(57)【要約】【課題】  様々な細胞種に適用できるより高い汎用性を有し、リン酸塩皮膜を含む細胞培養基材のリン酸塩被膜上で接着培養された細胞を容易に回収し得る細胞の製造方法を提供。【解決手段】  基材本体と基材本体表面に配置されたリン酸塩被膜とからなる細胞培養基材を有する培養容器を用いて、細胞培養基材のリン酸塩被膜上で細胞の接着培養を行い、次いで、ｐＨ７．０未満の溶液をリン酸塩被膜に接触させてリン酸塩被膜上から細胞を剥離し、剥離した細胞を回収する細胞の製造方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
基材本体と前記基材本体表面に配置されたリン酸塩被膜とからなる細胞培養基材を有する培養容器を用いて、前記細胞培養基材の前記リン酸塩被膜上で細胞の接着培養を行い、次いで、ｐＨ７．０未満の溶液を前記リン酸塩被膜に接触させて前記リン酸塩被膜上から前記細胞を剥離し、剥離した細胞を回収する細胞の製造方法。
【請求項２】
前記基材本体が、前記培養容器の底部の少なくとも一部を構成し、
底部表面に前記リン酸塩被膜を有する前記培養容器内で細胞の接着培養を行う、請求項１に記載の細胞の製造方法。
【請求項３】
前記基材本体が、基板または粒状担体で構成され、
前記細胞培養基材が配置された前記培養容器内で細胞の接着培養を行う、請求項１に記載の細胞の製造方法。
【請求項４】
前記リン酸塩被膜が、リン酸カルシウム化合物を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞の製造方法。
【請求項５】
底部表面に配置されたリン酸塩被膜を有する培養容器と、ｐＨ７．０未満の溶液とを有する、細胞を培養増殖するためのキット。
【請求項６】
基板および前記基板上に配置されたリン酸塩被膜を有する細胞培養基材または粒状担体および粒状担体上に配置されたリン酸塩被膜を有する細胞培養基材と、ｐＨ７．０未満の溶液とを有する、細胞を培養増殖するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の製造方法、および、キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、細胞の接触培養は、生体親和性材料で構成された細胞培養基材の表面上にて行われていた。
例えば、特許文献１においては、細胞を付着させ、細胞を増殖させる平板部を有する細胞培養支持体であって、平板部が主としてリン酸カルシウム系化合物で構成されている細胞培養支持体が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００４−１７３５０２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
一方で、細胞培養基材上で接触培養した細胞を回収するためには、細胞を細胞培養基材表面から剥離する必要がある。
本発明者らが特許文献１に記載されるようなリン酸塩被膜を含む細胞培養基材を用いて細胞の接着培養を行い、リン酸塩皮膜上の細胞を回収しようとしたところ、細胞の種類によっては剥離がしづらいという問題があった。
細胞培養基材としては、汎用性の点から、細胞の種類によらず、細胞の剥離ができることが望ましい。
なお、細胞を細胞培養基材表面から剥離する方法として、細胞と細胞培養基材との間の結合を破壊する作用を有する物質（例えば、トリプシンのようなタンパク質分解酵素、化学薬品）を用いる酵素処理や化学薬品処理がある。しかし、これらの処理は手順が煩雑である。また、これらの処理を行うと、不純物が混入する場合がある点、および、細胞自体が変性し本来の機能が損なわれる場合がある点が指摘されている。
【０００５】
