(57)【要約】      （修正有）【課題】切断または折り畳まれたヘリックスペプチドまたはペプチド類似体、それらを含む抗菌組成物、それらに薬物が連結された接合体またはこれを含む抗生剤の提供。【解決手段】疎水性アミノ酸および親水性アミノ酸から構成されたαヘリックス両面性ペプチドが折り畳まれた構造を有するグラム陰性菌膜透過性ペプチドまたはペプチド類似体であって、ｉ）前記αヘリックス両面性ペプチドの疎水性アミノ酸の一部が、プロリン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、そのＤ‐型アミノ酸、およびその誘導体からなる群から選択される一つ以上で置換され折り畳まれたαヘリックス構造を有するか、またはｉｉ）前記αヘリックス両面性ペプチドを構成する少なくとも２個以上のアミノ酸が、一つ以上の位置でジスルフィド結合、炭素‐炭素結合、マレイミド結合またはアミド結合により連結され折り畳まれたαヘリックス構造を有する。【選択図】図１
2020128386.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
疎水性アミノ酸および親水性アミノ酸から構成されたαヘリックス両面性ペプチドが折り
畳まれた構造を有するグラム陰性菌膜透過性ペプチドまたはペプチド類似体であって、
ｉ）前記αヘリックス両面性ペプチドの疎水性アミノ酸の一部が、プロリン（Ｐ）、アス
パラギン酸（Ｄ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン酸（Ｅ）、グルタミン（Ｑ）、その
Ｄ‐型アミノ酸、およびその誘導体から構成された群から選択される一つ以上で置換され
折り畳まれたαヘリックス構造を有するか、または
ｉｉ）前記αヘリックス両面性ペプチドを構成する少なくとも２個以上のアミノ酸が、ｉ
、ｉ＋３、ｉ＋４、ｉ＋７、ｉ＋８、ｉ＋１０およびｉ＋１１（ｉは、整数）からなる群
から選択される一つ以上の位置でジスルフィド結合、炭素‐炭素結合、マレイミド結合ま
たはアミド結合により連結され折り畳まれたαヘリックス構造を有することを特徴とする
ペプチドまたはペプチド類似体。
【請求項２】
以下の特性のいずれか一つを示すことを特徴とする請求項１に記載のペプチドまたはペプ
チド類似体：
ｉ）宿主細胞に対する溶血活性やグラム‐陽性菌に対する活性が全くなく、且つグラム‐
陰性菌に対する活性を有する；
ｉｉ）グラム‐陰性菌の外膜の表面にあるＬＰＳ層と結合することができる性質を有する
；
ｉｉｉ）グラム‐陰性菌の外膜の表面にあるＬＰＳ層と結合することができる性質を有し
、且つ外膜に入って外膜にのみ存在する；
ｉｖ）グラム‐陰性菌の外膜を貫通して入り、外膜にのみ存在する性質を有し、且つグラ
ム‐陰性菌の外膜または内膜を崩壊する能力はない；
ｖ）同じアミノ酸組成を有するペプチドの中、相対的に親水性が強い；
ｖｉ）Ｐｒｏによってαヘリックスが折り畳まれた構造をしており、折り畳まれた部分は
疎水性を帯びている；及び
ｖｉｉ）カチオン荷電されたアミノ酸が総アミノ酸の数を基準として３５％以上であるか
、疎水性アミノ酸が総アミノ酸の数を基準として３５％以上である。
【請求項３】
前記αヘリックス両面性ペプチドは１２〜２０個の疎水性アミノ酸および親水性アミノ酸
からなることを特徴とする請求項１に記載のペプチドまたはペプチド類似体。
【請求項４】
前記両面性ペプチドのアルギニン、リシン、ヒスチジンからなる正電荷を帯びるアミノ酸
群から選択される一つ以上を含むことを特徴とする請求項１に記載のペプチドまたはペプ
チド類似体。
【請求項５】
前記疎水性アミノ酸は、ロイシン、バリン、トリプトファン、フェニルアラニン、タイロ
シン、イソロイシン、そのＤ‐型アミノ酸およびその誘導体から構成された群から選択さ
れる一つ以上であることを特徴とする請求項１に記載のペプチドまたはペプチド類似体。
【請求項６】
前記αヘリックス両面性ペプチドは、以下の式（１）または（１‐１）で表される５個の
アミノ酸配列、その逆配列またはこれを繰り返して含む配列を含むことを特徴とする請求
項１に記載のペプチドまたはペプチド類似体：
ＸＸＺＹＸ（１）
ＸＹＺＹＹ（１‐１）
前記式中、Ｘは親水性アミノ酸、
Ｙは疎水性アミノ酸、
Ｚは折り畳まれたまたは切断された構造のために置換されたアミノ酸であり、プロリン、
アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、またはその誘導体である。
【請求項７】
前記αヘリックス両面性ペプチドは、以下の式（２）、または（２‐１）で表される７個
のアミノ酸配列、その逆配列またはこれを繰り返して含む配列を含むことを特徴とする請
求項１に記載のペプチドまたはペプチド類似体：
ＹＸＸＺＹＸＹ（２）
ＹＸＹＺＹＹＸ（２‐１）
前記式中、Ｘ、ＹおよびＺは、請求項５に記載の定義と同様である。
【請求項８】
前記両面性ペプチドは、以下の式（３）または（３‐１）で表される９個のアミノ酸配列
、その逆配列またはこれを繰り返して含む配列を含むことを特徴とする請求項１に記載の
ペプチドまたはペプチド類似体：
ＹＹＸＸＺＹＸＹＹ（３）
ＹＹＸＹＺＹＹＸＹ（３‐１）
前記式中、Ｘ、ＹおよびＺは、請求項５に記載の定義と同様である。
【請求項９】
前記両面性ペプチドは、以下の式（４）または（４‐１）で表される１１個のアミノ酸配
列、その逆配列またはこれを繰り返して含む配列を含むことを特徴とする請求項１に記載
のペプチドまたはペプチド類似体：。
ＸＹＹＸＸＺＹＸＹＹＸ（４）
ＹＹＹＸＹＺＹＹＸＹＸ（４‐１）
前記式中、Ｘ、ＹおよびＺは、請求項５に記載の定義と同様である。
【請求項１０】
前記両面性ペプチドは、以下の式（５）で表される６個のアミノ酸配列、その逆配列また
はこれを繰り返して含む配列を含むことを特徴とする請求項１に記載のペプチドまたはペ
プチド類似体：
ＹＸＺＺＸＸ（５）
前記式中、Ｘ、ＹおよびＺは、請求項５に記載の定義と同様である。
【請求項１１】
前記両面性ペプチドは、以下の式（６）で表される８個のアミノ酸配列、その逆配列また
はこれを繰り返して含む配列を含むことを特徴とする請求項１に記載のペプチドまたはペ
プチド類似体：
ＹＹＸＺＺＸＸＹ（６）
前記式中、Ｘ、ＹおよびＺは、請求項５に記載の定義と同様である。
【請求項１２】
前記αヘリックス両面性ペプチドは、以下の式（７）で表される１０個のアミノ酸配列、
その逆配列またはこれを繰り返して含む配列を含むことを特徴とする請求項１に記載のペ
プチドまたはペプチド類似体：
ＸＹＹＸＺＺＸＸＹＹ（７）
前記式中、Ｘ、ＹおよびＺは、請求項５に記載の定義と同様である。
【請求項１３】
前記αヘリックス両面性ペプチドは、以下の式（８）で表される１２個のアミノ酸配列、
その逆配列またはこれを繰り返して含む配列を含むことを特徴とする請求項１に記載のペ
プチドまたはペプチド類似体：
ＸＸＹＹＸＺＺＸＸＹＹＸ（８）
前記式中、Ｘ、ＹおよびＺは、請求項５に記載の定義と同様である。
【請求項１４】
前記αヘリックス両面性ペプチドは、正電荷を帯びるアルギニン、ロイシンおよびヒスチ
ジンからなる群から選択される一つ以上の残基をペプチドを構成する総アミノ酸の３５％
以上含むことを特徴とする請求項１に記載のペプチドまたはペプチド類似体。
【請求項１５】
前記αヘリックス両面性ペプチドは、ロイシン、トリプトファン、バリン、フェニルアラ
ニン、タイロシン、およびイソロイシンから構成された群から選択される一つ以上の疎水
性アミノ酸残基をペプチドを構成する総アミノ酸の３５％ 以上含むことを特徴とする請
求項１に記載のペプチドまたはペプチド類似体。
【請求項１６】
前記αヘリックス両面性ペプチドは、以下の配列番号１または２で表される配列、その逆
配列またはこれを含む繰り返し配列を含むことを特徴とする請求項１に記載のペプチドま
たはペプチド類似体：
ＫＬＬＫＬ（配列番号１）
ＬＫＫＬＬ（配列番号２）。
【請求項１７】
前記αヘリックス両面性ペプチドは、以下の配列番号３または４で表される配列 、その
逆配列またはこれを含む繰り返し配列を含むことを特徴とする請求項１に記載のペプチド
またはペプチド類似体：
ＬＫＫＬＬＫＬ（配列番号３）
ＫＬＬＫＬＬＫ（配列番号４）。
【請求項１８】
前記αヘリックス両面性ペプチドのＮ末端からＣ末端の方向に６番、７番、８番、９番、
１１番および１２番位置から構成された群から選択される一つ以上の位置に存在するアミ
ノ酸が置換されることを特徴とする請求項１に記載のペプチドまたはペプチド類似体。
【請求項１９】
前記αヘリックス両面性ペプチドからプロリン、アスパラギン酸またはその誘導体で置換
されることを特徴とする請求項１に記載のペプチドまたはペプチド類似体。
【請求項２０】
前記αヘリックス両面性ペプチドは、ＬＫＫＬＬＫＬＬＫＫＬＬＫＬ（配列番号５）また
はＫＬＬＫＬＬＫＫＬＬＫＬＬＫ（配列番号６）であることを特徴とするペプチドでり、
配列番号５の７、８番ロイシン位置、または配列番号６の９番位置に折り畳まれた構造の
ために置換されたアミノ酸をを含むことを特徴とする請求項１に記載のペプチドまたはペ
プチド類似体。
【請求項２１】
請求項１〜２０の中いずれか一項によるペプチドまたはペプチド類似体を含む併用投与用
抗菌組成物。
【請求項２２】
前記ペプチドはｌｏｐＰ（ｐａｒｔｉｔｉｏｎ  ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）値が０．１９
以上の疎水性化合物、生理的ｐＨ条件でカチオンに荷電された化合物およびコリスチンか
ら構成された群から選択される一つ以上と、併用投与することを特徴とする請求項２１に
記載の組成物。
【請求項２３】
請求項１〜２０の中いずれか一項によるペプチドまたはペプチド類似体及び前記ペプチド
またはペプチド類似体に薬物が連結された接合体。
【請求項２４】
前記薬物はｌｏｐＰ（ｐａｒｔｉｔｉｏｎ  ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）値が０．１９以上
の疎水性化合物、生理的ｐＨ条件でカチオンに荷電された化合物およびコリスチンから構
成された群から選択される一つ以上であることを特徴とする請求項２３に記載の接合体。
【請求項２５】
前記ペプチドまたはペプチド類似体と薬物は共有結合により連結されることを特徴とする
請求項２３に記載の接合体。
【請求項２６】
請求項２１に記載の組成物を含む抗生剤。
【請求項２７】
請求項２３に記載の接合体を含む抗生剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、切断または折り畳まれたヘリックスペプチドまたはペプチド類似体およびそ
の用途に関し、より詳細には、本発明は、疎水性アミノ酸および親水性アミノ酸から構成
されたαヘリックス両面性ペプチドが折り畳まれた構造を有するグラム陰性菌膜透過性ペ
プチド、またはペプチド類似体またはそのグラム‐陰性菌特異的膜活性を用いた抗菌組成
物、併用投与用抗菌組成物、前記ペプチドまたはペプチド類似体に薬物が連結された接合
体またはこれを含む抗生剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
グラム‐陽性菌とグラム‐陰性菌とに分けられる抗菌薬物に対する耐性菌の割合はます
ます増加しており、既存に存在していたすべての薬に対する耐性を有する菌のみが存在す
る日がそれほど遠くない。かかる耐性菌による病院内感染（ｈｏｓｐｉｔａｌ‐ａｃｑｕ
ｉｒｅｄ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）が最も深刻な状態である。例えば、２０１４年の米国内
の患者だけ見ても病院内の感染患者数だけ約１７０万人であり、死亡者数は１０万人に達
している。この死亡者の数は、米国内の女性死亡率１位である乳癌死亡者と男性死亡率１
位である前立腺癌死亡者を合算した数よりも多い。
【０００３】
かかる耐性菌を克服するためには、新たな抗菌剤がリリースされ続ける必要がある。幸
いなことに、グラム‐陽性菌に対する新たな薬は、２０００年代に入ってもリリースされ
ているが、グラム‐陰性菌に対する抗菌治療剤は、１９８０年代を最後に新たにリリース
されていない。さらに、グラム‐陰性菌を制御できる新薬を開発するためのパイプ‐ライ
ンにも候補群の化合物がないため、新薬の開発のためには、少なくとも１０〜２０年の時
間を要する。
【０００４】
グラム‐陰性菌に対する新たな抗生剤は、寸刻を争って開発すべきにもかかわらず、薬
がないため、疾患のための格別の措置を取る必要がある。今までＦＤＡで承認された他の
用途に開発されたすべての薬をまたグラム‐陰性菌にスクリーニングし、新たな抗生剤と
して用いようとするリポジショニング（ｒｅｐｏｓｉｔｉｏｎｉｎｇ）またはリパーパシ
ング（ｒｅｐｕｒｐｏｓｉｎｇ）が試みられた。７２７個のうち、４２個はグラム‐陽性
菌に、２個はグラム‐陰性菌に効力があると知られている。しかし、これら２個は、非常
に高い濃度で効果があるため、実際、化合物の毒性などを考慮すると、スクリーニングに
より選別されたグラム‐陰性菌に作用可能なリポジショニング可能な薬物はない。
【０００５】
これに関し、グラム‐陽性菌に対する薬物は相当数が存在する一方、グラム‐陰性菌に
対する薬物は少ない方であり、これは、抗生剤の候補物質がグラム‐陰性菌が構築した外
膜を通過できないためであると考えられる。
【０００６】
ＬＰＳ（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）層から始まった外膜は、ＬＰＳ層に
よって親水性および疎水性をいずれも有しているため、ほとんどの低分子の薬が膜を自在
に通過できないことが多いためである。グラム‐陽性菌によく効きながらグラム‐陰性菌
に効かない抗生剤のほとんどが外膜を通過できないと知られている。代表的な薬としては
、リネゾリドおよびクロキサシリンなどがある。
【０００７】
したがって、グラム‐陰性菌の外膜は、新薬を開発するための主な標的であり、これを
分解または弱化する化合物は、グラム‐陰性菌の治療剤として使用することができる。実
際、多種の抗菌ペプチド（ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ、ＡＭＰ）がか
かる膜を分解するメカニズムとして抗菌効果を有する。かかるＡＭＰを用いて、膜によっ
て通過することができなかった抗生物質を菌の中に導入する方法を考慮してきた。この仮
説は、抗菌ペプチド／抗生剤の併行投与によるシナジー効果があるか否かに応じて立証さ
れ得る。
【０００８】
しかし、すでに報告された併行投与によるシナジー効果は、実験方法の誤謬による誤っ
た結果（ｆａｌｓｅ‐ｐｏｓｉｔｉｖｅ）と判明されており、抗菌ペプチド／抗生剤の間
にはシナジーがなかった。すなわち、膜を分解する抗菌ペプチドを用いて既存の抗生物質
のシナジーを高める方法は、期待ほどに作用しないことが判明された。抗菌ペプチドの膜
崩壊による抗生剤の菌内への浸透によるシナジーがないことは、たぶん時間差による不調
和、例えば、抗菌ペプチドは非常に速い速度で膜を崩壊する一方、ほとんどの抗生剤はこ
れよりも遅い速度で薬効を示すことから起因した現象であり得ると考えられる。
【０００９】
したがって、菌の膜を速い速度で分解して損傷するペプチドよりは、逆に、菌の膜を損
傷せず、且つ膜を通過して菌の中に入ることができたり、膜そのものに活性を与えること
ができ、膜を緩くするペプチドが、有用にシナジー効果を与えるペプチドになり得ると考
えられる。膜の硬直度のため膜を通過することができなかった抗生剤が、膜を通過できる
ことになり、シナジーを示すことができると判断される。
【００１０】
かかる技術的な背景の下で、本出願の発明者らは、特異的にグラム陰性菌の外膜にのみ
作用することで膜を緩くすることができる能力を有するグラム陰性菌膜活性ペプチドまた
はペプチド類似体およびその用途を確認し、本発明を完成した。
【発明の概要】
【００１１】
本発明の目的は、疎水性アミノ酸および親水性アミノ酸から構成されたαヘリックス両
面性ペプチドの疎水性アミノ酸の一部が置換された切断または折り畳まれたαヘリックス
