(57)【要約】【課題】キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と、シグナル伝達改変タンパク質とを含む、細胞を提供すること。【解決手段】シグナル伝達改変タンパク質は、（ｉ）リン酸化免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）に結合するがキナーゼドメインを欠くタンパク質由来のＳＨ２ドメインを含む切断型タンパク質；（ｉｉ）リン酸化免疫受容体チロシンベース阻害モチーフリン酸化免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）に結合するがホスファターゼドメインを欠くタンパク質由来のＳＨ２ドメインを含む切断型タンパク質；（ｉｉｉ）（ａ）リン酸化免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）に結合するタンパク質由来の、またはリン酸化免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）に結合するタンパク質由来のＳＨ２ドメイン；および（ｉｉ）異種ドメインを含む融合タンパク質のうちの１つから選択され得る。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、免疫細胞活性化後に伝搬されるシグナル伝達経路を操作またはモジュレートすることを可能にする融合タンパク質および切断型タンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
自己Ｔ細胞を用いた養子免疫療法は、抗腫瘍特異性を示すＴ細胞の集団を生成するために、患者からＴ細胞を単離し、続いてそれらをエクスビボで刺激、改変および／または増殖させることを含む。患者に再注入されると、これらの細胞は、腫瘍発現抗原を認識し、腫瘍拒絶を媒介することができる。
【０００３】
様々な状況の多くの試験において、このアプローチは、強力で有効な長期間持続する癌処置である可能性を有することが既に示されている。例えば、固形臓器移植後のリンパ増殖性疾患などのＥＢＶ駆動腫瘍は、エクスビボで増殖させたＥＢＶ特異的Ｔ細胞によって有効に処置され得る。
【０００４】
非ウイルス性悪性腫瘍のための同様の治療は、腫瘍の切除片から腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を単離し、次いで、自己腫瘍試料による刺激および増殖に供することを含む。次いで、腫瘍反応性を示す増殖したＴ細胞培養物を患者に再注入し得る。
【０００５】
抗原への反復曝露によってＴ細胞特異性を選択および改善するのではなく、遺伝子改変および腫瘍特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）のいずれかの導入によって、所望の抗腫瘍特異性をＴ細胞に付与し得る。十分な数の細胞を生産して患者内で有意義な臨床反応を達成するために、これらの細胞は、エクスビボで増殖する。
【０００６】
しかしながら、上記で詳述されるアプローチには限界がある。例えば、不十分なシグナル伝達、ＩＬ２の欠如または分化のために、養子移入Ｔ細胞は、インビボで限定的な持続性および増殖を示し得る。さらなる例として、養子移入Ｔ細胞は、腫瘍微小環境内において阻害性刺激に屈し得る。例えば、それらは消耗し、過剰活性化による活性化誘導性細胞死を受け得るか、またはオンターゲットオフ腫瘍効果を引き起こし得る。
【０００７】
治療抗腫瘍免疫を活性化するための別の有望なアプローチは、免疫チェックポイントの遮断である。免疫チェックポイントは、自己寛容を維持し、末梢組織における生理学的免疫応答の持続時間および振幅をモジュレートするために重要な免疫系の様々な阻害経路を指す。
【０００８】
腫瘍は、特に腫瘍抗原に特異的なＴ細胞に対する主要な免疫耐性機構として、特定の免疫チェックポイント経路を利用することが公知である。免疫チェックポイントの多くは、リガンド−受容体相互作用によって開始されるが、これは、それらが抗体によって遮断され得るか、または組換え形態のリガンドもしくは受容体によってモジュレートされ得ることを意味する。細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ４）抗体は、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）の承認を得たこのクラスの最初の免疫療法薬であった。より最近では、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１）などのさらなる免疫チェックポイントタンパク質の遮断薬が開発されており、抗腫瘍免疫を増強することが示されている。
【０００９】
免疫チェックポイント阻害剤の使用に伴う１つの問題は、多数のリガンド：受容体相互作用によって引き起こされる多数の阻害経路があることである。抗体または組換え形態のリガンド／受容体の使用は、このような阻害経路の１つのみを遮断し、腫瘍が、他の分子を使用して特異的な免疫チェックポイント遮断を埋め合わせ得る可能性が残る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、Ｔ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などの免疫細胞におけるシグナル伝達経路をモジュレートおよび／または操作するための系を開発した。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と、以下：
（ｉ）リン酸化免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）に結合するがキナーゼドメインを欠くタンパク質由来のＳＨ２ドメインを含む切断型タンパク質；
（ｉｉ）リン酸化免疫受容体チロシンベース阻害モチーフリン酸化免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）に結合するがホスファターゼドメインを欠くタンパク質由来のＳＨ２ドメインを含む切断型タンパク質；
（ｉｉｉ）（ａ）リン酸化免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）に結合するタンパク質由来の、またはリン酸化免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）に結合するタンパク質由来のＳＨ２ドメイン；および（ｉｉ）異種ドメインを含む融合タンパク質
のうちの１つから選択されるシグナル伝達改変タンパク質とを含む、細胞。
（項目２）
前記シグナル伝達改変タンパク質が、ＺＡＰ７０  ＳＨ２ドメインを含むがＺＡＰ７０キナーゼドメインを欠く切断型タンパク質である、項目１に記載の細胞。
（項目３）
前記シグナル伝達改変タンパク質が、ＰＴＰＮ６  ＳＨ２を含むがＰＴＰＮ６ホスファターゼドメインを欠く切断型タンパク質である、項目１に記載の細胞。
（項目４）
前記シグナル伝達改変タンパク質が、ＳＨＰ−２  ＳＨ２ドメインを含むがＳＨＰ−２ホスファターゼドメインを欠く切断型タンパク質である、項目１に記載の細胞。
（項目５）
前記シグナル伝達改変タンパク質が、（ｉ）リン酸化免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）に結合するタンパク質由来のＳＨ２ドメイン；および（ｉｉ）ホスファターゼドメインを含む融合タンパク質である、項目１に記載の細胞。
（項目６）
前記融合タンパク質がＺＡＰ７０  ＳＨ２ドメインを含む、項目５に記載の細胞。
（項目７）
前記融合タンパク質が、ＰＴＰＮ６またはＳＨＰ−２ホスファターゼドメインを含む、項目５または６に記載の細胞。
（項目８）
前記シグナル伝達改変タンパク質が、（ｉ）リン酸化免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）に結合するタンパク質由来のＳＨ２ドメイン；および（ｉｉ）キナーゼドメインを含む融合タンパク質である、項目１に記載の細胞。
（項目９）
前記融合タンパク質が、ＰＴＰＮ６またはＳＨＰ−２由来のＳＨ２ドメインを含む、項目８に記載の細胞。
（項目１０）
前記融合タンパク質がＺａｐ７０キナーゼドメインを含む、項目８または９に記載の細胞。
（項目１１）
前記融合タンパク質が、ＡＫＴまたはＪＡＫキナーゼドメインを含む、項目８または９に記載の細胞。
（項目１２）
前記シグナル伝達改変タンパク質が、（ｉ）リン酸化免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）に結合するタンパク質由来の、またはリン酸化免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）に結合するタンパク質由来のＳＨ２ドメイン；および（ｉｉ）異種シグナル伝達ドメインを含む融合タンパク質である、項目１に記載の細胞。
（項目１３）
前記融合タンパク質が、ＺＡＰ７０、ＰＴＰＮ６またはＳＨＰ−２由来のＳＨ２ドメインを含む、項目１２に記載の細胞。
（項目１４）
前記異種シグナル伝達ドメインが、ＩＴＡＭまたはＩＴＩＭ含有受容体によって通常は活性化されないシグナル伝達分子に由来する、項目１２または１３に記載の細胞。
（項目１５）
前記異種シグナル伝達ドメインが共刺激性ドメインである、項目１２、１３または１４に記載の細胞。
（項目１６）
前記融合タンパク質が、ＣＤ２８、ＯＸ４０または４１ＢＢ共刺激性ドメインを含む、項目１５に記載の細胞。
（項目１７）
前記異種シグナル伝達ドメインが阻害性ドメインである、項目１２、１３または１４に記載の細胞。
（項目１８）
前記阻害性ドメインが、ＣＤ１４８またはＣＤ４５のエンドドメインを含む、項目１７に記載の細胞。
（項目１９）
前記異種シグナル伝達ドメインが、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＢＴＬＡ、ＣＤ３０、ＧＩＴＲまたはＨＶＥＭのエンドドメインであるか、またはこれを含む、項目１７に記載の細胞。
（項目２０）
前記シグナル伝達改変タンパク質が、（ｉ）リン酸化免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）に結合するタンパク質由来のＳＨ２ドメイン；および（ｉｉ）ＩＴＡＭ含有ドメインを含む融合タンパク質である、項目１に記載の細胞。
（項目２１）
前記融合タンパク質がＺＡＰ７０  ＳＨ２ドメインを含む、項目２０に記載の細胞。
（項目２２）
前記ＩＴＡＭ含有ドメインがＣＤ３ゼータのエンドドメインであるか、またはこれを含む、項目２０または２１に記載の細胞。
（項目２３）
前記シグナル伝達改変タンパク質が、（ｉ）リン酸化免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）に結合するタンパク質由来のＳＨ２ドメイン；および（ｉｉ）ＩＴＩＭ含有ドメインを含む融合タンパク質である、項目１に記載の細胞。
（項目２４）
前記融合タンパク質が、ＰＴＰＮ６またはＳＨＰ−２由来のＳＨ２ドメインを含む、項目２３に記載の細胞。
（項目２５）
前記ＩＴＩＭ含有ドメインが、ＰＤ１、ＰＤＣＤ１、ＢＴＬＡ４、ＬＩＬＲＢ１、ＬＡＩＲ１、ＣＴＬＡ４、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＬ５、ＫＩＲ３ＤＬ１またはＫＩＲ３ＤＬ３由来のエンドドメインであるか、またはこれを含む、項目２３または２４に記載の細胞。
（項目２６）
前記シグナル伝達改変タンパク質が、（ｉ）リン酸化免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）に結合するタンパク質由来の、またはリン酸化免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）に結合するタンパク質由来のＳＨ２ドメイン；および（ｉｉ）プロテアーゼドメインを含む融合タンパク質である、項目１に記載の細胞。
（項目２７）
前記融合タンパク質が、ＺＡＰ７０、ＰＴＰＮ６またはＳＨＰ−２由来のＳＨ２ドメインを含む、項目２６に記載の細胞。
（項目２８）
前記プロテアーゼドメインがタバコエッチウイルスプロテアーゼ（ＴｅＶ）であるか、またはこれを含む、項目２６または２７に記載の細胞。
（項目２９）
プロテアーゼ切断部位を有する膜繋留転写因子も含む、項目２６〜２８のいずれかに記載の細胞。
（項目３０）
前記プロテアーゼ切断部位における切断が、標的遺伝子の発現増加をもたらす前記転写因子を放出する、項目２９に記載の細胞。
（項目３１）
前記標的遺伝子がサイトカインをコードする、項目３０に記載の細胞。
（項目３２）
前記サイトカインが、以下の群：ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５およびＩＬ−１２から選択される、項目３１に記載の細胞。
（項目３３）
前記キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が、細胞内プロテアーゼ切断部位を含む標的ＣＡＲである、項目２６〜２８のいずれかに記載の細胞。
（項目３４）
前記標的ＣＡＲが活性化または共刺激性エンドドメインを含み、前記プロテアーゼ切断部位における切断が、前記標的ＣＡＲからエンドドメインを除去する、項目３３に記載の細胞。
（項目３５）
前記標的ＣＡＲが阻害性エンドドメインを含み、前記プロテアーゼ切断部位における切断が、前記標的ＣＡＲから前記阻害性エンドドメインを除去する、項目３３に記載の細胞。
（項目３６）
前記阻害性エンドドメインが、ＣＤ１４８またはＣＤ４５エンドドメインを含む、項目３５に記載の細胞。
（項目３７）
２つのＣＡＲ：ＩＴＡＭ含有エンドドメインを含む活性化ＣＡＲ；および項目３３〜３６のいずれかで定義される標的ＣＡＲを含む、項目１に記載の細胞。
（項目３８）
２つのＣＡＲ：ＩＴＩＭ含有エンドドメインを含む阻害性ＣＡＲ；および項目３３〜３６のいずれかで定義される標的ＣＡＲを含む、項目１に記載の細胞。
（項目３９）
キメラ抗原受容体をコードする第１の核酸配列；および
上記項目のいずれかで定義される切断型タンパク質または融合タンパク質をコードする第２の核酸配列
を含む、核酸構築物。
（項目４０）
項目２９〜３２のいずれかで定義される膜繋留転写因子をコードする第３の核酸配列も含む、項目３９に記載の核酸構築物。
（項目４１）
項目３３〜３６のいずれかで定義される標的ＣＡＲをコードする第３の核酸配列も含む、項目３９に記載の核酸構築物。
（項目４２）
項目３７で定義される活性化ＣＡＲまたは項目３８で定義される阻害性ＣＡＲをコードする第４の核酸配列も含む、項目４１に記載の核酸構築物。
（項目４３）
項目３９〜４２のいずれかに記載の核酸構築物、または項目３９〜４２のいずれかで定義される第１および第２のならびに場合により第３および／もしくは第４（ｆｏｕｔｈ）の核酸配列を含む、ベクター。
（項目４４）
項目３９〜４２のいずれかで定義される第１および第２のならびに場合により第３および／または第４（ｆｏｕｔｈ）の核酸配列を含む、ベクターのセット。
（項目４５）
レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクター（複数も可）である、項目４３または４４に記載のベクターまたはベクターのセット。
（項目４６）
複数の項目１〜３８のいずれかに記載の細胞を含む、医薬組成物。
（項目４７）
疾患の処置および／または予防において使用するための、項目４６に記載の医薬組成物。
（項目４８）
疾患を処置および／または予防するための方法であって、項目４６に記載の医薬組成物を被験体に投与する工程を含む、方法。
（項目４９）
以下：
（ｉ）被験体から細胞含有試料を単離する工程；
（ｉｉ）項目４１または４２に記載の核酸構築物、項目４３〜４５のいずれかに記載のベクターまたはベクターのセットを前記細胞に形質導入またはトランスフェクトする工程；および
（ｉｉｉ）（ｉｉ）の細胞を前記被験体に投与する工程
を含む、項目４８に記載の方法。
（項目５０）
疾患の処置および／または予防のための医薬の製造における、項目４６に記載の医薬組成物の使用。
（項目５１）
前記疾患が癌である、項目４７に記載の使用のための医薬組成物、または項目４８もしくは４９に記載の方法、または項目５０に記載の使用。
（項目５２）
項目１〜３８のいずれかに記載の細胞を作製するための方法であって、項目４１または４２に記載の核酸構築物、項目４３〜４５のいずれかに記載のベクターまたはベクターのセットを前記細胞に導入する工程を含む、方法。
（項目５３）
前記細胞が、被験体から単離された試料に由来する、項目５２に記載の方法。
【００１１】
細胞内シグナル伝達経路は、タンパク質の可逆的な翻訳後修飾によって開始および制御される。本発明者らは、Ｔ細胞における活性化および阻害性シグナル伝達経路が、即時Ｔ細胞シグナル伝達タンパク質由来のＳＨ２ドメインを含む融合タンパク質または切断型タンパク質によってモジュレートおよび／または操作され得ることを決定した。換言すれば、Ｔ細胞における活性化および阻害性シグナル伝達経路は、リン酸化免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）またはリン酸化免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）に結合することができるタンパク質由来のＳＨ２ドメインを含む融合タンパク質または切断型タンパク質によってモジュレートおよび／または操作され得る。
【００１２】
したがって、第１の態様では、本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と、以下：
（ｉ）リン酸化免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）に結合するがキナーゼドメインを欠くタンパク質由来のＳＨ２ドメインを含む切断型タンパク質；
（ｉｉ）リン酸化免疫受容体チロシンベース阻害モチーフリン酸化免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）に結合するがホスファターゼドメインを欠くタンパク質由来のＳＨ２ドメインを含む切断型タンパク質；
（ｉｉｉ）（ａ）リン酸化免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）に結合するタンパク質由来の、またはリン酸化免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）に結合するタンパク質由来のＳＨ２ドメイン；および（ｉｉ）異種ドメインを含む融合タンパク質
のうちの１つから選択されるシグナル伝達改変タンパク質とを含む、細胞を提供する。