本発明は、上記実情を鑑みて、様々な細胞種に適用できるより高い汎用性を有し、リン酸塩皮膜を含む細胞培養基材のリン酸塩被膜上で接着培養された細胞を容易に回収し得る細胞の製造方法の提供を課題とする。
また、本発明は、上記製造方法にて使用されるキットの提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を解決するための具体的手段は以下の通りである。
（１）  基材本体と基材本体表面に配置されたリン酸塩被膜とからなる細胞培養基材を有する培養容器を用いて、細胞培養基材のリン酸塩被膜上で細胞の接着培養を行い、次いで、ｐＨ７．０未満の溶液をリン酸塩被膜に接触させてリン酸塩被膜上から細胞を剥離し、剥離した細胞を回収する細胞の製造方法。
（２）  基材本体が、培養容器の底部の少なくとも一部を構成し、
底部表面にリン酸塩被膜を有する培養容器内で細胞の接着培養を行う、（１）に記載の細胞の製造方法。
（３）  基材本体が、基板または粒状担体で構成され、
細胞培養基材が配置された培養容器内で細胞の接着培養を行う、（１）に記載の細胞の製造方法。
（４）  リン酸塩被膜が、リン酸カルシウム化合物を含む、（１）〜（３）のいずれかに記載の細胞の製造方法。
（５）  底部表面に配置されたリン酸塩被膜を有する培養容器と、ｐＨ７．０未満の溶液とを有する、細胞を培養増殖するためのキット。
（６）  基板および基板上に配置されたリン酸塩被膜を有する細胞培養基材または粒状担体および粒状担体上に配置されたリン酸塩被膜を有する細胞培養基材と、ｐＨ７．０未満の溶液とを有する、細胞を培養増殖するためのキット。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、様々な細胞種に適用できるより高い汎用性を有し、リン酸塩皮膜を含む細胞培養基材のリン酸塩被膜上で接着培養された細胞を容易に回収し得る細胞の製造方法を提供できる。
また、本発明によれば、上記製造方法にて使用されるキットを提供できる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】本発明の細胞の製造方法の第１実施形態の工程Ａ１を説明するための図である。
【図２】リン酸塩被膜から細胞が剥離する機構を説明するための図であり、（Ａ）はリン酸塩被膜とｐＨ７．０未満の溶液（以後、「特定溶液」とも称する）とを接触させる前のリン酸塩被膜の一部拡大図であり、（Ｂ）はリン酸塩被膜と特定溶液とを接触させた後のリン酸塩被膜の一部拡大図である。
【図３】リン酸塩被膜と特定溶液とを接触させる方法の一形態の手順を示す図である。
【図４】リン酸塩被膜と特定溶液とを接触させた状態の図である。
【図５】リン酸塩被膜と特定溶液とを接触させる方法の他形態の手順を示す図である。
【図６】リン酸塩被膜と特定溶液とを接触させた状態の図である。
【図７】被膜付き培養容器の他の実施形態を示す図である。
【図８】本発明の細胞の製造方法の第２実施形態の工程Ｂ１を説明するための図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
＜第１実施形態＞
本発明の細胞の製造方法（細胞の培養方法）の第１実施形態は、以下の工程Ａ１および工程２を有する。
工程Ａ１：液体培地が収容され、かつ、底部表面にリン酸塩被膜を有する培養容器内において、リン酸塩被膜上で細胞の接着培養を行う工程
工程２：特定溶液をリン酸塩被膜に接触させて、リン酸塩被膜上から細胞を剥離して回収する工程
以下、本実施形態の手順について、図面を参照しながら、説明する。
【００１０】
（工程Ａ１）
