(57)【要約】      （修正有）【課題】分化細胞を分化転換する方法を提供する。【解決手段】少なくとも１種類の要素（ｉ）および少なくとも１種類の要素（ｉｉ）と分化細胞を接触させる。（ｉ）（ａ）ＢＨ１ドメイン、ＢＨ２ドメイン、ＢＨ３ドメイン又はＢＨ４ドメインを含むポリペプチド；（ｂ）Ｂｃｌ−２ファミリーのメンバーの野生型のアミノ酸配列を含むポリペプチド；（ｃ）Ｂｃｌ−２ファミリーのメンバーの野生型のアミノ酸配列を含み、１つ以上の点突然変異を含む前記ポリペプチド；（ｄ）Ｂｃｌ−２ファミリーのメンバーの野生型と少なくとも３０％の配列同一性を示すアミノ酸配列を含むポリペプチド、から選択され、（ｉｉ）前記細胞を分化転換することが可能である転写因子、前記転写因子をコードする核酸、ならびに前記細胞において前記転写因子の量および／または活性を増加させるための手段から選択される。【選択図】図１Ａ
2020039345.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
分化細胞を分化転換する方法であって、少なくとも１種類の要素（ｉ）および少なくとも１種類の要素（ｉｉ）と前記細胞を接触させることを含む方法であり、
前記要素（ｉ）が
（ａ）ＢＨ１ドメイン、ＢＨ２ドメイン、ＢＨ３ドメインおよびＢＨ４ドメインからなる群より選択される少なくとも１つのドメインを含むポリペプチド、
（ｂ）Ｂｃｌ−２ファミリーのメンバーの野生型またはその断片のアミノ酸配列を含む、または前記アミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｃ）Ｂｃｌ−２ファミリーのメンバーの野生型またはその断片のアミノ酸配列を含む、または前記アミノ酸配列からなるポリペプチドであって、前記野生型またはその断片と比較すると１つ以上の点突然変異を含む前記ポリペプチド、
（ｄ）Ｂｃｌ−２ファミリーのメンバーの野生型であって、ヒトＢｃｌ−２（配列番号１または５）、ヒトＢｃｌ−ＸＬ（配列番号６）、ヒトＢｃｌ−ｗ（配列番号７）、ヒトＭｃｌ１（配列番号８）、ヒトＢｆＩ１（配列番号９または１０）、ヒトＮｒｈ（配列番号１１）、ヒトＢｃｌ２Ｌ１（配列番号１２）、ヒトＤＩＶＡ（配列番号１３）、ヒト骨髄細胞白血病配列１アイソフォーム１（配列番号１４）、およびヒトＢｃｌ−ｘβ（配列番号１５）からなる群より選択されることが好ましいＢｃｌ−２ファミリーのメンバーの前記野生型と少なくとも３０％の配列同一性を示すアミノ酸配列を含む、または前記アミノ酸配列からなるポリペプチド、
前記野生型は、抗アポトーシス活性を有し、
前記ポリペプチドをコードする核酸、および
前記細胞において前記ポリペプチドの量および／または活性を増加させるための手段
から選択され、
前記要素（ｉ）が無いときと比較すると前記要素（ｉ）によって分化転換細胞の収率が少なくとも３０％向上し、
且つ、
前記要素（ｉｉ）が前記細胞を分化転換することが可能である転写因子、前記転写因子をコードする核酸、ならびに前記細胞において前記転写因子の量および／または活性を増加させるための手段から選択され、
ヒトまたは動物の身体を治療処置するあらゆる方法が除外される前記方法。
【請求項２】
分化細胞を分化転換する方法であって、少なくとも１種類の要素（ｉｉｉ）および少なくとも１種類の要素（ｉｉ）と前記細胞を接触させることを含む方法であり、
前記要素（ｉｉｉ）によって脂質過酸化が減少し、前記要素（ｉｉｉ）が
（ａ）ビタミンＤ受容体、その機能ホモログ、および前記受容体またはその前記機能ホモログをコードする核酸、
（ｂ）ステロイド性抗酸化剤、好ましくはカルシトリオール、
（ｃ）フェノール性抗酸化剤、好ましくはα−トコフェロールまたはα−トコトリエノール、および
（ｄ）キニン、好ましくはコエンザイムＱ
から選択されることが好ましく、
且つ、
前記要素（ｉｉ）が前記細胞を分化転換することが可能である転写因子、前記転写因子をコードする核酸、ならびに前記細胞において前記転写因子の量および／または活性を増加させるための手段から選択され、
ヒトまたは動物の身体を治療処置するあらゆる方法が除外される前記方法。
【請求項３】
請求項２において規定される少なくとも１種類の要素（ｉｉｉ）と前記細胞を接触させることをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項４】
（ａ）請求項１において規定される少なくとも１種類の要素（ｉ）と請求項１において規定される少なくとも１種類の要素（ｉｉ）、
（ｂ）請求項２において規定される少なくとも１種類の要素（ｉｉｉ）と請求項２において規定される少なくとも１種類の要素（ｉｉ）、または
（ｃ）請求項３において規定される少なくとも１種類の要素（ｉ）、請求項３において規定される少なくとも１種類の要素（ｉｉ）、および請求項３において規定される少なくとも１種類の要素（ｉｉｉ）
を含む、またはそれらからなる配合物。
【請求項５】
機能性神経細胞の消失および／または機能性筋細胞の消失を特徴とする神経障害または筋障害を治療または予防する方法に使用するための請求項４において規定される配合物であって、前記１つ以上の転写因子が神経原性転写因子および筋原性転写因子から選択され、好ましくは分化細胞を分化転換することによって前記治療または予防が達成される前記配合物。
【請求項６】
前記ポリペプチドが
（ａ）アミノ酸配列が配列番号１に示されているヒトＢｃｌ−２と比較すると低下した抗アポトーシス機能を有しているか、またはその抗アポトーシス機能を失っており、および／または
（ｂ）ヒトＢｃｌ−２よりも高い程度にまで分化転換細胞の収率を向上させる、請求項１または３に記載の方法、請求項４に記載の配合物、または請求項５に記載の使用のための配合物。
【請求項７】
前記ポリペプチドがＢＨ４ドメインと所望によりＢＨ１ドメイン、ＢＨ２ドメイン、ＢＨ３ドメインおよびＢＨ４ドメインからなる群より選択される１つ、２つ、３つ、またはそれより多くのドメインを含み、前記ポリペプチドがただ１つのＢＨ１ドメイン、ただ１つのＢＨ２ドメイン、ただ１つのＢＨ３ドメインおよびただ１つのＢＨ４ドメインを含むことが好ましい、請求項１、３または６に記載の方法、請求項４または６に記載の配合物、または請求項５または６に記載の使用のための配合物。
【請求項８】
前記ポリペプチドが、
（ａ）可動性ループドメイン中の１つ以上のリン酸化可能残基がリン酸化不能残基によって置き換えられているか、または欠失している点で野生型Ｂｃｌ−２と異なるＢｃｌ−２突然変異体、例えば、
（ｉ）ヒトＢｃｌ−２のＳ７０Ａ突然変異体、
（ｉｉ）ヒトＢｃｌ−２のＴ６９Ａ／Ｓ７０Ａ二重突然変異体、
（ｉｉｉ）ヒトＢｃｌ−２のＳ８７Ａ突然変異体、
（ｉｖ）ヒトＢｃｌ−２のＴ６９Ａ／Ｓ７０Ａ二重突然変異体、
（ｖ）ヒトＢｃｌ−２のＴ６９Ａ／Ｓ８７Ａ二重突然変異体、
（ｖｉ）ヒトＢｃｌ−２のＳ７０Ａ／Ｓ８７Ａ二重突然変異体、
（ｖｉｉ）ヒトＢｃｌ−２のＴ６９Ａ／Ｓ７０Ａ／Ｓ８７Ａ三重突然変異体、
（ｖｉｉｉ）ヒトＢｃｌ−２のＴ６９、Ｓ７０およびＳ８７のうちの１つ、２つ、または３つの欠失から選択される欠失突然変異体、および
（ｉｘ）ヒトＢｃｌ−２のａａ６９〜８７の欠失突然変異体、または
（ｂ）膜貫通領域が欠失しているか、または非機能的になったヒトＢｃｌ−２の突然変異体であるＢｃｌ−２突然変異体
から選択される、請求項１、３、６または７のいずれか一項に記載の方法、請求項４、６または７のいずれか一項に記載の配合物、または請求項５から７のいずれか一項に記載の使用のための配合物。
【請求項９】
（ａ）前記細胞が
（ｉ）体細胞、好ましくは線維芽細胞、星状細胞、および周皮細胞から選択される体細胞であり、
（ｉｉ）脊椎動物細胞、好ましくは哺乳類細胞、より好ましくはマウス起源またはヒト起源の細胞であり、および／または
（ｉｉｉ）胚由来または出生後段階、好ましくは成体段階に由来する細胞であり、
および／または
（ｂ）前記要素（ｉｉ）が神経原性転写因子、好ましくはＡｓｃｌ１、Ｎｅｕｒｏｇ２、Ｂｒｎ２、Ｄｌｘ２、ＭＹＴ１Ｌ、Ｓｏｘ１１およびＳｏｘ２、ならびに筋原性転写因子、好ましくはＭｙｏＤ、Ｇａｔａ４ｍ、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｈａｎｄ２、Ｔ−ｂｏｘ５、ミオカルディン、ｍｉＲ−１およびＭｉＲ−１３３から選択される、請求項１、３または６から８のいずれか一項に記載の方法、請求項４または６から８のいずれか一項に記載の配合物、または請求項５から８のいずれか一項に記載の使用のための配合物。
【請求項１０】
前記細胞が線維芽細胞であり、前記要素（ｉｉ）が１つの転写因子である、請求項９に記載の方法、配合物、または使用のための配合物。
【請求項１１】
前記転写因子が神経原性転写因子、好ましくはＡｓｃｌ１、Ｎｅｕｒｏｇ２およびＤｌｘ２から選択される神経原性転写因子であり、前記方法によってＧＡＢＡ作動性神経細胞、グルタミン酸作動性神経細胞、および運動神経細胞から選択される１つ以上の分化転換細胞が産出される、請求項１０に記載の方法、配合物、または使用のための配合物。
【請求項１２】
前記転写因子が筋原性転写因子、好ましくはＭｙｏＤであり、前記方法によって筋細胞が産出される、請求項１０に記載の方法、配合物、または使用のための配合物。
【請求項１３】
機能性神経細胞の消失および／または機能性筋細胞の消失を特徴とする神経障害および／または筋障害のモデルを作製する方法であって、請求項１１および／または１２に記載の方法を含む方法であり、前記神経障害および／または筋障害の素因を有する個体または前記神経障害および／または筋障害を患う患者から前記線維芽細胞を入手している前記方法。
【請求項１４】
機能性神経細胞の消失および／または機能性筋細胞の消失を特徴とする神経障害および／または筋障害を診断する方法であって、請求項９から１２のいずれか一項に記載の方法を含む方法であり、前記神経障害および／または筋障害を有することが疑われる個体または前記神経障害および／または筋障害の素因を有することが疑われる個体から前記分化細胞を入手しており、好ましくは前記分化細胞が線維芽細胞であり、分化転換により獲得され、且つ、疾患表現型を有する神経細胞および／または筋細胞が前記神経障害および／または筋障害を示す前記方法。
【請求項１５】
分化転換細胞を含む組成物を作製する方法であって、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法を含む前記方法。
【請求項１６】
分化転換の促進因子としての請求項１または６から８のいずれか一項において規定されるポリペプチドまたは前記ポリペプチドをコードする核酸の使用であって、ヒトまたは動物の治療処置方法におけるあらゆる使用が除外される前記使用。
【請求項１７】
前記配合物がキットとして提供され、前記配合物の要素（ｉ）および（ｉｉ）が異なる容器に収められており、前記キットが請求項１から３または６から１５のいずれか一項に記載の方法を実施するための指示を有するマニュアルを含んでもよい、請求項４に記載の
配合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分化細胞を分化転換する方法であって、少なくとも１種類の要素（ｉ）および少なくとも１種類の要素（ｉｉ）と前記細胞を接触させることを含む方法であり、前記要素（ｉ）が（ａ）ＢＨ１ドメイン、ＢＨ２ドメイン、ＢＨ３ドメインおよびＢＨ４ドメインからなる群より選択される少なくとも１つのドメインを含むポリペプチド；（ｂ）Ｂｃｌ−２ファミリーのメンバーの野生型またはその断片のアミノ酸配列を含む、または前記アミノ酸配列からなるポリペプチド；（ｃ）Ｂｃｌ−２ファミリーのメンバーの野生型またはその断片のアミノ酸配列を含む、または前記アミノ酸配列からなるポリペプチドであって、前記野生型またはその断片と比較すると１つ以上の点突然変異を含む前記ポリペプチド；（ｄ）Ｂｃｌ−２ファミリーのメンバーの野生型であって、ヒトＢｃｌ−２（配列番号１または５）、ヒトＢｃｌ−ＸＬ（配列番号６）、ヒトＢｃｌ−ｗ（配列番号７）、ヒトＭｃｌ１（配列番号８）、ヒトＢｆＩ１（配列番号９または１０）、ヒトＮｒｈ（配列番号１１）、ヒトＢｃｌ２Ｌ１（配列番号１２）、ヒトＤＩＶＡ（配列番号１３）、ヒト骨髄細胞白血病配列１アイソフォーム１（配列番号１４）、およびヒトＢｃｌ−ｘβ（配列番号１５）からなる群より選択されることが好ましいＢｃｌ−２ファミリーのメンバーの前記野生型と少なくとも３０％の配列同一性を示すアミノ酸配列を含む、または前記アミノ酸配列からなるポリペプチド；前記野生型は、抗アポトーシス活性を有し；前記ポリペプチドをコードする核酸、および前記細胞において前記ポリペプチドの量および／または活性を増加させるための手段から選択され、前記要素（ｉ）が無いときと比較すると前記要素（ｉ）によって分化転換細胞の収率が少なくとも３０％向上し、且つ、前記要素（ｉｉ）が前記細胞を分化転換することが可能である転写因子、前記転写因子をコードする核酸、ならびに前記細胞において前記転写因子の量および／または活性を増加させるための手段から選択され、ヒトまたは動物の身体を治療処置するあらゆる方法が除外される前記方法に関する。
【０００２】
本明細書において特許願書および製造業者のマニュアルをはじめとする多数の文書が引用される。これらの文書の開示は本発明の特許性に関連するとは考えられないが、これによりその開示の全体を参照して援用する。より具体的には、引用した全ての文書が、それぞれ個々の文書が参照により援用されると具体的および個別に表明された場合と同程度にまで参照により援用される。
【背景技術】
【０００３】
幹細胞研究によって細胞および組織の再生に対する様々なアプローチが産み出されている。幹細胞はそれらの多能性のため、それ自体が好ましい再生用出発物質である。しかしながら、それらの利用可能性は、特に自己起源のものの利用可能性は一般に限定的である。より最近のアプローチでは出発物質として分化細胞を使用することに関心が集まっている。脱分化と呼ばれる過程は充分に分化した細胞における多能性の回復を含む。一旦、多能性状態に達すると、得られた人工多能性細胞を次に後続の所望の細胞種への人工分化ステップの出発物質として使用することができる。細胞が多能性状態を経験することがこのアプローチのホールマークである。さらにより最近の、且つ、成績と収量の点で概して不満足である分化転換が記載されている。この用語は基本的に分化細胞を別の分化細胞に転換する過程であって、その分化転換過程の間に細胞が多能性状態を経験しない過程を示す。専門用語についても扱っている最近の総説はJopling et al. (Nature Reviews, Molecular Cell Biology, 11, 79-89 (2011))である。
【０００４】
異なる系統への体細胞の直接的分化転換によって他の方法では簡単に利用できない特定の細胞種を作製することができる。これはインビトロで増殖させることができず、したが
って成体のヒトからの単離と増殖が不可能である神経細胞などの分裂終了細胞に特に当てはまる。したがって、様々な細胞種の完全機能性神経細胞への直接的分化転換（例えば、Berninger et al., Journal of Neuroscience, 27, 8654-8664, (2007)、Heinrich et al., PLoS biology, 8, e1000373 (2010)、Vierbuchen et al., Nature, 463, 1035-1041 (2011)を参照されたい）は様々な種および細胞起源に由来する神経細胞を調査するために有用なアプローチである。しかしながら、そのような人工神経細胞（ｉＮ）の作製効率と純度は満足できるものではなく、このダイレクトリプログラミングを援助する基本原理は解明されずにいる。我々は分化転換が時には「ダイレクトリプログラミング」と呼ばれることを特記する。
【０００５】
ある特定の神経原性転写因子が知られているが、しかしながらそれらが機能する様式の基本原理は未だに解明されずにいる。例えば、分化転換の背景で活性化される直接的下流エフェクターはまだ分かっていない。したがって、ｉＮの作製のために異なる器官に由来する細胞に異なる転写因子がどの程度まで必要であるのかも、様々な細胞種における発現が神経細胞の作製を促進する「神経マスター遺伝子」が存在するのかも明らかではない。一方では、星状細胞を神経細胞に分化転換するが線維芽細胞ではあまり効率的ではないように見えるＮｅｕｒｏｇ２（Heinrich et al. (上掲)、 Vierbuchen et al. (上掲)）や線維芽細胞では効率的であるが星状細胞ではそうではないＭｙｔ１ｌのように様々な細胞種でかなり異なる因子が機能することが示されている。反対に、Ａｓｃｌ１および／またはＳｏｘ２などの他の転写因子が様々な細胞起源、例えば、星状細胞（Berninger et al.