【００１３】
シグナル伝達改変タンパク質は、ＺＡＰ７０  ＳＨ２ドメインを含むがＺＡＰ７０キナーゼドメインを欠く切断型タンパク質であり得る。
【００１４】
シグナル伝達改変タンパク質は、ＰＴＰＮ６  ＳＨ２を含むがＰＴＰＮ６ホスファターゼドメインを欠く切断型タンパク質であり得る。
【００１５】
シグナル伝達改変タンパク質は、ＳＨＰ−２  ＳＨ２ドメインを含むがＳＨＰ−２ホスファターゼドメインを欠く切断型タンパク質であり得る。
【００１６】
シグナル伝達改変タンパク質は、（ｉ）リン酸化免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）に結合するタンパク質由来のＳＨ２ドメイン；および（ｉｉ）ホスファターゼドメインを含む融合タンパク質であり得る。
【００１７】
融合タンパク質は、例えばＺＡＰ７０  ＳＨ２ドメイン、ＰＴＰＮ６またはＳＨＰ−２ホスファターゼドメインを含み得る。
【００１８】
シグナル伝達改変タンパク質は、（ｉ）リン酸化免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）に結合するタンパク質由来のＳＨ２ドメイン；および（ｉｉ）キナーゼドメインを含む融合タンパク質であり得る。
【００１９】
融合タンパク質は、ＰＴＰＮ６またはＳＨＰ−２由来のＳＨ２ドメインを含み得る。融合タンパク質はＺａｐ７０キナーゼドメインを含み得る。
【００２０】
融合タンパク質は、ＡＫＴまたはＪＡＫキナーゼドメインを含み得る。
【００２１】
シグナル伝達改変タンパク質は、（ｉ）リン酸化免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）に結合するタンパク質由来の、またはリン酸化免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）に結合するタンパク質由来のＳＨ２ドメイン；および（ｉｉ）異種シグナル伝達ドメインを含む融合タンパク質であり得る。
【００２２】
融合タンパク質は、ＺＡＰ７０、ＰＴＰＮ６またはＳＨＰ−２由来のＳＨ２ドメインを含み得る。
【００２３】
異種シグナル伝達ドメインは、ＩＴＡＭまたはＩＴＩＭ含有受容体によって通常は活性化されないシグナル伝達分子に由来し得る。
【００２４】
異種シグナル伝達ドメインは共刺激性ドメインであり得る。これに関して、融合タンパク質は、ＣＤ２８、ＯＸ４０または４１ＢＢ共刺激性ドメインを含み得る。
【００２５】
異種シグナル伝達ドメインは阻害性ドメインであり得る。これに関して、阻害性ドメインは、ＣＤ１４８またはＣＤ４５のエンドドメインであってもよいし、これを含んでもよい。あるいは、異種シグナル伝達ドメインは、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＢＴＬＡ、ＣＤ３０、ＧＩＴＲまたはＨＶＥＭのエンドドメインであるか、またはこれを含む。
【００２６】
シグナル伝達改変タンパク質は、（ｉ）リン酸化免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）に結合するタンパク質由来のＳＨ２ドメイン；および（ｉｉ）ＩＴＡＭ含有ドメインを含む融合タンパク質であり得る。
【００２７】
融合タンパク質はＺＡＰ７０  ＳＨ２ドメインを含み得る。
【００２８】
ＩＴＡＭ含有ドメインはＣＤ３ゼータのエンドドメインであってもよいし、またはこれを含んでもよい。
【００２９】
シグナル伝達改変タンパク質は、（ｉ）リン酸化免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）に結合するタンパク質由来のＳＨ２ドメイン；および（ｉｉ）ＩＴＩＭ含有ドメインを含む融合タンパク質であり得る。
【００３０】
融合タンパク質は、ＰＴＰＮ６またはＳＨＰ−２由来のＳＨ２ドメインを含み得る。
【００３１】
ＩＴＩＭ含有ドメインは、ＰＤ１、ＰＤＣＤ１、ＢＴＬＡ４、ＬＩＬＲＢ１、ＬＡＩＲ１、ＣＴＬＡ４、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＬ５、ＫＩＲ３ＤＬ１またはＫＩＲ３ＤＬ３由来のエンドドメインであってもよいし、またはこれを含んでもよい。
【００３２】
シグナル伝達改変タンパク質は、（ｉ）リン酸化免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）に結合するタンパク質由来の、またはリン酸化免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）に結合するタンパク質由来のＳＨ２ドメイン；および（ｉｉ）プロテアーゼドメインを含む融合タンパク質であり得る。
【００３３】
融合タンパク質は、ＺＡＰ７０、ＰＴＰＮ６またはＳＨＰ−２由来のＳＨ２ドメインを含み得る。
【００３４】
プロテアーゼドメインはタバコエッチウイルスプロテアーゼ（ＴｅＶ）であってもよいし、またはこれを含んでもよい。
【００３５】
細胞はまた、プロテアーゼ切断部位を有する膜繋留転写因子も含む。プロテアーゼ切断部位における切断は、標的遺伝子の発現増加をもたらす転写因子を放出し得る。
【００３６】
標的遺伝子は、サイトカイン、例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５およびＩＬ−１２から選択されるサイトカインをコードする。
【００３７】
この実施形態では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、細胞内プロテアーゼ切断部位を含む標的ＣＡＲであり得る。
【００３８】
標的ＣＡＲは活性化または共刺激性エンドドメインを含み、プロテアーゼ切断部位における切断が、前記標的ＣＡＲからエンドドメインを除去し得る。
【００３９】
あるいは、標的ＣＡＲは、阻害性エンドドメインを含み、プロテアーゼ切断部位における切断が、前記標的ＣＡＲから前記阻害性エンドドメインを除去し得る。阻害性エンドドメインは、ＣＤ１４８またはＣＤ４５エンドドメインを含み得る。
【００４０】
本発明の細胞は、２つのＣＡＲ：ＩＴＡＭ含有エンドドメインを含む活性化ＣＡＲ；および上で定義される標的ＣＡＲを含み得る。
【００４１】
あるいは、本発明の細胞は、２つのＣＡＲ：ＩＴＩＭ含有エンドドメインを含む阻害性ＣＡＲ；および上で定義される標的ＣＡＲを含み得る。
【００４２】
第２の態様では、本発明は、キメラ抗原受容体をコードする第１の核酸配列；および
本発明の第１の態様との関連で定義される切断型タンパク質または融合タンパク質をコードする第２の核酸配列
を含む、核酸構築物を提供する。
【００４３】
核酸構築物は、上で定義される膜繋留転写因子をコードする第３の核酸配列も含み得る。
【００４４】
核酸構築物は、上で定義される標的ＣＡＲをコードする第３の核酸配列も含み得る。
【００４５】
核酸構築物は、上で定義される活性化ＣＡＲまたは阻害性ＣＡＲをコードする第４の核酸配列も含み得る。
【００４６】
第３の態様では、本発明の第２の態様に従う核酸構築物、または上で定義される第１および第２のならびに場合により第３および／もしくは第４（ｆｏｕｔｈ）の核酸配列を含む、ベクター。
【００４７】
上で定義される第１および第２のならびに場合により第３および／または第４の核酸配列を含む、ベクターのセットもまた提供される。
【００４８】
ベクターまたはベクターのセットは、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクター（複数も可）であり得る。
【００４９】
第４の態様では、複数の本発明の第１の態様に従う細胞を含む、医薬組成物が提供される。
【００５０】
第５の態様では、疾患の処置および／または予防において使用するための、本発明の第４の態様に従う医薬組成物が提供される。
【００５１】
第６の態様では、疾患を処置および／または予防するための方法であって、本発明の第４の態様に従う医薬組成物を被験体に投与する工程を含む、方法が提供される。
【００５２】
方法は、以下：
（ｉ）被験体から細胞含有試料を単離する工程；
（ｉｉ）本発明の第２の態様に従う核酸構築物、本発明の第３の態様に従うベクターまたはベクターのセットを前記細胞に形質導入またはトランスフェクトする工程；および
（ｉｉｉ）（ｉｉ）の細胞を前記被験体に投与する工程
を含み得る。
【００５３】
第７の態様では、疾患の処置および／または予防のための医薬の製造における、本発明の第４の態様に従う医薬組成物の使用が提供される。
【００５４】
疾患は癌であり得る。
【００５５】
第８の態様では、本発明の第１の態様の細胞を作製するための方法であって、本発明の第２の態様の核酸構築物、本発明の第３の態様のベクターまたはベクターのセットを前記細胞に導入する工程を含む方法が提供される。
【００５６】
細胞は、被験体から単離された試料に由来し得る。
【００５７】
第１のさらなる態様では、本発明はまた、（ｉ）ＺＡＰ７０またはＰＴＰＮ６  ＳＨ２ドメイン；および（ｉｉ）異種ドメインを含む融合タンパク質を提供する。
【００５８】
融合タンパク質は、ＺＡＰ７０  ＳＨ２ドメインおよびＩＴＡＭ含有ドメインを含み得る。ＩＴＡＭ含有ドメインは、ＣＤ３ゼータのエンドドメインであり得るか、またはこれを含み得る。
【００５９】
融合タンパク質は、ＰＴＰＮ６  ＳＨ２ドメインおよびＩＴＩＭ含有ドメインを含み得る。ＩＴＩＭ含有ドメインは、ＰＤＣＤ１、ＢＴＬＡ４、ＬＩＬＲＢ１、ＬＡＩＲ１、ＣＴＬＡ４、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＬ５、ＫＩＲ３ＤＬ１またはＫＩＲ３ＤＬ３由来のエンドドメインであり得るか、またはこれを含み得る。
【００６０】
融合タンパク質は、ＰＴＰＮ６  ＳＨ２ドメインを含み、ＺＡＰ７０キナーゼドメインに融合され得る。
【００６１】
融合タンパク質は、ＰＴＰＮ６キナーゼドメインに融合されたＺＡＰ７０  ＳＨ２ドメインを含み得る。
【００６２】
融合タンパク質は、（ｉ）ＺＡＰ７０またはＰＴＰＮ６  ＳＨ２ドメイン；および（ｉｉ）異種シグナル伝達ドメインを含み得る。
【００６３】
異種シグナル伝達ドメインは、ＩＴＡＭ含有受容体によって通常は活性化されないシグナル伝達分子に由来し得る。異種シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８、４１ＢＢまたはＯＸ４０のエンドドメインであり得るか、またはこれを含み得る。異種シグナル伝達ドメインは、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＢＴＬＡ、ＣＤ３０、ＧＩＴＲまたはＨＶＥＭのエンドドメインであり得るか、またはこれを含み得る。
【００６４】
融合タンパク質は、（ｉ）ＺＡＰ７０またはＰＴＰＮ６  ＳＨ２ドメイン；および（ｉｉ）キナーゼドメインを含み得る。
【００６５】
キナーゼドメインは、ＡＫＴまたはＪＡＫキナーゼドメインであり得るか、またはこれを含み得る。
【００６６】
融合タンパク質は、（ｉ）ＺＡＰ７０またはＰＴＰＮ６  ＳＨ２ドメイン；および（ｉｉ）プロテアーゼドメインを含み得る。
【００６７】
プロテアーゼドメインは、タバコエッチウイルスプロテアーゼ（ＴｅＶ）であり得るか、またはこれを含み得る。
【００６８】
第２のさらなる態様では、本発明は、ＺＡＰ７０  ＳＨ２ドメインを含むがＺＡＰ７０キナーゼドメインを欠く切断型タンパク質を提供する。
【００６９】
第３のさらなる態様では、本発明は、ＰＴＰＮ６  ＳＨ２ドメインを含むがＰＴＰＮ６キナーゼドメインを欠く切断型タンパク質を提供する。
【００７０】
本発明はまた、シグナル伝達系であって、
（ｉ）抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、ＣＤ３ゼータエンドドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインとを含む受容体；および
（ｉｉ）ＺＡＰ７０  ＳＨ２ドメインを含む本発明の第１のさらなる態様の融合タンパク質；または本発明の第２のさらなる態様の切断型タンパク質
を含み、前記抗原結合ドメインへの抗原の結合が、前記ＣＤ３ゼータエンドドメインと前記融合／切断型タンパク質との間の結合をもたらすシグナル伝達系を提供する。
【００７１】
本発明はまた、シグナル伝達系であって、
（ｉ）抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、ＰＴＰＮ６結合ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインとを含む受容体；および
（ｉｉ）ＰＴＰＮ６  ＳＨ２ドメインを含む本発明の第１のさらなる態様の融合タンパク質；または本発明の第３のさらなる態様の切断型タンパク質
を含み、前記抗原結合ドメインへの抗原の結合が、前記ＰＴＰＮ６結合ドメインと前記融合／切断型タンパク質との間の結合をもたらすシグナル伝達系を提供する。
【００７２】
受容体は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であり得る。
【００７３】
第４のさらなる態様では、本発明は、本発明の第１のさらなる態様の融合タンパク質または本発明の第２もしくは第３のさらなる態様の切断型タンパク質をコードする核酸を提供する。
【００７４】
第５のさらなる態様では、本発明は、（ｉ）ＺＡＰ７０またはＰＴＰＮ６  ＳＨ２ドメイン；および（ｉｉ）プロテアーゼドメイン（例えば、ＴｅＶドメイン）を含む融合タンパク質をコードする核酸配列、ならびに
（ｉ）膜繋留；
（ｉｉ）プロテアーゼ認識部位；および
（ｉｉｉ）転写因子
を含む膜繋留転写因子をコードする核酸配列を含む核酸構築物を提供する。
【００７５】
第６のさらなる態様では、本発明は、
（ａ）ＰＴＰＮ６  ＳＨ２ドメインを含む本発明の第１のさらなる態様の融合タンパク質または本発明の第３のさらなる態様の切断型タンパク質をコードする核酸配列；および
（ｂ）ＩＴＩＭ含有エンドドメインを含む受容体をコードする核酸配列
を含む核酸構築物を提供する。
【００７６】
第７のさらなる態様では、本発明は、（ｉ）ＺＡＰ７０またはＰＴＰＮ６  ＳＨ２ドメイン；および（ｉｉ）プロテアーゼドメイン（例えば、ＴｅＶドメイン）を含む融合タンパク質をコードする核酸配列、ならびにプロテアーゼ切断部位を含む受容体をコードする核酸配列を含む核酸構築物を提供する。
【００７７】
第８のさらなる態様では、本発明は、
（ａ）（ｉ）ＰＴＰＮ６  ＳＨ２ドメイン；および（ｉｉ）プロテアーゼドメイン（例えば、ＴｅＶドメイン）を含む融合タンパク質をコードする核酸配列；
（ｂ）プロテアーゼ切断部位を含む受容体をコードする核酸配列；ならびに
（ｃ）ＩＴＩＭ含有エンドドメインを含む受容体をコードする核酸配列
を含む核酸構築物を提供する。
【００７８】
受容体は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であり得る。
【００７９】
適切には、本発明の第８の態様の核酸構築物では、核酸配列（ｂ）は、
（ｉ）膜貫通ドメインと活性化エンドドメインとの間のプロテアーゼ切断部位；または
（ｉｉ）プロテアーゼ切断部位を介して阻害性エンドドメインに融合された活性化エンドドメイン
を含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であり得る。
【００８０】
第９のさらなる態様では、本発明は、本発明の第４のさらなる態様の核酸または本発明の第５〜９のさらなる態様のいずれかの核酸構築物を含むベクターを提供する。
【００８１】
ベクターは、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターであり得る。
【００８２】
第１０のさらなる態様では、本発明は、本発明の第１のさらなる態様の融合タンパク質または本発明の第２もしくは第３のさらなる態様の切断型タンパク質を含む細胞を提供する。
【００８３】
第１１のさらなる態様では、本発明は、（ａ）ＰＴＰＮ６  ＳＨ２ドメインを含む本発明の第１のさらなる態様の融合タンパク質、または本発明の第３のさらなる態様の切断型タンパク質；および（ｂ）ＩＴＩＭ含有エンドドメインを含む受容体を含む細胞を提供する。
【００８４】
細胞は、Ｔ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などの免疫細胞であり得る。
【００８５】
第１２のさらなる態様では、本発明は、（ｉ）ＺＡＰ７０またはＰＴＰＮ６  ＳＨ２ドメイン；および（ｉｉ）プロテアーゼドメイン（例えば、ＴｅＶドメイン）を含む融合タンパク質、ならびにプロテアーゼ切断部位を含む受容体を含む細胞を提供する。
【００８６】
第１３のさらなる態様では、本発明は、
（ａ）（ｉ）ＰＴＰＮ６  ＳＨ２ドメイン；および（ｉｉ）プロテアーゼドメイン（例えば、ＴｅＶドメイン）を含む融合タンパク質；
（ｂ）プロテアーゼ切断部位を含む受容体；ならびに
（ｃ）ＩＴＩＭ含有エンドドメインを含む受容体
を含む細胞を提供する。
【００８７】
受容体は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であり得る。
【００８８】
受容体（ｂ）は、
（ｉ）膜貫通ドメインと活性化エンドドメインとの間のプロテアーゼ切断部位；または
（ｉｉ）プロテアーゼ切断部位を介して阻害性エンドドメインに融合された活性化エンドドメイン
を含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であり得る。
【００８９】
第１４のさらなる態様では、本発明は、本発明の第４のさらなる態様の核酸または本発明の第５〜９のさらなる態様のいずれかの核酸構築物を含む細胞を提供する。
【００９０】
第１５のさらなる態様では、本発明は、複数の、本発明の第１０〜１４のさらなる態様のいずれかの細胞を含む医薬組成物を提供する。
【００９１】
第１６のさらなる態様では、本発明は、疾患の処置および／または予防において使用するための、本発明の第１５のさらなる態様の医薬組成物を提供する。
【００９２】
第１７のさらなる態様では、本発明は、疾患を処置および／または予防するための方法であって、第１５のさらなる態様の医薬組成物を被験体に投与する工程を含む方法に関する。
【００９３】
前記方法は、以下：
（ｉ）被験体からＴ細胞またはＮＫ細胞含有試料を単離する工程；
（ｉｉ）本発明の第４〜９のさらなる態様のいずれかの核酸、または本発明の第１０のさらなる態様のベクターを前記Ｔ細胞またはＮＫ細胞に形質導入またはトランスフェクトする工程；および
（ｉｉｉ）（ｉｉ）からのＴ細胞またはＮＫ細胞を前記被験体に投与する工程
を含み得る。
【００９４】
第１８のさらなる態様では、本発明は、疾患の処置および／または予防のための医薬の製造における、第１５のさらなる態様の医薬組成物の使用に関する。
