(57)【要約】【課題】Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｉの発現増大及び／又は発現減少抑制作用を有する抗皮膚老化剤のスクリーニング方法を提供すること。【解決手段】細胞骨格制御因子の発現の増大及び／又は発現の減少抑制を指標とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞骨格制御因子の発現の増大及び／又は発現の減少抑制を指標とする、Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｉの発現の増大及び／又は発現の減少抑制作用を有する抗皮膚老化剤のスクリーニング方法。
【請求項２】
前記細胞骨格制御因子が、アクチン関連タンパク質３Ｂ（ａｃｔｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ３  ｈｏｍｏｌｏｇ  Ｂ、ＡＣＴＲ３Ｂ）、リムキナーゼ−１（ＬＩＭ  ｋｉｎａｓｅ−１、ＬＩＭＫ１）、及びスーパービリン（ｓｕｒｐｅｒｖｉｌｌｉｎ、ＳＶＩＬ）からなる群から選択される１又は２以上であることを特徴とする、請求項１に記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
前記抗皮膚老化剤は、皮膚支帯（Ｒｅｔｉｎａｃｕｌａ ｃｕｔｉｓ）の本数が減ることを抑制する作用を有するものであることを特徴とする、請求項１又は２に記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
前記抗皮膚老化剤が、生理老化に基づく肌状態の改善作用を有するものであることを特徴とする、請求項１〜３の何れか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
前記肌状態が、シワの増加、肌のタルミ、ハリの低下、肌の弾力性の低下からなる群から選択される１又は２以上であることを特徴とする、請求項１〜４の何れか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
細胞に物質の投与を適用する適用工程と、
適用工程後に前記細胞の細胞骨格制御因子の発現量を測定する測定工程と、
前記測定工程の測定結果に基づき、細胞骨格制御因子の発現の増大及び／又は発現の減少抑制を計測する計測工程と、
を有することを特徴とする、請求項１〜５の何れか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
２種以上の物質を、２以上の細胞群に対し各々適用する適用工程と、
適用工程後に各々の前記細胞の細胞骨格制御因子の発現量を測定する測定工程と、
測定結果に基づき、細胞骨格制御因子の発現の増大及び／又は発現の減少抑制を計測する計測工程と、
を有することを特徴とする、請求項１〜５の何れか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項８】
前記細胞が、線維芽細胞及び／又は腱細胞であることを特徴とする、請求項６又は７に記載のスクリーニング方法。
【請求項９】
前記細胞は、皮膚支帯が存在する細胞であることを特徴とする、請求項６〜８の何れか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項１０】
細胞骨格制御因子の発現の増大及び／又は発現の減少抑制を指標とする、生理老化に基づく肌状態の改善作用を有する抗皮膚老化剤のスクリーニング方法。
【請求項１１】
細胞骨格制御因子の発現量が少ないほど、皮膚支帯（Ｒｅｔｉｎａｃｕｌａ ｃｕｔｉｓ）の数が少ないと判定することを特徴とする、皮膚支帯（Ｒｅｔｉｎａｃｕｌａ ｃｕｔｉｓ）の本数の推定方法。
【請求項１２】
細胞骨格制御因子の発現量を指標とする、皮膚における加齢の程度の推定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
皮膚老化は、その要因に基づき、生理老化、光老化などに分類することができる（特許文献１）。ここで、生理老化は年齢を原因とする老化現象であり、一般に赤みの減少、黄みの増加、角層水分量の減少、たるみ、皮脂減少などの表現形質を特徴とする（特許文献１  参照）。
【０００２】
ところで、Ｉ型コラーゲン（Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｉ）は皮膚支帯（Ｒｅｔｉｎａｃｕｌａ ｃｕｔｉｓ）の構成成分であり、皮膚支帯（Ｒｅｔｉｎａｃｕｌａ ｃｕｔｉｓ）の疎密は年齢および皮膚のタルミ程度と相関関係を有することが知られている（特許文献２）。
【０００３】
また、皮膚支帯（Ｒｅｔｉｎａｃｕｌａ ｃｕｔｉｓ）と呼ばれる網目状の線維構造の疎密が顔のタルミとの関連性を有することが知られている（非特許文献１）。また、額及び目尻において、深いシワ部位直下の皮下組織では皮膚支帯密度が減少していることが知られている（非特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００５−０５３７８９号公報
