(57)【要約】      （修正有）【課題】高濃度の薬物処理で誘発される腎臓細胞、肝細胞の細胞死を抑制し、細胞を保護する、細胞保護用薬学的組成物の提供。【解決手段】シクロヒスチジン−プロリン（Ｃｙｃｌｏ  Ｈｉｓ−Ｐｒｏ、ＣＨＰ）を有効成分として含む細胞保護用薬学的組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
シクロヒスチジン−プロリン（Ｃｙｃｌｏ  Ｈｉｓ−Ｐｒｏ、ＣＨＰ）またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する細胞保護用薬学的組成物。
【請求項２】
前記細胞は、腎臓細胞または肝細胞のものである、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項３】
前記組成物は、細胞死（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）を抑制するものである、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項４】
前記組成物は、薬剤により誘発される肝または腎臓細胞の損傷を抑制するものである、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項５】
前記薬剤は、抗がん剤または抗菌薬のものである、請求項４に記載の薬学的組成物。
【請求項６】
前記抗がん剤は、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、オキサリプラチン（ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）及びネダプラチン（ｎｅｄａｐｌａｔｉｎ）からなる群から選択される一つ以上の白金系抗がん剤のものである、請求項５に記載の薬学的組成物。
【請求項７】
シクロヒスチジン−プロリン（Ｃｙｃｌｏ  Ｈｉｓ−Ｐｒｏ、ＣＨＰ）またはその食品学的に許容される塩を有効成分として含む肝または腎臓損傷に対する予防または改善用健康機能食品。
【請求項８】
前記肝または腎臓損傷は、抗がん剤または抗菌薬から誘発されるものである、請求項７に記載の健康機能食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シクロヒスチジン−プロリン（Ｃｙｃｌｏ  Ｈｉｓ−Ｐｒｏ、ＣＨＰ）を有効成分として含む細胞保護用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
シクロヒスチジン−プロリン（Ｃｙｃｌｏ  Ｈｉｓ−Ｐｒｏ、ＣＨＰ）は、構造的には、甲状腺刺激放出ホルモン（ＴＲＨ）と関連した自然に発生する環式ジペプチドである。ヒスチジン−プロリン（ＣＨＰ）は、動物とヒトの組織と体液に内在するペプチドであり、血液、精液、胃腸管、尿等で発見され、特に、前立腺（ｐｒｏｓｔａｔｅ）に豊富な代謝産物である。ヒスチジン−プロリン（ＣＨＰ）は、抗糖尿病、抗肥満、抗炎症、抗酸化作用等、様々な生理活性機能があると知られている。
【０００３】
細胞死（アポトーシス、ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）は、多細胞生命体の正常な発達及び機能に重要な過程である。生理学的細胞死は、正常な過程で重要な役割を果たすが、非正常な細胞死は、様々な疾病を引き起こす。例えば、細胞死が阻害すると、がん、自己免疫疾患、炎症疾患、ウイルス感染等がもたらされる。
【０００４】
また、細胞死（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）は、アルツハイマー、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｌａｔｅｒａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、ルー・ゲーリッグ病のような退行性神経疾患及び脳の局所貧血（ｃｅｒｅｂｒａｌ  ｉｓｃｈｅｍｉａ）、外傷性脳損傷（ｔｒａｕｍａｔｉｃ  ｂｒａｉｎ  ｉｎｊｕｒｙ）、脊髄外傷（ｓｐｉｎａｌ  ｃｏｒｄ  ｉｎｊｕｒｙ）、脳卒中のような急性疾患とも関連があると知られている。
【０００５】
しかし、未だヒスチジン−プロリン（ＣＨＰ）の細胞保護効果とその機序に関する研究は報告されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで、本発明者らは、シクロヒスチジン−プロリン（Ｃｙｃｌｏ  Ｈｉｓ−Ｐｒｏ、ＣＨＰ）が高濃度の薬物処理で誘発される腎臓細胞、肝細胞の細胞死を抑制し、細胞を保護するという事実を実験的に確認したので、本発明を完成した。
