(57)【要約】      （修正有）【課題】光依存的にＡＴＰ合成可能な人工脂質膜小胞（プロテオリポソーム）及びその調製方法、並びに、巨大ベシクルである巨大膜小胞（ＧＵＶ）内に人工細胞小器官（人工オルガネラ）としての人工脂質膜小胞を無細胞タンパク質合成系と組み合わせて封入して成る、光依存的なタンパク質合成等の細胞内反応が可能なエネルギー自立型の人工細胞系の提供。【解決手段】脂質成分を界面活性剤で可溶化した後、該界面活性剤の少なくとも一部を除去した後に初めて、光駆動プロトンポンプ及び／又はＡＴＰ合成酵素等の膜タンパク質を添加して、それらの膜タンパク質をリポソームの脂質二重層内に組み込ませることを特徴とするプロテオリポソームの調製方法（Ｓｔｅｐｗｉｓｅ法）、それにより得られるプロテオリポソームを含む巨大膜小胞等の反応系。【選択図】図３
2020115806.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リポソームの脂質二重層内に光駆動プロトンポンプ及び／又はATP合成酵素が組み込まれているプロテオリポソームの調製方法であって、以下のステップ：
（１）脂質成分を界面活性剤で可溶化するステップ；
（２）界面活性剤の少なくとも一部を除去するステップ；及び
（３）光駆動プロトンポンプ及び／又はATP合成酵素を添加してリポソームの脂質二重層内に組み込ませるステップ、
を上記の順に含む、前記調製方法。
【請求項２】
一回または複数回のステップ（２）によって界面活性剤を除去した後、ステップ（３）を行う、請求項１に記載の調製方法。
【請求項３】
ステップ（３）の後に、界面活性剤の残りの全てを除去するステップ（４）を含む、請求項１に記載の調製方法。
【請求項４】
界面活性剤を除去する最初のステップ（２）の１〜４時間後に光駆動プロトンポンプ及び／又はATP合成酵素を添加する、請求項１〜３のいずれか一つに記載の調製方法。
【請求項５】
光駆動プロトンポンプがHalobacterium salinarum由来のバクテリオロドプシンである、請求項１〜４のいずれか一つに記載の調製方法。
【請求項６】
プロテオリポソームの粒径が１００〜２００nmである、請求項１〜５のいずれか一つに記載の調製方法。
【請求項７】
リポソームの脂質二重層内に光駆動プロトンポンプ及びATP合成酵素が組み込まれている光依存的にATP合成可能なプロテオリポソームであって、組み込まれた光駆動プロトンポンプの正しい膜配向率が５０％以上である、前記プロテオリポソーム。
【請求項８】
リポソームの脂質二重層内に光駆動プロトンポンプ及びATP合成酵素が組み込まれている光依存的にATP合成可能なプロテオリポソームであって、組み込まれたATP合成酵素の正しい膜配向率が５０％以上である、請求項７に記載のプロテオリポソーム。
【請求項９】
組み込まれているバクテリオロドプシン及びATP合成酵素の量の比率が10:1〜200:1である、請求項７又は８に記載のプロテオリポソーム。
【請求項１０】
粒径が１００〜２００nmである、請求項７〜９のいずれか一項に記載のプロテオリポソーム。
【請求項１１】
脂質膜に脂質成分の20〜40モル％のコレステロールが含有されている、請求項７〜１０のいずれか一項に記載のプロテオリポソーム。
【請求項１２】
請求項７〜１１のいずれか一項に記載のプロテオリポソームを含む反応系 。
【請求項１３】
ATPを消費する反応系を更に含む請求項１２に記載の反応系。
【請求項１４】
プロテオリポソームによって光依存的に産生されたATPが前記ATPを消費する反応系で利用される、請求項１３に記載の反応系。
【請求項１５】
前記ATPを消費する反応系が無細胞タンパク質合成系である、請求項１４に記載の反応系。
【請求項１６】
プロテオリポソームによって光依存的に産生されたATPが無細胞タンパク質合成系の翻訳過程で利用される、請求項１５に記載の反応系。
【請求項１７】
プロテオリポソームによって光依存的に産生されたATPが更に無細胞タンパク質合成系の転写過程で利用される、請求項１６に記載の反応系。
【請求項１８】
無細胞タンパク質合成系がPUREシステムである、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の反応系。
【請求項１９】
請求項７〜１１のいずれか一項に記載のプロテオリポソームを内包する巨大膜小胞（GUV）。
【請求項２０】
粒径が５〜５０μmである、請求項１９に記載の巨大膜小胞。
【請求項２１】
プロテオリポソームが２００〜２０，０００個含まれている請求項２０に記載の巨大膜小胞。
【請求項２２】
請求項１３〜１８のいずれかに記載の反応系における少なくとも一つの特徴を有する、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の巨大膜小胞から成る、エネルギー自立型（リン酸循環型）人工細胞。
【請求項２３】
光駆動プロトンポンプ及び／又はATP合成酵素の少なくとも一部をコードする遺伝子を含む無細胞タンパク質合成系を含む、請求項２２に記載の人工細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光駆動プロトンポンプとアデノシン三リン酸（ATP）合成酵素が組み込まれている、光依存的にATP合成可能な人工脂質膜小胞（プロテオリポソーム:PL）及びその調製方法、並びに、巨大ベシクルである巨大膜小胞（GUV）内に人工細胞小器官（人工オルガネラ）としての該人工脂質膜小胞を無細胞タンパク質合成系と組み合わせて封入して成る、光依存的なタンパク質合成等の細胞内反応が可能なエネルギー自立型の人工細胞系等に関する。
【背景技術】
【０００２】
合成生物学の最近の進歩により、単純な生体分子および人工的な最小ゲノムからの全細胞再構成が行われつつあり、生細胞にとって必須の成分が知られるようになってきた（参考文献1-4）。
【０００３】
しかし、このような人工細胞系に於いては、自律のためのエネルギー生産の実現が未解決の課題として残っている（参考文献5）。人工細胞系を現実の生細胞と同様にエネルギー的に独立したシステムに発展させるには、無制限の外部の物理的または化学的エネルギー源により駆動される、循環するエネルギーの消費‐生産システムを確立させることが必要となる。
【０００４】
ATP合成酵素と光駆動プロトンポンプの一種であるバクテリオロドプシンとを組み合わせてATPを産生する生体模倣型人工オルガネラが数十年前から研究されている（特許文献１及び２、参考文献6-11）。
【０００５】
例えば、特許文献１には、リン脂質、バクテリオロドプシン及びATP合成酵素で構成されたリポソームを用いたATP合成装置に関する発明が記載されている。該発明の特徴は、該リポソームの構成要素としてリン脂質抗原を更に含ませることによって、バイオ素子の所定の位置に組み込むことを可能にした点にある。該発明では、フラスコ内で上記リポソームの全ての構成要素を予め乾燥クロロホルムに溶解した後、該クロロホルムを留去し、これに所定の緩衝液を入れてフラスコ内のものを膨潤させて剥離し、次に、該フラスコを超音波破砕器で超音波処理し、得られた懸濁液をカラムで分画することによって、リポソーム懸濁液を得ている。
【０００６】
特許文献２には、ATP再生産バイオリアクターに関する発明が記載されている。該発明は、ADPとアセチルリン酸を基質として酢酸キナーゼの酵素作用によりATPを産生する従来技術に於ける、アセチルリン酸が不安定で高価である等の課題を解決することを目的としたものである。その特徴は、ATP合成酵素を導入した平面脂質２重層積膜又は脂質２重層膜リポソームを提供し、そこで、例えば、バクテリオロドプシン等の光プロトンポンプによる外部からの物理的エネルギー（光エネルギー等）を用いることである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開平４−８８９９５号公報
【特許文献２】特開昭６１−１２４３８４号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Buddingh, B.C. & van Hest, J.C.M. Artificial Cells: Synthetic Compartments with Life-like Functionality and Adaptivity. Accounts of chemical research 50, 769-777 (2017).
