(57)【要約】      （修正有）【課題】シーケンサーを用いた配列解析の精度を向上した、配列決定方法の提供。【解決手段】標的核酸のヌクレオチド配列を決定する方法であって、標的特異的プライマー部位を含む特定の配列を有するタグ化プライマーを用いてＰＣＲを行うことにより標的核酸の標的領域にタグ付けしたヌクレオチドを調製し、ユニバーサルプライマーを用いて増幅することにより、アンプリコンのプールを調製し、各アンプリコンをシーケンシングする工程；前記各アンプリコンの配列情報の一部と、前記標的特異的プライマー部位の配列の少なくとも一部とを比較する工程；前記標的特異的プライマー部位の配列の少なくとも一部を含むか否かを決定する工程；及び前記標的特異的プライマー部位の配列の少なくとも一部を含むアンプリコンの配列情報を使って、前記標的領域の配列を決定する工程を含む前記方法。【選択図】図８
2020195377.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸のヌクレオチド配列を決定する方法であって、
アンプリコンのプールを調製する工程；
ここで、前記アンプリコンのプールは、タグ化プライマーを使ってＰＣＲを行うことにより標的核酸の標的領域にタグ部位を付してタグ付けされたヌクレオチドを調製し、ユニバーサルプライマーを使ってＰＣＲによりタグ付けされたヌクレオチドを増幅することにより調製され、
前記タグ化プライマーは、その５’側にタグ部位と、その３’側に標的特異的プライマー部位とを含み；前記タグ部位はその５’側にユニバーサルプライマー部位とその３’側にインデックス部位とを含み、前記インデックス部位の長さがＸヌクレオチド（ｎｔ）であり、
各アンプリコンの配列情報を取得するため前記アンプリコンのプールに含まれる各アンプリコンをシーケンシングする工程；
前記各アンプリコンの配列情報の一部と、前記標的特異的プライマー部位の配列の少なくとも一部とを比較する工程；
ここで、前記各アンプリコンの配列情報の一部は、前記配列情報の５’末端から数えてＸ＋１の位置から始まる配列であり、
前記各アンプリコンの配列情報の一部が、前記標的特異的プライマー部位の配列の少なくとも一部を含むか否かを決定する工程；及び
前記標的特異的プライマー部位の配列の少なくとも一部を含むアンプリコンの配列情報を使って、前記標的領域の配列を決定する工程
を含む前記方法。
【請求項２】
Ｘは４ｎｔ以上、３０ｎｔ以下である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記配列決定工程において、前記標的特異的プライマー部位の配列の少なくとも一部を含む配列情報は、エラーフリーアンプリコンまたはロングアンプリコンから取得され、
ここで、
前記エラーフリーアンプリコンは、その３’側にインデックス部位の相補配列と、前記インデックス部位の相補配列の５’側に標的領域の相補配列を含み、
前記ロングアンプリコンは、その３’側により長いインデックス部位の相補配列と、前記より長いインデックス部位の相補配列の５’側に標的領域の相補配列を含む、
請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記標的特異的プライマー部位のヌクレオチド数が、１０から５０である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記インデックス部位がランダム配列を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記インデックス部位が所定の配列を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記インデックス部位がｕｎｉｑｕｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ部位である、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記タグ部位が、前記ユニバーサルプライマー部位の５’側に、アダプター部位をさらに含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記配列決定工程において、前記標的特異的プライマー部位の配列の少なくとも一部を含まない配列情報を、配列を決定するために使用しない、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
標的核酸のヌクレオチド配列を決定する方法であって、
アンプリコンのプール内の各アンプリコンから取得した配列情報を使用して、標的領域の配列を決定する工程を含み、
ここで、
鋳型核酸は標的核酸を含み、ここで、前記アンプリコンはポリメラーゼとタグ化プライマーを使用することにより鋳型核酸から調製され；
前記タグ化プライマーは、その５’側にタグ部位を含み、その３’側に標的特異的プライマー部位を含み；前記タグ部位はインデックス部位を含み；
前記アンプリコンのプールは、エラーフリーアンプリコンと、第１のエラーアンプリコンと、第２のエラーアンプリコンとを含み；
前記エラーフリーアンプリコンに由来する配列情報は、その３’側にインデックス部位の相補配列と、前記インデックス部位の相補配列の５’側に標的領域の相補配列を含み；
前記第１のエラーアンプリコンに由来する取得された配列情報は、その３’側により短いインデックス部位の相補配列と、前記より短いインデックス部位の相補配列の５’側に標的領域の相補配列を含み；及び
前記第２のエラーアンプリコンに由来する配列情報は、その３’側により長いインデックス部位の相補配列と、前記より長いインデックス部位の相補配列の５’側に標的領域の相補配列を含み；
標的領域の配列は、前記第１のエラーアンプリコンから得られた配列情報以外の配列情報を使用して決定される、
前記方法。
【請求項１１】
前記決定工程の前に、前記各アンプリコンから配列情報を取得することをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記取得工程の前に、さらに前記アンプリコンを調製する工程を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１のエラーアンプリコン内のより短いインデックス部位に対する相補配列は、全長のインデックス部位に対する相補配列と比較して少なくとも１つのヌクレオチド欠失を有する配列を含み、
前記第２のエラーアンプリコン内のより長いインデックス部位に対する相補的配列は、全長インデックス部位に対する相補的配列と比較して少なくとも１つのヌクレオチドの付加を有する配列を含む、
請求項１０から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記インデックス部位配列のヌクレオチド数が整数Ｘである時、
前記決定工程が、前記アンプリコンから得られた配列情報において５’末端からＸヌクレオチド（ｎｔ）を除いた配列情報が前記標的特異的プライマー部位の所定の領域配列を含まない場合、前記アンプリコンを前記第１のエラーアンプリコンと決定する、
請求項１０から１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記インデックス部位がランダム配列を含む、請求項１０から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記インデックス部位がｕｎｉｑｕｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ部位である、請求項１０から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記標的領域の配列が、第１のエラーアンプリコンから取得された配列情報を使用せずに、前記エラーフリーアンプリコンから取得された配列情報と、前記第２のエラーアンプリコンから取得された配列情報を使って決定される、請求項１０から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法を実行する、標的核酸をシーケンシングするための装置。
【請求項１９】
コンピュータに実行させたときに、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法を実行するための指令を備える、コンピュータプログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書には、核酸配列の解析方法、核酸配列の解析装置、及び核酸配列の解析プログラムが開示される。
【背景技術】
【０００２】
特許文献１（ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．２０１５−０３６１４９２  Ａ１）には、ｕｎｉｑｕｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ  （ＵＩＤ）配列を使用してＤＮＡ小断片に存在する変異をシーケンサーで同定するＳａｆｅ−ＳｅｑＳが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】米国特許出願公開第2015／0361492号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ＤＮＡ断片の核酸配列を次世代シーケンサー（Ｎｅｘｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ：ＮＧＳ）で解析する場合には、はじめにＤＮＡ断片をライブラリ化する。次に、このライブラリから、解析の標的領域を含む前記ポリヌクレオチドを得る。前記ポリヌクレオチドには、シーケンシングプライマーを結合させるためのユニバーサルプライマー配列や検体を識別するためのインデックス配列等を含むタグ配列が付加されることが一般的である。