構造を有するペプチドまたはペプチド類似体を提供することにある。
【００１２】
本発明の他の目的は、前記ペプチドまたはペプチド類似体を含む併用投与用抗菌組成物
を提供することにある。
【００１３】
本発明のさらに他の目的は、ペプチドまたはペプチド類似体および前記ペプチドに薬物
が連結された接合体を提供することにある。
【００１４】
前記目的を解決するために、本発明は、疎水性アミノ酸および親水性アミノ酸から構成
されたαヘリックス両面性ペプチドが折り畳まれた構造を有するグラム陰性菌膜透過性ペ
プチドまたはペプチド類似体であって、
ｉ）前記αヘリックス両面性ペプチドまたはペプチド類似体の疎水性アミノ酸の一部が
、プロリン（Ｐ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン酸（Ｅ）、
グルタミン（Ｑ）、そのＤ‐型アミノ酸、およびその誘導体から構成された群から選択さ
れる一つ以上で置換され折り畳まれたαヘリックス構造を有し、または
ｉｉ）前記αヘリックス両面性ペプチドを構成する少なくとも２個以上のアミノ酸が、
ｉ、ｉ＋３、ｉ＋４、ｉ＋７、ｉ＋８、ｉ＋１０およびｉ＋１１（ｉは、整数）からなる
群から選択される一つ以上の位置でジスルフィド結合、炭素‐炭素結合、マレイミド結合
またはアミド結合により連結され折り畳まれたαヘリックス構造を有することを特徴とす
るペプチドまたはペプチド類似体を提供する。
【００１５】
場合に応じて、本発明は、両面性抗菌ペプチドのうち（例えば、ｂｕｆｏｒｉｎ５‐２
１）疎水性部分が、プロリン（Ｐ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アスパラギン（Ｎ）、グル
タミン酸（Ｅ）、グルタミン（Ｑ）により置換され折り畳まれたαヘリックス構造を有す
ることを特徴とするペプチドまたはペプチド類似体を提供する。
【００１６】
また、本発明は、前記ペプチドまたはペプチド類似体を含む併用投与用抗菌組成物を提
供する。
【００１７】
また、本発明は、前記ペプチドまたはペプチド類似体および前記ペプチドに薬物が連結
された接合体を提供する。
【００１８】
さらに、本発明は、前記組成物または接合体を含む抗生剤を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】５個の突然変異ペプチドＰ、Ｎ、Ｄ、ＱまたはＥに蛍光標識子であるＴＡＭＲＡをつけて実際に本発明に係るペプチドがグラム‐陰性菌の外膜に透過されるか否かをＦＡＣＳ実験で確認した結果を示す図である。
【図２】ＦＡＣＳを用いて本発明に係るペプチドのＭＤＡ  ＭＢ２３１真核細胞に対する透過度を確認した結果を示す図である。
【図３】ＬＫまたはＫＬペプチドのうち最も低い溶血現象を示すペプチドを示す結果である。
【図４】本発明に係るペプチドがグラム‐陰性菌の膜に対する透過性および活性を有しているか否かを包括的に確認した結果を示す図である。
【図５】本発明に係るペプチドが膜を活性化するメカニズムを確認するためにＥ．ｃｏｌｉの存在下でＮＰＮ（Ｎａｐｈｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌａｍｉｎｅ）を用いた蛍光を観察した結果を示す図である。
【図６】本発明に係るペプチドがグラム‐陰性菌の外壁または内壁に対する分解力または分解能を有しているか否かを観察した結果を示す図である。
【図７】ＤＬＳによるＬＰＳからなるリポソームおよびペプチドの存在下でのリポソームサイズの変化を示す図である。
【図８】ＴＡＭＲＡ接合されたペプチドを処理したＥ．ｃｏｌｉでＮＤｍ‐１染色に対する共焦点顕微鏡画像を示す図である。
【図９】ＫＬ‐Ｌ９Ｐとリネゾリドまたはクロキサシリンのシナジー効果を確認した結果を示す図である。
【図１０】ＫＬ‐Ｌ９Ｐとレスベラトロールのシナジー効果を確認した結果を示す図である。
【図１１】併用投与される化合物の親水性または疎水性を示すｌｏｇＰとシナジー効果との相関関係を図式化した結果を示す図である。
【図１２】併用投与される化合物の分子量とシナジー効果との相関関係を図式化した結果を示す図である。
【図１３】併用投与される候補化合物の全体とシナジー効果との相関関係を図式化した結果を示す図である。
【図１４】負電荷または正電荷で荷電された化合物の極性表面積（ｐｏｌａｒ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｒｅａ）および分子量とシナジー効果との相関関係を図式化した結果を示す図である。
【図１５】両面性αヘリックス構造のペプチドと本発明に係る折り畳まれたまたは切断された構造のペプチドを比較して図式化したものである。
【図１６】本発明において、グラム‐陰性菌の外膜活性があって抗生剤とシナジー効果を示す３個のペプチドをホイールダイヤグラム（ｗｈｅｅｌ  ｄｉａｇｒａｍ）に図式化したものである（一般的に両面性ペプチドの疎水面がプロリンによって損傷して折り畳まれた（図１５参照）構造を示す）。
【図１７】シナジー効果を評価するためのＷｉｍｌｅｙの方法（ＢＢＡ，２０１５，ｖ．１８４８（１），ｐｐ．８‐１５．）を示す図である。
【図１８】ＫＬ‐Ｌ９Ｐとシナジー効果がある抗生剤（黒色で表示）とない抗生剤（灰色で表示）とを区分して示す図である。
【図１９】ＫＬ‐Ｌ９Ｐとシナジー効果がある非抗生剤薬物、ニュートラシューティカル（Ｎｅｕｔｒａｃｅｕｔｉｃａｌ）（黒色）とない非抗生剤薬物、ニュートラシューティカル（Ｎｅｕｔｒａｃｅｕｔｉｃａｌ）（灰色）とを区分して示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
今まで知られたグラム‐陰性菌を撲滅することができる抗菌ペプチド（ａｎｔｉｍｉｃ
ｒｏｂｉａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ；ＡＭＰ）がいくつか知られている。しかし、これらの多
くは、バクテリアの細胞壁を崩壊させるメカニズムで病原体を撲滅している。かかるペプ
チドは、病原体であるグラム‐陰性菌の細胞壁を崩壊させるだけでなく、宿主細胞である
真核細胞も崩壊させるため、抗生剤として使用するには副作用が大きい。ただし、これら
のＡＭＰを様々に突然変異させると、性質が少しずつ変わることになる。このうち特定の
突然変異は、真核細胞に対する細胞壁の崩壊が減少するだけでなく、グラム‐陰性菌の膜
を特異的に通過するか外膜のみ活性化する能力のみを残して、グラム‐陰性菌特異的な性
質のみを示すこともある。
【００２１】
したがって、本発明者らは、両面性ヘリックス構造を有しているペプチドを突然変異さ
せ続けることで、グラム‐陰性菌に細胞透過性質が残っていながら宿主細胞である真核細
胞に対する溶血や透過が全くないペプチドを見付けることを試みた。
【００２２】
１９５０年代初めに開発されたものの毒性が強くてグラム‐陰性菌治療剤としてよく使
用されていない化合物が、ポリミキシン系の抗生剤であるコリスチンである。コリスチン
は、カチオンが豊かな環状を有しており、一方に長い炭素鎖を有する両面性ペプチドであ
る。反応メカニズムは、先ず、コリスチンがグラム‐陰性菌の外膜に存在するＬＰＳの脂
質層を認識し、外膜の中に入って外膜を緩くし、長い炭素鎖部分のため内膜も貫通して菌
を殺すと知られている。すなわち、コリスチン抗菌ペプチドのメカニズムは、他の抗菌ペ
プチドのように迅速に菌膜を取り除くのではなく、長時間膜に滞留しながら膜を緩くする
ことができる性質を有しており、実際、いくつの低分子抗生剤分子とのシナジーを観察で
きることが報告されている。かかるコリスチンは、外膜を緩くする役割をする黄金基準（
ｇｏｌｄｅｎ  ｓｔａｎｄａｒｄ）として使用されており、グラム‐陰性菌以外の真核細
胞の膜には比較的作用しない面がある。本発明では、外膜を刺激することはコリスチンと
類似しているが、さらに毒性がなく、外膜を振動させる能力がより極大化したペプチドを
両面性ペプチドの突然変異から見出すことを目的とする。
【００２３】
αヘリックスを減少させながらグラム‐陰性菌を退治することができる折り畳まれたま
たは切断された構造を有する一部の突然変異ペプチドの様々な突然変異に関する研究と関
連し、そのうち疎水面の最も敏感な部分を親水性残基を有するアミノ酸で置換すると、α
ヘリックスの折り畳まれたまたは切断された構造によって宿主細胞に対する活性が無くな
り、副作用を最小化できることを確認した。その他にも、折り畳まれたまたは切断された
構造を有する一部の突然変異ペプチドは、グラム‐陰性菌であるＥ．ｃｏｌｉの膜を分解
または通過することで菌の中に入ることができることから、グラム‐陰性菌を殺すか、少
なくとも膜を緩くする可能性があることを見出した。
【００２４】
これに基づいて、本発明は、一観点から、疎水性アミノ酸および親水性アミノ酸から構
成されたαヘリックス両面性ペプチドの疎水性アミノ酸の一部が置換され折り畳まれたま
たは切断されたαヘリックス構造を有するペプチドまたはペプチド類似体であって、この
際、置換されたアミノ酸は、プロリン（Ｐ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アスパラギン（Ｎ
）、グルタミン酸（Ｅ）、グルタミン（Ｑ）、そのＤ‐型アミノ酸、およびその誘導体か
ら構成された群から選択される一つ以上であることを特徴とするペプチドまたはペプチド
類似体に関する（例えば、図１６のＢ（ＫＬ‐Ｌ９Ｐ）およびＣ（ＬＫ‐Ｌ８Ｄ）構造）
。
【００２５】
場合に応じて、本発明は、自然に存在する両面性抗菌ペプチドのうち（例えば、ｂｕｆ
ｏｒｉｎ５‐２１）疎水性部分が、プロリン（Ｐ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アスパラギ
ン（Ｎ）、グルタミン酸（Ｅ）、グルタミン（Ｑ）により置換され折り畳まれたαヘリッ
クス構造を有することを特徴とするペプチドまたはペプチド類似体に関する（図１６のＡ
構造）。本明細書において、「折り畳まれた」とは、明細書における「折り曲げられた、
曲がったまたは切断された」と併用して同じ意味で使用可能であり、前記「折り畳まれた
」構造は、疎水性アミノ酸および親水性アミノ酸から構成されたαヘリックス両面性ペプ
チドの疎水性アミノ酸の一部が置換され形成された構造であってもよく、αヘリックス両
面性ペプチドでアミノ酸置換部分を中心にαヘリックスが折り曲げられている形態であっ
てもよい。
【００２６】
この際、置換されたアミノ酸は、プロリン（Ｐ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アスパラギ
ン（Ｎ）、グルタミン酸（Ｅ）、グルタミン（Ｑ）、そのＤ‐型アミノ酸、およびその誘
導体から構成された群から選択される一つ以上である。
【００２７】
特に、疎水性アミノ酸から構成された疎水面をプロリン（Ｐ）を用いて突然変異させて
ペプチドを作製すると、ＡＭＰの一般的な性質のように膜を損傷することなく膜を特異的
に活性化することができることが判明された。すなわち、本発明に係るペプチドは、膜の
内側へ通過したり、または膜を緩くすることで他の低分子化合物が菌の中への浸入を容易
にすることが期待されている。これを用いると、膜を緩くするコリスチンのように抗生剤
などとのシナジー効果を奏することを期待できるようになり、他の用途で使用している治
療剤のリポジショニング（ｒｅｐｏｓｉｔｉｏｎｉｎｇ）も可能となった。
【００２８】
これと関連し、図１５によると、Ａは折り畳まれるか切断されていない構造の両面性α
ヘリックスＫＬペプチド構造に相当し、Ｂ‐１は９番位置のＬをプロリンで置換して形成
されたＫＬ‐Ｌ９Ｐペプチドであり、Ｂ‐２は７および８番位置のＬをプロリンで置換し
て形成されたＬＫ‐Ｌ７ＰＬ８Ｐペプチドであり、Ｂ‐３は８番位置のＬをアスパラギン
酸で置換したＬＫ‐Ｌ８Ｄペプチドを示す。
【００２９】
また、図１６によると、折り畳まれるか切断されていない構造の両面性αヘリックスペ
プチドは、一種の完全な円筒構造を維持するが、折り畳まれたまたは切断されたペプチド
は、アミノ酸が置換された部分で折り曲げられた形状を有し得る。
【００３０】
前記例示されたアミノ酸のＤ‐型アミノ酸は、Ｌ‐型アミノ酸とは異なり、天然状態で
存在しないアミノ酸であり、Ｄ‐型アミノ酸で置換されると、最初のペプチドと部分異性
体をなすペプチドを提供することができる。Ｄ‐型アミノ酸で置換されると、アミノ酸残
基の配列が変化してαヘリックスをさらに壊す可能性があり、宿主細胞に対する毒性をさ
らに減少させる可能性と、自然的な酵素による攻撃から保護されて生体内の半減期を増加
させる可能性がある。
【００３１】
前記例示されたアミノ酸の誘導体は、アミノ酸に様々な保護基を含有している形態であ
ってもよく、例えば、プロリンの誘導体として、アゼチジン‐２‐カルボン酸（Ａｚｅｔ
ｉｄｉｎｅ‐２  ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）、ホモプロリン（Ｈｏｍｏｐｒｏｌ
ｉｎｅ）、ヒドロキシプロリン（Ｈｙｄｒｏｘｙｐｏｒｌｉｎｅ）、αメチルプロリン（
Ａｌｐｈａ  ｍｅｔｈｙｌｐｒｏｌｉｎｅ）、または４‐フルオロプロリン（４‐ｆｌｕ
ｏｒｏｐｒｏｌｉｎｅ）であり、グルタミン酸の誘導体として、αアミノアジピン酸（ａ
ｌｐｈａ  ａｍｉｎｏ  ａｄｉｐｉｃ  ａｃｉｄ）、γヒドロキシルグルタミン酸（ｇａ
ｍｍａ  ｈｙｄｒｏｘｙｌ  ｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ）、２‐アミノヘプタン二酸（
２‐ａｍｉｎｏ  ｈｅｐｔａｎｅｄｉｏｉｃ  ａｃｉｄ）、またはαアミノスベリン酸（
ａｌｐｈａ  ａｍｉｎｏ  ｓｕｂｅｒｉｃ  ａｃｉｄ）であってもよく、これに制限され
るものではない。本明細書において使用された誘導体に対して、前記のような定義および
例示が同様に適用され得る。
【００３２】
また、本発明に係るグラム陰性菌膜透過性ペプチドは、αヘリックス両面性ペプチドを
構成する少なくとも２個以上のアミノ酸が、ｉ、ｉ＋３、ｉ＋４、ｉ＋７、ｉ＋８、ｉ＋
１０およびｉ＋１１（ｉは、整数）からなる群から選択される一つ以上の位置で、ジスル
フィド結合、炭素‐炭素結合、マレイミド結合またはアミド結合により連結され折り畳ま
れたαヘリックス構造を有する。前記ステープル構造は、本出願の発明者らによって出願
されたＷＯ２０１６／０８５２８０に開示されており、本出願に参照として組み込まれる
。
【００３３】
前記ペプチドまたはペプチド類似体は、以下の特性のいずれか一つを示すことができる
。
ｉ）宿主細胞に対する溶血活性やグラム‐陽性菌に対する活性が全くなく、且つグラム
‐陰性菌に対する活性を有する。
ｉｉ）グラム‐陰性菌の外膜の表面にあるＬＰＳ層と結合することができる性質を有す
る。
ｉｉｉ）グラム‐陰性菌の外膜の表面にあるＬＰＳ層と結合することができる性質を有
し、且つ外膜に入って外膜にのみ存在する。
ｉｖ）グラム‐陰性菌の外膜を貫通して入り、外膜にのみ存在する性質を有し、且つグ
ラム‐陰性菌の外膜または内膜を崩壊する能力はない。
ｖ）同じアミノ酸組成を有するペプチド、例えば、親水性アミノ酸および疎水性アミノ
酸を含み、且つ一部のアミノ酸が、プロリン（Ｐ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アスパラギ
ン（Ｎ）、グルタミン酸（Ｅ）、グルタミン（Ｑ）、そのＤ‐型アミノ酸、およびその誘
導体で置換されたペプチドと比較して、本発明に係る両面性ペプチドのうち特定の位置、
例えば、αヘリックス両面性ペプチドでＮ末端からＣ末端の方向に６番、７番、８番、９
番、１１番および１２番位置から構成された群から選択される一つ以上の位置に、疎水性
アミノ酸が、プロリン（Ｐ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン
酸（Ｅ）、グルタミン（Ｑ）、そのＤ‐型アミノ酸、およびその誘導体で置換されたペプ
チドが、相対的に親水性が強い。
