(57)【要約】【課題】本発明は一般に、IL-17アイソフォームのアンタゴニスト、ならびに診断および治療での、特にがんまたは自己免疫疾患および慢性炎症性疾患の処置または防止のためのその使用に関する。【解決手段】少なくとも1つのIL-17アイソフォームの少なくとも1つのIL-17アンタゴニストを含む、がんの処置の使用のための組成物であって、前記IL-17アイソフォームがIL-17Bであり、前記IL-17アンタゴニストがIL-17Bまたはその受容体であるIL-17RBに対する抗体または抗原結合性抗体フラグメントである、組成物の提供。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも1つのIL-17アイソフォームの少なくとも1つのIL-17アンタゴニストを含む、がんの処置の使用のための組成物であって、前記IL-17アイソフォームがIL-17Bであり、前記IL-17アンタゴニストがIL-17Bまたはその受容体であるIL-17RBに対する抗体または抗原結合性抗体フラグメントである、組成物。
【請求項２】
乳がん、軟部組織肉腫、結腸がん、胃がん、神経膠腫、肝細胞癌、腎がん、白血病、肺がん、リンパ腫、黒色腫、多発性骨髄腫、卵巣がん、膵がん、頭頸部がん、甲状腺がんまたは前立腺がんの処置のための、請求項1に記載の使用のための組成物。
【請求項３】
処置が、治療剤の有効性を高めるためである、請求項1または2に記載の使用のための組成物。
【請求項４】
治療剤が、化学療法剤である、請求項3に記載の使用のための組成物。
【請求項５】
処置が、がん細胞の増殖を低減するためである、請求項1または2に記載の使用のための組成物。
【請求項６】
処置が、がん細胞の浸潤を低減するためである、請求項1または2に記載の使用のための組成物。
【請求項７】
IL-17Bとは異なるIL-17アイソフォームの1つのIL-17アンタゴニストをさらに含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項８】
前記IL-17Bとは異なるIL-17アイソフォームのIL-17アンタゴニストが、L-17Aのアアンタゴニストである、請求項7に記載の使用のための組成物。
【請求項９】
乳がん、結腸がん、黒色腫、卵巣がんまたは膵がんの処置のための、請求項2に記載の使用のための組成物。
【請求項１０】
乳がんまたは卵巣がんの処置のための、請求項9に記載の使用のための組成物。
【請求項１１】
がんの処置における同時的、個別的または連続的使用のための併用調製物としての、化学療法剤と、IL-17B抗体またはその抗原結合断片とを含む、癌の処置用キット。
【請求項１２】
がんが、請求項2、9または10に規定されたものである、請求項11に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に、IL-17アイソフォームのアンタゴニスト、ならびに診断および治療での、特にがんまたは自己免疫疾患および慢性炎症性疾患の処置または防止のためのその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
インターロイキン17(IL-17)ファミリーは、6つのインターロイキン(IL-17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E = IL-25およびIL-17F)およびその受容体(IL-17RA、IL-17RB、IL-17RC、IL-17RDおよびIL-17RE)を含む(Gaffen, S. L. (2009)「Structure and signalling in the IL-17 receptor family」Nature reviews. Immunology 9(8): 556〜567頁)。IL-17Aは、ホモダイマー(IL-17A/A)またはヘテロダイマー(IL-17A/F)として存在する(Gaffen, S. L. (2009)「Structure and signalling in the IL-17 receptor family」Nature reviews. Immunology 9(8): 556〜567頁)。
【０００３】
IL-17AおよびIL-17Fは、発現のユビキタスなIL-17RAおよびIL-17RCの三量体複合体に結合する。IL-17AおよびIL-17Fは主に、Tリンパ球のサブセットであるTh17細胞により産生される。IL-17AおよびIL-17Fの生物学的役割は、急性炎症反応を誘導することによって、微生物または真菌の感染に対する宿主防御に関与することである。この急性炎症反応は、線維芽細胞、ケラチノサイト、内皮細胞および上皮細胞からの、炎症促進性サイトカイン、ケモカイン、抗菌ペプチド、およびマトリックスメタロプロテアーゼの放出をもたらす(Iwakura, Y.、H. Ishigameら(2011)「Functional specialization of interleukin-17 family members」Immunity 34(2): 149〜162頁)。IL-17Aはまた、好中球を炎症部位に動員する(Iwakura, Y.、H. Ishigameら(2011)「Functional specialization of interleukin-17 family members」Immunity 34(2): 149〜162頁)。しかしながら、実験的自己免疫性脳脊髄炎のマウスモデル、コラーゲン誘導関節炎(CIA)またはSKG関節炎のマウス、大腸炎および乾癬の種々のモデルで証明されているように、慢性的または異所的なIL-17AおよびIL-17Fの産生は、自己免疫疾患および慢性炎症性疾患の発生に関与している(Iwakura, Y.、H. Ishigameら(2011)「Functional specialization of interleukin-17 family members」Immunity 34(2): 149〜162頁)。ヒトでは、IL-17Aおよび/またはIL-17Fは例えば、関節リウマチ(RA)、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス炎症性腸疾患(Systemic Lupus Erythematosus inflammatory bowel diseases)、クローン病および乾癬に関与している(Iwakura, Y.、H. Ishigameら(2011)「Functional specialization of interleukin-17 family members」Immunity 34(2): 149〜162頁)。IL-17Aは、線維芽細胞におけるNFκBおよびStat3活性化を含めた、IL-6シグナル伝達の正のフィードバックループを誘発して、慢性炎症をもたらす。IL-17AおよびIL-17Fはまた、アレルギー疾患にも関与している(Iwakura, Y.、H. Ishigameら(2011)「Functional specialization of interleukin-17 family members」Immunity 34(2): 149〜162頁)。
【０００４】
このファミリーの、他の4つのメンバーは、最近、配列相同性から同定されたものの、これまでほとんど研究されていない。IL-17BはIL-17RBに結合する;IL-17CはIL-17REに結合し、IL-17EはIL-17RAおよびIL-17RBの複合体に結合する;IL-17Dの受容体は知られていない(Gaffen, S. L. (2009)「Structure and signalling in the IL-17 receptor family」Nature reviews. Immunology 9(8): 556〜567頁)。IL-17B、IL-17C、IL-17DおよびIL-17Eは、NFκb、TNFα、IL-6、IL-8、IL-1βなど、IL-17AおよびIL-17Fにより誘導されるのと類似した経路およびサイトカイン放出を活性化する(Lee, J.、W. H. Hoら(2001)「IL-17E, a novel proinflammatory ligand for the IL-17 receptor homolog IL-17Rh1」J Biol Chem 276(2): 1660〜1664頁; Starnes, T.、H. E. Broxmeyerら(2002)「Cutting edge: IL-17D, a novel member of the IL-17 family, stimulates cytokine production and inhibits hemopoiesis」J Immunol 169(2): 642〜646頁; Stamp, L. K.、A. Eassonら(2008)「Different T cell subsets in the nodule and synovial membrane: absence of interleukin-17A in rheumatoid nodules」Arthritis Rheum 58(6): 1601〜1608頁; Iwakura, Y.、H. Ishigameら(2011)「Functional specialization of interleukin-17 family members」Immunity 34(2): 149〜162頁; Ramirez-Carrozzi, V.、A. Sambandamら(2011)「IL-17C regulates the innate immune function of epithelial cells in an autocrine manner」Nat Immunol 12(12): 1159〜1166頁)。IL-17AおよびIL-17Fと同様に、IL-17Cは細菌感染に対する防御に重要である(Ramirez-Carrozzi, V.、A. Sambandamら(2011)「IL-17C regulates the innate immune function of epithelial cells in an autocrine manner」Nat Immunol 12(12): 1159〜1166頁)。IL-17AおよびIL-17Fと同様に、IL-17BおよびIL-17Cも、マウスにおけるCIAで役割を担っており(Yamaguchi (2007)「IL-17B and IL-17C are associated with TNF-α  production and contribute to the exacerbation of inflammatory arthritis」J. Immunol 179: 7128〜7136頁)、IL-17A、IL-17B、IL-17D、IL-17Eの発現は、ヒトのRA結節でも検出されている(Stamp, L. K.、A. Eassonら(2008)「Different T cell subsets in the nodule and synovial membrane: absence of interleukin-17A in rheumatoid nodules」Arthritis Rheum 58(6): 1601〜1608頁)。もとはIL-25と命名されていたIL-17Eは、このファミリーの最も分岐したメンバーである。IL-17Eは、一部の共通な標的(NFκB、IL-6、IL-8)、および固有の標的(IL-4、IL-5およびIL-13)を有する(Wong, C. K.、P. F. Cheungら(2005)「Interleukin-25-induced chemokines and interleukin-6 release from eosinophils is mediated by p38 mitogen-activated protein kinase, c-Jun N-terminal kinase, and nuclear factor-kappaB」American journal of respiratory cell and molecular biology 33(2): 186〜194頁; Iwakura, Y.、H. Ishigameら(2011)「Functional specialization of interleukin-17 family members」Immunity 34(2): 149〜162頁)。IL-17Eは、Th2細胞のサイトカインを誘導することにより、喘息に関与している(Iwakura, Y.、H. Ishigameら(2011)「Functional specialization of interleukin-17 family members」Immunity 34(2): 149〜162頁)。
【０００５】
結論として、全アイソフォームが、生物学的機能および標的について、いくらかの冗長性を呈するようであり(それらが異なる細胞タイプにより産生されるにもかかわらず)、また、IL-6またはTNFαなどの炎症性メディエーターを誘導し、かつNFκBおよびStat3などの発癌経路を活性化する、類似した能力を有する可能性があるようである。
【０００６】
増加したIL-17AまたはIL-17A産生細胞(例えば、Th17細胞)は、数多くの固形がんおよび血液がんにおいて報告されており、したがって、がんの治療標的となり得る(Iwakura, Y.、H. Ishigameら(2011)「Functional specialization of interleukin-17 family members」Immunity 34(2): 149〜162頁)。対照的に、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17EおよびIL-17Fの発現および役割は、がんにおいては評価されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】Mullisら米国特許第4,683,195号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Gaffen, S. L. (2009)「Structure and signalling in the IL-17 receptor family」Nature reviews. Immunology 9(8): 556〜567頁
【非特許文献２】Iwakura, Y.、H. Ishigameら(2011)「Functional specialization of interleukin-17 family members」Immunity 34(2): 149〜162頁
【非特許文献３】Lee, J.、W. H. Hoら(2001)「IL-17E, a novel proinflammatory ligand for the IL-17 receptor homolog IL-17Rh1」J Biol Chem 276(2): 1660〜1664頁
【非特許文献４】Starnes, T.、H. E. Broxmeyerら(2002)「Cutting edge: IL-17D, a novel member of the IL-17 family, stimulates cytokine production and inhibits hemopoiesis」J Immunol 169(2): 642〜646頁
【非特許文献５】Stamp, L. K.、A. Eassonら(2008)「Different T cell subsets in the nodule and synovial membrane: absence of interleukin-17A in rheumatoid nodules」Arthritis Rheum 58(6): 1601〜1608頁
【非特許文献６】Ramirez-Carrozzi, V.、A. Sambandamら(2011)「IL-17C regulates the innate immune function of epithelial cells in an autocrine manner」Nat Immunol 12(12): 1159〜1166頁
【非特許文献７】Yamaguchi (2007)「IL-17B and IL-17C are associated with TNF-α  production and contribute to the exacerbation of inflammatory arthritis」J. Immunol 179: 7128〜7136頁
【非特許文献８】Wong, C. K.、P. F. Cheungら(2005)「Interleukin-25-induced chemokines and interleukin-6 release from eosinophils is mediated by p38 mitogen-activated protein kinase, c-Jun N-terminal kinase, and nuclear factor-kappaB」American journal of respiratory cell and molecular biology 33(2): 186〜194頁
【非特許文献９】Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第2版(1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.
【非特許文献１０】FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY、Paul編、第3版、1993
【非特許文献１１】Wardら、(1989) Nature 341:544〜546頁
【非特許文献１２】Birdら(1988) Science 242:423〜426頁
【非特許文献１３】Hustonら(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879〜5883頁
【非特許文献１４】「Remington's Pharmaceutical Sciences」第15版、1035〜1038頁および1570〜1580頁
【非特許文献１５】Jalkanenら、J. Cell. Biol. 101:976〜985頁(1985)
【非特許文献１６】Jalkanenら、J. Cell Biol. 105:3087〜3096頁(1987)
【非特許文献１７】Sambrookら編(1992) Molecular Cloning: A Laboratory Manual、(Cold Springs Harbor Laboratory、NY)
【非特許文献１８】D. N. Glover編、(1985) DNA Cloning、I巻およびII巻
【非特許文献１９】Gait編(1984) Oligonucleotide Synthesis
【非特許文献２０】HamesおよびHiggins編(1984) Nucleic Acid Hybridization
【非特許文献２１】HamesおよびHiggins編(1984) Transcription And Translation
【非特許文献２２】Freshney (1987) Culture Of Animal Cells (Alan R. Liss, Inc.)
【非特許文献２３】Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press) (1986)
【非特許文献２４】Perbal (1984) A Practical Guide To Molecular Cloning; the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc.、N.Y.)
