(57)【要約】      （修正有）【課題】特異的な多量体化状態を支持するタンパク質及び該タンパク質を用いた成長因子受容体の発現を変化させる方法の提供。【解決手段】リガンド誘導性の受容体の二量体化として知られる、腫瘍及び幹細胞に特異的なＭＵＣ１膜貫通タンパク質の切断型であるＭＵＣ１＊の細胞外ドメインへのＮＭ２３二量体の結合において、受容体の二量体化に影響を与えるＮＭ２３の多量体を選択的に形成することが可能な組換えＮＭ２３又はＮＭ２３突然変異体。該ＮＭ２３と幹細胞を一緒に培養する工程を含む、ＭＵＣ１＊成長因子受容体の発現を変化させる方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）リンカーを介して形成されるＮＭ２３二量体をコードする核酸を作製する工程と、
（ｉｉ）前記核酸を標的化細胞に導入させる工程と、
（ｉｉｉ）ＭＵＣ１＊遺伝子のプロモータ部位付近の位置に挿入されるように、前記核酸を設計する工程、
（ｉｖ）核酸が導入された標的化細胞が発現するＮＭ２３二量体と幹細胞を一緒に培養する工程、
を含む、ＭＵＣ１＊成長因子受容体の発現を変化させる方法。
【請求項２】
前記標的化細胞が幹細胞又は前駆細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記前駆細胞が造血細胞である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記前駆細胞がＢ細胞又はＢ細胞前駆体である、請求項１又は２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．  発明の分野
本願は、成長因子変異体、及びかかる成長因子の多量体化を制御する方法の分野に関するものである。
【０００２】
［関連出願の相互参照］
本願は２０１１年５月９日付で出願された米国仮出願第６１／４８４，０５２号（この開示は引用することにより本明細書の一部をなすものとする）の利益を主張する。
【背景技術】
【０００３】
２．  一般的背景及び現行の技術水準
生体系では、タンパク質は多くの場合、細胞を特定の方法で機能させる複雑なシグナル伝達カスケードを構築する。例えば、細胞の分裂プロセスを開始させる一般的な方法は、タンパク質（リガンド）を膜貫通タンパク質受容体の細胞外ドメインに結合させ、リガンドの細胞外ドメインへの結合により受容体の立体構造を変化させることである。リガンド誘導性の立体構造の変化は、細胞外ドメイン、細胞内ドメイン又はその両方で起きる可能性があり、タンパク質又は分子が受容体に結合することができるという変化をもたらす。この外から内へのシグナル伝達は、細胞の分裂をシグナル伝達するとともに、プログラム細胞死及び多くの他のプロセスを開始するのに使用される一般的な機構である。
【０００４】
成長因子受容体の活性を調節するのに一般的に使用される機構の１つは、受容体の細胞外ドメインのリガンド誘導性の二量体化であり、これは細胞内尾部を互いに近付け、シグナル伝達カスケードを開始するキナーゼ等のタンパク質を修飾するのに良好なドッキング部位を構築し、細胞を分裂させる細胞核へのシグナルがもたらされる。
【０００５】
成長因子受容体の細胞外ドメインのリガンド誘導性の二量体化は、多くの場合リガンド二量体、すなわち互いに非共有結合して、同じ（ホモ）又は異なる（ヘテロ）２つの受容体に結合するホモ二量体又はヘテロ二量体を形成する２つのリガンドの結合によって達成される。
【０００６】
リガンド誘導性の受容体の二量体化の重要な例は、腫瘍及び幹細胞に特異的なＭＵＣ１膜貫通タンパク質の切断型であるＭＵＣ１＊の細胞外ドメインへのＮＭ２３二量体の結合、及びＭＵＣ１＊の細胞外ドメインの二量体化である。リガンドが単量体であるか否かにかかわらず、二量体又はより高次の多量体には、とりわけその濃縮機能がある。多くの成長因子受容体では、二量体形態のリガンドのみが成長因子受容体を活性化する。さらに、多くの生体系では、より高次の多量体が二量体によって促進される機能を停止するフィードバックループが存在する。例えば、ＮＭ２３二量体は多能性成長を活性化するが、ＮＭ２３六量体は多能性成長を停止し、分化を開始する。同様に、λファージのＣＩタンパク質は、四量体としてＤＮＡに結合することで一組の遺伝子の転写を開始するが、濃度の増大に応じてＣＩタンパク質が八量体になることでそれらの遺伝子の転写を停止する。多くの場合、成長因子受容体を構造的に活性化するか、又はタンパク質の特異的な多量体化状態によって媒介される一部の活性を増大することが望ましい。問題は、特異的な多量体を発現及び単離するのが極めて困難であり、更には特異的な多量体を生体系に添加するか又は生体系内で発現させる場合にこの多量体化状態を維持することがより困難であることである。そのため、特異的な多量体化状態でのみ存在するか、又は二量体等の多量体化状態を支持する若しくは二量体化を支持するリガンドを生成することができることが有益である。
【０００７】
ＮＭ２３突然変異体は二量体の形成を支持するという報告があるが、不活性状態の六量体に対する活性状態の二量体として存在する割合は、特に組換えタンパク質として発現される場合、二量体を発現している細胞、濃度、及び制御することが困難な又は不可能な多くのタンパク質発現状態に応じて大きく異なる。そのため、二量体形態のＮＭ２３又はＮＭ２３突然変異体のより大きな比率又はより安定した集団をもたらす、組換え方法を含む方法を開発することが有益であると考えられる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は上述の問題を克服し、特異的な多量体化状態を支持するタンパク質を産生するタンパク質の遺伝的変異体、キメラ、及び一本鎖構築物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
一態様では、本発明は、特異的な多量体を選択的に形成する組換えによって作製されたタンパク質構築物に関するものである。多量体化状態はその生物学的に活性な状態であり得る。多量体化状態は二量体であり得る。代替的には、多量体化状態はその不活性状態であり得る。多量体化状態はより高次の多量体であり得る。
【００１０】
タンパク質は成長因子又は転写因子であり得る。二量体形態はホモ二量体又はヘテロ二量体であり得る。タンパク質はヒトタンパク質又はマウスタンパク質等の哺乳動物タンパク質であり得る。
【００１１】
タンパク質構築物は、リンカーペプチドを通じて連結することができる２つの単量体又は２つの単量体断片を含むことができ、このようにして単量体−リンカー−単量体構築物が形成される。
【００１２】
単量体タンパク質はＨ１アイソフォーム、Ｈ２アイソフォーム又はＨ７アイソフォーム等のＮＭ２３であり得る。単量体は、二量体の形成を支持するとともに、より高次の多量体の形成を阻害する、ＮＭ２３又はその突然変異体であり得る。突然変異型ＮＭ２３はＳ１２０Ｇ又はＰ９６Ｓ又はＮＭ２３及びＰ９６Ｓであり得る。単量体は、二量体の形成を支持する、ＮＭ２３又は１個〜１０個のＣ末端アミノ酸が欠失しているその突然変異体であり得る。１個〜６個のＣ末端アミノ酸が欠失し得る。
【００１３】
リンカーは、ＧＳ、ＧＳ２、ＧＳ３、ＩｇＧ１ヒンジ領域若しくはＩｇＧ２ａヒンジ領域、又はそれらの組合せを含み得る。
【００１４】
一態様では、タンパク質構築物は以下のものを含み得る：
ＮＭ２３  Ｓ１２０Ｇ  ＧＳ２、
ＮＭ２３  Ｐ９６Ｓ  ＧＳ２、
ＮＭ２３  Ｐ９６Ｓ／Ｓ１２０Ｇ  ＧＳ２、
ＮＭ２３  Ｐ９６ＳΔＣ１  ＧＳ２、
ＮＭ２３  Ｐ９６ＳΔＣ２  ＧＳ２、
ＮＭ２３  Ｐ９６ＳΔＣ６  ＧＳ２、
ＮＭ２３  Ｐ９６ＳΔＣ１／Ｓ１２０Ｇ  ＧＳ２、
ＮＭ２３  Ｐ９６ＳΔＣ２／Ｓ１２０Ｇ  ＧＳ２、
ＮＭ２３  Ｐ９６ＳΔＣ６／Ｓ１２０Ｇ  ＧＳ２、
ＮＭ２３  Ｓ１２０Ｇ  ＧＳ３、
ＮＭ２３  Ｐ９６Ｓ  ＧＳ３、
ＮＭ２３  Ｐ９６Ｓ／Ｓ１２０Ｇ  ＧＳ３、
ＮＭ２３  Ｐ９６ＳΔＣ１  ＧＳ３、
ＮＭ２３  Ｐ９６ＳΔＣ２  ＧＳ３、
ＮＭ２３  Ｐ９６ＳΔＣ６  ＧＳ３、
ＮＭ２３  Ｐ９６ＳΔＣ１／Ｓ１２０Ｇ  ＧＳ３、
ＮＭ２３  Ｐ９６ＳΔＣ２／Ｓ１２０Ｇ  ＧＳ３、
ＮＭ２３  Ｐ９６ＳΔＣ６／Ｓ１２０Ｇ  ＧＳ３、
ＮＭ２３  Ｓ１２０Ｇ  ＩｇＧ１ｈ  ｎｏＣ、
ＮＭ２３  Ｐ９６Ｓ  ＩｇＧ１ｈ  ｎｏＣ、
ＮＭ２３  Ｐ９６Ｓ／Ｓ１２０Ｇ  ＩｇＧ１ｈ  ｎｏＣ、
ＮＭ２３  Ｐ９６ＳΔＣ１  ＩｇＧ１ｈ  ｎｏＣ、
ＮＭ２３  Ｐ９６ＳΔＣ２  ＩｇＧ１ｈ  ｎｏＣ、
ＮＭ２３  Ｐ９６ＳΔＣ６  ＩｇＧ１ｈ  ｎｏＣ、
ＮＭ２３  Ｐ９６ＳΔＣ１／Ｓ１２０Ｇ  ＩｇＧ１ｈ  ｎｏＣ、
ＮＭ２３  Ｐ９６ＳΔＣ２／Ｓ１２０Ｇ  ＩｇＧ１ｈ  ｎｏＣ、
ＮＭ２３  Ｐ９６ＳΔＣ６／Ｓ１２０Ｇ  ＩｇＧ１ｈ  ｎｏＣ、
ＮＭ２３  Ｓ１２０Ｇ  ＩｇＧ２ａｈ  ｎｏＣ、
ＮＭ２３  Ｐ９６Ｓ  ＩｇＧ２ａｈ  ｎｏＣ、
ＮＭ２３  Ｐ９６Ｓ／Ｓ１２０Ｇ  ＩｇＧ２ａｈ  ｎｏＣ、
ＮＭ２３  Ｐ９６ＳΔＣ１  ＩｇＧ２ａｈ  ｎｏＣ、
ＮＭ２３  Ｐ９６ＳΔＣ２  ＩｇＧ２ａｈ  ｎｏＣ、
ＮＭ２３  Ｐ９６ＳΔＣ６  ＩｇＧ２ａｈ  ｎｏＣ、
ＮＭ２３  Ｐ９６ＳΔＣ１／Ｓ１２０Ｇ  ＩｇＧ２ａｈ  ｎｏＣ、
ＮＭ２３  Ｐ９６ＳΔＣ２／Ｓ１２０Ｇ  ＩｇＧ２ａｈ  ｎｏＣ、
ＮＭ２３  Ｐ９６ＳΔＣ６／Ｓ１２０Ｇ  ＩｇＧ２ａｈ  ｎｏＣ、
ＮＭ２３  Ｓ１２０Ｇ  ＩｇＧ１ｈ／ＩｇＧ２ａｈ  ｎｏＣ、
ＮＭ２３  Ｐ９６Ｓ  ＩｇＧ１ｈ／ＩｇＧ２ａｈ  ｎｏＣ、
ＮＭ２３  Ｐ９６Ｓ／Ｓ１２０Ｇ  ＩｇＧ１ｈ／ＩｇＧ２ａｈ  ｎｏＣ、
ＮＭ２３  Ｐ９６ＳΔＣ１  ＩｇＧ１ｈ／ＩｇＧ２ａｈ  ｎｏＣ、
ＮＭ２３  Ｐ９６ＳΔＣ２  ＩｇＧ１ｈ／ＩｇＧ２ａｈ  ｎｏＣ、
ＮＭ２３  Ｐ９６ＳΔＣ６  ＩｇＧ１ｈ／ＩｇＧ２ａｈ  ｎｏＣ、
ＮＭ２３  Ｐ９６ＳΔＣ１／Ｓ１２０Ｇ  ＩｇＧ１ｈ／ＩｇＧ２ａｈ  ｎｏＣ、
ＮＭ２３  Ｐ９６ＳΔＣ２／Ｓ１２０Ｇ  ＩｇＧ２ａｈ  ｎｏＣ、又は、
ＮＭ２３  Ｐ９６ＳΔＣ６／Ｓ１２０Ｇ  ＩｇＧ２ａｈ  ｎｏＣ。
【００１５】
一態様では、特異的な多量体は、タンパク質単量体と第２の構成要素とを組換えによって結び付けることによって形成され得る。特異的な多量体は第２の構成要素間に形成され得る。第２の構成要素はリンカーペプチド又はタンパク質若しくはタンパク質断片であり得る。
【００１６】
一態様では、多量体は化学結合を介して第２の構成要素間に形成され得る。代替的には、多量体は共有結合を介して第２の構成要素間に形成され得る。共有結合はジスルフィド結合であり得る。特に、多量体は二量体であり得る。
【００１７】
一態様では、第２の構成要素はＩｇＧ１ヒンジ若しくはＩｇＧ２ａヒンジ又はそれらの組合せであり得る。タンパク質構築物はＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−ＩｇＧ１ｈ、ｂＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−ＩｇＧ２ａｈ、又はＮＭ２３  Ｓ１２０Ｇ  ＩｇＧ１Ｆｃであり得る。
【００１８】
別の態様では、上記のタンパク質構築物では、多量体は非共有結合を介して第２の構成要素間に形成され得る。第２の構成要素は別のタンパク質との結合に対して高い親和性を有するタンパク質であり得る。第２の構成要素は抗体のＦｃ領域の全体又は一部、Ｆｏｓ又はＪｕｎであり得る。Ｆｃ領域はＩｇＧ１Ｆｃであり得る。一態様では、第２の構成要素はホモ二量体化又はヘテロ二量体化することが可能であり得る。
【００１９】
別の態様では、システインをタンパク質に挿入することで、ジスルフィド結合を介した多量体の形成を促進することができる。第２の構成要素はＩｇＭ抗体のＦｃドメインの断片であり得る。
【００２０】
別の態様では、上述のタンパク質構築物のいずれかに、細胞への又は細胞の核への侵入を促すアミノ酸配列が含まれ得る。
【００２１】
更に別の態様では、上述のタンパク質構築物のいずれかに、タンパク質構築物のその発現宿主細胞からの分泌を促すアミノ酸配列が含まれ得る。
【００２２】
さらに本発明は、上述のタンパク質構築物のいずれかを含む単離核酸に関するものである。核酸は細胞への又は細胞の核への侵入を促すアミノ酸配列をコードする配列を更に含み得る。核酸はタンパク質のその発現宿主細胞からの分泌を促すアミノ酸配列をコードする配列を更に含み得る。核酸は二量体の形成を支持する、ＮＭ２３又はその突然変異体をコードする核酸を含み得る。
【００２３】
別の態様では、本発明は上述の核酸のいずれかを含む発現ベクターに関するものである。ベクターはプラスミド又はウイルスであり得る。
【００２４】
別の態様では、本発明は上述のベクターを含む宿主細胞に関するものである。
【００２５】
更に別の態様では、本発明は細胞を増殖させる方法であって、細胞に本明細書で述べられるベクターをトランスフェクト又は形質導入することを含む、方法に関するものである。細胞は幹細胞又は前駆細胞であり得る。
【００２６】
更に別の態様では、本発明は体細胞において多能性を誘導する方法であって、細胞に本明細書に記載のベクターをトランスフェクト又は形質導入することを含む、方法に関するものである。
【００２７】
別の態様では、本発明は未熟細胞の投与による治療によって軽減される病態を患う患者を治療する方法であって、
（ｉ）宿主細胞に本明細書で述べられるベクターをトランスフェクト又は形質導入することであって、幹細胞、前駆細胞又はｉＰＳ細胞を得ることと、
（ｉｉ）得られた幹細胞、前駆細胞又はｉＰＳ細胞を患者に投与することと、
を含む、方法に関するものである。
【００２８】
ベクターにおける１つ又は複数の遺伝子の核酸配列が細胞に固有のものであっても、修飾されていてもよい。
【００２９】
別の態様では、本発明は標的化遺伝子の発現を変化させる方法であって、
（ｉ）転写因子変異体をコードする核酸を作製することと、
（ｉｉ）核酸を標的化細胞に導入させることと、
を含む、方法に関するものである。
【００３０】
上記の方法は、（ｉｉｉ）標的化遺伝子のプロモータ部位付近の位置に挿入されるように、核酸を設計する工程を更に含み得る。標的化細胞は幹細胞又は前駆細胞であり得る。前駆細胞は造血細胞であり得る。さらに前駆細胞はＢ細胞又はＢ細胞前駆体であり得る。
【００３１】
別の態様では、本発明は、対象の遺伝子が発現されることが望ましい場合には活性状態を促進し、対象の遺伝子が抑制されることが望ましい場合には活性状態を促進しないように、転写因子の多量体化状態を操作することを更に含む、上記方法に関するものである。
【００３２】
更に別の態様では、本発明は幹細胞又は前駆細胞の産生の増大の恩恵を受け得る疾病を治癒又は軽減する方法であって、疾患、遺伝的欠陥又は不健康な病態を患う又はそれらを発症するリスクがある患者に、上記の細胞を投与することを含む、方法に関するものである。細胞は受精卵又は未受精卵であり得る。細胞は幹細胞又は前駆細胞であり得る。細胞は治療される患者から得ることができる。代替的には細胞はｉＰＳ細胞であり得る。細胞は治療される患者由来のｉＰＳ細胞であり得る。
【００３３】
別の態様では、本発明は二量体化を支持するとともに、より高次の多量体の形成を抑える成長因子突然変異体を同定する方法であって、成長因子の標的受容体への結合の親和性を決定することを含み、より高次の多量体は二量体と同じ親和性では標的受容体と結合しない、方法に関するものである。成長因子はＮＭ２３であり、標的受容体はＭＵＣ１＊であり得る。標的受容体は、GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA（配列番号１）の配列を有するＰＳＭＧＦＲペプチドであり得るＭＵＣ１＊細胞外ドメインペプチドであり得る。
【００３４】
別の態様では、本発明は二量体の形成を抑えるように遺伝子操作されている上記のタンパク質に関するものである。タンパク質はより高次の多量体の形成を支持するように遺伝子操作され得る。タンパク質は四量体、五量体又は六量体の形成を支持するように遺伝子操作され得る。より高次の多量体はＩｇＭ抗体のＦｃ部分に遺伝子的に融合するタンパク質を含む。タンパク質は成長因子であり得る。タンパク質はＮＭ２３であり得る。タンパク質は転写因子であり得る。タンパク質はｐ５３であり得る。
【００３５】
本発明はタンパク質の特異的な多量体化状態を増大する方法及び組成物に関するものである。該方法は多量体が活性型である任意のタンパク質に適用することができ、特に活性型は二量体である。
【００３６】
多量体のリガンドを作製する１つの方法は、予め結び付いた組換えタンパク質を構築することである。例えば、２つ以上の単量体が直接又は長さ若しくは配列が異なり得るリンカーを介して結び付いている一本鎖タンパク質によって所望の生体活性が得られる。
【００３７】
多量体のリガンドを作製する別の方法は、各単量体が、多量体化するタンパク質の一部分に結び付いている組換えキメラを作製することである。例えば、タンパク質ＦｏｓとＪｕｎとが相互作用し、それによりこれらのタンパク質が、同じでも又は異なっていてもよい複数のリガンドに遺伝子的に結び付くことで、得られたキメラの二量体化をもたらすことができる。同様にして、抗体のＦｃ領域が二量体化する。リガンド−Ｆｃ領域キメラが作製される場合、これらは二量体化し、自然発生的な二量体リガンドの活性と似たような活性を示し得る。
【００３８】
リガンド多量体を作製する更に別の方法は、２つ以上の単量体リガンドの化学共役によるものである。例えば、二官能性リンカーを使用して、２つのタンパク質リガンドを化学共役することで、ホモ二量体又はヘテロ二量体を作製することができる。
【００３９】
多量体リガンドを作製する更に別の方法は、標的受容体に結合する小分子を同定した後、小分子の多量体を合成することである。
【００４０】
好ましい実施の形態では、自然の生物学的相互作用を増進させる、例えば成長因子受容体を活性化するのに好ましい多量体化状態は二量体である。より好ましい実施の形態では、二量体となる又は二量体の形成を支持するリガンドはＮＭ２３である。ＮＭ２３アイソフォームＨ１（ＮＭＥ１）、Ｈ２（ＮＭＥ２）及びＨ７（ＮＭＥ７）が好ましく、Ｈ１が特に好ましい。更により好ましい実施の形態では、ＮＭ２３はヒト由来のものである。
【００４１】
受容体、特に成長因子受容体に結合し、それらを活性化する多くのリガンドが、その同族受容体を二量体化することによりその同族受容体を活性化することから、成長を阻害するアプローチは、上述の方法の１つを用いて、３つ以上のリガンドが互いに結び付いているか、又はより高次の多量体を形成するように働きかけるリガンドの多量体を作製することである。さらに、特異的な核酸配列に結合するリガンドが、二量体状態でのみ特異的な核酸配列に結合することはよく知られている。さらに、上述の方法を用いて、特に核酸に結合する場合に選択的に二量体を形成するように、これらのタンパク質又は小分子の変異体を作製することができる。核酸結合を阻害するのに、より高次の多量体の形成を支持する変異体を生成することができる。
【００４２】
好ましい実施の形態では、より高次の多量体を形成するように設計されたリガンドを野生型タンパク質と相互作用させ、天然タンパク質の二量体を形成する能力を阻害することができる。例えば、ＮＭ２３−Ｈ１はＭＵＣ１＊成長因子受容体に結合し、成長、生存及び多能性を誘起する二量体化を誘導する。天然のＮＭ２３はその配列及び濃度に応じて、単量体、二量体、四量体又は六量体として存在する。組換えＮＭ２３を、二量体の集団を単離することができるようにリフォールディング又は精製することができる。二量体の形成を支持するとともに、四量体及び六量体の形成を抑えるＮＭ２３−Ｈ１の突然変異体（Mutations）がヒトがんから単離されている。そのため、がん性成長の阻害のアプローチは、より高次の多量体の形成を支持し、成長及び多能性を誘導しないＮＭ２３突然変異体を同定することである。野生型ＮＭ２３を多量体へと戻し、そうすることでがん関連の二量体が形成されなくなる突然変異体が特に好ましい。
【００４３】
二量体形態のＮＭ２３は幹細胞及び前駆細胞上のＭＵＣ１＊受容体に結合する。ＭＵＣ１＊への結合がＮＭ２３二量体のエンドサイトーシスを促し、その後ＮＭ２３二量体は核へと移行し、そこでＮＭ２３は二量体の形でＤＮＡに結合することで、幹細胞及び前駆細胞の成長及び多能性に関わる遺伝子の転写を調節する。そのため、記載の方法を用いて、成長、多能性の維持及び誘導に使用される、二量体の形成を支持するＮＭ２３変異体を作製することが本発明の重要な適用である。すなわち、二量体の形成を支持するＮＭ２３変異体を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏで使用することで、幹細胞及び前駆細胞の成長を促進し、多能性を維持することができる。
【００４４】
加えて本発明は、幹細胞及び前駆細胞を含む未熟細胞による治療の恩恵を受ける病態の治療のためのこれらのＮＭ２３変異体の患者への投与も含む。ＮＭ２３及びＮＭ２３変異体を患者に全身投与又は局所投与することができる。
【００４５】
本発明は、本発明の方法を用いて、研究又は治療に用いられ、多能性を誘導するか又は細胞をより成熟していない状態へと誘導する、患者、受精卵若しくは未受精卵、又は幹細胞においてｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで、タンパク質に作用し、該タンパク質を単量体又は幾つかの他の多量体では与えられない生物学的機能を果たす特異的な多量体化状態にさせることも含む。このような場合、ＮＭ２３変異体をコードする核酸が、例えば発現ベクターの一部として使用される。一実施の形態では、ＮＭ２３変異体は、標的遺伝子付近に位置するように設計される。例えば、ＮＭ２３変異体を、対象の遺伝子内に又はその付近に挿入されるように設計することができる。或る場合では、ｉＰＳ細胞又は部分ｉＰＳ細胞であり得る患者自身の細胞が修復遺伝子又は挿入遺伝子を保有しており、二量体化を支持する１つ又は複数のＮＭ２３変異体をコードする核酸を同じ細胞に挿入することで、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏのいずれかで該細胞の増殖を促進する。
【００４６】
一実施の形態では、これらの方法を、特異的な細胞集団を選択的に増殖することによって遺伝的欠陥又は疾患状態を修復する方法と併用する。例えば、二量体ＮＭ２３を作製し、胎児型のヘモグロビン又は修復遺伝子を発現する細胞において発現させ、鎌状細胞貧血症を治療することができる。別の実施の形態では、これらの方法を用いて、遺伝子療法環境で細胞の成長を刺激する。自己免疫疾患の治療等の別の実施の形態では、成長を促進する多量体又は成長を阻害する多量体のいずれかを使用して、特異的な細胞型の産生を増大又は低減する。
【００４７】
さらにＮＭ２３及びＮＭ２３変異体は他の哺乳動物の幹細胞及び前駆細胞の成長を促進することもできる。例えば、マウスの幹細胞及び前駆細胞は野生型タンパク質若しくはタンパク質の変異体に関係なく又はヒト由来若しくはマウス由来であるかに関係なくＮＭ２３二量体の存在下で増殖する。
【００４８】
本発明のこれらの及び他の目的は、本発明の以下の記載、添付の図面及び添付の特許請求の範囲からより完全に理解される。
【００４９】
本発明は以下に示される詳細な説明及び添付の図面からより完全に理解されるが、これらは例示のために示されているに過ぎず、本発明を限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】二価抗体又は一価抗体の濃度に応じて測定されたがん細胞成長のグラフであり、ＭＵＣ１＊受容体の二量体化が成長を刺激することが示唆されている。ＭＵＣ１陽性乳がん細胞であるＺＲ−７５−３０の成長は、二価（Ａｂ）抗ＭＵＣ１＊の添加により刺激され、一価Ｆａｂの添加により阻害された。二価抗体の添加によって、成長因子受容体の二量体化を示す特徴的な釣鐘成長曲線が生じる。ＭＵＣ１陰性ＨＥＫ  ２９３細胞の成長は二価又は一価のＦａｂ抗ＭＵＣ１＊のいずれによる影響も受けなかった。二価抗体が過剰に添加されると、１つの二価抗体が２つの受容体を二量体化するのではなく、１つの二価抗体が各々の受容体に結合し、それにより成長が阻害される。
【図２】野生型ＮＭ２３（ＷＴ）又は突然変異型ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇの３つの異なる調製物のいずれかの様々な多量体化状態を特性化しているＦＰＬＣトレースのオーバーレイを示す図である。野生型ＮＭ２３は、六量体の分子量に相当する単一ピークと、より高次の多量体に相当するショルダーとを示す。リフォールディングされていないＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇの一調製物（「ミックス」と表示）は、二量体に相当する主ピークと、より小さい四量体ピークとを有する。同様にリフォールディングされていないＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇの別の調製物（「六量体」）は主となる六量体ピークとより高次の多量体のショルダーとを有する。ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇのリフォールディング調製物（「二量体」）は大部分が二量体で構成されている。
【図３】ａ）は、ＮＭ２３−ＷＴ、ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−ミックス、ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−六量体及びＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−二量体の非還元ゲルの写真を示し、野生型タンパク質及びＳ１２０Ｇ突然変異体の３つの異なる調製物の多量体化状態が示されている。ｂ）は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定結果のオーバーレイを示し、４つの異なるＮＭ２３のＳＰＲチップ表面に付着したＭＵＣ１＊細胞外ドメインペプチド（ＰＳＭＧＦＲ）への結合能が示されている。結果から、ＮＭ２３のその同族受容体、ＭＵＣ１＊への結合量は二量体がサンプルにどれくらい存在するかに依存することが示唆される。ＳＰＲによって、チップ−溶液界面でのタンパク質の質量が測定され、六量体がＭＵＣ１＊ペプチド表面に結合した場合、二量体が結合した場合よりも３倍大きいＳＰＲシグナルが生じる。ｃ）はナノ粒子実験の写真を示し、ＮＭ２３二量体のみが同族受容体ＭＵＣ１＊に結合することが示唆される。ＭＵＣ１＊細胞外ドメインペプチドを金ナノ粒子上に固定した。一定分量のナノ粒子それぞれに、ＮＭ２３−ＷＴ、ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−二量体又はＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−六量体のいずれかを添加した。ＮＭ２３が、ナノ粒子上に固定されたＭＵＣ１＊ペプチドに結合した場合、ナノ粒子同士が近付き、それにより溶液がピンク色から青色へと変色する。この実験から、ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−二量体のみがＭＵＣ１＊ペプチドに結合したことが示唆される。抗ＭＵＣ１＊  Ｆａｂの添加が、溶液中のＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−二量体のナノ粒子上のＭＵＣ１＊ペプチドへの結合を競合的に阻害した。（ｄ〜ｇ）は、多能性幹細胞の成長を支持する能力に関して試験された異なるＮＭ２３多量体を示している。ヒトＥＳ（胚性幹）細胞を、（ｄ）ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−二量体、（ｅ）ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−六量体、（ｆ）ＮＭ２３−ＷＴ、又は（ｇ）ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−二量体＋ＭＵＣ１＊細胞外ドメインペプチド（ＰＳＭＧＦＲ）のいずれかで培養し、幹細胞表面上でのＮＭ２３二量体のＭＵＣ１＊受容体への結合を競合的に阻害した。分化の誘導（コロニーの肥厚化、暗化）が、（ｇ）、（ｅ）及び（ｆ）の順で容易に観察され、これによりＮＭ２３−二量体−ＭＵＣ１＊相互作用の阻害は、細胞をＭＵＣ１＊に結合しないＮＭ２３六量体で培養した場合に分化を誘導することが示される。ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇの二量体調製物（ｄ）のみが未分化の幹細胞成長を支持することが可能であった。
【図４】組換え型ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇの３つの異なる調製物に対するＮＭ２３−ＷＴの多量体化状態を示す非変性のネイティブゲルを示す図である。
