(57)【要約】【課題】アルファ−１抗トリプシン融合分子のための組成物、方法および使用を提供すること。【解決手段】本明細書における実施形態は、アルファ−１抗トリプシン融合ポリペプチドまたはそのペプチド誘導体の組成物を報告する。ある実施形態において、組成物および方法は、アルファ−１抗トリプシン療法または治療を必要とする被験体を治療するために、薬学的に許容され得る組成物における使用のための構築物を生成することに関する。他の実施形態において、本明細書において開示される組成物および方法は、アルファ−１抗トリプシンまたはその誘導体を免疫フラグメントに対して連結することに関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権
このＰＣＴ出願は、２０１１年６月２４日に出願された米国仮出願第６１／５００，７９５号に対する優先権を主張する。この出願は、全ての目的のためにその全体が参考として本明細書に援用される。
【０００２】
本明細書における実施形態は、組換えアルファ−１抗トリプシン（α−１抗トリプシン、ＡＡＴ）の組成物に関する。ある実施形態において、本明細書において開示される組換えＡＡＴは、ＡＡＴの他の形態よりも直ちに精製することができる。他の実施形態において、組換えＡＡＴは、天然に存在するＡＡＴまたはＡＡＴの他の市販の製剤と比較して、抗炎症および抗免疫活性が増強している。さらに他の実施形態において、２倍、１０倍、または１００倍少ない組換えＡＡＴ（ｒＡＡＴ）は、被験体における状態または疾患の予防または治療のために、血漿由来のＡＡＴの任意のおよびすべての現在の形態の代わりに、使用され得る。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＴは、様々な組織もしくは器官の炎症、感染症、または他の健康状態などのような状態を有する被験体を治療するために使用することができる。
【背景技術】
【０００３】
ＡＡＴ
アルファ−１抗トリプシン（ＡＡＴ）の正常な血漿濃度は、１．３〜３．５ｍｇ／ｍｌの範囲にわたる。ある条件下で、ＡＡＴは、組織空間の中に容易に拡散し、標的プロテアーゼ、主に好中球エラスターゼと１：１複合体を形成する。トリプシン、キモトリプシン、カテプシンＧ、プラスミン、トロンビン、組織カリクレイン、および第Ｘａ因子などのような他の酵素もまた、基質として果たすことができる。酵素／阻害剤複合体は、次いで、セルピン−酵素複合体（ＳＥＣ）受容体に結合することによって血液循環から除去され、肝臓および脾臓によって異化される。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本明細書における実施形態は、市販で入手可能なＡＡＴ組成物に対して優れた特性を有するアルファ−１抗トリプシンの組換え構築物を生成するおよび使用することを報告する。他の実施形態は、治療上の使用のための組換えＡＡＴ産生を精製するおよびスケールアップするための方法を報告する。これらの実施形態に従って、組換えＡＡＴは、たとえば抗炎症剤、免疫モデュレータ、および／またはセリンプロテアーゼ阻害剤として、任意のＡＡＴに関連した活性のための使用のために単離することができる。
【０００５】
ある実施形態において、本明細書において開示される組換えＡＡＴは、当技術分野において知られている任意の組換え技術によって生成される完全長分子またはそのカルボキシ末端ペプチド誘導体を含む。いくつかの実施形態は、たとえば、ＡＡＴの急速な精製および活性保存に使用するためのまたはＡＡＴもしくはそのペプチドの活性を増大させるための、ＡＡＴと結合した免疫学的エレメントを有するＡＡＴまたはそのカルボキシ末端誘導体を含む構築物に関する。他の実施形態は、それぞれが免疫学的エレメント（たとえばＦｃフラグメント）と結合し、１つのユニットとして同時に精製されるＡＡＴ分子を有する、１つを超える構築物の同時の合成に関する。他の実施形態は、本明細書において開示される組成物、方法、および使用のための構築物を形成するために、たとえば、１つまたはそれより多い免疫分子と結合した分子の最後の８０ＡＡ（カルボキシ末端上の）のフラグメントまたはそのサブフラグメント（たとえば約４０、約３０、約２０、もしくは約１０ＡＡ、または約５ＡＡ）を含む、ＡＡＴの１つまたはそれより多いカルボキシ末端誘導体またはフラグメントの構築物を生成することに関することができる。
【０００６】
本明細書において企図される構築物のＡＡＴ分子は、天然に存在するアルファ−１抗トリプシン（たとえばヒト）またはＡＡＴの最も豊富な形態またはその他の天然に存在する形態またはそのフラグメントもしくは誘導体または有意なセリンプロテアーゼ阻害剤活性を有していないＡＡＴの変異体形態またはその対立遺伝子（たとえば、およそ１００の天然に存在するＡＡＴ改変体があり、これらの改変体のいずれも、本明細書において開示される構築物において使用することができる）またはそのアナログまたはその融合タンパク質（たとえばヒトＩｇＧもしくはヒトＩｇＧのフラグメント）に関するものとすることができる。これらの実施形態に従って、最終構築物または融合ポリペプチドは、それぞれが共通の免疫学的フラグメント（たとえばＦｃフラグメント）と結合した２つのＡＡＴ分子または融合ポリペプチドを含んでいてもよく、ＡＡＴ免疫フラグメント構築物が、二量体ＡＡＴ免疫フラグメント融合分子を形成するように、ジスルフィド結合によって相互に連結される（たとえば図２Ａおよび図６Ａ〜６Ｂを参照されたい）。
【０００７】
本明細書において開示されるある方法において、免疫分子と結合したＡＡＴまたはＡＡＴペプチドの精製は、市販で入手可能な製剤または天然のＡＡＴと比較して、ＡＡＴ組成物の活性を有意に増大させる。そのうえ、精製までの時間は、構築物または融合分子の決定的な活性を保護しながら、複数の精製ステップを排除することによって、劇的に低下する。他の実施形態において、本明細書において企図される融合分子の回収の改善は、ＡＡＴ分子および免疫フラグメントの間のリンカー分子を使用して、より直ちに実現することができる。本明細書において開示されるある融合分子は、コントロール（たとえば、天然に存在するＡＡＴの典型的な精製および市販で入手可能な配合薬（ｆｏｒｍｕｌａ）の精製）と比較して、サイトカインを阻害することができ、分子の免疫および炎症機能を調整する。これらの実施形態に従って、２つ以上のＡＡＴ免疫構築物（またはＡＡＴフラグメント）を含むユニットは、精製し、本明細書において開示される組成物および方法において使用することができる。Ｆｃ−ｈｕＡＡＴは、本明細書において企図される任意の方法または組成物において使用することができる。他の実施形態は、ＡＡＴ分子の活性を保護するために、急速な精製方法によって精製されるＡＡＴ分子に連結されるＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、またはＩＧＤ  Ｆｃフラグメントを使用することを含む。たとえば、本明細書において開示されるある実施形態は、当技術分野において知られている他の方法の有害な影響を回避するために、最少のステップ（たとえばワンステップ）精製としてプロテインＡを使用することに関する。本明細書におけるいくつかの実施形態は、市販で入手可能な産物（たとえばＡｒａｌａｓｔ（商標）、Ｐｒｏｌａｓｔｉｎ（商標））に使用される標準的な精製と比較しておよび／または血漿中に見つけられる天然に存在するＡＡＴと比較して、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上の抗炎症性活性を保護することに関する。一実施形態において、本出願の組換え分子は、市販で入手可能な製剤と比較して、２〜１０、１０〜１００、およびある実施形態において、２〜１００倍大きい活性を実証した。インビボにおけるまたは天然のＡＡＴに類似し、ある実施形態においてそれより優れた活性を有する構築物を作り出し、回収するための方法が、本明細書において開示される。ＡＡＴに関して関心があるとして知られている、ある活性は、免疫調節性または炎症調整活性を含むが、これらに限定されない。たとえば、本明細書において記載される融合分子は、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒａ）、ＣＴＬＡ−４、ＩＬ−１８結合タンパク質、および／またはＩＬ−１０、ならびにその他同種のものなどのような、天然に存在する抗炎症分子の誘発により、抗炎症分子として作用することができる。記載される構築物は、単離し、セリンプロテアーゼ阻害剤活性以外のものとなり得る活性について、評価することができることが、本明細書において企図される。いくつかの実施形態において、本明細書において開示される構築物は、市販で入手可能な組成物と比較して、より高いＩＬ−１受容体アンタゴニスト活性を有する。
【０００８】
ある実施形態において、組成物（たとえば構築物または融合ポリペプチド組成物）および方法は、被験体に対する放射線の副作用を調整することに関する。いくつかの実施形態において、組成物および方法は、たとえば、癌を有するまたは悪性疾患の発症もしくはコントロール不良の細胞の増殖が疑われる被験体に投与される場合に、放射線療法または放射線を有する被験体を治療することに関する。本明細書において開示される他の実施形態は、たとえば偶然にまたは目的のある行為によって、放射線に対して曝露されたことがある被験体を治療することに関する。
【０００９】
他の実施形態において、本明細書において開示される組成物は、被験体が放射線および／または化学療法を受けるごとに、被験体に投与することができる。本明細書において開示されるいくつかの実施形態は、癌療法を受けている被験体の治療に関する。癌治療は、膀胱、乳房、腎臓、白血病、肺、骨髄腫、脂肪肉腫、リンパ腫、舌、前立腺、胃、結腸、子宮癌、黒色腫、膵臓、眼、および他の知られている癌のための治療を含むが、これらに限定されない。
【００１０】
本明細書において開示されるいくつかの実施形態は、前立腺癌を有する被験体を治療することに関する。これらの実施形態に従って、前立腺癌を有する男性の被験体は、前立腺癌療法の共通の副作用であるインポテンスまたは勃起障害の発症を低下させるために、放射線および／または化学療法の前に、その間に、またはその後に、本明細書において開示される組成物により治療することができる。
【００１１】
他の実施形態は、癌関連性の療法を受けている被験体の治療のための併用療法に関する、たとえば、本明細書において開示される組成物は、腫瘍を縮小させる、もしくは排除する、または被験体の腫瘍の転移を低下させる、または被験体の癌の他の側面を治療することが知られている任意の他の作用物質と組み合わせることができる。
【００１２】
ある実施形態において、正常な細胞の傷害を調整するために、本明細書において包含される組成物により被験体を治療することが、組成物により治療されない被験体と比較して、少なくとも１０％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％とすることができる。
【００１３】
いくつかの実施形態は、ＡＡＴ療法を必要とする被験体に対して、組換え技術を使用することによって生成されるＡＡＴを投与することに関する。これらの実施形態に従い、被験体は、ＡＡＴ欠乏症、炎症もしくは免疫状態、または当技術分野において知られている他のＡＡＴに関連した状態を有し得る。本明細書における、ある実施形態は、そのような治療を必要とする被験体に対して、少なくとも１つの構築物および薬学的に許容され得るキャリアを有する組成物を投与することを含む。ある実施形態において、被験体に対して投与される用量は、市販で入手可能な製剤と比較して、被験体に対する用量における２倍、１０倍、または１００倍の低下を含むことができる。ある実施形態において、用量は、１０ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ（共通して使用される、Ａｒａｌａｓｔ（商標）またはＰｒｏｌａｓｔｉｎ  Ｃ（商標）などのような市販で入手可能なＡＡＴの濃度）と比較して、被験体に対して約０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇとすることができる。
【００１４】
本発明のいくつかの実施形態は、心組織リモデリング（たとえば心組織の拡大および壊死）、たとえば左または右心室（ＬＶ）リモデリングの発病または進行を調整することを報告する。これらの実施形態に従って、たとえば、本明細書において開示される組成物の投与による介入が、心筋損傷をもたらし得る心イベントの前に、その間に、またはその後に、発病、重症度（たとえば損傷の）、または進行を調整することができる。さらに他の実施形態において、本明細書において開示される組成物は、初期または末期の梗塞サイズを低下させるべき心臓状態を有する被験体に投与することができる。これらの実施形態に従って、初期の梗塞は、手術または他の心イベントの前に（たとえばベースライン）、その間に、またはその後４８時間以内に測定されるものとすることができる。他の実施形態において、末期の梗塞は、手術または他の心イベントの４８時間後にまたはその後数日もしくは数週間までに、たとえば、心イベントの７日後に測定されるものとすることができる。さらに他の実施形態において、本明細書において開示される組成物は、これらの組成物により治療されない被験体と比較して、約５％、または約１０％、または約１５％、または約２０％、または約２５％、または約３０％、またはそれ以上、心イベントの結果としての心拡大および機能不全を調整するために、心イベント（たとえば心筋梗塞）を有する被験体を治療するために使用することができる。
【００１５】
ある実施形態は、心イベントを有する被験体を治療するための組成物に関する。これらの実施形態に従って、組成物は、組換えアルファ−１抗トリプシン（たとえばヒト）またはその融合タンパク質もしくはペプチドまたは組換え体または有意なセリンプロテアーゼ阻害剤活性を有していないその変異体またはその対立遺伝子（たとえば、およそ１００の天然に存在するＡＡＴ改変体がある）またはそのアナログまたはその融合タンパク質（たとえばヒトＩｇＧもしくはヒトＩｇＧのフラグメント（Ｆｃ））を含むことができる。いくつかの実施形態は、ＬＶリモデリングを調整するために、心イベントを有するまたは有したことがある被験体に対して、天然に存在するＡＡＴを投与することに関する。他の実施形態は、たとえば、３９４ＡＡの天然に存在するＡＡＴ（配列番号１および３３）の最後の８０ＡＡのフラグメントを含む、ＡＡＴの１つまたはそれより多いカルボキシ末端誘導体またはフラグメントの組成物を投与することに関する。ある実施形態は、心臓の状態を寛解させるために、本明細書において開示される、組換えで産生された融合ＡＡＴペプチドにより、心臓の状態を有する被験体を治療することに関する。
【００１６】
他の実施形態は、感染症（たとえば細菌もしくはウイルス感染症）を有する被験体を治療することまたは本明細書において開示される組成物を使用して、被験体が感染症にかかるのを予防することを含む。
【００１７】
いくつかの実施形態は、移植片拒絶を低下させるまたは予防するための、本明細書において開示される組成物に関する。他の実施形態において、本明細書において開示される組成物は、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の発生率を低下させるまたはそれを予防するために使用することができる。他の実施形態において、本明細書において開示される組成物は、細胞の移植拒絶反応またはその副作用を低下させるために使用することができる。細胞の移植は、島細胞、幹細胞、角膜上皮細胞、肝細胞、皮膚、または他の同様の移植を含むことができる。いくつかの実施形態は、移植を受けている被験体において、炎症活性および／または不利な免疫応答を低下させることに関する。
【００１８】
他の本明細書における実施形態は、被験体において、その状態を治療するおよび／または不利益な免疫応答を阻害するために、自己免疫障害を有する被験体を治療することに関する。
【００１９】
ある実施形態において、投与のための組成物は、１ｍｌまたは１ｍｇの製剤当たり約０．１ｎｇ〜約１０ｍｇの範囲とすることができる。ＡＡＴペプチドまたはＡＡＴもしくはペプチドと同様の活性を有する構築物の治療有効量は、モル濃度で測定されてもよく、約１ｎＭ〜約１０ｍＭの範囲にわたってもよい。製剤はまた、薬学的にまたは美容的に許容され得るキャリアと組み合わせて企図される。詳細な用量は、不必要な実験作業を伴うことなく、よく知られているルーチン的な臨床試験によって確立することができる。一実施形態において、被験体は、１回の用量（たとえば、コントロールと比較して、構築物組成物の効力に依存して、ＩＶ注入により０．６ｍｇ／ｋｇ〜０．８ｍｇ／ｋｇ）の活性作用物質（たとえばＡＡＴ構築物またはそのＡＡＴペプチド誘導体）により、状態について治療されてもよい。この実施形態に従って、被験体は、医療従事者によって決定されるように、継続する治療により治療することができる（たとえば、１回の用量後、５〜１０日間またはそれ以上）。他の実施形態は、プラセボを有するコントロール集団を使用すること（たとえばヒト血清アルブミン投与または他の同等のプラセボ）および本明細書において開示される組成物を受けている集団とプラセボ効果を比較することを含むことができる。
【００２０】
本明細書において開示される組成物を投与するための任意の方法が、企図される。ある実施形態において、組成物は、静脈内に、鼻腔内に、皮下に、経口的に、吸入によって、皮膚に対して、たとえば局所的に適用して、坐剤によって、腟内に（ｖａｇｉｎａｌｌｙ）、または当技術分野において知られている任意の方法によって、その必要のある被験体に対して投与することができる。
【００２１】
ある実施形態において、被験体は、哺乳動物である。いくつかの実施形態において、哺乳動物は、ヒトである。さらに他の実施形態において、被験体は、妊娠している女性または幼い子供である。他の実施形態において、被験体は、ペット、家畜化された（ｄｏｍｅｓｔｉｃａｔｅｄ）動物、または家畜である。
【００２２】
他の実施形態において、被験体または哺乳動物は、捕獲されたまたは自由な野生動物などのような家畜化されていない（ｎｏｎ−ｄｏｍｅｓｔｉｃａｔｅｄ）哺乳動物とすることができる。
【００２３】
ある実施形態において、ヒトＡＡＴ変異体を含む組成物は、有意なセリンプロテアーゼ阻害剤活性を有していなくてもよく、記載される方法において使用するために、本明細書において開示される構築物において使用することができる（たとえばＡＡＴ融合ペプチド誘導体または反応中心ループ（Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｌｏｏｐ）（ＲＣＬ）関連性の変異体融合ポリペプチド）。これらの実施形態に従って、本明細書において開示される組換え分子または融合タンパク質構築物は、有意なセリンプロテアーゼ阻害活性を有していない。免疫分子（たとえばＦｃ）と結合しているこれらの構築物を生成することができる。たとえば、免疫分子との融合は、融合ポリペプチドの急速な精製のための好都合な方法を提供し、それによって、精製ステップを減らすことによって、ＡＡＴまたはそのカルボキシ末端の活性を保護することができる。ある実施形態において、精製ステップは、アフィニティープロセス（たとえばプロテインＡ）を使用する単一のステップである。これらのプロセスは、他の市販で入手可能な製剤（たとえばＡｒａｌａｓｔ（商標）、Ｐｒｏｌａｓｔｉｎ  Ｃ（商標））において使用される有害な精製ステップを減らすことによって、本明細書において開示される構築物のコンホメーションを保護する。他の実施形態は、有意なセリンプロテアーゼ阻害剤活性を有しないように改作された、ＡＡＴ由来のフラグメント構築物に関する。本明細書における他の構築物は、免疫分子（たとえばＩｇＧ分子）に連結された、ＡＡＴに対応するカルボキシ末端のペプチドもしくはアミノ末端のペプチドを含む構築物、そのアナログ、セルピン−酵素複合体（ＳＥＣ）受容体に結合するＡＡＴカルボキシ末端の任意の誘導体、またはその組み合わせを含むことができるが、これらに限定されない。
【００２４】
本明細書において企図される医薬組成物は、被験体の必要に依存して、抗炎症剤、免疫抑制剤、免疫調節剤、抗ウイルス剤、抗病原性作用物質、抗菌剤、プロテアーゼ阻害剤、およびその組み合わせからなる群から選択される作用物質をさらに含んでいてもよい。これらの作用物質のいくつかは、単独でまたは一緒に使用される、１つまたはそれより多いインターフェロン、ベタセロン（ｂｅｔａｓｅｒｏｎ）を含むインターフェロン誘導体、ベータ−インターフェロン、イロプロストを含むプロスタン誘導体、シカプロスト；コルチゾール、プレドニゾロン、メチル−プレドニゾロン、デキサメタゾンを含むグルココルチコイド；シクロスポリンＡ、ＦＫ−５０６、メトキサレン（ｍｅｔｈｏｘｓａｌｅｎｅ）、サリドマイド、スルファサラジン、アザチオプリン、メトトレキサートを含む免疫抑制薬（ｉｍｍｕｎｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ）；ジロートン（ｚｉｌｅｕｔｏｎｅ）、ＭＫ−８８６、ＷＹ−５０２９５、ＳＣ−４５６６２、ＳＣ−４１６６１Ａ、ＢＩ−Ｌ−３５７を含むリポキシゲナーゼ阻害剤；ロイコトリエンアンタゴニスト；ＡＣＴＨおよびそのアナログを含むペプチド誘導体；可溶性ＴＮＦ受容体；ＴＮＦ抗体；インターロイキン、他のサイトカイン、Ｔ細胞タンパク質の可溶性受容体；インターロイキン、Ｔ細胞タンパク質の受容体に対する抗体；ならびにカルシポトリオール；Ｃｅｌｃｅｐｔ（登録商標）、ミコフェノール酸モフェチル、およびその類似体を含むが、これらに限定されない。