【非特許文献２５】MillerおよびCalos編(1987) Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells、(Cold Spring Harbor Laboratory)
【非特許文献２６】Wuら編、Methods In Enzymology、154巻および155巻
【非特許文献２７】MayerおよびWalker編(1987) Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Academic Press、London)
【非特許文献２８】WeirおよびBlackwell編、(1986) Handbook Of Experimental Immunology、I〜IV巻
【非特許文献２９】Manipulating the Mouse Embryo、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.、(1986)
【非特許文献３０】Ausubelら(1989) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons、Baltimore、Md.)
【非特許文献３１】Borrebaeck編(1995) Antibody Engineering (第2版; Oxford Univ. Press)
【非特許文献３２】Rickwoodら編(1995) Protein Engineering, A Practical Approach (IRL Press at Oxford Univ. Press、Oxford、Eng.)
【非特許文献３３】Nisonoff (1984) Molecular Immunology (第2版; Sinauer Associates、Sunderland、Mass.)
【非特許文献３４】Steward (1984) Antibodies, Their Structure and Function (Chapman and Hall、New York、N.Y.)
【非特許文献３５】Current Protocols in Immunology、John Wiley & Sons、New York
【非特許文献３６】Stitesら編(1994) Basic and Clinical Immunology (第8版; Appleton & Lange、Norwalk、Conn.)
【非特許文献３７】MishellおよびShiigi (編) (1980) Selected Methods in Cellular Immunology (W.H. Freeman and Co.、NY)
【非特許文献３８】Klein (1982) J. Immunology: The Science of Self-Nonself Discrimination (John Wiley & Sons、NY)
【非特許文献３９】Kennettら編(1980) Monoclonal Antibodies, Hybridoma: A New Dimension in Biological Analyses (Plenum Press、NY)
【非特許文献４０】Campbell (1984)「Monoclonal Antibody Technology」、Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology、Burdenら編(Elsevere、Amsterdam)に収録
【非特許文献４１】Goldsbyら編(2000) Kuby Immunnology (第4版; H. Freemand & Co.)
【非特許文献４２】Roittら(2001) Immunology (第6版; London: Mosby)
【非特許文献４３】Abbasら(2005) Cellular and Molecular Immunology (第5版; Elsevier Health Sciences Division)
【非特許文献４４】KontermannおよびDubel (2001) Antibody Engineering (Springer Verlan)
【非特許文献４５】SambrookおよびRussell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press)
【非特許文献４６】Lewin (2003) Genes VIII (Prentice Hall2003)
【非特許文献４７】HarlowおよびLane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press)
【非特許文献４８】DieffenbachおよびDveksler (2003) PCR Primer (Cold Spring Harbor Press)
【非特許文献４９】http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/
【非特許文献５０】Guedj M、A refined molecular taxonomy of breast cancer、Oncogene (2012) 31、1196〜1206頁
【非特許文献５１】Del Rio M、Gene Expression Signature in Advanced Colorectal Cancer Patients Select Drugs and Response for the Use of Leucovorin, Fluorouracil, and Irinotecan、JOURNAL OF CLINICAL ONCOLOGY、2007
【非特許文献５２】Albini Aら(1987)「A Rapid in Vitro Assay for Quantitating the Invasive Potential of Tumor Cells」Cancer Research 47: 3239〜3245頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
定義
明示的に別段の規定がない限りは、本明細書で使用される用語は、当技術分野での通常の意味に従って解釈されたい。単数形で使用され、または「a」もしくは「an」として言及される用語は、別段の指定があるか、または文脈により示されない限り、複数をも含意し、逆もまた真である。標準的手法および手順は一般に、当技術分野における慣用の方法、および本文書全体にわたって提供されている種々の一般的参考文献に従って行う(一般には、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第2版(1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.を参照されたい)。
【００１０】
本明細書で使用される「IL-17」という用語は、IL-17タンパク質またはインターロイキン17を指し、有利にはヒト由来である。
【００１１】
本明細書で使用される「IL-17アイソフォーム」という用語は、IL-17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E = IL-25またはIL-17Fを指す。
【００１２】
本明細書で使用される「IL-17アンタゴニスト」という用語は、IL-17の活性またはIL-17経路を破綻、妨害、阻害し、そうでなければ標的とし、かつ/または干渉する薬剤、物質、分子などを指す。IL-17アンタゴニストの、非限定的な例としては、IL-17またはその受容体に対する抗体(例えば、中和抗体を含む)、低分子アンタゴニスト、デコイ受容体、タンパク質アンタゴニスト(融合タンパク質および糖タンパク質を含む)、および核酸アンタゴニスト(例えば、遺伝子サイレンサー、ショートヘアピンRNAすなわち「shRNA」、siRNA、およびアンチセンス核酸分子)が挙げられる。
【００１３】
本明細書で使用される「抗体」(または「免疫グロブリン」)という用語は、完全な抗体もしくは「全長」抗体、およびあらゆる抗原結合性フラグメントまたはその単鎖を含意する。「抗体」とは、ジスルフィド結合で互いに連結された、少なくとも2本の重(H)鎖および2本の軽(L)鎖を含む糖タンパク質、またはその抗原結合性部分を指す。全長重鎖は、重鎖可変領域(VH)と重鎖定常領域とを含有する。全長重鎖定常領域は3つのドメイン、CH1、CH2およびCH3を有する。全長軽鎖は、軽鎖可変領域(VL)と、1つのドメイン、CLを含有する軽鎖定常領域とを含有する。VHおよびVL領域はさらに、より保存されたフレームワーク領域(FR)内に位置し、相補性決定領域(CDR)と呼ばれる超可変性領域へと細区画することができる。全長VHおよび全長VLはそれぞれ、アミノ末端からカルボキシ末端へ、FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4の順に並んだ、3つのCDRおよび4つのFRを含有する。VHおよびVLは、抗原と相互作用する結合ドメインを形成する。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞(例えば、エフェクター細胞)および古典的補体系の第1の成分(C1q)を含めた、宿主の組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介することができる。
【００１４】
本明細書で使用される「抗原結合性フラグメント」という用語は、抗原(例えば、IL-17)に特異的に結合する能力を維持する、抗体の1つまたは複数のフラグメントを指す。抗原に結合するという抗体の機能は、全長抗体のフラグメントによって担われ得る。「抗原結合性フラグメント」の例としては、(i)Fabフラグメント、VL、VH、CLおよびCH1ドメインからなる一価フラグメント;(ii)F(ab)2フラグメント、ヒンジ領域でのジスルフィド架橋で連結された2つのFabフラグメントを含む、二価フラグメント;(iii)Fab'フラグメント、ヒンジ領域の一部を有するFab(FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY、Paul編、第3版、1993を参照されたい);(iv)VHおよびCH1ドメインからなるFdフラグメント;(v)抗体の一つの腕の、VLおよびVHドメインからなるFvフラグメント、(vi)VHドメインからなる、dAbフラグメント(Wardら、(1989) Nature 341:544〜546頁);(vii)単離された相補性決定領域(CDR);ならびに(viii)ナノボディ、単一の可変ドメインおよび2つの定常ドメインを含有する、重鎖可変領域が挙げられる。さらには、Fvフラグメントの2つのドメインVLおよびVHは別個の遺伝子にコードされているものの、これらのドメインは組換え法を用い、人工リンカーによって繋ぎ合わすことができる。この人工リンカーによりこれらのドメインは、VLおよびVH領域が対となり一価の分子(単鎖Fv(scFv)として知られる;例えば、Birdら(1988) Science 242:423〜426頁;およびHustonら(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879〜5883頁を参照されたい)を形成する、タンパク質単鎖として作られることが可能となる。このような単鎖抗体も、抗体の「抗原結合性部分」という用語に包含されることを意図する。このような抗体フラグメントは、当業者に知られた慣用の手法を用いて得られ、フラグメントは、完全体の抗体と同様に、有用性についてスクリーニングされる。
【００１５】
「ダイアボディ」という用語は、2つの抗原結合性部位を有し、重鎖可変ドメイン(VH)、およびそれに連結された軽鎖可変ドメイン(VL)を同じポリペプチド鎖(VH-VL)中に含む、小さな抗体フラグメントを指す。同じ鎖上の2つのドメイン同士が対をなすには短すぎるリンカーを使用することによって、これらのドメインは、もう1つの鎖の相補ドメインと対になることを強いられ、2つの抗原結合性部位を形成する。
【００１６】
「精製された」および「単離された」とは、ポリペプチド(例えば、抗体)または塩基配列に言及している際は、指示された分子が、同タイプの他の生体高分子の実質的不在のもとに存在することを意味する。本明細書で使用される「精製された」という用語は、同タイプの生体高分子のうち、好ましくは少なくとも75重量%、より好ましくは少なくとも85重量%、さらにより好ましくは少なくとも95重量%、最も好ましくは少なくとも98重量%存在することを意味する。特定のポリペプチドをコードする、「単離された」核酸分子とは、実質的に、そのポリペプチドをコードしない他の核酸分子の混ざっていない核酸分子を指す;しかしその分子は、組成物の基本的性質に有害な影響を与えないいくつかの追加の塩基または部分を含んでいてもよい。
【００１７】
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、単一分子組成よりなる抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体の組成物は、抗原(すなわち、IL-17)の特定のエピトープに対し、単一の結合特異性および親和性を呈する。
【００１８】
本明細書で使用される「ヒト抗体」という用語は、フレームワーク領域およびCDR領域が共にヒト免疫グロブリンの生殖系列配列に由来する、可変領域を有する抗体を含むことを意図する。抗体が定常領域を含有する場合は、その定常領域もヒト免疫グロブリンの生殖系列配列に由来する。本発明で使用されるヒト抗体は、ヒト免疫グロブリンの生殖系列配列にコードされていないアミノ酸残基を含むことができる(例えば、インビトロでのランダムもしく部位特異的変異誘発により、またはインビボでの体細胞突然変異により導入された突然変異)。
【００１９】
本明細書で使用される「ヒト化抗体」という用語は、マウス、ラット、またはウサギなどの別の哺乳動物種の生殖系列由来のCDR配列が、ヒトフレームワーク配列上に移植された抗体を指す。ヒトフレームワーク配列内で、フレームワーク領域をさらに改変してもよい。
【００２０】
本明細書で使用される「キメラ抗体」という用語は、例えば、可変領域の配列がマウス、ラットまたはラビット抗体に由来し、定常領域の配列がヒト抗体に由来する抗体など、可変領域の配列がある1つの種に由来し、定常領域の配列が別の種に由来する抗体を指す。
【００２１】
本明細書で使用される「低分子」という用語は、それらだけに限らないが、1モルあたり1000グラム未満、より具体的には、1モルあたり750グラム未満、さらにより具体的には1モルあたり500グラム未満の分子量を有する、有機または無機化合物(ヘテロ有機化合物および有機金属化合物を含む)を含意する。このような化合物の塩、エステル、および他の薬学的に許容される形態も包含される。
【００２２】
本明細書で使用される「核酸アンタゴニスト」という用語は、例えばshRNA(「ショートヘアピンRNA」または「低分子ヘアピンRNA」)または干渉RNA(「RNAi」または低分子干渉RNA、「siRNA」)など、あらゆる遺伝子発現抑制分子またはツールを含むことを意図する。