【０００７】
本発明の目的は、シクロヒスチジン−プロリン（ＣＨＰ）またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する細胞保護用薬学的組成物を提供することである。
【０００８】
本発明の他の目的は、シクロヒスチジン−プロリン（ＣＨＰ）またはその食品学的に許容される塩を有効成分として含む肝または腎臓損傷に対する予防または改善用健康機能食品を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記目的を達成するために、本発明は、シクロヒスチジン−プロリン（ＣＨＰ）またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する細胞保護用薬学的組成物を提供する。
【００１０】
本発明の実施例によれば、前記細胞は、腎臓細胞または肝細胞であってよい。
【００１１】
本発明の実施例によれば、前記組成物は、細胞死（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）を抑制できる。
【００１２】
本発明の実施例によれば、前記組成物は、薬剤により誘発される細胞損傷を抑制するものであってよい。
【００１３】
本発明の実施例によれば、前記薬剤は、抗がん剤または抗菌薬のものであり、抗がん剤は、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、オキサリプラチン（ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）及びネダプラチン（ｎｅｄａｐｌａｔｉｎ）からなる群から選択される一つ以上の白金系抗がん剤のものであってよい。
【００１４】
また、本発明は、シクロヒスチジン−プロリン（ＣＨＰ）またはその食品学的に許容される塩を有効成分として含む肝または腎臓損傷に対する予防または改善用健康機能食品を提供する。
【００１５】
本発明の実施例によれば、前記肝または腎臓毒性を誘発する薬剤は、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、ゲンタマイシン（ＧＭ）及びアセトアミノフェン（ａｃｅｔａｍｉｎｏｐｈｅｎ、ＡＰＡＰ）からなる群から選択される一つ以上の抗がん剤；または抗菌薬のものであってよい。
【発明の効果】
【００１６】
本発明のシクロヒスチジン−プロリン（Ｃｙｃｌｏ  Ｈｉｓ−Ｐｒｏ、ＣＨＰ）を有効成分として含有する細胞保護用薬学的組成物は、毒性から腎臓細胞または肝細胞の細胞死を抑制することを確認したので、腎臓及び肝毒性を予防及び治療する組成物として有用に使用され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ＣＨＰのＧＭ誘発腎臓細胞（ＬＬＣ−ＰＫ１  ｃｅｌｌ）の細胞死抑制効果を示した図である：＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。ＣＨＰ；Ｃｙｃｌｏ  Ｈｉｓ−Ｐｒｏ、ＧＭ；ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ。
【図２】ＣＨＰのＡＰＡＰ誘発肝細胞（Ｃｈａｎｇ  ｌｉｖｅｒ  ｃｅｌｌ）の細胞死抑制効果を示した図である：＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１。ＣＨＰ；Ｃｙｃｌｏ  Ｈｉｓ−Ｐｒｏ、ＡＰＡＰ；ａｃｅｔａｍｉｎｏｐｈｅｎ。
【図３】ＣＨＰの摂取がマウスでのシスプラチンによる肝毒性の保護機能を確認するためにＡＬＴを測定したグラフである。
【図４】ＣＨＰの摂取がマウスでのシスプラチンによる肝毒性の保護機能を確認するためにＡＳＴを測定したグラフである。
【図５】ＣＨＰの摂取がマウスでのシスプラチンによる腎臓毒性の保護機能を確認するためにＣｒｅａｔｉｎｉｎｅを測定したグラフである。
【図６】ＣＨＰの摂取がマウスでのシスプラチンによる腎臓毒性の保護機能を確認するためにＢＵＮを測定したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１９】
本発明のシクロヒスチジン−プロリン（Ｃｙｃｌｏ  Ｈｉｓ−Ｐｒｏ、ＣＨＰ）を有効成分として含有する細胞保護用組成物は、腎臓細胞または肝細胞の細胞死を抑制する効果があることを確認した。
【００２０】
