを実施した。プレインキュベーションステップを行わない以外は上記のように、抗VEGF分子およびベバシズマブ(アバスチン)がVEGFR1およびVEGFR2に対するVEGF結合を阻害する能力を測定した。
【表１１Ａ】
2020054374.tif 000025
【表１１Ｂ】
2020054374.tif 000026
【実施例１８】
【０３５６】
実施例18 - ヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)増殖アッセイ:  C末端改変を含む抗VEGF Vh/Vk dAb-Fc-dAb分子を用いる阻害:
以下の変更点: (i) 外側ウェルを細胞を含まないままにせず、96ウェルプレート全体を使用したことおよび(ii) シグモイドカーブフィット、非線形回帰の可変勾配(可変勾配)を使用するGraphPad Prismを使用してデータを解析したこと、を伴う下記方法を使用して、DMS30037およびDMS30038に基づくがC末端改変を有するdAb-Fc-dAb分子: DMS30037-R (DMS30047) & DMS30037+T (DMS30050)、DMS30038-R (DMS30051) & DMS30038+T (DMS30054)の、ヒト臍静脈内皮細胞の増殖を抑制する能力をベバシズマブ(アバスチン)と比較した。試験化合物をコンパレータ分子、ベバシズマブ(アバスチン)に対して個別のプレートで独立して評価した; ベバシズマブ(アバスチン): 15; DMS30037: 7; DMS30038: 8; DMS30037-R (DMS30047): 3; DMS30037+T (DMS30050): 4;  DMS30038-R (DMS30051): 4 & DMS30038+T (DMS30054): 4の分子あたりのトータルデータセットを用いて少なくとも3つの別の機会にアッセイを実施した(データは示していない)。焦点は、ベバシズマブ(アバスチン)との比較での、特定の分子によって生成されるアッセイでの最大阻害の程度および相対EC50値の両者の解析にあった。
【０３５７】
シグモイドカーブフィット、非線形回帰の可変勾配(可変勾配)を使用するGraphPad Prismを使用してデータを解析した。個別のカーブフィットを分子ごとでかつ日ごとにフィッティングした。一部の不十分なフィッティングのせいで、より低い濃度でプラトーが観察されない曲線に制限を導入することを決定した。制限にもかかわらずカーブフィッティングが不十分なせいで1プレートを分析から除外した。この制限は最低濃度でのポイントの平均に等しい。最低限が制限されるかされないかに関してデータを手動で選択し、カーブフィットおよびパラメータをこの基準選択に基づいて自動的に更新した。1/ (標準誤差)2、[SE]2、を重みとして使用する重みつき混合モデル分散分析を使用して極大(the curve maxima)および標準誤差の算出値を解析した。変量効果の条件を使用して、プレート間および日数間の変動に関して分析を調節した。この分析から、予測平均を見積もり、立ち返ってアバスチン(コントロール)との比較を行った(表12Aを参照のこと)。次いでIC50に関してlog10スケールで同分析を実施し、結果を逆変換した。この結果から、幾何平均の算出値を生成し、立ち返ってアバスチン(コントロール)に対する比の形式でアバスチンとの比較を行った。すなわち0.5の比であれば、アバスチンからの50%低下を示す(表12Bを参照のこと)。
【０３５８】
ヒト臍帯内皮細胞(HUVEC)増殖アッセイ:
ベバシズマブ(アバスチン)の能力と比較して、ヒト臍静脈内皮細胞の増殖を抑制する能力に関して抗VEGF分子をアッセイした。このアッセイでは、規定の濃度のVEGF165によって誘発される内皮細胞増殖の程度およびVEGFアンタゴニストがこの効果をブロックする能力を測定する。96ウェルゼラチンコーティングプレートに5000細胞/ウェルでHUVECを播種し、外側ウェルを無細胞のままにし、数時間インキュベートして接着させた。試験分子を2倍段階希釈で等モル濃度(max 3.33x10-08M)で、それぞれ3回、分析した。VEGF165を基本培地中で調製し、75ng/ml終濃度を達成した。細胞単層から手動で培地を除去し、基本培地50μlを加えて細胞の乾燥を防いだ。VEGF165含有培地25μlおよび基本培地または試験抗体含有培地25μlを必要に応じて加えた。細胞を72時間インキュベートし、その後、Cell Titre Gloを使用して細胞の総数を測定した。HUVECをVEGF165で処理すると、VEGF165未処理細胞と比較して、72時間後の細胞の総数についての予測される増加が生じた(データは示していない)。このVEGF媒介性の増加は、HUVEC増殖およびHUVEC細胞死の予防の両者に関するVEGFの累積的効果を示すと解釈される。比較分子であるベバシズマブ(アバスチン)に対して個別のプレートで試験化合物を独立して評価した。
