(57)【要約】      （修正有）【課題】大量の抗体産生細胞について、短時間で効率良く簡便に抗体のスクリーニングを可能とする新たな方法を提供する。【解決手段】標的抗原に対する抗体のスクリーニング方法であり、液滴を形成する液滴形成工程、染色検出工程、および標的抗原に結合する抗体を産生する抗体産生細胞を選択する選択工程を含み、前記液滴形成工程において、前記液滴は、抗体産生細胞、エフェクター細胞、染色された標的細胞、および液体を含み、前記標的細胞は、染色物質が導入され且つ標的抗原を発現する細胞であり、前記染色検出工程において、形成した前記液滴の染色を検出し、前記選択工程において、前記液滴の内部全体に染色が確認された場合、前記液滴に含まれる前記抗体産生細胞を、前記標的抗原に結合する抗体を産生する抗体産生細胞として選択することを特徴とする。【選択図】図１
2020039288.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
液滴を形成する液滴形成工程、
染色検出工程、および
標的抗原に結合する抗体を産生する抗体産生細胞を選択する選択工程を含み、
前記液滴形成工程において、
前記液滴は、抗体産生細胞、エフェクター細胞、染色された標的細胞、および液体を含み、
前記標的細胞は、染色物質が導入され且つ標的抗原を発現する細胞であり、
前記染色検出工程において、
形成した前記液滴の染色を検出し、
前記選択工程において、
前記液滴の内部全体に染色が確認された場合、前記液滴に含まれる前記抗体産生細胞を、前記標的抗原に結合する抗体を産生する抗体産生細胞として選択することを特徴とする標的抗原に対する抗体のスクリーニング方法。
【請求項２】
前記液滴において、前記液体が、さらに、前記染色物質を含む、請求項１記載の抗体のスクリーニング方法。
【請求項３】
さらに、前記形成した液滴をインキュベートするインキュベート工程を含む、請求項１または２記載の抗体のスクリーニング方法。
【請求項４】
前記液体が、液体培地である、請求項１から３のいずれか一項に記載の抗体のスクリーニング方法。
【請求項５】
前記抗体産生細胞が、ハイブリドーマ、およびＢ細胞の少なくとも一方の細胞である、請求項１から４のいずれか一項に記載の抗体のスクリーニング方法。
【請求項６】
前記エフェクター細胞が、細胞傷害性細胞である、請求項１から５のいずれか一項に記載の抗体のスクリーニング方法。
【請求項７】
前記エフェクター細胞が、ＮＫ細胞、およびマクロファージの少なくとも一方の細胞である、請求項１から６のいずれか一項に記載の抗体のスクリーニング方法。
【請求項８】
前記染色物質が、蛍光物質であり、
前記染色検出工程において、前記液滴の蛍光を検出する、請求項１から７のいずれか一項に記載の抗体のスクリーニング方法。
【請求項９】
前記蛍光物質が、Ｃａｌｃｅｉｎ  ＡＭ、ＢＣＥＣＦ−ＡＭ、ＣＦＳＥ、ＣｙｔｏＲｅｄ、およびＦＤＡからなる群から選択された物質である、請求項８記載の抗体のスクリーニング方法。
【請求項１０】
前記液滴の直径が、６０〜１２０μｍである、請求項１から９のいずれか一項に記載の抗体のスクリーニング方法。
【請求項１１】
前記液滴の体積が、１００〜１０００ｐＬである、請求項１から１０のいずれか一項に記載の抗体のスクリーニング方法。
【請求項１２】
前記液滴形成工程において、前記液滴を含むエマルションを形成する、請求項１から１１のいずれか一項に記載の抗体のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的抗原に対する抗体の抗体スクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
標的抗原に結合する抗体のスクリーニングは、抗体医薬品の開発において極めて重要である。スクリーニングの一般的な方法としては、例えば、ハイブリドーマから産生された抗体をスクリーニング対象の一次抗体とし、プレートのウェル内で、固定化した標的抗原と前記一次抗体とを反応させ、さらに、ＩｇＧに結合する標識化二次抗体を添加した後、前記ウェルを洗浄する。そして、前記ウェルについて、前記標識化二次抗体の標識物質を検出することによって、前記一次抗体が、固定化された標的抗原に結合する抗体か否かを評価できる（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Nature.  1975  Aug  7;256(5517):495-7.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、標的抗原に対する抗体をスクリーニングするには、まず前記標的抗原で免疫した抗体産生細胞がライブラリーとして大量に得られるものの、一つ一つの抗体産生細胞から抗体を精製し、標的抗原との結合および標的抗原を発現している細胞への作用の有無を、同時に確認するには、時間、コスト、および労力のいずれをも必要となり、全てについてのスクリーニングは、困難である。特に、特異性を示す抗体の作製が困難である標的抗原については、大量の抗体産生細胞についてスクリーニングせざるを得ないという問題もある。