工程Ａ１は、液体培地が収容され、かつ、底部表面にリン酸塩被膜を有する培養容器内において、リン酸塩被膜上で細胞の接着培養を行う工程である。より具体的には、図１に示すように、液体培地Ｍが収容された培養容器１０の底部表面にリン酸塩被膜１２が配置されており、リン酸塩被膜１２上で細胞Ｃを接着培養する工程である。つまり、本実施形態では、培養容器と、培養容器の底部表面に配置されたリン酸塩被膜とを有する被膜付き培養容器が用いられる。本実施形態では、培養容器の底部の一部が、基材本体に該当する。
以下では、まず、本工程で使用される部材および材料について詳述し、その後、工程の手順について詳述する。
【００１１】
培養容器は、その内部に液体培地を収容でき、かつ、その底部上にリン酸塩被膜が配置できるものであればよい。通常、培養容器は、少なくとも底部と、底部の周囲からのびる壁部とを少なくとも有する。
【００１２】
リン酸塩被膜は、リン酸塩から構成される被膜である。
リン酸塩の具体例としては、リン酸カルシウム化合物、リン酸ナトリウム化合物、リン酸カリウム化合物が挙げられ、細胞培養により好適な点から、リン酸カルシウム化合物が好ましい。
リン酸カルシウム化合物としては、リン酸源（リン酸、第１リン酸ナトリウム、第２リン酸ナトリウム、第１リン酸カリウム、第２リン酸カリウム、第１リン酸アンモニウム、第２リン酸アンモニウム、より選択される１種以上の塩）と、カルシウム源（硝酸カルシウム、炭酸カルシウム、塩化カルシウム、水酸化カルシウム、酢酸カルシウム、より選択される１種以上の塩）との混合物、または、混合反応物が好ましい。リン酸カルシウム化合物の具体例としては、リン酸一水素カルシウム無水和物（ＣａＨＰＯ４）、リン酸一水素カルシウム二水和物（ＣａＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ）、リン酸三カルシウム（Ｃａ３（ＰＯ４）２）、リン酸二水素カルシウム無水和物（Ｃａ（Ｈ２ＰＯ４）２）、リン酸二水素カルシウム１水和物（Ｃａ（Ｈ２ＰＯ４）２・Ｈ２Ｏ）、リン酸四カルシウム（Ｃａ４Ｏ（ＰＯ４）２）、水酸アパタイト（Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２）、リン酸八カルシウム（Ｃａ８Ｈ２（ＰＯ４）６・５Ｈ２Ｏ）、非晶質リン酸カルシウム（Ｃａ３（ＰＯ４）２・ｎＨ２Ｏ）が挙げられる。
【００１３】
リン酸塩被膜の形成方法としては、カルシウム溶液とリン溶液への浸漬、乾燥による方法や、高エネルギーレーザーやプラズマを用いた方法がある。より具体的には、特許４４８４６３１号公報に記載の方法が挙げられる。
【００１４】
リン酸塩被膜は、少なくとも培養容器の底部の全面に配置されるのが好ましい。なお、リン酸塩被膜は、細胞が接触し得る培養容器の全ての面上に配置されていてもよい。
なお、必要に応じて、培養容器とリン酸塩被膜との間には他の層が配置されていてもよい。例えば、両者の密着性を高めるための、両者の間にプライマー層が配置されていてもよい。
【００１５】
液体培地は、通常用いられる細胞培養培地から、接着培養する細胞に応じて適宜選択できる。細胞培養培地の具体例としては、Ｅ−ＭＥＭ、ＭＥＭ−α、ＭＥＭ、ダルベッコ改変イーグル培地、ＲＰＭＩ１６４０が挙げられる。
また、これらの液体培地に対しては、必要に応じて、血清、各種ビタミン、各種抗生物質等の細胞培養に適用可能な各種添加剤を添加してもよい。
なお、液体培地には、水が含まれる場合が多い。一般的に、液体培地は、栄養分を水に溶解させて得られる。
【００１６】
リン酸塩被膜上で接着培養される細胞の種類としては、ヒトを含む哺乳動物の細胞が挙げられ、例えば、体細胞、その前駆細胞、その幹細胞、多能性幹細胞（ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞等）およびそれらの混合細胞が挙げられる。細胞の具体例としては、内皮細胞、間葉系幹細胞、脂肪由来幹細胞、臍帯血由来幹細胞、歯髄幹細胞、心筋細胞、心臓壁細胞、肝細胞、線維芽細胞、骨芽細胞、血管内皮細胞、肝前駆細胞、間葉系細胞、膵島細胞、軟骨細胞、上皮細胞が挙げられる。