本発明は、シクロヒスチジン−プロリン（ＣＨＰ）またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する細胞保護用組成物を提供する。本発明の実施例によれば、前記シクロヒスチジン−プロリン（ＣＨＰ）は、前立腺抽出物（Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｅｘｔｒａｃｔ）から分離されたものであってよい。
【００２１】
【化１】
2020128411.tif 000002
【００２２】
本発明は、シクロヒスチジン−プロリン（ＣＨＰ）またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する細胞保護用組成物は、腎臓細胞または肝細胞を保護することができる。
【００２３】
本発明のシクロヒスチジン−プロリン（ＣＨＰ）を有効成分として含有する組成物は、細胞死（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）を抑制するものであってよい。
【００２４】
本発明の組成物は、薬剤により誘発される細胞損傷を抑制するものであり、前記薬剤は、抗がん剤または抗菌薬であってよく、具体的には、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、オキサリプラチン（ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）及びネダプラチン（ｎｅｄａｐｌａｔｉｎ）からなる群から選択される一つ以上の白金系抗がん剤；またはゲンタマイシンまたはアセトアミノフェンのような抗菌薬であってよい。
【００２５】
本発明の薬学的組成物は、薬学的組成物の製造に通常使用する適切な担体、賦形剤または希釈剤をさらに含むことができる。このとき、前記組成物に含まれる前記シクロヒスチジン−プロリン（ＣＨＰ）、その塩、抽出物または分画物の含量は、特にこれに制限されないが、組成物の総重量に対して０．０００１〜１０重量％であり、好ましくは、０．００１〜１重量％を含むように製造できる。
【００２６】
本発明の用語「薬学的に許容される塩」とは、陽イオンと陰イオンが静電気的引力により結合している物質である塩の中でも薬剤学的に使用され得る形態の塩を意味するが、通常、金属塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性または酸性アミノ酸との塩等となり得る。例えば、金属塩としては、アルカリ金属塩（ナトリウム塩、カリウム塩等）、アルカリ土類金属塩（カルシウム塩、マグネシウム塩、バリウム塩等）、アルミニウム塩等となり得；有機塩基との塩としては、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、２，６−ルチジン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、シクロヘキシルアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ−ジベンジルエチレンジアミン等との塩となり得；無機酸との塩としては、塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸等との塩となり得；有機酸との塩としては、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、フタル酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等との塩となり得；塩基性アミノ酸との塩としては、アルギニン、リシン、オルニチン等との塩となり得；酸性アミノ酸との塩としては、アスパラギン酸、グルタミン酸等との塩となり得る。
【００２７】
本発明の組成物は、好ましくは、薬学的組成物であり、前記薬学的組成物は、経口または非経口投与でき、非経口投与時に皮膚外用または腹腔内注射、直腸内注射、皮下注射、静脈注射、筋肉内注射または胸部内注射注入方式を選択することが好ましい。
【００２８】