(上掲)、 Heinrich et al. (上掲)）、線維芽細胞（Vierbuchen et al. (上掲)）および周皮細胞（Karow et al, Cell stem cell, 11, 471-476 (2012)）に由来する神経細胞の作製に有用であることが示された。また、神経原性転写因子の効率はマウスおよびヒトなどの様々な種に由来する細胞でかなり異なるように見えることが多い（例えば、Vierbuchen et al. (上掲)を参照されたい）。同じ神経原性転写因子が細胞および種の背景に応じてＮｅｕｒｏＤまたはＳｏｘ１１またはＭｙｔ１ｌなどの追加神経原性転写因子の個別の組合せを必要とすることが多い。したがって、どの程度まで共通または異なる機構がこれらの異なる出発細胞で機能しているのかは未だに理解しにくいままである。
【０００６】
Ｂｃｌ−２ファミリー抗アポトーシスメンバーであるＢｃｌ−２は脱分化過程に関係があるとされている。一般に、その抗アポトーシス特性は細胞運命の変更を含む過程における生存上昇に関与すると見られている。例えば、Ｋａｗａｍｕｒａら（Nature 460, 1140-1144 (2009)）は多能性幹細胞を誘導する体細胞のリプログラミングについて記載している。著者らはＢｃｌ−２の過剰発現がアポトーシスを抑制し、且つ、多能性マーカーであるＮａｎｏｇを発現する細胞の頻度の上昇を観察した。Ｌｉｕら（Stem Cells, 29, 2077-2089 (2011)）は脱分化間葉系幹細胞においてＢｃｌ−２が過剰発現することを発見した。この出版物においてもＢｃｌ−２の抗アポトーシス特性が関連すると考えられている。その分野の先行技術の追加のホールマークは、１つより多くの転写因子、時には転写因子の複合混合物を使用して細胞運命の変更を達成することである。
【０００７】
神経再生におけるＢｃｌ−２の関与および可能性のある役割はあまり明確ではなく、議論が定まっていない。例えば、ＢｅｒｎｉｅｒとＰａｒｅｎｔ（The Journal of Neurosciene, 18, 2486-2497 (1998)）は神経未成熟のマーカーとしてのＢｃｌ−２について記載しており、切断されたアクソンの再生がこのタンパク質によって促進されることが示されていることをさらに特記している。それと正反対に、Ｉｎｏｕｅら（The Journal of Neuroscience, 22, 4468-4477 (2002)）はＢｃｌ−２の過剰発現によってインビボでアクソンの再生が促進されないことを報告した。
【発明の概要】
【０００８】
先行技術を鑑みて、分化細胞を分化転換するための代替的な、または改善された手段お
よび方法を提供することの中に本発明の根底にある技術的課題を見ることができる。この課題は添付されている特許請求の範囲によって解決された。
【０００９】
以上より、第１の態様において本発明は、分化細胞を分化転換する方法であって、少なくとも１種類の要素（ｉ）および少なくとも１種類の要素（ｉｉ）と前記細胞を接触させることを含む方法であり、前記要素（ｉ）が（ａ）ＢＨ１ドメイン、ＢＨ２ドメイン、ＢＨ３ドメインおよびＢＨ４ドメインからなる群より選択される少なくとも１つのドメインを含むポリペプチド；（ｂ）Ｂｃｌ−２ファミリーのメンバーの野生型またはその断片のアミノ酸配列を含む、または前記アミノ酸配列からなるポリペプチド；（ｃ）Ｂｃｌ−２ファミリーのメンバーの野生型またはその断片のアミノ酸配列を含む、または前記アミノ酸配列からなるポリペプチドであって、前記野生型またはその断片と比較すると１つ以上の点突然変異を含む前記ポリペプチド；（ｄ）Ｂｃｌ−２ファミリーのメンバーの野生型であって、ヒトＢｃｌ−２（配列番号１または５）、ヒトＢｃｌ−ＸＬ（配列番号６）、ヒトＢｃｌ−ｗ（配列番号７）、ヒトＭｃｌ１（配列番号８）、ヒトＢｆＩ１（配列番号９または１０）、ヒトＮｒｈ（配列番号１１）、ヒトＢｃｌ２Ｌ１（配列番号１２）、ヒトＤＩＶＡ（配列番号１３）、ヒト骨髄細胞白血病配列１アイソフォーム１（配列番号１４）、およびヒトＢｃｌ−ｘβ（配列番号１５）からなる群より選択されることが好ましいＢｃｌ−２ファミリーのメンバーの前記野生型と少なくとも３０％の配列同一性を示すアミノ酸配列を含む、または前記アミノ酸配列からなるポリペプチド；前記野生型は、抗アポトーシス活性を有し；前記ポリペプチドをコードする核酸、および、前記細胞において前記ポリペプチドの量および／または活性を増加させるための手段から選択され、前記要素（ｉ）が無いときと比較すると前記要素（ｉ）によって分化転換細胞の収率が少なくとも３０％向上し、且つ、前記要素（ｉｉ）が前記細胞を分化転換することが可能である転写因子、前記転写因子をコードする核酸、ならびに前記細胞において前記転写因子の量および／または活性を増加させるための手段から選択され、ヒトまたは動物の身体を治療処置するあらゆる方法が除外される前記方法に関する。
【００１０】
これに関して本発明は、分化細胞を分化転換する方法であって、（ｉ）ＢＨ１ドメイン、ＢＨ２ドメイン、ＢＨ３ドメインおよびＢＨ４ドメインからなる群より選択される少なくとも１つのドメインを含むポリペプチド、前記ポリペプチドをコードする核酸、および／または前記細胞において前記ポリペプチドの量または活性を増加させるための手段であって、それぞれ前記ポリペプチド、前記ポリペプチドをコードする核酸、または前記細胞において前記ポリペプチドの量または活性を増加させるための手段が無いときと比較すると分化転換細胞の収率を少なくとも５０％増加させる前記ポリペプチド、前記ポリペプチドをコードする前記核酸、または前記細胞において前記ポリペプチドの量または活性を増加させるための前記手段、ならびに（ｉｉ）前記細胞を分化転換することが可能である１つ以上の転写因子、前記１つ以上の転写因子をコードする１つ以上の核酸、および／または前記細胞において前記１つ以上の転写因子の量を増加させるための手段と前記細胞を接触させることを含む方法であり、ヒトまたは動物の身体を治療処置するあらゆる方法が除外される前記方法を提供する。
【００１１】
「分化転換する」という用語は当技術分野において確立された意味を有する。特に、その用語は１種類の分化細胞を第２の別の種類の分化細胞に転換することを指す。脱分化とその後の分化と異なり分化転換は本質的に多能的である中間状態を伴わない。本発明に準ずる分化転換は分裂細胞または非分裂細胞を用いて実施され得る。さらに、本発明に準ずる分化転換は増殖性細胞および非増殖性細胞を用いて実施され得る。
【００１２】
多能性状態の回避には明白な利点がある。例えば、多能性細胞は腫瘍原性である可能性があると一般に理解されている。したがって、分化細胞を調製する代替的経路であって、多能性状態を介して進行する代替的経路と比較すると高い程度の安全性が多能性状態の回
避によって与えられる。さらに、直接的分化転換によって最初の脱分化ステップが回避され、したがって所望の細胞種を得るために必要な時間が短くなる。
【００１３】
「分化細胞」という用語は当技術分野において確立された意味を有する。分化細胞は特殊化細胞である。そのような特殊化細胞種の例は筋細胞と神経細胞である。多数の例において分化細胞は成熟した生物のある特定の組織に限定される。通常の状況下では分化細胞は脱分化も細胞運命の他の変更もできない。実施例において示されているように、本発明の方法は出発細胞種（上文では「分化細胞」とも呼ばれている）と無関係に機能する。外胚葉起源の分化細胞に限定されることは特にない。むしろ、本方法は様々な胚葉に由来する分化細胞に対して効率的に機能する。また、本方法は異なる種を起源とする細胞について機能する。このことは全て本明細書に添付されている実施例によって証明される。
【００１４】
特定の理論に捉われることを望むものではないが、分化転換過程は標的分化細胞（出発細胞種）の遺伝子発現パターンの変化を伴うと考えられている。したがって、本発明の第１の態様の要素（ｉ）および（ｉｉ）はそれらの作用を及ぼすために好ましくは標的分化細胞の細胞膜を通過しなくてはならないことが理解される。言い換えると、そのような細胞膜の通過を可能にする条件下で前記接触が達成されることが好ましい。当業者は適切な方法を知っている。特定の理論に捉われることを望むものではないが、転写因子がそれらの作用を及ぼすにはそれらの転写因子が細胞核中に存在する必要があるとさらに考えられている。第１の態様の要素（ｉ）に準ずるポリペプチドに関しても前記ポリペプチドが細胞核の中に存在するときにその作用を及ぼすと指摘されている。細胞核内での存在は、細胞核への送達、または細胞膜の通過が分化転換の達成にとって概ね充分であるような標的分化細胞内に存在する輸送機構のどちらかによって達成され得る。
【００１５】
第１の態様の要素（ｉ）および（ｉｉ）に準ずる作用剤が核酸である限り、形質導入および形質移入が細胞を前記作用剤と接触させる好ましい手段である。細胞への核酸の送達を支援する目的で様々な化学物質が記載されており、そのような化学物質にはリン酸カルシウム、リポソーム形成可能な両親媒性分子、およびポリエチレンイミンなどのカチオン性重合体が含まれる。一般的に使用される形質移入用の試薬とキット、特に初代線維芽細胞の形質移入用のものはＮｕｃｌｅｏｆａｃｔｏｒＴキット（Ｌｏｎｚａ）とＦｕＧＥＮＥ（登録商標）６形質移入試薬（プロメガ、ロッシュ・アプライド・サイエンス）である。物理的方法には電気穿孔法と遺伝子銃の使用が含まれる。その他の代替法ではウイルスがベクターとして使用され得る。
【００１６】
細胞へのペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の送達にも物理的方法および化学的方法が採用されている。多数の例において、送達されるポリペプチドに短鎖ペプチドを融合することにより、細胞膜を通過するタンパク質画分を増やすことができる。これらの短鎖ペプチドは当技術分野において細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）またはタンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）として知られている。
【００１７】
ポリペプチドまたは前記ポリペプチドをコードする核酸の送達が好ましく、核酸の送達が特に好ましいが、本発明の実施を目的とするその他の選択肢が想定される。この点に関し、第１の態様に準ずるポリペプチドの野生型は分化転換される分化細胞に存在するゲノムＤＮＡによってコードされることが理解される。同様に、第１の態様に準ずる前記転写因子の野生型も前記分化細胞の内在性ＤＮＡによってコードされる。前記内在性因子が使用される限り、対応する翻訳産物、すなわち、前記ポリペプチドまたは前記転写因子の量および／または活性を増加させることが可能であるあらゆる手段が本発明の実施にとって適切である。例を挙げると、前記ポリペプチドの発現、例えば、ヒトＢｃｌ−２の発現を上昇させる転写因子が適切な手段である。前記ポリペプチドの発現および／または活性を増加させるためのその他の手段は本明細書において「Ｆｋ」とも示されるホルスコリンで
ある。細胞によって内在的にコードされていない要素（ｉ）および（ｉｉ）に対しても上記の考慮事項が必要な変更を加えて適用される。その場合にも核酸またはポリペプチドを提供する代わりに、またはそれに加えて発現および／または活性を増加させるための手段が提供され得る。後者の場合でもホルスコリンは好ましい手段である。
【００１８】
「ポリペプチド」という用語が当技術分野において知られており、且つ、アミノ酸の重縮合体を指す。前記ポリペプチドにおけるアミノ酸の最小数は第１の態様において提供される前記ポリペプチドの定義に準ずる要件のいずれかによって規定される。前記ポリペプチドは少なくとも１０個のアミノ酸を含むことが完全を期すために特記される。構成要素に関しては２０種類のタンパク質構成性アミノ酸が優先される。それらのアミノ酸は例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化および当技術分野においてよく知られているその他の修飾によって修飾されてよい。末端は保護されてよく、例えば、アミノ末端がアセチル化されてよく、および／またはカルボキシ末端がアミド化されてよい。２０種類のタンパク質構成性アミノ酸に加えて他のアミノ酸がそれら構成要素の最大で１０％、最大で２０％、最大で３０％、最大で４０％または最大で５０％までを構成してよい。そのような他のアミノ酸にはα−アミノ酸であるセレノシステイン、ピロリシン、ヒドロキシプロリンおよびセレノメチオニンが含まれるが、あまり好ましくない実施形態ではβ−アミノ酸も含まれる。それらの構成要素間の結合に関して所与のアミノ酸のカルボキシル基と後続のアミノ酸のアミノ基との間のペプチド結合が優先される。とはいえ、最大で１０％、最大で２０％、最大で３０％、最大で４０％または最大で５０％までのイソペプチド結合、すなわち、側鎖カルボキシレートおよび／またはアミンが関与するペプチド結合の存在が想定される。構成要素の最大で１０％、２０％、３０％、４０％または５０％までが乳酸などのα−ヒドロキシ酸であり得、その結果、隣接する構成要素を接続する官能基の対応する部分がエステル基である。エステル結合の割合が上で列挙された値を超えない限り、デプシペプチド、すなわち、隣接する構成要素がペプチド結合またはエステル結合によって接続されている化合物は「ポリペプチド」という用語に包含される。ペプチド模倣体の使用も想定される。ペプチド模倣体は、１個以上のアミノ酸、ポリペプチドの部分配列、またはポリペプチド全体が置換される前記アミノ酸、前記部分配列または前記ポリペプチドの構造を模倣する部分によって置換されている点で前記ポリペプチドと異なる化合物である。
【００１９】
とはいえ、構成要素が専らペプチド結合によって接続され、および／または専ら２０種類のタンパク質構成性アミノ酸によって構成されるポリペプチドが特に優先される。
【００２０】
当技術分野において確立されているように、「核酸」という用語は少なくとも３０ヌクレオチドを含むことが好ましいヌクレオチドの重縮合体を指す。前記ヌクレオチドに含まれる塩基はアデニン、グアニン、シトシン、チミン、およびウラシルから選択されることが好ましい。２’−Ｏ−メチル修飾などの当技術分野において確立された修飾が存在してよい。その用語にはｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡなどのＤＮＡ、ならびにＲＮＡが含まれる。好ましいＲＮＡはｍＲＮＡである。
【００２１】
「から選択される」という語句は、後ほど数を数えられる要素のうちの１つ、２つ、３つ、またはそれより多くを使用してよいことを表している。例として、要素（ｉ）に関して定義された前記ポリペプチドをコードする核酸および前記手段を要素（ｉ）として使用することにより第１の態様に従う方法を作成することができる。前記核酸（だけ）を使用することが特に好ましい。
【００２２】
本発明の第１の態様の要素（ａ）に従うポリペプチドは少なくとも１つの保存ドメインを含み、前記保存ドメインはＢＨ１ドメイン、ＢＨ２ドメイン、ＢＨ３ドメインおよびＢＨ４ドメインからなる群より選択される。これらの４つのドメインはアポトーシス制御に
関与する特定のクラスのタンパク質の特色となる特徴である。驚くべきことに本発明者らはそれら前述のドメインのうちの少なくとも１つを含むポリペプチドが前述のアポトーシスへの関与に加えてその他の機能を特徴とする可能性がかなり高いことを発見した。このその他の機能は分化細胞の分化転換の強化である。（ｉ）ＢＨ１ドメイン、ＢＨ２ドメイン、ＢＨ３ドメインおよびＢＨ４ドメインからなる群より選択される少なくとも１つのドメインの存在と分化細胞の分化転換を強化する可能性との間の関係を確立する本発明の教示、（ｉｉ）前述のドメインの当技術分野において確立された定義（詳細については下記参照）、および（ｉｉｉ）分化転換の強化を定量するためのアッセイ（詳細については下記参照）が提供されると、第１の態様の要素（ｉ）の要件に合致するポリペプチドを直接的に特定することができ、且つ、本発明を首尾よく実施することができる。
【００２３】
次のポリペプチド、すなわち、ＢＨ１ドメインを含むが、ＢＨ２ドメイン、ＢＨ３ドメイン、およびＢＨ４ドメインを含まないポリペプチド；ＢＨ２ドメインを含むが、ＢＨ１ドメイン、ＢＨ３ドメイン、およびＢＨ４ドメインを含まないポリペプチド；ＢＨ４ドメインを含むが、ＢＨ１ドメイン、ＢＨ２ドメイン、およびＢＨ３ドメインを含まないポリペプチドも本発明に準ずるポリペプチドであることが理解される。ＢＨ３ドメインだけを含むポリペプチドは、特にそのようなポリペプチドがアポトーシス促進作用を有している限りあまり好ましくない。本発明に準ずるその他のポリペプチドはＢＨ１ドメインとＢＨ２ドメインを含むが、ＢＨ３ドメインとＢＨ４ドメインを含まないポリペプチド；ＢＨ１ドメインとＢＨ３ドメインを含むが、ＢＨ２ドメインとＢＨ４ドメインを含まないポリペプチド；ＢＨ１ドメインとＢＨ４ドメインを含むが、他のＢＨドメインのいずれも含まないポリペプチド；ＢＨ２ドメインとＢＨ４ドメインを含むが、他のＢＨドメインのいずれも含まないポリペプチド；ＢＨ３ドメインとＢＨ４ドメインを含むが、他のＢＨドメインのいずれも含まないポリペプチド；ＢＨ２ドメインとＢＨ３ドメインを含むが、他のＢＨドメインのいずれも含まないポリペプチドである。３つのＢＨドメインを含み、ＢＨドメインをそれ以上含まないポリペプチドも包含され、前記３つのＢＨドメインは（ｉ）ＢＨ１ドメイン、ＢＨ２ドメインおよびＢＨ３ドメイン；ＢＨ１ドメイン、ＢＨ２ドメインおよびＢＨ４ドメイン；ＢＨ１ドメイン、ＢＨ３ドメインおよびＢＨ４ドメイン；またはＢＨ２ドメイン、ＢＨ３ドメインおよびＢＨ４ドメインである。最後に、且つ、特に、ＢＨ１ドメイン、ＢＨ２ドメイン、ＢＨ３ドメインおよびＢＨ４ドメインを含むポリペプチドが好ましい。これらのポリペプチドの全てで膜貫通ドメイン（そのような膜貫通ドメインは例えばヒト野生型Ｂｃｌ−２に存在する）は存在していても存在していなくてもよく、後者の選択肢が好ましい。
【００２４】
第１の態様の要素（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）は本発明に準ずるポリペプチドの特徴を明らかにする代替的手段である。
【００２５】
要素（ｂ）に準ずる「断片」という用語はその最も広い形態で第１の態様に準ずる要件によって限定される他には特に限定されない。好ましい実施形態ではその断片はＢｃｌ−２ファミリーのメンバーの野生型のアミノ酸配列の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％からなり、前記野生型は抗アポトーシス活性を有し、且つ、好ましくは第１の態様の要素（ｄ）に準じて規定されるＢｃｌ−２ファミリーメンバーから選択される。
【００２６】
同様に、要素（ｃ）に準ずる点突然変異の数は第１の態様に準ずる要件によって限定される他には特に限定されない。好ましい実施形態では「より多くの点突然変異」は２か所、３か所、４か所、５か所、６か所、７か所、８か所、９か所、または１０か所の点突然変異である。
【００２７】
第１の態様の要素（ｄ）はヒトＢｃｌ−２、ヒトＢｃｌ−ＸＬ、ヒトＢｃｌ−ｗ等の１
つ１つを中心とするポリペプチドのクラスを規定する。配列同一性の程度は少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％であることが好ましい。配列同一性の決定方法が当技術分野において知られている。当技術分野において知られている適切なコンピュータプログラムを使用して２つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を電子的に整列させることができる。そのようなプログラムはＢＬＡＳＴ（Altschul et al., J. Mol. Biol. 215, 403-410 (1990)）、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ（Altschul & Gish, Methods Enzymol. 266, 460-480 (1996)）のようなその改変型、ＦＡＳＴＡ（Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 2444-2448 (1988)）またはＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムの処理系（ＳＳＥＡＲＣＨ、 Smith
& Waterman, J. Mol. Biol. 147, 195-197 (1981)）を含む。これらのプログラムはペアワイズ配列アラインメントを提供することに加えて配列同一性レベル（通常はパーセント同一性）とそのアラインメントが偶然に生じる確率（Ｐ値）も報告する。ＣＬＵＳＴＡＬＷ（Higgins et al., Nucleic Acids Res. 22, 4673-4680 (1994)）のようなプログラムを使用して２つより多くの配列を整列させることができる。それぞれのコンピュータプログラムの公開された通りの初期設定を使用することが好ましい。好ましいアラインメントプログラムはＢＬＡＳＴ（上掲）である。
【００２８】
本発明の文脈の中でヒトＢｃｌ−２、ヒトＢｃｌ−ＸＬ、ヒトＢｃｌ−ｗ等である所与の基準配列の上で規定された配列同一性レベルのいずれかの範囲内にあるあらゆる突然変異体を前記基準配列に「由来」する突然変異体として使用することが好ましい。多数の例において、且つ、下でこのことをさらに詳細に説明するが、抗アポトーシス機能を低下させる、または無効にするには、および／または分化転換能を増強するには野生型配列のわずかな変更で充分である。
【００２９】
要素（ｄ）に準ずるタンパク質のいずれかが１種類より多くのスプライシング変異体として天然で生じる限り、そのようなスプライシング変異体のどれもが本発明によって包含され、配列同一性に関して規定されるホモログを定義するための基準としてさらに役に立つ（下記参照）。Ｂｃｌ−２−βアイソフォームとして知られるヒトＢｃｌ−２の変異体が本明細書により配列番号５として含まれる。配列番号１の配列を有する形態のヒトＢｃｌ−２が優先される。