【非特許文献２】Lee, K.Y. et al. Photosynthetic artificial organelles sustain and control ATP-dependent reactions in a protocellular system. Nature biotechnology36, 530-535 (2018).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
これまでに開発された、ATP合成酵素と光駆動プロトンポンプの一種であるバクテリオロドプシンとを組み合わせてATPを産生する生体模倣型人工オルガネラではATP生産性が低いために、これらを実際に人工細胞系（バイオセンサーデバイス等）へ適用することには未だ成功していない。
【００１０】
尚、特許文献１又は２のいずれに於いても、バクテリオロドプシン等のプロテオリポソームに於ける構成要素がどのような配向でリン脂質膜に組み込まれているかについての記載はなく、更に、ATP合成装置等におけるバクテリオロドプシンによるプロトンポンプ活性又はATP産生効率については特に開示されていない。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、光駆動プロトンポンプとATP合成酵素が組み込まれているプロテオリポソームの調製に際して、従来技術とは異なる工程を用いる高効率な調製方法を開発して、プロテオリポソームに組み込まれている光駆動プロトンポンプの膜配向性を顕著に改善することに成功した。その結果、該プロテオリポソームに於けるプロトンポンプ活性及びATP産生効率を顕著に向上させることが出来、従来技術に見られる上記の課題を解決することに成功した。本発明は以上の知見に基づき完成したものである。
【００１２】
即ち、本発明は以下の各態様に係る。
[態様１]  
リポソームの脂質二重層内に光駆動プロトンポンプ及び／又はATP合成酵素が組み込まれているプロテオリポソームの調製方法であって、以下のステップ：
（１）脂質成分を界面活性剤で可溶化するステップ；
（２）界面活性剤の少なくとも一部を除去するステップ；及び
（３）光駆動プロトンポンプ及び／又はATP合成酵素を添加してリポソームの脂質二重層内に組み込ませるステップ、
を上記の順に含む、前記調製方法。
[態様２]  
一回または複数回のステップ（２）によって界面活性剤を除去した後、ステップ（３）を行う、態様１に記載の調製方法。
[態様３]  
ステップ（３）の後に、界面活性剤の残りの全てを除去するステップ（４）を含む、態様１に記載の調製方法。
[態様４]  
界面活性剤を除去する最初のステップ（２）の１〜４時間後に光駆動プロトンポンプ及び／又はATP合成酵素を添加する、態様１〜３のいずれか一つに記載の調製方法。
[態様５]  
光駆動プロトンポンプがHalobacterium salinarum由来のバクテリオロドプシンである、態様１〜４のいずれか一つに記載の調製方法。
[態様６]  
プロテオリポソームの粒径が１００〜２００nmである、態様１〜５のいずれか一つに記載の調製方法。
[態様７]  
リポソームの脂質二重層内に光駆動プロトンポンプ及びATP合成酵素が組み込まれている光依存的にATP合成可能なプロテオリポソームであって、組み込まれた光駆動プロトンポンプの正しい膜配向率が５０％以上である、前記プロテオリポソーム。
[態様８]  
リポソームの脂質二重層内に光駆動プロトンポンプ及びATP合成酵素が組み込まれている光依存的にATP合成可能なプロテオリポソームであって、組み込まれたATP合成酵素の正しい膜配向率が５０％以上である、態様７に記載のプロテオリポソーム。
[態様９]  
組み込まれているバクテリオロドプシン及びATP合成酵素の量の比率が10:1〜200:1である、態様７又は８に記載のプロテオリポソーム。
[態様１０]  
粒径が１００〜２００nmである、態様７〜９のいずれか一項に記載のプロテオリポソーム。
[態様１１]  
脂質膜に脂質成分の20〜40モル％のコレステロールが含有されている、態様７〜１０のいずれか一項に記載のプロテオリポソーム。
[態様１２]   
態様７〜１１のいずれか一項に記載のプロテオリポソームを含む反応系 。
[態様１３]
ATPを消費する反応系を更に含む態様１２に記載の反応系。
[態様１４]
プロテオリポソームによって光依存的に産生されたATPが前記ATPを消費する反応系で利用される、態様１３に記載の反応系。
[態様１５]
前記ATPを消費する反応系が無細胞タンパク質合成系である、態様１４に記載の反応系。
[態様１６]
プロテオリポソームによって光依存的に産生されたATPが無細胞タンパク質合成系の翻訳過程で利用される、態様１５に記載の反応系。
[態様１７]  
プロテオリポソームによって光依存的に産生されたATPが更に無細胞タンパク質合成系の転写過程で利用される、態様１６に記載の反応系。
[態様１８]  
無細胞タンパク質合成系がPUREシステムである、態様１５〜１７のいずれか一項に記載の反応系。
[態様１９]  
態様７〜１１のいずれか一項に記載のプロテオリポソームを内包する巨大膜小胞（GUV）。
[態様２０]  
粒径が５〜５０μmである、態様１９に記載の巨大膜小胞。
[態様２１]  
プロテオリポソームが２００〜２０，０００個含まれている態様２０に記載の巨大膜小胞。
[態様２２]  
態様１３〜１８のいずれかに記載の反応系における少なくとも一つの特徴を有する、態様１９〜２１のいずれか一項に記載の巨大膜小胞から成る、エネルギー自立型（リン酸循環型）人工細胞。
[態様２３]  
光駆動プロトンポンプ及び／又はATP合成酵素の少なくとも一部をコードする遺伝子を含む無細胞タンパク質合成系を含む、態様２２に記載の人工細胞。
【発明の効果】
【００１３】
本発明方法によって、光駆動プロトンポンプ及び／又はATP合成酵素等の膜タンパク質が正味の機能に係る膜配向率が高い状態で組み込まれているプロテオリポソームを調製することが可能となった。こうして調製されるプロテオリポソームを含む各種の反応系に於いて、特に、実際の細胞に近いサイズを有する巨大膜小胞（GUV）に内包された状態で、該GUV内でｍＭ程度の高濃度のＡＴＰを光依存的に産生(光合成)することができ、このような反応系は、所謂、「光駆動型ATP合成バイオマシーン」として機能することが出来る。
【００１４】
その結果、該GUV内に光駆動プロトンポンプ及び／又はATP合成酵素が組み込まれたプロテオリポソームを含ませることによって得られる本発明の人工細胞に於いて、産生されたＡＴＰをエネルギー源として使用するタンパク質合成等の細胞内の様々な生化学反応を実際の細胞に非常に近い空間スケールで再現・制御することが可能となった。このようにして得られる本発明の人工細胞は、従来のクレアチンホスフェート及びクレアチンキナーゼなどによる一方的なリン酸消費によるエネルギー供給とは異なり、ＡＴＰから生じたＡＤＰに再度リン酸を補填する、エネルギー自立型又はリン酸循環型のエネルギー供給デバイス（システム）として利用することが出来る。
【００１５】
更に、該GUV内にタンパク質合成系を含ませることによって、該人工細胞内で産生されたＡＴＰを利用して、該人工細胞に内包されるプロテオリポソーム自身の構成要素（因子）である光駆動プロトンポンプ等の膜タンパク質を合成する（再帰的合成）ことが出来る。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】光で駆動する人工オルガネラのATP合成を示す。A)人工オルガネラの概要図。光をあてることでバクテリオロドプシン(bR)がプロトンを膜小胞外部から内部へポンプする。これにより形成された膜内外のプロトン濃度勾配が、同じ小胞上に位置するF型ATP合成酵素(FoF1)を稼働させることでADPとリン酸(Pi)からATPを合成する。B)精製したbRとFoF1タンパク質。bRレーンの左側に示した数字は分子量マーカーの分子サイズを、 FoF1のレーン右側に示したギリシャ文字は構成するサブユニットタンパク質の位置を示す。C)膜小胞に再構築した精製bRの光依存的なプロトンポンプ活性。 5, 10, 20μMのbRを用いて膜小胞(プロテオリポソーム：PL)を再構築し、プロトン濃度勾配依存的に蛍光を示す試薬(ACMA)存在下で光を当てた。 bRにより膜外のプロトンが内部にポンプ輸送された場合、相対的に膜外のプロトン濃度が減少し、膜内外にプロトン濃度勾配が生じる。このプロトン濃度勾配の発生をACMAの蛍光強度の低下として検出した。X軸に測定時間をY軸に形成されたプロトン濃度勾配（ΔpH）を示す。図中、光を当てていない時間をグレイで、光を当てた時間を白で示す。 比較実験としてPL膜上に孔を形成し膜内外のプロトン濃度勾配を消失させるFCCP（Carbonyl cyanide-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone）を加えた。独立した実験を３回繰り返し、その標準偏差値からグラフを作成した。D) PLに再構築した精製FoF1のATP合成活性。 10, 20, 30nMのFoF1を用いてFoF1-PLを再構築し、膜内外のプロトン濃度差からFoF1を駆動させることでATPを合成した。ATPをエネルギーとして発光するルシフェリン/ルシフェラーゼを用いて合成されたATP量を見積もった。図中、FoF1-PLsを投入したタイミングを矢印で示す。X軸は測定時間を、Y軸は合成されたATP濃度を示す。比較実験としてPLs膜上に孔を形成し膜内外のプロトン濃度勾配を消失させるFCCPを加えた。独立した実験を３回繰り返し、その標準偏差値からグラフを作成した。E)光依存的なATP合成。 精製したbRとFoF1両方を用いてbRFoF1-PLを再構築し、光依存的に合成したATPの量を測定した。1μMのFoF1に対して35, 70, 140, 176μMのbRを使用して再構築し、活性を比較した。X軸は測定時間を,Y軸は人工オルガネラあたりが合成したATPの分子数を示す。比較実験として同じ反応を、光を当てずに行った結果(Dark, 黒)と、FCCP存在下で行った結果(+FCCP, グレー)を示す。Insetは反応開始後５分までの初速値を示す. 独立した実験を３回繰り返し,その標準偏差値からグラフを作成した。F)光依存的な巨大膜小胞(GUV)内ATP合成。人工オルガネラであるbRFoF1-PLをGUVに内包し光を照射した後、内部で合成されたATP量をルシフェリン・ルシフェラーゼにより測定した。GUVに内包されなかった、またはGUVの崩壊により外に漏れ出た人工オルガネラを不活化するため、GUV外側にProteinaseK(PK)を加えFoF1を分解した(PKout)。また。このPKが正しく機能していることを示すために, GUV内部にもPKを内包し、ATPが合成されないことを示す比較実験(PKin)も行った。測定したATP量がどれほどの数の人工オルガネラから合成されたかを知るために、測定したサンプル内のGUVの数と平均的なサイズをFACS（fluorescence activated cell sorting）により測定した。これにより、全GUVの総体積(vol)と、用いた人工オルガネラの濃度からその数を算出した。これらの結果から人工オルガネラあたりに合成したATP量を算出しY軸��プロットした。GUVに内包しない系(in Bulk)とATP合成効率を比較するため, 上記Eと同じ条件で反応したATP量をグラブ右側に示した。独立した実験を３回繰り返し、その標準偏差値からグラフを作成した。p<0.005。