【特許文献２】特開２０１７−２１８４２９号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Sakata A., et al. :”Breakthrough in improving the skin sagging with focusing on the subcutaneous tissue structure, retinacula cutis”, 23rd IFSCC, Zurich (2015)
【非特許文献２】Tsukahara K. et al., Arch Dermatol. (2012), 148, 39-46
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
前述の先行技術のあるところ、本発明は、Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｉの発現増大及び／又は発現減少抑制作用を有する抗皮膚老化剤のスクリーニング方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
すなわち、本発明は、
細胞骨格制御因子の発現の増大及び／又は発現の減少抑制を指標とする、Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｉの発現増大及び／又は発現減少抑制作用を有する抗皮膚老化剤のスクリーニング方法である。すなわち、本発明は、Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｉの発現増大及び／又は発現減少抑制作用を有する抗皮膚老化剤のスクリーニング方法を提供することを課題とする。
【０００８】
上記課題を解決する本発明は、
細胞骨格制御因子の発現の増大及び／又は発現の減少抑制を指標とする、Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｉの発現の増大及び／又は発現の減少抑制作用を有する抗皮膚老化剤のスクリーニング方法である。
【０００９】
また、本発明の好ましい形態では、
前記細胞骨格制御因子がアクチン関連タンパク質３Ｂ（ａｃｔｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ３  ｈｏｍｏｌｏｇ  Ｂ、ＡＣＴＲ３Ｂ）、リムキナーゼ−１（ＬＩＭ  ｋｉｎａｓｅ−１、ＬＩＭＫ１）、及びスーパービリン（ｓｕｒｐｅｒｖｉｌｌｉｎ、ＳＶＩＬ）からなる群から選択される１又は２以上であることを特徴とする。
【００１０】
また、本発明の好ましい形態では、
前記抗皮膚老化剤は、皮膚支帯（Ｒｅｔｉｎａｃｕｌａ ｃｕｔｉｓ）の本数が減ることを抑制する作用を有するものであることを特徴とする。
ここで、『皮膚支帯（Ｒｅｔｉｎａｃｕｌａ ｃｕｔｉｓ）の本数が減ること』は、皮膚支帯（Ｒｅｔｉｎａｃｕｌａ ｃｕｔｉｓ）の構成要素であるＣｏｌｌａｇｅｎ  Ｉが減少することにより、皮膚支帯（Ｒｅｔｉｎａｃｕｌａ ｃｕｔｉｓ）が消滅する現象を指す。
【００１１】
また、本発明の好ましい形態では、
前記抗皮膚老化剤が、生理老化に基づく肌状態の改善作用を有するものであることを特徴とする。
【００１２】
また、本発明の好ましい形態では、
前記肌状態が、シワの増加、肌のタルミ、ハリの低下、肌の弾力性の低下からなる群から選択される１又は２以上であることを特徴とする。
【００１３】
また、本発明の好ましい形態では、
前記細胞が、線維芽細胞及び／又は腱細胞であることを特徴とする。
【００１４】
また、本発明の好ましい形態では、
細胞に物質を適用する適用工程と、
適用工程後に前記細胞の細胞骨格制御因子の発現量を測定する測定工程と、
前記測定工程の測定結果に基づき、細胞骨格制御因子の発現の増大及び／又は発現の減少抑制を計測する計測工程と、
を有することを特徴とする。
【００１５】
また、本発明の好ましい形態では、
２種以上の物質を、２以上の細胞群に対し各々適用する適用工程と、
適用工程後に各々の前記細胞の細胞骨格制御因子の発現量を測定する測定工程と、
測定結果に基づき、細胞骨格制御因子の発現の増大及び／又は発現の減少抑制を計測する計測工程と、
を有することを特徴とする。
【００１６】
また、本発明の好ましい形態では、
前記細胞が、線維芽細胞及び／又は腱細胞であることを特徴とする。
【００１７】
また、本発明の好ましい形態では、
前記細胞は、皮膚支帯（Ｒｅｔｉｎａｃｕｌａ ｃｕｔｉｓ）に存在する細胞であることを特徴とする。
【００１８】
また、本発明は、細胞骨格制御因子の発現の増大及び／又は発現の減少抑制を指標とする、生理老化に基づく肌状態の改善作用を有する抗皮膚老化剤のスクリーニング方法でもある。
【００１９】
また、本発明は、細胞骨格制御因子の発現量が少ないほど、皮膚支帯（Ｒｅｔｉｎａｃｕｌａ ｃｕｔｉｓ）の数が少ないと判定することを特徴とする、皮膚支帯（Ｒｅｔｉｎａｃｕｌａ ｃｕｔｉｓ）の本数の推定方法でもある。
【００２０】
