(57)【要約】【課題】リンパ球性漏斗下垂体後葉炎の病因メカニズムを明らかにし、リンパ球性漏斗下垂体後葉炎のモデル動物を提供すると共に、リンパ球性漏斗下垂体後葉炎に対するＴリンパ球を標的とした新規免疫抑制療法を提供すること。【解決手段】ラブフィリン３Ａを免疫することにより、リンパ球性漏斗下垂体後葉炎実験動物モデルを作製する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラブフィリン３Ａを免疫することにより、リンパ球性漏斗下垂体後葉炎実験動物モデルを作製する方法。
【請求項２】
実験動物が、ラット又はマウスである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
同種の被免疫実験動物に比してラブフィリン３Ａに対するＴ細胞反応性レベルが高い、リンパ球性漏斗下垂体後葉炎実験モデル動物。
【請求項４】
Ｔ細胞反応性を指標として用いる、リンパ球性漏斗下垂体後葉炎の診断方法。
【請求項５】
検体中のＴ細胞反応性を測定するステップを含み、ラブフィリン３Ａへの反応性レベルが高いことが、リンパ球性漏斗下垂体後葉炎であることの指標となる、請求項４に記載の診断方法。
【請求項６】
検体が末梢血である、請求項４又は５に記載の診断方法。
【請求項７】
同種の被免疫実験動物に比してラブフィリン３Ａに対するＴ細胞反応性レベルが高い、リンパ球性漏斗下垂体後葉炎実験モデル動物、あるいは、請求項１又は２に記載の方法により得られるリンパ球性漏斗下垂体後葉炎実験モデル動物を用いる、リンパ球性漏斗下垂体後葉炎の治療に用いることができる化合物を選択する方法。
【請求項８】
Ｔ細胞活性化阻害剤を含有する、リンパ球性漏斗下垂体後葉炎の治療用医薬。
【請求項９】
Ｔ細胞活性化阻害剤が、シクロスポリン、タクロリムス又はアバタセプトである、請求項８に記載の治療用医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はリンパ球性漏斗下垂体後葉炎実験動物モデルを作製する方法に関する。また、本発明は、リンパ球性漏斗下垂体後葉炎に対するＴリンパ球を標的とした免疫抑制療法に関する。
【背景技術】
【０００２】
リンパ球性漏斗下垂体後葉炎（「ＬＩＮＨ」との略称が用いられることもある）は、原因不明の下垂体機能障害の一つである。リンパ球性漏斗下垂体後葉炎は、１９７０年に初めて報告された疾患であり、非特許文献１には、「Ｉ．主症候」として、「頻尿、多飲、口渇などの尿崩症に特有な症候」を挙げ、「ＩＩ．検査・病理所見」として、
１．中枢性尿崩症に合致する検査所見
２．画像検査で、下垂体茎の限局的肥厚、または下垂体神経葉の腫大
造影剤による強い造影増強効果
３．下垂体または下垂体茎生検で、リンパ球を中心とした細胞浸潤、慢性炎症像
を挙げている。
リンパ球性漏斗下垂体後葉炎の有効な治療法は確立されておらず、有効な治療法の確立が望まれている。
【０００３】
特許文献１には、抗ラブフィリン３Ａ抗体からなるリンパ球性漏斗下垂体後葉炎のバイオマーカーや、リンパ球性漏斗下垂体後葉炎の検査方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２０１３／０８０８１１号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】厚生労働省  間脳下垂体機能障害研究班「自己免疫性視床下部下垂体炎の診断と治療の手引き」
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、特許文献１の開示をもってしても、未だ、リンパ球性漏斗下垂体後葉炎の病因メカニズムは不明であり、また、ラブフィリン３Ａがリンパ球性漏斗下垂体後葉炎の病因に関わっているかは不明であった。そのため、リンパ球性漏斗下垂体後葉炎の治療薬の開発は困難であった。
そこで、本発明が解決しようとする課題は、リンパ球性漏斗下垂体後葉炎の病因メカニズムを明らかにし、リンパ球性漏斗下垂体後葉炎のモデル動物を提供すると共に、リンパ球性漏斗下垂体後葉炎に対するＴリンパ球を標的とした新規免疫抑制療法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は以下のとおりである。
（１）
ラブフィリン３Ａを免疫することにより、リンパ球性漏斗下垂体後葉炎実験動物モデルを作製する方法。
（２）
実験動物が、ラット又はマウスである、（１）に記載の方法。
（３）
同種の被免疫実験動物に比してラブフィリン３Ａに対するＴ細胞反応性レベルが高い、リンパ球性漏斗下垂体後葉炎実験モデル動物。
（４）
Ｔ細胞反応性を指標として用いる、リンパ球性漏斗下垂体後葉炎の診断方法（本発明において、当該診断方法は、補助的な診断方法であってもよく、Ｔ細胞反応性を指標として用いる、リンパ球性漏斗下垂体後葉炎の検査方法であってもよい。したがって、本明細書においては、診断方法を、補助的な診断方法と読み替えてもよく、検査方法と読み替えてもよい。）。
（５）
検体中のＴ細胞反応性を測定するステップを含み、ラブフィリン３Ａへの反応性レベルが高いことが、リンパ球性漏斗下垂体後葉炎であることの指標となる、（４）に記載の診断方法。
（６）
検体が末梢血である、（４）又は（５）に記載の診断方法。
（７）
同種の被免疫実験動物に比してラブフィリン３Ａに対するＴ細胞反応性レベルが高い、リンパ球性漏斗下垂体後葉炎実験モデル動物、あるいは、請求項１又は２に記載の方法により得られるリンパ球性漏斗下垂体後葉炎実験モデル動物を用いる、リンパ球性漏斗下垂体後葉炎の治療に用いることができる化合物を選択する方法。
（８）
Ｔ細胞活性化阻害剤を含有する、リンパ球性漏斗下垂体後葉炎の治療用医薬。
（９）
Ｔ細胞活性化阻害剤が、シクロスポリン、タクロリムス又はアバタセプトである、（８）に記載の治療用医薬。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、リンパ球性漏斗下垂体後葉炎のモデル動物を提供することができると共に、リンパ球性漏斗下垂体後葉炎に対するＴリンパ球を標的とした新規免疫抑制療法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ラブフィリン３Ａで免疫したマウスにおける初回免疫の１ヵ月後の神経下垂体、視索上核（ＳＯＮ）及び視床下部の室傍核（ＰＶＮ）におけるリンパ球浸潤の結果を示す。（図１Ａ及びＢ）造血細胞による浸潤を、（Ａ）対照マウス又は（Ｂ）ラブフィリン３Ａ（ＲＰＨ３Ａ、以下同じ。）で免疫したマウス（免疫化マウス、以下同じ。）から得た神経下垂体のＨ＆Ｅ染色によって可視化した結果を示す（スケールバー：２０μｍ）。（図１Ｃ）高倍率視野（ＨＰＦ）あたりの浸潤性単核細胞数を示す。（図１Ｄ及びＥ）（Ｄ）対照マウス又は（Ｅ）ラブフィリン３Ａで免疫したマウスから得た神経下垂体におけるＣＤ４５の免疫組織化学的染色の結果を示す。（図１Ｆ）ＨＰＦあたりのＣＤ４５+細胞数を示す。（図１Ｇ及びＨ）（Ｇ）対照マウス又は（Ｈ）ラブフィリン３Ａで免疫したマウスから得た神経下垂体におけるＣＤ３ｅの免疫組織化学的染色の結果素示す（スケールバー：５０μｍ）。（図１Ｉ）ＨＰＦあたりのＣＤ３ｅ+細胞数を示す。（図１Ｊ及びＫ）（Ｊ）対照マウス又は（Ｋ）ラブフィリン３Ａで免疫したマウスから得た神経下垂体におけるＣＤ４の免疫組織化学的染色の結果を示す（スケールバー：５０μｍ）。（図１Ｌ）ＨＰＦあたりのＣＤ４+細胞数を示す。（図１Ｍ及びＮ）（Ｍ）対照マウス又は（Ｎ）ラブフィリン３Ａで免疫したマウスから得た神経下垂体におけるＣＤ８ａの免疫組織化学的染色の結果を示す（スケールバー：５０μｍ）。（図１Ｏ）ＨＰＦあたりのＣＤ８ａ+細胞数を示す。（図１Ｐ及びＱ）（Ｐ）対照マウスまたは（Ｑ）ラブフィリン‐３Ａで免疫したマウスから得た神経下垂体におけるＢ２２０の免疫組織化学的染色の結果を示す（スケールバー：５０μｍ）。（図１Ｒ）ＨＰＦあたりのＢ２２０+細胞数を示す。（図１Ｓ及びＴ）ラブフィリン３Ａで免疫したマウスにおける（Ｓ）ＳＯＮ又は（Ｔ）ＰＶＮにおけるＣＤ３ｅの免疫組織化学染色の結果を示す（スケールバー：５０μｍ）。図中、ｔ検定において、＊は、ｐ＜０．０５、＊＊は、ｐ＜０．０１であることを意味する。また、Ｎ．Ｓ．は、有意差なしである。
