(57)【要約】【課題】発光タンパク質を利用して水の硬度を測定する方法の提供。【解決手段】  一態様において、発光タンパク質指示薬に水と発光基質とを接触させること、及び、前記発光タンパク質指示薬の発光シグナルから水の硬度を判定又は算出することを含み、  前記発光タンパク質指示薬は、化学発光タンパク質の部分と、金属イオン結合タンパク質の部分と、蛍光タンパク質の部分とを有し、化学発光タンパク質部分と蛍光タンパク質部分との間に金属イオン結合タンパク質部分が連結されている融合発光タンパク質であり、  前記金属イオン結合タンパク質は、２価の金属陽イオン結合ドメインを有するタンパク質であり、  前記発光基質は、前記化学発光タンパク質の基質である、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
発光タンパク質指示薬を用いて水の硬度を測定する方法であって、
前記発光タンパク質指示薬に水と発光基質とを接触させること、及び、
前記発光タンパク質指示薬の発光シグナルから水の硬度を判定又は算出することを含み、
前記発光タンパク質指示薬は、化学発光タンパク質の部分と、金属イオン結合タンパク質の部分と、蛍光タンパク質の部分とを有し、化学発光タンパク質部分と蛍光タンパク質部分との間に金属イオン結合タンパク質部分が連結されているタンパク質であり、
前記金属イオン結合タンパク質は、２価の金属陽イオン結合ドメインを有するタンパク質であり、
前記発光基質は、前記化学発光タンパク質の基質である、方法。
【請求項２】
前記発光タンパク質指示薬は、金属イオン結合タンパク質部分にカルシウムイオン又はマグネシウムイオンが結合することで化学発光タンパク質部分から前記蛍光タンパク質部分へ共鳴エネルギー移動が可能なように連結されている、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記化学発光タンパク質がルシフェラーゼ、イクオリン、オベリン、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される発光タンパク質である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記基質が、ホタルルシフェリン、バクテリアルルシフェリン、渦鞭毛藻類ルシフェリン、ヴァルグリン、セレンテラジン、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される物質である、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記金属イオン結合タンパク質は、ＥＦハンドモチーフ又はドッケリンモチーフを有するタンパク質である、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
発光タンパク質指示薬及び前記指示薬の発光基質が配置された試薬部と、前記試薬部が形成された基材とを有し、
前記発光タンパク質指示薬は、化学発光タンパク質の部分と、金属イオン結合タンパク質の部分と、蛍光タンパク質の部分とを有し、化学発光タンパク質部分と蛍光タンパク質部分との間に金属イオン結合タンパク質部分が連結されているタンパク質であり、
前記金属イオン結合タンパク質は、２価の金属陽イオン結合ドメインを有するタンパク質であり、
前記発光タンパク質指示薬及び前記発光基質は、前記試薬部に独立して配置されている、水の硬度測定用デバイス。
【請求項７】
請求項６に記載のデバイスに水を供給することで発せられる発光シグナルを、撮像部を備える携帯情報端末で撮像すること、及び、
前記携帯情報端末が備える情報処理手段により、前記撮像部で得られた発光シグナルの撮像データから水の硬度を判定又は算出することを含む、水の硬度の測定方法。
【請求項８】
請求項６に記載のデバイス、該デバイスに水を供給することで発せられる発光シグナルを撮像可能な撮像部を備える携帯情報端末、及び、撮像部で得られた発光シグナルの撮像データから水の硬度を判定又は算出可能なアプリケーションソフトウェアを含む、水の硬度測定システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、水の硬度の測定に関する。一態様において、本開示は、発光タンパク質指示薬を用いる、水の硬度の測定に関する。
【背景技術】
【０００２】
水の硬度は、水に含まれるカルシウムとマグネシウムの濃度から算出される指標である。水の硬度の測定方法として、例えば、ｏ−クレゾールフタレインコンプレクソン、エリオクロムブラックＴ、カルマガイトなどの低分子化合物を発色試薬として利用した比色定量法が知られている（特許文献１及び２）。
【０００３】
ルシフェラーゼ等の発光タンパク質は、ルシフェリンなどの発光基質の反応を触媒することで放射シグナルを生成でき、外部光源から完全に独立して発光できるタンパク質である。近年、最も明るいルシフェラーゼであるＮａｎｏＬｕｃ（Ｎｌｕｃ）が、深海エビのＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼ（Ｏｌｕｃ）を用いた遺伝子工学により開発された。最適な基質であるフリマジン（ｆｕｒｉｍａｚｉｎｅ）も開発された。
さらに、発光タンパク質と蛍光タンパク質とが融合された発光タンパク質も開発された。この融合発光タンパク質では、ドナーである発光タンパク質のエネルギーが、フェルスター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）によりアクセプターである蛍光タンパク質に伝達され発光が生じる。
この融合発光タンパク質の1つ例が、ナノランタンである。Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼとイエロー蛍光タンパク質Ｖｅｎｕｓが結合され、イエローナノランタン（ＹＮＬ）が作り出された。また、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼとオレンジ蛍光タンパク質ＫｕｓａｂｉｒａＯｒａｎｇｅ２が結合され、オレンジナノランタン（ＯＮＬ）が作り出された。
