(57)【要約】      （修正有）【課題】ポックスウイルスに基づく薬剤を製造するために好適な細胞および細胞株の提供。治療薬または予防薬の製造のためのポックスウイルスを増殖させるための方法の提供。【解決手段】改変細胞株が、非改変細胞ではほとんど増殖できない、または増殖不能であるポックスウイルスの増殖を保持するよう、プロモーターの制御下にＣＰ７７をコードする配列を含んでなるように細胞のゲノムが改変された、改変哺乳動物細胞。また、ＣＨＯ細胞では増殖しないオルソポックスウイルスを増殖させるための方法であって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで哺乳動物細胞株においてポックスウイルスを増殖させることを含んでなり、前記細胞株がプロモーターの制御下にＣＰ７７をコードおよび発現するように改変されている、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
改変された哺乳動物細胞であって、この改変細胞株が、非改変細胞ではほとんど増殖できないかまたは増殖不能であるポックスウイルスの増殖を保持するよう、プロモーターの制御下にあるＣＰ７７をコードする配列を含んでなるように細胞のゲノムが改変された、細胞。
【請求項２】
細胞のゲノムがプロモーターの制御下にあるＤ１３Ｌをコードする配列をさらに含んでなる、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
細胞のゲノムがプロモーターの制御下にあるＫ１Ｌをコードする配列をさらに含んでなる、請求項１または２に記載の細胞。
【請求項４】
細胞が連続細胞株である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項５】
細胞がＣＨＯ細胞である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項６】
細胞がヒト細胞、霊長類細胞、ハムスター細胞またはウサギ細胞である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項７】
ＣＰ７７遺伝子の発現が哺乳動物プロモーターの制御下にある、請求項１〜６のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項８】
Ｄ１３Ｌ遺伝子の発現が哺乳動物プロモーターの制御下にある、請求項２〜７のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項９】
Ｋ１Ｌ遺伝子の発現が哺乳動物プロモーターの制御下にある、請求項３〜８のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１０】
ＣＰ７７遺伝子の発現が、許容細胞株で見られるものと同等のウイルス収量を生成するようにウイルスの増殖を維持する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１１】
ＣＰ７７遺伝子の発現が、５００を超えるウイルス複製増幅比を維持する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１２】
ＣＰ７７が、哺乳動物細胞での発現のためにコドンが最適化された連続ヌクレオチド配列によりコードされている、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１３】
ＣＨＯ細胞では増殖しないオルソポックスウイルスを増殖させるための方法であって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで哺乳動物細胞株においてポックスウイルスを増殖させることを含んでなり、前記細胞株がプロモーターの制御下にＣＰ７７をコードおよび発現するように改変されている、方法。
【請求項１４】
前記改変細胞株が、プロモーターの制御下にＤ１３Ｌをコードおよび発現するように改変されている、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記改変細胞株が、プロモーターの制御下にＫ１Ｌをコードおよび発現するように改変されている、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記改変細胞株がヒト細胞、霊長類細胞株、ハムスター細胞株またはウサギ細胞株である、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞株がＣＨＯ細胞株である、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の参照】
【０００１】
本出願は２０１３年１１月１日出願のオーストラリア特許出願第２０１３９０４２４２号および２０１４年２月７日出願のオーストラリア特許出願第２０１４９００３７０号に関連し、これらの出願からの優先権を主張するものであり、これらの各出願の全内容は引用することにより本明細書の一部とされる。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、ポックスウイルスを増殖させるため、従って、ポックスウイルスに基づく薬剤を製造するために好適な細胞および細胞株の開発に関する。特に、本明細書は、治療薬または予防薬の製造のためのこのようなポックスウイルスを増殖させるための組換え改変細胞基質に関する。
【背景技術】
【０００３】
本明細書中の参照文献の書誌詳細は本明細書の末尾に一覧化されている。
【０００４】
本明細書におけるいずれの事前掲載（またはそれに由来する情報）、または既知のいずれの事項に対する言及も、その事前掲載（またはそれに由来する情報）または既知事項は本明細書が関連する努力傾注分野での共通の一般知識の一部を成すことの承認または容認または何らかの形態の示唆と見なされず、また、見なされるべきでない。
【０００５】
本明細書に記載の総ての刊行物は、引用することによりそれらの全内容が本明細書の一部とされる。
【０００６】
ポックスウイルス科は、コードポックスウイルス亜科(Chordopoxvirinae)およびエントモポックスウイルス亜科(Entomopoxvirinae)の２つ亜科を含んでなる。コードポックスウイルス亜科は、ヒトに感染する種（例えば、痘瘡の病原体である天然痘ウイルス、牛痘ウイルス（１７９６年にＪｅｎｎｅｒによって報告された原痘瘡ワクチンを形成した）、ワクシニアウイルス（第二世代痘瘡ワクチンとして使用）およびサル痘ウイルス）を含んでなるオルソポックスウイルス科(Orthopoxviridae)ならびに鳥類に感染する鶏痘ウイルスおよびカナリア痘ウイルスなどの種を含んでなるアビポックスウイルス科(Avipoxviridae)ウイルスをはじめとする８属を含んでなる。痘瘡ワクチンにおける抗原としてのそれらの使用に加え、組換えワクシニアに基づくウイルスおよびアビポックスウイルスの「骨格」ベクターとしての使用においても多大な関心が寄せられている。細胞質内ベクター、オルソポックスウイルス科は、とりわけ、宿主細胞質および抗原プロセシング経路（細胞表面に提示するために抗原を処理してペプチドとする）に外来抗原を送達することができる。外来抗原を発現するこのようなベクターは、他のワクチン接種戦略によっては治療が難しいことが分かっているＡＩＤＳ、結核、マラリアおよび癌などの疾患のためのワクチンの開発に使用される。
【０００７】
コードポックスウイルス亜科は、パラポックスウイルスの１３０ｋｂからアビポックスウイルスの３００ｋｂを超えるまでのサイズ範囲の線状二本鎖ＤＮＡゲノムを有し、宿主内でのそれらの生活環は完全に宿主細胞の細胞質内で費やされる。ポックスウイルスは、特に初期ｍＲＮＡ合成に関与するプロセスについては、それらの宿主細胞および宿主細胞分子とは実質的に独立に機能する。しかしながら、宿主分子は中期の開始時または終了時および後期のウイルス転写には使用されると思われる。ポックスウイルスは、ウイルス複製を可能とする細胞条件を許容する宿主シグナル伝達経路を特異的に標的として操作する構造的に多様な「宿主域因子」を産生する。ほとんどのポックスウイルスは哺乳動物細胞に結合して感染することができるが、続いての感染が許容される（感染性ビリオンを産生できる）か許容されない（感染性ビリオンを実質的に産生できない）かは、関与する特定のポックスウイルスおよび特定の細胞種に依存する。現在のところ、ポックスウイルス−宿主相互作用の分子レベルでの理解、特に、宿主域遺伝子、およびウイルスと細胞の両方の増殖を助長するための関係を変調するためにはどの因子が必要かについての理解は比較的低い。宿主域遺伝子については、引用することによりその全内容が本明細書の一部とされるWerden et al. 2008を参照することができる。
【０００８】
天然痘ワクチンとしての、続いてウイルスベクターとしてのそれらの使用に関連するワクシニア株に関する所見は、１９６０年代の初めから今日まで報告されている。天然痘ワクチンとして使用される株を含むある種のワクシニア株はヒト細胞で増殖可能であるので、  ウイルス性脳炎の発症などの健康リスクを呈する。より安全なワクチンを開発する目的で、アンカラ由来のワクシニア株（「ＣＶＡ」と呼ばれる）が非ヒト細胞で５００回を超えて継代された。この過程でワクシニアゲノムは実質的に変化し、元のＣＶＡゲノムに比べて少なくとも６つの主要な欠失の発生を含んだ。改変されたウイルスはヒトにおける病原性が低いが、防御免疫応答をなお生成することができる。この弱毒ワクシニアウイルスはＭＶＡ（改変ワクシニアアンカラ）と呼ばれ、継代数が異なるウイルスは遺伝的および表現型的に異なることが見出されているので、継代数によっても分類される。しかしながら、継代数５１５回までＭＶＡ５１５は遺伝的に安定であると理解された。１９９０年代の初めに、ＭＶＡ５７２、およびその誘導体ＭＶＡ  Ｆ６などのＭＶＡ株は非許容細胞（ウイルスが増殖しない）において高レベルでワクシニアタンパク質および異種（組換え）タンパク質を発現することができ、ワクチンまたは治療送達のための抗原をコードするものなどの目的異種分子用のベクターとしてのＭＶＡの開発を可能とすることが認められた。
【０００９】
より最近では、ＣＶＡにＭＶＡの６つの大きな既知の欠失を導入することによりＭＶＡの品質を備えた改変ワクシニアウイルスを生産する試みがなされた。興味深いことに、これはＭＶＡの弱毒品質を備えたウイルスをもたらさなかった。宿主域遺伝子の不在が見られた弱毒化の一因であり得ると提案されたが、これは実証されていない（例えば、Meyer et al., Journal of General Virology (1991) 72:1031-1038参照）。
【００１０】
ポックスウイルスは大きな線状ｄｓＤＮＡゲノム、増殖の場が細胞質であること、および複雑なビリオン形態を特徴とするウイルスの大きな科からなる。ワクシニアウイルスは、このウイルス群の代表的ウイルスであり、ウイルスの形態形成に関して最も研究されている。ワクシニアウイルスビリオンは、「側体」により挟み込まれた有壁の両凹コアを特徴とする複雑な内部構造を有する「煉瓦状」または「卵形」の膜結合粒子の様相を呈する。ビリオンアセンブリ経路は、未成熟ビリオン（ＩＶ）に発達する半月体を含有する膜の形成とその後の成熟ビリオン（ＭＶ）への発達を含む。ワクシニアウイルスビリオン内には７０を超える特異的遺伝子産物が含まれ、現今で、ワクシニアウイルスアセンブリに対する５０を超える特異的遺伝子の突然変異の影響が記載されている。
【００１１】
ワクシニアウイルスは、その表面膜と宿主細胞の原形質膜との融合、コア（および側体）の細胞質への放出、およびウイルス転写プログラムの活性化によって細胞に侵入する。
ビリオンコアは、初期ｍＲＮＡの合成および修飾に必要なウイルスコード酵素の完全な相補物を含む。初期遺伝子はＤＮＡ増幅に必要な酵素をコードし、従って、初期遺伝子発現がピークに達した際に、「工場」と呼ばれる細胞質部位でウイルスＤＮＡの増幅が続いて起こる。初期遺伝子はまた、中期転写因子、および中期遺伝子もコードし、さらに後期転写因子をコードし、これにより中期遺伝子と後期遺伝子は、ウイルスＤＮＡ増幅の必須の開始の後に連続して発現される。よって、ウイルス遺伝子の完全相補物は一時的カスケードで転写され、この初期、中期および後期クラスはクラス特異的転写プロモーターおよびウイルスによりコードされる転写因子により区別される。さらに、増幅されたゲノムだけが中期および後期転写の適格鋳型となる。これらの２つのクラスの遺伝子はともに、ビリオン構造タンパク質、ビリオン酵素、およびアセンブリ因子をコードし、新たな後代ウイルス粒子のアセンブリに必要とされる。
【００１２】
ウイルス取り込みおよび初期発現の後間もなく、濃度が均一で、経時的に大きくなる小胞体（ＥＲ）由来嚢により取り囲まれることがある細胞内に感染特異的細胞質ドメインが生じる。これらのドメインはウイルスＤＮＡ増幅の場となり、「ウイルス工場」と呼ばれることが多い。
【００１３】
ウイルスアセンブリは、ウイルス工場内での強固な半月型構造（三次元では杯)）の形成で始まる。高解像度電子顕微鏡写真では、これらの半月型構造の外層は、「スピキュラ(spicules)」と呼ばれる一定間隔の突起から構成される。半月体は、未成熟ビリオン（ＩＶ）と呼ばれる閉じた円（三次元では球体）となるまで、同じ曲率を維持しつつ見掛け上長くなる。ＩＶは、濃度は均一ながら周囲の工場より目に見えて電子密度が高い物質である「ウイロプラズム(viroplasm)」で充填されている。ＩＶが生じると、キャプシド封入ＤＮＡの取り込みも起こり、これらは顕微鏡写真で「核様体(nucleoid)」と呼ばれるＩＶ内の電子密度の高い円形または卵形のサブドメインとして見られる。濃ＤＮＡの核様体を含むＩＶは「ＩＶＮ」と呼ばれることが多い。ＩＶＮから成熟ビリオン（ＭＶ）への形態形成には、タンパク質分解切断による数種のビリオンタンパク質前駆体の成熟が必要とされる。成熟ビリオンの大多数は工場の外部に見られ、工場の周縁部に、または最も近い工場からかなりの距離をおいて見かけ上分離して、クラスター状で存在し得る。
【００１４】
ポックスウイルスビリオンは、成熟ビリオン（ＭＶ）、ラップビリオン(wrapped virions)（ＷＶ）、および細胞外ビリオン（ＥＶ）の３つの感染性形態で存在する。ウイルスの最も単純な形態であるＭＶは、コアの陥凹部を満たす側体により挟み込まれた、両凹のＤＮＡ含有コアを含む膜状の粒子である。ＭＶは通常、もっぱら細胞内部に見られ、細胞溶解によってはじめて遊離する。ＷＶは、トランスゴルジ槽に由来する２つの付加的な脂質二重層に取り囲まれたＭＶからなる。ＷＶは、その外膜が特徴的なウイルスタンパク質を含み、ＥＶの前駆体であり、これもまた細胞内に見られる。ＥＶは、最外ＷＶ膜と原形質膜の融合によりエキソサイトーシスを受けたＷＶからなり、ＭＶは１層の付加的な膜に包まれたままとなる。ＥＶの一部は細胞表面と結合しているのが見られ、一部は細胞外媒体中に遊離しているのが見られる。ＥＶは、生物体内でのウイルスの拡散に重要であると思われる。
【００１５】
ウイルス由来の必須遺伝子の除去および宿主細胞における補足は、処置および療法のために安全かつ効果的なウイルスベクターを作出するために一般的な提案戦略として当技術分野で知られている。高い安全性、発現および／または免疫原性を有する改良された弱毒オルソポックスベクターが必要であり、ならびに、これに見合ったそのようなオルソポックスベクターを安全かつ経済的に複製および製造する方法が必要である。
【００１６】
いくつかの哺乳動物細胞株が研究目的の組換えタンパク質の製造に使用される。これらには、ウサギ、ハムスター、霊長類およびヒト由来細胞株、例えば、限定されるものではないが、当技術分野で公知のように、ＨＥＫ２９３、２９３Ｔ、１４３Ｂ、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＶｅｒｏおよびＢＨＫ、ＨｅｐＧ２、および３Ｔ３細胞が挙げられる。しかしながら、特に、大多数の組換え治療用タンパク質のＧＭＰ生産はＣＨＯ細胞で製造されてきたので、この細胞株が最もよく研究され、ヒト治療薬として承認された細胞株となっている。ＣＨＯ細胞は懸濁培養として極めて高密度で増殖させることができ、生成物を精製するための下流プロセスが十分に開発されている。関連することとして、ワクシニア−ＣＯＰまたはワクシニア−ＷＲまたはその誘導体、例えば、ＭＶＡおよびＮＹＶＡＣなどのワクシニアにはＣＨＯ細胞で増殖するものはない。
【００１７】
ローカルウイルスプロモーターの制御下でのポックスウイルス内からのウイルス宿主域遺伝子の発現およびポックスウイルスＲＮＡポリメラーゼは当技術分野で公知である。
【００１８】
ウイルス複製をレスキューまたは許容し、宿主細胞の生存を許容するための適時様式での哺乳動物細胞のゲノムからのある特定のウイルス宿主域遺伝子の発現はこれまでに記載されたことはない。
【発明の概要】
【００１９】
本明細書は、ポックスウイルス宿主域因子を発現するように形質転換されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養哺乳動物細胞およびそのような細胞を培養することを含んでなるウイルスベクターを増殖させるための方法を記載する。
【００２０】
第１の態様において、本発明は、改変細胞株が非改変細胞ではほとんど増殖できない、または増殖不能であるポックスウイルスの増殖を保持するよう、プロモーターの制御下にＣＰ７７をコードする配列を含んでなるように細胞のゲノムが改変された、改変哺乳動物細胞を提供する。
【００２１】
第２の態様において、本発明は、ＣＨＯ細胞では増殖しないオルソポックスウイルスを増殖させるための方法であって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで哺乳動物細胞株においてポックスウイルスを増殖させることを含んでなり、前記細胞株がプロモーターの制御下にＣＰ７７をコードおよび発現するように改変されている方法を提供する。
【００２２】
種々の別の実施態様では、改変細胞は、プロモーターの制御下にＤ１３Ｌをコードする配列を含んでなるように、かつ／またはプロモーターの制御下にＫ１Ｌをコードする配列を含んでなるようにさらに改変される。
【００２３】
本明細書で「ＣＰ７７」、「Ｋ１Ｌ」および「Ｄ１３Ｌ」という場合には、機能的オーソログおよび機能的変異体を含む。
【発明の具体的説明】
【００２４】
本発明は、特定の手順または薬剤、薬剤の特定の処方物および種々の医学的方法論に限定されず、従って、異なってもよい。本明細書で使用される用語は特定の実施態様を記載するためのものに過ぎず、限定を意図しない。そうではないことが定義されない限り、本明細書で使用される総ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の熟練者により共通に理解されているものと同じ意味を有する。
【００２５】
本明細書に記載のものと類似または同等の材料および方法はいずれも本発明を実施または試験するために使用可能である。実務者は特にSambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, Cold Spring Harbor Press, Plainsview, N.Y.; Ausubel et al. (1999) Current Protocols in Molecular Biology (Supplement 47), John Wiley & Sons, New York; Murphy et al. (1995) Virus Taxonomy Springer Verlag:79-87, Mahy Brian WJ and Kangro O Hillar (編): Virology Methods Manual 1996, Academic Press; and Davison AJ and Elliott RM (編): Molecular Virology, A practical Approach 1993, IRL Press at Oxford University Press; Perkus et al., Virology (1990) 179(1):276-86、または当技術分野の定義および用語ならびに当業者に公知の他の方法に従う。
【００２６】
本明細書に記載のものと類似または同等の方法および材料が本発明の実施または試験に使用可能であるが、好ましい方法および材料を記載する。本発明の目的で、以下の用語は下記のように定義される。
【００２７】
本明細書を通じて、文脈がそうではないことを必要としない限り、用語「含んでなる("comprise," "comprises" and "comprising")」は、記載の工程もしくは要素または工程群もしくは要素群の包含を意味するが、他の任意の工程もしくは要素または工程群もしくは要素群の排除を意味しないと理解される。このように、用語「含んでなる」などの使用は、挙げられている要素が必要または必須であるが、他の要素は任意選択であり、存在してもしなくてもよいことを示す。弱毒オルソポックスベクターに関しては、対象ベクターは、必須成熟またはアセンブリ遺伝子の欠失を含んでなることによって弱毒のために改変されているが、抗原または他のタンパク質を運ぶためなどのさらなる改変が包含される。
【００２８】
「からなる」とは、限定されるものではないが、「からなる」という句の後に来るものを含むことを意味する。よって、「からなる」という句は、挙げられている要素が必要または必須であり、他の要素は存在しなくてよいことを示す。「から本質的になる」とは、この句の後に挙げられ、かつ、挙げられている要素に関して本開示で明示された活性または作用に干渉しないまたは寄与しない他の要素に限定されるいずれの要素も含むことを意味する。よって、「から本質的になる」という句は、挙げられている要素が必要または必須であるが、他の要素は任意選択であり、挙げられている要素の活性または作用も影響を及ぼすかどうかに応じて存在してもしなくてもよいことを示す。
【００２９】
本明細書で使用する場合、単数形「１つの(a)」、「１つの(an)」および「その(the)」は、文脈がそうではないことを明示しない限り、複数の態様も含む。よって、例えば、「１つの細胞(a cell)」という場合には、単細胞ならびに２以上の細胞を含む、「１個体の生物(a organism)」は、１個体の生物体ならびに２個体以上の生物を含むなどである。いくつかの実施態様では、「１つの(an)」は「１または１以上」を意味する。
【００３０】
本明細書で使用する場合、「および／または」は、挙げられている１以上の関連用語のいずれかおよびすべてのあり得る組合せ、ならびに択一（または）で解釈される場合には組合せの欠如を意味し、包含する。
【００３１】
「弱毒」または「弱毒された」とは、本明細書で使用する場合、ウイルスベクターの毒力の軽減を意味する。毒力は、特定の宿主で疾患を引き起こすウイルスの能力と定義される。感染性ウイルスを産生できないポックスウイルスベクターはまず細胞に感染し得るが、宿主内でそれ自体完全に複製もしくは増殖すること、または病態を引き起こすことが実質的にできない。これは、ベクターがそのタンパク質または核酸を宿主細胞の細胞質に送達するが対象に害を与えないので望ましい。
【００３２】
「制御エレメント」または「制御配列」とは、特定のポックスウイルス、ベクター、プラスミドまたは細胞内における、機能的に連結されたコード配列の発現に必要な核酸配列（例えばＤＮＡ）を意味する。真核細胞に好適な制御配列としては、転写制御配列、例えば、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、転写エンハンサー、翻訳制御配列（例えば、翻訳エンハンサーおよび内部リボソーム結合部位（ＩＲＥＳ））、ｍＲＮＡの安定性を調整する核酸配列、ならびに転写されたポリヌクレオチドによりコードされた生成物を細胞内の、ある細胞内コンパートメント、または細胞外環境に標的化する標的化配列が挙げられる。
【００３３】
