(57)【要約】【課題】抗ＣＤ２０糖操作抗体群およびその使用の提供。【解決手段】本開示は、Ｆｃのそれぞれに同じＮ−グリカンを有する抗ＣＤ２０ＩｇＧ分子の均一な集団を含む新規クラスの抗ＣＤ２０モノクローナル抗体に関する。本発明の抗体は、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体からＦｃ糖鎖工学によって作製することができる。重要なことに、本発明の抗体は、糖鎖工学により操作されていない対応するモノクローナル抗体と比較してＡＤＣＣ活性が増大し、Ｆｃ受容体結合親和性が増大した、改善された治療的価値を有する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
この出願は、２０１４年５月２７日に出願された米国仮出願連続番号第（ＵＳＳＮ）６２／００３，１３６号、２０１４年７月２日に出願されたＵＳＳＮ  ６２／０２０，１９９号および２０１５年１月３０日に出願されたＵＳＳＮ  ６２／１１０，３３８号への優先権の利益を主張する。これらそれぞれの内容は、それらの全体が参考として本明細書に援用される。
【０００２】
ＣＤ２０に結合する抗体、抗体バリアント、その抗原結合性断片およびコンジュゲート、ならびに関連する組成物および使用方法が本明細書に開示されている。使用方法としては、限定することなく、がん療法および診断が挙げられる。
【背景技術】
【０００３】
免疫グロブリンおよびＦｃ受容体は、免疫系の重要な糖タンパク質成分である。Ｆｃ受容体は、抗体分子のＦｃ（エフェクター）領域に結合し、自然免疫系および適応免疫系内で情報を伝達する。抗体、特にＩｇＧのＦｃ領域におけるグリコシル化は、抗体の活性の調節において重要な役割を果たす。同一の重鎖内のＮ−グリカンは、構造的完全性、Ｆｃ受容体との情報伝達および下流の免疫学的応答を維持するために重要であることが示されている。
【０００４】
Ｆｃグリコシル化は、治療用モノクローナル抗体の分野において重要な主題となっている。Ｆｃグリコシル化により、Ｆｃ受容体結合および補体活性化などのＦｃエフェクター機能を有意に改変する、したがって、治療用抗体のｉｎ  ｖｉｖｏにおける安全性および有効性プロファイルに影響を及ぼすことができる。
【０００５】
遺伝子操作に基づくいくつかの発現系により治療用モノクローナル抗体が産生されることが報告されている。これらとしては、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓなどの酵母、昆虫細胞株、および、さらには細菌が挙げられる。しかし、これらの発現系には、治療用抗体のエフェクター機能に負の影響を及ぼす可能性があるいくつかの欠点がある。
【０００６】
大多数の生物製剤は、所望のグリコシル化パターンを有するタンパク質を送達し、したがって、免疫原性の低下およびより高いｉｎ  ｖｉｖｏにおける有効性および安定性を確実にするために、哺乳動物細胞培養系において産生される。ＣＨＯ細胞またはＮＳ０細胞などの非ヒト哺乳動物発現系は、複雑な、ヒト型グリカンを付加するために必要な機構を有する。しかし、これらの系において産生されるグリカンは、ヒトにおいて産生されるグリカンとは異なる可能性がある。それらのグリコシル化機構により、多くの場合、タンパク質フォールディングを変更させ、免疫原性を誘導し、薬物の循環寿命を短縮させる可能性がある望ましくない炭水化物決定因子が付加される。特に、Ｎ−アセチルノイラミン酸のようなシアル酸は大多数の哺乳動物細胞では効率的に付加されず、これらの細胞では６−結合が欠けている。シアル酸の移行に必要な種々の酵素活性を用いた細胞の工学的操作では、タンパク質薬にヒト様パターンのグリコフォームを成功裏にもたらすことが未だできていない。現在まで、動物細胞または糖タンパク質を工学的に操作してヒトタンパク質と可能な限り密接に類似した、高度にシアリル化された産物をもたらすことが必要とされている。
【０００７】
さらに、哺乳動物の細胞培養では、全てが同じ性質を有するとは限らないグリコシル化パターンの不均一な混合物が送達される。治療用タンパク質の安全性、有効性および血清中半減期のような性質は、これらのグリコシル化パターンの影響を受ける可能性がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本開示は、「糖操作抗体群（ｇｌｙｃｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」という名称の新規クラスのモノクローナル抗体の開発に関する。したがって、本開示の一態様は、Ｆｃのそれぞれに同じＮ−グリカンを有する抗ＣＤ２０ＩｇＧ分子の均一な集団を含む抗ＣＤ２０糖操作抗体群の組成物に関する。本発明の抗ＣＤ２０糖操作抗体群は、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体からＦｃ糖鎖工学によって作製することができる。重要なことに、抗ＣＤ２０糖操作抗体群は、糖鎖工学により操作されていない対応するモノクローナル抗体と比較してＡＤＣＣ活性が増大し、Ｆｃ受容体結合親和性が増大した、改善された治療的価値を有する。さらに、本開示は、単独療法、または実質的に均一な本明細書に記載の糖操作抗体群と他の抗体および／もしくは他の治療剤とを含む併用療法に適した組合せ医薬組成物も提供する。医薬組成物は、共製剤（ｃｏｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）として投与することもでき、共投与（ｃｏ−ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）治療レジメンで使用することもできる。
【０００９】
一実施形態では、Ｎ−グリカンがＦｃ領域のＡｓｎ−２９７に付着している（ＣＨ２ドメイン）。
【００１０】
一部の実施形態では、本明細書に記載の抗ＣＤ２０糖操作抗体（ｇｌｙｃｏａｎｔｉｂｏｄｙ）は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する重鎖、および配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む。好ましい実施形態では、糖操作抗体は、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標））の軽鎖配列および重鎖配列を含む。異なる型の抗ＣＤ２０抗体が２つ存在する（Ｃｒａｇｇ、Ｍ．Ｓ．ら、Ｂｌｏｏｄ、１０３巻（２００４年）２７３８〜２７４３頁；およびＣｒａｇｇ、Ｍ．Ｓ．ら、Ｂｌｏｏｄ、１０１巻（２００３年）１０４５〜１０５２頁）。例えばリツキシマブ（通常のグリコシル化パターンを有する無フコシル化されていない（ｎｏｎ−ａｆｏｃｕｓｙｌａｔｅｄ）、糖鎖工学により操作されていない抗体、「ＲＴＸ」とも称される）のようなＩ型抗体は、補体媒介性細胞傷害性において強力であるが、例えばトシツモマブ（Ｂ１）、１１Ｂ８、ＡＴ８０またはヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体のようなＩＩ型抗体は、同時のホスファチジルセリン曝露での、カスパーゼに依存しないアポトーシスによる標的細胞死滅を有効に開始させる。
【００１１】
リツキシマブからＦｃ糖鎖工学によって構築されるいくつかの機能的に活性な抗ＣＤ２０糖操作抗体群が本明細書に開示されている。重要なことに、最適化グリコフォームを有する抗ＣＤ２０糖操作抗体群は、リツキシマブと比較して有意に改善されたＡＤＣＣ活性を示す。これは、ＡＤＣＣ活性が増強された、均一にＦｃ−グリコシル化された抗ＣＤ２０抗体が成功裏に生成されたことを示す最初の報告である。
【００１２】
一部の実施形態では、本明細書に記載の抗ＣＤ２０糖操作抗体群は、糖操作抗体群がリツキシマブと比較してＦｃγＲＩＩＩＡへの結合の増強を示すという点で特徴付けられる。ある特定の実施形態では、本発明による糖操作抗体の、結果として生じるＡＤＣＣ活性は、親抗体のＡＤＣＣ活性と比較して少なくとも８倍増大した、好ましくは少なくとも１５倍、より好ましくは少なくとも３５倍増大したＡＤＣＣ活性、好ましくは少なくとも５０倍増大したＡＤＣＣ活性、好ましくは少なくとも６０倍増大したＡＤＣＣ活性、最も好ましくは少なくとも８０倍増大したＡＤＣＣ活性である。
【００１３】
一部の実施形態では、本明細書に記載のＮ−グリカンは二分岐（ｂｉａｎｔｅｎｎａｒｙ）構造を有する。一部の実施形態では、Ｎ−グリカンは、バイセクティング（ｂｉｓｅｃｔｉｎｇ）ＧｌｃＮＡｃを含む。
【００１４】
一部の実施形態では、本明細書に記載のＮ−グリカンは、α２−６末端シアル酸を少なくとも１つ含む。ある特定の実施形態では、Ｎ−グリカンは、α２−６末端シアル酸を１つ含む。好ましい実施形態では、Ｎ−グリカンは、α２−６末端シアル酸を２つ含む。
【００１５】
一部の実施形態では、本明細書に記載のＮ−グリカンは、α２−３末端シアル酸を少なくとも１つ含む。ある特定の実施形態では、Ｎ−グリカンは、α２−３末端シアル酸を１つ含む。好ましい実施形態では、Ｎ−グリカンは、α２−３末端シアル酸を２つ含む。
【００１６】
一部の実施形態では、本明細書に記載のＮ−グリカンは、ガラクトースを少なくとも１つ含む。ある特定の実施形態では、Ｎ−グリカンは、ガラクトースを１つ含む。好ましい実施形態では、Ｎ−グリカンは、ガラクトースを２つ含む。
【００１７】
本開示によるＮ−グリカンは、コアフコースを含まないことが好ましい。
【００１８】
一部の実施形態では、本明細書に記載のＮ−グリカンは、Ｓｉａ２（α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−３／α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−６／α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−３／α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−６／α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−６）ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−３）ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−６）ＧａｌＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−３）ＧａｌＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２およびＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群より選択される配列を含む。
【００１９】
好ましい実施形態では、本明細書に記載のＮ−グリカンは、Ｓｉａ２（α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−３／α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−６／α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−３／α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−６／α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−６）ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−３）ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−６）ＧａｌＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−３）ＧａｌＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２およびＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群より選択される配列を有する。
【００２０】
本開示の別の態様は、本明細書に記載の抗ＣＤ２０糖操作抗体群の組成物と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を特徴とする。
【００２１】
本開示による医薬組成物は、治療薬に使用することができる。本開示には、患者においてがんを処置するための方法であって、患者に、有効量の本明細書に記載の医薬組成物を投与するステップを含む方法が含まれる。
【００２２】
がんの例としては、これだけに限定されないが、ＣＤ２０発現がん、Ｂ細胞リンパ腫、ＮＨＬ、前駆Ｂリンパ芽球性白血病／リンパ腫および成熟Ｂ細胞新生物、Ｂ細胞性慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）／小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、Ｂ細胞性前リンパ性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、低悪性度、中悪性度および高悪性度（ＦＬ）、皮膚濾胞中心リンパ腫（ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｆｏｌｌｉｃｌｅ  ｃｅｎｔｅｒ  ｌｙｍｐｈｏｍａ）、辺縁層Ｂ細胞リンパ腫、ＭＡＬＴ型辺縁層Ｂ細胞リンパ腫、節性辺縁層Ｂ細胞リンパ腫、脾臓型辺縁層Ｂ細胞リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、形質細胞腫、形質細胞骨髄腫、移植後リンパ増殖性障害、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、および未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）が挙げられる。
【００２３】
ある特定の実施形態では、がんは、非ホジキンリンパ腫などのＢ細胞リンパ腫である。
【００２４】
さらに、本明細書に記載の医薬組成物は、自己免疫疾患または炎症性疾患を有する患者を処置するために使用することができる。処置方法は、患者に、有効量の本明細書に記載の医薬組成物を投与するステップを含む。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の追加的な他の細胞傷害性剤、化学療法剤もしくは抗がん剤、またはそのような薬剤の効果を増強する化合物もしくは電離放射線を共投与する。
【００２５】
自己免疫疾患または炎症性疾患の例としては、これだけに限定されないが、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ウェゲナー病、炎症性腸疾患、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、自己免疫性血小板減少症、多発性硬化症、乾癬、ＩｇＡ腎症、ＩｇＭ多発ニューロパチー、重症筋無力症、血管炎、糖尿病、レイノー症候群（Ｒｅｙｎａｕｄ’ｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、クローン病、潰瘍性大腸炎、胃炎、橋本甲状腺炎、強直性脊椎炎、Ｃ型肝炎関連クリオグロブリン血症性血管炎、慢性限局性脳炎（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｆｏｃａｌ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）、水疱性類天疱瘡、血友病Ａ、膜性増殖性糸球体腎炎（ｍｅｍｂｒａｎｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｇｌｏｍｅｒｕｌｎｅｐｈｒｉｔｉｓ）、成人皮膚筋炎および若年性皮膚筋炎、成人多発性筋炎、慢性蕁麻疹、原発性胆汁性肝硬変、視神経脊髄炎、グレーブス甲状腺異常症、水疱性類天疱瘡、膜性増殖性糸球体腎炎（ｍｅｍｂｒａｎｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｇｌｏｎｅｒｕｌｏｎｅｐｈｒｉｔｉｓ）、チャーグ・ストラウス症候群、喘息、乾癬性関節炎、皮膚炎、呼吸窮迫症候群、髄膜炎、脳炎（ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｔｓ）、ぶどう膜炎、湿疹、アテローム性動脈硬化症、白血球接着不全症、若年発症糖尿病、ライター病、ベーチェット病、溶血性貧血、アトピー性皮膚炎、ウェゲナー肉芽腫症、オーメン症候群、慢性腎不全、急性伝染性単核球症、ＨＩＶおよびヘルペス関連疾患、全身性硬化症、シェーグレン症候群（Ｓｊｏｒｇｅｎ’ｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）および糸球体腎炎、皮膚筋炎、ＡＮＣＡ、再生不良性貧血、自己免疫性溶血性貧血（ＡＩＨＡ）、第ＶＩＩＩ因子欠損症、血友病Ａ、自己免疫性好中球減少症、キャッスルマン症候群、グッドパスチャー症候群、固形臓器移植片拒絶反応、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、自己免疫性肝炎、リンパ性間質性肺炎（ＨＩＶ）、閉塞性細気管支炎（非移植）、ギラン・バレー症候群、大型血管炎（ｌａｒｇｅ  ｖｅｓｓｅｌ  ｖａｓｃｕｌｉｔｉｓ）、巨細胞（高安）動脈炎、中型血管炎（ｍｅｄｉｕｍ  ｖｅｓｓｅｌ  ｖａｓｃｕｌｉｔｉｓ）、川崎病、および結節性多発性動脈炎が挙げられる。
【００２６】
ある特定の実施形態では、自己免疫疾患または炎症性疾患は関節リウマチである。
【００２７】
本明細書に記載のこれらの処置方法では、抗ＣＤ２０糖操作抗体群の医薬組成物は、単独で、または、第２の抗体、もしくは化学療法剤もしくは免疫抑制剤などの第２の治療剤と併せて投与することができる。第２の抗体は、ＣＤ２０もしくは異なるＢ細胞抗原、またはＮＫ細胞抗原もしくはＴ細胞抗原に結合する抗体であってよい。
【００２８】
本明細書に記載の抗ＣＤ２０糖操作抗体群は、ＦＤＡによる認可を受けたまたは開発中の抗ＣＤ２０モノクローナル抗体から生成することができる。抗ＣＤ２０モノクローナル抗体は、ヒト化モノクローナル抗体、ヒトモノクローナル抗体またはキメラモノクローナル抗体であってよい。
【００２９】
本明細書に記載の抗ＣＤ２０糖操作抗体群は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで作製することができる。抗ＣＤ２０糖操作抗体群は、Ｆｃ糖鎖工学によって生成することができる。ある特定の実施形態では、抗ＣＤ２０糖操作抗体群は、哺乳動物細胞培養によって得られた抗ＣＤ２０モノクローナル抗体から酵素的にまたは化学酵素的に工学的に作製される。
【００３０】
さらに別の態様では、本開示は、抗ＣＤ２０糖操作抗体を作出する方法であって、（ａ）抗ＣＤ２０モノクローナル抗体をアルファ−フコシダーゼおよび少なくとも１種のエンドグリコシダーゼと接触させ、それにより、Ｆｃ上に脱フコシル化単糖ＧｌｃＮＡｃを有する抗ＣＤ２０モノクローナル抗体を作製するステップと、（ｂ）適切な条件下でＧｌｃＮＡｃに炭水化物部分を付加するステップとを含む方法に関する。
【００３１】
一部の実施形態では、抗ＣＤ２０糖操作抗体を作出するために使用される抗ＣＤ２０モノクローナル抗体はリツキシマブである。
【００３２】
一部の実施形態では、炭水化物部分は、Ｓｉａ２（α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−３／α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−６／α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−３／α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−６／α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−６）ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−３）ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−６）ＧａｌＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−３）ＧａｌＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２およびＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群より選択される。
【００３３】
好ましい実施形態では、炭水化物部分は、Ｓｉａ２（α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−３／α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−６／α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−３／α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−６／α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−６）ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−３）ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−６）ＧａｌＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−３）ＧａｌＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２およびＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群より選択される。
【００３４】
ステップ（ｂ）の付加は、トランスグリコシラーゼによって実施することができる。トランスグリコシラーゼとしては、これだけに限定されないが、ＥｎｄｏＳ、ＥｎｄｏＳ２、ＥｎｄｏＨ、ＥｎｄｏＡ、ＥｎｄｏＭ、ＥｎｄｏＦ、ＥｎｄｏＦ１、ＥｎｄｏＦ２およびＥｎｄｏＦ３が挙げられる。
【００３５】
本発明の方法に有用なエンドグリコシダーゼとしては、これだけに限定されないが、ＥｎｄｏＳ、ＥｎｄｏＳ２、ＥｎｄｏＨ、ＥｎｄｏＡ、ＥｎｄｏＭ、ＥｎｄｏＦ、ＥｎｄｏＦ１、ＥｎｄｏＦ２およびＥｎｄｏＦ３が挙げられる。
【００３６】
一部の実施形態では、アルファ−フコシダーゼは、配列番号５と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
【００３７】
ある特定の実施形態では、アルファ−フコシダーゼは、組換えＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓアルファ−Ｌ−フコシダーゼである。
【００３８】
本発明の１つまたは複数の実施形態の詳細が以下の説明に記載されている。本発明の他の特徴または利点は、以下の図およびいくつかの実施形態の詳細な説明から、ならびに添付の特許請求の範囲からも明らかになるであろう。
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
Ｆｃ領域のそれぞれに同じＮ−グリカンを有する抗ＣＤ２０ＩｇＧ分子の単離された均一な集団を含む抗ＣＤ２０糖操作抗体群または抗ＣＤ２０結合性断片の組成物。
（項目２）
前記抗ＣＤ２０ＩｇＧ分子が、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する重鎖、および配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む、項目１に記載の組成物。
（項目３）
前記抗ＣＤ２０ＩｇＧ分子が、リツキシマブの軽鎖配列および重鎖配列を含む、項目１に記載の組成物。
（項目４）
前記抗ＣＤ２０糖操作抗体群が、リツキシマブよりも改善されたＡＤＣＣ活性を有する、項目１に記載の組成物。
（項目５）
前記ＡＤＣＣが少なくとも約１０倍改善される、項目４に記載の組成物。
（項目６）
前記抗ＣＤ２０糖操作抗体群が、リツキシマブと比較して改善されたＦｃγＲＩＩＩＡへの結合を示す、項目１に記載の組成物。
（項目７）
前記Ｎ−グリカンが前記Ｆｃ領域のＡｓｎ−２９７に付着している、項目１に記載の組成物。
（項目８）
前記Ｎ−グリカンがフコースを含まない、項目１に記載の組成物。
（項目９）
前記Ｎ−グリカンが、α２−６シアル酸を少なくとも１つ含む、項目１に記載の組成物。
（項目１０）
前記Ｎ−グリカンがα２−６シアル酸を２つ含む、項目９に記載の組成物。
（項目１１）
前記Ｎ−グリカンが、Ｓｉａ２（α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−３／α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−６／α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−３／α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−６／α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−６）ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−３）ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−６）ＧａｌＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−３）ＧａｌＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２およびＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群より選択される、項目１に記載の組成物。
（項目１２）
前記Ｎ−グリカンが、Ｓｉａ２（α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−３／α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−６／α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−３／α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−６／α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−６）ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−３）ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−６）ＧａｌＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−３）ＧａｌＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２およびＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群より選択される、項目１１に記載の組成物。（項目１３）
項目１から１２までに記載の抗ＣＤ２０糖操作抗体群またはその抗原結合性断片の実質的に純粋な集団と薬学的に許容される担体とを含む医薬製剤。
（項目１４）
患者においてがんを処置するための方法であって、それを必要とする前記患者に、有効量の項目１３に記載の医薬製剤を投与するステップを含む、方法。
（項目１５）
前記がんが、Ｂ細胞リンパ腫、ＮＨＬ、前駆Ｂリンパ芽球性白血病／リンパ腫および成熟Ｂ細胞新生物、Ｂ細胞性慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）／小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、Ｂ細胞性前リンパ性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、低悪性度、中悪性度および高悪性度（ＦＬ）、皮膚濾胞中心リンパ腫、辺縁層Ｂ細胞リンパ腫、ＭＡＬＴ型辺縁層Ｂ細胞リンパ腫、節性辺縁層Ｂ細胞リンパ腫、脾臓型辺縁層Ｂ細胞リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、形質細胞腫、形質細胞骨髄腫、移植後リンパ増殖性障害、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、および未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）からなる群より選択される、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記患者に、治療剤を投与するステップをさらに含む、項目１４に記載の方法。
（項目１７）
前記治療剤がリツキシマブを含む、項目１４に記載の方法。
（項目１８）
Ｂ細胞枯渇に基づく疾患処置を改善するための方法であって、治療有効量の項目１３に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
（項目１９）
治療有効量の項目１３に記載の医薬組成物を共投与または共製剤として投与するステップを含む、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
項目１に記載の抗ＣＤ２０糖操作抗体または抗原結合性断片を作出する方法であって、
（ａ）抗ＣＤ２０モノクローナル抗体をα−フコシダーゼおよび少なくとも１種のエンドグリコシダーゼと接触させ、それにより、単一のＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を有する脱フコシル化抗体を得るステップと、
（ｂ）適切な条件下でＧｌｃＮＡｃに炭水化物部分を付加するステップと
を含む、方法。
（項目２１）
前記抗ＣＤ２０モノクローナル抗体がリツキシマブである、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記抗ＣＤ２０糖操作抗体群をｉｎ  ｖｉｔｒｏで作製する、項目２０に記載の方法。（項目２３）
前記抗ＣＤ２０糖操作抗体群を、細胞培養によって得られた抗体から酵素的に工学的に作製する、項目２０に記載の方法。
（項目２４）
