(57)【要約】【課題】ビウレット反応を利用した２試薬系の総タンパク質の測定系において、保存安定性を向上させることにより、長期間安定かつ正確に試料中の総タンパク質を測定できる測定試薬及び測定方法を提供する。【解決手段】ビウレット反応を利用した２試薬系の総タンパク質測定試薬において、ｐＨ３〜１３の第１試薬、及び銅イオンを含有するアルカリ性の第２試薬に、水酸化リチウムを含有させる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｐＨ３〜１３の第１試薬、及び銅イオンを含むアルカリ性の第２試薬からなる、試料中の総タンパク質測定試薬であって、水酸化リチウムを含有することを特徴とする総タンパク質測定試薬。
【請求項２】
水酸化リチウムが第２試薬に含まれる、請求項１記載の総タンパク質測定試薬。
【請求項３】
ｐＨ３〜１３の第１試薬、及び銅イオンを含むアルカリ性の第２試薬からなる試料中の総タンパク質測定試薬に、水酸化リチウムを含有させることを特徴とする、総タンパク質測定試薬の安定化方法。
【請求項４】
水酸化リチウムを第２試薬に含有させる、請求項３記載の総タンパク質測定試薬の安定化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、長期間、安定でありかつ正確に測定を行うことができる、試料中の総タンパク質を測定するための測定試薬及び総タンパク質測定試薬の安定化方法に関するものである。
本発明は、特に、化学、生命科学、分析化学及び臨床検査等の分野において有用なものである。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質は、生体組織を構成する主要な物質であり、細胞の主要構成成分である。また、血中タンパク質には、生体の膠質浸透圧の維持、酸塩基平衡の維持、代謝、栄養素や微量金属等の輸送、筋肉運動、生体防御に働く抗体作用、血液凝固作用など種々の機能のものがあり、生命の維持や活動に重要な役割を果たしている。これらタンパク質の集合体が、総タンパク質であり、血清成分の約７％を占めている。血液中のタンパク質濃度は、タンパク質の吸収異常、腎障害、肝障害、悪性腫瘍等により変動し、その測定は臨床上極めて重要とされている。
【０００３】
総タンパク質の測定方法として使用されている方法としては、Ｋｊｅｌｄａｈｌ法、屈折計法、比重から算出する方法、ビウレット法がある。Ｋｊｅｌｄａｈｌ法は窒素量を測定して総タンパク質量を算出する方法であるが、操作が繁雑でありタンパク質の種類による差が大きいという問題がある。また、屈折計法は簡便に使用できるが正確度に問題がある。
【０００４】
ビウレット法は、アルカリ溶液中でタンパク質のポリペプチド鎖を形成しているペプチド結合の窒素原子４個が銅イオンと錯体を形成し、赤紫色に発色する反応（ビウレット反応）を利用した方法であり、タンパク質の種類による発色反応に差が少ないため、日常的に広く使用されている。しかしながら、このビウレット法は、試料と１種類の試薬のみを混合して測定を行う１試薬系の方法であるため、溶血試料の影響を受け測定値に正誤差を生じるという問題があった。
【０００５】
このため、測定に必要な成分を第１試薬と第２試薬に分割して含有させることにより、上記の問題点を解消した２試薬系２波長測定のビウレット法が提案されている。
例えば、試料を銅イオンを含有する試薬（第１試薬）と反応させた後にアルカリ性の試薬（第２試薬）と反応させ、銅イオンと試料中のタンパク質との錯体を形成させ発色させる方法や（特許文献１参照。）、試料をアルカリ性の試薬（第１試薬）と混合した後に銅イオンを含有する試薬（第２試薬）と反応させ、銅イオンと試料中のタンパク質との錯体を形成させ発色させる方法等が提案されている（特許文献２参照。）。
【０００６】
しかしながら、このようなアルカリ性の試薬を使用する場合、試薬が空気に触れると、空気中の二酸化炭素（ＣＯ２ ）が試薬中に徐々に溶解し、試薬中にて炭酸（Ｈ２ＣＯ３）となり、試薬のｐＨを徐々に低下させ、これらの試薬を添加した混合液のｐＨも低下してしまい、試薬又は混合液の内容成分の変性若しくは分解又は効力の低下が生じ、試薬又は混合液が使用できなくなってしまう。
【０００７】