【００９５】
疾患は、癌であり得る。
【００９６】
第１９のさらなる態様では、本発明は、本発明の第４のさらなる態様の核酸、または本発明の第５〜８のさらなる態様のいずれかの核酸構築物、または本発明の第９のさらなる態様のベクターを含むキットを提供する。
【００９７】
第２０のさらなる態様では、本発明は、本発明の第１０〜１４のさらなる態様のいずれかの細胞を含むキットに関する。
【００９８】
第２１のさらなる態様では、本発明は、本発明の第１０〜１４のさらなる態様のいずれかの細胞を作製するための方法であって、本発明の第４〜８のさらなる態様のいずれかの核酸配列、または本発明の第９のさらなる態様のベクターを前記細胞に導入する工程を含む方法に関する。
【００９９】
細胞は、被験体から単離された試料に由来し得る。本発明のまたさらなる態様は、以下の項目に要約されている。
【０１００】
Ａ１．リン酸化免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）に結合するがキナーゼドメインを欠くタンパク質由来のＳＨ２ドメインを含む、切断型タンパク質。
【０１０１】
Ａ２．ＺＡＰ７０  ＳＨ２ドメインを含むがＺＡＰ７０キナーゼドメインを欠く、項目Ａ１に記載の切断型タンパク質。
【０１０２】
Ｂ１．リン酸化免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）に結合するがホスファターゼドメインを欠くタンパク質由来のＳＨ２ドメインを含む、切断型タンパク質。
【０１０３】
Ｂ２．ＰＴＰＮ６  ＳＨ２ドメインを含むがＰＴＰＮ６ホスファターゼドメインを欠く、項目Ｂ１に記載の切断型タンパク質。
【０１０４】
Ｂ３．ＳＨＰ−２  ＳＨ２ドメインを含むがＳＨＰ−２ホスファターゼドメインを欠く、項目Ｂ１に記載の切断型タンパク質。
【０１０５】
Ｃ１．（ｉ）リン酸化免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）に結合するタンパク質由来のＳＨ２ドメイン；および（ｉｉ）ホスファターゼドメインを含む、融合タンパク質。
【０１０６】
Ｃ２．ＺＡＰ７０  ＳＨ２ドメインを含む、項目Ｃ１に記載の融合タンパク質。
【０１０７】
Ｃ３．ＰＴＰＮ６またはＳＨＰ−２ホスファターゼドメインを含む、項目Ｃ１またはＣ２に記載の融合タンパク質。
【０１０８】
Ｄ１．（ｉ）リン酸化免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）に結合するタンパク質由来のＳＨ２ドメイン；および（ｉｉ）キナーゼドメインを含む、融合タンパク質。
【０１０９】
Ｄ２．ＰＴＰＮ６またはＳＨＰ−２由来のＳＨ２ドメインを含む、項目Ｄ１に記載の融合タンパク質。
Ｄ３．Ｚａｐ７０キナーゼドメインを含む、項目Ｄ１またはＤ２に記載の融合タンパク質。
【０１１０】
Ｄ４．ＡＫＴまたはＪＡＫキナーゼドメインを含む、項目Ｄ１またはＤ２に記載の融合タンパク質。
【０１１１】
Ｅ１．（ｉ）リン酸化免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）に結合するタンパク質由来の、またはリン酸化免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）に結合するタンパク質由来のＳＨ２ドメイン；および（ｉｉ）異種シグナル伝達ドメインを含む、融合タンパク質。
【０１１２】
Ｅ２．ＺＡＰ７０、ＰＴＰＮ６またはＳＨＰ−２由来のＳＨ２ドメインを含む、項目Ｅ１に記載の融合タンパク質。
【０１１３】
Ｅ３．前記異種シグナル伝達ドメインが、ＩＴＡＭまたはＩＴＩＭ含有受容体によって通常は活性化されないシグナル伝達分子に由来する、項目Ｅ１またはＥ２に記載の融合タンパク質。
【０１１４】
Ｅ４．前記異種シグナル伝達ドメインが共刺激性ドメインである、項目Ｅ１、Ｅ２またはＥ３に記載の融合タンパク質。
【０１１５】
Ｅ５．ＣＤ２８、ＯＸ４０または４１ＢＢ共刺激性ドメインを含む、項目Ｅ４に記載の融合タンパク質。
【０１１６】
Ｅ６．前記共刺激性ドメインが阻害性ドメインである、項目Ｅ１、Ｅ２またはＥ３に記載の融合タンパク質。
【０１１７】
Ｅ７．前記阻害性ドメインが、ＣＤ１４８またはＣＤ４５のエンドドメインを含む、項目Ｅ６に記載の融合タンパク質。
【０１１８】
Ｅ８．前記異種シグナル伝達ドメインが、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＢＴＬＡ、ＣＤ３０、ＧＩＴＲまたはＨＶＥＭのエンドドメインであるか、またはこれを含む、項目Ｅ６に記載の融合タンパク質。
【０１１９】
Ｆ１．（ｉ）リン酸化免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）に結合するタンパク質由来のＳＨ２ドメイン；および（ｉｉ）ＩＴＡＭ含有ドメインを含む、融合タンパク質。
【０１２０】
Ｆ２．ＺＡＰ７０  ＳＨ２ドメインを含む、項目Ｆ１に記載の融合タンパク質。
【０１２１】
Ｆ３．前記ＩＴＡＭ含有ドメインがＣＤ３ゼータのエンドドメインであるか、またはこれを含む、項目Ｆ１またはＦ２に記載の融合タンパク質。
【０１２２】
Ｇ１．（ｉ）リン酸化免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）に結合するタンパク質由来のＳＨ２ドメイン；および（ｉｉ）ＩＴＩＭ含有ドメインを含む、融合タンパク質。
【０１２３】
Ｇ２．ＰＴＰＮ６またはＳＨＰ−２由来のＳＨ２ドメインを含む、項目Ｇ１に記載の融合タンパク質。
【０１２４】
Ｇ３．前記ＩＴＩＭ含有ドメインが、ＰＤ１、ＰＤＣＤ１、ＢＴＬＡ４、ＬＩＬＲＢ１、ＬＡＩＲ１、ＣＴＬＡ４、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＬ５、ＫＩＲ３ＤＬ１またはＫＩＲ３ＤＬ３由来のエンドドメインであるか、またはこれを含む、項目Ｇ１またはＧ２に記載の融合タンパク質。
【０１２５】
Ｈ１．（ｉ）リン酸化免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）に結合するタンパク質由来の、またはリン酸化免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）に結合するタンパク質由来のＳＨ２ドメイン；および（ｉｉ）プロテアーゼドメインを含む、融合タンパク質。
【０１２６】
Ｈ２．ＺＡＰ７０、ＰＴＰＮ６またはＳＨＰ−２由来のＳＨ２ドメインを含む、項目Ｈ１に記載の融合タンパク質。
【０１２７】
Ｈ３．前記プロテアーゼドメインがタバコエッチウイルスプロテアーゼ（ＴｅＶ）であるか、またはこれを含む、項目Ｈ１またはＨ２に記載の融合タンパク質。
【０１２８】
Ｉ１．項目ＡもしくはＢのいずれかに記載の切断型タンパク質、または項目Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、ＧもしくはＨのいずれかに記載の融合タンパク質をコードする核酸配列。
【０１２９】
Ｊ１．項目Ｉに記載の核酸配列、およびキメラ抗原受容体をコードする核酸配列を含む、核酸構築物。
【０１３０】
Ｊ２．項目Ｉに記載の核酸配列、およびプロテアーゼ切断部位を有する膜繋留転写因子をコードする核酸配列を含む、核酸構築物。
【０１３１】
Ｊ３．項目Ｉに記載の核酸配列、および細胞内プロテアーゼ切断部位を含む標的ＣＡＲをコードする核酸配列を含む、核酸構築物。
【０１３２】
Ｋ１．項目Ｉに記載の核酸配列または項目Ｊに記載の核酸構築物を含む、ベクター。
【０１３３】
Ｌ１．項目ＡもしくはＢのいずれかに記載の切断型タンパク質、または項目Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、ＧもしくはＨのいずれかに記載の融合タンパク質を含む、細胞。
【０１３４】
Ｍ１．項目Ｈのいずれかに記載の融合タンパク質、およびプロテアーゼ切断部位を有する膜繋留転写因子を含む、細胞。
【０１３５】
Ｍ２．前記プロテアーゼ切断部位における切断が、標的遺伝子の発現増加をもたらす転写因子を放出する、項目Ｍ１に記載の細胞。
【０１３６】
Ｍ３．前記標的遺伝子がサイトカインをコードする、項目Ｍ２に記載の細胞。
【０１３７】
Ｍ４．前記サイトカインが、以下の群：ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５およびＩＬ−１２から選択される、項目Ｍ３に記載の細胞。
【０１３８】
Ｍ５．項目Ｈのいずれかに記載の融合タンパク質、および細胞内プロテアーゼ切断部位を含む標的受容体（ＣＡＲ）を含む、細胞。
【０１３９】
Ｍ６．前記標的ＣＡＲが活性化または共刺激性エンドドメインを含み、前記プロテアーゼ切断部位における切断が、前記標的ＣＡＲから前記エンドドメインを除去する、項目Ｍ５に記載の細胞。
【０１４０】
Ｍ７．前記標的ＣＡＲが阻害性エンドドメインを含み、前記プロテアーゼ切断部位における切断が、前記標的ＣＡＲから前記阻害性エンドドメインを除去する、項目Ｍ５に記載の細胞。
【０１４１】
Ｍ８．前記阻害性エンドドメインが、ＣＤ１４８またはＣＤ４５エンドドメインを含む、項目Ｍ７に記載の細胞。
【０１４２】
Ｍ９．項目Ｈのいずれかに記載の融合タンパク質、ならびに２つのＣＡＲ：ＩＴＡＭ含有エンドドメインを含む活性化ＣＡＲ；および項目Ｍ５〜Ｍ８のいずれかで定義される標的ＣＡＲを含む、細胞。
【０１４３】
Ｍ１０．項目Ｈのいずれかに記載の融合タンパク質、ならびに２つのＣＡＲ：ＩＴＩＭ含有エンドドメインを含む阻害性ＣＡＲ；および項目Ｍ５〜Ｍ８のいずれかで定義される標的ＣＡＲを含む、細胞。
【０１４４】
上記本発明の態様は、Ｔ細胞シグナル伝達経路を、例えば表１に記載されている機構によってモジュレートし、または変化させることを可能にする。
【表１−１】
2020115898.tif 000002
【表１−２】
2020115898.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【０１４５】
【図１】（ａ）−即時Ｔ細胞活性化経路の図。Ｔ細胞受容体活性化は、ＩＴＡＭのリン酸化をもたらす。リン酸化ＩＴＡＭは、ＺＡＰ７０  ＳＨ２ドメインによって認識される。認識されると、ＺＡＰ７０は膜近位領域にリクルートされ、続いてそのキナーゼドメインがＬＡＴをリン酸化する。続いて、リン酸化ＬＡＴは、ＧＲＡＰ、ＧＲＢ２およびＰＬＣ−γのＳＨ２ドメインによって認識される。（ｂ）−即時Ｔ細胞阻害経路の図。ＰＤ１などの阻害性免疫受容体の活性化は、ＩＴＩＭドメインのリン酸化をもたらす。これらは、ＰＴＰＮ６のＳＨ２ドメインによって認識される。認識されると、ＰＴＰＮ６は膜近位領域にリクルートされ、続いてそのホスファターゼドメインがＩＴＡＭドメインを脱リン酸化して、免疫活性化を阻害する。
【０１４６】
【図２】遮断シグナル系の図−ａ）キナーゼドメインを含まない切断型ＺＡＰ７０が過剰発現される。その結果として、それは、ＩＴＡＭについて全長ＺＡＰ７０と競合し、ＩＴＡＭシグナル伝達を低減する。（ｂ）ホスファターゼドメインを含まない切断型ＰＴＰＮ６が過剰発現され、全長ＰＴＰＮ６と競合して、ＩＴＩＭシグナル伝達を低減する。
【０１４７】
【図３】クロスワイヤーシグナル系の図：（ａ）ＺＡＰ７０  ＳＨ２はＰＴＰＮ６ホスファターゼに融合されているので、ＩＴＡＭリン酸化を弱めるように作用する。（ｂ）ＰＴＰＮ６  ＳＨ２はＺＡＰ７０キナーゼに融合されており、阻害性シグナルに応じて逆説的に活性化される。
【０１４８】
【図４】増幅シグナル系の図：（ａ）全長ＺＡＰ７０は、そのアミノ末端に結合されたＣＤ３ゼータエンドドメインを有するので、一連のＩＴＡＭがアセンブルする。（ｂ）全長ＰＴＰＮ６は、そのアミノ末端に結合されたＰＤ１エンドドメインを有するので、一連のＩＴＩＭがアセンブルする。
【０１４９】
【図５】バイパスシグナル系の例の図：（ａ）ＣＤ２８エンドドメインに融合されたＺＡＰ７０；（ｂ）４１ＢＢエンドドメインに融合されたＺＡＰ７０；（ｃ）ＡＫＴキナーゼに融合されたＺＡＰ７０；（ｄ）ＰＴＰＮ６  ＳＨ２ドメインは、４１ＢＢエンドドメインに融合されている。
【０１５０】
【図６】例示的な転写シグナル系の図：ａ）ＺＡＰ−ＴｅＶ融合物は、そのＴｅＶ認識モチーフの切断によって膜から放出され得る膜繋留転写因子と共発現される。これは、ＣＤ１９  ＣＡＲと共発現されることが示されている。したがって、標的細胞上のＣＤ１９を認識すると、Ｔ細胞が活性化し、加えて転写因子が活性化する。（ｂ）代わりにＰＴＰＮ６−ＴｅＶ融合物を使用した代替の系。ここで、ＣＡＲは、ＩＴＩＭを有するエンドドメインからなる。したがって、ＣＡＲによってＣＤ１９が認識されると、転写因子が活性化するが、これはＴ細胞の活性化とは無関係である。
【０１５１】
【図７】去勢シグナル系の図：２つのＣＡＲが示されている−ＣＤ１９を認識し、活性化するもの、およびＣＤ３３を認識し、阻害するもの−これらの特異性は、例示のためのものに過ぎない。（ａ）ＡＮＤ  ＮＯＴシグナル去勢；この場合、活性化されると、ＳＨ２−Ｔｅｖ融合タンパク質は活性化ＩＴＩＭ  ＣＡＲにリクルートされる。これは、ＴｅＶ切断部位が膜貫通ドメインをＩＴＡＭドメインに接続するように、構築された活性化ＣＡＲからのＩＴＡＭの切断をもたらす。したがって、活性化ＣＡＲは阻害される。（ｂ）ＡＮＤシグナル去勢：この場合、活性化されると、ＳＨ２−ＴｅＶ融合タンパク質はＩＴＩＭ  ＣＡＲにリクルートされる。これは、ホスファターゼがＴｅＶ切断ドメインを介してそのカルボキシ末端に接続されるように、構築された活性化ＣＡＲからのホスファターゼドメインの放出をもたらす。これは構成的阻害の解放をもたらし、ＣＡＲが同種抗原の存在下で活性化することを可能にする。
【０１５２】
【図８】異なるＳＨ２ドメインとＡＫＴキナーゼドメインとのいくつかの融合物を構築した：ＺＡＰ−ＡＫＴ、ＧＲＡＰ−ＡＫＴ、ＧＲＢ−ＡＫＴおよびＰＬＣ−γ。
【０１５３】
【図９−１】（ａ）分裂促進抗体ＯＫＴ３で活性化してまたは活性化せずに、異なるＳＨ２／ＡＫＴ融合物を形質導入したＴ細胞のホスホＡＫＴ染色。（ｂ）ＺＡＰ−ＡＫＴ融合物、ＺＡＰおよびＡＫＴがフレキシブルリンカーを介して接続された改良ＺＡＰ−ＡＫＴ融合物、ならびにＲ１９０Ｋ置換がＺＡＰのＩＴＡＭ結合能力を除去する対照ＺＡＰ−ＡＫＴを形質導入したＴ細胞のホスホＡＫＴ染色。Ｔ細胞をＯＫＴ３で刺激し、またはＯＫＴ３で刺激しなかった。ｆａｃｓプロットは、非形質導入Ｔ細胞のものに対してオーバーレイされている。
【図９−２】（ａ）分裂促進抗体ＯＫＴ３で活性化してまたは活性化せずに、異なるＳＨ２／ＡＫＴ融合物を形質導入したＴ細胞のホスホＡＫＴ染色。（ｂ）ＺＡＰ−ＡＫＴ融合物、ＺＡＰおよびＡＫＴがフレキシブルリンカーを介して接続された改良ＺＡＰ−ＡＫＴ融合物、ならびにＲ１９０Ｋ置換がＺＡＰのＩＴＡＭ結合能力を除去する対照ＺＡＰ−ＡＫＴを形質導入したＴ細胞のホスホＡＫＴ染色。Ｔ細胞をＯＫＴ３で刺激し、またはＯＫＴ３で刺激しなかった。ｆａｃｓプロットは、非形質導入Ｔ細胞のものに対してオーバーレイされている。
【０１５４】
【図１０】（ａ）漸増量のＯＫＴ３で活性化されたＴ細胞のホスホ−ＡＫＴブロット。（ｂ）刺激しなかった、ＯＫＴ３のみで刺激した、またはＯＫＴ３およびＩＬ−２の両方で刺激したＺＡＰ−ＡＫＴまたは対照Ｔ細胞の顕微鏡写真。ＯＫＴ３のみで刺激したＺＡＰ−ＡＫＴ  Ｔ細胞は、ＯＫＴ３およびＩＬ２の両方で刺激した非形質導入Ｔ細胞に類似する。
【０１５５】
【図１１】（ａ）直接的なＴｅＶ転写スイッチの実行。ＣＤ１９  ＣＡＲのエンドドメインは、ＴｅＶプロテアーゼで置換されている。膜繋留ＶＰ１６／ＧＡＬ４転写因子も共発現される。ルシフェラーゼレポーターは、ＶＰ１６／ＧＡＬ５活性を検出する。（ｂ）ＺＡＰ−ＴｅＶによる実行。標準的なＣＤ１９  ＣＡＲは、膜繋留転写因子と一緒にＺＡＰ−ＴｅＶ融合物と共発現される。
【０１５６】
【図１２】ＣＤ１９陰性（左）またはＣＤ１９陽性（右）標的への曝露後の、ＺＡＰ−ＴｅＶ系転写スイッチおよび対照発現Ｔ細胞の活性。活性は、ルシフェラーゼを添加した後の光出力によって測定される。順に、試験した条件は、（ａ）ＺＡＰ−ＴｅＶと共発現させたａＣＤ１９  ＣＡＲ；（ｂ）不活性（Ｒ１９０Ｋ）と共発現させたａＣＤ１９  ＣＡＲ；（ｃ）ＺＡＰ−ＴｅＶおよび膜繋留転写因子と共に共発現させたａＣＤ１９  ＣＡＲ；（ｄ）膜繋留転写因子と共発現させた不活性（Ｒ１９０Ｋ）ＺＡＰ−ＴＥＶと共発現させたａＣＤ１９  ＣＡＲ；（ｅ）膜繋留転写因子と共発現させたａＣＤ１９  ＣＡＲ／ＴｅＶ融合物；（ｆ）構成的に活性なＧＡＬ４／ＶＰ１６転写因子。
【０１５７】
【図１３】（ａ）ＣＡＲの一般的な構造：結合ドメインは、抗原を認識する；スペーサーは、細胞表面から結合ドメインを引き上げる；膜貫通ドメインはタンパク質を膜に固定し、エンドドメインはシグナルを伝達する。（ｂ）〜（ｄ）：様々な世代および配置のＣＡＲエンドドメイン：（ｂ）初期の設計は、ＩＴＡＭシグナルを単独で、ＦｃεＲ１−γまたはＣＤ３ζエンドドメインを介して伝達する設計であり、後期の設計は、さらなる（ｃ）１つまたは（ｄ）２つの共刺激性シグナルをシスで伝達するる設計である。
【０１５８】
【図１４−１】本発明の例示的なタンパク質配列。
【図１４−２】本発明の例示的なタンパク質配列。
【図１４−３】本発明の例示的なタンパク質配列。
【図１４−４】本発明の例示的なタンパク質配列。
【図１４−５】本発明の例示的なタンパク質配列。
【図１４−６】本発明の例示的なタンパク質配列。
【図１４−７】本発明の例示的なタンパク質配列。
【図１４−８】本発明の例示的なタンパク質配列。
【０１５９】
【図１５】切断型ＳＨＰ−１（ＰＴＰＮ６）または切断型ＳＨＰ−２を使用したＰＤ−１シグナルの遮断。ＰＤ１と、ＣＡＲのみ（ＦＭＣ６３）；またはＣＡＲおよび切断型ＳＨＰ−１もしくはＣＡＲおよび切断型ＳＨＰ−２を含有するバイシストロン性構築物のいずれかとをＰＢＭＣ細胞に共形質導入した。これらの細胞を、ＣＤ１９、ＰＤＬ１またはその両方を形質導入したＳｕｐＴ１細胞と４８時間共培養し、ＩＦＮγ放出をＥＬＩＳＡによって測定した。
【０１６０】
【図１６】ＳＨＰ−２  ＳＨ２ドメインとＺａｐ７０キナーゼとの融合物を使用したＰＤ−１シグナルのハイジャック。ＰＤ１と、ＣＡＲのみ（ＦＭＣ６３）；またはＣＡＲ、ならびにＳＨＰ−２  ＳＨ２ドメインおよびＺＡＰ７０キナーゼを含む融合タンパク質を含有するバイシストロン性構築物のいずれかとをＰＢＭＣ細胞に共形質導入した。これらの細胞を、ＣＤ１９またはＰＤＬ１を形質導入したＳｕｐＴ１細胞と１：１の比で２４時間共培養した。ＩＦＮγ放出をＥＬＩＳＡによって測定し（Ａ）、ＳｕｐＴ１細胞の死滅をＦＡＣＳによって定量した（Ｂ）。
【発明を実施するための形態】
【０１６１】
詳細な説明
タンパク質
本発明は、ＳＨ２ドメインを含む切断型タンパク質を提供する。
