(57)【要約】【課題】遺伝子操作された非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、マウス又はラット）を提供すること。【解決手段】遺伝子操作された非ヒト動物は、ヒト化Ｔ細胞共受容体（例えば、ヒト化ＣＤ４及び／若しくはＣＤ８（例えば、ＣＤ８α及び／若しくはＣＤ８β））、少なくとも１つのヒトＴＣＲ可変領域遺伝子セグメントによりコードされる可変ドメインを含むヒト若しくはヒト化Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、及び／又はヒト化Ｔ細胞共受容体に結合するヒト若しくはヒト化主要組織適合複合体（例えば、それぞれ、ヒト若しくはヒト化ＭＨＣ  ＩＩ（例えば、ＭＨＣ  ＩＩα及び／又はＭＨＣ  ＩＩβ鎖）及び／又はＭＨＣ  Ｉ（例えば、ＭＨＣ  Ｉα）、場合により、ヒト又はヒト化β２ミクログロブリン）を発現し得る。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、米国仮出願シリアル番号第６２／１４３，６８７号（２０１５年４月６日出願）及び同第６２／１５８，８０４号（２０１５年５月８日出願）及び同第６２／１８６，９３５号（２０１５年６月３０日出願）の優先権を主張し、これらのそれぞれの出願は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表
配列表の正式なコピーは、２０１６年４月６日に作成され、かつ５６．７キロバイトのサイズを有する、ファイル名「２０１６−０４−０６−１０１４５ＷＯ０１−ＳＥＱ−ＬＩＳＴ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」のＡＳＣＩＩ形式の配列表としてＥＦＳ−Ｗｅｂ経由で電子的に提出され、かつ本明細書と同時に提出される。このＡＳＣＩＩ形式の文書に含まれる配列表は、本明細書の一部であり、かつ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００３】
本発明は、実質的にヒト（化）Ｔ細胞媒介性免疫応答を開始することができ、（ｉ）１つ又は２つ以上のヒト（化）Ｔ細胞共受容体（例えば、ＣＤ４及び／又はＣＤ８（例えば、ＣＤ８α及び／又はＣＤ８β））、（ｉｉ）１つ又は２つ以上のヒト（化）Ｔ細胞共受容体と会合する１つ又は２つ以上のヒト（化）主要組織適合複合体（例えば、ＭＨＣ  ＩＩ（例えば、ＭＨＣ  ＩＩα及び／又はＭＨＣ  ＩＩβ）及び／又はＭＨＣ  Ｉ（例えば、ＭＨＣ  Ｉα及び／又はβ２ミクログロブリン）、並びに／又は（ｉｉｉ）ヒト（化）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）（例えば、ＴＣＲα及び／又はＴＣＲβ）を発現することができる、非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、マウス又はラット）；胚、組織、細胞、及び／又は非ヒト動物から単離された核酸；非ヒト動物を生産する方法；並びにヒトの治療の開発のために、非ヒト動物を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
適応免疫応答において、外来抗原は、Ｂリンパ球上の受容体分子（例えば、免疫グロブリン）及びＴリンパ球状の受容体分子（例えば、Ｔ細胞受容体、ＴＣＲとも呼ばれる）により認識される。これらの外来抗原は、細胞の表面上に、一般に主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子と呼ばれ、特に、ヒトにおいてヒト白血球抗原（ＨＬＡ）と呼ばれる特殊なタンパク質により、ペプチドフラグメントとして提示される。Ｔ細胞媒介性応答中に、ＭＨＣ分子により提示された抗原は、Ｔ細胞受容体により認識される。しかしながら、ＭＨＣ−抗原複合体のより多くのＴ細胞受容体認識が、効果的な免疫応答に必要とされる。Ｔ細胞共受容体分子（例えば、ＣＤ４又はＣＤ８）のＭＨＣのインバリアントな部分への結合も必要とされる。
【０００５】
Ｔ細胞は、ヘルパーＴ細胞及び細胞傷害性Ｔ細胞を含む複数の多様性を有する。ヘルパーＴ細胞は、共受容体ＣＤ４を発現し、ＭＨＣ  ＩＩ分子に結合した抗原を認識する。ＣＤ４＋  Ｔ細胞は、免疫系における他のエフェクター細胞、例えば、抗体を生成するＭＨＣ  ＩＩ発現Ｂ細胞、病原体を破壊するＭＨＣ  ＩＩ発現マクロファージ等を活性化する。ＣＤ４及びＴ細胞受容体の同じＭＨＣ  ＩＩにより提示された外来抗原への結合により、Ｔ細胞がその抗原に対してより顕著に高感度になる。
【０００６】
対照的に、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）は、共受容体ＣＤ８を発現し、ＭＨＣ  Ｉ分子に結合した外来抗原を認識する。ＣＴＬは、それ自体の膜結合ＴＣＲにより認識されたＭＨＣ  Ｉ結合ペプチドを有する任意の細胞を殺傷するように特殊化されている。細胞が、（例えば、ウイルス、腫瘍、又は他の非自己起源の）通常存在しない細胞タンパク質由来ペプチドを提示する場合、このようなペプチドは、ＣＴＬにより認識される。同ＣＴＬは活性化され、このペプチドを提示している細胞を殺傷する。ＣＤ４と同様に、ＣＤ８の結合により、ＣＴＬがＭＨＣ  Ｉにより提示された抗原に対してより高感度になる。
【０００７】
寛容メカニズムのために、全ての抗原が、Ｔ細胞活性化を引き起こすわけではない。一方で、一部の疾患（例えば、ガン、自己免疫疾患）では、自己タンパク質由来のペプチドが、免疫系の細胞コンポーネントのターゲットになる。同ターゲット化により、このようなペプチドを提示している細胞の破壊がもたらされる。臨床的に意義のある抗原（例えば、種々の種類のガンに関連する抗原）及び／又は、臨床的に意義のある抗原に結合するＴＣＲ配列を認識することにおける顕著な進歩がなされてきた。しかしながら、ヒトＴ細胞における適切な応答を引き起こすであろう臨床的に意義のあるペプチド、及び／又は臨床的に意義のある抗原に結合することができるＴＣＲ（例えば、ガンの適応免疫療法用、自己免疫用のＴ細胞ワクチン等）の特定及び選択を改善するために、ヒトの免疫系の態様を模倣するｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ系についての必要性が未だに存在する。このため、ヒトの免疫系のコンポーネント、特に、Ｔ細胞免疫応答のコンポーネントを提示することができる生体系（例えば、遺伝子改変非ヒト動物及び細胞）についての必要性が存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本明細書で開示されるように、実質的にヒト化されたＴ細胞免疫系を含む遺伝子改変非ヒト動物の胸腺は、コントロール動物と同様の絶対数の胸腺細胞及びＣＤ３＋  Ｔ細胞を有する。加えて、これらの細胞は、コントロール動物に対して、シングルポジティブなＴ細胞への同等の発達を示し、抗原、例えば、ウイルス抗原に対する堅牢なヒト細胞応答を生じさせることができる。非ヒト動物のヒト細胞応答は、一般的には、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）細胞外ドメインにより形成されたペプチド結合クレフトにおいて提示された抗原を認識するヒト又はヒト化Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）可変ドメインを発現している、活性化非ヒトＴ細胞を含む。同細胞外ドメインは、非ヒト抗原提示細胞の表面上に発現される場合がある。一部の実施態様では、実質的にヒト化されたＴ細胞免疫系は、
（Ａ）非ヒトＴ細胞であって、
