(57)【要約】      （修正有）【課題】商業開発に適した規模での全長ラブリシンの組換え産生方法を提供する。【解決手段】優れた潤滑特性及び新規グリコシル化パターンを有する、ヒト様ラブリシン又はＰＲＧ４糖タンパク質の新たな組換えアイソフォームと、商業的産生を可能にする高レベルでのこれらの製造のための方法であって、少なくとも３０重量％のグリコシド残基を含むラブリシン糖タンパク質を少なくとも０．４ｇ／リットルの培地中濃度で産生するのに十分な時間及び培養条件下で、ヒトＰＲＧ４遺伝子をトランスフェクトされそれを発現しその発現産物を翻訳後にグリコシル化するチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞を培地中で培養する工程と、前記培地からラブリシン糖タンパク質を精製する工程とを含む、組換えラブリシン糖タンパク質の製造方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも３０重量％のグリコシド残基を含むラブリシン糖タンパク質を少なくとも０．４ｇ／リットルの培地中濃度で産生するのに十分な時間及び培養条件下で、ヒトＰＲＧ４遺伝子をトランスフェクトされそれを発現しその発現産物を翻訳後にグリコシル化するチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞を培地中で培養する工程と、
前記培地からラブリシン糖タンパク質を精製する工程と
を含む、組換えラブリシン糖タンパク質の製造方法。
【請求項２】
前記ＣＨＯ細胞が、前記ヒトＰＲＧ４遺伝子をコードする核酸を含むＣＨＯ−Ｍ細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＣＨＯ細胞が、クロマチンエレメントをコードする核酸を含む第１のベクター及び前記ヒトＰＲＧ４遺伝子をコードする核酸を含む第２のベクターをトランスフェクトされる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記クロマチンエレメントが、境界エレメント、マトリックス付着領域、遺伝子座調節領域又はユニバーサルクロマチンオープニングエレメントである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記クロマチンエレメントが、マトリックス付着領域である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞が、前記ラブリシン糖タンパク質を少なくとも０．５ｇ／リットルの培地中濃度で産生するのに十分な時間及び培養条件下で培養される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞が、前記ラブリシン糖タンパク質を少なくとも０．８ｇ／リットルの培地中濃度で産生するのに十分な時間及び培養条件下で培養される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞が、前記ラブリシン糖タンパク質を少なくとも１．０ｇ／リットルの培地中濃度で産生するのに十分な時間及び培養条件下で培養される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞が、前記ラブリシン糖タンパク質を少なくとも２．０ｇ／リットルの培地中濃度で産生するのに十分な時間及び培養条件下で培養される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ラブリシン糖タンパク質のグリコシル化の少なくとも９５重量％が、コア１のグリコシル化である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ラブリシン糖タンパク質のグリコシル化の少なくとも９９重量％が、コア１のグリコシル化である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記グリコシド残基が、天然ヒトラブリシンと比較して硫酸化糖類側鎖に富む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ラブリシン糖タンパク質が、軟骨−軟骨摩擦検査において測定される、精製された天然ウシラブリシンの静止摩擦係数の１５０％以下の静止摩擦係数を生ずる多量体タンパク質を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ラブリシン糖タンパク質が、軟骨−軟骨摩擦検査において測定される、精製された天然ウシラブリシンの静止摩擦係数の１２０％以下の静止摩擦係数を生ずる多量体タンパク質を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ラブリシン糖タンパク質が、軟骨−軟骨摩擦検査において測定される、精製された天然ウシラブリシンの静止摩擦係数の１１０％以下の静止摩擦係数を生ずる多量体タンパク質を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ラブリシン糖タンパク質が、前記培養培地から多量体ラブリシン種と共精製され、前記多量体ラブリシン種と混合してる単量体ラブリシン種を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記ラブリシン糖タンパク質が、二量体ラブリシン種を含む、請求項１３〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記ラブリシン糖タンパク質が、ジスルフィド結合又は非共有結合により会合した個々のグリコシル化アミノ酸鎖を少なくとも５個含み、少なくとも１２００ｋＤａの分子量を有する、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞が、少なくとも１０、５０又は１００リットルの培地において培養される、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記ラブリシン糖タンパク質が、少なくとも３５重量％のグリコシド残基を含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法によって産生されるラブリシン糖タンパク質。
【請求項２２】
宿主細胞培養液においてヒトＰＲＧ４遺伝子から発現された組換え多量体ラブリシン糖タンパク質であって、少なくとも３０重量％のグリコシド残基を含み、軟骨−軟骨摩擦検査において測定される、精製された天然ウシラブリシンの動摩擦係数の１５０％以下の動摩擦係数を生ずる組換え多量体ラブリシン糖タンパク質を含む組成物。
【請求項２３】
前記ラブリシン糖タンパク質が、軟骨−軟骨摩擦検査において測定される、精製された天然ウシラブリシンの動摩擦係数の１２０％以下の動摩擦係数を生ずるものとして特徴付けられる、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記ラブリシン糖タンパク質が、軟骨−軟骨摩擦検査において測定される、精製された天然ウシラブリシンの動摩擦係数の１１０％以下の動摩擦係数を生ずるものとして特徴付けられる、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２５】
前記ラブリシン糖タンパク質が、少なくとも３５重量％のグリコシド残基を含む、請求項２２〜２４のいずれかに記載の組成物。
【請求項２６】
前記ラブリシン糖タンパク質が、少なくとも４０重量％のグリコシド残基を含む、請求項２２〜２４のいずれかに記載の組成物。
【請求項２７】
前記ラブリシン糖タンパク質のグリコシル化の少なくとも９９重量％が、コア１のグリコシル化である、請求項２２〜２６のいずれかに記載の組成物。
【請求項２８】
前記グリコシド残基が、天然ヒトラブリシンと比較して硫酸化糖類側鎖に富む、請求項２２〜２７のいずれかに記載の組成物。
【請求項２９】
多量体ラブリシン種と混合している単量体ラブリシン種を更に含む、請求項２２〜２８のいずれかに記載の組成物。
【請求項３０】
二量体ラブリシン種を含む、請求項２２〜２９のいずれかに記載の組成物。
【請求項３１】
少なくとも１２００ｋＤａの分子量を有する、ジスルフィド結合又は非共有結合により会合した個々のグリコシル化アミノ酸鎖を少なくとも５個含むラブリシン種を含む、請求項２２〜３０のいずれかに記載の組成物。
【請求項３２】
前記ラブリシン糖タンパク質と混合しているヒアルロン酸又はその塩を更に含む、請求項２２〜３１のいずれかに記載の組成物。
【請求項３３】
関節内補充療法による関節結合部の処置のための医薬の調製のための、請求項２２〜３２のいずれかに記載の組成物。
【請求項３４】
組織表面への局所的適用のための医薬の調製のための、請求項２２〜３２のいずれかに記載の組成物。
【請求項３５】
ドライアイ疾患の処置のための医薬の調製のための、請求項２２〜３２のいずれかに記載の組成物。
【請求項３６】
後に接着又は線維性結合組織が形成されるのを阻害するための、外科手術における身体表面への適用のための医薬の調製のための、請求項２２〜３２のいずれかに記載の組成物。
【請求項３７】
脈管構造内の細胞−細胞接着又は運動性を阻害するための、全身注射のための医薬の調製のための、請求項２２〜３２のいずれかに記載の組成物。
【請求項３８】
ヒトラブリシン１００ｇを含む溶液を含む組成物であって、前記ラブリシンが、少なくとも９９重量％がコア１のグリコシル化であるグリコシル化を含む組成物。
【請求項３９】
前記ヒトラブリシンが、組換えヒトラブリシンである、請求項３８に記載の組成物。
【請求項４０】
溶液における前記ラブリシンの濃度が、少なくとも０．５ｇ／Ｌである、請求項３８又は３９に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
[0001]  本願は、ここに本明細書の一部を構成するものとしてその内容全体を組み込む、２０１３年１０月２２日に出願された米国特許仮出願第６１／８９４，３６６号に対する優先権及び利益を主張するものである。
【０００２】
[0002]  本明細書に開示されている発明は、トランスフェクトされた細胞を用いた、組換えヒト様ラブリシンを含む商業的な量の組成物を産生する方法に関する。より具体的には、本発明は、優れた潤滑特性を有し、また、製剤化して、例えば、関節痛からドライアイ疾患に及ぶ様々な状態の予防的又は治療的処置のために用いることができる、新規型のラブリシンの商業的規模での産生に関する。
【背景技術】
【０００３】
