(57)【要約】【課題】Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ由来のフコシダーゼおよびそれを使用する方法の提供。【解決手段】本開示は、α−（１，２）、α−（１，３）、α−（１，４）、およびα−（１，６）フコシダーゼ活性を有するα−フコシダーゼに関する。本開示は、α−フコシダーゼを含む組成物、ならびにα−フコシダーゼを作製し、複合糖質におけるα−（１，２）、α−（１，３）、α−（１，４）、および／またはα−（１，６）結合型フコースの切断においてα−フコシダーゼを使用する方法にも関する。したがって、本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのフコースの改善された酵素加水分解のための組成物および方法を提供する。特に、本発明は、糖タンパク質の変性も機能悪化も起こさずに、天然糖タンパク質におけるコアフコースを効率的に切断するのに有用である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１４年５月２７日に出願された米国仮出願連続番号第（ＵＳＳＮ）６２／００３，１３６号、２０１４年５月２７日に出願されたＵＳＳＮ  ６２／００３，１０４号、２０１４年５月２８日に出願されたＵＳＳＮ  ６２／００３，９０８号、２０１４年７月２日に出願されたＵＳＳＮ  ６２／０２０，１９９号および２０１５年１月３０日に出願されたＵＳＳＮ  ６２／１１０，３３８号への優先権の利益を主張する。これらそれぞれの内容は、それらの全体が参考として本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
フコースは、複合糖質の多くのＯ−またはＮ−結合型オリゴ糖構造体の重要な構成成分である。フコース含有グリカンは、発達およびアポトーシスを含めた多数の生物学的事象に関与しており、炎症、がん、および嚢胞性線維症の病理に関与している。複合糖質の脱フコシル化は、複合糖質の生物学的効果を理解するための重要なプロセスである。
【０００３】
α−Ｌ−フコシダーゼ（α−フコシダーゼ）は、主にガラクトースまたはＮ−アセチルグルコサミンに付加されているフコースのα−（１，２）、α−（１，３）、α−（１，４）、およびα−（１，６）結合を加水分解することによる、複合糖質の非還元末端からのフコース残基の除去を司るエキソグリコシダーゼである。
【０００４】
ヒト血清ＩｇＧと治療用抗体はいずれも重度にフコシル化されていることが周知である。抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）は、治療用抗体の臨床的有効性を司る重要なエフェクター機能の１つであることが見出された。ＡＤＣＣは、抗体Ｆｃ領域へのリンパ球受容体（ＦｃｃＲ）の結合が引き金になって開始される。ＡＤＣＣ活性は、α−（１，６）結合を介してＮ−結合型Ｆｃオリゴ糖の最も内側のＧｌｃＮＡｃに付加されているフコースの量に依存する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
したがって、本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのフコースの改善された酵素加水分解のための組成物および方法を提供する。特に、本発明は、糖タンパク質の変性も機能悪化も起こさずに、天然糖タンパク質におけるコアフコースを効率的に切断するのに有用である。本発明の組成物および方法は、Ｆｃ融合タンパク質または治療用抗体などの抗体のＦｃ糖鎖工学を促進し得る。本発明によって、複合糖質上のフコース位置を識別するためのグリカン配列決定の応用を提供する。複合糖質は、糖脂質、糖タンパク質、オリゴ糖、または糖ペプチドであり得る。
【０００６】
一態様では、本発明は、配列番号１との少なくとも８５％の配列同一性を有するポリペプチドを含むα−フコシダーゼに関する。一部の実施形態では、α−フコシダーゼは、配列番号１との少なくとも８８％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。一部の実施形態では、α−フコシダーゼは、配列番号１との配列同一性を有するポリペプチドを含む。ある特定の実施形態では、α−フコシダーゼは、配列番号２との配列同一性を有するポリペプチドを含む。配列番号１および２は、８８％の配列同一性を共有する。
【０００７】
本明細書で記載されたフコシダーゼは、１つまたは複数のα（１，２）、α（１，３）、α（１，４）、およびα（１，６）結合型フコースを加水分解し得る。フコースは、複合糖質におけるＮ−および／またはＯ−結合型グリカン中に存在し得る。ある特定の実施形態では、α−フコシダーゼは、組換えＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  α−フコシダーゼである。
【０００８】
好ましい実施形態では、α−フコシダーゼは、４〜９の最適ｐＨを示す。
【０００９】
別の態様では、本発明は、上記のα−フコシダーゼを含む組成物に関する。組成物は、少なくとも１つのグリコシダーゼをさらに含み得る。一部の実施形態では、グリコシダーゼは、エキソグリコシダーゼであり得る。エキソグリコシダーゼは、シアリダーゼ、ガラクトシダーゼ、アルファ−フコシダーゼ、およびそれらの変異体を含むが、これらに限定されない。一部の実施形態では、グリコシダーゼは、エンドグリコシダーゼであり得る。エンドグリコシダーゼは、エンド−ベータ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（ＮＡＧ）、ＥｎｄｏＡ、ＥｎｄｏＦ１、ＥｎｄｏＦ２、ＥｎｄｏＦ３、ＥｎｄｏＨ、ＥｎｄｏＭ、ＥｎｄｏＳ、およびそれらの変異体を含むが、これらに限定されない。
【００１０】
本発明の組成物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの複合糖質の脱フコシル化を行うのに有用である。特に、本明細書で記載された組成物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの糖タンパク質のコア脱フコシル化を行うのに有用である。一部の実施形態では、コア脱フコシル化は、コアα（１，６）脱フコシル化である。ある特定の実施形態では、コア脱フコシル化は、コアα（１，３）脱フコシル化である。脱フコシル化は、糖タンパク質の変性も機能悪化も起こさずに行われ得る。
【００１１】
本発明の別の態様は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの複合糖質の脱フコシル化を行うための方法を提供する。本発明の方法は、複合糖質を、上記の本発明のα−フコシダーゼと接触させるステップを含む。複合糖質は、α（１，２）、α（１，３）、α（１，４）、およびα（１，６）結合型フコースから選択される１つまたは複数のフコースを含む。フコースは、複合糖質におけるＮ−および／またはＯ−結合型グリカン中に存在し得る。
【００１２】
一部の実施形態では、複合糖質は、糖タンパク質である。一部の実施形態では、糖タンパク質は、コアフコースを含む。一部の実施形態では、コアフコースは、コアα−（１，３）結合型フコースまたはコアα−（１，６）結合型フコースである。
【００１３】
