(57)【要約】【課題】ヒトλ可変領域およびマウス定常領域を含む軽鎖を発現するマウスの提供。【解決手段】ヒトλ可変（ｈＶλ）配列を発現する遺伝的に改変されたマウス（内在性マウスλ軽鎖遺伝子座からｈＶλ配列を発現するマウス、内在性マウスκ軽鎖遺伝子座からｈＶλ配列を発現するマウス、および導入遺伝子またはエピソームからｈＶλ配列を発現するマウスを含む）が提供され、ここで、そのｈＶλ配列は、マウス定常配列に接続されている。抗原結合タンパク質の作製に有用な体細胞変異したヒトλ可変配列の起源となるマウスが提供される。ヒト抗体を含むヒトλ可変配列を含む抗原結合タンパク質を作製するための組成物および方法が提供される。【選択図】図４Ａ
2020128440.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト重鎖可変領域配列またはヒト軽鎖可変領域配列を作製する方法であって、
（ａ）遺伝的に改変されたマウスを抗原で免疫する工程であって、該遺伝的に改変されたマウスが、
（ｉ）マウス免疫グロブリンκ軽鎖定常領域（Ｃκ）遺伝子に作動可能に接続された、少なくとも１つのヒトＶλ遺伝子セグメントと少なくとも１つのヒトＪλ遺伝子セグメントとを含む、第１の軽鎖対立遺伝子
（ｉｉ）マウス免疫グロブリンκ軽鎖定常領域（Ｃκ）遺伝子に作動可能に接続された、少なくとも１つのヒトＶκ遺伝子セグメントと少なくとも１つのヒトＪκ遺伝子セグメントとを含む、第２の軽鎖対立遺伝子、および
（ｉｉｉ）マウス免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子に作動可能に接続された、１つ以上のヒトＶＨ遺伝子セグメントと、１つ以上のヒトＤＨ遺伝子セグメントと、１つ以上のヒトＪＨ遺伝子セグメントとを含む、操作された重鎖遺伝子座
を含む生殖細胞系列ゲノムを有する、免疫する工程、ならびに
（ｂ）（ｉ）該抗体に特異的に結合し、かつ（ｉｉ）該遺伝的に改変されたマウスにより作製された抗体の、ヒト重鎖可変ドメインまたはヒト軽鎖可変ドメインをそれぞれコードするヒト重鎖可変領域配列またはヒト軽鎖可変領域配列を決定する工程
を含む、方法。
【請求項２】
前記遺伝的に改変されたマウスが、前記操作された重鎖遺伝子座についてホモ接合である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも１つのヒトＶλ遺伝子セグメントが、少なくとも１２のヒトＶλ遺伝子セグメントを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記少なくとも１つのヒトＶλ遺伝子セグメントが、少なくとも２８のヒトＶλ遺伝子セグメントを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記少なくとも１つのヒトＶλ遺伝子セグメントが、少なくとも４０のヒトＶλ遺伝子セグメントを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも１つのヒトＪλ遺伝子セグメントが、ヒトＪλ１、Ｊλ２、Ｊλ３、Ｊλ７、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記遺伝的に改変されたマウスの前記生殖細胞系列ゲノムが、ヒトＶκ−Ｊκ遺伝子間領域配列をさらに含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記ヒトＶκ−Ｊκ遺伝子間領域配列が、ヒトＶλ遺伝子セグメントとヒトＪλ遺伝子セグメントとの間の位置で前記第１の軽鎖対立遺伝子上に存在する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ヒトＶκ−Ｊκ遺伝子間領域配列が、配列番号１００に記載の配列を有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
内在性マウス免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子座が、不活性化されている、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記内在性マウス免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子座が、全体的にまたは部分的に欠失されている、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記遺伝的に改変されたマウスが、再配列に対して機能的であるマウスＶκ遺伝子セグメントを欠くか、再配列に対して機能的であるマウスＪκ遺伝子セグメントを欠くか、または両方の組み合わせである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
少なくとも１つのヒトＶλ遺伝子セグメントと少なくとも１つのヒトＪλ遺伝子セグメントとを含む前記第１の軽鎖対立遺伝子が、内在性κ遺伝子座に存在する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
少なくとも１つのヒトＶκ遺伝子セグメントと少なくとも１つのヒトＪκ遺伝子セグメントとを含む前記第２の軽鎖対立遺伝子が、内在性κ遺伝子座に存在する、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
ヒト重鎖可変ドメイン配列またはヒト軽鎖可変ドメイン配列を作製する方法であって、
（ａ）遺伝的に改変されたマウスを抗原で免疫する工程であって、該遺伝的に改変されたマウスが、
（ｉ）マウス免疫グロブリンκ軽鎖定常領域（Ｃκ）遺伝子に作動可能に接続された、少なくとも１つのヒトＶλ遺伝子セグメントと少なくとも１つのヒトＪλ遺伝子セグメントとを含む、第１の軽鎖対立遺伝子
（ｉｉ）マウス免疫グロブリンκ軽鎖定常領域（Ｃκ）遺伝子に作動可能に接続された、少なくとも１つのヒトＶκ遺伝子セグメントと少なくとも１つのヒトＪκ遺伝子セグメントとを含む、第２の軽鎖対立遺伝子、および
（ｉｉｉ）マウス免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子に作動可能に接続された、１つ以上のヒトＶＨ遺伝子セグメントと、１つ以上のヒトＤＨ遺伝子セグメントと、１つ以上のヒトＪＨ遺伝子セグメントとを含む、操作された重鎖遺伝子座
を含む生殖細胞系列ゲノムを有する、免疫する工程、ならびに
（ｂ）（ｉ）該抗体に特異的に結合し、かつ（ｉｉ）該遺伝的に改変されたマウスにより作製された抗体の、ヒト重鎖可変ドメイン配列またはヒト軽鎖可変ドメイン配列を決定する工程
を含む、方法。
【請求項１６】
ヒト重鎖可変ドメイン配列またはヒト軽鎖可変ドメイン配列を決定する工程が、ヒト重鎖可変ドメイン配列またはヒトλ軽鎖可変ドメイン配列をコードするヌクレオチド配列を決定する工程を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記遺伝的に改変されたマウスが、前記操作された重鎖遺伝子座についてホモ接合である、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記少なくとも１つのヒトＶλ遺伝子セグメントが、少なくとも１２のヒトＶλ遺伝子セグメントを含む、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記少なくとも１つのヒトＶλ遺伝子セグメントが、少なくとも２８のヒトＶλ遺伝子セグメントを含む、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記少なくとも１つのヒトＶλ遺伝子セグメントが、少なくとも４０のヒトＶλ遺伝子セグメントを含む、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記少なくとも１つのヒトＪλ遺伝子セグメントが、ヒトＪλ１、Ｊλ２、Ｊλ３、Ｊλ７、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１５〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記遺伝的に改変されたマウスの前記生殖細胞系列ゲノムが、ヒトＶκ−Ｊκ遺伝子間領域配列をさらに含む、請求項１５〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記ヒトＶκ−Ｊκ遺伝子間領域配列が、ヒトＶλ遺伝子セグメントとヒトＪλ遺伝子セグメントとの間の位置で前記第１の軽鎖対立遺伝子上に存在する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ヒトＶκ−Ｊκ遺伝子間領域配列が、配列番号１００に記載の配列を有する、請求項１５〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
内在性マウス免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子座が、不活性化されている、請求項１５〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
遺伝的に改変されたマウスの前記内在性マウス免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子座が、全体的にまたは部分的に欠失されている、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記遺伝的に改変されたマウスが、再配列に対して機能的であるマウスＶκ遺伝子セグメントを欠くか、再配列に対して機能的であるマウスＪκ遺伝子セグメントを欠くか、または両方の組み合わせである、請求項１５〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
少なくとも１つのヒトＶλ遺伝子セグメントと少なくとも１つのヒトＪλ遺伝子セグメントとを含む前記第１の軽鎖対立遺伝子が、内在性κ遺伝子座に存在する、請求項１５〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
少なくとも１つのヒトＶκ遺伝子セグメントと少なくとも１つのヒトＪκ遺伝子セグメントとを含む前記第２の軽鎖対立遺伝子が、内在性κ遺伝子座に存在する、請求項１５〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
分野
マウスまたはヒト軽鎖定常領域（λまたはカッパー（κ））と作動可能に接続されたマウスまたはヒトラムダ可変（Ｖλ）軽鎖配列を含む遺伝的に改変されたマウス。ヒトラムダ可変（ｈＶλ）遺伝子セグメント、ヒトラムダＪ（ｈＪλ）遺伝子セグメントに由来する可変ドメインおよびマウス軽鎖定常（ＣＬ）ドメインを含む免疫グロブリン軽鎖を含むエピトープ結合タンパク質を発現する遺伝的に改変されたマウス。内在性マウス軽鎖遺伝子座に、再配列されていない免疫グロブリンラムダ（λ）軽鎖可変核酸配列を含む遺伝的に改変されたマウス。１つ以上のｈＶλ遺伝子セグメントおよび１つ以上のｈＪλ遺伝子セグメントによるすべての内在性マウス軽鎖可変領域遺伝子セグメントの置換を含む内在性軽鎖遺伝子座からキメラヒトλ／マウスＣＬ軽鎖を再配列し、発現することができるマウス。ｈＶλドメインおよびマウスＣＬドメインを含む体細胞変異した抗体。
【背景技術】
【０００２】
背景
完全にヒトの抗体、または部分的にヒトの抗体でありかつ部分的にマウスの抗体である抗体を発現するマウスが、当該分野で公知である。例えば、ヒト軽鎖および重鎖免疫グロブリン可変領域遺伝子を含む導入遺伝子から完全ヒト抗体を発現するトランスジェニックマウスが、報告されている。同様に、ヒト重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）および軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）遺伝子セグメントによる内在性マウスＨＣＶＲ遺伝子セグメントおよびカッパー（κ）ＬＣＶＲ遺伝子セグメントの置換を含み、キメラヒト／マウスカッパー鎖を有するキメラ抗体を産生する、遺伝的に改変されたマウスも公知である。
【０００３】
抗体軽鎖は、２個の別個の遺伝子座：カッパー（κ）およびラムダ（λ）のうちの１つによってコードされる。マウス抗体軽鎖は、主にκタイプである。ヒトにおけるκとλの軽鎖の使用比は、約６０：４０であり、一方マウスでは、約９５：５である。報告によると、マウスでのκ軽鎖に偏った使用頻度（ｕｓａｇｅ）は、完全ヒト抗体または部分ヒト抗体を発現することができる遺伝的に改変されたマウスにおいても維持される。したがって、完全ヒト抗体または部分ヒト抗体を発現するマウスは、ラムダ可変の使用が抑制されているとみられる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
当該分野では、マウスであってもヒトであっても、エピトープ結合タンパク質を作製する際に使用するために、ラムダ可変領域を作製することが必要とされている。当該分野では、高いラムダ可変（Ｖλ）使用頻度を示す、完全ヒト抗体または部分ヒト抗体を発現するマウスが必要とされている。
【０００５】
当該分野では、高いλ可変（Ｖλ）使用頻度を示す、完全ヒト抗体または部分ヒト抗体を発現するマウスが必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
要旨
遺伝的に改変されたマウス、胚、細胞、組織ならびにマウスを改変するための核酸構築物、ならびにそれらを作製するためおよび使用するための方法および組成物が提供される。カッパー（κ）軽鎖という背景においてラムダ（λ）可変領域（ヒトまたは非ヒト）を産生するマウスおよび細胞が提供される。例えば、内在性マウス軽鎖遺伝子座から、κまたはλ軽鎖という背景においてヒトλ可変領域を産生するマウスおよび細胞も提供される。ラムダ可変領域を含む抗体を作製するための方法も提供される。同族のラムダ可変領域とともに発現する重鎖を選択するための方法も提供される。
【０００７】
体細胞変異した可変領域を含むキメラおよびヒト抗原結合タンパク質（例えば、抗体）（マウス軽鎖定常ドメインに融合されたヒトＶλおよびヒトＪλ遺伝子セグメントに由来する可変ドメインを含む軽鎖を有する抗体を含む）およびそれらをコードする核酸が提供される。
【０００８】
１つの態様において、マウス定常領域を含む軽鎖においてヒトλ可変領域配列を発現するマウスが提供される。１つの態様において、κ定常領域を含む軽鎖においてヒトλ可変領域配列を発現するマウスが提供される。１つの態様において、内在性マウス軽鎖遺伝子座から、ヒトλ可変領域配列を含む軽鎖を発現するマウスが提供される。１つの態様において、マウス定常領域配列に接続されたヒトλ可変配列を含む再配列された軽鎖遺伝子を含むマウスが提供され；１つの実施形態において、そのマウス定常領域配列は、λ定常配列であり；１つの実施形態において、そのマウス定常領域配列は、κ定常配列である。
【０００９】
１つの態様において、遺伝的に改変されたマウスが提供され、ここで、そのマウスは、再配列されていないヒトλ軽鎖可変遺伝子セグメント（ｈＶλ）およびヒトλ連結遺伝子セグメント（ｈＪλ）を含む。１つの実施形態において、その再配列されていないｈＶλおよびｈＪλは、マウス軽鎖遺伝子座に存在する。１つの実施形態において、その再配列されていないｈＶλおよび再配列されていないｈＪλは、導入遺伝子上に存在し、ヒトまたはマウス定常領域配列に作動可能に接続されている。１つの実施形態において、その再配列されていないｈＶλおよび再配列されていないｈＪλは、エピソーム上に存在する。１つの実施形態において、そのマウスは、再配列されていないｈＶλ配列およびｈＪλ配列ならびにマウス軽鎖定常領域（ＣＬ）核酸配列に由来する軽鎖を含む免疫グロブリンを産生することができる。遺伝的に改変されたマウスを作製するためおよび使用するための方法および組成物も提供される。（ａ）マウス重鎖定常領域に融合されたヒト重鎖可変ドメイン（ｈＶＨ）、および（ｂ）マウスＣＬドメインに融合されたヒトＶλを含む抗体が提供され、ここで、例えば、本発明のマウスにおける抗体または免疫細胞の選択中に、それらの可変ドメインの１つ以上が体細胞変異したものも含まれる。１つの実施形態において、再配列されていないｈＶλおよび再配列されていないｈＪλは、ヒトまたはマウスκ定常領域（Ｃκ）と作動可能に接続される。１つの実施形態において、その再配列されていないｈＶλおよび再配列されていないｈＪλは、ヒトまたはマウスλ定常領域（Ｃλ）と作動可能に接続される。
【００１０】
１つの態様において、生殖細胞系列において内在性マウス軽鎖遺伝子座にヒトλ軽鎖可変領域配列を含むマウスが提供され、ここで、そのヒトラムダ可変領域配列は、マウス免疫グロブリン定常領域遺伝子配列を含む軽鎖において発現される。
【００１１】
１つの実施形態において、内在性マウス軽鎖遺伝子座は、λ遺伝子座である。１つの実施形態において、内在性マウス軽鎖遺伝子座は、κ遺伝子座である。
【００１２】
１つの実施形態において、上記マウスは、内在性マウス軽鎖遺伝子座において内在性軽鎖可変配列を欠く。
【００１３】
１つの実施形態において、すべてまたは実質的にすべての内在性マウス軽鎖可変領域遺伝子セグメントが、１つ以上のヒトλ可変領域遺伝子セグメントで置換される。
【００１４】
１つの実施形態において、ヒトλ軽鎖可変領域配列は、ヒトＪλ配列を含む。１つの実施形態において、そのヒトＪλ配列は、Ｊλ１、Ｊλ２、Ｊλ３、Ｊλ７およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。
【００１５】
１つの実施形態において、ヒトλ軽鎖可変領域配列は、ヒト軽鎖遺伝子座のクラスターＡのフラグメントを含む。特定の実施形態において、そのヒトλ軽鎖遺伝子座のクラスターＡのフラグメントは、ｈＶλ３−２７からｈＶλ３−１にわたる。
【００１６】
１つの実施形態において、ヒトλ軽鎖可変領域配列は、ヒト軽鎖遺伝子座のクラスターＢのフラグメントを含む。特定の実施形態において、そのヒトλ軽鎖遺伝子座のクラスターＢのフラグメントは、ｈＶλ５−５２からｈＶλ１−４０にわたる。
【００１７】
１つの実施形態において、ヒトλ軽鎖可変領域配列は、クラスターＡのゲノムフラグメントおよびクラスターＢのゲノムフラグメントを含む。１つの実施形態において、ヒトλ軽鎖可変領域配列は、クラスターＡの少なくとも１つの遺伝子セグメントおよびクラスターＢの少なくとも１つの遺伝子セグメントを含む。
【００１８】
１つの実施形態において、上記マウスの軽鎖ナイーブレパートリーの１０％超が、２−８、２−２３、１−４０、５−４５および９−４９から選択される少なくとも２つのｈＶλ遺伝子セグメントに由来する。１つの実施形態において、上記マウスの軽鎖ナイーブレパートリーの２０％超が、２−８、２−２３、１−４０、５−４５および９−４９から選択される少なくとも３つのｈＶλ遺伝子セグメントに由来する。１つの実施形態において、上記マウスの軽鎖ナイーブレパートリーの３０％超が、２−８、２−２３、１−４０、５−４５および９−４９から選択される少なくとも４つのｈＶλ遺伝子セグメントに由来する。
【００１９】
１つの態様において、マウス定常領域と融合されたヒトλ可変配列を含む免疫グロブリン軽鎖を発現するマウスが提供され、ここで、そのマウスは、約１：１というκの使用頻度とλの使用頻度との比を示す。
【００２０】
１つの実施形態において、その免疫グロブリン軽鎖は、内在性マウス軽鎖遺伝子座から発現される。
【００２１】
１つの態様において、マウスκ軽鎖定常領域配列と連続する、λ軽鎖可変領域配列（Ｖλ）および少なくとも１つのＪ配列（Ｊ）を含むマウスが提供される。
【００２２】
１つの実施形態において、そのマウスは、機能的なマウスＶκおよび／またはマウスＪκ遺伝子セグメントを欠く。
【００２３】
１つの実施形態において、そのＶλは、ヒトＶλ（ｈＶλ）であり、そのＪは、ヒトＪλ（ｈＪλ）である。１つの実施形態において、そのｈＶλおよびｈＪλは、再配列されていない遺伝子セグメントである。
【００２４】
１つの実施形態において、上記マウスは、複数の再配列されていないｈＶλ遺伝子セグメントおよび少なくとも１つのｈＪλ遺伝子セグメントを含む。特定の実施形態において、その複数の再配列されていないｈＶλ遺伝子セグメントは、少なくとも１２個の遺伝子セグメント、少なくとも２８個の遺伝子セグメントまたは少なくとも４０個の遺伝子セグメントである。
【００２５】
１つの実施形態において、その少なくとも１つのｈＪλ遺伝子セグメントは、Ｊλ１、Ｊλ２、Ｊλ３、Ｊλ７およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。
【００２６】
１つの実施形態において、内在性マウスλ軽鎖遺伝子座は、全体的にまたは部分的に欠失される。
【００２７】
１つの実施形態において、マウスκ軽鎖定常領域配列は、内在性マウスκ軽鎖遺伝子座に存在する。
【００２８】
１つの実施形態において、上記マウスのＢ細胞の約１０％〜約４５％は、ヒトλ軽鎖可変（Ｖλ）ドメインおよびマウスκ軽鎖定常（Ｃκ）ドメインを含む軽鎖を含む抗体を発現する。
【００２９】
１つの実施形態において、そのヒトλ可変ドメインは、３−１／１、３−１／７、４−３／１、４−３／７、２−８／１、３−９／１、３−１０／１、３−１０／３、３−１０／７、２−１４／１、３−１９／１、２−２３／１、３−２５／１、１−４０／１、１−４０／２、１−４０／３、１−４０／７、７−４３／１、７−４３／３、１−４４／１、１−４４／７、５−４５／１、５−４５／２、５−４５／７、７−４６／１、７−４６／２、７−４６／７、９−４９／１、９−４９／２、９−４９／７および１−５１／１からなる群より選択される再配列されたｈＶλ／ｈＪλ配列に由来する。
【００３０】
１つの実施形態において、上記マウスは、ヒトκ軽鎖遺伝子座由来のヒトＶκ−Ｊκ遺伝子間領域をさらに含み、ここで、そのヒトＶκ−Ｊκ遺伝子間領域は、Ｖλ配列およびＪ配列と連続する。特定の実施形態において、ヒトＶκ−Ｊκ遺伝子間領域は、Ｖλ配列とＪ配列との間に配置される。
【００３１】
１つの態様において、（ａ）内在性マウス軽鎖遺伝子座に、少なくとも１２個〜少なくとも４０個の再配列されていないヒトλ軽鎖可変領域遺伝子セグメントおよび少なくとも１つのヒトＪλ遺伝子セグメント；（ｂ）少なくとも１２個〜少なくとも４０個のヒト軽鎖可変領域遺伝子セグメントと少なくとも１つのヒトＪλ配列との間に配置されたヒトＶκ−Ｊκ遺伝子間配列を含むマウスが提供され；ここで、そのマウスは、ヒトＶλドメインおよびマウスＣκドメインを含む軽鎖を含む抗体を発現する。
【００３２】
１つの態様において、λ可変配列およびκ定常配列を含む軽鎖を含む抗体を発現するマウスが提供される。
【００３３】
１つの実施形態において、そのマウスは、約１：１というκの使用頻度とλの使用頻度との比を示す。
【００３４】
１つの実施形態において、そのマウスの骨髄から得られる未熟Ｂ細胞の集団は、約１：１というκの使用頻度とλの使用頻度との比を示す。
【００３５】
１つの態様において、遺伝的に改変されたマウスが提供され、ここで、そのマウスは、マウスＣＬ遺伝子を含むマウス軽鎖遺伝子座に作動可能に接続された再配列されていない免疫グロブリンＶλおよびＪλ遺伝子セグメントを含む。
【００３６】
１つの実施形態において、上記Ｖλおよび／またはＪλ遺伝子セグメントは、ヒトの遺伝子セグメントである。１つの実施形態において、上記Ｖλおよび／またはＪλ遺伝子セグメントは、マウスの遺伝子セグメントであり、ＣＬは、マウスＣκである。
【００３７】
１つの実施形態において、内在性マウス軽鎖遺伝子座は、κ軽鎖遺伝子座である。１つの実施形態において、内在性マウス軽鎖遺伝子座は、λ軽鎖遺伝子座である。
【００３８】
１つの実施形態において、再配列されていないＶλおよびＪλ遺伝子セグメントは、内在性マウス軽鎖遺伝子座に存在する。
【００３９】
１つの実施形態において、再配列されていない免疫グロブリンＶλおよびＪλ遺伝子セグメントは、導入遺伝子上に存在する。
【００４０】
１つの実施形態において、上記マウスは、内在性マウス重鎖免疫グロブリン遺伝子座に、１つ以上のヒトＶ、Ｄおよび／またはＪ遺伝子セグメントによる１つ以上の重鎖Ｖ、Ｄおよび／またはＪ遺伝子セグメントの置換をさらに含む。