【００２３】
本明細書で使用される「対象」または「患者」という用語は、哺乳動物(それらだけに限らないが、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ウシ、イヌ、ネコ、ラットおよびマウスなどの非霊長類を含む)、より具体的には霊長類(それらだけに限らないが、サル、類人猿、およびヒトを含む)、さらにより具体的にはヒトを指す。
【００２４】
本発明の文脈においては、本明細書で使用される「処置すること」または「処置」という用語は、このような用語の適用される障害もしくは状態、またはこのような障害もしくは状態の1つもしくは複数の症状について、その進行を逆行、軽減、阻止する、またはそれらを防止することを意味する。「治療に有効な量」とは、対象に治療効果をもたらすのに必要な、活性剤の最少量を意味する。例えば、ある哺乳動物にとって「治療に有効な量」とは、障害に関連する病的症状、疾患の進行もしくは生理的状態の改善を、または障害への屈服に対する耐性を誘導する、寛解させる、そうでなければ引き起こすような量のことである。いずれかの特定の、疾患の症状もしくは影響を軽減するのに有効な、治療剤の量(「治療に有効な量」とも呼ばれる)、または特定の、疾患の症状もしくは影響を防止するのに有効な、治療剤の量(「予防に有効な量」とも呼ばれる)は、患者の病状、年齢および体重、ならびに薬物が患者において所望の応答を引き出す能力などの要因に応じて変更できる。疾患の症状または影響が軽減されたか否かは、その症状または影響の重症度または進行度を評価するのに通常使用される(例えば、医療提供者または検査室の臨床医(laboratory clinicians)によって)、いずれの臨床測定によっても評価することができる。
【００２５】
本明細書で使用される「防止する」または「防止」または「予防の」または「予防」という用語は、症状、影響、疾患または障害(例えば、細胞増殖性障害)の発生、発症または再発を、まだそれを有しているとは診断されていない対象において阻止することを指す。
【００２６】
本明細書で使用される「参照量」または「参照レベル」という用語は、例えばタンパク質、核酸、酵素などの物質または分子についての、確立された量または発現レベルであって、それと、対象試料から測定される同じ物質または分子の量とを比較している量または発現レベルを指す。参照量は例えば、正常組織試料に見出されるタンパク質量(または、組織試料の集合からの平均量)であってよく、それと、疾患(例えば、がん性の)組織試料由来のタンパク質量とを比較する。
【００２７】
本明細書で使用される「発現」または「発現している」という用語は、鋳型核酸からのRNA(例えば、mRNA)の転写を指す。「発現」または「発現している」とは、mRNAのポリペプチドへの翻訳をも指す。「発現」または「発現している」という用語は、細胞により放出および/または分泌される、遺伝子産物またはポリペプチドの産生をも含むことを意図する。「産生される」または「産生」という用語は、細胞により分泌または放出される(例えば、細胞外環境へと、またはもし細胞がインビトロに存在する場合、培養液へと)遺伝子産物またはポリペプチドが、発現されていることを示すために使用される場合もある。「増加した発現」という用語は、一般に遺伝子産物またはタンパク質の量の増加に帰結する、少なくとも増加したmRNA産生のレベルでの、および/またはポリペプチド発現のレベルでの遺伝子発現量の変化を含むことを意図する。「増加した発現」は、「過剰発現」または「過剰発現している」という用語と互換的に使用される場合もある。
【００２８】
本明細書で使用される「応答する可能性が高い」という用語は、対象が治療剤から治療効果を受ける可能性が、受けない可能性よりも高いこと意味をする。例えば、治療剤が、疾患の1つまたは複数の症状または影響を軽減するなどの、所望の効果を達成する可能性が、そうならない可能性より高い、などである。具体例を1つ挙げる:IL-17アイソフォームのレベルが各因子の参照量よりも上昇している、細胞増殖性障害を有する対象は、前記IL-17アイソフォームのアンタゴニストを用いた細胞増殖性障害の処置に対し、応答する可能性がより高い。
【００２９】
本明細書で使用される「試料」という用語は、対象由来の体液、細胞、組織または他の構成要素の、いずれをも指す。試料としては、それらに限定されないが、組織断片(疾患組織または非疾患組織の)、器官、細胞、細胞構成要素、全血、血清、血漿、唾液、尿、滑液、骨髄、脳脊髄液、膣粘液、頸管粘液、鼻分泌物、痰、精液、羊水、気管支肺胞洗浄液、細胞性滲出液および腫瘍断片が挙げられる。
【００３０】
発明の説明
本発明者らは、全IL-17アイソフォームが、ヒトのがんもしくはがん細胞株で上方制御されている、または腫瘍内に浸潤する免疫細胞により分泌されることを見出した。さらには、全IL-17アイソフォームが類似した発癌性を呈する:全IL-17アイソフォームはがん細胞増殖を刺激し、がん細胞の浸潤を増加させ、またIL-6などの炎症促進性メディエーター(pro-inflammatory mediators)分泌を誘導することもある。したがって、全IL-17アイソフォームが、がん治療の標的となり得る。
【００３１】
第1の態様によれば、本発明は、がんを有する、またはがんの発生する可能性の高まっている対象を同定する方法であって、前記対象の試料中の、IL-17B、IL-17C、IL17D、IL-17E、および場合によってIL-17Fからなる群から選択される、少なくとも1つのIL-17アイソフォームの量を測定する工程を含み、ここでIL-17B、IL-17C、IL17D、IL-17Eおよび場合によってIL-17Fからなる群から選択される、少なくとも1つのIL-17アイソフォームの発現または産生が増加していると、対象ががんを有する、またはがんの発生する可能性の高まっていることが示される、方法を提供する。
【００３２】
別の態様によれば、本発明は、IL-17B、IL-17C、IL17D、IL-17EおよびIL-17Fからなる群から選択される少なくとも1つのIL-17アイソフォームの、少なくとも1つのIL-17アンタゴニストを含む組成物であって、細胞増殖性障害またはがんの処置または防止に使用するための組成物に関する。
【００３３】
別の態様によれば、本発明は、IL-17B、IL-17C、IL17D、IL-17EおよびIL-17Fからなる群から選択される少なくとも1つのIL-17アイソフォームの、少なくとも1つのIL-17アンタゴニストを含む組成物であって、増加した量(発現量または産生量)の前記IL-17アイソフォームを有する対象における細胞増殖性障害またはがんの処置または防止に使用するための組成物に関する。
【００３４】
本発明は、対象における細胞増殖性障害、有利にはがんを処置する方法であって、前記対象に、IL-17B、IL-17C、IL17D、IL-17EおよびIL-17Fからなる群から選択される少なくとも1つのIL-17アイソフォームの、少なくとも1つのIL-17アンタゴニストを含む組成物を、前記細胞増殖性障害またはがんを処置するのに有効な量投与する工程を含む、方法を提供する。
【００３５】
本発明はまた、細胞増殖またはがんのリスクが増大した対象における細胞増殖性障害、有利にはがんを防止する方法であって、前記対象に、IL-17B、IL-17C、IL17D、IL-17EおよびIL-17Fからなる群から選択される少なくとも1つのIL-17アイソフォームの、少なくとも1つのIL-17アンタゴニストを含む組成物を、前記細胞増殖性障害またはがんを防止するのに有効な量投与する工程を含む、方法を提供する。
【００３６】
一態様では、本発明の方法はさらに、IL-17B、IL-17C、IL17D、IL-17EおよびIL-17Fからなる群から選択される少なくとも1つのIL-17アイソフォームの、前記対象由来の試料における量を測定する工程と、測定された量を参照量と比較して、前記対象が前記組成物の投与に応答する可能性が高いか否かを判断する工程であって、ここで前記IL-17アイソフォームの量(発現量または産生量)が参照量より多いと、対象が応答する可能性が高いことが示される工程とを含む。
【００３７】
本発明の一部の実施形態では、試料は、器官試料、組織試料、細胞試料および血液試料からなる群から選択される。一部の実施形態では、試料はがん細胞を含む。
【００３８】
特定の一実施形態では、組成物は、IL-17B、IL-17C、IL17DおよびIL-17Eからなる群から選択される少なくとも1つのIL-17アイソフォームの、少なくとも1つのIL-17アンタゴニストを含む。換言すれば、組成物は、少なくともIL-17Bのアンタゴニスト、または少なくともIL-17Cのアンタゴニスト、または少なくともIL-17Dのアンタゴニスト、または少なくともIL-17Eのアンタゴニストを含む。
【００３９】
別の特定の実施形態では、組成物は、IL-17B、IL-17CおよびIL-17Dからなる群から選択される少なくとも1つのIL-17アイソフォームの、少なくとも1つのIL-17アンタゴニストを含む。換言すれば、組成物は、少なくともIL-17Bのアンタゴニスト、または少なくともIL-17Cのアンタゴニスト、または少なくともIL-17Dのアンタゴニストを含む。
【００４０】
細胞増殖性障害またはがんの例としては、それらだけに限らないが、以下のものが挙げられる:急性小児リンパ芽球性白血病(Acute Childhood Lymphoblastic Leukemia)、急性リンパ芽球性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、成人(原発性)肝細胞がん、成人(原発性)肝がん、成人急性リンパ性白血病、成人急性骨髄性白血病、成人ホジキン病、成人ホジキンリンパ腫、成人リンパ性白血病、成人非ホジキンリンパ腫、成人原発性肝がん、成人軟部組織肉腫、エイズ関連リンパ腫、エイズ関連悪性腫瘍、肛門がん、星状細胞腫、胆管がん、膀胱がん、骨がん、脳幹神経膠腫、脳腫瘍、乳がん、腎盂尿管がん、中枢神経系(原発性)リンパ腫、中枢神経系リンパ腫、小脳星状細胞腫、大脳星状細胞腫、子宮頸がん、小児(原発性)肝細胞がん、小児(原発性)肝がん、小児急性リンパ芽球性白血病、小児急性骨髄性白血病、小児脳幹神経膠腫、小児小脳星状細胞腫、小児大脳星状細胞腫、小児頭蓋外胚細胞腫瘍、小児ホジキン病、小児ホジキンリンパ腫、小児視床下部および視覚路神経膠腫、小児リンパ芽球性白血病、小児髄芽腫、小児非ホジキンリンパ腫、小児松果体およびテント上原始神経外胚葉性腫瘍、小児原発性肝がん、小児横紋筋肉腫、小児軟部組織肉腫、小児視経路および視床下部神経膠腫、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、結腸がん、皮膚T細胞リンパ腫、内分泌膵島細胞癌(Endocrine Pancreas Islet Cell Carcinoma)、子宮内膜がん、上衣腫、上皮がん、食道がん、ユーイング肉腫および関連する腫瘍、膵外分泌がん、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管がん、眼がん、女性乳がん、ゴーシェ病、胆嚢がん、胃がん(Gastric Cancer)、胃腸カルチノイド腫瘍、胃腸腫瘍、胚細胞腫瘍、妊娠性絨毛腫瘍、毛様細胞性白血病、頭頸部がん、肝細胞がん、ホジキン病、ホジキンリンパ腫、高ガンマグロブリン血症、下咽頭がん、腸がん、眼球内黒色腫、膵島細胞癌、島細胞膵がん(Islet Cell Pancreatic Cancer)、カポジ肉腫、腎がん、喉頭がん、唇および口腔がん、肝がん、肺がん、リンパ増殖性障害、マクログロブリン血症、男性乳がん、悪性中皮腫、悪性胸腺腫、髄芽腫、黒色腫、中皮腫、転移性原発不明扁平上皮性頸部がん、転移性原発性扁平上皮性頸部がん、転移性扁平上皮性頸部がん、多発性骨髄腫、多発性骨髄腫/形質細胞腫、骨髄異形成症候群、ミエロイド性白血病(Myelogenous Leukemia)、骨髄性白血病、骨髄増殖性障害、鼻腔および副鼻腔がん、鼻咽腔がん、神経芽細胞腫、妊娠中の非ホジキンリンパ腫、非黒色腫皮膚がん、非小細胞肺がん、原発不明転移性扁平上皮性頸部がん、中咽頭がん、骨線維肉腫/悪性線維性肉腫(Osteo-/Malignant Fibrous Sarcoma)、骨肉腫/悪性線維性組織球腫、骨の骨肉腫/悪性線維性組織球腫、卵巣上皮がん、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍、膵がん、パラプロテイン血症、紫斑病、副甲状腺がん、陰茎がん、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、形質細胞腫/多発性骨髄腫、原発性中枢神経系リンパ腫、原発性肝がん、前立腺がん、直腸がん、腎細胞がん、腎盂および尿管のがん(Renal Pelvis and Ureter Cancer)、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、サルコイドーシス肉腫、セザリー症候群、皮膚がん、小細胞肺がん、小腸がん、軟部組織肉腫、扁平上皮性頸部がん、胃がん(Stomach Cancer)、テント上原始神経外胚葉���および松果体腫瘍、T細胞リンパ腫、精巣がん、胸腺腫、甲状腺がん、腎盂および尿管の移行細胞がん(Transitional Cell Cancer of the Renal Pelvis)、腎盂尿管移行上皮がん(Transitional Renal Pelvis and Ureter Cancer)、絨毛性腫瘍、尿管および腎盂細胞のがん(Ureter and Renal Pelvis Cell Cancer)、尿道がん、子宮がん、子宮肉腫、腟がん、視経路および視床下部膠腫、外陰がん、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ウィルムス腫瘍、ならびに上に列挙した器官系に位置する、新生物を除く、他のあらゆる過剰増殖性疾患。
【００４１】
本発明の組成物は典型的には、乳がん、結腸がん、胃がん(gastric cancer)、神経膠腫、肝細胞癌、腎がん、白血病、肺がん、リンパ腫、黒色腫、多発性骨髄腫、卵巣がん、膵がん、前立腺がんの防止または処置に有用である。
【００４２】
有利には、処置は:
-  がん細胞またはがん性になるリスクの増大した細胞を標的とする、かつ/または死滅させる;
-  治療剤、有利には化学療法剤の有効性を高める、かつ/または
-  腫瘍転移を防止する
ためである。
【００４３】
本発明は、対象におけるがん細胞またはがん性になるリスクの増大した細胞を標的とする、かつ/または死滅させる方法であって、前記対象に、IL-17B、IL-17CおよびIL17D、ならびに場合によってIL-17EおよびIL-17Fからなる群から選択される少なくとも1つのIL-17アイソフォームの、少なくとも1つのIL-17アンタゴニストを含む組成物を、がん細胞またはがん性になるリスクの増大した細胞を標的とする、かつ/または死滅させるのに有効な量投与する工程を含む、方法を提供する。
【００４４】
