(57)【要約】【課題】角膜の治療技術を提供すること。【解決手段】より詳細には、本発明は、ラミニンおよびそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１つの因子を含む、角膜内皮疾患の状態の治療または予防剤であって、角膜内皮細胞がともに投与されることをさらに特徴とする技術を提供することによって上記課題が解決された。詳細には、本発明はラミニン５１１（α５β１γ１）、ラミニン５２１（α５β２γ１）あるいはこれらのフラグメントを含みうる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラミニンを用いた新規治療に関する。より詳細には、ラミニンを用いた眼科治療に関し、さらに詳細には角膜内皮の治療および予防に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの角膜内皮細胞は、出生時には１平方ミリメートル当たり約３０００個の密度で存在しているが、一度障害を受けると再生する能力を持たない。このように、角膜内皮細胞は、培養が困難であるとされており、移植技術において培養、増殖が困難な現在の状況のため、角膜内皮の処置、手術が事実上不可能となっている。日本での角膜提供は不足しており、角膜移植の待機患者約２６００人に対し、年間に国内で行われている角膜移植件数は１７００件程度である。
【０００３】
ラミニンとの眼科との関係では特許文献１および２が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２００４−５０００１２号公報
【特許文献２】特表２００３−５３２６４７号公報
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、特定のラミニンが、眼科の治療、特に角膜内皮の治療に有用であることを見出したことによって、本発明を完成した。したがって、本発明は、代表的に、以下を提供する。
（１）ラミニンおよびそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１つの因子を含む、角膜内皮疾患、障害または状態の治療または予防剤。
（２）前記ラミニンは、ＲＧＤ配列を含む、項目１に記載の治療または予防剤。
（３）前記ラミニンは、α５鎖および／またはγ１鎖を含む、項目１または２に記載の治療または予防剤。
（４）前記ラミニンは、ラミニン５１１（α５β１γ１）およびラミニン５２１（α５β２γ１）を含む、項目１〜３のいずれか一項に記載の治療または予防剤。
（５）前記フラグメントは、角膜内皮細胞の細胞接着能を有する、項目１〜４のいずれか一項に記載の治療または予防剤。
（６）前記因子は、ラミニン５１１、ラミニン５２１またはラミニン５１１−Ｅ８フラグメントである、項目１〜５のいずれか一項に記載の治療または予防剤。
（７）前記角膜内皮は霊長類のものである、項目１〜６のいずれか一項に記載の治療または予防剤。
（８）前記角膜内皮疾患、障害または状態は、フックス角膜内皮ジストロフィ、角膜内皮炎、外傷、ならびに眼科手術の障害および状態からなる群より選択される、項目１〜７のいずれか一項に記載の治療または予防剤。
（９）前記角膜内皮疾患、障害または状態は、羞明、霧視、視力障害、眼痛、流涙、充血、疼痛、水疱性角膜症、眼の不快感、コントラスト低下、グレア、角膜実質の浮腫、水疱性角膜症、および角膜混濁からなる群より選択される、項目１〜８のいずれか一項に記載の治療または予防剤。
（１０）前記角膜内皮は、角膜内皮層、デスメ膜、またはその両方を含む、項目１〜９のいずれか一項に記載の治療または予防剤。
（１１）前記角膜内皮は、デスメ膜が剥離した状態である、項目１〜１０のいずれか一項に記載の治療または予防剤。
（１２）さらに、角膜内皮細胞を含む、項目１〜１１のいずれか1項に記載の治療または予防剤。
（１３）さらに、ＲＯＣＫ阻害剤を含む、項目１〜１１のいずれか1項に記載の治療または予防剤。
（１４）さらに、角膜内皮細胞およびＲＯＣＫ阻害剤を含む、項目１〜１１のいずれか1項に記載の治療または予防剤。
（１５）前記ＲＯＣＫ阻害剤は、Y-27632（（R）−（＋）−トランス−（４−ピリジル）−４−（１−アミノエチル）−シクロヘキサンカルボキサミド２塩酸塩１水和物）、およびその薬学的に受容可能な塩からなる群より選択される、項目１３または１４に記載の治療または予防剤。
（１６）前記因子は、眼内に注入され眼内の組織と接触されることを特徴とする、項目１〜１５のいずれか一項に記載の治療または予防剤。
（１７）前記因子は、約２１ｎM以上で存在する、項目１〜１６のいずれか一項に記載の治療または予防剤。
（１８）さらに角膜内皮細胞が投与されることを特徴とする、項目１〜１７のいずれか一項に記載の治療または予防剤。
（１９）前記因子は、角膜内皮細胞と混合されて提供され、さらに、ラミニンおよびそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１つの因子が眼内に注入され眼内の組織と接触されることを特徴とする、項目１〜１８のいずれか一項に記載の治療または予防剤。
（２０）さらに、ＲＯＣＫ阻害剤を含む、項目１〜１９のいずれか一項に記載の治療または予防剤。
（２１）前記ＲＯＣＫ阻害剤は、Y-27632（（R）−（＋）−トランス−（４−ピリジル）−４−（１−アミノエチル）−シクロヘキサンカルボキサミド２塩酸塩１水和物）、およびその薬学的に受容可能な塩からなる群より選択される、項目１〜２０のいずれか一項に記載の治療または予防剤。
（２２）角膜内皮細胞と混合される前記因子は、約２．１ｎＭ以上であり、注入される前記因子は約２１ｎM以上である、項目１〜２１のいずれか一項に記載の治療または予防剤。
（２３）角膜内皮疾患、障害または状態の治療または予防のために使用するための、ラミニンおよびそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１つの因子。
（２４）項目２〜２２のいずれか1項または複数の項に記載される特徴をさらに備える、項目２３に記載の因子。
（２５）角膜内皮疾患、障害または状態の治療または予防するための方法であって、該方法は、ラミニンおよびそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１つの因子の有効量を該治療または予防を必要とする被験体に投与する工程を包含する、方法。
（２６）項目２〜１１のいずれか1項または複数の項に記載される特徴をさらに備える、項目２５に記載の方法。
（２７）さらに、角膜内皮細胞を前記被験体に投与する工程を含む、項目２６または２６に記載の方法。
（２８）さらに、ＲＯＣＫ阻害剤を前記被験体に投与する工程を含む、項目２５〜２７のいずれか1項に記載の方法。
（２９）前記ＲＯＣＫ阻害剤は、Y-27632（（R）−（＋）−トランス−（４−ピリジル）−４−（１−アミノエチル）−シクロヘキサンカルボキサミド２塩酸塩１水和物）、およびその薬学的に受容可能な塩からなる群より選択される、項目２８に記載の方法。
（３０）さらに、角膜内皮細胞およびＲＯＣＫ阻害剤を前記被験体に投与する工程を含む、項目２５〜２９のいずれか1項に記載の方法。
（３１）前記因子は前記被験体の眼内に注入され、眼内の組織と接触されることを特徴とする、項目２５〜３０のいずれか1項に記載の方法。
（３２）前記因子は、約２１ｎM以上で存在する、項目２５〜３１のいずれか1項に記載の方法。
（３３）角膜内皮細胞を前記因子とは別に投与する工程をさらに包含する、項目２５〜３２のいずれか1項に記載の方法。
（３４）前記因子は、角膜内皮細胞と混合されて提供され、さらに、ラミニンおよびそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１つの因子が眼内に注入され眼内の組織と接触されることを特徴とする、項目２５〜３３のいずれか1項に記載の方法。
（３５）ＲＯＣＫ阻害剤を前記因子とは別に投与する工程をさらに包含する、項目２５〜３４のいずれか1項に記載の方法。
（３６）前記ＲＯＣＫ阻害剤は、Y-27632（（R）−（＋）−トランス−（４−ピリジル）−４−（１−アミノエチル）−シクロヘキサンカルボキサミド２塩酸塩１水和物）、およびその薬学的に受容可能な塩からなる群より選択される、項目２５〜３５のいずれか1項に記載の方法。
（３７）角膜内皮細胞と混合される前記因子は、約２．１ｎＭ以上であり、注入される前記因子は約２１ｎM以上である、項目２５〜３２のいずれか1項に記載の方法。
（３８）ラミニンおよびそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１つの因子の、角膜内皮疾患、障害または状態の治療または予防のための医薬の製造における使用。
（３９）項目２〜２２のいずれか1項または複数の項に記載される特徴をさらに備える、項目３８に記載の使用。
（４０）ラミニンおよびそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１つの因子の、角膜内皮疾患、障害または状態の治療または予防のための使用。
（４１）項目２〜２２のいずれか1項または複数の項に記載される特徴をさらに備える、項目４０に記載の使用。
【０００６】
本発明において、上述した１または複数の特徴は、明示された組み合わせに加え、さらに組み合わせて提供され得ることが意図される。本発明のなおさらなる実施形態および利点は、必要に応じて以下の詳細な説明を読んで理解することにより、当業者に認識される。
【発明の効果】
【０００７】
本発明は、眼科、特に角膜内皮細胞（特に、ヒト角膜内皮細胞）の新規治療を可能にした。特に、水疱性角膜症をほぼ完治させるまでの状態にもたらされることができており、また、好ましい実施形態では、デスメ膜を治癒させているところ、このような効果は、従来技術では達成できなかった格別の効果である。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、ラミニン５１１−Ｅ８フラグメントを用いたウサギ水疱性角膜症モデルにおける培養角膜内皮移植後の前眼部写真である。左からＣｏｎｔｒｏｌ：コントロールとしてウサギの角膜内皮細胞を機械的に掻爬したもの、ＲＣＥＣ：作製したモデルに培養したウサギ角膜内皮細胞を前房内に注入してうつむき姿勢を３時間取らせたもの、ＲＣＥＣ＋Ｅ８：作製したモデルに培養したウサギ角膜内皮細胞を、ラミニン５１１−Ｅ８フラグメントを濃度２．１ｎＭに調整したＤＭＥＭととともに前房内に注入してうつむき姿勢を３時間取らせたものの前眼部写真を示す。上段は１週間後であり、下段は２週間後の写真を示す。
【図２】図２は、ラミニン５１１−Ｅ８フラグメントを用いたウサギ水疱性角膜症モデルにおける培養角膜移植後の角膜厚の変化である。縦軸は超音波パキメーターパキメーターにより測定した角膜厚（μｍ）を示す。横軸は処置後の日数である。標準誤差をバーで示している。
【図３】図３は、ラミニン５１１−Ｅ８フラグメントを用いた培養角膜内皮移植後の組織学的検討結果を示す。左から抗Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅ抗体、抗ＺＯ−１抗体、抗Ｎ−カドヘリン抗体およびファロイジン（Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ）での染色を示す。
【図４】図４は、ラミニンとＲＯＣＫ阻害剤を併用したウサギ水疱性角膜症モデルにおける培養角膜内皮移植の検討結果を示す。ウサギの角膜内皮を機械的に剥離して水疱性角膜症モデルを作製した。培養したウサギ角膜内皮細胞を前房内にＲＯＣＫ阻害剤であるＹ−２７６３２（＋）（１００μＭ）とともに注入した個体と、細胞とラミニン５１１−Ｅ８（２．１ｎＭ）とＹ−２７６３２（＋）（１００μＭ）とともに注入した個体において２４時間後の注入した細胞の基質への接着を比較した。（左）にＰｈａｌｌｏｉｄｉｎおよびＤＡＰＩでの染色写真を示す。上段はラミニン５１１−Ｅ８なしかつＹ−２７６３２（＋）（１００μＭ）、下段はラミニン５１１−Ｅ８ありかつＹ−２７６３２（＋）（１００μＭ）での結果を示す。Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ染色により細胞とラミニン５１１−Ｅ８（２．１ｎＭ）とＹ−２７６３２（＋）（１００μＭ）とともに注入した個体においてより多くの細胞が接着していることが示された。（右）に細胞密度のデータのグラフを示す。このグラフでは、縦軸は細胞密度（個／ｍｍ２）を示す。また接着した細胞密度は有意に細胞とラミニン５１１−Ｅ８（２．１ｎＭ）とＹ−２７６３２（＋）（１００μＭ）とともに注入した個体において高い値であった（右）。
【図５】図５は、ウサギ水疱性角膜症モデルにおける培養角膜内皮移植後の前眼部写真である。左からデスメ膜剥離を行わず角膜内皮細胞を剥離しＹ−２７６３２（＋）（１００μＭ）とともに培養角膜内皮細胞を注入した個体、デスメ膜剥離を行わず角膜内皮細胞を剥離しラミニン５１１−Ｅ８（２．１ｎＭ）とＹ−２７６３２（＋）（１００μＭ）とともに注入した個体、デスメ膜剥離を行った水疱性角膜症モデルにＹ−２７６３２（＋）（１００μＭ）とともに注入した個体、デスメ膜剥離を行った水疱性角膜症モデルにラミニン５１１−Ｅ８（２．１ｎＭ）とＹ−２７６３２（＋）（１００μＭ）とともに注入した個体の前眼部写真を示す。上段は、Ｄａｙ３を示し、下段はＤａｙ７を示す。
【図６】図６は、図５で示した４群の培養角膜内皮移植後の角膜厚（μｍ）を示す。横軸は処置後の日数である。実線はデスメ膜剥離なしを示し、破線はデスメ膜剥離有を示す。黒丸はいずれもラミニン５１１−Ｅ８ありを示し、白丸はラミニン５１１−Ｅ８なしを示す。デスメ膜を剥離した方が、剥離しない場合に比べて角膜厚の菲薄化が遅延した。
【図７】図７は、図５で示した4群の培養角膜内皮移植後の眼圧（ｍｍＨｇ）を示す。横軸は処置後の日数である。実線はデスメ膜剥離なしを示し、破線はデスメ膜剥離有を示す。黒丸はいずれもラミニン５１１−Ｅ８ありを示し、白丸はラミニン５１１−Ｅ８なしを示す。細胞移植による合併症として考えられる眼圧上昇はすべての群で認められなかった。
【図８】図８は、図６で示した４群の培養角膜内皮移植から１４日後の組織学的検討を示す。左から抗Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅ抗体、抗ＺＯ−１抗体、抗Ｎ−カドヘリン抗体およびＰｈａｌｌｏｉｄｉｎでの染色を示す。上段からデスメ膜剥離を行わず角膜内皮細胞を剥離しＹ−２７６３２（＋）（１００μＭ）とともに培養角膜内皮細胞を注入した個体、デスメ膜剥離を行わず角膜内皮細胞を剥離しラミニン５１１−Ｅ８（２．１ｎＭ）とＹ−２７６３２（＋）（１００μＭ）とともに注入した個体、デスメ膜剥離を行った水疱性角膜症モデルにＹ−２７６３２（＋）（１００μＭ）とともに注入した個体、およびデスメ膜剥離を行った水疱性角膜症モデルにラミニン５１１−Ｅ８（２．１ｎＭ）とＹ−２７６３２（＋）（１００μＭ）とともに注入した個体の染色像を示す。
【図９】図９は、ラミニン５１１−Ｅ８を併用したサル水疱性角膜症モデルにおける培養角膜内皮移植後の前眼部写真を示す。カニクイザルの角膜内皮細胞を機械的に掻爬したモデルに培養したカニクイザル角膜内皮細胞を前房内に注入してうつむき姿勢を３時間取らせた。左上はＤａｙ１、右上はＤａｙ３、左下はＤａｙ７、右下はＤａｙ１４を示す。
【図１０】図１０は、サル水疱性角膜症モデルにおいてデスメ膜剥離を行い、ラミニン５１１−Ｅ８を併用して培養角膜内皮細胞を移植した後の前眼部写真を示す。カニクイザルの角膜内皮細胞を機械的に掻爬したモデルにおいて、デスメ膜を剥離した後に、培養したカニクイザル角膜内皮細胞を前房内に注入してうつむき姿勢を３時間取らせた。左上はＤａｙ１、右上はＤａｙ３、左下はＤａｙ７、右下はＤａｙ１４を示す。
【図１１】図１１は、ラミニン５１１−Ｅ８を併用したサル水疱性角膜症モデルにおける培養角膜内皮移植後の角膜厚を示す。デスメ膜剥離を行った個体と行わなかった個体の角膜厚（μｍ）を示す。横軸は処置後の日数である。横軸は移植後の日数を示し、縦軸は角膜厚（μｍ）を示す。実践はデスメ膜剥離がない例を示し、破線は、デスメ膜剥離を行った個体を示す。黒丸および三角は個体の相違を示す。デスメ膜剥離を行った例では、２個体ともに角膜厚の菲薄化を認めなかった。
【図１２】図１２は、サル水疱性角膜症モデルにおいてデスメ膜剥離を行い、前房内にラミニン５１１  Ｅ８フラグメントを２１ｎＭの濃度で注入し１時間おくことで生体内でデスメ膜の剥離により露出した角膜実質をコーティングした。その後、ラミニン５１１−Ｅ８ラミニン５１１−Ｅ８を併用して培養角膜内皮細胞を移植した後の前眼部写真を示す。左上はＤａｙ  １、右上はＤａｙ  ３、左下はＤａｙ  ７、右下はＤａｙ１４を示す。
【図１３】図１３は、インテグリンの角膜内皮細胞の細胞接着への影響を示す。ラミニン511-E8フラグメントを最終濃度2.1nMとなるように添加して角膜内細胞を播種した。その際、左端から順にマウスＩｇＧ、抗インテグリンα３抗体、抗インテグリンα６抗体、抗インテグリンα２抗体、抗インテグリンβ１抗体、抗インテグリンα３β１抗体、抗インテグリンα６β１抗体を添加して播種した場合の24時間後の接着細胞数（マウスＩｇＧに対する割合を示す）を示す。なお、右端はコントロールとしてラミニン511-E8フラグメントを添加せずにマウスＩｇＧのみを添加して播種したものを示す。
【図１４】図１４は、細胞接着関連タンパク質の活性化はインテグリンを介していることを示す。左端はコントロールとしてラミニン511-E8フラグメント非添加の群、左から2番目以降はラミニン511-E8フラグメントを最終濃度2.1nMとなるように添加した群を用意した。左から2番目以降は順に、マウスＩｇＧ、抗インテグリンα３抗体、抗インテグリンα６抗体、抗インテグリンα２抗体、抗インテグリンβ１抗体、抗インテグリンα３β１抗体、抗インテグリンα６β１抗体を添加して播種した場合のウェスタンブロットの結果を示す。上段からｐ−ＦＡＫ、ＦＡＫ、ｐ−パキシリン、バックグラウンドのＧＡＰＤＨを示す。各バンドの数値はバンドの強度を数値化して左端のラミニン511-E8無しを1としたときの相対値を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。従って、他に定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
