(57)【要約】【課題】ニトリルヒドラターゼを含有する菌体またはその菌体処理物を、安定化剤の添加や、凍結処理をせずとも安定的に保存可能な方法を提供する。【解決手段】ニトリルヒドラターゼを含有する菌体またはその菌体処理物を保存する際に、乾燥菌体１ｍｇ当たり活性量が１００Ｕ以上であるニトリルヒドラターゼを含有する菌体および／またはその菌体処理物を氷点以上の温度で保存することで、酵素の活性低下を抑制することが可能となった。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
乾燥菌体１ｍｇ当たりの活性量が１００Ｕ以上であるニトリルヒドラターゼを含有する菌体またはその菌体処理物を準備する工程と、前記菌体またはその菌体処理物を氷点以上の温度で２４時間以上にわたり保存する工程と、を有するニトリルヒドラターゼ含有菌体またはその菌体処理物の保存方法。
【請求項２】
保存開始から９０日後の酵素活性が７０％以上維持される、請求項１に記載のニトリルヒドラターゼ含有菌体またはその菌体処理物の保存方法。
【請求項３】
保存温度が氷点以上４０℃以下である請求項１または２に記載のニトリルヒドラターゼ含有菌体またはその菌体処理物の保存方法。
【請求項４】
前記ニトリルヒドラターゼがシュードノカルディア属由来のニトリルヒドラターゼである請求項１〜３いずれかに記載のニトリルヒドラターゼ含有菌体またはその菌体処理物の保存方法。
【請求項５】
請求項１〜４いずれかに記載の保存方法を経たニトリルヒドラターゼ含有菌体またはその菌体処理物を用いることを特徴とする、アクリルアミドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミド化合物の生産など工業的に有用な酵素であるニトリルヒドラターゼの保存方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
アミド化合物の主要な製造方法の一つとして、ニトリル化合物を原料とする水和法は多くの場合に用いられており、アクリルアミド等のアミド化合物の工業的製法としては、例えば、ラネー銅などの金属を触媒として用い、アクリロニトリル等のニトリル化合物を水和する方法、あるいは近年ではニトリルヒドラターゼを含有する菌体および／またはその菌体処理物等を触媒として用い、ニトリル化合物を水和する方法が知られている。
【０００３】
ニトリルヒドラターゼを含有する菌体および／またはその菌体処理物を触媒として用いる方法は、アクリロニトリル等のニトリル化合物の転化率および選択率が高いことから工業的に注目を浴びている。
【０００４】
ニトリルヒドラターゼなどの酵素は使用時まで安定に保存しておく必要がある。一般に、その活性の低下を抑制する目的で、安定剤、代謝阻害剤、高濃度塩類などの存在下で保存することにより酵素活性の低下を抑制している。上述の安定剤などを添加しない場合には、凍結、あるいは通気や攪拌などにより酵素活性を維持しつつ保存することが知られている。
【０００５】
ニトリルヒドラターゼの保存方法に関しては、これまでにも次のような検討が行われている。例えば、特許文献１には、安定化剤としてニトリル類、アミド類、及び有機酸またはその塩類の中から選ばれた少なくとも一種の化合物を添加して酵素活性を１日以上安定に維持する方法が開示されている。また、特許文献２には、酵素活性を有する微生物またはその固定化物を水性媒体に懸濁した状態で、酵素活性および菌体細胞を長期安定に保存する方法において、該水性媒体が中性乃至弱塩基性で且つ１００ｍＭ及至飽和濃度の無機塩類水溶液であることを特徴とする菌体または固定化菌体の懸濁液保存方法が開示されている。しかし、これらの方法はいずれも安定剤などの添加剤を含有することとなり、安定化剤の添加によるコストの上昇を招くのみではなく、ニトリルヒドラターゼを利用して生産するアクリルアミド等の最終製品の品質に大きな影響を与え、それを除去するためにさらに製造コストが増大することは言うまでもない。したがって、安定剤を積極的に添加することなく保存できることは産業上望ましい。
【０００６】
また、特許文献３には、ニトリルヒドラターゼを保存する際に、その保存温度を−５℃以下窒素沸点（−１９５．８℃）以上の凍結した状態で保存することを特徴とする酵素触媒の保存方法が開示されている。しかしながら、凍結による保存方法においては、凍結、解凍などの操作が煩雑であることや、当該操作の影響により酵素活性が低下する恐れがある。