なお、細胞としては、付着性細胞が好ましい。ここで付着性細胞とは、非浮遊性の細胞であり、細胞増殖に際して培養器面に対する接着依存性を示す細胞である。
特に、本発明に好適に適用できる細胞としては、ＭＳＣ（間葉系幹細胞）、ＨｅｐＧ２細胞、ＴｉＧ−３細胞が挙げられる。なお、ＭＳＣは、中胚葉由来である。また、ＨｅｐＧ２細胞は、人肝癌由来（内胚葉由来）である。また、ＴＩＧ−３細胞は、人胎児肺由来（内胚葉由来）である。
【００１７】
本工程の手順はリン酸塩被膜上で細胞が接着培養されればよく、代表例としては、所定の種類の細胞を所定数となるように培養容器内のリン酸塩被膜上に播種し、さらに液体培地を培養容器内に加え、接着培養を行う。なお、液体培地を先に培養容器内に加えて、その後、細胞を播種してもよい。
【００１８】
細胞の接着培養条件は、細胞の種類に応じて適宜最適な条件を選択できる。例えば、培養温度は、通常、約３０〜４０℃が好ましく、約３７℃がより好ましい。接着培養は、例えば、ＣＯ２含有空気の雰囲気下で行われ、ＣＯ２濃度は、例えば２〜５％である。培養時間は、例えば、１〜１０日間である。
なお、気体を供給しながら、接着培養を行ってもよい。供給される気体の具体例としては、酸素、窒素、一酸化窒素、二酸化窒素、一酸化炭素、二酸化炭素、水素、硫化水素が挙げられる。
【００１９】
（工程２）
工程２は、リン酸塩被膜と特定溶液とを接触させて、リン酸塩被膜上から細胞を剥離して回収する工程である。
リン酸塩被膜と特定溶液とを接触させると、リン酸塩被膜が溶解し、結果としてリン酸塩被膜表面上から細胞が剥離され、細胞を容易に回収できる。
以下、図面を参照して、細胞が剥離する機構について説明する。
図２（Ａ）に示すように、リン酸塩被膜１２が工程２で使用される特定溶液と接触する前は、細胞Ｃがリン酸塩被膜１２上に接着している状態である。
次に、リン酸塩被膜と特定溶液とを接触させると、リン酸塩被膜の一部が溶解する。特に、図２（Ｂ）に示すように、特定溶液と接触するリン酸塩被膜１２の表面から溶解が進行するため、リン酸塩被膜１２の厚みが薄くなる。それに伴い、リン酸塩被膜１２上から細胞Ｃが離れる。言い換えると、リン酸塩被膜上にあった細胞を剥離させることができる。
【００２０】
本実施形態によれば、単にリン酸塩被膜と特定溶液とを接触させて、リン酸塩被膜から細胞を容易に剥離・回収できる。
また、本実施形態は、細胞が接着しているリン酸塩皮膜を溶解することにより細胞を剥離するため、様々な細胞種に適用できる。
【００２１】
以下では、本工程で使用される材料について詳述し、その後、工程の手順について詳述する。
【００２２】
特定溶液は、ｐＨ７．０未満の溶液である。
特定溶液のｐＨは、７．０未満であり、細胞の回収がより容易である点から、６．０以下が好ましく、５．０以下がより好ましい。また、特定溶液のｐＨは、細胞に影響を与えない点で、２．５以上が好ましく、２．８以上がより好ましい。
特定溶液のｐＨの測定は、室温（測定時は２０．９℃）において、堀場製作所  ｐＨ Ｍｅｔｅｒ Ｆ５２を用いたガラス電極法にて実施する。
【００２３】
特定溶液には、酸が含まれていてもよい。酸の具体例としては、塩酸、硫酸、硝酸、後述する各種緩衝剤が挙げられる。酸の濃度は、上述したｐＨとなるように調整される。
特定溶液には、水が主成分として含まれることが好ましい。なお、主成分とは、特定溶液全質量に対して、水の含有量が９０質量％以上を意味する。
なお、特定溶液には、有機溶媒が含まれていてもよい。
【００２４】
特定溶液には、緩衝剤が含まれていてもよい。つまり、特定溶液は、ｐＨ７．０未満の緩衝液であってもよい。
