(57)【要約】      （修正有）【課題】ＲＮＡ誘導型ゲノム編集、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を用いた編集の特異性を増大させる方法を提供する。【解決手段】ｄＣａｓ９の末端、たとえばＮ末端に融合するＦｏｋＩ触媒ドメイン配列を含むＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９融合タンパク質であって、任意に、介在リンカー、たとえば、２〜３０個、たとえば４〜１２個のアミノ酸、たとえば、Ｇｌｙ４Ｓｅｒのリンカーを含む、ＦｏｋＩ−Ｃａｓ９融合タンパク質などを開示する。【選択図】図５Ａ
2020039350.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＮＡ誘導型ＦｏｋＩヌクレアーゼ（ＲＦＮ）融合タンパク質であって、触媒的に不活
性であるＣＲＩＳＰＲ関連９（ｄＣａｓ９）のアミノ末端に融合するＦｏｋＩ触媒ドメイ
ン配列を含み、任意に、介在リンカーを備える、ＲＮＡ誘導型ＦｏｋＩヌクレアーゼ（Ｒ
ＦＮ）融合タンパク質。
【請求項２】
２〜３０個のアミノ酸のリンカーを含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記リンカーが、Ｇｌｙ４Ｓｅｒを含む、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
ＦｏｋＩ触媒ドメインが、配列番号４のアミノ酸３８８〜５８３、または４０８〜５８
３を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
ｄＣａｓ９が、Ｄ１０、Ｅ７６２、Ｈ９８３、またはＤ９８６での変異、およびＨ８４
０またはＮ８６３での変異を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
ｄＣａｓ９が、
（ｉ）Ｄ１０ＡまたはＤ１０Ｎ、および
（ｉｉ）Ｈ８４０Ａ、Ｈ８４０Ｙ、またはＨ８４０Ｎ
での変異を含む、請求項５に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
請求項１〜６に記載の融合タンパク質をコードする核酸。
【請求項８】
請求項７に記載の核酸を含むベクター。
【請求項９】
請求項１〜６に記載の融合タンパク質を発現する宿主細胞。
【請求項１０】
細胞において、ゲノム配列の配列特異的な崩壊を誘導する方法であって、前記方法が、
請求項１〜６に記載のＲＮＡ誘導型ＦｏｋＩヌクレアーゼ（ＲＦＮ）融合タンパク質、お
よび好ましくは０〜３１ヌクレオチド離れた２つの標的ゲノム配列に前記ＲＦＮを配向す
るガイドＲＮＡを、前記細胞に発現すること、または前記細胞と接触させることとを含み
、好ましくは、前記２つの標的配列が、それぞれ３’末端でＰＡＭ配列を有する、
方法。
【請求項１１】
前記２つの標的ゲノム配列が、１０〜２０塩基対、好ましくは、１３〜１７塩基対離れ
ている、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ガイドＲＮＡが、
（ａ）２つの単一ガイドＲＮＡであって、１つの単一ガイドＲＮＡが第１の鎖を標的と
し、他方のガイドＲＮＡが相補鎖を標的とし、ＦｏｋＩが各鎖を切断して、反対のＤＮＡ
鎖上に１対のニックをもたらし、それにより二重鎖を切断する、２つの単一ガイドＲＮＡ
、または
（ｂ）ｔｒａｃｒＲＮＡおよび２つのｃｒＲＮＡであって、１つのｃｒＲＮＡが第１の
鎖を標的とし、他方のｃｒＲＮＡが相補鎖を標的とし、ＦｏｋＩが各鎖を切断して、反対
のＤＮＡ鎖上に１対のニックをもたらし、それにより二重鎖を切断する、ｔｒａｃｒＲＮ
Ａおよび２つのｃｒＲＮＡ
である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記２つのガイドＲＮＡが、それぞれ、標的ゲノム配列の１７〜２０個のヌクレオチド
と相補的な相補領域を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
挿入欠失変異が、前記２つの標的配列の間に誘導される、請求項１０〜１３のいずれか
１項に記載の方法。
【請求項１５】
細胞におけるＲＮＡ誘導型ゲノム編集の特異性が増大する、請求項１０〜１４のいずれ
か１項に記載の方法。
【請求項１６】
細胞におけるＲＮＡ誘導型ゲノム編集の特異性を増大させる方法であって、前記細胞を
、請求項１〜６に記載のＲＮＡ誘導型ＦｏｋＩヌクレアーゼ（ＲＦＮ）融合タンパク質と
接触させることを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（優先権の主張）
本願は、２０１３年３月１５日に出願された米国仮特許出願第６１／７９９，６４７号
；２０１３年６月２１日に出願された米国仮特許出願第６１／８３８，１７８号；２０１
３年６月２１日に出願された米国仮特許出願第６１／８３８，１４８号および２０１３年
１２月２６日に出願された米国仮特許出願第６１／９２１，００７号に対する米国特許法
１１９条（ｅ）に基づく優先権を主張するものである。上記出願の内容全体が参照により
本明細書に組み込まれる。
【０００２】
（連邦支援による研究または開発）
本発明は、米国国立衛生研究所により授与された助成番号ＤＰ１  ＧＭ１０５３７８の
下、政府の支援を受けてなされたものである。政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
ＲＮＡ誘導型ＦｏｋＩヌクレアーゼ（ＲＦＮ）、たとえばＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９融合タ
ンパク質を用いて、ＲＮＡ誘導型ゲノム編集、例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を用いた
編集の特異性を増大させる方法。
【背景技術】
【０００４】
近年の研究では、クラスター化され等間隔にスペーサーが入った短い回文型の反復配列
（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）系（Ｗｉｅｄｅｎｈｅｆｔら，Ｎａｔｕ
ｒｅ  ４８２，３３１−３３８（２０１２）；Ｈｏｒｖａｔｈら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２
７，１６７−１７０（２０１０）；Ｔｅｒｎｓら，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌ  １４，３２１−３２７（２０１１））が、細菌、酵母およびヒト細胞のほか、ショ
ウジョウバエ、ゼブラフィッシュおよびマウスなどのそのままの生物体においてｉｎ  ｖ
ｉｖｏで基板としてのゲノム編集の役割を果たし得ることが明らかにされている（Ｗａｎ
ｇら，Ｃｅｌｌ  １５３，９１０−９１８（２０１３）；Ｓｈｅｎら，Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ
（２０１３）；Ｄｉｃａｒｌｏら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ（２０１３）；
Ｊｉａｎｇら，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３１，２３３−２３９（２０１３）；Ｊ
ｉｎｅｋら，Ｅｌｉｆｅ  ２，ｅ００４７１（２０１３）；Ｈｗａｎｇら，Ｎａｔ  Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３１，２２７−２２９（２０１３）；Ｃｏｎｇら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  
３３９，８１９−８２３（２０１３）；Ｍａｌｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９，８２３−
８２６（２０１３ｃ）；Ｃｈｏら，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３１，２３０−２３
２（２０１３）；Ｇｒａｔｚら，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １９４（４）：１０２９−３５（２
０１３））。化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９ヌクレアーゼ（以
降、単にＣａｓ９と呼ぶ）は、人工的に設計されたｇＲＮＡの最初の２０ヌクレオチドと
、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）、例えば、配列ＮＧＧまたはＮＡＧにマッチ
するＰＡＭに隣接する目的とする標的ゲノムＤＮＡ配列の相補鎖との間の塩基対相補性を
介して誘導され得る（Ｓｈｅｎら，Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ（２０１３）；Ｄｉｃａｒｌｏら，
Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ（２０１３）；Ｊｉａｎｇら，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｏｌ  ３１，２３３−２３９（２０１３）；Ｊｉｎｅｋら，Ｅｌｉｆｅ  ２，ｅ０
０４７１（２０１３）；Ｈｗａｎｇら，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３１，２２７−
２２９（２０１３）；Ｃｏｎｇら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９，８１９−８２３（２０１３
）；Ｍａｌｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９，８２３−８２６（２０１３ｃ）；Ｃｈｏら，
Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３１，２３０−２３２（２０１３）；Ｊｉｎｅｋら，Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ  ３３７，８１６−８２１（２０１２））。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（Ｊｉｎｅｋ
ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３７，８１６−８２１（２０１２））、細菌（Ｊｉａｎｇら，Ｎ
ａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３１，２３３−２３９（２０１３））およびヒト細胞（Ｃ
ｏｎｇら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９，８１９−８２３（２０１３））で実施されたこれま
での研究では、Ｃａｓ９を介した切断が、場合によっては、ｇＲＮＡ／標的部位接合部、
特に２０ヌクレオチド（ｎｔ）ｇＲＮＡ相補性領域の３’末端にある最後の１０〜１２の
ヌクレオチド（ｎｔ）における単一のミスマッチによって、無効になり得ることが示され
ている。
【発明の概要】
【０００５】
多くの研究で、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓヌクレアーゼが、最大５つのミスマッチを許容し
、なおも切断することが可能であるが、任意の単一のミスマッチまたはミスマッチの組合
せが活性に及ぼす影響を予測するのは困難であることが示されている。まとめると、これ
らのヌクレアーゼは著しいオフターゲット効果を示し得るが、その部位を予測するのが困
難であり得る。本明細書には、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を用いるゲノム編集、例えば、Ｒ
ＮＡ誘導型ＦｏｋＩヌクレアーゼ（ＲＦＮ）、たとえばＦｏｋＩ−Ｃａｓ９またはＦｏｋ
Ｉ−ｄＣａｓ９ベースの融合タンパク質を用いるゲノム編集の特異性を増大させる方法が
記載される。
【０００６】
第一の態様では、本発明は、ｄＣａｓ９の末端、たとえばＮ末端に融合するＦｏｋＩ触
媒ドメイン配列を含むＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９融合タンパク質であって、任意に、介在リン
カー、たとえば、２〜３０個、たとえば４〜１２個のアミノ酸、たとえば、Ｇｌｙ４Ｓｅ
ｒのリンカーを含む、ＦｏｋＩ−Ｃａｓ９融合タンパク質を提供する。いくつかの実施形
態では、ＦｏｋＩ触媒ドメインは、配列番号４の３８８〜５８３、または４０８〜５８３
のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ｄＣａｓ９は、Ｄ１０、Ｅ７６２、Ｈ９８
３、またはＤ９８６での変異、およびＨ８４０またはＮ８６３での変異、たとえば、（ｉ
）Ｄ１０ＡまたはＤ１０Ｎ；および（ｉｉ）Ｈ８４０Ａ、Ｈ８４０ＹまたはＨ８４０Ｎで
の変異を含む。
【０００７】
別の態様では、本発明は、これらの融合タンパク質をコードする核酸、この核酸を含む
ベクター、およびこの核酸、ベクター、または融合タンパク質を保有または発現する宿主
細胞を提供する。
【０００８】
別の態様では、本発明は、細胞中の二重鎖ＤＮＡ分子の中、たとえば、ゲノム配列の中
で配列特異的な切断を誘導する方法であって、本明細書に記載されるＦｏｋＩ−ｄＣａｓ
９融合タンパク質を、細胞中で発現させるか、または細胞と接触させることと、
（ａ）２つの単一ガイドＲＮＡであって、この２つの単一ガイドＲＮＡのそれぞれが、
標的配列の１本鎖にそれぞれ相補的な配列を含むことにより、両方のガイドＲＮＡを使用
することにより、両方の鎖の標的化をもたらし、（すなわち、１つの単一ガイドＲＮＡは
、第１の鎖を標的化し、他方のガイドＲＮＡが、相補鎖を標的化する）、ＦｏｋＩが、反
対のＤＮＡ鎖上に１対のニックをもたらす各鎖を切断することにより、二重鎖が切断され
る、２つの単一ガイドＲＮＡと、
（ｂ）ｔｒａｃｒＲＮＡおよび２つのｃｒＲＮＡであって、２つのＣｒＲＮＡのそれぞ
れが、標的配列の内の１つの鎖と相補的な配列を含むことにより、両方のｃｒＲＮＡを使
用することにより、両方の鎖の標的化をもたらし（すなわち、１つのｃｒＲＮＡは第１の
鎖を標的化し、他方は、相補鎖を標的化する）、ＦｏｋＩが、反対のＤＮＡ鎖上に１対の
ニックをもたらす各鎖を切断することにより、二重鎖が切断される、ｔｒａｃｒＲＮＡお
よび２つのｃｒＲＮＡと
を含む。
【０００９】
別の態様では、本発明は、細胞のＲＮＡ誘導型ゲノム編集の特異性を増大させる方法で
あって、本明細書中に記載されるＲＮＡ誘導型ＦｏｋＩヌクレアーゼ（ＲＦＮ）融合タン
パク質と細胞を接触させることを含む、方法を提供する。
【００１０】
本方法は、
（ａ）２つの単一ガイドＲＮＡであって、この２つの単一ガイドＲＮＡのそれぞれが、
標的配列の内の１つの鎖とそれぞれ相補的である配列を含むことにより、両方のガイドＲ
ＮＡを使用することにより、両鎖の標的化をもたらし（すなわち１つの単一ガイドＲＮＡ
が第１の鎖を標的化し、他方のガイドＲＮＡが相補鎖を標的化する）、ＦｏｋＩが、反対
のＤＮＡ鎖上に１対のニックをもたらす各鎖を切断することにより、二本鎖が切断される
、２つの単一ガイド鎖と、
（ｂ）ｔｒａｃｒＲＮＡおよび２つのｃｒＲＮＡであって、２つのｃｒＲＮＡのそれぞ
れが、標的配列の内の１つの鎖に相補的な配列を含むことにより、両方のｃｒＲＮＡを使
用することにより、両方の鎖の標的化をもたらし（すなわち、１つのｃｒＲＮＡが第１の
鎖を標的化し、他方のｃｒＲＮＡが、相補鎖を標的化する）、ＦｏｋＩが、反対のＤＮＡ
鎖上に１対のニックをもたらすことにより、二重鎖が切断される、ｔｒａｃｒＲＮＡおよ
び２つのｃｒＲＮＡ
を細胞で発現させるか、この細胞と接触させることをさらに含んでもよい。
【００１１】
いくつかの実施形態では、２つの標的ゲノム配列（すなわち、ｃｒＲＮＡまたは単一ガ
イドＲＮＡの標的相補領域に相補的な配列）は、１０〜２０塩基対、好ましくは１３〜１
７塩基対離れている。
【００１２】
いくつかの実施形態では、挿入欠失変異が、２つの標的配列の間に誘導される。
【００１３】
いくつかの実施形態では、細胞のＲＮＡ誘導型ゲノム編集の特異性が増大する。
【００１４】
特に明記されない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語はいずれも、本
発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に
は本発明で使用する方法および材料が記載されるが、ほかにも、当該技術分野で公知の他
の適切な方法および材料を使用することができる。材料、方法および具体例は単に例示的
なものであって、限定することを意図するものではない。本明細書で言及される刊行物、
特許出願、特許、配列、データベースエントリをはじめとする参照物はいずれも、その全
体が参照により組み込まれる。不一致が生じた場合、定義を含めた本明細書が優先される
。
【００１５】
本発明のその他の特徴と利点は、以下の詳細な説明および図面ならびに特許請求の範囲
から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】標的ＤＮＡ部位と結合したｇＲＮＡ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼ複合体を示す模式図である。鋏はゲノムＤＮＡ標的部位のＣａｓ９ヌクレアーゼのおよその切断点を示す。ガイドＲＮＡのヌクレオチドの番号が５’から３’に向かって逆向きに進むことに留意されたい。
【図２Ａ】ｇＲＮＡの５’相補性領域を短縮する原理を示す模式図である。灰色の太線＝標的ＤＮＡ部位、灰色の細線の構造＝ｇＲＮＡ、灰色の楕円＝Ｃａｓ９ヌクレアーゼであり、黒線はｇＲＮＡと標的ＤＮＡ部位との間の塩基対形成を示している。
【図２Ｂ】ＥＧＦＰ崩壊アッセイの模式的概観である。単一の組み込まれたＥＧＦＰ−ＰＥＳＴレポーター遺伝子の標的化Ｃａｓ９仲介性二本鎖切断が、誤りがちなＮＨＥＪ仲介性修復によって修復されると、細胞にコード配列を崩壊させるフレームシフト変異およびそれに付随する蛍光の消失が起こる。
【図２Ｃ】ＥＧＦＰレポーター遺伝子配列の３つの異なる標的部位でアッセイした、（Ｃ）単一ミスマッチを有するｓｇＲＮＡを保有するＲＧＮの活性。反復試験の活性を完全にマッチするｇＲＮＡの活性に正規化した平均値が示されている（オンラインの方法を参照）。エラーバーは平均値の標準誤差を表す。各ｇＲＮＡのミスマッチの位置が下の格子に灰色で強調されている。３つのＥＧＦＰ標的部位の配列は以下の通りであった：  ＥＧＦＰ部位１  ＧＧＧＣＡＣＧＧＧＣＡＧＣＴＴＧＣＣＧＧＴＧＧ（配列番号１）  ＥＧＦＰ部位２  ＧＡＴＧＣＣＧＴＴＣＴＴＣＴＧＣＴＴＧＴＣＧＧ（配列番号２）  ＥＧＦＰ部位３  ＧＧＴＧＧＴＧＣＡＧＡＴＧＡＡＣＴＴＣＡＧＧＧ（配列番号３）
【図２Ｄ】ＥＧＦＰレポーター遺伝子配列の３つの異なる標的部位でアッセイした、（Ｄ）隣接する二重ミスマッチを有するｓｇＲＮＡを保有するＲＧＮの活性。反復試験の活性を完全にマッチするｇＲＮＡの活性に正規化した平均値が示されている（オンラインの方法を参照）。エラーバーは平均値の標準誤差を表す。各ｇＲＮＡのミスマッチの位置が下の格子に灰色で強調されている。３つのＥＧＦＰ標的部位の配列は以下の通りであった：  ＥＧＦＰ部位１  ＧＧＧＣＡＣＧＧＧＣＡＧＣＴＴＧＣＣＧＧＴＧＧ（配列番号１）  ＥＧＦＰ部位２  ＧＡＴＧＣＣＧＴＴＣＴＴＣＴＧＣＴＴＧＴＣＧＧ（配列番号２）  ＥＧＦＰ部位３  ＧＧＴＧＧＴＧＣＡＧＡＴＧＡＡＣＴＴＣＡＧＧＧ（配列番号３）
【図２Ｅ】ＥＧＦＰレポーター遺伝子配列の３つの異なる標的部位でアッセイした、（Ｅ）様々な間隔の二重ミスマッチを有するｓｇＲＮＡを保有するＲＧＮの活性。反復試験の活性を完全にマッチするｇＲＮＡの活性に正規化した平均値が示されている（オンラインの方法を参照）。エラーバーは平均値の標準誤差を表す。各ｇＲＮＡのミスマッチの位置が下の格子に灰色で強調されている。３つのＥＧＦＰ標的部位の配列は以下の通りであった：  ＥＧＦＰ部位１  ＧＧＧＣＡＣＧＧＧＣＡＧＣＴＴＧＣＣＧＧＴＧＧ（配列番号１）  ＥＧＦＰ部位２  ＧＡＴＧＣＣＧＴＴＣＴＴＣＴＧＣＴＴＧＴＣＧＧ（配列番号２）  ＥＧＦＰ部位３  ＧＧＴＧＧＴＧＣＡＧＡＴＧＡＡＣＴＴＣＡＧＧＧ（配列番号３）
【図２Ｆ】ＥＧＦＰレポーター遺伝子配列の３つの異なる標的部位でアッセイした、（Ｆ）数の増加する隣接するミスマッチを有するｓｇＲＮＡを保有するＲＧＮの活性。反復試験の活性を完全にマッチするｇＲＮＡの活性に正規化した平均値が示されている（オンラインの方法を参照）。エラーバーは平均値の標準誤差を表す。各ｇＲＮＡのミスマッチの位置が下の格子に灰色で強調されている。３つのＥＧＦＰ標的部位の配列は以下の通りであった：  ＥＧＦＰ部位１  ＧＧＧＣＡＣＧＧＧＣＡＧＣＴＴＧＣＣＧＧＴＧＧ（配列番号１）  ＥＧＦＰ部位２  ＧＡＴＧＣＣＧＴＴＣＴＴＣＴＧＣＴＴＧＴＣＧＧ（配列番号２）  ＥＧＦＰ部位３  ＧＧＴＧＧＴＧＣＡＧＡＴＧＡＡＣＴＴＣＡＧＧＧ（配列番号３）
【図２Ｇ】ｇＲＮＡの５’末端のミスマッチの方が３’のミスマッチよりもＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓの感度が高くなる。ｇＲＮＡは、ワトソン−クリックトランスバージョンを用いてミスマッチさせた「ｍ」で表される位置を除いて、ＲＮＡとＤＮＡとの間でワトソン−クリック塩基対を形成する（すなわち、ＥＧＦＰ部位＃２  Ｍ１８−１９は、位置１８および１９でｇＲＮＡをそのワトソン−クリックパートナーに変化させることによってミスマッチさせたものである）。ｇＲＮＡの５’付近の位置は一般に許容性が極めて高いが、他の残基がミスマッチである場合、この位置でのマッチがヌクレアーゼ活性には重要である。４つの位置すべてがミスマッチである場合、ヌクレアーゼ活性はもはやは検出されなくなる。このことはさらに、この５’の位置でのマッチがほかにも３’の位置に生じたミスマッチを相殺し得ることを示している。これらの実験はコドン最適化型よりも低い絶対レベルのヌクレアーゼ活性を示し得る非コドン最適化型のＣａｓ９を用いて実施したものであることに留意されたい。
【図２Ｈ】ヒト細胞ベースのＵ２ＯＳ  ＥＧＦＰ崩壊アッセイにおいて１５〜２５ｎｔの範囲の様々な長さの相補性領域を有するｇＲＮＡによって誘導されたＣａｓ９ヌクレアーゼ活性の効率。Ｕ６プロモーターからのｇＲＮＡ発現には５’Ｇの存在が必要であるため、標的ＤＮＡ部位に対して特定の長さの相補性（１５ｎｔ、１７ｎｔ、１９ｎｔ、２０ｎｔ、２１ｎｔ、２３ｎｔおよび２５ｎｔ）を保有するｇＲＮＡに限り評価することが可能であった。
