(57)【要約】【課題】本発明は、ＧＶＨＤモデル動物、当該動物の作製方法、及び当該動物を用いたＧＶＨＤ治療剤のスクリーニング方法を提供する。【解決手段】非ヒト動物に、ＳＴＡＰ１遺伝子を過剰発現しているトランスジェニック非ヒト動物から採取された移植片が、同種移植又は異種移植されている、ＧＶＨＤモデル動物、及びＧＶＨＤモデル動物に被験物質を投与し、ＧＶＨＤの症状が改善又は消失した場合に、前記被験物質をＧＶＨＤ治療剤の候補物質として選抜し、前記ＧＶＨＤモデル動物は、ＳＴＡＰ１遺伝子及びＳＴＡＰ２遺伝子からなる群より選択される１種以上の遺伝子を過剰発現しているトランスジェニック非ヒト動物から採取された移植片が同種移植又は異種移植されている非ヒト動物である、ＧＶＨＤの治療剤のスクリーニング方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
非ヒト動物に、ＳＴＡＰ１遺伝子を過剰発現しているトランスジェニック非ヒト動物から採取された移植片が、同種移植又は異種移植されている、移植片対宿主病モデル動物。
【請求項２】
前記移植片が骨髄液であり、
前記移植片対宿主病モデル動物の造血幹細胞が、前記トランスジェニック非ヒト動物に由来する造血幹細胞のみである、請求項１に記載の移植片対宿主病モデル動物。
【請求項３】
前記移植片が、Ｔリンパ球及びＢリンパ球が除去されている、請求項１又は２に記載の移植片対宿主病モデル動物。
【請求項４】
非ヒト動物に、ＳＴＡＰ１遺伝子を過剰発現しているトランスジェニック非ヒト動物から採取された移植片を、同種移植又は異種移植する、移植片対宿主病モデル動物の作製方法。
【請求項５】
前記移植片が骨髄液であり、
前記移植片を移植する前に、前記非ヒト動物の全身に致死量の放射線を照射する、請求項４に記載の移植片対宿主病モデル動物の作製方法。
【請求項６】
前記移植片が、Ｔリンパ球及びＢリンパ球が除去されている、請求項４又は５に記載の移植片対宿主病モデル動物の作製方法。
【請求項７】
移植片対宿主病モデル動物に被験物質を投与し、移植片対宿主病の症状が改善又は消失した場合に、前記被験物質を移植片対宿主病の治療剤の候補物質として選抜し、
前記移植片対宿主病モデル動物は、ＳＴＡＰ１遺伝子及びＳＴＡＰ２遺伝子からなる群より選択される１種以上の遺伝子を過剰発現しているトランスジェニック非ヒト動物から採取された移植片が同種移植又は異種移植されている非ヒト動物である、移植片対宿主病の治療剤のスクリーニング方法。
【請求項８】
前記移植片が骨髄液であり、
前記移植片対宿主病モデル動物の造血幹細胞が、前記トランスジェニック非ヒト動物に由来する造血幹細胞のみである、請求項７に記載の移植片対宿主病の治療剤のスクリーニング方法。
【請求項９】
前記移植片が、Ｔリンパ球及びＢリンパ球が除去されている、請求項７又は８に記載の移植片対宿主病の治療剤のスクリーニング方法。
【請求項１０】
被験物質をＳＴＡＰファミリータンパク質と接触させ、前記被験物質が前記ＳＴＡＰファミリータンパク質と結合した場合に、前記被験物質を移植片対宿主病の治療剤の候補物質として選抜し、
前記ＳＴＡＰファミリータンパク質が、ＳＴＡＰ１又はＳＴＡＰ２である、移植片対宿主病の治療剤のスクリーニング方法。
【請求項１１】
ＳＴＡＰ１とＳＴＡＰ２の少なくとも一方の機能を抑制又は阻害するＳＴＡＰ阻害物質を有効成分とする、医薬用組成物。
【請求項１２】
前記ＳＴＡＰ阻害物質が、ＳＴＡＰ１遺伝子又はＳＴＡＰ２遺伝子の発現を抑制又は阻害する物質である、請求項１１に記載の医薬用組成物。
【請求項１３】
前記ＳＴＡＰ阻害物質が、ＳＴＡＰ１とＳＴＡＰ２の少なくとも一方のタンパク質と結合する物質である、請求項１１に記載の医薬用組成物。
【請求項１４】
移植片対宿主病の予防又は治療のために用いられる、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の医薬用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、移植片対宿主病（graft versus host disease：ＧＶＨＤ）のモデル動物、及びＧＶＨＤの治療剤をスクリーニングする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
造血幹細胞（hematopoietic progenitor cell；ＨＳＣ）移植は、血液疾患の治癒を望める治療法であり、移植する幹細胞の種類・適応疾患・移植法は多様化してきている。現在、造血幹細胞移植は、非血縁者間骨髄移植が１０００症例以上の認定施設で行われている。ＧＶＨＤは、移植後、特に同種移植後に特有の合併症であり、ドナー由来リンパ球がレシピエントの正常臓器を異物とみなして攻撃することによって起こる。ＧＶＨＤの標準治療は、カルシニューリン阻害剤であるcyclosporin又はtaclorimusとmethotrexateとの２剤併用療法である。急性／慢性ＧＶＨＤの標準的初期治療薬は、副腎皮質ステロイドであり、２次治療薬としてＡＴＧ（抗胸腺細胞グロブリン）、ＭＭＦ（mycophenolate mofeti）、抗ＴＮＦ抗体、ＭＳＣ（間葉系幹細胞）、及びステロイドパルスなどが挙げられる。しかし、これらの医薬による治療法は、日本では未承認である場合が多い。このため、現在においても、ＧＶＨＤは、造血幹細胞移植に伴う死亡や患者生活レベル低下の主な原因である。 
【０００３】
一方で、ＳＴＡＰ（Signal transducing adaptor protein ）ファミリーは、ＰＨ（Pleckstrin homology）ドメインとＳＨ２（Src homology 2）ドメインを持つアダプタータンパク質である。ＳＴＡＰファミリーは、ＳＴＡＰ１とＳＴＡＰ２が存在する。生体内におけるＳＴＡＰファミリーの機能は未だ明らかになっていないが、他のアダプタータンパク質と同様に、様々なシグナル伝達経路に関与していると推定されている。例えばＳＴＡＰ２は、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）や急性リンパ性白血病の原因タンパク質であるＢｃｒ−ＡＢＬに結合すること、ヒトＣＭＬ細胞株Ｋ５６２においてＳＴＡＰ２遺伝子の発現を低下させることにより、細胞増殖が抑制され、かつ抗癌剤に対する感受性が亢進したことが報告されている（例えば、非特許文献１参照。）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Sekine，et al.，Oncogene，2012，vol.31，p.4384-4396.
