(57)【要約】      （修正有）【課題】本発明は、対象におけるタウのインビボ代謝のインビトロ測定方法を提供する。【解決手段】対象から得た各血液サンプル中の標識タウの量または標識タウと非標識タウの量を質量分析法によって検出及び測定する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象におけるタウの代謝をインビトロで測定する方法であって、
（ａ）タウのＮ末端またはミドルドメイン内に親和性を有する試薬を用いて標識タウまたは標識タウと非標識タウを対象から得た少なくとも1つの血液サンプルから分離すること、
（ｂ）前記対象から得た各血液サンプル中の標識タウの量または標識タウと非標識タウの量を質量分析法によって検出及び測定すること、および
（ｃ）工程（ｂ）から得た測定値を用いてタウの代謝を算出すること、ここで所定の時点における血液サンプル中の標識タウの量がタウの代謝を反映する、
を含み、
（ｉ）前記対象が、少なくとも１つの標識アミノ酸を、１日以上投与されており、
（ｉｉ）少なくとも１つの血液サンプルが、５日目〜２０日目、２０日目〜４０日目、４０日目〜１００日目またはこれらの組み合わせにおいて、前記対象から採取されたものである、前記方法。
【請求項２】
前記試薬が、タウの９〜１８個目または１９４〜１９８個目のアミノ酸内に親和性を有する試薬である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記試薬が、タウの９〜１８個目または１９４〜１９８個目のアミノ酸内に親和性を有する抗体である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記対象が、０日目〜３日目において、前記標識アミノ酸を２日以上投与されている、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記対象が、０日目〜５日目において、前記標識アミノ酸を２日以上投与されている、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記対象が、０日目〜１０日目において、前記標識アミノ酸を２日以上投与されている、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記対象が、前記標識アミノ酸を毎日投与されている、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記標識アミノ酸が非放射性同位体で標識されている、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記非放射性同位体を２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏ、１８Ｏ、３３Ｓ、３４Ｓ及び３６Ｓからなる群から選択する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記標識アミノ酸が１３Ｃ６ロイシンである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記対象が、前記標識アミノ酸を静脈内投与または経口投与されている、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
免疫沈降法によってタウを分離する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記標識アミノ酸が、０．１％、０．２％、０．５％、１％、２％、５％、０．１〜２０％及び０．１〜１０％からなる群から選択した量の、前記血液サンプル中の標識アミノ酸を産生させるために投与されている、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記対象が齧歯動物である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記対象がヒトである、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１の工程（ｃ）で割り出した、標識及び／または非標識タウの量を用いて、タウ代謝の代謝パラメーターを算出することを更に含み、前記代謝パラメーターが、相対標識値、合成比速度、クリアランス比速度、絶対合成速度、絶対クリアランス速度、代謝回転比速度、ラグタイム、半減期、ピーク時間及びピーク高さからなる群から選択されている、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
タウが、（２Ｎ  ３Ｒ）、（２Ｎ  ４Ｒ）、（１Ｎ  ３Ｒ）、（１Ｎ  ４Ｒ）、（０Ｎ  ３Ｒ）及び（０Ｎ  ４Ｒ）からなる群から選択したタウアイソフォームである、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
タウがリン酸化タウアイソフォームである、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府の権利
本発明は、米国国立衛生研究所により付与されたＲ−０１−ＮＳ０６５６６７の下で、米国政府からの援助によって行われたものである。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００２】
関連出願の相互参照
本願は、２０１４年９月３０日に提出された米国特許仮出願第６２／０５７，８５３号に基づく利益を主張するものであり、この仮出願は、参照により、その全体が本明細書に援用される。
【０００３】
本発明は、対象におけるタウのインビボ代謝のインビトロ測定方法に関する。
【０００４】
配列表の参照
配列表の紙による写しと、同じ配列表のコンピューター可読形式が下に添付されており、これらは、参照により本明細書に援用される。コンピューター可読形式で記録されている情報は、３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２１（ｆ）に従い、書面の配列表と同一である。
【背景技術】
【０００５】
アルツハイマー病及びその他のタウオパチーにおける神経原線維変化（ＮＦＴ）は、不溶性の過剰リン酸化タウタンパク質から構成されているが、溶解性の高いタウが不溶性のＮＦＴに変換する際の基礎となる機構は、依然として不明である。したがって、ＣＮＳにおけるタウのインビボ代謝を高感度かつ高精度に、再現良く測定する方法に対するニーズが存在する。
【発明の概要】
【０００６】
本発明の一態様は、タウのインビボ代謝の測定方法であって、標識部分を投与された対象から得た１つ以上の生体サンプル中の標識タウと非標識タウの量を検出し、生体サンプルにおける標識タウの非標識タウに対する比率を割り出すことによる方法を提供する。
【０００７】
本発明の別の態様は、対象におけるタウの代謝の測定方法であって、（ａ）１日以上の日程で、少なくとも１つの標識アミノ酸を対象に投与することと、（ｂ）１日目前後と２０日目前後との間、２０日目前後と４０日目前後との間、４０日目前後と１００日目前後との間またはこれらを組み合わせた日程に、少なくとも１つの生体サンプルを対象から採取することと、（ｃ）各生体サンプル中の標識タウの量及び／または非標識タウの量を検出及び測定することと、（ｄ）工程（ｃ）から得た測定値を用いてタウの代謝を算出することであって、所定の時点における生体サンプル中の標識タウの量がタウの代謝を反映している、こととを含む方法を提供する。
【０００８】
本発明の別の態様は、対象におけるタウの代謝の測定方法であって、（ａ）１日以上の日程で、少なくとも１つの標識アミノ酸を対象に投与することと、（ｂ）２日目前後と２０日目前後との間、２０日目前後と４０日目前後との間、４０日目前後と１００日目前後との間またはこれらを組み合わせた日程に、少なくとも１つの生体サンプルを対象から採取することと、（ｃ）各生体サンプル中の標識タウの量及び／または非標識タウの量を検出及び測定することと、（ｄ）工程（ｃ）から得た測定値を用いてタウの代謝を算出することであって、所定の時点における生体サンプル中の標識タウの量がタウの代謝を反映している、こととを含む方法を提供する。
【０００９】
本発明の別の態様は、対象におけるタウの代謝の測定方法であって、（ａ）２日以上の日程で、少なくとも１つの標識アミノ酸を対象に投与することと、（ｂ）１日目前後と２０日目前後との間、２０日目前後と４０日目前後との間、４０日目前後と１００日目前後との間またはこれらを組み合わせた日程に、少なくとも１つの生体サンプルを対象から採取することと、（ｃ）各生体サンプル中の標識タウの量及び／または非標識タウの量を検出及び測定することと、（ｄ）工程（ｃ）から得た測定値を用いてタウの代謝を算出することであって、所定の時点における生体サンプル中の標識タウの量がタウの代謝を反映している、こととを含む方法を提供する。
【００１０】
本発明の別の態様は、対象におけるタウの代謝の測定方法であって、（ａ）２日以上の日程で、少なくとも１つの標識アミノ酸を対象に投与することと、（ｂ）２日目前後と２０日目前後との間、２０日目前後と４０日目前後との間、４０日目前後と１００日目前後との間またはこれらを組み合わせた日程に、少なくとも１つの生体サンプルを対象から採取することと、（ｃ）各生体サンプル中の標識タウの量及び／または非標識タウの量を検出及び測定することと、（ｄ）工程（ｃ）から得た測定値を用いてタウの代謝を算出することであって、所定の時点における生体サンプル中の標識タウの量がタウの代謝を反映している、こととを含む方法を提供する。
【００１１】
本発明の別の態様は、対象におけるタウの代謝のインビトロ測定方法であって、（ａ）対象から得た各生体サンプル中の標識タウの量及び／または非標識タウの量を検出及び測定することと、（ｂ）工程（ａ）で割り出した標識タウ及び／または非標識タウの量を用いて、タウの代謝を算出することであって、所定の時点における生体サンプル中の標識タウの量がタウの代謝を反映している、こととを含み、（ｉ）標識が、１日以上の日程で対象に投与したものであり、（ｉｉ）各生体サンプルが、１日目と２０日目との間、２０日目と４０日目との間、４０日目と１００日目との間またはこれらを組み合わせた日程に、対象から採取したものである方法を提供する。
【００１２】
本発明の別の態様は、対象におけるタウの代謝のインビトロ測定方法であって、（ａ）対象から得た各生体サンプル中の標識タウの量及び／または非標識タウの量を検出及び測定することと、（ｂ）工程（ａ）で割り出した標識タウ及び／または非標識タウの量を用いて、タウの代謝を算出することであって、所定の時点における生体サンプル中の標識タウの量がタウの代謝を反映している、こととを含み、（ｉ）標識が、１日以上の日程で対象に投与したものであり、（ｉｉ）各生体サンプルが、２日目と２０日目との間、２０日目と４０日目との間、４０日目と１００日目との間またはこれらを組み合わせた日程に、対象から採取したものである方法を提供する。
【００１３】
本発明の別の態様は、対象におけるタウの代謝のインビトロ測定方法であって、（ａ）対象から得た各生体サンプル中の標識タウの量及び／または非標識タウの量を検出及び測定することと、（ｂ）工程（ａ）で割り出した標識タウ及び／または非標識タウの量を用いて、タウの代謝を算出することであって、所定の時点における生体サンプル中の標識タウの量が、タウの代謝を反映していることを含み、（ｉ）標識が、２日以上の日程で対象に投与したものであり、（ｉｉ）各生体サンプルが、１日目と２０日目との間、２０日目と４０日目との間、４０日目と１００日目との間またはこれらを組み合わせた日程に、対象から採取したものである方法を提供する。
【００１４】
本発明の別の態様は、対象におけるタウの代謝のインビトロ測定方法であって、（ａ）対象から得た各生体サンプル中の標識タウの量及び／または非標識タウの量を検出及び測定することと、（ｂ）工程（ａ）で割り出した標識タウ及び／または非標識タウの量を用いて、タウの代謝を算出することであって、所定の時点における生体サンプル中の標識タウの量が、タウの代謝を反映していることを含み、（ｉ）標識が、２日以上の日程で対象に投与したものであり、（ｉｉ）各生体サンプルが、１日目と２０日目との間、２０日目と４０日目との間、４０日目と１００日目との間またはこれらを組み合わせた日程に、対象から採取したものである方法を提供する。
【００１５】
本発明の更なる態様は、対象における神経由来タンパク質のインビボ代謝を測定するキットを含み、このタンパク質の代謝は、神経疾患もしくは神経変性疾患の予測因子、その疾患の進行のモニタリング因子、またはその疾患に対する治療の有効性の指標として用いてよい。
【００１６】
出願ファイルには、カラーで作成した写真が少なくとも１つ含まれている。カラー写真の付いた本特許出願公開のコピーは、要請と、必要な費用の支払いにより、米国特許庁から得られる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１Ａ〜Ｃは、プレセニリン変異（ＰＳｍｔ））を持つ対象とコントロールから得たヒト神経芽腫細胞ＳＨ−ＳＹ５Ｙまたは誘導多能性細胞（ｉＰＳＣ）に由来するニューロンの標識の成功を示している画像とグラフを示している。（Ａ）インビトロでのタウＳＩＬＫ実験のワークフローを示す概略図である。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞とｉＰＳＣニューロン（左端：ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞は顕微鏡写真、ｉＰＳＣニューロンは図である）を５０％１３Ｃ６ロイシン標識培地で６日間標識する（中央のパネルの上部）。培地と細胞溶解液のサンプルを１２日間、毎日採取した（中央のパネルの下部）。最後に、タウ特異抗体を用いて、標識タウと非標識タウを各サンプルから免疫沈降させ、酵素的に消化し、質量分析法によって、標識タウ断片と非標識タウ断片の量を検出した。（Ｂ）ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞溶解液と培地のタウ標識動態曲線である。ＴＴＲは、トレーサーのトレースに対する比率である。（Ｃ）ｉＰＳＣコントロール（Ｃｔｒｌ）とプレセニリン変異（ＰＳｍｔ）細胞のタウ標識動態曲線である。ＴＴＲは、トレーサーのトレースに対する比率である。