さらに、エンハンストナノランタン（ｅＮＬ）シリーズが開発された。Ｎｌｕｃが、シアン蛍光タンパク質ｍＴｕｒｏｑｕｏｉｓｅ２、グリーン蛍光タンパク質ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ、イエロー蛍光タンパク質Ｖｅｎｕｓ、オレンジ蛍光タンパク質ｍＫＯκ、及びレッド蛍光タンパク質ｔｄＴｏｍａｔｏと結合され、シアンｅＮＬ(ＣｅＮＬ)、グリーンｅＮＬ（ＧｅＮＬ）、イエローｅＮＬ（ＹｅＮＬ）、オレンジイエロー（ＯｅＮＬ）、及びレッドｅＮＬ（ＲｅＮＬ）が、それぞれ、作り出された（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００５−２８３３９２号公報
【特許文献２】特表２００４−５１８１１３号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Suzuki, K et al. Nat Commun. 2016, DOI: 10.1038/ncomms13718
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
生体タンパク質には、カルシウムを結合するタンパク質や、マグネシウムを結合するタンパク質が存在する。しかし、これらのタンパク質を水の硬度の測定に利用する試みは報告されていない。
そこで、本開示は、一態様において、融合発光タンパク質を利用して水の硬度を測定する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本開示は、一態様において、発光タンパク質指示薬を用いて水の硬度を測定する方法であって、
前記発光タンパク質指示薬に水と発光基質とを接触させること、及び、
前記発光タンパク質指示薬の発光シグナルから水の硬度を判定又は算出することを含み、
前記発光タンパク質指示薬は、化学発光タンパク質の部分と、金属イオン結合タンパク質の部分と、蛍光タンパク質の部分とを有し、化学発光タンパク質部分と蛍光タンパク質部分との間に金属イオン結合タンパク質部分が連結されているタンパク質であり、
前記金属イオン結合タンパク質は、２価の金属陽イオン結合ドメインを有するタンパク質であり、
前記発光基質は、前記化学発光タンパク質の基質である、方法に関する。
【０００８】
本開示は、一態様において、発光タンパク質指示薬及び前記指示薬の発光基質が配置された試薬部と、前記試薬部が形成された基材とを有する水の硬度測定用デバイスであって、前記発光タンパク質指示薬及び前記発光基質は、前記試薬部に独立して配置されている、水の硬度測定用デバイスに関する。
【０００９】
本開示は、一態様において、水の硬度測定用デバイスに試料水を供給することで発せられる発光シグナルを、撮像部を備える携帯情報端末で撮像すること、及び、前記携帯情報端末が備える情報処理手段により、前記撮像部で得られた発光シグナルの撮像データから水の硬度を判定又は算出することを含む、水の硬度の測定方法に関する。
【００１０】
本開示は、一態様において、水の硬度測定用デバイス、該デバイスに水を供給することで発せられる発光シグナルを撮像可能な撮像部を備える携帯情報端末、及び、撮像部で得られた発光シグナルの撮像データから水の硬度を判定又は算出可能なアプリケーションソフトウェアを含む、水の硬度測定システムに関する。
【発明の効果】
【００１１】
本開示によれば、一態様において、融合発光タンパク質を利用した水の硬度の測定方法を提供できる。
本開示によれば、その他の態様において、指示薬として１種類の融合発光タンパク質を用いる水の硬度の測定方法を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１Ａ及びＢは、それぞれ、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２及び１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２の存在下（黒線）又は非存在下（灰線）での発光タンパク質指示薬１の発光スペクトルを示す。  図１Ｃ及びＤは、それぞれ発光タンパク質指示薬１に対するカルシウムイオン及びマグネシウムイオンの滴定曲線（ヒルプロット曲線）を示す。
【図２】図２Ａは、発光タンパク質指示薬１に対するｐＨの影響を調べた結果の一例を示し、図２Ｂは、発光タンパク質指示薬１に対する金属イオンの影響を調べた結果の一例を示す。
【図３】図３Ａ及びＢは、ＵＳＧＳ（アメリカ地質調査所）が規定した水硬度（全硬度）の算出方法による硬度の値（Ｓｃａｌｅ）及び分類（Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ）である。図３Ｃは、異なるＣａＣＯ３の濃度に対する相対化学発光強度比の結果であり、図３Ｄは、異なるａＣｌ２もしくはＭｇＣｌ２の濃度に対する相対化学発光強度比の結果であり、図３Ｅは、６種類の市販ミネラルウォーターの測定結果である。  図３に示す通り、発光タンパク質指示薬１は、水硬度に依存した化学発光強度比を示した。
【図４】図４Ａ，Ｃ，及びＥは、それぞれ、実験３で用いた試料水でタンパク質発光指示薬を発光させた様子をスマートフォンのカメラで撮像した画像である。  図４Ｂ，Ｄ，及びＦは、それぞれ、図４Ａ，Ｃ，及びＥの画像データを画像分析してＲＧＢ画像比（Ｂｌｕｅ／Ｇｒｅｅｎ）を算出した結果を示す。
【図５】図５Ａ−Ｄは、デバイスの基材１１上に形成された試薬部１２における、発光タンパク質指示薬１３及び発光基質１４のパターニングの形状を例示する。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本開示は、生体でカルシウム結合性のタンパク質、又は、マグネシウム結合タンパク質として機能するタンパク質が、水の硬度の測定に利用できるという知見に基づく。
本開示は、また、生体でカルシウム結合性のタンパク質、又は、マグネシウム結合タンパク質として機能するタンパク質は、水の硬度測定における濃度範囲では、カルシウム及びマグネシウムの両方を結合でき、１種類の発光タンパク質指示薬を利用して総硬度を測定できるという知見に基づく。
なお、本開示において、「カルシウムを結合すること」及び「マグネシウムを結合すること」は、特に言及がない場合、「カルシウムイオンを結合すること」及び「マグネシウムイオンを結合すること」を意味しうる。
【００１４】
本開示において、水の硬度とは、特に言及がない場合、水中のカルシウムイオン及びマグネシウムイオンの濃度から算出される総硬度を意味しうる。
【００１５】
［発光タンパク質指示薬／融合発光タンパク質］
本開示において、発光タンパク質指示薬は、一又は複数の実施形態において、水の硬度を測定するためのカルシウムイオン及びマグネシウムイオンの濃度に応じた発光シグナルを発する指示薬をいう。
