(57)【要約】【課題】リグノセルロース系原料から効率的にエタノールを製造する方法を提供する。【解決手段】リグノセルロース系原料、糖化酵素および酵母を含んでなる発酵液に、該発酵液自体の物性値が予め設定した範囲内に維持されるように追加糖化酵素を連続的または間欠的に添加しながら並行複発酵を行う工程を含んでなる、リグノセルロース系原料からエタノールを製造する方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
リグノセルロース系原料からエタノールを製造する方法であって、
リグノセルロース系原料、糖化酵素および酵母を含んでなる発酵液に、該発酵液自体の物性値が予め設定した範囲内に維持されるように追加糖化酵素を連続的または間欠的に添加しながら並行複発酵を行う工程を含んでなる、方法。
【請求項２】
前記発酵液自体の物性値がエタノール濃度および／または粘度である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記発酵液のエタノール濃度が、発酵開始後に定常状態となった時点のエタノール濃度に対して８０％以上に維持されるように追加糖化酵素を添加する、請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記発酵液における酵素原単位が、発酵開始１〜１２時間後の酵素原単位に対して０．１〜３０％に維持されるように追加糖化酵素を添加する、請求項１〜３のいずれか一項に記載のエタノール製造方法。
【請求項５】
１日当たりの追加糖化酵素の添加量と、発酵液における糖化酵素の初期含量との質量比（１日当たりの追加糖化酵素の添加量：発酵液における糖化酵素の初期含量）が、１：１０〜１：１００である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のエタノール製造方法。
【請求項６】
前記発酵液に対して２０Ｕ／Ｌ以下の量で追加糖化酵素を添加する、請求項１〜５のいずれか一項に記載のエタノール製造方法。
【請求項７】
追加糖化酵素を２〜１９２時間毎に間欠的に添加する、請求項１〜６のいずれか一項に記載のエタノール製造方法。
【請求項８】
前記発酵液の粘度が１４０ｃＰを超えた時点で前記発酵液への追加糖化酵素の添加を開始する、請求項１〜７のいずれか一項に記載のエタノール製造方法。
【請求項９】
前記発酵液におけるリグノセルロース系原料の濃度が所定の範囲内に維持されるように調節される、請求項１〜８のいずれか一項に記載のエタノール製造方法。
【請求項１０】
前記発酵液におけるリグノセルロース系原料の濃度が５〜３０質量％に維持されるように調節される、請求項９に記載のエタノール製造方法。
【請求項１１】
前記並行複発酵が、互いに連結した少なくとも２槽の反応槽で行われる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のエタノール製造方法。
【請求項１２】
前記少なくとも２槽の反応槽が直列に連結している、請求項１１に記載のエタノール製造方法。
【請求項１３】
前記少なくとも２槽の反応槽が、前記発酵液を収容しかつリグノセルロース系原料が連続的に追加供給される第１反応槽を含んでなる、請求項１１または１２に記載のエタノール製造方法。
【請求項１４】
前記少なくとも２槽の反応槽が、前記第１反応槽から前記発酵液の一部が連続的に移送される第２反応槽を含んでなる、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載のエタノール製造方法。
【請求項１５】
以下の工程をさらに含んでなる、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のエタノール製造方法：
前記発酵液からエタノール水溶液を分離する固液分離工程であって、
前記エタノール水溶液を分離した後の固形分濃縮発酵液を反応槽に移送することを含んでなる、工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はリグノセルロース系原料からエタノールを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
非可食のリグノセルロース系原料から糖を製造する技術は、製造された糖を微生物の発酵基質として用いることによりアルコールのようなガソリンの代替となる燃料等を製造することができ、また食糧との競合を防ぐことができるため、循環型社会の形成に極めて有益な技術である。
【０００３】
リグノセルロース系原料中の多糖類から発酵基質となる単糖や少糖類等の糖類を製造する方法として、セルロース分解酵素等の糖化酵素やその糖化酵素を生産する微生物を用いて加水分解する酵素糖化法が知られている。
【０００４】
また、酵素糖化法を応用しリグノセルロースからエタノールを製造する方法として、並行複発酵が知られている。並行複発酵においては、上記糖化酵素と共にエタノール発酵微生物を共存させ、酵素糖化反応とエタノール発酵とが同時に行われる。
【０００５】
並行複発酵によるリグノセルロース系原料からのエタノール製造は、デンプン、廃糖蜜等を原料とする製造方法に比べ、コストが高いという問題がある。そこで、リグノセルロース系原料から効率的にエタノールを製造する手法が従前検討されている。
【０００６】
特許文献１には、連続反応液から未反応リグノセルロース材料及び糖化酵素を回収することを含み、基質としてリグニンの除去操作を施したリグノセルロース材料を使用し、連続糖化反応槽に供給される分散液における全基質量と糖化酵素量の割合を、全基質の少なくとも９６質量％が滞留時間内に糖化される割合に維持することにより、未反応リグノセルロースの蓄積を防止しつつ連続的に糖化反応を行う方法が開示されている。
【０００７】
しかしながら、リグノセルロース系原料から効率的にエタノールを製造することは依然として求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００６−０８７３１９号公報