緩衝剤の具体例としては、２−モルホリノエタンスルホン酸、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸、ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸、２−ヒドロキシ−３−モルホリノプロパンスルホン酸、リン酸、クエン酸、酢酸、フタル酸、コハク酸が挙げられる。
【００２５】
特定溶液の比重は、比重１．０超であってもよいし、比重１．０未満であってもよい。
後段で詳述するように、特定溶液の比重によって、適宜最適なリン酸塩被膜との接触方法が選択される。
【００２６】
リン酸塩被膜と特定溶液とを接触させる方法の具体例としては、図３に示すように、培養容器１０内の液体培地Ｍを一旦除去した後、図４に示すように、培養容器１０内に特定溶液Ｓを添加して、リン酸塩被膜１２と特定溶液Ｓとを接触させる方法が挙げられる。
また、上記方法以外にも、特定溶液の比重が液体培地の比重よりも大きい場合には、図５に示すように、液体培地Ｍが収容された培養容器１０内に特定溶液Ｓを添加する方法が挙げられる。この方法においては、特定溶液Ｓが液体培地Ｍよりも比重が大きいため、液体培地Ｍが上層側に、特定溶液Ｓが下層側に位置するため、図６に示すように、特定溶液Ｓがリン酸塩被膜１２と接触するまで、特定溶液Ｓを培養容器１０内に添加する。上述したように、リン酸塩被膜１２と特定溶液Ｓとが接触すると、リン酸塩被膜１２が特定溶液Ｓ中に溶解し、リン酸塩被膜１２上で接着培養された細胞Ｃがリン酸塩被膜１２上から剥離し、細胞を容易に回収できる。
【００２７】
リン酸塩被膜と特定溶液との接触時間としては、リン酸塩被膜の溶解性の点から、１〜６０分間が好ましく、５〜１５分間がより好ましい。
また、接触時の温度は、リン酸塩被膜の溶解性の点から、４〜３７℃が好ましく、２２℃（室温）〜３７℃がより好ましい。
【００２８】
なお、リン酸塩被膜と特定溶液とを接触させた後、必要に応じて、特定溶液を除去して、再度、培養容器内に液体培地を加えて、細胞の回収を実施してもよい。
また、回収された細胞の形態としては、細胞シート（細胞がシート状に集合したもの）であっても、個々の細胞がバラバラに分離したものであってもよい。
【００２９】
なお、培養容器の形状は図１の形態に限定されず、表面に複数の穴（ウェル）を有する培養容器であってもよい。より具体的には、被膜付き培養容器としては、図７に示すように、複数の穴（ウェル）１４を有し、その穴１４内部の底部表面にリン酸塩被膜１２が配置されている培養容器１００であってもよい。
なお、図７においては、穴の数は４つであるが、複数（２つ以上）あればよく、５つ以上であってもよい。穴の数の上限は、１５３６以下である。
また、図７においては、穴内部の底部上のみにリン酸塩被膜が配置されているが、穴内部の表面全面を覆うようにリン酸塩被膜が配置されていてもよい。つまり、穴内部の底部上および側面上にリン酸塩被膜が配置されていてもよい。
また、図７においては、穴の底部の形状は平底であるが、Ｕ底、Ｖ底であってもよい。
また、穴の開口部の形状は、円形であっても、矩形状であってもよい。
また、穴の開口部の大きさは、円相当径で１．５〜３５ｍｍが好ましい。円相当径とは、開口部の形状を、開口部の投影面積と同じ投影面積をもつ円と想定したときの円の直径である。
【００３０】
＜第２実施形態＞
本発明の細胞の製造方法の第２実施形態は、以下の工程Ｂ１および工程２を有する。
工程Ｂ１：細胞培養基材が配置された培養容器内で細胞の接着培養を行う工程
工程２：特定溶液をリン酸塩被膜に接触させて、リン酸塩被膜上から細胞を剥離して回収する工程
