(57)【要約】      （修正有）【課題】組換えタンパク質調製物中の残留宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）を検出または除去する方法の提供。【解決手段】潜在的アプタマーのライブラリーを提供すること、ＨＣＰ混合物に前記潜在的アプタマーのライブラリーを曝露しＨＣＰ標的に結合する複数の候補アプタマーを選択すること、およびＨＣＰにそれぞれ結合する複数の候補アプタマーのアイデンティティーを決定することを含み、前記ＨＣＰ混合物中のＨＣＰに特異的に結合する複数の候補アプタマーを同定する方法、および組換えタンパク質調製物から、前記アプタマー：ＨＣＰ複合体を分離することによりＨＣＰを除去する方法。【選択図】図１
2020115873.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えタンパク質調製物から複数のＨＣＰを検出または除去する方法において使用される複数のアプタマーを調製する方法であって、
潜在的アプタマーのライブラリーを提供すること；
複数のＨＣＰを含むＨＣＰ混合物に前記潜在的アプタマーのライブラリーを曝露し、ＨＣＰ標的に結合するそれぞれの候補アプタマーの能力について前記ライブラリーから複数の候補アプタマーを分離することにより、潜在的アプタマーのライブラリーから複数の候補アプタマーを選択すること；および
場合により、複数のＨＣＰ中のＨＣＰにそれぞれ結合する複数の候補アプタマーのアイデンティティーを決定すること；
を含み、
前記ＨＣＰ混合物中のＨＣＰに特異的に結合する複数の候補アプタマーを同定する方法。
【請求項２】
前記ＨＣＰ混合物が、ヌル細胞系からのものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記候補アプタマーのプールが、アプタマーの最終プールである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記候補アプタマーのプールが、前記アプタマーの最終プールの選択前にさらなる選択を受ける、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
ＨＣＰに結合する複数の候補アプタマーのアイデンティティーを決定することを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
複数の候補アプタマーの前記アイデンティティーを決定することが、前記複数の候補アプタマーをシーケンシングすることを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
シーケンシングすることが、前記複数の候補アプタマーを同時並行的にシーケンシングすることを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
特定のアプタマーにより結合されると推測されるＨＣＰの存在または不存在を確認することを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ＨＣＰ混合物が、未知のアイデンティティーの複数のＨＣＰ、または未知量の複数のＨＣＰ、または異なる量の複数のＨＣＰを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記潜在的アプタマーのライブラリーが、少なくとも約１０、少なくとも約１０2、少なくとも約１０3、少なくとも約１０4、少なくとも約１０5、少なくとも約１０6、少なくとも約１０7、少なくとも約１０8、少なくとも約１０9、少なくとも約１０10、または少なくとも約６×１０14のアプタマーを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記潜在的アプタマーのライブラリーから複数の候補アプタマーを選択することが、潜在的アプタマーのライブラリーを固体担体上でディスプレイすることを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記固体担体のそれぞれのユニットが、同一のアプタマーの複数コピーをディスプレイする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記固体担体および前記アプタマーが、アプタマー粒子を形成する、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）を使用して前記ＨＣＰ混合物中の前記ＨＣＰの１つに結合する能力を有するアプタマー粒子を単離する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記潜在的アプタマーのライブラリーから複数の候補アプタマーを選択することが、マイクロ流体選択を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
標的ＨＰＣに対する前記候補アプタマーについての結合親和性を、ＫDまたはＫAの計測により決定する、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
標的ＨＣＰに特異的に結合する少なくとも約１０、約２０、約２００、約３００、約４００、約５００、約６００、約７００、約８００、約９００、約１０００、または約６×１０14のアプタマーを生成する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
組換えタンパク質調製物中のＨＣＰアイデンティティーを決定する方法であって、
少なくとも１つのアプタマーを提供すること；
前記少なくとも１つのアプタマーを組換えタンパク質調製物と接触させること；および
前記組換えタンパク質調製物中の少なくとも１つのＨＣＰのアイデンティティーを決定すること
を含む方法。
【請求項１９】
組換えタンパク質調製物中のＨＣＰの存在または不存在を検出する方法であって、
アプタマーの混合物を提供すること；および
前記アプタマーのいずれかが前記組換えタンパク質調製物中のＨＣＰに特異的に結合するか否かを決定すること
を含む方法。
【請求項２０】
組換えタンパク質調製物からＨＣＰを除去する方法であって、
アプタマーのプールを提供すること；
前記組換えタンパク質調製物をアプタマーの最終プールに曝露すること；
前記アプタマーの最終プールをＨＣＰに結合させ、アプタマー：ＨＣＰ複合体を形成すること；および
前記組換えタンパク質調製物から前記アプタマー：ＨＣＰ複合体を分離すること
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１４年８月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／０３７，８６４号明細書；および２０１５年４月３０日に出願された米国仮特許出願第６２／１５４，９８１号明細書の優先権を主張する。これらの出願の内容は、参照により全体として本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本出願は、組換えタンパク質分野におけるものである。より具体的には、本出願は、組換えタンパク質調製物中の残留宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）の存在を決定する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
組換えタンパク質は、典型的には、宿主細胞中で産生される。宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）は、組換えタンパク質産生の通常の過程の間に宿主細胞から生じるプロセス関連不純物である［Wang et al., HCPs in Biologics Development: Identification, Quantitation and Risk Assessment, Biotechnol. Bioeng. 103(3):446-458(2009)］。組換え生物医薬において、ＨＣＰは、ＨＣＰ自体の活性に、または免疫応答を誘発するＨＣＰの能力に起因する潜在的な臨床安全性リスクを担持する。実際、生物療法剤中に存在するＨＣＰのクリアランスおよび／または制御の実証は、規制上の要件である［ICH Harmonised Tripartite Guideline Specifications: Test Procedures and Acceptance Criteria for Biotechnological/Biological Products Q6B(1999)］。したがって、生物医薬がヒトまたは動物の治療における使用のためにリリースされる前に、精製プロセスを介する組換え生物医薬からのＨＣＰの特徴決定、除去、および／またはクリアランスが望まれる。
【０００４】
ＨＣＰは、現在、免疫アッセイフォーマットでポリクローナル抗体（ｐＡｂ）を使用して組換えタンパク質調製物中で検出される。抗ＨＣＰｐＡｂの産生は時間を要し、高価であり、得られる抗ＨＣＰｐＡｂについて顕著な品質および有用性の問題が存在する：１）動物の免疫化に起因して、抗ＨＣＰｐＡｂ産生は、顕著なコストにおいて９〜１２ヵ月要する；２）混合物中のＨＣＰの全ての認識が可能でなく、これは、ポリクローナル免疫応答を生成するために使用される動物中のＨＣＰの一部の免疫原性の欠落、または動物を免疫化するために使用されるＨＣＰ混合物中に存在する個々のＨＣＰの低相対量のいずれかに起因する。
【０００５】
典型的なＨＣＰｐＡｂは、組換えタンパク質調製物中のＨＣＰのほぼ５０〜７５％を認識する。抗原性調製物中の考えられるＨＣＰは１，２００から１，６００であるという推定もあるため、そのようなアプローチでは、ｐＡｂにより検出不可能な多量のＨＣＰが潜在的に残る。したがって、ＨＣＰ免疫アッセイ結果により良好な定量的意味を与えるため、より良好なＨＣＰ検出試薬、全てまたはほぼ全ての潜在的ＨＣＰを認識するものがより強く望まれる。
【０００６】
単一標的に対するアプタマーが既に生成されている（精製形態であるか、複合混合物の一部としてであるかを問わない）。複合混合物からアプタマーを生成する場合、FitterおよびJamesの［Deconvolution of a Complex Target Using DNA Aptamers, J. Cell Biol., 280(40): 34193-34201(2005)］は、逐次的処理方針を教示している。この方針において、FitterおよびJamesは、混合物内の数種の標的のみへのアプタマーの収束を回避するための標的枯渇方針を使用する。具体的には、逐次的処理方針において、FitterおよびJamesは、スクリーニングの反復ラウンドを実施し、それぞれのラウンド後、事前のラウンドにおいて生成されたアプタマーを使用して混合物から標的を除去する。
【０００７】
本明細書において教示される方法は、固有に、標的のいかなる枯渇も要求しない同時並行的方針である。具体的には、本明細書において提供される方法は、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）を使用して混合物中の全ての標的への同時並行的結合のためのアプタマーを同定し、アプタマーアレイを使用して混合物中の全ての標的への全てのアプタマーの実際の結合を同時に計測する。このような複雑なタスクを達成することが可能であるとは、これまでは認識されなかった。具体的には、異なる標的に結合するアプタマーを同定するため、ならびにアプタマーのアイデンティティーとそれぞれの標的に結合するそれらの能力とを切り離すために同時並行的方針を使用することが可能であることは、これまで認識されなかった。本明細書において得られるアプタマーのプールは、組換えタンパク質調製物中のＨＣＰの存在の決定に使用することができる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Wang et al., HCPs in Biologics Development: Identification, Quantitation and Risk Assessment, Biotechnol. Bioeng. 103(3):446-458(2009)
【非特許文献２】ICH Harmonised Tripartite Guideline Specifications: Test Procedures and Acceptance Criteria for Biotechnological/Biological Products Q6B(1999)
【非特許文献３】Deconvolution of a Complex Target Using DNA Aptamers, J. Cell Biol., 280(40): 34193-34201(2005)
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
詳細な説明によれば、組換えタンパク質調製物中の複数のＨＣＰの存在または不存在を決定する方法は、組換えタンパク質調製物を提供すること；アプタマーの最終プールを提供すること；組換えタンパク質調製物を、アプタマーの最終プールと合わせること；および複数のＨＣＰの存在または不存在を決定することを含む。
【００１０】
一部の実施形態において、組換えタンパク質調製物は、生物医薬調製物である。
【００１１】
一実施形態において、複数のＨＣＰの存在を決定することは、マイクロアレイ、クロマトグラフィー、ポリメラーゼ連鎖反応、または酵素結合免疫吸着アッセイを含む。別の実施形態において、アプタマーの最終プールは、ＨＣＰに結合する個々のアプタマーの能力について選択されたものである。
【００１２】
一実施形態は、組換えタンパク質調製物中の複数のＨＣＰの検出または除去において使用されるアプタマーの最終プールを調製する方法であって潜在的（可能性のある）アプタマーのライブラリーを提供すること；複数のＨＣＰを含むＨＣＰ混合物に潜在的アプタマーのライブラリーを曝露し、１つのＨＣＰに結合するそれぞれの個々のアプタマーの能力により潜在的アプタマーのライブラリーから複数の候補アプタマーを分離することにより、潜在的アプタマーのライブラリーから複数の候補アプタマーを選択すること；および複数のＨＣＰに結合する複数のアプタマーのアイデンティティー（正体）を決定することを含み、ＨＣＰに特異的に結合するアプタマーの最終プールを同定する方法を包含する。
【００１３】
一実施形態において、組換えタンパク質調製物は、組換えタンパク質を一過的に発現する宿主細胞からのものである。別の実施形態において、組換えタンパク質調製物は、安定的に形質転換された宿主細胞からのものである。別の実施形態において、候補アプタマーのプールは、アプタマーの最終プールである。一実施形態において、候補アプタマーのプールは、アプタマーの最終プールの選択前に追加の選択を受ける。一部の実施形態において、候補アプタマーのプールは、アプタマーの最終プールを得るための１つ以上の選択ラウンドを受ける。
【００１４】
さらなる実施形態において、本方法は、特異的ＨＣＰに結合するアプタマーの最終プールのアイデンティティーを決定することを含む。一様式において、アプタマーの最終プールのアイデンティティーを決定することは、アプタマーの最終プールをシーケンシングすることを含む。別の態様において、シーケンシングすることは、アプタマーの最終プールを同時並行的にシーケンシングすることを含む。一実施形態において、同時並行的にシーケンシングすることは、次世代シーケンシングプロセスを使用して実施される。
【００１５】
追加の実施形態において、本方法は、アプタマーに結合する複数のＨＣＰのアイデンティティーを決定することを含む。さらなる態様において、組換えタンパク質調製物中のＨＣＰについての複数の候補アプタマーの結合親和性を決定することは、候補アプタマーを固体担体に固定すること、組換えタンパク質調製物を、固体担体に結合している候補アプタマーと接触させること、および候補アプタマーに対する組換えタンパク質調製物中のＨＣＰの結合親和性を決定すること、または組換えタンパク質調製物からのＨＣＰを固体担体に固定すること、候補アプタマーを、固体担体に結合しているＨＣＰと接触させること、および組換えタンパク質調製物中のＨＣＰに対する候補アプタマーの結合親和性を決定することを含む。
【００１６】
一様式において、候補アプタマーは、アレイとして固体担体に結合させる。別の態様において、結合親和性は、アレイを使用して組換えタンパク質調製物中のＨＣＰに対する候補アプタマーについて同時並行的に決定する。一実施形態において、組換えタンパク質調製物は、未知のアイデンティティーの複数のＨＣＰを含む。別の実施形態において、組換えタンパク質調製物は、未知量の複数のＨＣＰを含む。一様式において、組換えタンパク質調製物は、異なる量の複数のＨＣＰを含む。別の様式において、潜在的アプタマーのライブラリーは、少なくとも約１０、少なくとも約１０2、少なくとも約１０3、少なくとも約１０4、少なくとも約１０5、少なくとも約１０6、少なくとも約１０7、少なくとも約１０8、少なくとも約１０9、少なくとも約１０10、または少なくとも約６×１０14のアプタマーを含む。
【００１７】
一様式において、潜在的アプタマーのライブラリーから複数の候補アプタマーを選択することは、潜在的アプタマーのライブラリーを固体担体上でディスプレイすることを含む。一様式において、それぞれの固体担体は、同一のアプタマーの複数コピーをディスプレイする。一様式において、それぞれの固体担体は、複数のアプタマーをディスプレイする。別の態様において、固体担体およびアプタマーは、アプタマー粒子を形成する。一実施形態において、本方法は、ＨＣＰに結合する能力を有するアプタマーを単離することを含む。一態様において、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）を使用して組換えタンパク質調製物中のＨＣＰに結合する能力を有するアプタマーを単離する。別の態様において、潜在的アプタマーのライブラリーから複数の候補アプタマーを選択することは、マイクロ流体選択を含む。
【００１８】