また、臨床検査試薬は、自動分析装置により行われる測定において複数の試薬より構成される試薬群の形態にて使用されることが多く、この測定時には冷温（約２〜１０℃）ではあるものの開封され空気に触れた状態で使用される。
この自動分析装置の試薬保冷庫に置かれた試薬群は、これらの容器に収容された試薬を使いきるまで、１〜２週間以上、長い場合には１カ月程、開封状態のまま空気に触れた状態で使用される。
【０００８】
例えば、この開封状態のまま空気に触れた状態にて総タンパク質測定試薬を使用すると、空気中の二酸化炭素が徐々に溶解して試薬のｐＨが経時的に低下し、この総タンパク質測定試薬の混合液（最終反応液）のｐＨも徐々に低下してしまう。
このため、このようなｐＨの低下した試薬を使用して、試料中の総タンパク質を測定した場合には、使用開始時に比べて測定値が低下してしまうという問題点があった。
このように、正確な測定値が得られなくなることは、疾病の診断を誤らせることにもつながる重大な問題であり、その解決が望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開平１０−１９８９８号公報
【特許文献２】特開２００４−２５８０２５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従って、本発明の課題は、ビウレット反応を利用した２試薬系の総タンパク質の測定系において、保存安定性を向上させることにより、長期間安定かつ正確に試料中の総タンパク質を測定できる測定試薬を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、上記課題の解決を目指して鋭意検討を行った結果、ビウレット反応を利用した２試薬系の総タンパク質測定試薬において、ｐＨ３〜１３の第１試薬、及び銅イオンを含有するアルカリ性の第２試薬に、水酸化リチウムを含有させることにより、開封され空気に触れた状態においても、ｐＨの低下による試薬又は混合液の内容成分の変性若しくは分解又は効力の低下が生じることなく、長期間安定かつ正確に試料中の総タンパク質を測定できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち、本発明は、以下の発明を提供する。
（１）  ｐＨ３〜１３の第１試薬、及び銅イオンを含むアルカリ性の第２試薬からなる、試料中の総タンパク質測定試薬であって、水酸化リチウムを含有することを特徴とする総タンパク質測定試薬。
（２）  水酸化リチウムが第２試薬に含まれる、前記（１）記載の総タンパク質測定試薬。
（３）  ｐＨ３〜１３の第１試薬、及び銅イオンを含むアルカリ性の第２試薬からなる試料中の総タンパク質測定試薬に、水酸化リチウムを含有させることを特徴とする、総タンパク質測定試薬の安定化方法。  
（４）  水酸化リチウムを第２試薬に含有させる、前記（３）記載の総タンパク質測定試薬の安定化方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の測定試薬は、ｐＨ３〜１３の第１試薬、及び銅イオンを含むアルカリ性の第２試薬からなる試料中の総タンパク質測定試薬に、水酸化リチウムを含有させることにより、その保存安定性を向上させた総タンパク質測定試薬である。
また、本発明の総タンパク質測定試薬の安定化方法は、長期間正確な測定値を得ることができる方法である。
そして、これにより、疾患の診断等の場において、誤差を含まない、かつ正確な総タンパク質の測定値を提供することができるものである。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】総タンパク質測定試薬における各種塩基性物質の効果を確認した図である。
【図２】総タンパク質測定試薬における各種塩基性物質の効果を確認した図である。
【図３】総タンパク質測定試薬における各種塩基性物質の効果を確認した図である。
【図４】本発明の総タンパク質測定試薬の冷温保存時の安定性を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明を詳細に説明するが、以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明はこの実施の形態に限定されるものではない。また、本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施することができる。