【表１２Ａ】
2020054374.tif 000027
【０３５９】
この分析から、分子DMS30037、DMS30037+TおよびDMS30037-RはHUVECアッセイで最も大きい最大阻害を生じさせるようであり、それらはアバスチングループより性能が優れていて、信頼区間はゼロ基準と重複せず、データはアバスチンのデータと比べて統計学的に有意であった。データは示していない(表12Aを参照のこと)。
【表１２Ｂ】
2020054374.tif 000028
【０３６０】
95%信頼区間(CI)を有するIC50値の幾何平均についての類似の分析では、ほぼすべてのdAb-Fc-dAb分子DMS30037、DMS30037+T、DMS30038、DMS30038+TおよびDMS30038-Rがアバスチンより統計学的に有意に低いIC50値を有することが示された。データは示していない(表18Bを参照のこと)。DMS30037-Rで得られたデータセットは少ないn数(3)で非常に変動した。
【０３６１】
結局、データは、両dAb-Fc-dAb: DMS30037 & DMS30038のC末端改変がHUVECアッセイで親分子に非常に類似のIC50値および最大阻害のレベルを有し、最大阻害パーセンテージおよび低いIC50の両観点でベバシズマブ(アバスチン)より強力であると思われることを示唆する(表12Aおよび12Bを参照のこと)。
【実施例１９】
【０３６２】
実施例19 (ツールmAb):  既存の抗VH ADAの結合に関するエピトープを定義するための抗VH mAbの使用:
モノクローナル抗体(抗VH mAb M2.3G10.1G06)はDOM1H-131-206のVHフレームワークに結合し、かつ、このmAbがDOM1H-131-206 +Aに対するかなり低い結合を有することが決定された; したがってこの抗体は既存のヒト抗VH ADAと類似のエピトープに結合すると思われる。
【０３６３】
抗VH mAb M2.3G10.1G06のCDR配列:  
抗VH mAb M2.3G10.1G06のCDR配列を増幅し、ハイブリドーマセルラインからシークエンシングした。mAb M2.3G10.1G06の重鎖および軽鎖配列を示す[アミノ酸配列を図6aおよび6bに示す]。配列をヒトIgG1 mAb発現ベクターにクローニングし、哺乳類細胞にトランスフェクトして、特定されているmAbを発現させた。得られた抗体を細胞上清から精製し、VH dAbフレームワークに結合するその能力に関して試験した。
【０３６４】
抗VH mAb M2.3G10.1G06の特異性:  
MSDTMプラットフォームで実施されるTNFR1:dAb結合アッセイでのmAb M2.3G10.1G06の結合を測定することによって、VH dAbフレームワーク(既存のADA結合を抑止する改変の有無にかかわらない)に対する結合に関するmAb M2.3G10.1G06の特異性を測定した(MSDTMプラットフォームの詳細に関しては実施例1を参照のこと)。TNFR1:dAb結合アッセイを以下で詳述する。ルテニウム標識抗VH mAb M2.3G10.1G06が、アラニンの伸長によってC末端が改変された場合に、VHフレームワークに対する85%低下までの結合を有する(残留結合1〜15%)ことが示された(結果を表13に示す)。
【０３６５】
既存の抗VH ADAとmAb M2.3G10.1G06との競合:  
抗VH mAb M2.3G10.1G06が既存の血清抗VH ADAと同じエピトープに結合することを確認するために、競合アッセイを実施した。既存の抗VH ADAを有する一連のヒトドナー由来の血清が、DOM1H-131-206に対する結合に関して抗VH mAb M2.3G10.1G06と競合することを決定した(データを図７に示す)。発明者らは、既存のヒト抗VH ADAおよび抗VH mAb M2.3G10.1G06がVHフレームワーク上のオーバーラップエピトープを共有することを結論づける。
