(57)【要約】【課題】縮小ゲノム細菌の延長連続フロー発酵のための材料及び方法の提供。【解決手段】低突然変異縮小ゲノム菌株に関連した２容器型連続フローシステムにより、長期にわたり発酵が行われるためのプラットフォームを提供する。こうしたシステムは、プローブ、ポンプ、及び監視システムなどの標準発酵装置の改良形態ならびに供給送達方法、培養液の監視方法、及び生成物収穫方法のための改良方法を必要とする。少量でかつ長時間連続発酵を行い、大量の発酵生成物を生成するための最適化された２容器型システムは、既存の発酵戦略を上回る顕著な改善を呈する。２容器型連続培養発酵器具を用いた長時間連続フロー発酵のための方法及び組成物について記述する。【選択図】図１
2020171331.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１５年４月２日に出願された、米国特許仮出願第６２／１４２，２８２号の利益を主張し、その開示が参照により本明細書に援用される。
【０００２】
低突然変異縮小ゲノム菌株に関連した２容器型連続フローシステムにより、長期にわたる発酵のためのプラットフォームを提供する。こうしたシステムは、プローブ、ポンプ、及び監視システムなどの標準発酵装置の改良形態ならびに供給送達方法、培養液の監視方法、及び産物収穫方法のための改良方法を必要とする。少量でかつ長時間連続発酵を行い、大量の発酵生成物を生成するための最適化された２容器型システムは、既存の発酵戦略を上回る顕著な改善を呈する。
【背景技術】
【０００３】
細菌発酵は、生体分子を製造するために最も効率の良い産業的なプロセスであって、バイオ治療学的生成のために選択される方法であった。しかし、ここ数年、医薬品製造業者は、発酵において、このプロセス全体が１つの容器で一週間以上にわたって行われ、１つの発酵容器の発酵量のみの発酵物を得る回分発酵及び流加発酵に関連する問題に直面するようになった。細胞は比較的高い密度（〜ＯＤ＝１００）まで生育させ、その後、死滅し始めるまでに比較的短い期間（時間）で生成物を生成するよう誘導される。回分プロセスは、その多くは、使用される菌株の遺伝的不安定性による不具合の影響を受けやすく、多くの場合代謝的に非効率的であり、かつ、誘導下で負荷を非常に受けやすい。代謝的負荷が、生成物の生成及び完全性が損なわれ得る細胞中において応答を誘導する可能性があり、かつ、ゲノムを損傷させて、細胞の生育を遅らせるか、または細胞を殺す可能性さえもある。これ以上生成物を生成することのない変異体が、培養液もしくはバクテリオファージを急速に上回る可能性があるか、またはゲノムの溶原菌が全体の培養を死滅させること、もしくは、溶解させる可能性もある。
【０００４】
より効率が良く、かつ、信頼性の高い発酵プロトコルは、必要に応じて栄養素が培養液に連続的に添加され、かつ細菌及び生成物が連続的に収穫されるプロセスである。こうした連続フローバイオリアクタシステムは、ケモスタットとして操作されてもよく、培養液の投入（希釈率）を細胞及び使用済み培地の流出と同期させることによって、バイオリアクタの容量が一定の状態に保たれ、常在細菌中で生理学的な定常状態となる。商業的用途においては、この定常状態は、理想的には、最大の生成物形成における生理学的最適点において細菌細胞を保持するように設定される。残念なことに、ケモスタット操作は、希釈率によって確立される精巧な平衡が、システムを通る流量に対する物理的変化により乱れることがあることから、機械的破壊に対する感受性が非常に高い。更に、バイオリアクタ内の集団中の遺伝子変化により、生理学的定常状態が乱れるか、または非生産的変異体が培養液を占有する可能性がある［ｖａｎ  Ｈｅｅｒｄｏｎ  ａｎｄ  Ｎｉｃｏｌ，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ  １２：８０（２０１３）を参照されたい］。
【０００５】
連続フローバイオリアクタ操作における固有の機械的問題及び遺伝子上の問題に加えて、関心のある生成物を生成するにあたって遺伝子発現の誘導に必要な組換え型系を有する従来の１容器型ケモスタットにおいては、定常状態の確立に関連する問題がある。概して、このような系は最初の回分または流加培養段階で、予め定められた最適細胞密度まで生育させ、その後、ＩＰＴＧなどの外因性誘導剤を添加し、適切に希釈した誘導剤を含む供給流入を使用してケモスタットモードを確立し、発酵の全期間にわたって誘導レベルを維持する。これは、技術的に困難であるばかりでなく、多くの場合、誘導された遺伝子発現の負荷を減らす突然変異の変化を起こす細菌では、バイオリアクタ内で集団が過剰に生育する傾向があり、その結果、生産力の低下となる。このような問題は回分発酵においても発生するが、回分または流加培養発酵の寿命が有限である（概して短い）ことから、生産性に及ぼす影響は、通常、それほど重要ではない。
【０００６】
近年では、連続フロー発酵システムについて記述されており、その中では、温度感受性複製起点の誘導（米国特許公開第２００８／０３１８２８３号）によって閉環状ＤＮＡプラスミドを生成するために、２容器型がプロセスに組み込まれた。このプロセスにおいては、第１の容器中の細胞は比較的低い温度で生育され、その結果、細胞中において、低コピー数のプラスミドとなった。この状態下で、高誘導性プラスミドを含む所望の細胞、及び全体のプラスミドコピー数を減少させる突然変異を含む望ましくない細胞は、細胞自体の間に生育における利点をほとんどまたはまったく有さない。この系においては、より高い温度の第２の容器へと通過させるときのみ、プラスミドコピー数が誘導され、誘導された低コピー数のプラスミドを含む望ましくない細胞にのみ選択有利性が与えられた。このため、第１の（シード）容器は、第２の（生成）容器用連続接種材料として使用される。所望の細胞を用いる連続接種は、生成システム内で確立されている望ましくない、より急速に生育する変異体の能力を制限する。これは、変異体が、連続ｗａｓｈｏｕｔのみでなく、非汚染接種材料による連続置換を受けるためである。