本発明は、細胞増殖性障害またはがんを有する対象における、異常に増殖している細胞を死滅させるための治療剤の有効性を高める方法であって、IL-17B、IL-17CおよびIL17D、ならびに場合によってIL-17EおよびIL-17Fからなる群から選択される少なくとも1つのIL-17アイソフォームの、少なくとも1つのIL-17アンタゴニストを含む組成物を、前記治療剤の投与前、投与中または投与後からなる群から選択される時点に、前記治療剤の有効性を高めるのに有効な量投与する工程を含む、方法を提供する。
【００４５】
有利には、前記治療剤は化学療法剤である。より好ましくは、前記化学治療剤は、ドキソルビシン、パクリタキセル、タモキシフェン、シスプラチン、ビンクリスチンおよびビンブラスチンからなる群から選択される。
【００４６】
本発明はまた、細胞増殖性障害またはがんを有する対象における、腫瘍転移を防止する方法であって、IL-17B、IL-17CおよびIL17D、ならびに場合によってIL-17EおよびIL-17Fからなる群から選択される少なくとも1つのIL-17アイソフォームの、少なくとも1つのIL-17アンタゴニストを含む組成物を、前記対象における腫瘍転移を防止するのに有効な量投与する工程を含む、方法を提供する。
【００４７】
あるいは、上に開示した組成物(IL-17B、IL-17C、IL17D、IL-17EおよびIL-17Fからなる群から選択される少なくとも1つのIL-17アイソフォームの、少なくとも1つのIL-17アンタゴニストを含む、有利にはIL-17B、IL-17C、IL17DおよびIL-17Eからなる群から選択される少なくとも1つのIL-17アイソフォームの、少なくとも1つのIL-17アンタゴニストを含む、より有利にはIL-17B、IL-17CおよびIL-17Dからなる群から選択される少なくとも1つのIL-17アイソフォームの、少なくとも1つのIL-17アンタゴニストを含む)は、自己免疫疾患および慢性炎症性疾患、例えば関節リウマチ、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、炎症性腸疾患、クローン病、乾癬、潰瘍性大腸炎またはアトピー性皮膚炎などの処置または防止に使用できる。
【００４８】
特定の一実施形態では、組成物は、いずれかのIL-17アイソフォーム、好ましくは別のIl-17アイソフォームの、1つのIL-17アンタゴニストをさらに含む。本発明によれば、「別のIL-17アイソフォームの」という表現は、もし第1のアンタゴニストが第1のIL-17アイソフォームのアンタゴニストで、そこでもし、組成物が少なくとも別のアンタゴニスト(第2のアンタゴニスト)を含むならば、この第2のアンタゴニストは第2の(異なる)IL-17アイソフォームのアンタゴニストであることを、意味する。
【００４９】
より具体的には、もし第1のアンタゴニストがIL-17Bのアンタゴニストならば、別のIl-17アイソフォームのアンタゴニストは、好ましくは、IL-17A、IL-17C、IL-17D、IL-17EまたはIL-17Fのアンタゴニストである。特定の一実施形態によれば、もし第1のアンタゴニストがIL-17Bのアンタゴニストならば、別のIl-17アイソフォームのアンタゴニストは、好ましくは、IL-17Eのアンタゴニストではない。
【００５０】
より具体的には、もし第1のアンタゴニストがIL-17Cのアンタゴニストならば、別のIl-17アイソフォームのアンタゴニストは、好ましくは、IL-17A、IL-17B、IL-17D、IL-17EまたはIL-17Fのアンタゴニストである。
【００５１】
より具体的には、もし第1のアンタゴニストがIL-17Dのアンタゴニストならば、別のIl-17アイソフォームのアンタゴニストは、好ましくは、IL-17A、IL-17B、IL-17C、IL-17EまたはIL-17Fのアンタゴニストである。
【００５２】
この実施形態によれば、一例として、組成物は:
- IL-17BのアンタゴニストおよびIL-17Aのアンタゴニスト;もしくは
- IL-17BのアンタゴニストおよびIL-17Cのアンタゴニスト;もしくは
- IL-17BのアンタゴニストおよびIL-17Dのアンタゴニスト;もしくは
- IL-17BのアンタゴニストおよびIL-17Eのアンタゴニスト;もしくは
- IL-17BのアンタゴニストおよびIL-17Fのアンタゴニスト;もしくは場合により
- IL-17BのアンタゴニストおよびIL-17Bの別のアンタゴニスト;または
- IL-17CのアンタゴニストおよびIL-17Aのアンタゴニスト;もしくは
- IL-17CのアンタゴニストおよびIL-17Dのアンタゴニスト;もしくは
- IL-17CのアンタゴニストおよびIL-17Eのアンタゴニスト;もしくは
- IL-17CのアンタゴニストおよびIL-17Fのアンタゴニスト;もしくは場合により
- IL-17CのアンタゴニストおよびIL-17Cの別のアンタゴニスト;または
- IL-17DのアンタゴニストおよびIL-17Aのアンタゴニスト;もしくは
- IL-17DのアンタゴニストおよびIL-17Eのアンタゴニスト;もしくは
- IL-17DのアンタゴニストおよびIL-17Fのアンタゴニスト;もしくは場合により
- IL-17DのアンタゴニストおよびIL-17Dの別のアンタゴニスト;
または場合により
- IL-17EのアンタゴニストおよびIL-17Aのアンタゴニスト;もしくは
- IL-17EのアンタゴニストおよびIL-17Fのアンタゴニスト;もしくは場合により
IL-17EのアンタゴニストおよびIL-17Eの別のアンタゴニスト;
または場合により
- IL-17FのアンタゴニストおよびIL-17Fの別のアンタゴニスト
を含むことができる。
【００５３】
あるいは組成物は、IL-17B、IL-17CおよびIL17D、ならびに場合によってIL-17EおよびIL-17Fからなる群から選択される1つのIL-17アイソフォームの、1つのIL-17アンタゴニストであって、少なくとも別のIL-17アイソフォームのアンタゴニストでもある、アンタゴニストを含む。本発明によれば、「別のIL-17アイソフォームの」という表現は、もし第1のアンタゴニストが第1のIL-17アイソフォームのアンタゴニストならば、それは第2の(異なる)IL-17アイソフォームのアンタゴニストでもあることを、意味する。
【００５４】
より具体的には、もしそのアンタゴニストがIL-17Bのアンタゴニストならば、それは好ましくは、IL-17A、IL-17C、IL-17D、IL-17EまたはIL-17Fのアンタゴニストでもある。特定の一実施形態によれば、もしそのアンタゴニストがIL-17Bのアンタゴニストならば、それは好ましくは、IL-17Eのアンタゴニストではない。
【００５５】
より具体的には、もしそのアンタゴニストがIL-17Cのアンタゴニストならば、それは好ましくは、IL-17A、IL-17B、IL-17D、IL-17EまたはIL-17Fのアンタゴニストでもある。
【００５６】
より具体的には、もしそのアンタゴニストがIL-17Dのアンタゴニストならば、それは好ましくは、IL-17A、IL-17B、IL-17C、IL-17EまたはIL-17Fのアンタゴニストでもある。
【００５７】
この実施形態によれば、一例として、組成物は:
- IL-17Aのアンタゴニストでもある、IL-17Bのアンタゴニスト;もしくは
- IL-17Cのアンタゴニストでもある、IL-17Bのアンタゴニスト;もしくは
- IL-17Dのアンタゴニストでもある、IL-17Bのアンタゴニスト;もしくは
- IL-17Eのアンタゴニストでもある、IL-17Bのアンタゴニスト;もしくは
- IL-17Fのアンタゴニストでもある、IL-17Bのアンタゴニスト;または
- IL-17Aのアンタゴニストでもある、IL-17Cのアンタゴニスト;もしくは
- IL-17Dのアンタゴニストでもある、IL-17Cのアンタゴニスト;もしくは
- IL-17Eのアンタゴニストでもある、IL-17Cのアンタゴニスト;もしくは
- IL-17Fのアンタゴニストでもある、IL-17Cのアンタゴニスト;または
- IL-17Aのアンタゴニストでもある、IL-17Dのアンタゴニスト;もしくは
- IL-17Eのアンタゴニストでもある、IL-17Dのアンタゴニスト;もしくは
- IL-17Fのアンタゴニストでもある、IL-17Dのアンタゴニスト;
または場合により
- IL-17Aのアンタゴニストでもある、IL-17Eのアンタゴニスト;もしくは
- IL-17Fのアンタゴニストでもある、IL-17Eのアンタゴニスト
を含むことができる。
【００５８】
特定の一実施形態では、アンタゴニストは、IL-17の少なくとも2つのアイソフォームに結合する抗体である。IL-17AおよびIL-17Fの双方に結合し、かつ、これら特定の2つのアイソフォームにのみ結合する抗体は、有利には除外する。換言すれば、本発明の抗体は、少なくとも:
- IL-17AおよびIL-17B;または
- IL-17AおよびIL-17C;または
- IL-17AおよびIL-17D;または
- IL-17AおよびIL-17E;または
- IL-17BおよびIL-17C;または
- IL-17BおよびIL-17D;または
- IL-17BおよびIL-17E;または
- IL-17BおよびIL-17F;または
- IL-17CおよびIL-17D;または
- IL-17CおよびIL-17E;または
- IL-17CおよびIL-17F;または
- IL-17DおよびIL-17E;または
- IL-17DおよびIL-17F;または
- IL-17EおよびIL-17F
と結合することができる。
【００５９】
別の実施形態では、組成物は、いずれかのIL-17アイソフォーム、好ましくは他のIL-17アイソフォームの、二つ(2つ)のIL-17アンタゴニストをさらに含む。
【００６０】
あるいは組成物は、IL-17B、IL-17CおよびIL17D、ならびに場合によってIL-17EおよびIL-17Fからなる群から選択される1つのIL-17アイソフォームの、1つのIL-17アンタゴニストであって、少なくとも二つ(2つ)の他のIL-17アイソフォームのアンタゴニストでもある、アンタゴニストを含む。
【００６１】
別の実施形態では、組成物は、いずれかのIL-17アイソフォーム、好ましくは他のIl-17アイソフォームの、三つ(3つ)のIL-17アンタゴニストをさらに含む。
【００６２】
あるいは組成物は、IL-17B、IL-17CおよびIL17D、ならびに場合によってIL-17Eおよび/またはIL-17Fからなる群から選択される1つのIL-17アイソフォームの、1つのIL-17アンタゴニストであって、少なくとも三つ(3つ)の他のIL-17アイソフォームのアンタゴニストでもある、アンタゴニストを含む。
【００６３】
別の実施形態では、組成物は、いずれかのIL-17アイソフォーム、好ましくは他のIl-17アイソフォームの、四つ(4つ)のIL-17アンタゴニストをさらに含む。
【００６４】
あるいは組成物は、IL-17B、IL-17CおよびIL17D、ならびに場合によってIL-17Eおよび/またはIL-17Fからなる群から選択される1つのIL-17アイソフォームの、1つのIL-17アンタゴニストであって、少なくとも四つ(4つ)の他のIL-17アイソフォームのアンタゴニストでもある、アンタゴニストを含む。
【００６５】
別の実施形態では、組成物は、全IL-17アイソフォームのIL-17アンタゴニスト、すなわち:
- IL-17Aのアンタゴニスト;および
- IL-17Bのアンタゴニスト;および
- IL-17Cのアンタゴニスト;および
- IL-17Dのアンタゴニスト;および
- IL-17Eのアンタゴニスト;および
- IL-17Fのアンタゴニスト
を含む。
【００６６】
あるいは組成物は、全IL-17アイソフォーム(IL-17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17EおよびIL-17F)のアンタゴニストである、IL-17アンタゴニストを含む。
【００６７】
特定の一実施形態では、アンタゴニストは、全IL-17アイソフォームに(IL-17A、IL-17B、IL17-C、IL-17D、IL-17EおよびIL-17Fに)結合し、かつおそらくは中和する抗体、すなわちマルチアイソフォームIL-17抗体である。
【００６８】
一実施形態では、アンタゴニストは抗体または抗原結合性抗体フラグメントである。
【００６９】
一実施形態では、前記抗体はヒト化抗体またはヒト抗体である。
【００７０】
一実施形態では、前記抗体はモノクローナル抗体である。
【００７１】
より一般には、本発明はまた:
- Il-17B、IL-17C、IL-17D、およびIL-17Eからなる群から選択される少なくとも1つのIL-17アイソフォームの、少なくとも1つのIL-17アンタゴニスト、ならびに、別のIl-17アイソフォームの1つのアンタゴニスト;または
- IL-17B、IL-17C、IL17-DおよびIL-17Eからなる群から選択される少なくとも1つのIL-17アイソフォームの、少なくとも1つのIL-17アンタゴニストであって、少なくとも別のIL-17アイソフォームのアンタゴニストでもある、アンタゴニスト
を含む新規組成物に関する。
【００７２】
「別のIl-17アイソフォームの」という表現は、上に規定した通りである。
【００７３】
特定の一実施形態によれば、本発明は:
- Il-17B、IL-17CおよびIL-17Dからなる群から選択される少なくとも1つのIL-17アイソフォームの、少なくとも1つのIL-17アンタゴニスト、ならびに、別のIl-17アイソフォームの1つのアンタゴニスト;または
- IL-17B、IL-17CおよびIL17Dからなる群から選択される少なくとも1つのIL-17アイソフォームの、少なくとも1つのIL-17アンタゴニストであって、少なくとも別のIL-17アイソフォームのアンタゴニストでもある、アンタゴニスト
を含む新規組成物に関する。
【００７４】
有利には、組成物は:
- IL-17AのアンタゴニストおよびIL-17Fのアンタゴニストの、特定の組合せ;または
- IL-17Fのアンタゴニストでもある、IL-17Aの1つのアンタゴニスト;または
- IL-17BのアンタゴニストおよびIL-17Eのアンタゴニストの、特定の組合せ;または
- IL-17Eのアンタゴニストでもある、IL-17Bの1つのアンタゴニスト
を含まない。
【００７５】
一実施形態では、組成物は、全IL-17アイソフォームのIL-17アンタゴニスト、すなわち:
- IL-17Aのアンタゴニスト;および
- IL-17Bのアンタゴニスト;および
- IL-17Cのアンタゴニスト;および
- IL-17Dのアンタゴニスト;および
- IL-17Eのアンタゴニスト;および
- IL-17Fのアンタゴニスト
を含む。
【００７６】
あるいは組成物は、全IL-17アイソフォーム(IL-17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17EおよびIL-17F)のアンタゴニストである、1つのIL-17アンタゴニストを含む。
【００７７】
特定の一実施形態では、アンタゴニストは、全IL-17アイソフォームに(IL-17A、IL-17B、IL17-C、IL-17D、IL-17EおよびIL-17Fに)結合し、かつおそらくは中和する抗体、すなわちマルチアイソフォームIL-17抗体である。