前記炭水化物部分が、Ｓｉａ２（α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−３／α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−６／α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−３／α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−６／α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−６）ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−３）ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−６）ＧａｌＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−３）ＧａｌＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２およびＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群より選択される、項目２０に記載の方法。
（項目２５）
前記炭水化物部分が、Ｓｉａ２（α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−３／α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−６／α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−３／α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−６／α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−６）ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−３）ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−６）ＧａｌＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−３）ＧａｌＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２およびＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群より選択される、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
ステップ（ｂ）の前記付加をトランスグリコシラーゼによって行う、項目２０に記載の方法。
（項目２７）
前記エンドグリコシダーゼが、ＥｎｄｏＳ、Ｅｎｄｏ  Ｓ２、ＥｎｄｏＨ、ＥｎｄｏＡ、ＥｎｄｏＭ、ＥｎｄｏＦ、ＥｎｄｏＦ１、ＥｎｄｏＦ２またはＥｎｄｏＦ３である、項目２０に記載の方法。
（項目２８）
前記α−フコシダーゼが、配列番号５と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、項目２０に記載の方法。
（項目２９）
前記α−フコシダーゼが組換えＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓアルファ−Ｌ−フコシダーゼである、項目２０に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】図１は、モノクローナル抗体のＦｃ糖鎖工学の略図を示す。経路（Ａ）はフコシル化抗体と非フコシル化抗体の混合物が生じる当技術分野で公知の方法を示す。経路（Ｂ）は均一な糖操作抗体群が生じる本発明の方法を示す。
【００４０】
【図２】図２は、抗ＣＤ２０ＧＡｂｓ  １０１、１０２、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、２０１およびリツキシマブのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【００４１】
【図３】図３は、抗ＣＤ２０ＧＡｂｓ  １０１、１０２、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０および１１１のＮ−グリカンプロファイリングを示す。
【００４２】
【図４】図４は、リツキシマブ、ＧＡｂ１０１およびＧＡｂ１０４の（Ａ）ラモス細胞および（Ｂ）ＳＫＷ６．４細胞への結合、ならびに（Ｃ）リツキシマブ、ＧＡｂ１０１およびＧＡｂ１１７のラモス細胞、ラジ細胞およびＳＵ−ＤＨＬ４細胞への結合を示す。
【００４３】
【図５】図５は、リツキシマブ、ＧＡｂ１０１およびＧＡｂ１０４による（Ａ）ラモス細胞および（Ｂ）ＳＫＷ６．４細胞に対するアポトーシスを示す。
【００４４】
【図６】図６は、（Ａ）リツキシマブ、ＧＡｂ１０１およびＧＡｂ１１７；（Ｂ）ＧＡｂ１０１、ＧＡｂ１０４およびＧＡｂ１０８によって誘導される、ラモス細胞に対するＣＤＣを示す。
【００４５】
【図７−１】図７は、エフェクターＰＢＭＣ細胞を使用して、リツキシマブ、ＧＡｂ１０１、ＧＡｂ１０４およびＧＡｂ１１７によって誘導される、（Ａ）ラモス細胞および（Ｂ）（Ｃ）ＳＫＷ６．４細胞に対するＡＤＣＣを示す。
【図７−２】図７は、エフェクターＰＢＭＣ細胞を使用して、リツキシマブ、ＧＡｂ１０１、ＧＡｂ１０４およびＧＡｂ１１７によって誘導される、（Ａ）ラモス細胞および（Ｂ）（Ｃ）ＳＫＷ６．４細胞に対するＡＤＣＣを示す。
【００４６】
【図８】図８は、３ドナー由来のＰＢＭＣにおける、自己由来血漿の不在下で、リツキシマブおよび抗ＣＤ２０ＧＡｂｓ１０１、１０２、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０および１１１によるヒトＢ細胞の枯渇を示す。
【００４７】
【図９】図９は、ＳＣＩＤマウスにおける、ＧＡｂ１０１によるラモス腫瘍異種移植片の抑制を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標））は、Ｂ細胞リンパ腫の９５％超で発現するＣＤ２０タンパク質を標的とするキメラ抗ＣＤ２０抗体である。抗ＣＤ２０ｍＡｂリツキシマブを用いたモノクローナル抗体療法は、ここ３０年のリンパ球増殖性障害の処置における最も重要な進歩のうちの１つを表すものである。リツキシマブは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において産生される。哺乳動物細胞培養系では、全てが同じ性質を有するとは限らないグリコシル化パターンの不均一な混合物が送達される。抗体内のＦｃグリコシル化の多様性は、Ｆｃエフェクター機能の多様性に対応する。したがって、このＦｃグリカンの不均一性は、ＩｇＧ分子のＦｃ受容体およびＣ１ｑへの結合に影響を及ぼし、それにより、抗体エフェクター機能に影響を及ぼすので、機能的重要性があり、また、患者における望ましくない影響を誘発する可能性があり、したがって、これらは安全性に懸念があるとみなされる。例えば、ＣＤ２０陽性悪性疾患を有する患者の一部は、リツキシマブを含有する免疫化学療法に対して応答することができない、またはより一般には、リツキシマブを含有する免疫化学療法を受けた後に再発する。
【００４９】
改善された抗ＣＤ２０抗体を用いてモノクローナル抗体療法を改善することが依然として必要とされている。グリコシル化パターンの不均一な混合物中の数種類の特定のグリコフォームにより所望の生物学的機能が付与されることが公知である。したがって、治療目的で、所望のグリコフォームとして明確に定義されたグリカン構造および配列を含有する治療用抗体を生成することが大変興味深い。
【００５０】
定義
本発明の実施では、別段の指定のない限り、当技術分野の技術の範囲内に入る分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学の従来の技法を使用する。そのような技法は、文献において十分に説明されている。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ編（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９年）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｉ巻およびＩＩ巻（Ｄ．  Ｎ．  Ｇｌｏｖｅｒ編、１９８５年）；Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ（Ｒ．  Ｉ．  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．、１９８７年）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、１９８６年）；Ｂ．  Ｐｅｒｂａｌ、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４年）；論文集、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．、Ｎ．Ｙ．）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．  Ｈ．  ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．  Ｐ．  Ｃａｌｏｓ編、１９８７年、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１５４巻および１５５巻（Ｗｕら編）、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、１９８７年）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ、１９８８年）；およびＨａｎｄｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｉ〜ＩＶ巻（Ｄ．  Ｍ．  ＷｅｉｒおよびＣ．  Ｃ．  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編、１９８６年）を参照されたい。
【００５１】
「糖操作抗体群（ｇｌｙｃｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」という用語は、本発明者、Ｃｈｉ−Ｈｕｅｙ  Ｗｏｎｇ博士により造り出されたものであり、単一の一様化されたグリコフォームがＦｃ領域に結合したモノクローナル抗体（好ましくは、治療用モノクローナル抗体）の均一な集団を指す。基本的に均一な集団を構成する個々の糖操作抗体群は同一であり、同じエピトープに結合し、また、明確に定義されたグリカン構造および配列を有する同じＦｃグリカンを含有する。
【００５２】
本明細書で使用される場合、「抗ＣＤ２０糖操作抗体群」（「抗ＣＤ２０ＧＡｂｓ」）という用語は、Ｆｃ上に同じグリコフォームを有する抗ＣＤ２０ＩｇＧ分子の均一な集団を指す。
【００５３】
「抗ＣＤ２０糖操作抗体」（「抗ＣＤ２０ＧＡｂ」）という用語は、抗ＣＤ２０糖操作抗体群内の各々のＩｇＧ分子を指す。ある特定の実施形態では、抗ＣＤ２０「分子」は抗原結合性断片も含むことができる。
【００５４】
本明細書で使用される場合、「グリカン」という用語は、多糖、オリゴ糖または単糖を指す。グリカンは糖残基の単量体であってもポリマーであってもよく、直鎖であっても分枝していてもよい。グリカンとしては、天然の糖残基（例えば、グルコース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルノイラミン酸、ガラクトース、マンノース、フコース、ヘキソース、アラビノース、リボース、キシロースなど）および／または修飾された糖（例えば、２’−フルオロリボース、２’−デオキシリボース、ホスホマンノース、６’スルホＮ−アセチルグルコサミンなど）が含まれ得る。グリカンとは、本明細書では、糖タンパク質、糖脂質、グリコペプチド、グリコプロテオーム、ペプチドグリカン、リポ多糖またはプロテオグリカンなどの複合糖質の炭水化物部分を指すためにも使用される。グリカンは、通常、単糖間のＯ−グリコシド結合のみからなる。例えば、セルロースはβ−１，４結合したＤ−グルコースで構成されるグリカン（または、より詳細にはグルカン）であり、キチンはβ−１，４結合したＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンで構成されるグリカンである。グリカンは、単糖残基のホモポリマーであってもヘテロポリマーであってもよく、直鎖であっても分枝していてもよい。グリカンは、糖タンパク質およびプロテオグリカンのようにタンパク質に付着して見いだされ得る。グリカンは、一般に、細胞の外表面上に見いだされる。Ｏ結合およびＮ結合グリカンは、真核生物では非常に一般的であるが、原核生物においても、一般的ではないが見いだされ得る。Ｎ結合グリカンは、シークオン（ｓｅｑｕｏｎ）内のアスパラギンのＲ基窒素（Ｎ）に付着して見いだされる。シークオンは、Ａｓｎ−Ｘ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ配列であり、Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸である。
【００５５】
本明細書で使用される場合、「フコース」、「コアフコース」および「コアフコース残基」という用語は、互換的に使用され、Ｎ−アセチルグルコサミンとα１，６位結合したフコースを指す。
【００５６】
本明細書で使用される場合、「Ｎ−グリカン」、「Ｎ結合グリカン」、「Ｎ結合グリコシル化」、「Ｆｃグリカン」および「Ｆｃグリコシル化」という用語は、互換的に使用され、Ｆｃを含有するポリペプチド内のアスパラギン残基のアミド窒素と結合したＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）が付着したＮ結合オリゴ糖を指す。「Ｆｃを含有するポリペプチド」という用語は、Ｆｃ領域を含む、抗体などのポリペプチドを指す。
【００５７】
本明細書で使用される場合、「グリコシル化パターン」および「グリコシル化プロファイル」という用語は、互換的に使用され、糖タンパク質または抗体から酵素的にまたは化学的に放出され、次いで、それらの炭水化物構造について、例えば、ＬＣ−ＨＰＬＣ、またはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳなどを使用して分析されたＮ−グリカン種の特徴的な「指紋」を指す。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１巻、１号（２００５年）、２８〜５７頁の総説を参照されたい。
【００５８】
本明細書で使用される場合、「糖鎖工学により操作されたＦｃ」という用語は、本明細書で使用される場合、Ｆｃ領域上のＮ−グリカンが、酵素的にまたは化学的に変更または工学的に操作されていることを指す。「Ｆｃ糖鎖工学」という用語は、本明細書で使用される場合、糖鎖工学により操作されたＦｃを作出するために使用される酵素的または化学的なプロセスを指す。工学的操作の典型的な方法は、例えば、その内容が本明細書によって参照により組み込まれるＷｏｎｇら、ＵＳＳＮ１２／９５９，３５１に記載されている。
【００５９】
「均一な（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ）」、「一様な（ｕｎｉｆｏｒｍ）」、「一様に（ｕｎｉｆｏｒｍｌｙ）」および「均一性（ｈｏｍｏｇｅｎｅｉｔｙ）」という用語は、Ｆｃ領域のグリコシル化プロファイルに関しては、互換的に使用され、１つの所望のＮ−グリカン種によって単一のグリコシル化パターンが表され、前駆Ｎ−グリカンの痕跡量はほとんどないまたは全くないことを意味するものとする。ある特定の実施形態では、前駆Ｎ−グリカンの痕跡量は約２％未満である。
【００６０】
「基本的に純粋な」タンパク質とは、組成物の総重量に基づいて、例えば、少なくとも約９１重量％、少なくとも約９２重量％、少なくとも約９３重量％、少なくとも約９４重量％、少なくとも約９５重量％、少なくとも約９６重量％、少なくとも約９７重量％、少なくとも約９８重量％、または少なくとも約９９重量％を含め、少なくとも約９０重量％のタンパク質を含む組成物を意味する。
【００６１】
「基本的に均一な」タンパク質は、組成物の総重量に基づいて、例えば、少なくとも約９８．５％、少なくとも約９９％を含め、少なくとも約９８重量％のタンパク質で構成される組成物を意味する。ある特定の実施形態では、タンパク質は、抗体、構造バリアント、および／またはその抗原結合性断片である。
【００６２】
本明細書で使用される場合、「ＩｇＧ」、「ＩｇＧ分子」、「モノクローナル抗体」、「免疫グロブリン」、および「免疫グロブリン分子」という用語は、互換的に使用される。ある特定の実施形態では、抗ＣＤ２０「分子」は抗原結合性断片も含むことができる。
【００６３】
本明細書で使用される場合、「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」という用語は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体について述べるものである。好ましいＦｃＲは、ネイティブな配列のヒトＦｃＲである。さらに、好ましいＦｃＲはＩｇＧ抗体に結合するもの（ガンマ受容体）であり、それらの受容体の対立遺伝子バリアントおよび代替的にスプライスされた形態を含め、ＦｃγＲＩサブクラスの受容体（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩサブクラスの受容体（ＣＤ３２）、およびＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体（ＣＤ１６）が挙げられる。ＦｃγＲＩＩ受容体としてはＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）およびＦｃγＲＩＩＢ（「抑制受容体（ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）」）があり、これらは、同様のアミノ酸配列を有し、主にその細胞質ドメインが異なる。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメイン内に免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を含有する。抑制受容体ＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメイン内に免疫受容抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）を含有する（総説Ｍ．  ｉｎ  Ｄａｅｒｏｎ、Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５巻：２０３〜２３４頁（１９９７年）を参照されたい）。ＦｃＲは、ＲａｖｅｔｃｈおよびＫｉｎｅｔ、Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９巻：４５７〜９２頁（１９９１年）；Ｃａｐｅｌら、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ  ４巻：２５〜３４頁（１９９４年）；およびｄｅ  Ｈａａｓら、Ｊ．  Ｌａｂ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｅｄ．  １２６巻：３３０〜４１頁（１９９５年）に概説されている。今後同定されるものを含めた他のＦｃＲが本明細書における「ＦｃＲ」という用語に包含される。この用語は、母系ＩｇＧの胎児への移行に関与する新生児受容体、ＦｃＲｎも包含する（Ｇｕｙｅｒら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １１７巻：５８７頁（１９７６年）およびＫｉｍら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２４巻：２４９頁（１９９４年））。
【００６４】
「エフェクター機能」という用語は、本明細書で使用される場合、抗体Ｆｃ領域のＦｃ受容体またはリガンドとの相互作用によって生じる生化学的事象を指す。例示的な「エフェクター機能」としては、Ｃ１ｑ結合；補体依存性細胞傷害；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面受容体（例えばＢ細胞受容体；ＢＣＲ）の下方制御などが挙げられる。そのようなエフェクター機能は、当技術分野で公知の様々なアッセイを使用して評価することができる。
【００６５】
本明細書で使用される場合、「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」または「ＡＤＣＣ」という用語は、ある特定の細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、およびマクロファージ）上に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合した、分泌されたＩｇにより、これらの細胞傷害性エフェクター細胞が抗原を有する標的細胞に特異的に結合し、その後、細胞毒により標的細胞を死滅させることが可能になる、細胞傷害性の形態を指す。抗体は、細胞傷害性細胞を「武装」させるものであり、そのような死滅に絶対必要なものである。ＡＤＣＣを媒介する一次細胞であるＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞におけるＦｃＲ発現は、ＲａｖｅｔｃｈおよびＫｉｎｅｔ、Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９巻：４５７〜９２頁（１９９１年）の４６４頁、表３に要約されている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、米国特許第５，５００，３６２号または米国特許第５，８２１，３３７号に記載されているものなどのｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＡＤＣＣアッセイを実施することができる。そのようなアッセイのための有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。その代わりにまたはそれに加えて、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、例えば、Ｃｌｙｎｅｓら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９５巻：６５２〜６５６頁（１９９８年）に開示されているものなどの動物モデルにおいて評価することができる。
【００６６】
「補体依存性細胞傷害」または「ＣＤＣ」という用語は、本明細書で使用される場合、補体の存在下での標的細胞の溶解を指す。古典的な補体経路の活性化は、同族抗原に結合する抗体（適切なサブクラスのもの）に補体系の第１の構成成分（Ｃ１ｑ）が結合することによって開始される。補体活性化を評価するために、例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０２巻：１６３頁（１９９６年）に記載のＣＤＣアッセイを実施することができる。
【００６７】
「キメラ」抗体（免疫グロブリン）は、特定の種に由来するまたは特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同である重鎖および／または軽鎖の一部を有し、鎖（複数可）の残りは、別の種に由来するまたは別の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体、ならびに所望の生物活性を示す限りはそのような抗体の断片、の対応する配列と同一または相同である（米国特許第４，８１６，５６７号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８１巻：６８５１〜６８５５頁（１９８４年））。ヒト化抗体とは、本明細書で使用される場合、キメラ抗体のサブセットである。
【００６８】
非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小の配列を含有するキメラ抗体である。ほとんどの部分に関して、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域残基が所望の特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）由来の超可変領域残基で置き換えられた、ヒト免疫グロブリン（レシピエントまたはアクセプター抗体）である。いくつかの場合には、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基が対応する非ヒト残基で置き換えられている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体においては見いだされない残基を含んでよい。これらの改変は、結合親和性などの抗体の性能をさらに磨くために行われる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、一般には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ここで、超可変ループの全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンの超可変ループに対応し、ＦＲ領域の全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のＦＲ領域であるが、ＦＲ領域は結合親和性を改善する１つまたは複数のアミノ酸置換を含んでよい。ＦＲにおけるこれらのアミノ酸置換の数は、一般には、Ｈ鎖では６以下であり、Ｌ鎖では３以下である。ヒト化抗体は、場合により、一般にはヒト免疫グロブリンのものである免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分も含む。さらなる詳細に関しては、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１巻：５２２〜５２５頁（１９８６年）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２巻：３２３〜３２９頁（１９８８年）；およびＰｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．  ２巻：５９３〜５９６頁（１９９２年）を参照されたい。以下の総説論文およびそこに引用されている参考文献も参照されたい：ＶａｓｗａｎｉおよびＨａｍｉｌｔｏｎ、Ａｎｎ．  Ａｌｌｅｒｇｙ，  Ａｓｔｈｍａ  ＆  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １巻：１０５〜１１５頁（１９９８年）；Ｈａｒｒｉｓ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ２３巻：１０３５〜１０３８頁（１９９５年）；ＨｕｒｌｅおよびＧｒｏｓｓ、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  ５巻：４２８〜４３３頁（１９９４年）。
【００６９】
本明細書で使用される場合、「抗原」という用語は、免疫応答を引き出すことができる任意の物質と定義される。本明細書で使用される場合、「抗原特異的」という用語は、特定の抗原または抗原の断片の供給により特異的な細胞増殖がもたらされるような細胞集団の性質を指す。
【００７０】
本明細書で使用される場合、「免疫原性」という用語は、免疫応答を刺激する免疫原、抗原、またはワクチンの能力を指す。
【００７１】
本明細書で使用される場合、「エピトープ」という用語は、抗体またはＴ細胞受容体の抗原結合部位と接触する、抗原分子の一部と定義される。
【００７２】
本明細書で使用される場合、「特異的に結合すること」という用語は、結合対（例えば、抗体と抗原）間の相互作用を指す。種々の例では、特異的に結合することは、約１０−６モル／リットル、約１０−７モル／リットル、または約１０−８モル／リットル、またはそれ未満の親和性定数によって具体化することができる。
【００７３】
「単離された」抗体とは、同定され、その天然の環境の構成成分から分離および／または回収された抗体である。その天然の環境の混入構成成分は、抗体の研究、診断または治療的な使用に干渉する材料であり、それらとして、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性溶質が挙げられる。
【００７４】
「実質的に類似した」、「実質的に同じ」、「等価の」、または「実質的に等価の」という句は、本明細書で使用される場合、２つの数値（例えば、一方が分子に関連し、他方が参照／比較用（ｃｏｍｐａｒａｔｏｒ）分子に関連する）間の類似性の程度が十分に高く、したがって、当業者により、前記値（例えば、Ｋｄ値、抗ウイルス効果など）により測定される生物学的特性の文脈内で、その２つの値の差異の生物学的および／または統計的有意性がほとんどまたは全くないとみなされるだろうことを示す。前記２つの値の差異は、参照／比較用分子についての値の関数として、例えば、約５０％未満、約４０％未満、約３０％未満、約２０％未満、および／または約１０％未満である。
【００７５】
「実質的に低下した」または「実質的に異なる」という句は、本明細書で使用される場合、２つの数値（一般に、一方が分子に関連し、他方が参照／比較用分子に関連する）の差異の程度が十分に高く、したがって、当業者により、前記値（例えば、Ｋｄ値）により測定される生物学的特性の文脈内で、その２つの値の差異が統計的に有意であるとみなされるだろうことを示す。前記２つの値の差異は、参照／比較用分子についての値の関数として、例えば、約１０％超、約２０％超、約３０％超、約４０％超、および／または約５０％超である。
【００７６】
「結合親和性」とは、一般に、分子（例えば、抗体）の単一の結合性部位とその結合パートナー（例えば、抗原）の間の非共有結合性の相互作用の総計の強度を指す。別段の指定のない限り、本明細書で使用される場合、「結合親和性」とは、結合対（例えば、抗体と抗原）のメンバー間の１：１相互作用を反映する内因性の結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、一般に、解離定数（Ｋｄ）によって表すことができる。親和性は、本明細書に記載のものを含めた当技術分野で公知の一般的な方法によって測定することができる。低親和性抗体は、一般に、抗原にゆっくりと結合し、容易に解離する傾向があるが、高親和性抗体は、一般に、抗原により速く結合し、より長く結合したままである傾向がある。結合親和性を測定する種々の方法は当技術分野で公知であり、そのいずれも本発明の目的に関して使用することができる。特定の例示的な実施形態は以下に記載されている。