本発明に係る薬学的組成物は、通常使用される賦形剤、崩壊剤、甘味剤、滑沢剤、香味剤等をさらに含むことができる。前記崩壊剤としては、デンプングリコール酸ナトリウム、クロスポビドン、クロスカルメロースナトリウム、アルギン酸、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、キトサン、グアーガム、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、マグネシウムアルミニウムシリケート、ポラクリリンカリウム等がある。また、本発明に係る薬学的組成物は、薬剤学的に許容可能な添加剤をさらに含むことができ、このとき、薬剤学的に許容可能な添加剤としては、デンプン、ゼラチン化デンプン、微結晶セルロース、乳糖、ポビドン、コロイダルシリコンジオキシド、リン酸水素カルシウム、ラクトース、マンニトール、飴、アラビアゴム、前糊化デンプン、トウモロコシデンプン、粉末セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、オパドライ、デンプングリコール酸ナトリウム、カルナバワックス、合成ケイ酸アルミニウム、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸アルミニウム、ステアリン酸カルシウム、白糖、デキストロース、ソルビトール、タルク等が使用され得る。本発明に係る薬剤学的に許容可能な添加剤は、前記薬学的組成物に対して０．１〜９０重量部含まれることが好ましい。
【００２９】
経口投与のための固形製剤には、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、軟質カプセル剤、丸剤等が含まれる。経口のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤、エアゾール等が該当するが、よく使用される単純希釈剤である水、流動パラフィン以外に様々な賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤等が含まれ得る。非経口投与のための製剤としては、それぞれ通常の方法によって散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、滅菌された水溶液、液剤、非水性溶剤、懸濁剤、エマルジョン、シロップ、坐剤、エアゾール等の外用剤及び滅菌注射製剤の形態に剤形化して使用され得、好ましくは、クリーム、ゲル、パッチ、噴霧剤、軟膏剤、硬膏剤、ローション剤、リニメント剤、ペースト剤またはパップ剤の皮膚外用薬学的組成物を製造して使用することができるが、これに限定するものではない。非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステル等が使用され得る。坐剤の基剤としては、ウイテプゾール（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、ツイーン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチン等が使用され得る。
【００３０】
本発明の薬学的組成物の好ましい投与量は、体内で活性成分の吸収度、不活性化率及び排泄速度、患者の年齢、性別及び状態、治療する疾病の重症程度によって異なるが、当業者により適切に選択され得る。しかし、好ましい効果のために、経口投与剤の場合、一般的に、成人に１日に体重１ｋｇ当たり本発明の薬学的組成物を１日０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇで、好ましくは、０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇで投与することがよい。投与は、１日に１回投与してもよく、数回に分けて投与してもよい。前記投与量は、いかなる面でも本発明の範囲を限定するものではない。本発明の薬学的組成物は、毒性及び副作用がほとんどないので、長期間服用時にも安心して使用できる組成物である。
【００３１】
本発明の薬学的組成物は、腎臓細胞を保護する効果に優れるので、腎臓炎、急性腎盂腎炎、慢性腎盂腎炎、急性腎不全、尿細管間質線維化障害、ネフローゼ症候群（Ｎｅｐｈｒｏｔｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、腎性尿崩症、電解質代謝異常高尿酸血症及び低Ｎａ＋血症からなる群から選択される疾病を予防または治療でき、肝細胞を保護する効果に優れるので、肝不全、急性肝炎、慢性肝炎、肝硬変症、肝性昏睡及びアルコール性肝疾患からなる群から選択される疾病の予防または治療に有用に使用され得る。
【００３２】
本発明のシクロヒスチジン−プロリン（Ｃｙｃｌｏ  Ｈｉｓ−Ｐｒｏ、ＣＨＰ）またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含む組成物は、抗がん剤により誘発される肝または腎臓毒性の予防または治療用抗がん補助剤として使用することができる。
【００３３】