【図２】ラブフィリン３Ａで免疫したマウスの下垂体前葉の組織学的分析の結果を示す。（図２Ａ）ラブフィリン３Ａで免疫したマウスから得た下垂体前葉に造血細胞はほとんど観察されなかった（スケールバー：２０μｍ）。（図２Ｂ及びＣ）ラブフィリン３Ａで免疫したマウスと対照との間に（Ｂ）コルチコステロン又は（Ｃ）チロキシンのレベルに有意差はなかった。
【図３】大脳皮質、副腎髄質及び膵臓におけるＣＤ３のＨ＆Ｅ染色及び免疫組織化学的染色の結果を示す。（図３Ａ〜Ｃ）大脳皮質、副腎髄質又は膵臓にリンパ球浸潤は見られなかった。（図３Ｄ〜Ｆ）対照又はラブフィリン３Ａで免疫したマウスから得た大脳皮質、副腎髄質及び膵臓のＨ＆Ｅ染色の結果を示す。（図３Ｇ〜Ｉ）大脳皮質、副腎髄質及び膵臓におけるＨＰＦあたりの浸潤性単核細胞数を示す。（図３Ｊ〜Ｌ）ラブフィリン３Ａで免疫したマウスから得た大脳皮質、副腎髄質及び膵臓におけるＣＤ３ｅの免疫組織化学的染色の結果を示す（スケールバー：５０μｍ）。
【図４】大脳皮質におけるラブフィリン３Ａの免疫蛍光染色の結果を示す。（図４Ａ及びＢ）（Ａ）対照マウス及び（Ｂ）免疫化マウスの大脳皮質におけるラブフィリン３Ａの発現の結果を示す。（図４Ｃ）一次抗体なしで染色された免疫蛍光画像を示す（青はＤＡＰＩを示す）。ラブフィリン３Ａ染色は、主に細胞質において観察され、そして小胞状パターンであった（図４Ａ挿入図）。（図４Ｄ）大脳皮質におけるＨＰＦあたりのラブフィリン３Ａを発現する細胞数を示す（スケールバー：５０μｍ）。
【図５】海馬と線条体におけるリンパ球浸潤の結果を示す。免疫組織化学的検査により評価したところ、（Ａ）対照又は（Ｂ）ラブフィリン３Ａで免疫したマウスから得た海馬、あるいは（Ｃ）対照又は（Ｄ）ラブフィリン３Ａで免疫したマウスから得た線条体におけるＣＤ３ｅ+Ｔ細胞による浸潤は見られなかった（スケールバー：５０μｍ）。
【図６】初回免疫の１ヵ月後に、対照マウスと比較したラブフィリン３Ａで免疫したマウスからの低張性尿量の増加を示す。（図６Ａ）尿量は、対照マウスよりもラブフィリン３Ａで免疫したマウスにおいて有意に高かった。（図６Ｂ）尿浸透圧は、対照マウスよりもラブフィリン３Ａで免疫したマウスにおいて有意に低かった。（図６Ｃ）尿中アルギニンバソプレシン（ＡＶＰ）レベルは、対照マウスよりもラブフィリン３Ａで免疫したマウスにおいてより低い傾向があった。（図６Ｄ）１−デスアミノ−８−Ｄ−アルギニンバソプレシン（ｄＤＡＶＰ）耐性試験において尿量が一時的に減少した。
【図７】神経下垂体におけるＡＶＰの免疫蛍光染色の結果を示す。ＡＶＰは、（Ａ）対照及び（Ｂ）ラブフィリン３Ａで免疫したマウスから得た神経下垂体において同様のレベルで発現していた（スケールバー：５０μｍ）。
【図８】対照又はラブフィリン３Ａで免疫したマウスの体重と血糖値の結果を示す。（Ａ）０日目又は（Ｂ）初回免疫の１ヶ月後において、２つの群の間に体重の有意差はなかった。また、（Ｃ）０日目又は（Ｄ）初回免疫の１ヶ月後において、２つの群の間で血糖値に有意差はなかった。
【図９】初回免疫の４ヵ月後の神経下垂体の病理組織学的外観を示す。（図９Ａ）ＣＤ３Ｔ細胞による浸潤が、ラブフィリン３Ａで免疫されたマウスの神経下垂体においてほとんど観察されなかった（スケールバー：１００μｍ）。（図９Ｂ及びＣ）（Ｃ）ラブフィリン３Ａで免疫したマウスにおける神経下垂体の線維性変化を示し、（Ｂ）対照マウスでは観察されなかったことを示す。（スケールバー：５０μｍ）。（図９Ｄ）ラブフィリン３Ａで免疫したマウスと対照マウスとの間に尿量に有意差はなかった。
【図１０】抗ラブフィリン３Ａ抗体の投与は神経下垂体炎を誘発しなかったことを示す。（図１０Ａ）抗ラブフィリン３Ａ抗体は、ラブフィリン３Ａで免疫したマウス由来の血清中に検出されたが、対照マウス中には検出されなかった。（図１０Ｂ及びＣ）（Ｂ）モノクローナル抗ラブフィリン３Ａ抗体のカクテル又は（Ｃ）対照ＩｇＧを投与されたマウスからの下垂体神経変性症におけるＣＤ３ｅの免疫組織化学的染色の結果を示す（スケールバー：５０μｍ）。（図１０Ｄ）抗ラブフィリン３Ａ抗体を投与したマウスと対照ＩｇＧを投与したマウスとの間に尿量に有意差はなかった。
【図１１】ラブフィリン３Ａに特異的Ｔ細胞が、神経下垂体炎の病因に関与している可能性を示す。（図１１Ａ）ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて、ラブフィリン３Ａで免疫したマウス（ラブフィリン３Ａ群、左上）及びアバタセプトを投与したラブフィリン３Ａで免疫したマウス（アバタセプト群、右上）から得た血清中のラブフィリン３Ａに特異的Ｔ細胞を分析した。陽性対照（左下）または陰性対照（右下）として、ＰＢＭＣをＣＤ３抗体あり又はなしで刺激した。（図１１Ｂ）尿量はアバタセプト群の方がラブフィリン３Ａ群よりも有意に低かった。（図１１Ｃ）ラブフィリン３Ａに特異的Ｔ細胞数は、ラブフィリン３Ａ群と比較してアバタセプト群において減少した。（図１１Ｄ及びＥ）（Ｄ）ラブフィリン３Ａ群のマウスおよび（Ｅ）アバタセプト群のマウスの神経下垂体におけるＣＤ３ｅ+細胞の免疫組織化学染色の結果を示す（スケールバー：５０μｍ）。（図１１Ｆ）アバタセプト群と比較して、ラブフィリン３Ａ群ではＣＤ３+Ｔ細胞数が有意に減少した。（図１１Ｇ）ラブフィリン３Ａで免疫したマウスにおけるＰＢＭＣ中の神経下垂体中のＣＤ３ｅ+細胞数とラブフィリン３Ａに特異的Ｔ細胞数との直線的な相関関係を示す。
【図１２】神経下垂体におけるラブフィリン３Ａの免疫蛍光染色の結果を示す。（図１２Ａ〜Ｃ）（Ａ）対照、（Ｂ）ラブフィリン３Ａで免疫したマウス、及び（Ｃ）アバタセプトを投与したラブフィリン３Ａで免疫したマウスの神経下垂体におけるラフフィリン３Ａの発現の結果を示す。（図１２Ｄ）一次抗体ラブフィリン３Ａを含まない組織の免疫蛍光染色は、神経下垂体神経終末において主に発現していた（スケールバー：２５μｍ）。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明におけるリンパ球性漏斗下垂体後葉炎動物モデルを作製する方法は、ラブフィリン３Ａを免疫することにより実施することができる。