【００７７】
抗体の「可変領域」または「可変ドメイン」とは、抗体の重鎖または軽鎖のアミノ末端ドメインを指す。これらのドメインは、一般に、抗体の最も可変性の部分であり、抗原結合部位を含有する。
【００７８】
「可変性」という用語は、可変ドメインのある特定の部分が、その配列が抗体の間で広範囲にわたって異なり、特定の抗体のそれぞれのその特定の抗原に対する結合および特異性に使用されるという事実を指す。しかし、可変性は抗体の可変ドメイン全体を通して一様に分布しているのではない。可変性は、軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインの両方にある相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域と称される３つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク（ＦＲ）と称される。ネイティブな重鎖および軽鎖の可変ドメインはそれぞれ、大部分がベータ−シート立体配置をとっている４つのＦＲ領域を含み、これは、ベータ−シート構造の一部と接続し、いくつかの場合にはそれを形成するループを形成する３つのＣＤＲと接続している。各鎖のＣＤＲはＦＲ領域の極めて近傍に一緒に保持され、他の鎖由来のＣＤＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ（１９９１年）を参照されたい）。定常ドメインは抗体の抗原への結合に直接関与しないが、抗体依存性細胞傷害（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ）への抗体の関与などの、種々のエフェクター機能を示す。
【００７９】
抗体のパパイン消化により、それぞれが単一の抗原結合部位を有する「Ｆａｂ」断片と称される２つの同一の抗原結合性断片と、容易に結晶化できることが名称に反映されている残りの「Ｆｃ」断片とが生じる。ペプシン処理により、抗原結合性部位を２つ有し、なお抗原と架橋結合することが可能なＦ（ａｂ’）２断片がもたらされる。
【００８０】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識および抗原結合部位を含有する最小の抗体断片である。二本鎖Ｆｖ種では、この領域は、密接に非共有結合により結びついた重鎖可変ドメイン１つと軽鎖可変ドメイン１つの二量体からなる。単鎖Ｆｖ種では、重鎖可変ドメイン１つと軽鎖可変ドメイン１つが柔軟なペプチドリンカーによって共有結合により連結していてよく、したがって、軽鎖および重鎖が二本鎖Ｆｖ種のものと類似した「二量体」構造で結びついていてよい。この立体配置では、各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用してＶＨ−ＶＬ二量体の表面上の抗原結合部位が規定される。集合的に、６つのＣＤＲによって抗原結合特異性が抗体に付与される。しかし、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的なＣＤＲを３つのみ含むＦｖの半分）でさえ、結合性部位全体よりも親和性は低いが、抗原を認識し、それに結合する能力を有する。
【００８１】
Ｆａｂ断片は、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）も含有する。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域由来の１つまたは複数のシステインを含めた重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端の数残基の付加により、Ｆａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨとは、本明細書では、定常ドメインのシステイン残基（複数可）に遊離のチオール基を有するＦａｂ’に対する名称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、最初は、間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として生じた。抗体断片の他の化学的カップリングも公知である。
【００８２】
任意の脊椎動物種に由来する抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と称される、２つの明白に異なる型のうちの一方に割り当てることができる。
【００８３】
抗体（免疫グロブリン）は、重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、異なるクラスに割り当てることができる。免疫グロブリンには主要なクラスが５つ存在する：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ、これらの一部は、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２にさらに分けられる。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、およびμと称される。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および３次元立体配置は周知であり、一般に、例えば、Ａｂｂａｓら、Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第４版（２０００年）に記載されている。抗体は、抗体と１つまたは複数の他のタンパク質またはペプチドとの共有結合または非共有結合による結びつきによって形成されるより大きな融合分子の一部であってよい。
【００８４】
「全長抗体」、「インタクトな抗体」および「全抗体」という用語は、本明細書では互換的に使用され、下で定義される通り、抗体断片ではなく実質的にインタクトな形態にある抗体を指す。この用語は、特に、Ｆｃ領域を含有する重鎖を有する抗体を指す。
【００８５】
「抗体断片」は、インタクトな抗体の一部分のみを含み、その部分は、インタクトな抗体内に存在する場合にその部分に通常付随する機能の少なくとも１つ、できるだけ多く、大多数または全てを保持する。一実施形態では、抗体断片は、インタクトな抗体の抗原結合部位を含み、したがって、抗原に結合する能力を保持する。別の実施形態では、抗体断片、例えば、Ｆｃ領域を含む断片は、ＦｃＲｎ結合、抗体半減期調節、ＡＤＣＣ機能および補体結合などの、Ｆｃ領域がインタクトな抗体内に存在する場合に通常付随する生物学的機能の少なくとも１つを保持する。一実施形態では、抗体断片は、インタクトな抗体と実質的に類似したｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を有する一価抗体である。例えば、そのような抗体断片は、断片にｉｎ  ｖｉｖｏにおける安定性を付与することが可能なＦｃ配列に連結した抗原結合性アームを含んでよい。
【００８６】
「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指す、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、微量に存在し得る、可能性のある天然に存在する変異以外は同一である。したがって、「モノクローナル」という修飾語は、別個の抗体の混合物ではないという抗体の特性を示す。そのようなモノクローナル抗体は、一般には、標的に結合するポリペプチド配列を含む抗体を含み、ここで、標的結合性ポリペプチド配列は、複数のポリペプチド配列から単一の標的結合性ポリペプチド配列を選択することを含むプロセスによって得られたものである。例えば、選択プロセスは、ハイブリドーマクローン、ファージクローンまたは組換えＤＮＡクローンのプールなどの複数のクローンから固有のクローンを選択することであってよい。例えば、標的に対する親和性を改善するため、標的結合配列をヒト化するため、細胞培養物中でのその産生を改善するため、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるその免疫原性を低下させるため、多重特異性抗体を創出するためなどで、選択された標的結合配列をさらに変更できること、および、変更された標的結合配列を含む抗体も本発明のモノクローナル抗体であることが理解されるべきである。一般には異なる決定因子（エピトープ）を対象とする異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定因子を対象とする。モノクローナル抗体調製物は、それらの特異性に加えて、一般には他の免疫グロブリンが混入していないという点で有利である。「モノクローナル」という修飾語は、抗体の実質的に均一な集団から得られるという抗体の特性を示すものであり、任意の特定の方法による抗体の作製が必要であるとは解釈されない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、例えば、ハイブリドーマ法（例えば、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、２５６巻：４９５頁（１９７５年）；Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、第２版、１９８８年）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ５６３〜６８１頁（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８１年））、組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）、ファージディスプレイ技術（例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３５２巻：６２４〜６２８頁（１９９１年）；Ｍａｒｋｓら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２２巻：５８１〜５９７頁（１９９２年）；Ｓｉｄｈｕら、Ｊ．
Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３３８巻（２号）：２９９〜３１０頁（２００４年）；Ｌｅｅら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３４０巻（５号）：１０７３〜１０９３頁（２００４年）；Ｆｅｌｌｏｕｓｅ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １０１巻（３４号）：１２４６７〜１２４７２頁（２００４年）；およびＬｅｅら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２８４巻（１〜２号）：１１９〜１３２頁（２００４年）を参照されたい）、およびヒト免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子座または遺伝子の一部または全部を有する動物においてヒトまたはヒト様抗体を産生させるための技術（例えば、ＷＯ９８／２４８９３；ＷＯ９６／３４０９６；ＷＯ９６／３３７３５；ＷＯ９１／１０７４１；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０巻：２５５１頁（１９９３年）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６２巻：２５５〜２５８頁（１９９３年）；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎら、Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ７巻：３３頁（１９９３年）；米国特許第５，５４５，８０７号；５，５４５，８０６号；５，５６９，８２５号；５，６２５，１２６号；５，６３３，４２５号；５，６６１，０１６号；Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ．
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０巻：７７９〜７８３頁（１９９２年）；Ｌｏｎｂｅｒｇら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６８巻：８５６〜８５９頁（１９９４年）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ  ３６８巻：８１２〜８１３頁（１９９４年）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １４巻：８４５〜８５１頁（１９９６年）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １４巻：８２６頁（１９９６年）およびＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ、Ｉｎｔｅｒｎ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．
１３巻：６５〜９３頁（１９９５年）を参照されたい）を含めた様々な技法によって作出することができる。
【００８７】
本明細書のモノクローナル抗体は、詳細には、重鎖および／または軽鎖の一部が特定の種に由来するまたは特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同であり、鎖（複数可）の残りは、別の種に由来するまたは別の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体、ならびに所望の生物活性を示す限りはそのような抗体の断片、の対応する配列と同一または相同である「キメラ」抗体を含む（米国特許第４，８１６，５６７号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８１巻：６８５１〜６８５５頁（１９８４年））。
【００８８】
以下の総説論文およびそこに引用されている参考文献も参照されたい：ＶａｓｗａｎｉおよびＨａｍｉｌｔｏｎ、Ａｎｎ．    Ａｌｌｅｒｇｙ，  Ａｓｔｈｍａ  ＆  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １巻：１０５〜１１５頁（１９９８年）；Ｈａｒｒｉｓ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ２３巻：１０３５〜１０３８頁（１９９５年）；ＨｕｒｌｅおよびＧｒｏｓｓ、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  ５巻：４２８〜４３３頁（１９９４年）。
【００８９】
「超可変領域」、「ＨＶＲ」、または「ＨＶ」という用語は、本明細書で使用される場合、配列内で超可変性であり、および／または構造的に定義されているループを形成する抗体可変ドメインの領域を指す。一般に、抗体は、６つの超可変領域を含む；ＶＨに３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、およびＶＬに３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）。いくつもの超可変領域の記述が使用されており、本明細書に包含される。Ｋａｂａｔ相補性決定領域（ＣＤＲ）は配列の可変性に基づくものであり、最も一般的に使用されている（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９９１年））。Ｃｈｏｔｈｉａは、その代わりに、構造ループの場所に言及する（ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １９６巻：９０１〜９１７頁（１９８７年））。ＡｂＭ超可変領域は、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲとＣｈｏｔｈｉａ構造ループの折衷を示すものであり、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ’ｓ  ＡｂＭ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｓｏｆｔｗａｒｅに使用されている。「ｃｏｎｔａｃｔ」超可変領域は、入手可能な複合体結晶構造の解析に基づくものである。これらの超可変領域のそれぞれに由来する残基を以下に示す。
ループ  Ｋａｂａｔ  ＡｂＭ  Ｃｈｏｔｈｉａ  Ｃｏｎｔａｃｔ
Ｌ１  Ｌ２４−Ｌ３４  Ｌ２４−Ｌ３４  Ｌ２６−Ｌ３２  Ｌ３０−Ｌ３６
Ｌ２  Ｌ５０−Ｌ５６  Ｌ５０−Ｌ５６  Ｌ５０−Ｌ５２  Ｌ４６−Ｌ５５
Ｌ３  Ｌ８９−Ｌ９７  Ｌ８９−Ｌ９７  Ｌ９１−Ｌ９６  Ｌ８９−Ｌ９６
Ｈ１  Ｈ３１−Ｈ３５Ｂ  Ｈ２６−Ｈ３５Ｂ  Ｈ２６−Ｈ３２  Ｈ３０−Ｈ３５Ｂ
（Ｋａｂａｔ番号付け）
Ｈ１  Ｈ３１−Ｈ３５  Ｈ２６−Ｈ３５  Ｈ２６−Ｈ３２  Ｈ３０−Ｈ３５
（Ｃｈｏｔｈｉａ番号付け）
Ｈ２  Ｈ５０−Ｈ６５  Ｈ５０−Ｈ５８  Ｈ５３−Ｈ５５  Ｈ４７−Ｈ５８
Ｈ３  Ｈ９５−Ｈ１０２  Ｈ９５−Ｈ１０２  Ｈ９６−Ｈ１０１  Ｈ９３−Ｈ１０１
【００９０】
超可変領域は、以下の通り「伸長された超可変領域」を含み得る：ＶＬにおける２４−３６または２４−３４（Ｌ１）、４６−５６または５０−５６または４９−５６（Ｌ２）および８９−９７または８９−９６（Ｌ３）、ならびにＶＨにおける２６−３５（Ｈ１）、５０−６５または４９−６５（Ｈ２）および９３−１０２、９４−１０２、または９５−１０２（Ｈ３）。可変ドメイン残基は、これらの定義のそれぞれについて、Ｋａｂａｔら、上記に従って番号付けされる。
【００９１】
「フレームワーク」または「ＦＲ」残基とは、本明細書において定義される超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
【００９２】
「Ｋａｂａｔと同様の可変ドメイン残基の番号付け」または「Ｋａｂａｔと同様のアミノ酸位番号付け」という用語およびその変形は、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９９１年）における抗体の編集物（ｃｏｍｐｉｌａｔｉｏｎ）の重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインのために使用される番号付け系を指す。この番号付け系を使用して、実際の直鎖状アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲまたはＨＶＲにおける短縮、または挿入に対応して、より少ないまたは追加的なアミノ酸を含有し得る。例えば、重鎖可変ドメインは、Ｈ２の残基５２の後ろに単一のアミノ酸挿入（Ｋａｂａｔに従って残基５２ａ）、および重鎖ＦＲ残基８２の後ろに挿入残基（Ｋａｂａｔに従って例えば残基８２ａ、８２ｂ、および８２ｃなど）を含み得る。所与の抗体について、「標準の」Ｋａｂａｔ番号付けされた配列を有する抗体の配列の相同性の領域におけるアラインメントによって残基のＫａｂａｔ番号付けを決定することができる。
【００９３】
「単鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖内に存在する。一般に、ｓｃＦｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、これにより、ｓｃＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することが可能になる。ｓｃＦｖの概説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、１１３巻、ＲｏｓｅｎｂｕｒｇおよびＭｏｏｒｅ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２６９〜３１５頁（１９９４年）を参照されたい。
【００９４】
「ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）」という用語は、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片を指し、断片は、同じポリペプチド鎖内で接続した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）（ＶＨ−ＶＬ）を含む。同じ鎖上の２つのドメイン間での対形成が可能になるには短すぎるリンカーを使用することによって、ドメインは強制的に別の鎖の相補的なドメインと対形成し、２つの抗原結合部位が創出される。ダイアボディは、例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ９３／１１６１；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０巻：６４４４〜６４４８頁（１９９３年）により詳細に記載されている。
【００９５】
「ヒト抗体」とは、ヒトによって産生された抗体および／または本明細書に開示されているヒト抗体を作出するための技法のいずれかを使用して作出された抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する抗体である。このヒト抗体の定義は、非ヒト抗原結合性残基を含むヒト化抗体を明確に排除する。
【００９６】
「親和性成熟した」抗体とは、その１つまたは複数のＨＶＲに１つまたは複数の変更を伴う抗体であり、その変更により、それらの変更（複数可）を有さない親抗体と比較して、抗体の抗原に対する親和性の改善がもたらされる。一実施形態では、親和性成熟した抗体は、標的抗原に対してナノモル濃度またはさらにはピコモル濃度の親和性を有する。親和性成熟した抗体は、当技術分野で公知の手順によって作製される。Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０巻：７７９〜７８３頁（１９９２年）には、ＶＨドメインおよびＶＬドメインシャッフリングによる親和性成熟が記載されている。ＣＤＲおよび／またはフレームワーク残基のランダム変異誘発は、Ｂａｒｂａｓら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９１巻：３８０９〜３８１３頁（１９９４年）；Ｓｃｈｉｅｒら、Ｇｅｎｅ  １６９巻：１４７〜１５５頁（１９９５年）；Ｙｅｌｔｏｎら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５５巻：１９９４〜２００４頁（１９９５年）；Ｊａｃｋｓｏｎら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５４巻（７号）：３３１０〜９頁（１９９５年）；およびＨａｗｋｉｎｓら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２６巻：８８９〜８９６頁（１９９２年）により説明されている。
【００９７】
「遮断」抗体または「アンタゴニスト」抗体とは、それが結合する抗原の生物活性を阻害するまたは低下させる抗体である。ある特定の遮断抗体またはアンタゴニスト抗体は、抗原の生物活性を実質的にまたは完全に阻害する。
【００９８】
「アゴニスト抗体」とは、本明細書で使用される場合、目的のポリペプチドの機能活性の少なくとも１つを模倣する抗体である。
【００９９】
「障害」とは、本発明の抗体を用いた処置から利益を得る任意の状態である。障害には、哺乳動物に問題の障害の素因を与える病的状態を含めた慢性および急性の障害または疾患が含まれる。本明細書において処置される障害の非限定的な例としてはがんが挙げられる。
【０１００】
「細胞増殖性障害」および「増殖性障害」という用語は、ある程度の異常な細胞増殖に関連する障害を指す。一実施形態では、細胞増殖性障害はがんである。
【０１０１】
「腫瘍」とは、本明細書で使用される場合、悪性であるか良性であるかにかかわらず全ての新生細胞成長および増殖、ならびに全ての前がん性およびがん性細胞および組織を指す。「がん」、「がん性」、「細胞増殖性障害」、「増殖性障害」および「腫瘍」という用語は、本明細書で言及される場合、相互排他的なものではない。
【０１０２】
「がん」および「がん性」という用語は、一般に、調節されていない細胞成長／増殖を一般に特徴とする哺乳動物の生理的状態を指すまたは記述する。がんの例としては、これだけに限定されないが、癌腫、リンパ腫（例えば、ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫）、芽細胞腫、肉腫、および白血病が挙げられる。そのようながんのより詳細な例としては、扁平上皮細胞がん（ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｎｃｅｒ）、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺腺癌、肺扁平上皮癌（ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｕｎｇ）、腹膜がん、肝細胞がん、胃腸がん、膵がん（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ
ｃａｎｃｅｒ）、神経膠芽腫、子宮頸がん（ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、卵巣がん（ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ）、肝がん、膀胱がん、ヘパトーマ、乳がん（ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ）、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜または子宮癌、唾液腺癌、腎がん、肝がん、前立腺がん、外陰がん、甲状腺がん、肝癌、白血病および他のリンパ球増殖性障害、および種々の型の頭頸部がんが挙げられる。
【０１０３】
本明細書で使用される場合、「抗原」という用語は、免疫応答を引き出すことができる任意の物質と定義される。
【０１０４】
本明細書で使用される場合、「抗原特異的」という用語は、特定の抗原または抗原の断片の供給により特異的な細胞増殖がもたらされるような細胞集団の性質を指す。
【０１０５】
「ＣＤ２０発現がん」という用語は、本明細書で使用される場合、がん細胞がＣＤ２０抗原の発現を示す全てのがんを指す。ＣＤ２０発現がんとは、本明細書で使用される場合、リンパ腫（好ましくはＢ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ））およびリンパ性白血病を指すことが好ましい。そのようなリンパ腫およびリンパ性白血病としては、例えば、ａ）濾胞性リンパ腫、ｂ）小型非切れ込み核細胞性リンパ腫（Ｓｍａｌｌ  Ｎｏｎ−Ｃｌｅａｖｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ）／バーキットリンパ腫（地方病性バーキットリンパ腫、散発性バーキットリンパ腫および非バーキットリンパ腫を含む）、ｃ）辺縁層リンパ腫（節外周辺帯Ｂ細胞リンパ腫（粘膜関連リンパ組織リンパ腫、ＭＡＬＴを含む）、節性辺縁層Ｂ細胞リンパ腫（ｎｏｄａｌ  ｍａｒｇｉｎａｌ  ｚｏｎｅ  Ｂ  ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ）および脾性辺縁層リンパ腫（ｓｐｌｅｎｉｃ  ｍａｒｇｉｎａｌ  ｚｏｎｅ  ｌｙｍｐｈｏｍａ））、ｄ）マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、ｅ）大細胞型リンパ腫（びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＣＬ）、びまん性混合細胞型リンパ腫、免疫芽球性リンパ腫、縦隔原発Ｂ細胞リンパ腫（Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｍｅｄｉａｓｔｉｎａｌ
Ｂ−Ｃｅｌｌ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ）、血管中心性リンパ腫−肺Ｂ細胞リンパ腫（Ａｎｇｉｏｃｅｎｔｒｉｃ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ−Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  Ｂ−Ｃｅｌｌ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ）を含む）、ｆ）ヘアリー細胞白血病、ｇ）リンパ球性リンパ腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ｈ）急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）／小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、Ｂ細胞前リンパ性白血病、ｉ）形質細胞新生物、形質細胞骨髄腫、多発性骨髄腫、形質細胞腫、ｊ）ホジキン病が挙げられる。ＣＤ２０発現がんは、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）であることがより好ましい。特に、ＣＤ２０発現がんは、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＣＬ）、バーキットリンパ腫、ヘアリー細胞白血病、濾胞性リンパ腫、多発性骨髄腫、辺縁層リンパ腫、移植後リンパ増殖性障害（ＰＴＬＤ）、ＨＩＶ関連リンパ腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、またはＣＮＳ原発リンパ腫である。
【０１０６】
本明細書で使用される場合、「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」とは、処置される個体または細胞の自然経過を変更する試みにおける臨床介入を指し、予防法のためまたは臨床病理の過程中のいずれかで実施することができる。望ましい処置の効果としては、疾患の出現または再発の防止、症状の緩和、疾患のあらゆる直接または間接的な病理学的影響の減弱、炎症および／または組織／器官損傷の防止または減少、疾患の進行の速度の低下、病態の好転または一時的緩和（ｐａｌｌｉａｔｉｏｎ）、および寛解または予後の改善が挙げられる。一部の実施形態では、疾患または障害の発生を遅延させるために本発明の抗体を使用する。