【非特許文献２】Cooke et al.，Blood，1996，Vol.8(8)，p.3230-3239.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、ＧＶＨＤの治療剤開発や病態解析に有用なＧＶＨＤモデル動物、及びＧＶＨＤの治療剤の候補化合物のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、ＳＴＡＰ１及びＳＴＡＰ２を過剰発現させたトランスジェニックマウスの骨髄液を別系統のマウスに移植することにより、当該トランスジェニックマウスと同種の野生型マウスの骨髄液を移植した場合よりも、より重篤なＧＶＨＤ症状が観察されることを見出し、本発明を完成させた。
【０００７】
すなわち、本発明は、以下のＧＶＨＤモデル動物、ＧＶＨＤモデル動物の作製方法、ＧＶＨＤの治療剤のスクリーニング方法、及び医薬用組成物を提供するものである。
［１］  非ヒト動物に、ＳＴＡＰ１遺伝子を過剰発現しているトランスジェニック非ヒト動物から採取された移植片が、同種移植又は異種移植されている、ＧＶＨＤモデル動物。
［２］  前記移植片が骨髄液であり、
前記ＧＶＨＤモデル動物の造血幹細胞が、前記トランスジェニック非ヒト動物に由来する造血幹細胞のみである、前記［１］のＧＶＨＤモデル動物。
［３］  前記移植片が、Ｔリンパ球及びＢリンパ球が除去されている、前記［１］又は［２］のＧＶＨＤモデル動物。
［４］  非ヒト動物に、ＳＴＡＰ１遺伝子を過剰発現しているトランスジェニック非ヒト動物から採取された移植片を、同種移植又は異種移植する、ＧＶＨＤモデル動物の作製方法。
［５］  前記移植片が骨髄液であり、
前記移植片を移植する前に、前記非ヒト動物の全身に致死量の放射線を照射する、前記［４］のＧＶＨＤモデル動物の作製方法。
［６］  前記移植片が、Ｔリンパ球及びＢリンパ球が除去されている、前記［４］又は［５］のＧＶＨＤモデル動物の作製方法。
［７］  ＧＶＨＤモデル動物に被験物質を投与し、ＧＶＨＤの症状が改善又は消失した場合に、前記被験物質をＧＶＨＤの治療剤の候補物質として選抜し、
前記ＧＶＨＤモデル動物は、ＳＴＡＰ１遺伝子及びＳＴＡＰ２遺伝子からなる群より選択される１種以上の遺伝子を過剰発現しているトランスジェニック非ヒト動物から採取された移植片が同種移植又は異種移植されている非ヒト動物である、ＧＶＨＤの治療剤のスクリーニング方法。
［８］  前記移植片が骨髄液であり、
前記ＧＶＨＤモデル動物の造血幹細胞が、前記トランスジェニック非ヒト動物に由来する造血幹細胞のみである、前記［７］のＧＶＨＤの治療剤のスクリーニング方法。
［９］  前記移植片が、Ｔリンパ球及びＢリンパ球が除去されている、前記［７］又は［８］のＧＶＨＤの治療剤のスクリーニング方法。
［１０］  被験物質をＳＴＡＰファミリータンパク質と接触させ、前記被験物質が前記ＳＴＡＰファミリータンパク質と結合した場合に、前記被験物質をＧＶＨＤの治療剤の候補物質として選抜し、
前記ＳＴＡＰファミリータンパク質が、ＳＴＡＰ１又はＳＴＡＰ２である、ＧＶＨＤの治療剤のスクリーニング方法。
［１１］  ＳＴＡＰ１とＳＴＡＰ２の少なくとも一方の機能を抑制又は阻害するＳＴＡＰ阻害物質を有効成分とする、医薬用組成物。
［１２］  前記ＳＴＡＰ阻害物質が、ＳＴＡＰ１遺伝子又はＳＴＡＰ２遺伝子の発現を抑制又は阻害する物質である、前記［１１］の医薬用組成物。
［１３］  前記ＳＴＡＰ阻害物質が、ＳＴＡＰ１とＳＴＡＰ２の少なくとも一方のタンパク質と結合する物質である、前記［１１］の医薬用組成物。
［１４］  ＧＶＨＤの予防又は治療のために用いられる、前記［１１］〜［１３］のいずれかの医薬用組成物。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、ＧＶＨＤの症状を備えるＧＶＨＤモデル動物が得らえる。当該モデル動物は、ＧＶＨＤの治療剤開発や病態解析に有用である。
また、本発明により、ＧＶＨＤの予防又は治療のための医薬品の有効成分となり得る候補物質をスクリーニングすることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】実施例１において、各群のマウスの移植後の体重変化を示した図である。
【図２】実施例１において、各群のマウスの移植後のＧＶＨＤの総合スコアを示した図である。
【図３Ａ】実施例１において、移植後６０日目の野生型コントロール群とＳＴＡＰ２−Ｔｇドナー群の大腸腸管のＨＥ染色像である。
【図３Ｂ】実施例１において、移植後９０日目の野生型コントロール群とＳＴＡＰ１−Ｔｇドナー群の大腸腸管のＨＥ染色像である。
【図４Ａ】実施例１において、移植後６０日目の野生型コントロール群とＳＴＡＰ２−Ｔｇドナー群の胸腺のＨＥ染色像である。