【図３Ａ】Ｃａｓ９およびＥＧＦＰレポーター遺伝子の４か所の標的部位に対する完全長ｇＲＮＡまたは短縮ｇＲＮＡによって仲介されるＥＧＦＰ崩壊のヒト細胞における効率。相補性領域の長さおよび対応する標的ＤＮＡ部位が示されている。Ｃｔｒｌ＝相補性領域を欠く対照ｇＲＮＡ。
【図３Ｂ】マッチする標準的なＲＧＮおよびｔｒｕ−ＲＧＮによって７つの異なるヒト内在遺伝子標的に導入された標的化挿入欠失変異の効率。相補性領域の長さおよび対応する標的ＤＮＡ部位が示されている。挿入欠失頻度はＴ７ＥＩアッセイによって測定したものである。Ｃｔｒｌ＝相補性領域を欠く対照ｇＲＮＡ。
【図３Ｃ】ＥＭＸ１部位を標的とするｔｒｕ−ｇＲＮＡまたはマッチする完全長ｇＲＮＡを用いたＲＧＮによって誘発された挿入欠失変異のＤＮＡ配列。標的ＤＮＡ部位のｇＲＮＡ相補性領域と相互作用する部分が灰色で強調され、ＰＡＭ配列の最初の塩基が小文字で示されている。欠失が灰色で強調された破線で表され、挿入が灰色で強調されたイタリック体の文字で表されている。欠失または挿入塩基の正味の数および各配列が単離された回数が右側に示されている。
【図３Ｄ】マッチする標準的なＲＧＮおよびｔｒｕ−ＲＧＮによって２つの内在ヒト遺伝子に導入された正確なＨＤＲ／ｓｓＯＤＮ仲介性変化の効率。％ＨＤＲはＢａｍＨＩ制限消化アッセイを用いて測定したものである（実施例２の実験手順を参照されたい）。対照ｇＲＮＡ＝空のＵ６プロモーターベクター。
【図３Ｅ】Ｕ２ＯＳ．ＥＧＦＰ細胞に可変量の完全長ｇＲＮＡ発現プラスミド（上段）またはｔｒｕ−ｇＲＮＡ発現プラスミド（下段）を一定量のＣａｓ９発現プラスミドとともにトランスフェクトした後、ＥＧＦＰ発現が減少した細胞の百分率をアッセイした。二重反復実験の平均値が平均値の標準誤差とともに示されている。この３か所のＥＧＦＰ標的部位では、ｔｒｕ−ｇＲＮＡで得られたデータがｔｒｕ−ｇＲＮＡプラスミドの代わりに完全長ｇＲＮＡ発現プラスミドで実施した実験のデータと緊密に一致していることに留意されたい。
【図３Ｆ】Ｕ２ＯＳ．ＥＧＦＰ細胞に可変量のＣａｓ９発現プラスミドを可変量の完全長ｇＲＮＡ発現プラスミド（上段）またはｔｒｕ−ｇＲＮＡ発現プラスミド（下段）（図３Ｅの実験から各ｔｒｕ−ｇＲＮＡの量を決定した）とともにトランスフェクトした。二重反復実験の平均値が平均値の標準誤差とともに示されている。この３か所のＥＧＦＰ標的部位では、ｔｒｕ−ｇＲＮＡで得られたデータがｔｒｕ−ｇＲＮＡプラスミドの代わりに完全長ｇＲＮＡ発現プラスミドで実施した実験のデータと緊密に一致していることに留意されたい。これらの漸増法の結果から、実施例１および２で実施したＥＧＦＰ崩壊アッセイに使用するプラスミドの濃度を決定した。
【図４Ａ】ＲＮＡ誘導型ＦｏｋＩヌクレアーゼおよびＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓサブタイプＹｐｅｓｔタンパク質４（Ｃｓｙ４）ベースのマルチプレックスｇＲＮＡ発現系である。  （ａ）ＲＮＡ誘導型ＦｏｋＩヌクレアーゼの図式的概要。２つのＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９融合タンパク質が、ＦｏｋＩの二量体化およびＤＮＡの切断を促進するために、２つの異なるｇＲＮＡより隣接した標的部位に動員される。
【図４Ｂ】ＲＮＡ誘導型ＦｏｋＩヌクレアーゼおよびＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓサブタイプＹｐｅｓｔタンパク質４（Ｃｓｙ４）ベースのマルチプレックスｇＲＮＡ発現系である。  （ｂ）Ｃｓｙ４ベースのマルチプレックスｇＲＮＡ発現系の図式的概要。２つのｇＲＮＡ（いずれかの５’末端ヌクレオチドを備える）が、Ｃｓｙ４認識部位に隣接するそれぞれのｇＲＮＡと、ＵＧプロモーターから単一の転写物中で共発現される。Ｃｓｙ４は、転写物からｇＲＮＡを切断し、放出する。Ｃｓｙ４認識領域は、ｇＲＮＡの３’末端に維持され、Ｃｓｙ４ヌクレアーゼがこの部位に結合する。
【図４Ｃ】ＲＮＡ誘導型ＦｏｋＩヌクレアーゼおよびＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓサブタイプＹｐｅｓｔタンパク質４（Ｃｓｙ４）ベースのマルチプレックスｇＲＮＡ発現系である。  （ｃ）多重Ｃｓｙ４ベースの系の検証。ＥＧＦＰの隣接部位を標的とした２つのｇＲＮＡを、Ｃｓｙ４およびＣａｓ９のヌクレアーゼと共に、ヒトＵ２ＯＳ．ＥＧＦＰ細胞のＣｓｙ４ベースの系を使用して単一のＲＮＡ転写物中に発現した。これらの細胞に誘導された挿入欠失変異の配列が示される。野生型の配列が上部に示され、両方の標的部位が灰色で強調されて、ＰＡＭ配列が下線を施した文字として示される。欠失は、灰色の背景に対して破線により示され、挿入は、灰色の背景に対して小文字により示される。各配列の右側には、挿入（＋）または欠失（Δ）の大きさが特定される。
【図５Ａ】ＲＮＡ誘導型ＦｏｋＩヌクレアーゼの設計および最適化。  （ａ）ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９融合物およびｄＣａｓ９−ＦｏｋＩ融合物の概略的な例示。
【図５Ｂ】ＲＮＡ誘導型ＦｏｋＩヌクレアーゼの設計および最適化。  （ｂ）２つの配向：ＰＡＭ内部（ＰＡＭ  ｉｎ）（左側のパネル）およびＰＡＭ外部（ＰＡＭ  ｏｕｔ）（右側のパネル）のうちの１つの片側部位を標的化とするｇＲＮＡ対でのＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９融合物のＥＧＦＰ崩壊の活性化のスクリーニング。片側部位は、０〜３１ｂｐの範囲の可変的な長さのスペーサー配列により分離した。ＥＧＦＰ崩壊は、フローサイトメトリーにより定量した（ｎ＝１）。ｄＣａｓ９−ＦｏｋＩ融合物および同一のｇＲＮＡ対の対応するデータを図５Ｅに示す。
【図５Ｃ】ＲＮＡ誘導型ＦｏｋＩヌクレアーゼの設計および最適化。  （ｃ）ＰＡＭ外部と共に配向され、１０〜２０ｂｐの範囲の長さのスペーサー長と共に配向される片側部位を備える標的部位のＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９仲介性ＥＧＦＰ崩壊の追加的な評価。ＥＧＦＰ崩壊は、フローサイトメトリーにより定量化された。エラーバーは、平均値の標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ）を示す（ｎ＝２）。
【図５Ｄ】ＲＮＡ誘導型ＦｏｋＩヌクレアーゼの設計および最適化。  （ｄ）スペーサー長により分類した（ｃ）からのデータの、ＥＧＦＰ崩壊の平均値。エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍを示す。
【図５Ｅ】ＲＮＡ誘導型ＦｏｋＩヌクレアーゼの設計および最適化。  （ｅ）これらのプロットは、０〜３１ｂｐのスペーシングおよびＰＡＭ内部およびＰＡＭ外部の配向を伴う６０個のｇＲＮＡ対でのＵ２ＯＳ．ＥＧＦＰ細胞のＥＧＦＰ崩壊アッセイにおけるｄＣａｓ９−ＦｏｋＩ活性のスクリーニング結果を示す。
【図５Ｆ−１】ＲＮＡ誘導型ＦｏｋＩヌクレアーゼの設計および最適化。  （ｆ）Ｕ２ＯＳ細胞のＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９誘導型変異の配列を示す。Ｃａｓ９またはＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９により結合される２３ｎｔ標的配列を灰色で示す。プロトスペーサー隣接モチーフ、すなわちＰＡＭ配列を、下線を付して太字で表す。欠失を、薄い灰色の背景上に破線を付して表す。挿入は灰色で強調する。挿入または欠失した塩基の正味の数は、配列の直右側の縦列中に示される。
【図５Ｆ−２】ＲＮＡ誘導型ＦｏｋＩヌクレアーゼの設計および最適化。  （ｆ）Ｕ２ＯＳ細胞のＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９誘導型変異の配列を示す。Ｃａｓ９またはＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９により結合される２３ｎｔ標的配列を灰色で示す。プロトスペーサー隣接モチーフ、すなわちＰＡＭ配列を、下線を付して太字で表す。欠失を、薄い灰色の背景上に破線を付して表す。挿入は灰色で強調する。挿入または欠失した塩基の正味の数は、配列の直右側の縦列中に示される。
【図５Ｆ−３】ＲＮＡ誘導型ＦｏｋＩヌクレアーゼの設計および最適化。  （ｆ）Ｕ２ＯＳ細胞のＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９誘導型変異の配列を示す。Ｃａｓ９またはＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９により結合される２３ｎｔ標的配列を灰色で示す。プロトスペーサー隣接モチーフ、すなわちＰＡＭ配列を、下線を付して太字で表す。欠失を、薄い灰色の背景上に破線を付して表す。挿入は灰色で強調する。挿入または欠失した塩基の正味の数は、配列の直右側の縦列中に示される。
【図５Ｆ−４】ＲＮＡ誘導型ＦｏｋＩヌクレアーゼの設計および最適化。  （ｆ）Ｕ２ＯＳ細胞のＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９誘導型変異の配列を示す。Ｃａｓ９またはＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９により結合される２３ｎｔ標的配列を灰色で示す。プロトスペーサー隣接モチーフ、すなわちＰＡＭ配列を、下線を付して太字で表す。欠失を、薄い灰色の背景上に破線を付して表す。挿入は灰色で強調する。挿入または欠失した塩基の正味の数は、配列の直右側の縦列中に示される。
【図６Ａ】ＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９  ＲＦＮの二量体化が、有効なゲノム編集の活性に必要である。  （ａ）（ＥＧＦＰ部位４７および８１を）正確に標的とするｇＲＮＡ対、およびｇＲＮＡの１つまたは他方が、（ＶＥＧＦＡ遺伝子中の）非ＥＧＦＰ配列を標的とする別のｇＲＮＡと置き換えられている対の存在下で評価される２つのＲＥＮ対のＥＧＦＰ崩壊の活性。ＥＧＦＰ崩壊は、フローサイトメトリーにより定量化された。ＥＧＦＰ：高感度緑色蛍光タンパク質、ＶＥＧＦＡ：血管内皮増殖因子Ａ。エラーバーは、平均値の標準誤差の（ｓ．ｅ．ｍ）を表す（ｎ＝３）。
【図６Ｂ】ＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９  ＲＦＮの二量体化が、有効なゲノム編集の活性に必要である。  （ｂ）（ａ）のＥＧＦＰ崩壊アッセイで使用されるのと同一の細胞由来のゲノムＤＮＡで実施したＴ７ＥＩアッセイによる変異誘発の頻度の定量化。エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍを表す（ｎ＝３）。
【図６Ｃ】ＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９  ＲＦＮの二量体化が、有効なゲノム編集の活性に必要である。  （ｃ）ＡＰＣ、ＭＬＨ１およびＶＥＧＦＡ遺伝子中の部位を標的とするＲＦＮの活性化。各標的で、本出願人は、「左の」片側部位では１つのｇＲＮＡのみ、または「右の」片側部位では１つのｇＲＮＡのみである、１対の同族のｇＲＮＡとＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９を共発現させた。変異原性の比率は、Ｔ７Ｅ１アッセイにより測定した。ＡＰＣ：大腸腺腫症；ＭＬＨ１：ｍｕｔＬ  相同体１；ＶＥＧＦＡ：血管内皮細胞増殖因子。エラーバーはｓ．ｅ．ｍを表す（ｎ＝３）。
【図６Ｄ】ＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９  ＲＦＮの二量体化が、有効なゲノム編集の活性に必要である。  （ｄ）ＶＥＧＦＡ部位１を標的とするために使用されるｇＲＮＡの１つでのオンターゲット部位および５つの従来より知られているオフターゲット（ＯＴ）部位でＶＥＧＦＡ部位１を標的とするＲＦＮの変異誘発頻度。変異の頻度は、ディープシーケンシングにより決定した。報告される各値は、３つの独立したトランスフェクションの実験から集められたゲノムＤＮＡから調製した単一のディープシーケンシングライブラリーから決定した。オンターゲットＶＥＧＦＡ部位１について示される値（アスタリスクが付される）は、以下の図４ａの値と同一であり、この図面に表される値との比較を簡単にすることのみを目的として示される。
【図７Ａ】単一ｇＲＮＡと共発現したＣａｓ９ニッカーゼまたはＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９の変異原性活性。  （ａ）６つの異なるヒト遺伝子部位を標的とする１つまたは２つのｇＲＮＡの存在下でのＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９（左のバー）またはＣａｓ９ニッカーゼ（中央のバー）により誘導される挿入欠失変異の頻度。各遺伝子標的について、両方のｇＲＮＡでの挿入欠失の頻度を評価した。「左」の片側部位では１つのみのｇＲＮＡ、または「右」の片側部位では他方のｇＲＮＡのみを用いる。変異の頻度を、ディープシーケンシングにより決定した。報告するそれぞれの挿入欠失の頻度は、３つの独立したトランスフェクションの実験から集めたゲノムＤＮＡから調製した単一のディープシーケンシングライブラリーから決定した。ＶＥＧＦＡ：血管内皮増殖因子Ａ、ＤＤＢ２：損傷特異的ＤＮＡ結合タンパク質２（Ｄａｍａｇｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＤＮＡ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ２）；ＦＡＮＣＦ：ファンコニ貧血相補群Ｆ（Ｆａｎｃｏｎｉ  Ａｎｅｍｉａ，  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｇｒｏｕｐ  Ｆ）；ＦＥＳ：ネコ肉腫ウイルス癌遺伝子；ＲＵＮＸ  １：Ｒｕｎｔ関連転写因子１（Ｒｕｎｔ−Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ  １）。
【図７Ｂ】単一ｇＲＮＡと共発現したＣａｓ９ニッカーゼまたはＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９の変異原性活性。  （ｂ）単一ｇＲＮＡの実験または対照の実験（ｇＲＮＡなし、およびＣａｓ９ニッカーゼまたはＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９なし）のそれぞれに対して、ｇＲＮＡ対を備える各標的部位で得られた値と比較した挿入欠失の頻度における倍数減少として表される（ａ）由来のデータ。この倍数減少は、ＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９（各対の左側のバー、薄灰色）およびＣａｓ９ニッカーゼ（各対の右側のバー、濃灰色）の両方について計算された。
【図８】単一のＣａｓ９ニッカーゼは、それぞれの標的部位に点変異を高い効率で導入することができる。  ＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９、Ｃａｓ９ニッカーゼ、またはｔｄＴｏｍａｔｏ対照の存在下の（ａ）ＶＥＧＦＡ、（ｂ）ＦＡＮＣＦ、および（ｃ）ＲＵＮＸ１の遺伝子標的での、単一ｇＲＮＡが標的化とする片側部位の各位置で見出される異なる点変異の頻度。変異の頻度を、ディープシーケンシングにより決定した。報告する各点変異の値は、３つの独立したトランスフェクションの実験から集めたゲノムＤＮＡから調製した単一ディープシーケンシングから決定した。これらの実験に使用するゲノムＤＮＡは、図７Ａ〜Ｂの挿入欠失変異で分析した同一の細胞から単離したことに留意されたい。ＶＥＧＦＡ：血管内皮増殖因子Ａ；ＦＡＮＣＦ：ファンコニ貧血相補群Ｆ；ＲＵＮＸ  １：Ｒｕｎｔ関連転写因子１。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
（詳細な説明）
ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（ＲＧＮ）は、簡便で効率的なゲノム編集の
プラットフォームとして急速に登場した。Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉら（Ｊｉａｎｇら，Ｎａ
ｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３１，２３３−２３９（２０１３））は近年、細菌でのＣａ
ｓ９  ＲＧＮの特異性を体系的に研究したが、ヒト細胞でのＲＧＮ特異性については十分
に明らかにされていない。これらのヌクレアーゼを研究および治療応用に広く用いるので
あれば、ヒトをはじめとする真核細胞においてＲＧＮによるオフターゲット効果が及ぶ範
囲を理解することが極めて重要になる。本発明者らは、ヒト細胞ベースのレポーターアッ
セイを用いてＣａｓ９ベースのＲＧＮによるオフターゲット切断の特徴を明らかにした。
ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）−ＤＮＡ接合部に沿った位置に応じて、様々な程度で単一およ
び二重のミスマッチが許容された。一部ミスマッチのある部位を調べることによって、ヒ
ト細胞の内在遺伝子座を標的とした６種類のＲＧＮのうちの４種類によって誘発されるオ
フターゲット変化が迅速に検出された。特定されたオフターゲット部位は最大５つのミス
マッチを保有しており、その多くが目的とするオンターゲット部位で観察された頻度と同
等（またはそれ以上）の頻度で変異していた。したがって、ＲＧＮはヒト細胞において、
不完全にマッチしたＲＮＡ−ＤＮＡに対しても高い活性を示し、この観察結果は研究およ
び治療応用での使用を複雑なものにしかねないものである。
【００１８】
本明細書に記載される結果は、任意のＲＧＮの特異性プロファイルを予測することが容
易なものでもなく単純なものでもないことを示している。ＥＧＦＰレポーターアッセイの
実験は、単一および二重のミスマッチがヒト細胞でのＲＧＮ活性に様々な影響を及ぼし得
るものであり、その影響はミスマッチの標的部位内での位置（１つまたは複数）に厳密に
依存するものではないことを示している。例えば、これまでに公開されている報告の通り
、一般にｇＲＮＡ／ＤＮＡ接合部の３’側半分にみられる変化の方が、５’側半分にみら
れる変化よりも影響が大きいが（Ｊｉａｎｇら，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３１，
２３３−２３９（２０１３）；Ｃｏｎｇら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９，８１９−８２３（
２０１３）；Ｊｉｎｅｋら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３７，８１６−８２１（２０１２））。
しかしながら３’末端の単一および二重変異が十分に許容されると思われる場合もあるの
に対して、５’末端の二重変異は活性を大幅に低下させ得る。さらに、任意の位置（１つ
または複数）のミスマッチの影響の大きさは部位依存的であると思われる。可能なあらゆ
るヌクレオチド置換（本発明者らのＥＧＦＰレポーター実験で用いられるワトソン−クリ
ックトランスバージョン以外にも）を試験し、大きな一連のＲＧＮに関して広範囲にわた
るプロファイリングを実施すれば、オフターゲットの及び得る範囲についてさらに洞察が
得られると考えられる。この点に関して、近年記載されたＭａｒｒａｆｆｉｎｉらの細菌
細胞ベースの方法（Ｊｉａｎｇら，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３１，２３３−２３
９（２０１３））または以前にＬｉｕらがＺＦＮに適用したｉｎ  ｖｉｔｒｏのコンビナ
トリアルライブラリーベースの切断部位選択手法（Ｐａｔｔａｎａｙａｋら，Ｎａｔ  Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ  ８，７６５−７７０（２０１１））が、さらに大きなＲＧＮ特異性プロフ
ァイルの作製に有用であると考えられる。
【００１９】
ＲＧＮ特異性を広範囲にわたって予測するには上に挙げたような困難が伴うが、オンタ
ーゲット部位と１〜５つのミスマッチの分だけ異なる一部のゲノム部位を調べることによ
って、真のＲＧＮによるオフターゲットを特定することができた。注目すべきことに、こ
れらの実験の条件下では、多くのこれらのオフターゲット部位におけるＲＧＮ誘発変異の
頻度は、目的とするオンターゲット部位で観察された頻度とほぼ同じ（またはそれ以上）
であり、Ｔ７ＥＩアッセイ（本発明者らの実験室で実施した場合、信頼できる変異頻度の
検出限界が約２〜５％である）を用いてこれらの部位を検出することが可能であった。こ
れらの変異率は極めて高いため、これまではるかに頻度の低いＺＦＮ誘発オフターゲット
変化およびＴＡＬＥＮ誘発オフターゲット変化の検出に必要とされたディープシーケンシ
ング法の使用を回避することができた（Ｐａｔｔａｎａｙａｋら，Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ  ８，７６５−７７０（２０１１）；Ｐｅｒｅｚら，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  
２６，８０８−８１６（２００８）；Ｇａｂｒｉｅｌら，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
２９，８１６−８２３（２０１１）；Ｈｏｃｋｅｍｅｙｅｒら，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌ  ２９，７３１−７３４（２０１１））。このほか、ヒト細胞におけるＲＧＮオ
フターゲット変異誘発の解析から、ＲＧＮ特異性を予測することが困難であることが確認
され、単一および二重のミスマッチのあるオフターゲット部位がすべて変異の証拠を示す
わけではないが、ミスマッチが５つに及ぶ一部の部位でも変化がみられた。さらに、特定
された真のオフターゲット部位には、目的とする標的配列と比較して、転移または転換に
よる差への明らかな偏りは全くみられない。
【００２０】