【００４１】
１つの実施形態において、上記マウスは、マウスＣκ遺伝子を含む内在性マウスκ軽鎖遺伝子座に、再配列されていない免疫グロブリンＶλおよびＪλ遺伝子セグメントを含む。
【００４２】
１つの実施形態において、上記マウスは、マウスＣλ遺伝子を含む内在性マウスλ軽鎖遺伝子座に、再配列されていないヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変遺伝子セグメント（Ｖλ）およびλ連結遺伝子セグメント（Ｊλ）を含む。
【００４３】
１つの実施形態において、軽鎖可変遺伝子の遺伝子座（「ＶＬ遺伝子座」）は、少なくとも１つのヒトＶλ（ｈＶλ）遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、そのＶＬ遺伝子座は、少なくとも１つのヒトＪλ（ｈＪλ）遺伝子セグメントを含む。別の実施形態において、ＶＬ遺伝子座は、最大４個のｈＪλ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、そのＶＬ遺伝子座は、ヒトλおよびヒトκゲノム配列を含む連続する配列を含む。
【００４４】
１つの実施形態において、κ軽鎖可変遺伝子の遺伝子座（「κ遺伝子座」）は、少なくとも１つのヒトＶλ（ｈＶλ）遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、そのκ遺伝子座は、少なくとも１つのヒトＪλ（ｈＪλ）遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、そのκ遺伝子座は、最大４個のｈＪλ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、そのκ遺伝子座は、少なくとも１つのｈＶλおよび少なくとも１つのｈＪλを含み、機能的なＶκ領域遺伝子セグメントを欠くかまたは実質的に欠き、機能的なＪκ領域遺伝子セグメントを欠くかまたは実質的に欠く。１つの実施形態において、上記マウスは、機能的なＶκ領域遺伝子セグメントを含まない。１つの実施形態において、上記マウスは、機能的なＪκ領域遺伝子セグメントを含まない。
【００４５】
１つの実施形態において、λ軽鎖可変遺伝子の遺伝子座（「λ遺伝子座」）は、少なくとも１つのｈＶλ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、そのλ遺伝子座は、少なくとも１つのヒトＪλ（ｈＪλ）遺伝子セグメントを含む。別の実施形態において、そのλ遺伝子座は、最大４個のｈＪλ遺伝子セグメントを含む。
【００４６】
１つの実施形態において、ＶＬ遺伝子座は、複数のｈＶλを含む。１つの実施形態では、ヒトにおいて観察される約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％もしくは約９０％またはそれ以上のＶλ使用頻度を反映するλ軽鎖可変領域レパートリーの発現がもたらされるように、複数のｈＶλが選択される。１つの実施形態において、ＶＬ遺伝子座は、遺伝子セグメントｈＶλ１−４０、１−４４、２−８、２−１４、３−２１およびそれらの組み合わせを含む。
【００４７】
１つの実施形態において、ｈＶλは、３−１、４−３、２−８、３−９、３−１０、２−１１および３−１２を含む。特定の実施形態において、ＶＬ遺伝子座は、Ｖλ３−１２からＶλ３−１に及ぶヒトλ軽鎖遺伝子座の連続する配列を含む。１つの実施形態において、ＶＬ遺伝子座は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２個のｈＶλを含む。特定の実施形態において、ｈＶλは、３−１、４−３、２−８、３−９、３−１０、２−１１および３−１２を含む。特定の実施形態において、ＶＬ遺伝子座は、Ｖλ３−１２からＶλ３−１に及ぶヒトλ遺伝子座の連続する配列を含む。１つの実施形態において、ＶＬ遺伝子座は、内在性κ遺伝子座に存在する。特定の実施形態において、ＶＬ遺伝子座は、内在性κ遺伝子座に存在し、内在性λ軽鎖遺伝子座は、部分的にまたは完全に欠失される。１つの実施形態において、ＶＬ遺伝子座は、内在性λ遺伝子座に存在する。特定の実施形態において、ＶＬ遺伝子座は、内在性λ遺伝子座に存在し、内在性κ遺伝子座は、部分的にまたは完全に欠失される。
【００４８】
１つの実施形態において、ＶＬ遺伝子座は、１３〜２８個またはそれ以上のｈＶλを含む。特定の実施形態において、それらのｈＶλは、２−１４、３−１６、２−１８、３−１９、３−２１、３−２２、２−２３、３−２５および３−２７を含む。特定の実施形態において、κ遺伝子座は、Ｖλ３−２７からＶλ３−１に及ぶヒトλ遺伝子座の連続する配列を含む。１つの実施形態において、ＶＬ遺伝子座は、内在性κ遺伝子座に存在する。特定の実施形態において、ＶＬ遺伝子座は、内在性κ遺伝子座に存在し、内在性λ軽鎖遺伝子座は、部分的にまたは完全に欠失される。別の実施形態において、ＶＬ遺伝子座は、内在性λ遺伝子座に存在する。特定の実施形態において、ＶＬ遺伝子座は、内在性λ遺伝子座に存在し、内在性κ遺伝子座は、部分的にまたは完全に欠失される。
【００４９】
１つの実施形態において、ＶＬ遺伝子座は、２９〜４０個のｈＶλを含む。特定の実施形態において、κ遺伝子座は、Ｖλ３−２９からＶλ３−１に及ぶヒトλ遺伝子座の連続する配列およびＶλ５−５２からＶλ１−４０に及ぶヒトλ遺伝子座の連続する配列を含む。特定の実施形態において、遺伝的に改変されたマウスにおけるｈＶλ１−４０とｈＶλ３−２９との間のすべてまたは実質的にすべての配列は、ｈＶλ１−４０遺伝子セグメントの下流（３’非翻訳部分の下流）に天然に（例えば、ヒト集団において）見られるおよそ９５９ｂｐのヒトλ配列、制限酵素部位（例えば、ＰＩ−ＳｃｅＩ）、それに続いて天然に見られるｈＶλ３−２９遺伝子セグメントのおよそ３，４３１ｂｐ上流のヒトλ配列から本質的になる。１つの実施形態において、ＶＬ遺伝子座は、内在性マウスκ遺伝子座に存在する。特定の実施形態において、ＶＬ遺伝子座は、内在性マウスκ遺伝子座に存在し、内在性マウスλ軽鎖遺伝子座は、部分的にまたは完全に欠失される。別の実施形態において、ＶＬ遺伝子座は、内在性マウスλ遺伝子座に存在する。特定の実施形態において、ＶＬ遺伝子座は、内在性マウスλ遺伝子座に存在し、内在性マウスκ遺伝子座は、部分的にまたは完全に欠失される。
【００５０】
１つの実施形態において、ＶＬ遺伝子座は、少なくとも１つのｈＪλを含む。１つの実施形態において、ＶＬ遺伝子座は、複数のｈＪλを含む。１つの実施形態において、ＶＬ遺伝子座は、少なくとも２、３、４、５、６または７個のｈＪλを含む。特定の実施形態において、ＶＬ遺伝子座は、４個のｈＪλを含む。特定の実施形態において、その４個のｈＪλは、ｈＪλ１、ｈＪλ２、ｈＪλ３およびｈＪλ７である。１つの実施形態において、ＶＬ遺伝子座は、κ遺伝子座である。特定の実施形態において、ＶＬ遺伝子座は、内在性κ遺伝子座に存在し、内在性λ軽鎖遺伝子座は、部分的にまたは完全に欠失される。１つの実施形態において、ＶＬ遺伝子座は、１個のｈＪλを含む。特定の実施形態において、その１個のｈＪλは、ｈＪλ１である。１つの実施形態において、ＶＬ遺伝子座は、内在性κ遺伝子座に存在する。特定の実施形態において、ＶＬ遺伝子座は、内在性κ遺伝子座に存在し、内在性λ軽鎖遺伝子座は、部分的にまたは完全に欠失される。別の実施形態において、ＶＬ遺伝子座は、内在性λ遺伝子座に存在する。特定の実施形態において、ＶＬ遺伝子座は、内在性λ遺伝子座に存在し、内在性κ遺伝子座は、部分的にまたは完全に欠失される。
【００５１】
１つの実施形態において、ＶＬ遺伝子座は、少なくとも１つのｈＶλ、少なくとも１つのｈＪλおよびマウスＣκ遺伝子を含む。１つの実施形態において、ＶＬ遺伝子座は、少なくとも１つのｈＶλ、少なくとも１つのｈＪλおよびマウスＣλ遺伝子を含む。特定の実施形態において、そのマウスＣλ遺伝子は、Ｃλ２である。特定の実施形態において、そのマウスＣλ遺伝子は、マウスＣλ２と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または少なくとも９９％同一である。
【００５２】
１つの実施形態において、上記マウスは、内在性マウスκ遺伝子座に、１つ以上のｈＶλ遺伝子セグメントによる内在性マウスＶκ遺伝子セグメントの置換を含み、ここで、そのｈＶλ遺伝子セグメントは、内在性マウスＣκ領域遺伝子に作動可能に接続されており、そのマウスは、ヒトＶλ遺伝子セグメントを再配列し、ヒトＶλドメインおよびマウスＣκを含むリバースキメラ（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ）免疫グロブリン軽鎖を発現する。１つの実施形態において、再配列されていないマウスＶκ遺伝子セグメントの９０〜１００％が、少なくとも１つの再配列されていないｈＶλ遺伝子セグメントで置換される。特定の実施形態において、内在性マウスＶκ遺伝子セグメントのすべてまたは実質的にすべてが、少なくとも１つの再配列されていないｈＶλ遺伝子セグメントで置換される。１つの実施形態において、その置換は、少なくとも１２個、少なくとも２８個または少なくとも４０個の再配列されていないｈＶλ遺伝子セグメントによる置換である。１つの実施形態において、その置換は、少なくとも７個の機能的な再配列されていないｈＶλ遺伝子セグメント、少なくとも１６個の機能的な再配列されていないｈＶλ遺伝子セグメントまたは少なくとも２７個の機能的な再配列されていないｈＶλ遺伝子セグメントによる置換である。１つの実施形態において、上記マウスは、少なくとも１つの再配列されていないｈＪλ遺伝子セグメントによるすべてのマウスＪκ遺伝子セグメントの置換を含む。１つの実施形態において、その少なくとも１つの再配列されていないｈＪλ遺伝子セグメントは、Ｊλ１、Ｊλ２、Ｊλ３、Ｊλ４、Ｊλ５、Ｊλ６、Ｊλ７およびそれらの組み合わせから選択される。特定の実施形態において、１つ以上のｈＶλ遺伝子セグメントは、３−１、４−３、２−８、３−９、３−１０、２−１１、３−１２、２−１４、３−１６、２−１８、３−１９、３−２１、３−２２、２−２３、３−２５、３−２７、１−４０、７−４３、１−４４、５−４５、７−４６、１−４７、５−４８、９−４９、１−５０、１−５１、５−５２ｈＶλ遺伝子セグメントおよびそれらの組み合わせから選択される。特定の実施形態において、その少なくとも１つの再配列されていないｈＪλ遺伝子セグメントは、Ｊλ１、Ｊλ２、Ｊλ３、Ｊλ７およびそれらの組み合わせから選択される。
【００５３】
１つの実施形態において、上記マウスは、内在性マウスλ遺伝子座に、１つ以上のヒトＶλ遺伝子セグメントによる内在性マウスＶλ遺伝子セグメントの置換を内在性マウスλ遺伝子座に含み、ここで、そのｈＶλ遺伝子セグメントは、マウスＣλ領域遺伝子に作動可能に接続されており、そのマウスは、ｈＶλ遺伝子セグメントを再配列し、ｈＶλドメインおよびマウスＣλを含むリバースキメラ免疫グロブリン軽鎖を発現する。特定の実施形態において、そのマウスＣλ遺伝子は、Ｃλ２である。特定の実施形態において、そのマウスＣλ遺伝子は、マウスＣλ２と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９８％同一である。１つの実施形態において、再配列されていないマウスＶλ遺伝子セグメントの９０〜１００％が、少なくとも１つの再配列されていないｈＶλ遺伝子セグメントで置換される。特定の実施形態において、内在性マウスＶλ遺伝子セグメントのすべてまたは実質的にすべてが、少なくとも１つの再配列されていないｈＶλ遺伝子セグメントで置換される。１つの実施形態において、その置換は、少なくとも１２個、少なくとも２８個または少なくとも４０個の再配列されていないｈＶλ遺伝子セグメントによる置換である。１つの実施形態において、その置換は、少なくとも７個の機能的な再配列されていないｈＶλ遺伝子セグメント、少なくとも１６個の機能的な再配列されていないｈＶλ遺伝子セグメントまたは少なくとも２７個の機能的な再配列されていないｈＶλ遺伝子セグメントによる置換である。１つの実施形態において、上記マウスは、少なくとも１つの再配列されていないｈＪλ遺伝子セグメントによるすべてのマウスＪλ遺伝子セグメントの置換を含む。１つの実施形態において、その少なくとも１つの再配列されていないｈＪλ遺伝子セグメントは、Ｊλ１、Ｊλ２、Ｊλ３、Ｊλ４、Ｊλ５、Ｊλ６、Ｊλ７およびそれらの組み合わせから選択される。特定の実施形態において、その１つ以上のｈＶλ遺伝子セグメントは、３−１、４−３、２−８、３−９、３−１０、２−１１、３−１２、２−１４、３−１６、２−１８、３−１９、３−２１、３−２２、２−２３、３−２５、３−２７、１−４０、７−４３、１−４４、５−４５、７−４６、１−４７、５−４８、９−４９、１−５０、１−５１、５−５２ｈＶλ遺伝子セグメントおよびそれらの組み合わせから選択される。特定の実施形態において、その少なくとも１つの再配列されていないｈＪλ遺伝子セグメントは、Ｊλ１、Ｊλ２、Ｊλ３、Ｊλ７およびそれらの組み合わせから選択される。
【００５４】
１つの態様において、内在性マウスκ軽鎖遺伝子座に配置されたヒトＶκ−Ｊκ遺伝子間領域配列を含む遺伝的に改変されたマウスが提供される。
【００５５】
１つの実施形態において、そのヒトＶκ−Ｊκ遺伝子間領域配列は、ｈＶλおよびｈＪλ遺伝子セグメントを含むマウスの内在性κ軽鎖遺伝子座に存在し、そのヒトＶκ−Ｊκ遺伝子間領域配列は、ｈＶλ遺伝子セグメントとｈＪλ遺伝子セグメントとの間に配置される。特定の実施形態において、そのｈＶλおよびｈＪλ遺伝子セグメントは、そのマウスにおいて、機能的なヒトλ軽鎖可変ドメインを形成するように組み換わることができる。
【００５６】
１つの実施形態において、複数のｈＶλおよび１つ以上のｈＪλを含むマウスが提供され、転写の点から、ヒトＶκ−Ｊκ遺伝子間領域配列は、近位または最も３’側のｈＶλ配列の下流かつ最初のｈＪλ配列の上流または５’側に配置される。
【００５７】
１つの実施形態において、ヒトＶκ−Ｊκ遺伝子間領域は、ヒトＶκ４−１遺伝子セグメントの約１３０ｂｐ下流または３’側、すなわち、ヒトＶκ４−１遺伝子セグメントの３’非翻訳領域の約１３０ｂｐ下流に位置する領域であり、ヒトＪκ１遺伝子セグメントの約６００ｂｐ上流または５’側までに及ぶ。特定の実施形態において、ヒトＶκ−Ｊκ遺伝子間領域は、約２２．８ｋｂのサイズである。１つの実施形態において、Ｖκ−Ｊκ遺伝子間領域は、ヒトＶκ４−１遺伝子セグメントの３’非翻訳領域の末端からヒトＪκ１遺伝子セグメントの約６００ｂｐ上流にわたるヒトＶκ−Ｊκ遺伝子間領域と約９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上または約９５％以上同一である。１つの実施形態において、Ｖκ−Ｊκ遺伝子間領域は、配列番号１００を含む。特定の実施形態において、Ｖκ−Ｊκ遺伝子間領域は、配列番号１００の機能的なフラグメントを含む。特定の実施形態において、Ｖκ−Ｊκ遺伝子間領域は、配列番号１００である。
【００５８】
１つの態様において、列挙されたヒトＶκ−Ｊκ遺伝子間領域配列を含むマウス、マウス細胞（例えば、マウス胚性幹細胞）、マウス胚およびマウス組織が提供され、ここで、その遺伝子間領域配列は、異所性のものである。特定の実施形態において、その異所性の配列は、ヒト化された内在性マウス免疫グロブリン遺伝子座に配置されている。
【００５９】
１つの態様において、列挙されたヒトＶκ−Ｊκ遺伝子間領域配列を含む単離された核酸構築物が提供される。１つの実施形態において、その核酸構築物は、ヒトＶκ−Ｊκ遺伝子間領域配列をマウス軽鎖遺伝子座に標的化する標的化アーム（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ａｒｍ）を含む。特定の実施形態において、そのマウス軽鎖遺伝子座は、κ遺伝子座である。特定の実施形態において、その標的化アームは、ヒトＶκ−Ｊκ遺伝子間領域を改変された内在性マウスκ遺伝子座に標的化し、ここで、その標的化は、ｈＶλ配列とｈＪλ配列との間の位置に対するものである。
【００６０】
１つの態様において、遺伝的に改変されたマウスが提供され、ここで、そのマウスは、２つ以下の軽鎖対立遺伝子を含み、ここで、その軽鎖対立遺伝子は、（ａ）マウスＣＬ遺伝子を含む内在性マウス軽鎖遺伝子座に、再配列されていない免疫グロブリンヒトＶλおよびＪλ遺伝子セグメント；および（ｂ）マウスＣＬ遺伝子を含む内在性マウス軽鎖遺伝子座に、再配列されていない免疫グロブリンＶＬおよびＪＬ遺伝子セグメントを含む。
【００６１】
１つの実施形態において、内在性マウス軽鎖遺伝子座は、κ遺伝子座である。別の実施形態において、内在性マウス軽鎖遺伝子座は、λ遺伝子座である。
【００６２】
１つの実施形態において、上記２つ以下の軽鎖対立遺伝子は、κ対立遺伝子およびλ対立遺伝子、２つのκ対立遺伝子ならびに２つのλ対立遺伝子から選択される。特定の実施形態において、その２つの軽鎖対立遺伝子のうちの１つは、Ｃλ２遺伝子を含むλ対立遺伝子である。
【００６３】
１つの実施形態において、上記マウスは、１つの機能的な免疫グロブリン軽鎖遺伝子座および１つの非機能的な軽鎖遺伝子座を含み、ここで、その機能的な軽鎖遺伝子座は、マウスＣκ遺伝子を含む内在性マウスκ軽鎖遺伝子座に、再配列されていない免疫グロブリンヒトＶλおよびＪλ遺伝子セグメントを含む。
【００６４】
１つの実施形態において、上記マウスは、１つの機能的な免疫グロブリン軽鎖遺伝子座および１つの非機能的な軽鎖遺伝子座を含み、ここで、その機能的な軽鎖遺伝子座は、マウスＣλ遺伝子を含む内在性マウスλ軽鎖遺伝子座に、再配列されていない免疫グロブリンヒトＶλおよびＪλ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、そのＣλ遺伝子は、Ｃλ２である。特定の実施形態において、そのマウスＣλ遺伝子は、マウスＣλ２と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９８％同一である。
【００６５】
１つの実施形態において、上記マウスは、少なくとも１つの免疫グロブリン重鎖対立遺伝子をさらに含む。１つの実施形態において、その少なくとも１つの免疫グロブリン重鎖対立遺伝子は、ヒト／マウス重鎖を発現するヒト重鎖遺伝子を含む内在性マウス重鎖遺伝子座に、ヒトＶＨ遺伝子セグメント、ヒトＤＨ遺伝子セグメントおよびヒトＪＨ遺伝子セグメントを含む。特定の実施形態において、上記マウスは、２つの免疫グロブリン重鎖対立遺伝子を含み、そのマウスは、ヒト／マウス重鎖を発現する。
【００６６】
１つの実施形態において、上記マウスは、内在性Ｃκ遺伝子を含む内在性マウスκ遺伝子座に、再配列されていないｈＶκおよび再配列されていないｈＪκを含む第１の軽鎖対立遺伝子；ならびに内在性Ｃκ遺伝子を含む内在性マウスκ遺伝子座に、再配列されていないｈＶλおよび再配列されていないｈＪλを含む第２の軽鎖対立遺伝子を含む。特定の実施形態において、その遺伝的に改変されたマウスにおいて機能的な軽鎖対立遺伝子は、その第１および第２の軽鎖対立遺伝子だけである。特定の実施形態において、上記マウスは、非機能的なλ遺伝子座を含む。１つの実施形態において、遺伝的に改変されたマウスは、λ定常領域を含む軽鎖を発現しない。
【００６７】
１つの実施形態において、上記マウスは、内在性Ｃκ遺伝子を含む内在性マウスκ遺伝子座に、再配列されていないｈＶκおよび再配列されていないｈＪκを含む第１の軽鎖対立遺伝子；ならびに内在性Ｃλ遺伝子を含む内在性マウスλ遺伝子座に、再配列されていないｈＶλおよび再配列されていないｈＪλを含む第２の軽鎖対立遺伝子を含む。特定の実施形態において、その遺伝的に改変されたマウスにおいて機能的な軽鎖対立遺伝子は、その第１および第２の軽鎖対立遺伝子だけである。１つの実施形態において、その内在性Ｃλ遺伝子は、Ｃλ２である。特定の実施形態において、そのマウスＣλ遺伝子は、マウスＣλ２と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９８％同一である。
【００６８】
１つの実施形態において、上記マウスは、６個の免疫グロブリン対立遺伝子を含み、ここで、第１の対立遺伝子は、マウスＣκ遺伝子を含む内在性マウスκ軽鎖遺伝子座に、再配列されていない免疫グロブリンＶλおよびＪλ遺伝子セグメントを含み、第２の対立遺伝子は、マウスＣκ遺伝子を含む内在性マウスκ軽鎖遺伝子座に、再配列されていない免疫グロブリンＶκおよびＪκ遺伝子セグメントを含み、第３の対立遺伝子は、マウスＣλ遺伝子を含む内在性マウスλ軽鎖遺伝子座に、再配列されていない免疫グロブリンＶλおよびＪλ遺伝子セグメントを含み、第４および第５の対立遺伝子は、各々独立して、マウス重鎖遺伝子を含む内在性マウス重鎖遺伝子座に、再配列されていないＶＨおよびＤＨおよびＪＨ遺伝子セグメントを含み、そして第６の対立遺伝子は、（ａ）マウスＣλ遺伝子を含む内在性マウスλ軽鎖遺伝子座に、再配列されていない免疫グロブリンＶλおよびＪλ遺伝子セグメントを含むか、（ｂ）非機能的なλ遺伝子座を含むか、または（ｃ）全体的にもしくは部分的にλ遺伝子座の欠失を含む。
【００６９】
１つの実施形態において、上記の第１の対立遺伝子は、再配列されていないｈＶλおよびｈＪλを含む。１つの実施形態において、上記の第２の対立遺伝子は、再配列されていないｈＶκおよびｈＪκを含む。１つの実施形態において、上記の第３の対立遺伝子は、再配列されていないｈＶλおよびｈＪλを含む。１つの実施形態において、上記の第４および第５の対立遺伝子は、各々独立して、再配列されていないｈＶＨおよびｈＤＨおよびｈＪＨを含む。１つの実施形態において、上記の第６の対立遺伝子は、全体的にまたは部分的に欠失された内在性マウスλ遺伝子座を含む。
【００７０】
１つの実施形態において、上記マウスは、６個の免疫グロブリン対立遺伝子を含み、ここで、第１の対立遺伝子は、マウスＣλ遺伝子を含む内在性マウスλ軽鎖遺伝子座に、再配列されていない免疫グロブリンＶλおよびＪλ遺伝子セグメントを含み、第２の対立遺伝子は、マウスＣλ遺伝子を含む内在性マウスλ軽鎖遺伝子座に、再配列されていない免疫グロブリンＶλおよびＪλ遺伝子セグメントを含み、第３の対立遺伝子は、マウスＣκ遺伝子を含む内在性マウスκ軽鎖遺伝子座に、再配列されていない免疫グロブリンＶκおよびＪκ遺伝子セグメントを含み、第４および第５の対立遺伝子は、各々独立して、マウス重鎖遺伝子を含む内在性マウス重鎖遺伝子座に、再配列されていないＶＨおよびＤＨおよびＪＨ遺伝子セグメントを含み、そして第６の対立遺伝子は、（ａ）マウスＣκ遺伝子を含む内在性マウスκ軽鎖遺伝子座に、再配列されていない免疫グロブリンＶκおよびＪκ遺伝子セグメントを含むか、（ｂ）非機能的なκ遺伝子座を含むか、または（ｃ）κ遺伝子座の１つ以上のエレメントの欠失を含む。
【００７１】
１つの実施形態において、上記の第１の対立遺伝子は、再配列されていないｈＶλおよびｈＪλ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、上記の第２の対立遺伝子は、再配列されていないｈＶλおよびｈＪλ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、上記の第３の対立遺伝子は、再配列されていないｈＶκおよびｈＪκ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、上記の第４および第５の対立遺伝子は、各々独立して、再配列されていないｈＶＨおよびｈＤＨおよびｈＪＨ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、上記の第６の対立遺伝子は、機能的にサイレンシングされた内在性マウスκ遺伝子座を含む。
【００７２】
１つの実施形態において、上記遺伝的に改変されたマウスは、マウスＣＬドメインに作動可能に接続された再配列されたｈＶλドメインを含む再配列された抗体遺伝子を含むＢ細胞を含む。１つの実施形態において、そのマウスＣＬドメインは、マウスＣκおよびマウスＣλドメインから選択される。特定の実施形態において、そのマウスＣλドメインは、Ｃλ２遺伝子に由来する。特定の実施形態において、そのマウスＣλドメインは、マウスＣλ２と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９８％同一であるＣλドメインに由来する。
