(57)【要約】【課題】新たな機構に基づく癌転移抑制剤、及び癌転移抑制剤候補物質の選抜方法を提供する。【解決手段】Ｔｒｏｐ−２のＮ末端から３２２番目のセリンをリン酸化する酵素の阻害剤を有効成分として含有することを特徴とする癌転移抑制剤が提供される。前記阻害剤はプロテインキナーゼＣα及びプロテインキナーゼＣδの阻害剤であることが好ましい。Ｔｒｏｐ−２のＮ末端から３２２番目のセリンのリン酸化を阻害する作用を指標として、被検物質から癌転移抑制作用を有する物質を選抜することを特徴とする、癌転移抑制剤候補物質の選抜方法も提供される。【選択図】図１７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔｒｏｐ−２のＮ末端から３２２番目のセリンをリン酸化する酵素の阻害剤を有効成分として含有することを特徴とする癌転移抑制剤。
【請求項２】
前記阻害剤はプロテインキナーゼＣα及びプロテインキナーゼＣδの阻害剤である、請求項１に記載の癌転移抑制剤。
【請求項３】
Ｔｒｏｐ−２のＮ末端から３２２番目のセリンのリン酸化を阻害する作用を指標として、被検物質から癌転移抑制作用を有する物質を選抜することを特徴とする、癌転移抑制剤候補物質の選抜方法。
【請求項４】
プロテインキナーゼＣα及びプロテインキナーゼＣδによるリン酸化を阻害する作用を指標とする、請求項３に記載の癌転移抑制剤候補物質の選抜方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は癌転移抑制剤、及び癌転移抑制剤候補物質の選抜方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌治療における大きな課題として、癌転移を防ぐための技術開発がある。すなわち、癌転移は癌患者の生命を脅かす一大要因であり、癌転移を如何にして防止・抑制するかは重要な課題である。癌転移抑制剤に関して、例えば、特許文献１には、Ｎ，Ｎ’−プロピレンジニコチンアミドまたはその薬学上許容しうる塩を有効成分として含有する癌転移抑制剤について記載されている。特許文献２には、ＳＴＫ２４タンパク質の機能を抑制する抗腫瘍剤について記載され、その腫瘍転移抑制剤への適用について記載されている。特許文献３には、非ペプチド性のアンジオテンシン２型受容体アゴニストを有効成分として含有する悪性腫瘍の転移を抑制又は予防するための医薬について記載されている。
【０００３】
ところで、ヒトが罹患する癌細胞の大半は上皮細胞由来である。正常な上皮組織における細胞間は，特徴的な３つのタイプ、すなわち、タイトジャンクション（tight junction）、アドヘレンスジャンクション（adherens junction）、及びデスモソーム（desmosome）のような接着構造によって結合している。発癌後、癌細胞が腫瘍塊を形成したり、転移のために離散するには、この細胞間結合が崩壊する必要がある。しかし、上皮組織におけるこの場所及び時間依存的な崩壊過程のカスケードは、明確にはなっていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１７−２１８３８０号公報
【特許文献２】特開２０１０−６７３０号公報
【特許文献３】国際公開第２０１５／１５２３９３号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
抗癌剤と比較して、癌転移抑制剤の開発は十分に進んでいるとは言い難い。そこで本発明は、新たな機構に基づく癌転移抑制剤、及び癌転移抑制剤候補物質の選抜方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、上記した細胞間結合の崩壊過程のカスケードの初期に関与する可能性のある膜タンパク質として、Ｔｒｏｐ−２（trophoblast cell surface antigen 2）に着目した。そして、Ｔｒｏｐ−２を構成するアミノ酸のうち、特定のアミノ酸のリン酸化が、癌細胞の接着性と移動能に大きく影響することを見出した。そして、その特定のアミノ酸のリン酸化を阻害することによって、癌細胞の転移を抑制し得ることを見出した。
【０００７】
本発明の１つの様相は、Ｔｒｏｐ−２のＮ末端から３２２番目のセリンをリン酸化する酵素の阻害剤を有効成分として含有することを特徴とする癌転移抑制剤である。
【０００８】
好ましくは、前記阻害剤はプロテインキナーゼＣα及びプロテインキナーゼＣδの阻害剤である。
【０００９】
本発明の他の様相は、Ｔｒｏｐ−２のＮ末端から３２２番目のセリンのリン酸化を阻害する作用を指標として、被検物質から癌転移抑制作用を有する物質を選抜することを特徴とする、癌転移抑制剤候補物質の選抜方法である。
【００１０】