[0003]  プロテオグリカン４（PRG4）遺伝子は、ラブリシン、巨核球刺激因子（MSF）又は表在ゾーンタンパク質（SZP）と命名された、高度にグリコシル化された表面潤滑タンパク質をコードする（Jay, Curr. Opin. Orthop. 15, 355 （2004）；米国特許第６，７４３，７７４号；米国特許第６，９６０，５６２号を参照）。ラブリシンは、１２エクソンに及ぶ全長を有するＰＲＧ４遺伝子（配列番号２）から発現されるが、複数の天然起源のトランケートバージョンが報告されている。９４０アミノ酸の大型の「ムチン様」中央ドメイン（エクソン６にコードされる）は、約７０＋ＫＥＰＡＰＴＴ様配列を含み、重度にグリコシル化される。この糖タンパク質は、コア２グリコシル化残基及び多重コア１グリカン（Ｏ結合型β（１−３）Ｇａｌ−ＧａｌＮＡｃオリゴ糖）を含み、そのうち少なくとも後者は、その主要な生理的機能、境界潤滑を媒介することが示されている（Jay et al., Glycoconj J 18, 807 （2001））。ＰＲＧ４は、軟骨、滑膜、腱及び半月板の表面、涙膜ならびに他の解剖学的部位に存在することが示されている。ＰＲＧ４は、並置された関節軟骨表面の境界潤滑に寄与することが示されている。ＰＲＧ４は、単量体としてのみならず、Ｎ及びＣ末端の両方における保存されたシステインリッチドメインを介してジスルフィド結合された二量体及び多量体としても存在することが示されている（Schmidt etal., BiochimBiophys Acta. 1790（5）:375-84 （2009）; Kooyman et al., Paper No.255, 56th Ann. Meet of Orthop. Res. Soc., 2010）。
【０００４】
[0004]  滑膜結合部の軟骨界面において働いている潤滑には少なくとも２種の物理化学的モードが存在する。これらは、「境膜（fluid film）」及び「境界」として分類された。稼働的潤滑モードは、関節組織における垂直抗力及び接線力、これらの表面間の接線運動の相対速度、ならびに負荷及び運動の両方の時間履歴に依存する。摩擦係数、μ（無次元単位、相対運動における２個の接触表面間の測定された摩擦力の、加えられた垂直抗力に対する比）は、潤滑の定量的尺度をもたらす。
【０００５】
[0005]  流体媒介性潤滑又は「境膜」モードの１種は、静水力学的である。負荷の開始時及び典型的には延長された持続時間において、組織の二相的性質のため、軟骨内の間質液は加圧され、また流体は、浸出（weeping）機構により関節表面間の凹凸へと押しやられる場合もある。ヒアルロン酸を含む加圧された間質液及びトラップされた潤滑剤プールは、したがって、剪断応力に対し殆ど抵抗せずに垂直（normal）負荷に耐えることにかなり寄与し、これによって摩擦係数が非常に低くなりやすくなる。また、負荷及び／又は運動の開始時に、スクイズ膜（squeeze film）、水力学及び弾性流体力学型の境膜潤滑が起こることができ、相対運動において、加圧、運動及び変形は、粘稠性潤滑剤が２表面間の間隙から及び／又はそこを通って押し出されるように作用する。
【０００６】
[0006]  境界潤滑において、負荷は、表面−表面の接触によって支持され、関連する摩擦特性は、潤滑剤表面分子、即ち、ラブリシン種によって決定される。対向する軟骨層は、かみ合い平らになった凹凸により総面積の＋／−１０％にわたって接触し、これは摩擦の大部分が起こる場所である可能性が高いため、このモードは重要である。境界潤滑は、本質的に、「スティックスリップ（stick-slip）」（Meyer et al., Nanoscience: Frictioin and Rheology on the Nanometer Scale, World Scientific Publishing Co. Pte. Ltd, River Edge, N.J., （2002）, pp. 373）、即ち、界面荷重負荷軟骨表面が互いに滑る際に起こり得る自発的ジャーキング運動を軽減し、したがって、定常運動及び運動のスタートアップの両方に対する抵抗減少として現れる。軟骨表面の典型的な摩耗パターンは、関節軟骨の境界潤滑が、関節表面構造の保護及び維持に重大であることを示唆する。例えば、ラブリシンヌルマウスは、摩耗を示すが、荷重負荷がない新生仔マウス（nice）は示さない（Jay et al., Arthritis and Rheumatism,56:3662-3669 （2007））。
【０００７】
[0007]  負荷時間及び静水圧の散逸が増加するほど、潤滑剤コーティングされた表面は、加圧された流体に対しますます高い配分の負荷に耐え、結果的に、μは、境界モードの潤滑がますます支配的となり得る。したがって、境界モードの潤滑は、相対的滑り速度及び軸負荷等、境膜形成に影響を与える因子に関して不変である、定常滑りにおける摩擦係数によって示される。関節軟骨では、流体加圧及び他の機構によって補完されるが、境界潤滑が確実に起こることが結論付けられた。瞬目の際の角膜及び眼瞼の界面における潤滑機構は、かなりの負荷を伴うことはなく、したがって、有効潤滑のための物理化学的要件は緩和されるので、軟骨潤滑とは全く異なる可能性がある。しかし、ドライアイ疾患等、涙膜が損なわれた場合、境界モードの潤滑が優占的となり得ることが提案されている。
【０００８】
[0008]  その注目すべき潤滑特性の原因となると考えられる滑液の２種の機械的構成成分は、ラブリシン及びヒアルロン酸（又はヒアルロネート（hyaluronate）もしくは「HA」、以後互換的に用いる）である。ラブリシンは、関節結合部における境界潤滑剤として機能し、摩擦力、細胞接着及びタンパク質沈着から軟骨表面を保護することが示された。例えば、米国特許第６，９６０，５６２号及び同第６，７４３，７７４号は、実質的に純粋なＰＲＧ４アイソフォームを含む潤滑ポリペプチドと、全身投与又は組織に直接的に投与することにより結合部又は他の組織を潤滑する方法とを開示する。ＨＡそれ自体は、境界モード潤滑で、軟骨−軟骨界面において生理食塩水よりもμを減少させることが示されており（３．３ｍｇ／ｍｌ  HAにおける０．１２vs.PBSにおけるほぼ０．２４）、ラブリシン単独は、更により低いレベルまでμを減少させるが、ラブリシンと組み合わせてＨＡを含む滑液は、ラブリシン単独又はＨＡ及びラブリシンの合成混合物によっては達成されない摩擦係数を表面に付与することができる。ラブリシン及びＨＡの合成組成物は未だに、天然型滑液によって付与される低い摩擦係数を完全に再現することはできていない。様々な供給源由来の様々な分子量のＨＡが、滑膜細胞からｉｎ  ｖｉｔｒｏで発現されたラブリシン、ウシラブリシン、滑液から抽出されＨＡ中で「再構成」されたラブリシン、及びラブリシンを作製するための初期の努力において組換えＤＮＡ技術を用いてマイクログラム量で発現されたラブリシンとの混合物において検査されてきた。
【０００９】
[0009]  商業開発に適した規模での全長ラブリシンの組換え産生における以前の試みは、成功したとはいえない。ＣＨＯ細胞から発現されるヒトラブリシン種の、１リットル当たり１又は２桁のミリグラム数という非常に低い産生量は、商業製品を支持するには低すぎると考慮される。この問題を解決するためのアプローチの１つは、エクソン６における反復数をトランケートし、したがって、少なくともある程度の潤滑能力を保持しつつ、グリコシル化側鎖の質量を低下させることである（例えば、米国特許第７，６４２，２３６号及び同第７，８９３，０２９号を参照）。このアプローチは、報告によれば、１リットル当たり３〜４百ミリグラムのトランケート型コンストラクトの総産生量（精製前の）をもたらした。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
[0010]  ヒトＰＲＧ４遺伝子を用いて、大規模な商業的な量の、以後単純に「ラブリシン」と称する新規の高度にグリコシル化されたヒト様型のラブリシン、多量体ラブリシン、ｒｈラブリシン又はｒｈＰＲＧ４を産生することができることが今や発見された。これは、本明細書に開示されている通りに、大規模な発現タンパク質の翻訳後グリコシル化能があることが発見されたある特定の修飾チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞にヒトＰＲＧ４遺伝子（hPRG4）をトランスフェクトし、続いてこの細胞を商業的規模の容量の培地、例えば、少なくとも１０リットル、より典型的には少なくとも５０リットル、好ましくは少なくとも１００リットル又は少なくとも５００リットル、最も好ましくは１，０００リットル以上で培養することにより成し遂げられる。
【００１１】
[0011]  本発明のラブリシンは、二量体及び多量体ならびに任意選択により遊離単量体を形成する、多分散ラブリシン単量体単位を含む。各単位は、重度に且つ可変的にグリコシル化されており、グリコシド残基側鎖は、その分子量の少なくとも３０％、多くの場合、３５％又は４０％、恐らく４５％以上もの高さに寄与する。
【００１２】
[0012]  天然ヒトラブリシンにおいて、グリコシル化は、その少なくとも６０％がシアル酸に末端置換されているコア１のＯ結合型ＧａｌＮＡｃ−Ｇａｌ（Ｎ−アセチルガラクトサミン−ガラクトース）二糖と、また、様々な異性体立体配置におけるＧｌｃＮａｃ（Ｎ−アセチルグルコサミン）単糖のコア１への付加を伴うコア２グリコシル化からなる（例えば、Estrella et al., Biochem J., 429（2）:359-67 （2010）を参照）。
【００１３】
[0013]  本明細書に開示されている通りに産生された組換え材料は、天然型ヒトラブリシンと比較して、コア１グリカンに富む。そのグリコシル化は、少なくとも９５％コア１側鎖、より可能性が高いことには、９８％又は９９％超を含む。更に、側鎖は多くの場合、天然ヒトラブリシンでは見られない程度にまで硫酸化されている。この事実は、天然ｈＰＲＧ４から本発明のｒｈＰＲＧ４を区別する。硫酸化含量が増加すると、ムチン性（mucinous）糖タンパク質に更に負電荷を加え、これは付近の生体分子を追い払うその能力を増強することで潤滑性を増加させ、また、分子構造を硬化させ、分子の観点からこれをより強固にすることに役立つ可能性がある。これはナノスケール及びメソスケール（mesoscale）摩擦を低下させることで機能するその能力の補助になり得ると考えられる。
【００１４】
[0014]  全長（非トランケート型）ラブリシン単量体配列（配列番号１）は、コアタンパク質において１４０４アミノ酸又はおよそ１５１ｋＤａを含む。ヒトラブリシンのシグナル配列は、配列番号１の残基１〜２４である。したがって、成熟型のヒトラブリシンは、配列番号１の残基２５〜１４０４である。本明細書に開示されている通りに産生された組換え産物の完全還元は、ＳＤＳ  ｔｒｉｓ−アセテート３〜８％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を含む多数の分子量決定技法における分子量標準との比較によって推定される約３００ｋＤａ〜４６０ｋＤａの見かけ上の分子量を有する単量体種を生じる。質量分析法及び他の研究を組み合わせて用いたグリコシル化解析は、グリコシル化された組換え単量体の真の分子量（ゲル移動度から推論される分子量とは反対に）が、２２０〜２８０ｋＤａの範囲内に収まる可能性が高く、約３００ｋＤａを超える可能性が低いことを示唆した。ラブリシン単量体の配列におけるＯ結合型グリコシル化部位として潜在的に利用できる総計約３２９個の可能なＯ結合（そのうち２８４個はスレオニン）のうち多数が、その数はばらつきがあり未知であるが、置換される（１００〜１５０、恐らく２００又は２２０個もの多さ）。総グリコシル化のうち、約半分が２糖単位（ＧａｌＮＡｃ−Ｇａｌ）を含み、半分は３糖単位（ＧａｌＮＡｃ−Ｇａｌ−シアル酸）を含む。最も豊富な型は硫酸化Ｇａｌ−ＧａｌＮａｃであり、次に最も豊富なのはシアル酸付加Ｇａｌ−ＧａｌＮａｃである。
【００１５】