【図２】図２Ａ〜Ｃは、タウのトリプシンによる消化を示している。（Ａ）ヒト完全長タウのアミノ酸配列（２Ｎ４Ｒ、配列番号１）である。ロイシンは赤で示されている。下線が引かれているとともに青で示されているアミノ酸配列は、トリプシンによる酵素的切断によって作られる、タウのロイシン含有断片を示している。定量で用いるトリプシンペプチド断片は、ＴＰＳＬＰＴＰＰＴＲ（配列番号２）である。本発明の実験で用いる抗タウ抗体によって認識されるエピトープは、ＲＳＧＹＳ（配列番号３）である。（Ｂ）（Ａ）で同定されたタウトリプシンペプチドのクロマトグラムである。それらのペプチドをそれらの疎水性に従って溶出した。上から下に向かって、ＩＧＳＴＥＮＬＫ（配列番号４）、ＴＰＳＬＰＴＰＰＴＲ（配列番号２）、（ＨＶＰＧＧＧＳＶＱＩＶＹＫＰＶＤＬＳＫ（配列番号５）、ＳＴＰＴＡＥＤＶＴＡＰＬＶＤＥＧＡＰＧＫ（配列番号６）及びＬＱＴＡＰＶＰＭＰＤＬＫ（配列番号７）である。（Ｃ）ＴＰＳＬＰＴＰＰＴＲ（配列番号２）の検量線である。
【図３】図３Ａ〜Ｄは、本発明の方法の一実施形態の概要を示す図である。（Ａ）対象を安定同位体標識アミノ酸（１３Ｃ６ロイシン）で経口標識する。（Ｂ）標識の開始後、脳脊髄液（ＣＳＦ）と血液サンプルを採取する。（Ｃ）ＣＳＦサンプルからタウを免疫沈降させ、質量分析のために処理する。サンプル中の非標識タウと標識タウの量を質量分析で割り出す。（Ｄ）ＣＮＳ中のタウの同位体濃縮度の概略図（上）と、標識とサンプリングタイムラインの例（下）である。産生段階中の標識タウの増加は、中枢神経系（ＣＮＳ）におけるタウの相対的な産生を、クリアランス段階中の標識タウの除去は、ＣＮＳにおけるタウのクリアランスを反映している。
【図４】図４Ａ〜Ｆは、インビボでのタウの標識の成功と、インビトロでの標識タウの動態の分析を示すグラフを示している。５人の若齢の正常コントロール（ＮＣ）対象に、１３Ｃ６ロイシンを５日間（ＮＣ０１）または１０日間（ＮＣ０２、ＮＣ０３、ＮＣ０５、ＮＣ０６）経口投与した。１４日目、２８日目、４２日目及び６７〜８４日目に、ＣＳＦサンプルを得た。ＧＣ−ＭＳによって、各ＣＳＦサンプルにおける遊離ロイシンと総タンパク質の割合を測定した。抗タウ抗体による免疫沈降法とトリプシン消化後、ＬＣ−ＭＳを用いて、各ＣＳＦサンプル中の１３Ｃ６ロイシン標識タウと非標識タウを測定した。標識タウの定量には、ＴＰＳＬＰＴＰＰＴＲ（配列番号２）を用いた。（Ａ）はＮＣ０１、（Ｂ）はＮＣ０２、（Ｃ）はＮＣ０３、（Ｄ）はＮＣ０５、（Ｅ）はＮＣ０６である。各パネルにおいては、遊離ロイシン（四角）、総タンパク質（ダイヤモンド）及びタウトリプシンペプチドＴＰＳＬＰＴＰＰＴＲ（配列番号２、三角）の割合である。
【図５】図５Ａ〜Ｂは、１０日間、１３Ｃ６−ロイシンで経口標識し、ＣＳＦサンプルを採取した６人の参加者（すなわち、ＮＣ０２、ＮＣ０３、ＮＣ０５、ＮＣ０６、ＮＣ０７及びＮＣ０８）に対するタウＳＩＬＫ分析を示すグラフを示している。（Ａ）は、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）−ＭＳによって測定した血漿中の遊離ロイシンであり、（Ｂ）は、液体クロマトグラフィーＬＣ／ＭＳを用いて、トリプリケートで測定したＣＳＦ中の１３Ｃ６ロイシン標識タウである。
【図６】図６Ａ〜Ｄは、ある１人の対象におけるタウＳＩＬＫのコンパートメントモデルの一実施形態を示す図とグラフを示している。（Ａ）血漿中ロイシン、ＣＳＦ中タウ、ＣＳＦ中総タンパク質及び血漿中総タンパク質のトレーサー標識動態を説明するコンパートメントモデルを示す概略図である。代謝回転の遅い別のタンパク質ＳＯＤ１であって、サンプルにおいてその動態を測定したものも、比較のためにモデルに含めた。このモデルは、一次速度定数ｋによって連結された一連のコンパートメントを含み、これらの定数は、１日当たりにコンパートメントｉに輸送されるコンパートメントｊの割合を反映している。（Ｂ）血漿中ロイシンのトレーサー標識動態である。このモデルでは、１０日間で、経口トレーサーが３倍／日で血漿中に現れることから始まり、全身血漿中タンパク質プールが、トレーサーの摂取から８４日までの血漿中ロイシンの経時変化の形を説明する。脳（ＣＳＦを含む）と血漿中のタンパク質は、血漿からトレーサーロイシンを取り込む。したがって、血漿中ロイシンの経時変化の形により、これらのタンパク質の形成の際のトレーサーアベイラビリティの経時変化が定められる。（Ｃ）ＣＳＦ中タウとＳＯＤ１のトレーサー標識動態である。各タンパク質のＳＩＬＫ曲線の形は、その代謝回転比速度（ＦＴＲ）によって一意に決まる。タウのＦＴＲは０．０４９プール／日であり、ＳＯＤ１のＦＴＲは０．０３９プール／日である。（Ｄ）ＣＳＦ中総タンパク質と血漿中総タンパク質のトレーサー標識動態である。
【図７】図７Ａ〜Ｇは、タウの１３Ｃ６経口標識のコンパートメントモデル化の一実施形態を示す図とグラフを示している。（Ａ）このモデルは、一次速度定数ｋ（ｉ，ｊ）によって連結された一連のコンパートメント（ｑ１〜ｑ３）からなり、これらの定数は、１日当たりにコンパートメントｉに輸送されるコンパートメントｊの割合を反映している。このモデルは、参加者全員の血漿中遊離ロイシン（緑）とＣＮＳ中タウ（赤）の標識にあてはめられている。Ｙ軸は、遊離１３Ｃ−ロイシンと１３Ｃ−ロイシン標識ＣＳＦ中タウである。Ｘ軸は、時間（日）である。ＮＣ０２（Ｂ）、ＮＣ０３（Ｃ）、ＮＣ０５（Ｄ）、ＮＣ０６（Ｅ）、ＮＣ０７（Ｆ）及びＮＣ０８（Ｇ）のモデルが示されている。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、中枢神経系（ＣＮＳ）におけるタウ代謝の動態を割り出す方法を含む。本発明の方法を用いることによって、当業者は、タウの代謝の考え得る変化を調べることができるようになり得る。ある治療レジメンによって、タウの代謝の変化を必要としている対象において、タウの代謝が変化するか判断できるという点で、本発明の有用性は、当業者には明らかであろう。
【００１９】
Ｉ．タウタンパク質
タウタンパク質は、１つの遺伝子から選択的スプライシングにより作られるものである。多くの動物（ヒト、ヒト以外の霊長動物、齧歯動物、魚、ウシ、カエル、ヤギ及びニワトリが挙げられるが、これらに限らない）においては、その遺伝子は、ＭＡＰＴという。この遺伝子がＭＡＰＴと同定されていない動物では、当該技術分野において周知の方法によってホモログを同定できる。「タウタンパク質」、「タウ」及び「タウアイソフォーム」という用語は、同義的に使用してよい。タウタンパク質は、翻訳後修飾されていても、されていなくてもよい。例えば、タウは、リン酸化、ユビキチン化、グリコシル化及び糖化されることがあることが当該技術分野において知られている。
【００２０】
ヒトにおいては、タウには、ＭＡＰＴのエクソン２、３及び１０の選択的スプライシングにより生成される６つのアイソフォームが存在する。これらのアイソフォームの長さは、３５２〜４４１個のアミノ酸の範囲である。エクソン２及び３は、Ｎ末端における、２９個のアミノ酸の挿入配列（Ｎという）をそれぞれコードし、したがって、タウアイソフォームは、２Ｎ（両方が挿入されたもの）、１Ｎ（エクソン２のみ）または０Ｎ（両方とも挿入されないもの）であってよい。ヒトタウのアイソフォームにはいずれも、３リピートの微小管結合ドメイン（Ｒという）がある。Ｃ末端におけるエクソン１０の包含により、エクソン１０によってコードされる第４の微小管結合ドメインが包含される。すなわち、ヒトタウのアイソフォームは、４リピートの微小管結合ドメイン（エクソン１０が包含されたもの）または３リピートの微小管結合ドメイン（エクソン１０が包含されなかったもの）から構成されることがある。したがって、タウアイソフォームは、（２Ｎ，３Ｒ）、（２Ｎ，４Ｒ）、（１Ｎ，３Ｒ）、（１Ｎ，４Ｒ）、（０Ｎ，３Ｒ）または（０Ｎ，４Ｒ）であってよい。タウをコードする遺伝子の選択的スプライシングは、他の動物においても同様に生じる。
【００２１】
タウは、可溶性区画と不溶性区画に、単量体形態と凝集形態で、規則構造または不規則構造で、細胞内と細胞外で見ることができ、他のタンパク質または分子と複合体を形成することもある。タウの凝集形態の１つは、アミロイドである。アミロイドは、準結晶の規則的なタンパク質集合体である。アミロイドは概して、インビボまたはインビトロでクロスβ構造を有する。大半のクロスβ構造（ただし、全てではない）は、Ｃｏｎｇｏ  Ｒｅｄで染色して偏光光下で観察したときのアップルグリーン色の複屈折、またはＸ線繊維回折パターンによって同定してよい。アミロイドは、末梢もしくは中枢神経系、またはこれらの両方に存在し得る。アミロイドは、当該技術分野において周知である。例えば、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ．２０１２  Ｍａｒ  １６；１４８（６）：１１８８−２０３を参照されたい。
【００２２】
アミロイドは、疾患関連アミロイドであっても、なくてもよい。また、アミロイドは、２つ以上の疾患と関連し得る。「アミロイドーシス」という用語は、対象におけるアミロイドの沈着を指す。したがって、「タウアミロイドーシス」という用語は、対象におけるタウアミロイドの沈着を指す。タウアミロイドーシスは、当該技術分野において既知の方法によって臨床的に定義できる。例えば、脳内のタウ沈着の徴候は、タウ凝集体を選択的に標的とするイメージング剤（例えば、ＰＥＴイメージング剤、ＳＰＥＣＴイメージング剤またはＭＲＩイメージング剤）を用いることによって評価してよい。例えば、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ３１（３）：６０１−６１２，２０１２を参照されたい。別の例としては、Ａｖｉｄから市販されているトレーサーＴ−８０７が挙げられる。
【００２３】
タウアミロイドーシスの対象では、タウアミロイドーシスが関連する疾患の発症リスクも上昇する。タウアミロイドーシスが関連する疾患は、「タウオパチー」と称することもある。当該技術分野において既知のタウオパチーとしては、進行性核上麻痺、ボクサー認知症、慢性外傷性脳症、１７番染色体に連鎖しパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症、リティコ・ボディグ病、グアム型パーキンソン−認知症複合症、神経原線維変化優位な認知症、神経節膠腫、神経節細胞腫、髄膜血管腫症、亜急性硬化性全脳炎、鉛エンセファロパシー、結節性硬化症、ハレルフォルデン・スパッツ病、リポフスチン症、ピック病、大脳皮質基底核変性症、嗜銀顆粒性疾患（ＡＧＤ）、前頭側頭葉変性症、アルツハイマー病及び前頭側頭認知症が挙げられるが、これらに限らない。
【００２４】
ＩＩ．神経由来生体分子のインビボ代謝の測定方法
本発明は、対象におけるタウのインビボ代謝のインビトロ測定方法を提供する。「タウ代謝」とは、タウの合成、輸送、分解、修飾またはクリアランス速度をいずれかに組み合わせたものを指す。タウ代謝は、標識部分を投与された対象から得た１つ以上の生体サンプル中の標識タウと非標識タウの量を検出して、生体サンプルにおける標識タウの非標識タウに対する比率を割り出すことによって測定してよい。概して、生体サンプルにおける標識タウの非標識タウに対する比率は、ＣＮＳにおけるタウの代謝に正比例する。これらの測定値を用いて、タウ代謝の１つ以上のパラメーターを算出してもよい。具体的には、本発明は、タウ標識の動態を測定するために、１つ以上の生体サンプルを得る重大なタイムフレームを提供する。
【００２５】
（ａ）対象
本発明は、タウのインビボ代謝、すなわち、対象におけるタウの代謝の測定方法を提供する。本明細書で使用する場合、「対象」という用語は、哺乳動物を指す。好適な対象としては、ヒト、ペット、家畜、動物園の動物または研究用動物が挙げられるが、これらに限らない。ペットの非限定例としては、イヌまたはネコが挙げられる。家畜の非限定例としては、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジまたはヤギが挙げられる。研究用動物の非限定例としては、ヒト以外の霊長動物または齧歯動物が挙げられる。好ましい実施形態では、対象はヒトである。
【００２６】
