(57)【要約】      （修正有）【課題】癌及び感染性因子の処置のための方法の提供。【解決手段】癌及び感染性疾患を有する被験体を有効に処置するための、ＩＬ−１５ベーススーパーアゴニスト複合体と抗体を使用した併用療法薬を特色とするものである。【選択図】図１２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体の新生物又は感染を処置するための方法であって、
前記被験体に有効量の抗体又は抗体様分子と、ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ複合体（ＡＬＴ−８０３）を含む有効量の医薬組成物とを投与し、ここで、前記ＡＬＴ−８０３は、ダイマー型ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃと２分子のＩＬ−１５Ｎ７２Ｄを含むものであり、
それにより、該新生物又は感染を処置すること
を含む方法。
【請求項２】
ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ分子が配列番号３を含むものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃが配列番号６を含むものである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
新生物が、膠芽腫、前立腺癌、造血器の癌、Ｂ細胞腫瘍、多発性骨髄腫、Ｂ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、慢性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、固形腫瘍、尿路上皮／膀胱癌、黒色腫、肺癌、腎細胞癌、乳癌、胃及び食道の癌、頭頸部癌、結腸直腸癌、卵巣癌、非小細胞肺癌、Ｂ細胞性非ホジキンリンパ腫、並びに頭頸部扁平上皮癌からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
感染が、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）によるウイルス感染である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
有効量の前記ＡＬＴ−８０３を毎日投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ＡＬＴ−８０３の有効量が０．１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
有効量の前記ＡＬＴ−８０３が１週間に１回又は２回投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ＡＬＴ−８０３の有効量が０．１μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
該医薬組成物を全身、静脈内、皮下、筋肉内、膀胱内投与するか、又は点滴によって投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗体が腫瘍特異的抗体又は抗ウイルス抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗体が免疫チェックポイント阻害薬である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗体が、抗ｇｐ７５抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＨＥＲ２抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ−４）抗体、抗プログラム細胞死−１（ＰＤ−１）抗体、抗プログラム細胞死−リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）抗体又は抗プログラム細胞死−リガンド２（ＰＤ−Ｌ２）抗体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記被験体の腫瘍細胞又は感染細胞に対する前記抗体によって媒介される抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）又は抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）が、前記投与後、少なくとも５％増大する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記抗体と前記ＡＬＴ−８０３により、血中のＮＫ細胞、Ｔ細胞、好中球又は単球のカウント数又は活性のレベルが増大する、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記抗体と前記ＡＬＴ−８０３がＣＤ４＋又はＣＤ８＋  Ｔ細胞を刺激して腫瘍細胞又は感染細胞を死滅させる、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記抗体と前記ＡＬＴ−８０３がＮＫ細胞を刺激して腫瘍細胞又は感染細胞を死滅させる、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記抗体と前記ＡＬＴ−８０３が好中球又は単核球細胞を刺激して腫瘍細胞又は感染細胞を死滅させる、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記投与により腫瘍細胞又は感染細胞の数の減少がもたらされる、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記投与により新生物又は感染の疾患進行の低減がもたらされる、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記投与により、未処置の被験体と比べて前記被験体の生存期間の長期化がもたらされる、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記被験体がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記抗体と前記ＡＬＴ−８０３が同時又は逐次投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記投与により前記新生物又は感染の将来の再発が予防される、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
新生物の処置のためのキットであって、有効量のＡＬＴ−８０３、抗体、及び新生物の処置のための該キットの使用説明書を備えているキット。
【請求項２６】
ウイルスの処置のためのキットであって、有効量のＡＬＴ−８０３、抗体、及びウイルスの処置のための該キットの使用説明書を備えているキット。
【請求項２７】
標的抗原を発現している疾患細胞を死滅させるための方法であって：
免疫細胞を有効量のＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ複合体（ＡＬＴ−８０３）で処理すること、
ＡＬＴ−８０３処理した該免疫細胞を、該標的抗原に特異的な抗体及び前記標的抗原を発現している疾患細胞と混合すること、
該疾患細胞を、ＡＬＴ−８０３処理した該免疫細胞と該標的抗原特異的抗体によって媒介されるＡＤＣＣ又はＡＤＣＰによって死滅させること
を含む方法。
【請求項２８】
疾患細胞の死滅レベルが、ＡＬＴ−８０３で処理しなかった免疫細胞によって媒介されるレベルと比べて少なくとも５％増大する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記抗体と前記ＡＬＴ−８０３により血中サイトカインレベルが増大する、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
前記サイトカインがＩＦＮ−γ及び／又はＩＬ−６を含む、請求項２９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１４年６月３０日に出願された米国特許仮出願第６２／０１８，８９９号の３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に基づく優先権の恩典を主張する。この仮出願は、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
技術分野
本発明は、一般に、癌及び感染性因子の処置のための治療薬の分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
本明細書に記載の本発明の前は、癌及び感染細胞に対する免疫活性を増大させるため、及び／又は指向するため新たなストラテジーの開発の急を要する必要性が存在していた。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、少なくとも一部において、抗体と、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）スーパーアゴニスト変異型及びダイマー型ＩＬ−１５受容体α／Ｆｃ融合タンパク質の複合体であるＡＬＴ−８０３との併用が、新生物（例えば、膠芽腫、前立腺癌、造血器の癌、Ｂ細胞腫瘍、多発性骨髄腫、Ｂ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、急性骨髄性（ｍｙｅｌｏｉｄ）白血病、慢性リンパ性白血病、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、固形腫瘍、尿路上皮／膀胱癌、黒色腫、肺癌、腎細胞癌、乳癌、胃及び食道の癌、頭頸部癌、結腸直腸癌、卵巣癌、非小細胞肺癌、Ｂ細胞性非ホジキンリンパ腫、及び頭頸部扁平上皮癌）又は感染（例えば、ヒト免疫不全ウイルスによるウイルス感染）に対する免疫応答の増強に有用であるという驚くべき知見に基づいている。
【０００５】
被験体の新生物又は感染を処置するための方法は、被験体に有効量の抗体（又は抗体様分子）と、ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ複合体（ＡＬＴ−８０３）を含む有効量の医薬組成物とを投与することにより行われ、ここで、ＡＬＴ−８０３は、ダイマー型ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃと２分子のＩＬ−１５Ｎ７２Ｄを含むものである。一態様において、ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ分子は配列番号３を含むものである。例示的なＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃは配列番号６を含むものである。
【０００６】
被験体は好ましくは、かかる処置を必要とする哺乳動物、例えば、新生物若しくは感染又はその素因を有すると診断された被験体である。哺乳動物は、任意の哺乳動物、例えば、ヒト、霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、並びに家畜又は食料消費のために飼育する動物、例えば、畜牛、ヒツジ、ブタ、ニワトリ及びヤギである。好ましい一実施形態では、哺乳動物はヒトである。
【０００７】
本明細書に記載の方法での処置に好適な新生物としては、膠芽腫、前立腺癌、急性骨髄性白血病、Ｂ細胞腫瘍、多発性骨髄腫、Ｂ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ性白血病、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、固形腫瘍、尿路上皮／膀胱癌、黒色腫、肺癌、腎細胞癌、乳癌、胃及び食道の癌、頭頸部癌、結腸直腸癌、並びに卵巣癌が挙げられる。本明細書に記載の方法を使用して処置される例示的な感染はヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）による感染である。また、本明細書に記載の方法は、細菌感染（例えば、グラム陽性菌又はグラム陰性菌）を処置するためにも有用である（Ｏｌｅｋｓｉｅｗｉｃｚ  ｅｔ  ａｌ．２０１２．Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．５２６：１２４−３１）。
【０００８】
好ましくは、また、本明細書に記載の組成物の投与により、疾患処置後の新生物又は感染の将来の再発が予防される。
【０００９】
さらに、本発明の方法は、自己免疫応答と関連している細胞の阻害又は低減により患者に臨床的有益性がもたらされる自己免疫疾患の有効な処置に有用である。かかる細胞としては、白血球、特にＢ細胞又はＴ細胞が挙げられ、かかる自己免疫疾患としては、関節リウマチ、若年性特発性関節炎、乾癬、クローン病、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症、強直性脊椎炎、１型糖尿病及び全身性エリテマトーデスが挙げられる（Ｃｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１０．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：３０１−１６）。
【００１０】
ＡＬＴ−８０３の例示的な有効用量としては、０．１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、例えば、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００若しくは９００μｇ／ｋｇ体重又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０若しくは１００ｍｇ／ｋｇ体重が挙げられる。
【００１１】
一部の場合では、ＡＬＴ−８０３は毎日、例えば２４時間毎に投与される。又は、ＡＬＴ−８０３は連続的に、或いは１日数回、例えば、１時間毎、２時間毎、３時間毎、４時間毎、５時間毎、６時間毎、７時間毎、８時間毎、９時間毎、１０時間毎、１１時間毎、又は１２時間毎に投与される。
【００１２】
ＡＬＴ−８０３の例示的な有効日用量としては、０．１μｇ／ｋｇ〜１００μｇ／ｋｇ体重、例えば、０．１、０．３、０．５、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５又は９９μｇ／ｋｇ体重が挙げられる。
【００１３】
或いはまた、ＡＬＴ−８０３は、１週間に約１回、例えば７日毎に約１回投与される。又は、ＡＬＴ−８０３は、１週間に２回、１週間に３回、１週間に４回、１週間に５回、１週間に６回、又は１週間に７回投与される。ＡＬＴ−８０３の例示的な有効週用量としては、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜４ｍｇ／ｋｇ体重、例えば、０．００１、０．００３、０．００５、０．０１．０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３又は４ｍｇ／ｋｇ体重が挙げられる。例えば、ＡＬＴ−８０３の有効週用量は０．１μｇ／ｋｇ体重〜４００μｇ／ｋｇ体重である。或いはまた、ＡＬＴ−８０３は固定用量で、又は体表面積に基づいて（すなわち、１ｍ２あたりで）投与される。
【００１４】
一部の場合では、被験体は、毎週４回のＡＬＴ−８０３の静脈内投薬の後、２週間の休薬期間からなる２回の６週サイクルを受ける。最終的に、担当の医師又は獣医が適切な量及び投薬量レジメンを決定する。
【００１５】
本明細書に記載の組成物は、全身、静脈内、皮下、筋肉内、膀胱内投与されるか、又は点滴によって投与される。抗体とＡＬＴ−８０３は、同時に投与しても逐次投与してもよい。
【００１６】
好ましくは、抗体（Ａｂ）は腫瘍特異的抗体、免疫チェックポイント阻害薬又は抗ウイルス抗体である。好ましい抗体は、重鎖及び軽鎖免疫グロブリン（Ｉｇ）タンパク質（齧歯類型、ヒト型、キメラ形態及びヒト化形態が挙げられ得る）で構成されたものである。さらに、本明細書に記載の方法では、抗体様分子、例えば、抗原結合ドメインを含む分子（例えば、一本鎖抗体、Ｆａｂ、Ｆｖ、Ｔ細胞受容体結合ドメイン、リガンド結合ドメイン又は受容体結合ドメイン）が使用されることもあり得る。一部の場合では、このようなドメインを好ましくはＦｃドメインと連結させる。Ｉｇは、既知のアイソタイプの任意のもの（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ及びＩｇＭ）であり得る。疾患部標的化Ａｂ（又は抗体様分子）を使用する本明細書に記載の一部の用途では、Ａｂ（又は抗体様分子）は、Ｆｃ受容体と相互作用して抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び／又は抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）を媒介し得る重鎖又はＦｃドメインを含有しているものである。他の場合では、エフェクター分子にコンジュゲートさせた抗体が使用され得る。他の用途、例えば免疫チェックポイントブロッカーの使用では、好ましいＡｂ（又は抗体様分子）は、ＡＤＣＣ又はＡＤＣＰを有効に媒介できない重鎖又はＦｃドメイン（例えば、ＩｇＧ４  Ｆｃ）を含有しているものである。
【００１７】
一部の特定の実施形態では、抗体の対象の抗原は、細胞表面受容体若しくはリガンドを含む。さらなる一実施形態では、抗原は、ＣＤ抗原、サイトカイン若しくはケモカイン受容体若しくはリガンド、成長因子受容体若しくはリガンド、組織因子、細胞接着分子、ＭＨＣ／ＭＨＣ様分子、Ｆｃ受容体、Ｔｏｌｌ様受容体、ＮＫ受容体、ＴＣＲ、ＢＣＲ、正／負の補助刺激受容体若しくはリガンド、デス受容体若しくはリガンド、腫瘍関連抗原又はウイルスコード抗原を含む。
【００１８】
好ましくは、腫瘍特異的抗体は、腫瘍細胞上の抗原に結合し得るものである。癌を有する患者の処置に承認されている腫瘍特異的抗体としては、リツキシマブ、オファツムマブ、及びオビヌツズマブ（抗ＣＤ２０  Ａｂ）；トラスツズマブ及びペルツズマブ（抗ＨＥＲ２  Ａｂ）；セツキシマブ及びパニツムマブ（抗ＥＧＦＲ  Ａｂ）；並びにアレムツズマブ（抗ＣＤ５２  Ａｂ）が挙げられる。同様に、ＣＤ２０に特異的な抗体−エフェクター分子コンジュゲート（９０Ｙ標識イブリツモマブチウキセタン、１３１Ｉ標識トシツモマブ）、ＨＥＲ２に特異的な抗体−エフェクター分子コンジュゲート（トラスツズマブエムタンシン（ａｄｏ−  ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ  ｅｍｔａｎｓｉｎｅ））、ＣＤ３０に特異的な抗体−エフェクター分子コンジュゲート（ブレンツキシマブベドチン）及びＣＤ３３に特異的な抗体−エフェクター分子コンジュゲート（ゲムツズマブオゾガマイシン）が、癌の治療に承認されている（Ｓｌｉｗｋｏｗｓｋｉ  ＭＸ，Ｍｅｌｌｍａｎ  Ｉ．２０１３  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４１：１１９２）。
【００１９】
さらに、本発明の好ましい抗体としては、当該技術分野で知られている種々の他の腫瘍特異的抗体が挙げられ得る。癌の処置のための抗体及びそのそれぞれの標的としては、限定されないが、ニボルマブ（抗ＰＤ−１  Ａｂ）、ＴＡ９９（抗ｇｐ７５）、３Ｆ８（抗ＧＤ２）、８Ｈ９（抗Ｂ７−Ｈ３）、アバゴボマブ（抗ＣＡ−１２５（模倣物））、アデカツムマブ（抗ＥｐＣＡＭ）、アフツズマブ（抗ＣＤ２０）、アラシズマブペゴール（抗ＶＥＧＦＲ２）、アルツモマブペンテタート（ｐｅｎｔｅｔａｔｅ）（抗ＣＥＡ）、アマツキシマブ（ａｍａｔｕｘｉｍａｂ）（抗メソテリン）、ＡＭＥ−１３３（抗ＣＤ２０）、アナツモマブマフェナトクス（ａｎａｔｕｍｏｍａｂ  ｍａｆｅｎａｔｏｘ）（抗ＴＡＧ−７２）、アポリズマブ（抗ＨＬＡ−ＤＲ）、アルシツモマブ（ａｒｃｉｔｕｍｏｍａｂ）（抗ＣＥＡ）、バビツキシマブ（抗ホスファチジルセリン）、ベクツモマブ（ｂｅｃｔｕｍｏｍａｂ）（抗ＣＤ２２）、ベリムマブ（抗ＢＡＦＦ）、ベシレソマブ（ｂｅｓｉｌｅｓｏｍａｂ）（抗ＣＥＡ関連抗原）、ベバシズマブ（抗ＶＥＧＦ−Ａ）、ビバツズマブメルタンシン（ｂｉｖａｔｕｚｕｍａｂ  ｍｅｒｔａｎｓｉｎｅ）（抗ＣＤ４４  ｖ６）、ブリナツモマブ（抗ＣＤ１９）、ＢＭＳ−６６３５１３（抗ＣＤ１３７）、ブレンツキシマブベドチン（抗ＣＤ３０（ＴＮＦＲＳＦ８））、カンツズマブ（ｃａｎｔｕｚｕｍａｂ）メルタンシン（抗ムチンＣａｎＡｇ）、カンツズマブラブタンシン（抗ＭＵＣ１）、カプロマブ（ｃａｐｒｏｍａｂ）ペンデチド（抗前立腺癌細胞）、カルルマブ（抗ＭＣＰ−１）、カツマキソマブ（抗ＥｐＣＡＭ、ＣＤ３）、ｃＢＲ９６−ドキソルビシンイムノコンジュゲート（抗Ｌｅｗｉｓ−Ｙ抗原）、ＣＣ４９（抗ＴＡＧ−７２）、セデリズマブ（抗ＣＤ４）、Ｃｈ．１４．１８（抗ＧＤ２）、ｃｈ−ＴＮＴ（抗ＤＮＡ関連抗原）、シタツズマブボガトクス（ｃｉｔａｔｕｚｕｍａｂ  ｂｏｇａｔｏｘ）（抗ＥｐＣＡＭ）、シクスツムマブ（ｃｉｘｕｔｕｍｕｍａｂ）（抗ＩＧＦ−１受容体）、クリバツズマブテトラキセタン（抗ＭＵＣ１）、コナツムマブ（ｃｏｎａｔｕｍｕｍａｂ）（抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２）、ＣＰ−８７０８９３（抗ＣＤ４０）、ダセツズマブ（抗ＣＤ４０）、ダクリズマブ（抗ＣＤ２５）、ダロツズマブ（抗インスリン様成長因子Ｉ受容体）、ダラツムマブ（抗ＣＤ３８（環状ＡＤＰリボースヒドロラーゼ））、デムシズマブ（ｄｅｍｃｉｚｕｍａｂ）（抗ＤＬＬ４）、デツモマブ（ｄｅｔｕｍｏｍａｂ）（抗Ｂ−リンパ腫細胞）、ドロジツマブ（ｄｒｏｚｉｔｕｍａｂ）（抗ＤＲ５）、デュリゴツマブ（ｄｕｌｉｇｏｔｕｍａｂ）（抗ＨＥＲ３）、デュシジツマブ（ｄｕｓｉｇｉｔｕｍａｂ）（抗ＩＬＧＦ２）、エクロメキシマブ（ｅｃｒｏｍｅｘｉｍａｂ）（抗ＧＤ３ガングリオシド）、エドレコロマブ（抗ＥｐＣＡＭ）、エロツズマブ（抗ＳＬＡＭＦ７）、エルシリモマブ（ｅｌｓｉｌｉｍｏｍａｂ）（抗ＩＬ−６）、エナバツズマブｅｎａｖａｔｕｚｕｍａｂ）（抗ＴＷＥＡＫ受容体）、エノチクマブ（ｅｎｏｔｉｃｕｍａｂ）（抗ＤＬＬ４）、エンシツキシマブ（ｅｎｓｉｔｕｘｉｍａｂ）（抗５ＡＣ）、エピツモマブシツキセタン（ｅｐｉｔｕｍｏｍａｂ  ｃｉｔｕｘｅｔａｎ）（抗エピシアリン）、エプラツズマブ（抗ＣＤ２２）、エルツマキソマブ（ｅｒｔｕｍａｘｏｍａｂ）（抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ，ＣＤ３）、エタラシズマブ（抗インテグリンαｖβ３）、ファラリモマブ（ｆａｒａｌｉｍｏｍａｂ）（抗インターフェロン受容体）、ファルレツズマブ（抗葉酸受容体１）、ＦＢＴＡ０５（抗ＣＤ２０）、フィクラツズマブ（抗ＨＧＦ）、フィギツムマブ（抗ＩＧＦ−１受容体）、フランボツマブ（抗ＴＹＲＰ１（糖タンパク質７５））、フレソリムマブ（ｆｒｅｓｏｌｉｍｕｍａｂ）（抗ＴＧＦβ）、フツキシマブ（ｆｕｔｕｘｉｍａｂ）（抗ＥＧＦＲ）、ガリキシマブ（抗ＣＤ８０）、ガニツマブ（抗ＩＧＦ−Ｉ）、ゲムツズマブオゾガマイシン（抗ＣＤ３３）、ギレンツキシマブ（ｇｉｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ）（抗カルボニックアンヒドラーゼ９（ＣＡ−ＩＸ））、グレムバツムマブベドチン（抗ＧＰＮＭＢ）、グセルクマブ（抗ＩＬ１３）、イバリズマブ（抗ＣＤ４）、イブリツモマブチウキセタン（抗ＣＤ２０）、イクルクマブ（抗ＶＥＧＦＲ−１）、イゴボマブ（ｉｇｏｖｏｍａｂ）（抗ＣＡ−１２５）、ＩＭＡＢ３６２（抗ＣＬＤＮ１８．２）、ＩＭＣ−ＣＳ４（抗ＣＳＦ１Ｒ）、ＩＭＣ−ＴＲ１（ＴＧＦβＲＩＩ）、イムガツズマブ（ｉｍｇａｔｕｚｕｍａｂ）（抗ＥＧＦＲ）、インクラクマブ（抗セレクチンＰ）、インダツキシマブラブタンシン（ｉｎｄａｔｕｘｉｍａｂ  ｒａｖｔａｎｓｉｎｅ）（抗ＳＤＣ１）、イノツズマブオゾガマイシン（抗ＣＤ２２）、インテツムマブ（ｉｎｔｅｔｕｍｕｍａｂ）（抗ＣＤ５１）、イピリムマブ（抗ＣＤ１５２）、イラツムマブ（ｉｒａｔｕｍｕｍａｂ）（抗ＣＤ３０（ＴＮＦＲＳＦ８））、ＫＭ３０６５（抗ＣＤ２０）、ＫＷ−０７６１（抗ＣＤ１９４）、ＬＹ２８７５３５８（抗ＭＥＴ）  ラベツズマブ（抗ＣＥＡ）、ランブロリズマブ（抗ＰＤＣＤ１）、レキサツムマブ（ｌｅｘａｔｕｍｕｍａｂ）（抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２）、リンツズマブ（抗ＣＤ３３）、リリルマブ（抗ＫＩＲ２Ｄ）、ロルボツズマブ（ｌｏｒｖｏｔｕｚｕｍａｂ）メルタンシン（抗ＣＤ５６）、ルカツムマブ（抗ＣＤ４０）、ルミリキシマブ（抗ＣＤ２３（ＩｇＥ受容体））、マパツムマブ（抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ１）、マルゲツキシマブ（ｍａｒｇｅｔｕｘｉｍａｂ）（抗ｃｈ４Ｄ５）、マツズマブ（抗ＥＧＦＲ）、マブリリムマブ（抗ＧＭＣＳＦ受容体α−鎖）、ミラツズマブ（抗ＣＤ７４）、ミンレツモマブ（ｍｉｎｒｅｔｕｍｏｍａｂ）（抗ＴＡＧ−７２）、ミツモマブ（ｍｉｔｕｍｏｍａｂ）（抗ＧＤ３ガングリオシド）、モガムリズマブ（抗ＣＣＲ４）、モキセツモマブパスドトクス（ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂ  ｐａｓｕｄｏｔｏｘ）（抗ＣＤ２２）、ナコロマブタフェナトクス（ｎａｃｏｌｏｍａｂ  ｔａｆｅｎａｔｏｘ）（抗Ｃ２４２抗原）、ナプツモマブエスタフェナトクス（ｎａｐｔｕｍｏｍａｂ  ｅｓｔａｆｅｎａｔｏｘ）（抗５Ｔ４）、ナルナツマブ（ｎａｒｎａｔｕｍａｂ）（抗ＲＯＮ）、ネシツムマブ（抗ＥＧＦＲ）、ネスバクマブ（抗アンジオポエチン２）、ニモツズマブ（抗ＥＧＦＲ）、ニボルマブ（抗ＩｇＧ４）、ノフェツモマブメルペンタン、オクレリズマブ（抗ＣＤ２０）、オカラツズマブ（ｏｃａｒａｔｕｚｕ���ａｂ）（抗ＣＤ２０）、オララツマブ（抗ＰＤＧＦ−Ｒ  α）、オナルツズマブ（抗ｃ−ＭＥＴ）、オンツキシズマブ（ｏｎｔｕｘｉｚｕｍａｂ）（抗ＴＥＭ１）、オポルツズマブモナトクス（ｏｐｏｒｔｕｚｕｍａｂ  ｍｏｎａｔｏｘ）（抗ＥｐＣＡＭ）、オレゴボマブ（ｏｒｅｇｏｖｏｍａｂ）（抗ＣＡ−１２５）、オトレルツズマブ（ｏｔｌｅｒｔｕｚｕｍａｂ）（抗ＣＤ３７）、パンコマブ（ｐａｎｋｏｍａｂ）（ＭＵＣ１の抗腫瘍特異性グリコシル化）、パルサツズマブ（ｐａｒｓａｔｕｚｕｍａｂ）（抗ＥＧＦＬ７）、パスコリズマブ（ｐａｓｃｏｌｉｚｕｍａｂ）（抗ＩＬ−４）、パトリツマブ（抗ＨＥＲ３）、ペムツモマブ（ｐｅｍｔｕｍｏｍａｂ）（抗ＭＵＣ１）、ペルツズマブ（抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、ピジリズマブ（抗ＰＤ−１）、ピナツズマブベドチン（ｐｉｎａｔｕｚｕｍａｂ  ｖｅｄｏｔｉｎ）（抗ＣＤ２２）、ピンツモマブ（抗腺癌抗原）、ポラツズマブベドチン（抗ＣＤ７９Ｂ）、プリツムマブ（ｐｒｉｔｕｍｕｍａｂ）（抗ビメンチン）、ＰＲＯ１３１９２１（抗ＣＤ２０）、キリズマブ（ｑｕｉｌｉｚｕｍａｂ）（抗ＩＧＨＥ）、ラコツモマブ（ｒａｃｏｔｕｍｏｍａｂ）（抗Ｎ−グリコリルノイラミン酸）、ラドレツマブ（ｒａｄｒｅｔｕｍａｂ）（抗フィブロネクチンエクストラドメイン−Ｂ）、ラムシルマブ（抗ＶＥＧＦＲ２）、リロツムマブ（抗ＨＧＦ）、ロバツムマブ（ｒｏｂａｔｕｍｕｍａｂ）（抗ＩＧＦ−１受容体）、ロレデュマブ（ｒｏｌｅｄｕｍａｂ）（抗ＲＨＤ）、ロベリズマブ（ｒｏｖｅｌｉｚｕｍａｂ）（抗ＣＤ１１及びＣＤ１８）、サマリズマブ（ｓａｍａｌｉｚｕｍａｂ）（抗ＣＤ２００）、サツモマブ（ｓａｔｕｍｏｍａｂ）ペンデチド（抗ＴＡＧ−７２）、セリバンツマブ（ｓｅｒｉｂａｎｔｕｍａｂ）（抗ＥＲＢＢ３）、ＳＧＮ−ＣＤ１９Ａ（抗ＣＤ１９）、ＳＧＮ−ＣＤ３３Ａ（抗ＣＤ３３）、シブロツズマブ（ｓｉｂｒｏｔｕｚｕｍａｂ）（抗ＦＡＰ）、シルツキシマブ（抗ＩＬ−６）、ソリトマブ（ｓｏｌｉｔｏｍａｂ）（抗ＥｐＣＡＭ）、ソンツズマブ（ｓｏｎｔｕｚｕｍａｂ）（抗エピシアリン）、タバルマブ（抗ＢＡＦＦ）、タカツズマブ（ｔａｃａｔｕｚｕｍａｂ）テトラキセタン（抗α−フェトプロテイン）、タプリツモマブパプトクス（ｔａｐｌｉｔｕｍｏｍａｂ  ｐａｐｔｏｘ）（抗ＣＤ１９）、テリモマブアリトクス（ｔｅｌｉｍｏｍａｂ  ａｒｉｔｏｘ）、テナツモマブ（ｔｅｎａｔｕｍｏｍａｂ）（抗テネイシンＣ）、テネリキシマブ（ｔｅｎｅｌｉｘｉｍａｂ）（抗ＣＤ４０）、テプロツムマブ（ｔｅｐｒｏｔｕｍｕｍａｂ）（抗ＣＤ２２１）、ＴＧＮ１４１２（抗ＣＤ２８）、チシリムマブ（抗ＣＴＬＡ−４）、チガツズマブ（ｔｉｇａｔｕｚｕｍａｂ）（抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２）、ＴＮＸ−６５０（抗ＩＬ−１３）、トシツモマブ（抗ＣＳ２０）、トベツマブ（ｔｏｖｅｔｕｍａｂ）（抗ＣＤ１４０ａ）、ＴＲＢＳ０７（抗ＧＤ２）、トレガリズマブ（ｔｒｅｇａｌｉｚｕｍａｂ）（抗ＣＤ４）、トレメリムマブ（抗ＣＴＬＡ−４）、ＴＲＵ−０１６（抗ＣＤ３７）、ツコツズマブ（ｔｕｃｏｔｕｚｕｍａｂ）セルモロイキン（抗ＥｐＣＡＭ）、ウブリツキシマブ（Ｕｂｌｉｔｕｘｉｍａｂ）（抗ＣＤ２０）、ウレルマブ（抗��−１ＢＢ）、バンチクツマブ（ｖａｎｔｉｃｔｕｍａｂ）（抗フリズルド受容体）、バパリキシマブ（ｖａｐａｌｉｘｉｍａｂ）（抗ＡＯＣ３（ＶＡＰ−１））、バテリズマブ（ｖａｔｅｌｉｚｕｍａｂ）（抗ＩＴＧＡ２）、ベルツズマブ（抗ＣＤ２０）、ベセンクマブ（ｖｅｓｅｎｃｕｍａｂ）（抗ＮＲＰ１）、ビシリズマブ（ｖｉｓｉｌｉｚｕｍａｂ）（抗ＣＤ３）、ボロシキシマブ（抗インテグリンα５β１）、ボルセツズマブマホドチン（ｖｏｒｓｅｔｕｚｕｍａｂ  ｍａｆｏｄｏｔｉｎ）（抗ＣＤ７０）、ボツムマブ（ｖｏｔｕｍｕｍａｂ）（抗腫瘍抗原ＣＴＡＡ１６．８８）、ザルツムマブ（抗ＥＧＦＲ）、ザノリムマブ（抗ＣＤ４）、ザツキシマブ（ｚａｔｕｘｉｍａｂ）（抗ＨＥＲ１）、ジラリムマブ（ｚｉｒａｌｉｍｕｍａｂ）（抗ＣＤ１４７（ベイシジン））、ＲＧ７６３６（抗ＥＴＢＲ）、ＲＧ７４５８（抗ＭＵＣ１６）、ＲＧ７５９９（抗ＮａＰｉ２ｂ）、ＭＰＤＬ３２８０Ａ（抗ＰＤ−Ｌ１）、ＲＧ７４５０（抗ＳＴＥＡＰ１）並びにＧＤＣ−０１９９（抗Ｂｃｌ−２）が挙げられる。
【００２０】