配列が示されている場合には、相当する配列が包含される。「相当する("corresponds to" "corresponding"または"corresponding to")」とは、参照核酸配列と実質的配列同一性（例えば、参照核酸配列の全部もしくは一部との少なくとも約５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、９７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％もしくはさらには最大１００％の配列同一性）を示す核酸配列、または参照アミノ酸配列と実質的配列類似性もしくは同一性（例えば、参照アミノ酸配列の全部もしくは一部との少なくとも５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、９７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％もしくはさらには最大１００％の配列類似性もしくは同一性）を示すアミノ酸配列を意味する。
【００３４】
ある病態の治療もしくは予防に関する、または標的抗原または生物に対する免疫応答の調整のための「有効量」とは、そのような治療もしくは予防を必要とする個体への、単回用量または一連の処置の一部として、その病態の症状を受けることの予防、そのような症状の抑制、および／または既存の症状の治療のため、あるいは標的抗原または生物に対する免疫応答の調整のための量の薬剤（例えば、本明細書に記載の弱毒オルソポックスベクター）またはそれを含んでなる組成物の投与を意味する。有効量は処置される個体の健康および身体状態、処置される個体の分類群、組成物の処方、医学的状況の評価、および他の関連因子によって異なる。その量は通常の試験によって決定できる比較的広い範囲に入ると予想される。
【００３５】
本明細書で使用する場合、用語「コードする("encode," "encoding" and the like)」は、核酸の、別の核酸またはポリペプチドを提供する能力を意味する。例えば、核酸配列は、  それが転写および／もしくは翻訳されてポリペプチドを生成できれば、またはそれが転写および／もしくは翻訳されてポリペプチドを生成できる形態にプロセシングされ得るならば、そのポリペプチドを「コードする」と言われる。このような核酸配列は、コード配列またはコード配列と非コード配列の双方を含み得る。よって、用語「コードする("encode," "encoding" and the like)」は、ＤＮＡ分子の転写から生じるＲＮＡ産物、ＲＮＡ分子の翻訳から生じるタンパク質、ＤＮＡ分子の転写によるＲＮＡ産物の形成およびその後のＲＮＡ産物の翻訳から生じるタンパク質、またはＤＮＡ分子の転写によるＲＮＡ産物の提供、そのＲＮＡ産物のプロセシングによるプロセシングＲＮＡ産物（例えばｍＲＮＡ）の提供、およびその後のそのプロセシングＲＮＡ産物の翻訳により生じるタンパク質を含む。
【００３６】
用語「内因性」とは、宿主生物に通常見られる遺伝子または核酸配列またはセグメントを意味する。
【００３７】
用語「発現可能な」、「発現された」およびその変形形態は、細胞の、ヌクレオチド配列をＲＮＡに転写し、場合によりそのｍＲＮＡを翻訳して、生物学的または生化学的機能を提供するペプチドまたはポリペプチドを合成する能力を意味する。
【００３８】
本明細書で使用する場合、用語「遺伝子」は、場合によりこのプロセスを助けるためのエレメントの付加を伴って、ｍＲＮＡの生成のために使用され得る核酸分子を含む。遺伝子は、機能的タンパク質を生成するために使用可能であってもなくてもよい。遺伝子は、コード領域と非コード領域（例えば、イントロン、調節エレメント、プロモーター、エンハンサー、終止配列および５’および３’非翻訳領域）の両方を含み得る。
【００３９】
用語「異種核酸配列」、「異種ヌクレオチド配列」、「異種ポリヌクレオチド」、「外来ポリヌクレオチド」、「外因性ポリヌクレオチド」などは、実験操作により生物のゲノムに導入され、その導入遺伝子が改変前ウイルスゲノム配列に対して何らかの改変（例えば、少なくとも１つのヌクレオチドの点突然変異、欠失、置換または付加、エンドヌクレアーゼ切断部位の存在、ｌｏｘＰ部位の存在など）を含む限り、その生物体に見られる遺伝子配列を含み得る任意の核酸（例えば、ＩＲＥＳを含んでなるヌクレオチド配列）を意味して互換的に使用される。
【００４０】
用語「異種ポリペプチド」、「外来ポリペプチド」および「外因性ポリペプチド」は、上記に定義されたような「異種核酸配列」、「異種ヌクレオチド配列」、「異種ポリヌクレオチド」、「外来ポリヌクレオチド」および「外因性ポリヌクレオチド」によりコードされる任意のペプチドまたはポリペプチドを意味して互換的に使用される。
【００４１】
用語「哺乳動物細胞」は、本発明の弱毒オルソポックスベクターを含むベクターがポックスウイルスベクターを増殖させる目的で導入され得る細胞を意味する。一つの実施態様では、細胞は連続細胞株である。改変細胞は連続的に分裂可能な細胞株であることはそれほど重要でない。哺乳動物細胞または高等真核細胞は、本発明に従って改変され、その後、形質転換または不死化されて連続的に分裂する細胞株となり得る。しかしながら、修飾前の細胞は、好都合には、十分に特性決定された、当技術分野で公知の連続的に分裂するバイオテクノロジー適合性連続細胞株である。このような細胞は好都合には、American Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）またはEuropean Collection of Cell Cultures（ＥＣＡＣＣ）などの寄託機関から入手可能である。
【００４２】
好適な哺乳動物細胞株としては、限定されるものではないが、ＲＫ１８、ＢＨＫ、ＶＥＲＯ、ＨＢＯＣ−１４３Ｂ、ＨａＣａｔ、ＨｅｐＧ２、ＨｅＬａ、ＨＴ１０８０、ＨＥＫ−２９３、ＲＤ、ＣＯＳ−７、ＣＨＯ、Ｊｕｒｋａｔ、ＨＵＴ、ＳＵＰＴ、Ｃ８１６６、ＭＯＬＴ４／クローン８、ＭＴ−２、ＭＴ−４、Ｈ９、ＰＭ１、ＣＥＭ、骨髄腫細胞（例えば、ＳＢ２０細胞）およびＣＥＭＸ１７４が例えばＡＴＣＣから入手可能である。
【００４３】
異種遺伝子を発現する改変細胞株を産生するための当技術分野で認知されているいずれのゲノム操作法も使用可能である。ｐｉｇｇｙＢａｃベクターを使用することにより遺伝子を細胞ゲノムに挿入するためのトランスポゾン技術の使用が挙げられる。しかしながら、遺伝子を細胞に導入するためには、限定されるものではないが、レトロウイルス形質導入（例えば、ＭｏＭＬＶなど）、レンチウイルス形質導入、プラスミドトランスフェクションおよび組み込み、アデノウイルス、ＡＡＶ（アデノウイルス随伴ウイルス）、ＥＢＶなどの、細胞株を形質転換させるための他のウイルス系、および線状ＤＮＡを用いた相同組換えによる部位特異的挿入のためのゲノム編集技術、操作済みメガヌクレアーゼ(meganucelases)、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬ−ヌクレアーゼ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）およびＣＲＩＳＰＲを含む多くの方法が認識されている。
【００４４】
一つの実施態様では、哺乳動物細胞はＣＨＯ細胞である。従来技術のＣＨＯ細胞株は、ウイルス宿主名遺伝子をコードせず、ヒトで実質的に増殖できないワクシニアまたはワクシニア誘導体の生産を支持することはない。当業者に知られているように、ハムスター(Cricetulus griseus)の卵巣に由来するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、抗体を含む組換えタンパク質治療薬のバイオ産業的ＧＭＰ製造に最も慣用されている哺乳動物細胞である。このためのＣＨＯ細胞の普及は、一つには、それらの速い増殖と高いタンパク質生産から来ている。結果として、ＣＨＯ細胞株はよく特性決定がなされている。好適なＣＨＯ細胞株としては、限定されるものではないが、Ａ２、Ａ２Ｈ、ＸｒＳ６、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ／ｄｈｆｒ、ＲＲ−ＣＨＯ−Ｋ１、ＵＴ−Ｉ、Ｐ２２、ＣＨＯ−１Ｃ６、Ｌｅｃ１、Ｌｅｃ２、Ｌｅｃ８、Ｐｒｏ−５およびＣＤＫＸＢ１株が挙げられる。ＡＴＣＣに受託番号ＡＴＣＣ  ＣＬＬ−６１またはＡＴＣＣ  ＣＲＬ−９６１８として寄託されたＣＨＯ−Ｋ１細胞株が頻用される。ＣＨＯ−Ｋ１細胞株は、Ｐｕｃｋ  Ｔ．（１９５７）により成体チャイニーズハムスターの卵巣生検から誘導した親ＣＨＯ細胞株に由来するサブクローンとして誘導されたものである。本明細書は、改変ＣＨＯ細胞以外の改変細胞を記載する。
【００４５】
いくつかの実施態様では、哺乳動物細胞は、ヒト細胞、霊長類細胞、ハムスター細胞またはウサギ細胞である。
【００４６】
細胞は単細胞であってもよいし、または液体培養または単層などとして組織培養で増殖させることができる。宿主細胞はまた、組織から直接的もしくは間接的に誘導されてもよく、または動物を含む生物体内に存在してもよい。
【００４７】
本明細書で企図されるような免疫応答の「誘発」は、免疫応答の惹起もしくは刺激および／または既存の免疫応答の増強を含むと理解される。
【００４８】
本明細書で使用する場合、用語「内部リボゾームエントリー部位」または「ＩＲＥＳ」は、内部リボゾームエントリー部位の下流（すなわち３’側）に位置する機能的に連結されたコード領域の翻訳を提供するために、同じｍＲＮＡ内のコード領域に対して内部の部位で、またはｍＲＮＡの５’末端の３’部位でｍＲＮＡの翻訳の開始を可能とするウイルス、細胞、または合成（例えば、組換え）ヌクレオチド配列を意味する。これにより、翻訳は５’キャップ構造に非依存的となり、かつ、ｍＲＮＡの５’末端に非依存的となる。
ＩＲＥＳ配列は、機能的に連結されたコード領域の翻訳の開始に必要な必須のシス作用配列を提供する。
【００４９】
本明細書で使用する場合、用語「単離された」は、化合物が本来見られる環境とは異なる環境にある対象とする細胞、化合物（例えば、組換えポックスウイルス、ゲノム、ポリペプチドなどの核酸分子）を表すものとする。「単離された」とは、対象化合物が実質的に富化されているサンプル内にある、および／または対象化合物が部分的もしくは実質的に精製されている化合物を含むものとする。
【００５０】
用語「機能的に接続された」または「機能的に連結された」とは、本明細書で使用する場合、そのように記載された成分が、それらをそれらの意図される様式で機能することを可能とする関係にある並列を意味する。例えば、コード配列と「機能的に連結された」転写制御配列は、転写制御配列と適合する条件下でコード配列の発現を可能とするための、コード配列に対する転写制御配列の配置および／または配向を意味する。別の例では、オルソポックスウイルスコード配列と機能的に接続されたＩＲＥＳは、オルソポックスウイルスコード配列のキャップ非依存的翻訳を可能とするための、オルソポックスウイルスコード配列に対するＩＲＥＳの配置および／または配向を意味する。
【００５１】
本明細書で使用される場合、用語「オープンリーディングフレーム」および「ＯＲＦ」は、本明細書では、コード配列の翻訳開始コドンと翻訳終止コドンの間にコードされるアミノ酸配列を意味して互換的に使用される。用語「開始コドン」（例えば、ＡＴＧ）および「終止コドン」（例えば、ＴＧＡ、ＴＡＡ、ＴＡＧ）は、タンパク質合成（ｍＲＮＡの翻訳）のそれぞれ開始および鎖終止を明示するコード配列内の３つの隣接するヌクレオチドの単位（「コドン」）を意味する。
【００５２】
本明細書で使用する場合、用語「親ウイルス」は、異種核酸配列を組み込んで本発明の組換えウイルスを形成するように改変されたウイルスをいうものと理解される。
【００５３】
用語「ポリヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」、「ヌクレオチド配列」，「核酸」または「核酸配列」は本明細書で使用する場合、ｍＲＮＡ、ＲＮＡ、ｃＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはＤＮＡを表す。この用語は一般に、少なくとも１０塩基長の、リボヌクレオチドもしくはデオキシヌクレオチドまたはいずれかのタイプのヌクレオチドの改変形態のヌクレオチドのポリマー形態を意味する。この用語はＲＮＡまたはＤＮＡの一本鎖形態および二本鎖形態を含む。
【００５４】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、「タンパク質」および「タンパク質分子」は、アミノ酸残基のポリマーを含んでなるまたはからなる分子、ならびにその変異体および合成類似体を意味して、本明細書では互換的に使用される。よって、これらの用語は、１以上のアミノ酸残基が合成非天然アミノ酸、例えば、対応する天然アミノ酸の化学類似体であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然アミノ酸ポリマーに当てはまる。
【００５５】
本明細書で使用する場合、用語「組換え」は、「核酸分子」、「ポリヌクレオチド」などに当てはまる場合、本明細書に記載の宿主細胞または無細胞系で転写および／または翻訳され得る人工核酸構造（すなわち、非複製ｃＤＮＡまたはＲＮＡ；またはレプリコン、自己複製ｃＤＮＡまたはＲＮＡ）を意味すると理解される。組換え核酸分子またはポリヌクレオチドは、ベクターに挿入してもよい。プラスミド発現ベクターまたはウイルスベクターなどの非ウイルスベクターが使用可能である。ベクターの種類および本発明による核酸構築物の挿入の技術は当業者に公知である。本発明による核酸分子またはポリヌクレオチドは、本発明により記載される配置では天然に存在しない。言い換えれば、異種ヌクレオチド配列は、親ウイルスゲノムのエレメント（例えば、プロモーター、ＯＲＦ、ポリアデニル化シグナル、リボザイム）と天然には組み合わされていない。
【００５６】
本明細書で使用する場合、用語「組換えウイルス」は、少なくとも１つの異種核酸配列を含んでなる「親ウイルス」をいうと理解される。
【００５７】
用語「配列同一性」は、本明細書で使用する場合、配列が比較ウインドウにおいてヌクレオチドとヌクレオチドベースまたはアミノ酸とアミノ酸ベースで同一である程度を意味する。よって、「配列同一性のパーセンテージ」は、２つの最適にアラインされた配列を比較ウインドウにおいて比較すること、両配列において同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｉ）または同一のアミノ酸残基（例えば、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、ＣｙｓおよびＭｅｔ）が見られる位置の数を決定してマッチする位置の数を求めること、マッチする位置の数をその比較ウインドウの位置の総数（すなわち、ウインドウサイズ）で割ること、およびその商に１００を掛けて配列同一性パーセンテージを得ることにより計算される。本発明の目的では、「配列同一性」は、ＤＮＡＳＩＳコンピュータープログラム（ウインドウズ用バージョン２．５；日立ソフトウエアエンジニアリングＣｏ．，Ｌｔｄ．、サウスサンフランシスコ、カリフォルニア州、ＵＳＡ）により、そのソフトウエアに添付されている参照マニュアルで使用されている標準デフォルトを用いて計算された「マッチパーセンテージ」を意味すると理解される。
【００５８】
用語「シグナル配列」または「シグナルペプチド」は、サイトゾルから例えば、核、ミトコンドリアマトリックス、および小胞体などの特定のオルガネラへタンパク質の同時翻訳輸送または翻訳後輸送を指示する短い（約３〜約６０アミノ酸長の）ペプチドを意味する。ＥＲ標的化シグナルペプチドを有するタンパク質の場合、シグナルペプチドは一般に、タンパク質がＥＲに輸送された後にシグナルペプチダーゼによりその前駆形態から切断され、生じたタンパク質は二次経路に沿ってそれらの細胞内（例えば、ゴルジ体、細胞膜または細胞壁）または細胞外の場所へ移行する。「ＥＲ標的化シグナルペプチド」は、本明細書で使用する場合、通常、タンパク質の一部または全部がＥＲ膜からＥＲの内腔へ挿入された後に酵素的に除去されるアミノ末端疎水性配列を含む。よって、配列のシグナル前駆形態はタンパク質の前駆形態の一部として存在し得るが、一般にそのタンパク質の成熟形態には存在しないことは当技術分野で公知である。
【００５９】
「類似性」は、同一であるかまたは以下の表Ａに定義される保存的置換を構成するアミノ酸数のパーセンテージを意味する。類似性は、ＧＡＰ(Deveraux et al. 1984, Nucleic Acids Research12: 387-395)などの配列比較プログラムを用いて決定することができる。  このように、本明細書に挙げられているものと類似のまたは実質的に異なる長さの配列は、アラインメントにギャップを挿入することによって比較可能であり、このようなギャップは、例えば、ＧＡＰにより使用されている比較アルゴリズムにより決定される。
【００６０】
【表１】
2020039340.tif 000002
【００６１】
比較ウインドウをアラインするための配列の最適アラインメントは、アルゴリズムのコンピューター化実行（Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, WI, USAのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）によるか、または目視と選択された種々の方法のいずれかによって作成された最良のアラインメント（すなわち、比較ウインドウにおいて最高の相同性パーセンテージをもたらす）によって行うことができる。また、例えば、Altschul et al., 1997, Nucl. Acids Res.25:3389により開示されているＢＬＡＳＴ系列のプログラムも挙げられる。配列解析の詳細な考察は、Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons Inc, 1994-1998, Chapter 15のユニット１９．３に見出すことができる。
【００６２】
本明細書で互換的に使用される用語「対象」、「患者」、「宿主」または「個体」は、治療または予防が望まれる任意の対象、特に、脊椎動物対象、いっそうより詳しくは、哺乳動物対象を意味する。本発明の範囲内に入る好適な脊椎動物としては、限定されるものではないが、霊長類（例えば、ヒト、サルおよび類人猿、マカク属(Macaca)（例えば、カニクイザル(Macaca fascicularis)、および／またはアカゲザル(Macaca mulatta)などのマカクザル）に由来するものなどのサルの種を含む）およびヒヒ(Papio ursinus)、ならびにマーモセット（マーモセット属(Callithrix)由来の種）、リスザル（リスザル属(Saimiri)由来の種）、およびタマリン（タマリン属（Saguinus）由来の種）、ならびにチンパンジー(Pan troglodytes)などの類人猿種、齧歯類（例えば、マウス、ラット、モルモット）、ウサギ類（例えば、ウサギ、ノウサギ）、ウシ類（例えば、ウシ）、ヒツジ類（例えば、ヒツジ）、ヤギ類（例えば、ヤギ）、ブタ類（例えば、ブタ）、ウマ類（例えば、ウマ）、イヌ類（例えば、イヌ）、ネコ類（例えば、ネコ）、鳥類（例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガン、カナリア、セキセイインコなどの伴侶鳥類）、海洋哺乳動物（例えば、イルカ、クジラ）、爬虫類（ヘビ、カエル、トカゲなど）、および魚類を含む脊索動物亜門のいずれのメンバーも含む。好ましい対象は、病態の治療または予防を必要とするヒトである。しかしながら、前述の用語は症状が存在することを含意し
ないと理解される。
【００６３】
用語「導入遺伝子」は、本明細書では、宿主生物のゲノムに人為的に導入されたまたは導入しようとする、その宿主の後代の伝達される遺伝物質を表して使用される。いくつかの実施態様では、導入遺伝子はそれが導入される哺乳動物細胞もしくはオルソポックスベクターに所望の特性を付与するか、またはそうでなければ、所望の治療転帰または診断転帰につながる。
【００６４】
本明細書で使用する場合、用語「処置("treatment", "treating", and the like)」は、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることを意味する。この効果は、疾患もしくはその症状を完全にもしくは部分的に予防するという点で予防的であってよく、かつ／または疾患および／もしくはその疾患に帰すことができる有害な影響を部分的もしくは完全に治癒するという点で治療的であってもよい。「処置」は、本明細書で使用する場合、哺乳動物、特にヒトにおける疾患のいずれの処置も包含し、（ａ）その疾患の素因を持ち得る対象においてその疾患が起こらないように予防すること；（ｂ）疾患を抑制し、すなわち、その発症を阻止すること；および（ｃ）疾患を軽減する、すなわち、その疾患を退縮させることを含む。
【００６５】
生物、ポリペプチド、または核酸配列に関して用語「野生型」、「天然(natural)」、「天然(native)」などは、その生物、ポリペプチド、または核酸配列が天然に存在する、または変化していない、突然変異を受けていない、もしくはそうでなければヒトにより操作されてない少なくとも１つの天然に存在する生物において入手可能であることを意味する。
【００６６】
変異体は、中または高ストリンジェンシーの条件下で選択的ハイブリダイゼーションが達成され得る、または参照ポックスウイルス宿主域因子を定義するヌクレオチド配列と少なくとも約１５ヌクレオチドを含んでなる比較ウインドウにおいて約６０％〜９０％または９０〜９８％の配列同一性を有するように、参照分子またはその全体もしくは一部にわたるそれらの相補形態に十分に類似する核酸分子を含む。好ましくは、ハイブリダイゼーション領域は約１２〜約１８核酸塩基以上の長さである。好ましくは、特定のヌクレオチド配列と参照配列の間の同一性パーセントは、少なくとも約８０％、または８５％、またはより好ましくは約９０％またはそれを超える類似性、例えば、約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える類似性である。８０％〜１００％の間の同一性パーセントは包含される。ヌクレオチド配列の長さはその提案される機能によって異なる。
同族体も包含される。用語「ホモログ（単数）」、「相同遺伝子」または「ホモログ（複数）」は、他種由来のものも含め、機能的および構造的に関連のある分子を広く意味する。ホモログ種およびオーソログは変異体の例である。
【００６７】
核酸配列同一性は以下のように決定することができる。対象核酸配列は、プログラムＢＬＡＳＴＭバージョン２．１（Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Research 25:3389-3402に基づく）を用い、ＧｅｎＢａｎｋデータベース（ウェブサイトhttp://www.ncbi.nln.nih.gov/blast/でアクセス可能）などの核酸配列データベースを検索するために使用される。このプログラムはギャップを含まないモードで使用する。低複雑性の領域による配列ホモロジーを除去するためにデフォルトフィルタリングを使用する。ＢＬＡＳＴＭのデフォルトパラメーターを使用する。
【００６８】
アミノ酸配列同一性は以下のように決定することができる。対象ポリペプチド配列は、ＢＬＡＳＴＰプログラムを用い、ＧｅｎＢａｎｋデータベース（ウェブサイトhttp://www.ncbi.nln.nih.gov/blast/でアクセス可能）などのポリペプチド配列データベースを検索するために使用される。このプログラムはギャップを含まないモードで使用する。低複雑性の領域による配列ホモロジーを除去するためにデフォルトフィルタリングを使用する。
ＢＬＡＳＴＰのデフォルトパラメーターを使用する。低複雑性配列のフィルタリングにはＳＥＧプログラムを使用できる。
【００６９】
好ましい配列は、参照配列またはその相補配列とストリンジェント条件下でハイブリダイズする。用語「ストリンジェント条件下でハイブリダイズする」、およびその文法的等価表現は、定義された温度および塩濃度条件下で標的核酸分子（サザンブロットまたはノーザンブロットなどのＤＮＡまたはＲＮＡブロット上に固定化されている標的核酸分子など）とハイブリダイズする核酸分子の能力を意味する。約１００塩基長を超える核酸分子では、典型的なストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、天然二重鎖の融点（Ｔｍ）よりも２５℃〜３０℃以内で（例えば、１０℃）低い条件である（一般には、Sambrook et al., (前掲); Ausubel et al., (1999)参照）。約１００塩基より大きい核酸分子のＴｍは、式Ｔｍ＝８１．５＋０．４１％（Ｇ＋Ｃ−ｌｏｇ（Ｎａ＋））によって計算することができる。１００塩基未満の長さの核酸分子では、例示的なストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、Ｔｍより５℃〜１０℃低い。
