(57)【要約】【課題】多くの内分泌攪乱作用を評価することができる形質転換体を提供する。【解決手段】宿主細胞に、内分泌攪乱物質受容体をコードする核酸と、所定の塩基配列を有する応答配列及びレポーター遺伝子を有する核酸とを導入してなる形質転換体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主細胞に、内分泌攪乱物質受容体をコードする核酸と、以下の（ａ）又は（ｂ）の塩基配列を有する応答配列及びレポーター遺伝子を有する核酸とを導入してなる形質転換体。
（ａ）配列番号１に示す塩基配列（5’-TTTTTATTTTTCTGGTTA-3’）
（ｂ）配列番号１に示す塩基配列に対して１又は２個の塩基が置換、欠失又は付加された塩基配列
【請求項２】
上記内分泌攪乱物質受容体は、節足動物における幼若ホルモン受容体であることを特徴とする請求項１記載の形質転換体。
【請求項３】
上記節足動物における幼若ホルモン受容体は、甲殻類又は昆虫類の幼若ホルモン受容体であることを特徴とする請求項２記載の形質転換体。
【請求項４】
上記甲殻類の幼若ホルモン受容体は、オオミジンコの幼若ホルモン受容体であることを特徴とする請求項３記載の形質転換体。
【請求項５】
オオミジンコの幼若ホルモン受容体は、以下（ｃ）又は（ｄ）のタンパク質であることを特徴とする請求項４記載の形質転換体。
（ｃ）配列番号３に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｄ）配列番号３に示すアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、幼若ホルモン受容体転写因子活性を有するタンパク質
【請求項６】
上記応答配列は、上記（ａ）及び/又は上記（ｂ）に示す塩基配列を複数単位含むことを特徴とする請求項１記載の形質転換体。
【請求項７】
上記（ｂ）の塩基配列は、配列番号１に示す塩基配列における５’末端から１２〜１８番目の塩基から選ばれる１又は２個の塩基が置換又は欠失した塩基配列であるか、若しくは配列番号１に示す塩基配列における５’末端から１２〜１８番目の塩基の３’末端側に１又は２個の塩基が付加された塩基配列である請求項１記載の形質転換体。
【請求項８】
転写共役因子をコードする核酸を更に導入したことを特徴とする請求項１記載の形質転換体。
【請求項９】
上記宿主細胞は酵母であることを特徴とする請求項１記載の形質転換体。
【請求項１０】
請求項１乃至９いずれか一項記載の形質転換体に供試物質を接触させる工程と、
上記形質転換細胞における上記レポーター遺伝子の発現を測定する工程とを含み、
上記レポーター遺伝子の発現量に基づいて上記供試物質と内分泌攪乱物質受容体との相互作用を評価することを特徴とする、供試物質の評価方法。
【請求項１１】
上記レポーター遺伝子の発現量が供試物質の接触後に増加する場合、内分泌攪乱物質受容体のアゴニストと判断することを特徴とする請求項１０記載の評価方法。
【請求項１２】
上記供試物質を内分泌攪乱物質、ホルモン及び内分泌攪乱物質受容体のアゴニストからなる群から選ばれる少なくとも１つの物質とともに上記形質転換体に接触させ、上記レポーター遺伝子の発現量が、当該物質を単独で接触させたときと比較して低下している場合、内分泌攪乱物質受容体のアンタゴニストと判断することを特徴とする請求項１０記載の評価方法。
【請求項１３】
請求項１乃至９いずれか一項記載の形質転換体を含む、内分泌攪乱物質測定用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レポーターアッセイに利用できる形質転換体及び当該形質転換体を用いた供試物質の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
内分泌攪乱物質は、生物の内分泌作用を撹乱し、生殖機能阻害や悪性腫瘍等を引き起こす可能性のある物質である。内分泌攪乱物質は、ホルモン様作用物質（Hormonally Active Agents）とも呼称され、生体内に取り込まれると極微量であっても、正常なホルモン作用に影響を与える。内分泌攪乱物質は、例えば、本来、ホルモンが結合すべき受容体に結合することで生体に対する作用を発現する。内分泌攪乱物質による生体への作用としては、ホルモンと類似の作用がもたらされる場合と、当該ホルモンと反対の作用がもたらされる場合とがある。
【０００３】
例えば、農薬や殺虫剤、塗料、防錆剤等の成分には、エストロジェン様作用又はアンドロジェン様作用を示す内分泌攪乱物質として知られている化合物が含まれており、人体への影響が懸念されている。
【０００４】
一方、節足動物に特有の幼若ホルモン（Juvinele hormone：JH）の働きを制御する化学物質が殺虫剤として開発されている。幼若ホルモンは、様々な節足動物において変態や生殖を制御する特徴的なホルモンである。昆虫では、幼若ホルモンを受容体MET（Methoprene-tolerant）（ショウジョウバエではGce（Germ-cell-expressed）も存在）が受容すると下流のKruppel homolog 1（Kr-h1）の転写活性化を介して最終的な生理機能の発現に至る。したがって、幼若ホルモンが正常に働かないと、幼若ホルモンを有する節足動物は生存することができない。特に、哺乳動物は幼若ホルモンを持たないため、幼若ホルモンの働きを制御する化学物質を殺虫剤として利用しても、ヒトに対する安全性が高いと考えられてきた。なお、幼若ホルモンにはいくつかの種類があり、甲虫目や膜翅目、双翅目などの多くの昆虫ではJHIIIが、鱗翅目ではJHIとJHIIが知られている。
【０００５】
例えば、特許文献１には、幼若ホルモン（JH）に応答して下流の遺伝子の転写を活性化する応答配列（幼若ホルモン応答性配列（JH応答配列））をカイコにおいて見いだしたこと、当該JH応答配列をレポーター遺伝子と組み合わせて使用することで、JH応答性を評価するレポーターアッセイを構築したことが開示されている。
【０００６】
