(57)【要約】      （修正有）【課題】本発明は、γーアミノ酪酸高産出の調理方法を提供する。【解決手段】必要とする個体に、乳酸菌株CPC202或いはその組み立て物を与え、リットル含有量が20グラム（含む）以上に達するγーアミノ酪酸（γ-aminobutyric acid, GABA）が得られ、単一の乳酸菌でγーアミノ酪酸の高産出が実現され、その中、当該乳酸菌株CPC202が、ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）であるものと鑑定され、また、その組み立て物は、ラクトバチルス・ブレビスの成長や培養及び発酵の基質の3炭素や4炭素及び5炭素の酸類、アルコール類であり、また、必要とする個体は、グルタメート（glutamate）である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
必要とする個体に、乳酸菌株CPC202或いはその組み立て物を与え、リットル含有量が20グラム以上に達するγーアミノ酪酸（γ-aminobutyric acid, GABA）が得られ、単一の乳酸菌でγーアミノ酪酸の高産出が実現され、当該乳酸菌株が、天然物から、ラクトバチルスの分離株を分別して、当該乳酸菌株CPC202が、ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）であるものと鑑定され、また、その組み立て物は、ラクトバチルス・ブレビスの成長や培養及び発酵の基質の3炭素〜5炭素の酸類、アルコール類であり、そして、当該必要とする個体の濃度が、5〜9%（w/v）の範囲内のグルタメート（glutamate）であること、を特徴とする乳酸菌株を用いてγーアミノ酪酸を調理生産する方法。
【請求項２】
当該乳酸菌株は、発酵培養を介して、リットル毎に含有量が29.82グラムに達するγーアミノ酪酸を産出すること、を特徴とする請求項１に記載される乳酸菌株を用いてγーアミノ酪酸を調理生産する方法。
【請求項３】
当該乳酸菌株は、グラム染色鏡でグラム陽性桿菌を観察したこと、を特徴とする請求項１に記載される乳酸菌株を用いてγーアミノ酪酸を調理生産する方法。
【請求項４】
当該乳酸菌株は、好気雰囲気及び嫌気雰囲気下で成長し、カタラーゼやオキシダーゼ及び運動性を有しなく、自生胞子を生成しないこと、を特徴とする請求項１に記載される乳酸菌株を用いてγーアミノ酪酸を調理生産する方法。
【請求項５】
請求項１から4に記載される乳酸菌株を用いてγーアミノ酪酸を有して、血圧改善や睡眠改善及び減圧の効果を有すること、を特徴とする保健食品、栄養補充品或いは医薬組み立て物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、γーアミノ酪酸高産出の調理方法に関し、特に、単一のラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）で、高産出γーアミノ酪酸能力の菌株CPC202を産出するものに関し、そして、含有量が29.8g/Literにも達するγーアミノ酪酸を生成できるものに関する。
【背景技術】
【０００２】
中華民国国民健康署の2013〜2015年国民栄養健康状況変遷調査によれば、18歳以上の国民に、高血圧有病率が24.1%になる。高血圧は、心臓病、卒中、腎臓病、及び眼病等の疾病の重大リスク因子であり、世界高血圧学会は、地球全体に約18%の人口（九百四十万）の主な死亡原因が高血圧に関していることを推定する。高血圧は、通常、症候がないため、多い人が、自身に高血圧があると分かっても、人体器官に傷害を与えるまでに、何れかの血圧を制御する処置を取らない。
【０００３】
また、今の人々は、生活難が大きいため、睡眠に悪影響を与え、全台湾において、不眠症有病率が、19.3%（2013台湾睡眠医学学会）になり、2017年の調査によれば、更に、多い「年寄り」及び「女性」に、睡眠問題がある。長期の睡眠不足により、焦りが発生し、長期に、不眠や焦りに暴露されると、最後に、不安神経症に発展し、データから分かるように、抗不安薬を利用する人の数が、毎年に増加し、台湾うつ病有病率が、約7.3%（約150万人）であり、それは、症候が重大であるため、医者に助けて貰う一部であり、大部分は、軽い症候があっても、病院へ行かないため、保健食品で、不眠焦りや不安を解消するための潜在市場は、非常に大きくなり、また、世界保健機関は、うつ病と、新世紀の三大病気として見なす。