本発明において有用な他の抗体又は腫瘍標的結合性タンパク質（例えば、ＴＣＲドメイン）としては、限定されないが、以下の抗原（適応症の癌は非限定的な例を表す）：アミノペプチダーゼＮ（ＣＤ１３）、アネキシンＡｌ、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６，種々の癌）、ＣＡ１２５（卵巣癌）、ＣＡ１５−３（癌腫）、ＣＡ１９−９（癌腫）、Ｌ６（癌腫）、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ（癌腫）、Ｌｅｗｉｓ  Ｘ（癌腫）、αフェトプロテイン（癌腫）、ＣＡ２４２（結腸直腸癌）、胎盤のアルカリホスファターゼ（癌腫）、前立腺特異的抗原（前立腺）、前立腺酸性ホスファターゼ（前立腺）、上皮成長因子（癌腫）、ＣＤ２（ホジキン病，ＮＨＬリンパ腫，多発性骨髄腫）、ＣＤ３ε（Ｔ細胞リンパ腫、肺、乳房、胃、卵巣の癌，自己免疫疾患，悪性腹水）、ＣＤ１９（Ｂ細胞悪性腫瘍）、ＣＤ２０（非ホジキンリンパ腫，Ｂ細胞腫瘍、自己免疫疾患）、ＣＤ２１（Ｂ細胞リンパ腫）、ＣＤ２２（白血病，リンパ腫，多発性骨髄腫，ＳＬＥ）、ＣＤ３０（ホジキンリンパ腫）、ＣＤ３３（白血病，自己免疫疾患）、ＣＤ３８（多発性骨髄腫）、ＣＤ４０（リンパ腫，多発性骨髄腫，白血病（ＣＬＬ））、ＣＤ５１（転移性黒色腫，肉腫）、ＣＤ５２（白血病）、ＣＤ５６（小細胞肺癌、卵巣癌，メルケル細胞癌及び液性腫瘍，多発性骨髄腫）、ＣＤ６６ｅ（癌腫）、ＣＤ７０（転移性腎細胞癌及び非ホジキンリンパ腫）、ＣＤ７４（多発性骨髄腫）、ＣＤ８０（リンパ腫）、ＣＤ９８（癌腫）、ＣＤ１２３（白血病）、ムチン（癌腫）、ＣＤ２２１（固形腫瘍）、ＣＤ２２７（乳房，卵巣の癌）、ＣＤ２６２（ＮＳＣＬＣ及び他の癌）、ＣＤ３０９（卵巣癌）、ＣＤ３２６（固形腫瘍）、ＣＥＡＣＡＭ３（結腸直腸，胃の癌）、ＣＥＡＣＡＭ５（ＣＥＡ，ＣＤ６６ｅ）（乳房，結腸直腸及び肺の癌）、ＤＬＬ４（Ａ様−４）、ＥＧＦＲ（種々の癌）、ＣＴＬＡ４（黒色腫）、ＣＸＣＲ４（ＣＤ  １８４，ヘム腫瘍学（ｈｅｍｅ−ｏｎｃｏｌｏｇｙ），固形腫瘍）、エンドグリン（ＣＤ  １０５，固形腫瘍）、ＥＰＣＡＭ（上皮細胞接着分子，膀胱、頭部、頸部、結腸、ＮＨＬ  前立腺及び卵巣の癌）、ＥＲＢＢ２（肺，乳房，前立腺の癌）、ＦＣＧＲ１（自己免疫疾患）、ＦＯＬＲ（葉酸受容体，卵巣癌）、ＦＧＦＲ（癌腫）、ＧＤ２ガングリオシド（癌腫）、Ｇ−２８（細胞表面抗原糖脂質，黒色腫）、ＧＤ３イディオタイプ（癌腫）、ヒートショックプロテイン（癌腫）、ＨＥＲ１（肺，胃の癌）、ＨＥＲ２（乳房，肺及び卵巣の癌）、ＨＬＡ−ＤＲ１０（ＮＨＬ）、ＨＬＡ−ＤＲＢ（ＮＨＬ，Ｂ細胞性白血病）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（癌腫）、ＩＧＦ１Ｒ（固形腫瘍、血液の癌）、ＩＬ−２受容体（Ｔ細胞白血病及びリンパ腫）、ＩＬ−６Ｒ（多発性骨髄腫、ＲＡ，キャッスルマン病，ＩＬ６依存性腫瘍）、インテグリン（種々の癌のανβ３，α５β１，α６β４，α１１β３，α５β５，ανβ５）、ＭＡＧＥ−１（癌腫）、ＭＡＧＥ−２（癌腫）、ＭＡＧＥ−３（癌腫）、ＭＡＧＥ  ４（癌腫）、抗トランスフェリン受容体（癌腫）、ｐ９７（黒色腫）、ＭＳ４Ａ１（膜貫通４−ドメインサブファミリーＡメンバー１，非ホジキンＢ細胞リンパ腫，白血病）、ＭＵＣ１（乳房，卵巣，子宮頸部，気管支及び胃腸の癌）、ＭＵＣ１６（ＣＡ１���５）（卵巣癌）、ＣＥＡ（結腸直腸癌）、ｇｐ１００（黒色腫）、ＭＡＲＴＩ（黒色腫）、ＭＰＧ（黒色腫）、ＭＳ４Ａ１（膜貫通４−ドメインサブファミリーＡ、小細胞肺癌、ＮＨＬ）、ヌクレオリン、Ｎｅｕ癌遺伝子産物（癌腫）、Ｐ２１（癌腫）、ネクチン−４（癌腫）、抗（Ｎ−グリコリルノイラミン酸，乳房，黒色腫癌）のパラトープ、ＰＬＡＰ様精巣アルカリホスファターゼ（卵巣，精巣の癌）、ＰＳＭＡ（前立腺腫瘍）、ＰＳＡ（前立腺）、ＲＯＢ０４、ＴＡＧ  ７２（腫瘍関連糖タンパク質７２，ＡＭＬ，胃，結腸直腸，卵巣の癌）、Ｔ細胞膜貫通タンパク質（癌）、Ｔｉｅ（ＣＤ２０２ｂ）、組織因子、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ（腫瘍壊死因子受容体スパーファミリーメンバー１０Ｂ，癌腫）、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ（腫瘍壊死因子受容体スパーファミリーメンバー１３Ｂ，多発性骨髄腫，ＮＨＬ、他の癌，ＲＡ及びＳＬＥ）、ＴＰＢＧ（栄養膜糖タンパク質，腎細胞癌）、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１（腫瘍壊死アポトーシス誘導リガンド受容体１，リンパ腫，ＮＨＬ，結腸直腸，肺の癌）、ＶＣＡＭ−１（ＣＤ１０６、黒色腫）、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−２（ＣＤ３０９）（種々の癌）に結合するものが挙げられる。他の腫瘍関連抗原標的の一例が概説されている（Ｇｅｒｂｅｒ，ｅｔ  ａｌ，ｍＡｂ  ２００９  １：２４７−２５３；Ｎｏｖｅｌｌｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００５  ５４：１８７−２０７，Ｆｒａｎｋｅ，ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｔｈｅｒ  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．２０００，１５：４５９−７６，Ｇｕｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１３；１１９：４２１−４７５，Ｐａｒｍｉａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００７  １７８：１９７５−９）。このような抗原の例としては、分化抗原群（ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１２ｗ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤｗｌ７、ＣＤ１８、ＣＤ２１、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３１、ＣＤ３２、ＣＤ３４、ＣＤ３５、ＣＤ３６、ＣＤ３７、ＣＤ４１、ＣＤ４２、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ４８、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ５３、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤ６１、ＣＤ６２Ｅ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ６３、ＣＤ６８、ＣＤ６９、ＣＤ７１、ＣＤ７２、ＣＤ７９、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ８７、ＣＤ８８、ＣＤ８９、ＣＤ９０、ＣＤ９１、ＣＤ９５、ＣＤ９６、ＣＤ１００、ＣＤ１０３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＣＤ１０９、ＣＤ１１７、ＣＤ１２０、ＣＤ１２７、ＣＤ１３３、ＣＤ１３４、ＣＤ１３５、ＣＤ１３８、ＣＤ１４１、ＣＤ１４２、ＣＤ１４３、ＣＤ１４４、ＣＤ１４７、ＣＤ１５１、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、ＣＤ１５６、ＣＤ１５８、ＣＤ１６３、ＣＤ１６６、ＣＤ１６８、ＣＤ１８４、ＣＤｗｌ８６、ＣＤ１９５、ＣＤ２０２（ａ，ｂ）、ＣＤ２０９、ＣＤ２３５ａ、ＣＤ２７１、ＣＤ３０３、ＣＤ３０４）、アネキシンＡｌ、ヌクレオリン、エンドグリン（ＣＤ１０５）、ＲＯＢ０４、アミノペプチダ��ゼＮ，様−４（ＤＬＬ４）、ＶＥＧＦＲ−２（ＣＤ３０９）、ＣＸＣＲ４（ＣＤ１８４）、Ｔｉｅ２、Ｂ７−Ｈ３、ＷＴ１、ＭＵＣ１、ＬＭＰ２、ＨＰＶ  Ｅ６  Ｅ７、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、イディオタイプ、ＭＡＧＥ  Ａ３、ｐ５３非変異型、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＧＤ２、ＣＥＡ、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴｌ、Ｒａｓ変異型、ｇｐ１００、ｐ５３変異型、プロテイナーゼ３（ＰＲ１）、ｂｃｒ−ａｂｌ、チロシナーゼ、サバイビン、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座切断点、ＥｐｈＡ２、ＰＡＰ、ＭＬ−ＩＡＰ、ＡＦＰ、ＥｐＣＡＭ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２  ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、ＡＬＫ、アンドロゲン受容体、サイクリンＢｌ、ポリシアル酸、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ−２、ＧＤ３、フコシルＧＭｌ、メソテリン、ＰＳＣＡ、ＭＡＧＥ  Ａｌ、ｓＬｅ（ａ）、ＣＹＰＩＢ  Ｉ、ＰＬＡＣｌ、ＧＭ３、ＢＯＲＩＳ、Ｔｎ、ＧｌｏｂｏＨ、ＥＴＶ６−ＡＭＬ、ＮＹ−ＢＲ−１、ＲＧＳ５、ＳＡＲＴ３、ＳＴｎ、カルボニックアンヒドラーゼＩＸ、ＰＡＸ５、ＯＹ−ＴＥＳ１、精子タンパク質１７、ＬＣＫ、ＨＭＷＭＡＡ、ＡＫＡＰ−４、ＳＳＸ２、ＸＡＧＥ  １、Ｂ７Ｈ３、レグマイン、Ｔｉｅ２、Ｐａｇｅ４、ＶＥＧＦＲ２、ＭＡＤ−ＣＴ−１、ＦＡＰ、ＰＤＧＦＲ−β、ＭＡＤ−ＣＴ−２、及びＦｏｓ関連抗原１が挙げられる。
【００２１】
さらに、本発明の好ましい抗体としては、当該技術分野で知られた感染細胞と関連している抗原及びエピトープ標的に特異的なものが挙げられる。かかる標的としては、限定されないが、以下の感染性因子：ＨＩＶウイルス（特に、ＨＩＶエンベロープスパイクに由来する抗原及び／又はｇｐ１２０及びｇｐ４１エピトープ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、大腸菌、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、−ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  Ｂ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ、ライム病スピロヘータ、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ、狂犬病ウイルス、インフルエンザウイルス、サイトメガロウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ、単純ヘルペスウイルスＩＩ、ヒト血清パルボ様ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、アデノウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、エプスタイン−バーウイルス、マウス白血病ウイルス、ムンプスウイルス、水疱性口内炎ウイルス、シンドビスウイルス、リンパ性脈絡髄膜炎ウイルス、疣ウイルス、ブルータングウイルス、センダイウイルス、ネコ白血病ウイルス、レオウイルス、ポリオウイルス、シミアンウイルス４０、マウス乳癌ウイルス、デングウイルス、風疹ウイルス、西ナイルウイルス、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｒａｎｇｅｌｉ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｒｈｏｄｅｓｉｅｎｓｅｉ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｍａｎｓｏｎｉ、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ、Ｂａｂｅｓｉａ  ｂｏｖｉｓ、Ｅｌｍｅｒｉａ  ｔｅｎｅｌｌａ、Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃａ  ｖｏｌｖｕｌｕｓ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｔｒｏｐｉｃａ、Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ  ｓｐｉｒａｌｉｓ、Ｔｈｅｉｌｅｒｉａ  ｐａｒｖａ、Ｔａｅｎｉａ  ｈｙｄａｔｉｇｅｎａ、Ｔａｅｎｉａ  ｏｖｉｓ、Ｔａｅｎｉａ  ｓａｇｉｎａｔａ、Ｅｃｈｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｒａｎｕｌｏｓｕｓ、Ｍｅｓｏｃｅｓｔｏｉｄｅｓ  ｃｏｒｔｉ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓ、Ｍ．ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ、Ｍ．ｏｒａｌｅ、Ｍ  ａｒｇｉｎｉｎｉ、Ａｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａ  ｌａｉｄｌａｗｉｉ、Ｍ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｍ並びにＭ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに由来するものが挙げられ、重要である。
【００２２】
他の実施形態では、抗体（又は抗体様分子）は、免疫チェックポイント分子又はそのリガンドに特異的であり、免疫チェックポイント抑制活性の阻害薬として、又は免疫チェックポイント刺激活性のアゴニストとして作用するものである。かかる免疫チェックポイント分子及びリガンドとしては、ＰＤ１、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＣＴＬＡ４、ＣＤ２８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−Ｈ５、ＩＣＯＳ−Ｌ、ＩＣＯＳ、ＢＴＬＡ、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＤ１３７、ＨＶＥＭ、ＫＩＲ、４−１ＢＢ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ７０、ＣＤ２７、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＩＤＯ、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、ＶＩＳＴＡ、ＣＤ１５５、ＴＩＧＩＴ、ＬＩＧＨＴ、ＬＡＩＲ−１、Ｓｉｇｌｅｃｓ及びＡ２ａＲが挙げられる（Ｐａｒｄｏｌｌ  ＤＭ．２０１２．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  １２：２５２−２６４，Ｔｈａｖｅｎｔｈｉｒａｎ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．２０１２．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｓ１２：００４）。さらに、本発明の好ましい抗体としては、イピリムマブ及びトレメリムマブ（抗ＣＴＬＡ４）、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、ピジリズマブ、ＴＳＲ−０４２、ＡＮＢ０１１、ＡＭＰ−５１４及びＡＭＰ−２２４（リガンド−Ｆｃ融合体）（抗ＰＤ１）、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＭＥＤＩ４７３６、ＭＥＤＩ０６８０及びＢＭＳ−９３６５５６９（抗ＰＤＬ１）、ＭＥＤＩ６４６９（抗ＯＸ４０アゴニスト）、ＢＭＳ−９８６０１６、ＩＭＰ７０１、ＩＭＰ７３１及びＩＭＰ３２１（抗ＬＡＧ３）が挙げられ得る。
【００２３】
一態様において、インビトロ又はインビボでの抗体での処置にＡＬＴ−８０３を加えることにより、疾患細胞又は疾患関連細胞に対する免疫細胞の細胞傷害性が増大する。一部の場合では、ＡＬＴ−８０３は、免疫細胞を刺激して、疾患特異的抗体（又は抗体様分子）によって媒介される腫瘍細胞、感染細胞又は自己免疫疾患関連細胞に対するＡＤＣＣ又はＡＤＣＰ活性を増大させ得るものである。一実施形態では、ＡＬＴ−８０３での免疫細胞の処理により、疾患標的特異的抗体によって媒介される疾患細胞又は疾患関連細胞に対するＡＤＣＣ又はＡＤＣＰ活性が少なくとも５％、例えば、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも１００％増大する。好ましい一実施形態では、免疫細胞をＡＬＴ−８０３で処理し、腫瘍細胞を腫瘍特異的抗体媒介性ＡＤＣＣ又はＡＤＣＰによって死滅させるために使用し、このとき、腫瘍細胞死のレベルは、ＡＬＴ−８０３で処理しなかった免疫細胞でみられるレベルよりも少なくとも５％高い、例えば、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも１００％高い。好ましい実施形態では、被験体における腫瘍特異的ＡＤＣＣ又はＡＤＣＰは、ＡＬＴ−８０３と抗体の投与後、少なくとも５％、例えば、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも１００％増大する。具体的な実施形態では、ＮＫ細胞ベースのＡＤＣＣ活性がＡＬＴ−８０３での処置によって増大する。
【００２４】
他の場合では、ＡＬＴ−８０３は、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔ細胞を刺激して疾患細胞又は疾患関連細胞、例えば腫瘍細胞又は感染細胞を死滅させる。好ましくは、ＡＬＴ−８０３での処置は免疫細胞の細胞溶解活性を刺激するものであり、免疫チェックポイントブロッカーでの処置は免疫抑制応答を阻害するものであり、そのため、これらの処置の併用により、腫瘍細胞又は感染細胞に対して高度に有効及び／又は永続的な活性がもたらされる。一部の実施形態では、ＡＬＴ−８０３は、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）及び／又はＩＬ−６の血清レベルを高め、ＮＫ細胞及びＴ細胞の増殖を刺激し、ＮＫ細胞及びＴ細胞の活性化マーカー、例えばＣＤ２５、ＣＤ６９、パーフォリン及びグランザイムの発現を上方調節する。このようなマーカーの誘導により、疾患細胞に対する免疫細胞の応答性又は細胞溶解活性が増強され得る。例えば、本明細書に記載の方法によりＮＫ細胞を刺激して腫瘍細胞又は感染細胞を死滅させる。
【００２５】
他の実施形態では、ＡＬＴ−８０３は、他の自然免疫細胞、例えば好中球又は単核球細胞の活性及び／又はレベルを誘導する。かかる細胞は、疾患細胞、例えば腫瘍細胞又は感染細胞に対する治療用抗体のＡＤＣＣ及びＡＤＣＰを媒介することが知られている（Ｇｏｌａｙ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ．２０１３  １２２：３４８２−９１、Ｒｉｃｈａｒｄｓ，ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  ２００８  ７：２５１７−２７）。好ましくは、ＡＬＴ−８０３と抗体の併用療法により、少なくとも一部において自然免疫細胞によって媒介される機構により、癌又は感染を有する患者における臨床応答の改善がもたらされる。例えば、本明細書に記載の方法により好中球又は単核球細胞を刺激して腫瘍細胞又は感染細胞を死滅させる。
【００２６】
好ましくは、本明細書に記載の方法により、本明細書における組成物の投与前の腫瘍細胞又は感染細胞の数と比べて腫瘍細胞又は感染細胞の数の低減／減少がもたらされる。或いはまた、本明細書に記載の方法により、新生物又は感染の疾患進行の低減がもたらされる。好ましくは、本明細書に記載の方法により、未処置の被験体と比べて被験体の生存期間の長期化がもたらされる。
【００２７】
一部の場合では、被験体の新生物又は感染を処置するための方法は、被験体に有効量のカルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）と、ＡＬＴ−８０３を含む有効量の医薬組成物とを投与することにより行われ、ここで、ＡＬＴ−８０３は、ダイマー型ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃと２分子のＩＬ−１５Ｎ７２Ｄを含むものである。例えば、被験体はＢＣＧ＋ＡＬＴ−８０３を毎週、膀胱内留置尿道カテーテルにより連続６週間投与される。
【００２８】
また、新生物の処置のためのキットであって、有効量のＡＬＴ−８０３、抗体、及び新生物の処置のための該キットの使用説明書を備えているキットも提供する。
【００２９】
感染の処置のためのキットは、有効量のＡＬＴ−８０３、抗体、及び感染の処置のための該キットの使用説明書を備えているものである。
【００３０】
本発明の可溶性融合タンパク質複合体の一部の特定の態様では、ＩＬ−１５ポリペプチドは、天然ＩＬ−１５ポリペプチドとは異なるアミノ酸配列を有するＩＬ−１５変異体である。ヒトＩＬ−１５ポリペプチドは、本明細書においてｈｕＩＬ−１５、ｈＩＬ−１５、ｈｕＩＬ１５、ｈＩＬ１５、ＩＬ−１５野生型（ｗｔ）と称し、その変異体は、天然アミノ酸、成熟体の配列内のその位置及び変異体アミノ酸を用いて呼称する。例えば、ｈｕＩＬ１５Ｎ７２Ｄは、７２位にＮからＤへの置換を含むヒトＩＬ−１５を示す。一態様において、ＩＬ−１５変異体は、例えば、天然ＩＬ−１５ポリペプチドと比べてＩＬ−１５ＲβγＣ受容体に対する結合活性の増大によって実証されるようなＩＬ−１５アゴニストとしての機能を果たすものである。或いはまた、ＩＬ−１５変異体は、例えば、天然ＩＬ−１５ポリペプチドと比べてＩＬ−１５ＲβγＣ受容体に対する結合活性の低下によって実証されるようなＩＬ−１５アンタゴニストとしての機能を果たすものである。
【００３１】
標的細胞を死滅させるための方法は、複数の細胞を抗体及びＡＬＴ−８０３と接触させ（ここで、該複数の細胞は、さらに、ＩＬ−１５ドメインによって認識されるＩＬ−１５Ｒ鎖を有する免疫細胞、又はＦｃドメインによって認識されるＦｃ受容体鎖を有する免疫細胞、及び抗体（例えば、抗ＣＤ２０抗体）によって認識される抗原を有する標的細胞を含む）、標的細胞を死滅させることにより行われる。例えば、標的細胞は腫瘍細胞又は感染（例えば、ウイルス感染）細胞である。
【００３２】
標的抗原を発現している疾患細胞を死滅させるための方法は、免疫細胞を有効量のＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ複合体（ＡＬＴ−８０３）で処理し、ＡＬＴ−８０３処理した該免疫細胞を、該標的抗原に特異的な抗体及び前記標的抗原を発現している疾患細胞と混合し、該疾患細胞を、ＡＬＴ−８０３処理した該免疫細胞と該標的抗原特異的抗体によって媒介されるＡＤＣＣ又はＡＤＣＰによって死滅させることにより行われる。一態様において、疾患細胞の死滅レベルは、ＡＬＴ−８０３で処理しなかった免疫細胞によって媒介されるレベルと比べて少なくとも５％、例えば、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも１００％増大する。
【００３３】
また、本発明により、疾患細胞が疾患関連抗原を発現している患者の疾患を予防又は処置するための方法であって：複数の細胞を抗体及びＡＬＴ−８０３と接触させる工程、並びに該患者の疾患が予防又は処置されるのに充分に該疾患細胞を損傷又は死滅させる工程を含む方法を提供する。好ましい実施形態では、ＡＬＴ−８０３と抗体での併用療法により疾患進行が低減され得る、及び／又は患者の生存期間が長期化され得る。
【００３４】
本発明により、哺乳動物に有効量の抗体と有効量のＡＬＴ−８０３を投与することによって該哺乳動物の免疫応答を刺激する方法を提供する。
【００３５】
特に定義していない限り、本明細書で用いる科学技術用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者に一般的に理解されている意味を有する。以下の参考文献は、当業者に、本発明において用いている用語の多くの一般的な定義を示すものである：Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（第２版．１９９４）；Ｔｈｅ  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｗａｌｋｅｒ編，１９８８）；Ｔｈｅ  Ｇｌｏｓｓａｒｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，第５版，Ｒ．Ｒｉｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（編），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ（１９９１）；及びＨａｌｅ＆Ｍａｒｈａｍ，Ｔｈｅ  Ｈａｒｐｅｒ  Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９１）。本明細書で用いる場合、以下の用語は、特に指定のない限り、以下の、当該用語について示した意味を有する。
【００３６】
「薬剤」により、ペプチド、核酸分子又は低分子化合物を意図する。例示的な治療用薬剤はＡＬＴ−８０３である。
【００３７】
「ＡＬＴ−８０３」により、ダイマー型ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ融合タンパク質と非共有結合により結合しており、免疫賦活活性を有するＩＬ−１５Ｎ７２Ｄを含むものである複合体を意図する。一実施形態では、ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ及び／又はＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ融合タンパク質は、参照配列と比べて１、２、３、４つ、又はそれ以上のアミノ酸変異を含むものである。例示的なＩＬ−１５Ｎ７２Ｄアミノ酸配列は以下に示している。
【００３８】
「改善する」により、疾患の発現又は進行が低減、抑制、減弱、減退、停止又は安定化することを意図する。
【００３９】
「アナログ」により、同一ではないが、類似した機能的又は構造的特色を有する分子を意図する。例えば、ポリペプチドアナログは、対応する天然に存在するポリペプチドの生物活性を保持しているが、天然に存在するポリペプチドと比べて該アナログの機能を増強させる特定の生化学的修飾を有するものである。かかる生化学的修飾は、例えばリガンド結合を改変することなくアナログのプロテアーゼ耐性、膜透過性又は半減期を増大させ得るものである。アナログは非天然アミノ酸を含むものであってもよい。
【００４０】
本発明は、所望の生物活性を示すものである限り抗体又はかかる抗体の断片を包含している。また、本発明にはキメラ抗体、例えばヒト化抗体も包含される。一般的に、ヒト化抗体は、非ヒト供給源に由来する１個以上のアミノ酸残基が導入されたものである。ヒト化は、例えば、当該技術分野で報告されている方法を用いて、齧歯類の相補性決定領域の少なくとも一部分でヒト抗体の対応する領域を置き換えることにより行われ得る。
【００４１】
用語「抗体」又は「免疫グロブリン」は、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の両方を包含していることを意図する。好ましい抗体は、その抗原と反応性であるモノクローナル抗体である。また、用語「抗体」は、その抗原と反応性の１種類より多くの抗体の混合物（例えば、その抗原と反応性の異なる型のモノクローナル抗体のカクテル）も包含していることを意図する。さらに、用語「抗体」は、完全体の抗体、その生物学的機能性断片、一本鎖抗体並びに遺伝子組換え抗体、例えば、１種類より多くの種に由来する部分を含むキメラ抗体、二重機能性抗体、抗体コンジュゲート、ヒト化抗体及びヒト抗体も包含していることを意図する。生物学的機能性抗体断片（これもまた使用され得る）は、その抗原に結合するのに充分である抗体由来ペプチド断片である。「抗体」は、本明細書で用いる場合、抗体全体、並びに目的のエピトープ、抗原又は抗原性断片に結合し得る任意の抗体断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ）を包含していることを意図する。
【００４２】
分子「に結合する」により、該分子に対して物理化学的親和性を有することを意図する。
【００４３】
「検出する」は、検出対象の被検物質の有無又は量を特定することをいう。
【００４４】
「疾患」により、細胞、組織又は器官の正常な機能が損傷又は妨害される任意の病状又は障害を意図する。疾患の例としては新生物及び感染が挙げられる。
【００４５】
製剤又は製剤成分の「有効量」及び「治療有効量」という用語により、単独又は組み合わせで所望の効果をもたらすのに充分な製剤又は成分の量を意図する。例えば、「有効量」により、未処置の患者と比べて疾患の症状を改善するのに単独又は組み合わせで必要とされる化合物の量を意図する。疾患の治療的処置のための本発明を実施するのに使用される有効量の活性化合物（１種類又は複数種）は、投与様式、被験体の年齢、体重及び一般健康状態に応じて異なる。最終的に、担当の医師又は獣医が適切な量及び投薬量レジメンを決定する。かかる量を「有効」量と称する。
【００４６】
「断片」により、ポリペプチド又は核酸分子の一部分を意図する。この一部分は、参照核酸分子又はポリペプチドの全長の好ましくは少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％を含有するものである。例えば、断片は、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０個又は１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００個又は１０００個のヌクレオチド又はアミノ酸を含有するものであり得る。しかしながら、本発明には、それぞれ完全長のポリペプチド及び核酸の所望の生物活性を示すものである限りポリペプチド断片及び核酸断片もまた包含される。ほぼ任意の長さの核酸断片が使用される。例えば、約１０，０００、約５，０００、約３，０００、約２，０００、約１，０００、約５００、約２００、約１００、約５０塩基対の長さ（あらゆる中間の長さを含む）の全長を有する実例としてのポリヌクレオチドセグメントが本発明の多くの実行において含められる。同様に、ほぼ任意の長さのポリペプチド断片が使用される。例えば、約１０，０００、約５，０００、約３，０００、約２，０００、約１，０００、約５００、約２００、約１００又は約５０個のアミノ酸長（あらゆる中間の長さを含む）の全長を有する実例としてのポリペプチドセグメントが本発明の多くの実行において含められる。
【００４７】
用語「単離された」、「精製された」又は「生物学的に純粋な」は、物質が、その天然状態でみられるときには通常付随している成分を種々の度合で含有していないことをいう。「単離する」とは、元の供給源又は周囲環境からのある度合の分離を表す。「精製する」とは、単離よりも高いある度合の分離を表す。
【００４８】
「精製された」又は「生物学的に純粋な」タンパク質は、不純物（あれば）が該タンパク質の生物学的特性に実質的に影響しないような、又は他の有害な帰結を引き起こさないような充分に他の物質を含有していないものである。すなわち、本発明の核酸又はペプチドは、細胞性物質、ウイルス性物質又は組換えＤＮＡ手法によって作製した場合の培養培地又は化学合成した場合の化学的前駆物質若しくは他の化学物質を実質的に含有していない場合、精製されている。純度及び均一性は典型的には、分析化学手法、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又は高速液体クロマトグラフィーを用いて測定される。用語「精製された」は、核酸又はタンパク質が電気泳動ゲルにおいて本質的に１つのバンドをもたらすことを表している場合もあり得る。修飾、例えばリン酸化又はグリコシル化に供され得るタンパク質では、種々の修飾により種々の単離タンパク質が生じ得、これらは別々に精製され得る。
【００４９】
同様に、「実質的に純粋な」により、ヌクレオチド又はポリペプチドが、天然状態では付随している成分から分離されていることを意図する。典型的には、ヌクレオチド及びポリペプチドは、そのタンパク質及び天然状態では付随している天然に存在する有機分子の少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又はさらには９９％（重量基準で）を含有していない場合、実質的に純粋である。
【００５０】
「単離核酸」により、該核酸が由来する生物体の天然に存在するゲノム内でフランキングしている遺伝子を含有していない核酸を意図する。この用語は例えば：（ａ）天然に存在するゲノムＤＮＡ分子の一部分であるＤＮＡであるが、このＤＮＡが天然に存在する生物体のゲノム内では該分子の一部分にフランキングしている両方の核酸配列にフランキングされていないＤＮＡ；（ｂ）ベクター又は原核生物若しくは真核生物のゲノムＤＮＡ内に、得られる分子が任意の天然に存在するベクター又はゲノムＤＮＡと同一でないような様式で組み込まれた核酸；（ｃ）独立した分子、例えば、ｃＤＮＡ、ゲノム断片、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって作製された断片又は制限断片；及び（ｄ）ハイブリッド遺伝子、すなわち融合タンパク質をコードしている遺伝子の一部分である組換えヌクレオチド配列を包含している。本発明による単離核酸分子はさらに、合成により作製された分子、並びに化学的に改変されている、及び／又は修飾主鎖を有する任意の核酸も包含している。例えば、単離核酸は、精製されたｃＤＮＡ又はＲＮＡポリヌクレオチドである。また、単離核酸分子はメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）分子も包含している。
【００５１】
「単離ポリペプチド」により、天然状態では付随している成分から分離されている本発明のポリペプチドを意図する。典型的には、ポリペプチドは、そのタンパク質及び天然状態では付随している天然に存在する有機分子の少なくとも６０％（重量基準で）を含有していない場合、単離されている。好ましくは、その調製物は、少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９９％（重量基準で）が本発明のポリペプチドである。本発明の単離ポリペプチドは、例えば、天然の供給源からの抽出、かかるポリペプチドをコードしている組換え核酸の発現によって；又は該タンパク質を化学合成することにより得られ得る。純度は、任意の適切な方法、例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって、又はＨＰＬＣ分析によって測定され得る。
【００５２】
「マーカー」により、疾患又は障害と関連している発現レベル又は活性の改変を有する任意のタンパク質又はポリヌクレオチドを意図する。
【００５３】
「新生物」により、過剰な増殖又はアポトーシスの低減を特徴とする疾患又は障害を意図する。本発明が使用され得る実例としての新生物としては、限定されないが、白血病（例えば、急性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性（ｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ）白血病、急性骨髄芽球性白血病、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄単球性白血病、急性単球性白血病、急性赤白血病、慢性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病）、真性赤血球増加症、リンパ腫（ホジキン病、非ホジキン病）、ワルデンストレームマクログロブリン血症、重鎖病、並びに固形腫瘍、例えば、肉腫及び癌（例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏ）肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、胃及び食道の癌、頭頸部癌、直腸癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌、乳頭線癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝細胞癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、頸部癌、子宮癌、精巣癌、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、多形性膠芽腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、神経鞘腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫及び網膜芽腫）が挙げられる。具体的な実施形態では、新生物は多発性骨髄腫、β細胞リンパ腫、尿路上皮／膀胱癌又は黒色腫である。本明細書で用いる場合、「薬剤を得る」の場合のような「得る」とは、該薬剤を合成すること、購入すること、又はその他の様式で取得することを包含している。
【００５４】