【００２５】
そのため、当業者らは、本開示が基礎を置く概念を、本発明の実施形態のいくつかの特徴および利点を実行するための他の方法を設計するための基礎として直ちに使用することができることを十分に理解するであろう。
【００２６】
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本明細書において開示される、ある実施形態をさらに実証するために含まれる。実施形態は、本明細書において示される特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて、１つまたはそれより多いこれらの図面に対する参照によって、より理解されてもよい。
例えば、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
タンパク質のアミノ末端から始まって、（ｉ）アルファ−１抗トリプシンまたはそのカルボキシ末端フラグメントに存在する連続アミノ酸、（ｉｉ）ペプチドリンカーに存在する連続アミノ酸、および（ｉｉｉ）免疫フラグメントに存在する連続アミノ酸に対応する連続アミノ酸を含む融合ポリペプチドであって、上記連続アミノ酸（ｉ）が、精製された場合、（ｉｉｉ）に対して結合したままである、融合ポリペプチド。
（項目２）
上記免疫フラグメントが、Ｆｃフラグメントを含む、項目１に記載の融合タンパク質。
（項目３）
上記Ｆｃフラグメントが、ＩｇＧ２を含む、項目２に記載の融合タンパク質。
（項目４）
アルファ−１抗トリプシン（ＡＡＴ）またはそのフラグメントもしくはペプチド切断分子をコードする核酸、
リンカー、および
免疫フラグメントをコードする核酸を含む核酸構築物であって、上記免疫フラグメントが免疫グロブリン分子である、核酸構築物。
（項目５）
ＡＡＴをコードする上記核酸が、天然に存在するＡＡＴ（配列番号１）をコードする核酸を含む、項目４に記載の構築物。
（項目６）
上記ＡＡＴペプチド切断分子をコードする上記核酸が、天然に存在するＡＡＴの１つまたはそれより多いカルボキシ末端フラグメントをコードする核酸を含む、項目４に記載の構築物。
（項目７）
カルボキシ末端フラグメントが、配列番号１の最後の８０アミノ酸またはその１０またはそれより多い連続アミノ酸を含む、項目４に記載の構築物。
（項目８）
上記カルボキシ末端フラグメントが、配列番号３４のアミノ酸配列を含む、項目６に記載の構築物。
（項目９）
項目２に記載のポリペプチドをコードする、項目４に記載の構築物。
（項目１０）
上記免疫フラグメントが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、またはＩｇＤフラグメントを含む、項目４に記載の構築物。
（項目１１）
上記構築物が、上記免疫フラグメントに、ＡＡＴまたはそのカルボキシ末端フラグメントを、そのＮ−末端を通して連結することによって、形成される、項目４に記載の構築物。
（項目１２）
配列番号４８のポリペプチドをコードする、項目４に記載の構築物。
（項目１３）
項目４に記載の核酸構築物または項目１に記載の融合ポリペプチドを含む、組換え細胞クローン。
（項目１４）
タンパク質またはペプチドの混合物から、項目２に記載の融合ポリペプチドを精製するためのプロセスであって、
ａ．マトリックスと結合したプロテインＡに対して、タンパク質またはペプチドの上記混合物を曝露するステップおよび
ｂ．構築物または融合分子の免疫フラグメントを、上記マトリックスと結合したプロテインＡと結合させるステップ、
ｃ．上記混合物のうちの結合していないタンパク質またはペプチドを除去するステップ、ならびに
ｄ．競合的結合分子を使用して、プロテインＡから上記タンパク質または上記ペプチドを溶出するステップを含む、プロセス。
（項目１５）
上記免疫フラグメントが、上記構築物または上記融合分子から切断される、項目１４に記載のプロセス。
（項目１６）
上記競合的結合分子が、Ｆｃ受容体である、項目１４に記載のプロセス。
（項目１７）
回収された上記構築物または上記融合分子が、血漿由来のＡＡＴ調製物と比較して、少なくとも１０％増大した抗炎症活性を有する、項目１４に記載のプロセス。
（項目１８）
項目１に記載の融合ポリペプチドまたはタンパク質および薬学的に許容され得る賦形剤を含む医薬組成物。
（項目１９）
上記融合ポリペプチドが、治療有効量で上記組成物中に存在する、項目１８に記載の組成物。
（項目２０）
項目４に記載の核酸構築物を含むベクター。
（項目２１）
項目２０に記載のベクターを含む形質転換細胞。
（項目２２）
項目１に記載の融合タンパク質を含む、発現された封入体の単離調製物。
（項目２３）
被験体において、状態を治療するための方法であって、治療有効量の項目１に記載の融合ポリペプチドおよび薬学的に許容され得るキャリアまたはその塩の組成物を上記被験体に対して投与するステップを含み、上記投与が、上記被験体において、上記状態を治療する、方法。
（項目２４）
上記状態が、Ｉ型糖尿病またはＩＩ型糖尿病である、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
上記被験体が、器官または非器官移植を受けており、上記治療が、上記被験体において移植拒絶反応を調整する、項目２３に記載の方法。
（項目２６）
上記状態が、上記被験体におけるＡＡＴ欠乏症であり、上記治療が、上記被験体に対してＡＡＴ代償療法を提供する、項目２３に記載の方法。
（項目２７）
上記状態が、痛風であり、上記組成物の上記投与が、上記被験体において、痛風を調整する、項目２３に記載の方法。
（項目２８）
上記状態が、心臓の状態であり、上記投与が、上記被験体において、上記心臓の状態を調整する、項目２３に記載の方法。
（項目２９）
上記被験体に対する上記組成物の投与が、上記組成物を有していないコントロール被験体と比較して、心臓のリモデリングを低下させる、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
上記状態が、感染症であり、上記投与が、上記被験体において上記感染症を調整する、項目２３に記載の方法。
（項目３１）
上記感染症が、ウイルス感染症または細菌性感染症である、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
上記状態が、再建手術または形成外科手術の副作用であり、上記組成物が、上記被験体において炎症を低下させる、項目２３に記載の方法。
（項目３３）
上記状態が、上記状態に関連する過剰な炎症であり、上記組成物が、上記被験体において炎症を低下させる、項目２３に記載の方法。
（項目３４）
投与が、静脈内投与、気管内投与、皮内投与、鼻腔内投与、吸入による投与、皮下投与、局所投与、膣投与、または他の様式の投与のうちの１つまたはそれより多くを含む、項目２３に記載の方法。
（項目３５）
上記状態が、自己免疫性の状態であり、上記組成物が、上記被験体において上記自己免疫性の状態を治療する、項目２３に記載の方法。
（項目３６）
上記組成物の投与が、月に１回、週に１回、週に２回、または１日１回である、項目２３に記載の方法。
（項目３７）
被験体における移植のための器官、組織、または細胞を保存するための方法であって、上記方法は、項目１に記載の融合ポリペプチドおよび薬学的に許容され得るキャリアまたはその塩の組成物に対して上記器官、上記組織、または上記細胞を曝露するステップを含み、上記投与が、融合ポリペプチドでないアルファ−１抗トリプシンの投与と比較して、低減され、上記組成物が、移植または保存のために、上記器官、上記組織、または上記細胞を保存するのに有効である、方法。
（項目３８）
セリンプロテアーゼ阻害活性が、有意に低下している、反応中心ループ（ＲＣＬ）に変異を有する変異体ＡＡＴをコードする核酸、および
免疫グロブリン分子である免疫フラグメントをコードする核酸、
を含む、核酸構築物。
（項目３９）
放射線に対して曝露されたことがある被験体を治療するための方法であって、項目１に記載の融合ポリペプチドおよび薬学的に許容され得るキャリアまたはその塩の組成物を上記被験体に対して投与するステップを含み、上記投与が、上記被験体において、放射線の副作用を低下させ、投与される上記組成物が、融合ポリペプチドでないアルファ−１抗トリプシンの投与と比較して、低減される、方法。
（項目４０）
上記被験体が、癌療法により放射線に対して曝露される、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
上記被験体が、前立腺癌を有し、上記治療が、放射線療法を受けている上記被験体において、インポテンスまたは勃起障害の発症を低減させる、項目３９に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、本明細書において開示されるいくつかの実施形態に使用するために企図されるＡＡＴ構築物の概略図を示す図である。
【図２】図２Ａは、本明細書において開示される、いくつかの実施形態に使用するために企図される、免疫分子が結合したヒトＡＡＴ構築物の概略図を示す図である。
【図３】図３は、Ｆｃ−ＡＡＴの存在下または非存在下における細胞のモデルにおけるＩＬ−８産生のヒストグラムプロットを示す図である。
【図４】図４は、本明細書において記載される、ある実施形態の融合分子（たとえばＦｃ−ＡＡＴ）の存在下における、抗炎症分子（ＩＬ−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒａ））の発現の産生についてのヒストグラムプロットを示す図である。
【図５】図５は、本明細書において企図される、提案される融合分子を示す図である。
【図６】図６Ａ〜６Ｂは、本明細書において企図される例示的な構築物を示す図である。
【図７】図７は、増大性の量の、本明細書において企図される融合分子の存在下における、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒａ）の産生を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
例証となる実施形態の説明
定義
本明細書において使用するとき、「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」は、１つのまたは１つを超える要素を意味することができる。
【００２９】
本明細書において使用するとき、「約」は、プラスまたはマイナス１０％を意味することができ、たとえば、約１０分は、９〜１１分を意味することができる。
【００３０】
詳細な説明
以下のセクションにおいて、様々な例示的な組成物および方法は、本発明の様々な実施形態を詳述するために記載される。様々な実施形態の実行は、本明細書において述べられる特定の細部のすべてまたはいくつかさえ利用することを必要とせず、むしろ、濃度、時間、および他の特定の細部は、ルーチン的な実験作業を通して変更されてもよいことは、当業者にとって明白であろう。ある場合には、よく知られている方法または構成成分は、説明に含まれていない。
【００３１】
ＡＡＴ（アルファ−１抗トリプシン）抗炎症活性は、セリンプロテアーゼ、特に好中球エラスターゼを阻害するその能力に起因すると従来より考えられてきた。これは、ＡＡＴ欠乏症を有するヒトのための代償療法におけるその使用のための基礎となっている。ヒトへの使用のための、現在市販で入手可能なＡＡＴは、他のＡＡＴに関連した活性についてではなく、その抗エラスターゼユニットによって規格化される。これらの市販で入手可能な製剤は、プールされたヒト血漿から精製されるが、これらは、それらが他のヒト血清タンパク質を含有するので、純粋ではない（いくつかは他のものよりも純粋であるが）。ヒトＡＡＴインビトロおよびインビボモデルに関する大多数の研究は、それぞれがヒトにおける使用について承認されている、セリンプロテアーゼ阻害活性に関する、これらの市販で入手可能な調製物の使用に依存する。ＡＡＴの注入は、様々なＡＡＴ欠乏状態を有するヒトにおいて、安全であると考えられるが、混入しているタンパク質の役割は、未知のままである。本明細書におけるある実施形態は、混入している同時精製血漿タンパクについての問題を克服するための、高純度で高活性のＡＡＴの組換え形態の迅速な産生を報告する。
【００３２】
過剰な炎症または炎症活性化は、いくつかの慢性疾患、たとえば慢性破壊性または消耗性疾患の開始、進行、および破壊性の性質をもたらし得る。これらは、関節リウマチなどのような自己免疫性疾患、免疫攻撃によってインスリン産生ベータ細胞が破壊され得る１型などのような糖尿病を含むが、これらに限定されない。本明細書において開示される組成物および方法によって治療されてもよい他の状態は、２型糖尿病を含む。自己免疫性疾患に加えて、冠動脈の慢性炎症は、心臓発作または心発作の危険性を増大させ得る。慢性炎症はまた、腸における炎症（たとえばクローン病、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、または潰瘍性大腸炎）の一因ともなる。被験体において炎症をコントロールする、いくつかの天然に存在するタンパク質は、被験体において毎日産生される。ＡＡＴは、これらのタンパク質のうちの１つである。ＡＡＴによる療法の１つの欠点は、市販で入手可能なＡＡＴが、ヒト血液ドナーの血漿から単離され、そのため、供給が、入手可能な血漿に限られるということである。治療用ＡＡＴの使用は、その適用が、慢性肺閉塞性疾患（ＣＯＰＤ）およびＡＡＴ代償療法などのような現在の使用に限られないので、増えている。
【００３３】
ＡＡＴによる療法の１つの欠点は、市販で入手可能なＡＡＴが、ヒト血液ドナーの血漿から単離され、そのため、供給が、入手可能な血漿に限られるということである。治療用ＡＡＴの使用は、その適用が、慢性肺閉塞性疾患、気腫、嚢胞性線維症、細気管支炎（ｂｒｏｎｃｈｉｏｃｙｔｉｓ）、肺線維症、およびＡＡＴ代償療法などのような現在の使用に限られないので、増えている。
【００３４】
ある実施形態において、Ｆｃ分子は、たとえば、その免疫分子を通してジスルフィド結合によって連結された、Ｆｃ−ＡＡＴの二量体を作製するために、ＡＡＴ分子と結合されてもよい。他の実施形態において、Ｆｃ−ＡＡＴの単量体分子は、本明細書において開示される方法において生成し、使用することができる。本明細書において記載される分子のいずれも、活性を保護するための急速な分離のために、たとえばプロテインＡカラム、他のアフィニティー精製方法もしくはマトリックス、または他の迅速な精製もしくは濃縮方法を使用して、速やかに精製することができる。
【００３５】
本明細書における実施形態は、現在の市販で入手可能なＡＡＴ組成物に対して優れた特性を有する、アルファ−１抗トリプシン（ＡＡＴ）またはそのカルボキシ末端フラグメントの構築物を生成することを報告する。他の実施形態は、融合タンパク質またはペプチドを速やかに精製するための方法および本明細書において開示される精製ＡＡＴ融合分子についての続く使用を報告する。血漿に由来する、市販で入手可能なＡＡＴは、供給不足であり、ＡＡＴの重要な特性を破壊する方法によって現在、精製されており、合成的に産生されたＡＡＴが、ＡＡＴの天然の形態またはＡＡＴ由来のペプチドよりも好適ではないにしても、同様に働くことができる、この分子の合成バージョンまたは最新の精製方法についての必要性が存在することが企図される。
【００３６】
セリンプロテアーゼ阻害以外のＡＡＴ活性に関して、ＡＡＴは、いくつかのメカニズムによって抗炎症性特性を発揮する。抗プロテアーゼ部位の変異（たとえば、抗プロテアーゼ活性をわずかなレベルまで低下させるための）を使用する予備データは、ＡＡＴの活性のうちのいくつかが、ＡＡＴの抗プロテアーゼ特性を必要としないという概念を支持する。ある実施形態において、天然に存在するヒトＡＡＴ（たとえば３９４ＡＡ、分子量約５１，０００または他のＡＡＴ製剤）の異なる組換え切断型形態および変異体形態が、分子の抗炎症特性を評価するために生成される。このアプローチは、様々な組成のＡＡＴ分子を産生することを可能にし、これは、血漿由来のＡＡＴの標準的な方法を使用すると、非常に困難となる。ＡＡＴの抗炎症性特性は、市販で入手可能な組成物について現在、使用されている精製手順によって酸化され得ることが実証されており、したがって、ＡＡＴの融合分子を調製するおよび精製するための本発明の方法は、現在の方法より優れている。本明細書において開示される方法は、本明細書において記載される融合分子および構築物において、ＡＡＴに関連した活性を保護するための優れた急速な精製方法を提供する。
【００３７】
ある以前に開示された方法において、ＡＡＴは、マウスモデルおよびヒト膵島細胞のＩＬ−１βの毒性の活性をブロックすることが実証された。本明細書におけるいくつかの実施形態は、融合分子またはＡＡＴ融合分子の組換え産生がこの活性を模倣することができるかどうかを試験し、検証することに関する。ある実施形態において、ヒトＡＡＴのカルボキシル末端領域の組換えで産生された融合ペプチドが、ＩＬ−１βの毒性の活性または産生をブロックするためにおよびカスパーゼ−１活性を低下させるために、生成される。これらの融合ペプチドは、炎症促進性の分子の産生または活性をブロックするまたは低下させるのに有用であり、そのため、コントロール不良の炎症応答に関する多くの健康状態の治療および予防に有用である。
【００３８】
ＡＡＴは、セルピンスーパーファミリーに属するプロテアーゼ阻害剤として最初に分類された。ＡＡＴは、一般に、血清トリプシン阻害剤として知られている。ＡＡＴが種々様々のプロテアーゼを阻害するので、ＡＡＴはまた、アルファ−１プロテイナーゼ阻害剤（Ａ１ＰＩ）と呼ぶこともできる。ＡＡＴは、好中球エラスターゼなどのような、炎症細胞の酵素から組織を防御し、典型的に、約１．５〜３．５グラム／リットルの、血液における範囲を有する。α１−抗トリプシンの１００を超える異なる改変体が、様々な集団において記載されている。ＡＡＴの最も一般的な種類は、ＩＥＦゲルにおけるその移動に基づいて、Ｍと称される。他の改変体は、それらがＭのバンドに対して近位にまたは遠位に流れるかどうかに依存して、Ａ〜ＬおよびＮ〜Ｚと称される。ＩＥＦ上の、基準からはずれたバンドの存在は、ＡＡＴ欠乏症の存在を示し得る。上記に示されるように、ＭタイプのＡＡＴは、いくつかのサブタイプを有し、これらのサブタイプはすべて、本明細書における使用が企図される。ＡＡＴの任意の改変体は、本明細書において開示される構築物の設計を使用して、融合分子として使用することができることが企図される。
【００３９】
ＡＡＴの治療用濃縮物を得るための現在の傾向は、血液ドナー（たとえばヒトドナー）の血漿からＡＡＴを調製することである。これは、非常に限られた資源であり、市場性のある産物を得るために大規模な精製ステップを必要とする。これまでに、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｆｏｏｄ  ＆  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎは、ヒト血漿に由来する、いくつかの市販の製品の使用を承認してきた。たとえば、これらの製品のうちのいくつかは、Ｐｒｏｌａｓｔｉｎ（登録商標）、ＰｒｏｌａｓｔｉｎＣ（登録商標）、（Ｔａｌｅｃｒｉｓ（現在Ｇｒｉｆｏｌｓ、Ｒａｌｅｉｇｈ、Ｎ．Ｃ．））、Ｚｅｍａｉｒａ（登録商標）、およびＡｒａｌａｓｔ（登録商標）（Ｂａｘｔｅｒ）を含み、Ｋａｍａｄａは、エアロゾルおよび静脈内製品（Ｋａｍａｄａ、Ｉｓｒａｅｌ）の両方を有する。これらの製剤のほとんどは、ＡＡＴ欠損患者におけるＡＡＴ療法のために静脈内に投与され、患者当たり１年につき＄１００，０００もコストがかかる。血漿から単離されたＡＡＴは、血液に由来するＡＡＴと比較して、活性が低下していることが実証された。そのうえ、現在の精製プロトコールは、一般に、有意に低下した活性および血漿由来のＡＡＴをもたらす。本明細書において開示される組成物は、血漿由来のＡＡＴの抗炎症活性ではなく、血液の抗炎症活性と同様に、抗炎症活性が増大しており、また、抗炎症活性ではなく抗プロテアーゼ活性に基づく活性を有する、現在の市販で入手可能な製剤よりも、活性が高い。
【００４０】
ある研究により、ＦＤＡにより承認された製品のうちの３つが、その一次構造およびグリコシル化の点から分析され、比較された。製品のいくつかのものは、正常なヒト血漿ＡＡＴと比較して、おそらく、精製手順の間に持ち込まれる差異を示した。そのうえ、ある研究における、市販の製剤の比較により、セリンプロテアーゼ阻害活性およびＡＡＴ純度に関して大きなばらつきがあったことが以前に実証された。最近、標準的な市販で入手可能な製剤のうちの１つ、Ｐｒｏｌａｓｔｉｎ（登録商標）が、評価され、新しい製剤ＰｒｏｌａｓｔｉｎＣ（登録商標）は、最終製品における抗プロテアーゼ活性（たとえばセリンプロテアーゼ阻害活性）を増大させるために、Ｐｒｏｌａｓｔｉｎ（登録商標）とは別のやり方で精製された。これらの市販の製品について報告された活性はすべて、抗炎症または免疫調節活性または代わりとなるＡＡＴに関連した活性ではなく、セリンプロテアーゼ阻害活性の評価に関する。したがって、現在の市販の製品は、量が不足しているだけではなく、天然に存在する製剤に対して、品質においても粗悪である。
【００４１】