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、エタノールを効率的に製造することを目的としている。特に、本発明は、製造されるエタノール濃度を一定以上に維持することを目的としている。
【００１０】
本発明者らは、今般、リグノセルロース系原料、糖化酵素および酵母を含んでなる発酵液に、追加糖化酵素を連続的または間欠的に添加しながら並行複発酵を行うと、発酵液中に製造されるエタノール濃度が一定以上に維持されうることを見出した。さらに、追加糖化酵素の添加の指標として、上記発酵液自体の物性値を用いることができることを見出した。本発明は、かかる知見に基づくものである。
【００１１】
本発明は、以下の［１］〜［１５］を包含する。
［１］  
リグノセルロース系原料からエタノールを製造する方法であって、
リグノセルロース系原料、糖化酵素および酵母を含んでなる発酵液に、該発酵液自体の物性値が予め設定した範囲内に維持されるように追加糖化酵素を連続的または間欠的に添加しながら並行複発酵を行う工程を含んでなる、方法。
［２］  
前記発酵液自体の物性値がエタノール濃度および／または粘度である、［１］に記載の方法。
［３］
前記発酵液のエタノール濃度が、発酵開始後に定常状態となった時点のエタノール濃度に対して８０％以上に維持されるように追加糖化酵素を添加する、［１］または［２］に記載の製造方法。
［４］
前記発酵液における酵素原単位が、発酵開始１〜１２時間後の酵素原単位に対して０．１〜３０％に維持されるように追加糖化酵素を添加する、[１]〜[３]のいずれか一つに記載のエタノール製造方法。
［５］
１日当たりの追加糖化酵素の添加量と、発酵液における糖化酵素の初期含量との質量比（１日当たりの追加糖化酵素の添加量：発酵液における糖化酵素の初期含量）が、１：１０〜１：１００である、［１］〜［４］のいずれか一つに記載のエタノール製造方法。
［６］
前記発酵液に対して２０Ｕ／Ｌ以下の量で追加糖化酵素を添加する、［１］〜［５］のいずれか一つに記載のエタノール製造方法。
［７］
追加糖化酵素を２〜１９２時間毎に間欠的に添加する、［１］〜［６］のいずれか一つに記載のエタノール製造方法。
［８］
前記発酵液の粘度が１４０ｃＰを超えた時点で追加糖化酵素を前記発酵液に添加する、［１］〜［７］のいずれか一つに記載のエタノール製造方法。
［９］
前記発酵液におけるリグノセルロース系原料の濃度が所定の範囲内に維持されるように調節される、［１］〜［８］のいずれか一つに記載のエタノール製造方法。
［１０］
前記発酵液におけるリグノセルロース系原料の濃度が５〜３０質量％に維持されるように調節される、［９］に記載のエタノール製造方法。
［１１］
前記並行複発酵が、互いに連結した少なくとも２槽の反応槽で行われる、［１］〜［１０］のいずれか一つに記載のエタノール製造方法。
［１２］
前記少なくとも２槽の反応槽が直列に連結している、［１１］に記載のエタノール製造方法。
［１３］
前記少なくとも２槽の反応槽が、前記発酵液を収容しかつリグノセルロース系原料が連続的に追加供給される第１反応槽を含んでなる、［１１］または［１２］に記載のエタノール製造方法。
［１４］
前記少なくとも２槽の反応槽が、前記第１反応槽から前記発酵液の一部が連続的に移送される第２反応槽を含んでなる、［１１］〜［１３］のいずれか一つに記載のエタノール製造方法。
［１５］
以下の工程をさらに含んでなる、［１］〜［１４］のいずれか一つに記載のエタノール製造方法：
前記発酵液からエタノール水溶液を分離する固液分離工程であって、
前記エタノール水溶液を分離した後の固形分濃縮発酵液を反応槽に移送することを含んでなる、工程。
【００１２】
本発明によれば、発酵液自体の物性値が予め設定した範囲内に維持されるように追加糖化酵素を連続的または間欠的に添加しながら並行複発酵を行うことにより、エタノールを効率的に製造することができる。本発明は、製造されるエタノール濃度を一定以上に維持することができる上で有利である。さらに、本発明は、連続稼働時間を延長することにより製造にかかるコストを低減できる上で有利である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実施例１および比較例１の粘度の経時変化を示す。点線は追加糖化酵素の添加を開始した時点を示す。
【図２】実施例１および比較例１のエタノール濃度（相対値）の経時変化を示す。点線は追加糖化酵素の添加を開始した時点を示す。
【図３】比較例２の第１反応槽の粘度の経時変化を示す。点線は追加糖化酵素の添加を開始した時点を示す。
【図４】比較例２の第１反応槽のエタノール濃度（相対値）の経時変化を示す。点線は追加糖化酵素の添加を開始した時点を示す。
【図５】比較例２の第１反応槽の酵素原単位（相対値）の経時変化を示す。点線は追加糖化酵素の添加を開始した時点を示す。
【図６】実施例２の第１反応槽の粘度の経時変化を示す。点線は追加糖化酵素の添加を開始した時点を示す。
【図７】実施例２の第１反応槽のエタノール濃度（相対値）の経時変化を示す。点線は追加糖化酵素の添加を開始した時点を示す。
【図８】実施例２の第１反応槽の酵素原単位（相対値）の経時変化を示す。点線は追加糖化酵素の添加を開始した時点を示す。
【図９】実施例３の第１反応槽の粘度の経時変化を示す。点線は追加糖化酵素の添加を開始した時点を示す。
【図１０】実施例３の第１反応槽のエタノール濃度（相対値）の経時変化を示す。点線は追加糖化酵素の添加を開始した時点を示す。
【図１１】実施例３の第１反応槽の酵素原単位（相対値）の経時変化を示す。点線は追加糖化酵素の添加を開始した時点を示す。
【発明の具体的説明】
【００１４】
本発明のリグノセルロース系原料からエタノールを製造する方法は、リグノセルロース系原料、糖化酵素および酵母を含んでなる発酵液に、該発酵液自体の物性値が予め設定した範囲内に維持されるように追加糖化酵素を連続的または間欠的に添加しながら並行複発酵を行う工程を含むことを特徴としている。
【００１５】
＜製造方法＞
本発明のリグノセルロース系原料からエタノールを製造する方法は、リグノセルロース系原料、糖化酵素および酵母を含んでなる発酵液に、該発酵液自体の物性値が予め設定した範囲内に維持されるように追加糖化酵素を連続的または間欠的に添加しながら並行複発酵を行う工程を含む。
