(57)【要約】【課題】油田内に常在し、バイオサーファクタントを生産可能な新規微生物を提供する。【解決手段】この新規微生物は、バイオサーファクタント生産能を有するバチルス  エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）  Ｓ１０５３株（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２８３９）である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
バイオサーファクタント生産能を有する新規微生物バチルス  エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）  Ｓ１０５３株（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２８３９）。
【請求項２】
請求項１に記載の新規微生物を用いて行うことを特徴とする石油増進回収方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオサーファクタント生産能を有する新規微生物及びこの新規微生物を用いて行う石油増進回収方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
自然界には、種々の微生物が存在し、それらの中には有用な性状を有するものが数多く存在しており、従来から微生物の持つ有用な性状を利用する技術が研究されている。そのような技術として、例えば、石油の増進回収法（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｏｉｌ  Ｒｅｃｏｒｖｅｒｙ；ＥＯＲ）に微生物を用いる技術（特許文献１及び２参照）が提案されている。
【０００３】
地下の岩石層等の石油貯留層に存在する石油は、一般に、油井を掘削し、油田内の圧力で原油を油井の試錐孔まで押し上げることによって取り出すことができるが、石油を回収する際に、油田内圧力が経時的に衰退することや、油−水間の界面張力が高いこと、石油の粘度が水と比較して高いこと、油田内の構造が不均一であることなどが要因となって、５〜２５％程度しか回収できないといわれている。
これらの要因の少なくとも一部を克服して回収率を向上させることを目的としている技術がＥＯＲ技術である。ＥＯＲ技術には、特許文献１及び２に記載されているような微生物を用いた微生物攻法（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｏｉｌ  Ｒｅｃｏｒｖｅｒｙ；ＭＥＯＲ）の他、熱攻法やケミカル攻法などが提案されている。中でもＭＥＯＲは、微生物を栄養液とともに油田内に導入、或いは、栄養液を油田内に導入し、微生物が生産する物質や微生物自体によって種々の石油増進回収効果が現れる技術であり、他の攻法と比較して、初期投資が少なく、ランニングコストも小さいため経済性に優れ、更に、微生物が生産する物質が自然分解性であることから、環境面でも優れているという大きな利点があり、その実用化が切望されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２０１０−５３５２７１号公報
【特許文献２】特表平０３−５０５１０６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、ＭＥＯＲ技術は、１９２６年に提唱されて以降研究が進められ、１９４０年代〜１９５０年代にかけて多くの適用例があるにもかかわらず、油田に導入する微生物と石油増進回収効果との因果関係や、異なる油田における石油増進回収効果の確実性が明らかになっていなかったことなどが要因となり、未だ実用化に至っていないという実情にある。即ち、ＭＥＯＲ技術の実用化を実現する上では、石油増進回収効果が発現するメカニズムを解明し、石油増進回収効果を発現させるための条件（使用する微生物の種類やサイズや増殖条件、栄養剤等）を模索することが重要である。
【０００６】
ここで、ＭＥＯＲにおいて石油増進回収効果が発現するメカニズムとしては、種々のメカニズムが推察されているが、その１つとして、微生物による界面活性剤様物質（バイオサーファクタント）の生産に起因するメカニズムがある。このメカニズムは、微生物によって生産されたバイオサーファクタントが油−水間の界面張力を低下させることによって、石油増進回収効果が発現するというものである。
【０００７】
しかしながら、上記メカニズムは推察されたものに過ぎず、実際に、上記のようなメカニズムによって石油増進回収効果が発現しているかは否か未だ明確にはなっていない。上記メカニズムによって石油増進回収効果が発現することを明らかにするためには、油田内に常在し、且つバイオサーファクタントを生産可能な微生物を分離・同定すること、そのような微生物を分離・同定した上で、当該微生物を用いた石油増進回収方法によって実際にどのようなメカニズムで石油増進回収効果が発現するかを検証することが、ＭＥＯＲ技術の実用化を図る上で極めて重要である。
【０００８】