【図４Ｂ】実施例１において、移植後９０日目の野生型コントロール群とＳＴＡＰ１−Ｔｇドナー群の胸腺のＨＥ染色像である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
＜ＧＶＨＤモデル動物＞
本発明に係るＧＶＨＤモデル動物は、ＳＴＡＰ１遺伝子を過剰発現しているトランスジェニック非ヒト動物（以下、「ＳＴＡＰ１発現Ｔｇ動物」ということがある。）から採取された移植片が、同種移植又は異種移植されている非ヒト動物である。つまり、ＧＶＨＤモデル動物の製造において、ＳＴＡＰ１発現Ｔｇ動物がドナー動物であり、ＳＴＡＰ１発現Ｔｇ動物から採取された移植片が移植される非ヒト動物が、レシピエント動物である。移植片中に含まれているドナーの免疫細胞がＳＴＡＰ１遺伝子を過剰発現していると、移植後のレシピエントはＧＶＨＤを発症する。この発症確率は、野生型の免疫細胞が含まれている移植片を移植した場合よりも有意に高く、ほぼ確実に（例えば、９０％以上の発症率で）ＧＶＨＤは発症する。また、本発明に係るＧＶＨＤモデル動物のＧＶＨＤの症状は、野生型の免疫細胞が含まれている移植片を移植した場合よりもより重症な傾向にある。
【００１１】
ＳＴＡＰ１発現Ｔｇ動物は、ＳＴＡＰ１遺伝子をコードする領域を含むＤＮＡを、ＳＴＡＰ１が発現可能な状態でレシピエント動物のゲノムに導入することにより得られる。レシピエント動物のゲノムに導入するＤＮＡに含まれているＳＴＡＰ１遺伝子は、レシピエント動物が本来もっている天然型のＳＴＡＰ１遺伝子であってもよく、レシピエント動物とは異なる生物種の生物の野生型が保有しているＳＴＡＰ１遺伝子であってもよい。また、ＳＴＡＰ１の機能を有する改変体であってもよい。当該改変体としては、例えば、天然型のＳＴＡＰ１遺伝子の１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失、又は挿入された変異体をコードする遺伝子や、天然型のＳＴＡＰ１遺伝子又はその変異体がコードするＳＴＡＰ１のＮ末端若しくはＣ末端がペプチドで修飾された修飾体や他のタンパク質と融合したキメラ体をコードする遺伝子等が挙げられる。当該他のタンパク質としては、例えば、蛍光タンパク質が挙げられる。
【００１２】
ＳＴＡＰ１遺伝子をコードする領域を含むＤＮＡのゲノムへの挿入は、トランスジェニック動物の作製において使用されている遺伝子改変技術を利用して行うことができる。例えば、ＤＮＡを受精卵前核に直接注入する方法、レトロウイルスを利用する方法、トランスポゾンを利用する方法等によって、ＳＴＡＰ１遺伝子をコードする領域を含むＤＮＡがゲノム中のランダムな位置に挿入されたトランスジェニック非ヒト動物を作製することができる。また、相同組み換え法やゲノム編集等を利用することにより、ＳＴＡＰ１遺伝子をコードする領域を含むＤＮＡがゲノム中の特定の位置に挿入されたトランスジェニック非ヒト動物を作製することができる。相同組み換え法とは、ゲノム上の外来遺伝子を導入したい目的の領域の上流及び下流と相同な塩基配列で挟んだＤＮＡ断片を用い、相同組換えを利用する方法である。これらの方法は、常法により行うことができる。例えば、ゲノム編集のためのヌクレアーゼとしては、ＺＦＮ（Zinc-Finger Nuclease）、ＴＡＬＥＮ（Transcription Activator-Like Effector Nuclease）、CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）／Ｃａｓ９（Crispr Associated protein 9）等がある。
【００１３】
当該ＳＴＡＰ１発現Ｔｇ動物は、免疫細胞及びその前駆細胞においてＳＴＡＰ１遺伝子が過剰発現していればよい。このため、当該ＳＴＡＰ１発現Ｔｇ動物は、全身の細胞でＳＴＡＰ１遺伝子が過剰発現していてもよく、免疫細胞及びその前駆細胞においてのみＳＴＡＰ１遺伝子が過剰発現していてもよい。
【００１４】
なお、免疫細胞とは、免疫に関与する細胞である。具体的には、リンパ球、マクロファージ、樹状細胞などが挙げられる。リンパ球には、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、形質細胞等がある。また、免疫細胞の前駆細胞とは、造血幹細胞に加えて、造血幹細胞から各免疫細胞へ成熟する過程の全ての細胞を含む。
【００１５】
本発明に係るＧＶＨＤモデル動物の作製のために使用される移植片は、いずれの組織から採取されたものであってもよい。当該移植片としては、例えば、骨髄液、リンパ液、腹水、血液のような細胞を含む液であってもよく、心臓、肺、肝臓、膵臓、腎臓、小腸、大腸、皮膚、角膜等の固形の組織又はその一部であってもよい。ＳＴＡＰ１発現Ｔｇ動物から採取された移植片は、移植される前に、各種の前処理を行ってもよい。当該前処理としては、洗浄処理や、不要な生体成分の除去処理等が挙げられる。例えば、骨髄液を移植片とする場合、リンパ球、特にＴリンパ球及びＢリンパ球を予め除去する処理を行っておくことにより、劇症の急性ＧＶＨＤの発症を抑え、比較的長期間ＧＶＨＤの症状が観察できるＧＶＨＤモデル動物を作製できる。
