(57)【要約】【課題】植物におけるアーバスキュラー菌根菌の感染率を増加させ、これらの共生を促進すること、ならびにアーバスキュラー菌根菌のインビトロ培養系において得られる胞子量を増加させる。【解決手段】キチンオリゴ糖および／またはキチンナノファイバーを含む、植物におけるアーバスキュラー菌根菌の感染を促進するための剤、ならびにキチンオリゴ糖および／またはキチンナノファイバーを含む、インビトロ培養にてアーバスキュラー菌根菌の胞子生産量を増加させるための培地および培地添加剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
キチンオリゴ糖および／またはキチンナノファイバーを含む、植物におけるアーバスキュラー菌根菌の感染を促進するための剤。
【請求項２】
キチンオリゴ糖および／またはキチンナノファイバーを含む、植物とアーバスキュラー菌根菌との共生を促進するための剤。
【請求項３】
キチンオリゴ糖および／またはキチンナノファイバーを含む、植物の成長を促進するための剤。
【請求項４】
キチンオリゴ糖および／またはキチンナノファイバーを植物の根に適用することを含む、植物におけるアーバスキュラー菌根菌の感染を促進するための方法。
【請求項５】
キチンオリゴ糖および／またはキチンナノファイバーを植物の根に適用することを含む、植物とアーバスキュラー菌根菌との共生を促進するための方法。
【請求項６】
キチンオリゴ糖および／またはキチンナノファイバーを植物の根に適用することを含む、植物の成長を促進するための方法。
【請求項７】
キチンオリゴ糖および／またはキチンナノファイバーを含む、アーバスキュラー菌根菌のインビトロ培養用の培地。
【請求項８】
アーバスキュラー菌根菌の増殖を促進するための、請求項７記載の培地。
【請求項９】
アーバスキュラー菌根菌の胞子生産量を増加させるための、請求項７記載の培地。
【請求項１０】
キチンオリゴ糖および／またはキチンナノファイバーを含む、アーバスキュラー菌根菌のインビトロ培養用の培地添加剤。
【請求項１１】
アーバスキュラー菌根菌の増殖を促進するための、請求項１０記載の培地添加剤。
【請求項１２】
アーバスキュラー菌根菌の胞子生産量を増加させるための、請求項１０記載の培地添加剤。
【請求項１３】
キチンオリゴ糖および／またはキチンナノファイバーを含む、肥料補助剤または肥料添加剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物と微生物の共生を促進する技術に関する。詳細には、本発明は、植物におけるアーバスキュラー菌根菌の感染および共生を促進するための剤および方法、ならびにアーバスキュラー菌根菌の胞子生産量を増加させるための剤および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
陸上植物の約９割は根において真菌と共生しており、共生により土壌中の必須元素を効率的に利用可能となる。このような植物との共生体は「菌根」、共生菌は「菌根菌」、共生現象は「菌根共生」と呼ばれる。ほとんどの作物が共生するアーバスキュラー菌根（ＡＭ）菌（ＶＡ菌根菌とも呼ばれる）との共生により、植物に土壌中のリンが効率的に供給される。リンは生物にとって必須の元素であるが、菌根共生により、リンが少ない土壌でも植物は生育可能となる。世界的なリン鉱石の枯渇の問題、ならびに日本の土壌はリンの吸着性が強く、植物が吸収できないといった問題から、菌根菌の農業利用が期待されている。しかしながら、アーバスキュラー菌根菌を使用した菌根菌資材（ＶＡ菌根菌資材）は既に市販されているが、価格が高く、品質の安定性や使い勝手の面で必ずしも満足のいくものとはいえないため、地力増進法で定められた唯一の微生物資源であるにもかかわらず、普及があまり進んでいないのが現状である。
【０００３】
これまでに、植物と菌根菌との共生を促進するための方法がいくつか提案されている（例えば特許文献１等参照）が、より効果の大きい方法が望まれている。また、植物との共生の際に、アーバスキュラー菌根菌であるGigaspora margaritaやRhizophagus irregularisからキチンオリゴ糖などの物質が分泌されていることが報告されている（非特許文献１）が、これらの物質は共生成立前の菌由来のシグナル分子（Presymbiotic fungal signal）として考えられており、これらの処理によって共生が促進されることは報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１７−３８５６２号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Bonfante P. and Genre A. Trends Plant Sci. 2015 Mar; 20(3): 150-4.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