いくつかのＲＧＮにオフターゲット部位がみられたが、このような部位の特定は広範囲
の規模でもゲノム全域にわたる規模でもなかった。研究対象にした６種類のＲＧＮでは、
ヒトゲノム内にある総数がはるかに多い潜在的オフターゲット配列のごく一部のものだけ
を検討した。Ｔ７ＥＩアッセイによってこれだけ多数のオフターゲット変異の遺伝子座を
検討するのは実用的な戦略でも費用効果に優れた戦略でもないが、今後の研究でハイスル
ープットシーケンシングを使用することになれば、多数のオフターゲット部位の候補を調
べることが可能になり、より高感度に真のオフターゲット変異を検出する方法が得られる
ものと考えられる。例えば、そのような方法を用いれば、本発明者らがいかなるオフター
ゲット変異も明らかにできなかった２種類のＲＧＮについて、さらなるオフターゲット部
位を明らかにすることが可能になると考えられる。さらに、細胞内でのＲＧＮ活性に影響
を及ぼし得るＲＧＮ特異性とエピゲノミックな要因（例えば、ＤＮＡメチル化およびクロ
マチン状態）の両方の理解が進展すればほかにも、検討する必要のある潜在的部位の数が
減少し、これによりゲノム全域にわたるＲＧＮオフターゲットの評価の実用性が高まり、
価格も手頃なものになり得ると考えられる。
【００２１】
ゲノムオフターゲット変異の頻度を最小限に抑えるのにいくつかの戦略を用いることが
できる。例えば、ＲＧＮ標的部位の特異的選択を最適化することができる。目的とする標
的部位と最大５つの位置において異なるオフターゲット部位がＲＧＮによって効率的に変
異され得るとすると、ミスマッチの計数によって判定される最小数のオフターゲット部位
を有する標的部位を選択するのが効果的であるとは思われない。ヒトゲノム内の配列を標
的とする任意のＲＧＮには通常、２０ｂｐのＲＮＡ：ＤＮＡ相補性領域内の４つまたは５
つの位置が異なる何千もの潜在的オフターゲット部位が存在することになる。このほか、
ｇＲＮＡ相補性領域のヌクレオチド含有量が潜在的オフターゲット効果の範囲に影響を及
ぼす可能性がある。例えば、ＧＣ含有量が高いとＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドが安定する
ことが示されており（Ｓｕｇｉｍｏｔｏら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３４，１１２１
１−１１２１６（１９９５））、したがって、ｇＲＮＡ／ゲノムＤＮＡのハイブリダイゼ
ーションの安定性およびミスマッチの許容性も高まることが予想されると考えられる。こ
の２つのパラメータ（ゲノム内のミスマッチ部位の数およびＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド
の安定性）がゲノム全域にわたるＲＧＮ特異性に影響を及ぼす可能性およびその機序を評
価するには、ｇＲＮＡの数を増やした実験がさらに必要となる。しかし、このような予測
パラメータを定めることができるとしても、このようなガイドラインの実施による影響が
ＲＧＮの標的化の範囲をさらに制限することになる可能性があることに留意することが重
要である。
【００２２】
ＲＧＮ誘発オフターゲット効果を低減する一般的な戦略で有望なものの１つに、細胞内
で発現するｇＲＮＡおよびＣａｓ９ヌクレアーゼの濃度を低くすることが考えられる。Ｕ
２ＯＳ．ＥＧＦＰ細胞のＶＥＧＦＡ標的部位２および３にＲＧＮを用いて、この考えを検
討した。トランスフェクトするｇＲＮＡ発現およびＣａｓ９発現プラスミドを減らしたと
ころ、オンターゲット部位での変異率が低下したが、オフターゲット変異の相対的比率は
あまり変化しなかった。これと同じように、他の２種類のヒト細胞型（ＨＥＫ２９３細胞
およびＫ５６２細胞）でも、オンターゲット変異誘発の絶対的比率がＵ２ＯＳ．ＥＧＦＰ
細胞より低いものの、高レベルのオフターゲット変異誘発率が観察された。したがって、
細胞内でのｇＲＮＡおよびＣａｓ９の発現レベルを低下させてもオフターゲット効果を低
減する解決策にはならないと思われる。さらに、上の結果はほかにも、ヒト細胞に観察さ
れる高率のオフターゲット変異誘発がｇＲＮＡおよび／またはＣａｓ９の過剰発現に起因
するものではないことを示唆している。
【００２３】
３種類の異なるヒト細胞型でＲＧＮによって大幅なオフターゲット変異誘発が引き起こ
され得るという観察結果は、このゲノム編集プラットフォームの使用に重要な意味を持つ
。研究に適用する場合、特に望ましくない変化の他配が課題となる世代時間の長い培養細
胞または生物体を用いる実験では、高頻度のオフターゲット変異の潜在的に複雑な作用を
考慮に入れる必要がある。オフターゲット効果はランダムなものではなく、標的とする部
位と関係があるため、このような作用を制御する方法の１つとして、異なるＤＮＡ配列を
標的とする複数のＲＧＮを用いて同じゲノム変化を誘発することが考えられる。しかし、
治療に適用する場合、ここに挙げた観察結果は、これらのヌクレアーゼをヒト疾患の治療
により長期間にわたって安全に使用するのであれば、ＲＧＮ特異性を慎重に定め、かつ／
または改善する必要があることを明確に示している。
【００２４】
特異性を改善する方法
本明細書に示されるように、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９タンパ
ク質を土台とするＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、目的とするオン
ターゲット活性と同等以上の著しいオフターゲット変異誘発効果を有し得る（実施例１）
。このようなオフターゲット効果は、研究の適用する際に、また特に将来治療に適用する
際に問題となり得る。したがって、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（
ＲＧＮ）の特異性を改善する方法が必要とされている。
【００２５】
実施例１に記載されるように、Ｃａｓ９  ＲＧＮはヒト細胞のオフターゲット部位に高
頻度の挿入欠失変異を誘発し得る（このほか、Ｃｒａｄｉｃｋら，２０１３；Ｆｕら，２
０１３；Ｈｓｕら，２０１３；Ｐａｔｔａｎａｙａｋら，２０１３を参照されたい）。こ
のような望ましくない変化は、目的とするオンターゲット部位と５つものミスマッチによ
って異なるゲノム配列に起こり得る（実施例１を参照されたい）。さらに、ｇＲＮＡ相補
性領域の５’末端のミスマッチは一般に、３’末端のミスマッチよりも許容されやすいが
、このような関係は絶対的なものではなく、部位依存性を示す（実施例１およびＦｕら，
２０１３；Ｈｓｕら，２０１３；Ｐａｔｔａｎａｙａｋら，２０１３を参照されたい）。
その結果、現在、ミスマッチの数および／または位置に依存するコンピュータを用いる方
法は、真のオフターゲット部位を特定するために予測に用いる価値が低下している。した
がって、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼを研究および治療応用に使用するのであれば、オフタ
ーゲット変異の頻度を低下させる方法が依然として重要な優先事項である。
【００２６】
二量体化は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼの特異性を改善する魅力的な戦略となる可能性があ
る。これは、真の二量体系ではない、対形成されたＣａｓ９ニッカーゼの手法とは異なる
ものである。対形成されたニッカーゼは、ＤＮＡのセグメント上に２つのＣａｓ９ニッカ
ーゼを同時に局在することにより働き、これにより、定義されていない機構を介して効率
の高いゲノム編集を誘導する。二量体化は、酵素活性に必要ではないため、単一のＣａｓ
９ニッカーゼもまた、特定の部位で（知られていない機構を介して）挿入欠失を高い効率
で誘導することもでき、したがって、ゲノム中の望ましくないオフターゲット変異を潜在
的に引き起こす可能性がある。
【００２７】
したがって、ＲＧＮの特異性を改善する１つの手法として、Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａ
の変異を有する触媒的に不活性な形態のＣａｓ９（ｄＣａｓ９としても知られる）に、Ｆ
ｏｋＩエンドヌクレアーゼドメインを融合することがある。ＦｏｋＩヌクレアーゼドメイ
ンは、二量体として機能し、したがって、二重鎖の切断を誘導するために、２つのサブユ
ニットがＤＮＡの同一の局所部分に動員されなければならない。この構成（図９Ａおよび
実施例２）では、２つのＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９融合物が、二重鎖の切断を得るために２つ
の異なるｇＲＮＡを使用した適切な構成で動員される。したがって、この系では、Ｆｏｋ
Ｉ−ｄＣａｓ９融合物は、単一のＲＧＮの部位より２倍長い部位に結合し、それにより、
この系はより特異的になると予測される。
【００２８】
よって、本明細書は、ＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９融合タンパク質であって、ＦｏｋＩ配列が
、ｄＣａｓ９（好ましくは、ｄＣａｓ９のアミノ酸末端、また任意にカルボキシ末端）に
融合し、任意に、介在リンカー、たとえば、任意に２〜３０個のアミノ酸、たとえば４〜
１２個のアミノ酸、たとえばＧｌｙ４Ｓｅｒ（配列番号：２３）または（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ
）３のリンカーを含む、ＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９融合タンパク質を提供する。いくつかの実
施形態では、融合タンパク質は、ｄＣａｓ９およびＦｏｋＩのドメインの間にリンカーを
含む。これらの融合タンパク質（または連結構造の融合タンパク質の間）に使用し得るリ
ンカーは、融合タンパク質の機能に干渉しない任意の配列を含み得る。好ましい実施形態
では、リンカーは短く、例えば２〜２０アミノ酸であり、通常は柔軟である（すなわち、
グリシン、アラニンおよびセリンなどの自由度の高いアミノ酸を含む）。いくつかの実施
形態では、リンカーはＧＧＧＳ（配列番号２２）またはＧＧＧＧＳ（配列番号２３）、た
とえば、ＧＧＧＳ（配列番号２２）またはＧＧＧＧＳ（配列番号２３）ユニットのうちの
２、３、４つ、またはそれ以上の反復ユニットからなる１つ以上のユニットを含む。同様
に他のリンカー配列も使用できる。
【００２９】
また本明細書は、単なる共局在化ではなく二量体化が効率的なゲノム編集の活性に必要
であるＲＮＡ誘導型ＦｏｋＩヌクレアーゼプラットフォームを記載する。これらのヌクレ
アーゼは、ヒトの細胞で効率の高いゲノム編集を強く仲介することができ、高感度ディー
プシーケンシング法により判定して、検出できないレベルまでオフターゲット変異を減少
させることができる。また、５’末端のヌクレオチドを備えるｇＲＮＡ対を発現するため
に有効な系であって、ＲＦＮプラットフォーム上のより広い標的化範囲を与える方法を記
載する。最後に、単量体のＣａｓ９ニッカーゼは、一般的に、単一ｇＲＮＡが存在する中
、本明細書中に記載されるヌクレアーゼよりもよりも多く望ましくない挿入欠失および点
変異を導入する。これらの結果は、良好に特徴付けられた二量体構築物および対形成した
Ｃａｓ９ニッカーゼと比較した変異誘発プロファイルの改善、最も可能性のあるゲノム編
集の正確さを必要とする研究または治療の適用に重要な特徴といった、特異性の利点を備
えた、強力であり、取扱いが簡単なヌクレアーゼプラットフォームを定義する。
【００３０】
したがって、本明細書中で、ヒトの細胞で強力かつ特異性の高いゲノム編集を行うため
の新規のＲＮＡ誘導型ＦｏｋＩヌクレアーゼ（ＲＦＮ）プラットフォームが記載される。
ＲＦＮは、二量体としての活性と機能のために二つのｇＲＮＡを必要とする。驚くべきこ
とに、活性ＲＦＮの遺伝子操作は、ＦｏｋＩドメインが遺伝子操作した亜鉛フィンガーま
たは転写アクチベータ―様エフェクター反復アレイのカルボキシ末端に融合したＺｅｎお
よびＴＡＬＥＮと異なる構築物である、ｄＣａｓ９タンパク質のアミノ末端へのＦｏｋＩ
ヌクレアーゼドメインの融合を必要とした。またＲＦＮは、各Ｆｏｋ−ｄＣａｓ９／ｇＲ
ＮＡ複合体により結合された片側部位が、１４〜１７ｂｐの長さの相対的に限定された介
在スペーサーを備えた特定の相対配向（ＰＡＭ外部）を有することを必要とする。（活性
は、追加的なスペーシングで可能であり得るが、ほとんど一貫して成功しない）。
【００３１】
ＲＦＮの二量体の性質は、標準的な単量体Ｃａｓ９ヌクレアーゼに対して重要な特異性
に関する利点を提供する。理想的な二量体系では、活性は、片側部位で、モノマーではほ
とんど観察されない。提示されるデータから、単一ｇＲＮＡにより配向されるＦｏｋＩ−
ｄＣａｓ９は、ＲＦＮ片側部位で変異誘発をほとんど誘導しないか、または全く誘導しな
いことが例証される。１２つの単一ｇＲＮＡ（６つのＲＦＮ標的部位に対する）を、共発
現したＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９を用いて試験し、挿入欠失が、非常に低い頻度（０．００４
５％〜０．４７％の範囲）、場合によっては、ｇＲＮＡまたはヌクレアーゼの発現がない
対照細胞で観察されるバックグラウンドの比率と同程度の低いレベルで観察された。二量
体としてＦｏｋＩヌクレアーゼドメインが機能することを考慮すると、単一ｇＲＮＡで観
察されるいずれかの挿入欠失が、ＤＮＡへのＦｏｋＩ―ｄＣａｓ９ダイマーの動員による
ものである可能性が高いことが推定される。機構に関わらず、非常に低いレベルの変異誘
発のみが、ＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９を１２のオンターゲット片側部位での単一ｇＲＮＡを用
いて試験する際に観察されることを考慮すると、何等かの変異誘発が、部分的にミスマッ
チのオフターゲット片側部位で誘導される可能性が非常に少ない。実際に、ＶＥＧＦＡを
標的とするＲＦＮは、ディープシーケンシングにより判定されるように、ｇＲＮＡのうち
の１つの知られているオフターゲット部位で検出可能な変異を誘導しなかった。
【００３２】
ＲＦＮは真の二量体系であるので、ＲＦＮは、共局在化に依存するが二量体化を必要す
るものではない対形成するニッカーゼの技術に勝って、多くの重要な利点を有している。
第１に、本明細書中の直接的な比較から、単一のＣａｓ９ニッカーゼは、一般的に、同一
の個々のｇＲＮＡにより配向されるＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９融合タンパク質よりも挿入欠失
変異を効率良く導入することが示される。第２に、単量体のＣａｓ９ニッカーゼはまた、
標的片側部位に塩基対の置換を、この試験で包有されていない従来では知られていない変
異原性の副作用を伴って、高い効率で誘導する場合がある。ここでも、直接的な比較から
、単量体のＣａｓ９ニッカーゼが、同一の単一ｇＲＮＡにより誘導されるＦｏｋＩ−ｄＣ
ａｓ９融合物よりも実質的に高い比率で点変異を誘導することが示される。第３に、対形
成したＣａｓ９ニッカーゼは、二量体ＲＦＮよりも標的片側部位の配向およびスペーシン
グにおいて高い無差別性を示し、それゆえオフターゲット変異が誘導され得る可能性がよ
り高くなる範囲の部位を有する。対形成したニッカーゼの片側部位は、ＰＡＭ内部または
ＰＡＭ外部、および、０〜１０００ｂｐの範囲の長さのスペーサー配列を含んで配向でき
る（Ｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  １５４，  １３８０−１３８９  （２０１３）
；  Ｍａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３１，  ８３３−８３
８  （２０１３）；  Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ  （２０１３））
。この無差別性は、Ｃａｓ９ニッカーゼのゲノム編集活性が、酵素の二量体化に依存する
ものではなく、むしろ２つのニックの単なる共局在に依存するために存在する。対照的に
、ＲＦＮは、特異性において、より厳密性が高い。片側部位は、有効な切断のための２つ
のおおよそ配置されたＦｏｋＩ切断ドメインの必要条件のため、ＰＡＭ外部を有していな
ければならず、１４〜１７ｂｐ離れていなければならない。
【００３３】
ＦｏｋＩ
ＦｏｋＩは、ＤＮＡ認識ドメインおよび触媒（エンドヌクレアーゼ）ドメインを含む２
型制限エンドヌクレアーゼである。本明細書中に記載される融合タンパク質は、ＦｏｋＩ
全体、または触媒エンドヌクレアーゼドメイン、たとえば、ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッシ
ョン番号第ＡＡＡ２４９２７．１のアミノ酸３８８〜５８３または４０８〜５８３（たと
えばＬｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３９（１）：  ３
５９-３７２  （２０１１）；  Ｃａｔｈｏｍｅｎ  ａｎｄ  Ｊｏｕｎｇ，  Ｍｏｌ．  
Ｔｈｅｒ．  １６：  １２００-１２０７  （２００８）に記載）、またはＭｉｌｌｅｒ
ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２５：  ７７８-７８５  （２００７
）；  Ｓｚｃｚｅｐｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２５：  ７
８６-７９３  （２００７）；もしくはＢｉｔｉｎａｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ
．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ．  ９５：１０５７０-１０５７５  （
１９９８）に記載されるような、ＦｏｋＩの変異形態を含むことができる。
【００３４】
ＦｏｋＩの例示的なアミノ酸配列は、以下の通りである。
【化１】
2020039350.tif 000003
【００３５】
ＦｏｋＩをコードする例示的な核酸配列は、以下の通りである。
【化２】
2020039350.tif 000004
【００３６】
いくつかの実施形態では、本明細書中で使用されるＦｏｋＩヌクレアーゼは、配列番号
４、たとえば、配列番号４のアミノ酸３８８〜５８３、または４０８〜５８３と少なくと
も約５０％同一である。これらの変異体ヌクレアーゼは、ＤＮＡを切断する特性を保持し
たままでなければならない。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号４
のアミノ酸３８３〜５８３、または４０８〜５８３と約５０％、５５％、６０％、６５％
、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％同一である
。いくつかの実施形態では、配列番号４のアミノ酸３８８〜５８３、または４０８〜５８
３とのいずの差異も、非保存領域にある。
【００３７】
２つの配列のパーセント同一性を決定するには、最適比較目的で配列を整列させる（最
適な整列に必要であれば第一および第二のアミノ酸または核酸配列の一方または両方にギ
ャップを導入し、また非相同配列を比較目的のため無視することができる）。比較目的で
整列させる参照配列の長さは少なくとも５０％である（いくつかの実施形態では、参照配
列の長さの約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８５％、９０％、９５
％または１００％を整列させる）。次いで、対応する位置のヌクレオチドまたは残基を比
較する。第一の配列のある位置が、第二の配列の対応する位置と同じヌクレオチドまたは
残基によって占められていれば、２つの分子はその位置において同一である。２つの配列
間のパーセント同一性は、２つの配列の最適な整列のために導入する必要があるギャップ
の数および各ギャップの長さを考慮に入れた、２つの配列に共通する同一の位置の数の関
数となる。
【００３８】
配列の比較および２つの配列間のパーセント同一性の決定は、数学的アルゴリズムを用
いて実施することができる。本願の目的には、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプ
ログラムに組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（（１９７０）Ｊ．
Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３）のアルゴリズムを使用し、ギャップペナルテ
ィが１２、ギャップ伸長ペナルティが４、フレームシフトギャップペナルティが５のＢｌ
ｏｓｓｕｍ６２スコア行列を用いて、２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性を決定す
る。
【００３９】
Ｃａｓ９
いくつかの細菌がＣａｓ９タンパク質変異体を発現する。現在、化膿性連鎖球菌（Ｓｔ
ｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９が最もよく用いられているが、他
のＣａｓ９タンパク質にも化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９と高レベル
の配列同一性を有し、同じガイドＲＮＡを利用するものがある。それ以外のものはさらに
多様であり、利用するｇＲＮＡが異なり、認識するＰＡＭ配列（ＲＮＡによって定められ
る配列に隣接するタンパク質によって定められる、２〜５のヌクレオチド配列）も異なる
。Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉらは多数の細菌群のＣａｓ９タンパク質を分類し（ＲＮＡ  Ｂｉｏ
ｌｏｇｙ  １０：５，１−１２；２０１３）、その付図１および付表１に多数のＣａｓ９
タンパク質を列記しており、これらは参照により本明細書に組み込まれる。ほかのＣａｓ
９タンパク質については、Ｅｓｖｅｌｔら，Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１３  Ｎｏｖ
；１０（１１）：１１１６−２１およびＦｏｎｆａｒａら，“Ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ  ｏｆ
Ｃａｓ９  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｅｘｃｈａｎｇｅａｂｉｌ
ｉｔｙ  ｏｆ  ｄｕａｌ−ＲＮＡ  ａｎｄ  Ｃａｓ９  ａｍｏｎｇ  ｏｒｔｈｏｌｏｇｏ