「低減される」により、少なくとも５％、１０％、２５％、５０％、７５％又は１００％のマイナスの変化を意図する。
【００５５】
「参照」により、標準又は対照の条件を意図する。
【００５６】
「参照配列」は、配列比較の根拠として使用される規定の配列である。参照配列は、指定配列のサブセット又は全体；例えば、完全長のｃＤＮＡ若しくは遺伝子配列のセグメント又は完全なｃＤＮＡ若しくは遺伝子配列であり得る。ポリペプチドでは、参照ポリペプチド配列の長さは一般的に、少なくとも約１６個のアミノ酸、好ましくは少なくとも約２０個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも約２５個のアミノ酸、なおより好ましくは、約３５個のアミノ酸、約５０個のアミノ酸又は約１００個のアミノ酸である。核酸では、参照核酸配列の長さは一般的に、少なくとも約５０個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも約６０個のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約７５個のヌクレオチド、なおより好ましくは、約１００個のヌクレオチド若しくは約３００個のヌクレオチド又はそのあたり若しくはこれらの間の任意の整数である。
【００５７】
「特異的に結合する」により、化合物又は抗体が、本発明のポリペプチドを認識して結合するが、試料（例えば、天然状態で本発明のポリペプチドを含有している生物学的試料）中の他の分子は実質的に認識せず、結合もしないことを意図する。
【００５８】
本発明の方法に有用な核酸分子としては、本発明のポリペプチド又はその断片をコードしている任意の核酸分子が挙げられる。かかる核酸分子は、内在性核酸配列と１００％同一である必要はないが、典型的には実質的同一性を示すものである。内在性配列と「実質的同一性」を有するポリヌクレオチドは典型的には、二本鎖核酸分子の少なくとも一方の鎖とハイブリダイズし得るものである。「ハイブリダイズする」により、相補的なポリヌクレオチド配列間の二本鎖分子（例えば、本明細書に記載の遺伝子）又はその一部分を形成するための種々のストリンジェンシー条件下での塩基対合を意図する（例えば、Ｗａｈｌ，Ｇ．Ｍ．ａｎｄ  Ｓ．Ｌ．Ｂｅｒｇｅｒ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：３９９；Ｋｉｍｍｅｌ，Ａ．Ｒ．（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：５０７を参照のこと）。
【００５９】
例えば、ストリンジェント塩濃度は通常、約７５０ｍＭ未満のＮａＣｌと７５ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウム、好ましくは約５００ｍＭ未満のＮａＣｌと５０ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウム、より好ましくは約２５０ｍＭ未満のＮａＣｌと２５ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウムである。低ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、有機溶媒（例えば、ホルムアミド）の非存在下で得られ得るが、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、少なくとも約３５％のホルムアミド、より好ましくは少なくとも約５０％のホルムアミドの存在下で得られ得る。ストリンジェント温度条件としては通常、少なくとも約３０℃、より好ましくは少なくとも約３７℃、最も好ましくは少なくとも約４２℃の温度が挙げられる。さまざまなさらなるパラメータ、例えば、ハイブリダイゼーション時間、界面活性剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ））の濃度、及び担体ＤＮＡの封入又は除外は当業者によく知られている。種々のストリンジェンシーレベルは、必要に応じたこのような種々の条件を組み合わせることにより得られる。好ましい：一実施形態では、ハイブリダイゼーションは、３０℃にて７５０ｍＭのＮａＣｌ、７５ｍＭのクエン酸三ナトリウム及び１％のＳＤＳ中で行われる。より好ましい一実施形態では、ハイブリダイゼーションは、３７℃にて５００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのクエン酸三ナトリウム、１％のＳＤＳ、３５％のホルムアミド及び１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）中で行われる。最も好ましい一実施形態では、ハイブリダイゼーションは、４２℃にて２５０ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、１％のＳＤＳ、５０％のホルムアミド及び２００μｇ／ｍｌのｓｓＤＮＡ中で行われる。このような条件に対する有用な変形は当業者に容易に自明であろう。
【００６０】
ほとんどの用途では、ハイブリダイゼーション後に行う洗浄工程もまた、ストリンジェンシーはさまざまである。洗浄ストリンジェンシー条件は塩濃度と温度によって規定され得る。上記のように、洗浄ストリンジェンシーは、塩濃度を下げること、又は温度を上げることによって高めることができる。例えば、洗浄工程のためのストリンジェント塩濃度は好ましくは、約３０ｍＭ未満のＮａＣｌと３ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウム、最も好ましくは約１５ｍＭ未満のＮａＣｌと１．５ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウムである。洗浄工程のためのストリンジェント温度条件としては通常、少なくとも約２５℃、より好ましくは少なくとも約４２℃、なおより好ましくは少なくとも約６８℃の温度が挙げられる。好ましい一実施形態では、洗浄工程は、２５℃にて３０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのクエン酸三ナトリウム及び０．１％のＳＤＳ中で行われる。より好ましい一実施形態では、洗浄工程は、４２℃にて１５ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのクエン酸三ナトリウム及び０．１％のＳＤＳ中で行われる。より好ましい一実施形態では、洗浄工程は、６８℃にて１５ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのクエン酸三ナトリウム及び０．１％のＳＤＳ中で行われる。このような条件に対するさらなる変形は当業者に容易に自明であろう。ハイブリダイゼーション手法は当業者によく知られており、例えば、Ｂｅｎｔｏｎ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｓ（Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９６：１８０，１９７７）；Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｈｏｇｎｅｓｓ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ７２：３９６１，１９７５）；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００１）；Ｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｍｅｌ（Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９８７，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；及びＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載されている。
【００６１】
「実質的に同一の」により、ポリペプチド又は核酸分子が参照アミノ酸配列（例えば、本明細書に記載のアミノ酸配列のいずれか１つ）又は参照核酸配列（例えば、本明細書に記載の核酸配列のいずれか１つ）と少なくとも５０％の同一性を示すことを意図する。好ましくは、かかる配列は比較に使用される配列と、アミノ酸レベル又は核酸レベルで少なくとも６０％、より好ましくは８０％又は８５％、より好ましくは９０％、９５％又はさらには９９％同一である。
【００６２】
配列同一性は典型的には、配列解析ソフトウェア（例えば、ウィスコンシン大学バイオテクノロジーセンター（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒ）（１７１０  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｖｅｎｕｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．５３７０５）の遺伝学コンピュータグループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ）のＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、ＢＬＡＳＴ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＧＡＰ又はＰＩＬＥＵＰ／ＰＲＥＴＴＹＢＯＸプログラム）を用いて測定される。かかるソフトウェアは、相同性の度合を種々の置換、欠失及び／又は他の修飾に割り当てることにより同一配列又は類似配列をマッチングさせる。同類置換としては典型的には、以下の群：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リシン、アルギニン；及びフェニルアラニン、チロシン内での置換が挙げられる。同一性の度合を調べるための例示的なアプローチの一例では、ＢＬＡＳＴプログラムが使用され得、ｅ−３〜ｅ−１００の確率スコアは密接に関連している配列を示す。
【００６３】
「被験体」により哺乳動物、例えば限定されないが、ヒト又は非ヒト哺乳動物、例えば、ウシ、ウマ、イヌ、ヒツジ又はネコを意図する。被験体は好ましくは、かかる処置を必要とする哺乳動物、例えば、Ｂ細胞リンパ腫又はその素因を有すると診断された被験体である。哺乳動物は、任意の哺乳動物、例えば、ヒト、霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、並びに家畜又は食料消費のために飼育する動物、例えば、畜牛、ヒツジ、ブタ、ニワトリ及びヤギである。好ましい一実施形態では、哺乳動物はヒトである。
【００６４】
本明細書に示す範囲は、該範囲内のすべての値の省略形であると理解されたい。例えば、１〜５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０からなる群の任意の数、数の組み合わせ又は下位範囲を包含していると理解されたい。
【００６５】
用語「処置する」及び「処置」は、本明細書で用いる場合、薬剤又は製剤を、有害な病状、障害又は疾患に罹患している臨床症状のある個体に、症状の重症度及び／又は頻度の低減がもたらされるように、症状及び／又はその根本的な原因が解消されるように、及び／又は損傷の改善又は修復が助長されるように投与することをいう。除外はしないが、障害又は病状の処置は、障害、病状又はそれに伴う症状が完全に解消されることを必要としないことは認識されよう。
【００６６】
新生物を有する患者の処置としては、以下のとおりであり、わかっている腫瘍を最初の治療（例えば、手術）によって除去した後に存在しているかもしれない残存腫瘍細胞を破壊し、それにより起こり得る癌の再発を予防するための補助療法（ａｄｊｕｖａｎｔ  ｔｈｅｒａｐｙ）（「ａｄｊｕｎｃｔ  ｔｈｅｒａｐｙ」又は「ａｄｊｕｎｃｔｉｖｅ  ｔｈｅｒａｐｙ」とも称される）；外科処置の前に施される癌を縮小させるための術前補助療法；寛解を引き起こすための導入療法（典型的には急性白血病に対して）；寛解が得られたら寛解を持続させるために施される強化療法（ｃｏｎｓｏｌｉｄａｔｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ）（「ｉｎｔｅｎｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ」とも称される）；寛解の長期化を補助するためにより低用量又はより低頻度での用量で施される維持療法；ファーストライン治療（標準治療とも称される）；セカンド（又はサード、フォースなど）ライン治療（サルベージ療法とも称される）は、疾患がファーストライン治療後、応答又は再発しなかった場合に施される；及び癌が有意に小さくなることを期待せず、症状のマネージメントに対処するための待機療法（支持療法とも称される）の任意のものが挙げられ得る。
【００６７】
用語「予防する」及び「予防」は、薬剤又は組成物を、特定の有害な病状、障害又は疾患に対して易罹患性であるか、又は素因を有する臨床症状のない個体に投与することをいい、したがって、症状の発生及び／又はその根本的な原因の抑制に関するものである。
【００６８】
具体的に記載していない限り、又は文脈から自明でない限り、本明細書で用いる場合、用語「ｏｒ（又は，若しくは）」は包含的であると理解されたい。具体的に記載していない限り、又は文脈から自明でない限り、本明細書で用いる場合、用語「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「この（ｔｈｅ）」は単数形又は複数形であると理解されたい。
【００６９】
具体的に記載していない限り、又は文脈から自明でない限り、本明細書で用いる場合、用語「約」は、当該技術分野における通常許容される範囲内、例えば、平均の２標準偏差以内と理解されたい。約は、記載の値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％又は０．０１％以内と理解され得る。文脈から明らかでない限り、本明細書に示す数値はすべて、約という用語によって修飾されている。
【００７０】
本明細書における可変部の任意の定義における化学基の列挙の記載は、任意の単独の基又は記載の基の組み合わせとしての該可変部の定義を包含している。本明細書における可変部又は態様に関する実施形態の記載は、任意の１つの実施形態として、又は任意の他の実施形態若しくはその一部分との組み合わせでの該実施形態を包含している。
【００７１】
本明細書に示す任意の組成物又は方法は、本明細書に示す任意の他の組成物及び方法の１つ以上と組み合わされ得る。
【００７２】
移行句「〜からなる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「〜を有する（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「〜を含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」又は「〜を特徴とする（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ  ｂｙ）」と同義的であり、包含的又は非限定的であり、記載されていないさらなる要素又は方法工程を排除しない。対照的に、移行句「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ（〜のみからなる）」は、特許請求の範囲に明記されていない要素、工程又は成分はいずれも排除する。移行句「〜から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」は、請求項の範囲を、請求項に記載の発明の明記された材料又は工程「及び基本的な新規の特徴に実質的に影響しないもの」に限定する。
【００７３】
本発明の他の特色及び利点は、その好ましい実施形態の以下の説明及び特許請求の範囲から自明となろう。特に定義していない限り、本明細書で用いる科学技術用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者に一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様又は同等の方法及び材料が本発明の実施又は試験において使用され得るが、好適な方法及び材料を以下に記載する。本明細書で挙げた外国の公開特許及び特許出願はすべて、引用により本明細書に組み込まれる。本明細書に記載した受託番号によって示されるＧｅｎｂａｎｋ及びＮＣＢＩの寄託物は引用により本明細書に組み込まれる。本明細書で挙げた他の既刊の参考文献、文献、手稿及び科学文献はすべて、引用により本明細書に組み込まれる。矛盾する場合は、本明細書（定義を含む）に支配される。また、材料、方法及び実施例は実例にすぎず、限定を意図するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】図１Ａ〜図１Ｆは、ヒト免疫細胞サブセットのインビトロ増殖に対するＡＬＴ−８０３の効果を示す一連の折れ線グラフである。ヒトＰＢＭＣを２例の健常ドナー（ドナーＡ，図１Ａ，図１Ｃ及び図１Ｅ；ドナーＢ，図１Ｂ，図１Ｄ及び図１Ｆ）の血液バフィーコートから分離し、ＲＰＭＩ−１０中でＡＬＴ−８０３とともに、又はなしで５日間（図１Ａ及び図１Ｂ）又は表示した期間（図１Ｃ，図１Ｄ，図１Ｅ及び図１Ｆ）培養した。ＡＬＴ−８０３は、図１Ａ及び図１Ｂに表示した濃度で、並びに図１Ｃ〜図１Ｆに示した試験では１０ｎＭで添加し、ＲＰＭＩ−１０を培地対照（Ｃｔｒｌ）として使用した。インキュベーションの終了時、ＰＢＭＣを、ＣＤ４、ＣＤ８（Ｔ細胞のマーカーとして）及びＣＤ１６（ＮＫ細胞のマーカーとして）に特異的な蛍光色素標識抗体で染色した。細胞サブセットのパーセンテージを、ＦＡＣＳｕｉｔｅソフトウェアを備えたＦＡＣＳｖｅｒｓｅで解析した。図１Ａ及び図１Ｂでは個々のドナーの三連の試料を解析し、図１Ｃ及び図１Ｄでは各時点で単一の試料を解析した。図１Ｅ及び図１Ｆは、それぞれ図１Ｃ及び図１Ｄで得られた結果から求めたＣＤ４／ＣＤ８比を表す。
【図２】図２Ａ及び図２Ｂは、異なるドナー由来のヒト免疫細胞サブセットのインビトロ増殖に対するＡＬＴ−８０３の効果を示すドットプロットを示す。ヒトＰＢＭＣを７例の健常ドナーの血液バフィーコートから分離し、単独の培地中又は０．５ｎＭのＩＬ−１５若しくはＡＬＴ−８０３を含有している培地中で７日間培養した。インキュベーションの終了時、ＰＢＭＣを計数し、免疫細胞サブセットに特異的な蛍光色素標識抗体で染色した。細胞サブセットのパーセンテージを、ＦＡＣＳｕｉｔｅソフトウェアを備えたＦＡＣＳｖｅｒｓｅで解析し、細胞の絶対カウント数が図２Ａ及び図２Ｂに示したとおりに計算された。
【図３】図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｃ及び図３Ｄは、ＡＬＴ−８０３とのインキュベーション後の免疫細胞サブセット上のＣＤ２５分子及びＣＤ６９分子の上方調節を示す折れ線グラフである。ヒトＰＢＭＣを２例の健常ドナー（左パネル及び右パネル）の血液バフィーコートから分離し、表示した濃度のＡＬＴ−８０３とともにＲＰＭＩ−１０中で５日間培養した。ＡＬＴ−８０３活性化ＰＢＭＣを、（Ｔ細胞のマーカーとしての）ＣＤ４及びＣＤ８、（ＮＫ細胞のマーカーとしての）ＣＤ３３５、（活性化マーカーとしての）ＣＤ２５及びＣＤ６９に、それぞれ特異的な蛍光色素標識抗体で染色した。ＣＤ４＋  Ｔ細胞、ＣＤ８＋  Ｔ細胞及びＮＫ細胞上でのＣＤ２５及びＣＤ６９の発現の蛍光強度［幾何平均（ＭＦＩ）］を、ＦＡＣＳｕｉｔｅソフトウェアを備えたＦＡＣＳｖｅｒｓｅで解析した。
【図４】図４Ａ〜図４Ｄは、ヒトＣＤ８＋  Ｔ細胞及びＮＫ細胞におけるグランザイムＢ及びパーフォリンの発現のＡＬＴ−８０３による上方調節を示す折れ線グラフである。ヒトＰＢＭＣを血液バフィーコートから分離し、ＲＰＭＩ−１０中で表示した濃度のＡＬＴ−８０３とともに５日間培養した。ＡＬＴ−８０３活性化ＰＢＭＣを、ＣＤ８、（ＮＫ細胞のマーカーとしての）ＣＤ１６及びＣＤ３３５に、それぞれ特異的な蛍光色素標識抗体で染色し、次いで、グランザイムＢ又はパーフォリンに特異的な蛍光色素標識抗体で細胞内染色した。ＣＤ８＋  Ｔ細胞（図４Ａ：ドナー１及び図４Ｃ：ドナー２）とＮＫ細胞（図４Ｂ：ドナー１及び図４Ｄ：ドナー２）上でのグランザイムＢ及びパーフォリンの発現の平均蛍光強度（ＭＦＩ：幾何平均）を、ＦＡＣＳｕｉｔｅソフトウェアを備えたＦＡＣＳｖｅｒｓｅで解析した。
【図５】図５Ａ、図５Ｂ及び図５Ｃは、培養状態のヒト免疫細胞及びマウス免疫細胞によるサイトカイン産生及び細胞増殖に対するＡＬＴ−８０３の効果を示す一連の棒グラフである。ヒトＰＢＭＣ（図５Ａ）及びマウス脾細胞（図５Ｂ）を、表示したとおりのＡＬＴ−８０３を含有する培地中で４日間インキュベートした。細胞培養培地中に分泌されたサイトカインの変化を図５Ａ及び図５Ｂに示す。バイオレット色素希釈法に基づいた細胞増殖応答の変化を図５Ｃに示す。
【図６】図６Ａ〜図６Ｄは、ＤａｕｄｉヒトＢ細胞リンパ腫細胞及びＫ５６２ヒト骨髄性（ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ）白血病細胞に対してＡＬＴ−８０３によって誘導されるヒトＰＢＭＣの細胞傷害を示す一連の折れ線グラフ及び棒グラフである。ヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として使用し、Ｃｅｌｌｔｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔで標識したＤａｕｄｉ及びＫ５６２細胞を標的細胞として使用した。ヒトＰＢＭＣをＫ５６２細胞（図６Ａ）、Ｄａｕｄｉ細胞（図６Ｂ）又は１０ｎＭのリツキシマブ（抗ＣＤ２０  Ａｂ）を伴うＤａｕｄｉ細胞（図６Ｃ）と、表示したＥ：Ｔ比で、１０ｎＭのＡＬＴ−８０３を含む、又は含んでいないＲＰＭＩ−１０中で混合した。この細胞混合物を３７℃で３日間インキュベートし、Ｄａｕｄｉ及びＫ５６２標的細胞のバイアビリティを、バイオレット標識標的細胞のヨウ化プロピジウム染色のＦＡＣＳＶｅｒｓｅフローサイトメーターでの解析によって評価した。ヒトＰＢＭＣを、バイオレットで標識したＫ５６２若しくはＤａｕｄｉ細胞と１０：１の比で、又はＤａｕｄｉ細胞＋リツキシマブ（ＡＤＣＣ）と２：１の比で１０ｎＭのＡＬＴ−８０３を含む、又は含んでいないＲＰＭＩ−１０中で混合した。３７℃で１〜３日間のインキュベーション後、標的細胞の細胞傷害％を調べた（図６Ｄ）。
【図７】図７Ａ及び図７Ｂは、Ｋ５６２及びＤａｕｄｉ細胞に対するヒトＰＢＭＣ細胞傷害性のＡＬＴ−８０３濃度依存性誘導を示す一連の折れ線グラフである。ヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として使用し、Ｃｅｌｌｔｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔで標識したＤａｕｄｉ及びＫ５６２細胞を標的細胞として使用した。２例のドナー（Ａ及びＢ）のヒトＰＢＭＣを、バイオレット標識Ｋ５６２細胞又はＤａｕｄｉ細胞と２０：１のＥ：Ｔ比で、表示した濃度のＡＬＴ−８０３を含むＲＰＭＩ−１０中で混合した。３７℃で３日間のインキュベーション後、Ｄａｕｄｉ及びＫ５６２標的細胞のバイアビリティを、バイオレット標識標的細胞のヨウ化プロピジウム染色のＦＡＣＳＶｅｒｓｅフローサイトメーターでの解析によって評価した。
【図８】図８Ａ〜図８Ｄは、ＡＬＴ−８０３が腫瘍細胞に対する腫瘍特異的ＡｂのＡＤＣＣを増大させることを示す一連の折れ線グラフである。ドナー１（図８Ａ）又はドナー２（図８Ｂ）の新鮮ヒトＰＢＭＣをバイオレット標識ＣＤ２０陽性ＤａｕｄｉヒトＢ細胞リンパ腫細胞とＥ：Ｔ＝２：１で、表示した濃度（０．０１〜１０ｎＭ）のＡＬＴ−８０３だけを、又は１０ｎＭのリツキシマブ（抗ＣＤ２０  Ａｂ）とともに含むＲＰＭＩ−１０中で混合した。３７℃で２日間のインキュベーション後、Ｄａｕｄｉ細胞のバイアビリティを、バイオレット標識Ｄａｕｄｉ細胞のヨウ化プロピジウム染色のＢＤ  ＦＡＣＳＶｅｒｓｅでの解析によって評価した。追跡試験において、ＮＫ細胞を正常ヒトＰＢＭＣからＭＡＣＳによって単離し、エフェクター細胞として使用した。ＮＫ細胞（図８Ｃ）及びＮＫ枯渇ＰＢＭＣ（図８Ｄ）をバイオレット標識Ｄａｕｄｉ細胞とＥ：Ｔ＝１：１で、表示した濃度（０．０１又は０．１ｎＭ）のＡＬＴ−８０３を１０ｎＭのリツキシマブ又はＨＯＡＴ  Ａｂとともに、又はなしで含有するＲＰＭＩ−１０中で混合した。細胞を３７℃で２日間インキュベートした。Ｄａｕｄｉ細胞のバイアビリティを、ヨウ化プロピジウムで染色したバイオレット標識Ｄａｕｄｉ細胞のＢＤ  ＦＡＣＳＶｅｒｓｅでの分析によって評価した。
【図９】図９Ａ及び図９Ｂは、ＡＬＴ−８０３が、マウス脾細胞による腫瘍細胞に対する腫瘍特異的ＡｂのＡＤＣＣを増大させることを示す棒グラフ及び折れ線グラフである。図９Ａに示した試験では、ＰＢＳ、ＡＬＴ−８０３（０．２ｍｇ／ｋｇ）、リツキシマブ（１０ｍｇ／ｋｇ）又はＡＬＴ−８０３＋リツキシマブでの処置後の腫瘍担持ＳＣＩＤマウスから脾細胞を単離した。脾細胞とＣｅｌｌｔｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔ標識Ｄａｕｄｉ細胞をＥ：Ｔ＝２０：１で、単独の培地又はＡＬＴ−８０３（１０ｎＭ）、リツキシマブ（１０ｎＭ）若しくはＡＬＴ−８０３＋リツキシマブを含有している培地の存在下で混合した。２日間３７℃で２日間のインキュベーション後、Ｄａｕｄｉ標的細胞のバイアビリティを評価した。また、脾細胞は、ＡＬＴ−８０３（０．２ｍｇ／ｋｇ）での処置後のＢａｌｂ／ｃマウスから単離した（図９Ｂ）。脾細胞とＣｅｌｌｔｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔ標識ＨＥＲ２陽性ＳＫ−ＢＲ−３ヒト乳癌細胞をＥ：Ｔ＝１０：１で、単独の培地又は種々の濃度の抗ＨＥＲ２抗体（クローン２４Ｄ２）、ＡＬＴ−８０３若しくは両剤を含有している培地の存在下で混合した。３７℃で２４時間のインキュベーション後、ＳＫ−ＢＲ−３標的細胞のバイアビリティを評価した。
【図１０】図１０は、ＳＣＩＤマウスにおけるヒトＢリンパ腫に対するＡＬＴ−８０３＋抗ＣＤ２０抗体の抗腫瘍有効性を示す棒グラフである。Ｄａｕｄｉ細胞腫瘍を担持しているＦｏｘ  Ｃｈａｓｅ  ＳＣＩＤ雌マウスをＰＢＳ、ＡＬＴ−８０３（０．２ｍｇ／ｋｇ）、リツキシマブ（１０ｍｇ／ｋｇ）又はＡＬＴ−８０３＋リツキシマブで処置した。骨髄中のＤａｕｄｉ細胞を最後の処置後、４日目に測定した。
【図１１】図１１は、ＳＣＩＤマウスにおけるヒトＢリンパ腫に対するＡＬＴ−８０３＋抗ＣＤ２０抗体の抗腫瘍有効性を示す棒グラフである。Ｄａｕｄｉ細胞腫瘍を担持しているＦｏｘ  Ｃｈａｓｅ  ＳＣＩＤ雌マウスをＰＢＳ、リツキシマブ又はリツキシマブ＋種々の濃度のＡＬＴ−８０３で処置した。骨髄中のＤａｕｄｉ細胞を最後の処置後、４日目に測定した。
【図１２】図１２は、Ｄａｕｄｉ細胞腫瘍を担持しているマウスのＡＬＴ−８０３＋抗ＣＤ２０  Ａｂ療法後の生存期間の長期化を示す折れ線グラフである。Ｄａｕｄｉ細胞腫瘍を担持しているＦｏｘ  Ｃｈａｓｅ  ＳＣＩＤ雌マウスをＰＢＳ、リツキシマブ（１０ｍｇ／ｋｇ）、ＡＬＴ−８０３（０．０５ｍｇ／ｋｇ）又はリツキシマブ＋ＡＬＴ−８０３で処置した。マウスの生存率をモニタリングし、カプラン・マイヤー生存率曲線をプロットした。
【図１３】図１３Ａ及び図１３Ｂは、ＣＴ２６結腸癌肺転移癌を担持しているマウスのＡＬＴ−８０３療法及びＡＬＴ−８０３＋抗ＣＴＬＡ−４  Ａｂ療法後の生存期間の長期化を示す一連の折れ線グラフである。ＢＡＬＢ／ｃＣＴ２６結腸癌肺転移癌を担持しているマウスを、ＰＢＳ、ＡＬＴ−８０３、ＩＬ−１５の単独療法薬並びに抗ＣＴＬＡ４  Ａｂ及び抗ＰＤ−Ｌ１  Ａｂとの併用療法薬で、図に示したとおりに処置した。マウスの生存率をモニタリングし、カプラン・マイヤー生存率曲線をプロットした。
【図１４】図１４Ａ及び図１４Ｂは、５Ｔ３３Ｐ骨髄腫腫瘍を担持しているマウスのＡＬＴ−８０３＋抗ＰＤ−Ｌ１  Ａｂ療法後の生存期間の長期化を示す一連の折れ線グラフである。図１４Ａでは、５Ｔ３３Ｐ骨髄腫腫瘍を担持しているＣ５７ＢＬ／６マウスをＰＢＳ、ＡＬＴ−８０３、ＩＬ−１５の単独療法薬並びに抗ＣＴＬＡ４  Ａｂ及び抗ＰＤ−Ｌ１  Ａｂ（０．２ｍｇ／マウス）との併用療法薬で、図に示したとおりに処置した。マウスの生存率をモニタリングし、カプラン・マイヤー生存率曲線をプロットした。図１４Ｂでは、５Ｔ３３Ｐ骨髄腫腫瘍を担持しているＣ５７ＢＬ／６マウスをＰＢＳ、最適下限のＡＬＴ−８０３（０．０５ｍｇ／ｋｇ）、最適下限の抗ＰＤ−Ｌ１  Ａｂ（５μｇ）又はＡＬＴ−８０３＋抗ＰＤ−Ｌ１  Ａｂの組み合わせで図に示したとおりに処置した。マウスの生存率をモニタリングし、カプラン・マイヤー生存率曲線をプロットした。
【図１５】図１５Ａ及び図１５Ｂは、腫瘍細胞の表面上のＰＤ１及びＣＴＬＡ４に対するリガンドの発現を示す一連のグラフである。ＣＴ２６（図１５Ａ）及び５Ｔ３３Ｐ（図１５Ｂ）腫瘍細胞を、ＰＤ−Ｌ１、ＣＤ８６及びＣＤ８０（赤線）又はアイソタイプ対照（黒線）に対する抗体で染色し、次いで、フローサイトメトリーによって解析した。
【図１６】図１６Ａ、図１６Ｂ、図１６Ｃ、図１６Ｄ、図１６Ｅ及び図１６Ｆは、ＡＬＴ−８０３での反復用量処置後に観察されたマウスの変化及び処置後の回復を示す一連の棒グラフである。
【図１７】図１７は、カニクイザルにおけるＡＬＴ−８０３の薬物動態プロフィールを示す折れ線グラフである。
【図１８】図１８Ａ〜図１８Ｈは、カニクイザルにおける反復用量でのＡＬＴ−８０３での処置後の免疫細胞カウント数の変化及び処置後の回復を示す一連の折れ線グラフである。
【図１９】図１９Ａ及び図１９Ｂは、ＡＬＴ−８０３＋チェックポイントブロック療法後の同所性ＭＢ４９ｌｕｃ膀胱腫瘍を担持しているマウスの生存期間の長期化を示す一連の折れ線グラフである。図１９Ａでは、同所性ＭＢ４９ｌｕｃ膀胱腫瘍を担持しているＣ５７ＢＬ／６マウスをＰＢＳ、ＡＬＴ−８０３、並びに抗ＣＴＬＡ４  Ａｂ及び抗ＰＤ−Ｌ１  ＡｂとのＡＬＴ−８０３併用療法薬で図に示したとおりに処置した。マウスの生存率をモニタリングし、カプラン・マイヤー生存率曲線をプロットした。８０日後、ＡＬＴ−８０３＋抗ＰＤ−Ｌ１／抗ＣＴＬＡ４−Ａｂ群の生存マウス及び処置未経験の年齢適合マウスに、膀胱内投与にてＭＢ４９ｌｕｃ腫瘍細胞で再負荷刺激した。マウスの生存期間をさらにモニタリングした。図１９Ｂでは、ＭＢ４９ｌｕｃ膀胱腫瘍を担持しているＣ５７ＢＬ／６マウスをＰＢＳ、ＡＬＴ−８０３、抗ＰＤ−１  Ａｂ、抗ＣＴＬＡ−４  Ａｂ又は併用療法薬で図に示したとおりに処置した。マウスの生存率をモニタリングし、カプラン・マイヤー生存率曲線をプロットした。
【図２０】図２０は、ＭＢ４９ｌｕｃ腫瘍細胞の表面上のＰＤ１及びＣＴＬＡ４に対するリガンドの発現を示す一連のフローサイトメトリーグラフである。ＭＢ４９ｌｕｃ腫瘍細胞を、ＰＤ−Ｌ１、ＣＤ８６及びＣＤ８０（青線）又はアイソタイプ対照（黒線）に対する抗体で染色し、次いで、フローサイトメトリーによって解析した。
【図２１】図２１Ａ〜図２１Ｃは、同系マウス黒色腫モデルにおけるＡＬＴ−８０３とＴＡ９９の併用効果を示す一連の折れ線グラフである。図２１Ａでは、Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞（２×１０５）をＣ５７ＢＬ／６マウスの脇腹に皮下注射した。触知できる腫瘍が形成されたら、マウスを無作為化し、０．２ｍｇ／ｋｇのＡＬＴ−８０３、１０ｍｇ／ｋｇのＴＡ９９、ＡＬＴ−８０３＋ＴＡ９９の組み合わせ、又はＰＢＳ対照で、試験の１０、１４、１７、２１及び２４日目に静脈内処置した。図２１Ｂ及び図２１Ｃは、併用療法の抗腫瘍免疫に関与している種々の細胞サブセットのエフェクター機能の評価を示す。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔ細胞の枯渇は各々、それぞれラットｍＡｂ  ＧＫ１．５（抗ＣＤ４）及び５３．６．７２（抗ＣＤ８ａ）の腹腔内注射によって行った。ＮＫ細胞の枯渇はマウスｍＡｂ  ＰＫ１３６（抗ＮＫ１．１）の腹腔内投与によって行った。マクロファージの枯渇のためには、マウスにクロドネート負荷リポソーム（Ｃｌｏｐｈｏｓｏｍｅ）を腹腔内注射した。枯渇の影響を、腫瘍成長（図２１Ｂ）及びマウスの生存率（図２１Ｃ）の両方を用いて評価した。生存率曲線は、動物が腫瘍転移により死亡したとき、又は腫瘍が腫瘍量の閾値サイズ（一方向の寸法＞２０ｍｍ）に達したときの試験日を示す。ｎ＝８／群。＊＊：ｐ＜０．０１；＊＊＊：ｐ＜０．００１。
【図２２】図２２Ａ〜図２２Ｄは、脾臓及び腫瘍微小環境における免疫細胞のＡＬＴ−８０３媒介性増加を示す一連の棒グラフである。図２２Ａ〜図２２Ｄでは、マウス（ｎ＝６）にＢ１６Ｆ１０黒色腫細胞（２×１０５）を、試験の０日目（ＳＤ０）に注射（皮下）し、ＴＡ９９、ＡＬＴ−８０３、ＡＬＴ−８０３＋ＴＡ９９の組み合わせ又はＰＢＳでＳＤ１７に静脈内処置した。ＳＤ２０に、ＣＤ８＋  Ｔ細胞（ＣＤ８ａ＋）、ＣＤ４＋  Ｔ細胞（ＣＤ４＋）、ＮＫ細胞（ｐａｎＮＫ＋）、Ｂ細胞（ＣＤ１９＋）及びマクロファージ（Ｆ４／８０＋）のパーセンテージを、脾細胞（図２２Ａ）及びＴＩＬ（７−ＡＡＤ−ＣＤ４５＋，図２２Ｂ）において、フローサイトメトリーを用いて定量した。脾臓（図２２Ｃ）及びＴＩＬ（図２２Ｄ）のＣＤ８＋  Ｔ細胞集団のうちＣＤ８＋ＣＤ４４ｈｉｇｈ記憶Ｔ細胞のパーセンテージを測定し、プロットした。