【０００５】
標的配列へのタグ配列の付加は、タグを含むプライマーを用いたＰＣＲやタグのライゲーションにより行うことができる。
【０００６】
シーケンシングによってタグを含む配列情報が取得されるが、タグ部分の配列情報にエラーが含まれている場合がある。例えば、タグ部分に１または複数のヌクレオチドが挿入されていたり、１または複数のヌクレオチドが欠失していたりする。従来は、このようなエラーを含むリードの配列情報は解析対象から除外される。
【０００７】
本発明は、シーケンサーを用いた配列解析の精度を向上することを一課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
タグ部分にエラーを含む配列情報は、上記の通り、従来では解析から除外されていたが、そのような配列であっても標的配列は正確に解析されている場合がある。本発明では、タグ部分にエラーを含む配列情報をも解析対象とすることにより、シーケンシングの被覆率（「デプス」、「カバレッジ」、「デプスオブカバレッジ」などともいう）を向上させ、配列解析の精度を向上させる。
【０００９】
本発明のある実施形態は、標的核酸のヌクレオチド配列を決定する方法に関する。前記方法は、アンプリコンのプールを調製する工程；各アンプリコンの配列情報を取得するためアンプリコンのプールに含まれる各アンプリコンをシーケンシングする工程；前記各アンプリコンの配列情報の一部と、前記標的特異的プライマー部位の配列の少なくとも一部とを比較する工程；前記各アンプリコンの配列情報の一部が、前記標的特異的プライマー部位の配列の少なくとも一部を含むか否かを決定する工程；及び前記標的特異的プライマー部位の配列の少なくとも一部を含むアンプリコンの配列情報を使って、前記標的領域の配列を決定する工程を含む。ここで、前記アンプリコンのプールは、タグ化プライマーを使ってＰＣＲを行うことにより標的核酸の標的領域にタグ部位を付してタグ付けされたヌクレオチドを調製し、ユニバーサルプライマーを使ってＰＣＲによりタグ付けされたヌクレオチドを増幅することにより調製される。前記タグ化プライマーは、その５’側にタグ部位と、その３’側に標的特異的プライマー部位とを含み；前記タグ部位はその５’側にユニバーサルプライマー部位とその３’側にインデックス部位とを含み、前記インデックス部位の長さがＸヌクレオチド（ｎｔ）である。前記各アンプリコンの配列情報の一部は、前記配列情報の５’末端から数えてＸ＋１の位置から始まる配列である。
【００１０】
本発明のある実施形態は、標的核酸のヌクレオチド配列を決定する方法に関する。前記方法は、アンプリコンのプール内の各アンプリコンから取得した配列情報を使用して、標的領域の配列を決定することを含む。ここで、鋳型核酸は標的核酸を含む前記アンプリコンはポリメラーゼとタグ化プライマーを使用することにより鋳型核酸から調製される。前記タグ化プライマーは、その５’側にタグ部位を含み、その３’側に標的特異的プライマー部位を含む。前記タグ部位はインデックス部位を含む。前記アンプリコンのプールは、エラーフリーアンプリコンと、第１のエラーアンプリコンと、第２のエラーアンプリコンとを含む。前記エラーフリーアンプリコンに由来する配列情報は、その３’側にインデックス部位の相補配列と、前記インデックス部位の相補配列の５’側に標的領域の相補配列を含む。前記第１のエラーアンプリコンに由来する配列情報は、その３’側により短いインデックス部位の相補配列と、前記より短いインデックス部位の相補配列の５’側に標的領域の相補配列を含む。前記第２のエラーアンプリコンに由来する配列情報は、その３’側により長いインデックス部位の相補配列と、前記より長いインデックス部位の相補配列の５’側に標的領域の相補配列を含む。前記標的領域の配列は、前記第１のエラーアンプリコンから得られた配列情報以外の配列情報を使用して決定される。
【００１１】
本発明のある実施形態は、上記２つの方法を実行する、標的核酸をシーケンシングするための装置（１０，１００）に関する。
【００１２】
本発明のある実施形態は、コンピュータに実行させたときに、上記２つの方法を実行するための指令を備える、コンピュータプログラムに関する。
上記２つの方法、装置、及びコンピュータプログラムによれは、シーケンシングの被覆率を向上させることができる。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によると、配列解析の精度を向上することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】アンプリコンの概要を示す図である。
【図２】標的核酸の例を示す図である。
【図３】タグ付けされた娘分子を調製するためのタグ化プライマーの構成の例を示す図である。
【図４】標的核酸とタグ化プライマー及びリバースプライマーとのアニーリングの例を示す図である。
【図５】伸長反応によって生成されるアンプリコンの構造の一例を示す図である。
【図６】タグ化プライマー及びリバースプライマーの別の例を示す図である。
【図７】プライマーサーチの概要を示す図である。
【図８】Ｐｌａｓｍａ−Ｓａｆｅ−Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ技術の特徴を示す。
【図９】第１の標的核酸配列決定装置の構成を示す図である。（ａ）は標的核酸配列決定装置とシーケンシング装置が独立した構成となっている例である。（ｂ）は標的核酸配列決定装置とシーケンシング装置が一体化した構成となっている例である。
【図１０】第１の標的核酸配列決定装置のハードウェアの構成の概略を示す図である。
【図１１】第１の標的核酸配列決定装置の処理の一例を示すフローチャートである。
【図１２】第１の標的核酸配列決定装置における使用する配列情報の選別処理の一例を示すフローチャートである。
【図１３】サーチ配列データベースの例を示す図である。
【図１４】シーケンシング装置の処理の一例を示すフローチャートである。
【図１５】第２の標的核酸配列決定装置の構成を示す図である。（ａ）は標的核酸配列決定装置とシーケンシング装置が独立した構成となっている例である。（ｂ）は標的核酸配列決定装置とシーケンシング装置が一体化した構成となっている例である。
【図１６】第２の標的核酸配列決定装置のハードウェアの構成の概略を示す図である。
【図１７】第２の標的核酸配列決定装置における使用する配列情報の選別処理の一例を示すフローチャートである。
【図１８】シーケンシング装置の処理の一例を示すフローチャートである。
【図１９】標的領域の配列の決定方法を示すフローチャートである。
【図２０】アキュレート処理を示すフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本明細書及び図面において用いられる略語は以下の意味を有する。
TR:標的領域
c-TR：標的領域の相補配列
TS: タグ部位
u-PS1: 第１のユニバーサルプライマー部位
i-S: インデックス部位
t-PS1: 第１の標的特異的プライマー部位
u-PS2: 第２のユニバーサルプライマー部位
t-PS2: 第２の標的特異的プライマー部位
AS1: 第１のアダプター部位
AS2: 第２のアダプター部位
【００１６】
［１．標的核酸配列の決定方法］
標的核酸配列の決定方法は、標的核酸（ｔａｒｇｅｔ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）の核酸配列を決定する。標的核酸配列の決定方法は、タグ配列を使ったシーケンシングに適用され得る。
【００１７】
標的核酸配列の決定方法は、標的領域を含むポリヌクレオチドを鋳型核酸としてアンプリコンとアンプリコン相補鎖とを含むタグ付けされたアンプリコンのライブラリ（以下、単に「アンプリコンのプール」ともいう）を調製する工程Ａと、アンプリコンをシーケンシングする工程Ｂと、標的核酸の配列を決定する工程Ｃとを少なくとも含む。
【００１８】
標的核酸配列の決定方法は、さらに、標的核酸の配列情報を出力する工程を含んでもよい。
【００１９】
標的核酸配列の決定方法は、さらに、標的核酸に複数の標的領域が含まれる場合には、複数の標的領域すべてについて配列を決定してもよい。
【００２０】
以下、各工程について詳細に説明する。
【００２１】
［１−１．工程Ａ：アンプリコンのプールの調製］
アンプリコンのプールには、図１に示すように、以下のアンプリコンを含み得る：
タグ部位の全配列を有するアンプリコン（ｅｒｒｏｒ−ｆｒｅｅ  ａｍｐｌｉｃｏｎ）；
タグ部位の配列が本来有するべき長さよりも短いタグ部位配列を有するアンプリコン（ｓｈｏｒｔ  ａｍｐｌｉｃｏｎ）；及び
タグ部位の配列が本来有するべき長さよりも長いタグ部位配列を有するアンプリコン（ｌｏｎｇ  ａｍｐｌｉｃｏｎ）。
【００２２】
配列の長さは、ヌクレオチド数を意味し、単位「ｎｔ」で表される。
【００２３】