ところで、一般に、ミジンコは通常、単為生殖で雌個体のみを産出するが、環境が悪化すると雄個体を産出し受精し、耐久卵という環境変化に強い卵を産出する特性をもつことが知られている。近年、オオミジンコに関して、幼若ホルモンに曝されると雄個体を産出すると報告されており、幼若ホルモン受容体にリガンドとして作用する又は幼若ホルモン受容体の機能を阻害する物質も新たに内分泌攪乱物質として考えることができる。そのため、有害生物における幼若ホルモンに対して特異的にその機能を制御する化学物質の早期開発が求められている。
【０００７】
幼若ホルモン作用を評価する方法として、オオミジンコ個体を使用した繁殖毒性試験があるが、試験期間に長期間要することや、飼育・評価に技術を要するといった問題がある（非特許文献１）。また、培養細胞を用いて幼若ホルモン作用を評価する系も確立されているが、飼育・継代に技術を要するといった問題がある。また、非特許文献２には、オオミジンコにおける幼若ホルモン受容体遺伝子（MET遺伝子）及びJH応答配列の複数の候補が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特許第5754681号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Helen Ying Wang, et al., The screening of chemicals for juvenoid-related endocrine activity using the water flea Daphnia magna, Aquatic Toxicology 74 (2005) p. 193-204
【非特許文献２】Tomas A. Gorr, et al., A candidate juvenoid hormone receptor cis-element in the Daphnia magna hb2 hemoglobin gene promoter, Molecular and Cellular Endocrinology 247, (2006) p. 91-102
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上述のように、幼若ホルモンを含む各種ホルモンのそれぞれについて内分泌攪乱物質が存在する。このため、所定の化合物が如何なる内分泌攪乱作用を有するかは、各種のホルモンそれぞれに対して評価系を準備する必要があった。このように、所定の化合物における内分泌撹乱作用を評価するには、多くの工数が必要となり評価に要するコストが高くなるといった問題があった。
【００１１】
そこで、本発明は、上述した実情に鑑み、多くの内分泌攪乱作用を評価することができる形質転換体及びこれを用いた供試物質の評価方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上述した目的を達成するため、本発明者らが鋭意検討した結果、オオミジンコにおける幼若ホルモン応答配列が多くの内分泌攪乱物質に対して応答性を示すことを見いだし、本発明を完成するに至った。
本発明は以下を包含する。
【００１３】
（１）宿主細胞に、内分泌攪乱物質受容体をコードする核酸と、以下の（ａ）又は（ｂ）の塩基配列を有する応答配列及びレポーター遺伝子を有する核酸とを導入してなる形質転換体。
（ａ）配列番号１に示す塩基配列（5’-TTTTTATTTTTCTGGTTA-3’）
（ｂ）配列番号１に示す塩基配列に対して１又は２個の塩基が置換、欠失又は付加された塩基配列
（２）上記内分泌攪乱物質受容体は、節足動物における幼若ホルモン受容体であることを特徴とする（１）記載の形質転換体。
（３）上記節足動物における幼若ホルモン受容体は、甲殻類又は昆虫類の幼若ホルモン受容体であることを特徴とする（２）記載の形質転換体。
（４）上記甲殻類の幼若ホルモン受容体は、オオミジンコの幼若ホルモン受容体であることを特徴とする（３）記載の形質転換体。
（５）オオミジンコの幼若ホルモン受容体は、以下（ｃ）又は（ｄ）のタンパク質であることを特徴とする（４）記載の形質転換体。
（ｃ）配列番号３に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｄ）配列番号３に示すアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、幼若ホルモン受容体転写因子活性を有するタンパク質
（６）上記応答配列は、上記（ａ）及び/又は上記（ｂ）に示す塩基配列を複数単位含むことを特徴とする（１）記載の形質転換体。
（７）上記（ｂ）の塩基配列は、配列番号１に示す塩基配列における５’末端から１２〜１８番目の塩基から選ばれる１又は２個の塩基が置換又は欠失した塩基配列であるか、若しくは配列番号１に示す塩基配列における５’末端から１２〜１８番目の塩基の３’末端側に１又は２個の塩基が付加された塩基配列である（１）記載の形質転換体。
（８）転写共役因子をコードする核酸を更に導入したことを特徴とする（１）記載の形質転換体。
（９）上記宿主細胞は酵母であることを特徴とする（１）記載の形質転換体。
（１０）上記（１）乃至（９）いずれか記載の形質転換体に供試物質を接触させる工程と、上記形質転換細胞における上記レポーター遺伝子の発現を測定する工程とを含み、上記レポーター遺伝子の発現量に基づいて上記供試物質と内分泌攪乱物質受容体との相互作用を評価することを特徴とする、供試物質の評価方法。
（１１）上記レポーター遺伝子の発現量が供試物質の接触後に増加する場合、内分泌攪乱物質受容体のアゴニストと判断することを特徴とする（１０）記載の評価方法。
（１２）上記供試物質を内分泌攪乱物質、ホルモン及び内分泌攪乱物質受容体のアゴニストからなる群から選ばれる少なくとも１つの物質とともに上記形質転換体に接触させ、上記レポーター遺伝子の発現量が、当該物質を単独で接触させたときと比較して低下している場合、内分泌攪乱物質受容体のアンタゴニストと判断することを特徴とする（１０）記載の評価方法。
（１３）上記（１）乃至（９）いずれか記載の形質転換体を含む、内分泌攪乱物質測定用キット。
【発明の効果】
【００１４】
本発明に係る形質転換体は、レポーター遺伝子の発現制御領域にオオミジンコ由来の幼若ホルモン応答配列を有するため、作用の異なる様々な内分泌攪乱物質に対して応答性を示すことができる。
【００１５】