第１実施形態ではリン酸塩被膜が底部表面に配置された培養容器が用いられていたのに対して、第２実施形態では基板と基板上に配置されたリン酸塩被膜とを有する細胞培養基材が培養容器内に配置されている点以外は、同一の手順を実施するため、同一の手順（例えば、細胞の培養手順、工程２の構成）について説明を省略し、以下では、主に、第１実施形態との差異点について詳述する。
【００３１】
工程Ｂ１は、細胞培養基材が配置された培養容器内に収容された液体培地中で、かつ、細胞培養基材のリン酸塩被膜上で、細胞の接着培養を行う工程である。より具体的には、図８に示すように、液体培地Ｍが収容された培養容器１０の底部上に、基板１６とリン酸塩被膜１２とを有する細胞培養基材１８を配置して、リン酸塩被膜１２上で細胞Ｃを接着培養する工程である。本実施形態では、基板が、基材本体に該当する。
なお、図８においては、細胞培養基材が培養容器の底部上に配置されているが、この態様に限定されず、細胞培養基材を支持材で支持して培養容器底部から離れた培養液中に配置してもよい。
【００３２】
細胞培養基材は、基板と、基板上に配置されたリン酸塩被膜とを有し、リン酸塩被膜上にて細胞の接着培養が行われる。
基板の具体例としては、ガラス基板、樹脂基板、金属基板が挙げられる。基板としては、取り扱い性の点から、ガラス基板が好ましい。
基板の板厚は、例えば、０．０１〜２０ｍｍである。
【００３３】
リン酸塩被膜の構成は、第１実施形態と同様の構成である。
基板上に被膜を形成する方法の具体例としては、上述した第１実施形態で述べた方法が挙げられる。
【００３４】
リン酸塩被膜は、一対の主面を有する基板の少なくとも一方の主面上全面の配置されるのが好ましい。なお、リン酸塩被膜は、基板の全ての面上に配置されていてもよい。
なお、必要に応じて、基板とリン酸塩被膜との間には他の層が配置されていてもよい。例えば、両者の密着性を高めるための、両者の間にプライマー層が配置されていてもよい。
【００３５】
＜他の実施形態＞
上記第２実施形態においては、基板と基板上に配置されたリン酸塩被膜とを有する細胞培養基材について述べたが、本発明において細胞培養基材は他の形態であってもよい。例えば、リン酸塩被膜を担持する担体の形状は、粒状であってもよい。つまり、細胞培養基材は、粒状担体と、粒状担体上に配置されたリン酸塩被膜とを有する形態であってもよい。
なお、リン酸塩被膜を有する粒状担体を含む粒状の細胞培養基材は、培養容器底部等に配置して接着培養を行ってもよく、撹拌等の手段で培養液中に浮遊させて接着培養を行ってもよい。
【００３６】
粒状担体は、その表面上にリン酸塩被膜が配置される、粒状の部材である。
粒状担体の形状の具体例としては、球状、楕円体状、立方体状、直方体状が挙げられる。
粒状担体の粒径は、マイクロキャリア培養への適用の点から、１００〜１０００μｍが好ましく、２００〜５００μｍがより好ましい。
粒状担体を構成する材料の具体例としては、樹脂、ガラス、金属、金属酸化物（ただし、ガラス以外）、金属窒化物が挙げられる。
粒状担体の具体例としては、ガラスビーズ、樹脂粒子、シリカビーズが挙げられる。
【００３７】
粒状担体上に配置されるリン酸塩被膜の構成は、第１実施形態と同様の構成である。
また、粒状担体上にリン酸塩被膜を形成する方法の具体例としては、上述した第１実施形態で述べた方法が挙げられる。
なお、リン酸塩被膜は、粒状担体上の少なくとも一部に配置されていればよく、全面に配置されているのが好ましい。
【００３８】
＜キット＞
本発明は、細胞を培養増殖するためのキットにも関する。
キットとしては、底部表面に配置されたリン酸塩被膜を有する培養容器（上述した、被膜付き培養容器に該当）と、特定溶液とを有するキットも挙げられる。本キットは、上述した第１実施形態にて使用される。
【００３９】