【０００５】
そこで、本発明は、例えば、大量の抗体産生細胞について、短時間で効率良く簡便に抗体のスクリーニングを可能とする新たな方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
前記目的を達成するために、本発明は、標的抗原に対する抗体のスクリーニング方法であり、
液滴を形成する液滴形成工程、
染色検出工程、および
標的抗原に結合する抗体を産生する抗体産生細胞を選択する選択工程を含み、
前記液滴形成工程において、
前記液滴は、抗体産生細胞、エフェクター細胞、染色された標的細胞（染色標的細胞）、および液体を含み、
前記標的細胞は、染色物質が導入され且つ標的抗原を発現する細胞であり、
前記染色検出工程において、
形成した前記液滴の染色を検出し、
前記選択工程において、
前記液滴の内部全体に染色が確認された場合、前記液滴に含まれる前記抗体産生細胞を、前記標的抗原に結合する抗体を産生する抗体産生細胞として選択することを特徴とする。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、例えば、大量の抗体産生細胞であっても、スクリーニングに先立って、抗体を精製することなく、短時間で効率良く簡便に、標的抗原に対する抗体のスクリーニングが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、本発明のスクリーニング方法における前記液滴の状態を示す概略図である。
【図２】図２は、１個の液滴ついて、検出点を通過する時間と蛍光強度との関係を示すグラフである。
【図３】図３は、実施例１におけるエマルション中の液滴の画像である。
【図４】図４は、実施例１における液滴の蛍光を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の抗体のスクリーニング方法は、例えば、前記液滴において、前記液体が、さらに、前記染色物質を含む。
【００１０】
本発明の抗体のスクリーニング方法は、例えば、さらに、前記形成した液滴をインキュベートするインキュベート工程を含む。
【００１１】
本発明の抗体のスクリーニング方法は、例えば、前記液体が液体培地である。
【００１２】
本発明の抗体のスクリーニング方法は、例えば、前記抗体産生細胞が、ハイブリドーマ、およびＢ細胞の少なくとも一方の細胞である。
【００１３】
本発明の抗体のスクリーニング方法は、例えば、前記エフェクター細胞が、細胞傷害性細胞である。
【００１４】
本発明の抗体のスクリーニング方法は、例えば、前記エフェクター細胞が、ＮＫ（ナチュラルキラー）細胞、およびマクロファージからなる群から選択された細胞である。
【００１５】
本発明の抗体のスクリーニング方法は、例えば、前記染色物質が、蛍光物質であり、前記染色検出工程において、前記液滴の蛍光を検出する。
【００１６】
本発明の抗体のスクリーニング方法は、例えば、前記蛍光物質が、Ｃａｌｃｅｉｎ  ＡＭ、ＢＣＥＣＦ−ＡＭ、ＣＦＳＥ、ＣｙｔｏＲｅｄ、およびＦＤＡからなる群から選択された物質である。
【００１７】
本発明の抗体のスクリーニング方法は、例えば、前記液滴の直径が６０〜１２０μｍである。
【００１８】
本発明の抗体のスクリーニング方法は、例えば、前記液滴の体積が、１００〜１０００ｐＬである。
【００１９】
本発明の抗体のスクリーニング方法は、例えば、前記液滴形成工程において、前記液滴を含むエマルションを形成する。
【００２０】
本発明の抗体のスクリーニング方法は、前記染色標的細胞を使用し、前記液滴の内部全体における染色か否かによって、前記標的抗原に対する抗体を産生する抗体産生細胞を選択することがポイントであり、その他の工程および条件は、特に制限されない。
【００２１】
本発明において、「液滴（ドロップレット）」とは、いわゆる微小液滴（マイクロドロップレット）ともいう。
【００２２】
本発明のスクリーニング方法は、以下のようなメカニズムに基づいて、前記標的抗原に結合する抗体をスクリーニングできる。
【００２３】
本発明においては、前記標的抗原に対する抗体のスクリーニングにおいて、抗体産生細胞から精製した抗体を、スクリーニング対象のサンプルとして使用するのではなく、前記抗体産生細胞そのものを、スクリーニング対象のサンプルとして使用する。さらに、前記抗体産生細胞を、前記エフェクター細胞および前記染色標的細胞とともに前記液体の液滴中に封入して、抗原抗体反応を行い、染色を検出する。このような条件とすることで、本発明は、以下のようなメカニズムに基づいて、前記抗体産生細胞から産生される抗体が、前記標的抗原に対する抗体か否かをスクリーニングすることが可能となる。このメカニズムについて、図１の模式図を用いて説明する。図１は、本発明における液滴の状態を示す概略図であって、本発明は、これには制限されない。
