(57)【要約】【課題】抗ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ抗体およびそれらの使用方法の提供。【解決手段】本発明はヒトＩＬ−６受容体と複合体化した場合の膜結合ヒトインターロイキン−６（「ＩＬ−６」）（即ちヒトＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体（「ＩＬ−６Ｒｃ」）（即ち細胞表面上に発現されるか、可溶性形態にあるＩＬ−６Ｒｃ）を認識する完全ヒトモノクローナル抗体のようなモノクローナル抗体を提供する。本発明の抗体はＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路およびＭＡＰＫカスケードの活性化を介してＩＬ−６Ｒ細胞内シグナリングをモジュレート、例えばブロッキング、阻害、低減、拮抗、中和、または干渉することができる。本発明の抗体はまた、可溶性ＩＬ−６Ｒｃに結合する抗体も包含する。更にまた、本発明の抗体はＩＬ−６Ｒｃに結合する抗体も包含し、ここで、それらはまたヒトＩＬ−６Ｒ単独（即ちＩＬ−６と複合体化していない場合）にも結合する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
図面に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本願は、２００８年５月１３日に出願された米国仮特許出願第６１／１２７，４０３号および２００８年９月２５日に出願された米国仮特許出願第６１／１９４，１５６号の利益を主張し、これらの米国仮特許出願の各々の内容は、それらの全体が本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、一般的に、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体を認識するモノクローナル抗体、例えば完全ヒトモノクローナル抗体の発生、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体およびＩＬ−６Ｒの両方を認識するモノクローナル抗体、例えば完全ヒト抗体、ならびに治療薬としてのモノクローナル抗体の使用方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
インターロイキン（ＩＬ−６）は細胞の成長および分化を調節する強力なプレイオトロピックなサイトカインであり、そしてまた、急性炎症応答の重要なメディエーターである。ＩＬ−６は特定のＩＬ−６受容体（ＩＬ−６Ｒ）およびシグナル伝達サブユニット（ｇｐ１３０）よりなる受容体複合体を介してその作用を呈する。調節不全のＩＬ−６シグナリングは多発性骨髄腫、自己免疫疾患および前立腺癌のような多くの疾患の病因において関与するとされている。したがって、ＩＬ−６および／またはＩＬ−６Ｒの生物学的活性を中和する治療の必要性が存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
（発明の要旨）
本発明はヒトＩＬ−６受容体と複合体化した場合の膜結合ヒトインターロイキン−６（「ＩＬ−６」）（即ちヒトＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体（「ＩＬ−６Ｒｃ」）（即ち細胞表面上に発現されるか、可溶性形態にあるＩＬ−６Ｒｃ）を認識する完全ヒトモノクローナル抗体のようなモノクローナル抗体を提供する。本発明の抗体はＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路およびＭＡＰＫカスケードの活性化を介してＩＬ−６Ｒ細胞内シグナリングをモジュレート、例えばブロッキング、阻害、低減、拮抗、中和、または干渉することができる。本発明の抗体はまた、可溶性ＩＬ−６Ｒｃに結合する抗体も包含する。更にまた、本発明の抗体はＩＬ−６Ｒｃに結合する抗体も包含し、ここで、それらはまたヒトＩＬ−６Ｒ単独（即ちＩＬ−６と複合体化していない場合）にも結合する。
【０００５】
本発明により解決されるべき問題は、ＩＬ−６ＲおよびＩＬ−６により形成される複合体に結合する抗体の発生であり、これによりＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体（「ＩＬ−６Ｒｃ」の膜貫通糖蛋白質ｇｐ１３０への結合、およびＩＬ−６Ｒｃ／ｇｐ１３０シグナリング複合体により活性化されるその後のシグナリング（シスおよびトランスの両方）を防止する。
【０００６】
本発明の抗体はＩＬ−６Ｒｃとｇｐ１３０の間の相互作用をモジュレート、例えばブロック、阻害、低減、拮抗、中和または干渉する。ＩＬ−６およびＩＬ−６Ｒの結合によりＩＬ−６Ｒｃ複合体が形成されれば、ＩＬ−６Ｒｃは膜貫通糖蛋白質であるｇｐ１３０と相互作用または会合することが可能となる。特に、ＩＬ−６のＩＬ−６Ｒへの結合は細胞内部のｇｐ１３０のジスルフィド結合ホモ２量体化をもたらし、これが次にシグナル伝達における第１工程としてのチロシンキナーゼの活性化をもたらす。好ましい実施形態においては、本発明の抗体はＩＬ−６Ｒｃに結合し、そしてＩＬ−６Ｒｃがｇｐ１３０と相互作用することをブロックするか、または阻害し、これによりｇｐ１３０のホモ２量体化およびその後のシグナリング（シスおよびトランス）を部分的または完全に防止する。
【０００７】
例えばＩＬ−６がＩＬ−６Ｒに結合する溝部において、ＩＬ−６またはＩＬ−６Ｒに個別に結合する抗体とは異なり、本発明の抗体はＩＬ−６とＩＬ−６Ｒが相互作用してＩＬ−６Ｒｃ複合体を形成することを阻害または干渉することはない。従って本発明の抗体はＩＬ−６ＲとＩＬ−６との間の相互作用をブロックするか、または干渉する抗体、例えばＩＬ−６Ｒへの結合に関してＩＬ−６と、またはその逆において競合する抗体に対して必要とされる濃度よりも有意に低値である濃度において使用される。一部の実施形態においては、本発明の抗体の濃度はＩＬ−６とＩＬ−６Ｒとの間の相互作用をブロックするか、または干渉する抗体に対して必要とされる濃度よりも５０〜１００倍低値である。ＩＬ−６とＩＬ−６Ｒとの間の相互作用をブロックするか、または干渉する抗体に関しては、例えばＩＬ−６Ｒのレベルが高値となる、および／またはＩＬ−６の発現が増大する炎症を処置するためには、より高濃度を用いなければならない。ＩＬ−６および／またはＩＬ−６Ｒの増大したレベルと効果的および長期間にわたって競合するためには、ＩＬ−６とＩＬ−６Ｒとの間の相互作用をブロックするか、または干渉するこれらの抗体は高濃度で存在しなければならない。
【０００８】
本発明の例示されるモノクローナル抗体は、例えば、３９Ｂ９ＶＬ１抗体、３９Ｂ９ＶＬ５抗体、１２Ａ抗体および５Ｃ抗体を包含する。あるいは、モノクローナル抗体は、３９Ｂ９ＶＬ１抗体、３９Ｂ９ＶＬ５抗体、１２Ａ抗体および５Ｃ抗体と同じエピトープに結合する抗体である。これらの抗体は、それぞれ本明細書において「ｈｕＩＬ−６Ｒｃ」と称する。ｈｕＩＬ−６Ｒｃ抗体は完全ヒトモノクローナル抗体、ならびにヒト化モノクローナル抗体およびキメラ抗体を包含する。これらの抗体はヒトＩＬ−６ＲｃおよびＩＬ−６Ｒに対する特異性を示し、そしてそれらはＩＬ−６Ｒｃ媒介細胞内シグナリング（シスおよび／またはトランスシグナリング）をモジュレート、例えば、ブロック、阻害、低減、拮抗、中和または干渉することがわかっている。
【０００９】
好ましい実施形態においては、本発明の完全ヒト抗体は、（ｉ）軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ３）におけるコンセンサスアミノ酸配列ＱＱＳＸＳＹＰＬＴ（配列番号４２）、ここでＸがＮまたはＱであるもの；（ｉｉ）重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ２）におけるコンセンサスアミノ酸配列ＧＩＩＰＸ１ＦＸ２ＴＴＫＹＡＱＸ３ＦＱＧ（配列番号４３）、ここでＸ１がＬまたはＡ、Ｘ２がＤまたはＥ、およびＸ３がＱまたはＫであるもの；（ｉｉｉ）重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ３）におけるコンセンサスアミノ酸配列ＤＲＤＩＬＴＤＹＹＰＸＧＧＭＤＶ（配列番号４４）、ここでＸがＭまたはＬであるもの；および（ｉｖ）フレームワーク領域３（ＦＲＷ３）におけるコンセンサスアミノ酸配列ＴＡＶＸＹＣＡＲ（配列番号４５）、ここでＸがＦまたはＹであるもの；を包含する。
【００１０】
例えば、１つの好ましい実施形態においては、ｈｕＩＬ−６Ｒｃ抗体は軽鎖ＣＤＲ３領域におけるアミノ酸配列ＱＱＳＮＳＹＰＬＴ（配列番号２６）；重鎖ＣＤＲ２領域におけるアミノ酸配列ＧＩＩＰＬＦＤＴＴＫＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号３３）；重鎖ＣＤＲ３領域におけるアミノ酸配列ＤＲＤＩＬＴＤＹＹＰＭＧＧＭＤＶ（配列番号３６）；およびＦＲＷ３領域におけるアミノ酸配列ＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号３９）；を包含する。この抗体は本明細書においてはＮＩ−１２０１Ａ抗体と称する。
【００１１】
別の好ましい実施形態においては、ｈｕＩＬ−６Ｒｃ抗体は軽鎖ＣＤＲ３領域におけるアミノ酸配列ＱＱＳＮＳＹＰＬＴ（配列番号２６）、重鎖ＣＤＲ２領域におけるアミノ酸配列ＧＩＩＰＬＦＤＴＴＫＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号３３）、重鎖ＣＤＲ３領域におけるアミノ酸配列ＤＲＤＩＬＴＤＹＹＰＬＧＧＭＤＶ（配列番号３７）、およびＦＲＷ３領域におけるアミノ酸配列ＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号３９）を含む。この抗体は本明細書においてはＮＩ−１２０１Ｂ抗体と称する。
【００１２】
別の好ましい実施形態においては、ｈｕＩＬ−６Ｒｃ抗体は軽鎖ＣＤＲ３領域におけるアミノ酸配列ＱＱＳＮＳＹＰＬＴ（配列番号２６）、重鎖ＣＤＲ２領域におけるアミノ酸配列ＧＩＩＰＡＦＥＴＴＫＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号３４）、重鎖ＣＤＲ３領域におけるアミノ酸配列ＤＲＤＩＬＴＤＹＹＰＬＧＧＭＤＶ（配列番号３７）、およびＦＲＷ３領域におけるアミノ酸配列ＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号３９）を含む。この抗体は本明細書においてはＮＩ−１２０１Ｃ抗体と称する。
【００１３】
別の好ましい実施形態においては、ｈｕＩＬ−６Ｒｃ抗体は軽鎖ＣＤＲ３領域におけるアミノ酸配列ＱＱＳＱＳＹＰＬＴ（配列番号３２）、重鎖ＣＤＲ２領域におけるアミノ酸配列ＧＩＩＰＡＦＥＴＴＫＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号３４）、重鎖ＣＤＲ３領域におけるアミノ酸配列ＤＲＤＩＬＴＤＹＹＰＬＧＧＭＤＶ（配列番号３７）、およびＦＲＷ３領域におけるアミノ酸配列ＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号３９）を含む。この抗体は本明細書においてはＮＩ−１２０１Ｄ抗体と称する。
【００１４】
他の実施形態において、ｈｕＩＬ−６Ｒｃ抗体は軽鎖ＣＤＲ３領域におけるアミノ酸配列ＱＱＳＮＳＹＰＬＴ（配列番号２６）、重鎖ＣＤＲ２領域におけるアミノ酸配列ＧＩＩＰＬＦＤＴＴＫＹＡＱＱＦＱＧ（配列番号１６）、重鎖ＣＤＲ３領域におけるアミノ酸配列ＤＲＤＩＬＴＤＹＹＰＭＧＧＭＤＶ（配列番号３６）、およびＦＲＷ３領域におけるアミノ酸配列ＴＡＶＦＹＣＡＲ（配列番号３８）を含む。この抗体は本明細書においてはＮＩ−１２０１野生型（ＮＩ−１２０１−ＷＴ）抗体と称する。
【００１５】
本発明の完全ヒト抗体は、配列番号２、８、および１２のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含有する。本発明の完全ヒト抗体は、配列番号４、６、１０および１４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含有する。抗体はＩＬ−６Ｒに、ＩＬ−６と複合体化したＩＬ−６Ｒ（即ちＩＬ−６Ｒｃ）に、または両方に結合する。
【００１６】
３つの重鎖ＣＤＲは、配列番号１５、１８および２１よりなる群から選択される配列と少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％以上同一のアミノ酸配列を包含する可変重鎖（ＶＨ）相補性決定領域１（ＣＤＲ１）；配列番号１６、１９、２２、３３、３４および３５よりなる群から選択される配列と少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％以上同一のアミノ酸配列を包含するＶＨ相補性決定領域２（ＣＤＲ２）；ならびに配列番号１７、２０、２３、３６および３７よりなる群から選択される配列と少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％以上同一のアミノ酸配列を包含するＶＨ相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含む。抗体はＩＬ−６Ｒに、ＩＬ−６と複合体化したＩＬ−６Ｒ（即ちＩＬ−６Ｒｃ）に、または両方に結合する。
【００１７】
３つの軽鎖ＣＤＲは、配列番号２４、２７、２８、および３０よりなる群から選択される配列と少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％以上同一のアミノ酸配列を包含する可変軽鎖（ＶＬ）ＣＤＲ１；配列番号２５のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％以上同一のアミノ酸配列を包含するＶＬＣＤＲ２；ならびに配列番号２６、２９、３１および３２よりなる群から選択される配列と少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％以上同一のアミノ酸配列を包含するＶＬ  ＣＤＲ３を含む。抗体はＩＬ−６Ｒに、ＩＬ−６と複合体化したＩＬ−６Ｒ（即ちＩＬ−６Ｒｃ）に、または両方に結合する。
【００１８】
本明細書において提供されるｈｕＩＬ−６Ｒｃ抗体は、ｇｐ１３０媒介細胞内シグナリングカスケードがこれらの抗体の存在下で活性化されないようにＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体（ＩＬ−６Ｒｃ）に結合し、そしてＩＬ−６Ｒｃがｇｐ１３０に結合することを防止する完全ヒト抗体である。好ましくは、抗体はＩＬ−６Ｒｃに対して少なくとも１×１０−８の親和性を有し、より好ましくは、抗体はＩＬ−６Ｒｃに対して少なくとも１×１０−９の親和性を有する。
【００１９】
本発明の抗体は、ＩＬ−６Ｒｃに免疫特異的に結合し、ここで、抗体はヒトＩＬ−６および／またはヒトＩＬ−６Ｒ上の１つ以上のアミノ酸残基を含むエピトープに結合する。本発明の抗体はＩＬ−６ＲｃおよびＩＬ−６Ｒの両方に免疫特異的に結合し、ここで、抗体はヒトＩＬ−６および／またはヒトＩＬ−６Ｒ上の１つ以上のアミノ酸残基を含むエピトープに結合する。好ましくは、本明細書に記載したｈｕＩＬ−６Ｒｃ抗体は、ＩＬ−６受容体（ＩＬ−６Ｒ）のドメイン３におけるエピトープに結合する。より好ましくは、ｈｕＩＬ−６抗体が結合するエピトープは少なくともアミノ酸配列ＡＥＲＳＫＴ（配列番号４６）を包含する。
【００２０】
本発明の抗体はまた、ＩＬ−６Ｒｃに特異的に結合する完全ヒト抗体ならびにＩＬ−６ＲｃおよびＩＬ−６Ｒの両方に特異的に結合する抗体を包含し、ここで抗体はＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路およびＭＡＰＫカスケードのＩＬ−６媒介活性化の５０％超の阻害を呈する。例えば、本発明の抗体は、ＳＴＡＴ３活性化、急性期の蛋白質産生、抗体産生ならびに細胞分化および／または増殖を包含するＩＬ−６媒介機能の５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、または９９％超の阻害を呈する。
【００２１】
本発明はまた、異常なＩＬ−６受容体活性化および／または異常なＩＬ−６シグナリング（シスおよび／またはトランス）を処置または防止する、あるいは、そのような病状に関連する症状を軽減する方法を提供し、これはそのような処置または防止が望まれる対象に本発明のモノクローナル抗体（例えば完全ヒトモノクローナル抗体）を投与することにより行う。処置すべき対象は、例えばヒトである。モノクローナル抗体は病状に関連する症状を処置、防止または軽減するために十分な量で投与される。対象における病状を処置または防止するために十分なモノクローナル抗体の量は、例えば、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路またはＭＡＰＫカスケードのＩＬ−６Ｒｃ誘導活性化を低減するために十分である量である。例えばＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路またはＭＡＰＫカスケードのＩＬ−６Ｒｃ誘導活性化は、本発明のモノクローナル抗体の存在下のＳＴＡＴ３活性化のレベルがＳＴＡＴ３活性化の対照レベル（即ちモノクローナル抗体非存在下のＳＴＡＴ３活性化のレベル）より５％、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％以上低値である場合に、低下している。当業者の知る通り、ＳＴＡＴ３活性化のレベルは種々のアッセイ、例えば市販のＥＬＩＳＡキットを用いて計測できる。
【００２２】
本発明のモノクローナル抗体（例えば完全ヒトモノクローナル抗体）を用いながら処置および／または防止される病理は例えば、敗血症、癌（例えば多発性骨髄腫疾患（ＭＭ）、腎細胞癌（ＲＣＣ）、形質細胞性白血病（ｌｅｕｋａｅｍｉａ）、リンパ腫、Ｂ−リンパ増殖性障害（ＢＬＰＤ）、および前立腺癌）、骨再吸収、骨粗鬆症、悪液質、乾癬、メサンギウム増殖性糸球体腎炎、カポジ肉腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、および炎症性疾患（例えば、関節リウマチ、全身発症性若年性特発性関節炎、高ガンマグロブリン血症、クローン病、潰瘍性結腸炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、多発性硬化症、キャッスルマン病、ＩｇＭ免疫グロブリン血症、心臓粘液腫、喘息、アレルギー性喘息および自己免疫インシュリン依存性真正糖尿病）を包含する。
【００２３】
本発明の医薬組成物は本発明の抗体および担体を包含できる。これらの医薬組成物はキット、例えば診断キットなどに包含され得る。
【００２４】
当業者の知る通り、本発明の抗体は種々の用途を有する。例えば本発明の蛋白質は例えば敗血症、癌（例えば多発性骨髄腫疾患（ＭＭ）、腎細胞癌（ＲＣＣ）、形質細胞性白血病、リンパ腫、Ｂ−リンパ増殖性障害（ＢＬＰＤ）、および前立腺癌）、骨再吸収、骨粗鬆症、悪液質、乾癬、メサンギウム増殖性糸球体腎炎、カポジ肉腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、および炎症性疾患（例えば、関節リウマチ、全身発症性若年性特発性関節炎、高ガンマグロブリン血症、クローン病、潰瘍性結腸炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、多発性硬化症、キャッスルマン病、ＩｇＭ免疫グロブリン血症、心臓粘液腫、喘息、アレルギー性喘息および自己免疫インシュリン依存性真正糖尿病）のような障害におけるＩＬ−６受容体活性化を防止するための治療剤として使用される。本発明の抗体はまた、診断キット中の試薬として、または診断ツールとして使用され、あるいはこれらの抗体は治療用試薬を生成するための競合試験において使用できる。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
単離された完全ヒト抗体であって、ｇｐ１３０媒介細胞内シグナリングカスケードが該抗体の存在下で活性化されないように、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体（ＩＬ−６Ｒｃ）に結合し、そしてＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ受容体複合体（ＩＬ−６Ｒｃ）がｇｐ１３０に結合することを防止し、ここで該抗体が：
（ｉ）下記：
（ａ）軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ３）におけるアミノ酸配列ＱＱＳＸＳＹＰＬＴ（ここで、ＸはＮまたはＱである）；
（ｂ）重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ２）におけるアミノ酸配列ＧＩＩＰＸ１ＦＸ２ＴＴＫＹＡＱＸ３ＦＱＧ（ここで、Ｘ１はＬまたはＡであり、Ｘ２はＤまたはＥであり、そしてＸ３はＱまたはＫである）；
（ｃ）重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ３）におけるアミノ酸配列ＤＲＤＩＬＴＤＹＹＰＸＧＧＭＤＶ（ここで、ＸはＭまたはＬである）；および、
（ｄ）フレームワーク領域３（ＦＲＷ３）におけるアミノ酸配列ＴＡＶＸＹＣＡＲ（ここで、ＸはＦまたはＹである）；
を含む抗体；
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域および配列番号４のアミノ酸配列を含む可変軽鎖領域を含む抗体；
（ｉｉｉ）軽鎖ＣＤＲ３領域におけるアミノ酸配列ＱＱＳＮＳＹＰＬＴ、重鎖ＣＤＲ２領域におけるアミノ酸配列ＧＩＩＰＬＦＤＴＴＫＹＡＱＫＦＱＧ、重鎖ＣＤＲ３領域におけるアミノ酸配列ＤＲＤＩＬＴＤＹＹＰＭＧＧＭＤＶ、およびＦＲＷ３領域におけるアミノ酸配列ＴＡＶＹＹＣＡＲを含む抗体；
（ｉｖ）軽鎖ＣＤＲ３領域におけるアミノ酸配列ＱＱＳＮＳＹＰＬＴ、重鎖ＣＤＲ２領域におけるアミノ酸配列ＧＩＩＰＬＦＤＴＴＫＹＡＱＫＦＱＧ、重鎖ＣＤＲ３領域におけるアミノ酸配列ＤＲＤＩＬＴＤＹＹＰＬＧＧＭＤＶ、およびＦＲＷ３領域におけるアミノ酸配列ＴＡＶＹＹＣＡＲを含む抗体；
（ｖ）軽鎖ＣＤＲ３領域におけるアミノ酸配列ＱＱＳＮＳＹＰＬＴ、重鎖ＣＤＲ２領域におけるアミノ酸配列ＧＩＩＰＡＦＥＴＴＫＹＡＱＫＦＱＧ、重鎖ＣＤＲ３領域におけるアミノ酸配列ＤＲＤＩＬＴＤＹＹＰＬＧＧＭＤＶ、およびＦＲＷ３領域におけるアミノ酸配列ＴＡＶＹＹＣＡＲを含む抗体；ならびに、
（ｖｉ）軽鎖ＣＤＲ３領域におけるアミノ酸配列ＱＱＳＱＳＹＰＬＴ、重鎖ＣＤＲ２領域におけるアミノ酸配列ＧＩＩＰＡＦＥＴＴＫＹＡＱＫＦＱＧ、重鎖ＣＤＲ３領域におけるアミノ酸配列ＤＲＤＩＬＴＤＹＹＰＬＧＧＭＤＶ、およびＦＲＷ３領域におけるアミノ酸配列ＴＡＶＹＹＣＡＲを含む抗体、
よりなる群から選択される抗体を交差ブロッキングする、項目１記載の抗体。
（項目２）
前記抗体がＩＬ−６Ｒｃに対して少なくとも１ｘ１０−８の親和性を有する、項目１記載の抗体。
（項目３）
前記抗体がＩＬ−６Ｒｃに対して少なくとも１ｘ１０−９の親和性を有する、項目１記載の抗体。
（項目４）
前記抗体がＩＬ−６受容体（ＩＬ−６Ｒ）のドメイン３におけるエピトープに結合し、該エピトープは少なくともアミノ酸配列ＡＥＲＳＫＴを含む、項目１記載の抗体。
（項目５）
前記抗体がＩＬ−６およびＩＬ−６Ｒの間の相互作用をモジュレートしない、項目１記載の抗体。
（項目６）
前記抗体がＩＬ−６Ｒにも結合する、項目１記載の抗体。
（項目７）
前記抗体が配列番号１５のアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ１領域、配列番号１６のアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ２領域、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ３領域、配列番号２４のアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ１領域、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ２領域、および配列番号２６のアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ３領域を含む、項目１記載の抗体。
（項目８）
前記抗体が：
（ａ）配列番号１５、１８または２１のアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ１領域；
（ｂ）配列番号１６、１９、２２、３３、３４または３５のアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ２領域；
（ｃ）配列番号１７、２０、２３、３６または３７のアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ３領域；
（ｄ）配列番号２４、２７、２８、または３０のアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ１領域；（ｅ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ２領域；および、
（ｆ）配列番号２６、２９、３１または３２のアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ３領域
を含む、項目１記載の単離された抗体。
（項目９）
前記抗体が配列番号２から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変配列および配列番号４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変配列を含む、項目１記載の抗体。
（項目１０）
前記抗体がＩｇＧアイソタイプである、項目１記載の抗体。
（項目１１）
前記抗体がＩｇＧ１アイソタイプである、項目１記載の抗体。
（項目１２）
前記抗体が配列番号２、８、または１２から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変配列および配列番号４、６、１０または１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変配列を含む、項目１記載の抗体。
（項目１３）
単離された完全ヒトモノクローナル抗ＩＬ−６Ｒｃ抗体、またはそのフラグメントであって、該抗体が：
（ａ）配列番号１５、１８または２１のアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ１領域；
（ｂ）配列番号１６、１９、２２、３３、３４または３５のアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ２領域；
（ｃ）配列番号１７、２０、２３、３６または３７のアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ３領域；
（ｄ）配列番号２４、２７、２８、または３０のアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ１領域；
（ｅ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ２領域；および、
（ｆ）配列番号２６、２９、３１または３２のアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ３領域、
を含み、そして、該抗体がＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体に結合する、抗体。
（項目１４）
前記抗体がＩＬ−６Ｒにも結合する、項目１３記載の抗体。
（項目１５）
前記抗体がＩｇＧアイソタイプである、項目１３記載の抗体。
（項目１６）
前記抗体がＩｇＧ１アイソタイプである、項目１３記載の抗体。
（項目１７）
前記抗体が配列番号２、８、または１２から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変配列および配列番号４、６、１０または１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変配列を含む、項目１３記載の抗体。
（項目１８）
前記抗体が配列番号２から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変配列および配列番号４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変配列を含む、項目１３記載の抗体。
（項目１９）
前記項目のいずれか１項に記載の抗体および担体を含む、医薬組成物。
（項目２０）
対象における関節リウマチ、クローン病、乾癬、多発性硬化症または喘息に関連する臨床適応症の症状を軽減する方法であって、該方法が、項目１〜１８のいずれか一項に記載の抗体を、該軽減を必要とする対象に、関節リウマチ、クローン病、乾癬、多発性硬化症または喘息に関連する臨床適応症の症状を軽減するために十分な量で投与する工程を含む、方法。
（項目２１）
前記対象がヒトである、項目２０記載の方法。
（項目２２）
癌、自己免疫疾患または炎症性障害の症状を軽減する方法であって、該方法が、項目１〜１８のいずれか一項に記載の抗体を、該軽減を必要とする対象に、該対象における癌、自己免疫疾患または炎症性障害の症状を軽減するために十分な量で投与する工程を含む、方法。
（項目２３）
前記対象がヒトである、項目２２記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１−１】図１Ａ〜１ＤはＩＬ−６トランスシグナリングをブロックする本発明の抗体ＮＩ−１２０１の能力を示す一連のグラフである。