ｖｉ）Ｐｒｏによってαヘリックスが折り畳まれた構造をしており、折り畳まれた部分
は疎水性を帯びている。
ｖｉｉ）カチオン荷電されたアミノ酸が全体的に３５％（６／１６）、またはそれ以上
であるか、疎水性アミノ酸が全体的に３５％（６／１６）またはそれ以上である。
ｖｉｉｉ）宿主細胞に対する溶血活性およびグラム‐陽性菌に対する活性はない。
ｉｘ）グラム‐陰性菌に対する活性が弱く残っている（ＭＩＣ＝１０〜２０μＭ）。
【００３４】
本発明は、また、「ペプチド類似体」を含む。前記ペプチド類似体は、アミノ酸の側鎖
またはα‐アミノ酸バックボーンに対して一つ以上の他の官能基で置換された類似体を含
んでもよい。側鎖またはバックボーン修飾化ペプチド類似体の例としては、ピロリジン環
がヒドロキシ基で置換されたヒドロキシプロリン、またはＮ‐メチルグリシン「ペプトイ
ド」が挙げられる。
【００３５】
一実施形態において、前記両面性ペプチドの親水性アミノ酸は、アルギニン、リシン、
ヒスチジンからなる正電荷を帯びるアミノ酸群から選択される一つ以上を含んでもよい。
また、前記疎水性アミノ酸は、ロイシン、バリン、トリプトファン、フェニルアラニン、
タイロシン、イソロイシン、そのＤ‐型アミノ酸およびその誘導体から構成された群から
選択される一つ以上であってもよい。
【００３６】
前記例示されたアミノ酸のＤ‐型アミノ酸は、上述のとおり、天然状態で存在しないア
ミノ酸であり、Ｄ‐型アミノ酸で置換されると、最初のペプチドと部分異性体をなすペプ
チドを提供することができる。
【００３７】
一実施形態において、前記αヘリックス両面性ペプチドは、以下の式（１）または（１
‐１）で表される５個のアミノ酸配列、その逆配列またはこれを繰り返して含む配列を含
んでもよい。
【００３８】
ＸＸＺＹＸ（１）
ＸＹＺＹＹ（１‐１）
【００３９】
前記式中、Ｘは親水性アミノ酸、Ｙは疎水性アミノ酸、Ｚは折り畳まれたまたは切断さ
れた構造のために置換されたアミノ酸であり、プロリン、アスパラギン酸、アスパラギン
、グルタミン酸、グルタミン、またはその誘導体である。この際、前記親水性アミノ酸は
、アルギニン、ロイシン、ヒスチジン、またはその誘導体であってもよく、疎水性アミノ
酸は、ロイシン、バリン、トリプトファン、フェニルアラニン、タイロシン、イソロイシ
ン、またはその誘導体であってもよい。
【００４０】
前記の式（１）または（１‐１）に相当するペプチドの具体的な配列の例としては、Ｋ
ＫＰＬＫ、ＫＬＤＫＫまたはＱＦＰＶＧであってもよい。
【００４１】
前記逆配列は、５´末端から３´末端の方向に読み込まれる前記の式（１）または（１
‐１）で定義された配列を３´末端から５´末端の方向に読み込んだ配列を意味し、例え
ば、前記式（１）で表される５個のアミノ酸配列の逆配列は、ＸＹＺＸＸであってもよい
。
【００４２】
前記配列を含む繰り返し配列は、前記の式（１）または（１‐１）で定義された配列を
５´末端から３´末端の方向に、数回、例えば、２〜１０回、好ましくは２〜５回繰り返
して含む配列を意味してもよく、例えば、前記の式（１）または（１‐１）で定義された
配列を２回繰り返した場合、ＸＸＺＹＸＸＸＺＹＸの配列を含んでもよい。
【００４３】
場合に応じて、前記アミノ酸配列をダイマーやテトラマー形態で作製してもよい。
【００４４】
また、前記αヘリックス両面性ペプチドは、以下の式（２）、または（２‐１）で表さ
れる７個のアミノ酸配列、その逆配列またはこれを繰り返して含む配列を含んでもよい。
【００４５】
ＹＸＸＺＹＸＹ（２）
ＹＸＹＺＹＹＸ（２‐１）
【００４６】
前記式中、Ｘ、ＹおよびＺは、前記の式（１）での定義と同様である。
【００４７】
前記式（２）または（２‐１）に相当するペプチドの具体的な配列の例としては、ＬＫ
ＫＰＬＫＬ、またはＬＫＬＤＫＫＬであってもよい。
【００４８】
また、前記両面性ペプチドは、以下の式（３）または（３‐１）で表される９個のアミ
ノ酸配列、その逆配列またはこれを繰り返して含む配列を含んでもよい。
【００４９】
ＹＹＸＸＺＹＸＹＹ（３）
ＹＹＸＹＺＹＹＸＹ（３‐１）
【００５０】
前記式中、Ｘ、ＹおよびＺは、前記の式（１）での定義と同様である。
【００５１】
前記式（３）または（３‐１）に相当するペプチドの具体的な配列の例としては、ＬＬ
ＫＫＰＬＫＬＬ、ＬＬＫＬＤＫＫＬＬまたはＧＬＱＦＰＶＧＲＶであってもよい。
【００５２】
また、前記両面性ペプチドは、以下の式（４）または（４‐１）で表される１１個のア
ミノ酸配列、その逆配列またはこれを繰り返して含む配列を含んでもよい。
【００５３】
ＸＹＹＸＸＺＹＸＹＹＸ（４）
ＹＹＹＸＹＺＹＹＸＹＸ（４‐１）
【００５４】
前記式中、Ｘ、ＹおよびＺは、前記の式（１）での定義と同様である。
【００５５】
前記式（４）または（４‐１）に相当するペプチドの具体的な配列の例としては、ＫＬ
ＬＫＫＰＬＫＬＬＫ、ＫＬＬＫＬＤＫＫＬＬＫまたはＡＧＬＱＦＰＶＧＲＶＨであっても
よい。
【００５６】
また、前記両面性ペプチドは、以下の式（５）で表される６個のアミノ酸配列、その逆
配列またはこれを繰り返して含む配列を含んでもよい。
ＹＸＺＺＸＸ（５）
【００５７】
前記式中、Ｘ、ＹおよびＺは、前記の式（１）での定義と同様である。
【００５８】
前記式（５）に相当するペプチドの具体的な配列の例としては、ＬＫＰＰＫＫであって
もよい。
【００５９】
また、前記両面性ペプチドは、以下の式（６）で表される８個のアミノ酸配列、その逆
配列またはこれを繰り返して含む配列を含んでもよい。
【００６０】
ＹＹＸＺＺＸＸＹ（６）
【００６１】
前記式中、Ｘ、ＹおよびＺは、前記の式（１）での定義と同様である。
【００６２】
前記式（７）に相当するペプチドの具体的な配列の例としては、ＬＬＫＰＰＫＫＬであ
ってもよい。
【００６３】
また、前記αヘリックス両面性ペプチドは、以下の式（７）で表される１０個のアミノ
酸配列、その逆配列またはこれを繰り返して含む配列を含んでもよい。
【００６４】
ＸＹＹＸＺＺＸＸＹＹ（７）
【００６５】
前記式中、Ｘ、ＹおよびＺは、前記の式（１）での定義と同様である。
【００６６】
前記式（７）に相当するペプチドの具体的な配列の例としては、ＫＬＬＫＰＰＫＫＬＬ
であってもよい。
【００６７】
また、前記αヘリックス両面性ペプチドは、以下の式（８）で表される１２個のアミノ
酸配列、その逆配列またはこれを繰り返して含む配列を含んでもよい。
【００６８】
ＸＸＹＹＸＺＺＸＸＹＹＸ（８）
【００６９】
前記式中、Ｘ、ＹおよびＺは、前記の式（１）での定義と同様である。
【００７０】
前記式（８）に相当するペプチドの具体的な配列の例としては、ＫＫＬＬＫＰＰＫＫＬ
ＬＫであってもよい。
【００７１】
一実施形態において、前記αヘリックス両面性ペプチドは、１２〜２０個、好ましく１
２〜１８個、好ましく１２〜１６個、好ましく１２〜１４個の疎水性アミノ酸および親水
性アミノ酸から構成されてもよい。
【００７２】
場合に応じて、前記αヘリックス両面性ペプチドは、正電荷を帯びるアルギニン、ロイ
シンおよびヒスチジンからなる群から選択される一つ以上の残基をペプチドを構成する総
アミノ酸の３５％以上含んでもよい。
【００７３】
また、ロイシン、トリプトファン、バリン、フェニルアラニン、タイロシン、およびイ
ソロイシンから構成された群から選択される一つ以上の疎水性アミノ酸残基をペプチドを
構成する総アミノ酸の３５％以上を含んでもよい。
【００７４】
一実施形態において、前記αヘリックス両面性ペプチドは、以下の配列番号１または２
で表される配列ＫＬＬＫＬ（配列番号１）またはＬＫＫＬＬ（配列番号２）、その逆配列
またはこれを含む繰り返し配列を含んでもよい。この際、前記配列番号１または２の前段
に（ＬＫ）ｎまたは（ＫＬ）ｎ、または後段に（ＬＫ）ｍまたは（ＫＬ）ｍのアミノ酸が
さらに結合してもよく、前記ｎまたはｍは、それぞれ独立して、０〜２の整数であっても
よい。
【００７５】
他の一実施形態において、前記αヘリックス両面性ペプチドは、以下の配列番号３また
は４で表される配列ＬＫＫＬＬＫＬ（配列番号３）またはＫＬＬＫＬＬＫ（配列番号４）
、その逆配列またはこれを含む繰り返し配列を含んでもよい。この際、前記配列番号３ま
たは４の前段に（ＬＫ）ｎまたは（ＫＬ）ｎ、または後段に（ＬＫ）ｍまたは（ＫＬ）ｍ
のアミノ酸がさらに結合してもよく、前記ｎまたはｍは、それぞれ独立して、０〜２の整
数であってもよい。
【００７６】
かかるαヘリックス両面性ペプチドのうち折り畳まれたまたは切断されたペプチド構造
を形成するために、例えば、αヘリックス両面性ペプチドのＮ末端からＣ末端の方向に６
番、７番、８番、９番、１１番および１２番位置から構成された群から選択される一つ以
上の位置に存在するアミノ酸が置換されてもよい。この際、置換されるアミノ酸は、例え
ば、プロリン、アスパラギン酸またはその誘導体で置換されてもよい。
【００７７】
本発明に係る実施形態において、前記αヘリックス両面性ペプチドは、ＬＫＫＬＬＫＬ
ＬＫＫＬＬＫＬ（配列番号５）またはＫＬＬＫＬＬＫＫＬＬＫＬＬＫ（配列番号６）であ
り、配列番号５の７、８番ロイシン位置、または配列番号６の９番位置に折り畳まれた構
造のために置換されたアミノ酸を含んでもよい。この際、置換されたアミノ酸は、プロリ
ン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、またはその誘導体、好
ましくは、プロリン、アスパラギン酸またはその誘導体で置換されたアミノ酸配列を含ん
でもよい。
【００７８】
本発明は、他の観点から、前記ペプチドまたはペプチド類似体を含む抗菌組成物、特に
、グラム‐陰性菌に対する抗菌組成物、または併用投与用抗菌組成物に関する。特に、本
発明は、前記組成物を投与するステップを含む微生物感染疾患を予防または治療する方法
に関する。本発明は、さらに他の観点から、前記組成物を含む抗生剤に関する。
【００７９】
この際、前記微生物は、病原性微生物または耐性菌、好ましくは、グラム陰性菌の病原
性微生物または耐性菌を意味する。本発明において、「予防」とは、組成物の投与により
、前記病原性微生物または耐性菌による感染疾患を抑制したり発病を遅らせるすべての行
為を意味し、「治療」とは、組成物の投与により、病原性微生物または耐性菌感染疾患に
よる症状が好転したり良好に変更するすべての行為を意味することができる。
【００８０】
前記組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含んでもよい。前記「薬学的に許容可
能な担体」とは、任意の対象組成物または成分を一つの機関、または身体の部分から他の
機関、または身体の部分への運搬または輸送に関る液体または固体充填剤、希釈剤、賦形
剤、溶媒またはカプセル化物質のような製薬上許容可能な物質、組成物またはビヒクルを
指し、本発明における組成物は、投与のために、前記の有効成分以外に薬学的に許容可能
な担体、賦形剤または希釈剤をさらに含んでもよい。前記担体、賦形剤および希釈剤とし
ては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリ
トール、エリトリトール、マルチトール、デンプン、アカシアゴム、アルジネート、ゼラ
チン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース
、非晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロ
ピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウムおよび鉱物油が挙げら
れる。
【００８１】
また、本発明の組成物は、それぞれ通常の方法により、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル
剤、懸濁液、エマルション、シロップ、エアロゾルなどの経口型剤形、外用剤、坐剤また
は滅菌注射溶液の形態に剤形化して使用してもよい。詳細には、剤形化する場合、通常使
用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤
を使用して調剤されてもよい。経口投与のための固形製剤としては、錠剤、丸剤、散剤、
顆粒剤、カプセル剤などを含むが、これに限定されるものではない。かかる固形製剤は、
少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、デンプン、カルシウムカボネート、スクロース、
ラクトース、ゼラチンなどを混合して調剤されてもよい。また、単なる賦形剤以外にもス
テアリン酸マグネシウム、タルクといった潤滑剤も使用されてもよい。経口投与のための
液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などを含むが、これに限定され
ず、よく使用される単純希釈剤である水、流動パラフィンの他に、様々な賦形剤、例えば
、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などを添加して調剤されてもよい。非経口投与のため
の製剤は、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤および坐剤を含
む。非水性溶剤および懸濁剤としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール
、オリーブオイルのような植物性オイル、エチルオレエートのような注射可能なエステル
などが使用されてもよい。坐剤の基剤としては、ウィテップゾール、マクロゴール、ツイ
ン６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどが使用されてもよい。
【００８２】
本発明に係る組成物は、目的とする方法に応じて経口投与または非経口投与（例えば、
静脈内、皮下、腹腔内または局所に適用）してもよく、投与量は、患者の状態および体重
、疾病の程度、薬物形態、投与経路および期間に応じて異なるが、当業者により適宜選択
されてもよい。必要に応じて、１日１回〜数回に分けて投与してもよく、病原性細菌およ
び耐性菌に対する予防または治療のために、単独で、または手術、ホルモン治療、薬物治
療および生物学的反応調節剤を使用する方法と併用して使用してもよい。
【００８３】
本明細書において、前記併用投与は、併行投与と交互に使用してもよく、併用投与形態
は、ペプチドまたはペプチド類似体とその他の化合物を同時投与するか、または個別投与
する形態をいずれも含んでもよい。この際、ｌｏｐＰ（ｐａｒｔｉｔｉｏｎ  ｃｏｅｆｆ
ｉｃｉｅｎｔ）値が０．１９以上の疎水性化合物、生理的ｐＨ条件でカチオンに荷電され
た化合物およびコリスチンから構成された群から選択される一つ以上と、本発明に係るペ
プチドまたはペプチド類似体とを併用投与してもよい。
【００８４】
前記ｌｏｐＰ（ｐａｒｔｉｔｉｏｎ  ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）値が０．１９以上の疎
水性化合物は、例えば、クロキサシリン、リネゾリド、レスベラトロール、カルクミン、
ケルセチン、シンバスタチン、ロバスタチン、メバスタチンカテキン、またはチモールで
あってもよいが、これに制限されるものではない。
【００８５】
前記生理的ｐＨ条件、例えば、ｐＨ７．３〜７．４でカチオンに荷電された化合物は、
例えば、エリスロマイシン、リファンピシン、コリスチン、ポリミキシン‐ｂ、またはニ
コチンであってもよいが、これに制限されるものではない。
【００８６】
前記生理的ｐＨ条件、例えば、ｐＨ７．３〜７．４でアニオンに荷電された化合物は、
例えばイブプロフェン、アトルバスタチン、フルバスタチン、プラバスタチン、カルプロ
フェン、トランス‐フェルラ酸、またはブロムフェナクなどであってもよいが、これに制
限されるものではない。
【００８７】
一実施形態において、本発明に係るペプチドまたはペプチド類似体との併用投与により
シナジー効果、例えば、併用投与対象の複数のペプチドまたはペプチド類似体または化合