植物におけるアーバスキュラー菌根菌の感染および共生を促進すること、ならびにアーバスキュラー菌根菌の胞子生産量を増加させることが、本発明が解決しようとする課題であった。さらに、価格が安く、品質が安定した菌根菌資材を提供することも、本発明が解決しようとする課題であった。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ね、キチンオリゴ糖および／またはキチンナノファイバーを土壌に施用することで、様々な植物におけるアーバスキュラー菌根菌の感染が劇的に改善され、かつ共生による植物の成長促進も更に亢進可能であることを見出した。また、培地へのキチンオリゴ糖および／またはキチンナノファイバーの添加により、インビトロ培養系において得られるアーバスキュラー菌根菌の胞子量を飛躍的に増やすことが可能であることを見出した。本発明者らは、これらの知見に基づいて、本発明を完成させるに至った。
【０００８】
従って、本発明は以下のものを提供する。
（１）キチンオリゴ糖および／またはキチンナノファイバーを含む、植物におけるアーバスキュラー菌根菌の感染を促進するための剤。
（２）キチンオリゴ糖および／またはキチンナノファイバーを含む、植物とアーバスキュラー菌根菌との共生を促進するための剤。
（３）キチンオリゴ糖および／またはキチンナノファイバーを含む、植物の成長を促進するための剤。
（４）キチンオリゴ糖および／またはキチンナノファイバーを植物の根に適用することを含む、植物におけるアーバスキュラー菌根菌の感染を促進するための方法。
（５）キチンオリゴ糖および／またはキチンナノファイバーを植物の根に適用することを含む、植物とアーバスキュラー菌根菌との共生を促進するための方法。
（６）キチンオリゴ糖および／またはキチンナノファイバーを植物の根に適用することを含む、植物の成長を促進するための方法。
（７）キチンオリゴ糖および／またはキチンナノファイバーを含む、アーバスキュラー菌根菌のインビトロ培養用の培地。
（８）アーバスキュラー菌根菌の増殖を促進するための、（７）記載の培地。
（９）アーバスキュラー菌根菌の胞子生産量を増加させるための、（７）記載の培地。
（１０）キチンオリゴ糖および／またはキチンナノファイバーを含む、アーバスキュラー菌根菌のインビトロ培養用の培地添加剤。
（１１）アーバスキュラー菌根菌の増殖を促進するための、（１０）記載の培地添加剤。
（１２）アーバスキュラー菌根菌の胞子生産量を増加させるための、（１０）記載の培地添加剤。
（１３）キチンオリゴ糖および／またはキチンナノファイバーをアーバスキュラー菌根菌のインビトロ培養系に添加することを含む、アーバスキュラー菌根菌の増殖を促進するための方法。
（１４）キチンオリゴ糖および／またはキチンナノファイバーをアーバスキュラー菌根菌のインビトロ培養系に添加することを含む、アーバスキュラー菌根菌の胞子生産量を増加させるための方法。
（１５）キチンオリゴ糖および／またはキチンナノファイバーを含む、肥料補助剤または肥料添加剤。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、様々な植物においてアーバスキュラー菌根菌の感染および共生が大幅に促進されるため、植物の成長も促進される。したがって、農作物の大幅な収量増加が可能となる。これに伴ってリン酸肥料の使用量を減らすこともできる。さらに、本発明によれば、インビトロ培養系において大量のアーバスキュラー菌根菌の菌体および胞子を得ることができるため、安定した品質の菌根菌資材を製造することができる。そのため、菌根菌資材の普及も進むと考えられる。さらに、キチンオリゴ糖やキチンナノファイバーは、大量に廃棄されているカニやエビの甲羅から調製できるため、本発明を低コストで実施することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１の上段は、ミヤコグサの根におけるアーバスキュラー菌根菌の感染を示す写真である（トリパンブルー染色）。図１の下段左図は、ミヤコグサの根におけるアーバスキュール形成率を示すグラフ、下段右図は、ミヤコグサの根における菌糸侵入率を示すグラフである。ＣＯはキチンオリゴ糖を含む培養土を用いたことを示す。ＣＮＦはキチンナノファイバーを含む培養土を用いたことを示す。＊＊＊はＰ＜０．００１であることを示す。エラーバーは標準偏差を示す（ｎ＝６）。
【図２】図２は、アーバスキュラー菌根菌を感染させたミヤコグサの成長評価の結果を示すグラフである。上段左図は地上部長さ、上段右図は根の長さ、下段は新鮮重量を示すグラフである。ＣＯはキチンオリゴ糖を含む培養土を用いたことを示す。ＣＮＦはキチンナノファイバーを含む培養土を用いたことを示す。＊はＰ＜０．０５であることを示す。＊＊はＰ＜０．０１であることを示す。＊＊＊はＰ＜０．００１であることを示す。エラーバーは標準偏差を示す（ｎ＝６）。
【図３】図３は、キチンオリゴ糖、キチンナノファイバーの施用によるミヤコグサにおける共生マーカー遺伝子の発現増強を示すグラフである。＋ＣＯはキチンオリゴ糖を含む培養土を用いたことを示す。＋ＣＮＦはキチンナノファイバーを含む培養土を用いたことを示す。