好ましくは、前記選抜方法において、プロテインキナーゼＣα及びプロテインキナーゼＣδによるリン酸化を阻害する作用を指標とする。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、新たな機構に基づく癌転移抑制剤、及び癌転移抑制剤候補物質の選抜方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ＨＣＴ１１６／ＭとＨＣＴ１１６／ＷＴをフローサイトメトリーに供した結果を表すグラフである。
【図２】ＨＣＴ１１６／ＭとＨＣＴ１１６／ＷＴの細胞抽出物をイムノブロッティングに供した結果を表す写真である。
【図３】ＨＣＴ１１６／ＷＴの細胞抽出物のＮ−グリカナーゼ処理物をイムノブロッティングに供した結果を表す写真である。
【図４】ＨＣＴ１１６／ＭとＨＣＴ１１６／ＷＴの顕微鏡写真である。
【図５】ＨＣＴ１１６／ＭとＨＣＴ１１６／ＷＴのマイグレーションアッセイの結果を表す顕微鏡写真である。
【図６】図５の結果を数値化したグラフである。
【図７】ＨＣＴ１１６／ＷＴの細胞抽出物のＮ−グリカナーゼ処理物をＰｈｏｓ−ｔａｇ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後にイムノブロッティングに供した結果を表す写真である。
【図８】図７と同様のイムノブロッティングをＨＣＴ１１６／ＷＴ、ＨＣＴ１１６／Ｓ３０３Ａ、ＨＣＴ１１６／Ｓ３２２Ａについて行った結果を表す写真である。
【図９】図８の結果を数値化したグラフである。
【図１０】ＰＭＡ処理したＨＣＴ１１６／ＷＴの細胞抽出物をイムノブロッティングに供した結果を表す写真である。
【図１１】ＨＣＴ１１６／Ｓ３０３Ａ、ＨＣＴ１１６／Ｓ３２２Ａ、ＨＣＴ１１６／Ｓ３２２Ｅの顕微鏡写真である。
【図１２】ＨＣＴ１１６／Ｓ３０３Ａ、ＨＣＴ１１６／Ｓ３２２Ａ、ＨＣＴ１１６／Ｓ３２２Ｅのマイグレーションアッセイの結果を表す顕微鏡写真である。
【図１３】図１２の結果を数値化したグラフである。
【図１４】ＰＡＮＣ−１／Ｍ、ＰＡＮＣ−１／ＷＴ、ＰＡＮＣ−１／Ｓ３２２Ａ、ＰＡＮＣ−１／Ｓ３２２Ｅのマイグレーションアッセイの結果を表す顕微鏡写真である。
【図１５】図１４の結果を数値化したグラフである。
【図１６】各癌細胞を皮下に移植したマウスの肺の抽出物をイムノブロッティングに供した結果を表す写真である。
【図１７】肺転移を起こしたマウスと肺転移を起こさなかったマウスの外観を表す写真である。
【図１８】ＤＮＡマイクロアレイ分析の結果を表すグラフである。
【図１９】各種阻害剤の効果を調べたイムノブロッティングの結果を表す写真である。
【図２０】図１９の結果を数値化したグラフである。
【図２１】ｓｉＲＮＡ処理したＨＣＴ１１６／ＷＴの細胞抽出物をイムノブロッティングに供した結果を表す写真である。
【図２２】図２１の結果を数値化したグラフである。
【図２３】ＰＫＣαとＰＫＣδをノックダウンしたＨＣＴ１１６／ＷＴのマイグレーションアッセイの結果を表す顕微鏡写真である。
【図２４】図２３の結果を数値化したグラフである。
【図２５】ＰＫＣ阻害剤で処理したＨＣＴ１１６／ＷＴのマイグレーションアッセイの結果を表す顕微鏡写真である。
【図２６】図２５の結果を数値化したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
まずＴｒｏｐ−２について説明する。
Ｔｒｏｐ−２は、多くの上皮性癌細胞に発現している分子量３６ｋＤａ（糖鎖の付加によって５０〜７５ｋＤａとなり得る）の膜糖タンパク質である。Ｔｒｏｐ−２はTumor-associated calcium signal transducer (TACSTD) ファミリーに属する。Ｔｒｏｐ−２は、腫瘍の悪性化に伴ってその発現が増加することが知られており、腫瘍の悪性化に関与することが報告されている。一方で、Ｔｒｏｐ−２の発現の消失は発癌や上皮間葉系転換を促進するという癌抑制的な作用も報告されている。例えば、角膜の上皮組織の異常疾患であるGelatinous drop-like corneal dystrophy (GDLD)の原因遺伝子はＴｒｏｐ−２であることが知られている。この疾患では、タイトジャンクションの構成膜タンパク質であるクラウディン（Claudin）−１及びクラウディン−７の発現量の減少や分布に変化がみられ、Ｔｒｏｐ−２はこれらの膜タンパク質と相互作用し、それらの安定性の維持に関与するとされている。タイトジャンクションの機能は上皮細胞の極性の維持、すなわち上皮性細胞の膜タンパク質の分布を規定することから、本分子の異常は上皮組織の崩壊の発端になることも予想される。事実、多くの上皮性癌細胞でクラウディン−７の発現低下が報告されている。従って、Ｔｒｏｐ−２はクラウディン−１及び７との相互作用を通じて、タイトジャンクションの構造と機能の維持に関与しているものと考えられる。
ヒトＴｒｏｐ−２のアミノ酸配列を配列番号１に示す。
【００１４】