アンプリコンのプールは、タグ化プライマーを用いて調製される。タグ化プライマーは所定の長さに設定されるため、同一のプライマーセットで調製されたアンプリコンは理想的には全てｅｒｒｏｒ−ｆｒｅｅ  ａｍｐｌｉｃｏｎであり、全て同じ長さのヌクレオチド長を有する。しかしながら、タグ化プライマーは、測定系に添加される前に通常人工的に合成され、当該人工合成時に合成エラーが生じることがある。この合成エラーにより、所定の長さよりも短いタグ化プライマー及び所定の長さよりも長いタグ化プライマーが意図せず合成され、これらのエラーを含むタグ化プライマーもアンプリコン調製の反応系に添加され得る。このようなエラーを含むタグ化プライマーにより、ｓｈｏｒｔ  ａｍｐｌｉｃｏｎ及びｌｏｎｇ  ａｍｐｌｉｃｏｎが生じ得る。さらに、ポリメラーゼによる増幅反応時（アンプリコンのプール調製時）、増幅エラーが生じることもある。すなわち、増幅反応において１または複数のヌクレオチドの欠落、あるいは１または複数の不要なヌクレオチドの挿入が生じることがある。この増幅エラーによってｓｈｏｒｔ  ａｍｐｌｉｃｏｎ及びｌｏｎｇ  ａｍｐｌｉｃｏｎが生じ得る。
【００２４】
標的核酸は、解析対象となるＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、トランスポゾンＤＮＡ等に由来する）の全長、またはフラグメント、ＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ、リボゾーマルＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ  ＲＮＡ等に由来する）の全長、またはフラグメントを含む。標的核酸は、例えば遺伝子名で表されてもよく、Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ等に記載されているＧＥＮＥ  ＩＤ、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＮＯ．、Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ＩＤ、Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  Ｌｏｃｕｓ  Ｎｏ．、Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ＳＮＰ  （ｒｅｆＳＮＰ）  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｒｅｐｏｒｔ  ＩＤ等で示されてもよい。
【００２５】
アンプリコンのプールの調製は、好適には、ＰＣＲにより行われる。この調製は、（１）タグ化プライマーを用いたＰＣＲ（タグ化及び増幅工程）；または（２）タグ化プライマーを用いた第１のＰＣＲ（タグ化工程）及びユニバーサルプライマーを用いた第２のＰＣＲ（増幅工程）により行われ得る。
【００２６】
上記（１）の場合、プライマーとして少なくともタグ化プライマーが用いられる。タグ化プライマー及びユニバーサルプライマーの両方を標的核酸と混合してＰＣＲを行ってもよい。タグ化プライマーのみを用いる場合、ＰＣＲサイクル数は特に限定されないが、好ましくは１０〜５０サイクル、より好ましくは２０〜４０サイクルである。当該ＰＣＲの前に、タグ部位を含まないプライマーを用いてプレ増幅を行ってもよい。タグ部位を含まないプライマーは、標的領域に特異的なプライマーであってもよいし、ランダムプライマーであってもよい。
【００２７】
上記（２）の場合は少なくとも２度のＰＣＲ反応を行う。第１のＰＣＲにより、標的領域にタグが付与されたＤＮＡを生成することができる。第１のＰＣＲが完了した後、反応産物の少なくとも一部と、ユニバーサルプライマーと、ポリメラーゼとを混合して第２のＰＣＲを行うことができる。第１のＰＣＲのサイクル数及び第２のＰＣＲのサイクル数は特に限定されない。第１のＰＣＲサイクル数は好ましくは５〜２０サイクル、より好ましくは１０〜１５サイクルである。第２のＰＣＲサイクル数は好ましくは１０〜３０サイクル、より好ましくは１５〜２５サイクルである。第１のＰＣＲの前に、タグ部位を含まないプライマーを用いてプレ増幅を行ってもよい。タグ部位を含まないプライマーは、標的領域に特異的なプライマーであってもよいし、ランダムプライマーであってもよい。
【００２８】
以下、図２〜図６を用いて、タグ化プライマーを用いたアンプリコンのプールの調製等の一例について具体的に説明する。
【００２９】
図２に示すように、標的核酸は、配列解析の対象となる標的領域を含む。標的核酸には、複数の標的領域が含まれていてもよい。図２の例は、標的領域を含むポリヌクレオチドと、相補的なポリヌクレオチドからなる二本鎖ポリヌクレオチドである。
【００３０】
標的核酸は、解析対象のサンプルから抽出されたＤＮＡ、ＤＮＡライブラリ、解析対象のサンプルから抽出されたＲＮＡを逆転写して得られたｃＤＮＡ、これらを濃縮・精製したＤＮＡに含まれ得る。前記濃縮は、例えば、ＫＡＰＡ  Ｈｙｐｅｒ  Ｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（日本ジェネティクス株式会社）、ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔターゲットエンリッチメントシステム（アジレント・テクノロジーズ株式会社）等を使用することにより行うことができる。
【００３１】
図３は、タグ付けされた娘分子を調製するためのタグ化プライマー（ｔａｇｇｅｄ  ｐｒｉｍｅｒ）の構成の一例と、リバースプライマーの構成の一例を示す。タグ化プライマーは、５’側にタグ部位（ＴＳ）を含み、３’側に第１の標的特異的プライマー部位（ｔ−ＰＳ１）を含む。ｔ−ＰＳ１は、標的配列の５’側の配列の一部と同じ配列を有する。
【００３２】
タグ部位配列の長さは、特に制限されないが、２０〜１００ｎｔ、好ましくは３０〜５０ｎｔである。タグ部位は、インデックス部位を含む。タグ部位は、インデックス部位の５’側に第１のユニバーサルプライマー部位（ｕ−ＰＳ１）を含んでいてもよい。図２（ｂ）に示されるタグ化プライマーは、５’末端から順に、第１のユニバーサルプライマー部位、インデックス部位及び第１の標的特異的プライマー部位を含む例である。
【００３３】
リバースプライマーは、第２の標的特異的プライマー部位（ｔ−ＰＳ２）を含む。リバースプライマーは、ｔ−ＰＳ２の５’側に第２のユニバーサルプライマー部位（ｕ−ＰＳ２）等を含んでいてもよい。図３のリバースプライマーは、５’側から順に、ｕ−ＰＳ２及びｔ−ＰＳ２を含む例である。ｔ−ＰＳ２は、標的配列の３’側の配列の一部に相補的な配列を有する。
【００３４】
インデックス部位は、アンプリコンの由来を識別するための配列を含む。インデックス部位はタグ化プライマー内に挿入または付加することができる。リバースプライマー内にインデックス部位を挿入または付加してもよい。例えば、個体ごとに異なる配列のインデックス部位を付与することができる。この場合、個体Ａの標的配列から取得したアンプリコンと個体Ｂの標的配列から取得したアンプリコンとを混合して配列解析を行うことができる。検体ごとに異なる配列のインデックス部位を付与してもよい。この場合、検体Ａの標的配列から取得したアンプリコンと検体Ｂの標的配列から取得したアンプリコンとを混合して配列解析を行うことができる。いずれの場合においても、予め定められた配列のインデックスが用いられる。
【００３５】
試料に含まれる標的核酸の分子ごとに異なるインデックスを付与することもできる。この場合、アンプリコンの配列がどの分子に由来するかを識別することができる。この場合、インデックスの配列は好ましくはランダム配列であり、ＵＳ２０１５／０３６１４９２Ａ１に記載のｕｎｉｑｕｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ  （ＵＩＤ）であり得る。ＵＳ２０１５／０３６１４９２Ａ１は参照として本明細書に組み込まれる。
【００３６】
ユニバーサルプライマー部位は、シーケンシングに使用するユニバーサルプライマーと同じ配列を含む部位であり得る。ここで、「ユニバーサルプライマー」は、インデックス部位の配列及び標的核酸の配列にかかわらず、アンプリコンを増幅することのできるプライマーである。ユニバーサルプライマー部位の配列としては、公知の配列を用いることができ、例えば、Ｍ１３ファージ由来の配列を挙げることができる。インデックス部位は、各アンプリコンを識別するための配列を含む部位であり、好適には標的領域やユニバーサルプライマー部位には存在しない配列である。
【００３７】
ユニバーサルプライマー部位配列の長さは、特に制限されないが、５〜２０ｎｔ程度である。インデックス部位配列の長さは、特に制限されないが、４ｎｔ〜３０ｎｔ程度である。インデックス部位配列の長さは、例えば４ｎｔ、５ｎｔ、６ｎｔ、７ｎｔ、８ｎｔ、９ｎｔ、１０ｎｔ、１１ｎｔ、１２ｎｔ、１３ｎｔ、１４ｎｔ、１５ｎｔ、１６ｎｔ、１７ｎｔ、１８ｎｔ、１９ｎｔ、２０ｎｔ、２５ｎｔ、または３０ｎｔから構成される範囲で選択し得る。インデックス部位配列の長さについては、「Ｘ」で表す場合がある。Ｘは正の整数である。
【００３８】
ｅｒｒｏｒ−ｆｒｅｅ  ａｍｐｌｉｃｏｎのインデックス配列のヌクレオチド長がＸｎｔであるとき、ｓｈｏｒｔ  ａｍｐｌｉｃｏｎのインデックス配列のヌクレオチド長は（Ｘ−１）ｎｔ以下であり、ｌｏｎｇ  ａｍｐｌｉｃｏｎのインデックス配列のヌクレオチド長は（Ｘ＋１）ｎｔ以上である。ｓｈｏｒｔ  ａｍｐｌｉｃｏｎのインデックス配列は、（Ｘ−２５）ｎｔ以上、（Ｘ−１）ｎｔ以下であり得る。ｌｏｎｇ  ａｍｐｌｉｃｏｎのインデックス配列は、（Ｘ＋１）ｎｔ以上、（Ｘ＋４０）ｎｔ以下であり得る。