【００１０】
（定義）
本明細書において「角膜内皮細胞」とは当該分野で用いられる通常の意味で用いられる。角膜とは、眼を構成する層状の組織の一つであり、透明であり、最も外界に近い部分に位置する。角膜は、ヒトでは外側（体表面）から順に５層でできているとされ、外側から角膜上皮、ボーマン膜、固有層、デスメ膜（角膜内皮基底膜）、および角膜内皮で構成される。特に、特定しない限り、上皮および内皮以外の部分は「角膜実質」とまとめて称することがあり、本明細書でもそのように称する。本明細書において「ＨＣＥＣ」（human  corneal  endothelial  cells）とは、ヒト角膜内皮細胞の略称であり、ウサギのものは「ＲＣＥＣ」、サルのものは「ＭＣＥＣ」とも略称する。本発明で使用される角膜内皮細胞は、天然に存在する細胞のほか、幹細胞から分化した細胞、例えばｉＰＳ等からの誘導分化細胞を用いることができることが理解される。
【００１１】
本明細書において「単離された」とは、通常の環境において天然に付随する物質が少なくとも低減されていること、好ましくは実質的に含まないことをいう。従って、単離された細胞、組織などとは、天然の環境において付随する他の物質（たとえば、他の細胞、タンパク質、核酸など）を実質的に含まない細胞、組織などをいう。
【００１２】
＜ラミニン＞
本明細書において「ラミニン」とは細胞外マトリックスの基底膜を構成するタンパク質であり、多細胞体制・組織構築とその維持、細胞接着、細胞移動、細胞増殖を促進し、がん細胞と関係が深い。胚発生の初期（2細胞期）に発現するとされる。α鎖、β鎖およびγ鎖のそれぞれ１本ずつからなるヘテロ三量体である。ラミニンの命名は、発見順の名称（ラミニン−１、ラミニン−２等）が知られていたが、サブユニットとの対応は考慮されていないため本明細書では、より新たな命名法である、α、β、γのサブクラスの名称（３桁の番号、百の位はα、十の位はβ、一の位はγを示す。）を併記する方法を採用し、α１、β１およびγ１の場合、ラミニン１１１などと称する。ラミニンはα鎖が５種、β鎖が３種，γ鎖が３種、見出だされている。従って、理論的な組み合わせの最大数は、５×３×３＝４５で、４５種類のラミニン分子が可能であるが、天然にすべての組み合わせが存在しているわけではないとされている。各サブユニットは、例えばα鎖についてはＬＡＭＡ１、ＬＡＭＡ２、ＬＡＭＡ３、ＬＡＭＡ４、ＬＡＭＡ５等と称し、β鎖についてはＬＡＭＢ１、ＬＡＭＢ２、ＬＡＭＢ３と称し、γ鎖についてはＬＡＭＣ１、ＬＡＭＣ２、ＬＡＭＣ３と称される。本発明で使用されるラミニンタンパク質は天然型であっても、あるいはその生物学的活性、特に細胞接着促進活性を保持したまま１またはそれ以上のアミノ酸残基が修飾された修飾型であってもよい。また、本発明におけるラミニンタンパク質は本明細書に記載した特徴を有する限り、その起源、製法などは限定されない。したがって、本発明で使用されるラミニンタンパク質は、天然産のタンパク質、遺伝子工学的手法により組換えＤＮＡから発現させたタンパク質、あるいは化学合成タンパク質の何れでもよい。本発明で使用されるラミニンタンパク質の由来は特に、限定されないが、好ましくは、ヒト由来のものである。医療材料を得る目的などでヒト細胞を培養する場合には、他の動物に由来する材料の使用を避けるために、ヒト由来のラミニンを用いることが好ましいがこれに限定されない。
【００１３】
ラミニンの結合分子も知られており、α１β１、α２β１、α２β２、α３β１、α６β１、α６β４、α７β１、α９β１、αｖβ３、αｖβ５、αｖβ８がラミニンレセプターとして知られるインテグリンである。
【００１４】
以下の表に代表的なラミニンおよびその説明を記載する。
【００１５】
【表１】
2020128434.tif 000002
【００１６】
本明細書において「α１鎖」（ＬＡＭＡ１）とは、細胞外マトリックスにある細胞接着分子のタンパク質・ラミニンのサブユニットの１つであり、ＬＡＭＡ１；ＬＡＭＡ；Ｓ−ＬＡＭ−ａｌｐｈａなどと称する。ヒトＬＡＭＡ１は、それぞれ遺伝子およびタンパク質の配列がNCBI登録番号のNM_005559およびNP_005550に登録されている。OMIMは150320とのアクセッション番号で同定される。本明細書の目的で使用される場合は、「α１鎖」、「ＬＡＭＡ１」は、特定の配列番号またはアクセッション番号に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質（あるいはそれをコードする核酸）のみならず、機能的に活性なその誘導体、または機能的に活性なそのフラグメント、またはその相同体、または高ストリンジェンシー条件または低ストリンジェンシー条件下で、このタンパク質をコードする核酸にハイブリダイズする核酸にコードされる変異体もまた、意味することが理解される。
【００１７】
本明細書において「α２鎖」（ＬＡＭＡ２）とは、細胞外マトリックスにある細胞接着分子のタンパク質・ラミニンのサブユニットの１つであり、ＬＡＭＡ２；ＬＡＭＭなどと称する。ヒトＬＡＭＡ２は、それぞれ遺伝子およびタンパク質の配列がＮＣＢＩ登録番号のNM_000426およびNP_000417に登録されている。ＯＭＩＭは156225とのアクセッション番号で同定される。本明細書の目的で使用される場合は、「α２鎖」、「ＬＡＭＡ２」は、特定の配列番号またはアクセッション番号に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質（あるいはそれをコードする核酸）のみならず、機能的に活性なその誘導体、または機能的に活性なそのフラグメント、またはその相同体、または高ストリンジェンシー条件または低ストリンジェンシー条件下で、このタンパク質をコードする核酸にハイブリダイズする核酸にコードされる変異体もまた、意味することが理解される。
【００１８】
本明細書において「α３鎖」（ＬＡＭＡ３）とは、細胞外マトリックスにある細胞接着分子のタンパク質・ラミニンのサブユニットの１つであり、ＬＡＭＡ３；ＢＭ６００；Ｅ１７０；ＬＡＭＮＡ；ＬＯＣＳ；ｌａｍａ３ａなどと称する。ヒトＬＡＭＡ３は、それぞれ遺伝子およびタンパク質の配列がNCBI登録番号のNM_000227およびNP_000218に登録されている。OMIMは600805とのアクセッション番号で同定される。本明細書の目的で使用される場合は、「α３鎖」、「ＬＡＭＡ３」は、特定の配列番号またはアクセッション番号に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質（あるいはそれをコードする核酸）のみならず、機能的に活性なその誘導体、または機能的に活性なそのフラグメント、またはその相同体、または高ストリンジェンシー条件または低ストリンジェンシー条件下で、このタンパク質をコードする核酸にハイブリダイズする核酸にコードされる変異体もまた、意味することが理解される。
【００１９】
本明細書において「α４鎖」（ＬＡＭＡ４）とは、細胞外マトリックスにある細胞接着分子のタンパク質・ラミニンのサブユニットの１つであり、ＬＡＭＡ４；ＬＡＭＡ３；ＬＡＭＡ４＊−１；ＣＭＤ１ＪＪなどと称する。ヒトＬＡＭＡ４は、それぞれ遺伝子およびタンパク質の配列がNCBI登録番号のNM_001105206およびNP_001098676に登録されている。OMIMは600133とのアクセッション番号で同定される。本明細書の目的で使用される場合は、「α４鎖」、「ＬＡＭＡ４」は、特定の配列番号またはアクセッション番号に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質（あるいはそれをコードする核酸）のみならず、機能的に活性なその誘導体、または機能的に活性なそのフラグメント、またはその相同体、または高ストリンジェンシー条件または低ストリンジェンシー条件下で、このタンパク質をコードする核酸にハイブリダイズする核酸にコードされる変異体もまた、意味することが理解される。
【００２０】
本明細書において「α５鎖」（ＬＡＭＡ５）とは、細胞外マトリックスにある細胞接着分子のタンパク質・ラミニンのサブユニットの１つであり、ＬＡＭＡ５；ＫＩＡＡ１９０７などと称する。ヒトＬＡＭＡ５は、それぞれ遺伝子およびタンパク質の配列がNCBI登録番号のNM_005560およびNP_005551に登録されている。OMIMは601033とのアクセッション番号で同定される。本明細書の目的で使用される場合は、「α５鎖」、「ＬＡＭＡ５」は、特定の配列番号またはアクセッション番号に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質（あるいはそれをコードする核酸）のみならず、機能的に活性なその誘導体、または機能的に活性なそのフラグメント、またはその相同体、または高ストリンジェンシー条件または低ストリンジェンシー条件下で、このタンパク質をコードする核酸にハイブリダイズする核酸にコードされる変異体もまた、意味することが理解される。
【００２１】
本明細書において「β１鎖」（ＬＡＭＢ１）とは、細胞外マトリックスにある細胞接着分子のタンパク質・ラミニンのサブユニットの１つであり、ＬＡＭＢ１；ＣＬＭ；ＬＩＳ５などと称する。ヒトＬＡＭＢ１は、それぞれ遺伝子およびタンパク質の配列がNCBI登録番号のNM_002291およびNP_002282に登録されている。ＯＭＩＭは150240 とのアクセッション番号で同定される。本明細書の目的で使用される場合は、「β１鎖」、「ＬＡＭＢ１」は、特定の配列番号またはアクセッション番号に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質（あるいはそれをコードする核酸）のみならず、機能的に活性なその誘導体、または機能的に活性なそのフラグメント、またはその相同体、または高ストリンジェンシー条件または低ストリンジェンシー条件下で、このタンパク質をコードする核酸にハイブリダイズする核酸にコードされる変異体もまた、意味することが理解される。
【００２２】
本明細書において「β２鎖」（ＬＡＭＢ２）(laminin S)とは、細胞外マトリックスにある細胞接着分子のタンパク質・ラミニンのサブユニットの１つであり、ＬＡＭＢ２；ＬＡＭＳ；ＮＰＨＳ５などと称する。ヒトＬＡＭＢ２は、それぞれ遺伝子およびタンパク質の配列がNCBI登録番号のNM_002292およびNP_002283に登録されている。ＯＭＩＭは150325とのアクセッション番号で同定される。本明細書の目的で使用される場合は、「β２鎖」、「ＬＡＭＢ２」は、特定の配列番号またはアクセッション番号に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質（あるいはそれをコードする核酸）のみならず、機能的に活性なその誘導体、または機能的に活性なそのフラグメント、またはその相同体、または高ストリンジェンシー条件または低ストリンジェンシー条件下で、このタンパク質をコードする核酸にハイブリダイズする核酸にコードされる変異体もまた、意味することが理解される。
【００２３】
本明細書において「β３鎖」（ＬＡＭＢ３）とは、細胞外マトリックスにある細胞接着分子のタンパク質・ラミニンのサブユニットの１つであり、ＬＡＭＢ３；ＢＭ６００−１２５ＫＤＡ；ＬＡＭ５；ＬＡＭＮＢ１などと称する。ヒトＬＡＭＢ３は、それぞれ遺伝子およびタンパク質の配列がNCBI登録番号のNM_000228およびNP_000219に登録されている。ＯＭＩＭは150310とのアクセッション番号で同定される。本明細書の目的で使用される場合は、「β３鎖」、「ＬＡＭＢ３」は、特定の配列番号またはアクセッション番号に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質（あるいはそれをコードする核酸）のみならず、機能的に活性なその誘導体、または機能的に活性なそのフラグメント、またはその相同体、または高ストリンジェンシー条件または低ストリンジェンシー条件下で、このタンパク質をコードする核酸にハイブリダイズする核酸にコードされる変異体もまた、意味することが理解される。
【００２４】
本明細書において「γ１鎖」（ＬＡＭＣ１）とは、細胞外マトリックスにある細胞接着分子のタンパク質・ラミニンのサブユニットの１つであり、ＬＡＭＣ１；ＬＡＭＢ２などと称する。ヒトＬＡＭＣ１は、それぞれ遺伝子およびタンパク質の配列がNCBI登録番号のNM_002293およびNP_002284に登録されている。OMIMは150290 とのアクセッション番号で同定される。本明細書の目的で使用される場合は、「γ１鎖」、「ＬＡＭＣ１」は、特定の配列番号またはアクセッション番号に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質（あるいはそれをコードする核酸）のみならず、機能的に活性なその誘導体、または機能的に活性なそのフラグメント、またはその相同体、または高ストリンジェンシー条件または低ストリンジェンシー条件下で、このタンパク質をコードする核酸にハイブリダイズする核酸にコードされる変異体もまた、意味することが理解される。
【００２５】
本明細書において「γ２鎖」（ＬＡＭＣ２）とは、細胞外マトリックスにある細胞接着分子のタンパク質・ラミニンのサブユニットの１つであり、ＬＡＭＣ２；Ｂ２Ｔ；ＢＭ６００；ＣＳＦ；ＥＢＲ２；ＥＢＲ２Ａ；ＬＡＭＢ２Ｔ；ＬＡＭＮＢ２などと称する。ヒトＬＡＭＣ２は、それぞれ遺伝子およびタンパク質の配列がNCBI登録番号のNM_005562およびNP_005553に登録されている。OMIMは150292 とのアクセッション番号で同定される。本明細書の目的で使用される場合は、「γ２鎖」、「ＬＡＭＣ２」は、特定の配列番号またはアクセッション番号に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質（あるいはそれをコードする核酸）のみならず、機能的に活性なその誘導体、または機能的に活性なそのフラグメント、またはその相同体、または高ストリンジェンシー条件または低ストリンジェンシー条件下で、このタンパク質をコードする核酸にハイブリダイズする核酸にコードされる変異体もまた、意味することが理解される。
【００２６】
本明細書において「γ３鎖」（ＬＡＭＣ３）とは、細胞外マトリックスにある細胞接着分子のタンパク質・ラミニンのサブユニットの１つであり、ＬＡＭＣ３；ＯＣＣＭなどと称する。ヒトＬＡＭＣ３は、それぞれ遺伝子およびタンパク質の配列がNCBI登録番号のNM_006059およびNP_006050に登録されている。OMIMは604349 とのアクセッション番号で同定される。本明細書の目的で使用される場合は、「γ３鎖」、「ＬＡＭＣ３」は、特定の配列番号またはアクセッション番号に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質（あるいはそれをコードする核酸）のみならず、機能的に活性なその誘導体、または機能的に活性なそのフラグメント、またはその相同体、または高ストリンジェンシー条件または低ストリンジェンシー条件下で、このタンパク質をコードする核酸にハイブリダイズする核酸にコードされる変異体もまた、意味することが理解される。
【００２７】
本明細書において「角膜内皮細胞において発現するラミニン」とは、角膜内皮細胞において通常状態において遺伝子が発現、好ましくはタンパク質レベルで、有意に発現しているラミニンの種類をいう。本明細書における解析により、α５、β１、β２およびγ１が発現していることが確認されている（国際公開２０１５／０８０２９７の図２）。したがって、ラミニン５１１、ラミニン５２１が角膜内皮細胞において発現していることが少なくとも確認されている。ラミニン５１１については、Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．２１８，２１３−２３４，２０００、およびＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２７７（１５），１２７４１−１２７４８，２００２に詳細な記載があるので、これらの文献に記載された内容は、本明細書中に援用する。ラミニン５１１等は、市販されているものを利用することも可能である。例えば、ＢｉｏＬａｍｉｎａ社からラミニン５１１、ラミニン５２１の組換えタンパク質が市販されており入手可能である。
【００２８】
本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどの「発現」とは、その遺伝子などがインビボで一定の作用を受けて、別の形態になることをいう。好ましくは、遺伝子、ポリヌクレオチドなどが、転写および翻訳されて、ポリペプチドの形態になることをいうが、転写されてmRNAが作製されることもまた発現の一態様であり得る。より好ましくは、そのようなポリペプチドの形態は、翻訳後プロセシングを受けたもの（本明細書にいう誘導体）であり得る。例えば、ラミニン各鎖の発現レベルは、任意の方法によって決定することができる。具体的には、ラミニン各鎖のmRNAの量、ラミニン各鎖タンパク質の量、そしてラミニン各鎖タンパク質の生物学的な活性を評価することによって、ラミニン各鎖の発現レベルを知ることができる。ラミニン各鎖のmRNAやタンパク質の量は、本明細書に記載したような方法によって決定することができる。
【００２９】