本発明は以上の実情に鑑みなされたものであり、バイオサーファクタント生産能を有する新規微生物及びこの新規微生物を用いて行う石油増進回収方法の提供を、その目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本願発明者らは、油田中に常在し、バイオサーファクタント生産能を有する微生物を鋭意スクリーニングした結果、油田中からバチルス属に属し、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）に近縁な新菌株バチルス  エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）を分離・同定し、当該微生物がバイオサーファクタント生産能に優れることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１０】
即ち、上記目的を達成するための本発明に係る新規微生物は、バイオサーファクタント生産能を有する新規微生物バチルス  エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）  Ｓ１０５３株（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２８３９）である。
【００１１】
この新規微生物は、好気培養条件下において有意なバイオサーファクタント生産能を有し、特に、硝酸塩を還元せず、１０％ＮａＣｌ存在下で生育する点で既知のバチルス・リケニフォルミスと異なる生理・生化学的性状を示す。
【００１２】
また、本願発明者らは、上記新規微生物を石油増進回収方法に使用した場合の石油増進回収効果を簡易的な実験を行い評価したところ、新規微生物が生産したバイオサーファクタントによって油−水間の界面張力が低下し、有意な石油増進回収効果が現れることを確認した。
【００１３】
即ち、本発明に係る石油増進回収方法は、上記新規微生物を用いて行うものである。
【００１４】
上記石油増進回収方法によれば、バイオサーファクタント生産能を有する上記新規微生物を用いることで、微生物が生産したバイオサーファクタントによって油田中の油−水間の界面張力を低下させることができ、これにより、石油増進回収効果が発現して石油の回収率の向上を図ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】油層水又は圧入水と原油とを混合したサンプルとＢＳ濃度との関係をまとめたグラフである。
【図２】石油増進回収効果評価装置の概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明に係る新規微生物及び当該新規微生物を用いた石油増進回収方法について説明する。尚、以下に好適な実施例を記すが、これら実施例はそれぞれ、本発明をより具体的に例示するために記載されたものであって、本発明の趣旨を逸脱しない範囲において種々変更が可能であり、本発明は、以下の記載に限定されるものではない。
【００１７】
〔新規微生物バチルス  エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）  Ｓ１０５３株〕
本発明の微生物は、バチルス属に属し、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）に近縁な新菌株バチルス  エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）  Ｓ１０５３株（以下、単に「Ｓ１０５３株」ともいう）であり、このＳ１０５３株は、好気培養条件下において有意なバイオサーファクタント生産能を有する。
【００１８】
〔スクリーニング〕
上記Ｓ１０５３株のスクリーニングは以下の手順で行った。まず、油層水又は圧入水４０ｍｌと原油０．１ｍｌとを混合したサンプルを作製し、これらを４７℃、好気条件下又は嫌気条件下で培養した。その後、培養後の各サンプルについて、油−水間の界面張力を測定し、バイオサーファクタントの濃度（ＢＳ濃度：ＴｒｉｔｏｎＸ１００換算）を算出して、バイオサーファクタントの生産の有無を検証した。検証の結果、抗菌剤の有無にかかわらず、好気条件下においてバイオサーファクタントが生産されたことから、サンプル中にバイオサーファクタント生産能を有する微生物が存在することを確認した。尚、図１は、各サンプルとＢＳ濃度との関係をまとめたグラフであり、図１において、「圧入水Ａ」と「圧入水Ｂ」とは採取した日時が異なるものである。
【００１９】
次に、人工海水及び酵母エキス（０．１％）を添加した寒天培地を作製し、上記と同様の方法で作製した各サンプルをそれぞれ別々の寒天培地に接種し、４７℃、好気条件下で培養し、目視で形態の異なるコロニーを抽出した。
【００２０】
その後、抽出した各々のコロニー、人工海水及び酵母エキス（０．１％）を含む溶液をバイアルに封入して４７℃、好気条件下で培養し、各コロニーのサンプルごとに油−水間の界面張力を測定して、上記ＢＳ濃度を算出し、バイオサーファクタントの生産の有無を確認することで、バイオサーファクタント生産能を有するＳ１０５３株を単離した。このＳ１０５３株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに、新規微生物バチルス  エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）  Ｓ１０５３株（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２８３９）として寄託されている。
【００２１】
〔Ｓ１０５３株の分類〕