一部の実施形態では、本方法は、複合糖質を、少なくとも１つのグリコシダーゼと接触させることをさらに含む。ある特定の実施形態では、グリコシダーゼは、エンドグリコシダーゼである。エンドグリコシダーゼは、Ｎ−グリカンにおけるオリゴ糖の可変部分を切り取るために使用される。本明細書で使用されるエンドグリコシダーゼの例は、エンド−ベータ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（ＮＡＧ）、ＥｎｄｏＡ、ＥｎｄｏＦ１、ＥｎｄｏＦ２、ＥｎｄｏＦ３、ＥｎｄｏＨ、ＥｎｄｏＭ、ＥｎｄｏＳ、およびそれらの変異体を含むが、これらに限定されない。エキソグリコシダーゼ
【００１４】
コア脱フコシル化に関して、複合糖質は、逐次または同時にエンドグリコシダーゼおよびα−フコシダーゼで処理され得る。コア脱フコシル化は、コアα（１，３）脱フコシル化またはα（１，６）脱フコシル化であり得る。
【００１５】
本発明の１つまたは複数の実施形態の詳細は、以下の説明に記載されている。本発明の他の特性または利点は、以下の図面およびいくつかの実施形態の詳細な説明から、および添付の特許請求の範囲からも明らかとなろう。
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
配列番号１または配列番号２との少なくとも８５％の配列同一性を有するポリペプチドを含むα−フコシダーゼ、および少なくとも１つのグリコシダーゼを含む組成物。
（項目２）
前記α−フコシダーゼが配列番号１または配列番号２との少なくとも８８％の配列同一性を有する単離ポリペプチドを含む、項目１に記載の組成物。
（項目３）
前記α−フコシダーゼが配列番号１に記載されたアミノ酸配列を有する単離ポリペプチドを含む、項目１から２に記載の組成物。
（項目４）
前記α−フコシダーゼが配列番号２に記載されたアミノ酸配列を有する単離ポリペプチドを含む、項目１から２に記載の組成物。
（項目５）
前記グリコシダーゼがエンドグリコシダーゼである、項目１に記載の組成物。
（項目６）
前記エンドグリコシダーゼが、エンド−ベータ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（ＮＡＧ）、ＥｎｄｏＡ、ＥｎｄｏＦ１、ＥｎｄｏＦ２、ＥｎｄｏＦ３、ＥｎｄｏＨ、ＥｎｄｏＭ、ＥｎｄｏＳ、およびそれらの変異体からなる群から選択される、項目４に記載の組成物。
（項目７）
前記グリコシダーゼがエキソグリコシダーゼである、項目１に記載の組成物。
（項目８）
前記酵素が組換えＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  α−Ｌ−フコシダーゼである、項目１に記載の組成物。
（項目９）
前記酵素が、複合糖質におけるＮ−および／またはＯ−結合型グリカン中に存在するα−（１，２）、α−（１，３）、α−（１，４）、およびα−（１，６）結合型フコースを加水分解し得る、項目１に記載の組成物。
（項目１０）
前記α−フコシダーゼが４〜９の最適ｐＨを有する、項目１に記載の組成物。
（項目１１）
複合糖質における１つまたは複数のフコースを除去するための方法であって、前記複合糖質を、配列番号１または配列番号２との少なくとも８５％の配列同一性を有するポリペプチドを含むα−フコシダーゼと接触させることを含む方法。
（項目１２）
前記α−フコシダーゼが、配列番号１に記載されたアミノ酸配列を有する単離ポリペプチドを含む、項目１０に記載の方法。
（項目１３）
前記α−フコシダーゼが、配列番号２に記載されたアミノ酸配列を有する単離ポリペプチドを含む、項目１０に記載の方法。
（項目１４）
前記複合糖質が、α−（１，２）、α−（１，３）、α−（１，４）、およびα−（１，６）結合型フコースから選択される１つまたは複数のフコースを含む、項目１０に記載の方法。
（項目１５）
前記α−（１，２）、α−（１，３）、α−（１，４）、および／またはα−（１，６）結合型フコースが、複合糖質におけるＮ−および／またはＯ−結合型グリカン中に存在する、項目１２に記載の方法。
（項目１６）
前記複合糖質が糖脂質、糖タンパク質、オリゴ糖、または糖ペプチドである、項目１０に記載の方法。
（項目１７）
前記複合糖質が糖タンパク質である、項目１４に記載の方法。
（項目１８）
前記糖タンパク質がコアフコースを含む、項目１５に記載の方法。
（項目１９）
前記コアフコースがコアα−（１，３）結合型フコースまたはコアα−（１，６）結合型フコースである、項目１６に記載の方法。
（項目２０）
１つまたは複数のエンドグリコシダーゼをさらに含む、項目１０に記載の方法。
（項目２１）
１つまたは複数のエンドグリコシダーゼが、エンド−ベータ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（ＮＡＧ）、ＥｎｄｏＡ、ＥｎｄｏＦ１、ＥｎｄｏＦ２、ＥｎｄｏＦ３、ＥｎｄｏＨ、ＥｎｄｏＭ、ＥｎｄｏＳ、およびそれらの変異体からなる群から選択される、項目１８に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、ＢｆＦｕｃＨの生化学的性質を示す。
【００１７】
【図２】図２（ａ）は、ＢｆＦｕｃＨのｐＨプロファイル、（ｂ）は、ＢｆＦｕｃＨの酵素活性に及ぼす温度効果、（ｃ）は、ＢｆＦｕｃＨの酵素活性に及ぼす金属イオン効果を示す。
【００１８】
【図３】図３は、リツキサンに関するＢｆＦｕｃＨ処理の時間経過を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
非フコシル化抗体は、著しく増加した親和性でＦｃｇＲＩＩＩα受容体に結合するので、Ｆｃグリカンにコアフコース残基が無いことによって、ＩｇＧのＡＤＣＣ活性が実質的に増加することが公知である。ＦｃｇＲＩＩＩα結合およびＡＤＣＣを改善するために、α−（１，６）フコシルトランスフェラーゼの発現レベルを無効にするまたは低減させる産生細胞株の開発を含めた、いくつかの戦略が、ＩｇＧのフコシル化を低減させるために開発された。フコシル化を低減させるための代替の戦略は、ＲＮＡｉを使用してα−（１，６）フコシルトランスフェラーゼ遺伝子をサイレンシングすることを含む。しかしながら、Ｎ−グリカンのコア脱フコシル化は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで酵素的に達成されることができていないが、これは、主に、Ｎ−グリカンが２つのＦｃドメイン間に埋め込まれているからである。酵素脱フコシル化効率は、立体障害によりはるかに低い。すなわち、フコース残基へのα−フコシダーゼの接近は、Ｆｃドメインの部分によってブロックされている。
【００２０】
いくつかのα−フコシダーゼが当技術分野で公知である。例は、Ｔｕｒｂｏ  ｃｏｒｎｕｔｕｓ、Ｃｈａｒｏｎｉａ  ｌａｍｐａｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｕｌｍｉｎａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、ウシの腎臓（Ｇｌｙｋｏ）、ニワトリの肝臓（Tyagarajanら、１９９６年、Glycobiology  ６巻：８３〜９３頁）からのα−フコシダーゼおよびＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｎｉｈｏｔｉｓ（Ｇｌｙｋｏ、ＰＲＯｚｙｍｅ）からのα−フコシダーゼＩＩを含む。また、一部のフコシダーゼは、市販されている（特に、Ｇｌｙｋｏ、Ｎｏｖａｔｏ、Ｃａｌｉｆ．；ＰＲＯｚｙｍｅ、Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ、Ｃａｌｉｆ．；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｏｒｐ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）。これらのα−フコシダーゼのいずれも、まず糖タンパク質を変性させることなしには、Ｎ−結合型グリカンからコアフコースを効率的に切断することができない。