【図４】図４の上段は、イネの根におけるアーバスキュラー菌根菌の感染を示す写真である（トリパンブルー染色）。図４の下段は感染率を示すグラフである。ＣＯはキチンオリゴ糖を含む培養土を用いたことを示す。ＣＮＦはキチンナノファイバーを含む培養土を用いたことを示す。＊＊はＰ＜０．０１であることを示す。＊＊＊はＰ＜０．００１であることを示す。エラーバーは標準偏差を示す（ｎ＝６）。
【図５】図５は、チャイブの根におけるアーバスキュラー菌根菌の感染率を示すグラフである。ＣＯはキチンオリゴ糖を含む培養土を用いたことを示す。ＣＮＦはキチンナノファイバーを含む培養土を用いたことを示す。
【図６】図６は、ニンジン毛状根を用いたインビトロ培養におけるアーバスキュラー菌根菌の胞子形成に対するキチンオリゴ糖、キチンナノファイバーの促進効果を示すグラフである。ＣＯはキチンオリゴ糖を含む培地を用いたことを示す。ＣＮＦはキチンナノファイバーを含む培地を用いたことを示す。＊＊はＰ＜０．０１であることを示す。エラーバーは標準偏差を示す（ｎ＝６）。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、１の態様において、キチンオリゴ糖および／またはキチンナノファイバーを含む、植物におけるアーバスキュラー菌根菌の感染を促進するための剤を提供する。
【００１２】
本明細書において「キチンオリゴ糖および／またはキチンナノファイバー」という場合、キチンオリゴ糖、キチンナノファイバーのいずれか一方を意味してもよく、これら両方を意味してもよい。
【００１３】
キチンオリゴ糖は公知物質であり、Ｎ−アセチルグルコサミンが２個〜数個程度、例えば２個〜８個つながったオリゴ糖である。キチンオリゴ糖の製法も公知である。キチンオリゴ糖は、例えばカニやエビなどの甲羅から得たキチンを濃塩酸で加水分解し、次いで、加水分解、中和、濾過等の工程行うことによって得てもよい。市販のキチンオリゴ糖を本発明に用いてもよい。
【００１４】
キチンナノファイバーは天然界から、例えばキチン含有生物由来の材料から得ることができる。キチン含有生物としては、エビ、カニなどの甲殻類、昆虫類またはオキアミなどが例示されるが、これらに限定されない。好ましくは、キチン含量の多い生物、例えばエビ、カニなどの甲殻類の殻および外皮からキチンナノファイバーを得てもよい。ただし、生体中のキチンナノファイバーは、その周囲および間隙に存在する蛋白および炭酸カルシウムを含むマトリクスを有しているので、脱マトリクス処理を行わなければ得ることができない。脱マトリクス処理後に解繊処理を行う。上で説明した工程によりナノファイバー化されるキチンは、カニ殻やエビ殻由来のキチンなどのα型の結晶構造を有するキチンであってもよく、イカの甲由来のキチンなどのβ型の結晶構造を有するキチンであってもよい。
【００１５】
本発明において使用されるキチンナノファイバーはいずれの方法・手段にて製造されたものであってもよい。本発明において使用されるキチンナノファイバーの好ましい製造方法としては、例えば国際公開ＷＯ２０１０／０７３７５８の明細書（参照により本明細書にその内容を一体化させる）に記載された方法、あるいは高圧湿式粉砕機、湿式超高圧微粒化装置、ブレンダー、コロイドミル、ビーズミル、ボールミルなどを用いる方法などがある。
【００１６】
本発明において使用されるキチンナノファイバーは修飾または誘導体化されていてもよい。例えば、糖の３位の水酸基、６位の水酸基、または糖鎖の末端の水酸基の水素が、アルキル基などの他の基に置換されていてもよい。あるいはキチンの糖の２位のアセチル基中のメチル基が、エチル基などの他の基に置換されていてもよい。これらの修飾体、誘導体および塩はあくまでも例示であり、限定的なものではない。本明細書では、これらの修飾体、誘導体および塩もキチンナノファイバーに包含されるものとする。このような誘導体および修飾体は当業者に知られており、それらの製造方法も公知である。
【００１７】
本発明において使用されるキチンナノファイバーは、幅（または径）が約２ｎｍ〜約２００ｎｍ、好ましくは約２ｎｍ〜約１００ｎｍ、より好ましくは約２ｎｍ〜約５０ｎｍ、例えば、約５ｎｍ〜約２０ｎｍ、約２ｎｍ〜約２０ｎｍ等である。例えば、「キチンナノファイバーの幅（または径）が約２ｎｍ〜約２０ｎｍ」とは、幅（または径）が約２ｎｍ〜約２０ｎｍであるキチンナノファイバーが全体の約５０％以上、好ましくは約６０％以上、さらに好ましくは約７０％以上を占める状態をいう。
【００１８】
本発明において使用されるキチンナノファイバーのアスペクト比（繊維の長さ/繊維の幅）は約５０以上、好ましくは約１００以上である。例えば、「キチンナノファイバーのアスペクト比が約１００以上」とは、アスペクト比が約１００以上であるキチンナノファイバーが全体の約５０％以上、好ましくは約６０％以上、さらに好ましくは約７０％以上を占める状態をいう。
【００１９】
本発明において使用されるキチンナノファイバーの結晶状態はα型の伸びきり鎖微結晶であることが好ましい。「伸び切り鎖微結晶」とは無数のキチン分子が伸び切った状態で規則的に配列して結晶化した状態のことをいう。