【図１−２】図１Ａ〜１ＤはＩＬ−６トランスシグナリングをブロックする本発明の抗体ＮＩ−１２０１の能力を示す一連のグラフである。
【図２】図２Ａおよび２ＢはＩＬ−６シスシグナリングをブロックするＮＩ−１２０１抗体の能力を示す一連のグラフである。
【図３】図３Ａおよび３ＢはＩＬ−６シスシグナリングにより誘導されたＳＴＡＴ−３ホスホリル化をブロックするＮＩ−１２０１抗体の能力を示す一連の説明である。
【図４】図４は可溶性ヒトＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体（「ｓｈｕＩＬ−６Ｒｃ」）の融合蛋白質により媒介されるＩＬ−６トランスシグナリングをブロックするＮＩ−１２０１抗体の能力を示すグラフである。
【図５】図５は膜結合ＩＬ−６ＲへのＮＩ−１２０１抗体の結合を示すグラフである。
【図６Ａ】図６Ａ〜６ＤはＩＬ−６Ｒ上のＮＩ−１２０１エピトープのマッピングを示す一連の説明およびグラフである。
【図６Ｂ】図６Ａ〜６ＤはＩＬ−６Ｒ上のＮＩ−１２０１エピトープのマッピングを示す一連の説明およびグラフである。
【図６Ｃ】図６Ａ〜６ＤはＩＬ−６Ｒ上のＮＩ−１２０１エピトープのマッピングを示す一連の説明およびグラフである。
【図６Ｄ】図６Ａ〜６ＤはＩＬ−６Ｒ上のＮＩ−１２０１エピトープのマッピングを示す一連の説明およびグラフである。
【図７】図７Ａおよび７ＢはカニクイザルＩＬ−６シグナリングと交差反応して中和するＮＩ−１２０１抗体の能力を示す説明およびグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明は可溶性形態、または膜結合（即ち細胞表面上に発現される場合）においてヒトＩＬ−６／ＩＬ−６受容体複合体（「ＩＬ−６Ｒｃ」）に特異的に結合するモノクローナル抗体を提供する。本発明は、更に、ＩＬ−６Ｒｃと特異的に結合するモノクローナル抗体を提供し、ここで、抗体はＩＬ−６と複合体形成していない場合のＩＬ−６Ｒにも結合する。これらの抗体は総称して本明細書においては「ｈｕＩＬ−６Ｒｃ」抗体と称する。抗体は例えば完全ヒト抗体である。
【００２７】
本発明の抗体はＩＬ−６Ｒｃならびに／またはＩＬ−６ＲｃおよびＩＬ−６Ｒの両方に特異的に結合し、ここで、抗体はヒトＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、または両方の１つ以上のアミノ酸残基を包含するエピトープに結合する。
【００２８】
本発明の抗体は≦１μＭ、例えば≦１００ｎＭ、好ましくは≦１０ｎＭ、そしてより好ましくは≦１ｎＭの平衡結合定数（Ｋｄ）でＩＬ−６Ｒｃならびに／またはＩＬ−６ＲｃおよびＩＬ−６Ｒエピトープの両方に結合する。例えば本明細書において提供されるｈｕＩＬ−６Ｒｃ抗体は概ね≦１ｎＭ〜約１ｐＭの間の範囲におけるＫｄを示す。
【００２９】
ＩＬ−６は炎症促進性および抗炎症性のサイトカインの両方として作用する。それはＴ細胞およびマクロファージから分泌されることにより、外傷、特に熱傷、または炎症をもたらす他の組織損傷に対する免疫応答を刺激する。ＩＬ−６は発熱および応答の急性期の最も重要なメディエーターの１つである。筋肉および脂肪組織においては、ＩＬ−６は体温上昇をもたらすエネルギー動員を刺激する。ＩＬ−６は病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）と称される特定の微生物分子に応答してマクロファージにより分泌される場合がある。これらのＰＡＭＰは、炎症性サイトカイン産生をもたらす細胞内シグナリングカスケードを誘導する細胞表面上（または細胞内コンパートメント中）に存在するＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）と称される生得免疫系の高度に重要な検出分子に結合する。ＩＬ−６はまた、ハイブリドーマの成長のためにも必須であり、そしてブリクローンのような多くの補給クローニング培地中にも存在する。
【００３０】
ＩＬ−６はリガンド結合ＩＬ−６Ｒα鎖（ＣＤ１２６としても知られている）およびシグナリング伝達成分ｇｐ１３０（ＣＤ１３０とも称される）よりなる細胞表面Ｉ型サイトカイン受容体複合体を介してシグナルする。ｇｐ１３０は白血病阻害因子（ＬＩＦ）、毛様体神経栄養性因子、オンコスタチンＭ、ＩＬ−１１およびカルジオトロフィン−１を包含する数種のサイトカインに対する共通のシグナルトランスデューサーであり、そして多くの組織においてほぼユビキタスに発現される。これとは対照的に、ＣＤ１２６の発現は特定の組織に限定される。ＩＬ−６がその受容体と相互作用すると、それはｇｐ１３０およびＩＬ−６Ｒ蛋白質が複合体を形成するようにトリガーし、これにより受容体を活性化させる。これらの複合体がｇｐ１３０の細胞内領域をまとめることにより特定の転写因子、Ｊａｎｕｓキナーゼ（ＪＡＫ）、ならびに転写シグナルトランスデューサーおよびアクチベーター（ＳＴＡＴ）を介してシグナル伝達カスケードを開始させる。従って、ＩＬ−６シグナリングの中和は例えば敗血症、癌（例えば多発性骨髄腫疾患（ＭＭ）、腎細胞癌（ＲＣＣ）、形質細胞性白血病、リンパ腫、Ｂ−リンパ増殖性障害（ＢＬＰＤ）、および前立腺癌）、骨再吸収、骨粗鬆症、悪液質、乾癬、メサンギウム増殖性糸球体腎炎、カポジ肉腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、および炎症性疾患（例えば、関節リウマチ、全身発症性若年性特発性関節炎、高ガンマグロブリン血症、クローン病、潰瘍性結腸炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、多発性硬化症、キャッスルマン病、ＩｇＭ免疫グロブリン血症、心臓粘液腫、喘息、アレルギー性喘息および自己免疫インシュリン依存性真正糖尿病）のような障害の処置における潜在的治療戦略となる。
【００３１】
本発明のｈｕＩＬ−６Ｒｃ抗体はＩＬ−６Ｒｃの機能的活性をモジュレート、ブロック、阻害、低減、拮抗、中和または干渉する作用を有する。ＩＬ−６Ｒｃの機能的活性は例えば、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路の活性化およびＭＡＰＫカスケードの活性化を介した細胞内シグナリング、急性期の蛋白質産生、抗体の産生ならびに細胞分化および／または増殖を包含する。例えばｈｕＩＬ−６Ｒｃ抗体はシグナル伝達受容体成分ｇｐ１３０へのＩＬ−６Ｒｃの結合を部分的または完全にモジュレート、ブロック、阻害、低減、拮抗、中和または干渉することによりＩＬ−６Ｒｃの機能的活性を完全または部分的に阻害する。
【００３２】
ｈｕＩＬ−６Ｒｃ抗体は、ｈｕＩＬ−６Ｒｃ抗体の存在下におけるＩＬ−６Ｒｃの機能的活性のレベルが、本明細書に記載したｈｕＩＬ−６Ｒｃ抗体との結合の非存在下におけるＩＬ−６Ｒｃの機能的活性のレベルと比較して、少なくとも９５％まで、例えば９６％、９７％、９８％、９９％または１００％まで低下する場合に、ＩＬ−６Ｒｃの機能的活性を完全にモジュレート、ブロック、阻害、低減、拮抗、中和または干渉するものとみなされる。ｈｕＩＬ−６Ｒｃ抗体はｈｕＩＬ−６Ｒｃ抗体の存在下におけるＩＬ−６Ｒｃの活性のレベルが本明細書に記載したｈｕＩＬ−６Ｒｃ抗体との結合の非存在下におけるＩＬ−６Ｒｃの活性のレベルと比較して９５％、例えば１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、８０％、８５％または９０％未満まで低下する場合に、ＩＬ−６Ｒｃの機能的活性を部分的にモジュレート、ブロック、阻害、低減、拮抗、中和または干渉するとみなされる。
【００３３】
定義
特段に定義されない限り、本発明に関連して使用される科学的および技術的な用語は当業者が共通して理解する意味を有するものとする。更にまた、文脈により別途必要とされない限り、単数形の用語は複数形を包含し、そして複数形の用語は単数形を包含するものとする。一般的に、本明細書に記載する細胞および組織培養、分子生物学、ならびに蛋白質およびオリゴまたはポリヌクレオチド化学およびハイブリダイゼーションに関連して使用される命名法およびその手法は当該分野でよく知られ、そして共通して使用されている。標準的な手法が組み換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、ならびに組織培養および形質転換のために使用される（例えばエレクトロポレーション、リポフェクション）。酵素的な反応および精製の手法は製造元の仕様書に従って、または、当該分野で共通して実施されている通り、または本明細書に記載する通り実施される。上記した手法および操作法は一般的に当該分野で周知の従来の方法に従って、または、本明細書を通して引用され考察される種々の一般的およびより具体的な参考文献に記載する通り実施される。例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９））を参照できる。本明細書に記載する分析化学、合成有機化学、および医薬化学に関連して使用される命名法、ならびに実験操作および手法は、当該分野で周知であり、そして共通して使用されている。化学合成、化学分析、薬学的調製、製剤、および送達、ならびに患者の処置のためには標準的な手法が使用される。
【００３４】
本開示に従って使用する場合、以下の用語は、特段の記載が無い限り、以下の意味を有すると理解するものとする。
【００３５】
本明細書において使用する場合、インターロイキン−６受容体、ＩＬ−６Ｒ、インターロイキン−６受容体−アルファ、ＩＬ−６Ｒα、クラスター分化因子１２６、およびＣＤ１２６は同義であり、そして互換的に使用してよい。これらの用語の各々は特段の記載が無い限りホモ２量体蛋白質を指す。
【００３６】
本明細書において使用する場合、「抗体」という用語は免疫グロブリン分子および免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の免疫学的に活性な部分、即ち、抗原と特異的に結合する（免疫反応する）抗原結合部位を含有する分子を指す。「特異的に結合する」または「免疫反応する」または、「対抗して指向する」とは、抗体が所望の抗原の１つ以上の抗原決定基と反応するが、他のポリペプチドとは反応しないか、またははるかに低値の親和性（Ｋｄ＞１０−６）で結合することを意味する。抗体はポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ｄＡｂ（ドメイン抗体）、単鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２フラグメント、ｓｃＦｖｓ、およびＦａｂ発現ライブラリを包含するがこれらに限定されない。
【００３７】
基本的抗体構造単位は４量体を含むことが知られている。各４量体は同一の２対のポリペプチド鎖を有し、各対が１つの「軽」（約２５ｋＤａ）および１つの「重」（約５０〜７０ｋＤａ）鎖を有する。各鎖のアミノ末端部分は抗原認識を主に担っている約１００〜１１０以上のアミノ酸の可変領域を包含する。各鎖のカルボキシ末端部分はエフェクター機能を主に担っている定常領域を定義している。一般的に、ヒトから得られた抗体分子は分子中に存在する重鎖の性質により相互に異なっているクラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥおよびＩｇＤのいずれかに関連する。特定のクラスはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびその他のようなサブクラスも有する。更にまた、ヒトにおいては、軽鎖はカッパ鎖またはラムダ鎖であってよい。
【００３８】
「モノクローナル抗体」（ＭＡｂ）または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、本明細書において使用する場合、ユニークな軽鎖遺伝子産物およびユニークな重鎖遺伝子産物よりなる抗体分子の僅か１つの分子種を含有する抗体分子の集団を指す。特に、モノクローナル抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）は集団の全ての分子において同一である。ＭＡｂは自身に対するユニークな結合親和性を特徴とする抗原の特定のエピトープと免疫反応することができる抗原結合部位を含有する。
【００３９】
一般的に、ヒトから得られた抗体分子は分子中に存在する重鎖の性質により相互に異なっているクラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥおよびＩｇＤのいずれかに関連する。特定のクラスはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびその他のようなサブクラスも有する。更にまた、ヒトにおいては、軽鎖はカッパ鎖またはラムダ鎖であってよい。
【００４０】
「抗原結合部位」または「結合部位」という用語は抗原結合に参加する免疫グロブリン分子の部分を指す。抗原結合部位は重（「Ｈ」）および軽（「Ｌ」）鎖のＮ末端可変（「Ｖ」）領域のアミノ酸残基により形成される。「超可変領域」と称される重鎖および軽鎖のＶ領域内部の３つの高度にダイバージェントなストレッチは「フレームワーク領域」即ち「ＦＲ」として知られているより保存されたフランキングストレッチの間に介在している。即ち、「ＦＲ」という用語は免疫グロブリンにおける超可変領域の間、およびそれに隣接して天然には存在するアミノ酸配列を指す。抗体分子において、軽鎖の３つの超可変領域および重鎖の３つの超可変領域は抗原結合表面を形成するように３次元空間内に相互に相対的に配置される。抗原結合表面は結合抗原の３次元表面に相補であり、そして重鎖および軽鎖の各々の超可変領域は「相補性決定領域」即ち「ＣＤＲ」と称される。各ドメインへのアミノ酸の帰属はＫａｂａｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９８７および１９９１））、またはＣｈｏｔｈｉａ＆Ｌｅｓｋ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）、Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｎａｔｕｒｅ３４２：８７８−８８３（１９８９）の定義に従う。
【００４１】
本明細書において使用する場合、「エピトープ」という用語は免疫グロブリンもしくはそのフラグメント、またはＴ細胞受容体に特異的に結合することができるいずれかの蛋白質決定基を包含する。「エピトープ」という用語は免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体に特異的に結合することができるいずれかの蛋白質決定基を包含する。エピトープ決定基は通常はアミノ酸または糖側鎖のような分子の化学的に活性な表面の分子団よりなり、そして、通常は特定の３次元構造特徴、ならびに特定の荷電特徴を有する。抗体は解離定数が≦１μＭ；例えば≦１００ｎＭ、好ましくは≦１０ｎＭ、より好ましくは≦１ｎＭである場合に抗原に特異的に結合すると言われる。
【００４２】
本明細書において使用する場合、「免疫学的結合」および「免疫学的結合特性」という用語は、免疫グロブリン分子と免疫グロブリンが特異的である抗原との間に生じる型の非共有結合相互作用を指す。免疫学的結合相互作用の強度、または親和性は、相互作用の解離定数（Ｋｄ）の項で表すことができ、ここで、より小さいＫｄがより大きい親和性を表す。選択されたポリペプチドの免疫学的結合特性は当該分野で周知の方法を用いて定量できる。そのような方法の１つでは抗原結合部位／抗原複合体の形成および解離の速度を計測し、ここで、これらの速度は複合体相手の濃度、相互作用の親和性、および両方向の速度に等しく影響する幾何学的パラメーターに依存する。即ち「オンレート定数」（Ｋｏｎ）および「オフレート定数」（Ｋｏｆｆ）は、濃度ならびに会合および解離の実際の速度の計算により測定できる。（Ｎａｔｕｒｅ３６１：１８６〜８７（１９９３）参照）。Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎの比は親和性の関連しない全てのパラメーターの消去を可能にし、そして解離定数Ｋｄと等しい。（一般的に、Ｄａｖｉｅｓら（１９９０）Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖ
Ｂｉｏｃｈｅｍ５９：４３９〜４７３を参照）。本発明の抗体は、アッセイ、例えば放射性リガンド結合アッセイまたは当該分野で公知の同様のアッセイにより計測される場合に、平衡結合定数（Ｋｄ）が≦１μＭ、好ましくは≦１００ｎＭ、より好ましくは≦１０ｎＭ、そして最も好ましくは≦１００ｐＭ〜約１ｐＭである場合に、ＩＬ−６Ｒｃおよび／またはＩＬ−６ＲｃとＩＬ−６Ｒとの両方に特異的に結合すると言われる。
【００４３】
「単離されたポリヌクレオチド」という用語は、本明細書において使用する場合、ゲノム、ｃＤＮＡ、もしくは合成起源、またはこれらの何らかの組み合わせのポリヌクレオチドを意味するものとし、これはその起源により、「単離されたポリヌクレオチド」は（１）「単離されたポリヌクレオチド」が天然に存在するポリヌクレオチドの全てまたは一部分に会合していないか、（２）自身が天然には連結していないポリヌクレオチドに作動可能に連結しているか、または（３）より大きい配列の部分として天然には存在しない。本発明によるポリヌクレオチドは配列番号２、８および１２に存在する重鎖免疫グロブリン分子をコードする核酸分子、ならびに配列番号４、６、１０、および１４に示される軽鎖免疫グロブリン分子をコードする核酸分子を包含する。
【００４４】
「単離された蛋白質」という用語は、本明細書においては、ｃＤＮＡ、組み換えＲＮＡ、もしくは合成起源、またはこれらの何らかの組み合わせの蛋白質を意味し、これはその起源または誘導源により、「単離された蛋白質」は（１）天然には存在する蛋白質と会合しないか、（２）同じ源に由来する他の蛋白質を含有しない、例えば海洋性蛋白質を含有しないか、（３）異なる種に由来する細胞により発現されるか、または（４）天然には存在しない。
【００４５】
「ポリペプチド」という用語は、本明細書においてはネイティブの蛋白質、ポリペプチド配列のフラグメントまたは類縁体を指すための包括的用語として使用する。従って、ネイティブの蛋白質のフラグメントおよび類縁体はポリペプチドの属の種である。本発明によるポリペプチドは、配列番号２、８、および１２に示す重鎖免疫グロブリン分子ならびに配列番号４、６、１０、および１４に示す軽鎖免疫グロブリン分子、ならびに重鎖免疫グロブリン分子をカッパ軽鎖免疫グロブリン分子のような軽鎖免疫グロブリン分子とともに含む組み合わせにより形成された抗体分子、またはその逆、ならびにそのフラグメントおよび類縁体を含む。
【００４６】
「天然に存在する」という用語は、対象に適用しながら本明細書において使用する場合はその対象が天然に存在し得るという事実を指す。例えば、天然源から単離できる生物（ウィルスを包含）中に存在し、そして実験室においてヒトにより意図的に修飾されていないか、または天然に存在する、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列である。
【００４７】
「作動可能に連結」という用語は、本明細書において使用する場合、記載された成分の位置がその意図される態様においてそれらを機能可能とする関係にあることを指す。コーディング配列に「作動可能に連結」した制御配列はコーディング配列の発現が制御配列と適合する条件下に達成されるような方法においてライゲーションされる。
【００４８】
「制御配列」という用語は、本明細書において使用する場合、それらがライゲーションされているコーディング配列の発現およびプロセシングを行うために必要なポリヌクレオチド配列を指す。そのような制御配列の性質は、原核生物においては宿主細胞に応じて異なり、そのような制御配列は一般的にプロモーター、リボソーム結合部位を、そして真核生物においては転写終止配列を包含し、一般的にはそのような制御配列はプロモーターおよび転写終止配列を包含する。「制御配列」という用語は最小でも自身の存在が発現およびプロセシングのために必須である全ての成分を包含することを意図しており、そして更に、存在が好都合である追加的成分、例えばリーダー配列および融合相手の配列も包含する。「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書においては少なくとも１０塩基長のヌクレオチドの重合体ホウ素、リボヌクレオチドもしくはデオキシヌクレオチドのいずれか、またはいずれかの型のヌクレオチドの修飾された型を意味する。用語はＤＮＡの一本および二本鎖の型を包含する。
【００４９】
「オリゴヌクレオチド」という用語は本明細書においては天然に存在するおよび天然に存在しないオリゴヌクレオチド連結部により共に連結された、天然に存在する、および修飾されたヌクレオチドを包含する。オリゴヌクレオチドは２００塩基以下の長さを一般的には含むポリヌクレオチドのサブセットである。好ましくはオリゴヌクレオチドは１０〜６０塩基長であり、最も好ましくは１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０〜４０塩基長である。オリゴヌクレオチドは通常は例えばプローブに関しては１本鎖であるが、オリゴヌクレオチドは例えば遺伝子突然変異体の構築における使用のためには２本鎖であってよい。本発明のオリゴヌクレオチドはセンスまたはアンチセンスのオリゴヌクレオチドの何れかである。
【００５０】
「天然に存在するヌクレオチド」という用語は本明細書においてはデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを包含する。「修飾されたヌクレオチド」という用語は本明細書においては修飾または置換された糖基等を伴ったヌクレオチドを包含する。「オリゴヌクレオチド連結部」という用語は本明細書においては、オリゴヌクレオチド連結部、例えばホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレルロエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホラニラデート、ホスホロンミデート等を包含する。例えばＬａＰｌａｎｃｈｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：９０８１（１９８６）；Ｓｔｅｃら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０６：６０７７（１９８４），Ｓｔｅｉｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：３２０９（１９８８），Ｚｏｎら、Ａｎｔｉ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ６：５３９（１９９１）；Ｚｏｎら、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｐｐ．８７〜１０８（Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｅｎｇｌａｎｄ（１９９１））；Ｓｔｅｃら、米国特許５，１５１，５１０；Ｕｈｌｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｐｅｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ９０：５４３（１９９０）を参照。オリゴヌクレオチドは所望により検出のための標識を包含できる。
【００５１】
「選択的にハイブリダイズする」という用語は本明細書においては検出可能に、そして特異的に結合することを意味する。本発明によるポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよびそのフラグメントは非特異的核酸への検出可能な結合の感知可能な量を最小限にするハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件下において核酸鎖に選択的にハイブリダイズする。高ストリンジェント条件は当該分野で知られ、そして本明細書において考察される通りの選択的ハイブリダイゼーション条件を達成するために使用できる。一般的に本発明のポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、およびフラグメントと目的の核酸配列の間の核酸配列の相同性は少なくとも８０％、そしてより典型的には少なくとも８５％、９０％、９５％、９９％、および１００％の好ましく漸増する相同性を伴う。２つのアミノ酸配列は、それらの配列の間に部分的または完全な同一性がある場合に相同とされる。例えば８５％相同性とは２つの配列を最大マッチとなるようにアラインした場合にアミノ酸の８５％が同一であることを意味する。ギャップ（マッチさせるべき２配列のうちの何れかにおける）がマッチングを最大限にする場合に許容され、５以下のギャップ長が好ましく、２以下がより好ましい。或いは、そして好ましくは、２つの蛋白質配列（または少なくとも３０アミノ酸長のそれより誘導されたポリペプチド配列）は、それらが突然変異データマトリックスおよび６以上のギャプペナルティーとしたプログラムＡＬＩＧＮを用いた場合に５（標準偏差単位）より大きいアライメントスコアを有すれば、本明細書においてこの用語を用いた際の相同とする。Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．，Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｐｐ．１０１〜１１０（第５巻、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（１９７２））およびこの巻の補遺２、ｐｐ．１〜１０を参照。２つの配列またはその部分はより好ましくは、それらのアミノ酸がＡＬＩＧＮプログラムを用いて最適にアラインした場合に５０％以上同一であれば、相同である。「相当する」という用語は本明細書においてはポリヌクレオチド配列がレファレンスポリヌクレオチド配列の全てまたは一部分に相同である（即ち同一であり、厳密に進化的に関連していない）こと、または、ポリペプチド配列がレファレンスポリペプチド配列に同一であることを意味する。対照比較すれば、「相補である」という用語は本明細書においては、相補配列がレファレンスポリヌクレオチド配列の全てまたは一部分に相同であることを意味する。例示すれば、ヌクレオチド配列「ＴＡＴＡＣ」はレファレンス配列「ＴＡＴＡＣ」に相当し、そしてレファレンス配列「ＧＴＡＴＡ」に相補である。
【００５２】
以下の用語、即ち「レファレンス配列」「比較ウインドウ」、「配列同一性」、「配列同一性のパーセンテージ」、および「実質的な同一性」は、２つ以上のポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列の間の配列の関連性を説明するために使用する。「レファレンス配列」は配列比較のための基本として使用される定義された配列であり、レファレンス配列は例えば配列表に示された完全長ｃＤＮＡまたは遺伝子配列のセグメントとしてのより大きい配列のサブセットであってよく、または、完全なｃＤＮＡまたは遺伝子配列を含んでよい。一般的にレファレンス配列は少なくとも１８ヌクレオチドまたは６アミノ酸長、頻繁には少なくとも２４ヌクレオチドまたは８アミノ酸長、そしてしばしば少なくとも４８ヌクレオチドまたは１６アミノ酸長である。２つのポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列は各々（１）２つの分子の間で同様である配列（即ち完全なポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列の一部分）を含んでよく、そして（２）更に２つのポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列の間で不一致である配列を含んでいて良いため、２つ（以上）の分子の間の配列の比較は、典型的には配列同様性の局所的領域を発見して比較するための「比較ウインドウ」にわたる２つの分子の配列を比較することにより実施される。「比較ウインドウ」とは本明細書において使用する場合、少なくとも１８近接ヌクレオチド位置または６アミノ酸の概念的セグメントを指し、この場合、ポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列は少なくとも１８近接ヌクレオチドのレファレンス配列または６アミノ酸配列と比較してよく、そしてこの場合、比較ウインドウ中のポリヌクレオチド配列の部分は２つの配列の最適なアライメントのためにレファレンス配列（付加または欠失を有さない）と比較した場合に２０パーセント以下の付加、欠失、置換等（即ちギャップ）を含んでよい。比較ウインドウをアラインするための配列の最適なアライメントは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ  Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）のローカルホモロジーアルゴリズムによるか、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）のホモロジーアライメントアルゴリズムによるか、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８５：２４４４（１９８８）の同様性検索法によるか、これらのアルゴリズムのコンピューター処理（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ７．０中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ，およびＴＦＡＳＴＡ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）、Ｇｅｎｅｗｏｒｋｓ、またはＭａｃＶｅｃｔｏｒソフトウエアパッケージ）によるか、または、検査により実施してよく、そして種々の方法により発生した最良のアライメント（即ち比較ウインドウにわたる相同性の最高パーセンテージを与える）を選択する。