また、本発明は、細胞骨格制御因子の発現量を指標とする、皮膚における加齢の程度の推定方法でもある。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｉの発現増大及び／又は発現減少抑制作用を有する抗皮膚老化剤のスクリーニング方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】試験１の結果を示す図である。
【図２】生理老化と皮膚支帯（Ｒｅｔｉｎａｃｕｌａ ｃｕｔｉｓ）の本数の関連を示す図である。
【図３】試験２の結果を示す図である。
【図４】試験３（１−１）の結果を示す図である。
【図５】試験３（１−２）の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下、本発明の好ましい実施形態について説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施形態に限定されないことは言うまでもない。
【００２４】
＜１＞Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｉの発現増大及び／又は発現減少抑制作用を有する抗皮膚老化剤のスクリーニング方法
【００２５】
本発明のスクリーニング方法は、細胞骨格制御因子の発現の増大及び／又は発現の減少抑制を指標とする。
【００２６】
指標とする細胞骨格制御因子としては、アクチン関連タンパク質３Ｂ（ａｃｔｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ３  ｈｏｍｏｌｏｇ  Ｂ、ＡＣＴＲ３Ｂ）、リムキナーゼ−１（ＬＩＭ  ｋｉｎａｓｅ−１、ＬＩＭＫ１）、及びスーパービリン（ｓｕｒｐｅｒｖｉｌｌｉｎ、ＳＶＩＬ）を好ましく挙げることができる。
【００２７】
本発明のスクリーニング方法は、細胞の培養系に被験物質を添加し、細胞における細胞骨格制御因子の発現量を測定することを含む形態であることが好ましい。
ここで、細胞は、線維芽細胞及び／又は腱細胞であることが好ましく、また、皮膚支帯に存在する細胞であることがより好ましい。
【００２８】
具体的には、被験物質を添加して培養した細胞における細胞骨格制御因子の発現量が、被験物質を添加しないで培養した細胞における細胞骨格制御因子の発現量と比較して統計的に有意に大きい場合に、前記被験物質はＣｏｌｌａｇｅｎ  Ｉの発現増大及び／又は発現減少抑制作用を有する抗皮膚老化剤の候補として判定する形態であることが好ましい。
【００２９】
また、被験物質を添加して培養した細胞における細胞骨格制御因子の発現量が、被験物質を添加しないで培養した細胞における細胞骨格制御因子の発現量の１倍より大きい場合に、Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｉの発現増大及び／又は発現減少抑制作用を有する抗皮膚老化剤の候補として選択する形態であってもよい。
【００３０】
ここで、細胞骨格制御因子の発現量は、ｍＲＮＡ測定、免疫組織学化学的解析等の常法により測定することができる。
例えば、前記細胞骨格制御因子をコードする遺伝子の発現量は、当該遺伝子の配列に特異的に結合する配列を有するＤＮＡ断片をプライマーとして用いてＰＣＲを行い、定量的な検出を行う。なお、前記細胞骨格制御因子をコードする遺伝子配列は、公開されているので、当業者は適宜プライマーを設計することが可能である。
【００３１】
また、前記各細胞骨格制御因子の抗体についても市販品が存在するので、これを用いて、細胞における発現量を測定することができる。
【００３２】
さらに具体的には、本発明は、
細胞に物質を適用する適用工程と、
適用工程後に前記細胞の細胞骨格制御因子の発現量を測定する測定工程と、
前記測定工程の測定結果に基づき、細胞骨格制御因子の発現の増大及び／又は発現の減少抑制を計測する計測工程と、
を有する実施の形態とすることが好ましい。
【００３３】
また、本発明は、
２種以上の物質を、２以上の細胞群に対し各々適用する適用工程と、
適用工程後に各々の前記細胞の細胞骨格制御因子の発現量を測定する測定工程と、
測定結果に基づき、細胞骨格制御因子の発現の増大及び／又は発現の減少抑制を計測する計測工程と、
を有する実施の形態とすることが好ましい。
【００３４】
本発明のスクリーニング方法において、スクリーニングの対象となる抗皮膚老化剤は特に限定されず、たとえば、市販の化合物（ペプチドを含む）、公知化合物（ペプチドを含む）、コンビナトリアル・ケミストリー技術によって得られた化合物群、植物や海洋生物由来の天然成分、動物組織抽出物などの物質を挙げることができる。
【００３５】
ここで、動植物由来の抽出物は、動物又は植物由来の抽出物自体のみならず、抽出物の画分、精製した画分、抽出物乃至は画分、精製物の溶媒除去物の総称を意味する。
また、植物由来の抽出物は、自生若しくは生育された植物、漢方生薬原料等として販売されるものを用いた抽出物、市販されている抽出物等を挙げることができる。
【００３６】
ここで、スクリーニングの対象となる抗皮膚老化剤は、皮膚支帯（Ｒｅｔｉｎａｃｕｌａ ｃｕｔｉｓ）の本数が減ることを抑制する作用を有するものであることが好ましい。