【００１６】
〔１〕  測定試薬
本発明は、ｐＨ３〜１３の第１試薬、及び銅イオンを含むアルカリ性の第２試薬からなる、試料中の総タンパク質測定試薬であって、水酸化リチウムを含有することを特徴とする、総タンパク質測定試薬である。
【００１７】
１．  第１試薬
本発明の総タンパク質測定試薬の第１試薬は、ｐＨ３〜１３の第１試薬である。また、本発明の第１試薬のｐＨは、ｐＨ３〜７の範囲にあることが好ましい。
また、前記のｐＨ範囲となるように使用する緩衝剤としては、前記のｐＨ範囲に緩衝能がある従来公知の緩衝剤を適宜使用することができる。
このような緩衝剤として使用できるものとしては、例えば、リン酸、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、イミダゾール、グリシルグリシン、ＭＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＡＤＡ、ＡＣＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓプロパン、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＭＯＰＳ、ＢＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＴＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＴＡＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＰＳ、ＨＥＰＰＳＯ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、若しくはＴＡＰＳ又はこれらの塩等の各緩衝剤を挙げることができる。
【００１８】
また、本発明の総タンパク質測定試薬の第１試薬には、ビリルビンの影響を回避する目的のため、ビリルビンをあらかじめビリベルジンに変化させる物質として酸化剤等を含有させても良い。
ここで、酸化剤としては、例えば、フェリシアン化物、フェロシアン化物、硝酸塩、亜硝酸塩、過ヨウ素酸塩、過硫酸塩等を用いることができる。
【００１９】
２．  第２試薬
本発明の総タンパク質測定試薬の第２試薬は、銅イオンを含有するアルカリ性のものである。
【００２０】
（１）  銅イオン
本発明において銅イオンとしては、Ｃｕ２＋等を挙げることができる。本発明の総タンパク質測定試薬の第２試薬には、この銅イオンを含有させる。
この銅イオンを含有させることであるが、例えば、硫酸銅、塩化銅、硝酸銅、ＥＤＴＡ銅等の銅塩を含有させることにより達成できる。
この銅イオンの濃度は、第２試薬中において、４〜３００ｍＭの範囲にあることが好ましく、２０〜１５０ｍＭの範囲が特に好ましい。
また、この銅イオンの濃度は、試料、第１試薬及び第２試薬を混合した最終反応液中において、１〜１００ｍＭの範囲にあることが好ましく、５〜５０ｍＭの範囲が特に好ましい。
【００２１】
（２）  ｐＨ
本発明の総タンパク質測定試薬の第２試薬は、アルカリ性のものである。
なお、本発明の総タンパク質測定試薬は、アルカリ性下で銅イオンと試料中のタンパク質との錯体を形成させ発色させるビウレット反応を利用した測定試薬であり、本発明の測定試薬の第１試薬はｐＨ３〜１３のものであるので、第２試薬のｐＨは、試料と第１試薬と第２試薬を混合させた最終反応液のｐＨが、ビウレット反応を起こすようなｐＨ範囲にする必要がある。通常、ビウレット反応はｐＨ１３以上で起こるものであるので、本発明の試料中の総タンパク質測定試薬の第２試薬は、ｐＨ１３以上とするのが好ましい。
また、本発明の総タンパク質測定試薬の第２試薬を前記のｐＨ範囲に調整する場合は、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化リチウム、水酸化カリウム等の塩基性物質等を水等の水系溶媒に溶解する等により行うことができる。なお、本発明においては、測定試薬に水酸化リチウムを含有させるため、この水酸化リチウムをｐＨの調整に使用することが可能である。
さらに、前記のｐＨ範囲となるように使用する緩衝剤としては、前記のｐＨ範囲に緩衝能がある従来公知の緩衝剤を適宜使用することができる。
