(57)【要約】【課題】本発明は、より確実に異なる酵母を接合させ、交配株を得る方法を提供することを課題とする。【解決手段】本発明は、単離した第1の酵母の胞子又は発芽後の一倍体細胞と第2の酵母の胞子又は発芽後の一倍体細胞を隣接させることにより接合させ、交配株を得る接合ステップを含む、交配株の生産方法等を提供する。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離した第1の酵母の胞子又は発芽後の一倍体細胞と第2の酵母の胞子又は発芽後の一倍体細胞を隣接させることにより接合させ、交配株を得る接合ステップを含む、
交配株の生産方法。
【請求項２】
第1の酵母及び第2の酵母の少なくとも一方について、胞子を用いて接合ステップを行う、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第1の酵母及び第2の酵母の少なくとも一方がホモタリック性を有する酵母である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
第1の酵母及び第2の酵母の少なくとも一方が焼酎酵母である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
接合ステップにおいて、第1の酵母と第2の酵母の間の接合子の形成を顕微鏡下で確認することを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
第1の酵母及び第2の酵母、並びに接合ステップで得られる交配株の表現型及び／又は特定の核酸配列を調べるステップ、及び
交配株の表現型及び／又は特定の核酸配列と、第1の酵母及び第2の酵母の表現型及び／又は特定の核酸配列を比較することにより、交配株が得られたことを確認するステップを含む、
請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵母の交配株の生産方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
酵母は、遺伝子工学等の分野においてモデル生物として広く利用されているのみならず、発酵を利用した食品や物質の生産においても広く利用されている。このような分野において酵母を有効利用するためには、優れた性質を有する酵母を育種することが不可欠である。酵母の育種方法として、突然変異誘発、遺伝子組み換え手法を用いた変異の導入の他、異なる二つの菌株を接合させることによる交配育種が知られている。
【０００３】
酵母の接合は、一倍体の段階で生じ、接合が生ずるには、細胞は互いに異なる接合型、すなわち、ａ型とα型の接合型を持つことが必要である。清酒酵母又は実験室酵母においては、単離した胞子に由来する細胞は、一倍体クローンとして増殖するだけで、増殖した細胞は同じ接合型であるため接合により二倍体化することはない（このような性質を「ヘテロタリック」という）。一方、酵母の中には増殖の段階で接合型変換を起こすものがあり、このような酵母の胞子を単離して培養した場合、生じた一倍体細胞では接合型変換を経た細胞と経ていない細胞との間で接合子が形成され、自己二倍体化を起こし得る（このような性質を「ホモタリック」という）（非特許文献１）。
【０００４】
上記の通り、ホモタリック性を有する酵母では、単離した胞子が発芽後自己二倍体化し、異なる酵母との接合ができなくなる可能性がある。また、ホモタリック性を有する酵母を用いた交配では、得られた株が交配株であるのか自己二倍体株であるのか、区別が困難であった。さらに、ヘテロタリック性を有する酵母であっても、交配株を確実に得るには、交配させる菌株に別々の栄養要求性を持たせて、これに基づいて選抜を行う等の工程が必要であり、簡便ではなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Beth A Montelone, "Yeast Mating Type", ENCYCLOPEDIA OF LIFE SCIENCES, 2002, DOI: 10.1002/9780470015902.a0000598.pub2
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記の通り、異なる酵母を確実に接合させることは従来困難であった。本発明は、より確実に異なる酵母を接合させ、交配株を得る方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、単離した第1の酵母の胞子又は発芽後の一倍体細胞と第2の酵母の胞子又は発芽後の一倍体細胞を隣接させることによって接合させることにより、より確実に交配株が得られることを見出した。本発明者はさらに、接合過程において顕微鏡下で接合子の形成を確認することにより、得られた株が交配株であるか否かの判別をより正確に行うことができることを見出した。
【０００８】
本発明は、以下の態様を包含する。
（１）単離した第1の酵母の胞子又は発芽後の一倍体細胞と第2の胞子又は発芽後の一倍体細胞を隣接させることにより接合させ、交配株を得る接合ステップを含む、
