(57)【要約】      （修正有）【課題】低い耐性レベルの肺結核患者試料において、病原体のヘテロ耐性集団を検出する方法を提供する。【解決手段】ａ）病原体集団を含む試料を提供し；ｂ）試料から核酸を抽出し；ｃ）抽出された核酸における病原体ゲノムのターゲット遺伝子座を増幅し、ここで、ターゲット遺伝子座は、病原体における薬剤耐性と関連する、少なくとも１つのマイナー変異体を含む；ｄ）次世代配列決定（ＮＧＳ）プラットホーム上で、ターゲット遺伝子座から増幅される単一ＤＮＡ分子由来の重複核酸鎖両方を連続して配列決定し；ｅ）重複核酸鎖由来の配列決定データに整列アルゴリズムを適用し；そしてｆ）整列配列決定データの分析を実行して、少なくとも１つのマイナー変異体および病原体のヘテロ耐性集団を検出する工程を含む、前記方法。【選択図】図１
2020171304.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料において、病原体のヘテロ耐性集団を検出する方法であって：
ａ）病原体集団を含む試料を提供し；
ｂ）試料から核酸を抽出し；
ｃ）抽出された核酸における病原体ゲノムのターゲット遺伝子座を増幅し、ここで、ターゲット遺伝子座は、病原体における薬剤耐性と関連する、少なくとも１つのマイナー変異体を含む；
ｄ）次世代配列決定（ＮＧＳ）プラットホーム上で、ターゲット遺伝子座の単一ＤＮＡ分子から増幅された核酸鎖両方を連続して配列決定し；
ｅ）重複核酸鎖由来の配列決定データに整列アルゴリズムを適用し；そして
ｆ）整列配列決定データの分析を実行して、少なくとも１つのマイナー変異体および病原体のヘテロ耐性集団を検出する
工程を含む、前記方法。
【請求項２】
整列配列決定データの分析がマイナー変異体分析である、請求項１の方法。
【請求項３】
マイナー変異体分析がハプロタイプ変異体分析である、請求項２の方法。
【請求項４】
マイナー変異体に関する検出限界がヘテロ耐性集団の約０．１％未満である、先行する請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
ターゲット遺伝子座が、高忠実度ポリメラーゼで増幅される、先行する請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
重複核酸鎖各々が約３００ヌクレオチド未満からなる、先行する請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
整列アルゴリズムが約３００ヌクレオチド未満の短いヌクレオチドスペース読み取りに関して最適化されている、先行する請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
整列アルゴリズムがＮｏｖｏａｌｉｇｎである、請求項７の方法。
【請求項９】
ＮＧＳプラットホームがＩｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑプラットホームである、先行する請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
マイナー変異体分析が、ユーザーが関心対象のゲノム領域を入力し、そしてマイナー変異体を同定するために用いられる単一分子重複読み取り情報を含むレポートを生成することを要する、バイオインフォマティクス・スクリプトで実行される、先行する請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
請求項１の工程ｃ）〜ｆ）を非常に均質な合成プラスミド標準を用いて実行して、ターゲット遺伝子座および配列決定実行の間の実際の配列エラー率分散を同定する
工程をさらに含む、先行する請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
マイナー変異体が、一塩基多型（ＳＮＰ）、挿入、および欠失からなる群より選択される、先行する請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
病原体が結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）である、先行する請求項いずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
少なくとも１つのマイナー変異体が、ｋａｔＧ、ｉｎｈＡプロモーター、ｒｐｏＢ、ｇｙｒＡ、ｒｒｓ、ｅｉｓプロモーター、およびその組み合わせからなる群より選択されるゲノム配列内に位置する、請求項１３の方法。
【請求項１５】
ヘテロ耐性集団が、イソニアジド（ＩＮＨ）、リファンピン（ＲＩＦ）、モキシフロキサシン（ＭＯＸ）、アミカシン（ＡＭＫ）、カナマイシン（ＫＡＮ）および／またはカプレオマイシン（ＣＡＰ）に対して耐性である、請求項１３〜１４のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
結核菌のへテロ耐性集団に療法剤を投与する、ここで、療法剤が、ＰＡ−８２４、ＯＰＣ−６７６８３、ＳＱ１０９、ＴＭＣ２０７、ＮＡＳ−２１、ＮＡＳ−９１、チオリダジン、クロルプロマジン、および１，３−ベンゾチアジン−４−オン、ならびにその組み合わせからなる群より選択される
工程をさらに含む、請求項１３〜１５のいずれか一項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【０００１】
関連出願に対するクロスリファレンス
本出願は、２０１３年８月２６日出願の米国仮出願第６１／８７０，２２０号の恩典を請求し、該文書の内容は、その全体が本明細書に援用される。
【０００２】
電子出願される資料の援用
同時に提出され、そして以下のように同定される、コンピュータ読み取り可能ヌクレオチド配列リストが、その全体として本明細書に援用される：２０１４年８月２６日に生成された「９１４８２＿１３７＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」と称される１つの１，７６１バイトＡＳＣＩＩ（テキスト）ファイル。
【０００３】
政府が資金援助した研究または開発に関する言及
本発明は、米国衛生研究所によって授与されるＡＩ０８２２２９下の政府支援を用いて行われた。米国政府は本発明に特定の権利を有しうる。
【技術分野】
【０００４】
本発明は、病原体のヘテロ耐性集団の検出および治療のための診断法に関する。
【背景技術】
【０００５】
ヘテロ耐性は、患者試料における、そうでなければ薬剤感受性細菌集団中の薬剤耐性下位集団の同時存在であり、肺結核（ＴＢ）の治療および診断に不確実性を生じてきており、そして結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）（Ｍｔｂ）における多剤耐性の重要な駆動因子であると考えられ、ＴＢの分布が広がりつつあり、そして「完全薬剤耐性ＴＢ」（ＴＤＲ−ＴＢ）と呼ばれるものが出現していることを考慮すると、世界的規模のＴＢ制御に対する重大な脅威である。ヘテロ耐性は、「不確定」の試験結果を導くため、分子薬剤耐性試験の解釈に困難を生じることがよく文書化されてきているが、ヘテロ耐性の臨床的重要性はなお評価されつつある。感受性病原体のより大きな集団内に、以前検出不能であったレベルのＭｔｂ耐性下位集団（すなわちヘテロ耐性）が、２０％ものＴＢ患者において存在する可能性があり、そしてＴＢ治療転帰で観察される不一致のある程度の説明を補助することも可能である。以前は、ヘテロ耐性動力学を定量化する正確な手段がなく、また耐性下位集団が臨床試料内の病原体集団の＞１％に拡大するまで、ヘテロ耐性の存在を検出する手段さえなかった。しかし、この時点では、患者の感染は、治療目的に関しては耐性であると決定され、そして耐性を防止するための機会の潜在的なウィンドウは閉鎖されていた。
【０００６】
Ｍｔｂ薬剤感受性試験（ＤＳＴ）の現在の代表的な標準的方法を用いて、より後期の段階のヘテロ耐性を検出することも可能である。この表現型試験は、培養に基づく、間接比例法を用い、これは抗ＴＢ薬剤の臨界濃度を含有する培地上での接種物の＞１％の増殖の検出に頼る。１０７〜８Ｍｔｂ桿菌あたりに、特定の薬剤に対して天然に耐性にする遺伝子突然変異を有する少なくとも１つの桿菌があると概算される。最適以下の抗生物質治療は、いくつかのＭｔｂ天然耐性突然変異体（本質的に、特定レベルのへテロ耐性）が競合上の利点を獲得し、そして続いて病変を支配するようにする。ＤＳＴ法によって検出可能な耐性生物の１％集団構成要素は、天然存在Ｍｔｂ耐性突然変異率よりかなり高く、そして再び、このレベルでの検出は、典型的には、治療失敗を防止するには遅すぎる。
【０００７】
現在の診断法は、その使用および有効性において限定される。ｉｎ  ｖｉｔｒｏマイコ