ここで、『皮膚支帯（Ｒｅｔｉｎａｃｕｌａ ｃｕｔｉｓ）の本数が減ること』は、皮膚支帯（Ｒｅｔｉｎａｃｕｌａ ｃｕｔｉｓ）の構成要素であるＣｏｌｌａｇｅｎ  Ｉが減少することにより、皮膚支帯（Ｒｅｔｉｎａｃｕｌａ ｃｕｔｉｓ）が消滅する現象を指す。
【００３７】
また、スクリーニングの対象となる抗皮膚老化剤は、生理老化に基づく肌状態の改善作用を有するものであることが好ましい。
ここで、生理老化に基づく肌状態としては、シワの増加、肌のタルミ、ハリの低下、肌の弾力性の低下を好ましく挙げることができる。ここで、肌のタルミとは、皮膚および皮下組織の弾力性の低下によって生ずる肌の変形をさす。
【００３８】
本発明は、細胞骨格制御因子の発現の増大及び／又は発現の減少抑制を指標とする、生理老化に基づく肌状態の改善作用を有する抗皮膚老化剤のスクリーニング方法とすることもできる。
【００３９】
また、本発明は、細胞骨格制御因子の発現の増大及び／又は発現の減少抑制を指標とする、肌状態の推定方法とすることもできる。
【００４０】
＜２＞皮膚支帯（Ｒｅｔｉｎａｃｕｌａ ｃｕｔｉｓ）の本数の推定方法
本発明は、細胞骨格制御因子の発現量が少ないほど、皮膚支帯（Ｒｅｔｉｎａｃｕｌａ ｃｕｔｉｓ）の本数が少ないと判定することを特徴とする、皮膚支帯（Ｒｅｔｉｎａｃｕｌａ ｃｕｔｉｓ）の本数の推定方法にも関する、
【００４１】
本発明の皮膚支帯（Ｒｅｔｉｎａｃｕｌａ ｃｕｔｉｓ）の本数の推定方法は、細胞における細胞骨格制御因子の発現量を測定することを含む形態であることが好ましい。
【００４２】
ここで、細胞骨格制御因子の発現量が少ないほど、皮膚支帯（Ｒｅｔｉｎａｃｕｌａ ｃｕｔｉｓ）の本数が少ないと判定するための方法は特に限定されない。
【００４３】
たとえば、統計学的に有意な人数に対して、従来の手法による細胞骨格制御因子の発現量の測定と、皮膚支帯（Ｒｅｔｉｎａｃｕｌａ ｃｕｔｉｓ）の本数についての試験を行うことで、細胞骨格制御因子の発現量と皮膚支帯（Ｒｅｔｉｎａｃｕｌａ ｃｕｔｉｓ）の本数の相関についてのデータベースを予め作成しておき、被験者の皮膚における細胞骨格制御因子の発現量を当該データベースと照合することにより被験者の皮膚支帯（Ｒｅｔｉｎａｃｕｌａ ｃｕｔｉｓ）の本数を推定する実施の形態が好ましく挙げられる。
【００４４】
複数の被験者の皮膚における細胞骨格制御因子の発現量に基づき、被験者間での皮膚支帯（Ｒｅｔｉｎａｃｕｌａ ｃｕｔｉｓ）の本数の多寡を推定する実施の形態としてもよい。
また、同一被験者から取得した複数の細胞骨格制御因子の発現量に基づき、相対的に皮膚支帯（Ｒｅｔｉｎａｃｕｌａ ｃｕｔｉｓ）の本数を推定する実施の形態としてもよい。
また、被験者から取得した細胞骨格制御因子の発現量に関する情報を、既に用意された指標と照らし合わせることにより、皮膚支帯（Ｒｅｔｉｎａｃｕｌａ ｃｕｔｉｓ）の本数を推定する実施の形態としてもよい。
【００４５】
ここで、＜１＞に記載の技術的事項のうち、＜２＞皮膚支帯（Ｒｅｔｉｎａｃｕｌａ ｃｕｔｉｓ）の本数の推定方法に妥当する技術的事項については、前述した説明を準用することができる。
【００４６】
＜３＞皮膚における加齢の程度の推定方法
本発明は、細胞骨格制御因子の発現量を指標とする、皮膚における加齢の程度の推定方法にも関する。
【００４７】
細胞骨格制御因子の発現量が多いほど、皮膚における加齢の程度が少ないと判定する形態であることが好ましい。
ここで、細胞骨格制御因子の発現量が多いほど、皮膚における加齢していないと判定するための方法は特に限定されない。
【００４８】
たとえば、統計学的に有意な人数に対して、従来の手法による細胞骨格制御因子の発現量の測定と、皮膚における加齢の程度についての試験を行うことで、細胞骨格制御因子の発現量と皮膚における加齢の程度の相関についてのデータベースを予め作成しておき、被験者の皮膚における細胞骨格制御因子の発現量を当該データベースと照合することにより被験者の皮膚における加齢の程度を推定する実施の形態が好ましく挙げられる。
【００４９】
複数の被験者の皮膚における細胞骨格制御因子の発現量に基づき、皮膚における加齢の程度を推定する実施の形態としてもよい。
また、同一被験者から取得した複数の細胞骨格制御因子の発現量に基づき、相対的に、皮膚における加齢の程度を推定する実施の形態としてもよい。
また、被験者から取得した細胞骨格制御因子の発現量を、既に用意された指標と照らし合わせることにより、皮膚における加齢の程度を推定する実施の形態としてもよい。
【００５０】
また、皮膚における加齢の程度は、シワの本数、肌のタルミ、肌のハリ、肌の弾力性から選ばれる１又は２以上の皮膚の形態に基づくものであることが好ましい。
【００５１】
ここで、シワの本数は、皮膚画像解析カウンセリングシステム（Canfield社製、ＶＩＳＩＡ−ＥＶＯＬＵＴＩＯＮ）を用いて皮膚画像を採取し、画像解析の結果に基づくものであることが好ましい。
【００５２】
肌のタルミは、特開２０１６−０７７７５５号公報の記載に従い、斜め４５°の角度から顔面を写真撮影し、公知のタルミグレード基準（T. Ezure, et al., Skin Res. Technol., 15, 299-305(2009)参照）と照らし得た値であることが好ましい。