物由来の効果が単純に加わった場合に比べて、はるかに少ない濃度でも抗菌効果を奏する
化合物は、例えば、リネゾリド、エリスロマイシン、イブプロフェン、シンバスタチン、
クルクミン、またはレスベラトロールであってもよい。
【００８８】
本発明は、さらに他の観点から、ペプチド、またはペプチド類似体および前記ペプチド
またはペプチド類似体に薬物が連結された接合体に関する。本発明は、また、前記接合体
を含む抗生剤に関する。
【００８９】
前記薬物は、ｌｏｐＰ（ｐａｒｔｉｔｉｏｎ  ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）値が０．１９
以上の疎水性化合物、生理的ｐＨ条件でカチオンに荷電された化合物およびコリスチンで
あってもよい。各構成の定義は、上述のとおりである。
【００９０】
前記ペプチドまたはペプチド類似体と薬物は、例えば、非共有結合または共有結合によ
り連結されてもよい。前記非共有結合は、例えば、水素結合、静電相互作用、疎水性相互
作用、ファンデルワールス相互作用、π‐π相互作用およびカチオン‐π相互作用からな
る群から選択される１種以上であってもよい。前記共有結合は、分解性または非分解性結
合であってもよく、前記分解性結合は、ジスルフィド結合、酸分解性結合、エステル結合
、無水物結合、生分解性結合または酵素分解性結合であってもよく、非分解性結合は、ア
ミド結合またはホスフェート結合であってもよいが、これに制限されるものではない。
【００９１】
実施例
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は、単に本発明を
例示するためのものであって、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されると解釈
しないことは、当業界において通常の知識を有する者にとって自明である。
【００９２】
実施例１．両面性ＬＫペプチドの突然変異合成とグラム‐陰性菌膜‐特異的ペプチドの
選択
自然には多種の抗菌ペプチド（ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ、ＡＭＰ
）がある。これらは、主に、高等動物の免疫系のうち１次的な免疫反応のために作り出す
ペプチドであり、その種類および形状も非常に様々である。近年、かかる抗菌ペプチドの
生体内の新たな機能が判明されるに伴い、かかる抗菌ペプチドに対する関心は高まりつつ
ある。しかし、これらの抗菌ペプチドを実際に抗菌剤として使用した例は、今までただ一
件もない。これらが病源菌を殺す能力が他の低分子抗菌物質に比べて劣りすぎ、ペプチド
の生産コストが低分子抗菌物質に比べて経済的でははく、抗菌ペプチドが宿主細胞である
真核細胞を損傷し得るという副作用などが、ＡＭＰを薬として使用できなかった主な理由
である。
【００９３】
本出願の発明者らは、三つの理由を改善することで、ＡＭＰを実際に抗生剤として使用
するための努力を継続している。多くの自然由来のＡＭＰは、長年にわたり多くの突然変
異過程を経て、それなりのアミノ酸配列がＡＭＰの性質を極大化するように進化してきた
ことが事実であることを勘案すると、かかる自然由来のペプチドをもってその能力を向上
させたり選択性を与えることは容易でないようであった。したがって、本発明者らは、自
然由来のＡＭＰの能力を改善するのではなく、自然ＡＭＰを模倣するモデルペプチドであ
るＬＫペプチドで様々な突然変異を誘発してその能力の変化を観察し、改善したペプチド
を導出することで、前記三つの難点を解決しようと試みた。
【００９４】
その努力の一つとして、本発明者らは、１４個あるいは１６個からなる両面性αヘリッ
クスペプチドを選定し、様々な突然変異過程を経ている。両面性という特徴とαヘリック
スは、多くの自然由来のＡＭＰから観察されてきた一般的な特徴であるためである。この
ペプチドを選択したまた一つの理由は、ＬＫペプチドは、１４〜１６個のアミノ酸から構
成されているため、ペプチドを作製する経済的な負担が、自然由来のペプチドに比べて少
ないということも一つの理由になる。第二の理由を解決するための手段である。本発明者
らは、先ず、第三の理由から解決するために努力した。第一の理由である病原体に対する
活性を高めるとしても、これが選択性なしに、宿主細胞である真核細胞に対して毒性が示
されるとすると、活性を高めた努力が完全になくなることもあるためである。実際、よく
使用されている薬の特徴を見ても、薬効が高いことも重要であるが、選択性または治療範
囲（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｗｉｎｄｏｗ）（または、治療インデックス：ｔｈｅｒａ
ｐｅｕｔｉｃ  ｉｎｄｅｘ）が大きく、副作用なしに高い濃度で使用できる薬が良い新薬
になり得るためと言える。特に、抗菌ペプチドの場合は、この点に注目しなければならな
い。その理由は、抗菌ペプチドの作用メカニズムが病源菌の膜を損傷することが主であり
、この能力は、宿主細胞である真核細胞の壁の壊し得るためである。
【００９５】
本発明で使用しているモデルペプチドも抗菌能力とともに宿主細胞である真核細胞を殺
すことができる能力があるため、これを軽減するために、第一の突然変異を試みた。ＬＫ
ペプチドは、疎水面にはＬ、親水面にはＫから構成されており、位置特異的な突然変異を
引き起こすには非常に容易である。位置特異的にＡを置換した後、これらの赤血球に対す
る溶血現象を観測した。８番位置にＬがＡで置換された時に最も大幅に溶血現象が減少し
たため、このＬを他のアミノ酸で置換し、溶血現象を最小化するアミノ酸を見つけた。仮
に、８番位置にＮ（アスパラギン）が入ると（以下、Ｎ突然変異）、突然変異されていな
いものに比べて溶血現象が８，０００倍減少したことが判明された。さらに、Ｍ突然変異
は、大腸菌に８倍薄い濃度でも壊滅させることができ、この結果として、一つの突然変異
により６４，０００倍の選択性増加をもたらした。
【００９６】
Ｎ突然変異に対する正確な作用メカニズムはまだ正確に判明されていないが、Ｎ突然変
異のために生じたペプチドが一時的に折り曲げられたヘリックスペプチドの形状変化のた
め真核細胞を損傷する能力は無くなり、グラム‐陰性菌の膜をより損傷しやすくなると推
定している。膜を損傷することができるＡＭＰの能力とともにグラム‐陰性菌にさらに良
い抗菌力を有するまた一つの理由がある。これは、Ｎ突然変異ペプチドが膜を活性化させ
るメカニズムによって菌の中に入り、菌の中に存在する物質と結合して、病源菌の代謝を
阻止し壊滅させる可能性がある。実際、Ｎ突然変異ペプチドなどは、ＤＮＡまたはＲＮＡ
などの分子と強力に結合することができ、この結合は、ＤＮＡまたはＲＮＡが関連した病
院菌内の代謝停止による病源菌の死につながり得る。
【００９７】
前記実験の結果、得られた選択性の増加は、突然変異により得られたペプチドが真核細
胞の細胞壁溶出および細胞透過が最小化する条件から得られた結果である。すなわち、６
４，０００倍の選択性の増加で溶血現象の与えた要素が８，０００倍、グラム‐陰性菌に
対する殺菌力の増加要素が８倍に構成されている。したがって、かかる突然変異による抗
菌力の増加を観察するためには、溶血現象を大幅に低減する突然変異内で行うことが好ま
しく、先行研究の結果、この突然変異は、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｐ、Ｑの五つ程度であるとすでに
調査されている。グラム‐陰性菌に病原体に対する細胞透過力を迅速に点検するために、
８番位置のそれぞれのアミノ酸を用いた突然変異５個を作製した（Ｌ８Ｎ、Ｌ８Ｑ、Ｌ８
Ｄ、Ｌ８ＥおよびＬ８Ｐ）。８番位置が真核細胞の溶血に最も敏感な位置であることがす
でに行った実験により分かっているため、こちらの変化は、他の大きい変化を引き起こし
得ると予想される。これを確認するために、５個の突然変異ペプチドに蛍光標識子である
ＴＡＭＲＡをつけて、実際にこのペプチドがグラム‐陰性菌に入るか否かをＦＡＣＳ実験
で確認し、その結果を図１に示した。
【００９８】
本発明者らの考えどおり、この突然変異ペプチドは、グラム‐陰性菌である大腸菌にか
なり高い濃度で入ることを観察した。図１に示されているように、グラム‐陰性菌によく
入る程度は、Ｐ＞＞Ｎ＝Ｄ＞Ｑ＝Ｅに示され、最も良いＰ‐の場合、２．５ｍｉｃｒｏＭ
程度の濃度を使用する際に、約６０％程度のペプチドが菌に入ることが分かった。この突
然変異ペプチドは、少なくとも１００ｍｉｃｒｏＭまでは溶血現象を全く引き起こさない
だけでなく、ＭＤＡ  ＭＢ２３１細胞株で実験した真核細胞にＦＡＣＳを用いた細胞透過
度５ｍｉｃｒｏＭの濃度でほとんど引き起きないと調査された（図２）。また、このＰ‐
突然変異ペプチドは、グラム‐陽性菌でも入らないことを確認することができた（データ
図示せず）。結論的に、Ｐ‐突然変異ペプチドは、グラム‐陰性菌にのみ選択的に細胞透
過または膜を活性化することができるため、Ｐ‐突然変異ペプチドを用いると、グラム‐
陰性菌に選択的な薬物送達が可能となる。
【００９９】
実施例２．プロリンを用いた突然変異ペプチドの合成とグラム‐陰性菌膜特異的突然変
異の選択
（１）固体状ペプチド合成法を用いたＰｒｏ突然変異ＬＫ、ＫＬペプチドライブラリー
の製造
リンクアミドレジン（０．５２ｇ／ｍｍｏｌ）５０ｍｇを合成用プラスチックカラムに
入れてＤＭＦで１０分間膨張させた後、２０％ピペリジンを３ｍＬ入れてマイクロ波で脱
保護反応を行った。脱保護が終了してからＤＭＦ３回、ＤＣＭ５回、ＤＭＦ３回洗浄し、
６当量のアミノ酸とパイバブを電子計りで測量した後、ＤＭＦに溶解した。それぞれ６当
量に相当するアミノ酸、パイバブ、ＤＩＰＥＡを合成用カラムに入れ、マイクロ波を用い
てアミド結合を作製した。カップリングが終了してから、ＤＭＦ３回、ＤＣＭ３回、ＤＭ
Ｆ３回洗浄した。１％ＴＮＢＳテスト溶液と１０％ＤＩＰＥＡ溶液をそれぞれ１滴ずつレ
ジンに滴下し、反応が完了したか否かを確認した。当該アミノ酸配列をいずれもカップリ
ングさせた後、６当量ＨＯＢｔと６当量無水酢酸を用いてペプチドのＮ末端をアセチル化
した。レジンで合成されたペプチドは、９５％ｖ／ｖ  ＴＦＡ、２．５％ｖ／ｖ蒸留水、
２．５％ｖ／ｖ  ＴＩＳ溶液をカラムに入れて２時間８００〜１０００ｒｐｍで回転させ
ることでレジンから取り除いた。１５ｍＬのＦａｌｃｏｎチューブに切断されたペプチド
溶液を移した後、窒素ガスでＴＦＡを除去した。−２０℃で保管した結晶溶液（ｎ‐ヘキ
サン５０％ｖ／ｖ、ジエチルエーテル５０％ｖ／ｖ）を１５ｍＬのＦａｌｃｏｎチューブ
に総体積が１０ｍＬになるように注ぎ、１分間ボルテックスして結晶を形成した。ボルテ
ックスした後、重量を合わせた１５ｍＬのＦａｌｃｏｎチューブをもう一つ準備し、遠心
分離機機械に入れた後、２０分、４℃、４５００ｒｐｍの条件で遠心分離した。結晶を除
き結晶溶液を注ぎ出した後、ボルテックスをまた行って遠心分離機で同じ条件で遠心分離
した。ペプチド結晶が形成された上澄み液を除去し残った結晶溶液は窒素ガスで除去した
後、ＤＭＳＯでまた結晶を溶解し、０．４５μｍフィルターで濾過した後、高性能液体ク
ロマトグラフィーで分離した。高性能液体クロマトグラフィーのカラムとしてはＣ‐１８
カラムを使用しており、使用した溶媒はアセトニトリル（０．１％ｖ／ｖ  ＴＦＡ）と蒸
留水（０．１％ｖ／ｖ  ＴＦＡ）である。高性能液体クロマトグラフィーで分離したペプ
チドは、ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦＦを用いてｍ／ｚ値を測定し、確認した。高性能液体クロマ
トグラフィーで分離したペプチドは、−８０℃の冷蔵庫で２時間冷却した後、１次凍結乾
燥した。１次凍結乾燥が終了して残っているＴＦＡを除去するために、ペプチドを蒸留水
に溶解した後、ｅ‐ｔｕｂｅに移し、−８０℃の冷蔵庫で２時間冷却して２次凍結乾燥し
、ペプチド粉末を得た。
【０１００】
（２）グラム‐陰性菌膜特異的突然変異の選択
実施例１に記述したように、Ｐｒｏ‐突然変異を用いて折り曲げられたαヘリックスペ
プチドを製造すると、グラム‐陰性菌膜‐特異的なペプチドになる可能性を示した。本発
明では、１４個のアミノ酸から構成されたＬＫペプチド（アミノ酸配列、ＬＫＫＬＬＫＬ
ＬＫＫＬＬＫＬ；配列番号５、すべてのペプチドは、Ｎ‐末端はアセチル化しており、Ｃ
‐末端はアミド化している）およびＫＬペプチド（アミノ酸配列、ＫＬＬＫＬＬＫＫＬＬ
ＫＬＬＫ、配列番号６）のＮ‐末端またはＣ‐末端の外に位置するすべてのＬｙｓおよび
ＬｅｕをＰｒｏで置換したペプチドを作製し、折り畳まれた構造を有するペプチドライブ
ラリーを製造し、このうちいずれの突然変異が、最もグラム‐陰性菌膜特異的な性質を有
するかを調査した。折り畳まれた構造は、αヘリックスを急激に減少させ、宿主細胞に対
する毒性を大幅に減少させる可能性がある。また、グラム‐陰性菌膜特異性を示す可能性
のため、Ｐｒｏ‐突然変異を位置特異的に製造した。製造されたペプチドを用いてグラム
‐陰性菌であるＥ．ｃｏｌｉおよびグラム‐陽性菌であるＳ．ａｕｒｅｕｓなどに対する
ＭＩＣおよび宿主細胞に対する溶血現象を調べた（表１）。
【０１０１】
【表１】
2020128386.tif 000003
2020128386.tif 000004
【０１０２】
【表２】
2020128386.tif 000005
2020128386.tif 000006
【０１０３】
溶血アッセイにより、哺乳動物細胞毒性を評価した。ヒト赤血球細胞をＰＢＳバッファ
ーで３回水洗し、５％ヘマトクリット（ｈｅｍａｔｏｃｒｉｔｅ）に対してＰＢＳバッフ
ァー５ｖ／ｖ  ％で懸濁した。ペプチドを２倍のＰＢＳバッファーで希釈し、次に、５％
ヘマトクリットを添加した。サンプルを３７℃のインキュベータで３時間インキュベーシ
ョンし、１４００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上澄み液を底部が平坦な９６ウェルプレ
ートに移し、４０５ｎｍ（ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ  ７００ｎｍ）ＵＶ吸光度で測定した。
蒸留水が陽性対照群であり、ＰＢＳは陰性対照群である。
【０１０４】
図３によると、位置特異的に製造されたＰｒｏを含有しているペプチドを三つの部類に
分けることができた。第一の部類は、すべてのＬｙｓをＰｒｏで置換したペプチドであり
、これらは、グラム‐陰性菌を殺す能力／グラム‐陽性菌を殺す能力／溶血現象がいずれ
も向上し、グラム‐陰性菌特異的可能性を全く示さなかった。第二の部類に相当するペプ
チドは、ＬｅｕがＰｒｏで置換された一部のペプチドであり、Ｅ．ｃｏｌｉに対するＭＩ
Ｃ値も向上しており、溶血現象もかなりよく生じる方であった。この部類に属するペプチ
ドもグラム‐陰性菌／宿主細胞に対する活性がともに動いているため、グラム‐陰性菌特
異的な可能性があまり高く評価されなかった。第三の部類に相当するペプチドもまた、Ｌ
ｅｕがＰｒｏで置換されたペプチドの一部であったが、これらは、溶血現象とグラム‐陽
性菌に対する活性がほとんど無くなり、Ｅ．ｃｏｌｉに対するＭＩＣは置換されていない
ことに比べて変化がほぼないか少し向上したものなどであった。グラム‐陰性菌に対する
ＭＩＣに対する変化の差はあるものの、大幅の溶血現象の減少およびグラム‐陽性菌に対
する著しいＭＩＣ値を有する共通点があったため、このカテゴリーのペプチドは、グラム
‐陰性菌特異的に動く可能性があると想定し、次の実験対象とした。まとめると、両面性
αヘリックスの折り畳まれた構造を作る方法は、大きく二つ、すなわち、親水性の方にプ
ロリンを導入して折り畳むか、または疎水性の方にプロリンを導入して折り畳むかである
。前記の表１および表２と溶血現象の図３は疎水性の方に導入したプロリンに折り畳まれ
た構造のみが溶血現象を引き起こさず、グラム‐陰性菌に変化を与える余地を提供する。
【０１０５】
実施例３．選択されるグラム‐陰性菌膜特異的ペプチドと抗生剤であるメトトレキサー
トコンジュゲーションおよびＭＩＣ値の向上