[0015]  ラブリシン発現産物は、単量体又は二量体ラブリシン種への崩壊に対し抵抗性であるが、影響がない（immune）訳ではない。完全還元の結果は、これが、単量体単位の間及びその内にジスルフィド架橋を含むことを暗示する。また、還元なしの変性バッファーによる処理は、より低分子量の産物をもたらすことができ、疎水性相互作用、水素結合、物理的な絡み合い及び／又は自己集合を可能にする他の非共有結合的会合によっても同様に鎖が一体に結び付けられた、より高次の四次構造を示唆する。二量体及び多量体は多分散である。その内にある分子種は典型的には、少なくとも約４５０〜６００ｋＤａの分子量を有し、多量体種は多くの場合２，０００ｋＤａ以上である。典型的には、還元していない複合体の一部の分子種は、電気泳動実験における３〜８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに基本的に入っていかない。複合体のより大型の分子種は、３〜５の間、恐らくは２０もの多さの単量体単位を含むと考えられる。
【００１６】
[0016]  理論に制約されることは望まないが、斯かるより大型の超分子構成成分は、単量体／二量体濃度に応じて形成されると考えられる。現在、少なくとも約０．５ｍｇ／ｍｌ単量体／二量体の濃度が、より大型の複合体の自発的形成に最適であると考えられる。これを優に下回る濃度、例えば、約０．１ｍｇ／ｍｌ未満は、単量体及び二量体ならびにごく少量の複合体を含む；優に上回る濃度は、曇った又は濁った溶液として肉眼で目に見える凝集塊を形成することができる。サーファクタント、好ましくは、一般に安全と考慮される生理的に適合性の非イオン性サーファクタント、例えば、ポリオキシエチレンに基づくサーファクタント又は賦形剤を用いて、常に二量体種と共に存在すると思われる複合体の形成を可能にしつつ、大型の凝集塊形成を防止することができる。
【００１７】
[0017]  本発明のラブリシンを含む調製物の検査は、負荷下におけるその潤滑及び組織保護特性が、本技術分野において今までに知られた組換えラブリシンを超え得ることを示す。理論に制約されることは望まないが、本発明者らは、負荷下の非潤滑界面組織の移動の際にスティックスリップ現象が起こるが、本発明のラブリシンのコーティングは、その下層の軟骨表面から多分散ラブリシンのコーティング内の層へと剪断を移動することができると仮定する。即ち、本発明者らは、負荷及び往復運動において、コーティング内のラブリシン分子が互いにスリップし、続いて負荷が取り除かれると再編成する可能性があるため、その下層の表面が受ける剪断が少なく、その完全性を保持すると考える（例えば、Lee et al., PNAS, 110（7）:E567-574 （2013）を参照）。本発明者らは、結合部摩耗が、摩擦係数と直接的には関係しないが、スティックスリップ滑りとより直接的に関係し、結合部の異なる分子構成成分が相乗的に作用して、摩耗を防止することを記述する。
【００１８】
[0018]  いずれにせよ、本発明のラブリシン産物は、検査した場合、優れた潤滑特性を示し、多くの場合、本明細書に開示されている軟骨−軟骨（cartilage-on-cartilage）の潤滑検査によって測定される、精製された天然ウシラブリシンの係数の１５０％、１２０％、１１０％以内又は基本的に等しい摩擦係数（静止摩擦係数及び動的摩擦係数の両方）をもたらす。このような検査で、本発明のヒト様糖タンパク質は、両者共に定常的接触区域（stationary area of contact）によるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの軟骨ベアリングにおける減圧軟骨によって測定される、０．５以下及び０．２に満たない（本明細書に開示されている検査条件に依存）の静止摩擦係数ならびに多くの場合約０．１以下の動的摩擦係数を達成する。ヒアルロン酸（HA）と組み合わせると、これらの値は、ある特定の静止時における測定に関して約０．３を下回る及び０．１未満（滞留時間に依存）ならびに動的測定に関して０．１未満へと改善し、これは滑液に認容される値に極めて近い。したがって、斯かる組成物は、結合部摩耗を劇的に低下させることができる。
【００１９】
[0019]  したがって、本発明の一態様は、ラブリシンの商業的産生のための方法を含む。一実施形態において、本方法は、ラブリシン糖タンパク質を産生するのに十分な時間及び培養条件下で、ヒトＰＲＧ４遺伝子をトランスフェクトされそれを発現しその発現産物を翻訳後にグリコシル化するチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞を培地中で培養する工程と、前記培地からラブリシン糖タンパク質を精製する工程とを含む。例えば、一部の実施形態において、ラブリシン糖タンパク質は、少なくとも部分的に精製するために、細胞外ブロスにおける宿主細胞タンパク質及び他の夾雑物から分離する。組換えタンパク質は、本発明の方法の目的のために精製するためには、培養培地から濃縮されていれば十分であり、均一になるまで精製されている必要はない。本方法は、少なくとも３０重量％のグリコシド残基を有するラブリシン糖タンパク質を少なくとも０．４ｇ／Ｌの培地中濃度で産生するのに十分である。
【００２０】
[0020]  一部の実施形態において、ＣＨＯ細胞は、ヒトＰＲＧ４遺伝子をコードする核酸を含むＣＨＯ−Ｍ細胞である。他の実施形態において、ＣＨＯ細胞は、クロマチンエレメントをコードする核酸を含む第１のベクターをトランスフェクトされ、かつヒトＰＲＧ４遺伝子をコードする核酸を含む第２のベクターをトランスフェクトされる。クロマチンエレメントは、境界エレメント、マトリックス付着領域、遺伝子座調節領域又はユニバーサルクロマチンオープニングエレメントであってよい。好ましい実施形態において、クロマチンエレメントは、マトリックス付着領域である。
【００２１】
[0021]  更に別の実施形態において、ＣＨＯ細胞は、クロマチンエレメントをコードし、ヒトＰＲＧ４遺伝子をコードする核酸を含む第１のベクターをトランスフェクトされ、かつクロマチンエレメントをコードし、ヒトＰＲＧ４遺伝子をコードする核酸を含む第２のベクターをトランスフェクトされる。好ましい実施形態において、第１及び第２のベクターにおけるクロマチンエレメントは、マトリックス付着領域である。
【００２２】
[0022]  一部の実施形態において、二量体又は多量体ラブリシン糖タンパク質の重量の少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％又は少なくとも４５％は、グリコシド残基の重量である。一部の実施形態において、二量体又は多量体ラブリシン糖タンパク質の重量の３０％超、３５％超、４０％超又は４５％超は、グリコシド残基の重量である。組換えヒト様ラブリシンのグリコシル化は、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも９９重量％がコア１のグリコシル化であるため、グリコシド残基は、天然ヒトラブリシンのものとは異なることができる。また、一部の実施形態において、グリコシド残基は、天然ヒトラブリシンと比較して、硫酸化単糖に富む。
【００２３】
[0023]  本プロセスは、予想外なことに、商業的に存立可能な量の全長ラブリシン糖タンパク質を産生することができる。例えば、細胞は、１リットル当たり少なくとも約０．４グラム又は０．５グラム組換えラブリシン、好ましくは、１リットル当たり少なくとも０．８グラム、最も好ましくは、例えば、少なくとも約１０、５０又は１００リットルの培養において培養培地１リットル当たり少なくとも１．０グラムのラブリシンの培養培地中ラブリシン糖タンパク質濃度を生ずるのに十分な時間及び培養条件下で培養することができる。本プロセスは、最適化されると、培養１リットル当たり２．０、少なくとも２．５又は少なくとも３．０グラムもの多さのラブリシンを産生することができる。最適化された精製プロトコールの開発に応じて、１リットル当たり少なくとも約２００ミリグラムの精製された組換えラブリシン、好ましくは、少なくとも３００ｍｇ／Ｌ、より好ましくは、少なくとも５００ｍｇ／Ｌ、最も好ましくはそれ以上を得ることが可能となるであろう。本出願人らが認識する限りにおいて、これらのレベルの産生量は、いかなるムチン様タンパク質又はラブリシンにサイズが匹敵するタンパク質の組換え発現においてもこれまでに達成されたことがなく、ＰＲＧ４の発現における以前の試みのうち、本明細書に記載されている産物の特性を有する材料を製造することに成功したものはない。
【００２４】
[0024]  好ましい実施形態において、単量体ラブリシン種は、多くの場合、多量体タンパク質種と混合されて、培養培地から共精製される。多量体種は、二量体ラブリシン種に富む。例えば、一部の実施形態において、本方法は、単量体、二量体及び多量体ラブリシン種を含む組換えラブリシンの混合物を産生する。一部の実施形態において、ラブリシン糖タンパク質は、ジスルフィド結合又は非共有結合により会合した個々のグリコシル化アミノ酸鎖を少なくとも５個含み、少なくとも１２００ｋＤａの分子量を有する。
【００２５】
[0025]  本発明の方法に従って産生された糖タンパク質は、下に概要を述べるプロトコールを用いて検査されると、精製された天然哺乳類ラブリシンに関してこれまでに観察された最低値に近い摩擦係数を生ずる。例えば、一部の実施形態において、組換えラブリシン糖タンパク質は、軟骨−軟骨摩擦検査において測定される、精製された天然ウシラブリシンの静止摩擦係数の１５０％以下の静止摩擦係数を生ずる多量体タンパク質である。他の実施形態において、組換えラブリシン糖タンパク質は、軟骨−軟骨摩擦検査において測定される、精製された天然ウシラブリシンの静止摩擦係数の１２０％以下の静止摩擦係数を生ずる多量体タンパク質である。更に他の実施形態において、組換えラブリシン糖タンパク質は、軟骨−軟骨摩擦検査において測定される、精製された天然ウシラブリシンの静止摩擦係数の１１０％以下の静止摩擦係数を生ずる多量体タンパク質である。
【００２６】
[0026]  本発明の別の態様は、宿主細胞培養液においてヒトＰＲＧ４遺伝子から発現された組換え多量体ラブリシン糖タンパク質の組成物を対象にする。組換えラブリシン糖タンパク質は、少なくとも３０重量％がグリコシド残基であり、軟骨−軟骨摩擦検査において測定される、精製された天然ウシラブリシンの動摩擦係数の１５０％以下の動摩擦係数を生ずる。
【００２７】
[0027]  一部の実施形態において、組換えラブリシン糖タンパク質は、少なくとも３５％、少なくとも４０％又は少なくとも４５重量％がグリコシド残基である。
【００２８】
[0028]  一部の実施形態において、組換えラブリシン糖タンパク質は、軟骨−軟骨摩擦検査において測定される、精製された天然ウシラブリシンの動摩擦係数の１１０％以下又は１２０％以下の動摩擦係数を生ずる。
【００２９】
[0029]  一部の実施形態において、組換えラブリシンのグリコシル化は、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも９９重量％がコア１のグリコシル化であるため、組換えラブリシンのグリコシド残基は、天然ものとは異なる可能性がある。また、一部の実施形態において、組換えラブリシンのグリコシド残基は、天然ヒトラブリシンと比較して、硫酸化単糖に富む。
【００３０】
[0030]  一部の実施形態において、組換えラブリシンは、単量体、二量体及び多量体種の混合物である。一部の実施形態において、ラブリシンは、単量体種を含む。一部の実施形態において、ラブリシンは、二量体種を含む。一部の実施形態において、ラブリシンは、多量体種を含む。一部の実施形態において、ラブリシンは、多量体及び単量体種の混合物である。