【００５３】
また、肌のハリ、肌の弾力性は、皮膚粘弾性測定装置（CK electronic GmbH社製Ｃｕｔｏｍｅｔｅｒ  ＭＰＡ５８０）を用いて皮膚を、吸引圧４００ｍｂ、吸引時間２秒、開放時間２秒を１サイクルとする測定を１回行い、得られた「Ｒ０」〜「Ｒ８」の結果のうちＲ７（戻り率：Ｕｒ／Ｕｆ）の結果に基づくものであることが好ましい。
【００５４】
ここで、＜１＞及び＜２＞に記載の技術的事項のうち、＜３＞皮膚における加齢の程度の推定方法に妥当する技術的事項については、前述した説明を準用することができる。
【実施例】
【００５５】
以下、本発明の基礎となる知見を裏付ける各種試験結果を示す。
【００５６】
＜試験１＞生理老化と、Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｉの関連
試験１では、生理老化と、Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｉとの関連を調べた。
【００５７】
（１）実験操作
まず、若齢者（20-30代）及び老齢者（60-90代）のヒト正常非露光部組織を、凍結組織包理剤（ＯＣＴコンパウンド）で凍結処理し、組織切片を用意した。
【００５８】
用意した組織切片を１０％中性緩衝ホルマリンにて固定し、その後ＰＢＳで洗浄し、Ｂｌｏｃｋ  Ａｃｅを用い、ブロッキング処理した。
【００５９】
ブロッキング処理した組織切片に一次抗体を添加し、４℃条件下で一晩静置した。
静置後ＰＢＳで洗浄し、ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＡＢＣ−ＡＰ  Ｋｉｔ（ＶＥＣＴＯＲ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  社製）およびＡｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ＫｉｔI  ＜ＶＥＣＴＯＲ  Ｒｅｄ＞  （ＶＥＣＴＯＲ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  社製）を用い、処理した。
【００６０】
増感剤による処理後、ＰＢＳで洗浄しマイヤーヘマトキシリン染色溶液で核を染色した。染色後に流水洗水し、１００％エタノールで脱水処理をした。脱水処理後、キシレンで透徹処理をし、非水溶性封入剤を用い封入した。
以上の工程により封入した組織切片について、Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｉの染色度合いの観察を行った。
【００６１】
（２）結果及び考察
老齢者(生理老化の影響が大きい)の非露光部の皮膚支帯では若齢者(生理老化の影響が小さい)の非露光部の皮膚支帯に比して、Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｉの量少ないことがわかった（図１  参照）。
以上より、加齢による影響（生理老化）によって、Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｉが減少することが分かった。
【００６２】
また、図２に示すように、老齢者（加齢による影響が比較的大きい被験者）では、加齢による影響（生理老化）によって皮膚支帯（Ｒｅｔｉｎａｃｕｌａ ｃｕｔｉｓ）の本数が少なくなっていることがわかった。
【００６３】
＜試験２＞  生理老化と細胞骨格制御因子の関連
試験２では、生理老化と細胞骨格制御因子と関連を調べた。
【００６４】
（１）実験操作
ヒト正常皮下組織（若齢 (20-30代)、老齢 (60-80代)）を、ＲＮＡｌａｔｅｒ（ＱＩＡＧＥＮ  社製）を用いて固定処理した。
【００６５】
固定したヒト正常皮下組織（非露光部）から皮膚支帯（Ｒｅｔｉｎａｃｕｌａ ｃｕｔｉｓ）のみを単離した。単離した皮膚支帯（Ｒｅｔｉｎａｃｕｌａ ｃｕｔｉｓ）を破砕し、ＲＮｅａｓｙ  Ｆｉｂｒｏｕｓ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ  社製）を用いてＲＮＡを回収した。回収したＲＮＡについて、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＶＩＬＯ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  社製）を用い、ｃＤＮＡを合成した。
【００６６】
ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ａｓｓａｙ  （ＱＩＡＧＥＮ  社製）を用いて定量的ＲＴ−ＰＣＲを行い、アクチン関連タンパク質３Ｂ（ａｃｔｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ３  ｈｏｍｏｌｏｇ  Ｂ、ＡＣＴＲ３Ｂ）、リムキナーゼ−１（ＬＩＭ  ｋｉｎａｓｅ−１、ＬＩＭＫ１）、及びスーパービリン（ｓｕｒｐｅｒｖｉｌｌｉｎ、ＳＶＩＬ）の遺伝子発現量の遺伝子発現量を測定した。
ここで、遺伝子発現量は、内在性コントロールをβ-actinとし、比較ＣＴ法を用いて算出した。