ＡＡＴ製剤を改善するための努力にもかかわらず、入手可能な血漿ＡＡＴの供給には限界があり、そのため、組換えＡＡＴ分子が、求められてきたが、今まで、ほとんどまたは全く成功していない。以前に生成された組換え分子は、以前に示された市販で入手可能な製剤と比較して、セリンプロテアーゼ阻害剤アッセイによってアッセイされた場合、時に同等であったが、多くの場合、それほど活性ではなかった。したがって、供給が限られた血漿および過去の粗悪な組換えＡＡＴ分子は、以前のおよび最近発見された方法論における使用のための十分な供給量のＡＡＴの生成について、空白を残した。
【００４２】
本明細書におけるいくつかの実施形態は、当技術分野において知られている任意のＡＡＴ方法または治療における使用のための、市販で入手可能な製剤と比べて高度に活性で、高度に機能的な組換えＡＡＴ構築物の生成に関する。ある実施形態において、本明細書において開示される組換えＡＡＴは、完全長分子またはそのカルボキシ末端ペプチド誘導体を含む。いくつかの実施形態は、それぞれが免疫学的エレメント（たとえばジスルフィド結合によって連結されたＦｃフラグメントまたは他のフラグメント）と結合し、同時に精製されて、二量体を生成する、ＡＡＴ分子を有する、１つを超える構築物の同時の合成に関する。他の実施形態は、本明細書において開示される方法および使用のための構築物を形成するために、１つまたはそれより多い免疫分子と結合されたまたは融合された、たとえば、分子のカルボキシ末端の最後の８０、７０、６０、５０、４０、３０アミノ酸のフラグメントまたは他のフラグメントを含む、ＡＡＴの１つまたはそれより多いカルボキシ末端誘導体またはフラグメントの構築物を生成することに関するものとすることができる。
【００４３】
本明細書において企図される構築物のＡＡＴ分子は、天然に存在するアルファ−１抗トリプシン（たとえばヒトもしくは他の哺乳動物）全体（またはシグナル配列もしくは他の指示配列を有する）、またはそのフラグメントもしくは誘導体、またはＡＡＴの変異体形態、有意なセリンプロテアーゼ阻害剤活性を有していない任意のＡＡＴ分子、またはその対立遺伝子（たとえば、およそ１００の天然に存在するＡＡＴ改変体がある）またはそのアナログまたはその融合タンパク質（たとえばヒトＩｇＧもしくはヒトＩｇＧのフラグメント）に関するものとすることができる。これらの実施形態に従って、構築物が、免疫学的フラグメント（たとえばＡＡＴの２つの分子を連結するＦｃフラグメント）と結合した二量体ＡＡＴ構築物を含むことができ、Ｆｃ−ＡＡＴ構築物が、１つまたはそれより多いジスルフィド結合によって相互に連結される。たとえば、本明細書において開示される図２Ａおよび図６Ａ〜６Ｂを参照されたい。ある方法において、組換えＡＡＴまたはＡＡＴペプチドおよび免疫分子複合体の精製が、精製ステップを著しく減らし、ＡＡＴまたはＡＡＴペプチドの効力を著しく増大させることによって、ＡＡＴまたはＡＡＴペプチドの活性を増大させる。これらの実施形態に従って、本明細書において企図される組換えＡＡＴ分子は、融合ポリペプチド（たとえば二量体もしくは単量体形態）として使用することができるまたは精製の後にその免疫分子から切断し、市販で入手可能な製剤と比較して、濃度を低下させて使用することができる。いくつかの実施形態は、市販で入手可能な製剤と比較して、１／２、１／４、１／１０〜１／１００の濃度の使用に関する。ある実施例において、これらの分子が、コントロール（たとえば、天然に存在するＡＡＴの典型的な精製および市販で入手可能な配合薬の精製）と比較して、サイトカインを阻害するまたは分子の免疫および炎症機能を調整するための組成物において使用することができる。一実施形態において、本出願の組換え分子が、現在の市販で入手可能な製剤よりも多くの活性を実証した。本発明のＡＡＴ構築物に関して関心があるとして知られている、ある活性は、免疫調節性または炎症調整活性を含む。いくつかの実施形態において、本明細書において開示される構築物は、市販で入手可能な組成物と比較して、ＩＬ−１β受容体アンタゴニスト活性が増大している。
【００４４】
ある実施形態において、被験体は、哺乳動物である。いくつかの実施形態において、哺乳動物は、ヒトである。さらに他の実施形態において、被験体は、男性、女性、妊娠している女性、小児、または年少者である。
【００４５】
健康状態の治療における組換えＡＡＴのいくつかの使用
本明細書において報告されるいくつかの実施形態は、ＡＡＴ療法を必要とする被験体を治療するために、組換えＡＡＴまたは融合タンパク質またはそのカルボキシ末端フラグメント融合分子を使用することに関する。ＡＡＴ治療は、アポトーシス関連性の状態、一酸化窒素関連性の状態、虚血再灌流機能不全誘発性の状態、移植片拒絶および細胞性拒絶、糖尿病、気腫、他の肺の状態、細菌性感染症の治療および予防、ウイルス感染症の治療および予防、放射線誘発性の傷害、ならびにその他同種のものを含むが、これらに限定されない様々な状態における使用について報告されてきた。
【００４６】
本明細書におけるいくつかの実施形態は、炎症障害（たとえばＩＢＤ、関節炎）を治療するために使用する組成物に関し、その状態を治療するための組成物は、セリンプロテアーゼ活性が低下しているまたは排除されている。
【００４７】
ある実施形態において、本明細書において開示される組成物および方法は、被験体において、炎症腸障害の発病を低下させるまたは予防するために使用することができる。これらの実施形態に従って、被験体における、ＩＢＳと関連する状態における低下は、おおよそ、約１０〜２０％、または約３０〜４０％、または約５０〜６０％、または約７５〜１００％の低下または阻害であり得る。これらの実施形態に従って、ＩＢＳまたはＩＢＤを有する被験体は、そのような組成物を受けていないコントロール被験体と比較して、消耗を低下させるまたはバリア機能の損失を低下させるもしくはそれを回復させるために、ＡＡＴまたはＡＡＴカルボキシ末端ペプチドの組換えまたは融合タンパク質の薬学的に許容され得る組成物により治療されてもよい。
【００４８】
本明細書におけるいくつかの実施形態は、急性または慢性の状態を有する被験体において、腸または腸管の透過性亢進を回復させることに関する。これらの実施形態に従って、腸または腸管の透過性亢進またはバリア機能の損失は、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、炎症性腸疾患、１型糖尿病、アレルギー、および喘息などのような慢性疾患によるものとすることができる。ある実施形態において、腸または腸管の透過性亢進を有する被験体は、毎日、毎週２回、毎週、または他の所定のレジメンなどのような所定のレジメンによって医療従事者によって治療することができる。
【００４９】
ある実施形態において、本明細書において開示される組成物は、糖尿病（たとえば１型および２型）、自己免疫性疾患などのような免疫疾患、炎症疾患、心障害、伝染病、および他を含むが、これらに限定されない、ある徴候を治療するために使用することができる。本明細書において開示されるいくつかの疾患は、炎症疾患、自己免疫性疾患、もしくは肺疾患または他と見なすことができる喘息などのように、１つを超えるカテゴリー下に入ってもよい。ある実施形態において、本明細書において開示される組成物は、関節リウマチなどのようなリウマチ性疾患、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、Ｉ型糖尿病、ならびに甲状腺、消化管、および中枢神経系の自己免疫性疾患（たとえば関節リウマチ、エリテマトーデス、シェーグレン症候群、強皮症、混合結合組織病、皮膚筋炎、多発筋炎、ライター症候群、およびベーチェット病）；中枢神経系の自己免疫性疾患（たとえば多発性硬化症、重症筋無力症、または脳脊髄炎）；胃腸系の自己免疫性疾患：（たとえばクローン病、潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患、セリアック病、スプルー）；甲状腺の自己免疫性疾患：（たとえば橋本甲状腺炎またはグレーブス病）；ならびに目の自己免疫性疾患（たとえばブドウ膜炎）を含むが、これらに限定されない自己免疫性疾患を治療するために使用することができる。本明細書において企図される自己免疫障害は、円形脱毛症、強直性脊椎炎（ｎｋｙｌｏｓｉｎｇ  ｓｐｏｎｄｙｌｉｔｉｓ，）、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫性アジソン病、副腎の自己免疫性疾患、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性卵巣炎および精巣炎、自己免疫性血小板減少症、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、セリアックスプルー皮膚炎、慢性疲労免疫異常症候群（ＣＦＩＤＳ）、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパシー、チャーグ−ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡、ＣＲＥＳＴ症候群、クローン病、円板状狼瘡、クリオグロブリン血症、線維筋痛線維筋炎、糸球体腎炎、ギラン−バレー、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、過敏性腸疾患（ＩＢＤ）、ＩｇＡニューロパシー、若年性関節炎、扁平苔癬、エリテマトーデス、メニエール病、混合結合組織病、多発性硬化症、１型または免疫媒介性真性糖尿病、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発軟骨炎、多発内分泌腺症候群、リウマチ性多発筋痛症（Ｐｏｌｙｍｙａｌｇｉａ  ｒｈｅｕｍａｔｉｃ）、多発筋炎および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象（Ｒａｙｎａｕｌｄ’ｓ  ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ）、ライター症候群、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、スティッフマン症候群、全身性エリテマトーデス、エリテマトーデス、高安動脈炎、側頭動脈炎（Ｔｅｍｐｏｒａｌ  ａｒｔｅｒｉｓｔｉｓ）／巨細胞性動脈炎、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、疱疹状皮膚炎脈管炎（ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ  ｈｅｒｐｅｔｉｆｏｒｍｉｓ  ｖａｓｃｕｌｉｔｉｓ）などのような脈管炎、白斑、ウェゲナー肉芽腫症、Ｔ細胞媒介性自己免疫性疾患、リウマチ性疾患、リウマチ性関節炎、ならびにエリテマトーデスに関するものとすることができる。
【００５０】
ある実施形態は、本明細書において開示される組成物により肝臓状態を治療することに関する。本明細書において開示される肝臓の状態は、肝臓疾患、肝硬変（ｃｉｒｒｏｈｏｓｉｓ）、ウイルス感染症（たとえば肝炎）、および過剰な炎症または免疫障害によって引き起こされる他の肝臓状態を含むが、これらに限定されない。
【００５１】
本明細書において開示される、ある実施形態において、組成物は、被験体において、自己免疫性疾患を治療するために使用することができる。本明細書において企図される自己免疫性疾患は、急性播種性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）、アジソン病、無ガンマグロブリン血症、円形脱毛症、筋萎縮性側索硬化症、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、抗合成酵素症候群（Ａｎｔｉｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、アトピー性アレルギー、アトピー性皮膚炎、自己免疫性再生不良性貧血、自己免疫性心筋症、自己免疫性消化器病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳疾患、自己免疫性リンパ増殖性症候群、自己免疫性の末梢性ニューロパシー、自己免疫性膵炎、自己免疫性多内分泌腺症候群、自己免疫性プロゲステロン皮膚炎（Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）、自己免疫性血小板減少性紫斑病、自己免疫性じんま疹、自己免疫性ブドウ膜炎、バロー病／バロー同心円性硬化症（Ｂａｌｏ  ｃｏｎｃｅｎｔｒｉｃ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、ベーチェット病、ベルガー病、ビッカースタッフ脳炎、ブラウ症候群、水疱性類天疱瘡、癌、キャッスルマン病、セリアック病、シャガス病、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパシー、慢性再発性多発性骨髄炎、慢性閉塞性肺疾患、チャーグ−ストラウス症候群、良性粘膜類天疱瘡、コーガン症候群、寒冷凝集素症、補体成分２欠乏症（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ２  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）、接触皮膚炎、頭蓋動脈炎、ＣＲＥＳＴ症候群、クローン病（２つのタイプの特発性炎症性腸疾患「ＩＢＤ」のうちの１つ）、クッシング症候群、皮膚白血球破砕性血管炎、デゴス病、ダーカム病、疱疹状皮膚炎、皮膚筋炎、真性糖尿病１型、びまん性皮膚全身性硬化症（Ｄｉｆｆｕｓｅ  ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、ドレスラー症候群、薬剤誘発性エリテマトーデス、円板状エリテマトーデス、湿疹、子宮内膜症、腱付着部炎関連関節炎（Ｅｎｔｈｅｓｉｔｉｓ−ｒｅｌａｔｅｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、好酸球性筋膜炎、好酸球性胃腸炎、後天性表皮水疱症、結節性紅斑、胎児性赤芽球症、クリオグロブリン血症、エバンス症候群、進行性骨化性線維形成異常症、線維化肺胞炎（または特発性肺線維症）、胃炎、胃腸類天疱瘡（Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｐｅｍｐｈｉｇｏｉｄ）、巨細胞性動脈炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギラン−バレー症候群（ＧＢＳ）、橋本脳症、橋本甲状腺炎、ヘーノホ−シェーンライン紫斑病、妊娠性疱疹、妊娠性天疱瘡（Ｇｅｓｔａｔｉｏｎａｌ  Ｐｅｍｐｈｉｇｏｉｄ）、汗腺膿瘍、ヒューズ−ストーヴィン症候群、低ガンマグロブリン血症、特発性炎症性脱髄疾患、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（自己免疫性血小板減少性紫斑病）、ＩｇＡ腎症、封入体筋炎、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパシー、川崎病、ランバート−イートン筋無力症候群、白血球芽細胞性脈管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、線状ＩｇＡ病（ＬＡＤ）、ルーゲーリック病、筋萎縮性側索硬化症、ルポイド肝炎、別名自己免疫性肝炎、エリテマトーデス、マジード症候群、顕微鏡的多発血管炎、ミラー−フィッシャー症候群、��ラン−バレー症候群、混合結合組織病、斑状強皮症、ムッハ−ハーベルマン病、急性痘瘡状苔癬状粃糠疹、多発性硬化症、重症筋無力症、筋炎、ナルコレプシー、視神経脊髄炎、デビック病、神経性筋強直症、眼類天疱瘡（Ｏｃｃｕｌａｒ  ｃｉｃａｔｒｉｃｉａｌ  ｐｅｍｐｈｉｇｏｉｄ）、眼球クローヌスミオクローヌス症候群、オード甲状腺炎（Ｏｒｄ’ｓ  ｔｈｙｒｏｉｄｉｔｉｓ）、回帰性リウマチ、ＰＡＮＤＡＳ（連鎖球菌と関連する小児自己免疫性の神経精神障害）、傍腫瘍性小脳変性症、発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）、パリーロンベルク症候群、パーソネージ−ターナー症候群、毛様体扁平部炎、尋常性天疱瘡、悪性の貧血、静脈周囲脳脊髄炎、ＰＯＥＭＳ症候群、結節性多発動脈炎、リウマチ性多発筋痛症、ＰＯＥＭＳ症候群、結節性多発動脈炎、リウマチ性多発筋痛症、多発筋炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、進行性炎症性ニューロパシー、乾癬、乾癬性関節炎、壊疽性膿皮症、赤芽球癆、ラズムッセン脳炎、レイノー症状、再発性多発軟骨炎、ライター症候群、下肢静止不能症候群、後腹膜線維症、関節リウマチ、リウマチ熱、サルコイドーシス、統合失調症、シュミット症候群、シュニッツラー症候群、強膜炎、強皮症、血清病、シェーグレン症候群、脊椎関節症、スティル病、若年性関節リウマチ、全身硬直症候群、亜急性細菌性心内膜炎（ＳＢＥ）、スザック症候群、スウィート症候群、シデナム舞踏病、交感性眼炎、全身性紅斑性狼瘡、高安の動脈炎、側頭動脈炎、血小板減少症、トロサ−ハント症候群、横断性脊髄炎、潰瘍性大腸炎、未分化脊椎関節症、未分化結合組織疾患、じんま疹様血管炎、じんま疹様血管炎、脈管炎白斑、およびウェゲナー肉芽腫症を含むが、これらに限定されない。
【００５２】
他の実施形態において、本明細書において開示される組成物は、アレルギー性疾患、たとえば関節炎、炎症性の骨溶解、喘息、慢性炎症（たとえば慢性ウイルスまたは細菌感染症由来の）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、脳炎、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、乾癬（たとえば尋常性乾癬、膿疱性乾癬、乾癬性紅皮症、滴状乾癬、または逆性乾癬（ｉｎｖｅｒｓｅ  ｐｓｏｒｉａｓｉｓ））、肺線維症、未分化関節症（ｕｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  ａｒｔｈｒｏｐａｔｈｙ）、未分化脊椎関節症を含むが、これらに限定されない、炎症性の状態などのような状態を治療することを含むことができる。他の状態は、呼吸器系の状態、たとえば喘息、ＣＯＰＤ、気腫を含むことができるが、これらに限定されない。嚢胞性線維症および閉塞性細気管支炎などのような、他の肺の状態が、企図される。
【００５３】
放射線防護および癌
ある実施形態において、組成物（たとえば構築物組成物）および方法は、被験体に対する放射線の副作用を調整することに関する。いくつかの実施形態において、組成物および方法は、たとえば、癌を有するまたは悪性疾患の発症もしくはコントロール不良の細胞の増殖が疑われる被験体に対して投与される場合に、放射線療法または放射線を有する被験体を治療することに関する。本明細書において開示される他の実施形態は、放射線治療の不利な副作用を低下させるために、たとえば偶然にまたは目的のある行為によって、放射線に対して曝露されたことがある被験体を治療することに関する。
【００５４】
本明細書において開示されるいくつかの実施形態は、癌療法を受けている被験体の治療に関する。これらの実施形態に従って、癌療法を受けている被験体は、治療の有害な影響（たとえば放射線および／または化学療法による治療からの）を低下させるまたは予防するために、本明細書において開示される組成物により治療することができる。癌治療は、膀胱癌、乳癌、腎臓癌、白血病、肺癌、骨髄腫、脂肪肉腫、リンパ腫、舌癌、前立腺癌、胃癌、結腸癌、子宮癌、黒色腫、膵癌、脳癌、眼癌、皮膚癌、および他の知られている癌のための治療を含むが、これらに限定されない。
【００５５】
他の実施形態において、本明細書において開示される組成物が、癌を有する被験体を治療するために使用することができる。これらの実施形態について企図される癌は、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、リンパ管肉腫、カポジ肉腫、リンパ管内皮肉腫（ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、横紋肉腫、結腸直腸がん、膵癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、黒色腫、扁平上皮がん、基底細胞がん、腺がん、汗腺がん、脂腺がん、乳頭状がん、乳頭腺癌、嚢胞腺がん、髄様がん、気管支原性がん、腎細胞がん、肝癌、胆管がん、絨毛がん、セミノーマ、胎児性がん、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺がん、小細胞肺がん、膀胱がん、上皮がん、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、脳室上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、骨髄腫、リンパ腫、白血病、または他の知られている癌を含むが、これらに限定されない。
【００５６】