さらなる様式において、潜在的アプタマーのライブラリーから候補アプタマーを選択するために使用される固体担体は、ビーズである。別の様式において、ビーズは、磁気ビーズである。一実施形態において、ＨＣＰは、固体担体に結合させる。一部の実施形態において、ＨＣＰが結合している固体担体は、ビーズである。別の実施形態において、ビーズは、マイクロ磁気分離デバイス中で捕捉される。別の実施形態において、複数の選択ラウンドを実施してアプタマーライブラリーから複数の候補アプタマーを選択する。さらなる実施形態において、複数の選択ラウンドにおける選択条件は、異なる。異なる実施形態において、複数の選択ラウンドにおける選択条件は、同一である。
【００１９】
一態様において、アプタマーの最終プールのみの核酸配列を得る。別の態様において、選択における異なるステップにおけるアプタマーの核酸配列を得る。さらなる態様において、潜在的アプタマーのライブラリー中のアプタマーの核酸配列を得た後、追加の区別ステップは、候補アプタマーを結合させることができるアレイについての候補アプタマーを同定してＨＣＰについての親和性を決定する。一様式において、追加の区別ステップは、エンリッチメント倍率分析、リピートモチーフ分析、およびコピー数分析の少なくとも１つを含む。
【００２０】
一様式において、アレイを使用してＨＣＰに対する少なくとも約１０のアプタマーについての結合親和性を決定する。別の様式において、アレイは、ＨＣＰに対する少なくとも約１０、少なくとも約１００、少なくとも約１５０、少なくとも約２００、少なくとも約２５０、少なくとも約３００、少なくとも約２５０、少なくとも約３００、少なくとも約５００、少なくとも約１０００、少なくとも約２０００、少なくとも約５０００、少なくとも約１０，０００、少なくとも約２０，０００、少なくとも約１０5、少なくとも約１０6、少なくとも約１０7、少なくとも約１０8、少なくとも約１０9、少なくとも約１０10、または少なくとも約６×１０14のアプタマーについての結合親和性を決定する。別の様式において、アプタマーは、リンカーを使用して固体担体に付着させる。別の様式において、ＨＣＰに対するアプタマーについての結合親和性は、ＫDまたはＫAを計測することにより決定する。別の様式において、アプタマーは、少なくとも約２μＭのＫDで特異的ＨＣＰに結合する。
【００２１】
一態様において、本方法は、特異的ＨＣＰに結合する少なくとも約１０、少なくとも約２０、少なくとも約２００、少なくとも約３００、少なくとも約４００、少なくとも約５００、少なくとも約６００、少なくとも約７００、少なくとも約８００、少なくとも約９００、少なくとも約１０００、または少なくとも約６×１０14のアプタマーを生成する。一実施形態において、アプタマーを使用して組換えタンパク質調製物中のＨＣＰの存在を決定する。別の実施形態において、アプタマーを使用して組換えタンパク質調製物中のＨＣＰのアイデンティティーを決定する。一実施形態において、アプタマーを使用して組換えタンパク質調製物中のＨＣＰの量を決定する。
【００２２】
別の様式は、組換えタンパク質調製物中の少なくとも１つのＨＣＰのアイデンティティーを決定する方法であって、本明細書の方法により調製された少なくとも１つのアプタマーを提供すること；および少なくとも１つのＨＣＰのアイデンティティーを決定することを含む方法を包含する。
【００２３】
一態様において、本方法は、複数のアプタマーを用いる。別の態様において、少なくとも１つのＨＣＰのアイデンティティーは、質量分析により決定する。
【００２４】
別の様式は、組換えタンパク質調製物中の複数のＨＣＰの存在を検出する方法であって、本明細書の方法により調製された最終アプタマープールを提供すること；およびアプタマーの一部が組換えタンパク質調製物中の特異的ＨＣＰに結合するか否かを決定することを含む方法を包含する。
【００２５】
別の様式は、組換えタンパク質調製物からＨＣＰを除去する方法であって、本明細書の方法により調製されたアプタマーの最終プールを提供すること；ＨＣＰを含む組換えタンパク質調製物を、アプタマーの最終プールに曝露すること；アプタマーをＨＣＰに結合させること；および組換えタンパク質調製物からアプタマーに結合するＨＣＰを分離することを含む方法を包含する。一態様において、アプタマーの最終プールは、固体担体に固定する。一様式において、固体担体は、プレート、クロマトグラフィー樹脂、またはビーズである。一態様において、ビーズは、磁気ビーズである。別の様式において、アプタマーの最終プール中のアプタマーのそれぞれは、固体担体に個々に固定する。別の態様において、アプタマーの最終プール中のアプタマーの全ては、混合物として固体担体に固定する。
【００２６】
実施形態は、本願の一部を形成する以下の詳細な説明および添付の図面からより十分に理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】蛍光標識ＨＣＰに結合している個々のアプタマー粒子についての蛍光強度を示すＦＡＣＳプロットを示す。
【図２】５回の粒子ディスプレイラウンド後に得られ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７標識ＨＣＰとインキュベートされたアプタマーを含有するマイクロアレイからの２つの画像を示す。図２Ａの白線境界内に、空のウェルにより包囲される個々のアプタマーを含有するウェルがある；図２Ｂは、ランダム配列の一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を含有するウェルを示す。
【図３】図２Ａにおけるマイクロアレイの定量の棒グラフを示す。
【図４】ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ゲル電気泳動を使用して分離された溶出された上清溶液、およびＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｒｕｂｙタンパク質ゲル染色によるゲルの染色により可視化されたポリペプチドからの画像を示す。
【００２８】
配列の説明
以下に列挙される表は、本明細書において参照されるプライマー、リンカー、およびアプタマーの核酸配列、名称または説明、および配列識別番号（配列番号）を提供する。
【００２９】
表１は、配列番号１から配列番号３９８を含有し、本実施形態において参照されるプライマーおよびアプタマーの一部の配列のリストを提供する。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
Ｉ．定義
本開示に関して、多数の用語を利用すべきである。
【００３１】
本開示において、「ＨＣＰ」は、宿主細胞タンパク質を指す。
【００３２】
本明細書において使用される「宿主細胞タンパク質混合物」および「ＨＣＰ混合物」および「ＨＣＰ抗原」は、互換的に使用され、ヌル宿主細胞、すなわち、組換えタンパク質を発現しない宿主細胞から得られるＨＣＰの混合物を指す。
【００３３】
本明細書において使用される「組換えタンパク質調製物」は、宿主細胞中で組換えタンパク質を発現させた後に得られる調製物を指す。組換えタンパク質調製物は、抗体調製物であり得る。組換えタンパク質調製物は、生物医薬調製物であり得る。
【００３４】
用語「アプタマー」は、特異的標的分子に結合するオリゴ核酸またはペプチド分子を指す。オリゴヌクレオチドアプタマーは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはゼノ核酸（ＸＮＡ）アプタマーとして分類することができ、通常、オリゴヌクレオチドまたはＸＮＡの短鎖からなる。ペプチドアプタマーは、タンパク質足場に両端において付着している短鎖可変ペプチドドメインからなる。
【００３５】
用語「潜在的アプタマー」は、ＨＣＰの検出に使用すべきアプタマーを同定するための方法の開始時に提供することができるアプタマーのコレクションを指す。潜在的アプタマーは、ランダムに生成することができる。潜在的アプタマーは、潜在的アプタマーのライブラリーであり得る。
【００３６】
「候補アプタマー」は、ＨＣＰへの結合についてのいくらかの選択を受け、したがって、潜在的アプタマーのサブセットであるアプタマーである。
【００３７】
組換えタンパク質調製物中の複数のＨＣＰの存在を決定する方法において使用するために調製され、同定されるアプタマーのコレクションを指す「アプタマーの最終プール」および「最終アプタマープール」は、本明細書において互換的に使用される。アプタマーの最終プールは、追加の選択を受けた候補アプタマーのサブセットまたは候補アプタマーであり得る。アプタマーの最終プールは、複数のアプタマーである。
【００３８】
用語「複数のアプタマー」は、本願において、少なくとも約少なくとも約１０、少なくとも約１０2、少なくとも約１０3、少なくとも約１０4、少なくとも約１０5、少なくとも約１０6、少なくとも約１０7、少なくとも約１０8、少なくとも約１０9、少なくとも約１０10、または少なくとも約６×１０14のアプタマーを指す。
【００３９】
用語「抗ＨＣＰアプタマー」は、本明細書に記載の方法により調製され、１つのＨＣＰに特異的に結合するアプタマーを指す。
【００４０】
用語「マイクロフルイディクス」は、小容量の流体を扱い、少なくとも１つの寸法が約１０００μｍ未満または約５００μｍ未満である系を指す。
【００４１】
本明細書において使用される用語「約」は、数値、例として、例えば、整数、分数、および割合を指し、明示の有無を問わない。約という用語は、一般に、引用値と同等である（例えば、同一の機能または結果を有する）と当業者がみなす一連の数値範囲（例えば、引用範囲の＋／−５〜１０％）を指す。一部の例において、約という用語は、最も近い有効数字に丸められた数値を含み得る。
【００４２】
それぞれのＨＣＰの量は、タンパク質の濃度または量により決定することができる。
【００４３】
ＩＩ．ＨＣＰに対するアプタマーの産生
アプタマーは、ＨＣＰの検出に使用することができる。アプタマー生成は免疫認識に依存性でないため、アプタマーを使用する方法は、現在の方法よりも多数のＨＣＰを検出する潜在性を有する。
【００４４】
一実施形態において、アプタマーは、既知の異なる細胞型（例として、限定されるものではないが、哺乳動物、細菌、酵母、昆虫、または植物）のいずれか１つから得られる組換えタンパク質調製物中のＨＣＰの存在を決定するために選択することができる。
【００４５】
本開示は、特異的ＨＣＰに結合する複数のアプタマーを産生するための複数のアプローチを包含する。一実施形態において、複数のアプタマーを調製する方法は、以下のステップを含む。第１に、潜在的アプタマーのライブラリーを提供する。第２に、どの候補アプタマーがＨＣＰへのある程度の結合を示すかを決定することにより、潜在的アプタマーのライブラリーから候補アプタマーを選択することができる。このような方法において、ステップは、特異的ＨＣＰに結合する複数のアプタマーを同定する。一方法において、候補アプタマーは、アプタマーの最終プールであり得る。一部の実施形態において、アプタマーは、ＨＣＰの検出の方法または除去の方法において使用することができる。
【００４６】
別の実施形態において、アプローチは、以下のステップを含む。第１に、潜在的アプタマーのライブラリーを提供する。第２に、どのアプタマーがＨＣＰへのある程度の結合を示すかを決定することにより、潜在的アプタマーのライブラリーから候補アプタマーを選択することができる。第３に、本方法は、（ｉ）ＨＣＰに結合する複数のアプタマーおよび／または（ｉｉ）複数のアプタマーに結合する複数のＨＣＰのアイデンティティーを決定することを含み得る。一実施形態において、複数のアプタマーのアイデンティティーを決定することは、アプタマーをシーケンシングすることを含む。一実施形態において、アプタマーをシーケンシングすることは、同時並行的に実施する。一実施形態において、同時並行的にシーケンシングすることは、次世代シーケンシングプロセスを介して実施する。
【００４７】
一実施形態において、候補アプタマーのプールは、アプタマーの最終プールの調製前に追加の選択を受ける。別の実施形態において、アプローチは、以下のステップを含む。第１に、潜在的アプタマーのライブラリーを提供する。第２に、どのアプタマーがＨＣＰ混合物中のＨＣＰへの少なくともある程度の結合を示すかを決定することにより、潜在的アプタマーのライブラリーから候補アプタマーを選択することができる。第３に、ＨＣＰ混合物中のＨＣＰへのある程度の結合を示すそれらの候補アプタマーをシーケンシングすることができる。一部の実施形態において、シーケンシングは、同時並行的に実施する。第４に、複数の候補アプタマーについての結合親和性を特異的に決定することができる。第５に、ＨＣＰ混合物、または組換えタンパク質調製物中のＨＣＰに対する候補アプタマーの結合親和性に基づき、最終アプタマープールを同定することができる。一実施形態において、候補アプタマーをディスプレイする固体担体を用いることにより、結合親和性を特異的に決定することができる。一実施形態において、固体担体は、アレイであり得る。固体担体がアレイである実施形態において、候補アプタマーについての結合親和性は、同時並行的に決定することができる。
【００４８】
別の実施形態において、アプローチは、以下のステップを含む。第１に、潜在的アプタマーのライブラリーを提供する。第２に、どのアプタマーがＨＣＰ混合物または組換えタンパク質調製物中のＨＣＰへのある程度の結合を示すかを決定することにより、ライブラリーから候補アプタマーを選択することができる。第３に、ＨＣＰへのある程度の結合を示すそれらの候補アプタマーをシーケンシングすることができる。一部の実施形態において、シーケンシングすることは、同時並行的に実施することができる。第４に、候補アプタマーをディスプレイするアレイを提供することができる。第５に、ＨＣＰ混合物または組換えタンパク質調製物中のＨＣＰに対する候補アプタマーについての結合親和性を、アレイベースアプローチを使用して決定することができ、ＨＣＰ混合物または組換えタンパク質調製物中のＨＣＰへの２μＭ未満のＫDまたは１μＭ未満のＫDの結合を示すアプタマーを選択することができる。第６に、ＨＣＰ混合物または組換えタンパク質調製物中の特異的ＨＣＰに結合する複数のアプタマーを同定することができる。一部の実施形態において、特異的ＨＣＰに結合するアプタマーを同定するための試みにおいて突然変異誘発、または他の直接進化の形態を使用することができる。
【００４９】
用語「特異的に結合する」は、結合分子（本明細書においては、アプタマー）およびその結合パートナー（本明細書においては、ＨＣＰ）の相互作用を指し、その相互作用は、結合パートナー上の特定の構造の存在に依存的である。アプタマーは、ＨＣＰが他の分子（同一型の細胞系により産生される他のＨＣＰまたは組換えタンパク質を含む）の混合物中に存在する場合でもそのＨＣＰに優先的に結合し、またはそれを認識する。
【００５０】
一実施形態において、規定の組換えタンパク質により生成されるＨＣＰは、組換えタンパク質調製物中のＨＣＰを決定すること；同一型であるが、組換えタンパク質を発現しない細胞系（ヌル細胞系）からのタンパク質調製物中のＨＣＰを決定すること；およびヌル細胞系中のＨＣＰから組換えタンパク質調製物中のＨＣＰを減算することにより同定することができる。
【００５１】
場合により、アプタマーの最終プールを使用してそれぞれのアプタマーが結合するＨＣＰのアイデンティティーを決定することができる。一部の実施形態において、同定されたＨＣＰを単離することができる。
【００５２】
本明細書に記載の実施形態を介して生成された最終アプタマープール中のアプタマーの一部または全てと、それぞれのアプタマーが最も密接に結合するＨＣＰとの間の親和性（すなわち、最低ＫDを有する）は、約１×１０-8から約１×１０-13のＫDにより表すことができる。別の実施形態において、それは、約１×１０-9から約１×１０-12または約１×１０-9から約５００×１０-12のＫDにより表すことができる。組換えタンパク質調製物において、約１から１００ｎｇ／ｍＬの濃度範囲において約１，２００のＨＣＰが存在する。したがって、シグナルをスキャナにより把握するため、アプタマーは、約１×１０-8から約１×１０-13のＫDを有するべきである。別の実施形態において、それは、約１×１０-9から約１×１０-12または約１×１０-9から約５００×１０-12のＫDにより表すことができる。
【００５３】
一実施形態において、ＨＣＰは、ＨＣＰ混合物中で、または組換えタンパク質調製物中で異なる量で存在する。一部のＨＣＰは、極めて高い濃度において存在し得、他のＨＣＰは、極めて低い濃度において存在し得る。例えば、ＨＣＰは、少なくとも約１：１０の比、少なくとも約１：１００の比、または少なくとも約１：１０００の比だけ量が異なり得る。本方法の１つの利点は、このアプタマーアプローチを使用してアプタマーを調製し、または高いおよび低い濃度の両方において同時に存在するＨＣＰを検出することができることである。
【００５４】
Ａ．潜在的アプタマーのライブラリーの提供
ライブラリー中の潜在的アプタマーは、核酸を含み得る。一実施形態において、ライブラリー中の潜在的アプタマーは、ＤＮＡ、またはＲＮＡ、またはＸＮＡ、またはそれらの組合せを含み得る。一実施形態において、ライブラリー中の潜在的アプタマーは、ｓｓＤＮＡを含み得る。さらなる実施形態において、ライブラリー中の潜在的アプタマーは、ランダム化ヌクレオチド配列を含む。一実施形態において、潜在的アプタマーは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマー部位も含む。一実施形態において、潜在的アプタマーは、約１００ヌクレオチドを含む。一実施形態において、潜在的アプタマーは、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１１０、約１２０、または約１３０ヌクレオチドを含む。一実施形態において、潜在的アプタマーは、約５０から約１３０ヌクレオチド、約６０から約１２０ヌクレオチド、約９０から約１１０ヌクレオチドを含む。一実施形態において、アプタマーライブラリーは、同一数のヌクレオチドを有する潜在的アプタマーを含有する。別の実施形態において、ライブラリーは、異なる数のヌクレオチドを有する潜在的アプタマーを含有する。一実施形態において、アプタマー中の異なる量のランダム配列は、潜在的アプタマー中の異なる数のヌクレオチドを構成する。一部の実施形態において、ＣＨＯ溶解物中のＨＣＰを同定するために使用されるアプタマーは、５０ヌクレオチドを含有する。