【０１０７】
「個体」または「被験体」は、脊椎動物である。ある特定の実施形態では、脊椎動物は、哺乳動物である。哺乳動物としては、これだけに限定されないが、農場動物（例えば、ウシなど）、競技動物、愛玩動物（例えば、ネコ、イヌ、およびウマなど）、霊長類、マウスおよびラットが挙げられる。ある特定の実施形態では、脊椎動物は、ヒトである。
【０１０８】
「哺乳動物」とは、処置の目的に関しては、ヒト、家畜動物および農場動物、ならびに動物園の動物、競技動物、または愛玩動物、例えば、イヌ、ウマ、ネコ、ウシなどを含めた、哺乳動物に分類される任意の動物を指す。ある特定の実施形態では、哺乳動物はヒトである。
【０１０９】
「有効量」とは、治療的または予防的結果を達成するために必要な投与量および期間で有効な量を指す。
【０１１０】
本発明の物質／分子の「治療有効量」は、個体の病態、年齢、性別、および体重、ならびに個体における所望の応答を引き出す物質／分子の能力などの因子に応じて変動し得る。治療有効量は、物質／分子のあらゆる毒性の影響または有害な影響よりも治療的に有益な影響が上回る量でもある。「予防有効量」とは、所望の予防的結果を達成するために必要な投与量および期間で有効な量を指す。必ずではないが、一般に、予防用量は、被験体に疾患の前またはより早い段階で使用されるので、予防有効量は治療有効量よりも少なくなる。
【０１１１】
「細胞傷害性薬剤」という用語は、本明細書で使用される場合、細胞の機能を阻害するもしくは妨げ、かつ／または細胞の破壊を引き起こす物質を指す。この用語は、放射性同位元素（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２およびＬｕの放射性同位元素）、化学療法剤（例えば、メトトレキサート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシンまたは他の挿入剤）、核酸分解酵素などの酵素およびその断片、抗生物質、ならびに、断片および／もしくはそのバリアントを含めた、細菌、真菌、植物または動物起源の小分子毒素もしくは酵素的に活性な毒素などの毒素、ならびに以下に開示されている種々の抗腫瘍剤または抗がん剤を含むものとする。他の細胞傷害性薬剤が下に記載されている。殺腫瘍剤（ｔｕｍｏｒｉｃｉｄａｌ  ａｇｅｎｔ）は腫瘍細胞の破壊を引き起こすものである。
【０１１２】
「化学療法剤」はがんの処置において有用な化学化合物である。化学療法剤の例としては、チオテパおよびＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｓｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）などのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファンなどのアルキルスルホネート；ベンゾドパ、カルボコン、メツレドパ、およびウレドパなどのアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミドおよびトリメチルオロメラミンを含めた、エチレンイミンおよびメチルアメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅ）；アセトゲニン（特に、ブラタシンおよびブラタシノン）；デルタ−９−テトラヒドロカンナビノール（ドロナビノール、ＭＡＲＩＮＯＬ（登録商標））；ベータ−ラパコン（ｌａｐａｃｈｏｎｅ）；ラパコール（ｌａｐａｃｈｏｌ）；コルヒチン；ベツリン酸；カンプトテシン（合成類似体トポテカン（ＨＹＣＡＭＴＩＮ（登録商標））、ＣＰＴ−１１（イリノテカン、ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標））、アセチルカンプトテシン、スコポレチン（ｓｃｏｐｏｌｅｃｔｉｎ）、および９−アミノカンプトテシンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシンおよびビゼレシン合成類似体を含む）；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸；テニポシド；クリプトフィシン（特に、クリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体、ＫＷ−２１８９およびＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エリュテロビン；パンクラチスタチン（ｐａｎｃｒａｔｉｓｔａｔｉｎ）；サルコジクチイン（ｓａｒｃｏｄｉｃｔｙｉｎ）；スポンギスタチン（ｓｐｏｎｇｉｓｔａｔｉｎ）；クロラムブシル、クロマファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベムビシン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、およびラニムスチン（ｒａｎｉｍｎｕｓｔｉｎｅ）などのニトロソ尿素（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａ）；エンジイン抗生物質（例えば、カリチアマイシン、特に、カリチアマイシンガンマ１ＩおよびカリチアマイシンオメガＩ１など（例えば、Ａｇｎｅｗ、Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔｌ．  Ｅｄ．  Ｅｎｇｌ．、３３巻：１８３〜１８６頁（１９９４年）を参照されたい）；ジネミシン（ｄｙｎｅｍｉｃｉｎ）Ａを含めたジネミシン；エスペラミシン；ならびにネオカルジノスタチン発色団および関連する色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団）、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カルビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン（ｃｈｒｏｍｏｍｙｃｉｎｉｓ）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）ドキソルビシン（モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシンおよびデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン（ｅｓｏｒｕｂｉｃｉｎ）、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；メトトレキサートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）などの代謝拮抗薬；デノプテリン（ｄｅｎｏｐｔｅｒｉｎ）、メトトレキサート、プテロプテリン（ｐｔｅｒｏｐｔｅｒｉｎ）、トリメトレキサートなどの葉酸類似体；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどのプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジンなどのピリミジン類似体；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなどのアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなどの抗副腎剤（ａｎｔｉ−ａｄｒｅｎａｌ）；フォリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）などの葉酸補充剤；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド（ａｌｄｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ  ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ）；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキセート；デフォファミン；デメコルチン；ジアジクオン；エルフロルニチン（ｅｌｆｏｒｍｉｔｈｉｎｅ）；エリプチニウム（ｅｌｌｉｐｔｉｎｉｕｍ）酢酸塩；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダイニン（ｌｏｎｉｄａｉｎｉｎｅ）；マイタンシンおよびアンサマイトシンなどのメイタンシノイド；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール（ｍｏｐｉｄａｎｍｏｌ）；ニトラクリン（ｎｉｔｒａｅｒｉｎｅ）；ペントスタチン；フェナメット（ｐｈｅｎａｍｅｔ）；ピラルビシン；ロソキサントロン（ｌｏｓｏｘａｎｔｒｏｎｅ）；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）多糖複合体（ＪＨＳ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇ）；ラゾキサン；リゾキシン（ｒｈｉｚｏｘｉｎ）；シゾフラン（ｓｉｚｏｆｕｒａｎ）；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特に、Ｔ−２毒素、ベラクリン（ｖｅｒｒａｃｕｒｉｎ）Ａ、ロリジン（ｒｏｒｉｄｉｎ）Ａおよびアングイジン（ａｎｇｕｉｄｉｎｅ））；ウレタン；ビンデシン（ＥＬＤＩＳＩＮＥ（登録商標）、ＦＩＬＤＥＳＩＮ（登録商標））；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；チオテパ；タキソイド、例えば、ＴＡＸＯＬ（登録商標）パクリタキセル（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．）、パクリタキセルのアルブミンで工学的に操作したナノ粒子製剤であるＡＢＲＡＸＡＮＥ（商標）Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ−ｆｒｅｅ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ、Ｓｃｈａｕｍｂｅｒｇ、Ｉｌｌ．）、およびＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）ドセタキセル（ｄｏｘｅｔａｘｅｌ）（Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ、Ａｎｔｏｎｙ、Ｆｒａｎｃｅ）；クロラムブシル（ｃｈｌｏｒａｎｂｕｃｉｌ）；ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ（登録商標））；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチンおよびカルボプラチンなどの白金類似体；ビンブラスチン（ＶＥＬＢＡＮ（登録商標））；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン（ＯＮＣＯＶＩＮ（登録商標））；オキサリプラチン；ロイコボリン（ｌｅｕｃｏｖｏｖｉｎ）；ビノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標））；ノバントロン（ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ）；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロネート；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸などのレチノイド；カペシタビン（ＸＥＬＯＤＡ（登録商標））；上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体；ならびに、上記の２つまたはそれ超の組合せ、例えば、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレドニゾロンの併用療法の略語であるＣＨＯＰ、および、オキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮ（商標））と５−ＦＵおよびロイコボリン（ｌｅｕｃｏｖｏｖｉｎ）の組み合わせの処置レジメンの略語であるＦＯＬＦＯＸなどが挙げられる。
【０１１３】
本明細書で使用される場合、「処置」とは、処置される個体または細胞の自然経過を変更する試みにおける臨床介入を指し、予防法のためまたは臨床病理の過程中のいずれかで実施することができる。望ましい処置の効果としては、疾患の出現または再発の防止、症状の緩和、疾患のあらゆる直接または間接的な病理学的影響の減弱、炎症および／または組織／器官損傷の防止または減少、疾患の進行の速度の低下、病態の好転または一時的緩和、および寛解または予後の改善が挙げられる。一部の実施形態では、疾患または障害の発生を遅延させるために本発明の抗体を使用する。
【０１１４】
「個体」または「被験体」は、脊椎動物である。ある特定の実施形態では、脊椎動物は、哺乳動物である。哺乳動物としては、これだけに限定されないが、農場動物（例えば、ウシなど）、競技動物、愛玩動物（例えば、ネコ、イヌ、およびウマなど）、霊長類、マウスおよびラットが挙げられる。ある特定の実施形態では、脊椎動物は、ヒトである。
【０１１５】
「哺乳動物」とは、処置の目的に関しては、ヒト、家畜動物および農場動物、ならびに動物園の動物、競技動物、または愛玩動物、例えば、イヌ、ウマ、ネコ、ウシなどを含めた、哺乳動物に分類される任意の動物を指す。ある特定の実施形態では、哺乳動物はヒトである。
【０１１６】
「有効量」とは、所望される治療的または予防的結果を達成するために必要な投与量および期間で有効な量を指す。
【０１１７】
本発明の物質／分子の「治療有効量」は、個体の病態、年齢、性別、および体重、ならびに個体における所望の応答を引き出す物質／分子の能力などの因子に応じて変動し得る。治療有効量は、物質／分子のあらゆる毒性の影響または有害な影響よりも治療的に有益な影響が上回る量でもある。「予防有効量」とは、所望の予防的結果を達成するために必要な投与量および期間で有効な量を指す。必ずではないが、一般に、予防用量は、被験体に疾患の前またはより早い段階で使用されるので、予防有効量は治療有効量よりも少なくなる。
【０１１８】
「細胞傷害性薬剤」という用語は、本明細書で使用される場合、細胞の機能を阻害するもしくは妨げ、かつ／または細胞の破壊を引き起こす物質を指す。この用語は、放射性同位元素（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２およびＬｕの放射性同位元素）、化学療法剤（例えば、メトトレキサート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシンまたは他の挿入剤）、核酸分解酵素などの酵素およびその断片、抗生物質、ならびに、その断片および／もしくはバリアントを含めた、細菌、真菌、植物または動物起源の小分子毒素もしくは酵素的に活性な毒素などの毒素、および以下に開示されている種々の抗腫瘍剤または抗がん剤を含むものとする。他の細胞傷害性薬剤が下に記載されている。殺腫瘍剤は腫瘍細胞の破壊を引き起こすものである。
【０１１９】
「処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」または「緩和（ａｌｌｅｖｉａｔｉｏｎ）」とは、治療的処置および予防または防止措置の両方を指し、ここで、目的は、標的とした病的状態または障害を防止するまたは減速させる（減らす）ことである。処置を必要とするものとしては、すでに障害を有するものならびに障害を有しやすいものまたは障害が防止されるべきものが挙げられる。被験体または哺乳動物は、治療量の抗体を本発明の方法に従って受けた後、患者が以下のうちの１つまたは複数の観察可能かつ／または測定可能な低下または不在を示した場合、感染に対して成功裏に「処置」されている：感染細胞の数の低下または感染細胞の不在；感染した総細胞のパーセントの低下；ならびに／または特定の感染に付随する症状のうちの１つまたは複数のいくらかの程度までの軽減；罹患率および死亡率の低下、ならびに生活の質の問題の改善。疾患における成功裏の処置および改善を評価するための上記のパラメータは医師によく知られている常套的な手順によって容易に測定可能である。
【０１２０】
「治療有効量」という用語は、被験体または哺乳動物における疾患または障害を「処置する」ために有効な抗体または薬物の量を指す。前述の「処置すること」の定義を参照されたい。
【０１２１】
１種または複数種の別の治療剤「と組み合わせた（ｉｎ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ）」投与は、同時（並行（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔ））投与および任意の順序での連続した（ｃｏｎｓｅｃｕｔｉｖｅ）投与を含む。
【０１２２】
「担体」とは、本明細書で使用される場合、使用される投与量および濃度でそれに暴露される細胞または哺乳動物に対して非毒性である、薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤を含む。多くの場合、生理的に許容される担体は、水性ｐＨ緩衝溶液である。生理的に許容される担体の例としては、リン酸、クエン酸、および他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸を含めた抗酸化剤；低分子量（約１０残基未満の）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンもしくはリシンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含めた単糖、二糖、および他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；マンニトールもしくはソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成性対イオン；ならびに／またはＴＷＥＥＮ（商標）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）などの非イオン性界面活性剤が挙げられる。
【０１２３】
糖操作抗体群
培養物中で哺乳動物細胞から産生された組換えタンパク質のグリコシル化は、治療用抗体の有効な使用を確実にすることにおける重要なプロセスである（Ｇｏｏｃｈｅｅら、１９９１年；ＪｅｎｋｉｎｓおよびＣｕｒｌｉｎｇ、１９９４年）。哺乳動物の細胞培養では、全てが同じ性質を有するわけではない、グリコシル化パターンの不均一な混合物が送達される。治療用タンパク質の安全性、有効性および血清中半減期のような性質は、これらのグリコシル化パターンの影響を受ける可能性がある。本発明者らは、「糖操作抗体群（ｇｌｙｃｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」という名称の新規クラスのモノクローナル抗体を開発することにより、グリコフォーム不均一性問題に成功裏に対処した。
【０１２４】
糖操作抗体群は、市販されているまたは開発中のモノクローナル抗体（好ましくは、治療用モノクローナル抗体）から生成することができる。治療的使用のためのモノクローナル抗体は、ヒト化モノクローナル抗体、ヒトモノクローナル抗体またはキメラモノクローナル抗体であってよい。治療的使用のための認可されたモノクローナル抗体の例としては、これだけに限定されないが、ムロモナブ（Ｍｕｒｏｍｏｍａｂ）、アブシキシマブ、リツキシマブ、ダクリズマブ、バシリキシマブ、パリビズマブ、インフリキシマブ、トラスツズマブ、エタネルセプト、ゲムツズマブ、アレムツズマブ、イブリツモマブ（Ｉｂｒｉｔｏｍｏｍａｂ）、アダリムマブ、アレファセプト、オマリズマブ、エファリズマブ、セツキシマブ、ベバシズマブ、ナタリズマブ、ラニビズマブ、パニツムマブ、エクリズマブおよびセルトリズマブが挙げられる。
【０１２５】
治療用モノクローナル抗体からＦｃ糖鎖工学によって導出された機能的に活性な糖操作抗体群が本明細書に記載されている。最適化グリコフォームを有する糖操作抗体群は、治療用モノクローナル抗体と比較してより強力な生物活性を示す。最適化グリコフォームを有する糖操作抗体群により、治療的使用のための代替物がもたらされ得ることが意図されている。
【０１２６】
抗ＣＤ２０糖操作抗体群（抗ＣＤ２０ＧＡｂ）
「ＣＤ２０」抗原は、末梢血またはリンパ系器官に由来するＢ細胞の９０％超の表面に見いだされる、分子量およそ３５ｋＤの非グリコシル化膜貫通リンタンパク質である。ＣＤ２０は、初期プレＢ細胞発生の間に発現し、形質細胞分化まで残る。ＣＤ２０は、ヒト幹細胞、リンパ球前駆細胞または正常な形質細胞においては見いだされない。ＣＤ２０は、正常なＢ細胞ならびに悪性Ｂ細胞のどちらにも存在する。文献におけるＣＤ２０に対する他の名称としては、「Ｂリンパ球制限分化抗原」および「Ｂｐ３５」が挙げられる。ＣＤ２０抗原は、例えば、ＣｌａｒｋおよびＬｅｄｂｅｔｔｅｒ、Ａｄｖ．  Ｃａｎ  Ｒｅｓ．  ５２巻：８１〜１４９頁（１９８９年）およびＶａｌｅｎｔｉｎｅら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６４巻（１９号）：１１２８２〜１１２８７頁（１９８９年）に記載されている。
【０１２７】
本開示は、「抗ＣＤ２０糖操作抗体群」（「抗ＣＤ２０ＧＡｂ」）と称される新規クラスの抗ＣＤ２０抗体を特徴とする。抗ＣＤ２０糖操作抗体群は、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体からＦｃ糖鎖工学によって生成することができる。均一な集団を構成する個々の抗ＣＤ２０糖操作抗体群は同一であり、明確に定義されたグリカン構造および配列を有する同じＦｃグリカンを含有する。本発明による抗ＣＤ２０ＧＡｂは、その親抗体が結合するのと同じ、細胞膜上のヒトＣＤ２０抗原のエピトープに特異的に結合する。
【０１２８】
「親抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、抗ＣＤ２０糖操作抗体を作製するために使用される抗ＣＤ２０モノクローナル抗体を指す。
【０１２９】
親抗体は、哺乳動物細胞培養物、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓまたは昆虫細胞株などの細胞培養によって得ることができる。親抗体は哺乳動物細胞培養物中で産生されることが好ましい。親抗体はＦＤＡの認可を受けたものであってもよく、開発中のものであってもよい。例示的な親抗体としては、これだけに限定されないが、リツキシマブ、オファツムマブ、トシツモマブ、オクレリズマブ、１１Ｂ８または７Ｄ８（ＷＯ２００４／０３５６０７に開示されている）、Ｃ６などの、ＷＯ２００５／１０３０８１に開示されている抗ＣＤ２０抗体、ＩＭＭＵ−１０６（Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ）などの、ＷＯ２００３／６８８２１に開示されている抗ＣＤ抗体、ＡＭＥ−１３３（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ／Ｌｉｌｌｙ）などの、ＷＯ２００４／１０３４０４に開示されている抗ＣＤ２０抗体、および、ＴＲＵ−０１５（Ｔｒｕｂｉｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ）などの、ＵＳ２００３／０１１８５９２に開示されている抗ＣＤ２０抗体、「Ｙ２Ｂ８」（ＺＥＶＡＬＩＮ（登録商標））（Ｂｉｏｇｅｎ−Ｉｄｅｃ，Ｉｎｃ．）と称される９０Ｙ標識２Ｂ８マウス抗体（例えば、米国特許第５，７３６，１３７号、Ａｎｄｅｒｓｏｎら；ＡＴＣＣ寄託物ＨＢ１１３８８）；マウスおよびキメラ２Ｈ７抗体（例えば、米国特許第５，６７７，１８０号、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら）；ｒｈｕＭＡｂ２Ｈ７および他のバージョン（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）などのヒト化２Ｈ７抗体（例えば、ＷＯ２００４／０５６３１２、Ａｄａｍｓら、および下に示されている他の参考文献）；ＣＤ２０に対するヒトモノクローナル抗体（ＧｅｎＭａｂ  Ａ／Ｓ／Ｍｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．）（例えば、ＷＯ２００４／０３５６０７およびＷＯ２００５／１０３０８１、Ｔｅｅｌｉｎｇら）；ＣＤ２０の細胞外エピトープに結合するキメラ化またはヒト化モノクローナル抗体（Ｂｉｏｍｅｄｉｃｓ  Ｉｎｃ．）（例えば、ＷＯ２００６／１０６９５９、Ｎｕｍａｚａｋｉら）；ヒト化ＬＬ２および同様の抗体（Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ，Ｉｎｃ．）（例えば、米国特許第７，１５１，１６４号およびＵＳ２００５／０１０６１０８、Ｈａｎｓｅｎ）；キメラＡ２０（ｃＡ２０）またはヒト化Ａ２０抗体（ｈＡ２０、ＩＭＭＵＮ−１０６Ｔ、ベルツズマブ）などのＡ２０抗体（Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ，Ｉｎｃ．）（例えば、ＵＳ２００３／０２１９４３３、Ｈａｎｓｅｎら）；ＣＤ２０に対する完全ヒト抗体（Ａｍｇｅｎ／ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）（例えば、ＷＯ２００６／１３０４５８、Ｇａｚｉｔら）；ＣＤ２０に対する抗体（Ａｖｅｓｔｈａ  Ｇｅｎｇｒａｉｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｐｖｔ  Ｌｔｄ．）（例えば、ＷＯ２００６／１２６０６９、Ｍｏｒａｗａｌａ）；および、ＧＡ１０１などの、ＣＤ２０に対するキメラまたはヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体（Ｒｏｃｈｅ／ＧｌｙｃＡｒｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＡＧ）（例えば、ＷＯ２００５／０４４８５９；ＵＳ２００５／０１２３５４６；ＵＳ２００４／００７２２９０；およびＵＳ２００３／０１７５８８４、Ｕｍａｎａら）が挙げられる。
【０１３０】
一部の実施形態では、本明細書に記載の例示的な抗ＣＤ２０ＧＡｂは、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する重鎖、および配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む。好ましい実施形態では、抗ＣＤ２０ＧＡｂは、リツキシマブの軽鎖配列および重鎖配列を含む。
【０１３１】
以下の表１は、リツキシマブの重鎖および軽鎖配列を示す。
【表１】
2020171312.tif 000002
【０１３２】
一部の実施形態では、Ｎ−グリカンはＦｃ領域のＡｓｎ−２９７に付着している。
【０１３３】
本発明によるＮ−グリカンは、「トリマンノースコア」または「五糖コア」とも称されるＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２という共通の五糖コアを有し、ここで、「Ｍａｎ」はマンノースを指し、「Ｇｌｃ」はグルコースを指し、「ＮＡｃ」はＮ−アセチルを指し、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミンを指す。
【０１３４】
一部の実施形態では、Ｎ−グリカンは二分岐構造を有する。
【０１３５】
本明細書に記載のＮ−グリカンは、「バイセクティング」ＧｌｃＮＡｃを含む鎖内置換を有し得る。グリカンがトリマンノースコア上にバイセクティングＧｌｃＮＡｃを含む場合、構造は、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ３と表される。グリカンがトリマンノースコアに付着したコアフコースを含む場合、構造は、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆ）と表される。Ｎ−グリカンは、１つまたは複数の末端シアル酸（例えば、Ｎ−アセチルノイラミン酸）を含んでよい。「Ｓｉａ」と表される構造は、末端シアル酸を指す。シアリル化は、二分岐構造のα１−３アームまたはα１−６アームのいずれかにおいて起こり得る。
【０１３６】
一部の実施形態では、本明細書に記載のＮ−グリカンは、α２−６末端シアル酸を少なくとも１つ含む。ある特定の実施形態では、Ｎ−グリカンは、α２−６末端シアル酸を１つ含む。好ましい実施形態では、Ｎ−グリカンは、α２−６末端シアル酸を２つ含む。
【０１３７】
一部の実施形態では、本明細書に記載のＮ−グリカンは、α２−３末端シアル酸を少なくとも１つ含む。ある特定の実施形態では、Ｎ−グリカンは、α２−３末端シアル酸を１つ含む。好ましい実施形態では、Ｎ−グリカンは、α２−３末端シアル酸を２つ含む。
【０１３８】
一部の実施形態では、本明細書に記載のＮ−グリカンは、ガラクトースを少なくとも１つ含む。ある特定の実施形態では、Ｎ−グリカンは、ガラクトースを１つ含む。好ましい実施形態では、Ｎ−グリカンは、ガラクトースを２つ含む。
【０１３９】
本開示によるＮ−グリカンは、コアフコースを含まないことが好ましい。
【０１４０】
表２は、抗ＣＤ２０糖操作抗体群における例示的なＮ−グリカンの一覧である。本開示の複数の実施形態は、本明細書において列挙されているＮ−グリカンのいずれを含んでもよく排除してもよい。
【表２−１】
2020171312.tif 000003
【表２−２】
2020171312.tif 000004
【表２−３】
2020171312.tif 000005
【０１４１】
抗ＣＤ２０糖操作抗体群の生物学的特性
Ｆｃにおけるグリコシル化は、ＡＤＣＣ、ＣＤＣおよび循環半減期を含めた種々の免疫グロブリンエフェクター媒介性機能に影響を及ぼす可能性がある。ＡＤＣＣ増強は、治療用抗体の薬効を改善するための重要な戦略である。ＡＤＣＣ増強には、薬物費用の低減という利益のために、有効薬物投与量を低減させる潜在性がある。本明細書に記載の抗ＣＤ２０糖操作抗体群は、機能的性質を特徴とし得る。抗ＣＤ２０ＧＡｂには、ヒトＣＤ２０発現細胞に対するアポトーシスを含めた細胞増殖阻害活性がある。一部の実施形態では、抗ＣＤ２０ＧＡｂは、その親抗体と比較してより強力な細胞増殖阻害活性を示す。
【０１４２】