前記抗がん補助剤は、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、ネダプラチン、ドキソルビシン、タキソール、タモキシフェン、カムトベル、アドルシル、グリベック、エトポシド、ゾメタ、オンコビン等の既存の抗がん剤と併用投与することで、肝または腎臓毒性を減少させて抗がん効能を増進させることができる。
【００３４】
また、シクロヒスチジン−プロリン（Ｃｙｃｌｏ  Ｈｉｓ−Ｐｒｏ、ＣＨＰ）またはその食品学的に許容される塩を有効成分として含む肝または腎臓損傷に対する予防または改善用健康機能食品を提供する。
【００３５】
前記肝または腎臓損傷を誘発する薬剤は、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、ゲンタマイシン（ＧＭ）及びアセトアミノフェン（ａｃｅｔａｍｉｎｏｐｈｅｎ、ＡＰＡＰ）からなる群から選択される一つ以上の抗がん剤；または抗菌薬であってよい。
【００３６】
本発明の用語、「食品学的に許容される塩」とは、陽イオンと陰イオンが静電気的引力により結合している物質である塩の中でも食品学的に使用され得る形態の塩を意味し、その種類についての具体的な例は、上述の「薬学的に許容される塩」の例を含む。
【００３７】
本発明において用語、「健康食品（ｈｅａｌｔｈ  ｆｏｏｄ）」は、一般食品に比べて積極的な健康維持や増進効果を有する食品を意味し、健康補助食品（ｈｅａｌｔｈ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ｆｏｏｄ）は、健康補助目的の食品を意味する。場合によって、機能性食品、健康食品、健康補助食品の用語は互用される。前記食品は、有用な効果を得るために、錠剤、カプセル、粉末、顆粒、液状、丸剤等の様々な形態に製造され得る。
【００３８】
本発明において用語、「機能食品（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｆｏｏｄ）」は、特定保健用食品（ｆｏｏｄ  ｆｏｒ  ｓｐｅｃｉａｌ  ｈｅａｌｔｈ  ｕｓｅ、ＦｏＳＨＵ）と同じ用語であり、栄養供給の他にも生体調節機能が効率よく現れるように加工された医学、医療効果の高い食品を意味する。
【００３９】
このような健康機能食品の具体的な例として、前記組成物を利用して農産物、畜産物または水産物の特性を生かして変形させると同時に貯蔵性を良くした加工食品を製造することができる。
【００４０】
本発明の健康機能食品は、腎臓細胞を保護する効果に優れるので、腎臓炎、急性腎盂腎炎、慢性腎盂腎炎、急性腎不全、尿細管間質線維化障害、ネフローゼ症候群（Ｎｅｐｈｒｏｔｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、腎性尿崩症、電解質代謝異常高尿酸血症及び低Ｎａ＋血症からなる群から選択される疾病を予防または治療でき、肝細胞を保護する効果に優れるので、肝不全、急性肝炎、慢性肝炎、肝硬変症、肝性昏睡及びアルコール性肝疾患からなる群から選択される疾病の予防または改善用健康食品として有用に利用することができる。
【実施例】
【００４１】
＜実施例１＞シクロヒスチジン−プロリン（ＣＨＰ）の腎臓細胞死抑制分析
【００４２】
シクロヒスチジン−プロリン（ＣＨＰ）でゲンタマイシン（ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ、ＧＭ）により誘発される腎臓細胞の細胞死抑制効果を確認した。
【００４３】
具体的に、シクロヒスチジン−プロリン（ＣＨＰ）は、ペプチド専門の製造企業（Ｂａｃｈｅｍ；Ｂｕｂｅｎｄｏｒｆ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）にｔａｒｇｅｔ  ｓｐｅｃ（９９％ｐｕｒｉｔｙ）だけを要請して製造したものである。ゲンタマイシンは、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）で購入し、腎臓細胞（ＬＬＣ−ＰＫ１  ｃｅｌｌ）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ＵＳＡ）で購入した。腎臓細胞（ＬＬＣ−ＰＫ１  ｃｅｌｌ）にＣＨＰ０．１、１、５または１０ｍｇ／ｍＬそれぞれをＧＭ５ｍｇ／ｍＬと共に６時間の間同時に処理して培養した（図１Ａ）。
【００４４】