【００１６】
ＳＴＡＰ１発現Ｔｇ動物は、作製される目的のＧＶＨＤモデル動物と同種の非ヒト動物であってもよく、異種の非ヒト動物であってもよい。ただし、ＧＶＨＤ発症のために、ＳＴＡＰ１発現Ｔｇ動物は、作製される目的のＧＶＨＤモデル動物とは免疫的に異なる動物である。これらの非ヒト動物の動物種は、ヒト以外であれば特に限定されるものではなく、例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等の哺乳動物や、ニワトリ、ウズラ、カモ等の鳥類等が挙げられる。なかでも、実験動物として汎用されていることから、げっ歯類が好ましく、マウス又はラットがより好ましい。
【００１７】
本発明に係るＧＶＨＤモデル動物は、レシピエントである非ヒト動物に、ＳＴＡＰ１発現Ｔｇ動物から採取された移植片を、同種移植又は異種移植することにより作製できる。移植片は、当該移植片の由来する組織と同じ組織に移植してもよく（同所移植）、異なる組織に移植してもよい（異所移植）。移植片の移植方法は特に限定されるものではなく、一般的な移植方法で行うことができる。
【００１８】
本発明に係るＧＶＨＤモデル動物を製造するに際し、移植片が移植される前のレシピエント動物は、免疫機能を低下させる前処置を行っておくことが好ましい。移植前に免疫機能を低下させておくことにより、移植後の拒絶反応を抑制し、移植片の生着効率を高め、ＧＶＤＨモデル動物の作製効率を高めることができる。免疫機能を低下させる前処置としては、放射線照射処理、抗がん剤等の免疫抑制作用を備える薬剤の投与処理等が挙げられる。放射線処理の場合、レシピエント動物の全身に放射線を照射してもよく、一部にのみ照射してもよい。また、照射する放射線量は、致死量線量が好ましい。例えば、移植片を移植する前に、レシピエント動物の全身に致死量の放射線を照射しておくことにより、ドナー（ＳＴＡＰ１発現Ｔｇ動物）から採取された骨髄液を移植することで、造血幹細胞がＳＴＡＰ１発現Ｔｇ動物に由来する造血幹細胞のみであるＧＶＨＤモデル動物が作製できる。なお、致死量線量は、「照射後、骨髄液移植等の処置を行わない状態では、死亡率が１００％となる線量」である。致死量線量は動物種によって異なり、実験的に求められる。
【００１９】
本発明に係るＧＶＨＤモデル動物は、ヒトにおけるＧＶＨＤと同様の病理学的所見及び症状が観察される。本発明に係るＧＶＨＤモデル動物では、ＳＴＡＰファミリータンパク質が過剰発現されていないドナー動物から採取された移植片を移植した以外は同様にして製造された非ヒト動物よりも、より重篤なＧＶＨＤ症状が観察される。このため、本発明に係るＧＶＨＤモデル動物は、ＧＶＨＤの機能解析や、ＧＶＨＤの治療剤の候補物質のスクリーニングや薬効評価等に有用である。
【００２０】
例えば、急性ＧＶＨＤの場合、本発明に係るＧＶＨＤモデル動物では、斑丘疹状の皮疹、嘔気、嘔吐、るいそう、食欲不振、水様下痢、腹痛、黄疸、イレウス、胆汁うっ滞性肝炎等が観察される。慢性ＧＶＨＤの場合、口内炎、肝機能障害、皮膚の硬化病変、消化器症状 角結膜炎、骨髄抑制等が観察される。例えば、本発明に係るＧＶＨＤモデル動物のＧＶＨＤの重症度は、ヒトのＧＶＨＤの診断と同様にして鑑別できる。なお、本発明に係るＧＶＨＤモデル動物は、作製に用いたレシピエント動物と同様に、通常の飼育方法で飼育することができる。
【００２１】
なお、ＳＴＡＰ１遺伝子のみならず、ＳＴＡＰ２遺伝子も過剰発現しているトランスジェニック非ヒト動物（以下、「ＳＴＡＰ１／ＳＴＡＰ２発現Ｔｇ動物」ということがある。）から採取された移植片を、レシピエントである非ヒト動物に同種移植又は異種移植した場合にも、前述の本発明に係るＧＶＨＤモデル動物（ＳＴＡＰ１発現Ｔｇ動物由来の移植片が移植されたＧＶＨＤモデル動物）と同様に、ＧＶＨＤの病理学的所見及び症状が観察されるＧＶＨＤモデル動物を作製することもできる。また、ＳＴＡＰ１遺伝子に代えてＳＴＡＰ２遺伝子を過剰発現しているトランスジェニック非ヒト動物（以下、「ＳＴＡＰ２発現Ｔｇ動物」ということがある。）から採取された移植片を、レシピエントである非ヒト動物に同種移植又は異種移植することによっても、ＧＶＨＤの病理学的所見及び症状が観察されるＧＶＨＤモデル動物を作製することもできる。ＳＴＡＰ１／ＳＴＡＰ２発現Ｔｇ動物由来の移植片が移植されたＧＶＨＤモデル動物や、ＳＴＡＰ２発現Ｔｇ動物由来の移植片が移植されたＧＶＨＤモデル動物は、ＳＴＡＰ１発現Ｔｇ動物由来の移植片が移植されたＧＶＨＤモデル動物と同様にして作製することができる。
【００２２】
＜ＧＶＨＤモデル動物を用いたＧＶＨＤの治療剤のスクリーニング方法＞