テクノスルガ・ラボ微生物同定システムを用いたＤＢ−ＢＡ１２．０及び国際塩基配列データベースに対するＢＬＡＳＴ相同性検索の結果、単離したＳ１０５３株の１６Ｓ  ｒＤＮＡ部分塩基配列は、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）の基準株（アクセッション番号：ＡＥ０１７３３３）に対し相同率９９．７％の相同性を示した（表１及び表２）。尚、表１は、ＤＢ−ＢＡ１２．０に対する相同性検索の結果、表２は、国際塩基配列データベースに対する相同性検索の結果である。
【００２２】
【表１】
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【００２３】
【表２】
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【００２４】
また、ＤＢ−ＢＡ１２．０に対する相同性検索で得られた塩基配列を基に解析した分子系統樹において、Ｓ１０５３株が、バチルス属が構成するクラスター内に含まれ、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）の基準株とクラスターを形成し近縁であることが示された。
【００２５】
〔Ｓ１０５３株の生理・生化学的性状〕
上記単離したＳ１０５３株の生理・生化学的性状について示す。表３には、Ｓ１０５３株に関する形態観察、並びにカタラーゼ反応、オキシダーゼ反応、ブドウ糖からの酸／ガス産生及びブドウ糖の酸化／発酵（Ｏ／Ｆ）についての試験結果を示した。尚、形態観察は、オリンパス株式会社製の光学顕微鏡ＢＸ５０Ｆ４を用いて行い、グラム染色には、日水製薬株式会社製のファイバーＧ「ニッスイ」を用いた。また、カタラーゼ反応、オキシダーゼ反応、ブドウ糖からの酸／ガス産生及びブドウ糖の酸化／発酵（Ｏ／Ｆ）に関する試験は、Ｂａｒｒｏｗ及びＦｅｌｔｈａｍ（Ｂａｒｒｏｗ  Ｇ．Ｉ．  ａｎｄ  Ｆｅｌｔｈａｍ  Ｒ．Ｋ．Ａ．：Ｃｏｗａｎ  ａｎｄ  Ｓｔｅｅｌ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｉｎｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉａ．３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ．  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ．（１９９３））の方法に基づき行った。
【００２６】
【表３】
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【００２７】
表３に示すように、Ｓ１０５３株は、運動性を有するグラム陽性桿菌であり、芽胞を形成し、カタラーゼ反応は陽性、オキシダーゼ反応は陰性を示す。これらの性状は、バチルス属の性状と一致する。
【００２８】
次に、ＡＰＩ５０ＣＨＢによる試験を製造業者のプロトコルに従って行った。表４には発酵性試験の結果、表５には生化学試験の結果を示す。
【００２９】
【表４】
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【００３０】
【表５】
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【００３１】
表４及び表５に示すように、Ｓ１０５３株は、グリセロールやリボース、ガラクトース、フラクトースなどを発酵し、エリスリトールやアドニトール、ズルシトールなどを発酵せず、硝酸塩を還元しない。
【００３２】
表６には、Ｓ１０５３株の生理・生化学的性状に関する追加試験の結果を示す。
【００３３】
【表６】
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【００３４】
表６に示すように、Ｓ１０５３株は、５０℃で生育し、１０％ＮａＣｌ存在下でも生育する。また、カゼイン及びでんぷんを加水分解する。
【００３５】
生理・生化学的性状に関する試験結果から、Ｓ１０５３株は、１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列解析の結果において近縁と示唆されたバチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）の性状と比較して、硝酸塩を還元しない点及び１０％ＮａＣｌ存在下でも生育する点が異なる。
【００３６】
以上の結果から、Ｓ１０５３株をバチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）に近縁のバチルス  エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）と同定した。
【００３７】
〔Ｓ１０５３株を用いた石油増進回収効果の検討〕
Ｓ１０５３株を用いた石油増進回収効果の検討は、図２に示す石油増進回収効果評価装置を用いて行った。
【００３８】
図２に示すように、石油増進回収効果評価装置は、ＨＰＬＣ装置Ｈとして用いられるステンレス鋼製のカラム筒１１（８ｍｍ（内径）×１００ｍｍ（長さ）  カラム体積５ｍｌ：株式会社センシュー製  型番ＡＴ−３１５２）に関東ロームを成分とする多孔質粉体（ＪＩＳ試験用粉体１−８種、日本粉体工業技術協会）からなる充填材１２を圧力約６ＭＰａで高速充填したカラム体１を備える。このカラム体１は、一般的なＨＰＬＣ装置Ｈのカラムとしてセットされる。
【００３９】