また、本発明に係る供試物質の評価方法は、レポーター遺伝子の発現制御領域にオオミジンコ由来の幼若ホルモン応答配列を有する形質転換体を用いることで、様々な内分泌攪乱作用をレポーター遺伝子の発現に基づいて評価することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明に係る形質転換体は、宿主細胞に、内分泌攪乱物質受容体をコードする核酸と、所定の塩基配列を有する応答配列及びレポーター遺伝子を有する核酸とを導入したものである。
【００１７】
応答配列としては、配列番号１に示す塩基配列からなる単位を１又は複数個含む配列を挙げることができる。配列番号１に示す塩基配列は、Molecular and Cellular Endocrinology 247, (2006) p. 91-102に開示されているように、オオミジンコ（Daphnia magna）におけるヘモグロビン遺伝子（hb2遺伝子）の上流に位置するプロモーター配列（以下、phb2配列）に含まれている。このphb2配列は、オオミジンコにおける転写因子の一つであるMETタンパク質と相互作用し、下流のhb2遺伝子の発現を転写レベルで正に制御する機能を有している。
【００１８】
ただし、応答配列は、配列番号１に示したphb2配列に限定されず、配列番号１に示す塩基配列に対して１又は２個の塩基が置換、欠失又は付加された塩基配列からなる単位を１又は複数個含む配列であっても良い。なお、配列番号１に示す塩基配列に対して２個の変異（置換、欠失又は付加）を有する場合には配列番号１に示す塩基配列に対して88.9％の同一性を有し、配列番号１に示す塩基配列に対して１個の変異（置換、欠失又は付加）を有する場合には配列番号１に示す塩基配列に対して99.4％の同一性を有する。
【００１９】
配列番号１に示す塩基配列に対して１又は２個の塩基が置換、欠失又は付加された塩基配列であっても、オオミジンコにおける転写因子の一つであるMETタンパク質と相互作用し、下流のhb2遺伝子の発現を転写レベルで正に制御する機能を保持することができる。
【００２０】
ここで、上述した変異（置換、欠失又は付加）の位置は、特に限定されないが、例えば、配列番号１に示す塩基配列における５’末端から１２〜１８番目の領域にあることが好ましい。詳細には、変異の種類が置換又は欠失の場合、配列番号１に示す塩基配列における５’末端から１２〜１８番目の塩基から選ばれる１又は２個の塩基が置換又は欠失していることが好ましい。また、変異の種類が付加の場合、配列番号１に示す塩基配列における５’末端から１２〜１８番目の塩基の３’末端側に１又は２個の塩基が付加していることが好ましい。
【００２１】
上述した変異（置換、欠失又は付加）の部位を、配列番号１に示す塩基配列における５’末端から１２〜１８番目の領域とすることで、オオミジンコにおける転写因子の一つであるMETタンパク質と相互作用し、下流のhb2遺伝子の発現を転写レベルで正に制御する機能を確実に保持することができる。
【００２２】
また、応答配列としては、配列番号１に示す塩基配列からなる単位と、配列番号１に示す塩基配列に対して１又は２個の塩基が置換、欠失又は付加された塩基配列からなる単位とを含む配列であってもよい。これら単位を含む応答配列としては、これら単位のうち一方が複数個含まれていても良いし、両方が複数個含まれていても良い。
【００２３】
応答配列として上述した単位を複数個含む場合には、各単位を隣接するように配置しても良いし、１〜複数個の塩基からなるスペーサーを介して各単位を配置しても良い。スペーサーの塩基長としては、特に限定されず、１〜１００塩基長とすることができ、また、１〜９０塩基長とすることが好ましく、１〜８０塩基長とすることが好ましく、１〜７０塩基長とすることが好ましく、１〜６０塩基長とすることが好ましく、１〜５０塩基長とすることが好ましく、１〜４０塩基長とすることが好ましく、１〜３０塩基長とすることが好ましく、１〜２０塩基長とすることが好ましく、１〜１０塩基長とすることが好ましい。
【００２４】
本発明に係る形質転換体において、上述した応答配列は、下流のレポーター遺伝子の転写を制御する発現制御領域に配置される。発現制御領域とは、下流の遺伝子の転写を制御している領域であり、通常は遺伝子の上流（センス鎖の５’側領域）の領域を意味する。より具体的に、発現制御領域は、通常、下流遺伝子の転写開始部位から上流側の数千塩基の範囲とすることができ、例えば、転写開始部位から上流５ｋｂ以内、好ましくは４ｋｂ以内、３ｋｂ以内、２ｋｂ以内、１ｋｂ以内、５００ｂ以内、３００ｂ以内とすることができる。
【００２５】
さらに、発現制御領域には、上述した応答配列の他に、転写因子が結合する領域、エンハンサー領域等が含まれていても良い。例えば、上述した応答配列を含む発現制御領域は、オオミジンコにおけるhb2遺伝子の発現制御領域であって当該応答配列を含む所定の長さの領域、例えば、当該応答配列を含む２０ｂの領域、３０ｂの領域、４０ｂの領域、５０ｂの領域、６０ｂの領域、７０ｂの領域、８０ｂの領域、９０ｂの領域又は１００ｂの領域とすることができる。
【００２６】
本発明に係る形質転換体は、以上のように構成された、応答配列を有する発現制御領域の下流にレポーター遺伝子を有している。レポーター遺伝子としては、特に限定されず、例えば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）遺伝子、lacZ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、β-グルクロニダーゼ (GUS) 遺伝子及びGFP遺伝子等を挙げることができる。なお、レポーター遺伝子としては、上述した従来公知の遺伝子に限定されず、上述したhb2遺伝子をレポーター遺伝子としても良い。すなわち、如何なる遺伝子であれ、転写レベルの発現量をモニターできればレポーター遺伝子として使用することができる。
【００２７】
一方、本発明に係る形質転換体は、内分泌攪乱物質受容体をコードする核酸を有している。内分泌攪乱物質受容体とは、所定のホルモンがリガンドとして作用する受容体であって、当該ホルモン様の作用を有する内分泌攪乱物質もまた作用する受容体を意味する。内分泌攪乱物質受容体は、細胞膜受容体及び核内受容体の何れも含む意味である。本発明に係る形質転換体において、内分泌攪乱物質受容体としては、特定のホルモン又は内分泌攪乱物質の存在下にて上述した応答配列に相互作用し、転写因子活性を示す受容体とすることが好ましい。