【０００７】
上記の観点から、工業的な生産規模において、より効率的なニトリルヒドラターゼの保存方法が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開昭６２−２５９５８６号公報
【特許文献２】特開平８−１１２０８９号公報
【特許文献３】特開２００３−２１９８７０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記の状況から本発明が解決しようとする課題は、ニトリルヒドラターゼを含有する菌体またはその菌体処理物を、安定化剤などの添加や凍結工程をせずとも安定的に保存する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者等は上記課題を解決すべく鋭意研究を行った。その結果、ニトリルヒドラターゼを保存する際に、乾燥菌体１ｍｇ当たり活性量が１００Ｕ以上であるニトリルヒドラターゼを含有する菌体またはその菌体処理物を用いることで、上記課題を解決できることを見出し、本発明に至った。
【００１１】
すなわち、本発明には以下の事項が含まれる。
〔１〕  乾燥菌体１ｍｇ当たりの活性量が１００Ｕ以上であるニトリルヒドラターゼを含有する菌体またはその菌体処理物を準備する工程と、前記菌体またはその菌体処理物を氷点以上の温度で２４時間以上にわたり保存する工程と、を有するニトリルヒドラターゼ含有菌体またはその菌体処理物の保存方法。
〔２〕  保存開始から９０日後の酵素活性が７０％以上維持される、前記〔１〕に記載のニトリルヒドラターゼ含有菌体またはその菌体処理物の保存方法。
〔３〕  保存温度が氷点以上４０℃以下である前記〔１〕または〔２〕に記載のニトリルヒドラターゼ含有菌体またはその菌体処理物の保存方法。
〔４〕  前記ニトリルヒドラターゼがシュードノカルディア属由来のニトリルヒドラターゼである前記〔１〕〜〔３〕いずれかに記載のニトリルヒドラターゼ含有菌体またはその菌体処理物の保存方法。
〔５〕  前記〔１〕〜〔４〕いずれかに記載の保存方法を経たニトリルヒドラターゼ含有菌体またはその菌体処理物を用いることを特徴とする、アミド化合物の製造方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、ニトリルヒドラターゼを保存するに際し、安定化剤などの添加や凍結工程をせずとも酵素の活性低下を抑制することができる。また、このような保存方法を経たニトリルヒドラターゼ含有菌体またはその菌体処理物を用いてアミド化合物を製造することで、最終製品であるアミド化合物が添加剤等の影響を受ける心配がなく、安定剤などの余分な成分を精製により除去する必要もなく安価にアミド化合物を得ることができる。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明のニトリルヒドラターゼの保存方法について、以下にその詳細を説明する。
【００１４】
本発明は、ニトリルヒドラターゼを含有する菌体またはその菌体処理物の保存方法を提供するものである。
【００１５】
ニトリルヒドラターゼとは、ニトリル化合物を加水分解して対応するアミド化合物を生成する能力を有する酵素（たんぱく質）をいう。
【００１６】
本発明で使用するニトリルヒドラターゼを含有する菌体および／またはその菌体処理物としては乾燥菌体１ｍｇ当たりの活性量が１００Ｕ以上であれば特に限定されない。ニトリルヒドラターゼを産生する菌体としては、ノカルディア(Nocardia)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、バチルス(Bacillus)属、好熱性のバチルス属、シュードモナス(Pseudomonas)属、ミクロコッカス(Micrococcus)属、ロドクロウス(rhodochrous)種に代表されるロドコッカス(Rhodococcus)属、アシネトバクター(Acinetobacter)属、キサントバクター(Xanthobacter)属、ストレプトマイセス(Streptomyces)属、リゾビウム(Rhizobium)属、クレブシエラ(Klebsiella)属、エンテロバクター(Enterobacter)属、エルウィニア(Erwinia)属、エアロモナス(Aeromonas)属、シトロバクター(Citrobacter)属、アクロモバクター(Achromobacter)属、アグロバクテリウム(Agrobacterium)属またはサーモフィラ(thermophila)種に代表されるシュードノカルディア(Pseudonocardia)属、バクテリジューム（Bacteridium）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属に属する菌体などが挙げられる。これらは一種で用いても二種以上を併用しても良い。