【００３９】
標的特異的プライマー部位配列の長さは、鋳型核酸とアニーリングできる限り制限されない。例えば、５〜５０ｎｔ、好ましくは１０〜３０ｎｔ程度である。標的特異的プライマー部位配列の長さについては、「ｍ」で表す場合がある。ｍは正の整数である。標的特異的プライマー部位配列は、標的核酸にハイブリダイズし、プライマーとして機能する限り、標的配列に完全に相補的である必要はない。例えば、１ｎｔ、２ｎｔ、または３ｎｔ程度、標的配列と相補的でなくともよい。
【００４０】
図４は、標的核酸とタグ化プライマー及びリバースプライマーとのアニーリングの例を示す図である。フォワードプライマーとして機能するタグ化プライマーは、ｃ−ＴＲにハイブリダイズし、リバースプライマーはＴＲにハイブリダイズする。アニーリングした後は、公知の方法にしたがって、ＤＮＡポリメラーゼを使って伸長反応を行うことができる。
【００４１】
伸長反応によって生成されるアンプリコンの構造の一例を図５に示す。娘分子を、例えばＰＣＲ法で増幅することにより、アンプリコンのプールを調製する。アンプリコンは、相補鎖と結合した二本鎖状態であることが一般的である。
【００４２】
この例では、アンプリコンは図５に示される下側のストランドである。アンプリコンは、３’側からｃ−ｕ−ＰＳ１、ｃ−ｉ−Ｓ、ｃ−ＴＲ及びｕ−ＰＳ２を含む。ｃ−ｔ−ＰＳ１及びｔ−ＰＳ２はｃ−ＴＲ内に位置する。アンプリコン相補鎖は、５’側からｕ−ＰＳ１、ｉ−Ｓ、ＴＲ、およびｃ−ｕ−ＰＳ２を含む。ｔ−ＰＳ１及びｃ−ｔ−ＰＳ２はＴＲ内に位置する。
【００４３】
上で述べた通り、タグ化プライマーの合成エラーやＰＣＲ増幅エラー等により、アンプリコンのプールは、ｅｒｒｏｒ−ｆｒｅｅ  ａｍｐｌｉｃｏｎだけでなく、所定の長さよりも長いｃ−ＴＳを含むｌｏｎｇ  ａｍｐｌｉｃｏｎ及び所定の長さよりも短いｃ−ＴＳを含むｓｈｏｒｔ  ａｍｐｌｉｃｏｎを含み得る。当該エラーがｕ−ＰＳ１に存在する場合、ユニバーサルプライマーによる増幅が阻害され、非効率的となるため、長いｕ−ＰＳ１または短いｕ−ＰＳ１を含むアンプリコンは生じにくい。一方、当該エラーがｉ−Ｓに存在する場合、ユニバーサルプライマーによる増幅が阻害されない。よって、アンプリコンのプールに含まれるｓｈｏｒｔ  ａｍｐｌｉｃｏｎは主に短いｃ−ｉ−Ｓを有するアンプリコンであり、ｌｏｎｇ  ａｍｐｌｉｃｏｎは主に長いｃ−ｉ−Ｓを有するアンプリコンである。
【００４４】
タグ化プライマー及びリバースプライマーの別の例を図６に示す。このタグ化プライマーは、５’末端側に第１のアダプター部位（ＡＳ１）を含む。アンプリコンを固相に固定するために用いられ得る。リバースプライマーは、５’側に第２のアダプター部位（ＡＳ２）を含む。これらのアダプター部位は、固相（フローセル、ビーズなど）上でアンプリコンのシーケンシングを行う場合に、用いられる。例えば、固相上にアダプター部位に相補的な配列を予め固定することができる。アダプター部位を含むプライマーを用いて調製されたアンプリコンはその両端にアダプター部位を有するため、固相上にアンプリコンを固定することができる。アダプター部位を含むプライマーを用いたアンプリコン合成は、アダプター部位が末端に付加されていることを除き、図２から図５と同様である。
【００４５】
［１−２．工程Ｂ：シーケンシング］
工程Ｂにおいて、アンプリコンをシーケンシングする。このシーケンシングにより標的領域の配列情報（ｒｅａｄ）が取得される。配列情報は、シーケンサーにおいて各ヌクレオチドを示す情報として検出した蛍光シグナル、またはイオン等をＡ、Ｇ、Ｔ、Ｃそれぞれのヌクレオチド情報に変換し、検出した順番（昇順）に並べた情報である。通常、配列情報は５’側から取得される。シーケンサーは、アンプリコンから配列情報を取得できる限り制限されず、公知の装置を使用することができる。シーケンサーは例えば次世代シーケンサーが好ましい。次世代シーケンサーとしては、例えば、イルミナ社（サンディエゴ、ＣＡ）のＭｉＳｅｑ９（登録商標）、ＨｉＳｅｑ（登録商標）、ＮｅｘｔＳｅｑ（登録商標）、ＭｉＳｅｑ（登録商標）；サーモ・フィッシャー社（ウォルサム、ＭＡ）のＩｏｎ  Ｐｒｏｔｏｎ（登録商標）、Ｉｏｎ  ＰＧＭ（登録商標）；ロシュ社（バーゼル、スイス）のＧＳ  ＦＬＸ  ＋（登録商標）、ＧＳ  Ｊｕｎｉｏｒ（登録商標）等が挙げられる。
【００４６】
例えば、イルミナ社のシーケンサーは、Ｂｒｉｄｇｅ  ＰＣＲ法とＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓという手法との組み合わせにより、フローセル上で膨大な数の標的領域のポリヌクレオチドを増幅させ、その増幅産物のシーケンシングを行うことができる。
【００４７】
シーケンシングプライマーとしてｃ−ｕ−ＰＳ１に結合するユニバーサルプライマーが用いられ得る。これによると、ｉ−Ｓ及びＴＲを含む配列の情報を取得することができる。また、ｃ−ｕ−ＰＳ２に結合するユニバーサルプライマーを用いてｃ−ＴＲ及びｃ−ｉ−Ｓを含む配列の情報を取得することもできる。理想的には、タグ化プライマーが合成エラーを含まず、ＰＣＲの増幅エラーが生じず、シーケンシングエラーが生じないため、ｅｒｒｏｒ−ｆｒｅｅ  ａｍｐｌｉｃｏｎのｉ−Ｓ及びＴＲの配列情報を取得することができる。合成エラー等を含むタグ化プライマーが用いられた場合は、所定の長さＸよりも短いｉ−ＳとＴＲとを含むアンプリコン（Ｓｈｏｒｔ  ａｍｐｌｉｃｏｎ）の配列情報、及び所定の長さＸよりも長いｉ−ＳとＴＲとを含むアンプリコン（Ｌｏｎｇ  ａｍｐｌｉｃｏｎ）の配列情報が取得される。
【００４８】
［１−３．工程Ｃ：標的領域の配列の決定］
工程Ｃは、上記工程Ｂにおいて取得された配列情報のうち、ｅｒｒｏｒ−ｆｒｅｅ  ａｍｐｌｉｃｏｎから取得された配列情報と、ｌｏｎｇ  ａｍｐｌｉｃｏｎから取得された配列情報とを用いて標的領域の真の配列を決定する。真の配列の決定にｓｈｏｒｔ  ａｍｐｌｉｃｏｎは用いられない。言い換えると、以下に述べるアンプリコンを判別する工程は、標的領域の真の配列を決定するために用いない配列情報をオミットする工程ともいうことができる。
【００４９】
＜アンプリコンの判別＞
得られた配列情報がｅｒｒｏｒ−ｆｒｅｅ  ａｍｐｌｉｃｏｎ、ｌｏｎｇ  ａｍｐｌｉｃｏｎ、及びｓｈｏｒｔ  ａｍｐｌｉｃｏｎのいずれの配列を表すか、以下の方法により決定することができる。
【００５０】
シーケンシングにより得られた配列情報の５’側から数えてＸ＋１番目以降に、ｔ−ＰＳの配列またはｔ−ＰＳ１の５’末端側部分配列が含まれる場合は、ｅｒｒｏｒ−ｆｒｅｅ  ａｍｐｌｉｃｏｎまたはｌｏｎｇ  ａｍｐｌｉｃｏｎとなる。一方、得られた配列情報のＸ＋１番目以降の配列に、ｔ−ＰＳ１の配列の一部または全部が含まれない場合は、ｓｈｏｒｔ  ａｍｐｌｉｃｏｎとなる。したがって、好ましくは、まず得られた配列情報と、ｔ−ＰＳ１の配列を比較し、ｔ−ＰＳ１の配列の存否を検索する（「プライマーサーチ」ともいう）。次に、ｔ−ＰＳ１の配列が存在する配列情報のみを、真の配列の決定に用いる。得られた配列情報にｔ−ＰＳ１の配列が含まれない場合は、当該配列情報は真の配列の決定に用いない。ｔ−ＰＳ１の５’末端側部分配列の長さは特に限定されない。好ましくは、４ｎｔ以上、より好ましくは６ｎｔ以上である（図７の例では、ｔ−ＰＳ１の５’末端側部分配列は６ｎｔである）。
【００５１】
プライマーサーチについて、図７を例として説明する。図７において、配列番号１〜３は、それぞれｅｒｒｏｒ−ｆｒｅｅ  ａｍｐｌｉｃｏｎ、ｓｈｏｒｔ  ａｍｐｌｉｃｏｎ、ｌｏｎｇ  ａｍｐｌｉｃｏｎをそれぞれ示す。各アンプリコンは、ユニバーサルプライマー部位に対する相補配列部位（ｃ−ｕ−ＰＳ１：黒枠）、インデックス部位に対する相補配列部位（ｃ−ｉ−Ｓ：濃いグレー枠）、標的領域の相補配列（ｃ−ＴＲ）を含む。標的領域の相補配列の３’側は、標的特異的プライマー部位の相補配列（ｃ−ｔ−ＰＳ１：淡いグレー枠）である。ヌクレオチド番号１が、シーケンシングにおいて最初に検出されたヌクレオチドである。配列情報１〜３（配列番号４〜６）では、濃いグレー枠内の「ｎ」の繰り返し配列が、配列番号１〜３の「Ｎ」のリピートで示されるインデックス部位の配列情報の相補配列を意味する。淡いグレー枠内の「ＣＣＴＧＴＴＣＣＴＣＣＣＴＧＧ（配列番号７）」が、標的特異的プライマー部位の部分配列である。そして、四角枠で囲まれた「ＣＣＴＧＴＴ」が、所定領域の配列（サーチ配列）である。この例において、サーチ配列は、ｔ−ＰＳ１の５’末端側部分配列である。
【００５２】