【００２４】
図１（Ａ）に示すように、本発明において形成される液滴１は、抗体産生細胞２、エフェクター細胞３、染色標的細胞４を含む。抗体産生細胞２は、抗体２１を発現し、これを細胞外に放出する。染色標的細胞４は、予め導入された前記染色物質により、細胞外部からの細胞の染色が検出可能であり、また、標的抗原４１を発現し、これを細胞外に提示する。
【００２５】
そして、抗体産生細胞２から産生される抗体２１が、標的抗原４１に対する抗体である場合、液滴１中で、以下のような反応が生じる。すなわち、図１（Ｂ）に示すように、まず、抗体産生細胞２で産生された抗体２１は、エフェクター細胞３の受容体３１に結合する。そして、受容体３１に結合した抗体２１が、染色標的細胞４の標的抗原４１に結合すると、エフェクター細胞３は、標的抗原４１を有する細胞に対して細胞傷害性物質３２を放出するため、標的抗原４１を有する染色標的細胞４は破壊される。染色標的細胞４が破壊されると、図１（Ｃ）に示すように、染色標的細胞４に導入されていた前記染色物質は、液滴１の全域に拡散されることになり、結果として、液滴１の全域が染色される。
【００２６】
一方、抗体産生細胞２から産生される抗体２１が、標的抗原４１に対する抗体ではない場合、前述と同様に、抗体産生細胞２で産生された抗体２１は、エフェクター細胞３の受容体３１に結合するが、その抗体２１は、染色標的細胞４の標的抗原４１には結合しない。このため、図１（Ｃ）のように、染色標的細胞４の破壊による前記染色物質の拡散も起きないため、図１（Ｄ）に示すように、液滴１において、染色された領域は、染色標的細胞４に留まることとなる。
【００２７】
液滴１の大きさ（幅Ｄ）と染色標的細胞４の大きさ（幅Ｔ）とは、液滴１に染色標的細胞４が含まれていることから明らかなように、液滴１は、染色標的細胞４よりも大きい（Ｄ＞Ｔ）。このため、液滴１について染色を検出し、液滴１における染色の領域が、液滴１の全域か否かを判断することによって、液滴１中の抗体産生細胞２が、標的抗原４１に対する抗体を産生する細胞であるかを推定でき、その結果、標的抗原４１に対する抗体を産生する抗体産生細胞を選択できる。そして、この選択された抗体産生細胞によれば、標的抗原４１に対する抗原が産生されることから、標的抗原４１に対する抗体が選択されたことになる。
【００２８】
以下、本発明の抗体のスクリーニング方法の実施形態について、例をあげて説明する。本発明の抗体のスクリーニング方法は、下記の実施形態によって何ら限定および制限されない。なお、以下の各図において、同一部分には、同一符号を付している。
【００２９】
本発明のスクリーニング方法は、前述のように、標的抗原に対する抗体のスクリーニング方法であり、
液滴を形成する液滴形成工程、
染色検出工程、および
標的抗原に結合する抗体を産生する抗体産生細胞を選択する選択工程を含み、
前記液滴形成工程において、
前記液滴は、抗体産生細胞、エフェクター細胞、染色された標的細胞、およびを含み、
前記標的細胞は、染色物質が導入され且つ標的抗原を発現する細胞であり、
前記染色検出工程において、
形成した前記液滴の染色を検出し、
前記選択工程において、
前記液滴の内部全体に染色が確認された場合、前記液滴に含まれる前記抗体産生細胞を、前記標的抗原に結合する抗体を産生する抗体産生細胞として選択することを特徴とする。
【００３０】
前記抗体産生細胞は、抗体を産生する細胞であれば、特に制限されず、具体例として、ハイブリドーマ、Ｂ細胞等である。Ｂ細胞は、例えば、プラズマ細胞が好ましい。本発明は、標的抗原に結合する抗体のスクリーニングであることから、前記抗体産生細胞として、例えば、後述するように、前記標的抗原のエピトープを免疫して得られたライブラリーが使用できる。
【００３１】
前記エフェクター細胞は、特に制限されず、例えば、細胞傷害性物質を放出する細胞傷害性細胞等があげられる。前記細胞傷害性細胞は、例えば、抗体（例えば、抗体のＦｃ部位）が結合する活性化受容体を有し、抗体の結合により活性化され、前記細胞傷害性物質を放出する。前記エフェクター細胞の具体例としてＮＫ細胞、マクロファージ等の細胞傷害性リンパ球等があげられる。前記細胞傷害性物質は、特に制限されず、例えば、セリンプロテアーゼ、パーフォリン、グランザイム等である。
【００３２】