【００５３】
「配列同一性」という用語は２つのポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列が比較ウインドウにわたって同一（即ちヌクレオチド対ヌクレオチド、または残基対残基を基本として）であることを意味する。「配列同一性のパーセンテージ」という用語は、比較のウインドウにわたって最適にアラインされた配列を比較すること、同一の核酸塩基（例えばＡ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、ＵまたはＩ）または残基が両方の配列中に存在する位置の数を測定することによりマッチした位置の数を得ること、マッチした位置の数を比較ウインドウ中の位置の総数（即ちウインドウサイズ）で割ること、および、その結果に１００をかけることにより配列同一性のパーセンテージを得ることにより計算される。「実質的同一性」という用語は本明細書において使用する場合、ポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列の特性を示し、この場合、ポリヌクレオチドまたはアミノ酸は少なくとも１８ヌクレオチド（６アミノ酸）位置の比較ウインドウにわたって、頻繁には、少なくとも２４−４８ヌクレオチド（８−１６アミノ酸）位置のウインドウにわたってレファレンス配列と比較した場合に、少なくとも８５パーセント配列同一性、好ましくは少なくとも９０〜９５パーセント配列同一性、より通常は少なくとも９９パーセント配列同一性を有する配列を含み、この場合、配列同一性のパーセンテージは比較ウインドウにわたって合計レファレンス配列２０パーセント以下となる欠失または付加を包含してよい配列にレファレンス配列を比較することにより計算される。レファレンス配列はより大きい配列のサブセットであってよい。
【００５４】
本明細書において使用する場合、２０の従来のアミノ酸およびそれらの略記法は従来の使用法に従う。Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ−Ａ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（第２版、Ｅ．Ｓ．Ｇｏｌｕｂ  ａｎｄ  Ｄ．Ｒ．Ｇｒｅｎ編、Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ７、Ｍａｓｓ．（１９９１））を参照。２０の従来のアミノ酸、非天然のアミノ酸、例えばα−、α−ジ置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸、および他の非従来のアミノ酸の立体異性体（例えばＤ−アミノ酸）もまた本発明のポリペプチドの適当な成分であってよい。非従来のアミノ酸の例は４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリジン、ε−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、σ−Ｎ−メチルアルギニン、および他の同様のアミノ酸およびイミノ酸（例えば４−ヒドロキシプロリン）を包含する。本明細書において使用するポリペプチドの表記法においては、標準的な仕様および慣例に従って、左手の方向はアミノ末端の方向であり右手の方向はカルボキシ末端の方向である。
【００５５】
同様に、特段の記載が無い限り、１本鎖ポリヌクレオチド配列の左手末端は５’末端であり、２本鎖ポリヌクレオチド配列の左手方向は５’方向と称される。新生ＲＮＡ転写物の５’から３’への付加の方向は転写方向配列領域と称され、ＲＮＡと同じ配列を有するＤＮＡ鎖上にありそしてＲＮＡ転写物の５’に対して５’側である配列領域は「上流配列」と称され、ＲＮＡと同じ配列を有するＤＮＡ鎖上にあり、そしてＲＮＡ転写物の３’末端に対して３’側である配列領域は「下流配列」と称される。
【００５６】
ポリペプチドに適用する場合、「実質的同一性」という用語は、２つのペプチド配列が、例えばデフォルトギャップウエイトを使用しながらプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴにより最適にアラインされた場合に、少なくとも８０パーセントの配列同一性、好ましくは少なくとも９０パーセントの配列同一性、より好ましくは少なくとも９５パーセントの配列同一性、そして最も好ましくは少なくとも９９パーセントの配列同一性を共有することを意味する。
【００５７】
好ましくは、同一ではない残基の位置は保存的アミノ酸置換による相違である。
【００５８】
保存的アミノ酸置換とは、同様の側鎖を有する残基の互換性を指す。例えば脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群はグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンであり；脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群はセリンおよびスレオニンであり；アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群はアスパラギンおよびグルタミンであり；芳香族側鎖を有するアミノ酸の群はフェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンであり；塩基性側鎖を有するアミノ酸の群はリジン、アルギニン、およびヒスチジンであり；そしてイオウ含有側鎖を有するアミノ酸の群はシステインおよびメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換群は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン、バリン、グルタミン酸−アスパラギン酸、およびアスパラギン−グルタミンである。
【００５９】
本明細書において考察する場合、抗体または免疫グロブリンの分子のアミノ酸配列の些少な変動は、アミノ酸配列における変動が少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、そして最も好ましくは９９％で維持されている限り、本発明に包含されることを意図する。特に保存的なアミノ酸の置き換えを意図している。保存的置き換えはその側鎖に関して関連性を有するアミノ酸のファミリー内において起こるものである。遺伝子的にコードされているアミノ酸は一般的に、以下のファミリーに分割され、即ち、（１）酸性アミノ酸はアスパルテート、グルタメート；（２）塩基性アミノ酸はリジン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性アミノ酸はアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンであり、そして（４）非荷電の極性アミノ酸はグリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシンである。親水性アミノ酸はアルギニン、アスパラギン、アスパルテート、グルタミン、グルタメート、ヒスチジン、リジン、セリンおよびスレオニンを包含する。疎水性アミノ酸はアラニン、システイン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシンおよびバリンを包含する。アミノ酸の他のファミリーは（ｉ）脂肪族ヒドロキシファミリーであるセリンおよびスレオニン；（ｉｉ）アミド含有ファミリーであるアスパラギンおよびグルタミン；（ｉｉｉ）脂肪族ファミリーであるアラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン；および（ｉｖ）芳香族ファミリーであるフェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンを包含する。例えばロイシンのイソロイシンまたはバリンとの、アスパルテートのグルタメートとの、スレオニンのセリンとの単離された置き換え、またはあるアミノ酸の構造的に関連性のあるアミノ酸との同様の置き換えは、特に置き換えにフレームワーク部位内部のアミノ酸が関与していない場合には、結果として生じる分子の結合または特性に大きな影響を及ぼさないと期待することは合理的である。アミノ酸の変化が機能的ペプチドをもたらすかどうかは、ポリペプチド誘導体の特定の活性をアッセイすることにより容易に測定できる。アッセイは本明細書に詳細に記載する。抗体または免疫グロブリンの分子のフラグメントまたは類縁体は当業者により容易に調製できる。フラグメントまたは類縁体の好ましいアミノおよびカルボキシ末端は機能的ドメインの境界近傍に存在する。構造的および機能的なドメインはヌクレオチドおよび／またはアミノ酸の配列のデータの公的または私的な配列データベースとの比較により発見できる。好ましくは、コンピューター化された比較方法を用いることにより既知の構造および／または機能の他の蛋白質中に存在する配列モチーフまたは予測蛋白質コンホーメーションドメインを発見する。既知の３次元構造に折りたたまれる蛋白質配列を発見するための方法は知られている。Ｂｏｗｉｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５３：１６４（１９９１）。即ち、上記した例は、当業者であれば本発明より構造的および機能的なドメインを定義するために使用してよい配列モチーフおよび構造的コンホーメーションを認識できることを示している。
【００６０】
好ましいアミノ酸置換は（１）蛋白質分解に対する感受性を低減し、（２）酸化に対する感受性を低減し、（３）蛋白質複合体を形成するための結合親和性を改変し、（４）結合親和性を改変し、そして（４）そのような類縁体のその他の物理化学的または機能的な特性を付与または変調させるものである。類縁体は天然に存在するペプチド配列以外の配列の種々のムテインを包含できる。例えば、単一または多数のアミノ酸の置換（好ましくは保存的アミノ酸置換）を天然に存在する配列中に形成してよい（好ましくは細胞間接触を形成するドメインの外部のポリペプチドの部分において）。保存的アミノ酸置換は親配列の構造的特徴を実質的に変化させてはならない（例えば置き換えのアミノ酸は親配列に存在するヘリックスを破断したり、または、親配列を特徴付ける２次構造の他の型を破断させるような傾向を有してはならない）。当該分野で知られたポリペプチドの２次および３次構造の例はＰｒｏｔｅｉｎｓ、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ編、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４））；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｃ．ＢｒａｎｄｅｎおよびＪ．Ｔｏｏｚｅ編、Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９９１））；およびＴｈｏｒｎｔｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：１０５（１９９１）に記載されている。
【００６１】
「ポリペプチドフラグメント」という用語は本明細書においては、アミノ末端および／またはカルボキシ末端の欠失を有するポリペプチドを指すが、その場合、残余のアミノ酸配列は、例えば完全長ｃＤＮＡ配列から推定される天然に存在する配列における相当する位置に同一である。フラグメントは典型的には少なくとも５、６、８または１０アミノ酸長、好ましくは少なくとも１４アミノ酸長、より好ましくは少なくとも２０アミノ酸長、通常は少なくとも５０アミノ酸長、そしてより更に好ましくは少なくとも７０アミノ酸長である。「類縁体」という用語は本明細書において使用する場合、推定されたアミノ酸配列の一部分に対する実質的同一性を有し、そして適当な結合条件下でＩＬ−６Ｒｃおよび／またはＩＬ−６ＲｃとＩＬ−６Ｒの両方への特異的結合を有する少なくとも２５アミノ酸のセグメントを含むポリペプチドを指す。典型的には、ポリペプチド類縁体は天然に存在する配列に対して保存的アミノ酸置換（または付加または欠失）を含む。類縁体は典型的には少なくとも２０アミノ酸長、好ましくは少なくとも５０アミノ酸長以上で有り、そして頻繁には完全長の天然に存在するポリペプチドと同じ長さであることができる。
【００６２】
ペプチド類縁体は鋳型ペプチドと類似の特性を有する非ペプチド薬品として製薬産業において一般的に使用されている。これらの型の非ペプチド化合物は「ペプチドのミメティック」または「ペプチドミメティック」と称されている。Ｆａｕｃｈｅｒｅ，Ｊ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．１５：２９（１９８６），ＶｅｂｅｒおよびＦｒｅｉｄｉｎｇｅｒＴＩＮＳ  ｐ．３９２（１９８５）；およびＥｖａｎｓら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３０：１２２９（１９８７）このような化合物は頻繁にはコンピューター化された分子モデリングを用いて開発される。治療上有用なペプチドと構造的に同様であるペプチドミメティックは等価な治療的または予防的な効果をもたらすために使用してよい。一般的に、ペプチドミメティックはパラダイムポリペプチド（即ち生化学的な特性または薬理学的な活性を有するポリペプチド）、例えばヒト抗体と構造的に同様であるが、当該分野で良く知られている方法により−−ＣＨ２ＮＨ−−、−−ＣＨ２Ｓ−、−−ＣＨ２−ＣＨ２−−、−−ＣＨ＝ＣＨ−−（シスおよびトランス）、−−ＣＯＣＨ２−−、ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−−、および−ＣＨ２ＳＯ−−よりなる群から選択される連結部により場合により置き換えられている１つ以上のペプチド連結部を有する。コンセンサス配列の１つ以上のアミノ酸の同じ型のＤ−アミノ酸との系統的置換（例えばＬ−リジンの代わりにＤ−リジン）はより安定なペプチドを形成するために使用してよい。更にまた、コンセンサス配列または実質的に同一のコンセンサス配列の変動を含むコンストレインを有するペプチドを当該分野で知られた方法（ＲｉｚｏおよびＧｉｅｒａｓｃｈ  Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１：３８７（１９９２））により形成してよく；例えばペプチドを環化する分子内ジスルフィド架橋を形成することができる内部システイン残基を付加させることにより行ってよい。
【００６３】
「作用物質」という用語は本明細書において使用する場合、化学的化合物、化学的化合物の混合物、生物学的巨大分子、または生物学的材料から作成した抽出物を指す。
【００６４】
本明細書において使用する場合、「標識」または「標識された」という用語は例えば放射標識アミノ酸の取り込み、または、マーカーを有するアビジン（例えば蛍光マーカーまたは光学的または熱量測定的な方法により検出され得る酵素活性を含有するストレプトアビジン）により検出され得るビオチニル化部分のポリペプチドへの連結による、検出可能なマーカーの取り込みを指す。特定の状況においては、標識またはマーカーも治療薬であることができる。ポリペプチドおよび糖蛋白質を標識する種々の方法が当該分野で知られており、使用してよい。ポリペプチドのための標識の例は以下のもの、即ち放射性同位体または放射性核種（例えば３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、蛍光標識（例えばＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニドリン）、酵素標識（例えばセイヨウワサビパーオキシダーゼ、ｐ−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学ルミネセント、ビオチニル基、２次レポーターにより認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えばロイシンジッパー対配列、２次抗体のための結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）を包含するがこれらに限定されない。一部の実施形態においては、標識は種々の長さのスペーサーアームにより連結することにより潜在的な立体障害を低減する。「薬剤または薬品」という用語は本明細書において使用する場合、患者に適切に投与された場合に所望の治療効果を誘導することができる科学的化合物または組成物を指す。
【００６５】
本明細書に置ける他の化学的用語は例えばＴｈｅ  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｒｍｓ（Ｐａｒｋｅｒ，Ｓ．編、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ（１９８５））により例示される通り当該分野における従来の使用に従って使用する。
【００６６】
「抗新生物剤」という用語は本明細書において使用する場合、ヒトにおける新生物、特に悪性（癌性）の患部、例えば癌腫、肉腫、リンパ腫、または白血病の発生または進行を阻害する機能的特性を有する薬剤を指す。転移の阻害は頻繁には抗新生物剤の特性である。
【００６７】
本明細書において使用する場合、「実質的に純粋」とはある対象物質種が存在する優勢な物質種であること（即ち分子基準において、それが組成物中の如何なる他の個々の物質種よりも豊富にあること）を意味し、そして好ましくは、実質的に精製された画分は、その対象物質種が存在する全ての巨大分子物質種の少なくとも約５０パーセント（モル基準において）を含む組成物である。
【００６８】
一般的に、実質的に純粋な組成物は組成物中に存在する全ての巨大分子物質種の約８０％超、より好ましくは約８５％、９０％、９５％、および９９％超を含むことになる。最も好ましくは対照物質種は、組成物が本質的に単一の巨大分子物質種よりなる本質的均質性（夾雑物質種が従来の検出方法によっては組成物中に検出できない）にまで精製される。
【００６９】
自己免疫疾患は例えば後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ、自己免疫成分によるウィルス疾患である）、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質症候群、自己免疫性アジソン病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳疾患（ＡＩＥＤ）、自己免疫性リンパ増殖症候群（ＡＬＰＳ）、自己免疫性血小板減少性紫斑病（ＡＴＰ）、ベーチェット病、心筋症、セリアックスプルー−疱疹状皮膚炎；慢性疲労免疫機能不全症候群（ＣＦＩＤＳ）、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパシー（ＣＩＰＤ）、瘢痕性類天疱瘡、寒冷凝結反応病、ｃｒｅｓｔ症候群、クローン病、ドゴー病、若年性皮膚筋炎、円盤状狼瘡、本態性混合型クリオグロブリン血症、線維筋肉痛−線維筋炎、グレーブス病、ギランバレー症候群、ハシモト甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡネフロパシー、インスリン依存性真性糖尿病、若年性慢性関節炎（スティル病）、若年性関節リウマチ、メニエール病、混合型結合組織病、多発性硬化症、重症筋無力症、悪性貧血、結節性多発性動脈炎、多発性軟骨炎、多腺症候群、リウマチ性多発性筋痛、多発性筋炎および皮膚筋炎、一次無ガンマグロブリン血症、一次胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象、ライター症候群、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、硬皮症（進行性全身性硬化症（ＰＳＳ）、全身硬化症（ＳＳ）としても知られている）、シェーグレン症候群、スティッフマン症候群、全身性エリテマトーデス、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、潰瘍性結腸炎、ブドウ膜炎、白斑およびウェーゲナー肉芽腫症を包含する。
【００７０】
炎症性障害は例えば慢性および急性の炎症性障害を包含する。炎症性障害の例はアルツハイマー病、喘息、慢性閉塞性肺疾患、アトピー性アレルギー、アレルギー、アテローム性動脈硬化症、気管支喘息、湿疹、糸球体腎炎、対宿主性移植片病、溶血製貧血、変形性関節症、敗血症、卒中、組織および臓器の移植、血管炎、糖尿病性網膜症および換気装置誘導肺傷害を包含する。
【００７１】
癌は例えば多発性骨髄腫疾患（ＭＭ）、腎細胞癌（ＲＣＣ）、形質細胞性白血病、リンパ腫、Ｂ−リンパ増殖性障害（ＢＬＰＤ）、および前立腺癌を包含する。
【００７２】
ｈｕＩＬ−６Ｒｃ抗体
本発明のモノクローナル抗体（例えば完全ヒトモノクローナル抗体）はＩＬ−６Ｒｃ媒介細胞シグナリングを阻害する能力を有する。阻害は例えば実施例１および２に記載する細胞アッセイを用いて測定する。
【００７３】
本発明の例示される抗体は例えば、３９Ｂ９ＶＬ１抗体、３９Ｂ９ＶＬ５抗体、１２Ａ抗体および５Ｃ抗体を包含する。これらの抗体はヒトＩＬ−６Ｒｃおよび／またはＩＬ−６ＲｃとＩＬ−６Ｒの両方に対して特異性を示し、そしてそれらはインビトロでＩＬ−６Ｒｃの機能的活性（即ちｇｐ１３０に結合してシグナリングカスケードを誘導すること）を阻害することがわかっている。
【００７４】
本明細書に記載するｈｕＩＬ−６Ｒｃモノクローナル抗体の各々は以下に列挙するアミノ酸および相当する核酸の配列に示す通り、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を包含する。
【００７５】
３９Ｂ９ＶＬ１および３９Ｂ９ＶＬ５抗体は配列番号１に示す核酸配列によりコードされる共通の重鎖可変領域（配列番号２）を共有している。
【００７６】
【化１】
2020128444.tif 000002
３９Ｂ９ＶＬ１抗体は配列番号３に示す核酸配列によりコードされる軽鎖可変領域（配列番号４）を含む。
【００７７】
【化２】
2020128444.tif 000003
３９Ｂ９ＶＬ５抗体は配列番号５に示す核酸配列によりコードされる軽鎖可変領域（配列番号６）を含む。
【００７８】
【化３】
2020128444.tif 000004
１２Ａ抗体は配列番号７に示す核酸配列によりコードされる重鎖可変領域（配列番号８）を含む。
【００７９】
【化４】
2020128444.tif 000005
１２Ａ抗体は配列番号９に示す核酸配列によりコードされる軽鎖可変領域（配列番号１０）を含む。
【００８０】
【化５】
2020128444.tif 000006
５Ｃ抗体は配列番号１１に示す核酸配列によりコードされる重鎖可変領域（配列番号１２）を含む。
【００８１】
【化６】
2020128444.tif 000007
５Ｃ抗体は配列番号１３に示す核酸配列によりコードされる軽鎖可変領域（配列番号１４）を含む。
【００８２】
【化７】
2020128444.tif 000008
本発明のｈｕＩＬ−６Ｒｃ抗体は更に、例えば、表１において以下に示す重鎖相補性決定領域（ＶＨＣＤＲ）、表２において以下に示す軽鎖相補性決定領域（ＶＬＣＤＲ）、およびこれらの組み合わせを含む。
【００８３】
【表１】
2020128444.tif 000009
【００８４】
【表２−１】
2020128444.tif 000010
相補性決定領域（ＣＤＲ）を包含するアミノ酸はＥ．Ａ．Ｋａｂａｔらにより定義されるとおりである（Ｋａｂａｔ，ＥＡ，ら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ＨｅａｌｔｈおよびＨｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＵＳ  Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｏｆｆｉｃｅ（１９９１）参照）。
【００８５】
更に本発明に包含されるものは本明細書に記載する抗体と同じエピトープに結合する抗体である。例えば、本発明の抗体はＩＬ−６Ｒに特異的に結合し、その場合、抗体はヒトＩＬ−６Ｒ（例えばＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｐ０８８８７）上の１つ以上のアミノ酸残基を包含するエピトープに結合する。本発明の抗体はＩＬ−６Ｒｃに特異的に結合し、その場合、抗体はヒトＩＬ−６（例えばＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０００５９１）、ＩＬ−６Ｒ（例えばＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｐ０８８８７）、または両方の上の１つ以上のアミノ酸残基を包含するエピトープに結合する。
【００８６】
当業者の知る通り、あるモノクローナル抗体（例えば完全ヒトモノクローナル抗体）が本発明のモノクローナル抗体（例えばクローン３９Ｂ９ＶＬ１、３９Ｂ９ＶＬ５、１２Ａおよび５Ｃ）と同じ特異性を有するかについては、後者がｇｐ１３０に結合することを前者が防止するかどうかを確認することにより、予定外の実験を行うことなく、測定することができる。本発明のモノクローナル抗体による結合の低下により示される通り、試験すべきモノクローナル抗体が本発明のモノクローナル抗体と競合すれば、２つのモノクローナル抗体は同じかまたは緊密に関連したエピトープに結合する。
【００８７】
あるモノクローナル抗体が本発明のモノクローナル抗体の特異性を有するかどうかを測定するための別の方法は、本発明のモノクローナル抗体を可溶性ＩＬ−６ＲｃまたはＩＬ−６Ｒ蛋白質（それは通常これと反応性である）と共に予備インキュベートし、次に試験すべきモノクローナル抗体を添加することにより、試験すべきモノクローナル抗体がＩＬ−６Ｒｃおよび／またはＩＬ−６ＲｃとＩＬ−６Ｒの両方に結合するその能力において阻害されるかどうかを測定することである。試験すべきモノクローナル抗体が阻害されれば、その場合は、全ての尤度において、それは、本発明のモノクローナル抗体と同じか、機能的に等価なエピトープ特異性を有する。
【００８８】
本発明のモノクローナル抗体のスクリーニングはまた、例えばＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路および／またはＭＡＰＫシグナリングカスケードのＩＬ−６受容体媒介活性化を計測すること、および、試験用モノクローナル抗体がＩＬ−６シグナリングをモジュレート、ブロック、阻害、低減、拮抗、中和または干渉することができるかどうかを測定することによって実施することもできる。
【００８９】
当該分野で知られた種々の操作法をＩＬ−６Ｒｃおよび／またはＩＬ−６ＲｃとＩＬ−６Ｒの両方に対抗して、またはその誘導体、フラグメント、類縁体、相同体またはオーソログに対して指向されたモノクローナル抗体の製造のために使用してよい。（例えば参照により本明細書に組み込まれるＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｈａｒｌｏｗ  Ｅ、およびＬａｎｅ  Ｄ、１９８８、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ  ｈｅｒｅｉｎ  ｂｙ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅを参照できる）。完全ヒト抗体はＣＤＲを包含する軽鎖および重鎖の両方の全配列がヒト遺伝子から生じている抗体分子である。そのような抗体は本明細書においては「ヒト抗体」または「完全ヒト抗体」と称する。ヒトモノクローナル抗体は例えば後述する実施例に記載する操作法を用いて調製する。ヒトモノクローナル抗体はまた、トリオーマ手法；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ手法（Ｋｏｚｂｏｒら、１９８３  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ４：７２参照）；およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶハイブリドーマ手法（Ｃｏｌｅら、１９８５：ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ  ＡＮＤ  ＣＡＮＣＥＲ  ＴＨＥＲＡＰＹ、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７〜９６参照）を用いることによって産生することもできる。ヒトモノクローナル抗体はヒトハイブリドーマを用いること（Ｃｏｔｅら、１９８３．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ
ＵＳＡ  ８０：２０２６  ２０３０参照）によるか、またはインビトロでエプスタイン・バー・ウィルスによりヒトＢ細胞を形質転換すること（Ｃｏｌｅら、１９８５：ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ  ＡＮＤ  ＣＡＮＣＥＲ  ＴＨＥＲＡＰＹ、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７〜９６参照）により、利用してよく、そして産生してよい。
【００９０】