また、これら菌体よりクローニングしたニトリルヒドラターゼ遺伝子を任意の宿主で高発現させた形質転換体、および組換えＤＮＡ技術を用いて該ニトリルヒドラターゼの構成アミノ酸の一個または二個以上を他のアミノ酸で置換、欠失、削除もしくは挿入することにより、アミド化合物耐性やニトリル化合物耐性、温度耐性を更に向上させた変異型のニトリルヒドラターゼを発現させた形質転換体なども挙げられる。尚、ここでいう任意の宿主には、後述の実施例のように大腸菌(Escherichia coli)が代表例として挙げられるが、とくに大腸菌に限定されるものではなく枯草菌(Bacillus subtilis)等のバチルス属菌、酵母や放線菌等の他の菌株も含まれる。その様なものの例として、ＭＴ−１０８２２〔本菌株は、１９９６年２月７日に茨城県つくば市東１丁目１番３号の通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（現  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  独立行政法人製品評価技術基盤機構  バイオテクノロジーセンター  特許生物寄託センター）に受託番号ＦＥＲＭＢＰ−５７８５として、特許手続き上の菌体の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づいて寄託されている。〕が挙げられる。
【００１７】
これら菌体の中でも、高活性、高安定性のニトリルヒドラターゼを有するという点で、シュードノカルディア(Pseudonocardia)属に属する菌体、および該菌体よりクローニングしたニトリルヒドラターゼ遺伝子を任意の宿主で高発現させた形質転換体、および変異型のニトリルヒドラターゼを発現させた形質転換体が好ましい。なお、上記形質転換体は、ニトリルヒドラターゼの安定性をより高め、菌体当たりの活性がより高い点で好ましい。
【００１８】
また、菌体内にニトリルヒドラターゼを高発現できる、ロドコッカス・ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）Ｊ−１、該菌体よりクローニングしたニトリルヒドラターゼ遺伝子を任意の宿主で高発現させた形質転換体も同様に好ましい。
【００１９】
上記ニトリルヒドラターゼを産生する菌体は、分子生物学・生物工学・遺伝子工学の分野において公知の一般的な方法により調製できる。
【００２０】
本明細書で後述する実施例１〜３中に記載の文献に記載の方法を参照すれば、好適に乾燥菌体１ｍｇ当たりの活性量が１００Ｕ以上の菌体または菌体処理物を得ることができる。
【００２１】
本発明に係る組換えベクターは、ニトリルヒドラターゼをコードする遺伝子を含有するものであり、ベクターにニトリルヒドラターゼをコードする遺伝子を連結することにより得ることができる。ベクターとしては、特に限定されるものではなく、例えばｐＥＴ−２１ａ（＋）、ｐＫＫ２２３−３、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ（＋）およびｐＢＲ３２２等に代表される市販の発現プラスミドに、ニトリルヒドラターゼをコードする遺伝子を組み込むことにより、該ニトリルヒドラターゼの発現プラスミドを構築することができる。また、形質転換に使用する宿主生物としては、組換えベクターが安定、かつ自己増殖可能で、さらに外来のＤＮＡの形質が発現できるものであれば良く、例えば大腸菌が好例として挙げられるが、大腸菌だけに限らず枯草菌、酵母等に導入することにより、ニトリルヒドラターゼの生産能を有する形質転換体を得ることができる。
【００２２】