【００５５】
一実施形態において、潜在的アプタマーは、約６０ヌクレオチドのランダム配列を含む。一実施形態において、潜在的アプタマーは、約３０から約１００、約４０から約９０ヌクレオチド、または約５０から７０ヌクレオチドのランダム配列を含む。一実施形態において、潜在的アプタマーは、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、または約１００ヌクレオチドのランダム配列を含む。
【００５６】
別の実施形態において、潜在的アプタマーは、それぞれ約２０ヌクレオチドのＰＣＲプライマー部位を含む。一実施形態において、潜在的アプタマーは、それぞれ約１５から約２５ヌクレオチド、または約１８から約２２ヌクレオチドのＰＣＲプライマー部位を含む。一実施形態において、ＰＣＲプライマー部位は、それぞれ約１５、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、または約２５ヌクレオチドである。
【００５７】
一実施形態において、潜在的アプタマーは、５’−プライマー部位ランダム化配列−プライマー部位−３’としてそれぞれ配置される約２０ヌクレオチドのＰＣＲプライマー部位によりフランキングされるランダム化配列中の約６０ヌクレオチドを含む。一実施形態において、ＰＣＲプライマー部位は、ＡＧＣＡＧＣＡＣＡＧＡＧＧＴＣＡＧＡＴＧ（配列番号１に記載）およびＣＣＴＡＴＧＣＧＴＧＣＴＡＣＣＧＴＧＡＡ（配列番号２に記載）であり得る。他のＰＣＲプライマー部位を使用することもできる。アプタマーライブラリーおよびプライマーは、ホスホラミダイト化学反応を使用して合成することができる。アプタマーライブラリーおよびプライマーは、少なくともＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入することができる。
【００５８】
一実施形態において、潜在的アプタマーのライブラリーは、潜在的アプタマーのライブラリーを担体上でディスプレイすることを含む。一実施形態において、それぞれの担体は、同一アプタマーの複数コピーをディスプレイする。一実施形態において、それぞれの担体は、複数のアプタマーをディスプレイする。
【００５９】
一実施形態において、アプタマーは、アプタマーをそれらの天然状態（すなわち、液相状態）で使用することができる。別の実施形態において、アプタマーは、ビーズ上でアプタマー粒子に形成することができる。一部の実施形態において、アプタマー粒子は、磁気ビーズ上に存在する。一実施形態において、アプタマー粒子は、エマルジョンポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して合成することができる。一実施形態において、油中水型エマルジョンは、それぞれの液滴が１つのＤＮＡテンプレートおよびフォワードプライマーによりコーティングされた１つのビーズ（例えば、磁気ビーズなど）を含有する（多くの場合）ようにＰＣＲ試薬により調製することができる。ＰＣＲ増幅は、液滴内で実施することができ、アプタマーの複数コピーを表面上でディスプレイする粒子を生じさせる。一実施形態において、粒子は、アプタマーの約２．４×１０5コピーをディスプレイすることができる［Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  Ｈｉｇｈ−Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ａｐｔａｍｅｒｓ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．５３（１９）：４７９６−４８０１（２０１４）］。エマルジョンを破壊し、未反応ＰＣＲ試薬を除去した後、アプタマー相補鎖をＮａＯＨによる処理により変性および放出させ、アプタマー粒子を回収することができる。磁気ビーズを用いる場合、アプタマー粒子を後続のステップにおいて磁気分離により回収することができる。一部の実施形態において、磁気でないビーズを使用することができる。
【００６０】
Ｂ．ライブラリーからの候補アプタマーの選択
ライブラリーから複数の候補アプタマーを選択するために種々の技術を使用することができる。一実施形態において、複数の候補アプタマーは、ライブラリーを複数の宿主タンパク質に曝露し、ライブラリーから複数の候補アプタマーをＨＣＰの少なくとも１つにそれぞれ結合するそれらの能力について分離することによりライブラリーから選択する。一実施形態において、ライブラリーから候補アプタマーを、既知の標的へのアプタマーの結合について選択するために使用される任意の技術を、本方法のこの部分において使用することができる。したがって、ライブラリーから候補アプタマーを選択する特定の方法の記載は、本方法のこの特定の部分を限定しない。
【００６１】
一実施形態において、候補アプタマーのそれぞれは、１つのみのＨＣＰへのその高い親和性結合について選択する。一実施形態において、候補アプタマーは、その標的ＨＣＰについての約２μＭ以下のＫDを有する。別の実施形態において、候補アプタマーは、その標的ＨＣＰについての約１ｎＭから約２５ｎＭ以下のＫDを有する。一実施形態において、候補アプタマーのそれぞれは、１つのみのＨＣＰについてのその親和性によりソーティングする。一実施形態において、少なくとも約１０、少なくとも約１０2、少なくとも約１０3、少なくとも約１０4、約１０5、約１０6、約１０7、約１０8、約１０9、または約１０10の候補アプタマーをこのプロセスにより同定する。多数の異なる配列をアレイ上で同時並行的に合成し、開裂させ、回収し、アプタマー混合物の生成を極めて簡易なプロセスにすることができる。
【００６２】
一実施形態において、候補アプタマーは、アプタマーの最終プールである。別の実施形態において、候補アプタマーは、アプタマーの最終プールの組成を決定する前に追加の選択を受ける。ライブラリーから候補アプタマーを選択する一連の方法が存在し、一部を以下のとおり記載する。
【００６３】
１．マイクロ流体選択プラットフォーム
一実施形態において、アプタマーは、マイクロフルイディクス技術を使用する指数関数的富化によるリガンドのシステマチック進化を介して生成することができる。一実施形態において、マイクロ流体選択は、ミクロンサイズであり得る磁気ビーズの表面上でＨＣＰを固定化することにより開始する。コーティングされたビーズは、上記のとおり核酸ライブラリーとインキュベートすることができる。
【００６４】
インキュベーションの間、ＨＣＰに結合しているアプタマーがＨＣＰコーティングビーズに結合する。ビーズは、種々の様式を使用して洗浄し、ソーティングすることができる。一実施形態において、ビーズは磁性であり、マイクロ磁気分離デバイス（ＭＭＳ）内で５０ｍＬ／時間の流速において高ストリンジェンシーな連続洗浄に供される。分離後、外部磁石を除去し、選択されたアプタマーを担持するビーズを溶出させ、アプタマーを増幅させることができる。アプタマーの増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により実施して二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を得ることができ、それを追加の選択ラウンドにおける使用のためにｓｓＤＮＡに変性させることができる。
【００６５】
一実施形態において、アプタマーｓｓＤＮＡと標的との間のモル比は、少なくとも約１：１、約５：１、約１０：１、約２５：１、約５０：１、約７５：１、約１００：１、約２００：１、約５００：１であり得、アプタマーｓｓＤＮＡと標的との比が高くなると、プロセスの選択圧が増加する。
【００６６】
一部の実施形態において、他の分子をビーズに結合させて選択アプタマーの特異性を増加させることにより、陰性選択構成要素を追加することもできる。一実施形態において、宿主細胞により産生された組換えタンパク質を使用することができる。一実施形態において、陰性選択様式を使用する場合、枯渇プールを使用して陽性選択前に陰性選択を行うことができる。別の実施形態において、陽性選択後に陰性選択を行うことができる。陰性選択により、当該宿主細胞により産生されている組換えタンパク質に結合するライブラリー中の潜在的アプタマーの除去が可能となる。
【００６７】
一実施形態において、複数の選択ラウンドを使用し、それらの間でデータを比較することができる。複数の選択ラウンドを使用する場合、それぞれのラウンドにおける条件は同一であっても異なってもよい。例えば、複数の選択ラウンドを使用し、選択ラウンドの全てにおいて出現する候補アプタマーを全選択プロセスにおいてより高度に優先することができる。あるいは、異なる条件を使用してプロセスのストリンジェンシーと、候補アプタマーとして選択されるアプタマーの数とのバランスを取ることができる。さらにマイクロ流体選択を粒子ディスプレイ選択と組み合わせることもでき、異なる技術を異なるラウンドで使用し、候補アプタマーは、両方のプロセスを介して選択されるものである。一実施形態において、約１から約４回のマイクロ流体選択ラウンドおよび約１から約４回の粒子ディスプレイラウンドを使用する。一実施形態において、少なくとも約２、少なくとも約３、少なくとも約４、少なくとも約５、または少なくとも約６回の合計選択ラウンドを使用して候補アプタマーを決定する。
【００６８】
２．粒子ディスプレイ法
アプタマーライブラリーをアプタマー粒子上で提供する場合、一実施形態において、粒子ディスプレイ法を使用することができる。このような方法において、アプタマーをディスプレイする粒子を複数のＨＣＰに曝露し、複数の候補アプタマー粒子を、ＨＣＰの１つのみにそれぞれ結合するそれらの能力について選択する。一実施形態において、アプタマーを１つのＨＣＰについてのそれらの親和性により、それらの親和性を計測した後にソーティングする。
【００６９】
一実施形態において、複数のＨＣＰを蛍光部分により標識する。次いで、ＦＡＣＳ分析を使用してＨＣＰの１つに対するより高い親和性を有するアプタマー粒子を、ＨＣＰの１つに対するより低い親和性を有するアプタマー粒子から分離することができる。一実施形態において、単一蛍光標識をＨＣＰの混合物にアプライし、タンパク質の全てを単一ステップにおいて単一蛍光標識により標識することができる。それというのも、この方法は、どのＨＣＰが結合しているかの区別を要求しないためである。
【００７０】
アプタマー粒子により捕捉されたタンパク質からの蛍光強度は、標的ＨＣＰに対するアプタマーの結合親和性に比例する。蛍光とアプタマー親和性との間の直接相関により、ＨＣＰに対する最大親和性を有する候補アプタマーの定量的同定およびソーティングが可能となる。
【００７１】
ＦＡＣＳ分析において使用することができる蛍光標識としては、限定されるものではないが、フルオロフォア、例えば、７−ＡＡＤ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４０５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）７００、ＡＰＣ（アロフィコシアニン）、ＡＰＣ−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）７５０、ＡＰＣ−ｅＦｌｕｏｒ（登録商標）７８０、Ｃｙ５、ｅＦｌｕｏｒ（登録商標）４５０、ｅＦｌｕｏｒ（登録商標）６０５ＮＣ、ｅＦｌｕｏｒ（登録商標）６２５ＮＣ、ｅＦｌｕｏｒ（登録商標）６５０ＮＣ、ｅＦｌｕｏｒ（登録商標）６６０、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）、フルオレセイン、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ（商標）、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｏｒａｎｇｅ、ＰＥ−シアニン５、ＰＥ−シアニン５．５、ＰＥ−シアニン５．５、ＰＥ−シアニン７、ＰＥ−ｅＦｌｕｏｒ（登録商標）６１０、ＰｅｒＣＰ−シアニン５．５、ＰｅｒＣＰ−ｅＦｌｕｏｒ（登録商標）７１０、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、Ｒ−ＰＥ（Ｒ−フィコエリスリン）、ＲＰＥ、ＲＰＥ−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６１０、ＲＰＥ−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）７００、ＲＰＥ−Ｃｙ（登録商標）５．５、ＲＰＥ−Ｃｙ（登録商標）７、ＲＰＥ−Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（登録商標）、およびＴＲＩ−ＣＯＬＯＲ（登録商標）が挙げられる。蛍光標識としては、慣習的なフルオロフォアに代えてＦＡＣＳ分析において使用することもできる量子ドットも挙げられる。量子ドットとしては、限定されるものではないが、Ｑｄｏｔ（登録商標）５２５ナノクリスタル、Ｑｄｏｔ（登録商標）５６５ナノクリスタル、Ｑｄｏｔ（登録商標）５８５ナノクリスタル、Ｑｄｏｔ（登録商標）６０５ナノクリスタル、Ｑｄｏｔ（登録商標）６５５ナノクリスタル、Ｑｄｏｔ（登録商標）７０５ナノクリスタル、Ｑｄｏｔ（登録商標）８００ナノクリスタル（全てＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）が挙げられる。
【００７２】
一態様において、蛍光標識は、ビオチン−ストレプトアビジン方針を介してＨＣＰに付着させることができる。ＨＣＰをビオチン化し、蛍光タンパク質をストレプトアビジンにコンジュゲートさせることができる。一様式において、水溶解度を改善するためのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）スペーサーを含むＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｍｉｃｒｏ  ＮＨＳ−ＰＥＯ4−ビオチン化キット（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用することができる。ビオチン化前にタンパク質濃度をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）により０．５ｍｇ／ｍＬに調整することができる。５０〜１００μｇのタンパク質を標識するための５０倍モル過剰のビオチン試薬を、室温において３０分以上使用し、Ｚｅｂａ脱塩スピンカラム（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を介して遊離ビオチンを除去することができる。ビオチン化タンパク質濃度は、例えば、ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して２８０ｎｍにおける吸光度に基づき計測することができる。
【００７３】
別の実施形態において、蛍光標識は、フルオロフォアをＨＣＰに固定する任意の反応を介してＨＣＰに付着させることができる。例えば、フルオロフォアの化学反応性誘導体を使用してＨＣＰと反応させることができる。例としては、イソチオシアネート誘導体、スクシンイミジルエステル、マレイミド活性化フルオロフォアなどが挙げられる。
【００７４】
３．技術の組合せ
当分野において公知の任意の技術を使用してライブラリーからアプタマーを選択することができる。一部の実施形態において、本明細書に記載の技術の少なくとも１つを使用してライブラリーからアプタマーを選択することができる。一実施形態において、複数の単一技術ラウンドを組み合わせることができ、および／または複数の技術を多段階プロセスにおいて組み合わせることができる。
【００７５】
Ｃ．ＨＣＰに結合する複数のアプタマーアイデンティティーの任意選択の決定
ＨＣＰ混合物または組換えタンパク質調製物中のＨＣＰへのいくらかのレベルの結合を実証する候補アプタマーを選択したら、選択された候補アプタマーのアイデンティティーを確認することができる。一実施形態において、アプタマーのアイデンティティーは、同時並行シーケンシングプロセス、例えば、次世代シーケンシングプロセスを介して確認する。
【００７６】
１．次世代シーケンシング
次世代シーケンシングは、多く（典型的には、数千から数十億）の核酸配列を本質に同時並行的な様式で決定する方法を使用する配列決定を意味し、すなわち、１つずつではないバルクプロセスにおけるシーケンシングのためにＤＮＡテンプレートを調製し、多くの配列を好ましくは同時並行的に、あるいはそれ自体、同時並行化することができる超ハイスループット逐次プロセスを使用してリードアウトする。このような方法としては、限定されるものではないが、パイロシーケンシング（例えば、４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｒａｎｆｏｒｄ，ＣＴにより市販されているもの）；ライゲーションによるシーケンシング（例えば、ＳＯＬｉＤ（商標）技術、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡにおいて市販されているもの）；修飾ヌクレオチドを使用する合成によるシーケンシング（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡによるＴｒｕＳｅｑ（商標）およびＨｉＳｅｑ（商標）技術、およびＰａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｉｎｃ．，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡによるＰａｃＢｉｏ  ＲＳにおいて市販されているもの）、イオン検出技術によるシーケンシング（Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）；ＤＮＡナノボールのシーケンシング（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）；ナノポアベースシーケンシング技術（例えば、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＬＴＤ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫにより開発）および同様の高度に同時並行化されたシーケンシング法が挙げられる。