前記染色標的細胞は、前述のように、染色物質が導入され且つ標的抗原を発現する細胞である。前記染色標的細胞は、例えば、標的抗原を発現する標的細胞に、前記染色物質を導入することで調製できる。前記染色物質は、特に制限されず、細胞内に導入され、細胞外から検出可能に細胞を染色する物質であればよい。前記染色物質は、例えば、細胞内に導入され、前記細胞内の酵素（例えば、エステラーゼ等）で分解されることにより、前記細胞を発色する物質でもよく、生細胞検出用の染色物質等が利用できる。前記染色の種類は、特に制限されず、蛍光、発光、発色等のいずれもよく、前記染色物質は、例えば、蛍光物質、発光物質、発色物質等である。前記蛍光物質は、例えば、以下に列挙する物質等があげられる。細胞１個あたりに導入する前記染色物質の量は、特に制限されず、例えば、前記染色物質の染色による前記細胞の染色が、検出可能であれよく、前記染色物質の種類、染色対象の前記標的細胞の種類に応じて、適宜決定できる。
Ｃａｌｃｅｉｎ  ＡＭ（アセトキシメチルエステル化カルセイン）：  化学名3',6'-Di(O-acetyl)-4',5'-bis[N,N-bis(carboxymethyl)aminomethyl]fluorescein, tetraacetoxymethyl ester
ＢＣＥＣＦ−ＡＭ（アセトキシメチルエステル化ＢＣＥＣＦ）：  化学名3'-O-Acetyl-2',7'-bis(carboxyethyl)-4 or 5-carboxyfluorescein, diacetoxymethyl ester
ＣＦＳＥ：  化学名5- or 6-（N-Succinimidyloxycarbonyl)fluorescein 3’,6’-diacetate
ＣｙｔｏＲｅｄ：  化学名7-Isobutyloxycarbonyloxy-3H-phenoxazin-3-one
ＦＤＡ：  化学名Fluorescein diacetate
【００３３】
前記標的抗原を発現する標的細胞は、例えば、細胞に、前記標的抗原のコード遺伝子を有する発現ベクターを導入することで調製できる。前記発現ベクターは、特に制限されず、前記標的抗原を、細胞表面（例えば、細胞膜表面）において細胞外に提示し且つ過剰発現するベクターが好ましい。
【００３４】
前記標的抗原の種類は、何ら制限されず、抗体の取得が求められる任意の抗原を設定できる。前記標的抗原は、前述のように、前記標的細胞の細胞表面において細胞外に提示するように発現できればよい。この場合、前記標的抗原は、例えば、本来、膜タンパク質であるタンパク質でもよいし、本来、非膜タンパクであるタンパク質でもよい。前記標的抗原が前記膜タンパク質の場合、例えば、前記膜タンパク質のコード遺伝子を組み込んだ発現ベクターを、前記標的細胞に導入し、前記標的細胞において前記コード遺伝子を発現させれば、前記細胞表面に前記膜タンパク質を提示することができる。他方、前記非膜タンパク質であっても、例えば、前記発現ベクターにおいて、前記標的細胞の細胞表面に発現するように改変することで、前記標的細胞の細胞表面に発現させることもできる。
【００３５】
前記液滴における液体は、例えば、後述するドロップレット形成方法における分散媒である。前記液滴において、前記液体は、例えば、さらに前記染色物質を含んでもよく、この場合、前記染色物質は、例えば、細胞内の酵素で分解されることにより、色（例えば、蛍光、発光、発色等）を呈する物質が好ましい。前述のように、抗体産生細胞２から産生される抗体２１が、標的抗原４１に対する抗体である場合、染色標的細胞４の標的抗原４１に抗体２１が結合すると、標的抗原４１を有する染色標的細胞４は破壊され、その結果、染色標的細胞４に導入されていた前記染色物質が、液滴１の全域に拡散され、結果として、液滴１の全域が染色される。この際、液滴１の液体が、さらに前記染色物質を含むと、例えば、染色標的細胞４の破壊により、染色標的細胞４内の酵素が細胞外に漏れだすため、この酵素によって、液滴１の液体内に含まれていた前記染色物質が分解され、液体１の全体が染色される。このように、前記液体における液体がさらに前記染色物質を含むことによって、より効率良い染色が可能となる。
【００３６】
前記液滴形成工程において、前記液滴の形成方法は、特に制限されず、例えば、公知のドロップレット形成方法が採用できる。前記ドロップレット形成方法は、例えば、前記液滴が分散されたエマルションの形成方法があげられる。前記エマルションの形成方法は、例えば、分散媒となる液体に、分散質となる液体を接触させる方法であり、これによって、前記分散媒に液滴（前記分散質）が分散されたエマルションを形成できる。本発明においては、分散媒となる液体に、前記各種細胞を含む液体を接触させることで、前記分散媒に分散された、前記各種細胞を含む前記液滴を形成できる。前記液滴形成工程においては、例えば、前記分散媒の液体として非水溶性溶媒、前記液滴の液体（前記分散質の液体）として水溶性溶媒を使用でき、この組合せによって形成されるエマルションは、例えば、油中水（Ｗ／Ｏ）型エマルションともいう。
【００３７】
前記水溶性溶媒は、特に制限されず、例えば、前記液滴に含まれる各種細胞の種類に応じて、適宜決定できる。前記水溶性溶媒は、例えば、水、緩衝液、液体培地、水溶性高分子溶液等があげられる。前記水溶性高分子としては、例えば、でんぷん、寒天、ゼラチン等があげられる。前記水溶性溶媒は、例えば、一種類を単独で使用してもよいし、二種類以上を併用してもよい。