【図５】Ａ）野生型ＮＭ２３（ＷＴ）及びＢ）６０％二量体を生じるＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−「ミックス」調製物のＳＰＲによる測定結果を示す図である。タンパク質を５つの異なる濃度で注入した。結果から、ＮＭ２３−ＷＴよりも８倍多いＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−ミックスタンパク質がＭＵＣ１＊細胞外ドメインペプチド表面に結合したことが示唆される。野生型タンパク質が六量体であることから、ＲＵの数値は、二量体の結合量と比較するために３で除算しなければならない。野生型及びＳ１２０Ｇ−二量体の両方が濃度依存的な結合を示すが、野生型六量体の結合量はこのシステムのノイズ範囲内であると考えられる程に小さい。
【図６】（ａ）はジスルフィド結合を低減する添加ＤＴＴ（ジチオスレイトール）の存在下又は非存在下でのＮＭ２３一本鎖変異体を充填した非還元ゲルの写真を示す。二量体は赤色のボックスで示している。ＤＴＴの非存在下では、幾つかの分子量が高い種が存在するが、これは細胞を培養するのに用いられる濃度のおよそ１０００倍でタンパク質をゲルに充填したためであると考えられる。（ｂ）はＮＭ２３一本鎖変異体が二量体の予測分子量でゲルを移動することを示す還元ゲルの写真を示す。
【図７】ジスルフィド結合の破壊を避けるのに非還元ゲルを用いた、一本鎖変異体ＮＭ２３  Ｓ１２０Ｇ  ＩｇＧ１ｈ及びＮＭ２３  Ｓ１２０Ｇ  ＩｇＧ２ａｈの精製のＰＡＧＥによる特性化を示す図である。
【図８】ジスルフィド結合の破壊を避けるのに非還元ゲルを用いた、融合キメラ変異体ＮＭ２３  Ｓ１２０Ｇ  ＩｇＧ１Ｆｃの精製のＰＡＧＥによる特性化を示す図である。
【図９】ジスルフィド結合の破壊を避けるのに非還元ゲルを用い、更に還元ゲルを用いた、リフォールディングした融合キメラ変異体ＮＭ２３  Ｓ１２０Ｇ  ＩｇＧ１ＦｃのＰＡＧＥによる特性化を示す図である。非還元ゲルでは変異体が二量体の分子量で泳動し、還元ゲルではジスルフィド結合の非存在下で融合変異体が単量体の見掛け分子量で泳動することが示唆される。
【図１０】融合キメラ変異体ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−ＩｇＧ１ＦｃのＦＰＬＣ（ａ）及び非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ｂ）による特性化を示す図である。
【図１１】二量体の主集団を示すリフォールディングしたＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−ＧＳ２のＦＰＬＣ（ａ）及び非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ｂ）による特性化を示す図である。（ｃ〜ｅ）は、最少幹細胞培地中のマトリゲル上で（ｃ及びｄ）及び抗ＭＵＣ１＊抗体、ＭＮ−Ｃ３をコーティングした細胞培養プレート上で（ｅ）、リフォールディング又は精製しなかった８ｎＭのＮＭ２３変異体ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−ＧＳ２で培養したヒトＥＳ細胞、ＢＧＯ１ｖ／ｈＯＧ株の写真を示す。これらのデータから、ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−ＧＳ２は、使用前にリフォールディング又は精製する必要がないことが示唆される。
【図１２】二量体の主集団を示すリフォールディングしたＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−ＩｇＧ１ｈ  ｎｏＣのＦＰＬＣ（ａ）及び非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ｂ）による特性化を示す図である。（ｃ〜ｅ）は、最少幹細胞培地中のマトリゲル上で（ｃ及びｄ）及び抗ＭＵＣ１＊抗体、ＭＮ−Ｃ３をコーティングした細胞培養プレート上で（ｅ）、リフォールディング又は精製しなかった８ｎＭのＮＭ２３変異体ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−ＩｇＧ１ｈ  ｎｏＣで培養したヒトＥＳ細胞、ＢＧＯ１ｖ／ｈＯＧ株の写真を示す。これらのデータから、この変異体は、使用前にリフォールディング又は精製する必要がないことが示唆される。
【図１３】二量体の主集団を示すリフォールディングしたＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−ＩｇＧ１ｈ／ＩｇＧ２ａｈ  ｎｏＣのＦＰＬＣ（ａ）及び非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ｂ）による特性化を示す図である。（ｃ〜ｅ）は、最少幹細胞培地中のマトリゲル上で（ｃ及びｄ）及び抗ＭＵＣ１＊抗体、ＭＮ−Ｃ３をコーティングした細胞培養プレート上で（ｅ）、リフォールディング又は精製しなかった８ｎＭのＮＭ２３変異体ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−ＩｇＧ１ｈ／ＩｇＧ２ａｈ  ｎｏＣで培養したヒトＥＳ細胞、ＢＧＯ１ｖ／ｈＯＧ株の写真を示す。これらのデータから、この変異体は、使用前にリフォールディング又は精製する必要がないことが示唆される。
【図１４】リフォールディング又は精製しなかった、ＮＭ２３一本鎖変異体ＮＭ２３−Ｐ９６ＳΔＣ１（ａ、ｂ）、ＮＭ２３−Ｐ９６ＳΔＣ２（ｃ、ｄ）、ＮＭ２３−Ｐ９６ＳΔＣ６（ｅ、ｆ）及びＮＭ２３−Ｐ９６Ｓ（ｇ、ｈ）に関する非還元ゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥによる特性化及び対応するＦＰＬＣトレースを示す図である。ＦＰＬＣトレースの比較から分かるように、ＮＭ２３−Ｐ９６ＳΔＣ２及びＮＭ２３−Ｐ９６ＳΔＣ６は二量体範囲に主ピークを有することから、好ましい。これらのデータから、これらの変異体は、使用前にリフォールディング又は精製する必要がないことが示唆される。
【図１５】最少幹細胞培地中のマトリゲル上で（ａ、ｂ、ｄ、ｅ）及び抗ＭＵＣ１＊抗体、ＭＮ−Ｃ３をコーティングした細胞培養プレート上で（ｃ、ｆ）、８ｎＭのＮＭ２３変異体で培養したヒトＥＳ細胞、ＢＧＯ１ｖ／ｈＯＧ株の写真を示す図である。（ａ〜ｃ）は変異体がＰ９６ＳΔＣ２であり、（ｄ〜ｆ）は変異体がＰ９６ＳΔＣ６である。これらの変異体はリフォールディング又は精製しておらず、このことから、これらは使用前にリフォールディング又は精製する必要がないことが示唆される。
【図１６】ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ（リフォールディング、「ＲＳ」）の主集団がＦＰＬＣトレースで示されるように（ａ）、また非還元ＰＡＧＥによって確認されるように（ｂ）二量体として存在することが示唆されている図である。ＦＰＬＣによって精製された二量体単独の画分をプールし、最少幹細胞培地中、８ｎＭで使用し、ヒトＥＳ細胞、ＢＧＯ１ｖ／ｈＯＧ株を成長させた。（ｃ〜ｅ）のヒト幹細胞の写真から、８ｎＭのＮＭ２３変異体での培養によって、マトリゲル上（ｃ、ｄ）又は抗ＭＵＣ１＊抗体、ＭＮ−Ｃ３をコーティングした細胞培養プレート上（ｅ）のいずれでも多能性幹細胞が生じることが示唆される。
【図１７】最少幹細胞培地＋リフォールディング及び精製したＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ  ＲＳ（ａ〜ｄ）、又は二量体として発現され、リフォールディング及び精製する必要のない一本鎖構築物Ｓ１２０Ｇ−ＧＳ２のいずれかで培養したヒトＥＳ細胞（Ｈ９株）の写真を示す。Ｓ１２０Ｇ−ＧＳ２を添加ＤＴＴの存在下で（ｅ〜ｈ）又は非存在下で（ｉ〜ｌ）添加した。画像から、一本鎖変異体で培養した幹細胞が成長し、またリフォールディング及び精製したＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−ＲＳの二量体画分でも幹細胞が成長することが示唆される。細胞は、細胞塊の肥厚化及び暗化がないことから分かるように未分化な多能性幹細胞である。
【図１８】最少幹細胞培地中、ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−ＩｇＧ１ｈ  ｎｏＣで培養したヒトＥＳ細胞（Ｈ９株）の写真を示す。このＮＭ２３変異体は二量体として発現され、二量体状態にするのに更なる処理又はリフォールディングを必要としない。Ｓ１２０Ｇ−ＩｇＧ１ｈ  ｎｏＣを添加ＤＴＴの存在下で（ａ〜ｄ）又は非存在下で（ｅ〜ｈ）添加した。画像から、一本鎖変異体で培養した幹細胞が成長し、またリフォールディング及び精製したＳ１２０Ｇ  ＲＳの二量体画分でも幹細胞が成長することが示唆される（図１７ａ〜図１７ｄと比較する）。細胞は、細胞塊の肥厚化及び暗化がないことから分かるように未分化な多能性幹細胞である。
【図１９】最少幹細胞培地＋リフォールディング及び精製したＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ  ＲＳ（ａ〜ｄ）、又は二量体として発現され、リフォールディング及び精製する必要のない一本鎖構築物（ＮＭ２３）Ｓ１２０Ｇ−ＩｇＧ１ｈ／ＩｇＧ２ａｈ  ｎｏＣのいずれかで培養したヒトＥＳ細胞（Ｈ９株）の写真を示す。Ｓ１２０Ｇ−ＩｇＧ１ｈ／ＩｇＧ２ａｈ  ｎｏＣを添加ＤＴＴの存在下で（ｅ〜ｈ）又は非存在下で（ｉ〜ｌ）添加した。画像から、一本鎖変異体で培養した幹細胞が成長し、またリフォールディング及び精製したＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ  ＲＳの二量体画分でも幹細胞が成長することが示唆される（図１７ａ〜図１７ｄと比較する）。細胞は、細胞塊の肥厚化及び暗化がないことから分かるように未分化な多能性幹細胞である。
【図２０】ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ又は二量体を自発的に形成するように設計されているか若しくは２つのＮＭ２３単量体で構成される一本鎖構築物であるＮＭ２３変異体のリフォールディング及び精製した二量体単独の画分のいずれかで培養したヒト幹細胞の成長をプロットしているグラフを示す。それぞれの場合で、２０００００個の細胞をプレーティングし、細胞を４日後に計数した。このグラフから、二量体集団のリフォールディング又は更なる精製を必要としない変異体によって、幹細胞が、二量体の大部分を形成するようにリフォールディングされ、更にＦＰＬＣにより精製されているＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−ＲＳ以上に良好に増殖することが示唆される（図１７ａ〜図１７ｄと比較する）。
【図２１】ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−ＲＳ又は二量体を自発的に形成するように設計されているか若しくは２つのＮＭ２３単量体で構成される一本鎖構築物であるＮＭ２３変異体のリフォールディング及び精製した二量体単独の画分のいずれかで培養したヒト幹細胞の成長をプロットしているグラフを示す。このグラフから、この変異体によって、幹細胞がＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−ＲＳ以上に良好に増殖し、効果が数代にわたって持続することが示唆される。
【図２２】リフォールディング及び精製したＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−ＲＳと比較したＮＭ２３変異体の遺伝子発現のＲＴ−ＰＣＲによる測定結果のグラフである。遺伝子発現解析によって、二量体を自発的に形成するように設計されたＮＭ２３変異体での細胞の培養が、ＮＭ２３のリフォールディング及び精製した二量体単独の集団以上のレベルまで多能性遺伝子を発現することが示唆される。
【図２３】二量体化を支持するが、大部分が二量体の集団を得るのにはリフォールディング及び精製しなければならない単一点突然変異であるＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−ＲＳの核局在化の写真を示す。ａ）外因性ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−ＲＳの添加なし、ｂ）１６ｎＭのＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ  ＲＳ、ｃ）１２８ｎＭのＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ  ＲＳ。（ａ〜ｃ）細胞を、蛍光標識した抗ＮＭ２３抗体で染色している。（ｄ〜ｆ）ＤＡＰＩ核染色と蛍光標識したＮＭ２３とのオーバーレイ。白色の矢印は核内のＮＭ２３の存在を示している。（ｇ）は４８８蛍光対照であり、（ｈ）はａ〜ｃ条件での核内のＮＭ２３の定量化を示す棒グラフであり、これにより外因性ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ  ＲＳを培養培地に添加することによって、ＮＭ２３の内部移行及び核への移行が起こることが示唆される。１２８ｎＭで添加するよりも１６ｎＭで添加した場合により多くのＮＭ２３が核内に存在し、このことは過度に高い濃度では、ＮＭ２３二量体が２つのＭＵＣ１＊受容体に結合し、二量体化するのではなく、ＮＭ２３二量体が各々のＭＵＣ１＊受容体に結合するという本発明者らの見解と一致することに留意されたい。
【図２４】ＮＭ２３変異体ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ  ＩｇＧ１ｈ／ＩｇＧ２ａｈ  ｎｏＣの核局在化の写真を示す。ａ）外因性ＮＭ２３変異体の添加なし、ｂ）１６ｎＭのＮＭ２３変異体、ｃ）１２８ｎＭのＮＭ２３変異体。（ａ〜ｃ）細胞を、蛍光標識した抗ＮＭ２３抗体で染色している。（ｄ〜ｆ）ＤＡＰＩ核染色と蛍光標識したＮＭ２３とのオーバーレイ。白色の矢印は核内のＮＭ２３の存在を示している。（ｇ）は４８８蛍光対照であり、（ｈ）はａ〜ｃ条件での核内のＮＭ２３の定量化を示す棒グラフであり、これにより外因性ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ  ＩｇＧ１ｈ／ＩｇＧ２ａｈ  ｎｏＣ変異体を培養培地に添加することによって、ＮＭ２３の内部移行及び核への移行が起こることが示唆される。１２８ｎＭで添加するよりも１６ｎＭで添加した場合により多くのＮＭ２３変異体が核内に存在し、このことは過度に高い濃度では、ＮＭ２３二量体が２つのＭＵＣ１＊受容体に結合し、二量体化するのではなく、ＮＭ２３二量体が各々のＭＵＣ１＊受容体に結合するという本発明者らの見解と一致することに留意されたい。
【図２５】ｍＬＩＦ又はＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−ＲＳのいずれかを添加したマウスＥＳ細胞最少培地中、不活性化ＭＥＦフィーダー細胞層で２日間培養したマウス胚性幹（ＥＳ）細胞の写真を示す。画像から、マウスＥＳ細胞は、唯一の成長因子としてＮＭ２３二量体を用いることで、ｍＬＩＦを基礎成長因子として用いた標準的なマウス幹細胞培地中の場合と同程度に良好に成長することが示唆される。
【図２６】ＮＭ２３−ＷＴ及びＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ（非リフォールディング）と比較した、リフォールディングしていない、ＮＭ２３変異体ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−ＧＳ２、ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−ＩｇＧ１ｈ  ｎｏＣ及びＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−ＩｇＧ１ｈ／ＩｇＧ２ａｈ  ｎｏＣの非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる特性化の写真を示す。ａ）から、非還元ゲル上において、リフォールディング又は精製していない、変異体ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−ＧＳ２、ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−ＩｇＧ１ｈ  ｎｏＣ及びＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−ＩｇＧ１ｈ／ＩｇＧ２ａｈ  ｎｏＣが、単量体の見掛け分子量で泳動する野生型タンパク質とは対照的に二量体として存在することが示唆される。しかしながら、二量体がジスルフィド結合に依存するのに対して、より高次のＮＭ２３多量体はジスルフィド結合に依存しないことから、ＮＭ２３六量体が非還元ゲル上を単量体の分子量で泳動することに留意されたい。
【図２７】組換えによって生成されたＮＭ２３変異体の例を示す図である。（ヒスチジン）６、Ｓｔｒｅｐ  ＴａｇＩＩ等の親和性タグは任意の要素であることに留意する。
【図２８】リフォールディングしている（図では「Ｒ」という表示で示されている）ＮＭ２３変異体で培養したヒト幹細胞の写真を示す。８ｎＭで用いられるＮＭ２３変異体は、ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−ＲＳ（ａ、ｅ）、ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−ＧＳ２（ｂ、ｆ）、ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−ＩｇＧ１ｈ  ｎｏＣ（ｃ、ｇ）及びＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−ＩｇＧ１ｈ／ＩｇＧ２ａｈ  ｎｏＣ（ｄ、ｈ）であった。細胞形態は、球形であり、形状が線維芽細胞ではなく、細胞分化を示す肥厚化又は暗化のない単一層であるという点で多能性幹細胞と一致している。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
本願において、数量を特定していないものは単数及び複数の対象の両方を含む（"a" and "an" are used to refer to both singleand a plurality of objects）。
【００５２】
本明細書で使用される場合、「多量体」は互いに共有結合する又は互いに非共有的に融合する複数の単量体を指す。
【００５３】
本明細書で使用される場合、「より高次の多量体」は、二量体より大きい、互いに共有結合する又は互いに非共有的に融合する複数の単量体を指す。
【００５４】
配列表フリーテキスト
ａ、ｇ、ｃ、ｔ以外のヌクレオチド記号の使用に関しては、ＷＩＰＯ標準ＳＴ．２５の附属書２の表１に記載の表記法に準拠して、ｋはｔ又はｇを表し、ｎはａ、ｃ、ｔ又はｇを表し、ｍはａ又はｃを表し、ｒはａ又はｇを表し、ｓはｃ又はｇを表し、ｗはａ又はｔを表し、ｙはｃ又はｔを表す。
【００５５】
ヒトＮＭ２３  Ｈ１
（ＤＮＡ）
atggccaactgtgagcgtaccttcattgcgatcaaaccagatggggtccagcggggtcttgtgggagagattatcaagcgttttgagcagaaaggattccgccttgttggtctgaaattcatgcaagcttccgaagatcttctcaaggaacactacgttgacctgaaggaccgtccattctttgccggcctggtgaaatacatgcactcagggccggtagttgccatggtctgggaggggctgaatgtggtgaagacgggccgagtcatgctcggggagaccaaccctgcagactccaagcctgggaccatccgtggagacttctgcatacaagttggcaggaacattatacatggcagtgattctgtggagagtgcagagaaggagatcggcttgtggtttcaccctgaggaactggtagattacacgagctgtgctcagaactggatctatgaatga（配列番号９７）
（アミノ酸）
MANCERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVGLKFMQASEDLLKEHYVDLKDRPFFAGLVKYMHSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNPADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGSDSVESAEKEIGLWFHPEELVDYTSCAQNWIYE-（配列番号９８）
【００５６】
マウスＮＭ２３  Ｈ１
（ＤＮＡ）
atggccaacagtgagcgcaccttcattgccatcaagcctgatggggtccagcgggggctggtgggcgagatcatcaagcggttcgagcagaaggggttccgccttgttggtctgaagtttctgcaggcttcagaggaccttctcaaggagcactacactgacctgaaggaccgccccttctttactggcctggtgaaatacatgcactcaggaccagtggttgctatggtctgggagggtctgaatgtggtgaagacaggccgcgtgatgcttggagagaccaaccccgcagactctaagcctgggaccatacgaggagacttctgcatccaagttggcaggaacatcattcatggcagcgattctgtaaagagcgcagagaaggagatcagcttgtggtttcagcctgaggagctggtggagtacaagagctgtgcgcagaactggatctatgagtga（配列番号９９）
（アミノ酸）
MANSERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVGLKFLQASEDLLKEHYTDLKDRPFFTGLVKYMHSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNPADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGSDSVKSAEKEISLWFQPEELVEYKSCAQNWIYE-（配列番号１００）
【００５７】
ヒトＮＭ２３Ｈ２
（ＤＮＡ）
atggccaacctggagcgcaccttcatcgccatcaagccggacggcgtgcagcgcggcctggtgggcgagatcatcaagcgcttcgagcagaagggattccgcctcgtggccatgaagttcctccgggcctctgaagaacacctgaagcagcactacattgacctgaaagaccgaccattcttccctgggctggtgaagtacatgaactcagggccggttgtggccatggtctgggaggggctgaacgtggtgaagacaggccgagtgatgcttggggagaccaatccagcagattcaaagccaggcaccattcgtggggacttctgcattcaggttggcaggaacatcattcatggcagtgattcagtaaaaagtgctgaaaaagaaatcagcctatggtttaagcctgaagaactggttgactacaagtcttgtgctcatgactgggtctatgaataa（配列番号１０１）
（アミノ酸）
MANLERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVAMKFLRASEEHLKQHYIDLKDRPFFPGLVKYMNSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNPADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGSDSVKSAEKEISLWFKPEELVDYKSCAHDWVYE-（配列番号１０２）
【００５８】
マウスＮＭ２３  Ｈ２
（ＤＮＡ）
atggccaacctcgagcgtaccttcattgccatcaagccagatggcgtgcagcgcggcctggtgggcgagatcatcaaacggttcgagcagaaggggttccgcctggtggccatgaagttccttcgggcctctgaagaacacctgaagcagcattacatcgacctgaaagaccgtcctttcttcccggggctggtgaagtacatgaactcggggcccgtggtggccatggtctgggaggggctcaatgtggtgaaaacgggccgagtgatgctgggggagaccaatccagctgattcaaaaccaggcaccatccgtggggatttctgcattcaagttggcaggaacatcattcatggcagtgattcagtggagagtgctgagaaagagatccatctgtggtttaagcccgaagaactgatcgactacaagtcttgtgcccatgactgggtgtacgagtag（配列番号１０３）
（アミノ酸）
MANLERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVAMKFLRASEEHLKQHYIDLKDRPFFPGLVKYMNSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNPADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGSDSVESAEKEIHLWFKPEELIDYKSCAHDWVYE-（配列番号１０４）
【００５９】
ヒトＮＭ２３−Ｈ７−１
（ＤＮＡ）
atgaatcatagtgaaagattcgttttcattgcagagtggtatgatccaaatgcttcacttcttcgacgttatgagcttttattttacccaggggatggatctgttgaaatgcatgatgtaaagaatcatcgcacctttttaaagcggaccaaatatgataacctgcacttggaagatttatttataggcaacaaagtgaatgtcttttctcgacaactggtattaattgactatggggatcaatatacagctcgccagctgggcagtaggaaagaaaaaacgctagccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagctggatttactataaccaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaatgagctgatccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacctgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggccctgattcttttgcttctgcggccagagaaatggagttgttttttccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttactaattgtacctgttgcattgttaaaccccatgctgtcagtgaaggactgttgggaaagatcctgatggctatccgagatgcaggttttgaaatctcagctatgcagatgttcaatatggatcgggttaatgttgaggaattctatgaagtttataaaggagtagtgaccgaatatcatgacatggtgacagaaatgtattctggcccttgtgtagcaatggagattcaacagaataatgctacaaagacatttcgagaattttgtggacctgctgatcctgaaattgcccggcatttacgccctggaactctcagagcaatctttggtaaaactaagatccagaatgctgttcactgtactgatctgccagaggatggcctattagaggttcaatacttcttcaagatcttggataattag（配列番号１０５）
（アミノ酸）
MNHSERFVFIAEWYDPNASLLRRYELLFYPGDGSVEMHDVKNHRTFLKRTKYDNLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN-（配列番号１０６）
【００６０】
大腸菌（E. coli）発現用に最適化したヒトＮＭ２３−Ｈ７−１配列
（ＤＮＡ）