本発明においては、ラブフィリン３Ａ免疫マウスにおいて、下垂体後葉炎と低張尿性多尿というヒトにおいて認められるリンパ球性漏斗下垂体後葉炎に類似した症状が観察されたため、ラブフィリン３Ａ免疫マウスをリンパ球性漏斗下垂体後葉炎動物モデルとして確立することができた。
本発明の動物モデル作製法においては、ラブフィリン３Ａを自己抗原として投与して免疫することによりリンパ球性漏斗下垂体後葉炎動物のモデル動物を創出することができるため、本法によれば、モデル動物の継代維持を必要としないという利点を有する。
また、本発明の動物モデル作製法により作出されるモデル動物を用いることにより、リンパ球性漏斗下垂体後葉炎の新規治療用医薬のスクリーニングが可能となる。
【００１１】
本発明においては、リンパ球性漏斗下垂体後葉炎のモデル動物も提供される。
モデル動物の動物種としては、特に限定されるものではないが、実験動物に用いられる動物種が挙げられ、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモットなどのげっ歯類、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、サル、チンパンジー、ヤギなどが挙げられる。
リンパ球性漏斗下垂体後葉炎のモデル動物としては、げっ歯類であることが好ましく、リンパ球性漏斗下垂体後葉炎のモデルマウス又はリンパ球性漏斗下垂体後葉炎のモデルラットなどが挙げられる。
【００１２】
本発明におけるリンパ球性漏斗下垂体後葉炎動物モデルを作製する方法において、自己免疫源となるラブフィリン３Ａは、以下のとおりである。
ラブフィリン３Ａとは、そのＮ末端側にはＲａｂ結合ドメインが存在し、Ｎ末端側にはＣ２Ａドメイン及びＣ２Ｂドメインが存在する全長６９０アミノ酸からなるタンパク質である。
ラブフィリン３Ａのアミノ酸配列及びそれをコードするヌクレオチド配列は、下記の通り公知である（DEFINITION: Homo sapiens rabphilin 3A homolog (mouse), mRNA (cDNA clone MGC:29559 IMAGE:3510158), complete cds. ACCESSION: BC017259））。また、当該ラブフィリン３Ａのアミノ酸配列及びそれをコードするヌクレオチド配列は、特開２０１６−２２３７７４号公報において、配列番号１及び配列番号２として示されている。
本明細書の実施例においては、免疫源とするラブフィリン３Ａとして、当該公報において示されているアミノ酸配列の全長のラブフィリン３Ａを用いている。本発明のリンパ球性漏斗下垂体後葉炎動物モデルを作製する方法において用いられる免疫源としてのラブフィリン３Ａとしては、全長のタンパク質を用いてもよく、その部分アミノ酸配列を有するタンパク質を用いてもよい。
また、ラブフィリン３Ａは、従来公知の方法で製造したものを用いてもよく、従来公知の方法で精製して得られたものを用いてもよい。
【００１３】
被免疫動物への、ラブフィリン３Ａの免疫方法は、特に限定されず、従来公知の免疫方法により免疫することができる。
免疫源であるラブフィリン３Ａと同時に、又は異時に、公知のアジュバントを利用して免疫してもよい。
また、免疫源であるラブフィリン３Ａの投与量も適宜設定することができる。
【００１４】
本発明における、リンパ球性漏斗下垂体後葉炎実験モデル動物は、リンパ球性漏斗下垂体後葉炎を発症している実験モデル動物である。
本発明における、リンパ球性漏斗下垂体後葉炎実験モデル動物は、被免疫動物に、ラブフィリン３Ａを免疫することにより、作製することができるが、以下の特性を有する場合、リンパ球性漏斗下垂体後葉炎実験モデル動物といえる。
本発明において、当該実験モデル動物が、リンパ球性漏斗下垂体後葉炎を発症してリンパ球性漏斗下垂体後葉炎実験モデル動物といえるためには、同種の被免疫実験動物に比してラブフィリン３Ａに対するＴ細胞反応性レベルが高い必要がある。
被免疫実験動物とは、実験動物においてリンパ球性漏斗下垂体後葉炎を発症させるために、ラブフィリン３Ａを投与される動物であって、同種同系統の実験動物を意味し、一般には、被免疫される上で標準動物といえる実験動物の同種同系統の実験動物を意味し、ラブフィリン３Ａ免疫の前後で対照として用いられる動物である。
例えば、実験動物がマウスである場合、同種同系統の実験動物としてＳＪＬマウスが挙げられる。
【００１５】
本発明のリンパ球性漏斗下垂体後葉炎実験モデル動物は、同種の被免疫実験動物に比してラブフィリン３Ａに対するＴ細胞反応性レベルが高いという特性を有するが、本明細書において、「Ｔ細胞反応性レベルが高い」とは、ラブフィリン３Ａに特異的に反応するＴ細胞数が、リンパ球性漏斗下垂体後葉炎実験モデル動物において同種の被免疫実験動物に比して検体（好ましくは血液由来サンプル）中に多いことを意味する。
ラブフィリン３Ａに特異的に反応するＴ細胞数が、リンパ球性漏斗下垂体後葉炎実験モデル動物において同種の被免疫実験動物に比して検体（好ましくは血液由来サンプル）中に、有意差をもって多いことが好ましい。
ラブフィリン３Ａに特異的に反応するＴ細胞数が多いことは、複数の測定の平均として多くてもよく、同種の被免疫実験動物の平均的Ｔ細胞数に対して多くてもよい。
有意差を判定するためには、ｔ検定を利用してよい。
本発明において、検体（好ましくは血液）中のラブフィリン３Ａに特異的に反応するＴ細胞数の測定法は、実施例に記載の方法に準じて行うことが可能である。
【００１６】
本発明のリンパ球性漏斗下垂体後葉炎動物モデルは、特に限定されるものではないが、実施例に記載するように、以下の病態をさらに有していることが好ましい。
すなわち、本発明のリンパ球性漏斗下垂体後葉炎動物モデルは、
（１）同種の被免疫実験動物に比してラブフィリン３Ａに対するＴ細胞反応性レベルが高い、という特性を有するが、さらに、
（２）リンパ球浸潤が神経下垂体及び視索上核に認められる、及び／又は
（３）同種の被免疫実験動物に比して低張性である尿量の増加を示す、といった特性を有していてもよい。
【００１７】
本発明において、「リンパ球浸潤が神経下垂体及び視索上核に認められる」とは、被免疫動物に対してラブフィリン３Ａを免疫源として投与した後、神経下垂体及び視索上核にリンパ球浸潤が観測される場合には、当該ラブフィリン３Ａを免疫源として投与された被免疫動物は、リンパ球性漏斗下垂体後葉炎動物モデルと理解できる。
本発明において、神経下垂体及び視索上核にリンパ球浸潤が観察されるか否かは、実施例に記載の方法に準じて行うことが可能である。
リンパ球浸潤が観察される時期は、ラブフィリン３Ａの免疫を行ってから特定の時期である必要はないが、例えば、ラブフィリン３Ａの初回免疫の１ヶ月後が挙げられる。
【００１８】
本発明において、リンパ球性漏斗下垂体後葉炎実験モデル動物において同種の被免疫実験動物に比して「低張性である尿量の増加を示す」とは、低張性である尿量が多いことを意味する。
低張性である尿量が、リンパ球性漏斗下垂体後葉炎実験モデル動物において同種の被免疫実験動物に比して、有意差をもって多いことが好ましく、尿量を比較して、リンパ球性漏斗下垂体後葉炎実験モデル動物において、例えば、１．５倍量、２倍量であってもよい。