【００２８】
内分泌攪乱物質としては、特に限定されず、内分泌攪乱作用を有することが公知である物質、内分泌攪乱物質を有することが疑われている物質の双方を含む意味である。例えば、内分泌攪乱物質としては、女性ホルモン（エストロジェン）に対してアゴニスト作用を有する物質又はアゴニスト作用を有する物質、男性ホルモン（アンドロジェン）に対してアゴニスト作用を有する物質又はアゴニスト作用を有する物質を挙げることができる。なお、内分泌攪乱物質としては、これら女性ホルモン又は男性ホルモンに対する攪乱作用を有する物質に限定されず、例えば甲状腺ホルモン、成長ホルモン、副腎皮質ホルモン又はインシュリンに対する攪乱作用を有する物質も含む意味である。
【００２９】
したがって、内分泌攪乱物質受容体とは、上述した各種ホルモンに対する受容体であるエストロジェン受容体、アンドロジェン受容体、甲状腺ホルモン受容体、成長ホルモン受容体、副腎皮質ホルモン受容体又はインシュリン受容体を挙げることができる。
【００３０】
また、本発明において、内分泌攪乱物質には、節足動物が特異的に有している幼若ホルモンに対してアゴニスト作用又はアンタゴニスト作用を有する物質が含まれる。したがって、内分泌攪乱物質受容体としては、幼若ホルモン受容体（MET）もまた含まれる。
【００３１】
幼若ホルモン受容体としては、特に限定されないが、昆虫類、甲殻類、クモ類及びムカデ類を含む節足動物における幼若ホルモン受容体とすることができる。なかでも、節足動物における幼若ホルモン受容体としては、甲殻類又は昆虫類の幼若ホルモン受容体とすることが好ましい。
【００３２】
昆虫類としては、カブトムシ及びゴミムシ等を含む甲虫目（鞘翅目）、チョウ及びガを含むチョウ目（鱗翅目）、ハエ、カ及びアブを含むハエ目（双翅目）、ハチ及びアリを含むハチ目（膜翅目）、セミ及びカメムシを含むカメムシ目（半翅目）、バッタ及びコオロギを含むバッタ目（直翅目）、トンボを含むトンボ目（蜻蛉目）を挙げることができる。本発明に係る形質転換体には、これら昆虫類由来の幼若ホルモン受容体をコードする核酸を使用することができる。
【００３３】
より具体的には、ハエ目に属するキイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）の幼若ホルモン受容体をコードする核酸を使用することができる（He Q et al. ; J Biol Chem. 289 (40), p. 27874-27885 (2014)参照）。
【００３４】
また、甲殻類としては、エビ、カニ、オキアミ、フジツボ及びミジンコを含む甲殻亜門に含まれる動物を挙げることができる。本発明に係る形質転換体には、これら甲殻類由来の幼若ホルモン受容体をコードする核酸を使用することができる。
【００３５】
特に、甲殻類由来の幼若ホルモン受容体をコードする核酸のなかでも、特に、ミジンコ科に属する動物由来の幼若ホルモン受容体をコードする核酸を使用することが好ましい。ミジンコ科に属する動物としては、トガリネコゼミジンコ（Ceriodaphnia cornuta）、アミメネコゼミジンコ（Ceriodaphnia reticulata）、ニセネコゼミジンコ（Ceriodaphnia dubia）、キレオネコゼミジンコ（Ceriodaphnia megalops）、ヒメネコゼミジンコ（Ceriodaphnia pulchella）及びネコゼミジンコ（Ceriodaphnia quadrangular）等のネコゼミジンコ属（Ceriodaphnia）に属する動物；タイリクミジンコ（Daphnia similis）、オオミジンコ（Daphnia magna）、ミジンコ（Daphnia pulex）、オオビワミジンコ（Daphnia pulicaria）、マギレミジンコ（Daphnia ambigua）、オナシミジンコ（Daphnia obtuse）、ビワミジンコ（Daphnia biwaensis）、ハリナガミジンコ（Daphnia longispina）、カワリハリナガミジンコ（Daphnia rosea）、ウスカワハリナガミジンコ（Daphnia hyaline）、カブトミジンコ（Daphnia galeata）、エゾハリナガミジンコ（Daphnia ezoensis）、カムリハリナガミジンコ（Daphnia cuculata）、Daphnia cristata及びトガリハリナガミジンコ（Daphnia longiremis）等のミジンコ属（Daphnia）に属する動物；アオムキミジンコ（Scapholeberis mucronata）及びタイリクアオムキミジンコ（Scapholeberis kingi）等のアオムキミジンコ属（Scapholeberis）に属する動物；並びにトガリオカメミジンコ（Simocephalus serrulatus）、トゲオカメミジンコ（Simocephalus exspinosus）、オカメミジンコ（Simocephalus vetulus）、オオオカメミジンコ（Simocephalus vetuloides）及びニッポンテングオカメミジンコ（Simocephalus japonica）等のオカメミジンコ属（Simocephalus）に属する動物を挙げることができる。
【００３６】
これらの中でも特に、ミジンコ属（Daphnia）に属する動物の幼若ホルモン受容体をコードする核酸を使用することが好ましく、更にオオミジンコ（Daphnia magna）の幼若ホルモン受容体をコードする核酸を使用することがより好ましい。オオミジンコの幼若ホルモン受容体のアミノ酸配列を配列番号３に示し、当該幼若ホルモン受容体をコードする核酸の塩基配列を配列番号２に示す。
【００３７】
ただし、本発明に係る形質転換体は、配列番号３に示すアミノ酸配列からなる幼若ホルモン受容体をコードする核酸を有するものに限定されず、配列番号３に示すアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性、好ましくは８０％以上の同一性、より好ましくは９０％以上の同一性、更に好ましくは９５％以上の同一性、最も好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、幼若ホルモン受容体転写因子活性を有するタンパク質をコードする核酸を有するものであってもよい。