ＧＶＨＤモデル動物に被験物質を投与し、ＧＶＨＤの症状が改善又は消失した場合には、当該被験物質は、ＧＶＨＤの治療効果を有すると評価できる。そこで、当該被験物質をＧＶＨＤの治療剤の候補物質として選抜することによって、ＧＶＨＤの治療剤をスクリーニングすることができる。ＧＶＨＤモデル動物のＧＶＨＤの症状が改善したかどうかや消失したかどうかは、ヒトのＧＶＨＤの症状の重症度判断基準を利用して判断することができる。
【００２３】
当該スクリーニング方法に使用されるＧＶＨＤモデル動物としては、ＳＴＡＰ１発現Ｔｇ動物由来の移植片が移植されたＧＶＨＤモデル動物、ＳＴＡＰ１／ＳＴＡＰ２発現Ｔｇ動物由来の移植片が移植されたＧＶＨＤモデル動物、又はＳＴＡＰ２発現Ｔｇ動物由来の移植片が移植されたＧＶＨＤモデル動物が好ましい。これらのＳＴＡＰファミリーが過剰発現している免疫細胞及びその前駆細胞を含む移植片を同種移植又は異種移植して作製されたＧＶＨＤモデル動物は、ＳＴＡＰファミリーが過剰発現していない免疫細胞を含む移植片を移植して作製された非ヒト動物よりも、観察されるＤＶＨＤの症状は比較的重篤であるため、被験物質のＧＶＨＤの治療効果をより評価しやすい。
【００２４】
被験物質としては、特に限定されるものではなく、例えば、核酸であってもよく、ペプチドであってもよく、タンパク質であってもよく、低分子化合物であってもよい。
【００２５】
被験物質のＧＶＨＤモデル動物への投与方法は、特に限定されるものではなく、経口投与であってもよく、静脈投与、腹腔内投与、皮下投与等の非経口投与であってもよい。これらの投与は常法により行うことができる。
【００２６】
＜ＳＴＡＰファミリータンパク質を用いたＧＶＨＤの治療剤のスクリーニング方法＞
後期実施例に示すように、ＳＴＡＰ１遺伝子のノックアウト動物又はＳＴＡＰ２遺伝子のノックアウト動物に由来する移植片を同種移植又は異種移植した場合には、ＧＶＨＤが生じない。つまり、移植片中の免疫細胞及びその前駆細胞におけるＳＴＡＰファミリータンパク質の機能を低下又は阻害することにより、ＧＶＨＤの発症を抑制できる。
【００２７】
一般的に、タンパク質の機能は、当該タンパク質に他の分子が結合することにより、当該タンパク質と本来のパートナー分子との相互作用が阻害される結果、低下又は阻害される。すなわち、ＳＴＡＰファミリータンパク質と結合する分子の中には、ＳＴＡＰファミリータンパク質の機能を阻害することにより、ＧＶＨＤの発症を抑制できるものがある。このため、被験物質のＳＴＡＰファミリータンパク質との結合能を指標として、ＧＶＨＤの治療剤をスクリーニングすることができる。
【００２８】
具体的には、被験物質をＳＴＡＰファミリータンパク質と接触させ、当該被験物質が前記ＳＴＡＰファミリータンパク質と結合した場合に、当該被験物質をＧＶＨＤの治療剤の候補物質として選抜することで、ＧＶＨＤの治療剤のスクリーニングを行うことができる。当該ＳＴＡＰファミリータンパク質としては、ＳＴＡＰ１であってもよく、ＳＴＡＰ２であってもよい。
【００２９】
被験物質とＳＴＡＰファミリータンパク質とを接触させる方法は特に限定されるものではない。例えば、精製した又は粗精製したＳＴＡＰファミリータンパク質と被験物質とを適当な溶媒に共に混合した反応液を調製し、当該反応液から両者の結合体を各種の方法で検出することができる。当該方法の場合、予めＳＴＡＰファミリータンパク質にペプチドタグを付加しておき、当該ペプチドタグに対する抗体を利用した免疫沈降法を利用して被験物質とＳＴＡＰファミリータンパク質との結合の有無を調べることができる。ペプチドタグに代えてビオチンを用い、アビジン又はストレプトアビジンで修飾されたビーズを用いることにより、ＳＴＡＰファミリータンパク質と結合した被験物質を回収することができる。
【００３０】
＜医薬用組成物＞
本発明に係る医薬用組成物は、ＳＴＡＰ１とＳＴＡＰ２の少なくとも一方の機能を抑制又は阻害するＳＴＡＰ阻害物質を有効成分とする。移植片中の免疫細胞及びその前駆細胞におけるＳＴＡＰファミリータンパク質の機能を低下又は阻害することにより、ＧＶＨＤの発症を抑制できることから、ＳＴＡＰ阻害物質は、ＧＶＨＤの予防又は治療のために用いられる医薬用組成物の有効成分となる。ＳＴＡＰ阻害物質としては、ＳＴＡＰ１の機能を抑制又は阻害する物質であってもよく、ＳＴＡＰ２の機能を抑制又は阻害する物質であってもよく、ＳＴＡＰ１とＳＴＡＰ２の両方の機能を抑制又は阻害する物質であってもよい。ＳＴＡＰ欠損マウス自身では大きな異常が認められないことから、ＳＴＡＰ阻害物質の副作用は軽微であることが予想される。
【００３１】