atgaatcactccgaacgctttgtttttatcgccgaatggtatgacccgaatgcttccctgctgcgccgctacgaactgctgttttatccgggcgatggtagcgtggaaatgcatgacgttaaaaatcaccgtacctttctgaaacgcacgaaatatgataatctgcatctggaagacctgtttattggcaacaaagtcaatgtgttctctcgtcagctggtgctgatcgattatggcgaccagtacaccgcgcgtcaactgggtagtcgcaaagaaaaaacgctggccctgattaaaccggatgcaatctccaaagctggcgaaattatcgaaattatcaacaaagcgggtttcaccatcacgaaactgaaaatgatgatgctgagccgtaaagaagccctggattttcatgtcgaccaccagtctcgcccgtttttcaatgaactgattcaattcatcaccacgggtccgattatcgcaatggaaattctgcgtgatgacgctatctgcgaatggaaacgcctgctgggcccggcaaactcaggtgttgcgcgtaccgatgccagtgaatccattcgcgctctgtttggcaccgatggtatccgtaatgcagcacatggtccggactcattcgcatcggcagctcgtgaaatggaactgtttttcccgagctctggcggttgcggtccggcaaacaccgccaaatttaccaattgtacgtgctgtattgtcaaaccgcacgcagtgtcagaaggcctgctgggtaaaattctgatggcaatccgtgatgctggctttgaaatctcggccatgcagatgttcaacatggaccgcgttaacgtcgaagaattctacgaagtttacaaaggcgtggttaccgaatatcacgatatggttacggaaatgtactccggtccgtgcgtcgcgatggaaattcagcaaaacaatgccaccaaaacgtttcgtgaattctgtggtccggcagatccggaaatcgcacgtcatctgcgtccgggtaccctgcgcgcaatttttggtaaaacgaaaatccagaacgctgtgcactgtaccgatctgccggaagacggtctgctggaagttcaatactttttcaaaattctggataattag（配列番号１０７）
（アミノ酸）
MNHSERFVFIAEWYDPNASLLRRYELLFYPGDGSVEMHDVKNHRTFLKRTKYDNLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN-（配列番号１０８）
【００６１】
ヒトＮＭ２３−Ｈ７−２
（ＤＮＡ）
atgcatgatgtaaagaatcatcgcacctttttaaagcggaccaaatatgataacctgcacttggaagatttatttataggcaacaaagtgaatgtcttttctcgacaactggtattaattgactatggggatcaatatacagctcgccagctgggcagtaggaaagaaaaaacgctagccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagctggatttactataaccaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaatgagctgatccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacctgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggccctgattcttttgcttctgcggccagagaaatggagttgttttttccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttactaattgtacctgttgcattgttaaaccccatgctgtcagtgaaggactgttgggaaagatcctgatggctatccgagatgcaggttttgaaatctcagctatgcagatgttcaatatggatcgggttaatgttgaggaattctatgaagtttataaaggagtagtgaccgaatatcatgacatggtgacagaaatgtattctggcccttgtgtagcaatggagattcaacagaataatgctacaaagacatttcgagaattttgtggacctgctgatcctgaaattgcccggcatttacgccctggaactctcagagcaatctttggtaaaactaagatccagaatgctgttcactgtactgatctgccagaggatggcctattagaggttcaatacttcttcaagatcttggataattga（配列番号１０９）
（アミノ酸）
MHDVKNHRTFLKRTKYDNLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN-（配列番号１１０）
【００６２】
マウスＮＭ２３−Ｈ７−１
（ＤＮＡ）
atgagagcctgtcagcagggaagaagttccagtttggtttctccatatatggcacccaagaatcagagcgagagattcgctttcattgcagagtggtatgatccaaatgcttcattgctccgacgctatgagctgctgttttaccccacagacggatctgttgaaatgcatgatgtaaagaatcgtcgcaccttcttaaagcggaccaagtatgaggacctgcgcctggaagatctatttataggcaacaaagtcaatgtgttttctcgacagctggtgttgattgactatggggaccaatacacagcccgccagctgggcagcaggaaagagaaaactttagccctgatcaaaccagatgcagtgtcaaaggccggagaaatcattgagatgataaacaaaagtggatttactataaccaaactccgaatgatgactctgacaaggaaagaagcagcggactttcatgtagaccatcactcaagacctttttataacgaactgatccagtttatcacaagtgggcctgttattgccatggagatcttaagagatgacgcgatctgtgagtggaaaaggttgcttggacccgcaaactctgggctatcacggacagatgcccccggaagcatccgagccctctttgggacagatggcgtgagaaatgcagctcacggccctgatacttttgcatctgctgccagagaaatggaattgttttttccttcaagtggaggctgtgggccagcgaacactgctaaatttaccaattgcacctgttgcatcattaagcctcatgctatcagtgaaggaatgttgggaaagattttaatagctattcgggatgcatgctttggaatgtcagcgatacagatgttcaatttggatcgggctaatgttgaagaattctatgaagtctataaaggtgtagtgtctgagtataatgatatggtgacagagctgtgctccggcccttgcgtagcaatagagatccaacagagcaaccctacaaagacatttcgagaattctgcggacctgctgatcctgaaatcgcccggcatttacgacctgagaccctcagggcaatttttggtaaaactaaggttcaaaatgctgttcattgcacggatctgccggaggatgggctcctggaggtccagtatttcttcaagatcttggataattag（配列番号１１１）
（アミノ酸）
MRACQQGRSSSLVSPYMAPKNQSERFAFIAEWYDPNASLLRRYELLFYPTDGSVEMHDVKNRRTFLKRTKYEDLRLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAVSKAGEIIEMINKSGFTITKLRMMTLTRKEAADFHVDHHSRPFYNELIQFITSGPVIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGLSRTDAPGSIRALFGTDGVRNAAHGPDTFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIIKPHAISEGMLGKILIAIRDACFGMSAIQMFNLDRANVEEFYEVYKGVVSEYNDMVTELCSGPCVAIEIQQSNPTKTFREFCGPADPEIARHLRPETLRAIFGKTKVQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN-（配列番号１１２）
【００６３】
マウスＮＭ２３−Ｈ７−２
（ＤＮＡ）
atgagagcctgtcagcagggaagaagttccagtttggtttctccatatatggcacccaagaatcagagcgagagattcgctttcattgcagagtggtatgatccaaatgcttcattgctccgacgctatgagctgctgttttaccccacagacggatctgttgaaatgcatgatgtaaagaatcgtcgcaccttcttaaagcggaccaagtatgaggacctgcgcctggaagatctatttataggcaacaaagtcaatgtgttttctcgacagctggtgttgattgactatggggaccaatacacagcccgccagctgggcagcaggaaagagaaaactttagccctgatcaaaccagatgcagtgtcaaaggccggagaaatcattgagatgataaacaaaagtggatttactataaccaaactccgaatgatgactctgacaaggaaagaagcagcggactttcatgtagaccatcactcaagacctttttataacgaactgatccagtttatcacaagtgggcctgttattgccatggagatcttaagagatgacgcgatctgtgagtggaaaaggttgcttggacccgcaaactctgggctatcacggacagatgcccccggaagcatccgagccctctttgggacagatggcgtgagaaatgcagctcacggccctgatacttttgcatctgctgccagagaaatggaattgttttttccttcaagtggaggctgtgggccagcgaacactgctaaatttaccaattgcacctgttgcatcattaagcctcatgctatcagtgaagatttatttattcattatatgtaa（配列番号１１３）
（アミノ酸）
MRACQQGRSSSLVSPYMAPKNQSERFAFIAEWYDPNASLLRRYELLFYPTDGSVEMHDVKNRRTFLKRTKYEDLRLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAVSKAGEIIEMINKSGFTITKLRMMTLTRKEAADFHVDHHSRPFYNELIQFITSGPVIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGLSRTDAPGSIRALFGTDGVRNAAHGPDTFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIIKPHAISEDLFIHYM-（配列番号１１４）
【００６４】
Ｃ末端のヒスチジン群でタグ付けしたＮＭ２３  Ｓ１２０Ｇ（ＮｄｅＩとＸｈｏＩとの間にクローニングした）
（ＤＮＡ）
atggccaactgtgagcgtaccttcattgcgatcaaaccagatggggtccagcggggtcttgtgggagagattatcaagcgttttgagcagaaaggattccgccttgttggtctgaaattcatgcaagcttccgaagatcttctcaaggaacactacgttgacctgaaggaccgtccattctttgccggcctggtgaaatacatgcactcagggccggtagttgccatggtctgggaggggctgaatgtggtgaagacgggccgagtcatgctcggggagaccaaccctgcagactccaagcctgggaccatccgtggagacttctgcatacaagttggcaggaacattatacatggcggtgattctgtggagagtgcagagaaggagatcggcttgtggtttcaccctgaggaactggtagattacacgagctgtgctcagaactggatctatgaactcgagcaccaccaccaccaccactga（配列番号６１）
（アミノ酸）
MANCERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVGLKFMQASEDLLKEHYVDLKDRPFFAGLVKYMHSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNPADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGGDSVESAEKEIGLWFHPEELVDYTSCAQNWIYELEHHHHHH-（配列番号６２）
【００６５】
Ｃ末端のヒスチジン群でタグ付けしたＮＭ２３  Ｓ１２０Ｇ（ＮｄｅＩとＡｇｅＩとの間にクローニングした）
atggccaactgtgagcgtaccttcattgcgatcaaaccagatggggtccagcggggtcttgtgggagagattatcaagcgttttgagcagaaaggattccgccttgttggtctgaaattcatgcaagcttccgaagatcttctcaaggaacactacgttgacctgaaggaccgtccattctttgccggcctggtgaaatacatgcactcagggccggtagttgccatggtctgggaggggctgaatgtggtgaagacgggccgagtcatgctcggggagaccaaccctgcagactccaagcctgggaccatccgtggagacttctgcatacaagttggcaggaacattatacatggcggtgattctgtggagagtgcagagaaggagatcggcttgtggtttcaccctgaggaactggtagattacacgagctgtgctcagaactggatctatgaaaccggtcaccaccaccaccaccactga（配列番号６３）
（アミノ酸）
MANCERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVGLKFMQASEDLLKEHYVDLKDRPFFAGLVKYMHSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNPADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGGDSVESAEKEIGLWFHPEELVDYTSCAQNWIYETGHHHHHH-（配列番号６４）
【００６６】
Ｃ末端のヒスチジン群でタグ付けしたＮＭ２３  Ｐ９６Ｓ（ＮｄｅＩとＡｇｅＩとの間にクローニングした）
（ＤＮＡ）
atggccaactgtgagcgtaccttcattgcgatcaaaccagatggggtccagcggggtcttgtgggagagattatcaagcgttttgagcagaaaggattccgccttgttggtctgaaattcatgcaagcttccgaagatcttctcaaggaacactacgttgacctgaaggaccgtccattctttgccggcctggtgaaatacatgcactcagggccggtagttgccatggtctgggaggggctgaatgtggtgaagacgggccgagtcatgctcggggagaccaactctgcagactccaagcctgggaccatccgtggagacttctgcatacaagttggcaggaacattatacatggcagtgattctgtggagagtgcagagaaggagatcggcttgtggtttcaccctgaggaactggtagattacacgagctgtgctcagaactggatctatgaaaccggtcaccaccaccaccaccactga（配列番号６５）
（アミノ酸）
MANCERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVGLKFMQASEDLLKEHYVDLKDRPFFAGLVKYMHSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNSADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGSDSVESAEKEIGLWFHPEELVDYTSCAQNWIYETGHHHHHH-（配列番号６６）
【００６７】
Ｃ末端のヒスチジン群でタグ付けしたＮＭ２３  Ｐ９６Ｓ（ＮｄｅＩとＸｈｏＩとの間にクローニングした）
（ＤＮＡ）
atggccaactgtgagcgtaccttcattgcgatcaaaccagatggggtccagcggggtcttgtgggagagattatcaagcgttttgagcagaaaggattccgccttgttggtctgaaattcatgcaagcttccgaagatcttctcaaggaacactacgttgacctgaaggaccgtccattctttgccggcctggtgaaatacatgcactcagggccggtagttgccatggtctgggaggggctgaatgtggtgaagacgggccgagtcatgctcggggagaccaactctgcagactccaagcctgggaccatccgtggagacttctgcatacaagttggcaggaacattatacatggcagtgattctgtggagagtgcagagaaggagatcggcttgtggtttcaccctgaggaactggtagattacacgagctgtgctcagaactggatctatgaactcgagcaccaccaccaccaccactga（配列番号１１５）
（アミノ酸）
MANCERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVGLKFMQASEDLLKEHYVDLKDRPFFAGLVKYMHSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNSADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGSDSVESAEKEIGLWFHPEELVDYTSCAQNWIYELEHHHHHH-（配列番号１１６）
【００６８】
Ｃ末端のヒスチジン群でタグ付けしたＮＭ２３  Ｐ９６Ｓ／Ｓ１２０Ｇ（ＮｄｅＩとＡｇｅＩとの間にクローニングした）
（ＤＮＡ）
atggccaactgtgagcgtaccttcattgcgatcaaaccagatggggtccagcggggtcttgtgggagagattatcaagcgttttgagcagaaaggattccgccttgttggtctgaaattcatgcaagcttccgaagatcttctcaaggaacactacgttgacctgaaggaccgtccattctttgccggcctggtgaaatacatgcactcagggccggtagttgccatggtctgggaggggctgaatgtggtgaagacgggccgagtcatgctcggggagaccaactctgcagactccaagcctgggaccatccgtggagacttctgcatacaagttggcaggaacattatacatggcggtgattctgtggagagtgcagagaaggagatcggcttgtggtttcaccctgaggaactggtagattacacgagctgtgctcagaactggatctatgaaaccggtcaccaccaccaccaccactga（配列番号６７）
（アミノ酸）
MANCERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVGLKFMQASEDLLKEHYVDLKDRPFFAGLVKYMHSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNSADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGGDSVESAEKEIGLWFHPEELVDYTSCAQNWIYETGHHHHHH-（配列番号６８）
【００６９】
Ｃ末端のヒスチジン群でタグ付けしたＮＭ２３  Ｐ９６Ｓ／Ｓ１２０Ｇ（ＮｄｅＩとＸｈｏＩとの間にクローニングした）
（ＤＮＡ）
atggccaactgtgagcgtaccttcattgcgatcaaaccagatggggtccagcggggtcttgtgggagagattatcaagcgttttgagcagaaaggattccgccttgttggtctgaaattcatgcaagcttccgaagatcttctcaaggaacactacgttgacctgaaggaccgtccattctttgccggcctggtgaaatacatgcactcagggccggtagttgccatggtctgggaggggctgaatgtggtgaagacgggccgagtcatgctcggggagaccaactctgcagactccaagcctgggaccatccgtggagacttctgcatacaagttggcaggaacattatacatggcggtgattctgtggagagtgcagagaaggagatcggcttgtggtttcaccctgaggaactggtagattacacgagctgtgctcagaactggatctatgaactcgagcaccaccaccaccaccactga（配列番号１１７）
（アミノ酸）
MANCERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVGLKFMQASEDLLKEHYVDLKDRPFFAGLVKYMHSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNSADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGGDSVESAEKEIGLWFHPEELVDYTSCAQNWIYELEHHHHHH-（配列番号１１８）
【００７０】
Ｃ末端のヒスチジン群でタグ付けしたＮＭ２３  Ｐ９６ＳΔＣ１（ＮｄｅＩとＡｇｅＩとの間にクローニングした）
atggccaactgtgagcgtaccttcattgcgatcaaaccagatggggtccagcggggtcttgtgggagagattatcaagcgttttgagcagaaaggattccgccttgttggtctgaaattcatgcaagcttccgaagatcttctcaaggaacactacgttgacctgaaggaccgtccattctttgccggcctggtgaaatacatgcactcagggccggtagttgccatggtctgggaggggctgaatgtggtgaagacgggccgagtcatgctcggggagaccaactctgcagactccaagcctgggaccatccgtggagacttctgcatacaagttggcaggaacattatacatggcagtgattctgtggagagtgcagagaaggagatcggcttgtggtttcaccctgaggaactggtagattacacgagctgtgctcagaactggatctataccggtcaccaccaccaccaccactga（配列番号６９）
（アミノ酸）
MANCERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVGLKFMQASEDLLKEHYVDLKDRPFFAGLVKYMHSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNSADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGSDSVESAEKEIGLWFHPEELVDYTSCAQNWIYTGHHHHHH-（配列番号７０）
【００７１】
Ｃ末端のヒスチジン群でタグ付けしたＮＭ２３  Ｐ９６ＳΔＣ１（ＮｄｅＩとＸｈｏＩとの間にクローニングした）
（ＤＮＡ）
atggccaactgtgagcgtaccttcattgcgatcaaaccagatggggtccagcggggtcttgtgggagagattatcaagcgttttgagcagaaaggattccgccttgttggtctgaaattcatgcaagcttccgaagatcttctcaaggaacactacgttgacctgaaggaccgtccattctttgccggcctggtgaaatacatgcactcagggccggtagttgccatggtctgggaggggctgaatgtggtgaagacgggccgagtcatgctcggggagaccaactctgcagactccaagcctgggaccatccgtggagacttctgcatacaagttggcaggaacattatacatggcagtgattctgtggagagtgcagagaaggagatcggcttgtggtttcaccctgaggaactggtagattacacgagctgtgctcagaactggatctatctcgagcaccaccaccaccaccactga（配列番号１１９）
（アミノ酸）
MANCERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVGLKFMQASEDLLKEHYVDLKDRPFFAGLVKYMHSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNSADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGSDSVESAEKEIGLWFHPEELVDYTSCAQNWIYLEHHHHHH-（配列番号１２０）
【００７２】
Ｃ末端のヒスチジン群でタグ付けしたＮＭ２３  Ｐ９６ＳΔＣ２（ＮｄｅＩとＡｇｅＩとの間にクローニングした）
（ＤＮＡ）
atggccaactgtgagcgtaccttcattgcgatcaaaccagatggggtccagcggggtcttgtgggagagattatcaagcgttttgagcagaaaggattccgccttgttggtctgaaattcatgcaagcttccgaagatcttctcaaggaacactacgttgacctgaaggaccgtccattctttgccggcctggtgaaatacatgcactcagggccggtagttgccatggtctgggaggggctgaatgtggtgaagacgggccgagtcatgctcggggagaccaactctgcagactccaagcctgggaccatccgtggagacttctgcatacaagttggcaggaacattatacatggcagtgattctgtggagagtgcagagaaggagatcggcttgtggtttcaccctgaggaactggtagattacacgagctgtgctcagaactggatcaccggtcaccaccaccaccaccactga（配列番号７１）
（アミノ酸）
MANCERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVGLKFMQASEDLLKEHYVDLKDRPFFAGLVKYMHSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNSADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGSDSVESAEKEIGLWFHPEELVDYTSCAQNWITGHHHHHH-（配列番号７２）
【００７３】
Ｃ末端のヒスチジン群でタグ付けしたＮＭ２３  Ｐ９６ＳΔＣ２（ＮｄｅＩとＸｈｏＩとの間にクローニングした）
（ＤＮＡ）