【００３８】
なお、アミノ酸配列間の同一性の値は、BLASTアルゴリズムを実装したBLASTNやBLASTXプログラムにより算出することができる（デフォルトの設定）。なお、同一性の値は、一対のアミノ酸配列をペアワイズ・アライメント分析した際に完全に一致するアミノ酸残基を算出し、比較した全アミノ酸残基中の割合として算出される。
【００３９】
また、本発明に係る形質転換体は、配列番号３に示すアミノ酸配列からなる幼若ホルモン受容体をコードする核酸を有するものに限定されず、配列番号２の塩基配列からなる核酸の相補鎖の全部又は一部に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされ、且つ、幼若ホルモン受容体転写因子活性を有するタンパク質をコードする核酸を有するものであっても良い。「ストリンジェントな条件」とはいわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件を意味し、例えばMolecular Cloning: A Laboratory Manual(Third Edition)を参照して適宜決定することができる。具体的には、サザンハイブリダイゼーションの際の温度や溶液に含まれる塩濃度、及びサザンハイブリダイゼーションの洗浄工程の際の温度や溶液に含まれる塩濃度によりストリンジェンシーを設定することができる。より詳細には、ストリンジェントな条件としては、例えば、ナトリウム濃度が25〜500mM、好ましくは25〜300mMであり、温度が42〜68℃、好ましくは42〜65℃である。より具体的には、5×SSC(83mM NaCl、83mMクエン酸ナトリウム)、温度42℃である。
【００４０】
ここで所定の塩基配列からなる核酸によりコードされるタンパク質における幼若ホルモン受容体転写因子活性は以下のように評価することができる。すなわち、まず、評価対象の核酸と、上述したphb2配列及びその下流に配したレポーター遺伝子とを導入した形質転換体を準備する。そして、得られた形質転換体を幼若ホルモンの存在下又は非存在下で培養し、レポーター遺伝子の発現を測定する。幼若ホルモンの存在下におけるレポーター遺伝子の発現量が、幼若ホルモンの非存在下におけるレポーター遺伝子の発現量よりも有意に大であれば、評価対象の核酸は、幼若ホルモン受容体転写因子活性を有するタンパク質をコードしていることとなる。
【００４１】
ところで、本発明に係る形質転換体は、上述した核酸や応答配列及びレポーター遺伝子に加えて、転写共役因子をコードする遺伝子を更に有していても良い。転写共役因子としては、特に限定されないが、Tai、SRC、FISC、CBP、P300、TIF2、AIB、ARA70、ASC2及びERAP140を挙げることができる。これら転写共役因子をコードする遺伝子を導入することで、内分泌攪乱物質受容体によるレポーター遺伝子の転写促進活性を更に活性化することができる。
【００４２】
一方、本発明に係る形質転換体における宿主細胞は、酵母であり、出芽酵母であることが好ましい。宿主となる酵母内に、上述した核酸や応答配列及びレポーター遺伝子等を導入する方法としては、特に限定されず、従来公知の方法を適用することができる。遺伝子の導入方法としては、例えば、酢酸リチウム法、リン酸カルシウム法、リポソームを用いた方法、エレクトロポレーション法、ウイルスベクターを用いる方法及びマイクロピペットインジェクション法等があげられる。なお、本発明に係る形質転換体において、上述した核酸や応答配列及びレポーター遺伝子等の導入は、分析に用いることが可能であれば、一過性型の導入でもよく、宿主染色体へ組み込むことで導入しても良いし、自律複製・分配可能な人工染色体又はプラスミド型の導入でもよい。
【００４３】
以上のように構成された本発明に係る形質転換体は、供試物質と内分泌攪乱物質受容体との相互作用の評価、及び当該供試物質について相互作用に起因する内分泌攪乱作用の有無を評価する系に使用することができる。特に、本発明に係る形質転換体を利用する場合、上述した応答配列を使用するため、特定の内分泌攪乱作用に限定されず、供試物質について内分泌攪乱作用の有無を評価することができる。
【００４４】
ここで、供試物質としては、特に限定されず、如何なる物質であっても良い。供試物質としては、例えば、低分子化合物、高分子化合物、ペプチド、単一化合物、複数の化合物を含む組成物、培養物、抽出物、天然物及び合成化合物を挙げることができる。
【００４５】
具体的には、供試物質の存在下又は非存在下に形質転換体を培養し、それぞれのレポーター遺伝子の発現を測定する。供試物質の存在下におけるレポーター遺伝子の発現量が、供試物質の非存在下におけるレポーター遺伝子の発現量と比較して有意に大である場合、当該供試物質は内分泌攪乱物質受容体と相互作用し、上述した応答配列を介して遺伝子発現を正に制御するアゴニスト作用を有すると判断することができる。すなわち、この場合、供試物質がアゴニスト作用を有する内分泌攪乱物質である可能性が高いと判断できる。
【００４６】
或いは、供試物質及び内分泌攪乱物質受容体に対するアゴニスト作用を有する物質の存在下又は非存在下に形質転換体を培養し、それぞれのレポーター遺伝子の発現を測定する。供試物質の存在下におけるレポーター遺伝子の発現量が、供試物質の非存在下におけるレポーター遺伝子の発現量と比較して有意に小である場合、当該供試物質は、内分泌攪乱物質受容体に対するアゴニスト作用を阻害し、上述した応答配列を介した遺伝子発現を負に制御するアンタゴニスト作用を有すると判断することができる。すなわち、この場合、供試物質がアンタゴニスト活性を有する内分泌攪乱物質である可能性が高いと判断できる。なお、内分泌攪乱物質受容体に対するアゴニスト作用を有する物質とは、内分泌攪乱物質受容体に作用するホルモン、当該ホルモンに対応する内分泌攪乱物質、内分泌攪乱物質受容体に対するアゴニスト化合物から選ばれる物質を意味する。
【００４７】
以上のように本発明に係る形質転換体を使用することで、非常に簡便な操作によって供試物質に関する内分泌攪乱作用を評価することができる。すなわち、本発明に係る形質転換体は、内分泌攪乱物質の測定用途に利用することができ、供試物質に関する内分泌攪乱作用を評価する内分泌攪乱物質測定用キットとすることができる。