【０００７】
これにより、生成細胞の安定性に関する問題の一部に対する的確な解決法が示されるが、これは部分的な解決法であるのみである。生成菌株の安定性を改善するための直接的な細胞工学を２容器型システムに組み合わせて、全体のプロセスを改良することができる。更に、熱誘導よりも化学的または生物学的誘導を含む誘導スキームが同程度に有用であることがわかり、かつ、シード容器では誘導剤を含まない状態を維持しつつ、生成容器内で連続レベルの誘導剤を提供するためには、必然的に、より複雑な投入ストリームを必要とするであろう点については、完全に確信されているものではない。更に、２容器型システムは、同一の細胞源を有する異なる条件を連続して変更することが可能であることによって、最適な生成条件を決定するために理想的なフレームワークとなり得る。この場合、生成容器は、定常状態を確立するにあたって必要な期間、所望の条件で保持され、生産性を決定するために、また、単に供給または他の実験パラメータ（酸素分圧、ｐＨ、誘導剤の量、など）を改良し、かつ試料が新しいラウンドになる前に、システムを新たな定常状態とすることによって次の実験条件を確立させるために、試料を採取する。このようなプロセスは、新たな実験的投入を行う以外、使用者からのいかなる投入も必要とすることなく、何回でも繰り返すことができる。このプロセスの多くは、予めプログラムされたコンピュータコントローラによって完全に実行され得る。更に、１つのシード容器が、平行して行われる実験的操作または生成操作を容易にする複数の生成容器となり得る。
本明細書おいて、「Ｃフロー」器具と称される適切な器具及び特別に設計された細菌を用いて、連続プロセスでは、より少ないエネルギー、人的資源、ダウンタイム、主要な装置、経費及び接地面積を使用し、正確に設定することで、数ヶ月間作動でき、複数の細胞密度で、１日当たり任意の容器容量の発酵物を生成し、その生成物濃度は、同じ生成物の流加培養プロセスの生成物濃度の２倍以上である。Ｃフローシステムを用いると、所定のサイズの容器により、３週間ほどの短期間内に、流加培養システムを用いる同程度のサイズの容器の５〜５０倍以上の生成物を生成できる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許公開第２００８／０３１８２８３号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】ｖａｎ  Ｈｅｅｒｄｏｎ  ａｎｄ  Ｎｉｃｏｌ，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ  １２：８０（２０１３）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
一実施形態においては、本装置は、図１に示し、かつ図２において実施するために減少させたように、例えば、ＤＡＳＧＩＰ−Ｐｒｏ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙの発酵槽の一対の２Ｌの発酵容器を使用する。各容器は、独立した連続フローケモスタットとして構成され、標準ＤＡＳＧＩＰ付属品と共に示すとおり、調整した。各ケモスタットは、沈殿及び変色を回避するためにリン酸塩の送達を他の媒体成分から分離させる二重供給法を用いて、グルコース最少塩培地を供給する。各ケモスタットに必要な２つの飼料ボトルは、それぞれ、一組のプログラム可能コントローラを介して、適合する送達管を有する蠕動ポンプを重量測定法により制御する１つのメトラーはかり上に静置する。
まず、「シード」ケモスタットでは、所望の産物をコードする発現ベクターを含む非誘導性組換え型Ｅ．ｃｏｌｉの連続供給を行う。第２の生成ケモスタットには、ＩＰＴＧ誘導剤含有培地が供給される。２つのタンクは、流出管から引き出されている転送ポンプによって直列に接続して、上流タンクの流体量を維持する。シードタンクは、アッセイ用にデバブラーを介して冷却自動分画器に転送される試料部分を生成タンクに注入し、生成タンクは、その試料部分を冷却回収容器に圧送させる。
【００１１】
別の実施形態においては、生成有機体は、複数欠失株（ＭＤＳ）Ｅ．ｃｏｌｉであり、これらは、高代謝効率、グルコース最少塩培地上で生育する能力、及び野生型Ｅ．ｃｏｌｉより突然変異率が１００倍低いことを目的として、遺伝的に設計された。いくつかの実施形態においては、生成株は、ＭＤＳ６９  ｍｅｔａ  ΔｒｅｃＡである。ペリプラズム生成に関しては、１つのペプチドを用いて、生成有機体のペリプラズムへのタンパク質産物の輸送を容易にする。
【００１２】