【００６７】
（２）結果及び考察
図３に示した通り、加齢によって、アクチン関連タンパク質３Ｂ（ａｃｔｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ３  ｈｏｍｏｌｏｇ  Ｂ、ＡＣＴＲ３Ｂ）、リムキナーゼ−１（ＬＩＭ  ｋｉｎａｓｅ−１、ＬＩＭＫ１）、及びスーパービリン（ｓｕｒｐｅｒｖｉｌｌｉｎ、ＳＶＩＬ）が減少することがわかった。
【００６８】
ここで、試験１における図２では、加齢による影響（生理老化）によって皮膚支帯（Ｒｅｔｉｎａｃｕｌａ ｃｕｔｉｓ）の本数が少なくなっていることが示されている。
すなわち、図２、図３及び観察の結果、アクチン関連タンパク質３Ｂ（ａｃｔｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ３  ｈｏｍｏｌｏｇ  Ｂ、ＡＣＴＲ３Ｂ）、リムキナーゼ−１（ＬＩＭ  ｋｉｎａｓｅ−１、ＬＩＭＫ１）、及びスーパービリン（ｓｕｒｐｅｒｖｉｌｌｉｎ、ＳＶＩＬ）の減少によって、皮膚支帯（Ｒｅｔｉｎａｃｕｌａ ｃｕｔｉ）の本数が少なくなることがわかった。
【００６９】
＜試験３＞Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｉと細胞骨格制御因子の関連
試験３では、Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｉと細胞骨格制御因子の関連を調べた。
【００７０】
（１）実験操作
（１−１）若齢由来の皮膚支帯細胞における、細胞骨格制御因子をノックダウンした際の細胞変化評価
【００７１】
（１−１−１）操作
ヒト正常皮下組織から取得した細胞をＯＧ（アウトグロース）法により培養した。培養した細胞から、皮膚支帯（Ｒｅｔｉｎａｃｕｌａ ｃｕｔｉｓ）細胞のみをＣｅｌｌ  Ｓｏｒｔｅｒ  ＳＨ８００（ＳＯＮＹ  社製）を用い、単離した。
【００７２】
単離した皮膚支帯（Ｒｅｔｉｎａｃｕｌａ ｃｕｔｉｓ）細胞を4穴チャンバースライドに１．７×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように播種し、３７℃、５％ＣＯ２環境下で２４時間培養した。
【００７３】
次に、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）  Ｉ  Ｒｅｄｕｃｅｄ  Ｓｅｒｕｍ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  社製）を用い、Ｓｉｌｅｎｃｅ  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｐｒｅ−ｄｅｓｉｇｎｅｄ  ｓｉＲＮＡ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  社製）を調製した。
調製したＳｉｌｅｎｃｅ  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｐｒｅ−ｄｅｓｉｇｎｅｄ  ｓｉＲＮＡ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  社製）を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｍｉｎ  ＲＮＡｉＭＡＸ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  社製）を用い、培養後の皮膚支帯（Ｒｅｔｉｎａｃｕｌａ  ｃｕｔｉｓ）細胞に導入した。
【００７４】
ここで、使用したｓｉＲＮＡについて、１９塩基対の配列と３’末端オーバーハング部分の２塩基の配列とを、下記表１、表２、及び表３に示す。
なお、下記表１はＳＶＩＬを標的とするｓｉＲＮＡ、下記表２はＬＩＭＫ１を標的とするｓｉＲＮＡ、下記表３はＡＣＴＲ３Ｂを標的とするｓｉＲＮＡの配列である。
また、各表中の配列番号は、１９塩基対の配列番号を示す。
【００７５】
【表１】
2020128888.tif 000002
【００７６】
【表２】
2020128888.tif 000003
【００７７】
【表３】
2020128888.tif 000004
【００７８】
Ｓｉｌｅｎｃｅ  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｐｒｅ−ｄｅｓｉｇｎｅｄ  ｓｉＲＮＡ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  社製）を導入した皮膚支帯（Ｒｅｔｉｎａｃｕｌａ ｃｕｔｉｓ）細胞を２４時間培養した。
【００７９】
培養後の皮膚支帯（Ｒｅｔｉｎａｃｕｌａ ｃｕｔｉｓ）細胞をＰＢＳで洗浄し、４％ＰＦＡを用い、固定した。
【００８０】
固定後、ＰＢＳで洗浄し、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ／ＰＢＳを用い、処理した。