他の実施形態は、本明細書において開示される放射能障害予防および組成物に関して、化学療法の間の、ホルモン療法と組み合わせての、および／または免疫療法の併用としての、三叉神経痛のための治療、重度の甲状腺眼疾患のための治療、翼状片のための治療、色素性絨毛結節性滑膜炎のための治療、ケロイド瘢痕増殖の予防、異所性骨化の予防、美容、形成、または再建手術の適用による外科手術（たとえば瘢痕形成を低下させる）を含み、それに関するものとすることができる。本明細書におけるある実施形態において、融合ポリペプチドを含有する組成物は、形成外科手術を受けているまたは受けたことがある被験体において、炎症を低下させるために使用することができる。そのような組成物の投与は、被験体の炎症および瘢痕を低下させるために使用されてもよい。
【００５７】
ある副作用は、放射線被曝の間におよび放射線療法または化学療法の副作用としてさえ生じ得る。本明細書におけるいくつかの実施形態は、本明細書において開示される組成物により、被験体を治療することによる、被験体におけるこれらの副作用の低下または予防に関する。組成物は、ＡＡＴの組換え形態および／またはＡＡＴカルボキシ末端ペプチドの組換え形態（たとえば８０アミノ酸長、３６アミノ酸長など）を含むことができる。放射線療法の副作用は、細胞の損傷、痛み、腫脹、局所刺激、線維症、瘢痕化、組織の完全性の損失、組織脆弱性の増大、嚥下困難、および放射線治療または被曝と関連する他の症状を含むことができるが、これらに限定されない。低下させるまたは予防することができる他の副作用は、たとえば骨髄移植の間の全身照射（ＴＢＩ）からの副作用に関する。これらの副作用は、上記のものならびにそのうえ、急性および慢性免疫不全ならびに日和見感染症を含むことができる。
【００５８】
本明細書において開示されるいくつかの実施形態は、前立腺癌を有するまたは発症が疑われる被験体を治療することに関する。これらの実施形態に従って、前立腺癌を有するまたはその発症が疑われる男性の被験体は、これらの療法に起因する副作用を低下させるために、放射線および／または化学療法による治療の前に、その間に、またはその後に、本明細書において開示される組成物（複数可）により治療することができる。たとえば、副作用は、インポテンスまたは勃起障害の発症を含むが、これらに限定されない。
【００５９】
本明細書において企図される他の状態は、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥまたは狼瘡）、関節リウマチ、敗血症、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥまたは狼瘡）、関節リウマチ、炎症性腸疾患、敗血症、自己免疫性疾患、アテローム性動脈硬化症、アルツハイマー病、関節炎、筋ジストロフィー、ダウン症候群、多発性硬化症、発作、神経変性障害、他の炎症疾患または状態、および血清陰性脊椎関節症を含む。
【００６０】
移植片拒絶および移植片生着
他の実施形態において、本明細書において企図される組換えまたは融合ポリペプチド（たとえばＦｃ−ＡＡＴまたはＦｃ−ＡＡＴフラグメント）は、器官または非器官（たとえば細胞の）移植などのような移植を受けている被験体を治療するために使用することができる。ある実施形態において、細胞の移植は、骨髄、島細胞（たとえば島同種移植）、角膜細胞、幹細胞、皮膚（たとえば細胞もしくはそれよりも大きな）、皮膚の一時的な死体からの移植（たとえば軟部組織、顔面、もしくは他）、または移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）などのような細胞の移植拒絶反応に関する状態を含むことができる。本発明の実施形態は、移植されたまたはそれを必要とする被験体が経験した症状またはサインを寛解させるための方法を提供する。これらの実施形態に従って、症状またはサインは、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）または移植片拒絶と関連する状態を含んでいてもよい。一実施例において、本明細書において開示される方法が、骨髄移植を受けている被験体を治療するために使用されてもよい。他の実施形態において、本明細書において開示される方法は、幹細胞または他の細胞の移植を受けている被験体を治療するために使用されてもよい。これらの実施形態に従って、被験体が、移植拒絶を低下させる、移植の細胞を保護する、および／または移植された細胞（移植片）生着を延長するために治療されてもよい。他の実施形態は、心臓、肺、腸管、肝臓、膵臓、腎臓、または他の臓器移植などのような臓器移植を受けている被験体を治療することを含むことができる。
【００６１】
一実施例において、本明細書において開示される方法が、骨髄移植を受けている被験体を治療するために使用されてもよい。これらの実施形態に従って、被験体は、被験体において、移植片拒絶および／またはＧＶＨＤを低下させるまたは予防するために、骨髄移植の前に、その間に、またはその後に治療することができる。
【００６２】
他の実施形態において、本明細書において開示される組成物および方法は、臓器移植拒絶の発生を予防するまたは低下させることに関する。他の実施形態において、本明細書において開示される組成物および方法は、器官移植を延長することに関する。本明細書において企図される移植は、腎臓、心臓、肝臓、軟部組織の移植、顔の構成成分移植、腸管移植、および膵移植に関する。そのうえ、本明細書において開示される組成物は、器官または非器官の移植と関連する症状の低下または予防に関する。本明細書において開示される組成物による移植を受けている被験体を治療することによって低下させるまたは予防することができる症状は、移植片拒絶、腎不全、肺不全、心不全、粘膜潰瘍、島機能の低下（グルコースの増大、真性糖尿病）、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、胃腸（ＧＩ）潰瘍、肺の不全、皮膚潰瘍、凝血異常、ＣＮＳ機能不全、および昏睡を含むことができる。
【００６３】
本発明の実施形態は、被験体において、移植片生着および機能の延長を促すための方法であって、組換えＡＡＴまたはその融合タンパク質の物質および薬学的に許容され得る賦形剤を含む、治療有効量の組成物を、その必要のある被験体に対して投与するステップを含む、方法を提供する。
【００６４】
ある実施形態において、被験体は、哺乳動物である。いくつかの実施形態において、哺乳動物は、ヒトである。さらに他の実施形態において、被験体は、男性、女性、妊娠している女性、小児、または年少者である。
【００６５】
本発明のさらに他の態様は、移植前の器官または細胞保存に関する。たとえば、凍結保護または輸送の間の保護または他の保存方法は、本明細書において開示される組成物に対して、器官、組織、または細胞を曝露することによって増強されてもよい。本明細書における、ある実施形態は、移植のためのまたは凍結保護のための調製において、器官、組織、または細胞を保護するための、本明細書において開示される組成物の使用に関する。これらの実施形態に従って、器官、組織、または細胞は、本明細書において開示されるもののいずれか、たとえば、膵島細胞、幹細胞、骨髄細胞、腎臓、肝臓、肺、および他の器官または細胞の移植を含むことができる。
【００６６】
本発明のある実施形態において、本明細書において開示される組成物は、併用療法をさらに含むことができる。たとえば、併用療法は、単独でまたは一緒に使用される、１つまたはそれより多いインターフェロン、ベタセロンを含むインターフェロン誘導体、ベータ−インターフェロン、イロプロストを含むプロスタン誘導体、シカプロスト；コルチゾール、プレドニゾロン、メチル−プレドニゾロン、デキサメタゾンを含むグルココルチコイド；シクロスポリンＡ、ＦＫ−５０６、メトキサレン（ｍｅｔｈｏｘｓａｌｅｎｅ）、サリドマイド、スルファサラジン、アザチオプリン、メトトレキサートを含む免疫抑制薬；ジロートン、ＭＫ−８８６、ＷＹ−５０２９５、ＳＣ−４５６６２、ＳＣ−４１６６１Ａ、ＢＩ−Ｌ−３５７を含むリポキシゲナーゼ阻害剤；ロイコトリエンアンタゴニスト；ＡＣＴＨおよびそのアナログを含むペプチド誘導体；可溶性ＴＮＦ受容体；ＴＮＦ抗体；インターロイキン、他のサイトカイン、Ｔ細胞タンパク質の可溶性受容体；インターロイキン、他のサイトカイン、Ｔ細胞タンパク質の受容体に対する抗体；ならびにカルシポトリオール；Ｃｅｌｃｅｐｔ（登録商標）、ミコフェノール酸モフェチル、およびその類似体を含むが、これらに限定されない。
【００６７】
ある実施形態において、心筋梗塞を有するまたはそれを有することが疑われる被験体に対して、心臓の状態の症状または副作用を寛解させるために、本明細書において開示される組成物を投与することができる。ある実施形態において、本明細書において開示される組成物は、心臓の心室リモデリングを低下させるまたは予防するために使用することができる。本明細書において開示される任意の状態を治療するための方法は、心イベントの前に、その間に、またはその後に、組成物を投与することを含むことができる。ある実施形態において、組成物は、心イベントが被験体において生じた後に、最適の効能を有するように医療従事者によって決定される期間、被験体に対して投与することができる。たとえば、被験体は、イベント後に、１週間まで、２週間まで、またはそれ以上、組成物により治療されてもよい。ある実施形態において、本明細書において記載される被験体に対して投与される組成物は、１用量当たり．００１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの組換えまたはＡＡＴ融合分子などのように、市販で入手可能なＡＡＴ製剤（たとえばＡｒａｌａｓｔ（商標）、Ｐｒｏｌａｓｔｉｎ  Ｃ（商標））を使用するよりも、５倍、１０倍、１００倍、または１，０００倍少ないものとすることができる。
【００６８】
糖尿病
そのうえ、本明細書において開示される組成物は、被験体において、疾患を治療するために、糖尿病を有する任意の被験体に対して投与されてもよい。１型または２型糖尿病を有する被験体は、その疾患を治療するまたは疾患症状を治療するために、本明細書において開示される組成物を投与されることができる。これらの治療は、糖尿病について当技術分野において知られている任意の治療と組み合わせることができる。ある実施形態において、本明細書において開示される組成物は、糖尿病を有する被験体を治療するために、現在入手可能な市販の製剤と比較して、レベル（たとえば濃度）を低下させて、被験体に対して投与することができる。これらの実施形態に従って、糖尿病を有する被験体は、たとえば、検出できるｃ−ペプチドレベルによりおよび／または検出できるインスリン産生によりおよび／または残存している島細胞機能により、５歳以内に診断されるものなどのような、早期発症型の糖尿病１型を有する被験体とすることができる。
【００６９】
他の実施形態は、インビボにおいて（たとえば、島細胞機能を保護するもしくは復活させるために）またはインビトロにおいて（たとえば移植のための輸送の間に）、島細胞を防御するための、本明細書において開示される組成物の使用に関するものとすることができる。本明細書において開示される組成物は、いくつかの残っている島細胞機能を有する糖尿病を有する被験体を治療するおよび／または島細胞を保護するために被験体において移植前に島細胞を治療するために使用することができることが企図される。そのため、被験体は、島細胞移植前に、その間に、またはその後に治療されてもよい。他の実施形態において、糖尿病治療は、インスリン抵抗性糖尿病、Ｉ型、およびＩＩ型を有する被験体を治療することを含むことができる。
【００７０】
心臓の状態
本発明のいくつかの実施形態は、心臓の状態を有するまたは心臓病の介入（たとえば外科手術、予防の治療）を受けている被験体を治療することを含む。これらの実施形態に従って、心臓の状態を有する被験体は、以下の状態、心筋梗塞、心筋虚血、慢性全身性動脈性および静脈性高血圧、肺動脈および静脈高血圧、先天性心疾患（心臓内シャンティングを有するおよび有していない）、心臓弁膜症、特発性拡張型心筋症、感染性および非感染性心筋炎、ストレス心筋症（救急疾患（ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｃａｒｅ  ｉｌｌｎｅｓｓ）、物理的および情動ストレス、ならびに頭蓋内出血および発作と関連して見られるような）、敗血症性心筋症、心房性および心室性不整脈、心内膜炎、心膜炎、心筋に対する損傷、心臓麻痺、心停止、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）、心筋虚血再灌流傷害、心室リモデリング、求心性肥大、遠心性肥大、ならびに他の知られている心臓の状態を含むが、これらに限定されない、１つまたはそれより多い状態を有していてもよい。
【００７１】
ある実施形態において、心筋梗塞を有するまたはそれを有することが疑われる被験体に対して、心臓の状態の症状または副作用を寛解させるために、本明細書において開示される組成物を投与することができる。ある実施形態において、本明細書において開示される組成物は、心臓の心室リモデリングを低下させるまたは予防するために使用することができる。本明細書において開示される任意の状態を治療するための方法は、心イベントの前に、その間に、またはその後に、組成物を投与することを含むことができる。ある実施形態において、組成物は、心イベントが被験体において生じた後に、最適の効能を有するように医療従事者によって決定される期間、被験体に対して投与することができる。たとえば、被験体は、イベント後に、１週間まで、２週間まで、またはそれ以上、組成物により治療されてもよい。ある実施形態において、本明細書において記載される被験体に対して投与される組成物は、１用量当たり．００１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの組換えまたはＡＡＴ融合分子などのように、市販で入手可能なＡＡＴ製剤（たとえばＡｒａｌａｓｔ（商標）、Ｐｒｏｌａｓｔｉｎ  Ｃ（商標））を使用するよりも、５倍、１０倍、１００倍、または１，０００倍少ないものとすることができる。
【００７２】
胃腸障害
本発明のいくつかの実施形態は、胃腸障害または状態（たとえば間欠性、孤立性、または慢性状態）を有する被験体を治療することを含む。これらの実施形態に従って、胃腸状態を有する被験体は、炎症性腸疾患（たとえばＩＢＳまたはＩＢＤ）、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、クローン病（ＣＤ）、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、アレルギー関連性の腸疾患、１型糖尿病に関連性の腸疾患、他の大腸炎のタイプ（たとえばコラーゲン形成大腸炎、虚血性大腸炎、便流変更性大腸炎（ｄｉｖｅｒｓｉｏｎ  ｃｏｌｉｔｉｓ）、未確定の大腸炎）、腸の炎症と関連するベーチェット症候群、および他の腸障害を含むが、これらに限定されない、１つまたはそれより多い状態を有していてもよい。ある実施形態において、腸障害の症状または副作用が、本明細書において開示される組成物によって治療することができる。たとえば、腸障害の副作用は、皮膚症状発現、体重減少、結腸短縮、腸粘膜、腸または腸管の透過性亢進を含むが、これらに限定されない。ある実施形態は、障害を有する被験体において、体重減少を低下させるまたは予防するために、本明細書において開示される組成物により、腸障害を有する被験体を治療することを含むことができる。
【００７３】
細菌性の状態
本発明のいくつかの実施形態は、細菌性感染症を有する被験体を治療することを含む。他の実施形態は、被験体において、細菌性感染症を予防するために、本明細書において開示される組成物を投与することを含むことができる。本明細書において企図される細菌性感染症は、グラム陰性もしくはグラム陽性細菌またはマイコバクテリウム生物を含むが、これらに限定されない。グラム陰性細菌は、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎ．ｍｅｎ  ｉｎｇｉｔｉｄｉ、Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ、Ｈ．ｉｎｊｉｕｅｎｚａｅ、大腸菌、すべてのＫｌｅｂｓｉｅｌａ種、すべてのＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ種、すべてのＳｅｒｒａｔｉａ種、すべてのＳａｌｍｏｎｅｌｌａ種、Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ、Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ、すべてのＰｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ種、すべてのＭｏｒｇａｎｅｌｌａ種、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、すべてのＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ種、すべてのＰａｓｔｅｕｒｅｌｌａ種、すべてのＡｅｒｏｍｏｎａｓ種、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｅｐａｃｉａ、すべてのＳｈｉｇｅｌｌａ種、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ、すべてのＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ種、すべてのＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ種、Ｙ．ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ、他のＹｅｒｓｉｎｏｉｉｏｓｉｓ、Ｈ．ｄｕｃｒｅｙｅｉｉ、すべてのＣｈｌａｍｙｉｄｉａ種、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｐ．ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃａ、すべてのＭｏｒａｘｅｌｌａ種、すべてのＢｏｒｔｅｄｅｌｌａ種、およびＰ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａを含むことができるが、これらに限定されない。
【００７４】
本明細書において企図されるマイコバクテリウムは、Ｍ．ｂｏｖｉｓ、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、マイコバクテリウムアビウムコンプレックス（ＭＡＣ）生物、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ、Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、ハンセン病を引き起こす（Ｍ．ｌｅｐｒａｅ、Ｍ．ｆｌａｖａｓｃｅｎｓ、Ｍ．ｌｅｐｒａｅｍｕｒｉｕｍ、Ｍ．ｍｉｃｒｏｔｉ、Ｍ．ｃｈｅｌｏｎｅｉ、Ｍ．ａｆｒｉｃａｎｕｍ、Ｍ．ｍａｒｉｎｉｕｍ、Ｍ．ｂｕｒｕｌｉ、Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ、Ｍ．ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｍ、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ、Ｍ．ｌｉｔｔｏｒａｌｅ、Ｍ．ｍａｌｍｏｅｎｓｅ、Ｍ．ｍａｒｉａｎｕｍ、Ｍ．ｓｉｍｉａｅ、Ｍ．ｓｚｕｌｇａｉ、Ｍ．ｕｌｃｅｒａｎｓ、Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ、Ｍ．ｇａｓｔｒｉ、Ｍ．ｐｈｌｅｉ、Ｍ．ｎｏｎｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃｕｍ、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ、Ｍ．ｔｅｒｒａｅ、Ｍ．ｔｒｉｖｉａｌ、Ｍ．ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ、Ｍ．ｘｅｎｏｐｉ、Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ、Ｍ．ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｍ、Ｍ．ｇｅｎａｖｅｎｓｅ、Ｍ．ｓｉｍｉａｅ、Ｍ．ｖａｃｃａｅを含むことができるが、これらに限定されない。
【００７５】
本明細書において企図されるグラム陽性細菌は、Ｃ．ｔｅｔａｎｉ、Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＧ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ，Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｌｌｅｒｉ群、Ｖｉｒｉｄａｎｓ  ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、すべてのＬｉｓｔｅｒｉａ種、すべてのＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＭＳＳＡ）、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）、Ｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ、すべてのＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種、Ｃ．ｄｉｐｔｈｅｒｉｅａ、Ｃ．ｊｅｉｋｉｕｍ、すべてのＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ種、すべてのＬｅｕｋｏｎｏｓｔｏｃ種、ならびにＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ（たとえば、炭疽を引き起こす）を含むが、これらに限定されない。