抗ＣＤ２０糖操作抗体群のＡＤＣＣ活性
本発明による糖操作抗体のＡＤＣＣ活性の増大は、これだけに限定されないが、親抗体のＡＤＣＣ活性と比較して、少なくとも約６倍、約７倍、約８倍、約９倍  約１０倍、約１５倍、約２０倍、約２５倍、約３０倍、約３５倍、約４０倍、約５０倍、約６０倍、および約８０倍を含め、少なくとも約５倍、または、少なくともおよそ、本明細書において列挙されている任意の２つの数字の間の範囲内の値である。
【０１４３】
表３は、リツキシマブと比較した抗ＣＤ２０ＧＡｂｓのＡＤＣＣ活性の増強の例の一覧である。例示的なアッセイは、実施例に記載されている。
【表３】
2020171312.tif 000006
【０１４４】
本明細書に記載のいくつかの抗ＣＤ２０ＧＡｂｓ、特にＧＡｂ１０１およびＧＡｂ１０４は、その親抗体であるリツキシマブと比較してＡＤＣＣ活性の増強を示す。本発明の糖操作抗体群は、Ｂ細胞媒介性悪性腫瘍およびＢ細胞またはＢ細胞によって産生される抗体が関与する免疫学的疾患に対する治療剤として優れた効果を示し得、治療剤の開発における抗ＣＤ２０ＧＡｂの使用は本発明の目的であることが意図されている。
【０１４５】
抗ＣＤ２０糖操作抗体群のＣＤＣ活性
驚いたことに、本明細書に記載の糖操作抗体により、ＣＤＣに影響を及ぼすことなく、ＡＤＣＣの改善をもたらすことができる。例示的なＣＤＣアッセイが実施例に記載されている。例示的な実施形態では、糖操作抗体のＡＤＣＣは増大するが、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）などの他の免疫グロブリン型エフェクター機能は同様のままである、または有意には影響を受けない。
【０１４６】
ＦｃγＲＩＩＩと抗ＣＤ２０糖操作抗体群の間の結合
表５は、抗ＣＤ２０ＧＡｂｓおよびリツキシマブの例示的なＦｃγＲＩＩＩＡ結合の一覧である。ＦｃγＲＩＩＩＡ結合は、当技術分野で公知のアッセイを使用して測定することができる。例示的なアッセイが実施例に記載されている。Ｆｃ受容体結合は、抗ＣＤ２０ＧＡｂとリツキシマブの相対比として決定することができる。例示的な実施形態では、Ｆｃ受容体結合は、少なくとも１．２倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍または２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍またはそれを超えて増大する。
【表４】
2020171312.tif 000007
【０１４７】
結合データから、リツキシマブと比較して、抗ＣＤ２０ＧＡｂｓ、特にＧＡｂ１０１およびＧＡｂ１０４が標的分子ＣＤ２０に対してより強力な結合親和性を示すことが示された。
【０１４８】
総合すると、抗ＣＤ２０Ｇａｂｓは、リツキシマブと比較して、ＡＤＣＣ活性の増強およびより強力なＦｃγＲＩＩＩＡ結合親和性を示す。本発明の糖操作抗体群により、単独で、またはそのような抗体を２種またはそれ超含む組成物中のいずれかで、および場合によって化学療法などの他の処置と組み合わせて、優れた臨床応答をもたらすことができることが意図されている。ＡＤＣＣが増強された抗ＣＤ２０糖操作抗体により、Ｂ細胞リンパ腫および他の疾患に対する代替治療薬をもたらすことができることが意図されている。本発明の糖操作抗体群のエフェクター機能の増大は、より低濃度かつ低頻度で投薬することが可能になり、それにより、抗体毒性および／または抗体耐性の発生の潜在性が減少することを意味するので、有利なことに、本発明の糖操作抗体群を使用して、現在の投与経路および現在の治療レジメンを変更することができる。さらに、エフェクター機能の改善により、組換え宿主系で産生された対応する抗ＣＤ２０モノクローナル抗体を用いた処置には以前に抵抗性または不応性であった臨床的適応症を処置するための新しい手法がもたらされる。
【０１４９】
抗ＣＤ２０ＧＡｂの調製
本発明の抗ＣＤ２０糖操作抗体群は、市販されているまたは前臨床または臨床開発中の抗ＣＤ２０モノクローナル抗体（「親抗体」）からＦｃ糖鎖工学によって作製することができる。モノクローナル抗体は治療用モノクローナル抗体であることが好ましい。Ｆｃ糖鎖工学は、酵素的にまたは化学酵素的に行うことができる。好ましい実施形態では、親抗体はリツキシマブである。
【０１５０】
本発明の糖操作抗体群におけるＮ−グリカンは、脱フコシル化されていることが好ましい。
【０１５１】
Ｎ−グリカンの脱フコシル化は、ＦｃドメインのＮ−グリカン内のコアフコースを除去するプロセスである。脱フコシル化は酵素的に使用することができる。Ｎ−グリカンは２つのＦｃドメイン間に埋め込まれているので、酵素的脱フコシル化効率は、立体的な障害、すなわち、フコシダーゼのフコース残基への接近がＦｃドメインの一部によって遮断されることに起因して、はるかに低い。
【０１５２】
多くのα−フコシダーゼが当技術分野で公知である。例としては、Ｔｕｒｂｏ  ｃｏｒｎｕｔｕｓ、Ｃｈａｒｏｎｉａ  ｌａｍｐａｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｕｌｍｉｎａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、ウシ腎臓（Ｇｌｙｋｏ）、ニワトリ肝臓に由来するα−フコシダーゼ（Ｔｙａｇａｒａｊａｎら、１９９６年、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ６巻：８３〜９３頁）およびＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｎｉｈｏｔｉｓに由来するα−フコシダーゼＩＩ（Ｇｌｙｋｏ、ＰＲＯｚｙｍｅ）が挙げられる。同様に多種多様なフコシダーゼが市販されている（とりわけ、Ｇｌｙｋｏ、Ｎｏｖａｔｏ、Ｃａｌｉｆ．；ＰＲＯｚｙｍｅ、Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ、Ｃａｌｉｆ．；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｏｒｐ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）。しかし、コアフコースをＮ結合グリカンから効率的に除去することが分かっているα−フコシダーゼは存在しない。
【０１５３】
ＷＯ２０１３／１２０６６では、ウシ腎臓由来のα−フコシダーゼによる（Ｆｕｃα１，６）ＧｌｃＮＡｃ−リツキシマブの脱フコシル化が開示された。ＷＯ２０１３／１２０６６に記載の通り、（Ｆｕｃα１，６）ＧｌｃＮＡｃ−リツキシマブの反応混合物をウシ腎臓由来のα−フコシダーゼ（Ｐｒｏｚｙｍｅから市販されている）と一緒に３７℃で２０日間インキュベートして、（Ｆｕｃα１，６）ＧｌｃＮＡｃ−リツキシマブのフコースが完全に除去された。
【０１５４】
免疫グロブリンの熱不安定性が報告されている（Ｖｅｒｍｅｅｒら、Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｊ．  Ｊａｎ  ７８巻：３９４〜４０４頁（２０００年））。Ｆａｂ断片は加熱処理に対する感受性が最も高く、一方、Ｆｃ断片は、ｐＨの低下に対する感受性が最も高い。抗体の熱安定性および機能活性を検査するために、ＷＯ２０１３／１２０６６に記載されているものと同じ実験を実施し、３７℃で３日間熱処理した後に抗体がＣＤ２０に対する結合親和性を約１０％失ったことを見いだした。さらに、本発明者らは、３７℃で７日間熱処理した後に抗体がＣＤ２０に対する結合親和性を約２０％失ったことを見いだした。ＷＯ２０１３／１２０６６に記載の通り、抗体のＣＤ２０に対する結合親和性は、３７℃で２０日間などの持続的な熱処理後に有意に失われることが意図されている。
【０１５５】
治療的価値が改善された糖操作抗体群を合成するための本発明者らの試みにおいて、Ｎ結合グリカンからフコース残基を効率的に除去することができるＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ
ｆｒａｇｉｌｉｓ  α−フコシダーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＹＰ＿２１２８５５．１）が予想外に発見された。効率的な脱フコシル化は、特定の酵素を使用して成功裏に達成されている。重要なことに、本発明の糖操作抗体群の作出効率は、図１において例示されているように、容易なＮ−グリカンの脱フコシル化をもたらす特定のα−フコシダーゼを使用することによって有益に改善されている。
【０１５６】
したがって、本発明は、α−フコシダーゼの組成物、および、α−フコシダーゼを使用してＮ−グリカンのコアフコースを除去するための、改善された方法を提供する。α−フコシダーゼは、配列番号５またはそのバリアントの配列に対して少なくとも８０％、８５％  ９０％、９５％、９８％または９９％同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。脱フコシル化の改善された方法は、抗体をα−フコシダーゼと接触させるステップを含み、ここで、α−フコシダーゼは、配列番号５、そのバリアントまたは断片の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
【０１５７】
抗ＣＤ２０糖操作抗体を作出するための、改善された方法であって、（ａ）抗ＣＤ２０モノクローナル抗体をα−フコシダーゼおよび少なくとも１種のエンドグリコシダーゼと接触させ、それにより、単一のＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を有する脱フコシル化抗体を得るステップと、（ｂ）適切な条件下でＧｌｃＮＡｃに炭水化物部分を付加するステップと、を含む方法が本明細書の記載に含まれる。
【０１５８】
一部の実施形態では、本発明の方法による抗ＣＤ２０モノクローナル抗体はリツキシマブである。
【０１５９】
Ｎ−グリカン内のオリゴ糖の可変性部分を切り取るために、エンドグリコシダーゼを使用する。本明細書で使用されるエンドグリコシダーゼの例としては、これだけに限定されないが、ＥｎｄｏＡ、ＥｎｄｏＦ、ＥｎｄｏＦ１、ＥｎｄｏＦ２、ＥｎｄｏＦ３、ＥｎｄｏＨ、ＥｎｄｏＭ、ＥｎｄｏＳ、ＥｎｄｏＳ２およびそのバリアントが挙げられる。
【０１６０】
本発明の方法によるα−フコシダーゼは、配列番号５、その機能的バリアントの配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
【０１６１】
一部の実施形態では、α−フコシダーゼは、配列番号５、そのバリアントまたは断片の配列に対して少なくとも９０％または９５％同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
【０１６２】
ある特定の実施形態では、α−フコシダーゼは、組換えＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  α−フコシダーゼである。
【表５】
2020171312.tif 000008
【０１６３】
本発明の方法のステップ（ａ）により、単一のＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を有する脱フコシル化抗体が導かれる。その後、トランスグリコシラーゼを使用した酵素媒介性グリコシル化を実施して、指定の炭水化物部分をＧｌｃＮＡｃに付加し、糖鎖を伸長させる。したがって、糖操作抗体群の均一な集団を作製することができる。本明細書に記載のトランスグリコシラーゼの例としては、これだけに限定されないが、ＥｎｄｏＡ、ＥｎｄｏＦ、ＥｎｄｏＦ１、ＥｎｄｏＦ２、Ｅｎｄｏ  Ｆ３、ＥｎｄｏＨ、ＥｎｄｏＭ、ＥｎｄｏＳ、Ｅｎｄｏ  Ｓ２およびそのバリアントが挙げられる。
【０１６４】
一部の実施形態では、本発明の方法による炭水化物部分は、Ｓｉａ２（α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−３／α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−６／α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−３／α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−６／α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−６）ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−３）ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−６）ＧａｌＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−３）ＧａｌＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２およびＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群より選択される。
【０１６５】
好ましい実施形態では、炭水化物部分は、Ｓｉａ２（α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−３／α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−６／α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−３／α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−６／α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−６）ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−３）ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−６）ＧａｌＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−３）ＧａｌＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２およびＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群より選択される。
【０１６６】
本発明の方法におけるステップ（ｂ）により、糖鎖の伸長が導かれる。糖鎖を伸長させるための１つの方法は、酵素により触媒されるグリコシル化反応を通じたものである。グリコシル化反応は付加反応であり、いかなる酸、水などの付随的な排除も伴わずに進行するので、酵素により触媒されるグリコシル化反応の中でも、糖ドナーとして糖オキサゾリンを使用するグリコシル化がオリゴ糖の合成に関して有用であることが当技術分野で周知である（Ｆｕｊｉｔａら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ  ２００１年、１５２８巻、９〜１４頁）。
【０１６７】
一部の実施形態では、炭水化物部分は、糖オキサゾリンである。
【０１６８】
適切な条件は、反応混合物を少なくとも２０分、３０分、４０分、５０分、６０分、７０分、８０分、９０分または１００分、好ましくは６０分未満にわたってインキュベートすることも含む。インキュベーションは室温で行うことが好ましく、およそ２０℃、２５℃、３０℃、３５℃、４０℃または４５℃で行うことがより好ましく、およそ３７℃で行うことが最も好ましい。
【０１６９】
本発明のα−フコシダーゼのポリペプチドは、それらの単離または精製を補助するために、誘導体化または修飾することができることが理解されよう。したがって、本発明の一実施形態では、本発明において使用するためのポリペプチドを、分離手段に直接かつ特異的に結合することができるリガンドを付加することによって誘導体化または修飾する。あるいは、ポリペプチドを、結合対の一方のメンバーを付加することによって誘導体化または修飾し、分離手段に、結合対の他方のメンバーを付加することによって誘導体化または修飾される試薬を含める。任意の適切な結合対を使用することができる。本発明において使用するためのポリペプチドを、結合対の一方のメンバーを付加することによって誘導体化または修飾する好ましい実施形態では、ポリペプチドにヒスチジン−タグを付けるまたはビオチン−タグを付けることが好ましい。一般には、ヒスチジンまたはビオチンタグのアミノ酸コード配列を遺伝子レベルで含め、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて組換えによりタンパク質を発現させる。ヒスチジンまたはビオチンタグは、一般には、ポリペプチドの一端、Ｎ末端またはＣ末端のいずれかに存在する。ヒスチジンタグは、一般には６つのヒスチジン残基からなるが、これより長くてもよく、一般には、最大７アミノ酸、８アミノ酸、９アミノ酸、１０アミノ酸または２０アミノ酸またはそれ未満、例えば、５アミノ酸、４アミノ酸、３アミノ酸、２アミノ酸または１アミノ酸であってよい。さらに、ヒスチジンタグは、アミノ酸置換、好ましくは上で定義されている保存的置換を１つまたは複数含有してよい。
【０１７０】
本明細書に記載のバリアントポリペプチドは、アミノ酸配列が配列番号５のものから変動するものであるが、配列番号５のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む酵素の同じまたは同様の機能を示す。
【０１７１】
本明細書で使用される場合、配列に関するパーセント（％）配列同一性は、配列をアラインメントし、必要であれば、最大のパーセント配列同一性を達成するためにギャップを導入した後の、参照ポリペプチド配列内のアミノ酸残基と同一である候補ポリペプチド配列内のアミノ酸残基の百分率と定義される。パーセント配列同一性を決定するためのアラインメントは、当技術分野の技術の範囲内である種々のやり方で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含めた、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。
【０１７２】
本発明のいくつかの好ましい実施形態が実施例において実証されている。
【０１７３】
非ヒト抗体をヒト化するための方法は当技術分野で周知である。一般に、ヒト化抗体には、非ヒトである供給源から１つまたは複数のアミノ酸残基が導入されている。これらの非ヒトアミノ酸残基は、多くの場合、「移入」残基と称され、一般には、「移入」可変ドメインから取得される。ヒト化は、基本的に、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３２１巻：５２２〜５２５頁（１９８６年）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３３２巻：３２３〜３２７頁（１９８８年）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９巻：１５３４〜１５３６頁（１９８８年））の方法に従って、齧歯類ＣＤＲまたはＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列の代わりに使用することによって実施することができる。したがって、そのような「ヒト化」抗体はキメラ抗体（米国特許第４，８１６，５６７号）であり、非ヒト種に由来する対応する配列で置換されているインタクトなヒト可変ドメインが実質的により少ない。実際には、ヒト化抗体は、一般には、いくつかのＣＤＲ残基および場合によっていくつかのＦＲ残基が齧歯類抗体における類似部位由来の残基で置換されたヒト抗体である。
【０１７４】
ヒト化抗体の作出に使用する軽鎖および重鎖の両方のヒト可変ドメインの選択は、抗原性を低下させるために非常に重要である。いわゆる「最良適合」法に従って、齧歯類抗体の可変ドメインの配列を公知のヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体に対してスクリーニングする。次いで、齧歯類の配列に最も近いヒト配列をヒト化抗体のヒトフレームワーク（ＦＲ）として許容する（Ｓｉｍｓら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５１巻：２２９６頁（１９９３年）；Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、１９６巻：９０１頁（１９８７年））。別の方法では、軽鎖または重鎖の特定のサブグループの全てのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークをいくつかの異なるヒト化抗体に使用することができる（Ｃａｒｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８９巻：４２８５頁（１９９２年）；Ｐｒｅｓｔａｅｔａｌ．、Ｊ．  Ｉｍｍｎｏｌ．、１５１巻：２６２３頁（１９９３年））。
【０１７５】
さらに、抗体を、抗原に対する高親和性および他の好都合な生物学的性質を保持させながらヒト化することが重要である。この目標を達成するために、好ましい方法に従って、ヒト化抗体は、親配列およびヒト化配列の３次元モデルを使用した、親の配列および種々の概念的なヒト化産物の分析のプロセスによって調製される。３次元免疫グロブリンモデルが一般に利用可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の可能性のある３次元コンフォメーション構造を例示し、表示するコンピュータプログラムが利用可能である。これらの表示の検査により、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能性のある役割の分析、すなわち、候補免疫グロブリンのそれの抗原に結合する能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このように、ＦＲ残基をレシピエントから選択し、組み合わせ、配列に移入し得、したがって、標的抗原（複数可）に対する親和性の増大などの所望の抗体特性を達成する。一般に、ＣＤＲ残基は、抗原結合への影響に直接かつほぼ実質的に関与する。
【０１７６】
あるいは、現在、免疫化すると内在性免疫グロブリン産生の不在下でヒト抗体の完全なレパートリーを産生することができるトランスジェニック動物（例えば、マウス）を作製することが可能である。例えば、キメラおよび生殖細胞系変異体マウスにおける抗体重鎖連結領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合性欠失により、内在性抗体産生の完全な阻害がもたらされることが記載されている。そのような生殖細胞系変異体マウスにおけるヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子アレイの移行により、抗原による攻撃に際してヒト抗体の産生がもたらされる。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、９０巻：２５５１頁（１９９３年）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３６２巻：２５５〜２５８頁（１９９３年）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎら、Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏ．、７巻：３３頁（１９９３年）を参照されたい。ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリーから導出することもできる（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２２７巻：３８１頁（１９９１年）；Ｍａｒｋｓら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２２２巻：５８１〜５９７頁（１９９１年））。
【０１７７】
医薬製剤
本発明の抗体を含む治療用製剤は、保管のために、所望の程度の純度を有する抗体を任意選択の生理的に許容される担体、賦形剤または安定剤と混合することによって（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  第１６版、Ｏｓｏｌ，  Ａ．編（１９８０年））、水溶液、凍結乾燥製剤または他の乾燥製剤の形態で調製する。許容される担体、賦形剤、または安定剤は、使用される投与量および濃度でレシピエントに対して非毒性のものであり、それらとして、リン酸、クエン酸、ヒスチジンおよび他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンを含めた抗酸化剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；メチルパラベンまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満の）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリシンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含めた単糖、二糖、および他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート化剤；スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成性対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）；および／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性物質が挙げられる。
【０１７８】
本明細書の製剤は、これだけに限定されないが、互いに悪影響を及ぼさない補完的な活性を有するものを含めた、処置される特定の適応症に関して、必要に応じて１つ超の活性化合物も含有してよい。そのような分子は、意図された目的のために有効な量で組み合わせて適切に存在させる。
【０１７９】
活性成分は、例えば、コアセルベーション技法によってまたは界面重合によって調製したマイクロカプセル、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−（メタクリル酸メチル）マイクロカプセルに、コロイド薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子およびナノカプセル）に、またはマクロエマルションに封入され得る。そのような技法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  第１６版、Ｏｓｏｌ，  Ａ．編（１９８０年）に開示されている。
【０１８０】
ｉｎ  ｖｉｖｏ投与に使用する製剤は、無菌であるべきである。これは、滅菌濾過膜を通して濾過することによって容易に達成される。
【０１８１】
持続放出調製物を調製することができる。持続放出調製物の適切な例としては、本発明の免疫グロブリンを含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられ、このマトリックスは、造形品、例えば、フィルム、またはマイクロカプセルの形態である。持続放出マトリックスの例としては、ポリエステル、ハイドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリ乳酸（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタメートの共重合体、非分解性エチレン−酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グリコール酸共重合体および酢酸リュープロリドで構成される注射可能なマイクロスフェア）などの分解性乳酸−グリコール酸共重合体、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン−酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸などのポリマーでは１００日超にわたって分子を放出させることが可能であるが、ある特定のハイドロゲルでは、より短い期間にわたってタンパク質が放出される。カプセル封入された免疫グロブリンが長時間にわたって体内に留まる場合、それらは３７℃で水分に曝露された結果として変性または凝集し、その結果、生物活性の喪失および起こり得る免疫原性の変化が生じる可能性がある。関与する機構に応じて、安定化のための合理的な戦略を考案することができる。例えば、凝集機構が、チオ−ジスルフィド交換による分子間Ｓ−−Ｓ結合の形成であることが分かった場合、スルフヒドリル残基を修飾すること、酸性溶液から凍結乾燥させること、適切な添加剤を使用して水分含量を制御すること、および特定のポリマーマトリックス組成物を開発することによって安定化を達成することができる。
【０１８２】
凍結乾燥前製剤中の抗体の量は、所望の用量体積、投与の様式（複数可）などを考慮に入れて決定する。選択されたタンパク質がインタクトな抗体（全長抗体）である場合、例示的な出発タンパク質濃度は、約２ｍｇ／ｍＬから約５０ｍｇ／ｍＬまで、好ましくは約５ｍｇ／ｍＬから約４０ｍｇ／ｍＬまで、最も好ましくは約２０ｍｇ／ｍＬから３０ｍｇ／ｍＬまでである。タンパク質は、一般に、溶液中に存在する。例えば、タンパク質は、ｐＨ緩衝溶液中に約４〜８、好ましくは約５〜７のｐＨで存在し得る。例示的な緩衝液としては、ヒスチジン、リン酸、トリス、クエン酸、コハク酸および他の有機酸が挙げられる。緩衝液の濃度は、例えば、緩衝液および製剤（例えば、再構成製剤）の所望の等張性に応じて、約１ｍＭから約２０ｍＭまで、または約３ｍＭから約１５ｍＭまでであり得る。以下で実証される通り、凍結保護性を有し得るという点で、ヒスチジンが好ましい緩衝液である。コハク酸が別の有用な緩衝液であることが示された。
【０１８３】
凍結保護剤を凍結乾燥前製剤に添加する。好ましい実施形態では、凍結保護剤は、スクロースまたはトレハロースなどの非還元糖である。凍結乾燥前製剤中の凍結保護剤の量は、一般に、再構成した時に得られる製剤が等張性になるような量である。しかし、高張性の再構成製剤も適切であり得る。さらに、凍結保護剤の量は、凍結乾燥した時に許容されない量のタンパク質の分解／凝集が起こるほど少ないものであってはならない。凍結保護剤が糖（例えば、スクロースまたはトレハロースなど）であり、タンパク質が抗体である場合、凍結乾燥前製剤中の例示的な凍結保護剤濃度は、約１０ｍＭから約４００ｍＭまで、好ましくは約３０ｍＭから約３００ｍＭまで、最も好ましくは約５０ｍＭから約１００ｍＭまでである。