【図２３】図２３Ａ〜図２３Ｃは、ＡＬＴ−８０３＋ＴＡ９９により再腫瘍負荷刺激からの免疫防御がもたらされることを示す一連の折れ線グラフである。図２３Ａ〜図２３Ｂでは、試験の０日目（ＳＤ０）にＢ１６Ｆ１０細胞（２×１０５）を皮下移植したマウス（ｎ＝２０）を即座にＰＢＳ、ＴＡ９９又はＴＡ９９＋ＡＬＴ−８０３で静脈内処置した。３週間の処置及び２ヶ月間のモニタリング後、未投薬の動物及び生存動物に、Ｂ１６Ｆ１０細胞（２×１０５）の皮下注射によって反対側に再負荷刺激した。腫瘍初期負荷刺激の際の動物の無腫瘍生存率（動物の皮下腫瘤は＜５０ｍｍ３に維持）（図２３Ａ）及び再負荷刺激の際の腫瘍成長（図２３Ｂ）を測定し、プロットした。ＴＢ＝腫瘍担持。＊：ｐ＜０．０５；＊＊：ｐ＜０．０１；＊＊＊：ｐ＜０．００１。図２３Ｃでは、マウス黒色腫Ｂ１６Ｆ１０細胞（２×１０５／マウス）をＣ５７ＢＬ／６マウスの脇腹に試験の−５８日目（ＳＤ−５８）に皮下注射した。マウスにはＢ１６Ｆ１０細胞を図２３Ａのとおりに注射し、ＡＬＴ−８０３（０．２ｍｇ／ｋｇ）及びＴＡ９９（１０ｍｇ／ｋｇ）で、週２回、３週間（０日目に開始）静脈内処置した。ＣＤ４＋  Ｔ細胞、ＣＤ８＋  Ｔ細胞又はＮＫ細胞を枯渇させるため、抗ＣＤ４（ＧＫ１．５）、抗ＣＤ８（５３−６．７２）及び／又は抗ＮＫ（ＰＫ１３６）を無腫瘍マウスに、腫瘍移植後４６日目に腹腔内投与した。無腫瘍マウスの抗腫瘍記憶応答を評価するため、Ｂ１６Ｆ１０細胞（２×１０５／マウス）を無腫瘍マウスの反対側に、最初の腫瘍移植後５８日間目（ＳＤ０）に皮下注射した。Ｂ１６Ｆ１０細胞を注射した（ｉｎｊｅｃｔｅｄ  ｗｉｔｈ）処置未経験のマウスを対照として使用した。生存率曲線に、動物が腫瘍転移により死亡したときの試験日、又は閾値サイズ（腫瘍体積＞４０００立方ｍｍ）をまとめる。ｎ＝１０／群。
【図２４】図２４Ａ〜図２４Ｅは、ＡＬＴ−８０３はＣＤ４＋  Ｔ細胞を活性化してそのＰＤ−Ｌ１発現を上方調節するが、ＣＤ８＋  Ｔ細胞上のＰＤ−１発現は低減させることを示す一連の棒グラフである。腫瘍担持マウス（ｎ＝６）のＴＩＬ（７−ＡＡＤ−ＣＤ４５＋）画分（図２４Ａ及び図２４Ｃ）並びに脾臓（図２４Ｂ）由来のＣＤ４＋  Ｔ細胞（ＣＤ４＋）を抗ＣＤ２５（図２４Ａ）又は抗ＰＤ−Ｌ１（図２４Ｂ及び図２４Ｃ）抗体で、被験物質の単回注射後３日目に染色した後、フローサイトメトリー定量を行った。腫瘍担持マウス（ｎ＝６）の脾臓（図２４Ｄ）及びＴＩＬ（７−ＡＡＤ−ＣＤ４５＋）画分（図２４Ｅ）由来のＣＤ８＋  Ｔ細胞（ＣＤ８＋；図２４Ｄ及び図２４Ｅ）は、抗ＰＤ−１（図２４Ｄ及び図２４Ｅ）抗体で被験物質の単回注射後３日目に染色した後、フローサイトメトリー定量を行った。ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−１の発現を、平均蛍光強度（ＭＦＩ）を用いてスコア化する。＊：ｐ＜０．０５；＊＊：ｐ＜０．０１；＊＊＊：ｐ＜０．００１。
【図２５】図２５Ａ〜図２５Ｄは、ＡＬＴ−８０３がＮＫ細胞を活性化してＮＫ細胞上のＰＤ−１発現を下方調節することを示す一連の棒グラフである。腫瘍担持マウス（ｎ＝６）の脾臓（図２５Ａ及び図２５Ｃ）及びＴＩＬ（７−ＡＡＤ−ＣＤ４５＋）画分（図２５Ｂ及び図２５Ｄ）由来のＮＫ細胞（ｐａｎＮＫ＋；）を抗ＫＬＲＧ１（図２５Ａ及び図２５Ｂ）及び抗ＰＤ−１（図２５Ｃ及び図２５Ｄ）抗体で被験物質の単回注射後３日目に染色した後、フローサイトメトリー定量を行った。ＫＬＲＧ１及びＰＤ−１の発現を、平均蛍光強度（ＭＦＩ）を用いてスコア化する。＊：ｐ＜０．０５；＊＊：ｐ＜０．０１；＊＊＊：ｐ＜０．００１。
【図２６】図２６Ａ〜図２６Ｂは、同系マウス黒色腫モデルにおけるＡＬＴ−８０３／ＴＡ９９と抗ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂの併用効果を示す一連の折れ線グラフである。図２６Ａでは、Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞（２×１０５）をＣ５７ＢＬ／６マウスの右背側脇腹に皮下注射した。触知できる腫瘍が形成されたら、マウスを無作為化し、０．２ｍｇ／ｋｇのＡＬＴ−８０３（ｉ．ｖ．）及び１０ｍｇ／ｋｇのＴＡ９９（ｉ．ｖ．）で１００μｇ／マウスの抗ＰＤ−Ｌ１  Ａｂ  １０Ｆ．９Ｇ２（ｉ．ｐ．）とともに、又はなしで、試験の１０、１４、１７、２１及び２４日目に処置した。＊：ｐ＜０．０５；＊＊＊：ｐ＜０．００１。図２６Ｂは、Ｂ１６Ｆ１０細胞におけるＰＤ−Ｌ１のインビトロ及びインビボでの発現を示す。インビトロ培養物（実線）並びに腫瘍担持マウス（点線）から収集したＢ１６Ｆ１０細胞をフルオロフォア標識抗ＰＤ−Ｌ１抗体（赤）で染色し、フローサイトメトリーに供した。抗体アイソタイプ（黒）を陰性対照として含めた。
【発明を実施するための形態】
【００７５】
本発明は、少なくとも一部において、抗体と、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）スーパーアゴニスト変異型及びダイマー型ＩＬ−１５受容体α／Ｆｃ融合タンパク質の複合体であるＡＬＴ−８０３との併用が、新生物（例えば、膠芽腫、前立腺癌、造血器の癌、Ｂ細胞腫瘍、多発性骨髄腫、Ｂ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、固形腫瘍、尿路上皮／膀胱癌、黒色腫、肺癌、腎細胞癌、乳癌、頭頸部癌、結腸直腸癌、及び卵巣癌）又は感染（例えば、ヒト免疫不全ウイルスによる感染）に対する免疫応答の増強に有用であるという驚くべき知見に基づいている。
【００７６】
ＡＬＴ−８０３
ＡＬＴ−８０３は、ＩＬ−２Ｒβγに対する増大した結合能及び増強された生物活性を有するＩＬ−１５変異型を含むものである（米国特許第８，５０７，２２２号，引用により本明細書に組み込まれる）。ＩＬ−１５のこのスーパーアゴニスト変異型は刊行物（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００９  １８３：３５９８）に報告され、米国特許庁により該スーパーアゴニストに対する特許が発行されており、いくつかの特許出願が係属中である（例えば、米国特許出願第１２／１５１，９８０号及び同第１３／２３８，９２５号）。このＩＬ−１５スーパーアゴニストを可溶性ＩＬ−１５α受容体融合タンパク質（ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ）と組み合わせると、インビトロ及びインビボで非常に強力なＩＬ−１５活性を有するタンパク質複合体がもたらされる（Ｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，５６：８０４−８１０；Ｘｕ，ｅｔ  ａｌ．，２０１３  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７３：３０７５−８６，Ｗｏｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，２０１３，ＯｎｃｏＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２：ｅ２６４４２）。このＩＬ−１５スーパーアゴニスト複合体（ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ）はＡＬＴ−８０３と称される。薬物動態解析により、該複合体は、マウスにおいてｉ．ｖ．投与後２５時間の半減期を有することが示された。ＡＬＴ−８０３は、免疫適格マウスの侵襲性の固形腫瘍モデル及び造血器腫瘍モデルに対して見事な抗腫瘍活性を示す。これは、単独療法として週２回又は毎週のｉ．ｖ．投薬レジメンを用いて投与してもよく、抗体との併用療法薬として投与してもよい。また、ＡＬＴ−８０３の抗腫瘍応答は永続的である。また、ＡＬＴ−８０３での処置後に治癒した腫瘍担持マウスは、同じ腫瘍細胞での再負荷刺激に対して高度に耐性であり、ＡＬＴ−８０３が、再導入された腫瘍細胞に対して有効な免疫学的記憶応答を誘導することが示された。
【００７７】
インターロイキン−１５
インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）は、エフェクターＮＫ細胞及びＣＤ８＋記憶Ｔ細胞の発生、増殖及び活性化のための重要なサイトカインである。ＩＬ−１５はＩＬ−１５受容体α（ＩＬ−１５Ｒα）に結合し、エフェクター細胞上のＩＬ−２／ＩＬ−１５受容体β−共通γ鎖（ＩＬ−１５Ｒβγｃ）複合体に対してトランス型で提示される。ＩＬ−１５とＩＬ−２はＩＬ−１５Ｒβγｃに対する結合を共有しており、ＳＴＡＴ３経路及びＳＴＡＴ５経路を介してシグナル伝達する。しかしながら、ＩＬ−２はまた、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋  制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の維持も補助し、活性化ＣＤ８＋  Ｔ細胞の細胞死を誘導する。このような効果は、腫瘍に対するＩＬ−２の治療活性を制限し得る。ＩＬ−１５は、このような免疫抑制活性をＩＬ−２と共有していない。さらに、ＩＬ−１５は、エフェクターＣＤ８＋  Ｔ細胞に抗アポトーシスシグナル伝達をもたらすことが知られている唯一のサイトカインである。ＩＬ−１５は単独又はＩＬ−１５Ｒαとの複合体のいずれかで投与すると、実験動物モデルにおいて、充分に確立された固形腫瘍に対して強力な抗腫瘍活性を示し、したがって、潜在的に癌を治癒し得る将来最も有望な免疫療法薬の１つであると認定されている。
【００７８】
ＩＬ−１５ベース癌治療薬の臨床開発を助長するため、ＩＬ−１５と比べて増大した生物活性を有するＩＬ−１５変異型（ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ）が同定された（Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１８３：３５９８−３６０７，２００９）。このＩＬ−１５スーパーアゴニスト（ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ）の薬物動態及び生物活性は、ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ融合複合体（ＡＬＴ−８０３）の作出により、該スーパーアゴニスト複合体がインビボで天然サイトカインの少なくとも２５倍の活性を有するようにさらに改善された（Ｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，５６：８０４−８１０，２０１１）。
【００７９】
Ｆｃドメイン
ＡＬＴ−８０３は、ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ融合複合体を含むものである。ＩｇＧのＦｃ領域と別のタンパク質（種々のサイトカイン及び可溶性受容体など）のドメインを合わせた融合タンパク質が報告されている（例えば、Ｃａｐｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３７：５２５−５３１，１９８９；Ｃｈａｍｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１４：５２−６０，１９９６）；米国特許第５，１１６，９６４号及び同第５，５４１，０８７号を参照のこと）。このプロトタイプの融合タンパク質は、ＩｇＧ  Ｆｃのヒンジ領域内のシステイン残基によって連結され、重鎖の可変ドメインとＣＨ１ドメイン及び軽鎖がないＩｇＧ分子と同様の分子になっているホモダイマータンパク質である。Ｆｃドメインを含む融合タンパク質のダイマー型の性質は、他の分子との高次相互作用（すなわち、二価結合又は二重特異性結合）をもたらすのに好都合であり得る。構造的相同性のため、Ｆｃ融合タンパク質は、同様のアイソタイプを有するヒトＩｇＧのものと同等のインビボ薬物動態プロフィールを示す。免疫グロブリンの中でもＩｇＧクラスは、ヒト血液中に最も多いタンパク質であり、その循環半減期は２１日間という長いものであり得る。ＩＬ−１５若しくはＩＬ−１５融合タンパク質の循環半減期を長くするため、及び／又はその生物活性を高めるため、ヒト重鎖ＩｇＧタンパク質のＦｃ部分と共有結合させたＩＬ−１５ＲαＳｕと非共有結合させたＩＬ−１５ドメインを含有する融合タンパク質複合体が作製された（例えば、ＡＬＴ−８０３）。
【００８０】
用語「Ｆｃ」は、抗体の非抗原結合断片をいう。かかる「Ｆｃ」は、モノマー型形態であってもポリマー型形態であってもよい。天然Ｆｃの元の免疫グロブリン供給源は、好ましくはヒト起源のものであり、任意の免疫グロブリンであってよいが、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２が好ましい。天然Ｆｃは、共有結合（すなわち、ジスルフィド結合）及び非共有結合によって連結されてダイマー型形態又はポリマー型形態になったものであり得るモノマー型ポリペプチドで構成されている。天然Ｆｃ分子のモノマーサブユニット間の分子間ジスルフィド結合の数は、クラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ）又はサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＡ１、ＩｇＧＡ２）にもよるが１〜４の範囲である。天然Ｆｃの一例はＩｇＧのパパイン消化により得られるジスルフィド結合型ダイマーである（Ｅｌｌｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１０：４０７１−９参照）。用語「天然Ｆｃ」は、本明細書で用いる場合、モノマー型形態、ダイマー型形態及びポリマー型形態に対する総称である。Ｆｃドメインは、プロテインＡ、プロテインＧ、種々のＦｃ受容体及び相補的タンパク質に対する結合部位を含有している。
【００８１】
一部の実施形態では、用語「Ｆｃ変異体」は、天然Ｆｃから修飾されているが、依然としてサルベージ受容体ＦｃＲｎに対する結合部位を含んでいる分子又は配列をいう。国際特許出願ＷＯ９７／３４６３１（１９９７年９月２５日公開）及びＷＯ９６／３２４７８には、例示的なＦｃ変異体並びにサルベージ受容体との相互作用が記載されており、引用により本明細書に組み込まれる。したがって、用語「Ｆｃ変異体」は、非ヒト天然Ｆｃをヒト化した分子又は配列を含む。さらに、天然Ｆｃは、本発明の融合分子に必要とされない構造的特色又は生物活性をもたらすため除去してもよい部位を含むものである。したがって、一部の特定の実施形態では、用語「Ｆｃ変異体」は、（１）ジスルフィド結合の形成、（２）選択された宿主細胞との不適合、（３）選択された宿主細胞内での発現時におけるＮ末端不均一性、（４）グリコシル化、（５）補体との相互作用、（６）サルベージ受容体以外のＦｃ受容体との結合、（７）抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、又は（８）抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）に影響を及ぼすか、又はこれらに関与している天然Ｆｃの１つ以上の部位又は残基が欠失している分子又は配列を含む。Ｆｃ変異体を、本明細書において以下にさらに詳細に記載する。
【００８２】
用語「Ｆｃドメイン」は、上記のように、天然Ｆｃ及びＦｃ変異体の分子及び配列を包含している。Ｆｃ変異体及び天然Ｆｃの場合と同様、用語「Ｆｃドメイン」は、完全体の抗体を消化したものであれ、組換え遺伝子発現又は他の手段によって作製したものであれ、モノマー型形態又はポリマー型形態の分子を包含している。
【００８３】
融合タンパク質複合体
本発明によりＡＬＴ−８０３を提供し、これはＩＬ−１５Ｎ７２ＤとＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ間のタンパク質複合体である。一部の特定の実施形態では、ＡＬＴ−８０３ポリペプチドは、他のタンパク質ドメインとの融合のための骨格としての機能を果たし得る。かかる融合タンパク質複合体では、第１の融合タンパク質が、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）又はその機能性断片と共有結合させた第１の生物活性ポリペプチドを含むものであり；第２の融合タンパク質が、可溶性インターロイキン−１５受容体アルファ（ＩＬ−１５Ｒα）ポリペプチド又はその機能性断片と共有結合させた第２の生物活性ポリペプチドを含むものであり、第１の融合タンパク質のＩＬ−１５ドメインを第２の融合タンパク質の可溶性ＩＬ−１５Ｒαドメインと結合させて可溶性融合タンパク質複合体が形成されている。また、本発明の融合タンパク質複合体は、第１及び第２の融合タンパク質の一方又は両方と連結させた免疫グロブリンのＦｃドメイン又はその機能性断片も含んでいる。好ましくは、第１と第２の融合タンパク質と連結させたＦｃドメインが相互作用して融合タンパク質複合体を形成したものである。かかる複合体は、免疫グロブリンのＦｃドメイン間でのジスルフィド結合の形成によって安定化され得る。一部の特定の実施形態では、本発明の可溶性融合タンパク質複合体は、ＩＬ−１５ポリペプチド、ＩＬ−１５変異体又はその機能性断片と可溶性ＩＬ−１５Ｒαポリペプチド又はその機能性断片を含み、ＩＬ−１５及びＩＬ−１５Ｒαポリペプチドの一方又は両方がさらに、免疫グロブリンＦｃドメイン又はその機能性断片を含むものである。
【００８４】
さらなる一実施形態では、第１及び第２の生物活性ポリペプチドの一方又は両方が抗体又はその機能性断片を含むものである。
【００８５】
別の実施形態では、抗体ドメインの対象の抗原が細胞表面受容体又はリガンドを含む。
【００８６】
さらなる一実施形態では、抗原は、ＣＤ抗原、サイトカイン若しくはケモカイン受容体若しくはリガンド、成長因子受容体若しくはリガンド、組織因子、細胞接着分子、ＭＨＣ／ＭＨＣ様分子、Ｆｃ受容体、Ｔｏｌｌ様受容体、ＮＫ受容体、ＴＣＲ、ＢＣＲ、正／負の補助刺激受容体若しくはリガンド、デス受容体若しくはリガンド、腫瘍関連抗原又はウイルスコード抗原を含む。
【００８７】
本明細書で用いる場合、用語「生物活性ポリペプチド」又は「エフェクター分子」は、本明細書において論考した所望の効果をもたらし得るアミノ酸配列、例えば、タンパク質、ポリペプチド又はペプチド；糖質又は多糖；脂質又は糖脂質、糖タンパク質又はリポタンパク質を意図する。また、エフェクター分子には化学薬品も包含される。また、生物活性な、又はエフェクターのタンパク質、ポリペプチド又はペプチドをコードしているエフェクター分子核酸も想定される。したがって、好適な該分子としては、調節因子、酵素、抗体又は薬物並びにＤＮＡ、ＲＮＡ及びオリゴヌクレオチドが挙げられる。生物活性ポリペプチド又はエフェクター分子は天然に存在するものであってもよく、既知の成分から、例えば、組換え合成又は化学合成によって合成されるものであってもよく、非相同成分を含むものであってもよい。生物活性ポリペプチド又はエフェクター分子は一般的に、標準的な分子サイズ計測手法（遠心分離又はＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動など）によって判定したとき、約０．１〜１００ＫＤ又はそれより大きく約１０００ＫＤまで、好ましくは約０．１、０．２、０．５、１、２、５、１０、２０、３０〜５０ＫＤである。本発明の所望の効果としては限定されないが、例えば、増大した結合活性を有する本発明の融合タンパク質複合体の形成、標的細胞の死滅（例えば、細胞増殖若しくは細胞死を誘導するため、疾患の予防若しくは処置において免疫応答を起こすため、又は診断目的のための検出分子としての機能を果たすためのいずれかのため）が挙げられる。かかる検出には、アッセイ、例えば、細胞を培養して増殖させる逐次工程を含むアッセイが使用され得る。
【００８８】
エフェクター分子と本発明の融合タンパク質複合体との本発明による共有結合により、いくつかの大きな利点がもたらされる。単一のエフェクター分子、例えば既知構造のかかるペプチドを含む本発明の融合タンパク質複合体を作製することができる。さらに、多種多様なエフェクター分子を同様のＤＮＡベクターで作製することができる。すなわち、種々のエフェクター分子のライブラリーを感染細胞又は疾患細胞の認識のための該融合タンパク質複合体と連結させることができる。さらに、治療用途では、本発明の融合タンパク質複合体を被験体に投与するのではなく、該融合タンパク質複合体をコードしているＤＮＡ発現ベクターを投与し、該融合タンパク質複合体をインビボで発現させることができる。かかるアプローチにより、組換えタンパク質の調製に典型的に付随する費用のかかる精製工程が回避され、慣用的なアプローチに付随する抗原の取込み及びプロセッシングの複雑さが回避される。
【００８９】
記載のように、本明細書に開示の融合タンパク質の成分と抗体、例えば、エフェクター分子コンジュゲート、例えば、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、タンパク質毒素、免疫グロブリンドメイン又は他の生理活性分子及び任意のペプチドリンカーは、ほぼ任意の様式で組織化され得るが、該融合タンパク質又は抗体は意図された機能を有しているものとする。特に、該融合タンパク質の各成分は、所望により、別の成分と少なくとも１つの適切なペプチドリンカー配列によって隔離されていてもよい。さらに、該融合タンパク質は、例えば、該融合タンパク質の修飾、識別及び／又は精製を容易にするためのタグを含むものであってもよい。
【００９０】
治療用医薬品
本発明により、治療薬としての使用のためのＡＬＴ−８０３を含む医薬組成物を提供する。一態様において、ＡＬＴ−８０３は、例えば、薬学的に許容され得るバッファー、例えば生理食塩水で製剤化して全身投与される。好ましい投与経路としては、例えば、連続的持続レベルの該組成物を患者にもたらす膀胱内への点滴、皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内又は皮内注射が挙げられる。ヒト患者又は他の動物の処置は、治療有効量の本明細書において確認される治療薬を生理学的に許容され得る担体に含めて用いて行われる。好適な担体及びその製剤は、例えば、Ｅ．Ｗ．ＭａｒｔｉｎによるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓに記載されている。投与される治療用薬剤の量は、投与様式、患者の年齢及び体重、並びに新生物又は感染の臨床症状に応じて異なる。一般的に、該量は、新生物又は感染と関連している他の疾患の処置に使用される他の薬剤で使用されるものの範囲内であるが、一部の特定の場合では、該化合物の高い特異性のため、必要とされる量はより少ない。該化合物は、被験体の免疫応答を増強させる投薬量で、又は当業者に知られた方法によって測定される新生物細胞の増殖、生存若しくは浸潤性が低減される投薬量で投与される。或いはまた、該化合物は、対象のウイルス又は他の病原体による感染が低減される投薬量で投与される。
【００９１】
医薬組成物の配合
新生物又は感染の処置ためのＡＬＴ−８０３の投与は、他の成分と併せて新生物又は感染の改善、低減又は安定化に有効な濃度の該治療薬がもたらされる任意の適切な手段によるものであり得る。ＡＬＴ−８０３は、任意の適切な量で任意の適切な担体物質中に含有され得、一般的に、組成物の総重量の１〜９５重量％の量で存在させる。該組成物は、非経口（例えば、皮下、静脈内、筋肉内、膀胱内又は腹腔内）投与経路に適した投薬形態で提供され得る。医薬組成物は慣用的な製薬実務に従って製剤化され得る（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（第２０版），Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，２０００並びにＥｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｊ．Ｓｗａｒｂｒｉｃｋ及びＪ．Ｃ．Ｂｏｙｌａｎ編，１９８８−１９９９，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照のこと）。
【００９２】
ヒトの投薬量は、ヒトに対する投薬量を動物モデルと比べて加減することは当業者が当該技術分野において常套的と認識しているため、まず、マウス又は非ヒト霊長類に使用される該化合物の量から外挿することにより決定され得る。一部の特定の実施形態では、投薬量は、約０．１μｇの化合物／ｋｇ体重〜約５０００μｇの化合物／ｋｇ体重；又は約１μｇ／ｋｇ体重〜約４０００μｇ／ｋｇ体重又は約１０μｇ／ｋｇ体重〜約３０００μｇ／ｋｇ体重の間で異なり得ることが想定される。他の実施形態では、この用量は約０．１、０．３、０．５、１、３、５、１０、２５、５０、７５、１００、１５０，２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１２５０、１３００、１３５０、１４００、１４５０、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００，２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００又は５０００μｇ／ｋｇ体重であり得る。他の実施形態では、用量は約０．５μｇの化合物／ｋｇ体重〜約２０μｇの化合物／ｋｇ体重の範囲内であり得ることが予想される。他の実施形態では、用量は約０．５、１、３、６、１０又は２０ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。もちろん、この投薬量は、かかる処置プロトコルにおいて常套的に行われるように、最初の臨床試験の結果及び具体的な患者のニーズに応じて上方又は下方に調整され得る。
【００９３】
具体的な実施形態では、ＡＬＴ−８０３は、非経口投与に適した賦形剤に含めて製剤化される。具体的な実施形態では、ＡＬＴ−８０３は、０．５μｇ／ｋｇ〜約１５μｇ／ｋｇ（例えば、０．５、１、３、５、１０又は１５μｇ／ｋｇ）で投与される。
【００９４】
膀胱癌の処置には、ＡＬＴ−８０３は、点滴によって膀胱内に投与される。点滴の方法は知られている。例えば、Ｌａｗｒｅｎｃｉａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ８，７６０−８（２００１）；Ｎｏｇａｗａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １１５，９７８−８５（２００５）；Ｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ３９１，３０４−１３  ２００５；Ｔｙａｇｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｕｒｏｌ  １７１，４８３−９（２００４）；Ｔｒｅｖｉｓａｎｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ  ３０９，１１６７−７３（２００４）；Ｔｒｅｖｉｓａｎｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ５，５４６−５１（２００２））；（Ｓｅｇａｌ，ｅｔ  ａｌ．，１９７５）。（Ｄｙｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，２００５）。（Ｂａｔｉｓｔａ，ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｄｙｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，２００５）を参照のこと。一部の特定の実施形態では、点滴用のＡＬＴ−８０３投薬量は約５〜１０００μｇ／投薬（ｄｏｓｅ）の間で異なり得ることが想定される。他の実施形態では、膀胱内用量は約２５、５０、１００，２００又は４００μｇ／投薬であり得る。他の実施形態では、ＡＬＴ−８０３は、点滴によって膀胱内に、標準治療薬、例えばマイトマイシンＣ又はカルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）と併用して投与される。
【００９５】
医薬組成物は、適切な賦形剤を用いて医薬組成物に製剤化され、投与されると、該治療薬を制御様式で放出する。例としては、単一の単位又は複数単位の錠剤又はカプセル剤組成物、油性の液剤、懸濁剤、乳剤、マイクロカプセル、マイクロスフィア、分子複合体、ナノ粒子、貼付剤及びリポソームが挙げられる。
【００９６】
非経口用組成物
ＡＬＴ−８０３を含む医薬組成物は、注射、輸注又は埋込み（皮下、静脈内、筋肉内、膀胱内、腹腔内など）により、慣用的な無毒性の薬学的に許容され得る担体及びアジュバントを含有している投薬形態、製剤で、又は適切な送達デバイス若しくは埋入物によって非経口投与され得る。かかる組成物の製剤化及び調製は医薬品製剤化の当業者によく知られている。製剤化は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（上掲）において知得され得る。
【００９７】
非経口使用のためのＡＬＴ−８０３を含む組成物は、単位投薬形態（例えば、単回用量のアンプル、シリンジ若しくはバッグ）で、又は数回用量を含有しており、適切な保存料が添加され得る（下記参照）バイアルで提供され得る。該組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、輸注デバイス若しくは埋込み用送達デバイスの形態であり得るか、又は使用直前に水若しくは別の適切なビヒクルで再構成するための乾燥粉末として提示され得る。新生物又は感染を低減又は改善するための活性薬剤以外に、該組成物には、非経口に許容され得る適切な担体及び／又は賦形剤が含められ得る。治療用活性薬剤（１種類又は複数種）を、制御放出のためにマイクロスフィア、マイクロカプセル、ナノ粒子、リポソームなどに組み込んでもよい。さらに、該組成物には懸濁化剤、可溶化剤、安定化剤、ｐＨ調整剤、張度調整剤及び／又は分散化剤が含められ得る。
【００９８】
上記のように、ＡＬＴ−８０３を含む医薬組成物は、滅菌注射に適した形態であり得る。かかる組成物を調製するため、適切な抗新生物／抗感染活性治療薬（１種類又は複数種）を非経口に許容され得る液状ビヒクルに溶解又は懸濁させる。中でも、使用され得る許容され得るビヒクル及び溶媒は水、適切な量の塩酸、水酸化ナトリウム又は適切なバッファーの添加によって適切なｐＨに調整された水、１，３−ブタンジオール、リンゲル液、及び等張性塩化ナトリウムブドウ糖液である。また、水性製剤には、１種類以上の保存料（例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチル、エチル又はｎ−プロピル）が含有され得る。化合物のうちの１種類が水に溶けにくいか、又はわずかしか溶けない場合、溶解向上剤若しくは可溶化剤が添加され得るか、又は溶媒に１０〜６０％ｗ／ｗのプロピレングリコールなどが含められ得る。
【００９９】
本発明により、本明細書における処方の化合物を含む治療有効量の医薬組成物を被験体（例えば、ヒトなどの哺乳動物）に投与することを含む、新生物性又は感染性の疾患及び／又は障害或いはその症状の処置方法を提供する。したがって、一実施形態は、新生物性又は感染性の疾患又は障害或いはその症状に苦しんでいるか、又は易罹患性の被験体の処置方法である。該方法は、哺乳動物に、疾患又は障害或いはその症状が処置されるのに充分な量である治療量の本明細書における化合物を、該疾患又は障害が処置されるような条件下で投与する工程を含むものである。
【０１００】
本明細書における方法は、被験体（例えば、かかる処置を必要とすると認定された被験体）に、本明細書に記載の化合物又は本明細書に記載の組成物を、かかる効果がもたらされるのに有効な量で投与することを含むものである。かかる処置を必要とする被験体の認定は、被験体又は保険医療の専門家の判断によるものであってもよく、主観的（例えば、意見）又は客観的（例えば、試験若しくは診断法によって測定可能なもの）であってもよい。
【０１０１】
本発明の治療方法（これは予防的処置を包含している）は一般に、治療有効量の本明細書における化合物、例えば、本明細書における処方の化合物を、これを必要とする被験体（例えば、動物、ヒト）、例えば哺乳動物、特にヒトに投与することを含むものである。かかる処置は、新生物性又は感染性の疾患、障害又はその症状に苦しんでいるか、有するか、易罹患性であるか、又はリスクのある被験体、特にヒトに適切に投与される。「リスクのある」被験体の判定は、診断試験又は被験体若しくは保険医療提供者の意見（例えば、遺伝子検査、酵素若しくはタンパク質マーカー、（本明細書において定義される）マーカー、家族歴など）による任意の客観的又は主観的判定によって行われ得る。ＡＬＴ−８０３は、免疫応答の増大が所望される任意の他の障害の処置に使用され得る。
【０１０２】
一実施形態では、本発明により、処置の進行のモニタリング方法を提供する。該方法は、診断用マーカー（マーカー）（例えば、本明細書における化合物によってモジュレートされる本明細書に記載した任意の標的、タンパク質若しくはそのインジケータなど）のレベル又は診断測定値（例えば、スクリーニング、アッセイ）を、新生物又は感染と関連している障害又はその症状に苦しんでいるか、又は易罹患性の被験体において測定する工程を含むものであり、ここで、該被験体には、該疾患又はその症状が処置されるのに充分な治療量の本明細書における化合物が投与されている。該方法において測定されたマーカーレベルは正常な健常対照又は他の罹患患者のいずれかの既知のマーカーレベルと比較され、被験体の疾患状態が確立され得る。好ましい実施形態では、被験体の第２のマーカーレベルを最初のレベルの測定よりも後の時点で測定し、この２つのレベルを比較して疾患過程又は治療の有効性をモニタリングする。一部の特定の好ましい実施形態では、被験体の処置前のマーカーレベルを本発明による処置の開始前に測定し；次いで、この処置前のマーカーレベルが処置の開始後の被験体のマーカーレベルと比較され、処置の有効性が判定され得る。
【０１０３】
併用療法
好ましくは、ＡＬＴ−８０３は、抗新生物治療薬又は抗感染治療薬、例えば抗体、例えば、腫瘍特異的抗体又は免疫チェックポイント阻害薬と併用して投与される。抗体とＡＬＴ−８０３は同時に投与しても逐次投与してもよい。一部の実施形態では、抗体での処置は該疾患の適応症に確立された治療であり、この抗体レジメンにＡＬＴ−８０３での処置を加えることにより、患者に対する治療上の有益性が改善される。かかる改善は、個々の患者ベースでの応答の増大又は患者集団における応答の増大として測定され得る。また、併用療法により、より低用量又はより低頻度での用量の抗体で改善された応答がもたらされ、耐容性がより良好な処置レジメンがもたらされ得る。記載のように、ＡＬＴ−８０３と抗体の併用療法により、種々の機構、例えば、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ及び／又はＮＫ細胞、Ｔ細胞、好中球若しくは単核球細胞レベル或いは免疫応答の増大によって臨床的活性の増強がもたらされ得る。