【００２１】
ＷＯ２０１３／１２０６６は、ウシの腎臓からのα−フコシダーゼによる（Ｆｕｃαｌ，６）ＧｌｃＮＡｃ−リツキシマブの脱フコシル化を開示した。ＷＯ２０１３／１２０６６に記載されているように、（Ｆｕｃαｌ，６）ＧｌｃＮＡｃ−リツキシマブの反応混合物を、３７℃で２０日間、ウシの腎臓からのα−フコシダーゼ（Ｐｒｏｚｙｍｅから市販されている）とインキュベートすることで、（Ｆｕｃαｌ  ，６）ＧｌｃＮＡｃ−リツキシマブにおけるフコースを完全に除去した。免疫グロブリンの熱不安定は、当技術分野で公知である（Vermeerら、Biophys  J.  Jan  ７８巻：３９４〜４０４頁（２０００年）
）。Ｆａｂ断片は、加熱処理に最も感受性である一方、Ｆｃ断片は、ｐＨの減少に最も感受性である。ＷＯ２０１３／１２０６６に記載されているような、３７℃で２０日間などの長期の熱処理後に抗体がＣＤ２０への結合親和性を著しく失うことになると考えられている。
【００２２】
現在公知のα−フコシダーゼの制約は、いくつかのＮ−結合型グリカンの効果的な操作を妨げた。したがって、ヒト治療学の発達のためのＦｃ融合タンパク質または抗体のＦｃ糖鎖工学に適した新規なα−フコシダーゼが依然として必要とされている。
【００２３】
本開示は、Ｎ−結合型グリカンからコアフコースを効率的に切断することができる細菌α−フコシダーゼの予想外の発見に関する。
【００２４】
本開示は、Ｎ−結合型グリカンから複数のコアフコースを効率的に切断することができる細菌α−フコシダーゼの予想外の発見に関する。
【００２５】
一部の例では、α−フコシダーゼは、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓからのα−フコシダーゼ（ＢｆＦｕｃＨ）であり得る。一部の例では、α−フコシダーゼは、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎからのα−フコシダーゼ（ＢｔＦｕｃＨ）であり得る。α−フコシダーゼは、細菌、酵母、バキュロウイルス／昆虫、または哺乳動物細胞から発現され得る。一部の実施形態では、α−フコシダーゼは、組換えＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  α−フコシダーゼであり得る。一部の実施形態では、α−フコシダーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉから発現される組換えＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  α−フコシダーゼであり得る。
【００２６】
α−フコシダーゼは、１つまたは複数のα（１，２）、α（１，３）、α（１，４）、およびα（１，６）結合型フコースを加水分解し得る。フコースは、複合糖質におけるＮ−および／またはＯ−結合型グリカン中に存在し得る。フコースは、コアα−（１，３）フコースまたはコアα−（１，６）フコースであり得る。
【００２７】
スキーム１は、様々なフコース含有複合糖質を示す。
【化１】
2020171320.tif 000003
【００２８】
前記酵素に適した基質の例は、乳オリゴ糖、グロボＨなどのがん関連炭水化物抗原、ルイス血液型（ａ、ｂ、ｘ、ｙ）、ならびにシアリルルイスａ（ＳＬｅａ）およびｘ（ＳＬｅｘ）を含むが、これらに限定されない。当技術分野で公知の報告とは異なり、前記α−フコシダーゼは、末端シアル酸を切断することなく、シアリルルイスａ（ＳＬｅａ）およびｘ（ＳＬｅｘ）を加水分解し得る。乳オリゴ糖は、α−（１，２）、α−（１，３）および／またはα−（１，４）結合型フコースを有し得る。
組成物
【００２９】
本発明は、上記のα−フコシダーゼの組成物にも関する。α−フコシダーゼは、配列番号１との少なくとも８５％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。一部の実施形態では、α−フコシダーゼは、配列番号１との少なくとも８８％の同一性を有するポリペプチド、またはその機能的変異体を含む。一部の実施形態では、α−フコシダーゼは、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。一部の実施形態では、α−フコシダーゼは、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。配列番号２は、配列番号１との８８％の配列同一性を有する。
【００３０】
本明細書に記載の変異ポリペプチドは、アミノ酸配列が配列番号１または２におけるものとは異なるが、配列番号１または２のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む酵素の同じまたは類似した機能を示すものである。
【表１】
2020171320.tif 000004
【００３１】
本明細書では、配列に関するパーセント（％）配列同一性は、必要な場合、配列をアラインし、ギャップを導入して、最大パーセント配列同一性を達成した後、参照ポリペプチド配列におけるアミノ酸残基と同一である、候補ポリペプチド配列におけるアミノ酸残基の百分率として定義される。パーセント配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当技術分野の範囲内である様々な方法で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピューターソフトウェアを使用して達成され得る。当業者は、比較される配列の全長にわたる最大アラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含めた、アラインメントを測定するための適切なパラメーターを決定し得る。
【００３２】
本発明のα−フコシダーゼのポリペプチドは、それらの単離または精製を補助するために誘導体化または修飾され得ることが理解されよう。したがって、本発明の一実施形態では、本発明における使用のためのポリペプチドは、分離手段に直接的または特異的に結合する能力があるリガンドを加えることによって誘導体化または修飾される。あるいは、ポリペプチドは、結合対のうちの１つのメンバーを加えることによって誘導体化または修飾され、分離手段は、結合対の他のメンバーを加えることによって誘導体化または修飾される試薬を含む。任意の適した結合対が使用され得る。本発明における使用のためのポリペプチドが結合対のうちの１つのメンバーを加えることによって誘導体化または修飾される好ましい実施形態では、ポリペプチドは、好ましくは、ヒスチジンタグをつけられているまたはビオチンタグをつけられている。典型的に、ヒスチジンまたはビオチンタグのアミノ酸コード配列は、遺伝子レベルで含まれており、タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて組換えで発現される。ヒスチジンまたはビオチンタグは、ポリペプチドの一端に、Ｎ末端にまたはＣ末端に典型的に存在する。ヒスチジンタグは、６ヒスチジン残基から典型的になるが、それは、典型的に最大７、８、９、１０または２０アミノ酸のようにこれよりも長くても、または例えば５、４、３、２または１アミノ酸のように短くてもよい。さらに、ヒスチジンタグは、１つまたは複数のアミノ酸置換、好ましくは上記で定義した保存的置換を含有し得る。