【００７０】
本明細書において用語「欠失」は、標的遺伝子のコード領域の総てまたは一部の除去を意味する。この用語はまた、標的遺伝子の遺伝子発現を除去する、またはコードされているタンパク質のレベルまたは活性を除去もしくは実質的にダウンレギュレートする突然変異または形質転換のいずれの形態も包含する。
【００７１】
「遺伝子」という場合には、遺伝子のエキソンまたはオープンリーディングフレームに相当するＤＮＡを含む。本明細書で「遺伝子」という場合にはまた、転写および／または翻訳調節配列および／またはコード領域および／または非翻訳配列（すなわち、イントロン、５’−および３’−非翻訳配列）；または遺伝子のコード領域（すなわち、エキソン）ならびに５’−および３’−非翻訳配列に相当するｍＲＮＡもしくはｃＤＮＡからなる古典的ゲノム遺伝子を含むものとする。
【００７２】
「調節エレメント」または「調節配列」とは、特定の宿主細胞において機能的に連結されたコード配列の発現に必要な核酸配列（例えば、ＤＮＡ）を意味する。例えば原核細胞に好適な調節配列としては、プロモーター、場合により、オペレーター配列およびリボソーム結合部位などのシス作用配列が挙げられる。真核細胞に好適な制御配列としては、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、転写エンハンサー、翻訳エンハンサー、ｍＲＮＡの安定性を調整するリーダー配列またはトレーリング配列、ならびに転写されたポリヌクレオチドによりコードされている産物を細胞内部の細胞内コンパートメントまたは細胞外環境に標的化する標的化配列が挙げられる。
【００７３】
本改変哺乳動物細胞を達成するために好適なキメラ構築物は、調節配列に機能的に連結された、オルソポックス宿主域因子をコードする配列核酸を含んでなる。調節配列は好適には、細胞内での発現に適合する転写および／または翻訳制御配列を含んでなる。一般に、転写および翻訳調節制御配列としては、限定されるものではないが、プロモーター配列、５’非コード領域、シス調節領域、例えば、転写調節タンパク質または翻訳調節タンパク質のための機能的結合部位、上流オープンリーディングフレーム、リボゾーム結合配列、転写開始部位、翻訳開始部位、および／またはリーダー配列、終止コドン、翻訳終止部位および３’非翻訳領域をコードするヌクレオチド配列が挙げられる。当技術分野で公知の構成的プロモーターまたは誘導プロモーターが企図される。これらのプロモーターは、天然プロモーター、または２つ以上のプロモーターのエレメントを組み合わせたハイブリッドプロモーターであり得る。
【００７４】
企図されるプロモーター配列は、哺乳動物細胞にとって天然のものであっても、またはその領域が選択された生物において機能的である限り、別の供給源に由来するものであってもよい。プロモーターの選択は、意図される宿主細胞によって異なる。例えば、哺乳動物細胞での発現に使用可能なプロモーターとしては、カドミウムなどの重金属に応答して誘導され得るメタロチオネインプロモーター、β−アクチンプロモーター、ならびにとりわけＳＶ４０ラージＴ抗原プロモーター、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期（ＩＥ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲプロモーター、マウス乳癌ウイルスＬＴＲプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ  ＭＬＰ）、単純ヘルペスウイルスプロモーター、およびＨＰＶプロモーター、特に、ＨＰＶ上流調節領域（ＵＲＲ）などのウイルスプロモーターが挙げられる。これらのプロモーターは総て、当技術分野で十分に記載され、容易に入手可能である。
【００７５】
エンハンサーエレメントもまた、哺乳動物構築物の発現レベルを高めるために本明細書で使用可能である。例としては、Dijkema et al. (1985) EMBO J. 4:761に記載されているＳＶ４０初期遺伝子エンハンサー、例えばGorman et al., (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:6777に記載されているラウス肉腫ウイルスの長い末端反復配列（ＬＴＲ）由来のエンハンサー／プロモーター、および例えばBoshart et al. (1985) Cell 41:521に記載されているヒトＣＭＶ由来のエレメント、例えば、ＣＭＶイントロンＡ配列に含まれるエレメントが挙げられる。
【００７６】
キメラ構築物はまた３’非翻訳配列も含んでなり得る。３’非翻訳配列は、ポリアデニル化シグナルおよびｍＲＮＡプロセシングまたは遺伝子発現を果たし得る他の任意の調節シグナルを含むＤＮＡセグメントを含んでなる遺伝子の部分を意味する。ポリアデニル化シグナルは、ｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデニル酸トラクトの付加を果たすことを特徴とする。ポリアデニル化シグナルは、カノニカル型５’ＡＡＴＡＡＡ−３’との相同性によって一般に認識されるが、変形形態もめずらしくない。３’非翻訳調節ＤＮＡ配列は好ましくは約５０〜１，０００ｎｔを含み、ポリアデニル化シグナルに加えて転写および翻訳終止配列、ならびにｍＲＮＡプロセシングまたは遺伝子発現を果たし得る他の任意の調節シグナルも含んでよい。
【００７７】
いくつかの実施態様では、キメラ構築物は、構築物を含有する細胞の選択を可能とするための選択マーカー遺伝子をさらに含む。選択遺伝子は当技術分野で周知であり、対象細胞での発現に適合される。
【００７８】
一つの実施態様では、オルソポックス構造またはアセンブリ遺伝子の発現はプロモーターの制御下にある。１つの非限定的実施態様では、プロモーターは、宿主細胞に対して有意な毒性作用が存在せずにウイルス増殖を維持するように十分なレベルのＣＰ７７の発現を指示する細胞構成的プロモーター、例えば、ヒトＥＦ１α（ヒト延長因子１α遺伝子プロモーター）、ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子プロモーター）またはＰＧＫ（ホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子プロモーター）である。プロモーターはまた誘導性、例えば、細胞誘導プロモーターであってもよい。ＭＴＨ（メタロチオネイン遺伝子由来）ウイルスプロモーターもまた、ＣＭＶ、ＲＳＶ、ＳＶ−４０、およびＭｏＵ３などの哺乳動物細胞で使用される。
【００７９】
第１の態様において、本発明は、改変細胞株が非改変細胞ではほとんど増殖できない、または増殖不能であるポックスウイルスの増殖を保持するよう、プロモーターの制御下にＣＰ７７をコードする配列を含んでなるように細胞のゲノムが改変された、改変哺乳動物細胞を提供する。
【００８０】
第２の態様において、本発明は、ＣＨＯ細胞では増殖しないオルソポックスウイルスを増殖させるための方法であって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで哺乳動物細胞株においてポックスウイルスを増殖させることを含んでなり、前記細胞株がプロモーターの制御下にＣＰ７７をコードおよび発現するように改変されている方法を提供する。
【００８１】
一つの実施態様において、細胞のゲノムは、プロモーターの制御下にＤ１３Ｌをコードする配列をさらに含んでなり、かつ／またはプロモーターの制御下にＫ１Ｌをコードする配列をさらに含んでなる。
【００８２】
別の実施態様では、細胞は連続細胞株、好ましくはＣＨＯ細胞である。
【００８３】
他の実施態様では、細胞は、ヒト細胞、霊長類細胞、ハムスター細胞またはウサギ細胞であり得る。
【００８４】
別の実施態様では、ＣＰ７７遺伝子、Ｄ１３Ｌ遺伝子および／またはＫ１Ｌ遺伝子は哺乳動物プロモーターの制御下にある。
【００８５】
別の実施態様では、ＣＰ７７遺伝子の発現は、許容細胞株で見られるものと同等のウイルス収量を生じるようにウイルスの増殖を支持し、好ましくは、５００を超えるウイルス複製増幅比を支持する。
【００８６】
別の実施態様では、ＣＰ７７、Ｄ１３Ｌおよび／またはＫ１Ｌは、哺乳動物細胞での発現のためにコドンが最適化された連続ヌクレオチド配列によりコードされる。
【００８７】
例としてＫ１Ｌ配列を配列番号６および配列番号７に示す。
【００８８】
本明細書は、改変（組換えまたは形質転換）細胞および培養高等真核生物宿主細胞におけるウイルスベクターのｉｎ  ｖｉｔｒｏ生産のための方法に広く関連し、ここで、この細胞はｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて細胞内でまたは細胞集団を介してウイルスベクターの増幅を促進または助長するような方法で遺伝的に改変される。１つの非限定的実施態様において、本明細書は、改変チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞におけるワクシニアに基づくポックスウイルスの増殖を提供する。
【００８９】
当業者に知られているように、ハムスター(Cricetulus griseus)の卵巣に由来するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、抗体を含む組換えタンパク質治療薬のバイオ産業的ＧＭＰ製造に最も慣用されている哺乳動物細胞である。このためのＣＨＯ細胞の普及は、一つには、それらの速い増殖と高いタンパク質生産から来ている。結果として、ＣＨＯ細胞株はよく特性決定がなされている。好適なＣＨＯ細胞株としては、限定されるものではないが、Ａ２、Ａ２Ｈ、ＸｒＳ６、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ／ｄｈｆｒ、ＲＲ−ＣＨＯ−Ｋ１、ＵＴ−Ｉ、Ｐ２２、ＣＨＯ−１Ｃ６、Ｌｅｃ１、Ｌｅｃ２、Ｌｅｃ８、Ｐｒｏ−５およびＣＤＫＸＢ１株が挙げられる。ＡＴＣＣに受託番号ＡＴＣＣ  ＣＬＬ−６１またはＡＴＣＣ  ＣＲＬ−９６１８として寄託されたＣＨＯ−Ｋ１細胞株が頻用される。ＣＨＯ−Ｋ１細胞株は、Ｐｕｃｋ  Ｔ．（１９５７）により成体チャイニーズハムスターの卵巣生検から誘導した親ＣＨＯ細胞株に由来するサブクローンとして誘導されたものである。本明細書は、改変ＣＨＯ細胞以外の改変細胞を記載する。
【００９０】
産生されるウイルスの収量を最大にするために、ＣＨＯ細胞などの細胞株を、標準的技術を用いて懸濁培養に適合させることができる。組換えまたは改変細胞という場合にはその後代を含む。細胞は凍結または液体懸濁液の形態を含め、いずれの形態で販売してもよい。ポックスウイルスベクターに感染させた細胞を販売してもよい。
【００９１】
本明細書でＣＰ７７という場合には、Sphener et al. (1988)およびHsiao et al. (2006)に示されている牛痘宿主域遺伝子、ならびに本明細書で判定された通りに、哺乳動物宿主細胞のゲノム内で異種遺伝子として発現させた場合にポックスウイルスの増殖を支持することができるその機能的オーソログおよび改変形態を意味する。「改変形態」という場合には、野生型または参照配列に由来する変形形態（例えば、欠失、置換または付加）を含む。参照ヌクレオチド配列は配列番号１に示される。改変形態はコード領域または少なくとも２００の連続する塩基対を含んでなるその１以上の部分にわたって少なくとも８０％の配列同一性を共有する。改変形態は、ＣＨＯ細胞を含め、哺乳動物または他の高等真核細胞での発現のために最適化された、本明細書に記載のコドン最適化形態を含む。ＣＰ７７とう場合には、オーソログ、すなわち、他種に存在するまたは異なる名称で識別される、同じ機能を有する遺伝子を含む。牛痘宿主域因子ＣＰ７７はまた、ＶＨＲ１、ＣＨＯｈｒ、およびＣＰＸＶ０２５とも呼ばれる。ワクシニアのウエスタンリザーブ（ＷＲ）株のＣＨＯｈｒ／ＣＰ７７遺伝子は実質的に断片化され、機能的因子を産生できない。ＣＰ７７はＭＶＡおよびコペンハーゲン株には存在しない。
【００９２】
本明細書で「ＣＰ７７」、「Ｄ１３Ｌ」および「Ｋ１Ｌ」という場合には、機能的オーソログおよび機能的変異体を含む。「機能的」とは、培養細胞の哺乳動物ゲノムから発現中の細胞質内でポックスウイルスの増殖を支持するように指示された本明細書に記載の発現（すなわち、転写および翻訳）の質を意味する。用語「増殖」は、細胞内増殖および細胞間増殖を含み、成熟ウイルス粒子の生産を包含する。
【００９３】
一つの実施態様では、改変細胞の集団は、非改変対照細胞ではほとんど増殖できない、または増殖不能であるポックスウイルスの増殖を維持する。増殖不能とは、細胞から細胞へのまたは対象から対象への伝搬が一般に起こらないことを意味する。
【００９４】
「非改変対照細胞」と言う場合には、ＣＰ７７、Ｋ１ＬおよびＳＰＩ−１からなる群から選択される少なくとも１つのウイルス宿主域因子をコードし、プロモーター、ならびに当技術分野で公知の他の好適な制御細胞の制御下でそのゲノムからそれを発現するような改変の前に存在する場合の改変細胞を含む。
【００９５】
例えば、ＭＶＡおよびワクシニアなどのポックスウイルスはＣＨＯ細胞で増殖することができない。しかしながら、驚くことに本明細書で判定されたように、プロモーターの制御下でそれらのゲノムからＣＰ７７を発現するように組換えにより改変されたＣＨＯ細胞は、ワクシニアだけでなくＭＶＡなどのワクシニアの誘導体の増殖も支持することができる。対象改変ＣＨＯ−ＣＰ７７細胞における増殖の後、ＭＶＡおよびワクシニアは非改変ＣＨＯ細胞または他の好適な対照ではやはり増殖することができない。
【００９６】
本明細書で「ポックスウイルス」という場合には、薬剤、予防薬、診断薬または治療薬として対象とする異種分子（例えば、対象とする抗原）をコードする組換えポックスウイルスベクターを含む。このような組換えポックスウイルスベクターは一般に、非ポックスウイルスにより誘発される疾患または病態に対するワクチンとして使用するためのものである。また、用語ポックスウイルスには、天然痘(variola or small pox)感染などのポックスウイルス感染に対して治療用または予防用ワクチンとして提案される単離されたポックスウイルスおよびそれらの誘導体も含む。
【００９７】
本明細書で「ワクシニアに基づく」という場合には、ワクシニアならびにワクシニアウイルスの誘導体および改変形態を含む。ワクシニアに基づく誘導体は、何ら限定されるものではないが、ＭＶＡおよびＮＹＶＡＣを含む。ＭＶＡおよびＮＹＶＡＣという場合には、当技術分野で公知のこれらのポックスウイルスの株または誘導体を含む。改変形態は１〜１０またはそれを超える遺伝子における改変を有し得る。用語「改変」は、野生型または参照配列からの変形（例えば、欠失、置換または付加）を意味するものとする。「弱毒」とは、増殖しないか、または同じウイルスの非弱毒型に比べて関連の対象において実質的に低い程度でしか増殖しないポックスウイルスを含む。この用語はまた、対象において非病原性のウイルスも含む。
【００９８】
一つの実施態様では、細胞は連続細胞株である。改変細胞は連続的に分裂可能な細胞株であることはそれほど重要でない。哺乳動物細胞または高等真核細胞は、本発明に従って改変され、その後、形質転換または不死化されて連続的に分裂する細胞株となり得る。しかしながら、修飾前の細胞は、好都合には、十分に特性決定された、当技術分野で公知の連続的に分裂するバイオテクノロジー適合性連続細胞株である。このような細胞は好都合には、American Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）またはEuropean Collection of Cell Cultures（ＥＣＡＣＣ）などの寄託機関から入手可能である。
【００９９】
好適な哺乳動物細胞株としては、限定されるものではないが、ＲＫ１８、ＢＨＫ、ＶＥＲＯ、ＨＢＯＣ−１４３Ｂ、ＨａＣａｔ、ＨｅｐＧ２、ＨｅＬａ、ＨＴ１０８０、ＨＥＫ−２９３、ＲＤ、ＣＯＳ−７、ＣＨＯ、Ｊｕｒｋａｔ、ＨＵＴ、ＳＵＰＴ、Ｃ８１６６、ＭＯＬＴ４／クローン８、ＭＴ−２、ＭＴ−４、Ｈ９、ＰＭ１、ＣＥＭ、骨髄腫細胞（例えば、ＳＢ２０細胞）およびＣＥＭＸ１７４が例えばＡＴＣＣから入手可能である。
【０１００】
一つの実施態様では、細胞はＣＨＯ細胞である。従来技術のＣＨＯ細胞株は、ウイルス宿主名遺伝子をコードせず、ヒトで実質的に増殖できないワクシニアまたはワクシニア誘導体の生産を支持することはない。
【０１０１】
いくつかの実施態様では、細胞はヒト細胞、霊長類細胞、ハムスター細胞またはウサギ細胞である。
【０１０２】
本改変哺乳動物細胞を達成するために好適なキメラ構築物は、調節配列に機能的に連結された、ポックスウイルス宿主域因子をコードする配列核酸を含んでなる。調節配列は好適には、細胞内での発現に適合する転写および／または翻訳制御配列を含んでなる。一般に、転写および翻訳調節制御配列としては、限定されるものではないが、プロモーター配列、５’非コード領域、シス調節領域、例えば、転写調節タンパク質または翻訳調節タンパク質のための機能的結合部位、上流オープンリーディングフレーム、リボゾーム結合配列、転写開始部位、翻訳開始部位、および／またはリーダー配列、終止コドン、翻訳終止部位および３’非翻訳領域をコードするヌクレオチド配列が挙げられる。当技術分野で公知の構成的プロモーターまたは誘導プロモーターが企図される。これらのプロモーターは、天然プロモーター、または２つ以上のプロモーターのエレメントを組み合わせたハイブリッドプロモーターであり得る。
【０１０３】
企図されるプロモーター配列は、哺乳動物細胞にとって天然のものであっても、またはその領域が選択された生物において機能的である限り、別の供給源に由来するものであってもよい。プロモーターの選択は、意図される宿主細胞によって異なる。例えば、哺乳動物細胞での発現に使用可能なプロモーターとしては、カドミウムなどの重金属に応答して誘導され得るメタロチオネインプロモーター、β−アクチンプロモーター、ならびにとりわけＳＶ４０ラージＴ抗原プロモーター、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期（ＩＥ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲプロモーター、マウス乳癌ウイルスＬＴＲプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ  ＭＬＰ）、単純ヘルペスウイルスプロモーター、およびＨＰＶプロモーター、特に、ＨＰＶ上流調節領域（ＵＲＲ）などのウイルスプロモーターが挙げられる。これらのプロモーターは総て、当技術分野で十分に記載され、容易に入手可能である。
【０１０４】
エンハンサーエレメントもまた、哺乳動物構築物の発現レベルを高めるために本明細書で使用可能である。例としては、Dijkema et al. (1985) EMBO J. 4:761に記載されているＳＶ４０初期遺伝子エンハンサー、例えばGorman et al., (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:6777に記載されているラウス肉腫ウイルスの長い末端反復配列（ＬＴＲ）由来のエンハンサー／プロモーター、および例えばBoshart et al. (1985) Cell 41:521に記載されているヒトＣＭＶ由来のエレメント、例えば、ＣＭＶイントロンＡ配列に含まれるエレメントが挙げられる。
【０１０５】
キメラ構築物はまた３’非翻訳配列も含んでなり得る。３’非翻訳配列は、ポリアデニル化シグナルおよびｍＲＮＡプロセシングまたは遺伝子発現を果たし得る他の任意の調節シグナルを含むＤＮＡセグメントを含んでなる遺伝子の部分を意味する。ポリアデニル化シグナルは、ｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデニル酸トラクトの付加を果たすことを特徴とする。ポリアデニル化シグナルは、カノニカル型５’ＡＡＴＡＡＡ−３’との相同性によって一般に認識されるが、変形形態もめずらしくない。３’非翻訳調節ＤＮＡ配列は好ましくは約５０〜１，０００ｎｔを含み、ポリアデニル化シグナルに加えて転写および翻訳終止配列、ならびにｍＲＮＡプロセシングまたは遺伝子発現を果たし得る他の任意の調節シグナルも含んでよい。
【０１０６】
いくつかの実施態様では、キメラ構築物は、構築物を含有する細胞の選択を可能とするための選択マーカー遺伝子をさらに含む。選択遺伝子は当技術分野で周知であり、対象細胞での発現に適合される。
【０１０７】
一つの実施態様では、ウイルス宿主域遺伝子の発現はプロモーターの制御下にある。１つの非限定的実施態様では、プロモーターは、宿主細胞に対して有意な毒性作用が存在せずにウイルス増殖を維持するように十分なレベルのＣＰ７７の発現を指示する細胞構成的プロモーター、例えば、ヒトＥＦ１α（ヒト延長因子１α遺伝子プロモーター）、ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子プロモーター）またはＰＧＫ（ホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子プロモーター）である。プロモーターはまた誘導性、例えば、細胞誘導プロモーターであってもよい。ＭＴＨ（メタロチオネイン遺伝子由来）ウイルスプロモーターもまた、ＣＭＶ、ＲＳＶ、ＳＶ−４０、およびＭｏＵ３などの哺乳動物細胞で使用される。
【０１０８】
好都合には、一つの実施態様において、ウイルス宿主域遺伝子の発現は、許容細胞株で見られるものと同等のウイルス収量を生じるようにウイルスの増殖を支持する。ウイルス宿主域遺伝子の発現は、例えば、５００を超えるウイルス複製増幅比を支持する。ウイルス宿主域遺伝子の発現は、有意な宿主細胞毒性なくウイルスの増殖を支持する。有意な宿主細胞毒性とは、未成熟宿主細胞死または分裂不全のためにウイルス収量を減じるウイルス宿主域因子発現のレベルを意味する。当業者ならば、宿主細胞の生存および複製などの宿主細胞パラメーター、ならびにウイルス宿主域遺伝子発現、ウイルス複製およびウイルス収量などのウイルスパラメーターを定性的または定量的に評価するための方法を知っている。
【０１０９】
一つの実施態様では、ポックスウイルスは、機能的ＣＰ７７またはＣＰ７７オーソログをコードするオルソポックスウイルス以外のコードポックスウイルスである。牛痘ウイルスはＣＰ７７をコードし、従って、本態様に包含されない。オルソポックスウイルスには、バッファローポックスウイルス、牛痘ウイルス、ラクダポックスウイルス、エクトロメリアウイルス、サル痘ウイルス、ウサギ痘ウイルス、アライグマ痘ウイルス(racconpox virus)、アレチネズミ痘ウイルス(teterapox virus)、ワクシニアウイルス、ハタネズミ痘ウイルス、スカンク痘ウイルス、および馬痘ウイルス(Uasin Gishu disease virus of horses）が含まれる。他の属には、パラポックスウイルス、アビポックスウイルス、カプリポックスウイルス、レポリポックスウイルス、豚痘ウイルス、モルシポックスウイルスおよびヤタポックスウイルスが含まれる。
【０１１０】
一つの実施態様では、ポックスウイルスはヒト／対象において実質的に複製できないＭＶＡまたはＭＶＡの誘導体である。
【０１１１】
一つの実施態様では、ポックスウイルスは、ヒトにおいてｉｎ  ｖｉｖｏで実質的に複製できないワクシニアまたはワクシニアの誘導体である。
【０１１２】
別の実施態様では、ポックスウイルスはポックスウイルスワクチンとして使用するために好適である。
【０１１３】
１つのさらなる実施態様では、ポックスウイルスは、医学的対象の抗原などの対象とする異種分子をコードおよび発現する組換えポックスウイルスベクターであり、ここで、この組換えポックスウイルスベクターは、対象において診断薬、治療薬または予防薬として使用するためのものである。
【０１１４】
本明細書でＫ１Ｌという場合には、Shisler and Jin (2004)により記載されている遺伝子およびそのオーソログまたは改変形態を意味する。
【０１１５】