また、腎臓細胞（ＬＬＣ−ＰＫ１  ｃｅｌｌ）にＣＨＰ０．１、１、５または１０ｍｇ／ｍＬそれぞれを前処理して２時間の間培養した後、ＧＭ５ｍｇ／ｍＬを加えて４時間さらに培養した（図１Ｂ）。細胞生存度は、ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ−８（Ｄｏｊｉｎｄｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ｋｕｍａｍｏｔｏ、Ｊａｐａｎ）を使用して分析し、ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＬＬＣ；Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）で測定した。
【００４５】
その結果、ゲンタマイシン（ＧＭ）は、腎臓細胞の細胞死を誘発し、シクロヒスチジン−プロリン（ＣＨＰ）は、ゲンタマイシン（ＧＭ）により誘発される腎臓細胞の細胞死を濃度依存的に抑制した。特に、シクロヒスチジン−プロリン（ＣＨＰ）を腎臓細胞に前処理したとき、ゲンタマイシン（ＧＭ）により誘発される細胞死が大きく抑制された。
【００４６】
＜実施例２＞シクロヒスチジン−プロリン（ＣＨＰ）の肝細胞死抑制分析
【００４７】
シクロヒスチジン−プロリン（ＣＨＰ）のアセトアミノフェン（ａｃｅｔａｍｉｎｏｐｈｅｎ、ＡＰＡＰ）により誘発される肝細胞の細胞死抑制効果を確認した。
【００４８】
具体的に、アセトアミノフェンは、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）で購入し、肝細胞（Ｃｈａｎｇ  ｌｉｖｅｒ  ｃｅｌｌ）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ＵＳＡ）で購入した。肝細胞（Ｃｈａｎｇ  ｌｉｖｅｒ  ｃｅｌｌ）にＣＨＰ０．１、１、５または１０ｍｇ／ｍＬそれぞれをＡＰＡＰ１５ｍＭと共に２４時間の間同時に処理して培養した（図２Ａ）。
【００４９】
また、肝細胞（Ｃｈａｎｇ  ｌｉｖｅｒ  ｃｅｌｌ）にＣＨＰ０．１、１、５または１０ｍｇ／ｍＬそれぞれを前処理して２４時間の間培養した後、ＡＰＡＰ１５ｍＭを加えて２４時間さらに培養した（図２Ｂ）。細胞生存度は、ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ−８（Ｄｏｊｉｎｄｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ｋｕｍａｍｏｔｏ、Ｊａｐａｎ）を使用して分析し、ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＬＬＣ；Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）で測定した。
【００５０】
その結果、アセトアミノフェン（ＡＰＡＰ）は、肝細胞の細胞死を誘発し、ＣＨＰ（Ｃｙｃｌｏ  Ｈｉｓ−Ｐｒｏ）は、アセトアミノフェン（ＡＰＡＰ）により誘発される肝細胞の細胞死を濃度依存的に抑制した。特に、シクロヒスチジン−プロリン（ＣＨＰ）を肝細胞にアセトアミノフェン（ＡＰＡＰ）と同時処理したとき、アセトアミノフェン（ＡＰＡＰ）により誘発される細胞死が大きく抑制された。
【００５１】
＜実施例３＞シクロヒスチジン−プロリン（ＣＨＰ）摂取をした動物モデルでシスプラチンによる肝損傷抑制分析
【００５２】
＜３−１＞ＣＨＰ摂取及びシスプラチン投与
【００５３】
ＣＨＰによるマウスの肝毒性保護効果を測定するために、ＳＤ  ｒａｔをコアテック（株）で購入して一定の条件（温度：２３±３℃、相対湿度：５５±１０％、一周期：１２時間）で飼育した。５匹を一群としてケージで水とえさを自由供給し、実験前に１週間馴化を経て実験に使用した。順応期間が終了した後、５個の群に分けて下記表１のように実験を進行した。
【００５４】
【表１】
2020128411.tif 000003
【００５５】
１グループは、水を摂取して陰性対照群に設定し、２グループは、水を摂取した後、シスプラチン投与による肝損傷対照群に設定し、３グループは、ＣＨＰ１ｍｇ／Ｌの飲水摂取、４グループは、ＣＨＰ５ｍｇ／Ｌの飲水摂取、５グループは、ＣＨＰ１０ｍｇ／Ｌの飲水摂取の１週間後、シスプラチン投与による肝損傷保護効果グループに設定した。ＣＨＰで供給される飲水は、２日に１回の取り替えで実施した。
【００５６】
＜３−２＞マウスの肝機能保護効果測定
【００５７】
ＣＨＰの肝機能保護効果を確認するために、まず、ＣＨＰを濃度別に１週間マウスに投与した後、シスプラチンを投与し、２４時間後、肝機能を確認した。ＡＬＴとＡＳＴを測定するために、マウスで腹大動脈採血して血液を採取した後、遠心分離機を利用して血清だけを分離した後、ａｕｔｏｍａｔｉｃ  ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｈｉｔａｃｈｉ７１８０；Ｔｏｋｙｏ、日本）を利用して測定した。