本発明の方法を用いて、タウアミロイドーシスの対象におけるタウ代謝を特徴付けることができるが、本発明は、タウアミロイドーシスの対象に限定されないことは、当業者には明らかであろう。タウ代謝の変化が、その疾患、障害またはプロセスの臨床徴候または症状に寄与することが知られているかまたは考えられているいずれの疾患、障害またはプロセスも含め、いずれかの疾患、障害またはプロセスを有する対象におけるタウ代謝を特徴付けるために、本発明の方法を用いてよいことが想定されている。加えて、健常な対象における正常なタウ代謝を特徴付けるために、本発明の方法を用いてよいことが想定されている。いくつかの実施形態では、対象は、タウアミロイドーシスではない対象であり、その対象は、認知症、軽度認知症、中度認知症または重度認知症ではない。いくつかの実施形態では、対象は、タウアミロイドーシスの対象であり、その対象は、認知症、軽度認知症、中度認知症または重度認知症ではない。特定の実施形態では、認知症は、アルツハイマー型認知症、血管性認知症、レビー小体型認知症、混合型認知症、パーキンソン病型認知症及び前頭側頭認知症からなる群から選択したタイプのものである。いくつかの実施形態では、対象は、タウアミロイドーシスではない対象であり、その対象は、認知症、軽度認知症、中度認知症または重度認知症ではない。特定の実施形態では、認知症は、アルツハイマー型認知症、血管性認知症、レビー小体型認知症、混合型認知症、パーキンソン病型認知症及び前頭側頭認知症からなる群から選択したタイプのものである。認知症の診断を行うためのいずれかの好適な評価スケールを用いてよい。
【００２７】
（ｂ）標識部分
タウ代謝は、標識部分、好ましくは標識アミノ酸を投与された対象において測定する。異なるいくつかの部分を用いて、タウを標識してよい。一般的に言えば、本発明の方法で典型的に用いられる２種類の標識部分は、放射性同位体と非放射性（安定）同位体である。好ましい実施形態では、非放射性同位体を用いてよく、その同位体を質量分析法によって測定してよい。好ましい安定同位体としては、重水素２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏ、１８Ｏ、３３Ｓ、３４Ｓまたは３６Ｓが挙げられるが、一般的に見られる天然型よりも中性子が多いかまたは少ないことによって、原子の質量を変化させる多くの他の安定同位体も有効であることが認識されている。好適な標識は概して、検査下で、タウの質量を変化させて、質量分析計で検出できるようにする。一実施形態では、標識部分は、非放射性同位体を含むアミノ酸であり、標識タウの量を質量分析法によって測定する。好ましい実施形態では、非放射性同位体は１３Ｃである。別の実施形態では、放射性同位体を用いてよく、標識タウの量をシンチレーションカウンターで測定してよい。１つ以上標識部分を同時または順次に用いてよい。
【００２８】
いくつかの標識アミノ酸を用いて、タウを標識してよいことは当業者には明らかであろう。概して、アミノ酸の選択は、（１）そのアミノ酸が概して、対象となるタンパク質またはペプチドの少なくとも１つの残基に存在すること、（２）そのアミノ酸が概して、タンパク質合成部位まで迅速に到達できるとともに、ＣＮＳで合成されるタンパク質の場合には、血液脳関門を越えて迅速に平衡化できること、（３）そのアミノ酸が理想上は、必須アミノ酸（体内で産生されないアミノ酸）であってよく、その結果、より高い標識率を得ることができること（非必須アミノ酸も用いてよいが、測定の精度が下がる可能性が高くなる）、（４）そのアミノ酸標識が、所定の投与量において、概して、対象となるタンパク質の代謝に影響を及ぼさないこと、及び（５）所望のアミノ酸の入手可能性（すなわち、いくつかのアミノ酸は、他のアミノ酸よりも、かなり高額か、または製造が困難である）といった様々な要因に基づく。ＣＮＳで合成されるタンパク質を標識するには、ロイシンとフェニルアラニンが、好ましいアミノ酸である。一実施形態では、１３Ｃ６−フェニルアラニンを用いて、タウを標識する。別の実施形態では、１３Ｃ６−ロイシンを用いて、タウを標識する。
【００２９】
標識アミノ酸（非放射性同位体及び放射性同位体の両方）の供給業者は数多く存在する。概して、標識アミノ酸は、生物または合成により作製してよい。生物により作製されるアミノ酸は、その生物がタンパク質を産生するときにアミノ酸に組み込まれる１３Ｃ、１５Ｎまたは別の同位体の富化混合物中で生育した生物（例えばコンブ／海藻）から得てよい。続いて、そのアミノ酸を分離及び精製する。あるいは、アミノ酸は、既知の合成化学プロセスによって作製してもよい。
【００３０】
（ｃ）標識部分の投与
標識部分は、いくつかの方法によって対象に投与してよい。好適な投与方法としては、静脈内投与、動脈内投与、皮下投与、腹腔内投与、筋内投与または経口投与が挙げられる。好ましい実施形態では、標識部分は標識アミノ酸であり、その標識アミノ酸は、静脈内注入によって投与する。別の実施形態では、標識部分は標識アミノ酸であり、その標識アミノ酸は、経口投与する。
【００３１】
標識部分の量（または投与量）は、投与期間と投与頻度と同様に、変化できるとともに、変化することになる。標識部分は、対象に１日に１回以上（例えば、１日に１回、２回、３回、４回、５回、またはそれ以上）、１日以上の日程で（例えば１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日またはそれ以上）投与してよい。各ケースでは、標識部分は、ある期間をかけてゆっくり投与しても、大量の単回投与量として投与してもよい。標識タウが、確実に定量できる量で生体サンプルに存在するように、標識部分は、十分な量かつ十分な期間投与しなければならない。いずれのケースにおいても、「０日目」とは、標識初日を指し、「１日目」とは、を指す。
【００３２】
標識タウの量は、投与標識率と標識期間に左右される（また、投与標識率と標識期間によって推定される）。一般的に言えば、標識タウの量は、投与標識率に標識期間を乗じた値とほぼ等しくなる。換言すると、標識時間の長さは、標識アミノ酸の非標識アミノ酸に対する割合（例えば１０％、５０％または１００％）と逆相関する。同じ量のタウ標識を得るには、標識時間が短いほど、標識アミノ酸の量を増やす必要がある。タウの代謝回転速度が遅いことにより、典型的には、標識タウの高感度な定量方法（例えば＜５％）及び／または長い標識期間（例えば＞９時間）が必要となる。
【００３３】
標識タウを確実に定量するのに十分な標識時間は、生体サンプルによって変わり得る。例えば、血液サンプルを用いるときに必要な標識時間は、ＣＳＦサンプルにおける同じタウアイソフォームを確実に定量するのに必要な時間よりも短くなり得る。
【００３４】
確実な定量のために必要な標識タウの量は、定量方法の感度の関数である。現行の質量分析方法は、０．０１〜０．２％ほどの低さの標識タウを測定することができるが、約１％〜約２％の標識タウが好ましい。しかしながら、これらの測定は、技術の進歩により、向上する（すなわち、更に低レベルの標識タウを測定できる）可能性が高い。他の検出方法による確実な定量のために必要な標識タウの割合は、日常的な実験によって容易に割り出すことができ、本明細書における教示に基づき、標識プロトコールを修正することができることは当業者には明らかであろう。
【００３５】
いくつかの実施形態では、標識アミノ酸は、対象に、１日以上の日程で、静脈内または経口投与してよい。例えば、標識アミノ酸は、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日またはそれ以上の日程で投与してよい。標識アミノ酸の１日当たりの総投与量を数回に分け、各投与間の時間間隔がほとんどない状態で、少ない量で順次投与してもよく、または、１日を通じて複数回投与を等間隔または不等間隔で行ってもよい。各投与間の時間間隔の長さは、数秒、数分または数時間であってよい。静脈内投与するときには、ある投与量の標識アミノ酸を数分から数時間の期間にわたって投与してよく、その期間としては、少なくとも１０分、少なくとも２０分、少なくとも３０分、少なくとも１．０時間、少なくとも１．５時間、少なくとも２．０時間、少なくとも２．５時間、少なくとも３．０時間、少なくとも３．５時間、少なくとも４．０時間、少なくとも４．５時間、少なくとも５．０時間、少なくとも５．５時間、少なくとも６．０時間、少なくとも６．５時間、少なくとも７．０時間、少なくとも７．５時間、少なくとも８．０時間、少なくとも８．５時間、少なくとも９．０時間、少なくとも９．５時間、少なくとも１０．０時間、少なくとも１０．５時間、少なくとも１１．０時間、少なくとも１１．５時間または少なくとも１２時間が挙げられるが、これらに限らない。別の態様では、ある投与量の標識アミノ酸を約１時間〜約１２時間または約３時間〜約１５時間の期間にわたって静脈内投与してよい。別の態様では、ある投与量の標識アミノ酸を約１時間〜約６時間、約６時間〜約１２時間または約９時間〜約１５時間の期間にわたって静脈内投与してよい。別の態様では、ある投与量の静脈内標識アミノ酸を約１０分〜約３０分、約１０分〜約１時間または約３０分〜約３時間の期間にわたって投与してよい。別の態様では、ある投与量の標識アミノ酸を約１時間〜約３時間、約３時間〜約６時間、約６時間〜約９時間の期間にわたって静脈内投与してよい。別の態様では、ある投与量の標識アミノ酸を約９時間〜約１２時間、約１０時間〜約１３時間または約１２時間〜約１５時間、静脈内投与してよい。経口投与するときには、各投与量の標識アミノ酸を単回投与または多回数投与として、１日以上の日程で投与してよい。多回数経口投与を順次行うか、または各投与間に、ある長さの時間間隔を置いてもよい。各経口投与間の時間間隔の長さは、数秒、数分または数時間であってよい。好ましい実施形態では、標識アミノ酸を経口投与するときには、対象に飲料として供給する。例示的な一実施形態では、標識タウを検出するために、標識アミノ酸を２０％で少なくとも９時間、少なくとも１０時間、少なくとも１１時間、少なくとも１２時間またはそれ以上の時間投与してよい。別の例示的な実施形態では、標識アミノ酸を５日間、６日間、７日間、８日間、９日間または１０日間、１日当たり約３％〜約４％の標識アミノ酸で、毎日投与してよい。
【００３６】
単一の対象に、２つ以上の標識を用いてよいことは当業者には明らかであろう。これにより、同じ生体分子の多重標識が可能になり、その生体分子の様々な時点における産生またはクリアランスに関する情報を得ることができる。例えば、第１の標識を最初の期間にわたって対象に供給してから、薬理作用剤（薬剤）を投与してよく、続いて、第２の標識を投与してよい。概して、この対象から得たサンプルの分析により、薬剤投与前と薬剤投与後の代謝の測定値が得られ、同じ対象における薬剤の薬力学的効果が直接測定される。
【００３７】
あるいは、生体分子の標識を増やすとともに、より広範な生体分子の標識を得るために、多重標識を同じ時点に用いてもよい。
【００３８】
（ｄ）生体サンプル
測定する標識タウは、対象から得た生体サンプル内にある。好適な生体サンプルとしては、標識タウを検出できる体液または組織が挙げられるが、これらに限らない。例えば、いくつかの実施形態では、生体サンプルは脳脊髄液（ＣＳＦ）である。別の実施形態では、生体サンプルは間質液（ＩＳＦ）である。更に別の実施形態では、生体サンプルは血液サンプルである。本明細書で使用する場合、「血液」とは、全血、血漿または血清を指す。別の実施形態では、生体サンプルは組織サンプルである。好適な組織サンプルとしては、脳組織と脊髄組織が挙げられるが、これらに限らない。
【００３９】
脳脊髄液は、ＣＳＦカテーテルを留置した状態または留置しない状態で、腰椎穿刺によって得てよい。血液は、静脈内カテーテルを用いるかもしくは用いずに静脈穿刺によって、または指先採血（もしくはその類似法）によって採取してよいとともに、当該技術分野において既知の方法に従って処理してよい。標準的な適正製造基準（ＧＭＰ）の方法を用いて直接採取することによって、他のタイプのサンプルを採取してもよい。生体サンプルは、すぐに用いても、凍結して無期限に保存してもよい。
【００４０】
第１の生体サンプルは、対象におけるベースラインを得るために、標識の投与前に、対象から採取してよい。あるいは、標識の投与前に、第１の生体サンプルを対象から採取しないときには、ベースラインサンプルの同位体分布が正常であると推測することができる。標識の投与後、１つ以上のサンプルを対象から得てよい。生体サンプルは、２日超、３日超、４日超、５日超、６日超、７日超、８日超、９日超または１０日超にわたって採取してよい。あるいは、生体サンプルは、少なくとも２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間または１２週間にわたって採取してもよい。いずれのケースにおいても、「０日目」とは標識初日を指し、標識初日は、サンプル採取初日であってもなくてもよい。概して、標識段階中に得た生体サンプルを用いて、タウの合成速度を割り出してよく、クリアランス段階中に採取した血液サンプルを用いて、タウのクリアランス速度を割り出してよい。加えて、タウ標識曲線の全体にわたる様々な時点に得た生体サンプルを用いて、タウ代謝の他の態様（例えば、標識タウのピーク時間、標識タウのピーク量、絶対定量値、相対標識値、代謝回転比速度）を割り出してよい。当業者には明らかなように、サンプルの数とタイミングは概して、分析の種類、標識段階の長さ、対象となるタウタンパク質、生体サンプル、検出の種類、対象などといった多くの要因によって決定し得る。
【００４１】
タウ標識の動態曲線は、標識段階の長さから影響を受けることがあるが、タウの動態（例えば、産生、クリアランス、代謝回転速度）は実質的に変化しない。実施例に示されているように、標識タウは、５日の標識後では、１０日の標識よりも早くピークに達するとともに、ピーク値が低い。同様に、標識タウは、１０日超の標識では、１０日の標識よりも遅くピークに達するとともに、ピーク値が高い。しかしながら、同様の対象群（例えば、年齢及び／または疾患の状態が合致する群）では、曲線の形が概ね同じになる。したがって、当業者は、本明細書に示されているデータを用いれば、標識プロトコールに基づき、好適なサンプリングタイムフレームを選択できるであろう。
【００４２】