バクテリア増殖指標試験管（ＭＧＩＴ）ヘテロ耐性検出の閾値は、集団のおよそ１％であるが、定性的であり、そして完了するまで数週間かかる。迅速にヘテロ耐性を検出する潜在能力もまた有する、Ｍｔｂコード遺伝子およびプロモーター領域における耐性授与突然変異を検出する現在の分子ツールには、ＤＮＡ配列決定（サンガー法およびピロシーケンス法）およびアレル特異的ＰＣＲ分析が含まれるが、これらの方法は高感度でないかまたは限定される遺伝子カバー度を有する。サンガー配列決定法およびピロシーケンス法は、各々、混合集団を分析するための重大な技術的限界を有する。サンガー配列決定は、混合試料における〜２５％のマイナー構成要素のよく確立された検出閾値を有し、そして「定量化」のため、電気泳動図の主観的な視覚的評価に頼る。ピロシーケンス法（例えばＱｉａｇｅｎ  Ｐｙｒｏｍａｒｋ）は、真の定量的配列決定が可能であるが、２．５％〜５％のＭｔｂ集団に等しい報告される検出定量化閾値を有し、そして限定された配列決定深度能を有する。ライン−プローブ・アッセイのＰＣＲ−ハイブリダイゼーション・アプローチは、５％のマイナー耐性変異体検出の記載される検出感度を有する。ＭＧＩＴ−ＤＳＴによって提供される１％レベルであってさえ、ヘテロ耐性の検出は不十分であり、そして治療失敗を防止するには遅すぎる可能性がある。定量的でそしてより感受性の方法が非常に望ましい。
【０００８】
Ｍｔｂヘテロ耐性は、稀な現象ではなく、研究されるＭｔｂ集団の９〜３０％で起こり、そして第一選択薬剤（ＩＮＨ、ＲＩＦ、ＥＴＨ、およびＳＴＲ）および第二選択フルオロキノロン（オフロキサシン−ＯＦＸ）および注射剤（ＡＭＫ）に表現型的に耐性であるＭｔｂ集団において同定されてきている。患者において典型的に見られる高い桿菌負荷を考慮すると、非常にマイナーな集団構成要素としてであっても、薬剤耐性生物が、大部分のＴＢ病変に存在する可能性が非常に高い。
【発明の概要】
【０００９】
カスタム化可能な患者治療を可能にし、そして変異体集団の時間を通じた進行を追跡するため、療法初期に、臨床試料においてマイナー耐性変異体集団を検出する、決定的な必要性もまたある。本発明は、多重ターゲット遺伝子座増幅および臨床的に適切な次世代技術を用いた配列決定法を用いて、低い耐性レベルのＴＢ患者試料において、ヘテロ耐性を検出する方法を提供することによって、この必要性に取り組む。これは、他の方法に比較して、検出感度レベルの有意な増加、および耐性病原体集団に対する有効な療法で患者を治療する能力増進につながる。
【００１０】
発明の概要
いくつかの態様において、本発明は、試料において、病原体のヘテロ耐性集団を検出する方法であって：ａ）病原体集団を含む試料を提供し；ｂ）試料から核酸を抽出し；ｃ）抽出された核酸における病原体ゲノムのターゲット遺伝子座を増幅し、ここで、ターゲット遺伝子座は、病原体における薬剤耐性と関連する、少なくとも１つのマイナー変異体を含む；ｄ）次世代配列決定（ＮＧＳ）プラットホーム上で、ターゲット遺伝子座から増幅される単一ＤＮＡ分子由来の重複核酸鎖両方を連続して配列決定し；ｅ）重複核酸鎖由来の配列決定データに整列アルゴリズムを適用し；そしてｆ）整列配列決定データの分析を実行して、少なくとも１つのマイナー変異体および病原体のヘテロ耐性集団を検出する工程を含む、前記方法に関する。特定の態様において、両方の重複核酸鎖は、遺伝子（例えば耐性遺伝子、例えば限定されるわけではないが、ｒｒｓ、ｋａｔＧ、ｉｎｈＡ、およびｇｙｒＡ）のコード鎖および非コード鎖を指す。
【００１１】
いくつかの実行において、整列配列決定データの分析はマイナー変異体分析である。特定の側面において、マイナー変異体分析はハプロタイプ変異体分析である。ターゲット遺伝子座は、ＫＡＰＡ  ＨｉＦｉＴＭ  ＤＮＡポリメラーゼまたはＱ５（登録商標）ＨＩＦＩ  ＤＮＡポリメラーゼなどの高忠実度ポリメラーゼで増幅可能である。
【００１２】
いくつかの側面において、重複核酸鎖各々は、約５００ヌクレオチド未満、約４５０ヌクレオチド未満、約４００ヌクレオチド未満、約３５０ヌクレオチド未満、約３００ヌクレオチド未満、約２５０ヌクレオチド未満、約２００ヌクレオチド未満、約１５０ヌクレオチド未満、約１００ヌクレオチド未満、または約５０ヌクレオチド未満からなる。
【００１３】
他の側面において、整列アルゴリズムは、約５００ヌクレオチド未満、約４５０ヌクレオチド未満、約４００ヌクレオチド未満、約３５０ヌクレオチド未満、約３００ヌクレオチド未満、約２５０ヌクレオチド未満、約２００ヌクレオチド未満、約１５０ヌクレオチド未満、約１００ヌクレオチド未満、または約５０ヌクレオチド未満の短いヌクレオチドスペース読み取りに関して最適化される。整列アルゴリズムはＮｏｖｏａｌｉｇｎであることも可能である。Ｉｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑプラットホームを含めて、多様なＮＧＳプラットホームが本発明で使用可能である。
【００１４】
いくつかの側面において、マイナー変異体分析は、ユーザーが関心対象のゲノム領域を入力し、そしてマイナー変異体を同定するために用いられる単一分子重複読み取り情報を含むレポートを生成することを要する、バイオインフォマティクス・スクリプトで実行される。
【００１５】
さらに他の側面において、本発明の方法は、非常に均質な合成プラスミド標準を用いて、ターゲット遺伝子座および配列決定実行の間の実際の配列エラー率分散を同定する工程をさらに含む。
【００１６】
いくつかの態様において、マイナー変異体は、一塩基多型（ＳＮＰ）、挿入、および欠失からなる群より選択される。
【００１７】
他の態様において、病原体は結核菌である。これらの態様において、少なくとも１つのマイナー変異体は、ｋａｔＧ、ｉｎｈＡプロモーター、ｒｐｏＢ、ｇｙｒＡ、ｒｒｓ、ｅｉｓプロモーター、およびその組み合わせからなる群より選択されるゲノム配列内に位置することも可能である。
【００１８】
特定の側面において、ヘテロ耐性集団は、イソニアジド（ＩＮＨ）、リファンピン（ＲＩＦ）、モキシフロキサシン（ＭＯＸ）、アミカシン（ＡＭＫ）、カナマイシン（ＫＡＮ）および／またはカプレオマイシン（ＣＡＰ）に対して耐性である。
【００１９】
いくつかの態様において、本発明は、結核菌のヘテロ耐性集団に対する療法剤で治療する必要がある被験体を治療する方法であって、療法剤が、ＰＡ−８２４、ＯＰＣ−６７６８３、ＳＱ１０９、ＴＭＣ２０７、ＮＡＳ−２１、ＮＡＳ−９１、チオリダジン、クロルプロマジン、および１，３−ベンゾチアジン−４−オン、ならびにその組み合わせからなる群より選択される、前記方法に関する。特定の側面において、治療には、被験体由来の試料における結核菌の１またはそれより多いヘテロ耐性集団の検出が先行する。
【００２０】
図面の簡単な説明
本発明の説明的および例示的態様を図に示す。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、非協力的患者におけるＭｔｂのヘテロ耐性動力学のモデルを示す。
【図２】図２は、ｉｎｈＡおよびｇｙｒＡに関する読み取りのＳＭＯＲ分析を示す。
【図３】図３は、示す６つの異なる配列（配列番号１〜６）を含む重複読み取り分析からのｇｙｒＡに対する混合読み取り整列を示す。耐性（１％）および感受性（９９％）アレルの混合物を＞２２４，０００ｘカバー度まで配列決定し、そして１８読み取り（９対セット）の整列を示して、マイナー変異体の検出を例示する。一方の鎖上に存在するがその相補体には存在しないランダム単一ＳＮＰを、配列決定エラーとして、真の変異体（２例）と区別する。
【図４】図４は、ＳＭＯＲヘテロ耐性検出アッセイを用いた試料分析パイプラインを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
図中の要素および事実は、単純化のために例示されており、そして必ずしも、何らかの特定の配列または態様にしたがって与えられてはいない。
【００２３】
詳細な説明
本明細書に提示される本発明の側面および適用は、本発明の図および詳細な説明において以下に記載される。特に言及することがない限り、明細書および請求項中の単語および句は、適用可能な技術分野の一般の当業者に、平明で一般的で、そして通例の意味を提供すると意図される。
【００２４】
以下の説明において、そして説明の目的のため、本発明の多様な側面の完全な理解を提供するため、多くの特定の詳細を示す。しかし、関連する技術分野の当業者によって、本発明がこれらの特定の詳細を伴わずに実行可能であることが理解されるであろう。本発明の完全な範囲は、以下に記載する特定の実施例に限定されない。
【００２５】
本明細書において、動詞「含む」は、本説明において、そして請求項およびその活用において用いられる際、限定されない意味で、該単語に続く項目が含まれるが、特異的には言及されない項目が排除されないことを意味するよう用いられる。さらに、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」による要素への言及は、文脈が明らかに、要素が１つでありそして１つのみであることを必要としない限り、１より多い要素が存在する可能性を排除しない。不定冠詞「ａ」または「ａｎ」は、通常、したがって、「少なくとも１つ」を意味する。
【００２６】