本発明の癌転移抑制剤は、Ｔｒｏｐ−２のＮ末端から３２２番目のセリン（以下、「Ｓｅｒ３２２」などと略記することがある）をリン酸化する酵素の阻害剤を有効成分として含有するものである。すなわち本発明は、癌細胞におけるＴｒｏｐ−２のＳｅｒ３２２がリン酸化されると癌細胞の接着性が低下して移動能が向上し、一方、Ｓｅｒ３２２のリン酸化が阻止されると癌細胞の接着性が維持される、という新しい知見に基づいている。
【００１５】
前記阻害剤としては、Ｔｒｏｐ−２のＳｅｒ３２２のリン酸化を阻害できるものであれば特に限定はない。好ましい実施形態では、前記阻害剤は、プロテインキナーゼＣα（ＰＫＣα）及びプロテインキナーゼＣδ（ＰＫＣδ）の阻害剤である。すなわち、後述の実施例で示すように、プロテインキナーゼＣαとプロテインキナーゼＣδは、いずれもＴｒｏｐ−２のＳｅｒ３２２をリン酸化する作用を有している。前記阻害剤の具体的な化合物としては、Ｇｏ６９８３（CAS番号：133053-19-7）、ビスインドリルマレイミド  １（Bisindolylmaleimide 1, ＢＩＭ−１）（CAS 番号：133052-90-1）、及びこれらの誘導体が挙げられる。さらに、これらの薬学上許容しうる塩が挙げられる。
【００１６】
本発明の癌転移抑制剤の対象となる癌としては特に限定はなく、原発性癌、転移性癌、等を問わない。癌細胞の種類としても特に限定はなく、大腸癌細胞、膵臓癌細胞、肝臓癌細胞、肺癌細胞、胃癌細胞、食道癌細胞、腎臓癌細胞、前立腺癌細胞、乳癌細胞、卵巣癌細胞、皮膚癌細胞、等の全ての臓器・部位に由来する癌が対象となり得る。
【００１７】
本発明の癌転移抑制剤の投与方法、例えば、投与経路、投与量、投与時期については、有効成分の種類、患者の年齢、体重、状態等に応じて適宜選択できる。投与経路は、経口経路と非経口経路のいずれでもよい。非経口的経路としては、静脈内、皮下、筋肉内、動脈内、直腸内、口腔内、等が挙げられる。
本発明の癌転移抑制剤の剤型は、投与方法等によって適宜選択することができる。
【００１８】
また、有効成分である前記阻害剤、例えばＰＫＣα及びＰＫＣδの阻害剤は、抗Ｔｒｏｐ−２抗体との結合物の形で用いることができる。この実施形態によれば、より有効な癌転移抑制効果が期待できる。
【００１９】
本発明は、Ｔｒｏｐ−２のＮ末端から３２２番目のセリン（Ｓｅｒ３２２）のリン酸化を阻害する作用を指標として、被検物質から癌転移抑制作用を有する物質を選抜する癌転移抑制剤候補物質の選抜方法を包含する。例えば、プロテインキナーゼＣα及びプロテインキナーゼＣδによるリン酸化を阻害する作用を指標とすることができる。例えば、試験管内でプロテインキナーゼＣα及びプロテインキナーゼＣδのリン酸化活性を阻害する作用を有する化合物を探索することにより、癌転移抑制剤候補物質を選抜することができる。
【００２０】
以下に、実施例をもって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００２１】
１．実験方法
１−（１）発現プラスミドの構築
ヒト卵巣癌細胞ＯＶＣＡＲ３から全ＲＮＡを調製し、文献１（Akita, K. et al., Eur. J. Cell Biol. 92, 257-263 (2013)）記載の方法でｃＤＮＡ合成を行った。合成したｃＤＮＡとプライマー（配列番号２、３）を用いてＰＣＲを行い、ヒトＴｒｏｐ−２遺伝子を増幅した。ＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ ＴＡベクター（インビトロジェン社）にクローニングした。配列確認後、このベクターをＥｃｏＯ６５Ｉで処理し、Blunting Kination Ligation Kit（タカラバイオ社）で末端平滑化した。末端平滑化したベクターをＢａｍＨＩで処理し、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−３発現ベクターの平滑化ＫｐｎＩサイトと突出末端化ＢａｍＨＩサイトにサブクローニングした。これにより、野生型のＴｒｏｐ−２（ＷＴ−Ｔｒｏｐ−２）遺伝子がサブクローニングされた。
【００２２】
QuickChange II XL Site-Directed Mutagenesis Kit（ストラタジーン社）を用いて部位特異的変異導入を行い、３種の変異型Ｔｒｏｐ−２遺伝子を得た。具体的には、配列番号４と５のプライマーを用いて、Ｓｅｒ３０３をＡｌａに置換する変異を導入した。配列番号６と７のプライマーを用いて、Ｓｅｒ３２２をＡｌａに置換する変異を導入した。配列番号８と９のプライマーを用いて、Ｓｅｒ３２２をＧｌｕに置換する変異を導入した。なおＧｌｕは、リン酸化されたＳｅｒと同等とみなすことができる。
【００２３】
１−（２）プラスミドのトランスフェクションと細胞培養