組成物の適用
【００３３】
本発明の組成物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの複合糖質の脱フコシル化を行うために使用され得る。本発明の方法は、複合糖質を、上記の本発明のα−フコシダーゼと接触させるステップを含む。複合糖質は、α−（１，２）、α−（１，３）、α−（１，４）、およびα−（１，６）結合型フコースから選択される１つまたは複数のフコースを含む。フコースは、複合糖質におけるＮ−および／またはＯ−結合型グリカン中に存在し得る。
【００３４】
一部の実施形態では、複合糖質は、糖タンパク質である。一部の実施形態では、糖タンパク質は、コアフコースを含む。一部の実施形態では、コアフコースは、コアα−（１，３）結合型フコースまたはコアα−（１，６）結合型フコースである。
【００３５】
一部の実施形態では、本方法は、複合糖質を、少なくとも１つのグリコシダーゼと接触させることをさらに含む。ある特定の実施形態では、グリコシダーゼは、エンドグリコシダーゼである。エンドグリコシダーゼは、Ｎ−グリカンにおけるオリゴ糖の可変部分を切り取るために使用される。本明細書で使用されるエンドグリコシダーゼの例は、エンド−ベータ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（ＮＡＧ）、ＥｎｄｏＡ、ＥｎｄｏＦ１、ＥｎｄｏＦ２、ＥｎｄｏＦ３、ＥｎｄｏＨ、ＥｎｄｏＭ、ＥｎｄｏＳ、およびそれらの変異体を含むが、これらに限定されない。
【００３６】
コア脱フコシル化に関して、複合糖質は、逐次または同時にエンドグリコシダーゼおよびα−フコシダーゼで処理され得る。コア脱フコシル化は、コアα（１，３）脱フコシル化またはα（１，６）脱フコシル化であり得る。
【００３７】
本発明の方法は、モノクローナル抗体からＦｃ糖鎖工学的に操作するのに有用であり得る。工学的に操作する例示的な方法は、例えば、その内容が参照によって本明細書に組み込まれているＷｏｎｇら、ＵＳＳＮ１２／９５９，３５１において記載されている。好ましくは、モノクローナル抗体は、治療用モノクローナル抗体である。一部の例では、均一にグリコシル化されたモノクローナル抗体を作製するための方法は、（ａ）モノクローナル抗体を、α−フコシダーゼおよび少なくとも１つのエンドグリコシダーゼと接触させ、それによって単一のＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を有する脱フコシル化抗体をもたらすステップ、および（ｂ）炭水化物部分を適した条件下でＧｌｃＮＡｃに加えるステップを含む。ある特定の実施形態では、グリカンは、エンド−ＧｌｃＮＡＣａｓｅおよび例示的なフコシダーゼ、次いで、それに続く例示的なエンド−Ｓ変異体およびグリカンオキサゾリンでの処理によって調製され得る。
【００３８】
特定の例では、本発明の方法によるモノクローナル抗体は、リツキシマブである。ある特定の実施形態では、本発明の方法による炭水化物部分は、Ｓｉａ２（α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、Ｓｉａ２（α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、Ｓｉａ２（α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、Ｓｉａ２（α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、Ｓｉａ２（α２−３／α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、Ｓｉａ２（α２−６／α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、Ｓｉａ２（α２−３／α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、Ｓｉａ２（α２−６／α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、Ｓｉａ（α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、Ｓｉａ（α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、Ｓｉａ（α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、Ｓｉａ（α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、Ｓｉａ（α２−６）ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、Ｓｉａ（α２−３）ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、Ｓｉａ（α２−６）ＧａｌＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、Ｓｉａ（α２−３）ＧａｌＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃおよびＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃからなる群から選択される。
【００３９】
一部の実施形態では、炭水化物部分は、糖オキサゾリンである。
【００４０】
本発明の方法におけるステップ（ｂ）は、糖鎖伸長につながり得る。糖鎖伸長のためのある方法は、酵素触媒グリコシル化反応によるものである。グリコシル化反応は、付加反応であり、酸、水などのいかなる付随的な排除もなく進むので、酵素触媒グリコシル化反応の中で糖ドナーとして糖オキサゾリンを使用したグリコシル化がオリゴ糖を合成するのに有用であることは当技術分野で周知である。（Fujitaら、Biochim.  Biophys.  Acta  ２００１年、１５２８巻、９〜１４頁）
【００４１】
ステップ（ｂ）における適した条件は、少なくとも２０分、３０分、４０分、５０分、６０分、７０分、８０分、９０分または１００分、好ましくは６０分未満の反応混合物のインキュベーションを含む。インキュベーションは、好ましくは室温で、より好ましくは約２０℃、２５℃、３０℃、３５℃、４０℃または４５℃で、最も好ましくは約３７℃で行われる。
【００４２】
本明細書では、「フコース」および「Ｌ−フコース」という用語は、互換的に使用される。
【００４３】
本明細書では、「コアフコース」および「コアフコース残基」という用語は、互換的に使用され、アスパラギン結合Ｎ−アセチルグルコサミンに結合したα１，３−位またはα１，６−位におけるフコースを指す。
【００４４】
本明細書では、「α−（１，２）フコシダーゼ」という用語は、オリゴ糖からのα−（１，２）結合型Ｌ−フコース残基の加水分解を特異的に触媒するエキソグリコシダーゼを指す。
【００４５】
本明細書では、「α−（１，４）フコシダーゼ」という用語は、オリゴ糖からのα−（１，４）結合型Ｌ−フコース残基の加水分解を特異的に触媒するエキソグリコシダーゼを指す。
【００４６】