【００５８】
その結果、図３及び図４に示されたように、陰性対照群とシスプラチン誘導肝損傷群のｔ検証を実施してその有意性を検証し、統計学的に有意な差を示した（＃ｐ＜０．０５、＃＃＃ｐ＜０．０００５）。
【００５９】
また、シスプラチン誘導肝損傷群とＣＨＰ摂取投与群間のアノーバ（ＡＮＯＶＡ）を利用した有意差で多重比較し、テューキー事後検定を利用した個別比較をし、統計学的に有意な差を示した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５）。
【００６０】
マウスにシスプラチンを投与すると肝損傷を招いてＡＬＴ及びＡＳＴが増加することを確認することができた。また、ＣＨＰを摂取したマウスには、シスプラチンにより増加したＡＬＴ及びＡＳＴが顕著に減少することを確認した。
【００６１】
従って、ＣＨＰが血中肝機能数値を確認できるＡＬＴ及びＡＳＴの濃度を減少させる優れた効果を示すので、ＣＨＰを有効成分として含む薬学的組成物が肝細胞を保護する効果に優れるので、肝疾患からなる疾病の予防または治療に有用に使用され得ることが分かる。
【００６２】
＜実施例４＞シクロヒスチジン−プロリン（ＣＨＰ）摂取をした動物モデルでシスプラチンによる腎臓損傷抑制効果分析
【００６３】
＜４−１＞ＣＨＰ摂取及びシスプラチン投与
【００６４】
シクロヒスチジン−プロリン（ＣＨＰ）によるマウスの腎臓毒性保護効果を測定するために、ＩＣＲマウスをコアテック（株）で購入して一定の条件（温度：２３±３℃、相対湿度：５５±１０％、一周期：１２時間）で飼育した。５匹を一群としてケージで水とえさを自由供給し、実験前に１週間馴化を経て実験に使用した。順応期間が終了した後、３個の群に分けて下記表２のように実験を進行した。
【００６５】
【表２】
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【００６６】
１グループは、水を経口投与して陰性対照群に設定し、２グループは、水を経口投与した後、シスプラチン投与による腎臓損傷対照群に設定し、３グループは、ＣＨＰ１ｍｇ／ｋｇで１週間毎日経口投与した後、シスプラチン投与による腎臓損傷保護効果グループに設定した。
【００６７】
＜４−２＞マウスの腎臓機能保護効果測定
【００６８】
シクロヒスチジン−プロリン（ＣＨＰ）の腎臓機能保護効果を確認するために、まず、シクロヒスチジン−プロリン（ＣＨＰ）を１ｍｇ／ｋｇの濃度で１週間毎日１ｍｌ注射器を通して経口投与した後、シスプラチンを投与し、７２時間後、腎臓機能を確認した。クレアチニン（Ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ）を測定するために、マウスの心臓で血液を採取した後、遠心分離機を利用して血清だけを分離した後、生化学分析装備（ＢＳ−３９０、Ｍｉｎｄｒａｙ  Ｂｉｏ−Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．、中国）を利用して測定した。その結果を図５に示した。前記実験結果は、シスプラチンを処理した肝損傷群と他の実験群間のｔ検証を実施してその有意性を検証し、統計学的に有意な差を示した（＃ｐ＜０．０５、＃＃ｐ＜０．００５）。
【００６９】
図５に示したように、マウスにシスプラチンを投与すると腎臓損傷を招いてクレアチニンが増加することを確認することができた。また、シクロヒスチジン−プロリン（ＣＨＰ）を摂取したマウスには、シスプラチンにより増加したクレアチニンが顕著に減少することを確認した。
【００７０】
従って、シクロヒスチジン−プロリン（ＣＨＰ）の血中腎臓機能数値を確認できるクレアチニン（Ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ）の濃度を減少させる優れた効果を示すので、シクロヒスチジン−プロリン（ＣＨＰ）を有効成分として含む薬学的組成物が腎臓細胞を保護する効果に優れるので、腎臓疾患からなる疾病の予防または治療に有用に使用され得ることが分かる。
【００７１】
＜実施例５＞シクロヒスチジン−プロリン（ＣＨＰ）を摂取したマウスでシスプラチンによる腎臓損傷抑制効果測定
【００７２】
＜５−１＞シクロヒスチジン−プロリン（ＣＨＰ）摂取及びシスプラチン投与
【００７３】
シクロヒスチジン−プロリン（ＣＨＰ）によるマウスの腎臓毒性保護効果を測定するために、ＩＣＲマウスをコアテック（株）で購入して一定の条件（温度：２３±３℃、相対湿度：５５±１０％、一周期：１２時間）で飼育した。５匹を一群としてケージで水とえさを自由供給し、実験前に１週間馴化を経て実験に使用した。順応期間が終了した後、３個の群に分けて下記表３のように実験を進行した。