ＳＴＡＰ阻害物質としては、ＳＴＡＰ１遺伝子又はＳＴＡＰ２遺伝子の発現を抑制又は阻害する物質であってもよい。当該物質としては、ＳＴＡＰ１遺伝子又はＳＴＡＰ２遺伝子のｃＤＮＡの部分領域のアンチセンス鎖や、ＲＮＡ干渉を引き起こす核酸等が挙げられる。ＲＮＡ干渉を引き起こす核酸としては、具体的には、ＳＴＡＰ１遺伝子又はＳＴＡＰ２遺伝子のｃＤＮＡの部分領域（ＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）標的領域）のセンス鎖とアンチセンス鎖からなる二本鎖構造を有するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はｍｉＲＮＡが挙げられる。
【００３２】
ＳＴＡＰ阻害物質としては、ＳＴＡＰ１とＳＴＡＰ２の少なくとも一方のタンパク質と結合する物質であってもよい。当該物質としては、核酸、ペプチド、タンパク質、脂質、糖質、低分子化合物、又はこれらの複合物質等のいずれであってもよい。ＳＴＡＰ１又はＳＴＡＰ２と結合する核酸、ペプチド、低分子化合物は、例えば、核酸、ペプチド、低分子化合物等のライブラリーに対して、ＳＴＡＰ１又はＳＴＡＰ２の全長タンパク質又は部分タンパク質と結合する物質をスクリーニングすることによって取得できる。スクリーニングを行う核酸、ペプチド、低分子化合物等のライブラリーは、公知の様々なライブラリーを用いることができる。例えば核酸やペプチドの場合には、ＳＥＬＥＸ法を用いることによって、ＳＴＡＰ１又はＳＴＡＰ２と特異的に結合するアプタマーを取得できる。
【００３３】
ＧＶＨＤは、ドナーリンパ球による免疫応答を介して、宿主臓器へのリンパ球浸潤や炎症反応が病的背景である。このため、ＳＴＡＰ１とＳＴＡＰ２の少なくとも一方の機能を抑制又は阻害することにより、免疫応答や炎症反応をも抑制することができる。すなわち、ＳＴＡＰ阻害物質は、免疫抑制剤や抗炎症剤としても応用できる。
【実施例】
【００３４】
次に実施例等を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
なお、以降の動物実験は、北海道大学の動物実験倫理委員会の承認のもと、北海道大学動物実験に関する規定に従い行った。
【００３５】
［実施例１］
ＧＶＨＤモデル動物を作製し、ＧＶＨＤの症状等を評価した。
【００３６】
＜ＳＴＡＰ１発現Ｔｇマウスの作製＞
Ｃ５７ＢＬ／６マウスのゲノム中、Ｌｃｋ及びＥμエンハンサーの下流に、マウスＳＴＡＰ１遺伝子を組み込み、ＳＴＡＰ１遺伝子を過剰発現するＳＴＡＰ１発現Ｔｇマウスを作製した（日本エスエルシー社により作製）。ＳＴＡＰ１発現Ｔｇマウスは、Ｌｃｋ及びＥμエンハンサー遺伝子を上流に組み込んだヒトＳＴＡＰ１遺伝子断片を含む発現用プラスミドをマウス受精卵にマイクロインジェクションした後、仮親の卵管内に移植し、自然分娩により得られたマウスのゲノムを解析し、ＳＴＡＰ１遺伝子が目的のゲノム領域に組み込まれた個体を、ＳＴＡＰ１発現Ｔｇマウスとして選抜した。
【００３７】
作製されたＳＴＡＰ１発現Ｔｇマウスについて、造血幹細胞から成熟したリンパ球までの各成熟段階における細胞について、ＰＣＲ法によりＳＴＡＰ１の発現量等を調べた。この結果、ＳＴＡＰ１発現Ｔｇマウスでは、ＳＴＡＰ１発現は、共通リンパ球前駆細胞段階から増強していることが確認された。
【００３８】
＜ＳＴＡＰ２発現Ｔｇマウスの作製＞
Ｃ５７ＢＬ／６マウスのゲノム中、Ｌｃｋ及びＥμエンハンサーの下流に、ヒトＳＴＡＰ２遺伝子を組み込み、ＳＴＡＰ２遺伝子を過剰発現するＳＴＡＰ２発現Ｔｇマウスを作製した（日本エスエルシー社により作製）。ＳＴＡＰ２発現Ｔｇマウスは、遺伝子断片にヒトＳＴＡＰ２遺伝子を組み込んだ以外は、ＳＴＡＰ１発現Ｔｇマウスと同様にして作製した。
【００３９】
作製されたＳＴＡＰ２発現Ｔｇマウスについて、造血幹細胞から成熟したリンパ球までの各成熟段階における細胞について、ＰＣＲ法によりＳＴＡＰ２の発現量等を調べた。この結果、ＳＴＡＰ２発現Ｔｇマウスでは、ＳＴＡＰ２発現は、共通リンパ球前駆細胞段階から増強していることが確認された。
【００４０】
＜ＳＴＡＰ１ＫＯマウスの作製＞
Ｃ５７ＢＬ／６マウスのゲノム中のＳＴＡＰ１遺伝子領域を切り出し、ＳＴＡＰ１遺伝子をノックアウトしたＳＴＡＰ１ＫＯマウスを作製した。
ＳＴＡＰ１ＫＯマウスは、ゲノム上のＳＴＡＰ１遺伝子領域又はその一部に、ネオマイシン耐性遺伝子を組み込むための相同組換え用断片を含む発現用ベクターを用いた相同組換え法により作製した。まず、線状にした発現用ベクターをエレクトロポレーションによりマウスＥＳ細胞に導入した後、抗生物質Ｇ４１８とジフテリア毒素の存在下で培養し、薬剤耐性クローンを選抜した。この選抜された薬剤耐性クローンのうち、ゲノムを解析して目的の相同組換えがなされたことが確認されたクローンを、マウスの胚盤胞に注入し、これを擬制妊娠させた仮親に移植してキメラマウスを得た。このキメラマウスを戻し交配を繰り返して、ホモ接合型のＳＴＡＰ１ＫＯマウスを得た。
【００４１】
作製されたＳＴＡＰ１ＫＯマウスについて、造血幹細胞から成熟したリンパ球までの各成熟段階における細胞について、ＰＣＲ法によりＳＴＡＰ１の発現を調べた。この結果、ＳＴＡＰ１ＫＯマウスでは、ＳＴＡＰ１は発現していないことが確認された。