図２に示すＣフローシステムを得るために、標準ＤＡＳＧＩＰ  Ｐｒｏシステムに次の改良を加えて、はかりの制御をコントローラソフトウェアに統合し、正確な重量測定により調整された供給を可能にし、沈殿しないように供給ストリームを分離し、１つの制御チャネルを介して、２つの供給ストリームの制御を統合するために、１つのはかり上で２つの別の貯蔵容器内において高濃度培地ストックを再度配合した。ストックＤＡＳＧＩＰ供給ポンプが十分に強力ではないため、その代わりに外部供給ポンプを使用した。このため、１つの容器当たり２つの供給ライン及び２つのポンプを必要とする。ＤＡＳＧＩＰポンプは、１つの供給ストックであっても、指数的流加培養段階終了時には、流速能力が不足する。外部供給ポンプは、ＤＡＳＧＩＰソフトウェアによってアナログ信号を介して制御される。従来のＤＡＳＧＩＰ供給ポンプは、消泡送液、ならびにｐＨ制御、水酸化アンモニウムの添加による窒素の供給に使用される。放出廃気は、あらゆる発泡を捕捉するために滅菌可能な捕捉容器に対して再度配管させた。余分のポンプでは、シード容器から生成容器まで、及び生成容器から下流処理まで培養液を転送する必要がある。気泡発生散気管を改良して、実行時に、散気管のガス放出口端部から周期的に押し上げられるプッシュロッドを起動させるソレノイドによる除去が可能になり、蓄積されたいかなる閉塞も取り除くことができるようになった。余分なディップチューブも、追加的な監視及びサンプリングに必要とされた。デバブラーを使用して、生成物ストリームを大量の生成物プールに分割し、１時間ごとの小試料用の自動分画器を使用して、時間の経過と共に収率プロファイル及び他のパラメータを監視する。
【００１３】
図３に示す別の実施形態においては、本システムは、循環ループから現われるか、または別の実施形態においては、自動分画器のストリームから引き出され、測定後廃棄される、きわめて少量の試料から非常に高いＯＤを安定して読み取り可能な独自のフローセルを組み込む。典型的な発酵においては、試料を希釈する必要があり、試料を測定する前に、必要な補償を提供するために設定した標準及び装置に対して、バックグラウンド吸光度または光散乱を測定する必要がある。長期にわたり発酵を監視するにあたって、その間、バックグラウンド補償が顕著に変動する可能性が高く、再調節するには閉鎖している流体回路を切断する必要があり、このため、システムの無菌性が危ぶまれることから、このプロセスは有用ではない。更に、完全に「手に触れない自動化システム」においては、Ｃフロー発酵の高細胞濃度（ＯＤ＞２００）、ならびに準備段階で比較的低いＯＤは、直接測定することは困難である。図３は、この問題に対する発明的解決法を示す。図示した実施形態においては、自動連続フロー希釈装置を経路長１〜２ｍｍを有する非常に短い経路のフローセル、及び２つのフォトダイオード検出器を備える安定した感受性光学密度読み取り装置と組み合わせる。一方のフォトダイオード検出器は、１つのＬＥＤ源の出力を直接読み取り、他方のフォトダイオード検出器は、フローセルを通過する試料ストリームを介して読み取る。一実施形態においては、２つのフォトダイオードは、異なる材料で構成され、一方のフォトダイオードは、光波長５００〜６００ｎｍに対して感受性があり、一般に屈折により細胞数を測定するために使用され、他方のフォトダイオードは、非常に長い光波長８９０〜１２００ｎｍに対して感受性があり、溶液中粒子サイズの細胞の存在に対する感受性は徐々に減少する。時間の経過と共にＬＥＤ源から放出されるさまざまな光は、短いまたは長い経路長を用いて、図３に示す希釈率を１：１００から調節することによって、または、光散乱感受性の異なるフォトダイオード対を切り替えることによって、連続して調節し得る（図３）。
【００１４】
別の実施形態においては、Ｃフローシステムは、すべての転位遺伝因子を除去し、遺伝的安定性を向上し、代謝能を改善し、かつ組換えタンパク質、核酸または小分子などの所望の生成物を生成できるように、遺伝子操作がなされた縮小ゲノム細菌株を接種する。縮小ゲノム細菌は、こうした組換えタンパク質、核酸、または小分子の生成を促進するために、１つ以上のプラスミドまたは他のエピソームもしくはゲノム構造体を含んでもよい。縮小ゲノム細菌株は、米国特許第  ９，０８５，７６５号、第８，１７８，３３９号、第８，０４３，８４２号及び第６，９８９，２６５号、ならびに国際公開第ＷＯ／２０１３／０５９５９５号に記述されているものなど、遺伝的安定性を向上させるために改良形態を有してもよく、また国際公開第ＷＯ／２０１５／０７３７２０号に記述されているものなど、代謝能を改善するための改良形態を有してよく、それぞれのその全体が参照によって本明細書に援用される。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
連続フロー発酵において使用するための器具であって、（１）非誘導状態において縮小ゲノム細胞の第１の集団を培養するためのシード容器であって、流入口及び流出口を有する、シード容器と、（２）誘導状態において縮小ゲノム細胞を培養するための少なくとも１つの生成容器であって、各生成容器が、前記シード容器の前記流出口に接続されている第１の流入口、誘導剤を添加するための第２の流入口、及び流出口を有する、生成容器と、（３）前記シード容器及び生成容器を連結されたケモスタットとして操作し、これにより、前記シード容器の流出が、前記生成容器への流入として用いられる手段と、を備える、器具。
（項目２）
１つ以上の容器においてＥテープレベル監視装置が取り付けられる、項目１に記載の器具。
（項目３）
前記器具を通る流量を調整するために、複数のポンプ及び複数のはかりを備える、マルチ重量測定式供給システム（ｍｕｌｔｉ  ｇｒａｖｉｍｅｔｒｉｃ  ｆｅｅｄ  ｓｙｓｔｅｍ）が取り付けられる、項目１に記載の器具。
（項目４）
前記器具を通る流量を調整するために、複数のポンプ及び１つのはかりを備える、マルチ重量測定式供給システムが取り付けられる、項目１に記載の器具。
（項目５）
複数のソレノイドを有する、１つ以上のポンプ及び１つのはかりを備える、マルチ重量測定式供給システムが取り付けられる、項目１に記載の器具。
（項目６）
散気要素を取り囲み、それと接触する気体不透過性膜と、前記散気要素の長手方向軸線に沿って前記接触面を調節するための手段と、を備える散気システムが取り付けられる、項目１に記載の器具。
（項目７）