上述のようなニトリルヒドラターゼを生産する菌体は、公知の方法により、適宜培養し増殖させ、ニトリルヒドラターゼを生産させても良い。この場合使用される培地としては炭素源、窒素源、無機塩類およびその他の栄養素を適量含有する培地であれば合成培地または天然培地のいずれも使用可能である。例えば、ＬＢ培地、Ｍ９培地等の通常の液体培地に、菌体を植菌した後、適当な培養温度（一般的には２０℃〜５０℃であるが、好熱菌の場合は５０℃以上でも良い。）で培養させることにより調製できる。培養は前記培養成分を含有する液体培地中で振とう培養、通気攪拌培養、連続培養、流加培養などの通常の培養方法を用いて行うことができる。形質転換体の培養温度としては、１５〜３７℃が好ましい。培養条件は、特に限定されるものではなく、培養の種類、培養方法により適宜選択すれば良く、菌株が生育しニトリルヒドラターゼを生産することが出来れば良い。
【００２３】
本発明では上述のニトリルヒドラターゼを生産する菌体を、遠心等による集菌や、破砕し菌体破砕物を作製する等、さまざまな処理を行っても良く、これらのなんらかの処理を施した菌体を菌体処理物と総称する。なお、本発明の実施例で集菌液と表記したものは、ここでいうところの菌体処理物を意味する。
【００２４】
破砕される菌体の形態としては、ニトリルヒドラターゼを産生する菌体を含む限り特に限定はされず、例えば、該菌体を含む培養液そのもの、その培養液を遠心分離して分離・回収された集菌体、さらにこの集菌体を生理食塩水等で洗浄したものなどが挙げられる。
【００２５】
本発明でいう活性量の単位「Ｕ」とは、ニトリル化合物から対応するアミド化合物を１分間に１マイクロモル生成することを意味する。すなわち、乾燥菌体１ｍｇ当たり活性量とは、乾燥菌体１ｍｇを用いてニトリル化合物を反応させた際に、１分間に生成した対応するアミド化合物の量をマイクロモルで表した数である。
【００２６】
活性量の測定方法は、以下の通りである。１００ｍｌの密閉可能なガラス容器に５０ｍＭトリス塩酸水溶液（ｐＨ８．０）１０ｇを入れ、ニトリルヒドラターゼを懸濁させた後に２０℃に調整する。次いでニトリル化合物を添加し１５分間攪拌し反応を行う。１５分後に１０ｍＭリン酸水溶液８０ｇを添加して反応を完結させた後にＨＰＬＣ分析により反応終了液中のアミド化合物濃度を測定し、使用したニトリルヒドラターゼの重量及びアミド化合物の生成量から活性量を算出する。
【００２７】
ニトリルヒドラターゼ及びニトリル化合物の使用量は、反応終了時にニトリル化合物が反応液中に残存し、かつ反応後のアミド化合物が精度良く測定できる濃度にまで生成する様に設定する。
【００２８】
ニトリル化合物としては、例えば、炭素数２〜２０の脂肪族ニトリル化合物、炭素数６〜２０の芳香族ニトリル化合物などが挙げられ、一種で用いても二種以上を併用しても良い。
【００２９】
脂肪族ニトリル化合物としては、例えば、炭素数２〜６の飽和または不飽和ニトリルが挙げられる。具体的には、アセトニトリル、プロピオニトリル、ブチロニトリル、イソブチロニトリル、バレロニトリル、イソバレロニトリル、カプロニトリル等の脂肪族飽和モノニトリル；マロノニトリル、サクシノニトリル、アジポニトリル等の脂肪族飽和ジニトリル；アクリロニトリル、メタクリロニトリル、クロトンニトリル等の脂肪族不飽和ニトリル；などが挙げられる。
【００３０】
芳香族ニトリル化合物としては、例えば、ベンゾニトリル、ｏ−，ｍ−またはｐ−クロロベンゾニトリル、ｏ−，ｍ−またはｐ−フルオロベンゾニトリル、ｏ−，ｍ−またはｐ−ニトロベンゾニトリル、ｏ−，ｍ−またはｐ−トルニトリル、ｏ−，ｍ−またはｐ−シアノピリジン、ベンジルシアナイドなどが挙げられる。
【００３１】
ニトリル化合物の中でも、アクリロニトリル、メタクリロニトリルが好ましい。
【００３２】
本発明は乾燥菌体１ｍｇ当たり活性量が１００Ｕ以上であるニトリルヒドラターゼを用いた場合に本発明の効果を得ることができるが、前記活性量は１１０Ｕ以上であることが好ましく、前記活性量は１２０Ｕ以上であることがより好ましく、１５０Ｕ以上であることがさらに好ましい。
【００３３】
本発明において、保存とはタンクなどの容器中でニトリルヒドラターゼを含有する菌体またはその菌体処理物を保管することを示す。
【００３４】
保存期間は特に限定するものではなく、通常は１日間以上（２４時間以上）であるが工業的な使用を考慮すると、保存期間は３０日以上が好ましく、６０日以上がより好ましく、９０日以上がさらに好ましい。
【００３５】