本明細書において「機能的等価物」とは、対象となるもとの実体に対して、目的となる機能が同じであるが構造が異なる任意のものをいう。従って、「ラミニンもしくはラミニン各鎖またはその機能的等価物」または「ラミニン、ラミニン各鎖およびその機能的等価物からなる群」という場合は、ラミニンもしくはラミニン各鎖自体のほか、ラミニンもしくはラミニン各鎖のフラグメント、変異体または改変体（例えば、アミノ酸配列改変体等）であって、眼細胞等の細胞接着能、分化制御および／または増殖促進作用を１つ以上有するもの、ならびに、作用する時点においてラミニンもしくはラミニン各鎖自体またはこのラミニンもしくはラミニン各鎖のフラグメント、変異体もしくは改変体に変化することができるもの（例えば、ラミニンもしくはラミニン各鎖自体またはラミニンもしくはラミニン各鎖のフラグメント、変異体もしくは改変体をコードする核酸、およびその核酸を含むベクター、細胞等を含む）が包含されることが理解される。「ラミニンもしくはラミニン各鎖またはその機能的等価物」または「ラミニン、ラミニン各鎖およびその機能的等価物からなる群」としては、ラミニンおよびそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１つの因子が代表例として挙げられる。本発明において、ラミニンもしくはラミニン各鎖の機能的等価物は、格別に言及していなくても、ラミニンもしくはラミニン各鎖と同様に用いられうることが理解される。
【００３０】
本明細書において「フラグメント」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１〜ｎ−１までの配列長を有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。本明細書において、このようなラミニンの鎖は、その活性、例えば、増殖促進または維持の因子として機能する場合、そのフラグメント自体も本発明の範囲内に入ることが理解される。本発明に従って、用語「活性」は、本明細書において、最も広い意味での分子の機能を指す。活性は、限定を意図するものではないが、概して、分子の生物学的機能、生化学的機能、物理的機能または化学的機能を含む。活性は、例えば、酵素活性、他の分子と相互作用する能力、および他の分子の機能を活性化するか、促進するか、安定化するか、阻害するか、抑制するか、または不安定化する能力、安定性、特定の細胞内位置に局在する能力を含む。適用可能な場合、この用語はまた、最も広い意味でのタンパク質複合体の機能にも関する。本明細書において「生物学的機能」とは、ある遺伝子またはそれに関する核酸分子もしくはポリペプチドについて言及するとき、その遺伝子、核酸分子またはポリペプチドが生体内において有し得る特定の機能をいい、これには、例えば、特異的な抗体の生成、酵素活性、抵抗性の付与等を挙げることができるがそれらに限定されない。本明細書において、生物学的機能は、「生物学的活性」によって発揮され得る。本明細書において「生物学的活性」とは、ある因子（例えば、ポリヌクレオチド、タンパク質など）が、生体内において有し得る活性のことをいい、種々の機能（例えば、転写促進活性）を発揮する活性が包含され、例えば、ある分子との相互作用によって別の分子が活性化または不活化される活性も包含される。2つの因子が相互作用する場合、その生物学的活性は、その二分子との間の結合およびそれによって生じる生物学的変化、例えば、一つの分子を抗体を用いて沈降させたときに他の分子も共沈するとき、2分子は結合していると考えられる。従って、そのような共沈を見ることが一つの判断手法として挙げられる。例えば、ある因子が酵素である場合、その生物学的活性は、その酵素活性を包含する。別の例では、ある因子がリガンドである場合、そのリガンドが対応するレセプターへの結合を包含する。そのような生物学的活性は、当該分野において周知の技術によって測定することができる。従って、「活性」は、結合（直接的または間接的のいずれか）を示すかまたは明らかにするか；応答に影響する（すなわち、いくらかの曝露または刺激に応答する測���可能な影響を有する）、種々の測定可能な指標をいい、例えば、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに直接結合する化合物の親和性、または例えば、いくつかの刺激後または事象後の上流または下流のタンパク質の量あるいは他の類似の機能の尺度が挙げられる。
【００３１】
本明細書で使用される「機能的に活性な」は、本発明のポリペプチド、フラグメントまたは誘導体が関連する態様に従って、生物学的活性などの、タンパク質の構造的機能、制御機能、または生化学的機能を有する、ポリペプチド、フラグメントまたは誘導体を指す。
【００３２】
本明細書において、ラミニンの「フラグメント」とは、ラミニンの任意のフラグメントを指し、本発明において使用される因子としては、ラミニン全長のみならず、ラミニンのフラグメントも、その機能、特に内皮細胞の細胞接着能を有する限り使用されうることが理解される。したがって本発明において使用されるラミニンのフラグメントは、通常、ラミニンの機能を少なくとも１つ有する。そのような機能としては、特に内皮細胞の細胞接着能が含まれうる。
【００３３】
以下に、本発明で角膜内皮細胞に発現していることが見出されたラミニンについて、その配列について説明する。これらのラミニンは、本発明の好ましい代表例を示すものであり、本発明は、これらの特定のラミニンサブタイプに限定されるものではないことが理解される。
【００３４】
ラミニンα５鎖の代表的なヌクレオチド配列は、
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される１つの変異を有する改変体ポリペプチドまたはそのフラグメントであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号１に記載の塩基配列のスプライス変異体もしくは対立遺伝子変異体またはそのフラグメントである、ポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの種相同体またはそのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド；
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または
（ｇ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、ラミニンα５鎖の有する活性をいう。α５鎖については、Ｄｏｉ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２７７（１５），１２７４１−１２７４８，２００２；米国特許第６，９３３，２７３号を参照することができる。
【００３５】
ラミニンα５鎖のアミノ酸配列としては、
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される１つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；
（ｃ）配列番号１に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド；
（ｄ）配列番号２に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；または
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、
であり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、ラミニンα５鎖の有する活性をいう。α５鎖については、Ｄｏｉ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２７７（１５），１２７４１−１２７４８，２００２；米国特許第６，９３３，２７３号を参照することができる。
【００３６】
ラミニンβ１鎖の代表的なヌクレオチド配列は、
（ａ）配列番号３に記載の塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される１つの変異を有する改変体ポリペプチドまたはそのフラグメントであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号３に記載の塩基配列のスプライス変異体もしくは対立遺伝子変異体またはそのフラグメントである、ポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの種相同体またはそのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド；
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または
（ｇ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、ラミニンβ１鎖の有する活性をいう。β１鎖については、Ｐｉｌｌａｒａｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２（２２），１０４５４−１０４６２，１９８７；米国特許第６，９３３，２７３号を参照することができる。
【００３７】
ラミニンβ１鎖のアミノ酸配列としては、
（ａ）配列番号４に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド；
（ｂ）配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される１つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；
（ｃ）配列番号３に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド；
（ｄ）配列番号４に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；または
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、
であり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、ラミニンβ１鎖の有する活性をいう。β１鎖については、Ｐｉｌｌａｒａｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２（２２），１０４５４−１０４６２，１９８７；米国特許第６，９３３，２７３号を参照することができる。
【００３８】
ラミニンβ２鎖の代表的なヌクレオチド配列は、
（ａ）配列番号５に記載の塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号６に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される１つの変異を有する改変体ポリペプチドまたはそのフラグメントであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号５に記載の塩基配列のスプライス変異体もしくは対立遺伝子変異体またはそのフラグメントである、ポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの種相同体またはそのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド；
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または
（ｇ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、ラミニンβ２鎖の有する活性をいう。β２鎖については、Ｗｅｗｅｒ  ＵＭ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．  １９９４  Ｎｏｖ  １５；２４（２）：２４３−５２．，１９８７；米国特許第６，９３３，２７３号を参照することができる。
【００３９】
ラミニンβ２鎖のアミノ酸配列としては、
（ａ）配列番号６に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド；
（ｂ）配列番号６に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される１つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；
（ｃ）配列番号５に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド；
（ｄ）配列番号６に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；または
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、
であり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、ラミニンβ２鎖の有する活性をいう。β２鎖については、Ｗｅｗｅｒ  ＵＭ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．  １９９４  Ｎｏｖ  １５；２４（２）：２４３−５２．，１９８７；米国特許第６，９３３，２７３号を参照することができる。
【００４０】
ラミニンγ１鎖の代表的なヌクレオチド配列は、
（ａ）配列番号７に記載の塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号８に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される１つの変異を有する改変体ポリペプチドまたはそのフラグメントであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号７に記載の塩基配列のスプライス変異体もしくは対立遺伝子変異体またはそのフラグメントである、ポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの種相同体またはそのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド；
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または
（ｇ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、ラミニンγ１鎖の有する活性をいう。γ１鎖については、Ｐｉｌｌａｒａｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３（１４），６７５１−６７５８，１９８８；米国特許第６，９３３，２７３号を参照することができる。
【００４１】
ラミニンγ１鎖のアミノ酸配列としては、
（ａ）配列番号８に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド；
（ｂ）配列番号８に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される１つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；
（ｃ）配列番号７に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド；
（ｄ）配列番号８に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；または
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、
、
であり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、ラミニンγ１鎖の有する活性をいう。γ１鎖については、Ｐｉｌｌａｒａｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３（１４），６７５１−６７５８，１９８８；米国特許第６，９３３，２７３号を参照することができる。
【００４２】
本明細書において「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」は、交換可能で本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。このポリマーは、直鎖であっても分岐していてもよく、環状であってもよい。アミノ酸は、天然のものであっても非天然のものであってもよく、改変されたアミノ酸であってもよい。この用語はまた、複数のポリペプチド鎖の複合体へとアセンブルされたものを包含し得る。この用語はまた、天然または人工的に改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。そのような改変としては、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化または任意の他の操作もしくは改変（例えば、標識成分との結合体化）が包含される。この定義にはまた、例えば、アミノ酸の1または2以上のアナログを含むポリペプチド（例えば、非天然アミノ酸などを含む）、ペプチド様化合物（例えば、ペプトイド）および当該分野において公知の他の改変が包含される。本発明のタンパク質（例えばラミニン各鎖）は、目的とする各鎖遺伝子をコードするＤＮＡを、適当なベクター中に組み込み、これを真核生物または原核生物細胞のいずれかに、各々の宿主で発現可能な発現ベクターを用いて導入し、それぞれの鎖を発現させることにより所望のタンパク質を得ることができる。ラミニンを発現させるために用いることができる宿主細胞は特に限定されるものではなく、大腸菌、枯草菌等の原核宿主細胞、および酵母、真菌、昆虫細胞、植物および植物細胞、哺乳動物細胞等の真核生物宿主が挙げられる。目的とするラミニン鎖等を発現するように構築したベクターを、トランスフォーメーション、トランスフェクション、コンジュゲーション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、粒子銃技術、リン酸カルシウム沈殿、アグロバクテリウム法、直接マイクロインジェクション等により、上記の宿主細胞中に導入することができる。ベクターを含む細胞を適当な培地中で成長させて、本発明で使用するラミニン鎖等を産生させ、細胞または培地から精製することにより、ラミニン鎖等を得ることができる。精製はサイズ排除クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、イオン交換クロマトグラフィー、および免疫アフィニティークロマトグラフィー等を用いて行うことができる。