生体産物を生成するための連続発酵プロセスであって、少なくとも２つの連続した発酵槽において、生体産物をコードする誘導性発現ベクターを含む縮小ゲノム細菌細胞の集団を培養することを含み、前記それぞれの発酵槽は、独立した連続フローケモスタットとして構成され、前記発酵槽は、培地を備えた第１の発酵槽であって、前記細胞が非誘導条件下で培養される、第１の発酵槽と、前記生体産物を生成するための第２の連続した連続発酵槽であって、誘導剤を含む培地を備え、かつ、前記第２の発酵槽に接種するのに十分な量の、前記第１の発酵槽由来の前記培地を更に備えた、第２の連続した連続発酵槽と、を備え、前記細胞は、前記生体産物を生成するのに好適な条件下で培養され、かつ、前記生体産物は、前記第２の発酵槽から回収される、プロセス。
（項目８）
それぞれの発酵槽は、リン酸塩の送達を他の媒体成分から分離させる二重供給法を用いてグルコース最少塩培地が供給される、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記縮小ゲノム細菌細胞は、ＭＤＳ６９  ｍｅｔａ  ΔｒｅｃＡ細胞である、項目７に記載の方法。
（項目１０）
前記発酵槽は、重量測定的に供給される、項目７または項目９に記載の方法。
（項目１１）
重量測定的供給は、前記発酵槽を通る流量を調節するための、複数のポンプ及び複数のはかりを備える、マルチ重量測定式システムによって達成される、項目９に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】Ｃフロー装置の概略を示す。
【図２】ＤＡＳＧＩＰ発酵槽プラットフォームに実装されるＣフローシステムの写真である。それぞれのはかり上の対の貯蔵ボトルは、コンピュータワークステーションの左隣にある。さまざまなコンピュータコントローラ及びポンプは、発酵システムの後側、ならびに貯蔵ボトルと発酵容器との間にある棚にある。連続フロー光検知器は、中心の主要プラットフォームの下にある。シード容器は、生成容器の真横の中心の左側にある。自動分画器及び下流処理計器装備は、右側にある。
【図３】発酵容器において細胞濃度を監視するための１〜２ｍｍフローセル装置の詳細を示すＣフロー器具の概略図である。
【図４】培養レベルの連続監視または制御のためのＥテープセンサーの図である。
【図５Ａ】は、複数の供給流入を提供し、供給成分の分離を容易にし、代謝状態、栄養素の流入、生成物の品質を最適にするために、実験設計（ＤＯＥ）によりかかる成分の平衡を微調整できるように、マルチ重量測定式供給システム（ｍｕｌｔｉ  ｇｒａｖｉｍｅｔｒｉｃ  ｆｅｅｄ  ｓｙｓｔｅｍ）のためのスキームを示す。図５ａは、複数のポンプ、複数のはかり構成を用いるマルチ重量測定式供給システムを示す。図５ｂは、１つのはかり及び２つのポンプシステムを有するマルチ重量測定式供給システムを示す。図５ｃは、１つのはかり、２つのソレノイド構成を有するマルチ重量測定式供給システムを示す。
【図５Ｂ】は、複数の供給流入を提供し、供給成分の分離を容易にし、代謝状態、栄養素の流入、生成物の品質を最適にするために、実験設計（ＤＯＥ）によりかかる成分の平衡を微調整できるように、マルチ重量測定式供給システム（ｍｕｌｔｉ  ｇｒａｖｉｍｅｔｒｉｃ  ｆｅｅｄ  ｓｙｓｔｅｍ）のためのスキームを示す。図５ａは、複数のポンプ、複数のはかり構成を用いるマルチ重量測定式供給システムを示す。図５ｂは、１つのはかり及び２つのポンプシステムを有するマルチ重量測定式供給システムを示す。図５ｃは、１つのはかり、２つのソレノイド構成を有するマルチ重量測定式供給システムを示す。
【図５Ｃ】は、複数の供給流入を提供し、供給成分の分離を容易にし、代謝状態、栄養素の流入、生成物の品質を最適にするために、実験設計（ＤＯＥ）によりかかる成分の平衡を微調整できるように、マルチ重量測定式供給システム（ｍｕｌｔｉ  ｇｒａｖｉｍｅｔｒｉｃ  ｆｅｅｄ  ｓｙｓｔｅｍ）のためのスキームを示す。図５ａは、複数のポンプ、複数のはかり構成を用いるマルチ重量測定式供給システムを示す。図５ｂは、１つのはかり及び２つのポンプシステムを有するマルチ重量測定式供給システムを示す。図５ｃは、１つのはかり、２つのソレノイド構成を有するマルチ重量測定式供給システムを示す。
【図６】図５ａ〜図５ｃに示すマルチ重量測定式システムがどのように制御スキーム全体に統合されているかを示す。
【図７】１つのはかりと４つのプッシュポンプを備えるマルチ重量測定式供給システムを示す。
【図８】発酵容器内で散気管の調節が可能な外装システムの図である。
【図９】溶解ガス及び小さい気泡を培地内で保持するために、平面円板要素を取り付けた外側シースを備える散気装置の図である。
【図１０】それぞれｐＳＸ２−Ｃｒｍ１９７発現ベクターを含み、前述のとおりＣフロー発酵槽内で生育させたＭＤＳ６９  ｍｅｔａ  ΔｒｅｃＡ（ひし形）、ＢＬ２１／ＤＥ３（四角形）、ＭＧ１６５５  ΔｒｅｃＡ（三角形）及びＢＬＲ（ＤＥ３）（丸形）によって毎日生成したＣｒｍ１９７試験タンパク質の量のプロットである。
【図１１】ｐＳＸ２−ｒＥＰＡ発現ベクターを含み、前述のとおり、Ｃフロー発酵装置内で生育させたＭＤ６９  ｍｅｔａ  ΔｒｅｃＡによって毎日生成したｒＥＰＡ試験タンパク質の量のプロットである。
【図１２】ｐＳＸ２−ゲルソリン発現ベクターを含み、前述のとおりＣフロー発酵槽内で生育させたＭＤ６９  ｍｅｔａ  ΔｒｅｃＡによって毎日生成したヒトゲルソリン試験タンパク質の量のプロットである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、２容器型連続フロー発酵内で培養された生成有機体から大量の生体産物を生成するためのシステムを備え、２容器型の一方の容器は、他方の容器に連続して安定した非誘導性生成細胞源を提供するために動作する。こうしたシステムは、遺伝的に安定化させた生成細胞株に連結させる場合、特定の発酵ハードウェアの改良形態により、安定した生成プラットフォームならびに最適な生成条件の迅速かつ再生成可能な実験的測定を行うための汎用システムが提供される。