【００３１】
[0031]  一部の実施形態において、ラブリシン糖タンパク質は、ジスルフィド結合又は非共有結合により会合した個々のグリコシル化アミノ酸鎖を少なくとも５個含み、少なくとも１２００ｋＤａの分子量を有する。
【００３２】
[0032]  一部の実施形態において、組換えラブリシン糖タンパク質の組成物は、ラブリシンと混合しているヒアルロン酸又はその塩を更に含む。
【００３３】
[0033]  別の実施形態において、本発明は、ヒトラブリシン１００グラムを含む溶液を含む組成物を対象とし、このラブリシンのグリコシル化は、少なくとも９９重量％がコア１のグリコシル化である。一実施形態において、ラブリシンは、組換えヒトラブリシンである。更に別の実施形態において、溶液におけるラブリシンの濃度は、少なくとも０．５ｇ／Ｌである。更に別の実施形態において、溶液は、細胞培養培地である。
【００３４】
[0034]  本発明の組成物は、身体との接触を目的とする様々なデバイスのコーティングとして（例えば、米国特許出願公開第２００９／００６８２４７号及び同第２０１１／０１４２９０８号を参照）；結合部潤滑の増強によるヒトもしくは動物における関節結合部の処置のため（米国特許出願公開第２００４／０２２９８０４号）又は関節内補充療法（米国特許出願公開第２００８／０２８７３６９号）；例えば、後に接着又は線維性結合組織が形成されるのを阻害するための外科手術における組織表面への局所的適用のため（米国特許出願公開第２００４／０２２９８０４号）；ドライアイ疾患の処置のため（米国特許出願公開第２０１１／００５９９０２号）；口渇疾患の処置のため（米国特許出願公開第２０１３／００３９８６５号）；間質性膀胱炎の処置のため（米国特許出願公開第２０１２／０３２１６９３号）；腟潤滑剤として（米国特許出願公開第２０１２／００５２０７７号）；コンタクトレンズケア及び貯蔵溶液のため（米国特許出願公開第２０１２／０３２１６１１号）或いは例えば、脈管構造内の細胞−細胞接着又は運動性を阻害するための全身注射のため（例えば、２０１３年１１月２６日に出願された米国特許仮出願第６１／９０８，９５９号を参照）を含む、ＰＲＧ４糖タンパク質のいずれかの公知の又は今後発見される医学的又は他の使用のための医薬の調製に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】[0035]本発明のプロセスにおいて用いられるラブリシン発現ＣＨＯ−Ｍクローンの構築において用いられる、ｈＰＲＧ４の全長配列をコードするベクターのプラスミドマップを示す図である。
【図２】[0035]本発明のプロセスにおいて用いられるラブリシン発現ＣＨＯ−Ｍクローンの構築において用いられる、ｈＰＲＧ４の全長配列をコードするベクターのプラスミドマップを示す図である。
【図３】[0036]本発明のｒｈラブリシンの構造の評価において有用なポリアクリルアミドゲルを示す写真である。
【図４】[0036]本発明のｒｈラブリシンの構造の評価において有用なポリアクリルアミドゲルを示す写真である。
【図５】[0037]トランスフェクトされたＣＨＯ−Ｍ細胞の培養液１リットル当たりの経時的に産生されたラブリシンのマイクログラム量を測定する、１回のラブリシン産生における産生量をグラフに示す図である。各回収日付に３種類のバーが存在する。左のバーは、「検量線１４年６月２４日」である。中央のバーは、「検量線１４年７月２４日」であり、右のバーは、「検量線１４年７月２５日」である。
【図６】[0038]本発明のｒｈラブリシンのコア１グリカンを示す図である。
【図７】[0039]本発明のｒｈラブリシンにおけるＳＥＲ及びＴＨＲ残基における様々な二及び三糖側基の相対的存在量を示す、ピークを標識したクロマトグラフである。
【図８】[0040]ヒト滑液から抽出された天然ラブリシンにおけるコア２構造に及ぶ、より大きな範囲のグリカンを示す図である。
【図９】[0041]天然ヒトラブリシンにおける様々な糖残基の相対的存在量を示す、ピークを標識したクロマトグラフである。
【図１０Ａ】[0042]ｒｈＰＲＧ４濃度増加に伴う表面張力の低下を示す、表面張力対ｒｈＰＲＧ４及び／又はポリオキシエチレンサーファクタント濃度のプロットを示す図である。
【図１０Ｂ】[0042]ｒｈＰＲＧ４濃度増加に伴う表面張力の低下を示す、表面張力対ｒｈＰＲＧ４及び／又はポリオキシエチレンサーファクタント濃度のプロットを示す図である。
【図１０Ｃ】[0042]ｒｈＰＲＧ４濃度増加に伴う表面張力の低下を示す、表面張力対ｒｈＰＲＧ４及び／又はポリオキシエチレンサーファクタント濃度のプロットを示す図である。
【図１１Ａ】[0043]精製された天然ウシＰＲＧ４、生理食塩水（PBS）及びウシ滑液に対し、どちらのＰＲＧ４調製物も４５０μｇ／ｍＬである、ｒｈＰＲＧ４溶液の静止（図１１Ａ）及び動的（図１１Ｂ）摩擦係数を比較するデータを示す図である。記号表示ａ、ｂ及びｃは、結果における統計的有意差を示す（ｐ＜０．０５）。ｎ＝７。図１１Ｂにおける各バーの上の「ｂ」の存在によって示す通り、ｒｈ−ＰＲＧ４（組換え）及びｎＰＲＧ４（天然）の結果に統計的有意差は存在しなかった。
【図１１Ｂ】[0043]精製された天然ウシＰＲＧ４、生理食塩水（PBS）及びウシ滑液に対し、どちらのＰＲＧ４調製物も４５０μｇ／ｍＬである、ｒｈＰＲＧ４溶液の静止（図１１Ａ）及び動的（図１１Ｂ）摩擦係数を比較するデータを示す図である。記号表示ａ、ｂ及びｃは、結果における統計的有意差を示す（ｐ＜０．０５）。ｎ＝７。図１１Ｂにおける各バーの上の「ｂ」の存在によって示す通り、ｒｈ−ＰＲＧ４（組換え）及びｎＰＲＧ４（天然）の結果に統計的有意差は存在しなかった。
【図１２Ａ】[0044]生理食塩水、ｒｈＰＲＧ４単独及びウシ滑液に対し、ｒｈＰＲＧ４は４５０μｇ／ｍＬであり、ＨＡ（１．５ＭＤａ）は３．３３ｍｇ／ｍＬである、ＨＡプラスｒｈＰＲＧ４溶液の静止（図１２Ａ）及び動的（図１２Ｂ）摩擦係数を比較するデータを示す図である。図１２Ｂにおける各バーの上の記号表示ａ、ｂ、ｃ及びｄは、結果における統計的有意差を示す（ｐ＜０．０５）、ｎ＝４。
【図１２Ｂ】[0044]生理食塩水、ｒｈＰＲＧ４単独及びウシ滑液に対し、ｒｈＰＲＧ４は４５０μｇ／ｍＬであり、ＨＡ（１．５ＭＤａ）は３．３３ｍｇ／ｍＬである、ＨＡプラスｒｈＰＲＧ４溶液の静止（図１２Ａ）及び動的（図１２Ｂ）摩擦係数を比較するデータを示す図である。図１２Ｂにおける各バーの上の記号表示ａ、ｂ、ｃ及びｄは、結果における統計的有意差を示す（ｐ＜０．０５）、ｎ＝４。
【図１３】[0045]天然ウシＰＲＧ４の消化及びｒｈＰＲＧ４の適用後の、界面ウシ組織表面における潤滑性の再建を示すデータの図である。
【図１４Ａ】[0046]生理食塩水中３００μｇ／ｍｌの天然ウシＰＲＧ４及びｒｈＰＲＧ４ならびに生理食塩水単独の、ヒト角膜−眼瞼界面（図１４Ａ−静止、図１４Ｂ−動的）及びヒト角膜−ＰＤＭＳ（図１４Ｃ−静止、図１４Ｄ−動的）界面の境界潤滑におけるｒｈＰＲＧ４の効果を示すデータの図である。値は平均±ＳＥＭ（ｎ＝６）であり、それぞれ角膜−眼瞼（ＡＢ）及び角膜−ＰＤＭＳ（ＣＤ）界面の平均垂直応力（normal stress）は、１４．１±２．２及び１６．９±５．３（平均±SD）である。これらのデータは、低負荷潤滑タスクにおけるｒｈＰＲＧ４及び精製された天然ＰＲＧ４の実質的に同一の潤滑特性を説明する。
【図１４Ｂ】[0046]生理食塩水中３００μｇ／ｍｌの天然ウシＰＲＧ４及びｒｈＰＲＧ４ならびに生理食塩水単独の、ヒト角膜−眼瞼界面（図１４Ａ−静止、図１４Ｂ−動的）及びヒト角膜−ＰＤＭＳ（図１４Ｃ−静止、図１４Ｄ−動的）界面の境界潤滑におけるｒｈＰＲＧ４の効果を示すデータの図である。値は平均±ＳＥＭ（ｎ＝６）であり、それぞれ角膜−眼瞼（ＡＢ）及び角膜−ＰＤＭＳ（ＣＤ）界面の平均垂直応力（normal stress）は、１４．１±２．２及び１６．９±５．３（平均±SD）である。これらのデータは、低負荷潤滑タスクにおけるｒｈＰＲＧ４及び精製された天然ＰＲＧ４の実質的に同一の潤滑特性を説明する。
【図１４Ｃ】[0046]生理食塩水に溶解した３００μｇ／ｍｌの天然ウシＰＲＧ４及びｒｈＰＲＧ４ならびに生理食塩水単独の、ヒト角膜−眼瞼界面（図１４Ａ  −  静止、図１４Ｂ−動的）及びヒト角膜−ＰＤＭＳ（図１４Ｃ−静止、図１４Ｄ−動的）界面の境界潤滑におけるｒｈＰＲＧ４の効果を示すデータの図である。値は平均±ＳＥＭ（ｎ＝６）であり、それぞれ角膜−眼瞼（ＡＢ）及び角膜−ＰＤＭＳ（ＣＤ）界面の平均垂直応力（normal stress）は、１４．１±２．２及び１６．９±５．３（平均±SD）である。これらのデータは、低負荷潤滑タスクにおけるｒｈＰＲＧ４及び精製された天然ＰＲＧ４の実質的に同一の潤滑特性を説明する。
【図１４Ｄ】[0046]生理食塩水に溶解した３００μｇ／ｍｌの天然ウシＰＲＧ４及びｒｈＰＲＧ４ならびに生理食塩水単独の、ヒト角膜−眼瞼界面（図１４Ａ−静止、図１４Ｂ−動的）及びヒト角膜−ＰＤＭＳ（図１４Ｃ−静止、図１４Ｄ−動的）界面の境界潤滑におけるｒｈＰＲＧ４の効果を示すデータの図である。値は平均±ＳＥＭ（ｎ＝６）であり、それぞれ角膜−眼瞼（ＡＢ）及び角膜−ＰＤＭＳ（ＣＤ）界面の平均垂直応力（normal stress）は、１４．１±２．２及び１６．９±５．３（平均±SD）である。これらのデータは、低負荷潤滑タスクにおけるｒｈＰＲＧ４及び精製された天然ＰＲＧ４の実質的に同一の潤滑特性を説明する。
【図１５】[0047]１４０４アミノ酸の長さである全長ヒトラブリシンのアミノ酸配列を示す図である。シグナル配列残基（１〜２４）を太字で示す。
【図１６】[0048]全長ヒトラブリシンをコードする核酸配列を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
[0049]  本発明者らは、無血清成長培地において哺乳類細胞を活用する懸濁培養を伴う産生プロセスの作成を目標として、組換えＤＮＡ技法を用いた公知ヒトラブリシン糖タンパク質の産生のための選択肢について検討した。組換えＤＮＡ技法を用いてタンパク質を産生するための、本出願人らが知るいかなる以前の取り組みとも異なり、本課題は、その価値が、その生化学的特性とは反対に、そのナノスケールの機械的特性にある複合体の大型のバイオポリマーの商業的な量を産生することであり、これらの物理的特性は、遺伝子操作された細胞においてこれまでに観察されたことのない規模での、翻訳後グリコシル化過程の利用に成功することに依存した。
【００３７】
[0050]  全長ラブリシンの組換え産生における以前の試みは、１リットル当たり僅かなミリグラム数の量しか生じず、１リットル当たり少なくとも約１〜２グラムを産生する方法が必要とされた。文献の再検討は、全長の適切にグリコシル化されたラブリシンの商業的規模での成功した組換え産生に関するいかなる報告も、いかなるムチン又はムチン様タンパク質の商業的規模発現も明らかにしなかった。この探索から、ラブリシン等の高度にグリコシル化された糖タンパク質の発現が、極めて困難であったことを示唆する報告が見出された。例えば、「発現パラメータを最適化し、およそ７６〜７８種のＫＥＰＡＰＴＴ類似配列全ての機能的な必要性について検討するために、異なるＯ結合型オリゴ糖置換の程度を有する組換えラブリシンタンパク質の合成を可能にするラブリシン発現コンストラクトを設計した」ことを記す、米国特許第７，６４２，２３６号を参照されたい。トランケート型ラブリシンコンストラクトを発現する組換え細胞株の産生量データは、この特許において開示されていない。