atggccaactgtgagcgtaccttcattgcgatcaaaccagatggggtccagcggggtcttgtgggagagattatcaagcgttttgagcagaaaggattccgccttgttggtctgaaattcatgcaagcttccgaagatcttctcaaggaacactacgttgacctgaaggaccgtccattctttgccggcctggtgaaatacatgcactcagggccggtagttgccatggtctgggaggggctgaatgtggtgaagacgggccgagtcatgctcggggagaccaactctgcagactccaagcctgggaccatccgtggagacttctgcatacaagttggcaggaacattatacatggcagtgattctgtggagagtgcagagaaggagatcggcttgtggtttcaccctgaggaactggtagattacacgagctgtgctcagaactggatcctcgagcaccaccaccaccaccactga（配列番号１２１）
（アミノ酸）
MANCERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVGLKFMQASEDLLKEHYVDLKDRPFFAGLVKYMHSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNSADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGSDSVESAEKEIGLWFHPEELVDYTSCAQNWILEHHHHHH-（配列番号１２２）
【００７４】
Ｃ末端のヒスチジン群でタグ付けしたＮＭ２３  Ｐ９６ＳΔＣ６（ＮｄｅＩとＡｇｅＩとの間にクローニングした）
（ＤＮＡ）
atggccaactgtgagcgtaccttcattgcgatcaaaccagatggggtccagcggggtcttgtgggagagattatcaagcgttttgagcagaaaggattccgccttgttggtctgaaattcatgcaagcttccgaagatcttctcaaggaacactacgttgacctgaaggaccgtccattctttgccggcctggtgaaatacatgcactcagggccggtagttgccatggtctgggaggggctgaatgtggtgaagacgggccgagtcatgctcggggagaccaactctgcagactccaagcctgggaccatccgtggagacttctgcatacaagttggcaggaacattatacatggcagtgattctgtggagagtgcagagaaggagatcggcttgtggtttcaccctgaggaactggtagattacacgagctgtgctaccggtcaccaccaccaccaccactga（配列番号７３）
（アミノ酸）
MANCERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVGLKFMQASEDLLKEHYVDLKDRPFFAGLVKYMHSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNSADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGSDSVESAEKEIGLWFHPEELVDYTSCATGHHHHHH-（配列番号７４）
【００７５】
Ｃ末端のヒスチジン群でタグ付けしたＮＭ２３  Ｐ９６ＳΔＣ６（ＮｄｅＩとＸｈｏＩとの間にクローニングした）
（ＤＮＡ）
atggccaactgtgagcgtaccttcattgcgatcaaaccagatggggtccagcggggtcttgtgggagagattatcaagcgttttgagcagaaaggattccgccttgttggtctgaaattcatgcaagcttccgaagatcttctcaaggaacactacgttgacctgaaggaccgtccattctttgccggcctggtgaaatacatgcactcagggccggtagttgccatggtctgggaggggctgaatgtggtgaagacgggccgagtcatgctcggggagaccaactctgcagactccaagcctgggaccatccgtggagacttctgcatacaagttggcaggaacattatacatggcagtgattctgtggagagtgcagagaaggagatcggcttgtggtttcaccctgaggaactggtagattacacgagctgtgctctcgagcaccaccaccaccaccactga（配列番号１２３）
（アミノ酸）
MANCERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVGLKFMQASEDLLKEHYVDLKDRPFFAGLVKYMHSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNSADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGSDSVESAEKEIGLWFHPEELVDYTSCALEHHHHHH-（配列番号１２４）
【００７６】
Ｃ末端のヒスチジン群でタグ付けしたＮＭ２３  Ｐ９６ＳΔＣ１／Ｓ１２０Ｇ（ＮｄｅＩとＡｇｅＩとの間にクローニングした）
（ＤＮＡ）
atggccaactgtgagcgtaccttcattgcgatcaaaccagatggggtccagcggggtcttgtgggagagattatcaagcgttttgagcagaaaggattccgccttgttggtctgaaattcatgcaagcttccgaagatcttctcaaggaacactacgttgacctgaaggaccgtccattctttgccggcctggtgaaatacatgcactcagggccggtagttgccatggtctgggaggggctgaatgtggtgaagacgggccgagtcatgctcggggagaccaactctgcagactccaagcctgggaccatccgtggagacttctgcatacaagttggcaggaacattatacatggcggtgattctgtggagagtgcagagaaggagatcggcttgtggtttcaccctgaggaactggtagattacacgagctgtgctcagaactggatctataccggtcaccaccaccaccaccactga（配列番号７５）
（アミノ酸）
MANCERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVGLKFMQASEDLLKEHYVDLKDRPFFAGLVKYMHSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNSADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGGDSVESAEKEIGLWFHPEELVDYTSCAQNWIYTGHHHHHH-（配列番号７６）
【００７７】
Ｃ末端のヒスチジン群でタグ付けしたＮＭ２３  Ｐ９６ＳΔＣ１／Ｓ１２０Ｇ（ＮｄｅＩとＸｈｏＩとの間にクローニングした）
（ＤＮＡ）
atggccaactgtgagcgtaccttcattgcgatcaaaccagatggggtccagcggggtcttgtgggagagattatcaagcgttttgagcagaaaggattccgccttgttggtctgaaattcatgcaagcttccgaagatcttctcaaggaacactacgttgacctgaaggaccgtccattctttgccggcctggtgaaatacatgcactcagggccggtagttgccatggtctgggaggggctgaatgtggtgaagacgggccgagtcatgctcggggagaccaactctgcagactccaagcctgggaccatccgtggagacttctgcatacaagttggcaggaacattatacatggcggtgattctgtggagagtgcagagaaggagatcggcttgtggtttcaccctgaggaactggtagattacacgagctgtgctcagaactggatctatctcgagcaccaccaccaccaccactga（配列番号１２５）
（アミノ酸）
MANCERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVGLKFMQASEDLLKEHYVDLKDRPFFAGLVKYMHSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNSADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGGDSVESAEKEIGLWFHPEELVDYTSCAQNWIYLEHHHHHH-（配列番号１２６）
【００７８】
Ｃ末端のヒスチジン群でタグ付けしたＮＭ２３  Ｐ９６ＳΔＣ２／Ｓ１２０Ｇ（ＮｄｅＩとＡｇｅＩとの間にクローニングした）
（ＤＮＡ）
atggccaactgtgagcgtaccttcattgcgatcaaaccagatggggtccagcggggtcttgtgggagagattatcaagcgttttgagcagaaaggattccgccttgttggtctgaaattcatgcaagcttccgaagatcttctcaaggaacactacgttgacctgaaggaccgtccattctttgccggcctggtgaaatacatgcactcagggccggtagttgccatggtctgggaggggctgaatgtggtgaagacgggccgagtcatgctcggggagaccaactctgcagactccaagcctgggaccatccgtggagacttctgcatacaagttggcaggaacattatacatggcggtgattctgtggagagtgcagagaaggagatcggcttgtggtttcaccctgaggaactggtagattacacgagctgtgctcagaactggatcaccggtcaccaccaccaccaccactga（配列番号７７）
（アミノ酸）
MANCERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVGLKFMQASEDLLKEHYVDLKDRPFFAGLVKYMHSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNSADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGGDSVESAEKEIGLWFHPEELVDYTSCAQNWITGHHHHHH-（配列番号７８）
【００７９】
Ｃ末端のヒスチジン群でタグ付けしたＮＭ２３  Ｐ９６ＳΔＣ２／Ｓ１２０Ｇ（ＮｄｅＩとＸｈｏＩとの間にクローニングした）
（ＤＮＡ）
atggccaactgtgagcgtaccttcattgcgatcaaaccagatggggtccagcggggtcttgtgggagagattatcaagcgttttgagcagaaaggattccgccttgttggtctgaaattcatgcaagcttccgaagatcttctcaaggaacactacgttgacctgaaggaccgtccattctttgccggcctggtgaaatacatgcactcagggccggtagttgccatggtctgggaggggctgaatgtggtgaagacgggccgagtcatgctcggggagaccaactctgcagactccaagcctgggaccatccgtggagacttctgcatacaagttggcaggaacattatacatggcggtgattctgtggagagtgcagagaaggagatcggcttgtggtttcaccctgaggaactggtagattacacgagctgtgctcagaactggatcctcgagcaccaccaccaccaccactga（配列番号１２７）
（アミノ酸）
MANCERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVGLKFMQASEDLLKEHYVDLKDRPFFAGLVKYMHSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNSADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGGDSVESAEKEIGLWFHPEELVDYTSCAQNWILEHHHHHH-（配列番号１２８）
【００８０】
Ｃ末端のヒスチジン群でタグ付けしたＮＭ２３  Ｐ９６ＳΔＣ６／Ｓ１２０Ｇ（ＮｄｅＩとＡｇｅＩとの間にクローニングした）
（ＤＮＡ）
atggccaactgtgagcgtaccttcattgcgatcaaaccagatggggtccagcggggtcttgtgggagagattatcaagcgttttgagcagaaaggattccgccttgttggtctgaaattcatgcaagcttccgaagatcttctcaaggaacactacgttgacctgaaggaccgtccattctttgccggcctggtgaaatacatgcactcagggccggtagttgccatggtctgggaggggctgaatgtggtgaagacgggccgagtcatgctcggggagaccaactctgcagactccaagcctgggaccatccgtggagacttctgcatacaagttggcaggaacattatacatggcggtgattctgtggagagtgcagagaaggagatcggcttgtggtttcaccctgaggaactggtagattacacgagctgtgctaccggtcaccaccaccaccaccactga（配列番号７９）
（アミノ酸）
MANCERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVGLKFMQASEDLLKEHYVDLKDRPFFAGLVKYMHSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNSADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGGDSVESAEKEIGLWFHPEELVDYTSCATGHHHHHH-（配列番号８０）
【００８１】
Ｃ末端のヒスチジン群でタグ付けしたＮＭ２３  Ｐ９６ＳΔＣ６／Ｓ１２０Ｇ（ＮｄｅＩとＸｈｏＩとの間にクローニングした）
（ＤＮＡ）
atggccaactgtgagcgtaccttcattgcgatcaaaccagatggggtccagcggggtcttgtgggagagattatcaagcgttttgagcagaaaggattccgccttgttggtctgaaattcatgcaagcttccgaagatcttctcaaggaacactacgttgacctgaaggaccgtccattctttgccggcctggtgaaatacatgcactcagggccggtagttgccatggtctgggaggggctgaatgtggtgaagacgggccgagtcatgctcggggagaccaactctgcagactccaagcctgggaccatccgtggagacttctgcatacaagttggcaggaacattatacatggcggtgattctgtggagagtgcagagaaggagatcggcttgtggtttcaccctgaggaactggtagattacacgagctgtgctctcgagcaccaccaccaccaccactga（配列番号１２９）
（アミノ酸）
MANCERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVGLKFMQASEDLLKEHYVDLKDRPFFAGLVKYMHSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNSADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGGDSVESAEKEIGLWFHPEELVDYTSCALEHHHHHH-（配列番号１３０）
【００８２】
リンカー配列：
ＧＳ２リンカー
5'-ggcggtggcggatccggcggtggcggatcc-3'（配列番号８１）
GGGGSGGGGS（配列番号８２）
【００８３】
ＧＳ３リンカー
5'-ggcggtggcggatccggcggtggcggatccggcggtggcggatcc-3'（配列番号８３）
GGGGSGGGGSGGGGS（配列番号８４）
【００８４】
ＩｇＧ１ｈ  ｎｏ  Ｃリンカー（抗体のＦｃ領域の修飾ヒンジ部分）
5'-gataaaacccatactaaaccgccaaaaccggcgccggaactgctgggtggtcctggtaccggt-3'（配列番号８５）
DKTHTKPPKPAPELLGGPGTG（配列番号８６）
【００８５】
ＩｇＧ２ａｈ  ｎｏ  Ｃリンカー（抗体のＦｃ領域の修飾ヒンジ部分）
5'-actggtggtccgactattaaacctccgaaacctccgaaacctgctccgaacctgctgggtggtccg-3'（配列番号８７）
TGGPTIKPPKPPKPAPNLLGGP（配列番号８８）
【００８６】
ＩｇＧ１ｈ／ＩｇＧ２ａｈ  ｎｏ  Ｃリンカー（２つの異なるアイソタイプ抗体の２つのＦｃ領域の混合ヒンジ部分）
5'gataaaacccatactaaaccgccaaaaccggcgccggaactgctgggtggtcctggtaccggtactggtggtccgactattaaacctccgaaacctccgaaacctgctccgaacctgctgggtggtccg-3'（配列番号８９）
DKTHTKPPKPAPELLGGPGTGTGGPTIKPPKPPKPAPNLLGGP（配列番号９０）
【００８７】
配列の他の例は以下のとおりである：
（ＤＮＡ）（ggtggttctggt）n（ｎ＝１〜３）（各アミノ酸に用いられるコドンに応じて、他のＤＮＡ配列が可能である）（配列番号１３１）
（対応するアミノ酸配列）（GGSG）n（ｎ＝１〜３）（配列番号１３２）
【００８８】
（ＤＮＡ）gct（gaagctgctgctaaa）nGCT（各アミノ酸に用いられるコドンに応じて、他のＤＮＡ配列が可能である）（配列番号１３３）
（対応するアミノ酸配列）A（EAAAK）nA（ｎ＝２〜５）（配列番号１３４）
【００８９】
（ＤＮＡ）ggtgctggtggtgctggtggtgctggtgctggtggtgctggtgctggtgctggt（各アミノ酸に用いられるコドンに応じて、他のＤＮＡ配列が可能である）（配列番号１３５）
（対応するアミノ酸配列）GAGGAGGAGAGGAGAGAG（配列番号１３６）
【００９０】
（ＤＮＡ）
ggtgctggtggtgctggtggtgctggtgctggtggtgctggtgctggtgctggtgaacttggtgctggtggtgctggtggtgctggtgctggtggtgctggtgctggtgctggt（各アミノ酸に用いられるコドンに応じて、他のＤＮＡ配列が可能である）（配列番号１３７）
（対応するアミノ酸配列）
GAGGAGGAGAGGAGAGAGELGAGGAGGAGAGGAGAGAG（配列番号１３８）
【００９１】
（ＤＮＡ）ggtggtgctggtgctggtgctggt（各アミノ酸に用いられるコドンに応じて、他のＤＮＡ配列が可能である）（配列番号１３９）
（対応するアミノ酸配列）GGAGAGAG（配列番号１４０）
【００９２】
（ＤＮＡ）ggttctggtggtggtggttctggtggtggtggttctggt（各アミノ酸に用いられるコドンに応じて、他のＤＮＡ配列が可能である）（配列番号１４１）
（対応するアミノ酸配列）GSGGGGSGGGGSG（配列番号１４２）
【００９３】
（ＤＮＡ）cttgctgctgct（各アミノ酸に用いられるコドンに応じて、他のＤＮＡ配列が可能である）（配列番号１４３）
（対応するアミノ酸配列）LAAA（配列番号１４４）
【００９４】
（ＤＮＡ）cttggtggtggtggttctggtggtggtggttctggtggtggtggttctgctgctgct（各アミノ酸に用いられるコドンに応じて、他のＤＮＡ配列が可能である）（配列番号１４５）
（対応するアミノ酸配列）LGGGGSGGGGSGGGGSAAA（配列番号１４６）
【００９５】
（ＤＮＡ）
ctttctggtggtggtggttctggtggtggtggttctggtggtggtggttctggtggtggtggttctgctgctgct（各アミノ酸に用いられるコドンに応じて、他のＤＮＡ配列が可能である）（配列番号１４７）
（対応するアミノ酸配列）LSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSAAA（配列番号１４８）
【００９６】
（ＤＮＡ）cttgct（gaagctgctgctaaa）ngctgctgct（ｎ＝１〜５）（各アミノ酸に用いられるコドンに応じて、他のＤＮＡ配列が可能である）（配列番号１４９）
（対応するアミノ酸配列）LA（EAAAK）nAAA（ｎ＝１〜５）（配列番号１５０）
【００９７】
（ＤＮＡ）
ctttttaataaagaacaacaaaatgctttttatgaaattcttcatcttcctaatcttaatgaagaacaacgtaatggttttattcaatctcttaaagatgatccttctcaatctgctaat（各アミノ酸に用いられるコドンに応じて、他のＤＮＡ配列が可能である）（配列番号１５１）
（対応するアミノ酸配列）
LFNKEQQNAFYEILHLPNLNEEQRNGFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAAA（配列番号１５２）
【００９８】
サンプルのキメラ配列：
ＮＭ２３  Ｓ１２０Ｇ  ＩｇＧ１Ｆｃ（抗体のＦｃ領域に結び付いたＮＭ２３−Ｘ）
atggccaactgtgagcgtaccttcattgcgatcaaaccagatggggtccagcggggtcttgtgggagagattatcaagcgttttgagcagaaaggattccgccttgttggtctgaaattcatgcaagcttccgaagatcttctcaaggaacactacgttgacctgaaggaccgtccattctttgccggcctggtgaaatacatgcactcagggccggtagttgccatggtctgggaggggctgaatgtggtgaagacgggccgagtcatgctcggggagaccaaccctgcagactccaagcctgggaccatccgtggagacttctgcatacaagttggcaggaacattatacatggcggtgattctgtggagagtgcagagaaggagatcggcttgtggtttcaccctgaggaactggtagattacacgagctgtgctcagaactggatctatgaactcgagggttgtaagccttgcatatgtacagtcccagaagtatcatctgtcttcatcttccccccaaagcccaaggatgtgctcaccattactctgactcctaaggtcacgtgtgttgtggtagacatcagcaaggatgatcccgaggtccagttcagctggtttgtagatgatgtggaggtgcacacagctcagacgcaaccccgggaggagcagttcaacagcactttccgctcagtcagtgaacttcccatcatgcaccaggactggctcaatggcaaggagttcaaatgcagggtcaacagtgcagctttccctgcccccatcgagaaaaccatctccaaaaccaaaggcagaccgaaggctccacaggtgtacaccattccacctcccaaggagcagatggccaaggataaagtcagtctgacctgcatgataacagacttcttccctgaagacattactgtggagtggcagtggaatgggcagccagcggagaactacaagaacactcagcccatcatggacacagatggctcttacttcgtctacagcaagctcaatgtgcagaagagcaactgggaggcaggaaatactttcacctgctctgtgttacatgagggcctgcacaaccaccatactgagaagagcctctcccactctcctggtaaactcgagcaccaccaccaccaccactga（配列番号９１）
MANCERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVGLKFMQASEDLLKEHYVDLKDRPFFAGLVKYMHSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNPADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGGDSVESAEKEIGLWFHPEELVDYTSCAQNWIYELEGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGKLEHHHHHH-（配列番号９２）
【００９９】
ＮＭ２３  Ｓ１２０Ｇ  ＩｇＧ１ｈ（抗体のＦｃ領域の修飾ヒンジ部分のみに結び付いたＮＭ２３−Ｘ）
atggccaactgtgagcgtaccttcattgcgatcaaaccagatggggtccagcggggtcttgtgggagagattatcaagcgttttgagcagaaaggattccgccttgttggtctgaaattcatgcaagcttccgaagatcttctcaaggaacactacgttgacctgaaggaccgtccattctttgccggcctggtgaaatacatgcactcagggccggtagttgccatggtctgggaggggctgaatgtggtgaagacgggccgagtcatgctcggggagaccaaccctgcagactccaagcctgggaccatccgtggagacttctgcatacaagttggcaggaacattatacatggcggtgattctgtggagagtgcagagaaggagatcggcttgtggtttcaccctgaggaactggtagattacacgagctgtgctcagaactggatctatgaaccggtgccacgtgattctggttgtaaaccgtgtatttgtgttggtctcgagcaccaccaccaccaccactga（配列番号９３）
MANCERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVGLKFMQASEDLLKEHYVDLKDRPFFAGLVKYMHSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNPADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGGDSVESAEKEIGLWFHPEELVDYTSCAQNWIYEPVPRDSGCKPCICVGLEHHHHHH-（配列番号９４）
【０１００】
ＮＭ２３  Ｓ１２０Ｇ  ＩｇＧ２ａｈ（抗体のＦｃ領域の修飾ヒンジ部分のみに結び付いたＮＭ２３−Ｘ）
atggccaactgtgagcgtaccttcattgcgatcaaaccagatggggtccagcggggtcttgtgggagagattatcaagcgttttgagcagaaaggattccgccttgttggtctgaaattcatgcaagcttccgaagatcttctcaaggaacactacgttgacctgaaggaccgtccattctttgccggcctggtgaaatacatgcactcagggccggtagttgccatggtctgggaggggctgaatgtggtgaagacgggccgagtcatgctcggggagaccaaccctgcagactccaagcctgggaccatccgtggagacttctgcatacaagttggcaggaacattatacatggcggtgattctgtggagagtgcagagaaggagatcggcttgtggtttcaccctgaggaactggtagattacacgagctgtgctcagaactggatctatgaaccgcgtggtccgaccattaaaccgtgtccaccgtgtaaatgtccaggtctcgagcaccaccaccaccaccactga（配列番号９５）
MANCERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVGLKFMQASEDLLKEHYVDLKDRPFFAGLVKYMHSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNPADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGGDSVESAEKEIGLWFHPEELVDYTSCAQNWIYEPRGPTIKPCPPCKCPGLEHHHHHH-（配列番号９６）
【０１０１】