【０３６６】
既存のADA結合に関するエピトープを分裂させるVH dAbの改変は、抗VH mAb M2.3G10.1G06の結合に基づいて予測することができる。したがって、抗VH mAb M2.3G10.1G06の結合を使用して、既存のADA結合の低下を導く改変に関してアッセイすることができる。
【０３６７】
使用される方法:
TNFR1:dAb結合アッセイプロトコール
1.  TNFR1:Fcを4℃で一晩ハイバインドMSDプレート上に捕捉する。次いでMSDプレートをMSD/TRIS洗浄バッファーで3回洗浄する。
【０３６８】
2.  PBS中の3% BSAで室温で1.5時間プレートをブロックする。次いでMSDプレートをMSD/TRIS洗浄バッファーで3回洗浄する。
【０３６９】
3.  希釈系列の試験dAb (DOM 1H-131-206 (配列番号１)またはC末端アラニン伸長を有するDOM 1H-131-206 (配列番号１６))をRTで2時間加える。次いでMSDプレートをMSD/TRIS洗浄バッファーで3回洗浄する。
【０３７０】
4.  終濃度1μg/mlのルテニウム標識mAb M2.3G10.1G06を室温で1時間加える。次いでMSDプレートをMSD/TRIS洗浄バッファーで3回洗浄する。
【０３７１】
5.  150μL/ウェルの読み取りバッファーを加え、プレートを読み取る。
【０３７２】
既存の抗VH ADAおよびmAb M2.3G10.1G06の競合アッセイプロトコール
1.  アッセイ希釈液(PBS中の1%カゼイン)中の0.2μg/mLのDOM 1H-131-206 (配列番号１)であったビオチン化試験分子(dAb)および20%血清サンプルを丸底アッセイプレートでRTで1時間±5分間インキュベートする。
【０３７３】
2.  終濃度0.5μg/mLのルテニウム標識抗VH mAb M2.3G10.1G06を室温で1時間加える。
【０３７４】
3.  150μL/ウェルのPBS中のブロッキングカゼイン(1%)で室温(RT)で1〜2時間、MSDTMストレプトアビジンプレートをブロックする。
【０３７５】
4.  サンプルをMSDTMストレプトアビジンプレートに移し、室温(RT)で1〜2時間インキュベートする。
【０３７６】
5.  次いでMSDプレートをPBSTで3回洗浄する。
【０３７７】
6.  150μL/ウェルの読み取りバッファーを加え、プレートを読み取る。
【表１３】
2020054374.tif 000029
【０３７８】
このmAbはVH dAb、例えばDOM 1H-131-206 (配列番号１)のフレームワークに結合するが、+A C末端改変を有するdAb、例えばC末端アラニン伸長を有するDOM 1H-131-206 (配列番号１６)では、結合は大きく低下する。H & L鎖配列はBiocatに寄託されたハイブリドーマから決定されている。LC配列は1つのみだが、2つのHC配列: 1機能的配列(下記参照のこと)ならびに終止コドンおよびフレームシフトを含む1非機能的配列が存在した。
【０３７９】
mAbの発現および、下記の予測される機能的配列に基づく上記2つの分子に対する結合の確認により、発明者らは出願のための正しいmAb配列を有することを確認できる。pTT5構築物が組立てられた方法は、斜体でない配列のみがハイブリドーマ由来であり、斜体は、それがクローニングされたpTTベクター由来のキメラである(これは結合アッセイに必要とされない)ことを意味する。
【０３８０】
軽鎖
2020054374.tif 000030
【０３８１】
重鎖
2020054374.tif 000031
【０３８２】
可変領域は正常型である。
【０３８３】
CDRは下線/太字である。
【０３８４】
Fcのキメラ配列は斜体である。
【０３８５】
FcはヒトIgG1である。
【０３８６】
ツールmAbの配列を図６(配列番号１４および１５)に示す。
【図１】
2020054374.tif 000032
【図２−１】
2020054374.tif 000033
【図２−２】
2020054374.tif 000034
【図２−３】
2020054374.tif 000035
【図３】
2020054374.tif 000036