【００１７】
Ｃフローシステムの頑強性及び簡便さは顕著である。初めに発酵容器には、容器間の移送ポンプの電源を切った状態で誘導剤を用いずに生育させた平行流加培養発酵物を充填した。生育の流加培養段階終了後、それぞれの容器の一定供給速度３０ｍｌ／ｈｏｕｒが確立され、移送ポンプの電源を入れた。各タンクとも、２４時間以内に標的ＯＤに到達し、生成タンクへの供給を減少させて、１５ｍｌ／時間とした。誘導剤の供給を開始し、生成物の生成を監視した。生成物の流出が安定化した後、最適化実験を実施した。１３ヶ月目が過ぎて、１つの連続発酵物において、異なる発酵条件の試験を行ったところ、必要とする実際の労力は最小限であった。制御コンピュータへのＶＰＮ接続を介して及び「監視カメラ（ｎａｎｎｙ−ｃａｍ）」を介して、動作を随時観察し、目に見える問題点の有無を確認した。毎朝、固有の動作を監視し、１つの条件でデュエルボリュームが２〜３となった後、本システムを次の状態へと遷移させた。１つの一連の実験においては、試験タンパク質の最も高い生成率によりＯＤ６００が２００を超え、流速１Ｌ／ｄａｙにて、発酵物からの完全溶解タンパク質の連続フロー（７２ｇ／ｍｏｎｔｈ）とした。ほとんどの組織は、１週間に１回の割合で、流加培養発酵を完了させる点に悩まされている。これらの２つの発酵槽容器の予測収率は、独立した２つの流加培養発酵として動作させると、それぞれ１週間に１回実行して、４週＊２つの容器＊１Ｌ／容器＊生成物１．２ｇ／Ｌ＝生成物９．６グラム、因子７．５となり、Ｃフロー構成と比べて、装置の効率的でない使用である点に留意のこと。更に、８つの対応する流加培養発酵は、経費面、労働集約の点で非常に高く、１つのＣフロー発酵に比べて、性能が変動する傾向にある。
【００１８】
いくつかの他の観察結果が妥当である。例えば、配管の詰まり、供給ボトルの振れ、酸素供給の中断、または過剰に誘導された培養の結果として、偶発的な動作上の破壊が発生した。迅速に回復できるＣフローシステムは優れている。流加培養発酵においては、嫌気性の合間または細胞生育を緩徐にするあらゆる事象により、グルコースの顕著な累積を急速にもたらし、回復が困難であるか、または不可能である生理学的ランナウェイフィードバックループとなる。Ｃフローシステムにおいては、こうした事象が発生することはない。その理由は、高密度でのバイオリアクタを維持するためのグルコース供給量が、こうした発生を引き起こすのに必要である量よりもきわめて少なく、このため、ランナウェイフィードバックループが容易に発生することがないためである。酢酸塩は、嫌気性状態が数時間持続する場合を除き、形成され得るが、酢酸塩は、きわめて高い毒性レベルに到達し得る前に、再度同化させるか、または流し出す。
【００１９】
以下の計算は、ペリプラズム試験タンパク質から収集されたデータに基づき、Ｃフロー発酵槽で生成されるタンパク質の慎重な見積もり値を提示する。本試験タンパク質の流加培養発酵は、完了して、流速約６Ｌ／１６８時間にて発酵をもたらすまでに１週間を要し、この流速は約０．０３Ｌ／時間に等しく、生成収量１ｇ／Ｌであり、合計５．０４ｇの試験タンパク質を生成する。また、１Ｌ実験室プロトタイプＣフローシステムは、１ｇ／Ｌ、流速２．４Ｌ／ｄａｙ（０．１Ｌ／時間）で、実容量１Ｌを用いて試験タンパク質を生成する。同システムにおいては、Ｃフローシステムは、試験タンパク質１６．８ｇを送達し、これは実容量の１／６から試験タンパク質の量の３倍であるか、または約１８倍以上、効率が良い。
【００２０】
このため、１２．５Ｌ容器を必要とし、標準コンタミネントフードに都合よく嵌合できる最も大きいサイズである６Ｌ  Ｃフローシステムは、１年間連続して動作させるようにした。これにより、ＯＤ６００が２５０で３０００Ｌの発酵物を生成し得る。これは、１回稼働する発酵槽の実容量（能力）は、３０００Ｌ、または１年間、２週ごとに稼働する流加発酵槽の実容量１２０Ｌに一致する。外挿すると、Ｃフローシステムにより、１年当たり１ｇ／Ｌで３ｋｇ、または６ｇｍ／Ｌで１８ｋｇ／ｙｒの試験タンパク質を生成する。これは、上記のとおり行われた観察結果と一致し、１回限りで実施するＣフローにおいて、生産性がそれぞれ同じ経過時間稼働させた流加培養の約２０倍となる。
【００２１】
費用効果の改善度は、発酵の延長させ得る程度に比例して非常に大きく、また、宿主細胞の低突然変異率及び突然変異の選択を減少させる２つのチェンバ発酵槽設計の使用に直接相関する。本明細書に記載の実施例で使用される実容量スケールが１Ｌであっても、Ｃフローシステムでは、より多くのタンパク質産物が生成することが観察され、１０Ｌスケールの培養発酵さえも同じ時間スケールで生成可能である。
【００２２】
Ｃフロー対流加培養の費用効率計画は次表に示す。
【表１】
2020171331.tif 000003
【表２】
2020171331.tif 000004
流加培養連続生成の費用効果の算出では、５Ｌ流加培養発酵は毎週、１００Ｌ発酵は隔週で繰り返し行われ得ると想定して概算する。それぞれの発酵量を、１回の発酵当たりの定価で評価した。Ｃフローは、実験によって提示された２つの流量を用いて、１Ｌ容量としてモデル化し、比例として、５Ｌ連続流量を測定した。Ｃフロー費は、設置作業及び設置後のわずかなメンテナンス作業のみに対して、１週間と想定したものである。
【００２３】