【００１６】
本発明のリグノセルロース系原料からエタノールを製造する方法は、以下の工程を含んでいてもよい。
（１）上記糖化酵素と共にエタノール発酵微生物を共存させ、酵素糖化反応とエタノール発酵とを同時に行う並行複発酵工程
（２）固液分離工程
（３）エタノール濃縮工程
（４）固形分除去工程
【００１７】
＜並行複発酵工程＞
まず、リグノセルロース系原料、糖化酵素および酵母を反応槽中に供給する。本発明において、リグノセルロース系原料、糖化酵素および酵母は予め混合して反応槽内に供給してもよく、それぞれを別々に反応槽内に供給してもよいが、反応槽中に予め供給されたリグノセルロース系原料に糖化酵素および酵母を添加することが好ましい。リグノセルロース系原料は糖化酵素により糖化され、生成された糖類が酵母による発酵でエタノールに変換される。
【００１８】
（リグノセルロース系原料）
リグノセルロース系原料は、パルプ、または、パルプ以外の、リグノセルロースを含む原料である。リグノセルロース系原料は１種を単独で用いてもよいし、２種以上混合して用いてもよい。
パルプとしては、針葉樹、広葉樹、林地残材、建築廃材等から得られる木材パルプ、コットンリンターやコットンリント、麻、麦わら、バガス等の非木材パルプ、古紙を原料とした古紙パルプや脱墨パルプ等が挙げられる。パルプの製法としてはアルカリ抽出、アルカリ蒸解等の化学パルプ製造法等、高度にリグニンを除去する方法が好ましく、化学パルプ製造法により製造されるパルプの中でも、入手のしやすさという点で、製紙用パルプが好ましい。製紙用パルプとしては、広葉樹クラフトパルプ（例えば、晒クラフトパルプ（ＬＢＫＰ）、未晒クラフトパルプ（ＬＵＫＰ）、酸素漂白クラフトパルプ（ＬＯＫＰ））、針葉樹クラフトパルプ（例えば、晒クラフトパルプ（ＮＢＫＰ）、未晒クラフトパルプ（ＮＵＫＰ）、酸素漂白クラフトパルプ（ＮＯＫＰ））、サルファイトパルプ（ＳＰ）、ソーダパルプ（ＡＰ）等の化学パルプ、セミケミカルパルプ（ＳＣＰ）、ケミグラウンドウッドパルプ（ＣＧＰ）等の半化学パルプが挙げられる。パルプとして、好ましくは、広葉樹クラフトパルプ、針葉樹クラフトパルプ、サルファイトパルプ（ＳＰ）、セミケミカルパルプ（ＳＣＰ）であり、より好ましくは、広葉樹晒クラフトパルプ（ＬＢＫＰ）、針葉樹酸素漂白クラフトパルプ（ＮＯＫＰ）である。
【００１９】
パルプ以外のリグノセルロース系原料としては、木質系として、製紙用樹木、林地残材、間伐材等のチップ又は樹皮、木本性植物の切株から発生した萌芽、製材工場等から発生する鋸屑又はおがくず、街路樹の剪定枝葉、建築廃材等が挙げられる。前記木質系のリグノセルロース系原料としては、ユーカリ（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ）属植物、ヤナギ（Ｓａｌｉｘ）属植物、ポプラ属植物、アカシア（Ａｃａｃｉａ）属植物、スギ（Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ）属植物等が利用できる。これらのうちでも、ユーカリ属植物、アカシア属、ヤナギ属植物が原料として大量に採取し易いため好ましい。草本系としてケナフ、稲藁、麦わら、コーンコブ、バガス等の農産廃棄物、油用作物やゴム等の工芸作物の残渣及び廃棄物（例えば、ＥＦＢ：Ｅｍｐｔｙ  Ｆｒｕｉｔ  Ｂｕｎｃｈ）、草本系エネルギー作物のエリアンサス、ミスカンサスやネピアグラス等が挙げられる。
また、パルプ以外のリグノセルロース系原料はバイオマスであってもよい。バイオマスとしては、木材由来の紙、古紙、パルプスラッジ、スラッジ、下水汚泥、食品廃棄物等が挙げられる。これらのバイオマスは、単独、あるいは複数を組み合わせて使用することができる。また、バイオマスは、乾燥固形物であっても、水分を含んだ固形物であっても、スラリーであってもよい。
上述のパルプ以外のリグノセルロース系原料は、前処理（脱リグニン処理等）を行った上で好適に使用される。
【００２０】
反応槽中の発酵液におけるリグノセルロース系原料の濃度は、好ましくは５〜３０質量％であり、さらに好ましくは１０〜２０質量％である。リグノセルロース系原料の濃度を５質量％以上にすることは、最終的に生産物の濃度が低すぎてエタノールの濃縮のコストが高くなるという問題を回避する上で有利である。また、リグノセルロース系原料の濃度を３０質量％以下とすることは、高濃度となるにしたがって原料の攪拌が困難になり、生産性が低下するという問題を回避する上で有利である。
【００２１】
（糖化酵素）
糖化酵素はセルロースまたはヘミセルロース分解酵素である限り特に限定されない。セルロース分解酵素は、セロビオヒドロラーゼ活性、エンドグルカナーゼ活性、ベータグルコシダーゼ活性等を有する、所謂セルラーゼと総称される酵素が挙げられる。
各セルロース分解酵素は、それぞれの活性を有する酵素を適宜の量で添加しても良いが、市販されているセルロース分解酵素剤は、上記の各種のセルラーゼ活性を有すると同時に、ヘミセルラーゼ活性も有しているものが多いので市販のセルロース分解酵素剤を用いても良い。
【００２２】
市販のセルロース分解酵素剤としては、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ファネロケエテ（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）属、トラメテス（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）属、フーミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、イルペックス（Ｉｒｐｅｘ）属等に由来するセルロース分解酵素剤がある。このようなセルロース分解酵素剤の市販品としては、全て商品名で、例えば、セルロイシンＴ２（エイチピィアイ社製）、ノボザイム１８８（ノボザイム社製）、マルティフェクトＣＸ１０Ｌ（ジェネンコア社製）、ＧＣ２２０（ジェネンコア社製）等が挙げられる。
【００２３】