【００７７】
このような次世代シーケンシング法は、例えば、ワンパスシーケンシング法を使用してまたはペアードエンドシーケンシングを使用して実施することができる。次世代シーケンシング法としては、限定されるものではないが、ハイブリダイゼーションベース法、合成によるシーケンシング法、ライゲーションベース法、ナノポアシーケンシングおよび他の方法が挙げられる。
【００７８】
一実施形態において、シーケンシングは、選択プロセスからの候補アプタマーに対して実施する。別の実施形態において、シーケンシングは、選択プロセスからの候補アプタマーの複数のプールに対して実施する。
【００７９】
一実施形態において、ＰＣＲを使用してシーケンシング前に選択プロセスからの候補アプタマーを増幅させることができる。
【００８０】
２．配列情報を使用する任意選択の追加の区別ステップ
一実施形態において、シーケンシングプロセスからの情報を使用する追加の区別ステップは、アプタマーの最終プールを同定する。アプタマーの最終プールは、結合親和性の決定に使用することができる。アプタマーをグルーピングし、またはより低濃度でＨＣＰに結合し得るアプタマーをエンリッチするための技術を用いることができる。あるいは、異なるスクリーニングラウンドからのアプタマープールを比較することにより、標的ＨＣＰに高い親和性で結合するアプタマーを標的ＨＣＰに対する低い親和性を有するアプタマーから区別するための技術を用いることができる。
【００８１】
リピートモチーフ分析は、候補アプタマーの初期グループの配列を評価して選択集団の不均一性を試験し、均一配列を同定することを含む。少なくとも１つのモチーフが複数の候補アプタマー中の全体または一部として示される場合、それはそれらのアプタマーが同一ＨＣＰまたは関連ＨＣＰ（例えば、均一構造を有するＨＣＰ）に結合することを意味し得る。これらのアプタマーをグループ化し、試験してそれらが同一または関連ＨＣＰに結合するか否かを決定することができる。一実施形態において、複数の候補アプタマー中の全体または一部として示される少なくとも１つのモチーフは、候補アプタマー内の同一または類似位置（例えば、５、１０、１５ヌクレオチド内）に位置させることができる。別の実施形態において、少なくとも１つのモチーフは、候補アプタマー内の可変位置に位置させることができる。
【００８２】
一実施形態において、コピー数分析は、アプタマーをそれらのコピー数に基づき順位付けし、この情報を使用してアプタマーを評価することができるプロセスを含む。例えば、高コピー数を有するアプタマーは、より高い濃度においてＨＣＰに結合し得、より低いコピーを有するアプタマーは、より低い濃度においてＨＣＰに結合し得る。このような情報を有することは、アプタマーの評価およびアプタマーの最終プールの選択または追加のスクリーニングのための候補アプタマーの選択のいずれかにおいて調査者を支援する。一実施形態において、コピー数分析は、アプタマーの最終プールに対して実施することができる。別の実施形態において、コピー数分析は、アプタマーの最終プールの選択間で候補アプタマーの複数のプールに対して実施することができる。
【００８３】
一実施形態において、エンリッチメント倍率分析は、アプタマーの最終プールの選択間で候補アプタマーの複数のプールのそれぞれにおけるそれぞれのアプタマーのコピー数を決定すること、およびあらゆるアプタマーについての２つの選択ラウンド間のコピー数の比によりアプタマーを順位付けすることを含む。選択間でエンリッチされるそれらのアプタマー（すなわち、より早期の選択ラウンドよりも高いコピー数を後の選択ラウンドについて有するもの）は、より重要なアプタマーである可能性が高い。例えば、複数の選択プール中の高コピー数を有するアプタマーが存在し得るが、それはいかなる顕著なエンリッチメント倍率も実証しない。このような場合、それらのアプタマーは、ライブラリー合成またはＰＣＲ間のバイアスの結果として過剰に提示され得る。例えば、３つの選択プールを得た場合、第３ラウンドについてのコピー数を第１ラウンドについてのコピー数と比較することができる（第３ラウンド／第１ラウンド）。あるいは、または組合せにおいて、第３ラウンドについてのコピー数を第２ラウンドについてのコピー数と比較することができる（第３ラウンド／第２ラウンド）。あるいは、または上記アプローチの一方もしくは両方との組合せにおいて、第２ラウンドについてのコピー数を第１ラウンドについてのコピー数と比較することができる（第２ラウンド／第１ラウンド）。それぞれのアプタマーについて比を得る場合、より高いエンリッチメント倍率を実証するアプタマーがより重要である可能性が高い。
【００８４】
Ｄ．アプタマーに結合するＨＣＰのアイデンティティーの任意選択の決定
一実施形態において、アプタマー、例えば、候補アプタマーに結合する複数のＨＣＰを決定することができる。アプタマーに結合するＨＣＰのアイデンティティー（アプタマーのアイデンティティーが既知であるか未知であるかを問わない）は、以下のセクションＩＩ．Ｇに記載の方法のいずれかを使用して決定することができる。候補アプタマーに結合するＨＣＰのアイデンティティーは、候補アプタマーがアプタマーの最終プールであるアプタマーの最終プールの特徴決定の一部として決定することができる。候補アプタマーに結合するＨＣＰのアイデンティティーは、追加ステップを用いて異なるアプタマーの最終プールをさらに選択する連続選択プロセスの一部として決定することができる。
【００８５】
Ｅ．ＨＣＰ調製物に対する候補アプタマーについての結合親和性の任意選択の決定
ＨＣＰ混合物中または組換えタンパク質調製物中の１つのＨＣＰに対するそれぞれのアプタマーについての結合親和性を決定するためのアプローチを、場合により使用することができる。結合親和性を決定する方法のいずれにおいても、候補アプタマー、またはさらなるスクリーニング、例えば、エンリッチメント倍率、リピートモチーフ、およびコピー数分析の少なくとも１つの後に選択されるアプタマーのいずれかを、候補アプタマーとしてのアプタマーの名称を変えずに使用することができる。一実施形態において、候補アプタマーの配列情報をこの任意選択のプロセスにおいて用いることができる。
【００８６】
一態様において、ＨＣＰ混合物または組換えタンパク質調製物中のＨＣＰについての複数の候補アプタマーの結合親和性を決定することは、候補アプタマーを固体担体に固定すること、固体担体に固定されたアプタマーを、ＨＣＰ混合物または組換えタンパク質調製物と接触させること、および候補アプタマーへのＨＣＰの結合を決定することを含む。別の実施形態において、本方法は、ＨＣＰ混合物または組換えタンパク質調製物を固体担体に固定すること、ＨＣＰ混合物または組換えタンパク質調製物を候補アプタマーと接触させること、およびＨＣＰへの候補アプタマーの結合を決定することを含む。
【００８７】
一実施形態において、アレイを調製してＨＣＰ混合物または組換えタンパク質調製物中のＨＣＰに対する候補アプタマーについての結合親和性を決定することができる。一実施形態において、本方法は、アレイを使用してＨＣＰ混合物または組換えタンパク質調製物中のＨＣＰに対する候補アプタマーについての結合親和性を同時並行的に決定することを含む。
【００８８】
一実施形態において、候補アプタマーについての結合親和性は、それらの標的ＨＣＰについての候補アプタマーのＫDまたはＫAを計測することにより決定する。別の実施形態において、アプタマーは、少なくとも２μＭのＫDでＨＣＰに特異的に結合する。さらなる実施形態において、本方法は、標的ＨＣＰに特異的に結合する複数のアプタマーを生成する。一実施形態において、本方法は、ＨＣＰに特異的に結合する少なくとも約２、少なくとも約２０、少なくとも約２００、少なくとも約３００、少なくとも約４００、少なくとも約５００、少なくとも約６００、少なくとも約７００、少なくとも約８００、少なくとも約９００、少なくとも約１０００、または少なくとも約６×１０14のアプタマーを生成する。
【００８９】
１．アプタマーチップアレイ
複数のフィーチャーを有する少なくとも１つのアレイを用いてアプタマーチップを調製することができる。一実施形態において、アレイは、化学修飾一本鎖オリゴヌクレオチド基板をアレイチップの反応性基板上にプリントすることにより調製することができる。一実施形態において、アプタマーチップは、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）、ＭＹｃｒｏａｒｒａｙ、または別の販売会社から市販されているものもある。一実施形態において、アプタマーチップは、２つ以上のアレイを含有し得る。一実施形態において、それぞれのアレイは結合親和性データが望まれるアプタマーを取り込む。アレイは、場合により、ランダム配列を有する対照ポリヌクレオチドを取り込み得る。別の実施形態において、それぞれのアプタマーは、２、３、または４コピー以上により提示させてデュプリケート、トリプリケート計測などを可能とすることができる。
【００９０】
候補アプタマーは、潜在的アプタマーのライブラリーからのフォワードおよび／もしくはリバースプライマー結合領域を有し、または潜在的アプタマーのライブラリーからのフォワードおよび／もしくはリバースプライマー結合領域を有さないアレイにアプライすることができる。一実施形態において、プライマー結合領域は、切断することができる。それというのも、アレイは、候補アプタマーのランダム化部分とプライマー部分の長さであるポリヌクレオチドを最適に収容し得ず、または収容しないためである。別の実施形態において、プライマー結合領域を切断してアプタマーがそれらの領域なしでそれらの機能を保持することを確認することができる。
【００９１】
リンカーを使用して候補アプタマーをアレイ表面に付着させることができる。一実施形態において、リンカーは、約１０から約５０ヌクレオチド、または約３０から約４５ヌクレオチドであり得る。一実施形態において、リンカーは、約４０ヌクレオチドであり得る。一実施形態において、ポリＴリンカー、例えば、約４０ヌクレオチドのポリＴリンカーを使用して候補アプタマーをアレイ表面に付着させることができる。別の実施形態において、ポリＡリンカー、例えば、約４０ヌクレオチドのポリＡリンカーを使用して候補アプタマーをアレイ表面に付着させることができる。別の実施形態において、リンカーは、リバースプライマーを含み得る。一実施形態において、リンカーは、フォワードおよびリバースプライマーの両方を含み得る。固体表面への付着のためのリンカーは、上記で使用されるＰＣＲプライマーと同一でも異なってもよい。例えば、リバースプライマー方針は、Ｘ1−i−ＣＣＴＡＴＧＣＧＴＧＣＴＡＣＣＧＴＧＡＡ（配列番号３に記載）を含み得、フォワードおよびリバースプライマー方針は、ＡＧＧＴＣＡＧＡＴＧ−Ｘ1−i−ＣＣＴＡＴＧＣＧＴＧ（配列番号４に記載）を含み得、Ｘは任意のヌクレオチドを表し、ｉは、候補アプタマー中のヌクレオチドの数を表すための整数である。以下の実施例において、候補アプタマーは５０ヌクレオチドを含有する。
【００９２】
アレイを調製したら、それを蛍光標識ＨＣＰとインキュベートする。一実施形態において、アレイを複数の同一アレイに分け、次いでそれらを同一濃度の蛍光標識ＨＣＰまたは異なる濃度の蛍光標識ＨＣＰとインキュベートすることができる。異なる濃度を使用する場合、これにより、それぞれの異なるＨＣＰ濃度におけるあらゆる単一アプタマーフィーチャーからの蛍光シグナルが結合等温線を構築することができ、同時にあらゆる配列についてのＫD値の同時誘導が可能となる。
【００９３】
例えば、アレイは、約１０、約２５、約５０、約７５、約１００、約１５０、約２００、または約５００ｎＭの標識ＨＣＰと、または約１μＭの標識ＨＣＰとインキュベートすることができる。一実施形態において、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７標識ＨＣＰを使用することができる。洗浄および乾燥後、アレイスキャナを使用してあらゆるフィーチャーからの蛍光強度を計測することができる。それぞれの配列をアレイにトリプリケートでアプライする場合、シグナルは、ＫD値を計算するプロセスにおいて平均化することができる。
【００９４】
一実施形態において、ラングミュア結合等温線を想定し、以下の式を使用することができる：Ｙ＝Ｂmax×Ｘ／（ＫD）＋Ｘ）、式中、Ｙは、それぞれの濃度における正味の蛍光強度であり、Ｘは、蛍光標識ＨＣＰの濃度であり、Ｂmaxは、飽和における正味の蛍光強度である。一実施形態において、バックグラウンドよりも２倍小さいＢmaxを有する任意のアプタマー配列を廃棄する。
【００９５】
一様式において、アレイは、少なくとも５０の候補アプタマーについての、それらの標的ＨＣＰに対する特異的結合親和性を決定する。別の様式において、アレイは、標的ＨＣＰに対する少なくとも約１００、少なくとも約１５０、少なくとも約２００、少なくとも約２５０、少なくとも約３００、少なくとも約５００、少なくとも約１０００、少なくとも約２，０００、少なくとも約５，０００、少なくとも約１０，０００、少なくとも約２０，０００、少なくとも約５０，０００または少なくとも約１００，０００の候補アプタマーについての結合親和性を決定する。
【００９６】
２．ビーズベース蛍光結合アッセイ
ＨＣＰ混合物または組換えタンパク質調製物中の特異的ＨＣＰに対する候補アプタマーについての結合親和性は、ビーズベース蛍光結合アッセイを使用して評価することもできる。一様式において、ユニーク配列を有するアプタマーをそれぞれディスプレイするアプタマー粒子の形態の異なるアプタマーを、ＨＣＰ混合物または組換えタンパク質調製物とインキュベートすることができる。場合により、非結合フォワードプライマーをディスプレイする粒子をそれぞれの計測における陰性対照として使用することができる。これは、選択候補アプタマーの相対結合親和性を提供し得る。
【００９７】
それぞれの候補アプタマーのＫDは、ビーズベース蛍光結合アッセイを使用して決定することもできる。一実施形態において、反応は、０．０１％のＴｗｅｅｎ−２０およびＭｇＣｌ2が１ｍＭまたは１．５ｍＭで補給されたＰＢＳＭＣＴ緩衝液（ＨｙＣｌｏｎｅ  ＤＰＢＳ、カタログ番号ＳＨ３０２６４．０１）中で行うことができる。最終反応容量が１００μＬになるように、適切な緩衝液容量をそれぞれ１．５ｍＬチューブに添加することができる。ビオチン化ＨＣＰ（ｂＨＣＰ）を、０．２ｍｇ／ｍＬ（最終濃度）のサケ精子ＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の存在下で０．５ｎＭから５００ｎＭの範囲の濃度でそれぞれのチューブに添加することができる。ｂＨＣＰを有さない陰性対照をそれぞれのアプタマーと使用することもできる。
【００９８】
ｓｓＤＮＡアプタマー（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）は、５’末端アミノ修飾物であり得、１μｍのＣＯＯＨビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にコンジュゲートさせることができる。実験開始前、ビーズをＰＢＳＭＣＴ緩衝液中で１：５００に希釈することができる。緩衝液およびｂＨＣＰを含有するそれぞれのチューブに１マイクロリットルの１：５００希釈物を添加することができる。それぞれのチューブを３秒間ボルテックスに供し、次いでローテーター上に室温において１時間置くことができる。
【００９９】
１時間のインキュベーション後、チューブは、短時間スピンダウンさせ、磁気ラックを使用して上清からビーズを分離し、プレミアムグレードのストレプトアビジンフィコエリスリン溶液（ＳＡ−ＰＥ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の原液の１００μＬの１：１０００希釈物をそれぞれのチューブに添加することができる。チューブをボルテックスに３秒間供した後、ローテーター上で室温において１５分間インキュベートすることができる。
【０１００】
ＳＡ−ＰＥとの１５分間のインキュベーション後、チューブを短時間スピンダウンさせ、磁気ラック上に１分間置くことができる。上清を除去し、ビーズを１００μＬのＰＢＳＭＣＴ緩衝液中で再懸濁させることができる。１００μＬの溶液を含有するチューブを氷上に置きながら、それらを移してＡｃｃｕｒｉ  Ｃ６（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）フローサイトメーターにより計測することができる。
【０１０１】
バックグラウンド減算ＦＬ−２蛍光中央値を、ビオチン化ＨＣＰ濃度の関数としてプロットすることができる。データを、ＧｒａｐｈＰａｄからの１サイト特異的結合モデルを使用して非線形回帰式とフィットさせることができる。したがって、平衡解離結合定数（ＫD）をそれぞれのアプタマーについて決定することができる。
【０１０２】
Ｆ．大過剰の組換えタンパク質の任意選択の対処
大過剰量の組換えタンパク質（例えば、組換え抗体、例えば、ＩｇＧ）の存在下でも、アプタマーアレイを使用してＨＣＰに特異的に結合するアプタマーをスクリーニングすることもできる。ＨＣＰをある色により、組換えタンパク質を別の色によりフルオロフォア標識することより、所与のフィーチャーから放出される蛍光のレベルおよび波長に基づき、ＨＣＰ標的についての親和性を有するが、組換えＩｇＧについての親和性を有さない配列を同定することが可能である。
【０１０３】
アプタマー配列をアレイ上で同定したら、それらの個々の配列を合成し、ビーズまたはプレートベースアレイを使用して試験してそれらがＨＣＰに結合することを確認することができる。この任意選択のステップは、本方法の特殊性にさらに対処する。
【０１０４】
この任意選択の技術は、単独で、または候補アプタマーの選択前にアプタマーライブラリーから組換えタンパク質に結合する潜在的アプタマーを除去する上記の陰性選択プロセスとの組合せにおいて使用することができる。
【０１０５】
Ｇ．１つ以上のアプタマーが結合するＨＣＰの存在および／またはアイデンティティーの決定
本方法は、１つ以上のアプタマーが結合するＨＣＰのアイデンティティーを決定することも含み得る。