【０００４】
γーアミノ酪酸（γ-aminobutyric acid,GABA）は、四つの炭素からなる非タンパクの組み立ての水溶性天然アミノ酸であり、それの分布が、非常に広くて、動植物にも、存在して、イオン化状態で、存於原核や真核細胞の遊離アミノ酸群に存在する。動物体内において、γーアミノ酪酸は、血液脳関門を通しなくて、神経組織だけに存在し、それは、脳みそによって自己合成されたものであり、また、脳みその含有量は、0.1〜0.6mg/gである。γーアミノ酪酸は、交感神経系ニューロトランスミッターであるドーパミンを抑制する作用があり、神経の激しやすい性質を制御でき、てんかんの発生を低下でき、また、高血圧や焦りの生成を抑えることができ、そのため、心血管機能や圧力解放及び落ち着きの効果に、大きい役目を発揮できる。また、γーアミノ酪酸の生成は、TCAサイクル（TCA cycle）にあるグルタメート（glutamate）が、Lーグルタミン酸デカルボキシラーゼ（Glutamate decarboxylase,GAD）とビタミンB6によって促進され、γーアミノ酪酸のGABAシャント（GABA shunt）を介して生成される。γーアミノ酪酸は、新規な機能性原料で、幅広く、保健食品や医薬化学工業等に応用される。
【０００５】
γーアミノ酪酸は、化学合成や天然物からの抽出、或いは微生物代謝によって生成される。その中、化学合成法の欠点は、コストが高く、産出が低いだけでなく、合成方法の条件が厳しく、化学物質の残存の問題があり、純粋物であっても、天然製品ではなく、また、生産過程において、リスク溶剤、そして、有毒溶剤が使用されるため、得られたγーアミノ酪酸は、主として、化学工業や医薬分野に応用されて、食品には、応用できなく、天然の食品添加剤として応用できない。天然抽出のγーアミノ酪酸は、時間やコストがかかるし、産出が低い問題がある。また、微生物発酵は、今、業界において、よく利用される、γーアミノ酪酸を生産する方法であり、その製品は、コストが低くて、含有量が高い、また、安全に食品に応用できる利点が得られる。
【０００６】
微生物発酵については、既に、多い関連特許や文献が提案され、例えば、中華民国特許公告TW I460272 Bの説明書には、「コルディセプス属（Cordyceps）真菌類ライスベース（Fungus rice base）を発酵させてγーアミノ酪酸を調理する方法とその応用」が掲示され、それによると、複合菌株を利用して、所定のプロセスと菌種割合でγーアミノ酪酸を生産するものであり、また、中国特許公告CN 105482981 Aの説明書には、「血圧低下保健酢の生産方法」が掲示され、それによっても、二種類のラクトバチルスを結合してγーアミノ酪酸を製作する調理方法であり、上記らの提案と本提案は、単一のラクトバチルス・ブレビス菌株で30 g/Liter γーアミノ酪酸が得られる方式が、異なり、中国特許公告CN 103013879 Bの説明書には、「γーアミノ酪酸の高産出能力を有する菌株」が掲示され、この提案は、植物ラクトバチルスをγーアミノ酪酸生産の菌種とするが、本提案に用いられる菌株と異なり、また、その提案の特許に、γーアミノ酪酸の産出量が138 mg/Literであると掲示され、本提案に用いられた菌株によって産出されたγーアミノ酪酸の産出量（〜30 g/Liter）よりも、遥かに低く、また、Jang EKらは、2015年に、Pubmed定期刊行物に、文献（Jang EK et al., "γ-aminobutyric acid(GABA) production and angiotensinー1 converting enzyme (ACE) inhibitory activity of fermented soybean containing Sea Tangle by the coーculture of Lactobacillus brevis with Aspergillus oryzae", Journal of Microbiology and Biotechnology, 2015, 25:1315ー20.）を提案し、それは、アスペルギルス‐オリーゼにラクトバチルス・ブレビスを結合して、一同に1.9 g/kgのγーアミノ酪酸を発酵産出でき、その発酵方式と菌株の使用形態及びγーアミノ酪酸産出は、ともに、本提案との差異が極めて大きい。