ｕｓ  ｔｙｐｅ  ＩＩ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍｓ．”  Ｎｕｃｌｅｉｃ  
Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１３  Ｎｏｖ  ２２．［印刷前電子出版］ｄｏｉ：１０．１０
９３／ｎａｒ／ｇｋｔ１０７４に記載されている。
【００４０】
本明細書に記載の方法および組成物には様々な種のＣａｓ９分子を用いることができる
。化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）およびサーモフィルス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏ
ｐｈｉｌｕｓ）のＣａｓ９分子が本開示の大部分の対象となるが、ほかにも、本明細書に
列記する他の種のＣａｓ９タンパク質に由来するか、これに基づくＣａｓ９分子を用いる
ことができる。換言すれば、本記載の大部分が化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）
およびサーモフィルス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のＣａｓ９分子を用いるもの
であるが、他の種のＣａｓ９分子をその代わりに用いることができる。このような種とし
ては、Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉら，２０１３の付図に基づいて作成した以下の表に記載される
種が挙げられる。
【００４１】
【表１】
2020039350.tif 000005
2020039350.tif 000006
2020039350.tif 000007
【００４２】
本明細書に記載の構築物および方法は上に挙げたいずれかのＣａｓ９タンパク質および
その対応するガイドＲＮＡまたはこれに相当する他のガイドＲＮＡの使用を含み得る。こ
のほか、サーモフィルス菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）
ＬＭＤ−９のＣａｓ９  ＣＲＩＳＰＲ１系がヒト細胞で機能することがＣｏｎｇらに示さ
れている（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９，８１９（２０１３））。髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎ
ｇｉｔｉｄｅｓ）Ｃａｓ９オルソログがＨｏｕら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃ
ｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２０１３  Ｓｅｐ  ２４；１１０（３９）：１５６４４−９およびＥｓ
ｖｅｌｔら，Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１３  Ｎｏｖ；１０（１１）：１１１６−２
１に記載されている。さらに、Ｊｉｎｅｋらは、サーモフィルス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐ
ｈｉｌｕｓ）およびＬ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）のＣａｓ９オルソログ（異な
るガイドＲＮＡを利用すると思われる髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）および
ジェジュニ菌（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）のＣａｓ９オルソログではない）が、わずかに効率が
低下するものの、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）二重ｇＲＮＡによって誘導さ
れて標的プラスミドＤＮＡを切断し得ることをｉｎ  ｖｉｔｒｏで明らかにしている。
【００４３】
いくつかの実施形態では、本発明の系は、細菌にコードされるか、哺乳動物細胞での発
現にコドン最適化され、Ｄ１０、Ｅ７６２、Ｈ９８３またはＤ９８６およびＨ８４０また
はＮ８６３の変異、例えば、Ｄ１０Ａ／Ｄ１０ＮおよびＨ８４０Ａ／Ｈ８４０Ｎ／Ｈ８４
０Ｙを含む化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９タンパク質を用いてタンパ
ク質のヌクレアーゼ部分の触媒能を不活性化し；これらの位置における置換は、（Ｎｉｓ
ｈｉｍａｓｕら，Ｃｅｌｌ  １５６，９３５−９４９（２０１４）に記載されているよう
に）アラニンであってよく、また他の残基、例えばグルタミン、アスパラギン、チロシン
、セリンまたはアスパラギン酸、例えばＥ７６２Ｑ、Ｈ９８３Ｎ、Ｈ９８３Ｙ、Ｄ９８６
Ｎ、Ｎ８６３Ｄ、Ｎ８６３ＳまたはＮ８６３Ｈであってよい（図１Ｃ）。本明細書に記載
の方法および組成物に使用することができる触媒能が不活性化された化膿性連鎖球菌（Ｓ
．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９は以下の通りであり、例示的なＤ１０ＡおよびＨ８４０Ａ
の変異は太字で表され、下線が施されている。
【００４４】
【表２】
2020039350.tif 000008
2020039350.tif 000009
【００４５】
いくつかの実施形態では、本明細書で使用されるＣａｓ９ヌクレアーゼは、化膿性連鎖
球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９の配列と少なくとも約５０％同一である、すなわ
ち、配列番５０％同号５と少なくとも一である。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド
配列は配列番号５と約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５
％、９０％、９５％、９９％または１００％同一である。いくつかの実施形態では、配列
番号５との差はいずれも非保存領域内にあり、これはＣｈｙｌｉｎｓｋｉら，ＲＮＡ  Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ  １０：５，１−１２；２０１３（例えば、その付図１および付表１）；Ｅ
ｓｖｅｌｔら，Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１３  Ｎｏｖ；１０（１１）：１１１６−
２１およびＦｏｎｆａｒａら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（２０１４）４２（４）
：２５７７−２５９０．［印刷前電子出版  ２０１３  Ｎｏｖ  ２２］ｄｏｉ：１０．１
０９３／ｎａｒ／ｇｋｔ１０７４に記載されている配列の配列アライメントによって確認
される。同一性を上述のように決定する。
【００４６】
ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）
一般的に言えば、ガイドＲＮＡには２つの系、すなわち、一緒に機能してＣａｓ９によ
る切断を誘導する別個のｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡを用いる系１および２つの別個の
ガイドＲＮＡを単一の系に組み合わせるキメラｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッ
ドを用いる系２（単一ガイドＲＮＡまたはｓｇＲＮＡと呼ばれる。このほか、Ｊｉｎｅｋ
ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１２；３３７：８１６−８２１を参照されたい）がある。ｔｒ
ａｃｒＲＮＡは様々な長さに短縮することが可能であり、様々な長さのものが別個の系（
系１）およびキメラｇＲＮＡ系（系２）の両方で機能することが示されている。例えば、
いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡは、その３’末端から少なくとも１ｎｔ、２
ｎｔ、３ｎｔ、４ｎｔ、５ｎｔ、６ｎｔ、７ｎｔ、８ｎｔ、９ｎｔ、１０ｎｔ、１５ｎｔ
、２０ｎｔ、２５ｎｔ、３０ｎｔ、３５ｎｔまたは４０ｎｔ短縮されていてよい。いくつ
かの実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ分子は、その５’末端から少なくとも１ｎｔ、２ｎ
ｔ、３ｎｔ、４ｎｔ、５ｎｔ、６ｎｔ、７ｎｔ、８ｎｔ、９ｎｔ、１０ｎｔ、１５ｎｔ、
２０ｎｔ、２５ｎｔ、３０ｎｔ、３５ｎｔまたは４０ｎｔ短縮されていてよい。あるいは
、ｔｒａｃｒＲＮＡ分子は、５’末端および３’末端の両方から、例えば、５’末端で少
なくとも１ｎｔ、２ｎｔ、３ｎｔ、４ｎｔ、５ｎｔ、６ｎｔ、７ｎｔ、８ｎｔ、９ｎｔ、
１０ｎｔ、１５ｎｔまたは２０ｎｔ、３’末端で少なくとも１ｎｔ、２ｎｔ、３ｎｔ、４
ｎｔ、５ｎｔ、６ｎｔ、７ｎｔ、８ｎｔ、９ｎｔ、１０ｎｔ、１５ｎｔ、２０ｎｔ、２５
ｎｔ、３０ｎｔ、３５ｎｔまたは４０ｎｔ短縮されていてよい。例えば、Ｊｉｎｅｋら，
Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１２；３３７：８１６−８２１；Ｍａｌｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２
０１３  Ｆｅｂ  １５；３３９（６１２１）：８２３−６；Ｃｏｎｇら，Ｓｃｉｅｎｃｅ
．２０１３  Ｆｅｂ  １５；３３９（６１２１）：８１９−２３；ならびにＨｗａｎｇお
よびＦｕら，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３  Ｍａｒ；３１（３）：２２７−
９；Ｊｉｎｅｋら，Ｅｌｉｆｅ  ２，ｅ００４７１（２０１３）を参照されたい。系２で
は一般に、キメラｇＲＮＡの長さが長いほどオンターゲット活性が高いことがわかってい
るが、様々な長さのｇＲＮＡの相対的特異性は現時点では明らかにされておらず、したが
って、場合によっては短いｇＲＮＡを用いる方が望ましいことがある。いくつかの実施形
態では、ｇＲＮＡは、転写開始部位の上流約１００〜８００ｂｐ以内、例えば、転写開始
部位の上流約５００ｂｐ以内、または転写開始部位の下流約１００〜８００ｂｐ以内、例
えば、約５００ｂｐ以内にある領域に相補的である。いくつかの実施形態では、２種類以
上のｇＲＮＡをコードするベクター（例えば、プラスミド）、例えば、標的遺伝子の同じ
領域の異なる部位を対象とする２種類、３種類、４種類、５種類またはそれ以上のｇＲＮ
Ａをコードするプラスミドを用いる。
【００４７】
Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、たとえば、ゲノムＤＮＡ標的部位の相補鎖に相補的な５’末
端で１７〜２０ｎｔを有する単一ｇＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡ／ｃｒＲＮＡといった
、ガイドＲＮＡを使用して、配列ＮＧＧといった追加的なプロトスペーサー隣接モチーフ
（ＰＡＭ）を有する、特異的な１７〜２０ｎｔのゲノム標的に誘導することができる。し
たがって、本発明の方法は、たとえば、Ｍａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２
０１３  Ｆｅｂ  １５；  ３３９（６１２１）：８２３−６に記載されるような単一のＣ
ａｓ９ガイドＲＮＡといった、標準的なトランスコード化ｔｒａｃｒＲＮＡに融合される
ｃｒＲＮＡを含む単一のガイドＲＮＡの使用を含むことができる。これは、たとえば、Ｎ
ＧＧ、ＮＡＧ、またはＮＮＧＧといったプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の５’
末端標的配列に相補的な鎖のうち、２０ｎｔ、１９ｎｔ、１８ｎｔ、または１７ｎｔ、好
ましくは１７ｎｔまたは１８ｎｔといった、２５〜１７、任意に２０以下のヌクレオチド
（ｎｔ）の標的配列に相補的な５’末端での配列を備える。いくつかの実施形態では、単
一のＣａｓ９誘導型ＲＮＡは、配列
【化３】
2020039350.tif 000010
であって、式中Ｘ１７〜２０が、標的配列の１７〜２０個の連続したヌクレオチドに相補
的なヌクレオチド配列である、配列からなる。単一ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡは、
以前に文献で記載されている（Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ３３７
（６０９６）：８１６−２１  （２０１２）およびＪｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｌｉ
ｆｅ．  ２：ｅ００４７１  （２０１３））。
【００４８】
ガイドＲＮＡは、リボ核酸とＣａｓ９との結合に干渉しない任意の配列であり得るＸＮ
を含んでよく、（ＲＮＡ中の）Ｎは０〜２００、例えば、０〜１００、０〜５０または０
〜２０であり得る。
【００４９】
いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、３’末端に１つまたは複数のアデニン（Ａ
）またはウラシル（Ｕ）ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ  Ｐｏｌ
ＩＩＩ転写を停止させる終止シグナルとして用いられる１つまたは複数のＴが任意選択で
存在する結果として、ＲＮＡは、分子の３’末端に１つまたは複数のＵ、例えば、１〜８
つまたはそれ以上のＵ（例えば、Ｕ、ＵＵ、ＵＵＵ、ＵＵＵＵ、ＵＵＵＵＵ、ＵＵＵＵＵ
Ｕ、ＵＵＵＵＵＵＵ、ＵＵＵＵＵＵＵＵ）を含む。
【００５０】
本明細書中に記載されるいくつかの例は単一ｇＲＮＡを利用するが、本方法は、二重の
ｇＲＮＡ（たとえば天然に存在する系で見出されるｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ）
を用いても使用できる。この場合、単一のｔｒａｃｒＲＮＡ、本発明の系を使用して発現
する複数の異なるｃｒＲＮＡ、たとえば以下
（Ｘ１７―２０）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ（配列番号：１３）；
（Ｘ１７―２０）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＵＵＵＵＧ（配列番号：１４）；
または
（Ｘ１７―２０）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵ（配列番号：１５）
およびｔｒａｃｒＲＮＡ配列と共に使用される。この場合、ｃｒＲＮＡは、本明細書に記
載される方法および分子におけるガイドＲＮＡとして使用され、ｔｒａｃｒＲＮＡは、同
一または異なるＲＮＡ分子から発現できる。いくつかの実施形態では、本方法は、配列
【化４】
2020039350.tif 000011
またはその活性部位（活性部位は、Ｃａｓ９またはｄＣａｓ９との複合体を形成する特性
を保持する部位である）を含む、またはからなるｔｒａｃｒＲＮＡと細胞を接触させるこ
とを含む。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ分子は、少なくとも１ｎｔ、２ｎ
ｔ、３ｎｔ、４ｎｔ、５ｎｔ、６ｎｔ、７ｎｔ、８ｎｔ、９ｎｔ、１０ｎｔ、１５ｎｔ、
２０ｎｔ、２５ｎｔ、３０ｎｔ、３５ｎｔ、または４０ｎｔだけ、３’末端から短縮され
ていてもよい。別の実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ分子は、少なくとも１ｎｔ、２ｎｔ
、３ｎｔ、４ｎｔ、５ｎｔ、６ｎｔ、７ｎｔ、８ｎｔ、９ｎｔ、１０ｎｔ、１５ｎｔ、２
０ｎｔ、２５ｎｔ、３０ｎｔ、３５ｎｔ、または４０ｎｔだけ、５’末端から短縮されて
もよい。あるいは、ｔｒａｃｒＲＮＡ分子は、たとえば５’末端上で少なくとも１ｎｔ、
２ｎｔ、３ｎｔ、４ｎｔ、５ｎｔ、６ｎｔ、７ｎｔ、８ｎｔ、９ｎｔ、１０ｎｔ、１５ｎ
ｔ、または２０ｎｔ分、および３’末端上で少なくとも１ｎｔ、２ｎｔ、３ｎｔ、４ｎｔ
、５ｎｔ、６ｎｔ、７ｎｔ、８ｎｔ、９ｎｔ、１０ｎｔ、１５ｎｔ、２０ｎｔ、２５ｎｔ
、３０ｎｔ、３５ｎｔ、または４０ｎｔ分、５’末端および３’末端の両方から短縮され
てもよい。配列番号８に加えて例示的なｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、以下を含む：
【化５】
2020039350.tif 000012
【００５１】
（Ｘ１７―２０）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＵＵＵＵＧ（配列番号：１４）
をｃＲＮＡとして使用するいくつかの実施形態では、以下のｔｒａｃｒＲＮＡを使用する
：
【化６】
2020039350.tif 000013
（Ｘ１７―２０）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ（配列番号：１３）をｃｒＲＮＡとして使用
するいくつかの実施形態では、以下のｔｒａｃｒＲＮＡを使用する：
【化７】
2020039350.tif 000014
（Ｘ１７―２０）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵ（配列番号：１５）をｃｒＲＮＡと
して使用するいくつかの実施形態では、以下のｔｒａｃｒＲＮＡを使用する：
【化８】
2020039350.tif 000015
【００５２】
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、オフターゲット作用を最小限にするために、ゲ
ノムの残りのいずれかの配列と異なる少なくとも３つ以上のミスマッチである部位を標的
とする。
【００５３】
ロックト核酸（ＬＮＡ）などの修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドが、修飾オリゴヌクレオ
チドをより好ましい（安定な）コンホメーションにロックすることによってＲＮＡ−ＤＮ
Ａハイブリダイゼーションの特異性を増大させることが示されている。例えば、２’−Ｏ
−メチルＲＮＡは２’酸素と４’炭素の間に追加の共有結合が存在する修飾塩基であり、
これをオリゴヌクレオチド内に組み込むことによって全体の熱安定性および選択性を改善
することができる（式Ｉ）。
【化９】
2020039350.tif 000016
【００５４】
したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるｔｒｕ−ｇＲＮＡは、１
つまたは複数の修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含み得る。例えば、本明細書に記載の短
縮ガイドＲＮＡ分子は、標的配列に相補的なガイドＲＮＡの１７〜１８ｎｔまたは１７〜
１９ｎｔの５’領域のうちの１つ、一部または全部が修飾されていてよく、例えば、ロッ
クされていてよく（２’−Ｏ−４’−Ｃメチレン架橋）、５’−メチルシチジンであって
よく、２’−Ｏ−メチル−プソイドウリジンであってよく、あるいはリボースリン酸骨格
がポリアミド鎖に置き換わっていてよく（ペプチド核酸）、例えば、合成リボ核酸であっ
てよい。
【００５５】
他の実施形態では、ｔｒｕ−ｇＲＮＡ配列の１つ、一部または全部のヌクレオチドが修
飾されていてよく、例えば、ロックされていてよく（２’−Ｏ−４’−Ｃメチレン架橋）
、５’−メチルシチジンであってよく、２’−Ｏ−メチル−プソイドウリジンであってよ
く、あるいはリボースリン酸骨格がポリアミド鎖に置き換わっていてよく（ペプチド核酸
）、例えば、合成リボ核酸であってよい。
【００５６】
いくつかの実施形態では、単一ガイドＲＮＡおよび／またはｃｒＲＮＡおよび／または
ｔｒａｃｒＲＮＡは、３’末端に１つまたは複数のアデニン（Ａ）またはウラシル（Ｕ）
ヌクレオチドを含み得る。
【００５７】
既存のＣａｓ９ベースのＲＧＮは、目的とするゲノム部位への標的化を誘導するのにｇ
ＲＮＡ−ＤＮＡヘテロ二本鎖の形成を利用するものである。しかし、ＲＮＡ−ＤＮＡヘテ
ロ二本鎖ではそのＤＮＡ−ＤＮＡ対応物よりも無差別な範囲の構造が形成され得る。実際
、ＤＮＡ−ＤＮＡ二本鎖の方がミスマッチに対する感度が高く、このことは、ＤＮＡ誘導
型ヌクレアーゼがオフターゲット配列と容易には結合せず、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼに
比して特異性が高いことを示唆している。したがって、本明細書に記載の方法に使用可能
なガイドＲＮＡはハイブリッド、すなわち、１つまたは複数のデオキシリボヌクレオチド
、例えば短いＤＮＡオリゴヌクレオチドが、ｇＲＮＡの全部または一部、例えばｇＲＮＡ
の相補性領域の全部または一部と置き換わったハイブリッドであり得る。このＤＮＡベー
スの分子は、単一ｇＲＮＡ系の全部または一部と置き換わってもよく、あるいは二重ｃｒ
ＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ系のｃｒＲＮＡおよび／またはｔｒａｃｒＲＮＡの全部または
一部と置き換わってもよい。一般にＤＮＡ−ＤＮＡ二本鎖の方がＲＮＡ−ＤＮＡ二本鎖よ
りもミスマッチに対する許容性が低いことから、相補性領域内にＤＮＡを組み込むこのよ
うな系の方がより高い信頼性で目的とするゲノムＤＮＡ配列を標的とするはずである。こ
のような二本鎖を作製する方法は当該技術分野で公知であり、例えば、Ｂａｒｋｅｒら，
ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．２００５  Ａｐｒ  ２２；６：５７；およびＳｕｇｉｍｏｔ
ｏら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２０００  Ｓｅｐ  １９；３９（３７）：１１２７０
−８１を参照されたい。
【００５８】
さらに、別個のｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを使用する系では、１つまたは両方
を合成とすることができ、１つ以上の修飾（たとえばロックト）ヌクレオチドまたはデオ
キシリボヌクレオチドを含むことができる。
【００５９】
細胞との関連において、Ｃａｓ９と合成ｇＲＮＡの複合体を使用して、ＣＲＩＳＰＲ／
Ｃａｓ９ヌクレアーゼ系のゲノム全域にわたる特異性を改善することが可能である。