上表は、Ｃフロー発酵時間が長くなるにつれて、試験タンパク質の予測された１グラム当たりの費用が下がることを示す。これは、実施費用が開始時費用よりかなり低いためである。発酵を４週から６週に延長することによってこのＣフローの利点が増えることが認められており、２週の時点であってもその利点は重要な事象であり、これは一般的な生成活動の範囲内である。４つすべてのＣフロー生成速度により、４〜６週までのこの利点が示される。実験結果により、本明細書に記載の現在のＣフロー構成によって、このレベルに到達できることが示唆される。更に驚くことに、流速０．５Ｌ／時間での５Ｌ  Ｃフローは、同一期間において、試験タンパク質１グラム当たり１／６の費用で３０％以上の生成物を生成することから、１００Ｌ発酵槽よりも優れた性能となり得る。このように同じＣフローシステムにより、４２００Ｌ回分培養発酵槽と同じ生成量を１年間で生成できる。
【００２４】
当業者は、Ｃフローシステムは、従来の回分または流加発酵システムよりも、顕著に多い量の生体産物を生成し得ること、及び、Ｃフローシステムの物理的接地面積が、同等の従来の発酵システムよりも顕著に小さいことを理解するであろう。現在の用途またはポータブルもしくはモバイル式用途であっても、既存の一連の発酵内でのコンタミネントフードまたは他の限定された空間との使用に適した１つの統合ユニットとしてのＣフローシステムの生成を意図している。こうした統合Ｃフローシステムは、特定の培地貯蔵部に連結され、所望の生成有機体を接種し、かつセンサーモニター及び下流の処理システムに、生成運転終了時に廃棄し得る１つの使い捨て可能な統合装置としての発酵操作の助けとなる方法で取り付け得るように、流入口及び流出口配管ならびに監視センサーへの電子アクセスを備えてもよい。
【００２５】
Ａ．マルチ重量測定式システム
マルチ重量測定供給流入が使用できるように、標準発酵装置に対するいくつかの固有の改良形態も意図される。
【００２６】
１つのこうした改良は、Ｅテープセンサーと称され、改良発酵容器内で培養レベルの連続監視を行うために提供される。器具自体は、導線を含む粘着耐久性柔軟フィルムを備え、任意により、フィルム全体にわたって均圧にするのに好適な、柔軟フィルムの長手方向軸線に沿って離間配置させた穴を備える。導線は、容器壁内のポートに適合するように配置させ、例えば図４に示すような気密及び水密封入部を介して、外部伝導度センサーに接続させる。
【００２７】
別の改良形態は、さまざまな組み合わせ及び比率で添加させる供給成分を分離することができる複合供給流入のためのシステムを備える。こうしたシステムは、実験設計（ＤＯＥ）を容易にするのみでなく、設計操作パラメータが一旦決定されると、沈降、変色、または供給材料成分間での他の化学的もしくは物理的交差反応のおそれなく、高濃度の供給材料を使用し得るために有用である。こうした交差反応の１つの一般的な例は、リン酸塩と微量要素材料中に存在する特定の金属（カルシウムまたはマグネシウムなど）との相互作用であり、その結果、リン酸カルシウム結晶またはリン酸マグネシウム結晶の沈殿となる。こうした方法の複合構成が可能である。図５ａは、複数のポンプ、複数のはかり構成を用いるマルチ重量測定式供給システムを示す。図５ｂは、１つのはかり及び２つのポンプシステムを有するマルチ重量測定式供給システムを示す。図５ｃは、１つのはかり、２つのソレノイド構成を有するマルチ重量測定式供給システムを示す。
【００２８】
図６に示す全体の制御スキームにおいては、蠕動ポンプは、管の直径に応じて制御電圧（０〜５ｖ）に比例する速度で容量を送達する。校正は、ポンプ速度に対して特には直線性ではなく、粘度及び圧送圧力の変動ならびに他の偶然要因により、安定していない。時間の経過と共に、管は変形、摩耗し、弾性の時定数を変化させ、また温度によって変動し得る。こうした非直線性であり、かつ予測不可能な変動を解決するために、デジタル式はかり上でのボトルからのフィードバック制御により、長期安定性及びポンプ速度の正確性が得られる。
【００２９】
発酵用途においては、栄養素の供給が指数関数、線形関数または階段関数などの限定されたプログラムに準拠するように記載されてもよい。圧送は、プログラムされた曲線が１分〜５分の時間スケールで正確である限り、いくぶん間欠的であってもよい。これによって、フィードバックループによる重量による制御が良好な設計上の選択となる。
【００３０】
多くの場合、発酵の供給曲線は、非常に速度がゆっくりであるものも含め、幅広い範囲のポンプ速度を網羅する。低ポンプ速度では、蠕動ポンプは問題である。特定の電圧以下の場合、機能が停止する。低ポンプ速度を必要とする場合、いくらかの送達を行うために必要なゼロから最少電圧の間のポンプ速度信号のパルス幅変調は、最良の解決法である。
【００３１】
発酵には、多くの場合、圧送させる複数の基質を必要とする。複数のポンプとする理由の１つは、原液中の沈殿を回避するためである。例えば、マグネシウム、リン酸塩及び糖液は、細胞が、これらを取り込むときと同じ速度で異なるボトルからゆっくり供給されてもよい。このため、培地内に累積することがない。２つ目の理由は、蒸発またはｐＨの変化など、偶発的な変動を制御するためである。
【００３２】
デジタル式はかり及び蠕動ポンプは高価であることから、多重化するだけの価値がある場合もある。１つのはかりを使用して、いくつかのポンプを制御することは、合理的な第１のステップである。複数の飼料に同じポンプを使用することは可能ではあるが、不適合な基質の混合を回避するために注意が必要である。重量による制御下では、安定性の乏しい安価なポンプか、またはパルス送達ポンプであっても、発酵槽での飼料用途における全安定性が考慮される限り、良好に実施可能である。
【００３３】