【００７３】
１つの態様において、ＣκであるＣＬにおいてＶλ領域を発現する遺伝的に改変されたマウスが提供される。１つの態様において、ヒトＣκ、ヒトＣλまたはマウスＣκから選択されるＣＬにおいてｈＶλ領域を発現する遺伝的に改変されたマウスが提供される。１つの態様において、マウスＣκにおいてｈＶλ領域を発現する遺伝的に改変されたマウスが提供される。
【００７４】
１つの実施形態において、上記マウスの脾細胞の約１０〜５０％は、Ｂ細胞（すなわち、ＣＤ１９陽性）であるか、またはその約９〜２８％は、マウスＣκドメインに融合されたｈＶλドメインを含む免疫グロブリン軽鎖を発現する。
【００７５】
特定の実施形態において、上記マウスの脾細胞の約２３〜３４％は、Ｂ細胞（すなわち、ＣＤ１９陽性）であるか、またはその約９〜１１％は、マウスＣκドメインに融合されたｈＶλドメインを含む免疫グロブリン軽鎖を発現する。
【００７６】
特定の実施形態において、上記マウスの脾細胞の約１９〜３１％は、Ｂ細胞（すなわち、ＣＤ１９陽性）であるか、またはその約９〜１７％は、マウスＣκドメインに融合されたｈＶλドメインを含む免疫グロブリン軽鎖を発現する。
【００７７】
特定の実施形態において、上記マウスの脾細胞の約２１〜３８％は、Ｂ細胞（すなわち、ＣＤ１９陽性）であるか、またはその約２４〜２７％は、マウスＣκドメインに融合されたｈＶλドメインを含む免疫グロブリン軽鎖を発現する。
【００７８】
特定の実施形態において、上記マウスの脾細胞の約１０〜１４％は、Ｂ細胞（すなわち、ＣＤ１９陽性）であるか、またはその約９〜１３％は、マウスＣκドメインに融合されたｈＶλドメインを含む免疫グロブリン軽鎖を発現する。
【００７９】
特定の実施形態において、上記マウスの脾細胞の約３１〜４８％は、Ｂ細胞（すなわち、ＣＤ１９陽性）であるか、またはその約１５〜２１％は、マウスＣκドメインに融合されたｈＶλドメインを含む免疫グロブリン軽鎖を発現する。特定の実施形態において、上記マウスの脾細胞の約３０〜３８％は、Ｂ細胞（すなわち、ＣＤ１９陽性）であり、その約３３〜４８％は、マウスＣκドメインに融合されたｈＶλドメインを含む免疫グロブリン軽鎖を発現する。
【００８０】
１つの実施形態において、上記マウスの骨髄の約５２〜７０％は、Ｂ細胞（すなわち、ＣＤ１９陽性）であるか、またはその約３１〜４７％の未熟Ｂ細胞（すなわち、ＣＤ１９陽性／Ｂ２２０中等度陽性（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ）／ＩｇＭ陽性）は、マウスＣκドメインに融合されたｈＶλドメインを含む免疫グロブリン軽鎖を発現する。
【００８１】
１つの実施形態において、上記マウスの骨髄の約６０％は、Ｂ細胞（すなわち、ＣＤ１９陽性）であるか、またはその約３８．３％の未熟Ｂ細胞（すなわち、ＣＤ１９陽性／Ｂ２２０中等度陽性／ＩｇＭ陽性）は、マウスＣκドメインに融合されたｈＶλドメインを含む免疫グロブリン軽鎖を発現する。
【００８２】
１つの実施形態において、上記マウスは、ヒトＶおよびヒトＪ遺伝子セグメントに由来する可変ドメインならびにマウス定常領域遺伝子に由来する定常ドメインを含む軽鎖を含む抗体を発現する。１つの実施形態において、そのマウス定常領域遺伝子は、Ｃκ遺伝子である。別の実施形態において、そのマウス定常領域遺伝子は、Ｃλ遺伝子である。特定の実施形態において、そのＣλ領域は、Ｃλ２である。特定の実施形態において、そのマウスＣλ遺伝子は、マウスＣλ２と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９８％同一であるＣλ遺伝子に由来する。特定の実施形態において、上記抗体は、ヒトＶ、ヒトＤおよびヒトＪ遺伝子セグメントに由来する可変ドメインを含む重鎖、ならびにマウス重鎖定常領域遺伝子に由来する重鎖定常ドメインをさらに含む。１つの実施形態において、そのマウス重鎖定常領域遺伝子は、重鎖定常ドメインのヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３配列を含む。別の実施形態において、そのマウス重鎖定常領域遺伝子は、重鎖定常ドメインのＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３配列を含む。別の実施形態において、そのマウス重鎖定常領域遺伝子は、重鎖定常ドメインのＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−ＣＨ４配列を含む。別の実施形態において、そのマウス重鎖定常領域遺伝子は、重鎖定常ドメインのＣＨ２−ＣＨ３−ＣＨ４配列を含む。
【００８３】
１つの実施形態において、上記マウスは、再配列されたヒトＶλ−Ｊλ配列およびマウスＣκ配列を含む軽鎖を含む抗体を発現する。１つの実施形態において、その再配列されたヒトＶλ−Ｊλ配列は、３−１、４−３、２−８、３−９、３−１０、２−１４、３−１９、２−２３、３−２５、１−４０、７−４３、１−４４、５−４５、７−４６、１−４７、９−４９および１−５１遺伝子セグメントから選択されるｈＶλ遺伝子セグメントの再配列に由来する。１つの実施形態において、その再配列されたヒトＶλ−Ｊλ配列は、Ｊλ１、Ｊλ２、Ｊλ３およびＪλ７遺伝子セグメントから選択されるｈＪλ遺伝子セグメントの再配列に由来する。
【００８４】
１つの実施形態において、上記マウスは、３−１／１、３−１／７、４−３／１、４−３／７、２−８／１、３−９／１、３−１０／１、３−１０／３、３−１０／７、２−１４／１、３−１９／１、２−２３／１、３−２５／１、１−４０／１、１−４０／２、１−４０／３、１−４０／７、７−４３／１、７−４３／３、１−４４／１、１−４４／７、５−４５／１、５−４５／２、５−４５／７、７−４６／１、７−４６／２、７−４６／７、９−４９／１、９−４９／２、９−４９／７および１−５１／１から選択されるヒトＶλ／Ｊλ配列を含む再配列された免疫グロブリンλ軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む抗体を発現する。特定の実施形態において、Ｂ細胞は、マウス重鎖定常ドメインと融合されたヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインおよびマウスκ軽鎖定常ドメインと融合されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変ドメインを含む抗体を発現する。
【００８５】
１つの態様において、（ａ）再配列されていないヒト重鎖可変領域遺伝子セグメントに由来する重鎖可変ドメインを含む重鎖（ここで、その重鎖可変ドメインは、マウス重鎖定常（ＣＨ）領域に融合されている）；および（ｂ）再配列されていないｈＶλおよびｈＪλに由来する軽鎖可変ドメインを含む軽鎖（ここで、その軽鎖可変ドメインは、マウスＣＬ領域に融合されている）を含む抗体を発現するマウスが提供される。
【００８６】
１つの実施形態において、上記マウスは、（ｉ）すべてまたは実質的にすべての機能的なヒトＶ、ＤおよびＪ遺伝子セグメントによるすべてまたは実質的にすべての機能的な内在性マウスＶ、ＤおよびＪ遺伝子セグメントの置換、マウスＣＨ遺伝子を含む重鎖遺伝子座、（ｉｉ）すべて、実質的にすべてまたは複数の機能的なｈＶλおよびｈＪλ遺伝子セグメントによるすべてまたは実質的にすべての機能的な内在性マウスＶκおよびＪκ遺伝子セグメントの置換、ならびにマウスＣκ遺伝子を含む第１のκ軽鎖遺伝子座、（ｉｉｉ）すべて、実質的にすべてまたは複数の機能的なｈＶκおよびｈＪκ遺伝子セグメントによるすべてまたは実質的にすべての機能的な内在性マウスＶκおよびＪκ遺伝子セグメントの置換、ならびにマウスＣκ遺伝子を含む第２のκ軽鎖遺伝子座を含む。１つの実施形態において、上記マウスは、Ｃλ領域を含む抗体を発現しない。１つの実施形態において、上記マウスは、Ｃλ遺伝子および／またはＶλおよび／またはＪλ遺伝子セグメントの欠失を含む。１つの実施形態において、上記マウスは、非機能的なλ軽鎖遺伝子座を含む。特定の実施形態において、そのλ軽鎖遺伝子座は、全体的にまたは部分的に欠失されている。
【００８７】
１つの実施形態において、上記マウスは、（ｉ）すべてまたは実質的にすべての機能的なヒトＶ、ＤおよびＪ遺伝子セグメントによるすべてまたは実質的にすべての機能的な内在性マウスＶ、ＤおよびＪ遺伝子セグメントの置換、マウスＣＨ遺伝子を含む重鎖遺伝子座、（ｉｉ）すべて、実質的にすべてまたは複数の機能的なｈＶλおよびｈＪλ遺伝子セグメントによるすべてまたは実質的にすべての機能的な内在性マウスＶλおよびＪλ遺伝子セグメントの置換ならびにマウスＣλ遺伝子を含む第１のλ軽鎖遺伝子座、（ｉｉｉ）すべて、実質的にすべてまたは複数の機能的なｈＶλおよびｈＪλ遺伝子セグメントによるすべてまたは実質的にすべての機能的な内在性マウスＶλおよびＪλ遺伝子セグメントの置換ならびにマウスＣλ遺伝子を含む第２のλ軽鎖遺伝子座を含む。特定の実施形態において、そのマウスＣλ遺伝子は、Ｃλ２である。特定の実施形態において、そのマウスＣλ遺伝子は、マウスＣλ２と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９８％同一であるＣλ遺伝子に由来する。
【００８８】
１つの実施形態において、上記マウスは、Ｃκ遺伝子および／またはＶκおよび／またはＪκ遺伝子セグメントの欠失を含む。１つの実施形態において、上記マウスは、非機能的なκ軽鎖遺伝子座を含む。
【００８９】
１つの態様において、抗体を発現する遺伝的に改変されたマウスが提供され、ここで、そのマウスによって産生される全ＩｇＧ抗体の１０％超、１５％超、２０％超、２５％超、３０％超、３５％超、４０％超、６０％超、７０％超、８０％超または９０％超が、λ由来の可変ドメインを含み、そのマウスは、マウスＣκ領域と融合されたκ由来の可変ドメインを含む抗体を発現する。特定の実施形態において、そのマウスによって産生される全抗体の約１５〜４０％、２０〜４０％、２５〜４０％、３０〜４０％または３５〜４０％が、λ由来の可変ドメインを含む。
【００９０】
１つの実施形態において、上記のλ由来の可変ドメインは、ｈＶλおよびｈＪλに由来する。１つの実施形態において、上記のλ由来の可変ドメインは、マウスＣκ領域を含む軽鎖に存在する。特定の実施形態において、上記のλ由来の可変領域は、マウスＣλ領域を含む軽鎖に存在する。別の特定の実施形態において、そのＣλ領域は、Ｃλ２領域である。１つの実施形態において、κ由来の可変ドメインは、ｈＶκおよびｈＪκに由来し、特定の実施形態では、マウスＣκ領域を含む軽鎖に存在する。
【００９１】
１つの態様において、上流の相同性アーム（ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ａｒｍ）および下流の相同性アームを含む単離されたＤＮＡ構築物が提供され、ここで、その上流および下流の相同性アームは、その構築物をマウスκ遺伝子座に標的化し、その構築物は、機能的な再配列されていないｈＶλセグメントおよび機能的な再配列されていないｈＪλセグメントならびに選択配列またはマーカー配列を含む。
【００９２】
１つの態様において、転写の方向に関して５’から３’に向かって、マウスＶλ２の上流のマウスλ配列を標的化するための標的化アーム、リコンビナーゼ認識部位と５’側および３’側で隣接した選択カセット、ならびにマウスＪλ２の３’側のマウスλ配列を標的化するための標的化アームを含む単離されたＤＮＡ構築物が提供される。１つの実施形態において、その選択カセットは、Ｆｒｔで挟まれた（Ｆｒｔ’ｅｄ）Ｈｙｇ−ＴＫカセットである。１つの実施形態において、その３’標的化アームは、マウスＣλ２、Ｊλ４、Ｃλ４およびマウスエンハンサー２．４を含む。
【００９３】
１つの態様において、転写の方向に関して５’から３’に向かって、Ｖλ１に対して５’側のマウスλ遺伝子座を標的化するための標的化アーム、リコンビナーゼ認識部位と５’側および３’側で隣接した選択カセット、ならびにマウスＣλ１に対して３’側のマウスλ配列を標的化するための３’標的化アームを含む、単離されたＤＮＡ構築物が提供される。１つの実施形態において、その選択カセットは、ｌｏｘで挟まれた（ｌｏｘｅｄ）ネオマイシンカセットである。１つの実施形態において、その３’標的化アームは、マウスλ３’エンハンサーおよびマウスλ３’エンハンサー３．１を含む。
【００９４】
１つの態様において、転写の方向に関して５’から３’に向かって、Ｖλ２に対して５’側のマウスλ遺伝子座を標的化するための標的化アーム、リコンビナーゼ認識部位と５’側および３’側で隣接した選択カセット、ならびにマウスＪλ２に対して３’側かつマウスＣλ２に対して５’側のマウスλ配列を標的化するための３’標的化アームを含む、単離されたＤＮＡ構築物が提供される。１つの実施形態において、その選択カセットは、Ｆｒｔで挟まれたハイグロマイシン−ＴＫカセットである。１つの実施形態において、その３’標的化アームは、マウスＣλ２−Ｊλ４−Ｃλ４遺伝子セグメントおよびマウスλエンハンサー２．４を含む。
【００９５】
１つの態様において、転写の方向に関して５’から３’に向かって、Ｖλ２に対して５’側のマウスλ遺伝子座を標的化するための標的化アーム、リコンビナーゼ認識部位と５’側および３’側で隣接した選択カセット、ｈＪλ１の末端に対して下流にｈＶλ３−１２由来のヒトλ軽鎖遺伝子座の連続する領域を含むヒトゲノムフラグメント、ならびにマウスＪλ２に対して３’側のマウスλ配列を標的化するための３’標的化アームを含む、単離されたＤＮＡ構築物が提供される。１つの実施形態において、その選択カセットは、Ｆｒｔで挟まれたネオマイシンカセットである。１つの実施形態において、その３’標的化アームは、マウスＣλ２−Ｊλ４−Ｃλ４遺伝子セグメントおよびマウスλエンハンサー２．４を含む。
【００９６】
１つの態様において、ｈＪλ１の末端に対して下流にｈＶλ３−１２由来のヒトλ軽鎖遺伝子座の連続する領域を含む、単離されたＤＮＡ構築物が提供される。
【００９７】
１つの態様において、転写の方向に関して５’から３’に向かって、Ｖλ２に対して５’側のマウスλ遺伝子座を標的化するための標的化アーム、リコンビナーゼ認識部位と５’側および３’側で隣接した選択カセット、ならびにｈＶλ２−８の末端に対して下流のｈＶλ３−２７由来のヒトλ軽鎖遺伝子座の連続した領域を含むヒトゲノムフラグメントを含む、単離されたＤＮＡ構築物が提供される。１つの実施形態において、その選択カセットは、Ｆｒｔで挟まれたハイグロマイシンカセットである。１つの実施形態において、そのヒトゲノムフラグメントは、３’標的化アームを構成する。特定の実施形態において、その３’標的化アームは、ｈＶλ２−８の末端に対して下流にｈＶλ３−１２由来の約５３ｋｂのヒトλ軽鎖遺伝子座を含む。
【００９８】
１つの態様において、ｈＶλ３−１２の末端に対して下流にｈＶλ３−２７由来のヒトλ軽鎖遺伝子座の連続する領域を含む、単離されたＤＮＡ構築物が提供される。
【００９９】
１つの態様において、転写の方向に関して５’から３’に向かって、Ｖλ２に対して５’側のマウスλ遺伝子座を標的化するための標的化アーム、リコンビナーゼ認識部位と５’側および３’側で隣接した選択カセット、ｈＶλ１−４０の末端の下流にｈＶλ５−５２由来のヒトλ軽鎖遺伝子座の連続する領域を含む第１のヒトゲノムフラグメント、制限酵素部位、ならびにｈＶλ８２Ｋの末端に対して下流にｈＶλ３−２９由来のヒトλ軽鎖遺伝子座の連続する領域を含む第２のヒトゲノムフラグメントを含む、単離されたＤＮＡ構築物が提供される。１つの実施形態において、その選択カセットは、Ｆｒｔで挟まれたネオマイシンカセットである。１つの実施形態において、その制限酵素部位は、ホーミングエンドヌクレアーゼ（ｈｏｍｉｎｇ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）のための部位である。特定の実施形態において、そのホーミングエンドヌクレアーゼは、ＰＩ−ＳｃｅＩである。１つの（ｏｎ）実施形態において、上記の第２のヒトゲノムフラグメントは、３’標的化アームである。特定の実施形態において、その３’標的化アームは、ｈＶλ８２Ｋの末端に対して下流にｈＶλ３−２９由来の約２７ｋｂのヒトλ軽鎖遺伝子座を含む。
【０１００】
１つの態様において、ｈＶλ１−４０の末端に対して下流にｈＶλ５−５２由来のヒトλ軽鎖遺伝子座の連続する領域を含む、単離されたＤＮＡ構築物が提供される。
【０１０１】
１つの態様において、転写の方向に関して５’から３’に向かって、内在性Ｖκ遺伝子セグメントに対して５’側のマウスκ遺伝子座を標的化するための標的化アーム、２個の並置されたリコンビナーゼ認識部位、その並置されたリコンビナーゼ認識部位に対して３’側の選択カセット、およびκ軽鎖可変遺伝子セグメントに対して５’側のマウスκ配列を標的化するための３’標的化アームを含む、単離されたＤＮＡ構築物が提供される。１つの実施形態において、その並置されたリコンビナーゼ認識部位は、互いに対して逆の向きである。特定の実施形態において、上記リコンビナーゼ認識部位は、異なる。別の特定の実施形態において、そのリコンビナーゼ認識部位は、ｌｏｘＰ部位およびｌｏｘ５１１部位である。１つの実施形態において、選択カセットは、ネオマイシンカセットである。
【０１０２】
１つの態様において、転写の方向に関して５’から３’に向かって、マウスＪκ遺伝子セグメントに対して５’側のマウスκ遺伝子座を標的化するための標的化アーム、選択カセット、その選択カセットに対して３’側のリコンビナーゼ認識部位、およびマウスＪκ遺伝子セグメントに対して３’側かつマウスκイントロンエンハンサーに対して５’側のマウスκ配列を標的化するための３’標的化アームを含む、単離されたＤＮＡ構築物が提供される。１つの実施形態において、その選択カセットは、ハイグロマイシン−ＴＫカセットである。１つの実施形態において、そのリコンビナーゼ認識部位は、転写に関して選択カセットと同じ向きである。特定の実施形態において、そのリコンビナーゼ認識部位は、ｌｏｘＰ部位である。
【０１０３】
１つの態様において、転写の方向に関して５’から３’に向かって、内在性マウスＶκ遺伝子セグメントの５’側の配列を含む第１のマウスゲノムフラグメント、第１のリコンビナーゼ認識部位、第２のリコンビナーゼ認識部位、および内在性マウスＪκ遺伝子セグメントの３’側かつマウスκイントロンエンハンサーの５’側の配列を含む第２のマウスゲノムフラグメントを含む、単離されたＤＮＡ構築物が提供される。
【０１０４】
１つの態様において、遺伝的に改変されたマウスが提供され、ここで、その遺伝的改変は、上または本明細書中に記載されるＤＮＡ構築物の１つ以上による改変を含む。
【０１０５】
１つの態様において、本明細書中に記載されるようなマウスを作製するための単離されたＤＮＡ構築物の使用が提供される。１つの態様において、抗原結合タンパク質を作製するための方法における本明細書中に記載されるような単離されたＤＮＡ構築物の使用が提供される。
【０１０６】
１つの態様において、上および本明細書中に記載されるようなＤＮＡ構築物を含む標的化ベクターを含む非ヒト幹細胞が提供される。１つの態様において、非ヒト幹細胞が提供され、ここで、その非ヒト幹細胞は、本明細書中に記載されるマウスに由来する。
【０１０７】
１つの実施形態において、上記非ヒト幹細胞は、胚性幹（ＥＳ）細胞である。特定の実施形態において、そのＥＳ細胞は、マウスＥＳ細胞である。
【０１０８】
１つの態様において、本明細書中に記載されるようなマウスを作製するための本明細書中に記載されるような非ヒト幹細胞の使用が提供される。１つの態様において、抗原結合タンパク質を作製するための本明細書中に記載されるような非ヒト幹細胞の使用が提供される。
【０１０９】
１つの態様において、マウス胚が提供され、ここで、そのマウス胚は、本明細書中に提供されるような遺伝的改変を含む。１つの実施形態において、ドナーＥＳ細胞を含む宿主マウス胚が提供され、ここで、そのドナーＥＳ細胞は、本明細書中に記載されるような遺伝的改変を含む。１つの実施形態において、上記マウス胚は、前桑実胚（ｐｒｅ−ｍｏｒｕｌａ）の段階の胚である。特定の実施形態において、その前桑実胚の段階の胚は、４細胞期の胚または８細胞期の胚である。別の特定の実施形態において、上記マウス胚は、胚盤胞である。
【０１１０】
１つの態様において、本明細書中に記載されるようなマウスを作製するための本明細書中に記載されるようなマウス胚の使用が提供される。１つの態様において、抗原結合タンパク質を作製するための本明細書中に記載されるようなマウス胚の使用が提供される。
【０１１１】
１つの態様において、非ヒト細胞が提供され、ここで、その非ヒト細胞は、本明細書中に記載されるような遺伝的に改変されたマウスに由来する再配列された免疫グロブリン軽鎖遺伝子配列を含む。１つの実施形態において、その細胞は、Ｂ細胞である。１つの実施形態において、その細胞は、ハイブリドーマである。１つの実施形態において、その細胞は、体細胞変異した、免疫グロブリン軽鎖可変ドメインおよび／または免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードする。
【０１１２】
１つの態様において、非ヒト細胞が提供され、ここで、その非ヒト細胞は、本明細書中に記載されるような遺伝的に改変されたマウスに由来する再配列された免疫グロブリン軽鎖遺伝子配列を含む。１つの実施形態において、その細胞は、Ｂ細胞である。１つの実施形態において、その細胞は、ハイブリドーマである。１つの実施形態において、その細胞は、体細胞変異した、免疫グロブリン軽鎖可変ドメインおよび／または免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードする。
【０１１３】
１つの態様において、本明細書中に記載されるようなマウスを作製するための本明細書中に記載されるような非ヒト細胞の使用が提供される。１つの態様において、抗原結合タンパク質を作製するための本明細書中に記載されるような非ヒト細胞の使用が提供される。
【０１１４】
１つの態様において、（ａ）ｈＶλ遺伝子セグメントおよびｈＪλ遺伝子セグメントに由来する可変領域；ならびに（ｂ）マウスＣＬ遺伝子を含む免疫グロブリン軽鎖を発現するマウスＢ細胞が提供される。１つの実施形態において、そのマウスＣＬ遺伝子は、ＣκおよびＣλ遺伝子から選択される。特定の実施形態において、そのＣλ遺伝子は、Ｃλ２である。特定の実施形態において、上記マウスＣλ遺伝子は、マウスＣλ２と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９８％同一であるＣλ遺伝子に由来する。１つの実施形態において、上記マウスＢ細胞は、さらに、（ｃ）ｈＶＨ、ｈＤＨに由来する可変領域および（ｄ）ｈＪＨセグメントを含む同族重鎖を発現する。１つの実施形態において、上記Ｂ細胞は、再配列されたλ遺伝子を含まない。別の実施形態において、上記Ｂ細胞は、再配列されたκ遺伝子を含まない。
【０１１５】
１つの態様において、遺伝的に改変されたマウスにおいて抗体を作製するための方法が提供され、その方法は：（ａ）遺伝的に改変されたマウスを抗原に曝露する工程（ここで、そのマウスは、内在性軽鎖遺伝子座に少なくとも１つのｈＶλおよび少なくとも１つのｈＪλを含むゲノムを有し、その内在性軽鎖遺伝子座は、マウスＣＬ遺伝子を含む）；（ｂ）その遺伝的に改変されたマウスにその抗原に対する免疫応答を生じさせる工程；および（ｃ）（ｂ）のマウスから、その抗原を特異的に認識する抗体を単離する工程、または（ｂ）のマウスから、その抗原を特異的に認識する免疫グロブリンドメインを含む細胞を単離する工程（ここで、その抗体は、ｈＶλ、ｈＪλおよびマウスＣＬ遺伝子に由来する軽鎖を含む）を包含する。特定の実施形態において、上記マウスＣＬ遺伝子は、マウスＣκ遺伝子である。
【０１１６】
１つの実施形態において、遺伝的に改変されたマウスにおいて抗体を作製するための方法が提供され、その方法は：（ａ）遺伝的に改変されたマウスを抗原に曝露する工程（ここで、そのマウスは、内在性κ遺伝子座に少なくとも１つのｈＶλを含みかつそのκ遺伝子座に少なくとも１つのｈＪλを含むゲノムを有し、そのκ遺伝子座は、マウスＣκ遺伝子を含む）；（ｂ）その遺伝的に改変されたマウスにその抗原に対する免疫応答を生じさせる工程；および（ｃ）（ｂ）のマウスから、その抗原を特異的に認識する抗体を単離する工程、または（ｂ）のマウスから、その抗原を特異的に認識する免疫グロブリンドメインを含む細胞を単離する工程（ここで、その抗体は、ｈＶλ、ｈＪλおよびマウスＣκ遺伝子に由来する軽鎖を含む）を包含する。