ヒト大腸癌細胞ＨＣＴ１１６とヒト膵臓癌細胞ＰＡＮＣ−１をＡＴＣＣから入手した。FuGENE HD Transfection Reagent（プロメガ社）を用いて、細胞に上記発現ベクター又は空のベクターをトランスフェクションし、６００μｇ／ｍＬ Ｇ４１８存在下で安定した形質転換体を選抜した。
【００２４】
＜作製した形質転換体＞
・モック細胞（ＨＣＴ１１６／Ｍ、ＰＡＮＣ−１／Ｍ）
・ＦＬＡＧタグ付きの野生型Ｔｒｏｐ−２発現細胞（ＨＣＴ１１６／ＷＴ、ＰＡＮＣ−１／ＷＴ）
・Ｓｅｒ３０３をＡｌａに置換した、ＦＬＡＧタグ付きの変異型Ｔｒｏｐ−２発現細胞（ＨＣＴ１１６／Ｓ３０３Ａ）
・Ｓｅｒ３２２をＡｌａに置換した、ＦＬＡＧタグ付きの変異型Ｔｒｏｐ−２発現細胞（ＨＣＴ１１６／Ｓ３２２Ａ、ＰＡＮＣ−１／Ｓ３２２Ａ）
・Ｓｅｒ３２２をＧｌｕに置換した、ＦＬＡＧタグ付きの変異型Ｔｒｏｐ−２発現細胞（ＨＣＴ１１６／Ｓ３２２Ｅ、ＰＡＮＣ−１／Ｓ３２２Ｅ）
【００２５】
これらの細胞を、１０％ＦＢＳ（熱不活化済み）、４ｍＭグルタミン、１００ユニット／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含むＤＭＥＭを用いて培養した。
【００２６】
１−（３）細胞抽出物、組織抽出物の調製
サブコンフルエントまで増殖させた細胞を、可溶化バッファー（Protease and phosphatase inhibitor cocktails (ナカライテスク社）を含む、25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton X-100 (TX-100)）で溶解した。可溶化後、４℃で１０分間遠心分離（13,000 rpm）して上清を回収し、細胞抽出物とした。
【００２７】
マウスから摘出した肝臓と肺を小片にカットし、ＰＢＳで洗浄した。組織ペレットを上記と同様に可溶化した後、４℃で３０分間遠心分離（13,000 rpm）して上清を回収し、組織抽出物とした。
【００２８】
１−（４）ＰＫＣ／ＰＫＤ阻害剤による処理、ＰＭＡ又は４αＰＭＡによる処理
下記のＰＫＣ阻害剤、ＰＫＤ阻害剤、又はＤＭＳＯで細胞を１時間処理した。
・ＢＩＭ−１（ｐａｎ−ＰＫＣ（α／βＩ／βＩＩ／γ／δ／ε）阻害剤、１μＭ、セルシグナリングテクノロジー社）
・Ｇｏ６９８３（ｐａｎ−ＰＫＣ（α／βＩ／βＩＩ／γ／δ／ζ）阻害剤、１μＭ、シグマ−アルドリッチ社）
・Ｇｏ６９７６（ＰＫＣα／βＩ阻害剤、１μＭ、ケイマンケミカル社）
・ヒスピジン（Hispidin）（ＰＫＣβＩ／βＩＩ阻害剤、１０μＭ、メルクミリポア社）
・ＨＢＤＤＥ（ＰＫＣα／γ阻害剤、１００μＭ、エンゾライフサイエンス社）
・ＣＩＤ７５５６７３（ＰＫＤ阻害剤、１０μＭ、メルクミリポア社）
【００２９】
細胞を１００ｎｇ／ｍＬのＰＭＡ又は４α−ＰＭＡで所定時間処理した。
【００３０】
１−（５）免疫沈降
Anti-FLAG M2 Magnetic Beads（シグマ−アルドリッチ社）を用いて、細胞抽出物から、ＦＬＡＧタグ付きＴｒｏｐ−２を免疫沈降させた。
マウス anti-claudin-7 抗体(インビトロジェン社) と Protein G Sepharose 4 Fast Flow (ＧＥヘルスケア社）を用いて、細胞抽出物から、クラウディン−７を免疫沈降させた。
ヤギ anti-Trop-2 抗体（Ｒ＆Ｄシステムズ社）と Protein G Sepharose 4 Fast Flowを用いて、組織抽出物から、Ｔｒｏｐ−２を免疫沈降させた。
【００３１】
１−（６）イムノブロッティング
上記で調製した細胞抽出物若しくは組織抽出物、又はこれらの免疫沈降物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、イムノブロッティングを行った。
下記いずれかの１次抗体、及びホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識２次抗体とインキュベートし、ケミルミネッセンスにてバンドを検出し、Ｉｍａｇｅ Ｊ Ｓｏｆｔｗａｒｅでバンドを定量化した。
【００３２】
＜１次抗体＞
・ＨＲＰ標識マウス抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体（シグマ−アルドリッチ社）
・マウス抗ｃｌａｕｄｉｎ−７抗体（セルシグナリングテクノロジー社）
・マウス抗β−ａｃｔｉｎ抗体（シグマ−アルドリッチ社）
・ウサギ抗ＰＫＣα抗体（アブカム社）
・ウサギ抗ＰＫＣδ抗体（アブカム社）
・ウサギ抗リン酸化Ｔｒｏｐ−２抗体（自家調製品）
【００３３】
１−（７）抗リン酸化Ｔｒｏｐ−２抗体の調製、抗非リン酸化Ｔｒｏｐ−２抗体の調製、特異性評価
キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）結合ペプチド（Ｔｒｏｐ−２ 細胞内ドメイン）のＳｅｒ３２２リン酸化物と、同非リン酸化物を、北海道システムサイエンス社から入手した。これらのペプチドをフロイントの完全（１回目）及び不完全（２回目）アジュバント（ディフコラボラトリーズ社）で乳化し、１２週齢の雌ニュージーランド白色ウサギ（New Zealand white rabbit）に、５回、皮下注射した。５回目の免疫後に採血し、血清から、プロテインＡカラムでＩｇＧ画分を調製した。
リン酸化Ｔｒｏｐ−２に対する抗体を含むＩｇＧ画分を、ＫＬＨ−結合非リン酸化ペプチドＣＮＢｒ活性化Sepharose 4 Fast Flowに供した。通過画分を回収し、抗リン酸化Ｔｒｏｐ−２抗体を得た。
非リン酸化Ｔｒｏｐ−２に対する抗体を含むＩｇＧ画分を、ＫＬＨ結合ＣＮＢｒ活性化Sepharose 4 Fast Flowに供した。通過画分を回収し、抗非リン酸化Ｔｒｏｐ−２抗体を得た。
【００３４】
各抗体の特異性を調べるために、以下のプレートアッセイを行った。
リン酸化又は非リン酸化Ｔｒｏｐ−２細胞内ペプチドを、９６穴ＭａｘｉＳｏｒｐプレート（ヌンク社）に４℃で一晩固相化した。各穴に、段階希釈した抗リン酸化Ｔｒｏｐ−２抗体又は抗非リン酸化Ｔｒｏｐ−２抗体（０−１μｇ／ｍＬ）を入れ、インキュベートした。1-Step Ultra TMB-ELISA Substrate（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を添加して４５０ｎｍの吸光度を測定し、免疫複合体を検出した。各プレートアッセイにおいて、実験は４重（quadruplicate）で行った。
【００３５】
１−（８）フローサイトメトリー
細胞を、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識マウスａｎｔｉ−ＦＬＡＧ Ｍ２抗体（シグマアルドリッチ社）と４℃で２時間インキュベートした。１％ＢＳＡ／ＰＢＳで洗浄後、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤバイオサイエンシズ社）を用いて、Ｔｒｏｐ−２の発現を検出した。
【００３６】
１−（９）ＤＮＡマイクロアレイ分析
ＤＮＡマイクロアレイ解析は、基本的に、文献２（Mori, Y. et al., J. Biol. Chem. 289, 35193-35204 (2014)）の方法で行った。
ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社）を用いて全ＲＮＡを単離した。Low Input Quick Amp Labeling Kit（アジレントテクノロジーズ社）を用いて、前記全ＲＮＡからシアニン−３標識ｃＲＮＡを調製した。精製及び断片化した後、標識されたｃＲＮＡを、SurePrint G3 Human Gene Expression 8×60K v3 Microarray（アジレントテクノロジーズ社）にハイブリダイズさせた。洗浄後、アレイスライドをAgilent SureScan Microarray Scanner (G2600D)でスキャンした。
【００３７】
１−（１０）マイグレーションアッセイ、ＭＴＴアッセイ
マイグレーションアッセイとＭＴＴアッセイは、基本的に、上記文献１に記載の方法で行った。
細胞（４×１０4cells）を、０．２％ＢＳＡを含む無血清培地に懸濁し、フィブロネクチンをコートしたＴｒａｎｓｗｅｌｌ（２４ウェルカルチャープレート、ポアサイズ８．０μｍ、コーニング社）の上部チャンバーにシードした。必要に応じて、いくつかのＰＫＣ阻害剤若しくはＤＭＳＯ、又はＰＭＡ若しくは４α−ＰＭＡを添加した。下部プレートを無血清培地で満たし、細胞を２０時間インキュベートした。チャンバーを固定化してヘマトキシリンで染色し、その後、移動しなかった細胞を取り除いた。細胞の移動（マイグレーション）は、ランダムに選んだ５フィールドにて、倍率１００倍でカウントして定量化した。
【００３８】
細胞マイグレーションアッセイにおける細胞増殖の影響を調べるために、ＭＴＴアッセイを行った。
マイグレーションアッセイと同じ培地で、細胞（４×１０4cells）を９６ウェルプレートで１８時間培養した。ＭＴＴ試薬（ナカライテスク社）を加えて２時間インキュベートし、リファレンス６３０ｎｍで５７０ｎｍの吸光度を測定した。ＭＴＴアッセイでは、少なくとも２重で実験を行った。
【００３９】
１−（１１）Ｐｈｏｓ−ｔａｇ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
ＦＬＡＧタグ結合Ｔｒｏｐ−２免疫沈降物を、グリコペプチダーゼＦ（タカラバイオ社）で処理した。Nanosep Centrifugal Device with a 10 kDa cutoff（ポールライフサイエンシズ社）を用いて脱塩及び濃縮を行った。得られた試料をＺｎ2+−Ｐｈｏｓ−ｔａｇ ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、イムノブロッティングを行った。ＨＲＰ−標識マウスａｎｔｉ−ＦＬＡＧ Ｍ２抗体を用いて、リン酸化及び非リン酸化Ｔｒｏｐ−２を検出した。