先ず、三つの選択されたペプチドがグラム‐陰性菌の膜に活性を有することができるか
否かを調査した。このために、三つのペプチドのＮ‐末端にＴＡＭＲＡという蛍光標識子
をつけて大腸菌に膜‐活性があるか否かを調査した。幸いなことに、２．５〜５μＭ程度
の濃度で三つのペプチドがいずれも大腸菌の内側へ入ることが観測（図４）され、三つの
ペプチドがいずれも特異的にグラム‐陰性菌の膜を活性化させる可能性を確認した。
【０１０６】
図４の三つのペプチドは、少なくともヒト赤血球を用いた実験で１ｍＭ以上の濃度で溶
血現象がないことから、ペプチドを抗菌の目的で使用した場合には副作用がないことを予
想することができる。しかし、ペプチドは、変わりなく大腸菌に対する抗菌力があまり強
くないという共通点を有していた（ＭＩＣ＝１０‐２０μＭ）。このＭＩＣ値を向上する
ために、葉酸の生合成を阻害する化合物であるＭＴＸ（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）をそ
れぞれのペプチドのＮ‐末端につけて三つのコンジュゲート化合物のＭＩＣを測定した。
以下の表３に提示したように、三つのＭＴＸ‐コンジュゲートペプチドは、それらの母体
になるペプチドに比べて２倍から４倍程度ＭＩＣ値が向上した。かかる現象は、少なくと
もペプチドが選択的に大腸菌膜に作用しており、その一部は菌の中に入って細胞を殺す効
果を有すると考えられる。したがって、かかるグラム‐陰性菌膜特異的ペプチドと菌に入
り難い抗生剤とのコンジュゲーション方法は、新たな抗生剤を開発するための好ましい方
法として提案することができる。菌の中への透過が難しい多種の抗生剤を、副作用が少な
くも大腸菌の膜を活性化して菌の中に入る可能性があるペプチドと共有結合で連結し、グ
ラム‐陰性菌に対する新たな抗生剤として用いることができる。
【０１０７】
【表３】
2020128386.tif 000007
【０１０８】
実施例４．膜‐活性ペプチドによる新たな抗生剤の発見
溶血現状が極小化しており、グラム‐陰性菌の膜を活性化させることができる三つのペ
プチドを用いた次の実験は、コリスチンとシナジー効果があるか否かを調査するものであ
った。コリスチンは、グラム‐陰性菌の外膜を刺激する効果があるため、ペプチドのいず
れでもＥ．ｃｏｌｉの外膜を刺激するコリスチンの抗菌力を向上させるものであれば、Ｅ
．ｃｏｌｉ膜特異的活性を有する可能性があるという推論から始まった。すでにグラム‐
陰性菌によく入る性質として選択された三つのペプチド（ＬＫ‐Ｌ８Ｐ、ＫＬ‐Ｌ６Ｐ、
ＫＬ‐Ｌ９Ｐ）および特に、ＭＩＣ値が良好なＬＫ‐Ｌ１１Ｐなどの四つのペプチドがコ
リスチンとシナジーがあるか否かを調査した。実験方法は、それぞれのペプチドにコリス
チンを単純に混合してグラム‐陰性菌の代表格である大腸菌に処理することで、単独でペ
プチドやコリスチンを打った時に比べて、大腸菌を殺す能力が向上することができること
を調査する実験であった。特に、コリスチンがグラム‐陰性菌を殺す能力が大幅に向上す
ると、これは、ペプチドがコリスチンとのシナジーが良いと（ＦＩＣＩ＜１．０）判断可
能である。シナジーが良いということは、結局、二つの化合物（ここでは、コリスチンと
ペプチド）が互いに助け合って二つの効果が単純に合算された（ＦＩＣＩ＝１．０）場合
よりもはるかに少ない濃度でも菌を殺すことができるということを意味する。
【０１０９】
以下の表４に示されているように、コリスチンとのシナジーは、ＫＬ‐Ｌ９Ｐペプチド
が最も向上させ、ＦＩＣＩ（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｃｏｎｃｅ
ｎｔｒａｔｉｏｎ  ｉｎｄｅｘ）値が０．５７であり、他のペプチドに比べて、コリスチ
ンとのシナジーが著しく良かった。ペプチドの特徴は、他の三つのペプチドと比較して、
単一ペプチドである時のＭＩＣ値が他のペプチドに比べて５倍も良くないにもかかわらず
、コリスチンと良いシナジーを有しているということであった。たぶん、三つのＭＩＣが
良いペプチドが膜を崩壊する一般的な抗菌ペプチドの性質を有している反面、ＫＬ‐Ｌ９
Ｐペプチドは、少し異なる能力を有しているという推測が可能である。ペプチドを一旦Ｅ
．ｃｏｌｉ‐特異的膜活性ペプチドと定め、次の研究を試みた。
【０１１０】
【表４】
2020128386.tif 000008
【０１１１】
実施例５．選択されたＫＬ‐Ｌ９Ｐペプチドの膜活性メカニズム
次に、選択されたＫＬ‐Ｌ９Ｐペプチドがいかなるメカニズムによって膜を活性化させ
るかを確認した。微生物外部膜透過は、ＮＰＮ処理されたＥ．ｃｏｌｉ蛍光強度（λｅｘ
＝３５５ｎｍ、λｅｍ＝４０５ｎｍ）で測定した。Ｅ．ｃｏｌｉ懸濁液（８×１０７ｃｅ
ｌｌｓ／ｍＬ）を１０ｍｉｎ、２５℃、１３０００ｒｐｍの条件で遠心分離し、５ｍＭ  
ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．２）で懸濁した。ＮＰＮをＥ．ｃｏｌｉ懸濁液に追加し
、ＮＰＮ最終濃度は５μＭであった。Ｅ．ｃｏｌｉ懸濁液の蛍光強度をＦＬ‐５５蛍光測
定装置で測定した。ペプチドを５μＭ  ＮＰＮとともにＥ．ｃｏｌｉ懸濁液に追加した。
蛍光強度Ｆ．Ｉ＝Ｅ．ｃｏｌｉ懸濁液に追加されたペプチドのＦ．Ｉ．‐５μＭ  ＮＰＮ
を含むＥ．ｃｏｌｉ懸濁液のＦ．Ｉ．で計算される。
【０１１２】
先ず、ＮＰＮ（Ｎａｐｈｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌａｍｉｎｅ）を用いた蛍光をＥ．ｃｏｌ
ｉの存在下で観察したが、ＫＬ‐Ｌ９Ｐとコリスチンがいずれも外膜を刺激して外膜の中
に入る性質を有していた（図５）。これをＫＬ‐Ｌ９Ｐおよび競争薬物であるコリスチン
を用いて測定したところ、ＫＬ‐Ｌ９Ｐが単位モルで比較したときに、コリスチンよりも
外膜を緩くする効果が大きいということが分かった。相対的に膜に穴を開けると知られて
いるメリチンもＮＰＮ蛍光を増加させる能力が高かった。しかし、ＫＬ‐Ｌ９Ｐペプチド
は、長さが短くて穴を開けることはできないと推論される。
【０１１３】
第二の実験としては、ペプチドが外壁／内壁をいずれも壊す能力を有しているか否かを
観察する実験であった。このために、特異的にＤＮＡのみを染色することができる蛍光物
質であるＳｙｔｏｘ  Ｇｒｅｅｎを用いており、ＳＹＴＯＸ  Ｇｒｅｅｎが処理されたＥ
．ｃｏｌｉ平均蛍光強度から微生物膜透過度を評価した。ＳＹＴＯＸ  Ｇｒｅｅｎ（２．
５μＭ）の存在下で１０分間Ｅ．ｃｏｌｉ懸濁液（２×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を三つ
のペプチドとインキュベーションした。透過度は、蛍光活性細胞分類装置で定量した。１
×１０４ゲート細胞の平均蛍光強度を測定した。メリチン（対照群）は、微生物細胞膜を
破壊する空隙形成ペプチドである。
【０１１４】
ＫＬ‐Ｌ９ＰがＤＮＡを全く染色することはできない一方、コリスチンは、かなりよく
染色させると調査された。これは、ＫＬ‐Ｌ９Ｐペプチドは、内壁に対する分解力または
透過力はないが、コリスチンおよび空隙をよく形成するメリチンもこの能力があることを
示している（図６）。
【０１１５】
ＬＰＳ抽出物（ｓｉｇｍａ）とペプチドをＰＢＳバッファーに懸濁した。２５℃でＬＰ
Ｓ０．５ｍｇ／ｍＬ単独またはＬＰＳ０．５ｍｇ／ｍＬと５００μＭペプチドを含む条件
で、各サンプルを３セットで測定した。最大の体積百分率を有する体積値を選別し、体積
直径（ｎｍ）を計算した。
【０１１６】
ＬＰＳからなるリポソームの安定性をＫＬ‐Ｌ９Ｐおよびコリスチンの存在下で確認し
たところ、コリスチンは、リポソームを細く割ってしまう性質を有している一方、ＫＬ‐
Ｌ９Ｐは、かかる能力があるものの、その程度がひどくないことが分かる（図７）。
【０１１７】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＮＤｍ‐１をＯＤ６００＝０．５で希釈した。２．５μＭのペプチドを
３０分間３７℃のインキュベータで微生物に処理した。ＬＫ‐Ｌ１２Ｐを陽性対照群とし
て使用した。ペプチドは、内部膜および外部膜で漏出を強く誘導した。ＫＬ‐Ｌ９Ｐの共
焦点画像によりＬＫ‐Ｌ１２Ｐと比較して、ＴＡＭＲＡ標識されたＫＬ‐Ｌ９Ｐが薄い周
辺細胞質膜箇所に分布していることを示す。
【０１１８】
実際、ＫＬ‐Ｌ９Ｐに蛍光を付着したペプチドの存在をＥ．ｃｏｌｉで共焦点蛍光顕微
鏡で観察すると、環状のほぼすべてのＥ．ｃｏｌｉに蛍光分子が環の形状を有して均一に
分布していることが分かる。これは、ＭＩＣ値がより好ましく、膜を崩壊させる能力を有
するＬＫ‐Ｌ１２Ｐペプチドが、菌全体を染色させる形状またはより多くの部分の菌が蛍
光標識されたペプチドによって標識されるものと確実に区別される（図８）。
【０１１９】
前記の四つの実験の結論として、ＫＬ‐Ｌ９Ｐペプチドは、グラム‐陰性菌の外膜に入
り込む能力が他のいかなるペプチドよりも優れるが、この膜を壊す能力はなく、その状態
でとどまっていることが分かった。そうすると、膜を緩くする可能性があり、入ることが
できなかった小さな疎水性分子が、膜の中に入ることができる。
【０１２０】
実施例６．ＫＬ‐Ｌ９Ｐの存在下でリポジショニングした薬物とのシナジー効果
ＫＬ‐Ｌ９Ｐペプチドの存在下でグラム‐陰性菌で他の化合物の抗菌能力が向上するこ
とができるかを立証する。このために、二つの抗生剤であるリネゾリドおよびクロキサシ
リンを選別した。この二つの化合物は、いずれもグラム‐陽性菌にのみ使用される抗生剤
であって、特に、グラム‐陰性菌の外膜を通過する能力に欠けており、グラム‐陰性菌に
はほぼ薬効がないと調査された抗菌物質であることが共通している。仮に、ＫＬ‐Ｌ９Ｐ
がリネゾリドおよびクロキサシリン二つの化合物に対してＥ．ｃｏｌｉに抗菌力にシナジ
ー効果を有した場合に、希望していたグラム‐陰性菌特異的膜活性ペプチドがリネゾリド
およびクロキサシリンの化合物の細胞透過を容易にしたと予想される。
【０１２１】
ＫＬ‐Ｌ９Ｐは、リネゾリドまたはクロキサシリンに対してシナジー効果を有してグラ
ム‐陰性菌を殺す能力を大幅に向上させた。本発明者らの競争薬物であるコリスチンもこ
の二つの薬物に対するシナジーがあるか否かを観察したところ、シナジー効果がほとんど
ないことが分かった（図９）。膜活性ペプチドであるＫＬ‐Ｌ９Ｐとリネゾリドまたはク
ロキサシリンのシナジー効果、膜活性ペプチドであるＫＬ‐Ｌ９Ｐとリネゾリドまたはク
ロキサシリンを処理した（１）、（２）は、ＦＩＣＩ値が０．５未満であり、シナジー効
果がある。コリスチンとリネゾリドまたはクロキサシリンを処理した（３）、（４）は、
ＦＩＣＩが１に近く、シナジー効果がない。
【０１２２】
そうすると、他の類似したペプチドは、抗菌力が知られた化合物とのシナジーがないか
確認するために、Ｅ．ｃｏｌｉに対する抗菌力が最も強いＬＫ‐Ｌ７ＰとＬＫ‐Ｌ１１Ｅ
のシナジー効果を弱いが抗菌力があるというレスベラトロールとのシナジー効果があるか
否かを観測した。図１０に示されているように、膜にとどまっているＫＬ‐Ｌ９Ｐは良い
シナジーがある一方、他の二つのペプチドは強力な抗菌力にもかかわらずシナジーがなか
った。膜活性ペプチドであるＫＬ‐Ｌ９Ｐとレスベラトロールのシナジー効果と関連し、
膜活性ペプチドであるＫＬ‐Ｌ９Ｐは、レスベラトロールとの強力なシナジーを有する一
方（ＦＩＣＩ＝０．２）、これよりもＥ．ｃｏｌｉに対するＭＩＣ値が５倍以上低い（良
い）ＬＫ‐Ｌ７ＰまたはＬＫ‐Ｌ１１Ｅは、ＦＩＣＩ値が１以上であり、シナジー効果が
ない。
【０１２３】
結局、前記の二つの実験より、ＫＬ‐Ｌ９Ｐが特異的にＥ．ｃｏｌｉの膜を活性化させ
て大きなシナジーがあることを証明した。
【０１２４】
次に、ＫＬ‐Ｌ９Ｐに対するシナジー効果を、抗生剤ではなく、非抗生剤で確張する実
験を行った。シナジー効果を観察するために、既存の薬において最も頻繁に使用されてい
る薬のうち、ＮＳＡＩＤの中に、アスピリン、イブプロフェン、アセトアミノフェンなど
、売上が不動の１位である高脂血症治療剤のアトロバスタチン、ロバスタチン、シンバス
タチン、また多くの薬効が知られているものの水に対する溶解度および効能に問題があっ
たクルクミン（ｃｕｒｃｕｍｉｎ）、ベルベニン（ｂｅｒｂｅｒｉｎｅ）などの天然物な
どを選抜した。ＫＬ‐Ｌ９Ｐとシナジー効果を観察する化合物は、グラム‐陰性菌に対し
て微弱ながら薬効を示すことがすでに報告されており、これらに対する抗菌能力はある程
度周知の事実である。しかし、グラム‐陰性菌に対して膜活性ペプチドとともに併行投与
し、低い濃度でもグラム‐陰性菌を殺すことができるという報告はない状態であったため
、この薬が大きなシナジー効果があることは、これらの薬を抗生剤として再使用できるか
否かを決定する実験であった。
【０１２５】
シナジー効果は、新規の抗生剤相互作用アッセイ（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  ｉｎｔｅｒ
ａｃｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ：Ｗｉｍｌｅｙ，２０１５）により評価した。Ｗｉｍｌｅｙの
方法（ＢＢＡ、２０１５，ｖ．１８４８（１），ｐｐ．８‐１５．）を用いて、膜活性ペ
プチドと抗生剤とのシナジー効果をＦＩＣＩ値で測定した（図１７）。ＭＩＣ  ａｓｓａ
ｙは、実験条件に応じて値が２〜４倍程度変動するため、シナジー効果を正確に調査する
ためには、１／２希釈方法より２／３希釈方法で化合物を希釈し、より高密度の化合物の
濃度間隔でＭＩＣを観察することが統計的に強点がある。すなわち、３×ＭＩＣになる膜
活性ペプチド（第１行目）の濃度で開始し、２／３ずつ希釈した行を作ってＭＩＣを測定
し、同じ方法で抗生剤またはｒｅｐｏｓｉｔｉｏｎｉｎｇ  ｄｒｕｇ（第２行目）のＭＩ
Ｃを測定する。第３行目は二つの化合物を半分ずつ入れてＭＩＣを測定する。図７を参照
すると、二つを合わせた行が、それぞれの化合物処理群に比べてより低い濃度でよく殺す
ことができると、シナジー効果が大きいといえる。
【０１２６】
ブロス微細希釈技術（Ｂｒｏｔｈ  ｍｉｃｒｏｄｉｌｕｔｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ
（２／３  ｄｉｌｕｔｉｏｎ））をＭＨブロス（ＭＨ  Ｂｒｏｔｈ）とともに使用した。
抗生剤およびペプチド処理されたＥ．ｃｏｌｉを１８時間３７℃のインキュベータでイン
キュベーションした。
【０１２７】
実験結果、６９％に達する多くの薬が、ＫＬ‐Ｌ９Ｐと良いシナジー効果（ＦＩＣＩ＜
１０）があり、これらを単独で使用してＥ．ｃｏｌｉを殺す濃度に比べてはるかに少ない
濃度でＥ．ｃｏｌｉを殺すことができるようになった（表５）。例えば、クロキサシリン
の場合、１２８倍希釈された０．３μＭのＭＩＣ値を有することになり、リネゾリドは、
１／１６程度希釈した濃度である１０μＭのＭＩＣ値を有することになった。ＮＳＡＩＤ
の中にはイブプロフェンが３０００倍程度希釈された３μＭのＭＩＣを、クルクミンは、
３３０倍希釈された４μＭのＭＩＣ値を有することになった。この化合物は、いずれもグ
ラム‐陰性菌膜活性ペプチドであるＫＬ‐Ｌ９Ｐが１μＭの存在下でかかるシナジー効果
を出すことができた。
【０１２８】
2020128386.tif 000009
【０１２９】
実施例７．ＫＬ‐Ｌ９Ｐ／コリスチン同時存在下でリポジショニング薬物とのシナジー
効果
コリスチンは、既存の抗生剤または新たに抗生剤として糾明されたリポジショニング薬
物と併行投与してシナジー効果を（ＫＬ‐Ｌ９Ｐに比べて）大きく示すことができなかっ
たものの、本発明で発明した膜活性ペプチドと異なるＭＯＡで膜を活性化させることがで
きる。コリスチンは、依然として膜を緩くする黄金標準（ｇｏｌｄｅｎ  ｓｔａｎｄａｒ
ｄ）試薬として使用されているため、外膜特異的活性ペプチドとして使用することができ
る。また、コリスチンとＫＬ‐Ｌ９Ｐとの間には高いシナジーがあるということをすでに
本発明者らが見出したため、この二つの膜活性ペプチドが同時に存在する時に、ＫＬ‐Ｋ