抗体は免疫血清のＩｇＧ画分を主にもたらすプロテインＡまたはプロテインＧを用いたアフィニティークロマトグラフィーのような当該分野で良く知られている手法により精製する。その後、または代替として、目的の免疫グロブリンの標的である特異的な抗原またはそのエピトープをカラムに固定化することにより免疫アフィニティークロマトグラフィーにより免疫特異的な抗体を精製してよい。免疫グロブリンの精製は例えばＤ．Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ（Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ，Ｉｎｃ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ  ＰＡ発行のＴｈｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ，Ｖｏｌ．１４，Ｎｏ．８（２０００年４月１７日），ｐｐ．２５〜２８）により考察されている。
【００９１】
本発明の抗体（例えば３９Ｂ９ＶＬ１、３９Ｂ９ＶＬ５、１２Ａおよび５Ｃ）は完全ヒトモノクローナル抗体である。ＩＬ−６Ｒｃ媒介細胞シグナリングをモジュレート、ブロック、阻害、低減、拮抗、中和または干渉するモノクローナル抗体は例えば、膜結合型および／または可溶性のＩＬ−６Ｒｃ、例えばネズミ、ラットまたはヒトのＩＬ−６Ｒｃ、またはその免疫原性のフラグメント、誘導体または変異体で動物を免疫化することにより形成される。或いは、ＩＬ−６Ｒｃをコードする核酸分子を含有するベクターでトランスフェクトされた細胞で動物を免疫化し、これによりトランスフェクトされた細胞の表面にＩＬ−６Ｒｃが発現され、そして会合するようにする。或いは、ＩＬ−６Ｒｃへの結合のための抗体または抗原結合ドメイン配列を含有するライブラリをスクリーニングすることにより抗体を得る。このライブラリは例えば、組み立てられたファージ粒子の表面上に発現されるバクテリオファージ被膜蛋白質およびファージ粒子内に含有されるＤＮＡ配列をコードするコードＤＮＡ配列への、蛋白質またはペプチドの融合物としてバクテリオファージ中に調製する（即ち「ファージディスプレイライブラリ」）。次に骨髄腫／Ｂ細胞融合物から生じるハイブリドーマを、ＩＬ−６Ｒｃおよび／またはＩＬ−６ＲｃとＩＬ−６Ｒの両方への反応性を有するものを求めるべくスクリーニングする。
【００９２】
モノクローナル抗体は例えばＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）により記載されたもののようなハイブリドーマ方法を用いて調製する。ハイブリドーマ方法において、マウス、ハムスター、または他の適切な宿主動物は、典型的には、免疫化剤に特異的に結合することになる抗体を産生するか、産生することが可能なリンパ球を生じさせる免疫化剤を用いて面液化する。或いは、リンパ球はインビトロで免疫化できる。
【００９３】
免疫化剤は典型的には蛋白質抗原、そのフラグメントまたはその融合蛋白質を包含することになる。一般的に、ヒト起源の細胞が望まれる場合は末梢血リンパ球を使用し、或いは、非ヒト哺乳類原料が望まれる場合は脾細胞またはリンパ節細胞を使用するかの、何れかとなる。次にリンパ球を適当な融合剤、例えばポリエチレングリコールを用いながら不朽化細胞系統と融合させることにより、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓおよびＰｒａｃｔｉｃｅ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、（１９８６）ｐｐ．５９〜１０３）。不朽化細胞系統は通常は形質転換された哺乳類細胞、特にげっ歯類、ウシおよびヒト機嫌の骨髄腫細胞である。通常はラットまたはマウスの骨髄腫細胞系統を使用する。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは未融合の不朽化細胞の成長または生存を阻害する１つ以上の物質を含有する適当な培養基中で培養できる。例えば、親細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠失している場合、ハイブリドーマ用の培養基は典型的には、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン（ＨＡＴ培地）を包含することになり、これらの物質がＨＧＰＲＴ欠損細胞の成長を防止する。
【００９４】
好ましい不朽化細胞系統は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベル発現を支援し、そしてＨＡＴ培地のような培地に対して感受性であるものである。より好ましい不朽化細胞系統はネズミ骨髄腫系統であり、これは例えばＳａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣａｌｉｆｏｒｎｉａおよびＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａから得ることができる。ヒト骨髄腫およびマウスヒトへテロ骨髄腫の細胞系統もまた、モノクローナル抗体の産生のために報告されている。（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓおよびＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９８７）ｐｐ．５１〜６３）参照）。
【００９５】
次にハイブリドーマ細胞を培養する培養基を、抗原に対抗して指向されたモノクローナル抗体の存在に関してアッセイすることができる。好ましくはハイブリドーマ細胞により産生されたモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降によるか、または、インビトロの結合アッセイ、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により、測定する。そのような手法およびアッセイは当該分野で知られている。モノクローナル抗体の結合親和性は例えばＭｕｎｓｏｎおよびＰｏｌｌａｒｄ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７：２２０（１９８０）のスカッチャード分析により測定することができる。更にまた、、モノクローナル抗体の治療適用においては、標的抗原に対する高い程度の特異性および高い結合親和性を有する抗体を発見することが重要である。
【００９６】
所望のハイブリドーマ細胞が発見された後、限界希釈法によりクローンをサブクローニングし、そして標準的な方法により成長させることができる。（Ｇｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓおよびＰｒａｃｔｉｃｅ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、（１９８６）ｐｐ．５９〜１０３参照）。この目的のための適当な培養基は例えばダルベッコの変性イーグル培地およびＲＰＭＩ１６４０培地を包含する。或いは、ハイブリドーマ細胞は哺乳類中の腹水としてインビボで成長させることができる。
【００９７】
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は従来の免疫グロブリン精製の操作法、例えばプロテインＡセファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーにより培養基または腹水から単離または精製することができる。
【００９８】
モノクローナル抗体はまた、米国特許４，８１６，５６７に記載のもののような組み換えＤＮＡ方法によっても作成できる。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは従来の操作法を用いて（例えばネズミ抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）容易に単離および配列決定することができる。本発明のハイブリドーマ細胞はそのようなＤＮＡの好ましい原料として使用される。単離された後、ＤＮＡは発現ベクター内に入れられ、次にこれをサルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または免疫グロブリン蛋白質を産生しない骨髄腫細胞のような宿主細胞内にトランスフェクトすることにより組み換え宿主細胞中のモノクローナル抗体の合成を達成できる。ＤＮＡはまた、例えば相同ネズミ配列の代わりにヒト重鎖および軽鎖の定常ドメインに関するコーディング配列を置換することにより（米国特許４，８１６，５６７；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ
３６８、８１２〜１３（１９９４）参照）または、免疫グロブリンコーディング配列に非免疫グロブリンポリペプチドに関するコーディング配列の全てまたは部分を共有結合的に連結することにより、修飾することができる。そのような非免疫グロブリンポリペプチドは本発明の抗体の定常ドメインに対して置換させることができ、または、本発明の抗体の１つの抗原複合化部位の可変ドメインに対して置換させることができ、これによりキメラ２価抗体を作成することができる。
【００９９】
ヒト抗体および抗体のヒト化
本発明のモノクローナル抗体は完全ヒト抗体またはヒト化抗体を包含する。これらの抗体は投与された免疫グロブリンに対抗したヒトによる免疫応答を引き起こすことなくヒトへ投与するのに適している。
【０１００】
ｈｕＩＬ−６Ｒｃ抗体は例えば後述する実施例に記載する操作法を用いながら形成する。
【０１０１】
他の代替法においては、ｈｕＩＬ−６Ｒｃ抗体は例えばヒト配列のみを含有する抗体を用いたファージディスプレイ法を用いながら発生させる。そのような手順は、例えば参照により本明細書に組み込まれるＷＯ９２／０１０４７および米国特許６，５２１，４０４において当該分野で良く知られている。この手順において、軽鎖および重鎖のランダムな対を担持しているファージのコンビナトリアルライブラリを、ＩＬ−６Ｒｃまたはそのフラグメントの天然または組み換えの原料を用いながらスクリーニングする。別の手順においては、ｈｕＩＬ−６Ｒｃ抗体は、過程の少なくとも１つの工程がヒトＩＬ−６Ｒｃ蛋白質でトランスジェニック非ヒト動物を免疫化することを包含する過程により製造できる。この手順においては、この異種性の非ヒト動物の内因性重鎖および／またはカッパ軽鎖の遺伝子座の一部は無能力化されており、そして抗原に応答して免疫グロブリンをコードする遺伝子を発生させるために必要な再配列が不可能となっている。更にまた、、少なくとも１つのヒト重鎖遺伝子座および少なくとも１つのヒト軽鎖遺伝子座が動物に安定にトランスフェクトされている。即ち、投与された抗原に応答して、ヒト遺伝子座は再配列することにより、抗原に免疫特異的なヒト可変領域をコードする遺伝子を与える。従って免疫化により、ゼノマウスは完全ヒト免疫グロブリンを分泌するＢ細胞を産生する。
【０１０２】
異種性非ヒト動物を製造するための種々の手法が当該分野で良く知られている。例えば、例えば参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許６，０７５，１８１および６，１５０，５８４を参照できる。この一般的な戦略は１９９４年に公開された状態の最初のＸｅｎｏＭｏｕｓｅTMの作成に関連して明らかにされた。参照により本明細書に組み込まれるＧｒｅｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ７：１３〜２１（１９９４）を参照できる。更にまた、米国特許６，１６２，９６３、６，１５０，５８４、６、１１４，５９８、６，０７５，１８１，および５，９３９，５９８および日本国特許３０６８１８０Ｂ２、３０６８５０６Ｂ２，および３０６８５０７Ｂ２および欧州特許ＥＰ０４６３１５１Ｂ１および国際特許出願ＷＯ９４／０２６０２、ＷＯ９６／３４０９６、ＷＯ９８／２４８９３、ＷＯ００／７６３１０および関連するファミリーメンバーも参照できる。
【０１０３】
代替の手順においては、外因性Ｉｇ遺伝子座がＩｇ遺伝子座に由来する細分物（個々の遺伝子）の封入を介して模倣される「ミニ遺伝子座」手順が利用されている。即ち、１つ以上のＶＨ遺伝子、１つ以上のＤＨ遺伝子、１つ以上のＪＨ遺伝子、ｍｕ定常領域、および第２の定常領域（好ましくはガンマ定常領域）を動物内への挿入用のコンストラクトに形成する。米国特許５，５４５，８０６；５，５４５，８０７；５，５９１，６６９；５，６１２，２０５；５，６２５，８２５；５，６２５，１２６；５，６３３，４２５；５，６４３，７６３；５，６６１，０１６；５，７２１，３６７；５，７７０，４２９；５，７８９，２１５；５，７８９，６５０；５，８１４，３１８；５，８７７；３９７；５，８７４，２９９；６，０２３，０１０；および６，２５５，４５８；および欧州特許０５４６０７３Ｂ１；および国際特許出願ＷＯ９２／０３９１８、ＷＯ９２／２２６４５、ＷＯ９２／２２６４７、ＷＯ９２／２２６７０、ＷＯ９３／１２２２７、ＷＯ９４／００５６９、ＷＯ９４／２５５８５、ＷＯ９６／１４４３６、ＷＯ９７／１３８５２、およびＷＯ９８／２４８８４および関連するファミリーメンバーも参照できる。
【０１０４】
マイクロ細胞融合を介して染色体の大型細分物または全染色体を導入するマウス由来のヒト抗体の形成もまた発表されている。欧州特許出願７７３２８８および８４３９６１を参照できる。
【０１０５】
ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答は当産業にキメラまたはヒト化された抗体を調製するように誘導した。キメラ抗体はヒト定常領域および免疫可変領域を有するが、特定のヒト抗キメラ抗体（ＨＡＣＡ）応答が特にその抗体の長期または多用量の利用において観察されることになると予測される。即ち、ＨＡＭＡまたはＨＡＣＡ応答の関与および／または作用を無効化または緩和するためには、ＩＬ−６Ｒｃおよび／またはＩＬ−６ＲｃとＩＬ−６Ｒの両方に対抗する完全ヒト抗体を提供することが望ましい。
【０１０６】
低減された免疫原性を有する抗体の産生はまた、ヒト化、キメラ化および適切なライブラリを用いたディスプレイ手法を介しても達成される。当然ながら、ネズミ抗体または他の種に由来する抗体は当該分野で良く知られている手法を用いてヒト化または霊長類化することができる。例えばＷｉｎｔｅｒおよびＨａｒｒｉｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ１４：４３４６（１９９３）およびＷｒｉｇｈｔら、Ｃｒｉｔ、Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２１２５−１６８（１９９２）を参照できる。目的の抗体はＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ヒンジドメイン、および／またはフレームワークドメインを相当するヒト配列で置換する組み換えＤＮＡ手法により操作してよい（ＷＯ９２１０２１９０および米国特許５，５３０，１０１；５，５８５，０８９；５，６９３，７６１；５，６９３，７９２；５，７１４，３５０；および５，７７７，０８５参照）。更にまた、キメラ免疫グロブリン遺伝子の構築のためのＩｇｃＤＮＡの使用も知られている（Ｌｉｕら、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．８４：３４３９（１９８７）およびＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：３５２１（１９８７））。ｍＲＮＡをハイブリドーマまたは他の抗体産生細胞から単離し、そしてｃＤＮＡを産生するために使用する。目的のｃＤＮＡは特定のプライマーを用いながらポリメラーゼ連鎖反応により増幅してよい（米国特許４，６８３，１９５および４，６８３，２０２）。或いはライブラリを作成し、そしてスクリーニングすることにより目的の配列を単離する。次に抗体の可変領域をコードするＤＮＡ配列をヒト定常領域配列に融合させる。ヒト定常領域遺伝子の配列はＫａｂａｔら、（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ
Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｎ．Ｉ．Ｈ．ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｎｏ．９１−３２４２に記載されている場合がある。ヒトＣ領域遺伝子は既知クローンから容易に入手される。アイソタイプの選択は所望のエフェクター機能、例えば補体固定化、または抗体依存性細胞性細胞毒性における活性を指針とすることになる。好ましいアイソタイプはＩｇＧｌ、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４である。ヒト軽鎖定常領域のカッパまたはラムダの何れかを使用してよい。次にキメラ、ヒト化抗体を従来の方法により発現させる。
【０１０７】
抗体フラグメント、例えばＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦａｂは例えばプロテアーゼまたは化学的切断による未損傷蛋白質の切断により調製してよい。或いはトランケーションされた遺伝子を設計する。例えばＦ（ａｂ’）２フラグメントの１部分をコードするキメラ遺伝子はＨ鎖のＣＨ１ドメインおよびヒンジ領域をコードするＤＮＡ配列、それに続く翻訳終止コドンを包含することによりトランケーションされた分子を与える場合がある。
【０１０８】
ＨおよびＬのＪ領域のコンセンサス配列は、ヒトＣ領域セグメントへのＶ領域セグメントの後の連結のためにＪ領域内部に有用な制限部位を導入するためのプライマーとしての使用のためにオリゴヌクレオチドを設計するために用いてよい。Ｃ領域のｃＤＮＡはヒト配列における類似の位置に制限部位を位置づけるための部位指向性の突然変異誘発により修飾できる。
【０１０９】
発現ベクターはプラスミド、レトロウィルス、ＹＡＣ、ＥＢＶ誘導エピソーム等を包含する。好都合なベクターは、いずれかのＶＨまたはＶＬ配列も容易に挿入して発現できるように操作された適切な制限部位を有する機能的に完全なヒトＣＨまたはＣＬ免疫グロブリン配列をコードするものである。そのようなベクターにおいて、スプライシングは通常は挿入されたＪ領域におけるスプライスドナー部位とヒトＣ領域に先行するスプライスアクセプター部位の間において、そしてヒトＣＨエクソン内部に存在するスプライス領域においても生じる。ポリアデニル化および転写の終止はコーディング領域の下流のネイティブ染色体部位において生じる。得られたキメラ抗体はレトロウィルスＬＴＲ、例えばＳＶ−４０初期プロモーター（Ｏｋａｙａｍａら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ．３：２８０（１９８３））、ラウス肉腫ウィルスＬＴＲ（Ｇｏｒｍａｎら、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．７９：６７７７（１９８２））、およびモロニーネズミ白血病ウィルスＬＴＲ（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌら、Ｃｅｌｌ４１：８８５（１９８５））を包含するいずれかの強力なプロモーターに連結してよい。更にまた、当然ながら、ネイティブのＩｇプロモーター等も使用してよい。
【０１１０】
更にまた、ヒト抗体または他の種に由来する抗体は、ディスプレイ型の技術、例えば限定しないがファージディスプレイ、レトロウィルスディスプレイ、リボソームディスプレイ、および他の手法を介して、当該分野で良く知られている手法を用いながら、作成することができ、そして得られた分子を追加的な成熟化、例えばアフィニティー成熟化に付すことができ、そしてそのような手法は当該分野で良く知られている。Ｗｒｉｇｈｔら、Ｃｒｉｔ、Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２１２５〜１６８（１９９２）、ＨａｎｅｓおよびＰｌｕｅｃｋｔｈｕｎ  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ９４：４９３７〜４９４２（１９９７）（ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｄｉｓｐｌａｙ）、ＰａｒｍｌｅｙおよびＳｍｉｔｈ  Ｇｅｎｅ７３：３０５〜３１８（１９８８）（ファージディスプレイ）、Ｓｃｏｔｔ、ＴＩＢＳ、第１７巻：２４１〜２４５（１９９２）、Ｃｗｉｒｌａら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ８７：６３７８〜６３８２（１９９０）、Ｒｕｓｓｅｌら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２１：１０８１〜１０８５（１９９３）、Ｈｏｇａｎｂｏｏｍら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖｉｅｗｓ  １３０：４３〜６８（１９９２）、ＣｈｉｓｗｅｌｌおよびＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ＴＩＢＴＥＣＨ；１０：８０〜８Ａ（１９９２）、および米国特許５，７３３，７４３。ディスプレイ技術を利用してヒト型ではない抗体を産生する場合、そのような抗体は上記した通りヒト化することができる。
【０１１１】
これらの手法を用いながら、抗体を形成してＩＬ−６Ｒｃ発現細胞、ＩＬ−６Ｒｃの可溶性形態、エピトープまたはそのペプチド、およびそれらに対する発現ライブラリとすることができ（例えば米国特許５，７０３，０５７参照）、そしてこれをその後、上記した通り本明細書に記載する活性に関してスクリーニングすることができる。
【０１１２】
本発明のｈｕＩＬ−６Ｒｃ抗体は上記した単鎖抗体をコードするＤＮＡセグメントを含有するベクターにより発現させることができる。
【０１１３】
これらは、ベクター、リポソーム、ネイキッドＤＮＡ、アジュバント支援ＤＮＡ、遺伝子銃、カテーテル等を包含できる。ベクターはターゲティング部分（例えば細胞表面受容体に対するリガンド）および核酸結合部分（例えば（ポリリジン）を有するＷＯ９３／６４７０１に記載のような化学コンジュゲート、ウィルスベクター（例えばＤＮＡまたはＲＮＡウィルスベクター）、ターゲティング部分（例えば標的細胞に特異的な抗体）および核酸結合部分（例えばプロタミン）を含有する融合蛋白質であるＰＣＴ／ＵＳ９５／０２１４０（ＷＯ９５／２２６１８）に記載のような融合蛋白質、プラスミド、ファージ等を包含する。ベクターは染色体、非染色体または合成のものであることができる。
【０１１４】
好ましいベクターはウィルスベクター、融合蛋白質および化学コンジュゲートを包含する。レトロウィルスベクターはモロニーネズミ白血病ウィルスを包含する。ＤＮＡウィルスベクターが好ましい。これらのベクターはポックスベクター、例えばオルトポックスまたはアビポックスベクター、ヘルペスウィルスベクター、例えばＩ型単純疱疹ウィルス（ＨＳＶ）ベクター（Ｇｅｌｌｅｒ，Ａ．Ｉ．ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ，６４：４８７（１９９５）；Ｌｉｍ，Ｆ．ら、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ，Ｅｄ．（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｅｎｇｌａｎｄ）（１９９５）；Ｇｅｌｌｅｒ，Ａ．Ｉ．ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．：Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：７６０３（１９９３）；Ｇｅｌｌｅｒ，Ａ．Ｉ．ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃｉＵＳＡ８７：１１４９（１９９０）参照）、アデノウィルスベクター（ＬｅＧａｌ  ＬａＳａｌｌｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５９：９８８（１９９３）；Ｄａｖｉｄｓｏｎら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ  ３：２１９（１９９３）；Ｙａｎｇら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：２００４（１９９５）参照）およびアデノ関連ウィルスベクター（Ｋａｐｌｉｔｔ，Ｍ．Ｇ．ら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．８：１４８（１９９４）参照）を包含する。
【０１１５】
ポックスウィルスベクターは細胞の細胞質内に遺伝子を導入する。アビポックスウィルスベクターは短い期間のみの核酸発現をもたらす。アデノウィルスベクター、アデノ関連ウィルスベクターおよび単純疱疹ウィルス（ＨＳＶ）ベクターは神経細胞内に核酸を導入するために好ましい。アデノウィルスベクターはよりアデノ関連ウィルス（約４ヶ月）よりも短い期間の発現（約２ヶ月）をもたらし、後者は更にＨＳＶベクターよりも短い。選択される特定のベクターは標的細胞および処置すべき状態に応じたものとなる。導入は標準的な手法、例えば感染、トランスフェクション、トランスダクションまたは形質転換により行うことができる。遺伝子転移の様式の例は、例えばネイキッドＤＮＡ、ＣａＰＯ４沈降、ＤＥＡＥデキストラン、エレクトロポレーション、プロトプラスト融合、リポフェクション、細胞マイクロインジェクション、およびウィルスベクターを包含する。
【０１１６】
ベクターは本質的に如何なる所望の標的細胞をターゲティングするためにも使用できる。例えば定位注射を用いて所望の位置にベクター（例えばアデノウィルス、ＨＳＶ）を指向させることができる。更にまた、ＳｙｎｃｈｒｏＭｅｄ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍのようなミニポンプ注入システムを用いた脳室内（ｉｃｖ）注入により粒子を送達することができる。コンベクションと称されるバルクフローに基づいた方法もまた脳の拡張された区域に大型分子を送達する場合に有効であることがわかっており、そして標的細胞へのベクターの送達において有用である場合がある。（Ｂｏｂｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：２０７６〜２０８０（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６６：２９２〜３０５（１９９４）参照）。使用できる他の方法はカテーテル、静脈内、非経腸、腹腔内および皮下注射、および経口または他の知られた投与経路を包含する。
【０１１７】
これらのベクターは種々の方法で使用することができる抗体を大量に発現するために使用できる。例えば試料中のＩＬ−６Ｒｃおよび／またはＩＬ−６Ｒの存在を検出できる。抗体はまた、ＩＬ−６Ｒｃ関連シグナリングに結合して破断させる試みのために使用できる。
【０１１８】
本発明の抗原性蛋白質に特異的な単鎖抗体の産生のために手法を適合させることができる（例えば米国特許４，９４６，７７８参照）。更にまた、Ｆａｂ発現ライブラリの構築のために方法を適合させる（例えばＨｕｓｅら、１９８９Ｓｃｉｅｎｃｅ２４６：１２７５〜１２８１参照）ことにより、蛋白質または誘導体、そのフラグメント、類縁体または相同体に対する所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速および効果的な発見を可能とすることができる。蛋白質抗原に対するイディオタイプを含有する抗体フラグメントは当該分野で知られた手法、例えば限定しないが（ｉ）抗体分子のペプシン消化により産生したＦ（ａｂ’）２フラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することにより形成したＦａｂフラグメント；（ｉｉｉ）パパインおよび還元剤で抗体分子を処理することにより形成したＦａｂフラグメント、および（ｉｖ）Ｆｖフラグメントにより産生してよい。
【０１１９】
本発明はまた、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２抗−ＩＬ−６Ｒフラグメントまたは抗−ＩＬ−６Ｒｃ複合体フラグメント、単鎖抗−ＩＬ−６Ｒまたは抗−ＩＬ−６Ｒｃ抗体、二重特異性抗−ＩＬ−６Ｒ、および／または抗−ＩＬ−６Ｒｃ抗体、およびヘテロコンジュゲート抗−ＩＬ−６Ｒおよび／または抗−ＩＬ−６Ｒｃ抗体を包含する。
【０１２０】
二重特異性抗体は少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有する抗体である。本例においては、結合特異性の１つはＩＬ−６ＲｃまたはＩＬ−６Ｒに対するものである。第２の結合標的はいずれかの他の抗原であり、そして好都合には細胞表面蛋白質または受容体または受容体サブユニットである。
【０１２１】
二重特異性抗体を作成するための方法は当該分野で知られている。伝統的には二重特異性抗体の組み換え産生は２つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖の対の同時発現に基づいており、その場合、２つの重鎖は異なる特異性を有している（ＭｉｌｓｔｅｉｎおよびＣｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ，３０５：５３７〜５３９（１９８３））。免疫グロブリン重鎖および軽鎖のランダムな取り合わせのために、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は１０種の異なる抗体分子の潜在的混合物を産生し、そのうち僅か１つのみが正確な二重特異性構造を有している。正しい分子の精製は通常はアフィニティークロマトグラフィー工程により達成される。同様の操作法は１９９３年５月１３日公開のＷＯ９３／０８８２９およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら、ＥＭＢＯＪ．，１０：３６５５〜３６５９（１９９１）において開示されている。