【００７６】
ある実施形態において、本明細書において開示される組成物は、細菌性の状態を有する被験体を治療するために使用され、細菌関連性の状態の発病を低下させるまたは予防することができる。
【００７７】
ウイルス性の状態
本発明のいくつかの実施形態は、ウイルス感染症を有する被験体を治療することを含む。他の実施形態は、被験体において、ウイルス感染症を予防するまたはウイルス感染症を治療するために、本明細書において開示される組成物を投与することを含むことができる。本明細書において企図されるウイルス感染症は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）  ＡＩＤＳ、インフルエンザウイルス（たとえばＡ、Ｂ、Ｃ、インフルエンザＡ  Ｈ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２、Ｈ３Ｎ２、Ｈ９Ｎ２、Ｈ７Ｎ２、Ｈ１０Ｎ７型）、帯状疱疹、単純ヘルペス、ヒトパピローマウイルス、大痘瘡ウイルス（痘瘡）、ラッサ熱ウイルス、鳥インフルエンザ、ＡＩＤＳ関連症候群、水痘（水疱瘡）、サイトメガロウイルス、コロラドダニ熱ウイルス、デング熱、エボラ出血熱、手足口病、肝炎、ＨＰＶ、感染性単核症、ムンプス、灰白脊髄炎、進行性多巣性白質脳症（Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｍｕｌｔｉｆｏｃａｌ  ｌｅｕｋｏｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ）、狂犬病、風疹、ＳＡＲＳ、ウイルス性脳炎、ウイルス性胃腸炎、ウイルス性髄膜炎、西ナイル病、黄熱病、マールブルグ出血熱、麻疹、および他のウイルス関連性の障害を含むことができるが、これらに限定されない。
【００７８】
本明細書において開示される他の実施形態は、被験体において、ウイルス複製および／または感染症を阻害することによって、ウイルスによって誘発される癌を低下させるまたは予防することに関する。ウイルスによって誘発される癌は、ラウス肉腫誘発性の癌、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）誘発性の癌、ポリオーマ誘発性の癌、Ｂ型肝炎ウイルス誘発性の癌、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、血管肉腫、脊索腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、中皮腫、滑膜腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、横紋肉腫、結腸直腸がん、膵癌、乳癌、黒色腫、前立腺癌、卵巣癌、扁平上皮がん、基底細胞がん、脂腺がん、腺がん、汗腺がん、乳頭状がん、肝癌、嚢胞腺がん、乳頭腺癌、気管支原性がん、髄様がん、腎細胞がん、セミノーマ、胆管がん、子宮頸癌、ウィルムス腫瘍、胎児性がん、肺がん、絨毛がん、精巣腫瘍、膀胱がん、上皮がん、小さな細胞肺がん、頭蓋咽頭腫、髄芽腫、星状細胞腫、神経膠腫、脳室上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫（ｍｅｎａｎｇｉｏｍａ）、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、骨髄腫、リンパ腫、および白血病を含むことができるが、これらに限定されない。さらに他の実施形態は、ウイルス性肺炎および気管支肺炎に関する。
【００７９】
ある実施形態において、本明細書において開示される組成物は、ウイルス感染症を有する被験体を治療するために使用され、ウイルス関連性の状態の発病を低下させるまたは予防することができる。たとえば、本明細書において開示される組成物は、被験体において、ウイルスの伝染を低下させ、ウイルス複製を低下させるために、ウイルス感染症を有する被験体を治療するために使用することができる（たとえば、被験体から被験体に伝染するインフルエンザまたは他の疾患）。
【００８０】
他の例示的な実施形態において、本明細書において開示される組成物は、被験体において、炎症および尿酸結晶の産生を低下させるように、被験体において、痛風を治療するために使用することができる。これについては、痛風性関節炎のモデルは、痛風の炎症におけるＩＬ−１βの役割に基づいて用いることができる（市販で入手可能な製剤を使用して以前に示されるモデル）。このモデルにおいて、ＭＳＵおよびＣ１８脂肪酸を混合し、マウスモデルとしてのＣ５７Ｂｌａｃｋ６マウスの膝蓋下の空間に注射することができる。組換えヒトＦｃ−ＡＡＴは、マウスの膝蓋下の空間に、２μｇで、単独で関節内（ｉ．ａ．）注射し、検査することができる。他の試験グループでは、マウスにＭＳＵ／Ｃ１８を注射することができる。マウスの他のセットにおいて、ＭＳＵ／Ｃ１８および本明細書において開示される組成物の組み合わせを注射することができる。マウスの膝は、次いで、血漿由来のＡＡＴによるモデルにおいて行われるように、炎症について検査することができる。一実施例において、滑膜に浸潤する細胞の数を、観察することができる。
【００８１】
様々なペプチドの構築物
本明細書における実施形態は、組換えＡＡＴまたはＡＡＴに由来する１つまたはそれより多いカルボキシ末端ペプチド（たとえば、ＡＡＴの最後の８０アミノ酸において見つけられる、ＡＡＴのカルボキシ末端ペプチド、もしくはＡＡＴの最後の３６アミノ酸において見つけられる、ＡＡＴのカルボキシ末端ペプチドなど）を有する組換え体の生成および使用を提供する。これらの実施形態に従って、たとえば、ペプチドの半減期を増大させるおよび／または免疫分子結合を通して融合ポリペプチドをさらに指示するために免疫分子を使用するために免疫分子に連結される融合ポリペプチドを、生成することができる。本明細書において設計される構築物は、市販で入手可能な製剤と同じくらい活性なものとすることができるか、または市販の製剤よりも、特定の活性、たとえば抗炎症活性においてより活性なものとすることができる。
【００８２】
本発明の一実施形態において、組成物は、ＡＡＴ療法（たとえば哺乳動物由来ＡＡＴによる治療または補充）を必要とする被験体を治療するための、たとえば、ＡＡＴおよびその誘導体に対応するカルボキシ末端アミノ酸ペプチドを含む、一連のペプチドを投与するための構築物を含んでいてもよい。これらのペプチドは、融合構築物の一部である
【００８３】
【化１】
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およびその任意の組み合わせを含むペンタペプチドを含むことができる。
【００８４】
他の実施形態において、本明細書における構築物、医薬組成物、および方法における使用のために企図されるＡＡＴペプチドは、カルボキシ末端アミノ酸と結合した、配列番号１または配列番号３３のそれらの特定のＡＡＴペプチドのいずれかおよびすべてを含むように意図される（最も一般的な形態が、サブタイプＭ１、Ｍ２、Ｍ３などを有するＭタイプである、３９４アミノ酸の天然に存在するＡＡＴもまた、本明細書において企図される）。抗炎症性活性および／または免疫制御活性を持つＡＡＴポリペプチドはすべて、本明細書において開示される方法における使用について企図される。３１５〜３９４の範囲にわたるアミノ酸、３２５〜３８４、３５８〜３９４、３４０〜３８０などの範囲にわたるアミノ酸などのような、ＡＡＴのまたはＡＡＴ様の活性をまねる連続アミノ酸の任意の組み合わせが、使用されてもよい。そのうえ、カルボキシ末端の５アミノ酸長、１０アミノ酸長、１５アミノ酸長、２０アミノ酸長、２５アミノ酸長、３０アミノ酸長、３５アミノ酸長などのような連続アミノ酸配列の組み合わせもまた、使用することができる。たとえば、配列番号１  ＡＡ  ３１４〜３９４由来の５アミノ酸長、１０アミノ酸長、１５アミノ酸長、２０アミノ酸長の連続アミノ酸の任意の組み合わせは、本明細書において企図される構築物を開発するまたは精製するのに使用することができる。
【００８５】
ある実施形態は、組換え融合ポリペプチドまたはタンパク質を生成することに関し、ＡＡＴ分子全体（たとえば配列番号１もしくは３３）またはＡＡＴのカルボキシ末端アミノ酸領域に由来するペプチド分子を、ＩｇＧまたはそのフラグメントに連結することを含む。ＡＡＴの一般的な１つの形態は、配列番号３３によって示される。本明細書において企図される１つの構築物は、配列番号３２（たとえばＡＡＴ全体、リーダー配列、および免疫グロブリン分子のＦｃ部分）ならびに配列番号４８（リンカーを有するＡＡＴ全体および免疫グロブリン分子のＦｃ部分）として参照される。これらの構築物は、本明細書において開示される組成物において二量体としてまたは単量体形態として使用することができる。これらの実施形態に従って、薬学的に許容され得る組成物は、Ｆｃ−ＡＡＴの二量体またはＦｃ−ＡＡＴの単量体またはＦｃから切断されたＡＡＴまたはその組み合わせおよび薬学的に許容され得る賦形剤を含むことができる。そのうえ、点変異は、ヒンジ領域の可動性を低下させ、かつ新規なＦｃ−ＡＡＴ分子を生成するために、Ｆｃ領域中に作製することができる。
【００８６】
【化２】
2020171316.tif 000003
他の実施形態において、ＡＡＴプロテアーゼ結合ドメインは、分子のプロテアーゼ機能を低下させ、または排除し、かつエラスターゼ活性を阻害しないように、変異させることができ、これらの分子は、本明細書において企図される任意の構築物において使用することができる。ある実施形態において、変異ＡＡＴは、本明細書において開示される方法によってＡＡＴ構築物を生成するために使用することができる。他の実施形態において、変異分子（たとえば、プロテアーゼ活性が低下した、またはプロテアーゼ活性が本質的にない）は、その抗炎症効果および／または免疫調節性の効果を保持し、ＡＡＴ療法を必要とする被験体において、抗炎症分子として使用することができる。当業者は、ＡＡＴの非プロテアーゼ結合ドメインおよび天然に存在するＡＡＴのカルボキシ末端の最後の８０アミノ酸と称されるものを理解するであろう。
【００８７】
上記の列挙される方法のそれぞれにおいて、α１−抗トリプシンまたはそのカルボキシ末端ペプチド誘導体は、本明細書における組成物における使用について企図される。これらのペプチド誘導体は、ＡＡＴの最後の８０のカルボキシ末端由来アミノ酸を含有するアミノ酸ペプチド、
【００８８】
【化３】
2020171316.tif 000004
、またはその任意の組み合わせを含んでいてもよいが、これらに限定されない。ある実施形態において、ＡＡＴのカルボキシ末端ペプチドは、配列番号３３によって同定される、天然に存在するＭタイプのアミノ酸配列に対して、８０％、または８５％、または９０％、または９５％、または９９％同一である。ある実施形態において、約２、約３、もしくは約４、または約５つのアミノ酸が、Ｍタイプの配列のカルボキシ末端由来の８０アミノ酸長と異なり得る（たとえば様々な点変異）。
【００８９】
ある実施形態は、配列番号３２または配列番号４８の構築物の組成物を含む。これらの実施形態に従って、組成物は、医薬組成物とすることができる。
【００９０】
ある実施態様において、ＳＥＣ受容体に結合することができる組換えＡＡＴもしくはＡＡＴ由来のカルボキシ末端ペプチドの組成物またはＡＡＴ様の活性を有する組成物が、その必要のある被験体に対して投与されてもよい。本明細書において開示されるように、ＡＡＴのカルボキシ末端領域は、配列番号３１または配列番号３３または他のヒトＡＡＴ分子または他の天然に存在するＡＡＴ分子の最後の８０アミノ酸を含む。他の実施形態において、ＡＡＴに由来するペプチドは、５アミノ酸長、１０アミノ酸長、２０アミノ酸長、２５アミノ酸長、３０アミノ酸長、３５アミノ酸長、４０アミノ酸長、５０アミノ酸長、および８０アミノ酸長までのＡＡＴ分子を含むことができ、企図されるペプチドのいずれも、有意なセリンプロテアーゼ阻害剤活性を有さず、ＡＡＴのカルボキシ末端に由来し、かつ放射線を受けている被験体または偶然もしくは他の原因によって多量の線量の放射線に対して曝露された被験体を治療するために使用することができる。
【００９１】
一実施形態において、構築物は、ＳＥＣ受容体と関係するまたは結合する化合物を含んでいてもよい。列挙される方法のいくつかにおいて、有意なセリンプロテアーゼ阻害剤活性を有しない、ＡＡＴ変異体またはＡＡＴ由来ペプチド（たとえば哺乳動物由来の）は、ＡＡＴに対応するカルボキシ末端アミノ酸ペプチドを含む、一連のペプチドを含むことができる、本発明の組成物および使用内での使用のために企図される。そのうえ、５アミノ酸長、または１０アミノ酸長、または２０アミノ酸長、または３０アミノ酸長、またはそれ以上のアミノ酸の組み合わせもまた、使用することができる。たとえば、１つまたはそれより多い５アミノ酸長または１０アミノ酸長または２０アミノ酸長などは、配列番号１として示される天然に存在するＡＡＴのＡＡ  ３１５から始まり、ＡＡ  ３９４で終わる連続アミノ酸を含むことができる。本明細書において企図されるように、カルボキシ端に向う、配列の後半部分は、カルボキシ末端と呼ばれる。ある実施形態において、カルボキシル末端から後方に行くＡＡＴのカルボキシルドメインは、異なる種の間でほとんど保存されており、ＡＡＴのプロテアーゼ結合ドメインに関与しないアミノ酸として定義される。そのうえ、他の実施形態において、ＡＡＴプロテアーゼ結合ドメインは、分子のプロテアーゼ機能を低下させるまたは排除するために変異させることができ、この分子は、本明細書において企図される任意の組成物において使用することができる。他の実施形態において、変異させたＡＡＴ関連分子は、その抗炎症および／または免疫調節性の効果を保持することができる。カルボキシルドメインが、他のＡＡＴ活性を有する非プロテアーゼ結合ドメインであるということもまた、本明細書において企図される。当業者は、ＡＡＴの非プロテアーゼ結合ドメインを理解するであろう。
【００９２】
上記に列挙される方法のそれぞれにおいて、本明細書における組成物は、ＡＡＴのカルボキシ末端に由来するペプチドを含んでいてもよい。ある実施形態において、本明細書における方法および組成物において使用されるＡＡＴ結合分子は、配列番号１、天然に存在するＡＡＴ（血清から単離されたＡＡＴのおよそ９０％を構成する３９４ＡＡ長の分子）、他のＡＡＴ  Ｍ−タイプ、または他のＡＡＴ分子の組成物を含むことができるが、これらに限定されない。
【００９３】
本明細書における使用のうちで、本明細書において開示される融合分子の組換え体との比較および／またはコントロールのための市販で入手可能な製剤は、Ａｒａｌａｓｔ（商標）（Ｂａｘｔｅｒ）、Ｚｅｍａｉｒａ（商標）（Ａｖｅｎｔｉｓ  Ｂｅｈｒｉｎｇ）、Ｐｒｏｌａｓｔｉｎ（商標）もしくはＰｒｏｌａｓｔｉｎＣ（商標）（Ｔａｌｅｃｒｉｓ）、Ａｐｒｏｔｏｎｉｎ（商標）もしくはＴｒａｓｙｌｏｌ（商標）（Ｂａｙｅｒ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、Ｕｌｉｎｉｓｔａｔｉｎ（商標）（Ｏｎｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，  Ｉｎｃ．）、ならびに吸入および／もしくは注射用ＡＡＴ（Ｋａｍａｄａ，  Ｌｔｄ．、Ｉｓｒａｅｌ）または他の市販で入手可能なＡＡＴ組成物またはその任意の組み合わせを含むことができる。
【００９４】
他の実施形態は、ヒトＡＡＴの変異体に関し、変異体は、抗炎症活性が増大している。変異体を生成するための、当技術分野において知られている任意の方法が、企図される。いくつかの実施形態は、有意なセリンプロテアーゼ阻害剤活性を有しないｈＡＴＴを生成するために部位特異的変異誘発を使用することを含む（実施例のセクションおよびｐＥＦ−ｈＡＡＴを参照されたい）。いくつかの実施形態において、組成物は、変異ヒトアルファ−１抗トリプシン（ｈＡＡＴ）を有する医薬組成物とすることができ、ＡＡＴが、ＡＡＴの反応中心ループ（ＲＣＬ）内のＡＡＴのプロテアーゼ結合部位に１つまたはそれより多い点変異を有するＡＡＴを含む。これらの１つ以上点変異は、コントロールヒトＡＡＴと比較して、ＡＡＴのセリンプロテアーゼ阻害活性を有意に低下させるまたは排除することができる。他の方法は、ｈＡＡＴの加熱などのような他の破壊方法によってｈＡＡＴのセリンプロテアーゼ阻害領域を破壊することまたはセリンプロテアーゼ阻害剤活性を排除するまたは劇的に低下させるための、ＲＣＬ内の３５７位でのシステイン残基へのプロリンの修飾によりＲＣＬ変異体などのような他の変異体を生成することを含む。ある実施形態において、融合分子は、ＦＣ（たとえばＩｇＧ１、２、３、または４）を、ＲＣＬ内の１つまたはそれより多いアミノ酸（たとえば天然のＡＡＴのアミノ酸３５５〜３６３）に１つまたはそれより多い点変異を有するＡＡＴ変異体に連結することを含むことができ、ＡＡＴ変異体が、有意なセリンプロテアーゼ阻害活性を有さず、ＲＣＬはインタクトなままである。
【００９５】
医薬組成物
本明細書における実施形態は、インビボにおける医薬投与に適した、生物学的に適合性の形態における被験体に対する組成物の投与を提供する。「インビボにおける投与に適した、生物学的に適合性の形態」によって、活性な作用物質の治療効果がいかなる毒作用にも勝る、投与されることになっている活性な作用物質の形態（たとえば、実施形態の医薬化学物質、タンパク質、遺伝子、抗体など）が意味される。治療上活性な量の治療用組成物の投与は、所望の結果を実現するのに必要である投薬量のおよび期間の有効な量として定義される。たとえば、化合物の治療上活性な量は、個体の疾患状態、年齢、性別、および体重ならびに抗体が個体において所望の応答を誘発する能力などのような因子によって異なってもよい。投薬量レジメンは、最適な治療応答をもたらすように調節されてもよい。
【００９６】
ＡＡＴまたはそのペプチドフラグメントもしくはそのアナログもしくはその変異体もしくはその機能的誘導体（たとえば、実施形態のいくつかの医薬化学物質、タンパク質、ペプチド）を含有する医薬組成物が、たとえば、皮下、静脈内、心臓内、冠内、筋肉内によって、経口投与によって、吸入、経皮適用、膣内適用、局所適用、鼻内もしくは直腸内投与によって、被験体に対して投与されてもよい。投与のルートに依存して、活性化合物は、化合物を不活性化し得る酵素、酸、および他の天然の条件による分解から化合物を防御するための材料中にコーティングされてもよい。好ましい実施形態において、化合物は、経口的に投与されてもよい。他の好ましい実施形態において、化合物は、静脈内に投与されてもよい。ある特定の実施形態において、組成物は、吸入などのように、鼻腔内に投与されてもよい。
【００９７】
本明細書において開示されるいくつかの実施形態は、癌を有するまたは癌治療が疑われる被験体に対して、１つまたはそれより多い化学療法剤（たとえば本明細書において開示される組成物に加えて）を送達するためにステントまたはカテーテルを使用することに関する。腫瘍部位に１つまたはそれより多い作用物質を直接、送達することができる、当技術分野において知られている任意のステントまたは他の送達方法が、企図される。これらの送達技術は、単独でまたは他の送達方法と組み合わせて使用することができる。
【００９８】
化合物（たとえばペプチド、タンパク質、融合タンパク質、またはその混合物）は、適切なキャリアまたは希釈剤において被験体に対して投与され、酵素阻害剤と共にまたはリポソームなどのような適切なキャリアにおいて同時投与されてもよい。本明細書において使用される用語「薬学的に許容され得るキャリア」は、食塩水および水性バッファー溶液などのような希釈剤を含むことが意図される。その不活性化を妨げるための材料により化合物をコーティングするまたはそれと共に化合物を同時投与することが必要であってもよい。活性な作用物質はまた、非経口的にまたは腹腔内に投与されてもよい。分散液はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびその混合物において、ならびに油において調製することもできる。保存および使用の通常の条件下で、これらの調製物は、微生物の増殖を妨げるために保存剤を含有してもよい。
【００９９】
注射用の使用に適した医薬組成物は、当技術分野において知られている手段によって投与されてもよい。たとえば、滅菌注射用溶液または分散液の即時調製のための滅菌水溶液（水溶性である場合）または分散液および滅菌粉末が、使用されてもよい。
【０１００】
滅菌注射用溶液は、必要に応じて、上記に列挙される成分のうちの１つまたはその組み合わせと共に、適切な溶剤中に、必要とされる量で、活性化合物（たとえばセリンプロテアーゼ活性を低下させる化合物）を組み込み、その後、ろ過滅菌（ｆｉｌｔｅｒｅｄ  ｓｔｅｒｉｌｉｚａｔｉｏｎ）することによって、調製することができる。
【０１０１】