【００７８】
一実施形態では、アンタゴニストは抗体または抗原結合抗体フラグメントである。
【００７９】
一実施形態では、前記抗体はヒト化抗体またはヒト抗体である。
【００８０】
一実施形態では、前記抗体はモノクローナル抗体である。
【００８１】
本発明の組成物は、診断および治療に一般的な関心を有する。
【００８２】
一実施形態では前述の通り、前記組成物は、細胞増殖性障害またはがんの処置または防止に有用である。
【００８３】
本発明の組成物は典型的には、乳がん、結腸がん、胃がん、神経膠腫、肝細胞癌、腎がん、白血病、肺がん、リンパ腫、黒色腫、多発性骨髄腫、卵巣がん、膵がん、前立腺がんの防止または処置に有用である。
【００８４】
有利には、処置は、
-  がん細胞またはがん性になるリスクの増大した細胞を標的とする、かつ/または死滅させる、
-  治療剤、有利には化学療法剤の有効性を高める、かつ/または
-  腫瘍転移を防止する
ためである。
【００８５】
一実施形態では、前記組成物は、自己免疫疾患および慢性炎症性疾患の処置または防止に有用である。
【００８６】
免疫関連および炎症性疾患としては、例えば以下が挙げられる:全身性エリテマトーデス、関節炎、乾癬性関節炎、関節リウマチ、変形性関節症、若年性慢性関節炎、脊椎関節症、全身性硬化症、特発性炎症性筋疾患、シェーグレン症候群、全身性血管炎、サルコイドーシス、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少症、甲状腺炎、糖尿病、免疫によって媒介される腎疾患、中枢および末梢神経系における脱髄性疾患、例えば多発性硬化症、特発性脱髄性多発ニューロパチーまたはギラン・バレー症候群、筋萎縮性側索硬化症および慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー、肝胆道疾患、例えば感染性肝炎、自己免疫性慢性活動性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、肉芽腫性肝炎、硬化性胆管炎、炎症性腸疾患、大腸炎、クローン病グルテン過敏性腸症(Crohn's disease gluten-sensitive enteropathy)、および内毒血症、水疱性皮膚疾患と、多形性紅斑ならびにアトピー性および接触性皮膚炎とを含めた、自己免疫性のまたは免疫によって媒介される皮膚疾患、乾癬、好中球性皮膚症、嚢胞性線維症、アレルギー疾患、例えば喘息、アレルギー性鼻炎、食物過敏症および蕁麻疹、嚢胞性線維症、肺の免疫疾患、例えば好酸球性肺炎、特発性肺線維症、成人呼吸器疾患(ARD)、急性呼吸促迫症候群(ARDS)、ならびに炎症性肺損傷、例えば喘息、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、気道過敏性、慢性気管支炎、アレルギー性喘息および過敏性肺炎、移植片および臓器の拒絶と、移植片対宿主病とを含めた、移植に伴う疾患、敗血症性ショック、多臓器不全、肥満、2型糖尿病、非アルコール性肝硬変、非アルコール性肝疾患、オンコロジー(腫瘍血管新生、原発性腫瘍および転移)。
【００８７】
自己免疫疾患および慢性炎症性疾患のうち好ましい疾患は、関節リウマチ、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、炎症性腸疾患、クローン病、乾癬、潰瘍性大腸炎、アトピー性皮膚炎である。
【００８８】
本発明の組成物の診断および治療用途
治療
有利には、IL-17によって媒介される疾患は、例えば以下を含む免疫関連および炎症性疾患である:全身性エリテマトーデス、関節炎、乾癬性関節炎、関節リウマチ、変形性関節症、若年性慢性関節炎、脊椎関節症、全身性硬化症、特発性炎症性筋疾患、シェーグレン症候群、全身性血管炎、サルコイドーシス、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少症、甲状腺炎、糖尿病、免疫によって媒介される腎疾患、中枢および末梢神経系における脱髄性疾患、例えば多発性硬化症、特発性脱髄性多発ニューロパチーまたはギラン・バレー症候群、筋萎縮性側索硬化症および慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー、肝胆道疾患、例えば感染性肝炎、自己免疫性慢性活動性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、肉芽腫性肝炎、硬化性胆管炎、炎症性腸疾患、大腸炎、クローン病グルテン過敏性腸症、および内毒血症、水疱性皮膚疾患と、多形性紅斑ならびにアトピー性および接触性皮膚炎とを含めた、自己免疫性のまたは免疫によって媒介される皮膚疾患、乾癬、好中球性皮膚症、嚢胞性線維症、アレルギー疾患、例えば喘息、アレルギー性鼻炎、食物過敏症および蕁麻疹、嚢胞性線維症、肺の免疫疾患、例えば好酸球性肺炎、特発性肺線維症、成人呼吸器疾患(ARD)、急性呼吸促迫症候群(ARDS)、ならびに炎症性肺損傷、例えば喘息、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、気道過敏性、慢性気管支炎、アレルギー性喘息および過敏性肺炎、移植片および臓器の拒絶と、移植片対宿主病とを含めた、移植に伴う疾患、敗血症性ショック、多臓器不全、肥満、2型糖尿病、非アルコール性肝硬変、非アルコール性肝疾患、オンコロジー(腫瘍血管新生、原発性腫瘍および転移)。
【００８９】
自己免疫疾患および慢性炎症性疾患のうち好ましい疾患は、関節リウマチ、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、炎症性腸疾患、クローン病、乾癬、潰瘍性大腸炎、アトピー性皮膚炎である。
【００９０】
細胞増殖性障害またはがんの例としては、それらだけに限らないが、以下のものが挙げられる:急性小児リンパ芽球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、成人(原発性)肝細胞がん、成人(原発性)肝がん、成人急性リンパ性白血病、成人急性骨髄性白血病、成人ホジキン病、成人ホジキンリンパ腫、成人リンパ性白血病、成人非ホジキンリンパ腫、成人原発性肝がん、成人軟部組織肉腫、エイズ関連リンパ腫、エイズ関連悪性腫瘍、肛門がん、星状細胞腫、胆管がん、膀胱がん、骨がん、脳幹神経膠腫、脳腫瘍、乳がん、腎盂尿管がん、中枢神経系(原発性)リンパ腫、中枢神経系リンパ腫、小脳星状細胞腫、大脳星状細胞腫、子宮頸がん、小児(原発性)肝細胞がん、小児(原発性)肝がん、小児急性リンパ芽球性白血病、小児急性骨髄性白血病、小児脳幹神経膠腫、小児小脳星状細胞腫、小児大脳星状細胞腫、小児頭蓋外胚細胞腫瘍、小児ホジキン病、小児ホジキンリンパ腫、小児視床下部および視覚路神経膠腫、小児リンパ芽球性白血病、小児髄芽腫、小児非ホジキンリンパ腫、小児松果体およびテント上原始神経外胚葉性腫瘍、小児原発性肝がん、小児横紋筋肉腫、小児軟部組織肉腫、小児視経路および視床下部神経膠腫、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、結腸がん、皮膚T細胞リンパ腫、内分泌膵島細胞癌、子宮内膜がん、上衣腫、上皮がん、食道がん、ユーイング肉腫および関連する腫瘍、膵外分泌がん、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管がん、眼がん、女性乳がん、ゴーシェ病、胆嚢がん、胃がん(Gastric Cancer)、胃腸カルチノイド腫瘍、胃腸腫瘍、胚細胞腫瘍、妊娠性絨毛腫瘍、毛様細胞性白血病、頭頸部がん、肝細胞がん、ホジキン病、ホジキンリンパ腫、高ガンマグロブリン血症、下咽頭がん、腸がん、眼球内黒色腫、膵島細胞癌、島細胞膵がん、カポジ肉腫、腎がん、喉頭がん、唇および口腔がん、肝がん、肺がん、リンパ増殖性障害、マクログロブリン血症、男性乳がん、悪性中皮腫、悪性胸腺腫、髄芽腫、黒色腫、中皮腫、転移性原発不明扁平上皮性頸部がん、転移性原発性扁平上皮性頸部がん、転移性扁平上皮性頸部がん、多発性骨髄腫、多発性骨髄腫/形質細胞腫、骨髄異形成症候群、ミエロイド性白血病、骨髄性白血病、骨髄増殖性障害、鼻腔および副鼻腔がん、鼻咽腔がん、神経芽細胞腫、妊娠中の非ホジキンリンパ腫、非黒色腫皮膚がん、非小細胞肺がん、原発不明転移性扁平上皮性頸部がん、中咽頭がん、骨線維肉腫/悪性線維性肉腫、骨肉腫/悪性線維性組織球腫、骨の骨肉腫/悪性線維性組織球腫、卵巣上皮がん、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍、膵がん、パラプロテイン血症、紫斑病、副甲状腺がん、陰茎がん、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、形質細胞腫/多発性骨髄腫、原発性中枢神経系リンパ腫、原発性肝がん、前立腺がん、直腸がん、腎細胞がん、腎盂および尿管のがん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、サルコイドーシス肉腫、セザリー症候群、皮膚がん、小細胞肺がん、小腸がん、軟部組織肉腫、扁平上皮性頸部がん、胃がん(Stomach Cancer)、テント上原始神経外胚葉性および松果体腫瘍、T細胞リンパ腫、精巣がん、胸腺腫、甲状腺がん、腎盂および尿管の移行細胞がん、腎盂尿管移行上皮がん、絨毛性腫瘍、尿管���よび腎盂細胞のがん、尿道がん、子宮がん、子宮肉腫、腟がん、視経路および視床下部膠腫、外陰がん、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ウィルムス腫瘍、ならびに上に列挙した臓器系に位置する、新生物を除く、他のあらゆる過剰増殖性疾患。
【００９１】
本発明の組成物は典型的には、乳がん、結腸がん、胃がん(gastric cancer)、神経膠腫、肝細胞癌、腎がん、白血病、肺がん、リンパ腫、黒色腫、多発性骨髄腫、卵巣がん、膵がん、前立腺がんの防止または処置に有用である。
【００９２】
有利には、処置は、
-  がん細胞またはがん性になるリスクの増大した細胞を標的とする、かつ/または死滅させる、
-  治療剤、有利には化学療法剤の有効性を高める、かつ/または
-  腫瘍転移を防止する
ためである。
【００９３】
本発明はまた、上に規定したアンタゴニストを含む医薬組成物に関する。したがって、前記アンタゴニストを、薬学的に許容される添加剤および場合によって徐放性マトリックス、例えば生分解性ポリマーなど、と組み合わせて、医薬組成物を形成することができる。
【００９４】
「薬学的に」または「薬学的に許容される」とは、哺乳動物、特にヒトに必要に応じて投与した際に、有害な、アレルギー性の、またはその他の都合の悪い反応を生じない分子実体および組成物を指す。薬学的に許容される担体または添加剤とは、無毒性の固体、半固体もしくは液体充填剤、賦形剤、封入材料または任意の型の処方補助剤を指す。
【００９５】
医薬組成物の形態、投与経路、投薬量およびレジメンは当然、処置しようとする状態、疾病の重症度、患者の年齢、体重および性別などに依存する。
【００９６】
本発明の医薬組成物は、局所、経口、非経口、鼻腔内、静脈内、筋肉内、皮下または眼内投与などのために製剤化することができる。
【００９７】
好ましくは、医薬組成物は、注射可能な製剤として薬学的に許容される、ビヒクルを含有する。これらは具体的には、等張滅菌生理食塩液(リン酸一ナトリウムもしくはリン酸二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムもしくは塩化マグネシウムなど、またはこのような塩の混合物)であってよく、または、場合に応じて滅菌水もしくは生理食塩水を添加すると、注射溶液が構成可能な乾燥組成物、特に凍結乾燥組成物であってもよい。
【００９８】
投与に使用される用量は、種々のパラメーターに応じて、特に、使用する投与方法、当の病理、あるいはまた所望の処置期間長に応じて適宜調整することができる。
【００９９】
医薬組成物を調製するには、有効量のアンタゴニストを、薬学的に許容される担体または水性媒体に溶解または分散させてもよい。
【０１００】
注射剤として使用するのに適した医薬形態としては、滅菌水性溶液または分散液(dispersions);ゴマ油、ピーナッツ油または水性プロピレングリコールを含む製剤;および、滅菌注射溶液または分散液を即座に調製するための滅菌散剤が挙げられる。全ての場合で、この形態は滅菌されていなければならず、また、注射器で用意に扱える程度に流動性でなければならない。それは製造および貯蔵条件下で安定でなければならず、また、細菌や真菌などの微生物による汚染作用から保護されていなければならない。
【０１０１】
遊離塩基または薬理学的に許容される塩としての活性化合物の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤を適宜混合した水中で、調製することができる。分散液は、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物、ならびに油中で調製することができる。通常の貯蔵および使用条件下では、微生物の増殖を防止するために、これらの調製物に保存剤を含有させる。
【０１０２】
本発明のアンタゴニストは、中性または塩の形態の組成物へと製剤化することができる。薬学的に許容される塩としては、酸付加塩(タンパク質の遊離アミノ基と形成された)であって、無機酸、例えば塩酸もしくはリン酸など、または有機酸、例えば酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸など、と形成された酸付加塩が挙げられる。遊離カルボキシル基と形成された塩は、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化第二鉄などの無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基に由来し得る。
【０１０３】
担体もまた、例えば水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど)、それらの適切な混合物、および植物油を含有する、溶媒または分散媒であってよい。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用、分散液の場合は必要な粒径の維持、および界面活性剤の使用により維持することができる。微生物作用の防止は、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどの、種々の抗菌剤および抗真菌剤によりもたらすことができる。多くの場合、等張化剤、例えば糖または塩化ナトリウムなどを含めるのが好ましい。
【０１０４】
注射剤組成物の持続的吸収は、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの、吸収遅延剤の組成物を使用することによってもたらすことができる。
【０１０５】
滅菌注射溶液は、必要量の活性化合物を、必要に応じて上に列挙した種々の他成分と共に、適切な溶媒に混合し、続いて濾過滅菌することによって調製する。