【０１２２】
所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン（抗体抗原複合体化部位）は免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合することができる。融合は好ましくはヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３領域の少なくとも部分を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインと行う。融合の少なくとも１つにおいて存在する軽鎖結合のために必要な部位を含有する第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）を有することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合物、および、所望により免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡを、別個の発現ベクター内に導入し、そして、適当な宿主生物中に同時トランスフェクトする。二重特異性抗体を形成することに関するこれ以上の詳細に関しては、例えばＳｕｒｅｓｈら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１２１：２１０（１９８６）を参照できる。
【０１２３】
ＷＯ９６／２７０１１に記載された別の手順によれば、抗体分子の対の間の界面を操作することにより、組み換え細胞培養物から回収されるヘテロ２量体のパーセンテージを最大限にすることができる。好ましい界面は抗体定常ドメインのＣＨ３領域の少なくとも一部分を含む。この方法においては、第１の抗体分子の界面に由来する１つ以上小型のアミノ酸側鎖をより大きい側鎖（例えばチロシンまたはトリプトファン）で置き換える。大きい側鎖と同一か同様のサイズの補償「キャビティー」が、大きいアミノ酸側鎖をより小さいもの（例えばアラニンまたはにスレオニン）と置き換えることにより、第２の抗体分子の界面に生じる。これによりホモ２量体のような他の望ましくない最終生成物よりもヘテロ２量体の収率を増大させるための機序が与えられる。
【０１２４】
二重特異性抗体は完全長抗体または抗体フラグメント（例えばＦ（ａｂ’）２二重特異性抗体）として調製できる。抗体フラグメントから二重特異性抗体を形成するための手法は文献に記載されている。例えば二重特異性抗体は化学結合を用いて調製できる。ＢｒｅｎｎａｎらはＳｃｉｅｎｃｅ２２９：８１（１９８５）において未損傷の抗体が蛋白質分解的に切断されてＦ（ａｂ’）２フラグメントを形成する操作法を記載している。これらのフラグメントはジチオール複合体化剤の亜ヒ酸ナトリウムの存在下に還元されて近接したジチオールを安定化させ、分子間ジスルフィド形成を防止する。次に形成されたＦａｂ’フラグメントをチオニトロベンゾエート（ＴＮＢ）誘導体に変換する。次にＦａｂ’ＴＮＢ誘導体の１つをメルカプトエチルアミンによる還元によりＦａｂ’チオールに再変換し、そして他のＦａｂ’ＴＮＢ誘導体の等モル量と混合することにより二重特異性抗体を形成する。産生した二重特異性抗体は酵素の選択的固定化のための作用物質として使用できる。
【０１２５】
更にまた、Ｆａｂ’フラグメントをＥ．ｃｏｌｉから直接回収し、化学的にカップリングすることにより二重特異性抗体を形成することができる。ＳｈａｌａｂｙらはＪ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：２１７〜２２５（１９９２）において完全ヒト化二重特異性抗体Ｆ（ａｂ’）２分子の産生を記載している。各Ｆａｂ’フラグメントは別個にＥ．ｃｏｌｉから分泌され、そしてインビトロで指向性化学カップリングに付されることにより二重特異性抗体を形成している。このようにして形成された二重特異性抗体はＥｒｂＢ２受容体を過剰発現する細胞および正常ヒトＴ細胞に結合することができており、並びにヒト乳癌標的に対抗するヒト細胞毒性リンパ球の溶解活性をトリガーしている。
【０１２６】
組み換え細胞培養物から直接二重特異性抗体フラグメントを作成して単離する種々の方法が記載されている。例えば二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して産生されている。Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８（５）：１５４７〜１５５３（１９９２）。ＦｏｓおよびＪｕｎ蛋白質に由来するロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により２つの異なる抗体のＦａｂ’部分に連結した。抗体ホモ２量体をヒンジ領域で還元することにより単量体を形成し、そして、次に再酸化することにより抗ヘテロ２量体を形成した。この方法はまた、抗体ホモ２量体の産生のためにも利用できる。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：６４４４〜６４４８（１９９３）により記載された「ダイアボディー」技術は二重特異性抗体フラグメントを作成するための代替となる機序をもたらしている。フラグメントは同じ鎖上の２つのドメインの間の対形成を可能にするには短すぎるリンカーにより軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。従って、１つのフラグメントのＶＨおよびＶＬドメインは別のフラグメントの相補ＶＨおよびＶＬドメインと強制的に対形成させられ、これにより２つの抗原結合部位が形成される。単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）２量体の使用により二重特異性抗体フラグメントを作成するための別の方策もまた報告されている。Ｇｒｕｂｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５３６８（１９９４）を参照できる。
【０１２７】
２つより多い価数を有する抗体が意図される。例えば三重特異性抗体を調製できる。Ｔｕｔｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）。
【０１２８】
例示される二重特異性抗体は２つの異なるエピトープに結合することができ、そのうち少なくとも１つが本発明の蛋白質抗原を起源とする。或いは、免疫グロブリン分子の抗抗原アームを白血球上のトリガー分子、例えばＴ細胞受容体分子（例えばＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２８、またはＢ７）、またはＩｇＧ（ＦｃγＲ）に対するＦｃ受容体、例えばＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）に結合するアームと組み合わせることにより特定の抗原を発現する細胞に対して細胞防御機序を集中させることができる。二重特異性抗体はまた、特定の抗原を発現する細胞に対して細胞毒性剤を指向させるためにも使用できる。これらの抗体は抗原結合アームおよび細胞毒性剤または放射性核種キレーター、例えばＥＯＴＵＢＥ、ＤＰＴＡ、ＤＯＴＡ、またはＴＥＴＡに結合するアームを保有している。目的の別の二重特異性抗体は本明細書に記載した蛋白質抗原に結合し、そして更に組織因子（ＴＦ）に結合する。
【０１２９】
ヘテロコンジュゲート抗体もまた本発明の範囲に包含される。ヘテロコンジュゲート抗体は２つの共有結合された抗体からなる。そのような抗体は例えば望ましくない細胞に対して免疫系細胞をターゲティングするため（米国特許４，６７６，９８０参照）、およびＨＩＶ感染症の処置のため（ＷＯ９１／００３６０；ＷＯ９２／２００３７３；ＥＰ０３０８９参照）に提案されている。抗体は交差結合剤を用いるものを包含する合成蛋白質化学における知られた方法を用いてインビトロで調製できることが企図される。例えばジスルフィド交換反応を用いるか、チオエーテル結合を形成することにより、免疫毒を構築できる。この目的のための適当な試薬の例は、イミノチオレートおよびメチル−４−メルカプトブチルイミデートおよび例えば米国特許４，６７６，９８０に開示されたものを包含する。
【０１３０】
例えば異常なＩＬ−６シグナリングに関連する疾患および傷害を処置する場合の抗体の有効性を増強するためにエフェクター機能に関して本発明の抗体を修飾することが望ましい場合がある。例えばシステイン残基をＦｃ領域に導入することにより、この領域における鎖間ジスルフィド結合形成を可能にできる。このようにして形成されたホモ２量体抗体は進歩した内在化能力および／または増大した補体媒介細胞殺傷および抗体依存性細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を有する場合がある。（Ｃａｒｏｎら、Ｊ．Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．，１７６：１１９１〜１１９５（１９９２）およびＳｈｏｐｅｓ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８：２９１８〜２９２２（１９９２）参照）。或いは、抗体は二重のＦｃ領域を有するように操作することができ、そしてこれにより増強された補体溶解およびＡＤＣＣ能力を有することができる。（Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら、Ａｎｔｉ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ，３：２１９〜２３０（１９８９）参照）。
【０１３１】
本発明はまた、毒素（例えば細菌、カビ、植物、または動物起源の酵素的に活性な毒素、またはそのフラグメント）または放射性同位体（即ち放射性コンジュゲート）のような細胞毒性剤にコンジュゲートした抗体を含むイムノコンジュゲートにも関する。
【０１３２】
使用できる酵素的に活性な毒素およびそのフラグメントはジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、エキソトキシンＡ鎖（シュードモナス・アエルギノーサ由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファサルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ．ｆｏｒｄｉｉ蛋白質、ジアンシン蛋白質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ・ａｍｅｒｉｃａｎａ蛋白質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、モモルジカ・カランチア阻害剤、クルシン、クロチン、サパオナリア・オフィシナリス阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、およびトリコテセン類を包含する。種々の放射性核種が放射性コンジュゲート抗体の製造のために使用できる。例としては２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ、および１８６Ｒｅが包含される。
【０１３３】
抗体と細胞毒性剤のコンジュゲートは種々の２官能性蛋白質カップリング剤、例えばＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの２官能性誘導体（例えば塩酸ジメチルアジピミデート）、活性エステル（例えばジスクシンイミジルズベレート）、アルデヒド類（例えばグルタルアルデヒド）、ビスアジド化合物（例えばビス−（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビスジアゾニウム誘導体（例えばビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）エチレンジアミン）、ジイソシアネート類（例えばトリエン２，６−ジイソシアネート）、およびビス活性フッ素化合物（例えば１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）を用いながら作成する。例えばリシン免疫毒はＶｉｔｅｔｔａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２３８：１０９８（１９８７）に記載の通り調製できる。１４Ｃ標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は抗体への放射性核種のコンジュゲーションのために例示されるキレート形成剤である。（ＷＯ９４／１１０２６参照）。
【０１３４】
当業者の知る通り、多くの種類の可能な部分を本発明で得られる抗体にカップリングすることができる。（例えば参照により全体が本明細書に組み込まれる「Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ」，Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ  ｔｏ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊ．Ｍ．ＣｒｕｓｅおよびＲ．Ｅ．Ｌｅｗｉｓ，Ｊｒ（編），Ｃａｒｇｅｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９８９）参照）。
【０１３５】
カップリングは抗体および他の部分がそれらの該当する活性を保持する限り、２つの分子を結合することになる如何なる化学的反応により行っても良い。この連結は多くの化学的機序、例えば共有結合、アフィニティー結合、インターカレーション、配位結合および複合体形成を包含できる。しかしながら好ましい結合は共有結合である。共有結合は既存の側鎖の直接の縮合によるか、または、外部架橋分子の取り込みによるかのいずれかにより達成できる。多くの２価または多価の連結剤が本発明の抗体のような蛋白質分子を他の分子にカップリングさせる場合に有用である。例えば代表的なカップリング剤は有機化合物、例えばチオエステル、カルボジイミド、スクシンイミドエステル、ジイソシアネート、グルタルアルデヒド、ジアゾベンゼンおよびヘキサメチレンジアミン類を包含することができる。この列挙例は当該分野で知られたカップリング剤の種々のクラスを網羅しているとは意図しておらず、寧ろより一般的なカップリング剤の例示である。（ＫｉｌｌｅｎおよびＬｉｎｄｓｔｒｏｍ，Ｊｏｕｒ．Ｉｍｍｕｎ．１３３：１３３５〜２５４９（１９８４）；Ｊａｎｓｅｎら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ６２：１８５〜２１６（１９８２）；およびＶｉｔｅｔｔａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２３８：１０９８（１９８７）参照）。
【０１３６】
好ましいリンカーは文献に記載されている。（例えばＭＢＳ（Ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）の使用を記載しているＲａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ，Ｓ．ら、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．４４：２０１〜２０８（１９８４）参照）。更にまた、オリゴペプチドリンカーを用いて抗体にカップリングしたハロゲン化アセチルヒドラジド誘導体の使用を記載している米国特許５，０３０，７１９も参照できる。特に好ましいリンカーは（ｉ）ＥＤＣ塩酸（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド；（ｉｉ）ＳＭＰＴ（４−スクシンイミジルオキシカルボニル−アルファ−メチル−アルファ−（２−ピリジルジチオ）−トルエン（ＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍ．Ｃｏ．，カタログ番号（２１５５８Ｇ）；（ｉｉｉ）ＳＰＤＰ（スクシンイミジル−６［３−（２−ピリジルチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエート（ＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍ．Ｃｏ．，カタログ番号２１６５１Ｇ）；（ｉｖ）スルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰ（スルホスクシンイミジル６［３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド］ヘキサノエート（ＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍ．Ｃｏ．カタログ番号２１６５−Ｇ）；および（ｖ）スルホ−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（ＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍ．Ｃｏ．，カタログ番号２４５１０）をＥＤＣにコンジュゲートしたものを包含する。
【０１３７】
上記したリンカーは異なる属性を有する成分を含有し、このため、異なる物理化学的特性を有するコンジュゲートをもたらす。例えば、アルキルカルボキシレートのスルホ−ＮＨＳエステルは芳香族カルボキシレートのスルホ−ＮＨＳエステルよりも安定である。ＮＨＳ−エステル含有リンカーはスルホ−ＮＨＳエステルよりも低溶解性である。更にまた、リンカーＳＭＰＴは立体障害されたジスルフィド結合を含有し、そしてより安定にコンジュゲートを形成できる。ジスルフィド連結部はインビトロで切断され、使用可能なコンジュゲートを少なくするため、ジスルフィド連結部は一般的には他の連結部よりも低安定性である。特にスルホ−ＮＨＳはカルボジイミドカップリングの安定性を増強することができる。スルホ−ＮＨＳと組み合わせて使用する場合のカルボジイミドカップリング（例えばＥＤＣ）はカルボジイミドカップリング反応単独よりも加水分解に対してより抵抗性であるエステルを形成する。
【０１３８】
本明細書に開示される抗体はまた、イムノリポソームとして製剤することもできる。抗体を含有するリポソームは当該分野で知られた方法により、例えばＥｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：３６８８（１９８５）；Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４０３０（１９８０）；および米国特許４，４８５，０４５および４，５４４，５４５に記載される通り調製される。増強された循環時間を有するリポソームは米国特許５，０１３，５５６に開示されている。
【０１３９】
特に有用なリポソームはホスファチジルコリン、コレステロール、およびＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いた逆相蒸発法により形成できる。リポソームは所望の直径を有するリポソームが得られるように所定の孔径のフィルターを通して押し出される。本発明の抗体のＦａｂ’フラグメントはジスルフィド交換反応を介してＭａｒｔｉｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５７：２８６〜２８８（１９８２）に記載の通りリポソームにコンジュゲートできる。
【０１４０】
ＩＬ−６Ｒｃに対抗する抗体の使用
当然ながら、本発明による治療薬実体の投与は、適当な担体、賦形剤、および進歩した転移、送達、耐性等を与えるために製剤に配合される他剤と共に投与されることになる。適切な製剤の多くは全ての薬化学者が知る処方集Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１５版Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９７５））の、特にＢｌａｕｇ，Ｓｅｙｍｏｕｒによる８７章に記載されている。これらの製剤は、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、油脂、脂質、脂質（カチオン性またはアニオン性）含有小胞（例えばＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））、ＤＮＡコンジュゲート、無水吸収ペースト、水注油および油中水のエマルジョン、エマルジョンカーボワックス（種々の分子量のポリエチレングリコール）、半固体のゲル、およびカーボワックスを含有する半固体混合物を包含する。上記した混合物のいずれも、製剤中の活性成分が製剤により不活性化されず、そして製剤が投与経路に対して生理学的に適合し、耐性を示す限り、本発明による処置および施療において適切であってよい。薬化学者が良く知る製剤、賦形剤および担体に関連する追加的情報に関してはＢａｌｄｒｉｃｋ  Ｐ．”Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：ｔｈｅ  ｎｅｅｄ  ｆｏｒ  ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｇｕｉｄａｎｃｅ．”  Ｒｅｇｕｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３２（２）：２１０〜８（２０００），Ｗａｎｇ  Ｗ．”Ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｏｌｉｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ．”Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．２０３（１−２）：１〜６０（２０００），Ｃｈａｒｍａｎ  ＷＮ  ”Ｌｉｐｉｄｓ，ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ  ｄｒｕｇｓ，ａｎｄ  ｏｒａｌ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ−ｓｏｍｅ  ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｃｏｎｃｅｐｔｓ．”
Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ．８９（８）：９６７〜７８（２０００），Ｐｏｗｅｌｌら、”Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ
ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ”  ＰＤＡ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．５２：２３８〜３１１（１９９８）およびその引用文献を参照できる。
【０１４１】
１つの実施形態において、本発明のモノクローナル抗体（例えば完全ヒトモノクローナル抗体）を包含する本発明の抗体は治療剤として使用してよい。そのような治療剤は一般的に対象における異常なＩＬ−６シグナリングに関連する疾患または病理を診断、予測、モニタリング、処置、軽減、および／または防止するために使用されることになる。治療投薬法は標準的な方法を用いながら、異常なＩＬ−６シグナリングに関連する疾患または障害、例えば関節リウマチのような炎症性疾患に罹患した（または発症の危険性のある）対象、例えばヒト患者を発見することにより実施される。抗体調製物、好ましくはその標的抗原に対する高い特異性および高い親和性を有するものは対象に投与され、そして一般的には標的へのその結合により作用を有することになる。抗体の投与は標的（例えばＩＬ−６Ｒｃ）のシグナリング機能を停止または阻害または干渉してよい。抗体の投与は、標的（例えばＩＬ−６Ｒｃ）の自身が天然に結合する内因性リガンド（例えばｇｐ１３０）との結合を停止または阻害または干渉してよい。例えば、抗体は標的に結合し、そして、ＩＬ−６シグナリングをモジュレート、ブロック、阻害、低減、拮抗、中和または別様に干渉する。
【０１４２】
異常なＩＬ−６シグナリングに関連する疾患または障害は敗血症、癌（例えば多発性骨髄腫疾患（ＭＭ）、腎細胞癌腫（ＲＣＣ）、形質細胞性白血病、リンパ腫、Ｂ−リンパ増殖性障害（ＢＬＰＤ）、および前立腺癌）、骨再吸収、骨粗鬆症、悪液質、乾癬、メサンギウム増殖性糸球体腎炎、カポジ肉腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、および炎症性疾患（例えば、関節リウマチ、全身発症性若年性特発性関節炎、高ガンマグロブリン血症、クローン病、潰瘍性結腸炎、全身エリテマトーデス（ＳＬＥ）、多発性硬化症、キャッスルマン病、ＩｇＭ免疫グロブリン血症、心臓粘液腫、喘息、アレルギー性喘息および自己免疫インシュリン依存性真正糖尿病）を包含する。
【０１４３】
炎症関係の障害に関連する症状は、例えば、炎症、発熱、全身倦怠感、発熱、疼痛、頻繁には炎症領域に局在するもの、頻脈、関節の疼痛または痛み（関節痛）、頻呼吸または他の異常な呼吸パターン、寒気、混乱、見当識障害、動揺、眩暈、咳、呼吸困難、肺感染症、心疾患、呼吸疾患、浮腫、体重増、粘液膿性の再発、水性基質、ぜん鳴、頭痛、および腹部の症状、例えば腹痛、下痢または便秘を包含する。免疫に関係する症状は例えば、炎症、発熱、食欲消失、体重減、腹部の症状、例えば腹痛、下痢または便秘、間接の疼痛または痛み（関節痛）、疲労、発疹、貧血、寒冷に対する極端な感受性（レイノー現象）、筋肉脆弱、筋肉疲労、皮膚または組織の色調の変化、息切れまたは他の異常な呼吸パターン、胸部痛または胸部筋肉の収縮、異常な心拍（例えば上昇または低下）、光感受性、かすみ眼または別様の異常な視力、および低下した臓器機能を包含する。
【０１４４】
本発明の抗体の治療有効量は一般的には治療目的を達成するために必要な量に関係する。上記した通り、これは、抗体とその標的抗原との間の、場合によっては標的の機能に干渉する、結合相互作用であってよい。投与を必要とされる量は更に抗体のその特定の抗原に対する結合親和性に依存することになり、そしてまた、投与される抗体が投与相手である対象の自由体積から枯渇する速度にも依存することになる。本発明の抗体または抗体フラグメントの治療有効な投薬量の一般的範囲は、非限定的に例示すれば、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重であってよい。一般的な投薬頻度は例えば一日２回〜週１回の範囲であってよい。
【０１４５】
処置の有効性は、特定の炎症に関係する障害を診断または処置するためのいずれかの知られた方法に関連して決定される。炎症に関係する障害の１つ以上の症状の軽減は抗体が臨床上の利益をもたらすことを示している。
【０１４６】
所望の特異性を保有している抗体のスクリーニングのための方法は酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）および当該分野で知られた他の免疫学的に媒介される手法を包含するがこれらに限定されない。
【０１４７】
別の実施形態においては、ＩＬ−６Ｒｃおよび／またはＩＬ−６ＲｃとＩＬ−６Ｒの両方に対抗して指向された抗体はＩＬ−６Ｒｃの位置測定および／または定量に関係する当該分野で知られた方法において使用してよい（例えば適切な生理学的試料内のＩＬ−６Ｒｃおよび／またはＩＬ−６ＲｃとＩＬ−６Ｒの両方のレベルの測定における使用のため、診断方法における使用のため、蛋白質の画像化における使用のため等）。所定の実施形態においては、抗体由来抗原結合ドメインを含有するＩＬ−６Ｒｃおよび／またはＩＬ−６ＲｃとＩＬ−６Ｒの両方、またはその誘導体、フラグメント、類縁体または相同体に特異的な抗体は、薬理学的に活性な化合物（以後「治療薬」と称する）として利用される。
【０１４８】
別の実施形態においては、ＩＬ−６Ｒｃに特異的な抗体は免疫アフィニティー、クロマトグラフィーまたは免疫沈降のような標準的手法によりＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−６Ｒｃ、および／またはＩＬ−６ポリペプチドを単離するために使用できる。ＩＬ−６Ｒｃおよび／またはＩＬ−６ＲｃとＩＬ−６Ｒの蛋白質（またはそのフラグメント）の両方に対抗して指向された抗体は、例えば所定の処置投薬法の薬効を測定するために臨床試験操作法の部分として組織中の蛋白質のレベルをモニタリングするために診断的に使用できる。検出は検出可能な物質に抗体をカップリング（即ち物理的に連結）することにより簡便化できる。検出可能な物質の例は、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、ルミネセント物質、バイオルミネセント物質、および放射性物質を包含する。適当な酵素の例はセイヨウワサビパーオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼを包含し；適当な補欠分子族の複合体の例はストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンを包含し；適当な蛍光物質の例はウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリスリンを包含し；ルミネセント物質の例はルミノールを包含し；バイオルミネセント物質の例はルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンを包含し；そして適当な放射性物質の例は１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈを包含する。