【０１６２】
本発明はまた、（ｉ）ＳＨ２ドメイン；および（ｉｉ）異種ドメインを含む融合タンパク質を提供する。
【０１６３】
ＳＨ２ドメインは、リン酸化免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）に結合するタンパク質に由来し得るか、またはリン酸化免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）に結合するタンパク質に由来し得る。
【０１６４】
ＩＴＡＭに結合するタンパク質の例は、ＺＡＰ７０である。ＩＴＩＭに結合するタンパク質の例としては、ＰＴＰＮ６およびＳＨＰ−２が挙げられる。
【０１６５】
したがって、本発明の融合タンパク質は、ＳＨ２ドメイン、およびＳＨ２ドメインが由来する野生型タンパク質に存在しない少なくとも１つのさらなるドメインを含む。
【０１６６】
ＳＲＣ相同性２（ＳＨ２）ドメイン
細胞内シグナル伝達経路は、タンパク質の可逆的な翻訳後修飾（リン酸化、ユビキチン化およびアセチル化を含む）によって開始および制御される。
【０１６７】
ＳＨ２ドメインはモジュールタンパク質ドメインであり、アダプターとして機能し、それらの各タンパク質結合パートナー（多くの場合は細胞表面受容体）におけるリン酸化ペプチドに結合することによって、タンパク質間相互作用を媒介する。典型的には、ＳＨ２ドメインは、より長いペプチドモチーフが標的タンパク質内にある状況ではリン酸化チロシン残基に結合し、ＳＨ２ドメインは、最大クラスの公知のｐＴｙｒ認識ドメインを表す。
【０１６８】
ＳＨ２ドメインは、いかなる内在性の触媒活性も欠くが、多くの場合、それらは独立の触媒ドメインにカップリングされて、特異的な入力シグナルに応じて、これらの触媒ドメインを特定の細胞内位置に、または適切な基質、活性化因子もしくは阻害因子の近位に局在化するように機能する。加えて、ＳＨ２ドメインはまた、アダプタータンパク質ドメインに連結されて見られ得るので、大きな多タンパク質複合体の形成において働き得る。
【０１６９】
ゼータ鎖関連プロテインキナーゼ７０（ＺＡＰ７０）
ＺＡＰ７０は、Ｔ細胞およびナチュラルキラー細胞の表面膜の近くで通常は発現されるタンパク質である。それはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の一部であり、Ｔ細胞シグナル伝達において重要な役割を果たす。その分子量は７０ｋＤａであり、２つのＮ末端ＳＨ２ドメインおよびＣ末端キナーゼドメインから構成される。それは、プロテインチロシンキナーゼファミリーのメンバーである。
【０１７０】
Ｔ細胞活性化における最初の段階は、ＴＣＲによる標的細胞上のペプチドＭＨＣ複合体の認識である。この初期事象は、ＴＣＲ複合体におけるＬｃｋキナーゼと、ＣＤ３ゼータの細胞質尾部との近接会合を引き起こす。次いで、Ｌｃｋは、ＣＤ３ゼータの細胞質尾部におけるチロシン残基をリン酸化して、ＺＡＰ７０がリクルートを可能にする。ＺＡＰ７０は、ＴＣＲの結合後のＴ細胞活性化において中心的な役割を果たすＳＨ２含有キナーゼである。ＺＡＰ７０におけるタンデムＳＨ２ドメインがリン酸化ＣＤ３に結合し、その結果、ＺＡＰ７０は、Ｌｃｋによって、または他のＺＡＰ７０分子によってトランスにリン酸化および活性化される。次いで、活性ＺＡＰ７０は、下流の膜タンパク質、とりわけ活性化Ｔ細胞のリンカー（ＬＡＴ）タンパク質をリン酸化することができる。ＬＡＴは足場タンパク質であり、複数の残基におけるそのリン酸化は、ＬＡＴにおけるリン酸化ペプチドを認識し、Ｔ細胞活性化シグナルを下流に伝達するいくつかの他のＳＨ２ドメイン含有タンパク質（Ｇｒｂ２、ＰＬＣ−ｇおよびＧｒａｐ）とそれが相互作用することを可能にし、最終的には広範なＴ細胞応答が生じる。このプロセスは、図１に要約されている。
【０１７１】
ヒトＺＡＰ７０タンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ４３４０３を有する。この配列は６１９アミノ酸長であり、配列番号１として示されている。
【化１】
2020115898.tif 000004
【０１７２】
本発明の融合タンパク質は、ＺＡＰ７０  ＳＨ２ドメインを含み得る。本発明の切断型タンパク質は、ＺＡＰ７０  ＳＨ２ドメインを含み得るか、またはこれからなり得る。これに関して、融合または切断型タンパク質は、配列番号２として示されている配列を含み得るか、またはこれからなり得る。
【化２】
2020115898.tif 000005
【０１７３】
ＺＡＰ７０は、配列のＮ末端、配列番号１として示されている配列の残基１０〜１０２および１６３〜２５４において、２つのＳＨ２ドメインを有する。したがって、本発明の切断型タンパク質または融合タンパク質は、配列番号３および４として示されている配列の一方または両方を含み得る。
【化３】
2020115898.tif 000006
【０１７４】
変異型配列が、必要な特性を有するＳＨ２ドメイン配列である限り、融合タンパク質は、少なくとも８０、８５、９０、９５、９８または９９％の配列同一性を有する配列番号２、３または４の変異型を含み得る。換言すれば、変異型配列は、ＺＡＰ７０のリクルートを可能にするＣＤ３ゼータの細胞質尾部におけるリン酸化チロシン残基に結合することができなければならない。
【０１７５】
配列アラインメントの方法は、当技術分野では周知であり、好適なアラインメントプログラムを用いて遂行される。配列同一性％は、２つの配列を最適な形で並列させたときにその２つの配列において同一であるアミノ酸残基またはヌクレオチド残基のパーセンテージをいう。ヌクレオチドおよびタンパク質の配列相同性または同一性は、ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖで公的に入手可能である、デフォルトパラメータを用いるＢＬＡＳＴプログラム（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）などの標準アルゴリズムを用いて決定され得る。配列同一性または相同性を決定するための他のアルゴリズムとしては、ＬＡＬＩＧＮ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／ｌａｌｉｇｎ／およびｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／ｌａｌｉｇｎ／ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ．ｈｔｍｌ）、ＡＭＡＳ（マルチプルアライメント配列分析、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｏｍｐｂｉｏ．ｄｕｎｄｅｅ．ａｃ．ｕｋ／Ｓｏｆｔｗａｒｅ／Ａｍａｓ／ａｍａｓ．ｈｔｍｌ）、ＦＡＳＴＡ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｓｓｓ／ｆａｓｔａ／）、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｏｍｅｇａ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｃｌｕｓｔａｌｏ／）、ＳＩＭ（ｈｔｔｐ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｓｉｍ／）ならびにＥＭＢＯＳＳ  Ｎｅｅｄｌｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／ｅｍｂｏｓｓ＿ｎｅｅｄｌｅ／ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ．ｈｔｍｌ）が挙げられる。
【０１７６】
特定の実施形態では、融合タンパク質は、ＺＡＰ７０  ＳＨ２ドメインおよびＺＡＰ７０キナーゼドメインを含み得る。例えば、融合タンパク質は、配列番号１として示されている配列、または少なくとも８０、８５、９０、９５、９８もしくは９９％の配列同一性を有するその変異型を含み得る。
【０１７７】
非受容体６型チロシンプロテインホスファターゼ（ＰＴＰＮ６）
ＰＴＰＮ６は、Ｓｒｃ相同性領域２ドメイン含有ホスファターゼ−１（ＳＨＰ−１）としても公知である。それは、プロテインチロシンホスファターゼファミリーのメンバーである。
【０１７８】
ＰＴＰＮ６のＮ末端領域は、ＰＴＰＮ６とその基質との相互作用を媒介する２つのタンデムＳＨ２ドメインを含有する。Ｃ末端領域は、チロシンプロテインホスファターゼドメインを含有する。
【０１７９】
ＰＴＰＮ６は、多くの阻害性免疫受容体またはＩＴＩＭ含有受容体に結合して、それからのシグナルを伝搬することができる。このような受容体の例としては、限定されないが、ＰＤ１、ＰＤＣＤ１、ＢＴＬＡ４、ＬＩＬＲＢ１、ＬＡＩＲ１、ＣＴＬＡ４、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＬ５、ＫＩＲ３ＤＬ１およびＫＩＲ３ＤＬ３が挙げられる。
【０１８０】
ヒトＰＴＰＮ６タンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ２９３５０を有する。この配列は５９５アミノ酸長であり、配列番号５として示されている。
【化４】
2020115898.tif 000007
【０１８１】
本発明の融合タンパク質は、ＰＴＰＮ６  ＳＨ２ドメインを含み得る。本発明の切断型タンパク質は、ＰＴＰＮ６  ＳＨ２ドメインを含み得るか、またはこれからなり得る。これに関して、融合または切断型タンパク質は、配列番号６として示されている配列を含み得るか、またはこれからなり得る。
【化５】
2020115898.tif 000008
【０１８２】
ＰＴＰＮ６は、配列のＮ末端、配列番号５として示されている配列の残基４〜１００および１１０〜２１３において、２つのＳＨ２ドメインを有する。したがって、本発明の切断型タンパク質または融合タンパク質は、配列番号３および４として示されている配列の一方または両方を含み得る。
【化６】
2020115898.tif 000009
【０１８３】
変異型配列が、必要な特性を有するＳＨ２ドメイン配列である限り、融合タンパク質は、少なくとも８０、８５、９０、９５、９８または９９％の配列同一性を有する配列番号６、７または８の変異型を含み得る。換言すれば、変異型配列は、ＰＴＰＮ６のリクルートを可能にするＰＤ１、ＰＤＣＤ１、ＢＴＬＡ４、ＬＩＬＲＢ１、ＬＡＩＲ１、ＣＴＬＡ４、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＬ５、ＫＩＲ３ＤＬ１またはＫＩＲ３ＤＬ３の少なくとも１つの細胞質尾部におけるリン酸化チロシン残基に結合することができなければならない。
【０１８４】
特定の実施形態では、融合タンパク質は、ＰＴＰＮ６  ＳＨ２ドメインおよびＰＴＰＮ６ホスファターゼドメインを含み得る。例えば、融合タンパク質は、配列番号５として示されている配列、または少なくとも８０、８５、９０、９５、９８もしくは９９％の配列同一性を有するその変異型を含み得る。
【０１８５】
ＳＨＰ−２
ＰＴＰＮ１１、ＰＴＰ−１ＤおよびＰＴＰ−２Ｃとしても公知のＳＨＰ−２は、プロテインチロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）ファミリーのメンバーである。ＰＴＰＮ６のように、ＳＨＰ−２は、そのＮ末端における２つのタンデムＳＨ２ドメインと、それに続くプロテインチロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）ドメインとからなるドメイン構造を有する。不活性状態では、Ｎ末端ＳＨ２ドメインはＰＴＰドメインに結合し、活性部位への潜在的基質のアクセスを遮断する。したがって、ＳＨＰ−２は、自己阻害される。標的ホスホ−チロシル残基に結合すると、Ｎ末端ＳＨ２ドメインはＰＴＰドメインから放出され、自己阻害を緩和することによって酵素を触媒的に活性化する。
【０１８６】
ヒトＳＨＰ−２は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ３５２３５−１を有する。この配列は５９７アミノ酸長であり、配列番号９として示されている。
【化７】
2020115898.tif 000010
【０１８７】
本発明の融合タンパク質は、ＳＨＰ−２  ＳＨ２ドメインを含み得る。本発明の切断型タンパク質は、ＳＨＰ−２  ＳＨ２ドメインを含み得るか、またはこれからなり得る。これに関して、融合または切断型タンパク質は、例えば配列番号９のアミノ酸６〜１０２を含むＳＨＰ−２の第１のＳＨ２ドメイン、もしくは例えばＳＨＰ−２のアミノ酸１１２〜２１６を含むＳＨＰ−２の第２のＳＨ２ドメインを含み得るか、またはこれからなり得る。融合または切断型タンパク質は、配列番号１０、１１もしくは１２として示されている配列を含み得るか、またはこれからなり得る。
【化８】
2020115898.tif 000011
【０１８８】
変異型配列が、ＩＴＩＭ含有ドメインに結合することができるＳＨ２ドメイン配列である限り、融合タンパク質は、少なくとも８０、８５、９０、９５、９８または９９％の配列同一性を有する配列番号１０、１１または１２の変異型を含み得る。例えば、変異型配列は、ＰＤ１、ＰＤＣＤ１、ＢＴＬＡ４、ＬＩＬＲＢ１、ＬＡＩＲ１、ＣＴＬＡ４、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＬ５、ＫＩＲ３ＤＬ１またはＫＩＲ３ＤＬ３の細胞質尾部におけるリン酸化チロシン残基に結合することができるものであり得る。
【０１８９】
異種ドメイン
本明細書で使用される用語「異種ドメイン」は、
ｉ）ＺＡＰ７０  ＳＨ２ドメインを含む融合タンパク質については、野生型ＺＡＰ７０（配列番号１を参照のこと）；
ｉｉ）ＰＴＰＮ６  ＳＨ２ドメインを含む融合タンパク質については、野生型ＰＴＰＮ６（配列番号５を参照のこと）；または
ｉｉｉ）ＳＨＰ−２  ＳＨ２ドメインを含む融合タンパク質については、野生型ＳＨＰ−２（配列番号９を参照のこと）
に存在しない任意のタンパク質ドメインを指す。
【０１９０】
異種ドメインは、ＺＡＰ７０、ＳＨＰ−２もしくはＰＴＰＮ６由来の異なるタンパク質であり得るか、またはこれに由来し得る（例えば、その一部）。
【０１９１】
あるいは、融合タンパク質は、ＺＡＰ７０  ＳＨ２ドメインと、ＰＴＰＮ６由来のドメイン、例えばＰＴＰＮ６キナーゼドメインとの融合物を含み得る。同様に、融合タンパク質は、ＰＴＰＮ６  ＳＨ２ドメインと、ＺＡＰ７０由来のドメイン、例えばＺＡＰ７０キナーゼドメインとの融合物を含み得る。
【０１９２】
増幅シグナル
本発明は、ＩＴＡＭ結合タンパク質由来のＳＨ２ドメイン；およびＩＴＡＭ含有ドメインを含む融合タンパク質を提供する。
【０１９３】
本発明はまた、ＩＴＩＭ結合タンパク質由来のＳＨ２ドメイン；およびＩＴＩＭ含有ドメインを含む融合タンパク質を提供する。
【０１９４】
これらの「増幅」シグナル伝達分子は、Ｔ細胞などの免疫細胞内において興奮性または阻害性シグナルを増幅するであろう。
【０１９５】
図４に示されているように、このような分子の存在は、ＩＴＡＭまたはＩＴＩＭのいずれかの連結をもたらして、それぞれ活性化または阻害性シグナルの増大をもたらすであろう。
【０１９６】
活性化シグナルの増幅は、抗原に対する免疫細胞（例えば、ＣＡＲ−Ｔ細胞）の感受性を増加させることが望ましい状況において有用である。これは、例えば、標的抗原が標的細胞上において低レベルで発現される場合であり得る。
【０１９７】
Ｔ細胞活性化を低減または防止することが望ましい状況における阻害系の増幅。国際公開第２０１５／０７５４６９号には、Ｔ細胞などの細胞によって発現されると、少なくとも２つの標的抗原ＡおよびＢ）の特定の発現パターンを検出することができる「論理ゲート」キメラ抗原受容体ペアのパネルが記載されている。この出願に記載されている「ＡＮＤ  ＮＯＴゲート」は、抗原Ａが標的細胞上に存在するが抗原Ｂは存在しない場合にのみ、Ｔ細胞がトリガーするように、ＣＡＲのペアを含む。このＡＮＤ  ＮＯＴゲートでは、（抗原Ａを認識する）一方のＣＡＲは、ＩＴＡＭを含む活性化エンドドメインを有するのに対して、（抗原Ｂを認識する）他方のＣＡＲは、ＩＴＩＭを含み得る阻害性エンドドメインを有する。抗原Ａのみの存在下では、ライゲーションされていない阻害性ＣＡＲの存在は、Ｔ細胞活性化を防止するために不十分であるので、活性化が起こる。しかしながら、両抗原の存在下では、高密度の活性化および阻害性ＣＡＲの両方を有する膜領域が形成する。両エンドドメインが濃縮するので、Ｔ細胞活性化が防止または低減される。
【０１９８】
本発明の増幅シグナル伝達分子を使用した阻害性シグナルの増幅をＡＮＤゲートで使用して、両抗原の存在下で（すなわち、阻害性ＣＡＲによる活性化ＣＡＲの不完全阻害により）起こる任意の残存シグナル伝達を低減または除去し得る。
【０１９９】
ＩＴＡＭ含有ドメイン
一実施形態では、融合タンパク質は、ＺＡＰ７０  ＳＨ２ドメインおよび免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）含有ドメインを含む。
【０２００】
全長ＺＡＰ７０とＩＴＡＭ含有ドメインとの融合物は、活性化免疫シグナルを増幅する構造をもたらす。ここで、融合タンパク質は、ホスホ−ＩＴＡＭ免疫受容体エンドドメインにリクルートされる。通常、ＺＡＰ７０は、シグナルを伝搬するように機能するだけではなく、リン酸化されてより多くのＺＡＰ７０をリクルートする別の一連のＩＴＡＭも提供する。これは、シグナル強度を増加させるために有用であり得、例えば、低密度抗原に対する感受性を増加させ得る。いくつかの実施形態では、融合物は、ＩＴＡＭ含有エンドドメインを有するＺＡＰ７０  ＳＨ２ドメインのみを含み得る（例えば、融合物は、ＺＡＰ７０キナーゼドメインを含有しない）。他の実施形態では、ＩＴＡＭを有するＺＡＰ７０触媒ドメイン（キナーゼドメイン）の比を変動させて、活性化受容体と同種標的との相互作用のダイナミクスに応じて、活性化の動態に影響を与え得る。
【０２０１】
ＩＴＡＭは、免疫系の特定の細胞表面タンパク質の細胞質尾部において２回反復される４アミノ酸の保存的配列である。モチーフは、任意の２つの他のアミノ酸によってロイシンまたはイソロイシンから分離されたチロシンを含有し、シグネチャーはＹｘｘＬ／Ｉとなる。典型的には、これらのシグネチャーの２つは、分子の尾部において６〜８アミノ酸によって分離される（ＹｘｘＬ／Ｉｘ（６−８）ＹｘｘＬ／Ｉ）。
【０２０２】
ＩＴＡＭは、免疫細胞におけるシグナル伝達に重要である。したがって、それらは、重要な細胞シグナル伝達分子の尾部、例えばＴ細胞受容体複合体のＣＤ３およびζ鎖、Ｂ細胞受容体複合体のＣＤ７９アルファおよびβ鎖、ならびに特定のＦｃ受容体に見られる。これらのモチーフ内のチロシン残基は、受容体分子とそれらのリガンドとの相互作用後にリン酸化され、細胞のシグナル伝達経路に関与する他のタンパク質のためのドッキング部位を形成する。