【００３０】
ヒトＢｃｌ−ＸＬの配列が本明細書により配列番号６として含まれる。ヒトＢｃｌ−ｗの配列が配列番号７として含まれる。ヒトＭｃｌ１の配列が配列番号８として含まれる。ヒトＢｆｌ１のアイソフォーム１および２の配列がそれぞれ配列番号９および１０として含まれる。ヒトＮｒｈの配列が配列番号１１に提供される。ヒトＢｃｌ２Ｌ１の配列が配列番号１２に提供される。ヒトＤＩＶＡの配列が配列番号１３に提供される。ヒト骨髄細胞白血病配列１アイソフォーム１の配列が配列番号１４に提供される。ヒトＢｃｌ−ｘβの配列が配列番号１５に提供される。
【００３１】
上記の要素（ａ）および要素（ｄ）に準ずる要件の組合せも好ましい。
【００３２】
「Ｂｃｌ−２ファミリー」という用語が当技術分野において確立されている（Chao and
Korsmeyer, Annu. Rev. Immunol. 16, 395-419 (1998)）。「Ｂｃｌ−２」という用語は野生型で抗アポトーシス活性を有するこのファミリーのメンバーを示す。「Ｂｃｌ−２」はそれが起源とする生物または種に限定されない。
【００３３】
分化転換の強化の程度を決定するための適切なアッセイは次のとおりである。神経原性転写因子Ａｓｃｌ１をコードする核酸と分化細胞、好ましくはヒト成体線維芽細胞を接触させる。候補ポリペプチドが存在しているときとそれが存在していないときに前記接触を
行う。その後、分化転換細胞、このアッセイでは神経細胞の数量を計測する。候補ポリペプチドの存在下で得られた神経細胞の数がその不在下で得られた神経細胞の数を少なくとも３０％超える場合、前記候補ポリペプチドが本発明の第１の態様に準ずるポリペプチドである。神経細胞の数を定量するためのアッセイは、専ら神経細胞において発現するタンパク質、例えば、βＩＩＩチューブリン、ニューロフィラメント、ダブルコルチンまたはＭＡＰ−２などを認識する特異的抗体を使用する免疫細胞化学によって通常実施される。好ましくは、βＩＩＩチューブリン免疫染色が用いられる。例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）の中で培養物を室温で１０分間にわたって固定し、ＰＢＳ中で洗浄し、ＰＢＳ中の０．５％トリトンＸ−１００の中で３０分間にわたって前処理し、続いてＰＢＳ中の２％ＢＳＡと０．５％トリトンＸ−１００の中で３０分間にわたってインキュベートする。一次βＩＩＩチューブリン抗体（マウスＩｇＧ２ｂ、Ｓｉｇｍａ、Ｔ８６６０）と一次ＲＦＰ抗体（ウサギ、１：５００、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、ＡＢ３２１６、または１：２０００、Ｒｏｃｋｌａｎｄ、６００−４０１−３７９）をＰＢＳ中の２％ＢＳＡ（１：５００）、０．５％トリトンＸ−１００の中で標本に対して４℃で一晩インキュベートする。ＰＢＳ中での洗浄の後にそれぞれＣｙ（商標）２およびＣｙ（商標）３が複合体化した二次抗マウス抗体および二次抗ウサギ抗体（１：５００、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）と細胞をインキュベートする。その後で落射蛍光顕微鏡法により二重陽性細胞（βＩＩＩチューブリン＋およびＲＦＰ＋）の数を分析することができる。
【００３４】
好ましい実施形態では分化転換の強化の程度は少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、少なくとも１０倍、２０倍、５０倍または少なくとも１００倍である。
【００３５】
４つの上述のＢｃｌ−２相同ドメインが当技術分野において知られており、例えばペアワイズ配列アラインメント、マルチプル配列アラインメント、または保存モチーフもしくは保存ドメインのデータベースを使用する配列分析であって好ましいデータベースがＰｆａｍ（Punta et al., Nucleic acid research database issue 40: D290-D301 (2012)）である配列分析によってそれらのドメインの存在を決定することができる。前述のドメインの存在を決定することを目的として、初期設定を使用して２０１３年３月のバージョン２７．０のＰｆａｍデータベースおよびアルゴリズムを使用することが好ましい。例示目的で我々は、ＢＨ１ドメイン、ＢＨ２ドメイン、ＢＨ３ドメインおよびＢＨ４ドメインが強調されている配列アラインメントをそれぞれ表示しているＩｎｏｈａｒａら（The Journal of Biological Chemistry, Issue of December 4, 273, 32479-32486 (1998)）およびＩｎｏｈａｒａら（The Journal of Biological Chemistry, Issue of April 10, 273,
8705-8710 (1998)）をさらに参照する。ＢＨ１ドメイン、ＢＨ２ドメイン、ＢＨ３ドメインおよびＢＨ４ドメインに（この順序で）対応する残基範囲は次のとおりである：ヒトＢｃｌ−２（配列が配列番号１として本明細書に添付されている）中の１３６〜１５５、１８７〜２０２、９７〜１０５、および７〜３０；マウスＢｃｌ−２（配列番号３）中の１３３〜１５１、１８４〜１９８、９４〜１０２、および７〜３０。
【００３６】
「ＢＨ１ドメイン、ＢＨ２ドメイン、ＢＨ３ドメインおよびＢＨ４ドメインからなる群より選択される少なくとも１つのドメインを含むポリペプチド」という用語は野生型（上記要素（ｂ）を参照されたい）と人為型の両方を含み、前記人為型は天然の同一な対応物を有しない（それが断片、要素（ｃ）および（ｄ）に関する限り、上記要素（ｂ）を参照されたい）。前記人為型の範囲内で野生型に由来する突然変異体が優先され、所与の突然変異体が野生型に由来するという事実は配列同一性の観点で表現される。上記要素（ｄ）を参照されたい。野生型ポリペプチドを使用する限り、前記野生型が抗アポトーシス活性を有していることが好ましい。本発明者らはＢＨ１ドメイン、ＢＨ２ドメイン、ＢＨ３ド
メインおよびＢＨ４ドメインから選択される少なくとも１つのドメインを含むポリペプチド群の中に分化転換能を特徴とする可能性が高く、抗アポトーシス活性を特徴とする亜群が存在することを発見した。第１の態様の要素（ａ）において定義された（前述のドメインのうちの少なくとも１つの存在で定義された）ポリペプチド群の野生型メンバーについて、それらのメンバーが抗アポトーシス活性を有しているかどうかが一般に知られている。特許請求項の文言（ドメインの存在；抗アポトーシス活性）に一致する野生型ポリペプチドの例はＢｃｌ−２、Ｂｃｌ−ＸＬ、Ｂｃｌ−ｗ、Ｍｃｌ１、Ｂｆｌ１、Ｎｒｈ、Ｂｃｌ２Ｌ１、ＤＩＶＡ、骨髄細胞白血病配列１アイソフォーム１、およびＢｃｌ−ｘβである。アポトーシスの存在、不在および程度は、例えば、ビデオタイムラプストラッキングによって（添付されている実施例も参照されたい）、特定のアポトーシス事象（カスパーゼ−３切断、Nicholson, D. W. et al. (1995) Nature 376, 37-43.）の免疫染色によって、または市販のキット（例えばＡＰＯ  ＬＯＧＩＸ（商標）カルボキシフルオレセインカスパーゼ検出キットとして知られるＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙのカスパーゼ／アポトーシス検出キット）を使用して決定され得る。
【００３７】
第１の態様の要素（ｉｉ）は転写因子に関する。１つ以上の転写因子を使用してよい。「転写因子」という用語は当技術分野において確立された意味を有する。その用語は１つ以上の遺伝子の発現レベルを改変するポリペプチドまたはタンパク質（「タンパク質」という用語はポリペプチドならびに非共有結合または共有結合により相互に結合した１つより多くのポリペプチドを含む組成物を含む）を指し、前記１つ以上の遺伝子はその転写因子の標的遺伝子とも呼ばれる。転写因子はその作用を及ぼすために概して核の中に入らなくてはならない。転写因子が１つ以上の標的遺伝子のプロモーター領域および／またはエンハンサー領域に結合することが好ましい。前記１つ以上の転写因子は前記細胞を分化転換することが可能である。したがって、前記１つ以上の転写因子は細胞運命が変化するように標的とされた分化細胞の遺伝子発現プロファイルを改変する。幾つかの例では転写因子、または典型的には１つより多くの転写因子の混合物によって分化転換が引き起こされ得るが、得られる細胞の収量ならびに純度は一般的に低い。上文の先行技術文献の考察を参照されたい。さらに、ある特定の種類の細胞を分化転換過程の最後に得るためにどの転写因子が有用であるについて確立された知見が存在する。したがって、公知の転写因子がそれらの投与時に得ることができる細胞の種類に準じてグループ化されている。そのようなグループには筋原性転写因子と神経原性転写因子が含まれる。
【００３８】
「転写因子」という用語は野生型転写因子ならびにそれらの機能性断片の両方を包含することが理解される。転写因子の機能性断片に関する「機能性」という用語は細胞を分化転換することが可能である断片であって、より好ましくは対応する野生型転写因子を使用すると達成可能である分化転換の程度の少なくとも５０％を達成する断片を定義する。転写因子の断片が本発明に準ずる機能性断片であるか決定するために次のアッセイが実施され得る。第１アッセイにおいて分化細胞、好ましくは成体線維芽細胞を所与の転写因子と接触させてよく、第２アッセイにおいてその転写因子の断片と接触させてよい。その接触の後に分化転換細胞の数を決定する。例えば、前記転写因子がＮｅｕｒｏｇ２である場合に前記分化転換過程によって得られる細胞は神経細胞である。第１アッセイで得られた神経細胞の数量の少なくとも５０％が第２アッセイによってもたらされる場合、前記転写因子の前記断片は本発明に準ずる機能性断片である。
【００３９】
要素（ｉ）と同様に、１つ以上の転写因子をコードする１つ以上の核酸を使用することが好ましい。その他の代替法として、前記細胞において前記１つ以上の転写因子の量および／または活性を増加させる手段を使用してよい。
【００４０】
本方法は転写因子と無関係に機能する。このことは実施例において示されている。また、先行技術の方法は転写因子の混合物を日常的に使用しているが、本発明の方法は、前記
ポリペプチドによって付与される分化転換の強化に少なくとも部分的に起因して、たった１つの転写因子しか存在しないときでも効率的に機能する。「１つの転写因子」という用語は１種類の転写因子を指し、前記種類は特定のアミノ酸配列に関して規定される。１つの転写因子を使用して本発明が実施される限り、他の転写因子が存在しないことが理解される。「１つの転写因子」という用語は、少なくとも必ずしも一分子を意味しない。
【００４１】
本明細書に添付されている実施例によって証明されるように、本発明に従う方法は著しく高率の分化転換（最大で１００％）を特徴とする。効率が高いだけでなく、分化転換時に得られる分化細胞の純度の程度も高い。特定の理論に捉われることはないが、その高い程度の純度は少なくとも２つの特徴に起因し得る。第１に、多能性状態または多能性出発物質の回避。第２に、およびこれは下で詳細に説明される好ましい実施形態の主題であるが、本発明の方法はたった１つの転写因子しか使用されない実施例においても素晴らしい働きをする。得られた細胞の純度を保証するその他の手段は、たった１つの転写因子しか使用しないことである。
【００４２】
本発明者らは分化転換のチェックポイントが酸化ストレスに依存することをさらに発見した。好ましくは、前記酸化ストレスは脂質の過酸化反応である。Ｄｒｕｍｍｅｎおよび共同研究者によって記載される方法（Drummen et al., 2002）の中に脂質過酸化の判定例を見出すことができる。「チェックポイント」という用語は当技術分野において確立された意味を有する。特に、その用語は細胞運命を決定する細胞機構を指す。分化転換の背景ではチェックポイントは細胞が分化転換の経路を進むのか、または細胞がアポトーシスまたはフェロトーシスであることが典型的である異なる運命を経験するのか決定する。フェロトーシスはイオン依存型の非アポトーシス性細胞死である（Dixon and Stockwell, 2014）。酸化ストレス、特に脂質過酸化は分化転換に対する阻害効果を有し、我々は分化転換中の細胞において要素（ｉ）によって脂質過酸化とフェロトーシスが減少することを観察した。
【００４３】
結果として、上で規定された要素（ｉ）の代わりに代替的な要素（ｉｉｉ）を使用してよいことが発見された。下記参照。同時に我々はＢＣｌ−２と本明細書において開示されるその誘導体をそれらの細胞機能の観点から抗酸化剤として見ることもできることを特記する。
【００４４】
以上より、本発明の第１の態様は分化細胞を分化転換する代替的方法にまで拡大する。より具体的には、分化細胞を分化転換する方法であって、少なくとも１種類の要素（ｉｉｉ）および少なくとも１種類の要素（ｉｉ）と前記細胞を接触させることを含む方法であり、前記要素（ｉｉｉ）によって脂質過酸化が減少し、前記要素（ｉｉｉ）が（ａ）ビタミンＤ受容体、その機能ホモログ、および前記受容体またはその前記機能ホモログをコードする核酸、（ｂ）ステロイド性抗酸化剤、好ましくはカルシトリオール、（ｃ）フェノール性抗酸化剤、好ましくはトコフェロールまたはトコトリエノール、および（ｄ）キノン、好ましくはコエンザイムＱから選択されることが好ましく、且つ、前記要素（ｉｉ）が前記細胞を分化転換することが可能である転写因子、前記転写因子をコードする核酸、ならびに前記細胞において前記転写因子の量および／または活性を増加させるための手段から選択され、ヒトまたは動物の身体を治療処置するあらゆる方法が除外される前記方法が提供される。
【００４５】
一般的に言って、脂質過酸化を減少することが可能であるあらゆる作用剤または化合物が適切な要素（ｉｉｉ）である。この点で好ましい作用剤は要素（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）の作用剤である。
【００４６】
前記ビタミンＤ受容体がヒトまたはマウスのビタミンＤ受容体（それぞれ配列番号１６
および１７）であることが好ましい。前記ビタミンＤ受容体の前記ホモログは前記ビタミンＤ受容体の配列に対してアミノ酸レベルで８０％、９０％、９５％または９８％の配列同一性を示すことが好ましい。機能ホモログはビタミンＤ受容体依存性経路の抗酸化剤機能を保存するホモログである。
【００４７】
上で特記したように、要素（ｂ）に準ずる好ましいステロイド性抗酸化剤は１α，２５（ＯＨ）２−コレカルシフェロールまたは１α，２５（ＯＨ）２−ビタミンＤ３としても知られるカルシトリオールである。別の好ましいステロイド性抗酸化剤はビタミンＤ３である。
【００４８】
多数の天然フェノール類が抗酸化剤としてよく知られている。好ましいサブクラスはビタミンＥとして知られている。同様にビタミンＥは一群の化合物を指定する。抗酸化特性を有するビタミンＥファミリーのメンバーだけが本発明の関心である。これらには前述のトコフェロールとトコトリエノールが含まれる。α−トコフェロールが特に好ましい。
【００４９】
キノンもよく知られたビタミン様抗酸化分子である。好ましいキノンはコエンザイムＱである。
【００５０】
「少なくとも１種類の要素」と記述されるときはいつでも１種類の要素が優先される。他方、「少なくとも１種類の」という用語は上文で規定された要素（ｉ）、要素（ｉｉ）または要素（ｉｉｉ）である２種類の、３種類の、４種類の、５種類の、またはそれより多くの要素も包含すると理解される。
【００５１】
好ましい実施形態では第１の態様の方法はインビトロまたはエクスビボで実施される。
【００５２】
「インビトロ」という用語は本方法の全体がヒトまたは動物の身体の外側で実施されることを必要とする。「インビトロ」という用語はその他のあらゆる制限を意味しない。分化転換される分化細胞が１種類の生物または種に由来し、且つ、分化転換過程の結果として得られた細胞が異なる生物または種に投与されることが考えられる。それらの実際の獲得ステップと投与ステップは上で規定された第１の態様の文言に含まれていない。
【００５３】
「エクスビボ」という用語は、分化転換される分化細胞が１種類の生物から採取され、且つ、分化転換過程の結果として得られた細胞が同じ生物または異なる生物に再導入される実施例を包含する。とはいえ、分化細胞の獲得過程も分化転換細胞の再導入過程も本発明の第１の態様の文言に含まれていないことが理解される。
【００５４】
完全を期すために、本発明は第１の態様に準じて規定される方法であって、ヒトまたは動物から分化細胞を得るステップ、および／または本方法によって得られた分化転換細胞を同じ生物または異なる生物に導入する（エクスビボ用途の場合は再導入する）ステップが前記接触の前に来る方法も企図していることが特記される。前記異なる生物は同じ種または異なる種の生物であり得る。好ましい種は哺乳類動物、特にヒトである。後者の場合、前記方法が分化転換細胞の導入ステップを含む限り前記方法は治療用途を包含する、または治療用途に限定される。治療を受けることができる適応症は下でさらに詳細に説明される。
【００５５】
第２の態様において、本発明は、（ａ）少なくとも１種類の要素（ｉ）および少なくとも１種類の要素（ｉｉ）、（ｂ）少なくとも１種類の要素（ｉｉｉ）および少なくとも１種類の要素（ｉｉ）、または（ｃ）少なくとも１種類の要素（ｉ）、少なくとも１種類の要素（ｉｉ）、および少なくとも１種類の要素（ｉｉｉ）を含む、またはそれらからなる配合物を提供し、前記要素の各々は上で規定されたとおりである。要素（ｉ）、要素（ｉ
ｉ）および要素（ｉｉｉ）（ａ）には核酸が好ましい。
【００５６】
前記配合物は単一の組成物として提供されてよく、その場合に前記組成物は混合物である。あるいは、前記要素およびさらには、複数のいずれかの要素が使用される限り、個々の要素の各々が別々に、例えば、別々のバイアル瓶の中に提供され得る。それに関して、本発明は下でさらに詳細に説明されるキットも提供する。インビトロ用途用にキットを設計してよいが、それらのキットは診断用途に有用であってもよい（これも下でさらに詳細に説明される）。
【００５７】
また、前記配合物は治療用途も有する。したがって、本発明は前記配合物と所望により薬学的に許容可能な担体または賦形剤を含む、またはそれらからなる医薬組成物も提供する。さらに、本発明に従う配合物または医薬組成物の中に不特定の治療薬が含まれていてもよい。それでも、活性薬剤として明示的に列挙されている成分だけを含む医薬組成物が好ましい。
【００５８】
適切な医薬担体、賦形剤および／または希釈剤の例が当技術分野においてよく知られており、それらの例にはリン酸緩衝生理食塩水、水、水中油型乳液のような乳液、様々な種類の湿潤剤、無菌溶液等が含まれる。そのような担体を含む組成物はよく知られている従来法によって製剤化され得る。これらの医薬組成物は適切な用量で対象に投与され得る。それらの適切な組成物の投与は様々な方法で、例えば、静脈内投与、髄腔内投与、眼内投与、腹腔内投与、皮下投与、筋肉内投与、局所投与、皮内投与、鼻腔内投与または気管支内投与によって達成され得る。前記投与が注射によって行われることが特に好ましい。それらの組成物は標的部位へ直接的に、例えば、筋肉または脳のような外部標的部位または内部標的部位への微粒子銃による送達またはウイルスベクターによる送達によって投与されてもよい。主治医および臨床学的因子によって投与計画が決定される。医療分野においてよく知られているように、どの１人の患者についてもその投与量は、患者の体格、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与時間と投与経路、一般健康状態、および所望により同時に投与されている他の薬品をはじめとする多くの因子に依存する。タンパク質性薬学的活性物質は１用量当たり１ｋｇの体重に対して１ｎｇと１０ｍｇの間の量で存在してよい。しかしながら、この例となる範囲より下または上の用量が特に前述の因子を考慮して想定される。投与法が連続点滴である場合、その投与法も１分当たり１キログラムの体重に対して１ｎｇ単位から１０ｍｇ単位の範囲にあるほうがよい。
【００５９】
１つ以上の転写因子が使用されるかどうかに応じて次に再生目的で使用され得る様々な種類の分化転換細胞が得られる。また、前記分化転換細胞は治療目的でその場で作製され得る。したがって、第４の態様において本発明は、機能性神経細胞の消失および／または機能性筋細胞の消失を特徴とする神経障害または筋障害を治療または予防する方法に使用するための上で規定された配合物であって、前記１つ以上の転写因子が神経原性転写因子および筋原性転写因子から選択され、好ましくは分化細胞を分化転換することによって前記治療または予防が達成される前記配合物を提供する。
【００６０】
これに関して、本発明は、機能性神経細胞の消失を特徴とする神経障害を治療または予防する方法に使用するための上で規定された配合物であって、前記１つ以上の転写因子が神経原性転写因子から選択され、好ましくは分化細胞を分化転換することによって前記治療または予防が達成される前記配合物を提供する。
【００６１】
これに関して、本発明は、機能性筋細胞の消失を特徴とする筋障害を治療または予防する方法に使用するための上で規定された配合物であって、前記１つ以上の転写因子が筋原性転写因子から選択され、好ましくは分化細胞を分化転換することによって前記治療または予防が達成される前記配合物を提供する。
【００６２】
前述の機能性神経細胞の消失または機能性筋細胞の消失は部分的消失または完全消失であり得る。「消失」という用語はそれぞれの細胞それ自体が例えばアポトーシスまたはネクローシスの結果として失われるシナリオを包含し、前記神経細胞または筋細胞の機能が失われるシナリオもさらに包含する。神経細胞の機能には情報の伝達が含まれる。筋細胞の機能には収縮性が含まれる。
【００６３】
好ましい実施形態では（ａ）前記神経障害はアルツハイマー病、レビー小体型認知症、パーキンソン病、てんかん、および中枢神経系の外傷性損傷または虚血性損傷をはじめとする神経変性障害から選択される。
【００６４】