（ｉ）ヒトＴ細胞共受容体の細胞外部分の一部又は全部を含むＴ細胞共受容体ポリペプチド、例えば、１つ又は２つ以上のヒトＴ細胞共受容体細胞外ドメインを含むＴ細胞共受容体ポリペプチドを、Ｔ細胞共受容体ポリペプチドが、
（ａ）ヒト又はヒト化ＨＬＡ分子の１つ又は２つ以上の細胞外ドメイン（例えば、Ｔ細胞共受容体ポリペプチドについての結合部位である第１のヒトＨＬＡ細胞外ドメイン、及び／又はペプチド結合クレフトを形成する第２のヒトＨＬＡ細胞外ドメインと、例えば、第３のヒトＨＬＡ細胞外ドメイン）
（ｂ）ヒト又はヒト化ＴＣＲ可変ドメイン（例えば、少なくとも１つのヒトＴＣＲα及び／又はＴＣＲβ可変領域遺伝子セグメントにより、それぞれコードされるヒト若しくはヒト化ＴＣＲα可変ドメイン並びに／又はヒト又はヒト化ＴＣＲβ可変ドメイン）の細胞外ドメイン、及び／又は
（ｃ）ヒトＴＣＲ定常ドメインの細胞外ドメインと会合可能であり、かつ／又はこれらと会合するように発現し、
（ｉｉ）少なくともヒトＴＣＲ可変ドメインを含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する、非ヒトＴ細胞と、任意選択で、
（Ｂ）ヒトＨＬＡに関する抗原を提示する非ヒト抗原提示細胞、例えば、その細胞表面上に、２つのＨＬＡ細胞外ドメインにより形成されるペプチド結合クレフトを含み、非ヒトＴ細胞を活性化することができ、及び／又は、同細胞を活性化する、少なくとも１つのＭＨＣ分子を発現する非ヒト抗原提示細胞とを含む。
【０００９】
一態様において、非ヒトＴ細胞及び非ヒト抗原提示細胞は、同じ非ヒト動物に見出される、又は、同動物から単離される。
【００１０】
したがって、本明細書において、
（Ａ）ヒト又はヒト化Ｔ細胞共受容体（例えば、ヒト若しくはヒト化ＣＤ４及び／又はヒト若しくはヒト化ＣＤ８（例えば、ヒト若しくはヒト化ＣＤ８α及び／又はヒト若しくはヒト化ＣＤ８β））、
（Ｂ）ヒト又はヒト化Ｔ細胞共受容体と会合するヒト又はヒト化主要組織適合複合体（例えば、ヒト又はヒト化ＣＤ４に結合するヒト又はヒト化ＭＨＣ  ＩＩ（例えば、ヒト若しくはヒト化ＭＨＣ  ＩＩα及び／又はヒト若しくはヒト化ＭＨＣ  ＩＩβ）、並びに／又はヒト又はヒト化ＣＤ８に結合するヒト若しくはヒト化ＭＨＣ  Ｉ（例えば、ヒト又はヒト化ＭＨＣ  Ｉα、及び場合により、ヒト又はヒト化β２ミクログロブリン）、並びに／又は
（Ｃ）ヒト又はヒト化Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するように遺伝子操作された非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、マウス又はラット）；
並びに、これらを発現している胚、組織、及び細胞、並びにこれらをコードする核酸が提供される。また、開示される非ヒト動物を生産する方法及び同動物を使用する方法も提供される。
【００１１】
一態様において、遺伝子改変非ヒト動物であって、
（Ａ）ヒト化ＣＤ４共受容体、並びに／又はヒト化ＣＤ８αポリペプチド及びヒト化ＣＤ８βポリペプチドを含むヒト化ＣＤ８共受容体（例えば、非ヒト動物は、例えば、その生殖細胞系ゲノム中に、キメラヒト／非ヒトＣＤ４ポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列、並びに／又はキメラヒト／非ヒトＣＤ８αポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列、及びキメラヒト／非ヒトＣＤ８βポリペプチドをコードする第３のヌクレオチド配列を含む）であって、
各ヒト化Ｔ細胞共受容体ポリペプチドが、非ヒトＴ細胞共受容体の少なくとも膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを含み、例えば、ヒト化ＣＤ４共受容体が、非ヒトＣＤ４共受容体の少なくとも膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを含み、かつ／又はヒト化ＣＤ８共受容体が、非ヒトＣＤ８α及び非ヒトＣＤ８βポリペプチドの少なくとも膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを含み、
各キメラＴ細胞共受容体ポリペプチドが、ヒトＴ細胞共受容体の細胞外部分の一部又は全部、例えば、ヒトＴ細胞共受容体の１つ又は２つ以上の細胞外ドメイン、例えば、ＨＬＡ分子と会合するヒトＴ細胞共受容体の少なくとも細胞外ドメインを含み、例えば、ヒト化ＣＤ４共受容体が、ＭＨＣ  ＩＩとの相互作用を担うヒトＣＤ４の細胞外部分（又は、その一部、例えば、細胞外ドメイン）、Ｔ細胞受容体可変ドメイン、Ｔ細胞受容体定常ドメイン、又はそれらの組み合わせを含み、かつ／又は、例えば、ヒト化ＣＤ８共受容体が、ＭＨＣ  Ｉとの相互作用を担うヒトＣＤ８α及び／又はヒトＣＤ８βの細胞外部分（又は、その一部、例えば、細胞外ドメイン）、Ｔ細胞受容体可変ドメイン、Ｔ細胞受容体定常ドメイン、又はそれらの組み合わせを含む、ヒト化ＣＤ４共受容体及び／又はヒト化ＣＤ８共受容体、
（Ｂ）ヒト（化）ＴＣＲ（例えば、非ヒト動物は、例えば、その生殖細胞系ゲノム中に、少なくとも１つのヒトＶαセグメント及び少なくとも１つのヒトＪαセグメントを含み、非ヒトＴＣＲα定常遺伝子配列に操作可能に連結している非再配列Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α可変遺伝子座、並びに／又は少なくとも１つのヒトＶβセグメント、少なくとも１つのヒトＤβセグメント、及び少なくとも１つのヒトＪβセグメントを含み、非ヒトＴＣＲβ定常遺伝子配列に操作可能に連結している非再配列ＴＣＲβ可変遺伝子座を含む）、並びに、任意選択で、
（Ｃ）ヒト化ＣＤ４共受容体と会合するヒト（化）ＭＨＣ  ＩＩ複合体及び／又はヒト化ＣＤ８共受容体と会合するヒト（化）ＭＨＣ  Ｉ複合体（例えば、非ヒト動物は、例えば、その生殖細胞系ゲノム中に、キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  ＩＩαポリペプチドをコードする第１の核酸配列、並びにキメラヒト／非ヒトＭＨＣ  ＩＩβポリペプチドをコードする第２の核酸配列、及び／又はキメラヒト／非ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドをコードする第３の核酸配列を含む）であって、
各キメラＭＨＣポリペプチドが、ヒトＭＨＣポリペプチド（例えば、ＨＬＡポリペプチド）の少なくとも細胞外部分（又はその一部）を含み、各キメラＭＨＣポリペプチドが、単独（例えば、ＭＨＣ  Ｉ）又は別のキメラＭＨＣポリペプチド（例えば、ＭＨＣ  ＩＩα及びＭＨＣ  ＩＩβ）と複合体化された場合のいずれかにおいて、それぞれ、ヒト（化）ＣＤ８共受容体又はヒト（化）ＣＤ４共受容体と会合することができ、ＨＬＡに関するペプチドを提示することができ、例えば、ヒト化ＭＨＣ  ＩＩ複合体が、（ｉ）ヒトＨＬＡクラスＩＩαポリペプチドのα１及びα２ドメイン並びに非ヒトＨＬＡクラスＩＩαポリペプチドの膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを含むキメラヒト／非ヒトＭＨＣ  ＩＩαポリペプチドを含み、（ｉｉ）キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  ＩＩβポリペプチドが、ヒトＨＬＡクラスＩＩβポリペプチドのβ１及びβ２ドメイン、非ヒトＨＬＡクラスＩＩβポリペプチドの膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを含み、かつ／又はヒト化ＭＨＣ  Ｉ複合体が、ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドのα１、α２、及びα３ドメインと、場合により、ヒト（化）β２ミクログロブリンとを含む、ヒト（化）ＭＨＣ  ＩＩ複合体及び／又はヒト（化）ＭＨＣ  Ｉ複合体を含む、遺伝子改変非ヒト動物が提供される。