使用される糖化酵素は、セルロース分解酵素剤の性質等を勘案して、単独もしくは組み合わせて用いることができる。本発明では、並行複発酵の初期に添加する糖化酵素と一定時間経過後に連続的または間欠的に添加する追加糖化酵素の２種類が存在するが、それら糖化酵素の種類は同一であっても異なってもよい。
【００２４】
本発明における糖化酵素の活性は、以下の通りに定義される。
１Ｍ酢酸緩衝液１．５ｍＬを含む８ｍＬの水溶液（ｐＨ４．８）に酵素液３７５μＬ、広葉樹晒クラフトパルプ（ＬＢＫＰ）絶乾重量０．５ｇを加えた計１０ｍＬの系で３３℃、４時間反応を行ったのち、９５℃、１０分間加熱して反応停止させた。これを高速液体クロマトグラフィー（Ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＨＰＬＣ）（Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ、島津製作所社製）にて示差屈折率（ＲＩ）検出器を用いて分析、グルコース濃度を測定する。測定結果に基づき、１分間に１μｍｏｌのグルコースを生じる酵素タンパク量を１単位（Ｕ）とする。
ＨＰＬＣの測定条件は以下の通りである。
カラム：８０Ｓｈｏｄｅｘ  ＳＵＧＡＲ  ＳＰ０８１０（昭和電工株式会社製）
移動相：超純水
流速：０．８ｍＬ／ｍｉｎ
温度：８０℃
【００２５】
反応槽中の発酵液における糖化酵素の初期含量は、特に限定されないが、好ましくは５０〜５００Ｕ／Ｌであり、さらに好ましくは１００〜３００Ｕ／Ｌである。
【００２６】
また、反応槽中の発酵液における糖化酵素の初期含量とリグノセルロース系原料の初期含量との比（糖化酵素の初期含量（Ｕ）／リグノセルロース系原料の初期含量（ｋｇ））は、好ましくは５００〜５０，０００Ｕ／ｋｇであり、さらに好ましくは１，０００〜３０，０００Ｕ／ｋｇである。
【００２７】
（酵母）
酵母は、特に限定されないが、糖類（六炭糖、五炭糖）を発酵できることが好ましい。具体的には、酵母としては、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）等のサッカロマイセス属酵母、ピキア・スティピティス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ）等のピキア属酵母、キャンディダ・シハタエ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｈｉｈａｔａｅ）等のキャンディダ属酵母、パチソレン・タノフィルス（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ  ｔａｎｎｏｐｈｉｌｕｓ）等のパチソレン属酵母、イサチェンキア・オリエンタリス（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）等のイサチェンキア属酵母等の酵母が挙げられ、好ましくはサッカロマイセス属、イサチェンキア属に属する酵母、さらに好ましくは、サッカロマイセス・セレビシエ、イサチェンキア・オリエンタリスである。また、遺伝子組換技術を用いて作製した遺伝子組換酵母を用いることもできる。遺伝子組換酵母としては、六炭糖と五炭糖を同時に発酵できる酵母を特に制限なく用いることができる。
【００２８】
並行複発酵工程で用いる酵母としては、酵母培養液を用いることが好ましい。かかる酵母培養液は、上記工程に適した添加量となるように、異なるサイズの培養槽を用いて段階的に培養し得ることができる。例えば、最初に１００〜３００ｍＬで培養し、次に、得られた培養液を用いて１０〜３０Ｌで培養し、さらに得られた培養液を用いて５００〜１０００Ｌで培養し、得られた培養液を並行複発酵工程に用いることができる。
【００２９】
並行複発酵工程での反応槽中の発酵液のｐＨは、特に限定されないが、３〜１０の範囲に維持することが好ましく、４〜８の範囲に維持することがより好ましい。
【００３０】
並行複発酵工程での反応槽中の発酵液の温度は、糖化酵素および／または酵母の至適温度の範囲内であれば特に限定されないが、２０〜４０℃が好ましく、３０〜４０℃がより好ましい。
【００３１】
また、並行複発酵工程における反応槽中の菌体数は、特に限定されないが、１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上が好ましく、１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上がより好ましい。また、好ましい菌体数の範囲は、１０７〜１０９ｃｅｌｌｓ／ｍＬであり、より好ましい菌体数の範囲は１０８〜１０９ｃｅｌｌｓ／ｍＬである。
【００３２】
並行複発酵工程における発酵液の固形分（Sustained Solid：ＳＳ）の増加速度は、特に限定されないが、−１〜５ｋｇ／ｈの範囲が挙げられ、好ましくは０〜５ｋｇ／ｈの範囲である。
【００３３】
並行複発酵工程におけるグルコース濃度は、特に限定されないが、０〜０．２質量／体積％の範囲が挙げられる。
【００３４】
並行複発酵工程は、連続式が好ましいが、セミバッチ式、バッチ式でも良い。ここで、連続式とは、例えば、原料供給およびエタノールの生成が継続される態様をいう。反応時間は、酵素濃度によっても異なるが、バッチ式の場合は好ましくは１２〜２４０時間、より好ましくは２４〜１２０時間である。セミバッチ式および連続式の場合、平均滞留時間は、好ましくは１２〜２４０時間、さらに好ましくは２４〜１２０時間である。ここで、平均滞留時間とは、リグノセルロース系原料が反応槽内へ供給されてから反応槽外に移送されるまでに平均して滞留する時間をいう。
【００３５】
本発明は、並行複発酵工程において、リグノセルロース系原料、糖化酵素および酵母を含んでなる発酵液に、該発酵液自体の物性値が予め設定した範囲内に維持されるように追加糖化酵素を連続的または間欠的に添加することを含む。かかる物性値としては、特に限定されないが、エタノール製造量当たりの必要酵素量を一定レベルに維持する観点からは、発酵液のエタノール濃度および／または粘度が好ましい。
【００３６】