【００６０】
記載される方法は、本明細書中に記載されるＣａｓ９  ｇＲＮＡ＋融合タンパク質を、
細胞中で発現すること、または細胞と接触させることとを含むことができる。
【００６１】
発現系
記載される融合タンパク質を使用するためには、それをコードする核酸から発現させる
のが望ましいであろう。これは様々な方法で実施することができる。例えば、ガイドＲＮ
Ａをコードする核酸を中間ベクターにクローン化して原核細胞または真核細胞を形質転換
し、複製および／または発現させる。中間ベクターは通常、融合タンパク質をコードする
核酸を保管または操作して融合タンパク質を産生するための原核生物ベクター、例えばプ
ラスミドもしくはシャトルベクターまたは昆虫ベクターである。このほか、融合タンパク
質をコードする核酸を発現ベクターにクローン化して植物細胞、動物細胞、好ましくは哺
乳動物細胞もしくはヒト細胞、真菌細胞、細菌細胞または原生動物細胞に投与してもよい
。
【００６２】
発現させるためには、融合タンパク質をコードする配列を通常、転写を指令するプロモ
ーターを含む発現ベクターにサブクローン化する。適切な細菌プロモーターおよび真核プ
ロモーターは当該技術分野で周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版，２００１）
；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９９０）；およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔ
ｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編，２０１
０）に記載されている。設計したタンパク質を発現させるための細菌発現系を例えば、大
腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）菌種およびサルモネラ（Ｓａｌｍ
ｏｎｅｌｌａ）で入手することができる（Ｐａｌｖａら，１９８３，Ｇｅｎｅ  ２２：２
２９−２３５）。そのような発現系のキットが市販されている。哺乳動物細胞、酵母およ
び昆虫細胞用の真核発現系は当該技術分野で周知であり、同じく市販されている。
【００６３】
核酸の発現を指令するために使用するプロモーターは、具体的な用途によって決まる。
例えば、融合タンパク質の発現および精製には通常、強力な構成的プロモーターを使用す
る。これに対して、遺伝子調節のためにガイドＲＮＡをｉｎ  ｖｉｖｏで投与する場合、
ガイドＲＮＡの具体的な用途に応じて構成的プロモーターまたは誘導プロモーターのいず
れかを使用することができる。さらに、ガイドＲＮＡの投与に好ましいプロモーターは、
ＨＳＶ  ＴＫなどの弱いプロモーターまたはこれと類似する活性を有するプロモーターで
あり得る。プロモーターはほかにも、トランス活性化に応答性の要素、例えば、低酸素応
答要素、Ｇａｌ４応答要素、ｌａｃリプレッサー応答要素ならびにテトラサイクリン調節
系およびＲＵ−４８６系などの小分子制御系を含み得る（例えば、ＧｏｓｓｅｎおよびＢ
ｕｊａｒｄ，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：５５４
７；Ｏｌｉｇｉｎｏら，１９９８，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，５：４９１−４９６；Ｗａｎ
ｇら，１９９７，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，４：４３２−４４１；Ｎｅｅｒｉｎｇら，１９
９６，Ｂｌｏｏｄ，８８：１１４７−５５；ならびにＲｅｎｄａｈｌら，１９９８，Ｎａ
ｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１６：７５７−７６１を参照されたい）。
【００６４】
発現ベクターは通常、プロモーターに加えて、原核または真核宿主細胞で核酸を発現す
るのに必要なほかのあらゆる要素を含む転写単位または発現カセットを含む。したがって
、典型的な発現カセットは、例えばｇＲＮＡをコードする核酸配列と作動可能に連結され
たプロモーターと、例えば効率的な転写産物のポリアデニル化、転写停止、リボソーム結
合部位または翻訳停止に必要な任意のシグナルとを含む。カセットのほかの要素としては
、例えば、エンハンサーおよび異種スプライスイントロンシグナルを挙げ得る。
【００６５】
細胞内に遺伝情報を輸送するのに使用する具体的な発現ベクターは、意図するｇＲＮＡ
の用途、例えば、植物、動物、細菌、真菌、原生動物などでの発現を考慮して選択する。
標準的な細菌発現ベクターとしては、ｐＢＲ３２２ベースのプラスミド、ｐＳＫＦ、ｐＥ
Ｔ２３ＤなどのプラスミドならびにＧＳＴおよびＬａｃＺなどの市販のタグ融合発現系が
挙げられる。
【００６６】
真核発現ベクターには真核ウイルスの調節要素を含む発現ベクター、例えば、ＳＶ４０
ベクター、パピローマウイルスベクターおよびエプスタイン・バーウイルス由来のベクタ
ーを用いることが多い。その他の例示的な真核ベクターとしては、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００
９／Ａ＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ＋、ｐＭＡＭｎｅｏ−５、バキュロウイルスｐＤＳＶＥおよ
びＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモータ
ー、マウス乳腺腫瘍ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘド
リンプロモーターをはじめとする真核細胞での発現に効果を示すプロモーターの指令を受
けてタンパク質を発現させる他の任意のベクターが挙げられる。
【００６７】
ガイドＲＮＡを発現させるためのベクターは、ガイドＲＮＡの発現を駆動するＲＮＡ  
ＰｏｌＩＩＩプロモーター、例えば、Ｈ１、Ｕ６または７ＳＫプロモーターを含み得る。
これらのヒトプロモーターは、プラスミドトランスフェクション後に哺乳動物細胞にｇＲ
ＮＡを発現させる。あるいは、例えばｖｉｔｒｏ転写にＴ７プロモーターを使用してもよ
く、ＲＮＡをｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写させてから精製することができる。短いＲＮＡ、例
えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡをはじめとする低分子ＲＮＡの発現に適したベクターを使
用することができる。図４Ｂに記載のＣｙｓ４ベースのマルチプレックス系を用いて、複
数のｇＲＮＡを、単一の転写物に発現でき（ＲＮＡ  ＰｏｌＩＩまたはＰｏｌ  ＩＩＩプ
ロモーターにより駆動）、次いでより大きな転写物から切断され得る。
【００６８】
一部の発現系は、安定にトランスフェクトされた細胞系を選択するためのマーカー、例
えばチミジンキナーゼ、ヒグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼおよびジヒドロ葉酸
レダクターゼなどを有する。このほか、昆虫細胞にバキュロウイルスベクターを用いてポ
リヘドリンプロモーターをはじめとする強力なバキュロウイルスプロモーターの指令の下
にｇＲＮＡコード配列を置くものなど、高収率の発現系が適している。
【００６９】
発現ベクターに通常含まれる要素としてはほかにも、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で機能す
るレプリコン、組換えプラスミドを保有する細菌の選択を可能にする抗生物質耐性をコー
ドする遺伝子およびプラスミドの非必須領域にあり組換え配列の挿入を可能にする固有の
制限部位が挙げられる。
【００７０】
標準的なトランスフェクション法を用いて、大量のタンパク質を発現する細菌、哺乳動
物、酵母または昆虫の細胞系を作製し、次いで標準的な技術を用いてこのタンパク質を精
製する（例えば、Ｃｏｌｌｅｙら，１９８９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４：１７
６１９−２２；Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｉｎ  
Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１８２（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒら
編，１９９０）を参照されたい）。真核および原核細胞の形質転換を標準的な技術により
実施する（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，１９７７，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１３２：３
４９−３５１；Ｃｌａｒｋ−ＣｕｒｔｉｓｓおよびＣｕｒｔｉｓｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉ
ｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １０１：３４７−３６２（Ｗｕら編，１９８３）を参照され
たい）。
【００７１】
宿主細胞内に外来ヌクレオチド配列を導入するあらゆる既知の方法を用い得る。このよ
うな方法としては、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン、プロトプラス
ト融合、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクション、リポソーム、マイクロインジ
ェクション、裸のＤＮＡ、プラスミドベクター、ウイルスベクター（エピソーム型および
組込み型の両方）およびクローン化したゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡをはじめと
する外来遺伝物質を宿主細胞内に導入する他のあらゆる周知の方法の使用が挙げられる（
例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，上記を参照されたい）。唯一必要なのは、用いる具体的な
遺伝子工学的方法で、宿主細胞内にｇＲＮＡの発現が可能な遺伝子を少なくとも１つ良好
に導入することができることである。
【００７２】
本発明は、ベクターおよびベクターを含む細胞を含む。
【実施例】
【００７３】
本発明は以下の実施例でさらに説明されるが、これらの実施例は特許請求の範囲に記載
される本発明の範囲を限定するものではない。
【００７４】
実施例１．ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼの特異性の評価
ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（ＲＧＮ）は、簡便で効率的なゲノム編集の
プラットフォームとして急速に登場したものである。この実施例では、ヒト細胞ベースの
レポーターアッセイを用いてＣａｓ９ベースのＲＧＮのオフターゲット切断の特徴を明ら
かにすることついて記載する。
【００７５】
材料および方法
実施例１では以下の材料および方法を用いた。
【００７６】
ガイドＲＮＡの構築
Ｃａｓ９標的化のための可変２０ｎｔ配列を保有するＤＮＡオリゴヌクレオチドをアニ
ールさせて、４ｂｐオーバーハングを有しＢｓｍＢＩ消化プラスミドｐＭＬＭ３６３６へ
のライゲーションに適合した短い二本鎖ＤＮＡフラグメントを作製した。このアニールし
たオリゴヌクレオチドのクローン化により、Ｕ６プロモーターの発現下に２０の可変５’
ヌクレオチドを有するキメラ＋１０３一本鎖ガイドＲＮＡをコードするプラスミドが得ら
れる（Ｈｗａｎｇら，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３１，２２７−２２９（２０１３
）；Ｍａｌｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９，８２３−８２６（２０１３））。この研究に
使用するｐＭＬＭ３６３６および発現プラスミドｐＪＤＳ２４６（コドン最適化型のＣａ
ｓ９をコードする）はともに非営利プラスミド配布サービスＡｄｄｇｅｎｅ（ａｄｄｇｅ
ｎｅ．ｏｒｇ／ｃｒｉｓｐｒ−ｃａｓ）から入手可能である。
【００７７】
ＥＧＦＰ活性アッセイ
ＥＧＦＰ−ＰＥＳＴ融合遺伝子の単一コピーが組み込まれたＵ２ＯＳ．ＥＧＦＰ細胞を
既に記載されている通りに培養した（Ｒｅｙｏｎら，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ３０，４
６０−４６５（２０１２））。トランスフェクションでは、ＳＥ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  
４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）Ｘキット（Ｌｏｎｚａ）を製造業者のプロトコ
ルに従って用い、示される量のｇＲＮＡ発現プラスミドおよびｐＪＤＳ２４６をＴｄ−ト
マトコードプラスミド３０ｎｇとともに２００，０００個の細胞にヌクレオフェクトした
。トランスフェクションの２日後、ＢＤ  ＬＳＲＩＩフローサイトメータを用いて細胞を
解析した。ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９プラスミドの濃度を最適化するトランスフェクションを三
重反復で実施し、他のトランスフェクションをいずれも二重反復で実施した。
【００７８】
内在ヒトゲノム部位のＰＣＲ増幅および配列検証
Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  ＩＩ高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）を
用いてＰＣＲ反応を実施した。ほとんどの遺伝子座がタッチダウンＰＣＲ（［９８℃、１
０秒；７２〜６２℃、−１℃／サイクル、１５秒；７２℃、３０秒］１０サイクル、［９
８℃、１０秒；６２℃、１５秒；７２℃、３０秒］２５サイクル）を用いて良好に増幅さ
れた。必要に応じて、６８℃または７２℃の一定のアニーリング温度および３％ＤＭＳＯ
または１Ｍベタインを用いて残りの標的のＰＣＲを３５サイクル実施した。ＰＣＲ産物を
ＱＩＡＸＣＥＬキャピラリー電気泳動系で分析して、その大きさおよび純度を検証した。
妥当性が確認された産物をＥｘｏＳａｐ−ＩＴ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）で処理し、サン
ガー法（ＭＧＨ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｃｏｒｅ）により配列決定して各標的
部位を検証した。
【００７９】
ヒト細胞におけるＲＧＮ誘発オンターゲットおよびオフターゲット変異の頻度の決定
Ｕ２ＯＳ．ＥＧＦＰ細胞およびＫ５６２細胞では、４Ｄ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  
Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｏｎｚａ）を製造業者の説明書に従って用い、２×１０５個の細胞にｇ
ＲＮＡ発現プラスミドまたは空のＵ６プロモータープラスミド（陰性対照）２５０ｎｇ、
Ｃａｓ９発現プラスミド７５０ｎｇおよびｔｄ−トマト発現プラスミド３０ｎｇをトラン
スフェクトした。ＨＥＫ２９３細胞では、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＬＴＸ試薬（Ｌ
ｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を製造業者の指示に従って用い、１．６５×１０５
個の細胞にｇＲＮＡ発現プラスミドまたは空のＵ６プロモータープラスミド（陰性対照）
１２５ｎｇ、Ｃａｓ９発現プラスミド３７５ｎｇおよびｔｄ−トマト発現プラスミド３０
ｎｇをトランスフェクトした。ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（
ＱＩＡＧＥＮ）を製造業者の説明書に従って用い、トランスフェクトしたＵ２ＯＳ．ＥＧ
ＦＰ細胞、ＨＥＫ２９３細胞またはＫ５６２細胞からゲノムＤＮＡを回収した。オフター
ゲット候補部位を増幅するのに十分なゲノムＤＮＡが得られるように、３回のヌクレオフ
ェクション（Ｕ２ＯＳ．ＥＧＦＰ細胞）、２回のヌクレオフェクション（Ｋ５６２細胞）
または２回のＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＬＴＸトランスフェクションで得られたＤＮ
ＡをプールしてからＴ７ＥＩを実施した。試験した各条件に対してこの操作を２回実施す
ることにより同じゲノムＤＮＡのプールを２つ作製し、各トランスフェクションを計４回
または６回分得た。次いで、これらのゲノムＤＮＡを鋳型に用いてＰＣＲを上記の通りに
実施し、Ａｍｐｕｒｅ  ＸＰビーズ（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ）を製造業者の説明書に従って
用い精製した。Ｔ７ＥＩアッセイを既に記載されている通りに実施した（Ｒｅｙｏｎら，
２０１２，上記）。
【００８０】
ＮＨＥＪ仲介性挿入欠失変異のＤＮＡ配列決定
Ｔ７ＥＩアッセイに使用した精製ＰＣＲ産物をＺｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＴＯＰＯベクタ
ー（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にクローン化し、ＭＧＨ  ＤＮＡ  Ａｕｔｏ
ｍａｔｉｏｎ  Ｃｏｒｅによりアルカリ溶解ミニプレップ法を用いてプラスミドＤＮＡを
単離した。Ｍ１３順方向プライマー（５’−ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧ−３’（
配列番号１９）を用いてサンガー法（ＭＧＨ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｃｏｒｅ
）によりプラスミドの配列を決定した。
【００８１】
実施例１ａ．単一ヌクレオチドミスマッチ
ヒト細胞におけるＲＧＮ特異性決定因子を明らかにすることを始めるにあたり、複数の
ｇＲＮＡ／標的ＤＮＡ接合部内の様々な位置に系統的にミスマッチを生じさせることの影
響を評価するために大規模な試験を実施した。これを実施するため、既に記載されている
標的ヌクレアーゼ活性の迅速の定量化が可能な定量的なヒト細胞ベースの高感度緑色蛍光
タンパク質（ＥＧＦＰ）崩壊アッセイ（上の「方法」およびＲｅｙｏｎら，２０１２，上
記を参照されたい）（図２Ｂ）を用いた。このアッセイでは、ヌクレアーゼ誘発二本鎖切
断（ＤＳＢ）の誤りがちな非相同末端結合（ＮＨＥＪ）修復によって導入されるフレーム
シフト挿入／欠失（挿入欠失）変異を不活性化することによって起こるヒトＵ２ＯＳ．Ｅ
ＧＦＰ細胞内の蛍光シグナルを評価することによって、単一の組み込まれたＥＧＦＰレポ
ーター遺伝子を標的とするヌクレアーゼの活性を定量化することができる（図２Ｂ）。こ
こに記載される研究では、ＥＧＦＰ内の異なる配列を標的とする以下のような３種類の約
１００ｎｔの単一ｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を用いた：
ＥＧＦＰ部位１  ＧＧＧＣＡＣＧＧＧＣＡＧＣＴＴＧＣＣＧＧＴＧＧ（配列番号１）
ＥＧＦＰ部位２  ＧＡＴＧＣＣＧＴＴＣＴＴＣＴＧＣＴＴＧＴＣＧＧ（配列番号２）
ＥＧＦＰ部位３  ＧＧＴＧＧＴＧＣＡＧＡＴＧＡＡＣＴＴＣＡＧＧＧ（配列番号３）。
上記ｓｇＲＮＡはそれぞれ、Ｃａｓ９仲介性のＥＧＦＰ発現崩壊を効率的に誘導すること
ができる（実施例１ｅおよび２ａならびに図３Ｅ（最上段）および３Ｆ（最上段）を参照
されたい）。
【００８２】
最初の実験では、３種類のＥＧＦＰ標的化ｓｇＲＮＡの相補的標的化領域の２０ヌクレ
オチドのうち１９ヌクレオチドにおける単一ヌクレオチドミスマッチの影響を試験した。
これを実施するため、３種類の標的部位のそれぞれについて、位置１〜１９（３’から５
’の方向に１〜２０の番号を付した；図１を参照されたい）にワトソン−クリックトラン
スバージョンミスマッチを保有する変異体ｓｇＲＮＡを作製し、これらの各種ｓｇＲＮＡ
がヒト細胞においてＣａｓ９仲介性ＥＧＦＰ崩壊を誘導する能力を試験した（位置２０の
ヌクレオチドはＵ６プロモーター配列の一部であり、発現への影響を避けるためグアニン
でなければならないことから、この位置に置換のある変異体ｓｇＲＮＡは作製しなかった
）。
【００８３】
ＥＧＦＰ標的部位＃２では、ｇＲＮＡの３’末端よりも５’末端のミスマッチの方が許
容性に高いことを示唆するこれまでの研究結果（Ｊｉａｎｇら，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌ  ３１，２３３−２３９（２０１３）；Ｃｏｎｇら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９，８
１９−８２３（２０１３）；Ｊｉｎｅｋら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３７，８１６−８２１（
２０１２））の通り、ｇＲＮＡの位置１〜１０に単一ミスマッチがあると、付随するＣａ
ｓ９の活性に著しい影響がみられた（図２Ｃ、中央パネル）。しかし、ＥＧＦＰ標的部位
＃１および＃３では、ｇＲＮＡの一部を除くいずれの位置に単一ミスマッチがあっても、
それが配列の３’末端内でも、高い許容性がみられた。さらに、上記２種類の標的にはミ
スマッチに対する感度が高い具体的な位置に差がみられた（図２Ｃ、最上段と最下段のパ
ネルを比較されたい）。例えば、標的部位＃１は特に位置２のミスマッチに対して高い感
度を示したのに対して、標的部位＃３は位置１および８のミスマッチに対して最も高い感
度を示した。
【００８４】
実施例１ｂ．複数のミスマッチ
ｇＲＮＡ／ＤＮＡ接合部の２つ以上のミスマッチによる影響を試験するため、隣接する
位置および離れた位置にワトソン−クリックトランスバージョンミスマッチを２つ有する
一連の変異体ｓｇＲＮＡを作製し、ＥＧＦＰ崩壊アッセイを用いて、ヒト細胞でこれらの
ｓｇＲＮＡがＣａｓ９ヌクレアーゼ活性を誘導する能力を試験した。全般的に標的部位は
３種類とも、一方または両方のミスマッチがｇＲＮＡ標的化領域の３’側半分に起こる２