図７において、配列情報（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）１〜３（配列番号４〜６）は、工程Ｂで取得された異なるアンプリコンに由来する配列情報である。配列番号４は配列番号１のアンプリコンに由来する配列情報であり、配列番号５は配列番号２のアンプリコンに由来する配列情報であり、配列番号６は配列番号３のアンプリコンに由来する配列情報である。配列番号４〜６の「ｎ」は、配列番号１〜３の「Ｎ」のリピートで示される配列の相補配列を意味する。シーケンスは、ｕ−ＰＳ１の配列を有するプライマーで行うため、配列番号４〜６では、ｃ−ｕ−ＰＳ１の相補配列は含まれない。理論上、ｉ−Ｓは、１４ｎｔであるため、各配列情報について、それぞれの配列情報の５’末端から１４番目（Ｘ＝１４）までのヌクレオチドを除き、さらに、１番目以降の配列情報にサーチ配列が存在しているか検出し、真の配列決定に各配列情報を使用するか否かを決定する。図７において、黒実線は、配列情報の５’末端から１４番目と１５番目のヌクレオチドの間に引かれており、実線より矢印方向がサーチ配列を検索する対象となる配列（各配列の１５番目以降のヌクレオチド）である。配列情報１及び３（配列番号４及び６）において、黒実線より矢印方向でサーチ配列「ＴＴＣＣＴＣ」のすべてが連続して検出されているため、サーチ配列の全配列が存在すると決定される。配列情報１及び３（配列番号４及び６）は、それぞれｅｒｒｏｒ−ｆｒｅｅ  ａｍｐｌｉｃｏｎ、またはｌｏｎｇ  ａｍｐｌｉｃｏｎに由来すると決定することができる。配列情報３（配列番号６）は、サーチ配列の一部が欠けているため、サーチ配列の全配列が存在しないと決定される。したがって、配列情報２（配列番号５）はｓｈｏｒｔ  ａｍｐｌｉｃｏｎに由来すると決定することができる。
【００５３】
ｓｈｏｒｔ  ａｍｐｌｉｃｏｎに由来する配列情報の１〜Ｘ番目の配列にはＴＲの５’末端の部分配列が含まれる。解析に際しては、ｓｈｏｒｔ  ａｍｐｌｉｃｏｎに由来する配列情報であっても５’末端側から１〜Ｘ番目の配列がインデックス配列と認識されるため、同一インデックスを共有するファミリー形成が不可となる。さらに、標的領域の配列はＸ＋１番目以降であると判断されるため、解析された標的領域の配列は、真の標的領域の配列に比べて５’末端側の一部が欠落する。このような配列を配列決定に用いると、標的領域の配列解析の精度が低下するおそれがある。一方で、ｌｏｎｇ  ａｍｐｌｉｃｏｎから解析された標的領域の配列は、真の配列に比べて欠落はない。ｌｏｎｇ  ａｍｐｌｉｃｏｎから解析された標的領域の配列を使用することによって、配列決定に用いられる配列情報の数が増加する。その結果、ｄｅｐｔｈ  ｏｆ  ｃｏｖｅｒａｇｅが向上し、解析結果の信頼性が向上すると考えられる。
【００５４】
プライマーサーチにより、次の工程で行う標的領域の真の配列の決定に使用できる配列情報が選別される。
【００５５】
＜標的領域の真の配列の決定＞
次に、ｅｒｒｏｒ−ｆｒｅｅ  ａｍｐｌｉｃｏｎから取得された配列情報と、ｌｏｎｇ  ａｍｐｌｉｃｏｎから取得された配列情報から、標的領域の真の配列（ａｃｃｕｒａｔｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を決定する。言い換えると、ｓｈｏｒｔ  ａｍｐｌｉｃｏｎから取得された配列情報以外の配列情報を用いて、標的領域の真の配列を決定する。
【００５６】
ＰＣＲやシーケンシングなどのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける操作で生じる塩基配列の変化（エラー）は、一般的にＰＣＲエラーやシーケンシングエラーと呼ばれ、鋳型となった標的核酸の配列には存在しない配列である。
【００５７】
本工程では、ｅｒｒｏｒ−ｆｒｅｅ  ａｍｐｌｉｃｏｎから取得された配列情報またはｌｏｎｇ  ａｍｐｌｉｃｏｎから取得された配列情報が、標的核酸の配列を反映しているか、すなわち標的領域の配列が真の配列であるか否かを決定する。
【００５８】
標的領域の配列が真の配列であるか否かは、例えば、ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．  ２０１５−０３６１４９２  Ａ１の技術により判別することができる。
【００５９】
具体的には、配列情報に含まれるインデックス配列により、上記１−１．で述べたように、各アンプリコンの由来を識別することができる。図８に例示するように、上述のＵＩＤをインデックス配列として使用する場合には、ＤＮＡ試料中に存在する複数コピーの標的核酸（この例では標的核酸に含まれる標的領域の種類は１つである。）の標的領域から標的核酸ごとに異なったＵＩＤ配列が付加された娘分子が調製される（図８：Ｓｔｅｐ  Ａ１）。次に、ＵＩＤ配列が付加された娘分子をユニバーサルプライマーを使ってＰＣＲで増幅することによって、アンプリコンのプールを調製する（図８：Ｓｔｅｐ  Ａ２）。このようにして調製されたアンプリコンのプールには、ＵＩＤ配列が付加された娘分子それぞれを鋳型として増幅されたアンプリコンが含まれる。図８に示される工程Ａは、上記１−１．で述べた工程Ａに対応する。
【００６０】
次に、各アンプリコンのシーケンシングを行う。図８に示される工程Ｂは、上記１−２．で述べた工程Ｂに対応する。
【００６１】
ＵＩＤ配列が付加された娘分子１分子から増幅されたアンプリコンに由来する配列情報は、すべて同じＵＩＤ配列を有する。同じＵＩＤ配列を有するアンプリコンのグループを「ファミリー」と称し、同じＵＩＤ配列を有する個々のアンプリコンを「メンバー」と称する。
【００６２】
次に、アンプリコンの長さについて＜アンプリコンの判別＞で述べた方法に従って、標的配列の真の配列の決定に使用する配列を選別する。図８に示す工程Ｃ１は、＜アンプリコンの判別＞に記載の工程に対応する。
【００６３】
次に、アンプリコンの判別の工程で選別された配列情報を用いて標的領域の配列が真の配列であるか否かの判定を行う。
本工程では、はじめにこの同一ファミリー内で配列情報の比較（アラインメント）を行う。このアラインメントによって、配列情報内の各ポジションにおいて所定値以上のコンセンサス率を示すヌクレオチドを標的領域のヌクレオチドと判定する。この判定を配列情報の全ポジションで行い、標的領域の全配列のａｃｃｕｒａｔｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅを決定する。このようにすることで、ＰＣＲエラー、シーケンシングエラー等が排除される。一般的に、ＰＣＲエラー、シーケンシングエラー等はファミリー内で０〜数％であり、ファミリー内でマジョリティとなりにくいためである。
【００６４】
所定値は、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％でありうる。好ましくは８０％、または９０％である。
【００６５】
図８の工程Ｃ２では、ｅｒｒｏｒ−ｆｒｅｅ  ａｍｐｌｉｃｏｎ及びｌｏｎｇ  ａｍｐｌｉｃｏｎのファミリーから得られた配列情報がａｃｃｕｒａｔｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ決定に用いられる。ｓｈｏｒｔ  ａｍｐｌｉｃｏｎのファミリーから取得された配列情報はａｃｃｕｒａｔｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅの決定に用いられない。
【００６６】
［１−４．変異検出方法］
標的核酸配列の決定方法は、上記の工程Ａ〜Ｃに加えて、変異検出工程Ｄを含んでいてもよい。本明細書において、「変異」とは、生体内において野生型配列の特定の塩基が、別の塩基に置き換わることをいう。
【００６７】
工程Ｄにおいては、参照配列と、工程Ｃで解析された各ファミリーの配列情報とが比較される。参照配列は、標的領域の野生型の配列が用いられ得る。一部のファミリーの配列に参照配列と異なるヌクレオチドが存在する場合、この配列はサンプル中の変異型ＤＮＡに由来すると判断され得る。この場合、サンプルＤＮＡは変異を含むと判定することができる。参照配列と異なるヌクレオチドが存在しない場合、サンプルＤＮＡは変異を含まないと判定することができる。
【００６８】
参照配列としては、公開配列情報データベースに登録されている配列を用いることができる。公開配列情報データベースとしては、ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ（ウェブページ、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｒｅｆｓｅｑ／）、ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋ（ウェブページ、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｂａｎｋ／）、ＵＣＳＣ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒなどが挙げられる。また、参照配列として、公開されている既知の変異情報データベースに登録されている配列を用いてもよい。公開既知変異情報データベースとしては、ＣＯＳＭＩＣデータベース（ウェブページ、ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｇｅｎｅｔｉｃｓ／ＣＧＰ／ｃｏｓｍｉｃ／）、ＣｌｉｎＶａｒデータベース（ウェブページ、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｌｉｎｖａｒ／）、ｄｂＳＮＰ（ウェブページ、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＳＮＰ／）、ＨａｐＭａｐ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒ  ｒｅｌｅａｓｅ  ＃２８、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｖａｒｉａｔｉｏｎ  Ｂｒｏｗｓｅｒ（ウェブページ、ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｍｅｄ．ｋｙｏｔｏ−ｕ．ａｃ．ｊｐ／ＳｎｐＤＢ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）及び１０００  Ｇｅｎｏｍｅｓ（ウェブページ、ｗｗｗ．１０００ｇｅｎｏｍｅｓ．ｏｒｇ／）が挙げられる。