前記発酵液の物性値がエタノール濃度である場合、発酵開始後に定常状態になった時のエタノール濃度に対して、発酵液のエタノール濃度（相対値）が８０％以上に維持されるように追加糖化酵素を添加することが好ましい。上記エタノール濃度として、より好ましくは８５％以上である。かかるエタノール濃度の測定時点は、特に限定されず、適宜設定されるものであるが、例えば、発酵開始後３００〜５００時間である。発酵液のエタノール濃度の測定は、少なくとも１ｍＬの発酵液を反応槽よりサンプリングし、反応停止後、ＨＰＬＣによる上清の分析により測定することができる。このような測定は、Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ（株式会社島津製作所）を用いることにより、簡便に行うことができる。
【００３７】
ここで、上記「発酵開始後に定常状態になった時点」とは、発酵開始後にエタノール濃度が最初に極大値となった時点であって、その後もエタノール濃度の変動範囲が２０％未満に留まる時点を好ましく意味する。発酵開始後に定常状態になる時点は、反応条件等に応じて適宜変更することができるが、例えば、発酵開始後１２〜２４０時間であり、好ましくは２４〜１２０時間である。
【００３８】
本発明の一つの態様によれば、添加する追加糖化酵素の量は、前記発酵液における酵素原単位（Ｕ／Ｌ）が、例えば、発酵開始１〜１２時間後、好ましくは、１〜８時間後の酵素原単位に対する相対値として０．１〜３０％に維持されるような量であることが好ましい。ここで、酵素原単位とは、単位容量のエタノールを生成するのに必要な酵素量をいう。上記酵素原単位は、酵素コストの指標に用いられ、好ましくは、以下の式から算出できる。
酵素原単位（Ｕ／Ｌ）＝糖化酵素の総量（Ｕ）／生成したエタノールの総量（Ｌ）
酵素コストの抑制の観点から、酵素原単位が継続的に減少するように酵素反応を実施することは、効率的なエタノール製造が可能な点で特に有利である。追加糖化酵素の量は、発酵開始１〜１２時間後の酵素原単位に対して、発酵液の酵素原単位（相対量）が、例えば、０．１〜３０％、好ましくは０．１〜１０％、より好ましくは０．１〜２％となるように設定することが好ましい。かかる酵素原単位の算出時点は、特に限定されず、適宜設定されるものであるが、例えば、３００〜５００時間である。
【００３９】
添加する追加糖化酵素の量は、例えば、発酵液１Ｌあたり２０Ｕ以下とすることができ、好ましくは１Ｕ以上１５Ｕ以下、さらに好ましくは３Ｕ以上１０Ｕ以下である。ここで、添加する追加糖化酵素の量は１日当たりの追加糖化酵素の添加量として計算できる。また、追加糖化酵素の量は、並行複発酵工程の温度、ｐＨ、時間、酵素の性質や組み合わせ等によって適宜設定することができる。
【００４０】
１日当たりの追加糖化酵素の添加量と、発酵液における糖化酵素の初期含量との質量比（１日当たりの追加糖化酵素の添加量：発酵液における糖化酵素の初期含量）は、特に限定されないが、好ましくは１：１０〜１：１００であり、より好ましくは１：１５〜１：８０であり、さらに好ましくは１：１５〜１：５０である。
【００４１】
追加糖化酵素の添加は連続的または間欠的に行われる。ここで、追加糖化酵素の添加が間欠的に行われる場合、追加糖化酵素の添加は２〜１９２時間毎が好ましく、６〜９６時間毎がより好ましく、１２〜４８時間毎がさらに好ましい。
【００４２】
追加糖化酵素の添加の開始は、該発酵液自体の物性値を測定し、該測定値が予め設定した範囲内に維持されるように開始することが好ましい。
【００４３】
追加糖化酵素を添加するための指標としては、発酵液の粘度もまた採用することができる。上記粘度は、リグノセルロース系原料の糖化の進行度合いに関する指標として用いることが考えられる。上記発酵液の物性値が発酵液の粘度である場合、該粘度は攪拌条件や反応条件等に応じて適宜決定することができるが、該粘度が１４０ｃＰを超えた時点で追加糖化酵素を前記発酵液に添加することが好ましい。上記粘度の指標は、並行複発酵工程における反応が連続式である場合に特に有利に用いることができる。並行複発酵工程がセミバッチ式、バッチ式である場合には、発酵液の粘度は攪拌条件や反応条件等に応じて適宜決定することができるが、該粘度が４ｃＰを超えた時点で追加糖化酵素を前記発酵液に添加することが好ましい。
【００４４】
また、発酵液の物性値が粘度である場合、該粘度は攪拌条件や反応条件等に応じて適宜決定することができるが、上述の予め設定された範囲は発酵液の粘度として３００ｃＰ以下が好ましい。上記粘度として、より好ましくは２５０ｃＰ以下である。上記粘度の範囲は、並行複発酵工程における反応が連続式である場合に有利に用いることができる。並行複発酵工程における反応がセミバッチ式、バッチ式である場合には、発酵液の粘度が２０ｃＰ以下となるように追加糖化酵素を前記発酵液に添加することが好ましい。
【００４５】
発酵液の粘度の測定は、少なくとも１０ｍＬの発酵液を反応槽よりサンプリングし、粘度計による粘度測定に直接供することにより測定することができる。このような測定は、粘度計（アナログＢ型粘度計ＬＶ−Ｔ、ＢＲＯＯＫＦＩＥＬＤ社）を用いることにより、簡便に行うことができる。
【００４６】
また、並行複発酵工程においては、発酵液におけるリグノセルロース系原料の濃度が所定の範囲内に維持されるように調節されることが好ましい。上記所定の範囲としては、５〜３０質量％が挙げられ、好ましくは１０〜２０質量％である。上記調節は、例えば、反応槽にリグノセルロース系原料を供給することにより行われる。ここで、リグノセルロース系原料の反応槽への供給速度は特に限定されないが、並行複発酵工程が連続式であって、反応槽から発酵液が排出されている場合、反応槽へのリグノセルロース系原料の供給速度と反応槽からの発酵液の排出速度が同程度であることが好ましい。また、下記に示すように、固液分離工程において、エタノール水溶液分離後の固形分濃縮発酵液を回収し、反応槽へ移送する場合、該固形分濃縮発酵液と反応槽へのリグノセルロース系原料との合計の供給速度と反応槽からの発酵液の排出速度とが同程度であることが好ましい。
【００４７】