【図４】
2020054374.tif 000037
【図５】
2020054374.tif 000038
【図６】
2020054374.tif 000039
【図７】
2020054374.tif 000040
【図８】
2020054374.tif 000041
【図９】
2020054374.tif 000042
【図１０−１】
2020054374.tif 000043
【図１０−２】
2020054374.tif 000044
【図１１−１】
2020054374.tif 000045
【図１１−２】
2020054374.tif 000046
【図１１−３】
2020054374.tif 000047
【図１２−１】
2020054374.tif 000048
【図１２−２】
2020054374.tif 000049
【図１２−３】
2020054374.tif 000050
【図１２−４】
2020054374.tif 000051
【配列表】
2020054374000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年12月11日(2019.12.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的抗原に1価で結合することができる、治療用の、ラクダ科重鎖(VHH)単一免疫グロブリン可変ドメイン(dAb)であって、以下から選択される１以上の改変を有する単一免疫グロブリン可変ドメイン(dAb):
C末端配列VTVSSX、ここでXは1アミノ酸〜5アミノ酸のアミノ酸伸長であり;前記伸長は(a) A 、(b) AS、(c) AST 、(d) ASTK、(e) ASTKG、(f) AAA若しくは(g) Tから選択される、
かつ、無改変の単一免疫グロブリン可変ドメイン(dAb)と比較して既存のADAに対する低下した結合性を有する、
前記の単一免疫グロブリン可変ドメイン(dAb)。
【請求項２】
前記単一免疫グロブリン可変ドメインが-S欠失であるC末端欠失をさらに含む、或いは、
前記単一免疫グロブリン可変ドメインがP14A置換、P41A置換、L108A置換、T110A置換およびS112A置換からなる群から選択される１以上のアミノ酸置換をさらに有する、
請求項１に記載の単一免疫グロブリン可変ドメイン(dAb)。
【請求項３】
受容体、重合体標的、TNFα、TNF受容体、TNF受容体1 (TNFR1)、VEGF、IL-1R、IL-6R、IL-4、IL-5、IL-13、DC-SIGN、ASGPR、アルブミン、フォンウィルブランド因子、フォンウィルブランド因子A1ドメインおよびTGFβR2から選択される標的に結合する、請求項１または２に記載の単一免疫グロブリン可変ドメイン(dAb)。
【請求項４】
前記dAbが、追加のdAbもしくはタンパク質もしくはポリペプチドまたはそのフラグメント、半減期を延長できるかまたは追加の治療用分子もしくは活性分子であるタンパク質もしくはポリペプチドまたはそのフラグメント、PEG分子、抗体またはそのフラグメントまたはFc領域から選択される、追加の分子との融合物またはコンジュゲートとして存在する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の単一免疫グロブリン可変ドメイン(dAb)。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の単一免疫グロブリン可変ドメイン(dAb)を、製薬的または生理学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤とともに含む医薬組成物。
【請求項６】
副作用の予防方法での使用のための、請求項１〜４のいずれか１項に記載の単一免疫グロブリン可変ドメイン、または請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