例は、液体洗剤にて販売されている種類と同様の空気式またはばね式ピストンポンプボトルにより加圧されるシステム内のソレノイド弁であってもよい。これらは、ソレノイドにより直接起動させることもできる。
【００３４】
マルチ重量測定式システムを確実に構成するために、次のステップの一部またはすべてに標準プロトコルを効率の良く取り込む必要がある。本明細書に示すステップは、図７に示すとおり、１つのはかり、４つのプッシュポンプ構成を適切に構成するために必要であることから決定されたステップである。ステップ１では、自重飼槽プログラムを設定する必要があり、ステップ２では、ポンプｎの目標重量を決定する必要がある。ステップ３では、ボトルｎの自重を回復させ、ステップ４では、はかりを読み取り、ステップ５では、自重ｎを減算する。ステップ６では、圧送量を決定し、ステップ７では、ポンプ速度の見積もり、設定を行い、ステップ８では、新たな自重ｎを記憶して、次のポンプに移行する。このプロセスは、繰り返し行う。
【００３５】
Ｂ．散気管の改良
効率良く気体、通常は酸素を発酵容器に送達させるには、容器は、その容器内で細胞に対する有効性を最大限にする形態で、気体を培養液にのみ送達させる必要がある。図８は、散気気体の発酵容器のヘッドスペースへの分布を最小限にするためのシースシステムを示し、これにより、有効な実容量を有する１つの発酵槽において１つの散気ユニットを効率良く使用することができる。本システムは、散気要素の外側面を密接して係合させるメタルジャケットに固定させた気体不透過性膜を備える。図８に示すとおり、培養レベル上で散気管を封入するために、かつ気体がヘッドスペースに放出されないようにするために、培養容量が増えるか、または減少するにつれて、それぞれ装置を上げるか、または下げる。
【００３６】
発酵容器内の気体分布を更に改善するために、発酵容器の最大内径未満の外径を有する複数の平らな円板を固定させるときに、散気管（シースシステムの有無にかかわらず）を金属シャフト内に嵌合するように構成させる。金属シャフトの頂部及び底部は、加圧気体のみが小孔（好ましくは１〜５ミクロンの有孔性）を通って分散し得るように封入させ、その時にこれらの気体を平らな円板の間で分離させる。これらは、ヘッドスペースへの気泡の逸脱を遅延させるためにバッフルシステムとして有用である。こうしたシステムは、図９に示す。
【実施例】
【００３７】
実施例１
縮小ゲノム細菌株は、非縮小ゲノム細菌株よりも連続発酵において更に安定し、発酵の過程においてより高い生成収率となる。
延長Ｃフロー発酵において、縮小ゲノム細菌株がタンパク質を生成する能力を試験するために、ペリプラズム試験タンパク質（ＣＲＭ１９７）を測定した。Ｃフロー実験では、低突然変異株Ｅ．ｃｏｌｉ  ＭＤＳ６９  ｍｅｔａ  ΔｒｅｃＡ（遺伝的に安定し、かつ発酵中代謝的に効率が良いように遺伝子組換えが行われたもの）または一般的に使用されるＥ．Ｃｏｌｉ生成株（ＢＬ２１／ＤＥ３、ＢＬＲ及びＭＧ１６５５  ΔｒｅｃＡなど）を使用した。これらの株のそれぞれの収率プロファイルを比較すると（図１０に示す）、縮小ゲノム株が、Ｃフロー発酵において一般的に使用される生成株に対して、タンパク質の生成を顕著に改善することがわかる。
【００３８】
これらの実験においては、全株が、選択マーカーとしてカナマイシン（国際公開第ＷＯ／２０１５／１３４４０２号に記述され、その全体が参照によって本明細書に援用される）（Ｓｃａｒａｂ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ＬＬＣ（Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）より市販されている）を用いて、プラスミドｐＳＸ−２  Ｔ５ｌａｃＯをベースにした同じＣｒｍ１９７発現プラスミド構造体により形質転換させた。いずれの菌株も図１及び図２に示すように構成されたＣフローシステムで試験を行った。シード容器及び生成容器において、ＯＤ約２００にて、温度を２５℃に安定させて、ケモスタットを安定操作した後、生成容器内の培養液を１００μΜ  ＩＰＴＧで誘導した。試験タンパク質は、誘導して数時間以内に、全細胞ホモジネート試料中で特定され、その後の数日にわたって増加したことがわかった。誘導開始後１〜３日以内に、試験タンパク質レベルは回分培養発酵において得られた収率とほぼ同じまたは超えるピーク値に到達した。明らかに、通常使用される生成株のみ、短期間、試験タンパク質のピークレベルとなり、その後生産性は、急速に低下し始めた。連続培養を開始して数日間内に、これらの株の生産性は、生成物０．５ｇ／Ｌ以下まで低下し、場合によっては、培養液は、完全に崩壊した（溶解したか、またはｗａｓｈ  ｏｕｔした）。対照的に、縮小ゲノム細菌株は、引き続き、発酵過程全体にわたって細胞密度も依然として高い状態で、４週以上にわたり高レベルの生成物を生成した。
【００３９】
本明細書に記載の比較的スケールの小さいＣフローシステム（流速０．２５Ｌ／時間で作業発酵容量約１Ｌ）においては、縮小ゲノム細菌株は、１ヶ月の過程でＣＲＭ１９７約１００ｇを生成した。典型的なＥ．ｃｏｌｉ株（ＢＬ２１／ＤＥ３、ＢＬＲ及びＭＧ１６５５  ΔｒｅｃＡ）は、それぞれの発酵過程にわたって、５ｇ未満のＣｒｍ１９７を生成し、いずれも培養液が崩壊するまで１週間以上継続しなかった。全体のピークレベルが低い試験タンパク質の生成に加えて、非変性Ｅ．Ｃｏｌｉ株は、生成ピークレベルを数日間持続することのみ可能であり、その一方で、縮小ゲノム発現株は、発酵の期間を延長した１か月以上全体にわたって、ピーク発現を持続した。崩壊の理由は依然として不明であるが、場合によっては、細胞溶解、内在性プロファージまたは他の溶原性要素が誘導された結果によるものと考えられ、他の場合には、発酵物の配列分析により、培養液が他の微生物により汚染されていることが示され、また、観察された培養液崩壊は、毒素またはこうした汚染物質により生成された他の化合物が原因である可能性もある。重要なことに、縮小ゲノム細菌発酵は、培養崩壊を受けることなく、こうした株の遺伝的安定性の向上により、株自体からの溶解要素のいかなる誘導機会も最小限に抑えられることが示された。更に、汚染物質からの縮小ゲノム細菌へのいかなる有害性の影響もないことから、シード容器から生成容器へ非汚染縮小ゲノム細菌を連続導入することにより、汚染能力を最小限に抑えて、生成容器を支配することが示唆される。