【０００７】
上記の分析結果に基づくと、一般の従来ものは、単一のラクトバチルス・ブレビスでγーアミノ酪酸高産出能力を有する菌株を提供できないから、実用的とは言えない。
【０００８】
本発明者は、上記欠点を解消するため、慎重に研究し、また、学理を活用して、有効に上記欠点を解消でき、設計が合理である本発明を提案する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】中華民国特許公告TW I460272 B
【特許文献２】中国特許公告CN 105482981 A
【特許文献３】中国特許公告CN 103013879 B
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】文献（Jang EK et al., "γ-aminobutyric acid(GABA) production and angiotensinー1 converting enzyme (ACE) inhibitory activity of fermented soybean containing Sea Tangle by the coーculture of Lactobacillus brevis with Aspergillus oryzae", Journal of Microbiology and Biotechnology, 2015, 25:1315ー20.）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の主な目的は、従来技術の上記問題を解消でき、単一のラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）でγーアミノ酪酸高産出能力を有できる、菌株CPC202のγーアミノ酪酸高産出の調理方法を提供する。
【００１２】
本発明の他の目的は、γーアミノ酪酸を高生成産出できる乳酸菌株CPC202を選別し、その菌株或いはその組み立てを、血圧改善や睡眠改善及び減圧の効果が得られる保健食品や栄養補充品或いは医薬組み立て物に応用できる、γーアミノ酪酸高産出の調理方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、上記の目的を達成するため、γーアミノ酪酸高産出の調理方法であり、必要とする個体に、乳酸菌株CPC202或いはその組み立て物を与え、リットル含有量が20グラム（含む）以上に達するγーアミノ酪酸が得られ、単一の乳酸菌でγーアミノ酪酸の高産出が実現され、その中、当該乳酸菌株CPC202が、ラクトバチルス・ブレビスであるものと鑑定され、また、その組み立て物は、ラクトバチルス・ブレビスの成長や培養及び発酵の基質に適合する3炭素や4炭素及び5炭素の酸類、アルコール類であり、そして、必要とする個体は、グルタメート（glutamate）である。
【００１４】
本発明の上記実施例において、当該乳酸菌株は、天然物検体から選別されるラクトバチルスの分離株である。
【００１５】
本発明の上記実施例において、当該分離株は、発酵物や野菜或いは乳幼児便検体から選別される。
【００１６】
本発明の上記実施例において、当該ラクトバチルス・ブレビスの成長や培養及び発酵の基質は、固体或いは液体形態の培養媒質である。
【００１７】
本発明の上記実施例において、当該乳酸菌株は、発酵培養を介して、リットル毎に含有量が29.82グラムに達するγーアミノ酪酸を産出する。
【００１８】
本発明の上記実施例において、当該グルタメートの濃度は、5〜9%（w/v）の範囲内にある。
【００１９】
本発明の上記実施例において、当該乳酸菌株は、グラム染色鏡でグラム陽性桿菌を観察した。
【００２０】
本発明の上記実施例において、当該乳酸菌株は、カタラーゼやオキシダーゼ及び運動性を有しない。
【００２１】