さらに好ましい実施形態では（ｂ）前記筋障害は慢性コンパートメント症候群、アイザック症候群、横紋筋融解、筋ジストロフィー、重症筋無力症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、多発性硬化症（ＭＳ）、フリードリッヒ運動失調症、ランバート・イートン症候群、およびケネディー病から選択される。
【００６５】
第２の態様に従う配合物、第３の態様に従う医薬組成物、および第４の態様に従う使用のための配合物の好ましい実施形態では前記配合物または組成物はそれぞれ分化転換を受けることができるインビトロ細胞をさらに含む。分化転換を受けることができる好ましい細胞はヒト成体線維芽細胞をはじめとする線維芽細胞である。分化転換を受けることができる前記細胞が自家細胞であることも好ましい。
【００６６】
この好ましい実施形態は、本発明に従う配合物が送達される予定の部位における分化転換を受けることができる細胞の存在に依存しない。代わりに、分化転換を受けることができる細胞が前記配合物または組成物のそれぞれの中の第３の要素として含まれる。成熟線維芽細胞をはじめとする線維芽細胞は簡単に入手できるので好ましい。
【００６７】
本発明者らはＢｃｌ−２相同ドメインを含むタンパク質の機能を調査し、一方ではアポトーシス関連機能であって、他方では分化転換関連機能である２つの異なる機能を初めて明確に解明した。したがって、幾つかの好ましい実施形態がこれまでに開示された本発明の様々な態様のポリペプチド（要素（ｉ））の好ましい態様に関連する。
【００６８】
好ましい実施形態では前記ポリペプチドは、（ａ）アミノ酸配列が配列番号１に示されているヒトＢｃｌ−２と比較すると低下した抗アポトーシス機能を有しているか、またはその抗アポトーシス機能を失っており、および／または（ｂ）ヒトＢｃｌ−２よりも高い程度にまで分化転換細胞の収率を向上させる。
【００６９】
この好ましい実施形態の態様（ａ）は、抗アポトーシス機能は候補ポリペプチドの特定にとって有用な基準であるが、実際には無くてもよいという本発明者らの驚くべき発見に関する。Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーの抗アポトーシス特性が分化過程におけるＢｃｌ−２の推定上の役割に重要であるという理解が先行技術において優勢であることを考慮するとこの発見は驚くべきものである。
【００７０】
抗アポトーシス機能を例えばＴＵＮＥＬアッセイ、ＤｅＰｓｉｐｈｅｒアッセイ（Ｒ＆Ｄシステムズ）ならびにヨウ化プロピジウムおよびカスパーゼ−３の染色のような標準的方法によってアッセイすることができ、あるいは細胞死をタイムラプスビデオ顕微鏡法（実施例において提供される方法も参照されたい）によって分析することができる。タイムラプスビデオ顕微鏡法によってアポトーシス細胞を検出し、適格とすることが好ましい。これにより細胞死の直接的観察が可能になる。詳細は実施例の方法の節に提供される。抗アポトーシス機能の低下を決定するための基準として配列番号１の配列からなるヒトＢｃ
ｌ−２を使用することができる。好ましくは、抗アポトーシス機能の低下はヒトＢｃｌ−２と比較すると少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％または少なくとも５０％である。「その抗アポトーシス機能を失っている」という用語は、上で記載されたような抗アポトーシス機能のアッセイを用いると測定可能な抗アポトーシス機能を全く働かせない突然変異体に適用される。上で特記したように、抗アポトーシス機能の低下はアポトーシスの増加を測定することによっても決定され得る。言い換えると、ヒトＢｃｌ−２と比較すると低下した抗アポトーシス機能を同時に有する上で規定されたポリペプチドはヒトＢｃｌ−２の代わりに使用されるとアポトーシスの増加をもたらす。アポトーシスがヒトＢｃｌ−２と比較すると少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％増加することが好ましい。アポトーシスの存在と程度は上文で開示されたアポトーシスのアッセイによって決定され得る。
【００７１】
とはいえ、前記ポリペプチドの抗アポトーシス機能の保持も想定される。その場合、前記ポリペプチドは分化転換を強化する一方で分化転換の最中に生存も促進する。細胞運命を変更している細胞の一部が分化転換の最中にアポトーシスを経験する可能性があるので、そのような生存促進によって本発明の分化転換過程の全体的収率がさらに向上し得る。
【００７２】
あるいは、または加えて、前記ポリペプチドはヒトＢｃｌ−２よりも分化転換細胞の収率を高い程度にまで上昇させる。この実施形態は本発明者らの別の驚くべき発見に関する。より具体的には、前記ポリペプチドの前記抗アポトーシス機能は無くてよいばかりではない。その抗アポトーシス機能が低下していることで、または完全に無いことで、本発明によって包含されているが、抗アポトーシス機能もなお働かせるポリペプチドと比較すると増強された分化細胞を分化転換する能力が提供される。そのようなそれでもさらに増強された分化転換能の具体的な例は本明細書に添付されている実施例においてさらに詳細に説明される「Ａ  Ｂｃｌ−２」と名付けられた突然変異体である。ヒトＢｃｌ−２の使用と比較した分化転換細胞の収率の増加は次のように決定され得る。神経原性転写因子Ａｓｃｌ１をコードする核酸と分化細胞、好ましくはヒト成体線維芽細胞を接触させる。ヒトＢｃｌ−２が存在しているとき、または候補ポリペプチドが存在しているときに前記接触を行う。その後、分化転換細胞、この事例では神経細胞の数量を計測する。候補ポリペプチドの存在下で得られた神経細胞の数がヒトＢｃｌ−２の存在下で得られた神経細胞の数を超える場合、前記候補ポリペプチドがＢｃｌ−２よりも分化転換細胞の収率を高い程度にまで上昇させるポリペプチドである。好ましくは、ヒトＢｃｌ−２は配列番号１のアミノ酸配列からなる。好ましくは、この好ましい実施形態に準じるポリペプチドを使用して得られる分化転換細胞の数はヒトＢｃｌ−２を使用するときの分化転換細胞の数よりも少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％または少なくとも５０％多い。
【００７３】
これまでに開示された本発明の４つの態様のうちのいずれかのさらに好ましい実施形態では前記ポリペプチドはＢｃｌ−２、Ｂｃｌ−ＸＬ、Ｂｃｌ−ｗ、Ｍｃｌ１、ＢｆＩ１、Ｎｒ１３／Ｎｒｈ（ＮｒｈはＮｒ１３のヒトオルソログである）、Ｂｃｌ２Ｌ１、ＤＩＶＡ、骨髄細胞白血病配列１アイソフォーム１、およびＢｃｌ−ｘβから選択され、それぞれヒトのポリペプチドであることが好ましい。それらの列挙されたタンパク質は十分に特徴づけられたドメイン構造を有する十分に認識された抗アポトーシスタンパク質である。特に、それらのタンパク質はＢＨ１ドメイン、ＢＨ２ドメイン、ＢＨ３ドメインおよびＢＨ４ドメインから選択される少なくとも１つのドメインを含む。幾つかの例において、それらのタンパク質はただ１つのＢＨ１ドメイン、ただ１つのＢＨ２ドメイン、ただ１つのＢＨ３ドメイン、およびただ１つのＢＨ４ドメインを含む。後者のドメイン構造が特に好ましい。前記タンパク質はあらゆる種に由来してよく、哺乳類の種に由来することが好ましく、ヒトに由来することが特に好ましい。上で特記したように、ヒトＢｃｌ−２（αア
イソフォーム）のアミノ酸配列は配列番号１として本明細書に添付されている。そのマウスの対応物が配列番号３に示されている。Ｉｎｏｈａｒａらによる前述の刊行物は前述のタンパク質の大半の配列とドメイン構造を示している。
【００７４】
さらに好ましい実施形態では前記ポリペプチドがＢＨ４ドメインと所望によりＢＨ１ドメイン、ＢＨ２ドメイン、ＢＨ３ドメインおよびＢＨ４ドメインからなる群より選択される１つ、２つ、３つ、またはそれより多くのドメインを含み、前記ポリペプチドがただ１つのＢＨ１ドメイン、ただ１つのＢＨ２ドメイン、ただ１つのＢＨ３ドメインおよびただ１つのＢＨ４ドメインを含むことが好ましい。
【００７５】
この好ましい実施形態はポリペプチドをそれらのポリペプチドのドメイン構造の観点から規定し、「構造」という用語はポリペプチド内にあるドメインのリストを指し、好ましい実施形態では前記ポリペプチド内のドメインの順序も指す。この点に関し、ＢＨ１ドメイン、ＢＨ２ドメイン、ＢＨ３ドメイン、およびＢＨ４ドメインのうちのいずれか１つの存在がポリペプチドを候補ポリペプチドとして適格とする（本発明のポリペプチドであるには上で規定された分化転換試験を通過する必要がある）上で充分であり、本発明者らは、あらゆる特定の理論に捉われることはないが、分化転換の構造的決定因子が存在する可能性がＢＨ４ドメインの存在によってさらに高められると考えていることを我々は特記する。
【００７６】
上で特記したように、Ｂｃｌ−２に見られるドメイン構造の種類、すなわち、ただ１つのＢＨ１、ただ１つのＢＨ２ドメイン、ただ１つのＢＨ３ドメインおよびただ１つのＢＨ４ドメインの存在が特に好ましい。
【００７７】
低下した抗アポトーシス機能または無効になった抗アポトーシス機能を有するという上で規定された構造的要件は、タンパク質間相互作用に関する構造的相互関係を有する。より具体的には、野生型Ｂｃｌ−２はその抗アポトーシス機能を発揮させるためにＢａｘと相互作用する。本発明の上で規定された態様のいずれかの好ましい実施形態では前記ポリペプチドはＢａｘと相互作用しないか、またはＢａｘと前記ポリペプチドの相互作用はヒトＢａｘとヒトＢｃｌ−２の相互作用と比較すると低下しており、ヒトＢａｘのアミノ酸配列は配列番号２において示されている。
【００７８】
あるいは、所与のポリペプチドがこの好ましい実施形態の文言に合致するか決定するためにマウスＢａｘを使用してよい。マウスＢａｘ（アミノ酸配列）は配列番号４として提供される。第１の態様の要素（ｉ）のポリペプチドと同じ種に由来するＢａｘを使用することが好ましい。このことは前記ポリペプチドが野生型から派生した突然変異体である場合にも当てはまる。本発明に準ずるＢａｘとの低下した相互作用は、ヒトＢｃｌ−２とヒトＢａｘの間の相互作用と比較するとその結合状態の１０％、好ましくは少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％またはそれより多くの割合の低下を必要とする。相互作用はＢｉａｃｏｒｅアッセイによって決定されることが好ましい。Ｂｃｌ−２とＢａｘの間の相互作用を定量する別の好ましい手段はＤｅｎｇら（Molecular and cellular biology 26, 4421-4434 (2006)）によって記載される共免疫沈降アッセイである。
【００７９】
上で開示された本発明の態様のいずれかのさらに好ましい実施形態では前記ポリペプチドは、（ａ）可動性ループドメイン中の１つ以上のリン酸化可能残基がリン酸化不能残基によって置き換えられているか、または欠失している点で野生型Ｂｃｌ−２と異なるＢｃｌ−２突然変異体、例えば、（ｉ）ヒトＢｃｌ−２のＳ７０Ａ突然変異体、（ｉｉ）ヒトＢｃｌ−２のＴ６９Ａ／Ｓ７０Ａ二重突然変異体、（ｉｉｉ）ヒトＢｃｌ−２のＳ８７Ａ突然変異体、（ｉｖ）ヒトＢｃｌ−２のＴ６９Ａ／Ｓ７０Ａ二重突然変異体、（ｖ）ヒト
Ｂｃｌ−２のＴ６９Ａ／Ｓ８７Ａ二重突然変異体、（ｖｉ）ヒトＢｃｌ−２のＳ７０Ａ／Ｓ８７Ａ二重突然変異体、（ｖｉｉ）ヒトＢｃｌ−２のＴ６９Ａ／Ｓ７０Ａ／Ｓ８７Ａ三重突然変異体、（ｖｉｉｉ）ヒトＢｃｌ−２のＴ６９、Ｓ７０およびＳ８７のうちの１つ、２つ、または３つの欠失から選択される欠失突然変異体、および（ｉｘ）ヒトＢｃｌ−２のａａ６９〜８７の欠失突然変異体、または（ｂ）膜貫通領域が欠失しているか、または非機能的になったヒトＢｃｌ−２の突然変異体であるＢｃｌ−２突然変異体から選択される。その膜貫通領域の不在または非機能性によってＢｃｌ−２の膜結合が無くなる。所与の突然変異体が膜結合性であるかそうでないかは当技術分野において確立された方法、例えば、（例えば、フルオロフォアによる）候補突然変異体の標識、および細胞内でのその局在の決定によって決定され得る。
【００８０】
部分要素（ｉ）から（ｖｉｉ）は置換突然変異体である。ヒトＢｃｌ−２のＳ７０Ａ突然変異体は本明細書において「Ａ−Ｂｃｌ−２」とも呼ばれ、添付される実施例においてさらに特徴解析される突然変異体である。それらの置換突然変異体の残りのものは、可動性ループドメイン内に位置し、且つ、リン酸化を受けることができる１つ以上の残基がリン酸化不能残基によって置き換えられるというパラダイムをこの特定の突然変異体と共に共有する。リン酸化不能残基による置換の代わりに前記位置のうちの１つ以上を完全に欠失してよい。上記の部分要素（ｖｉｉｉ）を参照されたい。ヒトＢｃｌ−２の可動性ループドメイン全体、好ましくはアミノ酸残基６９〜８７を欠失してよい。また、前記可動性ループドメインのあらゆる部分領域の欠失が、そのような欠失によって位置６９、位置７０および位置８７のリン酸化可能残基のうちの少なくとも１つが影響を受ける限り想定される。「可動性ループドメイン」という用語が当技術分野において確立されており（Deng
et al., Mol. Cell. Biol. 26, 4421 (2006)を参照されたい）、ヒトＢｃｌ−２を参照すると残基６９から残基８７まで（マウスＢｃｌ−２では残基６９〜８４）の残基範囲によって規定される。代替的アプローチではＢｃｌ−２野生型の特徴的な特色である膜貫通領域（ヒトでは残基２１２〜２３３、マウスでは残基２１５〜２３５）を、例えば、その１つ以上の残基に突然変異を入れるか、または１つ以上の残基を欠失することによって欠失するか、または非機能的にしてよい。特定の理論に捉われることを望むものではないが、分化転換の最中にＢｃｌ−２が核に局在するという本発明者らの観察結果は膜貫通領域の除去によって本発明に従うポリペプチドの分化転換能がさらに増強され得ることを表していると本発明者らは考えている。
【００８１】
他の生物に由来するＢｃｌ−２配列が対応する突然変異体の設計に使用される予定である限り、対応するアミノ酸の位置は例えばペアワイズ配列アラインメントまたはマルチプル配列アラインメントによってすんなりと決定され得る。完全を期すために我々はヒトＢｃｌ−２の位置６９、位置７０および位置８７がそれらの対応物をマウスＢｃｌ−２の位置６９、位置７０および位置８４において有することを特記する。
【００８２】
上で開示された本発明の態様のいずれかのさらに好ましい実施形態では前記細胞は（ｉ）体細胞、好ましくは線維芽細胞、星状細胞、および周皮細胞から選択される体細胞であり、（ｉｉ）脊椎動物細胞、好ましくは哺乳類細胞、より好ましくはマウス起源またはヒト起源の細胞であり、および／または（ｉｉｉ）胚由来または出生後段階、好ましくは成体段階に由来する細胞である。
【００８３】
別の好ましい実施形態では前記１つ以上の転写因子（要素（ｉｉ））は神経原性転写因子、好ましくはＡｓｃｌ１、Ｎｅｕｒｏｇ２、Ｄｌｘ２（Heinrich et al., 2010）、Ｂｒｎ２、ＭＹＴ１Ｌ（Vierbuchen et al. (2010)、上掲）、Ｓｏｘ１１（Liu et al., Nature communications 4, 2183 (2013)）およびＳｏｘ２（Karow et al. (2012)、上掲）、ならびに筋原性転写因子、好ましくはＭｙｏＤ（Choi et al., 1990)(Choi et al., 1990)(Choi et al., 1990)(Choi et al., 1990)(Choi et al., 1990)(Choi et al., 1990)(
Choi et al., 1990)(Choi et al., 1990)(Choi et al., 1990)(Choi et al., 1990)(Choi et al., 1990)(Choi et al., 1990)(Choi et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 87, 7988-7992 (1990)）、Ｇａｔａ４ｍ、Ｍｅｆ２ｃおよびＴｂｘ５（Ieda et al., Cell 142, 375-386 (2010)）、Ｈａｎｄ２、Ｔ−ｂｏｘ５、ミオカルディン、およびマイクロＲＮＡ  ｍｉＲ−１およびｍｉＲ−１３３（Nam et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 110, 5588-5593 (2013)）から選択される。
【００８４】
さらに好ましい実施形態では前記細胞は線維芽細胞であり、前記１つ以上の転写因子（すなわち、要素（ｉｉ））はただ１つの転写因子である。
【００８５】
線維芽細胞は先行技術の方法（典型的には多能性状態を経て進行し、典型的には転写因子の複合混合物を使用する）が用いられるとわずかな量しか分化転換細胞を産出しないが、本発明に準じて線維芽細胞を使用することができる。簡単に入手できることを考慮すると線維芽細胞には利点が有る。
【００８６】
さらに好ましい実施形態では前記転写因子は神経原性転写因子、好ましくはＡｓｃｌ１、Ｎｅｕｒｏｇ２およびＤｌｘ２から選択される神経原性転写因子であり、前記方法によってＧＡＢＡ作動性神経細胞、グルタミン酸作動性神経細胞、および運動神経細胞から選択される１つ以上の分化転換細胞が産出される。Ｎｅｕｒｏｇ２は例えば星状細胞からグルタミン酸作動性神経細胞を誘導し、Ａｓｃｌ１とＤｌｘ２は（単体で、または組み合わせて使用されると）星状細胞からＧＡＢＡ作動性神経細胞を誘導し、Ａｓｃｌ１とＮｅｕｒｏｇ２は（単体で、または組み合わせて使用されると）例えば線維芽細胞から運動神経細胞を誘導する。
【００８７】
別の好ましい実施形態では前記転写因子は筋原性転写因子、好ましくはＭｙｏＤであり、前記方法によって筋細胞が産出される。
【００８８】
前述の２つの好ましい実施形態を組み合わせてもよく、それによって本発明の方法の別の好ましい実施形態が生じる。その実施形態では前記細胞は線維芽細胞であり、前記方法は別々に実施される次のステップ、すなわち、（ａ）（ｉ）前記ポリペプチドまたは前記ポリペプチドをコードする核酸、および（ｉｉ）ただ１つの神経原性転写因子、好ましくはＡｓｃｌ１、Ｎｅｕｒｏｇ２およびＤｌｘ２から選択される神経原性転写因子、またはただ１つの筋原性転写因子、好ましくはＭｙｏＤと前記線維芽細胞を接触させるステップ、（ｂ）ステップ（ａ）において神経原性転写因子が使用された場合にはただ１つの筋原性転写因子、好ましくはＭｙｏＤと、ステップ（ａ）において筋原性転写因子が使用された場合にはただ１つの神経原性転写因子、好ましくはＡｓｃｌ１またはＮｅｕｒｏｇ２のどちらかとステップ（ａ）の結果物を前記ポリペプチドまたは前記ポリペプチドをコードする核酸の存在下で接触させるステップを含む。
【００８９】
分化転換の最中に前記細胞が多能性状態を経験しないことが特に好ましい。上で特記したように、多能性状態の回避は分化転換の固有の特徴として見られている。所望の細胞の作製中に潜在的に腫瘍原性である細胞が回避されるという点で多能性状態の回避は明白な利点をもたらす。
【００９０】
別の特に好ましい実施形態では１つ以上のベクターに前記核酸のうちの１つ、それより多く、または全てが含まれる。１つ以上の転写因子ならびに第１の態様の要素（ｉ）のポリペプチドの両方を核酸の形で提供することが特に好ましい。これらの核酸は単一のベクターに組み込まれもよく、またはそれらの核酸の各々が別々のベクターに組み込まれてもよい。単一のベクターにコード配列が含まれる複数の転写因子を提供し、本発明の第１の
態様の要素（ｉ）のポリペプチドをコードする核酸を別のベクター上に提供することも想定されていることが理解される。ＭＬＶベースレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターおよびアデノウイルスベースベクターなどの当技術分野において確立されたベクターを使用してよい。
【００９１】
第５の態様において、本発明は、機能性神経細胞の消失および／または機能性筋細胞の消失を特徴とする神経障害および／または筋障害のモデルを作製する方法であって、分化細胞の分化転換方法を含み、上で規定されたように神経原性および／または筋原性転写因子を使用し、前記神経障害および／または筋障害の素因を有する個体または前記神経障害および／または筋障害を患う患者から前記線維芽細胞を入手している前記方法を提供する。
【００９２】
この実施形態は分化転換される細胞が上で規定された障害を患っているか、またはそのような障害を発症する素因を有している個体から獲得されることを必要とする。結果として、線維芽細胞の分化転換によってそのような障害に特徴的な表現型を示す神経細胞および／または筋細胞が産出される。
【００９３】
第６の態様において、本発明は、機能性神経細胞の消失および／または機能性筋細胞の消失を特徴とする神経障害および／または筋障害を診断する方法であって、前記細胞および／または前記１つ以上の転写因子が上文のようにさらに規定される限りにおいて第１の態様に従う分化細胞の分化転換方法を含み、前記神経障害および／または筋障害を有することが疑われる個体または前記神経障害および／または筋障害の素因を有することが疑われる個体から前記分化細胞を入手しており、好ましくは前記分化細胞が線維芽細胞であり、分化転換により獲得され、且つ、疾患表現型を有する神経細胞および／または筋細胞が前記神経障害および／または筋障害を示す前記方法を提供する。
【００９４】
本発明の第１の態様の方法の高い効率を特に考慮すると、そのような診断方法は当技術分野において確立された神経障害および／または筋障害の診断方法よりも迅速および／または好適であり得る。インビトロで観察され得る疾患表現型の一例は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの患者から得られた線維芽細胞由来筋線維における異常なジストロフィン発現である。ジストロフィンタンパク質の発現はＰＣＲ、ウエスタンブロット、または免疫細胞化学アッセイなどの標準的方法によって分析され得る。
【００９５】
第７の態様において、本発明は、分化転換細胞を含む組成物を作製する方法であって、上で開示された分化細胞の分化転換方法を含む前記方法を提供する。
【００９６】