【図２】光駆動によるＧＵＶ内のタンパク質合成を示す。緑色蛍光タンパク質(GFP)をその鋳型遺伝子であるmRNAから(A-E)、もしくはDNAから(F-H)合成した。A)組成を調整した再構成型無細胞タンパク質合成系(PUREシステム)と人工オルガネラを混合し、GFPのmRNAまたはDNAと共にGUVに内包した後、37℃で温めながら数時間光を照射した。反応後, 内部で合成されたGFPの蛍光を共焦点顕微鏡により観察した(Light)。比較実験として光を当てずに温めたGUVも観察した(Dark)。GUVの脂質膜はNileRedでラベルした(赤色)。スケールバー20μm。B)上記A(Light)で観察された蛍光が内部で合成されたGFPに依存したものかを確かめるために、同じ反応をGUVに内包しない状態で行った。反応は35Sで放射線ラベルしたメチオニン存在下で行った。 反応後, 反応液をSDS-PAGEで展開し, オートラジオグラフで可視化した。C)上記A(LightとDark)で示したGUVのうちどれほどのGUVが有意に内部でタンパク質を合成しているのかを知るために、同じサンプルをFACSで解析した。X軸はGFPの蛍光の強度を、Y軸はGUVの大きさを示す。また, Darkのサンプルを黒色で、Lightのサンプルを緑色でプロットした。 その結果、約60％のGUVが有意にGFPを合成していた。D)光合成したATPからGTPを合成するために、上記Bのサンプルから翻訳反応に必須なGTPを欠損させ、代わりにATPとGDPからGTPを合成するNDK(Nucleoside-Diphosphate Kinase)を投入した。反応は試験管内で行い、反応後のサンプルは上記Bと同じ要領で処理した。E) NDK存在・非存在下で上記Eと同じ反応をGUV内で行い、共焦点顕微鏡で観察した。スケールバー、20μm。 F)光合成したATPからmRNAを合成するため、GFP mRNAを欠損させ、代わりにGFP DNAとT7 RNA polymerase (T7RNAP)を上記Bのサンプルに投入した。比較として、組成を調整しない通常のPUREシステムで合成したGFPを同じSDS-PAGEで解析した(右端レーン)。反応は試験管内で行い、反応後のサンプルは上記Bと同じ要領で処理した。G) GFPを１５アミノ酸からなる小ペプチドとそれ以外の大部分に分け、小ペプチドのみを上記F(左端レーン)と同じ要領で、反応を光存在下(Light)・非存在下(Dark)においてGUV内部で合成した。その際に細胞から精製した大部分も同時に内包した。スケールバー、20μm。H)上記Gと同じサンプルを上記Cと同じ要領でFACSにより解析した。その結果約15%のGUVが有意にGFPを合成していた。
【図３】光に依存して再帰的にタンパク質合成をする人工細胞A)概要図。GUV内部で起こる反応の順序を図中の番号で示す。aa: アミノ酸, tRNA: 転位RNA, aa-tRNA: アミノアシル化tRNA。B) GUV内bR-GFP合成。bRとGFPの遺伝子をつなげた鋳型mRNAを調製し、図2Aと同じ条件で合成した。スケールバー、20μm。C)リポソームを含むPUREシステム内で合成されたbRがリポソームの脂質膜に局在していることを確認するために、反応後のサンプルを粘性の高いショ糖水溶液に重層し超遠心処理を行った。TopからF3までのフラクションはリポソーム画分を、Bot.は凝集したタンパク質画分を示す。各画分を回収後、図2Bと同じ処理を行い、バンドを可視化した。得られたバンドの濃さから各画分に含まれるbRの割合を算出し、ゲル下部に%Frac.として示した。D) PUREシステムで合成したbRのプロトンポンプ活性。上記Cと同じ条件でbRを合成し、図1Cと同じ条件でプロトンポンプ活性を測定した。bRを合成した時間を図中に示す。E)光合成したbRが人工オルガネラの一部となり、ATP合成活性を増大するか否かを検証した。プロトンポンプ活性のある野生型bR(bRwt), または活性のない変異型bR(bRmut)を、人工オルガネラを含んだPUREシステムで120分間光を当てて合成した。途中何度かサンプリングし、反応液中のATP濃度をルシフェリン／ルシフェラーゼにより測定した。X軸は光合成した時間を、Y軸は人工オルガネラあたりのATP合成量を示す。挿入図は反応開始後10minまでの初速を示す。独立した実験を３回繰り返し、その標準偏差値からグラフを作成した。bRwtを合成した試料（上側の線で示される）は反応時間が進むごとに、人工オルガネラのATP合成効率が増加した。反対に, bRmutを合成した試料（下側の線で示される）はいくら合成しても、人工オルガネラのATP合成効率は変化しなかった。つまり、光によりde novoに合成されたbRの機能を, bRwtとbRmutの差として評価することができる。このことをグラフ右側に図で示した。
【図４】界面活性剤除去剤を用いた、従来技術及び本発明によるプロテオリポソーム調製法の比較を示す。
【図５】再構築したbRの膜配向性解析の結果を示す。
【図６】再構築したbRのプロトンポンプ活性を示す。
【図Ｓ１】紫色膜のSDS-PAGE分析  Halobacterium salinarumから調製した紫膜を緩衝液で5回洗浄し、ショ糖密度勾配（SDG）遠心にかけた。全てのサンプルを15％SDS-PAGEにより分析した。マーカータンパク質（ＭＫ）のサイズは上から250、150、100、75、50、37、25、20、15、10kDaを示す。ゲルをクマシーブリリアントブルーで染色した。
【図Ｓ２】bR-PLの内側から外側へのプロトン漏れ  bR-PLを20μMのbRおよび16mg/mlの大豆由来フォスファチジルコリン（SoyPC）抽出物から調製した。光依存性Ｈ＋ポンプアッセイは異なる温度で実施した。灰色と白い領域は、それぞれ暗い状態と明るい状態を表わす。ＰＬの内外におけるプロトン濃度勾配は、プロトン濃度勾配指示薬ＡＣＭＡ（ex 410nm/em 480nm）を用いてモニターした。450秒の時点で、光を消し、輸送されたＨ＋の漏れを測定した。Ｈ＋漏れおよびＨ＋ポンプの初期勾配は、それぞれ454〜474秒および35〜55秒の期間から得られる。
【図Ｓ３】プロトン漏出に対するコレステロールの効果  bR-PLによるプロトンポンプ活性およびその暗状態（灰色領域）における漏出を、bR-PLの脂質組成中の30%コレステロールの存在下または非存在下で測定した。 bR-PLを図S2に記載のように調製した。 ＰＬの内外のプロトン濃度勾配をプロトン濃度勾配指示薬ＡＣＭＡ（ex 410nm/em 480nm）を用いてモニターした。450秒で、光を消し、そして励起されたプロトンの漏れを測定した。プロトン漏洩の初期勾配は451〜470秒の期間から得られた。
【図Ｓ４】PL中に再構築されたbRの膜配向  Ｃ末端にHisTagを含有する0.2μMのbRおよび41.3ｍＭの脂質混合物（モル比70/30のSoyPC抽出物／コレステロール）を用いてbR-PLを調製した。TritonX-100の存在下または非存在下でNiをチャージした磁気ビーズと混合した後、フロースルー画分、洗浄画分および溶出画分を分離し、SDS-PAGEによって分析した。得られたゲルを抗HisTag抗体を用いたウエスタンブロッティングによりさらに分析した。溶出画分で検出されたbRは、bRのＣ末端がPLの外側に露出していることを表し、一方、フロースルー画分中のbRは、bRのC末端が内側に露出していることを表す。光駆動プロトン流束は破線の矢印で示されている。バンド強度はImageGaugeソフトウェア（Fujifilm）によって測定した。
【図Ｓ５】PLで再構築したFoF1の膜配向  FoF1-PLは、β-サブユニット中にHisTagを含有する0.2μMのFoF1および41.3mMの脂質混合物（モル比70/30のSoyPC抽出物／コレステロール）を用いて調製した。TritonX-100の存在下または非存在下でNiをチャージした磁気ビーズと混合した後、フロースルー画分、洗浄画分および溶出画分を分離し、SDS-PAGEによって分析した。抗HisTag抗体を用いたウエスタンブロッティングにより得られたゲルをさらに分析してFoF1のβサブユニットを可視化した。溶出画分で検出されたFoF1は、F1部分がPLの外側に露出していることを表し、一方、フロースルー画分中のFoF1は、F1部分が内側に露出していることを表す。ＡＴＰ合成を推進するプロトン流束は破線の矢印で示されている。バンド強度はImageGaugeソフトウェア（Fujifilm）によって測定した。
【図Ｓ６】FoF1のATP依存性プロトンポンプ活性  プロトン濃度勾配インジケーターACMA（ex 410nm/em 480nm）を用いてPLの内外のプロトン濃度勾配をモニターすることにより、再構築したFoF1 -PLのプロトンポンプ活性を測定した。30秒でATPを添加することにより反応を開始させ、３００秒でイオノフォアFCCPを添加することにより終了させた。FoF1のＡＴＰアーゼ活性によって駆動されるプロトン流束を赤矢印（長い矢印）で示し、そしてPL膜（左）またはFCCP（右）を介したプロトン漏れを青矢印(短い矢印)で示した。灰色の影は3回測定からのS.Dを示す。
【図Ｓ７】bRFoF1 -PLのATP生産性に対する光強度の影響。  ATP合成速度（ｎＭ／分）は、0、0.8、1.4、4.5、7.6、14.3、26.0および50.0mW/cm 2の光強度で測定した。
【図Ｓ８】再構成型無細胞タンパク質合成系（PUREシステム）におけるATP消費  ATPを消費する経路、即ち、tRNAのアミノアシル化、GDPへのリン酸付加、および転写は赤い四角で示される。光駆動タンパク質合成反応のためにPUREシステムから排除された触媒酵素は対角線を含む四角によって記載されている。
【図Ｓ９】PUREシステムにおけるタンパク質合成に対するNaN3の影響  様々な濃度のNaN3存在下において[35 S]メチオニンでラベルした状態でGFPを合成した。合成したタンパク質をSDS-PAGEで分析し、オートラジオグラフィーで可視化した。
【図Ｓ１０】bRFoF1 -PLを含むPUREシステムにおける光駆動GFP合成  反応は、NaN3、［35S］メチオニン、およびGFPをコードするmRNAの存在下、３７℃で６時間、様々な条件で行った。合成したタンパク質をSDS-PAGEで分析し、オートラジオグラフィーで可視化した。レーン１条件を用いて、６時間までのGFP合成の時間依存的増加を分析した。
【図Ｓ１１】光照射により制御されるタンパク質合成  GFPをbRFoF1-PLおよびGFPをコードするmRNAを含むPUREシステムで合成した。光照射により生成されたＡＴＰ（薄い（黄色）ゾーン）はtRNAのアミノアシル化にのみ消費され、その量はルシフェリン／ルシフェラーゼアッセイにより測定された（赤いトレース：左縦軸）。 合成されたタンパク質の量は、オートラジオグラフィーデータのバンド強度を測定することによって定量化された（緑色のトレース：右縦軸）。
【図Ｓ１２】分割GFPの蛍光の回復  （A）分割GFPの概略図。 GFP11は15個のアミノ酸（a.a）からなり、GFP1-10は213個のアミノ酸からなり、集合したＧＦＰは蛍光を示す。（Ｂ）NiNTAカラム、続いてMonoQカラム精製によって大腸菌細胞から精製されたGFP1-10。（Ｃ）精製GFP1-10タンパク質存在下でＰＵＲＥシステムを用いてGFP11を合成した結果、完全なGFPとして蛍光を回復した。
【図Ｓ１３】bRFoF 1-PLを含むPUREシステムにおける光駆動転写と翻訳  bRFoF1-PL、精製GFP1-10タンパク質、T7 RNAP、NaN3、および［35S］メチオニンを含むPUREシステムにおいて、GFP11ペプチドをそのＤＮＡから合成した。生成物をフィルターカラムにより遊離の放射性メチオニンから分離した。得られた試料の放射能をシンチレーションカウンターで計数した。
【図Ｓ１４】GUV含有リポソーム内でのbR-GFP合成  bR-GFP融合タンパク質を、PUREシステムを封入しているGUV内で、リポソームが存在する状態又は存在しない状態で合成した。スケールバーは20μｍを示す。内部と同じ反応を反応チューブ内で行い、動的光散乱によって分析した。初期のサイズ分布は赤で示され、そして反応後のそれは青で示される。