【００１２】
いくつかの実施形態では、非ヒト動物は、
（Ａ）ヒト化ＣＤ４共受容体、並びにヒト化ＣＤ８αポリペプチド及びヒト化ＣＤ８βポリペプチドを含むヒト化ＣＤ８共受容体（例えば、非ヒト動物は、例えば、その生殖細胞系ゲノム中に、キメラヒト／非ヒトＣＤ４ポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列、キメラヒト／非ヒトＣＤ８αポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列、及びキメラヒト／非ヒトＣＤ８βポリペプチドをコードする第３のヌクレオチド配列を含む）であって、
各ヒト化Ｔ細胞共受容体ポリペプチドが、非ヒトＴ細胞共受容体の少なくとも膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを含み、例えば、ヒト化ＣＤ４共受容体が、非ヒトＣＤ４共受容体の少なくとも膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを含み、ヒト化ＣＤ８共受容体が、非ヒトＣＤ８α及び非ヒトＣＤ８βポリペプチドの少なくとも膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを含み、
各キメラＴ細胞共受容体ポリペプチドが、ヒトＴ細胞共受容体の細胞外部分の一部又は全部、例えば、ヒトＴ細胞共受容体の１つ又は２つ以上の細胞外ドメイン、例えば、ＨＬＡ分子と会合するヒトＴ細胞共受容体の少なくとも細胞外ドメインを含み、例えば、ヒト化ＣＤ４共受容体が、ＭＨＣ  ＩＩとの相互作用を担うヒトＣＤ４の細胞外部分（又は、その一部、例えば、細胞外ドメイン）、Ｔ細胞受容体可変ドメイン、Ｔ細胞受容体定常ドメイン、又はそれらの組み合わせを含み、かつ／又は、例えば、ヒト化ＣＤ８共受容体が、ＭＨＣ  Ｉとの相互作用を担うヒトＣＤ８α及び／又はヒトＣＤ８βの細胞外部分（又は、その一部、例えば、細胞外ドメイン）、Ｔ細胞受容体可変ドメイン、Ｔ細胞受容体定常ドメイン、又はそれらの組み合わせを含む、ヒト化ＣＤ４共受容体及び／又はヒト化ＣＤ８共受容体と、
（Ｂ）ヒト（化）ＴＣＲ（例えば、非ヒト動物は、例えば、その生殖細胞系ゲノム中に、少なくとも１つのヒトＶαセグメント及び少なくとも１つのヒトＪαセグメントを含み、非ヒトＴＣＲα定常遺伝子配列に操作可能に連結している非再配列Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α可変遺伝子座、並びに／又は、少なくとも１つのヒトＶβセグメント、少なくとも１つのヒトＤβセグメント、及び少なくとも１つのヒトＪβセグメントを含み、非ヒトＴＣＲβ定常遺伝子配列に操作可能に連結している非再配列ＴＣＲβ可変遺伝子座を含む）と、
（Ｃ）ヒト化ＣＤ４共受容体と会合するヒト化ＭＨＣ  ＩＩ複合体及びヒト化ＣＤ８共受容体と会合するヒト化ＭＨＣ  Ｉ複合体（例えば、非ヒト動物は、例えば、その生殖細胞系ゲノム中に、キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  ＩＩαポリペプチドをコードする第１の核酸配列、キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  ＩＩβポリペプチドをコードする第２の核酸配列、及び、キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドをコードする第３の核酸配列を含む）であって、
各キメラＭＨＣポリペプチドが、ヒトＭＨＣポリペプチド（例えば、ＨＬＡポリペプチド）の少なくとも細胞外部分（又はその一部）を含み、各キメラＭＨＣポリペプチドが、単独（例えば、ＭＨＣ  Ｉ）又は別のキメラＭＨＣポリペプチド（例えば、ＭＨＣ  ＩＩα及びＭＨＣ  ＩＩβ）と複合体化された場合のいずれかにおいて、それぞれ、ヒト化ＣＤ８共受容体又はヒト化ＣＤ４共受容体と会合することができ、ＨＬＡに関するペプチドを提示することができ、ヒト化ＭＨＣ  ＩＩ複合体が、（ｉ）ヒトＨＬＡクラスＩＩαポリペプチドのα１及びα２ドメイン並びに非ヒトＨＬＡクラスＩＩαポリペプチドの膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを含むキメラヒト／非ヒトＭＨＣ  ＩＩαポリペプチドを含み、（ｉｉ）キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  ＩＩβポリペプチドが、ヒトＨＬＡクラスＩＩβポリペプチドのβ１及びβ２ドメイン、非ヒトＨＬＡクラスＩＩβポリペプチドの膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを含み、ヒト化ＭＨＣ  Ｉ複合体が、ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドのα１、α２、及びα３ドメインと、場合により、ヒト（化）β２ミクログロブリンと、を含む（例えば、非ヒト動物は、ヒトβ２ミクログロブリンアミノ酸配列又はその一部を含むポリペプチドをコードするβ２ミクログロブリン座を更に含む）、ヒト（化）ＭＨＣ  ＩＩ複合体及びヒト（化）ＭＨＣ  Ｉ複合体を含む。
【００１３】
いくつかの実施形態では、キメラＴ細胞ＣＤ４共受容体ポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列は、内在性ＣＤ４  Ｔ細胞共受容体座に存在し、かつ／又は、キメラＴ細胞ＣＤ８α共受容体ポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列が、内在性ＣＤ８α  Ｔ細胞共受容体座に存在し、キメラＴ細胞ＣＤ８β共受容体ポリペプチドをコードする第３のヌクレオチド配列が、内在性ＣＤ８β  Ｔ細胞共受容体座に存在する。更なる実施形態は、図５Ａに示された遺伝子によりコードされるキメラヒト／非ヒトＣＤ４ポリペプチド（例えば、得られたキメラヒト／非ヒトＣＤ４  Ｔ細胞共受容体ポリペプチドのヒト部分は、少なくともヒトＩｇ１、ヒトＩｇ２、及びヒトＩｇ３ドメイン（他の方法において、それぞれ、Ｄ１、Ｄ２、及びＤ３ドメインと呼ばれる）を含む）、及び／又は図５Ｂに示された遺伝子よりコードされるキメラＣＤ８共受容体（例えば、キメラＣＤ８共受容体のヒト部分は、ヒトＣＤ８ポリプチド（例えば、ＣＤ８α及び／又はＣＤ８β）の細胞外部分の全て又は実質的に全て（ヒト免疫グロブリンＶ（ＩｇＶ）様α及びβドメインを含む）を含む）を含む。いくつかの実施形態では、キメラＣＤ４  Ｔ細胞共受容体ポリペプチドのヒト部分は、ヒトＣＤ４ポリペプチドの１つ又は２つ以上の細胞外ドメイン（例えば、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、又はそれらの任意の組み合わせ）を含み、キメラＣＤ４  Ｔ細胞共受容体ポリペプチドの非ヒト部分は、非ヒトＣＤ４  Ｔ細胞共受容体の膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを含み、キメラＣＤ８αポリペプチドのヒト部分は、ヒトＣＤ８αポリペプチドの細胞外ドメイン（例えば、ＩｇＶ様ドメイン）を含み、キメラＣＤ８αポリペプチドの非ヒト部分は、非ヒトＣＤ８αポリペプチドの膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを含み、かつ／又はＣＤ８βポリペプチドのヒト部分は、ヒトＣＤ８βポリペプチドの細胞外ドメイン（例えば、ＩｇＶ様ドメイン）を含み、キメラＣＤ８β