【０１０６】
アプタマーが結合する特異的ＨＣＰを同定するための種々の技術を使用することができる（アプタマーの配列が既知であるか未知であるかを問わない）。これらの技術としては、タンパク質質量分析、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）を挙げることができる。あるいは、プロテアーゼ（例えば、トリプシン）を使用することにより、タンパク質をより小さいペプチドに酵素消化し、質量分析器中に導入し、ペプチドマスフィンガープリンティングまたはタンデム質量分析により同定することができる。
【０１０７】
アプタマーが結合する特異的ＨＣＰの同定において有用な他の技術としては、ウエスタンブロット、免疫アッセイ、等電点電気泳動、キャピラリー電気泳動、マイクロチップベース電気泳動、ラマン分光法、プロトンＮＭＲ、およびｘ線結晶分析を介する結晶構造の決定がとりわけ挙げられる。
【０１０８】
ＩＩＩ．アプタマーを使用するＨＣＰの検出方法
一実施形態において、組換えタンパク質調製物中の複数のＨＣＰの存在を決定する方法は、組換えタンパク質調製物を提供すること、アプタマーの最終プールを提供すること、組換えタンパク質調製物をアプタマーの最終プールと合わせること；および複数のＨＣＰの存在を決定することを含む。一実施形態において、複数のＨＣＰの存在を決定することは、マイクロアレイ、クロマトグラフィー、ポリメラーゼ連鎖反応、または酵素結合免疫吸着アッセイを含む。一実施形態において、アプタマーの最終プールは、１つのＨＣＰに結合するそれぞれのアプタマーの能力について選択する。別の実施形態において、アプタマーの最終プールは、上記セクションＩに記載の方法を使用して標的ＨＣＰに結合するそれぞれのアプタマーの能力について選択する。
【０１０９】
一実施形態において、組換えタンパク質調製物中の少なくとも１つのＨＣＰのアイデンティティーを決定する方法は、上記セクションＩに記載の方法のいずれか１つにより調製された少なくとも１つのアプタマーを提供すること；およびセクションＩＩ．Ｇに記載の少なくとも１つのＨＣＰのアイデンティティーを決定することを含む。一実施形態において、本方法は、複数のアプタマーを用いる。一実施形態において、本方法は、複数のＨＣＰの存在および／またはアイデンティティーを決定する。
【０１１０】
一実施形態において、ＨＣＰ混合物または組換えタンパク質調製物中のＨＣＰの濃度は、本明細書に記載の方法を使用して決定することができる。
【０１１１】
Ａ．アッセイプラットフォーム
アプタマーを種々のアッセイプラットフォーム、例として、限定されるものではないが、アレイベース検出（例えば、多数のＨＣＰの同時検出を可能とするマイクロアレイ）、ＥＬＩＳＡおよびＥＬＩＳＡ型の方法（例えば、ＡＬＰＨＡｌｉｓａ）、表面プラズモン共鳴、免疫親和性法、例として、限定されるものではないが、免疫沈降、ブロッティング、親和性クロマトグラフィー、マイクロ流体プラットフォーム（例えば、Ｇｙｒｏｓ）、およびプロセス分析技術において使用してＨＣＰを検出することができる。
【０１１２】
Ｂ．効力
アプタマーを使用してＨＣＰを検出する方法は、ＨＣＰをより正確に検出すると予測される。一実施形態において、ＨＣＰ検出の方法は、組換えタンパク質調製物中のＨＣＰの少なくとも約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％、または約９９．９％同定し得る。別の実施形態において、検出の方法は、組換えタンパク質調製物中のＨＣＰの約１００％を同定し得る。
【０１１３】
一実施形態において、アプタマーのプールを調製し、固体担体に付着させてアプタマー粒子のプールを調製することができる。ＨＣＰ混合物をアプタマー粒子のプールと接触させる。アプタマー粒子のプールに結合していないＨＣＰ（未結合ＨＣＰ分画と称する）を回収することができる。アプタマー粒子のプールに結合しているＨＣＰ（結合ＨＣＰ分画と称する）は、ＨＣＰ／アプタマー粒子プール接触面の破壊後に回収することができる。二次元ゲル電気泳動、ウエスタンブロッティングおよび／または質量分析などの技術を使用して未結合ＨＣＰ分画を結合ＨＣＰ分画と比較することができる。
【０１１４】
ＩＶ．ＨＣＰの除去方法
組換えタンパク質調製物中のＨＣＰを同定したら、調製物からＨＣＰを除去するための種々の様式を使用することができる。一実施形態において、組換えタンパク質調製物からＨＣＰを除去する方法は、複数のアプタマーを提供すること；組換えタンパク質調製物を複数のアプタマーに曝露すること；アプタマーをＨＣＰに結合させること；および組換えタンパク質調製物からＨＣＰに結合しているアプタマーを分離することを含む。一実施形態において、本方法において使用される複数のアプタマーは、固体担体に固定する。一実施形態において、固体担体は、プレート、クロマトグラフィー樹脂、またはビーズ（磁気ビーズを含む）である。
【０１１５】
一実施形態において、少なくとも１つのアプタマー、例えば、本明細書に記載の方法により産生されたものを使用して組換えタンパク質産物からＨＣＰを除去することができる。アプタマーを固体担体、例えば、多孔性樹脂またはビーズ（例として、磁気ビーズ）に固定し、組換えタンパク質産物をアプライし、インキュベートさせ、固体担体−アプタマー−ＨＣＰ複合体から組換えタンパク質産物を分離することができる。例えば、一実施形態において、少なくとも１つのアプタマーを有する少なくとも１つの親和性カラムを使用してＨＣＰを除去することができる。
【０１１６】
一実施形態において、複数のアプタマーのそれぞれの個々のアプタマーは、それぞれの固体表面がそれに固定されるアプタマーの均一調製物を有するように固体表面に固定する。別の実施形態において、複数のアプタマーは、それぞれの固体表面が固定されるアプタマーの不均一混合物を有するように混合物として固体表面にアプライする。
【０１１７】
代替的な実施形態は、アプタマーを使用せずに、例えば、遺伝子ノックアウトまたはｓｉＲＮＡ技術などを使用して進行させ、上記セクションＩＩ．Ｇに記載のとおり特異的に同定したら組換えタンパク質調製物からの排除または低減が望まれるＨＣＰの発現を排除し、または低減させることもできる。アプタマーに結合するＨＣＰは、当分野において公知の方法を使用して単離することができ、所望により潜在的により高度の親和性除去プロセスのために追加のアプタマーまたは抗体を作出してそれに結合させることができる。このようなアプタマーまたは抗体のいずれかを、上記の除去方法において使用することができる。
【０１１８】
例示的方法
実施形態１：組換えタンパク質調製物中の複数の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）の存在または不存在を決定する方法であって、組換えタンパク質調製物を提供すること；複数のアプタマーを提供すること；組換えタンパク質調製物を複数のアプタマーと合わせること；および複数のＨＣＰの存在または不存在を決定することを含む方法。
【０１１９】
実施形態２：複数のＨＣＰの存在または不存在を決定することが、マイクロアレイ、クロマトグラフィー、ポリメラーゼ連鎖反応、または酵素結合免疫吸着アッセイを含む、実施形態１の方法。
【０１２０】
実施形態３：複数のアプタマーが、それらのＨＣＰ標的に特異的に結合するそれらの能力について選択された候補アプタマーである、実施形態１〜２のいずれか１つの方法。
【０１２１】
実施形態４：組換えタンパク質調製物が、生物医薬調製物である、先行する実施形態のいずれかの方法。
【０１２２】
実施形態５：組換えタンパク質調製物から複数のＨＣＰを検出または除去する方法において使用される複数のアプタマーを調製する方法であって、潜在的アプタマーのライブラリーを提供すること；複数のＨＣＰを含むＨＣＰ混合物に潜在的アプタマーのライブラリーを曝露することにより、潜在的アプタマーのライブラリーから複数の候補アプタマーを選択すること、およびライブラリーから複数の候補アプタマーを、ＨＣＰ標的に結合するそれぞれの候補アプタマーの能力について分離すること；および場合により、複数のＨＣＰ中のＨＣＰ標的にそれぞれ結合する複数の候補アプタマーのアイデンティティーを決定することを含み；ＨＣＰ混合物中の標的ＨＣＰに特異的に結合する複数の候補アプタマーを同定する方法。
【０１２３】
実施形態６：ＨＣＰ混合物が、ヌル細胞系からのものである、実施形態５の方法。
【０１２４】
実施形態７：候補アプタマーのプールが、アプタマーの最終プールである、実施形態５または６のいずれか１つの方法。
【０１２５】
実施形態８：候補アプタマーのプールが、アプタマーの最終プールの選択前に追加の選択を受ける、実施形態５または６のいずれか１つの方法。
【０１２６】
実施形態９：ＨＣＰに結合する複数の候補アプタマーのアイデンティティーを決定することを含む、実施形態５〜８のいずれか１つの方法。
【０１２７】
実施形態１０：複数の候補アプタマーのアイデンティティーを決定することが、複数の候補アプタマーをシーケンシングすることを含む、実施形態９の方法。
【０１２８】
実施形態１１：シーケンシングすることが、複数の候補アプタマーを同時並行的にシーケンシングすることを含む、実施形態１０の方法。
【０１２９】
実施形態１２：次世代シーケンシングプロセスを使用して同時並行的にシーケンシングすることを実施する、実施形態１１の方法。
【０１３０】
実施形態１３：ＨＣＰのアイデンティティーを決定することにより、特定のアプタマーにより結合されると推測されるＨＣＰの存在または不存在を確認することを含む、実施形態５〜１２のいずれか１つの方法。
【０１３１】
実施形態１４：ＨＣＰ混合物についての複数の候補アプタマーの結合親和性を決定することを含み：候補アプタマーを固体担体に固定すること；固体担体に結合している候補アプタマーをＨＣＰ混合物と接触させること；および固体担体に結合している候補アプタマーに対するＨＣＰ混合物中のＨＣＰの結合親和性を決定すること；またはＨＣＰ混合物からのＨＣＰを固体担体に固定すること；候補アプタマーを固体担体に結合しているＨＣＰと接触させること；およびＨＣＰ混合物中のＨＣＰに対する候補アプタマーの結合親和性を決定することを含む、実施形態５〜１２のいずれか１つの方法。
【０１３２】
実施形態１５：候補アプタマーをディスプレイするアレイを提供することを含む、実施形態１４の方法。
【０１３３】
実施形態１６：候補アプタマーをディスプレイするアレイを使用してＨＣＰ混合物中のＨＣＰに対する候補アプタマーの結合親和性を同時並行的に決定することを含む、実施形態１５の方法。
【０１３４】
実施形態１７：ＨＣＰ混合物が、未知のアイデンティティーの複数のＨＣＰを含む、実施形態５〜１６のいずれか１つの方法。
【０１３５】
実施形態１８：ＨＣＰ混合物が、未知量の複数のＨＣＰを含む、実施形態５〜１７のいずれか１つの方法。
【０１３６】
実施形態１９：ＨＣＰ混合物が、異なる量の複数のＨＣＰを含む、実施形態５〜１８のいずれか１つの方法。
【０１３７】
実施形態２０：潜在的アプタマーのライブラリーが、少なくとも約１０、少なくとも約１０2、少なくとも約１０3、少なくとも約１０4、少なくとも約１０5、少なくとも約１０6、少なくとも約１０7、少なくとも約１０8、少なくとも約１０9、少なくとも約１０10、または少なくとも約６×１０14のアプタマーを含む、実施形態５〜１９のいずれか１つの方法。
【０１３８】
実施形態２１：潜在的アプタマーのライブラリーから複数の候補アプタマーを選択することが、潜在的アプタマーのライブラリーを固体担体上でディスプレイすることを含む、実施形態５〜２０のいずれか１つの方法。
【０１３９】
実施形態２２：固体担体のそれぞれのユニットが、同一アプタマーの複数コピーをディスプレイする、実施形態２１の方法。
【０１４０】
実施形態２３：固体担体およびアプタマーが、アプタマー粒子を形成する、実施形態２１または２２のいずれか１つの方法。
【０１４１】
実施形態２４：ＨＣＰ混合物中のＨＣＰの１つのみに特異的に結合する能力を有するアプタマーを含むアプタマー粒子を単離することを含む、実施形態２３の方法。
【０１４２】
実施形態２５：蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）を使用してＨＣＰ混合物中のＨＣＰの１つに結合する能力を有するアプタマー粒子を単離する、実施形態２３または２４のいずれか１つの方法。
【０１４３】
実施形態２６：潜在的アプタマーのライブラリーから複数の候補アプタマーを選択することが、マイクロ流体選択を含む、実施形態２１〜２５のいずれか１つの方法。
【０１４４】
実施形態２７：固体担体に結合しているＨＣＰを使用して潜在的アプタマーのライブラリーから候補アプタマーを選択する、実施形態５〜２６のいずれか１つの方法。
【０１４５】
実施形態２８：固体担体が、ビーズである、実施形態２７の方法。
【０１４６】
実施形態２９：ビーズが、磁気ビーズである、実施形態２８の方法。
【０１４７】
実施形態３０：固体担体に結合しているＨＣＰを、マイクロ磁気分離デバイス中で捕捉する、実施形態２９の方法。
【０１４８】
実施形態３１：潜在的アプタマーのライブラリーからの複数の選択ラウンドを実施して複数の候補アプタマーを選択する、実施形態５〜３０のいずれか１つの方法。
【０１４９】
実施形態３２：複数の選択ラウンドにおける選択条件が異なる、実施形態３１の方法。
【０１５０】
実施形態３３：複数の選択ラウンドにおける選択条件が同一である、実施形態３１の方法。
【０１５１】
実施形態３４：アプタマーの最終プール中のアプタマーのみをシーケンシングする、実施形態３１〜３３のいずれか１つの方法。
【０１５２】
実施形態３５：複数の候補アプタマーのラウンドにおけるアプタマーをシーケンシングする、実施形態３１〜３３のいずれか１つの方法。
【０１５３】
実施形態３６：シーケンシング後の追加の区別ステップが、アプタマーの最終プールを同定する、実施形態１０〜３５のいずれか１つの方法。
【０１５４】
実施形態３７：追加の区別ステップが、エンリッチメント倍率分析、リピートモチーフ分析、およびコピー数分析の少なくとも１つを含む、実施形態３６の方法。
【０１５５】
実施形態３８：アレイに結合している候補アプタマーの結合親和性を、ＨＣＰ標的に対する少なくとも約１０の候補アプタマーについて決定する、実施形態１５〜３７のいずれか１つの方法。
【０１５６】
実施形態３９：アレイに結合している候補アプタマーを使用して特異的ＨＣＰ標的に対する少なくとも約１０、少なくとも約１００、約１５０、約２００、約２５０、約３００、約２５０、約３００、約５００、約１０００、約２０００、約５０００、約１０，０００、約２０，０００、約５０，０００または約１００，０００の候補アプタマーについての結合親和性を決定する、実施形態３８の方法。
【０１５７】
実施形態４０：リンカーを使用して候補アプタマーを固体担体に付着させる、実施形態１４〜３９のいずれか１つの方法。
【０１５８】
実施形態４１：標的ＨＣＰに対する候補アプタマーについての結合親和性を、ＫDまたはＫAの計測により決定する、実施形態１４〜４０のいずれか１つの方法。
【０１５９】
実施形態４２：少なくとも１つの候補アプタマーが、少なくとも約２μＭのＫDでＨＣＰに特異的に結合する、実施形態４１の方法。
【０１６０】
実施形態４３：標的ＨＣＰに特異的に結合する少なくとも約１０、約２０、約２００、約３００、約４００、約５００、約６００、約７００、約８００、約９００、約１０００、または約６×１０14のアプタマーを生成する、実施形態５〜４２のいずれか１つの方法。
【０１６１】
実施形態４４：アプタマーを使用して組換えタンパク質調製物中のＨＣＰの存在を決定する、実施形態５〜４３のいずれか１つの方法。
【０１６２】
実施形態４５：アプタマーを使用して組換えタンパク質調製物中のＨＣＰのアイデンティティーを決定する、実施形態５〜４３のいずれか１つの方法。
【０１６３】
実施形態４６：アプタマーを使用して組換えタンパク質調製物中のＨＣＰの量を決定する、実施形態５〜４３のいずれか１つの方法。
【０１６４】
実施形態４７：組換えタンパク質調製物中の少なくとも１つのＨＣＰのアイデンティティーを決定する方法であって、実施形態５〜４３のいずれか１つの方法により調製された少なくとも１つのアプタマーを提供すること；少なくとも１つのアプタマーを組換えタンパク質調製物と接触させること；および組換えタンパク質調製物中の少なくとも１つのＨＣＰのアイデンティティーを決定することを含む方法。
【０１６５】
実施形態４８：複数のアプタマーを用いる、実施形態４７の方法。
【０１６６】
実施形態４９：少なくとも１つのＨＣＰのアイデンティティーを、ＨＣＰに結合するアプタマーにより決定する、実施形態４７または４８のいずれか１つの方法。
【０１６７】
実施形態５０：組換えタンパク質調製物中のＨＣＰの存在または不存在を検出する方法であって、少なくとも１つのアプタマーを提供すること；および少なくとも１つのアプタマーが組換えタンパク質調製物中のＨＣＰに特異的に結合するか否かを決定することを含む方法。
【０１６８】
実施形態５１：少なくとも１つのアプタマーを、実施形態５〜４６のいずれか１つの方法により調製する、実施形態５０の方法。
【０１６９】
実施形態５２：複数のアプタマーを用いる、実施形態５０または５１の方法。
【０１７０】
実施形態５３：組換えタンパク質調製物からＨＣＰを除去する方法であって、アプタマーのプールを提供すること；組換えタンパク質調製物をアプタマーのプールに曝露すること；アプタマーのプールをＨＣＰに結合させてＨＣＰ：アプタマー複合体を形成すること；および組換えタンパク質調製物からＨＣＰ：アプタマー複合体を分離することを含む方法。
【０１７１】
実施形態５４：アプタマーのプールが、アプタマーの最終プールである、実施形態５３の方法。
【０１７２】
実施形態５５：アプタマーのプールが、配列番号７４から配列番号３９８に記載のヌクレオチド配列を有するアプタマーを含む、実施形態５３の方法。
【０１７３】
実施形態５６：アプタマーのプールを、実施形態５〜４６のいずれか１つの方法により調製する、実施形態５３〜５５のいずれか１つの方法。
【０１７４】
実施形態５７：アプタマーのプールを、固体担体に固定する、実施形態５３〜５６のいずれか１つの方法。
【０１７５】
実施形態５８：固体担体が、プレート、クロマトグラフィー樹脂、またはビーズである、実施形態５７の方法。