【０１０４】
所望により、ＡＬＴ−８０３は、任意の慣用的な治療、例えば限定されないが、手術、放射線療法、化学療法、タンパク質ベース治療又は生物製剤療法と併用して投与される。化学療法薬としては、アルキル化剤（例えば、白金ベース薬、テトラジン、アジリジン、ニトロソウレア、ナイトロジェンマスタード）、代謝拮抗薬（例えば、抗葉酸薬、フルオロピリミジン、デオキシヌクレオシドアナログ、チオプリン）、微小管阻害剤（例えば、ビンカアルカロイド、タキサン）、トポイソメラーゼ阻害薬（例えば、トポイソメラーゼＩ及びＩＩ阻害薬）、細胞傷害性抗生物質（例えば、アントラサイクリン）並びに免疫調節薬（例えば、サリドマイド及びアナログ）が挙げられる。
【０１０５】
キット又は医薬品システム
ＡＬＴ−８０３を含む医薬組成物を新生物又は感染の処置における使用のためのキット又は医薬品システムに一体化してもよい。本発明のこの態様によるキット又は医薬品システムは、内部に１つ以上の容器、例えばバイアル、チューブ、アンプル、ボトル、シリンジ又はバッグが密封されている持ち運び手段、例えば、ボックス、カートン、チューブを備えたものである。また、本発明のキット又は医薬品システムは、ＡＬＴ−８０３の使用のための使用説明書を付随して備えていてもよい。
【０１０６】
組換えタンパク質発現
一般に、本発明の融合タンパク質複合体（例えば、ＡＬＴ−８０３の成分）の調製は、本明細書に開示した手順及び認知されている組換えＤＮＡ手法によって行われ得る。
【０１０７】
一般に、組換えポリペプチドは、適切な宿主細胞を、適切な発現媒体内のポリペプチドコード核酸分子又はその断片の全部又は一部で形質転換することによって作製される。分子生物学の分野の当業者には、組換えタンパク質を得るために多種多様な任意の発現系が使用され得ることが理解されよう。使用される厳密な宿主細胞は本発明に重要ではない。組換えポリペプチドは、事実上任意の真核生物宿主（例えば、出芽酵母、昆虫細胞、例えばＳｆ２１細胞、又は哺乳動物細胞、例えば、ＮＩＨ  ３Ｔ３、ＨｅＬａ、ＣＯＳ若しくは好ましくはＣＨＯ細胞）において作製され得る。かかる細胞は広範な供給元（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｌａｎｄ，Ｍｄ．；また、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，１９９７も参照のこと）から入手可能である。トランスフェクションの方法及び発現媒体の選択は選択される宿主系に依存する。形質転換方法は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（上掲）に記載されている；発現媒体は、例えば、Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｐ．Ｈ．Ｐｏｕｗｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，追補１９８７）に示されたものから選択され得る。
【０１０８】
組換えポリペプチドの作製のための発現系には、さまざまなものが存在する。かかるポリペプチドの作製に有用な発現ベクターとしては、限定されないが、染色体、エピソーム及びウイルス由来のベクター、例えば、細菌のプラスミド、バクテリオファージ、トランスポゾン、酵母エピソーム、挿入エレメント、酵母染色体エレメント、ウイルス、例えばバキュロウイルス、パポバウイルス、例えばＳＶ４０、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス及びレトロウイルスに由来するベクター、並びにその組み合わせに由来するベクターが挙げられる。
【０１０９】
組換えポリペプチドが発現されたら、これは、例えば、アフィニティクロマトグラフィーを用いて単離される。一例では、該ポリペプチドに対して生じる抗体（例えば、本明細書に記載のようにして作製される）をカラムに結合させ、組換えポリペプチドを単離するために使用され得る。アフィニティクロマトグラフィーの前のポリペプチド含有細胞の溶解及び分別は標準的な方法によって行われ得る（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（上掲）を参照のこと）。単離されたら、組換えタンパク質を所望により、例えば、高速液体クロマトグラフィーによってさらに精製してもよい（例えば、Ｆｉｓｈｅｒ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｏｒｋ及びＢｕｒｄｏｎ編，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，１９８０を参照のこと）。
【０１１０】
本明細書で用いる場合、本発明の生物活性ポリペプチド又はエフェクター分子には、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、タンパク質毒素、免疫グロブリンドメイン又は他の生物活性タンパク質（酵素など）などの因子が包含され得る。また、生物活性ポリペプチドには、他の化合物とのコンジュゲート、例えば、非タンパク質毒素、細胞傷害剤、化学療法剤、検出可能な標識、放射性物質などとのコンジュゲートも包含され得る。
【０１１１】
本発明のサイトカインは、細胞によって産生される因子であって、他の細胞に影響を及ぼし、細胞性免疫のいくつかの多重効果の任意の効果を担う任意の因子と定義する。サイトカインの例としては、限定されないが、ＩＬ−２ファミリー、インターフェロン（ＩＦＮ）、ＩＬ−１０、ＩＬ−１、ＩＬ−１７、ＴＧＦ及びＴＮＦサイトカインファミリー、及び、ＩＬ−１〜ＩＬ−３５、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＴＧＦ−β、ＴＮＦ−α及びＴＮＦ−βが挙げられる。
【０１１２】
本発明の一態様において、第１の融合タンパク質は、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）ドメイン又はその機能性断片と共有結合させた第１の生物活性ポリペプチドを含むものである。ＩＬ−１５は、Ｔ細胞の活性化と増殖に影響を及ぼすサイトカインである。免疫細胞の活性化と増殖への影響におけるＩＬ−１５活性は、いくつかの点でＩＬ−２と同様であるが、根本的な違いが充分に特性評価されている（Ｗａｌｄｍａｎｎ，Ｔ  Ａ，２００６，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５９５−６０１）。
【０１１３】
本発明の別の態様では、第１の融合タンパク質は、ＩＬ−１５変異体（本明細書においてＩＬ−１５変異型とも称する）であるインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）ドメインを含むものである。ＩＬ−１５変異体は好ましくは、天然（又は野生型）ＩＬ−１５タンパク質とは異なるアミノ酸配列を含むものである。ＩＬ−１５変異体は好ましくは、ＩＬ−１５Ｒαポリペプチドに結合し、ＩＬ−１５のアゴニスト又はアンタゴニストとしての機能を果たすものである。好ましくは、アゴニスト活性を有するＩＬ−１５変異体はスーパーアゴニスト活性を有するものである。一部の実施形態では、ＩＬ−１５変異体は、ＩＬ−１５Ｒαとの結合に関係なくＩＬ−１５のアゴニスト又はアンタゴニストとしての機能を果たし得るものである。ＩＬ−１５アゴニストは、野生型ＩＬ−１５と比べて同等又は高い生物活性のものが例示される。ＩＬ−１５アンタゴニストは、野生型ＩＬ−１５と比べて低い生物活性のもの、又はＩＬ−１５媒介性応答の阻害能があるものが例示される。一部の例では、ＩＬ−１５変異体はＩＬ−１５ＲβγＣ受容体に対して、高活性又は低活性で結合するものである。一部の実施形態では、ＩＬ−１５変異体の配列は、天然ＩＬ−１５の配列と比べて少なくとも１個のアミノ酸の変化、例えば、置換又は欠失を有し、かかる変化によりＩＬ−１５のアゴニスト又はアンタゴニスト活性がもたらされる。好ましくは、該アミノ酸の置換／欠失は、ＩＬ−１５Ｒβ及び／又はγＣと相互作用するＩＬ−１５ドメイン内に存在する。より好ましくは、該アミノ酸の置換／欠失は、ＩＬ−１５Ｒαポリペプチドとの結合又はＩＬ−１５変異体の産生能に影響しないものである。ＩＬ−１５変異体を作製するのに好適なアミノ酸の置換／欠失は、ＩＬ−１５の推定又は既知構造、ＩＬ−１５と既知構造の相同な分子（ＩＬ−２など）との比較に基づいて、合理的若しくはランダム変異誘発及び機能アッセイ（本明細書に示しているような）、又は他の経験的方法によって特定され得る。さらに、好適なアミノ酸置換は、同類又は非同類置換及びさらなるアミノ酸の挿入であり得る。好ましくは、本発明のＩＬ−１５変異体は、１個又は１個より多くのアミノ酸の置換／欠失をヒト成熟ＩＬ−１５配列の６、８、１０、６１、６５、７２、９２、１０１、１０４、１０５、１０８、１０９、１１１又は１１２位に含有するものである；特に、Ｄ８Ｎ（「Ｄ８」は、天然のヒト成熟ＩＬ−１５配列内のアミノ酸と残基の位置を示し、「Ｎ」は、ＩＬ−１５変異体内のその位置の置換されたアミノ酸残基を示す）、Ｉ６Ｓ、Ｄ８Ａ、Ｄ６１Ａ、Ｎ６５Ａ、Ｎ７２Ｒ、Ｖ１０４Ｐ又はＱ１０８Ａ置換により、アンタゴニスト活性を有するＩＬ−１５変異体がもたらされ、Ｎ７２Ｄ置換により、アゴニスト活性を有するＩＬ−１５変異体がもたらされる。
【０１１４】
ケモカインは、サイトカインと同様、他の細胞に曝露されたとき細胞性免疫のいくつかの多重効果の任意の効果を担う任意の化学物質の因子又は分子と定義する。好適なケモカインとしては、限定されないが、ＣＸＣ、ＣＣ、Ｃ及びＣＸ３Ｃケモカインファミリー、及び、ＣＣＬ−１〜ＣＣＬ−２８、ＣＸＣ−１〜ＣＸＣ−１７、ＸＣＬ−１、ＸＣＬ−２、ＣＸ３ＣＬ１、ＭＩＰ−１ｂ、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１、及び、Ｒａｎｔｅｓが挙げられ得る。
【０１１５】
成長因子としては、特定の細胞に曝露されると影響を及ぼす対象の細胞の増殖及び／又は分化を誘発する任意の分子が包含される。成長因子にはタンパク質分子及び化学物質分子が包含され、一例としては、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ヒト成長因子及び幹細胞成長因子が挙げられる。さらなる成長因子もまた、本明細書に記載の使用に好適であり得る。
【０１１６】
毒素又は細胞傷害剤には、細胞に曝露されると成長に対して致死効果又は阻害効果を有する任意の物質が包含される。より具体的には、エフェクター分子は、例えば、植物起源又は細菌起源の細胞毒素、例えば、ジフテリア毒素（ＤＴ）、志賀毒素、アブリン、コレラ毒素、リシン、サポリン、シュードモナス外毒素（ＰＥ）、ヤマゴボウ（ｐｏｋｅｗｅｅｄ）抗ウイルスタンパク質、又はゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）などであり得る。かかる毒素の生物活性断片は、当該技術分野でよく知られており、例えばＤＴ  Ａ鎖及びリシンＡ鎖が挙げられる。さらに、毒素は、細胞表面で活性な薬剤、例えば、ホスホリパーゼ酵素（例えば、ホスホリパーゼＣ）などであってもよい。
【０１１７】
さらに、エフェクター分子は化学療法薬、例えば、ビンデシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、メトトレキサート、アドリアマイシン、ブレオマイシン又はシスプラチンなどであってもよい。
【０１１８】
さらに、エフェクター分子は、診断試験又はイメージング試験に適した検出可能に標識された分子であってもよい。かかる標識としては、ビオチン又はストレプトアビジン／アビジン、検出可能なナノ粒子又は結晶、酵素又はその触媒活性断片、蛍光標識、例えば、緑色蛍光タンパク質、ＦＩＴＣ、フィコエリトリン、シコム（ｃｙｃｈｏｍｅ）、テキサスレッド又は量子ドット、放射性核種、例えば、ヨウ素−１３１、イットリウム−９０、レニウム−１８８又はビスマス−２１２、リン光性若しくは化学発光性分子又はＰＥＴ、超音波若しくはＭＲＩによって検出可能な標識、例えば、Ｇｄ系若しくは常磁性金属イオン系造影剤が挙げられる。例えば、エフェクター又はタグを含むタンパク質の作製及び使用に関する開示については、Ｍｏｓｋａｕｇ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４，１５７０９（１９８９）；Ｐａｓｔａｎ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  ４７，６４１，１９８６；Ｐａｓｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｔｏｘｉｎｓ  ａｓ  Ｎｏｖｅｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１，３３１，（１９９２）；「Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ｔｏｘｉｎｓ」Ｏｌｓｎｅｓ  ａｎｄ  Ｐｈｉｌ，Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．，２５，３５５（１９８２）；公開ＰＣＴ出願ＷＯ９４／２９３５０号；公開ＰＣＴ出願ＷＯ９４／０４６８９号；公開ＰＣＴ出願ＷＯ２００５０４６４４９号及び米国特許第５，６２０，９３９号を参照のこと。
【０１１９】
共有結合により連結させたＩＬ−１５とＩＬ−１５Ｒαドメインを含むタンパク質融合体又はコンジュゲート複合体は、いくつかの重要な用途を有する。損傷又は死滅を受け易い細胞又は組織が本明細書に開示の方法によって容易にアッセイされ得る。
【０１２０】
本発明のＩＬ−１５及びＩＬ−１５Ｒαのポリペプチドは、アミノ酸配列が、天然に存在するＩＬ−１５及びＩＬ−１５Ｒαの分子、例えば、ヒト、マウス若しくは他の齧歯類又は他の哺乳動物のＩＬ−１５及びＩＬ−１５Ｒαの分子に相応に対応するものである。これらのポリペプチド及びコード核酸の配列、例えば、ヒトインターロイキン１５（ＩＬ１５）ｍＲＮＡ−−ＧｅｎＢａｎｋ：Ｕ１４４０７．１、ハツカネズミインターロイキン１５（ＩＬ１５）ｍＲＮＡ−−ＧｅｎＢａｎｋ：Ｕ１４３３２．１、ヒトインターロイキン−１５受容体アルファ鎖前駆体（ＩＬ１５ＲＡ）ｍＲＮＡ−−ＧｅｎＢａｎｋ：Ｕ３１６２８．１、ハツカネズミインターロイキン１５受容体，アルファ鎖−−ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＣ０９５９８２．１は、文献において知られている。
【０１２１】
一部の状況では、例えば、ｓｃ−ＴＣＲ又はｓｃ−抗体の結合価を高めるために、本発明のタンパク質融合体又はコンジュゲート複合体を多価にすることが有用であり得る。特に、該融合タンパク質複合体のＩＬ−１５ドメインとＩＬ−１５Ｒαドメイン間の相互作用により、多価複合体を生成させる手段がもたらされる。また、多価融合タンパク質は、共有結合又は非共有結合により１〜４個のタンパク質（同じ又は異なる）間を一体に、例えば、標準的なビオチン−ストレプトアビジン標識手法を使用することによって、又は適切な固相支持体（ラテックスビーズなど）とのコンジュゲーションによって連結させることによっても作製され得る。また、化学架橋タンパク質（例えば、ナノ粒子と架橋）も好適な多価種である。例えば、そのタンパク質は、修飾され得るタグ配列（ビオチン化ＢｉｒＡタグなど）又は化学反応性側鎖を有するアミノ酸残基（Ｃｙｓ若しくはＨｉｓなど）をコードしている配列を含めることにより修飾され得る。かかるアミノ酸タグ又は化学反応性アミノ酸は、該融合タンパク質又は抗体内のさまざまな位置に、好ましくは、生物活性ポリペプチド又はエフェクター分子の活性部位の遠位に配置され得る。例えば、可溶性融合タンパク質のＣ末端を、タグ又はかかる反応性アミノ酸（１個若しくは複数）を含む他の融合タンパク質と共有結合させ得る。２個以上の融合タンパク質を適切なナノ粒子に化学結合させるのに適切な側鎖を含めると多価分子が得られ得る。例示的なナノ粒子としては、デンドリマー、リポソーム、コア−シェル粒子又はＰＬＧＡベース粒子が挙げられる。
【０１２２】
本発明の別の実施形態では、融合タンパク質複合体のポリペプチドの一方又は両方が免疫グロブリンドメインを含むものである。或いはまた、タンパク質結合ドメイン−ＩＬ−１５融合タンパク質をさらに、免疫グロブリンドメインと連結させてもよい。好ましい免疫グロブリンドメインは、上記に示したような多重鎖タンパク質が形成されるように他の免疫グロブリンドメインとの相互作用が可能な領域を含むものである。例えば、免疫グロブリン重鎖領域、例えばＩｇＧ１  ＣＨ２−ＣＨ３は、安定的に相互作用してＦｃ領域を作出し得る。また、好ましい免疫グロブリンドメイン、例えばＦｃドメインは、エフェクター機能、例えばＦｃ受容体若しくは補体タンパク質結合活性を有する領域、及び／又はグリコシル化部位を有する領域を含むものである。一部の実施形態では、融合タンパク質複合体の免疫グロブリンドメインは、Ｆｃ受容体若しくは補体結合活性又はグリコシル化を低減又は増大させ、それにより、得られるタンパク質の生物活性に影響を及ぼす変異を含有するものである。例えば、Ｆｃ受容体との結合を低減させる変異を含有している免疫グロブリンドメインは、Ｆｃ受容体担持細胞に対する結合活性が低い本発明の融合タンパク質複合体を生成させるために使用され得、これは、特異的抗原を認識又は検出するために設計される試薬に好都合であり得る。
【０１２３】
核酸及びベクター
本発明により、さらに、本発明のタンパク質（例えば、ＡＬＴ−８０３の成分）をコードしている核酸配列、特にＤＮＡ配列を提供する。好ましくは、該ＤＮＡ配列を、染色体外複製に適合させたベクター、例えば、ファージ、ウイルス、プラスミド、ファージミド、コスミド、ＹＡＣ又はエピソームに担持させる。特に、所望の融合タンパク質をコードしているＤＮＡベクターは、本明細書に記載の調製方法を容易にするため、及び有意な量の融合タンパク質を得るために使用され得る。該ＤＮＡ配列を適切な発現ベクターに、すなわち、挿入したタンパク質コード配列の転写及び翻訳のために必要なエレメントを含むベクターに挿入してもよい。さまざまな宿主−ベクター系が、タンパク質コード配列を発現させるために使用され得る。このようなものとしては、ウイルス（例えば、ワクシニアウイルス、アデノウイルスなど）に感染させた哺乳動物細胞系；ウイルス（例えば、バキュロウイルス）に感染させた昆虫細胞系；微生物、例えば、酵母ベクターを含有している酵母、又はバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ若しくはコスミドＤＮＡで形質転換した細菌が挙げられる。使用される宿主−ベクター系に応じて、いくつかの適切な転写エレメント及び翻訳エレメントのうちのいずれか１つが使用され得る。Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（上掲）及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（上掲）を参照のこと。
【０１２４】
本発明には、可溶性融合タンパク質複合体の作製方法であって、宿主細胞に、第１及び第２の融合タンパク質をコードしている本明細書に記載のＤＮＡベクターを導入すること、該宿主細胞を培地中で、該融合タンパク質が該細胞内又は該培地中で発現され、第１の融合タンパク質のＩＬ−１５ドメインと第２の融合タンパク質の可溶性ＩＬ−１５Ｒαドメイン間の結合が可能になるのに充分な条件下で培養し、可溶性融合タンパク質複合体を形成させること、該可溶性融合タンパク質複合体を該宿主細胞又は培地から精製することを含む方法が包含される。
【０１２５】
一般に、本発明による好ましいＤＮＡベクターは、５’から３’の方向に、生物活性ポリペプチドをコードしている第１のヌクレオチド配列の導入のための第１のクローニング部位と、作動可能に連結されたエフェクター分子コード配列とを含み、これらがホスホジエステル結合によって連結されたヌクレオチド配列を含むものである。
【０１２６】
ＤＮＡベクターにコードさせる融合タンパク質成分をカセット形式で提供してもよい。用語「カセット」により、標準的な組換え法によって各成分を別の成分で容易に置き換えることができることを意図する。特に、カセット形式に構成したＤＮＡベクターは、コードされた融合複合体が、血清型を有する病原体又は血清型発現能を有する病原体に対して使用される場合、特に望ましい。
【０１２７】
融合タンパク質複合体をコードするベクターを作製するため、生物活性ポリペプチドをコードしている配列を、エフェクターペプチドをコードしている配列と、適切なリガーゼの使用によって連結させる。提示ペプチドをコードしているＤＮＡは、ＤＮＡを天然の供給源（適切な細胞株など）から単離すること、又は既知の合成方法（例えばリン酸トリエステル法）によって得られ得る。例えば、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編，１９８４）を参照のこと。また、合成オリゴヌクレオチドを、市販の自動オリゴヌクレオチド合成装置を用いて調製してもよい。単離したら、生物活性ポリペプチドをコードしている遺伝子を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）又は当該技術分野で知られた他の手段によって増幅させ得る。生物活性ポリペプチド遺伝子を増幅させるための好適なＰＣＲプライマーは、ＰＣＲ産物に制限部位を付与し得るものである。ＰＣＲ産物は好ましくは、エフェクターペプチドのスプライス部位と、生物活性ポリペプチド−エフェクター融合複合体の適正な発現及び分泌に必要なリーダー配列とを含むものである。また、ＰＣＲ産物は好ましくは、リンカー配列をコードしている配列、又はかかる配列のライゲーションのための制限酵素部位を含むものである。
【０１２８】
本明細書に記載の融合タンパク質は好ましくは、標準的な組換えＤＮＡ手法によって作製される。例えば、生物活性ポリペプチドをコードしているＤＮＡ分子を単離したら、この配列は、エフェクターポリペプチドをコードしている別のＤＮＡ分子にライゲートされ得る。生物活性ポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列は、エフェクターペプチドをコードしているＤＮＡ配列に直接連接させてもよく、より典型的には、本明細書において論考したリンカー配列をコードしているＤＮＡ配列を、生物活性ポリペプチドをコードしている配列とエフェクターペプチドをコードしている配列の間に介在させ、適切なリガーゼを用いて連接させてもよい。得られたハイブリッドＤＮＡ分子を適切な宿主細胞内で発現させると融合タンパク質複合体が産生され得る。ＤＮＡ分子は互いに５’から３’の向きに、ライゲーション後にコードポリペプチドの翻訳フレームが改変されない（すなわち、ＤＮＡ分子が互いにインフレームにライゲートされる）ようにライゲートされる。得られるＤＮＡ分子は、インフレーム融合タンパク質をコードしている。
【０１２９】
また、他のヌクレオチド配列を遺伝子構築物に含めてもよい。例えば、プロモーター配列（これは、エフェクターペプチドと融合させた生物活性ポリペプチドをコードしている配列の発現を制御する）又はリーダー配列（これは、融合タンパク質を細胞表面又は培養培地に指向させる）を、構築物内に含有させ得るか、又は該構築物を挿入する発現ベクター内に存在させ得る。免疫グロブリン又はＣＭＶのプロモーターが特に好ましい。
【０１３０】
変異体生物活性ポリペプチド、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒα又はＦｃドメインをコードしている配列を得る際に、当業者には、該ポリペプチドが特定のアミノ酸の置換、付加、欠失及び翻訳後修飾により、生物活性の減損又は低減を伴うことなく修飾され得ることが認識されよう。特に、同類アミノ酸置換、すなわち、１個のアミノ酸の、同様のサイズ、電荷、極性及びコンホメーションの別のアミノ酸との置換では、タンパク質機能が有意に改変されにくいことはよく知られている。タンパク質の構成成分である２０個の標準アミノ酸は、以下のような４つの同類アミノ酸グループに大別することができる。無極性（疎水性）のグループには、アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン及びバリンが含まれ、極性（無電荷，中性）グループには、アスパラギン、システイン、グルタミン、グリシン、セリン、トレオニン及びチロシンが含まれ、正電荷を有する（塩基性の）グループには、アルギニン、ヒスチジン及びリシンが含まれ、負電荷を有する（酸性の）グループには、アスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれる。タンパク質における同じグループ内での１個のアミノ酸の別のアミノ酸での置換が該タンパク質の生物活性に対して有害な効果を有することはありそうにない。他の場合では、タンパク質の生物活性を低下又は増強させるために、アミノ酸位置に修飾がなされ得る。かかる変更はランダムに導入してもよく、標的残基（１個又は複数）の既知の又は推定される構造的又は機能的特性に基づいた部位特異的変異によって導入してもよい。変異体タンパク質の発現後、修飾による生物活性の変化は、結合アッセイ又は機能アッセイを用いて容易に評価され得る。
【０１３１】
ヌクレオチド配列間の相同性はＤＮＡハイブリダイゼーション分析によって決定され得、このとき、二本鎖ＤＮＡハイブリッドの安定性は、生じる塩基対合の程度に依存する。高温及び／又は低塩含有量の条件は、ハイブリッドの安定性を低下させ、選択したものより低い相同性度合を有する配列のアニーリングが抑制されるように変更され得る。例えば、約５５％のＧ−Ｃ含有量を有する配列では、４０〜５０℃、６×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウムバッファー）及び０．１％のＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）のハイブリダイゼーション及び洗浄条件は約６０〜７０％の相同性を示し、５０〜６５℃、１×ＳＳＣ及び０．１％のＳＤＳのハイブリダイゼーション及び洗浄条件は約８２〜９７％の相同性を示し、５２℃、０．１×ＳＳＣ及び０．１％のＳＤＳのハイブリダイゼーション及び洗浄条件は約９９〜１００％の相同性を示す。また、ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を比較する（及び相同性の度合を測定する）ための広範なコンピュータプログラムが利用可能であり、市販のソフトウェア及び無料ソフトウェアの供給元を示すリストはともに、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）にみられる。配列比較及び多重配列アラインメントの容易に入手可能なアルゴリズムは、それぞれ、Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）及びＣｌｕｓｔａｌＷプログラムである。ＢＬＡＳＴはワールドワイドウェブのｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖにおいて入手可能であり、ＣｌｕｓｔａｌＷのバージョンは２．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋにおいて入手可能である。
【０１３２】
融合タンパク質の成分は、各々がその意図された機能を発揮し得る限り、ほぼ任意の順序で組織化され得る。例えば、一実施形態では、生物活性ポリペプチドはエフェクター分子のＣ又はＮ末端に配置される。
【０１３３】
本発明の好ましいエフェクター分子は、該ドメインに意図された機能を助長するサイズを有するものである。本発明のエフェクター分子は、さまざまな方法、例えば、よく知られた化学架橋によって作製され、生物活性ポリペプチドと融合され得る。例えば、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｈｏｌｄｅｎ−ＤａｙのＭｅａｎｓ，Ｇ．Ｅ．ａｎｄ  Ｆｅｅｎｅｙ，Ｒ．Ｅ．（１９７４）を参照のこと。また、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ，ＣＲＣ  ＰｒｅｓｓのＳ．Ｓ．Ｗｏｎｇ（１９９１）も参照のこと。しかしながら、一般的に、インフレーム融合タンパク質を作製するための組換え操作を使用することが好ましい。
【０１３４】
記載のように、本発明による融合分子又はコンジュゲート分子は、いくつかの様式で組織化され得る。例示的な構成の一例では、生物活性ポリペプチドのＣ末端を、エフェクター分子のＮ末端と作動可能に連結させる。この連結は、所望により、組換え法によって行われ得る。しかしながら、別の構成では、生物活性ポリペプチドのＮ末端を、エフェクター分子のＣ末端と連結させる。
【０１３５】
代替的又は付加的に、必要に応じて１個以上のさらなるエフェクター分子を生物活性ポリペプチド又はコンジュゲート複合体内に挿入してもよい。
【０１３６】
ベクター及び発現
ＡＬＴ−８０３を発現させるために、いくつかのストラテジーが使用され得る。例えば、ＡＬＴ−８０３をコードしている構築物が適切なベクター内に、該ベクター内に該構築物を挿入した後、ライゲーションするための切断部を作製するための制限酵素を用いて組み込まれ得る。遺伝子構築物を含有しているベクターは次いで、融合タンパク質の発現のために適切な宿主内に導入される。一般的には、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（上掲）を参照のこと。好適なベクターの選択は、クローニングプロトコルに関連する要素に基づいて経験的に行われ得る。例えば、ベクターは、使用される宿主と適合性でであり、適正なレプリコンを有するものであるのがよい。ベクターは、発現させる融合タンパク質複合体をコードしているＤＮＡ配列に適応できるものでなければならない。好適な宿主細胞としては、真核生物細胞及び原核生物細胞、好ましくは、容易に形質転換され得、培養培地中で急速な増殖を示し得る細胞が挙げられる。具体的には、好ましい宿主細胞としては、例えば大腸菌、枯草菌などの原核生物、及び動物細胞及び酵母株、例えば出芽酵母などの真核生物が挙げられる。哺乳動物細胞、特に、Ｊ５５８、ＮＳＯ、ＳＰ２−Ｏ又はＣＨＯが一般的に好ましい。他の適切な宿主としては、例えばＳｆ９などの昆虫細胞が挙げられる。慣用的な培養条件が使用される。Ｓａｍｂｒｏｏｋ（上掲）を参照のこと。安定な形質転換細胞株又はトランスフェクト細胞株が次いで、選択され得る。本発明の融合タンパク質複合体を発現している細胞は、既知の手順によって判定され得る。例えば、免疫グロブリンと連結させた融合タンパク質複合体の発現は、連結させた免疫グロブリンに特異的なＥＬＩＳＡ及び／又はイムノブロッティングによって調べることができる。ＩＬ−１５又はＩＬ−１５Ｒαドメインと連結させた生物活性ポリペプチドを含む融合タンパク質の発現を検出するための他の方法は本実施例に開示している。
【０１３７】
上記に一般的に記載したように、宿主細胞は、所望の融合タンパク質をコードしている核酸を増殖させるための調製目的のために使用され得る。したがって、宿主細胞には、融合タンパク質の生成が具体的に意図される原核生物細胞又は真核生物細胞が包含され得る。したがって、宿主細胞として具体的には、酵母、ハエ、ムシ、植物、カエル、哺乳動物の細胞及び該融合体をコードしている核酸を増殖させ得る器官が挙げられる。使用され得る哺乳動物細胞株の非限定的な例としては、ＣＨＯ  ｄｈｆｒ細胞（Ｕｒｌａｕｂ  ａｎｄ  Ｃｈａｓｍ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４２１６（１９８０））、２９３細胞（Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，３６：５９（１９７７））又は骨髄腫細胞様ＳＰ２若しくはＮＳＯ（Ｇａｌｆｒｅ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，７３（Ｂ）：３（１９８１））が挙げられる。
【０１３８】
所望の融合タンパク質複合体をコードしている核酸を増殖させ得る宿主細胞はまた、非哺乳動物の真核生物細胞、例えば、昆虫（例えば、Ｓｐ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、酵母（例えば、出芽酵母、Ｓ．ｐｏｍｂｅ、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ．，Ｋ．ｌａｃｔｉｓ、Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ；Ｆｌｅｅｒ，Ｒ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３（５）：４８６４９６（１９９２）に一般的に概説されている）、真菌細胞及び植物細胞も包含している。また、特定の原核生物、例えば、大腸菌及びバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）も想定される。
【０１３９】
所望の融合タンパク質をコードしている核酸は宿主細胞内に、細胞をトランスフェクトするための標準的な手法によって導入され得る。用語「トランスフェクトする」又は「トランスフェクション」は、核酸を宿主細胞内に導入するためのあらゆる慣用的な手法、例えば、リン酸カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、ウイルス形質導入及び／又は組込みを包含していることを意図する。宿主細胞をトランスフェクトするための好適な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（上掲）及び他の実験教本において知得され得る。
【０１４０】
種々のプロモーター（転写開始調節領域）が本発明に従って使用され得る。適切なプロモーターの選択は、提案される発現宿主に依存する。非相同供給源に由来するプロモーターは、選択した宿主において機能性である限り、使用してもよい。