本明細書において、「試料」、例えば核酸分子を含む生物学的試料は、被験体から得られる試料である。本明細書において、生物学的試料には、限定されるわけではないが、細胞、組織、および体液、例えば：血液；血液の派生物および分画、例えば血清；抽出された胆汁；生検または外科的に取り除かれた組織、例えば非固定、凍結、ホルマリン固定され、そして／またはパラフィン包埋された組織を含む；涙；ミルク；皮膚掻爬；表面洗浄液；尿；痰；脳脊髄液；前立腺液；膿；または骨髄吸引物が含まれる。特定の例において、試料には、ヒト被験体から得られる血液、例えば全血または血清が含まれる。別の特定の態様において、試料には、頬側細胞、例えばスワブを用いてまたは口腔リンスによって収集されたものが含まれる。
【００２７】
いくつかの態様において、本発明は、抗菌および抗ウイルス耐性を含む、重要な表現型と関連する突然変異を含有する試料のマイナー部分を検出するための次世代配列決定分析方法論に関する。この分析は、非常に低レベルの真のマイナー構成要素（例えばＳＮＰ遺伝子座）が検出可能であるように、配列決定エラー率を減少させる。
【００２８】
薬剤耐性（ＤＲ）結核（ＴＢ）の発生率は、世界中で増加し続けている。治療開始時の、感染に関与する細菌集団においてＤＲおよび感受性遺伝子型が存在する、検出されないヘテロ耐性があると、ＤＲ株の拡大および治療失敗に役割を果たす可能性もある。結核菌において、現在のマイナーＤＲ構成要素検出レベルは、表現型薬剤感受性試験を用いると、〜１％に限定され、この試験は、完了まで１５〜３０日またはさらにそれより長い期間を必要とする。感染中のその時点では、ＤＲ−ＴＢおよび治療失敗を防止するには遅すぎ
る可能性が高い。
【００２９】
いくつかの側面において、本発明は、１週間未満で、総Ｍｔｂ集団の０．１％またはそれ未満からなる耐性Ｍｔｂ下位集団を検出する方法に関する。複雑な生物学的混合物中のマイナー構成要素の検出は、次世代配列決定の出現とともに、急速に進歩してきた。しかし、配列データからの低レベル検出は、主に配列決定におけるエラー率のため、明白ではない。それぞれの配列決定プラットホーム、ならびに生物のＧＣ含量と関連するエラーは、エラーから実際のマイナー構成要素を識別する限界を設定する。しかし、ターゲット遺伝子座（例えば抗生物質耐性遺伝子）における実際の突然変異率の決定のための「単一分子重複読み取り」（ＳＭＯＲ）分析の使用は、ヘテロ耐性検出感度の増加を導き、そしてエラーバイアスを低下させる。
【００３０】
重複読み取りの使用は、個々の配列決定ＤＮＡ分子の両方の鎖に対する各遺伝子座の有効なカバーを可能にし、これは次に、その単一遺伝子座での特定のヌクレオチドの独立の確認を可能にする。単一分子上の１つの遺伝子座が２回読まれる場合、１つのエラーが起こる可能性を平方した検出下限を有するような確率の積法則が適用される。いくつかの態様において、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｍｉｓｅｑプラットホームを用いて、ＤＲおよび感受性Ｍｔｂ株のいくつかの異なるｉｎ  ｖｉｔｒｏ混合物からアンプリコンを配列決定して、ヘテロ耐性を同定するためのＳＭＯＲの使用を検証する。Ｍｔｂ（高ＧＣ生物）に関する組み合わせた増幅および配列決定エラー率の計算された平均は、試験するアンプリコンに渡って、位あたり０．５１％である。ＳＭＯＲを使用する際、マイナー構成要素の検出の理論的限界は２．６ｘ１０−６であり、０．５１％未満のマイナー構成要素の検出が容易に可能になる。
【００３１】
本発明者らは、３．０７ｘ１０−３の頻度で、ｉｎｈＡプロモーター中のＳＮＰアレルの０．３％人工的混合物を検出可能であり、これは同定可能な配列エラーよりも少なくとも２桁より頻繁であった。ＳＭＯＲの使用は、研究者および臨床医らが、ヘテロ耐性の発展を監視し、臨床的関連性を決定し、そして臨床的に重大になる前に、マイナー構成要素耐性下位集団を抑制するための適切な治療戦略を発展させることを可能にする。
【００３２】
結核菌（Ｍｔｂ）において、いくつかの異なる抗生物質に対する耐性を与える特徴付けられたＳＮＰがある。これらのターゲティング領域に関する重複読み取りを用いることによって、本発明者らは、以前達成されてこなかったレベルまで、臨床試料中のヘテロ耐性を特徴付けることが可能である。重複読み取りは、全ゲノム検査を改善するために、次世代配列決定において用いられてきているが、抗生物質耐性集団評価において、信頼性を付加するためには用いられてこなかった。
【００３３】
本発明を用いると、現在の技術で一般的であるような１ヶ月またはそれより長くではなく、１週間以内にヘテロ耐性が検出された際、臨床医は、よりタイムリーな方式で患者治療を追跡し、そして治療経過を改変することが可能である。この分析はまた、細菌の単一試料内の集団構造を特徴付けることを望む研究者にも有用でありうる。
【００３４】
１つの態様において、本発明は、臨床試料中の結核菌におけるヘテロ耐性の検出のための診断アッセイを提供する。本発明者らがまた、インフルエンザで立証したように、このアッセイの修飾を、他の生物において、低レベルのマイナー突然変異耐性に用いてもよい。
【００３５】
いくつかの態様において、マイナー変異体の検出限界は、ヘテロ耐性集団の約１．０％未満、約０．９％未満、約０．８％未満、約０．７％未満、約０．６％未満、約０．５％未満、約０．４％未満、約０．３％未満、約０．２％未満、約０．１％未満、約０．０９
％未満、約０．０８％未満、約０．０７％未満、約０．０６％未満、約０．０５％未満、約０．０４％未満、約０．０３％未満、約０．０２％未満、または約０．０１％未満である。
【００３６】
他の態様において、開示する方法で配列決定しようとする重複核酸鎖の各々は、約５００ヌクレオチド未満、約４５０ヌクレオチド未満、約４００ヌクレオチド未満、約３５０ヌクレオチド未満、約３００ヌクレオチド未満、約２５０ヌクレオチド未満、約２００ヌクレオチド未満、約１５０ヌクレオチド未満、約１００ヌクレオチド未満、または約５０ヌクレオチド未満からなる。
【００３７】
さらに他の態様において、開示する方法は、結核菌のヘテロ耐性集団に療法剤を投与する工程をさらに含む。例示的な療法剤は、Ｄａ  Ｓｉｌｖａら（２０１１）  Ｊ．  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．  ６６：１４１７に見られる。
【００３８】
結核菌のヘテロ耐性集団で検出されるマイナー変異体は、ＳＮＰ、挿入、または欠失であることも可能である。結核菌における薬剤耐性と関連する遺伝子突然変異の限定されない例は、Ｇｅｏｒｇｈｉｏｕら（２０１２）  ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ７（３）：ｅ３３２７５に見られる。
【００３９】
宿主内Ｍｔｂ集団動力学の数学的モデルは、ヘテロ耐性が、治療開始前にＭＤＲ−ＴＢ出現を引き起こす可能性があり、そしてこの出現は１，０００〜１０，０００倍、より頻繁に起こる可能性があると予測している。治療中のＭｔｂ増殖の宿主内動力学の研究もまた、耐性下位集団が、治療に協力的な患者および非協力的な患者の両方において、時間に渡り、容易に病変を支配しうることを示してきている（図１）。耐性を与える突然変異の存在は、結核菌の感染集団のマイナー構成要素であっても、対応する薬剤の存在下で、耐性株の選択を、そして続いて治療失敗を導く可能性が高い。しかし、優性生物表現型がいかなるマイナー構成要素変異体も隠してしまうため、マイナー耐性集団は、典型的には、単離体の標準的分析を通じては見逃される。特定の側面において、本発明は、マイナー耐性集団を検出し、そして定量化する有効な方法を提供することによって、この問題に取り組む。
【００４０】
いくつかの態様において、本発明は、結核菌感染におけるヘテロ耐性の検出および分析に向けられる。臨床的に適切なテーブルトップ次世代配列決定（ＮＧＳ）技術および高度バイオインフォマティクス・アルゴリズムを用いて、Ｍｔｂにおけるヘテロ耐性を正確に検出し、そして０．１％までのすべての耐性アレルマイナー構成要素の存在および比率を定量化することが可能である、アッセイを提供する。このアプローチは、いかなる他の現存する技術によっても達成不能である、ＴＢ患者由来の連続臨床試料におけるヘテロ耐性の潜在的な臨床的関連性を検出し、そして監視するための、迅速で、高感度であり、そして特異的な方法を提供する。さらに、該アッセイで用いられるＮＧＳ技術は、多数のターゲット領域を同時にディープシーケンスするために使用可能であり、該技術は、すべてのターゲット部位で、一度に、集団中の非常にまれなマイナー構成要素の検出を可能にする。この多重化アプローチは、患者の痰から直接、ヘテロ耐性の現実的で、効率的な、そして迅速な分析を発展させるために理想的であり、これは現存する技術に勝る重要な利点を有する。
【００４１】
ディープシーケンス法は、明確な解決法であるようであるが、それ自体およびそれだけでは十分ではない。ＮＧＳマイナー変異体検出は；主に配列決定プラットホームと関連するエラー率のため、明白ではない（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑプラットホームは、０．１％エラーを有する塩基の７５％の標準レーティングを有する）。この率は、エラー由来の稀な変異体に関する理論的限界を設定するが、技術およびバイオインフォマ