【００４３】
本明細書において、「アミノ酸」は、本発明の目的を満たす限り、天然のものでも非天然のものでもよい。
【００４４】
本明細書において「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、交換可能で本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいう。この用語はまた、「オリゴヌクレオチド誘導体」または「ポリヌクレオチド誘導体」を含む。「オリゴヌクレオチド誘導体」または「ポリヌクレオチド誘導体」とは、ヌクレオチドの誘導体を含むか、またはヌクレオチド間の結合が通常とは異なるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいい、互換的に使用される。そのようなオリゴヌクレオチドとして具体的には、例えば、２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がN3’−P5’ホスホロアミデート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合とがペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがC−5プロピニルウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがC−5チアゾールウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがC−5プロピニルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（phenoxazine−modified  cytosine）で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、DNA中のリボースが2’−O−プロピルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体およびオリゴヌクレオチド中のリボースが2’−メトキシエトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体などが例示される。他にそうではないと示されなければ、特定の核酸配列はまた、明示的に示された配列と同様に、その保存的に改変された改変体（例えば、縮重コドン置換体）および相補配列を包含することが企図される。具体的には、縮重コドン置換体は、1またはそれ以上の選択された（または、すべての）コドンの3番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作製することにより達成され得る（Batzer  et  al.,  Nucleic  Acid  Res.19:5081(1991);  Ohtsuka  et  al.,  J.  Biol.  Chem.  260:2605-2608(1985);  Rossolini  et  al.,  Mol.  Cell.  Probes  8:91-98(1994)）。本明細書において「核酸」はまた、遺伝子、cDNA、mRNA、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドと互換可能に使用される。本明細書において「ヌクレオチド」は、天然のものでも非天然のものでもよい。
【００４５】
本明細書において「遺伝子」とは、遺伝形質を規定する因子をいう。通常染色体上に一定の順序に配列している。タンパク質の一次構造を規定する遺伝子を構造遺伝子といい、その発現を左右する遺伝子を調節遺伝子という。本明細書では、「遺伝子」は、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」をさすことがある。
【００４６】
アミノ酸は、その一般に公知の3文字記号か、またはIUPAC−IUB  Biochemical  Nomenclature  Commissionにより推奨される1文字記号のいずれかにより、本明細書中で言及され得る。ヌクレオチドも同様に、一般に認知された1文字コードにより言及され得る。本明細書では、アミノ酸配列および塩基配列の類似性、同一性および相同性の比較は、配列分析用ツールであるBLASTを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。同一性の検索は例えば、NCBIのBLAST  2.2.26（2011.10.30発行）を用いて行うことができる。本明細書における同一性の値は通常は上記BLASTを用い、デフォルトの条件でアラインした際の値をいう。ただし、パラメーターの変更により、より高い値が出る場合は、最も高い値を同一性の値とする。複数の領域で同一性が評価される場合はそのうちの最も高い値を同一性の値とする。類似性は、同一性に加え、類似のアミノ酸についても計算に入れた数値である。
【００４７】
本明細書において「ストリンジェント（な）条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、当該分野で慣用される周知の条件をいう。本発明で使用されるラミニンは、具体的に開示された各ラミニンの核酸配列に対して「ストリンジェント（な）条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド」によってコードされるものも使用されうることが理解される。本発明のポリヌクレオチド中から選択されたポリヌクレオチドをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法などを用いることにより、そのようなポリヌクレオチドを得ることができる。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のDNAを固定化したフィルターを用いて、0．7〜1．0MのNaCl存在下、65℃でハイブリダイゼーションを行った後、0．1〜2倍濃度のSSC（saline−sodium  citrate）溶液（1倍濃度のSSC溶液の組成は、150mM  塩化ナトリウム、15mM  クエン酸ナトリウムである）を用い、65℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。ハイブリダイゼーションは、Molecular  Cloning  2nd  ed.,  Current  Protocols  in  Molecular  Biology,  Supplement  1-38,  DNA  Cloning  1:Core  Techniques,  A  Practical  Approach,  Second  Edition,  Oxford  University  Press(1995)などの実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列からは、好ましくは、A配列のみまたはT配列のみを含む配列が除外される。従って、本発明において使用されるポリペプチド（例えば、ラミニンなど）には、本発明で特に記載されたポリペプチドをコードする核酸分子に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるポリペプチドも包含される。これらの低ストリンジェンシー条件は、３５％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０２％  ＰＶＰ、０．０２％ＢＳＡ、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、および１０％（重量／体積）デキストラン硫酸を含む緩衝液中、４０℃で１８〜２０時間ハイブリダイゼーションし、２ｘＳＳＣ、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、および０．１％ＳＤＳからなる緩衝液中、５５℃で１〜５時間洗浄し、そして２×ＳＳＣ、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、および０．１％ＳＤＳからなる緩衝液中、６０℃で１．５時間洗浄することを含む。
【００４８】
本発明の機能的等価物としては、アミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸の挿入、置換もしくは欠失、またはその一方もしくは両末端への付加されたものを用いることができる。本明細書において、「アミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸の挿入、置換もしくは欠失、またはその一方もしくは両末端への付加」とは、部位特異的変異誘発法等の周知の技術的方法により、あるいは天然の変異により、天然に生じ得る程度の複数個の数のアミノ酸の置換等により改変がなされていることを意味する。
【００４９】
本発明で用いられるラミニン各鎖等の改変アミノ酸配列は、例えば約１〜３０個、好ましくは約１〜２０個、より好ましくは約１〜９個、さらに好ましくは約１〜５個、特に好ましくは約１〜２個のアミノ酸の挿入、置換、もしくは欠失、またはその一方もしくは両末端への付加がなされたものであることができる。改変アミノ酸配列は、好ましくは、そのアミノ酸配列が、ラミニン各鎖等のアミノ酸配列において１または複数個（好ましくは１もしくは数個または１、２、３、もしくは４個）の保存的置換を有するアミノ酸配列であってもよい。ここで「保存的置換」とは、タンパク質の機能を実質的に改変しないように、１または複数個のアミノ酸残基を、別の化学的に類似したアミノ酸残基で置換えることを意味する。例えば、ある疎水性残基を別の疎水性残基によって置換する場合、ある極性残基を同じ電荷を有する別の極性残基によって置換する場合などが挙げられる。このような置換を行うことができる機能的に類似のアミノ酸は、アミノ酸毎に当該分野において公知である。具体例を挙げると、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニンなどが挙げられる。極性（中性）アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システインなどが挙げられる。陽電荷をもつ（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジンなどが挙げられる。また、負電荷をもつ（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。
【００５０】
本明細書において「薬剤」、「剤」または「因子」（いずれも英語ではａｇｅｎｔに相当する）は、広義には、交換可能に使用され、意図する目的を達成することができる限りどのような物質または他の要素（例えば、光、放射能、熱、電気などのエネルギー）でもあってもよい。そのような物質としては、例えば、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡのようなＤＮＡ、ｍＲＮＡのようなＲＮＡを含む）、ポリサッカリド、オリゴサッカリド、脂質、有機低分子（例えば、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、有機低分子、コンビナトリアルケミストリで合成された分子、医薬品として利用され得る低分子（例えば、低分子リガンドなど）など）、これらの複合分子が挙げられるがそれらに限定されない。ポリヌクレオチドに対して特異的な因子としては、代表的には、そのポリヌクレオチドの配列に対して一定の配列相同性を（例えば、７０％以上の配列同一性）もって相補性を有するポリヌクレオチド、プロモーター領域に結合する転写因子のようなポリペプチドなどが挙げられるがそれらに限定されない。ポリペプチドに対して特異的な因子としては、代表的には、そのポリペプチドに対して特異的に指向された抗体またはその誘導体あるいはその類似物（例えば、単鎖抗体）、そのポリペプチドがレセプターまたはリガンドである場合の特異的なリガンドまたはレセプター、そのポリペプチドが酵素である場合、その基質などが挙げられるがそれらに限定されない。
【００５１】
本明細書において細胞の「正常細胞機能」とは、角膜内皮細胞等の具体的細胞について言う場合、その細胞が本来有している機能をいう。角膜内皮細胞についていえば、そのような機能としては、ＺＯ−１およびＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅ、角膜移植への適応能（Matsubara  M,  Tanishima  T:  Wound-healing  of  the  corneal  endothelium  in  the  monkey:  a  morphometric  study,  Jpn  J  Ophthalmol  1982,  26:264-273；Matsubara  M,  Tanishima  T:  Wound-healing  of  corneal  endothelium  in  monkey:  an  autoradiographic  study,  Jpn  J  Ophthalmol  1983,  27:444-450；Van  Horn  DL,  Hyndiuk  RA:  Endothelial  wound  repair  in  primate  cornea,  Exp  Eye  Res  1975,  21:113-124およびVan  Horn  DL,  Sendele  DD,  Seideman  S,  Buco  PJ:  Regenerative  capacity  of  the  corneal  endothelium  in  rabbit  and  cat,  Invest  Ophthalmol  Vis  Sci  1977,  16:597-613）等が挙げられるがそれらに限定されない。
【００５２】
ＺＯ−１およびＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅは、遺伝子の発現を免疫的な手段またはＲＴ−ＰＣＲ等の核酸レベルでの発現をみることによって評価することができる。Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅおよびＺＯ−１が正常細胞と同程度に発現および／または機能していることを確認することによって、対象の細胞が正常の機能を有しているかどうかを確認することができる。
【００５３】
角膜移植への適応能は、通常ウサギ等の実験動物においても水疱性角膜症モデルとして角膜内皮を機械的に掻爬して、培養細胞の移植試験を行うことができる。しかしながら、ウサギの角膜内皮細胞は生体内で増殖するため、ホストの角膜内皮細胞の増殖による自然治癒の可能性を否定できない（Matsubara  M,  et  al.,  Jpn  J  Ophthalmol  1982,  26:264-273；Matsubara  M,et  al.,  Jpn  J  Ophthalmol  1983,  27:444-450；Van  Horn  DL,  et  al.,  Exp  Eye  Res  1975,  21:113-124およびVan  Horn  DL,  et  al.,  Invest  Ophthalmol  Vis  Sci  1977,16:597-613）。したがって、より正確な移植適応能を評価するためには、霊長類への生着を評価することが好ましい。ヒトへの移植適応能を評価する場合は、霊長類であるカニクイザルなどにおいて、例えば、少なくとも１ヶ月、好ましくは少なくとも２ヶ月、より好ましくは少なくとも３ヶ月、さらに好ましくは少なくとも６ヶ月、さらにより好ましくは少なくとも１２ヶ月経過させた後の適応性を評価する。サル等の霊長類での移植適応能を確認することは特にヒトへの適用において重要である。
【００５４】
（一般技術）