【０１４１】
また、プロモーターの選択は、所望の効率及びペプチド又はタンパク質の産生レベルにも依存する。大腸菌内でのタンパク質の発現レベルを劇的に増大させるためには、ｔａｃなどの誘導性プロモーターが多くの場合で使用される。タンパク質の過剰発現は宿主細胞にとって有害となる場合があり得る。そのため、宿主細胞の増殖が制限されることになり得る。誘導性プロモーター系の使用により、遺伝子発現の誘導前に宿主細胞が許容され得る密度まで培養され、それにより高産生物収量を助長することが可能になる。
【０１４２】
種々のシグナル配列が本発明に従って使用され得る。生物活性ポリペプチドコード配列に相同なシグナル配列が使用され得る。或いはまた、発現宿主内での効率的な分泌及びプロセッシングのために選択又は設計されたシグナル配列を使用してもよい。例えば、適切なシグナル配列／宿主細胞のペアとしては、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ内での分泌のためのＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｓａｃＢシグナル配列、及び出芽酵母α−接合因子又はＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ分泌のためのＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ酸性ホスファターゼｐｈｏＩシグナル配列が挙げられる。シグナル配列は、シグナルペプチダーゼ切断部位をコードしている配列を介してタンパク質コード配列に直接連接させてもよく、通常１０個より少ないコドンからなる短鎖ヌクレオチドブリッジを介して連接させてもよく、この場合、該ブリッジは、下流のタンパク質配列の正しいリーディングフレームを確保するものである。
【０１４３】
転写及び翻訳を向上させるためのエレメントは、真核生物のタンパク質発現系について同定されている。例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）プロモーターを非相同プロモーターの両側（ｅｉｔｈｅｒ  ｓｉｄｅ）１０００ｂｐに配置することにより、植物細胞において転写レベルが１０〜４００倍高まり得る。また、発現構築物に適切な翻訳開始配列も含めるのがよい。適正な翻訳開始のためのコザックコンセンサス配列を含めるための発現構築物の修飾により翻訳レベルが１０倍増大し得る。
【０１４４】
発現構築物の一部であっても発現構築物と別個（例えば、発現ベクターに担持させる）であってもよい選択的マーカーが多くの場合で、該マーカーが目的の遺伝子とは異なる部位に組み込まれ得るように使用される。例としては、抗生物質に対する耐性を付与するマーカー（例えば、ｂｌａは、大腸菌宿主細胞にアンピシリンに対する耐性を付与し、ｎｐｔＩＩは、多種多様な原核生物細胞及び真核生物細胞にカナマイシン耐性を付与する）又は宿主が最少培地で増殖することを可能にするマーカー（例えば、ＨＩＳ４はＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ又はＨｉｓ−出芽酵母がヒスチジンの非存在下で増殖することを可能にする）が挙げられる。選択可能マーカーは、その独自の転写開始及び翻訳開始並びに終結の調節領域を有しており、該マーカーの独立した発現が可能である。抗生物質耐性をマーカーとして使用する場合、選択のための該抗生物質の濃度は、抗生物質に応じて一般的には１０〜６００μｇの抗生物質／ｍＬ培地の範囲で異なる。
【０１４５】
発現構築物は、既知の組換えＤＮＡ手法を使用することにより組織化される（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。制限酵素消化及びライゲーションは、２つのＤＮＡ断片を連接するために使用される基本工程である。ＤＮＡ断片の両末端は、ライゲーション前に修飾を必要とするものであってもよく、これは、突出端の埋め込み、ヌクレアーゼ（例えば、ＥｘｏＩＩＩ）による断片の末端部分の除去、部位特異的変異誘発によって、又はＰＣＲにより新たな塩基対を付加することによって行われ得る。選択した断片の連接を助長するためにポリリンカー及びアダプターを使用してもよい。発現構築物は典型的には、制限、ライゲーション及び大腸菌の形質転換の繰り返しを使用して段階的に組織化される。発現構築物の構築に適した数多くのクローニングベクターが当該技術分野で知られており（λＺＡＰ及びｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ  ＳＫ−１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）、ｐＥＴ（Ｎｏｖａｇｅｎ  Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９に記載）、具体的な選択は本発明にとって重要ではない。クローニングベクターの選択は、宿主細胞内への発現構築物の導入に選択される遺伝子導入系に影響される。各段階の終了時、得られた構築物は、制限、ＤＮＡ配列、ハイブリダイゼーション及びＰＣＲ解析によって解析され得る。
【０１４６】
発現構築物は、クローニングベクター構築物（線状又は環状のいずれか）として宿主を形質転換してもよく、クローニングベクターから取り出し、そのままで使用するか、又は送達ベクターに導入してもよい。送達ベクターは、選択した宿主細胞型への発現構築物の導入と維持を助長するものである。発現構築物は宿主細胞内に、いくつかの既知の遺伝子導入系のいずれか（例えば、自然な能力、化学的媒介形質転換、プロトプラスト形質転換、エレクトロポレーション、バイオリスティック形質転換、トランスフェクション又はコンジュゲーション）によって導入される（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）。選択される遺伝子導入系は、使用される宿主細胞及びベクター系に依存する。
【０１４７】
例えば、発現構築物は出芽酵母細胞内に、プロトプラスト形質転換又はエレクトロポレーションによって導入され得る。出芽酵母のエレクトロポレーションは容易に行われ、スフェロプラスト形質転換と同等の形質転換効率がもたらされる。
【０１４８】
本発明により、さらに、目的の融合タンパク質を単離するための生産プロセスを提供する。プロセスでは、調節配列と作動可能に連結させた目的タンパク質コード核酸が導入された宿主細胞（例えば、酵母、真菌、昆虫、細菌又は動物細胞）を、目的の融合タンパク質をコードしているヌクレオチド配列の転写が刺激される生産規模で培養培地中にて培養する。続いて、目的の融合タンパク質を、収集した宿主細胞又は培養培地から単離する。目的のタンパク質を培地又は収集した細胞から単離するためには、標準的なタンパク質精製手法が使用され得る。特に、精製手法は、所望の融合タンパク質を大規模で（すなわち、少なくともミリグラム量で）発現させて、さまざまな実施、例えば、ローラーボトル、スピナーフラスコ、組織培養プレート、バイオリアクター又は発酵槽から精製するために使用され得る。
【０１４９】
発現したタンパク質融合複合体は、既知の方法によって単離及び精製され得る。典型的には、培養培地を遠心分離又は濾過し、次いで、上清みをアフィニティクロマトグラフィー若しくはイムノアフィニティクロマトグラフィー、例えば、プロテイン−Ａ若しくはプロテイン−Ｇアフィニティクロマトグラフィー、又は発現した融合複合体に結合するモノクローナル抗体の使用を含む免疫親和性プロトコルによって精製する。本発明の融合タンパク質を既知の手法の適切な組み合わせによって分離及び精製してもよい。このような方法としては、例えば、溶解度を使用する方法（塩析沈殿及び溶媒沈殿など）、分子量の差を使用する方法（透析、限外濾過、ゲル濾過及びＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動など）、電荷の差を使用する方法（イオン交換カラムクロマトグラフィーなど）、特異的親和性を使用する方法（アフィニティクロマトグラフィーなど）、疎水性の差を使用する方法（逆相高速液体クロマトグラフィーなど）並びに等電点の差を使用する方法（等電点電気泳動、金属アフィニティカラム（Ｎｉ−ＮＴＡなど）など）が挙げられる。これらの方法に関する開示については、一般的に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（上掲）を参照されたい。
【０１５０】
本発明の融合タンパク質は実質的に純粋であることが好ましい。すなわち、該融合タンパク質は、天然状態では付随している細胞置換基（ｓｕｂｓｔｉｔｕｅｎｔ）から、該融合タンパク質が好ましくは少なくとも８０％又は９０％〜９５％の均一性（ｗ／ｗ）で存在しているように単離されている。少なくとも９８〜９９％の均一性（ｗ／ｗ）を有する融合タンパク質が、多くの薬学的用途、臨床用途及び研究用途に最も好ましい。実質的に精製されたら、該融合タンパク質は、治療用途のために夾雑物を実質的に含有していないのがよい。部分的又は相当な純度まで精製されたら、該可溶性融合タンパク質は治療的に、又は本明細書に開示のようなインビトロ若しくはインビボアッセイの実施に使用され得る。相当な純度は、さまざまな標準的な手法（クロマトグラフィー及びゲル電気泳動など）によって判定され得る。
【０１５１】
本発明の融合タンパク質複合体は、癌性であるか、若しくは感染しているか、又は１つ以上の疾患に影響を受ける状態になるかもしれないさまざまな細胞とのインビトロ又はインビボでの使用に適している。
【０１５２】
ヒトインターロイキン−１５（ｈＩＬ−１５）は、抗原提示細胞上に発現されたヒトＩＬ−１５受容体α鎖（ｈＩＬ−１５Ｒα）により、免疫エフェクター細胞に対してトランス型で提示される。ＩＬ−１５ＲαはｈＩＬ−１５に、主に細胞外ｓｕｓｈｉドメイン（ＩＬ−１５ＲαＳｕ）によって高親和性（３８ｐＭ）で結合する。本明細書に記載のように、ＩＬ−１５及びＩＬ−１５ＲαＳｕドメインが、可溶性の複合体（例えば、ＡＬＴ−８０３）を作製するために、又はマルチドメイン融合複合体を構築するための骨格として使用され得る。
【０１５３】
ＩｇＧドメイン、特にＦｃ断片は、いくつかの治療用分子（例えば、承認済の生物製剤薬）のダイマー骨格として成功裡に使用されている。例えば、エタネルセプトは、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインと連結させた可溶性ヒトｐ７５腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）受容体（ｓＴＮＦＲ）のダイマーである。このダイマー化により、エタネルセプトがＴＮＦ−α活性の阻害においてモノマー型のｓＴＮＦＲよりも１，０００倍まで強力になることが可能になり、この融合体にモノマー型形態よりも５倍長い血清半減期がもたらされる。その結果、エタネルセプトは、インビボでのＴＮＦ−αの炎症促進活性の中和及びいくつかの異なる自己免疫性適応症での患者の転帰の改善に有効である。
【０１５４】
ダイマー化による活性に加えて、Ｆｃ断片はまた、補体活性化並びに天然のキラー（ＮＫ）細胞、好中球、単球細胞、食細胞及び樹状細胞上にディスプレイされるＦｃγ受容体との相互作用により、細胞傷害性エフェクター機能ももたらす。抗癌治療用抗体及び他の抗体ドメイン−Ｆｃ融合タンパク質との関連において、このような活性は、動物腫瘍モデル及び癌患者で観察される有効性に重要な役割を果たしていると思われる。しかしながら、このような細胞傷害性エフェクター応答は、いくつかの治療用途では充分でない場合がある得る。したがって、Ｆｃドメインのエフェクター活性に対する改善及び拡大、並びに免疫療法用分子による疾患部位における細胞溶解性免疫応答（例えば、ＮＫ細胞及びＴ細胞）の活性又は漸増を増大させるための他の手段の開発に大きな関心がもたれている。
【０１５５】
ヒト由来免疫賦活治療薬を開発するための取り組みにおいて、ヒトＩＬ−１５（ｈＩＬ−１５）とＩＬ−１５受容体ドメインを使用した。ｈＩＬ−１５は、ｈＩＬ−１５受容体α−鎖（ｈＩＬ−１５Ｒα）と高い結合親和性（平衡解離定数（ＫＤ）約１０−１１Ｍ）で結合する４つのα−へリックスバンドルを有する小さいサイトカインファミリーの構成員である。得られる複合体は次いで、Ｔ細胞及びＮＫ細胞の表面上にディスプレイされたヒトＩＬ−２／１５受容体β／共通γ鎖（ｈＩＬ−１５ＲβγＣ）複合体に対してトランス型で提示される。このサイトカイン／受容体相互作用により、ウイルス感染細胞及び悪性細胞の根絶に重要な役割を果たすエフェクターＴ細胞とＮＫ細胞の増殖及び活性化がもたらされる。通常、ｈＩＬ−１５とｈＩＬ−１５Ｒαは樹状細胞において共産生されて細胞内で複合体が形成され、該複合体は続いて分泌され、細胞表面上にヘテロダイマー分子としてディスプレイされる。したがって、ｈＩＬ−１５とｈＩＬ−１５Ｒαの相互作用の特徴により、このような鎖間結合ドメインがヒト由来免疫賦活複合体として、及び標的に特異的に結合し得る可溶性ダイマー分子を作製するための骨格としての機能を果たしている可能性があることが示唆される。
【０１５６】
本発明の実施では、特に記載のない限り、充分に当業者の技能の範囲内である分子生物学（組換え手法を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学及び免疫学の慣用的な手法を使用する。かかる手法は、文献、例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」，第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，１９８９）；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｇａｉｔ，１９８４）；「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，１９８７）；「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（Ｗｅｉｒ，１９９６）；「Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ」（Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｃａｌｏｓ，１９８７）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ａｕｓｕｂｅｌ，１９８７）；「ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ」，（Ｍｕｌｌｉｓ，１９９４）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（Ｃｏｌｉｇａｎ，１９９１）に充分に説明されている。これらの手法は、本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチドの作製に適用可能であり、そのため、本発明の作製及び実施において考慮され得る。具体的な実施形態に特に有用な手法を以下のセクションに論考する。
【０１５７】
以下の実施例は、当業者に本発明のアッセイ、スクリーニング及び治療方法をどのようにして行い、使用するかの完全な開示と説明を提供するために示したものであり、本発明者らが自身の発明とみなすものの範囲を限定することを意図するものではない。
【実施例１】
【０１５８】
実施例１：ＡＬＴ−８０３によるリンパ球の増殖及び活性化の誘導
正常個体由来のヒト血液バフィーコートを使用し、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７を用いて末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を単離した。ＰＢＭＣを、３７℃で５％ＣＯ２にてＲＰＭＩ−１０培地（ＲＰＭＩ−１６４０，２−メルカプトエタノール，ペニシリン−ストレプトマイシン−グルタミン，非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム及び１０％ウシ胎仔血清）中で、種々の量のＡＬＴ−８０３とともに培養した。「ＡＬＴ−８０３」により、ダイマー型ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ融合タンパク質と非共有結合により結合しているＩＬ−１５Ｎ７２Ｄを含むものである複合体を意図し、ここで、前記複合体は免疫賦活活性を示すものである。任意選択で、ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ及び／又はＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ融合タンパク質は、参照配列と比べて１、２、３、４つ、又はそれ以上のアミノ酸変異を含むものである。例示的なＩＬ−１５Ｎ７２Ｄアミノ酸配列を以下に示す（例えば、米国特許出願第１３／７６９，１７９号（引用により本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。
【０１５９】
例示的なＩＬ−１５Ｎ７２Ｄの核酸配列を以下に示す（リーダーペプチドを含む）（配列番号１）：
（リーダーペプチド）
【０１６０】
2020128390.tif 000003
【０１６１】
（ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ）
【０１６２】
2020128390.tif 000004
【０１６３】
（終止コドン）
【０１６４】
2020128390.tif 000005
【０１６５】
例示的なＩＬ−１５Ｎ７２Ｄのアミノ酸配列を以下に示す（リーダーペプチドを含む）（配列番号２）：
（リーダーペプチド）
【０１６６】
2020128390.tif 000006
【０１６７】
（ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ）
【０１６８】
2020128390.tif 000007
【０１６９】
一部の場合では、リーダーペプチドが成熟ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄポリペプチドから切断されている（配列番号３）：
（ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ）
【０１７０】
2020128390.tif 000008
【０１７１】
例示的なＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃの核酸配列（リーダーペプチドを含む）を以下に示す（配列番号４）：
（リーダーペプチド）
【０１７２】
2020128390.tif 000009
【０１７３】
（ＩＬ−１５ＲαＳｕ）
【０１７４】
2020128390.tif 000010
【０１７５】
（ＩｇＧ１  ＣＨ２−ＣＨ３（Ｆｃドメイン））
【０１７６】
2020128390.tif 000011
【０１７７】
（終止コドン）
【０１７８】
2020128390.tif 000012
【０１７９】
例示的なＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃのアミノ酸配列（リーダーペプチドを含む）を以下に示す（配列番号５）：
（リーダーペプチド）
【０１８０】
2020128390.tif 000013
【０１８１】
（ＩＬ−１５ＲαＳｕ）
【０１８２】
2020128390.tif 000014
【０１８３】
（ＩｇＧ１  ＣＨ２−ＣＨ３（Ｆｃドメイン））
【０１８４】
2020128390.tif 000015
【０１８５】
一部の場合では、成熟ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃタンパク質はリーダー配列が欠失している（配列番号６）：
（ＩＬ−１５ＲαＳｕ）
【０１８６】
2020128390.tif 000016
【０１８７】
（ＩｇＧ１  ＣＨ２−ＣＨ３（Ｆｃドメイン））
【０１８８】
2020128390.tif 000017
【０１８９】
リンパ球サブセットの増殖及び活性化を評価するため、ＡＬＴ−８０３処理細胞を、表面マーカーに対してＢｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｖｉｏｌｅｔ  ５１０−抗ＣＤ４、ＰＥＣＹ７−抗ＣＤ８、及びＢｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｖｉｏｌｅｔ  ４２１−抗ＣＤ１６抗体の組み合わせで、その後、ＦＩＴＣ−抗グランザイムＢ抗体での細胞内染色、又は表面マーカーに対してＢｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｖｉｏｌｅｔ−抗ＣＤ４、ＰＥ−抗ＣＤ８、ＰＥＣＹ７−抗ＣＤ３３５、ＰｅｒＣＰ−ＣＹ５．５−抗ＣＤ６９及びＡＰＣ−抗ＣＤ２５抗体の組み合わせで、その後、ＦＩＴＣ−抗パーフォリン抗体での細胞内染色のいずれかで染色した。細胞内染色のため、細胞を固定バッファー（２％のパラホルムアルデヒドを含むＰＢＳ）で固定し、室温で２０分間インキュベートした。固定された細胞を易透化バッファー（０．１％のサポニンと０．０５％のアジ化ナトリウムを含むＰＢＳ）中で透過処理し、ヒトグランザイムＢ又はパーフォリンに特異的なＦＩＴＣ標識抗体で染色した。ＡＬＴ−８０３活性化ＰＢＭＣのうちのＣＤ４＋  Ｔ細胞、ＣＤ８＋  Ｔ細胞及びＣＤ１６＋  ＮＫ細胞のパーセンテージ、並びにＣＤ４＋  Ｔ細胞、ＣＤ８＋  Ｔ細胞及びＣＤ３３５＋  ＮＫ細胞上のＣＤ２５及びＣＤ６９の活性化マーカーの発現をＦＡＣＳＶｅｒｓｅフローサイトメーターでＦＡＣＳｕｉｔｅソフトウェアを用いて解析した。
【０１９０】
０．０１〜１０ｎＭのＡＬＴ−８０３を含有している培地中での５日間のインキュベーション後、培地対照と比べて、異なるドナー由来のヒトＰＢＭＣにおけるＣＤ４＋  Ｔ細胞、ＣＤ８＋  Ｔ細胞又はＮＫ細胞のパーセンテージに有意な変化はみられなかった（図１Ａ及び図１Ｂ）。以前の研究では、ＡＬＴ−８０３がインビトロでヒトＰＭＢＣの増殖性応答を刺激し得ることが示されていたため、このアッセイの感度が高まるように培養物のインキュベーション時間を長くした。図１Ｃ（ドナーＡ）及び図１Ｄ（ドナーＢ）に示されるように、１０ｎＭのＡＬＴ−８０３の存在下での７日間の培養後、ＡＬＴ−８０３の非存在下でインキュベートした細胞で観察されるものと比べたとき、ＰＢＭＣ培養物中のＣＤ４＋  Ｔ細胞のパーセンテージは減少し、ＣＤ８＋  Ｔ細胞のパーセンテージは増大した。この所見は、ＣＤ４／ＣＤ８比を分析した場合、より明白であった（図１Ｅ：ドナーＡ及び図１Ｆ：ドナーＢ）。ＡＬＴ−８０３の存在下又は非存在下で１０日間までインキュベートしたＰＢＭＣ培養物中のＮＫ細胞のパーセンテージに有意差はなかった（図１Ｃ及びＤ）。
【０１９１】
異なるドナー由来のヒト免疫細胞サブセットの増殖性に対するＡＬＴ−８０３のインビトロ効果をＩＬ−１５と比較した。０．５ｎＭのＡＬＴ−８０３又は０．５ｎＭのＩＬ−１５のいずれかをヒトＰＢＭＣ培養物に添加すると、７日間のインキュベーション期間後、リンパ球カウント数の約２倍の増加がもたらされた。ＡＬＴ−８０３は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞及びＮＫ細胞サブセットの絶対数の増加においてＩＬ−１５と同等に強力であった（図２Ａ及び図２Ｂ）。また、ＡＬＴ−８０３はＣＤ４＋  Ｔ細胞の絶対カウント数を有意に増加させたが、ＩＬ−１５はＴｒｅｇ細胞の絶対カウント数を増加させた。
【０１９２】
また、ＡＬＴ−８０３の免疫賦活効果を理解するため、免疫細胞サブセット上における活性化マーカーＣＤ２５とＣＤ６９の発現を調べた。図３Ａ〜図３Ｄに示されるように、ＡＬＴ−８０３でのインビトロ処理により、ＣＤ４＋  Ｔ細胞、ＣＤ８＋  Ｔ細胞及びＮＫ細胞によるＣＤ２５発現が濃度依存的様式で増大され得た。注目すべきことに、ＡＬＴ−８０３によるＣＤ２５の上方調節は、ＣＤ８＋  Ｔ又はＮＫ細胞でみられるものと比べてＣＤ４＋  Ｔ細胞において最も有意であった。ＡＬＴ−８０３によって誘導されるＣＤ８＋  Ｔ細胞によるＣＤ２５発現は最小限であった。ＣＤ２５と対照的に、ＣＤ６９発現はＮＫ細胞において、ＡＬＴ−８０３とのインキュベーションによって高度に上方調節されたが、ＣＤ４＋  Ｔ細胞によるＣＤ６９発現に対しては、処理効果はほとんど又は全くみられなかった。
【０１９３】
また、この試験は、ＡＬＴ−８０３がＮＫ細胞及びＣＤ８＋  Ｔ細胞に対し、細胞溶解応答において枢要な役割を果たしているグランザイム及びパーフォリンをより高レベルで発現するように誘導し得るかどうかを評価するためにも実施した。ヒトＰＢＭＣを、上記のようにしてインビトロでＡＬＴ−８０３により活性化させた後、Ａｂ染色によってＣＤ８＋  Ｔ細胞とＮＫ細胞のサブセットを識別し、次いで、ヒトグランザイムＢ又はパーフォリンに特異的なＦＩＴＣ標識抗体で細胞内染色した。図４Ａ〜図４Ｄに示されるように、ＡＬＴ−８０３は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞（図４Ａ及び図４Ｃ）とＮＫ細胞（図４Ｂ及び図４Ｄ）によるグランザイムＢ及びパーフォリンの発現を濃度依存的様式で上方調節することができた。さらに、グランザイムＢの発現のＡＬＴ−８０３媒介性誘導は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞及びＮＫ細胞のどちらにおいても、パーフォリンの発現に対するＡＬＴ−８０３媒介性効果よりも有意であった。このような所見は、グランザイムＢ及び／又はパーフォリンのＡＬＴ−８０３誘導性発現が、ＡＬＴ−８０３とのインキュベーション後のＰＢＭＣの細胞傷害性の増強に役割を果たしているのかもしれないという考えと整合する。
【０１９４】
ヒト及びマウスの免疫細胞に対するＡＬＴ−８０３の効果を比較するため、さらなる試験を行った。以前の研究では、ヒトＰＢＭＣに対するタンパク質の免疫賦活効果は、該タンパク質が水性形態で存在しているのか固定化された形態で存在しているのかによって有意に異なり得ることが示されていた。したがって、サイトカインの放出及び増殖のアッセイをヒト及びマウスの細胞に対して、ＡＬＴ−８０３を可溶性タンパク質として、又はプラスチックに固定化した湿潤若しくは風乾タンパク質調製物として用いて行った。ＡＬＴ−８０３は０．０８、０．８及び４４ｎＭで試験し、これらは、それぞれ、ヒトにおける０．３、３．０及び１７０μｇ／ｋｇのｉ．ｖ．用量での最大血清濃度に相当する。増殖アッセイのため、脾細胞から富化した（ＣＤ３＋  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔカラム，Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ）ヒトＰＢＭＣ及びマウスＣＤ３＋細胞をＣｅｌｌｔｒａｃｅ（商標）Ｖｉｏｌｅｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識し、ＰＢＳ又はＡＬＴ−８０３を含めたウェル内で培養した。陽性対照として、２７ｎＭの抗ＣＤ３  Ａｂ（マウス脾細胞では１４５−２Ｃ１１、及びヒトＰＢＭＣではＯＫＴ３）を同じアッセイフォーマットの別々のウェルに添加した。細胞を４日間インキュベートし、次いでフローサイトメトリーによって解析し、バイオレット色素希釈法に基づいて細胞増殖を測定した。さらに、ヒト及びマウスの免疫細胞を上記のようにして２４時間及び４８時間培養し、培地中に放出されたサイトカインを、Ｈｕｍａｎ  ａｎｄ  Ｍｏｕｓｅ  Ｔｈ１／Ｔｈ２／Ｔｈ１７  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ｂｅａｄ  Ａｒｒａｙ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅキットを製造業者の使用説明書（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に従って用いて測定した。免疫細胞サブセットの分析のため、ヒトＰＢＭＣを種々の濃度のＡＬＴ−８０３又はＩＬ−１５中で培養し、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ３３５、ＣＤ１６若しくはＣＤ１９に特異的な抗体を用いて、又はヒトＴｒｅｇキット（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を用いて染色した。また、一部の実験では細胞を、ＣＤ６９、グランザイムＢ又はパーフォリンに特異的な抗体でも上記のようにして染色した。
【０１９５】
固定化したＡＬＴ−８０３との１日又は４日間のインキュベーション（図５Ａ）により、ヒトＰＢＭＣによるＩＦＮ−γ放出の増加がもたらされた。また、ＡＬＴ−８０３で処理したヒトＰＢＭＣの４日培養物において可溶性ＩＬ−６も増加したが、この効果は用量依存性ではなかった（図５Ａ）。対照的に、ＡＬＴ−８０３は、ヒトＰＢＭＣの４日培養物によるＴＮＦ−α、ＩＬ−４、ＩＬ−１０又はＩＬ−１７Ａの放出に対して効果を有しなかった。パラレル培養物で試験した場合、陽性対照の抗ＣＤ３  ｍＡｂは、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１０、ＩＬ−４及びＩＬ−１７Ａの放出を誘導した。ヒト免疫細胞と比べ、マウス脾細胞は、ＡＬＴ−８０３とのインキュベーション後、ＩＦＮ−γ放出に対して同様であるが強度が低い応答を示した（図５Ｂ）。また、ＡＬＴ−８０３もマウス脾細胞によるＴＮＦ−α産生を誘導したが、ＩＬ−６、ＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＬ−４及びＩＬ−１７Ａレベルに対する有意な効果は示さなかった。逆に、固定化した抗ＣＤ３抗体とともにインキュベートしたマウスリンパ球は、試験した全サイトカインの有意に高い放出を示した。総合すると、このような所見は、抗ＣＤ３抗体によって誘導される広範なサイトカインプロフィールとは対照的に、ＡＬＴ−８０３が主にヒト及びマウスの免疫細胞によるＩＦＮ−γ産生を刺激することを示す。
【０１９６】
また、ＡＬＴ−８０３が、ヒト及びマウスのＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）Ｖｉｏｌｅｔで標識した免疫細胞のインビトロ増殖を誘導する能力も評価した。０．７ｎＭ〜４４ｎＭの可溶性ＡＬＴ−８０３とのインキュベーション後、マウスリンパ球の顕著な増殖が明白であった（図５Ｃ）。４日間のインキュベーション期間中、可溶性ＡＬＴ−８０３高用量群では、８３％までもの細胞が１〜６回の細胞分裂を行った。未処理のマウス細胞又は０．０７ｎＭの可溶性ＡＬＴ−８０３で処理した細胞では、増殖はほとんど又は全く検出されなかった。予測通り、固定化した抗ＣＤ３抗体とともにインキュベートしたマウスリンパ球は、強力な増殖性応答を示した。ＡＬＴ−８０３用量依存性のリンパ球増殖はヒトＰＢＭＣ培養物においても観察されたが、この応答は、マウス細胞でみられたものよりもかなり低かった。全般的に、高用量のＡＬＴ−８０３に応答して増殖したヒトリンパ球は全体の２０％未満であり、この応答は、陽性対照の抗ＣＤ３抗体によって誘導されるものより低かった。さらに、異なるドナーの血中リンパ球において、ＡＬＴ−８０３及び抗ＣＤ３  Ａｂに対する細胞増殖応答はどちらも個体差が観察された。
【実施例２】
【０１９７】
実施例２：ＡＬＴ−８０３及び抗体と併用したＡＬＴ−８０３による細胞媒介性細胞傷害の誘導
ＡＬＴ−８０３が細胞媒介性細胞傷害に影響を及ぼすかどうかを評価するため、血液バフィーコート由来のヒト単離ＰＢＭＣをエフェクター細胞として使用した。ＤａｕｄｉヒトＢ細胞リンパ腫細胞及びＫ５６２ヒト骨髄性白血病細胞を標的細胞として使用し、ＲＰＭＩ−１０中５μＭのＣｅｌｌｔｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔで３７℃にて２０分間、製造業者による説明のとおりに標識した。エフェクター細胞をバイオレット標識標的細胞と混合し、３７℃で５％ＣＯ２にてＲＰＭＩ−１０中、ＡＬＴ−８０３とともに又はなしで、表示した期間インキュベートした。一部の実験では、Ｄａｕｄｉ細胞の表面上に発現されるＣＤ２０に特異的な抗ＣＤ２０  Ａｂ（リツキシマブ，１０ｎＭ）を、エフェクター：Ｄａｕｄｉ細胞培養液に添加し、抗ＣＤ２０  Ａｂ媒介性抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）に対するＡＬＴ−８０３の効果を調べた。エフェクター細胞と標的細胞の混合物を遠心分離によって収集し、フェノールレッドなしで２μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウムを含めたＲＰＭＩ−１０中に再懸濁させた。標的細胞に対するエフェクター細胞の細胞傷害性をフローサイトメトリーによって、ヨウ化プロピジウム陽性染色後の死滅したバイオレット標識標的細胞のパーセンテージを調べることにより評価した。
【０１９８】
図６Ａ〜図６Ｄに示されるように、新鮮ヒトＰＢＭＣは、ＡＬＴ−８０３の非存在下では、Ｄａｕｄｉ細胞及びＫ５６２細胞に対して有する細胞傷害性は弱かった。対照的に、ＰＢＭＣは、１０ｎＭのＡＬＴ−８０３の存在下では、Ｄａｕｄｉ及びＫ５６２腫瘍標的細胞に対して非常に強力な細胞傷害性を有していた。Ｄａｕｄｉ腫瘍細胞はＣＤ２０分子を発現し、これは抗ＣＤ２０  Ａｂ（リツキシマブ）によって認識され得る。本明細書に記載したように、ＣＤ２０は、造血器腫瘍及び自己免疫疾患の治療用抗体での処置のための確立された標的である。ヒトＰＢＭＣは、リツキシマブ単独によって媒介されるＡＤＣＣによりＤａｕｄｉ細胞を溶解させ得る（図６Ｃ，培地対照）。興味深いことに、ＡＬＴ−８０３もまた、Ｄａｕｄｉ細胞に対するヒトＰＢＭＣのリツキシマブ媒介性ＡＤＣＣ活性を有意に増大させることができた。図６Ｄに示されるように、ＰＢＭＣの細胞傷害性及びＡＤＣＣに対するＡＬＴ−８０３媒介性効果の時間依存性の増大が観察され、１日のＡＬＴ−８０３とのインキュベーション後では応答はほとんど又は全くみられないが、さらなる日数の各インキュベーションでは標的細胞の死滅の増大が観察された。