【０１７６】
実施形態５９：ビーズが、磁気ビーズである、実施形態５８の方法。
【０１７７】
実施形態６０：アプタマーのプール中のアプタマーを、固体担体にそれぞれ個々に固定する、実施形態５７〜５９のいずれか１つの方法。
【０１７８】
実施形態６１：アプタマーのプール中のアプタマーを、固体担体に混合物としてアプライする、実施形態５７〜５９のいずれか１つの方法。
【０１７９】
目下、本発明の例示的実施形態が詳細に参照され、その実施例は、添付の図面において説明される。他の実施形態は、本明細書の留意事項および本明細書に開示の実施から当業者に明らかである。実施形態は、以下の実施例においてさらに説明される。これらの実施例は、特許請求の範囲を限定するものではないが、ある実施形態を明確にするように機能するにすぎない。本明細書および実施例を例示としてのみみなすことが意図され、真の範囲および趣旨は以下の特許請求の範囲により示される。
【実施例】
【０１８０】
実施例１
アプローチの概要
潜在的アプタマーのライブラリーから複数の候補アプタマーを、ＨＣＰ混合物中の単一ＨＣＰに結合するそれらの能力について選択すること；候補アプタマーを同時並行的にシーケンシングすること；およびＨＣＰ混合物中の標的ＨＣＰに対する候補アプタマーの相対結合親和性を同時並行的に決定して候補アプタマーを選択することを含む同時並行的アプタマー生成ワークフローを利用した。アプタマーが結合するＨＣＰのアイデンティティーは、個々のアプタマーをビーズ上で結合させてアプタマー粒子を調製すること、およびＨＣＰ混合物の存在下でアプタマー粒子を適切な時間量インキュベートすることにより同定することができる。ＨＣＰに結合しなかったアプタマー粒子を洗浄除去した後、結合したアプタマー粒子を溶出させ、ＨＣＰを質量分析により同定する。
【０１８１】
アプタマー選択法としてマイクロフルイディクスを使用して磁気ビーズに付着しているＨＣＰ標的に対する高い親和性を有するアプタマーを迅速に単離することができる。標的コーティングビーズを、潜在的アプタマープールを含むランダム化配列からなるｓｓＤＮＡライブラリーとインキュベートする。アプタマーの一部がＨＣＰに特異的に結合し、マイクロ流体デバイスを使用して磁気ビーズを捕捉し、ＨＣＰに結合していないいかなるアプタマーも効率的に洗浄する。ＨＣＰに結合しているアプタマーを担持する磁気ビーズをマイクロ流体デバイスから溶出させる。最終結果は、候補アプタマーのプールである。
【０１８２】
粒子ディスプレイ選択は、粒子ディスプレイ（ＰＤ）、エマルジョンＰＣＲ、および蛍光ベース粒子ソーティングを活用して潜在的アプタマーライブラリーから特異的ＨＣＰについての高い親和性を有するアプタマーを単離する強力なアプタマー選択法である。粒子ディスプレイ選択の１つの利点は、ＰＤの能力にある：それぞれのビーズ（粒子）を、１つの特異的配列のアプタマーの複数コピーによりコーティングし、アプタマー同定を簡易化する（例えば、ＤＮＡシーケンシングを介する）。
【０１８３】
実施例２
複数の候補アプタマーの選択
マイクロフルイディクスを使用することにより、ＨＣＰに特異的に結合した候補アプタマーのプールを単離してＨＣＰに結合するアプタマーについて潜在的アプタマーライブラリーをエンリッチした。単一のアプタマーエンリッチメントラウンドを粒子ディスプレイスクリーニング開始前に実施してアプタマー粒子の開始プールの多様性をＦＡＣＳによりソーティングすることができるアプタマー粒子の数に減少させた。このエンリッチメントを実施するため、最初に、ＨＣＰ混合物をＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）活性化ビーズ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）に共有結合によりコンジュゲートさせた。ビーズへのＨＣＰの良好なコンジュゲーションは、ＮａｎｏＯｒａｎｇｅ（登録商標）タンパク質定量キット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（登録商標），Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を使用して確認した。潜在的アプタマーを変性させ、ＨＣＰコーティングビーズと混合し、未結合アプタマーを洗浄除去した後、ＨＣＰコーティングビーズを５０μＬの水中で９５℃において５分間加熱することにより結合アプタマーをＨＣＰから溶出させた。このマイクロフルイディクス抗ＨＣＰアプタマープールを粒子ディスプレイのための開始点として使用した。
【０１８４】
Ａ）ＣＨＯ  ＨＣＰ
５０Ｌスケールにおいて標準的なバイオリアクター条件を使用してヌルＣＨＯ宿主細胞系を増殖させ、連続遠心分離によりハーベストした。得られたハーベストをＰＢＳ中に透析濾過し、アリコート化し、必要となるまで−８０℃において貯蔵した。この細胞ハーベストからＨＣＰ混合物を調製した。
【０１８５】
Ｂ）マイクロフルイディクススクリーニングにおいて使用すべきＨＣＰコーティングビーズ
Ｐｉｅｒｃｅ  ＮＨＳ活性化磁気ビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号８８８２６；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）についての説明書に従って、いくつか修正してＨＣＰ結合ビーズを調製した。手短に述べると、ビーズ結合能よりも３倍過剰のＨＣＰを使用して１ｍｇのビーズ当たり１５０μｇのＨＣＰの最終濃度を得た。ビーズを氷冷１ｍＭのＨＣｌにより１回洗浄し、ＰＢＳ中でＨＣＰと合わせ、エンドオーバーエンド回転させながら４℃において４時間インキュベートした。ビーズを０．１Ｍのグリシンにより２回洗浄し、３Ｍのエタノールアミンと室温において２時間インキュベートし、ｎａｎｏｐｕｒｅＨ2Ｏにより１回洗浄した。貯蔵緩衝液（０．０１％のＴｗｅｅｎ−２０を有する１０ｍＭのＴｒｉｓ）中で３回洗浄後、ビーズを貯蔵緩衝液中で１０ｍｇ／ｍＬの元の濃度に再構成させ、４℃において貯蔵した。
【０１８６】
Ｃ）単一のアプタマーエンリッチメントラウンド
単一のアプタマーエンリッチメントラウンドを以下のとおり進行させた。１ｎモル（６×１０14）のｓｓＤＮＡライブラリーを９５℃に５分間加熱し、４℃に５分間冷却し、次いで室温において５分間インキュベートした。このｓｓＤＮＡライブラリーを、磁気ビーズに結合している３μＭの最終濃度のＨＣＰタンパク質と２時間インキュベートしてアプタマーをそれらのタンパク質標的に結合させた。２時間後、ビーズをＰＢＳＭＣＴ緩衝液（１×リン酸緩衝生理食塩水、１．５ｍＭのＭｇＣｌ2、および１ｍＭのＣａＣｌ2、０．０１％のＴｗｅｅｎ２０）（Ｈｙｃｌｏｎｅ；Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）中で３回洗浄した。ビーズを５０μＬの水中で９５℃において５分間加熱することにより、ｓｓＤＮＡ（アプタマー）をタンパク質標的から溶出させた。ここで得られたアプタマーを次のラウンドの調製においてＰＣＲにより増幅させた。
【０１８７】
実施例３
複数の候補アプタマーの選択
粒子ディスプレイを使用して特異的ＨＣＰに結合した特異的アプタマーについて選択した。統計的に、１ビーズ当たり単一配列の１つのみのアプタマーが結合するように、マイクロフルイディクス抗ＨＣＰ候補アプタマープールをビーズと混合した。目的は、ビーズの２０％のみをアプタマーによりコーティングさせることである。コーティングされるビーズの割合がこれより高くなり始めるにつれ、ビーズはそれぞれの液滴中で２つ以上の配列を有し始める。エマルジョンＰＣＲを使用して１ビーズ当たりのアプタマーの数を拡張した。合計で、約１０7のアプタマーコーティングビーズが存在し、それぞれのビーズが単一配列の複数のアプタマーにより均一にコーティングされた。これらのアプタマーコーティングビーズを、非特異的結合を低減させるために添加するサケ精子ＤＮＡの存在下で２０ｎＭのＡｌｅｘａ−６４７標識ＨＣＰとインキュベートし、次いでＦＡＣＳによりソーティングした。多量の結合Ａｌｅｘａ−６４７シグナルを有するビーズを回収し、次いでハイスループットＤＮＡシーケンシングに供した。
【０１８８】
具体的には、ビーズからのｓｓＤＮＡアプタマーの溶出後、ＤＮＡを増幅させ、精製し（Ｑｉａｇｅｎ）、プライマーを有さないｄｓＤＮＡを生じさせた。次いで、このｄｓＤＮＡを使用して１μｍ直径のフォワードプライマーコーティングビーズを用いてエマルジョンＰＣＲを実施してモノクローナルアプタマー候補粒子を産生した。種々の濃度のビオチン化ＨＣＰ（ｂＨＣＰ）を用いるフローサイトメトリーベース結合アッセイを、モノクローナルアプタマー粒子を用いて実施してソーティングに適切な条件を決定した。好適な条件を決定したら、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）装置を使用してアプタマー含有粒子をソーティングした。
【０１８９】
Ａ）粒子ディスプレイにおいて使用されるアプタマーコーティング粒子
アプタマー粒子は、エマルジョンＰＣＲ［Ｄｒｅｓｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  Ｓｉｎｇｌｅ  ＤＮＡ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  Ｉｎｔｏ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｅｎｕｍｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  １００（１５）８８１７−８８２２（２００３）］を介して生成した。ＤＮＡ伸長は、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ＭｙＯｎｅ（商標）カルボン酸磁気粒子（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号６５０１１）のアミン修飾ｓｓＤＮＡによるコーティングのためのプロトコルに従って合成されたフォワードプライマービーズに対して実施した。手短に述べると、５００μＬの１μｍのＭｙＯｎｅ（商標）カルボン酸磁気粒子（１０7／μＬ；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を５００μＬの０．００１ＮのＮａＯＨにより１回洗浄し、１ｍＬのヌクレアーゼフリー水により３回洗浄し、次いで２００ｍＭのＮａＣｌ、０．２ｍＭの５’−アミノ修飾ＦＰ（５’−アミノ−ＰＥＧ１８−ＡＧＣＡＧＣＡＣＡＧＡＧＧＴＣＡＧＡＴＧ−３’）、１ｍＭの塩化イミダゾール、５０％ｖ／ｖのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、および２５０ｍＭの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を含有する１５０μＬの反応混合物中で再懸濁させた。アミノ基修飾は、共有結合を可能とし、熱サイクリングの間の粒子へのＦＰの付着を保持し、ＰＥＧ１８および５’末端がスペーサーとして機能する。粒子を試薬と十分に混合し、ボルテックスに供し、超音波処理し、室温においてローテーター上で一晩インキュベートした。フォワードプライマー（ＦＰ）を結合させた後、ビーズ表面をＰＥＧ１２分子により表面処理して標的ＨＣＰの非特異的結合を防止した。粒子上の残留カルボキシル基を、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ４．７；Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）中２５０ｍＭのＥＤＣおよび１００ｍＭのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）の存在下でアミノ反応性ＮＨＳエステルに室温において３０分間変換し、次いで２０ｍＭのアミノ−ＰＥＧ１２（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）とＭＥＳ緩衝液中で１時間コンジュゲートさせた。粒子を５００μＬのＴＥ緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０、０．１ｍＭのＥＤＴＡ）により４回洗浄し、５００μＬのＴＥ緩衝液中で懸濁させ、４℃において貯蔵した。
【０１９０】
エマルジョンＰＣＲは、１×ＧｏＴａｑ（登録商標）ＰＣＲマスターミックス（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、２５ｍＭのＭｇＣｌ2、３．５ｍＭのそれぞれのｄＮＴＰ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、４０ｎＭのＦＰ、３μＭのリバースプライマー（ＲＰ）、０．２５Ｕ／μＬのＧｏＴａｑ（登録商標）ホットスタートポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、１ｐＭのテンプレートＤＮＡ、および３×１０8のＦＰコーティング粒子の総容量１ｍＬの水相；ならびに鉱油中４．５％のＳｐａｎ  ８０、０．４０％のＴｗｅｅｎ  ８０および０．０５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（全てＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入）の油相（毎日新たに調製）を用いて調製した。油中水型エマルジョンは、Ｕｌｔｒａ−Ｔｕｒｒａｘ（登録商標）デバイス（ＩＫＡ；Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）中に固定されたＤＴ−２０チューブ（ＩＫＡ）中で１ｍＬの水相を７ｍＬの油相に添加することにより調製した。この添加は、３０分間にわたり滴加して実施した一方、混合物をＵｌｔｒａ−Ｔｕｒｒａｘ（登録商標）中で９００ｒｐｍにおいて撹拌した。水相を添加した後、内容物を５分間混合した。エマルジョンを１００μＬのアリコートで、９６ウェルＰＣＲプレートの約８０ウェル中に分配した。ＰＣＲの４０サイクル後、エマルジョンを３０×ｇにおける２分間の遠心分離によりエマルジョン回収トレイ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に回収した。１０ｍＬの２−ブタノールをトレイに添加し、回収された試料を５０ｍＬのチューブに移すことにより、エマルジョンを破壊した。３０秒間ボルテックスに供した後、粒子を遠心分離により３，５００×ｇにおいて５分間ペレット化した。油相を慎重に除去した後、粒子を６００μＬのエマルジョン破壊（ＥＢ）緩衝液（１００ｍＭのＮａＣｌ、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、および１ｍＭのＥＤＴＡ）中で再懸濁させ、次いで新たな１．５ｍＬのチューブに移した。ボルテックスに３０秒間供し、１５，０００×ｇにおいて９０秒間遠心分離した後、上清を除去した。磁気分離を使用して粒子をＴＥ  ｐＨ８．０緩衝液により３回洗浄し、次いで３００μＬのＴＥ中で再懸濁させた。
【０１９１】
Ｂ）陰性対照
２つの陰性対照試料を使用してＦＡＣＳベースソーティングのためのゲートの確立を支援した。アプタマーコーティング粒子をｂＨＣＰなしでインキュベートし、洗浄し、次いで、３７μＭの原液濃度からの１：５００の希釈においてストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７コンジュゲート（ＳＡ−６４７）とインキュベートしてアプタマーが実験において使用された蛍光標識についての親和性を有したか否かを決定した。第２の陰性対照実験をフォワードプライマーコーティングビーズおよびソーティングに使用される標的濃度におけるｂＨＣＰを用いて実施した。インキュベーションおよび洗浄後、ビーズをＳＡ−６４７と再度インキュベートした。この対照を使用して本発明者らのフォワードプライマーが標的ｂＨＣＰに結合している程度を決定した。
【０１９２】
陰性対照実験に基づきゲートを設定した後、ビーズ上のマイクロフルイディクス抗ＨＣＰアプタマープールを、２０ｎＭの濃度におけるｂＨＣＰと１．５時間インキュベートした。ビーズをＰＢＳＭＣＴ緩衝液により１回洗浄した。この洗浄ステップ後、ビーズをＳＡ−６４７と１５分間インキュベートした。ＳＡ−６４７インキュベーション後、ビーズを再度洗浄し、ＰＢＳＭＣＴ緩衝液中に戻した。ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ  ＩＩ装置（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）を使用して、バックグラウンドレベルよりも顕著に高い蛍光を有する粒子を回収チューブ中にソーティングした。粒子を約２０００イベント／秒の速度において合計３時間ソーティングした。ソーティング後、粒子をパイロットＰＣＲ反応により直接増幅させて回収された全ての粒子の増幅に最適なサイクル数を決定した。このフルスケール増幅から得られたｄｓＤＮＡ産物は、Ｑｉａｇｅｎ  ＭｉｎＥｌｕｔｅキット（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＭＤ）を使用して精製した。
【０１９３】
図１は、抗ＨＣＰアプタマープールの初回ＵｎｉＱ−ＰＡＳＳ生成についてのＦＡＣＳプロットを提供し、実験において使用された１μｍの粒子についてのＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７面積蛍光強度に対する側方散乱面積を示す。データは、２０ｎＭのビオチン化ＨＣＰとインキュベートされ、次いでＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７標識されたアプタマーコーティング粒子の結果を示す。ＦＡＣＳゲートＰ６中の粒子を回収し、それは評価された集団全体の約１．１％を表した。対照的に、ＨＣＰを使用せず、フォワードプライマーコーティングビーズと２０ｎＭのｂＨＣＰを使用する陰性対照実験は、高蛍光Ｐ６ゲートにおいて全てのイベントの０．０％および０．２％をそれぞれ示した。