【０１８４】
タンパク質と凍結保護剤の比は、各々のタンパク質と凍結保護剤の組合せに対して選択する。タンパク質濃度が高い等張性の再構成製剤を生成するためにタンパク質としての選択された抗体と、凍結保護剤としての糖（例えば、スクロースまたはトレハロース）との場合、抗体に対する凍結保護剤のモル比は、１モルの抗体に対して約１００モルから約１５００モルまでの凍結保護剤、好ましくは１モルの抗体に対して約２００モルから約１０００モルまでの凍結保護剤、例えば、１モルの抗体に対して約２００モルから約６００モルまでの凍結保護剤であり得る。
【０１８５】
本発明の好ましい実施形態では、凍結乾燥前製剤に界面活性剤を添加することが望ましいことが見いだされた。その代わりに、またはそれに加えて、凍結乾燥製剤および／または再構成製剤に界面活性剤を添加することができる。例示的な界面活性剤としては、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０または８０）；ポロキサマー（例えば、ポロキサマー１８８）；トリトン；ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）；ラウリル硫酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｌａｕｒｅｌ  ｓｕｌｆａｔｅ）；オクチルグリコシドナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｏｃｔｙｌ  ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ）；ラウリルスルホベタイン、ミリスチルスルホベタイン、リノレイルスルホベタイン、またはステアリルスルホベタイン；ラウリルサルコシン、ミリスチルサルコシン、リノレイルサルコシンまたはステアリルサルコシン；リノレイルベタイン、ミリスチルベタイン、またはセチルベタイン；ラウロアミドプロピルベタイン、コカミドプロピルベタイン、リノールアミドプロピルベタイン、ミリスタミドプロピルベタイン、パルニドプロピルベタイン、またはイソステアラミドプロピルベタイン（例えばラウロアミドプロピル）；ミリスタミドプロピルジメチルアミン、パルミドプロピルジメチルアミン、またはイソステアラミドプロピルジメチルアミン；ナトリウムメチルココイルタウレート、または二ナトリウムメチルオレイルタウレート；およびＭＯＮＡＱＵＡＴＴＭシリーズ（Ｍｏｎａ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｐａｔｅｒｓｏｎ、Ｎ．Ｊ．）、ポリエチルグリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌ  ｇｌｙｃｏｌ）、ポリプロピルグリコール（ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌ  ｇｌｙｃｏｌ）、およびエチレンとプロピレングリコールの共重合体（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ、ＰＦ６８など）などの非イオン性界面活性剤が挙げられる。添加する界面活性剤の量は、再構成されたタンパク質の凝集が減少し、再構成後の微粒子物の形成が最小限になるような量にする。例えば、界面活性剤は、凍結乾燥前製剤中に、約０．００１〜０．５％、好ましくは約０．００５〜０．０５％の量で存在してよい。
【０１８６】
本発明のある特定の実施形態では、凍結乾燥前製剤の調製において、凍結保護剤（例えば、スクロースまたはトレハロースなど）と増量剤（例えば、マンニトールまたはグリシン）の混合物を使用する。増量剤により、中に過剰なポケットを伴わない一様な凍結乾燥ケーキなどの作製が可能になり得る。
【０１８７】
製剤の所望の特性に悪影響を及ぼさないのであれば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  第１６版、Ｏｓｏｌ，  Ａ．編（１９８０年）に記載されているものなどの、他の薬学的に許容される担体、賦形剤または安定剤を凍結乾燥前製剤（および／または凍結乾燥製剤および／または再構成製剤）に含めることができる。許容される担体、賦形剤または安定剤は、使用される投与量および濃度でレシピエントに対して非毒性のものであり、それらとして、追加的な緩衝剤；防腐剤；共溶媒；アスコルビン酸およびメチオニンを含めた抗酸化剤；ＥＤＴＡなどのキレート剤；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）；ポリエステルなどの生分解性ポリマー；ならびに／またはナトリウムなどの塩形成性対イオンが挙げられる。
【０１８８】
本明細書に記載の医薬組成物および製剤は、安定であることが好ましい。「安定な」製剤／組成物とは、保管に際してその中の抗体の物理的安定性および化学的安定性および完全性が基本的に保持される製剤／組成物である。タンパク質安定性を測定するための種々の分析技法が当技術分野において利用可能であり、Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ、２４７〜３０１頁、Ｖｉｎｃｅｎｔ  Ｌｅｅ編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、Ｐｕｂｓ（１９９１年）およびＪｏｎｅｓ，  Ａ．  Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．
１０巻：２９〜９０頁（１９９３年）に概説されている。安定性は、選択された温度で選択された期間にわたって測定することができる。
【０１８９】
ｉｎ  ｖｉｖｏ投与に使用する製剤は、無菌であるべきである。これは、凍結乾燥および再構成の前またはその後に滅菌濾過膜を通して濾過することによって容易に達成される。あるいは、混合物全体の無菌性は、タンパク質以外の成分を、例えば約１２０℃で約３０分にわたってオートクレーブすることによって達成することができる。
【０１９０】
タンパク質、凍結保護剤および他の任意選択の構成成分を混合した後、製剤を凍結乾燥する。この目的のために、Ｈｕｌｌ５０（登録商標）（Ｈｕｌｌ、ＵＳＡ）またはＧＴ２０（登録商標）（Ｌｅｙｂｏｌｄ−Ｈｅｒａｅｕｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）フリーズドライヤーなどの多くの異なるフリーズドライヤーが利用可能である。フリーズドライは、製剤を凍結させ、その後、一次乾燥に適した温度で凍結した内容物から氷を昇華させることによって達成される。この条件の下で、産物の温度は製剤の共融点または崩壊温度を下回る。一般には、一次乾燥の棚温度は、一般には約５０〜２５０ｍＴｏｒｒにわたる適切な圧力で、約−３０〜２５℃にわたる（産物が一次乾燥の間凍結したままであることを条件とする）。乾燥に必要な時間は、主に、製剤、試料を保持する容器のサイズおよび型（例えば、ガラスバイアル）ならびに液体の体積により規定され、これは、数時間から数日（例えば、４０〜６０時間）までにわたる。二次乾燥段階は、主に、使用する容器の型およびサイズならびにタンパク質の型に応じて、約０〜４０℃で行うことができる。しかし、本明細書では、二次乾燥ステップは必要でない場合があることが見いだされた。例えば、凍結乾燥の水除去相全体を通した棚温度は、約１５〜３０℃（例えば、約２０℃）であり得る。二次乾燥に必要な時間および圧力は、例えば温度および他のパラメータに応じて、適切な凍結乾燥ケーキが生じる時間および圧力である。二次乾燥時間は、産物中の所望の残留水分レベルにより規定され、一般には、少なくとも約５時間（例えば、１０〜１５時間）かかる。圧力は、一次乾燥ステップの間に使用する圧力と同じであってよい。フリーズドライ条件は、製剤およびバイアルサイズに応じて変動し得る。
【０１９１】
いくつかの場合には、移行ステップを回避するために、タンパク質の再構成を行う容器中でタンパク質製剤を凍結乾燥することが望ましい。この場合、容器は、例えば、３ｃｃ、５ｃｃ、１０ｃｃ、２０ｃｃ、５０ｃｃまたは１００ｃｃのバイアルであってよい。一般命題として、凍結乾燥により、水分含量が約５％未満、および好ましくは約３％未満である凍結乾燥製剤がもたらされる。
【０１９２】
所望の段階、一般には、タンパク質を患者に投与する時に、希釈剤を用いて凍結乾燥製剤を再構成し、したがって、再構成製剤中のタンパク質の濃度を少なくとも５０ｍｇ／ｍＬ、例えば、約５０ｍｇ／ｍＬから約４００ｍｇ／ｍＬまで、より好ましくは約８０ｍｇ／ｍＬから約３００ｍｇ／ｍＬまで、最も好ましくは約９０ｍｇ／ｍＬから約１５０ｍｇ／ｍＬまでにすることができる。そのような再構成製剤中の高タンパク質濃度は、再構成製剤の皮下送達が意図されている場合に特に有用であると考えられる。しかし、静脈内投与などの他の投与経路に関しては、再構成製剤中のタンパク質の濃度はより低いことが所望される場合がある（例えば、再構成製剤中、約５〜５０ｍｇ／ｍＬ、または約１０〜４０ｍｇ／ｍＬのタンパク質）。ある特定の実施形態では、再構成製剤中のタンパク質の濃度は、凍結乾燥前製剤中のタンパク質の濃度よりも有意に高い。例えば、再構成製剤中のタンパク質の濃度は、凍結乾燥前製剤中のタンパク質の濃度の約２〜４０倍、好ましくは３〜１０倍、最も好ましくは３〜６倍（例えば、少なくとも３倍または少なくとも４倍）であり得る。
【０１９３】
一般には、再構成は、完全な湿潤化（ｈｙｄｒａｔｉｏｎ）を確実にするために約２５℃の温度で行うが、所望であれば他の温度を使用することができる。再構成に必要な時間は、例えば、希釈剤の型、賦形剤（複数可）およびタンパク質の量に依存する。例示的な希釈剤としては、滅菌水、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝溶液（例えば、リン酸緩衝食塩水）、滅菌食塩溶液、リンゲル液またはデキストロース溶液が挙げられる。希釈剤は、場合によって防腐剤を含有する。例示的な防腐剤が上に記載されており、好ましい防腐剤はベンジルまたはフェノールアルコールなどの芳香族アルコールである。使用する防腐剤の量は、異なる防腐剤濃度をタンパク質との適合性について評価すること、および防腐剤有効性試験によって決定する。例えば、防腐剤が芳香族アルコール（例えば、ベンジルアルコールなど）である場合、約０．１〜２．０％、好ましくは約０．５〜１．５％、しかし最も好ましくは約１．０〜１．２％の量で存在してよい。再構成製剤は、サイズが１０μｍ超の粒子をバイアル当たり６０００個未満有する。
【０１９４】
治療適用
本明細書に記載の糖操作抗体は、がんを有する患者を処置するために使用することができる。処置方法は、患者に、有効量の本明細書に記載の糖操作抗体または医薬組成物を投与するステップを含む。がんの例としては、これだけに限定されないが、Ｂ細胞リンパ腫、ＮＨＬ、前駆Ｂリンパ芽球性白血病／リンパ腫および成熟Ｂ細胞新生物、Ｂ細胞性慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）／小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、Ｂ細胞性前リンパ性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、低悪性度、中悪性度および高悪性度（ＦＬ）、皮膚濾胞中心リンパ腫、辺縁層Ｂ細胞リンパ腫、ＭＡＬＴ型辺縁層Ｂ細胞リンパ腫、節性辺縁層Ｂ細胞リンパ腫、脾臓型辺縁層Ｂ細胞リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、形質細胞腫、形質細胞骨髄腫、移植後リンパ増殖性障害、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、および未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）が挙げられる。
【０１９５】
ある特定の実施形態では、がんは、非ホジキンリンパ腫などのＢ細胞リンパ腫である。
【０１９６】
さらに、本明細書に記載の糖操作抗体は、自己免疫疾患または炎症性疾患を有する患者を処置するために使用することができる。処置方法は、患者に、有効量の本明細書に記載の糖操作抗体または医薬組成物を投与するステップを含む。自己免疫疾患または炎症性疾患の例としては、これだけに限定されないが、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ウェゲナー病、炎症性腸疾患、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、自己免疫性血小板減少症、多発性硬化症、乾癬、ＩｇＡ腎症、ＩｇＭ多発ニューロパチー、重症筋無力症、血管炎、糖尿病、レイノー症候群、クローン病、潰瘍性大腸炎、胃炎、橋本甲状腺炎、強直性脊椎炎、Ｃ型肝炎関連クリオグロブリン血症性血管炎、慢性限局性脳炎、水疱性類天疱瘡、血友病Ａ、膜性増殖性糸球体腎炎（ｍｅｍｂｒａｎｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｇｌｏｍｅｒｕｌｎｅｐｈｒｉｔｉｓ）、成人皮膚筋炎および若年性皮膚筋炎、成人多発性筋炎、慢性蕁麻疹、原発性胆汁性肝硬変、視神経脊髄炎、グレーブス甲状腺異常症、水疱性類天疱瘡、膜性増殖性糸球体腎炎（ｍｅｍｂｒａｎｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｇｌｏｎｅｒｕｌｏｎｅｐｈｒｉｔｉｓ）、チャーグ・ストラウス症候群、喘息、乾癬性関節炎、皮膚炎、呼吸窮迫症候群、髄膜炎、脳炎、ぶどう膜炎、湿疹、アテローム性動脈硬化症、白血球接着不全症、若年発症糖尿病、ライター病、ベーチェット病、溶血性貧血、アトピー性皮膚炎、ウェゲナー肉芽腫症、オーメン症候群、慢性腎不全、急性伝染性単核球症、ＨＩＶおよびヘルペス関連疾患、全身性硬化症、シェーグレン症候群および糸球体腎炎、皮膚筋炎、ＡＮＣＡ、再生不良性貧血、自己免疫性溶血性貧血（ＡＩＨＡ）、第ＶＩＩＩ因子欠損症、血友病Ａ、自己免疫性好中球減少症、キャッスルマン症候群、グッドパスチャー症候群、固形臓器移植片拒絶反応、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、自己免疫性肝炎、リンパ性間質性肺炎（ＨＩＶ）、閉塞性細気管支炎（非移植）、ギラン・バレー症候群、大型血管炎、巨細胞（高安）動脈炎、中型血管炎、川崎病、および結節性多発性動脈炎が挙げられる。
【０１９７】
ある特定の実施形態では、自己免疫疾患または炎症性疾患は関節リウマチである。
【０１９８】
これらの処置方法では、抗ＣＤ２０糖操作抗体は、単独で、または、第２の抗体、もしくは化学療法剤もしくは免疫抑制剤などの第２の治療剤と併せて投与することができる。第２の抗体は、ＣＤ２０もしくは異なるＢ細胞抗原、またはＮＫ細胞抗原もしくはＴ細胞抗原に結合する抗体であってよい。
【０１９９】
本発明の抗体（および補助治療剤）は、非経口投与、皮下投与、腹腔内投与、肺内投与、および鼻腔内投与、ならびに所望であれば局所的な処置のための病変内投与を含めた、任意の適切な手段によって投与することができる。非経口注入としては、筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、または皮下投与が挙げられる。さらに、抗体を、パルス注入によって、特に、抗体の用量を減少させながら、適切に投与する。投薬は、投与が短期的なものか長期的なものかに一部依存して、任意の適切な経路によるもの、例えば、静脈内注射または皮下注射などの注射によるものであってよい。
【０２００】
本発明の抗体の結合標的の場所を抗体の調製および投与に関して考慮に入れることができる。結合標的が細胞内分子である場合、本発明のある特定の実施形態は、結合標的が位置する細胞内に導入される抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
【０２０１】
別の実施形態では、内部移行性抗体が提供される。抗体は、細胞内への抗体の送達を増強するある特定の特性を有し得る、または、そのような特性を有するように改変することができる。これを達成するための技法は、当技術分野で公知である。例えば、抗体をカチオン化することにより、細胞内への取り込みが容易になることが公知である（例えば、米国特許第６，７０３，０１９号を参照されたい）。リポフェクションまたはリポソームを使用して細胞内に抗体を送達することもできる。抗体断片を使用する場合、標的タンパク質の結合性ドメインに特異的に結合する最小の阻害性の断片が一般に有利である。例えば、抗体の可変性領域配列に基づいて、標的タンパク質配列に結合する能力を有するペプチド分子を設計することができる。そのようなペプチドは、化学的に合成することおよび／または組換えＤＮＡ技術によって作製することができる。例えば、Ｍａｒａｓｃｏら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、９０巻：７８８９〜７８９３頁（１９９３年）を参照されたい。
【０２０２】
標的細胞内へのモジュレーターポリペプチドの進入を当技術分野で公知の方法によって増強することができる。例えば、ＨＩＶ  Ｔａｔまたはアンテナペディアホメオドメインタンパク質に由来するものなどの、ある特定の配列により、細胞膜を横切る異種タンパク質の効率的な取り込みを導くことができる。例えば、Ｃｈｅｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ（１９９９年）、９６巻：４３２５〜４３２９頁を参照されたい。
【０２０３】
結合標的が脳内に位置する場合、本発明のある特定の実施形態は、血液脳関門を横切る抗体またはその抗原結合性断片を提供する。ある特定の神経変性疾患には血液脳関門の透過性の増大が付随し、したがって、抗体または抗原結合性断片を脳に容易に導入することができる。血液脳関門がインタクトなままである場合には、これだけに限定されないが、物理的方法、脂質に基づく方法、ならびに受容体およびチャネルに基づく方法を含め、血液脳関門を横切って分子を運搬するための当技術分野で公知の手法がいくつかある。
【０２０４】
血液脳関門を横切って抗体または抗原結合性断片を運搬する物理的方法としては、これだけに限定されないが、血液脳関門を完全に迂回すること、または血液脳関門に開口を創出することによるものが挙げられる。迂回方法としては、これだけに限定されないが、脳内への直接注射（例えば、Ｐａｐａｎａｓｔａｓｓｉｏｕら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ
９巻：３９８〜４０６頁（２００２年）を参照されたい）、組織内注入／対流増強送達（ｃｏｎｖｅｃｔｉｏｎ−ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ）（例えば、Ｂｏｂｏら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９１巻：２０７６〜２０８０頁（１９９４年）を参照されたい）、および脳内への送達デバイスの埋め込み（例えば、Ｇｉｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．  ９巻：５８９〜５９５頁（２００３年）；およびＧｌｉａｄｅｌ  Ｗａｆｅｒｓ（商標）、Ｇｕｉｌｄｆｏｒｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌを参照されたい）が挙げられる。関門に開口を創出する方法としては、これだけに限定されないが、超音波（例えば、米国特許出願公開第２００２／００３８０８６号を参照されたい）、浸透圧（例えば、高張性マンニトールを投与することによる（Ｎｅｕｗｅｌｔ，  Ｅ．  Ａ．、Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂｌｏｏｄ−Ｂｒａｉｎ  Ｂａｒｒｉｅｒ  ａｎｄ  ｉｔｓ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ、１巻および２巻、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．（１９８９年）））、例えばブラジキニンまたは透過処理剤（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｅｒ）Ａ−７による透過処理（例えば、米国特許第５，１１２，５９６号、同第５，２６８，１６４号、同第５，５０６，２０６号、および同第５，６８６，４１６号を参照されたい）、および血液脳関門にまたがるニューロンを、抗体または抗原結合性断片をコードする遺伝子を含有するベクターを用いてトランスフェクトすること（例えば、米国特許出願公開第２００３／００８３２９９号を参照されたい）が挙げられる。
【０２０５】
血液脳関門を横切って抗体または抗原結合性断片を運搬する、脂質に基づく方法としては、これだけに限定されないが、血液脳関門の血管内皮上の受容体に結合する抗体結合性断片とカップリングしたリポソーム中に抗体または抗原結合性断片を封入すること（例えば、米国特許出願公開第２００２００２５３１３号を参照されたい）、ならびに、抗体または抗原結合性断片を低密度リポタンパク質粒子（例えば、米国特許出願公開第２００４０２０４３５４号を参照されたい）またはアポリポタンパク質Ｅ（例えば、米国特許出願公開第２００４０１３１６９２号を参照されたい）でコーティングすることが挙げられる。
【０２０６】
血液脳関門を横切って抗体または抗原結合性断片を運搬する、受容体およびチャネルに基づく方法としては、これだけに限定されないが、グルココルチコイド遮断薬を使用して血液脳関門の透過性を増大させること（例えば、米国特許出願公開第２００２／００６５２５９、２００３／０１６２６９５、および２００５／０１２４５３３号を参照されたい）；カリウムチャネルを活性化すること（例えば、米国特許出願公開第２００５／００８９４７３号を参照されたい）、ＡＢＣ薬物輸送体を阻害すること（例えば、米国特許出願公開第２００３／００７３７１３号を参照されたい）；抗体をトランスフェリンでコーティングし、１つまたは複数のトランスフェリン受容体の活性を調節すること（例えば、米国特許出願公開第２００３／０１２９１８６号を参照されたい）、および抗体をカチオン化すること（例えば、米国特許第５，００４，６９７号を参照されたい）が挙げられる。
【０２０７】
本発明の抗体組成物は、優良医療基準（ｇｏｏｄ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｐｒａｃｔｉｃｅ）に従って製剤化し、投薬し、投与する。この文脈で考慮する因子としては、処置される特定の障害、処置される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床的状態、障害の原因、薬剤の送達の部位、投与の方法、投与のスケジュール、および医療実施者に公知の他の因子が挙げられる。抗体は、必ずではないが、場合により、問題の障害を防止または処置するために現在使用されている１種または複数種の薬剤と共に製剤化する。そのような他の薬剤の有効量は、製剤中に存在する本発明の抗体の量、障害または処置の型、および上記の他の因子に依存する。これらは、一般に、本明細書に記載のものと同じ投与量および投与経路で、または本明細書に記載の投与量の約１％から９９％まで、または適切であることが経験的に／臨床的に決定された任意の投与量でかつ任意の経路によって使用される。
【０２０８】
疾患の防止または処置に関して、本発明の抗体の適切な投与量（単独で、または化学療法剤などの他の薬剤と組み合わせて使用する場合）は、処置される疾患の型、抗体の型、疾患の重症度および経過、抗体が防止目的で投与されるか治療目的で投与されるか、以前の療法、患者の臨床病歴および抗体への応答、ならびに主治医の自由裁量に依存する。抗体は、一度にまたは一連の処置にわたって患者に適切に投与される。疾患の型および重症度に応じて、例えば、１つまたは複数の別々の投与によるものか持続注入によるものかに関わらず、約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ）の抗体が患者に投与される最初の候補投与量であり得る。典型的な毎日の投与量の１つは、上記の因子に応じて約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇまたはそれ超までにわたり得る。状態に応じて、数日またはそれ超にわたる反復投与に関しては、処置は、一般に、疾患の症状の所望の抑制が起こるまで持続させる。１つの例示的な抗体の投与量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇまでにわたる。したがって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇのうちの１つまたは複数の用量（またはそれらの任意の組合せ）を患者に投与することができる。そのような用量は、断続的に、例えば、毎週または３週間ごとに投与することができる（例えば、患者が約２〜約２０、または例えば、約６用量の抗体を受けることになるように）。最初のより高い負荷用量、その後の１つまたは複数のより低い用量を投与することができる。例示的な投薬レジメンは、最初の負荷用量の約４ｍｇ／ｋｇを投与し、その後、維持用量の約２ｍｇ／ｋｇの抗体を週に１回投与することを含む。しかし、他の投与量レジメンが有用であり得る。この治療の進行は、従来の技法およびアッセイによって容易にモニターされる。
【０２０９】
製造品
本発明の別の態様では、上記の障害の処置、予防および／または診断のために有用な材料を含有する製造品が提供される。製造品は、容器および容器上のまたは容器に付随したラベルまたは添付文書を含む。適切な容器としては、例えば、ビン、バイアル、シリンジなどが挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの種々の材料から形成することができる。容器は、単独または状態の処置、予防および／または診断に有効な別の組成物と組み合わせた組成物を保持するものであり、滅菌アクセスポートを有してよい（例えば、容器は、静脈内溶液バッグまたは皮下注射針で穴をあけることができる止め栓を有するバイアルであってよい）。組成物中の少なくとも１種の活性薬剤は本発明の抗体である。ラベルまたは添付文書には、組成物が選択された状態を処置するために使用されるものであることが示されている。さらに、製造品は、（ａ）本発明の抗体を含む組成物を含有する第１の容器；および（ｂ）別の細胞傷害性剤または他の治療剤を含む組成物を含有する第２の容器を含んでよい。本発明のこの実施形態における製造品は、組成物を使用して特定の状態を処置することができることを示す添付文書をさらに含んでよい。その代わりにまたはそれに加えて、製造品は、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝食塩水、リンゲル液およびデキストロース溶液などの薬学的に許容される緩衝液を含む第２の（または第３の）容器をさらに含んでよい。製造品は、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、およびシリンジを含めた、商業的観点および使用者の観点から望ましい他の材料をさらに含んでよい。
【０２１０】
抗ＣＤ２０ＧＡｂ製剤および安定性
治療的使用に適した抗体を含む、せん断および温度に対して安定な医薬製剤を製剤化することが必要とされている。
【０２１１】
一実施形態では、本発明は、治療有効量の抗ＣＤ２０抗体を含む抗ＣＤ２０抗体製剤であって、１０〜１００ｍＭの酢酸ナトリウム、２５〜１００ｍＭの塩化ナトリウム、０．５〜５％アルギニン遊離塩基、０．０２〜０．２ｍＭのＥＤＴＡ、０．０１〜０．２％のポリソルベート８０をさらに含み、ｐＨ５．０〜７．０に調整された製剤に関する。
【０２１２】
別の実施形態では、本発明は、抗ＣＤ２０抗体を２０〜３００ｍｇ／ｍＬの濃度範囲で含む抗ＣＤ２０抗体製剤であって、５０ｍＭの酢酸ナトリウム、５１ｍＭの塩化ナトリウム、１％アルギニン遊離塩基、０．０５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０２％のポリソルベート８０をさらに含み、ｐＨ５．５に調整された製剤に関する。
【０２１３】
一実施形態では、本発明は、治療有効量の糖操作抗体を含む抗ＣＤ２０糖操作抗体製剤であって、１０〜１００ｍＭの酢酸ナトリウム、２５〜１００ｍＭの塩化ナトリウム、０．５〜５％アルギニン遊離塩基、０．０２〜０．２ｍＭのＥＤＴＡ、０．０１〜０．２％のポリソルベート８０をさらに含み、ｐＨ５．０〜７．０に調整された製剤に関する。
【０２１４】
一実施形態では、本発明は、糖操作抗体を２０〜３００ｍｇ／ｍＬの濃度範囲で含む糖操作抗体製剤であって、５０ｍＭの酢酸ナトリウム、５１ｍＭの塩化ナトリウム、１％アルギニン遊離塩基、０．０５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０２％のポリソルベート８０をさらに含み、ｐＨ５．５に調整された製剤に関する。
【０２１５】
さらに別の実施形態では、本発明は、少なくとも２年にわたって安定である抗ＣＤ２０抗体製剤に関する。別の実施形態では、本発明は、少なくとも５５℃までの温度で安定である抗ＣＤ２０抗体製剤に関する。別の実施形態では、本発明は、約５℃の温度で少なくとも２年にわたって安定である抗ＣＤ２０抗体製剤に関する。別の実施形態では、本発明は、約２５℃の温度で少なくとも３カ月にわたって安定である抗ＣＤ２０抗体製剤に関する。別の実施形態では、本発明は、約４０℃の温度で少なくとも１カ月にわたって安定である抗ＣＤ２０抗体製剤に関する。別の実施形態では、本発明は、約５５℃の温度で少なくとも１日にわたって安定である抗ＣＤ２０抗体製剤に関する。
【０２１６】
別の実施形態では、本発明は、抗体が約２０〜３００ｍｇ／ｍＬ、５０〜３００ｍｇ／ｍＬ、１００〜３００ｍｇ／ｍＬ、１５０〜３００ｍｇ／ｍＬ、２００〜３００ｍｇ／ｍＬ、または２５０〜３００ｍｇ／ｍＬの量で存在する抗ＣＤ２０抗体製剤に関する。
【０２１７】
別の実施形態では、本発明は、ポリソルベート８０が約０．０２％、０．０１５％、または０．０２５％の量で存在する抗ＣＤ２０抗体製剤に関する。他の実施形態では、ポリソルベート８０は、０．０１〜０．２％、０．０１〜０．１５％、０．０２〜０．２％、０．０２〜０．１５％、０．０１〜０．２５％、または０．０１〜０．０５％の量で存在してよい。
【０２１８】
本発明の１つまたは複数の実施形態の詳細が以下の説明に記載されている。本発明の他の特徴または利点は、以下の図およびいくつかの実施形態の詳細な説明から、ならびに添付の特許請求の範囲からも明らかになるであろう。