【０１９９】
さらに、Ｋ５６２及びＤａｕｄｉ細胞に対するヒトＰＢＭＣ細胞傷害性のＡＬＴ−８０３濃度依存性誘導を調べた。新鮮ヒトＰＢＭＣを、Ｃｅｌｌｔｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔで標識したＫ５６２細胞又はＤａｕｄｉ細胞と、種々の濃度（０．０１ｎＭ〜１０ｎＭ）のＡＬＴ−８０３を含むＲＰＭＩ−１０培地中で混合した後、３日間インキュベーションした。標的細胞に対するヒトＰＢＭＣの細胞傷害性を、フローサイトメトリーによって上記のようにして評価した。図６Ａ〜図６Ｄとの結果と整合して、ＡＬＴ−８０３は１０ｎＭで、Ｄａｕｄｉ細胞及びＫ５６２細胞に対するヒトＰＢＭＣの細胞傷害性を増大させることができた（図７Ａ及び図７Ｂ：ドナーＡ及びドナーＢ）。さらに、ＡＬＴ−８０３は、０．０１ｎＭという低濃度でも、標的細胞に対するヒトＰＢＭＣの細胞傷害性の増大が示された。２例の個体に由来するＰＢＭＣは、異なるこれらの腫瘍標的細胞に対して有意に異なる細胞傷害活性を示した。ドナーＡ由来のＰＢＭＣ（図７Ａ）の方がずっと高いベースラインを示し、Ｄａｕｄｉ細胞よりもＫ５６２細胞に対してずっと高いＡＬＴ−８０３誘導性細胞傷害性を示した。対照的に、ドナーＢ由来のＰＢＭＣ（図７Ｂ）は、同様のベースライン及びこれらの２つの異なる標的細胞に対する同様のＡＬＴ−８０３誘導性細胞傷害性を示した。この所見は、異なる患者におけるＡＬＴ−８０３媒介性臨床応答のばらつきの可能性の理解において重要であり得る。同様の細胞傷害性アッセイを、この分子の臨床的使用の一部としてのＡＬＴ−８０３に対する患者の免疫応答の推論評価として組み込む。
【０２００】
また、腫瘍特異的ＡＤＣＣに対するＡＬＴ−８０３の濃度依存性効果もさらに評価した。図８Ａ〜図８Ｂに示されるように、ＡＬＴ−８０３は、０．０１ｎＭという低い濃度でヒトＤａｕｄｉ  Ｂリンパ腫細胞に対する抗ＣＤ２０  ｍＡｂ（１０ｎＭ）のＡＤＣＣ活性を増大させることができた。この応答は、Ｄａｕｄｉ細胞とともに２：１のＥ：Ｔ比でインキュベートしたヒトＰＭＢＣエフェクター細胞で観察され、この活性の高感度さを示す。観察された標的腫瘍細胞の死滅を担う免疫エフェクターを特定するため、ＮＫ細胞をヒトＰＢＭＣからＭＡＣＳによって単離し、上記のＡＤＣＣアッセイにおけるエフェクター細胞として使用した。ヒト全ＰＢＭＣでの結果と同様、ＮＫ細胞は、リツキシマブ媒介性ＡＤＣＣ活性によってＤａｕｄｉ細胞を死滅させることができ、これはＡＬＴ−８０３の添加によって増強された（図８Ｃ）。対照的に、この設定において、ＮＫ細胞枯渇ＰＢＭＣ（無ＮＫ細胞）では、Ｄａｕｄｉ細胞を死滅させる検出可能なＡＤＣＣ活性は示されなかった（図８Ｄ）。さらに、対照抗体ＨＯＡＴ（ヒト化抗ヒト組織因子ＩｇＧ１  Ａｂ）をＮＫ細胞に添加しても、Ｄａｕｄｉ細胞に対する検出可能なＡＤＣＣ活性は、ＡＬＴ−８０３の添加ありでもなしでも、もたらされなかった。
【０２０１】
また、ＡＬＴ−８０３がヒトＤａｕｄｉ細胞に対するマウス免疫細胞のＡＤＣＣ活性を増大させる能力も調べた。この試験では、ＳＣＩＤマウスにＤａｕｄｉ細胞（１０×１０６／マウス）を試験の０日目（ＳＤ０）に移植し、ＳＤ１５及びＳＤ１８にＡＬＴ−８０３（０．２ｍｇ／ｋｇ）、リツキシマブ（１０ｍｇ／ｋｇ）又はＡＬＴ−８０３（０．２ｍｇ／ｋｇ）＋リツキシマブ（１０ｍｇ／ｋｇ）で処置した。マウスを２回目の処置後４日目に致死させ、脾細胞を調製した。したがって、脾細胞は、インビボ処置の結果、種々の活性化状態を有し得る。次いで脾細胞をＤａｕｄｉ標的細胞とＥ：Ｔ比２０：１で、単独の培地又はリツキシマブ（１０ｎＭ）、ＡＬＴ−８０３（１０ｎＭ）若しくはリツキシマブ（１０ｎＭ）＋ＡＬＴ−８０３（１０ｎＭ）を含む培地のＲＰＭＩ−１０中で混合した。３７℃で２日間のインキュベーション後、Ｄａｕｄｉ標的細胞のバイアビリティを、ＢＤ  ＦＡＣＳＶｅｒｓｅで、バイオレット標識Ｄａｕｄｉ細胞のヨウ化プロピジウム染色の分析によって評価した。図９Ａに示されるように、対照処置マウスに由来する脾細胞に対するＡＬＴ−８０３の添加では、ヒトＤａｕｄｉ細胞に対する抗ＣＤ２０  ｍＡｂ指向性ＡＤＣＣが増大され得た。さらに、ＡＬＴ−８０３でのインビボ刺激により、ヒトＤａｕｄｉ細胞に対する抗ＣＤ２０  ｍＡｂ指向性ＡＤＣＣにおいてより活性な脾細胞がもたらされた。この結果は、ＡＬＴ−８０３での処置によって腫瘍特異的ＡＤＣＣ応答が増強され得ることを示すヒト免疫細胞を用いた所見と整合する。
【０２０２】
ＡＬＴ−８０３が他のヒト腫瘍細胞に対する免疫細胞のＡＤＣＣ活性を増大させる能力を調べた。ＨＥＲ−２は、固形腫瘍、例えば、乳癌及び胃又は胃食道接合部の腺癌の治療用抗体での処置のための確立された標的である。ＨＥＲ−２陽性腫瘍に対するＡＤＣＣ活性に対するＡＬＴ−８０３の効果を評価するため、ＨＥＲ−２を過剰発現しているＳＫ−ＢＲ−３ヒト乳癌細胞株を標的細胞株として使用し、抗ヒトＨＥＲ−２抗体（クローン２４Ｄ２）を腫瘍細胞標的化Ａｂとして使用した。活性化エフェクター細胞を得るため、Ｂａｌｂ／ｃマウスに０．２ｍｇ／ｋｇのＡＬＴ−８０３を試験の（ＳＤ）０日目に静脈内注射した。ＳＤ３にマウスを致死させ、脾臓を収集した。活性化脾細胞をＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔ標識ＳＫ−ＢＲ−３細胞と１０：１のＥ：Ｔ比で混合した。細胞を３７℃で、種々の濃度の抗ＨＥＲ２抗体（クローン２４Ｄ２）、ＡＬＴ−８０３又は両剤を含有するＲ１０培地中で共培養した。２４時間後、細胞混合物を回収し、死細胞をヨウ化プロピジウムで染色した。ＳＫ−ＢＲ−３死細胞のパーセンテージをフローサイトメトリーを用いて調べた。図９Ｂに示されるように、ＳＫ−ＢＲ−３細胞と活性化脾細胞との抗ＨＥＲ２  Ａｂ又はＡＬＴ−８０３のいずれか単独の存在下でのインキュベーションでは、培地対照と比べてＳＫ−ＢＲ−３細胞死はもたらされなかった。しかしながら、ＡＬＴ−８０３（０．０１〜１．０ｎＭ）と抗ＨＥＲ２抗体（クローン２４Ｄ２）（０．１〜１０ｎＭ）の併用処理では、ＳＫ−ＢＲ−３ヒト乳癌細胞に対する脾臓免疫細胞のＡＤＣＣ活性が有意に増大した。この結果により、ＡＬＴ−８０３は、治療が確立されたいくつかの異なる疾患標的に対するＡＤＣＣ応答を増大させ得ることが確認される。
【実施例３】
【０２０３】
実施例３：腫瘍担持マウスにおけるＡＬＴ−８０３＋腫瘍特異的抗体での処置の抗腫瘍活性
ＡＬＴ−８０３が抗ＣＤ２０  ｍＡｂの抗腫瘍活性を増大させる能力を、Ｄａｕｄｉ腫瘍を担持させたＳＣＩＤマウスにおいてさらに評価した。このマウスは、おそらく腫瘍に対するＡＤＣＣ応答を媒介する機能性のＮＫ細胞を有している。この試験のため、Ｆｏｘ  Ｃｈａｓｅ  ＳＣＩＤ雌マウス（Ｈａｒｌａｎ，Ｃ．Ｂ−１７／ＩｃｒＨｓｄ−Ｐｒｋｄｃ−ｓｃｉｄ：６週齢）にＤａｕｄｉ細胞（１０×１０６／マウス）（３マウス／群）を静脈内（ｉ．ｖ．）移植した。腫瘍担持マウスをＰＢＳ、ＡＬＴ−８０３（０．２ｍｇ／ｋｇ）、リツキシマブ（１０ｍｇ／ｋｇ）又はＡＬＴ−８０３（０．２ｍｇ／ｋｇ）＋リツキシマブ（１０ｍｇ／ｋｇ）で、腫瘍移植後１５日目及びその３日後にｉ．ｖ．処置した。２回目の処置の４日後にマウスを致死させ、骨髄中のＤａｕｄｉ細胞レベルを調べた。大腿骨の骨髄細胞のうちのＤａｕｄｉ細胞のパーセンテージを、ＰＥコンジュゲート抗ヒトＨＬＡ−ＤＲ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）での染色及びフローサイトメトリー分析後に評価した。図１０に示す結果は、ＡＬＴ−８０３及び抗ＣＤ２０  ｍＡｂの単独療法で、腫瘍担持マウスの骨髄中のＤａｕｄｉ細胞のパーセンテージが低減され得ることを示す。しかしながら、ＡＬＴ−８０３＋抗ＣＤ２０  ｍＡｂの併用で最も大きな抗腫瘍活性がもたらされ、骨髄のＤａｕｄｉ細胞は、対照マウスにおける３８％からＡＬＴ−８０３＋リツキシマブ処置マウスにおける５％まで低減された。このモデルでの用量応答試験により、０．０２ｍｇ／ｋｇという少ないＡＬＴ−８０３で抗ＣＤ２０  ｍＡｂの抗腫瘍活性が増大され得ることが確認された（図１１）。
【０２０４】
また、ＡＬＴ−８０３＋抗ＣＤ２０  ｍＡｂがＤａｕｄｉ細胞腫瘍を担持しているマウスの生存率を改善する能力も評価した。この試験のため、Ｆｏｘ  Ｃｈａｓｅ  ＳＣＩＤ雌マウスにＤａｕｄｉ細胞（１０×１０６／マウス）を静脈内（ｉ．ｖ．）移植した。腫瘍担持マウスをＰＢＳ、ＡＬＴ−８０３（最適下限の０．０５ｍｇ／ｋｇ）、リツキシマブ（１０ｍｇ／ｋｇ）又はＡＬＴ−８０３（０．０５ｍｇ／ｋｇ）＋リツキシマブ（１０ｍｇ／ｋｇ）で、腫瘍移植後１５日目及びその３日後にｉ．ｖ．処置した。マウスの生存率（後肢麻痺に基づく疾患率を含む）をモニタリングした。図１２に示されるように、ＰＢＳ、最適下限のＡＬＴ−８０３及びリツキシマブでの単独療法群の腫瘍担持マウスでは２６〜３０日の生存期間中央値が示されたが、最適下限のＡＬＴ−８０３＋リツキシマブで処置したマウスは５０日間を超える平均生存期間を有しており、併用療法により、Ｂ細胞リンパ腫を担持しているマウスの生存期間が有意に長くなることを示す。総合すると、この結果により、インビボでのＡＬＴ−８０３と腫瘍特異的抗体との併用の相乗的抗腫瘍効果が確認される。また、ＡＬＴ−８０３＋抗ＣＤ２０  ｍＡｂの併用では、上記の試験の腫瘍担持動物においてなんら有意な毒性の徴候が引き起こされなかったことも注目に値し、これは、この併用の耐容性が良好であることを示す。
【実施例４】
【０２０５】
実施例４：腫瘍担持マウスにおけるＡＬＴ−８０３の免疫チェックポイントブロッカーとの併用での抗腫瘍活性
免疫チェックポイントブロッカー、例えば、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＬＡＧ−３、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ−３、ＶＩＳＴＡ、ＩＤＯ、Ａ２ａＲ、ＨＶＥＭ、ＫＩＲｓ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＥＡＣＡＭ−１、２Ｂ４、ＣＤ２００Ｒ及びそのリガンド並びに本明細書に記載の他の標的に対する抗体により、免疫抑制シグナルを阻害することによって免疫応答を向上させることが可能であり得る。上記のように、ＡＬＴ−８０３は、ＮＫ細胞とＴ細胞の増殖及び活性を向上させる免疫賦活分子である。しかしながら、その有効性は、阻害性チェックポイント及び免疫応答を減弱させ得る経路によって制限される場合があり得る。このような負の調節因子を排除してＡＬＴ−８０３の活性を増強させるストラテジーにより、治療上の有益性がもたらされ得よう。
【０２０６】
ＡＬＴ−８０３のＣＴＬＡ−４−ＣＤ８０／ＣＤ８６経路のブロックとの併用での抗腫瘍活性を調べるため、ＣＴ２６マウス結腸癌細胞株をｉ．ｖ．注射したＢＡＬＢ／ｃマウスを用いて肺転移モデルを作製した。４〜６匹のマウスの群に２×１０５個のＣＴ２６腫瘍細胞を０日目（ＳＤ０）にｉ．ｖ．注射した。ＡＬＴ−８０３群では、各マウスに４μｇのｉ．ｖ．ＡＬＴ−８０３を週２回、２週間（ＳＤ１に開始）投与した。ＡＬＴ−８０３とともに、一部のマウスには抗ＰＤ−Ｌ１抗体（Ａｂ）（クローン９Ｇ２）、抗ＣＴＬＡ−４（クローンＵＣ１０−４Ｆ１０−１１）Ａｂ又は両方のいずれかを、１００μｇ／注射（／Ａｂ）のｉ．ｖ．投与で週２回、２週間（ＳＤ１に開始）投与した。組換えヒトＩＬ−１５群では、各マウスに５μｇのＩＬ−１５を腹腔内（ｉ．ｐ．）に毎日、週５回、２週間（ＳＤ１に開始）投与した。ＩＬ−１５とともに、動物には、抗ＰＤ−Ｌ１  Ａｂと抗ＣＴＬＡ−４  Ａｂ（１００μｇ／注射）の両方のｉ．ｖ．処置もまた、ＳＤ１、ＳＤ４、ＳＤ８及びＳＤ１１に行った。対照マウスにはＰＢＳの注射を行った。マウスを毎日、有効性のエンドポイントとしての生存期間について評価した。
【０２０７】
図１３に示されるように、ＣＴ２６腫瘍を担持しているＢＡＬＢ／ｃマウスの生存期間中央値は試験にもよるが１５〜２０日間であった。ＡＬＴ−８０３単独での処置では、対照群と比べた場合、腫瘍担持マウスの生存期間が有意に長期化した。ＡＬＴ−８０３に抗ＰＤ−Ｌ１  Ａｂでの処置を加えても、これらのマウスにおける生存期間は改善されないようであった。対照的に、ＡＬＴ−８０３と抗ＣＴＬＡ４  Ａｂの併用（抗ＰＤ−Ｌ１  Ａｂあり、又はなし）では、ＣＴ２６腫瘍担持マウスの生存期間がＰＢＳ群及びＡＬＴ−８０３群と比べて有意に長くなった。この腫瘍モデルにおける以前の研究では、抗ＣＴＬＡ４  Ａｂ単独療法では生存期間は改善されないことが示されていた。したがって、ＡＬＴ−８０３と抗ＣＴＬＡ４  Ａｂの併用（抗ＰＤ−Ｌ１  Ａｂはなし）は、腫瘍担持マウスにおける生存期間の長期化によって測定されるように、より有効な抗腫瘍応答をもたらすのに相乗的に作用する。
【０２０８】
ＡＬＴ８０３との併用のＰＤ−１−ＰＤ−Ｌ１ブロックの効果を、免疫適格Ｃ５７ＢＬ／６マウスの５Ｔ３３Ｐ骨髄腫モデルにおいてさらに評価した。５匹のマウスの群に１×１０７個の５Ｔ３３Ｐ腫瘍細胞をＳＤ０にｉ．ｖ．注射した。処置はＳＤ４に開始した。ＩＬ−１５群では、各マウスに５μｇのＩＬ−１５をｉ．ｖ．でＳＤ４及びＳＤ１１に投与した。ＩＬ−１５とともに、一部の動物には抗ＰＤ−Ｌ１  Ａｂ（クローン９Ｇ２，２００μｇ／マウス／ｉ．ｐ．注射）又は抗ＣＴＬＡ−４  Ａｂ（クローンＵＣ１０−４Ｆ１０−１１，２００μｇ／マウス／ｉ．ｐ．注射）もまた週１回、それぞれＳＤ４とＳＤ１１に投与した。ＡＬＴ−８０３群では、各マウスに１μｇ／マウス／注射の最適下限のＡＬＴ−８０３の２回のｉ．ｖ．注射をＳＤ４とＳＤ１１に行った。ＡＬＴ−８０３とともに、一部のマウスには、抗ＰＤ−Ｌ１  Ａｂ、抗ＣＴＬＡ−４  Ａｂ又は両方の抗体のいずれかを上記に示したとおりに投与した。さらに、マウスの群に、抗ＰＤ−Ｌ１  Ａｂ又は抗ＣＴＬＡ−４  Ａｂの単独療法を行い、ＰＢＳの注射を行った。マウスを毎日、試験のエンドポイントとしての生存期間及び／又は両後肢の完全麻痺について評価した。図１４Ａに示されるように、５Ｔ３３Ｐ腫瘍を担持しているＣ５７ＢＬ／６マウスの生存期間中央値は２４日であった。最適下限用量のＡＬＴ−８０３での処置では動物の生存期間は有意に変化しなかったが、最適下限のＡＬＴ−８０３＋抗ＰＤ−Ｌ１  Ａｂの投与では、この試験群の全動物で少なくとも５０日間の生存期間がもたらされた。対照的に、ＡＬＴ−８０３と抗ＣＴＬＡ４  Ａｂの併用では、マウスの生存期間は有意に長くならなかった。さらに、どちらも最適下限のレベルのＡＬＴ−８０３と抗ＰＤ−Ｌ１  Ａｂを単独療法として、及び併用して試験した場合、５Ｔ３３Ｐ腫瘍を担持しているＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて、ＡＬＴ−８０３＋抗ＰＤ−Ｌ１  Ａｂでの処置後、いずれかの単独療法で処置したマウスと比べて有意に長い生存期間が観察された（図１４Ｂ）。したがって、ＡＬＴ−８０３＋抗ＰＤ−Ｌ１  Ａｂの併用により、骨髄腫腫瘍を担持しているマウスにおいて相乗的抗腫瘍活性がもたらされる。
【０２０９】
ＡＬＴ−８０３併用療法薬のこれらの２つのモデルにおける相違する活性をよりよく理解するため、腫瘍細胞株を、ＰＤ１及びＣＴＬＡ４受容体のリガンドについて染色した。図１５に示されるように、ＣＴ２６細胞は、ＣＴＬＡ４に対するリガンドを発現しているが、ＰＤ１に対するリガンドは発現していない。対照的に、５Ｔ３３Ｐ腫瘍細胞は、ＰＤ−Ｌ１を発現しているが、ＣＴＬＡ４に対するリガンドは発現していない。この結果は、これらの各腫瘍モデルにおける抗ＣＴＬＡ４及び抗ＰＤ−Ｌ１  ＡｂとＡＬＴ−８０３との併用の抗腫瘍活性と整合し、免疫チェックポイント受容体のリガンドを有する腫瘍の染色は、ＡＬＴ−８０３＋免疫チェックポイントブロッカーに対する応答の予測インジケータを示し得ることを示す。
【０２１０】
また、Ｚｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１３  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｒａｄｉａｔ  Ｏｎｃｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｐｈｙｓ．，８６：３４３−９に記載された膠芽腫の確立されたモデルを使用し、ＡＬＴ−８０３単独療法及びＡＬＴ−８０３と抗ＰＤ−１  ｍＡｂとの併用の試験を、膠芽腫細胞株ＧＬ２６１−ｌｕｃが頭蓋内移植されたＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて行った。単独療法としての反復用量のＡＬＴ−８０３（３回若しくは４回用量）又は抗ＰＤ−１  ｍＡｂ（３回用量）での処置（腫瘍移植後、７〜１０日目に開始）では、ＰＢＳ処理対照と比べた場合、同様の抗腫瘍活性の増大及び同様の動物生存期間の長期化が示された。ＡＬＴ−８０３と抗ＰＤ１  ｍＡｂの併用での処置では、腫瘍担持マウスの生存期間中央値の期間がさらに長くなった。さらに、抗ＰＤ−１  ｍＡｂと４回用量のＡＬＴ−８０３との併用では、長期無腫瘍生存個体（移植後＞６０日間）のパーセンテージが、抗ＰＤ−１  Ａｂ及びＡＬＴ−８０３単独療法で処置したマウスで観察された２０％の割合から４０％の割合に増大した。興味深いことに、「治癒した」マウスは再腫瘍負荷刺激に耐性であり、腫瘍に対する処置誘導性免疫記憶応答が示唆される。この結果は、ＡＬＴ−８０３の免疫賦活活性とチェックポイントブロッカー抗ＰＤ−１  Ａｂの組み合わせが、膠芽腫腫瘍担持マウスの生存期間の長期化に有益な効果を有することを示唆する。
【０２１１】
また、ＡＬＴ−８０３＋チェックポイント阻害薬ブロックの組み合わせでは、上記の試験の腫瘍担持動物においてなんら有意な毒性の徴候が引き起こされなかったことも注目に値し、これは、この併用の耐容性が良好であることを示す。
【実施例５】
【０２１２】
実施例５：マウスにおけるＡＬＴ−８０３の毒性
動物におけるＡＬＴ−８０３の安全性プロフィール及び治療指数を評価するため、並びに安全で有効なヒト用量を推定するため、反復用量のＡＬＴ−８０３での処置の毒性試験をマウスとカニクイザルにおいて行った。Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウス（１０匹のマウス／性別／群）に０．１、１．０又は４．０ｍｇ／ｋｇのＡＬＴ−８０３又はＰＢＳを尾静脈から、毎週、連続４週間投与した。最後の注射の４日後（２６日目）、身体検査、血液化学検査、血液検査、肉眼検死、体重及び器官重量の測定並びに組織病理検査を含む評価を行った（５匹のマウス／性別／群）。最後の処置の１４日後（３６日目）、残ったマウスに対して同様の評価を行った。第２の試験において、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウス（１５匹のマウス／性別／群）を０．１又は１．０ｍｇ／ｋｇのＡＬＴ−８０３又はＰＢＳの４回の毎週のｉ．ｖ．注射で処置した。上記のような毒性評価を、最後の注射の４日後（２６日目）（１０匹のマウス／性別／群）又は４週間後（５０日目）（５匹のマウス／性別／群）に行った。
【０２１３】
ＡＬＴ−８０３の安全性プロフィール及び薬力学的プロフィールを、０．１、１．０又は４．０ｍｇ／ｋｇのＡＬＴ−８０３又はＰＢＳを毎週、連続４週間ｉ．ｖ．注射した健常Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウスにおいて評価した。４．０ｍｇ／ｋｇのＡＬＴ−８０３を投与したマウスは、処置開始後４〜２０日の間に毒性の徴候（すなわち、体重減少、脱毛）及び死亡を示した。死後検死では死因は判定されなかったが、観察結果（すなわち、肺水腫、脾腫）はサイトカイン誘導性の致死性炎症応答と整合した。１．０又は０．１ｍｇ／ｋｇのＡＬＴ−８０３で処置したマウスでは死亡は観察されなかった。脾臓重量及び白血球（ＷＢＣ）カウント数の用量依存性増加が最後のＡＬＴ−８０３投与の４日後（２６日目）にみられた（図１６）。ＷＢＣのうち、リンパ球、好中球及び単球の絶対カウント数は各々、１．０ｍｇ／ｋｇのＡＬＴ−８０３で処置したマウスでは対照と比べて８倍より多く増加した。処置の２週間後（３６日目）及び４週間後（５０日目）（図１６Ａ〜図１６Ｆ）、好中球カウント数は、１．０ｍｇ／ｋｇのＡＬＴ−８０３で処置したマウスでは高値のままであったがリンパ球カウント数は対照レベルに戻った。組織病理学的分析により、脾臓、肝臓、胸腺、腎臓、肺及びリンパ節における免疫細胞増殖及びリンパ球浸潤のＡＬＴ−８０３用量依存性刺激が２６日目に、及び度合は低いが３６日目と５０日目に確認された。これらの試験の結果により、マウスにおける１ｍｇ／ｋｇまでの反復用量のＡＬＴ−８０３での処置の耐用量を規定した。
【実施例６】
【０２１４】
実施例６：カニクイザルにおけるＡＬＴ−８０３の毒性、薬力学（ＰＤ）及び薬物動態（ＰＫ）
優良試験所基準（Ｇｏｏｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ）の規定の下、ＡＬＴ−８０３の反復用量のｉ．ｖ．投与の効果を評価するための試験をカニクイザルにおいて行った。動物（５匹のサル／性別／群）を毎週、連続４週間（１、８、１５及び２２日目）、０．０３若しくは０．１ｍｇ／ｋｇのＡＬＴ−８０３で処置するか、又はＰＢＳを約３分間のｉ．ｖ．注射で投与した。試験中の生存期間を通して、動物を、臨床観察結果及び行動の観察結果、食料消費、体重、心臓及び目の機能について評価した。血液検査、化学的評価及び凝固評価（投与前並びに投与後５、２６及び３６日目）並びに免疫細胞分析のために採血した。免疫原性試験のために血清を得、定量的酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）方法を用いてＰＫ解析を行った。尿検査のために採尿した（投与前並びに４、２５及び３５日目）。身体検査、肉眼検死、器官重量測定及び組織病理検査を含む臨床病理学評価を、最後の注射の４日後（２６日目）（３匹の動物／性別／群）及び２週間後（３６日目）（２匹の動物／性別／群）に行った。
【０２１５】
マウスでの耐用量に対するアロメトリックスケーリング側に基づき、０．１及び０．０３ｍｇ／ｋｇのＡＬＴ−８０３の反復用量ｉ．ｖ．処置の活性プロフィール及び毒性プロフィールを健常カニクイザルにおいて評価した。最初の投与後のＰＫ分析により、ＡＬＴ−８０３の１消失半減期はおよそ７．６時間であると推定され、これは、用量レベル間で有意に異ならないようであった（図１７）。０．１ｍｇ／ｋｇのＡＬＴ−８０３の３０ｎＭというＣｍａｘ値は投与用量の完全回収と整合するが、Ｃｍａｘ及びＡＵＣＩＮＦの値は、０．０３ｍｇ／ｋｇ用量での回収が約３０％少ないことを示す。しかしながら、低用量レベルであっても、血清中の６ｎＭというＣｍａｘは、インビトロで免疫細胞の増殖、活性化及び細胞傷害性を刺激することがわかっている０．１ｎＭ濃度より５０倍超高かった。
【０２１６】
４週連続で毎週のＡＬＴ−８０３の注射を受けたサルは、処置期間の最初の２週間で用量依存性の食欲低下を示した。しかしながら、試験中、群間で、平均体重又は他の用量関連の臨床観察結果又は行動の観察結果（あれば）に有意差はなかった。さらに、器官重量は、ＡＬＴ−８０３処置動物において対照と比べて有意に異ならなかった。
【０２１７】
毎週のＡＬＴ−８０３での処置後に観察された最も生物学的に重要な変化は、血中ＷＢＣ及びリンパ球のカウント数の用量依存性増加であった（図１８Ａ〜図１８Ｈ）。４週間の投薬期間の終了時、絶対リンパ球カウント数（ａｂｓｏｌｕｔｅ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｃｏｕｎｔｓ）は、０．１ｍｇ／ｋｇのＡＬＴ−８０３を受けた動物では１．５倍増加し、次いで２週間の回復期間後、対照レベルに戻った。リンパ球サブセットのうち、ＮＫ細胞及びＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔ細胞カウント数の一過性の用量依存性増加が処置後にみられた（図１８Ａ〜図１８Ｆ）。また、血中単球カウント数も、０．１ｍｇ／ｋｇのＡＬＴ−８０３で処置したサルで増加したが、血中好中球レベルは処置群間で異ならなかった。この結果は、報告された主な毒性がグレード３／４の一過的好中球減少症であったマカク属及びアカゲザルに対するＩＬ−１５投与の以前の研究と対照的である。
【０２１８】
血中免疫細胞レベルの変化に加え、最後のＡＬＴ−８０３投与の４日後に実施した組織病理検査に基づいて、ＡＬＴ−８０３で処置したサルの肝臓、腎臓及び肺の軽度の多病巣性リンパ球浸潤の用量依存性増大がみとめられた。また、ＡＬＴ−８０３処置動物では、散在する軽度の肝臓壊死も高頻度でみられた。この時点での臨床化学検査により、ＡＬＴ−８０３高用量群では対照と比べて血清アルブミンの減少が示され（０．１ｍｇ／ｋｇのＡＬＴ−８０１，３．８５±０．１２ｇ／ｄＬ；ＰＢＳ，４．４６±０．１３ｇ／ｄＬ；Ｐ＜０．０１）、これは、肝臓における炎症応答の結果であり得る。しかしながら、血清肝臓酵素レベルは、ＡＬＴ−８０３処置動物では対照と比べて高値ではなかった。ほとんどの動物で骨髄過形成が観察されたが、ＡＬＴ−８０３高用量群の方が重症度は高かった。ＡＬＴ−８０３処置群の大部分の疾患器官の病変部は、処置後２週間までに、発生率及び重症度が低下し、対照動物における所見と整合した。一般的に、この試験で観察された血中及び組織内リンパ球に対するＡＬＴ−８０３媒介性効果は、０．１ｍｇ／ｋｇまでで週２回又は１０〜５０μｇ／ｋｇで毎日のＩＬ−１５で処置した非ヒト霊長類で報告された一過性応答と整合する。
【実施例７】
【０２１９】
実施例７：静脈内及び皮下ＡＬＴ−８０３の比較試験
組換えヒトＩＬ−１５（ｒｈＩＬ−１５）製剤品を用いた進行中の治験で得られているデータは、高Ｃｍａｘ並びに耐容性に影響を及ぼす二次サイトカイン放出（ＩＬ−６及びＩＦＮ−γ）が誘導されるため、静脈内投与はＩＬ−１５に最適でなく、したがって限定的と思われることを示唆している。ＩＬ−２を用いた前臨床試験及び臨床試験では、皮下投与の方が安全であり、ずっと良好な耐容性がもたらされることが示されている。例えば、Ｗａｌｄｍａｎｎ及び同僚らは、連続１２日間の毎日の静脈内ボーラス輸注を用いて、ヒトにおけるｒｈＩＬ−１５の最初の固形腫瘍での治験を実施した（Ｃｏｎｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，３３：７４−８２）。３．０及び１．０μｇ／ｋｇ／日のコホートで観察された用量制限毒性は、グレード３の低血圧症、血小板減少症、及びアラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）とアスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）の上昇であった。最大耐用量（ＭＴＤ）は０．３μｇ／ｋｇ／日と示された。静脈内投与での同じ用量レベルと比べたときのＣｍａｘの低下、及びｒＩＬ−１５製剤品のより持続的な循環レベルの結果、皮下投与での耐容性の増大が予想される。Ｃｍａｘが低下すると、全体的により多くの薬物送達が可能になる。
【０２２０】
このような所見をＡＬＴ−８０３に拡張するため、ＡＬＴ−８０３のｉ．ｖ．（静脈内）及びｓ．ｃ．（皮下）投与を、薬物動態、免疫賦活及び抗腫瘍有効性について評価するための前臨床試験をＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて実施した。０．２ｍｇ／ｋｇのＡＬＴ−８０１で処置したＣ５７ＢＬ／６マウスの初期試験では、ｉ．ｖ．投与では５．３時間及びｓ．ｃ．投与では３．８時間の推定半減期が示された。ＡＬＴ−８０３の最大血清濃度は、ｓ．ｃ．投与後２０時間の時点で６５０ｎｇ／ｍｌ、ｉ．ｖ．投与後２０時間の時点では１７００ｎｇ／ｍｌであった。免疫賦活に関して、ｓ．ｃ．又はｉ．ｖ．で投与されたＡＬＴ−８０３は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞及びＮＫ細胞の増殖を等しく誘導することができた。さらに、ＡＬＴ−８０３のｉ．ｖ．投与及びｓ．ｃ．投与は、同様に免疫細胞を活性化させ、５Ｔ３３骨髄腫担持マウスの骨髄中の腫瘍量を低減させた。０．２ｍｇ／ｋｇまでのＡＬＴ−８０３のｉ．ｖ．投与及びｓ．ｃ．投与はどちらも、正常マウス及び腫瘍担持Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて耐容性が良好であった。
【０２２１】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに毎週４週間ｓ．ｃ．注射した１ｍｇ／ｋｇのＡＬＴ−８０３の毒物学的効果に関する追跡試験では、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを同じＡＬＴ−８０３投薬レジメンでｉ．ｖ．経路を用いて処置した以前の毒物学的試験でみられたものと同様の免疫系関連変化が示された。１ｍｇ／ｋｇのＡＬＴ−８０３の４回の毎週のｓ．ｃ．注射後、マウスの死亡は観察されなかった。若干の体重減少及びＡＬＴ−８０３の最初のｓ．ｃ．注射後に猫背の姿勢が観察されたこと以外、この試験中、被験物質に関連する毒性の臨床徴候は観察されなかった。末梢血の検査により、ＰＢＳ対照と比べてＷＢＣ数及びリンパ球カウント数の増加がみられることが示された。全般的に、ＷＢＣ及びリンパ球の両方について、ＡＬＴ−８０３で処置した動物ではＰＢＳ注射マウスと比べて９倍の増加がみられた。また、好中球、単球、好酸球及び好塩基球の増加も、ｓ．ｃ．ＡＬＴ−８０３処置マウスにおいて観察された。ＡＬＴ−８０３処置マウスの脾臓、リンパ節及び肝臓の重量の有意な増加（それぞれ５．５倍、３倍及び１．３倍）が観察された。免疫細胞の同等の広範ベースの増殖及びリンパ系器官の重量の増加が、反復用量のＡＬＴ−８０３でのｉ．ｖ．処置を受けたマウスについて以前に報告された。
【０２２２】
全般的に、ＡＬＴ−８０３の前臨床試験の結果により、ｓ．ｃ．投与では、ｉ．ｖ．投与と比べてＣｍａｘが低くなるが、免疫賦活活性と抗腫瘍有効性は、毒性が悪化することなく保持されることが示された。
【実施例８】
【０２２３】
実施例８：同所性膀胱腫瘍を担持しているマウスにおけるＡＬＴ−８０３と免疫チェックポイントブロッカーとの併用の抗腫瘍活性
実施例４に記載の試験に加え、ＡＬＴ−８０３と免疫チェックポイントブロッカーとの併用の抗腫瘍活性を、同所性ＭＢ４９ｌｕｃ膀胱腫瘍を担持しているマウスにおいて評価した。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝６／群）に、ポリリシンで膀胱を前処置した後、試験の０日目にＭＢ４９ｌｕｃ細胞（３×１０４個の細胞／膀胱）を膀胱内点滴した。ＰＢＳ、ＡＬＴ−８０３（０．２ｍｇ／ｋｇ，ｉ．ｖ．）又はＡＬＴ−８０３（０．２ｍｇ／ｋｇ）＋抗ＰＤ−Ｌ１及び抗ＣＴＬＡ４  Ａｂ（各々、１００μｇ／注射，ｉ．ｐ．で）を、ＭＢ４９ｌｕｃ腫瘍細胞の点滴後、７、１０、１４及び１７日目に投与した。マウスを、有効性エンドポイントとしての処置群間生存率を評価するために維持した。ＡＬＴ−８０３での処置により、ＭＢ４９ｌｕｃ担持マウスの生存期間がＰＢＳと比べて有意に長くなった（図１９Ａ）。しかしながら、ＡＬＴ−８０３と抗ＰＤ−Ｌ１及び抗ＣＴＬＡ４  Ａｂとの併用では、単独療法の対照と比べて生存期間がさらに長くなった。この効果は、ＡＬＴ−８０３＋抗ＰＤ１及びＡＬＴ−８０３＋抗ＰＤ１／抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂの併用療法でもみられた（図１９Ｂ）。
【０２２４】
さらに、ＡＬＴ−８０３＋抗ＰＤ−Ｌ１／抗ＣＴＬＡ４  Ａｂ療法によって腫瘍が治癒したマウスは、さらなる薬物処置なしでも膀胱再腫瘍負荷刺激に耐性であったが、処置未経験の年齢適合マウスでは、腫瘍細胞の点滴後、腫瘍が発生して死亡した（図１９Ａ）。この結果は、ＡＬＴ−８０３の単独療法並びに抗ＰＤ−Ｌ１、抗ＰＤ−１及び抗ＣＴＬＡ４  Ａｂとの併用療法が膀胱腫瘍担持マウスの処置（治癒的応答を含む）に有効であったこと、並びにＡＬＴ−８０３／抗ＰＤ−Ｌ１／抗ＣＴＬＡ４  Ａｂ併用療法により、その後の腫瘍負荷刺激に対する免疫記憶応答がもたらされたことを示す。また、ＡＬＴ−８０３＋チェックポイント阻害薬ブロックの併用では、上記の試験の腫瘍担持動物においてなんら有意な毒性の徴候が引き起こされなかったことも注目に値し、これは、この併用の耐容性が良好であることを示す。図２０に示されるように、ＭＢ４９ｌｕｃ細胞は、ＣＴＬＡ４及びＰＤ−１のリガンドを発現している。そのため、この結果は、この腫瘍モデルにおける抗ＣＴＬＡ４、抗ＰＤ−１及び抗ＰＤ−Ｌ１  ＡｂとＡＬＴ−８０３との併用の抗腫瘍活性と整合する。
【実施例９】
【０２２５】
実施例９：マウス黒色腫モデルにおけるＡＬＴ−８０３と抗ｇｐ７５抗体ＴＡ９９の併用療法
同系Ｃ５７ＢＬ／６マウスの皮下Ｂ１６Ｆ１０黒色腫腫瘍モデルを使用し、固形腫瘍に対するＡＬＴ−８０３＋腫瘍抗原特異的治療用抗体の有効性をさらに評価した。また、このモデルは、確立された腫瘍及び再腫瘍負荷刺激に対するＴ細胞及び他の免疫細胞の活性も評価されるという利点を有する。標的療法のための重要な黒色腫特異的抗原の一例は、メラノソームにおけるメラニン合成に関与している７５ｋＤａのタンパク質であるｇｐ７５（ＴＹＲＰ−１，チロシナーゼ関連タンパク質−１）である（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．１９９４．ＥＭＢＯ  Ｊ．１３：５８１８−２５）。ＴＡ９９（マウスＩｇＧ２ａ）は、ヒト及びマウスｇｐ７５に特異的なモノクローナル抗体（ｍＡｂ）である（Ｔｈｏｍｓｏｎ  ＴＭ，ｅｔ  ａｌ．１９８５．Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．８５：１６９−７４）。この抗体での処置により、同系マウスのマウス皮下Ｂ１６Ｆ１０黒色腫が、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の活性化によって有効に排除される（Ｈａｒａ  Ｉ，ｅｔ  ａｌ．１９９５．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１８２：１６０９−１４）。