【図Ｓ１５】bRの不活性変異型（bRmut）のプロトンポンプ活性。  bRmutをリポソームとレチナールを含むPUREシステム中で合成した。反応した試料をプロトン濃度勾配指示薬ACMA（ex 410 nm/em 480 nm）の存在下で分光蛍光光度計により直接分析した。 プロトンポンプ活性は、３０秒でライトオンによって刺激され、１００秒でライトオフによって終了した。
【図Ｓ１６】PUREシステム内での野生型または変異型bR合成。  各bRは、［35S］メチオニン存在下のPUREシステム中で合成した。野生型（bRwt）または変異型（bRmut）に対するmRNAをそれぞれ400 nMまたは800 nM添加することによって反応を開始させた。反応後、サンプルをSDS-PAGEによって分析し、オートラジオグラフィーによって可視化した。タンパク質定量のためにバンド強度を測定し計算した。
【図Ｓ１７】新たに光合成されたbRの定量 5μMのbRおよび1μMのFoF1からなる36nM人工オルガネラ及び100μＭのレチナールの存在下で、bRwtを濃度400n MのmRNAから合成した。生成物を[35S]メチオニンで標識した。反応後、サンプルをSDS-PAGEによって分析し、オートラジオグラフィーによって可視化した。タンパク質定量のためにバンド強度を測定し計算した。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
[プロテオリポソームの調製方法]
本発明は第一に、リポソームの脂質二重層内に光駆動プロトンポンプ及び／又はATP合成酵素が組み込まれているプロテオリポソームの調製方法であって、以下のステップ：
（１）脂質成分を界面活性剤で可溶化するステップ；
（２）該界面活性剤の少なくとも一部を除去するステップ；及び
（３）光駆動プロトンポンプ及び／又はATP合成酵素を添加してリポソームの脂質二重層内に組み込ませるステップ、
を上記の順に含む、前記調製方法に関する。
【００１８】
人工脂質膜小胞は、人工的に調製された「脂質膜小胞（Lipid membrane vesicle）」である。脂質膜小胞は、単に、「小胞（ベシクル）」又は「リポソーム」等とも称され、球状の脂質二重層から成り内部に水相をもつ閉鎖小胞であり、その粒子径は数〜数百nmの広範囲に及ぶ。該リポソームの脂質二重層内に膜タンパク質が組み込まれた（再構成された）ものが「プロテオリポソーム」と称される。本発明のプロテオリポソームの粒径に特に制限はないが、例えば、本発明の人工細胞に人工細胞小器官（オルガネラ）として内包されるような場合には、数百nm、例えば、１００〜２００nm程度の粒径（直径）であることが好ましい。
【００１９】
「光駆動(光依存的)プロトンポンプ」とは、一般的に、光エネルギーによって、細胞内やオルガネラ内のプロトン(水素イオン、H+)を電気化学的ポテンシャルに逆らって細胞外やオルガネラ外に能動輸送する機能を有するタンパク質を意味する。バクテリオロドプシン（bR）は高度好塩菌Halobacterium salinarumの「紫膜」と呼ばれる構造体に含まれている、レチナールを発色団とするタンパク質であり、構造生物学上初めて立体構造が解明された光駆動(光依存的)プロトンポンプの一つである。また、プロトン輸送のメカニズムも明らかになっている。例えば、本明細書に記載されているような、当業者に公知の方法・手段によって、bRを容易に調製することができる。
【００２０】
F型ATP合成酵素であるFoF1は、ミトコンドリア内膜、葉緑体チラコイド膜、各種細菌細胞膜に含まれている膜タンパク質であり、電子伝達系の働きにより膜を介して形成されたH+電気化学的ポテンシャル差（プロトン濃度勾配）を利用して、ADPと無機リン酸からATPを合成する。尚、逆反応であるイオン輸送性ATPアーゼ活性も有していて、F型ATPアーゼとも呼ばれる。膜内に存在してH+の輸送経路となるFo（エフオー）と ATP合成及び加水分解の触媒部分であるF1（エフワン）の2つの部位からなる。例えば、本明細書に記載されているような、当業者に公知の方法・手段によって、FoF1を容易に調製することができる。
【００２１】
従来技術に於けるこのようなプロテオリポソームの調製方法に於いては、最初のステップ（段階）で、その構成成分である膜タンパク質を脂質成分と共に可溶化している（One-Step法）。これに対して、本発明の調製方法に於いては、脂質成分を界面活性剤で可溶化した後、該界面活性剤の少なくとも一部を除去した後に初めて、光駆動プロトンポンプ及び／又はATP合成酵素等の膜タンパク質を添加して、それらの膜タンパク質をリポソームの脂質二重層内に組み込ませることを特徴とする（Stepwise法）。
【００２２】
具体的には、例えば、本明細書の実施例に記載されているように、一回又は複数回（例えば、２〜３回程度の数回）のステップ（２）によって界面活性剤を大部分除去した後、界面活性剤を含む膜タンパク質を添加してリポソームの脂質二重層内に組み込ませるステップ（３）を実施する。又は、膜タンパク質を添加してリポソームの脂質二重層内に組み込ませるステップの後に、ステップ（２）で除去しなかった界面活性剤の残りの全てを除去するステップ（４）を実施しても良い。
【００２３】
更に、本発明の調製方法に於いては、上記の各ステップの後に、適当な条件下でインキュベーションするステップを任意に含むことが出来る。
【００２４】
本発明の調製方法に於ける各ステップは、当業者に公知の任意の手段・操作を用いて適当な反応条件（脂質成分等のプロテオリポソームの原料の種類及び含有割合、組み込まれる膜タンパク質の含有比率、界面活性剤等の反応試薬及び緩衝液等の種類・濃度、並びに、各ステップの反応及びインキュベーションの時間・温度等)下で実施することが出来る。例えば、各ステップは〜数時間程度、室温で行うことが出来る。又、界面活性剤の除去は当業者に公知の任意の手段、例えば、ビーズ形状等の適当な界面活性剤除去剤（市販されている）を用いて行うことが出来る。
【００２５】
例えば、各ステップは、適当な時間、例えば、３０分〜数時間をかけて行うことができる。更に、界面活性剤を除去する最初のステップの約３０分〜４時間、好ましくは約３０分〜３．５時間後に光駆動プロトンポンプ及び／又はATP合成酵素等を添加することができる。
【００２６】
更に、調製されたプロテオリポソーム内部からのプロトンの漏れ（流出）を抑制する為に、脂質膜の平面方向流動性を阻害することが出来る、当業者に公知の適当な化合物、例えば、コレステロールを適当な割合（例えば、脂質膜の脂質組成全体の20〜40モル％程度）で脂質膜に含有させることが好ましい。
【００２７】
プロテオリポソームに組み込まれた（再構成された）bR等の光駆動プロトンポンプの正味の活性（net-activity）は、プロテオリポソームの外部から内部へプロトンを輸送する「内側向き（正しい）配向」と、内部のプロトンを外部に戻してしまう「外側向き（逆向きの）配向」の差分と考えられる。理論的には、内側向きと外側向きの光駆動プロトンポンプの量はほぼ等しくなると予想され、プロトンポンプの正味の活性が低い原因となる。逆にいえば、「内側向き（正しい）配向」のプロトンポンプが優先的に得られる調製法が重要である。本発明の調製方法により得られたプロテオリポソームでは、膜に組み込まれた光駆動プロトンポンプのうち、「内側向き（正しい）配向」の光駆動プロトンポンプの割合（「正しい膜配向率」）は８５％以上であり、高い正味のプロトンポンプ活性が確認された。その結果、プロテオリポソーム内外に高いプロトン濃度勾配が形成され、実施例で示されるように、プロテオリポソームに更にATP合成酵素を組み込むことによって、従来技術では得られなかったような高い産生効率（濃度）で光依存的にATPを産生することが可能となった。
【００２８】
[プロテオリポソーム]
従って、本発明は第二に、上記の本発明方法によって調製されるプロテオリポソーム、即ち、リポソームの脂質二重層内にバクテリオロドプシン等の光駆動プロトンポンプ及びATP合成酵素が組み込まれている光依存的にATP合成可能なプロテオリポソームに係る。該プロテオリポソームに於いて、光駆動プロトンポンプの正しい膜配向率は５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、更に好ましくは８５％以上である。その結果、例えば、本明細書の実施例に示した条件下（10 mM HEPES-KOH [pH7.3], 3 mM MgCl2, 0.5μg/ml ACMAを含むアッセイ反応液にbR-PLsを加えλ＞500nm以上の光を照射しつつex 410nm/em 480nmの条件で蛍光を測定）で、該プロテオリポソームに再構成されたbRは、約-2〜-3.5ΔpH/min/nmol、例えば、-2.87±0.53ΔpH/min/nmol、又は、約-0.8〜-1.5ΔpH /min/mg、例えば、-0.11±0.02ΔpH /min/mgの初期反応速度に示される、プロトンポンプ活性を有する。更に、本発明のプロテオリポソームには、F1部分がプロテオリポソームの外側に露出している割合（正しい膜配向率）が５０％以上、好ましくは６０％以上となるようにATP合成酵素が膜に組み込まれている。
【００２９】
該プロテオリポソームに組み込まれているbR及びATP合成酵素の比率に特に制限はなく、例えば、ATP合成酵素に対して数十倍〜数百倍の量のbR（例えば、bR / FoF1の量の比率が10:1〜200:1）を含有させることが出来る。その結果、例えば、本明細書の実施例に示した条件下（10 mM HEPES-KOH [pH7.3], 3mM MgCl2, 10 mM NaH2PO4, 200 mM sucrose, 10 mM NaN3, 7.3 mM ultrapurified ADPを含むアッセイ反応液に176μM bR/1μM FoF1から成るbRFoF1-PLsを加えλ＞500nm以上の光を照射しつつ37℃で保温）での測定に於いて、一つのbRFoF1-PLは、照射の4時間以内に約5〜７×105分子、例えば、6.0×105分子のATPを産生することが出来、最初の5分間の反応速度として約8〜9 ATP /s /bRFoF1-PL、例えば、8.3 ± 0.3 ATP /s /bRFoF1-PLのATP産生能を示す。
【００３０】
[プロテオリポソームを内包する巨大単層小胞（GUV）及び人工細胞]
本発明は第三に、上記のプロテオリポソームを含む反応系に係るものである。特に、該プロテオリポソームを内包する巨大単層小胞（GUV）及び人工細胞に係るものである。該巨大単層小胞はリポソームの一種であり、球状の脂質二重層から成り内部に水相をもつ閉鎖小胞であり、その粒径は数μm〜数十μm、例えば、５μm〜５０μmであって、ヒト等の生物の血球細胞の大きさに匹敵する。このような巨大膜小胞には、目的などに応じて、適当な量の該プロテオリポソーム、例えば、半径5μmのGUVあたり約２００〜２０，０００個、又は、半径5μmのGUVあたり約1.1×104個の該プロテオリポソームを内包させることが可能である。また、該反応系は、例えば、当業者に公知の適当なチャンバー又は試験管等の反応容器の中に該プロテオリポソームを含む水溶液を収容することによって形成された反応系も含む。更に、FoF1のATP加水分解活性を阻害するために、該反応系内（プロテオリポソームの外部）にNaN3等の当業者に公知の任意の化合物を含有させることも出来る。
【００３１】
更に、本発明の反応系は、目的に応じて、該プロテオリポソーム以外にも、ATPを利用するタンパク質合成系等の当業者に公知の様々な反応系及び溶媒等のその他の任意の成分・要素を含有する（共存させる）ことが出来る。例えば、該反応系に更に無細胞タンパク質合成系を含ませることによって、該プロテオリポソームにより産生されたＡＴＰをエネルギー源として使用して、該反応系内でタンパク質の合成等を光依存的に高効率で行わせることが出来る。
【００３２】