交配株の生産方法。
（２）第1の酵母及び第2の酵母の少なくとも一方について、胞子を用いて接合ステップを行う、（１）に記載の方法。
（３）第1の酵母及び第2の酵母の少なくとも一方がホモタリック性を有する酵母である、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）第1の酵母及び第2の酵母の少なくとも一方が焼酎酵母である、（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）接合ステップにおいて、第1の酵母と第2の酵母の間の接合子の形成を顕微鏡下で確認することを含む、（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）第1の酵母及び第2の酵母、並びに接合ステップで得られる交配株の表現型及び／又は特定の核酸配列を調べるステップ、及び
交配株の表現型及び／又は特定の核酸配列と、第1の酵母及び第2の酵母の表現型及び／又は特定の核酸配列を比較することにより、交配株が得られたことを確認するステップを含む、
（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、より確実に異なる酵母を接合させ、交配株を得ることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図1は、出芽酵母の生活環を例示的に示したものである。
【図２】図2は、YPD培地における四分子解析の結果を示したものである。Aは鹿児島2号株の、Bは鹿児島5号株の結果を示す。それぞれ、子嚢に含まれる4つの胞子を並べ（縦軸）、8つの子嚢に対して実験を行った（横軸）。
【図３】図3は、隣接させた胞子を顕微鏡にて観察した結果を示す。両胞子の発芽後、それぞれの細胞が出芽した場合の写真を図3Aに、接合子を形成した場合の写真を図3Bに示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の理解を容易にするために、出芽酵母の生活環を図1に例示的に示す（なお、図1は、本発明の範囲を何ら限定するものではない）。出芽酵母には一組の染色体をもつ一倍体と二組の染色体をもつ二倍体の世代が存在し、一倍体と二倍体はそれぞれ出芽によって増殖することが可能である。出芽酵母は富栄養環境では通常二倍体として存在するが、窒素源が枯渇する等して貧栄養環境におかれると、減数分裂により一倍体の胞子を形成する（胞子にはa型とα型の2つの接合型が存在し、a型同士又はα型同士では接合は生じない）。減数分裂によって、a型とα型の接合型を有する各々二つずつの胞子が、細胞内に形成される。胞子は過酷な環境に耐性があり、やがて環境が好転すると発芽し、一倍体として再び出芽による増殖を開始する。また、異なる接合型を有する発芽後の胞子は、接合により二倍体を形成することもできる。
【００１２】
本明細書において、「ホモタリック性を有する酵母」とは、胞子発芽後の一倍体の段階で接合型変換を起こすため自己二倍体化を起こし得る酵母を指す。ホモタリック性を有する酵母の胞子を単離して培養した場合、発芽後の増殖過程で接合型変換を経た一倍体と経ていない一倍体との間で接合が生じ得る。また、本明細書において「ヘテロタリック性を有する酵母」とは、胞子発芽後の増殖の段階で接合型変換を起こさず、自己二倍体化を起こさない酵母を指す。ヘテロタリック性を有する酵母の胞子を単離して培養した場合、発芽後に一倍体クローンとして増殖するだけで、接合は生じない。
【００１３】
一態様において、本発明は、単離した第1の酵母の胞子又は発芽後の一倍体細胞と第2の酵母の胞子又は発芽後の一倍体細胞を隣接させることにより接合させ、交配株を得る接合ステップを含む、交配株の生産方法に関する。
【００１４】
接合ステップは、単離した第1の酵母の胞子又は発芽後の一倍体細胞と第2の酵母の胞子又は発芽後の一倍体細胞を、接合が可能な距離に隣接させることにより行うことができる。本工程は、単離した胞子を、直接栄養培地上で隣接させて発芽及び接合をさせることによって行うこともできるし、胞子を一度栄養培地で発芽させたものを隣接させて接合させることによって行うこともできる。栄養培地としては、従来公知の組成の培地、例えば実施例に記載のYPD寒天培地を使用することができる。接合が可能な距離は、限定しないが、顕微鏡下で2つの胞子が接触していることを確認できる距離、又は例えば10μm以下、5μm以下、3μm以下、2μm以下、例えば1μm以下、0.5μm以下、又は0.1μm以下であってよい。接合ステップは、光学顕微鏡下で行うことができる。
【００１５】
一実施形態において、第1の酵母及び第2の酵母の一方又は両方について（例えばホモタリック性を有する酵母について）、胞子を用いて接合ステップを行う。胞子を用いることで、ホモタリック性を有する酵母について、発芽直後の胞子が接合する可能性を高め、発芽後に接合型変換を介して自己二倍体化が生ずるリスクを低減することができる。
【００１６】