本発明の一つの態様によれば、酵母生育の観点または原料が未反応のまま反応槽から移送されるリスクを防ぐ観点から、並行複発酵が行われる反応槽は、互いに連結した少なくとも２槽であることが好ましい。上記少なくとも２槽の反応槽は直列に連結していることが好ましい。かかる態様においては、例えば、第１反応槽から排出される第一の発酵液を、ライン部を介して第２反応槽に注入するように、各反応槽を直列に連結することができる。
ここで、上記第１反応槽は、発酵液を収容しかつリグノセルロース系原料が連続的に追加供給されるものであることが好ましい。リグノセルロース系原料の供給量としては、第一反応槽内の発酵液におけるリグノセルロース系原料の濃度が所定の範囲内に維持されるように調節されることが好ましく、上記所定の範囲としては、５〜３０質量％が挙げられ、好ましくは１０〜２０質量％である。
さらに、上記第２反応槽における発酵液が、上記第１反応槽から前記発酵液の一部が連続的に移送されるものであることが好ましい。
【００４８】
並行複発酵を行う反応槽として互いに連結した少なくとも２槽を用いる場合、追加糖化酵素の添加の指標となるような発酵液の物性値は、第１反応槽の発酵液の物性値を用いることが好ましい。第１反応槽の発酵液は、未反応のリグノセルロース原料の割合が多く酵素活性の低下が物性値に影響しやすいことから、追加糖化酵素の添加の正確な指標として利用する上で有利である。
【００４９】
＜固液分離工程＞
上記反応槽から排出された発酵液は、固液分離工程で減圧蒸留装置、膜分離装置等の分離装置により、固形分濃縮発酵液と水溶液、例えば、固形分濃縮発酵液とエタノール水溶液とに分離することができる。反応槽が２槽である場合には、第２反応槽から発酵液が排出されエタノール分離装置に移送されることが好ましい。減圧蒸留装置としては、ロータリーエバポレーター、フラッシュエバポレーター等を用いることができる。減圧下では低い温度でエタノールを分離できるため、酵素の失活を防ぐことができる。得られたエタノール水溶液は下記のエタノール濃縮工程で濃縮されうる。
エタノール水溶液を分離した後の固形分濃縮発酵液を回収して、そのまま反応槽へと移送してもよく、また、以下に示すように、固形分除去装置により残渣と上清に分離してもよい。反応槽が少なくとも２槽である場合には、移送される反応槽は第１反応槽が好ましい。
【００５０】
＜エタノール濃縮工程＞
上記固液分離工程で得られたエタノール水溶液は、さらに蒸留処理または各種分離膜、例えば、ゼオライト膜を用いて濃縮することにより、高純度のエタノールを生成することができる。また、上記エタノール水溶液は、エタノール除去後に反応槽に移送してもよい。
【００５１】
＜固形分除去工程＞
固液分離工程においてエタノール水溶液を分離した後の固形分濃縮発酵液は、固形分除去装置に移送し残渣と上清に分離してもよい。得られた上清は反応槽へ移送してもよい。反応槽が少なくとも２槽である場合には、移送される反応槽は第１反応槽が好ましい。固形分除去装置としては、ディスク型遠心分離機、スクリュープレス、スクリーン、フィルタープレス、ベルトプレス、ロータリープレス等を用いることができる。分離された残渣には、酵素、リグニン、酵母が含まれている。残渣に吸着している酵素を遊離させて回収し、再利用することもできる。リグニンは、燃焼原料として回収しエネルギーとして利用することもできるし、リグニンを回収し有効利用することもできる。酵母を残渣から分離して、並行複発酵工程で再利用することもできる。
【００５２】
本発明のエタノールの製造方法によれば、効率的に、リグノセルロース系用原料からエタノールを製造することができる。前記エタノールの製造方法により得られたエタノールは、例えば、燃料用エタノール、工業用エタノール、食品添加用エタノール等として好適に利用可能である。
【実施例】
【００５３】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されない。また、特に指摘されない限り、本明細書に記載の単位および測定方法は日本工業規格（ＪＩＳ）による。
【００５４】
粘度の測定方法
各実施例、比較例において得られた発酵液の粘度は、粘度計（アナログＢ型粘度計ＬＶ−Ｔ、ＢＲＯＯＫＦＩＥＬＤ社）を用いて、Ｎｏ．２７スピンドルを使用して回転数６０ｒｐｍ、温度２５℃にて測定した。
【００５５】
濁度の測定方法
各実施例、比較例において得られた発酵液のＳＳ濁度は、濁度計（ポータブル濁度計２１００Ｑ、ＨＡＣＨ社）を用いて測定した。その後、得られたＳＳ濁度とその１２時間前に測定されたＳＳ濁度との差を求め、２点間の経過時間である１２時間で除してＳＳ増加速度を算出した。
【００５６】
菌体数の計測方法
各実施例、比較例において得られた培養液、発酵液中の菌体数はトーマ血球計算盤を用い、光学顕微鏡（倍率４００倍）で観察、計測した。
【００５７】
グルコース、エタノール濃度の測定方法
発酵液中のグルコース濃度およびエタノール濃度については、発酵液を９５℃、１０分間加熱して酵母および酵素を失活させたのち、これをＨＰＬＣ（Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ、島津製作所社製）にて示差屈折率（ＲＩ）検出器を用いて分析、測定した。
ＨＰＬＣの測定条件は以下の通りである。
カラム：８０Ｓｈｏｄｅｘ ＳＵＧＡＲ ＳＰ０８１０（昭和電工株式会社製）
移動相：超純水： 
流速：０．８ｍＬ／ｍｉｎ
温度：８０℃
【００５８】
酵素原単位の算出方法
各実施例、比較例における並行複発酵開始から所定の時間までの酵素原単位は、各実施例、比較例で得られた発酵液に含まれるエタノール濃度に基づき、以下の計算式に基づき酵素原単位（Ｕ／Ｌ）を算出した。
酵素原単位（Ｕ／Ｌ）＝糖化酵素の総量（Ｕ）／生成したエタノールの総量（Ｌ）
上記酵素原単位とは、酵素コストの指標であり、単位容量のエタノールを生成するのに必要な酵素量を示す。
【００５９】
実施例１：５Ｌ反応槽での試験（追加糖化酵素の少量の繰り返し添加あり）
５００ｍＬのフラスコにＣＳＬ（コーンスティープリカー） １質量／体積％、ブドウ糖 ２質量／体積％の水溶液２００ｍＬを調製した。得られた水溶液に、酵母サッカロマイセス・セレビシエを、１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように植菌し、終夜培養し、酵母培養液を調製した。