本開示において、発光タンパク質指示薬は、一又は複数の実施形態において、化学発光タンパク質の部分と、金属イオン結合タンパク質の部分と、蛍光タンパク質の部分とを有し、化学発光タンパク質部分と蛍光タンパク質部分との間に金属イオン結合タンパク質部分が連結されている融合発光タンパク質である。
本開示において、発光タンパク質指示薬は、一又は複数の実施形態において、特に言及がない場合、前記融合発光タンパク質そのものを意味しうる。本開示は、一態様において、化学発光タンパク質部分と、金属イオン結合タンパク質部分と、蛍光タンパク質部分とを有し、化学発光タンパク質部分と蛍光タンパク質部分との間に金属イオン結合タンパク質部分が連結されている融合発光タンパク質に関する。該融合発光タンパク質は、本開示に係る水の硬度を測定する方法において、発光タンパク質指示薬として使用できる。
【００１６】
本開示において、融合発光タンパク質は、一又は複数の実施形態において、水の硬度を測定する観点から、前記金属イオン結合タンパク質部分にカルシウムイオン又はマグネシウムイオンが結合することで前記化学発光タンパク質部分から前記蛍光タンパク質部分へ共鳴エネルギー移動が可能になるように連結されていることが好ましい。
本開示において、前記共鳴エネルギー移動は、一態様において、フェルスター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）である。
一又は複数の実施形態において、前記化学発光タンパク質の部分はＦＲＥＴのドナーとなるものであり、前記蛍光タンパク質の部分はＦＲＥＴのアクセプターとなるものである。
【００１７】
［化学発光タンパク質の部分］
本開示における「化学発光タンパク質の部分」は、一又は複数の実施形態において、化学発光タンパク質に由来する。本開示において、化学発光タンパク質は、一又は複数の実施形態において、特定の化学的基質の発光生成反応を触媒するタンパク質である。前記化学発光タンパク質としては、一又は複数の実施形態において、ルシフェラーゼ、イクオリン、オベリン、及びこれらの組み合わせが挙げられる。
【００１８】
化学発光タンパク質は、自然界に存在するルシフェラーゼ、イクオリン、及びオベリンを単離又はクローニングしたものでもよく、それらの改変体であってもよい。化学発光タンパク質の改変体は、一又は複数の実施形態において、化学発光機能特性（例えば、発光強度、発光色）に影響のない部分に変異（例えば欠失及び／又は置換）があり、かつ、該変異がない状態と比較して実質的に同じあるいは類似した化学発光機能特性を有する化学発光タンパク質である。また、化学発光タンパク質の改変体は、一又は複数の実施形態において、化学発光機能特性に影響する部分に変異（例えば欠失及び／又は置換）があり、かつ、該変異がない状態と比較して実質的に異なる化学発光機能特性を有する化学発光タンパク質である。
【００１９】
ルシフェラーゼとしては、限定されない一又は複数の実施形態において、ウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ）、深海エビルシフェラーゼ（Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼ）、ウミホタルルシフェラーゼ（Ｖａｒｇｕｌａ／Ｃｙｐｒｉｄｉｎａルシフェラーゼ）、カイアシルシフェラーゼ（Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ、Ｍｅｔｒｉｄｉａルシフェラーゼ）、渦鞭毛藻類ルシフェラーゼ、発光キノコ（ヤコウタケ：Ｍｙｃｅｎａ  ｃｈｌｏｒｏｐｈｏｓ、ツキヨタケ：Ｏｍｐｈａｌｏｔｕｓ  ｊａｐｉｎｉｃｕｓ）のルシフェラーゼ、サクラエビのルシフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ（Ｐｈｏｔｉｎｕｓルシフェラーゼ）、バクテリアルシフェラーゼ、Ａｋａｌｕｃ、Ｔｕｒｂｏｌｕｃなどが挙げられる。
【００２０】
本開示において「化学発光タンパク質の部分」とは、融合発光タンパク質に組み込まれて（融合されて）いる化学発光タンパク質又はその一部をいう。「化学発光タンパク質の部分」は、化学発光タンパク質の全体でもよく、その一部でもよい。化学発光タンパク質の一部とは、一又は複数の実施形態において、Ｎ末端及び／又はＣ末端の一部が欠失しており、かつ、欠失していない状態と比較して実質的に同じあるいは類似した化学発光機能特性（例えば、発光強度、発光色）を有する前記化学発光タンパク質の部分である。
本開示における化学発光タンパク質は、市販のものを使用できる。
【００２１】
［発光基質］
本開示において、発光基質とは、本開示における化学発光タンパク質の発光基質をいう。例えば、ルシフェラーゼの発光基質は、ルシフェリンとよばれる。
一般的に、化学発光タンパク質と発光基質とは特異的な組み合わせであり、当業者であれば、化学発光タンパク質に対応する発光基質（ルシフェラーゼに対応するルシフェリン）を理解でき、あるいは、発光基質に対応する化学発光タンパク質（ルシフェリンに対応するルシフェラーゼ）を理解できる。
前記発光基質としては、限定されない一又は複数の実施形態において、ホタルルシフェリン、バクテリアルルシフェリン、渦鞭毛藻類ルシフェリン、ヴァルグリン、セレンテラジン（Ｃｏｅｌｅｎｔｅｒａｚｉｎｅ）、ＡｋａＬｕｍｉｎｅ−ＨＣｌ及びこれらの改変体、並びにこれらの組み合わせが挙げられる。
【００２２】
ホタルルシフェリン、バクテリアルルシフェリン、渦鞭毛藻類ルシフェリン、及びヴァルグリンは、それぞれ、ホタルルシフェラーゼ、バクテリアルシフェラーゼ、渦鞭毛藻類ルシフェラーゼ、及びウミホタルルシフェラーゼ（Ｖａｒｇｕｌａ／Ｃｙｐｒｉｄｉｎａルシフェラーゼ）のルシフェリンとなりうる。
また、セレンテラジンは、ウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ）、深海エビルシフェラーゼ（Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼ）、カイアシルシフェラーゼ（Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ）、イクオリン、及びオベリンの基質となりうる。
前記発光基質は、自然界に存在する基質を単離又は合成したものでもよく、それらの改変体であってもよい。
【００２３】
［蛍光タンパク質の部分］