【００４０】
１−（１２）ｓｉＲＮＡ処理
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent（インビトロジェン社）を用いたリバーストランスフェクションにより、細胞を、Silencer Select siRNA of PKCα (5 nM) 及び／若しくは PKCδ (10 nM)、又はSilencer Select Negative Control #1 siRNAでトランスフェクションし、３日間インキュベートした。標的特異的ｓｉＲＮＡとして、以下のものを使用した。
・ＰＫＣα ｓｉＲＮＡ ＃１（配列番号１０、１１）、＃２（配列番号１２、１３）
・ＰＫＣδ ｓｉＲＮＡ ＃１（配列番号１４、１５）、＃２（配列番号１６、１７）
【００４１】
１−（１３）転移
６週齢のＢＡＬＢ／ｃ ｎｕ／ｎｕ雄マウスに、細胞（５×１０6cells）を、腹腔内または皮下に注射した。腹腔内の場合は４週後、皮下の場合は８週後に、肺と肝臓を摘出した。これらを、ＦＬＡＧ結合 Ｔｒｏｐ−２の生化学的検出と、Ｈ＆Ｅ染色による腫瘍組織の組織学的観察に用いた。
Go6983の転移への効果を調べる場合は、腹腔内にＨＣＴ１１６／ＷＴ細胞を接種されたヌードマウスに、Go6983の毎日の腹腔内注射（０．２５ｍｇ／マウス／日）を行った。
【００４２】
１−（１４）統計解析
２つのグループの比較は、ｔｗｏ−ｔａｉｌｅｄスチューデントｔ検定で行った。２を超えるグループ間の違いは、ＡＮＯＶＡ、Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ、又はＤｕｎｎｅｔｔ’ｓ ｔｅｓｔで評価した。全ての解析において、ｐ＜０．０５で有意差ありとした。
【００４３】
２．結果
２−（１）Ｔｒｏｐ−２の発現に伴う腫瘍の悪性化検討
ＨＣＴ１１６／ＷＴ（ＦＬＡＧタグ付きの野生型Ｔｒｏｐ−２発現細胞）におけるＴｒｏｐ−２の発現を、フローサイトメトリーで確認した（図１）。図１の「Ｍ」はモック細胞（ＨＣＴ１１６／Ｍ）、「ＷＴ」はＨＣＴ１１６／ＷＴ（２クローン）を示す。ＨＣＴ１１６／ＷＴがＴｒｏｐ−２を発現していることが確認された。
【００４４】
ＨＣＴ１１６／ＭとＨＣＴ１１６／ＷＴの抽出物の免疫沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、イムノブロッティングを行った（図２）。その結果、ＨＣＴ１１６／ＷＴから５０−７５ｋＤａのブロードなバンドが検出された。これにより、Ｔｒｏｐ−２が糖鎖修飾を受けている可能性が示唆された。
【００４５】
ＨＣＴ１１６／ＷＴの抽出物の免疫沈降物をＮ−グリカナーゼで処理し、同様のＳＤＳ−ＰＡＧＥとイムノブロッティングを行った（図３）。その結果、Ｎ−グリカナーゼ処理した試料では４０ｋＤａ付近にバンドが検出された。これにより、Ｔｒｏｐ−２が糖鎖修飾を受けていることが示された。
【００４６】
各細胞の集団を顕微鏡観察したところ、モック細胞と比較して、ＨＣＴ１１６／ＷＴは細胞同士の接着性が緩いように見られた（図４）。
【００４７】
Ｔｒａｎｓｗｅｌｌを用いたマイグレーションアッセイを行った。図５は顕微鏡観察の結果を示す写真、図６はその結果を数値化したグラフである。すなわち、ＨＣＴ１１６／ＷＴは高い移動能を有していた。
なお、ＭＴＴアッセイの結果、モック細胞とＨＣＴ１１６／ＷＴとで増殖能に差は無かった。
【００４８】
２−（２）Ｔｒｏｐ−２のリン酸化部位の特定
リン酸化Ｔｒｏｐ−２と非リン酸化Ｔｒｏｐ−２を区別するために、Ｎ−グリカナーゼ処理したＨＣＴ１１６／ＷＴライセートの免疫沈降物をＰｈｏｓ−ｔａｇ ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、イムノブロッティングを行った（図７）。その結果、２本のバンドが検出され、一部のＴｒｏｐ−２がリン酸化されていることが分かった。なお、抗リン酸化チロシン抗体ではバンドは検出されなかった。
【００４９】
ＨＣＴ１１６／ＷＴ（２クローン）、ＨＣＴ１１６／Ｓ３０３Ａ（２クローン）、及びＨＣＴ１１６／Ｓ３２２Ａ（２クローン）を用いて同様のイムノブロッティングを行った。図８はイムノブロッティングの結果を示す写真、図９はその結果を数値化したグラフである。図８に示すように、ＨＣＴ１１６／ＷＴと同様に、ＨＣＴ１１６／Ｓ３０３Ａでは２本のバンドが検出された。一方、ＨＣＴ１１６／Ｓ３２２Ａでは非リン酸化Ｔｒｏｐ−２のバンドのみ検出された。すなわち、Ｔｒｏｐ−２のリン酸化は３２２番目のＳｅｒ（Ｓｅｒ３２２）に対してのみ認められた。