ＨＰＬＣ装置Ｈは、カラム体１を内部に保持して所定温度に加熱維持可能にする加熱装置２を備え、カラム体１に対し、充填液、原油、試料、有機溶媒を各別に選択供給自在にする複数のサンプルループ３１，３２を切替自在に接続してある供給路３が接続形成されており、カラム体１にこれら溶媒を圧入する供給ポンプ４を備えて構成してある。原油、試料、有機溶媒は、所定のサンプルループ３１，３２に収容された原油、試料、有機溶媒を押し出してカラム体１に搬送可能に構成してある。また、カラム体１を通過した各溶媒は、フラクションコレクター５に回収可能に構成してあるとともに、回収した溶媒の成分を分析可能に構成してある。
【００４０】
石油増進回収効果評価装置を用いた石油増進回収効果の検討は、以下の手順で行った。尚、サンプル溶液及びコントロール溶液を試料として使用し、サンプル溶液には、Ｓ１０５３株のスクリーニングにおいて、当該Ｓ１０５３株のコロニーをバイアルに封入して培養したものの水相（Ｓ１０５３株含有培養液）を使用し、コントロール溶液には、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を使用した。また、サンプル溶液使用時の原油には、上記Ｓ１０５３株のコロニーをバイアルに封入して培養したものの油相を使用し、コントロール溶液使用時の原油には、Ｓ１０５３株のスクリーニングにおいて、サンプルを作製する際に、油層水等に混合した原油と同じものを使用した。
【００４１】
まず、カラム体１の内部に充填液としてのＰＢＳを充填する平衡化工程を行い、ついで、カラム体１に原油を流通し、充填材１２に原油を保持させて、カラム体１内に模擬油層を作製した後、リン酸緩衝生理食塩水をカラム体１に流通し、カラム体１内部に残留する、充填材１２に保持されていない原油をカラム体１の外部に排出させた。
【００４２】
次に、所定温度（例えば、４０〜５０℃）に維持したカラム体１にサンプル溶液又はコントロール溶液を流通して、充填材１２から原油を流出させる流出工程を行った後、カラム体１内部に残留するサンプル溶液又はコントロール溶液をカラム体１の外部に排出させるために、ＰＢＳをカラム体１に流通した。その後、原油の流出が認められなくなったカラム体１に、原油を溶解する有機溶媒としてのジクロロメタンを流通して、充填材１２に保持された原油を回収する回収工程を行った。
【００４３】
そして、流出工程で流出した原油量と回収工程で回収した原油量とを基に増油率（＝（流出工程で流出した原油量）／（回収工程で回収した原油量）×１００）を算出した。
【００４４】
また、サンプル溶液及びコントロール溶液それぞれの流出工程で回収されたフラクションコレクター５内の溶液について、油−水間の界面張力を測定するとともに、測定した界面張力を基にＢＳ濃度（ＴｒｉｔｏｎＸ１００換算）を算出した。
【００４５】
表７は、これらの結果をまとめた表である。表７に示すように、サンプル溶液では、コントロール溶液と比較して、増油率が格段に高い、即ち、高い増油効果が発現しており、また、サンプル溶液は、コントロール溶液と比較して、界面張力が小さく、且つＢＳ濃度が高くなっている。
【００４６】
【表７】
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【００４７】
これらの結果から、Ｓ１０５３株がバイオサーファクタントを生産し、サンプル溶液中に含まれたバイオサーファクタントによって油−水間の界面張力が低下することで、充填材に取り込まれた原油が流出し易くなり、石油増進回収効果が発現することを確認でき、ＭＥＯＲ技術の微生物として、Ｓ１０５３株を好適に使用できることがわかった。
【００４８】
〔Ｓ１０５３株を用いた石油増進回収方法〕
以下、本発明に係る石油増進回収方法について説明する。この石油増進回収方法は、バイオサーファクタント生産能を有する新規微生物バチルス  エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）  Ｓ１０５３株を用いて行うものである。
【００４９】
一実施形態に係る石油増進回収方法は、ＢＳ濃度をモニタリングしながら地上に設置した曝気槽内でＳ１０５３株を殺菌剤存在下で培養した後、ＢＳ濃度が所定濃度となったＳ１０５３株を含む圧入水を注入井に導入する。
【００５０】
この一実施形態に係る石油増進回収方法によれば、油田内に導入した圧入水中のバイオサーファクタントによって、油田内の油−水間の界面張力が低下し、これにより、石油増進回収効果が発現するため、石油の回収率が向上する。また、この石油増進回収方法においては、殺菌剤の存在下でＳ１０５３株を培養するため雑菌の増殖が少なく、（１）硫化水素発生のリスクが少ない、（２）病原菌の発生リスクが低く、安全性が高い、（３）沈殿物が少なく、油田中の油層閉塞のリスクが少ない、（４）曝気槽内のＳ１０５３株の菌量を管理し易いという利点がある。更に、既存設備を利用することができるため、初期投資を抑えることができる。
【００５１】
尚、本発明に係る石油増進回収方法は、Ｓ１０５３株を微生物として使用する点を除き、その具体的な手順は特に限定されず、Ｓ１０５３株を微生物として使用し、ＭＥＯＲ技術として従来から行われている手順に沿って行うものであっても良い。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
本発明に係る新規微生物は、石油増進回収方法に好適に用いることができ、当該新規微生物を用いた石油増進回収方法は、石油の回収率を向上するために利用することができる。
【図１】
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【図２】
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