本開示における「蛍光タンパク質の部分」は、一又は複数の実施形態において、蛍光タンパク質に由来する。本開示において、蛍光タンパク質は、一又は複数の実施形態において、上述したドナーである化学発光タンパク質のエネルギーのアクセプターとして機能することができ、ドナーのエネルギーを吸収して蛍光発光できるものが挙げられる。前記蛍光タンパク質は、一又は複数の実施形態において、前記化学発光タンパク質の発光の強度を強めるか、又は、発光の色を変更できるものが挙げられる。
蛍光タンパク質は、自然界に存在するものを単離又はクローニングしたものでもよく、市販されているものでもよく、それらの改変体であってもよい。様々な色の蛍光タンパク質が開発されており、これらを利用することで、本開示に係る融合発光タンパク質の発光の色を様々に設計することができる。
蛍光タンパク質の改変体は、一又は複数の実施形態において、蛍光特性（例えば、発光強度、発光色）に影響のない部分に変異（例えば欠失及び／又は置換）があり、かつ、該変異がない状態と比較して実質的に同じあるいは類似した蛍光特性を有する蛍光タンパク質である。また、蛍光タンパク質の改変体は、一又は複数の実施形態において、蛍光特性（例えば、発光強度、発光色）に影響する部分に変異（例えば欠失及び／又は置換）があり、かつ、該変異がない状態と比較して実質的に異なる蛍光特性を有する蛍光タンパク質である。
【００２４】
。
蛍光タンパク質としては、限定されない一又は複数の実施形態において、緑色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、黄緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、橙色蛍光タンパク質、及び赤色蛍光タンパク質が挙げられ、より具体的な限定されない一又は複数の実施形態において、Azurite, bsDronpa, Cerulean, Citrine, Clover, CyOFP1, Dendra2, Dreiklang, Dronpa2, Dronpa3, DsRed, EBFP, EBFP2, ECFP, EGFP, Emerald, eqFP650, eqFP670, EYFP, Fast-FT, FusionRed, Gamillus, hmKeima8.5, IFP1.4, IFP2.0, iRFP670, iRFP682, iRFP702, iRFP713, iRFP720, Kaeda, KikGR, Kohinoor, LSSmCherry, LSSmKate2, LSSmOrange, mAG1, mAmetrine, mAmetrine1.2, mApple, mBlueberry2, mCardinal, mCerulean3, mCherry, mCherry2, mClover3, mCyRFP1, Medium-FT, mEOS2, mEOS3.1, mEOS3.2, mGarnet2, mIFP2, miniSOG, miRFP670, miRFP720, mKalama1, mKate2, mK-GO, mKOkappa, mKO1, mKO2, mlris, mMaroon1, mNeonGreen, mNeptune, mNeptune2, mNeptune2.5, mNeptune681, mNeptune684, mOrange, mOrange2, mPlum, mRFP1, mRuby2, mRuby3, mScarlet, mScarlet-H, mScarlet-I, mStable, mStrawberry, mTagBFP2, mTFP1, mTurquoise, mTurquoise2, Neptune, NowGFP, oxFP series, Padron, PA-GFP, PAmCherry1, PAmCherry2, PAmCherry3, Phanta, PS-CFP, PS-CFP2, PSLSSmKate, PSmOrange, RDSmCherry1, rsCherry, rsEGFP, rsEGFP2, rsTagRFP, SBFP2, shyRFP, Sirius, skylan NS, skylan S, Slow-FT, SPOON, TagBFP, TagCFP, TagFP635, TagGFP, TagGFP2, TagRFP, TagRFP657, TagRFP675, TagRFP-T, TagYFP, T-Sapphire, TurboFP602, TurboGFP, TurboRFP, TurboYFP, UnaG, Venus、並びにこれらの円順列変異体などが挙げられる。これらの蛍光タンパク質の詳細は、例えば、https://sites.google.com/site/ilovegfp/Home/fpsなどを参照できる。
【００２５】
本開示において「蛍光タンパク質の部分」とは、融合発光タンパク質に組み込まれて（融合されて）いる蛍光タンパク質又はその一部をいう。「蛍光タンパク質の部分」は、蛍光タンパク質の全体でもよく、その一部でもよい。蛍光タンパク質の一部とは、一又は複数の実施形態において、Ｎ末端及び／又はＣ末端の一部が欠失しており、かつ、欠失していない状態と比較して実質的に同じあるいは類似した蛍光特性を有する蛍光タンパク質の部分である。
本開示における蛍光タンパク質は、市販のものを使用してもよい。
【００２６】
［金属イオン結合タンパク質の部分］
本開示における金属イオン結合タンパク質部分は、一又は複数の実施形態において、金属イオン結合タンパク質に由来する。本開示において、金属イオン結合タンパク質は、一又は複数の実施形態において、水の硬度を測定する際に、水中のカルシウム及びマグネシウムと結合性を有するタンパク質である。金属イオン結合タンパク質は、さらなる一又は複数の実施形態において、水の硬度を測定する際に、水中のカルシウム又はマグネシウムと結合することで構造変化を生じるタンパク質である。
【００２７】
金属イオン結合タンパク質としては、生体又は細胞において、カルシウム結合タンパク質、若しくは、マグネシウム結合タンパク質として知られているタンパク質、又はそれらの改変体が挙げられる。
生体又は細胞においてカルシウムを結合しうる機能を有するタンパク質、及び、マグネシウムを結合しうる機能を有するタンパク質は、水の硬度を測定する場合のカルシウム濃度及びマグネシウム濃度では、カルシウム及びマグネシウムの双方と結合しうるタンパク質として機能するという知見に、本開示は一態様において基づく。