また、キットの他の形態としては、基板および基板上に配置されたリン酸塩被膜を有する細胞培養基材と、特定溶液とを有するキットが挙げられる。本キットは、上述した第２実施形態にて使用される。
さらに、キットの他の形態としては、粒状担体および粒状担体上に配置されたリン酸塩被膜を有する細胞培養基材と、特定溶液とを有するキットも挙げられる。
【実施例】
【００４０】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。
【００４１】
培養容器として、以下の２種を用意した。
培養容器１：Corning社製  Corning（登録商標）  Osteo Assay Surface 24 Well Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile （Product #3987）（アパタイトをコートした培養容器）
培養容器２：CellSeed社製  UpCell  細胞シート回収用温度応答性細胞培養器材２４穴プレート（Product #CS3012）（温度刺激応答性のポリマーをコートした培養容器）
なお、上記培養容器１は、複数のウェルを有する容器であり、ウェルの底部が結晶性リン酸カルシウムでコーティングされた培養容器であり、リン酸塩被膜を有する培養容器に該当する。
【００４２】
＜実施例１〜３、比較例１〜３＞
（前培養）
１００ｍｍディッシュ（旭テクノグラス社製  製品＃３０２０−１００）に各種細胞を播種し、３７℃、５％ＣＯ２環境下で培養して、播種細胞を増殖させた。１００ｍｍディッシュ１枚当たりの播種細胞数は２×１０５とし、細胞の種類および各細胞の培地は以下の通りであった。４日から７日の培養後、増殖を確認して、後述する（前培養後の細胞回収）の方法にて細胞を回収した。
種類１：ＭＳＣ（間葉系幹細胞）（細胞株：ＰＴ−２５０１）
細胞１の培地：培地としては、ＦＢＳを最終濃度１０％、抗生物質を最終濃度１％となるように添加したＭＥＭ ａｌｐｈａを用いた。
細胞２：ＨｅｐＧ２（ヒト肝癌由来細胞株）（細胞株：ＨＢ−８０６５１）
細胞２の培地：培地としては、ＦＢＳを最終濃度１０％、抗生物質を最終濃度１％となるように添加したＥ−ＭＥＭを用いた。
細胞３：ＴＩＧ−３（ヒト胎児肺由来線維芽細胞）（細胞株：ＪＣＲＢ０５０６）
細胞３の培地条件：培地としては、ＦＢＳを最終濃度１０％、抗生物質を最終濃度１％となるように添加したＭＥＭを用いた。
【００４３】
なお、上記で使用した材料は以下の通りであった。
ＭＥＭ ａｌｐｈａ：ｇｉｂｃｏ社製  (製品＃１２５７１−０６３)
Ｅ−ＭＥＭ：和光純薬工業社製  (製品＃０５５−０８９７５)
ＭＥＭ：ｇｉｂｃｏ社製  (製品＃１１０９５−０８０)
ＦＢＳ：ＧＥ社製  Ｈｙｃｌｏｎｅ（製品＃ＳＨ３０９１０．０３）
抗生物質：ナカライテスク社製  ペニシリン-ストレプトマイシン混合溶液（製品＃０９３６７−３４）
後述する（細胞培養）にも同様の培地を各細胞に使用し、培養環境は３７℃、５％ＣＯ２とした。
【００４４】
（前培養後の細胞回収）
上記（前培養）にて細胞を培養した後、培地を吸引し、ＰＢＳ（５ｍｌ）を加えて撹拌してから吸引する洗浄工程を２回行った。次に、ディッシュにトリプシン溶液１ｍｌを滴下し、３７℃にて５分間インキュベーションを行った。その後、ディッシュに各種培地４ｍｌを加え、細胞懸濁液を回収した。得られた細胞懸濁液に対して遠心処理を行い（遠心条件：１０００ｒｐｍ、３分間）、細胞を沈降させて上精を除去し、得られた細胞にさらに５ｍｌの培地を加えて、懸濁させた。次に、血球計算盤にて細胞数をカウントした。
上記手順によって、細胞１〜３をそれぞれ含む細胞懸濁液１〜３を得た。
なお、使用した試薬は以下の通りであった。
ＰＢＳ：和光純薬工業社製ＰＢＳ（−）（製品＃１６６−２３５５５）