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Sambrook  J.  et  al.(1989).Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual,  Cold  Spring  Harborおよびその3rd  Ed.(2001);  Ausubel,  F.  M.(1987).Current  Protocols  in  Molecular  Biology,  Greene  Pub.  Associates  and  Wiley-Interscience;  Ausubel,  F.  M.(1989).Short  Protocols  in  Molecular  Biology:  A  Compendium  of  Methods  from  Current  Protocols  in  Molecular  Biology,  Greene  Pub.  Associates  and  Wiley-Interscience;  Innis,  M.  A.  (1990).  PCR  Protocols:  A  Guide  to  Methods  and  Applications,  Academic  Press;  Ausubel,  F.  M.  (1992).Short  Protocols  in  Molecular  Biology:  A  Compendium  of  Methods  from  Current  Protocols  in  Molecular  Biology,  Greene  Pub.  Associates;  Ausubel,  F.  M.(1995).Short  Protocols  in  Molecular  Biology:  A  Compendium  of  Methods  from  Current  Protocols  in  Molecular  Biology,  Greene  Pub.  Associates;  Innis,  M.  A.  et  al.(1995).  PCR  Strategies,  Academic  Press;  Ausubel,  F.  M.  (1999).  Short  Protocols  in  Molecular  Biology:  A  Compendium  of  Methods  from  Current  Protocols  in  Molecular  Biology,  Wiley,  and  annual  updates;  Sninsky,  J.  J.  et  al.(1999).PCR  Applications:  Protocols  for  Functional  Genomics,  Academic  Press,  Gait,  M.  J.  (1985).  Oligonucleotide  Synthesis:  A  Practical  Approach,  IRL  Press;  Gait,  M.  J.  (1990).  Oligonucleotide  Synthesis:  A  Practical  Approach,  IRL  Press;  Eckstein,  F.(1991).  Oligonucleotides  and  Analogues:  A  Practical  Approach,  IRL  Press;  Adams,  R.  L.  et  al.(1992).The  Biochemistry  of  the  Nucleic  Acids,  Chapman  &  Hall;  Shabarova,  Z.  et  al.(1994).  Advanced  Organic  Chemistry  of  Nucleic  Acids,  Weinheim;  Blackburn,  G.  M.  et  al.(1996).  Nucleic  Acids  in  Chemistry  and  Biology,  Oxford  University  Press;  Hermanson,  G.  T.  (I996).  Bioconjugate  Techniques,  Academic  Press、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されている。角膜内皮細胞については、Ｎａｎｃｙ  Ｊｏｙｃｅらの報告｛Joyce,  2004  #161｝  {Joyce,  2003  #7}がよく知られているが、前述のごとく長期培養、継代培養により線維芽細胞様の形質転換を生じるため、効率的な培養法の研究が現在も行われている。これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。
【００５５】
（好ましい実施形態の説明）
以下に好ましい実施形態の説明を記載するが、この実施形態は本発明の例示であり、本発明の範囲はそのような好ましい実施形態に限定されないことが理解されるべきである。当業者はまた、以下のような好ましい実施例を参考にして、本発明の範囲内にある改変、変更などを容易に行うことができることが理解されるべきである。また、任意の実施形態が組み合わせ得ることも理解されるべきである。
【００５６】
＜治療または予防＞
１つの局面において、本発明は、ラミニンおよびそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１つの因子を含む、角膜内皮等の角膜の疾患、障害または状態の治療または予防剤を提供する。この局面において、本発明はまた、角膜内皮疾患、障害または状態の治療または予防のために使用するための、ラミニンおよびそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１つの因子を提供する。あるいは、この局面において、本発明は、角膜内皮疾患、障害または状態の治療または予防するための方法であって、該方法は、ラミニンおよびそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１つの因子の有効量を該治療または予防を必要とする被験体に投与する工程を包含する、方法を提供する。この局面において、角膜についていえば、角膜内皮のほか、上皮等でも、同様に治療または予防効果が奏され得ることが理解される。
【００５７】
特定の実施形態において、本発明は、ラミニンおよびそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１つの因子を含む、角膜内皮疾患、障害または状態の治療または予防剤を提供する。
【００５８】
１つの実施形態では、本発明で使用される因子またはラミニンは、ＲＧＤ配列を含む。理論に拘束されることを望まないが、ＲＧＤ配列は細胞接着と関連するとされており、ラミニンのうちでも細胞接着能が顕著なものを用いることにより、角膜内皮の疾患、障害または状態を治療または予防することができ、あるいはそれらを改善することができると理解される。
【００５９】
別の実施形態では、本発明で使用される因子またはラミニンは、α５鎖を含む。理論に拘束されることを望まないが、実施例等で示される結果から、α５鎖を含むラミニン種が角膜内皮の疾患、障害または状態を治療または予防することができ、あるいはそれらを改善することが実証されており、α５鎖さえあれば、β鎖またはγ鎖については一定程度フレキシビリティーがあると考えられるからである。
【００６０】
別の実施形態では、本発明で使用される因子またはラミニンは、γ１鎖を含む。理論に拘束されることを望まないが、実施例等で示される結果から、γ１鎖を含むラミニン種が角膜内皮の疾患、障害または状態を治療または予防することができ、あるいはそれらを改善することが実証されており、γ１鎖さえあれば、α鎖またはβ鎖については一定程度フレキシビリティーがあると考えられるからである。
【００６１】
さらに別の実施形態では、本発明で使用される因子またはラミニンは、α５鎖および／またはγ１鎖を含む。理論に拘束されることを望まないが、実施例等で示される結果から、α５鎖および／またはγ１鎖を含むラミニン種が角膜内皮を治療または予防することができ、あるいはそれらを改善することが実証されており、ラミニン５１１およびラミニン５２１が効果が実証されていることから、α５鎖および／またはγ１鎖が確定すれば、βについては一定程度フレキシビリティーがあることが示されているからである。
【００６２】
１つの好ましい実施形態では、前記ラミニンは、ラミニン５１１およびラミニン５２１を含む。したがって、この実施形態では、本発明の因子は、ラミニン５１１、ラミニン５２１またはそれらのフラグメントでありうる。本発明のラミニン５１１のフラグメントまたはラミニン５２１のフラグメントは、角膜内皮の疾患、障害または状態を治療または予防することができ、あるいはそれらを改善することができる限り、どのようなフラグメントを用いてもよい。このようなフラグメントとしては、ラミニン５１１−Ｅ８フラグメントおよびラミニン５２１−フラグメント（それぞれ、配列番号９、１０（核酸配列、アミノ酸配列）および配列番号１１、１２（核酸配列、アミノ酸配列））（Taniguchi  Y,  Ido  H,  Sanzen  N,  Hayashi  M,  Sato-Nishiuchi  R,  Futaki  S,  Sekiguchi  K.  The  C-terminal  region  of  laminin  beta  chains  modulates  the  integrin  binding  affinities  of  laminins.  J  Biol  Chem.  284:7820-7831,  2009、参照。ニッピ株式会社から入手可能）が挙げられるがそれに限定されない。ラミニン５１１−Ｅ８フラグメントおよびラミニン５２１−フラグメントは、エラスターゼ処理により得られるフラグメントの一つで、ヘテロ３量体のｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌドメインの一部とα鎖Ｃ末端領域にある３個のＬＧドメイン（ＬＧ１〜ＬＧ３）からなる。Ｅ８フラグメントは、ラミニンのα鎖、β鎖、γ鎖が互いにｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌドメインを介して会合したヘテロ３量体分子のインテグリン結合部位に該当するとされている。したがって、好ましいフラグメントとしては、ラミニン全長において、インテグリン結合部位が実質的に保持されたものを使用することができる。このようなフラグメントは、ラミニン５１１−Ｅ８フラグメント、ラミニン５２１−フラグメントの情報を元に、適宜改変して作製することができることが理解される。
【００６３】
ここで、ヒトラミニンα５β１γ１のＥ８フラグメント（本明細書において「ヒトラミニン５１１−Ｅ８」ともいう。）は、マウスラミニンα１β１γ１のＥ８フラグメント（本明細書において「マウスラミニン１１１−Ｅ８」ともいう。）に相当するヒトラミニンα５β１γ１（本明細書において「ヒトラミニン５１１」ともいう）のフラグメントを意味する。ラミニンのＥ８フラグメントは、マウスラミニンα１β１γ１（以下、「マウスラミニン１１１」と記す。）をエラスターゼで消化して得られたフラグメントの中で、強い細胞接着活性をもつフラグメントとして同定されたものである（Edgar  D.,  Timpl  R.,  Thoenen  H.  The  heparin-binding  domain  of  lamininis  responsible  for  its  effects  on  neurite  outgrowth  and  neuronal  survival.  EMBOJ.,  3:1463-1468,  1984.、Goodman  SL.,  Deutzmann  R.,  von  der  Mark  K.  Two  distinct  cell-binding  domains  in  laminin  can  independently  promote  nonneuronal  cell  adhesion  and  spreading.  J.  Cell  Biol.,  105:589-598,  1987.）。ヒトラミニン５１１およびヒトラミニン３３２についてもエラスターゼで消化した際にマウスラミニン１１１−Ｅ８に相当するフラグメントの存在が推定されている。本発明に用いられるヒトラミニン５１１−Ｅ８は、ヒトラミニン５１１のエラスターゼ消化産物であることを要するものではなく、マウスラミニン１１１−Ｅ８と同様の細胞接着活性を有し、同様の構造を有し、同程度の分子量を有するヒトラミニン５１１のフラグメントであればよい。ヒトラミニン５１１−Ｅ８の製造方法は特に限定されず、例えば、全長のヒトラミニン５１１をエラスターゼ等のタンパク質分解酵素で消化し、目的のフラグメントを分取、精製する方法や、組換えタンパク質として製造する方法などが挙げられる。製造量、品質の均一性、製造コスト等の観点から、組換えタンパク質として製造することが好ましい。組換えヒトラミニン５１１−Ｅ８は、公知の遺伝子組換え技術を適宜用いることにより製造することができる。組換えヒトラミニン５１１−Ｅ８の製造方法としては、例えば、ヒトラミニン５１１−Ｅ８のα鎖、β鎖およびγ鎖の各タンパク質をコードするＤＮＡをそれぞれ取得し、これをそれぞれ発現ベクターに挿入し、得られた３種類の発現ベクターを適切な宿主細胞に共導入して発現させ、３量体を形成しているタンパク質を公知の方法で精製することにより製造できる（例えば、Hiroyuki  Ido,  et  al,  “The  requirement  of  the  glutamic  acid  residue  at  the  third  position  from  the  carboxyl  termini  of  the  laminin  γ  chains  in  integrin  binding  by  laminins”  The  Journal  of  Biological  Chemistry,  282,  11144-11154,  2007.参照）。具体的な作製方法としては、特願2011-78370を参照することができる。同様のフラグメントは、ヒトラミニン５２１を用いても作製することができる。これは、ラミニン５２１−Ｅ８フラグメントと称され、ラミニン５１１−Ｅ８と同様に作製することができ、ラミニン５１１−Ｅ８と同様の活性を保持することが理解される。本発明では、同様に、α５鎖および／またはγ１鎖を含む任意のラミニンについて、同様に、Ｅ８フラグメントを製造することができることが理解され、そのようなＥ８フラグメントは、本発明において全長のものと同様に使用することができることが理解される。
【００６４】
１つの好ましい実施形態では、前記ラミニンは、ラミニン５１１（α５β１γ１）およびラミニン５２１（α５β２γ１）を含み、あるいは、前記因子は、ラミニン５１１、ラミニン５２１、ラミニン５１１−Ｅ８フラグメントまたはラミニン５２１−Ｅ８フラグメントである。
【００６５】
別の実施形態では、本発明において使用される前記フラグメントは、角膜の細胞（例えば、角膜内皮細胞）の細胞接着能を有する。
【００６６】
１つの実施形態では、使用される因子（例えば、ラミニンまたはそのフラグメント）の濃度は、治療または予防効果がある限りどのような濃度でもよく（有効濃度ともいい、治療の場合治療有効濃度、予防の場合予防有効濃度ともいう。）、例えば、約０．１ｎＭ以上、約０．２ｎＭ以上、約０．３ｎＭ以上、約０．４ｎＭ以上、約０．５ｎＭ以上、約０．６ｎＭ以上、約０．７ｎＭ以上、約０．８ｎＭ以上、約０．９ｎＭ以上、約１ｎＭ以上、約２ｎＭ以上、約２．１ｎＭ以上、約３ｎＭ以上、約４ｎＭ以上、約５ｎＭ以上、約６ｎＭ以上、約７ｎＭ以上、約８ｎＭ以上、約９ｎＭ以上、約１０ｎＭ以上、約１５ｎＭ以上、約２０ｎＭ以上、約２１ｎＭ以上、約２５ｎＭ以上、約３０ｎＭ以上、約４０ｎＭ以上、約５０ｎＭ以上、約６０ｎＭ以上、約７０ｎＭ以上、約８０ｎＭ以上、約９０ｎＭ以上、約１００ｎＭ以上等を挙げることができるがこれらに限定されない。
【００６７】
１つの実施形態では、本発明が対象とする部位は、角膜内皮を含む。したがって、本発明が対象とする疾患、障害または状態としては、本発明が対象とする角膜内皮疾患、障害または状態を含むが、これらに限定されない。
【００６８】
１つの実施形態では、前記眼科の部位は霊長類のものであり、別の実施形態では前記眼科の部位はヒトのものである。
【００６９】
１つの実施形態では、前記眼の細胞は霊長類のものであり、別の実施形態では前記眼の細胞はヒトのものである。
【００７０】
１つの実施形態では、前記角膜内皮は霊長類のものであり、別の実施形態では前記角膜内皮はヒトのものである。
【００７１】
１つの実施形態では、前記角膜内皮の細胞は霊長類のものであり、別の実施形態では前記角膜内皮の細胞はヒトのものである。理論に束縛されることを望まないが、本明細書の実施例では、角膜内皮をモデルとしてラミニンでの治療ないし予防効果が、ウサギのみならず霊長類でも実証されていることから、任意の哺乳動物において同様の治療ないし予防効果が奏されると当業者には理解される。
【００７２】
本発明が対象とする角膜内皮疾患、障害または状態としては、角膜内皮の移植が必要な疾患、例えば水疱性角膜症、角膜浮腫、角膜白斑、特に、角膜ジストロフィ、外傷または内眼手術に起因する角膜内皮障害によって生じる水疱性角膜症の治療における移植片として用いることができる。このような水疱性角膜症、角膜内皮障害などの原因としては、手術のほかフックス角膜内皮ジストロフィ、外傷、偽落屑症候群、角膜内皮炎等を挙げることができる。
【００７３】
別の実施形態では、前記角膜内皮疾患、障害または状態としては、羞明、霧視、視力障害、眼痛、流涙、充血、疼痛、水疱性角膜症、眼の不快感、コントラスト低下、グレア、角膜実質の浮腫、水疱性角膜症、および角膜混濁等を挙げることができる。
【００７４】
本発明の角膜内皮の疾患、障害または状態の治療または予防の対象は、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、サル等）があげられ、好ましくは霊長類（例えば、ヒト）である。
【００７５】
１つの実施形態では、本発明が対象とする角膜内皮は、角膜内皮層、デスメ膜、またはその両方を含む。
【００７６】
好ましい実施形態では、本発明が対象とする角膜内皮は、デスメ膜を含む。あるいは、本発明が対象とする角膜内皮は、デスメ膜が剥離された状態の角膜内皮を含む。本発明の技術では、従来完治が難しかったデスメ膜を剥離した状態をも治療し得ることができることが見出されており、その点においては質的な改善がみられるともいえる。