本明細書では、「グリカン」という用語は、多糖、オリゴ糖または単糖を指す。グリカンは、糖残基のモノマーまたはポリマーであり得、直鎖状または分枝状であり得る。グリカンは、天然糖残基（例えば、グルコース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルノイラミン酸、ガラクトース、マンノース、フコース、ヘキソース、アラビノース、リボース、キシロースなど）および／または修飾糖（例えば、２’−フルオロリボース、２’−デオキシリボース、ホスホマンノース、６’スルホＮ−アセチルグルコサミンなど）を含み得る。
【００４７】
本明細書では、「Ｎ−グリカン」、「Ｎ−結合型グリカン」、「Ｎ−結合型グリコシル化」、「Ｆｃグリカン」および「Ｆｃグリコシル化」という用語は、互換的に使用され、Ｆｃ含有ポリペプチドにおけるアスパラギン残基のアミド窒素に結合したＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）によって付加されたＮ−結合型オリゴ糖を指す。「Ｆｃ含有ポリペプチド」という用語は、Ｆｃ領域を含む、抗体などのポリペプチドを指す。
【００４８】
本明細書では、「グリコシル化パターン」および「グリコシル化プロファイル」という用語は、互換的に使用され、酵素的または化学的に糖タンパク質または抗体から放出され、次いで、例えば、ＬＣ−ＨＰＬＣ、またはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳなどを使用して、それらの炭水化物構造に関して分析されるＮ−グリカン種の特徴的な「フィンガープリント」を指す。例えば、その全体が参照によって本明細書に組み込まれたCurrent  Analytical  Chemistry、１巻、１号（２００５年）、２８〜５７頁における総説を参照されたい。
【００４９】
本明細書では、「糖鎖工学的に操作されたＦｃ」という用語は、本明細書で使用される場合、酵素的または化学的に改変されたまたは操作されたＦｃ領域上のＮ−グリカンを指す。本明細書では、「Ｆｃ糖鎖工学」という用語は、糖鎖工学的に操作されたＦｃを作製するために使用される酵素プロセスまたは化学プロセスを指す。
【００５０】
Ｆｃ領域のグリコシル化プロファイルの文脈における「均一な」、「一様な」、「一様に」および「均一性」という用語は、互換的に使用され、微量の前駆Ｎ−グリカンも有さない１つの望ましいＮ−グリカン種によって表された単一のグリコシル化パターンを意味することが意図されている。
【００５１】
本明細書では、「ＩｇＧ」、「ＩｇＧ分子」、「モノクローナル抗体」、「免疫グロブリン」、および「免疫グロブリン分子」という用語は、互換的に使用される。本明細書では、「分子」は、抗原結合断片も含み得る。
【００５２】
本明細書では、「複合糖質」という用語は、本明細書では、少なくとも１つの糖部分が少なくとも１つの他の部分に共有結合している全ての分子を包含する。用語は、例えばＮ−結合型糖タンパク質、Ｏ−結合型糖タンパク質、糖脂質、プロテオグリカンなどを含めた、共有結合的に付加された糖部分を有する全ての生体分子を特に包含する。
【００５３】
本明細書では、「糖脂質」という用語は、１つまたは複数の共有結合した糖部分（すなわち、グリカン）を含有する脂質を指す。糖部分は、単糖、二糖、オリゴ糖、および／または多糖の形であり得る。糖部分は、糖残基の単一の分岐していない鎖を含み得るか、または１つもしくは複数の分岐した鎖から構成され得る。ある特定の実施形態では、糖部分は、硫酸基および／またはリン酸基を含み得る。ある特定の実施形態では、糖タンパク質は、Ｏ−結合型糖部分を含有し；ある特定の実施形態では、糖タンパク質は、Ｎ−結合型糖部分を含有する。
【００５４】
本明細書では、「糖タンパク質」という用語は、そこに共有結合的に付加された１つまたは複数のオリゴ糖鎖（例えば、グリカン）を含むアミノ酸配列を指す。例示的なアミノ酸配列は、ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質を含む。例示的な糖タンパク質は、グリコシル化抗体および抗体様分子（例えば、Ｆｃ融合タンパク質）を含む。例示的な抗体は、モノクローナル抗体および／またはその断片、ポリクローナル抗体および／またはその断片、ならびにＦｃドメイン含有融合タンパク質（例えば、ＩｇＧ１のＦｃ領域、またはそのグリコシル化部分を含有する融合タンパク質）を含む。
【００５５】
本明細書では、「Ｎ−グリカン」という用語は、複合糖質から放出されたが、窒素結合を介して複合糖質に以前は結合していた糖のポリマーを指す（以下のＮ−結合型グリカンの定義を参照されたい）。
【００５６】
本明細書では、「Ｏ−グリカン」という用語は、複合糖質から放出されたが、酸素結合を介して複合糖質に以前は結合していた糖のポリマーを指す（以下のＯ−結合型グリカンの定義を参照されたい）。
【００５７】
本明細書では、野生型酵素の機能的変異体は、野生型対応物と同じ酵素活性を有し、例えば、野生型対応物のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であり、高アミノ酸配列相同性を典型的に共有する。２つのアミノ酸配列の「パーセント同一性」は、Karlin  and  Altschul  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  ９０巻：５８７３〜７７頁、１９９３年にお
いて修正された、Karlin  and  Altschul  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  ８７巻：
２２６４〜６８頁、１９９０年のアルゴリズムを使用して決定される。かかるアルゴリズムは、Altschulら  J.  Mol.  Biol.  ２１５巻：４０３〜１０頁、１９９０年のＮＢＬ
ＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。ＢＬＡＳＴタンパク質探索が、目的のタンパク質分子と相同であるアミノ酸配列を得るために、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、語長＝３で行われ得る。ギャップが２つの配列間に存在する場合、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴがAltschulら、Nucleic  Acids  Res.  ２５巻（１７号）：３３８９〜３４０２頁、１９９７年において記載されたように利用され得る。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターが使用され得る。機能的変異体は、１つまたは複数のアミノ酸残基の付加、欠失、または置換を含めた、様々な変異を有し得る。かかる変異体は、野生型酵素の酵素活性に必須ではない領域における変異をしばしば含有し、機能的ドメインにおける変異を含有し得ないか、または保存的アミノ酸置換のみを含有し得る。当業者は、保存的アミノ酸置換が、機能的に同等の変異体を提供するためにリポ酸リガーゼミュータントにおいて行われ得る、すなわち、変異体は、特定のリポ酸リガーゼミュータントの機能的能力を保持することを理解するはずである。
【００５８】