つの変化に対して感度が高くなることが分かった。しかし、この影響の大きさには部位に
よる差がみられ、標的部位＃２がこの２つのミスマッチに対して最も高い感度を示し、標
的部位＃１が全般的に最も低い感度を示した。許容され得る隣接したミスマッチの数を試
験するため、ｇＲＮＡ標的化領域の５’末端の位置１９〜１５（単一および２つのミスマ
ッチの許容性が高いと思われる位置）の範囲でミスマッチの位置の数が漸増する変異体ｓ
ｇＲＮＡを構築した。
【００８５】
このようにミスマッチを漸増させたｓｇＲＮＡを試験したところ、３種類の標的部位で
いずれも、３つ以上の隣接するスマッチを導入することによってＲＧＮ活性が大幅に消失
することが明らかになった。５’末端の位置１９から開始し、３’末端に向かってミスマ
ッチを追加して漸増させていくと、３種類の異なるＥＧＦＰ標的化ｇＲＮＡの活性が突然
低下した。具体的には、位置１９および１９＋１８にミスマッチを含むｇＲＮＡが実質的
に完全な活性を示すのに対して、位置１９＋１８＋１７、１９＋１８＋１７＋１６および
１９＋１８＋１７＋１６＋１５にミスマッチのあるｇＲＮＡには陰性対照に比して実質的
に差がみられなかった（図２Ｆ）。（位置２０はｇＲＮＡの発現を駆動するＵ６プロモー
ターの一部であるためＧでなければならないことから、本発明者らは上記変異体ｇＲＮＡ
の位置２０にはミスマッチを生じさせなかったことに留意されたい。）
【００８６】
ｇＲＮＡ相補性を短縮することにより特異性が増大したＲＧＮを得ることができる根拠
がほかにも以下の実験で得られた：４種類の異なるＥＧＦＰ標的化ｇＲＮＡ（図２Ｈ）で
は、位置１８および１９に２つのミスマッチを導入しても活性にあまり影響を及ぼさなか
った。しかし、上記ｇＲＮＡの位置１０および１１にさらに２つのミスマッチを導入する
と活性がほぼ完全に消失する。１０／１１の２つのミスマッチのみを導入しても、全般的
に活性にそれほど大きな影響を及ぼさないのは興味深い。
【００８７】
以上をまとめると、ヒト細胞で得られたこれらの結果は、ＲＧＮの活性がｇＲＮＡ標的
化配列の３’側半分のミスマッチに対する方が高い感度を示し得ることを裏付けるもので
ある。しかし、以上のデータはほかにも、ＲＧＮ特異性が複雑で標的部位依存性であり、
単一および２つのミスマッチであれば、ＲＮＡ標的化領域の３’側半分に１つまたは複数
のミスマッチが生じても高い許容性を示すことが多いことを明確に示している。さらに、
以上のデータはほかにも、ｇＲＮＡ／ＤＮＡ接合部の５’側半分のあらゆるミスマッチが
必ずしも許容性が高いわけではないことを示唆している。
【００８８】
さらに、以上の結果は、より短い領域の相補性（具体的には約１７ｎｔ）を有するｇＲ
ＮＡの方が活性の特性が高くなることを強く示唆している。本発明者らは、１７ｎｔの特
異性と、ＰＡＭ配列によって付与される２ｎｔの特異性とを組み合わせることによって、
ヒト細胞にみられるゲノムのような大型で複雑なゲノム内で固有なものとなるのに十分な
長さの１つである１９ｂｐ配列の仕様が得られることに注目する。
【００８９】
実施例１ｃ．オフターゲット変異
内在ヒト遺伝子を標的とするＲＧＮのオフターゲット変異を特定することができるかど
うかを明らかにするため、ＶＥＧＦＡ遺伝子の３つの異なる部位、ＥＭＸ１遺伝子の１つ
の部位、ＲＮＦ２遺伝子の１つの部位およびＦＡＮＣＦ遺伝子の１つの部位を標的とする
６種類のｓｇＲＮＡを用いた。上記６種類のｓｇＲＮＡは、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ（
Ｔ７ＥＩ）アッセイによって検出されたように、ヒトＵ２ＯＳ．ＥＧＦＰ細胞のそれぞれ
の内在遺伝子座におけるＣａｓ９仲介性挿入欠失を効率的に誘導するものであった（上の
「方法」）。次いで本発明者らは、この６種のＲＧＮそれぞれについて、Ｕ２ＯＳ．ＥＧ
ＦＰ細胞におけるヌクレアーゼ誘発ＮＨＥＪ仲介性挿入欠失変異の証拠を得るため、候補
となるオフターゲット部位を数十か所（４６から６４に及ぶ箇所数）検討した。評価した
遺伝子座には、ヌクレオチドが１つまたは２つ異なる全ゲノム部位のほかにも、ヌクレオ
チドが３〜６つ異なるゲノム部位のサブセットを含め、ｇＲＮＡ標的化配列の５’側半分
にこのようなミスマッチを１つまたは複数有するものを重視した。Ｔ７ＥＩアッセイを用
いて、ＶＥＧＦＡ部位１では（検討した５３か所の候補部位うち）４か所のオフターゲッ
ト部位、ＶＥＧＦＡ部位２では（検討した４６か所のうち）１２か所、ＶＥＧＦＡ部位３
では（検討した６４か所のうち）７か所、ＥＭＸ１部位では（検討した４６か所のうち）
１か所が容易に特定された。ＲＮＦ２またはＦＡＮＣＦ遺伝子について検討したそれぞれ
４３か所および５０か所の候補部位にはオフターゲット変異は検出されなかった。実証さ
れたオフターゲット部位の変異率は極めて高く、目的とする標的部位に観察された変異率
の５．６％から１２５％（平均４０％）に及ぶものであった。このような真のオフターゲ
ットには、標的部位の３’末端にミスマッチを有し、合計５つに及ぶミスマッチを有する
配列が含まれ、ほとんどのオフターゲット部位がタンパク質をコードする遺伝子内にみら
れた。一部のオフターゲット部位のＤＮＡシーケンシングから、予測されるＲＧＮ切断部
位に挿入欠失変異が起こることを示す分子的な裏付けがさらに得られた（図８Ａ〜８Ｃ）
。
【００９０】
実施例１ｄ．その他の細胞型のオフターゲット変異
ＲＧＮがＵ２ＯＳ．ＥＧＦＰ細胞に高頻度でオフターゲット変異を誘発し得ることが確
認されたため、次に、これらのヌクレアーゼが他のタイプのヒト細胞にもこのような影響
を及ぼすかどうかを明らかにしようとした。これらの細胞は、以前、ＴＡＬＥＮ１５の活
性を評価するのにＵ２ＯＳ．ＥＧＦＰ細胞を用いたため、最初の実験にはＵ２ＯＳ．ＥＧ
ＦＰ細胞を選択したが、標的化ヌクレアーゼの活性の試験にはヒトＨＥＫ２９３細胞およ
びＫ５６２細胞の方が広く用いられている。したがって、ＨＥＫ２９３細胞およびＫ５６
２細胞についてもＶＥＧＦＡ部位１、２および３ならびにＥＭＸ１部位を標的とする４種
類のＲＧＮの活性をも評価した。この４種類のそれぞれのＲＧＮが、変異頻度はＵ２ＯＳ
．ＥＧＦＰ細胞に観察された頻度よりもいくぶん低いものの、上記のさらなる２種類のヒ
ト細胞系でもその目的とするオンターゲット部位にＮＨＥＪ仲介性挿入欠失変異を効率的
に誘発した（Ｔ７ＥＩアッセイによる評価）。最初にＵ２ＯＳ．ＥＧＦＰ細胞で特定され
た上記４種類のＲＧＮの２４か所のオフターゲット部位を評価したところ、多くの部位が
、ＨＥＫ２９３細胞およびＫ５６２細胞でも同様にその対応するオンターゲット部位と同
程度の頻度で変異することが明らかになった。予想された通り、ＨＥＫ２９３細胞のこれ
らのオフターゲット部位の一部のＤＮＡシーケンシングにより、予測されたゲノム遺伝子
座に変化が生じることを示す分子的な根拠がさらに得られた。Ｕ２ＯＳ．ＥＧＦＰ細胞で
特定されたオフターゲット部位のうち、ＨＥＫ２９３細胞の４か所、Ｋ５６２細胞の１１
か所が検出可能な変異を示さなかった理由は正確にはわからない。しかし、これらのオフ
ターゲット部位の多くがＵ２ＯＳ．ＥＧＦＰ細胞でも比較的低い変異頻度を示したことが
注目される。したがって、本発明者らの実験ではＵ２ＯＳ．ＥＧＦＰ細胞に比してＨＥＫ
２９３細胞およびＫ５６２細胞の方が全般的にＲＧＮの活性が低いと思われるため、ＨＥ
Ｋ２９３細胞およびＫ５６２細胞のこれらの部位における変異率がＴ７ＥＩアッセイの信
頼できる検出限界（約２〜５％）未満になり得る。以上をまとめると、ＨＥＫ２９３細胞
およびＫ５６２細胞で得た結果は、今回ＲＧＮに観察される高頻度のオフターゲット変異
が複数のヒト細胞型にみられる一般的な現象である根拠を示すものである。
【００９１】
実施例１ｅ．ＥＧＦＰ崩壊アッセイに使用するｇＲＮＡ発現およびＣａｓ９発現プラス
ミドの量の漸増
非相同末端結合を介したフレームシフト変異の誘発がＥＧＦＰの発現を確実に崩壊させ
得る位置であるＥＧＦＰヌクレオチド５０２の上流に位置する３つの異なる配列（上に示
したＥＧＦＰ部位１〜３）に対して単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を作製した（Ｍａｅ
ｄｅｒ，Ｍ．Ｌ．ら，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ３１，２９４−３０１（２００８）；Ｒｅｙｏ
ｎ，Ｄ．ら，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ３０，４６０−４６５（２０１２））。
【００９２】
３つの標的部位について、最初に様々な量のｇＲＮＡ発現プラスミド（１２．５〜２５
０ｎｇ）を、構成的に発現するＥＧＦＰ−ＰＥＳＴレポーター遺伝子の単一コピーを有す
る本発明者らのＵ２ＯＳ．ＥＧＦＰレポーター細胞に、コドン最適化型のＣａｓ９ヌクレ
アーゼ発現プラスミド７５０ｎｇとともにトランスフェクトした。最高濃度のｇＲＮＡプ
ラスミド（２５０ｎｇ）ではＲＧＮが３種類とも効率的にＥＧＦＰ発現を崩壊させた（図
３Ｅ（上段））。しかし、これより少ない量のｇＲＮＡ発現プラスミドをトランスフェク
トした場合、標的部位＃１および＃３に対するＲＧＮが同レベルの崩壊を示したのに対し
て、標的部位＃２のＲＧＮ活性は、トランスフェクトするｇＲＮＡ発現プラスミドの量を
減らすと直ちに低下した（図３Ｅ（上段））。
【００９３】
本発明者らのＵ２ＯＳ．ＥＧＦＰレポーター細胞にトランスフェクトするＣａｓ９コー
ドプラスミドの量を漸増させて（５０ｎｇ〜７５０ｎｇ）ＥＧＦＰ崩壊をアッセイした。
図３Ｆ（上段）に示されるように、標的部位＃１では、トランスフェクトするＣａｓ９コ
ードプラスミドの量を３分の１にしても、ＥＧＦＰ崩壊活性が実質的に低下せずに許容さ
れた。しかし、標的部位＃２および＃３を標的とするＲＧＮの活性は、トランスフェクト
するＣａｓ９プラスミドの量を３分の１にすると直ちに低下した（図３Ｆ（上段））。以
上の結果を踏まえて、実施例１ａ〜１ｄに記載される実験には、ＥＧＦＰ標的部位＃１、
＃２および＃３に対してｇＲＮＡ発現プラスミド／Ｃａｓ９発現プラスミドをそれぞれ２
５ｎｇ／２５０ｎｇ、２５０ｎｇ／７５０ｎｇおよび２００ｎｇ／７５０ｎｇ用いた。
【００９４】
一部のｇＲＮＡ／Ｃａｓ９の組合せが他の組合せよりもＥＧＦＰ発現の崩壊に高い効果
を示す理由も、これらの組合せの一部がトランスフェクションに用いるプラスミドの量に
多かれ少なかれ感受性を示す理由も理解されていない。上記３種類のｓｇＲＮＡゲノム内
に存在するオフターゲット部位の範囲がそれぞれの活性に影響を及ぼしている可能性があ
るが、３種類のｓｇＲＮＡの挙動の差の原因となり得るこれらの特定の標的部位の１〜６
ｂｐだけ異なるゲノム部位の数に差はみられなかった（表１）。
【００９５】
【表３】
2020039350.tif 000017
ＶＥＧＦＡ、ＲＮＦ２、ＦＡＮＣＦおよびＥＭＸ１遺伝子を標的とする６種類のＲＧＮな
らびにＥＧＦＰ標的部位＃１、＃２および＃３を標的とする３種類のＲＧＮそれぞれのオ
フターゲット部位はヒトゲノム配列ビルドＧＲＣｈ３７で特定されたものである。ミスマ
ッチはｇＲＮＡがアニールする２０ｎｔ領域に対するもののみを認め、ＰＡＭ配列に対す
るものは認めなかった。
【００９６】
実施例２：ＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９融合タンパク質とのガイドＲＮＡ対の使用
単量体のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、標的化ゲノム編集に広く使用されて
いるが、望まれていないオフターゲット変異を高い頻度で誘導し得る。本実施例は、伸長
した、二本鎖の配列を認識し、切断活性のための２つの単一ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）に
厳密に依存する新規の二量体ＲＮＡ誘導型ＦｏｋＩヌクレアーゼ（ＲＦＮ）を記載する。
ＲＦＮは、内在性のヒト遺伝子のＤＮＡ配列を効率良く強力に編集できる。さらに、いず
れかの５’末端のヌクレオチドを保有するｇＲＮＡを発現する方法が記載され、これは、
二量体ＲＦＮに有益な標的化範囲を与える重要な利点を有する。直接の比較では、単量体
Ｃａｓ９ニッカーゼは、一般的に、マッチした単一ｇＲＮＡにより導かれるＲＦＮよりも
高い頻度で、望ましくない挿入欠失および予期していない限局的点変異を誘導する。ＲＦ
Ｎは、二量体化の特異性の増強とＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡベースの標的化の簡便性を組み合
わせ、非常に正確なゲノム編集を必要とする研究および治療上の適用のための重要な新規
プラットフォームを提供する。
【００９７】
材料および方法
以下の材料および方法を実施例２に使用した。
単一ｇＲＮＡおよびマルチクレックスｇＲＮＡ発現プラスミド
単一またはマルチプレックスｇＲＮＡをコードするプラスミドを、ＢｓｍＢＩ消化型Ｃ
ｓｙ４−隣接ｇＲＮＡ骨格（ｐＳＱＴ１３１３；  Ａｄｄｇｅｎｅ）を備える、アニール
した標的部位のオリゴ二重鎖（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ
ｓ）および定常領域のオリゴ二重鎖（複数のｇＲＮＡに対して）の単一ステップの連結で
構築した。
【００９８】
マルチプレックスｇＲＮＡコードプラスミドを、１）第１の標的部位をコードするアニ
ーリングしたオリゴ、２）ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびＣｓｙ４結合部位をコー
ドするリン酸化しアニールしたオリゴ、および３）第２の標的部位をコードするアニール
化オリゴを、ＢｓｍＢＩ  ２型制限酵素で消化したＵ６−Ｃｓｙ４部位−ｇＲＮＡプラス
ミド骨格の中に連結することにより構築した。Ｃｓｙ４ＲＮＡ結合部位を、ｇＲＮＡ配列
の３’末端および５’末端に付着させ、細胞においてＣａｓ９とともに発現させた。Ｃｓ
ｙ４  ＲＮＡ結合部位の配列‘ＧＵＵＣＡＣＵＧＣＣＧＵＡＵＡＧＧＣＡＧＣＵＡＡＧＡ
ＡＡ’（配列番号：２０）を、標準的なｇＲＮＡ配列の５’末端および３’末端に融合し
た。
【化１０】
2020039350.tif 000018
【００９９】
この配列は、Ｃｓｙ４部位に隣接するマルチプレックスｇＲＮＡ配列である（下線）。
機能的に、１つの転写物上のマルチプレックスにこれらをコードすることは、別々にこれ
らをコードしたものと同一の結果を有する。Ｃｓｙ４隣接ｓｇＲＮＡの全ての部分は、本
明細書に記載される実験の多重部分で発現したが、ｓｇＲＮＡは、１つの転写物上でコー
ドされるＣｓｙ４部位により分離されるマルチプレックスｓｇＲＮＡ、および追加的なＣ
ｓｙ４配列を有する個々のｓｇＲＮＡでコードすることができる。この配列では、第１の
Ｎ２０配列は、標的ゲノム配列の１つの鎖に相補的な配列を表し、第２のＮ２０配列は、
標的ゲノム配列の他方の鎖に相補的な配列を表す。
【０１００】
ｇＲＮＡを含むＣｓｙ４認識部位をコードするプラスミドを、「２Ａ」ペプチド結合に
より分かれるＣａｓ９およびＣｓｙ４タンパク質をコードするプラスミドと共に同時にト
ランスフェクトした。この結果から、５’末端および３’末端に融合したＣｓｙ４部位を
備えるｇＲＮＡは、上述したＵ２ＯＳ−ＥＧＦＰ崩壊アッセイを使用して、ヒト細胞中で
のＣａｓ９仲介性切断の誘導が可能なままであった。したがって、Ｃｓｙ４ＲＮＡの結合
部位は、ｇＲＮＡ配列の３’末端に付着することができ、Ｃａｓ９とこれらＣｓｙ４部位
含有ｇＲＮＡの複合体は、細胞中で機能的なままである。
【０１０１】
いくつかの実験では、Ｃｓｙ４−Ｔ２Ａ−ＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９をコードする構築物を
使用した。ＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９融合物の配列を以下に示す。この配列は、ＦｏｋＩおよ
びｄＣａｓ９および核局在配列の間にＧＧＧＧＳ（配列番号：２３）リンカー（下線）を
含む。
【化１１】
2020039350.tif 000019
【化１２】
2020039350.tif 000020
2020039350.tif 000021
【０１０２】
代替として、ヒトコドンを最適化した構築物を使用した。これは、ＮおよびＣ末端核局
在シグナルを含むものであった。配列を以下に示す。
【化１３】
2020039350.tif 000022
2020039350.tif 000023
2020039350.tif 000024
【化１４】
2020039350.tif 000025
2020039350.tif 000026
2020039350.tif 000027
【０１０３】
組織培養およびトランスフェクション
すべての細胞培養実験を、ＨＥＫ２９３細胞、Ｕ２ＯＳ細胞、または安定して統合され
た単一複製の不安定化ＥＧＦＰ遺伝子を保有するＵ２ＯＳ細胞（Ｕ２ＯＳ．ＥＧＦＰ細胞
）で行った。細胞株を、１０％のＦＢＳ、２ｍＭ  ＧｌｕｔａＭａｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、およびペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＡｄｖａｎｃ
ｅｄ  ＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の中、５％のＣＯ２、３７Cで
培養した。さらに、Ｕ２ＯＳ．ＥＧＦＰ細胞を、４００μｇ／ｍｌのＧ４１８の存在下で
培養した。
【０１０４】
Ｕ２ＯＳ細胞およびＵ２ＯＳ．ＥＧＦＰ細胞を、製造元の説明書にしたがって、Ｌｏｎ
ｚａ  ４Ｄ−ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒのＤＮ−１００プログラムを使用してトランスフ
ェクトした。最初のＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９活性のスクリーニングおよび融合したスペーサ
ー長解析の実験では、７５０ｎｇのｐＣＡＧ−Ｃｓｙ４−ＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９−ｎｌｓ
ヌクレアーゼプラスミドおよび２５０ｎｇのｇＲＮＡコードプラスミドを、トランスフェ
クションの対照としての５０ｎｇのｔｄＴｏｍａｔｏ発現プラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ
）と共にトランスフェクトした。Ｕ２ＯＳ細胞およびＵ２ＯＳ．ＥＧＦＰ細胞の他のすべ
ての実験では、９７５ｎｇのヒトコドン最適化ｐＣＡＧ−Ｃｓｙ４−Ｔ２Ａ−ｎｌｓ−ｈ
ＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９−ｎｌｓ（ＳＱＴ１６０１）またはｐＣＡＧ−Ｃａｓ９−Ｄ１０Ａ
ニッカーゼ（ＮＷ３）を、３２５ｎｇのｇＲＮＡベクターおよび１０ｎｇのＴｄ  ｔｏｍ
ａｔｏ発現プラスミドと共にトランスフェクトし、トランスフェクションから３日後に解
析した。ＨＥＫ２９３細胞を、製造元の説明書にしたがってリポフェクタミン（Ｌｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用し、７５０ｎｇのヌクレアーゼプラスミド、２５０
ｎｇのｇＲＮＡ発現プラスミド、および１０ｎｇのＴｄ  ｔｏｍａｔｏでトランスフェク
トし、トランスフェクションから３日後に、ＮＨＥＪ媒介性変異原性について解析した。
【０１０５】
単一のトランスフェクションを、最初のスペーサー活性スクリーニングのために実施し
、焦点を当てたスペーサー長解析のためにトランスフェクションを二重に行った。他のす
べてのトランスフェクションを３重に行った。
【０１０６】
ＥＧＦＰ崩壊アッセイ
ＥＧＦＰ崩壊アッセイを、Ｕ２ＯＳ．ＥＧＦＰレポーター細胞を使用して、以前に記載
されているように実施した（実施例１およびＲｅｙｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｂｉ
ｏｔｅｃｈ  ３０，  ４６０−４６５  （２０１２）参照）。細胞を、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃ
ｉｅｎｃｅｓ  ＬＳＲ  ＩＩまたはＦｏｒｔｅｓｓａ  ＦＡＣＳのアナライザーを使用し
てＥＧＦＰおよびｔｄＴｏｍａｔｏの発現についてアッセイした。
【０１０７】
Ｔ７Ｅ１アッセイによるヌクレアーゼまたはニッカーゼ誘導型変異比率の定量化
Ｔ７Ｅ１アッセイを、以前に記載されているように実施した（Ｒｅｙｏｎ  ｅｔ  ａｌ
．，  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ３０，  ４６０−４６５  （２０１２））。簡潔に述べ
ると、Ｓｃｉｃｌｏｎｅ  Ｇ３  リキッドハンドリングワークステーション（Ｃａｌｉｐ
ｅｒ）と共に製造元の説明書にしたがってＡｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＤＮＡｄｖａｎｃｅ  ゲ
ノムＤＮＡ単離キット（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）を使用し
て、ゲノムＤＮＡをトランスフェクションから７２時間後に単離した。ゲノムの座位を増
幅するＰＣＲ反応を、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｏｔ−ｓｔａｒｔ  Ｆｌｅｘ  ＤＮＡポリメラ
ーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して実施した。２つのステップ
プロトコル（９８℃、３０秒；（９８℃、７秒；７２℃、３０秒）×３５、７２℃、５分
）、またはタッチダウンプロトコル（（９８°Ｃ、１０秒；７２〜６２°Ｃ、?１°Ｃ／
周期、１５秒；７２°Ｃ、３０秒）×１０周期（９８°Ｃ、１０秒；６２°Ｃ、１５秒；
７２°Ｃ、３０秒）×２５周期）を使用して試料を増幅した。２００ｎｇの精製したＰＣ
Ｒアンプリコンを、変性、ハイブリダイズし、Ｔ７エンドヌクレアーゼ（Ｉ）（Ｎｅｗ  
Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて処理した。変異の頻度を、以前に記載されて
いるようにＱｉａｘｃｅｌ  キャピラリー電気泳動器具（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて定量し
た（Ｒｅｙｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ３０，  ４６０−４６５  