低張性である尿量が多いことは、同種の被免疫実験動物の平均的尿量に対して多くてもよい。また、試験期間の全体において尿量が多くてもよく、１回の尿量として多くてもよい。
本発明において、低張性である尿量の測定法は、尿を公知の方法により採取して測定することが可能である。
【００１９】
本発明においては、リンパ球性漏斗下垂体後葉炎動物モデルを作製できたことにより、本動物モデルを用いることで以下の現象を確認することができた。
すなわち、ラブフィリン３Ａに特異的に反応するＴ細胞が血液中に存在することを見出し、キメラタンパク質であって、Ｔ細胞活性化阻害剤であるアバタセプトを投与したところ、
（１）ラブフィリン３Ａに特異的に反応するＴ細胞数の減少、
（２）下垂体後葉におけるＴ細胞の浸潤の抑制、及び
（３）尿量の減少
を観察することができた。
これらの結果から、ラブフィリン３Ａに特異的に反応するＴ細胞が病態に関与し、Ｔ細胞の活性化抑制が、リンパ球性漏斗下垂体後葉炎の新たな治療につながると考えられた。
そこで、本発明では、Ｔ細胞反応性を指標として用いる、リンパ球性漏斗下垂体後葉炎の診断方法をさらに提供し、また、リンパ球性漏斗下垂体後葉炎に対するＴリンパ球を標的とした免疫抑制療法を提供する。
Ｔリンパ球を標的とした免疫抑制療法として、Ｔ細胞活性化阻害剤を用いることができる。
したがって、本発明のリンパ球性漏斗下垂体後葉炎の治療用医薬は、Ｔ細胞活性化阻害剤を含有する。
【００２０】
本発明におけるリンパ球性漏斗下垂体後葉炎の診断方法は、Ｔ細胞反応性を指標として用いる方法である。
本発明のリンパ球性漏斗下垂体後葉炎の診断方法は、医師の介在を要しない補助的な診断方法であってもよく、Ｔ細胞反応性を指標としてリンパ球性漏斗下垂体後葉炎の可能性が高いことを推定する被験者の検体中のＴ細胞反応性の検査方法であってもよい。
すなわち、本発明においては、リンパ球性漏斗下垂体後葉炎の診断に供することを目的とした、被験者由来の検体中のＴ細胞反応性を測定することによる検査方法であってもよい。
【００２１】
本発明の診断方法において、Ｔ細胞反応性を指標とするとは、検体中のＴ細胞反応性を測定するステップを有していることを実質的に意味する。
Ｔ細胞反応性は、検体中のラブフィリン３Ａに特異的に反応するＴ細胞の数を計測することにより行うことができる。
このことは、本発明の診断方法が、リンパ球性漏斗下垂体後葉炎の有用な診断技術として、ラブフィリン３Ａに特異的に反応するＴ細胞を検出することによるラブフィリン３Ａに特異的に反応するＴ細胞の検出方法であってよいことを意味する。
ラブフィリン３Ａへの特異的Ｔ細胞数を計測するためには、特に限定するものではないが、簡易には、実施例に記載するような酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイが利用可能である。
【００２２】
本発明の診断方法により、リンパ球性漏斗下垂体後葉炎を発症しているか、発症の可能性があると診断可能である。
本発明において、「発症の可能性」には、現在の発症可能性と将来の発症可能性があり、「現在の発症可能性」は、検査時においてリンパ球性漏斗下垂体後葉炎を発症しているか否か又は発症している確率を表すこととなり、「将来の発症可能性」はリンパ球性漏斗下垂体後葉炎を将来発症する可能性を意味する。
したがって、本発明の診断方法は、リンパ球性漏斗下垂体後葉炎を現在発症しているか否かを判定するための手段として、又はリンパ球性漏斗下垂体後葉炎を将来発症する可能性を判定するための手段としても有用である。
【００２３】
本発明の診断方法（検査方法）を実施するにあたっては、その一部の工程において、特開２０１６−２２３７７４号公報及び国際公開第２０１３／０８０８１１号を参照して、これら公報に記載の方法に準じることも可能である。
【００２４】
本発明の診断方法においては、（１）検体を用意するステップを含む。
本発明の診断方法において用いられる検体としては、特に限定されるものではないが、診断方法の対象となる被検体に由来する血液由来サンプルが好適である。
ここで、被検体としては、診断対象となる動物（例えば、モデル動物）であってよく、患者であってもよい。
血液由来サンプルとしては、Ｔ細胞が含まれていれば特に限定されないが、全血又は血清が好ましく用いられる。また、採血箇所は、特に限定されないが、抹消血や静脈血であってよい。
得られた血液由来サンプルから、従来公知の方法により、単核細胞、好適には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を選択してくることが好適である。
【００２５】
選択してきた単核細胞、好適には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に対して例えば、酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイを利用して、ラブフィリン３Ａに特異的に反応するＴ細胞数を計測する。
コントロールに対して、当該Ｔ細胞数が多い場合には、リンパ球性漏斗下垂体後葉炎を発症しているか、発症の可能性があると診断可能である。
ラブフィリン３Ａに特異的に反応するＴ細胞数が、コントロールに対して検体（好ましくは血液由来サンプル）中に、有意差をもって多いことが好ましい。
ラブフィリン３Ａに特異的に反応するＴ細胞数が多いことは、複数の測定の平均として多くてもよく、コントロールの平均的Ｔ細胞数に対して多くてもよい。
検体が患者（ヒト）由来である場合、コントロールは、リンパ球性漏斗下垂体後葉炎を発症していない被検体由来の検体としてもよい。
実際の臨床の現場においては、コントロールに対して、ラブフィリン３Ａに特異的に反応するＴ細胞数が多いことを、ラブフィリン３Ａに特異的に反応するＴ細胞数を計測して、その絶対数として判断してもよい。その場合、特定の数値範囲にある場合を、あるいは、特定の数値以上である場合を、コントロールに対して、ラブフィリン３Ａに特異的に反応するＴ細胞数が多いと判断してもよい。
【００２６】
本発明の診断方法は、他の診断方法と組み合わせてもよく、他の診断方法と組み合わせることで、より精度の高い罹患している疾患がリンパ球性漏斗下垂体後葉炎であるか否か、又はリンパ球性漏斗下垂体後葉炎の発症可能性を判定することが可能となる。
【００２７】
本発明においては、リンパ球性漏斗下垂体後葉炎の治療に用いることができる化合物のスクリーニング方法も提供する。
本発明において、リンパ球性漏斗下垂体後葉炎動物モデルを確立できたことにより、当該モデル動物を用いることにより、リンパ球性漏斗下垂体後葉炎に有効な薬剤をスクリーニングすることができる。
リンパ球性漏斗下垂体後葉炎動物モデルにおいては、
（１）同種の被免疫実験動物に比してラブフィリン３Ａに対するＴ細胞反応性レベルが高い、という特性を有するが、さらに、好適には、
（２）リンパ球浸潤が神経下垂体及び視索上核に認められる、好ましくは、ラブフィリン３Ａの初回免疫の１ヵ月後にリンパ球浸潤が神経下垂体及び視索上核に認められる、及び／又は
（３）同種の被免疫実験動物に比して低張性である尿量の増加を示す、といった特性を有している。
したがって、当該モデル動物に対して化合物を投与して、当該モデル動物における
（１）ラブフィリン３Ａに特異的に反応するＴ細胞数の減少、