【０１１７】
１つの実施形態において、上記κ軽鎖定常遺伝子は、ヒトＣκ遺伝子およびマウスＣκ遺伝子から選択される。
【０１１８】
１つの実施形態において、遺伝的に改変されたマウスにおいて抗体を作製するための方法が提供され、その方法は：（ａ）遺伝的に改変されたマウスを抗原に曝露する工程（ここで、そのマウスは、λ軽鎖遺伝子座に少なくとも１つのｈＶλを含み、かつそのλ軽鎖遺伝子座に少なくとも１つのＪλを含むゲノムを有し、そのλ軽鎖遺伝子座は、マウスＣλ遺伝子を含む）；（ｂ）その遺伝的に改変されたマウスにその抗原に対する免疫応答を生じさせる工程；および（ｃ）（ｂ）のマウスから、その抗原を特異的に認識する抗体を単離する工程、または（ｂ）のマウスからその抗原を特異的に認識する免疫グロブリンドメインを含む細胞を単離する工程、またはＢのマウスにおいて、その抗原に結合する重鎖および／または軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を特定する工程（ここで、その抗体は、ｈＶλ、ｈＪλおよびマウスＣλ遺伝子に由来する軽鎖を含む）を包含する。
【０１１９】
１つの実施形態において、上記λ軽鎖定常遺伝子は、ヒトＣλ遺伝子およびマウスＣλ遺伝子から選択される。１つの実施形態において、上記λ軽鎖定常遺伝子は、ヒトＣλ遺伝子である。特定の実施形態において、そのヒトＣλ遺伝子は、Ｃλ１、Ｃλ２、Ｃλ３およびＣλ７から選択される。１つの実施形態において、上記λ軽鎖定常遺伝子は、マウスＣλ遺伝子である。特定の実施形態において、そのマウスＣλ遺伝子は、Ｃλ１、Ｃλ２およびＣλ３から選択される。より特定の実施形態において、そのマウスＣλ遺伝子は、Ｃλ２である。別の特定の実施形態において、そのマウスＣλ遺伝子は、マウスＣλ２と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９８％同一であるＣλ遺伝子に由来する。
【０１２０】
１つの態様において、遺伝的に改変されたマウスにおいて再配列された抗体遺伝子を作製するための方法が提供され、その方法は：（ａ）遺伝的に改変されたマウスを抗原に曝露する工程（ここで、その遺伝的改変は、内在性軽鎖遺伝子座にｈＶλおよびｈＪλを含み、その内在性軽鎖遺伝子座は、マウスＣＬ遺伝子またはその機能的なフラグメントを含む）；および（ｂ）前記マウスにおいて再配列された免疫グロブリン遺伝子を特定する工程（ここで、その再配列された免疫グロブリン遺伝子は、λ軽鎖可変領域遺伝子セグメントおよびＣＬ遺伝子またはその機能的なフラグメントを含む）を包含する。
【０１２１】
１つの実施形態において、上記方法はさらに、上記マウスから重鎖および／または軽鎖可変領域をコードする核酸配列をクローニングする工程を包含し、ここで、その重鎖および／または軽鎖可変領域は、ヒトＶλおよびマウスＣＬを含む抗体に由来する。
【０１２２】
１つの実施形態において、上記マウスＣＬ遺伝子またはその機能的なフラグメントは、ヒトＣＬ遺伝子およびマウスＣＬ遺伝子またはそれらの機能的なフラグメントから選択される。
【０１２３】
１つの実施形態において、遺伝的に改変されたマウスにおいて再配列された抗体遺伝子を作製するための方法が提供され、その方法は：（ａ）遺伝的に改変されたマウスを抗原に曝露する工程（ここで、その遺伝的改変は、κ軽鎖遺伝子座にｈＶλおよびｈＪλを含み、そのκ軽鎖遺伝子座は、マウスＣκ遺伝子またはその機能的なフラグメントを含む）；および（ｂ）前記マウスにおいて再配列された免疫グロブリン遺伝子を特定する工程（ここで、その再配列された免疫グロブリン遺伝子は、λ軽鎖可変領域遺伝子セグメントおよびＣκ遺伝子またはその機能的なフラグメントを含む）を包含する。
【０１２４】
１つの実施形態において、上記κ軽鎖定常遺伝子またはその機能的なフラグメントは、ヒトＣκ遺伝子およびマウスＣκ遺伝子またはそれらの機能的なフラグメントから選択される。
【０１２５】
１つの実施形態において、上記方法はさらに、上記マウスから重鎖および／または軽鎖可変領域をコードする核酸配列をクローニングする工程を包含し、ここで、その重鎖および／または軽鎖可変領域は、ヒトＶλおよびマウスＣκを含む抗体に由来する。
【０１２６】
１つの実施形態において、遺伝的に改変されたマウスにおいて再配列された抗体遺伝子を作製するための方法が提供され、その方法は：（ａ）遺伝的に改変されたマウスを抗原に曝露する工程（ここで、その遺伝的改変は、マウスλ軽鎖遺伝子座にｈＶλおよびｈＪλを含み、そのλ軽鎖遺伝子座は、マウスＣλ遺伝子またはその機能的なフラグメントを含む）；および（ｂ）前記マウスにおいて再配列された免疫グロブリン遺伝子を特定する工程（ここで、その再配列された免疫グロブリン遺伝子は、λ軽鎖可変領域遺伝子セグメントおよびＣλ遺伝子またはその機能的なフラグメントを含む）を包含する。
【０１２７】
１つの実施形態において、上記λ軽鎖定常遺伝子またはその機能的なフラグメントは、ヒトＣλ遺伝子およびマウスＣλ遺伝子またはそれらの機能的なフラグメントから選択される。特定の実施形態において、上記λ軽鎖定常遺伝子は、マウスＣλ遺伝子またはその機能的なフラグメントである。
【０１２８】
１つの実施形態において、上記方法は、重鎖および／または軽鎖可変領域をコードする核酸配列を上記マウスからクローニングする工程をさらに包含し、ここで、その重鎖および／または軽鎖可変領域は、ヒトＶλおよびマウスＣλを含む抗体に由来する。
【０１２９】
１つの態様において、抗体を作製するための方法が提供され、その方法は、本明細書中に記載されるようなマウスを抗原に曝露する工程、そのマウスに、その抗原に特異的に結合する抗体の産生を含む免疫応答を開始させる工程、そのマウス内の重鎖をコードする再配列された核酸配列およびそのマウス内の抗体の同族軽鎖可変ドメイン配列をコードする再配列された核酸配列を特定する工程（ここで、その抗体は、その抗原に特異的に結合する）、ならびにヒト定常ドメインに融合された重鎖および軽鎖可変ドメインの核酸配列を使用して、所望の抗体を作製する工程（ここで、その所望の抗体は、ＣＬドメインに融合されたＶλドメインを含む軽鎖を含む）を包含する。１つの実施形態において、そのＶλドメインは、ヒトのドメインであり、ＣＬドメインは、ヒトまたはマウスのＣλドメインである。１つの実施形態において、そのＶλドメインは、マウスのドメインであり、ＣＬドメインは、ヒトまたはマウスのＣκドメインである。
【０１３０】
１つの実施形態において、抗体を作製するための方法が提供され、その方法は、本明細書中に記載されるようなマウスを抗原に曝露する工程、そのマウスに、その抗原に特異的に結合する抗体の産生を含む免疫応答を開始させる工程、そのマウス内の重鎖をコードする再配列された核酸配列およびそのマウス内の抗体の同族軽鎖可変ドメイン配列をコードする再配列された核酸配列を特定する工程（ここで、その抗体は、その抗原に特異的に結合する）、ならびにヒト定常ドメインの核酸配列に融合された重鎖および軽鎖可変ドメインの核酸配列を使用して、所望の抗体を作製する工程（ここで、その所望の抗体は、Ｃκドメインに融合されたＶλドメインを含む軽鎖を含む）を包含する。
【０１３１】
１つの実施形態において、抗体を作製するための方法が提供され、その方法は、本明細書中に記載されるようなマウスを抗原に曝露する工程、そのマウスに、その抗原に特異的に結合する抗体の産生を含む免疫応答を開始させる工程、そのマウス内の重鎖可変ドメインをコードする再配列された核酸配列および抗体の同族軽鎖可変ドメイン配列をコードする再配列された核酸配列を特定する工程（ここで、その抗体は、その抗原に特異的に結合する）、ならびにヒト重鎖定常ドメインおよびヒト軽鎖定常ドメインをコードする核酸配列に融合された核酸配列を使用して、ヒト配列に由来する抗体を作製する工程（ここで、その抗原に特異的に結合する抗体は、マウスＣλ領域に融合されたヒトＶλドメインを含む軽鎖を含む）を包含する。
【０１３２】
１つの実施形態において、上記マウスＣλ領域は、Ｃλ１、Ｃλ２およびＣλ３から選択される。特定の実施形態において、上記マウスＣλ領域は、Ｃλ２である。
【０１３３】
１つの態様において、再配列された抗体軽鎖可変領域遺伝子配列を作製するための方法が提供され、その方法は、（ａ）本明細書中に記載されるようなマウスを抗原に曝露する工程；（ｂ）そのマウスに免疫応答を開始させる工程；（ｃ）マウスＣＬドメインと融合された再配列されたヒトＶλドメイン配列をコードする核酸配列を含む細胞をそのマウスにおいて特定する工程（ここで、その細胞は、ヒトＶＨドメインおよびマウスＣＨドメインを含む同族重鎖もコードし、その細胞は、その抗原に結合する抗体を発現する）；（ｄ）その細胞からヒトＶλドメインをコードする核酸配列および同族ヒトＶＨドメインをコードする核酸配列をクローニングする工程；および（ｅ）ヒトＶλドメインをコードするクローニングされた核酸配列および同族ヒトＶＨドメインをコードするクローニングされた核酸配列を使用して、完全ヒト抗体を作製する工程を包含する。
【０１３４】
１つの実施形態において、再配列された抗体軽鎖可変領域遺伝子配列を作製するための方法が提供され、その方法は、（ａ）本開示に記載されるようなマウスを抗原に曝露する工程；（ｂ）そのマウスに免疫応答を開始させる工程；（ｃ）マウスＣκドメインをコードする核酸配列と、同じ核酸分子上で連続する再配列されたヒトＶλドメイン配列をコードする核酸配列を含む細胞をそのマウスにおいて特定する工程（ここで、その細胞は、ヒトＶＨドメインおよびマウスＣＨドメインを含む同族重鎖もコードし、その細胞は、その抗原に結合する抗体を発現する）；（ｄ）その細胞からヒトＶλドメインをコードする核酸配列および同族ヒトＶＨドメインをコードする核酸配列をクローニングする工程；および（ｅ）ヒトＶλドメインをコードするクローニングされた核酸配列および同族ヒトＶＨドメインをコードするクローニングされた核酸配列を使用して、完全ヒト抗体を作製する工程を包含する。
【０１３５】
１つの実施形態において、再配列された抗体軽鎖可変領域遺伝子配列を作製するための方法が提供され、その方法は、（ａ）本明細書中に記載されるようなマウスを抗原に曝露する工程；（ｂ）そのマウスにその抗原に対する免疫応答を開始させる工程；（ｃ）マウスＣλドメインと融合された再配列されたヒトＶλドメイン配列をコードするＤＮＡを含む細胞をそのマウスにおいて特定する工程（ここで、その細胞は、ヒトＶＨドメインおよびマウスＣＨドメインを含む同族重鎖もコードし、その細胞は、その抗原に結合する抗体を発現する）；（ｄ）その細胞から、再配列されたヒトＶλドメインをコードする核酸配列および同族ヒトＶＨドメインをコードする核酸配列をクローニングする工程；および（ｅ）ヒトＶλドメインをコードするクローニングされた核酸配列および同族ヒトＶＨドメインをコードするクローニングされた核酸配列を使用して、完全ヒト抗体を作製する工程を包含する。１つの実施形態において、上記マウスＣλドメインは、マウスＣλ２である。特定の実施形態において、上記マウスＣλドメインは、マウスＣλ２と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９８％同一であるＣλ遺伝子に由来する。
【０１３６】
１つの態様において、内在性軽鎖定常領域（ＣＬ）に融合されたヒトλ由来の軽鎖を発現する遺伝的に改変されたマウスが提供され、ここで、そのマウスは、抗原で免疫されると、マウスＣＬドメインに融合されたヒトＶλドメインを含む抗体を産生する。１つの実施形態において、そのマウスＣＬドメインは、ＣκドメインおよびＣλドメインから選択される。１つの実施形態において、そのマウスＣＬドメインは、Ｃκドメインである。１つの実施形態において、そのマウスＣＬドメインは、Ｃλドメインである。特定の実施形態において、そのＣλドメインは、Ｃλ２である。特定の実施形態において、そのマウスＣλドメインは、マウスＣλ２と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９８％同一であるＣλ遺伝子に由来する。
【０１３７】
１つの態様において、複数の免疫グロブリン重鎖と会合される複数の免疫グロブリンλ軽鎖を発現する、本明細書中に記載されるような改変された内在性κまたはλ軽鎖遺伝子座を含む遺伝的に改変されたマウスが提供される。１つの実施形態において、その重鎖は、ヒト配列を含む。様々な実施形態において、そのヒト配列は、可変配列、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３およびそれらの組み合わせから選択される。１つの実施形態において、複数の免疫グロブリンλ軽鎖は、ヒト配列を含む。様々な実施形態において、そのヒト配列は、可変配列、定常配列およびそれらの組み合わせから選択される。１つの実施形態において、上記マウスは、無能力にされた（ｄｉｓａｂｌｅｄ）内在性免疫グロブリン遺伝子座を含み、導入遺伝子または染色体外エピソームから重鎖および／またはλ軽鎖を発現する。１つの実施形態において、上記マウスは、一部もしくは全部の内在性マウス重鎖遺伝子セグメント（すなわち、Ｖ、Ｄ、Ｊ）、および／または一部もしくは全部の内在性マウス重鎖定常配列（例えば、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３またはそれらの組み合わせ）および／または一部もしくは全部の内在性マウス軽鎖配列（例えば、Ｖ、Ｊ、定常またはそれらの組み合わせ）の内在性マウス遺伝子座に、１つ以上のヒト免疫グロブリン配列による置換を含む。
【０１３８】
１つの態様において、ヒトλ由来の軽鎖を有する抗体の作製に適したマウスが提供され、ここで、そのマウスにおいて産生されるすべてまたは実質的にすべての抗体は、ヒトλ由来の軽鎖とともに発現される。１つの実施形態において、そのヒトλ由来の軽鎖は、内在性軽鎖遺伝子座から発現される。１つの実施形態において、その内在性軽鎖遺伝子座は、κ軽鎖遺伝子座である。特定の実施形態において、そのκ軽鎖遺伝子座は、マウスκ軽鎖遺伝子座である。
【０１３９】
１つの態様において、ヒト抗体用のλ由来軽鎖を作製するための方法が提供され、その方法は、本明細書中に記載されるようなマウスから軽鎖配列および重鎖配列を得る工程、ならびにヒト抗体を作製する際にその軽鎖配列および重鎖配列を使用する工程を包含する。
【０１４０】
１つの態様において、抗原結合タンパク質を作製するための方法が提供され、その方法は、本明細書中に記載されるようなマウスを抗原に曝露する工程；そのマウスに免疫応答を開始させる工程；およびその抗原に結合する抗原結合タンパク質をそのマウスから得る工程、またはその抗原に結合する抗原結合タンパク質を作製する際に使用される配列をそのマウスから得る工程を包含する。
【０１４１】
１つの態様において、本明細書中に記載されるようなマウスに由来する細胞が提供される。１つの実施形態において、その細胞は、胚性幹細胞、多能性細胞、誘導多能性細胞、Ｂ細胞およびハイブリドーマから選択される。
【０１４２】
１つの態様において、本明細書中に記載されるような遺伝的改変を含む細胞が提供される。１つの実施形態において、その細胞は、マウス細胞である。１つの実施形態において、その細胞は、ハイブリドーマおよびクアドローマから選択される。１つの実施形態において、その細胞は、マウス定常配列と融合されたヒトλ可変配列を含む免疫グロブリン軽鎖を発現する。特定の実施形態において、そのマウス定常配列は、マウスκ定常配列である。
【０１４３】
１つの態様において、本明細書中に記載されるようなマウスに由来する組織が提供される。
【０１４４】
１つの態様において、抗原結合タンパク質を作製するための本明細書中に記載されるようなマウスまたは細胞の使用が提供される。１つの実施形態において、その抗原結合タンパク質は、ヒトタンパク質である。１つの実施形態において、そのヒトタンパク質は、ヒト抗体である。
【０１４５】
１つの態様において、本明細書中に記載されるようなマウス、細胞、組織または方法によって作製される抗原結合タンパク質が提供される。１つの実施形態において、その抗原結合タンパク質は、ヒトタンパク質である。１つの実施形態において、そのヒトタンパク質は、ヒト抗体である。
【０１４６】
別段示されないかまたは文脈から明らかでない限り、本明細書中に記載されるいずれの実施形態および態様も、互いと組み合わせて使用することができる。他の実施形態は、下記の説明を検討することによって当業者に明らかになるだろう。
例えば、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目Ａ１）
生殖細胞系列において、内在性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座にヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域の核酸配列を含むマウスであって、ここで、該ヒト免疫グロブリンλ可変領域の核酸配列は、マウス免疫グロブリン定常領域の核酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖において発現される、マウス。
（項目Ａ２）
上記内在性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座が、免疫グロブリンλ遺伝子座である、項目Ａ１に記載のマウス。
（項目Ａ３）
上記内在性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座が、免疫グロブリンκ遺伝子座である、項目Ａ１に記載のマウス。
（項目Ａ４）
上記マウスが、上記内在性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座において内在性免疫グロブリン軽鎖可変配列を欠く、項目Ａ１に記載のマウス。
（項目Ａ５）
すべてまたは実質的にすべての内在性免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントが、１つ以上のヒト免疫グロブリンλ可変領域遺伝子セグメントで置換されている、項目Ａ１に記載のマウス。
（項目Ａ６）
上記ヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域配列が、ヒトＪλ配列を含む、項目Ａ１に記載のマウス。
（項目Ａ７）
上記ヒトＪλ配列が、Ｊλ１、Ｊλ２、Ｊλ３、Ｊλ７およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、項目Ａ６に記載のマウス。
（項目Ａ８）
上記ヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域配列が、ヒト免疫グロブリン軽鎖遺伝子座のクラスターＡのフラグメントを含む、項目Ａ１に記載のマウス。
（項目Ａ９）
上記ヒト免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子座のクラスターＡのフラグメントが、ｈＶλ３−２７からｈＶλ３−１にわたる、項目Ａ８に記載のマウス。
（項目Ａ１０）
上記ヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域配列が、ヒト免疫グロブリン軽鎖遺伝子座のクラスターＢのフラグメントを含む、項目Ａ１に記載のマウス。
（項目Ａ１１）
上記ヒト免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子座のクラスターＢのフラグメントが、ｈＶλ５−５２からｈＶλ１−４０にわたる、項目Ａ１０に記載のマウス。
（項目Ａ１２）
上記ヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域配列が、ヒト免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子座のクラスターＡのゲノムフラグメントおよびクラスターＢのゲノムフラグメントを含む、項目Ａ１に記載のマウス。
（項目Ａ１３）
上記ヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域配列が、ヒト免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子座のクラスターＡの少なくとも１つの遺伝子セグメントおよびクラスターＢの少なくとも１つの遺伝子セグメントを含む、項目Ａ１２に記載のマウス。
（項目Ａ１４）
上記マウスの免疫グロブリン軽鎖レパートリーの１０％超が、２−８、２−２３、１−４０、５−４５および９−４９から選択される少なくとも２つのｈＶλ遺伝子セグメントに由来する、項目Ａ１に記載のマウス。
（項目Ａ１５）
上記マウスの免疫グロブリン軽鎖レパートリーの２０％超が、２−８、２−２３、１−４０、５−４５および９−４９から選択される少なくとも３つのｈＶλ遺伝子セグメントに由来する、項目Ａ１４に記載のマウス。
（項目Ａ１６）
上記マウスの免疫グロブリン軽鎖レパートリーの３０％超が、２−８、２−２３、１−４０、５−４５および９−４９から選択される少なくとも４つのｈＶλ遺伝子セグメントに由来する、項目Ａ１５に記載のマウス。
（項目Ａ１７）
マウス定常領域と融合されたヒトラムダ可変配列を含む免疫グロブリン軽鎖を発現するマウスであって、ここで、該マウスは、約１：１というκの使用頻度とλの使用頻度との比を示す、マウス。
（項目Ａ１８）
上記免疫グロブリン軽鎖が、内在性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座から発現される、項目Ａ１７に記載のマウス。
（項目Ａ１９）
抗原結合タンパク質を作製するための、前述の項目のいずれか１項に記載されたマウスの使用。
（項目Ａ２０）
上記抗原結合タンパク質がヒトの抗原結合タンパク質である、項目Ａ１９に記載の使用。
（項目Ａ２１）
項目Ａ１〜１８のいずれか１項に記載のマウスに由来する、細胞または組織であって、該細胞は、内在性免疫グロブリン軽鎖定常領域の核酸配列と連続する、ヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域の核酸配列を含む、細胞または組織。
（項目Ａ２２）
目的の抗原に結合する、体細胞変異した抗体を作製するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）項目Ａ１〜１８のいずれか１項に記載のマウスを、目的の抗原に曝露する工程；
（ｂ）（ａ）のマウスの１以上のＢリンパ球を取得する工程であって、該１以上のＢリンパ球は、該目的の抗原に結合する抗体を産生する、工程；ならびに
（ｃ）（ｂ）の抗体の免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸配列を特定する工程であって、該免疫グロブリン軽鎖は、ヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変ドメインおよびマウス免疫グロブリン軽鎖定常ドメインを含む、工程；ならびに
（ｄ）ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域の核酸配列と、（ｃ）の核酸配列を使用して、該目的の抗原に結合するヒト抗体を作製する工程
を包含する、方法。
【図面の簡単な説明】
【０１４７】
【図１】図１は、Ｖλ遺伝子セグメントのクラスター（Ａ、ＢおよびＣ）およびＪλとＣλとの領域対（Ｊ−Ｃ対）を含むヒトλ軽鎖遺伝子座の一定の拡大比ではない詳細な説明図を示している。
【図２】図２は、内在性マウスλ軽鎖遺伝子座を不活性化するために使用された標的化ストラテジーの一定の拡大比ではない全体的な説明図を示している。
【図３】図３は、内在性マウスκ軽鎖遺伝子座を不活性化するために使用された標的化ストラテジーの一定の拡大比ではない全体的な説明図を示している。
【図４Ａ】図４Ａは、１２個のｈＶλ遺伝子セグメントおよびｈＪλ１遺伝子セグメントを含むヒトλ軽鎖配列を用いて内在性マウスλ軽鎖遺伝子座を標的化するための最初の標的化ベクター（１２／１−λ標的化ベクター）の一定の拡大比ではない全体的な説明図を示している。