Ｔ細胞共受容体ポリペプチドの非ヒト部分は、非ヒトＣＤ８βポリペプチドの膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを含む。
【００１４】
いくつかの実施態様では、ヒト（化）ＭＨＣ  ＩＩαをコードする第１の核酸配列は、内在性非ヒトＭＨＣ  ＩＩα座に存在し、ヒト（化）ＭＨＣ  ＩＩβをコードする第２の核酸配列は、内在性非ヒトＭＨＣ  ＩＩβ座に存在し、かつ／又はヒト（化）ＭＨＣ  Ｉをコードする第３の核酸配列は、内在性非ヒトＭＨＣ  Ｉ座に存在する。一態様において、ヒト（化）ＭＨＣ  ＩＩαポリペプチドは、ヒトＭＨＣ  ＩＩαポリペプチド（例えば、ＨＬＡクラスＩＩαポリペプチド）の細胞外部分（又はその一部）を含み、ヒト（化）ＭＨＣ  ＩＩβポリペプチドは、ヒトＭＨＣ  ＩＩβポリペプチド（例えば、ＨＬＡクラスＩＩβポリペプチド）の細胞外部分（又はその一部）を含み、かつ／又はヒト（化）ＭＨＣ  Ｉポリペプチドは、ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチド（例えば、ＨＬＡクラスＩポリペプチド）の細胞外部分（又はその一部）を含む。いくつかの実施形態では、ヒト化ＭＨＣ
ＩＩαポリペプチドは、ヒトＭＨＣ  ＩＩ  α１及びα２ドメインを含み、ヒト化ＭＨＣ  ＩＩβポリペプチドは、ヒトＭＨＣ  ＩＩ  β１及びβ２ドメインを含み、かつ／又はヒト化ＭＨＣ  Ｉポリペプチドは、ヒトＭＨＣ  Ｉ  α１、α２、及びα３ドメインを含む。いくつかの実施形態では、キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  ＩＩαポリペプチドをコードする第１の核酸配列は、内在性非ヒトＭＨＣ  ＩＩαプロモータ及び調節エレメントの制御調節下で発現され、キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  ＩＩβポリペプチドをコードする第２の核酸配列は、内在性非ヒトＭＨＣ  ＩＩβプロモータ及び調節エレメントの制御調節下で発現され、かつ／又はキメラヒト／非ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドをコードする第３の核酸配列が、内在性非ヒトＭＨＣ  Ｉプロモータ及び調節エレメントの制御調節下で発現される。更なる実施形態では、キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  ＩＩαポリペプチドの非ヒト部分は、内在性非ヒトＭＨＣ  ＩＩαポリペプチドの膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを含み、キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  ＩＩβポリペプチドの非ヒト部分は、内在性非ヒトＭＨＣ  ＩＩβポリペプチドの膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを含み、かつ／又はキメラヒト／非ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドの非ヒト部分は、内在性非ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドの膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを含む。実施形態は、キメラヒト／非ヒトＭＨＣＩＩ複合体におけるタンパク質のヒト部分が、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱ、及びＨＬＡ−ＤＰからなる群から選択される対応するヒトＨＬＡクラスＩＩタンパク質から得られ、かつ／又は第３のキメラヒト／非ヒトＭＨＣＩポリペプチドのヒト部分が、ヒトＨＬＡ−Ａ、ヒトＨＬＡ−Ｂ、又はヒトＨＬＡ−Ｃから得られる、非ヒト動物を含む。非限定的な例として、いくつかの実施形態では、キメラＭＨＣＩＩαポリペプチドは、ＨＬＡ−ＤＲαタンパク質、ＨＬＡ−ＤＱαタンパク質、又はＨＬＡ−ＤＰαタンパク質の細胞外部分若しくはその一部を含み、キメラＭＨＣＩＩβポリペプチドは、ＨＬＡ−ＤＲβタンパク質、ＨＬＡ−ＤＱβタンパク質、又はＨＬＡ−ＤＰβタンパク質の細胞外部分若しくはその一部を含み、かつ／又はキメラＭＨＣＩポリペプチドは、ヒトＨＬＡ−Ａタンパク質、ヒトＨＬＡ−Ｂタンパク質、又はヒトＨＬＡ−Ｃタンパク質の細胞外部分若しくはその一部を含む。また、対応するヒトＨＬＡ−ＤＲタンパク質に由来するキメラヒト／非ヒトＭＨＣ  ＩＩタンパク質のヒト部分、例えば、ヒト／非ヒトＭＨＣ  ＩＩαポリペプチドのヒト部分が、ＨＬＡ−ＤＲ２のα鎖のα１及びα２ドメインを含み、ヒト／非ヒトＭＨＣ  ＩＩβポリペプチドのヒト部分が、ＨＬＡ−ＤＲ２のβ鎖のβ１及びβ２ドメインを含み、ＭＨＣ  Ｉポリペプチドのヒト部分が、ヒトＨＬＡ−Ａポリペプチドに由来し、例えば、ヒト／非ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドのヒト部分が、ヒトＨＬＡ−Ａ２ポリペプチドのα１、α２、及びα３ドメイン、例えば、ヒトＨＬＡ−Ａ２．１ポリペプチドのα１、α２、及びα３ドメインを含む、非ヒト動物も提供される。ＭＨＣ  ＩＩ複合体の非ヒト部分が、マウスＨ−２Ｅコード配列に由来し、かつ／又はＭＨＣ  Ｉポリペプチドの非ヒト部分が、マウスＨ−２Ｋコード配列に由来する、非ヒト動物も提供される。例えば、キメラＭＨＣ  ＩＩαポリペプチドは、マウスＨ−２Ｅαポリペプチドの膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを含み、キメラＭＨＣ  ＩＩβポリペプチドは、マウスＨ−２Ｅβポリペプチドの膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを含み、キメラＭＨＣ  Ｉポリペプチドは、マウスＨ−２Ｋポリペプチドの膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを含む。
【００１５】
いくつかの実施形態では、非再配列ＴＣＲα可変遺伝子座は、内在性ＴＣＲα可変遺伝子座に存在し、非再配列ＴＣＲβ可変遺伝子座は、内在性ＴＣＲβ可変遺伝子座に存在する。いくつかの態様では、非再配列ＴＣＲα可変遺伝子座は、ヒト非再配列Ｖα遺伝子セグメントの完全なレパートリ及びヒト非再配列Ｊα遺伝子セグメントの完全なレパートリを含み、かつ／又は非再配列ＴＣＲβ可変遺伝子座は、ヒト非再配列Ｖβ遺伝子セグメントの完全なレパートリ、ヒト非再配列Ｄβ遺伝子セグメントの完全なレパートリ、及びヒト非再配列Ｊβ遺伝子セグメントの完全なレパートリを含む。いくつかの実施形態では、非再配列ヒトＶα及びＪα遺伝子セグメントが再配列して、再配列ヒトＶα／Ｊα配列を形成しており、かつ／又は非再配列ヒトＶβ、Ｄβ、及びＪβ遺伝子セグメントが再配列して、再配列ヒトＶβ／Ｄβ／Ｊβ配列を形成している。いくつかの実施形態では、本明細書で開示される非ヒト動物は、Ｔ細胞の表面上に、ヒトＴＣＲα可変領域及び／又はヒトＴＣＲβ可変領域を含むＴ細胞受容体を発現する。いくつかの実施形態では、内在性非ヒトＶα及びＪαセグメントは再配列して、再配列Ｖα／Ｊα配列を形成することができず、かつ／又は内在性非ヒトＶβ、Ｄβ、及びＪβセグメントが再配列して、再配列Ｖβ／Ｄβ／Ｊβ配列を形成することができない。