０．２％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ／ＰＢＳによる処理の後、ＰＢＳで洗浄し、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ５６８  Ｐｈａｌｌｏｄｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  社製）を用い、染色した。
【００８１】
染色後の皮膚支帯（Ｒｅｔｉｎａｃｕｌａ ｃｕｔｉｓ）細胞を、再度、ＰＢＳで洗浄し、ＤＡＰＩ  Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ−Ｇ  （ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ  社製）を用い、封入した。封入後の皮膚支帯（Ｒｅｔｉｎａｃｕｌａ ｃｕｔｉｓ）細胞について、共焦点顕微鏡による観察を行った。
結果を図４に示す。
【００８２】
（１−１−２）結果及び考察
図４に示した通り、アクチン関連タンパク質３Ｂ（ａｃｔｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ３  ｈｏｍｏｌｏｇ  Ｂ、ＡＣＴＲ３Ｂ）、リムキナーゼ−１（ＬＩＭ  ｋｉｎａｓｅ−１、ＬＩＭＫ１）、及びスーパービリン（ｓｕｒｐｅｒｖｉｌｌｉｎ、ＳＶＩＬ）のノックダウンによって、皮膚支帯（Ｒｅｔｉｎａｃｕｌａ ｃｕｔｉｓ）細胞内のアクチンが凝集することがわかった。
【００８３】
（１−２）若齢由来の皮膚支帯細胞における、アクチン関連タンパク質３Ｂ（ａｃｔｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ３  ｈｏｍｏｌｏｇ  Ｂ、ＡＣＴＲ３Ｂ）、リムキナーゼ−１（ＬＩＭ  ｋｉｎａｓｅ−１、ＬＩＭＫ１）、及びスーパービリン（ｓｕｒｐｅｒｖｉｌｌｉｎ、ＳＶＩＬ）をノックダウンした際のＣｏｌｌａｇｅｎ  Ｉ発現量の評価
【００８４】
（１−２−１）操作
ヒト正常皮下組織から取得した細胞をＯＧ（アウトグロース）法により培養した。培養した細胞から、皮膚支帯（Ｒｅｔｉｎａｃｕｌａ ｃｕｔｉｓ）細胞のみをＣｅｌｌ  Ｓｏｒｔｅｒ  ＳＨ８００（ＳＯＮＹ  社製）を用い、単離した。
【００８５】
単離した皮膚支帯（Ｒｅｔｉｎａｃｕｌａ ｃｕｔｉｓ）細胞を２４穴プレートに１．７×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように播種し、３７℃、５％ＣＯ２環境下で２４時間培養した。
【００８６】
次に、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）  Ｉ  Ｒｅｄｕｃｅｄ  Ｓｅｒｕｍ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  社製）を用い、Ｓｉｌｅｎｃｅ  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｐｒｅ−ｄｅｓｉｇｎｅｄ  ｓｉＲＮＡ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  社製）を調製した。
調製したＳｉｌｅｎｃｅ  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｐｒｅ−ｄｅｓｉｇｎｅｄ  ｓｉＲＮＡ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  社製）を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｍｉｎ  ＲＮＡｉＭＡＸ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  社製）を用い、培養後の皮膚支帯（Ｒｅｔｉｎａｃｕｌａ  ｃｕｔｉｓ）細胞に導入した。
【００８７】
Ｓｉｌｅｎｃｅ  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｐｒｅ−ｄｅｓｉｇｎｅｄ  ｓｉＲＮＡ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  社製）を導入した皮膚支帯（Ｒｅｔｉｎａｃｕｌａ ｃｕｔｉｓ）細胞を２４時間培養した。
【００８８】
培養後の皮膚支帯（Ｒｅｔｉｎａｃｕｌａ ｃｕｔｉｓ）細胞をＰＢＳで洗浄し、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ  社製）を用いてＲＮＡを回収した。回収したＲＮＡについて、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＶＩＬＯ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  社製）を用い、ｃＤＮＡを合成した。
【００８９】
ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ａｓｓａｙ  （ＱＩＡＧＥＮ  社製）を用いて定量的ＲＴ−ＰＣＲを行い、Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｉの遺伝子発現量を測定した。