【００５０】
ＰＭＡ処理でＰＫＣを活性化した場合のＨＣＴ１１６／ＷＴライセートの免疫沈降物を用いて、同様のイムノブロッティングを行った（図１０）。その結果、リン酸化Ｔｒｏｐ−２のバンドが濃くなるだけで、新たなバンドの出現はなかった。これにより、３２２番目のＳｅｒ（Ｓｅｒ３２２）のみがリン酸化されることが示された。
【００５１】
２−（３）野性型及び変異型Ｔｒｏｐ−２発現細胞の異なる形態と移動能
ＨＣＴ１１６／Ｓ３０３Ａ、ＨＣＴ１１６／Ｓ３２２Ａ、及びＨＣＴ１１６／Ｓ３２２Ｅについて、各細胞の集団を顕微鏡観察した（図１１）。その結果、ＨＣＴ１１６／Ｓ３０３Ａは、図４に示したＨＣＴ１１６／ＷＴと同様に、細胞同士の接着性が緩いように見られた。一方、ＨＣＴ１１６／Ｓ３２２Ａは、細胞同士が強く結合していた。ＨＣＴ１１６／Ｓ３２２Ｅは、細胞同士の接着性がＨＣＴ１１６／ＷＴよりも弱いように見られた。なお前述のように、Ｇｌｕ（Ｅ）はリン酸化されたＳｅｒ（Ｓ）と同等とみなすことができる。
【００５２】
ＨＣＴ１１６／Ｓ３０３Ａ、ＨＣＴ１１６／Ｓ３２２Ａ、及びＨＣＴ１１６／Ｓ３２２Ｅについて、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌを用いたマイグレーションアッセイを行った。図１２は顕微鏡観察の結果を示す写真、図１３はその結果を数値化したグラフである。すなわち、ＨＣＴ１１６／Ｓ３２２Ｅの移動能が一番高く、次いで、ＨＣＴ１１６／Ｓ３０３Ａの移動能が高かった。これに対し、ＨＣＴ１１６／Ｓ３２２Ａの移動能は低かった。なお、ＭＴＴアッセイの結果、これら３種の細胞の増殖能に差は無かった。
【００５３】
ＰＡＮＣ−１／Ｍ、ＰＡＮＣ−１／ＷＴ、ＰＡＮＣ−１／Ｓ３２２Ａ、及びＰＡＮＣ−１／Ｓ３２２Ｅについても同様に、マイグレーションアッセイを行った。図１４は顕微鏡観察の結果を示す写真、図１５はその結果を数値化したグラフである。ＨＣＴ１１６を用いた場合と同様の結果であり、ＰＡＮＣ−１／ＷＴとＰＡＮＣ−１／Ｓ３２２Ｅの移動能が高く、ＰＡＮＣ−１／Ｓ３２２Ａの移動能は低かった。なお、ＭＴＴアッセイの結果、これら４種の細胞の増殖能に差は無かった。
【００５４】
以上の結果から、３２２番目のＳｅｒ（Ｓｅｒ３２２）のリン酸化が細胞の移動能を制御していることが示唆された。
【００５５】
次いで、ＨＣＴ１１６／Ｍ、ＨＣＴ１１６／ＷＴ、ＨＣＴ１１６／Ｓ３２２Ａ、及びＨＣＴ１１６／Ｓ３２２Ｅについて、１−（１５）の方法にてインビボでの転移を調べた。すなわち、各々の細胞をヌードマウス（Ｎ＝５）の皮下に移植し、８週後に肺と肝臓を取り出した。それぞれの臓器を可溶化し、抗ＦＬＡＧ抗体を用いて、Ｔｒｏｐ−２を免疫沈降した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥとイムノブロッティングにより、ＦＬＡＧタグ付きＴｒｏｐ−２を検出した。肺を用いた結果を図１６に示す。β−アクチンのバンドはコントロールである。すなわち、ＨＣＴ１１６／ＷＴ（野生型）とＨＣＴ１１６／Ｓ３２２Ｅ（Ｓｅｒ３２２→Ｇｌｕ置換）ではＴｒｏｐ−２のバンド（７５ｋＤａ付近）に検出され、転移が認められた（ＷＴ：５個体中３個体、Ｓ３２２Ｅ：５個体中１個体）。これに対し、ＨＣＴ１１６／Ｓ３２２Ａ（Ｓｅｒ３２２→Ａｌａ置換）ではバンドは検出されず、転移は認められなかった(５個体中ゼロ）。
なお、いずれの細胞でも、肝臓への転移は認められなかった。
【００５６】
同様に、各々の細胞を腹腔内に移植し、４週後に肺と肝臓を取り出した。同様のＳＤＳ−ＰＡＧＥとイムノブロッティングを行った。その結果、ＨＣＴ１１６／ＷＴ（野生型）で肝転移（５個体中２個体）と肺転移（５個体中４個体）が認められた。ＨＣＴ１１６／Ｓ３２２Ｅ（Ｓｅｒ３２２→Ｇｌｕ置換）も肝転移（４個体中２個体）と肺転移（４個体中３個体）が認められた。これに対し、ＨＣＴ１１６／Ｓ３２２Ａ（Ｓｅｒ３２２→Ａｌａ置換）では肝転移、肺転移とも認められなかった。
【００５７】
図１７に、肺転移を起こしたマウスと転移を起こさなかったマウスの写真を示す。左から、ＨＣＴ１１６／Ｍ（モック）、ＨＣＴ１１６／ＷＴ（野生型）、ＨＣＴ１１６／Ｓ３２２Ａ（変異型：Ｓｅｒ３２２→Ａｌａ置換）、ＨＣＴ１１６／Ｓ３２２Ｅ（変異型：Ｓｅｒ３２２→Ｇｌｕ置換）の各細胞を移植したマウスである。ＨＣＴ１１６／Ｍ、ＨＣＴ１１６／ＷＴ、又はＨＣＴ１１６／Ｓ３２２Ｅを移植したマウスでは肺転移を起こしており、外観も異常である。ＨＣＴ１１６／Ｓ３２２Ａを移植したマウスでは肺転移を起こしておらず、外観も正常である。
【００５８】
２−（４）ＰＫＣαとＰＫＣδによるＴｒｏｐ−２のリン酸化
ＰＫＣは、その構造、活性化機構、生理機能によって、在来型（conventionalあるいはclassical：α、βI、βII、γ）、新型（novel：δ、ε、η、θ）、非典型（atypical：ζ、λ/ι）の３つのサブファミリーに分類される。そこで、Ｔｒｏｐ−２をリン酸化するＰＫＣの特定を試みた。