好ましい実施形態では分化転換細胞の濃縮も精製も実施されない。この好ましい実施形態は、本発明に従う方法を適用すると特に高い程度の分化転換ならびに実に優れた純度の分化転換細胞が得られるという本発明者らの驚くべき観察結果を考慮している。
【００９７】
第９の態様において、本発明は、分化転換の促進因子としての本発明に準じて規定されるポリペプチドまたは前記ポリペプチドをコードする核酸の使用であって、ヒトまたは動物の治療処置方法におけるあらゆる使用が除外される前記使用を提供する。
【００９８】
本発明の第２の態様に準ずる配合物の好ましい実施形態では前記配合物はキットとして提供され、前記配合物の要素（ｉ）および（ｉｉ）が異なる容器に収められており、前記キットは本発明の第１の態様の方法を実施するための指示を有するマニュアルを含んでもよい。１つより多くの転写因子が使用される限り、各転写因子（または所与の転写因子をコードする核酸を担持するベクター）を別々の容器の中に提供してよい。
【００９９】
この明細書において特徴づけられる実施形態、特に特許請求の範囲において特徴づけられる実施形態について、従属請求項で述べられる各実施形態は前記従属請求項が従属する各（独立または従属）請求項の各実施形態と組み合わされることが考えられている。例えば、３つの選択肢Ａ、ＢおよびＣを記載する独立請求項１、３つの選択肢Ｄ、ＥおよびＦを記載する従属請求項２、ならびに請求項１および２に従属し、且つ、３つの選択肢Ｇ、ＨおよびＩを記載する請求項３の場合では、別途具体的に述べられない限り、組合せＡ、Ｄ、Ｇ；Ａ、Ｄ、Ｈ；Ａ、Ｄ、Ｉ；Ａ、Ｅ、Ｇ；Ａ、Ｅ、Ｈ；Ａ、Ｅ、Ｉ；Ａ、Ｆ、Ｇ；Ａ、Ｆ、Ｈ；Ａ、Ｆ、Ｉ；Ｂ、Ｄ、Ｇ；Ｂ、Ｄ、Ｈ；Ｂ、Ｄ、Ｉ；Ｂ、Ｅ、Ｇ；Ｂ、Ｅ、Ｈ；Ｂ、Ｅ、Ｉ；Ｂ、Ｆ、Ｇ；Ｂ、Ｆ、Ｈ；Ｂ、Ｆ、Ｉ；Ｃ、Ｄ、Ｇ；Ｃ、Ｄ、Ｈ；Ｃ、Ｄ、Ｉ；Ｃ、Ｅ、Ｇ；Ｃ、Ｅ、Ｈ；Ｃ、Ｅ、Ｉ；Ｃ、Ｆ、Ｇ；Ｃ、Ｆ、Ｈ；Ｃ、Ｆ、Ｉに対応する実施形態をその明細書が明確に開示していると理解されるべきである。
【０１００】
同様に、且つ、独立請求項および／または従属請求項が選択肢を記載しない場合でも、従属請求項が複数の先行請求項を参照する場合にはそれによって包含される内容のあらゆる組合せが明白に開示されると考えられていることが理解される。例えば、独立請求項１、請求項１を参照する従属請求項２、および請求項２および１の両方を参照する従属請求項３の場合では請求項３、２および１の内容の組合せが明白および明確に開示されているように請求項３および１の内容の組合せが明白および明確に開示されていることになる。請求項１から３のいずれか１つを参照する追加の従属請求項４が存在する場合では請求項４および１の内容の組合せ、請求項４、２および１の内容の組合せ、請求項４、３および１の内容の組合せ、ならびに請求項４、３、２および１の内容の組合せが明白および明確に開示されていることになる。
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１Ａ】図１は、星状細胞から神経細胞へのリプログラミングに対するＢｃｌ−２の効果のタイムラプス分析を示す。（Ａ）Ａｓｃｌ１／ＲＦＰコードベクター単体（左のパネル）で、またはＢｃｌ−２コードベクター（右のパネルおよび挿入図）と組み合わせて形質移入された星状グリア細胞培養物の落射蛍光像であって、βＩＩＩチューブリンに対する免疫反応性が試験された（下のパネル）落射蛍光像。
【図１Ｂ】（Ｂ）様々な時点の（Ａ）に示される形質移入細胞の分析。
【図１Ｃ】（Ｃ）Ａｓｃｌ１／ＲＦＰコードプラスミド単体（左列）で、またはＢｃｌ−２コードベクターと組み合わせて（右列）形質移入された培養物中の様々な時点での星状グリア細胞（白の矢印）、神経細胞（黒の矢印）および死細胞（矢頭）を示すビデオタイムラプスムービーの静止画像例。Ｂｃｌ−２発現によって神経細胞の数が増加することに留意されたい。
【図１Ｄ】（Ｄ）（Ｃ）における例から追跡された単一細胞のプロジェニーツリーであって、リプログラミング中の低細胞増殖、Ｂｃｌ−２発現細胞における減少した細胞死（「ｘ」で示される）およびより速く増加した神経細胞への転換（黒線）を示すプロジェニーツリー。
【図１Ｅ】（Ｅ）１５０時間の観察中に増殖した細胞の割合のヒストグラム。Ｂｃｌ−２によってこの比率が影響を受けないことに留意されたい。
【図１Ｆ】（Ｆ）Ａｓｃｌ１／ＲＦＰだけを、またはそれをＢｃｌ−２と共に発現する星状グリア細胞から新規に分化転換した神経細胞のヒストグラム定量。
【図１Ｇ】（Ｇ）Ａｓｃｌ１／ＲＦＰだけを、またはそれをＢｃｌ−２と共に発現する星状グリア細胞における細胞死の定量。
【図１Ｈ】（Ｈ）観察期間中に死ぬ星状グリア細胞由来神経細胞のヒストグラム。
【図１Ｉ】（Ｉ）Ａｓｃｌ／ＲＦＰ単独形質移入細胞またはＡｓｃｌ／ＲＦＰ＋Ｂｃｌ−２形質移入細胞の観察期間中の神経細胞転換および細胞生存の分析。神経細胞のパーセンテージは様々な時点で形質移入細胞の初期数に対して正規化されている。
【図１Ｊ】（Ｊ）Ａｓｃｌ１介在性星状細胞神経細胞間分化転換におけるＢｃｌ−２の作用の時間分布。大半の神経細胞が観察期間の最初の半分の間に現れることに留意されたい。  エラーバーは±ＳＤを表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、ｐ≧０．０５は統計学的有意差無し（ｎ．ｓ．）；Ｅ、Ｆ、Ｇ、ＨおよびＪではマン・ホイットニー検定；ＩではＡＮＯＶＡテューキー・ポスト検定。スケールバーは４０μｍ。
【図２Ａ】図２は、神経リプログラミングに対するＢｃｌ−２の効果はＢＡＸとの相互作用と無関係であることを示す。（Ａ）これまでに説明されたＢｃｌ−２と幾つかの分子パートナーの相互作用を示す漫画。ＢＡＸが介在するアポトーシスは、Ｂｃｌ−２の可動性ループドメインが位置Ｓ７０、位置Ｔ６９または位置Ｓ８４（最後の位置はヒトＢＣＬ−２のＳ８７である）のうちのいずれか１つにおいてリン酸化されると生じるＢｃｌ−２との相互作用によって妨げられる。非リン酸化Ｂｃｌ−２は優先的にｐ５３に結合し、且つ、ＢＡＸが介在するアポトーシスを妨げる能力の低下を示す（Deng et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 101, 153-158 (2004)）。Ａ−Ｂｃｌ−２突然変異体およびＥＥ−Ｂｃｌ−２突然変異体はそれぞれＢｃｌ−２のリン酸化形状と非リン酸化形状を模倣する。
【図２Ｂ】（Ｂ）Ａｓｃｌ１／ＲＦＰコードプラスミド（左のパネル）単体（）で、またはＢｃｌ−２、ＥＥ−Ｂｃｌ−２もしくはＡ−Ｂｃｌ−２と組み合わせて形質移入された星状グリア細胞培養物の形質移入後４日目の顕微鏡写真。βＩＩＩチューブリン免疫染色によって神経細胞転換を分析した（右のパネル）。
【図２Ｃ】（Ｃ）Ａｓｃｌ１−ＲＦＰコードプラスミド単体で、またはＷＴ−Ｂｃｌ−２、ＥＥ−Ｂｃｌ−２もしくはＡ−Ｂｃｌ−２と組み合わせて形質移入された星状グリア細胞培養物の形質移入後（ＤＰＴ）４日目のヒストグラム。最終時点（４ＤＰＴ）での形質移入細胞（ＲＦＰ＋）の数を形質移入細胞の初期数（１ＤＰＴ）に対して正規化して生存率（％）を計算した。神経細胞転換率（％）をβＩＩＩチューブリン免疫染色により分析し、その実験の最後でのＲＦＰ＋細胞の総数に対して正規化した。エラーバーは±ＳＤを表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１；ＡＮＯＶＡテューキー・ポスト検定。スケールバーは５０μｍ。
【図３Ａ】図３は、アポトーシスの減少ではなくＢｃｌ−２が介在する酸化ストレス／フェロトーシスの減少によって神経細胞転換の効率が上昇することを示す。Ａ，  Ａｓｃｌ１−ＲＦＰで形質移入された星状グリア細胞の生存／転換効率におけるフェロトーシスの阻害剤であるα−ｔｏｃとアポトーシスの阻害剤であるＺＶＡＤの効果を示す５ＤＰＴ（形質移入後日数）での定量。α−ｔｏｃと反対にＺＶＡＤは生存だけを改善し、転換効率を改善しないことに留意されたい。
【図３Ｂ】Ｂ，  Ａの例を示す顕微鏡写真。
【図３Ｃ】Ｃ，  Ａｓｃｌ１−ＲＦＰ単体で、またはＥＥ−Ｂｃｌ−２もしくはＡ−Ｂｃｌ−２と組み合わせて形質移入された星状グリア細胞における２ＤＰＴでの酸化脂質（Ｃ１１−Ｂｏｄｉｐｙ染色）が顕微鏡写真によって示されている。Ａｓｃｌ１＋Ａ−Ｂｃｌ−２で共形質移入された細胞（黒の矢頭）と比較してＡｓｃｌ１単独またはＡｓｃｌ１＋ＥＥ−ＢＣｌ−２（黒の矢印）で形質移入された細胞において高いレベルの酸化に留意されたい。Ａｓｃｌ１＋ＥＥ−Ｂｃｌ−２で共形質移入された細胞と反対にＡｓｃｌ１発現細胞におけるＣ１１−Ｂｏｄｉｐｙ染色とＤＡＰＩの部分的共局在が高倍率の写真によって示されている（矢印を参照されたい）。
【図３Ｄ】Ｄ，  Ｃにおいて示されているのと同じ細胞のグルタチオン（ＧＳＨ）検出が写真によって示されている。正常レベルまたは上昇したレベルのＧＳＨを有する細胞がそれぞれ矢頭と矢印によって示されている。ＧＳＨ染色はＡｓｃｌ１−ＲＦＰとＥＥ−Ｂｃｌ−２で共形質移入された細胞の主に核内（ＤＡＰＩを参照されたい）にあることが高倍率の写真によって示されている。  ＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、ｐ≧０．０５；ＡではＡＮＯＶＡテューキーのポスト・ホク検定。スケールバーは４０μｍ。
【図４Ａ】図４は、Ｂｃｌ−２およびＡ−Ｂｃｌ−２がＭＥＦの運動神経細胞へのＡｓｃｌ１介在性転換を改善することを示す。（Ａ）レトロウイルスＲＶ−ｆｌａｇ／ｍｙｃ−Ａｓｃｌ１−ＩＲＥＳ−Ｂｃｌ−２に感染したＭＥＦの共焦点顕微鏡写真であって、感染から１５日後の形質導入集団の中で高い割合のβＩＩＩチューブリン免疫反応性神経細胞を示す共焦点顕微鏡写真。
【図４Ｂ】（Ｂ）表示通りに名づけられたレトロウイルスＲＶ−ｆｌａｇ／ｍｙｃ−Ａｓｃｌ１−ＩＲＥＳ−Ａ−Ｂｃｌ−２による感染から１５日後のＭＥＦの共焦点画像。
【図４Ｃ】（Ｃ）感染細胞中の神経細胞のパーセンテージのヒストグラム。ＭＥＦの神経細胞へのＡｓｃｌ１介在性分化転換の誘導にとってＡ−Ｂｃｌ−２が最適であることに留意されたい。
【図４Ｄ】（Ｄ）神経突起中にペリフェリン（右のパネル）とβＩＩＩチューブリン（左のパネル）を共発現するＡｓｃｌ１／Ｂｃｌ−２で形質導入されたＭＥＦの顕微鏡写真。
【図４Ｅ】（Ｅ）複雑な形態を示し、且つ、βＩＩＩチューブリンとペリフェリンを共発現するＡｓｃｌ１／Ｂｃｌ−２で２０日間にわたって形質導入されたＭＥＦであって、高密度のシナプトブレビン（ＳＶ）陽性斑点を有するＭＥＦの顕微鏡写真。
【図４Ｆ】（Ｆ）Ａｓｃｌ１／Ｂｃｌ−２で１５日間にわたって形質導入されたＭＥＦに由来する神経細胞であって、ＨＢ９（ａ）、ＦｏｘＰ１（ｄ）、ペリフェリン（ｃ、ｆ）、βＩＩＩチューブリン（ｂ、ｅ）について陽性の神経細胞の顕微鏡写真。
【図４Ｇ】（Ｇ）Ａｓｃｌ１／ＲＦＰおよびＡ−Ｂｃｌ−２／ＧＦＰを発現するレトロウイルスに共感染したＭＥＦ（上のパネル）は感染から１５日後にＣｈＡＴ（下のパネル）について免疫反応性である。  エラーバーは±ＳＤを表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１；ＡＮＯＶＡテューキー・ポスト検定。スケールバーはＡ、Ｂでは３０μｍ、Ｄでは２０μｍ、Ｅでは２５μｍ、Ｆでは４０μｍ、Ｇでは３０μｍ。
【図５Ａ】図５は、ＭＥＦの運動神経細胞への、および星状細胞のグルタミン酸作動性神経細胞へのＮｅｕｒｏｇ２介在性リプログラミングがＡ−Ｂｃｌ−２によって増進することを示す。（Ａ）ＲＶ−ｆｌａｇ−Ｎｅｕｒｏｇ２−ＩＲＥＳ−ＡＢｃｌ−２の感染から１５日後のβＩＩＩチューブリンについて免疫染色されたＭＥＦの共焦点写真。
【図５Ｂ】（Ｂ）ＡおよびＣ〜Ｅにおいて例示される感染から１５日後の全てのｆｌａｇ＋細胞の中の（βＩＩＩチューブリンについて免疫反応性である）神経細胞の割合を示すヒストグラム。
【図５Ｃ】（Ｃ〜Ｅ）ＨＢ９免疫陽性（挿入図の中の核を参照されたい）運動神経細胞にリプログラムされた高倍率のＮｅｕｒｏｇ２−Ａ−Ｂｃｌ−２感染ＭＥＦを示す顕微鏡写真（Ｃ）、βＩＩＩチューブリンおよびペリフェリンについて免疫反応性である長い突起（右の挿入図）を有するＦｌａｇ免疫陽性（左の挿入図）Ｎｅｕｒｏｇ２−Ａ−Ｂｃｌ−２形質導入神経細胞（Ｄ）、およびコリンアセチルトランスフェラーゼ（右のパネル）について免疫反応性であるＮｅｕｒｏｇ２／ＲＦＰおよびＡ−Ｂｃｌ−２／ＧＦＰ（矢印によって示される）に共感染した細胞。
【図５Ｄ】（Ｃ〜Ｅ）ＨＢ９免疫陽性（挿入図の中の核を参照されたい）運動神経細胞にリプログラムされた高倍率のＮｅｕｒｏｇ２−Ａ−Ｂｃｌ−２感染ＭＥＦを示す顕微鏡写真（Ｃ）、βＩＩＩチューブリンおよびペリフェリンについて免疫反応性である長い突起（右の挿入図）を有するＦｌａｇ免疫陽性（左の挿入図）Ｎｅｕｒｏｇ２−Ａ−Ｂｃｌ−２形質導入神経細胞（Ｄ）、およびコリンアセチルトランスフェラーゼ（右のパネル）について免疫反応性であるＮｅｕｒｏｇ２／ＲＦＰおよびＡ−Ｂｃｌ−２／ＧＦＰ（矢印によって示される）に共感染した細胞。
【図５Ｅ】（Ｃ〜Ｅ）ＨＢ９免疫陽性（挿入図の中の核を参照されたい）運動神経細胞にリプログラムされた高倍率のＮｅｕｒｏｇ２−Ａ−Ｂｃｌ−２感染ＭＥＦを示す顕微鏡写真（Ｃ）、βＩＩＩチューブリンおよびペリフェリンについて免疫反応性である長い突起（右の挿入図）を有するＦｌａｇ免疫陽性（左の挿入図）Ｎｅｕｒｏｇ２−Ａ−Ｂｃｌ−２形質導入神経細胞（Ｄ）、およびコリンアセチルトランスフェラーゼ（右のパネル）について免疫反応性であるＮｅｕｒｏｇ２／ＲＦＰおよびＡ−Ｂｃｌ−２／ＧＦＰ（矢印によって示される）に共感染した細胞。
【図５Ｆ】（Ｆ）Ｎｅｕｒｏｇ２＋Ａ−Ｂｃｌ−２によって誘導された星状細胞由来神経細胞がグルタミン酸作動性表現型を表すｖＧｌｕＴ１陽性斑点によって覆われていることを示すＤｓＲｅｄ（左のパネル）、ＧＦＰ（中央のパネル）、およびｖＧｌｕＴ１（右のパネルおよび挿入図）の三重免疫染色。  エラーバーは±ＳＤを表す。＊ｐ＜０．０５；マン・ホイットニー検定。スケールバーはＡとＦでは４０μｍ、Ｃでは１５μｍ、ＤとＥでは２０μｍ。
【図６Ａ】図６は、神経細胞転換におけるビタミンＤの役割を示す。Ａ，  Ａｓｃｌ１コードベクター単体またはＡｓｃｌ１＋Ａ−Ｂｃｌ−２に感染した培養物における５ＤＰＩでのＶｄｒを発現する細胞のパーセンテージ。Ｖｄｒの存在は免疫染色によって決定された（Ｂ）。神経リプログラミング時に内在性Ｖｄｒを発現する細胞の割合がＢｃｌ−２によって上昇することに留意されたい。
【図６Ｂ】Ｂ，  Ａｓｃｌ１−ＲＦＰ単体（左のパネル）で、またはＡ−Ｂｃｌ−２（右のパネル）と組み合わせて共形質移入された培養物における二重ＲＦＰ＋／Ｖｄｒ＋細胞（矢印）の割合と一重ＲＦＰ＋／Ｖｄｒ−細胞（矢頭）の割合を示すＡの実験の例。
【図６Ｃ】Ｃ，  Ａｓｃｌ１コードプラスミド単体で、またはＢｃｌ−２および／またはＶｄｒと組み合わせて形質移入された星状グリア細胞における５ＤＰＴでカルシトリオールによる処理から４日後の、または未処理での神経細胞のパーセンテージ。
【図６Ｄ】Ｄ，  Ｃにおいて示されている実験の例。
【図６Ｅ】Ｅ，  組合せＡｓｃｌ１／Ｂｃｌ−２／Ｖｄｒによって成体ヒト由来線維芽細胞（４７歳の患者）から得られた６０ＤＰＩでの神経細胞を示す共焦点写真。形質導入細胞が非常に長い突起を伸ばしていることに留意されたい。βＩＩＩチューブリン発現が高倍率（下の小さいパネル）によってさらに詳細に示されている。  ＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１；Ａではｔ検定；ＣではＡＮＯＶＡテューキーのポスト・ホク検定。スケールバーは４０μｍ。
【図７Ａ】図７は、Ｎｅｕｒｏｇ２、Ｂｃｌ−２およびカルシトリオールを用いる反応性グリア細胞の神経細胞へのインビボ転換を示す。Ａ，  刺傷形成と後続のレトロウイルスベクター（Ｎｅｕｒｏｇ２／ＲＦＰおよびＢｃｌ−２／ＧＦＰ）の感染、またはカルシトリオールによる処理についての実験プロトコルであって、感染後（ＤＰＩ）１０日目または２０日目に分析される実験プロトコル。
【図７Ｂ】Ｂ，  両方のベクターに共感染した細胞が１０ＤＰＩでの注入部位の共焦点写真によって示されている。白の四角（＊；＊＊）は高倍率の単一の光学的断面を示している。矢頭はＮｅｕＮ＋（右；白）共感染細胞を示している。
【図７Ｃ】Ｃ，  カルシトリオールによる処理後の注入部位（１０ＤＰＩ）の共焦点写真。白の四角（＊；＊＊；＊＊＊）は高倍率の単一の光学的断面を示している。矢頭は二重感染細胞のＮｅｕＮ＋核を示している。ＮｅｕＮを発現するＮｅｕｒｏｇ２含有ウイルスだけに感染した細胞（ＲＦＰ＋、矢頭）も示されている（＊＊＊）。
【図７Ｄ】Ｄ，  カルシトリオールが無いとき、または有るときの１０ＤＰＩでのＮｅｕＮ＋であるＲＦＰ＋細胞およびＲＦＰ＋／ＧＦＰ＋細胞の定量。各条件（すなわち、カルシトリオールの有無）について最低３匹の動物を分析した。
【図７Ｅ】Ｅ，  カルシトリオールを投与した、または投与していない２０ＤＰＩでの共感染細胞の例。細胞体およびＮｅｕＮ＋核（矢印）の単一の光学的断面が高倍率のボックス（＊、左のパネル）によって示されている。右では、白のボックス（＊；＊＊）はとげ様構造を有する高倍率の２本の突起（矢頭）を示している。  ＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１；ＤではＡＮＯＶＡテューキーのポスト・ホク検定。スケールバーは２０μｍ。
【図８】図８は、ＭＥＦ由来のリプログラムされた筋細胞を神経支配するリプログラムされた運動神経細胞の共培養物を示す。（Ａ）レトロウイルスベクターＲＶ−ｍｙｃ−ＭｙｏＤ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ（左のパネル）およびＲＶ−ｍｙｃ−ＭｙｏＤ−ＩＲＥＳ−Ａ−Ｂｃｌ−２（右のパネル）で形質導入されたＭＥＦの生未染色画像であって、感染から５日後にＡ−Ｂｃｌ−２発現筋細胞のチューブ状形態の増加を示している画像。下のパネルは固定された培養物中のＧＦＰ／ｍｙｃについて免疫染色され、さらにファロイジンで染色された形質導入細胞の形態を示している。（Ｂ）感染から１０日後のＭｙｏＤ発現対照（左のパネル）と対照的にＭｙｏＤとＡ−Ｂｃｌ−２を共発現する筋細胞（右のパネル）の筋節の組織的構造を示している高倍率共焦点画像。下のパネルのボックスで囲まれた拡大領域を参照されたい。（Ｃ）、（Ｄ）および（Ｅ）ＭｙｏＤ形質導入細胞およびＭｙｏＤ／Ａ−Ｂｃｌ−２形質導入細胞における筋細胞パラメーターを示すヒストグラム。Ａ−Ｂｃｌ−２は５ＤＰＩにおいてＭＥＦ由来筋細胞の多核細胞の割合（Ｃ）を増やし、筋管の長さ（Ｄ）を増やし、収縮能（Ｅ）を促進することに留意されたい。（Ｆ）顕微鏡写真。ニューロフィラメント陽性神経細胞（ＮＦ；周辺の灰色の細胞）に囲まれているファロイジンについて染色された２つの筋肉細胞（中央の色が濃い細胞）が免疫細胞化学によって示されている（中央のパネル）。白色のコーナーは明視野画像（左のパネル）と免疫染色画像の中の同じ領域を示している。ボックスで囲まれた領域ａとｂはそれぞれパネルａ〜ａ’’およびｂ〜ｂ’’で拡大されており、ブンガロトキシン（ＢＴＸ）の染色によって証明される神経細胞（ＮＦ陽性）と筋肉（組織化された筋節が矢印によって示される）との間の連結性を示している。エラーバーは±ＳＤを表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１；マン・ホイットニー検定。スケールバーはＡでは３０μｍ、ＢおよびＦでは１０μｍ。
【図９】図９は、ダイレクトリプログラミングにおけるＢｃｌ−２の作用を要約する模式図である。文書中に詳細に説明されるように、Ｂｃｌ−２の発現およびＶｄｒなどの抗酸化ストレス応答に関与する他の分子経路が神経細胞転換効率を上昇させる。全体的には、これらの経路は神経リプログラミングにおける決定的チェックポイントを上手に切り抜け、神経細胞代謝への移行を促進し、且つ、神経細胞分化転換に関連するフェロトーシスを減少させるのに役立つ。同様の経路が体細胞の筋細胞へのリプログラミングを改善することが期待される。
【０１０２】
実施例によって本発明が例示される。
【実施例１】
【０１０３】
星状細胞からのダイレクト神経リプログラミングの連続的単一細胞ライブイメージングにより、細胞増殖ではなく細胞死の重要な役割が明らかにされる
神経リプログラミングの細胞機構を特定するため、細胞増殖と核膜の崩壊を遺伝子導入の成功のために必要とするＭＬＶベースレトロウイルスベクターのようなアプローチによって形質導入された細胞に加え、出生後５〜７日目のマウス大脳皮質から単離した星状グリア細胞にＡｓｃｌ１コードベクターを形質移入することにより非増殖細胞を標的とした。我々の形質移入プロトコル（Heinrich et al., PLoS biology 8, e1000373 (2010)、 Heinrich et al., Nature protocols 6, 214-228 (2011)）により、形質移入から２４時間後に赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）によって標識された細胞がリプログラミングの主要段階の間（すなわち、６日間）に連続的ライブイメージングの対象となることができる。グリア細胞および神経細胞をそれらの形態によって特定した。前者は平坦な星状細胞様形態を示し、後者は丸い細胞体とその細胞体よりも少なくとも３倍長い細い突起（単極性、双極性、および多極性）を有する。この形態ベースの分類は撮像後の免疫染色（図１Ａ）によって確認された。Ａｓｃｌ１で形質導入された細胞のうち、１５０時間の観察中に分裂した細胞は少なかった（１５％：図１Ｅ）。したがって、この系ではダイレクト神経リプログラミングの大多数は細胞増殖が無い状態で起こる。
【０１０４】
逆に、多数の形質導入細胞が最初の１００時間以内に死に、神経の形態を獲得していない事実上全ての形質移入グリア細胞が観察期間中のある時点で細胞死を起こした（９４±２．４％；図１Ｇ）。このことはＡｓｃｌ１の高い発現レベルが少なくともこれらの培養条件下では星状細胞の生存と相容れないことを示している。興味深いことに、転換した神経細胞の約半分だけが死んだ（約４８．６％±１０．２：図１Ｈ）。このことはリプログ