炎症性疾患、または呼吸器疾患または肺疾患から選択される少なくとも1つの疾患の治療または予防に使用するための、請求項１〜４のいずれか１項に記載の単一免疫グロブリン可変ドメイン(dAb)、または請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の単一免疫グロブリン可変ドメイン(dAb)を含む、注射用、経口、吸入用若しくは噴霧用製剤、持続放出製剤、または凍結乾燥製剤。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の単一免疫グロブリン可変ドメイン(dAb)をコードする、単離された核酸または組換え核酸。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３８６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３８６】
ツールmAbの配列を図６(配列番号１４および１５)に示す。   
本発明は以下の実施形態を包含する。
[１]  以下の改変:
(a) 1アミノ酸〜5アミノ酸のアミノ酸伸長を含むC末端伸長; または
(b) 少なくとも1つの置換が、P14A置換、P41A置換およびL108A置換から選択される置換である、1以上のアミノ酸フレームワーク置換
から選択される1以上の改変を含み、
かつ、無改変の単一免疫グロブリン可変ドメイン(dAb)と比較して既存のADAに対する低下した結合性を有する、
単一免疫グロブリン可変ドメイン(dAb)。
[２]  該dAbが、ヒトVH、またはヒトVL dAbまたはラクダ科VHHから選択される、１に記載の単一免疫グロブリン可変ドメイン(dAb)。   
[３]  1アミノ酸〜4アミノ酸のC末端伸長を含む、１または２に記載の単一免疫グロブリン可変ドメイン(dAb)。   
[４]  該C末端伸長が、アラニンであるアミノ酸を含む、先行するのいずれかに記載の単一免疫グロブリン可変ドメイン(dAb)。   
[５]  (i) 該単一免疫グロブリン可変ドメインがヒトVHまたはラクダ科VHHである場合、該C末端伸長は(a) A (b) AS、(c) AST (d) ASTK、(e) ASTKG (f) AAAまたは(g) Tから選択されるアミノ酸伸長を含むか、またはそれからなり; および(ii) 該単一免疫グロブリン可変ドメインがVカッパなどのヒトVLである場合、該C末端伸長は(a) AAA (b) A (c) TVおよび(d) Tから選択されるアミノ酸伸長を含むか、またはそれからなる、先行するのいずれかに記載の単一免疫グロブリン可変ドメイン(dAb)。   
[６]  標的抗原に1価で結合する単一免疫グロブリン可変ドメイン(dAb)であって、以下のもの:
a.  該dAbが該抗原に5μM〜1pMの範囲のKDで結合するような、該標的抗原に特異的な3つの相補性決定(CDR)領域;
b.  4つのフレームワーク(FW)領域; および
c.  配列VTVS(S)nXまたはVEIKpRqXからなるC末端配列; および場合により
d.  ヒト生殖細胞系列フレームワーク配列と比較して14、41、108、110、または112位の1以上のアミノ酸置換
を含み、ここで:
nは0または1から独立して選択される整数を表し;
pおよびqは、それぞれ、pが1を表す場合、qは0または1であり、かつpが0を表す場合、qも0を表すように、0または1を表し;
Xは存在または不存在であり、かつ存在すれば、1〜5アミノ酸残基のアミノ酸伸長を表し;ただしXが不存在ならば;
i.  nは0であり、かつ/または末端がVTVS(S)nであるdAbは1以上の該アミノ酸置換を含み;
ii.pおよび/またはqは0であり、かつ/または末端がVEIKpRqであるdAbは1以上の該アミノ酸置換を含む、
単一免疫グロブリン可変ドメイン(dAb)。   
[７]  等価なdAbではXが不存在であり、n、pおよびqが1であり、かつアミノ酸置換が存在しないことを除いて同一の配列を有する等価なdAbより低い、抗薬物抗体に関する結合親和性および/またはアビディティーを有する、６に記載の単一免疫グロブリン可変ドメイン。   
[８]  約10pMまたはそれ未満〜約50nMの範囲のKDを有する、６に記載の単一免疫グロブリン可変ドメイン。   
[９]  ヒトVH dAb、ヒトVL dAb (例えばVカッパ)およびラクダ科VHHからなる群から選択される、１〜８のいずれかに記載の単一免疫グロブリン可変ドメイン。   
[１０]  該1以上のアミノ酸置換が、P14A置換、P41A置換、L108A置換、T110A置換およびS112A置換からなる群から選択される、１〜９のいずれかに記載の単一免疫グロブリン可変ドメイン。   
[１１]  Xが存在する、６〜１０のいずれかに記載の単一免疫グロブリン可変ドメイン。   