タウ代謝の動態は、生体サンプルの種類によって異なることもある。例えば、血液サンプルで測定されるタウ代謝の動態は、ＣＳＦサンプルで測定される動態よりも速いことが予想される。例えば、血液サンプルで測定されるタウ代謝の動態は、ＣＳＦサンプルと比べて、約２〜約１５倍または約５〜約１０倍速いことがある。
【００４３】
いくつかの実施形態では、生体サンプルは、ＣＳＦサンプルまたは血液サンプルであり、０日目と２０日目との間、１日目と２０日目との間または２日目と２０日目との間に、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個のサンプルを採取する。例えば、０日目、１日目、２日目、３日目、４日目、５日目、６日目、７日目、８日目、９日目、１０日目、１１日目、１２日目、１３日目、１４日目、１５日目、１６日目、１７日目、１８日目、１９日目もしくは２０日目、またはこれらのいずれかに組み合わせた日に、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個のＣＳＦサンプルを採取してよい。別の実施形態では、生体サンプルはＣＳＦサンプルであり、０日目と２０日目との間、１日目と２０日目との間または２日目と２０日目との間に、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個のサンプルを採取する。別の実施形態では、生体サンプルはＣＳＦサンプルであり、０日目と１５日目との間、１日目と１５日目との間、２日目と１５日目との間に、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個のサンプルを採取する。別の実施形態では、生体サンプルはＣＳＦサンプルであり、０日目と１０日目との間、１日目と１０日目との間または２日目と１０日目との間に、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個のサンプルを採取する。別の実施形態では、生体サンプルはＣＳＦサンプルであり、５日目と２０日目との間または５日目と１５日目との間に、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個のサンプルを採取する。生体サンプルがＣＳＦサンプルである実施形態では、０日目と２０日目との間でのサンプル採取を用いて、標識タウの産生速度、またはタウの産生と関連する代謝パラメーターを割り出してよい。生体サンプルが血液サンプルである実施形態では、標識タウの産生は、ＣＳＦにおける標識タウの産生よりも短いタイムフレームで行われる可能性が高くなる。
【００４４】
いくつかの実施形態では、生体サンプルはＣＳＦサンプルまたは血液サンプルであり、２０日目と４０日目との間に、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個のサンプルを採取する。例えば、２０日目、２１日目、２２日目、２３日目、２４日目、２５日目、２６日目、２７日目、２８日目、２９日目、３０日目、３１日目、３２日目、３３日目、３４日目、３５日目、３６日目、３７日目、３８日目、３９日目もしくは４０日目、またはこれらをいずれかに組み合わせた日に、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個のＣＳＦサンプルを採取してよい。別の実施形態では、生体サンプルはＣＳＦサンプルであり、２０日目と３５日目との間、２０日目と３０日目との間または２０日目と２５日目との間に、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個のサンプルを採取する。別の実施形態では、生体サンプルはＣＳＦサンプルであり、２５日目と４０日目との間、２５日目と３５日目との間または２５日目と３０日目との間に、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個のサンプルを採取する。生体サンプルがＣＳＦサンプルである実施形態では、２０日目と４０日目との間のサンプル採取を用いて、標識タウの産生ピークまたは標識タウのピーク産生と関連する代謝パラメーター（例えば、ピークまでの時間、ピーク高さなど）を割り出してよい。生体サンプルが血液サンプルである実施形態では、標識タウの産生ピークは、ＣＳＦにおけるよりも早く現れる可能性が高くなる。標識タウの産生ピークが合理的に分かっているときには、２０日目と４０日目との間のサンプル採取を用いて、標識タウの産生と標識タウのクリアランスとに関連する代謝パラメーターを割り出してよい（例えば、標識タウの産生ピーク前に採取したサンプルを用いて、標識タウの産生と関連する代謝パラメーターを算出してよく、標識タウの産生ピーク後に採取したサンプルを用いて、標識タウのクリアランスと関連する代謝パラメーターを算出してよい）。
【００４５】
いくつかの実施形態では、生体サンプルはＣＳＦサンプルまたは血液サンプルであり、２５日目と４５日目との間に、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個のサンプルを採取する。例えば、２５日目、２６日目、２７日目、２８日目、２９日目、３０日目、３１日目、３２日目、３３日目、３４日目、３５日目、３６日目、３７日目、３８日目、３９日目、４０日目、４１日目、４２日目、４３日目、４４日目もしくは４５日目、またはこれらをいずれかに組み合わせた日に、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個のＣＳＦサンプルを採取してよい。別の実施形態では、生体サンプルはＣＳＦサンプルであり、２５日目と４０日目との間、２５日目と３５日目との間または２５日目と３０日目との間に、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個のサンプルを採取する。別の実施形態では、生体サンプルはＣＳＦサンプルであり、３０日目と４５日目との間、３０日目と４０日目との間または３０日目と３５日目との間に、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個のサンプルを採取する。生体サンプルがＣＳＦサンプルである実施形態では、２０日目と４０日目との間のサンプル採取を用いて、標識タウの産生ピークまたは標識タウのピーク産生と関連する代謝パラメーター（例えば、ピークまでの時間、ピーク高さなど）を割り出してよい。生体サンプルが血液サンプルである実施形態では、標識タウの産生ピークは、ＣＳＦにおけるよりも早く現れる可能性が高くなる。標識タウの産生ピークが合理的に分かっているときには、２５日目と４５日目との間のサンプル採取を用いて、標識タウの産生と標識タウのクリアランスとに関連する代謝パラメーターを割り出してもよい（例えば、標識タウの産生ピーク前に採取したサンプルを用いて、標識タウの産生と関連する代謝パラメーターを算出してよく、標識タウの産生ピーク後に採取したサンプルを用いて、標識タウのクリアランスと関連する代謝パラメーターを算出してよい）。
【００４６】
いくつかの実施形態では、生体サンプルはＣＳＦサンプルまたは血液サンプルであり、４０日目と１００日目との間に、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個のサンプルを採取する。例えば、４０日目、４１日目、４２日目、４３日目、４４日目、４５日目、４６日目、４７日目、４８日目、４９日目、５０日目、５１日目、５２日目、５３日目、５４日目、５５日目、５６日目、５７日目、５８日目、５９日目、６０日目、６１日目、６２日目、６３日目、６４日目、６５日目、６６日目、６７日目、６８日目、６９日目、７０日目、７１日目、７２日目、７３日目、７４日目、７５日目、７６日目、７７日目、７８日目、７９日目、８０日目、８１日目、８２日目、８３日目、８４日目、８５日目、８６日目、８７日目、８８日目、８９日目、９０日目、９１日目、９２日目、９３日目、９４日目、９５日目、９６日目、９７日目、９８日目、９９日目または１００日目に、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個のＣＳＦサンプルを採取してよい。いくつかの実施形態では、生体サンプルはＣＳＦサンプルであり、４０日目と９０日目との間、４０日目と８０日目との間、４０日目と７０日目との間または４０日目と６０日目との間に、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個のサンプルを採取する。別の実施形態では、生体サンプルはＣＳＦサンプルであり、５０日目と１００日目との間、５０日目と９０日目との間、５０日目と８０日目との間、５０日目と７０日目との間または５０日目と６０日目との間に、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個のサンプルを採取する。更に別の実施形態では、生体サンプルはＣＳＦサンプルであり、６０日目と１００日目との間、６０日目と９０日目との間、６０日目と８５日目との間、６０日目と８０日目との間または６０日目と７０日目との間に、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個のサンプルを採取する。更に別の実施形態では、生体サンプルはＣＳＦサンプルであり、７０日目と１００日目との間、７０日目と９５日目との間、７０日目と９０日目との間、７０日目と８５日目との間または７０日目と８０日目との間に、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個のサンプルを採取する。生体サンプルがＣＳＦサンプルである実施形態では、４０日目と１００日目との間のサンプル採取を用いて、標識タウの産生速度またはタウの産生と関連する代謝パラメーターを割り出してよい。生体サンプルが血液サンプルである実施形態では、標識タウのクリアランスは、ＣＳＦにおけるよりも早く開始され、ＣＳＦにおけるよりも早く完了する可能性が高くなる。
【００４７】
（ｅ）標識タウと非標識タウの量の検出
標識タウと非標識タウの好適な検出方法は、検査下のタウの形態及び／またはタウを標識するのに用いる標識部分の種類によって変化し得るとともに、変化することになる。標識部分が、放射性標識アミノ酸である場合には、検出方法は、シンチレーションカウンターであってよい。標識部分が、非放射性標識アミノ酸である場合には、検出方法は典型的には、非標識タンパク質に対する標識タンパク質の質量変化を検出するのに十分な感度でなければならない。好ましい実施形態では、質量分析法を用いて、標識タウと非標識タウとの間の質量差を検出する。特定の実施形態では、ガスクロマトグラフ質量分析法を使用する。代替的な実施形態では、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法を使用する。好ましい実施形態では、高分解能タンデム質量分析法を使用する。
【００４８】
検出前に、追加的な技法を用いて、生体サンプル中の他のタンパク質と生体分子から、標識タウと非標識タウを分離してよい。例えば、免疫沈降法を用いて、タウ（その断片を含む）を単離して、部分的または完全に精製してから、質量分析法によって分析してよい。タウタンパク質の他の分離または濃縮方法を単独で用いても、免疫沈降法と組み合わせて用いてもよい。例えば、クロマトグラフィーの技法を用いて、タウタンパク質（またはその断片）をサイズ、疎水性またはアフィニティーによって分離してよい。具体的には、クロマトグラフィーの工程を質量分析法と結びつける技法を用いてよい。例示的な一実施形態では、タウを免疫沈降させてから、高分解能タンデムＭＳユニットと連結した液体クロマトグラフィーシステムによって分析する。別の例示的な実施形態では、タウを免疫沈降させてから、エレクトロンスプレイイオン源を備えた高分解能タンデムＭＳユニットと連結した液体クロマトグラフィーシステム（ＬＣ−ＥＳＩ−タンデムＭＳ）によって分析する。
【００４９】
標識タウと非標識タウは、検出前に、更に小さいペプチドに切断してもよい。例えば、タウをプロテアーゼによって酵素的に切断して、いくつかの小さいペプチドを作製してよい。好適なプロテアーゼとしては、トリプシン、Ｌｙｓ−Ｎ、Ｌｙｓ−Ｃ及びＡｒｇ−Ｎが挙げられるが、これらに限らない。例示的な一実施形態では、標識タウと非標識タウを生体サンプルから完全または部分的に精製し、プロテアーゼによって酵素的に切断してから、高分解能タンデムＭＳユニットと連結した液体クロマトグラフィーシステムによって分析する。別の例示的な実施形態では、標識タウと非標識タウをプロテアーゼによって酵素的に切断し、完全または部分的に精製してから、高分解能タンデムＭＳユニットと連結した液体クロマトグラフィーシステムによって分析する。特定の例示的な実施形態では、タウを免疫沈降法によって完全または部分的に精製する。
【００５０】
本発明は、同じ生体サンプル中の多数のタウアイソフォームを同じ質量分析サンプルで同時に測定できることも提供する。すなわち、非標識タウと標識タウの両方の量を、多数のタウアイソフォームについて、別々または同時に検出及び測定することができる。したがって、本発明は、様々なアイソフォームの合成とクリアランスの変化の有用な大規模スクリーニング方法を提供するとともに、裏に潜む病態に関与するタンパク質の高感度な検出及び測定手段を提供する。
【００５１】
（ｆ）代謝分析