（２０１２））。
【０１０８】
変異誘発ゲノムＤＮＡのサンガー配列決定
Ｔ７Ｅ１アッセイで使用した同一の精製したＰＣＲ産物を、Ｔｏｐｏクローニングし（
Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、個々のクローンのプラスミドＤＮＡを単離し、
Ｍ１３リバースプライマー（５′−ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧ−３′；配列番号
：１９）を使用して配列決定した。
【０１０９】
照度ライブラリーの調製および解析
２００〜３５０ｂｐの短いＰＣＲ産物を、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｏｔ−ｓｔａｒｔ  ＦＬ
ＥＸ  ＤＮＡポリメラーゼを使用して増幅した。ＰＣＲ産物を、製造元の説明書にしたが
ってＡｍｐｕｒｅ  ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）
を使用して生成した。Ｄｕａｌ−ｉｎｄｅｘｅｄ  ＴｒｕＳｅｑ  Ｉｌｌｕｍｉｎａディ
ープシーケンシングライブラリーを、Ｓｃｉｃｌｏｎｅ  Ｇ３リキッドハンドリングワー
クステーション上のハイスループットライブラリー調製系（Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅ
ｍｓ）を使用して調製した。最終的なアダプター−連結ライブラリーを、Ｑｉａｘｃｅｌ
キャピラリー電気泳動器具（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて定量した。１５０ｂｐの対形成した
末端の配列決定を、Ｄａｎａ−Ｆａｒｂｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ＣｏｒｅによるＩｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ  シー
クエンサー上で実施した。
【０１１０】
ＭｉＳｅｑの対形成した末端の読み取り値を、ｂｗａを使用してヒトゲノム参照ＧＣｈ
ｒ３７に対してマッピングした。３０超の平均定量スコアを有する読み取り値を、統合し
た標的または候補となるオフターゲットヌクレアーゼの結合部位に重複する挿入または欠
失の変異について解析した。変異解析を、Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｔｏｏｌｋ
ｉｔ（ＧＡＴＫ）およびＰｙｔｈｏｎを用いて行った。
【０１１１】
オフターゲット探索アルゴリズム
ヒトゲノムを通してスライディングウインドゥ中に特定数未満のミスマッチを有するマ
ッチを探索する標的部位のマッチングアルゴリズムを実施した。
【０１１２】
実施例２ａ：二量体ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼを設計する根拠
Ｃａｓ９の標的化の簡便性と二量体の特異性の利点を組み合わせる単一のプラットフォ
ームを開発し得ると仮定した。それを実施するために、良好に特徴付けられた、二量体化
依存性ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインを、ＲＮＡ誘導型触媒不活性Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９
）タンパク質に融合した。ＦｏｋＩ含有ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮのように、これら融合体
の二量体は、これらの間に特定の長さの「スペーサー」配列を備える２つの「片側部位」
から構成される部位を標的化するために結合する際、配列特異的なＤＮＡ切断を媒介し得
ることが期待された（図４Ａ）。そのような融合体は、活性のために２つのｇＲＮＡを必
要とし、かつ単一ｇＲＮＡが、ＤＮＡ切断に必要な２つのＦｏｋＩ含有融合タンパク質を
動員するには恐らく不十分であるか、動員することができないので、高い特異性を有する
と仮定された（図４Ａ）。そのような二量体系は、標準的な単量体Ｃａｓ９ヌクレアーゼ
と比較して改善した特異性を示し、また、単一のニッカーゼが望ましくない変異原性作用
を発揮する場合のある対形成されたニッカーゼ系に勝って、重要な特性の利点を有する可
能性があるであろうと仮定された。
【０１１３】
実施例２ｂ：５’末端のヌクレオチドの制限なしのｇＲＮＡのマルチプレックス発現
二量体のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼのための標的化の範囲は、現存するｇＲＮＡ発現方
法を使用すると、狭い（ｌｏｗ）ものである。２つの配列の要件、すなわちｄＣａｓ９に
より特定される５’―ＮＧＧのＰＡＭ配列の要件、およびほとんどの発現ベクターにおけ
るＵ６プロモーターの使用により課されるｇＲＮＡの５’末端でのＧヌクレオチドの要件
は、概して、ｄＣａｓ９モノマーの標的化範囲を制限する。しかしながら、ｇＲＮＡの５
’Ｇの要件が軽減されるなら、標的化の範囲は１６倍改善するであろう。
【０１１４】
５’ヌクレオチドを備えるｇＲＮＡの発現を可能にするマルチプレックス系を開発する
ために、プラスミドを構築したが、そのプラスミドから、それぞれがＣｓｙ４リボヌクレ
アーゼの切断部位に隣接する（Ｈａｕｒｗｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３
２９，  １３５５−１３５８  （２０１０））２つのｇＲＮＡが、Ｕ６プロモーターから
転写した単一のＲＮＡの中に発現できる（図４Ｂ）。Ｃｓｙ４は、この転写物を処理し、
これにより２つのｇＲＮＡを放出すると予期される。知られているＣｓｙ媒介性切断の機
構（（Ｈａｕｒｗｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２９，  １３５５−１３
５８  （２０１０）；  Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ＲＮＡ  １８，  ６６１
−６７２  （２０１２））に基づき、それぞれ処理されたｇＲＮＡは、３’末端上にＣｓ
ｙ４認識領域を保持し、Ｃｓｙ４タンパク質がこの部位に結合される（図４Ｂ）。この構
成では、いずれの５’ヌクレオチドを備えるｇＲＮＡをも発現することが可能であるはず
である。この系を、ＥＧＦＰレポーター遺伝子内の部位を標的とする２つのｇＲＮＡを発
現するために使用することにより、試験した。ヒト細胞において、Ｃｓｙ４およびＣａｓ
９ヌクレアーゼと共にこの転写物を共発現することにより、両方のＥＧＦＰ標的部位での
挿入欠失変異、およびこれら部位の間の配列の欠失が導入される（図４Ｃ）。これらの実
験から、両方のｇＲＮＡが、単一の親ＲＮＡ転写物から処理され、両方が、ヒト細胞での
Ｃａｓ９ヌクレアーゼの活性を誘導できることが示唆される。
【０１１５】
実施例２ｃ．二量体ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼの構築および最適化
ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインおよびｄＣａｓタンパク質を保有する２つの異なるハイ
ブリッドタンパク質を構築した。このうち１つでは、ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインが、
ｄＣａｓ９のカルボキシ末端に融合しており（ｄＣａｓ９−ＦｏｋＩ）、もう一つでは、
アミノ末端に融合している（ＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９）（図５Ａ）。ｄＣａｓ９−ＦｏｋＩ
タンパク質は、構造上ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮに類似する（図５Ａ）。これらの融合物の
いずれかまたは両方が、ＤＮＡの部位特異性切断を媒介し得るかどうかを確かめるために
、ＮＨＥＪ媒介性挿入欠失のＥＧＦＰレポーター遺伝子への導入を迅速かつ簡便に定量化
できる良好に確立したヒト細胞系アッセイを使用した（実施例１で上述のＥＧＦＰ崩壊ア
ッセイ）。効率的な切断に必要とされる片側部位の幾何学形状は知られていないので、Ｅ
ＧＦＰの様々な部位を標的とする６０対のｇＲＮＡを設計した。これらｇＲＮＡ対のそれ
ぞれが標的化とする２つの片側部位は、ＰＡＭ配列の両方が、スペーサー配列に直接隣接
しているか（ＰＡＭ内部配向）、または完全長の標的部位の外の境界に位置している（「
ＰＡＭ外部」配向）（図５Ｂ）ように配向された。さらに、スペーサー配列は、０〜３１
ｂｐの長さでも変動させた（図５Ｂおよび表２）。
【表４】
2020039350.tif 000028
2020039350.tif 000029
2020039350.tif 000030
2020039350.tif 000031
2020039350.tif 000032
2020039350.tif 000033
2020039350.tif 000034
2020039350.tif 000035
【０１１６】
驚くべきことに、ｄＣａｓ９−ＦｏｋＩタンパク質は、ヒトＵ２ＯＳ．ＥＧＦＰ細胞に
おいて６０個のｇＲＮＡ対のいずれと共発現する際にも、検出可能なＥＧＦＰ崩壊活性を
示さなかった（図５Ｅ）。しかしながら、同一の６０のｇＲＮＡ対でのＦｏｋＩ−ｄＣａ
ｓ９タンパク質のスクリーニングは、ＰＡＭ外部の配向の片側部位から構成され、１３〜
１７ｂｐおよび２６ｂｐ（およそ１回転で１３〜１７ｂｐ超のスペーサー長のＤＮＡへリ
ックス）を備える標的部位のＥＧＦＰ崩壊活性を明らかにした（図５Ｂ）。１０〜２０ｂ
ｐの範囲のスペーサー長を備え、ＰＡＭ外部の配向の片側部位を備える追加の２５個の標
的ＤＮＡ部位上でのＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９の試験は、１３〜１８ｂｐのスペーサー長を備
える標的での効率的な切断を例証した（図５Ｃ〜Ｄ）。これらの実験では、１つの部位を
、それぞれ１７ｂｐまたは１８ｂｐのスペーサー長で試験し、１３ｂｐスペーサー長を備
える全ての部位が活性を示したわけではなかった。Ｔ７ＥＩ解析およびサンガー配列決定
により成功して標的とされた部位のサブセット解析は、さらに、意図する位置に挿入欠失
の存在を確認した。したがって、ＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９は、対象となる完全長の標的部位
を効率的に切断するために、２つの適切に配置されたｇＲＮＡにより配向できる。単純性
のため、２つのＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９融合物および２つのｇＲＮＡの複合体は、本明細書
中でＲＮＡ誘導型ＦｏｋＩヌクレアーゼ（ＲＦＮ）を指す。
【０１１７】
ＥＧＦＰレポーター遺伝子を用いて最初の知見を拡張し、ＲＦＮが、内在性ヒト遺伝子
の定常化したゲノム編集を実施するために使用できるかどうかを確認するために、ｇＲＮ
Ａ対を、９つの異なるヒト遺伝子の１２の異なる標的部位のために設計した（表２）。試
験した１２のＲＦＮのうち７つは、Ｔ７ＥＩにより判断されるように、ヒトＵ２ＯＳ．Ｅ
ＧＦＰ細胞において意図される標的部位で、高い効率の（３〜４０％の範囲）挿入欠失を
誘導した（表２）。類似の結果を、ＨＥＫ２９３細胞における同一の１２ＲＦＮ対を用い
て得た（表２）。Ｕ２ＯＳ．ＥＧＦＰ細胞からうまく標的化したアレルのサンガー配列決
定から、予期した切断部位で、ある範囲の挿入欠失（おもに欠損）の導入が明らかとなっ
た（図５Ｆ）。２つの異なるヒト細胞株で観察される修飾の高い成功率および高い効率は
、内在性ヒト遺伝子を修飾するＲＦＮの強さを例証するものである。
【０１１８】
実施例２ｄ．ＲＦＮは、それらの切断部位に対して拡張した特異性を有する
ＲＦＮが、二量体化に関連する高い認識特異性を有するかどうかを試験するために、こ
れらヌクレアーゼが、対の中の両方のｇＲＮＡの存在に密に依存するかどうかを試験した
。理想的な二量体系では、単一ｇＲＮＡは、ＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９誘導型挿入欠失を効率
的に配向することが可能でないはずである。最初の試験を実施するために、ヒトＵ２ＯＳ
．ＥＧＦＰ細胞における標的部位（ＥＧＦＰ部位４７および８１）に対してＦｏｋＩ−ｄ
Ｃａｓ９−誘導型挿入欠失を効率的に配向することを示した、ＥＧＦＰにおける２つの標
的部位に配向した２対のｇＲＮＡを使用した（図５Ｃ）。ＶＥＧＦＡ中の関連しない部位
を標的とするｇＲＮＡでのこれら２つの対のそれぞれの１つまたは他のｇＲＮＡの置換は
、ＥＧＦＰ崩壊活性の低減をもたらし（図６Ａ）、Ｔ７ＥＩアッセイにより判定して、検
出できないレベルまで標的化した変異の低減をもたらした（図６Ｂ）。同様に、２つのｇ
ＲＮＡのそれぞれの１つのみを使用した効果を、ヒトＡＰＣ、ＭＬＨ１、およびＶＥＧＦ
Ａ遺伝子におけるＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９−仲介性挿入欠失を効率的に誘導する対を使用し
て試験し（表２）、ここでも、Ｔ７ＥＩアッセイにより検出可能なＲＦＮ誘導型挿入欠失
の損失を観察した（図６Ｃ）。これらの結果は、ＲＦＮによるゲノム編集の効率的な誘導
が、完全長の標的部位に対する適切な相補性を備える２つのｇＲＮＡを必要とすることを
例証する。
【０１１９】
本出願人のＲＦＮの活性が２つのｇＲＮＡの発現に依存することを考慮すると、対の中
の単一ｇＲＮＡのうち１つの知られているオフターゲット部位上の変異原性作用は無視で
きるべきものであろうと推定される。これら直接的な比較を実施することは、二量体ＲＦ
Ｎを標的化するために必要とされる２つのｇＲＮＡのうちの１つとしてそれ自体が作用で
きる単一ｇＲＮＡにより誘導される単量体Ｃａｓ９ヌクレアーゼのオフターゲット部位を
知ることが必要である。単量体のＣａｓ９ヌクレアーゼオフターゲット部位が、文献でほ
とんど定義されていないが、本出願人がヒトＶＥＧＦＡ遺伝子の二量体ＲＦＮ部位を標的
とするために使用したｇＲＮＡのうちの１つについて５つのオフターゲット部位が以前に
特定されている（実施例１）。ディープシーケンシングを使用して、これら５つのオフタ
ーゲット部位が、ＶＥＧＦＡ−標的化ＲＦＮが発現した細胞での変異の根拠を示したかど
うかを確認した。（これらは、図６Ｃに示されるＴ７ＥＩアッセイで使用したものと同一
の細胞である）。５つすべてのオフターゲット部位での挿入欠失変異の頻度は、背景と区
別できないものであった（図６Ｄおよび表３）。これらの結果から、ＲＦＮの使用するこ
とにより、Ｃａｓ９ヌクレアーゼおよび単一ｇＲＮＡにより本来誘導されたオフターゲッ
ト作用を本質的に除去できることを例証し、ＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９と共に発現した単一ｇ
ＲＮＡが、挿入欠失を効率的に誘導しないとの本出願人の観察と一致した。しかしながら
、現在のところ、追加の部位上でのこれらの直接的な比較を実施することは可能ではなく
、このような実験は、二量体ＲＦＮの片側部位をも標的化できる、より多くの単一ｇＲＮ
Ａ部位のオフターゲット部位の特定を待つ必要があり、二量体ＲＦＮは、標準的な単量体
Ｃａｓ９ヌクレアーゼと比較して特異性を高めたとの結論となった。
【表５】
2020039350.tif 000036
2020039350.tif 000037
2020039350.tif 000038
【０１２０】
実施例２ｅ．単量体Ｃａｓ９ニッカーゼは、単一ｇＲＮＡ／ＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９複合
体よりも高い比率の変異原性を誘導する。
上述のように、対形成したＣａｓ９ニッカーゼの手法の重要となる脆弱性は、単一の単
量体ニッカーゼが、ある特定の標的部位で、挿入欠失変異を高頻度で誘導する可能性があ
ることである（実施例１およびＲａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  １５４，  １３８０
−１３８９  （２０１３）；  Ｍａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ
ｌ  ３１，  ８３３−８３８  （２０１３）；  Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｏｍｅ
Ｒｅｓ  （２０１３）；  ａｎｄ  Ｍａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３
９，  ８２３−８２６（２０１３）参照）。対形成されるＣａｓ９ニッカーゼ系の二量体
化−依存性の欠損は、２つの単量体ニッカーゼがゲノムの他の場所に望ましくない挿入欠
失変異をそれぞれ作製し得るため、オフターゲットの潜在的な原因である。ＲＦＮは、二
量体化依存性ＦｏｋＩヌクレアーゼを使用して変質を誘導するため、これらの融合物は、
単量体Ｃａｓ９ニッカーゼで観察されるものと比較して、１つのｇＲＮＡのみの存在下で
の望ましくない挿入欠失活性がより少ないことを示すと仮定される。
【０１２１】
この仮定を試験するために、ＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９およびＣａｓ９ニッカーゼの活性を
、６つの二量体ヒト遺伝子標的部位での単一ｇＲＮＡの存在下で比較した（合計１２の片
側部位、表４）。これら特定の部位は、対の中の１つのみおよび／または他のｇＲＮＡに
より配向される単量体Ｃａｓ９ニッカーゼが、これらの標的で挿入欠失変異を誘導し得る
ため、選択された。ディープシーケンシングを使用して、ＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９またはＣ
ａｓ９ニッカーゼのゲノム編集活性を、１つまたは他のｇＲＮＡのうち両方または１つの
みが存在する中で評価した。ＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９およびＣａｓ９ニッカーゼの両方は、
２つのｇＲＮＡの存在する中、高い効率で、６つすべての標的部位で挿入欠失を誘導した
（表５）。仮説として、１２個の単一ｇＲＮＡにより配向した単量体Ｃａｓ９ニッカーゼ
は、０．００４８％〜３．０４％の範囲の頻度で挿入欠失を誘導した（図７Ａおよび表５
）。対照的に、同一の１２個の単一ｇＲＮＡにより配向したＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９は、０
．００４５〜０．４７３％の範囲のより低い頻度で挿入欠失を誘導した（図７Ａおよび表
５）。これらのデータを直接比較することにより、ＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９は、１２個の単
一ｇＲＮＡのうち１０個でＣａｓ９ニッカーゼよりも低い頻度で、挿入欠失を誘導した（
図７Ａおよび表５）。さらに、ＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９は、単一ｇＲＮＡ比率と、対形成し
たｇＲＮＡの比率を比較する際に、１２個の片側部位のうち１１個でＣａｓ９ニッカーゼ
よりも多くの挿入欠失の頻度の倍数減少を示した（図７Ｂ）。
【表６】
2020039350.tif 000039
【表７】
2020039350.tif 000040
2020039350.tif 000041
【０１２２】
また、ディープシーケンシングの実験は、標的部位の中の特定の位置の点変異の導入
といった、特定の単量体のＣａｓ９ニッカーゼの従来説明されておらず、予期していない
副作用を明らかにした。ＶＥＧＦＡ標的の「右」の片側部位に対する単一ｇＲＮＡと共発
現したＣａｓ９ニッカーゼは、１０．５％の頻度で、認識部位の位置１５に塩基置換を誘
導した（図８Ａ）。類似の結果が、ＦＡＣＦ標的部位１の「右」の片側部位（位置１６で
１６．３％の変異頻度）（図８Ｂ）またはＲＵＮＸ１標的部位の「右」の片側部位（位置
１７で２％の変異頻度）（図８Ｃ）に配向されるＣａｓ９ニッカーゼおよび単一ｇＲＮＡ
で観察された。これらの位置での点変異は、Ｃａｓ９ニッカーゼまたはｇＲＮＡが細胞で
発現していない対照試料のバックグラウンドレベルを超えて観察されるものではなかった
（図８Ａ〜８Ｃ）。興味深いことに、この高頻度変異が観察された３つの部位のうち２つ
では、観察された置換基の大部分が、非標的ＤＮＡ鎖上のＣのＧへ塩基転換である。これ
ら点変異が観察された位置は、ｄＣａｓ９／ｇＲＮＡ／標的ＤＮＡ複合体においてｉｎ  
ｖｉｔｒｏでＰ１ヌクレアーゼに感受性があると観察された標的部位の鎖−分離領域内に
ある。重要なことに、これらの点変異は、ＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９タンパク質および同一の
ｇＲＮＡを発現する細胞において、より低い頻度（５〜１００倍低い）で起こる（図８Ａ
〜Ｃ）。全体的に見て、単一ｇＲＮＡにより配向されるＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９ヌクレアー
ゼは、概して、マッチした単一のＣａｓ９ニッカーゼよりも低い頻度で変異原性の挿入欠
失および点変異を誘導する。
【０１２３】
実施例２ｆ．二量体ＲＦＮは高い度合いの特異性を有する。
２つのｇＲＮＡにより配向される二量体ＲＦＮは、ヒトの細胞中で明らかなオフターゲ
ット変異を誘導すると予期されるものではない。２つの片側部位から構成される完全長の
配列を切断する１対のｇＲＮＡにより配向されるＲＦＮは、標的部位のＤＮＡのうち最大
４４ｂｐを特定すると予測される。この長さの配列は、偶然であるが、ほとんど常に固有
である（標的が複製したゲノム配列にある特定の状況を除く）。さらに、この完全長部位
に対して、ゲノムで最も近接してマッチした部位は、ほとんどの場合、多数のミスマッチ
を保有しており、それが次いで、ＲＦＮ二量体による切断活性を最小限にするか、または
消失させると予期される。実際に、この試験でのＲＦＮでの標的化が成功した１５の完全
長の配列に０〜１６個のミスマッチ（１２〜１７ｂｐの長さのスペーサーを可能にする）
を有するヒトゲノムの全ての部位を特定した。この解析から、全ての１５個の完全長配列
は固有であり、ゲノム中のほとんど近接して一致した部位は、７〜１２のミスマッチの範
囲であることが示された（表６）。この数のミスマッチを含む部位は、ＲＦＮにより効率