【００７４】
【表３】
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【００７５】
１グループは、水を経口投与して陰性対照群に設定し、２グループは、水を経口投与した後、シスプラチン投与による腎臓損傷対照群に設定し、３グループは、ＣＨＰ１ｍｇ／ｋｇで１週間毎日経口投与した後、シスプラチン投与による腎臓損傷保護効果グループに設定した。
【００７６】
＜５−２＞マウスの腎臓機能保護効果測定
【００７７】
シクロヒスチジン−プロリン（ＣＨＰ）の腎臓機能保護効果を確認するために、まず、シクロヒスチジン−プロリン（ＣＨＰ）を１ｍｇ／ｋｇの濃度で１週間毎日経口投与した後、シスプラチンを投与し、２４時間後、腎臓機能を確認した。ＢＵＮを測定するために、マウスの心臓で血液を採取した後、遠心分離機を利用して血清だけを分離した後、生化学分析装備（ＢＳ−３９０、Ｍｉｎｄｒａｙ  Ｂｉｏ−Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．、中国）を利用して測定した。
【００７８】
その結果、図６に示したように、前記実験結果は、シスプラチン誘導肝損傷群と他の実験群間のｔ検証を実施してその有意性を検証し、統計学的に有意な差を示した（＃ｐ＜０．０５）。
【００７９】
マウスにシスプラチンを投与すると腎臓損傷を招いてＢｕｎが増加することを確認することができた。また、シクロヒスチジン−プロリン（ＣＨＰ）を摂取したマウスには、シスプラチンにより増加したＢｕｎが顕著に減少することを確認した（図６）。
【００８０】
従って、シクロヒスチジン−プロリン（ＣＨＰ）の血中腎臓機能数値を確認できる血液尿素窒素であるＢｕｎの濃度を減少させる優れた効果を示すので、ＣＨＰを有効成分として含む薬学的組成物が腎臓細胞を保護する効果に優れるので、腎臓疾患からなる疾病の予防または治療に有用に使用され得ることが分かる。本発明に係るＣＨＰは、抗がん剤であるシスプラチンによる肝及び腎臓損傷を抑制及び減少させる優れた効果があることを確認することで、抗がん剤により誘発される肝及び腎臓毒性疾患の予防及び治療のための薬学組成物または健康機能食品として有用に利用され得る。
【００８１】
これまで、本発明についてその好ましい実施例を中心に検討した。本発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者は、本発明が本発明の本質的な特性から外れない範囲で変形された形態で具現され得ることを理解できるだろう。それゆえ、開示された実施例は、限定的な観点ではなく説明的な観点から考慮されるべきである。本発明の範囲は、前述した説明ではなく特許請求の範囲に示されており、それと同等な範囲内にある全ての相違点は、本発明に含まれたものと解釈されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年7月13日(2020.7.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
シクロヒスチジン−プロリン（Ｃｙｃｌｏ  Ｈｉｓ−Ｐｒｏ、ＣＨＰ）またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含有し、
細胞死を抑制することで肝細胞の損傷を抑制するために用いられる、薬学的組成物。
【請求項２】
前記肝細胞の損傷は、薬剤により誘発される肝細胞の損傷である、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項３】
前記薬剤は、抗がん剤または抗菌薬のものである、請求項２に記載の薬学的組成物。
【請求項４】
前記抗がん剤は、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、オキサリプラチン（ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）及びネダプラチン（ｎｅｄａｐｌａｔｉｎ）からなる群から選択される一つ以上の白金系抗がん剤のものである、請求項３に記載の薬学的組成物。
【請求項５】
シクロヒスチジン−プロリン（Ｃｙｃｌｏ  Ｈｉｓ−Ｐｒｏ、ＣＨＰ）またはその食品学的に許容される塩を有効成分として含み、細胞死を抑制することによる肝細胞の損傷に対する予防または改善用健康機能食品。
【請求項６】
前記肝細胞の損傷は、抗がん剤または抗菌薬から誘発されるものである、請求項５に記載の健康機能食品。