【０１９４】
実施例４
複数の候補アプタマーの同時並行シーケンシング
候補アプタマーをＩｌｌｕｍｉｎａのＴｒｕＳｅｑ  ＣｈＩＰ試料調製キット（ＩＰ−２０２−１０１２；Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）によりインデックス化した。試料をＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｑｕｂｉｔ（登録商標）フローサイトメーター（Ｑ３２８５７）により定量し、１レーン当たり１３のインデックス化されたＴｒｕＳｅｑ試料を用いてＩｌｌｕｍｉｎａのＨｉＳｅｑ  ２５００上でシーケンシングした。８つのＴｒｕＳｅｑ  ＲＮＡ−Ｓｅｑ調製試料を単に５つのＤＮＡアプタマー試料と同一のプール中に添加してランにおける全多様性を増加させた。これらのプール試料を単一リード９０ｂｐラピッドランの両方のレーン上でランした。
【０１９５】
ハイスループットシーケンシングを実施し、それぞれのプールについて約７００万リードを生成した。７００万リードのうち、約１００万のリードがユニーク配列であり、全てのユニーク配列の１０％が１０コピー以上で存在した。
【０１９６】
実施例５
マイクロアレイの調製およびＨＣＰ調製物に対する候補アプタマーの結合親和性の決定
インサイチュー合成を使用してクローニングおよびサンガーシーケンシングから得られた配列をマイクロアレイ中に置いた。約１５，０００の配列（対照配列を含む）を既知の位置において単一スライド上で合成した。スライド上でフルオロフォア標識ＨＣＰ（ｂＨＣＰ）を用いて結合アッセイを実施した。スライドをＰＢＳＭＣＴ緩衝液中で０．５％のアセチル化ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）により３．５時間ブロッキングし、次いで洗浄した。５０ｎＭのｂＨＣＰおよび０．１μｇ／μＬのサケ精子ＤＮＡを含有するＰＢＳＭＣＴ緩衝液とスライドを室温において３時間インキュベートし、再度洗浄した。次いで、スライドを、１５ｎＭの濃度におけるストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７フルオロフォアコンジュゲート１５分間標識した。ＰＢＳＭＣＴ緩衝液によるスライドの洗浄後、スライド全体をＧｅｎｅＰｉｘ（登録商標）４４００Ｂマイクロアレイスキャナー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ；Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）によりスキャンした。高い蛍光強度を有するフィーチャーは、アプタマーへのＨＣＰ（標的タンパク質）の結合を示した。それぞれのアプタマー配列をアレイ上で５回提示させて（それぞれのアプタマーを５つのフィーチャーにより提示させた）結合イベントが有意であることを確認した。
【０１９７】
個々のアプタマーへのＨＣＰの特異的結合を決定するため、５回の粒子ディスプレイラウンドから生成された６８の抗ＨＣＰアプタマーをシーケンシングし、アレイ上でスポットした。これらの６８のアプタマーのヌクレオチド配列を、以下の表１の配列番号５から配列番号７３に記載する。５０ヌクレオチドアプタマーを、それぞれマイクロアレイスライド上で５回インサイチュー合成した。同一スライドの異なる区画上で、５０００のランダムの、５０ヌクレオチドｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドをスライド上でインサイチュー合成した。スライドを、０．１μｇ／μＬのサケ精子ＤＮＡを有する緩衝液中で５０ｎＭのｂＨＣＰと３時間インキュベートした。１５ｎＭの濃度におけるストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７フルオロフォアコンジュゲートにより１５分間標識した後、スライドをＰＢＳにより３回洗浄し、スライドをイメージングした。図２において把握されるとおり、タンパク質結合は、候補アプタマーを含有するスポットにおいて明らかであり（図２Ａ、白線境界内）、結合はランダムｓｓＤＮＡを含むスポットにおいて明らかでなかった（図２Ｂ）。
【０１９８】
スライド上でスポットの全ての蛍光強度を定量した。個々のアプタマーの蛍光強度を平均化し、バックグラウンド蛍光を減算し、得られた蛍光強度を棒グラフとしてプロットし、図３に示した。この図は、アプタマーのいくつかが高い蛍光強度シグナルを生成したことを示し、ＨＣＰに結合するそれらの能力を反映する。
【０１９９】
実施例６
親和性沈殿を使用する個々のアプタマーにより結合されるＨＣＰの同定
図３において陽性蛍光強度をディスプレイするアプタマーにより結合される特異的ＨＣＰは、親和性沈殿を使用して決定した。アプタマー親和性沈殿は、以下の表１に列記される異なる配列を有する４３のアプタマーについて実施した。個々の５０ヌクレオチド（５０ｍｅｒ）アプタマーおよび５０ｍｅｒランダムオリゴヌクレオチドライブラリーをＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）により３’ビオチンおよび１８ｍｅｒ内部スペーサーを用いて合成した。
【０２００】
３’−ビオチン修飾ランダムオリゴヌクレオチドライブラリーは、親和性沈殿反応のための陰性対照として機能する。アプタマーおよびオリゴヌクレオチドは、製造業者から凍結乾燥で供給される。したがって、それぞれの３’−ビオチンアプタマーまたは３’−ビオチンランダムオリゴヌクレオチドを使用前にＵｌｔｒａＰｕｒｅ水中２．５μＭの最終濃度に溶解させた。
【０２０１】
１×結合および洗浄（ＢＷ）緩衝液（５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ７．４］、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、１ＭのＮａＣｌ、０．００５％のＴｗｅｅｎ−２０）を使用してストレプトアビジンコーティングビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ＭｙＯｎｅ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｃ１；Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによるＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）を洗浄した。次いで、ストレプトアビジンビーズを、３’−ビオチンアプタマーまたは３’−ビオチンランダムオリゴヌクレオチドとのコンジュゲーション前に２×ＢＷ緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ７．４］、１ｍＭのＥＤＴＡ、２ＭのＮａＣｌ、０．０１％のＴｗｅｅｎ−２０）中で製造業者の説明書に従って再懸濁させた。等量のビーズおよび３’−ビオチンアプタマーまたは３’−ビオチンランダムオリゴヌクレオチド溶液をエンドオーバーエンド回転させながら室温において１５分間インキュベートした。インキュベーション後、ビーズを１ｍＬの１×ＢＷ緩衝液により２回洗浄し、０．１ｍｇ／ｍＬのサケ精子ＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有するＰＢＳＭＣＴ（リン酸緩衝生理食塩水［ｐＨ７．４］、２．５ｍＭの塩化マグネシウム、１ｍＭの塩化カルシウム、０．０１％のＴｗｅｅｎ−２０）により１回洗浄した。
【０２０２】
親和性沈殿反応のため、１ｍｇの３’−ビオチンアプタマーまたは３’−ビオチンオリゴヌクレオチドコーティングストレプトアビジンビーズを、０．５ｍｇのＨＣＰおよび１ｍｇのサケ精子ＤＮＡと、総容量１０ｍＬのＰＢＳＭＣＴ中でインキュベートした。混合物を、エンドオーバーエンド回転させながら室温において３〜５時間インキュベートした。インキュベーション後、上清溶液を除去し、３’−ビオチンアプタマーまたは３’−ビオチンオリゴヌクレオチドライブラリーによりコーティングされたストレプトアビジンビーズを、０．１ｍｇ／ｍＬのサケ精子ＤＮＡを含有する１ｍＬのＰＢＳＭＣＴにより２回洗浄し、次いでＰＢＳＭＣＴにより１回洗浄した。結合ＨＣＰを３’−ビオチンアプタマーまたは３’−ビオチンオリゴヌクレオチドコーティングストレプトアビジンビーズから４５μＬの溶出緩衝液（１．５×ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）試料緩衝液［Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによるＮｏｖｅｘ］、２０％のグリセロール、５０ｍＭのジチオトレイトール［ＤＴＴ］）中で９７℃において１０分間溶出させた。溶出上清溶液を、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）４−１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｎｏｖｅｘ）上にＭＯＰＳランニング緩衝液（Ｎｏｖｅｘ）を用いてロードし、製造業者の説明書に従って処理した。ゲルをＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｒｕｂｙタンパク質ゲル染色（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により製造業者の説明書に従って染色し、Ｔｙｐｈｏｏｎ  Ｔｒｉｏバリアブルモードイメージャー（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して６１０ｎｍの発光フィルターならびに４８８ｎｍおよび５３２ｎｍの励起波長を使用して分析した。
【０２０３】
２つのアプタマーを使用して親和性沈殿後に得られた結果を示す代表的なｎｕＰＡＧＥ（登録商標）ゲルの画像を、図４に示す。レーン１：示される３０ｋＤａおよび２１ｋＤａのタンパク質バンドを有する分子量マーカー（Ｍａｒｋ１２，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号ＬＣ５６７７）；レーン２：アプタマーＲ５−３１についての親和性沈殿反応からの上清溶液；レーン３：アプタマーＲ５−１５０についての親和性沈殿反応からの上清溶液；レーン４：ランダムオリゴヌクレオチドライブラリーの親和性沈殿反応からの上清溶液。レーン２、３および４において、右側の矢印はストレプトアビジン（ＭＷ＝１７ｋＤａ）に対応するタンパク質バンドを示す。レーン２および３は、レーン４に存在しないタンパク質バンドの存在を示し、特異的および区別されるＨＣＰがアプタマーＲ５−３１およびＲ５−１５０により結合されることを示す。親和性沈殿は、少なくとも７０のアプタマーを用いて実施し、類似の結果であった。
【０２０４】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルからのタンパク質バンドは、ゲル内トリプシン消化とそれに続く液体クロマトグラフィーとそれに続く質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を使用して同定した。ＭＥＳ緩衝液系（上記）を使用して、それぞれの受入試料の半分を１０％のＢｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｎｏｖｅｘミニゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で約１．５ｃｍ分離した。ゲルをクーマシーにより染色し、それぞれのレーンを１０の等サイズのセグメントに切断した。ロボット（ＰｒｏＧｅｓｔ，ＤｉｇｉＬａｂ）を使用して以下のプロトコルでゲル片を処理した。
−２５ｍＭの重炭酸アンモニウムにより洗浄し、次いでアセトニトリルにより洗浄し、
−１０ｍＭのＤＴＴにより６０℃において還元し、次いで５０ｍＭのヨードアセトアミドにより室温においてアルキル化し、
−トリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）により３７℃において４時間消化し、
ギ酸によりクエンチし、上清をさらなる処理なしで直接分析した。
【０２０５】
ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｑ  Ｅｘａｃｔｉｖｅにインターフェース接続しているＷａｔｅｒｓ  ＮａｎｏＡｃｑｕｉｔｙ  ＨＰＬＣシステムを用いるナノＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより、ゲル消化物を分析した。ペプチドを捕捉カラム上でロードし、７５μｍ分析カラム上で３５０ｎＬ／分において溶出させ；両方のカラムにＪｕｐｉｔｅｒ  Ｐｒｏｔｅｏ樹脂（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ；Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）を充填した。質量分析器をデータ依存的モードにおいて操作し、ＭＳおよびＭＳ／ＭＳを、それぞれＯｒｂｉｔｒａｐ中で７０，０００ＦＷＨＭ分解能および１７，５００ＦＷＨＭ分解能において実施した。１５の最も豊富なイオンをＭＳ／ＭＳのために選択した。Ｍａｓｃｏｔのローカルコピーを使用して以下のパラメータを用いてデータをサーチした：酵素：トリプシン；データベース：Ｕｎｉｐｒｏｔ  ＣＨＯ（フォワードおよびリバースとそれに付随する一般的汚染物質）；固定修飾：カルバミドメチル（Ｃ）；可変修飾：酸化（Ｍ）、アセチル（タンパク質Ｎ末端）、ピロ−Ｇｌｕ（Ｎ末端Ｑ）、脱アミド化（ＮＱ）；質量値：モノアイソトピック；ペプチドマストレランス：１０ｐｐｍ；断片マストレランス：０．０２Ｄａ。
【０２０６】
相対存在量の尺度としてスペクトルカウントを質量分析において使用する。アプタマーＲ５−３１およびＲ５−１５０により結合されるＨＣＰのアイデンティティーを表２（下記）に列記する。＞５０のスペクトルカウントを有するＨＣＰのみを含めた。それというのも、それらのＨＣＰが相対的に高い存在量であると確認されたためである。全体として、アプタマーＲ５−３１は２つのＨＣＰに結合した一方、アプタマーＲ５−１５０は８つのＨＣＰに結合した（表２）。ＨＣＰの１０全てについての理論等電点（ｐＩ）値および分子量（ＭＷ）は、広い分布を示し、アプタマーがＨＣＰの特異的タイプ（例えば、高いｐＩを有するＨＣＰのみ；あるＭＷよりも低いＨＣＰのみ）に結合していないことを示す。
【０２０７】
【表１】
2020115873.tif 000003
【０２０８】
実施例７
親和性クロマトグラフィーおよび二次元ゲル電気泳動（２ＤＧＥ）を使用する抗ＨＣＰアプタマーの選択基により結合されるＨＣＰの分布の決定
個々の５０ｍｅｒのアプタマーまたは５０ｍｅｒランダムオリゴヌクレオチドをＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）により３’アミノ末端および１８ｍｅｒ内部スペーサーを用いて合成した。３’−ビオチン修飾ランダムオリゴヌクレオチドライブラリーは、親和性クロマトグラフィー反応のための陰性対照として機能する。約１μｍｏｌ（１５ｍｇ）の２２の３’−アミノ修飾アプタマーのプールまたは３’−アミノ修飾ランダムオリゴヌクレオチドのライブラリーのいずれかを、２ｍＬの結合緩衝液（０．２Ｍの重炭酸ナトリウム、０．５Ｍの塩化ナトリウム、ｐＨ８．３）中で溶解させた。親和性沈殿とそれに続くＳＤＳ−ＰＡＧＥから得られたＨＣＰの相対数および強度に基づき、それらのアプタマーを選択した（図４のレーン２および３において示される結果と類似）。このカラムのために選択されたアプタマーを表１に示す（上記ＸＸＸ）。
【０２０９】
２つの予備充填された１ｍＬのＨｉＴｒａｐ  ＮＨＳ活性化ＨＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（ＧＥ）を、ランダムオリゴヌクレオチドライブラリーまたはプールされたアプタマーのいずれかと製造業者の説明書に従ってコンジュゲートさせた。手短に述べると、カラムのトップキャップを除去し、１滴の１ｍＭの低温ＨＣｌをカラムインレットに添加した。次いで、１ｍＭのＨＣｌを含有するシリンジをカラムインレットに装着した。カラムのボトムキャップを除去し、第２のシリンジをカラムアウトレットに装着した。１ｍｌ／分（１滴／２秒）未満の手作業による流速において、カラムを６ｍＬの１ｍＭのＨＣｌにより洗浄した。ＨＣｌ洗浄直後、リガンド（２２のプールアプタマーまたはライブラリーのいずれか）をカラム上にロードした。約２分後、カラムフロースルーをカラムに戻して樹脂への曝露を最大化した。これを室温において３０分間繰り返した。カラムを以下のパターンに従って緩衝液Ａ（０．５Ｍのエタノールアミン、０．５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．３）および緩衝液Ｂ（０．１Ｍの酢酸ナトリウム、０．５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ４）の２ｍＬアリコートにより交互に洗浄した：３×２ｍＬの緩衝液Ａ、次いで３×２ｍＬの緩衝液Ｂ、次いで３×２ｍＬの緩衝液Ａ、次いで緩衝液Ａによるカラムの約３０分間の平衡化、次いで３×２ｍＬの緩衝液Ｂ、次いで３×２ｍＬの緩衝液Ａ、次いで３×２ｍＬの緩衝液Ｂ。次いで、それぞれのカラムをＰＢＳＭＣＴにより平衡化し、使用まで５℃において貯蔵した。
【０２１０】
クロマトグラフィーをＡＫＴＡ  Ａｖａｎｔ  １２５  ＦＰＬＣ装置上で実施した。カラムをロード前にＰＢＳＭＣＴ＋０．１ｍｇ／ｍＬのサケ精子ＤＮＡにより予備平衡化した。ＨＣＰをＰＢＳＭＣＴ＋サケ精子ＤＮＡ中０．０５ｍｇ／ｍＬに希釈し、４５ｍＬの希釈ＨＣＰ混合物を１ｍＬ／分の流速においてカラム上にロードした。カラムを１０カラム容量（約１０ｍＬ）のＰＢＳＭＣＴ＋サケ精子ＤＮＡにより洗浄した。結合ＨＣＰを５カラム容量（約５ｍＬ）のＰＢＳＭＣＴ＋２ＭのＮａＣｌ中で溶出させ；溶出物を回収し、さらなる試料処理のために保存した。溶出後、次いで、カラムをＰＢＳＭＣＴにより平衡化し、さらなる使用までに貯蔵した。この同一手順を２２のプールアプタマーコンジュゲートカラムおよびランダムオリゴヌクレオチドライブラリーコンジュゲートカラムの両方に対して実施した。