本開示に係る融合発光タンパク質は、このような金属イオン結合タンパク質部分を有することにより、一又は複数の実施形態において、１種類の融合発光タンパク質によってでも、水の硬度が測定できるようになる。
【００２８】
金属イオン結合タンパク質としては、２価の金属陽イオン結合ドメインを有するタンパク質が挙げられる。
２価の金属イオンとしては、カルシウムイオン及び／又はマグネシウムイオンが挙げられる。２価の金属陽イオン結合ドメインとしては、一又は複数の実施形態において、カルシウム結合ドメインが挙げられる。
カルシウム結合ドメインとしては、一又は複数の実施形態において、ＥＦハンドモチーフ、ドッケリンモチーフが挙げられる。
より具体的な限定されない一又は複数の実施形態において、金属イオン結合タンパク質としては、水の硬度を測定する観点から、Ｃｅｎ３、カルモジュリン、Ｔｗｉｔｃｈ−３などが挙げられ、好ましくはＣｅｎ３が挙げられる。
【００２９】
前記金属イオン結合タンパク質は、一又は複数の実施形態において、水の硬度を測定する観点から、カルシウムとの結合定数Ｋａは、０．２５ｍＭ〜２．５ｍＭが好ましく、マグネシウムとの結合定数Ｋａは、０．４１ｍＭ〜１．２５ｍＭが好ましい。
【００３０】
前記金属イオン結合タンパク質は、一又は複数の実施形態において、生体又は細胞においてカルシウム結合タンパク質、又は、マグネシウム結合タンパク質として知られているタンパク質を単離又はクローニングしたものでもよく、それらの改変体であってもよい。該タンパク質の改変体は、一又は複数の実施形態において、カルシウム及びマグネシウムへの結合能に影響のない部分に変異（例えば欠失及び／又は置換）があり、かつ、該変異がない状態と比較して実質的に同じあるいは類似したカルシウム及びマグネシウムへの結合能を有するタンパク質である。また、該タンパク質の改変体は、一又は複数の実施形態において、カルシウム及びマグネシウムへの結合能に影響する部分に変異（例えば欠失及び／又は置換）があり、かつ、該変異がない状態と比較して実質的に異なるカルシウム及びマグネシウムへの結合能を有するタンパク質である。
【００３１】
本開示において、「金属イオン結合タンパク質の部分」とは、融合発光タンパク質に組み込まれて（融合されて）いる金属イオン結合タンパク質又はその一部をいう。「金属イオン結合タンパク質の部分」は、金属イオン結合タンパク質の全体でもよく、その一部でもよい。金属イオン結合タンパク質の一部とは、一又は複数の実施形態において、Ｎ末端及び／又はＣ末端の一部が欠失しており、かつ、欠失していない状態と比較して実質的に同じあるいは類似したカルシウム及びマグネシウムへの結合能を有する前記金属イオン結合タンパク質の部分である。
【００３２】
本開示に係る融合発光タンパク質における前記３つの部分の連結順序は、一又は複数の実施形態において、Ｎ末端側から、化学発光タンパク質部分、金属イオン結合タンパク質部分、及び蛍光タンパク質部分の順であってもよく、Ｎ末端側から、蛍光タンパク質部分、金属イオン結合タンパク質部分、及び化学発光タンパク質部分の順であってもよい。
【００３３】
本開示に係る融合発光タンパク質は、一又は複数の実施形態において、水の硬度を測定する観点から、化学発光タンパク質部分と、金属イオン結合タンパク質部分と、蛍光タンパク質部分とが、以下の条件を満たすように融合（連結）されていることが好ましい。
（１）金属イオン結合タンパク質部分にカルシウムイオン又はマグネシウムイオンが結合していない場合、化学発光タンパク質部分から蛍光タンパク質部分へ共鳴エネルギー移動が起こらず、発光基質を加えても化学発光タンパク質の発光しか起こらない。
（２）金属イオン結合タンパク質部分にカルシウムイオン又はマグネシウムイオンが結合した場合、金属イオン結合タンパク質部分の構造が変化し、化学発光タンパク質部分から蛍光タンパク質部分へ共鳴エネルギー移動が可能になり、発光基質が加えられると蛍光発光が起こる。
一又は複数の実施形態において、前記３つの部分の連結する際に、各部分のＮ末端及びＣ末端の少なくとも一端から、１〜１０個のアミノ酸配列を欠失させることにより、上記（１）及び（２）の条件を満たしやすくすることができる。
【００３４】
本開示に係る融合発光タンパク質は、一又は複数の実施形態において、遺伝子組み換え技術により作製した組み換えタンパク質であってもよいし、化学合成により合成したタンパク質であってもよい。遺伝子組み換え技術による組み換えタンパク質の作製としては、一又は複数の実施形態において、本開示に係る融合発光タンパク質をコードする遺伝子を含有する発現ベクターで形質転換した宿主を用いて作製する方法、或いは、無細胞系で作製する方法が挙げられる。本開示に係る融合発光タンパク質は、タグタンパク質を利用するなどして精製してもよい。
【００３５】
［水の硬度の測定方法］
本開示に係る水の硬度の測定方法は、本開示に係る発光タンパク質指示薬（融合発光タンパク質）に測定試料である水と発光基質とを接触させること、及び、前記発光タンパク質指示薬の発光シグナルから水の硬度を判定又は算出することを含む。
硬度を測定する水としては、従来、硬度が測定されており、硬度の変動幅が予想できる水が挙げられる。硬度を測定する水としては、特に制限されないが、飲料水、水道水、湧水、井戸水、流水、地下水、工業用水などが挙げられる。
本開示に係る発光タンパク質指示薬が水及び発光基質と接触すると、カルシウム及びマグネシウム濃度に依存した発光が生ずる。この発光のシグナルに基づいて水の硬度を測定する。
発光のシグナルに基づく水の硬度の測定は、一又は複数の実施形態において、発光シグナルデータに基づく計算に基づいてもよい。例えば、携帯情報端末に発光シグナルテータを取り込み、該データを携帯情報末端のアプリ等で、あるいは、ネットを介して、測定を行うことが挙げられる。
発光のシグナルに基づく水の硬度の測定は、一又は複数の実施形態において、化学発光タンパク質の発光強度と蛍光タンパク質の発光強度とを測定し、それらの比を指標とすることを含む。発光強度の比に基づいた検量線を予め作成しておいてもよい。
発光のシグナルに基づく水の硬度の測定は、一又は複数の実施形態において、発光の様子を撮像して撮像データに変換し、該データの解析値を指標とすることを含む。例えば、撮像データから化学発光タンパク質に由来する色の輝度と蛍光タンパク質に由来する色の輝度とを得て、それらの比を指標とすることを含む。輝度の比に基づいた検量線を予め作成しておいてもよい。撮像データを用いた水の硬度の測定は、一又は複数の実施形態において、撮像データを得るためのカメラと、該撮像データを解析して水の硬度を測定するアプリケーションソフトウェアを備えた情報端末機（例えば、スマートフォン）によって簡便に行うことができる。