例えば、単離した第1の酵母の胞子と第2の酵母の胞子を隣接させることにより発芽直後の胞子を接合させることができ、さらに任意に顕微鏡で接合子の有無を確認することによって、より確実に交配株を得ることができる。
【００１７】
接合ステップは、マイクロマニピュレーターにより行うことができる。マイクロマニピュレーターとは、光学顕微鏡下での細胞等の取り扱いに用いる装置を指す。マイクロマニピュレーターは、細胞への直接接触による処置、微小試料の移動や加工等を行うことができる。本発明において、マイクロマニピュレーターは酵母を移動させ、隣接させることができるものである限り限定しないが、例えばガラス管等により陰圧で細胞を吸引する細胞採取部を有するものであってよい。取扱い対象が微小であるため、マイクロマニピュレーターは通常、細胞採取部をXYZ軸方向にそれぞれ精密に動かす駆動部を有する。
【００１８】
本発明の方法は、接合ステップにおいて、第1の酵母と第2の酵母の間の接合子の形成を顕微鏡下で確認することを含んでもよい。例えば、それぞれの細胞が出芽した場合、2個の母細胞から、それより少し小さな娘細胞が出芽していることが観察され得る。それに対して、細胞間で接合子が形成された場合、細胞が変形し、2個の細胞が繋がっていることが観察され得る。以上の様に、顕微鏡下で接合子の形成を確認することにより、異なる酵母が接合したことをより正確に判別できる。観察は経時的に行うこともでき、例えば数分ごとに観察を行うことにより、接合子の形成をより正確に判別できる。
【００１９】
本発明の方法は、接合ステップの前に、胞子又は発芽後の一倍体細胞を単離するステップを任意に含んでもよい。このステップでは、例えば、酵母を胞子形成培地において培養し、減数分裂を経て胞子を形成させる。胞子形成培地としては、従来公知の組成の培地、例えば実施例に記載の培地を使用することができる。培養は公知の条件で行うことができ、例えば20℃〜40℃、25℃〜35℃又は約30℃で、例えば1日〜1週間又は2日〜3日行うことができる。
【００２０】
本発明の方法は、胞子形成後に、ザイモリアーゼ処理等により酵母の細胞壁を溶解させるステップを含んでよい。ザイモリアーゼの濃度は限定しないが、例えば0.02 mg/ml〜2 mg/ml、0.1 mg/ml〜0.4mg/ml又は約0.2mg/mlであってよい。本ステップで用いるザイモリアーゼ溶液は、ザイモリアーゼの他、ソルビトール、メルカプトエタノール等の添加剤及び／又は緩衝液を含んでよく、例えば実施例に記載のザイモリアーゼ溶液を用いることができる。ザイモリアーゼ等により細胞壁を溶解させることによって、細胞内に含まれる個々の胞子を遊離させることができ、遊離胞子を単離することが容易になる。次に、必要に応じて画線等を行い、続いて例えばマイクロマニュピレーター等の機器を利用して、培地から胞子（子嚢）を分離することができる。単離した胞子は、直接栄養培地上で隣接させて発芽及び接合をさせてもよいし、一度栄養培地で発芽させたものを隣接させて接合させてもよい。
【００２１】
一実施形態において、本発明は、第1の酵母及び第2の酵母、並びに接合ステップで得られる交配株の表現型及び／又は特定の核酸配列を調べるステップ、及び交配株の表現型及び／又は特定の核酸配列と、第1の酵母及び第2の酵母の表現型及び／又は特定の核酸配列を比較することにより、交配株が得られたことを確認するステップ（比較ステップ）を含む。
【００２２】
交配株の表現型及び／又は特定の核酸配列を調べるステップは接合ステップの後に行われるが、第1の酵母及び第2の酵母の表現型及び／又は特定の核酸配列を調べるステップは接合ステップの前又は後のいずれにおいても行うことができる。
【００２３】
本工程で調べられ得る表現型は、その比較により交配株が得られたことを確認できる限り限定しないが、例えば増殖速度、アルコール等の物質生産能及び耐性能、資化性、例えば糖及び他の非発酵性炭素源（エタノール、酢酸、グリセロール等）の資化性、酸耐性（例えばクエン酸耐性）、凝集能、栄養要求性（例えばアミノ酸又は核酸要求性）等の一つ以上が挙げられる。これらの表現型を例えば特定の培地等で酵母を培養して調べることができる。ここで、物質の生産能を調べる場合、実際に酵母を用いて物質を生産させ、生産条件を調べてもよい。例えば、アルコールの生産能を調べる場合、酵母を用いて実際にアルコールを製造させて、発酵の速度、残糖量、有機酸量、アミノ酸量、もろみの酸度等を公知の方法により測定してもよいし、味や香りについて官能検査やGC-MSなどの機器を用いて分析してもよい。
【００２４】
本工程で調べられ得る特定の核酸配列は、その比較により交配株が得られたことを確認できる限り限定しないが、例えば上記表現型に関係する遺伝子の配列の一つ以上が挙げられる。核酸配列は、当業者に公知の方法により調べることができ、例えば特定のプライマーを用いるPCR、特定のプローブを用いるハイブリダイゼーション等により行うことができる。
【００２５】
比較工程では、交配株が第1の酵母と第2の酵母の表現型及び／又は特定の核酸配列を少なくとも一つ有することを確認することによって、交配株が得られたことを確かめることができる。
【００２６】