【００３８】
[0051]  本発明者らは、スイス、ジュネーブのＳｅｌｅｘｉｓ  Ｓ．Ａ．を探し出し最終的にはそれに従って、発現が困難なタンパク質の産生を増強するためにエピジェネティック調節因子を発現させることを伴うＳｅｌｅｘｉｓ技術の報告された能力に部分的に基づき、ラブリシン発現クローン培養液を作製した（ここに本明細書の一部を構成するものとしてその開示内容を組み込む、Selexis米国特許第７，１２９，０６２号及び同第８，２５２，９１７号ならびに米国特許出願公開第２０１１／００６１１１７号、同第２０１２／０２３１４４９号及び同第２０１３／０１４３２６４号；Girod et al., Nat Methods 4（9）:747-53 （2007）; Harraghy et al., Curr Gene Ther. 8（5）:353-66 （2008）を参照）。
【００３９】
[0052]  Ｓｅｌｅｘｉｓ技術の適用は、ラブリシンの発現に成功したクローンの構築をもたらした。解析、スケールアップ及び精製後に、新たに開発された組換え産生手によって、これまでに記載されたことがない、多量体が重度に且つ異なったかたちでグリコシル化された形態のヒト様ラブリシンと、斯かる重度にグリコシル化された、分子量が高いムチン様糖タンパク質の、前例のないレベルの収率とをもたらしたことが発見された。新たな組換えラブリシン型に富む調製物の検査は、予想外の特性を実証し、改善された生理的に適合性の組織潤滑組成物の産生を可能にした。
【００４０】
ｒｈラブリシン製造プロセス
宿主細胞
[0053]  クロマチンの動的組織化を制御するＤＮＡに基づくエレメント、いわゆるマトリックス付着領域を含有するその専売ＣＨＯ−Ｍ細胞株を用いて、Ｓｅｌｅｘｉｓクローン産生研究を行った。ＣＨＯ−Ｍ細胞株は、無血清培養条件に適応させた、組換えタンパク質の産生に用いられる、ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ATCC、Cat.#ＣＣＬ−６１、Lot.４７６５２７５）に由来するチャイニーズハムスター卵巣細胞株である。ＣＨＯ等、安定的高発現真核細胞株の構築のためにＭＡＲを使用するための方法のためのマトリックス付着領域（MAR）と、ＥＲ膜を越えた発現産物の転位置及び／又は細胞質膜を越えた分泌に関与するタンパク質を発現するようトランスフェクトされた細胞に関する、上に同定されたＧｉｒｏｄ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ４（９）：７４７−５３（２００７）ならびにＳｅｌｅｘｉｓ米国特許及び刊行物を参照されたい。ＣＨＯ−Ｍは、治療用組換えタンパク質の産生に用いられ、より高くより安定的な発現を可能にする。その使用は、組換えタンパク質の産生における使用のための所望の高レベル発現を示すクローンの単離を可能にした。
【００４１】
[0054]  マトリックス付着領域（「MAR」）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて高親和性で単離された核スキャフォールド又は核マトリックスに結合するＤＮＡ配列である（Hart et al., Curr OpinGenet Dev, 8（5）:519-25 （1998））。そのようなものとして、包含するシス調節エレメントのみが、ドメイン内の遺伝子の発現を制御するように、これは、独立的クロマチンドメインの境界を定義することができる。ＭＡＲ配列は、局所的クロマチン到達性を増加させるためのエンハンサーと相互作用することが示されており（Jenuweinet al., Nature, 385: 269-272 （1997））、細胞培養系統における異種遺伝子の発現を増強させることができる。ニワトリリゾチーム５’ＭＡＲエレメントを有するプラスミドと、１種又は複数の発現ベクターとの同時トランスフェクションは、安定的導入遺伝子発現の増加をもたらし、これは、対照コンストラクトと比較して発現を２０倍増加させことが示された。
【００４２】
[0055]  ＭＡＲは、本明細書に参照されているＳｅｌｅｘｉｓ出願及び刊行物において開示されている「クロマチンエレメント」（本明細書において、Selexis遺伝因子又はSGEとも称される）の１種である。クロマチンエレメント又はＳＧＥは、宿主染色体への異種遺伝子の組み込み部位周囲のクロマチンが、組み込まれた遺伝子の発現レベルに影響を与えることを防止するために用いられる。クロマチンエレメントは、境界エレメント又はインスレーターエレメント（BE）、マトリックス付着領域（MAR）、遺伝子座調節領域（LCR）及びユニバーサル又は遍在性クロマチンオープニングエレメント（UCOE）を含む。発現ベクターが宿主細胞染色体に組み込まれ、これにより、導入遺伝子が非常に転写活性な状態に維持されたら、ＳＧＥはクロマチンを形作る。
【００４３】
[0056]  ８ｍＭ  Ｌ−グルタミン、ヒポキサンチン及びチミジン（１×HT、Invitrogen）を補充したＳＦＭ４ＣＨＯ培地（HyClone）において、ＣＨＯ−Ｍ宿主細胞を培養した。加湿したインキュベーター内で３７℃及び５％ＣＯ２にて揺動下で（１２０ｒｐｍ、２５ｍｍストローク）細胞を維持した。
【００４４】
ベクター構築
[0057]  全長１４０４ＡＡヒトラブリシンタンパク質をコードするＰＲＧ４遺伝子（配列番号２）を、哺乳類細胞における遺伝子発現の増強のための、Ｓｅｌｅｘｉｓ  Ｓ．Ａ．（ジュネーブ、スイス）から市販される専売のプラスミドベクターに挿入した。全長ヒトラブリシンをコードする別の配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００５８０７．３により入手できる。
【００４５】
[0058]  ２種の発現ベクターを構築した。ラブリシン遺伝子を、ピューロマイシン抵抗性を保有する発現ベクター及びハイグロマイシン抵抗性を保有する別のベクターにクローニングした。ピューロマイシン抵抗性を含むベクターを、ｐＳＶｐｕｒｏ＿Ｃ＋＿ＥＦ１アルファ（KOZAK-ext9）ＥＧＦＰ＿ＢＧＨ  ｐＡ＞Ｘ＿Ｓ２９（２＊HindIII、SalI充填）（Mw＝９８６１）と命名した。ハイグロマイシン抵抗性を含むベクターを、ｐＳＶｈｙｇｒｏ＿Ｃ＋＿ＥＦ１アルファ（KOZAK-ext9）ＥＧＦＰ＿ＢＧＨ  ｐＡ＞Ｘ＿２９（２＊HindIII、SalI充填）（Mw＝１０２９９）と命名した。発現ベクターは、アンピシリン抵抗性を付与するトランスポゾンＴｎ３（AmpR）由来の細菌ベータ−ラクタマーゼ遺伝子、及び細菌ＣｏｌＥ１複製起点を含んでいた。ｐＧＬ３Ｃｏｎｔｒｏｌ（Promega）の誘導体として、発現ベクターのターミネーター領域は、ＢＧＨポリアデニル化シグナルの下流に配置されたＳＶ４０エンハンサーを含んでいた。各ベクターは、ＳＶ４０プロモーターの制御下に、発現カセットの下流の１個のヒトＸ＿２９ＳＧＥ、及び組み込まれたピューロマイシン又はハイグロマイシン抵抗性遺伝子も含んでいた。Ｘ＿２９ＳＧＥは、本明細書において参照されているＳｅｌｅｘｉｓ出願及び刊行物において開示されている、Ｓｅｌｅｘｉｓ遺伝因子（「SGE」）、この場合はマトリックス付着領域（MAR）を指す。両方の発現ベクターは、ＣＭＶエンハンサーにカップリングされたｈＥＦ−１−アルファプロモーターの制御下で、目的の遺伝子（PRG4）をコードした。配列決定によってプラスミドを検証した。
【００４６】
[0059]  ピューロマイシン抵抗性遺伝子を保有する及びハイグロマイシン抵抗性遺伝子を保有するベクターのプラスミドマップを、それぞれ図１及び図２に示す。
【００４７】
トランスフェクション
[0060]  ＣＨＯ−Ｍ細胞のためのパルス条件（１２５０Ｖ、２０ｍｓ及び３パルス）を定義するＭｉｃｒｏＰｏｒａｔｏｒ（商標）（NanoEnTek Inc.、韓国）を用いたマイクロポレーション（microporation）により、細胞をトランスフェクトした。ＧＦＰ発現ベクターを並行して用いてトランスフェクション効率を調節したところ、５０〜７０％の間のトランスフェクション効率が認められた。ＣＨＯ−Ｍ細胞をまず、ピューロマイシンＰＲＧ４発現ベクターでトランスフェクトし、最初はピューロマイシンを含有する培地において培養することにより、安定的にトランスフェクトされた細胞を選択した。より具体的には、希釈物を９６ウェルプレートに分注し、翌週の間に、全ウェルに１００μＬの新鮮な選択培地を添加することにより補給した（５μｇ／ｍＬのピューロマイシンを含む８ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１×HTを補充したSFM4CHO培地）。プレーティング１５日後に、対応する９６ウェルから、同じ培地を加え（prime）た２４ウェルプレートの１ウェルへと完全細胞懸濁液を移すことにより、２４ウェルプレートに２７個のミニプールを再び播種（reset）した。４日以内に、２４ウェル上清を解析し、１４個のミニプールを６ウェルプレートに移した（選択を含む（incl. selection）１ｍＬの細胞懸濁液＋２ｍＬの新鮮な成長培地）。最も良く発現するミニプール８個を、３日後にスピンチューブ（５ｍＬの作業容量）における懸濁及び回収により増やし、３日後に、振盪フラスコ（２０ｍＬの作業容量）において培養した。その後の継代を１回、バンク寄託（banking）前に行った。
【００４８】
[0061]  振盪フラスコにおいて抵抗性細胞のプールを増やして、予備試験に必要な材料を作製した（１〜２ｍｇ総計）。８００ｇで５分間の細胞培養液の遠心分離により、無細胞培地試料を得た。ドットブロット解析により、組換えＰＲＧ４の発現をアッセイした。１０マイクロリットルの無細胞培地（濃縮試料）を、ＰＶＤＦ膜（Millipore）上にスポットして試料を乾燥させた。８０μｇ／ｍｌのＰＲＧ４を２．５μｇ／ｍｌまで系列希釈することにより、ＰＲＧ４標準を作製した。ＰＲＧ４のラブリシン合成ペプチドに対して作製されたポリクローナル抗体（Pierce）によって組換えＰＲＧ４を検出した。
【００４９】
[0062]  第２の選択マーカー、ハイグロマイシン抵抗性カセットを用いて、最良の成績のミニプール由来の細胞を次にスーパー（super）トランスフェクトした（既に選択されたミニプール集団に対する追加的なトランスフェクション）。上述と同じトランスフェクションプロトコールを用いた。この第２のトランスフェクションの１日後に、８ｍＭ  Ｌ−グルタミン及び１×ＨＴを再度補充したが、１０００μｇ／ｍＬのハイグロマイシンを含むＳＦＭ４ＣＨＯ培地において選択を開始した。培地交換後に、４日以内に、３個のプールを６ウェルプレートに移した；４日後にスピンチューブ（５ｍＬの作業容量）、３日以内に振盪フラスコ（２０ｍＬの作業容量）へと移して全三（３）個のプールを増やした。
【００５０】
クローン作製
[0063]  次に、細胞特性を最大化する試みにおいて、スーパートランスフェクトされたプールを培養し、複数の連続的実験において成長潜在力を解析した。
【００５１】