発光のシグナルに基づく水の硬度の測定は、一又は複数の実施形態において、発光の様子をあらかじめ発光色で分類された表などと比べて目視で行ってもよい。
本開示において、水の硬度の測定とは、一又は複数の実施形態において、水の硬度の判定、及び／又は、水の硬度の算出を意味しうる。水の硬度は、国によって異なる算出方法を採用する場合があるが、カルシウム濃度及びマグネシウム濃度を算出の基礎とする点で共通するから、その算出方法に合わせて、適宜、適切な水の硬度の判定、及び／又は、算出が可能である。水の硬度の計算方法の一又は複数の実施形態は、水中のカルシウム及びマグネシウムをＣａＣＯ３に換算した値（ｍｇ／Ｌ）として算出する方法が挙げられる。
本開示において、水の硬度の判定は、一又は複数の実施形態において、軟水と硬水のいずれかに属するか判定をすること、軟水、中硬水、硬水及び超硬水のいずれかに属するか判定すること、あるいは、所定の硬度範囲に属するかどうかの判定をすることを含む。
【００３６】
［デバイス］
本開示に係る水の硬度の測定方法における、本開示に係る発光タンパク質指示薬に測定試料である水と発光基質とを接触させることは、デバイスを利用できる。
本開示に係るデバイスは、一又は複数の実施形態において、本開示に係る発光タンパク質指示薬及び該指示薬の発光基質が配置された試薬部と、前記試薬部が形成された基材とを有する。
試薬部には、少なくとも、本開示に係る発光タンパク質指示薬と発光基質とが配置される。
【００３７】
本開示に係るデバイスにおいて、発光タンパク質指示薬と発光基質とは、独立して配置されている。発光タンパク質指示薬と発光基質とは、一又は複数の実施形態において、これらが配置された試薬部に水を供給すると、発光タンパク質指示薬と発光基質とが反応して発光シグナルを発生可能なように配置されている。これにより、試薬部に水を供給すると、発光タンパク質指示薬と発光基質とが接触（混合）して発光シグナルを生じさせることができる。このような構成を有する本開示のデバイスによれば、一又は複数の実施形態において、より高いシグナル・ノイズ比を有し、また、励起光が不要であるため特別な測定装置や測定設備が不要であるという効果を好ましくは奏しうる。また、本開示のデバイスによれば、一又は複数の実施形態において、ユーザーが、自身が所持する携帯情報端末等の撮像手段によって撮像することにより、生じる発光シグナルを検出することができ、またそのユーザーが撮像することにより得られたデータを用いて迅速な測定、判定又は診断等を行うことができる。
【００３８】
本開示において「独立して配置」としては、一又は複数の実施形態において、発光タンパク質指示薬と発光基質とが、試料等の液体が接触することなしに反応が生じない状態で配置されていることが挙げられる。独立して配置としては、一又は複数の実施形態において、隣接する発光タンパク質指示薬と発光基質とが物理的に（あるいは空間的に）分離して配置されていることが挙げられる。また、独立して配置は、一又は複数の実施形態において、発光タンパク質指示薬と発光基質とが反応しない状態（例えば乾燥状態）であれば、互いに接触して配置された形態を含みうる。
【００３９】
発光タンパク質指示薬及び発光基質は、一又は複数の実施形態において、パターニングされて配置されていてもよい。パターニングの形状としては、一又は複数の実施形態において、ドット状、ライン状、又はサークル状等が挙げられる。発光タンパク質指示薬と発光基質との接触率を高め、より高い発光シグナルを発生させる点から、一又は複数の実施形態において、発光タンパク質指示薬と発光基質とが交互にかつモザイク状にパターニングされていることが好ましい。再現性を向上できる点から、パターニングは微細であることが好ましい。
【００４０】
本開示のデバイスにおいて、試薬部は基材に形成されている。試薬部は、一又は複数の実施形態において、１枚の基材の同一平面に形成されていてもよいし、２枚の基材によって挟み込まれるように形成されていてもよい。
【００４１】
図５に、特に限定されないパターニングの形状を例示する。図５Ａでは、１枚の基材１１上にドット状の発光タンパク質指示薬１３及び発光基質１４が交互にモザイク状にパターニングされることにより試薬部１２が形成されている。図５Ｂでは、２枚の基材１１の一方の面に発光タンパク質指示薬１３と発光基質１４とがそれぞれドット状にパターニングされ、発光タンパク質指示薬３と発光基質１４とがパターニングされた面が向かい合うように２枚の基材１１が配置されることにより試薬部１２が形成されている。図５Ｃ及びＤでは、それぞれ、１枚の基材１１上に発光タンパク質指示薬１３と発光基質１４とがライン状又はサークル状にパターニングされることにより試薬部１２が形成されている。
【００４２】
発光タンパク質指示薬及び発光基質は、水の供給前に発光タンパク質指示薬と発光基質とが反応することを低減する点から、一又は複数の実施形態において、乾燥状態であることが好ましい。
【００４３】
基材の材質は、特に限定されるものではなく、一又は複数の実施形態において、パラフィン、テフロン（登録商標）等のフッ素系材料、ガラス、ポリプロピレン、織布、不織布、及び紙等が挙げられる。基材の材質は、高い発光シグナルを検出できる点から、一又は複数の実施形態において、疎水性であることが好ましい。
【００４４】
［デバイスの製造方法］
本開示に係る製造方法は、一又は複数の実施形態において、本開示のデバイスの製造方法である。本開示の製造方法は、発光タンパク質指示薬と発光基質とが独立して配置されるように基材にパターニングすることを含む。
【００４５】
発光タンパク質指示薬と発光基質とのパターニングとしては、一又は複数の実施形態において、発光タンパク質指示薬と発光基質とが配置された箇所に水を供給すると、発光タンパク質指示薬と発光基質とが接触（混合）して発光シグナルを発生可能なように、これらを独立して配置することにより行うことができる。
【００４６】
パターニングの方法としては、一又は複数の実施形態において、発光タンパク質指示薬又は発光基質の溶液を、所定のパターン形状に配置して乾燥させることにより行うことができる。パターニングは、一又は複数の実施形態において、インクジェットプリンター等の公知の技術を用いて行うことができる。
【００４７】
［デバイスを用いた水の硬度の測定方法］
本開示に係る検出方法は、一又は複数の実施形態において、本開示に係るデバイスを用いて、水の硬度を測定する方法である。