【０１０６】
一般に分散液は、種々の滅菌有効成分を、基礎分散媒(basic dispersion medium)および上に列挙したうちの必要な他成分を含有する、滅菌ビヒクルに混合することによって調製する。滅菌注射溶液調製のための滅菌散剤の場合、好ましい調製法は、有効成分と、それに加えて、濾過滅菌してあった溶液由来の追加の任意の所望成分との散剤を生ずる、真空乾燥および凍結乾燥法である。
【０１０７】
直接注射用に、より濃縮された、または非常に濃縮された溶液を調製することも検討されており、ここでDMSOを溶媒として使用すると、極度に急速な浸透によって高濃度の活性剤が小さな腫瘍領域に送達されることが構想される。
【０１０８】
溶液は製剤化されたら、その投与製剤と適合した方法で、治療上有効な量を投与することになる。製剤は、上記の注射溶液の型など種々の剤形で容易に投与されるが、薬物放出性カプセル剤なども利用できる。
【０１０９】
水溶液での非経口投与では、例えば、溶液は必要ならば適切に緩衝化するべきであり、まず液体賦形剤を、十分な生理食塩水またはブドウ糖により等張化するべきである。これら特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内投与に特に適している。この点については、利用可能な滅菌水性媒体は、本開示に照らせば当業者には分かるはずである。例えば、単回投薬量を等張性NaCl溶液1mlに溶解し、これを皮下点滴療法用の液体1000mlに添加するか、または提唱される注入部位に注射することができる(例えば、「Remington's Pharmaceutical Sciences」第15版、1035〜1038頁および1570〜1580頁を参照されたい)。処置対象の状態に応じて、投薬量にいくらかのばらつきが必然的に生じることになる。いずれにしても、投与に対して責任がある者が、個々の対象にとって適切な用量を決定する。
【０１１０】
本発明のアンタゴニストは、治療混合物中で、1用量あたり約0.0001から1.0ミリグラム、もしくは約0.001から0.1ミリグラム、もしくは約0.1から1.0ミリグラムを、または約10ミリグラム程度をも含むように製剤化できる。また多回用量にて投与することもできる。
【０１１１】
例えば静脈内または筋肉内注射など、非経口投与用に製剤化した化合物に加え、他の薬学的に許容される形態には、例えば、経口投与用の錠剤または他の固体;徐放性カプセル;および現在使用されている他のあらゆる形態が含まれる。
【０１１２】
ある実施形態では、リポソームおよび/またはナノ粒子の使用が、宿主細胞へ抗体を導入するために検討される。リポソームおよび/またはナノ粒子の形成および使用は、当業者に知られている。
【０１１３】
ナノカプセルは一般に、化合物を安定で、かつ再現性のある形で取り込むことができる。細胞内にポリマーを過剰供給することによる副作用を回避するため、このような超微細粒子(約0.1μmのサイズ)は一般に、インビボで分解可能なポリマーを使用して設計する。こうした要求を満たす生分解性ポリアルキル-シアノアクリレートのナノ粒子を、本発明に使用することが検討されており、このような粒子は容易に作製できる。
【０１１４】
リポソームは、水性媒体に分散されており、かつ自発的に、多層同心円状の二重層小胞(多層小胞(multilamellar vesicles: MLV)とも呼ばれる)を形成するリン脂質から形成される。MLVは一般に、25nmから4μmまでの直径を有する。MLVを超音波処理すると、芯部に水溶液を含有し、200から500Åの範囲の直径を有する小さな単層小胞(small unilamellar vesicles: SUV)が形成される。リポソームの物理的性質は、pH、イオン強度および二価カチオンの存在に依存する。
【０１１５】
本発明はまた、本発明のアンタゴニストを含むキットを提供する。本発明のアンタゴニストを含有するキットは、診断および治療でのアッセイに用途を見出す。
【０１１６】
診断
本発明はさらに、固形腫瘍を含めた新生物障害などの、IL-17によって媒介される疾患の診断の際に有用な診断法を提供する。この診断法は、個体由来の組織または他の細胞または体液中の、IL-17タンパク質または転写物の発現レベルを測定し、その測定された発現レベルを、正常な組織または体液中での標準IL-17発現レベルと比較しようとするものであり、ここで発現レベルが標準と比較して上昇していたなら、障害のあることが示される。
【０１１７】
抗IL-17抗体、ならびにその抗原結合性フラグメント、変種および派生物は、当業者に知られている古典的な免疫組織学法を用いて生物学的試料中のIL-17タンパク質レベルをアッセイするのに使用できる(例えば、Jalkanenら、J. Cell. Biol. 101:976〜985頁(1985); Jalkanenら、J. Cell Biol. 105:3087〜3096頁(1987)を参照されたい)。IL-17タンパク質の発現を検出するのに有用な他の、抗体ベースの方法としては、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、免疫沈降、またはウェスタンブロッティングなどの免疫アッセイが挙げられる。適切なアッセイは、本明細書の他の箇所でより詳細に記述する。
【０１１８】
「IL-17ポリペプチドまたはアイソフォームの発現レベルをアッセイする」とは、第1の生物学的試料中のIL-17ポリペプチドレベルを、直接(例えば、タンパク質の絶対レベルを決定または推定することによって)または相対的に(例えば、第2の生物学的試料中の、疾患に伴うポリペプチドレベルと比較することによって)、定性的または定量的に測定または推定することを意味する。好ましくは、第1の生物学的試料中のIL-17ポリペプチドの発現レベルは、測定または推定され、かつ標準IL-17ポリペプチドレベルと比較される。ここでこの標準は、障害を有していない個体から得られる第2の生物学的試料から採られる、または、障害を有していない個体集団から得たレベルの平均をとり、決定される。当技術分野では理解されるであろうように、一旦「標準」IL-17ポリペプチドレベルが分かると、比較のための標準として繰返し使用できる。
【０１１９】
「生物学的試料」とは、個体、細胞株、組織培養、またはIL-17を発現している可能性のある細胞の他の供給源から得られる、あらゆる生物学的試料を意味する。組織生検材料および体液を哺乳動物から得る方法は、当技術分野で周知である。
【０１２０】
この節で上記した診断法に使用するための抗IL-17抗体は、この節で別個に列挙していると見做せる形で本明細書中の他の箇所に詳細に記載した、抗IL-17抗体、またはフラグメント、変種もしくは派生物を含むことを意図する。
【０１２１】
本発明を実施するには、別段の指定がない限り、当分野の技術範囲内の、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えDNAおよび免疫学の従来の手法を用いることになる。このような手法は、文献において完全に説明されている。例えば、Sambrookら編(1989) Molecular Cloning A Laboratory Manual (第2版; Cold Spring Harbor Laboratory Press); Sambrookら編(1992) Molecular Cloning: A Laboratory Manual、(Cold Springs Harbor Laboratory、NY); D. N. Glover編、(1985) DNA Cloning、I巻およびII巻; Gait編(1984) Oligonucleotide Synthesis; Mullisら米国特許第4,683,195号; HamesおよびHiggins編(1984) Nucleic Acid Hybridization; HamesおよびHiggins編(1984) Transcription And Translation; Freshney (1987) Culture Of Animal Cells (Alan R. Liss, Inc.); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press) (1986); Perbal (1984) A Practical Guide To Molecular Cloning; the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc.、N.Y.); MillerおよびCalos編(1987) Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells、(Cold Spring Harbor Laboratory); Wuら編、Methods In Enzymology、154巻および155巻; MayerおよびWalker編(1987) Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Academic Press、London); WeirおよびBlackwell編、(1986) Handbook Of Experimental Immunology、I〜IV巻; Manipulating the Mouse Embryo、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.、(1986);ならびにAusubelら(1989) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons、Baltimore、Md.)を参照されたい。
【０１２２】
抗体工学の一般原理は、Borrebaeck編(1995) Antibody Engineering (第2版; Oxford Univ. Press)中で説明されている。タンパク質工学の一般原理は、Rickwoodら編(1995) Protein Engineering, A Practical Approach (IRL Press at Oxford Univ. Press、Oxford、Eng.)中で説明されている。抗体、および抗体-ハプテン結合の一般原理は、Nisonoff (1984) Molecular Immunology (第2版; Sinauer Associates、Sunderland、Mass.)およびSteward (1984) Antibodies, Their Structure and Function (Chapman and Hall、New York、N.Y.)中で説明されている。さらに、当技術分野で知られているが具体的に記載されていない、免疫学の標準的方法は、Current Protocols in Immunology、John Wiley & Sons、New York; Stitesら編(1994) Basic and Clinical Immunology (第8版; Appleton & Lange、Norwalk、Conn.)ならびにMishellおよびShiigi(編) (1980) Selected Methods in Cellular Immunology (W.H. Freeman and Co.、NY)中にある通りに行う。
【０１２３】
免疫学の一般原理が説明されている標準的参考文献としては、Current Protocols in Immunology、John Wiley & Sons、New York; Klein (1982) J. Immunology: The Science of Self-Nonself Discrimination (John Wiley & Sons、NY); Kennettら編(1980) Monoclonal Antibodies, Hybridoma: A New Dimension in Biological Analyses (Plenum Press、NY); Campbell (1984)「Monoclonal Antibody Technology」、Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology、Burdenら編(Elsevere、Amsterdam)に収録; Goldsbyら編(2000) Kuby Immunnology (第4版; H. Freemand & Co.); Roittら(2001) Immunology (第6版; London: Mosby); Abbasら(2005) Cellular and Molecular Immunology (第5版; Elsevier Health Sciences Division); KontermannおよびDubel (2001) Antibody Engineering (Springer Verlan); SambrookおよびRussell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press); Lewin (2003) Genes VIII (Prentice Hall2003); HarlowおよびLane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press); DieffenbachおよびDveksler (2003) PCR Primer (Cold Spring Harbor Press)が挙げられる。
【０１２４】
本発明を、限定する意図はないが、以下の実施例に照らしながらさらに説明する。
【図面の簡単な説明】
【０１２５】
【図１Ａ−１】ヒト乳がんの生検材料における、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17RB(IL-17Bの受容体)およびIL-17RE(IL-17Cの受容体)の発現を示す図である。IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17RBおよびIL-17REのmRNA発現を、正常な乳房の生検材料(正常)および種々のグレード(グレードIからIVまで)の乳腺腫瘍において、RT-QPCRにより解析した。
【図１Ａ−２】ヒト乳がんの生検材料における、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17RB(IL-17Bの受容体)およびIL-17RE(IL-17Cの受容体)の発現を示す図である。IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17RBおよびIL-17REのmRNA発現を、正常な乳房の生検材料(正常)および種々のグレード(グレードIからIVまで)の乳腺腫瘍において、RT-QPCRにより解析した。
【図１Ｂ】ヒト乳がんの3つの生検材料における共発現のデータを示す図である。
【図２−１】IL-17B高発現が、乳がんを有する患者における、より芳しくない無再発生存(RFS)を予測することを示す図である。原発性乳癌試料285個のコホートにおけるIL-17Bの発現を、Affymetrixチップ上で解析した。基底様亜群(basal-like subgroup)では、IL-17B(灰色線)高発現は、より芳しくないRFSと有意に関連した。