【０２１１】
溶出させた試料を、二次元ゲル電気泳動（２ＤＧＥ）による分析のために調製した。タンパク質試料を２Ｄ細胞溶解緩衝液（３０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．８、７Ｍの尿素、２Ｍのチオ尿素、４％のＣＨＡＰＳ）中に緩衝液交換した。試料をペアで試験し、ペアのそれぞれの試料は異なるＣｙＤｙｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）：ＣｙＤｙｅ−３（Ｃｙ３）またはＣｙＤｙｅ−５（Ｃｙ５）により標識する。それぞれ試料を１．０μＬのいずれかのＣｙＤｙｅと混合し、暗所で氷上で３０分間保持した。１．０μＬの１０ｍＭのリジンをそれぞれの試料に添加し、暗所で氷上で１５分間インキュベートすることにより標識反応を停止させた。次いで、Ｃｙ３およびＣｙ５標識試料を一緒に混合した。２×２Ｄ試料緩衝液（８Ｍの尿素、４％のＣＨＡＰＳ、２０ｍｇ／ｍｌのＤＴＴ、２％のＰｈａｒｍａｌｙｔｅｓ、微量のブロモフェノールブルー）、１００μＬのストリーキング防止溶液および膨潤緩衝液（de-streak solution and Rehydration buffer）（７Ｍの尿素、２Ｍのチオ尿素、４％のＣＨＡＰＳ、２０ｍｇ／ｍｌのＤＴＴ、１％のＰｈａｒｍａｌｙｔｅｓ、微量のブロモフェノールブルー）を、標識ミックスに添加して１３ｃｍの固定化ｐＨ勾配ストリップ（ＩＰＧストリップ）のために２５０μＬの総容量にした。それぞれの試料を十分に混合し、次いで遠心分離してからＩＰＧストリップホルダー中にロードした。
【０２１２】
２ＤＧＥは、最初にタンパク質をそれらのｐｌに基づき分離し、次いで質量により分離することにより機能する。ｐｌによりタンパク質を分離する等電点電気泳動（ＩＥＦ；ｐＨ３〜１０の線形勾配）を、Ｅｔｔａｎ等電点電気泳動（ＩＥＦ）システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で製造業者の説明書（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に従ってランした。ＩＥＦ完了時、ＩＰＧストリップを作製直後の平衡化緩衝液−１（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．８、６Ｍの尿素、３０％のグリセロール、２％のＳＤＳ、１０ｍｇ／ｍＬのＤＴＴ、微量のブロモフェノールブルー）中で穏やかに振盪させながら１５分間インキュベートした。ストリップを作製直後の平衡化緩衝液−２（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．８、６Ｍの尿素、３０％のグリセロール、２％のＳＤＳ、４５ｍｇ／ｍＬのヨードアセトアミド、微量のブロモフェノールブルー）中で穏やかに振盪させながら１０分間リンスした。それぞれのＩＰＧストリップをＳＤＳ−ゲルランニング緩衝液中でリンスしてから、個々の１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル中に移した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを、先頭の色素がゲルの下部から流出するまで１５℃および定電圧においてランした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ直後にＴｙｐｈｏｏｎ  Ｔｒｉｏバリアブルモードイメージャー（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してゲルをスキャンした。次いで、スキャンされた画像をＩｍａｇｅ  Ｑｕａｎｔソフトウェア（バージョン６．０、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により分析した。ＤｅＣｙｄｅｒソフトウェア（バージョン６．５、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）をスポットカウント分析に使用した。
【０２１３】
両方のカラムに合計２．５ｍｇのＨＣＰをロードした場合、２２のプールアプタマーコンジュゲートカラムからの溶出物は、二次元ゲルからＤｅＣｙｄｅｒソフトウェアにより決定して２４３の区別されるタンパク質スポットを含有した一方、ランダムオリゴヌクレオチドライブラリーコンジュゲートカラムからの溶出物は２０の区別されるスポットを含有した。これは、２２のプールアプタマーコンジュゲートカラムが特異的ＨＣＰに結合している一方、ランダムオリゴヌクレオチドライブラリーコンジュゲートカラムが有意なＨＣＰ結合を示さないことを示す。
【０２１４】
実施例８
親和性クロマトグラフィーおよび二次元ゲル電気泳動（２ＤＧＥ）を使用する選択抗ＨＣＰアプタマーのＨＣＰ認識（または「カバレージ」）パーセントの決定
３２４の個々の５０ｍｅｒアプタマーをＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓにより３’アミノ末端および１８ｍｅｒ内部スペーサーを用いて合成した。約１２μｍｏｌの３２４の３’−アミノ修飾アプタマーのプールを２ｍＬの結合緩衝液中で溶解させた。これらの３２４のアプタマーを、６０００の候補アプタマーのマイクロアレイ分析から得られたＨＣＰ結合についての最も強力な相対蛍光強度を有することに基づき選択した（実施例５に記載のものと類似する様式で実施されたマイクロアレイ分析から決定）。このクロマトグラフィー評価について選択されたアプタマーを以下の表１に示し、それらのヌクレオチド配列を配列番号７４〜３９８に記載する。
【０２１５】
予備充填された５ｍＬのＨｉＴｒａｐ  ＮＨＳ活性化ＨＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムを３２４の３’−修飾の抗ＨＣＰアプタマーと、実施例７に記載のものと類似する様式でコンジュゲートさせた。手短に述べると、カラムトップキャップを除去し、１滴の１ｍＭの低温ＨＣｌをカラムインレットに添加した。次いで、１ｍＭのＨＣｌを含有するシリンジをカラムインレットに装着した。カラムのボトムキャップを除去し、第２のシリンジをカラムアウトレットに装着した。５ｍｌ／分未満の手作業による流速において、カラムを３０ｍＬの１ｍＭのＨＣｌにより洗浄した。ＨＣｌ洗浄直後、リガンド（３２４の３’−アミノ修飾アプタマーの等モル混合物）をカラム上にロードした。約２分後、カラムフロースルーをカラムに戻して樹脂への曝露を最大化した。これを室温において３０分間繰り返した。カラムを以下のパターンに従って緩衝液Ａおよび緩衝液Ｂの１０ｍＬアリコートにより交互に洗浄した：３×１０ｍＬの緩衝液Ａ、次いで３×１０ｍＬの緩衝液Ｂ、次いで３×１０ｍＬの緩衝液Ａ、次いで緩衝液Ａによるカラムの約３０分間の平衡化、次いで３×１０ｍＬの緩衝液Ｂ、次いで３×２ｍＬの緩衝液Ａ、次いで３×１０ｍＬの緩衝液Ｂ。次いで、カラムをＰＢＳＭＣＴにより平衡化し、使用まで５℃において貯蔵した。
【０２１６】
クロマトグラフィーをＡＫＴＡ  Ａｖａｎｔ  １２５  ＦＰＬＣ装置上で実施例７に記載のものと類似する様式で実施した。カラムをロード前にＰＢＳＭＣＴ＋０．１ｍｇ／ｍＬのサケ精子ＤＮＡにより予備平衡化した。ＨＣＰをＰＢＳＭＣＴ＋サケ精子ＤＮＡ中で２．５ｍｇ／ｍＬに希釈し、９５ｍＬの希釈ＨＣＰ混合物をカラム上に５ｍＬ／分の流速においてロードした。カラムを５カラム容量（約２５ｍＬ）のＰＢＳＭＣＴ＋サケ精子ＤＮＡにより洗浄した。結合ＨＣＰを５カラム容量（約２５ｍＬ）のＰＢＳＭＣＴ＋２ＭのＮａＣｌで溶出させ；溶出物を回収し、さらなる試料処理のために保存した。溶出後、次いでカラムをＰＢＳＭＣＴにより平衡化し、さらなる使用まで貯蔵した。
【０２１７】
溶出させた試料およびＨＣＰロードの試料（クロマトグラフィー前のＨＣＰ混合物）を２ＤＧＥによる分析のために、実施例７に記載のものと類似する様式で調製した。タンパク質試料を２Ｄ細胞溶解緩衝液中に緩衝液交換した。それぞれの試料を、１．０μＬのＣｙ３またはＣｙ５のいずれかと混合し、暗所で氷上で３０分間保持した。１．０μＬの１０ｍＭのリジンをそれぞれの試料に添加し、暗所で氷上で１５分間インキュベートすることにより標識反応を停止させた。次いで、Ｃｙ３およびＣｙ５標識試料を一緒に混合した。２×２Ｄ試料緩衝液、１００μＬのストリーキング防止溶液および膨潤緩衝液を標識ミックスを添加して１３ｃｍのＩＰＧストリップのために２５０μＬの総容量にした。それぞれの試料を十分に混合し、次いで遠心分離してからＩＰＧストリップホルダー中にロードした。
【０２１８】
ＩＥＦ完了時、ＩＰＧストリップを作製直後の平衡化緩衝液−１中で穏やかに振盪させながら１５分間インキュベートした。ストリップを作製直後の平衡化緩衝液−２中で穏やかに振盪させながら１０分間リンスした。それぞれのＩＰＧストリップをＳＤＳ−ゲルランニング緩衝液中でリンスしてから、個々の１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル中に移した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを、先頭の色素がゲルの下部から流出するまで１５℃および定電圧においてランした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ直後にＴｙｐｈｏｏｎ  Ｔｒｉｏバリアブルモードイメージャーを使用してゲルをスキャンした。次いで、スキャンされた画像をＩｍａｇｅ  Ｑｕａｎｔソフトウェアにより分析した。ＤｅＣｙｄｅｒソフトウェアをスポットカウント分析に使用した。
【０２１９】
３２４のアプタマーコンジュゲートカラムからの溶出物は、合計２５０ｍｇのＨＣＰをロードした場合、２ＤＧＥにより決定して１６２７の区別されるタンパク質スポットを含有した一方、ＨＣＰロード試料（インプット）は、２０５２の区別されるタンパク質スポットを含有した。カバレージパーセント、または３２４のアプタマーコンジュゲートカラムにより結合されるスポットの数は、７９．３％であった。したがって、ＨＣＰに結合する能力について特異的に選択された３２４のアプタマーは、存在する総ＨＣＰの約８０％に結合した。
【０２２０】
上記の本明細書の記載は、当業者が実施形態を実施することができるために十分であるとみなす。上記の詳細な説明および実施例は、ある実施形態を詳述し、本発明者らにより企図される最良の様式を記載する。しかしながら、上記のものが本文中でどんなに詳述されようと、実施形態を多くの手法で実施することができ、特許請求の範囲はそのあらゆる均等物を含むことが認識される。
【０２２１】
【表２】
2020115873.tif 000004
【０２２２】
【表３】
2020115873.tif 000005
【０２２３】
【表４】
2020115873.tif 000006
【０２２４】
【表５】
2020115873.tif 000007
【０２２５】
【表６】
2020115873.tif 000008
【０２２６】
【表７】
2020115873.tif 000009
【０２２７】
【表８】
2020115873.tif 000010
【０２２８】
【表９】
2020115873.tif 000011
【０２２９】
【表１０】
2020115873.tif 000012
【０２３０】
【表１１】
2020115873.tif 000013
【０２３１】
【表１２】
2020115873.tif 000014
【０２３２】
【表１３】
2020115873.tif 000015
【０２３３】
【表１４】
2020115873.tif 000016
【図１】
2020115873.tif 000017
【図２】
2020115873.tif 000018
【図３】
2020115873.tif 000019
【図４】
2020115873.tif 000020
【配列表】
2020115873000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年4月7日(2020.4.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えタンパク質調製物中のＨＣＰアイデンティティーを決定する方法であって、
少なくとも１つのアプタマーを提供すること；
前記少なくとも１つのアプタマーを組換えタンパク質調製物と接触させること；および
前記組換えタンパク質調製物中の少なくとも１つのＨＣＰのアイデンティティーを決定すること
を含む方法。
【請求項２】
組換えタンパク質調製物中のＨＣＰの存在または不存在を検出する方法であって、
アプタマーの混合物を提供すること；および
前記アプタマーのいずれかが前記組換えタンパク質調製物中のＨＣＰに特異的に結合するか否かを決定すること
を含む方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３３】
【表１４】
2020115873.tif 000021
本開示は以下の実施形態を包含する。   
[１]  組換えタンパク質調製物から複数の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）を検出または除去する方法において使用される複数のアプタマーを調製する方法であって、
潜在的アプタマーのライブラリーを提供すること；
複数のＨＣＰを含むＨＣＰ混合物に前記潜在的アプタマーのライブラリーを曝露し、ＨＣＰ標的に結合するそれぞれの候補アプタマーの能力について前記ライブラリーから複数の候補アプタマーを分離することにより、潜在的アプタマーのライブラリーから複数の候補アプタマーを選択すること；および
場合により、複数のＨＣＰ中のＨＣＰにそれぞれ結合する複数の候補アプタマーのアイデンティティー（正体）を決定すること；
を含み、
前記ＨＣＰ混合物中のＨＣＰに特異的に結合する複数の候補アプタマーを同定する方法。   
[２]  前記ＨＣＰ混合物が、ヌル細胞系からのものである、実施形態１に記載の方法。   
[３]  前記候補アプタマーのプールが、アプタマーの最終プールである、実施形態１または２に記載の方法。   
[４]  前記候補アプタマーのプールが、前記アプタマーの最終プールの選択前にさらなる選択を受ける、実施形態１または２に記載の方法。   
[５]  ＨＣＰに結合する複数の候補アプタマーのアイデンティティー（正体）を決定することを含む、実施形態１〜４のいずれかに記載の方法。   
[６]  複数の候補アプタマーの前記アイデンティティーを決定することが、前記複数の候補アプタマーをシーケンシングすることを含む、実施形態５に記載の方法。   
[７]  シーケンシングすることが、前記複数の候補アプタマーを同時並行的にシーケンシングすることを含む、実施形態６に記載の方法。   
[８]  特定のアプタマーにより結合されると推測されるＨＣＰの存在または不存在を確認することを含む、実施形態１〜７のいずれかに記載の方法。   
[９]  前記ＨＣＰ混合物が、未知のアイデンティティーの複数のＨＣＰ、または未知量の複数のＨＣＰ、または異なる量の複数のＨＣＰを含む、実施形態１〜８のいずれかに記載の方法。   
[１０]  前記潜在的アプタマーのライブラリーが、少なくとも約１０、少なくとも約１０2、少なくとも約１０3、少なくとも約１０4、少なくとも約１０5、少なくとも約１０6、少なくとも約１０7、少なくとも約１０8、少なくとも約１０9、少なくとも約１０10、または少なくとも約６×１０14のアプタマーを含む、実施形態１〜９のいずれかに記載の方法。   
[１１]  前記潜在的アプタマーのライブラリーから複数の候補アプタマーを選択することが、潜在的アプタマーのライブラリーを固体担体上でディスプレイすることを含む、実施形態１〜１０のいずれかに記載の方法。   
[１２]  前記固体担体のそれぞれのユニットが、同一のアプタマーの複数コピーをディスプレイする、実施形態１１に記載の方法。   
[１３]  前記固体担体および前記アプタマーが、アプタマー粒子を形成する、実施形態１１または１２に記載の方法。   
[１４]  蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）を使用して前記ＨＣＰ混合物中の前記ＨＣＰの１つに結合する能力を有するアプタマー粒子を単離する、実施形態１３に記載の方法。   
[１５]  前記潜在的アプタマーのライブラリーから複数の候補アプタマーを選択することが、マイクロ流体選択を含む、実施形態１〜１４のいずれかに記載の方法。   
[１６]  標的ＨＰＣに対する前記候補アプタマーについての結合親和性を、ＫDまたはＫAの計測により決定する、実施形態１〜１５のいずれかに記載の方法。   
[１７]  標的ＨＣＰに特異的に結合する少なくとも約１０、約２０、約２００、約３００、約４００、約５００、約６００、約７００、約８００、約９００、約１０００、または約６×１０14のアプタマーを生成する、実施形態１〜１６のいずれかに記載の方法。   
[１８]  組換えタンパク質調製物中のＨＣＰアイデンティティーを決定する方法であって、
少なくとも１つのアプタマーを提供すること；
前記少なくとも１つのアプタマーを組換えタンパク質調製物と接触させること；および
前記組換えタンパク質調製物中の少なくとも１つのＨＣＰのアイデンティティーを決定すること
を含む方法。   
[１９]  組換えタンパク質調製物中のＨＣＰの存在または不存在を検出する方法であって、
アプタマーの混合物を提供すること；および
前記アプタマーのいずれかが前記組換えタンパク質調製物中のＨＣＰに特異的に結合するか否かを決定すること
を含む方法。   
[２０]  組換えタンパク質調製物からＨＣＰを除去する方法であって、
アプタマーのプールを提供すること；
前記組換えタンパク質調製物をアプタマーの最終プールに曝露すること；
前記アプタマーの最終プールをＨＣＰに結合させ、アプタマー：ＨＣＰ複合体を形成すること；および
前記組換えタンパク質調製物から前記アプタマー：ＨＣＰ複合体を分離すること
を含む方法。