水性組成物は、薬学的に許容され得るキャリアまたは水性媒体中に溶解されたまたは分散された、有効量の治療用化合物、ペプチド、エピトープコア領域、刺激物質、阻害剤、およびその他同種のものを含むことができる。本明細書において開示される化合物および生体物質は、当技術分野において知られている手段によって精製することができる。遊離塩基または薬理学的に許容され得る塩としての活性化合物の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどのような界面活性剤と適切に混合された水において調製することができる。
【０１０２】
製剤に際して、溶液は、投薬製剤と適合性の方式でおよび治療上有効である量で投与されるであろう。製剤は、上記に記載される注射用溶液のタイプなどのような、様々な剤形で容易に投与される。緩効性カプセル、徐放性微粒子、およびその他同種のものもまた用いることができることが企図される。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下、および腹腔内投与にとりわけ適している。
【０１０３】
活性治療剤は、用量当たり約０．０００１〜１．０ミリグラムまたは約０．００１〜０．１ミリグラムまたは約０．１〜１．０またはさらに約１〜１０グラムを含むように混合物内に製剤されてもよい。１回の用量または複数の用量はまた、毎日、週に２回（ｂｉｗｅｅｋｌｙ）、毎週、隔月などのように、所定の条件について適切なスケジュールで投与することもできる。医薬組成物は、副作用を調整するのに有効である量でおよび頻度で投与される。治療の正確な投薬量および継続期間は、知られている試験プロトコールを使用してまたは当技術分野において知られているモデル系において組成物を試験し、それから推定することによって、経験的に決定されてもよい。投薬量はまた、状態の重症度により変化してもよい。ある実施形態において、組成物の範囲は、被験体に対して毎日または毎週、導入される１０〜７５ｍｇ／ｋｇとすることができる。α１−抗トリプシン、ペプチド、またはα１−抗トリプシンもしくはペプチドと同様の活性を有する薬剤の治療有効量はまた、モル濃度で測定することもでき、約１ｎＭ〜約２ｍＭの範囲にわたることができる。
【０１０４】
他の実施形態において、経鼻溶液もしくは噴霧剤、エアロゾル、または吸入剤が、関心のある化合物を送達するために使用されてもよい。投与の他の様式に適したさらなる製剤は、坐剤および腟坐薬を含んでいてもよい。直腸腟坐薬または坐剤もまた、使用されてもよい。一般に、坐剤については、従来のバインダーおよびキャリアは、たとえばポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドを含んでいてもよく、そのような坐剤は、０．５％〜１０％、好ましくは１％〜２％の範囲で活性成分を含有する混合物から形成されてもよい。
【０１０５】
リポソームまたは微粒子は、治療用送達系として使用することができ、知られている実験用の技術に従って調製することができる。そのうえ、以前に記載されるように調製された乾燥脂質または凍結乾燥リポソームは、活性な作用物質（たとえば核酸、ペプチド、タンパク質、または化学薬品）の溶液および当業者らに知られている、適した溶剤により適切な濃度まで希釈された溶液において、還元されてもよい。被包された活性な作用物質の量は、標準的な方法に従って決定することができる。
【０１０６】
いくつかの実施形態において、医薬構築物組成物は、有意なセリンプロテアーゼ阻害剤活性を有さないが、その他のα１−抗トリプシン活性を有する、ＡＡＴ分子に由来する構築物またはそのアナログに関し、被験体を治療するために、１回の治療量、急性の方式、または慢性の方式で使用されてもよい。たとえば、本明細書において企図される融合ポリペプチドは、有意なプロテアーゼ阻害活性を有しない融合ポリペプチドとすることができる。
【０１０７】
ある実施形態において、本明細書における組成物は、経口的に、全身的に、移植片を介して、徐放もしくは緩効性組成物（たとえばゲル、微粒子など）、静脈内に、局所的に、鞘内に、皮下に、吸入によって、経鼻的に、もしくは当技術分野において知られている他の手段、またはその組み合わせによって、投与することができる。
【０１０８】
発現タンパク質および構築物
一旦、標的遺伝子または遺伝子の一部分が決定されたら、遺伝子は、適切な発現系の中に挿入することができる。遺伝子は、大量のポリペプチド産物を生成するために、任意の数の様々な組換えＤＮＡ発現系において発現することができ、これは、次いで、本明細書において開示される組成物および方法において精製し、使用することができる。
【０１０９】
当業者に知られている発現系の例は、大腸菌などのような細菌、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓなどのような酵母、バキュロウイルス、およびＣｏｓまたはＣＨＯ細胞においてなどの哺乳動物発現系を含む。完全な遺伝子を発現することができ、またはその代わりに、ポリペプチドの一部分をコードする遺伝子のフラグメントを産生することができる。
【０１１０】
融合ポリペプチドをコードするＡＡＴ遺伝子または遺伝子フラグメントは、標準的なサブクローニング技術によって発現ベクターの中に挿入されてもよい。融合タンパク質として組換えポリペプチドを産生する大腸菌発現ベクターが、使用され、タンパク質の急速なアフィニティー精製を可能にしてもよい。そのような融合タンパク質発現系の例は、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ系（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）、マルトース結合タンパク質系（ＮＥＢ、Ｂｅｖｅｒｌｅｙ、ＭＡ）、ＦＬＡＧ系（ＩＢＩ、Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ、ＣＴ）、および６ｘＨｉｓ系（Ｑｉａｇｅｎ、Ｃｈａｔｓ  ｗｏｒｔｈ、ＣＡ）である。
【０１１１】
ポリペプチドのアミノ酸配列改変体もまた、調製されてもよい。これらは、たとえば、集団内の天然の変異により生じるポリペプチドのマイナーな配列改変体であってもよく、またはそれらは、他の種において見つけられるホモログであってもよい。それらはまた、天然に生じないが、十分に類似しており、同様に機能するおよび／またはポリペプチドの天然の形態と交差反応する免疫応答を誘発する配列であってもよい。配列改変体は、膜貫通配列を除去するための、本明細書において記載されるものなどのような、部位特異的変異誘発の標準的な方法によって調製されてもよい。
【０１１２】
ポリペプチドのアミノ酸配列改変体は、置換、挿入、または欠失改変体であってもよい。欠失改変体は、機能または免疫原性活性にとって本質的ではない、天然のタンパク質の１つまたはそれより多い残基を欠き、膜貫通配列を欠く改変体によって例証される。
【０１１３】
原核生物系または真核生物系における発現のためのＤＮＡセグメント（複数可）の遺伝子操作は、組換え発現において当業者らに一般に知られている技術によって実行されてもよい。事実上、任意の発現系が、主張される核酸配列の発現において用いられてもよいことが考えられる。
【０１１４】
本明細書において使用されるように、用語「遺伝子操作された」および「組換え」細胞は、ｃＤＮＡまたは遺伝子などのような外因性のＤＮＡセグメントまたは遺伝子が人の手を通して導入された細胞を指すことが意図される。そのため、遺伝子操作された細胞は、組換えで導入された外因性のＤＮＡセグメントまたは遺伝子を含有しない天然に存在する細胞から識別が可能である。組換え細胞は、導入されたｃＤＮＡまたはゲノム遺伝子を有するものを含み、また、特定の導入された遺伝子と天然に関連しない異種プロモータに隣接して位置する遺伝子をも含む。
【０１１５】
変異体か野生型かにかかわらず、組換えコードタンパク質またはペプチドを発現するために、本明細書におけるいくつかの実施形態に従って、１つまたはそれより多いプロモータのコントロール下のまたはそれに適切に作用するように連結された、主張される単離核酸のうちの１つを含む発現ベクターを調製することができる。プロモータ「のコントロール下に」コード配列を持ってくるために、一般に、約１〜約５０ヌクレオチドの転写リーディングフレームの転写開始部位の５’端を、選ばれたプロモータの「下流」（つまり３’）に位置づける。「上流の」プロモータは、ＤＮＡの転写を刺激し、コードされた組換えタンパク質の発現を促す。これは、この状況における「組換え発現」を意味する。
【０１１６】
多くの標準的な技術は、様々な宿主−発現系においてタンパク質またはペプチド発現を実現するために、適切な核酸および転写／翻訳コントロール配列を含有する発現ベクターを構築するのに利用可能である。発現に利用可能な細胞型は、組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターにより形質転換された大腸菌およびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓなどのような細菌を含むが、これらに限定されない。
【０１１７】
原核生物宿主のある例は、大腸菌株ＲＲ１、大腸菌ＬＥ３９２、大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ  １７７６（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．３１５３７）ならびに大腸菌Ｗ３１１０（Ｆ−、ｌａｍｂｄａ−、原栄養、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．２７３３２５）；Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓなどのようなバチルス；ならびにＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、および様々なＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種などのような他の腸内細菌科である。
【０１１８】
一般に、宿主細胞と適合性の種に由来するレプリコンおよびコントロールの配列を含有するプラスミドベクターは、これらの宿主に関連して使用される。ベクターは、通常、複製部位および形質転換細胞において表現型選択をもたらすことができるマーキング配列を持つ。たとえば、大腸菌は、多くの場合、大腸菌種に由来するプラスミドであるｐＢＲ３２２を使用して、形質転換される。ｐＢＲ３２２は、アンピシリンおよびテトラサイクリン抵抗性についての遺伝子を含有し、したがって、形質転換細胞を同定するための容易な手段を提供する。ｐＢＲプラスミドまたは他の微生物プラスミドまたはファージはまた、それ自体のタンパク質の発現のために微生物生物によって使用され得るプロモータをも含有しなければならない、またはそれを含有するように修飾されなければならない。
【０１１９】
そのうえ、宿主微生物と適合性のレプリコンおよびコントロール配列を含有するファージベクターは、これらの宿主に関連して形質転換ベクターとして使用されてもよい。たとえば、ファージラムダＧＥＭ（商標）−１１は、大腸菌ＬＥ３９２などのような宿主細胞を形質転換するために使用されてもよい組換えファージベクターを作製する際に利用されてもよい。
【０１２０】
さらに有用なベクターは、ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅら、１９８５）；ならびに後半の精製および分離または切断のためにグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）可溶性融合タンパク質を生成する際の使用のためのｐＧＥＸベクターを含む。他の適した融合タンパク質は、β−ガラクトシダーゼ、ユビキチン、またはその他同種のものを有するものである。
【０１２１】
組換えＤＮＡ構築において最も共通して使用されるプロモータは、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトース、およびトリプトファン（ｔｒｐ）プロモータ系を含む。これらが最も共通して使用されるが、他の微生物プロモータが、発見され、利用されており、それらのヌクレオチド配列に関する細部について、公開されており、当業者らが、プラスミドベクターとそれらを機能的にライゲーションすることが可能である。
【０１２２】
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓにおける発現については、プラスミドＹＲｐ７が、たとえば、共通して使用される（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら、１９７９；Ｋｉｎｇｓｍａｎら、１９７９；Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒら、１９８０）。このプラスミドは、トリプトファンにおいて成長するための能力を欠く酵母の変異株、たとえばＡＴＣＣ  Ｎｏ．４４０７６またはＰＥＰ４−１（Ｊｏｎｅｓ、１９７７）に対して選択マーカーを提供するｔｒｐ１遺伝子を既に含有している。次いで、酵母宿主細胞ゲノムの特質としてのｔｒｐ１機能傷害の存在は、トリプトファンの非存在下における増殖によって形質転換を検出するための有効な環境を提供する。
【０１２３】
酵母ベクターにおける適した促進配列は、３−ホスホグリセレートキナーゼ（Ｈｉｔｚｅｍａｎら、１９８０）またはエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、グルコースリン酸イソメラーゼ、およびグルコキナーゼなどのような他の解糖酵素（Ｈｅｓｓら、１９６８；Ｈｏｌｌａｎｄら、１９７８）についてのプロモータを含む。適した発現プラスミドを構築する際に、これらの遺伝子と結合した終結配列もまた、ｍＲＮＡのポリアデニル化および終結をもたらすように、発現されることが所望される配列の３’に、発現ベクターの中にライゲーションされる。
【０１２４】
増殖条件によってコントロールされる転写についてさらなる利点を有する他の適したプロモータは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロームＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝と関連する分解酵素、および前述のグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ならびにマルトースおよびガラクトース利用を担う酵素についてのプロモータ領域を含む。
【０１２５】
微生物に加えて、多細胞生物に由来する細胞の培養物もまた、宿主として使用されてもよい。原則として、脊椎動物培養物由来か無脊椎動物培養物由来かにかかわらず、任意のそのような細胞培養が、使用可能である。哺乳動物細胞に加えて、これらは、組換えウイルス発現ベクター（たとえばバキュロウイルス）により感染させた昆虫細胞系；および組換えウイルス発現ベクター（たとえばカリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）により感染させたまたは１つまたはそれより多いコード配列を含有する組換えプラスミド発現ベクター（たとえばＴｉプラスミド）により形質転換された植物細胞系を含む。
【０１２６】
有用な昆虫系において、オウトグラファカリフォルニア核多汗症ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｉｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ）（ＡｃＮＰＶ）は、外来遺伝子を発現するためのベクターとして使用される。ウイルスは、ヨトウガ細胞において成長する。単離された核酸コード配列は、ウイルスの非本質的な領域（たとえばポリヘドリン遺伝子）の中にクローニングされ、ＡｃＮＰＶプロモータ（たとえばポリヘドリンプロモータ）のコントロール下に配置される。コード配列の挿入の成功は、ポリヘドリン遺伝子の不活性化および非閉塞組換えウイルス（つまり、ポリヘドリン遺伝子によってコードされる、タンパク質性のコートを欠くウイルス）の産生をもたらす。次いで、これらの組換えウイルスは、挿入された遺伝子が発現されるヨトウガ細胞を感染させるために使用される（たとえば米国特許第４，２１５，０５１号（Ｓｍｉｔｈ））。
【０１２７】
有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ＶＥＲＯおよびＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ−７、２９３、ＨｅｐＧ２、３Ｔ３、ＲＩＮ、ならびにＭＤＣＫ細胞株である。そのうえ、挿入された配列の発現を調整する、または所望される特定の様式において遺伝子産物を修飾し、プロセシングする宿主細胞株が、選ばれてもよい。タンパク質産物のそのような修飾（たとえばグリコシル化）およびプロセシング（たとえば切断）は、コードされたタンパク質の機能にとって重要であり得る。
【０１２８】
様々な宿主細胞は、タンパク質の翻訳後プロセシングおよび修飾のための特有な特定のメカニズムを有する。適切な細胞株または宿主系は、発現される外来タンパク質の適正な修飾およびプロセシングを確実にするように選ばれてもよい。哺乳動物細胞における使用のための発現ベクターは、通常、任意の必要なリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写終結配列と共に、複製開始点（必要に応じて）、発現されることになっている遺伝子の前に位置するプロモータを含む。複製開始点は、ＳＶ４０もしくは他のウイルス（たとえばポリオーマ、アデノ、ＶＳＶ、ＢＰＶ）起源に由来し得るものなど、外因性の起点を含めるためのベクターの構築によって提供されてもよく、または宿主細胞染色体複製メカニズムによって提供されてもよい。ベクターが宿主細胞染色体の中に統合される場合、後者で十分であることが多い。
【０１２９】
プロモータは、哺乳動物細胞（たとえばメタロチオネインプロモータ）または哺乳動物ウイルス（たとえばアデノウイルス後期プロモータ；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモータ）のゲノムに由来してもよい。さらに、所望の遺伝子配列と通常、関連しているプロモータまたはコントロール配列を利用することもまた可能であり、望ましいかもしれない、ただし、そのようなコントロール配列が、宿主細胞系と適合性であることを条件とする。
【０１３０】
多くのウイルスベースの発現系は、本明細書において企図される分子を産生するために利用されてもよく、たとえば、共通して使用されるプロモータは、ポリオーマ、アデノウイルス２、および、最も頻繁にはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）に由来する。ＳＶ４０ウイルスの初期および後期プロモータは、両方とも、ＳＶ４０ウイルス複製開始点もまた含有するフラグメントとしてウイルスから容易に得られるので、特に有用である。より小さなまたはより大きなＳＶ４０フラグメントもまた、使用されてもよい、ただし、ウイルス複製開始点に位置する、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ部位〜Ｂｇｌ  Ｉ部位に伸長する、およそ２５０ｂｐの配列が含まれることを条件とする。
【０１３１】
アデノウイルスが発現ベクターとして使用される、ある場合において、コード配列は、アデノウイルス転写／翻訳コントロール複合体、たとえば後期プロモータおよび三連リーダー配列（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ  ｌｅａｄｅｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）にライゲーションされてもよい。次いで、このキメラ遺伝子は、インビトロにおけるまたはインビボにおける組換えによってアデノウイルスゲノムに挿入されてもよい。ウイルスゲノムの非本質的な領域（たとえば領域Ｅ１またはＥ３）における挿入は、生存可能であるが、侵襲性ではなく、感染した宿主においてタンパク質を発現することができる組換えウイルスをもたらすであろう。
【０１３２】
特定の開始シグナルもまた、主張される単離核酸コード配列の効率的な翻訳のために必要とされてもよい。これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接する配列を含む。ＡＴＧ開始コドンを含む外因性の翻訳コントロールシグナルは、そのうえ、提供される必要があってもよい。当業者は、直ちに、これを決定し、必要なシグナルを提供することができるであろう。開始コドンが、挿入物全体の翻訳を確実にするために、所望のコード配列のリーディングフレームとインフレーム（またはインフェーズ（ｉｎ−ｐｈａｓｅ））でなければならないことはよく知られている。これらの外因性の翻訳コントロールシグナルおよび開始コドンは、天然および合成の、様々な起源のものであってもよい。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメントまたは転写ターミネータの包含によって増強されてもよい。
【０１３３】