的に変異誘発されるものではなく、この仮説を確認するためのさらなる試験に興味がもた
れる。全体的にみて、二量体ＲＦＮは、ヒト細胞において高い度合いの特異性を有するが
、特異性の最終的な特徴付けは、ゲノム全体を通してＲＦＮの特異性を包括的に定義でき
る公平な方法の開発が待たれる。
【表８】
2020039350.tif 000042
【０１２４】
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ｎｏｌ  ３１，６８１−６８３．（２０１３ａ）．
Ｌｉ，Ｗ．，Ｔｅｎｇ，Ｆ．，Ｌｉ，Ｔ．，ａｎｄ  Ｚｈｏｕ，Ｑ．Ｓｉｍｕｌｔａｎｅ
ｏｕｓ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ
ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｇｅｎｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｒａｔ  ｕｓｉｎｇ
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３１，６８
４−６８６．（２０１３ｂ）．
Ｍａｅｄｅｒ，Ｍ．Ｌ．，Ｌｉｎｄｅｒ，Ｓ．Ｊ．，Ｃａｓｃｉｏ，Ｖ．Ｍ．，Ｆｕ，Ｙ
．，Ｈｏ，Ｑ．Ｈ．，ａｎｄ  Ｊｏｕｎｇ，Ｊ．Ｋ．ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅ
ｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｅｓ．Ｎ
ａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １０，９７７−９７９．（２０１３）．
Ｍａｌｉ，Ｐ．，Ａａｃｈ，Ｊ．，Ｓｔｒａｎｇｅｓ，Ｐ．Ｂ．，Ｅｓｖｅｌｔ，Ｋ．Ｍ
．，Ｍｏｏｓｂｕｒｎｅｒ，Ｍ．，Ｋｏｓｕｒｉ，Ｓ．，Ｙａｎｇ，Ｌ．，ａｎｄ  Ｃｈ
ｕｒｃｈ，Ｇ．Ｍ．ＣＡＳ９  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ
ｆｏｒ  ｔａｒｇｅｔ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｐａ
ｉｒｅｄ  ｎｉｃｋａｓｅｓ  ｆｏｒ  ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｎｇ
ｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３１，８３３−８３８．（２０１３
ａ）．
Ｍａｌｉ，Ｐ．，Ｅｓｖｅｌｔ，Ｋ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｃｈｕｒｃｈ，Ｇ．Ｍ．Ｃａｓ９  
ａｓ  ａ  ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｂｉｏｌ
ｏｇｙ．Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １０，９５７−９６３．（２０１３ｂ）．
Ｍａｌｉ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｎｇ
ｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｖｉａ  Ｃａｓ９．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９，８２３−８２６（２０
１３ｃ）．
Ｐａｔｔａｎａｙａｋ，Ｖ．，Ｌｉｎ，Ｓ．，Ｇｕｉｌｉｎｇｅｒ，Ｊ．Ｐ．，Ｍａ，Ｅ
．，Ｄｏｕｄｎａ，Ｊ．Ａ．，ａｎｄ  Ｌｉｕ，Ｄ．Ｒ．Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕ
ｔ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ  ＤＮＡ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｒ
ｅｖｅａｌｓ  ＲＮＡ−ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  Ｃａｓ９  ｎｕｃｌｅａｓｅ  ｓｐｅｃ
ｉｆｉｃｉｔｙ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３１，８３９−８４３．（２０１３）
．
Ｐａｔｔａｎａｙａｋ，Ｖ．，Ｒａｍｉｒｅｚ，Ｃ．Ｌ．，Ｊｏｕｎｇ，Ｊ．Ｋ．＆  Ｌ
ｉｕ，Ｄ．Ｒ．Ｒｅｖｅａｌｉｎｇ  ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｓｐｅ
ｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ  ｂｙ  ｉ
ｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ．Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ８，７６５−７７０（
２０１１）．
Ｐｅｒｅｚ，Ｅ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ  ｏｆ  ＨＩＶ−１  ｒ
ｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｉｎ  ＣＤ４＋  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔ
ｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔ
ｅｃｈｎｏｌ  ２６，８０８−８１６（２００８）．
Ｐｅｒｅｚ−Ｐｉｎｅｒａ，Ｐ．，Ｋｏｃａｋ，Ｄ．Ｄ．，Ｖｏｃｋｌｅｙ，Ｃ．Ｍ．，
Ａｄｌｅｒ，Ａ．Ｆ．，Ｋａｂａｄｉ，Ａ．Ｍ．，Ｐｏｌｓｔｅｉｎ，Ｌ．Ｒ．，Ｔｈａ
ｋｏｒｅ，Ｐ．Ｉ．，Ｇｌａｓｓ，Ｋ．Ａ．，Ｏｕｓｔｅｒｏｕｔ，Ｄ．Ｇ．，Ｌｅｏｎ
ｇ，Ｋ．Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｇｅｎｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  
ｂｙ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９−ｂａｓｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏ
ｒｓ．Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １０，９７３−９７６．（２０１３）．
Ｑｉ，Ｌ．Ｓ．，Ｌａｒｓｏｎ，Ｍ．Ｈ．，Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｌ．Ａ．，Ｄｏｕｄｎａ，
Ｊ．Ａ．，Ｗｅｉｓｓｍａｎ，Ｊ．Ｓ．，Ａｒｋｉｎ，Ａ．Ｐ．，ａｎｄ  Ｌｉｍ，Ｗ．
Ａ．Ｒｅｐｕｒｐｏｓｉｎｇ  ＣＲＩＳＰＲ  ａｓ  ａｎ  ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｐｌ
ａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  
ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｃｅｌｌ  １５２，１１７３−１１８３．（２０１３
）．
Ｒａｎ，Ｆ．Ａ．，Ｈｓｕ，Ｐ．Ｄ．，Ｌｉｎ，Ｃ．Ｙ．，Ｇｏｏｔｅｎｂｅｒｇ，Ｊ．
Ｓ．，Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ，Ｓ．，Ｔｒｅｖｉｎｏ，Ａ．Ｅ．，Ｓｃｏｔｔ，Ｄ．Ａ．，
Ｉｎｏｕｅ，Ａ．，Ｍａｔｏｂａ，Ｓ．，Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．Ｄｏｕｂｌｅ
ｎｉｃｋｉｎｇ  ｂｙ  ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ９  ｆｏｒ  ｅ
ｎｈａｎｃｅｄ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．Ｃｅｌｌ  
１５４，１３８０−１３８９．（２０１３）．
Ｒｅｙｏｎ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．ＦＬＡＳＨ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ＴＡＬＥＮｓ  ｆ
ｏｒ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ．Ｎａｔ  Ｂｉ
ｏｔｅｃｈ  ３０，４６０−４６５（２０１２）．
Ｓａｎｄｅｒ，Ｊ．Ｄ．，Ｍａｅｄｅｒ，Ｍ．Ｌ．，Ｒｅｙｏｎ，Ｄ．，Ｖｏｙｔａｓ，
Ｄ．Ｆ．，Ｊｏｕｎｇ，Ｊ．Ｋ．，ａｎｄ  Ｄｏｂｂｓ，Ｄ．ＺｉＦｉＴ（Ｚｉｎｃ  Ｆ
ｉｎｇｅｒ  Ｔａｒｇｅｔｅｒ）：ａｎ  ｕｐｄａｔｅｄ  ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ  ｅ
ｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｔｏｏｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３８，Ｗ４６
２−４６８．（２０１０）．
Ｓａｎｄｅｒ，Ｊ．Ｄ．，Ｒａｍｉｒｅｚ，Ｃ．Ｌ．，Ｌｉｎｄｅｒ，Ｓ．Ｊ．，Ｐａｔ
ｔａｎａｙａｋ，Ｖ．，Ｓｈｏｒｅｓｈ，Ｎ．，Ｋｕ，Ｍ．，Ｆｏｄｅｎ，Ｊ．Ａ．，Ｒ
ｅｙｏｎ，Ｄ．，Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，Ｂ．Ｅ．，Ｌｉｕ，Ｄ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎ
ｓｉｌｉｃｏ  ａｂｓｔｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ  ｎｕｃｌｅ
ａｓｅ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ａｎ  ｅｘｐａｎｄｅ
ｄ  ｌａｎｄｓｃａｐｅ  ｏｆ  ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ  ｓｉｔｅｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  
Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（２０１３）．
Ｓａｎｄｅｒ，Ｊ．Ｄ．，Ｚａｂａｃｋ，Ｐ．，Ｊｏｕｎｇ，Ｊ．Ｋ．，Ｖｏｙｔａｓ，
Ｄ．Ｆ．，ａｎｄ  Ｄｏｂｂｓ，Ｄ．Ｚｉｎｃ  Ｆｉｎｇｅｒ  Ｔａｒｇｅｔｅｒ（Ｚｉ
ＦｉＴ）：ａｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ／ｔａｒｇｅｔ  ｓｉ
ｔｅ  ｄｅｓｉｇｎ  ｔｏｏｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３５，Ｗ５９９
−６０５．（２００７）．
Ｓｈｅｎ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ
ｍｉｃｅ  ｖｉａ  Ｃａｓ９／ＲＮＡ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｔａｒｇｅｔｉ
ｎｇ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ（２０１３）．
Ｓｕｇｉｍｏｔｏ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃ  ｐａｒａｍｅｔｅｒ
ｓ  ｔｏ  ｐｒｅｄｉｃｔ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ＲＮＡ／ＤＮＡ  ｈｙｂｒｉｄ
ｄｕｐｌｅｘｅｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３４，１１２１１−１１２１６（１９
９５）．
Ｔｅｒｎｓ，Ｍ．Ｐ．＆  Ｔｅｒｎｓ，Ｒ．Ｍ．ＣＲＩＳＰＲ−ｂａｓｅｄ  ａｄａｐｔ
ｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １
４，３２１−３２７（２０１１）．
Ｗａｎｇ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｅ
Ｃａｒｒｙｉｎｇ  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｇｅｎｅｓ  ｂｙ
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．
Ｃｅｌｌ  １５３，９１０−９１８（２０１３）．
Ｗｉｅｄｅｎｈｅｆｔ，Ｂ．，Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ｈ．＆  Ｄｏｕｄｎａ，Ｊ．Ａ
．ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｉｎ
ｂａｃｔｅｒｉａ  ａｎｄ  ａｒｃｈａｅａ．Ｎａｔｕｒｅ  ４８２，３３１−３３８
（２０１２）．
Ｙａｎｇ，Ｌ．，Ｇｕｅｌｌ，Ｍ．，Ｂｙｒｎｅ，Ｓ．，Ｙａｎｇ，Ｊ．Ｌ．，Ｄｅ  Ｌ
ｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ，Ａ．，Ｍａｌｉ，Ｐ．，Ａａｃｈ，Ｊ．，Ｋｉｍ−Ｋｉｓｅｌａ
ｋ，Ｃ．，Ｂｒｉｇｇｓ，Ａ．Ｗ．，Ｒｉｏｓ，Ｘ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）．Ｏｐ
ｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｃａｒｌｅｓｓ  ｈｕｍａｎ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｇ
ｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ４１，９０４９−
９０６１．
【０１２５】
その他の実施形態
ここまで本発明をその詳細な説明と関連させて記載してきたが、上記説明は例示を目的
とするものであり、添付の「特許請求の範囲」の範囲によって定められる本発明の範囲を
限定するものではないことを理解するべきである。その他の態様、利点および改変は以下
の特許請求の範囲内にある。
【図１】
2020039350.tif 000043
【図２Ａ】
2020039350.tif 000044
【図２Ｂ】
2020039350.tif 000045
【図２Ｃ】
2020039350.tif 000046
【図２Ｄ】
2020039350.tif 000047
【図２Ｅ】
2020039350.tif 000048
【図２Ｆ】
2020039350.tif 000049
【図２Ｇ】
2020039350.tif 000050
【図２Ｈ】
2020039350.tif 000051
【図３Ａ】
2020039350.tif 000052
【図３Ｂ】
2020039350.tif 000053
【図３Ｃ】
2020039350.tif 000054
【図３Ｄ】
2020039350.tif 000055
【図３Ｅ】
2020039350.tif 000056
【図３Ｆ】
2020039350.tif 000057
【図４Ａ】
2020039350.tif 000058
【図４Ｂ】
2020039350.tif 000059
【図４Ｃ】
2020039350.tif 000060
【図５Ａ】
2020039350.tif 000061
【図５Ｂ】
2020039350.tif 000062
【図５Ｃ】
2020039350.tif 000063
【図５Ｄ】
2020039350.tif 000064
【図５Ｅ】
2020039350.tif 000065
【図５Ｆ−１】
2020039350.tif 000066
【図５Ｆ−２】
2020039350.tif 000067
【図５Ｆ−３】
2020039350.tif 000068
【図５Ｆ−４】
2020039350.tif 000069
【図６Ａ】
2020039350.tif 000070
【図６Ｂ】
2020039350.tif 000071
【図６Ｃ】
2020039350.tif 000072
【図６Ｄ】
2020039350.tif 000073
【図７Ａ】
2020039350.tif 000074
【図７Ｂ】
2020039350.tif 000075
【図８】
2020039350.tif 000076
【配列表】
2020039350000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年12月23日(2019.12.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＮＡ誘導型ＦｏｋＩヌクレアーゼ（ＲＦＮ）融合タンパク質であって、触媒的に不活性であるＣＲＩＳＰＲ関連９（ｄＣａｓ９）のアミノ末端に融合するＦｏｋＩ触媒ドメイン配列および２つの標的ゲノム配列に前記ＲＦＮを配向するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む、ＲＮＡ誘導型ＦｏｋＩヌクレアーゼ（ＲＦＮ）融合タンパク質。
【請求項２】
２〜３０個のアミノ酸の介在リンカーを含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記リンカーが、Ｇｌｙ４Ｓｅｒを含む、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
ＦｏｋＩ触媒ドメインが、配列番号４のアミノ酸３８８〜５８３、または４０８〜５８３を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
前記ｄＣａｓ９が、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のｄＣａｓ９であり、
前記ｄＣａｓ９が、Ｄ１０、Ｅ７６２、Ｈ９８３、またはＤ９８６での変異、およびＨ８４０またはＮ８６３での変異を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
ｄＣａｓ９が、
（ｉ）Ｄ１０ＡまたはＤ１０Ｎ、および
（ｉｉ）Ｈ８４０Ａ、Ｈ８４０Ｙ、またはＨ８４０Ｎ
での変異を含む、請求項５に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードする核酸。
【請求項８】
請求項７に記載の核酸を含むベクター。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の融合タンパク質を発現する宿主細胞。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２５】
その他の実施形態
ここまで本発明をその詳細な説明と関連させて記載してきたが、上記説明は例示を目的とするものであり、添付の「特許請求の範囲」の範囲によって定められる本発明の範囲を限定するものではないことを理解するべきである。その他の態様、利点および改変は以下の特許請求の範囲内にある。
本発明は次の態様を含む。
［１］ＲＮＡ誘導型ＦｏｋＩヌクレアーゼ（ＲＦＮ）融合タンパク質であって、触媒的に不活性であるＣＲＩＳＰＲ関連９（ｄＣａｓ９）のアミノ末端に融合するＦｏｋＩ触媒ドメイン配列を含み、任意に、介在リンカーを備える、ＲＮＡ誘導型ＦｏｋＩヌクレアーゼ（ＲＦＮ）融合タンパク質。
［２］２〜３０個のアミノ酸のリンカーを含む、上記［１］に記載の融合タンパク質。
［３］前記リンカーが、Ｇｌｙ４Ｓｅｒを含む、上記［２］に記載の融合タンパク質。
［４］ＦｏｋＩ触媒ドメインが、配列番号４のアミノ酸３８８〜５８３、または４０８〜５８３を含む、上記［１］に記載の融合タンパク質。
［５］ｄＣａｓ９が、Ｄ１０、Ｅ７６２、Ｈ９８３、またはＤ９８６での変異、およびＨ８４０またはＮ８６３での変異を含む、上記［１］に記載の融合タンパク質。
［６］ｄＣａｓ９が、
（ｉ）Ｄ１０ＡまたはＤ１０Ｎ、および
（ｉｉ）Ｈ８４０Ａ、Ｈ８４０Ｙ、またはＨ８４０Ｎ
での変異を含む、上記［５］に記載の融合タンパク質。
［７］上記［１］〜［６］に記載の融合タンパク質をコードする核酸。
［８］上記［７］に記載の核酸を含むベクター。
［９］上記［１］〜［６］に記載の融合タンパク質を発現する宿主細胞。
［１０］細胞において、ゲノム配列の配列特異的な崩壊を誘導する方法であって、前記方法が、上記［１］〜［６］に記載のＲＮＡ誘導型ＦｏｋＩヌクレアーゼ（ＲＦＮ）融合タンパク質、および好ましくは０〜３１ヌクレオチド離れた２つの標的ゲノム配列に前記ＲＦＮを配向するガイドＲＮＡを、前記細胞に発現すること、または前記細胞と接触させることとを含み、好ましくは、前記２つの標的配列が、それぞれ３’末端でＰＡＭ配列を有する、
方法。
［１１］前記２つの標的ゲノム配列が、１０〜２０塩基対、好ましくは、１３〜１７塩基対離れている、上記［１０］に記載の方法。
［１２］前記ガイドＲＮＡが、
（ａ）２つの単一ガイドＲＮＡであって、１つの単一ガイドＲＮＡが第１の鎖を標的とし、他方のガイドＲＮＡが相補鎖を標的とし、ＦｏｋＩが各鎖を切断して、反対のＤＮＡ鎖上に１対のニックをもたらし、それにより二重鎖を切断する、２つの単一ガイドＲＮＡ、または
（ｂ）ｔｒａｃｒＲＮＡおよび２つのｃｒＲＮＡであって、１つのｃｒＲＮＡが第１の鎖を標的とし、他方のｃｒＲＮＡが相補鎖を標的とし、ＦｏｋＩが各鎖を切断して、反対のＤＮＡ鎖上に１対のニックをもたらし、それにより二重鎖を切断する、ｔｒａｃｒＲＮＡおよび２つのｃｒＲＮＡ
である、上記［１０］に記載の方法。
［１３］前記２つのガイドＲＮＡが、それぞれ、標的ゲノム配列の１７〜２０個のヌクレオチドと相補的な相補領域を含む、上記［１０］に記載の方法。
［１４］挿入欠失変異が、前記２つの標的配列の間に誘導される、上記［１０］〜［１３］のいずれか１項に記載の方法。
［１５］細胞におけるＲＮＡ誘導型ゲノム編集の特異性が増大する、上記［１０］〜［１４］のいずれか１項に記載の方法。
［１６］細胞におけるＲＮＡ誘導型ゲノム編集の特異性を増大させる方法であって、前記細胞を、上記［１］〜［６］に記載のＲＮＡ誘導型ＦｏｋＩヌクレアーゼ（ＲＦＮ）融合タンパク質と接触させることを含む、方法。