（２）下垂体後葉におけるＴ細胞の浸潤の抑制、及び／又は
（３）尿量の減少
を指標としてスクリーニングをすることにより、リンパ球性漏斗下垂体後葉炎の治療及び／又は予防に用いることができる化合物を選択する方法を提供し得る。
すなわち、本発明は、同種の被免疫実験動物に比してラブフィリン３Ａに対するＴ細胞反応性レベルが高い、リンパ球性漏斗下垂体後葉炎実験モデル動物、あるいは、本明細書において記載の方法により得られるリンパ球性漏斗下垂体後葉炎実験モデル動物を用いる、リンパ球性漏斗下垂体後葉炎の治療に用いることができる化合物を選択する方法も提供する。
【００２８】
また、本発明は、リンパ球性漏斗下垂体後葉炎に対するＴリンパ球を標的とした新規免疫抑制療法を提供する。
Ｔ細胞活性化阻害剤であるアバタセプトを投与したところ、本発明において確立されたリンパ球性漏斗下垂体後葉炎動物モデルにおいて、
（１）ラブフィリン３Ａに特異的に反応するＴ細胞数の減少、
（２）下垂体後葉におけるＴ細胞の浸潤の抑制、及び
（３）尿量の減少
を観察することができたものであり、これまでにない、リンパ球性漏斗下垂体後葉炎における薬剤による尿量の増加抑制という効果が確認されている。
したがって、Ｔ細胞活性化阻害剤を用いることにより、リンパ球性漏斗下垂体後葉炎の根本的治療法を提供できる可能性がある。
Ｔ細胞活性化阻害剤としては、特に限定されるものではないが、Ｔ細胞活性化を阻害乃至抑制する物質を用いることができる。
本発明のＴ細胞活性化阻害剤としては、例えば、ラブフィリン３ＡによりＴ細胞活性化が確認される場合に、ラブフィリン３Ａに特異的に反応するＴ細胞数を減少させることのできる物質であり、具体的には、シクロスポリン、タクロリムス及びアバタセプト等が挙げられる。
【００２９】
本発明のＴ細胞活性化阻害剤を含有するリンパ球性漏斗下垂体後葉炎の治療用医薬は、医薬製剤の製造法として一般的に用いられている公知の方法（例えば、日本薬局方に記載の方法）に従って、製造することができる。
医薬製剤としては、特に限定されるものではないが、例えば、錠剤（例えば、糖衣錠、フィルムコーティング錠、舌下錠、口腔内崩壊錠を含む）、散剤、顆粒剤（例えば、細粒を含む）、カプセル剤（例えば、ソフトカプセル、マイクロカプセルを含む）、液剤、トローチ剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤、注射剤（例えば、皮下注射剤、静脈内注射剤、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤を含む）、外用剤（例えば、経鼻投与製剤、経皮製剤、軟膏剤を含む）坐剤（例えば、直腸坐剤、膣坐剤を含む）、ペレット、吸入剤（例えば、経鼻剤、経肺剤を含む）、及び点滴剤等が挙げられる。
固形製剤となる、錠剤、散剤、顆粒剤等は、従来公知の技術を用いて徐放性製剤や速崩性製剤としてもよい。
これら医薬製剤は、経口的又は非経口的（例、局所、直腸、静脈投与等）に投与することができる。
【００３０】
医薬製剤とするにあたって用いられる薬理学的に許容される添加剤としては、本技術分野において汎用される成分を用いることが可能である。
当該添加剤としては、特に限定されるものではないが、例えば、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤及び無痛化剤等が挙げられる。
必要に応じて、当該添加剤として、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤、吸着剤、湿潤剤等を適宜、適量用いてもよい。
【００３１】
Ｔ細胞活性化阻害剤の投与量及び投与方法は、特に限定されるものではなく、投与対象、症状等に応じて適宜選択してよい。
Ｔ細胞活性化阻害剤の投与量は、薬剤に応じて適宜設定されるものでもあり、特に限定されるものではなく、例えば、一日につき約０.０１〜１０００ｍｇであり、当該範囲内で、約０．１ｍｇ以上、約１ｍｇ以上、約２ｍｇ以上、約５ｍｇ以上、約１０ｍｇ以上としてもよく、約５００ｍｇ以下、約２００ｍｇ以下、約１００ｍｇ以下としてもよい。
当該投与量のＴ細胞活性化阻害剤を一日の投与回数に応じて、分割して投与してもよい。
投与回数は、一日あたり１回であってもよく、２回であってもよく、３回であってもよく、投与時間も、食後、食前、食間、空腹時、就寝前等適宜設定してよい。
投与間隔も、特に限定されるものではなく、例えば、毎日、１日おき、２日おき、１週間おき、隔週と適宜設定して投与してよい。
【００３２】
投与対象となる対象、例えば、患者も特に限定されるものではなく、小児であっても、大人であってもよく、その場合の投与量は適宜設定される。
本発明のＴ細胞活性化阻害剤は、それを必要とする対象、例えば、患者に、薬理学的に、薬学的に、あるいは製薬学的に有効量投与することにより、医薬として用い得る。好適には、有効量のＴ細胞活性化阻害剤を対象に投与することにより、リンパ球性漏斗下垂体後葉炎の治療方法又は予防方法が提供される。
【００３３】
本発明においては、Ｔ細胞活性化阻害剤による作用を高める目的として、本発明のＴ細胞活性化阻害剤の用量を減じることを目的として、また、所望の薬効を高める目的として、他の薬剤と併用してもよい。
他の薬剤との併用においては、合剤であってもよく、併用剤として、両者を単剤として投与してもよい。単剤同士を併用して患者に投与する場合には、同時に投与してもよく、別時に投与してもよい。
【実施例】
【００３４】
マウス
雌のＳＪＬ／Ｊマウスは、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｊａｐａｎから購入し、そしてそれらが１０週齢のときに使用した。マウスは参考文献１に記載されているようにして維持した。
【００３５】
免疫原
組換えラブフィリン３Ａタンパク質（ＮＰ＿０５５７６９．２）は、コムギ胚芽無細胞系（ＣｅｌｌＦｒｅｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて以下のように合成し、使用するまで−８０℃で保存した。
具体的には、ラブフィリン３Ａ遺伝子（ＲＰＨ３Ａ）を小麦胚細胞発現のためにベクターｐＥＵ−Ｅ０１−ＭＣＳ−ＴＥＶ−Ｈｉｓ−Ｃ３にクローニングした。組換えラブフィリン３Ａタンパク質を得られたベクターから翻訳した。得られたタンパク質は、Ｃ末端Ｈｉｓ６タグを含む。
まず、転写反応混合物を３７℃で４時間インキュベートした。翻訳反応は、自動不連続バッチタンパク質合成ロボットであるＰｒｏｔｅｍｉｓｔ  ＸＥ装置（ＣｅｌｌＦｒｅｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて行った。
Ｈｉｓ６タグを除去するために、融合タンパク質をＨｉｓタグ付きＴＥＶプロテアーゼで一晩室温で処理した。ＴＥＶプロテアーゼ処理融合タンパク質を、参考文献２に記載されているようにして、固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。
参考文献３に記載されているようにして、ラブフィリン３Ａタンパク質を２ｍｇ／ｍＬに調整して、免疫に利用した。
【００３６】
神経下垂体炎の誘発