本発明の巨大単層小胞は、例えば、本明細書の実施例に記載されているような、当業者に公知の任意の方法で調製することが出来る。又、巨大単層小胞以外の反応系は、当業者に公知の適当なチャンバー及び試験管等の反応容器の中に該プロテオリポソーム等を含む水溶液等の適当な反応液を収容することによって形成することが出来る。
【００３３】
従って、本発明は第四に、本発明の上記プロテオリポソームに加えて、例えば、無細胞タンパク質合成系等のATPを消費する反応系のような様々な反応系を更に含む上記の巨大膜小胞等の反応系、及び該反応系から成る人工細胞にも係るものである。人工細胞に封入された上記プロテオリポソームは、光依存的にATPを産生する人工オルガネラとして機能し、こうして産生されたATPが該人工細胞内の反応系で利用される。
【００３４】
例えば、本発明の人工細胞に於いて、プロテオリポソームによって光合成されたATPは、無細胞タンパク質合成系の翻訳前段階である、tRNAのアミノアシル化の反応及び最終的にリボソームに於いて消費されるグアノシン三リン酸（GTP）をGDPから生成のするために利用される。更に、プロテオリポソームによって光合成されたATPは、無細胞タンパク質合成系の転写段階に於いて、mRNA合成のための基質（ヌクレオチド）としても使用される。
【００３５】
無細胞タンパク質合成系としては、当業者に公知の任意の系を使用することが出来る。例えば、その一例として、参考文献16に記載されているPUREシステムを挙げることが出来る。
【００３６】
通常、このような無細胞タンパク質合成系には、必要に応じて、各種アミノ酸、それらに対応するtRNA及びアミノアシルtRNA合成酵素、リボソーム、翻訳開始因子（Initiation factor）、翻訳伸長因子(Elongation factor)、翻訳終結因子（Release factor）、タンパク質をコードするmRNA又はDNA、RNAポリメラーゼ、各種ヌクレオチド、エネルギー再生系（クレアチンリン酸、クレアチンカイネース）、ミオカイネース、ヌクレオチドジフォスフェートカイネース、ピロフォスファターゼ等のタンパク質合成に必要な各因子が適宜含まれている。
【００３７】
本発明の巨大単層小胞等の反応系をこのようなタンパク質生産等が可能な人工細胞として機能させるためには、そのエネルギー源として十分な量（mMレベル）のATPが生産されることが必要であるが、実施例で示されているように、本発明の巨大単層小胞等の反応系に於いては、このような量のATPを供給することが可能である。従って、該人工細胞は、光依存的にエネルギー自立型（リン酸循環型）の人工（光合成）細胞である。
【００３８】
更に、本発明の無細胞タンパク質合成系に、本発明の人工オルガネラ等の構成因子、例えば、光駆動プロトンポンプ及び／又はATP合成酵素（FoF1）等の膜タンパク質の少なくとも一部をコードする遺伝子を含めることによって、これら人工オルガネラの構成因子を人工細胞内で合成（再産生）させることが出来る。このようにして新規に合成された構成因子は元の人工オルガネラに自発的に局在化（再構成）してその一部として機能し、例えば、ATP合成活性を促進することが出来る。このように、本発明の人工細胞は再帰的にタンパク質を合成することが可能である。
【００３９】
本発明方法の実施に際して必要な各操作における具体的な条件・手段・手法等に関して、本明細書中で特に記載のないものについては、当該技術分野における技術常識に基づき、当業者が適宜、設定することが出来る。
【実施例】
【００４０】
以下、実施例に則して本発明を詳述する。尚、該実施例は本発明の一態様であって、本発明の技術的範囲はこれら実施例の記載によって制限されるものではなく、特許請求の範囲に記載に基づき、本明細書全体の記載、本明細書に引用された参考文献等の記載内容、及び、当該技術分野における技術常識等を参酌して判断される。
【００４１】
[材料と実験方法]
材料
本明細書に記載の実施例で使用された試薬はすべて、最高の純度とグレードのものを使用した。これらには、POPC（1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン）、コレステロール、PEG2000PE（1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N- [メトキシ（ポリエチレングリコール）-2000]（アンモニウム塩））、大豆ホスファチジルコリン（SoyPC）抽出物、EPC（1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン(塩酸塩)）、EPA（卵ホスファチジン酸（ナトリウム塩））、DAG（ジアシルグリセロール）（Avanti社）；流動パラフィン（Wako社）；pH勾配感受性フルオロフォアACMA（9-アミノ-6-クロロ-2-メトキシアクリジン）、プロトノフォアFCCP（シアン化カルボニル4-（トリフルオロメトキシ）フェニルヒドラゾン）、ADP（アデノシン5'-二リン酸一カリウム塩）、P1-P5-ジ（アデノシン-5 '）五リン酸五ナトリウム塩（AP5A）、カリウム特異的イオノフォアバリノマイシン、Triton-X 100、オールトランスレチナール（ATR）（Sigma社）；ATP（アデノシン5'-三リン酸）、GTP（グアノシン5'-三リン酸）、CTP（シチジン5'-三リン酸）、UTP（ウリジン5'-三リン酸）（geneACT Inc）； OG（オクチルβ-D-グルコピラノシド）、DDM（n-ドデシル-β-D-マルトシド）（Dojindo社）；Tween 20（Calbiochem社）；コール酸ナトリウム（Wako社）；ATP生物発光アッセイキットCLS II（Roche社）；可溶性蛍光色素（MESF）ビーズのQuantum Alexa Fluor 647分子（Bangs Laboratories社）；Alexa Fluor 647で標識されたヒト血清由来のトランスフェリン（Life Technologies社）。
【００４２】
紫膜の分離
しっかりと充填されたバクテリオロドプシン（bR）の二次元結晶を含有する紫色の膜パッチを、わずかな改変を伴う従来のプロトコール（補足参考文献1）に従って、Halobacterium salinarum R1から単離した。簡潔に述べると、H. salinarumコロニーを、4M NaClを含有する6リットルのトリプトン培地に植菌し、好気的条件下及び200W LEDランプを用いた連続照明下で、39℃で約192時間培養した。次いで、細胞を回収し、17μg/ mlのDNaseI（Sigma-Aldrich社）の存在下で塩基性塩溶液に再懸濁した。その後、100mM NaClに対して4℃で一晩透析した。
【００４３】
半透明の赤色溶解物を45,000gで60分間遠心し、沈殿物を100mM NaCl溶液および蒸留水で6回以上洗浄した。最終的に、紫膜沈殿物を30％〜50％ショ糖密度勾配層の上に重層し、SW28スィングローター（Beckman Coulter社）を用いて100,000gで17時間遠心した。遠心の終了後に、紫色のバンドを集めた。紫色の懸濁液を45,000gで1時間遠心することによりショ糖溶液を除去した。紫色の膜沈降物を、50mM Tris-HCl（pH7.6）、150mM NaClおよび10％ グリセロールで懸濁して保存した。
【００４４】
大腸菌でのバクテリオロドプシンの過剰発現および精製
大腸菌株C43（DE3）をpET21c-bR構築物で形質転換した。組換えbRは、そのC末端にヘキサヒスチジンタグを有して発現するように設計した。培養は、6リットルの2×YT培地で振盪しながら37℃で行った。OD 0.6〜0.7になった時に培地に1mM IPTGおよび10μM ATRを添加した。その後、30℃で1時間、次いで37℃で3時間培養を続けた後、細胞を回収し、洗浄した。洗浄した細胞を、溶菌緩衝液（50mM MES [pH6.0]、1mM EDTA、300mM NaCl、プロテイナーゼ阻害剤カクテル）に懸濁し、高圧ホモジナイザーを用いて550barで5回処理して溶菌した。溶菌液を234,788gで1時間遠心し、沈殿を回収することによって膜画分を集めた。回収した膜画分を、50mM MES [pH6.0]、300mM NaCl、5mMイミダゾール、及び1.5％ DDM を含む緩衝液に懸濁し、４℃で一晩インキュベーションして可溶化した。可溶化されたbRを含む画分を、（50mM MES pH6.0、300mM NaCl、0.2％DDM、40mMイミダゾールを含有する緩衝液で予め平衡化した）Niアフィニティークロマトグラフィーに供し、40mM〜300mMイミダゾールの直線勾配でbRを溶出した。最後に、bRを含む溶出画分を、0.2％DDMの存在下、Mono Qカラムに供し、10〜300mM NaClの直線勾配でbRを溶出した。
【００４５】
以下に、pET21c-bRのDNA配列を示す。一重下線はT7プロモーター配列を、二重下線はリボソーム結合配列を示す。太字は遺伝子のコーディング領域（タンパク質になる領域）を示す。
2020115806.tif 000003
【００４６】
組換えFoF1-ATP合成酵素の発現および精製
好熱性バチルスPS3 FoF1-ATP合成酵素を、pTR19ASDSεΔc構築物を保有するDK8大腸菌（uncマイナス）株で過剰発現させた（補足参考文献2）。培養は3リットルの2×YT培地で、37℃で21時間インキュベートすることによって実施した。FoF1の精製は、従来の方法(補足参考文献3) を修正して行った。集菌した大腸菌を、10mMのHEPES-KOH（pH7.5）、5mMのMgCl2、10％のグリセロールおよび28mMのβ-メルカプトエタノールを含む緩衝液に懸濁後、チップ超音波処理によって破砕した。溶解物を4℃で7600rpmで30分間遠心することにより、細胞残滓を除去した後、225,000gで1時間遠心することにより、FoF1複合体を含有する膜画分を回収した。膜画分を緩衝液I [pH7.5]（10mM HEPES、5mM MgCl2、2％ TritonX-100、0.5％ Cholate、10％ グリセロール及びプロテアーゼ阻害剤カクテル）で懸濁し、30℃で30分間温和な振盪下でインキュベートした。次いで、懸濁液を311,000gで20分間30℃で遠心し、上清を回収した。上清に2.3倍量の緩衝液II [pH7.5]（20mMリン酸カリウム、100mM KCl、24mMイミダゾールおよびプロテアーゼ阻害剤カクテル）を添加した。この混合液を、緩衝液A [pH7.5]（20mMリン酸カリウム、100mM KCl、20mMイミダゾールおよび0.15％ DDM）で予め平衡化したNi-NTA（Qiagen）に添加した後に、200mMイミダゾールを含む緩衝液A [pH7.5]でFoF1を溶出させた。タンパク質の均一性および純度は、10〜20％勾配ゲルを用いたSDS-PAGEによって判定した。最後に、純粋で均一な画分を集め、上記緩衝液を20mM KPi（pH7.6）、100mM NaClおよび0.15％ DDMを含む緩衝液に、透析により交換した。これを最終的に分画分子量50kDaの限外ろ過（AmiconUltra）によって濃縮した。
【００４７】
分割GFPの調製