【０２０３】
幾つかのタンパク質が、１つまたはそれより多くのＩＴＡＭモチーフを伴うエンドドメインを含むことが知られている。かかるタンパク質として少し例を挙げれば、ＣＤ３イプシロン鎖、ＣＤ３ガンマ鎖およびＣＤ３デルタ鎖が挙げられる。ＩＴＡＭモチーフは、サインＹｘｘＬ／Ｉを与える、任意の２つの他のアミノ酸によりロイシンまたはイソロイシンから分離されたチロシンとして容易に認識され得る。常というわけではないが、典型的には、これらのモチーフの２つが、分子（ＹｘｘＬ／Ｉｘ（６−８）ＹｘｘＬ／Ｉ）のテイルにおける６〜８個の間のアミノ酸により分離される。このため、当業者であれば、活性化シグナルを伝達するための１つまたはそれより多くのＩＴＡＭを含む既存のタンパク質を容易に見出すことができる。さらに、モチーフが単純であり、複合２次構造が要求されないと仮定すると、当業者であれば、活性化シグナルを伝達するための人工ＩＴＡＭを含むポリペプチドを設計できる（合成シグナル伝達分子に関する、国際公開第２００００６３３７２号参照）。
【０２０４】
ＩＴＡＭ含有ドメインは、ＣＤ３ゼータエンドドメインであり得るか、またはこれを含み得る。適切には、ＩＴＡＭ含有ドメインは、配列番号１３として示されている配列、または少なくとも８０、８５、９０、９５、９８もしくは９９％の配列同一性を有するその変異型であって、リン酸化されてＺＡＰ７０をリクルートする能力を保持するその変異型を含み得る。
【化９】
2020115898.tif 000012
【０２０５】
一例として、融合タンパク質は、ＣＤ３ゼータエンドドメインに融合されたＺＡＰ７０−ＳＨ２ドメインを含有する配列番号１４として示されている配列であり得るか、またはこれを含み得る。
【０２０６】
【化１０】
2020115898.tif 000013
【０２０７】
適切には、融合タンパク質は、配列番号１４として示されている配列、または少なくとも８０、８５、９０、９５、９８もしくは９９％の配列同一性を有するその変異型を含み得る。
【０２０８】
ＩＴＩＭ含有ドメイン
一実施形態では、融合タンパク質は、ＰＴＰＮ６  ＳＨ２ドメインおよび免疫受容阻害性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）含有ドメインを含む。
全長ＰＴＰＮ６とＩＴＩＭ含有ドメインとの融合物は、阻害性免疫シグナルを増幅する構造をもたらす。ここで、融合タンパク質は、ホスホ−ＩＴＩＭ免疫受容体エンドドメインにリクルートされる。通常、ＰＴＰＮ６は、シグナルを伝搬するように機能するだけではなく、リン酸化されてより多くのＰＴＰＮ６をリクルートする別の一連のＩＴＩＭも提供する。いくつかの実施形態では、融合物は、ＩＴＩＭ含有エンドドメインを有するＰＴＰＮ６  ＳＨ２ドメインのみを含み得る（例えば、融合物は、ＰＴＰＮ６ホスファターゼドメインを含有しない）。他の実施形態では、ＩＴＩＭを有するＰＴＰＮ６触媒ドメイン（ホスファターゼドメイン）の比を変動させて、阻害性受容体と同種標的との相互作用のダイナミクスに応じて、活性化の動態に影響を与え得る。
【０２０９】
ＩＴＩＭは、免疫系の多くの阻害性受容体の細胞質尾部に見られる保存的アミノ酸配列（Ｓ／Ｉ／Ｖ／ＬｘＹｘｘＩ／Ｖ／Ｌ）である。ＩＴＩＭを有する阻害性受容体がそれらのリガンドと相互作用した後、それらのＩＴＩＭモチーフは、Ｓｒｃキナーゼの酵素によってリン酸化されて、それらは、ＰＴＰＮ６  ＳＨ２ドメインとリン酸化ＩＴＩＭドメインとの間の相互作用を介して、ＰＴＰＮ６をリクルートすることが可能になる。
【０２１０】
ＩＴＩＭ含有エンドドメインとしては、例えば、ＣＤ２２、ＬＡＩＲ−１、キラー害性受容体ファミリー（ＫＩＲ）、ＬＩＬＲＢ１、ＣＴＬＡ４、ＰＤ−１、ＢＴＬＡ由来のものが挙げられる。ＰＤＣＤ１、ＢＴＬＡ４、ＬＩＬＲＢ１、ＬＡＩＲ１、ＣＴＬＡ４、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＬ５、ＫＩＲ３ＤＬ１およびＫＩＲ３ＤＬ３由来のＩＴＩＭエンドドメインは、それぞれ配列番号１５〜２４に示されている。
【化１１】
2020115898.tif 000014
【０２１１】
ＩＴＩＭ含有ドメインは、ＰＤＣＤ１、ＢＴＬＡ４、ＬＩＬＲＢ１、ＬＡＩＲ１、ＣＴＬＡ４、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＬ５、ＫＩＲ３ＤＬ１もしくはＫＩＲ３ＤＬ３エンドドメインであり得るか、またはこれを含み得る。適切には、ＩＴＩＭ含有ドメインは、配列番号１５〜２４のいずれかに示されている配列、または少なくとも８０、８５、９０、９５、９８もしくは９９％の配列同一性を有するその変異型であって、Ｓｒｃキナーゼによってリン酸化されて阻害性免疫シグナルを増幅する能力を保持するその変異型を含み得る。
【０２１２】
一例として、融合タンパク質は、ＰＤ１エンドドメインに融合されたＰＴＰＮ６−ＳＨ２ドメインを含有する配列番号２５として示されている配列であり得るか、またはこれを含み得る。
【化１２】
2020115898.tif 000015
【０２１３】
適切には、融合タンパク質は、配列番号２５として示されている配列、または少なくとも８０、８５、９０、９５、９８もしくは９９％の配列同一性を有するその変異型を含み得る。
【０２１４】
クロスワイヤーシグナル
本発明は、ＩＴＡＭ結合タンパク質由来のＳＨ２ドメイン；およびホスファターゼドメインを含む融合タンパク質を提供する。
【０２１５】
本発明はまた、ＩＴＩＭ結合タンパク質由来のＳＨ２ドメイン；およびキナーゼドメインを含む融合タンパク質を提供する。
【０２１６】
これらの「クロスワイヤー」シグナル伝達分子は、Ｔ細胞などの免疫細胞内において興奮性または阻害性シグナルを逆転させるであろう。例えば、ＣＡＲによる標的抗原の認識後に、またはＴＣＲによるＭＨＣ：ペプチドの認識後に、Ｔ細胞が興奮性シグナルを受け取ると、第１の種類のクロスワイヤー分子の存在により、細胞は、興奮性シグナルを阻害性シグナルと解釈するであろう。
【０２１７】
Ｔ細胞活性化を弱めることまたは修正は、様々な状況において有用であり得、例えば、それは、標的細胞上の標的抗原の発現が高レベルであるＣＡＲ発現Ｔ細胞のために使用され得る。それは、Ｔ細胞枯渇および／または活性化誘導性細胞死をもたらし得るＴ細胞過剰活性化を防止するために使用され得る。Ｔ細胞の非常に過度なまたは非常に迅速な活性化の防止はまた、ＣＡＲ−Ｔ細胞処置の病理的副作用、例えばサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）を予防または軽減し得る。
【０２１８】
逆の状況は、例えば、ＰＤ１のライゲーション後に、Ｔ細胞が阻害性シグナルを受け取る場合であり、第２の種類のクロスワイヤー分子の存在により、細胞は、阻害性シグナルを興奮性シグナルと解釈するであろう。
【０２１９】
Ｔ細胞阻害の軽減または逆転は、細胞が、敵対的な腫瘍微小環境内において阻害性刺激を克服するのに役立つので、Ｔ細胞の持続性およびインビボでの増殖を増加させるはずである。
【０２２０】
一実施形態では、融合タンパク質は、ＰＴＰＮ６  ＳＨ２ドメインおよびＺＡＰ７０キナーゼドメインを含む。別の実施形態では、本融合タンパク質は、ＰＴＰＮ６キナーゼドメインに融合されたＺＡＰ７０  ＳＨ２ドメインを含む。
【０２２１】
ＰＴＰＮ６由来のホスファターゼドメインに融合されたＺＡＰ７０  ＳＨ２ドメインに関する実施形態では、ＰＴＰＮ６ホスファターゼドメインが、ＺＡＰ７０  ＳＨ２ドメインを介して活性化ＩＴＡＭにリクルートされるので、Ｔ細胞は興奮性シグナルを受け取ると、それを阻害性シグナルと解釈する。
【０２２２】
ＺＡＰ７０由来のキナーゼドメインに融合されたＰＴＰＮ６  ＳＨ２ドメインに関する実施形態では、ＺＡＰ７０キナーゼドメインが、ＰＴＰＮ６ドメインを介して活性化ＩＴＩＭにリクルートされるので、Ｔ細胞は阻害性シグナルを受け取ると、それを興奮性シグナルと解釈する。ＰＴＰＮ６  ＳＨ２ドメインとＺＡＰ７０キナーゼドメインとの融合物は、野生型ＰＴＰＮ６によるリン酸化ＩＴＩＭの競合をもたらして阻害性シグナルを遮断するが、さらに逆説的な活性化シグナルを伝達するであろう。これは、腫瘍微小環境におけるチェックポイント遮断シグナルの克服に適用され得る。
【０２２３】
ヒトＺＡＰ７０キナーゼ、ＰＴＰＮ６ホスファターゼおよびＳＨＰ−２ホスファターゼドメインドメインの配列は、それぞれ配列番号２６、２７および２８として示されている。
【化１３】
2020115898.tif 000016
【０２２４】
ＺＡＰ７０キナーゼドメイン、ＰＴＰＮ６ホスファターゼドメインまたはＳＨＰ−２ホスファターゼドメインは、それぞれ配列番号２６、配列番号２７もしくは配列番号２８として示されている配列、または少なくとも８０、８５、９０、９５、９８もしくは９９％の配列同一性を有するその変異型であって、野生型キナーゼ／ホスファターゼドメインと同じ様式で下流のタンパク質をリン酸化もしくは脱リン酸化する能力を保持するその変異型であり得るか、またはこれを含み得る。
【０２２５】
ＺＡＰ７０キナーゼドメインに融合されたＰＴＰＮ６  ＳＨ２ドメイン；ＰＴＰＮ６キナーゼドメインに融合されたＺＡＰ７０  ＳＨ２ドメイン；およびＺＡＰ７０キナーゼドメインに融合されたＳＨＰ−２  ＳＨ２ドメインを含む融合タンパク質の例は、それぞれ配列番号２９、配列番号３０および配列番号６１として示されている。
【化１４】
2020115898.tif 000017
【化１５】
2020115898.tif 000018
【０２２６】
融合タンパク質は、配列番号２９、配列番号３０もしくは配列番号６１として示されている配列、または少なくとも８０、８５、９０、９５、９８もしくは９９％の配列同一性を有するその変異型であり得るか、またはこれを含み得る。
【０２２７】
異種シグナル伝達ドメイン
本融合タンパク質は、（ｉ）ＺＡＰ７０、ＰＴＰＮ６またはＳＨＰ−２  ＳＨ２ドメイン；および（ｉｉ）異種シグナル伝達ドメインを含み得る。
【０２２８】
本明細書で使用される用語「異種シグナル伝達ドメイン」は、野生型ＺＡＰ７０、ＰＴＰＮ６またはＳＨＰ−２タンパク質に存在しないシグナル伝達ドメインを指す。このように、融合タンパク質がＺＡＰ７０  ＳＨ２ドメインを含む場合、それは、ＺＡＰ７０キナーゼドメインではないシグナル伝達ドメインを含む。あるいは、融合タンパク質がＰＴＰＮ６  ＳＨ２ドメインを含む場合、それは、ＰＴＰＮ６ホスファターゼドメインではないシグナル伝達ドメインを含む。
【０２２９】
バイパスシグナル
異種シグナル伝達ドメインは、ＩＴＡＭ含有受容体によって通常は活性化されないシグナル伝達分子に由来し得る。換言すれば、異種シグナル伝達ドメインは、ＴＣＲへの抗原の結合後の免疫学的シグナル１の伝搬に関与しないシグナル伝達分子に由来し得る。免疫学的シグナル１は、同種標的細胞のＴ細胞死滅を引き起こすために十分であるが、増殖および生存のためにＴ細胞を完全に活性化しない。
【０２３０】
本発明のこの態様の一実施形態では、本発明は、（ｉ）ＩＴＡＭに結合するタンパク質由来のＳＨ２ドメイン；および（ｉｉ）異種シグナル伝達ドメインを含む融合タンパク質を提供する。
【０２３１】
例えば、ＺＡＰ７０と、ＩＴＡＭ含有受容体によって典型的には活性化されない別のシグナル伝達分子との融合物は、シグナルを一方の経路から別のものにバイパスするように作用し得る。一例は、共刺激である。ＺＡＰ７０とＣＤ２８のエンドドメインとの融合物は、ＣＤ２８共刺激性シグナルおよびＩＴＡＭ活性化シグナルを伝達し得る。同様に、ＺＡＰ７０と４１ＢＢまたはＯＸ４０のエンドドメインとの融合物は、４１ＢＢまたはＯＸ４０共刺激性シグナルを伝達し得る。他の経路もリクルートされ得、例えば、ＺＡＰ７０とＡＫＴキナーゼドメインとの融合物は、ＩＴＡＭがリン酸化されると、ＡＫＴシグナルの伝達をもたらし得る。他の例としては、ＪＡＫ由来のキナーゼドメインが挙げられ得る。このように、Ｔ細胞は、単純な抗原認識シグナルを、共刺激性シグナルの伝達またはサイトカイン型シグナルの伝達とさえ解釈し得る。
【０２３２】
このような融合タンパク質は、例えば、Ｔ細胞の反復エクスビボ刺激が、共刺激表面抗原を欠く集団であって、限定的なインビボ増殖能力を有する集団をもたらし、その結果、持続性および有効性が限定され得るアプローチにおいて有用であり得る。ＴＣＲのみを介したＴ細胞の活性化をもたらす共刺激表面抗原の喪失は、インビボ有効性と持続性に悪影響を及ぼすより大きな程度の活性化誘導性細胞死に関連している。この効果は、表面で発現される４−１ＢＢおよびＯＸ４０の活性化によって逆転され得るが、これは、共刺激が活性化誘導性細胞死を防止し得、腫瘍特異的Ｔ細胞のより大きな増殖を支持し得ることを実証している。
【０２３３】
本発明のこの態様の別の実施形態では、本発明は、（ｉ）ＩＴＩＭに結合するタンパク質由来のＳＨ２ドメイン；および（ｉｉ）異種シグナル伝達ドメインを含む融合タンパク質を提供する。
【０２３４】
例えば、ＰＴＰＮ６  ＳＨ２ドメインまたはＳＨＰ−２  ＳＨ２ドメインは、共刺激性エンドドメインに融合され得るので、Ｔ細胞は、阻害性シグナルを共刺激性シグナルと解釈する。
【０２３５】
異種シグナル伝達ドメインは、例えば、ＣＤ２８、４１ＢＢまたはＯＸ４０に由来し得る。
【０２３６】
ＣＤ２８は、Ｔ細胞増殖を引き起こす強力な共刺激性シグナル（すなわち、免疫学的シグナル２）を提供する。ＣＤ２８は、ＣＤ８０（Ｂ７．１）およびＣＤ８６（Ｂ７．２）タンパク質の受容体である。
【０２３７】
４１ＢＢ（ＣＤ１３７）は、ＴＮＦスーパーファミリーに属する２型膜貫通糖タンパク質であり、活性化Ｔ細胞上で発現される。４１ＢＢの架橋は、Ｔ細胞増殖、ＩＬ−２分泌、生存および細胞溶解活性を増強する。
【０２３８】
ＯＸ４０（ＣＤ１３４）は二次共刺激性分子であり、活性化の２４〜７２時間後に発現される；そのリガンドのＯＸ４０Ｌはまた、休止中の抗原提示細胞上では発現されないが、それらの活性化後に発現される。ＯＸ４０の発現は、Ｔ細胞の完全な活性化に依存する；ＣＤ２８なしでは、ＯＸ４０の発現は遅延し、４倍低いレベルである。ＯＸ４０を介したシグナル伝達は、初期活性化および増殖後の長期Ｔ細胞生存に必要である。
【０２３９】
ＣＤ２８、４１ＢＢおよびＯＸ４０シグナル伝達ドメイン（エンドドメイン）は、それぞれ配列番号３１、３２および３３として示されている。
【化１６】
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【０２４０】
異種シグナル伝達ドメインは、それぞれ配列番号３１；配列番号３２もしくは配列番号３３として示されている配列、または少なくとも８０、８５、９０、９５、９８もしくは９９％の配列同一性を有するその変異型であり得るか、またはこれを含み得る。
【０２４１】
異種シグナル伝達ドメインは、阻害性シグナル伝達ドメインであり得るか、またはこれを含み得る。
【０２４２】
例えば、阻害性シグナル伝達ドメインは、ＣＤ１４８またはＣＤ４５のエンドドメインを含み得る。ＣＤ１４８およびＣＤ４５は、本来的にはＴＣＲシグナル伝達の上流のリン酸化チロシンに対して作用することが示されている。
【０２４３】
ＣＤ１４８は、受容体様プロテインチロシンホスファターゼであり、ＰＬＣγ１およびＬＡＴのリン酸化および機能を妨害することによって、ＴＣＲシグナル伝達を負に調節する。
【０２４４】
すべての造血細胞上に存在するＣＤ４５は、プロテインチロシンホスファターゼであり、再度ＰＬＣγ１をリン酸化することによって、シグナル伝達および機能応答を調節することができる。
【０２４５】
阻害性シグナル伝達ドメインは、受容体様チロシンホスファターゼの一部の全部（ａｌｌ  ｏｆ  ｐａｒｔ）を含み得る。ホスファターゼは、Ｔ細胞シグナル伝達に関与する要素、例えばＰＬＣγ１および／またはＬＡＴのリン酸化および／または機能を妨害し得る。
【０２４６】
阻害性シグナル伝達ドメインは、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＢＴＬＡ、ＣＤ３０、ＧＩＴＲまたはＨＶＥＭのエンドドメインであり得るか、またはこれを含み得る。
【０２４７】
阻害性シグナル伝達ドメインは、配列番号３４〜３９として示されている配列、または少なくとも８０％の配列同一性を有するその変異型を含み得る。
【化１７】
2020115898.tif 000020
【０２４８】
配列が有効な細胞内シグナル伝達ドメインを提供する限り、変異型配列は、配列番号３４〜３９と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を有し得る。
【０２４９】
適切には、融合タンパク質は、配列番号４０〜４５として示されている配列のいずれかであり得るか、またはこれを含み得る。
【化１８】
2020115898.tif 000021
【化１９】
2020115898.tif 000022
【０２５０】
適切には、融合タンパク質は、配列番号４０〜４５として示されている配列、または少なくとも８０、８５、９０、９５、９８もしくは９９％の配列同一性を有するその変異型のいずれかを含み得る。
【０２５１】
キナーゼドメイン
異種シグナル伝達ドメインは、キナーゼドメインであり得る。例えば、異種シグナル伝達ドメインは、ＡＫＴキナーゼドメインまたはＪＡＫキナーゼドメインを含み得る。
【０２５２】
プロテインキナーゼＢ（ＰＫＢ）としても公知のＡｋｔは、セリン／トレオニン特異的プロテインキナーゼであり、グルコース代謝、アポトーシス、細胞増殖、転写および細胞遊走などの複数の細胞プロセスにおいて重要な役割を果たす。
【０２５３】
ＴＣＲの活性化後、Ｔ細胞は、生存および増殖を支持するＩＬ２を分泌する。しかしながら、この分泌は一過性であり、インビトロで活性化および増殖したＴ細胞は、生存を外因性ＩＬ２に依存するようになる。ＴＣＲまたはＣＡＲ活性化に関連するＩＴＡＭリン酸化後のＡＫＴリン酸化を増加させることによって、外因性ＩＬ２への活性化Ｔ細胞の依存性を低減または除去し、それらの増殖および生存を増強し得る。
【０２５４】
Ａｋｔキナーゼドメインは、配列番号４６として示されている。
【化２０】
2020115898.tif 000023
【０２５５】
配列が有効なキナーゼドメインを提供する限り、異種シグナル伝達ドメインは、配列番号４６として示されている配列、または少なくとも８０、８５、９０、９５、９８もしくは９９％の配列同一性を有するその変異型であり得るか、またはこれを含み得る。
【０２５６】
一例として、融合タンパク質は、それぞれ、Ａｋｔキナーゼドメインに直接融合されたＺＡＰ７０−ＳＨ２ドメイン、リンカーを介してＡｋｔキナーゼドメインに融合されたＺＡＰ７０−ＳＨ２ドメイン、非機能的になるように突然変異されたＺＡＰ７０であって、Ａｋｔキナーゼドメインに融合されたＺＡＰ７０；および、Ａｋｔキナーゼドメインに融合された二重ＳＨＰ−２  ＳＨ２ドメインを含有する配列番号４７〜４９および６２として示されている配列のいずれかであり得るか、またはこれを含み得る。