本発明の方法によってニトリルヒドラターゼを含有する菌体またはその菌体処理物を保存した場合には、酵素活性の低下が抑制され、保存期間後の酵素活性が維持できる。保存開始時の活性に対する保存期間後の活性の維持については、保存期間にもよるが、例えば、保存開始時の酵素活性を基準とし、保存開始から９０日後の酵素活性が５０％以上維持される。保存開始から９０日後の酵素活性が７０％以上維持されることが好ましく、８０％以上維持されることがより好ましく、９０％以上維持されることがさらに好ましい。
【００３６】
本発明において、ニトリルヒドラターゼを保存する温度は氷点以上であれば特に限定されるものではないが、ニトリルヒドラターゼの活性の低下を抑制するためには、氷点以上４０℃以下が好ましく、より好ましくは氷点以上２０℃以下、さらに好ましくは氷点以上１０℃以下である。ここで氷点とは、菌体および／またはその菌体処理物の懸濁液が固体状態と液体状態の平衡を保って共存する温度を意味し、氷点以上の温度での保存であれば、菌体および／またはその菌体処理物の懸濁液は液体状態で維持される。
【００３７】
もちろん、本発明の効果を妨げない態様であれば、本発明の構成（乾燥菌体１ｍｇ当たり活性量が１００Ｕ以上であるニトリルヒドラターゼを含有する菌体またはその菌体処理物を氷点以上の温度で保存する）に、加えて、さらに、背景技術に記載のような添加剤処理などを行っても良い。添加剤としては、たとえば、ニトリル類、アミド類及び有機酸類、あるいは、リン酸塩、硝酸塩、硫酸塩、亜硫酸塩および塩酸塩から選ばれる無機塩が挙げられる。しかしながら、本発明は背景技術に記載の事情から、実質的に添加剤等を含まないことが好ましい。「実質的に含まない」と記載したのは、本発明を意図的に狭く解釈し、本発明の構成に加えて、わずかな添加剤等を意図的に加えた実施態様がとられた場合に、その態様が、本発明の範囲外の実施態様であるかのような議論を生じさせないための記載である。添加剤等を「実質的に含まない」の具体的な値は記載し得ないが、本発明の工程中で、たとえ添加剤等を含んでいたとしても、最終製品であるアミド化合物に好ましくない影響を与えない程度の量のみを含むことを意味する。
【実施例】
【００３８】
以下に本発明の実施例を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３９】
［実施例１］
〔ニトリルヒドラターゼを含有する菌体の調製〕
特開２００４−１９４５８８号公報の実施例６３に記載の方法に従い同実施例６３に記載のクローン番号Ｎｏ．１０３の菌体を取得し、下記方法で培養してニトリルヒドラターゼを含有する湿菌体を得た。
【００４０】
本菌株の培養は９０Ｌの培養槽に下記の組成の培地４５．０Ｌを調製し、１２１℃・２０分間のオートクレーブにより滅菌した。この培地に終濃度が５０μｇ／ｍＬとなるようにアンピシリンを添加した後、上記Ｎｏ．１０３クローン菌体を一白金耳植菌し、３７℃・７００ｒｐｍにて４０時間培養した。遠心分離（１５０００Ｇ×１５分間）により菌体のみを培養液より分離し、分離した液に流動性を持たせるため固形分率が約１５重量％となるように遠心分離時の上澄み液を加えて湿菌体の集菌液を得た。
培地組成    酵母エキストラクト          ５．０ｇ／Ｌ
ポリペプトン              １０．０ｇ／Ｌ
ＮａＣｌ                    ５．０ｇ／Ｌ
塩化コバルト・六水和物    １０．０ｍｇ／Ｌ
硫酸第二鉄・七水和物      ４０．０ｍｇ／Ｌ
ｐＨ７．５
【００４１】
次に集菌液を２０Ｌのポリプロピレン製の容器（縦３０ｃｍ、横３０ｃｍ、高さ４５ｃｍ）に１８Ｋｇずつ充填し、５℃の温度の冷蔵庫にて保存した。
【００４２】
(ニトリルヒドラターゼ活性の測定)
上記の方法で調製した集菌液の保存を開始した直後（０日）のニトリルヒドラターゼ活性を以下の方法で測定した。１００ｍｌの密閉可能なガラス容器に５０ｍＭトリス塩酸水溶液（ｐＨ８．０）１０ｇを入れ、集菌液を混合した後に２０℃に調整し、次いでアクリロニトリルを添加し１５分間攪拌し反応を行った。１５分後に１０ｍＭリン酸水溶液８０ｇを添加して反応を完結させた後に高速液体クロマトグラフィー分析により反応終了液中のアクリルアミド濃度を測定し、使用したニトリルヒドラターゼの重量及びアクリルアミドの生成量から活性量を算出したところ、乾燥菌体１ｍｇ当たりの活性量は１２０Ｕであった。ここで分析条件は以下の通りである。