一実施形態において、前記第1の酵母及び第2の酵母の少なくとも一方又は両方が、ホモタリック性を有する酵母である。上記の通り、ホモタリック性を有する酵母では、単離した胞子が自己二倍体化し、異なる酵母との接合ができなくなる可能性がある。また、ホモタリック性を有する酵母を用いた交配では、得られた株が交配株であるのか自己二倍体株であるのか、区別が困難であった。本発明の方法は、より確実に異なる酵母を接合させ、交配株を得ることを可能とするため、交配を行う酵母の少なくとも一方がホモタリック性を有する酵母である場合に特に有用である。また、本発明の方法は、接合子の形成を顕微鏡下で確認することが可能であるため、清酒酵母のようにヘテロタリック性を有するが胞子形成能が低い酵母を用いる場合にも有用である。
【００２７】
本発明において、用い得る酵母の種類は限定しないが、例えばサッカロマイセス（Saccharomyces）属、ピキア（Pichia）属、及びクルイベロマイセス（Kluyveromyces）属に属する酵母、例えばサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）を例示することができる。また、食品や物質の生産に適する酵母、例えば焼酎酵母、清酒酵母、ビール酵母、ワイン酵母、ウイスキー酵母等の醸造用酵母や、パン酵母を用いることができる。本発明に用いる酵母は、接合が可能である限り、上記酵母の一種のみを接合させてもよいが、二種以上を接合させてもよい。
【実施例】
【００２８】
酵母株の顕微鏡下での接合
焼酎酵母鹿児島2号株及び鹿児島5号株（いずれもSaccharomyces cerevisiaeに属し、二倍体であり、ホモタリック株である。鹿児島県酒造組合より入手）のそれぞれを胞子形成寒天培地（1% 酢酸カリウム、0.1%酵母エキス、0.05%グルコース、2%寒天）上に塗布し、30℃にて2〜3日保温して胞子を形成させた。胞子形成が確認できた菌体をザイモリアーゼ溶液（0.2mg/ml Zymolyase 100-T（ナカライテスク）、1.2M ソルビトール、 50mM リン酸緩衝液 (pH7)、 0.1% 2-メルカプトエタノール）に懸濁し、37℃で5〜15分保温後、YPD寒天培地（2％グルコース、2％ペプトン、1％酵母エキス、2％寒天）上に画線した。その後、細胞壁が溶解して遊離した胞子をマイクロマニピュレーター（ナリシゲ社、MMO-202ND）を用いて単離し、30℃で保温することでコロニーを形成させた（F1株）。
【００２９】
その後、各F1株について四分子解析を利用して発酵能等の性質を調べた。四分子解析では、F1株単離を目的として、マイクロマニピュレーターを用いて1つの細胞に由来する4つの胞子を単離して1列に並べて、上記YPD培地にて培養を行った。F1株それぞれを上記と同様に胞子形成培地にて胞子形成させ、胞子形成確認後、ザイモリアーゼ処理を行いYPD寒天培地に画線した。交配させたい鹿児島2号株由来の胞子と鹿児島5号株由来の胞子をマイクロマニピュレーターを用いてYPD寒天培地上で隣接させた。この隣接作業を複数回行った。その後30℃で保温しながら、顕微鏡にて隣接させた胞子を観察し、胞子発芽後直ちに接合子を形成している場合、これを交配株として単離した。胞子発芽後、それぞれの細胞が出芽している場合は、同じ接合型であったと考えられた。
【００３０】
四分子解析の結果を図2に示す。Aは鹿児島2号株の、Bは鹿児島5号株の結果を示す。それぞれ、子嚢に含まれる4つの胞子を並べ（縦軸）、8つの子嚢に対して実験を行った（横軸）。鹿児島5号株については縦に並べた4つの胞子から全てコロニーが生じたのに対し、鹿児島2号株では、主に2個の胞子からコロニーが生じた。これにより、鹿児島2号株において生育に重要な遺伝子の片方に培地での生育が劣勢となる変異があるものと考えられた。接合には、生じたコロニーを用いた。
【００３１】
胞子接合の結果を図3に示す。それぞれの細胞が出芽した場合の写真を図3Aに、接合子を形成した場合の写真を図3Bに示す。図3Aでは、下側に見える2個の卵形の母細胞から、上側に見える少し小さな卵形の娘細胞をそれぞれ出芽していることが認められる。それに対して、図3Bでは、細胞が変形していびつな形（アレイ型）となり2個の細胞が繋がっていることが認められる。
【００３２】
以上の様に、マイクロマニピュレーターを用いて胞子を隣接させることで接合を生じさせることができた。また、接合した場合は変形して接合子を作るのに対し、接合しない場合はそれぞれの細胞が出芽するため、接合の有無を顕微鏡下で判別することで、より確実に異なる酵母を接合させ得ることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００３３】
本発明により、より確実に異なる酵母を接合させ、交配株を得ることが可能となる。したがって、本発明は、物質の生産等のためのより優れた性質を有する酵母株の育種のために有用であり得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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