【図４Ｂ】図４Ｂは、１２個のｈＶλ遺伝子セグメントおよびｈＪλ１遺伝子セグメント（１２／１−κ標的化ベクター）、１２個のｈＶλ遺伝子セグメントならびにｈＪλ１、２、３および７遺伝子セグメント（１２／４−κ標的化ベクター）、１２個のｈＶλ遺伝子セグメント、ヒトＶκ−Ｊκゲノム配列およびｈＪλ１遺伝子セグメント（１２（κ）１−κ標的化ベクター）、ならびに１２個のｈＶλ遺伝子セグメント、ヒトＶκ−Ｊκゲノム配列ならびにｈＪλ１、２、３および７遺伝子セグメント（１２（κ）４−κ標的化ベクター）を含むヒトλ軽鎖配列を用いて内在性マウスκ軽鎖遺伝子座を標的化するための４個の最初の標的化ベクターの一定の拡大比ではない全体的な説明図を示している。
【図５Ａ】図５Ａは、４０個のｈＶλ遺伝子セグメントおよび単一のｈＪλ遺伝子セグメントをマウスλ軽鎖遺伝子座に漸進的に挿入するための標的化ストラテジーの一定の拡大比ではない全体的な説明図を示している。
【図５Ｂ】図５Ｂは、４０個のｈＶλ遺伝子セグメントおよび単一のｈＪλ遺伝子セグメントをマウスκ遺伝子座に漸進的に挿入するための標的化ストラテジーの一定の拡大比ではない全体的な説明図を示している。
【図６】図６は、ヒトκ遺伝子間配列、複数のｈＪλ遺伝子セグメントまたはその両方を含むハイブリッド軽鎖遺伝子座を構築するための独特のヒトλ−κハイブリッド標的化ベクターを作製するために使用された標的化工程および分子操作工程の一定の拡大比ではない全体的な説明図を示している。
【図７Ａ】図７Ａは、内在性Ｃλ２遺伝子に作動可能に接続された４０個のｈＶλ遺伝子セグメントおよび単一のｈＪλ遺伝子セグメントを含む改変されたマウスλ軽鎖遺伝子座についての遺伝子座の構造の一定の拡大比ではない全体的な説明図を示している。
【図７Ｂ】図７Ｂは、内在性Ｃκ遺伝子に作動可能に接続された連続するヒトＶκ−Ｊκゲノム配列ありまたはなしで、４０個のｈＶλ遺伝子セグメントおよび１個または４個のｈＪλ遺伝子セグメントを含む４個の独立した改変されたマウスκ軽鎖遺伝子座についての遺伝子座の構造の一定の拡大比ではない全般的な説明を示している。
【図８Ａ】図８Ａは、野生型マウス（ＷＴ）、ヒトＶκ−Ｊκゲノム配列を含む１２個のｈＶλ遺伝子セグメントおよび４個のｈＪλ遺伝子セグメントについてホモ接合のマウス（１２ｈＶλ−ＶκＪκ−４ｈＪλ）ならびに４０個のｈＶλ遺伝子セグメントおよび１個のｈＪλ遺伝子セグメントについてホモ接合のマウス（４０ｈＶλ−１ｈＪλ）由来の、ＣＤ１９＋に対してゲーティングされたＩｇλ＋およびＩｇκ＋脾細胞のコンタープロット（ｃｏｎｔｏｕｒ  ｐｌｏｔ）を示している。
【図８Ｂ】図８Ｂは、野生型（ＷＴ）、ヒトＶκ−Ｊκゲノム配列を含む１２個のｈＶλ遺伝子セグメントおよび４個のｈＪλ遺伝子セグメントについてホモ接合のマウス（１２ｈＶλ−ＶκＪκ−４ｈＪλ）ならびに４０個のｈＶλ遺伝子セグメントおよび１個のｈＪλ遺伝子セグメントについてホモ接合のマウス（４０ｈＶλ−１ｈＪλ）から回収された脾臓におけるＣＤ１９＋Ｂ細胞の総数を示している。
【図９Ａ】図９Ａの上のパネルは、野生型マウス（ＷＴ）ならびにヒトＶκ−Ｊκゲノム配列を含む４０個のｈＶλおよび４個のＪλ遺伝子セグメントについてホモ接合のマウス（４０ｈＶλ−ＶκＪκ−４ｈＪλ）由来の、シングレット（ｓｉｎｇｌｅｔ）に対してゲーティングされ、かつＢおよびＴ細胞（それぞれＣＤ１９＋およびＣＤ３＋）について染色された脾細胞のコンタープロットを示している。下のパネルは、野生型マウス（ＷＴ）ならびにヒトＶκ−Ｊκゲノム配列を含む４０個のｈＶλおよび４個のＪλ遺伝子セグメントについてホモ接合のマウス（４０ｈＶλ−ＶκＪκ−４ｈＪλ）由来の、ＣＤ１９＋に対してゲーティングされ、かつＩｇλ＋およびＩｇκ＋発現について染色された、脾細胞のコンタープロットを示している。
【図９Ｂ】図９Ｂは、野生型マウス（ＷＴ）ならびにヒトＶκ−Ｊκゲノム配列を含む４０個のｈＶλおよび４個のＪλ遺伝子セグメントについてホモ接合のマウス（４０ｈＶλ−ＶκＪκ−４ｈＪλ）から回収された脾臓におけるＣＤ１９＋、ＣＤ１９＋Ｉｇκ＋およびＣＤ１９＋Ｉｇλ＋Ｂ細胞の総数を示している。
【図９Ｃ】図９Ｃは、野生型マウス（ＷＴ）ならびにヒトＶκ−Ｊκゲノム配列を含む４０個のｈＶλおよび４個のＪλ遺伝子セグメントについてホモ接合のマウス（４０ｈＶλ−ＶκＪκ−４ｈＪλ）由来の、ＣＤ１９＋に対してゲーティングされ、かつ免疫グロブリンＤ（ＩｇＤ）および免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）について染色された、脾細胞のコンタープロットを示している。コンタープロットの各々において、成熟Ｂ細胞（ＷＴについては７２、４０ｈＶλ−ＶκＪκ−４ｈＪλについては５１）および移行Ｂ細胞（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎａｌ  Ｂ  ｃｅｌｌ）（ＷＴについては１３、４０ｈＶλ−ＶκＪκ−４ｈＪλについては２２）が表示されている。
【図９Ｄ】図９Ｄは、野生型マウス（ＷＴ）ならびにヒトＶκ−Ｊκゲノム配列を含む４０個のｈＶλおよび４個のＪλ遺伝子セグメントについてホモ接合のマウス（４０ｈＶλ−ＶκＪκ−４ｈＪλ）から回収された脾臓におけるＣＤ１９＋Ｂ細胞、移行Ｂ細胞（ＣＤ１９＋ＩｇＭｈｉＩｇＤｌｏ）および成熟Ｂ細胞（ＣＤ１９＋ＩｇＭｌｏＩｇＤｈｉ）の総数を示している。
【図１０Ａ】図１０Ａの上のパネルは、野生型マウス（ＷＴ）ならびにヒトＶκ−Ｊκゲノム配列を含む４０個のｈＶλおよび４個のＪλ遺伝子セグメントについてホモ接合のマウス（４０ｈＶλ−ＶκＪκ−４ｈＪλ）由来の、ＢおよびＴ細胞（それぞれＣＤ１９＋およびＣＤ３＋）について染色された骨髄のコンタープロットを示している。下のパネルは、野生型マウス（ＷＴ）ならびにヒトＶκ−Ｊκゲノム配列を含む４０個のｈＶλおよび４個のＪλ遺伝子セグメントについてホモ接合のマウス（４０ｈＶλ−ＶκＪκ−４ｈＪλ）由来の、ＣＤ１９＋に対してゲーティングされ、かつｃｋｉｔ＋およびＣＤ４３＋について染色された、骨髄のコンタープロットを示している。下のパネルのコンタープロットでは、プロＢ細胞（ｐｒｏ  Ｂ  ｃｅｌｌ）およびプレＢ細胞（ｐｒｅ  Ｂ  ｃｅｌｌ）が表示されている。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、野生型マウス（ＷＴ）ならびにヒトＶκ−Ｊκゲノム配列を含む４０個のｈＶλおよび４個のＪλ遺伝子セグメントについてホモ接合のマウス（４０ｈＶλ−ＶκＪκ−４ｈＪλ）の大腿骨から回収された骨髄中のプロＢ細胞（ＣＤ１９＋ＣＤ４３＋ｃｋｉｔ＋）およびプレＢ細胞（ＣＤ１９＋ＣＤ４３−ｃｋｉｔ−）の数を示している。
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、野生型マウス（ＷＴ）ならびにヒトＶκ−Ｊκゲノム配列を含む４０個のｈＶλおよび４個のＪλ遺伝子セグメントについてホモ接合のマウス（４０ｈＶλ−ＶκＪκ−４ｈＪλ）由来の、免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）およびＢ２２０について染色されたシングレットに対してゲーティングされた骨髄のコンタープロットを示している。コンタープロットの各々において、未熟、成熟およびプロ／プレＢ細胞が表示されている。
【図１０Ｄ】図１０Ｄは、野生型マウス（ＷＴ）ならびにヒトＶκ−Ｊκゲノム配列を含む４０個のｈＶλおよび４個のＪλ遺伝子セグメントについてホモ接合のマウス（４０ｈＶλ−ＶκＪκ−４ｈＪλ）の大腿骨から単離された骨髄中の未熟Ｂ細胞（Ｂ２２０ｉｎｔＩｇＭ＋）および成熟Ｂ細胞（Ｂ２２０ｈｉＩｇＭ＋）の総数を示している。
【図１０Ｅ】図１０Ｅは、野生型マウス（ＷＴ）ならびにヒトＶκ−Ｊκゲノム配列を含む４０個のｈＶλおよび４個のＪλ遺伝子セグメントについてホモ接合のマウス（４０ｈＶλ−ＶκＪκ−４ｈＪλ）の大腿骨から単離された、ＩｇλおよびＩｇκ発現について染色された未熟Ｂ細胞（Ｂ２２０ｉｎｔＩｇＭ＋）および成熟Ｂ細胞（Ｂ２２０ｈｉＩｇＭ＋）に対してゲーティングされた骨髄のコンタープロットを示している。
【図１１】図１１は、内在性マウスκ軽鎖遺伝子座にヒトλ軽鎖遺伝子配列を有するマウスの脾細胞ＲＮＡから増幅された１８個の独立したＲＴ−ＰＣＲクローンのＶλ−Ｊλ−Ｃκジャンクションのヌクレオチド配列アラインメントを示している。Ａ６＝配列番号５７；Ｂ６＝配列番号５８；Ｆ６＝配列番号５９；Ｂ７＝配列番号６０；Ｅ７＝配列番号６１；Ｆ７＝配列番号６２；Ｃ８＝配列番号６３；Ｅ１２＝配列番号６４；１−４＝配列番号６５；１−２０＝配列番号６６；３Ｂ４３＝配列番号６７；５−８＝配列番号６８；５−１９＝配列番号６９；１０１０＝配列番号７０；１１Ａ１＝配列番号７１；７Ａ８＝配列番号７２；３Ａ３＝配列番号７３；２−７＝配列番号７４。小文字の塩基は、組換え中の変異および／またはＮ付加に起因する非生殖細胞系列の塩基を示している。ｈＪλ１およびマウスＣκのヌクレオチド配列によってコードされるフレームワーク４領域（ＦＷＲ４）内のコンセンサスアミノ酸が、配列アラインメントの下に表示されている。
【図１２】図１２は、内在性マウスκ軽鎖遺伝子座に、連続するヒトＶκ−Ｊκゲノム配列を含むヒトλ軽鎖遺伝子配列を有するマウスの脾細胞ＲＮＡから増幅された１２個の独立したＲＴ−ＰＣＲクローンのＶλ−Ｊλ−Ｃκジャンクションのヌクレオチド配列アラインメントを示している。５−２＝配列番号８７；２−５＝配列番号８８；１−３＝配列番号８９；４Ｂ−１＝配列番号９０；３Ｂ−５＝配列番号９１；７Ａ−１＝配列番号９２；５−１＝配列番号９３；４Ａ−１＝配列番号９４；１１Ａ−１＝配列番号９５；５−７＝配列番号９６；５−４＝配列番号９７；２−３＝配列番号９８。小文字の塩基は、組換え中の変異および／またはＮ付加に起因する非生殖細胞系列の塩基を示している。ヒトＪλおよびマウスＣκの各々のヌクレオチド配列によってコードされるフレームワーク４領域（ＦＷＲ４）内のコンセンサスアミノ酸が、配列アラインメントの下に表示されている。
【図１３】図１３は、内在性マウスλ軽鎖遺伝子座にヒトλ軽鎖遺伝子配列を有するマウスの脾細胞ＲＮＡから増幅された３個の独立したＲＴ−ＰＣＲクローンのＶλ−Ｊλ−Ｃλジャンクションのヌクレオチド配列アラインメントを示している。２Ｄ１＝配列番号１０１；２Ｄ９＝配列番号１０２；３Ｅ１５＝配列番号１０３。小文字の塩基は、組換え中の変異および／またはＮ付加に起因する非生殖細胞系列の塩基を示している。ｈＪλ１およびマウスＣλ２のヌクレオチド配列によってコードされるフレームワーク４領域（ＦＷＲ４）内のコンセンサスアミノ酸が、配列アラインメントの下に表示されている。
【発明を実施するための形態】
【０１４８】
詳細な説明
様々な実施形態の具体的な特徴が、詳細に明らかにされるが、その具体的な態様、実施形態および実施例の記載は、請求項の対象を限定せず；請求項は、本発明の範囲を記載するものである。本開示において使用されるすべての用語および語句は、当該分野において通常それらに与えられている意味を包含する。
【０１４９】
用語「連続する」は、同じ核酸分子上に存在することに対する言及を包含し、例えば、２つの核酸配列が、同じ核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ）分子上に存在するが別の核酸配列によって中断されている場合、それらは「連続している」。例えば、再配列されたＶ（Ｄ）Ｊ配列の最後のコドンは、定常領域配列の最初のコドンに直接続いていないが、そのＶ（Ｄ）Ｊ配列は、定常領域遺伝子配列と「連続している」。別の例では、２個のＶ遺伝子セグメント配列が、同じゲノムフラグメント上に存在する場合、それらは「連続している」が、それらは、Ｖ領域のコドンをコードしない配列によって分断されていることがあり、例えば、それらは、制御配列、例えば、プロモーターまたは他の非コード配列によって分断されていることがある。１つの実施形態において、連続する配列は、野生型ゲノムに見られるように配置されたゲノム配列を含むゲノムフラグメントを含む。
【０１５０】
語句「〜に由来する」は、言及されている遺伝子または遺伝子セグメント「に由来する」可変領域に関して使用されるとき、特定の再配列されていない遺伝子セグメントまたはその可変ドメインを発現する遺伝子を形成するように再配列された遺伝子セグメントまでその配列をさかのぼることができること（適用可能な場合、スプライシングの差異（ｓｐｌｉｃｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ）および体細胞変異を説明する）を含む。
【０１５１】
語句「機能的」は、可変領域遺伝子セグメントまたは連結遺伝子セグメントに関して使用されるとき、発現される抗体レパートリーの使用のことを指す；例えば、ヒトでは、Ｖλ遺伝子セグメント３−１、４−３、２−８などが機能的である一方、Ｖλ遺伝子セグメント３−２、３−４、２−５などは、非機能的である。
【０１５２】
「重鎖遺伝子座」は、野生型マウスにおいて重鎖可変（ＶＨ）、重鎖多様性（ＤＨ）、重鎖連結（ＪＨ）および重鎖定常（ＣＨ）領域のＤＮＡ配列が見られる、染色体上の位置、例えば、マウス染色体上の位置を含む。
【０１５３】
「κ遺伝子座」は、野生型マウスにおいてκ可変（Ｖκ）、κ連結（Ｊκ）およびκ定常（Ｃκ）領域のＤＮＡ配列が見られる、染色体上の位置、例えば、マウス染色体上の位置を含む。
【０１５４】
「λ遺伝子座」は、野生型マウスにおいてλ可変（Ｖλ）、λ連結（Ｊλ）およびλ定常（Ｃλ）領域のＤＮＡ配列が見られる、染色体上の位置、例えば、マウス染色体上の位置を含む。
【０１５５】
用語「再配列されていない」は、Ｖ遺伝子セグメントおよびＪ遺伝子セグメント（重鎖の場合、Ｄ遺伝子セグメントも同様）が、別々に維持されているが、Ｖ（Ｄ）Ｊレパートリーのうちの単一のＶ，（Ｄ），Ｊを含む再配列されたＶ（Ｄ）Ｊ遺伝子を形成するように連結されることが可能である、免疫グロブリン遺伝子座の状態を含む。
【０１５６】
ヒトλ可変ドメインを発現するマウス
完全にヒトのものである抗体または部分的にヒトのものでありかつ部分的にマウスのものである抗体を発現するマウスが以前に報告されている。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）遺伝子操作マウスは、内在性マウス遺伝子座に、ヒトＶ（Ｄ）Ｊ遺伝子セグメントによる再配列されていないＶ（Ｄ）Ｊ遺伝子セグメントの置換を含む。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスは、ヒト可変ドメインおよびマウス定常ドメインを有するキメラ抗体を発現する（例えば、米国特許第７，６０５，２３７号を参照のこと）。他のほとんどの報告は、無能力にされた内在性免疫グロブリン遺伝子座を有するマウスにおいて、完全ヒト導入遺伝子から完全ヒト抗体を発現するマウスに関する。
【０１５７】
抗体軽鎖は、２個の別個の遺伝子座：カッパー（κ）およびラムダ（λ）のうちの１つによってコードされる。マウス抗体軽鎖は、主にκタイプである。マウス抗体を産生するマウス、および完全ヒト抗体またはキメラヒト−マウス抗体を産生する改変されたマウスは、軽鎖の使用頻度に偏りを示す。ヒトもまた、軽鎖の偏りを示すが、マウスほど顕著でない；マウスにおけるκ軽鎖とλ軽鎖との比は、約９５：５である一方で、ヒトのその比は、約６０：４０である。マウスではまず第一にλ可変遺伝子座がそれほど多様でないので、マウスにおけるより顕著な偏りは、抗体の多様性に深刻な影響を及ぼさないと考えられている。このことは、ヒトではそうではない。ヒトλ軽鎖遺伝子座は、非常に多様である。
【０１５８】
ヒトλ軽鎖遺伝子座は、１，０００ｋｂに及び、可変（Ｖ）または連結（Ｊ）セグメントをコードする８０を超える遺伝子を含む（図１）。ヒトλ軽鎖遺伝子座のうち、観察されるすべてのＶλドメインの過半数が、遺伝子セグメント１−４０、１−４４、２−８、２−１４および３−２１によってコードされる。全体的に見て、約３０程度のヒトＶλ遺伝子セグメントが、機能的であると考えられている。Ｊλ遺伝子セグメントは７つ存在し、そのうち４つ（Ｊλ１、Ｊλ２、Ｊλ３およびＪλ７）だけが、一般的に機能的なＪλ遺伝子セグメントとされている。
【０１５９】
ヒトλ軽鎖遺伝子座が、機能的な軽鎖タンパク質を形成するように組み換わることができるいくつかの可変領域遺伝子セグメントを有するという点において、ヒトのλ軽鎖遺伝子座は、マウスとヒトの両方のκ遺伝子座と構造が似ている。ヒトλ軽鎖遺伝子座は、およそ７０個のＶ遺伝子セグメントおよび７個のＪλ−Ｃλ遺伝子セグメント対を含む。これらのＪλ−Ｃλ遺伝子セグメント対の４つだけが、機能的であるとみられる。いくつかの対立遺伝子において、第５のＪλ−Ｃλ遺伝子セグメント対は、報告によると偽遺伝子（Ｃλ６）である。７０個のＶλ遺伝子セグメントは、３８個の機能的な遺伝子セグメントを含むとみられる。７０個のＶλ配列は、３個のクラスターに配置されており、そのすべてが、異なるＶ遺伝子ファミリー群の異なるメンバーを含む（クラスターＡ、ＢおよびＣ；図１）。これは、ヒトＶ領域を有する抗体を非ヒト動物において作製するための、相対的に利用されていない多様性の潜在的に豊富な供給源である。
【０１６０】
全く対照的に、マウスλ軽鎖遺伝子座は、（系統に応じて）２つまたは３つのマウスＶλ領域遺伝子セグメントしか含まない（図２）。少なくともこのために、マウスにおけるκへの大きな偏りは、抗体多様性全体に対して特に不利益でないと考えられている。
【０１６１】
マウスλ軽鎖遺伝子座の公開されているマップによると、その遺伝子座は、およそ２００ｋｂ以内の２つのクラスターの遺伝子セグメントから本質的になる（図２）。その２つのクラスターは、独立した再配列が可能なＶ、ＪおよびＣ遺伝子の２セットを含む：Ｖλ２−Ｊλ２−Ｃλ２−Ｊλ４−Ｃλ４およびＶλ１−Ｊλ３−Ｃλ３−Ｊλ１−Ｃλ１。Ｖλ２は、すべてのＪλ遺伝子セグメントと組み換わると見出されているが、Ｖλ１は、もっぱらＣλ１と組み換わるとみられる。Ｃλ４は、スプライス部位を欠損した偽遺伝子であると考えられている。
【０１６２】
マウスκ軽鎖遺伝子座は、著しく異なる。組換え事象に関与してマウスκ遺伝子座から機能的な軽鎖タンパク質をもたらす遺伝子セグメントの構造および数は、相当に複雑である（図３）。したがって、マウスλ軽鎖は、典型的なマウスでは抗体集団の多様性に大きく寄与しない。
【０１６３】
とりわけ、マウスにおいてヒトλ軽鎖遺伝子座の豊富な多様性を利用することは、軽鎖Ｖドメインのより完全なヒトレパートリーに対して供給源をもたらす可能性がある。この多様性を利用する以前の試みでは、マウスゲノムにランダムに組み込まれたヒトλ軽鎖遺伝子座の塊を含むヒト導入遺伝子が使用された（例えば、米国特許第６，９９８，５１４号および米国特許第７，４３５，８７１号を参照のこと）。報告によると、これらのランダムに組み込まれた（ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ）導入遺伝子を含むマウスは、完全ヒトλ軽鎖を発現するが、しかしながら、場合によっては、片方または両方の内在性軽鎖遺伝子座がインタクトなまま残る。そのヒトλ軽鎖配列は、マウスの発現抗体レパートリーにおいてマウス軽鎖（κまたはλ）と競合するので、この状況は、望ましくない。
【０１６４】
対照的に、本発明者らは、マウス軽鎖遺伝子座から直接１つ以上のλ軽鎖核酸配列を発現すること（内在性マウス軽鎖遺伝子座における置換によるものを含む）ができる遺伝的に改変されたマウスを記載する。内在性遺伝子座からヒトλ軽鎖配列を発現することができる遺伝的に改変されたマウスは、ヒト重鎖遺伝子座を含むマウスとさらに交配され得、それゆえ完全にヒトのものであるＶ領域（重鎖および軽鎖）を含む抗体を発現するために使用され得る。様々な実施形態において、それらのＶ領域は、マウス定常領域とともに発現する。様々な実施形態において、内在性マウス免疫グロブリン遺伝子セグメントは存在せず、それらのＶ領域は、ヒト定常領域とともに発現する。これらの抗体は、数多くの用途（診断的な用途と治療的な用途の両方）において有益であると判明するだろう。
【０１６５】
ヒトＶλおよびＪλ遺伝子セグメントに由来する結合タンパク質をマウスにおいて発現させる様々な実施形態について、多くの利点を実現することができる。内在性軽鎖遺伝子座、例えば、マウスκまたはλ遺伝子座にヒトλ配列を配置することによって、利点を実現することができる。そのようなマウスから産生される抗体は、マウスＣＬ領域（具体的には、マウスＣκまたはＣλ領域）に融合されたヒトＶλドメインを含む軽鎖を有し得る。そのマウスは、ヒトＣＬ領域（具体的には、Ｃκおよび／またはＣλ領域）とともに使用するための、同定およびクローニングに適したヒトＶλドメインも発現し得る。そのようなマウスにおけるＢ細胞発生は、その他の点では正常であるので、ＣλまたはＣκ領域という背景において適合性のＶλドメイン（体細胞変異したＶλドメインを含む）を作製することが可能である。
【０１６６】
免疫グロブリンκまたはλ軽鎖遺伝子座に再配列されていないＶλ遺伝子セグメントを含む遺伝的に改変されたマウスが記載される。Ｃκおよび／またはＣλ領域に融合されたヒトＶλドメインを有する軽鎖を含む抗体を発現するマウスが記載される。
【０１６７】
免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座の無効の（ｓｔｅｒｉｌｅ）転写物
マウスにおいてヒト免疫グロブリンλ配列を発現するというテーマのバリエーションは、そのような発現が可能な遺伝的に改変されたマウスの様々な実施形態に反映される。したがって、いくつかの実施形態において、遺伝的に改変されたマウスは、ヒト遺伝子座由来のある特定の非コード配列を含む。１つの実施形態において、遺伝的に改変されたマウスは、内在性κ軽鎖遺伝子座にヒトＶλおよびＪλ遺伝子セグメントを含み、さらに、ヒトκ軽鎖ゲノムフラグメントを含む。特定の実施形態において、そのヒトκ軽鎖ゲノムフラグメントは、天然にはヒトＶκ遺伝子セグメントとヒトＪκ遺伝子セグメントとの間に見られる非コード配列である。
【０１６８】
上記ヒトおよびマウスκ軽鎖遺伝子座は、開始コドンまたはオープンリーディングフレームのいずれかを欠く無効の転写物をコードし、かつκ軽鎖遺伝子座の転写を制御するエレメントとされている、配列を含む。これらの無効の転写物は、最も近位のＶκ遺伝子セグメントの下流または３’側、かつκ軽鎖定常領域遺伝子（Ｃκ）の上流に存在するκ軽鎖イントロンエンハンサー（Ｅκｉ）の上流または５’側に位置する遺伝子間配列から生じる。その無効の転写物は、その遺伝子間配列の再配列から生じ、それにより、Ｃκに融合されたＶκＪκ１セグメントが形成される。
【０１６９】
Ｃκ遺伝子の上流のκ軽鎖遺伝子座の置換によって、無効の転写物をコードする遺伝子間領域が除去され得る。それゆえ、様々な実施形態において、ヒトλ軽鎖遺伝子セグメントによるマウスＣκ遺伝子の上流のマウスκ軽鎖配列の置換は、ヒトＶλおよびＪλ遺伝子セグメントを含むが無効の転写物をコードするκ軽鎖遺伝子間領域を含まないヒト化されたマウスκ軽鎖遺伝子座をもたらし得る。
【０１７０】
本明細書中に記載されるように、ヒトλ軽鎖遺伝子セグメントによる内在性マウスκ軽鎖遺伝子座のヒト化（ここで、そのヒト化によって遺伝子間領域が除去される）は、λ軽鎖の使用頻度の著明な増加に加えて、κ軽鎖遺伝子座の使用頻度の著しい低下をもたらす。それゆえ、その遺伝子間領域を欠くヒト化マウスは、そのマウスがヒト軽鎖可変ドメイン（例えば、ヒトλまたはκドメイン）を有する抗体を産生し得る点で有用であるが、その遺伝子座からの使用頻度は低下する。
【０１７１】
転写に関して、最終的なヒトＶλ遺伝子セグメントと第１のヒトＪλ遺伝子セグメントとの間にκ遺伝子間領域を含むＶλ遺伝子座を作製するためのヒトκ遺伝子間領域の挿入に加えて、ヒトＶλおよびＪλ遺伝子セグメントによる内在性マウスκ軽鎖遺伝子座のヒト化も記載され；それは、κ遺伝子間領域を欠く遺伝子座よりも高発現のＢ細胞集団を示す。この知見は、その遺伝子間領域が（無効の転写物を介して直接または間接的に）内在性λ軽鎖遺伝子座の使用を抑制するという仮説と一致する。そのような仮説の下では、その遺伝子間領域を含めることによって、内在性λ軽鎖遺伝子座の使用頻度が低下し得、それにより、そのマウスは制限された選択肢となるが、改変された遺伝子座（λをκに）を使用して抗体が産生される。
【０１７２】