【００７７】
＜併用療法＞
別の局面において、本発明は、ラミニンおよびそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１つの因子と、角膜内皮細胞とを用いる、角膜内皮の疾患、障害または状態の治療または予防剤を提供する。ここで、本発明の因子と角膜内皮細胞とは、混合物として用いてもよく、別々に投与されてもよい。したがって、この局面において、本発明は、角膜内皮疾患、障害または状態の治療または予防するための方法であって、該方法は、ラミニンおよびそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１つの因子の有効量を該治療または予防を必要とする被験体に投与する工程、ならびに角膜内皮細胞および／またはＲＯＣＫ阻害剤を前記被験体に投与する工程を包含する、方法を提供する。この局面の本発明の方法において用いられる因子（ラミニン、そのフラグメント等）、角膜内皮細胞、ＲＯＣＫ阻害剤等は、本明細書において説明される任意の形態を用いることができることが理解される。
【００７８】
理論に拘束されることを望まないが、角膜内皮細胞と、ラミニンおよびそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１つの因子とを治療自体に用いることによって、実施例において実証されるように、白濁していた角膜が透明化し、角膜厚が菲薄化し、機能を示すマーカーも正常に戻っており、さらに、従来にないほどの治療成績が達成された。また、治療に係る期間についても２，３日で効果が顕著に表れ、１週間でほぼ完治している例があるなど、その期間についても顕著に短いことが特徴として挙げられる。
【００７９】
別の局面において、本発明は、ラミニンおよびそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１つの因子と、ＲＯＣＫ阻害剤（この用語は、「Ｒｈｏキナーゼ阻害剤」と同義である。）とを用いる、角膜内皮の疾患、障害または状態の治療または予防剤を提供する。ここで、本発明の因子とＲＯＣＫ阻害剤とは、混合物として用いてもよく、別々に投与されてもよい。本発明の方法において用いられる因子（ラミニン、そのフラグメント等）は、本明細書において説明される任意の形態を用いることができることが理解される。
【００８０】
本発明において、「Ｒｈｏキナーゼ」とは、Ｒｈｏの活性化に伴い活性化されるセリン／スレオニンキナーゼを意味する。例えば、ＲＯＫα（ＲＯＣＫ−ＩＩ：Leung,  T.  et  al.,  J.Biol.Chem.,  270,  29051-29054,  1995）、ｐ１６０ＲＯＣＫ（ＲＯＫβ、ＲＯＣＫ−Ｉ：Ishizaki,  T.  et  al.,  The  EMBO  J.,  15(8),  1885-1893,  1996）およびその他のセリン／スレオニンキナーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。
【００８１】
ＲＯＣＫ阻害剤としては、下記文献：米国特許４６７８７８３号、特許第３４２１２１７号、国際公開第９５／２８３８７、国際公開９９／２０６２０、国際公開９９／６１４０３、国際公開０２／０７６９７６、国際公開０２／０７６９７７、国際公開第２００２／０８３１７５、国際公開０２／１００８３３、国際公開０３／０５９９１３、国際公開０３／０６２２２７、国際公開２００４／００９５５５、国際公開２００４／０２２５４１、国際公開２００４／１０８７２４、国際公開２００５／００３１０１、国際公開２００５／０３９５６４、国際公開２００５／０３４８６６、国際公開２００５／０３７１９７、国際公開２００５／０３７１９８、国際公開２００５／０３５５０１、国際公開２００５／０３５５０３、国際公開２００５／０３５５０６、国際公開２００５／０８０３９４、国際公開２００５／１０３０５０、国際公開２００６／０５７２７０、国際公開２００７／０２６６６４などに開示された化合物があげられる。かかる化合物は、それぞれ開示された文献に記載の方法により製造することができる。具体例として、１−（５−イソキノリンスルホニル）ホモピペラジンまたはその塩（たとえば、ファスジル（１−（５−イソキノリンスルホニル）ホモピペラジン））、（＋）−トランス−４−（１−アミノエチル）−１−（４−ピリジルカルバモイル）シクロヘキサン（（Ｒ）−（＋）−トランス−（４−ピリジル）−４−（１−アミノエチル）−シクロヘキサンカルボキサミド）またはその塩（たとえば、Ｙ−２７６３２（（Ｒ）−（＋）−トランス−（４−ピリジル）−４−（１−アミノエチル）−シクロヘキサンカルボキサミド２塩酸塩１水和物）など）などが挙げられ、これらの化合物は、市販品（和光純薬株式会社、旭化成ファーマ等）を好適に用いることもできる。
【００８２】
好ましい実施形態では、本発明において使用されるＲＯＣＫ阻害剤（Ｒｈｏキナーゼ阻害剤）は、Y-27632（（R）−（＋）−トランス−（４−ピリジル）−４−（１−アミノエチル）−シクロヘキサンカルボキサミド２塩酸塩１水和物）等を挙げることができるがそれに限定されない。
【００８３】
本発明で使用される「角膜内皮細胞」は、任意の角膜内皮細胞を用いることができ、単離したものでも培養したものであってもよい。角膜内皮細胞は、本発明者らが開発した手法で正常に培養する方法で培養したものであってもよいが、その他の手法で培養したものであってもよい。例えば、ＷＯ２０１３／１００２０８に記載される手法によって培養したものを使用することができる。例えば、線維化抑制剤は、前記角膜内皮細胞の培養の間常に存在させ、他方、接着促進剤は、一定期間（例えば、２４時間〜７２時間、あるいは４８時間等）存在させた後、いったん該接着促進剤を欠損させ、再度該細胞接着促進剤は、一定期間（例えば、２４時間〜７２時間、あるいは４８時間等、この期間は毎回変動してもよく同じであってもよい）存在させることができる。あるいは、これらの培養法において、接着促進剤を使用しないパターンもあり得る。例えば、以下の３種類例示することができる。
【００８４】
（培養法１）
初代培養および継代培養時には接着促進作用をもつＲＯＣＫ阻害剤であるＹ−２７６３２（例えば、ＷＡＫＯ、カタログ番号：２５３−００５１３から入手可能）を最終濃度１０μｍｏｌ／ｌとして４８時間添加する。
【００８５】
（培養法２）
ＲＯＣＫ阻害剤であるＹ−２７６３２を最終濃度１０μｍｏｌ／ｌとして培養中は常に添加する。
【００８６】
（培養法３）
Ｙ−２７６３２を添加しないで基本培地としてＳＢ４３１５４２（例えば、Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡから入手可能）（１μｍｏｌ／ｌ）およびＳＢ２０３５８０（１μｍｏｌ／ｌ）を添加したもので培養する。
【００８７】
使用される培地としては、従来販売され使用されている培地成分であってもよく、あるいは、別途角膜内皮用に開発された成分であってもよい。そのような培地成分の例としては、ＯｐｔｉＭＥＭ、ＤＭＥＭ，Ｍ１９９、ＭＥＭ等（これらは、ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ等から入手可能）を挙げることができるがこれらに限定されない。典型的な例としては、ヒトはＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ  Ｒｅｄｕｃｅｄ−Ｓｅｒｕｍ  Ｍｅｄｉｕｍ，  Ｌｉｑｕｉｄ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ  カタログ番号：３１９８５−０７０）＋８％ＦＢＳ（ＢＩＯＷＥＳＴ、カタログ番号：Ｓ１８２０−５００）＋２００ｍｇ／ｍｌ  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ（ＳＩＧＭＡ  カタログ番号：Ｃ７９０２−５００Ｇ）＋０．０８％コンドロイチン硫酸（ＳＩＧＭＡ  カタログ番号：Ｃ９８１９−５Ｇ）＋２０μｇ／ｍｌアスコルビン酸（ＳＩＧＭＡ  カタログ番号：Ａ４５４４−２５Ｇ）＋５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ  カタログ番号：１５７１０−０６４）＋５ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ  カタログ番号：ＰＨＧ０３１１）を３Ｔ３フィーダー細胞用の馴化させたものを基本培地としてＳＢ４３１５４２（１μｍｏｌ／ｌ）およびＳＢ２０３５８０（１μｍｏｌ／ｌ）を例示することができる。
【００８８】
＜１＞角膜内皮細胞の採取および試験管内での培養
角膜内皮細胞はレシピエント自身または適切なドナーの角膜から常法で採取される。本発明における移植条件を考慮すれば、同種由来の角膜内皮細胞を準備すればよい。例えば、角膜組織のデスメ膜と内皮細胞層を角膜実質から剥離した後、培養皿に移し、ディスパーゼなどで処理する。これによって角膜内皮細胞はデスメ膜より脱落する。デスメ膜に残存している角膜内皮細胞はピペッティングなどによって脱落させることができる。デスメ膜を除去した後、適切な培養液（例えば、ＷＯ２０１３／１００２０８に記載される）中で角膜内皮細胞を培養する。培地または培養液としては例えば市販のＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）（例えば、ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ、カタログ番号：１２３２０等を）にＦＢＳ（ウシ胎仔血清）（例えば、ＢＩＯＷＥＳＴ、カタログ番号：Ｓ１８２０−５００）、ｂ−ＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子）（例えば、ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ、カタログ番号：１３２５６−０２９）、およびペニシリン、ストレプトマイシンなどの抗生物質を適宜添加し、さらにＷＯ２０１３／１００２０８に例示される培養正常化剤の成分を添加したものを使用することができる。本発明の因子をコーティングして培養を行うことで角膜内皮細胞の培養容器表面への接着が促され、良好な増殖が行われる。また、培養液にラミニンを添加して培養する場合は、培養皿の表面にＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニンまたはウシ等の角膜内皮細胞の細胞外マトリックスなどをコーティングしてあるものを使用することが好ましい。あるいは、通常の培養容器をＦＮＣ  ｃｏａｔｉｎｇ  ｍｉｘ（登録商標）（５０ｍｌ（ＡＥＳ−０４０７）、ＡＴＨＥＮＡ、カタログ番号：０４０７）等の市販のコーティング剤で処理したものを用いてもよい。角膜内皮細胞を培養する際の温度条件は、角膜内皮細胞が生育する限りにおいて特に限定されないが、例えば約２５℃〜約４５℃、増殖効率を考慮すれば好ましくは約３０℃〜約４０℃、さらに好ましくは約３７℃である。培養方法は、通常の細胞培養用インキュベーター内で、加湿下、約５〜１０％のＣＯ２濃度の環境下で行われる。
【００８９】
＜２＞継代培養
培養に供された角膜内皮細胞が増殖した後に継代培養を行うことができる。好ましくはサブコンフルエントないしコンフルエントになった時点で継代培養を行う。継代培養は次のように行うことができる。まずトリプシン−ＥＤＴＡ等で処理することによって細胞を培養容器表面から剥がし、次いで細胞を回収する。回収した細胞に本発明の培養正常化剤または培地を加えて細胞浮遊液とする。細胞を回収する際、あるいは回収後に遠心処理を行うことが好ましい。かかる遠心分離処理によって細胞密度の高い細胞浮遊液を調製することができる。好ましい細胞密度は、約１〜２×１０６個／ｍＬである。尚、ここでの遠心分離処理の条件としては、例えば、５００ｒｐｍ（３０ｇ）〜１０００ｒｐｍ（７０ｇ）、１〜１０分を挙げることができるがこれらに限定されない。
【００９０】
細胞浮遊液は上記の初期培養と同様に培養容器に播種され、培養に供される。継代時の希釈倍率は細胞の状態によっても異なるが、約１：２〜１：４、好ましくは約１：３である。継代培養は上記の初期培養と同様の培養条件で行うことができる。培養時間は使用する細胞の状態などによっても異なるが、例えば７〜３０日間である。以上の継代培養は必要に応じて複数回行うことができる。ＲＯＣＫ阻害剤等を用いれば、培養初期の細胞接着を亢進させることにより、培養期間の短縮が可能となる。
【００９１】
＜密度勾配遠心分離を用いた高密度角膜内皮細胞の純化＞
１つの実施形態では、細胞として、密度勾配遠心分離を用いた高密度角膜内皮細胞の純化して本発明に用いることができる。その方法は代表的に以下のとおりである。低密度細胞と高密度細胞が入り混じった培養ヒト角膜内皮細胞を適宜の手段（例えば、OptiPrepTM）を用いて８００×ｇで15分間密度勾配遠心分離を行うことができる。ペレットおよび上清に含まれる細胞を回収してペレット群および上清群としてそれぞれ適宜の個数（例えば、４２０個／ｍｍ２）ずつ播種し培養することができる。３０日後に位相差顕微鏡による形態を観察し、免疫染色による角膜内皮機能関連マーカーの発現の解析および細胞密度・細胞面積を測定する。遠心分離後培養した細胞はペレット群、上清群共単層で多角形の細胞形態を示し、Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅおよびＺＯ−１発現がみられる細胞が得られる。そしてペレット群が一般に細胞密度が有意に高い。細胞面積の中央値（四分位範囲）は、一般にペレット群で低値であり、散らばりが小さい。したがって、これにより、密度勾配遠心分離により高密度の細胞を純化することができ、本発明において使用され得るものであることが理解される。
【００９２】
＜コーティング＞
１つの局面において、本発明は、ラミニンおよびそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１つの因子を含む、角膜内皮の疾患、障害または状態の治療または予防剤であって、該因子は、眼内に注入され眼内の組織と接触されることを特徴とする治療または予防剤を提供する。したがって、この局面において、本発明はまた、角膜内皮疾患、障害または状態の治療または予防するための方法であって、該方法は、ラミニンおよびそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１つの因子の有効量を該治療または予防を必要とする被験体に投与する工程を包含する方法であって、ここで前記因子は前記被験体の眼内に注入され、眼内の組織と接触されるものであることを特徴とする方法を提供する。この局面の本発明の方法において用いられる因子（ラミニン、そのフラグメント等）は、本明細書において説明される任意の形態を用いることができることが理解される。ここでは、因子は、眼内に注入され眼内の組織と接触される結果、眼内で、ラミニンおよびそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１つの因子のコーティング（本明細書においてラミニンコーティングともいう）が形成されることにより、角膜の治癒が促進されるものと理解される。
【００９３】
１つの実施形態では、コーティングの際に用いられる前記因子の濃度は、治療または予防効果がある限りどのような濃度でもよく（有効濃度ともいい、コーティングの場合コーティング有効濃度ともいう）、例えば、約０．１ｎＭ以上、約０．２ｎＭ以上、約０．３ｎＭ以上、約０．４ｎＭ以上、約０．５ｎＭ以上、約０．６ｎＭ以上、約０．７ｎＭ以上、約０．８ｎＭ以上、約０．９ｎＭ以上、約１ｎＭ以上、約２ｎＭ以上、約２．１ｎＭ以上、約３ｎＭ以上、約４ｎＭ以上、約５ｎＭ以上、約６ｎＭ以上、約７ｎＭ以上、約８ｎＭ以上、約９ｎＭ以上、約１０ｎＭ以上、約１５ｎＭ以上、約２０ｎＭ以上、約２１ｎＭ以上、約２５ｎＭ以上、約３０ｎＭ以上、約４０ｎＭ以上、約５０ｎＭ以上、約６０ｎＭ以上、約７０ｎＭ以上、約８０ｎＭ以上、約９０ｎＭ以上、約１００ｎＭ以上等を挙げることができるがこれらに限定されない。
【００９４】
１つの好ましい実施形態では、前記因子は角膜内皮付近に注入され角膜内皮を構成する細胞や組織と接触された後、同時に、またはその前に、さらに角膜内皮細胞等の角膜細胞が投与されてもよい。したがって、本発明では、角膜内皮細胞は前記因子とは別に投与されてもよい。角膜内皮細胞等の角膜細胞の投与されるタイミングは、好ましくは、前記因子が眼内に注入され眼内の組織と接触された（コーティングの）後または同時であり、より好ましくは、前記因子眼内に注入され眼内の組織と接触された後である。このように投与された角膜内皮細胞等の角膜細胞は、コーティングの存在により、角膜内皮組織への定着が促進され、治療効果が顕著に促進されることが判明した。
【００９５】