【００４０】
上述のハードウェアの改良を含み、かつ遺伝的安定性が向上し、代謝能が改善された縮小ゲノム菌株を含むＣフロー発酵システムは、現在、発酵に使用されている典型的なＥ．ｃｏｌｉ株よりも少なくとも２０倍の生成物の生成が可能である。本明細書に記載の重量測定式供給構成などの改良形態と散気管の改良形態とを組み合わせたもの、及び縮小ゲノム細菌株では、延長させたＣフロー発酵により、比較的少量の発酵物から大量の生成物を生成できる。本明細書に記載のハードウェアシステムの改良により、発酵パラメータの更に頑強な制御が可能であり、かつ機械的システムの信頼性を向上させ、また、発酵有機体の改善された遺伝的安定性により、培養液の寿命が改善され、内在性プロファージの誘導、遺伝子再配列、または外因性汚染物質による培養崩壊の危険を最小限に抑える。ハードウェア改良形態のこの独自の組み合わせ及び株の改良形態により、現在の株及び方法と比較して、高レベルでタンパク質及び他の発酵産物を生成するための安定した高生産性プラットフォームとなる。
【００４１】
実施例２
連続発酵における縮小ゲノム細菌株により、多くの異なるタンパク質がより高い生成収率となる。
Ｃｒｍ１９７試験タンパク質の生成特有のものであるが、Ｃフロー発酵システムにおいて縮小ゲノム細菌を使用する利点を判定するため、２つの追加の試験タンパク質の試験を行った。組換えＥＰＡ（ｒＥＰＡ）は、ワクチンをコンジュゲートするために、担体タンパク質として高頻度で使用されるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来の細胞外タンパク質Ａの組換え変異体である。Ｃｒｍ１９７のように、ｒＥＰＡタンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉｉにおいて生成するのは困難であり、最適化された回分発酵において、一般的な収率は約０．１ｇ／Ｌである。別のタンパク質、ヒトゲルソリンの試験も行った。ゲルソリンは、一般的には、最適化された回分発酵において生育させた典型的なＥ．ｃｏｌｉ生成株によって、２ｇ／Ｌ未満にて生成する。
【００４２】
ｒＥＰＡをコードする遺伝子は、ｐＳＸ−２  Ｔ５ｌａｃＯプラスミド発現系にクローン化し、標準微生物法を用いてＭＤＳ６９  ｍｅｔａ  ΔｒｅｃＡに形質転換させた。形質転換細胞は、二重タンク１Ｌ実容量Ｃフローシステムに接種し、実施例１に記述したとおり発酵を行った。図１１に示すとおり、２０日間でｒＥＰＡ約２ｇ／Ｌを生成した誘導細胞により、測定された全収率は、約２５ｇであった。これと比較して、４つの連続した１０Ｌ実容量回分発酵では、同じ期間でｒＥＰＡ約３ｇを生成する（同じ２０日間で１回の発酵当たり５日間の折り返しスケジュールと想定する）。
【００４３】
ヒトゲルソリンを最適化したコドンコード遺伝子は、ｐＳＸ−２  Ｔ５ｌａｃＯプラスミド発現系にクローン化し、標準対微生物法を用いてＭＤＳ６９  ｍｅｔａ  ΔｒｅｃＡに形質転換した。形質転換細胞は、二重タンク１Ｌ実容量Ｃフローシステムに接種し、実施例１に記述したとおり発酵を行った。図１２に示すとおり、誘導細胞は、６日間で約１０〜１４ｇ／Ｌのゲルソリンを生成し、その結果、測定された合計収量は２７ｇであった。この場合、Ｃフロー器具は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔの予定外のソフトウェアの更新により、予定より早く終了した。比較すると、実容量１０Ｌの回分発酵では、通常、ほぼ同じ時間スケールで１８ｇ未満のゲルソリンを生成する（同じ２０日間で１回の発酵当たり５日間の折り返しスケジュールと想定する）。
【００４４】
いずれの場合においても、Ｃフローシステム内で生育させた試験対象の縮小ゲノム細菌は、最適化された回分培養内で生育した典型的な株から観察されたものより、顕著に高レベルで試験タンパク質を生成した。このことは、縮小ゲノム細菌とＣフロー発酵との組み合わせにより、従来の発酵株及び方法よりも、長期間にわたって、低費用で、効率良く、比較的高レベルの貴重なタンパク質生成物の生成が可能な生成プラットフォームが提供されることを示す。
【図１】
2020171331.tif 000005
【図２】
2020171331.tif 000006
【図３】
2020171331.tif 000007
【図４】
2020171331.tif 000008
【図５Ａ】
2020171331.tif 000009
【図５Ｂ】
2020171331.tif 000010
【図５Ｃ】
2020171331.tif 000011
【図６】
2020171331.tif 000012
【図７】
2020171331.tif 000013
【図８】
2020171331.tif 000014
【図９】
2020171331.tif 000015
【図１０】
2020171331.tif 000016
【図１１】
2020171331.tif 000017
【図１２】
2020171331.tif 000018