本明細書でＳＰＩ−１という場合には、Brookes et al. (1995)により記載されている宿主域遺伝子またはそのオーソログおよび改変形態を意味する。
【０１１６】
いくつかの実施態様では、疑念を避けるため、本改良型のウイルス増殖法はポックスウイルスゲノムへの遺伝子の付加を必要としない。これは当然のことながら、限定されるものではないが、ワクチン目的で対象とする抗原としての異種分子をコードするため、または対象において免疫応答を生成するためなどの他の目的でのウイルスベクターの改変を排除しない。
【０１１７】
宿主細胞核内からのポックスウイルス宿主域遺伝子の転写およびコードされている産物の翻訳は感染細胞で起こり、宿主細胞の細胞質でのポックスウイルスの増殖に十分である。いずれの特定の作用様式にも限定されないが、ＣＰ７７はウイルス保護薬であることが提案される。
【０１１８】
１つの例示的実施態様では、感染細胞株により発現されるポックスウイルス宿主域遺伝子はＣＰ７７である。実施例４に示されるように、ＣＨＯ細胞核がＣＰ７７をコードおよび発現するように改変される場合、それは１４３Ｂなどの許容細胞株であった場合と同様にウイルス増幅を維持することができる。一般に、コンフルエントプラークは感染から２日以内に見られる。
【０１１９】
別の実施態様では、改変細胞におけるウイルス増殖のレベルは、少なくとも１０〜５０００の増幅率を提供する。増幅率は、いくつかの実施態様では、５００〜３０００の間、または１０００〜４０００の間である。
【０１２０】
別の実施態様では、異種ポックスウイルス宿主域遺伝子の発現を駆動するプロモーターは、細胞においてあるレベルのポックスウイルス宿主域異種遺伝子発現を提供する。ＣＰ７７発現のレベルは、許容細胞において牛痘ウイルスにより生成されるものと同等かまたはそれを超え得る。
【０１２１】
別の実施態様では、異種ポックスウイルス宿主域遺伝子の発現を駆動するプロモーターは、少なくとも許容細胞におけるウイルス増殖のレベルまでウイルス増殖を可能とするに十分な、細胞の異種遺伝子発現レベルを提供する。
【０１２２】
一つの実施態様では、ＣＨＯ細胞株におけるポックスウイルス生産は、陽性対照細胞におけるポックスウイルス生産レベルと同等かまたはそれを超える。
【０１２３】
一つの実施態様では、ＣＨＯ細胞におけるＭＶＡウイルス生産レベルは、ＣＥＦ細胞におけるＭＶＡウイルス生産レベルと実質的に同等かまたはそれを超える。
【０１２４】
一つの実施態様では、ＣＰ７７、Ｋ１Ｌおよび／またはＳＰＩ−１は、哺乳動物細胞での発現のためにコドンが最適化された連続ヌクレオチド配列によりコードされる。
【０１２５】
本明細書でさらに記載されるように、ＣＰ７７をコードするコドンが最適化された核酸配列は、ブライトンレッド株（ＵｎｉｐｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｐ１２９３２．１）の牛痘ＣＰ７７タンパク質をコードする配列と８０％未満または７５％未満のヌクレオチド配列同一性を持ち得る。いくつかの実施態様では、コドンが最適化された配列は、配列番号１で示される配列を有するか、または配列番号１で示される配列と少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸配列を含んでなる機能的変異体である。いくつかの実施態様では、ＣＰ７７ウイルス宿主域因子は、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するか、または配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性を有する。
【０１２６】
いくつかの実施態様では、本明細書に記載されるように、それらのゲノムからＣＰ７７を発現する改変哺乳動物細胞の集団、例えば、クローン集団を含んでなるまたは前記集団から本質的になるキットが企図される。いくつかの実施態様では、改変細胞はワクシニアウイルスを含有しない。
【０１２７】
本明細書は、ＣＨＯ細胞では増殖しないポックスウイルスを製造するためのプロセスまたは製造する方法をさらに記載し、そのプロセスは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで哺乳動物細胞株においてポックスウイルスを増殖させることを含んでなり、前記細胞株はプロモーターの制御下にＣＰ７７をコードおよび発現するように改変されている。このプロセスはウイルス粒子を単離することをさらに含んでなり得る。
【０１２８】
細胞株は好都合には、薬剤または治療薬、診断薬または予防薬の製造に好適であることが当業者に知られている哺乳動物細胞株である。
【０１２９】
本明細書は改変ＣＨＯ細胞を記載し、このＣＨＯ細胞はＣＰ７７をコードし、プロモーターの制御下でゲノムからそれを発現するように改変されている。
【０１３０】
一つの実施態様では、改変ＣＨＯ細胞株は、ＣＰ７７を発現しないものである非改変対照ＣＨＯ細胞ではほとんど増殖できない、または増殖不能であるウイルスの増殖を維持する。
【０１３１】
一つの実施態様では、ウイルスは、ＣＰ７７をコードするオルソポックスウイルス以外のオルソポックスウイルスである。当技術分野で公知のように、牛痘ウイルスは、ＣＰ７７をコードするポックスウイルスである。
【０１３２】
いくつかの実施態様では、ウイルスは、ｉｎ  ｖｉｖｏでヒト／対象において実質的に複製できないワクシニアまたはワクシニアの誘導体である。
【０１３３】
いくつかの実施態様では、ウイルスはＭＶＡである。
【０１３４】
別の実施態様では、本明細書は、ヒトにおいて実質的に複製できないポックスウイルスを増殖させる方法を提供し、この方法は、（ｉ）ＣＰ７７を発現するように形質転換されたＣＨＯ細胞を培養すること；および（ｉｉ）（ｉ）から得られた培養ＣＨＯ細胞に、ヒトにおいて実質的に複製できないポックスウイルスを感染させることを含んでなる。
【０１３５】
別の実施態様では、本明細書は、ヒトにおいて実質的に複製できないポックスウイルスを増殖させる方法を提供し、この方法は、（ｉ）ＣＰ７７およびＤ１３Ｌおよび／またはＫ１Ｌを発現するように形質転換されたＣＨＯ細胞を培養すること、および（ｉｉ）（ｉ）から得られた培養ＣＨＯ細胞に、ヒトにおいて実質的に複製できないポックスウイルスを感染させることを含んでなる。
【０１３６】
別の実施態様では、本明細書は、ＭＶＡを増殖させる方法を提供し、この方法は、（ｉ）ＣＰ７７およびＤ１３Ｌおよび／またはＫ１Ｌを発現するように形質転換されたＣＨＯ細胞を培養すること、および（ｉｉ）（ｉ）から得られた培養ＣＨＯ細胞にＭＶＡを感染させることを含んでなる。
【０１３７】
別の実施態様では、本明細書は、ヒトにおいて実質的に複製できないワクシニア誘導体を増殖させる方法を提供し、この方法は、（ｉ）ＣＰ７７およびＤ１３Ｌおよび／またはＫ１Ｌを発現するように形質転換されたＣＨＯ細胞を培養すること、および（ｉｉ）（ｉ）から得られた培養ＣＨＯ細胞にワクシニア誘導体を感染させることを含んでなる。
【０１３８】
別の実施態様では、本明細書は、異種タンパク質をコードするＭＶＡを増殖させる方法を提供し、この方法は、（ｉ）ＣＰ７７およびＤ１３Ｌおよび／またはＫ１Ｌを発現するように形質転換されたＣＨＯ細胞を培養すること、および（ｉｉ）（ｉ）から得られた培養ＣＨＯ細胞にＭＶＡを感染させることを含んでなる。
【０１３９】
別の実施態様では、本明細書は、ヒトにおいて実質的に複製できない、異種タンパク質をコードするワクシニア誘導体を増殖させる方法を提供し、この方法は、（ｉ）ＣＰ７７およびＤ１３Ｌおよび／またはＫ１Ｌを発現するように形質転換されたＣＨＯ細胞を培養すること、および（ｉｉ）（ｉ）から得られた培養ＣＨＯ細胞にワクシニア誘導体を感染させることを含んでなる。
【０１４０】
別の実施態様では、哺乳動物細胞株での発現のためのプロモーターなどの調節エレメントに機能的に接続されたウイルス宿主域遺伝子の核酸配列を含んでなる人為的に作出されたベクター、ポリヌクレオチドまたはプラスミドを提供する。いくつかの実施態様では、ウイルス遺伝子は、牛痘アンキリンリピートドメイン含有タンパク質ＣＰ７７遺伝子（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ｐ１２９３２．１［０２５ＬＢＲ  ＣＰ７７タンパク質］である。一つの実施態様では、ＣＰ７７などのウイルス宿主域遺伝子は、哺乳動物細胞株での発現のためにコドンが最適化される。好適なベクターおよびプラスミドは当技術分野で公知である。
【０１４１】
一つの実施態様では、ポリヌクレオチドはＣＰ７７をコードする。いくつかの実施態様では、ポリヌクレオチドは、配列番号１で示されるヌクレオチド配列（ＣＨＯなどの哺乳動物細胞での発現のためにコドンが最適化されたもの）を含んでなる。いくつかの実施態様では、単離されたポリヌクレオチドは、配列番号１で示されるヌクレオチド配列または配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードするその変異体を含んでなる。
【０１４２】
別の実施態様では、本明細書は、ウイルス宿主域遺伝子を哺乳動物細胞へ安定挿入するための転位送達ベクターを記載した。
【０１４３】
本明細書はまた、ウイルスに対して実質的に非許容性の哺乳動物または高等真核生物培養細胞をそのウイルスに対して許容性の細胞に形質転換する方法を提供し、この方法は、ＣＰ７７を発現するように細胞を形質転換することを含んでなる。
【０１４４】
いくつかの実施態様では、この方法は、細胞を、哺乳動物プロモーターの制御下、コードされているＣＰ７７の発現を指示することができるベクターでトランスフェクトすることを含む。
【０１４５】
いくつかの実施態様では、ベクターは、哺乳動物プロモーターの制御下にＣＰ７７をコードする転位送達ベクターである。
【０１４６】
１つの非限定的実施態様では、プロモーターは、宿主細胞に対して有意な毒性作用が存在せずにウイルス増殖を維持するように十分なレベルのＣＰ７７の発現を指示する細胞構成的プロモーター、例えば、ヒトＥＦ１α（ヒト延長因子１α遺伝子プロモーター）、ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子プロモーター）またはＰＧＫ（ホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子プロモーター）である。プロモーターはまた誘導性、例えば、細胞誘導プロモーターであってもよい。ＭＴＨ（メタロチオネイン遺伝子由来）ウイルスプロモーターもまた、ＣＭＶ、ＲＳＶ、ＳＶ−４０、およびＭｏＵ３などの哺乳動物細胞で使用される。
【０１４７】
いくつかの実施態様では、細胞はＣＨＯ細胞である。
【０１４８】
いくつかの実施態様では、ウイルスはポックスウイルスである。
【０１４９】
いくつかの実施態様では、ポックスウイルスは、ヒトにおいて非病原性であるかまたは複製しないワクシニア誘導体である。
【０１５０】
「単離された」とは、その自然状態でそれに通常伴っている成分を実質的にまたは本質的に含まない材料を意味する。例えば、「単離されたポリヌクレオチド」または「単離されたポリペプチド」などは、本明細書で使用する場合、その自然細胞環境からの、また、その細胞の他の成分との会合状態からのポリヌクレオチドまたはポリペプチド分子のｉｎ
ｖｉｔｒｏ単離および／または精製を意味する。限定されるものではないが、単離された組成物、複合体、ポリヌクレオチド、ペプチド、またはポリペプチドは、精製により単離された天然配列または組換えもしくは合成手段により生成された配列を意味し得る。
【０１５１】
変異体は、中または高ストリンジェンシーの条件下で選択的ハイブリダイゼーションが達成され得る、または参照ポックスウイルス宿主域因子を定義するヌクレオチド配列と少なくとも約１５ヌクレオチドを含んでなる比較ウインドウにおいて約６０％〜９０％または９０〜９８％の配列同一性を有するように、参照分子またはその全体もしくは一部にわたるそれらの相補形態に十分に類似する核酸分子を含む。好ましくは、ハイブリダイゼーション領域は約１２〜約１８核酸塩基以上の長さである。好ましくは、特定のヌクレオチド配列と参照配列の間の同一性パーセントは、少なくとも約８０％、または８５％、またはより好ましくは約９０％またはそれを超える類似性、例えば、約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える類似性である。８０％〜１００％の間の同一性パーセントは包含される。ヌクレオチド配列の長さはその提案される機能によって異なる。
同族体も包含される。用語「ホモログ（単数）」、「相同遺伝子」または「ホモログ（複数）」は、他種由来のものも含め、機能的および構造的に関連のある分子を広く意味する。ホモログ種およびオーソログは変異体の例である。
【０１５２】
核酸配列同一性は以下のように決定することができる。対象核酸配列は、プログラムＢＬＡＳＴＭバージョン２．１（Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Research 25:3389-3402に基づく）を用い、ＧｅｎＢａｎｋデータベース（ウェブサイトhttp://www.ncbi.nln.nih.gov/blast/でアクセス可能）などの核酸配列データベースを検索するために使用される。このプログラムはギャップを含まないモードで使用する。低複雑性の領域による配列ホモロジーを除去するためにデフォルトフィルタリングを使用する。ＢＬＡＳＴＭのデフォルトパラメーターを使用する。
【０１５３】
アミノ酸配列同一性は以下のように決定することができる。対象ポリペプチド配列は、ＢＬＡＳＴＰプログラムを用い、ＧｅｎＢａｎｋデータベース（ウェブサイトhttp://www.ncbi.nln.nih.gov/blast/でアクセス可能）などのポリペプチド配列データベースを検索するために使用される。このプログラムはギャップを含まないモードで使用する。低複雑性の領域による配列ホモロジーを除去するためにデフォルトフィルタリングを使用する。
ＢＬＡＳＴＰのデフォルトパラメーターを使用する。低複雑性配列のフィルタリングにはＳＥＧプログラムを使用できる。
【０１５４】
用語「ストリンジェント条件下でハイブリダイズする」、およびその文法的等価表現は、定義された温度および塩濃度条件下で標的核酸分子（サザンブロットまたはノーザンブロットなどのＤＮＡまたはＲＮＡブロット上に固定化されている標的核酸分子など）とハイブリダイズする核酸分子の能力を意味する。約１００塩基長を超える核酸分子では、典型的なストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、天然二重鎖の融点（Ｔｍ）よりも２５℃〜３０℃以内で（例えば、１０℃）低い条件である（一般には、Sambrook et al., (supra); Ausubel et al., (1999)参照）。約１００塩基より大きい核酸分子のＴｍは、式Ｔｍ＝８１．５＋０．４１％（Ｇ＋Ｃ−ｌｏｇ（Ｎａ＋））によって計算することができる。１００塩基未満の長さの核酸分子では、例示的なストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、Ｔｍより５℃〜１０℃低い。
【０１５５】
「ベクター」とは、ポリヌクレオチドを挿入またはクローニングすることができる例えば、プラスミド、バクテリオファージ、酵母、ウイルス、哺乳動物、鳥類、爬虫類または魚類由来のポリヌクレオチド分子、好適にはＤＮＡ分子を意味する。ベクターは好ましくは、１以上のユニークな制限部位を含み、標的細胞もしくは組織またはその前駆細胞もしくは組織を含む定義された宿主細胞で自律的複製能を持ち得るか、またはクローニングされた配列が複製可能なように定義された宿主のゲノムと統合可能である。よって、ベクターは、自律的に複製するベクター、すなわち、染色体外実体として存在し、その複製が染色体複製とは独立であるベクター、例えば、線状もしくは閉環プラスミド、染色体外エレメント、ミニ染色体、または人工染色体であり得る。ベクターは、自己複製を保証するための任意の手段を含むことができる。あるいは、ベクターは、宿主細胞に導入された際にゲノムに組み込まれ、それが組み込まされた１または複数の染色体とともに複製されるものであり得る。ベクター系は、単一のベクターまたはプラスミド、宿主細胞のゲノムに組み込まれる全ＤＮＡ、またはトランスポゾンを一緒に含む２以上のベクターまたはプラスミドを含んでなり得る。ベクターの選択は一般に、ベクターとベクターが導入される宿主細胞との適合性によって異なる。ベクターはまた、好適な形質転換体の選択のために使用可能な抗生物質耐性遺伝子などの選択マーカーを含むこともできる。このような耐性遺伝子の例は当業者に公知である。
【０１５６】
「遺伝子」という場合には、遺伝子のエキソンに対応するｃＤＮＡを含む。本明細書で「遺伝子」という場合にはまた、転写および／または翻訳調節配列および／またはコード領域および／または非翻訳配列（すなわち、イントロン、５’−および３’−非翻訳配列）；または遺伝子のコード領域（すなわち、エキソン）ならびに５’−および３’−非翻訳配列に相当するｍＲＮＡもしくはｃＤＮＡからなる古典的ゲノム遺伝子を含むものとする。
【０１５７】
「調節エレメント」または「調節配列」とは、特定の宿主細胞において機能的に連結されたコード配列の発現に必要な核酸配列（例えば、ＤＮＡ）を意味する。例えば原核細胞に好適な調節配列としては、プロモーター、場合により、オペレーター配列およびリボソーム結合部位などのシス作用配列が挙げられる。真核細胞に好適な制御配列としては、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、転写エンハンサー、翻訳エンハンサー、ｍＲＮＡの安定性を調整するリーダー配列またはトレーリング配列、ならびに転写されたポリヌクレオチドによりコードされている産物を細胞内部の細胞内コンパートメントまたは細胞外環境に標的化する標的化配列が挙げられる。
【０１５８】
相補配列およびこれらの配列の一部が包含される。用語「相補物」および「相補性」は、核酸分子に関して使用される場合、ワトソン−クリック塩基対形成で決定される相補的核酸配列を意味する。例えば、核酸配列５’ＣＣＡＴＧ３’の相補物は５’ＣＡＴＧＧ３’である。
【０１５９】
「特異的にハイブリダイズする」などの句は、その配列が複雑な混合物（例えば、全細胞）ＤＮＡまたはＲＮＡ中に存在する場合にストリンジェント条件下で特定のヌクレオチド配列のみに対する分子の結合、二重鎖形成、またはハイブリダイゼーションを意味する。
【０１６０】
本明細書で互換的に使用される用語「対象」または「個体」または「患者」は、治療または予防が望まれる任意の対象、特に脊椎動物対象、より詳しくは哺乳動物対象を意味する。本発明の範囲内に入る好適な脊椎動物としては、限定されるものではないが、霊長類、鳥類、家畜動物（例えば、ヒツジ、ウシ、ウマ、ロバ、ブタ）、研究試験動物（例えば、ウサギ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター）、伴侶動物（例えば、ネコ、イヌ）および捕捉された野生動物（例えば、キツネ、シカ、ディンゴ）が挙げられる。好ましい対象は、治療または予防を必要とするヒトなどの霊長類である。しかしながら、前述の用語は症状が存在することを含意しないと理解される。
【０１６１】
本明細書において可能な種々の実施態様を以下の限定されない例によりさらに説明する。
【実施例】
【０１６２】
実施例１
ＶＡＣＶ−ＣＯＰはＣＨＯ細胞で増殖できない
材料および試薬
・ＶＡＣＶ−ＣＯＰ、ＶＳＳ０２、ＳＥＭ１２０２１３、力価：１．６×１０（８）ｐｆｕ／ｍＬ
・Ｖｅｒｏ：ＷＨＯ−ＶＥＲＯ−ＭＣＢ継代数１４１、０８／０８／２００５、Ｖｉｒａｘ  Ｈｏｌｄｉｎｇｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ
・ＣＨＯ：ＳＡ−Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ７．０５．２００４
・増殖培地：ＲＰＭＩ、１０％ＦＢＳ、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ
・維持培地：ＲＰＭＩ、２％ＦＢＳ、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ
【０１６３】
ＣＨＯおよびＶｅｒｏ細胞を各細胞株につき１枚の６ウェルプレート（６−ＷＰ）でコンフルエントまで培養した。各ウェルに４×１０（４）ｐｆｕのＶＡＣＶ−ＣＯＰ  ＶＳＳ０２を室温で４５分間感染させ、その後、３７℃／５％ＣＯ２でインキュベートした。
各細胞株から、感染２４時間、４８時間、７２時間後に２ウェルの内容物を採取してプールした。ウイルス抽出液は３回の凍結融解によって作製し、力価測定まで−８０℃で保存した。各抽出液の力価を、実施例４に記載のプロトコールに記載の通りにＶｅｒｏ細胞を用いて測定した。
【０１６４】
凍結融解後、これらの大きな不溶塊を解すためにホモジネーションプローブを用いてよい。採取される各ウェルは２ｍＬのＭＭを含有する。各時点で、２ウェルをプールして各時点について総容量を４ｍＬとした。ＴＥバッファーを加え、各時点で総容量６ｍＬとしてもよい。
【０１６５】
力価測定結果、ウイルス収量結果および生産率を表１に示す。これらの結果は、ウイルス生産が経時的に増すＶｅｒｏ細胞とは異なり、ＣＨＯ細胞ではＶＡＣＶ−ＣＯＰは低ｍｏｉから増殖できないことを示す。ＶＡＣＰ−ＣＯＰはＣＨＯ細胞では非許容性である。
【０１６６】
実施例２
ＣＨＯとＶｅｒｏ−ＣＰ７７におけるＶＡＣＶ＋ＰＨ２２［ＣＰ７７］の多段階増殖はＶＡＣＶにおいて有効である
ＣＰ７７をコードする牛痘ウイルスＢＲ０２５Ｌ遺伝子を発現する組換えＶＡＣＶ−ＣＯＰ（ＶＡＣＶ−ＰＨ２２［ＣＰ７７］）のＣＨＯでの増殖能を、多段階増殖試験でＶｅｒｏ細胞と比較して決定した。
【０１６７】
ＶＡＣＶ−ＰＨ２２は、ＣＨＯ宿主域タンパク質ＣＰ７７をコードする牛痘ウイルスのブライトン株由来の天然０２５Ｌ  ＯＲＦを発現する組換えワクシニアウイルス・コペンハーゲン株である。ワクシニアにおけるこのＯＲＦはＢＲ０２５Ｌ天然プロモーターの制御下にもある。天然ＢＲ０２５Ｌ遺伝子（天然プロモーターおよびＯＲＦ）をクローニングし、赤色蛍光タンパク質もコードするｐＰＨ２２、ＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ２を作出した。ｐＰＨ２２は、可溶性および細胞表面ＩＦＮα／β受容体タンパク質をコードするＢＲ０２５Ｌ遺伝子およびＤｓＲｅｄ遺伝子をＶＡＣＶ−ＣＯＰのＢ１９Ｒ  ＯＲＦに挿入する組み込みベクターである。ＢＲ０２５ＬおよびＤｓＲｅｄのＶＡＣＶ−ＣＯＰへの挿入は、ＣＨＯに低多重度のＶＡＣＶ−ＣＯＰを感染させる結果としての相同組換えとｐＰＨ２２でのトランスフェクションにより達成した。ＢＲ０２５Ｌ遺伝子を含有するウイルスのみがＣＨＯ細胞でさらに増幅され、これは赤色蛍光感染細胞またはプラークの存在により視覚的に確認できる。
【０１６８】
相同組換えの３日後に抽出されたウイルスをＣＨＯで３倍に増幅させ、その後、ＣＨＯ細胞におけるこの多段階増殖試験で使用する前にＶｅｒｏ細胞で力価測定を行った。
【０１６９】
材料および試薬
・ＶＡＣＶ−ＣＯＰ、ＶＳＳ０２、ＳＥＭ１２０２１３、力価：１．６×１０８ｐｆｕ／ｍＬ
・ＶＡＣＶ−ＰＨ２２［ＣＰ７７］、力価：８×１０６ｐｆｕ／ｍＬ
・Ｖｅｒｏ：ＷＨＯ−ＶＥＲＯ−ＭＣＢ継代数１４１、０８／０８／２００５
・ＣＨＯ：ＳＡ−Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ７．０５．２００４
・増殖培地：ＣＨＯおよびＶｅｒｏ用としてＲＰＭＩ、１０％ＦＢＳ、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ
・維持培地：ＣＨＯおよびＶｅｒｏ用としてＲＰＭＩ、２％ＦＢＳ、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ
【０１７０】
ＣＨＯおよびＶｅｒｏ細胞を各細胞株につき２×Ｔ２５フラスコ内でコンフルエントまで培養した。各細胞株の１本のフラスコに１×１０５ｐｆｕのＶＡＣＶ−ＣＯＰ  ＶＳＳ０２を、もう１本に１×１０５ｐｆｕのＶＡＣＶ−ＰＨ２２を室温で４５分間感染させ、その後、３７℃／５％ＣＯ２でインキュベートした。各細胞株から、感染９６時間後に各フラスコの内容物を採取した。ウイルス抽出液は３回の凍結融解によって作製し、力価測定まで−８０℃で保存した。各抽出液の力価を、２４ウェルプレート形式で実施例４に詳細に示されたプロトコールに記載の通りにＶｅｒｏ細胞を用いて測定した。