本明細書では、「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸置換が行われるタンパク質の相対的電荷またはサイズ特徴を改変しないアミノ酸置換を指す。変異体は、かかる方法をまとめている参考文献、例えばMolecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual、J.  Sambrookら、eds.、Second  Edition、  Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press、Cold  Spring  Harbor、New  York、１９８９年、またはCurrent  Protocols  in  Molecular  Biology、F.M.  Ausubelら編、John  Wiley  &  Sons、Inc.、New  Yorkにおいて見出される
ものなどの当業者に公知のポリペプチド配列を改変するための方法に従って調製され得る。アミノ酸の保存的置換は、以下の群内のアミノ酸間で行われる置換を含む：（ａ）Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ；（ｂ）Ｆ、Ｙ、Ｗ；（ｃ）Ｋ、Ｒ、Ｈ；（ｄ）Ａ、Ｇ；（ｅ）Ｓ、Ｔ；（ｆ）Ｑ、Ｎ；および（ｇ）Ｅ、Ｄ。脱グリコシル系に関与する酵素の任意のものは、通例のテクノロジーによって調製され得る。一例では、酵素は、天然供給源から単離される。他の例では、酵素は、通例の組換えテクノロジーによって調製される。必要な場合、標的酵素のコード配列は、酵素を作製するために使用される宿主細胞に基づいてコドン最適化に供され得る。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞が組換えテクノロジーによって酵素を作製するための宿主として使用される場合、その酵素をコードする遺伝子は、それがＥ．ｃｏｌｉにおいて共通して使用されるコドンを含有するように修飾され得る。本発明の１つまたは複数の実施形態の詳細は、以下の説明に記載されている。本発明の他の特性または利点は、以下の図面およびいくつかの実施形態の詳細な説明から、および添付の特許請求の範囲からも明らかとなろう。
【００５９】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含まれている。以下の実施例において開示された技法は、本発明の実行においてよく機能することが本発明者によって発見された技法を表し、したがって、その実行のための好ましいモードを構成すると考えられ得ることが当業者によって認識されるはずである。しかしながら、当業者は、本開示を考慮して、開示されている特定の実施形態に多くの変更を加えることができ、そうしても本発明の精神および範囲から逸脱することなく同じまたは類似した結果を得ることを認識すべきである。
【実施例】
【００６０】
（実施例１）
タンパク質発現構築物
α−フコシダーゼを、それぞれ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＮＣＴＣ９３４３ゲノムＤＮＡ（ＡＴＣＣ  ２５２８５）およびＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  Ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ  ＶＰＩ−５４８２（ＡＴＣＣ  ２９１４８）からＰＣＲによって増幅し、内部ＡｃＴＥＶプロテアーゼ切断部位を有するＮ末端ポリヒスチンを有するｐＥＴ４７ｂ＋（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）中にクローニングした。ＥｎｄｏＦ１（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ２４９２２．１）、ＥｎｄｏＦ２（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ２４９２３．１）、ＥｎｄｏＦ３（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ２４９２４．１）、ＥｎｄｏＨ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ２６７３８．１）およびＰＮＧａｓｅ  Ｆ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＧｅｎＢａｎｋ：Ｊ０５４４９．１）などの研究に使用された他の酵素をＥ．ｃｏｌｉにコドン最適化し、それぞれ、Ｎ末端においてＭＢＰ融合を有するｐＥＴ２８ａ中にクローニングした。クローンの全ての配列をＡｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３７３０  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒによって最初に確認した。
【００６１】
Ｅ．ｃｏｌｉにおけるタンパク質発現構築物に使用されたプライマーを以下の表に列挙する。
【表２−１】
2020171320.tif 000005
【表２−２】
2020171320.tif 000006
【００６２】
ａ各遺伝子のコード配列を増幅するためのフォワード（Ｆ）およびリバース（Ｒ）ＰＣＲ反応のための一対のプライマー。
【００６３】
ｂ太字を有する下線は、制限酵素認識部位を意味する。
【００６４】
ｃＥ．ｃｏｌｉに関するコドン最適化。例えば、Puigboら、Nucleic  Acids  Research（２００７年）３５巻（Ｓ２号）：Ｗ１２６〜Ｗ１３０頁を参照されたい。
タンパク質発現および精製
【００６５】
タンパク質発現構築物を、１６℃で２４時間、０．２ｍＭイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を使用して、タンパク質発現のためにＢＬ２１（ＤＥ３）（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）に形質転換した。細胞をマイクロフルイダイザーによって破壊し、次いで、遠心分離した。上清を収集し、Ｎｉ−ＮＴＡアガロースカラム（ＱＩＡＧＥＮ  ＧｍｂＨ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）上にロードし、１０倍の洗浄緩衝液（リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、３００ｍＭ塩化ナトリウム、および１０ｍＭイミダゾール）で洗浄した。溶出を２倍の溶出緩衝液（リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、３００ｍＭ塩化ナトリウム、および２５０ｍＭイミダゾール）によって行い、その後、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５  １０Ｋ（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）によって反応緩衝液への緩衝液交換を行った。タンパク質純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって調べ、定量的タンパク質濃度をＱｕｂｉｔ（登録商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）によって測定した。Ｎｉ−ＮＴＡカラム精製が後に続き、ｈｉｓタグを有する組換えフコシダーゼは、９５％を超える純度で６０ｍｇ／Ｌの収量をもたらした。タンパク質濃度を、標準としてウシ血清アルブミンを用いたＢｒａｎｄｆｏｒｄ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ；Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）の方法によって決定した。酵素の純度および分子質量をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって調べた。