【００４８】
特に、オオミジンコにおける幼若ホルモン受容体をコードする核酸と、上述した応答配列及びレポーター遺伝子とを導入した形質転換体を使用した場合には、特に、ミジンコ科に属する動物に対する供試物質の内分泌攪乱作用を正当に評価することができる。
【００４９】
本発明に係る形質転換体は、宿主として酵母を利用しているため、動物細胞が有しているp450等の薬物代謝系による供試物質の分解といった影響を排し、供試物質の内分泌攪乱作用を正確に評価することができる。
【実施例】
【００５０】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
【００５１】
［形質転換酵母の作製］
本実施例では、下記に示す各レポータープラスミド、各転写因子（内分泌攪乱物質受容体）プラスミド、各転写共役因子プラスミドをそれぞれ作製し、出芽酵母株へ導入することで形質転換酵母を作製した。
【００５２】
［レポータープラスミドの作製］
配列番号１に示されるオオミジンコ（Daphnia magna）ヘモグロビン遺伝子の上流配列（phb2配列）を含むオリゴDNA（配列番号４）及び配列番号４に相補なオリゴDNA（配列番号５）を作製し、これらのオリゴDNAをアニーリングした。アニーリングの際は、95℃で2分間インキュベートした後、90℃から37℃まで30分かけて徐々に温度を低下させた。アニーリング後、phb2配列が1個又は連続して3個アニーリングしたものを精製した。そして、Wolf S S et al., Biotechniques. 20 (4), p. 568-573 (1996) に記載された方法に準じて作製したβ-ガラクトシダーゼ遺伝子を有するプラスミドpRW95-3のSpeIサイトに、これらphb2配列が1個又は連続して3個アニーリングしたものをそれぞれ挿入した。phb2配列が1個挿入されたプラスミドをレポータープラスミドＡ、連続して3個挿入されたプラスミドをレポータープラスミドＢとした。
【００５３】
また、phb2配列の周辺配列85bpを含んだ領域を挿入したプラスミドも作製した。作製方法は、前記配列番号４のオリゴDNAをphb2配列の周辺配列85bpを含んだ領域を含むオリゴDNA（配列番号６）に、及び前記配列番号５のオリゴDNAを配列番号６に相補的なオリゴDNA（配列番号７）に変えた以外は同様に行った。phb2配列の周辺配列85bpを含んだ領域が連続して3個挿入されたプラスミドをレポータープラスミドＣとした。
【００５４】
phb2配列を含むレポータープラスミドＡ〜Ｃと比較するため、キイロショウジョウバエのKr-h1遺伝子の幼若ホルモン応答配列を含んだ領域（DmJHRR）を挿入したプラスミドを作製した（比較例）。DmJHRRは、He Q et al. ; J Biol Chem. 289 (40), p. 27874-27885 (2014) に記載されている。作製方法は、前記配列番号４のオリゴDNAをDmJHRR配列を含むオリゴDNA（配列番号８）に、及び前記配列番号５のオリゴDNAを配列番号８に相補的なオリゴDNA（配列番号９）に変えた以外は前記の方法に準じた。DmJHRR配列が連続して3個挿入されたプラスミドを、DmJHRRレポータープラスミドとした。
【００５５】
［転写因子発現プラスミドの作製］
オオミジンコ幼若ホルモン受容体（DampaMET）発現プラスミドの作製のため、まず、CEN6/ARS4断片を作製した。酵母の自律的複製起点（ARS）とセントロメア配列（CEN）を含むDNA断片を、レポータープラスミドpYTβを鋳型として、CEN/ARS増幅用プライマーpUdp6 I-SceI CEN6 FW（配列番号１０）及びpUdp6 I-SceI ARS4 RE（配列番号１１）を用いたPCR（製品名：TaKaRa Thermal Cycler Dice TP600 Gradient タカラバイオ株式会社製）により増幅した。PCRは、94℃で20秒、58℃で20秒、72℃で1分30秒のサイクルを35サイクル実施した。
【００５６】
PCRにより増幅させたPCR断片を、制限酵素AatIIで切断して直鎖状にしたプラスミドpUdp6とともに、酵母野生株（Saccharomyces cerevisiae）W303a（MATa, ade2, his3, leu2, trp1, ura3）に酢酸リチウム法により導入した。pUdp6は、両方向プロモーター領域gal1、gal10及びgal10の下流にCYCターミネーターを持ち、gal1の下流にADHターミネーターを持ち、さらにウラシル選択マーカーURA3遺伝子を持つプラスミドである。相同組換えによりCEN6/ARS4断片がpUdp6に挿入されたプラスミドを酵母から抽出し、さらに大腸菌DH5α株に導入して得られた低コピーエピソーマル型ベクターをpUdp13とした。なお、CEN6/ARS4配列の外側には認識配列18bpの制限酵素I-SceIの認識配列が導入されており、マルチクローニングサイトへの目的遺伝子のクローニング後、I-SceIで切断してCEN6/ARS4断片を切り出すことで、容易にゲノム挿入型に変換することが可能である。
【００５７】
次に、DampaMET遺伝子のcDNAのオープンリーディングフレーム（ORF）を、抱卵したオオミジンコ成体のcDNAを鋳型として、DampaMET用プライマーとしてMET FW2（配列番号１２）及びMET REV-3（配列番号１３）を用いたPCRにより増幅した。PCRは、94℃で20秒、58℃で20秒、72℃で2分30秒のサイクルを35サイクル実施した。
【００５８】
増幅させたDampaMET遺伝子のcDNAを、制限酵素BamHIおよびHindIIIで切断した前記プラスミドpUdp13とともに野生酵母株W303aに酢酸リチウム法で導入した。この方法により、DampaMET遺伝子のcDNAをプラスミドpUdp13のGAL10プロモーターの下流に挿入したものをpUdp13 DapmaMetとした。酵母細胞内で構築されたpUdp13-DapmaMetを回収し、大腸菌DH5α株に導入して増幅した。
【００５９】
続いて、pUdp13-DapmaMetを制限酵素I-SceIで切断してCEN6/ARS4配列を切り出すことで、ゲノム挿入型に変換した。これによって、DampaMET遺伝子を有し、その上流にプロモーターを有するDampaMET発現プラスミドpUdp15-DampaMETを得た。