９Ｐとシナジーを示したリネゾリドおよびクルクミンなどのシナジーがどのように示され
るかを確認した。このために、本発明では、膜活性ペプチドであるＫＬ‐Ｌ９Ｐとコリス
チンが同時に存在する時に、リポジショニング薬物のシナジー効果を調査した。三つの化
合物をグラム‐陰性菌の撲滅のために混合して併行投与し、その二つは膜活性ペプチドで
あるＫＬ‐Ｌ９Ｐとコリスチンとして入れ、他の一つは既存の抗生剤やリポジショニング
薬物とした。
【０１３０】
膜活性ペプチドとリポジショニング薬物のシナジー効果の測定は、１０×化合物を準備
した後、これを蒸留水で２／３濃度になるように希釈し続けた。ＭＨブロス（９００μｌ
）を１０×化合物（１００μｌ）に入れて混合した後、このうち２００μｌを取って９６
‐ウェルプレートに入れた。１日間培養したＥ．ｃｏｌｉをＭＣＦａｒｌａｎｄを用いて
０．５ＭＣＦに調整し、これを１０倍希釈した後、ｗｅｌｌ当たり１０μｌを入れた（５
×１０５ＣＦＵ／ｍＬ）。菌を入れたｐｌａｔｅを３７℃で１８時間培養した後、ＵＶ‐
Ｖｉｓ（６００ｎｍ）でＯＤ値を測定した。菌が生きている程度（ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉ
ｌｉｔｙ；％）＝（ＯＤ６００  ｏｆ  ｓａｍｐｌｅ‐ＯＤ６００  ｏｆ  ｎｅｇａｔｉ
ｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ）／（ＯＤ６００  ｏｆ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ−Ｏ
Ｄ６００  ｏｆ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ）×１００．ｍｉｃはＣｅｌｌ  ｖ
ｉａｂｉｌｉｔｙ＜２０％の濃度を基準として選択した。
【０１３１】
三つの化合物に対するシナジー効果は、二つに対するシナジー効果（三つの場合）のう
ち最も良いものに劣らない程度に導出された。これは非常に良い結果である。その理由は
、二つの化合物が混合されたシナジーＦＩＣＩ値が０．３であると、二つの化合物を単独
で処理した時に比べて約１／７ずつ希釈された濃度でＥ．ｃｏｌｉを殺している反面、三
つの化合物が混合された併行投与で同様のＦＩＣＩ値０．３が導出されたとすると、これ
は、三つの化合物を単独で処理したものに比べて１／１０ずつ希釈された濃度で菌を殺す
ことになるためである。本発明では、ＫＬ‐Ｌ９Ｐ／コリスチン／リネゾリドのシナジー
値であるＦＩＣＩが０．２８と調査された。三つの化合物が単独で存在する時のＭＩＣが
１３μＭ／０．８μＭ／６０μＭであったものをそれぞれ１２倍／１６倍／１０倍下げた
濃度である１μＭ／５０μＭ／６μＭで殺すことができるようになった。かかる結果は、
２つの化合物間のシナジー効果よりも３つの化合物を併行投与した時の効果がさらに大き
くなり得るという暫定的な結論を導出することになる。仮にこのように予想してみると、
ｎ個数字による抗生物質のシナジー効果は、想像以上に大きくて、自然で様々な化合物が
混合されている時に、大きいシナジー効果により増幅した抗菌作用が示されると予測する
ことができる。そのうち、多数は、膜活性があるペプチドであるときに可能であり得る。
【０１３２】
また、二つの化合物の対による三つのシナジー効果のうち最も大きいシナジー効果は、
ＫＬ‐Ｌ９Ｐを使用した場合であることから、シナジー効果に最も大きい影響を及ぼす因
子は、本発明者が見出したＫＬ‐Ｌ９Ｐペプチドになり得ることを示しており、この因子
に従属的なシナジー効果が示されると言える。しかし、コリスチンシナジー効果に対して
注目する必要がある。コリスチンがＫＬ‐Ｌ９Ｐに比べてシナジー効果が少ないとはいえ
るが、仮に、既存に他の目的で使用している薬からグラム‐陰性菌を壊滅することができ
るシナジー効果を出すことができれば、今すぐこれら二つの併行治療剤は毒性がない限り
薬として使用可能であるためである。すなわち、すでに二つの薬がいずれも商用に使用さ
れているため、真正な意味の薬物リポジショニングが可能である。グラム‐陰性菌に対す
るシナジー効果は、普通、ＦＩＣＩ（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｃ
ｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｉｎｄｅｘ）で示すが、この値が０．５以下の場合には、シ
ナジー効果があると見ており、０．２程度になった場合には、二つの抗菌物質を単独で処
理したＭＩＣに比べて少なくとも１０倍以上減少させることができる可能性があると見て
いる。本発明では、コリスチンとのシナジーが０．２〜０．４に達する多種の化合物を見
出した。これらは、クルクミン、イブプロフェンの２種の異性体、シンバスタチンなどを
選択している。
【０１３３】
実施例８．膜活性ペプチドの一般的な性質の確認
Ａ）膜活性ペプチドの一般的な条件
ＫＬ‐Ｌ９Ｐは、他のある突然変異ペプチドに比べて大きなシナジー効果を与えており
、この化合物の一般的な性質を把握する必要がある。先ず、このペプチドは、１００％水
の条件下にある時に備えて、膜条件で高いαヘリックス度を有する。このペプチドがＰｒ
ｏによって正確な円筒状の正確なヘリックス形状から離れているが、ヘリックス形状によ
る親水面／疎水面の分離した形状が、膜活性を強力に与えることが確実である。ＰｙＭｏ
ｌプログラムによって予測してみたＫＬ‐Ｌ９Ｐの構造も折り曲げられいるαヘリックス
を示している。一般的に、Ｐｒｏが突然変異された部分がαヘリックスが折り畳まれた頂
点をなすと考えられるが、ＰｙＭｏｌによって予測された形状は、折り畳まれた部分が親
水性と疎水性の境界部分であると考えられる。この部分は、詳細な形状に対する研究が行
われたときに正確な形状が導き出されると考えられるが、折り畳まれた形状によってペプ
チドが膜にとどまる時間が増えるという事実は、様々な化学物質学的実験により知ること
ができる。この際、長すぎるαヘリックスを形成し得る突然変異ペプチドは、すでに第一
のスクリーニングから除かれた状態である。第一のスクリーニングの条件として宿主細胞
に対する溶血現象が最もないペプチドを選択したが、この際、長すぎるαヘリックスを形
成し得る突然変異ペプチドはもうすべて除去されたと考えられる。
【０１３４】
このように短いが高いαヘリックスを有しているペプチドが膜に長期間滞留すると、グ
ラム‐陰性菌の外膜では、このペプチドを頂点としてイオン‐再配置（ｉｏｎ‐ｃｌｕｓ
ｔｅｒｉｎｇ）が生じ得ると考えられる。そうすると、膜内の分子の流れが多くなって膜
そのものが緩くなり得る。膜が緩くなると、緩くない膜構造では通過することができなか
った多くの抗生剤候補物質低分子が、これから膜を通過して菌の中に入ることができるた
め、結局、ペプチドとのシナジー効果を奏して抗菌効果を示す。
【０１３５】
疎水面に入れたＰｒｏアミノ酸は、疎水性を示すため、これと認識を同様にする膜に存
在する炭化水素の長鎖との認識を妨害していない。また、折り畳まれた親水／疎水面の分
離は、親水面が有しているカチオンと膜の表面に存在するアニオンとの認識を両方（Ｎ‐
とＣ‐末端）ですべて可能にする構造になっているようである。仮に、これが完全な円筒
状のαヘリックスをなすと、親水面の認識が膜の分子と強くなされると疎水面の認識が弱
化し、また、疎水面の認識が膜に存在する分子と強くなされると親水性部分の認識力は弱
くなることがあるためである。長いαヘリックス形状は、宿主細胞に対する溶血現象など
真核細胞の膜を崩壊させる可能性も高める。
【０１３６】
ＫＬ‐Ｌ９Ｐが他の位置にプロリンが入った異性体との相違点は、このペプチドが非常
に親水性であるため、同様のＨＰＬＣ条件で最も速い保持時間（ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｔ
ｉｍｅ）を有していることが分かる。これは、ＫＬ‐Ｌ９Ｐでカチオンの荷電が全体的に
一方に偏る現象のために生じると考えら、このようになると、より明らかな両面性を有す
ることができる。膜活性ペプチドが一般的に最も速い保持時間を有している事実は、プロ
リンが二つ入った化合物のうちシナジーが最も良いＬＫ‐Ｌ７ＰＬ８ＰおよびＬＫ‐Ｌ８
Ｄの場合にも相当する。
【０１３７】
Ｂ）二つのＰｒｏが置換したペプチドの合成とシナジー効果
そうすると、ＬＫまたはＫＬの可能なすべての突然変異のうちＫＬ‐Ｌ９Ｐのみかかる
グラム‐陰性菌の外膜を活性化させることができるのか。先ず、ＬＫペプチドとＫＬ‐ペ
プチドのＰｒｏによる突然変異を１ヶ所から２ヶ所に増加させた。Ｐｒｏ‐突然変異が折
り畳まれた構造を演出することができるため、一つよりは二つのＰｒｏをペプチドに添加
した場合にペプチドがさらに折り畳まれた形状をすることができるためであった。複数個
の可能な位のうち２つの位をＰｒｏで突然変異させたペプチドを作製しており、これを以
下の表６に示した。
【０１３８】
【表６】
2020128386.tif 000010
2020128386.tif 000011
【０１３９】
Ｐｒｏが二つ入っているペプチドに対するスクリーニングはまた、コリスチンとのシナ
ジー効果があるかを観察した。これらのＰｒｏが二つ入っているペプチドの特徴は、ＬＫ
‐Ｌ４ＰＬ５Ｐ、ＬＫ‐Ｌ１１ＰＬ１２Ｐを除き、またグラム‐陰性菌に対するＭＩＣ値
がＰｒｏが一つ入っているペプチドに比べて著しく高くて、グラム‐陰性菌を殺すのに何
十μＭ以上の濃度が必要となる。これは、膜を透過するか損傷することができる能力が著
しく減少するということを意味し、そうすると、宿主細胞に対する毒性も著しく減少する
可能性が高いため、ペプチド新薬としては良い結果である。Ｅ．ｃｏｌｉに対して２．５
μＭの低いＭＩＣを示すＬＫ‐Ｌ１１ＰＬ１２Ｐは、ペプチド単独で新薬として活用され
ることもできる。複数個のＰｒｏが二つ入っているペプチドのうちコリスチンとのシナジ
ーが最も良い突然変異は、ＬＫ‐Ｌ７ＰＬ８Ｐであった。この突然変異は、コリスチンと
のＦＩＣＩが０．３に至るため、ＫＬ‐Ｌ９Ｐとほぼ匹敵すると考えられる。ただし、コ
リスチンとのシナジーをなす時の濃度が８．４μＭ程度になるため、ＫＬ‐Ｋ９Ｐが２．
６μＭでコリスチンとのシナジー効果が最大になるものに比べて、４〜５倍のペプチドを
さらに使用しなければならないという欠点がある。ＬＫ‐Ｌ７Ｐ／Ｌ８Ｐは、リネゾリド
ともシナジーがあったが、ＦＩＣＩ値が０．５３程度であった。これは、ＫＬ‐Ｌ９Ｐの
ＦＩＣＩ値が０．４０であるのに比べ、少し劣る部分的なシナジーを有していた（表７）
。ＬＫ‐Ｌ７ＰＬ８Ｐペプチドは、ペプチド／コリスチン／リネゾリドなどの三つを混合
した場合には、ＬＫ‐Ｌ９Ｐに類似しているＦＩＣＩ（＝０．２７）値を与えているため
、このペプチドによるシナジー効果が小さくないと言える（表８）。ペプチド形状予測プ
ログラムによって予測されたＬＫ‐Ｌ７Ｐ／Ｌ８Ｐペプチドの形状も二つのαヘリックス
がＰｒｏ部分によって短絡した形状をしているため、この形状は、シナジーを与えている
ペプチドの一般的な特徴になり得る。
【０１４０】
【表７】
2020128386.tif 000012
【０１４１】
【表８】
2020128386.tif 000013
【０１４２】
Ｃ）Ｄ‐アミノ酸を用いたＤ‐ｆｏｒｍペプチドの作製
ＫＬ‐Ｌ９Ｐペプチドのすべてのアミノ酸をＤ‐アミノ酸で置換したＫＬ‐Ｌ９Ｐ‐Ｄ
型も作製し、コリスチンおよびリネゾリドとのシナジー効果を観察した。ＫＬ‐Ｌ９Ｐ‐
Ｄ型ペプチドを作製した目的は、自然に存在するＬ‐アミノ酸からなるペプチドに比べて
化学的安定性および自然酵素であるプロテアーゼに対する安定性が著しいと考えられる上
に、ペプチドと膜との認識がキラルな構造に影響を受けない可能性が高く、Ｄ‐ｆｏｒｍ
もＬ‐ｆｏｒｍに劣らないシナジー効果を有することができると考えたためである。ただ
し、Ｄ‐ｆｏｒｍは、シナジー効果がＬ‐ｆｏｒｍに比べて大きくないことが分かった。
コリスチンの場合、ＦＩＣＩ＝０．３８、リネゾリドの場合、ＦＩＣＩ＝０．６６と部分
的なシナジーを示していた。これは、ペプチドの認識する箇所が膜のキラルな部分と関係
がない部分もかなり多く認識するが、キラルと関係がある部分（例えば、ホスフェートの
アニオンなど）も可能であるという結論を導出する。しかし、Ｄ型も全般的なシナジー効
果があることから、膜に存在するキラルでない箇所の認識が主になるため、グラム‐陰性
菌を退治するためのシナジー効果を奏することができるペプチドとしては遜色がない。
【０１４３】
Ｄ）Ｐｒｏ以外アミノ酸を用いた突然変異による折り畳まれた構造の創出
Ｐｒｏではなくても両面性ペプチドの疎水面に親水性アミノ酸を入れると、αヘリック
スの全体的な両面性は壊れることがあり、折り曲げられいる形状を部分的に演出し得る。
かかる両面性の崩壊とともにαヘリックスの減少による宿主細胞に対する副作用も少なく
なり得るため、Ｐｒｏが入っているものと同じ効果を有することができる。したがって、
すでにシナジー効果を有しているＫＬ‐Ｌ９ＰでＰｒｏの代わりに他の親水性アミノ酸を
入れた（Ｇ、Ｓ、Ｎ、Ｑ、ＤおよびＥ）突然変異ペプチドを作製し、これらのシナジー効
果を観察した。
【０１４４】
【表９】
2020128386.tif 000014
【０１４５】
【表１０】
2020128386.tif 000015
【０１４６】
【表１１】
2020128386.tif 000016
【０１４７】
簡潔な実験により、Ｌ９とともにＬ９Ｄのみがシナジー効果を観測することができ、Ｗ
ｉｍｌｅｙ方法でコリスチンとシンバスタチンとシナジー効果をＦＩＣＩ値で測定した。
以下の表１２に示されているように、ＫＬ‐Ｌ９Ｄのコリスチンおよびシンバスタチンと
のＦＩＣＩ値は、それぞれ０．４６および０．６１であり、シナジーはあるものの０．２
６および０．１８のＦＩＣＩを与えるＫＬ‐Ｌ９Ｐペプチドに比べて、大幅に劣る効果を
与えている。
【０１４８】
【表１２】
2020128386.tif 000017
【０１４９】
ＫＬ‐Ｌ９Ｐのように、ＫＬ‐Ｌ９Ｄもシナジー効果を示していたが、二つの化合物の
場合、いずれもＰｒｏを含有しているペプチドがＡｓｐを含有するペプチドに比べてシナ
ジーが高かった。したがって、かかるシナジー現象は、疎水面ペプチドがＰではなくＤに
よって全体的な両面性が壊れるとしても観測されていることを確認することができた。
【０１５０】
シナジー効果が最も大きく二つのＰｒｏを含有しているペプチドであるＬＫ‐Ｌ７Ｐ／
Ｌ８Ｐと類似した形状をしているＬＫ‐Ｌ８Ｄも作製し、シナジー効果を観察した。この
ペプチドもＫＬ‐Ｌ９Ｐよりは劣るがシナジーを有していたため、Ａｓｐで疎水性部分が
短絡されたペプチドは、Ｐｒｏで置換されたペプチドのようにグラム‐陰性菌の外膜を緩
くする膜活性ペプチドに近いと言える。しかし、他の親水性残基（例えば、Ｇ、Ｓ、Ｎ、
Ｑ、Ｅ）で全体的な両面性を壊したペプチドでは、いかなるシナジーも発見されなかった
。
【０１５１】
Ｅ）ＫＬ‐Ｌ９ＰのＡｌａ‐ｓｃａｎｎｉｎｇを用いたシナジー効果の変化観測
Ａｌａ‐ｓｃａｎｎｉｎｇ方法は、１４個のペプチドのうちいかなるアミノ酸が化学的
または生物学的効果を示すのに重要な位置の残基であるかを導き出せる良い手段であるた
め、様々なペプチドの研究に使用されている方法である。本発明でも同じ方法を使用する
と、いかなるアミノ酸が膜活性を起こし、小分子と大きいシナジー効果を奏することがで
きるかを判断することができる。したがって、本発明では、このＡｌａ‐ｓｃａｎｎｉｎ
ｇされたライブラリーをなすそれぞれのペプチドに対して、コリスチンとのシナジーを先
ず確認する実験を行った。ペプチドのシナジー効果に最も大きな影響を与えるアミノ酸位
置を見つけるために、ＫＬ‐Ｌ９Ｐとコリスチンとのシナジーを基準としてその値が最も
大きく変化したペプチドを選択する。当該ペプチドのＡｌａ置換位置が膜活性に最も大き
な影響を与えるアミノ酸残基位置であると言える。しかし、Ａｌａ‐ｓｃａｎｎｉｎｇさ
れたペプチドがＬＫ‐Ｌ９ＰＫ１４Ａ以外には、２倍以上の大きい変化がなかった。ＬＫ