【０１７１】
感染は、Ｔ２５フラスコで、各細胞株についてフラスコ２本として行い、フラスコ１にＶＡＣＶ−ＣＯＰを感染させ、フラスコ２にＶＡＣＶ−ＰＨ２２を感染させた。採取は感染後９６時間目にのみ行った。結果を表２に示す。表２から、ＣＨＯ細胞はＶＡＣＶ−ＣＯＰ  ウイルス後代の生産を支持することができないことが見て取れる。このことから実施例１に記載の結果が確認される。さらに、本研究における許容細胞株であるＶｅｒｏ細胞の感染は接種物レベルを２００倍を超えるまでに増幅したことからＶＡＣＶ−ＣＯＰは活性があり、従って、ＣＨＯで見られた結果は宿主細胞の限界によるものであった。しかしながら、ＣＰ７７が組換えワクシニアウイルスＶＡＣＶ−ＰＨ２２により発現された場合、接種物の増幅は約７００倍に達した。ＣＰ７７の発現は、ｖｅｒｏ細胞にＶＡＣＶ−ＰＨ２２を感染させた場合にも接種物は増幅したことから、ワクシニア宿主域をＣＨＯ細胞だけに限定するものではなかった。しかしながら、この増幅レベルは、ＣＰ７７を含まないワクシニアほど良好でないかもしれない。力価測定結果の標準誤差は極めて大きいので、収量の差は有意とは言えない。
【０１７２】
これらの結果は、ウイルスゲノムから発現されたＣＰ７７は、Ｖｅｒｏなどの許容細胞基質から予想されるものと同等の収量をもたらすことによりＶＡＣＶ−ＣＯＰを非許容性ＣＨＯ細胞株で増幅可能とするのに十分過ぎるほどであることを示す。
【０１７３】
ＣＨＯ細胞のワクシニアウイルス感染中のＣＰ７７タンパク質の潜在的機能はHsiao et al. (2006)により報告されている。この著者らは、ＣＰ７７がＨＭＧ２０Ａに結合し、ウイルス工場に位置する新たに合成されるワクシニアゲノムからそれを解離させ、これによりＣＨＯ細胞でワクシニア生活環を継続可能とするということを提案した。ここで、ＣＰ７７が新たに合成されるゲノムをパッケージングのために利用できようにし、そうでなければ、ＨＭＧ２０ａのゲノムへの結合およびゲノムの「ロック」のためにＣＨＯ細胞で利用可能とならないという仮説が立てられる。このＣＰ７７の機能はＶｅｒｏなどの許容細胞株でのウイルス増幅には必要とされないことから、ここで、おそらく少なくともＣＨＯ細胞では不活性であるかまたは存在せず、許容細胞株では活性であるかまたは存在する、この機能を有する代替の等価なタンパク質、さらには細胞タンパク質が存在することが提案される。この代替タンパク質はＣＰ７７を不要とすることができ、従って、ワクシニアの進化上、その機能欠失は広い宿主域に必須ではなかったので、その後、欠失または再構成を受けた。
【０１７４】
実施例３
ｐ−ＬＬ０７−ＣＨＯ（ＣＰ７７を発現するポリクローナル細胞株）の構築
ＣＨＯ細胞株を、ＣＰ７７タンパク質を発現するように構築した。緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）を発現するＶＡＣＶ−ＣＯＰ組換えウイルスは、感染数日以内にコンフルエント感染に発達するプラークを形成する。
【０１７５】
ワクシニア−ＣＯＰ（ＳＣＶ４０１Ｃ）は、増強緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）のタンパク質コード配列に機能的に連結され、ポックスウイルス初期転写終止配列を末端に持つ強力なワクシニアウイルス初期／後期プロモーターからなる発現カセットがＡ３９Ｒ  ＯＲＦに挿入された組換えワクシニアウイルス・コペンハーゲン株（ＶＡＣＶ−ＣＯＰ）である。非許容性細胞および許容細胞の感染時に、ＥＧＦＰは感染細胞内で発現され、蛍光顕微鏡を用いて可視化することができる。許容細胞では、ウイルスが細胞集団に拡散するにつれ緑色蛍光が細胞から細胞へ拡散するのが見て取れる。
【０１７６】
ＣＰ７７タンパク質コード配列は、ＧｅｎｅＡｒｔ  ＧｍｂＨ（ドイツ）により、牛痘ウイルス・ブライトンレッド株ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｐ１２９３２．１の０２５Ｌ  ＯＲＦによりコードされるＣＰ７７のアミノ酸からＤＮＡ配列を再構築（バックトランスレーションまたはリバーストランスレーション）することによって合成生成され、哺乳動物（ＣＨＯ）細胞での発現のためにコドンが最適化された。ＣＰ７７のタンパク質コード配列の発現のためにコドンが最適化されたヌクレオチド配列については配列番号１を参照。
【０１７７】
ｐＰＨ５１（コドンが最適化されたＣＰ７７タンパク質コード配列を保持するクローニングプラスミド）由来のコドンが最適化されたＣＰ７７タンパク質コード配列を、５’プライマーが開始コドン前後にコザック配列を付加するように設計され、３’プライマーが終止コドンの前にフラッグタグ配列を付加するように設計されたＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。増幅されたＰＣＲ産物を、ＤＮＡ２．０  Ｉｎｃ（ＵＳＡ）から購入したトランスポゾンｐｉｇｇｙｂａｃベクターｐＪ５０７−２（Ｈｙｇ＋）にＢｓａＩクローニング部位を介してサブクローニングした。ＢｓａＩへのクローニングは、ｃｏｍｅｔ  ＧＰＦコード配列をＣＰ７７タンパク質コード配列に効果的に置き換えてｐＬＬ０７作出する。この時、ＣＰ７７はヒト構成的延長因子１αプロモーター（ＥＦ１ａ）の制御下となり、両者がトランスフェクト細胞のゲノムに安定に組み込まれれば、ハイグロマイシン耐性遺伝子とともに共発現される。
【０１７８】
トランスポゾンにより補助されるＣＰ７７発現カセットとハイグロマイシン耐性発現カセットの安定挿入によるＣＨＯの形質導入：
ＣＨＯ細胞を６ウェルプレートの壁面に、一晩インキュベーション後に５０％前後の集密度となるように播種した。ＱｉａｇｅｎからのＥｆｆｅｃｔｅｎｅトランスフェクション試薬を用い、製造者の説明に従って、１μｇのｐＬＬ０７を１ウェルの５０％コンフルエントのＣＨＯ細胞にトランスフェクトした。次に、トランスフェクト細胞を増殖培地で一晩インキュベートした。翌日、培地を、形質導入細胞を選択するために、５００μｇ／ｍＬハイグロマイシンＢを含有する増殖培地に交換した。選択培地は２〜３日毎に交換し、形質導入細胞の数が増え始めたらそれらをＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて回収し、さらなる細胞の拡大培養のためにＴ２５フラスコに播種した。
【０１７９】
ウエスタンブロット法（フラッグタグ）ＣＰ７７発現の確認
ウサギ抗ＣＰ７７血清の作製：
ウサギに、ＣＰ７７タンパク質の短い内部アミノ酸配列を表すＫＨＬタンパク質に連結された１５アミノ酸のペプチドを注射した。このアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ｐ１２９３２．１［０２５ＬＢＲ  ＣＰ７７タンパク質］配列番号２の４８１〜４９５番のアミノ酸ＳＧＳＤＶＮＩＲＳＮＮＧＹＴＣであった。
【０１８０】
１か月あけて合計３回の注射を行い、このＫＨＬコンジュゲートアミノ酸配列に対する抗体を作製した。注射したウサギからの血液を、細菌で発現させＮｉ−ＮＴＡで精製したＮ末端ＨｉｓタグＣＰ７７タンパク質に対するウエスタンブロットにより試験した。ウサギ抗ＣＰ７７血清は、組換えＣＰ７７タンパク質を明確に認識することが示された。
【０１８１】
ｐ−ＬＬ０７−ＣＨＯによりＣＰ７７発現に関する試験：
２本のＴ２５フラスコにＣＨＯおよびｐ−ＬＬ０７−ＣＨＯを播種し、各フラスコ内で細胞単層が１００％コンフルエントに達するまで培養した。各フラスコから細胞を採取し、ＰＢＳで洗浄した後、２００μＬ中に再懸濁させた。これに、５０μＬの５×ＳＤＳ−ＰＡＧＥローディングバッファーを再懸濁細胞の各試験管に加えた後、９８℃で５分間インキュベートした。１５μＬの各細胞タンパク質抽出液を２枚の１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにロードし、電気泳動を行った後、エレクトロブロッティングによりＨｙｂｏｎｄ  ＥＣＬニトロセルロースにブロットした。
【０１８２】
次に、エレクトロブロット膜をＴｗｅｅｎ  ２０を含有するＴｒｉｓ緩衝生理食塩水（ＴＢＳＴ）に溶かした５％脱脂粉乳で室温にて１時間処理し、膜上の利用可能な総ての非特異的抗体結合部位をブロッキングした。次に、これらの膜をＴＢＳＴ中で数回洗浄した後、抗体でプロービングした。膜１は５０００希釈のＨＲＰコンジュゲート抗ＤＤＤＤＫタグ抗体［Ｍ２］（ａｂ４９７６３、Ｓａｐｐｈｉｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で４℃にて一晩プロービングした。膜２は、１：１００希釈の抗ＣＰ７７抗血清で４℃にて一晩プロービングし、ＴＢＳＴで３回洗浄した後、二次抗体として１：５０００希釈のＨＲＰコンジュゲート抗ウサギ抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で２時間プロービングした。その後、両方の膜をＴＢＳＴ中で３回洗浄し、ユーザーマニュアルにより指示されているように、ＥＣＬウエスタンブロッティング検出試薬（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で処理し、Ｘ線フィルムに露光した。
【０１８３】
ＣＨＯおよびｐ−ＬＬ７−ＣＨＯのプラークアッセイ：
ＣＨＯ細胞およびｐ−ＬＬ７−ＣＨＯ細胞を複数の６ウェルプレートに播種し、細胞単層が１００％コンフルエントになるまで培養した。
【０１８４】
初期／後期ワクシニアウイルスプロモーター（ＳＣＶ４０１Ｃ）の制御下にＥＧＦＰ発現カセット（緑色蛍光タンパク質）を保持する組換えワクシニアウイルス（コペンハーゲン株）を用いて細胞に感染させた。ＳＣＶ４０１Ｃの力価が未知であるために、１０μｌのウイルス原液を新しく１ｍｌのＭＭ培地（Ｄｉｌ  １：  １：１００希釈）に希釈した後、各ウェルに５００μｌのウイルス希釈液を感染させた。感染後１日目に、高ｍｏｉ感染が見られ、ほとんどの細胞が緑の蛍光を発していた。１００μｌのＤｉｌ  １を２ｍｌのＭＭ培地に加えることにより、Ｄｉｌ  １のさらに１：２０希釈を行うことにした（Ｄｉｌ  ２）。次に、これを用いて各ウェルに５００μｌのＤｉｌ  ２を感染させた。
【０１８５】
ウイルス感染は蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ５１）下でＧＦＰフィルター（Ｃａｔ＃Ｕ−ＭＧＦＰＨＱ、Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用いて観察した。画像はｃｅｌｌＳｅｎｓデジタルイメージングソフトウエア（Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用いて取り込んだ。
【０１８６】
これらの結果から、予想された通り、緑色蛍光タンパク質を発現するＶＡＣＶ−ＣＯＰ（ＳＣＶ４０１Ｃ）はＣＨＯ細胞では増殖しないことが分かった。緑色蛍光を発する単細胞はウイルスが細胞に侵入し、ＥＧＦＰを含むその遺伝子を発現するが、感染性ウイルス粒子は生産できず、従って、隣接する細胞に感染が拡散できない結果である。しかしながら、ＣＰ７７を発現するＣＨＯ細胞株では、ワクシニアウイルスは新たな感染性ウイルスを生産することができ、隣接する細胞に拡散し、感染後１日目までに感染巣を形成する。
これらの感染巣は感染後の次の２日間でコンフルエント感染となり、３日目には細胞単層全体にＳＣＶ４０１Ｃが感染する。宿主域タンパク質ＣＰ７７を発現するＣＨＯ細胞は、親（天然）ＣＨＯ細胞とは異なり、ワクシニアウイルス感染を許容する。
【０１８７】
ＨＭＧ２０ＡはＨＭＧボックスドメインを含有するタンパク質ファミリーに属す。ＨＭＧタンパク質は、十字形などのひずんだＤＮＡ構造を認識する染色体リモデリングタンパク質である。それらはまたＤＮＡの副溝への結合によりＤＮＡの湾曲も誘導し得る。従って、ＨＭＧボックス含有タンパク質は、ＤＮＡ複製、組換え、または修復の際の染色体リモデリングに重要であると考えられる。加えて、特定のＨＭＧボックス含有タンパク質は、プロモーター部位で転写因子と相互作用することによって遺伝子転写に影響を及ぼすこともできる。
【０１８８】
Hsiao et al. 2006により報告されている研究は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞においてＣＰ７７がＨＭＧ２０Ａと結合することを示している。この宿主細胞タンパク質ＨＭＧ２０Ａは、ワクシニア感染ＣＨＯ細胞のウイルス工場でウイルスＤＮＡと結合すると思われ、この宿主細胞タンパク質はこのＤＮＡをウイルス工場内に「ロック」し、ワクシニア生活環の次の段階を妨げ、従って、後代感染性ウイルスの生産を妨げると仮定された。牛痘ウイルスによるＣＰ７７の発現は、宿主ＨＭＧ２０ＡをウイルスＤＮＡから取り去り、ウイルス生活環を再開させ、最終的に後代の感染性ウイルス粒子が生産されると思われる。
【０１８９】
しかしながら、ウイルス感染が存在しない場合にＣＨＯでＣＰ７７が発現すると、このタンパク質は細胞質中に存在する新たに合成されたＨＭＧ２０Ａを、それが核へ移行するまえに封鎖すると思われる。こうした場合、核におけるＭＧ２０Ａの機能は失われ、それはＤＮＡ複製、組換えおよび修復中に重要な役割を果たすとともに遺伝子転写中にその機能を果たすので、ＣＰ７７の発現は細胞増殖および維持中にＣＨＯ細胞の完全性を損なうと思われる。これは予期しないことに、ＣＰ７７を発現するＣＨＯ細胞株は親ＣＨＯ細胞株に比べて多世代にわたるその複製能に顕著な影響なく連続培養として容易に維持されたので、そのようには思われない。
【０１９０】
実施例４
多段階増殖試験
多段階増殖動態試験をｐ−ＬＬ０７−ＣＨＯで行った：
宿主域遺伝子ＣＰ７７を発現するＣＨＯ細胞株のワクシニアウイルス感染に対する許容性を評価し、ウイルス生産レベルを天然許容性ヒト細胞株−１４３Ｂで達成された生産レベルと比較した。
【０１９１】
目的は、ｐ−ＬＬ０７−ＣＨＯ細胞株、ＣＨＯ細胞株および１４３Ｂ細胞株におけるＶＡＣＶ−ＣＯＰの増殖特性を比較することであった。本研究では、ｐ−ＬＬ０７−ＣＨＯにより発現されたＣＰ７７の機能性を、この細胞株内でのＶＡＣＶ−ＣＯＰの増幅特性をＣＨＯ細胞（非非許容性）および１４３Ｂ細胞（許容性）におけるその増幅特性と比較して調べることにより試験した。
【０１９２】
材料および方法
細胞株の準備
ＣＨＯの準備：
１枚の６ウェルプレート（６ＷＰ）にＣＨＯ細胞を播種し、増殖培地（ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ）中でコンフルエントまで培養した。
【０１９３】
１４３Ｂの準備：
１枚の６ウェルプレート（６ＷＰ）に１４３Ｂ細胞を播種し、増殖培地（ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ）中でコンフルエントまで培養した。
【０１９４】
ｐ−ＬＬ０７−ＣＨＯの準備：
６ウェルプレート（６ＷＰ）にｐ−ＬＬ０７−ＣＨＯ細胞を播種し、増殖培地（ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ＋５００μｇ／ｍｌハイグロマイシンＢ）中でコンフルエントまで培養した。
【０１９５】
ＶＡＣＶ−ＣＯＰの希釈：
各６ＷＰの各ウェルに総容量５００μＬで０．０１ｐｆｕを感染させた。１００％コンフルエントでウェル当たりの細胞総数は４×１０６細胞である推定された。感染率０．０１ｐｆｕ／ウェルのためには、４×１０４ｐｆｕ／ウェルが必要とされ、従って、ウイルス原液を維持培地（ＲＰＭＩ／２％ＦＢＳ）で８×１０４ｐｆｕ／ｍＬに希釈した。
【０１９６】
感染：
各プレートの各ウェルから培養培地を除去し、５００μＬの希釈ウイルスを加え、室温で１時間インキュベートして細胞にウイルスを吸着させた。次に、ウイルス接種物を除去し、各感染ウェルを１ｍＬの無菌ＰＢＳで１回洗浄し、その後、２ｍＬのＭＭ／ウェル中、３７℃／５％ＣＯ２でインキュベートした。
【０１９７】
採取：
各プレートから２セットのウェルを感染後下記の時点で採取した：２４時間、４８時間、および７２時間。採取当日、細胞を培養培地中で破砕し、各細胞株からの２セットのウェルを合わせ、１０００ｇで５分間の遠心分離により細胞をペレットとした。各細胞ペレットを１ｍＬの１０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ  ｐＨ８に再懸濁させた。次に、再懸濁した細胞ペレットに凍結融解を３回行い、力価測定まで−８０℃で保存した。
【０１９８】
力価測定は、２４ウェルプレートで１００％コンフルエントまで培養したＶｅｒｏ細胞および１４３Ｂ細胞で行った。
【０１９９】
希釈：
冷凍庫からウイルス抽出液を取り出し、解凍し、音波処理を施して目に見える塊をホモジナイズした。ウイルス抽出液を維持培地で１０−８まで連続希釈した。
【０２００】
感染：
各ウェルから増殖培地を除去し、１ｍＬの各希釈液（各希釈率につき４ウェル、１０−２希釈から始め、各ウイルスにつき１プレート）を用いて室温で１時間感染させた。インキュベーション後、各プレートをインキュベーターに移し、３７℃／５％ＣＯ２で３日間インキュベートしてプラークを発達させた。
【０２０１】
力価の計算：
希釈液は２０〜５０プラークを含み、これらのプラークを数えた後に平均を求めた。この平均総数に希釈率の逆数を掛け、１ｍＬの感染を用いたので、得られた数値が力価（ｐｆｕ／ｍＬ）となる。
【０２０２】
標準誤差の計算：
９５％信頼区間での標準誤差（ＳＥ）は、平均値を構成した４つの力価測定値から下式：１．９５×（ＳＤ／√ｎ）（式中、ＳＤは小規模サンプルからの標準偏差であり、ｎは力価測定の反復回数である（この場合４））を用いて計算した。
【０２０３】
収量の計算：
これは力価が決定されたウイルス抽出液内のウイルス総量である：  平均力価測定値（ｐｆｕ／ｍＬ）×ウイルス抽出液の容量＝ｐｆｕ。
【０２０４】
増幅率の計算：
この数値は接種物として使用した量に対する増幅倍率を表す：  収量（ｐｆｕ）／接種物量（ｐｆｕ）。
【０２０５】
多段階増殖動態試験を６ウェルプレート−各細胞株、各時点につき２ウェル。各ウェルに４×１０４ｐｆｕのＶＡＣＶ−ＣＯＰを感染させ、採取については、各細胞株、各時点につき２ウェルを採取して合わせ、そこからウイルス抽出液を調製した。このウイルス抽出液の力価測定を行った（総容量１ｍＬは、２つを合わせて８×１０４ｐｆｕ（４×１０４ｐｆｕ×２）の接種物量から得られた感染に相当する）。力価測定は２種類の指標細胞株１４３ＢおよびＶｅｒｏを用いて行った。
【０２０６】
力価測定およびウイルス収量の結果をそれぞれ表３および４に示す。ＶＡＣＶ−ＣＯＰは非許容性ＣＨＯ細胞を増幅せず、すなわち、それは投入接種物で使用した量よりも少ないウイルスしか生産しなかった。しかしながら、宿主域遺伝子ＣＰ７７を発現するＣＨＯ細胞株におけるウイルス増幅は投入接種物の約２０００倍であった（指標細胞株として１４３Ｂ細胞を用いた場合の力価測定結果に基づく）。許容細胞からの増幅は投入接種物の約３０００倍であった。これらの標準誤差はオーバーラップするので、ｐ−ＬＬ０７−ＣＨＯと１４３Ｂ細胞の間の増幅の違いは統計学的に有意でない。
【０２０７】
これら２つの細胞株の間のウイルス増幅をＶｅｒｏ指標細胞からの力価測定結果を用いて比較すれば、増幅は１４３Ｂ細胞よりもｐ−ＬＬ０７−ＣＨＯ細胞で若干多いと思われたが、これは統計学的に有意でなかった。
【０２０８】
本研究では、ウイルス生産のレベルが接種物として使用したウイルス量よりもはるかに少なかったことから、ワクシニアウイルスはＣＨＯ細胞において非許容性であることがさらに確認された。しかしながら、ＣＨＯがＣＰ７７タンパク質をコードする牛痘ウイルス宿主域遺伝子を発現すれば、その時それはワクシニアウイルスに対して許容性となり、許容細胞株で見られるのと同じレベルまでウイルスの生産を支持する。また、それはこの細胞株をワクシニアの生産に「使用可能な」許容細胞基質に変換するために１つの宿主域遺伝子ＣＰ７７の発現のみを必要としたことも注目に値する。ＣＨＯは細菌と同程度に速く増殖し、ウシ胎仔血清などの生物学的添加物の必要なく定義された合成培養培地で培養することができ、かつ、バイオリアクターで細胞懸濁液として培養することができるという点でバイオテクノロジー適合性細胞株であるので、ＣＨＯからワクシニアを生産することは極めて望ましい。ＣＨＯはまた、生物学的医学的製品を生産する歴史を有し、よく特性決定されており、かつ、ＦＤＡおよびＥＭＥＡなどのバイオメディカル統制機関によって知られ、好まれている。
【０２０９】
構成的細胞プロモーターの制御下でＣＰ７７タンパク質を発現するトランスジェニックＣＨＯ細胞株は、高レベルの後代ウイルスを生じる天然許容細胞株で見られるものと同レベルまでのワクシニアウイルスの複製および増殖に対して許容性である。
【０２１０】
実施例５
ＣＨＯ−ＣＰ７７細胞におけるＭＶＡ増殖
ＣＨＯ、１４３Ｂおよびｐ−ＬＬ０７−ＣＨＯにおけるＭＶＡ＋ＧＦＰ増殖
材料および方法
【０２１１】
増殖培地（ＧＭ）：
１０％ＦＢＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、ペニシリンおよびゲンタマイシンを添加したＲＰＭＩ−１６４０、Ｈｅｐｅｓ
【０２１２】
維持培地（ＭＭ）：
２％ＦＢＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、ペニシリンおよびゲンタマイシンを添加したＲＰＭＩ−１６４０、Ｈｅｐｅｓ
【０２１３】
ｐ−ＬＬ０７−ＣＨＯ培養時の注意：
ｐ−ＬＬ０７−ＣＨＯ細胞株の一般増殖および維持はＧＭおよび５００μｇ／ｍＬのハイグロマイシンＢで行ったが、播種および感染前の１００％コンフルエントまでの培養については、細胞はハイグロマイシンＢを含まないＧＭ中で培養した。
【０２１４】
細胞準備：
１４３Ｂ細胞、ＣＨＯ細胞およびＰ−ＬＬ０７−ＣＨＯ細胞を複数の６ウェルプレートに播種し、細胞単層が１００％コンフルエントとなるまで３７℃／５％ＣＯ２にて増殖培地（ＧＭ）中で培養した。各細胞株につき１プレートを培養した。
【０２１５】
感染
・ＧＦＰ発現カセット（緑色蛍光タンパク質）を保持する組換えＭＶＡを用いて、６ウェルプレートで培養した細胞を感染させた。ＭＶＡ−ＧＦＰの力価が未知であるので、ウイルスを下記のように維持培地（ＭＭ）で連続希釈した。
・Ｄｉｌ  １：  ２０μｌのウイルス原液を２ｍｌのＭＭ培地で希釈し（１：１００希釈）、激しいボルテックス撹拌により混合した。
・Ｄｉｌ  ２：  ５００μｌのＤｉｌ  １を４．５ｍｌのＭＭ（１：１０３希釈）に加え、激しいボルテックス撹拌により混合した。
・Ｄｉｌ  ３：５００μｌのＤｉｌ  ２を４．５ｍｌのＭＭに加え（１：１０４希釈）、激しいボルテックス撹拌により混合した。
・Ｄｉｌ  ４：５００μｌのＤｉｌ  ３を４．５ｍｌのＭＭに加え（１：１０５希釈）、激しいボルテックス撹拌により混合した。
・各プレートの１ウェルに５００μｌの下記ウイルス希釈液Ｄｉｌ  ２、Ｄｉｌ  ３、およびＤｉｌ  ４を感染させた。
・プレートを５日間インキュベートし、蛍光細胞巣の発生および拡散を調べた。本研究では、Ｄｉｌ  ４は、３日間で、識別可能な蛍光細胞巣を生成した。各プレートの非感染ウェルを自家蛍光の対照とした。
【０２１６】
顕微鏡観察
ウイルス感染は蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ５１）下でＧＦＰフィルター（Ｃａｔ＃Ｕ−ＭＧＦＰＨＱ、Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用いて観察した。画像はｃｅｌｌＳｅｎｓデジタルイメージングソフトウエア（Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用いて取り込んだ。
【０２１７】
結果
これらの結果は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するＭＶＡは予想されたようにＣＨＯ細胞および１４３Ｂ細胞では増殖しないことを示した。緑色蛍光を発する単細胞はウイルスが細胞に侵入し、ＧＦＰを含むその遺伝子を発現するが、感染性ウイルス粒子は生産できず、従って、隣接する細胞に感染が拡散できない結果である。しかしながら、ＣＰ７７を発現するＣＨＯ細胞株では、ＭＶＡは新たな感染性ウイルスを生産することができ、隣接する細胞に拡散し、感染後１日目までに感染巣を形成し、３日までにさらに発達する。