【００４２】
＜ＳＴＡＰ２ＫＯマウスの作製＞
Ｃ５７ＢＬ／６マウスのゲノム中のＳＴＡＰ２遺伝子領域を切り出し、ＳＴＡＰ２遺伝子をノックアウトしたＳＴＡＰ２ＫＯマウスを作製した。
ＳＴＡＰ２ＫＯマウスは、ゲノム上のＳＴＡＰ２遺伝子領域又はその一部にネオマイシン耐性遺伝子を組み込むための相同組換え用断片を用いた以外は、ＳＴＡＰ１ＫＯマウスと同様にして作製した。
【００４３】
作製されたＳＴＡＰ２ＫＯマウスについて、造血幹細胞から成熟したリンパ球までの各成熟段階における細胞について、ＰＣＲ法によりＳＴＡＰ２の発現を調べた。この結果、ＳＴＡＰ２ＫＯマウスでは、ＳＴＡＰ２は発現していないことが確認された。
【００４４】
＜ＧＶＨＤモデル動物の作製＞
移植片（ドナー細胞）としてＣ５７ＢＬ/６マウス由来血球細胞を用い、レシピエントとしてＢＡＬＢ／Ｃマウスを用いてＧＶＨＤモデル動物を作製した。
【００４５】
具体的には、まず、野生型Ｃ５７ＢＬ/６マウスの大腿骨及び脛骨から、骨髄液を採取した。この骨髄液から、ＭＡＣＳ（Magnetic cell sorting）を用いた磁気細胞分離法を利用したネガティブ・セレクション法を行い、Ｔリンパ球及びＢリンパ球を除去した。リンパ球除去骨髄液を、個体あたり５×１０６個の細胞が投与されるように、ＢＡＬＢ／Ｃマウスに尾静脈から輸注した。当該ＢＡＬＢ／Ｃマウスは、致死量の放射線を全身照射した後に、リンパ球除去骨髄液を静注した。
【００４６】
野生型Ｃ５７ＢＬ/６マウスに代えて、ＳＴＡＰ１発現Ｔｇマウス、ＳＴＡＰ２発現Ｔｇマウス、ＳＴＡＰ１ＫＯマウス、ＳＴＡＰ２ＫＯマウス、及びＢＡＬＢ／Ｃマウスからも同様にして骨髄液を採取し、Ｔリンパ球及びＢリンパ球を除去して得られたリンパ球除去骨髄液を、ＢＡＬＢ／Ｃマウスに尾静脈から輸注した。
【００４７】
＜ＧＶＨＤモデル動物の評価＞
リンパ球除去骨髄液の輸注日を移植後０日目とし、移植後９０日までの生存の有無、及びＧＶＨＤ症状の評価を経時的に行った。ＧＶＨＤ症状の評価は非特許文献２に記載の評価基準に準じて行った。具体的には、下記表１に示す。これらの基準に基づいてスコア化し、総合的な重症度を測定した。
【００４８】
【表１】
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【００４９】
また、各マウスについて、腸炎症状についても、下痢と下血の有無により重症度をグレード０〜４で評価した。皮膚炎症状についても、表皮及び真皮における組織ダメージと皮下脂肪の損失に基づいて１０段階で重症度を評価した。さらに、組織病理学的検討も行った。
【００５０】
図１に、各マウスの移植後の体重変化を示す。移植時の体重を１００％とした。また、図２に、各マウスのＧＶＨＤの総合スコアを示す。図中、「Ｂａｌｂ」はＢＡＬＢ／Ｃマウスの骨髄液を移植したマウス（同系移植群）、「ＷＴ」は野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスの骨髄液を移植したマウス（野生型コントロール群）、「Ｓ１Ｔｇ」はＳＴＡＰ１発現Ｔｇマウスの骨髄液を移植したマウス（ＳＴＡＰ１−Ｔｇドナー群）、「Ｓ２Ｔｇ」はＳＴＡＰ２発現Ｔｇマウスの骨髄液を移植したマウス（ＳＴＡＰ２−Ｔｇドナー群）、「Ｓ１ＫＯ」はＳＴＡＰ１ＫＯマウスの骨髄液を移植したマウス（ＳＴＡＰ１−ＫＯドナー群）、「Ｓ２ＫＯ」はＳＴＡＰ２ＫＯマウスの骨髄液を移植したマウス（ＳＴＡＰ２−ＫＯドナー群）、のそれぞれの結果を示す。
【００５１】
本実施例では、移植片としてリンパ球除去骨髄液を用いた。このため、いずれのマウスでも、移植後急性期に強い免疫応答は認めなかった。同系移植群では、放射線照射による一過性の体重減少が出現した後、体重は徐々に回復した。野生型コントロール群では、移植後３０日頃より体重はやや低下し、同種免疫応答が起きていることが示唆された。ただし、明らかな腸炎や皮膚炎と行ったＧＶＨＤ症状は認めなかった。
【００５２】
ＳＴＡＰ２−Ｔｇドナー群では、移植後３０日頃より腸炎・皮膚炎を伴う体重減少が出現した。野生型コントロール群ではこの体重減少からほぼ全例が生存した（９１．７％）のに対して、ＳＴＡＰ２−Ｔｇドナー群の場合は、移植後６０日目の生存率は２２．２％に低下した。ＳＴＡＰ２−Ｔｇドナー群では、移植後の体重減少率（図１）とＧＶＨＤスコア（図２）の両方とも、有意に悪化した。また、移植後６０日目の皮膚慢性ＧＶＨＤスコアは、野生型コントロール群では０．０であったのに対して、ＳＴＡＰ２−Ｔｇドナー群では２．４であり、悪化することが明らかになった。
【００５３】