【００６６】
Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓからの精製フコシダーゼは、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）において、４７．３ｋＤａの理論上の分子量に近い、約５０ｋＤａの分子質量を示した。
（実施例２）
酵素アッセイ
酵素の特徴
【００６７】
酸性条件（ｐＨ４．０〜６．０）における最適ｐＨを有する、哺乳動物または細菌からのフコシダーゼとは異なり、ＢｆＦｕｃＨは、緩やかな条件（ｐＨ７．０〜７．５）で事前によく形成された。さらに、ＢｆＦｕｃＨは、いくつかの二価金属イオンによって影響されず、金属イオンを外から加えても活性に影響しなかった。しかしながら、Ｎｉ２＋は、酵素活性を６０％劇的に低減させ得る。また、Ｚｎ２＋およびＣｕ２＋は、酵素活性を完全に無効にし得る。キレート剤ＥＤＴＡは、酵素活性に及ぼす効果を示さず、これは、金属イオンが触媒反応に関与しないことを示している。酵素は、室温および４℃で機能的に活性かつ安定である。
Ｎ−結合型グリカン（glycas）に及ぼす酵素活性
【００６８】
本明細書で記載されたフコシダーゼは、Ｎ−グリカンにおけるフコース位置を決定するために使用され得る。種々の位置で付加された様々なフコースを有するＮ−グリカンに及ぼすＢｆＦｕｃＨ加水分解活性を評価した。２つの合成糖ペプチド、０８００Ｆおよび０８２３Ｆを調製した。両方の糖ペプチドは、グリコシル化部位で外側のＧｌｃＮＡｃおよび最も内側のＧｌｃＮＡｃに結合したフコースをそれぞれ有する。
【００６９】
酵素アッセイは、フコースが試料０８００Ｆにおける外側のＧｌｃＮＡｃからのみ放出され、フコースが最も内側のＧｌｃＮＡｃに結合している糖ペプチド０８２３Ｆにおいては放出されないことを明らかにした。この結果は、Ｎ−グリカンにおけるＧ０構造の立体障害がフコースをフコシダーゼ加水分解から遮蔽かつ保護し得ることを示した。対照的に、０８２３Ｆがワンポット反応において同時にＢｆＦｕｃＨおよびエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（ＥｎｄｏＭ）で処理された場合、コアフコースは、容易に除去される。この結果は、α−フコシダーゼがグリカンに結合したフコースの位置を識別するために使用され得ることを示した。
オリゴ糖に及ぼす酵素活性
【００７０】
Ｅ．ｃｏｌｉ株の血清型Ｏ８６、０１２８、およびＯ１１１のリポ多糖（ＬＰＳ）は、様々な単糖、例えば、Ｇａｌ、ＧａｌＮＡｃ、およびフコースを含有する。ホルムアルデヒド脱水素酵素（ＦＤＨ）共役アッセイによって、本発明者らは、ＢｆＦｕｃＨがＬ−フコースをＥ．ｃｏｌｉ  Ｏ１２８：Ｂ１２株のＬＰＳから用量依存的に遊離させ得ることを確認した。本発明者らは、２’−フコシルラクトース（２’ＦＬ）、３’−フコシルラクトース（３’ＦＬ）、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩ（ＬＮＰＴＩ）、グロボＨ、ルイスａ（Ｌｅａ）、ルイスｘ（Ｌｅｘ）、ルイスｂ（Ｌｅｂ）、ルイスｙ（Ｌｅｙ）、シアリルルイスａ（ＳＬｅａ）、シアリルルイスｘ（ＳＬｅｘ）、およびｐＮＰ（パラ−ニトロフェノール）−α−Ｌ−フコシドを含めた様々な基質に及ぼす酵素の酵素活性も試験した。結果は、α−フコシダーゼが全ての基質を加水分解することができることを示した。
（実施例３）
糖タンパク質のコア脱フコシル化
【００７１】
Ａｌｅｕｒｉａ  ａｕｒａｎｔｉａは、フコースに関する特異的プローブとして広く使用されているフコース特異的レクチン（ＡＡＬ）を有する。ＡＡＬは、複合オリゴ糖および複合糖質上のフコースおよび末端フコース残基を認識し、これに特異的に結合する。ＡＡＬは、コア脱フコシル化を決定するために使用され得る。エンドグリコシダーゼは、Ｎ−グリカンにおけるオリゴ糖の可変部分を切り取るのに有用である。エンドグリコシダーゼ（ＥｎｄｏＦ１、ＥｎｄｏＦ２、ＥｎｄｏＦ３およびＥｎｄｏＨ）のカクテルの処理後、抗体（ヒュミラまたはリツキサン）は、高ＡＡＬ−ブロッティングシグナルを示し、これは、抗体におけるコアフコースの存在を示している。しかしながら、エンドグリコシダーゼ（ＥｎｄｏＦ１、ＥｎｄｏＦ２、ＥｎｄｏＦ３およびＥｎｄｏＨ）のカクテルおよびＢｆＦｕｃＨの組合せの処理後、抗体（ヒュミラまたはリツキサン）は、コアフコースの加水分解によりＡＡＬ−ブロッティングシグナルを失った。これらの結果は、ＢｆＦｕｃＨがコア脱フコシル化に活性であることを実証した。
材料および方法
【００７２】
他に断らない限り、全ての化合物および試薬をＳｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈまたはＭｅｒｃｋから購入した。抗腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦα）抗体、アダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ（登録商標））を（Ｎｏｒｔｈ  Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）から購入した。抗ヒトＣＤ２０マウス／ヒトキメラＩｇＧ１リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標））をＧｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．（Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）／ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入した。ＴＮＦ受容体−Ｆｃ融合タンパク質エタネルセプト（Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標））をＷｙｅｔｈ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ，ＵＫ）から購入した。エポエチンベータ（Ｒｅｃｏｒｍｏｎ（登録商標））をＨｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ
Ｌｔｄ（Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から購入した。インターフェロンβ１ａ（Ｒｅｂｉｆ（登録商標））をＥＭＤ  Ｓｅｒｏｎｏ，Ｉｎｃ．（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）から購入した。
【００７３】
パラ−ニトロフェニルα−またはβ−単糖、ルイス糖、血液型糖および人乳オリゴ糖をＣａｒｂｏｓｙｎｔｈ  Ｌｉｍｉｔｅｄ．（Ｂｅｒｋｓｈｉｒｅ，ＵＫ）から購入した。ＩｇＧ  Ｆｃ領域に対する一次抗体、Ｒｅｃｏｒｍｏｎ（登録商標）、およびＲｅｂｉｆ（登録商標）をＣｈｅｍｉｃｏｎ（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）から購入した。ビオチン化Ａｌｅｕｒｉａ  Ａｕｒａｎｔｉａレクチン（ＡＡＬ）およびＨＲＰコンジュゲートストレプトアビジンをＶｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）から購入した。タンパク質ブロット上の化学発光をＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＬＡＳ  ４０００生体分子撮像システムを使用して可視化し、定量化した。