【０２１９】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含まれる。以下の実施例に開示されている技法は、本発明者により、本発明の実施においてよく機能することが発見された技法であり、したがって、それを実施するための好ましい方式を構成するとみなすことができることが当業者には理解されるべきである。しかし、当業者は、本開示に照らして、開示されている特定の実施形態に多くの変更を行うことができ、それでもなお、本発明の主旨および範囲から逸脱することなく同様または類似の結果が得られることを理解するべきである。
【実施例】
【０２２０】
（実施例１）
抗ＣＤ抗体のＮ−グリコシル化を分析するための一般手順
本発明者らは、グリコペプチド前駆体に適用した衝突解離（ＣＩＤ）エネルギーに対するオリゴ糖由来断片イオン（オキソニウムイオン）の収量をモニターする質量分析法を開発した。オキソニウムイオン法の多重反応モニタリング（ＭＲＭ）は、来たるバイオシミラー（ｂｉｏｓｉｍｉｌａｒ）治療薬の常套的な品質管理分析に関する規制要件を満たすことができた。
【０２２１】
リツキシマブ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈから購入）５ｕｇを２Ｍのグアニジン−ＨＣｌ、２５ｕｌに溶解させ、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を添加して最終濃度を５ｍＭにした。１１０℃で１０分インキュベートした後、１０ｍＭのヨードアセトアミド（ＩＡＡ）中、３７℃で１時間にわたって還元型システイン残基をアルキル化した。５ｍＭのＤＴＴを添加して室温で１０分にわたって過剰なＩＡＡをクエンチした。産物を５０ｍＭの炭酸水素アンモニウム中１５倍に希釈した後、スピンカラムを用いて微量遠心分離した（タンパク質ＭＷカットオフ１０ｋＤａ）。トリプシン消化を、酵素：タンパク質比１：２５（ｗ／ｗ）を使用し、３７℃で４時間にわたって実施した。試料をＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析のために−２０℃で凍結させた。
【０２２２】
計装
ｍ／ｚ２０４オキソニウムイオン（ＨｅｘＮＡｃ）モニタリングによるグリコペプチド定量化を、４０００  ＱＴｒａｐトリプル四重極質量分析計（ＡＢ  Ｓｃｉｅｘ）をＡｇｌｉｅｎｔ  １２００  ＨＰＬＣシステムと共に使用して実施した。グリコペプチドの微小不均一性を相対的に定量化するために、可能性のあるグリカン組成物全てを網羅する前駆イオンｍ／ｚをｉｎ−ｓｉｌｉｃｏで導き、各前駆イオンについて単一の定量的トランジションをモニターした（Ｑ３  ｍ／ｚ＝２０４）。
【０２２３】
ＭＳデータ解析
取得した生データを、Ａｎａｌｙｓｔ  １．５（ＡＢ  Ｓｃｉｅｘ）を用いて処理した。各トランジションの質量クロマトグラムを統合し、ピーク面積によって定量化した。全ての構成成分を合わせた合計に対する各構成成分の百分率組成を算出した。
【０２２４】
Ｎ−グリカン組成物の分析により、リツキシマブには５０を超えるグリコフォームが存在することが明らかになった。結果から、二分岐複合型グリカンが主要なＮ−グリカンであることが示された。Ｎ−グリカンの９０％超がフコシル化されている。
【０２２５】
（実施例２）
抗ＣＤ２０ＧＡｂｓの生成
抗ＣＤ２０ＧＡｂ３０１
リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ）のＦｃ領域からのＡｓｎ２９７のＮ結合グリカンの完全な除去はＰＮＧａｓｅ  Ｆによって達成され、改変ＩｇＧおよび無改変ＩｇＧからのトリプシン処理グリコペプチド（ｔｒｙｐｔｉｃ  ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｅ）の４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ＮｅｕＰＡＧＥおよびＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を用いて評価される。トリプシン処理グリコペプチドの分子量は、各アスパラギンにおけるＮ結合グリコシル化の潜在的部位を決定するため、および優勢なグリカンの種を解明するための助けとなる。
【０２２６】
抗ＣＤ２０ＧＡｂ２００
市販のまたは所内製の不均一なｍＡｂを出発材料として使用し、選択されたグリコシダーゼを用いて改変した。エンドグリコシダーゼ（Ｅｎｄｏ  Ｆ２、Ｅｎｄｏ  Ｆ３、またはＥｎｄｏ  Ｈ）の適用により、そのＦｃ  Ｎ結合グリコシル化部位にＧｌｃＮＡｃ−Ｆｕｃがある均一な二糖（ｄｉ−ｓｕｇａｒ）ｍＡｂ（ＧＡｂ２００）をもたらすことができる。その後、フコシダーゼを適用することで均一な単糖（ｍｏｎｏ−ｓｕｇａｒ）ｍＡｂを得ることができる、または、単糖（ｍｏｎｏ−ｓｕｇａｒ）種は、リツキシマブに関して示されている通りＥｎｄｏ  Ｆ３とフコシダーゼの組合せを共に一段階で用いても得ることができる。産物をトリプシン処理し、グリコペプチドＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲ（配列番号）およびＥＥＱＹＮＳＴＹＲ（配列番号）を、ナノスプレーＬＣ／ＭＳを用いて分析してＧＡｂ２００のグリコシル化パターンを確認した。
【０２２７】
抗ＣＤ２０ＧＡｂ２０１
リン酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．０、１．２５ｍＬ）中リツキシマブ（２．５ｍｇ）をＥｎｄｏ  Ｓ（１２５μｇ）およびＢｆＦｕｃＨ（２．５ｍｇ）と一緒に３７℃で２２時間インキュベートした。ＬＣ−ＭＳおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、重鎖上のＮ−グリカンの完全な切断が示された。反応混合物を、リン酸ナトリウム緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．０）を用いて予め平衡化したプロテインＡ−アガロース樹脂（１ｍＬ）のカラムでのアフィニティークロマトグラフィーに供した。カラムをリン酸ナトリウム緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．０、１０ｍＬ）で洗浄した。結合したＩｇＧをグリシン−ＨＣｌ（５０ｍＭ、ｐＨ３．０、１０ｍＬ）を用いて放出させ、溶出画分をＴｒｉｓ−Ｃｌ緩衝液（１．０Ｍ、ｐＨ８．３）ですぐに中和した。Ｆｃ断片を含有する画分を合わせ、遠心濾過（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  ｆｉｌｔｅｒ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）によって濃縮して抗ＣＤ２０ＧＡｂ２０１（１．９３ｍｇ）を生じさせた。産物をトリプシン処理し、グリコペプチドＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲおよびＥＥＱＹＮＳＴＹＲを、ナノスプレーＬＣ／ＭＳを用いて分析してＧＡｂ２０１のグリコシル化パターンを確認した。
【０２２８】
抗ＣＤ２０ＧＡｂ１０１
鶏卵の卵黄からのシアリルグリコペプチド（ＳＧＰ）の単離は公開されている方法に従った。簡単に述べると、鶏卵の卵黄のフェノール抽出物を遠心分離し、濾過し、セファデックスＧ−５０、セファデックスＧ−２５、ＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅｒａｒｌ  ６５０Ｍ、ＣＭ−セファデックスＣ−２５およびセファデックスＧ−２５を含むクロマトグラフィーカラムによって精製した。リン酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ６．０、５ｍＭ）中シアリルグリコペプチド（ＳＧＰ）（５２ｍｇ）の溶液をＥｎｄｏ  Ｍ（５３μｇ）と一緒に３７℃でインキュベートした。７時間後、反応混合物をセファデックスＧ−２５カラムでのゲル濾過クロマトグラフィーに供し、水により溶出した。産物を含有する画分を合わせ、凍結乾燥して産物（グリカン−１０１）を白色粉末として生じさせた（３０ｍｇ、収率８２％）。
【０２２９】
水（５９３μＬ）中グリカン−１０１（Ｓｉａ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ）（３０ｍｇ）、２−クロロ−１，３−ジメチルイミダゾリニウムクロリド（ＤＭＣ）（６２．７ｍｇ）およびＥｔ３Ｎ（８９μＬ）の溶液を４℃で１時間にわたって撹拌した。反応混合物を、０．０５％水性Ｅｔ３Ｎにより溶出する、セファデックスＧ−２５カラムでのゲル濾過クロマトグラフィーに供した。産物（グリカンオキサゾリン−１０１）を含有する画分を合わせ、凍結乾燥して白色粉末を生じさせた（２６ｍｇ、収率８７．４％）。
【０２３０】
グリカンオキサゾリン−１０１を５０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．８）中エンドグリコシダーゼとＧＡｂ２０１の混合物に添加し、室温で１時間インキュベートした。反応混合物を、プロテインＡアフィニティーカラム、その後、陰イオン交換カラムｃａｐｔｏ  Ｑを用いて精製して、所望の産物である抗ＣＤ２０ＧＡｂ１０１を収集した。産物をトリプシン処理し、グリコペプチドＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲおよびＥＥＱＹＮＳＴＹＲを、ナノスプレーＬＣ／ＭＳを用いて分析してＧＡｂ１０１のグリコシル化パターンを確認した。
【０２３１】
抗ＣＤ２０ＧＡｂ１０２
グリカン−１０２（ＳｉａＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ）を、上記のグリカン−１０１を作出するためのプロセスと同様に調製した。水中、グリカン−１０２（ＳｉａＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ）（３０ｍｇ）、２−クロロ−１，３−ジメチルイミダゾリニウムクロリド（ＤＭＣ）（６２．７ｍｇ）およびＥｔ３Ｎ（８９μＬ）の溶液を４℃で１時間にわたって撹拌した。反応混合物をセファデックスＧ−２５カラムでのゲル濾過クロマトグラフィーに供し、０．０５％水性Ｅｔ３Ｎによって溶出した。産物（グリカンオキサゾリン−１０２）を含有する画分を合わせ、凍結乾燥して白色粉末を生じさせた。
【０２３２】
グリカンオキサゾリン−１０２を５０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．８）中エンドグリコシダーゼとＧＡｂ２０１の混合物に添加し、室温で１時間インキュベートした。反応混合物を、プロテインＡアフィニティーカラム、その後、陰イオン交換カラムｃａｐｔｏ  Ｑを用いて精製して、所望の産物である抗ＣＤ２０ＧＡｂ１０２を収集した。産物をトリプシン処理し、グリコペプチドＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲおよびＥＥＱＹＮＳＴＹＲを、ナノスプレーＬＣ／ＭＳを用いて分析してＧＡｂ１０２のグリコシル化パターンを確認した。
【０２３３】
抗ＣＤ２０ＧＡｂ１０３
水（５９３μＬ）中、グリカン−１０３（ＳｉａＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ）（３０ｍｇ）、２−クロロ−１，３−ジメチルイミダゾリニウムクロリド（ＤＭＣ）（６２．７ｍｇ）およびＥｔ３Ｎ（８９μＬ）の溶液を４℃で１時間にわたって撹拌した。反応混合物をセファデックスＧ−２５カラムでのゲル濾過クロマトグラフィーに供し、０．０５％水性Ｅｔ３Ｎによって溶出した。産物（グリカンオキサゾリン−１０３）を含有する画分を合わせ、凍結乾燥して白色粉末を生じさせた。
【０２３４】
グリカンオキサゾリン−１０３を５０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．８）中エンドグリコシダーゼとＧＡｂ２０１の混合物に添加し、室温で１時間インキュベートした。反応混合物を、プロテインＡアフィニティーカラム、その後、陰イオン交換カラムｃａｐｔｏ  Ｑを用いて精製して、所望の産物である抗ＣＤ２０ＧＡｂ１０３を収集した。産物をトリプシン処理し、グリコペプチドＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲおよびＥＥＱＹＮＳＴＹＲを、ナノスプレーＬＣ／ＭＳを用いて分析してＧＡｂ１０３のグリコシル化パターンを確認した。
【０２３５】
抗ＣＤ２０ＧＡｂ１０４
水中、グリカン−１０４（Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ）（３０ｍｇ）、２−クロロ−１，３−ジメチルイミダゾリニウムクロリド（ＤＭＣ）（６２．７ｍｇ）およびＥｔ３Ｎ（８９μＬ）の溶液を４℃で１時間にわたって撹拌した。反応混合物をセファデックスＧ−２５カラムでのゲル濾過クロマトグラフィーに供し、０．０５％水性Ｅｔ３Ｎによって溶出した。産物（グリカンオキサゾリン−１０４）を含有する画分を合わせ、凍結乾燥して白色粉末を生じさせた。
【０２３６】
グリカンオキサゾリン−１０４を５０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．８）中エンドグリコシダーゼとＧＡｂ２０１の混合物に添加し、室温で１時間インキュベートした。反応混合物を、プロテインＡアフィニティーカラム、その後、陰イオン交換カラムｃａｐｔｏ  Ｑを用いて精製して、所望の産物である抗ＣＤ２０ＧＡｂ１０４を収集した。産物をトリプシン処理し、グリコペプチドＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲおよびＥＥＱＹＮＳＴＹＲを、ナノスプレーＬＣ／ＭＳを用いて分析してＧＡｂ１０４のグリコシル化パターンを確認した。
【０２３７】
抗ＣＤ２０ＧＡｂ１０５
水中、カップリングさせるグリカン−１０５（ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ）（３０ｍｇ）、２−クロロ−１，３−ジメチルイミダゾリニウムクロリド（ＤＭＣ）（６２．７ｍｇ）およびＥｔ３Ｎ（８９μＬ）の溶液を４℃で１時間にわたって撹拌した。反応混合物をセファデックスＧ−２５カラムでのゲル濾過クロマトグラフィーに供し、０．０５％水性Ｅｔ３Ｎによって溶出した。産物（グリカンオキサゾリン−１０５）を含有する画分を合わせ、凍結乾燥して白色粉末を生じさせた。
【０２３８】
グリカンオキサゾリン−１０５を５０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．８）中エンドグリコシダーゼとＧＡｂ２０１の混合物に添加し、室温で１時間インキュベートした。反応混合物を、プロテインＡアフィニティーカラム、その後、陰イオン交換カラムｃａｐｔｏ  Ｑを用いて精製して、所望の産物であるＧＡｂ１０５を収集した。産物をトリプシン処理し、グリコペプチドＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲおよびＥＥＱＹＮＳＴＹＲを、ナノスプレーＬＣ／ＭＳを用いて分析してＧＡｂ１０５のグリコシル化パターンを確認した。
【０２３９】
抗ＣＤ２０ＧＡｂ１０６
水（５９３μＬ）中、カップリングさせるグリカン−１０６（ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ）（３０ｍｇ）、２−クロロ−１，３−ジメチルイミダゾリニウムクロリド（ＤＭＣ）（６２．７ｍｇ）およびＥｔ３Ｎ（８９μＬ）の溶液を４℃で１時間にわたって撹拌した。反応混合物をセファデックスＧ−２５カラムでのゲル濾過クロマトグラフィーに供し、０．０５％水性Ｅｔ３Ｎによって溶出した。産物（グリカンオキサゾリン−１０６）を含有する画分を合わせ、凍結乾燥して白色粉末を生じさせた。
【０２４０】
グリカンオキサゾリン−１０６を５０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．８）中エンドグリコシダーゼとＧＡｂ２０１の混合物に添加し、室温で１時間インキュベートした。反応混合物を、プロテインＡアフィニティーカラム、その後、陰イオン交換カラムｃａｐｔｏ  Ｑを用いて精製して、所望の産物である抗ＣＤ２０ＧＡｂ１０６を収集した。産物をトリプシン処理し、グリコペプチドＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲおよびＥＥＱＹＮＳＴＹＲを、ナノスプレーＬＣ／ＭＳを用いて分析してＧＡｂ１０６のグリコシル化パターンを確認した。
【０２４１】
抗ＣＤ２０ＧＡｂ１０７
水中、カップリングさせるグリカン−１０７（ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ）（３０ｍｇ）、２−クロロ−１，３−ジメチルイミダゾリニウムクロリド（ＤＭＣ）（６２．７ｍｇ）およびＥｔ３Ｎ（８９μＬ）の溶液を４℃で１時間にわたって撹拌した。反応混合物をセファデックスＧ−２５カラムでのゲル濾過クロマトグラフィーに供し、０．０５％水性Ｅｔ３Ｎによって溶出した。産物（グリカンオキサゾリン−１０７）を含有する画分を合わせ、凍結乾燥して白色粉末を生じさせた。
【０２４２】
グリカンオキサゾリン−１０７を５０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．８）中エンドグリコシダーゼとＧＡｂ２０１の混合物に添加し、室温で１時間インキュベートした。反応混合物を、プロテインＡアフィニティーカラム、その後、陰イオン交換カラムｃａｐｔｏ  Ｑを用いて精製して、所望の産物である抗ＣＤ２０ＧＡｂ１０７を収集した。産物をトリプシン処理し、グリコペプチドＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲおよびＥＥＱＹＮＳＴＹＲを、ナノスプレーＬＣ／ＭＳを用いて分析してＧＡｂ１０７のグリコシル化パターンを確認した。
【０２４３】
抗ＣＤ２０ＧＡｂ１０８
水中、カップリングさせるグリカン−１０８（ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ）（３０ｍｇ）、２−クロロ−１，３−ジメチルイミダゾリニウムクロリド（ＤＭＣ）（６２．７ｍｇ）およびＥｔ３Ｎ（８９μＬ）の溶液を４℃で１時間にわたって撹拌した。反応混合物をセファデックスＧ−２５カラムでのゲル濾過クロマトグラフィーに供し、０．０５％水性Ｅｔ３Ｎによって溶出した。産物（グリカンオキサゾリン−１０８）を含有する画分を合わせ、凍結乾燥して白色粉末を生じさせた。
【０２４４】
グリカンオキサゾリン−１０８を５０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．８）中エンドグリコシダーゼとＧＡｂ２０１の混合物に添加し、室温で１時間インキュベートした。反応混合物を、プロテインＡアフィニティーカラム、その後、陰イオン交換カラムｃａｐｔｏ  Ｑを用いて精製して、所望の産物である抗ＣＤ２０ＧＡｂ１０８を収集した。産物をトリプシン処理し、グリコペプチドＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲおよびＥＥＱＹＮＳＴＹＲを、ナノスプレーＬＣ／ＭＳを用いて分析してＧＡｂ１０８のグリコシル化パターンを確認した。
【０２４５】
抗ＣＤ２０ＧＡｂ１０９
水中、カップリングさせるグリカン−１０９（ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ）（３０ｍｇ）、２−クロロ−１，３−ジメチルイミダゾリニウムクロリド（ＤＭＣ）（６２．７ｍｇ）およびＥｔ３Ｎ（８９μＬ）の溶液を４℃で１時間にわたって撹拌した。反応混合物をセファデックスＧ−２５カラムでのゲル濾過クロマトグラフィーに供し、０．０５％水性Ｅｔ３Ｎによって溶出した。産物（グリカンオキサゾリン−１０９）を含有する画分を合わせ、凍結乾燥して白色粉末を生じさせた。
【０２４６】
グリカンオキサゾリン−１０９を５０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．８）中エンドグリコシダーゼとＧＡｂ２０１の混合物に添加し、室温で１時間インキュベートした。反応混合物を、プロテインＡアフィニティーカラム、その後、陰イオン交換カラムｃａｐｔｏ  Ｑを用いて精製して、所望の産物である抗ＣＤ２０ＧＡｂ１０９を収集した。産物をトリプシン処理し、グリコペプチドＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲおよびＥＥＱＹＮＳＴＹＲを、ナノスプレーＬＣ／ＭＳを用いて分析してＧＡｂ１０９のグリコシル化パターンを確認した。
【０２４７】
抗ＣＤ２０ＧＡｂ１１０
水中、カップリングさせるグリカン−１１０（ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ）（３０ｍｇ）、２−クロロ−１，３−ジメチルイミダゾリニウムクロリド（ＤＭＣ）（６２．７ｍｇ）およびＥｔ３Ｎ（８９μＬ）の溶液を４℃で１時間にわたって撹拌した。反応混合物をセファデックスＧ−２５カラムでのゲル濾過クロマトグラフィーに供し、０．０５％水性Ｅｔ３Ｎによって溶出した。産物（グリカンオキサゾリン−１１０）を含有する画分を合わせ、凍結乾燥して白色粉末を生じさせた。
【０２４８】
グリカンオキサゾリン−１１０を５０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．８）中エンドグリコシダーゼとＧＡｂ２０１の混合物に添加し、室温で１時間インキュベートした。反応混合物を、プロテインＡアフィニティーカラム、その後、陰イオン交換カラムｃａｐｔｏ  Ｑを用いて精製して、所望の産物である抗ＣＤ２０ＧＡｂ１１０を収集した。産物をトリプシン処理し、グリコペプチドＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲおよびＥＥＱＹＮＳＴＹＲを、ナノスプレーＬＣ／ＭＳを用いて分析してＧＡｂ１１０のグリコシル化パターンを確認した。
【０２４９】
抗ＣＤ２０ＧＡｂ１１１
水中、カップリングさせるグリカン−１１０（Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ）（３０ｍｇ）、２−クロロ−１，３−ジメチルイミダゾリニウムクロリド（ＤＭＣ）（６２．７ｍｇ）およびＥｔ３Ｎ（８９μＬ）の溶液を４℃で１時間にわたって撹拌した。反応混合物をセファデックスＧ−２５カラムでのゲル濾過クロマトグラフィーに供し、０．０５％水性Ｅｔ３Ｎによって溶出した。産物（グリカンオキサゾリン−１１１）を含有する画分を合わせ、凍結乾燥して白色粉末を生じさせた。
【０２５０】
グリカンオキサゾリン−１１１を５０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．８）中エンドグリコシダーゼとＧＡｂ２０１の混合物に添加し、室温で１時間インキュベートした。反応混合物を、プロテインＡアフィニティーカラム、その後、陰イオン交換カラムｃａｐｔｏ  Ｑを用いて精製して、所望の産物である抗ＣＤ２０ＧＡｂ１１１を収集した。産物をトリプシン処理し、グリコペプチドＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲおよびＥＥＱＹＮＳＴＹＲを、ナノスプレーＬＣ／ＭＳを用いて分析してＧＡｂ１１１のグリコシル化パターンを確認した。
【０２５１】
（実施例３）
ＧＡｂ３０１の特徴付け
抗ＣＤ２０ＧＡｂ３０１を、その抗原結合および誘導される機能についてＢリンパ腫ラモス細胞を使用して試験した。糖を含まないリツキシマブバリアントについてはＣＤ２０結合活性およびアポトーシスの誘導のどちらにおいても完全な強度が保持され、リツキシマブの最大値と比較して３５％のＣＤＣ効果が保たれたが、ＧＡｂ３０１ではＡＤＣＣ効果がほぼ完全に喪失した。これらの結果から、ＡＤＣＣの誘導には炭水化物の存在が必須であることが示され、ＣＤＣ活性は大いに損なわれた。
【０２５２】
（実施例４）
ＧＡｂ２００およびＧＡｂ２０１の特徴付け
抗原結合ならびに誘導されるアポトーシス、ＣＤＣおよびＡＤＣＣ効果を、ラモス細胞を使用して評価した。ＧＡｂ２００およびＧＡｂ２０１はどちらもリツキシマブとほぼ同じ生物活性を示したので、抗原結合およびアポトーシス効果はどちらも、エンドグリコシダーゼおよび／またはフコシダーゼを用いた酵素消化の影響を受けなかった。しかし、誘導されるＣＤＣ効果は、単糖（ｍｏｎｏ−ｓｕｇａｒ）バリアントであるＧＡｂ２０１では大いに損なわれたが、二糖（ｄｉ−ｓｕｇａｒ）バリアントであるＧＡｂ２００では、リツキシマブの最大の活性の約５０％を保持することができた。エフェクター細胞としてＰＢＭＣを使用したＡＤＣＣに関しては、単糖（ｍｏｎｏ−ｓｕｇａｒ）バリアントおよび二糖（ｄｉ−ｓｕｇａｒ）バリアントで、それぞれリツキシマブの最大の効果の約６０％および８０％が保持された。単糖（ｍｏｎｏ−ｓｕｇａｒ）バリアント（ＧＡｂ２０１）と比較して、二糖（ｄｉ−ｓｕｇａｒ）バリアント（ＧＡｂ２００）により、ＣＤＣおよびＡＤＣＣの両方がより良好になされた。
（実施例５）
抗ＣＤ２０ＧＡｂｓの特徴付け
精製抗ＣＤ２０ＧＡｂｓ  １０１、１０２、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１および２０１をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認し（図２）、抗ＣＤ２０ＧＡｂ１０１のＩｇＧ分子の分子量をＭＳによって確認した。Ｎ−グリカンプロファイリングをトリプシン消化によって実施し、切断されたグリコペプチドＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲに基づいて、ナノスプレーＬＣ／ＭＳによって分析した。抗ＣＤ２０ＧＡｂｓ１０１、１０２、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０および１１１についてのＮ−グリカンプロファイリングの結果が図３に示されている。
【０２５３】
（実施例６）
Ｂリンパ腫細胞への結合
ＧＡｂｓ、ＧＡｂ１０１、ＧＡｂ１１７およびＧＡｂ１０４のラモス細胞、ＳＫＷ６．４、ラジおよびＳＵ−ＤＨＬ４細胞への例示的な結合活性を調査し、結果から、これらの結合活性がリツキシマブと同様であることが示された（図４）。
【０２５４】
（実施例７）
Ｂリンパ腫細胞に対するアポトーシス
ＧＡｂ１０１およびＧＡｂ１０４によって誘導される、ラモス細胞（図５、左側のパネル）およびＳＫＷ６．４細胞（図５、右側のパネル）に対するアポトーシス効果も調査し、結果から、これらによるアポトーシス効果がリツキシマブと同様であることが示された。
【０２５５】
（実施例８）
Ｂリンパ腫細胞に対するＣＤＣ
ＧＡｂ１０１、ＧＡｂ１０４、ＧＡｂ１０８およびＧＡｂ１１７のＣＤＣ効果を、ラモス細胞を使用して試験した。図６Ａの結果から、ＧＡｂ１０１ではリツキシマブと同様のＣＤＣ効果が誘導されるが、ＧＡｂ１１７により示される活性はわずかに低いことが示された。これにより、ＣＤＣの誘導においては２，６シアル酸結合糖操作抗体が２，３シアル酸結合糖操作抗体よりも強力であることが示される。
【０２５６】
ＣＤＣ誘導におけるガラクトース残基の役割も、本発明者らのＧＡｂｓを使用して調査した。末端ガラクトースによりＣＤＣ活性に正の影響を及ぼすことができるという以前の報告と一致して、ＧＡｂ１０１およびＧＡｂ１０４により、Ｇ０バリアントであるＧＡｂ１０８よりも良好なＥＣ５０が示された。興味深いことに、ＧＡｂ１０１およびＧＡｂ１０４によって同等のＣＤＣが誘導されることから、末端対称シアル酸の存在は、「ガラクトース」依存性補体依存性細胞傷害に影響を及ぼさなかったことが示唆される。
（実施例９）
ｅｘ  ｖｉｖｏにおけるＡＤＣＣ活性
脱フコシル化および均一な再グリコシル化の際の最も劇的な効果はＡＤＣＣの誘導において生じた。ＧＡｂｓのラモス細胞およびＳＫＷ６．４細胞に対するＡＤＣＣ活性を、３つの異なるドナー（ＦｃＲＩＩＩアロタイプは決定せず）由来のエフェクターＰＢＭＣ細胞を使用して評価した。図７（Ａ〜Ｃ）に示されている通り、ＥＣ５０および％最大死滅の両方によって推定される、ＧＡｂ１０１、ＧＡｂ１１７およびＧＡｂ１０４によって誘導されたＡＤＣＣ効果は、リツキシマブよりも強力であった。一般に、リツキシマブの最大の死滅効果を達成するために必要なＧＡｂ１０１、ＧＡｂ１１７およびＧＡｂ１０４の濃度は１０〜１００分の１であった。ＧＡｂ１０１、ＧＡｂ１１７およびＧＡｂ１０４全ての場合において、超低濃度（１．０ｎｇ／ｍＬ未満）で有意なＡＤＣＣ効果（バックグラウンドを超えて１０〜２０％の細胞溶解）を誘導することができるが、リツキシマブについてはわずかな効果しか観察されなかったことに注目すべきである。
【０２５７】
ＳＫＷ６．４細胞においても同様の結果が観察された。抗ＣＤ２０処置後の最大のＡＤＣＣはラモスにおけるものほど高くなかったにもかかわらず（図７Ｂおよび７Ｃ）、リツキシマブと比較してＧＡｂｓによる増強はより明白であり、１００〜１０００倍であると推定された。総合すると、ＧＡｂ１０１、ＧＡｂ１１７およびＧＡｂ１０４によって誘導される、ラモス細胞およびＳＫＷ６．４細胞におけるＡＤＣＣ効果は、リツキシマブと比較しておよそ１０〜１０００倍高い。
【０２５８】
（実施例１０）
ヒトＢ細胞の枯渇
ヒトＢ細胞の枯渇を、ヒト血液から新しく調製したヒトＰＢＭＣ細胞を使用して行った。マイクロプレートで培養したＲＰＭＩ１６４０−５％ＦＢＳ中２×１０６個の細胞を、１５％自己由来血漿の不在下または存在下、種々の濃度の抗ＣＤ２０ＧＡｂｓ  １０１、１０２、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、２０１およびリツキシマブと一緒に３７℃で４時間インキュベートした。洗浄後の細胞を、抗ＣＤ２−ＰＥおよび抗ＣＤ１９−ＦＩＴＣを用いて氷上で５分にわたって染色した。Ｂ細胞枯渇をＣＤ１９＋ＣＤ２−Ｂ細胞に基づいてＦＡＣＳで分析した（図８）。
【０２５９】
（実施例１１）
抗ＣＤ２０ＧＡｂｓのＦｃγＲＩＩＩＡに対する結合親和性
ＦｃγＲＩＩＩＡをＨＥＫ−２９３細胞株にトランスフェクトして組換えタンパク質を発現させた。分泌されたＦｃγＲＩＩＩＡ組換えタンパク質を精製し、次いで、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液中、段階的な濃度に希釈した（２００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、および１２．５ｎＭ）。抗ＣＤ２０  ＧＡｂｓ１０１、１０２、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０および１１１のそれぞれをＨＢＳ−ＥＰ緩衝液中１０ｕｇ／ｍｌの濃度に希釈し、次いで、抗ヒトＦａｂドメイン抗体を予め固定化したＣＭ５チップに捕捉した。段階的な力価のＦｃγＲＩＩＩＡを毎分３０ｍｌの流量で注射し、結合させた。単一サイクルの動力学データを、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００評価ソフトウェアを使用して１：１結合モデルに当てはめて、平衡定数（Ｋａ／Ｋｄ）を測定した。結果が表４に示されている。抗ＣＤ２０ＧＡｂｓにより、リツキシマブと比較してより強力なＦｃγＲＩＩＩＡ結合親和性が示される。