【０２１８】
実施例６
ｐ−ＬＬ０７−ＣＨＯ感染から採取されたＭＶＡの宿主域制限の確認
細胞の準備
１４３Ｂ細胞、ＣＨＯ細胞およびＢＨＫ−２１細胞を複数の６ウェルプレートに播種し、細胞単層が１００％コンフルエントとなるまで３７℃／５％ＣＯ２にて増殖培地（ＧＭ）中で培養した。各細胞株につき１プレートを培養した。
【０２１９】
実施例５からのウイルス採取
実施例５のＤｉｌ  ３感染Ｐ−ＬＬ０７−ＣＨＯウェルからのＭＶＡ＋ＧＦＰを次のように感染５日後に採取した。
・上清および細胞の両方をウェルから採取し、１０００ｇで５分間遠心分離して感染細胞をペレットとした。
・細胞ペレットを５００μｌの１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８バッファーに再懸濁した。
・再懸濁細胞ペレットを少なくとも３回凍結および融解し、感染細胞からウイルスを放出させた。
【０２２０】
感染
・粗ウイルス抽出液の力価が未知であるために、実施例５と同様に、ウイルスをＭＭ培地で連続希釈した。
・各プレートの１ウェルに５００μｌの以下のウイルス希釈液Ｄｉｌ ２、Ｄｉｌ  ３、およびＤｉｌ  ４を感染させた。
・各プレートを５日間インキュベートし、蛍光細胞巣の発生および拡散を調べた。本研究では、Ｄｉｌ  ３は、３日間で、識別可能な蛍光細胞巣を生成した。
【０２２１】
顕微鏡観察
ウイルス感染は蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ５１）下でＧＦＰフィルター（Ｃａｔ＃Ｕ−ＭＧＦＰＨＱ、Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用いて観察した。画像はｃｅｌｌＳｅｎｓデジタルイメージングソフトウエア（Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用いて取り込んだ。
【０２２２】
結果
ＣＰ７７を発現するＣＨＯ細胞株から採取されたＭＶＡは、非許容細胞株ＣＨＯ（ハムスター）および１４３Ｂ細胞（ヒト）において増殖できないことによりその制限宿主域をなお維持した。ＣＨＯ細胞および１４３Ｂ細胞の感染後３日間緑色蛍光巣がないことは、これらの細胞株では感染性後代ウイルスが生産されなかったことを示す。しかしながら、緑色蛍光感染巣が感染後１日目までに見られ、その後３日にわたってサイズを増したことから、このＭＶＡは、ＢＨＫ２１細胞（ハムスター）に対するその宿主域をなお維持していた。
【０２２３】
結論
・宿主域タンパク質ＣＰ７７を発現するＣＨＯ細胞は、親（天然）ＣＨＯ細胞とは異なりＭＶＡ感染に対して許容性である。
・ＣＰ７７を発現するＣＨＯ細胞株で増殖したＭＶＡは、その宿主域をＣＨＯおよび１４３Ｂ（ヒト）などの非許容細胞株に拡大しなかった。
【０２２４】
実施例７
ｐＬＬ０７の構築
バックグラウンド情報：
ｐＰＨ５１  ＤＮＡ鋳型からのＣＰ７７（ＣＨＯコドン最適化）ＣＤＳ  ＰＣＲ産物を、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社のＩｎＦｕｓｉｏｎクローニングシステムによりｐＪ５０７−２（Ｈｙｇ＋）ＰｉｇｇｙＢａｃシステムにクローニングしてｐＬＬ０７を作出した。フラッグタグを有するＣＰ７７配列をｐＪ５０７−２のＢｓａＩに挿入し、それにより、ｃｏｍｅｔ  ＧＦＰ配列（配列番号３）を除去した。
【０２２５】
ｐＰＨ５１プラスミドＤＮＡからＣＰ７７−ＣＨＯ遺伝子をＰＣＲ増幅するために使用したＰＣＲプライマー対：
【化１】
2020039340.tif 000003
および
【化２】
2020039340.tif 000004
。フラッグタグ配列はＩｎｆ−ＬＬ０７−ＣＰ７７−Ｒｖプライマーにおいて太字で示されている。
【０２２６】
プラスミドインサート／カセット構成は次の通りである。インサート／カセットマップｐＬＬ７クローン＃３を配列決定に送った。
【０２２７】
１５のＡＢＩシーケンシングファイルとｐＬＬ０７リファレンスファイル「pLL07_ref.sbd」をＬａｓｅｒｇｅｎｅ’ｓ  ＤＮＡｓｔａｒ  Ｓｅｑｍａｎコンピュータープログラムに入力し、１つのコンセンサスコンティグにアセンブルした。これらのアラインメント配列を、参照配列の始めと終わりに一致するようにトリミングし、その後、コンセンサス配列の確立に影響のないようにアラインメントから参照配列を削除した。コンティグのコンセンサス配列は「pLL07_#3 consensus.seq」の名称のＤＮＡ配列ファイルとして保存した。コンティグの読み取り方向を決定したところ、参照配列と同じ読み取り方向に相当することが分かった。参照配列とpLL07_#3中の配列の間の不一致を識別する助けとするため、Ｍｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡｓｔａｒ）を用い、「pLL07_#3 consensus」を「pLL07_ref.sbd」参照配列に対して手動でアラインした。ＡＧＲＦシーケンシングサービスからのｐＬＬ０７クローン＃３の１５ＡＢ１ファイルを、Ｓｅｑｍａｎ（デフォルト設定）を用いてアセンブルしたところ１つのコンセンサスコンティグが得られ、これはｐＬＬ０７挿入参照配列の全長をカバーしていた。ｐＬＬ０７＿＃３の配列と参照配列の間には不一致は無かった。ｐＬＬ０７＿＃３コンティグコンセンサス中の挿入配列は、参照配列と同一である。
【０２２８】
実施例８
哺乳動物細胞におけるＧ１ＬおよびＩ７Ｌの発現
フラッグタグＧ１ＬまたはフラッグタグＩ７Ｌをコードする発現プラスミドを構築し、それらを用いて、これらのタンパク質を発現するトランスジェニック１４３Ｂ細胞株を作出した。これらの細胞を、形質導入細胞を陽性選択するためのジェネティシンの存在下で増幅され、ＰＣＲ分析によりこれらの細胞株のゲノム内にこれらのタンパク質コード配列の存在が確認されたものの、ウエスタンブロット解析では、抗ＤＤＤＤＫ抗体でプロービングした場合に、発現されたフラッグタグタンパク質の存在は検出できなった。
【０２２９】
Ｃ末端フラッグタグＣＯＰ−Ｇ１ＬおよびＣＯＰ−Ｉ７Ｌのタンパク質コード配列をＧｅｎｅＡｒｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により合成し、ＤＮＡ２．０  Ｉｎｃ（ＵＳＡ）から購入したｐＪ５０３−２（ｐｉｇｇｙＢａｃ−ネオマイシン抗生物質選択）のＢｓａＩ部位にサブクローニングした。このクローニング手順は、ｃｏｍｅｔＧＦＰをフラッグタグＧ１ＬまたはフラッグタグＩ７Ｌタンパク質コード配列に置き換える。得られたクローンは、Ｇ１Ｌ  ｐｉｇｇｙＢａｃベクターの場合にはｐＬＬ０８、およびＩ７Ｌ  ｐｉｇｇｙＢａｃベクターの場合にはｐＬＬ１０と呼称した。
【０２３０】
これら２つのプラスミドベクターの重要な特徴として、フラッグタグタンパク質コード配列が構成的ヒトプロモーターＥＦ１αの制御下にあり、これらの発現カセットはＮＰＴ
ＩＩ発現カセット（ネオマイシン耐性遺伝子）とともにレフトおよびライトトランスポゾンボーダーにより挟み込まれ、人工トランスポゾンエレメントを形成する。この人工トランスポゾンエレメントの外側に、ただし、同じプラスミド内に含まれて宿主ゲノムへのトランスポゾンエレメントの不可逆的組み込みを媒介するトランスポゾン酵素発現カセットが存在する。これらのトランスポゾンエレメントを保持する細胞は、細胞増殖培地にＧ４１８（ジェネティシン）を含めることによって陽性選択することができる。
【０２３１】
プラスミドベクターｐＬＬ０８（フラッグタグＧ１Ｌ）およびｐＬＬ１０（フラッグタグＩ７Ｌ）を１４３Ｂ細胞にトランスフェクトして、Ｇ１Ｌ−１４３Ｂ（Ｇ１Ｌ発現カセット含有）およびＩ７Ｌ−１４３Ｂ（Ｉ７Ｌ発現カセット含有）の２つの形質導入トランスジェニック細胞株を作出した。トランスポゾン組み込みに成功した細胞を、増殖培地にジェネティシンを含めることによって作業可能な量まで増殖させた。組み込みの成功を確認するために、ＱｉａｇｅｎからのＤＮｅａｓｙ  ＤＮＡ抽出キットをこのキットの説明マニュアルの指示に従って用い、これらのトランスジェニック細胞から全細胞ＤＮＡを抽出した。次に、抽出されたＤＮＡを、Ｇ１ＬおよびＩ７ＬのＰＣＲ増幅に特異的なＰＣＲプライマー対を用いるＰＣＲ増幅反応の鋳型として用いた。両細胞株は、それらのゲノム内のＧ１ＬおよびＩ７Ｌ  ＤＮＡ配列の存在に関して陽性であった。
【０２３２】
これらの細胞株によるＧ１ＬおよびＩ７Ｌの発現を調べるため、ＨＲＰコンジュゲート抗フラッグタグ抗体［Ｍ２］（抗ＤＤＤＤＫ抗体、Ａｂｃａｍ＃ａｂ４９７６３）を用いて各フラッグタグタンパク質の存在を検出することにより、ウエスタンブロット解析を行った。Ｇ１Ｌ−１４３Ｂ細胞株およびＩ７Ｌ−１４３Ｂ細胞株から抽出した全タンパク質を用いたこれらのウエスタンブロット解析の結果は、予想されたように、抗フラッグタグ抗体は１４３Ｂから抽出されたいずれのタンパク質も認識しないこと、およびもしフラッグタグ−ＣＰ７７トランスジェニックＣＨＯ細胞株（ＣＰ７７−ＣＨＯ）で発現されたフラッグタグタンパク質を認識できれば、その抗フラッグタグ抗体はフラッグタグタンパク質を認識できることが確認されることを示した。しかしながら、フラッグタグＧ１Ｌタンパク質はＧ１Ｌ−１４３Ｂサンプルからのタンパク質抽出液では検出できなかった。細菌により発現されたフラッグタグＩ７Ｌタンパク質は抗フラッグタグ抗体により検出できるが、この抗体はＩ７Ｌ−１４３Ｂ細胞株によるフラッグタグＩ７Ｌ発現を検出できなかった。
【０２３３】
Ｇ１Ｌ発現カセットおよびＩ７Ｌ発現カセットはそれらの各細胞株で検出できたことから、結論は、発現されたタンパク質がワクシニア感染の不在下で合成後に急速に分解される、すなわち、Ｇ１およびＩ７タンパク質は両方ともウイルス特異的酵素であって、それらのワクシニア特異的酵素基質が無ければ不安定であり得るか、またはこれら２つの発現カセットを駆動するプロモーターが欠損しているかのいずれかであり得る。別の仮説としては、ワクシニア感染の不在下でのこれらのタンパク質の発現は細胞に「毒性」があり、ジェネティシン選択過程で、トランスジェニックＧ１Ｌ発現カセットおよびＩ７Ｌ発現カセットについてはサイレントであり、ＮＰＴ  ＩＩ発現カセットについてはサイレントでなかった細胞は、Ｇ１ＬまたはＩ７Ｌタンパク質を発現しなかったジェネティシン耐性細胞の増幅を可能としたというものである。ｐＪ５０３−２  ｐｉｇｇｙＢａｃプラスミドは１４３Ｂ細胞におけるＣＯＰ−Ｄ１３Ｌの発現に関して本発明者らの研究室で好結果をもって使用されてきたことから、ＥＦ１αプロモーターは機能的であり、これらのタンパク質はワクシニア感染の不在下で不安定であったか、またはこれらのタンパク質の発現を駆動するプロモーターがジェネティシンの存在下での細胞増幅中に、「毒性」タンパク質の発現を回避するように選択的にサイレントとなったということが提案される。
【０２３４】
実施例９
必須の構造成熟またはアセンブリタンパク質の一例としてのＤ１３Ｌが哺乳動物細胞から発現され、Ｄ１３Ｌ遺伝子が欠失したワクシニアをレスキューし、Ｄ１３Ｌ欠損ワクシニアは感染細胞でタンパク質を発現する
【０２３５】
Ｄ１３レスキュー細胞株の構築−
アセンブリ／成熟プロセスの遮断による弱毒ワクシニアの一例として、コペンハーゲン株のＤ１３Ｌ  ＯＲＦを欠失のために標的化した。そうする上で、このタンパク質を発現する細胞株をまず、ＣＯＰ−Ｄ１３Ｌ欠損ウイルスが増殖可能なように構築しなければならない。レスキュー細胞株の構築のため、チャイニーズハムスター卵巣細胞株（しばしばＣＨＯと呼ばれる）が「バイオテクノロジー」適合性であることから、この細胞株を選択した。ＣＯＰ−Ｄ１３Ｌが欠失した感染性ワクシニアウイルスをレスキューするためには、この細胞株は、ワクシニアウイルスではなく細胞の転写機構を用いてその核ゲノムからＤ１３タンパク質を発現しなければならない。細胞により発現された、Ｃ末端タグアミノ酸配列ＤＹＫＤＤＤＤＫ（フラッグタグ、Hopp et al. 1988）を含有するＤ１３タンパク質のタンパク質アミノ酸配列をＣＨＯコドンについて最適化し、対応するヌクレオチド配列を作成した。この、哺乳動物プロモーターおよび哺乳動物ポリアデニル化シグナル配列からなるタグ含有Ｄ１３Ｌ−ＣＨＯコドン最適化発現カセットの核ＤＮＡへの安定組み込みは、Urschitz et al. 2010およびMatasci et al. 2011により報告されているタイプのトランスポゾン組み込み技術によって達成した。ＣＨＯの形質導入は、ＤＮＡ２．０  Ｉｎｃ（ＵＳＡ）から購入したｐｉｇｇｙ  Ｂａｃベクターシステムを用いて達成した。
【０２３６】
Ｄ１３Ｌタンパク質コード配列の構築−
Ｄ１３Ｌタンパク質コード配列は、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＧｅｎｅＡｒｔにより、ワクシニアウイルス・コペンハーゲン株のＤ１３Ｌ  ＯＲＦによりコードされているＤ１３アミノ酸からＤＮＡ配列を再構築することによって合成作製し、ＣＨＯ細胞での発現のためにコドンを最適化した。ＶＡＣＶ−ＣＯＰ  Ｄ１３Ｌ  ＯＲＦのタンパク質コード配列を配列表に示す。
【０２３７】
Ｄ１３Ｌ細胞形質導入ベクターの構築−
ｐＬＬ１７由来のコドンを最適化したＤ１３タンパク質コード配列（Ｄ１３ＬｃｈｏＴａｇｇｅｄ）をＰＣＲ増幅し、ＤＮＡ２．０  Ｉｎｃ（Ｃａｔ＃ｐＪ５０３−２）から購入したトランスポゾンｐｉｇｇｙＢａｃベクターｐＪ５０３−２（ＣｏｍｅｔＧＦＰおよびＮｅｏ＋を有するｐＨＵＬＫ  ｐｉｇｇｙＢａｃ哺乳動物発現ベクター）のＢｓａＩクローニング部位にサブクローニングし、ｐＬＬ１９を作出した。Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニング（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ：リガーゼ不含クローニング）によるＢｓａＩ間のクローニングは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ相同組換えにより、ｃｏｍｅｔ  ＧＰＦコード配列を除去してそれをタグＤ１３タンパク質コード配列に置き換える。この時、Ｄ１３Ｌｃｈｏタグタンパク質コード配列はヒト延長因子１αプロモーター（ＥＦ１ａ）の制御下となり、両方がトランスフェクト細胞のゲノムに安定に組み込まれた場合にネオマイシン耐性遺伝子と共発現される。宿主ゲノムへの安定組み込みは、ｐｉｇｇｙＢａｃベクターのレフトトランスポゾンボーダーとライトトランスポゾンボーダーによって挟み込まれたＤＮＡ配列のトランスポゾン組み込みにより媒介される。
【０２３８】
Ｄ１３Ｌｃｈｏタグ含有配列のＰＣＲ増幅は、以下のプライマー対を用いて行った。
フォワードプライマー配列：
【化３】
2020039340.tif 000005
【０２３９】
大文字、太字および下線のテキストの配列は、Ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎクローニングに必須の、ｐＪ５０３−２（Ｎｅｏ＋）中のｃｏｍｅｔ  ＧＦＰの上流のＢｓａＩ部位と相同な配列を表す。赤色の小文字および下線のテキストの配列は、改変コザック配列である。修飾のない大文字のテキストの配列は、ｐＬＬ１７のＤ１３Ｌｃｈｏタグ含有配列の５’末端と相同である。
【０２４０】
リバースプライマー配列：
【化４】
2020039340.tif 000006
【０２４１】
大文字、太字および下線のテキストの配列は、Ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎクローニングに必須の、ｐＪ５０３−２（Ｎｅｏ＋）中のｃｏｍｅｔ  ＧＦＰの下流のＢｓａＩ部位と相同な配列を表す。修飾のない大文字のテキストの配列は、ｐＬＬ１７のＤ１３Ｌｃｈｏタグ含有配列の３’末端と相同である。予想される１７１９ｂｐのＰＣＲ産物を、製造者の説明書に従ってＩｎＦｕｓｉｏｎクローニング（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）により、ＢｓａＩ切断ｐＪ５０３−２（Ｎｅｏ＋）にクローニングし、ｐＬＬ１９を作出した。
【０２４２】
Ｄ１３タンパク質を発現するＣＨＯ細胞株の構築：
ｐ−ＬＬ１９−ＣＨＯ−ＣＨＯ細胞を、一晩のインキュベーション後に５０％前後のコンフルエントとなるように、６ウェルプレートのウェルに播種した。ＱｉａｇｅｎからのＥｆｆｅｃｔｅｎｅトランスフェクション試薬（Ｃａｔ＃３０１４２５）を用い、製造者の説明書に従って、１μｇのｐＬＬ１９を１ウェルの５０％コンフルエントＣＨＯ細胞にトランスフェクトした。次に、トランスフェクト細胞を増殖培地（ＲＰＭＩ  １６４０／１０％ＦＢＳ／２ｍＭ  Ｇｌｕｔａｍａｘ／Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ）中で一晩インキュベートした。翌日、培地を形質導入細胞を選択するための１０００μｇ／ｍＬジェネティシンを含有する増殖培地に交換した。選択培地は２〜３日毎に交換した。形質導入細胞が９０〜１００％コンフルエントまで増殖した際に、ＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ（Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ、Ｃａｔ＃１２５６３−０２９）を用いてそれらを回収し、さらなる細胞拡大培養のためにＴ２５フラスコに播種した。
【０２４３】
ウエスタンブロット法によるＤ１３発現の確認−
ウサギ抗Ｄ１３抗血清の作製：
ウサギに天然Ｄ１３タンパク質のＣ末端アミノ酸に相当する１６アミノ酸のペプチドにＫＬＨタンパク質を連結させたものを注射した。このアミノ酸配列は、ＣＹＤＱＧＶＳＩＴＫＩＭＧＤＮＮであった。１か月あけて合計３回の注射を行い、このアミノ酸配列の抗体を生成させた。注射したウサギからの血清を、以下の細胞抽出液に対してウエスタンブロット解析により調べた：１４３Ｂ全細胞抽出液、フラッグタグＤ１３Ｌを発現する１４３Ｂ  トランスジェニック細胞株（ｐ−ＬＬ０６−１４３ｂ）からの全抽出液およびＶＡＣＶ−ＣＯＰ感染１４３Ｂ細胞抽出液。これらの結果は、ウサギ抗Ｄ１３血清が明確にＤ１３タンパク質を特異的に認識できることを明らかに示した。
【０２４４】
ＣＨＯ形質導入細胞の調製−
Ｄ１３Ｌｃｈｏタグ形質導入ＣＨＯポリクローナル拡大培養細胞株（ｐ−ＬＬ１９−ＣＨＯ）を、通常のＣＨＯ細胞と同様にＴ２５フラスコ中で  １００％コンフルエントまで培養した。各フラスコからの細胞をＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ（Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ、Ｃａｔ＃１２５６３−０２９）で採取し、低速遠心分離（３００ｇ  ５分間）によりペレットとし、ＰＢＳで洗浄し、２００μＬのＰＢＳに再懸濁させた。
【０２４５】
ウエスタンブロット解析−
５０μＬの５×ＳＤＳ−ＰＡＧＥローディングバッファーを各細胞懸濁液に加えた後、９８℃で５分間インキュベートした。１５μＬの各細胞タンパク質抽出液を２枚の１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにロードし、電気泳動を行い、その後、エレクトロブロッティングによりＨｙｂｏｎｄ  ＥＣＬニトロセルロースにブロットした。次に、エレクトロブロット膜をＴｗｅｅｎ  ２０を含有するＴｒｉｓ緩衝生理食塩水（ＴＢＳＴ）に溶かした５％脱脂粉乳で室温にて１時間処理し、膜上の利用可能な総ての非特異的抗体結合部位をブロッキングした。次に、これらの膜をＴＢＳＴ中で数回洗浄した後、抗体でプロービングした。膜１は５０００希釈のＨＲＰコンジュゲート抗ＤＤＤＤＫタグ抗体［Ｍ２］（Ａｂｃａｍ、Ｃａｔ＃ａｂ４９７６３）で４℃にて一晩プロービングした。膜２は、１：２０００希釈のウサギＤ１３抗血清で４℃にて一晩プロービングし、ＴＢＳＴで３回洗浄した後、二次抗体として１：５０００希釈のＨＲＰコンジュゲート抗ウサギ抗体（Ａｂｃａｍ、Ｃａｔ＃ａｂ９７０６９）で２時間プロービングした。その後、両方の膜をＴＢＳＴ中で３回洗浄し、ユーザーマニュアルにより指示されているように、ＥＣＬウエスタンブロッティング検出試薬（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で処理し、Ｘ線フィルムに露光した。
【０２４６】
実施例１０
Ｄ１３Ｌ  ＯＲＦ欠失によるＶＡＣＶ−ＣＯＰの弱毒化
ワクシニアウイルスを弱毒化するために、保存されている後期プロモーター配列をＣＯＰ−Ｄ１３Ｌ  ＯＲＦのタンパク質コード配列の大部分とともに、相同組換えによる欠失の目印とし、その代わりに選択／リポーターカセットを挿入し、これにより、相同組換えによる欠失に成功したものはＤ１３タンパク質を発現するＣＨＯ細胞株に関して選択でき、ここで、感染は赤色蛍光によって可視化することができる。選択／リポーターカセットは、ワクシニアプロモーターの制御下のＣＰ７７を発現するＣＨＯ宿主域遺伝子とＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ２配列からなる。
【０２４７】
ＣＯＰ−Ｄ１３Ｌ欠失相同組換えベクターの構築−
相同組換えによるＶＡＣＶ−ＣＯＰからのＤ１３Ｌ  ＯＲＦの欠失のために、ＣＯＰ−Ｄ１３Ｌ  ＯＲＦの両側に隣接する２つの相同組換えアームを設計した。しかしながら、ＣＯＰ−Ｄ１２Ｌ  ＯＲＦのプロモーター配列はＣＯＰ−Ｄ１３Ｌ  ＯＲＦの３’末端内にあり得ることから、ＣＯＰ−Ｄ１３Ｌ  ＯＲＦの３’末端およそ２００ｂｐはそのまま残した。
【０２４８】
相同組換えアームＦ１およびＦ２の構築−
相同組換えアームをＶＡＣＶ−ＣＯＰゲノムＤＮＡから、以下に示すプライマー対を用いてＰＣＲ増幅した。太字で下線のテキストは、Ｆ１およびＦ２アームと選択／リポートカセットおよびＣｌｏｎｔｅｃｈからのＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎキットに供給されている線状ｐＵＣ１９を連結するためのＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎアームを表す。Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ連結の結果、ｐＬＬ０９と呼ばれる環化プラスミドが形成される。
【０２４９】
ＶＡＣＶ−ＣＯＰ  ＤＮＡからＤ１３Ｌ−Ｆ１アームをＰＣＲ増幅するために使用したＰＣＲプライマー対：
【化５】
2020039340.tif 000007
。
太字で下線のテキスト（１５ｂｐ）は、ＣｌｏｎＴｅｃｈ  Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎキットによって供給される線状ｐＵＣ１９プラスミドに左末端と相同な配列を表す。
【０２５０】
【化６】
2020039340.tif 000008
。
太字で下線のテキスト（１５ｂｐ）は、選択／リポーターカセットの５’末端と相同な配列を表す。予想されるＰＣＲ産物サイズは６５７ｂｐである。
【０２５１】
ＶＡＣＶ−ＣＯＰ  ＤＮＡからＤ１３Ｌ−Ｆ２アームをＰＣＲ増幅するために使用したＰＣＲプライマー対：
【化７】
2020039340.tif 000009
。
太字で下線のテキスト（１５ｂｐ）は、選択／リポーターカセットの３’末端と相同な配列を表す。
【０２５２】
【化８】
2020039340.tif 000010
。
太字で下線のテキスト（１５ｂｐ）は、ＣｌｏｎＴｅｃｈ  Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎキットによって供給される線状ｐＵＣ１９プラスミドの右末端と相同な配列を表す。予想されるＰＣＲ産物サイズは６２１ｂｐである。
【０２５３】
選択／リポーターカセットの構築−