【０１４９】
更に別の実施形態において、本発明による抗体は試料中のＩＬ−６Ｒｃおよび／またはＩＬ−６ＲｃとＩＬ−６Ｒの蛋白質（またはその蛋白質フラグメント）の両方の存在を検出するための作用物質として使用できる。一部の実施形態においては、抗体は検出可能な標識を含有する。抗体はポリクローナル、またはより好ましくはモノクローナルである。未損傷の抗体またはそのフラグメント（例えばＦａｂ、ｓｃＦｖ、またはＦ（ａｂ）２）を用いる。プローブまたは抗体に関する「標識された」という用語は、プローブまたは抗体に検出可能な物質をカップリング（即ち物理的に連結）することによるプローブまたは抗体の直接の標識、並びに直接標識される別の試薬との反応性によるプローブまたは抗体の間接的な標識、を包含することを意図している。間接的な標識の例は、蛍光標識２次抗体を用いた１次抗体の検出、および、ビオチンによるＤＮＡプローブの末端標識によりそれを蛍光標識ストレプトアビジンで検出可能とすることを包含する。「生物学的試料」という用語は対象から単離された組織、細胞および生物学的流体、並びに対象内部に存在する組織、細胞および流体を包含することを意図している。従って「生物学的試料」という用語の使用の範囲に包含されるものは、血液および血液の画分または成分、例えば血清、血漿、またはリンパである。即ち本発明の検出方法はインビトロ並びにインビボで生物学的試料中の分析対象ｍＲＮＡ、蛋白質、またはゲノムＤＮＡを検出するために使用できる。例えば、分析対象ｍＲＮＡの検出のためのインビトロの手法はノーザンハイブリダイゼーションおよびインサイチュハイブリダイゼーションを包含する。分析対象蛋白質の検出のためのインビトロの手法は酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット、免疫沈降、および免疫蛍光を包含する。分析対象ゲノムＤＮＡの検出のためのインビトロの手法はサザンハイブリダイゼーションを包含する。イムノアッセイを実施するための操作法は例えば“ＥＬＩＳＡ：Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ４２，ＪＲＣｒｏｗｔｈｅｒ（Ｅｄ．）Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，１９９５；“Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ”，Ｅ．Ｄｉａｍａｎｄｉｓ  ａｎｄ  Ｔ．Ｃｈｒｉｓｔｏｐｏｕｌｕｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１９９６；および“Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ａｎｄ  Ｔｈｅｏｒｙ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ”，Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９８５に記載されている。更にまた、分析対象蛋白質の検出のためのインビボの手法は標識された抗分析対象蛋白質抗体を対象内に導入することを包含する。例えば、対象における自身の存在および位置が標準的な画像化手法により検出され得る放射性マーカーで抗体を標識できる。
【０１５０】
ｈｕＩＬ−６Ｒｃ抗体の治療上の投与および製剤
本発明の抗体（本明細書においては「活性化合物」とも称する）、およびその誘導体、フラグメント、類縁体および相同体は、投与に適する医薬組成物中に配合できる。そのような組成物の調製に関与する原則および注意点、並びに成分の選択の指針は例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  Ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ第１９版（Ａｌｆｏｎｓｏ  Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏら編）Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ：１９９５；Ｄｒｕｇ  Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ：Ｃｏｎｃｅｐｔｓ，Ｐｏｓｓｉｂｉｌｉｔｉｅｓ，Ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ，Ａｎｄ  Ｔｒｅｎｄｓ，Ｈａｒｗｏｏｄ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｌａｎｇｈｏｒｎｅ，Ｐａ．，１９９４；およびＰｅｐｔｉｄｅ  Ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（Ａｄｖａｎｃｅｓ  Ｉｎ  Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｖｏｌ４），１９９１，Ｍ．Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載されている。
【０１５１】
そのような組成物は典型的には抗体および製薬上許容しうる担体を含む。抗体フラグメントを使用する場合、標的蛋白質の結合ドメインに特異的に結合する最小の阻害フラグメントが好ましい。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、ペプチド分子は、標的蛋白質配列に結合する能力を保持するように設計することができる。このようなペプチドは化学的に合成および／または組み換えＤＮＡ技術により産生することができる。（例えばＭａｒａｓｃｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：７８８９〜７８９３（１９９３）参照）。
【０１５２】
本明細書において使用する場合、「製薬上許容しうる担体」という用語は、医薬品投与に適合する如何なる溶媒、分散媒体、コーティング、抗細菌および抗カビ剤、等張性付与および吸収遅延剤等も包含することを意図している。適当な担体は参照により本明細書に組み込まれる業界の標準的参考書であるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓの最新版に記載されている。そのような担体または希釈剤の好ましい例は、水、食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、および５％ヒト血清アルブミンを包含するがこれらに限定されない。リポソームおよび非水性のビヒクル、例えば固定油もまた使用してよい。薬学的に活性な物質に対するそのような媒体および作用物質の使用は当該分野で良く知られている。如何なる従来の媒体または作用物質も活性化合物と不適合となる場合を除き、組成物中のそれらの使用が意図される。
【０１５３】
インビボの投与のために使用される予定の製剤は滅菌されていなくてはならない。これは滅菌濾過膜を通した濾過により容易に達成される。
【０１５４】
本発明の医薬組成物はその意図する投与経路に適合するように製剤される。投与経路の例は非経腸、例えば静脈内、皮内、皮下、経口（例えば吸入）、経皮（即ち局所）、経粘膜、および直腸投与を包含する。非経腸、経皮、または皮下の適用のために使用される溶液または懸濁液は以下の成分、即ち：滅菌希釈剤、例えば注射用水、食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒；抗細菌剤、例えばベンジルアルコールまたはメチルパラベン；抗酸化剤、例えばアスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウム；キレート形成剤、例えばエチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）；緩衝物質、例えば酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩、および張力を調節するための剤、例えば塩化ナトリウムまたはデキストロースを包含できる。ｐＨは酸または塩基、例えば塩酸または水酸化ナトリウムを用いて調節できる。非経腸調製品はアンプル、使い捨てシリンジまたは多用量のバイアルであってガラスまたはプラスチックから作成されたものに封入できる。
【０１５５】
注射用途に適する医薬組成物は、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散液、および、滅菌された注射溶液または分散液の即時調合のための滅菌粉末を包含する。静脈内投与のためには、適当な担体は生理食塩水、静細菌性の水、ＣｒｅｍｏｐｈｏｒＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．）またはリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）を包含する。全ての場合において、組成物は滅菌されていることが必要であり、そして容易なシリンジ操作性が存在するような程度にまで流動性でなければならない。それは製造および保存の条件下で安定であることが必要であり、そして細菌およびカビのような微生物の汚染作用に対抗して保存されることが必要である。担体は例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール等）およびこれらの適当な混合物を含有する溶媒または分散媒体であることができる。適当な流動性は例えばレシチンのようなコーティングの使用により、分散体の場合は必要な粒径を維持することにより、そして、界面活性剤の使用により、維持することができる。微生物の作用の防止は、種々の抗細菌剤および抗カビ剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等により達成できる。多くの場合において、組成物中、等張性付与剤、例えば糖類、多価アルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムを包含させることが好ましいものとなる。注射用組成物の延長された吸収は、吸収遅延剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物中に含有させることによりもたらすことができる。
【０１５６】
滅菌注射用溶液は、必要に応じて上記列挙した成分の１つまたは組み合わせと共に、適切な溶媒中に必要量の活性化合物を配合し、その後、濾過滅菌することにより調製できる。一般的に、分散体は基剤分散媒体および上記列挙したもののうちの必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクル内に活性化合物を配合することにより調製する。滅菌注射溶液の調製のための滅菌粉末の場合は、調製の方法は、活性成分の粉末およびいずれかの追加的な所望の成分の粉末をそれらの以前滅菌濾過された溶液からもたらす真空乾燥および凍結乾燥である。
【０１５７】
経口用組成物は一般的に不活性の希釈剤または食用の担体を包含する。それらはゼラチンカプセル中に封入するか、圧縮して錠剤とすることができる。経口治療投与の目的のためには活性化合物は賦形剤と共に配合し、そして錠剤、トローチ、またはカプセルの形態において使用できる。経口用組成物はまた、洗口剤としての使用のための流体担体を用いて調製することができ、その場合、流体担体中の化合物は経口適用され、嗽をして喀出するか、または嚥下する。薬学的に適合する結合剤、および／またはアジュバント物質を組成物の部分として包含させることができる。錠剤、丸薬、カプセル、トローチ等は以下の成分または同様の性質の化合物のいずれか、即ち：結合剤、例えば微結晶セルロース、トラガカントガムまたはゼラチン；賦形剤、例えば澱粉または乳糖、崩壊剤、例えばアルギン酸、プリモゲル、またはコーンスターチ；潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウムまたはステロート；滑剤、例えばコロイド状２酸化ケイ素；甘味剤、例えばスクロースまたはサッカリン；またはフレーバー剤、例えばペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジフレーバーを含有できる。
【０１５８】
吸入による投与のためには、化合物は、適当な高圧ガス、例えば２酸化炭素のようなガスを含有する加圧容器またはディスペンサー、またはネブライザーからエアロゾルスプレーの形態で送達される。
【０１５９】
全身投与は経粘膜的または経皮的な手段により行うこともできる。経粘膜的または経皮的な投与のためには、透過すべき障壁に適する浸透剤を製剤において使用する。そのような浸透剤は一般的に当該分野で知られており、そして例えば経粘膜投与のためには、洗剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体を包含する。経粘膜投与は鼻用スプレーまたは座剤の使用を介して実施できる。経皮投与のためには、活性化合物は一般的に当該分野で知られる通り軟膏、膏薬、ゲル、またはクリームに製剤される。
【０１６０】
化合物はまた、座剤（例えばカカオ脂および他のグリセリドのような従来の座剤基剤と共に）または直腸送達のための停留型の浣腸の形態においても調製できる。
【０１６１】
１つの実施形態において活性化合物は身体からの急速な排出に対抗して化合物を保護することになる担体、例えば持続／制御放出製剤、例えばインプラントおよびマイクロカプセル化送達系により調製される。生体分解性、生体適合性の重合体、例えばエチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸を使用できる。そのような製剤を調製するための方法は当業者の知る通りである。
【０１６２】
例えば活性成分は、例えばコアセルベーション手法によるか、または界面重合によるかして調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンのマイクロカプセル、および、ポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセル中、コロイド状薬物送達系（例えばリポソーム、アルブミンマイクロカプセル、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル）中、またはマクロエマルジョン中に捕獲することができる。
【０１６３】
持続放出調製物を調製できる。持続放出調製物の適当な例は抗体を含有する固体疎水性重合体の半透性マトリックスを包含し、このマトリックスは形状付与された物品、例えばフィルムまたはマイクロカプセルの形態である。持続放出マトリックスの例はポリエステル、ヒドロゲル（例えばポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許３，７７３，９１９）、Ｌ−グルタミン酸とγエチルＬ−グルタメートの共重合体、非分解性エチレン酢酸ビニル、分解性乳酸グリコール酸共重合体、例えばＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸グリコール酸共重合体およびロイプロリドアセテートからなる注射可能な微小球）、およびポリＤ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸を包含する。エチレン酢酸ビニルおよび乳酸グリコール酸のような重合体は１００日を超える期間分子の放出を可能にするが、特定のヒドロゲルはより短い期間蛋白質を放出する。
【０１６４】
物質はＡｌｚａ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から商業的に入手できる。リポソーム懸濁液（ウィルス抗原に対するモノクローナル抗体を有する感染細胞にターゲティングされたリポソームを包含）もまた製薬上許容しうる担体として使用できる。これらは当業者に知られた方法により、例えば米国特許４，５２２，８１１に記載される通り調製できる。
【０１６５】
投与と投薬量の均一性の容易性のためには、単位剤型において経口または非経腸組成物を製剤することが特に好都合である。本明細書において使用する場合、単位剤型とは、処置すべき対象のための統一された投薬量に適合された物理的に個別の単位を指し；各単位は所望の薬学的担体と組み合わせて所望の治療効果をもたらすために計算された活性化合物の所定の量を含有する。本発明の単位剤型のための仕様は、活性化合物の独特の特徴および達成すべき特定の治療効果、および個体の処置のためのそのような活性化合物を調合する技術に固有の限界に左右され、そして直接依存している。
【０１６６】
医薬組成物は投与のための説明書と共に容器、パック、またはディスペンサー内に包含されることができる。
【０１６７】
製剤はまた、処置すべき特定の適応症のために必要な活性化合物１つより多くを、好ましくは相互に悪影響を及ぼさない補完的活性を有するものを含有することができる。代替的または追加的に、組成物はその機能を増強する薬剤、例えば細胞毒性剤、サイトカイン、化学療法剤、または成長阻害剤を含むことができる。このような分子は意図する目的に対して効果的である量において組み合わせて適宜存在する。
【０１６８】
１つの実施形態において、活性化合物は複合療法において投与され、即ち、病理学的状態または障害、例えば種々の形態の癌、自己免疫疾患および炎症性疾患を処置するために有用な、他剤、例えば治療薬と組み合わせられる。「組み合わせ」という用語はこの文脈においては薬剤が実質的に同時期に、同時または逐次的のいずれかにおいて与えられることを意味する。逐次的に与えられる場合は、第２の化合物の投与開始時において、２つの化合物の最初のものは好ましくは、処置部位において有効な濃度でなお検出可能である。
【０１６９】
例えば、複合療法は後により詳細に説明するとおり、１つ以上の追加的治療剤、例えば１つ以上のサイトカインおよび成長因子阻害剤、免疫抑制剤、抗炎症剤、代謝阻害剤、酵素阻害剤、および／または細胞毒性または細胞増殖抑制剤と同時製剤および／または同時投与される本発明の１つ以上の抗体を包含できる。そのような複合療法は投与される治療剤のより抵投薬量を好都合に利用してよく、これにより種々の単剤療法に関連する可能性のある毒性または合併症を回避できる。
【０１７０】
本発明の抗体と組み合わせて使用される好ましい治療剤は炎症応答の異なる段階において干渉するような薬剤である。１つの実施形態において、本明細書に記載する１つ以上の抗体は、１つ以上の追加的な薬剤、例えば他のサイトカインまたは成長因子拮抗剤（例えば可溶性受容体、ペプチド阻害剤、小分子、リガンド融合物）；または他の標的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント（例えば他のサイトカインまたは成長因子、それらの受容体、または他の細胞表面分子に結合する抗体）；および抗炎症サイトカインまたはそのアゴニストと同時製剤および／または同時投与されて良い。
【０１７１】
他の実施形態において、本発明の抗体は自己免疫疾患、炎症性疾患等に対抗するワクチンアジュバントとして使用される。障害のこのような型の処置のためのアジュバントの組み合わせはターゲティングされた自己抗原、即ち自己免疫に関与する自己抗原、例えばミエリン塩基性蛋白質；炎症性自己抗原、例えばアミロイドペプチド蛋白質、または移植片抗原、例えば自家抗原に由来する広汎な種類の抗原と組み合わせた使用に適している。抗原は蛋白質から誘導されたペプチドまたはポリペプチド、並びに以下のもの、即ち：糖類、蛋白質、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド、自己抗原、アミロイドペプチド蛋白質、移植片抗原、アレルゲン、または他の巨大分子成分のいずれかのフラグメントを含んでよい。一部の例においては、１つより多い抗原が抗原性組成物中に包含される。
【０１７２】
他の治療薬の設計および形成
本発明によれば、そしてＩＬ−６Ｒｃに関して本発明において産生および特性化された抗体の活性に基づけば、抗体部分を超越した他の治療様式の設計が容易になる。そのような様式は限定しないが、進歩した抗体治療薬、例えば二重特異性抗体、免疫毒、および放射標識治療薬、ペプチド治療薬世代、遺伝子療法、特にイントラボディー、アンチセンス治療薬、および小分子を包含する。
【０１７３】
例えば二重特異性抗体に関連すれば、二重特異性抗体は（ｉ）１つがＩＬ−６Ｒｃおよび／またはＩＬ−６ＲｃとＩＬ−６Ｒの両方に対して、そして他方が共にコンジュゲートされた第２の分子に対して特異性を有する２つの抗体、（ｉｉ）ＩＬ−６Ｒｃおよび／またはＩＬ−６ＲｃとＩＬ−６Ｒの両方に特異的な１つの鎖および第２の分子に特異的な第２の鎖を有する単一の抗体、または（ｉｉｉ）ＩＬ−６Ｒｃおよび／またはＩＬ−６ＲｃとＩＬ−６Ｒの両方および第２の分子に対する特異性を有する単鎖抗体を含むように形成することができる。そのような二重特異性抗体はよく知られている手法、例えば（ｉ）および（ｉｉ）に関しては例えばＦａｎｇｅｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ４：７２〜８１（１９９４）およびＷｒｉｇｈｔら、Ｃｒｉｔ，Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２１２５〜１６８（１９９２）に記載のもの、そして（ｉｉｉ）に関してはＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（補遺）７：５１〜５２（１９９２）に記載のものを用いながら形成される。
【０１７４】
免疫毒に関しては、抗体は当該分野で良く知られている手法を利用しながら免疫毒として作用するように修飾することができる。Ｖｉｔｅｔｔａ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ１４：２５２（１９９３）を参照できる。また、米国特許５，１９４，５９４も参照できる。放射標識抗体の調製に関しては、そのような修飾された抗体は当該分野で良く知られている手法を利用しながらやはり容易に調製できる。例えばＪｕｎｇｈａｎｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ６５５〜６８６（第２版、Ｃｈａｆｎｅｒ  ａｎｄ  Ｌｏｎｇｏ編、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｒａｖｅｎ（１９９６））を参照できる。更にまた、米国特許４，６８１，５８１、４，７３５，２１０、５，１０１，８２７、５，１０２，９９０（再特許３５，５００），５，６４８，４７１、および５，６９７，９０２も参照できる。免疫毒および放射標識分子の各々はＩＬ−６Ｒｃを発現する細胞を殺傷すると考えられる。
【０１７５】
ＩＬ−６Ｒｃおよび／またはＩＬ−６ＲｃとＩＬ−６Ｒの両方およびそれに対する抗体、例えば本発明の抗体に関連する構造的情報の利用またはペプチドライブラリのスクリーニングを介した治療用ペプチドの形成に関しては、治療用ペプチドは、ＩＬ−６Ｒｃおよび／またはＩＬ−６ＲｃとＩＬ−６Ｒの両方に対抗して指向されたものとして形成できる。ペプチド治療薬の設計およびスクリーニングはＨｏｕｇｈｔｅｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１３：４１２〜４２１（１９９２）、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ８２：５１３１〜５１３５（１９８５）、Ｐｉｎａｌｌａら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１３：９０１〜９０５（１９９２）、Ｂｌａｋｅ  ａｎｄ  Ｌｉｔｚｉ−Ｄａｖｉｓ  ＢｉｏＣｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．３：５１０〜５１３（１９９２）において考察されている。免疫毒および放射標識分子はまた、抗体に関して上記考察した通りペプチド部分との関連において同様の態様においても調製できる。ＩＬ−６Ｒｃおよび／またはＩＬ−６ＲｃとＩＬ−６Ｒの両方の分子（またはある形態、例えばスプライス変異体または代替の形態）が疾患過程において機能的に活性であると仮定すれば、従来の手法を介して遺伝子およびそれに対するアンチセンス治療薬を設計することも可能となる。そのような様式はＩＬ−６Ｒｃの機能をモジュレートするために利用できる。それに関しては本発明の抗体はそれに関係する機能アッセイの設計および使用を容易にする。アンチセンス治療薬の設計および方策は国際特許出願ＷＯ９４／２９４４４においてより詳細に考察されている。遺伝子療法の設計および方策は当該分野で良く知られている。しかしながら、特に、イントラボディーを使用する遺伝子療法の手法の使用は特に好都合であることがわかっている。例えばＣｈｅｎら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ５：５９５〜６０１（１９９４）およびＭａｒａｓｃｏ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ４：１１〜１５（１９９７）を参照できる。遺伝子治療薬に関係する一般的な設計および注意事項はまた、国際特許出願ＷＯ９７／３８１３７においても考察されている。
【０１７６】
ＩＬ−６Ｒｃ分子の構造および本発明による他の分子、例えば本発明の抗体とのその相互作用から得られた知識は、およびその他のものを利用することにより追加的な治療様式を合理的に設計することができる。この点に関し、合理的な薬品設計手法、例えばＸ線結晶学、コンピューター使用（支援）分子モデリング（ＣＡＭＭ）、定量的または定性的構造活性関係（ＱＳＡＲ）および同様の技術を利用することにより薬品発見の研究に集中することができる。合理的な設計はＩＬ−６Ｒｃの活性を修飾またはモジュレートするために使用できる分子またはその特定の形態と相互作用できる蛋白質または合成の構造の予測を可能にする。そのような構造は化学合成するか、生物学的な系において発現させることができる。この手順はＣａｐｓｅｙら、Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ
Ｈｕｍａｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇｓ（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９８８））によって検討されている。更にまた、コンビナトリアルライブラリを設計および合成して、スクリーニングプログラム、例えばハイスループットスクリーニング作業において使用することができる。
【０１７７】
スクリーニング法
本発明はモジュレーター、即ちｇｐ１３０またはＩＬ−６受容体のシグナリング機能をモジュレートするか別様に干渉する候補または被験化合物または薬剤へのＩＬ−６Ｒｃの結合をモジュレートまたは別様に干渉する、候補または被験化合物または薬剤（例えばペプチド、ペプチドミメティック、小分子または他の薬品）を発見するための方法（本明細書においては「スクリーニングアッセイ」とも称する）を提供する。同様に提供されるものは異常なＩＬ−６シグナリングに関連する障害を処置するために有用な化合物の発見方法である。本発明はまた、本明細書に記載するスクリーニングアッセイにおいて発見された化合物も包含する。
【０１７８】
１つの実施形態において、本発明はＩＬ−６Ｒｃのシグナリング機能をモジュレートする候補または被験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。本発明の被験化合物は生物学的ライブラリ；空間指定可能な平行固相または溶液相のライブラリ；逆重畳を必要とする合成ライブラリ法；「１ビーズ１化合物」ライブラリ法；およびアフィニティークロマトグラフィー選択を用いた合成ライブラリ法；を包含する当該分野で知られたコンビナトリアルライブラリ法における多くの手順のいずれかを使用しながら得られる。生物学的ライブラリの手順はペプチドライブラリに限定されるが、他の４つの手順はペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは化合物の小分子ライブラリに適用される。（例えばＬａｍ，１９９７．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ１２：１４５を参照できる）。
【０１７９】
「小分子」とは、本明細書において使用する場合、約５ｋＤ未満、そして最も好ましくは約４ｋＤ未満の分子量を有する組成物を指すことを意味している。小分子は例えば核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチドミメティック、炭水化物、脂質または他の有機または無機の分子であることができる。化学的および／または生物学的混合物、例えばカビ、細菌、または藻類の抽出物のライブラリも知られており、そして本発明のアッセイのいずれかを用いてスクリーニングできる。
【０１８０】