【０２６０】
（実施例１２）
ＧＡｂ１０１による腫瘍抑制
抗ＣＤ２０糖操作抗体群の抗腫瘍活性を、ラモスリンパ腫を有するＳＣＩＤマウスにおいて評価した。この試験ではＧＡｂ１０１を例示的なＡｂとして使用した。ＰＢＳ群における侵襲性の腫瘍成長とは対照的に、１ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇを週２回、全部で７回の注射でＧＡｂ１０１を投与することにより、腫瘍の成長が有効に抑制された（ｐ＜０．０１）（図９）。
【０２６１】
材料および方法
例示的な一般手順
方法Ａ：チオ−グリカンドナーによるグリコシル化
グリコシル化のために、モレキュラーシーブＭＳ−４Åを活性化するために真空系に接続し、１時間加熱した。活性化したモレキュラーシーブを室温まで冷却した後、ドナー（１位置のグリコシル化について１．５〜２．０当量）およびアクセプター（１．０当量）を含有するフラスコに添加した。混合物にジクロロメタンを添加し、次いで、溶液を室温で３時間撹拌した。−７８℃で溶液にＮ−ヨードスクシンイミド（ＮＩＳ、１．７〜２．２当量）およびトリメチルシリルトリフルオロメタンスルホネート（ＴＭＳＯＴｆ、０．１当量）を添加し、次いで、−２０℃で溶液を撹拌した。反応を、裏がガラスのシリカゲルプレート（Ｍｅｒｃｋ  ＤＣ  Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ  ６０Ｆ２５４）で行った薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）分析によってモニターし、ＵＶ光（２５４ｎｍ）および酸性モリブデン酸アンモニウムセリウムによって可視化した。アクセプターが完全に消費された後、飽和ＮａＨＣＯ３（ａｑ）および２０％Ｎａ２Ｓ２Ｏ３を用いて反応をクエンチし、次いで、混合物を、セライトのパッドを通して濾過した。２部分のジクロロメタンを用いて水層を抽出した後、合わせた有機層をブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、濃縮した。粗製物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出系としてトルエン／酢酸エチル）によって精製して、産物を生じさせた（収率をスキーム上に示した）。
【０２６２】
方法Ｂ：フッ化物−グリカンドナーによるグリコシル化
乾燥トルエン中トリフルオロメタンスルホン酸銀（５当量）、ビス（シクロペンタジエニル）ハフニウムジクロリド（３．５当量）および４Åの活性化したモレキュラーシーブの混合物を室温で１時間撹拌した。次いで、反応混合物を−５０℃まで冷却し、トルエン中アクセプター（１．０当量）およびドナー（１．２〜１．５当量）の溶液を添加した。混合物を−１０℃で２〜８時間撹拌した。ＴＬＣによりアクセプターの完全な消費が示された後、Ｅｔ３Ｎを用いて反応をクエンチし、ＥｔＯＡｃで希釈し、セライトを通して濾過した。濾液を水性ＮａＨＣＯ３およびブライン溶液で洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧下で濃縮した。粗製物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出系としてトルエン／酢酸エチル）によって精製して産物を生じさせた（収率をスキーム上に示した）。
【０２６３】
方法Ｃ：Ｏ−アセチルの脱保護
ＮａＯＭｅ（０．２５当量）をＴＨＦ／メタノール（２／３）中出発材料（１．０当量）の溶液に添加した。反応を室温で撹拌し、ＴＬＣ分析によってモニターした。アセチル基を完全に脱保護した後、溶液をＩＲ−１２０によって中和し、濾過し、濃縮した。粗製物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出系としてヘキサン／酢酸エチル）によって精製して産物を生じさせた（収率をスキーム上に示した）。
【０２６４】
方法Ｄ：Ｏ−Ｔｒｏｃの脱保護
Ｚｎ粉末（２０当量）および酢酸（０．２当量）をＴＨＦ中出発材料（１．０当量）の溶液に添加した。反応を室温で撹拌し、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）分析によってモニターした。Ｔｒｏｃ基を完全に脱保護した後、溶液を濾過し、濃縮した。粗製物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出系としてヘキサン／酢酸エチル）によって精製して産物を生じさせた（収率をスキーム上に示した）。
【０２６５】
方法Ｅ：ベンジリデンの脱保護
ｐ−トルエンスルホン酸（ｐＴＳＡ、１．５当量）をＡＣＮ／ＭｅＯＨ（２／１）中出発材料（１．０当量）の溶液に添加した。反応を室温で撹拌し、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）分析によってモニターした。ベンジリデン基を完全に除去した後、トリメチルアミンによって反応をクエンチし、次いで、濃縮した。粗製物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出系としてヘキサン／酢酸エチル）によって精製して産物を生じさせた（収率をスキーム上に示した）。
【０２６６】
方法Ｆ：全体的な脱保護
保護されたオリゴ糖（５０ｍｍｏｌ）とエチレンジアミン：ｎＢｕＯＨ（１／４）１０ｍＬの混合物を９０℃で一晩撹拌した。揮発性物質を蒸発させ、粗製物をＡｃ２Ｏ／ピリジン（１／２）１０ｍＬと一晩反応させた。高真空を使用して溶媒を除去し、産物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（溶出系としてアセトン／トルエン）によって精製した。産物を、ＭｅＯＨ（１０ｍＬ）中ナトリウムメトキシドを使用して一晩にわたって脱アセチル化した。ＩＲ−１２０を使用することによって反応を中和し、次いで、濾過し、真空中で濃縮した。残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（溶出系としてアセトン／トルエン）によって精製した。産物をＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ：ＨＣＯＯＨ（６／３／１）１０ｍＬに溶解させ、Ｐｄ（ＯＨ）２（５０重量％）を添加し、反応物を一晩にわたって水素化した。反応混合物を、セライトを通して濾過し、減圧下で濃縮した。残留物を、溶離液として水を使用してＧ−１５ゲルカラムクロマトグラフィーによって精製した。産物を凍結乾燥して白色粉末を生じさせた（収率をスキーム上に示した）。
【０２６７】
方法Ｇ：酵素的（２，６）−シアリル化
出発材料（５μｍｏｌ）、ＣＴＰ（１μｍｏｌ）、Ｎｅｕ５Ａｃ（９．５μｍｏｌ）、ＰＥＰ（１０μｍｏｌ）、α−２，６シアリルトランスフェラーゼ（２００μＬ、推定濃度２ｍｇ／Ｌ）、ＣＭＫ（８０単位）、ＰＫ（４０単位）、およびＰＰＡ（４０単位）を、１％ＢＳＡ（１３０μＬ）を含有する５０μｍｏｌのカコジル酸ナトリウム（ｐＨ７．４）に溶解させた。反応物を３７℃で穏やかに撹拌しながら２日間インキュベートした。Ｇ−１５ゲルクロマトグラフィー（溶離液Ｈ２Ｏ）を使用することによって産物を精製して、凍結乾燥後に所望の産物を白色固体としてもたらした。
【化１】
2020171312.tif 000009
【化２】
2020171312.tif 000010
【化３】
2020171312.tif 000011
【化４】
2020171312.tif 000012
【０２６８】
Ｂリンパ腫細胞への結合。抗体の結合をＣＤ２０＋Ｂリンパ腫細胞株（ラモスおよびＳＫＷ６．４）において調査し、フローサイトメトリーで分析した。１％ウシ胎仔血清を含有するＰＢＳ中の細胞をマイクロプレート１ウェル当たり２×１０５個で、種々の濃度の目的の抗体と一緒に氷上で１時間インキュベートした。細胞を洗浄し、ＰＢＳ緩衝液中に再浮遊させ、検出用ヤギ抗ｈＩｇＧ−Ｆｃγ−ＰＥと一緒に氷上で３０分インキュベートする。細胞を洗浄し、ＦＡＣＳでの分析に供する。
【０２６９】
ＦｃＲＩＩＩａ発現ＣＨＯ細胞への結合。抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の誘導と相関することが公知の前駆事象である、ＦｃＲＩＩＩａ受容体（ＣＤ１６ａ）への抗体の結合を、高親和性ＣＤ１６ａ（１５８Ｖａｌ）をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞において調査し、フローサイトメトリーで分析した。１％ウシ胎仔血清を含有するＰＢＳ中の細胞をマイクロプレート１ウェル当たり１×１０５個で、種々の濃度の目的の抗体と一緒に氷上で１時間インキュベートした。細胞を洗浄し、ＰＢＳ緩衝液中に再浮遊させ、検出用ヤギ抗ｈＩｇＧ−Ｆｃγ−ＰＥと一緒に氷上で３０分インキュベートする。細胞を洗浄し、ＦＡＣＳでの分析に供する。
【０２７０】
Ｂリンパ腫細胞に対するアポトーシス。抗体によって誘導されるアポトーシス活性をＣＤ２０＋Ｂリンパ腫細胞株（ラモスおよびＳＫＷ６．４）において調査し、フローサイトメトリーで分析した。ＲＰＭＩ１６４０−１０％ＦＢＳ培養培地中の細胞をマイクロプレート１ウェル当たり５×１０４個で、種々の濃度の目的の抗体と一緒に３７℃で２４時間インキュベートした。架橋剤ヤギＦ（ａｂ）’２抗ｈＩｇＧ−Ｆｃγの存在下、抗体との比率１：１の濃度で、アポトーシスを誘導した。細胞を洗浄し、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ／ＰＩ試薬と一緒に暗所中で５分インキュベートした。検出されたアポトーシスによる死滅をＦＡＣＳで分析した。
【０２７１】
Ｂリンパ腫細胞に対する補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）。抗体によって誘導されるＣＤＣ効果をＣＤ２０＋Ｂリンパ腫細胞株（ラモスおよびＳＫＷ６．４）において調査し、フローサイトメトリーで分析した。ＲＰＭＩ１６４０培養培地中の細胞をマイクロプレート１ウェル当たり２．０×１０５個で、種々の濃度の目的の抗体と一緒に氷上で３０分インキュベートした。細胞を洗浄し、ＲＰＭＩ１６４０中、１０％ヒト血清と一緒に３７℃で３０分インキュベートした。細胞を洗浄し、ＰＩ試薬と一緒に暗所中で５分インキュベートした。ＣＤＣによる細胞死をＦＡＣＳで分析した。
【０２７２】
Ｂリンパ腫細胞に対する抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）。糖操作抗体群によって誘導されるＡＤＣＣ効果を、ＣＤ２０を含有するＢリンパ腫細胞株（ラモスおよびＳＫＷ６．４）において、新しく調製したヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として使用して調査し、結果をフローサイトメトリーで分析した。ＰＢＳ−０．１％ＢＳＡ中の標的Ｂ細胞をまずＣＦＳＥを用いて３７℃で５分にわたって標識した。洗浄後、ＲＰＭＩ１６４０培地中のＣＦＳＥ標識細胞をマイクロプレート上、種々の濃度の目的の糖操作抗体群およびＰＢＭＣエフェクター細胞と一緒に３７℃で４時間インキュベートした。標的細胞とエフェクター細胞の比は２５：１に設定した。得られた混合物を、ＰＩ試薬を用いて暗所中で５分にわたって染色した。ＡＤＤＣによる細胞死をＦＡＣＳで分析した。
【０２７３】
ヒトＢ細胞の枯渇。ヒトＢ細胞の枯渇を、ヒト血液から新しく調製したヒトＰＢＭＣ細胞を使用して行った。マイクロプレートで培養したＲＰＭＩ１６４０−５％ＦＢＳ中２×１０６個の細胞を、１５％自己由来血漿の不在下または存在下、種々の濃度の目的の抗体と一緒に３７℃で４時間インキュベートした。洗浄後の細胞を、抗ＣＤ２−ＰＥおよび抗ＣＤ１９−ＦＩＴＣを用いて氷上で５分にわたって染色した。Ｂ細胞枯渇をＣＤ１９＋ＣＤ２−Ｂ細胞に基づいてＦＡＣＳで分析した。
【０２７４】
リンパ腫異種移植モデル。Ｂリンパ腫マウス異種移植試験を、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ’ｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）により承認された手順に従って実施した。簡単に述べると、６〜８週齢の雌Ｃ．Ｂ−１７重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウス（ＢｉｏＬＡＳＣＯ  Ｔａｉｗａｎ，Ｃｏ）にラモスリンパ腫細胞５×１０６個をｓ．ｃ．移植した。腫瘍が平均で約６０ｍｍ３に成長したらマウスを３つの群（ｎ＝６／群）にランダムに入れ、抗体処置を開始した。腫瘍細胞移植後９日目に、マウスに１ｍｇ／ｋｇもしくは１０ｍｇ／ｋｇのＧＡｂ１０１またはＰＢＳを週２回ｉ．ｖ．注射した（７回の注射について）。触知できる腫瘍を週２回カリパスで測定し、腫瘍体積を（長さ×幅２）／２として算出した。
【図１】
2020171312.tif 000013
【図２】
2020171312.tif 000014
【図３】
2020171312.tif 000015
【図４】
2020171312.tif 000016
【図５】
2020171312.tif 000017
【図６】
2020171312.tif 000018
【図７−１】
2020171312.tif 000019
【図７−２】
2020171312.tif 000020
【図８】
2020171312.tif 000021
【図９】
2020171312.tif 000022
【配列表】
2020171312000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年7月6日(2020.7.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６９】
本発明のα−フコシダーゼのポリペプチドは、それらの単離または精製を補助するために、誘導体化または修飾することができることが理解されよう。したがって、本発明の一実施形態では、本発明において使用するためのポリペプチドを、分離手段に直接かつ特異的に結合することができるリガンドを付加することによって誘導体化または修飾する。あるいは、ポリペプチドを、結合対の一方のメンバーを付加することによって誘導体化または修飾し、分離手段に、結合対の他方のメンバーを付加することによって誘導体化または修飾される試薬を含める。任意の適切な結合対を使用することができる。本発明において使用するためのポリペプチドを、結合対の一方のメンバーを付加することによって誘導体化または修飾する好ましい実施形態では、ポリペプチドにヒスチジン−タグを付けるまたはビオチン−タグを付けることが好ましい。一般には、ヒスチジンまたはビオチンタグのアミノ酸コード配列を遺伝子レベルで含め、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて組換えによりタンパク質を発現させる。ヒスチジンまたはビオチンタグは、一般には、ポリペプチドの一端、Ｎ末端またはＣ末端のいずれかに存在する。ヒスチジンタグは、一般には６つのヒスチジン残基からなる（配列番号６）が、これより長くてもよく、一般には、最大７アミノ酸、８アミノ酸、９アミノ酸、１０アミノ酸または２０アミノ酸またはそれ未満、例えば、５アミノ酸、４アミノ酸、３アミノ酸、２アミノ酸または１アミノ酸であってよい。さらに、ヒスチジンタグは、アミノ酸置換、好ましくは上で定義されている保存的置換を１つまたは複数含有してよい。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２６】
抗ＣＤ２０ＧＡｂ２００
市販のまたは所内製の不均一なｍＡｂを出発材料として使用し、選択されたグリコシダーゼを用いて改変した。エンドグリコシダーゼ（Ｅｎｄｏ  Ｆ２、Ｅｎｄｏ  Ｆ３、またはＥｎｄｏ  Ｈ）の適用により、そのＦｃ  Ｎ結合グリコシル化部位にＧｌｃＮＡｃ−Ｆｕｃがある均一な二糖（ｄｉ−ｓｕｇａｒ）ｍＡｂ（ＧＡｂ２００）をもたらすことができる。その後、フコシダーゼを適用することで均一な単糖（ｍｏｎｏ−ｓｕｇａｒ）ｍＡｂを得ることができる、または、単糖（ｍｏｎｏ−ｓｕｇａｒ）種は、リツキシマブに関して示されている通りＥｎｄｏ  Ｆ３とフコシダーゼの組合せを共に一段階で用いても得ることができる。産物をトリプシン処理し、グリコペプチドＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲ（配列番号３）およびＥＥＱＹＮＳＴＹＲ（配列番号４）を、ナノスプレーＬＣ／ＭＳを用いて分析してＧＡｂ２００のグリコシル化パターンを確認した。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２７】
抗ＣＤ２０ＧＡｂ２０１
リン酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．０、１．２５ｍＬ）中リツキシマブ（２．５ｍｇ）をＥｎｄｏ  Ｓ（１２５μｇ）およびＢｆＦｕｃＨ（２．５ｍｇ）と一緒に３７℃で２２時間インキュベートした。ＬＣ−ＭＳおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、重鎖上のＮ−グリカンの完全な切断が示された。反応混合物を、リン酸ナトリウム緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．０）を用いて予め平衡化したプロテインＡ−アガロース樹脂（１ｍＬ）のカラムでのアフィニティークロマトグラフィーに供した。カラムをリン酸ナトリウム緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．０、１０ｍＬ）で洗浄した。結合したＩｇＧをグリシン−ＨＣｌ（５０ｍＭ、ｐＨ３．０、１０ｍＬ）を用いて放出させ、溶出画分をＴｒｉｓ−Ｃｌ緩衝液（１．０Ｍ、ｐＨ８．３）ですぐに中和した。Ｆｃ断片を含有する画分を合わせ、遠心濾過（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  ｆｉｌｔｅｒ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）によって濃縮して抗ＣＤ２０ＧＡｂ２０１（１．９３ｍｇ）を生じさせた。産物をトリプシン処理し、グリコペプチドＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲ（配列番号３）およびＥＥＱＹＮＳＴＹＲ（配列番号４）を、ナノスプレーＬＣ／ＭＳを用いて分析してＧＡｂ２０１のグリコシル化パターンを確認した。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３０】
グリカンオキサゾリン−１０１を５０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．８）中エンドグリコシダーゼとＧＡｂ２０１の混合物に添加し、室温で１時間インキュベートした。反応混合物を、プロテインＡアフィニティーカラム、その後、陰イオン交換カラムｃａｐｔｏ  Ｑを用いて精製して、所望の産物である抗ＣＤ２０ＧＡｂ１０１を収集した。産物をトリプシン処理し、グリコペプチドＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲ（配列番号３）およびＥＥＱＹＮＳＴＹＲ（配列番号４）を、ナノスプレーＬＣ／ＭＳを用いて分析してＧＡｂ１０１のグリコシル化パターンを確認した。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３２】
グリカンオキサゾリン−１０２を５０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．８）中エンドグリコシダーゼとＧＡｂ２０１の混合物に添加し、室温で１時間インキュベートした。反応混合物を、プロテインＡアフィニティーカラム、その後、陰イオン交換カラムｃａｐｔｏ  Ｑを用いて精製して、所望の産物である抗ＣＤ２０ＧＡｂ１０２を収集した。産物をトリプシン処理し、グリコペプチドＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲ（配列番号３）およびＥＥＱＹＮＳＴＹＲ（配列番号４）を、ナノスプレーＬＣ／ＭＳを用いて分析してＧＡｂ１０２のグリコシル化パターンを確認した。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３４】
グリカンオキサゾリン−１０３を５０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．８）中エンドグリコシダーゼとＧＡｂ２０１の混合物に添加し、室温で１時間インキュベートした。反応混合物を、プロテインＡアフィニティーカラム、その後、陰イオン交換カラムｃａｐｔｏ  Ｑを用いて精製して、所望の産物である抗ＣＤ２０ＧＡｂ１０３を収集した。産物をトリプシン処理し、グリコペプチドＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲ（配列番号３）およびＥＥＱＹＮＳＴＹＲ（配列番号４）を、ナノスプレーＬＣ／ＭＳを用いて分析してＧＡｂ１０３のグリコシル化パターンを確認した。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３６】
グリカンオキサゾリン−１０４を５０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．８）中エンドグリコシダーゼとＧＡｂ２０１の混合物に添加し、室温で１時間インキュベートした。反応混合物を、プロテインＡアフィニティーカラム、その後、陰イオン交換カラムｃａｐｔｏ  Ｑを用いて精製して、所望の産物である抗ＣＤ２０ＧＡｂ１０４を収集した。産物をトリプシン処理し、グリコペプチドＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲ（配列番号３）およびＥＥＱＹＮＳＴＹＲ（配列番号４）を、ナノスプレーＬＣ／ＭＳを用いて分析してＧＡｂ１０４のグリコシル化パターンを確認した。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３８】
グリカンオキサゾリン−１０５を５０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．８）中エンドグリコシダーゼとＧＡｂ２０１の混合物に添加し、室温で１時間インキュベートした。反応混合物を、プロテインＡアフィニティーカラム、その後、陰イオン交換カラムｃａｐｔｏ  Ｑを用いて精製して、所望の産物であるＧＡｂ１０５を収集した。産物をトリプシン処理し、グリコペプチドＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲ（配列番号３）およびＥＥＱＹＮＳＴＹＲ（配列番号４）を、ナノスプレーＬＣ／ＭＳを用いて分析してＧＡｂ１０５のグリコシル化パターンを確認した。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２４０】
グリカンオキサゾリン−１０６を５０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．８）中エンドグリコシダーゼとＧＡｂ２０１の混合物に添加し、室温で１時間インキュベートした。反応混合物を、プロテインＡアフィニティーカラム、その後、陰イオン交換カラムｃａｐｔｏ  Ｑを用いて精製して、所望の産物である抗ＣＤ２０ＧＡｂ１０６を収集した。産物をトリプシン処理し、グリコペプチドＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲ（配列番号３）およびＥＥＱＹＮＳＴＹＲ（配列番号４）を、ナノスプレーＬＣ／ＭＳを用いて分析してＧＡｂ１０６のグリコシル化パターンを確認した。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２４２】
グリカンオキサゾリン−１０７を５０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．８）中エンドグリコシダーゼとＧＡｂ２０１の混合物に添加し、室温で１時間インキュベートした。反応混合物を、プロテインＡアフィニティーカラム、その後、陰イオン交換カラムｃａｐｔｏ  Ｑを用いて精製して、所望の産物である抗ＣＤ２０ＧＡｂ１０７を収集した。産物をトリプシン処理し、グリコペプチドＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲ（配列番号３）およびＥＥＱＹＮＳＴＹＲ（配列番号４）を、ナノスプレーＬＣ／ＭＳを用いて分析してＧＡｂ１０７のグリコシル化パターンを確認した。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２４４】
グリカンオキサゾリン−１０８を５０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．８）中エンドグリコシダーゼとＧＡｂ２０１の混合物に添加し、室温で１時間インキュベートした。反応混合物を、プロテインＡアフィニティーカラム、その後、陰イオン交換カラムｃａｐｔｏ  Ｑを用いて精製して、所望の産物である抗ＣＤ２０ＧＡｂ１０８を収集した。産物をトリプシン処理し、グリコペプチドＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲ（配列番号３）およびＥＥＱＹＮＳＴＹＲ（配列番号４）を、ナノスプレーＬＣ／ＭＳを用いて分析してＧＡｂ１０８のグリコシル化パターンを確認した。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２４６】
グリカンオキサゾリン−１０９を５０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．８）中エンドグリコシダーゼとＧＡｂ２０１の混合物に添加し、室温で１時間インキュベートした。反応混合物を、プロテインＡアフィニティーカラム、その後、陰イオン交換カラムｃａｐｔｏ  Ｑを用いて精製して、所望の産物である抗ＣＤ２０ＧＡｂ１０９を収集した。産物をトリプシン処理し、グリコペプチドＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲ（配列番号３）およびＥＥＱＹＮＳＴＹＲ（配列番号４）を、ナノスプレーＬＣ／ＭＳを用いて分析してＧＡｂ１０９のグリコシル化パターンを確認した。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２４８】
グリカンオキサゾリン−１１０を５０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．８）中エンドグリコシダーゼとＧＡｂ２０１の混合物に添加し、室温で１時間インキュベートした。反応混合物を、プロテインＡアフィニティーカラム、その後、陰イオン交換カラムｃａｐｔｏ  Ｑを用いて精製して、所望の産物である抗ＣＤ２０ＧＡｂ１１０を収集した。産物をトリプシン処理し、グリコペプチドＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲ（配列番号３）およびＥＥＱＹＮＳＴＹＲ（配列番号４）を、ナノスプレーＬＣ／ＭＳを用いて分析してＧＡｂ１１０のグリコシル化パターンを確認した。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２５０】
グリカンオキサゾリン−１１１を５０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．８）中エンドグリコシダーゼとＧＡｂ２０１の混合物に添加し、室温で１時間インキュベートした。反応混合物を、プロテインＡアフィニティーカラム、その後、陰イオン交換カラムｃａｐｔｏ  Ｑを用いて精製して、所望の産物である抗ＣＤ２０ＧＡｂ１１１を収集した。産物をトリプシン処理し、グリコペプチドＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲ（配列番号３）およびＥＥＱＹＮＳＴＹＲ（配列番号４）を、ナノスプレーＬＣ／ＭＳを用いて分析してＧＡｂ１１１のグリコシル化パターンを確認した。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２５２】
（実施例４）
ＧＡｂ２００およびＧＡｂ２０１の特徴付け
抗原結合ならびに誘導されるアポトーシス、ＣＤＣおよびＡＤＣＣ効果を、ラモス細胞を使用して評価した。ＧＡｂ２００およびＧＡｂ２０１はどちらもリツキシマブとほぼ同じ生物活性を示したので、抗原結合およびアポトーシス効果はどちらも、エンドグリコシダーゼおよび／またはフコシダーゼを用いた酵素消化の影響を受けなかった。しかし、誘導されるＣＤＣ効果は、単糖（ｍｏｎｏ−ｓｕｇａｒ）バリアントであるＧＡｂ２０１では大いに損なわれたが、二糖（ｄｉ−ｓｕｇａｒ）バリアントであるＧＡｂ２００では、リツキシマブの最大の活性の約５０％を保持することができた。エフェクター細胞としてＰＢＭＣを使用したＡＤＣＣに関しては、単糖（ｍｏｎｏ−ｓｕｇａｒ）バリアントおよび二糖（ｄｉ−ｓｕｇａｒ）バリアントで、それぞれリツキシマブの最大の効果の約６０％および８０％が保持された。単糖（ｍｏｎｏ−ｓｕｇａｒ）バリアント（ＧＡｂ２０１）と比較して、二糖（ｄｉ−ｓｕｇａｒ）バリアント（ＧＡｂ２００）により、ＣＤＣおよびＡＤＣＣの両方がより良好になされた。
（実施例５）
抗ＣＤ２０ＧＡｂｓの特徴付け
精製抗ＣＤ２０ＧＡｂｓ  １０１、１０２、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１および２０１をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認し（図２）、抗ＣＤ２０ＧＡｂ１０１のＩｇＧ分子の分子量をＭＳによって確認した。Ｎ−グリカンプロファイリングをトリプシン消化によって実施し、切断されたグリコペプチドＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲ（配列番号３）に基づいて、ナノスプレーＬＣ／ＭＳによって分析した。抗ＣＤ２０ＧＡｂｓ１０１、１０２、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０および１１１についてのＮ−グリカンプロファイリングの結果が図３に示されている。
【外国語明細書】
2020171312000001.pdf