このような緩衝剤として使用できるものとしては、例えば、リン酸、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、イミダゾール、グリシルグリシン、ＭＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＡＤＡ、ＡＣＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓプロパン、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＭＯＰＳ、ＢＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＴＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＴＡＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＰＳ、ＨＥＰＰＳＯ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＴＡＰＳ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳＯ、若しくはＣＡＰＳ又はこれらの塩等の各緩衝剤を挙げることができる。
【００２２】
（３）  キレート能力を持つ物質
また、本発明の総タンパク質測定試薬の第２試薬には、銅イオンにキレート能力を持つ物質を含有させてもよい。ここで、銅イオンにキレート能力を持つ物質は、アルカリ性下で銅イオンにキレート能力を持つ物質であれば、最終反応液中でも銅水酸化物が生じず安定的に測定が行えるので好適である。
ここで、アルカリ性下で銅イオンにキレート能力を持つ物質としては、例えば、酒石酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジアミノシクロヘキサン四酢酸（ＣｙＤＴＡ）、ジヒドロキシエチルグリシン（ＤＨＥＧ）、エチレンジアミン二酢酸（ＥＤＤＡ）、グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＧＥＤＴＡ）、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸（ＨＩＤＡ）、イミノ二酢酸（ＩＤＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、若しくはニトリロ三プロピオン酸（ＮＴＰ）又はその塩等を挙げることができる。
【００２３】
３．  水酸化リチウム
本発明の総タンパク質測定試薬は、水酸化リチウムを含有する。本発明において、水酸化リチウムとしては、水酸化リチウム又はその水和物を挙げることができる。
また、この水酸化リチウムの濃度は、試料、第１試薬及び第２試薬を混合した最終反応液中において、１５０〜２０００ｍＭの範囲にあることが好ましく、４００〜１６００ｍＭの範囲が特に好ましい。
なお、この水酸化リチウムは、混合後の最終反応液中の濃度が上記濃度範囲に入るのであれば、第１試薬又は第２試薬のいずれに含有させてもよく、第１試薬と第２試薬の両方に含有させてもよいが、第２試薬に含有させることが好ましい。
なお、本発明において、水酸化リチウムを第２試薬に含有させる場合、第２試薬のｐＨをアルカリ性に調整するために、水酸化リチウムに加えて、さらに水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等の塩基性物質を含有させることもできる。
また、この場合、水酸化リチウムの濃度を、塩基性物質（水酸化リチウム、水酸化ナトリウム及び／又は水酸化カリウム）の合計濃度の４０％以上となるように調整することが好ましい。
【００２４】
４．  測定試薬等の構成成分
本発明の総タンパク質測定試薬において、第１試薬及び／又は第２試薬には前記の成分の他に、公知の防腐剤、安定化剤、又は界面活性剤等を必要に応じて適宜使用することができる。
【００２５】
５．  液状試薬
本発明の総タンパク質測定試薬においては、第１試薬、第２試薬、又は第１試薬と第２試薬の両方が、溶液よりなる試薬、すなわち液状試薬である場合に好適である。