【００６０】
次に並行複発酵試験を行った。５Ｌ反応槽に針葉樹酸素晒クラフトパルプ（ＮＯＫＰ）総乾重量３００ｇ、尿素６．６ｇ、糖化酵素３９５Ｕおよび終濃度１．０×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなる量の酵母培養液を添加、全量３Ｌとなるよう滅菌水で液量を調整した。ｐＨが４．８となるように、５Ｎ硫酸および５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液で調整した。培養槽は温度３３℃、攪拌速度２０６ｒｐｍ、ｐＨ４．８で一定となるように制御した。さらに、４８時間経過後は、２４時間毎に一回、発酵液の半分を抜き出し、遠心分離機（ＫＵＢＯＴＡ  ５５００テーブルトップ冷却遠心機）にて遠心分離を行い、得られた上清からエバポレーター（日本ビュッヒ、Ｒ−３００）を用いてエタノールを除去した。エタノールの除去された上清と遠心分離で回収した固形分とを共に反応槽へと戻した。この時、発酵液には初期添加量の半分に相当する絶乾重量１５０ｇのＮＯＫＰも添加した。
【００６１】
並行複発酵工程の条件を以下に示す。
【表１】
2020039295.tif 000002
【００６２】
上記条件の下反応開始後１６８時間の時点から、２４時間毎に１回２２Ｕの追加糖化酵素を添加した。
【００６３】
発酵液は２４時間に一度サンプリングし、粘度、エタノール濃度、グルコース濃度を測定し、菌体数を計測し、ＳＳ増加速度を算出した。
粘度の測定結果を図１に、エタノール濃度（相対値）の測定結果を図２に示す。ここで、図２では、試験開始後に定常状態になった時点（試験開始後４８時間）のエタノール濃度を１としている。
また、並行複発酵開始から終了までの菌体数は１×１０８〜１×１０９ｃｅｌｌｓ／ｍＬであった。ＳＳ増加速度は、１６８時間で０．０００３６ｋｇ／ｈ、２８８時間で０．０００５７ｋｇ／ｈであった。グルコース濃度は、１６８時間で０．０２３質量／体積％、２８８時間で０質量／体積％であった。
【００６４】
比較例１：５Ｌ反応槽での試験（追加糖化酵素の添加なし）
反応開始後１６８時間の時点から追加糖化酵素を添加しない以外は、実施例１と方法により並行複発酵試験を行った。
結果を図１、２に示す。
また、並行複発酵開始から終了までの菌体数は１×１０８〜１×１０９ｃｅｌｌｓ／ｍＬであった。グルコース濃度は、１６８時間、２８８時間共に０質量／体積％であった。
実施例１、比較例１のどちらの系もエタノール濃度が低下したものの、エタノール濃度の減少、粘度上昇挙動のいずれも実施例１（追加糖化酵素の少量添加あり）の系の方が比較例１（追加糖化酵素の少量添加なし）の系に比べ緩やかになっており、追加糖化酵素の少量添加の効果ありと判断された。
【００６５】
比較例２：１２０００Ｌ容反応槽での試験（追加糖化酵素の一回添加あり）
発酵に用いる酵母サッカロマイセス・セレビシエは、（１）５００ｍＬフラスコを用いた２００ｍＬ培養、（２）３０Ｌ培養槽を用いた２０Ｌ培養、（３）９００Ｌ培養槽を用いた８００Ｌ培養の３段階で調製した。それぞれの段階においてＣＳＬ １質量／体積％、ブドウ糖 ２質量／体積％の水溶液を調製し、１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるよう植菌し、１２時間培養して、酵母培養液を得た。
【００６６】
次に並行複発酵試験を実施した。最大１２０００Ｌ容の第１反応槽に、滅菌水を張込み、１２．６ｋｇの尿素を添加後、滞留時間４８時間経過時点での乾燥パルプ濃度が１０％（ｗ／ｗ）となるよう、絶乾重量で１３．７５ｋｇ／ｈの速度で針葉樹酸素晒クラフトパルプ（ＮＯＫＰ）の供給を開始した。３Ｎ硫酸および３Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐＨを４．８に調整した後、８７８７３５Ｕの糖化酵素および９００Ｌ培養槽で調製した酵母培養液全量を添加し、反応を開始した。反応槽は、温度３３℃、攪拌速度２４ｒｐｍ、ｐＨ  ４．８で一定となるように制御した。さらに、４８時間経過時点で第１反応槽の半分量を最大１００００Ｌの第２反応槽へと移送した。第２反応槽への移送完了後、第２反応槽から減圧蒸留塔へ１４０ｋｇ／ｈの速度で発酵液移送を開始、４５ｋｇ／ｈの割合でエタノール水溶液を留去するとともに、９５ｋｇ／ｈの割合で固形分濃縮発酵液を第１反応槽へと回収する操作を運転停止まで継続した。この間、ＮＯＫＰ第１反応槽への供給は一定速度（４５ｋｇ／ｈ）で継続していた。
【００６７】
並行複発酵工程の条件を以下に示す。
【表２】
2020039295.tif 000003
【００６８】
反応開始後２２２時間経過時点で、第１反応槽のエタノール濃度低下が顕著になったため、酵素８７８７３５Ｕを再度添加した。
【００６９】
発酵液は最初に６時間後、それ以降は１２時間に一度サンプリングし、粘度、エタノール濃度、グルコース濃度を測定し、菌体数を計測し、ＳＳ増加速度を算出した。
第１反応槽の粘度測定の結果を図３に、第１反応槽のエタノール濃度（相対値）の測定結果を図４に、酵素原単位（相対値）の結果を図５に示す。ここで、図４では、試験開始後に定常状態になった時点（試験開始後５４時間）のエタノール濃度を１としている。
また、図５では、試験開始後６時間の酵素原単位（Ｕ／Ｌ）を１としている。
また、並行複発酵開始から終了までの第１反応槽の菌体数は１×１０８〜１×１０９ｃｅｌｌｓ／ｍＬであった。第１反応槽のＳＳ増加速度は、２２２時間で０．３３５ｋｇ／ｈ、４９８時間で０．００９３ｋｇ／ｈであった。グルコース濃度は、２２２時間で０．１４２質量／体積％、４９８時間で０．０７５質量／体積％であった。
酵素８７８７３５Ｕを一気に添加したものの、一時的な生産性改善効果しか得られなかった。したがって、一度に大容量を添加しても添加量に見合った効果が得られないことが判明した。
【００７０】
実施例２：１２０００Ｌ容反応槽での試験（追加糖化酵素の少量の繰り返し添加あり）