[0064]  第１の実験において、８ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１×ＨＴ及びＣｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ５（商標）（HyClone）（選択なし）を含む半固体培地（２×SFM4CHO培地（HyClone）及びCloneMatrix（Genetics））における１００細胞／ｍＬ（プール毎に２プレート）の濃度の培地交換後に、３個のスーパートランスフェクトされたプール（P01ST、P05ST及びP14STと命名）を６ウェルプレートに移した。１６日後に、プレーティングされた細胞をスクリーニングし（ClonePix（商標）システム（Molecular Devices））、２２個の候補を採取し、上述の成長培地（但し選択なし）の入った９６ウェルプレートに移した。６日後に、対応する９６ウェルから２４ウェルプレートの１ウェル（１ｍＬの培地を準備）へと完全細胞懸濁液を移すことにより、全１８個の成長する候補を２４ウェルプレートに再び播種した。３日以内に、２４ウェルの上清を解析し、１２個の候補を６ウェルプレートに移した（選択を含む１ｍＬの細胞懸濁液＋２ｍＬの新鮮な成長培地）。７個の最も良く発現する候補を、５日後にスピンチューブ（５ｍＬの作業容量）中の培地（選択なし）、５日以内に振盪フラスコ（２０ｍＬの作業容量）における懸濁培養に移して増やした。
【００５２】
[0065]  全細胞株をバンク寄託した。フェドバッチ（fed-batch）培養（補給戦略−本来の容量のＣＢ５溶液（HyClone）の１６％、５２ｍｇ／ｍＬ、０、３、４、５、６、７日目に補給）内の振盪フラスコ（３×１０５細胞／ｍＬ、２０ｍＬの培養容量を播種）において、３個の最良の候補の性能を比較した。８日目までに、培養液は、４．２２×１０６〜４．９５×１０６細胞／ｍＬを含み、生存率は９４％〜９６％だった。これらのプールの細胞集団を計数し、単細胞プレーティングのために希釈した（濃度１細胞／ウェル、２プレート）。１１日後に、１ウェル当たり１００μｌ成長培地（選択なし）を添加することにより、単一コロニーに補給した。１７日後に、対応する９６ウェルから２４ウェルプレートの１ウェル（１ｍＬの培地を準備）へと完全細胞懸濁液を移すことにより、９９クローンを２４ウェルプレートに再び播種した。４日以内に、２４を６ウェルプレートに移した（選択を含む３ｍＬの新鮮な成長培地）。８クローンを、４日後にスピンチューブ（５ｍＬの作業容量）における懸濁培養に移して増やし、１回の培地交換（SFM4CHO培地、８ｍＭ  Ｌ−グルタミン及び１×HTを補充）後に、全８クローンを、振盪フラスコ（２０ｍＬの作業容量）に移して増やした。全候補のバンク寄託前にその後の継代を１回行った。
【００５３】
[0066]  フェドバッチ培養（補給戦略Ａ、本来の容量のＣＢ５溶液（HyClone）の１６％、５２ｍｇ／ｍＬ、０、３、４、５、６、７日目に補給）による振盪フラスコ（３×１０５細胞／ｍＬ、２０ｍＬの培養容量を播種）において、５個の最良の候補の性能の比較を行った。３日目に、それぞれの培養液における細胞数は１．６１×１０６〜３．４６×１０６細胞／ｍＬの範囲、倍加時間は１９．８〜３０．７時間の範囲だった。８日目に、細胞濃度は４．０２×１０６〜９．４８×１０６細胞／ｍＬの範囲、細胞生存率は８８．６％〜９７．７％の範囲だった。
【００５４】
[0067]  第２の実験において、３個の異なるスーパートランスフェクトされたプール（P14STcp08、P05ST11及びP14ST33と命名）を上に概要を述べた手順と同じ手順で処理した。その結果、４個のクローン細胞株がもたらされた。再度、振盪フラスコにおけるこれらのクローンの性能を比較したところ、３．５×１０６〜９．４８×１０６細胞／ｍＬの範囲の８日目の細胞濃度、及び７５．３％〜８８．１％の間の生存率をもたらした。
【００５５】
[0068]  ８日目に６．０３×１０６細胞／ｍＬ及び９５．５％生存率を示した、上述の第１ラウンドのＣｌｏｎｅＰｉｘ（商標）システム選択由来のクローン（P14ST15）を、振盪フラスコ（２０ｍＬの作業容量）において解凍した。１回のその後の継代後に、８ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１×ＨＴ及びＣｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ５（商標）、選択なしを含む上述の半固体培地プラスＣｌｏｎｅＭａｔｒｉｘにおける２００細胞／ｍＬ（１プレート）の濃度で、単一のプレートに候補を移した。１２日後にＣｌｏｎｅＰｉｘ（商標）システムを用いてプレーティングされた細胞をスクリーニングし、８４クローンを採取し、９６ウェルプレート（選択なし）に移した。ウェル当たり１００μｌ成長培地を添加することにより、単一コロニーに補給した。プレーティング１８日後に９６ウェル上清のスクリーニングを行った。対応する９６ウェルから２４ウェルプレートの１ウェル（１ｍＬの培地（選択なし）を準備）へと完全細胞懸濁液を移すことにより、最良の２４個の成長するクローンを２４ウェルプレートに再び播種した。３日以内に２４ウェル上清を解析し、１２クローンを６ウェルプレート（選択を含む１ｍＬの細胞懸濁液＋２ｍＬの新鮮な成長培地）に移した。６個の最も良く発現するクローンを、４日後にスピンチューブ（５ｍＬの作業容量）、４日以内に振盪フラスコ（２０ｍＬの作業容量）における懸濁培養に移して増やした。バンク寄託前に２回のその後の継代を行った。６個のクローン細胞株をバンク寄託した。
【００５６】
[0069]  上述の振盪フラスコにおいて、６個の最良の候補の性能を比較した。８日目に、細胞密度は９．０４×１０６〜６．４０×１０６細胞／ｍＬの間の範囲、生存率は７４．６％〜９３．１％の間であった。
【００５７】
凍結保存（Cryoconservation）及び検査
[0070]  クローンプールの複数回の継代後に（６〜３１）、プールをバイアルにおいて６×１０６細胞／バイアルで凍結保存し、液体窒素中に貯蔵した。Ｖｅｎｏｒ（登録商標）Ｇｅｍマイコプラズマ検出キット（Minerva Biolabs）を用いることにより、全細胞株に対しマイコプラズマの非存在を確認した。製造業者のプロトコール（Heipha、Caso-Bouillon TSB）に従って、無菌性検査物を接種し、インキュベートした。全ミニプール及びスーパートランスフェクトされたミニプールの無菌性を確認した。
【００５８】
スケールアップした培養
[0071]  Ｐ０５ＳＴ１１−ｃｐ０５と命名された細胞株をスケールアップのために選択した。２００リットルランのために、次の条件及びプロトコールを用いた：
【００５９】
【表１】
2020039348.tif 000003
【００６０】
[0072]  １〜８日目に２００リットル培養において、ｒｈＰＲＧ４の発現は、生細胞密度（VCD）と共に増加する。ＶＣＤは、８日目までにプラトーに達し、続いて降下し始めるが、これは、条件がもはや高密度細胞培養系の代謝要求に最適ではなくなると典型的に見られる。それにもかかわらず、ｒｈＰＲＧ４の発現は不変であり続け、１２〜１４×１０６細胞／ｍｌのＶＣＤを有する培養系におけるその発現は、培養１３日目に最大濃度に達した。図５は、ＨＰＬＣプロットの曲線下面積を用いて測定された、経時的な組換えラブリシンの累積量を示し、少なくとも９９％純粋ラブリシンであると考えられるものの系列希釈した試料のＨＰＬＣ精製により作成された３種の異なる検量線との比較によるこの面積の解釈を示す。図示されている通り、この手順によって、組換えラブリシン産生は２．５ｇ／ｍｌに近いと推定された。更に産生を繰り返したところ、様々な技法によって測定される見かけ上の収率が変動した。ある１回では、競合的ＥＬＩＳＡによって測定された１．５ｇ／リットルレベルのラブリシンを産生した。別の回では、１．４ｇ／リットルの読み取り値を産生した。
【００６１】
組換えＰＲＧ４の精製
[0073]  精製プロトコールの開発の目標は、これを夾雑物から分離し、凝集を回避し、高収率を維持しながら、発現されたラブリシン産物及びその多量体複合体の潤滑機能を保持することである。これは、ラブリシンの重度グリコシル化、その高い分子量、その抗接着及び表面潤滑特性、ならびに複合体を形成し、純度が増加するにつれて凝集して不溶性微小粒子を形成する傾向のため、これが難題であった。初期実験は、回収した培地におけるラブリシン力価が高かったため、フロースルーモードクロマトグラフィーが、精製損失の回避に必要となり得ることを示唆した。フロースルーにラブリシン産物を保持しながら、クロマトグラフィー吸着により夾雑物を抽出するための戦略を開発した。開発の経過において、収率が、例えば、ソルビタンラウリン酸モノエステルのポリオキシエチレン誘導体等、非イオン性サーファクタント構成成分の使用に感受性であったことが発見された。ラブリシンプールにおける斯かるサーファクタントの省略は、クロマトグラフィー分離工程後の限外濾過／ダイアフィルトレーション及び０．２μｍ濾過における産物の著しい損失をもたらした。たった０．１重量％のサーファクタントの使用は、収率を大いに改善した。試行錯誤により、より低濃度のサーファクタントが、機能の保持及び収率の改善に成功したことが発見された。
【００６２】
[0074]  精製プロセスにおいて用いられる非イオン性サーファクタントに加えて、［（３−コールアミドプロピル（cholamidopropyl））ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホン酸塩（CHAPS）及び／又はリジン等、生理的に適合性の形態の賦形剤は、本発明のラブリシンの溶液と混合することができ、例えば、０．４又は０．６ｍｇ／ｍｌの濃度を超える濃度を含有する溶液におけるラブリシンの凝集を回避又は低下させるために、溶液の安定化において有益な効果を有することができる。
【００６３】
[0075]  反復検査によって、下に表記する精製手順が開発された。
【００６４】
[0076]  沈降によって清澄化された培地（１００ｍＬ）を、５ｍＬの２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、４０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ８．２で希釈し、４００ユニットのＢｅｎｚｏｎａｓｅ（２５０ユニット／μｌ、Novagen）と混合して、可溶性ポリヌクレオチドを除去した。この溶液を４時間室温で混合し、次に３７．８ｇ尿素と混合して、尿素濃度を６Ｍに調整し、１２０ｍＬの溶液をもたらした。これに１Ｎ  ＮａＯＨを添加して、ｐＨ１１及び０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０（ソルビタンラウリン酸モノエステル、Sigma）に調整した。
【００６５】
[0077]  次にＢｅｎｚｏｎａｓｅ後の材料を、樹脂に夾雑物が結合するが産物が結合しないフロースルー（FT）モードにおいて、６Ｍ尿素及び０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０の存在下でｐＨ１１のＧＥ  Ｑ  Ｂｉｇ  Ｂｅａｄｓ（商標）陰イオン交換樹脂を用いて処理した。カラムをまず０．１Ｎ  ＮａＯＨで消毒し；次に、１００ｍＭ  ＮａＰＯ４、１．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２を入れ；２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ホウ酸塩、６Ｍ尿素、ｐＨ１０で再平衡化した。次に、３０ｍｌ容量（ＸＫ２６×６ｃｍ）カラムに、流速２０ｍｌ／分（２４０ｃｍ／時間）にて１２０ｍｌ溶液を４ｍｌ／ｍｌ樹脂で負荷し、続いて平衡化バッファー−１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ホウ酸塩、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、６Ｍ尿素、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ１１で洗浄した。負荷の直後に、ストリップ（strip）溶液０．１Ｎ  ＮａＯＨ＋１Ｍ  ＮａＣｌの添加まで、洗浄（２９０ｍＬの総容量）により産物を収集した。