別の局面では、本発明は、ラミニンおよびそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１つの因子と角膜内皮細胞等の角膜細胞と混合した混合物を含む角膜内皮の疾患、障害または状態の治療または予防剤であって、ここでは、該ラミニンおよびそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１つの因子とは別に、ラミニンおよびそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１つの因子が眼内に注入され眼内の組織、好ましくは治療または予防の対象となる組織部分（例えば、角膜内皮等）と接触される。したがって、この局面において、本発明は、角膜内皮疾患、障害または状態の治療または予防するための方法であって、該方法は、ラミニンおよびそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１つの因子の有効量を該治療または予防を必要とする被験体に投与する工程を包含し、ここで、前記因子は、角膜内皮細胞と混合されて提供され、さらに、ラミニンおよびそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１つの因子が眼内に注入され眼内の組織と接触されることを特徴とする方法を提供する。この局面において、上記混合物は、ラミニンおよびそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１つの因子が眼内に注入され眼内の組織と接触された（コーティングの）後、同時に、またはその前に投与されてもよく、混合物の投与のタイミングは、好ましくは、該因子が眼内に注入され眼内の組織と接触された後または同時であり、より好ましくは、該因子が眼内に注入され眼内の組織と接触された後である。理論に拘束されることを望まないが、このようなコーティングをすることによって、上記因子と角膜内皮細胞等の角膜細胞の混合物の定着が促進される環境が提供されるため、角膜の治癒が促進されるものと理解される。角膜内皮細胞等の角膜細胞は、本明細書において説明される任意の形態または公知の任意の形態を用いることができることが理解される。
【００９６】
好ましい実施形態では、コーティングの態様において、本発明の治療または予防剤はまた、さらに、ＲＯＣＫ阻害剤を含む。ＲＯＣＫ阻害剤は前記因子とは同時、連続または別に投与されてもよい。
【００９７】
ＲＯＣＫ阻害剤は、本明細書において別途説明する任意の形態を採ることができ、好ましくは、Y-27632（（R）−（＋）−トランス−（４−ピリジル）−４−（１−アミノエチル）−シクロヘキサンカルボキサミド２塩酸塩１水和物）等であってよい。
【００９８】
１つの実施形態では、本発明において、１つの前記角膜内皮細胞等の角膜細胞と混合される因子は、約２．１ｎＭ以上であり、注入される前記因子は約２１ｎM以上である。
（使用）
【００９９】
別の局面では、本発明は、ラミニンおよびそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１つの因子の、角膜内皮疾患、障害または状態の治療または予防のための医薬の製造における使用を提供する。あるいは、この局面において、本発明は、ラミニンおよびそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１つの因子の、角膜内皮疾患、障害または状態の治療または予防のための使用を提供する。本発明の使用において用いられる因子（ラミニン、そのフラグメント等）は、本明細書において説明される任意の形態を用いることができることが理解される。
【０１００】
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。本明細書において「または」は、文章中に列挙されている事項の「少なくとも1つ以上」を採用できるときに使用される。「もしくは」も同様である。本明細書において「2つの値の範囲内」と明記した場合、その範囲には2つの値自体も含む。また、本明細書において「約」との表記は、特に言及しない限り有効数字で四捨五入する場合の数値を示すか、あるいは特定の値の場合その値の±１０％を示す。
【０１０１】
以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【０１０２】
以下に、本発明の実施例を記載する。該当する場合生物試料等の取り扱いは、厚生労働省、文部科学省等において規定される基準を遵守して行った。
【０１０３】
（実験手法：培養角膜内皮細胞の調製）
（手法）・（培養）ウサギ角膜内皮細胞（ＲＣＥＣ、入手先および培養方法）：以下の実験に使用したウサギ角膜内皮細胞は、角膜組織から内皮細胞層を含むデスメ膜を剥離し，ＤＭＥＭ（Gibco-Invitrogen）に溶解した１．２Ｕ／ｍｌ  Ｄｉｓｐａｓｅ  Ｉ［（三光純薬）  カタログ番号：ＧＤ８１０６０］に入れて、３７℃でインキュベートした。１時間後，ピペッティングでデスメ膜から角膜内皮細胞を剥離して回収し、１０００ｒｐｍ  ５分間遠心分離して上清を除去した．沈殿している角膜内皮細胞に培養培地を加えて混和し、ＦＮＣ  Ｃｏａｔｉｎｇ  Ｍｉｘをコートした６ウェルプレートへ全量を播種した。培養培地はＤＭＥＭ(カタログ番号：１２３２０；Gibco-Invitrogen)に１０％  ＦＢＳ、５０μｇ／ｍｌ  ゲンタマイシン（カタログ番号：１５７１０−０６４；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）  、１０μｇ／ｍｌ  Ｙ−２７６３２（カタログ番号：6880005;Calbiochem，  La  Jolla，CA）  、２ｎｇ／ｍｌ塩基性線維芽細胞増殖因子（basic  fibroblast  growth  factor；カタログ番号：１３２５６−０２９；ｂＦＧＦ；  Invitrogen）を加えたものを使用した。ウサギの角膜内皮細胞（ＣＥＣ）の培養には、サルと同様、以前に報告した系［Koizumi  Nら、Exp  Eye  Res.,2012;95:60-67；Koizumi  Nら、Invest  Ophthalmol  Vis  Sci..2007;48:4519-4526；Okumura  Nら、Am  J  Pathol.  2012;181:268-277］を使用した。
【０１０４】
培地交換は２日ごとに行った。継代は５０〜８０％コンフルエントになった時点で行った。継代方法は、Ｃａ２＋Ｍｇ２＋非含有（ｆｒｅｅ）ＰＢＳ（ＰＢＳ−；Nissui  Pharmaceutical  Co．，  Ltd.，  Tokyo．  Japan）で細胞を洗浄し、ＴｒｙｐＬＥＴＭ  Ｓｅｌｅｃｔ（カタログ番号：12563；Invitrogen）を加え，３７℃で５分間インキュベートした。プレートから細胞を剥離して回収し、１０００ｒｐｍ  ５分間遠心分離後、培養培地を加えて細胞懸濁液とした。ＦＮＣ  Coating  Ｍｉｘをコートしたプレートへ１：２の密度で細胞を播種した。
【０１０５】
これを培養角膜内皮細胞として用いた。
【０１０６】
（統計解析）
２サンプルの比較の平均値における統計的有意差（Ｐ値）は、スチューデントのｔ検定を用いて決定した。複数のサンプルセットの比較における統計的有意差は、ダネットの多重比較検定を用いて解析した。グラフに示す値は平均±ＳＥを表す。
【０１０７】
（実施例１：ラミニン５１１−Ｅ８フラグメントを用いたウサギ水疱性角膜症モデルにおける培養角膜内皮移植実験）
本実施例では、ラミニンとして、ラミニン５１１−Ｅ８フラグメントを用い、病態モデルとして、ウサギ水疱性角膜症モデルを用いて、培養角膜内皮移植を行った。
【０１０８】
（方法および材料）
（使用した試薬等）
本実施例では、以下の試薬等を使用した。
・培養ウサギ角膜内皮細胞（ＲＣＥＣとも略称する。上記のとおり調製したもの）
・ラミニン５１１  Ｅ８フラグメント（株式会社ニッピ、382-02413）
・ウサギ水疱性角膜症モデル（以下の（移植方法）に記載されるように作製）
・このほか、実験手法中において言及したもの
（移植方法）
図１に示す実験は以下のように行った。
【０１０９】
ウサギの角膜内皮を２０ゲージシリコーン針（Soft  Tapered  Needle;  Inami  ＆  Co．，  Ltd．，  Tokyo，  Japan）を用いて機械的に剥離して水疱性角膜症モデルを作製した。Control群は、作製したモデルに細胞を注入しなかった。ＲＣＥＣ群は、作製したモデルの前房内に、培養したウサギ角膜内皮細胞を注入してうつむき姿勢を３時間取らせた。また、ＲＣＥＣ＋Ｅ８群は、作製したモデルの前房内に、培養したウサギ角膜内皮細胞を、濃度２．１ｎＭに調整したラミニン５１１  Ｅ８フラグメントを含有するＤＭＥＭととともに注入してうつむき姿勢を３時間取らせた。
【０１１０】
（角膜厚の測定）
図２に示す測定実験は以下のように行った。
【０１１１】
図1にて作製した個体について、経時的に超音波パキメーター（ultrasound  pachymeter；SP-2000；  Tomey，  Nagoya，  Japan）により角膜厚を測定した。測定不可の場合は測定可能上限値である1200μmとした。
【０１１２】
（組織学的検討）
図３の組織学的検討は、以下のように行った。この検討は、正常機能の確認のためのものであり、Na＋／K＋−ATPaseおよびZO−１による免疫染色で確認したものである。角膜内皮細胞の機能であるポンプ機能、バリア機能を確認するためである。Na＋／K＋−ATPaseおよびZO−１はそれぞれ、角膜内皮細胞の機能であるポンプ機能、バリア機能の正常性を示す。手法は以下のとおりである。
【０１１３】
（染色等の細胞観察方法（組織学的試験））
細胞観察は位相差顕微鏡にて行った。また、細胞を固定した後に機能関連マーカーとしてZO−１、Na＋／K＋−ATPaseを用いて免疫染色を行い蛍光顕微鏡にて観察を行った。組織染色検査のために、ウサギから摘出した角膜組織を４％ホルムアルデヒドで１０分間室温（RT）で固定し、１％ウシ血清アルブミン（BSA）とともに３０分間インキュベートした。再生された角膜内皮組織の表現型を調べるために、密着結合関連タンパク質であるZO−１、ポンプ機能に関連するタンパク質であるNa＋／K＋−ATPaseの免疫組織化学分析を行った。細胞の機能に関連するマーカーとしてZO−１およびNa＋／K＋−ATPaseを使用した。ZO−１、Na＋／K＋−ATPaseの染色は、それぞれ、ZO−１ポリクローナル抗体（Zymed  Laboratories,  Inc．,  South  San  Francisco,  CA）、Na＋／K＋−ATPaseモノクローナル抗体（Upstate  Biotec,  Inc．,  Lake  Placid,  NY）の１：２００希釈を用いて実施した。二次抗体には、Alexa  Fluor（登録商標）４８８標識(Life  Technologies  Corp.,  Carlsbad,  CA))の１：２０００希釈を使用した。次いで、細胞の核をDAPI（Vector  Laboratories,  Inc．,  Burlingame,  CA）で染色した。また、細胞の形態を1:400希釈のAlexa  Fluor（登録商標）488-conjugated  phalloidin  (Life  Technologies  Corp.,  Carlsbad,  CA)により染色した。次いで、スライドを蛍光顕微鏡（TCS  SP２  AOBS；Leica  Microsystems,  Welzlar,  Germany）で観察した。
【０１１４】
（結果）
結果を図１〜３に示す。図１は、ラミニン５１１  Ｅ８フラグメントを用いたウサギ水疱性角膜症モデルにおける培養角膜内皮移植後の前眼部写真である。左からＣｏｎｔｒｏｌ：コントロールとしてウサギの角膜内皮細胞を機械的に掻爬したもの、ＲＣＥＣ：作製したモデルに培養したウサギ角膜内皮細胞を前房内に注入してうつむき姿勢を３時間取らせたもの、ＲＣＥＣ＋Ｅ８：作製したモデルに培養したウサギ角膜内皮細胞を、濃度２．１ｎＭに調整したラミニン５１１  Ｅ８フラグメントを含有するＤＭＥＭととともに前房内に注入してうつむき姿勢を３時間取らせたものの前眼部写真を示す。上段は１週間後であり、下段は２週間後の写真を示す。コントロール群およびＲＣＥＣ群では角膜が混濁したが、ＲＣＥＣ＋Ｅ８群では角膜が透明治癒したことから、細胞をラミニンとともに注入した場合には角膜が透明治癒することが示された。
【０１１５】
図２には、ラミニン５１１  Ｅ８フラグメントを用いたウサギ水疱性角膜症モデルにおける培養角膜移植後の角膜厚の変化を示す。示されるように、角膜厚は投与後から顕著に減少をはじめ、角膜厚を超音波パキメーターパキメーターで測定したところ、ControlおよびRCEC群では約1200μｍ以上（測定限界））と、角膜が肥厚した状態が維持されたが、RCEC+E8群においては、7日目に平均637μｍにまで角膜厚が菲薄化した。このことは細胞をラミニンとともに移植することで、角膜内皮が再生されポンプおよびバリア機能が再生されたことが理解される。
【０１１６】
図３は、ラミニンＥ８フラグメントを用いた培養角膜内皮移植後の組織学的検討結果を示すものである。図に示すように、正常の角膜内皮細胞に発現する遺伝子産物が発現していた。詳細には、ポンプ機能を示すNa＋／K＋−ATPaseおよびタイトジャンクションを示すZO−１（バリア機能）が発現した。加えて、アドへレンスジャンクションを示すN-カドヘリンも正常に発現していることが示される。また、ファロイディン（phalloidin）染色によれば形態も正常のものと同様の多角形の一層の細胞であることが示された。以上から、この細胞が正常な機能を回復していることが明らかになった。
【０１１７】
この結果から、ラミニンまたはそのフラグメントは、角膜内皮細胞とともに投与することで、顕著に角膜内皮疾患または障害を治癒させ、しかも正常の機能を回復させることができることが理解される。
【０１１８】
（実施例２：ラミニンとROCK阻害剤を併用したウサギ水疱性角膜症モデルにおける培養角膜内皮移植実験）
以前、培養した角膜内皮細胞をＲＯＣＫ阻害剤とともに前房内に注入することで、細胞の基質への接着を促進することを報告した。そこでラミニンとＲＯＣＫ阻害剤との併用効果を検討した。
【０１１９】
（方法および材料）
（使用した試薬等）
本実施例では、以下の試薬等を使用した。
・培養ウサギ角膜内皮細胞（ＲＣＥＣ、上記のとおり調製したもの）
・ラミニン５１１  Ｅ８フラグメント（実施例１と同じ；株式会社ニッピ、382-02413）
・Ｙ−２７６３２（（R）−（＋）−トランス−（４−ピリジル）−４−（１−アミノエチル）−シクロヘキサンカルボキサミド２塩酸塩１水和物）（カタログ番号：6880005；Calbiochem,  La  Jolla,CA）
・ウサギ水疱性角膜症モデル（実施例１と同じ；作製法は（移植方法）に記載）
・このほか、実験手法中において言及したもの
（移植方法）
図４に示す実験は以下のように行った。
【０１２０】
ウサギの角膜内皮を機械的に剥離して水疱性角膜症モデルを作製した。培養したウサギ角膜内皮細胞を前房内にＲＯＣＫ阻害剤であるＹ−２７６３２（＋）（１００μＭ）とともに注入した個体と、細胞とラミニン５１１−Ｅ８（２．１ｎＭ）とＹ−２７６３２（＋）（１００  μＭ）とともに注入した個体において２４時間後の注入した細胞の基質への接着を比較した。２４時間後に安楽死させ角膜組織を摘出してファロイディン（ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ）染色を行い、接着した細胞の形態および細胞数を評価した。
【０１２１】
図５〜８に示す測定実験は以下のように行った。
【０１２２】
（移植方法）
デスメ膜剥離を行わず角膜内皮細胞を剥離しＹ−２７６３２（＋）（１００μＭ）とともに培養角膜内皮細胞を注入、デスメ膜剥離を行わず角膜内皮細胞を剥離しラミニン５１１−Ｅ８（２．１ｎＭ）とＹ−２７６３２（＋）（１００μＭ）とともに注入、デスメ膜剥離を行った水疱性角膜症モデルにＹ−２７６３２（＋）（１００μＭ）とともに注入、デスメ膜剥離を行った水疱性角膜症モデルにラミニン５１１−Ｅ８（２．１ｎＭ）とＹ−２７６３２（＋）（１００μＭ）とともに注入の４群で各４匹ずつで試験を行った。
【０１２３】
（角膜厚および眼圧の測定）
超音波パキメーター（Ultrasound  pachymeter）（SP-2000；  Tomey，  Nagoya，  Japan）により角膜厚を測定した。測定不可の場合は測定可能上限値である１２００μｍとした。また眼圧はトノベット（ＭＥテクニカ、東京）により測定した。
【０１２４】
（組織学的検討）
図８に示す組織学的検討は、実施例１と同様の様式で行った。
【０１２５】
（結果）
図４に、ラミニンとＲＯＣＫ阻害剤を併用したウサギ水疱性角膜症モデルにおける培養角膜内皮移植の２４時間後の細胞の基質への接着についての結果を示す。ファロイディン染色により細胞とラミニン５１１−Ｅ８（２．１ｎＭ）とＹ−２７６３２（＋）（１００μＭ）とともに注入した個体においてより多くの細胞が接着していることが示された。また接着した細胞密度は有意に細胞とラミニン５１１−Ｅ８（２．１ｎＭ）とＹ−２７６３２（＋）（１００μＭ）とともに注入した個体において高い値であった（ラミニン不存在下で平均７１７．３個／ｍｍ２であり、ラミニン存在下で平均１６６２．８個／ｍｍ２にまで増加した。）。このことはＲＯＣＫ阻害剤にラミニンを併用することでも、ラミニンはさらに細胞接着を生体内で促進するものと理解される。
【０１２６】
図５はデスメ膜剥離を行わず角膜内皮細胞を剥離しＹ−２７６３２（＋）（１００  μＭ）とともに培養角膜内皮細胞を注入、デスメ膜剥離を行わず角膜内皮細胞を剥離しラミニン５１１−Ｅ８（２．１ｎＭ）とＹ−２７６３２（＋）（１００  μＭ）とともに注入、デスメ膜剥離を行った水疱性角膜症モデルにＹ−２７６３２（＋）（１００μＭ）とともに注入、デスメ膜剥離を行った水疱性角膜症モデルにラミニン５１１−Ｅ８（２．１ｎＭ）とＹ−２７６３２（＋）（１００μＭ）とともに注入の４群での前眼部写真を示す。細胞注入後１週間の時点で、デスメ膜の剥離の有無、ラミニンの使用の有無にかかわらず角膜は透明化した。
【０１２７】
図６、７はそれぞれ角膜厚、眼圧を示すグラフである。角膜厚はデスメ膜を剥離した方が、剥離しない場合に比べて角膜厚の菲薄化が遅延したが、最終的にはともに菲薄化した。眼圧は観察期間を通じて正常範囲内であった。
【０１２８】