【００３８】
前記非水溶性溶媒は、特に制限されず、例えば、前記液滴に含まれる液体と非相溶性の溶媒であり、具体例として、油、ミネラルオイル、クロロホルム、芳香族化合物等があげられる。前記非水溶性溶媒は、例えば、一種類を単独で使用してもよいし、二種類以上を併用してもよい。
【００３９】
前記液滴形成工程で形成される前記液滴は、前述のように、前記抗体産生細胞、前記エフェクター細胞、前記染色標的細胞、および前記液体を含む。１つの前記液滴において、前記抗体産生細胞、前記エフェクター細胞、および前記染色標的細胞のそれぞれの数は、例えば、５個以下、２個以下であり、好ましくは１個である。なお、前記エマルション形成における既存の方法によって、例えば、１つの液滴中に、目的の細胞を１個ずつ導入することも可能である。前記液滴形成工程は、例えば、前記抗体産生細胞、前記エフェクター細胞、および前記染色標的細胞を含む液体と、前記液体の分散媒とを接触させてもよいし、前記抗体産生細胞を含む液体、前記エフェクター細胞を含む液体、および前記染色標的細胞を含む液体と、前記液体の分散媒とを、同時に接触させてもよいし、いずれか二種類の細胞を含む液体、および一種類の細胞を含む液体と、前記液体の分散媒とを、同時に接触させてもよい。前記分散媒に、細胞を含む複数の液体を接触させる場合、それぞれの前記液体は、例えば、同じ溶媒でもよいし、異なる溶媒でもよい。
【００４０】
前記液滴形成工程は、例えば、前述のような前記エマルションの形成において、前記分散媒と、前記各種細胞を含む液体とを接触させることによって、同じエマルション中に、複数の前記液滴を形成することができる。この際、使用する前記エフェクター細胞、および前記染色標的細胞は、例えば、それぞれ、１種類でもよいし、２種類以上でもよい。図１を用いたメカニズムの説明のように、前記エフェクター細胞は、前記染色標的細胞の破壊に関与し、前記染色標的細胞は、前記標的抗原の提示と染色に関与することから、例えば、スクリーニング精度の安定性の点から、それぞれ１種類が好ましい。他方、前記抗体産生細胞は、スクリーニング対象の抗体を産生する細胞であることから、２種類以上が好ましく、より好ましくは、例えば、産生される抗体が異なるであろう２種類以上の抗体産生細胞を含むライブラリーである。前記抗体産生細胞のライブラリーを使用すれば、例えば、前記エマルション中には、それぞれ異なる前記抗体産生細胞が含まれる多数の前記液滴が分散される。このため、例えば、１つのエマルションであっても、これに含まれる複数の前記液滴のそれぞれについて、前記染色検出工程を施すことによって、前記ライブラリーに含まれる大量の抗体産生細胞のそれぞれについて、前記標的抗原に対する抗体を産生するか否かの判断を、容易に短時間で行うことが可能になる。従来のスクリーニング方法は、前述のように、抗体産生細胞を１クローンずつマイクロウェルプレート等で独立的に数日以上培養し、そこから発現してきた抗体と前記標的抗原との結合性を確認するため、ライブラリーに含まれる大量の抗体産生細胞のそれぞれについて、産生される抗体を容易に短時間でスクリーニングすることは現実的ではなかった。これに対して、本発明によれば、例えば、前記抗体産生細胞を前記液滴内で数時間（例えば、２時間程度）培養すればよく、抗体の開発において、時間、コスト、および労力等を低減できる。
【００４１】
前記エマルションの形成において、前記ライブラリーに含まれる前記抗体産生細胞の数は、特に制限されず、例えば、前記分散媒１０００μＬあたり、前記ライブラリーの前記抗体産生細胞の数は、１００，０００〜１００，０００，０００個でもよい。
【００４２】
前記エマルションの形成において、前記分散媒、前記液体、前記抗体産生細胞、前記エフェクター細胞、および前記染色標的細胞の割合は、特に制限されない。具体例として、以下の条件が例示できるが、これには何ら制限されない。前記分散媒１０００μＬあたり、前記液体は、例えば、２００〜３００μＬμＬであり、前記抗体産生細胞は、例えば、１００，０００〜１００，０００，０００個であり、前記エフェクター細胞は、例えば、１００，０００〜１００，０００，０００個であり、前記染色標的細胞は、例えば、１００，０００〜１００，０００，０００個である。前記抗体産生細胞、前記エフェクター細胞、および前記染色標的細胞の比率は、特に制限されず、例えば、前記抗体産生細胞の数を相対値１とした場合、前記エフェクター細胞は、相対値１〜１０、前記染色標的細胞は、相対値１〜１０が例示できる。
【００４３】
前記液滴の大きさは、特に制限されない。前記液滴の直径は、例えば、その下限が、６０μｍ、８０μｍμｍであり、その上限が、１００μｍ、１２０μｍである。また、前記液滴の体積は、例えば、その下限が、１００ｐＬ、３００ｐＬであり、その上限が、５００ｐＬ、１０００ｐＬ以下である。