【００２０】
キチンナノファイバーは水に均一に分散可能で、取り扱いが容易である。したがって、キチンナノファイバーは土壌や培地に適用し易く、効果のムラが少ない。
【００２１】
アーバスキュラー菌根菌は、「ＡＭ菌」または「ＶＡ菌根菌」とも呼ばれる内生菌根菌であり、約８０％以上の陸上植物と共生している。アーバスキュラー菌根菌は、グロムス門（phylum Glomeromycota）に属するすべての綱（classes）、目（orders）、科（families）、属（genera）および種（species）を包含する。アーバスキュラー菌根菌は、植物と共生して、土壌中のリンや水などを植物に供給して植物の生育を促進する。
【００２２】
本発明の剤は、いずれの形態であってもよい。本発明の剤は、例えば粉末、顆粒、ペレット、フレーク、ジェル、ペースト、溶液、懸濁液、濃縮液などであってもよい。本発明の剤がキチンナノファイバーを含む場合は、溶液、懸濁液、濃縮液、ジェル、ペーストなどの含水剤形が好ましい。本発明の剤は、アーバスキュラー菌根菌の菌糸および／または胞子を含んでいてもよい。本発明の剤は、肥料成分を含んでいてもよい。本発明の剤は、土壌を含んでいてもよい。本発明の剤は、バーミキュライトなどの公知の担体を用いて製剤化されていてもよい。
【００２３】
本発明の剤の適用方法は、キチンオリゴ糖および／またはキチンナノファイバーが植物の根に到達できればいずれの適用方法であってもよく、市販の資材と同様の適用方法であってもよい。本発明の剤を、公知の手段・方法を用いて土壌と混合してもよく、土壌に噴霧してもよい。本発明の剤を播種時に使用する場合は、本発明の剤を土壌と混合したところに播種してもよい。本発明の剤を苗の仮植え時あるいはポット苗の定植時に使用する場合は、苗の底部に「根部処理」してもよく、「植穴処理」してもよい。
【００２４】
本発明の剤の適用量は使用者が適宜定めうる。一般的には、土壌１リットルあたり約０．０００１ｇ〜約０．０２ｇ、好ましくは約０．００１ｇ〜約０．０２ｇのキチンオリゴ糖またはキチンナノファイバーが適用されるように本発明の剤を適用するが、これらの量に限定されない。本発明の剤の適用量は、上記量に限定されず、植物の種類や栽培方法などに応じて適宜変更されうる。
【００２５】
本発明の剤は、アーバスキュラー菌根菌が共生できるあらゆる植物に適用可能である。具体的には、本発明の剤は、アブラナ科、アカザ科およびカヤツリグサ科の植物以外の植物に適用可能である。本発明の剤が適用される植物は、双子葉植物、単子葉植物、裸子植物、シダ植物およびコケ植物であり得る。また本発明の剤が適用される植物は、草本植物および木本植物であり得る。本発明の剤は、野菜類、豆類、イモ類、果樹類、穀類、シソ科葉菜類、セリ科葉菜類、花卉、観葉植物、樹木、芝などの植物（これらに限定されない）に好適に用いられる。
【００２６】
本発明の剤は、植物におけるアーバスキュラー菌根菌の感染を促進するために使用される。アーバスキュラー菌根菌の感染を促進することによって、植物とアーバスキュラー菌根菌の共生が促進される。したがって、本発明は、さらなる態様において、キチンオリゴ糖および／またはキチンナノファイバーを含む、植物とアーバスキュラー菌根菌との共生を促進するための剤を提供する。上記の剤の適用方法、適用量、適用植物、剤形などについては上で説明したとおりである。
【００２７】
植物とアーバスキュラー菌根菌の共生が促進されると、植物へのリンや水分の供給が円滑となり、植物の成長が促進される。したがって、本発明は、さらなる態様において、キチンオリゴ糖および／またはキチンナノファイバーを含む、植物の成長を促進するための剤を提供する。上記の剤の適用方法、適用量、適用植物、剤形などについては上で説明したとおりである。
【００２８】
上で説明した３つの態様に係る剤は、土壌改良剤や肥料などの他の剤に添加して用いてもよく、これらと併用してもよい。したがって、本発明は、さらなる態様において、キチンオリゴ糖および／またはキチンナノファイバーを含む、肥料補助剤または肥料添加剤を提供する。本発明の肥料補助剤を肥料と併用することによって、あるいは本発明の肥料添加剤を肥料に添加することによって、植物の成長促進などの肥料の効果を高めることができる。
【００２９】
本発明は、もう１つの態様において、キチンオリゴ糖および／またはキチンナノファイバーを植物の根に適用することを含む、植物におけるアーバスキュラー菌根菌の感染を促進するための方法を提供する。
【００３０】
キチンオリゴ糖および／またはキチンナノファイバーを植物の根に適用する手段・方法は公知のものであってよく、特に限定されないが、好ましくは上記の剤として植物の根に適用する。キチンオリゴ糖および／またはキチンナノファイバーを植物の根に適用した場合、根の表面および周囲にキチンオリゴ糖および／またはキチンナノファイバーが存在することとなり、植物の根やその周囲に存在するアーバスキュラー菌根菌の感染が促進される。