【００６０】
同様にキイロショウジョウバエ幼若ホルモン受容体（DmMET）発現プラスミドを作製した。まず、DmMET遺伝子のcDNAのORFを、キイロショウジョウバエ幼虫cDNA（Clontech社製）を鋳型として、DmMET用プライマーDmMET Fwd（配列番号１４）及びDmMET Rev（配列番号１５）を用いたPCRにより増幅した。PCRは、98℃で10秒、55℃で30秒、68℃で1分30秒のサイクルを25サイクル実施した。
【００６１】
増幅させたDmMET遺伝子のcDNAを、制限酵素SmaI及びEcoRIで切断した。切断した前記DmMET遺伝子のcDNAを、制限酵素SmaI及びEcoRIで切断したプラスミドpUdp6のGAL10プロモーターの下流に挿入した。これによって、DmMET遺伝子を有し、その上流にプロモーターを有するDmMET発現プラスミドpUdp6-DmMETを得た。
【００６２】
［転写共役因子発現プラスミドの作製］
本実施例では、特に、キイロショウジョウバエTai（DmTai）遺伝子を含む転写因子発現プラスミド（以下、pESC-Leu-DmTaiとする）とオオミジンコ転写共役因子発現（SRC）プラスミド（以下、pESC-Leu-DampaSRC(1-2221)とする）を作製して用いた。pESC-Leu-DmTaiは、Ito-Harashima S et al. FEBS Open Bio. 7(7): p. 995-1008 (2017)に準じて作製した。
【００６３】
また、pESC-Leu-DampaSRC(1-2221)は以下の方法で作製した。まず、オオミジンコSRC（DampaSRC）遺伝子のcDNAのORFを、抱卵したオオミジンコ成体のcDNAを鋳型として、SRC用プライマーSRC-F1F-pESC（配列番号１６）及びSRC-F4short-pESC（配列番号１７）を用いたPCRにより増幅した。PCRは、94℃で20秒、58℃で10秒、72℃で7分のサイクルを35サイクル実施した。
【００６４】
次に、プラスミドpESC-Leu（Agilent technology社製）を制限酵素SpeI及びPacIで切断し、増幅したDampaSRC遺伝子のcDNAを野生酵母株W303aに酢酸リチウム法で導入することで、プラスミドpESC-Leuのgal1プロモーター領域の下流に前記DampaSRC遺伝子のcDNAを挿入したpESC-Leu-DampaSRC(1-2221)を得た。酵母細胞内で構築されたpESC-Leu-DampaSRC(1-2221)を回収し、大腸菌DH5α株に導入して増幅した。
【００６５】
［形質転換体酵母の作製］
まず、出芽酵母株W303aの菌体を、YPD培地（1％酵母エキス、2％ペプトン、2％D(+)-グルコース）中で、濁度（O.D.660）が1〜2になるまで、30℃で培養した。培養した菌体を、ソリューションＡ（0.1mol/L Lithium acetate、10mmol/L Tris-HCl(pH7.5)、1mmol/L EDTA）で洗浄した後、濁度（O.D.660）が150となるように、ソリューションＡにピペットを用いて再懸濁した。菌体の懸濁液を、1.5mLマイクロチューブに100μLずつ分注して、30℃で１時間インキュベートした。インキュベート後、前記チューブに、制限酵素EcoRVで処理し、直鎖状としたpUdp15-DampaMET 5μg、キャリアーDNA（商品名SALMON TESTES DNA for hybridization、SIGMA社製）150μgを含むTEバッファー（10mM Tris、1mM EDTA、pH8.0）を20μL添加し、さらに、ソリューションＢを850μL添加し、緩やかに混合し、混合液を得た。ソリューションＢは、ソリューションＡにポリエチレングリコール4000を所定量混合したものである。
【００６６】
前記混合液を30℃で30分インキュベートし、42℃で15分間熱処理した後、さらに、10分間室温に放置した。その後、5,000rpmで1分間遠心分離し、前記混合液から酵母菌体を集菌した。集菌した酵母菌体を、5〜10mLのYPD培地に懸濁し、30℃で一晩培養した。培養後の酵母菌体を集菌し、洗浄した後、0.9％NaCl溶液に懸濁し、懸濁液100μLを、Aureobasidin A（0.5g/mL）を含むYPDに2％の寒天を加えた選択培地に塗布し、培養した。Aureobasidin A耐性を示した酵母株を、gal1プロモーター及びMET遺伝子のcDNA領域が染色体上に組込まれた形質転換酵母として選択した。
【００６７】
次に、前記pUdp15-DampaMETを導入した形質転換酵母に、pESC-Leu-DmTaiを導入した。この際、形質転換酵母の選択培地は、表１及び２に示す前培養培地にトリプトファンを100mg添加した培養培地を使用した。
【００６８】
【表１】
2020039279.tif 000002
【００６９】
【表２】
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【００７０】
次に、前記pUdp15-DampaMET及びpESC-Leu-DmTaiを導入した酵母にレポータープラスミドＡを酢酸リチウム法により導入した。選択培地には、表１及び２の前培養培地を使用した。得られた形質転換酵母を形質転換酵母１とした。同様の方法で、形質転換酵母１のレポータープラスミドＡに変えてレポータープラスミドＢを導入した形質転換酵母を形質転換酵母２とした。同様に、形質転換酵母２のpUdp15-DampaMETに変えてpUdp6-DmMETを導入した形質転換酵母を形質転換酵母３とした。形質転換酵母１のpESC-Leu-DmTaiとレポータープラスミドＡに変えて、それぞれpESC-Leu-DampaSRC(1-2221)とレポータープラスミドＣを導入した形質転換酵母を形質転換酵母４とした。
【００７１】
本実施例の比較として、形質転換酵母２及び形質転換酵母３のレポータープラスミドＢに変えてDmJHRRレポータープラスミドを導入した形質転換酵母をそれぞれ形質転換酵母５及び形質転換酵母６とした。本実施例で作製した形質転換体を表３に纏めた。
【００７２】
【表３】
2020039279.tif 000004
【００７３】