分子ライブラリを合成するための方法の例は例えばＤｅＷｉｔｔら、１９９３．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６９０９；Ｅｒｂら、１９９４．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：１１４２２；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら、１９９４．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８；Ｃｈｏら、１９９３．Ｓｃｉｅｎｃｅ２６１：１３０３；Ｃａｒｒｅｌｌら、１９９４．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０５９；Ｃａｒｅｌｌら、１９９４．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０６１；およびＧａｌｌｏｐら、１９９４．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３において、当該分野で報告されている。
【０１８１】
化合物のライブラリは溶液中（例えばＨｏｕｇｈｔｅｎ、１９９２．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１３：４１２〜４２１参照）、またはビーズ上（Ｌａｍ、１９９１．Ｎａｔｕｒｅ３５４：８２〜８４参照）、チップ上（Ｆｏｄｏｒ、１９９３．Ｎａｔｕｒｅ３６４：５５５〜５５６参照）、細菌（米国特許５，２２３，４０９参照）、胞子（米国特許５，２３３，４０９参照）、プラスミド（Ｃｕｌｌら、１９９２．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１８６５〜１８６９参照）上、またはファージ上（Ｓｃｏｔｔ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ、１９９０．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６〜３９０；Ｄｅｖｌｉｎ、１９９０．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：４０４〜４０６；Ｃｗｉｒｌａら、１９９０．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：６３７８〜６３８２；Ｆｅｌｉｃｉ、１９９１．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：３０１〜３１０；および米国特許５，２３３，４０９参照）に提示してよい。
【０１８２】
１つの実施形態において、候補化合物を抗体−抗原複合体に導入し、そして候補化合物が抗体−抗原複合体を破断させるかどうかを調べるが、その場合、この複合体が破断されれば候補化合物がＩＬ−６Ｒｃのシグナリング機能および／またはＩＬ−６とＩＬ−６Ｒとの間の相互作用をモジュレートすることを示している。例えば抗体はモノクローナル抗体３９Ｂ９  ＶＬ１であり、そして抗原はＩＬ−６Ｒである。或いはモノクローナル抗体は３９Ｂ９  ＶＬ５、１２Ａ、または５Ｃであり、そして抗原はＩＬ−６ＲｃまたはＩＬ−６Ｒである。
【０１８３】
別の実施形態においては、本発明の可溶性ＩＬ−６Ｒｃおよび／またはＩＬ−６ＲｃとＩＬ−６Ｒの両方の蛋白質が提供され、そして少なくとも１つの中和モノクローナル抗体に曝露される。抗体−抗原複合体の形成が検出され、そして１つ以上の候補化合物が複合体に導入される。抗体−抗原複合体が１つ以上の候補化合物の導入後に破断されれば、候補化合物は異常なＩＬ−６シグナリングに関連する障害を処置するために有用である。
【０１８４】
抗体−抗原複合体に干渉するか、それを破断する被験化合物の能力の測定は例えば、抗原またはその生物学的に活性な部分への被験化合物の結合が複合体中の標識化合物を検出することにより測定できるように、放射性同位体または酵素標識に被験化合物をカップリングすることにより、達成することができる。例えば被験化合物は直接または間接的に１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３Ｈで標識し、そして放射性同位体は放射能放出の直接の計数によるか、シンチレーション計数により検出することができる。或いは、被験化合物を例えばセイヨウワサビパーオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼで酵素的に標識し、そして、適切な基質から生成物への変換を測定することにより酵素標識を検出することができる。
【０１８５】
１つの実施形態においては、アッセイは、被験化合物に抗体−抗原複合体を接触させること、および、被験化合物が抗原と相互作用するか、または存在する抗体−抗原複合体を別様に破断する能力を測定することを含む。本実施形態においては、抗原と相互作用する、および／または抗体−抗原複合体を破断する被験化合物の能力を測定することは、抗体に比較した場合の、抗原またはその生物学的に活性な部分に優勢に結合する被験化合物の能力を測定することを含む。
【０１８６】
別の実施形態においては、アッセイは、被験化合物に抗体−抗原複合体を接触させること、および、抗体−抗原複合体をモジュレートする被験化合物の能力を測定することを含む。抗体−抗原複合体をモジュレートする被験化合物の能力の測定は、例えば、被験化合物の存在下、抗体に結合するか相互作用する抗原の能力を測定することにより実施できる。
【０１８７】
当業者の知る通り、本明細書に開示したスクリーニング法のいずれかにおいて、抗体は中和抗体、例えばモノクローナル抗体３９Ｂ９  ＶＬ１、３９Ｂ９  ＶＬ５、１２Ａおよび５Ｃであってよく、その各々はＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路および／またはＭＡＰＫカスケードのＩＬ−６媒介活性化をモジュレートするか、別様に干渉する。
【０１８８】
本明細書に開示したスクリーニング法は細胞系アッセイまたは無細胞アッセイとして実施してよい。本発明の無細胞アッセイはＩＬ−６Ｒｃおよび／またはＩＬ−６ＲｃとＩＬ−６Ｒの両方およびそのフラグメントの可溶性型または膜結合型のいずれかの使用に適している。ＩＬ−６Ｒｃおよび／またはＩＬ−６ＲｃとＩＬ−６Ｒの両方の膜結合型を含む無細胞アッセイの場合は、蛋白質の膜結合型が溶液中に維持されるように可溶化剤を利用することが望ましい場合がある。そのような可溶化剤の例は非イオン系洗剤、例えばｎ−オクチルグルコシド、ｎ−ドデシルグルコシド、ｎ−ドデシルマルトシド、オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ１００、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ１１４、Ｔｈｅｓｉｔ（登録商標）、イソトリデシポリ（エチレングリコールエーテル）ｎ、Ｎ−ドデシル−−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート、３−（３−コラミドプロピル）−ジメチルアミニオール−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）、または３−（３−コラミドプロピル）ジメチルアミニオール−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳＯ）を包含する。
【０１８９】
１つより多い実施形態においては、抗体または抗原のいずれかを、候補化合物の導入後に一方または両方の未複合体型からの複合体型の分離を容易にするために、並びにアッセイの自動化に適合するために、固定化することが望ましい場合がある。候補化合物の存在下および非存在下における抗体−抗原複合体の観察は反応体を含有するのに適するいずれかの容器中で行うことができる。そのような容器の例はマイクロタイタープレート、試験管、およびマイクロ遠沈管を包含する。１つの実施形態において、蛋白質の一方または両方をマトリックスに結合できるようにするドメインを付加した融合蛋白質を提供することができる。例えば、ＧＳＴ抗体融合蛋白質またはＧＳＴ抗原融合蛋白質はグルタチオンセファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）またはグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレート上に吸着させることができ、次にこれを被験化合物と組み合わせ、そして混合物を複合体形成を誘導する条件下（例えば塩およびｐＨに関して生理学的条件下）にインキュベートする。インキュベーションの後、ビーズまたはマイクロタイタープレートのウェルを洗浄することにより未結合の成分があればそれを除去し、ビーズの場合はマトリックスを固定化し、複合体を直接または間接的に測定する。或いは、複合体はマトリックスから解離させることができ、そして抗体−抗原複合体の形成のレベルを標準的な手法を用いて測定することができる。
【０１９０】
マトリックスに蛋白質を固定化する他の手法もまた本発明のスクリーニングアッセイにおいて使用できる。例えば抗体（例えば３９Ｂ９  ＶＬ１、３９Ｂ９  ＶＬ５、１２Ａおよび５Ｃ）または抗原（例えばＩＬ−６Ｒｃおよび／またはＩＬ−６ＲｃとＩＬ−６Ｒの両方の蛋白質）のいずれかをビオチンおよびストレプトアビジンのコンジュゲーションを利用しながら固定化することができる。ビオチニル化された抗体または抗原の分子は、ビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）から、当該分野で良く知られている手法（例えばビオチニル化キット、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．）を用いながら調製し、そしてストレプトアビジンコーティング９６ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）のウェルに固定化することができる。或いは、目的の抗体または抗原に対して反応性であるが目的の抗体−抗原複合体の形成に干渉しない他の抗体をプレートのウェルに誘導体化し、そして未結合の抗体または抗原を抗体コンジュゲーションによりウェル内に捕獲する。ＧＳＴ固定化複合体に関する上記説明のほかにこのような複合体を検出するための方法は、抗体または抗原に対して反応性のそのような他の抗体を用いた複合体の免疫検出を包含する。
【０１９１】
本発明は更に上記スクリーニングアッセイのいずれかにより発見された新しい薬剤、および、本明細書に記載する処置のためのその使用に関する。
【０１９２】
診断および予防用の製剤
本発明のｈｕＩＬ−６ＲｃＭＡｂは診断および予防用の製剤中で使用される。１つの実施形態において、ＩＬ−６Ｒｃおよび／またはＩＬ−６ＲｃとＩＬ−６Ｒの両方の拮抗剤、例えば本発明のｈｕＩＬ−６ＲｃＭＡｂは、上記した疾患、例えば限定しないが、１つ以上の敗血症、癌（例えば多発性骨髄腫疾患（ＭＭ）、腎細胞癌腫（ＲＣＣ）、形質細胞性白血病、リンパ腫、Ｂ−リンパ増殖性障害（ＢＬＰＤ）、および前立腺癌）、骨再吸収、骨粗鬆症、悪液質、乾癬、メサンギウム増殖性糸球体腎炎、カポジ肉腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、および炎症性疾患（例えば、関節リウマチ、全身発症性若年性特発性関節炎、高ガンマグロブリン血症、クローン病、潰瘍性結腸炎、全身エリテマトーデス（ＳＬＥ）、多発性硬化症、キャッスルマン病、ＩｇＭ免疫グロブリン血症、心臓粘液腫、喘息、アレルギー性喘息および自己免疫インシュリン依存性真正糖尿病）を発症する危険性を有する患者に投与される。上記した１つ以上の自己免疫疾患または炎症性の疾患に対する患者または臓器の疾病素因は遺伝子型的、血清学的または生化学的なマーカーを用いて測定できる。
【０１９３】
本発明の別の実施形態においては、ＩＬ−６Ｒｃおよび／またはＩＬ−６ＲｃとＩＬ−６Ｒの両方の拮抗剤、例えばｈｕＩＬ−６Ｒｃ抗体は上記した疾患、例えば限定しないが、１つ以上の敗血症、癌（例えば多発性骨髄腫疾患（ＭＭ）、腎細胞癌腫（ＲＣＣ）、形質細胞性白血病、リンパ腫、Ｂ−リンパ増殖性障害（ＢＬＰＤ）、および前立腺癌）、骨再吸収、骨粗鬆症、悪液質、乾癬、メサンギウム増殖性糸球体腎炎、カポジ肉腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、および炎症性疾患（例えば、関節リウマチ、全身発症性若年性特発性関節炎、高ガンマグロブリン血症、クローン病、潰瘍性結腸炎、全身エリテマトーデス（ＳＬＥ）、多発性硬化症、キャッスルマン病、ＩｇＭ免疫グロブリン血症、心臓粘液腫、喘息、アレルギー性喘息および自己免疫インシュリン依存性真正糖尿病）に関連する臨床適応症を有すると診断されたヒト個体に投与される。診断があれば、ＩＬ−６Ｒｃおよび／またはＩＬ−６ＲｃとＩＬ−６Ｒの両方の拮抗剤、例えばｈｕＩＬ−６Ｒｃ抗体は、上記した疾患、例えば限定しないが、１つ以上の敗血症、癌（例えば多発性骨髄腫疾患（ＭＭ）、腎細胞癌腫（ＲＣＣ）、形質細胞性白血病、リンパ腫、Ｂ−リンパ増殖性障害（ＢＬＰＤ）、および前立腺癌）、骨再吸収、骨粗鬆症、悪液質、乾癬、メサンギウム増殖性糸球体腎炎、カポジ肉腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、および炎症性疾患（例えば、関節リウマチ、全身発症性若年性特発性関節炎、高ガンマグロブリン血症、クローン病、潰瘍性結腸炎、全身エリテマトーデス（ＳＬＥ）、多発性硬化症、キャッスルマン病、ＩｇＭ免疫グロブリン血症、心臓粘液腫、喘息、アレルギー性喘息および自己免疫インシュリン依存性真正糖尿病）に関連する臨床適応症の作用を緩和または逆行させるために投与される。
【０１９４】
本発明の抗体はまた、患者試料中のＩＬ−６Ｒｃおよび／またはＩＬ−６ＲｃとＩＬ−６Ｒの両方の検出においても有用であり、そしてそのため、診断薬として有用である。例えば、本発明のｈｕＩＬ−６Ｒｃ抗体は、患者試料中のＩＬ−６Ｒｃおよび／またはＩＬ−６ＲｃとＩＬ−６Ｒの両方のレベルを検出するために、インビトロのアッセイ、例えばＥＬＩＳＡにおいて使用される。
【０１９５】
１つの実施形態において、本発明のｈｕＩＬ−６Ｒｃ抗体は固体支持体（例えばマイクロタイタープレートのウェル）上に固定化される。固定化された抗体は被験試料中に存在する可能性のあるＩＬ−６Ｒｃおよび／またはＩＬ−６ＲｃとＩＬ−６Ｒの両方のいずれかに対するキャプチャー抗体として作用する。患者試料に固定化された抗体を接触させる前に、固体支持体は洗浄し、そして、ブロッキング剤、例えば乳蛋白質またはアルブミンで処理することにより分析対象の非特異的吸着を防止する。
【０１９６】
その後、抗原を含有することが疑われる被験試料で、または、抗原の標準量を含有する溶液でウェルを処理する。そのような試料は例えば、病理の診断であると考えられる循環抗原のレベルを有することが疑われる対象から得られた血清試料である。被験試料または標準物質を洗浄除去した後、検出可能に標識された第２の抗体で固体支持体を処理する。標識された第２の抗体は検出抗体として作用する。検出可能な標識のレベルを測定し、そして被験試料中のＩＬ−６Ｒｃおよび／またはＩＬ−６ＲｃとＩＬ−６Ｒの両方の抗原の濃度を、標準試料から求めた標準曲線との比較により測定する。
【０１９７】
当然ながら、インビトロの診断アッセイにおいて本発明のｈｕＩＬ−６Ｒｃ抗体を用いて得られた結果に基づけば、ＩＬ−６Ｒｃおよび／またはＩＬ−６ＲｃとＩＬ−６Ｒの両方の抗原の発現レベルに基づいて対象中の疾患（例えば虚血、自己免疫性または炎症性の障害に関連する臨床適応症）の病期判定をすることが可能である。所定の疾患に対して、疾患の進行の種々の病期に、および／または疾患の治療処置における種々の時点にあるものとして診断された対象から血液試料を採取する。進行または治療の各期に関して統計学的に有意な結果を与える試料の集団を用いながら、各期に特徴的であると考えることができる抗原の濃度の範囲を示す。
【０１９８】
本明細書において引用した全ての公開物および特許の文書は、各々のそのような公開物または文書が特定的および個別に参照により本明細書に組み込まれることを示すがごとく、参照により本明細書に組み込まれる。公開物および特許の文書の引用は如何なるものも関連する先行技術であることの了解とは意図されず、また、その内容または期日に関して如何なる了解をも構成しないものである。書面による説明により本発明を説明したが、当業者の知る通り、本発明は種々の実施形態において実施することができ、そして、上記した説明および後述する実施例は後に記載する請求項の限定ではなく説明を目的としている。
【実施例】
【０１９９】
以下の実施例は、実施した実験および達成した結果を含めて、説明目的のみのために提供しており、そして本発明を限定するものとみなしてはならない。
【０２００】
実施例１  インターロイキン−６（ＩＬ−６）、ＩＬ−６受容体（ＩＬ−６Ｒ）およびＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ（ＩＬ−６Ｒｃ）の複合体のクローニング、発現および精製
ヒトＩＬ−６Ｒ（アクセッション番号Ｘ１２８３０）、ヒトＩＬ−６（アクセッション番号ＢＣ０１５５１１）、カニクイザルＩＬ−６Ｒ、カニクイザルＩＬ−６（アクセッション番号ＡＢ０００５５４）、マウスＩＬ−６Ｒ（アクセッション番号ＮＭ＿０１０５５９）およびマウスＩＬ−６（アクセッション番号ＮＭ＿０３１１６８）をコードするｃＤＮＡを、末梢血単核細胞（ＰＭＢＣ）由来ｃＤＮＡからＰＣＲにより増幅し、そしてＰＣＲ４ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングした。その後のＰＣＲ工程の後、Ｈｉｓ−またはＡｖｉ−タグ（Ａｖｉｄｉｔｙ、Ｄｅｎｖｅｒ  ＣＯ）をサイトカインコーディング配列のＣ末端において導入した。次にこれらのコンストラクトを、ＩＬ−６、ＩＬ−６ＲおよびＩＬ−６Ｒｃの可溶性または膜結合型のいずれかの発現のための相当するベクター内にサブクローニングした。可溶性ヒトＩＬ−６Ｒｃ（ｓｈｕＩＬ−６Ｒｃ）組み換え蛋白質はＩＬ−６をＩＬ−６Ｒに融合することにより形成した（Ｍｉｚｕｇｕｃｈｉら、２００１Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．９１（３）：２９９〜３０４から得たＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒの融合蛋白質、ただしＩＬ−６Ｒについてはａａ１−３３３そしてＩＬ−６についてはａａ２８−２１２の修飾を有する）。種々の種（ヒト、カニクイザル、マウス）に由来するサイトカインのＨｉｓタグ付きコーディング配列を、可溶性形態に関するエピソーム発現ベクターｐＥＡＫ８またはｐＥＥ１４．４における発現のためのＥＦ１プロモーターおよび／またはＣＭＶプロモーターの制御下に置いた。サイトカインコーディング配列に続いてウィルス内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）および第２または第３のシストロンを置くことによりＢｉｒＡおよびＧＦＰの同時発現が行えるようにした。ｐＥＡＫ８ベクターはピューロマイシン耐性遺伝子、ＥＢＶ核抗原１（ＥＢＮＡ１）および複製起点ｏｒｉＰを含有している。ＥＢＮＡ１およびｏｒｉＰはヒト細胞におけるエピソームＤＮＡとしてのｐＥＡＫ８ベクターの増殖および安定なトランスフェクト体の形成のために必要である。安定にトランスフェクトされた細胞は２ｕｇ／ｍＬのピューロマイシンの存在下の培養７〜１０日後に得られた。ピューロマイシン耐性細胞を増殖させ、そして可溶性サイトカイン産生のために使用した。可溶性Ｈｉｓ−タグ付きヒト、マウスおよびカニクイザルのＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−６およびＩＬ−６Ｒｃの生物学的活性を種々の機能アッセイにより試験し、そして市販原料（入手可能な場合）から得られる試薬に適合していることがわかった。細胞表面発現のため、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−６およびＩＬ−６ＲｃコンストラクトをｐＤｉｓｐｌａｙベクター内にクローニングし、離断させてＣＨＯ細胞とし、そしてＧ４１８選択により選択した。
【０２０１】
実施例２  免疫化
完全ヒトモノクローナル抗体は、マウス抗体遺伝子発現が抑制され、そしてヒト抗体遺伝子発現に置き換えられているマウスのトランスジェニック系統を用いて形成した。以下の３系統のトランスジェニックマウスを使用した。
１）ＨｕＭａｂ（登録商標）マウス（Ｍｅｄａｒｅｘ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  ＮＪ）
２）ＫＭ（商標）マウス、ＨｕＭＡｂマウスとＫｉｒｉｎのＴＣマウス（Ｋｉｒｉｎ  Ｐｈａｒｍａ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｊａｐａｎ）の間の雑種  
３）ＫＭ（ＦＣγＲＩＩｂ−ＫＯ）マウス、ＫＭ（商標）マウスから誘導した系統、抑制性Ｆｃガンマ受容体ＩＩＢをコードしている遺伝子Ｆｃｇｒ２ｂが不活性化されているもの。
【０２０２】
マウスを細胞表面においてヒトＩＬ−６Ｒｃを発現しているチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ／ＩＬ−６Ｒｃ）によるか、または可溶性ヒトＩＬ−６Ｒｃ（ｓｈｕＩＬ−６Ｒｃ）によるかのいずれかで免疫化した。
【０２０３】
一般的に、全ての動物に、本明細書に記載するＭＰＬ＋ＴＤＭアジュバント（ＲＩＢＩ）中に乳化したＣＨＯ／ＩＬ−６ＲｃまたはＩＬ−６Ｒｃを腹腔内（ｉ．ｐ．）または皮下（ｓ．ｃ．）により７〜１０回注射した。最初の５〜８回の注射は全てアジュバントの存在下に実施した。融合に先立つ最後の２回の超ブーストは遊離の抗原を用いて、そしてアジュバントを用いることなく実施した。代表的免疫化スケジュールの例を示す。
第１日    ＲＩＢＩ中１０７ＣＨＯ／ＩＬ−６Ｒｃ細胞、ｉ．ｐ．
第１４日  ＲＩＢＩ中１０７ＣＨＯ／ＩＬ−６Ｒｃ細胞、ｉ．ｐ．
第２８日  ＲＩＢＩ中１０７ＣＨＯ／ＩＬ−６Ｒｃ細胞、ｉ．ｐ．
第４２日  ＲＩＢＩ中５０μｇ  ｓｈｕＩＬ−６Ｒｃ、ｉ．ｐ．
第５６日  ＲＩＢＩ中２０μｇ  ｓｈｕＩＬ−６Ｒｃ、ｓ．ｃ．
第７０日  ＰＢＳ中１０μｇ  ｓｈｕＩＬ−６Ｒｃ、ｓ．ｃ．
第８４日  ＰＢＳ中１０μｇ  ｓｈｕＩＬ−６Ｒｃ、ｓ．ｃ．
第８７日  ＰＢＳ中５μｇ  ｓｈｕＩＬ−６Ｒｃ、ｓ．ｃ．
免疫化された動物の血清をフローサイトメトリー分析により周期的にスクリーニングすることによりＣＨＯ細胞単独と比較した場合のＣＨＯ／ＩＬ−６Ｒｃに対して指向されたヒトＩｇＧの存在を検出した。ハイブリドーマを得るために、膝窩、鼠径、大動脈近傍、下顎骨下、頚部、軸性、および上腕のリンパ節をマウスから摘出し、そしてコラゲナーゼおよびＤＮＡｓｅで消化した。リンパ節細胞の単細胞懸濁液をＳＰ２／０骨髄腫細胞と１：１比で混合し、そしてＣｙｔｏｆｕｓｉｏｎ  Ｌｏｗ  Ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＣＰＳ−ＬＣＭＣ、ＣｙｔｏＰｕｌｓｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）中に懸濁した。融合は製造元（Ｃｙｔｏ  Ｐｕｌｓｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ）の示す通りＣｙｔｏＰｕｌｓｅ  ＣＥＥＦ５０電子融合装置中で３〜６千万脾細胞を用いて実施した。電子融合の後、細胞を３７℃で約１時間インキュベートすることにより、９６ウェルプレート内への分注の前に回収した。融合細胞はＨＡＴ選択培地中に再懸濁し、そして２００μｌ培地中ウェル当たり０．１〜０．２×１０５脾細胞の細胞濃度で４４〜５２枚の９６ウェルプレート中にプレーティングした。ハイブリドーマ選択は１４日間進行させた。免疫化マウスのリンパ節の融合はＩＬ−６Ｒｃに特異的な抗体を産生するハイブリドーマの形成をもたらした。融合後１４日、ハイブリドーマ含有プレートをヒトＣＨＯ／ＩＬ−６Ｒｃに結合するヒトＩｇＧの存在に関してスクリーニングした。
【０２０４】
実施例３  ＩＬ−６Ｒｃ活性に関する生物学的アッセイ
本明細書に記載した全てのアッセイはヒトＩＬ−６Ｒに対する対照ヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体（米国特許５，８１７，７９０、配列番号６９および配列番号７１）と平行して実施し；これを本明細書においては「対照ｍＡｂ」と称する。更にまた、３９Ｂ９  ＶＬ１抗体（核酸配列の配列番号１および３、アミノ酸配列の配列番号２および４）は「ＮＩ−１２０１」と命名した。
【０２０５】
標的細胞上、ＩＬ−６は第１に膜結合ＩＬ−６Ｒ（ｍＩＬ−６Ｒ）に結合する。ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒの複合体はシグナル伝達膜蛋白質ｇｐ１３０と会合し、これによりその２量体化およびその後の細胞内シグナリングの開始を促進する。ｇｐ１３０は細胞によりユビキタスに発現されるのに対し、ｍＩＬ−６Ｒは肝細胞および限定数の免疫細胞上において低減された発現プロファイルを有している。天然に存在するＩＬ−６Ｒの可溶性型（ｓＩＬ６Ｒ）は膜型の蛋白質分解によるか、またはＩＬ−６Ｒ  ｍＲＮＡの示差的スプライシングにより、形成される。ｓＩＬ−６ＲはＩＬ−６と組み合わせられて可溶性ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体（ＩＬ−６Ｒｃ）を形成し、そしてｍＩＬ−６Ｒ−陰性ｇｐ１３０−陽性細胞を活性化することができる。この機序はトランスシグナリングと称されるのに対し、ｍＩＬ−６ＲへのＩＬ−６の結合を介したシグナリングおよびその後のｇｐ１３０へのカップリングはシスシグナリングと称される（Ｔａｇａら、１９８９，Ｃｅｌｌ，５８：５７３〜５８１）。
【０２０６】
ＩＬ−６機能アッセイ：ＢＡＦ−ｈｕｇｐ１３０細胞（ＢＡＦ−１３０）、ヒトｇｐ１３０−トランスフェクトマウスｐｒｏ−Ｂ細胞系統はＩＬ−６およびｓｈｕＩＬ−６Ｒの存在下で増殖する（図１）。同様に、膜結合ｈｕＩＬ−６Ｒ（ＢＡＦ−１３０／ＩＬ−６Ｒ）でトランスフェクトしたＢＡＦ−１３０細胞はｈｕＩＬ−６と共に培養すれば増殖する（図２）。
【０２０７】
トランスシグナリング分析のために、サイトカイン（ＩＬ−６）を３〜４時間３７℃でその同系の可溶性受容体（ｓｈｕＩＬ−６Ｒ）と共にインキュベートすることにより「ネイティブ」のＩＬ−６Ｒｃ（組み換え融合複合体とは反対）を形成した。いくつかの濃度のｍＡｂを細胞に添加した後にネイティブ複合体と共に培養した。ＢＡＦ−１３０細胞（１ｘ１０４細胞／０．２ｍＬ／ウェル）をｈｕＩＬ−６＋ｓｈｕＩＬ−６Ｒと共に被験ｍＡｂｓ（対照ｍＡｂ、ｈｕＩｇＧ１またはＮＩ−１２０１）の存在下０．５％ウシ胎児血清を添加したＲＰＭＩ中、９６ウェル平底プレート中で７２時間インキュベートした（図１Ａ〜Ｄ）。増殖は細胞増殖試薬ＷＳＴ−１（Ｒｏｃｈｅ）を用いながら製造元の説明書に従って評価した。慨すれば、培養期間の後、２０μＬのＷＳＴ−１試薬を培地に添加し、そして４時間３７℃５％ＣＯ２でインキュベートした。吸光度（４５０〜６５０ｎｍ）をマイクロプレートリーダーを用いて計測した。結果によればＮＩ−１２０１は対照ｍＡｂよりも効果的にネイティブＩＬ−６Ｒｃの活性を中和していた。
【０２０８】
シスシグナリング分析のために、ＢＡＦ−１３０／ＩＬ−６Ｒ細胞を種々の用量のｍＡｂおよび固定量のＩＬ−６と共にインキュベートした（図２Ａ）。逆に、細胞を漸増量のＩＬ−６の存在下で１濃度のｍＡｂと共にインキュベートした（図２Ｂ）。増殖は細胞増殖試薬ＷＳＴ−１を用いながら上記した通り評価した。ＮＩ−１２０１および対照ｍＡｂはこのシスシグナリング試験をブロッキングする場合において等価な活性を示した。
【０２０９】
実施例４  ｈｕＩＬ−６Ｒｃ抗体の変異体
ｈｕＩＬ−６Ｒｃ抗体の変異体は当該分野で知られた手法の種々のもののいずれかを用いながら作成される。例えば、変異体ｈｕＩＬ−６Ｒｃ抗体は、抗体配列内の位置に１つ以上のアミノ酸修飾、例えばアミノ酸置換を有する抗体を包含する。
【０２１０】
アミノ酸置換の好ましい位置は、以下の表３において太字、下線を付した残基として示される。太字／下線のアミノ酸残基はいずれかのアミノ酸残基と置き換えることができる。好ましい実施形態においては、太字／下線のアミノ酸残基は以下の表３に示すアミノ酸残基で置き換えられる。これらの実施形態において、抗体は（ｉ）軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ３）におけるコンセンサスアミノ酸配列ＱＱＳＸＳＹＰＬＴ（配列番号４２）、ここで式中ＸはＮまたはＱであるもの；（ｉｉ）重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ２）におけるコンセンサスアミノ酸配列ＧＩＩＰＸ１ＦＸ２ＴＴＫＹＡＱＸ３ＦＱＧ（配列番号４３）、ここで式中Ｘ１はＬまたはＡ、Ｘ２はＤまたはＥ、そしてＸ３はＱまたはＫであるもの；（ｉｉｉ）重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ３）におけるコンセンサスアミノ酸配列ＤＲＤＩＬＴＤＹＹＰＸＧＧＭＤＶ（配列番号４４）、ここで式中ＸはＭまたはＬであるもの；および（ｉｖ）フレームワーク領域３（ＦＲＷ３）コンセンサスアミノ酸配列ＴＡＶＸＹＣＡＲ（配列番号４５）、ここで式中ＸはＦまたはＹであるものを含む。
【０２１１】
表３に列挙するＮＩ−１２０１−野生型（ＮＩ−１２０１−ＷＴ）抗体は軽鎖ＣＤＲ３領域におけるアミノ酸配列ＱＱＳＮＳＹＰＬＴ（配列番号２６）、重鎖ＣＤＲ２領域におけるアミノ酸配列ＧＩＩＰＬＦＤＴＴＫＹＡＱＱＦＱＧ（配列番号１６）、重鎖ＣＤＲ３領域におけるアミノ酸配列ＤＲＤＩＬＴＤＹＹＰＭＧＧＭＤＶ（配列番号３６）、およびＦＲＷ３領域におけるアミノ酸配列ＴＡＶＦＹＣＡＲ（配列番号３８）を含む。
【０２１２】