特に、第１試薬及び第２試薬が液状試薬である場合に好適である。
【００２６】
６．  試料
本発明において、試料とは、試料中の総タンパク質濃度の測定を行おうとするもののことであり、このようなものであれば特に限定されない。
このような試料としては、例えば、ヒト又は動物の血液、血清、血漿、尿、髄液、唾液、汗等の体液、ヒト若しくは動物の腎臓、心臓、肺、脳等の臓器等の抽出液；骨格筋、骨髄、皮膚、又は神経組織等の抽出液；毛髪等の抽出液、ヒト又は動物の糞便の抽出液又は懸濁液；細胞の抽出液等が挙げられる。
【００２７】
〔２〕  総タンパク質測定試薬の安定化方法
本発明の総タンパク質測定試薬の安定化方法は、ｐＨ３〜１３の第１試薬、及び銅イオンを含むアルカリ性の第２試薬からなる試料中の総タンパク質測定試薬に、水酸化リチウムを含有させることを特徴とするものである。
【００２８】
なお、本発明の総タンパク質測定試薬の安定化方法における、総タンパク質測定試薬の詳細については、前記「〔１〕測定試薬」に記載したとおりである。
【００２９】
そして、本発明の総タンパク質測定試薬の安定化方法は、上記の構成により、開封され空気に触れた状態においても、ｐＨの低下による測定試薬の変性若しくは分解又は効力の低下を抑制することができる方法である。
【実施例】
【００３０】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【００３１】
〔参考例１〕（総タンパク質測定試薬における各種塩基性物質の効果の確認）
各種塩基性物質を総タンパク質測定試薬に含有させた場合のｐＨの低下に対する効果を確認した。
【００３２】
１．  測定試薬の調製
（１）  第１試薬の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを５．８（２０℃）に調整し、総タンパク質測定試薬の第１試薬を調製した。
クエン酸１水和物  ４５ｍＭ
Ｌ−酒石酸  ３００ｍＭ
界面活性剤  ０．０１％
【００３３】
（２）  第２試薬Ａの調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、総タンパク質測定試薬の第２試薬Ａを調製した。
硫酸銅５水和物  ４０ｍＭ
酒石酸ナトリウムカリウム（４水塩）  ３６０ｍＭ
水酸化リチウム１水和物  ７３２ｍＭ
水酸化ナトリウム  ７３２ｍＭ
水酸化カリウム  １６４７ｍＭ
【００３４】
（３）  第２試薬Ｂの調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、総タンパク質測定試薬の第２試薬Ｂを調製した。
硫酸銅５水和物  ４０ｍＭ
酒石酸ナトリウムカリウム（４水塩）  ３６０ｍＭ
水酸化リチウム１水和物  １２８１ｍＭ
水酸化ナトリウム  ５６３ｍＭ
水酸化カリウム  １２６７ｍＭ
【００３５】
（４）  第２試薬Ｃの調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、総タンパク質測定試薬の第２試薬Ｃを調製した。
硫酸銅５水和物  ４０ｍＭ
酒石酸ナトリウムカリウム（４水塩）  ３６０ｍＭ
水酸化リチウム１水和物  ５６３ｍＭ
水酸化ナトリウム  １２８１ｍＭ
水酸化カリウム  １２６７ｍＭ
【００３６】
（５）  第２試薬Ｄの調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、総タンパク質測定試薬の第２試薬Ｄを調製した。
硫酸銅５水和物  ４０ｍＭ
酒石酸ナトリウムカリウム（４水塩）  ３６０ｍＭ
水酸化リチウム１水和物  ５６３ｍＭ
水酸化ナトリウム  ５６３ｍＭ
水酸化カリウム  １９８５ｍＭ
【００３７】
また、前記した第２試薬Ａ〜Ｄの各試薬中の各塩基性物質の添加濃度及び合計濃度を表１に示した。なお、表１に示した値は、各第２試薬中の各塩基性物質の濃度を示したものであり、カッコ内の数値は、塩基性物質の合計濃度に対する相対比率を表したものである。
【００３８】
【表１】
2020115112.tif 000002
【００３９】
２．  試料
試料として、市販標準血清である「ＴＰ／ＡＬＢ標準血清」（販売元：株式会社シノテスト）を使用した。
【００４０】
３．  試料中の総タンパク質の測定