これら形質転換酵母１〜６を用いて以下の試験例を実施した。
【００７４】
［試験例１］幼若ホルモンに対する形質転換酵母のレポーター活性測定
形質転換酵母１、２、３及び４について、表１の前培養培地を用いて、前培養培地の濁度（O.D.595）が1.0程度になるよう、30℃で18時間、前培養を行った。前培養した菌体液5μLとジメチルスルホアミド（DMSO）を用いて幼若ホルモン物質であるJHIIIを10μMに希釈した溶液1μLを表４に示す本培養培地100μLと96ウェルプレート内で混合し、30℃で18時間、静置培養を行い、反応液を調整した。これを処理区とした。
【００７５】
【表４】
2020039279.tif 000005
【００７６】
なお、本培養培地のドロップアウトパウダーは、表２に示した前培養培地用のドロップアウトパウダー成分のうちトリプトファン、ロイシン、チロシン、フェニルアラニン及びウラシルを未添加とした。JHIII希釈溶液の代わりにDMSO 1μLを添加した反応液を無処理区とした。調製した各反応液を5μLずつ採取し、新たな96ウェルプレートの各ウェルに分注した。その後、各ウェルに、溶菌液（Ｚバッファー：60mM Na2HPO4、40mM NaH2PO4、1mM MgCl2、10mM KCl、2mM ジチオスレイトール、0.20％ N-Lauroylsarcosine sodium salt）と1mg/mL ONPG（オルソニトロフェニルガラクトピラノシド）を混合した測定試薬を100μL分注し、37℃で30分間反応させた。その後、マイクロプレートリーダー（商品名ARVO X5；Perkinelmer社製）を用いて、各反応液の波長405nmにおける吸光度（O.D.405）及び濁度（O.D.595）を測定した。そして、下記式に示す誘導増加量（Increase of induction）を算出した。
【００７７】
【数１】
2020039279.tif 000006
【００７８】
誘導増加量は、Ito-Harashima S et al., FEBS Open Bio. 7(7): p. 995-1008 (2017) に記載されており、誘導増加量が0より大きい値の場合、その物質に対してレポーター活性を有すると解析される。試験は３連又は５連制で実施した。本試験例１の結果を表５に示した。
【００７９】
【表５】
2020039279.tif 000007
【００８０】
表５に示したように、本発明に係る形質転換酵母１、２、３及び４は、JHIIIの存在下においてレポーター遺伝子の発現が強く誘導されていることがわかる。したがって、試験例１の結果から、応答配列の数や転写因子プラスミドの種類、転写共役因子プラスミドの種類に関わらず、phb2配列を含むレポータープラスミドが導入された形質転換体であれば、節足動物類等に対して幼若ホルモン様作用を示す物質（内分泌攪乱物質）が検出できることが明らかとなった。
【００８１】
［試験例２］性ホルモン及び内分泌攪乱作用を有する疑いのあるとされる化学物質に対する形質転換酵母のレポーター活性測定
形質転換酵母２、３、５及び６を用いて、性ホルモンである17β-エストラジオール及びテストステロン、内分泌攪乱作用を有する疑いのあるとされる化学物質である4-ノニルフェノール、ビスフェノールA、1,1,1-トリクロロ-2,2-ビス（4-クロロフェニル）エタン（DDT）、2,2-ビス（4-クロロフェニル）-1,1-ジクロロエチレン（DDE）、ディルドリンに対するレポーター活性の測定を行った。試験方法は試験例１に準じた。結果を表６に示した。
【００８２】
【表６】
2020039279.tif 000008
【００８３】
表６に示したように、本発明に係る形質転換酵母２及び３は、内分泌攪乱物質の種類に関わらず全ての系においてレポーター遺伝子の発現が誘導されており、供試した全ての内分泌攪乱物質に対してphb2配列が応答性を示すことが確認できた。これに対して、表６に示したように、キイロショウジョウバエの幼若ホルモン応答配列（DmJHRR）を有する形質転換酵母５及び６は、4-ノニルフェノールを用いた系においてのみレポーター遺伝子の発現が誘導されており、その他の内分泌攪乱物質に対してDmJHRRが応答性を示さないことがわかった。この結果から、phb2配列を用いたレポーターアッセイにより、多様な作用を示す内分泌攪乱物質を検出できることが明らかとなった。
【００８４】
［試験例３］アンドロジェン受容体アンタゴニスト物質に対するレポーター活性の測定
試験例１に準じて、アンドロジェン受容体アンタゴニスト活性を示すヒドロキシフルタミド、DDE、ペンタクロロフェノールナトリウムに対するレポーター活性を測定した。本試験例３では形質転換酵母２を用い、アンタゴニスト活性を評価するため、テストステロン存在下で実施した。結果を表７に示した。
【００８５】
【表７】
2020039279.tif 000009
【００８６】
表７に示したように、本発明に係る形質転換酵母２は、供試した全てのアンドロジェン受容体アンタゴニスト物質は、テストステロンのみの場合と比較してレポーター遺伝子の発現が低下したことがわかった。この結果から、phb2配列を含んだ形質転換体を用いることで、アンタゴニスト活性を示す内分泌攪乱物質を検出できることが明らかとなった。
【００８７】
［試験例４］既存農薬活性成分に対する形質転換酵母のレポーター活性測定
試験例１に準じて、既存農薬活性成分であるメパニピリム、ベンチアバリカルブイソプロピル、ピリベンカルブ、ピロキサスルホン、フェンキノトリオンについて、形質転換酵母２を用いて内分泌攪乱作用をそれぞれ測定した。なお、供試した既存農薬活性成分は、全て内分泌攪乱作用を示さないことが明らかとなっている物質である。結果を表８に示した。
【００８８】
【表８】
2020039279.tif 000010
【００８９】
表８に示したように、phb2配列を含んだ形質転換体において、供試した全ての既存農薬活性成分に対してレポーター遺伝子の発現誘導が見られなかった。この結果から、転写因子活性を有する内分泌攪乱物質受容体をコードする核酸と、phb2配列及びレポーター遺伝子を導入した形質転換体は、内分泌攪乱物質を選択的に検出できることが示された。
【配列表】
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