【００４４】
本発明は、前記液滴形成工程後、後述する前記染色検出工程の前に、さらに、インキュベート工程を含んでもよく、前記インキュベート工程は、例えば、培養工程、反応工程ともいう。前記インキュベート工程により、例えば、前記抗体産生細胞において抗体を産生させ、産生した抗体を、前記抗体産生細胞から前記液滴内に放出させる。また、前記インキュベート工程において、例えば、産生された前記抗体と、前記エフェクター細胞と、前記染色標的細胞との間における反応を行うこともできる。前記インキュベートの条件は、特に制限されず、例えば、前記液滴に含まれる各種細胞の種類に応じて、適宜決定できる。前記インキュベートの条件は、特に制限されず、温度は、例えば、１０〜３７℃であり、時間は、例えば、０．２５〜４時間である。
【００４５】
前記染色検出工程は、前述のように、形成した前記液滴の染色を検出し、具体的には、前記液滴において、前記染色標的細胞が存在する領域での染色であるか、前記液滴の内部全体（全領域）に拡散した染色であるかを検出する。前記液滴形成工程で形成された前記液滴は、その内部に前記染色標的細胞を含むことから、当然、前記液滴は、前記染色標的細胞よりも大きい。このため、前記液滴の染色を検出した際、前記液滴における染色が検出された領域が、例えば、前記染色標的細胞の大きさであるか、前記液滴の内部全体の大きさであるかは、判別可能である。
【００４６】
前記液滴の染色の検出方法は、特に制限されず、例えば、前記染色物質の種類に応じて適宜決定できる。前記液滴の染色の検出は、例えば、顕微鏡、蛍光強度を検出する蛍光検出器等を利用できる。前記染色物質が励起光の照射によって蛍光を生じる蛍光物質の場合、例えば、レーザ等により励起光を照射して、それにより生じる蛍光を検出すればよい。
【００４７】
前記染色検出工程においては、続く前記選択工程のため、例えば、前記液滴の染色の有無、前記液滴における染色が、前記液滴の内部全体の染色であるか、前記液滴における染色が、前記液滴中の前記染色標的細胞の染色であるかを検出する。前記液滴の染色の有無は、前記液滴において染色が検出されるか否かで判断できる。前記液滴において染色が検出された場合、それが、前記液滴の内部全体の染色であるか、前記液滴中の前記染色標的細胞の染色であるかは、例えば、以下のように判断できる。前述のように、前記液滴の大きさと前記染色標的細胞の大きさは、異なっており、前記液滴の方が、前記染色標的細胞よりも大きい。このため、例えば、前記液滴の染色を顕微鏡で検出した場合、前記液滴における染色された領域が、前記液滴の全体領域に相当するか、前記液滴中に存在する前記染色標的細胞の領域に相当するかによって、判断できる。
【００４８】
また、例えば、セルソーター等のソーターに前記液滴を通過させ、１個の前記液滴について、染色の変化を検出することによっても、判断できる。具体例として、例えば、染色が蛍光であり、前記ソーターの検出部により検出点を通過する物体の蛍光強度を検出する場合を例にあげて、図２を用いて説明する。図２は、１個の液滴が検出点を通過する時間と蛍光強度との関係を示すグラフであり、横軸が時間、縦軸が蛍光強度である。前記ソーターによれば、前記１個の液滴が前記検出点を通過することで、前記１個の液滴について、通過方向の一端から他端までの蛍光強度が検出される。そして、前記染色標的細胞が破壊されていない場合は、前記染色標的細胞のみが染色されているため、図２（Ａ）に示すように、前記１個の液滴が前記検出点を通過するにあたって、前記染色標的細胞が前記検出点を通過した時のみ、蛍光強度が著しく増加する。一方、前記染色標的細胞が破壊され、前記液滴の全体が染色、つまり、産生される抗体が前記標的抗原に結合していない場合は、前記液滴の全体が染色されるため、図２（Ｂ）に示すように、前記１個の液滴が前記検出点を通過するにあたって、前記液滴が前記検出点を通過開始する時点から通過終了する時点まで、蛍光強度は、図２（Ａ）よりも低いが、検出される時間は延長する。このように、前記１個の液滴について、前記検出点の通過方向における染色の変動を検出することで、前記液滴の全体における染色か、前記染色標的細胞のみの染色かを判断することができる。
【００４９】
前記選択工程は、前述のように、前記液滴の内部全体に染色が確認された場合、前記液滴に含まれる前記抗体産生細胞を、前記標的抗原に結合する抗体を産生する抗体産生細胞として選択する。一方、前記液滴の内部全体ではなく、前記液滴における前記染色標的細胞の大きさの領域に染色が確認された場合、前記液滴に含まれる前記抗体産生細胞は、前記標的抗原に非結合の抗体を産生する抗体産生細胞として判断できる。また、前記液滴に染色が確認されなかった場合は、例えば、前記液滴に前記染色標的細胞が含まれていないと判断できる。
【００５０】