【００６６】
[0078]  この部分的に精製されたフロースルーラブリシンプールを１Ｍクエン酸塩ｐＨ＝７．５でｐＨ調整し、ヒドロキシアパタイトカラム（BioRad CHT）を通過させた；カラム容量−１４ｍｌ（ＸＫ１６×７ｃｍ）、カラム負荷−２１ｍｌ負荷／ｍｌ樹脂、流速＝１０ｍｌ／分（３００ｃｍ／時間）。カラムをまず０．１Ｎ  ＮａＯＨ及び１Ｍ  ＮａＣｌで消毒し、５００ｍＭ  ＮａＰＯ４、ｐＨ６．５を入れ；５００ｍＭ  ＮａＰＯ４／６Ｍ尿素、ｐＨ７．４で再平衡化し；上の工程から得た２９０ｍＬのフロースルーを負荷した。これに続き、平衡化バッファー、１５ｍＭ  ＮａＰＯ４、６Ｍ尿素、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４で洗浄して、産物を含有する３０５ｍｌのフロースルーを産生した。
【００６７】
[0079]  ヒドロキシアパタイトカラム由来のフロースルーを、１Ｍクエン酸塩でｐＨ４．８に調整し、水で希釈し、続いてＧＥ  ＳＰ  Ｂｉｇ  Ｂｅａｄ樹脂を通過させた；カラム容量−６ｍｌ（ＸＫ１．６×３ｃｍ）、カラム負荷−５８ｍｌ負荷／ｍｌ樹脂、流速＝６．７ｍｌ／分（２００ｃｍ／時間）。カラムをまず０．５Ｎ  ＮａＯＨで消毒し、１００ｍＭ  ＮａＰＯ４、１．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４を入れ；５０ｍＭクエン酸Ｎａ／６Ｍ尿素、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ４．８で再平衡化し；上の工程から得た３５０ｍＬのフロースルーを負荷した。これに続いて、平衡化バッファー、５０ｍＭクエン酸Ｎａ／６Ｍ尿素、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ４．８で洗浄して、産物を含有する３７８ｍｌのフロースルーを得た。次に、フロースルーを１０Ｎ  ＮａＯＨ（ｐＨ７．２）で中和した。
【００６８】
[0080]  ５０ｋＤａ分子量カットオフＴａｎｇｅｎＸ０．０１ｍ２フラットシーツ膜（TangenX Technology Corporation）、ＬＰスクリーンチャネルを用いて、濃縮及びバッファー交換のため、陽イオン交換後のフロースルー産物プールを濾過した。ダイアフィルトレーションバッファーは、１０ｍＭ  ＮａＰＯ４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２（PBS）及び０．１％Ｔｗｅｅｎ２０であった。０．１Ｎ  ＮａＯＨによる消毒；ＭｉｌｌｉＱ水によるリンス；及び１０ｍＭ  ＮａＰＯ４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２による平衡化後に、膜に、１５，０００ｍｌ／ｍ２；クロスフロー７０ｍｌ／分；膜横断圧力＝６〜７ｐｓｉ；透過フロー＝５〜６ｍｌ／分で負荷して、溶液をおよそ５０ｍｌに濃縮した。
【００６９】
[0081]  最後に、ＵＦＤＦ後の産物プールを、ほぼ１７，０００ｍｌ／ｍ２の膜負荷及び４５〜５０ｍｌ／分の流速でＳａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓａｒｔｏｐｏｒｅ２、１５０〜０．０１５ｍ２膜を通した０．２μｍ濾過に付した。膜をまず１０ｍＭ  ＮａＰＯ４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４で準備し、次に産物を濾過し、続いてほぼ４０ｍｌのバッファーで後追い（chase）濾過し、最後にフィルターの水気を切った。
【００７０】
[0082]  ＵＦＤＦ及び０．２ｕｍ濾過からの最終精製産物の回収を改善するための追加的な賦形剤が現在試験されている。この手順は、少なくとも９６％純度の、回収した培地１リットル当たりの産物の量を大きくすることができる。代替精製戦略は、当業者には明らかであろう。
【００７１】
ラブリシン産物の特徴付け
電気泳動
[0083]  全長ラブリシンアミノ酸骨格の分子量は、１５０，９１８ダルトンである。グリコシル化の程度及び種類は、分子間で変動する。本明細書に開示されている通りに二量体種として作られた組換えＰＲＧ４は、約４５０ｋＤａを超える平均分子量を有すると考えられる。単量体は、２２０〜２８０ｋＤａ且つ約３００ｋＤａ以下の重量を有する筈である。
【００７２】
[0084]  図３は、精製されたまま還元していないｒｈＰＲＧ４、ならびに還元及びアルキル化したｒｈＰＲＧ４の両方のクーマシー染色ゲル（Tris-Ac３〜８％NuPAGE（登録商標）SDS-PAGEポリアクリルアミドゲル電気泳動システム、Invitrogen）を示す。番号を振ったバンドは全て、ヒト（homo sapien）ＰＲＧ４（UniProt受託番号Ｑ９２９５４；配列番号１）にマッチするアミノ酸配列を有するラブリシンとしてＭＳ／ＭＳによって確認された。見て分かる通り、上述通りに産生された組換えラブリシン（NR）は、ほぼ４６０ｋＤａの、分子量標準との比較によって推定されるおよその分子量を有する主要バンドを含み、その一方は、これを僅かに超え、一方は、ゲル中に侵入することができずにゲルの上部に存在する。
【００７３】
[0085]  図４におけるＬ−ＮＯと標識されたレーンに示す通り、ｒｈＰＲＧ４をノイラミニダーゼ（NaNase 1）及びＯ−グリコシダーゼＤＳにより消化して、ｒｈＰＲＧ４のアミノ酸コアの分子量を曝露することにより、翻訳後プロセシング構成物の同定を行った。コアの予測される分子量は１５１ｋＤａであり、これは、この４〜１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより実験的に確認される。ノイラミニダーゼ単独による消化は、分子量に対する低減効果を有し、これから、グリコシル化が、ノイラミン酸により不完全にキャッピングされていることが分かる。Ｏ結合型β（１−３）ＧａｌＮＡｃ−Ｇａｌ残基を除去するＯ−グリコシダーゼＤＳ及びノイラミニダーゼによる消化は、このタンパク質バッチが、大まかに３０重量％グリコシル化されていることを暗示する。Ｏ−グリカナーゼ単独による消化は、一部のキャッピングされていないＧａｌＮＡＣ−Ｇａｌ残基の除去においてしか有効でない可能性が高い。
【００７４】
グリコシル化解析
[0086]  タンパク質を更に特徴付けるために、組換えラブリシン及び正常滑膜ラブリシン由来のＯ−グリカンの質量分析的解析を行って比較した。簡潔に説明すると、ＤＥＡＥクロマトグラフィーを用いて滑液から滑膜ラブリシンを単離した。３〜８％Ｔｒｉｓ−アセテートゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥにより組換え及び滑膜ラブリシンを分離し、その後ＰＶＤＦ膜に転写した。次に、還元的β−脱離によりラブリシンブロットからＯ−グリカンを放出させ、続いてＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析のために清浄化した。線形イオントラップ質量分析計、ＬＴＱ（Thermo Scientific）におけるデータ依存的な方法を用いたネガティブモードにおけるＭＳ／ＭＳ解析前の多孔性黒鉛化カーボンクロマトグラフィーによりＯ−グリカンを分離した。
【００７５】
[0087]  組換えラブリシン試料の解析は、コア１  Ｏ−グリカン構造のみを同定した（図６）。同定されたグリカンを表示する抽出されたイオンクロマトグラフを図７に示す。シアル酸付加された構造、［Ｍ−Ｈ］−６７５は、２個の主要ピークとして示される。これらは、同じ異性体であり、保持時間２１．４分間の第２のピークは、β−脱離プロセスの際に作製された化学的誘導体である。硫酸化構造の３種の異性体（［Ｍ−Ｈ］−４６４）を同定した。モノ硫酸化モノシアル酸付加構造の数種類の異性体も同定された。ジシアル酸付加構造は、存在量が非常に低く、クロマトグラフにおいて観察できなかった。同定されたグリカンのそれぞれの比率の推定を表１に示す（糖構造の鍵のため、図６を参照）。この解析は、表１における構造のそれぞれのあらゆる異性体、誘導体及び付加体を組み合わせる。
【００７６】
[0088]
【表２】
2020039348.tif 000004
【００７７】
[0089]  正常ヒト滑膜ラブリシンは、コア２構造へと伸長するより大きな範囲のグリカンを有する（図８）。これらの構造のうち最も豊富なものを、抽出されたイオンクロマトグラフにおいて図９に示す。
【００７８】
[0090]  例えば、図９と図７の比較から容易に認めることができる通り、ｒｈラブリシンのグリコシル化パターンは、天然ヒト糖タンパク質とは非常に異なる。天然滑膜ラブリシンにおいて、シアル酸付加されたコア１構造は、最も豊富なグリカンであるが、様々な種類の有意なコア２グリコシル化と、ごく少量の硫酸化多糖が存在する。組換え糖タンパク質において、シアル酸付加及び非修飾コア１は、グリカンの半分超を構成し、硫酸化コア１構造は、同定されたＯ−グリカンの約３分の１を構成し、全３種の可能な異性体が同定された。
【００７９】
ｒｈラブリシンの物理化学的特性
サーファクタント様（両親媒性）特性
[0091]  ｒｈＰＲＧ４の重要な性状は、物理化学的吸着により生物学的及び非生物学的表面の両方をコーティングするその能力である。天然ＰＲＧ４は、表面活性であり、大型のムチン様ドメインによって隔てられた末端球状ドメインが組み込まれている。これらは、その構造内で極性及び無極性ドメインへと分離する可能性がある。ヒト滑液ラブリシンについての表面力装置による研究から示されているように、中央ムチンドメインは自身に向かって折り返されることがあり、この配向性が達成されると、グリコシル化部分同士が離れることが示唆される。全体的に見て、ムチンドメインは、そのＮ又はＣ末端のいずれよりも親水性となる。このことの重要性は、グリコシル化部分を消化すると、潤滑能力が除去されることになるという知見によって裏付けられる（Jay et al., J Glycobiol 2001）。この両親媒性質は、ｒｈＰＲＧ４にも存在する。これは、脂肪性及び水性界面の間の界面張力の低下の評価により容易に測定することができる。
【００８０】
[0092]  本発明のプロセスを用いて作製されたｒｈラブリシンのサーファクタント特性を検査するように設計された実験において、希釈されていない疎水性シクロヘキサンによって覆われたＰＢＳの溶液中に、増加する濃度のｒｈＰＲＧ４を加えた。ｒｈＰＲＧ４を含有する水性副相（sub-phase）に置かれたＤｕ  Ｎｏｕｙ環は上向きに引かれ、環が界面を突き抜ける臨界張力（Γi）を記録した。Ａｔｔｅｎｓｉｏｎ  Ｓｉｇｍａ  ７０２ＥＴ張力計において、各濃度で５回測定値を収集した。ｒｈＰＲＧ４の濃度の用量反応曲線をΓiに対しプロットし、これは図１０Ａを参照されたい。図示されている通り、ＰＢＳを含有する水性副相におけるｒｈＰＲＧ４の濃度が増加するにつれて、界面張力が減少する。