【０２２６】
本明細書に記載の実験は、この活性がＡＬＴ−８０３との併用によってさらに増大され得るかどうかを調べ、抗腫瘍有効性を担う免疫応答を評価するために設計した。一般に、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＨｓｄマウス（７週齢の雌）の背側下脇腹に、２×１０５個のＢ１６Ｆ１０腫瘍細胞（２００μＬのＰＢＳ中）を試験の０日目（ＳＤ０）にｓ．ｃ．注射した。この試験では、再腫瘍負荷刺激を除くすべての実験で、処置は、週２回、２週間（試験の１０、１４、１７、２１及び２４日目に）行い、動物の７５％より多くが触知できるＢ１６Ｆ１０腫瘍を有した時点のＳＤ１０から開始した。より具体的には、マウスを群に分け、２００μＬのＰＢＳ（ｉ．ｖ．）（ビヒクル対照）、０．２ｍｇ／ｋｇのＡＬＴ−８０３（ｉ．ｖ．）、１０ｍｇ／ｋｇのＴＡ９９（ｉ．ｖ．）、１００μｇ／マウスの抗ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ  １０Ｆ．９Ｇ２（ｉ．ｐ．）、或いはＡＬＴ−８０３、ＴＡ９９及び／又は１０Ｆ．９Ｇ２の併用療法薬を注射した。枯渇実験では、２００μｇ／マウスの枯渇抗体（抗ＣＤ４  ＧＫ１．５、抗ＣＤ８ａ  ５３．６．７２及び抗ＮＫ１．１  ＰＫ１３６）を１週間毎に１回ｉ．ｐ．注射するか、又は１００μＬ／マウスのＣｌｏｐｈｏｓｏｍｅ（マクロファージ枯渇用のクロドネート負荷リポソーム）を４日毎に１回ｉ．ｐ．注射し、それぞれ、ＳＤ３及びＳＤ９から開始し、実験のエンドポイントまで行った。再腫瘍負荷刺激を伴う実験では、１０ｍｇ／ｋｇのＴＡ９９（ｉ．ｖ．）を週３回投与し、０．２ｍｇ／ｋｇのＡＬＴ−８０３（ｉ．ｖ．）を週１回、３週間投与した（ＳＤ０から開始）。約３ヶ月後、腫瘍初期負荷刺激で生き残った無腫瘍マウスの反対側に、２×１０５個のＢ１６Ｆ１０腫瘍細胞（２００μＬのＰＢＳ中）をｓ．ｃ．注射した。腫瘍体積を、処置の初日から開始して終了時まで毎日測定し、式１／２（長さ×幅２）を用いて計算した。一方向の寸法が＞２０ｍｍの腫瘍細胞量を担持しているマウスを致死させ、死亡としてカウントした。触知できる腫瘍がないか、又は＜５０ｍｍ３の安定なｓ．ｃ．量を有するマウスは無腫瘍としてカウントした。
【０２２７】
初期試験では、確立された腫瘍を担持しているマウス（ｎ＝８）を、ＴＡ９９、ＡＬＴ−８０３、ＴＡ９９＋ＡＬＴ−８０３又はＰＢＳ対照で週２回、２週間処置した（図２１Ａ）。治療的介入の遅れのため、いずれの処置群でも腫瘍退縮は観察されなかった。しかしながら、腫瘍の進行は、ＴＡ９９（ｐ＜０．００１）及びＡＬＴ−８０３（ｐ＜０．００１）により、ＰＢＳ処置群と比べて有意に抑止された。併用療法により、いずれかの単独療法と比べて腫瘍成長の阻害の有意な増強（ｐ＜０．００１）がもたらされ、ＡＬＴ−８０３によって腫瘍に対する抗体依存性免疫のさらなる防御がもたらされることが示唆される。
【０２２８】
どの免疫細胞サブセットがＡＬＴ−８０３／ＴＡ９９媒介性抗黒色腫免疫を担っているのかを調べるため、処置過程の前及び処置過程中に、細胞型特異的抗体又はリポソームの腹腔内投与によってＴリンパ球、ＮＫ細胞及びマクロファージを枯渇させた。ＣＤ８＋  Ｔ細胞、ＮＫ細胞及びマクロファージを枯渇させると、併用療法による腫瘍成長の阻害が有意に低下し（ｐ＜０．００１；図２１Ｂ）、３つの細胞サブセットすべてがＡＬＴ−８０３とＴＡ９９の有効性に寄与していることが示唆される。驚くべきことに、ＣＤ４＋  Ｔ細胞の枯渇は、枯渇なしのＡＬＴ−８０３＋ＴＡ９９処置群と比べて、腫瘍阻害の有意な増強を引き起こしただけでなく（ｐ＜０．００１；図２１Ｂ）、動物の生存率の有意な増大も引き起こした（ｐ＜０．０１；図２１Ｃ）。ＣＤ４＋  Ｔ細胞が免疫調節機能に大きく関与していることを考慮すると、この所見により、この細胞（又はＣＤ４＋  Ｔ細胞サブセット）は、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍に対する初期のＡＬＴ−８０３／ＴＡ９９媒介性免疫において免疫反応性ではなく免疫抑制性であることが示唆される。
免疫細胞に対する処置の効果を、Ｂ１６Ｆ１０黒色腫腫瘍を担持しているマウスから投与治療の３日後に収集した脾細胞及び腫瘍浸潤白血球（ＴＩＬ）において調べた。ＡＬＴ−８０３投与後、ＰＢＳ対照と比べて、ＣＤ８＋  Ｔ細胞集団及びＮＫ細胞集団の増加、並びにＣＤ４＋  Ｔ細胞集団、Ｂ細胞集団及びマクロファージ集団の減少がみられた（図２２Ａ及び図２２Ｂ）。予測通り、ＴＡ９９では、腫瘍関連マクロファージの少量の低減が引き起こされたこと以外、免疫細胞サブセットのパーセンテージは脾細胞又はＴＩＬのいずれにおいても変化しなかった。ＡＬＴ−８０３／ＴＡ９９併用では、免疫細胞集団においてＡＬＴ−８０３単独と同様の変化が示された。ＡＬＴ−８０３は、単独又はＴＡ９９との併用で、脾細胞とＴＩＬの両方のデータによって裏付けられるように、ＣＤ８＋  Ｔ細胞の記憶表現型（ＣＤ４４ｈｉｇｈ）の有意な増加をもたらした（図２２Ｃ及び図２２Ｄ）。ＴＩＬのＣＤ８＋ＣＤ４４ｈｉｇｈ  Ｔ細胞集団のベースラインは脾臓のこの細胞集団よりも２倍多いため、記憶ＣＤ８＋  Ｔ細胞のＡＬＴ−８０３媒介性増殖は、ＴＩＬではあまり目立たなかった（１．２倍，ｐ＜０．０１に対して脾臓では２．５倍，ｐ＜０．００１）。ＴＡ９９では、ＴＩＬにおける記憶ＣＤ８＋  Ｔ細胞のパーセンテージがわずかに低下し（ｐ＜０．０５）、おそらく、より多くのエフェクターＣＤ８＋  Ｔ細胞が、黒色腫に対する抗体依存性免疫に関与するよう推進されたためである。
【０２２９】
ＡＬＴ−８０３増強性免疫記憶が腫瘍細胞に対する長期免疫の改善に寄与し得るかどうかを評価するため、ＡＬＴ−８０３＋ＴＡ９９での処置を試験の０日目に、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍を負荷刺激したマウスの治癒を試みて開始した。この処置レジメンでは、ＴＡ９９療法にＡＬＴ−８０３を加えても、ＳＤ６０に無腫瘍動物のパーセンテージの中程度の増大が観察されたこと以外、動物の生存率の改善はもたらされなかった（図２３Ａ）。しかしながら、ＡＬＴ−８０３＋ＴＡ９９群の生存マウスにＢ１６Ｆ１０細胞で再負荷刺激すると、処置未経験の年齢適合マウスと比べた場合、腫瘍発生の有意な遅延が観察された（図２３Ｂ）。このような所見は、ＡＬＴ−８０３での事前処置により免疫細胞応答が誘導され、これは、その後の再腫瘍負荷刺激に供された動物の「ワクチン的」防御に極めて重要であるという仮説を支持する。どの細胞がこの防御的効果に関与しているかを評価するため、枯渇試験を、腫瘍細胞での再負荷刺激前のＡＬＴ−８０３＋ＴＡ９９「治療」マウスにおいて実施した。その結果により、ＰＢＳを投与したＡＬＴ−８０３＋ＴＡ９９「治療」マウスは再Ｂ１６Ｆ１０腫瘍負荷刺激から防御されたままであるが、ＣＤ８、ＣＤ４又はＮＫ細胞を枯渇する抗体で処置したこれらの「治療」マウスでは、皮下への再Ｂ１６Ｆ１０腫瘍負荷刺激による死亡に対する免疫防御は示されないことが示された（図２３Ｃ）。この結果は、これらの細胞型すべてが、最初の腫瘍移植後にＡＬＴ−８０３＋ＴＡ９９での処置によって媒介される防御的効果に関与していることを示す。
【０２３０】
また、免疫細胞活性化の役割及びＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１軸も、このモデルにおいて評価した。単回用量のＡＬＴ−８０３は、腫瘍浸潤ＣＤ４＋  Ｔ細胞のＣＤ２５＋細胞を上方調節した（ｐ＜０．０５）が、ＴＡ９９はこの活性化マーカーを下方調節した（ｐ＜０．０１；図２４Ａ）。さらに、ＡＬＴ−８０３での処置では、ＣＤ４＋  Ｔ細胞上のＰＤ−Ｌ１発現が、末梢（ｐ＜０．００１；図２４Ｂ）及び腫瘍内（ｐ＜０．０１；図２４Ｃ）の両方で有意に増大した。ＴＡ９９での処置では、ＴＩＬのみでＣＤ４＋  Ｔ細胞上のＰＤ−Ｌ１発現の若干の低減がもたらされ（ｐ＜０．０５）、ＡＬＴ−８０３を伴うＴＡ９９は、ＡＬＴ−８０３単独の影響を変えるのに充分でなかった。したがって、ＡＬＴ−８０３及びその治療用抗体との併用の有効性は、おそらく、ＣＤ４＋  Ｔ細胞によって強化された免疫チェックポイント阻害経路によって制限されている可能性がある。
【０２３１】
また、ＣＤ８＋  Ｔ細胞上のＰＤ−１発現に対するＡＬＴ−８０３の効果も、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍担持マウスにおいて評価した。単回用量のＡＬＴ−８０３により、ＰＢＳ対照と比べて脾臓ＣＤ８＋  Ｔ細胞上のＰＤ−１発現の中程度の低減がもたらされ、未処置マウスに近いレベルまで回復した（図２４Ｃ）。また、ＡＬＴ−８０３、ＴＡ９９及びＡＬＴ−８０３＋ＴＡ９９併用療法ではすべて、腫瘍浸潤ＣＤ８＋  Ｔ細胞上のＰＤ−１発現が約３倍低減された（図２４Ｄ）。
【０２３２】
ＩＬ−１５の重要な抗腫瘍作用機序の１つは、ＮＫ細胞の活性化によるものである。ＮＫ細胞上の活性化マーカーＫＬＲＧ１を調べると、Ｂ１６Ｆ１０黒色腫は、免疫原性は不充分であるが、脾臓ＮＫ細胞上のＫＬＲＧ１の中程度の増加を誘導し得ることがわかった（ｐ＜０．０５；図２５Ａ）。ＡＬＴ−８０３での処置により、脾臓におけるＮＫ細胞の活性化はさらに増大し（ｐ＜０．０５；図２５Ａ）、より重要なことには、腫瘍浸潤ＮＫ細胞上のＫＬＲＧ１発現の大きな増大が引き起こされる（４倍，ｐ＜０．００１；図２５Ｂ）。これは、なぜＡＬＴ−８０３が、ＮＫ細胞が応答に関与している主要な免疫細胞であるＢ１６Ｆ１０腫瘍に対するＴＡ９９媒介性ＡＤＣＣを有効に追加刺激し得るのかの説明となるかもしれない。ＣＤ８＋  Ｔ細胞と同様、ＡＬＴ−８０３もまた、脾臓（ｐ＜０．０１；図２５Ｃ）及び腫瘍（ｐ＜０．０５；図２５Ｄ）のＮＫ細胞上のＰＤ−１発現を下方調節し、ＡＬＴ−８０３がチェックポイント経路による阻害を、さらなるチェックポイントブロックに関係なく、ＣＤ８＋  Ｔ細胞及びＮＫ細胞のＰＤ−１アームによって内因的に減弱させているのかもしれないことが示唆される。
【０２３３】
チェックポイントブロックによってＡＬＴ−８０３とＴＡ９９のコンビナトリアル抗腫瘍機能がさらに増強され得るかどうかを探索するため、確立されたＢ１６Ｆ１０腫瘍を担持しているマウス（ｎ＝８）を、ＡＬＴ−８０３＋ＴＡ９９で、抗ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ  １０Ｆ．９Ｇ２とともに、及びなしで遅延介入モデルにおいて処置した（図２６Ａ）。抗ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ単独では、腫瘍成長が少量倍数低速化した（ｐ＜０．０５）。したがって、Ｂ１６Ｆ１０細胞はインビトロ及びインビボともに、ＰＤ−Ｌ１を構成的に発現させるという観察結果にもかかわらず（図２６Ｂ）、抗ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂは、このモデルにおいて黒色腫成長の阻害に対する強力な単独療法薬になり得なかった。腫瘍成長曲線から判断すると、ＡＬＴ−８０３＋ＴＡ９９と抗ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂとの併用では、ＡＬＴ−８０３＋ＴＡ９９療法と比べた場合、より大きな抗腫瘍活性が示された（ｐ＜０．０５）。
【０２３４】
全般的に、これらの試験の結果は、ＡＬＴ−８０３を腫瘍特異的抗体と併用すると抗腫瘍活性がもたらされ得、確立された固形腫瘍を担持しているマウスの生存期間が長くなり得ることを示す。また、この処置により、さらなる再腫瘍負荷刺激に対する免疫防御ももたらされる。このような効果は、処置に応答して活性化されて増殖するＮＫ細胞及びＴ細胞によって媒介される。さらに、チェックポイント阻害薬との治療的併用により、ＡＬＴ−８０３＋腫瘍特異的抗体レジメンの抗腫瘍有効性がさらに増大され得る。その結果、ＡＬＴ−８０３単独療法及びＡＬＴ−８０３併用療法ストラテジーは、新生物に対する種々の処置アプローチ、例えば、補助、術前補助、誘導、強化、維持、ファーストライン、セカンドライン以降の処置及び手術、放射線又は化学療法との併用に適用可能である。
【０２３５】
また、ＡＬＴ−８０３単独或いは抗腫瘍抗体及び／又はチェックポイント阻害薬ブロックとの併用では、上記の試験の腫瘍担持動物においてなんら有意な毒性の徴候が引き起こされなかったことも注目に値し、これは、この併用の耐容性が良好であることを示す。
【実施例１０】
【０２３６】
実施例１０：悪性腫瘍を有する患者でのＡＬＴ−８０３の臨床試験
ＡＬＴ−８０３は、悪性腫瘍を有する患者において、以下のとおりに評価中である。
【０２３７】
ＡＬＴ−８０３の多施設臨床試験が、転移性黒色腫及び他の固形腫瘍を有する患者で進行中である。この試験は用量漸増試験として実施中であり、ＡＬＴ−８０３の最大耐用量（ＭＴＤ）又は至適生物学的用量（Ｏｐｔｉｍｕｍ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｄｏｓｅ）（ＯＢＤ）を決定するため、各１名の患者を最初の２つのコホートに登録し、最低３名の患者を最後の３つのコホートに登録する。登録患者は、４回の毎週のＡＬＴ−８０３の静脈内投与の後、２週間の休薬期間からなる２回の６週間サイクルを受ける。疾患が安定しているか、又は疾患に便益がある患者を、さらに２回までの６週間サイクルを受けるのに適格とする。１名の患者を、０．３μｇ／ｋｇのＡＬＴ−８０３用量レベルに登録した。報告された治験薬に起因する有害事象は一過性の微熱、硬直（ｒｉｇｏｒ）、悪心及び嘔吐であった。次の患者を０．５μｇ／ｋｇ用量レベルに登録した。報告された有害事象はすべて、軽度から中程度の、例えば、悪心、倦怠感及び掻痒であった。３名の患者を登録し、１μｇ／ｋｇのＡＬＴ−８０３用量レベルでの試験処置を完了させた。これらの患者について報告された有害事象はすべて、軽度から中程度の、例えば、悪寒、便秘の悪化及び高血圧であった。この治験の試験プロトコルを、腎細胞癌、非小細胞肺癌及び頭頸部扁平上皮癌を含むように補正した。腎細胞癌を有する１名の患者を含む３名の患者を３μｇ／ｋｇ用量レベルに登録した。これまでに報告されている有害事象は軽度から中程度の、例えば、発熱、倦怠感、嘔吐及び筋肉痛であった。これらのＡＬＴ−９０３処置患者のいずれにおいても、用量制限毒性、グレード３／４の毒性又は重症有害事象はみとめられておらず、これは、この処置の耐容性が良好であったことを示す。疾患の安定化が一部の患者で報告されており、処置媒介性の臨床的有益性（例えば、腫瘍量、疾患進行若しくは再発若しくは毒性の低減、又は無増悪生存期間、進行までの期間、応答の持続期間、生存期間若しくは生活の質の増大）が期待される。
【０２３８】
ＡＬＴ−８０３の多施設臨床試験が、自家幹細胞移植（ＡＳＣＴ）後に再発した造血器の悪性腫瘍を有する患者で進行中である。この試験の第１フェーズは、毒性に関する用量漸増の標準的な３＋３設計で実施中である。登録患者は、週に１回、４週間投与されるＡＬＴ−８０３静脈内投与を受ける。６名の患者が登録されており、１μｇ／ｋｇのＡＬＴ−８０３用量レベルでの試験処置を完了させた。最初の３名の患者について、報告された治験薬に起因する有害事象は発熱、悪寒、硬直及び浮腫であった。ＡＬＴ−８０３投与のおよそ４〜５時間後にグレード１の発熱が２名の患者に起こり、次いで、ＡＬＴ−８０３投与のおよそ６〜７時間後におさまった。グレード２の硬直が２名の患者に起こり、グレード２の悪寒が２名の患者に起こり、グレード１の悪寒が１名の患者に起こった。１名の患者のグレード２の硬直には、４回のＡＬＴ−８０３投与のうち３回でデメロールが必要とされた。１名の患者にはグレード２の浮腫が起こり、別の患者にはグレード１の浮腫が起こった。最初の３名の患者には無症候性の低血圧症が起こったが、点滴療法後、低血圧症エピソードが再発することなく患者は正常血圧になった。いずれの処置患者にも、輸液による事前の水分補給は行わなかった。また、２回目のＡＬＴ−８０３投与後、グレード２の皮膚発疹も１名の患者において観察され、これは移植片対宿主病と整合した。４人目、５人目及び６人目の患者も試験処置を受け、報告された有害事象（ＡＥ）はなかった。３名の患者は３μｇ／ｋｇのＡＬＴ−８０３用量レベルで試験処置を完了させた。患者は各投与前に水分補給を受け、報告された有害事象としては、ＡＬＴ−８０３投与の６時間後と１０時間後のグレード１の発熱と悪寒が挙げられる。３名の患者を登録し、６μｇ／ｋｇのＡＬＴ−８０３用量レベルでの処置を完了させた。このコホートで報告された最も一般的な有害事象としては、軽度から中程度の発熱、硬直及び流感様症状が挙げられる。２名の患者が１０μｇ／ｋｇのＡＬＴ−８０３用量レベルで処置されている。第１の患者についてＡＬＴ−８０３の最初の投与後に報告された有害事象としては、一過性の発熱、悪心及び嘔吐が挙げられる。有害事象は、投与の３時間後くらいに始まり、およそ４時間持続した。また、この患者には、低グレードの無症候性の低血圧症も起こった。ＩＶ輸液を投与すると、血圧はベースラインに戻った。第２の患者にはＡＬＴ−８０３の最初の投与後に一過性の発熱と悪寒が起こった。悪寒はデモラール（Ｄｅｍｏｒａｌ）でコントロールした。これらのＡＬＴ−９０３処置患者のいずれにおいても、用量制限毒性、グレード３／４の毒性又は重症有害事象はみとめられておらず、これは、この処置の耐容性が良好であったことを示す。このプロトコルを、ＡＬＴ−８０３の投与をＩＶ注射から皮下注射に変更し、６μｇ／ｋｇ用量レベルで開始するように補正した。患者の登録は、このコホートに合計３名の患者が登録されるまで、ｉ．ｖ．投与にて１０μｇ／ｋｇ用量レベルで継続する。次いで、６μｇ／ｋｇでの皮下注射の患者の登録を開始する。処置媒介性の臨床的有益性（例えば、腫瘍量、疾患進行若しくは再発若しくは毒性の低減、又は無増悪生存期間、進行ま���の期間、応答の持続期間、生存期間若しくは生活の質の増大）が期待される。
【０２３９】
臨床バイオマーカー評価が実施中である。ＡＳＣＴ後に造血器の悪性腫瘍を有する患者の試験では、患者の投与前及び投与後の被検物のＮＫ、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋及びＮＫＴ細胞サブセット並びに血清サイトカインのＫｉ−６７分析に関する予備データが入手可能である。ともに血清レベルのＩＦＮ−γ及びＩＬ−６が、１μｇ／ｋｇ〜６μｇ／ｋｇのＡＬＴ−８０３の用量範囲内で、用量依存的様式で誘導された。Ｋｉ６７＋  ＮＫ、ＣＤ８＋及びＣＤ４＋  Ｔ細胞は、すべての患者で、≧３μｇ／ｋｇの用量レベルでのＡＬＴ−８０３投与後、増加した。したがって、予備データは、ＡＬＴ−８０３は、≧３μｇ／ｋｇの用量レベルで、この適応症を有する患者に対してＮＫ、Ｔ及びＮＫＴ細胞の活性化と増殖を一貫して向上させることを示唆する。同様に、血清レベルのＩＦＮ−γとＩＬ−６が、固形腫瘍を有する患者においてＡＬＴ−８０３の投与後に誘導され、このような患者における処置関連免疫賦活を示す。
【０２４０】
ＡＬＴ−８０３の多施設臨床試験が、再発した、又は不応性の多発性骨髄腫を有する患者で進行中である。この試験の第１フェーズは、ＭＴＤ又は最小有効用量（ＭＥＤ）を決定するため、及びフェーズＩＩの２段階の継続試験での用量レベルを指定するための古典的な（３＋３）用量漸増試験を含む。用量レベルは１、３、６、１０及び２０μｇ／ｋｇのＡＬＴ−８０３である。登録患者は、４回の毎週のＡＬＴ−８０３の静脈内投与の後、２週間の休薬期間からなる２回の６週間サイクルを受ける。疾患が安定しているか、又は疾患に便益がある患者を、さらに２回までの６週間サイクルを受けるのに適格とする。３名の患者を登録し、１μｇ／ｋｇのＡＬＴ−８０３用量レベルでの試験処置を完了させた。これらの患者について報告された有害事象はすべて、軽度から中程度の、例えば、便秘、悪心、倦怠感、ＡＬＣの減少及びＷＢＣカウント数の減少であった。患者はすべて、前投薬を受けている。２名の患者は、３μｇ／ｋｇのＡＬＴ−８０３用量レベルでの処置を受けている。報告された有害事象としては、軽度から中程度の発熱、硬直及び好中球減少症が挙げられる。これらのＡＬＴ−９０３処置患者のいずれにおいても、用量制限毒性、グレード３／４の毒性又は重症有害事象はみとめられておらず、これは、この処置の耐容性が良好であったことを示す。処置媒介性の臨床的有益性（例えば、腫瘍量、疾患進行若しくは再発若しくは毒性の低減、又は無増悪生存期間、進行までの期間、応答の持続期間、生存期間若しくは生活の質の増大）が期待される。血清レベルのＩＦＮ−γとＩＬ−６が、多発性骨髄腫を有する患者においてＡＬＴ−８０３の投与後に誘導され、このような患者における処置関連免疫賦活を示す。
【０２４１】
ＡＬＴ−８０３とカルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）との併用の多施設臨床試験は、ＢＣＧ未投薬の筋層非浸潤性膀胱癌を有する患者でのものである。この試験の第１フェーズは、ＡＬＴ−８０３のＭＴＤを決定するため、及び継続試験フェーズでＢＣＧと併用するＡＬＴ−８０３の推奨用量（ＲＤ）を決定するための古典的な（３＋３）用量漸増試験を含む。用量レベルは１００、２００及び４００μｇ／点滴のＡＬＴ−８０３＋標準的なＢＣＧ（５０ｍｇ／点滴）である。継続試験フェーズは、ＲＤレベルのＡＬＴ−８０３とＢＣＧとの併用又はＢＣＧ単独を受ける患者の非比較無作為化デザインからなる。登録患者はＢＣＧ＋ＡＬＴ−８０３を毎週、膀胱内留置尿道カテーテルにより連続６週間投与される。３名の患者を登録し、１００μｇ／点滴のＡＬＴ−８０３＋ＢＣＧの第１コホートの処置を完了させた。報告された治験薬に起因する有害事象には、軽度の悪心、頭痛、血尿及び尿路痛並びに中程度の非感染性膀胱炎が含まれた。３名の患者が登録されており、２００μｇ／点滴のＡＬＴ−８０３＋ＢＣＧの処置を完了させた。報告された治験薬に起因する有害事象には、軽度の血尿及び尿失禁が含まれた。登録された２名の患者では、４００μｇ／点滴のＡＬＴ−８０３コホートの処置が進行中である。このようなＡＬＴ−９０３＋ＢＣＧ処置患者のいずれにおいても、用量制限毒性、グレード３／４の毒性又は重症有害事象はみとめられておらず、これは、この処置の耐容性が良好であったことを示す。これらの処置患者の数名は、治療後、少なくとも９ヶ月間、疾患の再発を示さず（この適応症における完全応答とみなす）、処置関連臨床的活性が示唆される。また、一部の患者では、尿中サイトカインの処置関連増加も観察された。処置媒介性の臨床的有益性（例えば、腫瘍量、疾患進行若しくは再発若しくは毒性の低減、又は無増悪生存期間、進行までの期間、応答の持続期間、生存期間若しくは生活の質の増大）が期待される。
【０２４２】
ＡＬＴ−８０３＋リツキシマブの多施設臨床試験が、再発した、又は不応性のインドレントＢ細胞性非ホジキンリンパ腫を有する患者で進行中である。この試験の第１フェーズは、ＭＴＤ又はＭＥＤを決定するため、フェーズＩＩの２段階の継続試験での用量レベルを指定するための古典的な（３＋３）用量漸増試験を含む。用量レベルは１、３及び６μｇ／ｋｇのＡＬＴ−８０３である。登録患者は、ＡＬＴ−８０３の４回の毎週の投与と標準的な静脈内注射によるリツキシマブ（３７５ｍｇ／ｍ２）からなる４週間の導入サイクルを受ける。疾患が安定しているか、又は疾患に便益がある患者を、ＡＬＴ−８０３＋リツキシマブの単回処置、８週間毎に合計４回のさらなるＡＬＴ−８０３とリツキシマブの反復投与からなる４回までの強化処置サイクルを受けるのに適格とする。１名の患者を登録し、現在、１μｇ／ｋｇのＡＬＴ−８０３用量レベルでの処置を受けている。この患者についてこれまでに報告されている有害事象は軽度から中程度の、例えば、浮腫、ＡＬＣの減少及びＷＢＣカウント数の減少であった。このＡＬＴ−９０３＋リツキシマブ処置患者において、用量制限毒性、グレード３／４の毒性又は重症有害事象はみとめられておらず、これは、この処置の耐容性が良好であったことを示す。処置媒介性の臨床的有益性（例えば、腫瘍量、疾患進行若しくは再発若しくは毒性の低減、又は無増悪生存期間、進行までの期間、応答の持続期間、生存期間若しくは生活の質の増大）が期待される。
【０２４３】
ＡＬＴ−８０３＋ニボルマブ（抗ＰＤ−１  Ａｂ）の多施設臨床試験が、進行した、又は転移性の非小細胞肺癌を有する患者で実施される。この試験の第１フェーズは、ＡＬＴ−８０３のＭＴＤを決定するため、及びフェーズＩＩの２段階の継続試験での用量レベルを指定するための用量漸増試験を含む。用量レベルは６、１０及び１５μｇ／ｋｇの皮下ＡＬＴ−８０３である。登録患者は、ＡＬＴ−８０３の５回の毎週の投与と標準的な２週間毎の静脈内ニボルマブ（３ｍｇ／ｋｇ）からなる２回の６週間サイクルを受ける。疾患が安定しているか、又は疾患に便益がある患者を、さらに６週間のＡＬＴ−８０３＋ニボルマブサイクルを受けるのに適格とする。処置媒介性の臨床的有益性（例えば、腫瘍量、疾患進行若しくは再発若しくは毒性の低減、又は無増悪生存期間、進行までの期間、応答の持続期間、生存期間若しくは生活の質の増大）が期待される。
【０２４４】
他の実施形態
本発明を、その詳細説明に関して説明したが、前述の説明は、実例を示すことを意図したものであって、本発明の範囲を限定することを意図したものではなく、本発明は、添付の特許請求の範囲の範囲によって規定される。他の態様、利点及び変形例は以下の特許請求の範囲の範囲に含まれる。
【０２４５】
本明細書で言及した特許及び科学文献は、当業者に利用可能な知識を確認するものである。本明細書に挙げた米国特許及び公開又は未公開米国特許出願はすべて、引用により組み込まれる。本明細書に挙げた外国の公開された特許及び特許出願はすべて、引用により本明細書に組み込まれる。本明細書に挙げた受託番号によって示されるＧｅｎｂａｎｋ及びＮＣＢＩの寄託物は、引用により本明細書に組み込まれる。本明細書に挙げた他の公開された参考文献、文献、手稿及び科学文献はすべて、引用により本明細書に組み込まれる。
【０２４６】
本発明を、その好ましい実施形態に関して具体的に図示し、説明したが、当業者には、形態及び詳細において種々の変更が、添付の特許請求の範囲に包含される本発明の範囲を逸脱することなくなされ得ることが理解されよう。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２２−１】
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【図２２−２】
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【図２３】
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【図２４−１】
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【図２４−２】
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【図２５−１】
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【図２５−２】
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【図２６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年5月12日(2020.5.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効量の抗体又は抗体様分子と、有効量のＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ複合体（ＡＬＴ−８０３）とを含み、
ここで、前記ＡＬＴ−８０３は、ダイマー型ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃと２分子のＩＬ−１５Ｎ７２Ｄを含むものである、
被験体の新生物又は感染を処置するための医薬。
【請求項２】
ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ分子が配列番号３で表されるアミノ酸配列を含むものである、請求項１に記載の医薬。
【請求項３】
ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃが配列番号６で表されるアミノ酸配列を含むものである、請求項１に記載の医薬。
【請求項４】
新生物が、膠芽腫、前立腺癌、造血器の癌、Ｂ細胞腫瘍、多発性骨髄腫、Ｂ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、慢性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、固形腫瘍、尿路上皮／膀胱癌、黒色腫、肺癌、腎細胞癌、乳癌、胃及び食道の癌、頭頸部癌、結腸直腸癌、卵巣癌、非小細胞肺癌、Ｂ細胞性非ホジキンリンパ腫、並びに頭頸部扁平上皮癌からなる群より選択される、請求項１に記載の医薬。
【請求項５】
感染が、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）によるウイルス感染である、請求項１に記載の医薬。
【請求項６】
有効量の前記ＡＬＴ−８０３が、毎日投与されるように用いられることを特徴とする、請求項１に記載の医薬。
【請求項７】
前記ＡＬＴ−８０３の有効量が０．１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇである、請求項６に記載の医薬。
【請求項８】
有効量の前記ＡＬＴ−８０３が、１週間に１回又は２回投与されるように用いられることを特徴とする、請求項１に記載の医薬。
【請求項９】
前記ＡＬＴ−８０３の有効量が０．１μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇである、請求項８に記載の医薬。
【請求項１０】
有効量の前記ＡＬＴ−８０３が、全身、静脈内、皮下、筋肉内、膀胱内投与するか、又は点滴によって投与されるように用いられることを特徴とする、請求項１に記載の医薬。
【請求項１１】
前記抗体が腫瘍特異的抗体又は抗ウイルス抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗体が免疫チェックポイント阻害薬である、請求項１に記載の医薬。
【請求項１３】
前記抗体が、抗ｇｐ７５抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＨＥＲ２抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ−４）抗体、抗プログラム細胞死−１（ＰＤ−１）抗体、抗プログラム細胞死−リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）抗体又は抗プログラム細胞死−リガンド２（ＰＤ−Ｌ２）抗体を含む、請求項１に記載の医薬。
【請求項１４】
前記抗体によって媒介される前記被験体の腫瘍細胞又は感染細胞に対する抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）又は抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）が、少なくとも５％増大する、請求項１１に記載の医薬。
【請求項１５】
前記抗体と前記ＡＬＴ−８０３により、血中のＮＫ細胞、Ｔ細胞、好中球又は単球のカウント数又は活性のレベルが増大する、請求項１に記載の医薬。
【請求項１６】
前記抗体と前記ＡＬＴ−８０３がＣＤ４＋又はＣＤ８＋  Ｔ細胞を刺激して腫瘍細胞又は感染細胞を死滅させる、請求項１に記載の医薬。
【請求項１７】
前記抗体と前記ＡＬＴ−８０３がＮＫ細胞を刺激して腫瘍細胞又は感染細胞を死滅させる、請求項１に記載の医薬。
【請求項１８】
前記抗体と前記ＡＬＴ−８０３が好中球又は単核球細胞を刺激して腫瘍細胞又は感染細胞を死滅させる、請求項１に記載の医薬。
【請求項１９】
医薬が、腫瘍細胞又は感染細胞の数の減少させる、請求項１に記載の医薬。
【請求項２０】
医薬が、新生物又は感染の疾患進行の低減させる、請求項１に記載の医薬。
【請求項２１】
医薬が、未処置の被験体と比べて前記被験体の生存期間の長期化させる、請求項１に記載の医薬。
【請求項２２】
前記被験体がヒトである、請求項１に記載の医薬。
【請求項２３】
前記抗体と前記ＡＬＴ−８０３が同時又は逐次投与されるように用いられることを特徴とする、請求項１に記載の医薬。
【請求項２４】
医薬が、前記新生物又は感染の将来の再発を予防する、請求項１に記載の医薬。
【請求項２５】
新生物の処置のためのキットであって、有効量のＡＬＴ−８０３、抗体、及び新生物の処置のための該キットの使用説明書を備えているキット。
【請求項２６】
ウイルスの処置のためのキットであって、有効量のＡＬＴ−８０３、抗体、及びウイルスの処置のための該キットの使用説明書を備えているキット。
【請求項２７】
標的抗原を発現している疾患細胞を死滅させるための医薬であって：
有効量のＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ複合体（ＡＬＴ−８０３）及び該標的抗原に特異的な抗体を含み、
前記ＡＬＴ−８０３が免疫細胞を処理するように用いられることを特徴とし、
該標的抗原に特異的な抗体がＡＬＴ−８０３で処理された該免疫細胞及び前記標的抗原を発現している疾患細胞と混合するように用いられることを特徴とし、
該疾患細胞が、ＡＬＴ−８０３で処理された該免疫細胞と該標的抗原に特異的な抗体によって媒介されるＡＤＣＣ又はＡＤＣＰによって死滅されることを特徴とする、
医薬。
【請求項２８】
疾患細胞の死滅レベルが、ＡＬＴ−８０３で処理しなかった免疫細胞によって媒介されるレベルと比べて少なくとも５％増大する、請求項２７に記載の医薬。
【請求項２９】
前記抗体と前記ＡＬＴ−８０３により血中サイトカインレベルが増大する、請求項１に記載の医薬。
【請求項３０】
前記サイトカインがＩＦＮ−γ及び／又はＩＬ−６を含む、請求項２９に記載の医薬。
【外国語明細書】
2020128390000001.pdf