ＢｆＦｕｃＨ活性分析方法
【００７４】
酵素活性を、標準アッセイ条件として、基質としてｐＮＰ−α−Ｌ−Ｆｕｃ（ｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−Ｆｕｃ）を使用して、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０において２５℃で測定した。α−Ｌ−フコシダーゼ活性の１つの単位を２５℃での５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０における１分あたりのｐＮＰ−α−Ｌ−Ｆｕｃからの１μｍｏｌのｐＮＰおよびＦｕｃの形成として定義した。ミカエリス定数（Ｋｍ）、代謝回転数（Ｋｃａｔ）およびＶｍａｘの値を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｖ５ソフトウェア（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）によって非線形回帰分析によって、ミカエリスメンテン式からｐＮＰ−α−Ｌ−Ｆｕｃに関して計算した。
ＢｆＦｕｃＨの最適ｐＨの活性測定
【００７５】
フコシダーゼ活性に関する最適ｐＨを、酢酸ナトリウム、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、トリス−ＨＣｌ、ＣＨＥＳ緩衝液を含めたｐＨ範囲４．０〜１０．０において上記の標準酵素アッセイにおいて決定した。全ての反応を統計的評価のために三連で行った。
ＢｆＦｕｃＨの最適二価金属イオンの活性測定
【００７６】
金属要求性に関するアッセイを標準アッセイ条件において行った。酵素を、ＥＤＴＡの存在および非存在下で、５ｍＭの最終濃度で金属イオン（Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｚｎ２＋、Ｃｏ２＋、またはＮｉ２＋、Ｆｅ２＋、Ｃｕ２＋）と混合した。全ての反応を統計的評価のために三連で行った。
ＢｆＦｕｃＨの最適温度の活性測定
【００７７】
酵素の活性に及ぼす温度の効果を、十分な量の精製フコシダーゼをリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）においてｐＮＰ−α−Ｌ−Ｆｕｃとインキュベートすることによって決定した。アッセイ構成を保持するために、全ての構成成分をよく混合し、１０分間アッセイ温度で予熱し、反応を酵素を加えることによって開始し、一定温度において多モードプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）によって記録した。温度は、４から８０℃にわたった。全ての反応を、統計的評価のために三連で行った。
フコース脱水素酵素に基づく（ＦＤＨ）アッセイ
【００７８】
フコース脱水素酵素に基づくアッセイを以前の報告からわずかに修正した。ＮＡＤＰ＋とのみ活性であり反応する、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈによって販売されているＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐからの他のフコース脱水素酵素とは異なり、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉからのＦＤＨの組換え型は、ＮＡＤ＋とのみ機能性である。形成されたＮＡＤＨを、２５℃で多モードプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）によって３４０ｎｍで励起した際、約４５０ｎｍでのＮＡＤＰＨ蛍光によって測定した。この方法を使用することによって、ルイス糖および人乳オリゴ糖（ＨＭＯ）などの様々なオリゴ糖におけるフコシル−コンジュゲートを５分以内に定量化した。
免疫グロブリンＧ、Ｆｃ−融合タンパク質、ＥＰＯ、インターフェロン（ＩＦＮβ１ａ）およびインフルエンザ血球凝集素（ＨＡ）のモノ−ＧｌｃＮＡｃまたはＧｌｃＮＡｃ−（Ｆｕｃ  α−１，６）の生成
【００７９】
全ての糖タンパク質を反応緩衝液５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）によって緩衝液交換した。最初に、ＥｎｄｏＦ１、ＥｎｄｏＦ２、ＥｎｄｏＦ３、ＥｎｄｏＨおよびＥｎｄｏＳ（１ｍｇ／ｍＬ）を含むエンドグリコシダーゼカクテル溶液を、糖タンパク質のＡｓｎに結合したＧｌｃＮＡｃを除く全てのＮ−グリカン鎖を除去するために加え、その後、適した量のフコシダーゼを加えた。糖タンパク質のＧｌｃＮＡｃに結合したコア−フコースを完全に除去するために、３７℃で４８時間インキュベートする。
【図１】
2020171320.tif 000007
【図２】
2020171320.tif 000008
【図３】
2020171320.tif 000009
【配列表】
2020171320000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年7月17日(2020.7.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
本発明のα−フコシダーゼのポリペプチドは、それらの単離または精製を補助するために誘導体化または修飾され得ることが理解されよう。したがって、本発明の一実施形態では、本発明における使用のためのポリペプチドは、分離手段に直接的または特異的に結合する能力があるリガンドを加えることによって誘導体化または修飾される。あるいは、ポリペプチドは、結合対のうちの１つのメンバーを加えることによって誘導体化または修飾され、分離手段は、結合対の他のメンバーを加えることによって誘導体化または修飾される試薬を含む。任意の適した結合対が使用され得る。本発明における使用のためのポリペプチドが結合対のうちの１つのメンバーを加えることによって誘導体化または修飾される好ましい実施形態では、ポリペプチドは、好ましくは、ヒスチジンタグをつけられているまたはビオチンタグをつけられている。典型的に、ヒスチジンまたはビオチンタグのアミノ酸コード配列は、遺伝子レベルで含まれており、タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて組換えで発現される。ヒスチジンまたはビオチンタグは、ポリペプチドの一端に、Ｎ末端にまたはＣ末端に典型的に存在する。ヒスチジンタグは、６ヒスチジン残基から典型的になる（配列番号１９）が、それは、典型的に最大７、８、９、１０または２０アミノ酸のようにこれよりも長くても、または例えば５、４、３、２または１アミノ酸のように短くてもよい。さらに、ヒスチジンタグは、１つまたは複数のアミノ酸置換、好ましくは上記で定義した保存的置換を含有し得る。
組成物の適用
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６１】
Ｅ．ｃｏｌｉにおけるタンパク質発現構築物に使用されたプライマーを以下の表に列挙する。
【表２−１】
2020171320.tif 000010
【表２−２】
2020171320.tif 000011
【外国語明細書】
2020171320000001.pdf