ある実施形態において、真核生物宿主細胞が、所望されるポリペプチドを発現することができ、多くの場合、その目的のために使用される。それらは、細胞の中に、好ましくは発現カセットの形態をした、本明細書において開示されるＤＮＡ分子の導入によって、得ることができる。ある実施形態において、発現カセットが、関心のある宿主細胞のゲノムに統合され、これは、様々な宿主細胞において様々に位置することができ、選択により、トランスジーンが適した位置に統合されるクローンが提供され、発現レベル、安定性、および増殖特質などの点から、所望の特性を有する宿主細胞クローンがもたらされるであろう。標的分子のＤＮＡを含有する細胞についての選択は、当業者によって知られている、ルーチン的な方法を使用して、選択可能マーカーポリペプチドについて選択することによって実行することができる。
【０１３４】
宿主細胞は、当業者に知られている標準的な手順に従って、選択し、増殖させることができる安定性のクローン由来のものである。そのようなクローン培養物は、関心のあるポリペプチドを産生することができる。
【０１３５】
細胞において発現されることになっている核酸の導入は、当業者に知られているいくつかの方法のうちの１つによって行うことができ、また、導入されることとなる核酸の構成に依存する。方法は、トランスフェクション、感染、注射、形質転換、およびその他同種のものを含むことができるが、これらに限定されない。関心のあるポリペプチドを発現する、適した宿主細胞は、当技術分野において知られている任意の選択プロセスによって得ることができる。
【０１３６】
ある実施形態において、関心のあるＤＮＡ分子が、真核生物宿主細胞のゲノムの中に統合される。選択可能マーカーポリペプチドの存在についての、よって発現についての選択は、細胞を最初に得る間に実行することができる。ある実施形態において、選択作用物質は、選択可能マーカーポリペプチドを発現する細胞を選択するのに十分な濃度で、またはより低い濃度で、培養の間の少なくとも一部の時間、培養培地中に存在する。ある実施形態において、ポリペプチドが発現される場合、選択作用物質は、産生段階の間に培養培地中に、もはや存在しない。関心のあるポリペプチドは、任意のペプチドまたはタンパク質とすることができ、単量体タンパク質または多量体タンパク質（たとえば二量体）（の一部）であってもよい。多量体タンパク質は、少なくとも２つのポリペプチド鎖を含む。
【０１３７】
ある態様において、関心のあるポリペプチドを発現する宿主細胞を生成するための方法であって、複数の前駆細胞の中に、本発明のＤＮＡ分子または発現カセットを導入するステップ、選択条件下で、生成される細胞を培養するステップ、および関心のあるポリペプチドを産生する少なくとも１つの宿主細胞を選択するステップを含む方法が提供される。
【０１３８】
関心のある、１つまたはそれより多いポリペプチドを産生するための方法であって、本発明の宿主細胞を培養するステップを含む方法もまた、提供される。細胞の培養は、細胞が、代謝する、および／または成長する、および／または分裂する、および／または関心のある組換えタンパク質を産生するのを可能にするように行われる。これは、当技術分野においてよく知られている方法によって達成することができ、細胞に栄養素を提供することを含むが、これらに限定されない。培養は、たとえば、回分系、流加系、灌流系などのような連続系、およびその他同種のものを使用して、皿、ローラーボトルにおいて、またはバイオリアクターにおいて行うことができる。細胞培養を通して組換えタンパク質の大規模（連続）産生を実現するために、懸濁液中で成長することができる細胞を得ることが当技術分野において好ましく、動物もしくはヒト由来の血清または動物もしくはヒト由来の血清構成成分の非存在下において培養することができる細胞を得ることが好ましい。
【０１３９】
細胞を成長させるまたは増大させるための条件（たとえばＴｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｋｒｕｓｅ  ａｎｄ  Ｐａｔｅｒｓｏｎ，  ｅｄｉｔｏｒｓ（１９７３）を参照されたい）および組換え産物の発現のための条件は、当業者に知られている。一般に、哺乳動物細胞培養物の生産性を最大限にするための原理、プロトコール、および実践的技術は、Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｍ．Ｂｕｔｌｅｒ，  ｅｄ．、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、１９９１）において見つけることができる。
【０１４０】
ある実施形態において、発現タンパク質は、細胞からまたは培養培地からまたはその両方から、収集される（単離される）。次いで、それは、当技術分野において一般に知られている方法によって、知られている方法、たとえばろ過、カラムクロマトグラフイーなどを使用して、さらに精製されてもよい。
【０１４１】
真核生物の発現において、典型的に、適切なポリアデニル化部位（たとえば５’−ＡＡＴＡＡＡ−３’）が、もとのクローニングセグメント内に含有されていなかった場合、転写ユニットの中に組み込まれることもまた、所望されるであろう。典型的に、ポリＡ追加部位は、転写終結前の位置の、タンパク質の終結部位の約３０〜２０００ヌクレオチド「下流に」配置される。
【０１４２】
組換えタンパク質の長期間、高収率の産生のために、安定性の発現を、使用することができる。たとえば、タンパク質をコードする構築物を安定して発現する細胞株は、遺伝子操作されてもよい。ウイルス複製開始点を含有する発現ベクターを使用するのではなく、宿主細胞は、適切な発現コントロールエレメント（たとえばプロモータ、エンハンサー、配列、転写ターミネータ、ポリアデニル化部位など）および選択可能マーカーによってコントロールされるベクターにより形質転換されてもよい。外来性ＤＮＡの導入の後に、遺伝子操作された細胞は、１〜２日間、濃縮培地において成長させてもよく、次いで、選択培地に切り替えられる。組換えプラスミドにおける選択可能マーカーは、選択に対する抵抗性を付与し、細胞がそれらの染色体の中に安定してプラスミドを統合し、成長して、さらにはクローニングされ、細胞株へと増やされてもよいフォーカスを形成するのを可能にする。
【０１４３】
それぞれｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−、またはａｐｒｔ−細胞において、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子を含むが、これらに限定されない多くの選択系が、使用されてもよい。さらに、代謝拮抗物質抵抗性は、メトトレキサートに対する抵抗性を付与するｄｈｆｒ；ミコフェノール酸に対する抵抗性を付与するｇｐｔ；アミノグリコシドＧ−４１８に対する抵抗性を付与するｎｅｏ、およびヒグロマイシンに対する抵抗性を付与するｈｙｇｒｏ、または当技術分野において知られている任意の他の方法についての選択の基礎として使用されてもよい。
【０１４４】
本発明の単離核酸は、ヒト前立腺、膀胱、もしくは乳房細胞におけるその天然の発現に比べてまたはさらに、組換え宿主細胞における他のタンパク質の発現に比べて、「過剰発現されてもよい」、たとえば、増大したレベルで発現されてもよいことが企図される。そのような過剰発現は、放射標識および／またはタンパク質精製を含むが、これらに限定されない、様々な方法によって評価されてもよい。しかしながら、単純で直接的な方法、たとえば、ワンステップ精製プロセス（たとえばプロテインＡアフィニティー）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、およびタンパク質染色またはウェスタンブロッティング、その後に続く、結果として生ずるゲルまたはブロットの比重走査などのような定量分析を伴うものが、好ましい。コントロールにおけるレベルと比較した、組換えまたは融合タンパク質またはペプチドのレベルにおける増大は、宿主細胞によって産生される他のタンパク質に関しての標的タンパク質の相対的存在量であるように、過剰発現を示し、たとえば、ゲル上で目に見えるまたは本明細書において企図される方法によって直ちに単離することができる。
【０１４５】
免疫分子（たとえばＦｃ部分）を使用して本明細書において生成される構築物は、様々なアフィニティーカラムまたはアフィニティーマトリックス（たとえばプロテインＡ）を使用して単離することができることが企図される。ある実施形態において、本明細書において開示される構築物の精製は、プロテインＡカラムまたはプロテインＡマトリックスまたはその他同種のもの（たとえばＰｉｅｒｃｅ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、もしくは他のＩｇＧ精製／単離キット）を使用することを含むことができる。ある実施形態において、本明細書において開示される構築物の精製は、分解などから、抗炎症もしくは免疫調節活性または他のＡＡＴに関連した活性を保護するために、最少のステップを使用して実行することができる。これらの実施形態に従って、本明細書において企図される構築物の精製は、１回のステップ（たとえばＦｃ−ＡＡＴ分子のプロテインＡカラム精製）によるものであってもよい（たとえばＫｉｎ−Ｍｉｎｇら  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｖｏｌ．１１  ｎｏ．６  ｐｐ．４９５−５００、１９９８；ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ／Ｆｃ／Ｆｃ−Ｘ／ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ；  ａｎｄ  ｄｉａｂｏｄｙ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓを参照されたい）。
【０１４６】
それ自体に可逆的に結合することができる（たとえばジスルフィドまたは他の結合を通して）任意のタンパク質またはペプチドをコードする核酸は、本明細書において開示されるＡＡＴ構築物を生成するために使用することができることが、本明細書において企図される。これらの構築物は、機能の損失の低下と共に、精製の増大に向けて、一対または二量体のＡＡＴとして使用することができる。ある実施形態において、これらの構築物が、治療上の応用における使用のためのまたは研究目的のための二量体分子として、本明細書において開示される組成物において使用することができる。これらの実施形態のいくつかに従って、ＡＡＴまたはカルボキシ末端フラグメントに連結された免疫分子のフラグメントまたは一部分は、免疫原性の増大が治療目的に所望されない限り、不活性または本質的に非免疫原性とすることができる。本明細書において記載される構築物は、有益な免疫もしくは炎症効果を誘発する、またはたとえば、ある炎症促進性サイトカインの存在を低下させることによって、不利な免疫もしくは炎症効果を低下させるもしくは排除するために使用することができることが企図される。
【０１４７】
単離タンパク質
ある実施形態は、単離タンパク質およびその生物学的に活性なペプチドに関する。一実施形態において、天然のポリペプチドは、標準的なタンパク質精製技術を使用して、適切な精製手法によって細胞または組織供給源から単離することができる。ある実施形態において、天然のポリペプチドは、変異させてもよく、または他の場合には、セリンプロテアーゼ阻害剤活性を低下させるもしくは排除するために処理されてもよく、次いで、本明細書において記載される構築物における使用のために単離されてもよい。ある特定の実施形態において、セリンプロテアーゼ阻害剤活性が、低下しており、有意な活性が残らない。他の実施形態において、本明細書において企図されるポリペプチドは、主に、組換えＤＮＡ技術によって産生される。組換え発現の代わりに、ポリペプチドは、標準的なペプチド合成技術を使用して、化学的に合成することができる。本明細書において開示される組成物における使用に企図されるペプチドまたはタンパク質分子のいずれも、被験体の必要性または状態を治療するもしくは予防するための使用に依存して、セリンプロテアーゼ阻害剤活性を有するまたは有意なセリンプロテアーゼ阻害剤活性を有しない組成物とすることができる。たとえば、ＡＡＴ組成物は、セリンプロテアーゼ阻害剤活性を低下させるもしくは排除するように処理されてもよいまたはＡＡＴポリペプチドは、単離されてもよく、ポリペプチドは、セリンプロテアーゼ阻害剤活性が低下しているもしくは有意なセリンプロテアーゼ阻害剤活性を有していない。次いで、これらのＡＡＴ分子は、急速な産生および精製のために、本明細書において開示される構築物において使用することができる。
【０１４８】
「単離」または「精製」タンパク質またはその生物学的に活性な一部分は、タンパク質が由来する細胞（たとえばクローン由来の）もしくは組織供給源由来の細胞性物質もしくは他の混入タンパク質が実質的にない、または化学的に合成される場合、化学前駆物質もしくは他の化学物質が実質的にない。したがって、細胞性物質が実質的にないタンパク質は、約３０％、２０％、１０％、または５％（乾燥重量で）未満の異種タンパク質（本明細書において「混入タンパク質」とも呼ばれる）を有するタンパク質の調製物を含む。タンパク質またはその生物学的に活性な一部分が、組換えで産生される場合、それはまた、好ましくは、培養培地も実質的にない。タンパク質が化学合成によって産生される場合、それは、好ましくは、化学前駆物質または他の化学物質が実質的にない。たとえば、タンパク質のそのような調製物は、関心のあるポリペプチド以外に、約３０％、２０％、１０％、５％（乾燥重量で）未満の化学前駆物質または化合物を有する。
【０１４９】
ある実施形態において、ポリペプチドをコードするヌクレオチドが、ペプチドまたはタンパク質を生成するために、当技術分野において知られている任意の構築物に挿入することができる。これらのペプチドは、ＡＡＴまたはＡＡＴ対立遺伝子のカルボキシ末端の最後の８０アミノ酸の一部分またはすべてに対応する連続アミノ酸配列を有するポリペプチドを含むことができる。他の有用なタンパク質は、カルボキシ末端の任意の一部分と実質的に同一であり、対応する天然に存在するタンパク質のペプチドの機能的な活性を保持するが、天然の対立遺伝子変異または変異誘発によりアミノ酸配列が異なる。これらのポリペプチドは、本明細書において企図される任意の構築物（たとえば、免疫分子が連結された構築物（Ｆｃ））において使用することができる。
【０１５０】
本明細書において開示されるいくつかの組成物は、過度のセリンプロテアーゼ活性によって、全体的にまたは部分的に引き起こされる生理的な状態の治療における治療剤として使用されてもよい。そのうえ、生理的な状態は、全体的にまたは部分的に阻害することができる。本明細書において企図されるペプチドは、遊離ペプチド構築物またはその薬学的に許容され得る塩として、組成物において投与されてもよい。ペプチドは、医薬組成物として被験体に投与されてもよく、これらは、ほとんどの場合、薬学的に許容され得るキャリアと共にペプチド構築物および／またはその医薬品の塩を含むことができる。
【０１５１】
本発明のポリペプチドの生物学的に活性な一部分は、タンパク質のアミノ酸配列と十分に同一であるまたはそれに由来するアミノ酸配列（たとえば、セリンプロテアーゼ阻害活性以外の、対応する完全長タンパク質の少なくとも１つの活性を示す、配列番号２〜３１、３４のいずれかにおいて示されるアミノ酸配列）を含むポリペプチドを含む。本発明のタンパク質の生物学的に活性な一部分は、たとえば、長さが、５、１０、２０、３０、４０、またはそれ以上のアミノ酸であるポリペプチドとすることができる。さらに、タンパク質の他の領域が欠失している、他の生物学的に活性な一部分は、組換え技術によって調製し、本明細書において開示されるポリペプチドの天然の形態の１つまたはそれより多い機能的な活性に対して評価することができる。これらのポリペプチドのいずれも、免疫分子に連結することができ、ペプチドは、抗免疫および／もしくは抗炎症性活性またはセリンプロテアーゼ阻害活性を保持する。
【０１５２】
有意なセリンプロテアーゼ活性を有しないＡＡＴ分子の改変体は、変異誘発、たとえば個別の点変異または切断によって生成することができる。たとえば、点変異は、ＡＡＴまたはそのペプチド誘導体において生成されてもよく、それは、反応中心ループ（ＲＣＬ）をなおインタクトなまま残し、ＡＡＴまたはペプチドによるセリンプロテアーゼ結合能力に干渉するか、またはそれを妨げるが、放射線副作用を調整するためのその能力を保持する。アゴニストは、有意なセリンプロテアーゼ活性が残らないこと以外は、タンパク質の天然に存在する形態の同じまたはサブセットの生物学的活性を実質的に保持することができる。タンパク質のアンタゴニストは、たとえば、関心のあるタンパク質を含む細胞シグナル伝達カスケードの下流または上流のメンバーに競合的に結合することによって、タンパク質の天然に存在する形態の１つまたはそれより多い活性を阻害することができる。したがって、特定の生物学的効果は、限られた機能の改変体による治療によって誘発することができる。タンパク質の天然に存在する形態の生物学的活性のサブセットを有する改変体による被験体の治療は、タンパク質の天然に存在する形態による治療に比べて、被験体において、副作用をより少なくすることができる。
【０１５３】
融合ポリペプチド
ある実施形態において、ＡＡＴおよび／もしくはそのアナログまたはペプチド誘導体もしくはそのフラグメントなどのような作用物質が、融合ポリペプチド（ＡＡＴ関連分子）の一部であってもよい。ある実施例において、融合ポリペプチドは、ＩｇＧフラグメントなどのような免疫フラグメント（たとえばＦｃまたはその変異体）とすることができるＡＡＴ関連分子に連結されたまたは結合されたＡＡＴ（たとえば天然に存在する哺乳動物α１−抗トリプシン）またはそのペプチドフラグメントおよび異なるアミノ酸配列またはペプチドを含んでいてもよい。そのうえ、本明細書において開示される融合ポリペプチドは、その必要がある被験体に対する送達のための薬学的に許容され得るキャリア、賦形剤、または希釈剤を含むことができる。融合タンパク質または融合ペプチドを生成するための任意の知られている方法が、本明細書において企図される。
【０１５４】
さらに他の実施形態において、ＡＡＴポリペプチドまたはペプチド融合タンパク質は、ＧＳＴ配列のＣ−末端に融合されたＧＳＴ融合タンパク質とすることができる。融合物発現ベクターおよび精製および検出手段は、当技術分野において知られている。発現ベクターは、当技術分野において知られている手段によって、原核生物細胞（たとえば大腸菌）または真核生物細胞（たとえば昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを使用して）、酵母細胞、もしくは哺乳動物細胞）において、本発明の融合ポリペプチドの発現のためにルーチン的に設計することができる。さらに他の実施形態において、本発明の核酸は、当技術分野において記載されるように、哺乳動物発現ベクターを使用して、哺乳動物細胞において発現させることができる。他の実施形態において、ＡＡＴポリペプチドは、ｈｉｓタグ付き融合分子とすることができる。
【０１５５】
クローン
本明細書において開示される他の実施形態は、本明細書において開示される融合または組換え分子の生成およびクローンの単離を含むことができる。ある実施形態において、本明細書において企図されるクローンは、コントロールＡＡＴ（たとえば、市販で入手可能なまたは天然の単離ＡＡＴ）と比較して活性が増大した、リンカー領域を有するＦｃ−ＡＡＴ分子（たとえば完全長ＡＡＴまたはそのペプチドフラグメント）由来のものとすることができる。他の実施形態において、他のクローンは、ＡＡＴまたはそのフラグメント誘導体に連結されたＩｇＧ２分子に関する。
【０１５６】
併用療法
本明細書において詳述される実施形態のいずれも、１つまたはそれより多い治療有効量の癌関連性の医薬品をさらに含んでもよい。これらの療法は、アスピリンおよびたとえばクロピドグレル、プラスグレル、チカグレロール、アブシキシマブ、エプチフィバチド、チロフィバンを含むがこれらに限定されない他の抗血小板療法；ヘパリンおよび誘導体；直接トロンビン阻害剤（ｄｉｒｅｃｔ  ｔｈｒｏｍｂｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）もしくはＸａ阻害剤；ワルファリン；アンジオテンシン変換酵素阻害剤もしくはアンジオテンシン受容体遮断薬；ベータ−およびアルファ−アドレナリン作動性受容体遮断薬；カルシウムチャネル遮断薬；ＨＭＧＣｏＡレダクターゼ阻害剤（たとえばスタチン）；ナイアシンおよび誘導体；フェノフィブレート；魚油；アルドステロン遮断薬；ヒドララジンおよびニトロデリベート（ｎｉｔｒｏｄｅｒｉｖａｔｅ）；ホスホジエステラーゼ阻害剤；直接グアニリル（ｇｕａｎｙｌｉｌ）シクラーゼ活性化因子、抗微生物剤、抗炎症剤、免疫調節剤、もしくは免疫抑制剤、またはその組み合わせを含むことができるが、これらに限定されない。
【０１５７】
抗菌剤の例は、ペニシリン、キノロン（ｑｕｉｎｏｌｏｎｓ）、アミノグリコシド、バンコマイシン、モノバクタム、セファロスポリン、カルバセフェム、セファマイシン、カルバペネム、およびモノバクタムならびにそれらの様々な塩、酸、塩基、および他の誘導体を含むが、これらに限定されない。
【０１５８】