本発明は、特異的な多量体（複数の場合もある）を選択的に形成するタンパク質を作製する方法であって、特異的な多量体が、タンパク質の単量体又は幾つかの他の多量体が有しない所望の生物学的機能を有する、方法を開示している。例えば、多くの成長因子が、二量体形態で存在する場合にのみ成長促進機能を示す。これらの成長因子はホモ二量体又はヘテロ二量体であり得る。これらの場合、本発明の方法を用いて、成長因子の二量体の量を増大させることで成長を増進させる。反対に、所望の生物学的機能が、例えばがんの成長を阻害することである場合、二量体の形成を抑えるように、成長因子を操作するか又は突然変異体を選択する。
【０１０２】
単量体又は他の多量体形態では与えられない所望の生物学的機能をもたらす、所望の多量体形態で存在する可能性が高いタンパク質又は天然タンパク質の変異体を生成する本発明の方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで用いることができる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは、特異的な多量体化状態を支持する変異体を発現させ、任意で精製した後、細胞培養、特に造血幹細胞及び造血前駆細胞及び骨髄の他の未熟細胞を含む幹細胞及び前駆細胞の培養、又は他のｉｎ  ｖｉｔｒｏ用途に使用することができる。
【０１０３】
加えて、発現させ、任意で精製した多量体特異的な変異体は、クリーム、スアーヴ（suave）、絆創膏等によって局所投与するか、又は経口摂取、注射等によって全身治療として投与することで患者を治療するのに使用することができる。好ましい実施形態では、親タンパク質はＮＭ２３であり、多量体特異的な変異体は、二量体の形成を支持し、任意で四量体又は六量体の形成を阻害し、その一方で広範なタンパク質濃度にわたって存在する二量体の量を増大させる。場合によっては、タンパク質の細胞への侵入を増大させるリーダー配列を用いて多量体特異的な変異体を組換えによって合成することが望ましい場合もある。
【０１０４】
代替的には、相同組換え、安定な又は一過性のトランスフェクション又は形質導入、自己不活性化ベクター（自己不活性化レンチウイルスベクター及び自己不活性化レトロウイルスベクターを含む）を含むレンチウイルス又はレトロウイルスを使用すること等によるウイルス形質導入のような当業者に既知の多様な方法のいずれか１つを用いて、多量体特異的な変異体をコードする核酸を細胞に導入することができる。一実施形態では、細胞は幹細胞又はｉＰＳ細胞であり、これは患者又はドナーから誘導することができる。得られた細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖（expansion）の前又は後に患者に移植することができる。一実施形態では、核酸操作を行い、トランスフェクト又は形質導入している細胞での遺伝学的異常を修復することで、多量体特異的な変異体を発現させる。
【０１０５】
好ましい実施形態では、タンパク質はＮＭ２３であり、多量体特異的な変異体は二量体化を支持し、より高次の多量体の形成を阻害し、また親タンパク質と比較して広範な濃度にわたって発現タンパク質集団の二量体量を増大するという正味効果を有する。このようにして、成長因子であるＮＭ２３二量体は、患者に移植された後でも細胞の増殖を誘導する。一実施形態では、治療対象の遺伝学的障害は鎌状細胞貧血症であり、治療には、胎児型のヘモグロビン又は成体型に対する修復遺伝子を発現する細胞の成長を刺激することが含まれる。成長因子変異体を、例えば自己不活性化ウイルスベクターを用いて一時的に発現するように細胞に挿入することができる。代替的には、好ましい実施形態では二量体の形成を支持するＮＭ２３変異体である多量体特異的な変異体を、ゲノムに永続的に挿入することができる。さらに任意で、細胞をトランスフェクト又は形質導入することで、ＭＵＣ１、又はＭＵＣ１キメラ若しくは細胞外ドメインがＰＳＭＧＦＲ配列の本質的に大部分又は全てを含むように切断されているＭＵＣ１＊を含むＭＵＣ１の断片を発現することができる。
【０１０６】
細胞が多量体特異的な変異体をコードする核酸でトランスフェクトされている場合を含む幾つかの場合では、細胞に発現タンパク質を分泌させるリーダー配列を含むように、５’末端で変異体の核酸を修飾することが望ましい。このような配列は、当業者に既知であり、抗体から誘導される配列を一般的に含む。実施例１３を参照されたい。
【０１０７】
以下の配列は細胞から発現タンパク質を分泌させる例示的なリーダー配列である。これらの配列のいずれか又は当業者に既知の他の配列を、発現タンパク質が細胞から分泌されるように、変異体の核酸配列に付加することができる。任意で、この配列を核酸配列のＮ末端すなわち５’に付加する。このようにして、ＮＭ２３突然変異体、欠失体（deletions）、一本鎖変異体及び融合タンパク質キメラをｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｅｘ  ｖｉｖｏ並びにｉｎ  ｖｉｖｏで容易に使用することができる。
【０１０８】
大腸菌ペリプラズムでのタンパク質発現に関する配列
ｐｅｌＢ（エルウィニア・カロトボーラ（Erwinia carotovora）のペクチン酸リアーゼＢ）リーダー配列
（ＤＮＡ）
aaatatcttcttcctactgctgctgctggtcttcttcttcttgctgctcaacctgctatggct（配列番号１５３）（各アミノ酸に用いられるコドンに応じて、他のＤＮＡ配列が可能である）
（アミノ酸）
KYLLPTAAAGLLLLAAQPAMA（配列番号１５４）
【０１０９】
哺乳動物細胞でのタンパク質分泌に関する配列
ヒト血清アルブミンシグナルペプチド
（ＤＮＡ）
atgaaatgggttacttttatttctcttctttttcttttttcttctgcttattct（配列番号１５５）（各アミノ酸に用いられるコドンに応じて、他のＤＮＡ配列が可能である）
（アミノ酸）
MKWVTFISLLFLFSSAYS（配列番号１５６）
【０１１０】
ヒトκ軽鎖シグナルペプチド
（ＤＮＡ）
atggattttcaagttcaaattttttcttttcttcttatttctgcttctgttattatgtctcgtggt（配列番号１５７）（各アミノ酸に用いられるコドンに応じて、他のＤＮＡ配列が可能である）
（アミノ酸）
MDFQVQIFSFLLISASVIMSRG（配列番号１５８）
【０１１１】
成長因子変異体、例えば二量体化を支持するＮＭ２３変異体を発現するようにトランスフェクト又は形質導入された細胞は、体細胞、造血幹細胞を含む幹細胞、及び前駆細胞、又はｉＰＳ細胞であり得る。一実施形態では、線維芽細胞又は皮膚芽細胞（正：dermoblasts）等の体細胞に、二量体の形成を支持するＮＭ２３変異体をコードする核酸を形質導入する。それとともにＮＭ２３変異体の核酸に、宿主細胞をより未熟な状態へと戻す１つ又は複数の遺伝子を形質導入することができる。これらの他の遺伝子には、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｋｌｆ４、Ｌｉｎ２８及びｃ−Ｍｙｃが含まれ得るが、それらに限定されるものではない。細胞をトランスフェクト又は形質導入することで、限られた時間、この細胞型の拡大が誘導されるように一時的に、又は安定なトランスフェクション若しくは相同組換え等の方法を用いて永続的にＮＭ２３変異体を発現することができる。
【０１１２】
本発明の方法を用いて、遺伝学的突然変異又は修復を保有し得る、構造的に活性な又は天然の成長因子よりも特異的な細胞の集団の増殖を刺激する活性が高い成長因子を提供することができる。一実施形態では、成長因子の特異的な多量体状態の割合を増大させる１つの組換え変異（variant）を、修復遺伝子又は発現遺伝子の配列を保有する同じ核酸、プラスミド、又は発現ベクター上に保有する。別の実施形態では、遺伝子が下方調節されるのが望ましい場合、成長を刺激しない多量体を使用することができる。本発明には、患者、患者への移植用の細胞、胚盤胞及び胚、並びに体外受精に使用することができる受精卵又は未受精卵におけるこれらの方法の使用も含まれる。
【０１１３】
好ましい実施形態では、成長因子は、二量体形態が成長を活性化し、四量体及び六量体等のより高次の多量体が、成長を刺激し、多能性を誘導又は維持するＮＭ２３媒介経路を停止させるＮＭ２３である。例えば、ＮＭ２３二量体は、幹細胞及び前駆細胞の成長及び多能性を促進するとともに、がん細胞の成長も促進する。ＮＭ２３の六量体形態又は四量体形態は幹細胞又はがん細胞の成長を促進しない。したがって、二量体の形成を支持する変異体をもたらす本発明の方法を用いることで、幹細胞、前駆細胞及び／又はがん細胞の成長が促進される。幹細胞及び前駆細胞の場合、より高次のＮＭ２３多量体を用いることで、分化を誘導することができる。
【０１１４】
反対に、四量体、六量体又はより高次の多量体の形成を支持する変異体をもたらす本発明の方法を用いることで、がん細胞の成長が阻害される。代替的に、ＮＭ２３変異体を更に修飾して、がん細胞の破壊を目的とする毒素を保有させることができる。ＮＭ２３は多くの異なるがん細胞の表面に存在するＭＵＣ１＊のリガンドである。がん細胞を特異的に標的化することで、薬物又は毒素を送達し、標的化した細胞を破壊するのに、ＮＭ２３を使用することができる。一例としては、サポリンと呼ばれるリボソーム不活性化タンパク質の使用がある。サポリン自体は細胞へと進入することはできないが、細胞表面に結合する別のタンパク質と共役することで、細胞に対する毒性のあるサポリン／タンパク質複合体を内部移行させることができる。
【０１１５】
ＮＭ２３がＭＵＣ１＊成長因子受容体を活性化させることから、ＭＵＣ１又は主に細胞外ドメインにＰＳＭＧＦＲペプチドの配列が含まれるＭＵＣ１＊を含む、ＭＵＣ１の切断型を、ＮＭ２３変異体とともにｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで任意に発現させることができる。ＭＵＣ１又はＭＵＣ１切断体（truncations）若しくはＭＵＣ１変異体は、ＮＭ２３及び任意で発現されることが望ましい遺伝子と同じ発現プラスミドから同じように発現することができる。
【０１１６】
別の実施形態では、成長因子受容体自体を操作して、成長を促進又は阻害するような特異的な多量体化状態にする。好ましい実施形態では、成長因子受容体はＭＵＣ１＊であり、好ましい多量体は二量体である。
【０１１７】
特異的な多量体化状態を支持するタンパク質を生成する方法の１つは、この特異的な多量体化状態の形成を支持するタンパク質の突然変異体を同定することである。例えば、表１に、二量体の形成を促すＮＭ２３突然変異体（mutations）の一部を挙げる。
【０１１８】
表１．二量体の形成を支持する例示的なＮＭ２３突然変異体
【表１】
2020039359.tif 000002
【０１１９】
１つ又は複数の単量体が既に結び付いているような組換えタンパク質の構築物が生成される。例えば２つ以上の単量体が直接又は例えば長さ若しくは配列が異なり得るリンカーを介して間接的に結び付いている一本鎖タンパク質によって所望の生物学的活性が得られる。リンカーは長さ及び配列が異なっていてもよい。好ましい実施形態では、リンカーは５個〜１００個のアミノ酸である。より好ましい実施形態では、リンカーは１０個〜７５個のアミノ酸である。更により好ましい実施形態では、リンカーは１０個のアミノ酸又は４３個のアミノ酸のいずれかである。同様に、リンカーの配列は、（GGGGS）nタイプの可塑性リンカーから、可塑性又は溶解性を増大することが意図される幾つかの突然変異が挿入されている天然配列の修飾配列（modifications）を含む、天然タンパク質において可塑性であることが知られている又は可塑性である可能性がある任意の配列と様々なものであってもよい。表２に一部の好ましいリンカー配列を挙げる。
【０１２０】
表２．例示的なリンカー
【表２】
2020039359.tif 000003
【０１２１】
表３に、２つの単量体がリンカーを介して組換えによって結び付いている一部の好ましい一本鎖構築物を挙げる。
【０１２２】
表３．二量体の形成を支持するＮＭ２３変異体の例
【表３−１】
2020039359.tif 000004
【表３−２】
2020039359.tif 000005
【０１２３】
場合によっては、リンカー配列自体がホモ二量体又はヘテロ二量体を形成する傾向がある。例えば、抗体のＦｃ領域の一部分が別のＦｃ領域を二量体化する。親タンパク質の一部分＋自然状態で二量体化するタンパク質の一部分からなるキメラタンパク質は二量体の形成を支持する変異体である。代替的に、ＩｇＭタンパク質由来のＦｃ配列を使用するキメラは、特徴的な五量体等のより高次の多量体の形成を支持する。ＮＭ２３突然変異型単量体に融合した抗体の修飾ヒンジ領域が二量体を選択的に形成し、本明細書で詳細に説明されている。
【０１２４】
別のアプローチでは、タンパク質二量体は、二量体化ドメインを有するタンパク質又はタンパク質断片に融合している融合キメラである対象のタンパク質を遺伝学的に作製することによって実現される。多量体のリガンドを、各単量体が多量体化するタンパク質の一部分と結び付いている組換えキメラを作製することによって生成することができる。例えば、タンパク質ＦｏｓとＪｕｎとが相互作用し、それによりこれらのタンパク質が、同じでも又は異なっていてもよい複数のリガンドに組換えによって結び付くことで、得られたキメラの二量体化をもたらすことができる。表３には、好ましい構築物（その一部がキメラである）を挙げている。
【０１２５】
システインを対象のタンパク質に挿入することができ、そのようにして二量体の形成がジスルフィド結合の形成を介して促される。本発明は、システインを、リンカー（天然アミノ酸、又は非天然ポリマー若しくは小分子で構成されるかに関係なく）に挿入することで、二量体化を促すことも含む。表４には、二量体化がシステインの導入によって増進される好ましい変異体の一覧が含まれる。
【０１２６】
表４．抗体のヒンジ領域間でのジスルフィド結合の形成を介した二量体の形成の例
【表４】
2020039359.tif 000006
【０１２７】
リガンド多量体を作製する更に別の方法は、２つ以上の単量体リガンドの化学共役によるものである。例えば、二官能性リンカーを使用して、２つのタンパク質リガンドを化学共役することで、ホモ二量体又はヘテロ二量体を作製することができる。リンカーは、化学架橋リンカー、又は２つの単量体の共有共役によって二量体化を促すことで、ホモ二量体又はヘテロ二量体を形成する類似のものであってもよい。
【０１２８】
これは、タンパク質が二量体状態である場合、該タンパク質を化学共役すること、例えば標的タンパク質を規定の配置で、例えばＳＡＭ上に固定すること、及びタンパク質を二量体化状態に類する配置に閉じ込めながら、該タンパク質を直接又はリンカーを介して間接的に化学共役することによって達成することができる。代替的には、二量体を単離した後で、カップリング剤を添加することで、２つのタンパク質を直接又はリンカーを介して共役させる。
【０１２９】
多量体リガンドを作製する別の方法は、標的受容体に結合させた後、小分子の多量体を合成する小分子を同定することである。
【０１３０】
好ましい実施形態では、自然状態での生物学的相互作用、例えば成長因子の活性を増進させるのに好ましい多量体化状態は二量体である。より好ましい実施形態では、二量体となる又は二量体の形成を支持するリガンドはＮＭ２３である。ＮＭ２３アイソフォームＨ１、Ｈ２及びＨ７（ＮＭＥ７）が好ましく、Ｈ１が特に好ましい。更により好ましい実施形態では、ＮＭ２３はヒト由来のものである。さらに、成長因子の活性を増大させる方法とともに使用するのには、二量体化を増進させるとともに、最適にはより高次の多量体の形成を抑える突然変異体が好ましい。例えば、ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ突然変異体及びＮＭ２３−Ｐ９６Ｓ突然変異体は、二量体の形成を支持するとともに、ＭＵＣ１＊成長因子受容体を活性化せず、多能性及びがんに関わる遺伝子の発現を誘導する核酸に結合しない四量体及び六量体の形成を抑えることが報告されている。しかしながら、ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ突然変異体に関して、タンパク質が変性及びリフォールディングすることで、大きな二量体集団が得られることを本発明者らは発見した。同様に、二量体として存在するＰ９６Ｓ突然変異体の割合は変性及びリフォールディングによって増大した。Ｃ末端欠失によって、より高次の多量体の形成に関与する領域が破壊され、これにより二量体形態のタンパク質の割合が増大する。そのため、野生型ＮＭ２３又は突然変異体のＣ末端欠失は、二量体集団の割合及び安定性の増大に好ましい。既に二量体の形成を支持するものであるＳ１２０Ｇ及び／又はＰ９６Ｓ等の突然変異体のＣ末端欠失が特に好ましい。ＮＭ２３のＣ末端から１個〜６個のアミノ酸の欠失が特に好ましい。
【０１３１】
Ｓ１２０Ｇ突然変異及びＰ９６Ｓ突然変異は、ヒトがん及びミバエの発育異常においてそれぞれ同定された自然発生的な突然変異であるが、本発明は、突然変異を意図的に導入すること、及び二量体を形成する傾向を増大若しくは低減させる突然変異を同定することも含む。例えば、二量体形態である場合に活性となる成長因子の活性を増進するのに、二量体の形成を支持する突然変異を同定するのが好ましい。成長因子の活性を阻害するのには、二量体の形成を抑えるか、又は四量体若しくは六量体の形成を支持する突然変異が好ましい。部位特異的突然変異誘発又はランダム突然変異誘発のいずれかを使用することができ、そこでは二量体の形成を支持する突然変異が、結晶構造等の構造解析、幹細胞において多能性を支持、誘導又は維持する能力、ＰＳＭＧＦＲペプチド配列を本質的に含むＭＵＣ１＊ペプチドに結合する能力を含むが、これらに限定されるものではない多様な方法によって同定される。加えて、二量体の形成を支持するＮＭ２３変異体を、例えばファージ提示及び標準的なランダム突然変異誘発を用いることによって同定することができ、そこでは所望の突然変異体が、幹細胞又はＭＵＣ１＊ペプチドに結合する能力によって同定される。
【０１３２】
同様に、本発明のＮＭ２３変異体及び類似の多量体特異的な変異体を、細胞膜を透過する変異体の能力を増大させる配列で更に修飾することができる。
【０１３３】
明らかなように、二量体の形成を支持するように遺伝子操作しているリガンド単量体は、野生型タンパク質、又は二量体の形成を支持するか若しくはより高次の多量体の形成を抑える突然変異体若しくは切断体であってもよい。ＮＭ２３のケースは例示的なものであることが意図され、本発明は、二量体形態である場合に効果を発揮する他の作用物質の活性の増大へのこれらの方法、リンカー、リンカー配列の使用、及び／又は他のタンパク質若しくは分子の一部分の使用も含む。
【０１３４】
多量体化状態が重要である別のタイプのタンパク質は転写因子である。転写因子が、二量体状態である場合にのみ特異的な核酸配列に結合することはよく知られている。しかしながら、腫瘍抑制因子ｐ５３等の一部の転写因子は四量体としてＤＮＡに結合する。更に他の転写因子は、八量体として存在する場合にのみ特異的な転写機能を発揮する。本発明の方法を用いて、例えば二量体化を支持する転写因子変異体を作製することによって所望の活性を増大するこれらの転写因子の変異体を作製することができる。
【０１３５】
受容体、特に成長因子受容体に結合し、それらを活性化するリガンドは多くの場合、成長因子受容体に結合し、及び／又はその機能を活性化するのに二量体状態であることが必要とされることから、成長を阻害するアプローチは、上述の方法の１つを用いて、３つ以上のリガンドが互いに結び付いているか、又はより高次の多量体を形成するように働きかけるリガンドの多量体を作製することである。核酸の結合を阻害するのに、より高次の多量体の形成を支持する変異体を生成することができる。
【０１３６】
好ましい実施形態では、より高次の多量体を形成するように設計されたリガンドを野生型タンパク質と相互作用させ、天然タンパク質の二量体を形成する能力を阻害することができる。例えば、ＮＭ２３はＭＵＣ１＊成長因子受容体に結合し、成長、生存及び多能性を誘起する二量体化を誘導する。ＮＭ２３はその配列及び濃度に応じて、単量体、二量体、四量体又は六量体として存在することができる。組換えＮＭ２３を、二量体の集団を単離することができるようにリフォールディング又は精製することができる。二量体の形成を支持するとともに、四量体及び六量体の形成を抑えるＮＭ２３の突然変異体がヒトがんから単離されている。そのため、がん性成長の阻害のアプローチは、より高次の多量体の形成を支持し、成長及び多能性を誘導しないＮＭ２３突然変異体を同定することである。野生型ＮＭ２３を多量体へと戻し、そうすることでがん関連の二量体が形成されなくなる突然変異体が特に好ましい。
【０１３７】
ＭＵＣ１＊成長因子受容体がその細胞外ドメインのリガンド誘導性の二量体化によって活性化されることが知られている。ＭＵＣ１＊の細胞外ドメインに対して産生される二価抗体（ＰＳＭＧＦＲ配列：GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA（配列番号１）又はGTINVHDVETQFNQYKTEAASPYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA（配列番号２）は、用量依存的にＭＵＣ１＊受容体を二量体化し、成長を刺激する。用量応答曲線は典型的な釣鐘曲線であり、これは二量体化によって活性化されるクラスＩ成長因子受容体の特徴である。釣鐘曲線は、ＭＵＣ１＊の二量体化が増大するにつれて成長が増大するが、ＮＭ２３二量体又は二価抗体が過剰に存在する場合、各受容体が２つの成長因子ではなく１つの成長因子と結合することでもたらされる。これによって実際に、成長因子受容体の二量体化が妨げられ、それにより成長の低減が起こる。これらの所見に一致して、抗ＭＵＣ１＊ｅｃｄ抗体の一価Ｆａｂの添加によって、受容体の二量体化が妨げられ、結果として成長が阻害される。図１を参照されたい。同様に、二量体形態のＮＭ２３はＭＵＣ１＊陽性細胞の成長を刺激する。
【０１３８】
ＮＭ２３突然変異体Ｓ１２０Ｇを、事前にヒト神経芽細胞腫から単離した。突然変異型ＮＭ２３は二量体の形成を支持するとともに、野生型ＮＭ２３が形成することが知られているより高次の多量体、特に四量体及び六量体の形成を抑えるという報告がある。二量体化を支持するという報告がある他のＮＭ２３突然変異体は、Ｐ９６Ｓ突然変異体及びＣ末端の１個〜６個のアミノ酸欠失体であった。
【０１３９】
しかしながら、ＮＭ２３−ＷＴ（野生型）、Ｓ１２０Ｇ突然変異体又はＰ９６Ｓ突然変異体を組換えタンパク質として作製した場合、その多量体化状態は、配列、どのように発現するか、どのように回収及び精製するか、並びに濃度に応じて決まる。例えばＳ１２０Ｇ突然変異体の発現は、二量体の形成を支持するという報告があるにもかかわらず、多くの発現／精製方法では、四量体及び六量体のみからなる集団がもたらされた。他のタンパク質発現方法では、六量体と、四量体と、小さい二量体集団とで構成されたＮＭ２３集団が生じた。大きな二量体集団をもたらすＮＭ２３突然変異体を発現及び精製する方法の１つは、発現タンパク質を変性させた後、リフォールディングすることを伴うものであった。任意の工程では、二量体集団を本明細書の実施例４に記載のサイズ排除クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）によって更に精製した。
【０１４０】
ＮＭ２３−ＷＴ又は突然変異体Ｓ１２０Ｇの３つの異なる調製物の特性化をＦＰＬＣによって行った（図２）。ＦＰＬＣから、野生型であるＮＭ２３−ＷＴは、ほとんど六量体のみで構成され、これは発現タンパク質の可溶性画分を使用した突然変異体の調製物の１つである「ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−六量体」Ｓ１２０Ｇと同様であったことが示唆される。同様に可溶性画分を使用したＳ１２０Ｇ突然変異体の別の調製物である「ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−ミックス」は、ＦＰＬＣによって約６０％の二量体を含む多量体の混合物で構成されることが示唆される。実施例３ｂに記載の方法に従って発現タンパク質を変性させた後、リフォールディングして、突然変異体Ｓ１２０Ｇの別の調製物を得た。ＦＰＬＣから、この調製物「ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−二量体」は二量体及び単量体のみで構成され、二量体の割合が集団の８０％であったことが示唆された。図３ａは、非還元ゲル上で、ＮＭ２３二量体が約４０ｋＤａの見掛け分子量で泳動し、単量体及び六量体が両方とも約２０ｋＤａの見掛け分子量で泳動することを示しており、これにより二量体がジスルフィド結合によって安定化する一方で、六量体はジスルフィド結合によっては安定化しないことが示唆される。
【０１４１】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）実験を行い、ＭＵＣ１＊ペプチドに対する様々なＮＭ２３多量体（単量体、二量体及び六量体）の結合親和性に差があるかを求めた。ＳＰＲの測定結果はビアコア３０００機器で入手し、ここではヒスチジンでタグ付けしたＭＵＣ１＊ペプチド（ＰＳＭＧＦＲ）を、トリエチレングリコール終端チオールのバックグラウンドにおいて３．８％  ＮＴＡ−Ｎｉをコーティングした自己集合単分子層をコーティングしたＳＰＲチップ上で飽和するまで固定した。実施例５、図３ｂ及び図５を参照されたい。図３ｂに、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の測定結果のオーバーレイを示し、これによりＳＰＲチップ表面に付着したＭＵＣ１＊細胞外ドメインペプチド（ＰＳＭＧＦＲ）に結合する４つの異なるＮＭ２３調製物の能力に大きな差があることが示唆される。結果から、ＮＭ２３のその同族受容体、ＭＵＣ１＊への結合量は二量体がサンプルにどれくらい存在するかに依存することが示唆される。ＳＰＲによって、チップ−溶液界面でのタンパク質の質量が測定され、六量体がＭＵＣ１＊ペプチド表面に結合した場合、二量体が結合した場合よりも３倍大きいＳＰＲシグナルが生じる。このことは、ＮＭ２３−ＷＴ又はＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−六量体のＭＵＣ１＊ペプチドへの結合量がＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−二量体の結合量の約１２分の１であったことを意味する。対照実験では、無関係のペプチドを同じチップ上に固定し、最少のバックグラウンド結合量を得て、これを示される測定値から差し引いた。しかしながら、約１００ＲＵというＮＭ２３−ＷＴ及びＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−六量体（両方ともほとんど六量体のみからなる）で生じた結合量はほとんどの場合、システムのノイズ範囲内であると考えられる。
【０１４２】
様々なＮＭ２３多量体のその同族受容体への結合能を更に試験するために、本発明者らはナノ粒子実験を行った。実施例６及び図３ｃを参照されたい。この実験では、金ナノ粒子に、ＮＴＡ−Ｎｉ−チオールが組み込まれた自己集合単分子層（ＳＡＭ）をコーティングする。ＮＴＡ−Ｎｉ部はヒスチジンでタグ付けしたタンパク質を捕集する。ナノ粒子上に固定されたタンパク質が互いを認識し、付着したナノ粒子同士が近付く場合、ナノ金の固有の特性によって、溶液が特徴的なピンク色から青色へと変色する。同じことが、溶液中に添加される二量体タンパク質が、粒子に固定されたタンパク質に結合する場合にも起こる。ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−二量体、ＮＭ２３−ＷＴ、又はＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−六量体を、ＭＵＣ１＊ｅｃｄペプチド（ＰＳＭＧＦＲ）を保有するナノ粒子に別々に添加した。図３ｃの写真から、二量体形態のＮＭ２３のみがその同族受容体ＭＵＣ１＊ペプチドに結合し、溶液をピンク色から青色／灰色へと変色させることが示唆される。実質的に全てが六量体として発現される野生型ＮＭ２３又はＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ突然変異体のいずれもが、ＭＵＣ１＊ペプチドには全く結合せず、溶液をピンク色に保持し、ＮＭ２３タンパク質を添加しなかった対照「タンパク質なし」と識別不可能であった。観察された相互作用の特異性を確認するために、ＰＳＭＧＦＲペプチドに対して産生された抗ＭＵＣ１＊抗体のＦａｂを添加し、リガンドのペプチドへの結合を競合的に阻害した。図面から分かるように、ＦａｂはＮＭ２３二量体とＭＵＣ１＊ペプチドとの相互作用を阻害し、これにより相互作用が特異的な結合であることが示唆された。
【０１４３】