[１２]  Xが1〜5アミノ酸の伸長である、６〜１０のいずれかに記載の単一免疫グロブリン可変ドメイン。   
[１３]  Xが、アラニン残基を含むか、またはアラニン残基からなる1〜5アミノ酸の伸長である、１１に記載の単一免疫グロブリン可変ドメイン。   
[１４]  Xが、A、AS、AST、ASTK、ASTKGからなる群から選択される伸長である、１３に記載の単一免疫グロブリン可変ドメイン。   
[１５]  該C末端配列がVHまたはVHH dAbに関して配列VTVSSX、またはVカッパなどのVL dAbに関して配列VEIKRXからなり、かつXが1〜5アミノ酸のアミノ酸伸長である、６〜１４のいずれかに記載の単一免疫グロブリン可変ドメイン。   
[１６]  (i) 該単一免疫グロブリン可変ドメインがヒトVHまたはラクダ科VHHである場合、該C末端伸長は(a) A (b) AS、(c) AST (d) ASTK、(e) ASTKG (f) AAAまたは(g) Tから選択されるアミノ酸伸長または、-S欠失であるC末端欠失を含み; または(ii) 該単一免疫グロブリン可変ドメインがVカッパなどのヒトVLである場合、該C末端伸長は(a) AAA (b) A (c) TVおよび(d) Tから選択されるアミノ酸伸長または、-R欠失であるC末端欠失を含む、１〜１５のいずれかに記載の単一免疫グロブリン可変ドメイン。   
[１７]  TNFα、TNF受容体、TNF受容体1 (TNFR1)、VEGF、IL-1R、IL-6R、IL-4、IL-5、IL-13、DC-SIGN、ASGPR、アルブミン、フォンウィルブランド因子、フォンウィルブランド因子A1ドメインおよびTGFβR2から選択される標的に結合する、１〜１６のいずれかに記載の単一免疫グロブリン可変ドメイン(dAb)。   
[１８]  標的がTNFR1であり、かつ(a) C末端に単一アラニンの伸長を有するDOM1h-131-206 dAb (図8a: 配列番号１６に示される); (b) C末端に単一アラニンの伸長およびP14Aフレームワーク突然変異を有するDOM1h-131-206 dAb (図8B: 配列番号１７に示される); (c) P14Aフレームワーク突然変異を有するDOM1h-131-206 dAb (図8c: 配列番号１８に示される); (d) ASTKG C末端伸長を有するDOM1h-131-206 dAb (図8d: 配列番号１９に示される); および(e) ASTKG C末端伸長およびP14Aフレームワーク突然変異を有するDOM1h-131-206 dAb (図8e: 配列番号２０に示される)として特定されるアミノ酸配列のいずれかから選択される、１７に記載の単一免疫グロブリン可変ドメイン(dAb)。   
[１９]  標的がTNFR1であり、かつ無改変のdAbが、DOM1h-131-206 (図2a: 配列番号１に示される)、DOM 1h-131-511 (図2b: 配列番号２に示される)、DOM 1h-131-202 (図2c: 配列番号３に示される)として特定されるアミノ酸配列のいずれか1つと、100%、99.5%、99%、98%、97%、96%、95%、90%、85%または80%同一であるアミノ酸配列から選択される、１〜５または１７もしくは１８のいずれか一項に記載の単一免疫グロブリン可変ドメイン(dAb)。   
[２０]  dAbが追加の分子との融合物またはコンジュゲートとして存在する、先行するのいずれかに記載の単一免疫グロブリン可変ドメイン(dAb)。   
[２１]  dAbが、追加のdAbもしくはタンパク質もしくはポリペプチドまたはそのフラグメント、半減期を延長できるかまたは追加の治療用分子もしくは活性分子であるタンパク質もしくはポリペプチドまたはそのフラグメント、PEG分子、抗体またはそのフラグメントまたはFc領域から選択される1以上の追加の分子との融合物またはコンジュゲートとして存在する、先行するのいずれかに記載の単一免疫グロブリン可変ドメイン(dAb)。   
[２２]  dAbがmAbdAb分子として存在する、先行するのいずれかに記載の単一免疫グロブリン可変ドメイン(dAb)。   
[２３]  dAbが直列型（in-line）融合物として存在する、先行するのいずれかに記載の単一免疫グロブリン可変ドメイン(dAb)。   