【００４８】
本態様の方法は、一又は複数の実施形態において、本開示に係るデバイスの試薬部に水を供給すること、及び試料を供給することにより生じた発光シグナルを利用することを含む。本開示のデバイスによれば励起光が不要であるため、発光シグナルのデータ化は、一又は複数の実施形態において、携帯情報端末（スマートフォン等）及びデジタルカメラ等の撮像手段により行うことができる。
【００４９】
本開示の検出方法は、一又は複数の実施形態において、室温又は環境温度で行うことができる。水を供給してから観察するまでの時間としては、一又は複数の実施形態において、数秒から数分程度、又は、数秒から１分程度が挙げられる。
【００５０】
［水の硬度測定システム］
本開示は、一態様において、本開示に係るデバイス、該デバイスに水を供給することで発せられる発光シグナルを撮像可能な撮像部を備える携帯情報端末、及び、撮像部で得られた発光シグナルの撮像データから水の硬度を判定又は算出可能なアプリケーションソフトウェアを含む、水の硬度測定システムに関する。
前記撮像部を備える携帯情報端末としては、一又は複数の実施形態において、カメラを備えるスマートフォン、カメラを備えるタブレット等が挙げられる。
前記アプリケーションソフトウェアとしては、一又は複数の実施形態において、得られた発光シグナルの撮像データと、携帯情報端末に記憶された情報又はネットを介して得られた情報とに基づいて水の硬度の測定を行い、携帯情報末端に表示する処理を該末端に行わせるソフトウェアが挙げられる
前記アプリケーションソフトウェアとしては、その他の一又は複数の実施形態において、得られた発光シグナルの撮像データをネットを介してサーバに送り、サーバで測定された結果を受信して携帯情報末端に表示する処理を該末端に行わせるソフトウェアが挙げられる。
【００５１】
［核酸］
本開示は、一態様において、本開示に係る融合発光タンパク質をコードする核酸に関する。本開示において、核酸は、合成ＤＮＡ，ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ及びプラスミドＤＮＡから選択される一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ、並びにこれらのＤＮＡの転写生成物が挙げられる。
【００５２】
［発現カセット］
本開示は、一態様において、本開示に係る融合発光タンパク質をコードする核酸を含む発現カセットに関する。該発現カセットにおいて、前記核酸は、導入する宿主細胞に応じた発現調節配列が作動的に連結されている。発現調節配列としては、プロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター等が挙げられ、その他には、開始コドン、イントロンのスプライシングシグナル、及び停止コドンなどが挙げられる。
【００５３】
［ベクター］
本開示は、一態様において、本開示に係る融合発光タンパク質を発現可能なベクターに関する。本開示は、その他の態様において、本開示に係るベクターは、一又は複数の実施形態において、本開示に係る核酸又は発現カセットを有する発現ベクターである。本開示に係るベクターは、発現させたい細胞（宿主）に応じた発現ベクター系を適宜選択して使用できる。本開示に係るベクターに利用できるベクターとしては、限定されない一又は複数の実施形態として、プラスミド、コスミド、ＹＡＣＳ、ウイルス（例えば、アデノウイルス、レトロウイルス、エピソームＥＢＶなど）ベクター及びファージベクター、並びに、アグロバクテリウム法のためのバイナリーベクターが挙げられる。
【００５４】
［形質転換体］
本開示は、一態様において、本開示に係る融合発光タンパク質を発現する形質転換体に関する。本開示は、一又は複数の実施形態において、本開示に係る核酸又はベクターを有する形質転換体に関する。本開示の形質転換体は、一又は複数の実施形態において、本開示の核酸、発現カセット又はベクターを宿主に導入することによって作成することができる。宿主としては、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、微生物等が挙げられる。
【００５５】
本開示はさらに以下の限定されない一又は複数の実施形態に関する。
〔１〕  発光タンパク質指示薬を用いて水の硬度を測定する方法であって、
前記発光タンパク質指示薬に水と発光基質とを接触させること、及び、
前記発光タンパク質指示薬の発光シグナルから水の硬度を判定又は算出することを含み、
前記発光タンパク質指示薬は、化学発光タンパク質の部分と、金属イオン結合タンパク質の部分と、蛍光タンパク質の部分とを有し、化学発光タンパク質部分と蛍光タンパク質部分との間に金属イオン結合タンパク質部分が連結されているタンパク質であり、
前記金属イオン結合タンパク質は、２価の金属陽イオン結合ドメインを有するタンパク質であり、
前記発光基質は、前記化学発光タンパク質の基質である、方法。
〔２〕  前記発光タンパク質指示薬は、金属イオン結合タンパク質部分にカルシウムイオン又はマグネシウムイオンが結合することで化学発光タンパク質部分から前記蛍光タンパク質部分へ共鳴エネルギー移動が可能なように連結されている、〔１〕記載の方法。
〔３〕  前記化学発光タンパク質がルシフェラーゼ、イクオリン、オベリン、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される発光タンパク質である、〔１〕又は〔２〕に記載の方法。
〔４〕  前記基質が、ホタルルシフェリン、バクテリアルルシフェリン、渦鞭毛藻類ルシフェリン、ヴァルグリン、セレンテラジン、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される物質である、〔１〕から〔３〕のいずれかに記載の方法。
〔５〕  前記金属イオン結合タンパク質は、ＥＦハンドモチーフ又はドッケリンモチーフを有するタンパク質である、〔１〕から〔４〕のいずれかに記載の方法。
〔６〕  発光タンパク質指示薬及び前記指示薬の発光基質が配置された試薬部と、前記試薬部が形成された基材とを有し、
前記発光タンパク質指示薬は、化学発光タンパク質の部分と、金属イオン結合タンパク質の部分と、蛍光タンパク質の部分とを有し、化学発光タンパク質部分と蛍光タンパク質部分との間に金属イオン結合タンパク質部分が連結されているタンパク質であり、
前記金属イオン結合タンパク質は、２価の金属陽イオン結合ドメインを有するタンパク質であり、