例えば、動物は、機能的な内在性非ヒトＴＣＲα可変座を欠いていてもよく、かつ／又は動物は、機能的な内在性非ヒトＴＣＲβ可変座を欠いてもよく、例えば、動物は、（ａ）全て若しくは実質的に全ての機能的な内在性Ｖα遺伝子セグメントの欠失、（ｂ）全て若しくは実質的に全ての機能的な内在性Ｊα遺伝子セグメントの欠失、（ｃ）全て若しくは実質的に全ての機能的な内在性Ｖβ遺伝子セグメントの欠失、（ｄ）全て若しくは実質的に全ての機能的な内在性Ｄβ遺伝子セグメントの欠失、（ｅ）全て若しくは実質的に全ての機能的な内在性Ｊβ遺伝子セグメントの欠失、及び／又は（ｆ）それらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、内在性非ヒトＴＣＲα可変座は、全て若しくは実質的に全ての機能的な内在性Ｖα遺伝子セグメントを欠いており、かつ／又は全て若しくは実質的に全ての機能的な内在性Ｊα遺伝子セグメントを欠いており、かつ／又は内在性非ヒトＴＣＲβ可変座は、（ａ）全て若しくは実質的に全ての機能的な内在性Ｖβ遺伝子セグメントを欠いており、（ｂ）全て若しくは実質的に全ての機能的な内在性Ｄβ遺伝子セグメントを欠いており、（ｃ）全て若しくは実質的に全ての機能的な内在性Ｊβ遺伝子セグメントを欠いており、又は（ｄ）（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）の任意の組み合わせである。
【００１６】
いくつかの実施形態では、キメラＴ細胞ＣＤ４、ＣＤ８α、及び／又はＣＤ８β共受容体ポリペプチドをそれぞれコードする第１、第２、及び／又は第３のヌクレオチド配列は、内在性Ｔ細胞共受容体座、例えば、内在性ＣＤ４、ＣＤ８α、及び／又はＣＤ８β共受容体座にそれぞれ存在する。非再配列ＴＣＲα可変遺伝子座は、内在性ＴＣＲα可変遺伝子座に存在し、非再配列ＴＣＲβ可変遺伝子座は、内在性ＴＣＲβ可変遺伝子座に存在し、かつ／又はキメラＭＨＣ  ＩＩα、ＭＨＣ  ＩＩβ、及び／又はＭＨＣ  Ｉポリペプチドをそれぞれコードする第１、第２、及び／又は第３の核酸配列は、内在性ＭＨＣ座、例えば、ＭＨＣ  ＩＩα、ＭＨＣ  ＩＩβ、及び／又はＭＨＣ  Ｉ座にそれぞれ存在する。いくつかの実施形態では、キメラＴ細胞共受容体をコードするヌクレオチド配列、非再配列ＴＣＲα可変遺伝子座、非再配列ＴＣＲβ可変遺伝子座、及び／又はキメラＭＨＣ分子をコードする核酸配列は、非ヒトプロモータ及び調節配列に操作可能に連結していてもよい。例えば、第１のヌクレオチド配列は、内在性非ヒトＣＤ４プロモータ及び調節エレメントの制御調節下で発現されてもよく、第２のヌクレオチド配列は、内在性非ヒトＣＤ８αプロモータ及び調節エレメントの制御調節下で発現されてもよく、かつ／又は第３のヌクレオチド配列は、内在性非ヒトＣＤ８βプロモータ及び調節エレメントの制御調節下で発現されてもよい。非再配列ＴＣＲα可変遺伝子座は、内在性ＴＣＲα（可変）調節及びプロモータエレメントの制御調節下で発現されてもよく、非再配列ＴＣＲβ可変遺伝子座は、内在性ＴＣＲβ（可変）調節及びプロモータエレメントの制御調節下で発現されてもよい。第１の核酸配列は、内在性非ヒトＭＨＣ  ＩＩαプロモータ及び調節エレメントの制御調節下で発現されてもよく、第２の核酸配列は、内在性非ヒトＭＨＣ  ＩＩβプロモータ及び調節エレメントの制御調節下で発現されてもよく、第３の核酸配列は、内在性非ヒトＭＨＣ  Ｉプロモータ及び調節エレメントの制御調節下で発現されてもよい。
【００１７】
いくつかの実施形態では、ヒトＣＤ４ポリペプチドの細胞外部分（又はその一部、例えば、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、及び／又はＤ４）をコードするヌクレオチド配列は、内在性非ヒト（マウス）ＣＤ４共受容体ポリペプチドの細胞外部分（又はその一部、例えば、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、及び／又はＤ４）をコードする配列を置き換え、内在性非ヒト（マウス）ＣＤ４共受容体座において、内在性非ヒト（マウス）ＣＤ４膜貫通及び細胞質ドメインコード配列に操作可能に連結していてもよく、ヒトＣＤ８αポリペプチドの細胞外部分の全て又は一部をコードするヌクレオチド配列は、内在性非ヒト（マウス）Ｔ細胞ＣＤ８αポリペプチドの細胞外部分の全て又は一部をコードする配列を置き換え、内在性非ヒト（マウス）ＣＤ８α座において、内在性非ヒト（マウス）ＣＤ８α膜貫通及び細胞質ドメインのコード配列に操作可能に連結していてもよく、ヒトＣＤ８βポリペプチドの細胞外部分の全て又は一部をコードするヌクレオチド配列は、内在性非ヒト（マウス）Ｔ細胞ＣＤ８βポリペプチドの細胞外ドメインの全て又は一部をコードする配列を置き換え、内在性ＣＤ８β座において、内在性非ヒトＣＤ８β膜貫通及び細胞質ドメインのコード配列に操作可能に連結していてもよく、非再配列ＴＣＲα可変遺伝子座は、１つ又は２つ以上の内在性Ｖα及び／又はＪα遺伝子セグメントを、内在性非ヒト（マウス）ＴＣＲα可変遺伝子座において置き換え、非再配列ＴＣＲβ可変遺伝子座は、１つ又は２つ以上の内在性Ｖβ、Ｄβ、及び／又はＪβ遺伝子セグメントを、内在性非ヒト（マウス）ＴＣＲβ可変遺伝子座において置き換え、ヒトＭＨＣ  ＩＩαポリペプチドの細胞外部分（又はその一部、例えば、α１及びα２ドメイン）をコードする核酸配列は、内在性非ヒト（マウス）ＭＨＣ
ＩＩαポリペプチドの細胞外部分（又はその一部、例えば、α１及びα２ドメイン）をコードする配列を置き換え、内在性非ヒト（マウス）ＭＨＣ  ＩＩα座において、内在性非ヒト（マウス）ＭＨＣ  ＩＩα膜貫通及び細胞質ドメインのコード配列に操作可能に連結していてもよく、ヒトＭＨＣ  ＩＩβポリペプチドの細胞外部分（又はその一部、例えば、β１及びβ２ドメイン）をコードする核酸配列は、内在性非ヒト（マウス）ＭＨＣ  ＩＩβポリペプチドの細胞外部分（又はその一部、例えば、β１及びβ２ドメイン）をコードする配列を置き換え、内在性非ヒト（マウス）ＭＨＣ  ＩＩβ座において、内在性非ヒト（マウス）ＭＨＣ  ＩＩβ膜貫通及び細胞質ドメインのコード配列に操作可能に連結していてもよく、かつ／又はヒトＭＨＣ  Ｉβポリペプチドの細胞外部分（又はその一部、例えば、α１、α２、及び／又はα３ドメイン）をコードする核酸配列は、内在性非ヒト（マウス）ＭＨＣ  Ｉポリペプチドの細胞外部分（又はその一部、例えば、α１、α２、及び／又はα３ドメイン）をコードする配列を置き換え、内在性非ヒト（マウス）ＭＨＣ  Ｉ座において、内在性非ヒト（マウス）ＭＨＣ  Ｉ膜貫通及び細胞質ドメインのコード配列に操作可能に連結していてもよい。
【００１８】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示される遺伝子改変非ヒト動物は、その内在性座から、機能的な内在性非ヒトＴ細胞ＣＤ４共受容体を発現しておらず、その内在性ＣＤ８座から、機能的な内在性非ヒトＴ細胞ＣＤ８共受容体を発現しておらず、内在性ＴＣＲα可変座から、機能的なＴＣＲα可変ドメインを発現しておらず、内在性ＴＣＲβ可変座から、機能的なＴＣＲβ可変ドメインを発現しておらず、内在性ＭＨＣ  ＩＩ座から、内在性ＭＨＣ  ＩＩ複合体の細胞外ドメインを（例えば、細胞表面上で）発現しておらず、かつ／又は内在性ＭＨＣ  Ｉ座から、内在性ＭＨＣ  Ｉポリペプチドの細胞外ドメインを（例えば、細胞表面上で）発現していない。
【００１９】