ティクスの最近の進歩によって、予期されるエラー率よりも有意により低いレベルで、マイナー変異体検出が可能になる。本発明のアプローチから生じる利点は、「単一分子重複読み取り」（ＳＭＯＲ）分析を用いることによる、配列決定エラー未満のマイナー構成要素を正確に検出する能力である。
【００４２】
特定の側面において、本発明は、多剤耐性結核の進行中の臨床的および公衆衛生の問題に対して、最先端ゲノム科学および技術を適用するアプローチに関する。１つの態様において、最適化されたヘテロ耐性アッセイを用いて、６つの抗ＴＢ薬剤と関連する既知の突然変異を検出し、その後、患者集団由来の連続試料におけるヘテロ耐性の評価を行う。
【００４３】
特定の側面において、細菌集団は、アクチノメデュラ（Ａｃｔｉｎｏｍｅｄｕｒａｅ）、アクチノミセス・イスラエリ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｉｓｒａｅｌｉｉ）、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、セレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、フェカリス菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、リステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、ノカルジア属（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、アクネ菌（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍ）、ミュータンス菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、アフィピア・フェリス（Ａｆｉｐｉａ  ｆｅｌｉｓ）、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｉｏｄｅｓ）、バルトネラ・バシリフォルミス（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ  ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍｉｓ）、百日咳菌（Ｂｏｒｔａｄｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、ライム病ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、回帰熱ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｔｉｓ）、ブルセラ属（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、肉芽腫カリマトバクテリウム（Ｃａｌｙｍｍａｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｒａｎｕｌｏｍａｔｉｓ）、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、野兎病菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）、ガードネレラ菌（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、ヘモフィルス・エジプティウス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉｕｓ  ａｅｇｙｐｔｉｕｓ）、軟性下疳菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉｕｓ  ｄｕｃｒｅｙｉ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚｉａｅ）、ピロリ菌（Ｈｅｌｉｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、レプトスピラ・インテロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉａ）、ジンジバリス菌（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、プロビデンシア・スチュルティ（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ  ｓｔｕｒｔｉ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、腸炎菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｄｉｓ）、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）、霊菌（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、シゲラ・ボイディ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｂｏｙｄｉｉ）、ストレプトバチルス・モニリフォルミス（Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、梅毒トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、エンテロコリチカ菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ）、ヘンセラ菌（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ  ｈｅｎｓｅｌａｅ）、オウム病クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ）、トラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、Ｑ熱コクシエラ（Ｃｏｘｉｅｌｌａ  ｂｕｒｎｅｔｉｉ）、肺炎マイコプラズマ
（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、痘瘡リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ａｋａｒｉ）、発疹チフスリケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ）、リケッチア・リケッチィ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ）、ツツガムシ病リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｓｈｉ）、発疹熱リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｔｙｐｈｉ）、ウレアプラズマ・ウレアリチクム（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ  ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ）、肺炎双球菌（Ｄｉｐｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、エーリキア・シャフェンシス（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｃｈａｆｅｎｓｉｓ）、フェシウム菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、髄膜炎菌（Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｉ）、鼻疽菌（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｍａｌｌｅｉ）、類鼻疽菌（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ）、トウゴマ（Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ）、およびクリプトスポリジウム・パルブム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）からなる群より選択される１またはそれより多い細菌を含む。
【００４４】
いくつかの態様において、本発明は、病原体における抗生物質耐性マーカーの存在または非存在に基づいて、病原体集団を有効に制御する抗生物質の措置（ｒｅｇｉｍｅ）を被験体に投与する工程をさらに含む。
【００４５】
特定の側面において、本発明を用いて、細菌集団に感染した被験体における抗生物質耐性を検出し、そして監視する。抗生物質耐性は、集団中の１またはそれより多い抗生物質耐性遺伝子またはマーカーの存在または非存在によって決定可能である。こうした抗生物質耐性遺伝子の限定されない例には、
【００４６】
【化１】