ＳＴＡＰ１−Ｔｇドナー群では、生存率は野生型コントロール群と同等であったが、ＧＶＨＤ症状を示す指標は、いずれも統計学的有意差を持って増悪することが分かった。一方で、ＳＴＡＰ１−ＫＯドナー群及びＳＴＡＰ２−ＫＯドナー群では、両方ともに、野生型コントロール群に比してＧＶＨＤ症状は改善した（図１、図２）。すなわち、ＳＴＡＰ１−ＫＯドナー群及びＳＴＡＰ２−ＫＯドナー群では、体重の減少もほとんどなく、ＧＶＨＤ症状も軽症化していた。ＳＴＡＰ１−ＫＯドナー群及びＳＴＡＰ２−ＫＯドナー群における造血幹細胞移植後のＧＶＨＤ発症が限定的であり、生存率も高かった。このことは、ＳＴＡＰの発現や機能を抑制することで、ＧＶＨＤの予防や治療に繋がることを意味する。
【００５４】
移植後６０日及び９０日の時点で、移植マウスから各臓器を回収し、ＨＥ染色による病理学的検討を行った。ＳＴＡＰ２−Ｔｇドナー群及びＳＴＡＰ１−Ｔｇドナー群では、観察所見と一致して、皮膚、腸管組織はリンパ球浸潤を伴う炎症所見を示し、ＧＶＨＤを発症していることが確認された。図３Ａに、移植後６０日目の野生型コントロール群とＳＴＡＰ２−Ｔｇドナー群の大腸腸管のＨＥ染色像を示す。図３Ｂに、移植後９０日目の野生型コントロール群とＳＴＡＰ１−Ｔｇドナー群の大腸腸管のＨＥ染色像を示す。野生型コントロール群と比較して、ＳＴＡＰ２−Ｔｇドナー群及びＳＴＡＰ１−Ｔｇドナー群では、重症のＧＶＨＤ腸炎に罹患していた。
【００５５】
また、図４Ａには、移植後６０日目の野生型コントロール群とＳＴＡＰ２−Ｔｇドナー群の胸腺のＨＥ染色像を示す。野生型コントロール群と比較して、ＳＴＡＰ２−Ｔｇドナー群では、胸腺が委縮し、皮髄境界も不明瞭化していた。また、図４Ｂに、移植後９０日目の野生型コントロール群とＳＴＡＰ１−Ｔｇドナー群の胸腺のＨＥ染色像を示す。野生型コントロール群と比較して、ＳＴＡＰ１−Ｔｇドナー群では、胸腺の萎縮が強く、胸腺組織の観察が困難であった。
【００５６】
ＳＴＡＰ１−Ｔｇドナー群及びＳＴＡＰ２−Ｔｇドナー群では、胸腺が著明に萎縮していた。胸腺萎縮による制御性Ｔリンパ球回復遅延が、両群におけるＧＶＨＤ増悪の機序として考えられた。そこで、末梢血でのＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞数を、フローサイトメトリーを用いて解析したところ、制御性Ｔリンパ球は、特にＳＴＡＰ２−Ｔｇドナー群の場合に低下することが分かった。移植後６０日での制御性Ｔリンパ球の細胞数は、野生型コントロール群では４４．０／μＬであり、ＳＴＡＰ２−Ｔｇドナー群では１８．２／μＬであった（ｐ＜０．０５）。
【００５７】
これらの結果から、移植後にレシピエント造血器内で再構築されたリンパ球でのＳＴＡＰ１及びＳＴＡＰ２が、同種免疫反応調整に大きな役割を担っていることが明らかになった。
【００５８】
＜血球細胞におけるにＳＴＡＰ１及びＳＴＡＰ２遺伝子発現＞
血球細胞におけるにＳＴＡＰ１及びＳＴＡＰ２遺伝子発現について検討した。健常者由来の骨髄細胞及び末梢血細胞から、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−造血幹細胞（ＨＳＣ）、ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋造血前駆細胞（hematopoietic progenitor cell；ＨＰＣ）、ＣＤ１９＋ＣＤ２７−ｎａｉｖｅ  Ｂ細胞、ＣＤ１９＋ＣＤ２７＋ｍｅｍｏｒｙ  Ｂ細胞、ＣＤ３＋ＣＤ４＋ｈｅｌｐｅｒ  Ｔ細胞、ＣＤ３＋ＣＤ８＋ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ細胞を単離した。ＲＮｅａｓｙ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてＲＮＡを抽出し、Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  （Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）によりｃＤＮＡを合成した。Ｔａｑｍａｎ ｐｒｏｂｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いたｒｅａｌｔｉｍｅ  ＰＣＲ法により、半定量ＰＣＲ実験を行った。
【００５９】
ＳＴＡＰ１遺伝子及びＳＴＡＰ２遺伝子は、ＨＳＣレベルから成熟リンパ球の段階までユビキタスに発現していた。ＳＴＡＰ１遺伝子は、Ｂ細胞で発現が高い傾向を認める。これに対し、ＳＴＡＰ２遺伝子は、Ｔリンパ球系統で発現が上昇していた。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
2020039315.tif 000006
【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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