様々な実施形態において、ヒトλ軽鎖配列によるマウスＣκ遺伝子の上流のマウスκ軽鎖配列の置換は、転写の点から最も３’側のＶλ遺伝子セグメントの３’非翻訳領域と第１のヒトＪλ遺伝子セグメントに対して５’側との間に配置されたヒトκ軽鎖遺伝子間領域をさらに含む。あるいは、そのような遺伝子間領域は、内在性λ軽鎖遺伝子座において欠失を作製することによって、置換される内在性κ軽鎖遺伝子座（マウスＣκ遺伝子の上流）から取り除かれ得る。同様に、この実施形態では、それらのマウスは、ヒトλ軽鎖配列を含む内在性κ軽鎖遺伝子座から抗体を産生する。
【０１７３】
ヒトＶλドメインを発現するようにマウスを操作するアプローチ
内在性ＣＬ（例えば、ＣκまたはＣλ）領域に融合されたヒトＶλドメインを有する軽鎖を含む抗体を産生する遺伝的に改変されたマウスを作製する様々なアプローチが記載される。様々な実施形態において、片方または両方の内在性軽鎖遺伝子座の欠失を含む遺伝的改変が記載される。例えば、内在性抗体レパートリーからマウスλ軽鎖を排除するために、第１のＶλ−Ｊλ−Ｃλ遺伝子クラスターの欠失、およびヒトＶλ−Ｊλ遺伝子セグメントによる第２の遺伝子クラスターのＶλ−Ｊλ遺伝子セグメントの全体的または部分的な置換が行われ得る。遺伝的に改変されたマウス胚、細胞、ならびにそのマウス、マウス胚および細胞を作製するための標的化構築物も提供される。
【０１７４】
内在性Ｃλ遺伝子は、インタクトなままであり、ゆえに正常な機能性および内在性重鎖の定常領域と会合する能力を保持するので、様々な実施形態において、１つの内在性Ｖλ−Ｊλ−Ｃλ遺伝子クラスターの欠失および別の内在性Ｖλ−Ｊλ−Ｃλ遺伝子クラスターのＶλ−Ｊλ遺伝子セグメントの置換では、その動物における天然の抗体定常領域の会合および機能の相対的に最小限の破壊が用いられる。したがって、そのような実施形態では、その改変は、２つの重鎖および２つの軽鎖を含む機能的な抗体分子の組み立てのために機能的な軽鎖定常領域に依存する他の内在性重鎖定常領域に影響しない。さらに、様々な実施形態において、その改変は、内在性重鎖および軽鎖、例えば、マウスＣλ領域に接続されたｈＶλドメインを含む、膜に結合した機能的な抗体分子の組み立てにも影響しない。少なくとも１つの機能的なＣλ遺伝子が、内在性遺伝子座に保持されるので、ヒトＶλ−Ｊλ遺伝子セグメントによる内在性Ｖλ−Ｊλ−Ｃλ遺伝子クラスターのＶλ−Ｊλ遺伝子セグメントの置換を含む動物は、その動物の発現抗体レパートリー中に存在するヒトＶλ−Ｊλ遺伝子セグメントによって、免疫応答中に抗原に結合することができる正常なλ軽鎖を産生することができるはずである。
【０１７５】
欠失される内在性マウスＶλ−Ｊλ−Ｃλ遺伝子クラスターの略図（一定の拡大比ではない）が、図２に提供される。図示されるように、マウスλ軽鎖遺伝子座は、２つの遺伝子クラスターに組織化され、その両方が、機能的マウスλ軽鎖を形成するように組み換わることができる機能的遺伝子セグメントを含む。内在性マウスＶλ１−Ｊλ３−Ｃλ３−Ｊλ１−Ｃλ１遺伝子クラスターは、組換え部位に隣接したネオマイシンカセットを有する標的化構築物（標的化ベクター１）によって欠失される。他方の内在性遺伝子クラスター（Ｖλ２−Ｖλ３−Ｊλ２−Ｃλ２−Ｊλ４−Ｃλ４）は、組換え部位に隣接したハイグロマイシン−チミジンキナーゼカセットを有する標的化構築物（標的化ベクター２）によって部分的に欠失される。この第２の標的化事象では、Ｃλ２−Ｊλ４−Ｃλ４内在性遺伝子セグメントは保持される。第２の標的化構築物（標的化ベクター２）は、上記の第１の標的化構築物（標的化ベクター１）における組換え部位とは異なる組換え部位を用いて構築され、それにより、標的化が成功した後にその選択カセットの選択的な欠失が可能になる。得られる二重標的化された（ｄｏｕｂｌｅ−ｔａｒｇｅｔｅｄ）遺伝子座は、内在性λ軽鎖を産生することができないという点において、機能的にサイレンシングされている。この改変された遺伝子座は、ヒトＶλおよびＪλ遺伝子セグメントの挿入のために使用され、それにより、ヒトＶλおよびＪλ遺伝子セグメントを含む内在性マウスλ遺伝子座が作製され得る（ここで、改変された遺伝子座において組換えが生じると、その動物は、内在性マウスＣλ遺伝子セグメントに接続された再配列されたヒトＶλおよびＪλ遺伝子セグメントを含むλ軽鎖を産生する）。
【０１７６】
内在性λ遺伝子セグメントを非機能的にするようにマウスを遺伝的に改変することは、様々な実施形態において、その抗体レパートリーにおいてもっぱらκ軽鎖を示すマウスをもたらし、そのマウスは、その免疫応答におけるλ軽鎖の役割の評価にとって有用になり、また、Ｖκドメインを含むがＶλドメインを含まない抗体レパートリーの作製にとって有用になる。
【０１７７】
内在性マウスλ軽鎖遺伝子座において組み換えられるマウスＣλ遺伝子に接続されたｈＶλを発現する遺伝的に改変されたマウスは、当該分野で公知の任意の方法によって作製され得る。ヒトＶλおよびＪλ遺伝子セグメントによる内在性マウスＶλ２−Ｖλ３−Ｊλ２遺伝子セグメントの置換の略図（一定の拡大比ではない）が図４Ａに提供される。図示されるように、非機能的にされた内在性マウスλ軽鎖遺伝子座は、組換え部位に隣接したネオマイシンカセットを含む標的化構築物（１２／１−λ標的化ベクター）によって置換される。Ｖλ２−Ｖλ３−Ｊλ２遺伝子セグメントは、１２個のｈＶλ遺伝子セグメントおよび単一のｈＪλ遺伝子セグメントを含むヒトλ配列を含むゲノムフラグメントで置換される。
【０１７８】
したがって、この第１のアプローチによって、１つ以上のｈＶλ遺伝子セグメントが、単一のｈＪλ遺伝子セグメントと連続する内在性λ軽鎖遺伝子座に位置づけられる（図４Ａ）。
【０１７９】
改変された内在性λ軽鎖遺伝子座に対するさらなる改変は、より多くのｈＶλ遺伝子セグメントを挿入する同様の手法を用いて達成され得る。例えば、さらなるヒトｈＶλ遺伝子セグメントの漸進的な挿入のために使用される２つの追加の標的化構築物（＋１６−λおよび＋１２−λ標的化ベクター）の略図が図５Ａに提供される。図示されるように、特定のヒトｈＶλ遺伝子セグメントを含む追加のゲノムフラグメントが、ヒトλ軽鎖配列の先の挿入によって提供された相同性を用いて、逐次的な工程で、改変された内在性λ軽鎖遺伝子座に挿入される。図示される各標的化構築物を用いた組換えの際、逐次的な様式で、２８個の追加のｈＶλ遺伝子セグメントが、改変された内在性λ軽鎖遺伝子座に挿入される。これにより、マウスＣλ遺伝子に接続されたヒトＶλ−Ｊλ遺伝子セグメントを含むλ軽鎖タンパク質を産生するキメラ遺伝子座が作製される。
【０１８０】
ヒトλ軽鎖遺伝子セグメントをマウスλ遺伝子座に挿入する上記のアプローチは、Ｃλ２−Ｊλ４−Ｃλ４遺伝子セグメントの下流に位置づけられたエンハンサーを維持する（Ｅｎｈ２．４、ＥｎｈおよびＥｎｈ３．１と命名される、図４Ａおよび図５Ａ）。このアプローチによって、内在性マウスλ軽鎖遺伝子座に単一の改変された対立遺伝子がもたらされる（図７Ａ）。
【０１８１】
マウスＣλ遺伝子セグメントに作動可能に接続されたｈＶλおよびＪλ遺伝子セグメントを含む軽鎖を発現するマウスを作製するための組成物および方法（内在性マウスλ軽鎖遺伝子座からそのような遺伝子を発現するマウスを作製するための組成物および方法を含む）が提供される。それらの方法は、選択的に、１つの内在性マウスＶλ−Ｊλ−Ｃλ遺伝子クラスターを非機能的にする工程（例えば、標的化された欠失によって）ならびにその内在性マウスλ軽鎖遺伝子座においてｈＶλおよびＪλ遺伝子セグメントを使用してマウスにおいてｈＶλドメインを発現させる工程を包含する。
【０１８２】
あるいは、第２のアプローチでは、ヒトλ軽鎖遺伝子セグメントが、内在性κ軽鎖遺伝子座に位置づけられ得る。その遺伝的改変は、様々な実施形態において、内在性κ軽鎖遺伝子座の欠失を含む。例えば、内在性抗体レパートリーからマウスκ軽鎖を排除するために、マウスＶκおよびＪκ遺伝子セグメントの欠失が行われ得る。遺伝的に改変されたマウス胚、細胞、ならびにそのマウス、マウス胚および細胞を作製するための標的化構築物も提供される。
【０１８３】
上で述べられた理由のために、マウスＶκおよびＪκ遺伝子セグメントの欠失では、相対的に最小限の破壊が用いられる。欠失されるマウスＶκおよびＪκ遺伝子セグメントの略図（一定の拡大比ではない）が図３に提供される。２個の正確に位置づけられた標的化ベクター（各々が部位特異的組換え部位を使用する）の間に位置するマウス配列のリコンビナーゼによって媒介される欠失を介して、内在性マウスＶκおよびＪκ遺伝子セグメントが欠失される。第１の標的化ベクター（Ｊκ標的化ベクター）は、マウスＪκ遺伝子セグメントを欠失させる第１の標的化事象において使用される。第２の標的化ベクター（Ｖκ標的化ベクター）は、最も遠位のマウスＶκ遺伝子セグメントの５’に位置する配列を欠失させる、第２の逐次的な標的化事象において使用される。両方の標的化ベクターが、部位特異的組換え部位を含み、それにより、標的化が成功した後に、両方の選択カセットおよび介在するすべてのマウスκ軽鎖配列の選択的欠失が可能になる。得られる欠失された遺伝子座は、内在性κ軽鎖を産生することができないという点において、機能的にサイレンシングされている。この改変された遺伝子座は、ｈＶλおよびＪλ遺伝子セグメントの挿入のために使用され、それにより、ｈＶλおよびＪλ遺伝子セグメントを含む内在性マウスκ遺伝子座が作製され得る（ここで、改変された遺伝子座において組換えが生じると、その動物は、内在性マウスＣκ遺伝子セグメントに作動可能に接続された再配列されたｈＶλおよびＪλ遺伝子セグメントを含むλ軽鎖を産生する）。ヒトλ軽鎖配列を含む様々な標的化ベクターが、この欠失されたマウスκ遺伝子座と組み合わせて使用されることにより、マウスＣκ領域と作動可能に接続されたヒトλ遺伝子セグメントを含むハイブリッド軽鎖遺伝子座が作製され得る。
【０１８４】
したがって、第２のアプローチによって、１つ以上のヒトＶλ遺伝子セグメントが、単一のヒトＪλ遺伝子セグメントと連続するマウスκ軽鎖遺伝子座に位置づけられる（１２／１−κ標的化ベクター，図４Ｂ）。
【０１８５】
様々な実施形態において、このアプローチに対する変法は、遺伝子セグメントおよび／または制御配列を付加することにより、マウス抗体レパートリー内のマウスκ遺伝子座からのヒトλ軽鎖配列の使用頻度が最適化され得る。
【０１８６】
第３のアプローチでは、１つ以上のｈＶλ遺伝子セグメントが、４個のｈＪλ遺伝子配列と連続するマウスκ軽鎖遺伝子座に位置づけられる（１２／４−κ標的化ベクター，図４Ｂ）。
【０１８７】
第３のアプローチでは、１つ以上のｈＶλ遺伝子セグメントが、ヒトκ遺伝子間配列および単一のｈＪλ遺伝子配列と連続するマウスκ軽鎖遺伝子座に位置づけられる（１２（κ）１−κ標的化ベクター，図４Ｂ）。
【０１８８】
第４のアプローチでは、１つ以上のｈＶλ遺伝子セグメントが、ヒトκ遺伝子間配列、４個のｈＪλ遺伝子配列と連続するマウスκ軽鎖遺伝子座に位置づけられる（１２（κ）４−κ標的化ベクター図４Ｂ）。
【０１８９】
マウスκ遺伝子座にヒトλ軽鎖遺伝子セグメントを挿入する上記アプローチのすべてが、Ｃκ遺伝子の上流にκイントロンエンハンサーエレメント（Ｅκｉと命名される，図４Ｂおよび図５Ｂ）を維持し、かつＣκ遺伝子の下流に３’κエンハンサー（Ｅκ３’と命名される，図４Ｂおよび図５Ｂ）を維持する。このアプローチは、内在性マウスκ軽鎖遺伝子座に４個の別個の改変された対立遺伝子をもたらす（図７Ｂ）。
【０１９０】
様々な実施形態において、遺伝的に改変されたマウスは、内在性マウスλ軽鎖遺伝子座のノックアウトを含む。１つの実施形態において、そのλ軽鎖遺伝子座は、Ｖλ２からＪλ２に及ぶ領域およびＶλ１からＣλ１に及ぶ領域を欠失させるストラテジーによってノックアウトされる（図２）。内在性λ軽鎖遺伝子座が内在性λドメインを発現する能力を低下させるかまたは排除する任意のストラテジーが、本開示における実施形態との使用に適している。
【０１９１】
遺伝的に改変されたマウス由来のラムダドメイン抗体
マウスκまたはλ軽鎖遺伝子座にヒトλ配列を含むマウスは、マウスＣＬ（ＣκまたはＣλ）領域に融合されたｈＶλ領域を含む軽鎖を発現する。これらは、（ａ）機能的にサイレンシングされた軽鎖遺伝子座（例えば、内在性マウスκまたはλ軽鎖遺伝子座のノックアウト）を含むマウス；（ｂ）内在性マウスＣλ遺伝子に作動可能に接続されたｈＶおよびｈＪ遺伝子セグメントを含む内在性マウスλ軽鎖遺伝子座を含むマウス；（ｃ）内在性マウスＣκ遺伝子に作動可能に接続されたｈＶκおよびｈＪκ遺伝子セグメントを含む内在性マウスκ軽鎖遺伝子座を含むマウス；および（ｄ）一方のκ対立遺伝子がｈＶκおよびｈＪκを含み；他方のκ対立遺伝子がｈＶλおよびｈＪλを含み；一方のλ対立遺伝子がｈＶλおよびｈＪλを含み、一方のλ対立遺伝子がサイレンシングされているかもしくはノックアウトされているか、または両方のλ対立遺伝子が、ｈＶλおよびｈＪλを含み；かつ各々がｈＶＨ、ｈＤＨおよびｈＪＨを含む２個の重鎖対立遺伝子を含むマウスと都合よく交配される。
【０１９２】
ＣκまたはＣλという背景において発現されるｈＶλドメインを含む抗体は、ｈＶλドメインをコードする核酸を、ヒトＣλをコードする遺伝子を有する発現構築物にクローニングすることによって、完全ヒト抗体を作製するために使用される。得られる発現構築物は、ｈＣλに融合された完全なｈＶλドメインを示す抗体の発現に適した宿主細胞にトランスフェクトされる。
【実施例】
【０１９３】
以下の実施例は、本発明の方法および組成物を作製するおよび使用する方法を説明するために提供され、本発明者らが本発明者らの発明と見なす範囲を制限することを目的としていない。別段示されない限り、温度は、セルシウス度で示され、圧力は、大気圧または大気圧付近である。
【０１９４】
実施例Ｉ
マウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子座の欠失
マウスκおよびλ軽鎖遺伝子座を不活性化するためにマウスゲノム細菌人工染色体（ＢＡＣ）ライブラリーを改変するために、ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）技術（例えば、米国特許第６，５８６，２５１号およびＶａｌｅｎｚｕｅｌａら（２００３）Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２１（６）：６５２−６５９を参照のこと）を用いて様々な標的化構築物を作製した。
【０１９５】
マウスλ軽鎖遺伝子座の欠失。Ｖλ−Ｊλ−Ｃλ遺伝子クラスターの標的化欠失によって内在性マウスλ軽鎖遺伝子座を不活性化するために、マウスＢＡＣクローンＲＰ２３−１３５ｋ１５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）由来のＤＮＡを相同組換えによって改変した（図２）。
【０１９６】
簡潔には、Ｖλ１遺伝子セグメントの５’側の配列を含む５’マウス相同性アームおよびＣλ１遺伝子セグメントの３’側の配列を含む３’マウス相同性アームとともにｌｏｘＰ部位に隣接したネオマイシンカセットを含む標的化ベクターを用いて、Ｖλ１−Ｊλ３−Ｃλ３−Ｊλ１−Ｃλ１遺伝子セグメントを含む近位のクラスター全体を単一の標的化事象において欠失させた（図２，標的化ベクター１）。
【０１９７】
Ｖλ２−Ｊλ２−Ｃλ２−Ｊλ４−Ｃλ４を含む遠位の内在性マウスλ遺伝子クラスターを正確に欠失させるために、第２の標的化構築物を調製したが、ただ、その第２の標的化構築物は、Ｖλ２遺伝子セグメントの５’側の配列を含む５’マウス相同性アームおよび内在性Ｃλ２遺伝子セグメントに対して５’側の配列を含む３’マウス相同性アームを含んでいた（図２，標的化ベクター２）。したがって、その第２の標的化構築物は、内在性マウスλ遺伝子座にＣλ２−Ｊλ４−Ｃλ４をインタクトなままで残して、Ｖλ２−Ｊλ２を正確に欠失させた。不活性化された内在性λ遺伝子座（上に記載されたような）を含むＥＳ細胞を、当該分野で公知の核型分析およびスクリーニング法（例えば、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標））によって確かめた。次いで、その改変されたＥＳ細胞からＤＮＡを単離し、ＣＲＥリコンビナーゼによる処理に供することによって、ネオマイシンマーカー遺伝子を含む近位の標的化カセットの欠失が媒介され、それにより、ただ１つのｌｏｘＰ部位だけが欠失に残った（図２，下）。
【０１９８】
マウスκ軽鎖遺伝子座の欠失。上に記載された方法と同様の方法を用いていくつかの標的化構築物を作製して、相同組換えによってマウスＢＡＣクローンＲＰ２３−３０２ｇ１２およびＲＰ２３−２５４ｍ０４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのＤＮＡを改変することにより、２工程プロセスでマウスκ軽鎖遺伝子座を不活性化した（図３）。
【０１９９】
簡潔には、ハイグロマイシン−チミジンキナーゼ（ｈｙｇ−ＴＫ）カセットに対して３’に単一のｌｏｘＰ部位を含むｈｙｇ−ＴＫカセットを含む標的化ベクターを用いて、内在性マウスκ軽鎖遺伝子座のＪκ遺伝子セグメント（１−５）を単一の標的化事象において欠失させた（図３，Ｊκ標的化ベクター）。この標的化ベクターを作製するために使用された相同性アームは、内在性マウスＪκ遺伝子セグメントの５’側および３’側のマウスゲノム配列を含んだ。第２の標的化事象では、最も遠位の内在性マウスＶκ遺伝子セグメントに対して上流（５’）のマウスゲノム配列の一部を欠失させるための第２の標的化ベクターを調製した（図３，Ｖκ標的化ベクター）。この標的化ベクターは、逆向きのｌｏｘ５１１部位、ｌｏｘＰ部位およびネオマイシンカセットを含んだ。この標的化ベクターを作製するために使用された相同性アームは、最も遠位のマウスＶκ遺伝子セグメントの上流のマウスゲノム配列を含んだ。それらの標的化ベクターを、ＥＳ細胞においてＤＮＡを標的化するために逐次的な様式で（すなわち、Ｊκに次いでＶκを）使用した。二重標的化染色体（すなわち、両方の標的化ベクターで標的化された単一の内在性マウスκ遺伝子座）を有するＥＳを、当該分野で公知の核型分析およびスクリーニング法（例えば、Ｔａｑｍａｎ（商標））によって確かめた。次いで、その改変されたＥＳ細胞からＤＮＡを単離し、Ｃｒｅリコンビナーゼによる処理に供することによって、２つのｌｏｘ部位が互いに対して逆向きで並置されつつ、内在性マウスＶκ遺伝子セグメントおよび両方の選択カセットの欠失が媒介された（図３，下；配列番号１）。
【０２００】
このようにして、下に記載される標的化ベクターを用いて再配列されていないヒトλ生殖細胞系列遺伝子セグメントを正確な様式で漸進的に挿入するための、インタクトなエンハンサーおよび定常領域を含む２つの改変された内在性軽鎖遺伝子座（κおよびλ）が作製された。
【０２０１】
実施例ＩＩ
ヒトλ軽鎖ミニ遺伝子座によるマウス軽鎖遺伝子座の置換
上に記載された方法と同様の方法を用いて内在性マウスκおよびλ軽鎖遺伝子座にヒトλ遺伝子セグメントを漸進的に挿入するための複数の標的化ベクターを作出した。複数の独立した最初の改変を、内在性軽鎖遺伝子座に対して行ったところ、その各々が、マウス軽鎖定常遺伝子およびエンハンサーに作動可能に接続されたｈＶλおよびＪλ遺伝子セグメントを含むキメラ軽鎖遺伝子座をもたらした。
【０２０２】
１２個のヒトＶλおよび１個のヒトＪλ遺伝子セグメントを含むヒトλミニ遺伝子座。
ＲＰ１１−７２９ｇ４と命名されたヒトＢＡＣクローン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、クラスターＡからの初めの１２個の連続したヒトＶλ遺伝子セグメントおよびｈＪλ１遺伝子セグメントまたは４個のｈＪλ遺伝子セグメントを含むように、一連の最初の標的化ベクターを作出した。図４Ａおよび４Ｂは、それぞれマウスλおよびκ軽鎖遺伝子座においてヒトλ軽鎖遺伝子セグメントの最初の挿入を行うために構築された標的化ベクターを示している。
【０２０３】
最初の標的化ベクターの第１のセットについては、１２個のｈＶλ遺伝子セグメントおよびｈＪλ１遺伝子セグメントを含む７２９ｇ４ＢＡＣクローンからの１２４，１２５ｂｐのＤＮＡフラグメントを、３’マウス相同性アームのライゲーション用にｈＪλ１遺伝子セグメントの９９６ｂｐ下流（３’）にＰＩ−ＳｃｅＩ部位を含むように作出した。２個の異なるセットの相同性アームを、このヒトフラグメントへのライゲーションに使用した；一方のセットの相同性アームは、１３５ｋ１５ＢＡＣクローンからの内在性マウスλ配列を含み（図４Ａ）、もう一方のセットは、それぞれマウスＢＡＣクローンＲＰ２３−３０２ｇ１２およびＲＰ２３−２５４ｍ０４のマウスＶκおよびＪκ遺伝子セグメントの５’側および３’側の内在性κ配列を含んだ（図４Ｂ）。
【０２０４】
１２／１−λ標的化ベクターの場合（図４Ａ）、実施例１に記載された改変されたマウスλ遺伝子座のマウスＣλ２−Ｊλ４−Ｃλ４およびエンハンサー２．４を含む２７，８４７ｂｐのＤＮＡフラグメントの５’末端にＰＩ−ＳｃｅＩ部位を作出した。その約２８ｋｂのマウスフラグメントを、約１２４ｋｂのヒトλフラグメントへのライゲーションによって３’相同性アームとして使用することにより、５’から３’に向かって、ｈＪλ１遺伝子セグメント、そのｈＪλ１遺伝子セグメントの３’側の９９６ｂｐのヒトλ配列、マウスＣλ２遺伝子に対して５’側の１２２９ｂｐのマウスλ配列、マウスＣλ２遺伝子、およびその約２８ｋｂのマウスフラグメントの残りの部分を含む３’ジャンクションが作製された。ヒトＶλ３−１２遺伝子セグメントの上流（５’）には、内在性マウスλ遺伝子座の５’側の配列に対応する２３，７９２ｂｐのマウスゲノムＤＮＡを含む５’マウス相同性アームの開始部（ｓｔａｒｔ）より前に、追加の１４５６ｂｐのヒトλ配列が存在した。５’相同性アームとそのヒトλ配列の始まりとの間に、Ｆｒｔ部位に隣接したネオマイシンカセットが存在した。
【０２０５】
したがって、１２／１−λ標的化ベクターは、５’から３’に向かって、内在性λ遺伝子座の５’側の約２４ｋｂのマウスλゲノム配列を含む５’相同性アーム、５’Ｆｒｔ部位、ネオマイシンカセット、３’Ｆｒｔ部位、初めの１２個の連続したｈＶλ遺伝子セグメントおよびｈＪλ１遺伝子セグメントを含む約１２３ｋｂのヒトゲノムλ配列、ＰＩ−ＳｃｅＩ部位、ならびに内在性Ｃλ２−Ｊλ４−Ｃλ４遺伝子セグメント、マウスエンハンサー２．４配列およびそのエンハンサー２．４の下流（３’）の追加のマウスゲノム配列を含む約２８ｋｂのマウスゲノム配列を含む３’相同性アームを含んだ（図４Ａ）。
【０２０６】
同様の様式において、１２／１−κ標的化ベクター（図４Ｂ）は、内在性κ遺伝子座に対する標的化が相同組換えによって達成され得るようにマウスκ配列を含むマウス相同性アームを使用したことを除いて、同じ約１２４ヒトλフラグメントを使用した。したがって、１２／１−κ標的化ベクターは、５’から３’に向かって、内在性κ遺伝子座の５’側の約２３ｋｂのマウスゲノム配列を含む５’相同性アーム、Ｉ−ＣｅｕＩ部位、５’Ｆｒｔ部位、ネオマイシンカセット、３’Ｆｒｔ部位、初めの１２個の連続したｈＶλ遺伝子セグメントおよびｈＪλ１遺伝子セグメントを含む約１２４ｋｂのヒトゲノムλ配列、ＰＩ−ＳｃｅＩ部位、ならびに内在性マウスＣκ遺伝子、ＥκｉおよびＥκ３’ならびにそのＥκ３’の下流（３’）の追加のマウスゲノム配列を含む約２８ｋｂのマウスゲノム配列を含む３’相同性アームを含んだ（図４Ｂ，１２／１−κ標的化ベクター）。
【０２０７】
これらの２つの最初の標的化ベクターのいずれかによる相同組換えによって、内在性マウス軽鎖定常遺伝子およびエンハンサー（ＣκまたはＣλ２およびＥκｉ／Ｅκ３’またはＥｎｈ２．４／Ｅｎｈ３．１）遺伝子に作動可能に接続された１２個のｈＶλ遺伝子セグメントおよびｈＪλ１遺伝子セグメントを含む改変されたマウス軽鎖遺伝子座（κまたはλ）が作製された（それは、組換えが生じると、キメラλ軽鎖の形成をもたらす）。
【０２０８】