発酵に用いる酵母サッカロマイセス・セレビシエは、（１）５００ｍＬフラスコを用いた２００ｍＬ培養、（２）３０Ｌ培養槽を用いた２０Ｌ培養、（３）９００Ｌ培養槽を用いた８００Ｌ培養の３段階で調製した。それぞれの段階においてＣＳＬ １質量／体積％、ブドウ糖 ２質量／体積％の水溶液を調製し、１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるよう植菌し、１２時間培養して、酵母培養液を得た。
【００７１】
次に並行複発酵試験を実施した。最大１２０００Ｌ容の第１反応槽に、滅菌水を張込み、１４ｋｇの尿素、６３ｋｇのＣＳＬを添加後、滞留時間４８時間経過時点での乾燥パルプ濃度が１０％（ｗ／ｗ）となるよう、絶乾重量で１５．２ｋｇ／ｈの速度で広葉樹晒クラフトパルプ（ＬＢＫＰ）の供給を開始した。３Ｎ硫酸および３Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐＨを４．８に調整した後、９６６６０８Ｕの糖化酵素および９００Ｌ培養槽で調製した酵母培養液全量を添加し、反応を開始した。反応槽は温度３３℃、攪拌速度２４ｒｐｍ、ｐＨ  ４．８で一定となるように制御した。４８時間経過時点で第１反応槽の半分量を最大１００００Ｌの第２反応槽へと移送した。第２反応槽への移送完了後、第２反応槽から減圧蒸留装置へ１５０ｋｇ／ｈの速度で発酵液移送を開始し、４０ｋｇ／ｈの割合でエタノール水溶液を留去するとともに、１１０ｋｇ／ｈの割合で固形分濃縮発酵液を第１反応槽へと回収する操作を運転停止まで継続した。この間、ＬＢＫＰ含有液の第１反応槽への供給は一定速度（４０ｋｇ／ｈ）で継続していた。
【００７２】
並行複発酵工程の条件を以下に示す。
【表３】
2020039295.tif 000004
【００７３】
さらに、反応開始後３５４時間経過時点で追加糖化酵素の少量の添加を開始した。酵素は２４時間毎に４９２１０Ｕ添加した。
【００７４】
発酵液は最初に６時間後、それ以降は１２時間に一度サンプリングし、粘度、エタノール濃度、グルコース濃度を測定し、菌体数を計測し、ＳＳ増加速度を算出した。
第１反応槽の粘度測定の結果を図６に、第１反応槽のエタノール濃度（相対値）の測定の結果を図７に、酵素原単位（相対値）の結果を図８に示す。ここで、図７では、試験開始後に定常状態になった時点（試験開始後５４時間）のエタノール濃度を１としている。また、図８では、試験開始後６時間の酵素原単位（Ｕ／Ｌ）を１としている。
また、並行複発酵開始から終了までの第１反応槽の菌体数は１×１０８〜１×１０９ｃｅｌｌｓ／ｍＬであった。第１反応槽のＳＳ増加速度は３５４時間で０．１６ｋｇ／ｈ、５４６時間で０．２４ｋｇ／ｈであった。グルコース濃度は、３５４時間で０．０７９質量／体積％、５４６時間で０．０９７質量／体積％であった。
追加糖化酵素の少量の繰り返し添加によるエタノール濃度維持および粘度上昇の緩和を確認できた。
【００７５】
実施例３：１２０００Ｌ容反応槽での試験（追加糖化酵素の少量の繰り返し添加あり）
発酵に用いる酵母サッカロマイセス・セレビシエは、（１）５００ｍＬフラスコを用いた２００ｍＬ培養、（２）３０Ｌ培養槽を用いた２０Ｌ培養、（３）９００Ｌ培養槽を用いた８００Ｌ培養の３段階で調製した。それぞれの段階においてＣＳＬ １質量／体積％、ブドウ糖 ２質量／体積％の水溶液を調製し、１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるよう植菌し、１２時間培養して、酵母培養液を得た。
【００７６】
次に並行複発酵試験を実施した。最大１２０００Ｌ容の第１反応槽に、滅菌水を張込み、１４ｋｇの尿素、１３７ｋｇのＣＳＬを添加後、滞留時間４８時間経過時点での乾燥パルプ濃度が１０％（ｗ／ｗ）となるよう、絶乾重量で１５．２ｋｇ／ｈの速度で広葉樹晒クラフトパルプ（ＬＢＫＰ）の供給を開始した。３Ｎ硫酸および３Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐＨを４．８に調整した後、７９９６４９Ｕの糖化酵素および９００Ｌ培養槽で調製した酵母培養液全量を添加し、反応を開始した。反応槽は温度３３℃、攪拌速度２４ｒｐｍ、ｐＨ  ４．８で一定となるように制御し、４８時間経過時点で第１反応槽の半分量を最大１００００Ｌの第２反応槽へと移送した。第２反応槽への移送完了後、第２反応槽から減圧蒸留塔へ１５０ｋｇ／ｈの速度で発酵液移送を開始、４０ｋｇ／ｈの割合でエタノール水溶液を留去するとともに、１１０ｋｇ／ｈの割合で固形分濃縮発酵液を第１反応槽へと回収する操作を運転停止まで継続した。この間、ＬＢＫＰ含有液の第１反応槽への供給は一定速度（４０ｋｇ／ｈ）で継続していた。
【００７７】
並行複発酵工程の条件を以下に示す。
【表４】
2020039295.tif 000005
【００７８】
さらに、反応開始後２８２時間経過時点で追加糖化酵素の少量の添加を開始した。酵素は２４時間毎に４９２１０Ｕ添加した。
【００７９】
発酵液は最初に６時間後、それ以降は１２時間に一度サンプリングし、粘度、エタノール濃度、グルコース濃度を測定し、菌体数を計測し、ＳＳ増加速度を算出した。
第１反応槽の粘度測定の結果を図９に、第１反応槽のエタノール濃度（相対値）の測定の結果を図１０に、酵素原単位（相対値）の結果を図１１に示す。ここで、図１０では、試験開始後に定常状態になった時点（試験開始後５４時間）のエタノール濃度を１としている。また、図１１では、試験開始後６時間の酵素原単位（Ｕ／Ｌ）を１としている。
また、並行複発酵開始から終了までの第１反応槽の菌体数は１×１０８〜１×１０９ｃｅｌｌｓ／ｍＬであった。第１反応槽のＳＳ増加速度は２８２時間で−０．３１ｋｇ／ｈ、４７４時間で０．８３ｋｇ／ｈであった。グルコース濃度は、２８２時間で０．０７６質量／体積％、４７４時間で０．０３９質量／体積％であった。
追加糖化酵素の少量の繰り返し添加によるエタノール濃度維持および粘度上昇の緩和を確認できた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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