ＮＭ２３−ＷＴ、Ｓ１２０Ｇ−六量体及びＳ１２０Ｇ−二量体の３つ全てのバッチを未分化幹細胞の成長促進能に関して試験した。ヒト胚性幹細胞を、８ｎＭのＮＭ２３調製物の１つを含有する最少幹細胞培地中で培養した。ウェルの１つに、遊離ＭＵＣ１＊ｅｃｄペプチド（ＰＳＭＧＦＲ）を添加し、ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−二量体の全ての多能性幹細胞上に存在するＭＵＣ１＊受容体への結合を競合的に阻害した。結果を図３（ｄ〜ｇ）の写真に示す。分化幹細胞は、多能性幹細胞とは異なる形態を有し、細胞の肥厚化した暗色の領域として現れる一方で、多能性幹細胞は細胞の明色の単一層において成長する。図面から分かるように、ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇの二量体調製物（ｄ）のみが幹細胞の未分化成長を支持することが可能であった。野生型ＮＭ２３（ｆ）では、幹細胞は３日後に分化を開始し、ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−六量体では更に多くの分化がもたらされた（ｅ）。しかしながら、ＮＭ２３二量体とＭＵＣ１＊受容体との間の相互作用を競合的に阻害した結果として、最大量の分化が起こった（ｇ）。
【０１４４】
この実験の別のパートでは、幹細胞の多能性からの脱却をシグナル伝達するマイクロＲＮＡであるｍｉＲ−１４５のレベルを測定した。この実験から、ＮＭ２３二量体とＭＵＣ１＊との間の相互作用の破壊によってｍｉＲ−１４５の急増が引き起こされることが示唆され、このことはさらに、ＮＭ２３二量体とＭＵＣ１＊との間の相互作用の破壊が分化を誘発し、反対に相互作用が多能性を促進するという所見を裏付けるものであった。多能性幹細胞の成長を支持する能力を求めるのにこれらの実験で使用されるタンパク質は、非変性ネイティブゲルを用いたゲル電気泳動によって実験の時点で特性化された。図４のネイティブゲルから、ＮＭ２３−ＷＴが本質的にほとんど全て六量体で構成され、ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−六量体の調製物が僅かな割合の二量体を有するが、ほとんど六量体で構成されることが示唆される。ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−二量体の調製物は、ほとんど二量体で構成されるが、僅かな割合の四量体を有する。ＦＰＬＣによって６０％が二量体で構成されることが示された「ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−ミックス」調製物（図２を参照されたい）を、ほとんど六量体で構成されるＮＭ２３−ＷＴ（図２）とともに試験し、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いてＭＵＣ１＊ｅｃｄペプチド（ＰＳＭＧＦＲ）への結合能を決定した。この実験では、５つの異なる濃度の各タンパク質を、ＰＳＭＧＦＲペプチドをコーティングしたチップ上に別々に流した。図５に示されるＳＰＲトレースのオーバーレイから、「ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−ミックス」タンパク質が、ＮＭ２３−ＷＴよりおよそ８倍多くＭＵＣ１＊細胞外ドメインペプチド表面に結合したことが示唆される。野生型タンパク質が六量体であることから、ＲＵの数値は、二量体の結合量と比較するために３で除算しなければならない。野生型及びＳ１２０Ｇ−二量体の両方が濃度依存的な結合を示すが、野生型六量体の結合量はこのシステムのノイズ範囲内であると考えられる程に小さい。
【０１４５】
そのため、二量体の形成を支持する、ＮＭ２３突然変異体、欠失突然変異体及び操作変異体は、例えば体細胞における成長、多能性の維持及び誘導、並びに本明細書に開示される多くの用途にとって理想的なものである。さらに、これらの変異体をコードする核酸を、細胞ヘとトランスフェクトし、これらの細胞の成長を促進することができる。天然タンパク質と比較して特異的な二量体化状態を支持する例示的なタンパク質の変異体を、作製し、特性化して、特異的な多量体として機能する能力に関して試験した。作製し試験した、野生型タンパク質と比較して安定した二量体集団が増大しているＮＭ２３変異体を表１、表３及び表４に挙げる。さらに図２７にも、このような構築物の例を与える。これらの構築、発現及び精製の概要は実施例２、実施例３及び実施例９に記載する。全てで、野生型タンパク質と比較した上での安定な二量体集団の増大がもたらされた。一部の変異体を任意でリフォールディングし、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ用途のために二量体集団を増大させた。しかしながら、変異体はリフォールディングする必要はなく、発現の時点で多能性幹細胞の成長の支持及び分化の阻害等といった二量体関連の機能を果たすことが可能であった。図１１〜図１３、図１５〜図１９及び図２４によって、変異体が所望の機能を発揮することが実証される典型的な幹細胞成長実験の結果に基づき、リフォールディングすることなく、ＮＭ２３変異体が二量体を模倣し、ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇリフォールディング二量体以上に良好に機能することが示唆される。
【０１４６】
表１、表３及び表４に、二量体の形成を支持するＮＭ２３突然変異体と、２つの野生型ＮＭ２３又は突然変異体の単量体がリンカーを介して結び付き、二量体を形成している操作構築物と、二量体を選択的に形成するＮＭ２３融合タンパク質とを挙げる。表３には、生成し、発現し、特性化し、天然ＮＭ２３二量体の作用を模倣する能力に関して試験した、とりわけ８０％以上が二量体形態であったＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−二量体の作用を模倣する能力に関して試験したＮＭ２３変異体を挙げ、説明している。構築物を生成し、タンパク質を発現し、場合によってはリフォールディングするのに用いた方法を実施例２、実施例３、実施例９及び実施例１０に記載する。生じた変異体の機能を試験するのに用いた方法を実施例５〜実施例７及び実施例１１、実施例１２に記載する。
【０１４７】
図６に、表３に記載した多くのＮＭ２３変異体に関する非還元ゲル（ａ）及び還元ゲル（ｂ）の写真を示す。還元ゲルから、これらの一本鎖構築物がＮＭ２３二量体の分子量におおよそ等しい見掛け分子量で泳動することが示唆される。非還元ゲルから、非常に高い濃度では幾らかのより高次の多量体が存在するが、細胞内等のような還元条件によって、又はＤＴＴの添加によって排除されることが示唆される。
【０１４８】
図７に、二量体である更に２つの一本鎖ＮＭ２３変異体の精製のＰＡＧＥ分析を示す。図８及び図９に、表４に記載されている、一本鎖構築物ではないが、二量体を選択的に形成する変異体であるＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−ＩｇＧ１  Ｆｃの発現及び精製を確認するゲルを示す。図１０ａに、ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−ＩｇＧ１  Ｆｃ変異体のＦＰＬＣによる特性化を示し、図１０ｂの非還元ゲルにおいて強調表示された、タンパク質リフォールディング及び／又は二量体画分のＦＰＬＣによる精製によって増大することができる二量体の亜集団が形成されることが示唆される。
【０１４９】
ヒト多能性幹細胞をＮＭ２３変異体で培養し、未分化幹細胞の成長を促進し、細胞の自発分化を阻害する能力を求めた。ヒトＢＧＯ１ｖ／ｈＯＧ及びＨ９胚性幹細胞の両方を最少幹細胞培地＋８ｎＭの標準的なＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−ＲＳ又はＮＭ２３変異体で培養した。全ての場合で、試験したＮＭ２３変異体は、多能性幹細胞の成長を完全に支持した。細胞形態は、未分化の幹細胞特有のものであり、分化を示す肥厚化領域又は暗色領域を欠いていた。図１１〜図１３、図１５〜図１９を参照されたい。
【０１５０】
ＮＭ２３変異体が天然二量体又はＳ１２０Ｇ二量体と同じくらい良好に機能したことを証明するものとして幹細胞形態を評価することに加えて、ＮＭ２３変異体を含有する培地中で培養した幹細胞の成長速度を、単離画分が本質的に１００％の二量体となるように、リフォールディングした後、ＦＰＬＣによって精製しているＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ「ＲＳ」で培養した同一の細胞の成長速度と比較した。実施例１１ｃを参照されたい。これらの実験では、全て同じ供給源（ヒトＥＳ−ＢＧＯ１ｖ／ｈＯＧ）から採取した２０００００個の幹細胞をＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ  ＲＳ又は図２０及び図２１に示したＮＭ２３変異体の１つのいずれかで培養した。プレーティングの４日後、細胞をトリプシン処理によって採取し、細胞を血球計で計数した。グラフから分かるように、それぞれの場合で変異体によって、ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ（「ＲＳ」）の単離された二量体集団よりも多くの細胞が生じた。
【０１５１】
ＮＭ２３二量体を支持する変異体の機能を評価する別の方法として、定量的ＰＣＲを行い、ＮＭ２３変異体で培養した幹細胞における多能性遺伝子の発現レベルを測定した。実施例１１ｄを参照されたい。図２２では、少なくとも４代にわたってＮＭ２３変異体で培養した幹細胞における多能性遺伝子Ｏｃｔ４及びＮａｎｏｇ及びＭＵＣ１及びＮＭ２３の発現レベルを比較している。図２２のグラフから、ＮＭ２３変異体で成長させた細胞に関しては、これらの多能性の鍵となる指標遺伝子の発現レベルは純粋な二量体集団であるＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−ＲＳで培養された細胞以上であることが示唆される。
【０１５２】
ＮＭ２３二量体を支持する操作変異体の機能の更なる評価基準として、該変異体の細胞表面から細胞核への移動を追跡し、ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−ＲＳと比較した。実施例１１ｅ及び図２３、２４を参照されたい。ＮＭ２３二量体はＭＵＣ１＊陽性がん細胞及び全てＭＵＣ１＊陽性であるヒト多能性幹細胞の成長を媒介することが知られている。ＭＵＣ１＊陽性がん細胞を、二量体形態のＮＭ２３を含有する培地中でインキュベートすると、ＮＭ２３二量体はＭＵＣ１＊受容体に結合し、内部移行し、３０分〜６０分以内に核へと移行して、そこで転写因子として機能すると考えられる。図２３に、０ｎＭ、１６ｎＭ又は１２８ｎＭのＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−ＲＳ（１００％二量体集団）のいずれかの存在下又は非存在下でインキュベートしたがん細胞の共焦点画像を示す。次いで細胞を核染色ＤＡＰＩで染色した後、抗ＮＭ２３抗体を細胞及び蛍光標識した二次抗体に添加した。さらに、内因性ＮＭ２３も抗体によって染色することに留意されたい。しかしながら、二量体として外から添加した場合、核には検出可能なＮＭ２３しか存在しない。細胞の成長の増進及びＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇの核局在化に最適な濃度が８ｎＭ〜６４ｎＭであることは事前に求めていた。より高い濃度では、１つの二量体が２つのＭＵＣ１＊受容体に結合し、それらを二量体化するのではなく、各ＮＭ２３二量体が１つ１つのＭＵＣ１＊受容体に結合する（図１の釣鐘曲線を参照されたい。ここでは同じ理由から、過剰な二価抗ＭＵＣ１＊抗体によって、成長が刺激されずに阻害される）。図２３（ｂ、ｅ）に、白色の矢印で示される核内のＮＭ２３を示す。
【０１５３】
図２４に、外から添加されたＮＭ２３が、システインを含まない、修飾ＩｇＧ１ヒンジ領域及び修飾ＩｇＧ２ａヒンジ領域によって連結された２つのＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ単量体である一本鎖「二量体」変異体ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−ＩｇＧ１ｈ／ＩｇＧ２ａｈ  ｎｏＣであることを除いて図２３と同じ実験の共焦点画像を示す。実施例９ｅを参照されたい。図２４から分かるように、ＮＭ２３一本鎖変異体は、白色の矢印で示される核（ｂ、ｅ）へと容易に移行する。ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ  ＲＳ（図２３ｈ）及び一本鎖変異体、ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−ＩｇＧ１ｈ／ＩｇＧ２ａｈ  ｎｏＣ（図２４ｈ）に対応する核内のＮＭ２３の量を定量化するグラフから、操作「二量体」が、二量体集団として単離されているＮＭ２３単量体よりも良好に核へと移行することが示唆される。
【０１５４】
これらの実験から、リンカーを用いて２つの単量体を結び付けること又は強力な二量体化ドメイン部分を用いて対象のタンパク質を融合することによって、広範な濃度にわたって二量体として機能するより安定な「二量体」が得られ、天然ＮＭ２３の多量体化状態は濃度に強く依存し、極めて低いナノモル濃度でのみ二量体として存在することが示唆される。二量体化を支持する突然変異型ＮＭ２３タンパク質には、成長因子機能及び多能性の促進に関して野生型タンパク質を上回る改善が見られるが、配列、発現及び精製の方法に応じて、生じる二量体の量及び二量体の安定性が大きく異なる。表３及び表４に挙げられるような一本鎖構築物又は融合タンパク質であるＮＭ２３変異体には、形成される二量体の割合を増大するとともに、二量体の安定性を増大し、重要なことに「二量体の形成を支持する」突然変異体の二量体を形成するのに必要とされる発現方法及びリフォールディング方法を行うことができない細胞又は生物において擬似二量体として発現することができることから、現行の技術水準を上回る改善が見られる。
【０１５５】
実施例２、実施例９及び実施例１０に記載のものを含む本発明の突然変異体、欠失体及び／又は一本鎖キメラ若しくは融合キメラのいずれかを作製し、発現細胞によって分泌させ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ及び／又はｉｎ  ｖｉｖｏで使用することができる。発現タンパク質を分泌させる配列は当業者にとって既知である。特に、抗体から誘導される配列をタンパク質のＮ末端すなわち対象の遺伝子の５’末端に付加する。リーダー配列を包含することに加えて、発現細胞のタイプは大腸菌に限定されるものではなく、哺乳動物細胞、哺乳動物発現細胞、酵母、体細胞、幹細胞、ｉＰＳ細胞、又は多能性の誘導若しくは開始細胞よりも成熟していない状態への誘導を受けた細胞も含まれる。
【０１５６】
ＮＭ２３、その突然変異体又は変異体の使用はヒト細胞又はヒトでの使用に限定することを意図するものではない。ＭＵＣ１＊はＮＭ２３と同様に哺乳動物内で強い配列相同性を有する。図２５によって、マウス胚性幹細胞が、標準的なマウスＬＩＦの場合と同様に良好にヒトＮＭ２３二量体で成長することが示唆される。
【０１５７】
表２に、任意のリガンドとともに使用することができるが、好ましい実施形態では表１に示されるＮＭ２３変異体とともに使用される様々なリンカーを示す。表２には、表１に挙げられるリガンド単量体に遺伝学的に融合し、タンパク質の構造的活性型（特に好ましい実施形態ではＮＭ２３である）を形成したタンパク質部分も挙げている。
【０１５８】
二量体の形成を支持するとともに、より高次の多量体の形成を抑えるＳ１２０Ｇ突然変異体に加えて、さらに二量体の形成又は安定化を支持する他の突然変異体及び変異体が存在する。例えば、安定した二量体として発現及び維持するのがより容易な別のＮＭ２３突然変異体はＰ９６Ｓ突然変異体である。二量体を形成又は安定化する変異体を作製する別のアプローチは、四量体及び六量体等のより高次の多量体の形成に関与するタンパク質の領域を欠失することである。例えば、ＮＭ２３−Ｈ１では、Ｃ末端が四量体及び六量体の形成を促進する。Ｃ末端の１個〜９個のアミノ酸の欠失が、成長因子の活性の増大、ＭＵＣ１＊成長因子受容体への結合の増大、及び／又は他の多能性遺伝子の発現を調節する核酸への結合の増大を含む活性の増大を有するＮＭ２３変異体を生成するのに好ましい。
【０１５９】
好ましい実施形態では、２つのアミノ酸がヒトＮＭ２３−Ｈ１のＣ末端から欠失される（ＣΔ２）。特に好ましい実施形態では、６つのアミノ酸が欠失される（ＣΔ６）。溶解性、二量体の発現又は二量体の安定化を最大にするために、１つ又は複数の突然変異＋欠失を用いてタンパク質を作製することができる。例えば、組換えタンパク質として発現される場合に、ほとんどが二量体である可溶性画分を有するＮＭ２３変異体の１つがＮＭ２３−Ｐ９６Ｓ−ＣΔ６である。このＮＭ２３は、変性及びリフォールディングの必要がなく、可溶性画分の大部分が二量体であり、サイズ排除クロマトグラフィーにより更に精製することができる二量体集団が長期間、安定性を保つことから、幹細胞又は前駆細胞の成長を刺激するのに理想的なものである。
【０１６０】
図１４ｃ、図１４ｄ、図１４ｅ、及び図１４ｆにそれぞれ、ＮＭ２３−Ｐ９６Ｓ−ＣΔ２及びＮＭ２３−Ｐ９６Ｓ−ＣΔ６のゲル及びＦＰＬＣトレースを示す。構築物の設計、並びにタンパク質の発現及び精製は実施例２ｃに示す。加えて図１５に、最少培地中でＮＭ２３−Ｐ９６Ｓ−ＣΔ２及びＮＭ２３−Ｐ９６Ｓ−ＣΔ６を用いて増殖したヒトＥＳ細胞の写真を示す。図２２に、このＮＭ２３変異体を用いて増殖した後のこれらのヒト幹細胞の遺伝子発現を示す。遺伝子発現レベルは、ａ）ｂＦＧＦ及び線維芽細胞フィーダー細胞由来の馴化培地、ｂ）二量体の均一集団としてリフォールディング及び精製したＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ、又はｃ）ＮＭ２３−Ｐ９６Ｓ−ＣΔ６のいずれかで同じヒト胚性細胞株の成長と比較する。これらの結果から、ＮＭ２３の両形態で培養した幹細胞が遺伝子レベルで同程度であることが確認される。
【０１６１】
表１、表３及び表４に挙げられる他のＮＭ２３変異体を実施例２及び実施例９に記載のように生成した。図１１〜図１３及び図１５〜図１９によって、他のＮＭ２３変異体がヒト幹細胞の成長を効率的に促進することが示唆される。ＭＵＣ１の膜近位領域、すなわちＭＵＣ１＊又はＰＳＭＧＦＲ領域及び自己集合化ドメイン（ＩＢＲ）が哺乳動物内で高度に保存されることから、本発明者らは試験を行い、ＮＭ２３二量体がマウス幹細胞の成長及び維持も促進することを確認した。本発明は、ＮＭ２３二量体、とりわけ本明細書に記載の変異体がヒト細胞及びマウス細胞において多能性を維持及び誘導するように作用することも含む。
【０１６２】
ヒトＮＭ２３−Ｈ１とマウスＮＭ２３を含むが、これに限定するものではない他の哺乳動物ホモログとの間の配列アライメントによって、突然変異又は欠失されているとされる相同タンパク質の相当領域が明らかになる。
【０１６３】
がん細胞の成長
本明細書に記載のＮＭ２３変異体は、ＭＵＣ１＊陽性がんの治療用の薬物送達ビヒクルとしても使用することができる。例えば、細胞毒性剤をＮＭ２３又はＮＭ２３変異体に化学共役することができる。毒素はＮＭ２３に付着するように遺伝子操作することができる。代替的にはＮＭ２３変異体を、例えばシステイン又は治療剤とＮＭ２３変異体との特異的な共役を促す或る特定の酵素特異的な配列を用いて修飾することができる。
【０１６４】
二量体形態のＮＭ２３は幹細胞及び前駆細胞上のＭＵＣ１＊受容体に結合する。ＭＵＣ１＊への結合がＮＭ２３二量体のエンドサイトーシスを促し、その後ＮＭ２３二量体は核へと移行し、そこでＮＭ２３は二量体の形でＤＮＡに結合することで、幹細胞及び前駆細胞の成長及び多能性の維持に関わる遺伝子の転写を調節する。そのため一態様では、本発明は、成長、多能性の維持及び誘導に使用される二量体の形成を支持するＮＭ２３変異体の作製への本明細書に記載の方法の使用に関するものである。すなわち、二量体の形成を支持するＮＭ２３変異体をｉｎ  ｖｉｔｒｏで使用することで、幹細胞及び前駆細胞の成長を促進し、多能性を維持することができる。加えて本発明は、幹細胞及び前駆細胞を含む未熟細胞による治療の恩恵を受ける病態の治療のためのこれらのＮＭ２３変異体の患者への投与を含む。ＮＭ２３及びＮＭ２３変異体を患者に全身投与又は局所投与することができる。
【０１６５】
本発明は、四量体又は六量体を含むが、これらに限定されるものではないより高次の多量体のような二量体ではない多量体を形成するのに同様の方法を用いることも含む。加えて、多量体は活性状態のタンパク質を必要としない。例えば多くの場合、構造的に不活性型のタンパク質で患者を治療することが望ましい。好ましい実施形態では、患者は不活性型の成長因子で治療される。更により好ましい実施形態では、不活性型は六量体である。更により好ましい実施形態では、患者はがん患者であり、六量体形態のＮＭ２３で治療される。ＮＭ２３六量体は天然タンパク質を発現することによって得ることができる。４個〜６個の単量体を、本明細書に記載のリンカー及びキメラ戦略を使用して結び付けた変異体がより好ましい。例えば、不活性なＮＭ２３変異体を作製するために、ＮＭ２３が五量体の形成を支持するように、Ｆｃ部分又はヒンジ領域がＩｇＭ抗体から取り出されているＮＭ２３抗体断片キメラを作製することができる。
【０１６６】
本発明は、本明細書に記載の特定の実施形態によって範囲が限定されるものではない。実際、本明細書に記載のものに加えて、本発明の様々な修飾形態が上記の記載及び添付の図面から当業者には明らかとなるであろう。このような修飾形態は、添付の特許請求の範囲内にあることが意図される。以下の実施例は本発明を例示するものとして与えられており、限定するものではない。
【実施例】
【０１６７】
実施例１．  ＭＵＣ１＊成長因子受容体がリガンド誘導性の二量体化によって活性化される
クラスＩ成長因子受容体は、その細胞外ドメインのリガンド誘導性の二量体化によって活性化される。ＭＵＣ１＊がその細胞外ドメインのリガンド誘導性の二量体化によって活性化されることを実証するために、本発明者らは、ＭＵＣ１＊陽性細胞であるＺＲ７５−３０乳がん細胞を二価抗ＭＵＣ１＊抗体又は同じ抗体の一価Ｆａｂのいずれかで処理した。図１のグラフから、二価抗体は、過剰濃度で添加され、２つの受容体を二量体化するのではなく、抗体が１つ１つの受容体と結合し、これによって成長が阻害されるまで成長を刺激することが示唆される。同じ抗体のＦａｂの添加により、細胞成長の阻害が引き起こされ、細胞死が誘導された。ＭＵＣ１＊陰性ＨＥＫ−２９３細胞（Ｋ２９３）は、抗ＭＵＣ１＊抗体の二価抗体又は一価Ｆａｂのいずれによっても影響を受けなかった。
【０１６８】
実施例２．  タンパク質構築物の生成
実施例２ａ．  ＮＭ２３−ＷＴ
ＮＭ２３ｗｔを、以下のプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅した：
フォワード  5'-atcgatcatatggccaactgtgagcgtacctt-3'（配列番号３）
リバース  5'-gtggtgctcgagttcatagatccagttctga-3'（配列番号４）
【０１６９】
次いで断片を精製し、消化して（ＮｄｅＩ、ＸｈｏＩ）、発現ベクターｐＥＴ２１ｂのＮｄｅＩ制限部位とＸｈｏＩ制限部位との間にクローニングした。
【０１７０】
実施例２ｂ．  ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ
ＮＭ２３−Ｈ１突然変異体Ｓ１２０Ｇ（セリン＃１２０がグリシンへと突然変異した）を、以下のプライマーを使用してメーカーの取扱説明書に従ってＧｅｎｅＴａｉｌｏｒ（商標）部位特異的突然変異誘発システム（Life Technologies）を用いて作製した：5'-gcaggaacattatacatggcggtgattctg-3'（配列番号５）及び5'-gccatgtataatgttcctgccaacttgtat-3'（配列番号６）。図２に、野生型タンパク質の多量体化状態を非リフォールディングＳ１２０Ｇ突然変異体及びリフォールディングＳ１２０Ｇ突然変異体と比較しているＦＰＬＣトレースのオーバーレイを示す。図３〜図５から、二量体形態のタンパク質のみがＭＵＣ１＊に結合し（六量体では結合しない）、二量体のみが多能性幹細胞の成長を支持することが可能であることが示唆される。図１６は、発現タンパク質及びリフォールディングタンパク質に対する非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる特性化及び対応するＦＰＬＣトレース、並びにヒト幹細胞の写真を示し、これによりＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇの多能性幹細胞の成長を支持する能力が示される。
【０１７１】
実施例２ｃ．  ＮＭ２３  Ｐ９６Ｓ及び欠失構築物
本発明者らは、ＮＭ２３−Ｈ１突然変異体Ｐ９６Ｓ（プロリン＃９６がセリンへと突然変異した）を、以下のプライマーを使用してメーカーの取扱説明書に従ってＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ部位特異的突然変異誘発キット（Agilent）を用いて生成した：5'-tcggggagaccaactctgcagactccaag-3'（配列番号７）及び5'-cttggagtctgcagagttggtctccccga-3'（配列番号８）。ＰＣＲ反応に使用される鋳型は、ＮｄｅＩ制限部位とＸｈｏＩ制限部位との間にクローニングした野生型ＮＭ２３であった。配列確認後、欠失構築物をＰＣＲによって生成した。ＮＭ２３  Ｐ９６Ｓ  ΔＣ１を、以下のプライマーを用いて増幅した：5'-atcgatcatatggccaactgtgagcgtaccttc-3'（配列番号９）及び5'-gtggtgaccggtatagatccagttctgagcaca-3'（配列番号１０）。ＮＭ２３  Ｐ９６Ｓ  ΔＣ２を、以下のプライマーを用いて増幅した：5'-atcgatcatatggccaactgtgagcgtaccttc-3'（配列番号１１）及び5'-gtggtgaccggtgatccagttctgagcacagct-3'（配列番号１２）。ＮＭ２３  Ｐ９６Ｓ  ΔＣ６を、以下のプライマーを用いて増幅した：5'-atcgatcatatggccaactgtgagcgtaccttc-3'（配列番号１３）及び5'-gtggtgaccggtagcacagctcgtgtaatctacca-3'（配列番号１４）。得られた断片を精製し、消化して（ＮｄｅＩ、ＡｇｅＩ）、発現ベクターｐＥＴ２１ｂのＮｄｅＩ制限部位とＡｇｅＩ制限部位との間にクローニングした。ｐＥＴ２１ｂは、オーバーラップＰＣＲ法を用いてＸｈｏＩ制限をＡｇｅＩに置き換えることによって予め修飾させた。最適な二量体の形成が、ＮＭ２３−Ｐ９６ＳをＮｄｅＩとＸｈｏＩとの間にクローニングした場合に観察された。全ての欠失突然変異体に対して最適な二量体の形成が、ＮｄｅＩとＡｇｅＩとの間にクローニングした際に観察された。図１４は、リフォールディングしていないか又はＦＰＬＣによって精製されていたこれらの発現タンパク質に対する非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる特性化及び対応するＦＰＬＣトレースを示す。図１５により、多能性幹細胞の成長を支持する発現タンパク質の能力が示される。
【０１７２】
実施例３ａ．  タンパク質発現及び任意のリフォールディング／精製
ＬＢブロス（ルリア−ベルターニブロス）を一晩培養物の１／１０を用いて植菌し、ＯＤ６００が約０．５に達するまで３７℃で培養した。この時点で、組換えタンパク質の発現を、０．４ｍＭイソプロピル−β−Ｄ−チオ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ、Gold Biotechnology）で誘導し、培養を５時間後に停止させた。遠心分離（６０００ｒｐｍ、１０分間、４℃）によって細胞を採取した後、細胞ペレットを、泳動バッファー：ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、３６０ｍＭ  ＮａＣｌ及び８０ｍＭイミダゾールを用いて再懸濁した。次いでリゾチーム（１ｍｇ／ｍＬ、Sigma）、ＭｇＣｌ２（０．５ｍＭ）及びＤＮアーゼ（０．５ｕｇ／ｍＬ、Sigma）を添加した。細胞懸濁液を３７℃で３０分間、回転台（２７５ｒｐｍ）の上でインキュベートし、氷上で５分間超音波処理した。不溶性の細胞残屑を遠心分離（２００００ｒｐｍ、３０分、４℃）によって除去した。次いで除去後の溶解物を、泳動バッファーによって平衡化したＮｉ−ＮＴＡカラム（Qiagen）に適用した。カラムを洗浄した後（８ＣＶ）、４２０ｍＭイミダゾールを添加した泳動バッファー（６ＣＶ）を用いてカラムからタンパク質を溶出させた。