2020171304.tif 000003
【００４７】
が含まれる（オンラインで入手可能な抗生物質耐性遺伝子データベース（ＡＲＤＢ）を参照されたい）。
【００４８】
特定の態様において、本発明の方法は、抗生物質または抗生物質の措置で被験体を治療する工程をさらに含む。こうした抗生物質の限定されない例には、アモキシリン、エリスロマイシン、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、ゲンタマイシン、トブラマイシン、シプロフロキサシン、ノルフロキサシン、ガチフロキサシン、オフロキサシン、レボフ
ロキサシン、モキシフロキサシン、メトロニダゾール、ロメフロキサシン、シプロフロキサシン、ナタマイシン、ネオマイシン、ポリミキシンＢ、ゲンタマイシン、バシトラシン、トロバフロキサシン、グレパフロキサシン、スルファセタミド、テトラサイクリン、グラミシジン、クロラムフェニコール、またはグラミシジンアミノ配糖体（ゲンタマイシン、ネオマイシン、カナマイシン、トブラマイシン、フラミセチン、ストレプトマイシン、アミカシン）、アンピシリンおよびアモキシリン、スルホンアミド（トリメトプリム−スルファメトアゾール）、セファロスポリン、ベータラクタム群、クロラムフェニコール、リンコサミド、マクロリド、ペニシリン、キノロン類、テトラサイクリンおよびニトラフラトイン／ニトロフラゾン、ポリミキシンＢ、ムピロシン、バンコマイシン、１またはそれより多いビグアナイド基を含有する抗菌剤（例えばクロルヘキシジンまたはＰＨＭＢ）、銀複合体または銀塩、過酸化水素および他の酸化剤、四級アンモニウム化合物、塩素送達剤、および抗菌ペプチドが含まれる。
【００４９】
いくつかの態様において、合成による配列決定（ＳＢＳ）技術によって試料由来の核酸を分析する。ＳＢＳ技術は、一般的に、テンプレート鎖に対するヌクレオチドの反復付加を通じて、新生核酸鎖の酵素的伸長を伴う。ＳＢＳの伝統的な方法において、各送達において、ポリメラーゼの存在下で、ターゲットヌクレオチドに、単一ヌクレオチド単量体を提供してもよい。しかし、本明細書記載のいくつかの方法において、送達において、ポリメラーゼの存在下で、ターゲット核酸に、１より多いタイプのヌクレオチド単量体を提供してもよい。
【００５０】
ＳＢＳは、ターミネーター部分を有するヌクレオチド単量体、またはいかなるターミネーター部分も欠くものを利用してもよい。ターミネーターを欠くヌクレオチド単量体を利用する方法には、例えば、ピロシーケンス法およびγ−リン酸標識ヌクレオチドを用いる配列決定が含まれる。ターミネーターを欠くヌクレオチド単量体を用いる方法において、各周期で付加される異なる数のヌクレオチドは、テンプレート配列およびヌクレオチド送達様式に依存しうる。ターミネーター部分を有するヌクレオチド単量体を利用するＳＢＳ技術に関して、ジデオキシヌクレオチドを利用する伝統的なサンガー配列決定法に関する場合のように、ターミネーターは、配列決定条件下で有効に不可逆性であることも可能であるし、またはＳｏｌｅｘａ（現Ｉｌｌｕｍｉｎａ，  Ｉｎｃ．）によって開発される配列決定法に関する場合のように、ターミネーターは可逆性であることも可能である。好ましい方法において、ターミネーター部分は、可逆的に終結性であることも可能である。
【００５１】
ＳＢＳ技術は、標識部分を有するヌクレオチド単量体、または標識部分を欠くものを利用することも可能である。したがって、取り込み事象は、標識特性、例えば標識の蛍光；ヌクレオチド単量体の特性、例えば分子量または電荷；ヌクレオチド取り込みの副産物、例えばピロリン酸の放出等に基づいて検出可能である。態様において、２またはそれより多い異なるヌクレオチドが、配列決定試薬中に存在する場合、異なるヌクレオチドが互いに区別可能であるか、あるいは、２またはそれより多い異なる標識が、用いる検出技術下で区別不能でありうる。例えば、配列決定試薬中に存在する異なるヌクレオチドは、異なる標識を有することも可能であるし、そしてＳｏｌｅｘａ（現Ｉｌｌｕｍｉｎａ，  Ｉｎｃ．）によって開発された配列決定法によって例示されるような適切な光学を用いて、これらを区別することも可能である。しかし、配列決定試薬中に存在する２またはそれより多い異なるヌクレオチドに対して同じ標識を用いるか、あるいは異なる標識を必ずしも区別しない検出光学を用いることもまた可能である。したがって、Ａ／Ｃの混合物を有する二重配列決定試薬において、ＡおよびＣの両方を同じフルオロフォアで標識してもよい。さらに、二重送達法を用いる場合、異なるヌクレオチド単量体のすべてが、同じ標識を有することも可能であるし、または異なる標識を用いて、例えば、ヌクレオチド単量体の第二の混合物から、異なるヌクレオチド単量体の１つの混合物を区別することも可能である。例えば、上に示す［第一の送達ヌクレオチド単量体］＋［第二の送達ヌクレオチド単量
体］命名法を用い、そしてＡ／Ｃ＋（１／Ｔ）の例を採用すると、ＡおよびＣの単量体は同じ第一の標識を有してもよく、そしてＧおよびＴ単量体は同じ第二の標識を有してもよく、ここで、第一の標識は第二の標識とは異なる。あるいは、第一の標識は、第二の標識と同じであってもよく、そして第一の送達の取り込み事象は、ＳＢＳプロトコルにおける周期の一時的な分離に基づいて、第二の送達の取り込み事象とは区別可能である。したがって、こうした混合物から得られる低解像度配列提示は、ヌクレオチドの２つの対に関して縮重しているであろう（それぞれ、ＡおよびＣに対して相補的であるＴ／Ｇ；ならびにそれぞれＧ／Ｔに対して相補的であるＣ／Ａ）。
【００５２】
いくつかの態様には、ピロシーケンス技術が含まれる。ピロシーケンス法は、特定のヌクレオチドが新生鎖に取り込まれる際、無機ピロリン酸（ＰＰｉ）の放出を検出する（Ｒｏｎａｇｈｉ，  Ｍ．，  Ｋａｒａｍｏｈａｍｅｄ，  Ｓ．，  Ｐｅｔｔｅｒｓｓｏｎ，
Ｂ．，  Ｕｈｌｅｎ，  Ｍ．およびＮｙｒｅｎ，  Ｐ．  （１９９６）  “Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｒｅｌｅａｓｅ．”  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２４２（１），  ８４−９；  Ｒｏｎａｇｈｉ，  Ｍ．  （２００１）  “Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｓｈｅｄｓ  ｌｉｇｈｔ  ｏｎ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．”  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．  １１（１），  ３−１１；  Ｒｏｎａｇｈｉ，  Ｍ．，  Ｕｈｌｅｎ，  Ｍ．およびＮｙｒｅｎ，  Ｐ．  （１９９８）  “Ａ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ．”  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１（５３７５），  ３６３；米国特許第６，２１０，８９１号；米国特許第６，２５８，５６８号および米国特許第６，２７４，３２０号、該文献の開示は、その全体が本明細書に援用される）。ピロシーケンス法において、放出されたＰＰｉは、ＡＴＰスルフリラーゼによるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）への即時変換によって、検出可能であり、そしてルシフェラーゼが産生する光子を通じて、生成されたＡＴＰのレベルを検出する。
【００５３】
ＳＢＳの別の例のタイプにおいて、例えば、その開示が本明細書に援用される米国特許第７，４２７，６７号、米国特許第７，４１４，１１６３号および米国特許第７，０５７，０２６号に記載されるように、例えば切断可能または光漂白可能色素標識を含有する可逆的ターミネーターヌクレオチドを段階的に付加することによって、サイクル配列決定を達成する。このアプローチは、Ｓｏｌｅｘａ（現Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｉｎｃ．）によって商品化され、そしてまた、ＷＯ  ９１／０６６７８およびＷＯ  ０７／１２３，７４４（米国第１２／２９５，３３７号として、米国特許および商標局に出願）に記載され、これらは各々、その全体が本明細書に援用される。終結が可逆性であることが可能であり、そしてまた蛍光標識が切断されることが可能である、蛍光標識ターミネーターが利用可能であれば、効率的周期的可逆性終結（ＣＲＴ）配列決定が促進される。ポリメラーゼはまた、これらの修飾ヌクレオチドを効率的に取り込み、そしてそこから伸長するように同時操作されることも可能である。
【００５４】
他の態様において、イオン半導体配列決定を利用して、試料由来の核酸を分析する。イオン半導体配列決定は、ＤＮＡ増幅中に放出される水素イオンの検出に基づくＤＮＡ配列決定法である。これは、相補鎖がテンプレート鎖の配列に基づいて構築される間の、「合成による配列決定」の方法である。
【００５５】