[２４]  dAbがダンベル型で存在する、先行するのいずれかに記載の単一免疫グロブリン可変ドメイン(dAb)。   
[２５]  先行するのいずれかに記載の単一免疫グロブリン可変ドメイン(dAb)を、製薬的または生理学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤とともに含む医薬組成物。   
[２６]  治療方法または医療での使用のための、先行するのいずれかに記載の単一可変ドメイン(dAb)、または２５に記載の医薬組成物。   
[２７]  副作用の予防方法での使用のための、先行するのいずれかに記載の単一免疫グロブリン可変ドメイン、または２５に記載の医薬組成物。   
[２８]  XがYによって置換され、ここでYは、親和性タグ、mycタグ、FLAGタグまたはhisタグなどのタグ、PEG基などの化学修飾、または抗体のFc部分などのタンパク質からなる群から選択されることを特徴とする、副作用の予防方法での使用のための、６で定義される単一免疫グロブリン可変ドメイン。   
[２９]  該dAbがその標的のアンタゴニストである、先行するのいずれかに記載の単一免疫グロブリン可変ドメイン、または２５に記載の医薬組成物。   
[３０]  dAbの標的が受容体である、１〜２４、または２６〜２９に記載の単一免疫グロブリン可変ドメイン、または２５に記載の医薬組成物。   
[３１]  該受容体が活性化時に二量体化する、２９に記載の単一免疫グロブリン可変ドメインまたは医薬組成物。   
[３２]  該標的が重合体標的である、１〜２４、または２６〜３０に記載の単一免疫グロブリン可変ドメイン、または２５に記載の医薬組成物。   
[３３]  ADA結合を低下させるように改変された、先行するのいずれかに記載の単一免疫グロブリン可変ドメイン(dAb)であって、該dAbが、(i) ここで記載したADAに対する結合を低下させるいかなる改変も含まないことを除いて該改変されたdAbと同一であるdAbアミノ酸配列の親和性の少なくとも50%の親和性で標的に結合する能力を維持し、および/または(ii) ADAに対する結合を低下させるいかなる改変も含まないことを除いて該改変されたdAbと同一であるdAbアミノ酸配列のレベルの少なくとも10%のレベルで発現される、単一免疫グロブリン可変ドメイン(dAb)。   
[３４]  医療での使用のための、先行するのいずれかに記載の単一免疫グロブリン可変ドメイン。   
[３５]  炎症性疾患もしくは障害、または呼吸器疾患もしくは障害または肺疾患もしくは障害から選択される少なくとも1つの疾患または障害または症状の治療または予防に使用するための、１８または１９に記載の単一免疫グロブリン可変ドメイン(dAb)、または１８または１９に記載の(dAb)を含む医薬組成物。   
[３６]  dAbが、医療で使用するための、C末端に単一アラニンの伸長を有するDOM1h-131-206 dAb (図8a: 配列番号１６に示されるアミノ酸配列を有する)である、１８に記載の単一免疫グロブリン可変ドメイン(dAb)。   
[３７]  dAbが、C末端に単一アラニンの伸長を有するDOM1h-131-206 dAb (図8a: 配列番号１６に示されるアミノ酸配列を有する)であり、かつ関節炎、乾癬、多発性硬化症、炎症性腸疾患(例えば)クローン病および潰瘍性大腸炎; または例えば、喘息、慢性閉塞性肺疾患、慢性気管支炎、慢性閉塞性気管支炎および肺気腫、肺炎症、慢性閉塞性肺疾患、喘息、肺炎、過敏性間質性肺炎、好酸球増加を伴う肺浸潤、環境性肺疾患、肺炎、気管支拡張症、嚢胞性線維症、間質性肺疾患、原発性肺高血圧症、肺血栓塞栓症、胸膜の障害、縦隔の障害、横隔膜の障害、低換気、過換気、睡眠時無呼吸、急性呼吸困難症候群、中皮腫、肉腫、移植片拒絶、移植片対宿主病、肺癌、アレルギー性鼻炎、アレルギー、石綿沈着症、アスペルギルス腫、アスペルギルス症、気管支拡張症、慢性気管支炎、肺気腫、エオシン好性肺炎、特発性肺線維症、侵襲性肺炎球菌疾患、インフルエンザ、非結核性マイコバクテリア、胸水、塵肺、ニューモシスチス症(pneumocytosis)、肺炎、肺放線菌症、肺胞タンパク症、肺炭疽、肺水腫、肺動脈塞栓、肺の炎症、肺組織球症X、肺高血圧症、肺ノカルジア症、肺結核、肺静脈閉塞性疾患、リウマチ様肺疾患、サルコイドーシス、およびウェゲナー肉芽腫症、および急性肺損傷(ALI)および急性呼吸困難症候群(ARDS)およびそれらの合併症から例えば選択される、呼吸器または肺の疾患または障害、から選択される少なくとも1つの疾患または障害または症状を治療または予防するための使用のための、３６に記載の単一免疫グロブリン可変ドメイン(dAb)。   