標識タウと非標識タウの量を検出したら、タウの相対標識値を算出してよい。本明細書で使用する場合、「相対標識値」は、標識タウの非標識タウに対する比率または標識タウの割合を指してよい。標識タウ、非標識タウの量またはタウの相対標識値を用いて、１つ以上の追加のタウ代謝パラメーターも算出してもよい。好適なタウ代謝パラメーターの非限定例としては、合成比速度、クリアランス比速度、絶対合成速度、絶対クリアランス速度、代謝回転比速度、ラグタイム、半減期、ピーク高さまでの時間、ピーク高さなどが挙げられる。これらのパラメーターの算出方法は、当該技術分野において周知であり、当業者は、本発明の方法とともに用いてよい標識の一次動態モデルに精通しているであろう。加えて、ラグタイム及び同位体トレーサー定常状態のような他のパラメーターを割り出して、タウの代謝及び生理作用の測定値として使用してもよい。また、そのデータに対してモデル化を行って、マルチコンパートメントモデルをあてはめて、コンパートメント間の移動を推定してもよい。当然ながら、選択する数学的モデル化の種類は、個々のタンパク質の合成パラメーターとクリアランスパラメーター（例えば、１プール、マルチプール、定常状態、非定常状態、コンパートメントモデル化など）によって決まることになる。概して、生体サンプルにおけるタウの相対標識値は、ＣＮＳにおけるタウの代謝に正比例する。例えば、産生段階中の標識タウの増大と、クリアランス段階中の標識タウの除去は、ＣＮＳにおけるタウの相対的な産生とクリアランスを反映している。したがって、標識及び／または非標識タウの測定値を用いて算出されるタウ代謝パラメーターも、ＣＮＳにおけるタウの代謝を反映している。
【００５２】
所定の時点における生体サンプル中の標識タウの量は、合成速度（すなわち、産生）またはクリアランス速度（すなわち、除去もしくは破壊）を含む、タウの代謝を反映している。本発明では、タウの合成が典型的には、標識タンパク質／非標識タンパク質の比率の経時的な増加速度に基づく（すなわち、勾配、指数あてはめ曲線またはコンパートメントモデルあてはめによって、タウ合成速度を定義する）ことが提供される。これらの算出には、最低１つのサンプルが典型的に必要となり（ベースライン標識を推定できる）、標識の経時的な増加速度を算出するには、２つ以上のサンプルが好ましい。逆に、標識アミノ酸の投与の終了後では、標識タンパク質の非標識タンパク質に対する比率の低下速度は、典型的には、そのタンパク質のクリアランス速度を反映している。これらの算出には、最低１つのサンプルが典型的には必要となり（ベースライン標識を推定できる）、タウからの標識の経時的な減少速度を算出するには、２つ以上のサンプルが好ましい。
【００５３】
例示的な一実施形態では、実施例に示されているように、１３Ｃ６−ロイシンを対象に５日または１０日間、経口投与し、１回目の標識投与の２日後よりも後の時点に、少なくとも１つの生体サンプルを採取することによって、タウのインビボ代謝を測定する。生体サンプルは、ＣＳＦから採取してよい。生体サンプルにおける標識タウと非標識タウの量は典型的には、免疫沈降後に、ＬＣ−ＥＳＩ−タンデムＭＳによって割り出す。これらの測定値から、標識タウと非標識タウの量を割り出してよく、これらの測定値により、タウの相対標識値、合成速度、クリアランス速度などの、タウ動態の代謝パラメーターを割り出すことができるようになる。
【００５４】
（ｇ）好ましい実施形態
対象におけるタウの代謝の測定方法であって、（ａ）少なくとも１回のボーラスまたは少なくとも１回の注入の形で、少なくとも１つの標識アミノ酸を１日当たりの総投与量約０．１ｇ〜約１０ｇで、対象に少なくとも３日間、少なくとも５日間または少なくとも１０日間投与することと、（ｂ）１日目もしくは２日目と２０日目との間、２０日目と４０日目との間、４０日目と１００日目との間またはこれらを組み合わせた日程に、少なくとも１つの生体サンプルを対象から採取することと、（ｃ）質量分析法によって、各生体サンプルにおける標識タウの量または標識タウと非標識タウの量を検出及び測定することと、（ｄ）工程（ｃ）から得た測定値を用いてタウの代謝を算出することであって、所定の時点における生体サンプル中の標識タウの量（任意に応じて、タウの相対標識値として表される）がタウの代謝を反映している、こととを含む方法。あるいは、１日当たりの投与量は、約０．５ｇ〜約５ｇの標識アミノ酸、０．５ｇ〜約１ｇの標識アミノ酸または約１ｇ〜約５ｇの標識アミノ酸であることができる。各実施形態では、１日当たりの投与量を数回に分け、その少ない投与量ずつ一気に投与しても、１日を通じて等間隔または不等間隔で投与してもよい。好ましい生体サンプルとしては、ＣＳＦサンプル、血液サンプルまたはこれらの組み合わせが挙げられる。この方法は、工程（ｂ）と工程（ｃ）との間に、タウをプロテアーゼによって酵素的に切断すること、及び／またはタウもしくはその断片を完全または部分的に精製することを更に含んでもよい。
【００５５】
対象におけるタウの代謝の測定方法であって、（ａ）少なくとも１回のボーラスまたは少なくとも１回の注入の形で、少なくとも１つの標識アミノ酸を対象に投与することであって、標識を対象に、２日以上の日程で、０日目と３日目前後との間、好ましくは０日目と５日目前後との間、より好ましくは０日目と１０日目前後との間に、１日当たりの総投与量約０．１ｇ〜約１０ｇで投与することと、（ｂ）１日目もしくは２日目と２０日目との間、２０日目と４０日目との間、４０日目と１００日目との間またはこれらを組み合わせた日程に、少なくとも１つの生体サンプルを対象から採取することと、（ｃ）質量分析法によって、各生体サンプルにおける標識タウの量または標識タウと非標識タウの量を検出及び測定することと、（ｄ）工程（ｃ）から得た測定値を用いてタウの代謝を算出することであって、所定の時点における生体サンプル中の標識タウの量（任意に応じて、タウの相対標識値として表される）がタウの代謝を反映している、こととを含む方法。あるいは、１日当たりの投与量は、約０．５ｇ〜約５ｇの標識アミノ酸、０．５ｇ〜約１ｇの標識アミノ酸または約１ｇ〜約５ｇの標識アミノ酸であることができる。好ましい生体サンプルとしては、ＣＳＦサンプル、血液サンプルまたはこれらの組み合わせが挙げられる。この方法は、工程（ｂ）と工程（ｃ）との間に、タウをプロテアーゼによって酵素的に切断すること、及び／またはタウもしくはその断片を完全または部分的に精製することを更に含んでもよい。
【００５６】
対象におけるタウの代謝の測定方法であって、（ａ）少なくとも１回のボーラスまたは少なくとも１回の注入の形で、少なくとも１つの標識アミノ酸を対象に投与することであって、標識を対象に、２日、３日、４日またはそれ以上の日程で、０日目と５日目前後との間、好ましくは０日目と１０日目前後との間に、１日当たりの総投与量約０．１ｇ〜約１０ｇで投与することと、（ｂ）１日目もしくは２日目と２０日目との間、２０日目と４０日目との間、４０日目と１００日目との間またはこれらを組み合わせた日程に、少なくとも１つの生体サンプルを対象から採取することと、（ｃ）質量分析法によって、各生体サンプルにおける標識タウの量または標識タウと非標識タウの量を検出及び測定することと、（ｄ）工程（ｃ）から得た測定値を用いてタウの代謝を算出することであって、所定の時点における生体サンプル中の標識タウの量（任意に応じて、タウの相対標識値として表される）がタウの代謝を反映している、こととを含む方法。あるいは、１日当たりの投与量は、約０．５ｇ〜約５ｇの標識アミノ酸、０．５ｇ〜約１ｇの標識アミノ酸または約１ｇ〜約５ｇの標識アミノ酸であることができる。各実施形態では、１日当たりの投与量を数回に分け、その少ない投与量ずつ一気に投与しても、１日を通じて等間隔または不等間隔で投与してもよい。好ましい生体サンプルとしては、ＣＳＦサンプル、血液サンプルまたはこれらの組み合わせが挙げられる。この方法は、工程（ｂ）と工程（ｃ）との間に、タウをプロテアーゼによって酵素的に切断すること、及び／またはタウもしくはその断片を完全または部分的に精製することを更に含んでもよい。
【００５７】
対象におけるタウの代謝の測定方法であって、（ａ）少なくとも１回のボーラスまたは少なくとも１回の注入の形で、少なくとも１つの標識アミノ酸を対象に投与することであって、標識を対象に、２日、３日、４日、５日、７日、８日または９日の日程で、０日目と１０日目前後との間に、１日当たりの総投与量約０．１ｇ〜約１０ｇで投与することと、（ｂ）１日目もしくは２日目と２０日目との間、２０日目と４０日目との間、４０日目と１００日目との間またはこれらを組み合わせた日程に、少なくとも１つの生体サンプルを対象から採取することと、（ｃ）質量分析法によって、各生体サンプルにおける標識タウの量または標識タウと非標識タウの量を検出及び測定することと、（ｄ）工程（ｃ）から得た測定値を用いてタウの代謝を算出することであって、所定の時点における生体サンプル中の標識タウの量（任意に応じて、タウの相対標識値として表される）がタウの代謝を反映している、こととを含む方法。あるいは、１日当たりの投与量は、約０．５ｇ〜約５ｇの標識アミノ酸、０．５ｇ〜約１ｇの標識アミノ酸または約１ｇ〜約５ｇの標識アミノ酸であることができる。各実施形態では、１日当たりの投与量を数回に分け、その少ない投与量ずつ一気に投与しても、１日を通じて等間隔または不等間隔で投与してもよい。好ましい生体サンプルとしては、ＣＳＦサンプル、血液サンプルまたはこれらの組み合わせが挙げられる。この方法は、工程（ｂ）と工程（ｃ）との間に、タウをプロテアーゼによって酵素的に切断すること、及び／またはタウもしくはその断片を完全または部分的に精製することを更に含んでもよい。
【００５８】
対象におけるタウの代謝の測定方法であって、（ａ）少なくとも１回のボーラスまたは少なくとも１回の注入の形で、少なくとも１つの標識アミノ酸を対象に、１日当たりの総投与量約０．１ｇ〜約１０ｇで、少なくとも３日間、少なくとも５日間または少なくとも１０日間投与することと、（ｂ）タウの半減期の計算に基づき、タウの半減期から±１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日または１０日に、少なくとも１つの生体サンプルを対象から採取することと、（ｃ）質量分析法によって、各生体サンプルにおける標識タウの量または標識タウと非標識タウの量を検出及び測定することと、（ｄ）工程（ｃ）から得た測定値を用いてタウの代謝を算出することであって、所定の時点における生体サンプル中の標識タウの量（任意に応じて、タウの相対標識値として表される）がタウの代謝を反映している、こととを含む方法。あるいは、１日当たりの投与量は、約０．５ｇ〜約５ｇの標識アミノ酸、０．５ｇ〜約１ｇの標識アミノ酸または約１ｇ〜約５ｇの標識アミノ酸であることができる。各実施形態では、１日当たりの投与量を数回に分け、その少ない投与量ずつ一気に投与しても、１日を通じて等間隔または不等間隔で投与してもよい。好ましい生体サンプルとしては、ＣＳＦサンプル、血液サンプルまたはこれらの組み合わせが挙げられる。この方法は、工程（ｂ）と工程（ｃ）との間に、タウをプロテアーゼによって酵素的に切断すること、及び／またはタウもしくはその断片を完全または部分的に精製することを更に含んでもよい。
【００５９】
対象におけるタウの代謝の測定方法であって、（ａ）少なくとも１回のボーラスまたは少なくとも１回の注入の形で、少なくとも１つの標識アミノ酸を対象に、１日当たりの総投与量約０．１ｇ〜約１０ｇで、少なくとも３日間、少なくとも５日間または少なくとも１０日間投与することと、（ｂ）タウの半減期の計算に基づき、タウの半減期から±１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日または１０日のみに、１つ以上の生体サンプルを対象から採取する（すなわち、このタイムフレーム以外では、サンプルを採取しない）ことと、（ｃ）質量分析法によって、各生体サンプルにおける標識タウの量または標識タウと非標識タウの量を検出及び測定することと、（ｄ）工程（ｃ）から得た測定値を用いてタウの代謝を算出することであって、所定の時点における生体サンプル中の標識タウの量（任意に応じて、タウの相対標識値として表される）がタウの代謝を反映している、こととを含む方法。あるいは、１日当たりの投与量は、約０．５ｇ〜約５ｇの標識アミノ酸、０．５ｇ〜約１ｇの標識アミノ酸または約１ｇ〜約５ｇの標識アミノ酸であることができる。各実施形態では、１日当たりの投与量を数回に分け、その少ない投与量ずつ一気に投与しても、１日を通じて等間隔または不等間隔で投与してもよい。好ましい生体サンプルとしては、ＣＳＦサンプル、血液サンプルまたはこれらの組み合わせが挙げられる。この方法は、工程（ｂ）と工程（ｃ）との間に、タウをプロテアーゼによって酵素的に切断すること、及び／またはタウもしくはその断片を完全または部分的に精製することを更に含んでもよい。
【００６０】
対象におけるタウの代謝のインビトロ測定方法であって、（ａ）質量分析法によって、対象から得た各生体サンプルにおける標識タウの量または標識タウと非標識タウの量を検出及び測定することと、（ｂ）工程（ａ）で割り出した、標識タウの量または標識タウと非標識タウの量を用いてタウの代謝を算出することであって、所定の時点における生体サンプル中の標識タウの量（任意に応じて、タウの相対標識値として表される）がタウの代謝を反映している、こととを含み、（ｉ）その標識が、少なくとも１回のボーラスまたは少なくとも１回の注入として、０日目から少なくとも３日目前後まで、好ましくは０日目から少なくとも５日目前後まで、より好ましくは０日目から少なくとも１０日目前後まで、毎日投与したものであり、（ｉｉ）各生体サンプルが、１日目もしくは２日目と２０日目との間、２０日目と４０日目との間、４０日目と１００日目との間またはこれらを組み合わせた日程に、対象から採取したものである方法。あるいは、１日当たりの投与量は、約０．５ｇ〜約５ｇの標識アミノ酸、０．５ｇ〜約１ｇの標識アミノ酸または約１ｇ〜約５ｇの標識アミノ酸であることができる。各実施形態では、１日当たりの投与量を数回に分け、その少ない投与量ずつ一気に投与しても、１日を通じて等間隔または不等間隔で投与してもよい。好ましい生体サンプルとしては、ＣＳＦサンプル、血液サンプルまたはこれらの組み合わせが挙げられる。この方法は、工程（ａ）と工程（ｂ）との間に、タウをプロテアーゼによって酵素的に切断すること、及び／またはタウもしくはその断片を完全または部分的に精製することを更に含んでもよい。