分割（スプリット）GFPは、スーパーフォルダーGFP（sfGFP）遺伝子から開始して、従来の方法で調製した（補足参考文献4）。分割GFPは16点突然変異を含む。はじめに、sfGFP遺伝子に見出されない7箇所の突然変異、即ち、N39I、T105K、E111V、I128T、K166T、I167VおよびS205Tを、プライマーセットP1〜P14（表S３）を用いたquick change PCRにより導入した。次に、P15およびP16プライマーを用いたPCRによって、分割GFPのより大きなパートナー部分（GFP 1-10）のDNA鎖を増幅した。増幅産物を、GFP1-10のC末端にヘキサヒスチジンタグが付加された融合タンパク質の形で発現させるために、インフュージョンクローニング法（infusion cloning technique）を用いてpET29aベクターの制限酵素部位NdeIおよびEcoRIの間に挿入した。このプラスミドDNA は、pET29aGFP1-10と名付け、BL21（DE3）株を用いたGFP 1-10の過剰発現に使用した。より小さいパートナー部分（GFP 11）のDNAは、P17オリゴを鋳型として用い、P18およびP19プライマーを用いたPCRによって調製した。増幅したDNAを鋳型として、P22およびP23プライマーを用い第2段階PCRを行なった。最後に、P24およびP20プライマーを使用してPCRを行い、GFP11鋳型DNAをPUREシステムの発現用鋳型DNAとして使用できるようにした。同様に、PUREシステムでの発現のための鋳型を調製するために、第1および第2段階PCRのためのプライマーセット（P22およびP23、およびP24およびP23）をそれぞれ用いて、pET29aGFP1-10からGFP1-10を増幅した。
【００４８】
GFP 1-10の過剰発現および精製は、BL21（DE3）/pET29aGFP1-10から行った。この株をカナマイシン50μg/mlを含むLB培地に植菌し、振盪しながら37℃で培養した。ODが0.6になった時に1mM IPTGを添加して発現誘導し、インキュベーションを30℃でさらに6時間続けた。細胞を回収し、1回洗浄した。回収した細胞を、20mM Tris-HCl（pH8）、200mM NaCl、0.005％ Triton-X 100およびプロテアーゼ阻害剤カクテルを含有する緩衝液に懸濁して超音波処理した。溶解物を、緩衝液A（20mM Tris-HCl pH8.0、20mM NaClおよび10mMイミダゾール）で予め平衡化したHis-Trap Niカラムに添加した後に、目的タンパク質を10mM〜300mM イミダゾールの直線勾配で溶出した。溶出画分の緩衝液を、緩衝液C（20mM Tris-HCl pH8.0、10mM NaCl）と交換した後、陰イオン交換クロマトグラフィー（モノQカラム）に添加した後、目的タンパク質を10mM〜500mM NaClの直線勾配で溶出した。精製したタンパク質を、10mM Tris-HCl（pH8.0）、150mM NaClおよび10％  グリセロールを含む緩衝液中に-80℃で保存した。
【００４９】
プロテオリポソーム（PL）の再構成
bR若しくはFoF1のいずれかを含むPLの再構成、又は、それらの両者を含むbRFoF1-PLの共再構成は、従来文献（補足参考文献5〜7）の技術に幾つかの変更を加えた本発明の調製方法に従い、界面活性剤によるリポソームの完全な可溶化に基づき実施した。他に指示がない限り、緩衝液PA6-5を再構成緩衝液として使用した。まず、脂質粉末（または、必要に応じて、脂質フィルム）を41.3 mMの濃度で、10mM HEPES、3mM MgCl2、10mM NaH2PO4および200mM ショ糖からなる、緩衝液PA6-5液（pH 7.3）に懸濁した。その後、脂質懸濁液を6％オクチルβ-D-グルコピラノシド（W / V）によって室温で約1時間完全に可溶化した。次に、緩衝液PA6-5液（pH 7.3）で事前に平衡化したSM2バイオビーズ（Bio-Rad社）200mgの第1回目の添加により室温で30分間回転混合しながらインキュベートして界面活性剤を除去した。これに続いて、所定の最終濃度でbR（紫膜として）、FoF1、またはbRおよびFoF1の両方を添加して、回転混合しながらインキュベーションをさらに30分間続けた。その後、SM2バイオビーズ300mgの2回目の添加を行い、室温で90〜120分間混合したままにした。次に、プロテオリポソームを含む濁った上部画分を集め、使用するまで-80℃で保存した。
【００５０】
bR-PLの光依存性H+ポンプ活性
bRのプロトン輸送（ポンプ）活性をアッセイするために、予め37℃で加温した800μlの1R緩衝液（10mM HEPES-KOH [pH7.3]および3mM MgCl2）に、30μlのbR-PLおよび0.5μg/ ml ACMA（プロトン濃度勾配インディケーター）を補充した。その後、光源（Tokina、Techno light KTS-150RSV、15V 150Wランプと520nmロングパスフィルターを装着）を付けることによりカスタマイズされたJASCO FP6500分光蛍光光度計を使用して、励起波長410nmおよび蛍光波長480nmのセットでACMAの蛍光シグナルを0.2秒ごとに測定した。PUREシステムで合成されたbRについては、10mM HEPES-KOH [pH7.5]、5mM MgCl 2および100mM KClからなるアッセイ緩衝液を使用した。bRのH+ポンプ活性のアッセイは、サンプルを光源で照射することによって開始した。
【００５１】
ADPの超精製
購入したADP-モノカリウム塩粉末を、最初に10mM HEPES-KOH（pH7.3）に40 mMの濃度で溶解し、次いで予め平衡化したモノ-Qカラムに通し、0mM〜300mM NaClの直線濃度勾配で溶出した。ADPのピーク画分を集め、凍結乾燥し（Taitec VD-800F凍結乾燥機を使用）、ストック濃度80mMにて10mM HEPES-KOH（pH7.3）で懸濁した。
【００５２】
bRFoF1-PLの光駆動ATP合成活性
ATP合成活性アッセイのために、20μlのbRFoF1-PLを7.3mMの超精製ADPおよび10mMのNaN3と混合し、緩衝液PA6-5で総量を40μlに調製した。ハロゲンランプで所与の時間長および光強度でPLに照射した後、2.5％TCAでPLを破壊することによってATP合成を終了させた。更に、混合溶液と等容量の緩衝液N（250mM Tris-HCl [pH9.5]および4mM EDTA）で混合物を中和した。次いで、100μlのルシフェラーゼ/ルシフェリン混合物（CLSII）を予め添加した緩衝液R [pH8.3]（20mMトリシン、20mMコハク酸、80mM NaClおよび0.6mM KOH）800μlに混合物を注入した。AB-2270 ATTOルミノメーターを用いて、ルミネッセンスを1秒ごとに合計150秒間測定し、0.2nmolのATPを標準として3回注入した。ルミネセンスシグナルのトレースを用いて、ATPの既知の濃度に対して発光強度をプロットした標準曲線に基づいてATPの合成量を計算した。
【００５３】
FoF1-PLのΔpH依存性ATP合成活性
FoF1-PLのΔpH依存性ATP合成活性は、酸-塩基転移アッセイによって測定した（補足参考文献2,7）。16mg/mlのSoyPC抽出物を1μMのFoF1と共に再構成してFoF1-PLを形成させ、酸-塩基転移アッセイに用いた。30μlのFoF1-PLの内腔を、286nMバリノマイシン、0.8mM超精製ADPおよび0.07mM AP5Aを含む酸性化緩衝液（20mMコハク酸、0.6mM KOH、2.5mM MgCl2、10mM NaH2PO4 [pH 4.5]）中で、室温で5分酸性化した。ルシフェリン/ルシフェラーゼ試薬を含む塩基性緩衝液（20mMトリシン、130mM KOH、2.5mM MgCl2、10mM NaH2PO4、7.3mM超精製ADP [pH8.8]）に酸性化PLを注入することによりΔpH依存性ATP合成をアッセイした。生成したATP量は、標準として0.2nmolのATPを3回注入することによって推定した。
【００５４】
巨大膜小胞（GUV）の調製
GUVは、従来技術（補足参考文献8,9）に少し変更を加えて調製した。 GUVは用事調製した脂質-パラフィン混合物から調製した。所望のストック濃度でクロロホルムに溶解した脂質を500μlの脂質-パラフィン混合容量となるように混合した。この混合物をよく混合し、N2ガス流でフラッシュした。脂質混合を促進し、残りのクロロホルムを完全に除去するために、脂質パラフィン混合物を80℃で20分間加熱し、激しくボルテックスした。これをさらにN2ガスで充填した後、バイアルを密閉した。次いで、脂質混合物を含有するバイアルを、温水浴（55℃）中で30〜60分間超音波処理した。脂質混合物を室温で冷却した。続いて、300μlの脂質パラフィン溶液を、200mMのショ糖を補充した30μlの内部溶液と混合した。油中水エマルジョンは、数十秒間上下に穏やかにピペッティングすることによって作り出した。エマルジョンを外部溶液（等容量の400mMグルコースおよびPURE緩衝液からなる）上にゆっくりと置き、氷上で10分間保持した。次に、試料を10,000gで30分間遠心した後、平底のエッペンドルフチューブの底を18ゲージの針で穿孔することによって沈殿物を回収した。最後に、回収したGUV懸濁液を再び9,100gで10分間遠心分離し、沈降したGUVを50μlの新鮮な外部溶液に再懸濁した。
【００５５】
GUV内の光駆動ATP合成
GUVは、POPC、コレステロールおよびPEG2000PEの脂質混合物（5.75：4：0.25モル比）から調製した。GUV内部に封入するbRFoF1-PLは、176μMのbRおよび1μMのFoF1から再構成し、緩衝液-1（pH7.3）に再懸濁した。これに5mMの超精製ADPおよび10mMのNaN3を加えたものを脂質パラフィン溶液と混ぜ、上述の通りに油中水エマルジョンを形成することでGUVを調製した。GUVの調製後、外側の緩衝液を、200mMのグルコースを含有する新鮮な緩衝液-1で置換した。PLを含むGUVを調製する際、プロテイナーゼ-K（PK）を1μMの濃度で外部溶液のみ、または内部および外部溶液の両方に添加した。明暗インキュベーションに先立ち、試料を37℃で2時間インキュベートし、膜に挿入されていないbRおよびFoF1を分解した。これらのGUV試料を明または暗下で37℃でインキュベートした。対照として、GUV内に封入された反応混合物と同じ条件下で反応チューブ内に調製した反応混合物（GUV内に封入されていない反応混合物）を使用した。
【００５６】
光駆動タンパク質合成：GUVおよび試験管内部
光駆動翻訳反応用に、sfGFPをコードする500nMのmRNA、5mMのADP、10mMのNaN3、40A / mlのtRNA および200mMのショ糖を補充した緩衝液-1（表S４）に、bRFoF1-PL（176μM bRおよび1μM FoF1）を再懸濁した。これを対応する酵素混合物（表S２）と混合し、次いでGUVの内部に封入した。該GUV懸濁液を、500nmロングパスフィルターを通過する光照射下37℃で6時間インキュベートした。一方、光駆動転写‐翻訳反応用には、反応混合物を同じ方法で調製したが、GFP11をコードする1nM DNAおよび精製GFP 1-10タンパク質5μMを補充した緩衝液-2（表４）を使用し、反応は光照射下、37℃で7時間行った。
【００５７】
sfGFPを内部合成するGUVを共焦点レーザー走査型顕微鏡（CLSM）（Zeiss LSM 550）によって観察した。集団分析のために、GUV懸濁液を最初に緩衝液PA6-5で10倍に希釈し、蛍光活性化セルソーター（FACS Aria II）によって100,000個のGUVの蛍光強度を分析した。上記と同じ反応混合物を用いて[35S] -Metの存在下の試験管内で、光駆動転写‐翻訳反応を行った。合成したタンパク質を15％SDS-PAGEで展開し、オートラジオグラフィー（Fujifilm）で可視化した。光駆動転写‐翻訳反応では、試料を13時間反応させ、カラム濾過（Bio-Pel 30によるRNaseフリーMicro Bio-Spin Columns）に供した。得られた試料の放射能を液体シンチレーションカウンター（ALOKA LSC-6100）で計数した。
【００５８】
内部合成されたbRの膜局在の制御