ラミング時の細胞致死が５０〜１００時間の決定的ウィンドウ、すなわち、運命転換時にほぼ限られており、運命コンフリクトが神経アイデンティティーにとって有利となるように解消されると細胞致死が著しく低下することを表している。よって、生存細胞の大半が神経細胞へのリプログラミングに成功したことが分かった。しかしながら、これは形質移入星状細胞の初期数のたった１２％程度である（図１Ｆ、Ｉ、Ｊ）。まとめると、ダイレクトリプログラミングというこのパラダイムでは選択的細胞増殖が果たす役割はほとんどなく、細胞死が主要な決定因子であり、細胞死は撮像中の５０〜１００時間の間に起こる形態学的に目に見える運命転換ステージにピークを迎える（図１Ｊ）。
【実施例２】
【０１０５】
Ｂｃｌ−２は星状細胞から神経細胞への転換を強力に改善する
我々は出生後マウス星状細胞にＢｃｌ−２をＡｓｃｌ１／ＲＦＰと共に共形質移入し、６日後と１２日後の形質移入集団の中の全細胞数と神経細胞数を計数した（図１Ａ、Ｂ）。Ｂｃｌ−２は明らかに生存細胞の総数とリプログラムされた神経細胞の総数を増加させた（図１Ａ、Ｂ）。我々はＡｓｃｌ１単独またはＡｓｃｌ１とＢｃｌ−２で形質導入された星状細胞の１５０時間のリプログラミング中に連続単一細胞イメージングを行った。予想通り、Ｂｃｌ−２の共形質導入は神経細胞転換時に細胞の生存を頑強に高めたが（図１Ｃ〜Ｄ）、様々な細胞種の特異的生存率を変化させることはなかった（図１Ｇ、Ｈ）。最も顕著なことに、Ｂｃｌ−２の過剰発現にもかかわらず、運命を変えることができず、且つ、グリア細胞の形態を保持する細胞の大多数がそれでも死んだ（図１Ｇ）。
【０１０６】
非転換細胞と対照的に、神経の形態の獲得に成功した細胞については細胞死の割合はかなり低く、これらの細胞のうちの約１／３だけが死んだ（図１Ｈ）。したがって、神経細胞へのリプログラミング過程を完了することができた細胞の割合がＢｃｌ−２によってトラッキングの５０時間の時点でほぼ８倍に増加し（図１Ｆ、Ｉ）、トラッキング期間の最終時点では３倍を超えて増加した（図１Ｆ、ＩおよびＪ）。転換に成功した細胞は残っているグリア細胞（１０％）と比較して高率で（２／３）生存するので、Ｂｃｌ−２の過剰発現によって細胞生存の全体的な増加が生じた（図１Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｉ、Ｊ）。トラッキング期間の初期段階（最初の５０〜７５時間）における神経細胞の著しい増加（図１Ｉ、Ｊ）によって示されるようにＢｃｌ−２は星状細胞から神経細胞への転換も促進した。Ｂｃｌ−２はリプログラミング時に細胞増殖速度に影響しなかったので（図１Ｅ）、Ｂｃｌ−２の増強作用は細胞が神経細胞へより短時間でより効率的に転換し、結果としてこれらの細胞の生存が増加することに起因するようである。
【実施例３】
【０１０７】
アポトーシス促進性因子Ｂａｘとの相互作用に欠陥があるＢｃｌ−２の突然変異体は星状細胞およびＭＥＦの神経細胞転換を増進する
Ｂｃｌ−２が位置Ｔ６９、位置Ｓ７０および／または位置Ｓ８７においてリン酸化され、且つ、その立体構造を変えてホスホ−Ｂｃｌ−２（Ｐ−Ｂｃｌ−２）がＢａｘに結合し、それを隔離する（図２Ａ）と、Ｂｃｌ−２がその生存作用を働かせる（Deng et al., (2006))、 Deng et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 101, 153-158 (2004))。Ｂａｘはミトコンドリア膜と相互作用し、チトクロームＣの放出を誘導することでカスパーゼ介在性アポトーシスを活性化するので（Jurgensmeier et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 95, 4997-5002 (1998)）、Ｐ−Ｂｃｌ−２の結合によってカスパーゼカスケードのＢａｘ介在性活性化が妨げられる（図２Ａ）。Ｂａｘとの相互作用を特異的に低下させるため、我々は低下したＢａｘとの相互作用能を有し、且つ、非リン酸化型のＢｃｌ−２を模倣するＳ７０Ａ組換えＢｃｌ−２（Ａ−Ｂｃｌ−２と名付ける；図２Ａ）（Deng et al. (2004)）を使用した。我々は、グルタミン酸によるＴ６９残基とＳ７０残基の両方の置換により増加したＢａｘ相互作用および生存促進機能を有する構成
的リン酸化型のＢｃｌ−２を模倣する型のＢｃｌ−２（本明細書でＥＥ−Ｂｃｌ−２と名付けられるＴ６９Ｅ＋Ｓ７０Ｅ；図２Ａ； Deng et al., 2004）も相補的なアプローチとして使用した。ＷＴ−Ｂｃｌ−２、ＥＥ−Ｂｃｌ−２またはＡ−Ｂｃｌ−２をＡｓｃｌ１−ＲＦＰと共形質移入し、４日後に細胞数を評価すると、予想通りリプログラミング時の細胞生存がＥＥ−Ｂｃｌ−２によって強力に増加した（図２Ｃ）。しかしながら、特にＷＴ−Ｂｃｌ−２とは反対にＥＥ−Ｂｃｌ−２はＡｓｃｌ１介在性神経細胞転換の割合を著しく上昇させることができなかった（図２Ｂ、Ｄ）。これはＢｃｌ−２の調節性ドメインのリン酸化が介在する生存促進作用の増大が神経リプログラミングを増進するＢｃｌ−２の能力を妨げることを表している。さらに興味深いことに、我々がＡｓｃｌ１−ＲＦＰおよびＢａｘとの低下した相互作用を示す構成的非リン酸化型Ａ−Ｂｃｌ−２をコードするプラスミドで共形質移入された培養物を分析したとき、それらの細胞はＷＴ−Ｂｃｌ−２−またはＥＥ−Ｂｃｌ−２をコードするプラスミドで形質移入された細胞と比較して低下した生存を示すが（図２Ｃ）、形質移入星状細胞から誘導された神経細胞の割合の上昇を示す（図２Ｂ、Ｄ）ことを我々は発見した。したがって、Ｂｃｌ−２は明らかにその非リン酸化型で、且つ、Ｂａｘとの相互作用およびその生存促進機能と無関係にリプログラミングに対してその作用を媒介する。また、Ｂｃｌ−２は神経リプログラミングにおいて生存とは無関係の新しい役割を媒介する。
【実施例４】
【０１０８】
Ｂｃｌ−２は酸化ストレスの減少を介して神経細胞転換を誘導する
α−トコフェロール（α−ｔｏｃ；ビタミンＥ）のような幾つかの小分子はグルタチオンペルオキシダーゼ経路における連鎖的脂質過酸化反応によって誘導される酸化からの防御を提供し（Palamanda and Kehrer, 1993）、このことがフェロトーシスとして知られる特定の種類の細胞死に関連する（Dixon et al., 2014; Friedmann Angeli et al., 2014;
Palamanda and Kehrer, 1993）。我々は図３Ａ、Ｂにおいてα−トコフェロールによって細胞死が減少し、リプログラミング効率が上昇することを示している。このことはリプログラミング時の代謝ストレスがリプログラミング効率の低下の原因となることを示しており、且つ、初めてフェロトーシスをリプログラミング過程に関係があるものとしている。
【０１０９】
したがって、ＺＶＡＤ（図３Ａ、Ｂ）またはＥＥ−Ｂｃｌ−２（図２）はアポトーシスを消失させ、且つ、細胞死のパーセンテージを（１００％に及ばないが）著しく低下させるがこれらの細胞の大半はなお星状細胞であり、且つ、リプログラミング「チェックポイント」の克服に成功しなかった。ＥＥ−Ｂｃｌ−２およびＺＶＡＤはこのステップの克服に役立たないので、生き残ったそれらの余分な細胞はそれ以上リプログラミングに参加することはない。したがって、我々がその救出集団からの人工神経細胞の増加を見ることはない。
【０１１０】
なぜＥＥ−Ｂｃｌ−２は神経リプログラミングにおける作用を有さず、一方でＡ−Ｂｃｌ−２は有しているのかという疑問がこれらの観察から生じる。この理由のため、我々はＥＥ−Ｂｃｌ−２およびＡ−Ｂｃｌ−２が酸化ストレスによって誘導される脂質過酸化の細胞内蓄積に対して異なる効果を示すか調査した。図３Ｃ（Ｃ１１−Ｂｏｄｉｐｙによる染色）（Drummen et al., 2002）中のデータはＥＥ−Ｂｃｌ−２とは反対にＡ−Ｂｃｌ−２は非常に効率的に酸化ストレスを減少していることを示している。興味深いことに我々はＥＥ−Ｂｃｌ−２が核へのグルタチオン輸送を強力に誘導する（図３Ｄ）ことも観察した。この作用はこの突然変異体ではそれまで決して観察されなかった。グルタチオンは細胞を脂質過酸化およびフェロトーシスから保護するために必要であるので（Dixon and Stockwell, 2014）、この結果によってなぜＥＥ−Ｂｃｌ−２が代謝性ＲＯＳを効率的に減少させず、したがって神経リプログラミングの増進に失敗するのかを説明することができる。したがって、我々はダイレクト神経リプログラミングにおいてＡ−Ｂｃｌ−２が最も
強力であり、一方でＥＥ−Ｂｃｌ−２がこれを行うことができないことになる機序、すなわち、ＲＯＳの減少化を特定した。
【実施例５】
【０１１１】
線維芽細胞に由来するＡｓｃｌ１／Ａ−Ｂｃｌ−２およびＮｅｕｒｏｇ２／Ａ−Ｂｃｌ−２誘導型神経細胞は運動神経細胞の表現型を示す
上記の実験の全てが出生後星状細胞で実施されたので、我々は次に神経リプログラミングの他のモデルでもＢａｘ非依存的なリプログラミングに対するＢｃｌ−２の同じ効果が観察され得るかを問うた。線維芽細胞は形質移入するのがそれほど簡単ではないので、我々はＦｌａｇタグ化Ａｓｃｌ１とＷＴ−Ｂｃｌ−２またはＡ−Ｂｃｌ−２をコードするレトロウイルスベクター（それぞれＲＶ−ＣＡＧ−Ａｓｃｌ１−ＩＲＥＳ−ＷＴ−Ｂｃｌ−２およびＲＶ−ＣＡＧ−Ａｓｃｌ１−ＩＲＥＳ−Ａ−Ｂｃｌ−２と呼ぶ）を作製した。マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）を上で記載されたように感染させ、１４日後に神経細胞転換をβＩＩＩチューブリン免疫染色によって分析した。図４Ａに示されるように、ＷＴ−Ｂｃｌ−２はＭＥＦにおける神経細胞転換をＡｓｃｌ１／ＲＦＰが介在する２２．３％（±２．４）からＡｓｃｌ１／ＷＴ−Ｂｃｌ−２が介在する４２．８％（±８．１）まで２倍にした（図４Ａ、Ｃ）。星状細胞リプログラミングによって得られた結果と一致して、線維芽細胞から神経細胞へのリプログラミングの効率もＡ−Ｂｃｌ−２によってなおさらに高めることができた（＞７５％、図４Ｂ、Ｃ）。この効率はＷＴ−Ｂｃｌ−２の効率を超えているので、これらの結果はミトコンドリア膜においてＢａｘと相互作用するＷＴ−Ｂｃｌ−２の割合がリプログラミングに必要な他のパートナーとＢｃｌ−２の相互作用に利用できない可能性があることを示唆している。Ｂｃｌ−２のこの新しいＢａｘ非依存的機能は線維芽細胞または星状細胞などのむしろ多様な細胞種におけるダイレクト神経リプログラミングにおいて影響力の強い役割を果たし、且つ、Ｂｃｌ−２の抗アポトーシス機能と無関係である。
【０１１２】
この文脈におけるＢｃｌ−２の全般的役割をさらに確かなものとするため、我々はＡ−Ｂｃｌ−２を他のリプログラミング因子とも組み合わせた。まず、我々はＮｅｕｒｏｇ２とＡ−Ｂｃｌ−２をコードするレトロウイルスベクター（ＲＶ−ＣＡＧ−Ｎｅｕｒｏｇ２−ＩＲＥＳ−Ａ−Ｂｃｌ−２）を作製した。実際に、この組合せもＭＥＦから誘導される神経細胞の割合を６倍に増やしてその割合が全ての感染細胞の６３％に達した（Ｎｅｕｒｏｇ２／ＲＦＰが介在する１０％と比較して；図５Ａ、Ｂ）。このことはＢｃｌ−２の効果が転写因子非依存的であることを示している。
【０１１３】
我々はＡｓｃｌ１が特定の神経細胞サブタイプをマウスまたはヒトの線維芽細胞において誘導することもできるか調査した。実際に、Ａｓｃｌ１とＢｃｌ−２またはＡ−Ｂｃｌ−２によって誘導されたＭＥＦ由来神経細胞はウイルス感染から２０日後に運動神経細胞アイデンティティー（Aquilonius et al., Brain research 211, 329-340 (1981)、 Portier et al., Sciences de la vie 316, 1124-1140 (1993)、 Tanabe et al., Cell 95, 67-80 (1998)）と一致してペリフェリン（図４Ｄ、Ｅ）、ＨＢ９（ＭＮＲ２としても知られる；図３Ｆａ〜ｃ）およびＣｈＡＴ（図４Ｇ）に対して免疫反応性であったが、ｖＧｌｕＴ１に対しては免疫反応性ではなく、ｖＧＡＴに対してはほぼ免疫反応性ではなく（データは示されず）、これらのペリフェリン陽性突起はシナプス結合を表す密度が高いシナプトブレビン免疫陽性斑点によって覆われていた（図４Ｅ）。これらの人工神経細胞はＦｏｘＰ１（図４Ｆｄ〜ｆ）も均一に発現するのでこれらの人工神経細胞は外側運動神経柱（ＬＭＣ）および／または節前運動神経柱の神経細胞（Rousso et al., Neuron 59, 226-240 (2008)）のようである。興味深いことに、Ｎｅｕｒｏｇ２とＡ−Ｂｃｌ−２の組合せによって誘導されたＭＥＦ由来神経細胞もＨＢ９、ペリフェリン（図５Ｄ）およびＣｈＡＴ（図５Ｅ）に対して免疫反応性であったが、特徴的なグルタミン酸作動性ホールマーク（Hevner et al., Neuroscience research 55, 223-233 (2006)）であるＴｂｒ１、Ｔｂ
ｒ２またはＶ−Ｇｌｕｔに対しては免疫反応性でなかった（データは示されず）。まとめると、これらのデータは、星状細胞においてグルタミン酸作動性神経細胞アイデンティティーがＮｅｕｒｏｇ２によって誘導され（図５ＦにおけるｖＧｌｕＴ１発現およびHeinrich et al., PLoS biology 8, e1000373 (2010)を参照されたい）、一方でＭＥＦにおいて運動神経細胞がＮｅｕｒｏｇ２またはＡｓｃｌ１の両方によって誘導されるので、細胞種の起源によって誘導される神経細胞の種類が決定されることを意味している。
【０１１４】
Ｂｃｌ−２が他の種に由来する細胞においても神経細胞へのリプログラミングを効率的に増進するか決定するため、我々は４５歳の女性から得た線維芽細胞であって、増殖させ、且つ、Ａｓｃｌ１とＲＦＰをコードするレトロウイルスベクター単体で、またはヒトＢＣＬ−２（ｈＢＣＬ−２）とレポーターＧＦＰをコードする第２ベクターと組み合わせて上で記載されたように形質導入された線維芽細胞を使用した。我々はβＩＩＩチューブリン免疫反応性の獲得がＡｓｃｌ１の発現によって誘導されないことを観察した。反対に、それらの細胞がＡｓｃｌ１コードベクターとｈＢｃｌ−２コードベクターの両方で共形質導入されたとき、我々は（ＲＦＰおよびＧＦＰに対して免疫反応性の）それらの共感染細胞の最大で７０％がβＩＩＩチューブリン＋（Ａｓｃｌ１／ＲＦＰ発現細胞と比較して３２倍の増加）であり、神経細胞形態を獲得したことを観察した。このことはＢｃｌ−２が異なる細胞種および異なる種において神経リプログラミングを増進する普遍的な作用を有することを示している。マウスの対応物の場合のように、ヒト成体線維芽細胞から誘導された神経細胞もペリフェリンおよびＨＢ９免疫反応性運動神経細胞であった。このことは運動神経細胞の表現型は追加の神経原性転写因子を使用せずにＡｓｃｌ１またはＮｅｕｒｏｇ２によって線維芽細胞から誘導された全ての神経細胞にとって共通であることを示唆する。
【実施例６】
【０１１５】
Ｂｃｌ−２の下流で酸化ストレスを軽減する他の分子もリプログラミング効率を上昇させる
酸化ストレスがリプログラミングにおける主要なハードルであることが我々のこれまでのデータから示されているので、我々は次に酸化ストレスを調節する既知の役割を有する他の分子の発現がＢｃｌ−２によって制御され得るか試験した。これらの分子のうちの１つはこれまでに幾つかの生物学パラダイムにおいて酸化ストレスを減少させることが示されている（Bao et al., 2008、Dong et al., 2012）ビタミンＤ受容体（ｖｄｒ）である。まず、我々はＢｃｌ−２がｖｄｒの発現を誘導する（図６Ａ、Ｂ）ことを初めて示し、次に我々はＶｄｒの過剰発現またはそのリガンドであるカルシトリオールの適用も星状細胞（図６Ｃ、Ｄ）およびヒト線維芽細胞（図６Ｅ）のリプログラミング効率を上昇させ得ることを示した。これらのデータは酸化ストレスが神経細胞リプログラミングを妨害する最も重要な因子であり、Ｂｃｌ−２がｖｄｒ発現を誘導する新しい経路に関与することを確証している。
【実施例７】
【０１１６】
Ｂｃｌ−２およびカルシトリオールはグリア細胞の神経リプログラミングをインビボで強力に増進する
我々の発見の妥当性を強調するため、我々は次に上で記載された方法の効率をインビボで試験した。そのため、我々はこれまでに記載されたプロトコル（Heinrich et al., 2014を参照されたい）を使用して刺傷形成とそれに続く損傷部位の隣へのＮｅｕｒｏｇ２−ＩＲＥＳ−ＲＦＰおよびＢｃｌ−２−ＩＲＥＳ−ＧＦＰをコードするレトロウイルスベクターの注入（図７Ａ）を行った。対照感染細胞は本質的にグリア細胞性であり、ほとんどがこれまでに記載されたように（Heinrich et al., 2014）オリゴデンドロサイト系統のＮＧ２＋細胞またはＳ１００ｂ／ＧＦＡＰ＋星状細胞であった。このことは神経マーカーＮｅｕＮをほぼ獲得することがない（図７Ｂ、Ｄ）一重の（Ｂｃｌ−２またはＮｅｕｒｏ
ｇ２だけで形質導入された）ＧＦＰ＋細胞またはＲＦＰ＋細胞についても当てはまった。逆に、多数の共形質導入細胞（ＧＦＰ＋／ＲＦＰ＋）が神経細胞転換を表す細長い神経細胞形の形態を示し、ＮｅｕＮについて免疫反応性であり（図７Ｂ、Ｄ）、且つ、スパイン形成を示した（図７Ｅ、右の写真）。運命転換にとって重要であることがインビトロで観察された重要な代謝制約がインビボでも関連しているか調べるため、我々はリガンドであるカルシトリオールによるビタミンＤ受容体経路の活性化を試験した。Ｂｃｌ−２がＶｄｒの上方制御を可能にする時間であるウイルス注入から２日後にカルシトリオール（２００ｎｇ）を経口投与した。カルシトリオール処理によってＮｅｕｒｏｇ２とＢｃｌ−２の共発現により誘導されたＮｅｕＮ＋神経細胞の割合が上昇して全ての共形質導入細胞のほぼ９０％に達し（図７ＣおよびＤ）、神経細胞の形態と成熟状態が大いに改善され、ウイルス注入から２３日後に長い神経突起が生じた（図７Ｅ、左の写真）。全体的には、これらの結果は我々の発見がインビトロパラダイムとインビボパラダイムの両方における神経リプログラミングにおいて一般的価値を有することを示している。
【実施例８】
【０１１７】
Ｂｃｌ−２は筋細胞へのリプログラミングも改善し、人工神経細胞と人工筋細胞の間での神経筋接合部の構築を可能にする
Ｂｃｌ−２がどの程度まで非神経リプログラミングも促進することができるか決定するため、我々は筋原性コミットメントに必要なｂＨＬＨ転写因子であり（Braun et al., Development 120, 3083-3092 (1994)）、様々な細胞系統からの骨格筋転換を誘導する（Choi et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 87, 7988-7992 (1990)）とこれまでに決定されたＭｙｏＤをコードするレトロウイルスベクターを使用した。ＭＥＦにＲＶ−ＣＡＧ−ＭｙｏＤ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰまたはＲＶ−ＣＡＧ−ＭｙｏＤ−ＩＲＥＳ−Ａ−Ｂｃｌ−２を感染させるとＭｙｏＤとＡ−Ｂｃｌ−２の両方を発現するＭＥＦがかなり迅速に骨格筋細胞に転換された（図８Ａ、Ｂ）。成熟筋細胞はそれらの細胞の多核性と作製された筋管の長さによって判定され、Ａ−Ｂｃｌ−２との共感染後５ＤＰＩにおいてＭｙｏＤとレポーターＧＦＰだけを発現する対照（図８Ｃ、Ｄ）と比較して有意により多くの細胞が多核性筋管形態（図８Ａ、ＣおよびＤ）とより好適に組織化された筋節（図８Ｂ）を獲得した。さらに、ＭｙｏＤコードベクターとＡ−Ｂｃｌ−２コードベクターで共形質導入された培養物はＭｙｏＤ／ＧＦＰ形質導入対照（図８Ｅ）よりも早い時期に自発的に一貫的に収縮し始めた。このことはＡ−Ｂｃｌ−２がＭＥＦの筋肉への転換も効率的に増進することを表している。興味深いことに、星状細胞のタイムラプス顕微鏡法によって観察されたようにＢｃｌ−２は線維芽細胞を筋線維に転換させるこの異なるリプログラミングパラダイムにおいて運命転換を促進する。
【０１１８】
最後に我々は、神経筋相互作用を研究するための容易に入手可能なインビトロモデルとしてのリプログラムされた細胞によって完全に誘導された機能回路であって、ダイレクトリプログラミングを受けた線維芽細胞に由来する機能回路をＢｃｌ−２が媒介する効率を調べた。そのために播種から４時間後にＭＥＦにベクターＲＶ−ＣＡＧ−Ａｓｃｌ１−ＩＲＥＳ−Ａ−Ｂｃｌ−２を形質導入してＭＥＦの運動神経細胞への転換を開始した。同じ細胞内での異なるレトロウイルスベクターの望ましくない共感染を回避するため、ＲＶ−ＣＡＧ−Ａｓｃｌ１−ＩＲＥＳ−Ａ−Ｂｃｌ−２が分裂終了神経細胞に分化し、したがって細胞分裂時の核膜崩壊に組込みが依存しているそのＲＶベクターをそれ以上組み込むことができない時点である１０日後に筋肉細胞の作製のために第２ベクターＲＶ−ＣＡＧ−ＭｙｏＤ−ＩＲＥＳ−Ａ−Ｂｃｌ−２をそれらの培養物に形質導入した。しかしながら、残っている増殖性ＭＥＦはなお感染可能であり、７日後に筋管への転換に成功した。予想通り、我々は好適に組織化された筋節を表すファロイジン染色と神経筋接合部に特徴的なブンガロトキシン（ＢＴＸ）に対する親和性を有するｎＡＣｈＲの凝集（図８Ｆ）を後に示す収縮性筋管の例を容易に見つけ出した。まとめると、リプログラミングにおけるＢｃｌ−２の強力な作用により、ダイレクトリプログラミングを受けた細胞から完全に機能回
路を再構成するために使用することができる様々な系統へのＭＥＦの効率的リプログラミングが可能になる。
【実施例９】
【０１１９】
材料と方法
出生後マウス大脳皮質に由来する星状グリア細胞の細胞培養物