１２個のヒトＶλ遺伝子セグメントおよび４個のヒトＪλ遺伝子セグメントを有するヒトλミニ遺伝子座。キメラλ軽鎖遺伝子座に多様性を付加する別のアプローチでは、クラスターＡ由来の初めの１２個の連続したヒトＶλ遺伝子セグメントならびにｈＪλ１、２、３および７遺伝子セグメントをマウスκ軽鎖遺伝子座に挿入するために、第３の最初の標的化ベクターを作出した（図４Ｂ，１２／４−κ標的化ベクター）。各Ｊλ遺伝子セグメントならびに各Ｊλ遺伝子セグメントのすぐ隣りの５’領域と３’領域の両方からの約１００ｂｐのヒトゲノム配列を含む、ｈＪλ１、Ｊλ２、Ｊλ３およびＪλ７遺伝子セグメントを含むＤＮＡセグメントをデノボＤＮＡ合成（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって作製した。ＰＩ−ＳｃｅＩ部位を、この約１ｋｂのＤＮＡフラグメントの３’末端に作出し、クロラムフェニコール（ｃｈｌｏｒｏａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ）カセットにライゲートした。ヒトＢＡＣクローン７２９ｇ４のｈＪλ１遺伝子セグメントに対して５’位および３’位におけるヒトλ配列から相同性アームをＰＣＲ増幅した。この中間体標的化ベクターによる相同組換えを、５’Ｆｒｔ部位に対して５’側にＩ−ＣｅｕＩ部位も含むＦｒｔ部位に隣接したネオマイシンカセットでヒトＶλ３−１２遺伝子セグメントの上流（５’）に対して事前に標的化された、改変された７２９ｇ４ＢＡＣクローンにおいて行った。その二重標的化された７２９ｇ４ＢＡＣクローンは、５’から３’に向かって、Ｉ−ＣｅｕＩ部位、５’Ｆｒｔ部位、ネオマイシンカセット、３’Ｆｒｔ部位、初めの１２個のｈＶλ遺伝子セグメントを含む約１２３ｋｂのフラグメント、ヒトＪλ１、２、３および７遺伝子セグメントを含む約１ｋｂのフラグメント、ＰＩ−ＳｃｅＩ部位ならびにクロラムフェニコールカセットを含んだ。この中間体標的化ベクターを、Ｉ−ＣｅｕＩとＰＩ−ＳｃｅＩとで同時に消化し、続いて、改変されたマウスＢＡＣクローン（上に記載されたもの）にライゲートすることにより、第３の標的化ベクターを作製した。
【０２０９】
このライゲーションによって、ヒトλ配列を内在性κ軽鎖遺伝子座に挿入するための第３の標的化ベクターがもたらされ、それは、５’から３’に向かって、内在性マウスκ遺伝子座の５’側の約２３ｋｂのゲノム配列を含む５’マウス相同性アーム、Ｉ−ＣｅｕＩ部位、５’Ｆｒｔ部位、ネオマイシンカセット、３’Ｆｒｔ部位、初めの１２個のｈＶλ遺伝子セグメントを含む約１２３ｋｂのフラグメント、ｈＪλ１、２、３および７遺伝子セグメントを含む約１ｋｂのフラグメント、ＰＩ−ＳｃｅＩ部位、ならびに内在性マウスＣκ遺伝子、ＥκｉおよびＥκ３’ならびにそのＥκ３’の下流の（３’）の追加のマウスゲノム配列を含む約２８ｋｂのマウスゲノム配列を含む３’相同性アームを含んだ（図４Ｂ，１２／４−κ標的化ベクター）。この第３の標的化ベクターによる相同組換えによって、内在性マウスＣκ遺伝子に作動可能に接続された、１２個のｈＶλ遺伝子セグメントおよび４個のｈＪλ遺伝子セグメントを含む改変されたマウスκ軽鎖遺伝子座が作製された（それらは、組換えが生じると、キメラヒトλ／マウスκ軽鎖の形成をもたらす）。
【０２１０】
組み込まれたヒトκ軽鎖配列を有するヒトλミニ遺伝子座。同様の様式において、内在性κ軽鎖遺伝子座へのヒトλ遺伝子セグメントの最初の挿入を行うために作出された標的化ベクター（図４Ｂ，１２／１−κおよび１２／４−κ標的化ベクター）と類似の２個の追加の標的化ベクターを作出し、連続するヒトλおよびκゲノム配列を含む独特に構築された標的化ベクターを用いてヒトλ軽鎖遺伝子セグメントを漸進的に挿入した。これらの標的化ベクターは、ヒトＶκ４−１遺伝子セグメントとＪκ１遺伝子セグメントとの間に天然に位置する約２３ｋｂのヒトκゲノム配列を含むように構築された。このヒトκゲノム配列を、これらの２つの追加の標的化ベクターにおいてヒトＶλ遺伝子セグメントとヒトＪλ遺伝子セグメントとの間に特異的に位置づけた（図４Ｂ，１２（κ）１−κおよび１２（κ）４−κ標的化ベクター）。
【０２１１】
上記ヒトκゲノム配列を含む両方の標的化ベクターを、上に記載された改変されたＲＰ１１−７２９ｇ４ＢＡＣクローンを用いて作製した（図６）。この改変されたＢＡＣクローンを、ＮｏｔＩおよびＡｓｉＳＩ制限酵素認識部位に隣接したスペクチノマイシン選択カセットで標的化した（図６，左上）。スペクチノマイシンカセットによる相同組換えによって、二重標的化された７２９ｇ４ＢＡＣクローンがもたらされ、それは、５’から３’に向かって、Ｉ−ＣｅｕＩ部位、５’Ｆｒｔ部位、ネオマイシンカセット、３’Ｆｒｔ部位、初めの１２個のｈＶλ遺伝子セグメントを含む約１２３ｋｂのフラグメント、ｈＶλ３−１遺伝子セグメントの九量体配列の約２００ｂｐ下流（３’）のＮｏｔＩ部位、スペクチノマイシンカセットおよびＡｓｉＳＩ部位を含んだ。二重標的化された改変された７２９ｇ４ＢＡＣクローンに含まれるｈＶλ遺伝子セグメントとのライゲーション用の約２３ｋｂのフラグメントのその後のクローニングを可能にするためにｈＶκ４−１遺伝子セグメントとｈＪκ１遺伝子セグメントとの間の位置に制限酵素認識部位を作出するために、ヒトκ配列を含む別個のヒトＢＡＣクローン（ＣＴＤ−２３６６ｊ１２）を独立して２回標的化した（図６，右上）。
【０２１２】
簡潔には、２３６６ｊ１２ＢＡＣクローンは、約１３２ｋｂのサイズであり、ｈＶκ遺伝子セグメント１−６、１−５、２−４、７−３、５−２、４−１、それらのＶκ遺伝子セグメントの下流のヒトκゲノム配列、ｈＪκ遺伝子セグメント１−５、ｈＣκ、およびヒトκ遺伝子座の約２０ｋｂの追加のゲノム配列を含む。まず、このクローンを、Ｆｒｔ部位に隣接したハイグロマイシンカセットおよび３’Ｆｒｔ部位の下流（３’）にＮｏｔＩ部位を含む標的化ベクターで標的化した。この標的化ベクターに対する相同性アームは、そのＢＡＣクローン内のＶκ遺伝子セグメントの５’側および３’側のヒトゲノム配列を含んだ（それにより、この標的化ベクターによる相同組換えが生じると、Ｖκ遺伝子セグメントは欠失し、ｈＶκ４−１遺伝子セグメントの約１３３ｂｐ下流にＮｏｔＩ部位が作出された）（図６，右上）。この改変された２３６６ｊ１２ＢＡＣクローンを、３’末端において２つの標的化ベクターで独立して標的化し、クロラムフェニコールカセットでｈＪκ遺伝子セグメントを欠失させた（このクロラムフェニコールカセットは、ｈＪλ１遺伝子セグメント、ＰＩ−ＳｃｅＩ部位およびＡｓｉＳＩ部位、または４個のｈＪλ遺伝子セグメントを含むヒトλゲノムフラグメント（前出）、ＰＩ−ＳｃｅＩ部位およびＡｓｉＳＩ部位のいずれかも含む）（図６，右上）。これらの２個の類似の標的化ベクターに対する相同性アームは、ｈＪκ遺伝子セグメントの５’側および３’側の配列を含んだ。これらの第２の標的化ベクターおよび改変された２３６６ｊ１２ＢＡＣクローンによる相同組換えによって二重標的化された２３６６ｊ１２クローンが得られ、それは、５’から３’に向かって、５’Ｆｒｔ部位、ハイグロマイシンカセット、３’Ｆｒｔ部位、ＮｏｔＩ部位、Ｖκ４−１遺伝子セグメントとＪκ１遺伝子セグメントとの間の遺伝子間領域を含むヒトκ遺伝子座の２２，８００ｂｐのゲノムフラグメント、ｈＪλ１遺伝子セグメントまたはｈＪλ１、Ｊλ２、Ｊλ３およびＪλ７を含むヒトλゲノムフラグメントのいずれか、ＰＩ−ＳｃｅＩ部位ならびにクロラムフェニコールカセットを含んだ（図６，右上）。二重標的化された７２９ｇ４および２３６６ｊ１２クローンを用いた２つのライゲーション工程によって、２つの追加の改変を行うための２つの最終的な標的化ベクターが得られた。
【０２１３】
二重標的化された７２９ｇ４および２３６６ｊ１２クローンをＮｏｔＩおよびＡｓｉＳＩで消化したところ、それぞれ、ネオマイシンカセットおよびｈＶλ遺伝子セグメントを含む１つのフラグメント、ならびにＶκ４−１遺伝子セグメントとＪκ１遺伝子セグメントとの間の遺伝子間領域を含むヒトκ遺伝子座の約２３ｋｂのゲノムフラグメント、ｈＪλ１遺伝子セグメントまたはｈＪλ１、Ｊλ２、Ｊλ３およびＪλ７遺伝子セグメントを含むゲノムフラグメントのいずれか、ＰＩ−ＳｃｅＩ部位ならびにクロラムフェニコールカセットを含む別のフラグメントを得た。これらのフラグメントのライゲーションによって２つの独特のＢＡＣクローンが生成され、それらは、５’から３’に向かって、ｈＶλ遺伝子セグメント、Ｖκ４−１遺伝子セグメントとＪκ１遺伝子セグメントとの間のヒトκゲノム配列、ｈＪλ１遺伝子セグメントまたはｈＪλ１、Ｊλ２、Ｊλ３およびＪλ７遺伝子セグメントを含むゲノムフラグメントのいずれか、ＰＩ−ＳｃｅＩ部位ならびにクロラムフェニコールカセットを含んだ（図６，下）。次いで、これらの新しいＢＡＣクローンをＩ−ＣｅｕＩおよびＰＩ−ＳｃｅＩで消化することにより、上流のネオマイシンカセットおよび連続するヒトλおよびκ配列を含む独特のフラグメントが放出され、それらを、５’から３’に向かって、内在性κ遺伝子座の５’側のマウスゲノム配列、Ｉ−ＣｅｕＩ部位、５’Ｆｒｔ部位、ネオマイシンカセット、３’Ｆｒｔ部位、ｈＶλ遺伝子セグメント（３−１２から３−１）、Ｖλ３−１の約２００ｂｐ下流のＮｏｔＩ部位、ヒトＶκ４−１遺伝子セグメントとＪκ１遺伝子セグメントとの間に天然に見られる約２３ｋｂのヒトκ配列、ｈＪλ１遺伝子セグメントまたはｈＪλ１、Ｊλ２、Ｊλ３およびＪλ７遺伝子セグメントを含むゲノムフラグメントのいずれか、マウスＥκｉ、マウスＣκ遺伝子およびＥκ３’を含む改変されたマウスＢＡＣクローン３０２ｇ１２にライゲートした（図４，１２ｈＶλ−ＶκＪκ−ｈＪλ１および１２ｈＶλ−ＶκＪκ−４ｈＪλ標的化ベクター）。これらの両方の標的化ベクターによる相同組換えによって、内在性マウスＣκ遺伝子に作動可能に接続された、１２個のｈＶλ遺伝子セグメント、ヒトκゲノム配列および１個または４個のｈＪλ遺伝子セグメントを含む２つの別個の改変されたマウスκ軽鎖遺伝子座が作製された（それらは、組換えが生じると、キメラヒトλ／マウスκ軽鎖の形成をもたらす）。
【０２１４】
実施例ＩＩＩ
ヒトλ軽鎖ミニ遺伝子座への追加のヒトＶλ遺伝子セグメントの操作
同様の標的化ベクターおよび方法（図５Ａ，＋１６−λ標的化ベクターおよび図５Ｂ，＋１６−κ標的化ベクター）を用いて、追加のｈＶλ遺伝子セグメントを、実施例２に記載された最初の各改変物に独立して付加した。
【０２１５】
１６個の追加のヒトＶλ遺伝子セグメントの導入。１６個の追加のｈＶλ遺伝子セグメントを実施例２に記載された改変された軽鎖遺伝子座に付加するための標的化ベクターを構築する際に使用された上流の（５’）相同性アームは、内在性κまたはλ軽鎖遺伝子座の５’側のマウスゲノム配列を含んだ。３’相同性アームは、すべての標的化ベクターに関して同じであり、実施例２に記載されたような改変物のヒトλ配列の５’末端と重複するヒトゲノム配列を含んだ。
【０２１６】
簡潔には、１６個の追加のｈＶλ遺伝子セグメントを、実施例２に記載された改変されたマウス軽鎖遺伝子座に導入するための２つの標的化ベクターを作出した（図５Ａおよび５Ｂ，＋１６−λまたは＋１６−κ標的化ベクター）。クラスターＡ由来の２１個の連続したｈＶλ遺伝子セグメントを含むヒトＢＡＣクローンＲＰ１１−７６１ｌ１３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）由来の約１７２ｋｂのＤＮＡフラグメントを、内在性κまたはλ軽鎖遺伝子座に対して５’側のマウスゲノム配列を含む５’相同性アームおよびヒトゲノムλ配列を含む３’相同性アームを用いて作出した。これらの標的化構築物において使用された５’マウスκまたはλ相同性アームは、実施例２に記載されたものと同じ５’相同性アームだった（図５Ａおよび５Ｂ）。３’相同性アームは、実施例２に記載されたヒトゲノムλ配列の約１２３ｋｂのフラグメントの等価な５’末端に対応するヒトゲノムλ配列の５３，０５７ｂｐの重複を含んだ。これらの２つの標的化ベクターは、５’から３’に向かって、内在性マウスκ軽鎖遺伝子座の５’側の約２３ｋｂのゲノム配列または内在性λ軽鎖遺伝子座の５’側の約２４ｋｂのマウスゲノム配列を含む５’マウス相同性アーム、５’Ｆｒｔ部位、ハイグロマイシンカセット、３’Ｆｒｔ部位、および２１個の連続したｈＶλ遺伝子セグメントを含む１７１，４５７ｂｐのヒトゲノムλ配列（そのうちの約５３ｋｂは、実施例３に記載されたヒトλ配列の５’末端と重複し、この標的化構築物に対する３’相同性アームとして働く）を含んだ（図５Ａおよび５Ｂ，＋１６−λまたは＋１６−κ標的化ベクター）。これらの標的化ベクターによる相同組換えによって、独立して改変されたマウスκおよびλ軽鎖遺伝子座（各々が、内在性マウス定常遺伝子（ＣκまたはＣλ２）に作動可能に接続された２８個のｈＶλ遺伝子セグメントおよびｈＪλ１遺伝子セグメントを含む）が作製された（それらは、組換えが生じると、キメラ軽鎖の形成をもたらす）。
【０２１７】
同様の様式において、＋１６−κ標的化ベクターを使用することによっても、組み込まれたヒトκ配列ありおよびなしで複数のｈＪλ遺伝子セグメントを組み込む実施例２に記載されたその他の最初の改変物（図４Ｂ）に、１６個の追加のｈＶλ遺伝子セグメントを導入した。その他の最初の改変物を含む内在性マウスκ遺伝子座におけるこの標的化ベクターによる相同組換えによって、内在性マウスＣκ遺伝子に作動可能に接続されたヒトＶκ−Ｊκゲノム配列ありおよびなしで２８個のｈＶλ遺伝子セグメントならびにｈＪλ１、２、３および７遺伝子セグメントを含むマウスκ軽鎖遺伝子座が作製された（それらは、組換えが生じると、キメラλ−κ軽鎖の形成をもたらす）。
【０２１８】
１２個の追加のヒトＶλ遺伝子セグメントの導入。同様の標的化ベクターおよび方法を用いて、追加のｈＶλ遺伝子セグメントを、上に記載された各改変物に独立して付加した。追加のｈＶλ遺伝子セグメントを含む標的化ベクターによる相同組換えから生じる最終的な遺伝子座の構造は、図７Ａおよび７Ｂに示されている。
【０２１９】
簡潔には、上に記載された改変されたマウスκおよびλ軽鎖遺伝子座に１２個の追加のｈＶλ遺伝子セグメントを導入するために、標的化ベクターを作出した（図５Ａおよび５Ｂ，＋１２−λまたは１２−κ標的化ベクター）。クラスターＢ由来の１２個の連続したｈＶλ遺伝子セグメントを含むヒトＢＡＣクローンＲＰ１１−２２ｌ１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）由来の９３，６７４ｂｐのＤＮＡフラグメントを、内在性マウスκまたはλ軽鎖遺伝子座に対して５’側のマウスゲノム配列を含む５’相同性アームおよびヒトゲノムλ配列を含む３’相同性アームを用いて操作した。この標的化構築物において使用された５’相同性アームは、上に記載された１６個のｈＶλ遺伝子セグメントの付加に使用されたものと同じ５’相同性アームだった（図５Ａおよび５Ｂ）。ＢＡＣクローンＲＰ１１−７６１ｌ１３由来のヒトλ配列の２７，４６８ｂｐのゲノムフラグメントに含まれるヒトＶλ３−２９Ｐ遺伝子セグメントに対して約３４３１ｂｐだけ５’側にＰＩ−ＳｃｅＩ部位を作出することによって、３’相同性アームを作製した。このＰＩ−ＳｃｅＩ部位は、＋１６−λまたは＋１６−κ標的化ベクター（図５Ａおよび５Ｂ）を用いて、追加のヒトλ配列の約９４ｋｂのフラグメントと、先の改変におけるヒトλ配列の５’末端と重複するヒトλ配列の約２７ｋｂのフラグメントとを連結するライゲーション点として働いた。これらの２つの標的化ベクターは、５’から３’に向かって、内在性κ軽鎖遺伝子座の５’側の約２３ｋｂのマウスゲノム配列または内在性λ軽鎖遺伝子座の５’側の約２４ｋｂのマウスゲノム配列を含む５’相同性アーム、５’Ｆｒｔ部位、ネオマイシンカセット、３’Ｆｒｔ部位、ならびに１６個のｈＶλ遺伝子セグメントおよびＰＩ−ＳｃｅＩ部位を含む１２１，１８８ｂｐのヒトゲノムλ配列（そのうちの約２７ｋｂは、１６個の追加のｈＶλ遺伝子セグメントの挿入からのヒトλ配列の５’末端と重複し、この標的化構築物に対する３’相同性アームとして働く）を含んだ（図５Ａおよび５Ｂ，＋１２−λまたは１２−κ標的化ベクター）。これらの標的化ベクターによる相同組換えによって、内在性マウス定常遺伝子（ＣκまたはＣλ２）に作動可能に接続された４０個のｈＶλ遺伝子セグメントおよびヒトＪλ１を含む改変されたマウスκおよびλ軽鎖遺伝子座が独立して作製された（それらは、組換えが生じると、キメラ軽鎖の形成をもたらす）（図５Ａおよび５Ｂの下部）。
【０２２０】
同様の様式において、＋１２−κ標的化ベクターを使用することによっても、組み込まれたヒトκ配列ありおよびなしで複数のｈＪλ遺伝子セグメントを組み込むその他の最初の改変物（図４Ｂ）に、１２個の追加のｈＶλ遺伝子セグメントを導入した。その他の改変物を含む内在性マウスκ遺伝子座におけるこの標的化ベクターによる相同組換えによって、内在性マウスＣκ遺伝子に作動可能に接続されたヒトＶκ−Ｊκゲノム配列ありおよびなしで４０個のｈＶλ遺伝子セグメントならびにｈＪλ１、２、３および７遺伝子セグメントを含むマウスκ軽鎖遺伝子座が作製された（それらは、組換えが生じると、キメラλ−κ軽鎖の形成をもたらす）。
【０２２１】
実施例ＩＶ
ヒトλ軽鎖遺伝子セグメントを有する標的化されたＥＳ細胞の同定
前述の実施例に従って作製された標的化されたＢＡＣ  ＤＮＡを使用して、マウスＥＳ細胞をエレクトロポレートすることにより、ヒトλ軽鎖遺伝子セグメントを発現するキメラマウス作製用の改変されたＥＳ細胞を作製した。再配列されていないヒトλ軽鎖遺伝子セグメントの挿入を含むＥＳ細胞を定量的ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイによって同定した。特異的プライマーセットおよびプローブを、ヒトλ配列および付随する選択カセットの挿入（対立遺伝子の獲得，ＧＯＡ）、内在性マウス配列および任意の選択カセットの喪失（対立遺伝子の喪失，ＬＯＡ）、ならびに隣接するマウス配列の保持（対立遺伝子の保持，ＡＲ）についてデザインした。ヒトλ配列の追加の各挿入については、追加のプライマーセットおよびプローブを使用して、その追加のヒトλ配列の存在を確かめ、ならびに先のプライマーセットおよびプローブを使用して、先に標的化されていたヒト配列の保持を確かめた。表１は、定量的ＰＣＲアッセイにおいて使用されたプライマーおよび関連するプローブを示している。表２は、ＥＳ細胞クローンにおいてヒトλ軽鎖遺伝子セグメントの各区分の挿入を確かめるために使用された組み合わせを示している。
【０２２２】
ヒトＶλ５−５２−Ｖλ１−４０遺伝子セグメントを含む標的化構築物の挿入によって導入されたＦｒｔで挟まれたネオマイシンカセットを除去するために、ヒトλ軽鎖遺伝子セグメントを有するＥＳ細胞は必要に応じて、ＦＬＰを発現する構築物でトランスフェクトされる（図５Ａおよび５Ｂ）。そのネオマイシンカセットは必要に応じて、ＦＬＰリコンビナーゼを発現するマウス（例えば、米国特許第６，７７４，２７９号）と交配させることによって除去され得る。そのネオマイシンカセットは、必要に応じて、それらのマウスに保持される。
【０２２３】
【表１】
2020128440.tif 000003
【０２２４】
【表２−１】
2020128440.tif 000004
【０２２５】
【表２−２】
2020128440.tif 000005
実施例Ｖ
内在性軽鎖遺伝子座からヒトλ軽鎖を発現するマウスの作製
上に記載された標的化されたＥＳ細胞を、ドナーＥＳ細胞として使用し、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法によって８細胞期のマウス胚に導入した（例えば、米国特許第７，２９４，７５４号およびＰｏｕｅｙｍｉｒｏｕら（２００７）Ｆ０  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｍｉｃｅ  ｔｈａｔ  ａｒｅ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｆｕｌｌｙ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｄｏｎｏｒ  ｇｅｎｅ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  ＥＳ  ｃｅｌｌｓ  ａｌｌｏｗｉｎｇ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ａｎａｌｙｓｅｓ  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２５（１）：９１−９９を参照のこと）。ヒトλ遺伝子セグメントを独立して有するＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）（完全にドナーＥＳ細胞に由来するＦ０マウス）を、独特のヒトλ遺伝子セグメント（前出）の存在を検出する対立遺伝子アッセイの変法（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら、前出）を用いたジェノタイピングによって同定した。
【０２２６】
ヒトλ軽鎖遺伝子セグメントを有するマウスのκ：λ軽鎖使用頻度。単一のｈＪλ遺伝子セグメントを含むｈＶλ遺伝子セグメント（図５Ｂ）の連続した３つの挿入の各々についてホモ接合のマウス、およびヒトＶκ−Ｊκゲノム配列を含む、単一のｈＪλ遺伝子セグメントまたは４個のヒトＪλ遺伝子セグメントを含むｈＶλ遺伝子セグメント（図４Ｂ）の第１の挿入についてホモ接合のマウスを、フローサイトメトリーを用いて脾細胞におけるκおよびλ軽鎖発現について解析した。
【０２２７】
簡潔には、マウスの群（１群あたり３〜７匹の動物の範囲）から脾臓を回収し、スライドガラスを用いて粉砕した。ＡＣＫ溶解緩衝液（Ｌｏｎｚａ  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ）を用いて赤血球（ＲＢＣ）を溶解した後、脾細胞を、マウスＣＤ１９（クローン１Ｄ３；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、マウスＣＤ３（１７Ａ２；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、マウスＩｇκ（１８７．１；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびマウスＩｇλ（ＲＭＬ−４２；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）に特異的な蛍光色素結合体化抗体で染色した。ＢＤ（商標）ＬＳＲ  ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてデータを取得し、ＦＬＯＷＪＯ（商標）ソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ，Ｉｎｃ．）を用いて解析した。表３は、各遺伝的改変を有する動物の群由来の脾細胞において観察されたＢ細胞（ＣＤ１９＋）、κ軽鎖（ＣＤ１９＋Ｉｇκ＋Ｉｇλ−）およびλ軽鎖（ＣＤ１９＋Ｉｇκ−Ｉｇλ＋）発現についての平均パーセント値を示している。
【０２２８】
同様の実験において、マウスＣκ遺伝子に作動可能に接続されたヒトＶκ−Ｊκゲノム配列を含む１２個のｈＶλ遺伝子セグメントおよび４個のｈＪλ遺伝子セグメント（図４Ｂの下部）の第１の挿入についてホモ接合のマウスならびに４０個のｈＶλ遺伝子セグメントおよび１個のｈＪλ遺伝子セグメント（図５Ｂの下部または図７Ｂの上部）についてホモ接合のマウス由来の脾臓のコンパートメントのＢ細胞の含有量を、フローサイトメトリーを用いて（上に記載されたように）ＩｇκおよびＩｇλ発現について解析した。図８Ａは、各群の代表的なマウスに対するＣＤ１９＋Ｂ細胞におけるＩｇλおよびＩｇκ発現を示している。脾臓１つあたりのＣＤ１９＋Ｂ細胞の数もまた、各マウスについて記録した（図８Ｂ）。
【０２２９】
別の実験では、マウスＣκ遺伝子に作動可能に接続されたヒトＶκ−Ｊκゲノム配列を含む４０個のｈＶλ遺伝子セグメントおよび４個のｈＪλ遺伝子セグメント（図７Ｂの下部）についてホモ接合のマウス由来の脾臓および骨髄コンパートメントのＢ細胞の含有量を、様々な細胞表面マーカーのフローサイトメトリーを用いて、Ｂ細胞発生の経過について解析した。
【０２３０】
簡潔には、野生型ならびにマウスＣκ遺伝子に作動可能に接続されたヒトＶκ−Ｊκゲノム配列を含む４０個のｈＶλ遺伝子セグメントおよび４個のｈＪλ遺伝子セグメントについてホモ接合のマウスの２つの群（各々Ｎ＝３、９〜１２週齢、雄および雌）を屠殺し、脾臓および骨髄を回収した。完全ＲＰＭＩ培地（ウシ胎仔血清、ピルビン酸ナトリウム、Ｈｅｐｅｓ、２−メルカプトエタノール、可欠アミノ酸およびゲンタマイシンが補充されたＲＰＭＩ培地）で流すことによって大腿骨から骨髄を回収した。脾臓および骨髄の調製物由来のＲＢＣを、ＡＣＫ溶解緩衝液（Ｌｏｎｚａ  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ）で溶解した後、完全ＲＰＭＩ培地で洗浄した。１×１０６細胞を抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２（２．４Ｇ２，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）とともに氷上で１０分間インキュベートした後、氷上で３０分間、選択された抗体パネルで標識した。