本発明の上記実施例において、当該乳酸菌株は、好気雰囲気及び嫌気雰囲気下で成長する。
【００２２】
本発明の上記実施例において、当該乳酸菌株は、自生胞子を生成しない。
【００２３】
本発明は、また、上記のγーアミノ酪酸を有して、血圧改善や睡眠改善及び減圧の効果を有する保健食品や栄養補充品或いは医薬組み立て物を提供する。
【００２４】
以下、図面を参照しながら、本発明の特徴や技術内容について、詳しく説明するが、それらの図面等は、参考や説明のためであり、本発明は、それによって制限されることが無い。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】本発明のGAD遺伝子発現PCR産物の電気泳動図である。
【図２】本発明の乳酸菌株のGABA生成量概念図である。
【図３】本発明の乳酸菌株CPC202の顕微写真図である。
【図４】本発明の乳酸菌株CPC202の16S rDNAシーケンス概念図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
図１〜図４は、それぞれ、本発明のGAD遺伝子発現PCR産物の電気泳動図や、本発明の乳酸菌株のGABA生成量概念図、本発明の乳酸菌株CPC202の顕微写真図及び本発明の乳酸菌株CPC202の16S rDNAシーケンス概念図である。図のように、本発明は、γーアミノ酪酸高産出の調理方法であり、単一の微生物物種を利用して、発酵培養で、高産出のγーアミノ酪酸（γ-aminobutyric acid, GABA）を産出し、今までに、微生物を利用してγーアミノ酪酸を生産する時、産出が最も高い方法である。本発明は、γーアミノ酪酸を生産できる乳酸菌株で、γーアミノ酪酸を生産し、主として、必要とする個体に、乳酸菌株CPC202或いはその組み立て物を与え、リットル含有量が20グラム（含む）以上に達するγーアミノ酪酸が得られ、単一の乳酸菌でγーアミノ酪酸の高産出が実現され、その中、当該乳酸菌株CPC202が、ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）であるものと鑑定され、また、その組み立て物は、ラクトバチルス・ブレビスの成長や培養及び発酵の基質（固体や液体形態の培養媒質である）に適合する3炭素や4炭素及び5炭素の酸類、アルコール類であり、そして、必要とする個体は、濃度が5〜9%（w/v）の範囲内のグルタメート（glutamate）である。
【００２７】
上記乳酸菌株は、天然物（例えば、発酵物や野菜或いは乳幼児便検体）からラクトバチルスの分離株を分別して、γーアミノ酪酸生産制御遺伝子のグルタミン酸脱炭酸酵素（glutamate decarboxylase, GAD）発見量及びγーアミノ酪酸生成量等を検出する。
【００２８】
以下の実施例は、ただ、例を挙げて本発明を説明するためのものであり、本発明の特許請求の範囲は、それによって制限されない。
【００２９】
実施例一：γーアミノ酪酸生成制御遺伝子GAD発見テスト
本実施例において、ポリメラーゼ連鎖反応（polymerase chain reaction, PCR）で、各菌株のGAD遺伝子の表現形態を検知し、始めに、GABAを分泌できる乳酸菌株を選別し、結果は、図１のようである。図に、14065がBCRCの番号で、アシドフィルス菌（Lactobacillus acidophilus）を指し、この標準菌株は、陽性対照に供され、Mは、DNA分子径の標準である。
【００３０】
実施例二：γーアミノ酪酸生成方式
本発明は、乳酸菌株を、乳酸桿菌MRS培養基において、活性化培養させ、γーアミノ酪酸を生産する時、MRS培養液に7%（w/v）グルタメートを添加して、37℃の細菌培養器において、二日間培養した後、発酵液を、4℃条件下、13,000 rpmで、15分に遠心分離させ、上澄みに対して、γーアミノ酪酸生成量を検知する。
【００３１】
実施例三：γーアミノ酪酸生成量検知