無細胞タンパク質合成試薬（PUREfrex 2.0 （GeneFrontier社））を、bR :: sfGFP融合タンパク質をコードした5nM直鎖状DNA、150μMATRおよび8mg / mlリポソームとともにGUVに内包し、37℃で4時間インキュベートした。GUV内腔中の合成されたbR :: sfGFP融合タンパク質の蛍光パターンを共焦点顕微鏡CLSMにより分析した。同じ反応をGUVに封入せずに反応チューブ内で行い、適切な緩衝液により室温で100倍に希釈した後に、生成した凝集体またはリポソームのサイズを動的光散乱法DLS（Viscoteck 802 DLS）によって測定した。データ解析はOmnisizeバージョン3.0ソフトウェアを用いて行った。
【００５９】
bRの無細胞発現
PUREシステム内発現用にコドンを最適化したbR遺伝子は、プライマーP26およびP31を用いて最初のPCRにより増幅し、ついでP21およびP31プライマーを用いて２回目のPCRにより鋳型DNAを調製した。さらに、bR :: sfGFP融合遺伝子を調製するため、bR遺伝子の下流とsfGFP遺伝子の上流が重複するように設計した各々のPCR産物を得るために、bR遺伝子側はプライマーP25 / P27を、およびsfGFP遺伝子側はP28/P29をそれぞれ用いて別個にPCRを行なった。得られたそれぞれのPCR産物と、順方向プライマーであるP25、および逆方向プライマーであるP29を用いてオーバーラップPCRを行なった。最後に、プライマーP26/P30およびP21/P30を用いた2段階のPCR反応により、リボソーム結合部位およびT7プロモーター部位をbR遺伝子の上流に付加した。
【００６０】
浮揚アッセイ
無細胞合成したbRの自発的膜組み込みを、従来の技術（補足参考文献10）を改変して行った。bRはPUREシステムで[35S] -Metおよび8mg / mlのSoyPC抽出リポソームの存在下で5nMのbR鋳型DNA（上流T7プロモーターおよびリボソーム結合部位を有する）から合成した。リポソームは、マイクロエクストルーダー（Avanti Polar社）を使用して、200 nmの孔径の膜を11回通過させることでサイズを均一化した。20 ng/μlの濃度でRNaseAを添加し、37℃で30分間インキュベートすることにより合成反応を停止させた。次に、0％、25％および30％のショ糖溶液層の上部に、合成されたbR（すなわち、bR-PL）を含む合成反応液10μlを重層した。各層は、1×ショ糖浮揚緩衝液（50 mM HEPES-KOH [pH7.6]、100mM KCl、10mM MgCl2）を用いて調製し、300μlずつ重層した。これをTLS55ローターを用いたBeckman Coulter Optima Max XP超遠心機を用いて157,800gで30分間遠心した。遠心後、遠心チューブ上部から1画分あたり200μlずつ計4画分を回収した。収集した画分に氷冷TCAを10％の濃度で加え、20,400gで30分間、4℃で遠心した。上清を除去し、沈殿を200μlのアセトン中に再懸濁し、少なくとも3分間超音波処理した。懸濁液を再び20,400gで30分間遠心分離した。沈殿を室温で5分間放置し、10〜20μlのローディング色素と混合し、水浴中で1分間超音波処理した。最後に、サンプルを15％SDS-PAGEで分析した。
【００６１】
膜配向性アッセイ
再構築したbR-PLまたはFoF1-PLの膜配向性を、各タンパク質成分のNi-NTA磁性ビーズに対する結合親和性を観察することによって評価した。組換えFoF1のβサブユニットおよびbRのC末端にはヘキサヒスチジンタグを付加している。41.3mMの脂質混合物（モル比70：30のSoyPC抽出物/コレステロール）を0.2μMのタンパク質濃度のFoF1またはbRのいずれかと再構成した。Ni2+をチャージした磁気ビーズと混合して、リポソームの外側に露出したタンパク質のヘキサヒスチジンタグに結合させた。対照実験として、PLを0.5％TritonX-100で可溶化し、実験上記と同じ手順を行った。回収した流出、洗浄、溶出画分を10〜20％勾配ゲルで泳動し、抗Hisタグ抗体を用いたウエスタンブロッティングによってバンドを可視化した。
【００６２】
再帰的システム
bR-mut（D85NおよびK216N）を対照実験として使用した。D85NおよびK216Nの点変異を、P32/P33およびP34/P35プライマーを用いたquick change PCRによって、順次、pEXP-5-ct-bRwt プラスミドDNAに導入した。次に、P22およびP23を用いて、インビトロ転写のための鋳型として使用する直鎖状DNAテンプレートを調製した。機能を持たないbR-mutまたは機能を持ったbR-wtの光依存的タンパク質合成のために、PURE反応混合物に、bRFoF1-PL（5μMのbRおよび1μMのFoF1と共にPLを再構成した）、100μMのATR、および0.4μMのbR-wt mRNAまたは0.8μMのbR-mut mRNAを加えた。反応混合物を光照射下で37℃でインキュベートし、ATP濃度の定量のため所定の時間毎に2μlサンプリングした。
【００６３】
[実験結果]
光駆動人工オルガネラの構築
人工オルガネラの構成膜タンパク質であるbRとF型ATP合成酵素（FoF1）を細菌細胞から精製した（図1B、図S1）。精製したbRの光依存性H +ポンプ活性をbRを包埋した（組み込んだ）プロテオリポソーム（bR-PLs）の形態で測定した。光照射中、bR-PLの膜内外のプロトン濃度勾配（ΔpH）はbR濃度に比例して増大し（図1C）、プロトンがbR-PLの外側から内側に輸送されたことが示唆された。さらに、照射を停止したときのプロトン濃度の迅速な復帰が観察された。これは、bR-PLの内側から外側へプロトンが漏出していることを示唆する。温度を上げることによってbR-PL膜の水平方向の流動性が増加すると、プロトンリークが加速された（図Ｓ２）。したがって、膜の流動性を低下させるために、bR-PLの脂質成分に30％のコレステロールを添加し(参考文献12)、プロトンリークを30％減少させた（図Ｓ３）。これらの条件は以降のPL調製で維持された。
【００６４】
膜に再構成された膜タンパク質の内側向きまたは外側向きの配向性は理論的に等しくなると予想されるにも拘わらず、再構成されたbRの膜配向性は、内側向き（PLの外部から内部へプロトンを輸送する正しい配向）の膜配向率が約78.4％（正規化後約86％）と評価された（図Ｓ４）。この非対称配向については、bRのC末端の5つの負に荷電したアミノ酸残基によって引き起こされると示唆する研究報告がある(参考文献13)。逆向き（外側向き）のbRsは、PLの内部から外部へプロトンを輸送するので、再構成されたbRの正味の活性（net-activity）は、逆向きのbRが0%と仮定すると、72%のbRが活性を有する場合と同等になる（86.1%-(100%-86.1%)、表S１）。bRの膜配向を考慮すると、bRの初期反応速度は-2.87±0.53（-0.11±0.02）ΔpH/min/nmol（mg）であった（図1Cおよび表S１）。
【００６５】
一方、膜に再構成されたFoF1のうち、F1が露出している（正しい）配向のものが53.4％であった（正規化後約65.1％、図Ｓ５）。FoF1の膜配向を考慮すると、再構成されたFoF1-PLのATP合成活性の初期反応速度は118±3.2（223±6.1）ATP nmol/min/nmol（mg）であった（図1Dおよび表S１）。FoF1の逆反応であるATP依存性H +ポンプ活性も検出された（図Ｓ６）。従って、これらは再構成されたFoF1-PLの完全な機能性を示している。
【００６６】
いくつかの異なるbR / FoF1比率から組み立てたbRFoF1-PLに、500nmのロングパスフィルターを通した可視光線を照射し、光合成されたATPの量を測定した。最も高い生産性は、176μMのbRと1μMのFoF1で得られ、照射の4時間以内に約6×106のATPが一つのbRFoF1-PLによって産生されたことを示し（図1E）、最初の5分間の反応速度は150 ATP/s/bRFoF1-PLであった。計算上、1つのPLに於いて、3560の機能性bRが18のFoF1を駆動させることになる（表S１）。すべての場合において、FoF1の逆反応（ATPアーゼ活性）を阻害するために10mM NaN3を使用した。照射が≧10mW/cm2であるときに、ATP生成速度がプラトーになることを見出した（図S7）。
【００６７】
直径数十μmの巨大単層小胞（GUV）内で同じ反応を行なった。計算上、直径10μmのGUVあたり約1.1×104のbRFoF1-PLが含まれていた。6時間の光照射後、GUV内部でのATP光合成が観察された（図1F）。定量の結果、一つのGUVあたり1.8mMのATPが産生された（表S１）。恐らくGUV内の光強度は脂質膜がない水溶液中より低いと考えられることから、GUVにおけるATP産生効率は水溶液中のそれの約1/3であった。これらの光駆動型人工オルガネラが、mM濃度のATPを産生する能力があることから、光駆動ドラッグデリバリーシステムのような生体模倣光センサーの構築に適用可能であることを示唆している。
【００６８】
人工オルガネラを含む人工細胞内での光駆動タンパク質合成
次に、構築された人工オルガネラが人工細胞系で機能することを実証するために、GUV内部で光合成されたATPを用いて緑色蛍光タンパク質（GFP）を合成した。このために、bRFoF1-PLを精製翻訳因子から再構成された無細胞タンパク質合成系（PUREシステム）(参考文献14)と組み合わせた。尚、該PUREシステムを表S２に示すように一部改変し、産生されたATPがtRNAのアミノアシル化に特異的に消費されるようにし（図S8）、bRFoF1-PLおよびNaN3と組み合わせてGFPをコードするmRNAを供給した。50mM未満の濃度ではNaN3はタンパク質合成を阻害しなかった（図S9）。最終反応混合液をGUVの内部に封入し、光照射によりタンパク質合成を誘導した。6時間後、有意な蛍光がGUV内部から検出され、GFPがGUV内部で合成されたことが示された（図2A）。このGFP合成はまた、GUVに封入していない反応系でも検出され（図2Bおよび図S10）、光誘導ATP産生のタイミングと同期する結果も得られた（図S11）。これらの結果は、GUV内部のGFP合成が光によって駆動されることを示している。我々は、調製したGUVの50％〜60％が非光照射のGUVよりも有意に蛍光を放出することを見出した（図2C）。
【００６９】
次に、光エネルギーから翻訳の直接エネルギー源であるGTPを合成するため、反応混合液にヌクレオシド二リン酸キナーゼ（NDK）とGTPの代わりにGDPを導入し、光合成されたATPからGTPを合成した（図S8）。結果は、ADP、GDPおよびNDKを添加した場合にGFP合成が検出されたことがSDS-PAGEによって明確に示された（図2D）。GUV内部で同じ反応を行い、内部からの蛍光を観察した（図2E）。このことは光合成エネルギーがtRNAのアミノアシル化だけでなくGUV内部の翻訳反応にも直接使用されたことを示している。
【００７０】
細胞内では、ATPは転写基質としても使用されるため、人工光合成細胞をさらに翻訳-翻訳カップル系に発展させた。GFPの光合成は、GUVに封入しない反応系では検出されたが（図2F）、合成量が顕微鏡観察またはフローサイトメーターの検出限界以下であったためにGUVからの有意な蛍光を観察することができなかった。この問題を克服するために、我々は、Cabantousらによって開発された分割GFP法(参考文献15)を適用した。分割GFPは、GFPが2つの部分：小ペプチド（GFP11）および別の大きなパートナータンパク質（GFP1-10）に分割され、両者が複合体を形成した時に蛍光を発する。実際に、GFP11を組み込むことによってGFP1-10の蛍光が回復することを確認した（図Ｓ12）。強度はやや弱かったが、転写-翻訳反応用に改変したPUREシステム（表S２）、精製GFP1-10タンパク質、及びGFP11をコードするDNAを封入したGUVから蛍光が放出された（図2G）。GUVに封入しない反応系でも分割GFPの蛍光が検出され、GFP11が合成されることを確認した（図S13）。調製した全GUVの約15％が、転写-翻訳の結果として有意な蛍光を発した（図2H）。これらの結果は、光合成されたATPが、タンパク質合成のためのエネルギーとしてだけでなく、生細胞と同様にmRNA合成のための基質としても使用されたことを示している。