本明細書における使用に企図される抗真菌剤は、カスポファンギン、塩酸テルビナフィン、ナイスタチン、アムホテリシンＢ、グリセオフルビン、ケトコナゾール、硝酸ミコナゾール、フルシトシン、フルコナゾール、イトラコナゾール、クロトリマゾール、安息香酸、サリチル酸、および硫化セレンを含むことができるが、これらに限定されない。
【０１５９】
本明細書における使用に企図される抗ウイルス剤は、バルガンシクロビル（ｖａｌｇａｎｃｙｃｌｏｖｉｒ）、塩酸アマンタジン、リマンタジン（ｒｉｍａｎｔａｄｉｎ）、アシクロビル、ファムシクロビル、ホスカルネット（ｆｏｓｃａｍｅｔ）、ガンシクロビルナトリウム、イドクスウリジン、リバビリン、ソリブジン、トリフルリジン、バラシクロビル、ビダラビン（ｖｉｄａｒａｂｉｎ）、ジダノシン、スタブジン、ザルシタビン、ジドブジン、インターフェロンアルファ、およびエドクスジンを含むことができるが、これらに限定されない。
【０１６０】
本明細書における使用に企図される抗寄生虫剤は、ピレトリン（ｐｉｒｅｔｈｒｉｎ）／ピペロニルブトキシド、ペルメトリン、ヨードキノール、メトロニダゾール、クエン酸ジエチルカルバマジン、ピペラジン、パモ酸ピランテル、メベンダゾール、チアベンダゾール、プラジカンテル、アルベンダゾール、プログアニル、キニジングルコネート注射、硫酸キニーネ、リン酸クロロキン、塩酸メフロキン、リン酸プリマキン、アトバコン、コトリモキサゾール、（スルファメトキサゾール／トリメトプリム）、およびペンタミジンイセチオネートを含むことができるが、これらに限定されない。
【０１６１】
免疫調節剤は、たとえば、免疫系における細胞（たとえばＴ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、もしくは抗原提示細胞（ＡＰＣ））の細胞性の活性を刺激するもしくは抑制することによってまたは免疫系をさらには刺激する、抑制する、もしくは調整する、免疫系の外側の構成成分（たとえばホルモン、受容体アゴニストもしくはアンタゴニスト、および神経伝達物質）に作用することによって、免疫系に直接または間接的に作用する作用物質を含むことができ、他の免疫調節剤は、免疫抑制薬または免疫賦活薬を含むことができる。抗炎症剤は、たとえば、炎症応答、傷害に対する組織反応を治療する作用物質、免疫、血管、もしくはリンパ系を治療する作用物質、またはその任意の組み合わせを含むことができる。
【０１６２】
本明細書における使用に企図される抗炎症または免疫調節薬または剤は、インターフェロン誘導体、たとえばベタセロン、β−インターフェロン；プロスタン誘導体、イロプロスト、シカプロスト；コルチゾール、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾンなどのようなグルココルチコイド；シクロスポリンＡ、ＦＫ−５０６、メトキサレン、サリドマイド、スルファサラジン、アザチオプリン、メトトレキサートなどのような免疫抑制剤；リポキシゲナーゼ阻害剤、たとえばジロートン、ＭＫ−８８６、ＷＹ−５０２９５、ＳＣ−４５６６２、ＳＣ−４１６６１Ａ、ＢＩ−Ｌ−３５７；ロイコトリエンアンタゴニスト；ペプチド誘導体、たとえばＡＣＴＨおよびアナログ；可溶性ＴＮＦ（腫瘍壊死因子）受容体；ＴＮＦ抗体；インターロイキン、他のサイトカイン、Ｔ細胞タンパク質の可溶性受容体；インターロイキン（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎｅ）、他のサイトカイン、およびＴ細胞タンパク質の受容体に対する抗体を含むことができるが、これらに限定されない。
【０１６３】
本明細書における組成物と組み合わせて使用するための他の作用物質は、セリンプロテアーゼ阻害剤活性を有する分子とすることができる。たとえば、本明細書における使用に企図される他のセリンプロテアーゼ阻害剤は、白血球エラスターゼ、トロンビン、カテプシンＧ、キモトリプシン、プラスミノーゲン活性化因子、およびプラスミンを含むが、これらに限定されない。
【０１６４】
そのうえ、本明細書において開示される方法の他の併用組成物は、ある抗体ベースの療法を含むことができる。非限定的な例は、ポリクローナル抗リンパ球抗体、Ｔ細胞抗原受容体複合体に向けられるモノクローナル抗体（ＯＫＴ３、ＴＩＯＢ９）、インターロイキン−２受容体アルファを含む、さらなる細胞表面抗原に向けられるモノクローナル抗体を含む。ある実施形態において、抗体ベースの療法が、本明細書において開示される組成物および方法と組み合わせて導入療法として使用されてもよい。
【０１６５】
本明細書において企図される被験体は、ヒト被験体、男性もしくは女性、成人、または子供、小児、もしくは胎児または霊長動物、イヌ、ネコ、ウマ、雌ウシ、ブタ、モルモット、鳥、およびげっ歯動物を含むが、これらに限定されない非ヒト被験体などのような他の被験体を含むことができる。
【０１６６】
ＡＡＴ
ヒトＡＡＴは、内部ジスルフィド結合を有さず、通常、システインまたはグルタチオンのいずれかに分子間ジスルフィド連結した単一のシステイン残基のみを有する、単一のポリペプチド鎖である。ＡＡＴの１つの反応部位は、メチオニン残基を含有し、これは、タバコ煙または他の酸化汚染物質に対する曝露に際しての酸化に対して化学変化を起こしやすい。そのような酸化は、ＡＡＴのエラスターゼ阻害活性を低下させ、そのため、その位置での他のアミノ酸、たとえばアラニン、バリン、グリシン、フェニルアラニン、アルギニン、またはリシンへの置換により、より安定性のＡＡＴの形態が産生される。天然のＡＡＴは、配列番号１もしくは３３の式または哺乳動物被験体において見つけられる、他の知られている天然に存在するＡＡＴ分子によって示すことができる。
【０１６７】
本明細書において開示される分子（たとえば融合または組換え分子）の産生について知られている任意の手段が、企図される（たとえば、哺乳動物細胞において、細菌によって、真菌によって、藻類もしくは他の生物によって、または植物において産生される）。
【０１６８】
キット
さらなる実施形態において、上記に記載される組成物、構築物（たとえば組換えおよび／または融合分子）、ならびに方法との好都合な使用のためのキットが、企図される。キットは、ＡＡＴ融合もしくは組換え構築物（たとえばＦｃ−ＡＡＴ；Ｆｃ−変異ＡＡＴ、Ｆｃ−ＡＡＴペプチドフラグメント、ＡＡＴもしくはＡＡＴのカルボキシ末端誘導体に連結されたＩｇＧ２変異体）、ＡＡＴに由来する１つまたはそれより多いペプチドの構築物、変異ＡＡＴ構築物組成物、遺伝子療法送達系と関連する変異ＡＡＴ分子、または他の組み合わせを含んでいてもよい。小分子、タンパク質、またはペプチドは、開示される組成物のいずれの使用にも用いられてもよい。そのうえ、抗菌剤、免疫抑制剤、抗炎症剤などのような他の作用物質が、キットにおいて提供されてもよい。キットは、適した容器手段（たとえば器、バイアル、チューブなど）、タンパク質またはペプチドまたはアナログ作用物質、および任意選択で、１つまたはそれより多いさらなる作用物質を含むことができる。
【０１６９】
キットは、本明細書において開示される組成物における使用のための本明細書において記載される構築物を調製するためにおよび記載される治療上の応用のために使用されてもよい、標識されているか標識されていないかにかかわらず、コードされたタンパク質またはポリペプチド抗原、本明細書において開示される構築物を発現するためのクローンの適切に等分された構築物組成物をさらに含んでいてもよい。
【０１７０】
キットの容器は、一般に、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、注射器、もしくは他の容器手段または他の送達デバイス（たとえばステントもしくはカテーテル）を含むであろう。キットはまた、一般に、他の併用作用物質が入れられてもよい第２、第３、または他のさらなる容器を含有するであろう。そのような容器は、所望のバイアルが保持される射出またはブロー成形可塑性容器を含んでいてもよい。
【０１７１】
ある実施形態において、キットは、有意なセリンプロテアーゼ阻害剤活性を有しないＡＡＴ、ＡＡＴフラグメント、またはＡＡＴアナログもしくはポリペプチドの構築物を含むが、これらに限定されない組成物を含むことができる。これらの実施形態に従って、キットは、有意なセリンプロテアーゼ阻害剤活性を有しないＡＡＴまたはそのアナログを含有することができる。
【実施例】
【０１７２】
以下の実施例は、様々な実施形態を例証するために含まれる。続く実施例において開示される技術が、主張される方法、組成物、および装置の実施において十分に機能することが発見された技術を示すことは、当業者らによって十分に理解されるはずである。しかしながら、当業者らは、本開示を考慮して、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、変更が、開示されるいくつかの実施形態において成され、同様のまたは類似する結果をなお得てもよいことを十分に理解するはずである。
【０１７３】
組換えヒトＡＡＴの産生のための発現プラスミドの生成
実施例１
ある例示的な方法において、Ｆｃ−ＡＡＴ構築物は、図１において示されるように、生成することができる。たとえば、ヒトＡＡＴ配列は、発現ベクター、ｐＣＡＧＧＳの中に挿入することができる。この例示的な方法において、１２６０塩基対のヒトＡＡＴ  ｃＤＮＡは、ヒト肝臓ライブラリから単離し、図１において例証されるように、ｐＣＡＧＧＳの中に挿入した。所望される場合、他のＡＡＴ分子またはそのペプチドフラグメントを、１２６０ｂｐ配列の代わりに使用することができる。本実施例において、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を、プラスミドによりトランスフェクトし、構築物を産生することができる細胞を生成した。限界希釈法を使用して、ＡＡＴクローンを、選択し、無血清培地において成長させた。上清を、収集し、プールし、ＡＡＴ融合分子について分析した。ヒトＡＡＴに対する抗体を使用して、約５５ｋＤａのバンドが、ウェスタンブロット上に観察された（データ示さず）。本実施例において、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ受容体は、プロテインＡを使用して、組換えＡＡＴを精製するために使用した。融合分子を産生するクローンを同定し、一定分量を、今後の使用のために凍結させた。
【０１７４】
実施例２
他の例示的な方法において、図１および２Ａにおいて示される構築物を、精製し、市販で入手可能なＡＡＴ組成物または他の開示されるＡＡＴ組成物に関連する、知られている任意の状態のための方法または治療上の処置のために使用することができる。ある実施形態において、免疫分子に連結されたＡＡＴの二量体またはＡＡＴフラグメントを、使用することができる。
【０１７５】
ある例示的な方法において、ヒトＦｃ  ＩｇＧプラスミド（たとえばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、およびさらにＩｇＤなど）は、Ｑｉａｇｅｎから購入することができる（たとえばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、およびさらにＩｇＤなど）。ヒトｃＤＮＡは、切り取り、ＰＣＲクローニングを介してヒトＦｃベクターの中に挿入した。インフレーム配列について検証を実行した。プラスミドは、ＣＨＯ細胞にトランスフェクトし、単一のクローンを得るための限界希釈法の後、いくつかの安定性のクローンを単離した。安定性のクローンは、無血清培地を使用して増やし、さらに選択した。大規模細胞培養を実行し、上清を収集し、プールした。
【０１７６】
上清構築物は、１回のステップのプロテインＡマトリックスを使用して精製した。Ｈｈｕｍａｎ  Ｆｃ−ＡＡＴは、グリシン（ｐＨ２．４）を使用して溶出し、次いで、速やかに、ｐＨ７．４に中和した。ＳＤＳ  ＰＡＧＥにより、還元条件下で単一のバンドが明らかにされた。ある例示的な方法において、精製Ｆｃ−ＡＡＴを、エラスターゼ活性の阻害について、市販で入手可能なＡｒａｌａｓｔ（商標）と比較した。Ｆｃ−ＡＡｔ構築物を有するクローンは、同定し、増やし、一定分量は、後の使用のために、凍結させ、保存した。
【０１７７】
ヒトＡＡＴ  Ｆｃの精製：融合分子のウェスタンブロットにより、２つのＦｃ−ＡＡＴ分子のインタクトな二量体を示したバンド（約１７０ｋＤａ）が実証された。ウェスタンブロットの他のレーンは、ジスルフィド結合のすべてを融合分子において切断した場合、ＦＣ−ＡＡＴの２つの単量体分子を形成することを示した。非還元ゲルおよび還元ゲルの両方は、高レベルの純度のＡＡＴ構築物を実証した。そのため、Ｆｃ−ＡＡＴは、プロテインＡクロマトグラフィーを使用して、哺乳動物細胞培養上清から、１回のステップにおいて精製することができることが実証された。
【０１７８】
図３は、サイトカイン発現に対する、本明細書において記載される融合分子の効果の抗炎症モデルを示す。本実施例において、ＩＬ−８発現は、ＬＰＳの存在下または非存在下において測定される。このモデルは、刺激物質ＬＰＳを使用して、細胞における炎症活性を測定するための、よく知られているモデルである。ヒト血中好中球（３×１０６細胞／ｍｌ）は、単独でまたはＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）、１ミリリットル当たり１０マイクログラムのＦｃ−ＡＡＴ（ｒＡＡＴ）、もしくはＬＰＳおよびＦｃ−ＡＡＴの組み合わせの存在下において、６時間、インキュベートした。ＩＬ−８レベルは、培養上清において測定した（Ｎ＝３）。Ｆｃ−ＡＡＴの存在下においてＬＰＳにより治療した好中球は、ＬＰＳ単独と比較して、ＩＬ−８の有意に低下したレベルを実証した。そのため、Ｆｃ−ＡＡＴは、抗炎症活性を実証した。
【０１７９】
本明細書において開示される、ある実施形態において、Ｆｃ−ＡＡＴ構築物は、低下したまたはわずかなセリンプロテアーゼ阻害活性しか有し得ない。本明細書において生成される他の融合分子は、セリンプロテアーゼ阻害活性を含有する。
【０１８０】
実施例３
図４は、抗炎症分子、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒａ）の刺激に対する、本明細書において記載される構築物の一連の濃度を使用するヒストグラムプロットを示す。この例示的な方法において、好中球は、本明細書において生成される、減少性の濃度の融合分子（たとえばリンカー領域を有するＦｃ−ＡＡＴ）と共にインキュベートした。コントロールサンプルは、比較を実証するために使用した。これらの分子は、同等の量の市販の製剤（たとえばＡｒａｌａｓｔ（商標））よりも約１００倍活性である。本実験においてＮ＝２。
【０１８１】
実施例４
Ｆｃ−ＡＡＴの切断型改変体の構築。ある例示的な実施形態において、ＡＡＴのプロテアーゼ切断が、ＡＡＴの配列内のプロテアーゼ部位、たとえばタバコモザイクウイルスプロテアーゼの単純な挿入とすることができる。プロテアーゼ認識部位の挿入により、ＡＡＴの切断型カルボキシル末端が生成される。この部位は、天然に存在するＡＡＴのカルボキシ−３６−末端ペプチド：
ＳＩＰＰＥＶＫＦＮＫＰＦＶＦＬＭＩＥＱＮＴＫＳＰＬＦＭＧＫＶＶＮＰＴＱＫ（配列番号３４）
の上流にある（たとえば図５を参照されたい）。
【０１８２】
これらの切断型ＡＡＴ分子は、ＬＰＳ誘発性のＩＬ−１β、ＩＬ−６、およびＴＮＦαを阻害することができる。二価の切断型融合分子は、血漿半減期の増大の点から、ペプチドそれ自体より優れたものとなり得る。天然のＡＡＴが細胞膜の脂質ラフトにおいて見つけられる可能性を考慮すれば、挿入が、Ｃ−末端ではなく、Ｎ−末端になる可能性は低いであろう。そのため、二価の構造についてＦｃに連結されたＣ−末端３６のアミノ酸を有することは、おそらく、脂質ラフトにおいてより有効となるであろう。Ｃ−３６ペプチドが、１２０μｇ／ｍＬ〜３０μｇ／ｍＬの濃度で１８時間のＬＰＳ誘発性のＩＬ−１βを低下させることが実証された（データ示さず）。
【０１８３】
ペプチドのサイズ（およそ４ｋＤａ）は、おそらく、短い半減期を有するであろう、そのため、ある実施形態において、それが、キャリアと共に製剤されるであろう。そのため、補体受容体（ＦｃＲ）に対して結合するその能力について命名された、Ｆｃドメインとも呼ばれる、ヒトＩｇＧ１ドメインのＦｃ不変領域を使用することができる。融合タンパク質の１つの利点は、それが被験体の血液循環における半減期を延ばすということである。ここに、Ｆｃ融合タンパク質についての少なくとも２つの独特の利点がある：１）プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを使用する粗細胞上清液からの容易な精製；および２）Ｆｃ融合タンパク質は、ヒトにおいて、いくつかの疾患を治療するために使用することができ、そのため、確立された安全性についての記録を有する。例証されるように、Ｆｃ−ＡＡＴの他の切断型バージョンの効果は、直ちに評価することができる。たとえば、タバコモザイクウイルスプロテアーゼによるプロテアーゼ切断は、ＣＨＯ細胞上清に対して実行されるであろう。次いで、混合物は、プロテインＡカラムにかけられ、画分は、酸性バッファーにより溶出され、急速な中和が後続するであろう。ある切断型Ｆｃ−ＡＡＴは、抗エラスターゼ活性を有しないであろう。たとえば、３６−Ｃペプチドは、この活性を含有しない。そのため、これらの分子の活性は、セリンプロテアーゼ阻害活性以外の何かになるであろう。これらの切断型分子は、図５において例証されるように、Ｃ−８０またはＣ−６０などのように、Ｃ−３６分子よりも大きなものとすることができる。
【０１８４】
Ｆｃドメインの切断。他の切断部位は、所望される場合、ａＡＴまたはＡＡＴ由来のペプチドからＦｃフラグメントを除去するために、Ｆｃそれ自体の切断部位とすることができる。この部位は、ＡＡＴまたは切断型ＡＡＴの単量体形態を生成する。しかしながら、Ｆｃ−ＩｇＧ１についての酵素は、本明細書において企図されるＦｃ−ＩｇＧ２および他のＩｇＧ分子と異なる。
【０１８５】
Ｎ−末端の融合タンパク質。Ｎ−末端ＡＡＴの構築物は、ＡＡＴの抗炎症（または抗免疫）特性が、エラスターゼ阻害特性に非依存性であることを実証するデータに基づく新規な概念である。したがって、インフレーム構築のためにＮ−末端を使用することは、二価のＣ−末端を有する分子の形成を促進する。それぞれの構築物について、グリコシル化が分子の重要な構成成分であるので、ＣＨＯにおける発現は、不可欠となる。そのため、ＣＨＯ細胞は、野生型および切断型Ｆｃ−ＡＡＴの発現に使用されるであろう。
【０１８６】
切断型Ｆｃ−ＡＡＴの精製およびアッセイ。プロテアーゼ挿入部位の場合には、分子を切断するためのプロテアーゼは、最初に導入され、次いで、フラグメントだけを単離するためにプロテインＡを使用することができる。それにより、産物のほぼ純粋な形態が得られるであろう。Ｆｃ切断部位の場合などのようなある方法において、分子は、プロテインＡ上で精製し、Ｆｃ切断プロテアーゼを追加し、次いで、プロテインＡ上でＦｃフラグメントを除去し、残っているペプチドまたはタンパク質をほぼ純粋のままにすることができる。
【０１８７】
図７は、ＰｏｌｙＩ：Ｃ（５０μｇ／ｍｌ）の存在下における、Ｆｃ−ＡＡＴ（配列番号：）の存在下における、ヒト血中単球からのＩＬ−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−Ｒａ）の産生のヒストグラムプロットを示す（Ｎ＝１）。
【０１８８】
ある例示的な実験において、ヒト血中単球は、大量のインターフェロンを誘発することによってウイルス感染症を模倣するＰｏｌｙＩ：Ｃ（５０μｇ／ｍｌ）の存在下において、増大性の濃度の組換えＦｃ−ＡＡＴまたはＰｒｏｌａｓｔｉｎ  Ｃ（登録商標）（ＡＡＴの市販で入手可能な形態）と共にインキュベートした。ある場合には、当業者らは、ＬＰＳを使用するよりも、このモデル（ＰｏｌｙＩ：Ｃを使用）を適切なモデルとして見なす。Ｆｃ−ＡＡＴおよび市販で入手可能なＡＡＴ製剤の濃度は、０．００８〜５０μｇ／ｍｌの範囲にわたった。優れた効果は、Ｆｃ−ＡＡＴによる、抗炎症分子、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒａ）の誘発について観察された。図７は、１０μｇ／ｍｌおよび５０μｇ／ｍｌの濃度で、Ｆｃ−ＡＡＴ融合分子（リンカーを有する）が、Ｐｒｏｌａｓｔｉｎ  Ｃ（登録商標）と比較して、ＩＬ−１Ｒａにおける約１．５〜２倍の増大を誘発したことを実証する例示的なヒストグラムプロットを示す。
【０１８９】
本明細書において開示され、主張される組成物および方法はすべて、本開示を考慮して、不必要な実験作業を伴うことなく成され、実行されてもよい。組成物および方法が、好ましい実施形態の点から記載されたが、本発明の概念、精神、および範囲から逸脱することなく、変更が、本明細書において記載される組成物および方法に対してならびに方法のステップまたはステップの順序において適用されてもよいことは、当業者らに明らかであろう。より詳細には、化学的および生理学的の両方で関連するある作用物質が、本明細書において記載される作用物質と置換されてもよく、同じまたは同様の結果が、実現されるであろうということは明らかであろう。当業者らに明らかなすべてのそのような同様の置換および修飾は、添付の特許請求の範囲によって規定されるように、本発明の精神、範囲、および概念の範囲内にあると考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
2020171316000001.app
【外国語明細書】
2020171316000001.pdf