【０１７３】
実施例３ｂ．  続くリフォールディングに対する任意のタンパク質変性
タンパク質変性に関して、溶出画分をプールし、１ｖｏｌの１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）＋８Ｍ尿素を添加することによって変性させ、溶液を更に１．５（half and another）ｖｏｌの１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）＋８Ｍ尿素を添加することによって濃縮した。このサイクルを最終尿素濃度が約７Ｍになるまで繰り返した。次いでタンパク質を透析によってリフォールディングした。
【０１７４】
リフォールディングプロトコル
変性タンパク質を、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、４Ｍ尿素、０．２ｍＭイミダゾール、０．４Ｍ  Ｌ−アルギニン、１ｍＭ  ＥＤＴＡ及び５％グリセロールに対して一晩透析した後、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、２Ｍ尿素、０．２ｍＭイミダゾール、０．４Ｍ  Ｌ−アルギニン、１ｍＭ  ＥＤＴＡ及び５％グリセロールに対して２４時間透析し、次にタンパク質を１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１Ｍ尿素、０．２ｍＭイミダゾール、０．４Ｍ  Ｌ−アルギニン、１ｍＭ  ＥＤＴＡ及び５％グリセロールに対して２４時間透析した後、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、０．２ｍＭイミダゾール、０．４Ｍ  Ｌ−アルギニン、１ｍＭ  ＥＤＴＡ及び５％グリセロールに対して８時間透析し、その後タンパク質を２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、０．２ｍＭイミダゾール、０．１Ｍ  Ｌ−アルギニン、１ｍＭ  ＥＤＴＡ及び５％グリセロールで一晩透析し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、０．２ｍＭイミダゾール、１ｍＭ  ＥＤＴＡ及び５％グリセロールに対して３×３時間透析して、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、０．２ｍＭイミダゾール、１ｍＭ  ＥＤＴＡ及び５％グリセロールに対して一晩透析し、最後にリフォールディングタンパク質を４℃で３０分間、遠心分離し（１８５００ｒｐｍ）、上清を回収した。
【０１７５】
任意のＦＰＬＣ精製
特異的な多量体を、ＦＰＬＣとも呼ばれるサイズ排除クロマトグラフィーを用いて混合プールから更に精製することができる。二量体を、サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００）「ＦＰＬＣ」によって更に精製した。本質的に１００％二量体であったＦＰＬＣ画分を回収し、プールして、等量に分け、−８０℃で保存した。これを本明細書ではＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−ＲＳ又はＳ１２０Ｇ−ＲＳと称する。二量体含有画分をプールした。
【０１７６】
実施例４．  組換えＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ突然変異体の３つの異なる調製物と比較した、野生型ＮＭ２３のＦＰＬＣによる特性化
典型的に、特性化する各サンプルを５００ｕＬ、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １０／３００  ＧＬカラムに充填した。各種ピークの分子量は、サンプルタンパク質を特性化する前に注入される分子量標準によって作成されるＦＰＬＣトレースとの比較によって求められる。図２に、発現タンパク質の第１の調製物の可溶性画分（本明細書ではＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−六量体と表される）、第２の調製物の可溶性画分（本明細書ではＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−ミックスと表される）、又は変性及びリフォールディングしたＳ１２０Ｇの調製物（本明細書ではＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−二量体と表される）から精製されたＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇと比較したＮＭ２３−ＷＴの多量体組成を特性化するＦＰＬＣトレースのオーバーレイを示す。各サンプルを５００ｕｌ、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １０／３００  ＧＬに充填した。ＮＭ２３−ＷＴは０．１７ｍｇ／ｍｌで充填され、ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−六量体は０．１９ｍｇ／ｍｌで充填され、ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−ミックスは０．１０ｍｇ／ｍｌで充填され、ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−二量体は０．１５ｍｇ／ｍｌで充填された。ＮＭ２３−ＷＴ及びＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−六量体はＮＭ２３六量体の分子量に相当する９６ｋＤａでの主ピークを有し、ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−ミックス及びＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−二量体は両方とも二量体に相当する２９ＫＤａでの主ピークを有するが、リフォールディング調製物、ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−二量体における二量体の相対比は、可溶性部分から単離された画分よりもはるかに大きい。
【０１７７】
実施例５．  ＳＰＲチップ上に固定されたＭＵＣ１＊細胞外ドメインペプチド（ＰＳＭＧＦＲ）に結合する異なるＮＭ２３多量体の能力を試験する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）
組換えＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇの３つの異なる調製物及びＮＭ２３−ＷＴ（野生型）を、表面プラズモン共鳴の技法を用いてＭＵＣ１＊細胞外ドメインペプチド（ＰＳＭＧＦＲ配列）と結合する能力に関して試験した。まず、異なる調製物をＦＰＬＣによって分析し、どの多量体が形成されるかに従ってそれらを特性化した。試験したＮＭ２３種のＦＰＬＣ分析は図２に示し、上記の実施例４において説明している。サンプルを、ジスルフィド結合を破壊しない非還元ゲル上でのゲル電気泳動によっても分析した。図３ａを参照されたい。ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ二量体は、非還元ゲル上、およそ４０ＫＤａで現れる。反対に、単量体、四量体及び六量体は約２０ＫＤａの見掛け分子量で泳動し、これはより高次の多量体がジスルフィド形成には依存しないためであると推測される。図２においてＦＰＬＣによって９６ＫＤａで泳動した同じ調製物（六量体）は、非還元ゲル上、２０ＫＤａで泳動したことに留意されたい。
【０１７８】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）実験を、ビアコア３０００機器を用いて行った。コーティングのない（Bare）金ビアコアチップに、Bamdad, C. The use ofvariable density self-assembled monolayers to probe the structure of a target molecule.Biophys J. 1998 Oct; 75（4）:1989-96の方法に従って自己集合単分子層（ＳＡＭ）をコーティングした。ＮＴＡ−Ｎｉ−トリエチレングリコールＳＡＭを、ヒスチジンでタグ付けしたタンパク質に結合し、これを捕集する３．８％ＮＴＡ−Ｎｉを提示するように形成した。ヒスチジンでタグ付けしたＰＳＭＧＦＲペプチド（ＭＵＣ１＊ｅｃｄペプチド）をチップ表面上に流し、飽和するまで固定した。次に、ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇの４つの異なる調製物をそれぞれ、安定したペプチド表面上に注入した。
【０１７９】
図３ｂの表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の測定結果のオーバーレイから、ＳＰＲチップ表面に付着したＭＵＣ１＊細胞外ドメインペプチド（ＰＳＭＧＦＲ）に結合する４つの異なるＮＭ２３調製物の能力に大きな差があることが示唆される。結果から、ＮＭ２３のその同族受容体、ＭＵＣ１＊への結合量は二量体がサンプルにどれくらい存在するかに依存することが示唆される。ＳＰＲによって、チップ−溶液界面でのタンパク質の質量が測定され、六量体がＭＵＣ１＊ペプチド表面に結合した場合、二量体が結合した場合よりも３倍大きいＳＰＲシグナルが生じる。このことは、ＮＭ２３−ＷＴ又はＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−六量体のＭＵＣ１＊ペプチドへの結合量がＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−二量体の結合量の約１２分の１であったことを意味する。対照実験では、無関係のペプチドを同じチップ上に固定し、最少のバックグラウンド結合量を得て、これを示される測定値から差し引いた。しかしながら、約１００ＲＵというＮＭ２３−ＷＴ及びＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−六量体（両方ともほとんど六量体のみからなる）で生じた結合量はほとんどの場合、システムのノイズ範囲内であると考えられる。
【０１８０】
同様のＳＰＲ実験を行い、結果を図５に示している。ＦＰＬＣによって６０％の二量体からなることが示された「ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−ミックス」調製物（図２を参照されたい）を、ほとんど六量体からなるＮＭ２３−ＷＴ（図２）とともに試験し、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いてＭＵＣ１＊ｅｃｄペプチド（ＰＳＭＧＦＲ配列）への結合能を決定した。この実験では、５つの異なる濃度の各タンパク質を、ＰＳＭＧＦＲペプチドをコーティングしたチップ上に別々に流した。図５に示されるＳＰＲトレースのオーバーレイから、「ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−ミックス」タンパク質が、ＮＭ２３−ＷＴよりおよそ８倍多くＭＵＣ１＊細胞外ドメインペプチド表面に結合したことが示唆される。野生型タンパク質が六量体であることから、ＲＵの数値は、二量体の結合量と比較するために３で除算しなければならない。野生型及びＳ１２０Ｇ−二量体の両方が濃度依存的な結合を示すが、野生型六量体の結合量はこのシステムのノイズ範囲内であると考えられる程に小さい。まとめると、これらのＳＰＲ実験から、六量体形態のＮＭ２３はＭＵＣ１＊受容体に結合しないことが示唆される。
【０１８１】
実施例６．  ナノ粒子実験を行い、ＮＭ２３六量体に対するＮＭ２３二量体のＭＵＣ１＊ｅｃｄペプチド（ＰＳＭＧＦＲ）に結合する能力を更に試験する
ＮＴＡ−Ｎｉ  ＳＡＭを、Thompson et al, dx.doi.org/10.1021/am200459a I ACS Appl. Mater. Interfaces2011, 3, 2979-2987の方法に従って金ナノ粒子上に形成した。この方法では、金ナノ粒子に、ＮＴＡ−Ｎｉ−チオールが組み込まれた自己集合単分子層（ＳＡＭ）をコーティングする。ＮＴＡ−Ｎｉ部はヒスチジンでタグ付けしたタンパク質を捕集する。ナノ粒子上に固定したタンパク質が互いを認識し、付着したナノ粒子同士が近付く場合、ナノ金の固有の特性によって、溶液が特徴的なピンク色から青色へと変色する。同じことが、溶液中に添加される二量体タンパク質が、粒子に固定されたタンパク質に結合する場合にも起こる。ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−二量体、ＮＭ２３−ＷＴ、又はＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−六量体を、ＭＵＣ１＊ｅｃｄペプチド（ＰＳＭＧＦＲ）を保有するナノ粒子に別々に添加した。
【０１８２】
図３ｃの写真から、二量体形態のＮＭ２３のみがその同族受容体ＭＵＣ１＊ペプチドに結合し、溶液をピンク色から青色／灰色へと変色させることが示唆される。ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−ＲＳ（リフォールディング及び精製した）及びＮＭ２３−Ｐ９６Ｓ−ΔＣ２（非リフォールディング）が、粒子に固定されたＭＵＣ１＊ペプチドに結合した。実質的に全てが六量体として発現される野生型ＮＭ２３又はＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ突然変異体のいずれもが、ＭＵＣ１＊ペプチドには全く結合せず、溶液をピンク色に保持し、ＮＭ２３タンパク質を添加しなかった対照「タンパク質なし」と識別不可能であった。観察された相互作用の特異性を確認するために、ＰＳＭＧＦＲペプチドに対して産生された抗ＭＵＣ１＊抗体のＦａｂを添加し、リガンドのペプチドへの結合を競合的に阻害した。図面から分かるように、ＦａｂはＮＭ２３二量体とＭＵＣ１＊ペプチドとの相互作用を阻害し、これにより相互作用が特異的な結合であることが示唆された。
【０１８３】
実施例７．  ＮＭ２３六量体に対するＮＭ２３二量体の多能性幹細胞の成長を促進する能力の機能試験
ＮＭ２３−ＷＴ、Ｓ１２０Ｇ−六量体及びＳ１２０Ｇ−二量体の３つのバッチを未分化幹細胞の成長促進能に関して試験した。ヒト胚性幹細胞（Ｈ９）を、８ｎＭのＮＭ２３調製物の１つを含有する最少幹細胞培地中で培養した（この培地は以下の実施例８に記載されるものであった）。ウェルの１つに、遊離ＭＵＣ１＊ｅｃｄペプチド（ＰＳＭＧＦＲ）を添加し、ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−二量体の全ての多能性幹細胞上に存在するＭＵＣ１＊受容体への結合を競合的に阻害した。細胞を、抗ＭＵＣ１＊モノクローナル抗体（ＭＮ−Ｃ３）をコーティングしている６ウェルプレートの１つのウェル当たり２０００００個の細胞でプレーティングし、幹細胞を付着させた。培地を通例のように４８時間毎に交換した。写真を、オリンパス株式会社のＩＸ  ７１倒立顕微鏡を用いて４日目に撮影した。結果を図３（ｄ〜ｇ）の写真に示す。分化幹細胞は、多能性幹細胞とは異なる形態を有し、細胞の肥厚化した暗色の領域として現れる一方で、多能性幹細胞は細胞の明色の単一層において成長する。図面から分かるように、ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇの二量体調製物（ｄ）のみが幹細胞の未分化成長を支持することが可能であった。野生型ＮＭ２３（ｆ）では、幹細胞は３日後に分化を開始し、ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−六量体では更に多くの分化がもたらされた（ｅ）。しかしながら、ＮＭ２３二量体とＭＵＣ１＊受容体との間の相互作用を競合的に阻害した結果として、最大量の分化が起こった（ｇ）。対照ウェルでは、Ｈ９幹細胞を最少幹細胞培地に添加した標準的な４ｎｇ／ｍＬ  ｂＦＧＦ＋５０％ＭＥＦ馴化培地中で培養し、幹細胞をマトリゲルの層上にプレーティングした。ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−ＲＳ及びＮＭ２３変異体はこれらの対照以上に良好に作用した。
【０１８４】
この実験の別のパートでは、幹細胞の多能性からの脱却をシグナル伝達するマイクロＲＮＡであるｍｉＲ−１４５のレベルを測定した。この実験から、ＮＭ２３二量体とＭＵＣ１＊との間の相互作用の破壊によってｍｉＲ−１４５の急増が引き起こされることが示唆され、このことはさらに、ＮＭ２３二量体とＭＵＣ１＊との間の相互作用の破壊が分化を誘発し、反対に相互作用が多能性を促進するという所見を裏付けるものであった。多能性幹細胞の成長を支持する能力を求めるのにこれらの実験で使用されるタンパク質は、非変性ネイティブゲルを用いたゲル電気泳動によって実験の時点で特性化された。図４のネイティブゲルから、ＮＭ２３−ＷＴが本質的に全て六量体で構成され、ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−六量体の調製物が僅かな割合の二量体を有するが、ほとんど六量体で構成されることが示唆される。ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−二量体の調製物は、ほとんど二量体で構成されるが、僅かな割合の四量体を有する。
【０１８５】
実施例８．  最少幹細胞培地（また「最少培地」）
４００ｍｌ  ＤＭＥ／Ｆ１２／ＧｌｕｔａＭＡＸ  Ｉ（Invitrogen  ＃１０５６５−０１８）
１００ｍｌ  ノックアウト血清代替物（Invitrogen  ＃１０８２８−０２８）
５ｍｌ  １００×ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（Invitrogen  ＃１１１４０−０５０）
０．９ｍｌ（０．１ｍＭ）β−メルカプトエタノール（５５ｍＭ  ストック、Invitrogen  ＃２１９８５−０２３）
２．５ｍｌ  ＰＳＡ（ペニシリン、ストレプトマイシン、アンホテリシン）MP Biochem（＃１６７４０４９）
【０１８６】
実施例９．  ＮＭ２３変異体−構築物の生成
一本鎖ＮＭ２３構築物
Ｓ１２０Ｇ、Ｐ９６Ｓ又はＣ末端欠失等の突然変異を含む又は含まないＮＭ２３を、２つのタンパク質単量体を連結する構築物を作製することによって二量体の形成を支持するように操作することができる。四量体及び六量体の形成を抑えるタンパク質を作製するＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ又は他の突然変異が好ましい。表２に、ＤＮＡ配列、それに続いてコードアミノ酸配列を与える。図６に、リフォールディングされている一本鎖変異体の還元及び非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる特性化を示す。ゲルにより、それぞれが単量体−リンカー−単量体の見掛け分子量で泳動することが確認される。非還元ゲルから、より高次の多量体のより小さい集団は、ＤＴＴの添加により排除されたジスルフィド形成によるものであり、これによって細胞質のような還元環境が生じることが示唆される。
【０１８７】
実施例９ａ．  ＮＭ２３  Ｓ１２０Ｇ  ＧＳ２リンカー
（ＧＧＧＧＳ）×２リンカーを、以下のプライマーを用いたＰＣＲによってＮＭ２３  Ｓ１２０Ｇ（３’）のフレームに導入した：
フォワード  5'-atcgatcatatggccaactgtgagcgtacctt-3'（配列番号１５）
リバース  5'-atcgatgctagcggatccgccaccgccggatccgccaccgccttcatagatccagttctgagcacagctcg-3’（配列番号１６）
【０１８８】
得られた断片を精製し、消化して（ＮｄｅＩ、ＮｈｅＩ）、発現ベクターｐＥＴ２１ｂのＮｄｅＩ制限部位とＮｈｅＩ制限部位との間にクローニングした。
【０１８９】
別のＮＭ２３  Ｓ１２０Ｇ断片を、以下のプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅した：
フォワード  5'-atcgatgctagcatggccaactgtgagcgtaccttc-3'（配列番号１７）
リバース  5'-gtggtgctcgagttcatagatccagttctga-3'（配列番号１８）
【０１９０】
次いで断片を精製し、消化して（ＮｈｅＩ／ＸｈｏＩ）、（ＧＧＧＧＳ）×２リンカーを含有する予めクローニングしたＮＭ２３  Ｓ１２０ＧのＮｈｅＩ制限部位とＸｈｏＩ制限部位との間のフレームにクローニングした。発現タンパク質を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ用途のために、任意で１ｍＭ〜５ｍＭ  ＤＴＴを添加して、実施例３ｂの任意のリフォールディングプロトコルを用いて精製及び／又はリフォールディングすることができる。図１１に、リフォールディングタンパク質のＦＰＬＣ分析（ａ）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる特性化（ｂ）、及び非リフォールディング、非精製タンパク質の多能性幹細胞の成長を支持する能力（ｃ〜ｅ）を示す。図１７に、この変異体のリフォールディング又は精製することなく多能性幹細胞の成長を支持する能力を示す。図２６に、リフォールディングしていないこの変異体の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる特性化の写真を示し、これにより主集団が二量体であり、六量体及び他のより高次の多量体を本質的に欠いていることが示唆される。
【０１９１】
実施例９ｂ．  ＮＭ２３  Ｓ１２０Ｇ  ＧＳ３リンカー
（ＧＧＧＧＳ）×３リンカーを、以下のプライマーを用いたＰＣＲによってＮＭ２３  Ｓ１２０Ｇ（３’）のフレームに導入した：
フォワード  5'-atcgatcatatggccaactgtgagcgtacctt-3'（配列番号１９）
リバース  5'-atcgatgctagcggatccgccaccgccggatccgccaccgccggatccgccaccgcttcatagatccagttctgagcacagctcg-3'（配列番号２０）
【０１９２】
得られた断片を精製し、消化して（ＮｄｅＩ、ＮｈｅＩ）、発現ベクターｐＥＴ２１ｂのＮｄｅＩ制限部位とＮｈｅＩ制限部位との間にクローニングした。
【０１９３】
別のＮＭ２３  Ｓ１２０Ｇ断片を、以下のプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅した：
フォワード  5'-atcgatgctagcatggccaactgtgagcgtaccttc-3'（配列番号２１）
リバース  5'-gtggtgctcgagttcatagatccagttctga-3'（配列番号２２）
【０１９４】
次いで断片を精製し、消化して（ＮｈｅＩ／ＸｈｏＩ）、（ＧＧＧＧＳ）×３リンカーを含有する予めクローニングしたＮＭ２３  Ｓ１２０ＧのＮｈｅＩ制限部位とＸｈｏＩ制限部位との間のフレームにクローニングした。発現タンパク質を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ用途のために、任意で１ｍＭ〜５ｍＭ  ＤＴＴを添加して、実施例３ｂの任意のリフォールディングプロトコルを用いて精製及び／又はリフォールディングすることができる。
【０１９５】
実施例９ｃ．  ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−ＩｇＧ１ｈ  ｎｏＣ（システインを含まないＩｇＧ１の修飾ヒンジ領域）
システインを含まないＩｇＧ１の修飾ヒンジ領域を、２回の逐次ＰＣＲ反応によってＮＭ２３  Ｓ１２０Ｇ（３’）のフレームに導入した。初めに以下のプライマー対を使用した：
フォワード  5'-atcgatcatatggccaactgtgagcgtacctt-3'（配列番号２３）
リバースＩｇＧ１＃１  tccggcgccggttttggcggtttagtatgggttttatcttcatagatccagttctgagcacagctcg（配列番号２４）
【０１９６】
ＰＣＲ断片を精製し、以下のプライマーを用いた２回目のＰＣＲ反応の鋳型として使用した：
フォワード  5'-atcgatcatatggccaactgtgagcgtacctt-3'（配列番号２５）
リバース  ＩｇＧ１＃２  atcgatgctagcaccggtaccaggaccacccagcagttccggcgccggttttggcgtttagtatg（配列番号２６）
【０１９７】
得られた断片を精製し、消化して（ＮｄｅＩ、ＮｈｅＩ）、発現ベクターｐＥＴ２１ｂのＮｄｅＩ制限部位とＮｈｅＩ制限部位との間にクローニングした。
【０１９８】
別のＮＭ２３  Ｓ１２０Ｇ断片を、以下のプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅した：
フォワード  5'-atcgatgctagcatggccaactgtgagcgtaccttc-3'（配列番号２７）
リバース  5'-gtggtgctcgagttcatagatccagttctga-3'（配列番号２８）
【０１９９】
次いで断片を精製し、消化して（ＮｄｅＩ／ＸｈｏＩ）、修飾ヒンジ領域リンカーを含有する予めクローニングしたＮＭ２３  Ｓ１２０ＧのＮｈｅＩ制限部位とＸｈｏＩ制限部位との間のフレームにクローニングした。発現タンパク質を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ用途のために、任意で１ｍＭ〜５ｍＭ  ＤＴＴを添加して、実施例３ｂの任意のリフォールディングプロトコルを用いて精製及び／又はリフォールディングすることができる。図７に、ニッケルカラムでの発現タンパク質の精製を示す。図１２に、リフォールディングタンパク質のＦＰＬＣ分析（ａ）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる特性化（ｂ）、及び非リフォールディング、非精製タンパク質の多能性幹細胞の成長を支持する能力（ｃ〜ｅ）を示す。図１８に、この変異体のリフォールディング又は精製することなく多能性幹細胞の成長を支持する能力を示す。図２６に、リフォールディングしていないこの変異体の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる特性化の写真を示し、これにより主集団が二量体であり、六量体及び他のより高次の多量体を本質的に欠いていることが示唆される。
【０２００】
実施例９ｄ．  ＮＭ２３  Ｓ１２０Ｇ  ＩｇＧ２ａ  ｎｏＣ（システインを含まないＩｇＧ２ａの修飾ヒンジ領域）
システインを含まないＩｇＧ２ａの修飾ヒンジ領域を、２回の逐次ＰＣＲ反応によってＮＭ２３  Ｓ１２０Ｇ（３’）のフレームに導入した。初めに以下のプライマー対を使用した：
フォワード  5'-atcgatcatatggccaactgtgagcgtacctt-3'（配列番号２９）
リバース  ＩｇＧ２ａ＃１  tcggaggtttcggaggtttaatagtcggaccaccagtttcatagatccagttctgagcacagctcg（配列番号３０）
【０２０１】
ＰＣＲ断片を精製し、以下のプライマーを用いた２回目のＰＣＲ反応の鋳型として使用した：
フォワード  5'-atcgatcatatggccaactgtgagcgtacctt-3'（配列番号３１）
リバース  ＩｇＧ２ａ＃２  atcgatgctagccggaccacccagcaggttcggagcaggtttcggaggtttcggaggtttaatagtcg（配列番号３２）
【０２０２】
得られた断片を精製し、消化して（ＮｄｅＩ、ＮｈｅＩ）、発現ベクターｐＥＴ２１ｂのＮｄｅＩ制限部位とＮｈｅＩ制限部位との間にクローニングした。
【０２０３】
別のＮＭ２３  Ｓ１２０Ｇ断片を、以下のプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅した：
フォワード  5'-atcgatgctagcatggccaactgtgagcgtaccttc-3'（配列番号３３）
リバース  5'-gtggtgctcgagttcatagatccagttctga-3'（配列番号３４）
【０２０４】