【００６９】
さらに、配列解析の結果を出力してもよい。出力方法は特に限定されず、例えば、解析結果をシーケンシング装置のモニタに表示してもよいし、他の端末へ送信してもよいし、紙にプリントアウトしてもよい。変異の検出結果を出力する場合は、変異の有無を出力してもよい。変異がある場合は、その変異についての解析結果の説明（変異の種類、変異の箇所など）を付してもよい。
【００７０】
［２．標的核酸配列決定装置］
［２−１．第１の標的核酸配列決定装置］
［２−１−１．ハードウェアの構成］
標的核酸配列決定装置１０は、少なくとも処理部１０１と記憶部を備える。記憶部は、主記憶部１０２及び／または補助記憶部１０４から構成される。標的核酸配列決定装置１０は、特許請求の範囲または上記１に記載の方法を実現するための装置であってもよい。標的核酸配列決定装置１０及び標的核酸配列決定装置１０の動作に係る説明において、上記１で説明されている用語と共通する用語については、上記１の説明をここに援用する。
処理部１０１は、標的領域の配列を決定する。
【００７１】
図９及び図１０に、標的核酸配列決定装置１０の構成を示す。標的核酸配列決定装置１０は、入力部１１１と、出力部１１２と、記憶媒体１１３とに接続されていてもよい。また、標的核酸配列決定装置１０は、シーケンシングを行うシーケンシング装置３０と接続されていてもよい。標的核酸配列決定装置１０は、シーケンシング装置３０と直接またはネットワーク等を介して接続された、標的核酸配列決定システム５０を構成することもある（図９（ａ））。また、標的核酸配列決定装置１０とシーケンシング装置３０は、図９（ｂ）に示すように一体型であってもよい。
【００７２】
図１０に示すように、標的核酸配列決定装置１０において、処理部１０１と、主記憶部１０２と、ＲＯＭ（ｒｅａｄ  ｏｎｌｙ  ｍｅｍｏｒｙ）１０３と、補助記憶部１０４と、通信インタフェース（Ｉ／Ｆ）１０５と、入力インタフェース（Ｉ／Ｆ）１０６と、出力インタフェース（Ｉ／Ｆ）１０７と、メディアインターフェース（Ｉ／Ｆ）１０８は、バス１０９によって互いにデータ通信可能に接続されている。
【００７３】
処理部１０１は、ＣＰＵ、ＭＰＵまたはＧＰＵ等から構成される。処理部１０１が、補助記憶部１０４またはＲＯＭ１０３に記憶されているコンピュータプログラムを実行し、取得されるデータの処理を行うことにより、標的核酸配列決定装置１０が機能する。
【００７４】
ＲＯＭ１０３は、マスクＲＯＭ、ＰＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭなどによって構成され、処理部１０１により実行されるコンピュータプログラム及びこれに用いるデータが記録されている。ＲＯＭ１０３は、標的核酸配列決定装置１０の起動時に、処理部１０１によって実行されるブートプログラムや標的核酸配列決定装置１０のハードウェアの動作に関連するプログラムや設定を記憶する。
【００７５】
主記憶部１０２は、ＳＲＡＭまたはＤＲＡＭなどのＲＡＭ（Ｒａｎｄｏｍ  ａｃｃｅｓｓ  ｍｅｍｏｒｙ）によって構成される。主記憶部１０２は、ＲＯＭ１０３及び補助記憶部１０４に記録されているコンピュータプログラムの読み出しに用いられる。また、主記憶部１０２は、処理部１０１がこれらのコンピュータプログラムを実行するときの作業領域として利用される。
【００７６】
補助記憶部１０４は、ハードディスク、フラッシュメモリ等の半導体メモリ素子、光ディスク等によって構成される。補助記憶部１０４には、オペレーティングシステム及びアプリケーションプログラムなどの、処理部１０１に実行させるための種々のコンピュータプログラム及びコンピュータプログラムの実行に用いる各種設定データが記憶されている。補助記憶部１０４は、タグ化プライマー及びタグ化プライマーを構成する各部位の配列、タグ化プライマー及びタグ化プライマーを構成する各部位の配列の長さ、サーチ配列、及びサーチ配列の基準位置、所定領域の配列、コンセンサス率の所定値等を記憶する。補助記憶部１０４は、シーケンシング装置３０から取得された配列情報を記憶してもよい。補助記憶部１０４は、ネットワークを介して取得された参照配列等を記憶してもよい。さらに、補助記憶部１０４は、ヌクレオチド配列のプライマーサーチを行うためのコンピュータプログラムを記憶してもよい。
【００７７】
通信Ｉ／Ｆ１０５は、ＵＳＢ、ＩＥＥＥ１３９４、ＲＳ−２３２Ｃなどのシリアルインタフェース、ＳＣＳＩ、ＩＤＥ、ＩＥＥＥ１２８４などのパラレルインタフェース、およびＤ／Ａ変換器、Ａ／Ｄ変換器などからなるアナログインタフェース、ネットワークインタフェースコントローラ（Ｎｅｔｗｏｒｋ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ：ＮＩＣ）等から構成される。通信Ｉ／Ｆ１０５は、処理部１０１の制御下で、シーケンシング装置３０または他の外部機器からのデータを受信し、必要に応じて標的核酸配列決定装置１０が保存または生成する情報を、シーケンシング装置３０または外部に送信または表示する。通信Ｉ／Ｆ１０５は、ネットワークを介してシーケンシング装置３０または他の外部機器（図示せず、例えば他のコンピュータ、またはクラウドシステム）と通信を行ってもよい。
【００７８】
入力Ｉ／Ｆ１０６は、例えばＵＳＢ、ＩＥＥＥ１３９４、ＲＳ−２３２Ｃなどのシリアルインタフェース、ＳＣＳＩ、ＩＤＥ、ＩＥＥＥ１２８４などのパラレルインタフェース、およびＤ／Ａ変換器、Ａ／Ｄ変換器などからなるアナログインタフェースなどから構成される。入力Ｉ／Ｆ１０６は、入力部１１１から文字入力、クリック、音声入力等を受け付ける。受け付けた入力内容は、主記憶部１０２または補助記憶部１０４に記憶される。
【００７９】
入力部１１１は、タッチパネル、キーボード、マウス、ペンタブレット、マイク等から構成され、標的核酸配列決定装置１０に文字入力または音声入力を行う。入力部１１１は、標的核酸配列決定装置１０の外部から接続されても、標的核酸配列決定装置１０と一体となっていてもよい。
【００８０】
出力Ｉ／Ｆ１０７は、例えば入力Ｉ／Ｆ１０６と同様のインタフェースから構成される。出力Ｉ／Ｆ１０７は、処理部１０１が生成した情報を出力部１１２に出力する。出力Ｉ／Ｆ１０７は、処理部１０１が生成し、補助記憶部１０４に記憶した情報を、出力部１１２に出力する。
【００８１】
出力部１１２は、例えばディスプレイ、プリンタ等で構成され、シーケンシング装置３０から送信される測定結果及び標的核酸配列決定装置１０における各種操作ウインドウ、解析結果等を表示する。
【００８２】
メディアＩ／Ｆ１０８は、記憶媒体１１３に記憶された例えばアプリケーションソフト等を読み出す。読み出されたアプリケーションソフト等は、主記憶部１０２または補助記憶部１０４に記憶される。また、メディアＩ／Ｆ１０８は、処理部１０１が生成した情報を記憶媒体１１３に書き込む。メディアＩ／Ｆ１０８は、処理部１０１が生成し、補助記憶部１０４に記憶した情報を、記憶媒体１１３に書き込む。
【００８３】
記憶媒体１１３は、フレキシブルディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、またはＤＶＤ−ＲＯＭ等で構成される。記憶媒体１１３は、フレキシブルディスクドライブ、ＣＤ−ＲＯＭドライブ、またはＤＶＤ−ＲＯＭドライブ等によってメディアＩ／Ｆ１０８と接続される。記憶媒体１１３には、コンピュータがオペレーションを実行するためのアプリケーションプログラム等が格納されていてもよい。
【００８４】
処理部１０１は、標的核酸配列決定装置１０の制御に必要なアプリケーションソフトや各種設定をＲＯＭ１０３または補助記憶部１０４からの読み出しに代えて、ネットワークを介して取得してもよい。前記アプリケーションプログラムがネットワーク上のサーバコンピュータの補助記憶部内に格納されており、このサーバコンピュータに標的核酸配列決定装置１０がアクセスして、コンピュータプログラムをダウンロードし、これをＲＯＭ１０３または補助記憶部１０４に記憶することも可能である。
【００８５】
また、ＲＯＭ１０３または補助記憶部１０４には、例えば米国マイクロソフト社が製造販売するＷｉｎｄｏｗｓ（登録商標）などのグラフィカルユーザインタフェース環境を提供するオペレーションシステムがインストールされている。第２の実施形態に係るアプリケーションプログラムは、前記オペレーティングシステム上で動作するものとする。すなわち、標的核酸配列決定装置１０は、パーソナルコンピュータ等の汎用コンピュータであってもよい。
【００８６】
［２−１−２．シーケンシング装置の構成］
シーケンシング装置３０は、ヌクレオチド配列を解析できる限り制限されない。図１０に示すように、シーケンシング装置３０は、シーケンシング部３２の他、さらにアンプリコン調製部３１を備えていてもよい。シーケンシング装置３０は、次世代シーケンサーが好ましい。次世代シーケンサーとしては、上記１−２で述べた装置を例示することができる。
【００８７】
［２−１−３．第１の標的核酸配列決定装置の動作］
図１１を用いて、標的核酸配列決定装置１０の動作の一例について説明する。以下の動作は、後述するコンピュータプログラムにしたがって処理部１０１が処理する。
【００８８】