本テストは、液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析（LC/MC/MC）で、菌株γーアミノ酪酸の生成量（図２のように）を分析検知し、乳酸菌珠CPC202は、発酵培養により、29.820 g/Lのγーアミノ酪酸（発酵液）が産出され、ある文献によると、高血圧病者は、毎日18 mg γーアミノ酪酸であれば、優れた血圧調節効果が得られ、そのため、本方法による産出量は、文献によって建言された高血圧病者の毎日使用量の1656倍になる。
【００３２】
実施例四：乳酸菌株配列解析
本発明の乳酸菌株は、台湾中油株式会社が伝統発酵食品から選別する菌種であり、原株番号は、CPC202である。生産したγーアミノ酪酸の乳酸菌株CPC202に対して、食品工業発展研究所菌種中心によって菌種學名鑑定を行い、グラム染色鏡で、グラム陽性桿菌を観察し、結果は、図３のように、カタラーゼやオキシダーゼ及び運動性を有しなく、好気雰囲気や嫌気雰囲気下で成長するだけでなく、自生胞子を生成しない。16S rDNAシーケンスに基づいて、比較解析を行い、その菌株CPC202の菌種が、ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）であると鑑定確認でき、図４から分かるように、CPC202 16S rDNA遺伝子フラグメントが、最もLactobacillus brevisに近接し、シーケンス類似性が、100%になり、CPC202が、Lactobacillus brevis菌属であることを確証できる。また、API認証システムを利用して、API 50の生化学的検討を行い、結果から分かるように、CPC202が、最もLactobacillus brevisに近接、CPC202が、Lactobacillus brevis菌属であることを確証できる。上記の16S rDNA配列アライメント及びAPI 50生化学的検討に基づいて、当該菌株CPC202の菌種が、ラクトバチルス・ブレビス（表一の菌種鑑定を参照すること）であり、また、菌株種類が、衛福部公告の食用安全菌株である。
【００３３】
【表１】
2020115761.tif 000002
【００３４】
本発明のCPC202 16S rDNAのシーケンス表において、位置116のrに、a或いはg（DNAシーケンスを測定する時、aとgが同時に出現すること）が表示され、これは、ヘテロ接合体（Heterozygote）で、微生物によく現す現象である。
シーケンス分析に使用されるプライマー名與プライマーシーケンス
【００３５】
【表２】
2020115761.tif 000003
【００３６】
上記のように、本発明は、選別して、得られた乳酸菌株を実験で、その特徴及び機能を検知することにより、その乳酸菌株CPC202が、γーアミノ酪酸の高産出が実現され、γーアミノ酪酸は、交感神経系ニューロトランスミッターであるドーパミンを抑制する作用があり、神経の激しやすい性質を制御でき、てんかんの発生を低下でき、また、高血圧や焦りの生成を抑えることができ、心血管機能や圧力解放及び落ち着きの効果に、大きい役目を発揮できる。その菌株或いはその組み立てを、血圧改善や睡眠改善及び減圧の効果が得られる保健食品や栄養補充品或いは医薬組み立て物に応用でき、経済価値があると思う。
【００３７】
以上のように、本発明は、γーアミノ酪酸高産出の調理方法であり、有効に従来の諸欠点を解消でき、単一のラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）でγーアミノ酪酸（GABA）高産出能力を有する菌株を提供でき、γーアミノ酪酸に、重要な生理機能を有し、抗鬱や抗焦り或いは血圧調節の医薬と保健の重要原料として利用でき、本発明によるγーアミノ酪酸高産出の乳酸菌株CPC202は、血圧改善や睡眠改善及び減圧効果を有する保健食品や栄養補充品或いは医薬組み立て物に適用でき、そのため、本発明は、より進歩のかつより実用ので、法に従って特許請求を出願する。以上は、ただ、本発明のより良い実施例であり、本発明は、それによって制限されることが無く、本発明に係わる特許請求の範囲や明細書の内容に基づいて行った等価の変更や修正は、全てが、本発明の特許請求の範囲内に含まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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