前記選択工程において、選択された前記抗体産生細胞は、前記標的抗原に結合する抗体を産生する細胞と推定されることから、前記液滴に含まれる前記抗体産生細胞から産生される抗体を、前記標的抗原に結合する目的の抗体として選択できる。
【００５１】
本発明は、例えば、エマルション化デバイスおよびセルソーター等を利用して行うことができる。前記エマルション化デバイスと前記セルソーターは、例えば、別個でもよいし、一体化してもよい。
【００５２】
前記液滴形成工程は、例えば、マイクロ流路を有するエマルション化デバイスを使用できる。前記デバイスは、前記マイクロ流路として、例えば、前記各種細胞を含む液体（細胞含有液）を通過させる細胞用流路と、分散媒を通過させる分散媒用流路と、これらの連結部と、前記連結部から導出される導出流路とを含む。このデバイスを用いた場合、例えば、以下のように液滴が形成される。まず、前記連結部には、前記分散媒用流路から、前記分散媒が導入され、つぎに、前記分散媒が導入された前記連結部に向かって、前記細胞用流路から、前記細胞含有液が導入される。そして、前記連結部において、前記分散媒と前記細胞含有液とが接触し、エマルション化され、前記連結部から前記導出流路に、エマルション（前記分散媒に前記細胞含有液の液滴が分散された状態）として導出される。
【００５３】
前述のように、前記液滴形成工程は、マイクロ流路を有するデバイスを用いて行えることから、前記染色検出工程も、同様に、前記デバイスのマイクロ流路内で行うことが好ましい。この場合、前記デバイスは、例えば、前記導出流路の下流に連結された検出流路を有し、検出部より前記検出流路を通過する前記液滴を検出してもよい。前記検出部による前記検出流路を通過する前記液滴の染色の検出は、例えば、前述のように、セルソーター等が利用できる。
【実施例】
【００５４】
［実施例１］
本実施例では、前記染色標的細胞が破壊された液滴と、前記染色標的細胞が破壊されていない液滴とが、判別可能であることの確認を行った。
【００５５】
まず、生細胞特異的染色試薬Ｃａｌｃｅｉｎ  ＡＭ（商品名Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  ｋｉｔ  ＩＩ、ＰｒｏｍｏＫｉｎｅ社製）を用いて、使用説明書に順じ、染色細胞を作成した。具体的には、市販培地（商品名Ham’s F-12 Nutrient Mix,  GlutaMAX Supplement液、Ｔｈｅｒｍｏ社製）に、最終濃度が２μｍｏｌ／Ｌ  となるように前記Ｃａｌｃｅｉｎ  ＡＭ（ＰｒｏＫｉｎｅ社製）を混合し、その混合液５００μＬに、５ｘ１０＾６個の細胞を投入し、３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベート後、前記混合液中の細胞を回収し、前記細胞を１ｍＬの１ｘＰＢＳで２回洗浄し、Ｃａｌｃｅｉｎ  ＡＭを導入した染色細胞とした。Ｃａｌｃｅｉｎ  ＡＭは、生細胞中に導入されると、細胞内で加水分解され蛍光を発するカルセインとなる。
【００５６】
つぎに、ウシ胎児血清未添加の市販培地（商品名Ham’s F-12 Nutrient Mix,  GlutaMAX Supplement液、Ｔｈｅｒｍｏ社製）に、終濃度２μｍｏｌ／ＬとなるようにＣａｌｃｅｉｎ  ＡＭと、終濃度４μｍｏｌ／Ｌとなるように、死細胞特異的染色試薬ＥｔｈＤ−ＩＩＩ（ＰｒｏＫｉｎｅ社製）とを添加した。これらの染色物質を添加した培地１，０００μＬに、前記染色細胞を５００ｃｅｌｌｓ／μＬとなるように投入し、細胞液を調製した。なお、本発明において、前記培地へのＣａｌｃｅｉｎ  ＡＭの添加は任意である。また、前記死細胞特異的染色試薬は、予備的な確認のために導入したものであり、本発明において必須ではない。
【００５７】
つぎに、市販の装置（商品名QX200 Droplet Generator、Bio-Rad社製）を用いて、前記染色細胞を含む細胞液２０μＬと、分散媒（Ｐｉｃｏ−Ｓｕｒｆ１、Ｓｐｈｅｒｅ  Ｆｋｕｉｄｉｃｓ社製）７０μＬとを接触させ、Ｗ／Ｏ型のエマルション液を形成した。前記エマルション液について、顕微鏡で確認したところ、前記分散媒中に、前記染色細胞を含む大量の液滴が分散されていた。
【００５８】
そして、このエマルションについて、検出機器として市販のセルカウンター（商品名Countess（登録商標）II FL、Ｔｈｅｒｍｏ社製）を用い、前記各液滴の蛍光を検出した。具体的には、前記セルカウンターに付属するスライド（Countesstm Cell Counting Chamber Slides、Ｔｈｅｒｍｏ社製）に、前記分散媒１０ｕＬと前記エマルション液５ｕＬとを添加し、前記スライドを前記セルカウンターにセットした。そして、３７℃の条件でインキュベートを行い、０時間および４２時間後、下記検出条件で、前記エマルションについて各液滴の蛍光観察を行った。前記エマルションにおける液滴の形成に使用した前記培地は、ウシ胎児血清未添加であるため、前記培地中でインキュベートされたＣＨＯ細胞は、細胞死に至り破壊される。