コンプリートフロイントアジュバント（ＣＦＡ）（＃Ｆ５８８１−１０Ｘ１０ＭＬ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に、組換えラブフィリン３Ａタンパク質又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を１：１で乳化した。
参考文献３に記載されているようにして、ＣＦＡに熱殺菌した結核菌（＃２３１１４１；Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を５ｍｇ／ｍＬに調整した。続いて、０日目及び７日目にマウスに、１００μＬの乳化ラブフィリン３Ａを皮下注射した。
対照として、乳化ラブフィリン３Ａの皮下注射の場合と同様にして、マウスに１００μＬの乳化ＰＢＳを注射した。
下垂体の組織病理学を評価するために、マウスを初回免疫の１ヵ月後又は４ヵ月後に実験に供した。
【００３７】
下垂体組織病理学
下垂体は、初回免疫の１ヵ月後又は４ヵ月後に除去し、参考文献４に記載されているＢｅｃｋｓｔｅａｄの亜鉛固定剤で処理し、参考文献５に記載されているようにして処理した。マウス下垂体を４μｍ切片に切断し、顕微鏡評価のために、参考文献６に記載されているようにして、これらをヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。
神経下垂体、視索上核（ＳＯＮ）及び視床下部の室傍核（ＰＶＮ）における浸潤を分析するために、切片を免疫組織化学（抗ラットＨＲＰ−ＤＡＢ細胞及び組織染色キット；＃ＣＴＳ０１７；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ及び以下の抗体を有する）：
抗ＣＤ４５（＃５５０５３９、１：１００希釈；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）
抗ＣＤ３ｅ（＃ＭＣＡ１４７７Ｔ、１：１２５；Ｂｉｏ−Ｒａｄ）
抗ＣＤ３ｅ（＃５５３０５８、１：５０希釈；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）
抗ＣＤ８ａ（＃５５０２８１、１：１０希釈；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）
抗ＣＤ４（＃５５０２７８、１：４０希釈；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）
抗Ｂ２２０（＃ＲＡ３−６Ｂ２、１：２０希釈；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。
浸潤細胞数を評価するために、参考文献６に記載されているようにして、最も重篤な病理所見を示す切片における高倍率視野（ＨＰＦ）あたりの単核細胞数を計算した。
線維症の存在を評価するために、トリクロームステインキット（改良マッソン）（＃ＴＲＭ−１；ＳｃｙＴｅｋ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて、下垂体切片を染色した。
【００３８】
免疫蛍光法により評価されたラブフィリン３ＡとＡＶＰ発現
初回免疫の１ヵ月後、対照マウス及びラブフィリン３Ａ免疫マウスから神経下垂体、大脳皮質、副腎髄質及び膵臓を採取した。組織を固定し、４μｍの切片に切断した。
ラブフィリン３Ａ及びＡＶＰ発現を評価するために、以下の一次抗体を用いて免疫蛍光によって切片を評価した：
抗ラブフィリン‐３Ａ（＃ａｂ５９２５９、１：５０希釈；Ａｂｃａｍ）
抗バソプレシン（＃ＡＢ１５６５、１：５０００希釈；Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）。
以下の二次抗体を用いた；
Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８ヤギ抗ウサギＩｇＧ（＃Ａ１１０３６、１：５００希釈；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。
免疫蛍光を蛍光顕微鏡（ＢＺ−８０００；Ｋｅｙｅｎｃｅ）を用いて観察し、より高い倍率（×１００）の画像を、倒立共焦点レーザー走査型顕微鏡（ＴｉＥ−Ａ１Ｒ；Ｎｉｋｏｎ）を用いて測定した。
【００３９】
尿量、浸透圧及びＡＶＰの測定
マウスを代謝ケージ（＃ＫＮ−６４５；夏目）に収容して２４時間尿をプールした。初回免疫の１ヵ月後及び４ヵ月後に尿サンプルを採取して、ラブフィリン３Ａで免疫したマウス又は対照マウスにおける尿サンプルの体積、浸透圧及びＡＶＰレベルを測定した。尿中ＡＶＰレベルはラジオイムノアッセイ（ヤマサ）により測定した。
【００４０】
酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によるＴ４とコルチコステロンの測定
下垂体前葉に対するラブフィリン３Ａによる免疫化の効果を評価するために、チロキシン及びコルチコステロンの血清レベルをＴ４のＥＬＩＳＡキット（＃ＥＲＫＲ７０１４；Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）又はコルチコステロン（＃ＥＲＫＲ７００４；Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて測定した。
対照マウスからの血清もまた評価した。
【００４１】
ウエスタンブロッティング
ラブフィリン３Ａ免疫マウスからの血清中の抗ラブフィリン３Ａ抗体の存在を確認するために、抗体をウエスタンブロッティングによって分析した。
組換えヒトラブフィリン３Ａ（コムギ胚芽タンパク質合成システム（ＣｅｌｌＦｒｅｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で製造）又は対照溶解物を１：２００に希釈し、７．５％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、ポリビニリデンジフルオリド膜に移し、そして、参考文献７に記載されているようにして、ポジティブコントロールとしてマウス血清（１：５０希釈）又は抗Ｖ５抗体（１：２０００）でブロットした。
【００４２】
ラブフィリン３Ａに対するＩｇＧの投与
ラブフィリン３Ａに対する大量の抗体を得るために、ラブフィリン３Ａに対してＩｇＧを分泌するハイブリドーマを、ラブフィリン３Ａ（Ｍｅｄｉｃａｌ＆Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で免疫したマウスからのリンパ球の使用により確立した。
抗ラブフィリン３Ａ抗体を分泌する３４個のハイブリドーマが生成された。
０日目にマウスにラブフィリン３Ａに対する３．４ｍｇのＩｇＧ（各モノクローナル抗体１００μｇの混合物）を腹腔内注射し、次いで１ヵ月後まで観察した。
対照として、０日目にマウスに３．４ｍｇの正常マウスＩｇＧ（＃１４０‐０９５１１；ＷＡＫＯ）を腹腔内注射し、次いで１ヵ月まで観察した。
【００４３】
酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイ
ラブフィリン３Ａに対する特異的Ｔ細胞応答を評価するために、マウスインターフェロン（ＩＦＮ）−γＥＬＩＳＰＯＴ  ＰＬＵＳ（＃３３２１−４ＡＰＷ−２；Ｍａｂｔｅｃｈ）用のキットを用いてＥＬＩＳＰＯＴアッセイを行った。
この実験では、組換えラブフィリン３Ａタンパク質を抗原として使用した。抗マウスＣＤ３ｅモノクローナル抗体（機能グレード）（＃１６−００３１、１：２００希釈；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を陽性対照として用いた。初回免疫の１ヵ月後、参考文献８に記載されているようにして、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をリンパ球−哺乳動物（＃ＣＬ５１１０；Ｃｅｄａｒｌａｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて血液から単離した。
抗マウスＩＦＮ−γ抗体でプレコートした９６ウェルマイクロタイタープレートを滅菌ＰＢＳで洗浄した。１０％ウシ胎児血清（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地（＃ＳＨ３００２７．０１；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でブロッキングした後、１ウェルあたり１×１０5個のＰＢＭＣを抗原と共にインキュベートした（３７℃で２４時間、５％ＣＯ2の加湿インキュベーター中で（ウェルあたり１００μｇのラブフィリン３Ａタンパク質））。
ＰＢＳで洗浄した後、ビオチン化抗ＩＦＮ−γ検出抗体を加えた。プレートをＰＢＳで再度洗浄し、アルカリホスファターゼと結合したストレプトアビジンとインキュベートした。最後に、基質溶液の添加後１０分間スポットを発色させた。光学顕微鏡を用いて、抗原特異的リンパ球としてドット数を数えた。
【００４４】
アバタセプトの投与
ラブフィリン３Ａ免疫マウスに、初回免疫の２〜４週間後に隔日に１００μｇのアバタセプト（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂ）を腹腔内注射した。
参考文献９及び１０に記載されているようにして、アバタセプトの投与量を調節した。２週間アバタセプトを投与した後、尿量、神経下垂体への浸潤及びラブフィリン３Ａに対するＴ細胞応答を評価した。
【００４５】
統計分析
結果は中央値±標準誤差として表す。全ての実験で、２つのグループの比較はＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定で行った。０．０５未満のＰ値は、全ての場合において統計的に有意であると考えられた。
統計分析は、Ｓｔａｔａ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｒｅｌｅａｓｅ  １３（Ｓｔａｔａ  Ｃｏｒｐ．）を用いて行った。
【００４６】
ラブフィリン３Ａによる免疫化は神経下垂体炎を誘発する
自己免疫性神経性下垂体炎の病態生理学におけるラブフィリン３Ａの関与を評価するために、ＳＪＬ／Ｊマウスに乳化ラブフィリン３Ａタンパク質を皮下注射した。
初回免疫の１ヵ月後、造血単核細胞の浸潤が免疫マウスの神経下垂体で観察されたが、対照マウスでは観察されなかった（図１Ａ〜Ｃ）。
免疫組織化学による病理分析では、免疫化マウスではリンパ球浸潤（主にＣＤ４５+細胞）が明らかであったが、対照マウスではごくわずかであった（図１Ｄ〜Ｆ）。さらに、免疫化マウスのＣＤ３ｅ+Ｔ細胞数は、コントロールマウスのＣＤ３ｅ+Ｔ細胞と比較して有意に増加していた（図１Ｇ〜Ｉ）。
ＣＤ３+Ｔ細胞はＣＤ４+Ｔ細胞及びＣＤ８+細胞傷害性Ｔ細胞からなっていた。
同様に、免疫したマウスのＣＤ４+とＣＤ８ａ+Ｔ細胞の数は、コントロールマウスと比較して有意に増加していた（図１Ｊ〜Ｏ）。
少数のＢ細胞も免疫化マウスに存在したが、対照マウスには存在しなかった（図１Ｐ〜Ｒ）。
興味深いことに、免疫化マウスでは、ＡＶＰニューロンが存在するが対照マウスには存在しない。いくつかのＣＤ３ｅ+Ｔ細胞が視索上核（ＳＯＮ）（図１Ｓ）及び視床下部の室傍核（ＰＶＮ）（図１Ｔ）にも見られた。
さらに、２つのグループ間でコルチコステロン又はチロキシンのレベルに有意差がなく（図２Ｂ及びＣ）、下垂体前葉でリンパ球はほとんど検出されなかった（図２Ａ）。
ラブフィリン３Ａは大脳皮質、膵臓及び副腎髄質に発現されることが知られているが、免疫化マウスではこれらの臓器（図３）に浸潤は見られなかった。
実際、大脳皮質におけるラブフィリン３Ａの発現は免疫蛍光分析によって確認され、それは対照マウス及び免疫化マウスにおいて同様であった（図４）。さらに、ラブフィリン３Ａは海馬及び線条体において病態生理学的役割を果たすことが知られているが、海馬又は線条体にＣＤ３+Ｔ細胞の浸潤は認められなかった（図５Ａ〜Ｄ）。
これらの結果は、ラブフィリン３Ａによる免疫化がマウスにおいて神経下垂体炎を特異的に誘導したことを示唆する。
【００４７】
ラブフィリン３Ａによるマウスの免疫化は低張性尿量を増加させた
神経下垂体の機能に対するラブフィリン３Ａによる免疫化の効果を評価するために、初回免疫の１ヵ月後に尿量、浸透圧およびＡＶＰレベルを測定した。
対照マウスと比較して、免疫化マウスでは尿量が有意に増加した（図６Ａ）。尿浸透圧は、対照マウスより免疫化マウスにおいて有意に低かった（図６Ｂ）。免疫化マウスでは、対照マウスよりも尿中ＡＶＰレベルが低かった（ｐ＝０．０５７）（図６Ｃ）。
免疫蛍光評価による定量的評価は困難であったが、免疫化マウスの神経下垂体におけるＡＶＰのレベルは、対照マウスのそれと同様であるように観察された（図７Ａ〜Ｂ）。
尿量増加の原因を調べるために、１−デスアミノ−８−Ｄ−アルギニンバソプレシン（ｄＤＡＶＰ）耐性試験を行った（ｄＤＡＶＰはバソプレシンＶ２受容体選択的アゴニストであり、Ｖ２受容体を介した強力な抗利尿作用を有する）。ｄＤＡＶＰの投与後、対照マウスで見られたものと同様に（図６Ｄ）、免疫されたマウスでは尿量が一過性の減少を示し、尿量の増加は腎性ではないことが示唆された。体重に有意差はなかった。
初回免疫前又は初回免疫の１ヵ月後の２つのグループ間の血糖値（図８Ａ〜Ｄ）。
以上から、免疫したマウスは、低張出量を伴う尿量の増加を示し、これは、ＬＩＮＨによる中枢性尿崩症と同様の水分恒常性の乱れを示している。
【００４８】
後期にラブフィリン３Ａによる免疫化により誘発された神経下垂体炎の変化
ラブフィリン３Ａによる予防接種によって誘発される神経下垂体炎の時間依存的な変化を定義するために、下垂体の病理組織を評価し、初回免疫の４ヵ月後に尿量を測定した。
ＣＤ３ｅ+Ｔ細胞の浸潤はなかったが（図９Ａ）、免疫化マウスの神経下垂体では線維性変化が見られたが、対照マウスでは見られなかった（図９Ｂ及びＣ）。
初回免疫の４ヵ月後の２つの群の間で尿量に有意差はなかった（図９Ｄ）。
これらの結果は、神経下垂体の炎症が、ラブフィリン３Ａによる免疫後にリンパ球浸潤を伴う急性期から線維症を伴う慢性期へと動的に変化することを示している。
【００４９】
抗ラブフィリン３Ａ抗体は病因に直接関与していない
ラブフィリン３Ａによる免疫化によって誘発された神経性下垂体炎の病因における抗ラブフィリン３Ａ抗体の関与を調べた。