【００３１】
アーバスキュラー菌根菌の根への感染が促進されることにより、植物とアーバスキュラー菌根菌との共生が促進されうる。したがって、本発明は、さらなる態様において、キチンオリゴ糖および／またはキチンナノファイバーを植物の根に適用することを含む、植物とアーバスキュラー菌根菌との共生が促進するための方法を提供する。
【００３２】
植物とアーバスキュラー菌根菌の共生が促進されると、植物へのリンや水分の供給が円滑となり、植物の成長が促進される。したがって、本発明は、さらなる態様において、キチンオリゴ糖および／またはキチンナノファイバーを植物の根に適用することを含む、植物の成長を促進するための方法を提供する。
【００３３】
本発明は、さらなる態様において、キチンオリゴ糖および／またはキチンナノファイバーを含む、アーバスキュラー菌根菌のインビトロ培養用の培地を提供する。  
【００３４】
菌根菌のインビトロ培養は、一般的には、滅菌された植物の根とともに培地中で行われる。使用培地は液体培地であってもよく、固体培地（寒天培地など）であってもよい。アーバスキュラー菌根菌のインビトロ培養に用いられる培地は公知であり、例えばＭ培地、ＭＷ培地、改変Ｍ培地やＭＳＲ培地などが挙げられるが、これらに限定されない。植物の根は、アーバスキュラー菌根菌が共生可能な植物の根であればよく、特に限定されない。例えばニンジンの毛状根だけでなく、アマやチコリーなどの毛状根を用いてもよい。
【００３５】
培地中のキチンオリゴ糖またはキチンナノファイバーの培地中の濃度は適宜決定しうる。一般的には、約０．０００１重量％〜約０．０１重量％、好ましくは約０．００１重量％〜約０．０１重量％であるが、これらの量に限定されない。
【００３６】
本発明の培地はいずれの形態であってもよく、液体培地や固体培地（例えば寒天平板培地など）であってもよい。本発明の培地は、成分を濃縮した形態、例えば粉末、顆粒、ペレット、フレーク、ジェル、ペースト、溶液、懸濁液、濃縮液などであってもよいが、これらの形態に限定されない。かかる濃縮形態の培地は、所望の成分濃度となるように使用時に水等の媒体にて希釈される。
【００３７】
本発明の培地を用いることにより、アーバスキュラー菌根菌の増殖が促進され、菌糸が増える。その結果、胞子生産量も増加する。したがって、本発明の培地を、アーバスキュラー菌根菌の増殖が促進するために用いてもよい。また、本発明の培地を、アーバスキュラー菌根菌の胞子生産量を増加させるために用いてもよい。
【００３８】
本発明は、さらなる態様において、キチンオリゴ糖および／またはキチンナノファイバーを含む、アーバスキュラー菌根菌のインビトロ培養用の培地添加剤を提供する。
【００３９】
培地中において所望のキチンオリゴ糖および／またはキチンナノファイバーの濃度となるよう、本発明の培地添加剤を培地に添加する。
【００４０】
本発明の培地添加剤の形態は、例えば粉末、顆粒、ペレット、フレーク、ジェル、ペースト、濃縮液などであってもよいが、これらの形態に限定されない。
【００４１】
本発明の培地添加剤を用いることにより、アーバスキュラー菌根菌の増殖が促進され、菌糸が増える。その結果、胞子生産量も増加する。したがって、本発明の培地添加剤を、アーバスキュラー菌根菌の増殖が促進するために用いてもよい。また、本発明の培地添加剤を、アーバスキュラー菌根菌の胞子生産量を増加させるために用いてもよい。
【００４２】
本発明は、さらにもう１つの態様において、キチンオリゴ糖および／またはキチンナノファイバーをアーバスキュラー菌根菌のインビトロ培養系に添加することを含む、アーバスキュラー菌根菌の増殖を促進するための方法を提供する。
【００４３】
上記方法を用いることにより、アーバスキュラー菌根菌の増殖が促進され、菌糸が増える。その結果、胞子生産量も増加する。したがって、上記方法は、アーバスキュラー菌根菌の胞子生産量を増加させるための方法であってもよい。
【００４４】
上で説明した本発明の剤、培地、培地添加剤、肥料補助剤、肥料添加剤、および方法において、キチンオリゴ糖、キチンナノファイバーに代えて、あるいはそれらに加えて、ナノファイバー化されていないキチン、ナノファイバー化されていないキトサン、キトサンオリゴ糖、キトサンナノファイバー、および／または表面キトサン化キチンナノファイバーを用いてもよい。これらの物質およびその製造方法は公知である。これらの物質は修飾または誘導体化されていてもよい。キトサンナノファイバーの好ましい製造方法としては、国際公開ＷＯ２０１０／０７３７７５８号の明細書に記載された方法が挙げられるが、この方法に限定されない。
【００４５】
以下に実施例を示して本発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、実施例は説明のためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【００４６】
ミヤコグサの根に対するアーバスキュラー菌根菌（ＡＭ菌）の感染、菌糸侵入率およびアーバスキュール形成率に及ぼすキチンオリゴ糖およびキチンナノファイバーの影響について調べた。