【図２−２】IL-17B高発現が、乳がんを有する患者における、より芳しくない無再発生存(RFS)を予測することを示す図である。原発性乳癌試料285個のコホートにおけるIL-17Bの発現を、Affymetrixチップ上で解析した。基底様亜群(basal-like subgroup)では、IL-17B(灰色線)高発現は、より芳しくないRFSと有意に関連した。
【図２−３】IL-17B高発現が、乳がんを有する患者における、より芳しくない無再発生存(RFS)を予測することを示す図である。原発性乳癌試料285個のコホートにおけるIL-17Bの発現を、Affymetrixチップ上で解析した。基底様亜群(basal-like subgroup)では、IL-17B(灰色線)高発現は、より芳しくないRFSと有意に関連した。
【図３】ヒト膵がんの生検材料における、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17RB(IL-17Bの受容体)およびIL-17RE(IL-17Cの受容体)の発現を示す図である。IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17RBおよびIL-17REのmRNA発現を、正常な膵臓の生検材料(正常)および膵腫瘍において、RT-QPCRにより解析した。
【図４−１】ヒト結腸がんの生検材料における、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17RB(IL-17Bの受容体)およびIL-17RE(IL-17Cの受容体)の発現を示す図である。IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17RBおよびIL-17REのmRNA発現を、正常な結腸の生検材料(正常)および結腸腫瘍において、RT-QPCRにより解析した。
【図４−２】ヒト結腸がんの生検材料における、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17RB(IL-17Bの受容体)およびIL-17RE(IL-17Cの受容体)の発現を示す図である。IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17RBおよびIL-17REのmRNA発現を、正常な結腸の生検材料(正常)および結腸腫瘍において、RT-QPCRにより解析した。
【図４−３】ヒト結腸がんの生検材料における、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17RB(IL-17Bの受容体)およびIL-17RE(IL-17Cの受容体)の発現を示す図である。IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17RBおよびIL-17REのmRNA発現を、正常な結腸の生検材料(正常)および結腸腫瘍において、RT-QPCRにより解析した。
【図５】ヒト正常結腸、原発性結腸がんおよび結腸がん転移における、IL-17Dの発現を示す図である。正常結腸、原発性結腸がんおよび結腸がん転移の生検材料中におけるIL-17Dの発現を、Affymetrixチップ上で解析した。
【図６Ａ】ヒトがん細胞株における、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17RB(IL-17Bの受容体)およびIL-17RE(IL-17Cの受容体)の発現を示す図である。mRNA:(A)=結腸;(B)=乳房;(C)=黒色腫;(D)=卵巣。IL17B、IL17C、IL17D、IL17EおよびIL17Fの発現を、種々のヒト細胞株において、RT-QPCRにより解析した。
【図６Ｂ−１】ヒトがん細胞株における、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17RB(IL-17Bの受容体)およびIL-17RE(IL-17Cの受容体)の発現を示す図である。mRNA:(A)=結腸;(B)=乳房;(C)=黒色腫;(D)=卵巣。IL17B、IL17C、IL17D、IL17EおよびIL17Fの発現を、種々のヒト細胞株において、RT-QPCRにより解析した。
【図６Ｂ−２】ヒトがん細胞株における、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17RB(IL-17Bの受容体)およびIL-17RE(IL-17Cの受容体)の発現を示す図である。mRNA:(A)=結腸;(B)=乳房;(C)=黒色腫;(D)=卵巣。IL17B、IL17C、IL17D、IL17EおよびIL17Fの発現を、種々のヒト細胞株において、RT-QPCRにより解析した。
【図６Ｂ−３】ヒトがん細胞株における、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17RB(IL-17Bの受容体)およびIL-17RE(IL-17Cの受容体)の発現を示す図である。mRNA:(A)=結腸;(B)=乳房;(C)=黒色腫;(D)=卵巣。IL17B、IL17C、IL17D、IL17EおよびIL17Fの発現を、種々のヒト細胞株において、RT-QPCRにより解析した。
【図６Ｃ】ヒトがん細胞株における、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17RB(IL-17Bの受容体)およびIL-17RE(IL-17Cの受容体)の発現を示す図である。mRNA:(A)=結腸;(B)=乳房;(C)=黒色腫;(D)=卵巣。IL17B、IL17C、IL17D、IL17EおよびIL17Fの発現を、種々のヒト細胞株において、RT-QPCRにより解析した。
【図６Ｄ】ヒトがん細胞株における、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17RB(IL-17Bの受容体)およびIL-17RE(IL-17Cの受容体)の発現を示す図である。mRNA:(A)=結腸;(B)=乳房;(C)=黒色腫;(D)=卵巣。IL17B、IL17C、IL17D、IL17EおよびIL17Fの発現を、種々のヒト細胞株において、RT-QPCRにより解析した。
【図７】IL-17Bが乳がん細胞の増殖を高めることを示す図である。T47D(A)、MCF7(B)、MDA-MB436(C)およびMDA-MB468(D)細胞を、示した通りに組換えヒトIL-17Bを増加系列の用量で補充した、適切な完全培地で培養した。細胞増殖は、トリチウムチミジン([3H]-TdR)取込みプロトコールを用いて72時間で評価した。
【図８】IL-17Bが、乳がんおよび卵巣がん細胞の移動および浸潤を増加させることを示す図である。OAW42(卵巣、A)およびMCF7(乳房、B)細胞は、示した通りに適切な完全培地のみ(Ctl)または100ng/mlの組換えヒトIL-17B(IL-17B)を補充した完全培地で培養した。細胞移動を、トランスウェル移動アッセイで評価した。(C)OAW42細胞は、示した通りに適切な完全培地のみ(Ctl)または100ng/mlの組換えヒトIL-17B(IL-17B)を補充した完全培地で、14日間培養した。次いで細胞の浸潤性を、マトリゲル浸潤チャンバーで評価した。
【図９】IL-17Bが、ドセタキセルおよびドキソルビシンに誘導される細胞死を阻害することを示す図である。MCF7(A)、T47D(B)、MDA-MB436(C)、BT20(D)およびMDA-MB468(E)乳房細胞は、示した通りに適切な完全培地のみで(培地)または1もしくは10ng/mlの組換えヒトIL-17Bで処置して、48時間培養した。次に細胞を、対応する濃度のサイトカインを補充したウシ胎仔血清(FCS)非含有培地で24時間培養し、次いでさらに、示した通りにドセタキセルを5、10、20または40μg/mlの濃度で7時間補充した。細胞死の割合(=細胞毒性)は、Cytotoxicity Detection Kit(Roche)を使用して決定した。(F)MCF7細胞は、示した通りに適切な完全培地のみで(培地)または1もしくは10ng/mlの組換えヒトIL-17Bで処置して、48時間培養した。次に細胞を、対応する濃度のサイトカインを補充したFCS非含有培地で24時間培養し、次いでさらに、示した通りにドキソルビシンを20または30μMで7時間補充した。細胞死の割合(=細胞毒性)は、Cytotoxicity Detection Kit(Roche)を使用して決定した。
【図１０Ａ】IL-17Cが、卵巣がん細胞の増殖を高めることを示す図である。OAW42(卵巣)細胞を、示した通りに組換えヒトIL-17Cを増加系列の用量で補充した、適切な完全培地で培養した。細胞増殖は、トリチウムチミジン([3H]-TdR)取込みプロトコールを用いて72時間で評価した。
【図１０Ｂ】IL-17Cが、乳がん細胞の増殖を高めることを示す図である。MCF7(乳房)細胞を、示した通りに組換えヒトIL-17Cを増加系列の用量で補充した、適切な完全培地で培養した。細胞増殖は、トリチウムチミジン([3H]-TdR)取込みプロトコールを用いて72時間で評価した。
【図１０Ｃ】IL-17Cが、乳がん細胞の増殖を高めることを示す図である。T47D(乳房)細胞を、示した通りに組換えヒトIL-17Cを増加系列の用量で補充した、適切な完全培地で培養した。細胞増殖は、トリチウムチミジン([3H]-TdR)取込みプロトコールを用いて72時間で評価した。
【図１０Ｄ】IL-17Dが、卵巣がん細胞の増殖を高めることを示す図である。OAW42細胞を、示した通りに組換えヒトIL-17Dを増加系列の用量で補充した、適切な完全培地で培養した。細胞増殖は、トリチウムチミジン([3H]-TdR)取込みプロトコールを用いて72時間で評価した。
【図１０Ｅ】IL-17Dが、乳がん細胞の増殖を高めることを示す図である。MCF7細胞を、示した通りに組換えヒトIL-17Dを増加系列の用量で補充した、適切な完全培地で培養した。細胞増殖は、トリチウムチミジン([3H]-TdR)取込みプロトコールを用いて72時間で評価した。
【図１０Ｆ】IL-17Dが、乳がん細胞の増殖を高めることを示す図である。T47D細胞を、示した通りに組換えヒトIL-17Dを増加系列の用量で補充した、適切な完全培地で培養した。細胞増殖は、トリチウムチミジン([3H]-TdR)取込みプロトコールを用いて72時間で評価した。
【図１１】IL-17CおよびIL-17Dが、MDA-MB231乳がん細胞の浸潤を増加させることを示す図である。MDA-MB231を、示した通りに適切な完全培地のみで(培地)または100ng/mlの組換えヒトIL-17B、IL-17CまたはIL-17Dを補充した完全培地で、2日間培養した。次いで、細胞の浸潤性をマトリゲル浸潤チャンバーで評価した(A、代表的顕微鏡写真、B、定量)。
【図１２】IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17EおよびIL-17Fが、正常ヒト皮膚線維芽細胞(NHDF)による炎症促進性IL-6産生を増加させることを示す図である。NHDFを、示した通りに適切な完全培地のみで(培地)または30ng/mlの組換えヒトIL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17EまたはIL-17F存在下で、24時間培養した。全アイソフォームが、NHDFによる炎症促進性IL-6産生を増加させた。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【０１２６】
実験手順
細胞培養
HCT116、HT29およびSKOV3細胞株は、10%FCS、2%グルタミンおよび1%抗生物質(Life technologies)を補充したMcCoy5a培地(Life technologies)で培養した。MCF7、T47D、MDA-MB231およびBT20細胞株は、上記のように補充したRPMI1640培地で培養した。SKMEL5、LOVO、OAW42、MDA-MB435S、MDA-MB436、MDA-MB468細胞株、および正常ヒト皮膚線維芽細胞(NHDF)は、上記のように補充したDMEM/F12培地(Life Technologies)中で成長させた。MCF10A細胞株は、上記のように補充し、かつ10μg/mlのインスリン、0.5μg/mlのヒドロコルチゾン、20ng/mlのEGFおよび100ng/mlのコレラ毒素を補充したDMEM/F12培地(Life Technologies)中で維持した。MDA-MB157細胞株は、10%FCS、2%グルタミンおよび1%抗生物質を補充したDMEM培地(Life technologies)で培養した。全ての細胞は、37℃、5%CO2雰囲気のインキュベーター中で維持した。
【０１２７】
細胞増殖アッセイ([3H]-TdR)
96ウェルプレート(Corning)に1ウェルあたり400個の細胞を播種し、適切な完全培地中で一晩維持する。その後培地を除き、示した通りにサイトカインを0から100ng/mlで補充した適切な完全培地に交換する。各条件は3連で実施する。72時間培養後、細胞にトリチウムチミジン([3H]-TdR)(0.5μCi)を16時間パルス状に添加し、細胞を回収した。[3H]-TdRの取込みは、PerkinElmer microβ2 2450 microplate counterを使用して測定した。
【０１２８】
mRNA抽出およびcDNA合成
全RNAは、GenElute(商標)Mammalian Total RNA kit (Sigma-Aldrich、St. Louis、MO)を製造業者の指示に従い使用し、単離した。全RNA(1μg)を、10U/μgのRNAのRNaseOUT(Invitrogen)の存在下で、製造業者の指示に従い1U/μgのRNAのDNase I Amplification Grade(Invitrogen)で処理した。DNaseを失活させた後、RNAは、ランダムノナマー(Promega、Madison、WI)およびM-MLV Reverse Transcriptase H Minus (Promega)を製造業者の指示に従い使用し、逆転写した。
【０１２９】
乳がん、膵がん、および結腸がんのcDNA試料
すぐ使用できる(ready to use)正常乳房および乳がんのcDNA試料(図1)、正常膵臓および膵がんのcDNA試料(図3)ならびに正常結腸および結腸がんのcDNA試料(図4)は、ORIGENEより購入した。
【０１３０】
逆転写されたmRNAの定量ポリメラーゼ連鎖反応(RT-QPCR)