前記発光タンパク質指示薬及び前記発光基質は、前記試薬部に独立して配置されている、水の硬度測定用デバイス。
〔７〕  〔６〕に記載のデバイスに水を供給することで発せられる発光シグナルを、撮像部を備える携帯情報端末で撮像すること、及び、
前記携帯情報端末が備える情報処理手段により、前記撮像部で得られた発光シグナルの撮像データから水の硬度を判定又は算出することを含む、水の硬度の測定方法。
〔８〕  〔６〕に記載のデバイス、該デバイスに水を供給することで発せられる発光シグナルを撮像可能な撮像部を備える携帯情報端末、及び、撮像部で得られた発光シグナルの撮像データから水の硬度を判定又は算出可能なアプリケーションソフトウェアを含む、水の硬度測定システム。
【００５６】
以下、実施例により本開示をさらに詳細に説明するが、これらは例示的なものであって、本開示はこれら実施例に制限されるものではない。
【実施例】
【００５７】
［発光タンパク質指示薬１の作製］
発光タンパク質指示薬となる融合発光タンパク質を以下のように作製した。
化学発光タンパク質としてＮａｎｏＬｕｃ、金属イオン結合タンパク質としてカルシウム／マグネシウムイオン結合タンパク質Ｃｅｎ３（ヒト由来ＨｓＣｅｎ３）、及び、蛍光タンパク質としてＶｅｎｕｓを使用し、Ｎ末端側からＶｅｎｕｓ、ＨｓＣｅｎ３、及びＮａｎｏＬｕｃの順で連結させた融合発光タンパク質を作成し、発光タンパク質指示薬１とした。
なお、ＨｓＣｅｎ３は、Ｃ末端側から７アミノ酸残基を欠失させたて連結した。
【００５８】
［実験例１］
発光タンパク質指示薬１のカルシウムイオンとマグネシウムイオンに対する発光特性を確認した。その結果を図１に示す。
図１Ａ及びＢは、それぞれ、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２及び１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２の存在下（黒線）又は非存在下（灰線）での発光タンパク質指示薬１の発光スペクトルを示す。図１において、発光スペクトルは、等発光点（５０６ｎｍ）でノーマライズした。
図１Ａ及びＢから、発光タンパク質試薬１は、カルシウムイオンと結合して発光強度が強くなり、また、マグネシウムイオンと結合して発光強度が強くなることが示された。
図１Ｃ及びＤは、それぞれ、発光タンパク質指示薬１に対するカルシウムイオン及びマグネシウムイオンの滴定曲線（ヒルプロット曲線）を示す。カルシウムイオンに対するＫｄは、３５５μＭ（ヒル係数１．０４）であり、マグネシウムイオンに対するＫｄは、４．７ｍＭ（ヒル係数１．６）であった。
図１A-Dはすべて、発光タンパク質濃度4 nM、発光基質濃度10 nM、総量100 μLの反応液に対して行った。
【００５９】
［実験例２］
発光タンパク質指示薬１のｐＨ及び他の金属イオンの影響を確認した。その結果を図２に示す。
図２Ａは、さまざまなｐＨで、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２の存在下（黒線）又は非存在下（灰線）での発光タンパク質指示薬１の発光強度比を比較した。すべての測定は３回行い、その平均値を示した。発光強度比は、Ｖｅｎｕｓのピーク（５２５ｎＭ）をＮａｎｏＬｕｃのピーク（４５５ｎＭ）で割って算出した。
図２Ｂは、３μＭのカリウムイオン、ヒ素イオン、亜鉛イオン、銅イオン、コバルトイオン、カドミウムイオン、鉛イオン、マンガンイオン、ニッケルイオン又は鉄イオンの存在下（左バー）、同金属イオンと１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２との共存下（中バー）、及び、同金属イオンと１０ｍＭ  ＣａＣｌ２との共存下（右バー）で、発光タンパク質指示薬１の発光強度比を比較した。すべての測定は３回行い、ＳＥＭをエラーバーで示した。発光強度比は、Ｖｅｎｕｓのピーク（５２５ｎＭ）をＮａｎｏＬｕｃのピーク（４５５ｎＭ）で割って算出した。
図２Ａ及びＢより、発光タンパク質指示薬１は、ｐＨの変化に対して安定であり、また、異なる金属イオン存在下においてもカルシウムイオン及びマグネシウムイオンに特異性が高いことが示された。
【００６０】
［実験例３］
図３Ａに示す濃度のＣａＣＯ３水溶液、図３Ｂに示す濃度のＣａＣｌ２及びＭｇＣｌ２の混合水溶液、及び、６種類の市販ミネラルウォーター（ＣＭＷ１−６）を試料水とした場合の発光タンパク質指示薬１の発光強度比を測定した。その結果を図３Ｃ−Ｅに示す。
図３Ａ及び３Ｂの硬度の値（Ｓｃａｌｅ）及び分類（Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ）は、ＵＳＧＳ（アメリカ地質調査所）が規定した水硬度（全硬度）の算出方法による値と分類である。
図３Ｃは、図３Ａに示す濃度のＣａＣＯ３水溶液の結果であり、図３Ｄは、図３Ｂに示す濃度のＣａＣｌ２及ＭｇＣｌ２の混合水溶液の結果であり、そして、図３Ｅは、６種類の市販ミネラルウォーター（ＣＭＷ１−６）の結果である。
図３に示す通り、発光タンパク質指示薬１は、水硬度に依存した発光強度比を示した。
【００６１】
［実験例４］
実験例３で使用した試料水を用いた発光タンパク質指示薬１の発光をスマートフォンのカメラで撮像し、その撮像データから発光強度比を算出した。その結果を図４に示す。
図４Ａ，Ｃ，及びＥは、ぞれぞれ、実験３で用いた試料水；３Ａに示す濃度のＣａＣＯ３水溶液、図３Ｂに示す濃度のＣａＣｌ２及びＭｇＣｌ２の混合水溶液、及び、６種類の市販ミネラルウォーター（ＣＭＷ１−６）をタンパク質発光指示薬で発光させたときの様子をスマートフォンのカメラで撮像した取り込んだ画像である。
図４Ｂ，Ｄ，及びＦは、ぞれぞれ、図４Ａ，Ｃ，及びＥの画像データを画像分析してＲＧＢ画像比（Ｂｌｕｅ／Ｇｒｅｅｎ）を算出した結果を示す。コントロールとして、１０ｍＭ  ＭＯＰＳ（ｐＨ７．２）、１００ｍＭ  ＫＣｌを使用した。
図４に示すとおり、スマートフォンで取り込んだ画像データの画像分析で得られた発光強度比も、試料水の硬度に依存していた。これにより、スマートフォン等の携帯情報端末で撮像したデータに基づいて水の硬度が判定・算出できることが示された。
【図１】
2020115089.tif 000002
【図２】
2020115089.tif 000003
【図３】
2020115089.tif 000004
【図４】
2020115089.tif 000005
【図５】
2020115089.tif 000006