選択／リポーター発現カセットは、牛痘ウイルス  ０２５Ｌ  ＯＲＦ（ブライトンレッド株）由来のＣＰ７７  ＣＨＯ宿主域遺伝子およびＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ２の赤色蛍光タンパク質コード配列からなる。この発現カセットを、ＣＰ７７タンパク質コード配列がその天然プロモーター（ＣＰ７７  ＡＴＧ開始コドンの上流１００ｂｐ配列）の制御下にあり、かつ、ポックスウイルス初期転写終止配列（Ｔ５ＮＴ）で終わるように、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＧｅｎｅＡｒｔにより、合成作製した。ＤｓＲｅｄタンパク質コード配列はワクシニアウイルス初期／後期プロモーターの制御下にあり、また、ポックスウイルス初期転写終止配列で終わる。
【０２５４】
ｐＬＬ０９のアセンブリ−
Ｄ１３Ｌ−Ｆ１およびＤ１３Ｌ−Ｆ２  ＰＣＲ産物を選択／リポーターカセットとともに、ＣｌｏｎＴｅｃｈからのＩｎＦｕｓｉｏｎキットに供給されるｐＵＣ１９中に、製造者の説明書に従うＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニングによってアセンブルし、ｐＬＬ０９を作出した。
【０２５５】
相同組換えおよびプラーク精製によるＣＯＰ−Ｄ１３Ｌの欠失によるＳＣＶ１０４の作出−
ＣＯＰ−Ｄ１３Ｌ  ＯＲＦを、タンパク質コード配列の大部分と保存されている後期プロモーターエレメント「ＴＡＡＡＴ」を欠失させることによって不活性とした。ＣＯＰ−Ｄ１３Ｌ  ＯＲＦはワクシニアウイルス後期プロモーターの制御下にあり、ここで、保存されている後期プロモーターエレメントはプロモーター活性に極めて重要である(Moss, 2007) −これの欠失はＣＯＰ−Ｄ１３Ｌ  ＯＲＦのサイレント化をもたらす。タンパク質コード配列および保存されているプロモーターエレメントの欠失は、ＶＡＣＶ−ＣＯＰとｐＬＬ０９の間の相同組換えによって達成され、相同組換えの結果、欠失した領域にＣＰ７７／ＤｓＲｅｄ発現カセットが挿入される。この発現カセットの挿入は、この際にＳＣＶ１０４と呼ばれる組換えウイルスを、ＣＨＯ細胞で、ただし、ｐ−ＬＬ１９−ＣＨＯなどの機能的Ｄ１３タンパク質を発現する細胞でのみ増殖可能とする。相同組換え後、混入している「持ち越し」の親ウイルス（ＶＡＣＶ−ＣＯＰ）は、複数回の連続的プラーク精製によって除去された。混入親ウイルスの存在は挿入部位のＰＣＲ分析によってモニタリングした。
【０２５６】
相同組換え−
増殖培地（ＲＰＭＩ−１６４０／１０％ＦＣＳ／２ｍＭ  Ｇｌｕｔａｍａｘ／Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐおよび１０００μｇ／ｍＬジェネティシン）を含有する３本のＴ２５フラスコにｐ−ＬＬ１９−ＣＨＯを播種し、１００％コンフルエントまで３７℃／５％ＣＯ２で培養した。感染当日、２本のフラスコにｍｏｉ  ０．０１ｐｆｕ／細胞でＶＡＣＶ−ＣＯＰを感染させ、他のフラスコは非感染とした（非感染対照）。フラスコ１および２を室温で４５分間感染させた後、ウイルス接種物を除去し、細胞単層をＰＢＳで２回洗浄した。洗浄後、４ｍｌの維持培地（ＭＭ：ＲＰＭＩ−１６４０／２％ＦＣＳ／２ｍＭ  Ｇｌｕｔａｍａｘ／Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ）を、同じ洗浄工程を経たフラスコ３を含め、各フラスコに加えた。
【０２５７】
トランスフェクションはＥｆｆｅｃｔｅｎｅトランスフェクション試薬（Ｑｉａｇｅｎ、Ｃａｔ  Ｎｏ  ３０１４２５）を用い、製造者の説明書に従って行った。簡単に述べれば、１６μＬのエンハンサーを１５０μＬのＥＣバッファー中２μｇの線状ｐＬＬ０９に加え、十分に混合した後に室温で５分間静置した。これに２５μｌのＥｆｆｅｃｔｅｎｅトランスフェクション試薬を加え、室温で１０分間静置した。最後に、１ｍｌのＭＭ（ＲＰＭＩ−１６４０／２％ＦＣＳ／２ｍＭ  Ｇｌｕｔａｍａｘ／Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ）をこの混合物に加え、穏やかに十分に混合した。次に、このトランスフェクション混合物を、事前にＶＡＣＶ−ＣＯＰに感染させたフラスコ１に加えた。
【０２５８】
フラスコ１（相同組換え）、２（感染のみの対照）、３（非感染対照）を３７℃／５％ＣＯ２で一晩インキュベートし、翌日、各フラスコの培地をフラスコ当たり５ｍＬのＭＭに交換し、フラスコ１のみに顕著なＣＰＥが見られるまで、３７℃／５％ＣＯ２でさらにインキュベートした。ＶＡＣＶ−ＣＯＰはＣＨＯ細胞に対しては非感染性であるのでフラスコ２には感染の徴候はないはずであり、フラスコ３の単層は健常を呈するはずである。
【０２５９】
一晩感染の後、赤色蛍光細胞は、倒立蛍光顕微鏡観察下で明確に識別可能であった。フラスコ１の細胞を、培養培地中で細胞を破砕した後、低速遠心分離（５００ｇ  室温で５分）によりペレットとし、その細胞ペレットを１ｍＬの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８に再懸濁させることによって採取することにした。ウイルス抽出液は複数回の凍結および解凍により調製した後、プラーク精製段階まで−８０℃で保存した。このウイルス構築物をＳＣＶ１０４と呼称した。
【０２６０】
プラーク精製法−
原理は、相同組換え抽出液を連続希釈し、各希釈液を用いて、４８ウェルプレート中で培養した１列のｐ−ＬＬ１９−ＣＨＯ細胞に感染させるというものである。この目的は、１ｐｆｕ感染／ウェルまでウイルスを希釈し、次に、感染のおよそ３０時間後に蛍光プラークを１つだけ含むウェルを探し、その後採取することである。
【０２６１】
ｐ−ＬＬ１９−ＣＨＯ細胞を４８ウェルプレートの各ウェルに播種し、１０００μｇ／ｍＬジェネティシンを含有する増殖培地（ＲＰＭＩ−１６４０／１０％ＦＢＳ／２ｍＭ  Ｇｌｕｔａｍａｘ／ｐｅｎ−ｓｔｒｅｐ）中、３７℃／５％ＣＯ２で１００％まで培養した。
【０２６２】
感染については、相同組換え抽出液（ＳＣＶ１０４）を解凍し、軽く音波処理を施して塊状物および凝集物を解体した。１ｍＬ容量中、ＭＭ（ＲＰＭＩ／２％ＦＢＳ／Ｇｌｕｔａｍａｘ／ＰｅｎＳｔｒｅｐ）を用い、ウイルス抽出液の１０倍連続希釈を１０−５まで行った。各希釈液について、各ウェルから増殖培地を除去した後に４８ウェルプレートの１列に５００μＬの希釈ウイルスを播種し、ＰＢＳで１回洗浄した。この４８ウェルプレートを、ウイルスを吸着させるために室温で４５分間置いた。ウイルス吸着後、ウイルス接種物を各ウェルから注意深く除去し、ウェル当たり５００μＬのＰＢＳからなる洗浄工程によって残留接種物を除去した。洗浄後、５００μＬのＭＭ（ＲＰＭＩ／２％ＦＢＳ／Ｇｌｕｔａｍａｘ／ＰｅｎＳｔｒｅｐ）を各ウェルに加え、次いで、蛍光顕微鏡下で赤色蛍光の感染巣が明確に見られるまで３７℃／ＣＯ２でインキュベートした。
【０２６３】
採取には、可能な最低希釈液で蛍光巣を１つだけ含有するウェルのみを選択した。選択したウェルから培地を注意深く除去し、１００μＬの１０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ  ｐＨ８を加えた。このプレートを３回凍結解凍した後、選択したウェルの培養物を回収した。各回収プラークについて、このプラーク精製行程をさらに５回繰り返した。
【０２６４】
次に、選択されたクローンを、１００％コンフルエントのｐ−ＬＬ１９−ＣＨＯ細胞を含有する６ウェルプレートの１ウェルに感染させることにより（ウェルから増殖培地を除去してＰＢＳで５００μＬに希釈した１０μＬのウイルス抽出液を加えることによる）さらに増幅した。室温で４５分後、２ｍＬのＭＭをウェルに加え、３７℃／５％ＣＯ２で３日間、蛍光顕微鏡下で大多数の細胞が赤色蛍光を発するまでインキュベートした。感染ウェル内の細胞を培養培地中で破砕した後、５００ｇで５分間ペレット化した。これらのペレット細胞を５００μＬの１０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ  ｐＨ８に再懸濁させ、軽く音波処理を施してウイルス抽出液を作製した。
【０２６５】
ＳＣＶ１０４のＤ１３Ｌ  ＯＲＦへのＣＰ７７／ＤｓＲｅｄ発現カセット挿入のＰＣＲ確認−
相同組換えおよびプラーク精製後に、Ｄ１３Ｌ  ＯＲＦが実際にＣＰ７７／ＤｓＲｅｄ発現カセットで置換されていたかどうかを判定するためにＰＣＲ分析を行った。ＰＣＲプライマー対は、それらが「導入された」ＤＮＡではなく「天然」ＤＮＡ配列に結合するよう、２つのフランキング相同組換えアームの領域の外側に結合するように設計した。このような方法でのプライマー対の設計は、このプライマー対がＰＣＲ増幅のＤＮＡ鋳型としてＶＡＣＶ−ＣＯＰおよびＳＣＶ１０４を使用することができ、ＰＣＲ産物のサイズが発現カセットのＤ１３Ｌ  ＯＲＦへの挿入、または挿入のないウイルス、すなわち、ＶＡＣＶ−ＣＯＰの検出の指標となることを意味する。このＰＣＲアッセイは挿入の存在を示すだけでなく、複数回のプラーク精製の後に残留する混入親ウイルス（ＶＡＣＶ−ＣＯＰ）がなお存在するかどうかを確認することもできる。ＶＡＣＶ−ＣＯＰの望まない微量混入の存在は、この混入がＳＣＶ１０４にトランスでのＤ１３ヘルプを提供する可能性があり、それによりＳＣＶ１０４の弱毒生が低下することから、極めて望ましくない。
【０２６６】
ＱＩＡＧＥＮ  ＤＮｅａｓｙ  Ｔｉｓｓｕｅキット（Ｃａｔ＃６９５０４）を用いたＤＮＡ抽出−
ウイルスＤＮＡは、２００μＬの上記ＳＣＶ１０４増幅ウイルスからＤＮｅａｓｙ  Ｔｉｓｓｕｅキットを製造者の説明書に従って用いて抽出した。簡単に述べれば、これは、２０μｌのプロテイナーゼＫを２００μＬのウイルス抽出液に加えてよく混合することにより行った。これに、２００μｌのバッファーＡＬを加え、十分に混合し、その後、５６℃（加熱ブロック）で１０分間インキュベートした。インキュベーション後、２００μｌの１００％エタノールを加え、よく混合し、次いで、全内容物をスピンカラムに加えた。
製造者のユーザーハンドブックによって指示されているように、遠心分離によって液体をスピンカラムに通した後、スピンカラムをＡＷ１およびＡＷ２バッファーで洗浄した。スピンカラムに結合したＤＮＡを２回の１００μＬ  ＡＥバッファーで溶出させた。溶出したＤＮＡを１本の試験管に合わせ、ＰＣＲ分析用とするか、またはＰＣＲ分析まで４℃で保存した。
【０２６７】
ＰＣＲ増幅−
ＳＣＶ１０４から抽出したＤＮＡ（上記の第４．２．３．１節参照）をＰＣＲ増幅の鋳型として使用し、Ｄ１３Ｌ  ＯＲＦ内で挿入が起こったかどうかを判定した。下記のＰＣＲプライマーは、ＳＣＶ１０４  ＤＮＡからの増幅が、親ウイルスＶＡＣＶ−ＣＯＰから増幅された２８８１ｂｐのＰＣＲ産物とは対照的に４３６０ｂｐのＰＣＲ産物を増幅するように、Ｄ１３Ｌ  ＯＲＦの外側に隣接する配列に結合する。ＰＣＲ分析は、ＳＣＶ１０４の６回目のプラーク精製クローンが初めて４０００ｂｐより大きく５０００ｂｐより小さいものに相当する産物を増幅することを示し、このことはＳＣＶ１０４がＤ１３Ｌ  ＯＲＦ内にＣＰ７７／ＤｓＲｅｄカセットを含むことを示す。３０００ｂｐ前後のＰＣＲ産物が存在しないことは、このＳＣＶ１０４増幅原液には検出可能なレベルの親ウイルスの混入がないことを意味する。
【０２６８】
プライマー対の詳細
【化９】
2020039340.tif 000011
【０２６９】
実施例１１
プラーク感染力アッセイによるＳＣＶ１０４の弱毒化に関する試験
Ｄ１３Ｌ  ＯＲＦによりコードされるタンパク質はウイルスアセンブリに必須であるので、ＳＣＶ１０４によりレスキューされたウイルスが細胞に侵入しても、ワクシニアウイルスに対して許容性の通常細胞では感染性後代ビリオンを生産できず、従って、初期感染が隣接する細胞へ拡散して絶えず拡大する感染巣を形成することができないと予想される。これがその通りであることを確認するために、感染ウイルスの細胞から細胞への拡散が数日の期間でモニタリングできるように、本明細書に記載されるＤ１３Ｌ欠損ウイルス（ＳＣＶ１０４）を、少数のプラーク形成単位が６ウェルプレートで培養された細胞を感染させるために使用できる点まで連続希釈した。本研究では３種類の細胞株を検討した：ワクシニアウイルスに対して許容性である１４３Ｂ細胞、ワクシニアウイルスに対して非許容性であるが、ワクシニアウイルスがＣＰ７７タンパク質を発現する場合には可能となるＣＨＯ細胞およびＤ１３Ｌタンパク質を発現する組換え細胞株であるｐ−ＬＬ１９−ＣＨＯ。非機能性Ｄ１３−タンパク質が発現され得るようにＤ１３Ｌ  ＯＲＦ内にＣＰ７７／ＤｓＲｅｄ発現カセットが挿入された本発明に記載のウイルスが唯一、ｐ−ＬＬ１９−ＣＨＯ細胞株で感染力のある感染巣を形成するはずである。１４３Ｂ細胞単層内の感染巣の存在は、ウイルス集団混合物内に混入ワクシニアウイルスが存在することを示し、これは混入がＤ１３Ｌヘルプをトランスで提供するからである。ＣＨＯ単層内の感染巣の存在は、ＣＰ７７／ＤｓＲｅｄカセットの挿入がＤ１３Ｌ  ＯＲＦを不活化していなかったことを意味する。
【０２７０】
細胞の準備−
１４３Ｂ細胞、ＣＨＯ細胞およびｐ−ＬＬ１９−ＣＨＯ細胞を複数の６ウェルプレートに播種し、増殖培地（ＲＰＭＩ−１６４０／１０％ＦＢＳ／２ｍＭ  Ｇｌｕｔａｍａｘ／ｐｅｎ−ｓｔｒｅｐ、およびｐ−ＬＬ１９−ＣＨＯにのみ１０００μｇ／ｍＬジェネティシン）中、３７℃／５％ＣＯ２で、細胞単層が１００％コンフルエントとなるまで培養した。
【０２７１】
感染−
増幅した、３回目のプラーク精製ウイルス抽出液を細胞の感染に用いた。このウイルスの力価は未知であるため、下記のように、ウイルス原液の１０倍連続希釈を１０−４まで行った：まず、６０μｌのウイルス原液を６ｍｌのＭＭ培地で希釈し（Ｄｉｌ  １；  １：１００希釈）、次に、８００μｌの希釈液１を７．２ｍｌのＭＭ培地に加えることによりさらなる希釈液を作製し（希釈溶液２；１０−３希釈）、その後、１０−４希釈となるように繰り返した。感染については、５００μＬの各希釈液を６ウェルプレートの各ウェルに加え、各細胞株につき１プレートを使用した。ウイルス吸着は室温で４５分間行い、その後、ウイルス接種物を各ウェルから除去し、各ウェルをＰＢＳで洗浄し、その後、ＭＭを２ｍＬ／ウェルで加えた。これらのプレートを３７℃／５％ＣＯ２でインキュベートし、蛍光顕微鏡下で毎日観察した。１０−２希釈液が観察に最良のウイルス感染率を生じた。
【０２７２】
顕微鏡観察−
ウイルス感染は蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ５１）下でＤｓＲｅｄフィルター（Ｃａｔ＃Ｕ−ＭＲＦＰＨＱ、Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用いて観察した。ＣｅｌｌＳｅｎｓデジタルイメージングソフトウエア（Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用いて画像を取り込んだ。
【０２７３】
結果−
１０−２希釈液による感染で、初期単細胞感染および隣接細胞への感染の拡散を観察するために最良の結果が得られた。１４３Ｂ細胞の観察では、１日目に単細胞感染が存在し、このウイルスは２日目および３日目までに隣接細胞に拡散できなかったことを示し、このことは、ウイルスの単細胞への侵入は起こったものの、２日目および３日目までに感染性ウイルス後代は生産されなかったことを示す。ＣＨＯ単一感染細胞についても同じことが言え、すなわち、初期単細胞感染から感染性ウイルス後代は生産されなかった。
【０２７４】
ｐ−ＬＬ１９−ＣＨＯ細胞株の観察では、１日目までに小さな感染巣として見られるように、初期単細胞感染が後代感染性ウイルスを生産したことを示す。これらの感染巣は、２日目および３日目までに急速にサイズを増し、経時的にウイルス増幅が起こっていることを示す。
【０２７５】
よって、ワクシニアウイルスからの機能的ワクシニア半月体足場タンパク質コード配列の除去は、このウイルスを著しく弱毒化する。初期感染時に感染性後代ウイルスを生産できないとしても、そのタンパク質、特にＤｓＲｅｄの発現は、視覚的赤色蛍光からの証拠として初期単一感染細胞に見られる。このウイルスは、ワクシニアウイルス感染とは独立に、ワクシニア半月体足場タンパク質を発現する細胞株からレスキューされ得る。トランスジェニック細胞株によるワクシニア半月体足場タンパク質の構成的発現は、この細胞株の増殖または生理に悪影響を示さない。
【０２７６】
実施例１２
Ｄ１３Ｌを発現するＣ１１−ＬＬ１９−ＨｅＬａ細胞株の構築
Ｄ１３Ｌ欠失を有する非蛍光ＳＣＶの力価を測定するために、溶菌斑の形成を支持するワクシニア許容細胞株からなるＤ１３タンパク質発現レスキュー細胞株を作出した。ＣＨＯ細胞では、ＣＰ７７を発現するワクシニアウイルスまたはＣＰ７７の細胞株発現は、クリスタルバイオレットにより染色可能で目視で計数できる溶菌斑の形成を支持しない。力価測定細胞株を作出するために、ＨｅＬａ細胞に、構成的哺乳動物プロモーター、開始コドンの前後にコザック配列を含むＤ１３タンパク質コード配列からなりポリアデニル化シグナル配列で終わる発現カセットの安定組み込みによりＤ１３タンパク質を発現するように形質導入を行った。次に、このカセットを、宿主細胞ゲノムＤＮＡへの安定な遺伝子導入および抗生物質選択による組み込み成功の選択を可能とするプラスミドベクターにクローニングした。次に、形質導入細胞を、Ｄ１３発現カセットを含む細胞を選択するための抗生物質選択を使用することにより増殖させ、その後、０．００１ｐｆｕ／細胞のｍｏｉで細胞単層に感染させ、３日で最大のプラークサイズを生じた細胞株クローンを選択することにより、ＳＣＶ１０４（Ｄ１３Ｌ  ＯＲＦ欠失）でプラークアッセイを行った。ＳＣＶ１０４は、そのＤ１３Ｌ  ＯＲＦが２つの発現カセット：一方はＣＰ７７タンパク質の発現のためのもの、他方は赤色蛍光タンパク質の発現のためのものに置き換わっている。
Ｄ１３タンパク質を発現するＨｅＬａ細胞株にＳＣＶ１０４を感染させると、赤色蛍光溶菌斑が生じる。
【０２７７】
ｐＬＬ１９の構築−
Ｄ１３細胞形質導入ベクター：
ｐＬＬ１９の構築は上記されている。このプラスミドでは、Ｃ末端フラッグタグＤ１３タンパク質(protrein)コード配列が構成的ヒト延長因子１αプロモーターの制御下にあり、細胞ゲノムＤＮＡへの安定な遺伝子導入は転位により媒介される。転位はまた、増殖培地にＧ４１８／ジェネティシンを加えることにより形質導入細胞が陽性選択できるように、ネオマイシン抗生物質選択発現カセットも挿入する。
【０２７８】
ｐＬＬ１９を用いた形質導入によるＨｅＬａ細胞へのＤ１３−フラッグタグ発現カセットの安定挿入：
ＨｅＬａ細胞をＴ２５フラスコに播種し、ＲＰＭＩ−１６４０／１０％ＦＢＳ／２ｍＭ
Ｇｌｕｔａｍａｘ／ｐｅｎ−ｓｔｒｅｐ増殖培地中でおよそ５０％コンフルエントまで培養した。Ｑｉａｇｅｎ（Ｃａｔ＃３０１４２５）からのＥｆｆｅｃｔｅｎｅトランスフェクション試薬を用い、製造者の説明書に従って、１μｇのｐＬＬ１９をＴ２５フラスコの５０％コンフルエントＨｅＬａ細胞にトランスフェクトした。次に、トランスフェクト細胞を増殖培地（ＲＰＭＩ  １６４０／１０％ＦＢＳ／２ｍＭ  Ｇｌｕｔａｍａｘ／Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ）中で一晩インキュベートした。翌日、培地を形質導入細胞を選択するための１０００μｇ／ｍＬジェネティシンを含有する新鮮な増殖培地に交換した。ほとんどの細胞が死滅した際に、残っている細胞を、ＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ（Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ、Ｃａｔ＃１２５６３−０２９）を用いてそれらをフラスコ表面から剥がすことによって回収し、増殖培地および１０００μｇ／ｍＬジェネティシンを含有する９６ウェルプレートで単細胞を選別した。これらのプレートを各ウェルに細胞のコロニーが見られるまで３７℃／５％ＣＯ２でインキュベートした。選択培地は２〜３日毎に交換した。細胞の各コロニーを回収し、以下のように培養することにより連続的に拡大培養した：４８ウェルプレートから２４ウェルプレートへ、６ウェルプレートへ、Ｔ７５フラスコへ、冷凍細胞原株を作製するまで１：５分割比でＴ７５フラスコにて維持。
【０２７９】
ＳＣＶ１０４プラーク形成を最良に支持するモノクローナル細胞株のスクリーニング：
ＳＣＶ１０４は、そのＤ１３Ｌ  ＯＲＦが牛痘ウイルス０２５ＬプロモーターおよびＣＰ７７タンパク質をコードするＯＲＦならびに赤色蛍光タンパク質発現カセット（ＤｓＲｅｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓ２）に置き換えられているワクシニアウイルスである。ＣＰ７７発現はＨｅＬａ細胞におけるプラーク形成には重要でないかまたは必要でないが、このウイルスはＤ１３タンパク質の細胞株発現の不在下では増殖しない。しかしながら、Ｄ１３タンパク質を発現するＨｅＬａ細胞株では、ＳＣＶ１０４は増幅し、他の隣接細胞に拡散し、そうすることで細胞単層において赤色蛍光溶菌斑を形成することができるはずである。
このウイルスを、プラーク形成を最良に支持するクローンを選択するために、クローンＬＬ１９−ＨｅＬａ細胞株におけるプラーク形成試験で使用した。
【０２８０】
細胞株の準備：
ＬＬ１９−ＨｅＬａのいくつかの細胞株クローンを６ウェルプレートのウェルに播種し、１０００μｇ／ｍＬのジェネティシンを含有する増殖培地中で１００％コンフルエントまで３７℃／５％ＣＯ２で培養した。
【０２８１】
ウイルス感染：
ＳＣＶ１０４を用い、ウイルスをＭＭ（ＲＰＭＩ−１６４０／２％ＦＢＳ／２ｍＭ  Ｇｌｕｔａｍａｘ／ｐｅｎ−ｓｔｒｅｐ）で１０３ｐｆｕ／ｍｌに希釈することにより、０．００１ｐｆｕ／細胞で細胞に感染させた。１ｍｌの希釈ウイルスを感染のために各ウェルに加えた。６ウェルプレートの各ウェルは、コンフルエントの際におよそ１×１０６細胞を含むので、１ｍｌの１０３ｐｆｕ／ｍｌはｍｏｉ  ０．００１となる。ｍｏｉ  ０．００１は、１個の感染細胞からのプラーク形成を保証する。総てのプレートを室温で１時間インキュベートし、これによりウイルスは細胞に吸着でき、その後、１ｍＬのＭＭを各ウェルに加え、次いで、総てのプレートを３７℃／５％ＣＯ２でインキュベートして細胞へのウイルスの同時的侵入を促進し、その後、ウイルス増幅により細胞から細胞への拡散が経時的に起こった。赤色蛍光プラークの形成を蛍光顕微鏡下で毎日観察した。
【０２８２】
顕微鏡観察：
３日間のウイルス感染およびプラーク形成を蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ５１）下でＤｓＲｅｄフィルター（Ｃａｔ＃Ｕ−ＭＲＦＰＨＱ、Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用いて観察した。ＣｅｌｌＳｅｎｓデジタルイメージングソフトウエア（Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用いて画像を取り込んだ。
【０２８３】
結果：
感染後１日目に、総ての感染が散在する小さな赤色蛍光巣を生じた。３日目までに、総てのクローン細胞株が相当な大きさの赤色蛍光溶菌斑を生じ、クローン１１（Ｃ１１）は試験した総てのクローンで有意に最大のプラークサイズを生じた。
【０２８４】
結論：
これらの結果は、Ｃ１１クローン（Ｃ１１−ＬＬ１９−ＨｅＬａ）は、ＳＣＶ１０４感染から、試験した総てのクローンで最大のプラーク形成を支持するのに十分なＤ１３タンパク質を発現していたことを示す。この細胞株クローン（Ｃ１１）は、ワクシニアウイルスの力価測定を行うために慣用される力価測定の溶菌斑計数法を用いてＤ１３Ｌ欠失ワクシニアウイルスを定量するために優れている。
【０２８５】
実施例１３
ＣＰ７７およびＤ１３Ｌを発現するｐ−ＬＬ０７−ＬＬ２９−ＣＨＯ細胞株の構築
ＣＨＯ細胞においてＤ１３Ｌ  ＯＲＦ欠失を有するＶＡＣＶ−ＣＯＰウイルスをレスキューするためには、Ｄ１３およびＣＰ７７タンパク質を発現するＣＨＯ細胞株を構築しなければならないと思われた。これを、発現を駆動するための哺乳動物プロモーター、Ｄ１３またはＣＰ７７タンパク質をコードする、ＣＨＯに好ましくコドンを最適化したＤＮＡ配列、続いてポリアデニル化シグナル配列からなるＤ１３哺乳動物発現カセットおよびＣＰ７７哺乳動物発現カセットを構築することにより行った。次に、これらのカセットを、宿主細胞ゲノムＤＮＡへの安定な遺伝子導入および抗生物質選択による組み込み成功の選択を可能とするプラスミドベクターにクローニングした。次に、形質導入細胞を、Ｄ１３発現カセットとＣＰ７７発現カセットを含む細胞を選択するための抗生物質選択を使用することにより増殖させた。ＣＰ７７の発現を確認するために、増強緑色蛍光タンパク質（ＳＣＶ５０５）を発現するワクシニアウイルスを用いてトランスジェニック細胞株に感染させ、蛍光プラークの生成を４日間にわたってモニタリングした。４日わたって絶えず拡大する緑色蛍光プラークサイズにより、この細胞株によるＣＰ７７発現が確認された。Ｄ１３タンパク質の発現を確認するために、ＣＰ７７（ＳＣＶ１０４）およびＤｓ赤色蛍光タンパク質を発現するＤ１３Ｌ欠損ワクシニアウイルスを用いてトランスジェニック細胞株に感染させ、プラークの生成を４日間にわたってモニタリングした。４日にわたって絶えず拡大する赤色蛍光プラークサイズにより、この細胞株によるＤ１３タンパク質発現が確認された。