・分析条件：
高速液体クロマトグラフ装置：ＬＣ−１０Ａシステム（株式会社島津製作所製）
（ＵＶ検出器波長２５０ｎｍ、カラム温度４０℃）
分離カラム                ：ＳＣＲ-１０１Ｈ (株式会社島津製作所製)
溶離液                    ：０．００５％（容積基準）−リン酸水溶液
【００４３】
また、上記の方法で調製した集菌液を５℃の温度で保存し、それぞれ５、１０、３０、６０、９０日経過した後のニトリルヒドラターゼ活性を上記の方法で測定した。活性量の結果を表１に示す。
ニトリルヒドラターゼ活性の指標として、活性残存率（％）を次式にて求めた。保存開始時（０日）の活性を１００とした時の保存期間後の活性を相対値として表す指標である。
活性残存率（％）＝（保存開始時の活性／保存期間後の活性）×１００
活性残存率の結果を表２に示す。
【００４４】
［実施例２］
〔ニトリルヒドラターゼを含有する菌体の調製〕
特開２００４−１９４５８８号公報の実施例７６に記載の方法に従い同実施例７６に記載のクローン番号Ｎｏ．１１６の菌体を取得し、実施例１に記載の方法で培養し、その後に遠心分離処理を行ってニトリルヒドラターゼを含有する湿菌体の集菌液を得た。
【００４５】
次に集菌液を２０Ｌのポリプロピレン製の容器（縦３０ｃｍ、横３０ｃｍ、高さ４５ｃｍ）に１８Ｋｇずつ充填し、５℃の温度の冷蔵庫にて保存した
【００４６】
(ニトリルヒドラターゼ活性の測定)
上記の方法で調製した集菌液の保存を開始した直後（０日）のニトリルヒドラターゼ活性を実施例１と同様の方法で測定した。乾燥菌体１ｍｇ当たりの活性量は１６０Ｕであった。
【００４７】
また、上記の方法で調製した集菌液を５℃の温度で保存し、それぞれ５、１０、３０、６０、９０日経過した後のニトリルヒドラターゼ活性を実施例１と同様の方法で測定し、活性残存率（％）を求めた。
【００４８】
上記条件で保存した集菌液の活性量を表１に、活性残存率を表２にそれぞれ示す。
【００４９】
［実施例３］
〔ニトリルヒドラターゼを含有する菌体の調製〕
ＷＯ２０１０−５５６６６号公報の実施例５１に記載の方法に従い同実施例５１に記載の形質転換体番号９２の菌体を取得し、実施例１に記載の方法で培養し、その後に遠心分離処理を行ってニトリルヒドラターゼを含有する湿菌体の集菌液を得た。
【００５０】
次に集菌液を２０Ｌのポリプロピレン製の容器（縦３０ｃｍ、横３０ｃｍ、高さ４５ｃｍ）に１８Ｋｇずつ充填し、５℃の温度の冷蔵庫にて保存した。
【００５１】
(ニトリルヒドラターゼ活性の測定)
上記の方法で調製した集菌液の保存を開始した直後（０日）のニトリルヒドラターゼ活性を実施例１と同様の方法で測定した。乾燥菌体１ｍｇ当たりの活性量は２４０Ｕであった。
【００５２】
また、上記の方法で調製した集菌液を５℃の温度で保存し、それぞれ５、１０、３０、６０、９０日経過した後のニトリルヒドラターゼ活性を実施例１に記載の方法で測定し、活性残存率（％）を求めた。
【００５３】
上記条件で保存した集菌液の活性量を表１に、活性残存率を表２にそれぞれ示す。
【００５４】
［比較例］
〔ニトリルヒドラターゼを含有する菌体の調製〕
特開平９−２７５９７８号公報記載の実施例６に記載の方法に従い同実施例６に記載のクローン番号Ｎｏ．１の菌体を取得し、実施例１に記載の方法で培養し、その後に遠心分離処理を行ってニトリルヒドラターゼを含有する湿菌体の集菌液を得た。
【００５５】
次に集菌液を２０Ｌのポリプロピレン製の容器（縦３０ｃｍ、横３０ｃｍ、高さ４５ｃｍ）に１８Ｋｇずつ充填し、５℃の温度の冷蔵庫にて保存した。
【００５６】
(ニトリルヒドラターゼ活性の測定)
上記の方法で調製した集菌液の保存を開始した直後（０日）のニトリルヒドラターゼ活性を実施例１と同様の方法で測定した。乾燥菌体１ｍｇ当たりの活性量は６０Ｕであった。また、上記の方法で調製した集菌液を５℃の温度で保存し、それぞれ５、１０、３０、６０、９０日経過した後のニトリルヒドラターゼ活性を実施例１と同様の方法で測定し、活性残存率（％）を求めた。
【００５７】
上記条件で保存した集菌液の活性量を表１（保存期間と活性量）に、活性残存率を表２（保存期間と活性保持率）にそれぞれ示す。
【００５８】
【表１】
2020115838.tif 000002
【００５９】
【表２】
2020115838.tif 000003