【００８１】
[0093]  ｒｈラブリシン溶液は、残留する非イオン性サーファクタント（Tween 20）を含有していたため、このことが、組換え産物の添加によって誘導される表面張力の劇的な低下の原因となったか調べるために、まず様々な濃度のサーファクタント単独を使用して、次に非常に低濃度の本発明のｒｈＰＲＧ４を用いて実験を反復した。マイクロリットル量のサーファクタント及びＰＲＧ４を、１５ｍＬの水性副相に添加した。結果を図１０Ｂ及び図１０Ｃに示す。図示されている通り、ＰＲＧ４単独（図１０Ｃ）は、０．１％において商業的サーファクタント単独よりも表面張力を低下させる（図１０Ｂ）。よって、いずれにも同じ量の目的の溶液が添加された場合、０．１％Ｔｗｅｅｎを含有する及びＴｗｅｅｎを含有しないｒｈＰＲＧ４は、０．１％Ｔｗｅｅｎ単独よりもＰＢＳ及びシクロヘキサンの界面張力を低下させた。
【００８２】
[0094]  これらのデータは、低濃度であっても、ｒｈＰＲＧ４が、水性−脂肪性界面に優先的に集合し、界面張力を低下させることを示す。この現象は、摩擦の低下において必要とされる表面結合相互作用を再現し、天然ラブリシンの挙動を模倣する。更に、界面張力低下の活性は、ｒｈＰＲＧ４産生の品質管理手順として用いることができる。
【００８３】
潤滑特性
軟骨潤滑
[0095]  新鮮な骨軟骨性試料（ｎ＝１６）を、以前に記載された通りに、骨格的に成熟したウシ後膝関節結合部の膝蓋骨−大腿溝から摩擦検査のために調製した。簡潔に説明すると、流体減圧を可能にするための中心孔（半径＝０．５ｍｍ）を両者共に有するコア（半径＝６ｍｍ）及び弁輪（annulus）（外側半径＝３．２ｍｍ及び内側半径＝１．５ｍｍ）を骨軟骨性ブロックから回収した。試料をＰＢＳにおいて４℃で激しく一晩リンスして、残留する滑液を関節表面から取り除き、潤滑の存在を検査することによりこれを確認した。次に、プロテイナーゼ阻害剤を含有するＰＢＳにおいて−８０℃で試料を凍結し、解凍し、ＰＢＳにおいて一晩再振盪して、表面上に残留するＰＲＧ４を表面から更に完全に枯渇させた。次に、翌日の潤滑検査に先立ち、約０．３ｍｌのそれぞれの被験潤滑剤（後述）において４℃で一晩試料を完全に浸漬し、各検査後に、次の被験潤滑剤においてインキュベーションする前にＰＢＳで再度リンスした。
【００８４】
[0096]  Ｂｏｓｅ  Ｅｌｅｃｔｒｏｆｏｒｃｅ（登録商標）検査機器（ELF 3200、エデンプレーリー、ミネソタ州）を使用し、確立された軟骨−軟骨摩擦検査を用いてＰＲＧ４型のそれぞれ及び対照の境界潤滑能力を解析した。簡潔に説明すると、０．００２ｍｍ／ｓの定速で、総軟骨厚さの１８％まで、全試料を圧縮し、４０分間応力緩和させて、間質液の減圧を可能にした。次に、減圧された軟骨−軟骨界面における境界モード潤滑を維持することが知られている有効速度で（０．３ｍｍ／ｓ）、±２巡で試料を回転させた。１２００、１２０、１２及び１．２秒間の予すべり定常期間（pre-sliding stationary period）に放置した後、その後の定常期間それぞれの後に、＋／−２巡で試料を回転した。次に反対方向の回転、つまり−／＋２巡で検査順序（test sequence）を反復した。
【００８５】
[0097]  ２種の検査順序によって、単独及びＨＡとの組合せの両方のｒｈＰＲＧ４の軟骨境界潤滑能力を評価した。両方の検査順序において、ＰＢＳは陰性対照潤滑剤とし、ウシ滑液は陽性対照潤滑剤とした。ｒｈＰＲＧ４及び精製された天然ウシＰＲＧ４の両方は、ＰＢＳにおいて４５０μｇ／ｍＬの濃度で調製し、ＨＡ（1.5MDA Lifecore Biomedical、チャスカ、ミネソタ州）も、ＰＢＳにおいて３．３３ｍｇ／ｍＬの生理的濃度で調製した。仮定される潤滑能力増加（摩擦係数減少）順で、潤滑剤を検査した。検査順序１、ｒｈＰＲＧ４対ｎｂＰＲＧ４において、順序は、ＰＢＳ、ｒｈＰＲＧ４、ｎｂＰＲＧ４、滑液（ｎ＝７）であり；検査順序２、ｒｈＰＲＧ４対ｒｈＰＲＧ４＋ＨＡにおいて、順序はＰＢＳ、ｒｈＰＲＧ４、ｒｈＰＲＧ４＋ＨＡ、滑液（ｎ＝４）であった。
【００８６】
[0098]  ２種の摩擦係数；静止（μ静止，Ｎｅｑ）（静止状態からのスタートアップ運動の抵抗）及び動的（＜μ動的，Ｎｅｑ＞）（定常滑り運動の抵抗）を、以前に記載した通りに潤滑剤毎に計算した。結果を図１１及び図１２に示す。データを平均±ＳＥＭとして示す。ＡＮＯＶＡを用いて、１．２秒間の予すべり定常期間の＜μ動的，Ｎｅｑ＞におけるチューキー事後検定により、μ静止，Ｎｅｑ及び＜μ動的，Ｎｅｑ＞における反復因子として潤滑剤及び予すべり定常期間の効果を評価した。Ｓｙｓｔａｔ１２（Systat Software, Inc.、リッチモンド、カリフォルニア州）により統計解析を行った。
【００８７】
[0099]  図１１に示す通り、組換えＰＲＧ４及び僅かにより低い値の天然ウシＰＲＧ４の測定された潤滑特性、動的摩擦係数の間に統計的有意性はなかった。図１２に示す通り、ＨＡと組み合わせたｒｈＰＲＧ４は、ｒｈＰＲＧ４単独と比較して、静止時の潤滑性（図１２Ａ）及び動的（図１２Ｂ）潤滑性の両方を改善する。全測定値はＰＢＳにおいて最高であり、ウシ滑液において最低であり、ｒｈ−ＰＲＧ４及びｒｈＰＲＧ４＋ＨＡは中間であった。ｒｈＰＲＧ４＋ＨＡの混合溶液は、ｒｈＰＲＧ４単独よりも有意に低い摩擦係数の傾向を有し（ｐ＝０．０７５）、ウシ滑液と統計的に同様であった（０．０２１±０．００１、ｐ＝０．２０）。
【００８８】
[00100]  ヒアルロニダーゼによる２時間酵素消化を用いて、ベアリングとしての使用を目的とするウシ軟骨からの、天然ラブリシンの除去を保証するための努力も為された。ヒアルロニダーゼ消化は、軟骨外植片の表在ゾーンから天然ＰＲＧ４（Ｐ＜０．０５０）を除去することを目的とする。この処理は、関節軟骨の機械的特徴に有意に影響を与えることなく、表面ＰＲＧ４を除去する。このような表面へのｒｈＰＲＧ４の適用ならびにＢＳＦ及びＰＢＳ対照に対する摩擦応答の比較は、本発明のｒｈＰＲＧ４により低ＣＯＦを再確立することができることを示す。図１３は、介在する潤滑剤としてのｒｈＰＲＧ４、ＢＳＦ及びＰＢＳによる、ヒアルロニダーゼ処理したウシ内側顆状突起軟骨外植片のＣＯＦ値を示す。上に記述されているプロトコールに従って、上述の潤滑剤の後に骨軟骨性外植片を検査した。図示されている通り、組換えヒト様ＰＲＧ４は、低ＣＯＦを再確立した（rhPRG4  Ｎ＝１８；BSF  Ｎ＝６；PBS（Ｎ＝８））。
【００８９】
眼表面の潤滑
[00101]  南アルバータリオン（Southern Alberta Lions）アイバンクから、３ｍｍの強膜を有する正常ヒト角膜を得た。カルガリー大学（University of Calgary）献体プログラムの新鮮な屍体からヒト眼瞼を得た。これらの組織の使用及び歳出（appropriatioin）の承認は、衛生研究倫理委員会（Health Research Ethics Board）から得た。角膜（ｎ＝６）は、コンドロイチン硫酸に基づく角膜貯蔵培地（Optisol-GS）において４℃で貯蔵し、２週間以内に用いた。眼瞼（ｎ＝６）を凍結し、使用時に解凍した。
【００９０】
[00102]  ｒｈＰＲＧ４種の純度は、３〜８％Ｔｒｉｓ−アセテートＮＵＰＡＧＥドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動により、５０％であると評価された。濃縮ｒｈＰＲＧ４調製物の濃度をアッセイし、純度レベルを考慮に入れて調整した。
【００９１】
[00103]  軸及び回転アクチュエータならびに軸負荷及びトルクセンサーを備えるＢｏｓｅ  ＥＬＦ３２００に、組織試料をマウントした。強膜にシアノアクリレート接着剤（スーパーグルー）を塗布することにより、切除された角膜を半球状シリコーンゴムプラグ（半径＝６ｍｍ）の端に固定した。角膜−プラグ装置の周囲にシリコーンゴムスリーブを装着し、これは、潤滑剤流体の保持に役立った。次に、この装置をＢｏｓｅ  ＥＬＦ３２００の回転アクチュエータに取り付け、これにより、底部関節表面を形成した。モデルＰＤＭＳ材料（ほぼ０．４ｍｍ厚UntrSylgard 184、Dow Corning）又はヒト眼瞼組織から弁輪（外半径＝３．２ｍｍ、内半径＝１．５ｍｍ）を穿孔し、弁輪ホルダーにのり付けた。次に、この弁輪ホルダーを線形アクチュエータに取り付け、これにより、上部関節表面を形成した。
【００９２】
[00104]  試料をマウントした後に、０．３ｍｌの被験潤滑剤を角膜上に置いて潤滑剤浴とし、関節表面を被験潤滑剤で少なくとも５分間平衡化した。０．３±０．０２、０．５±０．０３及び０．７±０．０３Ｎの軸負荷に相当する３個の手動で決定された軸位置において、組織試料同士を接触させて、（２４．６ｍｍ２）の接触面積に基づくと１２．２〜２８．５ｋＰａの範囲の軸圧力をもたらす。所定の軸位置において接触したら、試料は、４種の異なる有効滑り速度で（νｅｆｆ＝３０、１０、１．０、０．３ｍｍ／ｓ）両方向における４巡を受けた；式中、νｅｆｆ＝ω・ｒｅｆｆ及びｒｅｆｆ＝２／３［（ｒｏ３−ｒｉ３）／（ｒｏ２−ｒｉ２）］。回転の際に２０Ｈｚで軸負荷及びトルクを収集した。各巡の間に１２秒間の滞留時間があった。後述する各検査順序は、組織が生理食塩水浴において記載の検査プロトコールを受けるプレコンディショニング工程を含んだ。
【００９３】
[00105]  ヒト角膜−眼瞼（検査１）及びヒト角膜−ポリジメチルシロキサン（PDMS、検査２）界面におけるｒｈＰＲＧ４調製物の境界潤滑能力を決定するために、次の検査順序を用いた：生理食塩水における３００μｇ／ｍＬ  ＰＲＧ４、生理食塩水における３００μｇ／ｍＬ  ｒｈＰＲＧ４、続いて生理食塩水（Sensitive Eyes Saline Plus、Bausch &Lomb）。
【００９４】
[00106]  この２種の界面における被験潤滑剤の有効性を判断するために、静止及び動的摩擦係数を計算した。図１４に図示されている通り、ＰＲＧ４及びｒｈＰＲＧ４の両方が、有意に且つ同様に、ヒト角膜−ＰＤＭＳ界面（図１４Ｃ及び図１４Ｄ参照）及び角膜眼瞼界面（図１４Ａ及び図１４Ｂ）における摩擦を低下させた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１６−３】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年12月17日(2019.12.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも３０重量％のグリコシド残基を含むラブリシン糖タンパク質を少なくとも０．４ｇ／リットルの培地中濃度で産生するのに十分な時間及び培養条件下で、ヒトＰＲＧ４遺伝子をトランスフェクトされそれを発現しその発現産物を翻訳後にグリコシル化するチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞を培地中で培養する工程と、
前記培地からラブリシン糖タンパク質を精製する工程と
を含む、組換えラブリシン糖タンパク質の製造方法。
【外国語明細書】
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