【００４７】
１．実験方法
供試植物としてミヤコグサ (Lotus japonicus Gifu B-129系統)を用いた。
供試菌としてRhizophagus irregularis DAOM 197198の胞子液（Premier Tech Biotechnologies）を用いた。
【００４８】
ミヤコグサの培養を以下の手順で行った。
１．サンドペーパーで傷をつけた種子を１％次亜塩素酸ナトリウム水溶液で１５分間表面殺菌し、滅菌水で洗浄してから１晩吸水させた。
２．滅菌水で湿らせた濾紙上に播種し、２４℃に設定された培養器内で３日間の暗期と２日間の明期を経て発芽させた。
【００４９】
ミヤコグサの移植およびＡＭ菌の接種を以下の手順で行った。
１．プラントボックス（plant box）を３段に組み、上段は通気口が空いたフタ、中段は培養土（３００ｍＬの川砂：バーミキュライト＝１：１) 、下段は水の受け皿として用いた。なお、中段のボックス底には穴があり、そこによじったキムワイプを通すことで下段の水が培養土に浸み込むようになっている。
２．１．で組み立てたプラントボックスをオートクレーブ処理（１２１℃、２０分間）  して滅菌した。
３．２５ｍＬのＫＨ２ＰＯ４を２０μＭにしたＢ＆Ｄ液に１％キチンオリゴ糖（焼津水産化学工業・ＮＡ−ＣＯＳ−Ｙ（残基数２−６））または１％キチンナノファイバー水分散液を１．５ｍＬ添加して得られた液を培養土に添加した。コントロールにはキチンオリゴ糖、キチンナノファイバーを添加しなかった。
４．ミヤコグサ実生を１ボックスにつき６個体ずつ移植し、根の周辺にR. irregularisの胞子を４００個接種した。
５．培養土が乾燥するのを防ぐため、下段のボックスに滅菌水を１００ｍＬほど加え、２４℃、１４時間明期に設定した培養室で６週間培養した。
なお、使用したキチンナノファイバーは以下のようにして調製した：
カニ殻由来のキチン粉末(キチンTC-L，甲陽ケミカル（株）)に水を添加して１％（ｗ／ｖ）に調整し，石臼式磨砕機（スーパーマスコロイダー，MKCA6-2，増幸産業（株））を用いて２回処理することで，キチンナノファイバーの水分散液を得た。
【００５０】
ＡＭ菌の菌糸侵入率およびアーバスキュール形成率を以下の手順で測定した。
１．固定液で固定したミヤコグサの根を１ｃｍ断片にして１０％  ＫＯＨ水溶液に浸し、１０５℃、１５分間オートクレーブ処理した。
２．２％  ＨＣｌ水溶液で根を中和した後、０．０５％トリパンブルー（１％トリパンブルー水溶液を乳酸で２０倍希釈）を９０℃、１５分間処理した。
３．染色された根断片をスライドガラスの長辺に並行になるように１０本ずつ並べ、カバーガラスをかけた。
４．接眼レンズに接眼ミクロメーターを取り付けた光学顕微鏡で、根に対して垂直  （Ｙ軸方向）になるようステージを動かし、接眼ミクロメーターの交点と根が接した時に、根内にＡＭ菌の菌糸の有無を調べた。以下に菌糸侵入率の式を示す。
菌糸侵入率％  ＝  （菌糸が確認できた視野数  ／  観察視野数）×１００
なお、アーバスキュール形成率は、分子を「アーバスキュールが確認できた視野数」に置き換えて算出した。
【００５１】
２．実験結果
ミヤコグサの根へのＡＭ菌の感染を示す写真を図１上段に示す。キチンオリゴ糖およびキチンナノファイバーの添加によって、感染が促進されたことがわかる。
【００５２】
アーバスキュール形成率を調べた結果を図１下段左図に示す。キチンオリゴ糖およびキチンナノファイバーの添加によって、アーバスキュール形成率が飛躍的に向上した。コントロールのアーバスキュール形成率が約５％であったのに対して、キチンオリゴ糖、キチンナノファイバーを添加した場合はいずれも９０％を超えていた。
【００５３】
菌糸侵入率を調べた結果を図１下段右図に示す。キチンオリゴ糖およびキチンナノファイバーの添加によって、菌糸侵入率が飛躍的に向上した。コントロールの菌糸侵入率が約５％であったのに対して、キチンオリゴ糖を添加した場合は約９０％、キチンナノファイバーを添加した場合は約８５％となった。
【００５４】
これらの結果から、キチンオリゴ糖およびキチンナノファイバーは、ＡＭ菌の植物への感染を促進し、アーバスキュラー形成率および菌糸侵入率を著しく増加させることがわかった。
【実施例２】
【００５５】
ミヤコグサの成長に及ぼすキチンオリゴ糖およびキチンナノファイバーの影響について調べた。
【００５６】
１．実験方法
供試植物および供試菌は実施例１と同じであった。実験手順も実施例１と同様であった。
１．６週間ＡＭ菌と共培養したミヤコグサ実生をサンプリングし、すぐに新鮮重量を電子天秤で測定した。
２．定規を用いて地上部と根の長さを測定した。
【００５７】
２．実験結果
図２からわかるように、キチンオリゴ糖およびキチンナノファイバーの添加によって、地上部長さ、根の長さ、新鮮重量が増加した。
【００５８】
これらの結果から、キチンオリゴ糖およびキチンナノファイバーは、ＡＭ菌と植物との共生を促進し、植物の成長を促進することがわかった。