【化２１】
2020115898.tif 000024
【化２２】
2020115898.tif 000025
【０２５７】
融合タンパク質は、配列番号４７〜４９もしくは６２のいずれかとして示されている配列、または少なくとも８０、８５、９０、９５、９８もしくは９９％の配列同一性を有するその変異型を含み得る。
【０２５８】
ヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）は、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ経路を介してサイトカイン媒介性シグナルを伝達する細胞内非受容体チロシンキナーゼのファミリーである。４つのＪＡＫファミリーメンバーは、ヤヌスキナーゼ１（ＪＡＫ１）；ヤヌスキナーゼ２（ＪＡＫ２）；ヤヌスキナーゼ３（ＪＡＫ３）；およびチロシンキナーゼ２（ＴＹＫ２）である。
【化２３】
2020115898.tif 000026
【化２４】
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【０２５９】
プロテアーゼドメイン
本発明はまた、（ｉ）ＩＴＡＭまたはＩＴＩＭ含有タンパク質に結合するタンパク質由来のＳＨ２ドメインおよび（ｉｉ）プロテアーゼドメインを含む融合タンパク質を提供する。
【０２６０】
プロテアーゼドメインは、特定の認識配列において切断することができる任意のプロテアーゼであり得る。このように、プロテアーゼドメインは、特定の標的配列における切断を介して、単一の標的ポリペプチドを２つの異なるポリペプチドに分離することを可能にする任意のプロテアーゼであり得る。
【０２６１】
プロテアーゼドメインは、タバコエッチウイルス（ＴｅＶ）プロテアーゼドメインであり得る。
【０２６２】
ＴｅＶプロテアーゼは、キモトリプシン様プロテアーゼである高度に配列特異的なシステインプロテアーゼである。ＴｅＶプロテアーゼは、その標的切断部位に非常に特異的であるので、インビトロおよびインビボの両方で融合タンパク質の制御切断に頻繁に使用される。コンセンサスＴｅＶ切断部位は、ＥＮＬＹＦＱ＼Ｓ（「＼」は、切断されるペプチド結合を示す）である。ヒト細胞などの哺乳動物細胞は、内因性ＴｅＶプロテアーゼを発現しない。
【０２６３】
したがって、ＴｅＶ切断認識部位は、配列番号５１として示されている。
配列番号５１−Ｔｅｖ切断部位
ＥＮＬＹＦＱＳ
【０２６４】
ＴｅＶプロテアーゼドメインは、配列番号５２として示されている。
【化２５】
2020115898.tif 000028
【０２６５】
したがって、配列が有効なプロテアーゼ機能を提供する限り、プロテアーゼドメインは、配列番号５２として示されている配列、または少なくとも８０、８５、９０、９５、９８もしくは９９％の配列同一性を有するその変異型であり得るか、またはこれを含み得る。
【０２６６】
一例として、融合タンパク質は、それぞれ、ＴＥＶプロテアーゼ配列に融合されたＺＡＰ７０−ＳＨ２ドメイン、またはＴＥＶプロテアーゼ配列に融合されたＰＴＰＮ６−ＳＨ２ドメインを含有する配列番号５３または５４として示されている配列であり得るか、またはこれを含み得る。
【化２６】
2020115898.tif 000029
【０２６７】
融合タンパク質は、配列番号５３もしくは５４として示されている配列、または少なくとも８０、８５、９０、９５、９８もしくは９９％の配列同一性を有するその変異型を含み得る。
【０２６８】
ＳＨ２ドメインおよび異種ドメインを空間的に分離するために、融合タンパク質のＳＨ２ドメインおよび異種ドメインは、リンカーによって分離され得る。
【０２６９】
転写シグナル
前記セクションに記載されているように、プロテアーゼを含む融合タンパク質は、細胞において、プロテアーゼ切断部位を有する膜繋留タンパク質と共発現され得る。プロテアーゼ部位における膜繋留タンパク質の切断は、タンパク質の膜遠位部分を放出するであろう。
【０２７０】
膜繋留タンパク質は、例えば、膜繋留転写因子であり得る。切断が起こると、転写はその繋留から放出され、自由に核に移行する。
【０２７１】
ＺＡＰ７０  ＳＨ２またはＰＴＰＮ６  ＳＨ２ドメインとプロテアーゼドメインとの融合物は、それぞれＩＴＡＭまたはＩＴＩＭリン酸化後に膜近位へのプロテアーゼのリクルートをもたらすであろう。
【０２７２】
ＩＴＡＭまたはＩＴＩＭドメインのリン酸化は、膜近位領域への、それぞれプロテアーゼドメインに融合されたＺＡＰ７０  ＳＨ２またはＰＴＰＮ６  ＳＨ２のリクルートをもたらす。この結果、転写因子はその繋留から放出され、核に移動する。これは、多くの用途を有し得る：例えば、活性化されると、Ｔ細胞は、Ｔ細胞の分化を防止するように作用する転写因子を発現するようにプログラムされ得る。例えば、活性化されると、Ｔ細胞は、Ｔ細胞の増殖および生存を刺激するように作用し得るＩＬ２、ＩＬ７もしくはＩＬ１５、または敵対的な腫瘍微小環境を腫瘍の免疫拒絶をより促すものに変換し得るＩＬ１２などのサイトカインを発現するようにプログラムされ得る。
【０２７３】
特に、
（ｉ）リン酸化ＩＴＡＭに結合するタンパク質由来のＳＨ２ドメインを含む融合タンパク質；および
（ｉｉ）膜繋留転写因子
を共発現する細胞であって、
前記転写因子が、膜繋留から放出されると、細胞におけるＩＬ２、Ｉｌ７および／またはＩＬ１５の発現を増加させる細胞が提供される。
【０２７４】
また、
（ｉ）リン酸化ＩＴＩＭに結合するタンパク質由来のＳＨ２ドメインを含む融合タンパク質；および
（ｉｉ）膜繋留転写因子
を共発現する細胞であって、
前記転写因子が、膜繋留から放出されると、細胞におけるＩＬ１２の発現を増加させる細胞が提供される。
【０２７５】
プロテアーゼ認識部位
プロテアーゼ認識部位は、融合タンパク質のプロテアーゼドメインが、膜繋留と転写因子との間において膜繋留転写因子を特異的に切断することを可能にする任意のアミノ酸配列であり得る。例えば、一実施形態では、プロテアーゼドメインはＴｅＶプロテアーゼドメインであり、プロテアーゼ認識部位はＴｅＶプロテアーゼ認識部位である。
【０２７６】
膜繋留
膜繋留は、転写因子およびプロテアーゼ認識部位を膜近位に局在化することができる任意の配列、シグナルまたはドメインであり得る。例えば、膜繋留は、ミリストイル化シグナルまたは膜貫通ドメインであり得る。
【０２７７】
適切には、膜貫通ドメインは、膜において熱力学的に安定な任意のタンパク質構造であり得る。これは、典型的には、いくつかの疎水性残基から構成されるアルファヘリックスである。膜貫通部分を供給するために、任意の膜貫通タンパク質の膜貫通ドメインが使用され得る。当業者であれば、ＴＭＨＭＭアルゴリズム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＴＭＨＭＭ−２．０／）を使用して、タンパク質の膜貫通ドメインの存在および範囲を決定し得る。さらに、タンパク質の膜貫通ドメインが比較的単純な構造（すなわち、膜を貫通するために十分な長さの疎水性アルファヘリックスを形成すると予測されるポリペプチド配列）であることを考慮して、人工的に設計されたＴＭドメインも使用され得る（米国特許第７０５２９０６号には、合成膜貫通成分が記載されている）。
【０２７８】
膜貫通ドメインは、良好な安定性を与えるＣＤ２８に由来し得る。
【０２７９】
転写因子
転写因子は、関連ＩＴＡＭまたはＩＴＩＭモチーフのリン酸化後に所望の応答を刺激するように選択される任意の転写因子であり得る。
【０２８０】
転写因子は、天然または人工のものであり得る。人工転写因子は、例えば、ＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーアセンブリまたはＣｒｉｓｐＲ／ＣＡＳ９に由来し得、後者は、ガイドｍＲＮＡと共発現される。
【０２８１】
好ましくは、転写因子は、プロテアーゼドメインによる切断後にヌクレアーゼへの輸送を助ける核局在化シグナルを含有するであろう。
【０２８２】
一例として、（膜繋留転写因子を含むタンパク質であって、（ｉ）膜繋留；（ｉｉ）プロテアーゼ認識部位；および（ｉｉｉ）転写因子を含むタンパク質をコードする）核酸配列（ｉｉ）は、ＲＱＲ８ドメイン；ＣＤ４−Ｅｎｄｏｔｏｘ１膜貫通ドメイン、ＴＥＶプロテアーゼ認識部位およびＶＰ１６−ＧＡＬ４転写因子を含有する配列番号５５として示されている配列からなるか、またはこれを含むタンパク質をコードし得る。
【化２７】
2020115898.tif 000030
適切には、タンパク質は、配列番号５５として示されている配列、または少なくとも８０、８５、９０、９５、９８もしくは９９％の配列同一性を有するその変異型を含み得る。
【０２８３】
受容体
本発明はさらに、（ａ）ＰＴＰＮ６  ＳＨ２ドメインを含む本発明の第１の態様の融合タンパク質または本発明の第３の態様の切断型タンパク質をコードする核酸配列；および（ｂ）ＩＴＩＭ含有エンドドメインを含む受容体をコードする核酸配列を含む核酸構築物を提供する。
【０２８４】
去勢シグナル
上記プロテアーゼを含む融合タンパク質は、細胞において、細胞内プロテアーゼ切断部位を含む標的受容体と共発現され得る。プロテアーゼ部位における標的受容体の切断は、標的受容体の細胞内膜遠位部分を放出するであろう。
【０２８５】
標的受容体は、例えば、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であり得る。
【０２８６】
受容体は、タンパク質の細胞内部分の末端に位置する活性化または共刺激性エンドドメインを含み得る。このため、プロテアーゼ切断部位における切断は、標的ＣＡＲから活性化または共刺激性エンドドメインを除去して、標的受容体媒介性Ｔ細胞活性化を低減または防止する。
【０２８７】
あるいは、標的受容体は、タンパク質の細胞内部分の末端に位置する阻害性エンドドメインを含み得る。このため、プロテアーゼ切断部位における切断は、標的ＣＡＲから阻害性エンドドメインを除去して、標的受容体媒介性Ｔ細胞活性化についての可能性「のスイッチを入れる」。
【０２８８】
阻害性エンドドメインは、例えば、ＣＤ１４８もしくはＣＤ４５エンドドメイン、またはＰＤ１、ＰＤＣＤ１、ＢＴＬＡ４、ＬＩＬＲＢ１、ＬＡＩＲ１、ＣＴＬＡ４、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＬ５、ＫＩＲ３ＤＬ１もしくはＫＩＲ３ＤＬ３などのタンパク質由来のＩＴＩＭ含有エンドドメインを含み得る。
【０２８９】
一例として、標的受容体は、ＰＤ−１由来のＩＴＩＭエンドドメインを含有するＣＤ３３に対するＣＡＲを含有する配列番号５６として示されている配列を含み得る。
【化２８】
2020115898.tif 000031
【０２９０】
適切には、タンパク質は、配列番号５６として示されている配列、または少なくとも８０、８５、９０、９５、９８もしくは９９％の配列同一性を有するその変異型を含み得る。
【０２９１】
受容体が、膜貫通ドメインと活性化エンドドメインとの間にプロテアーゼ切断部位を含む場合、去勢シグナル融合タンパク質は、受容体を阻害するために使用され得る。例えば、そのエンドドメインがプロテアーゼ切断部位によって膜貫通ドメインから分離される第１のＣＡＲが構築され得る。異なる抗原を認識する第２のＣＡＲは、ＩＴＩＭ含有エンドドメインから構成され得る。第２の受容体の同種抗原の認識は、膜への去勢シグナル融合タンパク質のリクルート、および続いてプロテアーゼ認識部位における切断をもたらすであろう。このような切断は、第１の受容体から活性化エンドドメインを分離し、前記受容体の活性化およびシグナル伝搬を防止する。
【０２９２】
これは、第１のＣＡＲが単独で活性化された場合（すなわち、第１のＣＡＲがその同種抗原に結合したが、第２のＣＡＲがその同種抗原に結合しなかった場合）にのみ、持続的なシグナルが伝達される「ＡＮＤ  ＮＯＴ」型論理ゲートをもたらすであろう。例えば、単一抗原の存在（または非存在）が癌を有効に描写することは比較的珍しく、これが特異性の欠如をもたらし得るので、このような「論理ゲート」は有用であり得る。正常細胞上の抗原発現の標的化は、オンターゲットオフ腫瘍毒性をもたらす。いくつかの癌では、腫瘍は、１つの抗原（典型的には、組織特異的抗原）の存在、および正常細胞上に存在する別の抗原の不存在によって最も首尾よく定義される。例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞は、ＣＤ３３を発現する。正常幹細胞はＣＤ３３を発現するがＣＤ３４も発現する一方、ＡＭＬ細胞は典型的にはＣＤ３４陰性である。ＡＭＬを処置するためのＣＤ３３のみの標的化は、それが正常な幹細胞を枯渇させるので、顕著な毒性に関連する。しかしながら、ＣＤ３３陽性であるがＣＤ３４陽性ではない細胞の特異的な標的化は、このかなりのオフターゲット毒性を回避するであろう。
【０２９３】
このような「ＡＮＤ  ＮＯＴ」ゲートのための抗原の潜在的なペアは、表２に示されている。
【表２】
2020115898.tif 000032
【０２９４】
一例として、膜貫通ドメインと活性化エンドドメインとの間にプロテアーゼ切断部位を含む受容体は、切断可能なＣＤ３ゼータエンドドメインを有するＣＤ１９に対するＣＡＲを含有する配列番号５７として示されている配列であり得る。
【化２９】
2020115898.tif 000033
【０２９５】
適切には、受容体は、配列番号５７として示されている配列；または少なくとも８０、８５、９０、９５、９８もしくは９９％の配列同一性を有するその変異型を含み得る。
【０２９６】
受容体が、プロテアーゼ切断部位を介して阻害性エンドドメインに融合された活性化エンドドメインを含む場合、去勢シグナル融合タンパク質は、人工シグナル伝達ドメインを活性化するために使用され得る。例えば、そのエンドドメインが、プロテアーゼ切断部位を介して阻害性エンドドメインに融合された活性化エンドドメインを含む第１のＣＡＲが構築され得る。異なる抗原を認識する第２のＣＡＲは、ＩＴＩＭ含有エンドドメインから構成され得る。第２の受容体の同種抗原の認識は、膜への去勢シグナル融合タンパク質のリクルート、および続いて第１の受容体の活性化エンドドメインからの阻害性エンドドメインの切断をもたらすであろう。活性化ドメインからの阻害性ドメインの切断およびそれによる分離は、抗原結合後の第１のＣＡＲの活性化を可能にし、したがって第１の受容体を介したシグナル伝達の活性化を可能にするであろう。
【０２９７】
これは、第１の受容体および第２の受容体が両方とも活性化された場合のみ、生産的なシグナル伝達が起こる「ＡＮＤ」型ＣＡＲ論理ゲートをもたらすであろう。例えば、ほとんどの癌は、単一抗原に基づいて正常組織と区別され得ないので、このような「論理ゲート」は有用である。したがって、正常組織が治療によって損傷されるかなりの「オンターゲットオフ腫瘍」毒性が生じる。いくつかの癌では、２つの癌抗原の存在の標的化が、１つの標的化よりも選択的であり、したがって有効であり得る。例えば、Ｂ慢性リンパ性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）は、ＣＤ１９を標的化することによって現在処置されている一般的な白血病である。これはリンパ腫を処置するだけではなく、処置がかなりの毒性効果を有するような、Ｂ細胞区画全体を枯渇させるものである。Ｂ−ＣＬＬは、ＣＤ５およびＣＤ１９が共発現されるという点で普通ではない表現型を有する。ＣＤ５およびＣＤ１９を発現する細胞のみを標的化することによって、オンターゲットオフ腫瘍毒性をかなり減少させることが可能であろう。
【０２９８】
このような「ＡＮＤ」論理ゲートのための抗原の潜在的なペアは、表３に示されている。
【表３】
2020115898.tif 000034
【０２９９】
一例として、プロテアーゼ切断部位を介して阻害性エンドドメインに融合された活性化エンドドメインを含む受容体は、ＣＤ３ゼータエンドドメインおよび切断可能なＣＤ１４８エンドドメインを有するＣＤ１９に対するＣＡＲを含有する配列番号５８として示されている配列であり得る。
【化３０】
2020115898.tif 000035
【０３００】
適切には、受容体は、配列番号５８として示されている配列；または少なくとも８０、８５、９０、９５、９８もしくは９９％の配列同一性を有するその変異型を含み得る。
【０３０１】
遮断シグナル
本発明は、リン酸化免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）に結合するがキナーゼドメインを欠くタンパク質由来のＳＨ２ドメインを含む切断型タンパク質を提供する。
【０３０２】
例えば、切断型タンパク質は、ＺＡＰ７０  ＳＨ２ドメインを含み得るが、ＺＡＰ７０キナーゼドメインを欠き得る。換言すれば、本発明は、（ｉ）配列番号２として示されている配列を含むが、配列番号２６として示されている配列を含まない切断型タンパク質を提供する。
【０３０３】
ＺＡＰ７０  ＳＨ２ドメインの過剰発現は、全長／野生型ＺＡＰ７０との競合をもたらす。切断型ＺＡＰ７０はシグナルを伝搬し得ないので、シグナル伝達は、野生型ＺＡＰ７０と切断型タンパク質との比に比例して減少する。これは、Ｔ細胞活性化の強度を減少させて、例えばＴ細胞過剰活性化（これは、Ｔ細胞枯渇、活性化誘導性細胞死をもたらし得、臨床状況ではサイトカインストームをもたらし得る）を防止するために有用であり得る。
【０３０４】
本発明はまた、リン酸化免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）に結合するがホスファターゼドメインを欠くタンパク質由来のＳＨ２ドメインを含む切断型タンパク質を提供する。
【０３０５】
例えば、切断型タンパク質は、ＰＴＰＮ６  ＳＨ２ドメインを含み得るが、ＰＴＰＮ６ホスファターゼドメインを欠き得る。換言すれば、本発明は、（ｉ）配列番号６として示されている配列を含むが、配列番号２７として示されている配列を含まない切断型タンパク質を提供する。
【０３０６】
この場合、ＩＴＩＭシグナル伝達は、野生型ＰＴＰＮ６と切断型タンパク質との比に比例して減少し得る。これは、ＰＤ１シグナル伝達などの阻害性シグナルを減少させるために有用であり得る。これは、Ｔ細胞が、ＰＤＬ１（または類似の阻害性受容体）を過剰発現して免疫拒絶を回避する腫瘍を標的化する場合に適用され得る。
【０３０７】