本明細書で開示される任意の非ヒト動物は、ヒト又はヒト化β２ミクログロブリンのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするβ２ミクログロブリン座を更に含んでもよく、非ヒト動物は、ヒト又はヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドを発現している。いくつかの実施形態では、非ヒト動物は、内在性非ヒトβ２ミクログロブリン座からの機能的な内在性非ヒト動物β２ミクログロブリンポリペプチドを発現していない。いくつかの実施形態では、β２ミクログロブリン座は、内在性非ヒトβ２ミクログロブリン調節エレメントに操作可能に連結している。一実施形態において、β２ミクログロブリン座は、ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエキソン２、エキソン３、及びエキソン４（例えば、エキソン２〜エキソン４）で示されるヌクレオチド配列を含み、場合により、β２ミクログロブリン座は、非ヒト、例えば、げっ歯類のβ２ミクログロブリン遺伝子のエキソン１で示されるヌクレオチド配列を更に含む。
【００２０】
本明細書で提供される非ヒト動物は、げっ歯類、例えば、マウス又はラットでもよい。
【００２１】
また、本明細書において、マウスＣＤ４、ＣＤ８α、及びＣＤ８β膜貫通及び細胞質ドメインをそれぞれ含む、各キメラヒト／マウスＴ細胞ＣＤ４、ＣＤ８α、及びＣＤ８β共受容体ポリペプチド、Ｔ細胞の表面上に、ヒトＴＣＲα可変領域及びヒトＴＣＲβ可変領域を含むＴ細胞受容体、ヒトＭＨＣ  ＩＩα（例えば、ヒトＨＬＡクラスＩＩα１及びα２ドメイン）、ＭＨＣ  ＩＩβ（ヒトＨＬＡクラスＩＩβ１及びβ２ドメイン）、及びＭＨＣ  Ｉポリペプチド（例えば、ヒトＨＬＡクラスＩα１、α２、及びα３ドメイン）の細胞外ドメインをそれぞれ含む、各キメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩα、ＭＨＣ  ＩＩβ、及びＭＨＣ  Ｉポリペプチド、並びに、場合により、ヒト又はヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドを発現している、マウスも提供される。一実施形態において、非ヒト動物、例えば、マウスであって、第１の核酸配列が、キメラヒト／マウスＨＬＡ−ＤＲ／Ｈ−２Ｅポリペプチドのα鎖をコードし、第２のヌクレオチド配列が、キメラＨＬＡ−ＤＲ／Ｈ−２Ｅポリペプチドのβ鎖をコードし、第３の核酸配列が、キメラヒト／マウスＨＬＡ−Ａ／Ｈ−２Ｋポリペプチドをコードし、マウスが、ＨＬＡ−Ａ／Ｈ−２Ｋ及びＨＬＡ−ＤＲ／Ｈ−２Ｅタンパク質を発現している、非ヒト動物、例えば、マウスが提供される。
【００２２】
また、本明細書において、実質的にヒト化されたＴ細胞免疫系を含み、例えば、実質的にヒト化されたＴ細胞免疫系が、抗原に対する実質的にヒト化されたＴ細胞免疫応答を開始する、非ヒト動物も提供される。いくつかの実施形態では、実質的にヒト化されたＴ細胞免疫応答は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）細胞外ドメインに関して提示された抗原及び／又はＨＬＡ細胞外ドメインに関する抗原を提示する抗原提示細胞を認識する、ヒトＴ細胞受容体（ＴＣＲ）可変ドメインを発現する活性化Ｔ細胞を含む。いくつかの実施態様では、実質的にヒト化されたＴ細胞免疫系は、（ａ）ヒトＨＬＡ分子及び／又は、少なくとも１つのヒトＴＣＲ可変領域遺伝子セグメントによりコードされるＴＣＲ可変ドメインを含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に結合するヒトＴ細胞共受容体ドメインを含むＴ細胞共受容体ポリペプチドを発現する非ヒトＴ細胞と、（ｂ）ヒトＨＬＡに関する抗原を提示し、非ヒトＴ細胞を活性化する非ヒト抗原提示細胞とを含む。
【００２３】
また、本明細書で開示される非ヒト動物を生産する方法及び同動物を使用する方法も提供される。概ね、本明細書で開示される遺伝子改変非ヒト動物を生産する方法は、（ａ）非ヒト動物のゲノム内に、キメラヒト／非ヒトＴ細胞共受容体ポリペプチド（例えば、キメラＣＤ４ポリペプチド）をコードする第１のヌクレオチド配列、及び／又は第２のキメラヒト／非ヒトＴ細胞共受容体ポリペプチド（例えば、キメラＣＤ８αポリペプチド）をコードする第２のヌクレオチド配列、及び第３のキメラヒト／非ヒトＴ細胞共受容体ポリペプチド（例えば、キメラＣＤ８βポリペプチド）をコードする第３のヌクレオチド配列を導入することであって、各キメラＴ細胞共受容体ポリペプチドの非ヒト部分が、非ヒトＴ細胞共受容体の少なくとも膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを含み、各キメラポリペプチドのヒト部分が、ヒトＴ細胞共受容体の細胞外部分（又はその一部、例えば、１つ又は２つ以上のドメイン）を含む、ことと、（ｂ）非ヒト動物のゲノム内に、少なくとも１つのヒトＶαセグメント及び少なくとも１つのヒトＪαセグメントを含み、非ヒトＴＣＲα定常遺伝子配列に操作可能に連結している非再配列Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α可変遺伝子座、並びに／又は少なくとも１つのヒトＶβセグメント、少なくとも１つのヒトＤβセグメント、及び少なくとも１つのヒトＪβセグメントを含み、非ヒトＴＣＲβ定常遺伝子配列に操作可能に連結している非再配列ＴＣＲβ可変遺伝子座を挿入することと、任意選択で、（ｃ）ゲノム内に、第１のキメラヒト／非ヒトＭＨＣポリペプチド（例えば、キメラＭＨＣ  ＩＩαポリペプチド）をコードする第１の核酸配列、第２のキメラヒト／非ヒトＭＨＣポリペプチド（例えば、キメラＭＨＣ  ＩＩβポリペプチド）をコードする第２の核酸配列、及び／又は第３のキメラヒト／非ヒトＭＨＣポリペプチド（例えば、キメラＭＨＣ  Ｉポリペプチド）をコードする第３の核酸配列を配置すること、並びに／又は（ｄ）非ヒト動物のゲノム内に、ヒト又はヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードするβ２ミクログロブリン座を付加すること、を含む。いくつかの実施形態では、第１のヌクレオチド配列は、非ヒトＣＤ４共受容体の少なくとも膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインに操作可能に連結しているヒトＣＤ４の細胞外部分又はその一部をコードし、第２のヌクレオチド配列は、ヒトＣＤ８αの細胞外部分若しくはその一部並びに非ヒトＣＤ８αの少なくとも膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインをコードし、第３のヌクレオチド配列は、ヒトＣＤ８βの細胞外部分若しくはその一部並びに非ヒトＣＤ８βの少なくとも膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインをコードし、第１の核酸配列は、ヒトＨＬＡクラスＩＩαポリペプチドの細胞外部分（又はその一部）並びに非ヒトＭＨＣ  ＩＩαポリペプチドの少なくとも膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインをコードし、第２の核酸配列は、ヒトＨＬＡクラスＩＩβポリペプチドの細胞外部分（又はその一部）並びに非ヒトＭＨＣ  ＩＩβポリペプチドの少なくとも膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインをコードし、第３の核酸配列は、ヒトＨＬＡクラスＩポリペプチドの細胞外部分（又はその一部）並びに非ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドの膜貫通ドメ��ン及び細胞質ドメインをコードし、β２ミクログロブリン座は、ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエキソン２〜４で示されるヌクレオチド配列、例えば、ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエキソン２、３、及び４で示されるヌクレオチド配列を含む。