【００６１】
対象におけるタウの代謝のインビトロ測定方法であって、（ａ）質量分析法によって、対象から得た各生体サンプルにおける標識タウの量または標識タウと非標識タウの量を検出及び測定することと、（ｂ）工程（ａ）で割り出した、標識タウの量または標識タウと非標識タウの量を用いてタウの代謝を算出することであって、所定の時点における生体サンプル中の標識タウの量（任意に応じて、タウの相対標識値として表される）がタウの代謝を反映している、こととを含み、（ｉ）その標識が、少なくとも１回のボーラスまたは少なくとも１回の注入として、２日以上の日程で、０日目と３日目前後との間、好ましくは０日目と５日目前後との間、より好ましくは０日目と１０日目前後との間に投与したものであり、（ｉｉ）各生体サンプルが、１日目もしくは２日目と２０日目との間、２０日目と４０日目との間、４０日目と１００日目との間またはこれらを組み合わせた日程に、対象から採取したものである方法。あるいは、１日当たりの投与量が、約０．５ｇ〜約５ｇの標識アミノ酸、０．５ｇ〜約１ｇの標識アミノ酸または約１ｇ〜約５ｇの標識アミノ酸であることができる。各実施形態では、１日当たりの投与量を数回に分け、その少ない投与量ずつ一気に投与しても、１日を通じて等間隔または不等間隔で投与してもよい。好ましい生体サンプルとしては、ＣＳＦサンプル、血液サンプルまたはこれらの組み合わせが挙げられる。この方法は、工程（ａ）と工程（ｂ）との間に、タウをプロテアーゼによって酵素的に切断すること、及び／またはタウもしくはその断片を完全または部分的に精製することを更に含んでもよい。
【００６２】
対象におけるタウの代謝のインビトロ測定方法であって、（ａ）質量分析法によって、対象から得た各生体サンプルにおける標識タウの量または標識タウと非標識タウの量を検出及び測定することと、（ｂ）工程（ａ）で割り出した、標識タウの量または標識タウと非標識タウの量を用いてタウの代謝を算出することであって、所定の時点における生体サンプル中の標識タウの量（任意に応じて、タウの相対標識値として表される）がタウの代謝を反映している、こととを含み、（ｉ）その標識を少なくとも１回のボーラスまたは少なくとも１回の注入として、対象に、２日、３日、４日またはそれ以上の日程で、０日目と５日目前後との間、好ましくは０日目と１０日目前後との間に投与し、（ｉｉ）各生体サンプルが、１日目もしくは２日目と２０日目との間、２０日目と４０日目との間、４０日目と１００日目との間またはこれらを組み合わせた日程に、対象から採取したものである方法。あるいは、１日当たりの投与量は、約０．５ｇ〜約５ｇの標識アミノ酸、０．５ｇ〜約１ｇの標識アミノ酸または約１ｇ〜約５ｇの標識アミノ酸であることができる。各実施形態では、１日当たりの投与量を数回に分け、その少ない投与量ずつ一気に投与しても、１日を通じて等間隔または不等間隔で投与してもよい。好ましい生体サンプルとしては、ＣＳＦサンプル、血液サンプルまたはこれらの組み合わせが挙げられる。この方法は、工程（ａ）と工程（ｂ）との間に、タウをプロテアーゼによって酵素的に切断すること、及び／またはタウもしくはその断片を完全または部分的に精製することを更に含んでもよい。
【００６３】
対象におけるタウの代謝のインビトロ測定方法であって、（ａ）質量分析法によって、対象から得た各生体サンプルにおける標識タウの量または標識タウと非標識タウの量を検出及び測定することと、（ｂ）工程（ａ）で割り出した、標識タウの量または標識タウと非標識タウの量を用いてタウの代謝を算出することであって、所定の時点における生体サンプル中の標識タウの量（任意に応じて、タウの相対標識値として表される）がタウの代謝を反映している、こととを含み、（ｉ）その標識を少なくとも１回のボーラスまたは少なくとも１回の注入として、対象に、２日、３日、４日、５日、７日、８日または９日の日程で、０日目と１０日目前後との間に投与し、（ｉｉ）各生体サンプルが、１日目もしくは２日目と２０日目との間、２０日目と４０日目との間、４０日目と１００日目との間またはこれらを組み合わせた日程に、対象から採取したものである方法。あるいは、１日当たりの投与量は、約０．５ｇ〜約５ｇの標識アミノ酸、０．５ｇ〜約１ｇの標識アミノ酸または約１ｇ〜約５ｇの標識アミノ酸であることができる。各実施形態では、１日当たりの投与量を数回に分け、その少ない投与量ずつ一気に投与しても、１日を通じて等間隔または不等間隔で投与してもよい。好ましい生体サンプルとしては、ＣＳＦサンプル、血液サンプルまたはこれらの組み合わせが挙げられる。この方法は、工程（ａ）と工程（ｂ）との間に、タウをプロテアーゼによって酵素的に切断すること、及び／またはタウもしくはその断片を完全または部分的に精製することを更に含んでもよい。
【００６４】
対象におけるタウの代謝のインビトロ測定方法であって、（ａ）質量分析法によって、対象から得た各生体サンプルにおける標識タウの量または標識タウと非標識タウの量を検出及び測定することと、（ｂ）工程（ａ）で割り出した、標識タウの量または標識タウと非標識タウの量を用いてタウの代謝を算出することであって、所定の時点における生体サンプル中の標識タウの量（任意に応じて、タウの相対標識値として表される）がタウの代謝を反映している、こととを含み、（ｉ）その標識が、少なくとも１回のボーラスまたは少なくとも１回の注入として、０日目から少なくとも３日目前後まで、好ましくは０日目から少なくとも５日目前後まで、より好ましくは０日目から少なくとも１０日目前後まで、毎日投与したものであり、（ｉｉ）各生体サンプルが、タウの半減期の計算に基づき、タウの半減期から±１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日または１０日に、対象から採取したものである方法。あるいは、１日当たりの投与量は、約０．５ｇ〜約５ｇの標識アミノ酸、０．５ｇ〜約１ｇの標識アミノ酸または約１ｇ〜約５ｇの標識アミノ酸であることができる。各実施形態では、１日当たりの投与量を数回に分け、その少ない投与量ずつ一気に投与しても、１日を通じて等間隔または不等間隔で投与してもよい。好ましい生体サンプルとしては、ＣＳＦサンプル、血液サンプルまたはこれらの組み合わせが挙げられる。この方法は、工程（ａ）と工程（ｂ）との間に、タウをプロテアーゼによって酵素的に切断すること、及び／またはタウもしくはその断片を完全または部分的に精製することを更に含んでもよい。
【００６５】
対象におけるタウの代謝のインビトロ測定方法であって、（ａ）質量分析法によって、対象から得た各生体サンプルにおける標識タウの量または標識タウと非標識タウの量を検出及び測定することと、（ｂ）工程（ａ）で割り出した、標識タウの量または標識タウと非標識タウの量を用いてタウの代謝を算出することであって、所定の時点における生体サンプル中の標識タウの量（任意に応じて、タウの相対標識値として表される）がタウの代謝を反映している、こととを含み、（ｉ）その標識が、少なくとも１回のボーラスまたは少なくとも１回の注入として、０日目から少なくとも３日目前後まで、好ましくは０日目から少なくとも５日目前後まで、より好ましくは０日目から少なくとも１０日目前後まで、毎日投与したものであり、（ｉｉ）各生体サンプルが、対象から、計算に基づき、タウの半減期の±１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日または１０日のみに採取したものである（すなわち、このタイムフレーム以外では、サンプルを採取しない）方法。あるいは、１日当たりの投与量は、約０．５ｇ〜約５ｇの標識アミノ酸、０．５ｇ〜約１ｇの標識アミノ酸または約１ｇ〜約５ｇの標識アミノ酸であることができる。各実施形態では、１日当たりの投与量を数回に分け、その少ない投与量ずつ一気に投与しても、１日を通じて等間隔または不等間隔で投与してもよい。好ましい生体サンプルとしては、ＣＳＦサンプル、血液サンプルまたはこれらの組み合わせが挙げられる。この方法は、工程（ａ）と工程（ｂ）との間に、タウをプロテアーゼによって酵素的に切断すること、及び／またはタウもしくはその断片を完全または部分的に精製することを更に含んでもよい。
【００６６】
ＩＩＩ．神経疾患と神経変性疾患の診断または進行のモニタリングまたは治療をするためのキット
本発明は、対象におけるタウのインビボ代謝を測定することによって、タウを測定するか、またはタウと関連する神経疾患もしくは神経変性疾患の進行をモニタリングするもしくは治療するためのキットを提供する。概して、キットは、代謝パラメーターを算出できるように、標識アミノ酸と、その標識アミノ酸を投与する手段と、経時的に生体サンプルを採取する手段と、標識タウ及び／または非標識タウの量を検出及び測定するための説明書を含む。続いて、その代謝パラメーターを、正常で健常な個体の代謝パラメーターと比較しても、同じ対象から事前に得た代謝パラメーターと比較してもよい。好適な代謝パラメーターは、上に記載されている。好ましい実施形態では、このキットは１３Ｃ６−ロイシンまたは１３Ｃ６−フェニルアラニンを含み、標識するタンパク質はタウであり、評価する疾患はタウアミロイドーシスである。
【００６７】
定義
別段の定義のない限り、本明細書で使用されている全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解される意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２ｎｄ  ｅｄ．１９９４）、Ｔｈｅ  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｗａｌｋｅｒ  ｅｄ．，１９８８）、Ｔｈｅ  Ｇｌｏｓｓａｒｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，５ｔｈ  Ｅｄ．，Ｒ．Ｒｉｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ（１９９１）及びＨａｌｅ＆  Ｍａｒｈａｍ，Ｔｈｅ  Ｈａｒｐｅｒ  Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９１）という参照文献は、本発明で使用されている多くの用語の一般的な定義を当業者に示す。本明細書で使用する場合、下記の用語は、別段の定めのない限り、それらに割り当てられた意味を有する。
【００６８】
「クリアランス速度」は、タウのような、対象となる生体分子を除去する速度を指す。
【００６９】
「クリアランス比速度」またはＦＣＲは、所定の期間における、タウなどの標識生体分子の比率の自然対数として算出する。
【００７０】
「合成比速度」またはＦＳＲは、所定の期間における、タウなどの標識生体分子の増加する比率の勾配を標識前駆体の予測値で除したものとして算出する。
【００７１】
「代謝回転比速度」またはＦＴＲは、タウなどの生体分子がＣＮＳから不可逆的に失われる速度であり、ＣＳＦ及びその他の喪失経路（例えば、局所組織での取り込み、タンパク質分解、アミロイドへの沈着）への喪失総量である。
【００７２】
「同位体」とは、核の原子番号は同じであるが、異なる数の中性子を含むために質量数が異なる、所定の元素の全ての形態を指す。非限定例としては、１２Ｃと１３Ｃはいずれも、炭素の安定同位体である。
【００７３】
「ラグタイム」とは概して、タウなどの生体分子を最初に標識してから、標識生体分子が検出されるまでの遅延時間を指す。
【００７４】
「代謝」とは、タウなどの生体分子の合成、輸送、分解、修飾またはクリアランス速度のいずれかの組み合わせを指す。
【００７５】
「神経由来細胞」には、ニューロン、星状細胞、ミクログリア、脈絡叢細胞、上衣細胞、その他のグリア細胞などを含む、血液脳関門内の全ての細胞が含まれる。
【００７６】
「相対標識値」とは、標識タウの非標識タウに対する比率または標識タウの割合を指す。相対標識値は、いずれかの好適な単位を用いて表してよい。非限定例としては、標識タウの非標識タウに対する比率は、質量分析から得られる、トレーサーとトレースとの関係（ＴＴＲ）として表してよい。別の非限定例として、ＴＴＲの比率を標識モル分率に変換してもよい。
【００７７】
「標識の開始」とは、標識が開始される時点、すなわち、時間＝０を指す。多数の日における標識の投与を必要とするタウ標識プロトコールでは、「標識の開始」とは、最初の標識を投与することを指す。標識の開始後、標識タウが確実に検出されたらすぐにサンプル採取を始めてよく、この検出は、標識の開始から１時間またはそれ以上のうちに行ってよい。
【００７８】
「定常状態」とは、所定の期間において、パラメーター測定値の変化がわずかである状態を指す。
【００７９】
「合成速度」とは、対象となる生体分子が合成される速度を指す。
【００８０】
代謝トレーサー調査では、「安定同位体」は、最も豊富な天然の同位体よりも豊富ではない非放射性同位体である。
【００８１】
「対象」とは、本明細書で使用する場合、中枢神経系を有する生物を意味する。具体的には、対象は哺乳動物である。好適な対象としては、研究用動物、ペット、家畜及び動物園の動物が挙げられる。好ましい対象はヒトである。
【００８２】
したがって、本発明は例えば以下の実施形態を提供する。
［１］
対象におけるタウの代謝をインビトロで測定する方法であって、