前記２の試料中の総タンパク質濃度を、前記１で調製した第１試薬及び第２試薬Ａにて測定した。
総タンパク質濃度の測定は、７１８０形汎用自動分析装置（販売元：株式会社日立ハイテクノロジーズ）にて行い、試料３．８μＬに前記１の（１）で調製した第１試薬１５０μＬを添加して、混和後３７℃で５分間反応させた後、前記１の（２）で調製した本発明・第２試薬Ａ７５μＬを添加し、３７℃で５分間反応させた。第１試薬添加後２７０．１秒目（１６ポイント目）と第２試薬添加後３０８．４秒目（３４ポイント目）の主波長５４６ｎｍ及び副波長７００ｎｍにおける吸光度を測定し、その差を求めた。
また、第２試薬に０、１．５、３、４．５及び６Ｎの塩酸を添加することによってｐＨを下げた場合の試料の測定値の変動を確認した。また、塩酸を添加した第２試薬のｐＨをそれぞれ測定した。
さらに、第２試薬を前記１の（３）〜（５）で調製した第２試薬Ｂ〜Ｄに変えて同様に測定を行った。
【００４１】
４．  測定結果
前記３の測定結果を図１に示した。なお、この図１において、横軸は「ｐＨ差」（１．５、３、４．５及び６Ｎの塩酸を添加した際のｐＨからそれぞれ、塩酸添加なし（０）のｐＨを差し引いたｐＨ差）を示し、縦軸は「吸光度差」（単位：吸光度×１００００）を示す。
【００４２】
図１から明らかなように、第２試薬Ａ、Ｃ及びＤを使用した場合、試薬のｐＨの低下に従って、吸光度が低くなっていくことが分かる。これに対して、第２試薬Ｂを使用した場合、試薬のｐＨの低下に対する吸光度の低下が緩やかとなっていることが分かる。
【００４３】
表１に示したとおり、第２試薬中の塩基性物質の合計濃度は、第２試薬Ａ〜Ｄのいずれも３１１１ｍＭである。また、第２試薬Ｂにおいては、塩基性物質の合計濃度に対する水酸化リチウムの比率が４１．２％となっており、第２試薬Ａ、Ｃ及びＤにおける水酸化リチウムの比率よりも高くなっている。
すなわち、ｐＨの低下に対する吸光度の変化量を小さくする効果があるのは、第２試薬中の水酸化リチウムであることが示唆された。
【００４４】
〔参考例２〕（総タンパク質測定試薬における各種塩基性物質の効果の確認）
各種塩基性物質を総タンパク質測定試薬に含有させた場合のｐＨの低下に対する効果を確認した。
【００４５】
１．  測定試薬の調製
（１）  第１試薬の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを５．８（２０℃）に調整し、総タンパク質測定試薬の第１試薬を調製した。
クエン酸１水和物  ４５ｍＭ
Ｌ−酒石酸  １００ｍＭ
界面活性剤  ０．０１％
【００４６】
（２）  第２試薬Ｅの調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、総タンパク質測定試薬の第２試薬Ｅを調製した。
硫酸銅５水和物  ４０ｍＭ
酒石酸ナトリウムカリウム（４水塩）  ３６０ｍＭ
水酸化リチウム１水和物  ２５００ｍＭ
【００４７】
（３）  第２試薬Ｆの調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、総タンパク質測定試薬の第２試薬Ｆを調製した。
硫酸銅５水和物  ４０ｍＭ
酒石酸ナトリウムカリウム（４水塩）  ３６０ｍＭ
水酸化ナトリウム  ２５００ｍＭ
【００４８】
（４）  第２試薬Ｇの調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、総タンパク質測定試薬の第２試薬Ｇを調製した。
硫酸銅５水和物  ４０ｍＭ
酒石酸ナトリウムカリウム（４水塩）  ３６０ｍＭ
水酸化カリウム  ２５００ｍＭ
【００４９】
２．  試料
試料として、市販標準血清である「ＴＰ／ＡＬＢ標準血清」（販売元：株式会社シノテスト）を使用した。
【００５０】
３．  試料中の総タンパク質の測定
前記２の試料中の総タンパク質濃度を、前記１で調製した第１試薬及び第２試薬Ｅにて測定した。
総タンパク質濃度の測定は、７１８０形汎用自動分析装置（販売元：株式会社日立ハイテクノロジーズ）にて参考例１の３と同様にして行った。
また、第２試薬に０、１．５、３、４．５及び６Ｎの塩酸を添加することによってｐＨを下げた場合の試料の測定値の変動を確認した。また、各濃度の塩酸を添加した第２試薬のｐＨをそれぞれ測定した。