【０２３１】
骨髄パネル：抗マウスＦＩＴＣ−ＣＤ４３（１Ｂ１１，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＰＥ−ｃｋｉｔ（２Ｂ８，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＰｅＣｙ７−ＩｇＭ（ＩＩ／４１，ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５−ＩｇＤ（１１−２６ｃ．２ａ，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＡＰＣ−Ｂ２２０（ＲＡ３−６Ｂ２，ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＡＰＣ−Ｈ７−ＣＤ１９（ＩＤ３，ＢＤ）およびＰａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ−ＣＤ３（１７Ａ２，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）。
【０２３２】
骨髄および脾臓パネル：抗マウスＦＩＴＣ−Ｉｇκ（１８７．１，ＢＤ）、ＰＥ−Ｉｇλ（ＲＭＬ−４２，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＰｅＣｙ７−ＩｇＭ（ＩＩ／４１，ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５−ＩｇＤ（１１−２６ｃ．２ａ，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ−ＣＤ３（１７Ａ２，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＡＰＣ−Ｂ２２０（ＲＡ３−６Ｂ２，ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＡＰＣ−Ｈ７−ＣＤ１９（ＩＤ３，ＢＤ）。
【０２３３】
染色後、細胞を洗浄し、２％ホルムアルデヒド中で固定した。ＦＡＣＳＣＡＮＴＯＩＩ（商標）フローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）においてデータを取得し、ＦＬＯＷＪＯ（商標）ソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ，Ｉｎｃ．）を用いて解析した。図９Ａ〜９Ｄは、各群の代表的な１匹のマウスの脾臓コンパートメントについての結果を示している。図１０Ａ〜１０Ｅは、各群の代表的な１匹のマウスの骨髄コンパートメントについての結果を示している。表４は、様々な遺伝的改変を有する動物の群由来の脾細胞において観察されたＢ細胞（ＣＤ１９＋）、κ軽鎖（ＣＤ１９＋Ｉｇκ＋Ｉｇλ−）およびλ軽鎖（ＣＤ１９＋Ｉｇκ−Ｉｇλ＋）発現についての平均パーセント値を示している。表５は、野生型ならびにマウスＣκ遺伝子に作動可能に接続されたヒトＶκ−Ｊκゲノム配列を含む４０個のｈＶλ遺伝子セグメントおよび４個のｈＪλ遺伝子セグメントについてホモ接合のマウスの骨髄において観察されたＢ細胞（ＣＤ１９＋）、成熟Ｂ細胞（Ｂ２２０ｈｉＩｇＭ＋）、未熟Ｂ細胞（Ｂ２２０ｉｎｔＩｇＭ＋）、κ軽鎖を発現する未熟Ｂ細胞（Ｂ２２０ｉｎｔＩｇＭ＋Ｉｇκ＋）およびλ軽鎖を発現する未熟Ｂ細胞（Ｂ２２０ｉｎｔＩｇＭ＋Ｉｇλ＋）についての平均パーセント値を示している。この実験は、上に記載された追加のマウス群を用いて繰り返され、同様の結果を示した（データ示さず）。
【０２３４】
【表３】
2020128440.tif 000006
【０２３５】
【表４】
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【０２３６】
【表５】
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ヒトλ軽鎖遺伝子セグメントを有するマウスにおけるヒトＶλ遺伝子の使用頻度。ヒトλ配列の第１の挿入（ｈＶλ３−１２−ｈＶλ３−１およびｈＪλ１，図５Ｂ）についてヘテロ接合のマウスおよびヒトλ配列の第３の挿入（ｈＶλ５−５２−ｈＶλ３−１およびｈＪλ１，図５Ｂ）についてホモ接合のマウスを、脾細胞から単離されたＲＮＡを用いた逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によってヒトλ軽鎖遺伝子の使用頻度について解析した。
【０２３７】
簡潔には、脾臓を回収し、滅菌された使い捨てバッグにおいて、５％ＨＩ−ＦＢＳを含む１０ｍＬのＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）で灌流した。次いで、１個の脾臓が入った各バッグをＳＴＯＭＡＣＨＥＲ（商標）（Ｓｅｗａｒｄ）に入れ、中位の設定で３０秒間ホモジナイズした。ホモジナイズされた脾臓を０．７μｍセルストレーナーで濾過し、次いで、遠心機でペレットにし（１０００ｒｐｍで１０分間）、ＲＢＣをＢＤ  ＰＨＡＲＭ  ＬＹＳＥ（商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で３分間溶解した。脾細胞をＲＰＭＩ−１６４０で希釈し、再度遠心した後、１ｍＬのＰＢＳ（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に再懸濁した。ペレットになった脾細胞から、当該分野で公知の標準的な手法を用いてＲＮＡを単離した。
【０２３８】
ヒトｈＶλ遺伝子セグメントおよびマウスＣκ遺伝子に特異的なプライマー（表６）を用いて、脾細胞ＲＮＡにおいてＲＴ−ＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物をゲル精製し、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ  ＴＡベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、そのベクター内のクローニング部位に隣接する位置に位置するプライマーＭ１３Ｆｏｒｗａｒｄ（ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧ；配列番号５５）およびＭ１３Ｒｅｖｅｒｓｅ（ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ；配列番号５６）を用いて配列決定した。ヒトλ配列の第１および第３の挿入に由来する合計８４個のクローンの配列決定を行うことにより、ｈＶλ遺伝子の使用頻度を決定した（表７）。選択されたＲＴ−ＰＣＲクローンについてのｈＶλ−ｈＪλ１−ｍＣκジャンクションのヌクレオチド配列を図１１に示す。
【０２３９】
同様の様式において、内在性マウスＣκ遺伝子に作動可能に接続されたヒトλ軽鎖遺伝子配列（すなわち、ヒトＶκ−Ｊκゲノム配列を含む４０個のｈＶλ遺伝子セグメントおよび４個のｈＪλ遺伝子セグメント，図７Ｂの下部）の第３の挿入についてホモ接合のマウスを、脾細胞から単離されたＲＮＡを用いるＲＴ−ＰＣＲによってヒトλ軽鎖遺伝子の使用頻度について解析した（上に記載されたように）。２６個の選択されたＲＴ−ＰＣＲクローンについてのヒトλ軽鎖遺伝子セグメントの使用頻度を表８に示す。選択されたＲＴ−ＰＣＲクローンについてのｈＶλ−ｈＪλ−ｍＣκジャンクションのヌクレオチド配列を図１２に示す。
【０２４０】
同様の様式において、内在性マウスＣλ２遺伝子に作動可能に接続されたヒトλ軽鎖遺伝子セグメント（１２個のｈＶλ遺伝子セグメントおよびｈＪλ１，図４Ａおよび図５Ａ）の第１の挿入についてホモ接合のマウスを、脾細胞から単離されたＲＮＡを用いるＲＴ−ＰＣＲによってヒトλ軽鎖遺伝子の使用頻度について解析した（上に記載されたように）。ｈＶλ遺伝子セグメントに特異的なプライマー（表６）を、マウスＣλ２遺伝子に特異的な２つのプライマー；Ｃλ２−１（配列番号１０４）またはＣλ２−２（配列番号１０５）のうちの１つと対にした。
【０２４１】
ｈλ１に再配列された複数のｈＶλ遺伝子セグメントが、内在性マウスλ軽鎖遺伝子座にヒトλ軽鎖遺伝子セグメントを有するマウス由来のＲＴ−ＰＣＲクローンから観察された。選択されたＲＴ−ＰＣＲクローンについてのｈＶλ−ｈＪλ−ｍＣλ２ジャンクションのヌクレオチド配列を図１３に示す。
【０２４２】
【表６】
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【０２４３】
【表７】
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図１１は、単一のｈＪλ遺伝子セグメントとともにｈＶλ遺伝子セグメントの第１および第３の挿入を有するマウス由来のＲＴ−ＰＣＲクローンについてのｈＶλ−ｈＪλ１−ｍＣκジャンクションの配列を示している。図１１に示されている配列は、マウスＣκ遺伝子に組み換えられたｈＪλ１とともに種々のｈＶλ遺伝子セグメントを含む独特の再配列を示している。１２個のｈＶλ遺伝子セグメントおよびｈＪλ１を含む単一の改変された内在性κ遺伝子座を有するヘテロ接合マウスと、４０個のｈＶλ遺伝子セグメントおよびｈＪλ１を含む２個の改変された内在性κ遺伝子座を有するホモ接合マウスの両方ともが、マウスＣκ遺伝子に作動可能に接続されたヒトλ遺伝子セグメントを生成することができ、ヒトλ軽鎖を発現するＢ細胞を産生することができた。これらの再配列は、それらのキメラ遺伝子座が、これらのマウスの複数の独立したＢ細胞においてヒトλ遺伝子セグメントを独立して再配列することができたことを実証する。さらに、ｈＪλ１とともに再配列すると観察された１６個の異なるｈＶλ遺伝子セグメントによって証明されるように（表７）、内在性κ軽鎖遺伝子座に対するこれらの改変は、いずれのｈＶλ遺伝子セグメントも作動不能にせず、またＢ細胞発生中にキメラ遺伝子座が複数のｈＶλおよびｈＪλ（Ｊλ１）遺伝子セグメントの組換えを妨げなかった。さらに、これらのマウスは、内在性免疫グロブリン軽鎖レパートリーの一部としてマウスＣκ遺伝子に作動可能に接続された再配列されたヒトＶλ−Ｊλ遺伝子セグメントを含む機能的な抗体を産生した。
【０２４４】
図１２は、ヒトＶκ−Ｊκゲノム配列を含む４０個のｈＶλ遺伝子セグメントおよび４個のｈＪλ遺伝子セグメントについてホモ接合のマウス由来の選択されたＲＴ−ＰＣＲクローンについてのｈＶλ−ｈＪλ−ｍＣκジャンクションの配列を示している。図１２に示されている配列は、キメラ遺伝子座全体にわたって複数の異なるｈＶλ遺伝子セグメントを含む独特の追加の再配列を示している（複数の異なるｈＪλ遺伝子セグメントは、再配列され、マウスＣκ遺伝子に作動可能に接続されている）。４０個のｈＶλ遺伝子セグメントおよび４個のｈＪλ遺伝子セグメントを含む改変された内在性κ遺伝子座を有するホモ接合マウスもまた、マウスＣκ遺伝子に作動可能に接続されたヒトλ遺伝子セグメントを生成することができ、ヒトλ軽鎖を発現するＢ細胞を産生することができた。これらの再配列は、すべての段階のキメラ遺伝子座が、これらのマウスの複数の独立したＢ細胞においてヒトλ遺伝子セグメントを独立して再配列することができたことをさらに実証する。さらに、２６個の選択されたＲＴ−ＰＣＲクローン由来の４つすべてのｈＪλ遺伝子セグメントとともに再配列すると観察された１２個の異なるｈＶλ遺伝子セグメントによって証明されるように（表８）、内在性κ軽鎖遺伝子座に対するこれらの追加の改変は、ヒトλ遺伝子セグメントの各挿入が、いずれのｈＶλ遺伝子セグメントおよび／またはＪλ遺伝子セグメントも作動不能にせず、またＢ細胞発生中にキメラ遺伝子座がｈＶλおよびＪλ遺伝子セグメントの組換えを妨げなかったことを実証する。さらに、これらのマウスも同様に、内在性免疫グロブリン軽鎖レパートリーの一部としてマウスＣκ領域に作動可能に接続されたヒトＶλ−Ｊλ遺伝子セグメントを含む機能的な抗体を産生した。
【０２４５】
図１３は、１２個のｈＶλ遺伝子セグメントおよびｈＪλ１についてホモ接合のマウス由来の３個の個別のＲＴ−ＰＣＲクローンについてのｈＶλ−ｈＪλ−ｍＣλ２ジャンクションの配列を示している。図１３に示されている配列は、第１の挿入の長さにわたって異なるｈＶλ遺伝子セグメントを含む追加の独特の再配列を示している（ｈＪλ１は、再配列され、マウスＣλ２遺伝子に作動可能に接続されている）（２Ｄ１＝Ｖλ２−８Ｊλ１；２Ｄ９＝Ｖλ３−１０Ｊλ１；３Ｅ１５＝Ｖλ３−１Ｊλ１）。１つのクローンが、ｈＶλ−ｈＪλジャンクションにおけるＮの付加に起因して、非産生性の再配列を示した（２Ｄ１，図１３）。これは、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えでは珍しいことではない。なぜなら、組換え中の遺伝子セグメントの連結は不正確であると示されているからである。このクローンは、これらのマウスの軽鎖レパートリーに存在する非産生性の組換え体を代表するが、これは、抗体遺伝子間のジャンクションの多様性に寄与する遺伝的メカニズムが、これらのマウスにおいて正常に作動しており、それにより、より高い多様性を有する軽鎖を含む抗体レパートリーがもたらされることを実証する。
【０２４６】
１２個のｈＶλ遺伝子セグメントおよびｈＪλ１を含む改変された内在性λ遺伝子座を有するホモ接合マウスもまた、内在性マウスＣλ遺伝子に作動可能に接続されたヒトλ遺伝子セグメントを生成することができ、マウスＣλ領域に接続されたｈＶλ領域を含むリバースキメラλ軽鎖を発現するＢ細胞を産生することができた。これらの再配列はさらに、その他の軽鎖遺伝子座（すなわち、λ遺伝子座）に配置されたヒトλ軽鎖遺伝子セグメントが、これらのマウスの複数の独立したＢ細胞においてヒトλ遺伝子セグメントを独立して再配列することができたことを実証する。さらに、内在性λ軽鎖遺伝子座に対する改変は、ヒトλ遺伝子セグメントの挿入が、いずれのｈＶλ遺伝子セグメントおよび／またはｈＪλ１遺伝子セグメントも作動不能にせず、またＢ細胞発生中にキメラ遺伝子座がｈＶλおよびｈＪλ１遺伝子セグメントの組換えを妨げなかったことを実証する。さらに、これらのマウスもまた、内在性免疫グロブリン軽鎖レパートリーの一部としてマウスＣλ領域に作動可能に接続されたヒトＶλ−Ｊλ遺伝子セグメントを含む機能的な抗体を産生した。
【０２４７】
機能的な軽鎖は、脾臓と骨髄の両方におけるＢ細胞発生の様々なチェックポイントにおいて必要とされるので、この実施例で示されるように、内在性κおよびλ軽鎖遺伝子座にヒトλ軽鎖遺伝子セグメントを有するマウスは、ヒトλ軽鎖遺伝子セグメントを再配列すること、ならびにそれらをそのマウスの通常の抗体レパートリーの一部としてマウスＣκおよび／またはＣλ領域という背景において発現することができる。さらに、Ｂ細胞の初期のサブセット（例えば、プレ−、プロ−および移行Ｂ細胞）が、これらのマウスにおいて野生型同腹仔と比べて正常な表現型を示す（図９Ｄ、１０Ａおよび１０Ｂ）。骨髄および末梢Ｂ細胞集団において軽微な欠陥が観察された（これは、自己反応性未熟Ｂ細胞のサブセットの欠失および／またはヒトλ軽鎖とマウス重鎖との最適以下の会合に起因し得る）。しかしながら、これらのマウスにおいて観察されたＩｇκ／Ｉｇλ使用頻度は、マウスにおいて観察される軽鎖発現よりもヒト軽鎖発現に似た状況を示す。
【０２４８】
実施例ＶＩ
内在性軽鎖遺伝子座からヒトλ軽鎖を発現するマウスの交配
内在性マウス軽鎖遺伝子座におけるヒトλ遺伝子セグメントの使用頻度を最適化するために、再配列されていないヒトλ遺伝子セグメントを有するマウスを、対立する内在性軽鎖遺伝子座（κまたはλ）に欠失を含む別のマウスと交配させる。例えば、内在性κ遺伝子座に位置づけられたヒトλ遺伝子セグメントだけが、内在性λ軽鎖遺伝子座にも欠失を有するマウスに存在する機能的な軽鎖遺伝子セグメントであり得る。この様式では、得られる子孫は、前述の実施例に記載されたようにヒトλ軽鎖だけを発現し得る。交配は、当該分野において認められている標準的な手法によって、およびあるいは、営利会社、例えば、Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙによって、行われる。内在性κ遺伝子座にヒトλ軽鎖遺伝子セグメントを有し、かつ内在性λ軽鎖遺伝子座の欠失を有するマウス系統は、独特のリバースキメラ（ヒト−マウス）λ軽鎖の存在および内在性マウスλ軽鎖の非存在についてスクリーニングされる。
【０２４９】
再配列されていないヒトλ軽鎖遺伝子座を有するマウスは、ヒト重鎖可変遺伝子の遺伝子座による内在性マウス重鎖可変遺伝子の遺伝子座の置換を含むマウス（米国特許第６，５９６，５４１号，Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓを参照のこと。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）遺伝子操作マウス）とも交配される。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスには、内在性マウス定常領域遺伝子座に作動可能に接続されたヒト重鎖可変領域を含むゲノムを有するマウスが部分的に含まれる（そのマウスは、抗原性の刺激に応答してヒト重鎖可変領域およびマウス重鎖定常領域を含む抗体を産生する）。それらの抗体の重鎖の可変領域をコードするＤＮＡは、単離され得、ヒト重鎖定常領域をコードするＤＮＡに作動可能に接続され得る。次いで、そのＤＮＡは、抗体の完全ヒト重鎖を発現することができる細胞において発現され得る。好適な交配スケジュールが行われると、ヒト重鎖遺伝子座による内在性マウス重鎖遺伝子座の置換を有し、かつ内在性κ軽鎖遺伝子座に再配列されていないヒトλ軽鎖遺伝子座を有するマウスが得られる。目的の抗原で免疫されると、体細胞変異したヒト重鎖可変領域およびヒトλ軽鎖可変領域を含む抗体が単離され得る。
【０２５０】
実施例ＶＩＩ
ヒト重鎖およびヒトλ軽鎖を発現するマウスからの抗体の産生
再配列されていないヒトλ軽鎖遺伝子座を含むマウスを他の内在性Ｉｇ遺伝子座の改変および欠失（上に記載されたような）を含む様々な所望の系統と交配させた後、選択されたマウスを目的の抗原で免疫する。
【０２５１】
一般には、単一の再配列されたヒト生殖細胞系列軽鎖領域のうちの１つを含むＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスを抗原で負荷（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）し、その動物の血清からリンパ細胞（例えば、Ｂ細胞）を回収する。そのリンパ細胞をミエローマ細胞株と融合させることにより、不死のハイブリドーマ細胞株が調製され、そのようなハイブリドーマ細胞株をスクリーニングし、選択することにより、ヒト重鎖およびヒトλ軽鎖を含む、免疫に使用した抗原に特異的な抗体を産生するハイブリドーマ細胞株が同定され得る。その重鎖およびλ軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡを単離し、その重鎖および軽鎖の望ましいアイソタイプの定常領域に接続し得る。内在性マウスλ遺伝子座と比べてさらにｈＶλ遺伝子セグメントが存在するおかげで、軽鎖レパートリーの多様性は、劇的に増加し、免疫されると抗原特異的レパートリーに対してより高い多様性を付与する。得られるクローニングされた抗体配列は、続いて、ＣＨＯ細胞などの細胞において生成され得る。あるいは、抗原特異的キメラ抗体または軽鎖および重鎖の可変ドメインをコードするＤＮＡが、抗原特異的リンパ球（例えば、Ｂ細胞）から直接単離され得る。
【０２５２】
はじめに、ヒト可変領域およびマウス定常領域を有する高親和性キメラ抗体が単離される。上に記載されたように、それらの抗体を特徴付け、親和性、選択性、エピトープなどをはじめとした望ましい特徴について選択する。それらのマウス定常領域を、所望のヒト定常領域で置換することにより、体細胞変異したヒト重鎖、および本発明の再配列されていないヒトλ軽鎖遺伝子座に由来するヒトλ軽鎖を含む完全ヒト抗体が生成される。好適なヒト定常領域としては、例えば、野生型のまたは改変されたＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４が挙げられる。
（項目１）  生殖細胞系列において、内在性マウス軽鎖遺伝子座にヒトλ軽鎖可変領域配列を含むマウスであって、ここで、該ヒトラムダ可変領域配列は、マウス免疫グロブリン定常領域遺伝子配列を含む軽鎖において発現される、マウス。
（項目２）  上記内在性マウス軽鎖遺伝子座が、λ遺伝子座である、項目１に記載のマウス。
（項目３）  上記内在性マウス軽鎖遺伝子座が、κ遺伝子座である、項目１に記載のマウス。
（項目４）  上記マウスが、上記内在性マウス軽鎖遺伝子座において内在性軽鎖可変配列を欠く、項目１に記載のマウス。
（項目５）  すべてまたは実質的にすべての内在性マウス軽鎖可変領域遺伝子セグメントが、１つ以上のヒトλ可変領域遺伝子セグメントで置換されている、項目１に記載のマウス。
（項目６）  上記ヒトλ軽鎖可変領域配列が、ヒトＪλ配列を含む、項目１に記載のマウス。
（項目７）  上記ヒトＪλ配列が、Ｊλ１、Ｊλ２、Ｊλ３、Ｊλ７およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、項目６に記載のマウス。
（項目８）  上記ヒトλ軽鎖可変領域配列が、ヒト軽鎖遺伝子座のクラスターＡのフラグメントを含む、項目１に記載のマウス。
（項目９）  上記ヒトλ軽鎖遺伝子座のクラスターＡのフラグメントが、ｈＶλ３−２７からｈＶλ３−１にわたる、項目８に記載のマウス。
（項目１０）  上記ヒトλ軽鎖可変領域配列が、ヒト軽鎖遺伝子座のクラスターＢのフラグメントを含む、項目１に記載のマウス。
（項目１１）  上記ヒトλ軽鎖遺伝子座のクラスターＢのフラグメントが、ｈＶλ５−５２からｈＶλ１−４０にわたる、項目１０に記載のマウス。
（項目１２）  上記ヒトλ軽鎖可変領域配列が、クラスターＡのゲノムフラグメントおよびクラスターＢのゲノムフラグメントを含む、項目１に記載のマウス。
（項目１３）  上記ヒトλ軽鎖可変領域配列が、クラスターＡの少なくとも１つの遺伝子セグメントおよびクラスターＢの少なくとも１つの遺伝子セグメントを含む、項目１２に記載のマウス。
（項目１４）  上記マウスの軽鎖レパートリーの１０％超が、２−８、２−２３、１−４０、５−４５および９−４９から選択される少なくとも２つのｈＶλ遺伝子セグメントに由来する、項目１に記載のマウス。
（項目１５）  上記マウスの軽鎖レパートリーの２０％超が、２−８、２−２３、１−４０、５−４５および９−４９から選択される少なくとも３つのｈＶλ遺伝子セグメントに由来する、項目１４に記載のマウス。
（項目１６）  上記マウスの軽鎖レパートリーの３０％超が、２−８、２−２３、１−４０、５−４５および９−４９から選択される少なくとも４つのｈＶλ遺伝子セグメントに由来する、項目１５に記載のマウス。
（項目１７）  マウス定常領域と融合されたヒトラムダ可変配列を含む免疫グロブリン軽鎖を発現するマウスであって、ここで、該マウスは、約１：１というκの使用頻度とλの使用頻度との比を示す、マウス。
（項目１８）  上記免疫グロブリン軽鎖が、内在性マウス軽鎖遺伝子座から発現される、項目１７に記載のマウス。
（項目１９）  抗原結合タンパク質を作製するための、前述の項目のいずれか１項に記載されたマウスの使用。
（項目２０）  上記抗原結合タンパク質がヒトの抗原結合タンパク質である、項目１９に記載の使用。
（項目２１）  項目１〜１８のいずれか１項に記載のマウスに由来する、細胞または組織。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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