処理部１０１は、例えばユーザが入力部１１１から入力した処理開始の指令にしたがって、シーケンシング装置３０において取得した配列情報を取得する（ステップＳ２０）。この時処理部１０１は、例えばユーザによる入力部１１１からの入力により、またはシーケンシング装置３０から配列情報を読み込む際に、サンプルを取得した被検者を識別するための識別番号（被検者ＩＤ）、サンプルの種別（血液、組織、ホルマリン固定・パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織）を識別するためのサンプル識別ＩＤ、標的核酸を識別するための識別番号（標的核酸識別ＩＤ）、標的領域を識別するための識別番号（標的領域識別ＩＤ）等を取得する。取得された配列情報及び識別ＩＤ等は、主記憶部１０２及び／または補助記憶部１０４に記憶される。
【００８９】
処理部１０１は、上記１−２．で述べた方法にしたがって、ステップＳ２０で取得した各配列情報が標的配列の真の配列を決定するために使用できるか否かを、上記１−３．に記載のプライマーサーチによって判別する（ステップＳ２１）。ステップＳ２１の具体的なフローは、図１２に示し、後述する。
【００９０】
処理部１０１は、ステップＳ２１において、標的配列の真の配列を決定するために使用できると判別された配列、すなわちｓｈｏｒｔ  ａｍｐｌｉｃｏｎの配列情報以外の配列情報（ｅｒｒｏｒ−ｆｒｅｅ  ａｍｐｌｉｃｏｎの配列情報とｌｏｎｇ  ａｍｐｌｉｃｏｎの配列情報）に基づいて、標的領域の真の配列を決定する（ステップＳ２２）。標的領域の真の配列を決定する方法については、後述する図１９で説明する。
【００９１】
次に図１２を用いて、ステップＳ２１に示すプライマーサーチにおける処理部１０１の処理を説明する。
【００９２】
処理部１０１は、取得された配列情報について、各配列情報内の各ヌクレオチドを検出された順番に配列させる（ステップＳ２１１）。この時、それぞれのヌクレオチドに、最初に検出されたヌクレオチドを最も小さい数字（例えば、「１」）として昇順にヌクレオチド番号を付与する。
【００９３】
処理部１０１は、図１１に示すステップＳ２０において取得した配列情報の標的領域識別ＩＤ等に基づいて、補助記憶部１０４に例えばサーチ配列データベース（図１３）として記憶されている複数のサーチ配列の配列とその基準位置の中から、前記取得した配列情報に対応するサーチ配列の配列を読み出す。サーチ配列データベースには、サーチ配列の配列と基準位置の他、標的核酸識別番号（標的核酸ＩＤ）、遺伝子名、標的領域識別番号（標的領域ＩＤ）、標的領域名等が含まれていてもよい。さらに、サーチ配列データベースは、解析する遺伝子のパネル（セット）毎にグループ化されていてもよい。サーチ配列データベースは、補助記憶部１０４に記憶されていてもよいが、ネットワークを介して配列の決定時に取得してもよい。
【００９４】
処理部１０１は、前記取得した配列情報について、補助記憶部１０４から読み出した所定領域の配列（以下、「サーチ配列」という）と実質的に同じ配列を検索する。この検索において、処理部１０１は、インデックス部位配列の長さＸとしたとき、前記取得した配列情報のＸ＋１番目以降の配列情報の中にサーチ配列と実質的に同じ配列があるか否かを検索する。
【００９５】
処理部１０１は、前記取得した配列情報のＸ＋１番目以降の配列情報の中にサーチ配列と同じ配列があったか否かを判定し（ステップＳ２１２）、「ある」と判定した場合（ＹＥＳ）、取得された配列情報がｅｒｒｏｒ−ｆｒｅｅ  ａｍｐｌｉｃｏｎまたはｌｏｎｇ  ａｍｐｌｉｃｏｎに由来すると決定する（ステップＳ２１３）。または、ステップＳ２１３において、取得された配列情報がｅｒｒｏｒ−ｆｒｅｅ  ａｍｐｌｉｃｏｎまたはｌｏｎｇ  ａｍｐｌｉｃｏｎに由来すると決定するかわりに、取得した配列情報を図１１に示すステップＳ２２で使用すると決定してもよい。前記判定において「ない」と判断された場合（ＮＯ）、取得された配列情報はｓｈｏｒｔ  ａｍｐｌｉｃｏｎに由来すると決定する（ステップＳ２１４）。または、ステップＳ２１４において、取得された配列情報がｓｈｏｒｔ  ａｍｐｌｉｃｏｎに由来すると決定するかわりに、取得した配列情報を図１１に示すステップＳ２２で使用しないと決定してもよい。図示しないが、ステップＳ２１３の後に、さらに、処理部１０１０は、取得された配列情報がｅｒｒｏｒ−ｆｒｅｅ  ａｍｐｌｉｃｏｎに由来するか、ｌｏｎｇ  ａｍｐｌｉｃｏｎに由来するか判別してもよい。この判別は、サーチ配列の基準位置と、取得された配列情報のどの位置にサーチ配列が位置しているかヌクレオチド番号を比較することにより判別できる。
【００９６】
また、処理部１０１は、ステップＳ２３の後に図２０に示す、後述する処理を行ってもよい。
【００９７】
処理部１０１は、図１１に示すステップＳ２０の前に、アンプリコン調製部３１に、図１４に示す、標的核酸からアンプリコンを調製させる処理（ステップＳ３０）を実行させてもよい。さらに、処理部１０１は、シーケンシング部３２にステップＳ３０で増幅された各アンプリコンをシーケンシングさせるための処理（ステップＳ３１）を、実行させてもよい。この場合、標的核酸は、ユーザによってシーケンシング装置３０にセットされる。また、ユーザによって入力部１１１から入力される処理開始の指令にしたがって、処理部は、ステップＳ３０を開始する。ステップＳ３１は、ユーザの処理開始の指令にしたがって開始してもよく、ステップＳ３０の終了に引き続き開始されてもよい。
【００９８】
次に、処理部１０１は、シーケンシングにより取得した配列情報を標的核酸配列決定装置１０に出力する（ステップＳ３２）。
【００９９】
上記１−３．で使用している用語と同じ用語については、その説明を本項の説明に援用する。
【０１００】
［２−２．第２の標的核酸配列決定装置］
［２−２−１．ハードウェアの構成］
図１５及び図１６に、標的核酸配列決定装置１００の構成を示す。標的核酸配列決定装置１００は、入力部１１１０と、出力部１１２０と、記憶媒体１１３０とに接続されていてもよい。また、標的核酸配列決定装置１００は、シーケンシングを行うシーケンシング装置３００と接続されていてもよい。標的核酸配列決定装置１００は、シーケンシング装置３００と直接またはネットワーク等を介して接続された、標的核酸配列決定システム５００を構成することもある（図１５（ａ））。また、標的核酸配列決定装置１００とシーケンシング装置３００は、図１５（ｂ）に示すように一体型であってもよい。
【０１０１】
図１６において、処理部１０１０と、主記憶部１０２０と、ＲＯＭ１０３０と、補助記憶部１０４０と、通信インタフェース１０５０と、入力インタフェース１０６０と、出力インタフェース１０７０と、メディアインターフェース１０８０と、バス１０９０と、入力部１１１０と、出力部１１２０と、記憶媒体１１３０と、シーケンシング装置３００と、アンプリコン調製部３１０と、シーケンシング部３２０とは、それぞれ図１１に記載の処理部１０１と、主記憶部１０２と、ＲＯＭ１０３と、補助記憶部１０４と、通信インタフェース１０５と、入力インタフェース１０６と、出力インタフェース１０７と、メディアインターフェース１０８と、バス１０９と、入力部１１１と、出力部１１２と、記憶媒体１１３と、シーケンシング装置３０と、アンプリコン調製部３１と、シーケンシング部３２とに対応するため、上記２−１−２の説明は、本項に援用する。
【０１０２】
［２−２−２．第２の標的核酸配列決定装置の動作］
図１７を用いて、標的核酸配列決定装置１００の動作について説明する。以下の動作は、後述するコンピュータプログラムにしたがって処理部１０１０が処理する。
【０１０３】
処理部１０１０は、例えばユーザが入力部１１１０から入力した処理開始の指令にしたがって、シーケンシング装置３００において取得した配列情報を取得する（ステップＳ４０）。この時処理部１０１０は、例えばユーザによる入力部１１１０からの入力により、またはシーケンシング装置３００から配列情報を読み込む際に、サンプルを取得した被検者を識別するための識別番号（被検者ＩＤ）、サンプルの種別（血液、組織、ホルマリン固定・パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織）を識別するためのサンプル識別ＩＤ、標的核酸を識別するための識別番号（標的核酸識別ＩＤ）、標的領域を識別するための識別番号（標的領域識別ＩＤ）等を取得する。取得された配列情報及び識別ＩＤ等は、主記憶部１０２０及び／または補助記憶部１０４０に記憶される。
【０１０４】
処理部１０１は、上記１−２．で述べた方法にしたがって、ステップＳ４０で取得した各配列情報が標的配列の真の配列を決定するために使用できるか否かを、上記１−３．に記載のプライマーサーチによって判別する（ステップＳ４１）。ステップＳ４１の具体的なフローは、図１２と上記２−１−３．で説明した通りである。
【０１０５】
処理部１０１は、ステップＳＳ４１において、標的配列の真の配列を決定するために使用できると判別された配列、すなわちｓｈｏｒｔ  ａｍｐｌｉｃｏｎの配列情報以外の配列情報（ｅｒｒｏｒ−ｆｒｅｅ  ａｍｐｌｉｃｏｎの配列情報とｌｏｎｇ  ａｍｐｌｉｃｏｎの配列情報）に基づいて、標的領域の真の配列を決定する（ステップＳ４２）。標的領域の真の配列を決定する方法については、後述する図１９で説明する。
【０１０６】
また、ステップＳ４２で決定された標的領域の真の配列の中に変異があるか否かを判定するステップＳ４３を行ってもよい。ステップＳ４３の詳細は、後述する図２０で説明する。
【０１０７】