【００５９】
＜検出条件＞
明視野
対物レンズ：１０倍
光強度：１０％
蛍光チャンネル（Ｃａｌｃｅｉｎ  ＡＭ用）
対物レンズ：１０倍
励起光波長（ｎｍ）：４７０／２２
検出蛍光波長（ｎｍ）：５２５／５０
励起光強度：５０％
露光時間：２５０ｍｓ
蛍光チャンネル（ＥｔｈＤ−ＩＩ用）
対物レンズ：１０倍
励起光波長（ｎｍ）：５８５／２９
検出蛍光波長（ｎｍ）：６２８／３２
励起光強度：９０％
露光時間：１２０ｍｓ
【００６０】
これらの結果を図３に示す。図３は、前記エマルションにおける液滴の画像であり、（Ａ）の列が、インキュベート０時間の結果であり、（Ｂ）の列が、インキュベート４２時間の結果であり、１段目が、明視野の画像、２段目が、Ｃａｌｃｅｉｎ  ＡＭの検出条件による蛍光画像、３段目が、ＥｔｈＤ−IIの検出条件による蛍光画像である。また、各図においてスケールバーは、４００μｍとした。
【００６１】
図３（Ａ）および（Ｂ）の（i）明視野の画像に示すように、前記エマルションをインキュベートしても、各液滴自体は構造が維持されていた。そして、インキュベート０時間の場合、図３（Ａ）に示すように、（ii）Ｃａｌｃｅｉｎ  ＡＭの分解物カルセインの蛍光は、（i）明視野の液滴と比較して極めて小さい大きさで検出された。これは、前記染色細胞が破壊されていないことを意味し、（iii）死細胞検出の蛍光物質ＥｔｈＤ−IIの蛍光が検出されていないことからも明らかである。一方、インキュベート４２時間の場合、図３（Ｂ）に示すように、（ii）Ｃａｌｃｅｉｎ  ＡＭの分解物カルセインの蛍光は、（i）明視野の液滴と同等の大きさで検出された。これは、前記染色細胞が破壊されたことによって、前記染色細胞内のカルセインが前記液滴の全体に拡散したことを意味し、前記染色細胞の破壊は、（iii）死細胞検出の蛍光物質ＥｔｈＤ−IIの蛍光が多数検出されていることからも明らかである。
【００６２】
また、図３（Ａ）（ii）の画像について、矢印で示す一端ａ１から他端ａ２までの一直線上におけるグレー値（輝度）と、図３（Ｂ）（ii）において、矢印で示す一端ｂ１から他端ｂ２までの一直線上におけるグレー値（輝度）を、図４に示す。図４（Ａ）は、インキュベート０時間の結果であり、図４（Ｂ）は、インキュベート４２時間の結果であり、Ｘ軸は、ａ１からａ２までの距離（ピクセル）、または、ｂ１からｂ２までの距離（ピクセル）を示す。グレー値は、値が高い程、蛍光を示していることを意味し、は、値が低い程、非蛍光であることを意味する。インキュベート０時間の場合、図４（Ａ）に示すように、約５００ピクセルの位置から５５０ピクセルの位置の間（長さ５０ピクセル）に、グレー値約８０付近をピークとする山を示したのに対し、インキュベート４２時間の場合、図４（Ｂ）に示すように、約４８０ピクセルの位置から約５７０ピクセルの位置の間（長さ９０ピクセル）に、グレー値１９付近をピークとする山を示した。つまり、インキュベート０時間で前記染色細胞が破壊されていない状態では、前記染色細胞内にカルセインが収容されているため、蛍光を示す距離が短く、且つ、蛍光強度のピークが高かった。これに対し、インキュベート４２時間では前記染色細胞が破壊され、前記液滴内の全体にカルセインが存在するため、蛍光を示す距離が長く、且つ、蛍光強度のピークが低かった。これは、前記染色細胞内のカルセインが前記液滴内に拡散され、また、前記染色細胞の破壊により前記染色細胞内から漏れ出たエステラーゼにより、前記培地に含まれるＣａｌｃｅｉｎ  ＡＭが分解され、カルセインが生成されたことによると解される。このように、蛍光強度のピークを含む山の長さまたは蛍光強度のピークの相対的な高さによっても、前記液滴に含まれる前記染色細胞内での蛍光であるか、前記染色細胞が破壊され前記蛍光物質が拡散されたことによる前記液滴全体での蛍光であるかを判別できることがわかった。
【００６３】
この結果から、前記染色細胞を含む液滴について、前記染色細胞が破壊されたか否かを、前記液滴の全体における染色か、前記液滴における前記染色細胞における染色かで判断できることが確認できた。
【００６４】
以上、実施形態および実施例を参照して、本発明を説明したが、本発明は、上記発明のスコープ内で当業者が理解し得る様々な変更をすることができる。また、本明細書で引用する特許文献および学術文献等の文献に記載の内容は、全て引用により本明細書に取り込むものとする。
【産業上の利用可能性】
【００６５】
前述のように、本発明によれば、例えば、大量の抗体産生細胞であっても、スクリーニングに先立って、抗体を精製することなく、短時間で効率良く簡便に、標的抗原に対する抗体のスクリーニングが可能となる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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