Ｈｅｉｎｓら（Nature Neuroscience 5, 308-315 (2002)）に記載される培養方法によって星状細胞を選択した。髄膜の除去後にＣ５７ＢＬ／６ＪマウスのＰ５〜Ｐ７の大脳皮質から灰白質組織を切り離し、機械的に解離させた。その後、細胞を５分間にわたって１０００ｒｐｍで遠心分離し、再懸濁し、そしてＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ）、３．５ｍＭグルコース（Ｓｉｇｍａ）、１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）、５％ウマ血清（Ｇｉｂｃｏ）、ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）からなり、且つ、Ｂ２７（Ｇｉｂｃｏ）、１０ｎｇ／ｍＬ上皮成長因子（ＥＧＦ、Ｒｏｃｈｅ）および１０ｎｇ／ｍＬ線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２、Ｒｏｃｈｅ）が添加された培地に播種した。１週間の増殖の後にトリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）を使用して細胞を回収し、同じ培地中にウェル当たり６００００細胞の密度でそれらの細胞を２４ウェルプレート（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中のポリ−Ｄ−リシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）被覆ガラス製カバースリップまたは直接的にタイムラプス実験用プラスチック製品に播種した。２４時間後に細胞をプラスミドで形質移入するか、または細胞にレトロウイルスベクターを感染させ、さらに２４時間後にＧｌｕｔａＭＡＸ、ペニシリン／ストレプトマイシンおよびＢ２７添加物（Ｇｉｂｃｏ）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２高グルコースからなる分化培地に培地を変更して細胞を神経細胞分化させた。
【０１２０】
マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）の細胞培養物
妊娠１４日目のマウス胚からＭＥＦを得た。頭、脊柱、および内蔵を取出し、廃棄した（Vierbuchen et al., Nature 463, 1035-1041 (2010)）。０．１５％のトリプシンを使用して残りの組織を解離させ、５分間にわたって１３００ｒｐｍで遠心分離し、再懸濁し、そしてＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｇｉｂｃｏ）、１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）およびペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を含むＤＭＥＭ高グルコース（３．５ｍＭ）からなる培地中に５％ＣＯ２および標準的酸素供給条件下で播種した。最低で３回の継代の後に線維芽細胞を実験に使用した。リプログラミング実験のため、細胞を回収し、星状細胞について上で記載されたように再播種した。
【０１２１】
マウス出生後星状グリア細胞培養物の形質移入
形質移入のため、下に記載されるレトロウイルスプラスミドとリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＯｐｔｉｍｅｍ媒体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の中にＤＮＡリポソーム複合体を調製した。４００μｌのＯｐｔｉｍｅｍ媒体当たり０．５μｇのＤＮＡの濃度のＤＮＡリポソーム複合体に星状細胞培養物を４時間にわたって曝露し、その後でそれらの培養物を上記の分化培地の中で培養した。
【０１２２】
マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）の細胞培養物
妊娠１４日目のマウス胚からＭＥＦを得た。頭、脊柱、および内蔵を取出し、廃棄した（Vierbuchen et al., 2010）。０．１５％のトリプシンを使用して残りの組織を解離させ、５分間にわたって１３００ｒｐｍで遠心分離し、再懸濁し、そしてＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｇｉｂｃｏ）、１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）およびペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を含むＤＭＥＭ高グルコース（３．５ｍＭ）からなる培地中に５％ＣＯ２および標準的酸素供給条件下で播種した。最低で３回の継代の後に線維芽細胞を実験に使用した。リプログラミング実験のため、細胞を回収し、星状細胞について上で記載されたように再播種した。
【０１２３】
ヒト線維芽細胞の細胞培養物
播種前に機械的に解離される直径３ｍｍの充分な厚さのパンチ生検試料からヒト皮膚線維芽細胞の初代培養物を確立した。生検試料から生じた線維芽細胞は、１０％ウシ血清（Ｇｉｂｃｏ）およびペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を含むＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）を５％ＣＯ２および標準的酸素供給条件で使用して維持および継代された。リプログラミング実験のため、星状細胞について上で記載されたように２４ウェルプレート中のカバースリップ上に細胞を播種し、感染から４８時間後にＧｌｕｔａＭＡＸおよび１％ウシ胎児血清、ペニシリン／ストレプトマイシンおよびＢ２７添加物（Ｇｉｂｃｏ）を含むＤＭＥＭ高グルコースに培地を変更した。リプログラミング過程の間に３日毎に星状細胞馴化培地で培地を交換した。最低２日間にわたって分化培地（上の出生後マウス大脳皮質に由来する星状グリア細胞の細胞培養物を参照されたい）で星状グリア細胞培養物を培養することにより星状細胞馴化培地が得られる。その後、その培地を星状細胞から回収し、ヒト細胞のリプログラミングに使用する。
【０１２４】
動物の外科手術
バイエルン州の方針に準じて認可番号５５．２−１−５４−２５３２−１７１−１１の下で手術を行った。これまでに記載されたように（Sirko et al. 2013、 Simon et al. 2011）、皮質白質を傷つけることなく１９ゲージの厚さのランセットで片側のみの刺傷（１ｍｍの長さ、硬膜から０．６ｍｍの深さ）を右の新皮質に行った。３日後に微量注入器に接続したガラス毛細管（Ｎａｎｏｌｉｔｅｒ２０００＋Ｓｙｓ−Ｍｉｃｒｏ４、Ｗｏｒｌｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）を使用して０．５〜１μｌのレトロウイルス懸濁液（Ｎｅｕｒｏｇ２−ＩＲＥＳ−ＲＦＰおよびＢｃｌ−２−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ、１：１）をその傷害部位に３０〜６０ｎｌ／分の速度で注入した。注入完了から５分後に針を引き抜いた。文書中に表記されているときは、トウモロコシ油に希釈した２００μｌのカルシトリオール（Ｔｏｃｒｉｓ）（１ｎｇ／μｌの終濃度）をレトロウイルス注入から２日後に強制経口投与した。その投薬量はこれまでの刊行物（Nashold et al. 2013）に従って決定された。
【０１２５】
プラスミドおよびＤＮＡコンストラクト
神経原性転写因子の発現のため、我々はこれまでに記載された（Heinrich et al., 2011）ようにリボソーム内部侵入部位（ＩＲＥＳ）によって蛍光レポーターに連結された目的遺伝子（ｆｌａｇ／ｍｙｃ−Ａｓｃｌ１、ｆｌａｇ−Ｎｅｕｒｏｇ２、Ｂｃｌ−２またはＤｌｘ−２）の発現を駆動するサイトメガロウイルスエンハンサーと共にアクチンプロモーターを含む自己不活化性レトロウイルスベクター（ｐＣＡＧ）を使用した。マウス版のＢｃｌ−２  ｃＤＮＡをＳｏｕｒｃｅ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅから入手し（ＩＲＡＶｐ９６８Ｈ０１１４５Ｄ、ｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ６．１−Ｂｃｌ−２）、ヒトｃＤＮＡ版（ｈ−Ｂｃｌ−２）をａｄｄｇｅｎｅ（プラスミド番号８７９３；ｐＭＩＧ−Ｂｃｌ−２−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ）から入手してＲＶ−ｐＣＡＧ−ｆｌａｇ／ｍｙｃ−Ａｓｃｌ１−ＩＲＥＳ−Ｂｃｌ−２、ＲＶ−ｐＣＡＧ−ｆｌａｇ−Ｎｅｕｒｏｇ２−ＩＲＥＳ−Ｂｃｌ−２、またはＢｃｌ−２とレポーターＧＦＰの両方をコードするＲＶ−ｐＣＡＧ−Ｂｃｌ−２−ＩＲＥＳ−ＧＦＰを作製した。それぞれオリゴ５’−ｇｇｃｔｇｃｃａｇｇａｃｇｇｃｔｃｃｔｃｔｃａｇｇｃｃｃｃｔｃｇｔｔｇ−３’（および相補オリゴ）およびオリゴ５’−ｇｇｇａｃａｔｇｇｃｔｇｃｃａｇｇｇａｇｇａｇｃｃｔｃｔｃａｇｇｃｃｃｃｔｃｇｔｔｇｃｃ−３’（および相補オリゴ）を使用する部位特異的突然変異形成によりＢｃｌ−２突然変異体Ａ−Ｂｃｌ−２およびＥＥ−Ｂｃｌ−２を作製してベクターｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ６．１−Ａ−Ｂｃｌ−２、ＲＶ−ｐＣＡＧ−Ａｓｃｌ１−ＩＲＥＳ−Ａ−Ｂｃｌ−２およびＲＶ−ｐＣＡＧ−Ｎｅｕｒｏｇ２−ＩＲＥＳ−Ａ−Ｂｃｌ−２および対応するＥＥ−Ｂｃｌ−２版のベクターを作製した。シーケンシングによって突然変異を確認した。Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ（ＭＧ５１１０６−Ｇ、ベクターｐＧＥＭ−Ｔ）からマウスのＶｄｒを入手し、レトロウイルスベクターにサブクローン化してＲＶ−ｐＣＡ
Ｇ−Ｖｄｒ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰを作製した。
【０１２６】
ウイルスベクターは１０６〜９のタイターでシュードタイピングする水泡性口内炎ウイルスを用いて作製され、上で記載されたように分割から２４時間後に細胞を感染させた。１６％Ｏ２および９％ＣＯ２中で細胞を分化させた。
【０１２７】
イムノブロット分析
プロテアーゼ（コンプリートＥＤＴＡフリー、Ｒｏｃｈｅ）を含むＲＩＰＡ緩衝液（１０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．２、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％デオキシコール酸ナトリウム、１％ノニデットＰ−４０、０．１％ＳＤＳ）の中で培養物を溶解した。ＩｎｔｅｒｃｈｉｍのＢＣＡ試薬を使用してタンパク質濃度を決定した。ポリアクリルアミドゲル電気泳動により等量のタンパク質（５０μｇ）を分離し、ポリビニリデンジフルオリド膜（Ｐａｌｌ；Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に転写した。
【０１２８】
標準的手法（ＥＣＬプライム・ウエスタンブロッティング検出試薬、Ａｍｅｒｓｈａｍ）によりタンパク質の免疫検出を実施した。ＣＲＥＢおよびＰ−ＣＲＥＢの発現はそれぞれポリクローナル抗ＣＲＥＢ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、４８Ｈ２）またはポリクローナル抗Ｐ−ＣＲＥＢ抗体（Ｓ１３３）（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、８７Ｇ３）を使用して検出した。ＰＫＡリン酸化標的はポリクローナル抗ＰＫＡ基質（Ｃｅｌｌ
Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、１００Ｇ７Ｅ）を使用して検出し、Ｂｃｌ−２またはα−チューブリンはポリクローナル抗ＢＣｌ−２抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、５０Ｅ３）またはモノクローナル抗α−チューブリン抗体（Ｓｉｇｍａ、５１６８）を使用して検出した。
【０１２９】
免疫細胞化学
細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中で１０分間にわたって室温（ＲＴ）で固定し、ＰＢＳ中で洗浄し、ＰＢＳ中の０．５％トリトンＸ−１００の中で３０分間にわたって前処理し、続いてＰＢＳ中の２％ＢＳＡと０．５％トリトンＸ−１００の中で３０分間にわたってインキュベートした。一次抗体をＰＢＳ中の２％ＢＳＡ、０．５％トリトンＸ−１００の中で標本に対して４℃で一晩インキュベートした。次の一次抗体を使用した：ポリクローナル抗Ｂｃｌ−２（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、５０Ｅ３）、ポリクローナル抗Ｐ−Ｃｒｅｂ（Ｓ１３３）（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、８７Ｇ３）、モノクローナル抗Ｍｙｃ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、９Ｂ１１）、ポリクローナル抗Ｇｒｅｅｎ蛍光タンパク質（ＧＦＰ、ニワトリ、１：１０００、Ａｖｅｓ  Ｌａｂｓ、ＧＦＰ−１０２０）、ポリクローナル抗グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ、ウサギ、１：４０００、ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ、Ｚ０３３４）、ポリクローナル抗Ｒｅｄ蛍光タンパク質（ＲＦＰ、ウサギ、１：５００、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、ＡＢ３２１６、または１：２０００、Ｒｏｃｋｌａｎｄ、６００−４０１−３７９）、モノクローナル抗βＩＩＩチューブリン（マウスＩｇＧ２ｂ、１：５００、Ｓｉｇｍａ、Ｔ８６６０）。ＰＢＳ中での洗浄の後に細胞をＣｙ（商標）２、Ｃｙ（商標）３、Ｃｙ（商標）５（１：５００、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８（１：５００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート、１：５００、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）、ＴＲＩＴＣ（テトラメチルローダミンイソチオシアネート、１：５００、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）またはビオチン（１：５００、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈまたはＶｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に複合体化した適切な種特異的またはサブクラス特異的二次抗体、またはファロイジンＡｌｅｘａ５９４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ１２３８１９）またはブンガロトキシンＴＲＩＴＣ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｔ−１１７５）と共に２時間にわたって暗所において室温でインキュベートし、続いてＰＢＳ中で広範囲に洗浄した。ビオチンに複
合体化した二次抗体を使用する処理に続いて細胞を後にＡＭＣＡストレプトアビジン（１：２００、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）またはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７ストレプトアビジン（１：５００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に２時間にわたって室温でインキュベートし、Ａｑｕａ  Ｐｏｌｙ／Ｍｏｕｎｔ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、ワーリントン、ペンシルバニア州）によりマウントした。
【０１３０】
酸化ストレスの検出のため、我々はＣｅｌｌＲＯＸグリーン試薬（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃ１０４４４）を記載されているプロトコルに従って使用し、顕微鏡により蛍光を検出した（下記参照）。
【０１３１】
免疫組織化学
動物に麻酔をかけ、１×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を使用して経心的灌流を行い、続いてＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を使用して経心的灌流を行った。脳を２時間にわたって後固定し、ＰＢＳで２回洗浄し、そして４％アガロース／水中に包埋した。最終的に振動ミクロトーム（Ｌｅｉｃａ）を使用して６０μｍ厚の冠状切片を切った。
【０１３２】
免疫組織学のため、切片を３０分間にわたってブロッキング溶液（ＰＢＳ中の２％ウシ血清アルブミン、０．５％トリトンＸ−１００）中で予備インキュベートした。次の一次抗体をブロッキング溶液中に希釈し、切片と４℃で４８時間にわたってインキュベートした：ニワトリ抗ＧＦＰ（１：５００、Ａｖｅｓ  Ｌａｂｓ、ＧＦＰ−１０２０）、ウサギ抗ＲＦＰ（１：５００、Ｒｏｃｋｌａｎｄ、６００−４０１−３７９）、マウス抗ＮｅｕＮ（１：２５０、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、ＭＡＢ３７７）。ＰＢＳ中での洗浄の後に二次抗体をブロッキング溶液中に希釈し、室温で２時間にわたってインキュベートした。それらの二次抗体は一次抗体に応じて選択し、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８またはＦＩＴＣ、Ｃｙ３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７に連結した。切片をマウントする前に最後にＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）で対比染色した。
【０１３３】
ＲＮＡ抽出およびリアルタイム定量ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）
ゲノムＤＮＡの除去をはじめとする製造業者の指示に従ってＲＮｅａｓｙプラス・ミクロキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＲＮＡを抽出した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩリバーストランスクリプテースおよびランダムプライマー（Ｒｏｃｈｅ）を使用してＲＮＡを逆転写した。各ｃＤＮＡ試料を１対５に希釈し、各定量的リアルタイム反応に１μｌを使用した。製造業者の指示に従ってＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒプローブマスターキット（Ｒｏｃｈｅ）とＭｏｎｏｃｏｌｏｒハイドロリシスプローブ（ＵＰＬ）プローブ（Ｒｏｃｈｅ）（２０μｌの最終体積）を使用してＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０装置（Ｒｏｃｈｅ）上でリアルタイム定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を実施した。各遺伝子の発現を三回の実験で分析した。データをΔΔＣｔ法（Livak and Schmittgen, 2001）により処理した。３つの独立した試料に対して定量を行った。
【０１３４】
顕微鏡法
ＬＳＭ７１０レーザー走査共焦点顕微鏡またはＡｘｉｏ  Ｏｂｓｅｒｖｅｒ  Ｚ１落射蛍光顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）により免疫染色を分析した。ＺＥＮソフトウェア（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）を使用してデジタル画像を捕捉し、１０倍の対物レンズを使用して全てのＲＦＰ／ＧＦＰ免疫反応性細胞の細胞計数を実施した。
【０１３５】
ライブイメージング顕微鏡法
セル・オブザーバー（Ｚｅｉｓｓ）を使用して３７℃の定温および８％ＣＯ２でタイムラプスビデオ顕微鏡法を実施した。１０倍の位相差対物レンズ（Ｚｅｉｓｓ）、およびＡｘｉｏＣａｍＨＲｍカメラを自分自身で書いたＶＢＡモジュール遠隔制御Ｚｅｉｓｓ  Ａ
ｘｉｏＶｉｓｉｏｎ  ４．７ソフトウェア（Rieger and Schroeder, Journal of cellular biochemistry 108, 343-352 (2009)）と共に使用して位相差画像を５分毎に獲得し、蛍光写真を４〜６時間毎に６．５〜７．５日間にわたって獲得した。Ｉｍａｇｅ  Ｊ  １．４２ｑ（国立衛生研究所、米国）ソフトウェアを使用してムービーを組み立てた。それらのムービーは秒当たり３フレームの速度で再生される。
【０１３６】
統計学
マン・ホイットニー検定またはＡＮＯＶＡテューキー・ポスト検定を用いることによりＧｒａｐｈＰｒｉｓｍ４ソフトウェアを使用して統計分析を行った。少なくとも３回分の独立した実験で各実験につき３枚のカバースリップに由来する全ての形質移入細胞を計数した。少なくとも３回の独立した実験において各実験につき３つの異なるウェルの５か所の無作為に選んだ１０倍の視野からレトロウイルスベクター形質導入細胞を定量した。
【０１３７】
追加参照文献
Bao, B.Y., Ting, H.J., Hsu, J.W., and Lee, Y.F. (2008). Protective role of 1 alpha, 25-dihydroxyvitamin D3 against oxidative stress in nonmalignant human prostate epithelial cells. International journal of cancer Journal international du cancer 122, 2699-2706.