トリプシン溶液：ナカライテスク社製２．５ｇ／ｌ−トリプシン／１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ溶液（製品＃３２７７７−４４）
【００４５】
（細胞培養）
後述する表１に示すように、各培養容器の２４穴プレート１穴あたり０．５ｍｌの各細胞懸濁液にて１×１０４個の細胞を播種し、３７℃、５％ＣＯ２環境下で、７日の接着培養を行った。
【００４６】
（細胞回収）
培養容器１を用いた各実施例においては、（細胞培養）の後、培地を吸引し、酸溶液であるＭＥＳバッファー調整用ＭＥＳ溶液（０．５ｍｌ）を培養容器に加えて、３７℃で１０分間インキュベーションし、酸溶液を吸引したのちにピペッティングにて細胞剥離を行い、細胞懸濁液を回収した。
培養容器２を用いた各比較例においては、（細胞培養）の後、３７℃から室温（２０℃前後）への温度移行による細胞剥離を３０分間行った後、ピペッティングにて細胞剥離を行った。
３種類の細胞種について、酸溶液による細胞回収効率と、温度移行による細胞回収効率を比較し、表１に示す。
【００４７】
（細胞生存確認）
得られた細胞懸濁液を培養容器（旭テクノグラス社製  製品＃３０２０−１００）に播種して細胞の生存を確認した。ポリスチレン培養容器に評価に用いた３種類の細胞を播種し、細胞の生着および増殖を確認した。結果を表１に示す。
なお、後述する表１に示すように、比較例において細胞種によっては細胞を培養容器からすべて剥離できず、また回収前に細胞が一部剥離しており細胞を効果的に回収できなかった。回収した細胞については酸溶液によるもの、温度移行によるものどちらも細胞の生着と増殖を確認できた。
【００４８】
なお、表１中の「培養容器の種類」欄は、使用した培養容器の種類を表し、「１」〜「２」は、それぞれ「培養容器１」〜「培養容器２」を表す。
また、表１中の「細胞の種類」欄は、使用した細胞の種類（細胞１〜細胞３）を表し、例えば、「１」は細胞１を表す。
また、表１中の「酸溶液の種類」欄は、使用した酸溶液の種類を表す。
なお、酸溶液の種類は、以下の通りであった。
「ＭＥＳ」：ＭＥＳバッファー調整用ＭＥＳ溶液：シグマアルドリッチ社製  ＭＥＳ溶液（Product #1317）（ｐＨ：２．９）
【００４９】
また、表１中の「評価」欄の「回収」欄は、酸溶液を培養容器と接触または温度移行させた後、細胞を回収できた場合を「Ａ」、回収できなかった場合を「Ｂ」として表す。
また、表１中の「評価」欄の「生存確認」欄は、回収した細胞を培養容器に播種して増殖した場合を「Ａ」、増殖しなかった場合を「Ｂ」として表す。
【００５０】
【表１】
2020039290.tif 000003
【００５１】
表１より、所定のリン酸塩被膜と特定溶液とを用いる場合、細胞培養基材から種々の細胞を容易に剥離でき、細胞を容易に製造できた。
一方で、比較例１〜３で用いられた培養容器の場合、細胞１は剥離できるものの、細胞２および３の剥離ができず、汎用性に劣る。
また、培養容器１の代わりに、リン酸カルシウム被膜で覆われたガラスビーズ（粒径５００μｍ）を用いて、実施例１〜３と同様の操作を行ったところ、実施例１〜３と同様の結果が得られた。つまり、粒状の細胞培養基材を用いた場合でも、所望の効果が得られた。
さらに、培養容器１の代わりに、リン酸カルシウム被膜で覆われた基板を用いて、実施例１〜３と同様の操作を行ったところ、実施例１〜３と同様の結果が得られた。
【符号の説明】
【００５２】
１０，１００    培養容器
１２    リン酸塩被膜
１４    穴
１６    基板
１８    細胞培養基材
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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