‐Ｌ９ＰＫ１４Ａは、ＬＫ‐Ｌ９ＰよりもむしろＭＩＣ値が良好になったため、この部分
のリシンが膜‐活性のために重要ではないと考えられる結果である。次に、それぞれペプ
チドの１／２ＭＩＣ濃度でコリスチンとのシナジーを観察し、ＫＬ‐Ｌ９Ｐを基準として
その値が最も大きく変化したアミノ酸残基位置から、シナジーの変化が少ない位置を並べ
ることができた（表１３）。
【０１５２】
【表１３】
2020128386.tif 000018
2020128386.tif 000019
【０１５３】
内側に位置したＫＬ‐Ｌ９Ｐ／Ｋ１１Ａ、ＫＬ‐Ｌ９Ｐ／Ｋ８Ａ、ＫＬ‐Ｌ９Ｐ／Ｋ７
Ａなどのシナジーが最も減少したため、この位のアミン官能基は、シナジー効果を示すた
めに非常に重要であると考えられ、一方、両端側にアラニンで置換されたＫＬ‐Ｌ９Ｐ／
Ｋ１ＡまたはＫＬ‐Ｌ９Ｐ／Ｋ１４Ａなどのシナジー効果はほとんど減少しなかった。こ
の二つのリシンがシナジー効果にそれほど大きく影響を与えていないことを勘案すると、
これを除去した１２個からなるペプチドもＫＬ‐Ｌ９Ｐと類似したコリスチンと類似した
シナジー効果が予想することができる。
【０１５４】
次に、疎水性面アミノ酸が膜活性に及ぼす影響を調べるために、ＫＬ‐Ｌ９Ｐの疎水性
面のロイシンをアラニンにスキャニングしたペプチドライブラリーを製造した。以下の表
は、それぞれのペプチドに対するアミノ酸配列とＥ．ｃｏｌｉに対するＭＩＣをまとめた
表である。予想した結果のように、アラニン置換によって両面性ペプチド疎水性面の相互
作用が弱くなり、ＫＬ‐Ｌ９Ｐに比べてＭＩＣが減少した。特に、ＫＬ‐Ｌ６ＡＬ９Ｐと
ＫＬＡ‐Ｌ９ＰのＭＩＣは、それぞれ８０μＭ、＞２００μＭとＭＩＣが大幅に増加した
。ペプチドのＭＩＣに最も大きな影響を与えるＬｅｕ位は６番位置であり、６番位置が両
面性ペプチドの疎水性面の相互作用を破壊するのに重要な役割を果たすことが分かる。Ｋ
ＬＡ‐Ｌ９Ｐは、Ｌｅｕ７個のうち３個のＬｅｕがＡｌａに変化すると、両面性ペプチド
構造がまともに形成されないか、ペプチドの疎水性減少によってＥ．ｃｏｌｉの細胞膜と
ペプチドとの疎水性相互作用が弱くなり、ＭＩＣの急激な増加が生じた。
【０１５５】
次に、ＭＩＣが大幅に減少したＫＬ‐Ｌ６ＡＬ９ＰとＫＬＡ‐Ｌ９Ｐを除き、コリスチ
ンとのシナジー効果を測定した。
【０１５６】
【表１４】
2020128386.tif 000020
【０１５７】
以下の表１５は、１／４ＭＩＣペプチドと１／２ＭＩＣペプチドをコリスチンと混合し
た時のＦＩＣＩ値である。１／４ＭＩＣペプチドと１／２ＭＩＣペプチドのＦＩＣＩ値を
比較すると、ＫＬ‐Ｌ９Ｐのシナジー効果に重要なＬｅｕ位が分かる。仮に、ペプチドと
コリスチンがシナジー効果があると、ペプチドが１／４ＭＩＣから１／２ＭＩＣになる時
にコリスチンのＭＩＣは減少する。すなわち、シナジーがある場合、ペプチドが１／４Ｍ
ＩＣから１／２ＭＩＣになる時に、ペプチド側の分率は０．２５から０．５に増加するが
、コリスチン側の分率は減少するため、全体ＦＩＣＩ値は０．２５よりも少なく増加しな
ければならない。ＫＬ‐Ｌ５ＡＬ９Ｐ、ＫＬ‐Ｌ９ＰＬ１０Ａ、ＫＬ‐Ｌ９ＰＬ１３Ａは
、１／４ＭＩＣから１／２ＭＩＣになる時に、０．３７、０．３１、０．２９ずつ増加し
たため、コリスチンとシナジーが急激に減少することが分かる。
【０１５８】
【表１５】
2020128386.tif 000021
【０１５９】
ＫＬ‐Ｌ９Ｐのシナジー効果に重要なＬｅｕ位を参照すると、Ｐｒｏの隣の位である１
０番位置にＫＬ‐９Ｐペプチドの折り畳まれた構造がシナジー効果に重要な役割を果たす
ことが分かる。また、５番位置、１３番位置ＬｅｕがＡｌａで置換される時に、シナジー
効果が減少したことから、折り畳まれた位から両方へ４個まで（Ｐまで含み９個の）アミ
ノ酸配列が重要であることが分かる。
【０１６０】
膜活性能によってコリスチンとのシナジーがどれほど減少したのかまたはＭＩＣがどれ
ほど悪くなったのかを基準として、親水性／疎水性結果をまとめて観察すると、重要な位
のアミノ酸配列を観察することができる。親水面では１１番、８番、７番の順に、疎水面
では６番、５番、１０番の順にシナジーが減少した。これをまとめて、効果があるアミノ
酸配列を四つの配列で表現すると、ＫＰＬＫ、五つの配列で表現するとＫＫＰＬＫ、六つ
の配列で表現するとＬＫＫＰＬＫ、七つの配列で表現するとＬＬＫＫＰＬＫで示すことが
できる。
【０１６１】
Ｆ）シナジー効果を有する膜活性ペプチドの形状
作製された８４個のペプチドのうち膜に活性を与えて化合物と抗生剤のシナジー効果を
奏するペプチドは４個しかなかった。したがって、この４個のペプチドの構造的特徴を観
察すると、膜活性の一般的な性質を知ることができる方法になり得る。ペプチド構造を把
握するためにＣＤおよび分子予測プログラムを導入した。先ず、ＣＤを見ると、ＫＬ‐Ｌ
９Ｐ（７０％）、ＫＬ‐Ｌ９Ｄ（５０％）、ＬＫ‐Ｌ８Ｄ（５０％）、ＬＫ‐Ｌ７ＰＬ８
Ｐ（６０％）比較的高いαヘリックスが膜条件で発見された。これとは対照的に、水条件
ではαヘリックスがほとんどなかった（１０％未満）。したがって、菌の外膜条件でも高
いαヘリックスを有していると予想される。しかし、図１５と同様、分子モデル予測プロ
グラムによるαヘリックス形状は、完全な円筒（Ａ）ではなく、Ｂ‐１、Ｂ‐２、Ｂ‐３
の形状のように常に折り畳まれたまたは折り曲げられたαヘリックス構造をしていた。か
かる事実から推測すると、αヘリックス度が高くて両面性が維持され、且つ折り畳まれた
構造を有するペプチドは、膜に存在する親水性および疎水性分子との認識を極大化できる
と考えられる。かかる認識力の極大化は、膜を崩壊させず且つ膜を緩くし、ペプチドがな
いと通過することができなかった疎水性低分子が膜を貫通して菌の中に入るのに大きい役
割をしていると考えられる。ペプチドがこのように折り畳まれた形状をしているとしても
どれほど折り畳まれたかについて定義することは容易でない。ペプチド形状予測プログラ
ムを動員しても、様々な一つのペプチドで様々な形状が大きいエネルギー差を示しながら
同時に存在する可能性があるためである。
【０１６２】
Ｇ）折り畳まれた形状を用いたペプチドのシナジー効果
そうすると、折り畳まれたαヘリックス構造のためにＰｒｏの含有が必須であるか。こ
れを調べるために、本発明者らは、ジスルフィド結合により人為的に折り畳まれた構造を
有するペプチドを作製してみた。すなわち、以下の表１６のようにＫＬペプチドと同様の
アミノ酸配列を有し、αヘリックスの上と下でのｉおよびｉ＋４（またはｉ＋３）位置に
シスチンを置換してαヘリックスの上と下を結ぶか、ｉおよびｉ＋８位置に炭化水素ステ
ープルリンカー（ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ  ｓｔａｐｌｅ  ｌｉｎｋｅｒ）を連結して折
り畳まれた形状を誘導した。この二つのペプチドを製造した後、これとコリスチンのシナ
ジー効果を観察した（表１７）。二つのペプチドはいずれもＰｒｏを含有するペプチドよ
りは弱いが、コリスチンと部分的なシナジー効果を有しており、ペプチド／コリスチン／
リネゾリドなど三つの化合物を混合した混合物でもシナジー効果が示された（表１８）。
シナジー効果は、ＫＬ‐Ｌ９Ｐよりは少なく示されたものの、ジスルフィド結合によって
折り畳まれた構造をしているペプチドで明白なシナジー効果を示したことは好ましいこと
である。また、コリスチンおよびリネゾリドの濃度は、ＫＬ‐Ｌ９Ｐ存在下で得られたＭ
ＩＣ濃度と比較して、類似するか少し高い濃度であり依然として意味があり、折り畳まれ
たペプチド自体のＭＩＣがＫＬ‐Ｌ９Ｐより相当進歩した結果を示し、ペプチドの使用濃
度を低減することができる特徴がある。この折り畳まれた構造により、αヘリックス構造
が宿主細胞に与える毒性を緩和できることも、このペプチドの利点と言える。両面性ペプ
チドがＰｒｏを入れて折り畳まなくても、人為的に折り畳まれた構造にすると、グラム‐
陰性菌の膜を活性化し、様々な化合物との併行投与により菌を制御することができる。
【０１６３】
【表１６】
2020128386.tif 000022
【０１６４】
【表１７】
2020128386.tif 000023
【０１６５】
【表１８】
2020128386.tif 000024
【０１６６】
Ｈ）ブフォリン（ＬＫまたはＫＬペプチド以外にＰｒｏによって折り畳まれた自然ペプ
チド）の膜活性の性質
本発明者らは、ＬＫまたはＫＬペプチドのように両面性が確実に１００％であるモデル
ペプチドだけでなく、適切な水準の両面性ペプチドまたは自然に存在する各種の抗菌活性
ペプチドおよび細胞透過ペプチドがかかるグラム‐陰性菌特異的膜活性ペプチドの性質を
有することができるかについて研究した。その理由は、本発明者らが見出した現象は、植
物で作製した有効成分であるクルクミンレスベラトロールなどが、植物に浸入したグラム
‐陰性菌を殺す非常に合理的な方法であり得るためである。すなわち、クルクミンは、グ
ラム‐陰性菌を殺す能力があるが、かかる膜活性ペプチドがない条件では非常に高い濃度
を有したときに菌を殺す。しかし、発明者らが発明したものと同じＫＬまたはＬＫのよう
な膜活性ペプチドが自然に存在すると、これを用いてクルクミンは、菌の中に入るはずで
あり、シナジー効果によって非常に低い濃度範囲でも菌を殺すことができるためである。
【０１６７】
自然に存在するヒストンタンパク質２Ａの一部であるブフォリン（２１個、ＴＲＳＳＲ
ＡＧＬＱＦＰＶＧＲＶＨＲＬＬＲＫ：配列番号５０）は、広い領域の抗生効果を有する。
多種の抗生効果が膜を分解する性質によって生じる反面、このブフォリンは、菌膜透過性
質を有している。菌膜を透過して菌の中に入った後、菌の中に存在するＤＮＡまたはＲＮ
Ａと結合して菌を殺すことになっている。本発明者らは、この菌透過性質をより弱化させ
ながら膜活性を維持するために、最初に２１個のアミノ酸から構成されたブフォリンII１
６個（ブフォリンIIの５〜２０番、ＲＡＧＬＱＦＰＶＧＲＶＨＲＬＬＲＫ：配列番号５１
）に減少させたブフォリン５‐２０を生産した。このブフォリンは、溶血現象がなく、グ
ラム‐陽性菌に対する活性もなく、グラム‐陰性菌に対する活性が若干ある程度と前に調
査されたペプチドであった。その上に、この三つ能力は、発明者らが発明したモデルペプ
チドであるＬＫ‐Ｌ９Ｐと非常に類似した性質と言える。
【０１６８】
次に、ブフォリン５‐２０ペプチドを合成し、その大腸菌に対するＭＩＣ値を測定し、
グラム‐陰性菌膜を活性化させてコリスチンまたはリネゾリドとのシナジーがあるか否か
を観察した。先ず、ブフォリン５‐２０のＭＩＣ値は２０μＭであり、論文で報告した値
とほぼ同様であった。Ｗｉｎｌｅｙ方法で観察したブフォリン５‐２０とコリスチンおよ
びリネゾリドのＦＩＣＩ値は、調査しており、この値は０．５および０．７であった。こ
れは、ＫＬ‐Ｌ９Ｐよりは劣るが、ブフォリン５‐２０がグラム‐陰性菌膜活性を有して
おり、これによって他の抗生剤とのシナジー効果があることを意味している。ブフォリン
５‐２０のアミノ酸配列は、ＫＬ‐Ｌ９Ｐに比べて著しく異なるが、１）両面性のαヘリ
ックス形状をしているという点、２）Ｐｒｏによってαヘリックスが折り畳まれた（また
は折り曲げられた）構造をしており、折り畳まれた部分は疎水性を帯びた部分、３）カチ
オン荷電されたアミノ酸が全体的に３５％（６／１６）という点、４）疎水性アミノ酸が
全体的に３５％（６／１６）という点、５）宿主細胞に対する溶血活性およびグラム‐陽
性菌に対する活性は全くないという点、６）グラム‐陰性菌に対する活性が弱く残ってい
るという点（ＭＩＣ＝１０〜２０μＭ）などは、ＬＫ‐Ｌ９Ｐおよびその誘導体から得ら
れた膜活性が一般的な性質と正確に一致する。したがって、前記で発見した五つの性質は
、グラム‐陰性菌膜活性ペプチドが有する一般的な性質に定義しても無理がないと考えら
れる。
【０１６９】
ブフォリン５‐２０は、そのサイズ（１６個のアミノ酸）が有することができるＨＰＬ
Ｃでのｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｔｉｍｅが相対的に非常に速いため、非常に親水性の特徴を
有する。また、前に指摘したように、ＫＬ‐Ｌ９Ｐが他の位置にプロリンが入っている異
性体との相違点が非常に親水性であるため同様のＨＰＬＣ条件で最も速いｒｅｔｅｎｔｉ
ｏｎ  ｔｉｍｅを有することと一致する結果である。膜活性ペプチドの一般的な性質とし
てカチオン荷電（または疎水性部分）を有するが、これの位置が全体的に親水性性質を有
するように配置されることが、膜活性ペプチドの一般的な性質の一つとして挙げられる。
【０１７０】
実施例９．膜活性ペプチドとのシナジーを有する化合物の一般的な性質
膜活性ペプチドとのシナジー効果がある低分子化合物を既存の抗生剤および薬理原子団
化合物を用いて調査した。低分子化合物としては、既存にグラム‐陽性菌に使用されてい
るリネゾリドを含む抗生剤をはじめ、抗炎症反応および解熱剤として多く使用されている
ＮＳＡＩＤ系の低分子化合物、高脂血症治療剤であるスタチン系の低分子化合物、また薬
効がよく知られているがまだ薬として許可を受けていないｎｕｔｒａｃｅｕｔｉｃａｌ化
合物など、各種の低分子化合物種類を網羅した。
【０１７１】
膜活性ペプチドの種類（実施例８）が様々であり、それぞれのペプチドが膜に作用する
メカニズムが多少異なり得るが、シナジー効果の算出のためには、ＫＬ‐Ｌ９Ｐペプチド
を使用した。その理由は、このペプチドは、最も適切な単一単位のマイクロモル濃度で低
分子化合物と容易にシナジー効果を確認することができる。かかる単一単位マイクロモル
濃度は、ペプチドとのシナジーを有する多種の新たなグラム‐陰性菌候補抗生剤の実験管
技法実験で有効濃度とも類似しているため、候補化合物の濃度差がもたらす誤差を最小に
低減することができるためである。
【０１７２】
膜活性ペプチドであるＫＬ‐Ｌ９Ｐと低分子の抗菌シナジー効果は、Ｗｉｍｌｅｙ方法
によってＦＩＣＩ値を算出する方式で行った。この方法は、既存方法であるｃｈｅｃｋｅ
ｒ‐Ｂｏａｒｄ  ａｓｓａｙ方法よりもはるかに正確な方法であり、既存方法が１／２‐
希釈方法を使用した一方、新たな方法は２／３‐希釈方法を使用することで、化合物また
はペプチドの希釈から現れ得る誤差を最小限に低減しながらシナジー効果があるか否かを
観察した。
【０１７３】
上述のシナジー効果の部分ですでに記述したように、驚くほどに高い割合（約６９％）
の低分子化合物がＫＬ‐Ｌ９Ｐとのシナジーがあった（図１８）。
【０１７４】
シナジー効果を与える化合物が様々な電荷（中性／正電荷／負電荷化合物）を帯びてい
ることから、陽性を帯びている性質を有するペプチドとの認識がシナジー効果の源泉とし
ては考えられない。その理由は、コリスチンのような両面性ペプチドもＫＬ‐Ｌ９Ｐペプ
チドと強力なシナジーを与えるだけでなくイブプロフェンのような簡単で且つ電気的に陰
性を有する化合物もほぼ類似している値で強力なシナジーを与えるためである。その構造
が非常に類似しいるシンバスタチンとロバスタチンの場合にも、シンバスタチンは非常に
強力なシナジーを与える一方、ロバスタチンはこれよりもはるかに劣るシナジーを与えて
いる。イブプロフェンは、二つの鏡面異性体がいずれもシナジー効果を有することが非常
に興味深い（図１９）。
【０１７５】
しかし、すべての化合物がいずれもシナジー効果を与えるものではない。抗生剤の中に
は、Ｄ‐ｃｙｃｌｏｓｅｒｉｎｅ、ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ、ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎ、ｃ
ｉｐｒｏｆｌｏｘａｃｉｎなどがシナジーがなかった。この化合物のうち、ｖａｎｃｏｍ
ｙｃｉｎは、グラム‐陰性菌にそれほど発現されなかった酵素の阻害剤であり、ｔｅｔｒ
ａｃｙｃｌｉｎおよびｃｉｐｒｏｆｌｏｘａｃｉｎは、菌膜に存在するｐｏｒｉｎタンパ
ク質を介して菌の中に入るメカニズムを有している。ＮＳＡＩＤの中にはアスピリンとア