さらに、第２試薬を前記１の（３）及び（４）で調製した第２試薬Ｆ及びＧに変えて同様に測定を行った。
【００５１】
４．  測定結果
前記３の測定結果を図２に示した。なお、この図２において、横軸は「ｐＨ差」（０、１．５、３、４．５及び６Ｎの塩酸を添加した際のｐＨからそれぞれ、塩酸添加なし（０）のｐＨを差し引いたｐＨ差）を示し、縦軸は「吸光度差」（単位：吸光度×１００００）を示す。
【００５２】
図２から明らかなように、第２試薬Ｆ及びＧを使用した場合、試薬のｐＨの低下に従って、吸光度が急激に低くなっていくことが分かる。これに対して、第２試薬中に水酸化リチウムを添加した第２試薬Ｅを使用した場合、試薬のｐＨの低下に対する吸光度の低下が緩やかとなっていることが分かる。
【００５３】
本参考例において、第２試薬中の塩基性物質（水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、又は水酸化リチウム）の濃度は、第２試薬Ｅ〜Ｇのいずれも２５００ｍＭである。
すなわち、ｐＨの低下に対する吸光度の変化量を小さくする効果があるのは、第２試薬中の水酸化リチウムであることが確認された。
【００５４】
〔参考例３〕（総タンパク質測定試薬における各種塩基性物質の効果の確認）
各種塩基性物質を総タンパク質測定試薬に含有させた場合のｐＨの低下に対する効果を確認した。
【００５５】
１．  測定試薬の調製
（１）  第１試薬の調製
参考例１の１の（１）で調製した第１試薬をそのまま使用した。
【００５６】
（２）  第２試薬Ｈの調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、総タンパク質測定試薬の第２試薬Ｈを調製した。
硫酸銅５水和物  ４０ｍＭ
酒石酸ナトリウムカリウム（４水塩）  ３６０ｍＭ
水酸化リチウム１水和物  ５６３ｍＭ
水酸化ナトリウム  ５６３ｍＭ
水酸化カリウム  １２６７ｍＭ
【００５７】
（３）  第２試薬Ｉの調製
前記（２）の第２試薬Ｈの水酸化リチウム１水和物の濃度を１２８１ｍＭとすること以外は、前記（２）の試薬成分及び濃度の通りに第２試薬Ｉの調製を行った。
【００５８】
（４）  第２試薬Ｊの調製
前記（２）の第２試薬Ｈの水酸化リチウム１水和物の濃度を１６０１ｍＭとすること以外は、前記（２）の試薬成分及び濃度の通りに第２試薬Ｊの調製を行った。
【００５９】
（５）  第２試薬Ｋの調製
前記（２）の第２試薬Ｈの水酸化リチウム１水和物の濃度を２００２ｍＭとすること以外は、前記（２）の試薬成分及び濃度の通りに第２試薬Ｋの調製を行った。
【００６０】
また、前記した第２試薬Ｈ〜Ｋの各試薬中の各塩基性物質の添加濃度及び合計濃度を表２に示した。なお、表２に示した値は、各第２試薬中の各塩基性物質の濃度を示したものであり、カッコ内の数値は、塩基性物質の合計濃度に対する相対比率を表したものである。
【００６１】
【表２】
2020115112.tif 000003
【００６２】
２．  試料
試料として、市販標準血清である「ＴＰ／ＡＬＢ標準血清」（販売元：株式会社シノテスト）を使用した。
【００６３】
３．  試料中の総タンパク質の測定
前記２の試料中の総タンパク質濃度を、前記１で調製した第１試薬及び第２試薬Ｈにて参考例１の３と同様にして測定を行った。
また、第２試薬に０、１．５、３、４．５及び６Ｎの塩酸を添加することによってｐＨを下げた場合の試料の測定値の変動を確認した。また、塩酸を添加した第２試薬のｐＨをそれぞれ測定した。
さらに、第２試薬を前記１の（３）〜（５）で調製した第２試薬Ｉ〜Ｋに変えて同様に測定を行った。
【００６４】
４．  測定結果
前記３の測定結果を図３に示した。なお、この図３において、横軸は「ｐＨ差」（０、１．５、３、４．５及び６Ｎの塩酸を添加した際のｐＨからそれぞれ、塩酸添加なし（０）のｐＨを差し引いたｐＨ差）を示し、縦軸は「吸光度差」（単位：吸光度×１００００）を示す。
【００６５】
図３から明らかなように、第２試薬Ｈを使用した場合は、試薬のｐＨの低下に対する吸光度の変化量が大きいことが分かる。これに対して、第２試薬中の水酸化リチウムの濃度を増加させた第２試薬Ｉ〜Ｋは、試薬のｐＨの低下に対する吸光度の変化量が小さくなっていることが分かる。また、第２試薬中の水酸化リチウムの濃度が高くなるにつれて、ｐＨの低下に対する吸光度の変化量が小さくなっていることが分かる。