PCR反応に使用したフォワードプライマーおよびリバースプライマーは、GAPDHの場合(Mayerら、2002)を除き、Primer-BLASTソフトウェア(http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)を用いて設計した。リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応による定量は、SYBR Premix Ex Taq(Tli RNaseH Plus)キット(Ozyme)を使用して、LightCycler480 IIシステム(Roche Diagnostics)で行った。サイクル条件は以下の通りであった: 95℃で1分間、続いて、95℃で20秒間、60℃で20秒間、および72℃で30秒間を40サイクル。RT-PCR産物のサイズは、アガロース電気泳動で確認した。増幅終了時に増幅された遺伝子産物の融解温度分析を、全ての場合でルーチン的に行った;PCR産物は、温度を60から95℃まで0.3℃刻みで徐々に上昇させることにより融解させ、LightCycler480ソフトウェア(Roche Diagnostics)の融解曲線分析ツールを用いて解離曲線を作成した。本発明者らは、全PCR反応で1つの産物だけが一貫して増幅されるのを確認した。水による陰性対照は、増幅を示さなかった。対象となる遺伝子の、GAPDHまたはアクチンで規格化した相対的発現量を、ΔCt法で決定した。
【０１３１】
【表１】
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【０１３２】
移動アッセイ
20,000個の細胞を、示した通りに1%FCSの適切な培地のみ(培地)または組換えヒトIL-17B(100ng/ml)を補充した培地中にある、トランスウェルチャンバー(transwell chambers)の上部チャンバー上に、37℃で22時間播種した。トランスウェル上の細胞は、イメージングおよび計数前に、0.5%クリスタルバイオレットで染色した。トランスウェルに移動した細胞数をカウントした(倍率4倍)。グラフは、定量後のデータを細胞移動の割合(%)として、非処置細胞との比較で表す。結果は、それぞれ3連で行われた独立な2回の実験の平均+/-SEMである。
【０１３３】
マトリゲル浸潤アッセイ
細胞は、100ng/mlの組換えサイトカインを補充した適切な完全培地で2日間(MDA-MB231)または14日間(OAW42)培養した。次いで、マトリゲル浸潤チャンバー(BD BioCoat(商標)BD Matrigel(商標)Invasion Chamber、24ウェル細胞培養インサート)を使用し、がん細胞の浸潤性を調べた。次に2.104個の細胞を、示した通りに1%FCSの適切な培地のみまたは100ng/mlの組換えサイトカインを補充した培地中にある、チャンバー上部区画に加える。10%FCSを補充した培地をチャンバー下部ウェルに加える。プレートは、37℃で22時間インキュベートする。次いでトランスウェルフィルターを固定、ギムザ溶液中で染色した後、浸潤していない細胞は、綿棒を使用してトランスウェル膜(transwell membrane)表面から除去する。細胞の画像をデジタルで、代表的な3つの視野から取得し、トランスウェル上に存在する細胞の数を数える。
【０１３４】
IL-6 ELISA
正常ヒト皮膚線維芽細胞(NHDF)は、示した通り、完全培地単独での培養、または30ng/mlLの組換えIL-17B、IL17CもしくはIL17Dを補充した完全培地での培養であった。16時間培養後、上清を回収する。IL-6 ELISAを、human IL-6 development kit (Peprotech)を用い製造業者の指示に従って行う。
【０１３５】
細胞毒性アッセイ
細胞を、示した通りに適切な完全培地のみで(培地)または1もしくは10ng/mlの組換えヒトIL-17Bで処置して、96ウェルプレートに播種した(1000個/ウェル)。48時間培養後、培地を、対応する濃度のサイトカインで補充したFCS非含有培地に変えた。24時間後、培養液に、示した通りにドセタキセルを5、10、20もしくは40μg/mlで、またはドキソルビシンを20または30μMでさらに補充する。無処置細胞(対照培地)およびTriton X100処置細胞(100%細胞死)を対照として用いた。各条件は、2連で行った。
【０１３６】
細胞死の割合(=細胞毒性)は、ドセタキセルまたはドキソルビシン存在下で7時間培養後、Cytotoxicity Detection Kit(Roche)を製造業者の指示に従って使用し、決定した。この目的のため、各ウェルから上清100μlを、96ウェルプレートに集め、新たに調製した反応液(Reaction Mixture)100μlと30分間、室温でインキュベートした。次いで、光学密度を490nmで読み取った。細胞毒性の割合は、以下のように算出する:% = 100×(実験値-対照培地での値)/(Triton X100処置細胞での値-対照培地での値)
【０１３７】
遺伝子発現プロファイリング
CITデータセット由来の285個の原発性乳癌試料を、Affymetrix U133-Plus2.0チップ上での発現プロファイリングについて解析した(Guedj M、A refined molecular taxonomy of breast cancer、Oncogene (2012) 31、1196〜1206頁)。
【０１３８】
正常結腸、結腸癌および転移試料は(Del Rio M、Gene Expression Signature in Advanced Colorectal Cancer Patients Select Drugs and Response for the Use of Leucovorin, Fluorouracil, and Irinotecan、JOURNAL OF CLINICAL ONCOLOGY、2007)由来のものを、Affymetrix U133チップ上での発現プロファイリングについて解析した。
【０１３９】
結果
(実施例1)
IL-17アイソフォームおよびそれらの受容体は、ヒトがんで発現している
IL-17AおよびIL-17A産生細胞(例えば、Th17細胞)はヒトがんで増加している。しかし、他のIL-17アイソフォーム(特に、IL-17B、IL17CおよびIL17D)の発現は知られていない。そこで本発明者らは、IL-17B、IL17CおよびIL17Dの発現、ならびにそれらの受容体(IL-17RB、すなわちIL-17Bの受容体、およびIL-17RE、すなわちIL-17Cの受容体)の発現を、RT-QPCRにより種々のヒトがん生検材料およびがん細胞株において解析した。図1Aに示すように、IL-17B、IL-17CおよびIL-17Dは、一部の乳がん生検材料では正常乳房に比べ、上方制御されていた。さらに、IL-17RBおよびIL-17REは共に、一部の乳がん生検材料では正常乳房に比べ、上方制御されていた。IL-17B高発現は、特に基底様亜群で、より芳しくないRFS (無再発生存)と有意に関連した(図2)。図3に示すように、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17RBおよびIL-17REは、一部の膵がん生検材料で発現していた。一部のがんの場合、IL-17CおよびIL-17Bが、正常膵臓に比べ上方制御されていた。図4に示すように、IL-17C、IL-17D、IL-17RBおよびIL-17REは一部の結腸腫瘍で上方制御されていた。このことから、これらが結腸がんの進行に関与するかもしれないことが示唆される。一部の結腸がん(原発腫瘍および転移)で、IL-17Dが正常結腸に比べ上方制御されていることは、図5でさらに例証された。図6に示すように、調べたヒトがん細胞株は、以下の遺伝子のうち1つまたはいくつかを発現していた:IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17RBおよびIL-17RE。興味深いことに、非がん性細胞株であるMCF10Aは、IL-17B、IL-17C、IL-17DまたはIL-17RBを発現していなかった(しかし、IL-17REは発現していた)。総じてこれは、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17RBおよびIL-17REがヒトがんおよびがん細胞株で発現かつ/または上方制御されていることを示唆し、よってこれらが、がん処置の治療標的になり得ることが示唆される。
【０１４０】
図1Bに例示するように、いくつかの乳がん生検材料は、2つ以上のIL-17アイソフォームを発現していた。同様に、図6に示すように、一部のがん細胞株はいくつかのIL-17アイソフォームを発現していた:MCF7はIL-17CおよびIL-17Dを、MDA-MB157はIL-17BおよびIL-17Dを発現していた。これは概して、がん処置には、2つ以上のアイソフォームまたはそれらの受容体を同時に標的とすることが必要かもしれない場合があることを示唆する。
【０１４１】
結論として、全IL-17アイソフォームおよびそれらの受容体が、ヒトがんで上方制御される。1つのアイソフォームもしくは受容体またはいくつかのアイソフォームを同時に、またはいくつかの受容体を同時に標的とするのは、がん処置のための治療選択肢かもしれない。
【０１４２】
(実施例2)
IL-17BおよびIL-17RBは、がん細胞増殖を刺激する
IL-17BおよびIL-17RBがヒトがんで上方制御されているので(実施例1)、本発明者らは、これらが発癌性を有する可能性の有無を調べた。本発明者らはまず、IL-17Bが、IL-17RBを発現するヒトがん細胞の増殖を変化させることになるかを調べた。図7に示すように、IL-17Bは、T47D、MCF7、MDA-MB436およびMDA-MB468乳がん細胞の増殖を高めた。興味深いことに、IL-17Bは、IL-17RBを発現しないMDA-MB231細胞の増殖は刺激しなかった(データ示さず)。したがって、IL-17BおよびIL-17RBは、がん細胞の増殖を高めることにより腫瘍の成長を促進し得る。
【０１４３】
(実施例3)
IL-17BおよびIL-17RBは、がん細胞の移動および浸潤を増加させる
本発明者らは、IL-17Bが、IL-17RBを発現するがん細胞の移動および浸潤を増加させる可能性の有無を調べた。マトリゲル浸潤チャンバーアッセイは、腫瘍細胞の浸潤性病変を形成し転移する能力を反映した、がん細胞の浸潤性を評価する上で有用である(Albini Aら(1987)「A Rapid in Vitro Assay for Quantitating the Invasive Potential of Tumor Cells」Cancer Research 47: 3239〜3245頁)。図8に示すように、IL-17Bは、OAW42卵巣がん細胞(図8A)およびMCF7乳がん細胞(図8B)の移動を増加させた。IL-17BはOAW42卵巣がん細胞(図8C)の浸潤性を増加させた。興味深いことに、IL-17Bは、IL-17RBを発現しないMDA-MB231細胞の浸潤を増加させなかった(図11)。したがって、IL-17BおよびIL-17RBは、がん細胞の移動、浸潤および転移を促進することができる。
【０１４４】
(実施例4)
IL-17BおよびIL-17RBは、がん細胞の化学療法抵抗性を促進する
本発明者らは、IL-17Bが、ドセタキセルおよびドキソルビシンなどの化学療法剤への抵抗性を促進する可能性の有無を調べた。図9に示すように、IL-17Bは、IL-17RBを発現するいくつかの乳がん細胞株において、ドセタキセルにより誘導される細胞死を減少させた(図9A〜図9E)。さらにIL-17Bはまた、MCF7乳がん細胞を、ドキソルビシンにより誘導される細胞死から保護した(図9F)。したがって、IL-17BおよびIL-17RBは化学療法抵抗性を促進することができる。
【０１４５】
(実施例5)
IL-17C、IL-17DおよびIL-17REは、がん細胞増殖を刺激する
IL-17C、IL-17DおよびIL-17REがヒトがんで上方制御されているので(実施例1)、本発明者らは、これらが発癌性を有する可能性の有無を調べた。本発明者らはまず、IL-17Cが、IL-17REを発現するヒトがん細胞の増殖を変化させるか否かを調べた。図10A〜図10Cに示すように、IL-17Cは、OAW42、T47DおよびMCF7がん細胞の増殖を高めた。次いで本発明者らは、IL-17Dが、ヒトがん細胞の増殖を変化させるか否かを調べた。図10D〜図10Fに示すように、IL-17Dは、OAW42およびMCF7がん細胞の増殖を高めた。
【０１４６】
したがってIL-17B、IL-17CおよびIL-17REは、がん細胞の増殖を高めることにより腫瘍の成長を促進し得る。
【０１４７】
(実施例6)
IL-17C、IL-17DおよびIL-17REは、がん細胞浸潤を増加させる
本発明者らは、IL-17Cが、IL-17REを発現したがん細胞の浸潤を増加させる可能性の有無を調べた。マトリゲル浸潤チャンバーアッセイは、腫瘍細胞の浸潤性病変を形成し転移する能力を反映した、がん細胞の浸潤性を評価する上で有用である(Albini Aら(1987)「A Rapid in Vitro Assay for Quantitating the Invasive Potential of Tumor Cells」Cancer Research 47: 3239〜3245頁)。図11に示すように、IL-17Cは、MDA-MB231乳がん細胞の浸潤性を高めた。次いで本発明者らは、IL-17Dが、乳がん細胞の浸潤を増加させる可能性の有無を調べた。図11に示すように、IL-17Dは、MDA-MB231乳がん細胞の浸潤性を高めた。したがってIL-17C、IL-17DおよびIL-17REは、がん細胞の浸潤および転移を促進することができる。
【０１４８】
(実施例7)
IL-17アイソフォームは、皮膚線維芽細胞における炎症促進性IL-6分泌を誘導する
IL-17Aは、IL-6など種々の炎症促進性メディエーターの産生を誘導することのできる、既知の炎症促進性サイトカインである。そこで本発明者らは、他のIL-17アイソフォームも、IL-17RBおよびIL-17REを発現する正常ヒト皮膚線維芽細胞(NHDF)による、IL-6などの炎症促進性メディエーターの分泌を誘導するか否かを調べた。NHDFを、組換えヒトIL-17B、IL17CまたはIL17Dを用いて刺激した。図12に示すように、調べた全アイソフォームが、NHDFによるIL-6分泌を増加させた。したがってIL-17B、IL17C、IL17D、IL-17RBおよびIL-17REは炎症促進活性を呈し、よって、慢性炎症性疾患または自己免疫疾患に関与しているかもしれない。
【図１Ａ−１】
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【図１Ａ−２】
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【図１Ｂ】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ−１】
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【図６Ｂ−２】
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【図６Ｂ−３】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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