上記遮断シグナルまたはクロスワイヤーシグナルの使用は、典型的には抗体を用いてＰＤ−Ｌ１／ＰＤ１などの単一リガンド／受容体相互作用を遮断する伝統的な免疫チェックポイント遮断アプローチよりも顕著な利点を提供する。上記で説明されているように、阻害性免疫受容体クラスは、Ｔ細胞状態によって変動する冗長および発現パターンを有する多くのメンバーを含有する。抗体または組換えリガンド／受容体の使用は、一方の阻害性受容体を有効に遮断し得るが、他方のものから伝達される阻害性シグナルに影響を与えないであろう。個々の阻害性受容体のゲノム編集（Ｍｅｎｇｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１６  Ａｐｒ  １５；７６（８）：２０８７−９３）は、同様の制限を有する。個々の阻害性受容体と共刺激性ドメインとの融合物の戦略もまた、同様の制限に悩まされている（Ｌｉｕら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１６  Ｍａｒ  １５；７６（６）：１５７８−９０）。
【０３０８】
本発明の方法は、ＩＴＩＭを介して伝達される阻害性シグナルを遮断（および戦略に応じて再解釈）するであろう。したがって、全クラスの阻害性シグナルがモジュレートされる。ＩＴＩＭを介してシグナル伝達する阻害性受容体のリストは、Ｏｄｏｒｉｚｚｉ  ａｎｄ  Ｗｈｅｒｒｙ（２０１２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８８：２９５７−２９６５の表ＩＩに提供されている。それらとしては、ＰＤ１、ＢＴＬＡ、２Ｂ４、ＣＴＬＡ−４、ＧＰ４９Ｂ、Ｌａｉｒ−１、Ｐｉｒ−Ｂ、ＰＥＣＡＭ−１、ＣＤ２２、Ｓｉｇｌｅｃ７、Ｓｉｇｌｅｃ９、ＫＬＲＧ１、ＩＬＴ２、ＣＤ９４−ＮＫＧ２ＡおよびＣＤ５が挙げられる。
【０３０９】
核酸
一態様では、本発明は、本発明の融合タンパク質または切断型タンパク質をコードする核酸を提供する。
【０３１０】
本明細書で使用される用語「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」および「核酸」は、互いに同義語であることを意図する。
【０３１１】
当業者であれば、多数の異なるポリヌクレオチドおよび核酸が、遺伝コードの縮重の結果として同じポリペプチドをコードし得ることを理解する。加えて、当業者であれば、ポリペプチドが発現される任意の特定の宿主生物のコドン使用頻度を反映するために、ルーチンな技術を使用して、本明細書記載のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド配列に影響を与えないヌクレオチド置換を行い得ると理解されよう。
【０３１２】
本発明にしたがう核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含み得る。それらは、単鎖または二本鎖であり得る。それらはまた、その中に合成ヌクレオチドまたは改変ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドであり得る。オリゴヌクレオチドに対するいくつかの異なる種類の改変が当技術分野で公知である。これらとしては、メチルホスホネート骨格およびホスホロチオエート骨格、分子の３’および／または５’末端におけるアクリジンまたはポリリシン鎖の付加が挙げられる。本明細書記載の使用の目的のために、ポリヌクレオチドは、当技術分野で利用可能な任意の方法によって改変され得ると理解すべきである。このような改変は、目的のポリヌクレオチドのインビボ活性または寿命を増強するために行われ得る。
【０３１３】
ヌクレオチド配列に関して、用語「変異体」、「相同体」または「誘導体」は、配列からのまたは配列への１つ（またはそれを超える）核酸の任意の置換、変異、改変、置き換え、欠失または付加を含む。
【０３１４】
核酸構築物
一態様では、本発明は、本発明の切断型タンパク質または融合タンパク質を別のタンパク質と共発現する核酸構築物を提供する。核酸構築物は、本発明の切断型タンパク質または融合タンパク質をコードする核酸配列；および別のタンパク質をコードする核酸を含み得る。
【０３１５】
本発明は、本発明の切断型タンパク質または融合タンパク質をキメラ抗原受容体と共発現する核酸構築物を提供する。核酸構築物は、（ｉ）本発明の切断型タンパク質または融合タンパク質をコードする核酸配列；および（ｉｉ）キメラ抗原受容体をコードする核酸を含み得る。
【０３１６】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、ＣＤ３ゼータなどのＩＴＡＭ含有エンドドメインを含む活性化ＣＡＲであり得る。ＣＡＲは、国際公開第２０１５／０７５４６９号に記載されているように「ライゲーション・オフ」エンドドメイン（これは、ＣＤ１４８またはＣＤ４５などの受容体様チロシンホスファターゼ由来のエンドドメインの全部または一部を含み得る）を含む阻害性ＣＡＲであり得る。ＣＡＲは、国際公開第２０１５／０７５４７０号に記載されているように「ライゲーション・オン」エンドドメイン（これは、ＩＴＩＭドメインを含み得る）を含む阻害性ＣＡＲであり得る。
【０３１７】
本発明の融合タンパク質および切断型タンパク質は、２つまたはそれを超えるＣＡＲの「論理ゲート」の組み合わせを発現する細胞と一緒に使用され得る。ＯＲゲートは、国際公開第２０１５／０７５４６８号に記載されているように２つの活性化ＣＡＲを含む。ＡＮＤゲートは、国際公開第２０１５／０７５４６９号に記載されているように活性化ＣＡＲおよび「ライゲーション・オフ」阻害性ＣＡＲを含む。ＡＮＤ  ｎｏｔは、国際公開第２０１５／０７５４７０号に記載されているように活性化ＣＡＲおよび「ライゲーション・オン」阻害性ＣＡＲを含む。
【０３１８】
したがって、本発明は、
（ｉ）本発明の切断型タンパク質または融合タンパク質をコードする核酸配列；
（ｉｉ）第１のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）；および
（ｉｉｉ）第２のキメラ抗原受容体
を含む核酸構築物を提供する。
【０３１９】
本発明の転写シグナル態様に関して、（ｉ）ＳＨ２ドメイン；およびプロテアーゼドメインを含む融合タンパク質をコードする核酸配列；ならびに（ｉｉ）膜繋留；プロテアーゼ認識部位；および転写因子を含む膜繋留転写因子をコードする核酸配列を含む核酸構築物が提供される。
【０３２０】
本発明の去勢シグナル態様に関して、（ｉ）ＳＨ２ドメインおよびプロテアーゼドメイン（例えば、ＴｅＶドメイン）を含む融合タンパク質をコードする核酸配列；ならびに（ｉｉ）プロテアーゼ切断部位を含む受容体をコードする核酸配列を含む核酸構築物が提供される。
【０３２１】
例えば、本発明は、（ａ）（ｉ）ＰＴＰＮ６  ＳＨ２ドメイン；および（ｉｉ）プロテアーゼドメイン（例えば、ＴｅＶドメイン）を含む融合タンパク質をコードする核酸配列；（ｂ）プロテアーゼ切断部位を含む受容体をコードする核酸配列；ならびに（ｃ）ＩＴＩＭ含有エンドドメインを含む受容体をコードする核酸配列を含む核酸構築物を提供する。
【０３２２】
受容体は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であり得る。
【０３２３】
適切には、核酸配列（ｂ）によってコードされるタンパク質は、（ｉ）膜貫通ドメインと活性化エンドドメインとの間のプロテアーゼ切断部位；または（ｉｉ）プロテアーゼ切断部位を介して阻害性エンドドメインに融合された活性化エンドドメインを含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であり得る。
【０３２４】
本発明の核酸構築物が別個のポリペプチドを生成する場合、例えば、それが本発明の融合タンパク質およびＣＡＲを共発現する場合、それはまた、両タンパク質の発現を可能にする核酸配列を含み得る。例えば、それは、２つの核酸配列間の切断部位をコードする配列を含み得る。新生ポリペプチドが生成されると、いかなる外部切断活性も必要とせずに、それが２つのタンパク質に直ぐに切断されるように、切断部位は自己切断性であり得る。
示されている配列を有する口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２ａ自己切断ペプチドを含む様々な自己切断部位が公知である：
【化３１】
2020115898.tif 000036
【０３２５】
共発現配列は、内部リボソームエントリー配列（ＩＲＥＳ）であり得る。共発現配列は、内部プロモーターであり得る。
【０３２６】
（詳細な説明）
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
図１３で概略的に示されているＣＡＲは、細胞外抗原認識ドメイン（バインダー）を細胞内シグナル伝達ドメイン（エンドドメイン）に結び付けるキメラＩ型膜貫通タンパク質である。バインダーは、典型的にはモノクローナル抗体（ｍＡｂ）から誘導された１本鎖可変フラグメント（ｓｃＦＶ）であるが、抗体様抗原結合部位を含む他のフォーマットに基づくことも可能である。スペーサードメインは、通常膜からバインダーを単離し、好適な配向をもたせるのに必要である。使用される一般的なスペーサードメインは、ＩｇＧ１のＦｃである。より小型のスペーサー、例えば、抗原によっては、ＣＤ８αからのストーク、さらにはＩｇＧ１ヒンジ単独でも十分であり得る。膜貫通ドメインは、細胞膜にタンパク質をつなぎ止め、スペーサーをエンドドメインに結び付ける。
【０３２７】
初期のＣＡＲ設計は、ＦｃεＲ１またはＣＤ３ゼータのガンマ鎖のどちらかの細胞内部分から誘導されたエンドドメインを有していた。したがって、これらの第一世代受容体は、免疫学的シグナル１を伝達するもので、同種標的細胞のＴ細胞による致死を誘発するのに十分ではあったが、Ｔ細胞を十分に活性化して増殖および生存をもたらすことはなかった。この限界を克服するため、複合エンドドメインが構築された：Ｔ細胞共刺激分子の細胞内部分とＣＤ３ゼータの細胞内部分の融合により、抗原認識後活性化シグナルおよび共刺激シグナルを同時に伝達することができる第二世代受容体がもたらされる。最も一般的に使用される共刺激ドメインは、ＣＤ２８の共刺激ドメインである。これは、Ｔ細胞増殖を誘発する最も強力な共刺激シグナル、すなわち免疫学的シグナル２を供給する。また、生存シグナルを伝達する密接に関連したＯＸ４０および４１ＢＢなど、ＴＮＦ受容体ファミリーのエンドドメインを含む一部の受容体も記載されている。活性化シグナル、増殖シグナルおよび生存シグナルを伝達することができるエンドドメインを有するさらにいっそう強力な第三世代ＣＡＲが現在記載されている。
【０３２８】
ＣＡＲエンコード核酸は、例えば、レトロウイルスベクターを用いてＴ細胞に移入され得る。レンチウイルスベクターも使用され得る。こうして、多数のがん特異的Ｔ細胞が、養子細胞移入のために生成され得る。ＣＡＲが標的抗原と結合したとき、これにより、活性化シグナルの、それが発現されるＴ細胞への伝達がもたらされる。すなわち、ＣＡＲは、標的抗原を発現する腫瘍細胞に向けたＴ細胞の特異性および細胞傷害性を誘導する。
【０３２９】
したがって、典型的には、ＣＡＲは、（ｉ）抗原結合ドメイン；（ｉｉ）スペーサー；（ｉｉｉ）膜貫通ドメイン；および（ｉｉｉ）シグナル伝達ドメインを含むかまたはこれと会合する細胞内ドメインを含む。
【０３３０】
抗原結合ドメイン
抗原結合ドメインは、抗原を認識するＣＡＲの部分である。抗体、抗体模倣物、およびＴ細胞受容体の抗原結合部位に基づくものを含め、多数の抗原結合ドメインが当技術分野では知られている。例えば、抗原結合ドメインは、モノクローナル抗体から誘導された１本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）；標的抗原の天然リガンド；標的に対する十分な親和力をもつペプチド；単一ドメイン抗体；Ｄａｒｐｉｎ（設計されたアンキリン反復タンパク質）などの人工単一バインダー；またはＴ細胞受容体から誘導された単鎖を含み得る。
【０３３１】
抗原結合ドメインは、抗体の抗原結合部位に基づかないドメインを含み得る。例えば、抗原結合ドメインは、腫瘍細胞表面受容体についての可溶性リガンド（例えば、サイトカインまたはケモカインなどの可溶性ペプチド）であるタンパク質／ペプチドに基づくドメイン；または膜結合リガンドもしくは結合対のカウンターパートを腫瘍細胞で発現させるための受容体の細胞外ドメインを含み得る。
【０３３２】
抗原結合ドメインは、抗原の天然リガンドに基づき得る。
【０３３３】
抗原結合ドメインは、コンビナトリアルライブラリーからの親和性ペプチドまたは新たに設計された親和性タンパク質／ペプチドを含み得る。  
【０３３４】
スペーサードメイン
ＣＡＲは、抗原結合ドメインを膜貫通ドメインと連結し、空間的に抗原結合ドメインをエンドドメインから分離させるためのスペーサー配列を含み得る。可撓性スペーサーは、抗原結合ドメインを異なる方向で配向させることにより、結合を促進し得る。
【０３３５】
２つのＣＡＲを必要とする本発明の態様では、第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲは、異なるスペーサー分子を含む。例えば、スペーサー配列は、例えば、ＩｇＧ１  Ｆｃ領域、ＩｇＧ１ヒンジまたはヒトＣＤ８ストークまたはマウスＣＤ８ストークを含み得る。あるいは、スペーサーは、ＩｇＧ１  Ｆｃ領域、ＩｇＧ１ヒンジまたはＣＤ８ストークと類似した長さおよび／またはドメインスペーシング特性を有する代替的リンカー配列を含み得る。ヒトＩｇＧ１スペーサーは、Ｆｃ結合性モチーフを除去するために改変され得る。
【０３３６】
上記スペーサードメインはすべて、ホモ二量体を形成する。しかしながら、機構は、ホモ二量体受容体の使用に限定されず、スペーサーが十分に強固である限り、単量体受容体で機能するはずである。このようなスペーサーの例は、ＣＤ２または切断型ＣＤ２２である。
【０３３７】
ＣＡＲは典型的にはホモダイマーであるため（図１３ａ参照）、交差対合がヘテロダイマー性キメラ抗原受容体を生じさせ得る。これは、例えば以下の様々な理由により望ましくない：（１）エピトープは、標的細胞上で同じ「レベル」にはないことがあり得、その結果、交差対合したＣＡＲは１つの抗原に結合できるのみであり得る；（２）２つの異なるｓｃＦｖからのＶＨおよびＶＬは、取り換え可能であるが、標的を認識できないか、またはなお悪いことには予想外で予測外の抗原を認識することがあり得る。上記の「ＡＮＤ」および「ＡＮＤ  ＮＯＴ」ゲートの場合、第１のＣＡＲのスペーサーは、交差対合を回避するため第２のＣＡＲのスペーサーとは十分に異なるが、共局在することに関して十分類似であり得る。オーソロガススペーサー配列の対が使用され得る。例は、ネズミおよびヒトＣＤ８ストーク、または、あるいはモノマー性であるスペーサードメイン、例えばＣＤ２のエクトドメインである。
共局在するスペーサー対の例を下表に示す：
【表４】
2020115898.tif 000037
【０３３８】
膜貫通ドメイン
膜貫通ドメインは、膜にわたるＣＡＲの配列である。
【０３３９】
膜貫通ドメインは、膜において熱力学的に安定しているいかなるタンパク質構造であってよい。これは、典型的には幾つかの疎水性残基で構成されるアルファ・へリックスである。いかなる膜貫通タンパク質の膜貫通ドメインでも、本発明の膜貫通部分を供給するのに使用され得る。タンパク質の膜貫通ドメインの存在および範囲は、ＴＭＨＭＭアルゴリズム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＴＭＨＭＭ−２．０／）を用いて当業者により決定され得る。さらに、タンパク質の膜貫通ドメインが比較的単純な構造、すなわち膜にわたるのに十分な長さを有する疎水性アルファへリックスを形成すると予測されるポリペプチド配列であるとすれば、人工的に設計されたＴＭドメインもまた使用され得る（米国特許第７０５２９０６Ｂ１号は、合成膜貫通成分について記載している）。
【０３４０】
膜貫通ドメインは、ＣＤ２８から誘導され得、良好な受容体安定性を与える。
【０３４１】
活性化エンドドメイン
エンドドメインは、ＣＡＲのシグナル伝達部分である。それは、ＣＡＲの細胞内ドメインの部分であってもよいし、それに会合してもよい。抗原認識後、受容体がクラスター形成し、天然ＣＤ４５およびＣＤ１４８は、シナプスから排除され、シグナルは細胞へ伝達される。最も一般的に使用されるエンドドメイン成分は、３つのＩＴＡＭを含むＣＤ３−ゼータのエンドドメイン成分である。これは、抗原が結合された後、活性化シグナルをＴ細胞に伝達する。ＣＤ３−ゼータは、十分に適格な活性化シグナルを提供しない可能性があるので、追加の共刺激シグナル伝達が必要とされ得る。例えば、キメラＣＤ２８およびＯＸ４０は、ＣＤ３−ゼータと併用されて、増殖／生存シグナルを伝達し得るか、または３つ全部が一緒に使用され得る。
【０３４２】
ＣＡＲが活性化エンドドメインを含む場合、該細胞は、ＣＤ３−ゼータエンドドメイン単独、ＣＤ２８またはＯＸ４０どちらかのエンドドメインと共にＣＤ３−ゼータエンドドメインまたはＣＤ２８エンドドメインならびにＯＸ４０およびＣＤ３−ゼータエンドドメインを含み得る。
【０３４３】
ＩＴＡＭモチーフを含有する任意のエンドドメインは、本発明において活性化エンドドメインとして作用し得る。ＩＴＡＭモチーフを含有する適切なエンドドメインは、本明細書に記載されている。
【０３４４】
阻害性ドメイン
「ＡＮＤ」ゲートとして上記で言及される実施形態では、第１のＣＡＲは、プロテアーゼ切断部位を介して阻害性エンドドメインに融合された活性化エンドドメインを含み得る。このようなものとして、阻害性エンドドメインは、第２のＣＡＲの活性化の非存在下では、第１のＣＡＲによってＴ細胞活性化を阻害する。第２のＣＡＲが活性化されると、第２のＣＡＲのエンドドメインにおけるＩＴＩＭがリン酸化され、ＰＴＰＮ６／プロテアーゼドメイン融合タンパク質が膜にリクルートされる。これは、活性化エンドドメインと阻害性エンドドメインとの間の第１のＣＡＲの切断をもたらして、Ｔ細胞活性化を可能にする。
【０３４５】
阻害性エンドドメインは、同じエンドドメインにある場合にＣＡＲを活性化することによってＴ細胞シグナル伝達を阻害する任意の配列を含み得る。
【０３４６】
阻害性エンドドメインは、受容体様チロシンホスファターゼなどのチロシンホスファターゼであり得るかまたはこれを含み得る。阻害性エンドドメインは、ＣＡＲの活性化エンドドメインと共局在化したときＴＣＲシグナル伝達を阻害することができる任意のチロシンホスファターゼであり得るかまたはこれを含み得る。阻害性エンドドメインは、ＣＡＲの活性化エンドドメインと共局在化したときＴＣＲシグナル伝達を阻害することができるリン酸化ＩＴＡＭについての十分に速い触媒速度を有する任意のチロシンホスファターゼであり得るかまたはこれを含み得る。
【０３４７】
ベクター
本発明は、本発明に従う１つまたは複数の核酸配列あるいは構築物を含むベクター、またはベクターのキットも提供する。そのようなベクターを使用して核酸配列または構築物を宿主細胞に導入し、そうすることで核酸配列または構築物によってコードされるタンパク質を発現させることができる。