（ａ）タウのＮ末端またはミドルドメイン内に親和性を有する試薬を用いて標識タウまたは標識タウと非標識タウを対象から得た少なくとも1つの脳脊髄液（ＣＳＦ）サンプルから分離すること、
（ｂ）前記対象から得た各ＣＳＦサンプル中の標識タウの量または標識タウと非標識タウの量を質量分析法によって検出及び測定すること、および
（ｃ）工程（ｂ）から得た測定値を用いてタウの代謝を算出すること、ここで所定の時点におけるＣＳＦサンプル中の標識タウの量がタウの代謝を反映する、
を含み、
（ｉ）前記対象が、少なくとも１つの標識アミノ酸を、１日以上投与されており、
（ｉｉ）少なくとも１つのＣＳＦサンプルが、５日目〜２０日目、２０日目〜４０日目、４０日目〜１００日目またはこれらの組み合わせにおいて、前記対象から採取されたものである、前記方法。
［２］
前記試薬が、タウの２７〜３５個目または１９４〜１９８個目のアミノ酸内に親和性を有する試薬である、前記［１］に記載の方法。
［３］
前記試薬が、タウの２７〜３５個目または１９４〜１９８個目のアミノ酸内に親和性を有する抗体である、前記［２］に記載の方法。
［４］
前記対象が、０日目〜３日目において、前記標識アミノ酸を２日以上投与されている、前記［１］〜［３］のいずれか１項に記載の方法。
［５］
前記対象が、０日目〜５日目において、前記標識アミノ酸を２日以上投与されている、前記［１］〜［３］のいずれか１項に記載の方法。
［６］
前記対象が、０日目〜１０日目において、前記標識アミノ酸を２日以上投与されている、前記［１］〜［３］のいずれか１項に記載の方法。
［７］
前記対象が、前記標識アミノ酸を毎日投与されている、前記［１］〜［６］のいずれか１項に記載の方法。
［８］
前記標識アミノ酸が非放射性同位体で標識されている、前記［１］〜［７］のいずれか１項に記載の方法。
［９］
前記非放射性同位体を２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏ、１８Ｏ、３３Ｓ、３４Ｓ及び３６Ｓからなる群から選択する、前記［８］に記載の方法。
［１０］
前記標識アミノ酸が１３Ｃ６ロイシンである、前記［１］〜［９］のいずれか１項に記載の方法。
［１１］
前記対象が、前記標識アミノ酸を静脈内投与または経口投与されている、前記［１］〜［１０］のいずれか１項に記載の方法。
［１２］
免疫沈降法によってタウを分離する、前記［１］に記載の方法。
［１３］
前記標識アミノ酸が、０．１％、０．２％、０．５％、１％、２％、５％、０．１〜２０％及び０．１〜１０％からなる群から選択した量の、前記ＣＳＦサンプル中の標識アミノ酸を産生させるために投与されている、前記［１］〜［１２］のいずれか１項に記載の方法。
［１４］
前記対象が齧歯動物である、前記［１］〜［１３］のいずれか１項に記載の方法。
［１５］
前記対象がヒトである、前記［１］〜［１４］のいずれか１項に記載の方法。
［１６］
請求項１の工程（ｃ）で割り出した、標識及び／または非標識タウの量を用いて、タウ代謝の代謝パラメーターを算出することを更に含み、前記代謝パラメーターが、相対標識値、合成比速度、クリアランス比速度、絶対合成速度、絶対クリアランス速度、代謝回転比速度、ラグタイム、半減期、ピーク時間及びピーク高さからなる群から選択されている、前記［１］〜［１５］のいずれか１項に記載の方法。
［１７］
タウが、（２Ｎ  ３Ｒ）、（２Ｎ  ４Ｒ）、（１Ｎ  ３Ｒ）、（１Ｎ  ４Ｒ）、（０Ｎ  ３Ｒ）及び（０Ｎ  ４Ｒ）からなる群から選択したタウアイソフォームである、前記［１］〜［１６］のいずれか１項に記載の方法。
［１８］
タウがリン酸化タウアイソフォームである、前記［１］〜［１７］のいずれか１項に記載の方法。
【００８３】
実施例
下記の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示す目的で含まれている。下記の実施例に開示されている技法は、本発明の実施の際に十分に機能すると本発明者が発見した技法を表しており、したがって、本発明の実施のための好ましい態様を構成するとみなすことができることは当業者には明らかであるはずである。しかしながら、当業者は、本開示に鑑みれば、開示されている具体的な実施形態に対して多くの変更を行うことができ、その変更によっても、本発明の趣旨と範囲から逸脱しなければ、同様または類似の結果が依然として得られることが分かるはずである。
【００８４】
実施例１．タウの免疫沈降法（ＩＰ）と質量分析法の開発
ＣＳＦ中タウは、切断断片の異種プールであると推定され、存在量が少ない。例えば、若齢の正常コントロールにおけるタウの総量は、約２００ｐｇ／ｍＬ＝４．４ｆｍｏｌ／ｍＬと推定される。ヒトＣＳＦからタウを高い回収率で得るために、完全長タウのＮ末端からＣ末端に及ぶエピトープを有する様々なタウ抗体のＩＰ効率について試験した（表１、図２）。様々なタウ（ｐｇ〜ｎｇ）を含むヒトＣＳＦと、ピコグラム〜ナノグラムのタウを含む細胞培養液（ヒト神経芽腫細胞ＳＨ−ＳＹ５Ｙ及び完全長タウを一過性に過剰発現させたＨＥＫ２９３Ｔ細胞）とを検証アッセイに用いた。回収率をＮ末端タウＥＬＩＳＡ（ＨＪ８．５：捕捉用、ＨＪ８．７：ビオチン検出用）によってアッセイし、ＣＳＦ中タウにおいては、タウのＮ末端を認識する３つの抗体（タウ１２、ＨＪ８．５及びＨＪ８．７）の免疫沈降効率が最も高かった（平均９９．３％）。このデータによって、完全長タウがヒトＣＳＦに存在しないことが示唆されており、これは、本文献と一致している。Ｎ末端抗体ＨＪ８．５とミドルドメイン抗体タウ１が、ＣＳＦにおける多数のタウ種の免疫沈降に最適な抗体として同定された。
【００８５】
質量分析（ＭＳ）を用いて、タウペプチドを定量するために、続いて、免疫沈降させたタウを４００ｎｇのトリプシンで１６時間、３７℃で消化した。代替的な酵素と消化期間を用いてもよい。Ｔｏｐｔｉｐ  Ｃ１８カラム（ｇｌｙｇｅｎ製）を用いて、消化したサンプルを脱塩または精製した。精製後、サンプルを乾燥し、２％アセトニトリルと０．１％ギ酸に再懸濁させ、ナノＬＣ−ＭＳ分析のために注入した（Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＴＳＱまたはＴｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｏｒｂｉｔｒａｐ  Ｆｕｓｉｏｎ）。ペプチドフィンガープリンティングによって、ヒトＣＳＦと、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ培地（実施例２参照）と、ヒトタウを過剰発現させたＨＥＫ２９３Ｔに由来する培地におけるタウから多数の断片を検出し、その断片には、単一または２つのロイシンを有するペプチド（ＴＰＳＬＰＴＰＰＴＲ（配列番号２）及びＬＱＴＡＰＶＰＭＰＤＬＫ（配列番号７）など）が含まれていた。全てのサンプルにおいて、ＴＰＳＬＰＴＰＰＴＲ（配列番号２）が、最大かつ最も整合性の高いシグナルを有していたので、１３Ｃ６−ロイシン標識タウの定量の更なる分析で使用した。
【００８６】
ＴＰＳＬＰＴＰＰＴＲペプチド（配列番号２）の検量線を作成するために、タウを過剰発現させたＨＥＫ２９３Ｔを１３Ｃ６−ロイシン標識培地とともにインキュベートし、その培地中の標識細胞外タウを回収した。簡潔に述べると、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１３Ｃ６−ロイシンによって、０％、０．０７８％、０．１５６％、０．３１２％、０．６２５％、１．２５０％及び２．５％で標識し、標識細胞培地に対して、上記のＩＰ／ＭＳ法を行った。検量線によって、予測標識率と測定した標識率との線形相関が示され、ＴＰＳＬＰＴＰＰＴＲペプチド（配列番号２）の検出限界（ＬＯＱ）が約０．１％であることが示唆されている（図２Ｃ）。
【表１】
2020115141.tif 000002
【００８７】
実施例２．インビトロでのタウの安定同位体標識動態（ＳＩＬＫ）
インビトロでのタウＳＩＬＫ法の実現可能性を試験するために、２つの細胞培養モデルを原理証明実験に用いた。第１のモデルでは、ヒト神経芽腫細胞ＳＨ−ＳＹ５Ｙを用いた。この細胞は、培地中で細胞外タウを産生することが既に示されているからである。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を培養し、５０％１３Ｃ６−ロイシン標識培地で６日間標識してから、６日間、逆標識化し、培地と細胞溶解液を回収し、タウに関して、ＩＰ／ＭＳ分析にかけた（図１Ａ）。標識タウを定量するためのＴＰＳＬＰＴＰＰＴＲ（配列番号２）を用いて、溶解液と培地において、４０〜５０％の１３Ｃ６−ロイシン前駆体に向かって、標識が安定的に増加したことを我々は観察した（図１Ｂ）。溶解液と比べて、培地では、標識タウが検出されるまで、２〜３日の遅延が観察され、これにより、標識タウが溶解液から培地に放出されるのに、２〜３日を要することが示唆された。１２Ｃ６−ロイシン培地に戻した後、培地と溶解液において、ベースラインに向かって標識が安定的に低下したことも観察された。産生曲線において、２〜３日目（溶解液）または５〜６日目（培地）に、標識率が２０〜２５％（すなわち、５０％標識の標識ロイシン前駆体の２分の１）であることに基づき、溶解液と培地における細胞外タウの半減期は、約３日であると我々は推定する。
【００８８】
第２のモデルでは、プレセニリン１変異Ｈ１６３Ｒ（ＰＳｍｔ）キャリアとノンキャリア（Ｃｔｒｌ）の皮膚線維芽細胞から得た誘導多能性細胞（ｉＰＳＣ）を用いた。これらのｉＰＳＣをニューロンに分化させ、タウＳＩＬＫ法を行った。ＡＤ患者から得たｉＰＳＣは、培地においてタウの分泌が増えることが既に報告されている。これらの実験では、ｉＰＳＣを６日間、５０％１３Ｃ６−ロイシン標識培地で培養してから、６日間、逆標識化した（図１Ａ）。培地のみを回収した。タウロイシン標識を定量するためのＴＰＳＬＰＴＰＰＴＲ（配列番号２）を用いて、培地において、２０％１３Ｃ６−ロイシン前駆体に向かって標識が安定的に増加したことを観察した（図１Ｃ）。５０％の標識率に達するには、６日間では十分ではなく、通常の培地に戻した後も、標識率は向上し続けた。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞とｉＰＳＣニューロンとの間の標識曲線の差は、ｉＰＳＣが最終分化細胞であるのに対して、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞が分裂細胞であることによるものとみられる。興味深いことに、ＰＳｍｔの方が、産生曲線が急であったことから、ＰＳｍｔのｉＰＳＣニューロンにおいて、タウの産生が増えることが示唆された。
【００８９】
これらのインビトロでの原理証明実験により、２つの細胞培養モデルを用いて、タウトリプシンペプチドＴＰＳＬＰＴＰＰＴＲ（配列番号２）を定量することが示されている。また、これらの結果により、タウＳＩＬＫの検査が、ヒトにおいて実行可能であることが強く示唆されている。
【００９０】
実施例３．ヒトにおけるタウの安定同位体標識動態（ＳＩＬＫ）
図３は、本発明の方法の一実施形態の概要を示している。簡潔に述べると、正常コントロール（ＮＣ）対象（年齢３２〜７３歳）に包装済みの低ロイシン食を与え、１３Ｃ６−ロイシンで５日間（ＮＣ０１）または１０日間（ＮＣ０２、ＮＣ０３、ＮＣ０５、ＮＣ０６、ＮＣ０７、ＮＣ０８）標識した。１３Ｃ６−ロイシンは、３３０ｍｇの散剤をＫｏｏｌ−Ａｉｄに溶解させ、１日当たりの総溶解投与量が１ｇになるように、１日に３回飲ませることによって、参加者に投与した。標識期間中、血漿中ロイシンの測定のために、１日目と１０日目に、一晩絶食後の採血を行った。標識後、参加者は、正常な食事に戻した。標識の開始から約１４日、２８日、４２日及び６７〜８４日に、腰椎穿刺（ＬＰ）と採血を行った（実際の時点は、参加者によって多少異なっていた）。各ＣＳＦサンプル１ｍＬに対して、免疫沈降法／質量分析（ＩＰ／ＭＳ）法を行って、ヒトタウを測定した。簡潔に述べると、タウ特異抗体を用いて、生体サンプルからタウを免疫沈降させてから消化し、ロイシンを含む多数のペプチドを得た（図２）。具体的には、消化にはトリプシンを用いてよく、定量にはＴＰＳＬＰＴＰＰＴＲ（配列番号２）のペプチドを用いてよい。その他の酵素とペプチドを用いてもよい。
【００９１】
インビボでのタウＳＩＬＫ法を実証するために、まず、１３Ｃ６ロイシンを５日間（ＮＣ０１）または１０日間（ＮＣ０２、ＮＣ０３、ＮＣ０５、ＮＣ０６）経口投与した５人の正常コントロール（ＮＣ）参加者から、ＣＳＦサンプルを得た（図４）。これらの対象では、ヒトＣＮＳにおけるタウの半減期は、約１５日である。タウの半減期の正確な測定値には幅があり、すなわち、約１０〜約３０日である。図５には、２人の追加の参加者（すなわち、ＮＣ０７及びＮＣ０８）から得たデータが含まれている。これらの２人の追加の対象を含めた後、半減期は約１９．６日となり、幅は、最初の算定と同様であった（１３〜３０日、ＣＶ３２．２％）。
【００９２】
図４及び図５のタウ動態曲線は合わせて、タウの代謝回転が、総タンパク質よりも遅いことを示している。１０日間の経口標識では、１３Ｃ６−ロイシンのロバストな標識（遊離アミノ酸プール）を血漿において実現でき（２−３％）、ロイシンをコントロールした食事中に、トレーサー濃度が十分なレベルに達したことが示された（図５Ａ）。ＣＮＳ中タウ標識曲線では、ゆっくり上昇したとともに（１０〜３０日）、低下（８０日以降）し、ＣＮＳ中タウの代謝回転速度が遅いことが示された（図５Ｂ）。
【００９３】
実施例４．タウ動態モデル