【００２４】
非ヒト動物を生産する方法は、（ａ）非ヒト動物のゲノム内に、キメラＴ細胞共受容体ポリペプチドをコードする第１、第２、及び／又は第３のヌクレオチド配列を導入することが、内在性ＣＤ４座において、内在性非ヒトＣＤ４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、キメラヒト／非ヒトＣＤ４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列により置き換えること、及び／又は内在性ＣＤ８α座において、内在性非ヒトＣＤ８αポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、キメラヒト／非ヒトＣＤ８αポリペプチドをコードするヌクレオチド配列により置き換えること、及び内在性ＣＤ８β座において、内在性非ヒトＣＤ８βポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、キメラヒト／非ヒトＣＤ８βポリペプチドをコードするヌクレオチド配列により置き換えること、を含み、（ｂ）非再配列ＴＣＲα座及び／又は非再配列ＴＣＲβ座を動物のゲノム内に挿入することが、内在性非ヒトＴＣＲα可変遺伝子座を、少なくとも１つのヒトＶαセグメント及び少なくとも１つのヒトＪαセグメントを含む非再配列ヒト化ＴＣＲα可変遺伝子座により置き換えて、ヒト化ＴＣＲα可変遺伝子座を生成することであって、ヒト化ＴＣＲα可変遺伝子座が、内在性非ヒトＴＣＲα定常領域に操作可能に連結している、こと、並びに／又は内在性非ヒトＴＣＲβ可変遺伝子座を、少なくとも１つのヒトＶβセグメント、少なくとも１つのヒトＤβセグメント、及び少なくとも１つのヒトＪβセグメントを含む非再配列ヒト化ＴＣＲβ可変遺伝子座により置き換えて、ヒト化ＴＣＲβ可変遺伝子座を生成することであって、ヒト化ＴＣＲβ可変遺伝子座が、内在性非ヒトＴＣＲβ定常領域に操作可能に連結している、こと、を含み、（ｃ）キメラＭＨＣポリペプチドをコードする第１、第２、及び／又は第３の核酸配列を非ヒト動物のゲノム内に配置することが、内在性非ヒトＭＨＣ  ＩＩ座において、非ヒトＭＨＣ  ＩＩ複合体をコードするヌクレオチド配列を、キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  ＩＩ複合体をコードするヌクレオチド配列により置き換えること、内在性非ヒトＭＨＣ  Ｉ座において、非ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドをコードするヌクレオチド配列により置き換えることを含み、かつ／又は（ｄ）ヒト又はヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードするβ２ミクログロブリン座を非ヒト動物のゲノム内に付加することが、内在性非ヒトβ２ミクログロブリン座において、非ヒトβ２ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、ヒト又はヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列により置き換えることを含む、実施形態を含む。
【００２５】
いくつかの実施形態では、（ａ）第１、第２、及び／又は第３のヌクレオチド配列それぞれを非ヒト動物のゲノム内に導入することは、（ｉ）内在性ＣＤ４座において、内在性非ヒトＣＤ４ポリペプチドの細胞外部分（又はその一部）をコードするヌクレオチド配列を、ヒトＣＤ４ポリペプチドの細胞外部分（又はその一部）をコードするヌクレオチド配列により、内在性非ヒトＣＤ４膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインをコードする配列と操作可能に連結している状態にあるように、置き換えること、（ｉｉ）内在性ＣＤ８α座において、内在性非ヒトＣＤ８αポリペプチドの細胞外部分（又はその一部）をコードするヌクレオチド配列を、ヒトＣＤ８αポリペプチドの細胞外部分（又はその一部）をコードするヌクレオチド配列により、内在性非ヒトＣＤ８α膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインをコードする配列と操作可能に連結している状態にあるように、置き換えること、並びに／又は（ｉｉｉ）内在性ＣＤ８β座において、内在性非ヒトＣＤ８βポリペプチドの細胞外部分（又はその一部）をコードするヌクレオチド配列を、ヒトＣＤ８βポリペプチドの細胞外部分（又はその一部）をコードするヌクレオチド配列により、内在性非ヒトＣＤ８β膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインをコードする配列と操作可能に連結している状態にあるように、置き換えることを含み、（ｂ）非再配列ＴＣＲα座及び／又は非再配列ＴＣＲβ座それぞれを動物のゲノム内に挿入することは、（ｉ）内在性非ヒトＴＣＲα可変遺伝子座を、少なくとも１つのヒトＶαセグメント及び少なくとも１つのヒトＪαセグメントを含む非再配列ヒト化ＴＣＲα可変遺伝子座により置き換えて、ヒト化ＴＣＲα可変遺伝子座を生成することであって、ヒト化ＴＣＲα可変遺伝子座が、内在性非ヒトＴＣＲα定常領域に操作可能に連結している、こと、並びに／又は（ｉｉ）内在性非ヒトＴＣＲβ可変遺伝子座を、少なくとも１つのヒトＶβセグメント、少なくとも１つのヒトＤβセグメント、及び少なくとも１つのヒトＪβセグメントを含む非再配列ヒト化ＴＣＲβ可変遺伝子座により置き換えて、ヒト化ＴＣＲβ可変遺伝子座を生成することであって、ヒト化ＴＣＲβ可変遺伝子座が、内在性非ヒトＴＣＲβ定常領域に操作可能に連結している、ことを含み、（ｃ）第１、第２、及び／又は第３の核酸配列それぞれを非ヒト動物のゲノム内に配置することは、（ｉ）内在性非ヒトＭＨＣ  ＩＩα座において、非ヒトＭＨＣ  ＩＩαポリペプチドの細胞外部分（又はその一部）をコードするヌクレオチド配列を、ヒトＨＬＡクラスＩＩαポリペプチドの細胞外部分（又はその一部）をコードするヌクレオチド配列により、内在性非ヒトＭＨＣ  ＩＩα膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインをコードする配列と操作可能に連結している状態にあるように、置き換えること、（ｉｉ）内在性非ヒトＭＨＣ  ＩＩβ座において、非ヒトＭＨＣ  ＩＩβポリペプチドの細胞外部分（又はその一部）をコードするヌクレオチド配列を、ヒトＨＬＡクラスＩＩβポリペプチドの細胞外部分（又はその一部）をコードするヌクレオチド配列により、内在性非ヒトＭＨＣ
ＩＩβ膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインをコードする配列と操作可能に連結している状態にあるように、置き換えること、並びに／又は（ｉｉｉ）内在性非ヒトＭＨＣ  Ｉ座において、非ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドの細胞外部分（又はその一部）をコードするヌクレオチド配列を、ヒトＨＬＡクラスＩポリペプチドの細胞外部分（又はその一部）をコードするヌクレオチド配列により、内在性非ヒトＭＨＣ  Ｉ膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインをコードする配列と操作可能に連結している状態にあるように、置き換えることを含み、かつ／又は内在性β２ミクログロブリン座において、エキソン２〜エキソン４に示されたヌクレオチド配列を、ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエキソン２、３、及び４を含むヌクレオチド配列により置き換えることを含む。