次いで断片を精製し、消化して（ＮｈｅＩ／ＸｈｏＩ）、修飾ヒンジ領域リンカーを含有する予めクローニングしたＮＭ２３  Ｓ１２０ＧのＮｈｅＩ制限部位とＸｈｏＩ制限部位との間のフレームにクローニングした。発現タンパク質を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ用途のために、任意で１ｍＭ〜５ｍＭ  ＤＴＴを添加して、実施例３ｂの任意のリフォールディングプロトコルを用いて精製及び／又はリフォールディングすることができる。図７に、ニッケルカラムでの発現タンパク質の精製を示す。図１２に、リフォールディングタンパク質のＦＰＬＣ分析（ａ）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる特性化（ｂ）、及び非リフォールディング、非精製タンパク質の多能性幹細胞の成長を支持する能力（ｃ〜ｅ）を示す。
【０２０５】
実施例９ｅ．  ＮＭ２３  Ｓ１２０Ｇ  ＩｇＧ１ｈ／ＩｇＧ２ａｈ  ｎｏＣ（システインを含まないＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａの修飾ヒンジ領域）
システインを含まないＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａの修飾ヒンジ領域を、４回の逐次ＰＣＲ反応によってＮＭ２３  Ｓ１２０Ｇ（３’）のフレームに導入した。初めに以下のプライマー対を使用した：
フォワード5'-atcgatcatatggccaactgtgagcgtacctt-3'（配列番号３５）
リバース＃１  tccggcgccggttttggcggtttagtatgggttttatcttcatagatccagttctgagcacagctcg（配列番号３６）
【０２０６】
ＰＣＲ断片を精製し、以下のプライマーを用いた２回目のＰＣＲ反応の鋳型として使用した：
フォワード  5'-atcgatcatatggccaactgtgagcgtacctt-3'（配列番号３７）
リバース＃２  tcggaccaccagtaccggtaccaggaccacccagcagttccggcgccggttttggcggtttagtatg（配列番号３８）
【０２０７】
ＰＣＲ断片を精製し、以下のプライマーを用いた３回目のＰＣＲ反応の鋳型として使用した：
フォワード  5'-atcgatcatatggccaactgtgagcgtacctt-3'（配列番号３９）
リバース＃３  tcggagcaggtttcggaggtttcggaggtttaatagtcggaccaccagtaccggtaccaggaccac（配列番号４０）
【０２０８】
ＰＣＲ断片を精製し、以下のプライマーを用いた４回目のＰＣＲ反応の鋳型として使用した：
フォワード  5'-atcgatcatatggccaactgtgagcgtacctt-3'（配列番号４１）
リバース＃４  atcgatgctagccggaccacccagcaggttcggagcaggtttcggaggtttcggag（配列番号４２）
【０２０９】
得られた断片を精製し、消化して（ＮｄｅＩ、ＮｈｅＩ）、発現ベクターｐＥＴ２１ｂのＮｄｅＩ制限部位とＮｈｅＩ制限部位との間にクローニングした。
【０２１０】
別のＮＭ２３  Ｓ１２０Ｇ断片を、以下のプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅した：
フォワード  5'-atcgatgctagcatggccaactgtgagcgtaccttc-3'（配列番号４３）
リバース  5'-gtggtgctcgagttcatagatccagttctga-3'（配列番号４４）
【０２１１】
次いで断片を精製し、消化して（ＮｈｅＩ／ＸｈｏＩ）、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ両方の修飾ヒンジ領域リンカーを含有する予めクローニングしたＮＭ２３  Ｓ１２０ＧのＮｈｅＩ制限部位とＸｈｏＩ制限部位との間のフレームにクローニングした。発現タンパク質を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ用途のために、任意で１ｍＭ〜５ｍＭ  ＤＴＴを添加して、実施例３ｂの任意のリフォールディングプロトコルを用いて精製及び／又はリフォールディングすることができる。図１３に、リフォールディングタンパク質のＦＰＬＣ分析（ａ）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる特性化（ｂ）、及び非リフォールディング、非精製タンパク質の多能性幹細胞の成長を支持する能力（ｃ〜ｅ）を示す。図１８に、この変異体のリフォールディング又は精製することなく多能性幹細胞の成長を支持する能力を示す。図２６に、リフォールディングしていないこの変異体の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる特性化の写真を示し、これにより主集団が二量体であり、六量体及び他のより高次の多量体を本質的に欠いていることが示唆される。
【０２１２】
実施例１０．  ＮＭ２３キメラの二量体化
ＮＭ２３−ｗｔ又は好ましくはＳ１２０Ｇ突然変異体が、自然状態で二量体化するタンパク質へと遺伝子融合している融合タンパク質は、二量体の形成を支持するＮＭ２３変異体を生成する別の方法であり、Ｓ１２０Ｇ突然変異が含まれる場合、得られる二量体は四量体及び六量体等のより高次の多量体の形成を抑える。このような方法の１つは、ＮＭ２３、又はＭＵＣ１＊ペプチドに結合するＮＭ２３の一部分を抗体のＦｃ部分に融合させることである。抗体のＦｃ部分は、システイン間のジスルフィド結合を介してホモ二量体化する。この構築物は、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域に結び付くＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇタンパク質からなる。ヒスチジンタグを包含することによって、ＮＴＡ−Ｎｉ親和性カラムでの精製が可能になる。代替的には、融合タンパク質はプロテインＡカラム又はプロテインＧカラムで精製することができる。ペプシンによる切断によってＦｃ領域が切断され、システイン直下の部分が放出される。
【０２１３】
実施例１０ａ．  ＮＭ２３  Ｓ１２０Ｇ−ＩｇＧ１  Ｆｃ（Ｆｃ領域抗体に融合したＮＭ２３）
ＮＭ２３  Ｓ１２０Ｇを、以下のプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅した：
フォワード  5'-atcgatcatatggccaactgtgagcgtacctt-3'（配列番号４５）
リバース  5'-gtggtgctcgagttcatagatccagttctga-3'（配列番号４６）
【０２１４】
次いで断片を精製し、消化して（ＮｄｅＩ、ＸｈｏＩ）、発現ベクターｐＥＴ２１ｂのＮｄｅＩ制限部位とＸｈｏＩ制限部位との間にクローニングした。
【０２１５】
ＩｇＧ１のＦｃ領域を、以下のプライマーを用いたＰＣＲによって増幅した：
フォワード  5'-attgtgctcgagggttgtaagccttgcatatgtacagtcccag-3'（配列番号４７）
リバース  5'-gcactactcgagtttaccaggagagtgggagaggctcttctcag-3'（配列番号４８）
【０２１６】
次いで断片を精製し、消化して（ＸｈｏＩ）、予めクローニングしたＮＭ２３  Ｓ１２０Ｇの（ＸｈｏＩ制限部位の）フレームにクローニングした。発現タンパク質をｉｎ  ｖｉｔｒｏ用途のために精製及び／又はリフォールディングすることができる。タンパク質が封入体に存在する場合、すなわち遠心分離（６０００ｒｐｍ、１０分間、４℃）によって細胞を採取した後、細胞ペレットを、泳動バッファー：１００ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭイミダゾール及び８Ｍ尿素を用いて再懸濁した。溶液を３７℃で３０分間、回転台（２７５ｒｐｍ）の上でインキュベートし、氷上で５分間超音波処理した。不溶性の細胞残屑を遠心分離（２００００ｒｐｍ、３０分、４℃）によって除去した。次いで除去後の溶解物を、泳動バッファーによって平衡化したＮｉ−ＮＴＡカラム（Qiagen）に適用した。カラムを洗浄した後（８ＣＶ）、４２０ｍＭイミダゾールを添加した泳動バッファー（６ＣＶ）を用いてカラムからタンパク質を溶出させた。リフォールディング前に、ＮＴＡ−Ｎｉ溶出画分をプールし、５ｍＭ還元グルタチオン（ＧＳＳＨ）及び０．５ｍＭ酸化グルタチオン（ＧＳＳＧ）を添加し、撹拌しながら４℃で一晩インキュベートした。次いでタンパク質を、実施例３ｂの任意のリフォールディングプロトコルを用いてリフォールディングした。変性及びリフォールディングが必要となる封入体へのタンパク質の隔絶を避けるために、以下のことを行う：タンパク質の発現を、ジスルフィド結合の形成を支持することが示されている発現細胞のペリプラズムへと指向させることができ、これによってタンパク質が正確にフォールディングされ、可溶性になる。図８〜図１０に、この変異体の精製、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＦＰＬＣによる特性化を示す。
【０２１７】
実施例１０ｂ．  ＮＭ２３  Ｓ１２０Ｇ  ＩｇＧ１ｈ（ＩｇＧ１のヒンジ領域に融合したＮＭ２３）
ＩｇＧ１ヒンジ領域を、以下のプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってＮＭ２３  Ｓ１２０Ｇの３’に融合させた：
フォワード  5'-atcgatcatatggccaactgtgagcgtacctt-3'（配列番号４９）
リバース  5'atcgatctcgagaccaacacaaatacacggtttacaaccagaatcacgtggcaccggttcatagatccagttctgagcacagctcg-3'（配列番号５０）
【０２１８】
次いで断片を精製し、消化して（ＮｄｅＩ、ＸｈｏＩ）、発現ベクターｐＥＴ２１ｂのＮｄｅＩ制限部位とＸｈｏＩ制限部位との間にクローニングした。発現タンパク質を、実施例１０ａに記載のように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ用途のために精製及び／又はリフォールディングすることができる。
【０２１９】
実施例１０ｃ．  ＮＭ２３  Ｓ１２０Ｇ  ＩｇＧ２ａｈ（ＩｇＧ２ａのヒンジ領域に融合したＮＭ２３）
ＩｇＧ２ａヒンジ領域を、以下のプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってＮＭ２３  Ｓ１２０Ｇの３’に融合させた：
フォワード  5'-atcgatcatatggccaactgtgagcgtacctt-3'（配列番号５１）
リバース  5'atcgatctcgagacctggacatttacacggtggacacggtttaatggtcggaccacgcggttcatagatccagttctgagcacagctcg-3'（配列番号５２）
【０２２０】
次いで断片を精製し、消化して（ＮｄｅＩ、ＸｈｏＩ）、発現ベクターｐＥＴ２１ｂのＮｄｅＩ制限部位とＸｈｏＩ制限部位との間にクローニングした。発現タンパク質を、実施例１０ａに記載のように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ用途のために精製及び／又はリフォールディングすることができる。
【０２２１】
実施例１１．  ＮＭ２３変異体の機能分析
実施例１１ａ．  安定した二量体を形成する能力
初めに、生成したＮＭ２３変異体を、二量体を形成する能力に関して試験した。一本鎖構築物は、単量体−リンカー−単量体の分子量で還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを移動するとされる。非還元ゲルでは、一本鎖変異体は二量体の見掛け分子量で移動するが、より高次の多量体は概して、単量体の見掛け分子量で泳動する。特徴的な四量体及び六量体は、多量体化するのにジスルフィド結合には依存しないが、天然のＮＭ２３、ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ及びＮＭ２３−Ｐ９６Ｓ、並びに他の変異体の二量体はジスルフィド結合に依存する。さらにネイティブゲル及びＦＰＬＣを用いて、変異体の多量体化状態を求めた。二量体の形成を示す還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル及び非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを図３、図６、図９、図１０〜図１４、図１６及び図２６に示す。二量体の形成を示すＦＰＬＣトレースを図２、図１０〜図１４及び図１６に示す。図４には、ネイティブＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示している。
【０２２２】
実施例１１ｂ．  多能性幹細胞の成長を促進する能力
Ｈ９又はＢＧＯ１ｖ／ｈＯＧ胚性幹細胞のいずれかを、１つのウェル当たり２０００００個の細胞という密度で、マトリゲルをコーティングした又は抗ＭＵＣ１＊（ＭＮ−Ｃ３）抗体をコーティングした６ウェル細胞培養プレートのいずれかの上にプレーティングした。細胞を、８ｎＭ  ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−ＲＳ又は本発明のＮＭ２３変異体を添加した最少幹細胞培地（実施例８を参照されたい）中で培養した。培地を、ＢＧＯ１ｖ／ｈＯＧ細胞では２４時間毎、及びＨ９細胞では４８時間毎に交換した。Ｒｈｏキナーゼ阻害剤をＢＧＯ１ｖ／ｈＯＧ細胞では各培地交換時に添加したが、Ｈ９細胞では初めの４８時間だけ添加した。細胞を４日間培養した後、拡大しながら撮影した。図１１〜図１３及び図１５〜図１９にその結果を示す。細胞の形態から、細胞が塊化又は暗化のない単一層であることにより未分化であることが示唆される。
【０２２３】
実施例１１ｃ．  ＮＭ２３変異体で培養した幹細胞の成長速度
ＮＭ２３変異体が天然二量体又はＳ１２０Ｇ二量体として機能したことを証明するものとして幹細胞形態を評価することに加えて、ＮＭ２３変異体を含有する培地中で培養した幹細胞の成長速度を、単離画分が本質的に１００％の二量体となるように、リフォールディングした後、ＦＰＬＣによって精製しているＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ「ＲＳ」で培養した同一の細胞の成長速度と比較した。これらの実験では、全て同じ供給源（ヒトＥＳ−ＢＧＯ１ｖ／ｈＯＧ）から採取した２０００００個の幹細胞をＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ  ＲＳ又は図２０及び図２１に示したＮＭ２３変異体の１つのいずれかで培養した。プレーティングの４日後、細胞をトリプシン処理によって採取し、細胞を血球計で計数した。グラフから分かるように、それぞれの場合で変異体によって、ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ（「ＲＳ」）の単離された二量体集団よりも多くの細胞が生じた。
【０２２４】
実施例１１ｄ．  ＮＭ２３変異体で培養した幹細胞における多能性遺伝子の発現レベルのＲＴ−ＰＣＲ分析
ＮＭ２３二量体を支持する変異体の機能を評価する別の方法として、定量的ＰＣＲを行い、ＮＭ２３変異体で培養した幹細胞における多能性遺伝子の発現レベルを測定した。図２２では、少なくとも４代にわたってＮＭ２３変異体で培養した幹細胞における多能性遺伝子Ｏｃｔ４及びＮａｎｏｇ及びＭＵＣ１及びＮＭ２３の発現レベルを比較している。図２２のグラフから、ＮＭ２３変異体で成長させた細胞に関しては、これらの多能性の鍵となる指標遺伝子の発現レベルは純粋な二量体集団であるＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ  ＲＳで培養された細胞以上であることが示唆される。
【０２２５】
実験詳細：異なるＮＭ２３変異体で成長させた幹細胞を回収した。細胞をペレット状にし、−７０℃で凍結した。総ＲＮＡをＴＲＩｚｏｌ（商標）試薬を用いてサンプルから抽出した。ＲＮＡサンプルにおけるＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４、ＭＵＣ１、ＮＭ２３及びＧＡＰＤＨの定量化を、ＴａｑＭａｎ（商標）ワンステップＲＴ−ＰＣＲマスターミックス試薬を用いて行った。リアルタイムＰＣＲのデータを、比較Ｃｔ法を用いて分析した。各サンプルにおける各転写産物の相対量を、標的Ｃｔと対応するＧＡＰＤＨとの差（ΔＣｔ）をコンピューターによって計算することによって得た。第二正規化を、データセットにおいて他の全てのものからＲＳサンプルのΔＣｔを差し引くことによって行った（ΔΔＣｔ）。
【０２２６】
実施例１１ｅ．  ＮＭ２３変異体の細胞膜を透過して、核へと移行する能力
ＮＭ２３二量体を支持する操作変異体の機能の更なる評価基準として、該変異体の細胞表面から細胞核への移動を追跡し、ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ  ＲＳと比較した。ＮＭ２３二量体がＭＵＣ１＊陽性がん細胞及び全てＭＵＣ１＊陽性であるヒト多能性幹細胞の成長を媒介することが知られている。ＭＵＣ１＊陽性がん細胞を、二量体形態のＮＭ２３を含有する培地中でインキュベートすると、ＮＭ２３二量体はＭＵＣ１＊受容体に結合し、内部移行し、３０分〜６０分以内に核へと移行して、そこで転写因子として機能すると考えられる。図２３に、０ｎＭ、１６ｎＭ又は１２８ｎＭのＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ  ＲＳ（１００％二量体集団）のいずれかの存在下又は非存在下でインキュベートしたがん細胞の共焦点画像を示す。次いで細胞を核染色ＤＡＰＩで染色した後、抗ＮＭ２３抗体を細胞及び蛍光標識した二次抗体に添加した。さらに、内因性ＮＭ２３も抗体によって染色することに留意されたい。しかしながら、二量体として外から添加した場合、核には検出可能なＮＭ２３しか存在しない。細胞の成長の増進及びＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇの核局在化に最適な濃度が８ｎＭ〜６４ｎＭであることは事前に求めていた。より高い濃度では、１つの二量体が２つのＭＵＣ１＊受容体に結合し、それらを二量体化するのではなく、各ＮＭ２３二量体が１つ１つのＭＵＣ１＊受容体に結合する（図１の釣鐘曲線を参照されたい。ここでは同じ理由から、過剰な二価抗ＭＵＣ１＊抗体によって、成長が刺激されずに阻害される）。図２３（ｂ、ｅ）に、白色の矢印で示される核内のＮＭ２３を示す。図２４に、外から添加されたＮＭ２３が、システインを含まない、修飾ＩｇＧ１ヒンジ領域及び修飾ＩｇＧ２ａヒンジ領域によって連結された２つのＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ単量体である一本鎖「二量体」変異体ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−ＩｇＧ１ｈ／ＩｇＧ２ａｈ  ｎｏＣであることを除いて図２３と同じ実験の共焦点画像を示す。実施例９ｅを参照されたい。図２４から分かるように、ＮＭ２３一本鎖変異体は、白色の矢印で示される核（ｂ、ｅ）へと容易に移行する。ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−ＲＳ（図２３ｈ）及び一本鎖変異体、ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−ＩｇＧ１ｈ／ＩｇＧ２ａｈ  ｎｏＣ（図２４ｈ）に対応する核内のＮＭ２３の量を定量化するグラフから、操作「二量体」が、二量体集団として単離されているＮＭ２３単量体よりも良好に核へと移行することが示唆される。
【０２２７】
実験詳細：初めにＴ４７Ｄ乳がん細胞を、１０％  ＦＢＳ  ＲＰＭＩ培地の入ったコラーゲンをコーティングした８ウェルチャンバ上に２４時間プレーティングした後、血清飢餓（１％  ＦＢＳ  ＲＰＭＩ）を２４時間、３７℃、５％ＣＯ２で行った。続いて、Ｔ４７Ｄ細胞を、１０％  ＦＢＳ  ＲＰＭＩ中の１６ｎＭ又は１２８ｎＭ  ＮＭ２３Ｓ１２０ＧＲＳ又はＮＭ２３ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａで３０分間、インキュベートした。次いでＴ４７Ｄ細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定した。細胞を、ＰＢＳ＋１％  ＢＳＡ＋５％正常ヤギ血清＋０.０１％  Ｔｒｉｔｏｎ−ｘ（「ブロッキングバッファー」）で１時間ブロッキングした後、室温で１時間、一次抗体の入ったブロッキングバッファー中でインキュベートした。次いで、細胞をＰＢＳで洗浄した後、適切な二次抗体（Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ、Invitrogen）とともに室温で１時間インキュベートした（暗所に保った）。ＰＢＳで洗浄した後、細胞にＰｒｏｌｏｎｇ  Ｇｏｌｄ＋ＤＡＰＩ（Invitrogen）及びカバースリップをマウントした。Ｔ４７Ｄ細胞を、ZeissのＬＳＭ  ５１０レーザー走査共焦点顕微鏡で可視化した。
【０２２８】
実施例１２．  交差種機能
ＮＭ２３は、多能性コロニー形態でマウスＥＳ細胞の増殖を支持する。
【０２２９】
マウスＥＳ細胞（１２９／Ｓ６、EMD Millipore, Billerica, MA）を、１０００Ｕ／ｍＬの組換えｍＬＩＦ（ａ、ｃ）（EMD Millipore）又は１６ｎＭ  ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−ＲＳ（ｂ、ｄ）のいずれかを添加したマウスＥＳ細胞最少培地（ｍＥＳＣ−ＭＭ）中で２日間、不活性化ＭＥＦフィーダー細胞層上に培養し、位相差照射下、低倍率で撮影した。サイズバーは５００ミクロンを示す。両方の場合で、１日目に僅か数個の細胞からなる単一の細胞及びコロニーから、多能性マウスＥＳ細胞に特有の明色の規定縁を備えるより大きい多細胞卵形コロニーが生じる。ｍＥＳＣ−ＭＭは、ノックアウトＤ−ＭＥＭ基礎培地、１５％ノックアウト血清代替物、１×ＧｌｕｔａＭａｘ  Ｉ、１×ＯｐｔｉＭＥＭ非必須アミノ酸、０．１ｍＭ  Ｂ−ＭＥ（Life Technologies, Carlsbad, CA）、及び１×ペニシリン／ストレプトマイシン（Lonza,Allendale, NJ）からなるものである。
【０２３０】
結果を図２５に示し、マウス幹細胞が、成長因子としてマウスＬＩＦを含むマウス幹細胞培地中の場合と同様に良好にＮＭ２３（ヒト）で成長することが実証される。そのため、本明細書に記載のＮＭ２３変異体をマウス細胞系に使用することができ、マウスＮＭ２３及びＮＭ２３変異体をヒト細胞系に使用することができる。
【０２３１】
実施例１３．  発現細胞により分泌される構築物の生成
実施例２、実施例９及び実施例１０に記載のものを含む本発明の突然変異体、欠失体及び／又は一本鎖キメラ若しくは融合キメラのいずれかを作製し、発現細胞によって分泌させ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ及び／又はｉｎ  ｖｉｖｏで使用することができる。発現タンパク質を分泌させる配列は当業者にとって既知である。特に、抗体から誘導される配列をタンパク質のＮ末端すなわち対象の遺伝子の５’末端に付加する。リーダー配列を包含することに加えて、発現細胞のタイプは大腸菌に限定されるものではなく、哺乳動物細胞、哺乳動物発現細胞、酵母、体細胞、幹細胞、ｉＰＳ細胞、又は多能性の誘導若しくは開始細胞よりも成熟していない状態への誘導を受けた細胞も含まれる。
【０２３２】
実施例１４．  リフォールディングのない本発明の組換えＮＭ２３−ＷＴ、Ｓ１２０Ｇ及び変異体の比較
本発明のＮＭ２３変異体の利点の１つは、ｉｎ  ｖｉｖｏ状況では行うことができない変性及びリフォールディングを必要とせず、安定した二量体を自発的に形成するように設計されていることである。自然状態で二量体化する一本鎖キメラ及び融合キメラの利点を実証するために、ＮＭ２３−ＷＴ、ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ及び変異体ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−ＧＳ２、ＩｇＧ１ｈ−ｎｏＣ、ＩｇＧ１ｈ／ＩｇＧ２ａｈ−ｎｏＣを発現させ、変性又はリフォールディングせずに、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより特性化を行った。図２６のゲルから、タンパク質変異体のみが二量体として移動することが示唆される。野生型ＮＭ２３及びＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ（非リフォールディング）は非還元ゲル上を単量体の見掛け分子量で泳動する。本明細書で先に述べたように、ＮＭ２３六量体は、多量体化がそのジスルフィド結合に依存しないことから、非還元ゲル上を単量体として泳動するが、ＦＰＬＣによって実際には六量体であることが分かっている（比較のための図２、図３ａ、及び図４を参照されたい）。
【０２３３】
実施例１５．  二量体化を支持するとともに、より高次の多量体の形成を抑える突然変異体の同定
がん細胞又は幹細胞の成長を促進する突然変異を、幾つかのがん由来のＮＭ２３をシークエンシングすることによって同定することができる。Ｓ１２０Ｇ突然変異体を、神経芽細胞腫から単離した。代替的に、ＮＭ２３をコードするＤＮＡをランダムに突然変異させた後、得られたタンパク質を試験することで、がん細胞又は幹細胞の成長を促進する突然変異体をスクリーニングすることができる。限定要因は、細胞ベースのアッセイにおける多くの可能性のある突然変異をスクリーニングするための時間である。二量体を形成すると同時により高次の多量体の形成を抑える能力に関して突然変異体を試験する簡便な方法は、ＭＵＣ１＊ペプチドへの結合能に関して突然変異体を試験することである。示してきたように、ＮＭ２３四量体及び六量体はＭＵＣ１＊ペプチドには結合しない。二量体を形成するが、四量体及び六量体は形成しない突然変異体を同時に同定するアッセイは、ＭＵＣ１＊ペプチドが金ナノ粒子に担持されているナノ粒子アッセイである。マルチウェルプレートにおいて、各突然変異体を、ペプチドを保有するナノ粒子に添加する。突然変異体が二量体を容易に形成する場合、二量体ＮＭ２３が、ナノ粒子に固定されたＭＵＣ１＊ペプチドに結合し、粒子同士が近付き、それにより溶液がピンク色から青色へと変色する。突然変異体が高濃度で添加されると、突然変異体が依然として四量体及び六量体を形成することが可能であり、ペプチドとは結合せずに溶液はピンク色のままとなる。したがって、二量体の形成を支持するとともに、不活性な六量体を形成しない突然変異体は、例えば５００ｎＭを超える高い濃度で添加されたとしてもナノ粒子溶液は青色に変わることから、容易に同定される。
【０２３４】
実施例１６．
ヒトＢＧＯ１ｖ／ｈＯＧ胚性幹細胞を、６ウェル細胞培養プレートの１つのウェル当たり１０００００個の細胞という細胞密度で１つのウェルに付き１２．５ｕｇのモノクローナル抗ＭＵＣ１＊抗体（ＭＮ−Ｃ３）をコーティングしたＶｉｔａプレート上にプレーティングした。細胞を、実施例３の任意のリフォールディングプロトコルに従ってリフォールディングしたＮＭ２３変異体で２日間、培養した。最少幹細胞培地中、８ｎＭで使用されたＮＭ２３変異体（実施例８を参照されたい）は、ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−ＲＳ（ａ、ｅ）、ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−ＧＳ２（図において「Ｒ」はリフォールディングを示す）（ｂ、ｆ）、ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−ＩｇＧ１ｈ  ｎｏＣ（ｃ、ｇ）及びＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−ＩｇＧ１ｈ／ＩｇＧ２ａｈ  ｎｏＣ（ｄ、ｈ）であった。細胞の形態から分かるように、全ての幹細胞は、分化する線維芽細胞様細胞を欠いており、さらに分化を示す肥厚化及び暗化のない多能性幹細胞として成長した。
【０２３５】
本明細書で言及される参考文献は全てその全体が、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
【０２３６】
当業者は、単なる通常の実験を用いて、本明細書に具体的に記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識するか又は確認することができる。このような均等物は特許請求の範囲に包含されるように意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【配列表】
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