ここで、遺伝子発現量は、内在性コントロールをβ-actinとし、比較ＣＴ法を用い、算出した。
結果を図５に示す。
【００９０】
（１−２−２）結果及び考察
図５に示した通り、アクチン関連タンパク質３Ｂ（ａｃｔｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ３  ｈｏｍｏｌｏｇ  Ｂ、ＡＣＴＲ３Ｂ）、リムキナーゼ−１（ＬＩＭ  ｋｉｎａｓｅ−１、ＬＩＭＫ１）、及びスーパービリン（ｓｕｒｐｅｒｖｉｌｌｉｎ、ＳＶＩＬ）のノックダウンによって、Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｉの遺伝子発現量が減少することがわかった。
【００９１】
＜試験４＞  スクリーニング手法の検討
試験４では、上記知見を基にした、スクリーニング手法の検討を行った。
【００９２】
（１）操作
（１−１）準備工程
ヒト正常皮下組織から取得した細胞をＯＧ（アウトグロース）法により培養した。培養した細胞から、皮膚支帯（Ｒｅｔｉｎａｃｕｌａ ｃｕｔｉｓ）細胞のみをＣｅｌｌ  Ｓｏｒｔｅｒ  ＳＨ８００（ＳＯＮＹ  社製）を用い、単離した。
【００９３】
単離した皮膚支帯（Ｒｅｔｉｎａｃｕｌａ ｃｕｔｉｓ）細胞を２４穴プレートに１．７×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように播種し、３７℃、５％ＣＯ２環境下で２４時間培養した。
【００９４】
（１−２）適用工程
別途、ヒト正常皮膚の皮下組織を除去し、処理した皮膚に１５ｍｍ径の穴あけを行い、ポピドンヨード（ｐｏｖｉｄｏｎｅ  ｉｏｄｉｎｅ）で洗浄後、ＰＢＳで洗浄した。
【００９５】
洗浄後のヒト正常皮膚をセルカルチャーインサート(スタンディングタイプ：  サーモフィッシャーサイエンティフィック  社製)に載せた。そして、１０ｍｍ径にカットした濾紙にスクリーニング対象となる物質を染み込ませ、ヒト正常皮膚中心部に配置した。
ヒト正常皮膚中心部に配置したセルカルチャーインサート(スタンディングタイプ：  サーモフィッシャーサイエンティフィック  社製)を、（１−１）で用意した皮膚支帯（Ｒｅｔｉｎａｃｕｌａ ｃｕｔｉｓ）細胞を播種した２４穴プレートに設置し、２４時間培養した。
【００９６】
（１−３）測定工程
２４時間培養後、培地を除いた後、ＰＢＳで洗浄した。その後、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ  社製）を用いてＲＮＡを回収し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＶＩＬＯ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  社製）を用いてｃＤＮＡを合成した。
【００９７】
ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ａｓｓａｙ（ＱＩＡＧＥＮ  社製）を用いて定量的ＲＴ−ＰＣＲを行い、皮膚支帯（Ｒｅｔｉｎａｃｕｌａ ｃｕｔｉｓ）における、以下のアクチン関連タンパク質３Ｂ（ａｃｔｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ３  ｈｏｍｏｌｏｇ  Ｂ、ＡＣＴＲ３Ｂ）、リムキナーゼ−１（ＬＩＭ  ｋｉｎａｓｅ−１、ＬＩＭＫ１）、及びスーパービリン（ｓｕｒｐｅｒｖｉｌｌｉｎ、ＳＶＩＬ）の遺伝子発現量を測定した。ここで、遺伝子発現量は、内在性コントロールをβ-actinとし、比較ＣＴ法を用いて算出した。
【００９８】
アクチン関連タンパク質３Ｂ（ａｃｔｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ３  ｈｏｍｏｌｏｇ  Ｂ、ＡＣＴＲ３Ｂ）、リムキナーゼ−１（ＬＩＭ  ｋｉｎａｓｅ−１、ＬＩＭＫ１）、及びスーパービリン（ｓｕｒｐｅｒｖｉｌｌｉｎ、ＳＶＩＬ）の測定値を基に、スクリーニング対象となる物質についての、Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｉの発現増大及び／又は発現減少抑制作用を有する抗皮膚老化剤としての有用性についての評価をすることができる。
【産業上の利用可能性】
【００９９】
本発明は、抗皮膚老化剤のスクリーニング方法に応用することができる。
【配列表フリーテキスト】
【０１００】
配列番号１  オーバーハングｓｉＲＮＡ
配列番号２  オーバーハングｓｉＲＮＡ
配列番号３  オーバーハングｓｉＲＮＡ
配列番号４  オーバーハングｓｉＲＮＡ
配列番号５  オーバーハングｓｉＲＮＡ
配列番号６  オーバーハングｓｉＲＮＡ
【図１】
2020128888.tif 000005
【図２】
2020128888.tif 000006
【図３】
2020128888.tif 000007
【図４】
2020128888.tif 000008
【図５】
2020128888.tif 000009
【配列表】
2020128888000001.app