表３に列挙するＮＩ−１２０１−Ａ抗体は軽鎖ＣＤＲ３領域におけるアミノ酸配列ＱＱＳＮＳＹＰＬＴ（配列番号２６）、重鎖ＣＤＲ２領域におけるアミノ酸配列ＧＩＩＰＬＦＤＴＴＫＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号３３）、重鎖ＣＤＲ３領域におけるアミノ酸配列ＤＲＤＩＬＴＤＹＹＰＭＧＧＭＤＶ（配列番号３６）、およびＦＲＷ３領域におけるアミノ酸配列ＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号３９）を含む。
【０２１３】
表３に列挙するＮＩ−１２０１−Ｂ抗体は軽鎖ＣＤＲ３領域におけるアミノ酸配列ＱＱＳＮＳＹＰＬＴ（配列番号２６）、重鎖ＣＤＲ２領域におけるアミノ酸配列ＧＩＩＰＬＦＤＴＴＫＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号３３）、重鎖ＣＤＲ３領域におけるアミノ酸配列ＤＲＤＩＬＴＤＹＹＰＬＧＧＭＤＶ（配列番号３７）、およびＦＲＷ３領域におけるアミノ酸配列ＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号３９）を含む。
【０２１４】
表３に列挙するＮＩ−１２０１−Ｃ抗体は軽鎖ＣＤＲ３領域におけるアミノ酸配列ＱＱＳＮＳＹＰＬＴ（配列番号２６）、重鎖ＣＤＲ２領域におけるアミノ酸配列ＧＩＩＰＡＦＥＴＴＫＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号３４）、重鎖ＣＤＲ３領域におけるアミノ酸配列ＤＲＤＩＬＴＤＹＹＰＬＧＧＭＤＶ（配列番号３７）、およびＦＲＷ３領域におけるアミノ酸配列ＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号３９）を含む。
【０２１５】
表３に列挙するＮＩ−１２０１−Ｄ抗体は軽鎖ＣＤＲ３領域におけるアミノ酸配列ＱＱＳＱＳＹＰＬＴ（配列番号３２）、重鎖ＣＤＲ２領域におけるアミノ酸配列ＧＩＩＰＡＦＥＴＴＫＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号３４）、重鎖ＣＤＲ３領域におけるアミノ酸配列ＤＲＤＩＬＴＤＹＹＰＬＧＧＭＤＶ（配列番号３７）、ＦＲＷ３領域におけるおよびアミノ酸配列ＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号３９）を含む。
【０２１６】
表３に列挙するＮＩ−１２０１−Ｅ抗体は軽鎖ＣＤＲ３領域におけるアミノ酸配列ＱＱＳＱＳＹＰＬＴ（配列番号３２）、重鎖ＣＤＲ２領域におけるアミノ酸配列ＧＩＩＰＬＦＤＴＴＫＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号３３）、重鎖ＣＤＲ３領域におけるアミノ酸配列ＤＲＤＩＬＴＤＹＹＰＬＧＧＭＤＶ（配列番号３７）、およびＦＲＷ３領域におけるアミノ酸配列ＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号３９）を含む。
【０２１７】
表３に列挙するＮＩ−１２０１−Ｆ抗体は軽鎖ＣＤＲ３領域におけるアミノ酸配列ＱＱＳＮＳＹＰＬＴ（配列番号２６）、重鎖ＣＤＲ２領域におけるアミノ酸配列ＧＩＩＰＡＦＤＴＴＫＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号３５）、重鎖ＣＤＲ３領域におけるアミノ酸配列ＤＲＤＩＬＴＤＹＹＰＬＧＧＭＤＶ（配列番号３７）、およびＦＲＷ３領域におけるアミノ酸配列ＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号３９）を含む。
【０２１８】
表３に列挙するＮＩ−１２０１−Ｇ抗体は軽鎖ＣＤＲ３領域におけるアミノ酸配列ＱＱＳＱＳＹＰＬＴ（配列番号３２）、重鎖ＣＤＲ２領域におけるアミノ酸配列ＧＩＩＰＡＦＤＴＴＫＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号３５）、重鎖ＣＤＲ３領域におけるアミノ酸配列ＤＲＤＩＬＴＤＹＹＰＬＧＧＭＤＶ（配列番号３７）、およびＦＲＷ３領域におけるアミノ酸配列ＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号３９）を含む。
【０２１９】
【表３】
2020128444.tif 000011
実施例５  ＮＩ−１２０１はＩＬ−６シスシグナリングにより誘導されたＳＴＡＴ−３ホスホリル化をブロックする。
【０２２０】
２４時間の血清枯渇の後、ｍＩＬ−６Ｒ−陽性ヒト肝細胞癌腫ＨｅｐＧ２細胞（ＡＴＣＣ）を１０分間、記載濃度のｈＩＬ−６（図３Ａ）と共に、または１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−６と共に、記載濃度のｈｕＩｇＧ１、対照ｍＡｂまたはＮＩ−１２０１ＷＴと共にインキュベートした（図３Ｂ）。試料緩衝液中の溶解の後、蛋白質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ウエスタンブロットにおいて、モノクローナル抗−ホスホ−ＳＴＡＴ３抗体、Ｐ−ＳＴＡＴ３（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いながら分析した。ブロットを分割し、活性化および非活性化のＳＴＡＴ３（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を認識するポリクローナル抗体を用いて再プローブした。ＮＩ−１２０１および対照ｍＡｂはＳＴＡＴ−３のシスシグナリング誘導ホスホリル化のブロッキングにおいて等価な活性を示した。
【０２２１】
実施例６  ＮＩ−１２０１はｓｈｕＩＬ−６Ｒｃにより媒介されたＩＬ−６トランスシグナリングをブロックする。
【０２２２】
ＰＥＡＫ細胞をルシフェラーゼレポータープラスミド（プロモーターＳＴＡＴ３依存性）で一過性にトランスフェクトした。ウェルあたり２．５ｘ１０４細胞を０．５％ウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭ中９６ウェル平底プレートに播種した。４〜６時間の細胞接着ののち、ＰＥＡＫ細胞を、記載のｍＡｂの漸増用量を用いながらｓｈｕＩＬ−６Ｒｃの３０ｎｇ／ｍＬで活性化した。１８時間後、培地を除去し、そして化学ルミネセンス分析器中、ｓｔｅａｄｙ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いながらルシフェラーゼアッセイを実施した。ＮＩ−１２０１の全変異体とも、用量依存的な態様において、ｓｈｕＩＬ−６Ｒｃの活性を中和したのに対し、対照ｍＡｂは予め形成された複合体の活性をブロックできなかった（図４）。
【０２２３】
実施例７  ｈｕＩＬ−６Ｒｃ抗体の親和性および結合速度
ネイティブの膜結合ｈｕＩＬ−６Ｒに結合するＮＩ−１２０１の能力をＨｅｐＧ２ヘパトーマ細胞系統上のフローサイトメトリー分析を用いて評価した。細胞表面染色はｍＡｂの異なる用量を用いながらＨｅｐＧ２細胞上で実施する。１次未コンジュゲートｍＡｂ（対照ｍＡｂ、ｈｕＩｇＧ１およびＮＩ−１２０１  ｍＡｂ）の結合はヤギ抗ヒトＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いながら検出した。各実験は３連で実施した。蛍光強度の平均（ＭＦＩ）を表し、そして対照ｍＡｂと比較した場合の膜ＩＬ−６Ｒに対するＮＩ−１２０１の明確に増大した親和性が示されている（図５）。
【０２２４】
ＮＩ−１２０１候補（Ａ〜Ｄ）、ＮＩ−１２０１ＷＴおよび対照ｍＡｂの親和性および結合速度はＢｉａｃｏｒｅ２０００装置（ＢｉａｃｏｒｅＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）上で特性化した。ＣＭ５  Ｂｉａｃｏｒｅチップを用い、そして抗ヒトＩｇＧＦｃ（ＢｉａｃｏｒｅＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）の１６４０ＲＵ（応答単位）をＥＤＣ／ＮＨＳ化学で固定化した。この表面を用いてＮＩ−１２０１候補，ＮＩ−１２０１ＷＴおよび対照ｍＡｂをキャプチャーした。表面は、３０秒間２０μＬ／分での３Ｍ塩化マグネシウムの注射、その後ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（ＢｉａｃｏｒｅＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）中の安定化時間１分により、各サイクル後に再生した。結合は以下の濃度、即ち１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、６．２５ｎＭおよび０ｎＭにおいて２連で、分析対象担体非含有可溶性ヒトＩＬ−６Ｒ（ｓｈｕＩＬ６−Ｒ；Ｒ＆Ｄ）、可溶性ヒトＩＬ−６Ｒｃ（ｓｈｕＩＬ−６Ｒｃ）、および可溶性カニクイザルＩＬ−６Ｒ（ｓｃｙＩＬ−６Ｒ）を通過させることにより計測した。全ての溶液はＨＢＳ−ＥＰ緩衝液中に希釈した。注射は５０μｌ／分において３分間実施し、その後１２分の解離時間を設け、そして温度は２５℃に設定した。データは１：１のＬａｎｇｍｕｉｒモデルに従ってフィットさせ、そしてＫｏｎ、ＫｏｆｆおよびＫＤ値を測定した。ＮＩ−１２０１変異体Ａ〜Ｄ，ＮＩ−１２０１ＷＴおよび対照ｍＡｂの親和性および速度定数を表４にまとめる。ネイティブまたは予め形成されたＩＬ−６Ｒｃのいずれかを用いた機能アッセイを確認するように、ＮＩ−１２０１は複合体に対するサブナノモルの親和性を示したのに対し、対照ｍＡｂは計測可能な結合を示さなかった。
【０２２５】
【表２−２】
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実施例８  ｈｕＩＬ−６Ｒｃ抗体のエピトープマッピング
ＩＬ−６Ｒキメラおよび突然変異したマウスＩＬ−６Ｒの構築：各修飾をＩＬ−６Ｒの可溶性形態に対して実施し、そしてｐＤＩＳＰＬＡＹ（商標）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に添加することによりコンストラクトの表面発現を可能にした。ＮＩ−１２０１のエピトープマッピングは、マウスＩＬ−６Ｒの第２のフィブロネクチンＩＩドメイン（Ｄ３ドメイン）におけるヒト残基を交換すること、および修飾したマウスＩＬ−６Ｒ上のｍＡｂの結合が回復しているかどうかを確認することにより、評価した。
【０２２６】
オーバーラップエクステンションＰＣＲの方策を用いることにより、ｈｕＩＬ−６Ｒ／マウスＩＬ−６Ｒキメラ蛋白質（図６Ａ）およびＤ３ドメインにおけるヒトアミノ酸置換を含有するマウスＩＬ−６Ｒ蛋白質（図６Ｂ）を特定するコーディング配列を形成した。部分オーバーラップ突然変異誘発性オリゴヌクレオチドプライマーを用いてｈｕＩＬ−６Ｒ／マウスＩＬ−６Ｒ接合部または置換領域のいずれかの側のＮおよびＣ末端配列のＰＣＲ増幅を行い、その後変性したＰＣＲ産物のゲル単離およびアニーリングを行った。次に完全長のＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩおよびＢｇｌＩＩで消化し、そしてｐＤＩＳＰＬＡＹ（商標）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内にライゲーションした。ＰＥＡＫ細胞は１０％ウシ胎児血清および４ｍＭのＬ−グルタミンを添加したＤＭＥＭ培地中で成育させた。細胞はトランスフェクション前１２〜２４時間にプレーティングすることにより６ウェルプレート中で４０〜５０％のコンフルエントとした。ｐＤＩＳＰＬＡＹ（商標）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のトランスフェクションはＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）ＬＴ１試薬（ＭｉｒｕｓＢｉｏ）を用いたリポフェクションにより製造元の仕様書にしたがって実施した。細胞は４８時間成育させた後、採取し、そしてフローサイトメトリーによる分析に付した。
【０２２７】
ＦＡＣＳ分析：細胞表面の染色はＩＬ−６の各変異体をディスプレイするＰＥＡＫ細胞に対して実施し、そしてフローサイトメトリーで分析した（図６Ｂ〜Ｄ）。各キメラＩＬ−６Ｒの細胞表面発現は抗ヒト−ＣＤ１２６ＰＥまたは抗−マウスＣＤ１２６−ＰＥ抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いながら評価した。対照ｍＡｂおよびＮＩ−１２０１結合はヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いながら検出した。データはＮＩ−１２０１が対照ｍＡｂに対するｈｕＩＬ−６Ｒ上の区別可能なエピトープを認識することを示していた。
【０２２８】
実施例９  ＮＩ−１２０１はカニクイザルＩＬ−６Ｒｃと交差反応し中和する。
【０２２９】
ヒトおよび記載した種の間のＩＬ−６Ｒ蛋白質配列の相同性を示す（図７Ａ）。実施例６に記載した通り、ＰＥＡＫ細胞をルシフェラーゼレポータープラスミド（ＳＴＡＴ３依存性プロモーターで一過性にトランスフェクトし、そして記載した抗ヒトｍＡｂの異なる用量を用いながら２５ｎｇ／ｍＬカニクイザルＩＬ−６＋２５０ｎｇ／ｍＬ  ｓｃｙＩＬ−６Ｒで活性化した。ルシフェラーゼアッセイは実施例６において上記した通り実施した（図７Ｂ）。結果はネイティブのカニクイザルＩＬ−６Ｒｃの機能的活性を中和するＮＩ−１２０１の能力を示していた。
【０２３０】
（項目１）  単離された完全ヒト抗体であって、ｇｐ１３０媒介細胞内シグナリングカスケードが該抗体の存在下で活性化されないように、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体（ＩＬ−６Ｒｃ）に結合し、そしてＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ受容体複合体（ＩＬ−６Ｒｃ）がｇｐ１３０に結合することを防止する、抗体。
（項目２）  前記抗体が：
（ｉ）下記：
（ａ）軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ３）におけるアミノ酸配列ＱＱＳＸＳＹＰＬＴ（ここで、ＸはＮまたはＱである）；
（ｂ）重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ２）におけるアミノ酸配列ＧＩＩＰＸ１ＦＸ２ＴＴＫＹＡＱＸ３ＦＱＧ（ここで、Ｘ１はＬまたはＡであり、Ｘ２はＤまたはＥであり、そしてＸ３はＱまたはＫである）；
（ｃ）重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ３）におけるアミノ酸配列ＤＲＤＩＬＴＤＹＹＰＸＧＧＭＤＶ（ここで、ＸはＭまたはＬである）；および、
（ｄ）フレームワーク領域３（ＦＲＷ３）におけるアミノ酸配列ＴＡＶＸＹＣＡＲ（ここで、ＸはＦまたはＹである）；
を含む抗体；
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域および配列番号４のアミノ酸配列を含む可変軽鎖領域を含む抗体；
（ｉｉｉ）軽鎖ＣＤＲ３領域におけるアミノ酸配列ＱＱＳＮＳＹＰＬＴ、重鎖ＣＤＲ２領域におけるアミノ酸配列ＧＩＩＰＬＦＤＴＴＫＹＡＱＫＦＱＧ、重鎖ＣＤＲ３領域におけるアミノ酸配列ＤＲＤＩＬＴＤＹＹＰＭＧＧＭＤＶ、およびＦＲＷ３領域におけるアミノ酸配列ＴＡＶＹＹＣＡＲを含む抗体；
（ｉｖ）軽鎖ＣＤＲ３領域におけるアミノ酸配列ＱＱＳＮＳＹＰＬＴ、重鎖ＣＤＲ２領域におけるアミノ酸配列ＧＩＩＰＬＦＤＴＴＫＹＡＱＫＦＱＧ、重鎖ＣＤＲ３領域におけるアミノ酸配列ＤＲＤＩＬＴＤＹＹＰＬＧＧＭＤＶ、およびＦＲＷ３領域におけるアミノ酸配列ＴＡＶＹＹＣＡＲを含む抗体；
（ｖ）軽鎖ＣＤＲ３領域におけるアミノ酸配列ＱＱＳＮＳＹＰＬＴ、重鎖ＣＤＲ２領域におけるアミノ酸配列ＧＩＩＰＡＦＥＴＴＫＹＡＱＫＦＱＧ、重鎖ＣＤＲ３領域におけるアミノ酸配列ＤＲＤＩＬＴＤＹＹＰＬＧＧＭＤＶ、およびＦＲＷ３領域におけるアミノ酸配列ＴＡＶＹＹＣＡＲを含む抗体；ならびに、
（ｖｉ）軽鎖ＣＤＲ３領域におけるアミノ酸配列ＱＱＳＱＳＹＰＬＴ、重鎖ＣＤＲ２領域におけるアミノ酸配列ＧＩＩＰＡＦＥＴＴＫＹＡＱＫＦＱＧ、重鎖ＣＤＲ３領域におけるアミノ酸配列ＤＲＤＩＬＴＤＹＹＰＬＧＧＭＤＶ、およびＦＲＷ３領域におけるアミノ酸配列ＴＡＶＹＹＣＡＲを含む抗体、
よりなる群から選択される抗体を交差ブロッキングする、項目１記載の抗体。
（項目３）  前記抗体がＩＬ−６Ｒｃに対して少なくとも１ｘ１０−８の親和性を有する、項目１記載の抗体。
（項目４）  前記抗体がＩＬ−６Ｒｃに対して少なくとも１ｘ１０−９の親和性を有する、項目１記載の抗体。
（項目５）  前記抗体がＩＬ−６受容体（ＩＬ−６Ｒ）のドメイン３におけるエピトープに結合し、該エピトープは少なくともアミノ酸配列ＡＥＲＳＫＴを含む、項目１記載の抗体。
（項目６）  前記抗体がＩＬ−６およびＩＬ−６Ｒの間の相互作用をモジュレートしない、項目１記載の抗体。
（項目７）  前記抗体がＩＬ−６Ｒにも結合する、項目１記載の抗体。
（項目８）  前記抗体が配列番号１５のアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ１領域、配列番号１６のアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ２領域、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ３領域、配列番号２４のアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ１領域、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ２領域、および配列番号２６のアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ３領域を含む、項目１記載の抗体。
（項目９）  前記抗体が：
（ａ）配列番号１５、１８または２１のアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ１領域；
（ｂ）配列番号１６、１９、２２、３３、３４または３５のアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ２領域；
（ｃ）配列番号１７、２０、２３、３６または３７のアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ３領域；
（ｄ）配列番号２４、２７、２８、または３０のアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ１領域；（ｅ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ２領域；および、
（ｆ）配列番号２６、２９、３１または３２のアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ３領域
を含む、項目１記載の単離された抗体。
（項目１０）  前記抗体がＩｇＧアイソタイプである、項目９記載の抗体。
（項目１１）  前記抗体がＩｇＧ１アイソタイプである、項目９記載の抗体。
（項目１２）  前記抗体が配列番号２、８、または１２から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変配列および配列番号４、６、１０または１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変配列を含む、項目９記載の抗体。
（項目１３）  単離された完全ヒトモノクローナル抗ＩＬ−６Ｒｃ抗体、またはそのフラグメントであって、該抗体が：
（ａ）配列番号１５、１８または２１のアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ１領域；
（ｂ）配列番号１６、１９、２２、３３、３４または３５のアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ２領域；
（ｃ）配列番号１７、２０、２３、３６または３７のアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ３領域；
（ｄ）配列番号２４、２７、２８、または３０のアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ１領域；（ｅ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ２領域；および、
（ｆ）配列番号２６、２９、３１または３２のアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ３領域、
を含み、そして、該抗体がＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体に結合する、抗体。
（項目１４）  前記抗体がＩＬ−６Ｒにも結合する、項目１３記載の抗体。
（項目１５）  前記抗体がＩｇＧアイソタイプである、項目１３記載の抗体。
（項目１６）  前記抗体がＩｇＧ１アイソタイプである、項目１３記載の抗体。
（項目１７）  前記抗体が配列番号２、８、または１２から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変配列および配列番号４、６、１０または１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変配列を含む、項目１３記載の抗体。
（項目１８）  前記項目のいずれか１項に記載の抗体および担体を含む、医薬組成物。
（項目１９）  対象における関節リウマチ、クローン病、乾癬、多発性硬化症または喘息に関連する臨床適応症の症状を軽減する方法であって、該方法が、ＩＬ−６Ｒｃの拮抗剤を、該軽減を必要とする対象に、関節リウマチ、クローン病、乾癬、多発性硬化症または喘息に関連する臨床適応症の症状を軽減するために十分な量で投与する工程を含む、方法。
（項目２０）  前記対象がヒトである、項目１９記載の方法。
（項目２１）  前記拮抗剤がモノクローナル抗体またはそのフラグメントである、項目１９記載の方法。
（項目２２）  前記モノクローナル抗体が項目１〜１７のいずれか１項に記載の抗体またはそのフラグメントである、項目２１記載の方法。
（項目２３）  癌、自己免疫疾患または炎症性障害の症状を軽減する方法でであって、該方法が、項目１〜１６のいずれか１項に記載の抗体を、該軽減を必要とする対象に、該対象における癌、自己免疫疾患または炎症性障害の症状を軽減するために十分な量で投与する工程を含む、方法。
（項目２４）  前記対象がヒトである、項目２３記載の方法。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
2020128444.tif 000020
【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
2020128444.tif 000022
【図７】
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【配列表】
2020128444000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年6月17日(2020.6.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における炎症関係の障害に関連する１つ以上の症状を軽減するための、ＩＬ−６Ｒ抗体を含む組成物であって、前記症状が、発熱、全身倦怠感、疲労、発熱、疼痛、関節の疼痛、頻呼吸、咳、呼吸困難、肺感染症、呼吸疾患、頭痛、下痢、発疹、貧血、または、低下した臓器機能であり、前記ＩＬ−６Ｒ抗体が、
ｉ．配列番号１５のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１領域、配列番号１６のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２領域、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３領域、配列番号２４のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１領域、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２領域および配列番号２６のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３領域；
ｉｉ．配列番号１５のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１領域、配列番号３３のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２領域、配列番号３６のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３領域、配列番号２４のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１領域、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２領域および配列番号２６のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３領域；
ｉｉｉ．配列番号１５のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１領域、配列番号３３のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２領域、配列番号３７のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３領域、配列番号２４のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１領域、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２領域および配列番号２６のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３領域；
ｉｖ．配列番号１５のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１領域、配列番号３４のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２領域、配列番号３７のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３領域、配列番号２４のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１領域、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２領域および配列番号２６のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３領域；
ｖ．配列番号１５のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１領域、配列番号３４のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２領域、配列番号３７のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３領域、配列番号２４のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１領域、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２領域および配列番号３２のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３領域；または
ｖｉ．配列番号１５のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１領域、ａ配列番号１６のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２領域、配列番号３６のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３領域、配列番号２４のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１領域、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２領域および配列番号２６のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３領域
を含む、組成物。
【請求項２】
前記抗体がＩｇＧアイソタイプである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記抗体がＩｇＧ１アイソタイプである、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記抗体が、配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖可変配列と、配列番号４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変配列とを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記対象がヒトである、請求項１に記載の組成物。
【外国語明細書】
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