限られた数の測定時点から完全な動態曲線を得て、タウの半減期を算出するために、血漿中ロイシン、ＣＳＦ中タウ、ＣＳＦ中総タンパク質及び血漿中総タンパク質のトレーサー標識動態を説明するコンパートメントモデルを開発した（１ｇ／日の経口１３Ｃ６−ロイシンを１０日）。代謝回転の遅い別のタンパク質ＳＯＤ１であって、その動態を同じサンプルで測定したものも、比較のためにモデルに含めた。これまで用いられてきた、代謝回転動態の「非モデル依存的」評価方法よりも、多数のデータ収集部位を説明する包括的モデルが好ましい。前駆体（すなわち、血漿中ロイシン）の経時変化の形を考慮に入れるからである。例えば、単一指数勾配分析では、勾配分析期間中に、産生タンパク質にトレーサーが組み込まれない、すなわち、前駆体プール（血漿中ロイシン）が標識を含まないと仮定される。半減期が長く、標識が長期のタンパク質では、コンパートメントモデルは、時間の関数としての前駆体プールの濃縮度を考慮する必要がある。このモデルでは、１０日間で、３倍／日で経口トレーサーが血漿中に現れることから始まり、全身血漿中タンパク質プールが、トレーサーの摂取から８４日まで、血漿中ロイシンの経時変化の形を説明する。脳（ＣＳＦを含む）と血漿中のタンパク質は、血漿からトレーサーロイシンを取り込むので、血漿中ロイシンの経時変化の形によって、これらのタンパク質の形成の際のトレーサーアベイラビリティの経時変化が定められる。このモデルは、一次速度定数ｋ（ｉ，ｊ）によって連結された一連のコンパートメントからなり、この定数は、１日当たりにコンパートメントｉに輸送されるコンパートメントｊの割合を反映している。
【００９４】
このトレーサー入力量経時変化が定められると、各タンパク質のＳＩＬＫ曲線の形は、その代謝回転比速度（ＦＴＲ）または不可逆的喪失によって一意に決まる。ある対象における結果が図６に示されている。対象ＮＣ０２、ＮＣ０３、ＮＣ０４、ＮＣ０５、ＮＣ０６、ＮＣ０７及びＮＣ０８における結果は、それぞれ図７Ｂ〜Ｇに示されている。参加者の代謝回転比速度（ＦＴＲ）、ＣＮＳ中タウの半減期、及びその他の情報（年齢、体重、身長、ＢＭＩ、性別及び人種）の概要が、下記の表２に示されている。
【表２】
2020115141.tif 000003
【００９５】
実施例における方法
１３Ｃ６−ロイシン標識タウの検量線の作成：ＨＥＫ２９３Ｔ細胞内で一過性に過剰発現させた完全長（ＦＬ．２Ｎ４Ｒ）タウを標識することによって、標準の標識培地を調製した。１０％ウシ胎仔血清（Ｓｉｇｍａ、Ｆ６１７８）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ、Ｄ５５４６）で、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を増殖し、トランスフェクションの前日に６ウェルプレートに分けた。トランスフェクションの日に、その培地に、１．０５ｇ／Ｌの１２Ｃ６−ロイシンを含むＤＭＥＭへの１３Ｃ６−ロイシン（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅｓ、ＣＬＭ−２２６２）を添加して、最終的なトレーサーのトレースに対する比率（ＴＴＲ）を２．５％、１．２５％、０．６２５％、０．３１２％、０．１５６％、０．０７８％及び０％にした。Ｆｕｇｅｎｅ  ＨＤ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｅ２３１２）を用いて、ＨＥＫ２９３Ｔに、ＦＬタウ−ｐｃＤＮＡ３．１を一過性にトランスフェクトした。６日後に、培地と細胞を回収した。培地を１５０００ｇで５分間回転させ、上清を希釈して、ヒトＣＳＦタウから得られるシグナルと適合させ、分注してから、−８０℃で凍結した。細胞をＰＢＳで１回洗浄し、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ、０４６９３１１６００１）を用いて冷ＰＢＳ中に回収し、１５０００ｇで５分間回転させてから、それらのアリコートを−８０℃で凍結した。
【００９６】
１３Ｃ６−ロイシン標識タウと血漿中遊離１３Ｃ６−ロイシンの単離と質量分析：
ＣＮＢｒ活性化セファロースビーズ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  １７−０４３０−０１）をタウ１２、タウ１、タウ５抗体（マウスモノクローナル、Ｍｉｃｈｉｇａｎ  Ｓｔａｔｅ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＤｒ．Ｓｋｉｐ  Ｂｉｎｄｅｒ及びＤｒ．Ｎｉｃｋ  Ｋａｎａａｎが提供）、ＨＪ８．５、ＨＪ８．７、ＨＪ９．３、ＨＪ９．１（マウスモノクローナル、Ｄｒ．  Ｄａｖｉｄ  Ｈｏｌｔｚｍａｎ及びＨｏｎｇ  Ｊｉａｎｇが提供）に、ビーズ１ｇ当たり３ｍｇの抗体という濃度で架橋させた。洗剤（１％ＮＰ−４０）、カオロトピック試薬（５ｍＭグアニジン）及びプロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ）中で、参加者から採取した１ｍＬのヒトＣＳＦと、Ｂａｒｎｅｓ−Ｊｅｗｉｓｈ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｃａｒｅ  Ｕｎｉｔ（ミズーリ州セントルイス）から集めたヒトＣＳＦと、細胞培養液（ＳＨ−ＳＹ５Ｙヒト神経芽腫と、完全長タウを一過性に過剰発現させたＨＥＫ２９３Ｔ細胞）から可溶性タウを免疫沈降させた。その溶液とともに、タウ抗体ビーズの５０％スラリー３０ｕＬを９０分、室温で回転させた。そのビーズを０．５Ｍグアニジン中で１回洗浄し、２５ｍＭ重炭酸トリエチルアンモニウム緩衝液（ＴＥＡＢＣ、Ｆｌｕｋａ１７９０２）中で２回洗浄した。結合したタウをビーズ上で、質量分析グレードトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｖ５１１１）４００ｎｇによって１６時間、３７℃で消化した。トリプシン消化物をＴｏｐＴｉｐ  Ｃ１８（Ｇｌｙｇｅｎ、ＴＴ２Ｃ１８．９６）に充填し、メーカーの説明書に従って脱塩し、精製し、溶出した。溶出したペプチド溶液を真空分離機（ＣｅｎｔｒｉＶａｐ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ  Ｌａｂｃｏｎｃｏ）によって乾燥し、ＭＳグレード水中の２％アセトニトリルと０．１％ギ酸の溶液２５ｕＬに再懸濁させた。そのペプチド再懸濁液の５ｕＬアリコートをｎａｎｏ−Ａｃｑｕｉｔｙ  ＬＣとＭＳ分析にかけた。ｎａｎｏ−Ａｃｑｕｉｔｙ  ＬＣ（マサチューセッツ州ミルフォードのＷａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）には、ＨＳＳ  Ｔ３  １３０Ｃ１８  １００□ｍ×１００ｍｍカラムを取り付け、０．５□ｌ／分の流速の溶液Ａ及びＢのグラジエントを用いて、ペプチドを分離した。溶液Ａは、ＭＳグレード水中の０．１％ギ酸から構成されていたとともに、溶液Ｂは、アセトニトリル中の０．１％ギ酸であった。ペプチドをカラムから、溶液Ｂの２％〜２０％のグラジエントで８分溶出してから、２０％〜４０％の溶液Ｂで更に３分溶出した後、更に３分で８５％の溶液Ｂまで上昇させて、カラムをクリーンアップした。Ｏｒｂｉｔｒａｐ  Ｆｕｓｉｏｎに、電子スプレイ源のｎａｎｏｆｌｅｘ（カリフォルニア州サンノゼのＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を取り付けた。イオン源に噴霧されるペプチドイオンを標的にし、四重極で単離してから、ＨＣＤによって断片化し、Ｏｒｂｉｔｒａｐで６０，０００の分解能において検出した。標識タウペプチドが非標識ペプチドとともに溶出し、これらの両方を順次断片化した。それらのクロマトグラフィーピークプロファイル下面積を算出し、面積比として表した。
【００９７】
各時点における血漿中の前駆体１３Ｃ６−ロイシンの濃縮率を割り出すために、血漿中タンパク質を１０％トリクロロ酢酸で一晩、４℃で沈殿させてから、２１，０００×ｇで１０分間回転させることによって除去した。上清中の遊離アミノ酸をＮ−ヘプタフルオロブチリルｎ−プロピルエステル誘導体に変換し、上記２３のように、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）−負化学イオン化−ＭＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ  ６８９０Ｎ  Ｇａｓ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ及びＡｇｉｌｅｎｔ  ５９７３Ｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ）によって、１３Ｃ６−ロイシンの同位体濃縮度［質量／電荷比（ｍ／ｚ）３４９及び３５５］を分析した。組織溶解液５０μＬに対して１０％ＴＣＡ沈殿を一晩、４℃で行い、サンプルを２１，０００×ｇで１０分間遠心分離し、上清を除去し、そのペレットを１０％ＴＣＡ冷溶液中で２回超音波処理することによって、総タンパク質への１３Ｃ６−ロイシン取り込みの測定値を割り出した。続いて、そのペレットを６Ｎ  ＨＣｌ中で２４時間、１１０℃で酸加水分解した。続いて、陽イオン交換クロマトグラフィー（５０Ｗ−Ｘ８樹脂）を用いて、溶出用緩衝液としての６Ｎ  ＮＨ４ＯＨによって、得られたアミノ酸を単離した。続いて、サンプルをスピードバックで乾燥し、ＧＣ−ＭＳのために処理した。トレーサー濃縮度の上昇に応じて生じる、トレーサー：トレーシー比（ＴＴＲ）におけるバイアスを考慮するために、ＭＦＬ＝（ＴＴＲ）／（１＋ＴＴＲ）という式を用いることによって、ＴＴＲをモル分率標識（ＭＦＬ）に変換した。
【００９８】
ヒト対象：ヒト対象が関与する研究については、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  ＣｏｍｍｉｔｔｅｅとＧｅｎｅｒａｌ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＧＣＲＣ）から承認を受けた。参加者全員からインフォームドコンセントを得た。参加者は、身体検査と神経学的検査からなる最初のスクリーニング診察を受けた。除外基準には、病歴または検査による神経障害の証拠、食料と飲料を安全に口から取ることができないこと、正常値よりも２倍高い検査値、特殊な食生活（例えばグルテンフリー）、妊娠、リドカインアレルギー、出血障害の病歴または腰椎穿刺の禁忌が含まれていた。続いて、参加者に包装済みの低ロイシン食を与え、１３Ｃ６−ロイシンで１０日間標識した。低ロイシン食（ロイシン約２０００ｍｇ／日）は、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｋｉｔｃｈｅｎの栄養士が準備して、参加者に渡し、その後、家で消費させた。食料摂取量は、自己申告式の食事日記によってモニタリングした。散剤３３０ｍｇをＫｏｏｌ−Ａｉｄ１２０ｍＬに溶解させることによって、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得た１３Ｃ６−標識ロイシン（ＣＬＭ−２２６２）を参加者に投与した。参加者は、１日当たりの総溶解投与量が１ｇになるように、この１３Ｃ６−ロイシンを１日に３回飲んだ。標識期間中、一晩絶食後の採血を１日目と１０日目に行った。標識後、参加者は、正常な食事に戻した。標識を始めてから約１４日、２８日、４２日及び６７〜８４日に、腰椎穿刺と採血を行った（実際の時点は、参加者によって多少異なっていた）。
【００９９】
血液は、１８００×ｇで１０分間遠心分離し、その上清（血清）を１．５ｍＬのローバインディングチューブに分注し、ドライアイス上で凍結し、−８０℃で保管した。ＣＳＦは、１０００×ｇで１０分間、４℃で回転させ、１ｍＬのアリコートを１．５ｍＬのローバインディングチューブに入れ、ドライアイス上で凍結し、−８０℃で保管した。
【０１００】
動態データのコンパートメントモデル化：上記２３のように、ＳＡＡＭ  ＩＩというソフトウェア（シアトルのＲｅｓｏｕｒｃｅ  ｆｏｒ  Ｋｉｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）を用いて、モデル化を行った。このモデルは、一次速度定数ｋ（ｉ，ｊ）によって連結された一連のコンパートメントからなり、この定数は、１日当たりにコンパートメントｉに輸送されるコンパートメントｊの割合を反映している。図４に示されているように、血漿中遊離１３Ｃ６−ロイシンの動態データをコンパートメントモデルに取り込んだ。ＴＰＳＬＰＴＰＰＴＲペプチドをモデル化に用いた。ＬＣ−ＭＳシグナルが最もロバストであったからである。
【図１Ａ】
2020115141.tif 000004
【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
2020115141.tif 000006
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
2020115141.tif 000025
【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
2020115141.tif 000027
【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図７Ｇ】
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【配列表】
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