【０３４８】
ベクターは、例えば、プラスミドまたはレトロウイルスベクターもしくはレンチウイルスベクターなどのウイルスベクター、またはトランスポゾンに基づくベクターまたは合成ｍＲＮＡであってよい。
【０３４９】
ベクターは、Ｔ細胞細胞にトランスフェクトまたは形質導入することができるものであってよい。
【０３５０】
細胞
本発明はまた、本発明の融合タンパク質、切断型タンパク質、核酸および／または核酸構築物を含む免疫細胞に関する。
【０３５１】
細胞は、細胞溶解性免疫細胞であり得る。
【０３５２】
細胞溶解性免疫細胞は、細胞媒介性免疫において中心的役割を演じるリンパ球のタイプであるＴ細胞またはＴリンパ球であり得る。それらは、細胞表面におけるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の存在により、Ｂ細胞およびナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）など、他のリンパ球とは区別することができる。下記で概説する通り、様々なタイプのＴ細胞がある。
【０３５３】
ヘルパーＴヘルパー細胞（ＴＨ細胞）は、形質細胞および記憶Ｂ細胞へのＢ細胞の成熟、ならびに細胞傷害性Ｔ細胞およびマクロファージの活性化を含む、免疫学的プロセスで他の白血球を補助する。ＴＨ細胞は、それらの表面でＣＤ４を発現する。ＴＨ細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面でＭＨＣクラスＩＩ分子によりペプチド抗原と共に提示されたときに活性化される。これらの細胞は、種々のサイトカインを分泌することにより、種々のタイプの免疫応答を促進する、ＴＨ１、ＴＨ２、ＴＨ３、ＴＨ１７、Ｔｈ９、またはＴＦＨを含む、幾つかのサブタイプのうちの１つに分化し得る。
【０３５４】
細胞傷害性Ｔ細胞（ＴＣ細胞またはＣＴＬ）は、ウイルス感染細胞および腫瘍細胞を破壊し、また移植拒絶でも関与する。ＣＴＬは、それらの表面でＣＤ８を発現する。これらの細胞は、全有核細胞の表面に存在する、ＭＨＣクラスＩに随伴する抗原に結合することにより標的を認識する。調節性Ｔ細胞により分泌されるＩＬ−１０、アデノシンおよび他の分子を通じて、ＣＤ８＋細胞はアネルギー状態に不活化され得、実験的自己免疫脳脊髄炎などの自己免疫疾患を防止する。
【０３５５】
記憶Ｔ細胞は、感染の消散後長期にわたって持続する抗原特異的Ｔ細胞のサブセットである。それらは、それらの同種抗原に再曝露されると、迅速に多数のエフェクターＴ細胞に拡大し、過去の感染に対する「記憶」をもつ免疫系を提供する。記憶Ｔ細胞は、３つのサブタイプ：セントラル記憶Ｔ細胞（ＴＣＭ細胞）および２タイプのエフェクター記憶Ｔ細胞（ＴＥＭ細胞およびＴＥＭＲＡ細胞）を含む。記憶細胞は、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋のいずれかであり得る。記憶Ｔ細胞は、典型的には細胞表面タンパク質ＣＤ４５ＲＯを発現する。
【０３５６】
以前にはサプレッサーＴ細胞として知られていた、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）は、免疫寛容の維持に非常に重要である。それらの主たる役割は、免疫反応の終末に向けてＴ細胞媒介性免疫を制止し、胸腺での負の選択のプロセスを逃れた自己反応性Ｔ細胞を抑制することである。
【０３５７】
ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞の２つの主なクラス−天然に存在するＴｒｅｇ細胞および適応Ｔｒｅｇ細胞については記載されている。
【０３５８】
天然に存在するＴｒｅｇ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇ細胞としても知られている）は、胸腺で生じ、ＴＳＬＰで活性化された骨髄性（ＣＤ１１ｃ＋）樹状細胞および形質細胞様（ＣＤ１２３＋）樹状細胞の両方と発達中のＴ細胞との間の相互作用に関連付けられている。天然に存在するＴｒｅｇ細胞は、ＦｏｘＰ３と呼ばれる細胞内分子の存在により他のＴ細胞からは区別され得る。ＦＯＸＰ３遺伝子の変異は、調節性Ｔ細胞の発達を防止し得るため、致命的な自己免疫疾患ＩＰＥＸが引き起こされ得る。
【０３５９】
適応Ｔｒｅｇ細胞（Ｔｒ１細胞またはＴｈ３細胞としても知られている）は、正常な免疫応答中に生じ得る。
【０３６０】
ナチュラルキラー細胞（またはＮＫ細胞）は、先天性免疫系の一部を形成する細胞溶解性細胞の１タイプである。ＮＫ細胞は、ＭＨＣ非依存的にウイルス感染細胞からの内生シグナルに対して、迅速な応答を提供する。
【０３６１】
ＮＫ細胞（自然リンパ球の群に属する）は、大顆粒リンパ球（ＬＧＬ）として定義され、Ｂリンパ球およびＴリンパ球を生じる共通のリンパ性前駆細胞から分化した第３の種類の細胞を構成する。ＮＫ細胞は、骨髄、リンパ節、脾臓、扁桃および胸腺で分化および成熟し、次いでそこから循環系に入ることが知られている。
【０３６２】
本発明の細胞は、上記で挙げた細胞タイプのいずれでもよい。
【０３６３】
本発明の分子を発現するＴまたはＮＫ細胞は、患者自身の末梢血から（第１団）、またはドナー末梢血からの造血幹細胞移植の状況において（第２団）、または非関連ドナーからの末梢血（第３団）から生体外で作製され得る。
【０３６４】
あるいは、本発明の分子を発現するＴまたはＮＫ細胞は、Ｔ細胞への誘導性前駆細胞または胚性前駆細胞の生体外分化から誘導され得る。あるいは、溶解機能を保持し、治療薬として作用することができる不死化Ｔ細胞系も使用され得る。
【０３６５】
これらのすべての実施形態において、細胞は、ウイルスベクターでの形質導入、ＤＮＡまたはＲＮＡでのトランスフェクションを含む多くの手段のうちの１つにより受容体構成成分およびシグナル伝達構成成分をコードするＤＮＡまたはＲＮＡを導入することにより生成される。
【０３６６】
本発明の細胞は、被験体由来の生体外ＴまたはＮＫ細胞であり得る。ＴまたはＮＫ細胞を、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）試料から得てもよい。ＴまたはＮＫ細胞は、本発明の核酸で形質導入される前に、例えば抗ＣＤ３モノクローナル抗体での処理により活性化および／または拡大され得る。
【０３６７】
本発明のＴまたはＮＫ細胞は、
（ｉ）被験体または上記で挙げた他の供給源からのＴまたはＮＫ細胞含有試料の単離；および
（ｉｉ）本発明に従う１つまたはそれより多くの核酸配列（複数も可）によるＴまたはＮＫ細胞の形質導入またはトランスフェクション
により作製され得る。
【０３６８】
次いで、Ｔ細胞またはＮＫ細胞は、抗原結合ポリペプチドの抗原結合ドメインの発現を基準にして選択されて、精製される。
【０３６９】
本発明はまた、本発明の融合タンパク質または切断型タンパク質およびキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む細胞を提供する。
【０３７０】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、ＣＤ３ゼータなどのＩＴＡＭ含有エンドドメインを含む活性化ＣＡＲであり得る。ＣＡＲは、国際公開第２０１５／０７５４６９号に記載されているように「ライゲーション・オフ」エンドドメイン（これは、ＣＤ１４８またはＣＤ４５などの受容体様チロシンホスファターゼ由来のエンドドメインの全部または一部を含み得る）を含む阻害性ＣＡＲであり得る。ＣＡＲは、国際公開第２０１５／０７５４７０号に記載されているように「ライゲーション・オン」エンドドメイン（これは、ＩＴＩＭドメインを含み得る）を含む阻害性ＣＡＲであり得る。
【０３７１】
本発明の融合タンパク質および切断型タンパク質は、２つまたはそれを超えるＣＡＲの「論理ゲート」の組み合わせを発現する細胞と一緒に使用され得る。ＯＲゲートは、国際公開第２０１５／０７５４６８号に記載されているように２つの活性化ＣＡＲを含む。ＡＮＤゲートは、国際公開第２０１５／０７５４６９号に記載されているように活性化ＣＡＲおよび「ライゲーション・オフ」阻害性ＣＡＲを含む。ＡＮＤ  ｎｏｔは、国際公開第２０１５／０７５４７０号に記載されているように活性化ＣＡＲおよび「ライゲーション・オン」阻害性ＣＡＲを含む。
【０３７２】
したがって、本発明は、
（ｉ）本発明の切断型タンパク質または融合タンパク質をコードする核酸配列；
（ｉｉ）第１のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）；および
（ｉｉｉ）第２のキメラ抗原受容体
を含む細胞を提供する。
【０３７３】
本発明の転写シグナル態様に関して、（ｉ）ＳＨ２ドメインおよびプロテアーゼを含む融合タンパク質；ならびに（ｉｉ）膜繋留、プロテアーゼ認識部位；および転写因子を含む膜繋留転写因子を含む細胞が提供される。
【０３７４】
本発明の去勢シグナル態様に関して、（ｉ）ＳＨ２ドメインおよびプロテアーゼを含む融合タンパク質；ならびに（ｉｉ）プロテアーゼ切断部位を含む受容体を含む細胞が提供される。
【０３７５】
受容体は、例えば、（ｉ）膜貫通ドメインと活性化エンドドメインとの間のプロテアーゼ切断部位；または（ｉｉ）プロテアーゼ切断部位を介して阻害性エンドドメインに融合された活性化エンドドメインを含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であり得る。
【０３７６】
組成物
本発明はまた、本発明の複数の細胞を含む医薬組成物に関する。医薬組成物は、さらに薬学的に許容し得る担体、希釈剤または賦形剤を含んでいてもよい。医薬組成物は、所望により１種またはそれより多くのさらなる医薬活性ポリペプチドおよび／または化合物を含んでいてもよい。かかる製剤は、例えば、静脈内注入に好適な形態であり得る。
【０３７７】
処置方法
本発明の細胞は、がん細胞などの標的細胞を殺すことができるものであればよい。
【０３７８】
本発明の細胞は、ウイルス感染症などの感染症の処置に使用され得る。
【０３７９】
本発明の細胞はまた、例えば自己免疫疾患、アレルギーおよび移植片対宿主拒絶における、病的免疫応答の制御に使用され得る。
【０３８０】
本発明の細胞は、膀胱がん、乳がん、結腸がん、子宮体がん、腎臓がん（腎細胞）、白血病、肺がん、メラノーマ、非ホジキンリンパ腫、膵臓がん、前立腺がんおよび甲状腺がんなどのがん性疾患の処置に使用され得る。
【０３８１】
本発明の細胞は、舌、口および咽頭のがんを含む口腔および咽頭のがん；食道がん、胃がんおよび結腸直腸がんを含む消化器系のがん；肝細胞癌および胆管癌を含む肝臓および胆道系のがん；気管支原性がんおよび喉頭のがんを含む呼吸器系のがん；骨肉腫を含む骨および関節のがん；メラノーマを含む皮膚のがん；乳がん；女性における子宮がん、卵巣がんおよび子宮頸がん、男性における前立腺がんおよび精巣がんを含む生殖器のがん；腎細胞癌および尿管（ｕｔｔｅｒｅｒ）もしくは膀胱の移行上皮癌を含む腎臓系（ｒｅｎａｌ  ｔｒａｃｔ）のがん；神経膠腫、多形神経膠芽腫および髄芽腫（ｍｅｄｕｌｌｏｂａｓｔｏｍａ）を含む脳がん；甲状腺がん、副腎癌および多発性内分泌腫瘍症候群に随伴するがんを含む内分泌系のがん；ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫を含むリンパ腫；多発性骨髄腫および形質細胞腫；急性および慢性の両方の、骨髄性またはリンパ性の白血病；ならびに神経芽細胞腫を含む他の部位および非特定部位のがんを処置するのに使用され得る。
【０３８２】
本発明の細胞による処置は、標準的手法で起こることが多い腫瘍細胞のエスケープまたは放出を防止するのを助け得る。
【０３８３】
以下、実施例により本発明をさらに記載するが、これは、本発明を実施する上で当業者を助ける役割を果たすことを意味するもので、本発明の範囲をいかなる意味にせよ限定する意図はない。
【実施例】
【０３８４】
実施例１−増大されたシグナルまたは非生理学的シグナルへのＴ細胞活性化経路の従属
Ｔ細胞を活性化する場合、シグナルをモジュレートまたは再伝達することができるように、Ｔ細胞活性化シグナルを従属させるまたは「ハイジャック」することができるかを決定するために、初期Ｔ細胞シグナル活性化に関与する多くのＳＨ２ドメインを試験した。
【０３８５】
本発明者らは、ＡＫＴのキナーゼドメインをＺａｐ７０、Ｇｒａｐ、Ｇｒｂ２およびＰＬＣγ由来のＳＨ２ドメインに連結することによって、いくつかのキメラＡＫＴ構築物を生成した（図８）。
【０３８６】
非形質導入（ＮＴ）Ｔ細胞では、ＯＫＴ３で処置してＴＣＲの架橋および活性化を誘導した後に、内因性ＡＫＴの非常に低レベルのリン酸化が検出可能であった（図１０ｂ：上のパネル）。しかしながら、Ｚａｐ−ＡＫＴ構築物を発現する細胞では、有意なレベルのホスホ−ＡＫＴが観察された（図１０ｂ：下のパネル）。
【０３８７】
Ｔ細胞活性化のためのリンカー（ＬＡＴ）はＺＡＰ７０の下流標的であり、Ｇｒｂ２、ＧｒａｐおよびＰＬＣγなどのいくつかのＳＨ２含有タンパク質によって結合される。これらの各ＬＡＴバインダー由来のＳＨ２ドメインもまた、ＣＤ３ゼータからの活性化シグナルをハイジャックすることを可能にすると予想された。しかしながら、これは当てはまらなかった。
【０３８８】
ＡＫＴキナーゼドメインをＧｒｂ２、ＧｒａｐまたはＰＬＣγ由来のＳＨ２ドメインに連結した場合、ＮＴ  Ｔ細胞について観察されたレベルを超えるＡＫＴキナーゼドメインのＴＣＲ依存性リン酸化は観察されなかった（図９ａ）。
【０３８９】
これは、このＴ細胞シグナル伝達ハイジャック系が、Ｚａｐ７０または非受容体６型チロシンプロテインホスファターゼ（ＰＴＰＮ６）などの非常に初期のＴ細胞シグナル伝達分子由来のタンデムＳＨ２ドメインを特に必要とすることを実証している。
【０３９０】
実施例２−転写制御
ＴｅＶプロテアーゼをＺａｐ７０  ＳＨ２ドメインに融合した。膜結合転写因子も以下のように生成した：ＴｅＶ切断部位によって分離されたＶＰ１６／ＧＡＬ４転写因子とインフレームで、ＲＱＲ８をクローニングした。この融合タンパク質は、ＴｅＶが切断されると、（核局在化シグナルを含有する）ＶＰ１６／ＧＡＬ４転写因子の放出を可能にする。
【０３９１】
これらのタンパク質を両方とも、ＣＤ１９特異的キメラ抗原受容体も発現するＴ細胞において発現させた。ＺＡＰ７０−ＴｅＶのアプローチが必要であることを実証するために、そのエンドドメインをＴｅＶで置換したＣＤ１９  ＣＡＲと共に転写因子を共発現させた（図１１）。
【０３９２】
Ｔ細胞をＣＤ１９陰性および陽性標的に曝露した。ＧＡＬｖ／ＶＰ１６に応答するルシフェラーゼカセットによって、転写活性化を測定した。標準ＣＤ１９  ＣＡＲをＺＡＰ−ＴｅＶおよび膜繋留転写因子と共発現させた条件のみが、ＣＤ１９が認識されると、選択的転写活性化をもたらした。ＴｅＶに直接融合したＣＤ１９  ＣＡＲは、構成的転写活性化をもたらした（図１２）。
【０３９３】
実施例３−切断型ＳＨＰ−１（ＰＴＰＮ６）または切断型ＳＨＰ−２を使用したＰＤ−１シグナル遮断
以下の表に示されているように、ＰＢＭＣ細胞を形質導入した：
【表５】
2020115898.tif 000038
【０３９４】
細胞を、ＣＤ１９、ＰＤＬ１またはその両方を形質導入したＳｕｐＴ１細胞と共に４８時間共培養し、ＩＦＮγ放出をＥＬＩＳＡによって測定した。結果は、図１５に示されている。
【０３９５】
ＳｕｐＴ１標的細胞上のＰＤＬ１の存在は、ＩＦＮγ放出の減少を引き起こした。切断型ＳＨＰ−１または切断型ＳＨＰ−２構築物と共にＣＡＲを発現するＰＢＭＣでは、ＣＡＲのみを発現するものと比較して、ＩＦＮγ放出が増加した。これは、切断型ＳＨｐ−１およびＳＨＰ−２構築物が、標的細胞からのＰＤＬ１阻害性シグナルを成功裏に阻害したことを示している。
【０３９６】
実施例４−ＳＨＰ−２  ＳＨ２ドメインとＺａｐ７０キナーゼとの融合物を使用したＰＤ−１シグナルハイジャック
以下の表に示されているように、ＰＢＭＣ細胞を形質導入した：
【表６】
2020115898.tif 000039
【０３９７】
細胞を、ＣＤ１９またはＰＤＬ１を形質導入したＳｕｐＴ１細胞と共に１：１の比で２４時間共培養した。ＩＦＮγ放出をＥＬＩＳＡによって測定した（図１６Ａ）。ＣＡＲ−ＳＨＰ２．Ｚａｐ７０＋ＰＤ１形質導入Ｔ細胞をＰＤＬ１  ＳｕｐＴ１標的細胞と共に共培養すると、ＣＡＲ＋ＰＤ１形質導入Ｔ細胞と比較して、ＩＦＮ−γ産生の増加が見られた。
【０３９８】
細胞毒性アッセイも行って、ＳｕｐＴ１細胞の死滅をＦＡＣＳによって定量した（図１６Ｂ）。ＰＤＬ１陽性標的細胞をＣＡＲ−ＳＨＰ２．Ｚａｐ７０＋ＰＤ１形質導入Ｔ細胞と共に共培養すると、ＰＤＬ１  ＳｕｐＴ１標的のほぼ完全な死滅が観察された。対照的に、ＣＡＲ＋ＰＤ１のみの構築物では、死滅が見られなかった。これにより、ＳＨＰ２のホスファターゼドメインをＺａｐ７０のキナーゼドメインで置換すると、阻害性ＰＤ１シグナルが活性化シグナルに成功裏に変換されたことが示された。したがって、ＳＨＰ−２−Ｚａｐ７０キナーゼ融合タンパク質は阻害性ＰＤＬ１−ＰＤ１シグナルを成功裏にハイジャックし、それをＴ細胞活性化シグナルに変えた。
【０３９９】
上記の明細書で挙げた出版物は全て、参照により本明細書に援用する。本発明の記載された方法および系の様々な修飾および変形は、本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく当業者には明らかである。本発明を特定の好ましい実施形態と共に記載したが、請求されている本発明は、かかる特定の実施形態に過度に限定されるべきではないことを理解するべきである。事実、分子生物学、細胞免疫学または関連分野における専門家にとって明白な、本発明を実施するために記載された方法の様々な修飾も以下の特許請求の範囲の範囲内に含まれるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１４−３】
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【図１４−４】
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【図１４−５】
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【図１４−６】
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【図１４−７】
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【図１４−８】
2020115898.tif 000061
【図１５】
2020115898.tif 000062
【図１６】
2020115898.tif 000063
【配列表】
2020115898000001.app
【外国語明細書】
2020115898000001.pdf