セトアミノフェンのシナジーがなかった。これらも分子量から見て非常に小さい物質であ
る。Ｎｕｔｒａｃｅｕｔｉｃａｌの中にはベルベリンがシナジーがないということは特異
である。この化合物は、最初に抗生剤として知られている化合物であるため、当然シナジ
ーがあると考えられたが、ＦＩＣＩ値が１．５に至るほどに全くシナジーがない。
【０１７６】
そうすると、膜活性ペプチドとシナジー効果を与える低分子は、一般的にいかなる特徴
を有しているのか。抗生剤のうちシナジー効果がなかった化合物を見ると、ｐｏｒｉｎタ
ンパク質を介して菌の中に入る化合物であった。また、アスピリン、アセトアミノフェン
などは、非常に分子量が２００以下の分子であった。すなわち、これらは、過剰に親水性
を有しているため、一般的な透過が膜に直接透過される経路を用いないと予想される。こ
の事実から推定すると、シナジーがある化合物は、膜活性ペプチドによって緩んだ疎水性
膜を通過して菌の中に入らなければならないが、そうすると、化合物が疎水的性質を多く
有していなければならない。この親水性および疎水性を表示する値がｐａｒｔｉｔｉｏｎ
ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔのｌｏｇＰ値である。この値は、化合物が疎水性であるオクタ
ノールに溶解している濃度と水に溶解している濃度との比にｌｏｇを取った値であり、ｌ
ｏｇＰが大きくなると、一般的に化合物の疎水性が増加する。
【０１７７】
化合物の親水／疎水性を示すｌｏｇＰとシナジー効果は、関係があるのか。一般的にＦ
ＩＣＩ値が小さいと、シナジー効果が大きいため、それの逆数とｌｏｇＰの相関関係を図
式化した。以下の図に示されているように、ＫＬ‐Ｌ９Ｐを膜活性ペプチドとして使用し
た時に化合物の疎水性はシナジー効果と強力な相関関係があった。すなわち、化合物の疎
水性が増加するほどシナジー効果は大きいといえる。シナジーは、ＦＩＣＩ値であり、１
以下になると効果があると定義されるため、ｌｏｐＰ値が０．１９以上にあるとシナジー
効果があり得ると考えられる。しかし、この定義にも例外はある。コリスチンとリネゾリ
ドは、非常に親水性分子であるにもかかわらず良好なシナジーを有する。また、アスピリ
ン、アトルバスタチンなどは、非常に疎水性性質であるにもかかわらずシナジーがない。
親水性でシナジーが良好な化合物の特徴は、生理的ｐＨ条件でカチオンを帯びることがで
きる性質である。疎水性であるにかかわらずシナジーがない化合物は、相対的に生理的ｐ
Ｈ条件でアニオンに荷電されている可能性が大きい。グラム‐陰性菌の内膜または外膜の
表面が負荷電されていることを考えると、かかる例外になる化合物がどうしてシナジーを
有することができるのか理解することができる。すなわち、カチオンに荷電された化合物
は、膜の表面に結合して膜活性ペプチドによって菌の中に入る可能性がある一方、アニオ
ンに荷電された化合物は、菌の表面のアニオンとの反発力によって機会がなくなる可能性
が大きい（図１１）。
【０１７８】
分子量とシナジー効果との相関関係も図式化してみた（図１２）。分子量とシナジー効
果との間には大きい相関関係はないが、分子量が２００にならないほとんどの化合物は、
シナジー効果を与えていない。前記の親水／疎水性の相関関係と結合すると、まとめて分
子量が２００以上になる比較的疎水性化合物が膜活性ペプチドによってグラム‐陰性菌の
外膜を通過し、菌の内外にある標的に結合することで抗菌力を示している。すでにメカニ
ズムが糾明された抗生剤を除き、新たに抗生効果を有するリサイクル可能な薬（例えば、
イブプロフェン、シンバスタチンなど）のメカニズムは、新たに判明される必要があるが
、本発明の範囲から逸脱するため、この発明で取り扱わない。
【０１７９】
図１３によると、膜活性ペプチドとシナジーを出すことができる化合物のｌｏｇＰ値と
化合物全体のシナジーの相関関係はあったが、それほど強くなかった。これをより分析し
、シナジーある化合物の一般的な性質についてて糾明するために、シナジーがある化合物
を三つの種類に分けた。第一のものは、全体的に荷電がない化合物（ｃｈａｒｇｅ０）、
負荷電されている化合物群（ｃｈａｒｇｅ‐１）、また正荷電されている化合物群である
。
【０１８０】
先ず、荷電がない化合物のｌｏｇＰ値とシナジー効果は、非常に好ましい相関関係を示
していた。これは、すべての化合物を含みシナジー効果との相関関係を分析したことに比
べてはるかに相関関係が一致することを示している。
【０１８１】
しかし、負荷電または正荷電された化合物は、ｌｏｇＰで一般的に算出する化合物の親
水／疎水性の比がよく合わないようである。それで、新たな変数である化合物の極性を帯
びる表面積を分子量で除した値を導入した（これは、単位分子量当たり極性分子の表面積
を示す指標、ＰＳＡ／ＭＷ）。結局、この値が小さいと、単位分子量当たり極性の面積が
少なくなったことを意味し、この値が大きいと、単位分子量当たり極性の面積が相対的に
大きいことを意味する。アニオンを帯びている化合物としては、この値と化合物のシナジ
ー効果が逆相慣性を有していた。これは、結局、単位分子量当たり極性が占める表面積が
少ないほどシナジー効果が大きいと解釈され得る。
【０１８２】
カチオンを帯びている化合物も単位分子当たり極性分子の表面積を示す指標（ＰＳＡ／
ＭＷ）を横軸とし、シナジー効果を示す１／ＦＩＣ値を縦軸として相関関係を観察した（
図１４）。予想とおりに極性分子の表面積が相対的に大きいと、シナジー効果が大きい相
関関係があった。これは、カチオンに荷電された表面積が大きいほどシナジー値が大きく
なり得ることを意味する。
【０１８３】
まとめると、シナジー効果は、化合物の疎水性と関係が大きく（全体的なｌｏｇＰとシ
ナジー効果は相関関係がある）。しかし、多少の例外はあり、アニオンに荷電された化合
物は、この荷電箇所が少ないほど、カチオンに荷電された分子はカチオン荷電箇所が大き
いほどシナジー効果が大きく示された。これは、グラム‐陰性菌箇所が負荷電されており
、正荷電された分子が膜活性ペプチドによって菌の中に入るのに負荷電された分子に比べ
て有利であるという事実を証明している。
【０１８４】
結局、グラム‐陰性菌の外膜の中、特に疎水性部分によって通過されなかった化合物が
膜活性ペプチドによって菌の中に入るメカニズムで菌に対する新たな抗菌性が生じると考
えられる。相対的に分子量の少ない物質は、比較的疎水性でもあるが、ｐｏｒｉｎなど膜
以外の他の部分から助けられて菌の中に入ることができ、この分子は膜‐活性ペプチドに
よるシナジー効果が相対的に弱いことも前記のメカニズムを説明することができるもう一
つの証拠でもある。正電荷を帯びた物質は負電荷を帯びた物質に比べて相対的にシナジー
が良い。これは、菌の表面の負荷電と無関係ではないと考えられるが、外膜または内膜に
ある負荷電のためであるかは確実に把握されない。
【０１８５】
正荷電された分子の相関関係は、データの量が少なくて示すことができなかった。全体
的には膜活性ペプチドとシナジーをなす化合物は疎水性がある（ｌｏｇＰ＞０．１９）化
合物として相関関係を定義することができるが、分子量が少なすぎる化合物（Ｍ．Ｗ．＜
２００）はシナジー効果が小さく、ｌｏｇＰが大きすぎて水に対する溶解度が問題になる
化合物もシナジーの大きな増加を期待することができない。したがって、実際、シナジー
がある化合物の範囲は、０．１９＜ｌｏｇＰ＜５．０程度であると予想される。
【０１８６】
実施例１０．ペプチドと併用治療
本発明では、グラム‐陰性菌膜を特異的に活性化させるＫＬ‐Ｌ９Ｐを用いてグラム‐
陰性菌に効く新たな抗生剤を見出す方法およびこれを用いたグラム‐陰性菌の制御のため
の併行治療剤に関する。すなわち、膜活性ペプチドは、６５％に達する多種の他の目的の
ための治療剤とシナジーがあり、これらの治療剤をグラム‐陰性菌の治療剤にリパーパシ
ング（ｒｅｐｕｒｐｏｓｉｎｇ）することに役立つ役割を示している。これらのうち最も
シナジーが大きい化合物は、ＮＳＡＩＤの中には（Ｓ）‐ｉｂｕｐｒｏｆｅｎ、スタチン
系の中にはｓｉｍｖａｓｔａｔｉｎ、天然物の中にはｃｕｒｃｕｍｉｎが挙げられる。グ
ラム‐陰性菌の外膜を刺激するすでに存在する薬物のうち一つがコリスチンもＫＬ‐Ｌ９
Ｐペプチドとシナジーがあったが、これは、両方とも外膜に触れるが若干の官能基上に差
があると調査された。外膜活性を有する二つのペプチドの存在下で、リポジショニング薬
物（ｒｅｐｏｓｉｔｉｏｎｉｎｇ  ｄｒｕｇ）は、さらにシナジー効果が大きくなってＦ
ＩＣＩ値では０．３より少ない値を有する。これは、三つの化合物（ＬＫ‐Ｌ９P、コリ
スチン、ｒｅｐｏｓｉｔｉｏｎｉｎｇ  ｄｒｕｇ）それぞれ単独で存在する時のＭＩＣに
比べて少なくとも１０倍以上低い濃度でグラム‐陰性菌を殺す効果を有しているというこ
とである。これをよく用いると、三つの化合物の毒性および細胞毒性を避けて非常に軟ら
かで弱い濃度でもグラム‐陰性菌を殺すことができるため、今すぐ耐性を有するグラム‐
陰性菌に適用することができる新たな抗菌剤になると考えられる。リポジショニング薬物
のうち、リネゾリド（表１９）、クロキサシリン（表２０）、クルクミン（表２１）、お
よびイブプロフェン（表２２）をそれぞれＫＬ‐Ｌ９Ｐとコリスチンと二重に混合した時
、また三重に混合した時にＥ．ｃｏｌｉを殺すＭＩＣを表に示した（表２３）。
【０１８７】
表１９において、第１行目（黒色）は三つの化合物をそれぞれ単独で打った時、第２行
目（灰色）は三つの化合物のうち二つのみを併行処理した時、第３行目（白色）は三つの
化合物をすべて混合して処理した時のＥ．ｃｏｌｉに対するＭＩＣを表示したものである
。表２０において、第１行目（黒色）は三つの化合物をそれぞれ単独で打った時、第２行
目（灰色）は三つの化合物のうち二つのみを併行処理した時、第３行目（白色）は三つの
化合物をすべて混合して処理した時のＥ．ｃｏｌｉに対するＭＩＣを表示したものである
。表２１において、第１行目（黒色）は三つの化合物をそれぞれ単独で打った時、第２行
目（灰色）は三つの化合物のうち二つのみを併行処理した時、第３行目（白色）は三つの
化合物をすべて混合して処理した時のＥ．ｃｏｌｉに対するＭＩＣを表示したものである
。表２２において、第１行目（黒色）は三つの化合物をそれぞれ単独で打った時、第２行
目（灰色）は三つの化合物のうち二つのみを併行処理した時、第３行目（白色）は三つの
化合物をすべて混合して処理した時のＥ．ｃｏｌｉに対するＭＩＣを表示したものである
。表２３において、第１行目（黒色）は三つの化合物をそれぞれ単独で打った時、第２行
目（灰色）は三つの化合物のうち二つのみを併行処理した時、第３行目（白色）は三つの
化合物をすべて混合して処理した時のＥ．ｃｏｌｉに対するＭＩＣを表示したものである
。
【０１８８】
すべての場合において、三つの化合物を単独で打った時にＭＩＣが最も大きく現れ、二
つのみを併行処理した時にはこれよりは低くなり、三つを混合した併行処理では最も低い
値のＭＩＣを有すると調査された。
【０１８９】
【表１９】
2020128386.tif 000025
【０１９０】
【表２０】
2020128386.tif 000026
【０１９１】
【表２１】
2020128386.tif 000027
【０１９２】
【表２２】
2020128386.tif 000028
【０１９３】
【表２３】
2020128386.tif 000029
【０１９４】
耐性を有するグラム‐陰性菌は、退治する薬がなく、格別の方法で早い時期に新たな種
類の薬を見つけなければならない。格別の方法の一つは、グラム‐陰性菌の外膜を選択的
に緩くし、化合物が入ることができなかったものを通過可能にすることである。プロリン
が含まれた両面性ペプチドをライブラリー形態にし、グラム‐陰性菌膜活性を有するＫＬ
‐Ｌ９Ｐを候補として選択した。このペプチドは、先ず、宿主細胞に全く触れなくて毒性
がなく、グラム‐陰性菌の外膜に入り込む性質があることが分かった。しかし膜を崩壊す
ることができる能力がなく、膜に長時間滞留して膜を緩くする効果によって、他の候補抗
生物質が膜を通過することを容易にしている。抗菌力を実験した化合物のうち前にはグラ
ム‐陰性菌の抗菌効果が知られていなかった多種の化合物が菌膜活性ペプチドの存在下で
抗菌効果を有することになった。その例として、リネゾリドは１６μＭでグラム‐陰性菌
を殺すことができるようになった。菌の外膜を緩くするさらに他の化合物であるコリスチ
ンとこのＫＬ‐Ｌ９Ｐペプチドのようにグラム‐陰性菌の膜を刺激すると、シナジー効果
を出している化合物のシナジー効果がより大きくなることが分かり、このときにはリネゾ
リド濃度が６．７μＭだけであっても大腸菌をよく殺していた。かかる膜活性ペプチドは
、両面性を有するαヘリックス形状が折り曲げられた形状を作る時に最も効果が極大化し
、且つ宿主細胞に対する毒性もないということが証明された。膜活性ペプチドとシナジー
をなす化合物は、分子量が２００以上の疎水性分子（ｌｏｇＰ＞０．１９）であれば効果
を示すと調査されたため、多種のグラム‐陰性菌を制御することができる新たな物質を導
出することができる。この事実は、今までグラム‐陰性菌特異的抗菌剤が開発されにくか
った理由が、結局、グラム‐陰性菌の外膜にあるということを意味している。本発明では
、また外膜を緩くし、透過力がなかった低分子化合物を菌の中に入れ得る膜活性ペプチド
の存在こそ、グラム‐陰性菌特異的抗菌剤を開発する最も迅速且つ確実な方法であること
を証明している。
【産業上の利用可能性】
【０１９５】
グラム‐陰性菌膜特異的活性ペプチドの開発は、腎臓毒性および神経毒性とともに副作
用が大きい従来の抗生剤、例えば、コリスチンなどの代わりに使用可能である。また、ペ
プチドとコリスチンを併行投与した時、大きいシナジー効果を期待することができるため
、毒性が強いコリスチンを既存の濃度に比べて１／１０以下の濃度で投与して副作用を最
小化しながらグラム‐陰性菌を制御することができる。本発明に係る膜活性ペプチドが外
膜を緩くする効果に加え、コリスチンの外膜を緩くする効果を有することができると、開
発した膜活性ペプチドとコリスチンの使用濃度を下げながら本発明者が見出した抗生剤を
併行使用してグラム‐陰性菌を制御することができる。グラム‐陰性菌の外膜を緩くする
が膜活性ペプチド単独でまたコリスチンを並行して使用すると、緩くないことで菌の中へ
の浸入することが難しかった多種の化合物が菌の中に浸透することが可能になる。さらに
、本発明に係るペプチドを介してグラム‐陰性菌の外膜内に通過し、抗生物質としての役
割をするか否かを正確にスクリーニングできるため、新規抗生剤を探索する可能性も非常
に大きい。
【０１９６】
本発明が属した分野において通常の知識を有する者であれば、前記内容に基づいて本発
明の範疇内で様々な応用および変形を行うことが可能である。
【図１】
2020128386.tif 000030
【図２】
2020128386.tif 000031
【図３】
2020128386.tif 000032
【図４】
2020128386.tif 000033
【図５】
2020128386.tif 000034
【図６】
2020128386.tif 000035
【図７】
2020128386.tif 000036
【図８】
2020128386.tif 000037
【図９】
2020128386.tif 000038
【図１０】
2020128386.tif 000039
【図１１】
2020128386.tif 000040
【図１２】
2020128386.tif 000041
【図１３】
2020128386.tif 000042
【図１４】
2020128386.tif 000043
【図１５】
2020128386.tif 000044
【図１６】
2020128386.tif 000045
【図１７】
2020128386.tif 000046
【図１８】
2020128386.tif 000047
【図１９】
2020128386.tif 000048
【配列表】
2020128386000001.app
【外国語明細書】
2020128386000001.pdf