例えば、配列決定しようとするテンプレートＤＮＡ鎖を含有するマイクロウェルに、単一種のデオキシリボヌクレオチド（ｄＮＴＰ）を満たしてもよい（ｆｌｏｏｄｅｄ）。導入されたｄＮＴＰがリードテンプレートヌクレオチドに相補的である場合、成長中の相補鎖に取り込まれる。これによって、高感度イオンセンサーを誘発する水素イオンの放出が引き起こされ、これが反応が起こったことを示す。ホモポリマー反復がテンプレート配列
中に存在する場合、多数のｄＮＴＰ分子が単一周期中に取り込まれるであろう。これは、対応する数の放出された水素および比例してより高い電子シグナルを導く。
【００５６】
この技術は、修飾ヌクレオチドまたは光学をまったく使用しない点で、他の配列決定技術とは異なる。イオン半導体配列決定法はまた、イオン急流（ｔｏｒｒｅｎｔ）配列決定法、プロトン仲介配列決定法、シリコン配列決定法、または半導体配列決定法とも称されうる。イオン半導体配列決定法は、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．によって開発され、そしてベンチトップ装置を用いて実行可能である。Ｒｕｓｋ，  Ｎ．
（２０１１）．  ”Ｔｏｒｒｅｎｔｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ，”  Ｎａｔ  Ｍｅｔｈ  ８（１）：  ４４−４４。本発明の機構を理解することは必要ではないが、共有結合が形成され、そしてピロリン酸および荷電水素イオンが放出されるため、核酸増幅中に水素イオン放出が起こると考えられる。イオン半導体配列決定は、反応に単一種のｄＮＴＰを提供した際に、水素イオンが放出されるかどうかを決定することによって、これらの事実を利用する。
【００５７】
例えば、各々、配列決定しようとする１つの一本鎖テンプレートＤＮＡ分子および１つのＤＮＡポリメラーゼを含有する半導体チップ上のマイクロウェルを、連続して、非修飾Ａ、Ｃ、ＧまたはＴ  ｄＮＴＰで連続的に満たしてもよい。Ｐｅｎｎｉｓｉ，  Ｅ．  （２０１０）．  ”Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒｓ  ｉｎｓｐｉｒｅ  ｎｅｗ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ”  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２７（５９７０）：  １１９０；およびＰｅｒｋｅｌ，  Ｊ．，  ”Ｍａｋｉｎｇ  ｃｏｎｔａｃｔ  ｗｉｔｈ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ’ｓ  ｆｏｕｒｔｈ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ”  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  （２０１１）。反応中に放出される水素イオンは、溶液のｐＨを変化させ、これを高感度イオンセンサーによって検出する。異なるｄＮＴＰ種が導入される際、次のサイクルの前に、付着していないｄＮＴＰ分子を洗い流す。
【００５８】
マイクロウェルの層の下には、イオン感受性層があり、その下に高感度ＩＳＦＥＴイオンセンサーがある。エレクトロニクス産業で使用されるものと同様、すべての層は、ＣＭＯＳ半導体チップ内に含有される。放出された水素イオンは各々、ＩＳＦＥＴイオンセンサーを誘発する。チップからコンピュータに伝達される一連の電気パルスは、ＤＮＡ配列に変換され、中間シグナル変換はまったく必要とされない。各チップは、対応するＩＳＦＥＴ検出装置を伴うマイクロウェルアレイを含有する。ヌクレオチド取り込み事象は、エレクトロニクスによって直接測定されるため、標識ヌクレオチドおよび光学測定手段の使用は回避される。
【００５９】
提供する開示の方法で使用するために適したイオン半導体配列決定技術の例は、イオン急流配列決定法（米国特許出願第２００９／００２６０８２号、第２００９／０１２７５８９号、第２０１０／００３５２５２号、第２０１０／０１３７１４３号、第２０１０／０１８８０７３号、第２０１０／０１９７５０７号、第２０１０／０２８２６１７号、第２０１０／０３００５５９号、第２０１０／０３００８９５号、第２０１０／０３０１３９８号、および第２０１０／０３０４９８２号）であり、該文献各々の内容は、その全体が本明細書に援用される。イオン急流配列決定法において、ＤＮＡはおよそ３００〜８００塩基対の断片に剪断され、そして断片は平滑末端である。次いで、オリゴヌクレオチド・アダプターを断片の末端に連結させる。アダプターは、断片の増幅および配列決定のためのプライマーとして働く。断片を表面に付着させてもよく、そして断片が個々に解像可能であるような解像度で付着させる。１またはそれより多いヌクレオチドの付加は、プロトン（Ｈ＋）を放出し、このシグナルは、配列決定装置において検出され、そして記録される。シグナル強度は、取り込まれたヌクレオチドの数に比例する。ユーザーガイド、例えば、配列決定プラットホーム、パーソナルゲノムマシンＴＭ（ＰＣＧ）とともに使用するための、「ユーザーガイドのためのイオン配列決定キットｖ．２．０」と題されるＬｉ
ｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓの文献は、本発明の方法において使用するために適したイオン急流プロトコル（単数または複数）を詳細に記載する。
【００６０】
いくつかの態様において、試料調製プロセスの一部として、「バーコード」が各試料に関連しうる。このプロセスにおいて、短いオリゴをプライマーに付加し、ここで異なる試料は、各々、プライマーに加えて、異なるオリゴを用いる。
【００６１】
用語「ライブラリー」は、本明細書において、ゲノム由来配列のライブラリーを指す。ライブラリーはまた、ポリメラーゼ連鎖反応または当業者に周知のｉｎ  ｖｉｔｒｏ増幅法によって、「ライブラリー」の増幅を可能にする配列を有することも可能である。ライブラリーはまた、次世代ハイスループット配列決定装置、例えばイオン半導体配列決定プラットホームと適合する配列を有することも可能である。
【００６２】
特定の態様において、プライマーおよびバーコードは、ライブラリー生成プロセスの一部として、各試料に連結される。したがって、イオンアンプリコンライブラリーの生成と関連する増幅プロセス中、プライマーおよび短いオリゴもまた増幅される。バーコードの関連は、ライブラリー調製プロセスの一部として行われるため、１より多いライブラリー、そしてしたがって１より多い試料を用いることが可能である。合成ＤＮＡバーコードは、プライマーの一部として含まれてもよく、ここで、異なる合成ＤＮＡバーコードを、各ライブラリーに用いてもよい。いくつかの態様において、フローセルに導入される際に、異なるライブラリーを混合してもよく、そして配列決定プロセスの一部として、各試料の同一性を決定することも可能である。試料同定因子と組み合わせて試料分離法を用いてもよい。例えば、チップは、４つの別個のチャネルを有し、そして４つの異なるバーコードを用いて、１６の異なる試料の同時実行を可能にすることも可能である。
【００６３】
本発明は、限定と見なしてはならない、以下の実施例によってさらに例示される。本出願全体に引用されるすべての参考文献、特許、および公開特許出願の内容、ならびに図は、すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される。
【実施例】
【００６４】
実施例１．  結核菌（Ｍｔｂ）ヘテロ耐性アッセイ最適化および検証
本研究の目的は、臨床試料中のＭｔｂ混合（耐性／感受性）集団の≦０．１％で存在する、一次ＴＢ薬剤（ＩＮＨ、ＲＩＦ、ＭＯＸ、ＡＭＫ、ＫＡＮ、およびＣＡＰ）耐性に関連する耐性アレルの存在を検出し、そして定量化することであった。この目的を達成するため、本発明者らは、ＮＧＳ技術に基づくプロトタイプＭｔｂヘテロ耐性アッセイを最適化し、そして検証し、該アッセイは、６つの一次耐性遺伝子におけるＸＤＲ−ＴＢと関連するすべての既知のＳＮＰに関して、０．１％未満まで、耐性アレル（マイナー構成要素）を正確に検出可能である。
【００６５】
本発明者らは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＮＧＳプラットホームが、Ｍｔｂ集団における非常に稀なマイナー構成要素を検出する、ディープシーケンス能力を利用した。ディープシーケンスカバー能は、配列決定するゲノム材料の複雑性に依存し；Ｍｔｂにおける耐性の場合、本発明者らは、薬剤耐性ターゲット遺伝子座を含有するアンプリコン（〜３００ｂｐ）の配列決定に重点を置く：ＳＮＰは、以前、９０〜９８％感度および〜１００％特異性でＸＤＲ−ＴＢ表現型耐性を予測することが立証された。この短いゲノム長によって、すべてのターゲット耐性遺伝子領域に関して、単回のＩｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ実行で最大１００の別個の臨床試料に関して、各個々のアンプリコンに関する１０４ｘ〜１０５ｘのカバー度が可能になる。しかし、上述のように、各ターゲット遺伝子座の検出下限は、配列決定エラー率に直接関連し、カバー度には関連しない。本発明者らは、高忠実度Ｔａｑポリメラーゼ、改善された整列アルゴリズム、高度バイオインフォマティクス、およ