[３８]  使用が、急性肺損傷(ALI)または急性呼吸困難症候群(ARDS)を治療または予防するための使用である、３７に記載の使用のための単一免疫グロブリン可変ドメイン(dAb) (図8a: 配列番号１６に示されるアミノ酸配列を有する)。   
[３９]  急性肺損傷(ALI)または急性呼吸困難症候群(ARDS)を治療または予防するための医薬の製造における、１８の単一免疫グロブリン可変ドメイン(dAb)の使用であって、dAbが、C末端に単一アラニンの伸長を有するDOM1h-131-206 dAb (図8a: 配列番号１６に示されるアミノ酸配列を有する)である、使用。   
[４０]  炎症性疾患もしくは障害、または呼吸器もしくは肺の疾患もしくは障害から選択される少なくとも1つの疾患または障害または症状の治療または予防方法であって、１８〜１９のいずれか一項に記載のdAb、または１８または１９に記載の(dAb)を含む医薬組成物の治療上または予防上有効量を、製薬的または生理学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤と組み合わせて被験体に投与することによる方法。   
[４１]  dAbが、C末端に単一アラニンの伸長を有するDOM1h-131-206 dAb (図8a: 配列番号１６に示されるアミノ酸配列を有する)である、４０に記載の方法。   
[４２]  該少なくとも1つの疾患または障害または症状が３７で特定される疾患または障害または症状のいずれか1つである、４０〜４１のいずれかの方法。   
[４３]  該疾患が急性肺損傷(ALI)または急性呼吸困難症候群(ARDS)である、４１に記載の方法。   
[４４]  該組成物またはdAbを、皮下、静脈内または筋肉内注射によって被験体に送達する、４０〜４３のいずれか一項に記載の方法。   
[４５]  該組成物またはdAbを、非経口、経口、経直腸、経粘膜、眼球、肺または胃腸管送達によって被験体に送達する、４０〜４４のいずれか一項に記載の方法。   
[４６]  １〜３３のいずれか一項に記載の組成物またはdAbを含む、注射用、経口、吸入用または噴霧用製剤。   
[４７]  １〜３３のいずれか一項に記載の組成物を含む、持続放出製剤。   
[４８]  １〜３３のいずれか一項に記載の組成物を含む、凍結乾燥製剤。   
[４９]  １〜３３のいずれか一項に記載の組成物を含む、送達デバイス。   
[５０]  噴霧器または吸入器である、１〜３３のいずれか一項に記載の組成物を含む送達デバイス。   
[５１]  １〜２４のいずれかに記載のdAbをコードする、単離された核酸または組換え核酸。   
[５２]  １３〜１４または１８のいずれかに記載のdAbをコードする、単離された核酸または組換え核酸。   
[５３]  図9b (配列番号２２)に示される核酸配列を有し、かつ、単一アラニンの伸長を有するDOM1h-131-206 dAbをコードする、５２に記載の単離された組換え核酸。   
[５４]  ５１〜５３のいずれか一項の核酸を含むベクター。   
[５５]  pave011であり、かつ配列番号２２の核酸を発現する、５４に記載のベクター。   
[５６]  ５１〜５３のいずれかの核酸、または５４〜５５のいずれかのベクターを含む宿主細胞。   
[５７]  E.coliであり、かつ５５のベクターを発現する、５６に記載の宿主細胞。   
[５８]  １〜２４のいずれかに記載のdAbを含むポリペプチドの製造方法であって、該核酸またはベクターの発現に好適な条件下で５６〜５７のいずれかの宿主細胞を維持し、それによりポリペプチドを製造するステップを含む方法。   
[５９]  該ポリペプチドが、C末端に単一アラニンの伸長を有するDOM1h-131-206として特定されるアミノ酸配列(配列番号１６)を有するdAbであり、かつ、配列番号２２の核酸を発現するpave011ベクターの発現に好適な条件下でE.coli宿主細胞を維持するステップを含む、５８に記載の方法。
【外国語明細書】
2020054374000001.pdf