第一に、免疫したマウスからの血清中の抗ラブフィリン３Ａ抗体の存在をウエスタンブロッティングにより確認した（図１０Ａ）。
抗ラブフィリン３Ａ抗体の病原性を調べるために、マウスにモノクローナル抗ラブフィリン３Ａ抗体（抗ラブフィリン３Ａ抗体群）のカクテルを腹腔内注射した。あるいは正常マウスＩｇＧ（対照ＩｇＧ群）とした。ＣＤ３ｅ+Ｔ細胞による浸潤は、抗ラブフィリン３Ａ抗体群（図１０Ｂ）又は対照ＩｇＧ群（図１０Ｃ）のいずれにおいても神経下垂体において誘導されなかった。
病理学的所見は、ラブフィリン３Ａ抗体群と対照ＩｇＧ群との間に尿量に有意差がないことが示された（図１０Ｄ）。
これらの結果は、病因における抗ラブフィリン３Ａ抗体の直接的な関与を示唆していない。
【００５０】
アバタセプトはラブフィリン‐３Ａに特異的なＴ細胞の数を減少させラブフィリン３Ａで免疫したマウスにおける神経下垂体炎を改善する
抗ラブフィリン３Ａ抗体の投与が神経下垂体のリンパ球浸潤を誘発しなかったことを考えると、神経下垂体炎の病因におけるラブフィリン３Ａに特異的なＴ細胞の関与を仮定した。
第一に、ラブフィリン３Ａに特異的なＴ細胞の存在を、ラブフィリン３Ａで免疫したマウスからのＰＢＭＣにおけるＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって確認した（図１１Ａ、左上）。
以下、神経下垂体炎に対するＴ細胞活性化の抑制効果をテストした。
初回免疫の２週間後、ラブフィリン３Ａで免疫したマウスにアバタセプトを注射した。
免疫抗原としてのアバタセプトは、ヒト細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４）の細胞外ドメインからなる可溶性キメラ融合タンパク質（ＣＴＬＡ４  Ｉｇ）である。
ＣＤ２８とＣＤ８０／８６の間の共刺激シグナルを遮断することによって、ＣＤ８０／８６と結合してＴ細胞活性化を抑制することができる。
アバタセプトを投与すると、ラブフィリン３Ａで免疫したマウスの尿量が回復した（図１１Ｂ）。
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、アバタセプトが、ラブフィリン３Ａで免疫したマウスにおいてラブフィリン３Ａに特異的なＴ細胞の数を減少させる傾向があることを示した（図１１Ａ及びＣ）。
さらに、アバタセプトの投与は、ラブフィリン３Ａで免疫したマウスの神経下垂体におけるＣＤ３ｅ+Ｔ細胞によるリンパ球浸潤を改善した（図１１Ｄ〜Ｆ）。
興味深いことに、ＰＢＭＣ中のラブフィリン３Ａに特異的なＴ細胞の数と神経下垂体中の浸潤ＣＤ３ｅ+Ｔ細胞の数との間に直線的な関連があった（図１１Ｇ）。
以上から、これらの結果は、アバタセプトによるＴ細胞の抑制がラフフィリン３Ａに対するＴ細胞応答を減弱させ、そして神経下垂体におけるリンパ球浸潤を改善することを示している。
【００５１】
神経下垂体におけるラフフィリン３Ａ発現
免疫化マウスの神経下垂体におけるラブフィリン３Ａの発現を免疫蛍光法により評価した。そのレベルは対照マウスのそれと同様であった。
さらに、ラブフィリン３Ａの発現は、アバタセプトで処理したラブフィリン３Ａで免疫したマウスで観察されたものと同様であった（図１２）。
【００５２】
参考文献は以下のとおりである。
参考文献１  Iwama S, Sugimura Y, Suzuki H, et al. Time-dependent changes in proinflammatory and neurotrophic responses of microglia and astrocytes in a rat model of osmotic demyelination syndrome. Glia 2011; 59: 452‐462.
参考文献２  Beebe ET, Makino S, Nozawa A, et al. Robotic large-scale application of wheat cell-free translation to structural studies including membrane proteins. Nat Biotechnol 2011; 28: 239‐249.
参考文献３  Tzou SC, Lupi I, Landek M, et al. Autoimmune hypophysitis of SJL mice: clinical insights from a new animal model. Endocrinology 2008; 149: 3461‐3469.
参考文献４  Beckstead JH. A simple technique for preservation of fixation-sensitive antigens in paraffin-embedded tissues: addendum. J Histochem Cytochem 1995; 43: 345.
参考文献５  Iwama S, De Remigis A, Bishop JA, et al. Hurthle cells predict hypothyroidism in interferon-γ transgenic mice of different genetic backgrounds. Endocrinology 2012; 153: 4059‐4066.
参考文献６  Iwama S, De Remigis A, Callahan MK, et al. Pituitary expression of CTLA-4 mediates hypophysitis secondary to administration
of CTLA-4 blocking antibody. Sci Transl Med 2014; 6: 230ra245.
参考文献７  Iwama S, Sugimura Y, Kiyota A, et al. Rabphilin-3A as a targeted autoantigen in lymphocytic infundibulo-neurohypophysitis. J Clin Endocrinol Metab 2015; 100: E946‐E954.
参考文献８  Ye Z, UittenbogaardAM, CohenDA, et al. Distinct CCR2(+)Gr1(+) cells control growth of the Yersinia pestis ΔyopM mutant in liver and spleen during systemic plague. Infect Immun 2011; 79: 674‐687.
【００５３】
本発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。本明細書の中で明示した論文、公開特許公報及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用して参照する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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