びマイナー変異体分析を用いて、エラー率未満の非常に稀なＳＮＰアレルを検出する能力を前進させた。高忠実度熱安定性ポリメラーゼの使用は、マイナー変異体検出に対するＰＣＲ−増幅エラーの影響を減少させる。ＫＡＰＡ  ＨｉＦｉ（２．８ｘ１０−７）のエラー率は、Ｔａｑポリメラーゼより１００ｘ低く、そしてＰＬＡＴＩＮＵＭ（登録商標）Ｔａｑ高忠実度などのポリメラーゼブレンドより４０ｘ低い。整列アルゴリズムの改善によって、配列データのより正確なアセンブリーおよび整列が可能になってきており、これは、全体のエラー率の減少を生じる。社内開発の最先端バイオインフォマティクス・ツールは、広範囲の配列カバー（＞１００，０００ｘ）をよりよく取り扱い、非常に稀な変異体の検出を可能にする。
【００６６】
マイナー変異体検出における最も重要な進歩は、「ハプロタイプ変異体分析」から来ており、これは、多数の独立変異体遺伝子座の検出および定量化を伴う。簡潔には、ハプロタイプ変異体分析は、個々の配列読み取りに含有されるターゲット遺伝子座の数に関する個々のエラー率の積によって、マイナー構成要素検出下限が減少すると予測する（ボックス１）。したがって、１つのＳＮＰ遺伝子座のみを調べる場合、そして遺伝子座が１０−３（０．１％）の既知の配列決定エラー率を有する場合、検出の理論的下限（ＬＯＤ）は１０−３であり、そして配列カバー度によって非常に影響を受ける。しかし、単一読み取りに関して、２つの別個のＳＮＰ遺伝子座を調べ、各々が１０−３の配列決定エラーを有する場合、そのハプロタイプを組み合わせたエラー率は、個々のエラー率の積、または１０−６である；確率議論を単純化するため（ボックス１）、１０倍高いまたは１０−５（０．００１％）の保存的ＬＯＤを用いる。本発明者らは、合成プラスミドおよびよく特徴付けられた炭疽菌ゲノム材料の非常に制御された混合物を用いて、法医学分析のためのディープシーケンスのカウントに基づく稀な変異体を検出するアッセイを確立するため、ハプロタイプ変異体分析の確率特性のこの積法則を用いた。ターゲットゲノム配列およびすべてのＳＮＰ遺伝子座がよく理解される限り、マイナー変異体配列分析のためにターゲティングするため、二ヌクレオチドまたはさらに三ヌクレオチド・ハプロタイプを含む領域を同定することは比較的容易である。
【００６７】
ボックス１．  マイナー変異体の検出に関するハプロタイプ分析の影響
【００６８】
【化２】
2020171304.tif 000004
【００６９】
Ｍｔｂに関するこうしたアッセイを確立するため、本発明者らは、Ｍｔｂ耐性マーカーにハプロタイプ精度および感度を適応させた。不運なことに、このハプロタイプ・アプローチは、単一配列決定読み取りに際して検出可能なＳＮＰ遺伝子座にのみ適用可能である。Ｍｔｂにおいて大部分の耐性機構は、いくつかの異なるゲノム的に分散した遺伝子中のＳＮＰ遺伝子座によるため、単一配列決定読み取り内にすべてのターゲティングされる耐性遺伝子座に関する二ヌクレオチド・ハプロタイプを生じることは不可能である。これを克服するため、本発明者らは、個々にターゲティングされたＳＮＰ遺伝子座に関する「重複読み取りを含む単一分子」（ＳＭＯＲ）分析と概念的に類似のアプローチを確立した。
ＳＭＯＲを用い、本発明者らは、連結配列決定読み取りにおいて、単一遺伝子座を２回調べる、より長い重複対形成末端配列読み取りを用いることによって、ＮＧＳ技術の最も最近の進歩を利用した。３００ｂｐ対形成末端配列決定化学反応とともに、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑプラットホームを用いることも可能であり、これは、ターゲット遺伝子座で、順方向および逆方向読み取りのほぼ完全な重複を生じる。これは、個々の配列決定ＤＮＡ分子の両方の鎖上の各遺伝子座の有効なカバーを可能にし、これは続いて、その単一遺伝子座での特定のヌクレオチドの独立の確認を可能にする。各鎖に独立にタグ付けし、そして別個に配列決定する類似のアプローチが検証されてきている；が、本明細書のアプローチは、両方の鎖を連続して配列決定する。再び、確率の積法則を適用し、単一分子上の１つの遺伝子座を２回読み取る場合、１回の読み取りで２つの別個の遺伝子座のハプロタイプを読み取る場合と同じ下限を有する。したがって、特定のＳＮＰ遺伝子座が、０．２５％の配列エラー率（Ｉｌｌｕｍｉｎａ技術で、Ｍｔｂなどの高ＧＣゲノムに関して典型的）を有する場合、本発明での正確な検出の限界は、ＬＯＤ＝（０．００２５２）（１０）（１００）＝０．００６％である。
【００７０】
図２は、およそ９９９：１（〜０．３％）で、それぞれ、「純粋な」感受性および「純粋な」耐性Ｍｔｂゲノムの実験的に得られた混合物における、ｇｙｒＡおよびｉｎｈＡ遺伝子における耐性付与ＳＮＰに関する対形成相補鎖読み取りの数値を示す。いくつかの耐性遺伝子（ｒｒｓ、ｋａｔＧ、ｉｎｈＡ、およびｇｙｒＡ）に関して分析を行い、このアッセイに関する原理の証明の十分な証拠が提供された。配列決定エラーは容易に検出され、そして「真のコール」から容易に分離される。
【００７１】
図３は、９９：１感受性対耐性混合物（１％）のｇｙｒＡ配列に対して整列させた実際の対形成重複読み取りの視覚化であり、耐性アレルおよび感受性アレル状態の存在を示す（影は、対形成読み取り由来の配列を示す）。
【００７２】
ヘテロ耐性検出アッセイ（ＨＤＡ）最適化
本発明者らは、ＳＭＯＲ分析を利用することによる、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑテーブルトップ配列決定装置を用いて、０．１％またはそれ未満まで単一耐性付与突然変異を同定する戦略を考案した。この戦略を、６つの耐性関連遺伝子：ｋａｔＧ、ｉｎｈＡプロモーター、ｒｐｏＢ、ｇｙｒＡ、ｒｒｓ、ｅｉｓプロモーターに対する、３６のマーカーに関するアッセイにおいて用いた。現在のＭｉＳｅｑスループットは、１回の実行で、最大９６の患者試料（最大６つのターゲット遺伝子）を可能にし、そしてなお、ターゲットあたり＞１０５読み取りを得て、存在する場合、０．１％（ＬＯＤ〜１０−４）未満までの変異体検出を可能にする。最終アッセイには、試料中に存在するＭｔｂの量を確立する、各臨床試料のＭｔｂ特異的定量的ＰＣＲ分析が含まれた。
【００７３】
ＨＤＡ標準
アッセイには、最大６つの遺伝子（〜３６のＳＮＰ）に関する各々よく記載される耐性付与突然変異を含有する非常に均質な合成プラスミドＤＮＡ標準が含まれることも可能である。標準のディープシーケンス法は、遺伝子座および配列決定実行の間の実際の配列エラー率変動の同定を可能にする。標準をＨＤＡアッセイのエラー対照として用いる。
【００７４】
ＨＤＡ検証
ＨＤＡを検証するため、二面アプローチを用いる：１）アッセイの精度および各ターゲットに関する検出レベルを評価するため、汎感受性および汎耐性株の既知の混合物にＨＤＡを適用する；２）アッセイ性能に対するヒトおよびバックグラウンド微生物ＤＮＡの影響を評価するため、ターゲットＤＮＡをスパイクした正常フロラ痰を用いて、臨床試料におけるマイナー変異体を正確に検出する能力を検証する。
【００７５】
実施例２．  臨床結核患者標本のヘテロ耐性分析
本研究の前提は、Ｍｔｂヘテロ耐性が、治療失敗前に患者試料において検出可能であることであった。あらかじめ存在するまたは出現する耐性下位集団の集団動力学を追跡し、そして総Ｍｔｂ集団の耐性生物のどのレベルの下位集団が薬剤耐性獲得および劣った治療転帰を予測するかを決定するため、連続臨床標本中で見られるＭｔｂ集団および不均一性における動的変化を定量化することも可能である。
【００７６】
目的は、治療または再治療の最初の９ヶ月を通じた、結核（ＴＢ）および薬剤耐性結核（ＤＲ−ＴＢ）患者の前向き研究における、イソニアジド（ＩＮＨ）、リファンピン（ＲＩＦ）、モキシフロキサシン（ＭＯＸ）、アミカシン（ＡＭＫ）、カナマイシン（ＫＡＮ）および／またはカプレオマイシン（ＣＡＰ）に対するＭｔｂヘテロ耐性の動的変化を定量化することであった。本発明者らは、耐性アレルを持つマイナー変異体Ｍｔｂ下位集団の存在および／または拡大が、劣った臨床転帰、例えば時間対痰および培養変換ならびに臨床改善に関連するかどうか決定することを望んだ。
【００７７】
プロジェクトは、薬剤耐性ＴＢ診断（ＧＣＤＤ）臨床研究結果およびインフラストラクチャーのための現存するＮＩＨ資金援助包括的コンソーシアムを利用する。本発明者らのグループ（ＧＣＤＤ）は、インド、モルドバ、フィリピンおよび南アフリカ由来の４００を超える臨床多剤／広範囲薬剤耐性結核（Ｍ／ＸＤＲ−ＴＢ）単離体の全ゲノム配列決定分析を完了して、臨床的に適切な表現型耐性のマーカーとして、個々のＳＮＰおよびＳＮＰ群の感度および特異性を定量化した。この研究に基づいて、本発明者らは、６つの遺伝子（ｋａｔＧ、ｉｎｈＡプロモーター、ｒｐｏＢ、ｇｙｒＡ、ｒｒｓ、およびｅｉｓプロモーター）における３０〜５０の特定のＳＮＰの検出が、ほぼ１００％の特異性で、ＩＮＨ、ＲＩＦ、ＦＱ、ＡＭＫ、ＫＡＮおよびＣＡＰに対する臨床的に適切な表現型耐性を持つＭｔｂ単離体の９０〜９８％を検出することを決定した。ＧＣＤＤ包括的インフラストラクチャーは、インド・ムンバイおよび南アフリカ・ポートエリザベスの臨床現場とともに、肺結核呼吸器学研究実験室（モルドバ・キシナウ）での蛍光スメア顕微鏡、結核同定、ＭＧＩＴ  ＤＳＴ（第一および第二選択薬剤）、およびＤＮＡ抽出（ラインプローブアッセイおよびピロシーケンス法のために用いる）を有した。発明者らは、すべて、ＭＤＲ−ＴＢを有すると推測される、モルドバにおける２２５人の研究参加者、インドにおける５８６人の参加者、そして南アフリカにおける２７５人の参加者を、ＸＤＲ−ＴＢの検出時間を数ヶ月から１週間に減少させることに重点を置く研究に登録した。