Choi, J., Costa, M.L., Mermelstein, C.S., Chagas, C., Holtzer, S., and Holtzer, H. (1990). MyoD converts primary dermal fibroblasts, chondroblasts, smooth muscle, and retinal pigmented epithelial cells into striated mononucleated myoblasts and multinucleated myotubes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 87, 7988-7992.
Dixon, S.J., Patel, D.N., Welsch, M., Skouta, R., Lee, E.D., Hayano, M., Thomas,
A.G., Gleason, C.E., Tatonetti, N.P., Slusher, B.S., et al. (2014). Pharmacological inhibition of cystine-glutamate exchange induces endoplasmic reticulum stress and ferroptosis. eLife 3, e02523.
Dixon, S.J., and Stockwell, B.R. (2014). The role of iron and reactive oxygen species in cell death. Nature chemical biology 10, 9-17.
Dong, J., Wong, S.L., Lau, C.W., Lee, H.K., Ng, C.F., Zhang, L., Yao, X., Chen, Z.Y., Vanhoutte, P.M., and Huang, Y. (2012). Calcitriol protects renovascular function in hypertension by down-regulating angiotensin II type 1 receptors and reducing oxidative stress. European heart journal 33, 2980-2990.
Drummen, G.P., van Liebergen, L.C., Op den Kamp, J.A., and Post, J.A. (2002). C11-BODIPY(581/591), an oxidation-sensitive fluorescent lipid peroxidation probe: (micro)spectroscopic characterization and validation of methodology. Free radical biology & medicine 33, 473-490.
Friedmann Angeli, J.P., Schneider, M., Proneth, B., Tyurina, Y.Y., Tyurin, V.A.,
Hammond, V.J., Herbach, N., Aichler, M., Walch, A., Eggenhofer, E., et al. (2014). Inactivation of the ferroptosis regulator Gpx4 triggers acute renal failure in mice. Nature cell biology 16, 1180-1191.
Heinrich, C., Bergami, M., Gascon, S., Lepier, A., Vigano, F., Dimou, L., Sutor,
B., Berninger, B., and Gotz, M. (2014). Sox2-Mediated Conversion of NG2 Glia into Induced Neurons in the Injured Adult Cerebral Cortex. Stem cell reports 3, 1000-1014.
Heinrich, C., Blum, R., Gascon, S., Masserdotti, G., Tripathi, P., Sanchez, R., Tiedt, S., Schroeder, T., Gotz, M., and Berninger, B. (2010). Directing astroglia from the cerebral cortex into subtype specific functional neurons. PLoS biology 8, e1000373.
Heinrich, C., Gascon, S., Masserdotti, G., Lepier, A., Sanchez, R., Simon-Ebert,
T., Schroeder, T., Gotz, M., and Berninger, B. (2011). Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex. Nature protocols 6, 214-228.
Livak, K.J., and Schmittgen, T.D. (2001). Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods 25, 402-408.
Palamanda, J.R., and Kehrer, J.P. (1993). Involvement of vitamin E and protein thiols in the inhibition of microsomal lipid peroxidation by glutathione. Lipids 28, 427-431.
Vierbuchen, T., Ostermeier, A., Pang, Z.P., Kokubu, Y., Sudhof, T.C., and Wernig, M. (2010). Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature 463, 1035-1041.
【図１Ａ】
2020039345.tif 000003
【図１Ｂ】
2020039345.tif 000004
【図１Ｃ】
2020039345.tif 000005
【図１Ｄ】
2020039345.tif 000006
【図１Ｅ】
2020039345.tif 000007
【図１Ｆ】
2020039345.tif 000008
【図１Ｇ】
2020039345.tif 000009
【図１Ｈ】
2020039345.tif 000010
【図１Ｉ】
2020039345.tif 000011
【図１Ｊ】
2020039345.tif 000012
【図２Ａ】
2020039345.tif 000013
【図２Ｂ】
2020039345.tif 000014
【図２Ｃ】
2020039345.tif 000015
【図３Ａ】
2020039345.tif 000016
【図３Ｂ】
2020039345.tif 000017
【図３Ｃ】
2020039345.tif 000018
【図３Ｄ】
2020039345.tif 000019
【図４Ａ】
2020039345.tif 000020
【図４Ｂ】
2020039345.tif 000021
【図４Ｃ】
2020039345.tif 000022
【図４Ｄ】
2020039345.tif 000023
【図４Ｅ】
2020039345.tif 000024
【図４Ｆ】
2020039345.tif 000025
【図４Ｇ】
2020039345.tif 000026
【図５Ａ】
2020039345.tif 000027
【図５Ｂ】
2020039345.tif 000028
【図５Ｃ】
2020039345.tif 000029
【図５Ｄ】
2020039345.tif 000030
【図５Ｅ】
2020039345.tif 000031
【図５Ｆ】
2020039345.tif 000032
【図６Ａ】
2020039345.tif 000033
【図６Ｂ】
2020039345.tif 000034
【図６Ｃ】
2020039345.tif 000035
【図６Ｄ】
2020039345.tif 000036
【図６Ｅ】
2020039345.tif 000037
【図７Ａ】
2020039345.tif 000038
【図７Ｂ】
2020039345.tif 000039
【図７Ｃ】
2020039345.tif 000040
【図７Ｄ】
2020039345.tif 000041
【図７Ｅ】
2020039345.tif 000042
【図８】
2020039345.tif 000043
【図９】
2020039345.tif 000044
【配列表】
2020039345000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年12月11日(2019.12.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
分化細胞を分化転換する方法であって、少なくとも１種類の要素（ｉ）および少なくとも１種類の要素（ｉｉ）と前記細胞を接触させることを含む方法であり、
前記要素（ｉ）が
（ａ）ＢＨ１ドメイン、ＢＨ２ドメイン、ＢＨ３ドメインおよびＢＨ４ドメインからなる群より選択される少なくとも１つのドメインを含むポリペプチド、
（ｂ）Ｂｃｌ−２ファミリーのメンバーの野生型またはその断片のアミノ酸配列を含む、または前記アミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｃ）Ｂｃｌ−２ファミリーのメンバーの野生型またはその断片のアミノ酸配列を含む、または前記アミノ酸配列からなるポリペプチドであって、前記野生型またはその断片と比較すると１つ以上の点突然変異を含む前記ポリペプチド、
（ｄ）Ｂｃｌ−２ファミリーのメンバーの野生型であって、ヒトＢｃｌ−２（配列番号１または５）、ヒトＢｃｌ−ＸＬ（配列番号６）、ヒトＢｃｌ−ｗ（配列番号７）、ヒトＭｃｌ１（配列番号８）、ヒトＢｆＩ１（配列番号９または１０）、ヒトＮｒｈ（配列番号１１）、ヒトＢｃｌ２Ｌ１（配列番号１２）、ヒトＤＩＶＡ（配列番号１３）、ヒト骨髄細胞白血病配列１アイソフォーム１（配列番号１４）、およびヒトＢｃｌ−ｘβ（配列番号１５）からなる群より選択されることが好ましいＢｃｌ−２ファミリーのメンバーの前記野生型と少なくとも３０％の配列同一性を示すアミノ酸配列を含む、または前記アミノ酸配列からなるポリペプチド、
前記野生型は、抗アポトーシス活性を有し、
前記ポリペプチドをコードする核酸
から選択され、
前記要素（ｉ）が無いときと比較すると前記要素（ｉ）によって分化転換細胞の収率が少なくとも３０％向上し、
且つ、
前記要素（ｉｉ）が前記細胞を分化転換することが可能である転写因子、前記転写因子をコードする核酸から選択され、
ヒトまたは動物の身体を治療処置するあらゆる方法が除外される前記方法。
【請求項２】
分化細胞を分化転換する方法であって、少なくとも１種類の要素（ｉｉｉ）および少な
くとも１種類の要素（ｉｉ）と前記細胞を接触させることを含む方法であり、
前記要素（ｉｉｉ）によって脂質過酸化が減少し、前記要素（ｉｉｉ）が
（ａ）ビタミンＤ受容体、その機能ホモログ、および前記受容体またはその前記機能ホモログをコードする核酸、
（ｂ）ステロイド性抗酸化剤、好ましくはカルシトリオール、
（ｃ）フェノール性抗酸化剤、好ましくはα−トコフェロールまたはα−トコトリエノール、および
（ｄ）キニン、好ましくはコエンザイムＱ
から選択されることが好ましく、
且つ、
前記要素（ｉｉ）が前記細胞を分化転換することが可能である転写因子、前記転写因子をコードする核酸から選択され、
ヒトまたは動物の身体を治療処置するあらゆる方法が除外される前記方法。
【請求項３】
請求項２において規定される少なくとも１種類の要素（ｉｉｉ）と前記細胞を接触させることをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項４】
（ａ）請求項１において規定される少なくとも１種類の要素（ｉ）と請求項１において規定される少なくとも１種類の要素（ｉｉ）、
（ｂ）請求項２において規定される少なくとも１種類の要素（ｉｉｉ）と請求項２において規定される少なくとも１種類の要素（ｉｉ）、または
（ｃ）請求項３において規定される少なくとも１種類の要素（ｉ）、請求項３において規定される少なくとも１種類の要素（ｉｉ）、および請求項３において規定される少なくとも１種類の要素（ｉｉｉ）
を含む、またはそれらからなる配合物であって、
前記配合物が請求項１から３または６から１５のいずれか一項に記載の方法を実施するためのキットとして提供され、前記配合物の要素（ｉ）および（ｉｉ）が異なる容器に収められている、配合物。
【請求項５】
機能性神経細胞の消失および／または機能性筋細胞の消失を特徴とする神経障害または筋障害を治療または予防する方法に使用するための請求項４において規定される配合物であって、前記１つ以上の転写因子が神経原性転写因子および筋原性転写因子から選択され、好ましくは分化細胞を分化転換することによって前記治療または予防が達成される前記配合物。
【請求項６】
前記ポリペプチドが
（ａ）アミノ酸配列が配列番号１に示されているヒトＢｃｌ−２と比較すると低下した抗アポトーシス機能を有しているか、またはその抗アポトーシス機能を失っており、および／または
（ｂ）ヒトＢｃｌ−２よりも高い程度にまで分化転換細胞の収率を向上させる、請求項１または３に記載の方法、請求項４に記載の配合物、または請求項５に記載の使用のための配合物。
【請求項７】
前記ポリペプチドがＢＨ４ドメインと所望によりＢＨ１ドメイン、ＢＨ２ドメイン、ＢＨ３ドメインおよびＢＨ４ドメインからなる群より選択される１つ、２つ、３つ、またはそれより多くのドメインを含み、前記ポリペプチドがただ１つのＢＨ１ドメイン、ただ１つのＢＨ２ドメイン、ただ１つのＢＨ３ドメインおよびただ１つのＢＨ４ドメインを含むことが好ましい、請求項１、３または６に記載の方法、請求項４または６に記載の配合物、または請求項５または６に記載の使用のための配合物。
【請求項８】
前記ポリペプチドが、
（ａ）可動性ループドメイン中の１つ以上のリン酸化可能残基がリン酸化不能残基によって置き換えられているか、または欠失している点で野生型Ｂｃｌ−２と異なるＢｃｌ−２突然変異体、例えば、
（ｉ）ヒトＢｃｌ−２のＳ７０Ａ突然変異体、
（ｉｉ）ヒトＢｃｌ−２のＴ６９Ａ／Ｓ７０Ａ二重突然変異体、
（ｉｉｉ）ヒトＢｃｌ−２のＳ８７Ａ突然変異体、
（ｉｖ）ヒトＢｃｌ−２のＴ６９Ａ／Ｓ７０Ａ二重突然変異体、
（ｖ）ヒトＢｃｌ−２のＴ６９Ａ／Ｓ８７Ａ二重突然変異体、
（ｖｉ）ヒトＢｃｌ−２のＳ７０Ａ／Ｓ８７Ａ二重突然変異体、
（ｖｉｉ）ヒトＢｃｌ−２のＴ６９Ａ／Ｓ７０Ａ／Ｓ８７Ａ三重突然変異体、
（ｖｉｉｉ）ヒトＢｃｌ−２のＴ６９、Ｓ７０およびＳ８７のうちの１つ、２つ、または３つの欠失から選択される欠失突然変異体、および
（ｉｘ）ヒトＢｃｌ−２のａａ６９〜８７の欠失突然変異体、または
（ｂ）膜貫通領域が欠失しているか、または非機能的になったヒトＢｃｌ−２の突然変異体であるＢｃｌ−２突然変異体
から選択される、請求項１、３、６または７のいずれか一項に記載の方法、請求項４、６または７のいずれか一項に記載の配合物、または請求項５から７のいずれか一項に記載の使用のための配合物。
【請求項９】
（ａ）前記細胞が
（ｉ）体細胞、好ましくは線維芽細胞、星状細胞、および周皮細胞から選択される体細胞であり、
（ｉｉ）脊椎動物細胞、好ましくは哺乳類細胞、より好ましくはマウス起源またはヒト起源の細胞であり、および／または
（ｉｉｉ）胚由来または出生後段階、好ましくは成体段階に由来する細胞であり、
および／または
（ｂ）前記要素（ｉｉ）が神経原性転写因子、好ましくはＡｓｃｌ１、Ｎｅｕｒｏｇ２、Ｂｒｎ２、Ｄｌｘ２、ＭＹＴ１Ｌ、Ｓｏｘ１１およびＳｏｘ２、ならびに筋原性転写因子、好ましくはＭｙｏＤ、Ｇａｔａ４ｍ、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｈａｎｄ２、Ｔ−ｂｏｘ５、ミオカルディン、ｍｉＲ−１およびＭｉＲ−１３３から選択される、請求項１、３または６から８のいずれか一項に記載の方法、請求項４または６から８のいずれか一項に記載の配合物、または請求項５から８のいずれか一項に記載の使用のための配合物。
【請求項１０】
前記細胞が線維芽細胞であり、前記要素（ｉｉ）が１つの転写因子である、請求項９に記載の方法、配合物、または使用のための配合物。
【請求項１１】
前記転写因子が神経原性転写因子、好ましくはＡｓｃｌ１、Ｎｅｕｒｏｇ２およびＤｌｘ２から選択される神経原性転写因子であり、前記方法によってＧＡＢＡ作動性神経細胞、グルタミン酸作動性神経細胞、および運動神経細胞から選択される１つ以上の分化転換細胞が産出される、請求項１０に記載の方法、配合物、または使用のための配合物。
【請求項１２】
前記転写因子が筋原性転写因子、好ましくはＭｙｏＤであり、前記方法によって筋細胞が産出される、請求項１０に記載の方法、配合物、または使用のための配合物。
【請求項１３】
機能性神経細胞の消失および／または機能性筋細胞の消失を特徴とする神経障害および／または筋障害のモデルを作製する方法であって、請求項１１および／または１２に記載の方法を含む方法であり、前記神経障害および／または筋障害の素因を有する個体または前記神経障害および／または筋障害を患う患者から前記線維芽細胞を入手している前記方法。
【請求項１４】
機能性神経細胞の消失および／または機能性筋細胞の消失を特徴とする神経障害および／または筋障害を診断する方法であって、請求項９から１２のいずれか一項に記載の方法を含む方法であり、前記神経障害および／または筋障害を有することが疑われる個体または前記神経障害および／または筋障害の素因を有することが疑われる個体から前記分化細胞を入手しており、好ましくは前記分化細胞が線維芽細胞であり、分化転換により獲得され、且つ、疾患表現型を有する神経細胞および／または筋細胞が前記神経障害および／または筋障害を示す前記方法。
【請求項１５】
分化転換細胞を含む組成物を作製する方法であって、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法を含む前記方法。
【請求項１６】
分化転換の促進因子としての請求項１または６から８のいずれか一項において規定されるポリペプチドまたは前記ポリペプチドをコードする核酸の使用であって、ヒトまたは動物の治療処置方法におけるあらゆる使用が除外される前記使用。
【請求項１７】
前記配合物がキットとして提供され、前記配合物の要素（ｉ）および（ｉｉ）が異なる容器に収められており、前記キットが請求項１から３または６から１４のいずれか一項に記載の方法を実施するための指示を有するマニュアルを含んでもよい、請求項４に記載の配合物。
【請求項１８】
前記細胞において前記ポリペプチドの量及び／又は活性を高める手段をさらに含む、請求項１及び３〜１５の何れか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞において前記転写因子の量及び／又は活性を高める手段をさらに含む、請求項１〜１５及び１８の何れか一項に記載の方法。