図８には、ラミニン５１１−Ｅ８フラグメントを用いた培養角膜内皮移植後の組織学的検討を示す。ここでは、図に示すように、すべての群においてＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅ（ポンプ機能）およびＺＯ−１（バリア機能）を発現しており、Ｎ−カドヘリンも正常に発現していることが示された。また、ラミニン５１１−Ｅ８フラグメント添加群においてファロイジン染色によれば形態も正常組織と同様の多角形の一層の細胞であり、正常であることが示された。加えて、ラミニン５１１−Ｅ８フラグメント添加群においてポンプ機能およびタイトジャンクションが正常に発現しており、アドヘレンスジャンクションも正常であり、正常の形態が示されていることから、ラミニン５１１−Ｅ８フラグメント添加群においてこの細胞が正常な機能を回復していることが明らかになった。
【０１２９】
この結果から、ラミニンまたはそのフラグメントは、ＲＯＣＫ阻害剤とともに用いて、角膜内皮細胞とともに投与することで、顕著に角膜内皮疾患または障害を治癒させ、しかも正常の機能を回復させる機能がより改善することができることが理解される。
【０１３０】
（実施例３：サル水疱性角膜症モデルにおける例）
次に、霊長類の例としてサル水疱性角膜症モデルを用いて、同様のラミニンとＲＯＣＫ阻害剤と角膜内皮細胞の移植併用の効果を確認した。
【０１３１】
（方法および材料）
（使用した試薬等）
本実施例では、以下の試薬等を使用した。
・培養サル角膜内皮細胞（ウサギの培養方法と同様に調製したものであるが、以下に再度説明する。）
・ラミニン５１１  Ｅ８フラグメント（実施例１と同じ；株式会社ニッピ、382-02413）
・Ｙ−２７６３２（（R）−（＋）−トランス−（４−ピリジル）−４−（１−アミノエチル）−シクロヘキサンカルボキサミド２塩酸塩１水和物）（実施例２と同じ；カタログ番号：6880005；  Calbiochem,  La  Jolla,  CA）
・サル水疱性角膜症モデル（以下の（移植方法）に記載されるように作製した。）
（培養方法）
サル角膜内皮細胞（ＭＣＥＣ）は以下のように入手および培養することができる。具体的には、角膜組織から内皮細胞層を含むデスメ膜を剥離し，ＤＭＥＭ（Gibco-Invitrogen）に溶解した１．２Ｕ／ｍｌ  Ｄｉｓｐａｓｅ  Ｉ［（三光純薬）  カタログ番号：ＧＤ８１０６０］に入れて、３７℃でインキュベートした。１時間後，ピペッティングでデスメ膜から角膜内皮細胞を剥離して回収し、１０００ｒｐｍ  ５分間遠心分離して上清を除去した．沈殿している角膜内皮細胞に培養培地を加えて混和し、ＦＮＣ  Ｃｏａｔｉｎｇ  Ｍｉｘをコートした６ウェルプレートへ全量を播種した。培養培地はＤＭＥＭ(カタログ番号：１２３２０；Gibco-Invitrogen)に１０％  ＦＢＳ、５０μｇ／ｍｌ  ゲンタマイシン（カタログ番号：１５７１０−０６４；Invitrogen）、１０μｇ／ｍｌ  Ｙ−２７６３２（カタログ番号：6880005；Calbiochem，  La  Jolla，CA）、２ｎｇ／ｍｌ塩基性線維芽細胞増殖因子（basic  fibroblast  growth  factor；カタログ番号：13256-029；ｂＦＧＦ；  Invitrogen）を加えたものを使用した。ウサギの角膜内皮細胞（ＣＥＣ）の培養には、サルと同様、以前に報告した系［Tan  DTら、Lancet.,  2012;379:1749-1761；  Koizumi  Nら、  Exp  Eye  Res.,  2012;95:60-67；  Koizumi  Nら、  Invest  Ophthalmol  Vis  Sci..2007;48:4519-4526；Okumura  Nら、  Am  J  Pathol.  2012;181:268-277］を使用した。
【０１３２】
培地交換は２日ごとに行った。継代は５０〜８０％コンフルエントになった時点で行った。継代方法は、Ｃａ２＋Ｍｇ２＋非含有（ｆｒｅｅ）ＰＢＳ（ＰＢＳ−；Nissui  Pharmaceutical  Co．，  Ltd．，  Tokyo．  Japan）で細胞を洗浄し、TrypLETM  Select（カタログ番号：１２５６３；Invitrogen）を加え，３７℃で５分間インキュベートした。プレートから細胞を剥離して回収し、１０００ｒｐｍ  ５分間遠心分離後、培養培地を加えて細胞懸濁液とした。ＦＮＣ  Coating  Mixをコートしたプレートへ１：２の密度で細胞を播種した。
【０１３３】
（移植方法）
カニクイザルの角膜内皮を２０ゲージシリコーン針（Soft  Tapered  Needle;  Inami  ＆  Co．，  Ltd．，  Tokyo，  Japan）を用いて機械的に剥離して水疱性角膜症モデルを作製した。図９では、水疱性角膜症モデルの前房内に、培養したサル角膜内皮細胞５．０×１０５個を、濃度２．１ｎＭに調整したラミニン５１１  Ｅ８フラグメントを含有するＤＭＥＭととともに注入してうつむき姿勢を３時間取らせた。図１０では、作製した水疱性角膜症モデルにおいてデスメ膜剥離を行い同様に、この水疱性角膜症モデルの前房内に、培養したサル角膜内皮細胞５．０×１０５個を、濃度２．１ｎＭに調整したラミニン５１１  Ｅ８フラグメントを含有するＤＭＥＭととともに注入してうつむき姿勢を３時間取らせた。
【０１３４】
（角膜厚の測定）
超音波パキメーター（Ultrasound  pachymeter）（SP-2000；  Tomey，  Nagoya，  Japan）により角膜厚を測定した。測定不可の場合は測定可能上限値である１２００μｍとした。
【０１３５】
（結果）
結果を図９〜１０に示す。図９は、ラミニン５１１−Ｅ８を併用したサル水疱性角膜症モデルにおける培養角膜内皮移植後の前眼部写真を示す。生体内での角膜内皮増殖が著しく制限される霊長類モデルにおいても本発明のラミニンまたはそのフラグメントは、ＲＯＣＫ阻害剤とともに用いて、角膜内皮細胞とともに投与することで、水疱性角膜症が治癒することが分かった。一方で、図１０は、サル水疱性角膜症モデルにおいてデスメ膜剥離を行い、ラミニン５１１-Ｅ８を併用して培養角膜内皮細胞を移植した後の前眼部写真を示す。カニクイザルの角膜内皮細胞を機械的に掻爬したモデルにおいては、角膜の透明治癒は得られなかった。ウサギ水疱性角膜症モデルにおいては透明治癒が得られたが、カニクイザルモデルにおいては治療効果が得られなかった。このことはデスメ膜を剥離すること移植した細胞の角膜への接着が低下するために動物種によっては角膜内皮が再生しない可能性が示唆された。図１１にデスメ剥離を行わずに移植した個体と、デスメ剥離を行って移植した個体の角膜厚の変化をグラフに示す。デスメ剥離群においては角膜厚が菲薄化しなかった一方、デスメ膜剥離しない場合には菲薄化した。
【０１３６】
（実施例４：デスメ膜剥離被験体におけるラミニンコーティングでの治療例）
次に、別途デスメ膜剥離により露出した角膜裏側の実質をラミニンでコーティングすることで、ラミニンとＲＯＣＫ阻害剤と角膜内皮細胞の移植併用の効果が改善することを確認した。
【０１３７】
（方法および材料）
（使用した試薬等）
本実施例では、以下の試薬等を使用した。
・培養サル角膜内皮細胞（実施例３のように調製したもの）
・ラミニン５１１  Ｅ８フラグメント（実施例１と同じ；株式会社ニッピ、382-02413）
・Ｙ−２７６３２（（R）−（＋）−トランス−（４−ピリジル）−４−（１−アミノエチル）−シクロヘキサンカルボキサミド２塩酸塩１水和物）（実施例２と同じ；カタログ番号：６８８０００５；Calbiochem，  La  Jolla，ＣＡ）
（方法）
カニクイザルの角膜内皮を２０−ゲージシリコーン針（Soft  Tapered  Needle；  Inami  ＆  Co．，  Ltd．，  Tokyo，  Japan）を用いて機械的に剥離して水疱性角膜症モデルを作製した。作製した水疱性角膜症モデルにおいてデスメ膜剥離を行い、水疱性角膜症モデルの前房内に、ラミニン５１１−Ｅ８フラグメントを２１ｎＭの濃度で注入し１時間おいた。このことにより、デスメ膜の剥離により露出した角膜実質を生体内でコーティングした。その後実施例３と同様に、水疱性角膜症モデルの前房内に、培養したサル角膜内皮細胞５．０×１０５個を、濃度２．１ｎＭに調整したラミニン５１１−Ｅ８フラグメントを含むＤＭＥＭととともに注入してうつむき姿勢を３時間取らせた。
【０１３８】
（結果）
結果を図１２に示す。図１２に示すようにデスメ膜を剥離したのちに前房内にラミニン５１１  Ｅ８フラグメントを２１ｎＭの濃度で注入して角膜実質をコーティングすることで、コーティング無しでは得られなかった（図１０）角膜の透明治癒が得られた。このことはラミニンは細胞懸濁液とともに注入することで、細胞接着を促進するのみならず、生体内のコーティング剤としても用い、細胞の生体内における生着を促進することが可能であることを示す。
【０１３９】
（実施例５：インテグリンの角膜内皮細胞の細胞接着への影響）
本実施例では、各種インテグリンの角膜内皮細胞の細胞接着への影響を調べた。
【０１４０】
（方法および材料）
（使用した試薬等）
本実施例では、以下の試薬等を使用した。
・コントロールは、ラミニン511-E8フラグメント非添加の群を意味する
・マウスＩｇＧ（DAKO、X0931）
・抗インテグリンα３（Millipore、MAB1952Z-20）
・抗インテグリンα６（Millipore、MAB1378-20）
・抗インテグリンα２（Millipore、MAB1950Z-20）
・抗インテグリンβ１（R&D  Systems、MAB17781）
・抗インテグリンα３β１および抗インテグリンα６β１は上記を組み合わせたものを使用した。
・511-E8フラグメント（上記実施例と同じである）
（方法）
ヒト角膜内皮細胞を培養している培養皿から培地を完全に除去し、PBS(-)で2回洗浄した。洗浄後、リン酸緩衝液を添加し、37℃（5%  CO2）で5分間インキュベートした。その後、PBS(-)を除去し、TrypLETMSelect（10X）（Life  Technologies、A12177-01）を添加し、37℃（5%  CO2）で10分間インキュベートした。その後、Opti-MEMＩ（Life  Technologies、31985-070）を添加し、細胞を回収した。回収後、1200rpmで3分間遠心分離し、Opti-MEMＩにて細胞懸濁液を作製した。この時、コントロールとしてラミニン511-E8フラグメント非添加の群、ラミニン511-E8フラグメントを最終濃度2.1nMとなるように添加した群を用意した。同時に、ラミニン511-E8フラグメント添加群にはmouseIgG、インテグリン中和抗体を最終濃度2μg/mlになるように添加し、調整した。調整後、96well  plateの1wellあたり5000個の細胞を播種し、37℃（5%CO2）で24時間インキュベートした。播種24時間後、培地を完全に除去し、PBS(-)で2回洗浄した。洗浄後、培地とCellTiter−Glo  Luminescent  Cell  Viability  Assay  （Promega  Corporation，  Madison，  WI）を1:1の割合で添加し、2分間遮光で振盪した後、10分間静置した。その後測定した。24h,*p<0.01,  Dunnet検定,  n=6。
（結果）
結果を図１３に示す。示されるように、ラミニン511-E8フラグメントを播種時に培地に添加することで角膜内皮細胞の細胞接着はコントロールに対して促進されたが、インテグリンβ1の中和抗体により、細胞接着はコントロールと同程度まで抑制された。
【０１４１】
（実施例６：細胞接着関連タンパク質の活性化とインテグリンとの関連性）
次に、本実施例では、細胞接着関連タンパク質の活性化はインテグリンを介していることを実証した。
【０１４２】
（材料および方法）
（試薬等）
原則として実施例５と同じ条件を用いた。
・マウスＩｇＧ（実施例５と同じである）
・抗インテグリンα３（実施例５と同じである）
・抗インテグリンα６（実施例５と同じである）
・抗インテグリンα２（実施例５と同じである）
・抗インテグリンβ１（実施例５と同じである）
・抗インテグリンα３β１（実施例５と同じである）
・抗インテグリンα６β１（実施例５と同じである）
（方法）
ヒト角膜内皮細胞を培養している培養皿から培地を完全に除去し、PBS(-)で2回洗浄した。洗浄後、リン酸緩衝液を添加し、37℃（5%  CO2）で5分間インキュベートした。その後、PBS(-)を除去し、TrypLETMSelect（10X）（Life  Technologies、A12177-01）を添加し、37℃（5%  CO2）で10分間インキュベートした。その後、Opti-MEMＩ（Life  Technologies、31985-070）を添加し、細胞を回収した。回収後、1200rpmで3分間遠心分離し、Opti-MEMＩにより、細胞懸濁液を作製した。この時、コントロールとしてラミニン511-E8フラグメント非添加の群、ラミニン511-E8フラグメントを最終濃度2.1nMとなるように添加した群を用意した。同時に、ラミニン511-E8フラグメント添加群にはmouseIgG、インテグリン中和抗体を最終濃度2μg/mlになるように添加し、調整した。調整後、12well  plateの1wellあたり1×105個の細胞を播種し、播種3時間後にタンパク質を回収した。ウエスタンブロッティング法により、Phospho-FAK（Cell  Signaling  TECHNOLOGY、8556S）、FAK（Cell  Signaling  TECHNOLOGY、3285S）、p-Paxillin（Cell  Signaling  TECHNOLOGY、2541S）の検出を行った。各抗体の希釈倍率は1:1000とした。デンシトメトリーはImage  Jを用いて定量した。
【０１４３】
（結果）
結果を図１４に示す。示されるように、播種3時間後ではp-FAKはラミニン511-E8フラグメントにより促進されたが、インテグリン中和抗体によりコントロールと同程度まで抑制された。p-Paxillinもラミニン511-E8フラグメントにより促進されたが、インテグリンβ1の中和抗体によりコントロールと同程度まで抑制された。このことからE8はインテグリンを介して接着関連タンパク質を活性化することで細胞接着を促進していることがわかる。
【０１４４】
また、実施例５および６から、ラミニン５１１−E8フラグメントを添加することにより、非添加の細胞と比較して早期の細胞接着を認め、24時間後の接着細胞数は１３７．３±２．８％と有意に増加した（ｐ＜０．０１）。また、インテグリンα３β１およびα６β１の中和抗体によりラミニン５１１−フラグメントE8による細胞接着作用は抑制され、ラミニン５１１−フラグメントE8非添加細胞と同程度となった（ｐ＜０．０１）。FAKのリン酸化はラミニン５１１−フラグメントE8により促進されたがインテグリン中和抗体によって抑制されていることから、ラミニン５１１はインテグリンと結合しFAKのリン酸化を促進することで角膜内皮細胞の基質接着性を促進するものと考えられる。したがって、ラミニン５１１−フラグメントE8等のラミニンは角膜内皮細胞移植に応用できるものと考えられる。
【０１４５】
（実施例７：製剤例：ラミニン細胞混合製剤）
本実施例では、製剤例として、本発明の因子を含有する治療液を以下のようにして製造する。
【０１４６】
常法により下に示す液を調製する。
ラミニン５１１、ラミニン５２１および／またはそれらのフラグメント（0.75μg/cm2）
最終濃度が２．１ｎＭ
培養角膜内皮細胞        （実施例１等に準じて調製したものを適量）
適宜の緩衝液                                                適量
全量                                                  １００ｍＬ
【０１４７】
（実施例８：製剤例：ラミニンコーティング用組成物）
本実施例では、製剤例として、本発明の因子を含む、コーティング用溶液を以下のように製造する。
【０１４８】
常法により下に示すコーティング液を調製する。
ラミニン５１１、ラミニン５２１および／またはそれらのフラグメント（0.75μg/cm2）
最終濃度が２１ｎＭ
適宜の緩衝液                                                適量
全量                                                  １００ｍＬ
各成分は、実施例１〜４に記載のように入手することができる。
【０１４９】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。本出願は、２０１４年１０月３１日に出願された日本国出願特願２０１４−２２２９４７号に基づく優先権の利益を主張し、その内容は、その全体が参照によって本明細書に援用される。
【産業上の利用可能性】
【０１５０】
本発明は、眼科、特に角膜内皮細胞（特に、ヒト角膜内皮細胞）の新規治療を可能にした。特に、水疱性角膜症をほぼ完治させるまでの状態にもたらされることができているため、製薬業において特に有用である。
【配列表フリーテキスト】
【０１５１】
配列番号1：ラミニンα5鎖核酸配列（NM_005560）
配列番号2：ラミニンα5鎖アミノ酸配列（NP_005551）
配列番号3：ラミニンβ1鎖核酸配列（NM_002291）
配列番号4：ラミニンβ1鎖アミノ酸配列（NP_002282）
配列番号5：ラミニンβ2鎖核酸配列（NM_002292）
配列番号6：ラミニンβ2鎖アミノ酸配列（NP_002283）
配列番号7：ラミニンγ1鎖核酸配列（NM_002293）
配列番号8：ラミニンγ1鎖アミノ酸配列（NP_002284）
【図１】
2020128434.tif 000003
【図２】
2020128434.tif 000004
【図３】
2020128434.tif 000005
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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