【００５９】
ＨＣＴ１１６／ＷＴ細胞に存在するＰＫＣアイソザイムをＤＮＡマイクロアレイ分析で調べた（図１８）。その結果、１つの在来型（ＰＫＣα）、３つの新型（ＰＫＣδ、ε、η）、及び２つの非典型（ＰＫＣζ、ι）が存在していた。
【００６０】
１−（４）の方法に従って、ＨＣＴ１１６／ＷＴを、ＰＫＣ阻害剤又はＰＫＤ阻害剤の存在下又は非存在下で１時間処理した。続いて、ＰＭＡ又は４α−ＰＭＡで２時間処理した。各々の細胞ライセートをＳＤＳ−ＰＡＧＥとイムノブロッティングに供した（図１９）。図１９の上段は抗リン酸化Ｔｒｏｐ−２抗体、下段は抗ＦＬＡＧ抗体で検出した結果である。図２０は、図１９の結果を数値化したグラフであり、４α−ＰＭＡ処理した場合を１としたときの、全Ｔｒｏｐ−２に対するリン酸化Ｔｒｏｐ−２の比（ｐ−Ｔｒｏｐ−２／ＦＬＡＧ）を表している。その結果、ＢＩＭ−１とＧｏ６９８３がリン酸化を強く阻害することがわかった。この両者が共通に阻害するＰＫＣはＰＫＣαとＰＫＣδであることから、Ｔｒｏｐ−２のリン酸化は、ＰＫＣαとＰＫＣδのいずれか一方あるいは両方であることが示唆された。
【００６１】
１−（１２）に記載のｓｉＲＮＡ処理によって、ＨＣＴ１１６／ＷＴ細胞のＰＫＣαとＰＫＣδのいずれか一方、あるいは両方をノックダウンした。コントロールとして、コントロール用ｓｉＲＮＡで処理をした。各々の細胞をＰＭＡ処理又は４α−ＰＭＡ処理した後、細胞ライセートをＳＤＳ−ＰＡＧＥとイムノブロッティングに供した（図２１）。図２１において、「Ｃｏｎｔ．」、「ｓｉＰＫＣα」、「ｓｉＰＫＣδ」、「ｓｉＰＫＣα＋δ」は、それぞれ、コントロール、ＰＫＣαノックダウン、ＰＫＣδノックダウン、ＰＫＣαとＰＫＣδの両方ノックダウン、を表す。その結果、ＰＫＣαとＰＫＣδの両方をノックダウンした場合（最右レーン）に、リン酸化Ｔｒｏｐ−２のバンドが消失しており、Ｔｒｏｐ−２のリン酸化がほぼ完全に阻止されていた。このことから、Ｔｒｏｐ−２のリン酸化には、ＰＫＣαとＰＫＣδの両方が関与していることが示唆された。
【００６２】
図２２は図２１の結果を数値化したものであり、リン酸化Ｔｒｏｐ−２の相対量を表している。
【００６３】
ＰＫＣαとＰＫＣδの両方をノックダウンした細胞について、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌを用いたマイグレーションアッセイを行った。図２３は顕微鏡観察の結果を示す写真、図２４はその結果を数値化したグラフである。すなわち、コントロール細胞ではＰＭＡ処理により移動能は上昇したが、ＰＫＣαとＰＫＣδをノックダウンした細胞では、移動能の上昇は見られなかった。
なお、ＭＴＴアッセイの結果、全ての細胞において増殖能に差はなかった。
【００６４】
２−（５）野生型細胞のインビトロにおける移動能、及びインビボにおける転移に対するＰＫＣ阻害剤の抑制効果
ＰＭＡで処理したＨＣＴ１１６／ＷＴ細胞を、ＰＫＣ阻害剤で処理し、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌを用いたマイグレーションアッセイを行った。図２５は顕微鏡観察の結果を示す写真、図２６はその結果を数値化したグラフである。すなわち、ＢＩＭ−１で処理した細胞と、Ｇｏ６９８３で処理した細胞の移動能が強く阻害されていた。なお、ＭＴＴアッセイの結果、これらの細胞において増殖能に差はなかった。
【００６５】
１−（１３）の方法に従って、ＨＣＴ１１６／ＷＴ細胞のヌードマウスの腹腔内に注射した。注射１日目から、毎日、Ｇｏ６９８３を腹腔内に投与した（０．２５ｍｇ／マウス）。コントロールとしてＤＭＳＯを投与した。４週後、肺と肝臓を摘出した。それぞれの臓器を可溶化し、抗ＦＬＡＧ抗体を用いて、Ｔｒｏｐ−２を免疫沈降した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥとイムノブロッティングにより、ＦＬＡＧタグ付きＴｒｏｐ−２を検出した。
【００６６】
その結果、肝転移は、コントロールのマウス９匹すべてに検出された。これに対し、Ｇｏ６９８３を投与したマウスでは肝転移は９匹中１匹のみしか検出されなかった。肺転移は、コントロールのマウス９匹中７匹に検出された。これに対し、Ｇｏ６９８３を投与したマウスでは肺転移は９匹中３匹のみしか検出されなかった。
以上より、ＰＫＣα／δの阻害剤であるＧｏ６９８３をマウスに投与することにより、癌の転移を抑制することができた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【配列表】
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