【０２８６】
ｐＬＬ０７の構築−  ＣＰ７７遺伝子導入プラスミド
ＣＰ７７タンパク質コード配列の構築：
ＣＰ７７タンパク質コード配列は、ＧｅｎｅＡｒｔ  ＧｍｂＨ（ドイツ）により、牛痘ウイルス・ブライトンレッド株ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｐ１２９３２．１の０２５Ｌ  ＯＲＦによりコードされるＣＰ７７のアミノ酸配列からＤＮＡ配列を再構築（バックトランスレーションまたはリバーストランスレーション）することによって合成生成され、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞での発現のためにコドンが最適化された。
【０２８７】
ＣＰ７７細胞形質導入ベクターの構築：
ｐＰＨ５１（コドンが最適化されたＣＰ７７タンパク質配列を保持するクローニングプラスミド）由来のコドンが最適化されたＣＰ７７タンパク質コード配列を、５’プライマーが開始コドン前後にコザック配列を付加するように設計され、３’プライマーが終止コドンの前にフラッグタグ配列を付加するように設計されたＰＣＲプライマー対を用いてＰＣＲ増幅した。増幅されたＰＣＲ産物を、ＤＮＡ２．０  Ｉｎｃ（ＵＳＡ）から購入したトランスポゾンｐｉｇｇｙｂａｃベクターｐＪ５０７−２（Ｈｙｇ＋）にＢｓａＩクローニング部位を介してサブクローニングした。ＢｓａＩ部位へのクローニングは、ｃｏｍｅｔＧＰＦコード配列をＣＰ７７タンパク質コード配列に効果的に置き換えてｐＬＬ０７作出する。この時、ＣＰ７７は構成的ヒト延長因子１αプロモーター（ＥＦ１ａ）の制御下となり、両者がトランスフェクト細胞のゲノムに安定に組み込まれれば、ハイグロマイシン耐性遺伝子とともに共発現される。宿主ゲノムへの安定組み込みは、ｐｉｇｇｙＢａｃベクターのレフトおよびライトトランスポゾンボーダーが結合しているＤＮＡ配列のトランスポゾン組み込みにより媒介される。
【０２８８】
ｐＰＨ５１プラスミドＤＮＡからＣＰ７７−ＣＨＯ遺伝子をＰＣＲ増幅するために使用したＰＣＲプライマー対：
フォワードプライマー配列：
【化１０】
2020039340.tif 000012
リバースプライマー配列：
【化１１】
2020039340.tif 000013
。
フラッグタグ配列を下線で示し、これに終止コドンが続く（小文字）。
【０２８９】
ｐＬＬ２９−Ｄ１３遺伝子導入プラスミドの構築
ＣＨＯコドン最適化Ｄ１３タンパク質コード配列をｐＬＬ１９（従前に記載）からＰＣＲ増幅してＣ末端フラッグタグ配列とＨＡタグ配列を交換し、その後、ＤＮＡ２．０  Ｉｎｃ（Ｃａｔ＃ｐＪ５０３−２）から購入したｐＪ５０３−０２（ＣｏｍｅｔＧＦＰおよびＮｅｏ＋を有するｐＨＵＬＫ  ｐｉｇｇｙＢａｃ哺乳動物発現ベクター）のＢｓａＩクローニング部位にクローニングした。
【０２９０】
Ｄ１３Ｌ−ＨＡ細胞形質導入ベクターの構築：
Ｃ末端フラッグタグ配列を含まないコドン最適化Ｄ１３タンパク質コード配列をｐＬＬ１９からＰＣＲ増幅し、ＤＮＡ２．０  Ｉｎｃ（Ｃａｔ＃ｐＪ５０３−２）から購入したＣｏｍｅｔＧＦＰおよびＮｅｏ＋）を有するトランスポゾンｐｉｇｇｙＢａｃベクターｐＪ５０３−２（ｐＨＵＬＫ  ｐｉｇｇｙＢａｃ哺乳動物発現ベクターのＢｓａＩクローニング部位にサブクローニングし、ｐＬＬ２９を作出した。Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニング（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ：リガーゼ不含クローニング）によるＢｓａＩ間のクローニングは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ相同組換えにより、ｃｏｍｅｔＧＰＦコード配列を除去してそれを新たにＨＡタグＤ１３タンパク質コード配列に置き換える。この時、Ｄ１３ＬｃｈｏＨＡタグタンパク質コード配列は構成的ヒト延長因子１αプロモーター（ＥＦ１ａ）の制御下となり、両方がトランスフェクト細胞のゲノムに安定に組み込まれた場合にネオマイシン耐性遺伝子と共発現される。宿主ゲノムへの安定組み込みは、ｐｉｇｇｙＢａｃベクターのレフトトランスポゾンボーダーとライトトランスポゾンボーダーによって挟み込まれたＤＮＡ配列のトランスポゾン組み込みにより媒介される。ｐＬＬ２９のプラスミドマップを以下に示す。
【０２９１】
Ｄ１３Ｌｃｈｏ−ＨＡタグ含有配列のＰＣＲ増幅は以下のプライマー対を用いて行った。
フォワードプライマー配列：
【化１２】
2020039340.tif 000014
リバースプライマー配列：
【化１３】
2020039340.tif 000015
下線の配列のテキストはＨＡコード配列を表す。「ｔｔａ」は終止コドンを表す。
【０２９２】
ｐＬＬ０７とｐＬＬ２９での同時形質導入によるＣＨＯ細胞へのＣＰ７７−フラッグタグ含有発現カセットとＤ１３−ＨＡタグ含有発現カセットの安定な二重挿入
ＣＨＯ細胞をＴ２５フラスコに播種し、ＲＰＭＩ−１６４０／１０％ＦＢＳ／２ｍＭ  Ｇｌｕｔａｍａｘ／ｐｅｎ−ｓｔｒｅｐ増殖培地中でおよそ５０％コンフルエントまで培養した。Ｑｉａｇｅｎ（Ｃａｔ＃３０１４２５）からのＥｆｆｅｃｔｅｎｅトランスフェクション試薬を用い、１μｇのｐＬＬ０７および１μｇのｐＬＬ２９を、製造者の説明書に従って、Ｔ２５フラスコの５０％コンフルエントＣＨＯ細胞にトランスフェクトした。
次に、トランスフェクト細胞を増殖培地（ＲＰＭＩ  １６４０／１０％ＦＢＳ／２ｍＭ  Ｇｌｕｔａｍａｘ／Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ）中で一晩インキュベートした。翌日、培地を形質導入細胞を選択するための５００μｇ／ｍＬジェネティシンおよび２５０μｇ／ｍｌハイグロマイシンＢを含有する新鮮な増殖培地に交換した。選択培地はほとんどの細胞が死滅するまで２〜３日毎に交換し、単細胞に由来した細胞の残っているコロニーを剥がした。形質導入細胞が９０〜１００％コンフルエントまで増殖した際に、ＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ（Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ、Ｃａｔ＃１２５６３−０２９）を用いてそれらを回収し、さらなる細胞拡大培養のためにＴ７５フラスコに播種した。
この新たなポリクローナル細胞株をｐ−ＬＬ０７−ＬＬ２９−ＣＨＯと呼称した。
【０２９３】
ワクシニアウイルスおよびＤ１３Ｌ  ＯＲＦ欠損ワクシニアウイルスをレスキューすることによるＤ１３およびＣＰ７７発現の確認
ＳＣＶ５０５は、増強緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）を発現し、ＣＨＯ細胞においてＣＰ７７タンパク質の存在下でのみ増殖するワクシニアウイルスである。このウイルスを、ｐ−ＬＬ０７−ＬＬ２９−ＣＨＯにおいてこの細胞株によるＣＰ７７発現を確認するためのプラーク感染力試験で用いた。ＳＣＶ１０４は、そのＤ１３Ｌ  ＯＲＦが牛痘ウイルス０２５ＬプロモーターおよびＣＰ７７タンパク質をコードするＯＲＦならびに赤色蛍光タンパク質発現カセット（ＤｓＲｅｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓ２）に置き換えられているワクシニアウイルスである。このウイルスはＤ１３タンパク質の細胞株発現の不在下では増殖しない。このウイルスをｐ−ＬＬ０７−ＬＬ２９−ＣＨＯにおいてこの細胞株によるＤ１３発現を確認するためのプラーク感染力試験で使用した。
【０２９４】
ｐ−ＬＬ０７−ＬＬ２９−ＣＨＯ細胞株プラーク感染力試験
本試験では、ＳＣＶ５０５（Ｄ１３＋  ＣＰ７７−  ＥＧＦＰ＋）およびＳＣＶ１０４（Ｄ１３−  ＣＰ７７＋  ＤｓＲｅｄ＋）による感染からのｐ−ＬＬ０７−ＬＬ２９−ＣＨＯによるＤ１３およびＣＰ７７の発現を定性する助けとするために種々の細胞株を使用した。以下の細胞株で予測される結果は次の通りである。
【０２９５】
Ｖｅｒｏ：
この細胞株は、ワクシニアウイルス感染に対して通常許容性である。このウイルスはこの細胞株において通常感染性であるので、プラーク形成は、ＳＣＶ５０５感染に関する緑色蛍光によって検出されるように、増殖したウイルスの細胞から細胞への経時的拡散を示す。しかしながら、ＳＣＶ１０４感染に関する赤色蛍光が欠如しているかまたは単細胞に限られることで検出されるように、見られるべきプラーク形成がなく、これは細胞株またはウイルスによるＤ１３タンパク質発現がないために、増殖したウイルスの細胞から細胞への経時的拡散がないことを示す。
【０２９６】
Ｃ１１−ＬＬ１９−ＨｅＬａ：
これはｐＬＬ１９形質導入を介してＤ１３タンパク質を発現するワクシニアウイルス許容細胞株である。ＳＣＶ５０５感染からのプラーク形成が予想され、Ｄ１３の細胞株発現とは無関係に、緑色蛍光により検出される増殖したウイルスの細胞から細胞への経時的拡散を示す。このウイルスはＤ１３タンパク質の細胞株発現のためにこの細胞株では増殖可能であるので、ＳＣＶ１０４感染からのプラーク形成が予想される。
【０２９７】
ＣＨＯ：
この細胞株は、ワクシニアウイルス感染に対して非許容性である。赤色または緑色蛍光が欠如しているかまたは単細胞に限られることにより検出されるように、ＳＣＶ５０５感染およびＳＣＶ１０４感染からのプラーク形成は見られないと予想される。これは、このウイルスがＣＰ７７を発現できるとしてもＳＣＶ１０４をレスキューするために必要とされる細胞株によるＤ１３タンパク質発現がないため、およびＳＣＶ５０５をレスキューするために必要とされる細胞株によるＣＰ７７タンパク質発現がないために、増殖したウイルスの細胞から細胞への経時的拡散は見られないことを示す。
【０２９８】
ｐ−ＬＬ０７−ＬＬ２９−ＣＨＯ：
これは、Ｄ１３およびＣＰ７７の両タンパク質を発現するＣＨＯ細胞株である。ＳＣＶ５０５感染からのプラーク形成が予想され、緑色蛍光により検出されるように、増殖したウイルスの細胞から細胞への経時的拡散を示すことは、ＣＰ７７タンパク質の細胞株発現を示す。ＳＣＶ１０４からのプラーク形成が予想され、赤色蛍光により検出されるように、増殖したウイルスの細胞から細胞への経時的拡散を示すことは、Ｄ１３タンパク質の細胞株発現を示す。
【０２９９】
細胞株の準備：
Ｖｅｒｏ、ＣＨＯ、Ｃ１１−ＬＬ１９−ＨｅＬａ、およびｐ−ＬＬ０７−ＬＬ２９−ＣＨＯ細胞株を複数の６ウェルプレート（１つはＳＣＶ５０５感染用および他はＳＣＶ１０４感染用）２セットに播種し、対応する増殖培地（下記の通り）中、３７℃／５％ＣＯ２で１００％コンフルエントまで培養した。
・Ｖｅｒｏ、ＣＨＯ：  ＲＰＭＩ−１６４０／１０％ＦＢＳ／２ｍＭ  Ｇｌｕｔａｍａｘ／ｐｅｎ−ｓｔｒｅｐ
・Ｃ１１−ＬＬ１９−Ｈｅｌａ：  ＲＰＭＩ−１６４０／１０％ＦＢＳ／２ｍＭ  Ｇｌｕｔａｍａｘ／ｐｅｎ−ｓｔｒｅｐ、および１０００μｇ／ｍＬジェネティシン
・ｐ−ＬＬ０７−ＬＬ２９−ＣＨＯ：  ＲＰＭＩ−１６４０／１０％ＦＢＳ／２ｍＭ  Ｇｌｕｔａｍａｘ／ｐｅｎ−ｓｔｒｅｐ、および５００μｇ／ｍＬジェネティシンおよび２５０μｇ／ｍｌハイグロマイシンＢ
【０３００】
ウイルス感染：
ＳＣＶ１０４およびＳＣＶ５０５を用い、ウイルスをＭＭ（ＲＰＭＩ−１６４０／２％ＦＢＳ／２ｍＭ  Ｇｌｕｔａｍａｘ／ｐｅｎ−ｓｔｒｅｐ）に１０３ｐｆｕ／ｍｌとなるように希釈することにより、０．００１ｐｆｕ／細胞で細胞に感染させた。１プレートにつき１ウイルス：  感染のために１ｍｌの希釈ウイルスを各ウェルに加えた。６ウェルプレートの各ウェルは、コンフルエントの際におよそ１×１０６細胞を含むので、１ｍｌの１０３ｐｆｕ／ｍｌはｍｏｉ  ０．００１となる。ｍｏｉ  ０．００１は、１個の感染細胞からのプラーク形成を保証する。総てのプレートを室温で１時間インキュベートし、これによりウイルスは細胞に吸着でき、その後、１ｍＬのＭＭを各ウェルに加え、次いで、総てのプレートを３７℃／５％ＣＯ２でインキュベートして細胞へのウイルスの同時的侵入を促進し、その後、ウイルス増幅により細胞から細胞への拡散が経時的に起こった。蛍光プラークの形成を蛍光顕微鏡下で毎日観察した。
【０３０１】
顕微鏡観察：
４日間のウイルス感染およびプラーク形成を蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ５１）下で、ＳＣＶ１０４ウイルスにはＤｓＲｅｄフィルター（Ｃａｔ＃Ｕ−ＭＲＦＰＨＱ、Ｏｌｙｍｐｕｓ）を、ＳＣＶ５０５にはＧＦＰフィルター（Ｃａｔ＃Ｕ−ＭＧＦＰＨＱ、Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用いて観察した。ＣｅｌｌＳｅｎｓデジタルイメージングソフトウエア（Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用いて画像を取り込んだ。
【０３０２】
結果：
ｍｏｉ  ０．００１でのＳＣＶ１０４およびＳＣＶ５０５によるＣＨＯ細胞の感染：
感染後１日目に、散在性の単細胞蛍光のみが見られ、これは両ウイルスが細胞に侵入したが、隣接細胞に感染を拡散するまでには増殖していなかったことを示す。しかしながら、これは感染後２日目から４日目にも同じ進行状態に留まり、すなわち、単細胞感染のみが見られ、ウイルスは時間が経っても隣接細胞に拡散しなかった。
【０３０３】
ｍｏｉ  ０．００１でのＳＣＶ１０４およびＳＣＶ５０５によるＶｅｒｏ細胞の感染：
ＳＣＶ５０５による感染は、予想通り、感染後１日目に小さなプラークを形成し、これらは総て、４日目までに総てのプラークが合体して、細胞単層の１つのコンフルエント感染となる時点までサイズを増した。これは、感染の拡散に向かう１日目から感染後４日目までの全面化までウイルスが増殖したことを示した。しかしながら、これはＳＣＶ１０４感染とは全く異なる。感染後１日目に、散在性の単細胞蛍光のみが見られ、これはその後３日にわたって同じ状態に留まった。これは、ＳＣＶ１０４は、このウイルスがＤ１３Ｌ
ＯＲＦを欠いており、ウイルスゲノム複製の後にウイルスのアセンブルを開始できないので増幅および増殖ができなかったこと、また、この細胞株はＤ１３タンパク質を発現せず、ウイルス増幅のレスキューを補助しなかったことを示す。
【０３０４】
０．００１でのＳＣＶ１０４およびＳＣＶ５０５によるＣ１１−ＬＬ１９−ＨｅＬａ細胞（Ｄ１３タンパク質を発現するＨｅＬａ細胞株）の感染：
ＳＣＶ５０５による感染は、予想されたように、感染後１日目に小さなプラークを形成し、これらは、４日目までに総てのプラークが合体して細胞単層の１つのコンフルエント感染となる時点までサイズを増した。これは、感染の拡散に向かう１日目から感染後４日目までの全面化までウイルスが増殖したことを示した。ＳＣＶ１０４による感染も同じ結果をもたらし、この細胞株によって産生されたＤ１３タンパク質がＳＣＶ１０４におけるＤ１３Ｌ  ＯＲＦの欠如を補足したこと、およびこの細胞株によって産生された量が、無傷のＤ１３Ｌ  ＯＲＦを有するＳＣＶ５０５に匹敵し得るウイルス増幅および感染拡散を支持するのに十分であったことを示す。
【０３０５】
ｍｏｉ  ０．００１でのＳＣＶ１０４およびＳＣＶ５０５によるｐ−ＬＬ０７−ＬＬ２９−ＣＨＯ細胞（Ｄ１３タンパク質およびＣＰ７７タンパク質を発現するＣＨＯ細胞株）の感染：
ＳＣＶ１０４およびＳＣＶ５０５の両方について、感染後１日目に小さな感染巣が見られた。その後３日にわたって、これらの感染巣は拡大し、絶えず増殖するより大きなプラークとなり、感染後４日目までに最終的に合体してコンフルエント感染となった。これは、ＣＰ７７が発現され（それがＳＣＶ５０５増幅および増殖を支持したため）、Ｄ１３タンパク質も発現された（それがＳＣＶ１０４の増幅および増殖を支持したため）ことを示した。
【０３０６】
結論：
これらの結果は、ＣＰ７７およびＤ１３タンパク質を発現するＣＨＯ細胞株がＤ１３Ｌ欠損ワクシニアウイルスの生産および製造のための細胞基質として使用可能であることを実証する。通常の許容細胞の感染の際には、Ｄ１３Ｌ欠損ウイルスは、ウイルスアセンブリを開始できず、従って、その感染生活環を全うできないので、それは安全性の点でヒトおよび動物のワクチン接種用の優れたウイルスワクチン送達ベクターとなる。しかしながら、バイオテクノロジー適合性ＣＨＯ細胞株では、この細胞株がＣＨＯ宿主域タンパク質（ＣＰ７７）およびミシングアセンブリタンパク質（Ｄ１３タンパク質）を発現する場合には、この弱毒性の高いワクシニアベクターは製造できない。
【０３０７】
実施例１４
ウエスタンブロット法によるｐ−ＬＬ０７−ＬＬ２９−ＣＨＯ細胞株のＤ１３およびＣＰ７７タンパク質発現分析
バックグラウンド情報
ｐ−ＬＬ０７−ＬＬ２９−ＣＨＯにより発現されるＤ１３およびＣＰ７７タンパク質はタグを持ち、Ｄ１３およびＣＰ７７タンパク質のＣ末端上のアミノ酸タグ配列を特異的に認識する抗体を用いて検出することができる。Ｄ１３およびＣＰ７７タンパク質を特異的に認識する抗体が存在しなくても、これらの抗タグ抗体を用いてウエスタンブロット分析を行い、ｐ−ＬＬ０７−ＬＬ２９−ＣＨＯ細胞株においてＤ１３およびＣＰ７７タンパク質の発現を確認することができる。Ｄ１３タンパク質のＣ末端はＨＡタグアミノ酸配列「ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ」を含み、ＣＰ７７タンパク質のＣ末端はフラッグタグアミノ酸配列「ＤＹＫＤＤＤＤＫ」を含む。
【０３０８】
ウエスタンブロット分析法
以下の細胞株をＴ７５フラスコに播種し、適当な選択抗生物質を含有する増殖培地（ＲＰＭＩ  １６４０／１０％ＦＢＳ／２ｍＭ  Ｇｌｕｔａｍａｘ／Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ）中で１００％コンフルエントまで培養した：  選択抗生物質無しのＣＨＯ、５００μｇ／ｍＬジェネティシンおよび２５０μｇ／ｍｌハイグロマイシンＢを用いるｐ−ＬＬ０７−ＬＬ２９−ＣＨＯ、２５０μｇ／ｍｌハイグロマイシンＢを用いるｐ−ＬＬ０７−ＣＨＯ、および１０００μｇ／ｍＬジェネティシンを用いるＣ１１−ＬＬ１９−ＨｅＬａ。コンフルエント細胞単層を剥がし、ＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔを含む単細胞懸濁液中、３７℃で１０分間消化した。各フラスコから細胞を回収し、３００ｇで５分間の遠心分離によりペレットとし、ＰＢＳで２回洗浄した。最終洗浄後、細胞ペレットを５００μＬのＰＢＳに再懸濁させた。このタンパク質抽出液に４ｘ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥローディングバッファーを加えて終濃度を１ｘとし、９８℃で２〜３分加熱した。変性したタンパク質サンプルをＢｉｏｒａｄ  Ｍｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮ（登録商標）ＴＧＸ  Ｓｔａｉｎ−Ｆｒｅｅ（商標）プレキャストゲル（グラジェントゲル）にて２００Ｖで３０〜４５分、電気泳動に付した。電気泳動後、分離されたタンパク質を、１００Ｖで１時間のエレクトロブロッティングによりニトロセルロース膜に転写した。
【０３０９】
タンパク質検出のため、ニトロセルロース膜をＰＢＳ中５％脱脂粉乳にて室温で１時間インキュベートして非特異的抗体結合部位をブロッキングした。ＨＡタグ含有タンパク質の検出のため、この膜をブロッキングバッファー中１：１０００希釈の抗ＨＡ  ＨＲＰコンジュゲート（Ａｂｃａｍ  Ｃａｔ＃ＡＢ１２６５）で４℃にて一晩インキュベートした。フラッグタグタンパク質の検出のためには、分離されたエレクトロブロットニトロセルロース膜をブロッキングバッファー中１：１０００希釈の抗フラッグＨＲＰコンジュゲート（Ａｂｃａｍ  Ｃａｔ＃ＡＢ４９７６３）で４℃にて一晩インキュベートした。次に、膜をＰＢＳ中で３回、各洗浄５分として洗浄し、その後、ＥＣＬ基質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｉｅｒｃｅ  ＥＣＬ  Ｗｅｓｔｅｒｎ−ｂｏｔ基質、Ｃａｔ  Ｎｏ  ３２１０６）にて２〜３分インキュベートした後、ＢｉｏＲａｄ  ＸＲＳゲルドックシステムを用いて画像を取得した。
【０３１０】
結果
ＨＡタグ検出によるＤ１３タンパク質の検出：
抗ＨＡタグ抗体はｐ−ＬＬ０７−ＬＬ２９−ＣＨＯから調製した全細胞タンパク質抽出液から予想されたサイズのタンパク質を検出することができたが、ＣＨＯ細胞から調製した全細胞タンパク質抽出液から検出できたタンパク質は無かった。これは、ｐ−ＬＬ０７−ＬＬ２９−ＣＨＯがＤ１３タンパク質を発現していたことを明らかに示した。
【０３１１】
フラッグタグによるＣＰ７７タンパク質の検出：
抗フラッグタグ抗体は、ｐ−ＬＬ０７−ＬＬ２９−ＣＨＯおよびｐ−ＬＬ０７−ＣＨＯ（ＣＨＯ細胞株はＣＰ７７のみ発現する）から調製した全細胞タンパク質抽出液から予想されたサイズのタンパク質を検出することができたが、ＣＨＯ細胞から調製した全細胞タンパク質抽出液から検出できたタンパク質は無かった。これは、ｐ−ＬＬ０７−ＬＬ２９−ＣＨＯおよびｐ−ＬＬ０７−ＣＨＯがＣＰ７７タンパク質を発現していたことを明らかに示した。
【０３１２】
フラッグタグ検出によるＤ１３タンパク質の検出：
Ｃ１１−ＬＬ１９−ＨｅＬａにより発現されたＤ１３タンパク質は、Ｃ末端フラッグタグを有するＤ１３タンパク質を発現し、この細胞株から作製した全細胞タンパク質抽出液のウエスタンブロットを行った場合、抗フラッグタグ抗体は予想されたサイズのタンパク質を検出することができた。これはＣ１１−ＬＬ１９−ＨｅＬａがＤ１３タンパク質を発現していたことを明らかに示した。
【０３１３】
本発明の範囲から逸脱することなく多くの改変が当業者には自明である。
【０３１４】
【表２】
2020039340.tif 000016
【０３１５】
【表３】
2020039340.tif 000017
【０３１６】
ウイルス収量（アウトプット）
感染に用いたウイルス量（インプット）は４×１０４ｐｆｕ／ｍＬであった。比較のため、収量は１０４値として表す。値は各時点での平均収量、すなわち、３ｍＬ（６ｍＬを２ウェルで割ったもの）採取物からの収量に相当する。
【０３１７】
【表４】
2020039340.tif 000018
【０３１８】
生産収率（アウトプット／インプット比）
下表は各時点で各細胞株からインプットレベルを超えて生産されたウイルスの収率、すなわち、アウトプット／インプット比を示す。
【０３１９】
【表５】
2020039340.tif 000019
【０３２０】
【表６】
2020039340.tif 000020
【０３２１】
ウェル当たりの感染からの平均ウイルスアウトプット（収量）
フラスコ当たりのウイルス抽出液容量は１ｍＬであった。力価測定のためのプレーティング容量は１ｍＬであった。従って、ウイルス収量は力価測定値（ｐｆｕ／ｍＬ）に１ｍＬ（プレーティング容量）を掛けたものに等しい。
【０３２２】
【表７】
2020039340.tif 000021
【０３２３】
【表８】
2020039340.tif 000022
【０３２４】
【表９】
2020039340.tif 000023
【０３２５】
【表１０】
2020039340.tif 000024
【０３２６】
【表１１】
2020039340.tif 000025
【０３２７】
参照文献
2020039340.tif 000026
【配列表】
2020039340000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年11月18日(2019.11.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書または図面に記載された発明。
【外国語明細書】
2020039340000001.pdf