【実施例３】
【００５９】
キチンオリゴ糖およびキチンナノファイバーがＡＭ菌と植物の共生を促進することを遺伝子レベルで確認した。
【００６０】
１．実験方法
実験手順を以下に示す。
１．供試植物および供試ＡＭ菌は実施例１と同じであった。水耕液としてリン酸含有量を２０μＭにした１／２ホーグランド（Hoagland）水耕液を用い、キチンオリゴ糖およびキチンナノファイバーの量を２倍とした以外は、実施例１と同様にして植物を培養した。
２． Total RNA Extraction Kit Mini（Plant）(RBC Bioscience)を用い、６週間生育させたミヤコグサの根からＲＮＡを抽出した。
３．ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover(TOYOBO)を用い、１００ｎｇのＲＮＡの逆転写を行うことでｃＤＮＡを合成した。
４．合成したｃＤＮＡを鋳型とし、THUNDERBIRD SYBR qPCR Mixを用いて定量ＰＣＲを行った。定量ＰＣＲはCFX Connect Real-Time System（BIO-RAD）により行った。表１に示す配列のプライマーを用いて各遺伝子の定量ＰＣＲを行った。
【表１】
2020171216.tif 000002
【００６１】
２．実験結果
図３からわかるように、アーバスキュラー菌根共生のマーカー遺伝子であるＰＴ４、ＲＡＭ１およびＳｂｔＭ１の発現量は、キチンオリゴ糖、キチンナノファイバーの添加によって増加した。同様にマーカー遺伝子であるＧＰＡＴおよびＶｐｙ１の発現は、キチンナノファイバーの添加によって増加した。キチンナノファイバー処理によるこれらマーカー遺伝子の発現増加効果はキチンオリゴ糖を上回っていた。
【００６２】
これらの結果から、キチンオリゴ糖およびキチンナノファイバーがＡＭ菌と植物の共生を促進することを、遺伝子発現の側面からも確認することができた。
【実施例４】
【００６３】
イネの根に対するＡＭ菌の感染率に及ぼすキチンオリゴ糖およびキチンナノファイバーの影響について調べた。
【００６４】
１．実験方法
供試植物としてイネ (Oryza sativa cv. Nipponbare)を用いた。
供試菌としてR. irregularis DAOM 197198を用いた。
【００６５】
イネの培養を以下の手順で行った。
１．１％次亜塩素酸ナトリウム水溶液で１５分間表面殺菌した種子を２８℃、暗所で３日間培養して発芽させた。
２．発芽させた種子を実施例１と同様に移植、ＡＭ菌の接種をした。処理液も実施例１の実験と同じものを使用した。
３．高照度（４００００ｌｕｘ）、２８℃に設定されたグロースチャンバー内で６週間培養した。
【００６６】
ＡＭ菌の感染率を以下の手順で測定した。
１．実施例１と同様に、サンプリングした根をトリパンブルー染色した。
２．５  ｍｍのマス目をひいたシャーレに染色した根断片を均一に広げた。
３．シャーレ上の線と根が交わった箇所を観察し、根内に侵入した菌糸の有無を調べた。以下に感染率の計算式を示す。
感染率％  ＝  （菌糸が確認できた交点  ／  総交点数）×１００
【００６７】
２．実験結果
図４に示すように、キチンオリゴ糖およびキチンナノファイバーの添加によって、イネの根に対してもＡＭ菌の感染が促進された。感染率は、コントロールが約７％であったのに対し、キチンオリゴ糖を添加すると約２５％に、キチンナノファイバーを添加すると約２０％に増加した。
【００６８】
これらの結果から、キチンオリゴ糖およびキチンナノファイバーは、ミヤコグサ以外の植物へのＡＭ菌の感染を促進することがわかった。
【実施例５】
【００６９】
チャイブの根に対する菌根菌資材中のＡＭ菌の感染率に及ぼすキチンオリゴ糖およびキチンナノファイバーの影響について調べた。
【００７０】
１．実験方法
供試植物としてチャイブ（Allium schoenoprasum）（サカタのタネ）を用いた。
供試ＡＭ菌として菌根菌資材Ｄｒキンコン（出光興産）を用いた。
液肥としてピータース２５−５−２０（粉２ｇ／Ｌ）（ハイポネックスジャパン）を用いた。
【００７１】
実験手順を以下に示す。
１．無菌播種した種子を、２４℃  暗黒下で５日間、続いて照明下（明期１４時間／暗期１０時間）で２日間培養した。
２．滅菌済みの土（ベストミックス３号）と、培養土と同量の以下の処理液、および５０ｇ／土１Ｌ量の菌根菌資材をよく混合し、底に穴を開けた５０ｍＬチューブに入れた。表２に示す組成の液を培養に用いた。
【表２】
2020171216.tif 000003
３．無菌播種して育てた植物を１チューブ当たり１個体植え替えたあと、２４℃、明期１４時間、暗期１０時間で６週間培養した。この間、適宜水やりと、週に１度２００μＬ／植物分のピータース施肥を行った。
４．６週間生育させたチャイブの根を、処理区ごとに５０ｍＬチューブに入れたＦＡＡ固定液に２４時間以上浸漬した。（５０ｍＬチューブは培養に用いたものとは別のチューブ）
５．固定したチャイブの根にトリパンブルー染色を行い、根内の菌根菌を可視化した。