【００７８】
ヘテロ耐性分析
試料分析パイプラインを確立した（図４）。簡潔には：（Ａ）標準法を用いて、試料収集および抽出を達成する；（Ｂ）単一コピーｒｐｏＢ遺伝子をターゲティングするｑＰＣＲを実行して、試料あたりのゲノムの実際の量に基づいて、各試料に関する検出限界を確立する；（Ｃ）Ｍｔｂゲノムの６つの遺伝子領域（ｋａｔＧ、ｉｎｈＡプロモーター、ｒｐｏＢ、ｇｙｒＡ、ｒｒｓ、ｅｉｓプロモーター；すべて４２の異なる耐性付与ＳＮＰ遺伝子座を含有する）を、高忠実度ポリメラーゼを用いて増幅する；（Ｄ）等モル濃度で、各患者あたり、各時点で、すべての６つのアンプリコンを一緒にプールする；（Ｅ）単一次世代配列決定Ｉｌｌｕｍｉｎａライブラリー調製物を各アンプリコンプールに関して作製する；（Ｆ）ＭｉＳｅｑ上で配列決定するため、いくつかの異なるＮＧＳライブラリー（最大９６）を等モル濃度で一緒にプールする（すべての配列決定プールで、プラスミド対照物を配列決定し、配列決定装置上の個々の実験のエラーを調べる）；および（Ｇ）すべてのターゲット遺伝子座でバイオインフォマティクス分析を行い、そしてＳＭＯＲ分析を含めて、社内開発し、そして公的に入手可能であるスクリプトを用いて、非耐性対耐性アレル状態の比を定量化する。
【００７９】
本出願全体に引用するすべての参考文献、特許、および公開特許出願、ならびに図の内
容は、すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される。
【００８０】
別に定義しない限り、本明細書のすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の一般の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載するものと類似かまたは同等のいかなる方法および材料も、本発明の実施または試験において使用可能であるが、本明細書において、好ましい方法および材料を記載する。引用するすべての刊行物、特許、および特許出願は、すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される。
【００８１】
本明細書で論じる刊行物は、単に、本出願の出願日前の開示に関してのみ、提供される。本明細書の何ものも、本発明が、先の発明のためにこうした公開に先行したとする権利を与えられないという承認とは見なされないものとする。
【００８２】
本発明は、その特定の態様と関連して記載されてきているが、さらなる修飾が可能であり、そして本出願は、一般的に本発明の原理にしたがう、本発明の任意の変形、使用、または適応を含むことが意図され、そして本発明が属する技術分野内の既知のまたは慣例的な実施内にあるような、そして本明細書において先に示し、そして以下のような、付随する請求項の範囲にある、本質的な特徴に適用可能であるような、本開示からの逸脱を含む。
【００８３】
参考文献
詳細な明細書の複雑さと長さを低減するために、本発明者らは、以下の資料の全てを、適用可能な程度において本願に援用することを明言する。
【００８４】
【化３−１】
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【００８５】
【化３−２】
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【００８６】
【化３−３】
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【００８７】
【化３−４】
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【００８８】
【化３−５】
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【００８９】
【化３−６】
2020171304.tif 000010
【００９０】
【化３−７】
2020171304.tif 000011
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年7月9日(2020.7.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料において、病原体のヘテロ耐性集団を検出する方法であって：
ａ）病原体集団を含む試料を提供し；
ｂ）試料から核酸を抽出し；
ｃ）抽出された核酸における病原体ゲノムのターゲット遺伝子座を増幅し、ここで、ターゲット遺伝子座は、病原体における薬剤耐性と関連する、少なくとも１つのマイナー変異体を含む；
ｄ）次世代配列決定（ＮＧＳ）プラットホーム上で、ターゲット遺伝子座の単一ＤＮＡ分子から増幅された重複核酸鎖両方を連続して配列決定し；
ｅ）重複核酸鎖由来の配列決定データに整列アルゴリズムを適用し；そして
ｆ）整列配列決定データの分析を実行して、少なくとも１つのマイナー変異体および病原体のヘテロ耐性集団を検出する
工程を含み、
ここで、ＮＧＳプラットホームは、多数のターゲット領域を同時にディープシーケンスするために使用され、多重化アプローチにおいて、一度に、すべてのターゲット部位で、ヘテロ耐性集団中の非常にまれなマイナー構成要素の検出を可能にするものである、
前記方法。
【請求項２】
整列配列決定データの分析がマイナー変異体分析である、請求項１の方法。
【請求項３】
マイナー変異体分析がハプロタイプ変異体分析である、請求項２の方法。
【請求項４】
少なくとも１つのマイナー変異体に関する検出限界がヘテロ耐性集団の約０．１％未満である、請求項１〜３のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
試料が最大１００の別個の臨床試料を含む、請求項１〜４のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
重複核酸鎖各々が約３００ヌクレオチド未満からなる、請求項１〜５のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
整列アルゴリズムが約３００ヌクレオチド未満の短いヌクレオチドスペース読み取りに関して最適化されている、請求項１〜６のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
整列アルゴリズムがＮｏｖｏａｌｉｇｎである、請求項７の方法。
【請求項９】
ＮＧＳプラットホームがＩｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑプラットホームである、請求項１〜８のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
マイナー変異体分析が、ユーザーが関心対象のゲノム領域を入力し、そしてマイナー変異体を同定するために用いられる単一分子重複読み取り情報を含むレポートを生成することを要する、バイオインフォマティクス・スクリプトで実行される、請求項１〜９のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
請求項１の工程ｃ）〜ｆ）を非常に均質な合成プラスミド標準を用いて実行して、ターゲット遺伝子座および配列決定実行の間の実際の配列エラー率分散を同定する
工程をさらに含む、請求項１〜１０のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
マイナー変異体が、一塩基多型（ＳＮＰ）、挿入、および欠失からなる群より選択される、請求項１〜１１のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
病原体が結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）である、請求項１〜１２のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
少なくとも１つのマイナー変異体が、ｋａｔＧ、ｉｎｈＡプロモーター、ｒｐｏＢ、ｇｙｒＡ、ｒｒｓ、ｅｉｓプロモーター、およびその組み合わせからなる群より選択されるゲノム配列内に位置する、請求項１３の方法。
【請求項１５】
ヘテロ耐性集団が、イソニアジド（ＩＮＨ）、リファンピン（ＲＩＦ）、モキシフロキサシン（ＭＯＸ）、アミカシン（ＡＭＫ）、カナマイシン（ＫＡＮ）および／またはカプレオマイシン（ＣＡＰ）に対して耐性である、請求項１３記載の方法。