【００７１】
人工細胞におけるエネルギー再帰システム
本発明の人工光合成細胞が自立系で働くことを示すために、次に、GFPの代わりに光合成オルガネラの構成因子であるbRを、翻訳のみの系を用いて合成した（表２「For mRNA start」参照）。新たに合成されたbRがbRFoF1-PL膜に局在し、bRFoF1-PLのATP産生活性を増加させることが期待された（図3A）。 PLと共存させて合成した場合、GFPと融合した合成bRは、GUV内腔内ではほとんど均一に観察されたが、GUV膜では観察されなかった（図3B）。対照的に、PLが共存しなかった場合、bR-GFPは凝集体を形成した（図S14）。この結果は、GUV中で合成されたbR-GFPが、内部PL膜上に局在して凝集を回避していることを示している。浮揚アッセイにより、bRの膜局在をさらに確認した。bRがリポソームの存在下で合成されると、リポソーム画分に蓄積し（図3C）、bRが翻訳と同時にPLの膜上に局在することを示した。合成され膜上に局在したbRは、bR合成の時間経過の関数としてプロトンポンプ活性を示した（図3D）。ここで、bRs / PLの化学量論比は、それぞれ10, 30, 60および180分後に11, 61, 124および233として計算された。不活性なbR変異型（bRmut）は何の活性も示さなかった（図S15）。これらの結果は、合成bRが翻訳後に内部PL膜上に自発的に局在し、PLのプロトンポンプ活性に寄与している可能性が高いことを強く支持する。
【００７２】
新たに合成されたbRが機能的である場合、PLに局在するFoF1の産生速度は、PL上にさらなるbRの蓄積が続くことによって増強されるはずである。この点を確認すべく、不活性bR変異型（bRmut）と比較して、野生型bR（bRwt）の合成中のATPレベルを測定した。ここでは、新たに合成されたbRの効果を顕著にするために、低い割合のbR（すなわち、5μM bR）を有するPLを使用した。bRwtまたはbRmutタンパク質の生産性は、mRNA投入量を調節することによってほぼ同等にした（図S16）。これらの条件下で、ATPは人工オルガネラによって産生され、同時にアミノアシルtRNA合成酵素によって消費される。したがって、消費速度が一定であるため、新規に光合成された bRの蓄積に起因するATP生成速度の増大によりbRmutの場合と比較してATPレベルが時間とともに増加すると推定される。bRwtを合成したときのATPレベルは、反応時間全体にわたってbRmutを合成したときの約1.5倍であった（図3E）。注目すべきことに、bRwtおよびbRmutの間のATPレベルの差は、10分後ですでに観察された（図3E、挿入図）。これは、bRが10分間の合成後にその活性を示したという事実と一致しており（図3D）、さらに、反応時間とともにその差が増加した（図3E）。
【００７３】
これらのデータは、所与のPL上の機能的bRの数を増加させることによってプロトン濃度勾配（ΔpH）生成の能力が増強されたので、bRwtの合成中にATP生成速度が加速されたことを示す。これは、新たに合成されたbRwtが、少なくとも2時間まで直線的に増加したことによってさらに支持された（図Ｓ17）。インビトロでFoF1が合成される（参考文献16）ことが既知なことから、FoF1が人工細胞内で同様に合成され得ると考えられる。したがって、以上の知見をまとめると、完全な人工オルガネラが人工細胞内で合成される可能性があり、人工細胞が自己複製を完了した場合には、分裂後の娘細胞が必須のオルガネラを産生する可能性を示している。
【００７４】
ATP中の高エネルギーリン酸結合に蓄えられた化学エネルギーは、ほとんどの細胞内機能にとって基本的なエネルギー源である。本発明によって、人工オルガネラを含む人工細胞系が、まず光エネルギーを電気化学ポテンシャルに変換し、次にGUV内部のATPの化学エネルギーに変換することが出来ることが示された。生成されたATPは、tRNAのアミノアシル化の反応及び最終的に翻訳のために消費されるグアノシン三リン酸（GTP）の生成のために消費された。また、産生されたATPがmRNAに変換され、その後に機能性タンパク質であるGFPに翻訳されることを示した。本発明に係る人工細胞で行われた生化学反応は、実際の生きている細胞で生起する反応に匹敵する。
【００７５】
更に、光合成人工細胞内でbR合成を行った。合成された新規に光合成された bRは、内部人工オルガネラの膜上に局在してATP産生活性を増強し、タンパク質合成とエネルギー産生反応の機能的関関連を示した。bRは人工オルガネラの構成因子であるため、本発明の人工細胞が正のフィードバックループでそれ自身の構成要素(タンパク質成分)を合成したことが示された。再構築された人工オルガネラおよび無細胞タンパク質合成システム（参考文献14）を使用しているので、これらの反応はすべて、最小限の酵素および分子で再構築されたことに留意すべきである。
【００７６】
【表Ｓ１−１】
2020115806.tif 000004
【表Ｓ１−２】
2020115806.tif 000005
【表Ｓ２】
2020115806.tif 000006
【表Ｓ３】
2020115806.tif 000007
【表Ｓ４】
2020115806.tif 000008
【００７７】
［本発明のプロテオリポソーム形成法（Stepwise法）によるイオンポンプ再構築の高効率化］
図４に示した工程に基づき、界面活性剤除去剤を用いた、従来技術及び本発明によるプロテオリポソーム調製法を比較した。即ち、従来の調製方法（One-Step法）の場合、界面活性剤（OG）による脂質単分散の状態でbRを添加した。これに対し、本発明のStepwise法ではOG除去剤添加後0.5時間経過後にbRを添加した（図４）。尚、その他の条件は、既に記載した[材料と実験方法]中の「プロテオリポソーム（PL）の再構築」に記載した各条件に準じた。その結果、One-Step法の場合、25.2%（正規化後は31.78％）のbRが正しい膜配向性で膜に再構築された。これに対して、本発明のStepwise法の場合、約3倍弱に当たる70.3%（正規化後は97.8%）のbRが正しい膜配向性を示した（図５）。
【００７８】
次に、再構築したバクテリオロドプシン(bR)のプロトンポンプ活性を検討した。その方法及び結果を図６に示す。以下の手順で行った。
１．bRプロテオリポソーム調製後、蛍光分光光度計にセットした。
２．プロトン濃度勾配（ΔpH）インディケーター（ACMA: 9-amino-6-chloro-2-methoxy acridine, 419/483）を添加した。
３. 上部から光を照射することで、bRのプロトンポンプを駆動し、プロテオリポソーム外のプロトン濃度の継時的変化を測定した。
４．得られたプロットから、Stepwise法またはOne-Step法により調製したbRのプロトンポンプ活性を比較した。
その結果、420秒光照射した場合、本発明のStepwise法により調製したbR（下の曲線）の方が、One-Step法で調製したbR（上の曲線）より、約２倍強いプロトンポンプ活性を示した。また、初速においては、約３倍の差異が認められた。これは膜配向性の結果と相関するものである。
【産業上の利用可能性】
【００７９】
人工細胞は、生命の起源の研究で、現在の細胞の前に存在していたと考えられているプロトセルまたは始原細胞のモデルとして用いられている(参考文献2,5,11,18,20)。特に、どのようにして始原細胞がエネルギーを生産する能力を獲得したか、ということは、重大な問題である（参考文献21）。ATP合成酵素の遺伝子は、種を超えて高度に保存されており、生命の初期段階から存在していたと考えられている（参考文献22）。しかしながら、複雑な電子伝達系の完成前に、どのような機構によりATP合成酵素を駆動するプロトン濃度勾配が生成されたかについては未だに知られていない。
【００８０】
本発明によって、光駆動プロトンポンプがATP合成酵素を駆動し、小胞内で細胞内に匹敵する濃度でATPの合成を引き起こすことを実証した。このように、周囲環境から供給される物質やエネルギーに大きく依存する始原細胞は、太陽光のエネルギーを使って一価のカチオン（H+またはNa+）勾配を生成することができる膜装置を得た時点で、エネルギー的に自立的な系に進化した可能性があり、これは現在の細胞へとさらに進化する機会を開いた、との仮説が成り立つ。生きている人工細胞を構築しようとする試みは、地球環境の初期に実際に起こった非生物から生物への移行の境界状態を明らかにするであろう。
【００８１】
本発明の人工細胞の技術的意義は、合成生物学の分野における人工細胞（または合成細胞）の研究を進めることである。GUV内に光合成人工オルガネラを封入することにより、光により細胞サイズの区画内のATP（またはGTP）依存性反応を制御することができる。これは、例えば、ATP結合輸送体またはFtsZ依存性細胞分裂(参考文献17)を再構成するのに有益であり得る。
【００８２】
更に、本発明は、光依存的にATPを循環生産する反応系を提供する。ATPを利用する様々な反応系と共存させることで、バイオセンサー等の各種のバイオデバイスの開発にも寄与し、細胞内反応のモデル化のためのプラットフォームとしての利用が期待できる。例えば、タンパク質合成系と共存させることにより、光を感知してタンパク質およびRNA合成を促進するバイオセンサー等が考えられる。
【００８３】
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【００８４】
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【図１】
2020115806.tif 000009
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図Ｓ１】
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【図Ｓ２】
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【図Ｓ３】
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【図Ｓ４】
2020115806.tif 000018
【図Ｓ５】
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【図Ｓ６】
2020115806.tif 000020
【図Ｓ７】
2020115806.tif 000021
【図Ｓ８】
2020115806.tif 000022
【図Ｓ９】
2020115806.tif 000023
【図Ｓ１０】
2020115806.tif 000024
【図Ｓ１１】
2020115806.tif 000025
【図Ｓ１２】
2020115806.tif 000026
【図Ｓ１３】
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【図Ｓ１４】
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【図Ｓ１５】
2020115806.tif 000029
【図Ｓ１６】
2020115806.tif 000030
【図Ｓ１７】
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【配列表】
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