６．実施例４と同様にして感染率を求めた。
【００７２】
２．実験結果
図５からわかるように、キチンオリゴ糖およびキチンナノファイバーはいずれもチャイブの根へのＡＭ菌の感染率を増加させた。コントロールの感染率が約７％であったのに対し、キチンオリゴ糖添加系では約１７％、キチンナノファイバー添加系では約１３％となっていた。
【００７３】
キチンオリゴ糖およびキチンナノファイバーは、ミヤコグサおよびイネの場合と同様に、チャイブへの感染率を増加させることがわかった。これらの結果から、キチンオリゴ糖およびキチンナノファイバーは、幅広い植物種へのＡＭ菌の感染を促進することがわかった。また、キチンオリゴ糖およびキチンナノファイバーは、既存の菌根菌資材を用いた場合にもＡＭ菌の感染率を増加させることがわかった。
【実施例６】
【００７４】
ＡＭ菌のインビトロ培養における胞子形成に及ぼすキチンオリゴ糖およびキチンナノファイバーの影響について調べた。
【００７５】
１．実験方法
供試植物としてニンジン毛状根 (Daucus carota)を用いた。
供試菌としてR. irregularis DAOM 197198を用いた。
【００７６】
毛状根へのＡＭ菌の接種を以下の手順で行った。
１．Ｍ培地で２８℃、暗所で２週間培養した毛状根の傍に、R. irregularisの胞子を５０個接種した。
２．さらに１ヶ月同じ条件で培養した後、培地上に菌糸が十分に蔓延したものから、ＡＭ菌が感染した毛状根を選んだ。
３．一方にキチンオリゴ糖、キチンナノファイバーをそれぞれ０．０１％添加したＭ培地（２５ｍＬ）、もう一方にキチンやショ糖を含まないＭ培地（８ｍＬ）を加えた２分割シャーレを用意した。なお、Ｍ培地（−ショ糖）でシャーレ中央の仕切り板を覆った。
４．２．で選んだ毛状根を培地ごとメスで切り取り、Ｍ培地（＋ショ糖、キチンオリゴ糖／キチンナノファイバー）に置いた。
５．２８℃、暗所で、Ｍ培地（−ショ糖）が下になるよう２分割シャーレを立て、約６〜８週間、菌糸がＭ培地（−ショ糖）で蔓延するまで培養した。
【００７７】
胞子数の測定を以下の手順で行った。
１．Ｍ培地（−ショ糖）側の適当な位置に、１ｃｍ２の正方形を描き、実体顕微鏡下でその範囲内の胞子数をカウントした。
２．１．で得られた値に、Ｍ培地（−ショ糖）の面積を乗じることで、１枚のシャーレで形成された胞子の数を算出した。
【００７８】
２．実験結果
図６に示すように、コントロール（キチンオリゴ糖／キチンナノファイバー不含）での胞子数がプレートあたり約２０００個であったのに対し、キチンオリゴ糖添加系ではプレートあたり約６０００個、キチンナノファイバー添加系ではプレートあたり約１００００個であった。キチンオリゴ糖またはキチンナノファイバーの添加により、菌体の増殖が促進され、その結果、胞子数も増加したものと考えられた。
【００７９】
これらの結果から、キチンオリゴ糖またはキチンナノファイバーを添加した培地を用いてＡＭ菌を培養することにより、胞子数が大幅に増加することが示された。
【産業上の利用可能性】
【００８０】
本発明は、農業、林業、緑化事業、農薬、農業資材、生物学の分野などにおいて利用可能である。
【配列表フリーテキスト】
【００８１】
配列番号：１は、ＲＴ−ｑＰＣＲ法によるＵＢＱ１０遺伝子の発現解析に用いたForward primerの塩基配列を示す。
配列番号：２は、ＲＴ−ｑＰＣＲ法によるＵＢＱ１０遺伝子の発現解析に用いたReverse primerの塩基配列を示す。
配列番号：３は、ＲＴ−ｑＰＣＲ法によるＰＴ４遺伝子の発現解析に用いたForward primerの塩基配列を示す。
配列番号：４は、ＲＴ−ｑＰＣＲ法によるＰＴ４遺伝子の発現解析に用いたReverse primerの塩基配列を示す。
配列番号：５は、ＲＴ−ｑＰＣＲ法によるＲＡＭ１遺伝子の発現解析に用いたForward primerの塩基配列を示す。
配列番号：６は、ＲＴ−ｑＰＣＲ法によるＲＡＭ１遺伝子の発現解析に用いたReverse primerの塩基配列を示す。
配列番号：７は、ＲＴ−ｑＰＣＲ法によるＳｂｔＭ１遺伝子の発現解析に用いたForward primerの塩基配列を示す。
配列番号：８は、ＲＴ−ｑＰＣＲ法によるＳｂｔＭ１遺伝子の発現解析に用いたReverse primerの塩基配列を示す。
配列番号：９は、ＲＴ−ｑＰＣＲ法によるＧＰＡＴ遺伝子の発現解析に用いたForward primerの塩基配列を示す。
配列番号：１０は、ＲＴ−ｑＰＣＲ法によるＧＰＡＴ遺伝子の発現解析に用いたReverse primerの塩基配列を示す。
配列番号：１１は、ＲＴ−ｑＰＣＲ法によるＶｐｙ１遺伝子の発現解析に用いたForward primerの塩基配列を示す。
配列番号：１２は、ＲＴ−ｑＰＣＲ法によるＶｐｙ１遺伝子の発現解析に用いたReverse primerの塩基配列を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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