【００６６】
すなわち、水酸化リチウムは、試薬のｐＨの低下に対する吸光度の変化量を小さくする効果があること、試薬中の水酸化リチウムの濃度を増加させることで、ｐＨが低下しても吸光度の変化量を小さくでき、試薬を安定化できることが示唆された。
【００６７】
〔実施例１〕（本発明の総タンパク質測定試薬の開封後の安定性の確認）
本発明の試料中の総タンパク質測定試薬を開封状態で保存し、保存時の安定性の確認を行った。
【００６８】
１．  測定試薬の調製
（１）  第１試薬の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを５．８（２０℃）に調整し、総タンパク質測定試薬の第１試薬を調製した。
クエン酸１水和物  ４５ｍＭ
Ｌ−酒石酸  ３００ｍＭ
界面活性剤  ０．０１％
【００６９】
（２）  本発明・第２試薬ａの調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、総タンパク質測定試薬の第２試薬（本発明・第２試薬ａ）を調製した。
硫酸銅５水和物  ４０ｍＭ
酒石酸ナトリウムカリウム（４水塩）  ３６０ｍＭ
水酸化リチウム１水和物  １６００ｍＭ
水酸化ナトリウム  ５６３ｍＭ
水酸化カリウム  １２６７ｍＭ
【００７０】
（３）  本発明・第２試薬ｂの調製
前記（２）の本発明・第２試薬ａの水酸化リチウム１水和物の濃度を２０００ｍＭとすること以外は、前記（２）の試薬成分及び濃度の通りに本発明・第２試薬ｂの調製を行った。
【００７１】
（４）  対照・第２試薬の調製
前記（２）の本発明・第２試薬ａの水酸化リチウム１水和物の濃度を５６３ｍＭとすること以外は、前記（２）の試薬成分及び濃度の通りに対照・第２試薬の調製を行った。
【００７２】
また、前記した本発明・第２試薬ａ及びｂ、対照・第２試薬の各試薬中の各塩基性物質の添加濃度及び合計濃度を表３に示した。なお、表３に示した値は、各第２試薬中の各塩基性物質の濃度を示したものであり、カッコ内の数値は、塩基性物質の合計濃度に対する相対比率を表したものである。
【００７３】
【表３】
2020115112.tif 000004
【００７４】
２．  試料
試料として、市販標準血清である「ＴＰ／ＡＬＢ標準血清」（販売元：株式会社シノテスト）を使用した。
【００７５】
３．  試料中の総タンパク質の測定
前記２の試料中の総タンパク質濃度を、前記１で調製した第１試薬及び本発明・第２試薬ａにて参考例１の３と同様にして測定を行った。
また、試薬ボトルの蓋を開けた状態で、自動分析装置の試薬庫に静置し、保存開始時（０日）、７日後、１５日後、２１日後、２８日後、及び３５日後の試料の測定値の変動を確認した。
さらに、第２試薬を前記１の（３）及び（４）で調製した本発明・第２試薬ｂ及び対照・第２試薬に変えて同様に測定を行った。
【００７６】
４．  測定結果
前記３の測定結果を表４及び図３に示した。なお、表４に示した値は、測定で得られた吸光度差を１０，０００倍した値であり、カッコ内の数値はその測定値の保存開始時（０日）の測定値に対する相対比率を表したものである。また、この図３において、横軸は「保存期間（日）」を示し、縦軸は「相対比率」を示す。
【００７７】
【表４】
2020115112.tif 000005
【００７８】
表４及び図３から明らかなように、対照・第２試薬では、保存２１日後以降、徐々に測定値が低下してしまっていることが分かる。
【００７９】
これに対して、本発明・第２試薬ａ及びｂでは、保存３５日後でも測定値の変動は見られない。
【００８０】
このように、総タンパク質測定試薬に水酸化リチウムを含有させることにより、試薬が開封され空気に触れた状態で保存した場合でも、安定的に測定を行うことができることが分かる。
【００８１】
これらのことより、本発明の総タンパク質測定試薬による測定では、長期間安定かつ正確に試料中の総タンパク質の測定を行えることが確かめられた。
【図１】
2020115112.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４】
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