処理部１０１０は、図１７に示すステップＳ４０の前に、アンプリコン調製部３１０に、図１８に示す、標的核酸からアンプリコンを調製させる処理（ステップＳ５０）を実行させてもよい。さらに、処理部１０１０は、シーケンシング部３２０にステップＳ５０で増幅された各アンプリコンをシーケンシングさせるための処理（ステップＳ５１）を、実行させてもよい。この場合、標的核酸は、ユーザによってシーケンシング装置３００にセットされる。また、ユーザによって入力部１１１０から入力される処理開始の指令にしたがって、処理部は、ステップＳ５０を開始する。ステップＳ５１は、ユーザの処理開始の指令にしたがって開始してもよく、ステップＳ５０の終了に引き続き開始されてもよい。
【０１０８】
次に、処理部１０１０は、シーケンシングにより取得した配列情報を標的核酸配列決定装置１００に出力する（ステップＳ５２）。
【０１０９】
上記１−３．で使用している用語と同じ用語については、その説明を本項の説明に援用する。
［２−３．その他の処理］
【０１１０】
さらに処理部１０１，１０１０は、図１１のステップＳ２２または図１７のステップＳ４２において図１９に示す標的配列の決定処理を行ってもよい。
【０１１１】
次に図１９を用いて、標的領域の真の配列を決定する処理の例を具体的に説明する。処理部１０１，１０１０は、図１１のステップＳ２２または図１７のＳ４２において標的領域の真の配列を決定する処理を行う。この処理において、処理部１０１，１０１０は、はじめに同一ＵＩＤ配列を有するファミリー内の各メンバーについて配列情報の各ポジションのヌクレオチドを他のメンバーの同一ポジションにアラインメントする（ステップＳ６１１）。
【０１１２】
次に、処理部１０１，１０１０は、そのポジションのコンセンサス率を算出する（ステップＳ６１２）。
【０１１３】
処理部１０１，１０１０は、ステップＳ６１２で算出されたコンセンサス率を、補助記憶部１０４，１０４０に記憶されたコンセンサス率の所定値と比較し、コンセンサス率が所定値以上のヌクレオチドを標的領域のヌクレオチドと決定する（ステップＳ６１３）。
【０１１４】
処理部１０１，１０１０は、標的領域内のすべてのポジションについてヌクレオチドを決定したかを判定し、標的領域内のすべてのポジションについてヌクレオチドを決定していない場合には、ステップＳ６１１に戻り、標的領域内のすべてのポジションについてヌクレオチドを決定するまで、ステップＳ６１１〜ステップＳ６１４を繰り返す。
【０１１５】
標的領域内のすべてのポジションについてヌクレオチドが決定された時は、ステップＳ６１５に進み、標的領域のａｃｃｕｒａｔｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅを補助記憶部１０４，１０４０等に記憶する。
【０１１６】
また、処理部１０１，１０１０は、標的領域のａｃｃｕｒａｔｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅを出力部１１２，１１２０に出力してもよい。
【０１１７】
図２０を用いて、標的領域の配列の中に変異があるか否かを判定する処理の例を具体的に説明する。処理部１０１，１０１０は、図１１のステップＳ２２または図１７のＳ４２において決定された標的領域の真の配列の配列情報をその配列情報に対応する参照配列にマッピングする（ステップＳ６１）。参照配列は、上記１−４．で述べた通りである。参照配列は、補助記憶部１０４，１０４０に記憶されていてもよいが、ネットワークを介して配列の決定時に取得してもよい。また、マッピングは、配列情報をネットワークを介して参照配列が記憶されているサーバ等に送って行ってもよい。
【０１１８】
処理部１０１，１０１０は、マッピングを行うことにより前記配列情報を参照配列（変異情報データベースに登録されている変異配列を含む）と比較する。
【０１１９】
処理部１０１，１０１０は、前記配列情報に変異配列が有るか否かを判定する（ステップＳ６２）。
【０１２０】
処理部１０１，１０１０は、前記配列情報に変異配列がない場合には、標的領域は変異を有さないと判定する（ステップＳ６３）。また、変異配列が真の変異でない場合（ＮＯ）には、標的領域に変異がないと判定する（ステップＳ６４）。
【０１２１】
処理部１０１，１０１０は、これらの標的領域の配列の決定結果を、補助記憶部１０４，１０４０に記憶してもよく、出力部１１２，１１２０に出力してもよい（ステップＳ６５）。出力先は、上記１−４．に記載した通り、シーケンシング装置のモニタ、他の端末、プリンタ等でありうる。
【０１２２】
［３．コンピュータプログラム］
コンピュータプログラムは、上記１に記載の標的核酸の配列決定方法を、第１の標的核酸配列決定装置１０、第１の標的核酸配列決定システム５０、または第２の標的核酸配列決定装置１００、第２の標的核酸配列決定システム５００を制御するためのプログラムである。
【０１２３】
コンピュータプログラムは、上記２−１−２．及び２−３．で述べた、ステップＳ２０〜ステップＳ２２及びステップＳ２１１〜ステップＳ２１４；ステップＳ３０、ステップＳ３１、ステップＳ２０〜ステップＳ２２及びステップＳ２１１〜ステップＳ２１４；ステップＳ２０〜ステップＳ２２、ステップＳ２１１〜ステップＳ２１４及びステップＳ６０〜ステップＳ６５；ステップＳ３０、ステップＳ３１、ステップＳ２０〜ステップＳ２２、ステップＳ２１１〜ステップＳ２１４及びステップＳ６０〜ステップＳ６５を処理部１０１に実行させることにより第１の標的核酸配列決定装置１０、第１の標的核酸配列決定システム５０を制御する。コンピュータプログラムは、上記２−２−２．、２−３．で述べた、ステップＳ４０〜ステップＳ４４；ステップＳ５０、ステップＳ５１、ステップＳ４０〜ステップＳ４４；ステップＳ４０〜ステップＳ４４、ステップＳ６１〜ステップＳ６５及びステップＳ６１１〜ステップＳ６１５；ステップＳ５０、ステップＳ５１、ステップＳ４０〜ステップＳ４４、ステップＳ６１〜ステップＳ６５及びステップＳ６１１〜ステップＳ６１５を処理部１０１０に実行させることにより、第２の標的核酸配列決定装置１００、第２の標的核酸配列決定システム５００を制御する。
【０１２４】
コンピュータプログラムは、記憶媒体記憶されていてもよい。すなわち、前記コンピュータプログラムは、ハードディスク、フラッシュメモリ等の半導体メモリ素子、光ディスク等の記憶媒体に記憶される。また前記コンピュータプログラムは、クラウドサーバ等のネットワークで接続可能な記憶媒体に記憶されていてもよい。コンピュータプログラムは、ダウンロード形式の、または記憶媒体に記憶されたプログラム製品であってもよい。
【０１２５】
前記記憶媒体へのプログラムの記憶形式は、前記提示装置が前記プログラムを読み取り可能である限り制限されない。前記記憶媒体への記憶は、不揮発性であることが好ましい。
【０１２６】
［４．解析例］
イルミナ社の次世代シーケンサーMiSeq（登録商標）を用いて、KIT遺伝子の配列解析を行った。プライマーセットは3種類（KIT61, KIT54, 及びKIT47）用いた。これらのプライマーセットはそれぞれ異なる標的領域を増幅するものである。いずれのプライマーセットも、フォワードプライマーとして、ユニバーサルプライマー部位、インデックス部位及び標的特異的プライマー部位を含み、リバースプライマーとして標的特異的プライマー部位及びユニバーサルプライマー部位を含む。インデックスはすべてランダム配列であった。結果はTable 1に示される。
【０１２７】
解析の結果、14ヌクレオチド以上のタグ部位配列を含むアンプリコン（Table 1において「>14 nt」と表される）が数多く検出された。これらのアンプリコンは標的領域の配列情報は正確に読めているが、タグ部位配列がエラーを含むため解析から除外されていた。これらの配列情報も標的領域の配列解析のために用いることにより、シークエンシングのdepth of coverageが向上し、シーケンシングの精度が向上され得ることが示された。
【０１２８】
【表１】
2020195377.tif 000003
「>14 nt」は、UIDが14 ntよりも長くなっていた配列情報
「<14 nt」は、UIDが14 ntよりも短くなっていた配列情報
【符号の説明】
【０１２９】
１０  標的核酸配列決定装置
１００  標的核酸配列決定装置
【図１】
2020195377.tif 000004
【図２】
2020195377.tif 000005
【図３】
2020195377.tif 000006
【図４】
2020195377.tif 000007
【図５】
2020195377.tif 000008
【図６】
2020195377.tif 000009
【図７】
2020195377.tif 000010
【図８】
2020195377.tif 000011
【図９】
2020195377.tif 000012
【図１０】
2020195377.tif 000013
【図１１】
2020195377.tif 000014
【図１２】
2020195377.tif 000015
【図１３】
2020195377.tif 000016
【図１４】
2020195377.tif 000017
【図１５】
2020195377.tif 000018
【図１６】
2020195377.tif 000019
【図１７】
2020195377.tif 000020
【図１８】
2020195377.tif 000021
【図１９】
2020195377.tif 000022
【図２０】
2020195377.tif 000023
【配列表】
2020195377000001.app