【００２６】
一実施形態では、導入する工程は、第１の非ヒト動物にて、内在性ＣＤ４座において、内在性非ヒトＣＤ４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、キメラヒト／非ヒトＣＤ４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列により置き換えること、第２の非ヒト動物にて、内在性ＣＤ８α座において、内在性非ヒトＣＤ８αポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、キメラヒト／非ヒトＣＤ８αポリペプチドをコードするヌクレオチド配列により置き換えること、及び内在性ＣＤ８β座において、内在性非ヒトＣＤ８βポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、キメラヒト／非ヒトＣＤ８βポリペプチドをコードするヌクレオチド配列により置き換えることを含む。いくつかの実施形態では、導入する工程は、第１の非ヒト動物の内在性ＣＤ４座において、内在性非ヒトＣＤ４ポリペプチドの細胞外部分（又はその一部）をコードするヌクレオチド配列を、ヒトＣＤ４ポリペプチドの細胞外部分（又はその一部）をコードするヌクレオチド配列により、内在性非ヒトＣＤ４膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインをコードする配列と操作可能に連結している状態にあるように、置き換えること、第２の非ヒト動物にて、内在性ＣＤ８α座において、内在性非ヒトＣＤ８αポリペプチドの細胞外部分（又はその一部）をコードするヌクレオチド配列を、ヒトＣＤ８αポリペプチドの細胞外部分（又はその一部）をコードするヌクレオチド配列により、内在性非ヒトＣＤ８α膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインをコードする配列と操作可能に連結している状態にあるように、置き換えること、並びに内在性ＣＤ８β座において、内在性非ヒトＣＤ８βポリペプチドの細胞外部分（又はその一部）をコードするヌクレオチド配列を、ヒトＣＤ８βポリペプチドの細胞外部分（又はその一部）をコードするヌクレオチド配列により、内在性非ヒトＣＤ８β膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインをコードする配列と操作可能に連結している状態にあるように、置き換えることを含む。いくつかの実施形態では、置き換える工程は、同時に、又は、任意の順序で行われる。
【００２７】
いくつかの実施形態では、挿入する工程は、第３の非ヒト動物において、内在性非ヒトＴＣＲα可変遺伝子座を、少なくとも１つのヒトＶαセグメント及び少なくとも１つのヒトＪαセグメントを含む非再配列ヒト化ＴＣＲα可変遺伝子座により置き換えて、ヒト化ＴＣＲα可変遺伝子座を生成することであって、ヒト化ＴＣＲα可変遺伝子座が、内在性非ヒトＴＣＲα定常領域に操作可能に連結している、ことと、第４の非ヒト動物において、内在性非ヒトＴＣＲβ可変遺伝子座を、少なくとも１つのヒトＶβセグメント、少なくとも１つのヒトＤβセグメント、及び少なくとも１つのヒトＪβセグメントを含む非再配列ヒト化ＴＣＲβ可変遺伝子座により置き換えて、ヒト化ＴＣＲβ可変遺伝子座を生成することであって、ヒト化ＴＣＲβ可変遺伝子座が、内在性非ヒトＴＣＲβ定常領域に操作可能に連結している、こととを含む。いくつかの実施形態では、置き換える工程は、同時に、又は、任意の順序で行われる。
【００２８】
いくつかの実施形態では、配置する工程は、順序を特定することなく、第５の非ヒト動物の内在性非ヒトＭＨＣ  ＩＩ座において、非ヒトＭＨＣ  ＩＩ複合体をコードする１つ又は２つ以上のヌクレオチド配列を、キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  ＩＩ複合体をコードする１つ又は２つ以上のヌクレオチド配列により置き換えることと、第５の非ヒト動物の内在性非ヒトＭＨＣ  Ｉ座において、非ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドをコードするヌクレオチド配列により置き換えることとを含む。いくつかの実施形態では、配置する工程は、第５の非ヒト動物にて、内在性非ヒトＭＨＣ  ＩＩα座において、非ヒトＭＨＣ  ＩＩαポリペプチドの細胞外部分（又はその一部）をコードするヌクレオチド配列を、ヒトＭＨＣ  ＩＩαポリペプチドの細胞外部分（又はその一部）をコードするヌクレオチド配列により、内在性非ヒトＭＨＣ  ＩＩα膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインをコードする配列と操作可能に連結している状態にあるように、置き換えることと、内在性非ヒトＭＨＣ  ＩＩβ座において、非ヒトＭＨＣ  ＩＩβポリペプチドの細胞外部分（又はその一部）をコードするヌクレオチド配列を、ヒトＭＨＣ  ＩＩβポリペプチドの細胞外部分（又はその一部）をコードするヌクレオチド配列により、内在性非ヒトＭＨＣ  ＩＩβ膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインをコードする配列と操作可能に連結している状態にあるように、置き換えることと、第５の非ヒト動物の内在性非ヒトＭＨＣ  Ｉ座において、非ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドの細胞外部分（又はその一部）をコードするヌクレオチド配列を、ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドの細胞外部分（又はその一部）をコードするヌクレオチド配列により、内在性非ヒトＭＨＣ  Ｉ膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインをコードする配列と操作可能に連結している状態にあるように、置き換えることとを含む。いくつかの実施形態では、置き換える工程は、同時に、又は、任意の順序で行われる。
【００２９】
いくつかの実施形態では、付加する工程は、第６の非ヒト動物の内在性非ヒトβ２ミクログロブリン座において、非ヒトβ２ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、ヒト又はヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列により置き換えることを含む。いくつかの実施形態では、ヒト又はヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドは、ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエキソン２、エキソン３、及びエキソン４に示されるヌクレオチド配列によりコードされる。
【００３０】
本明細書で開示される方法は、本明細書で記載される遺伝子改変のうちの１つ又は２つ以上を含む非ヒト動物を育種することにより、残りの遺伝子改変を含む同じ種の別の（又は複数の別の）非ヒト動物に対し、キメラＴ細胞共受容体ポリペプチドをコードする第１、第２、及び／又は第３のヌクレオチド配列が導入され、ＴＣＲα座及び／又は非再配列ＴＣＲβ座が挿入され、キメラＭＨＣポリペプチドをコードする第１、第２、及び／又は第３の核酸配列が配置され、並びに／又はβ２ミクログロブリン座が付加される、実施形態を含む。非限定的な実施形態は、任意の順序において、上記された第１、第２、第３、第４、第５、及び第６の非ヒト動物を育種することを含む。
【００３１】
本明細書で開示される方法は、非ヒト胚性幹（ＥＳ）細胞における相同組換えを含んでもよい。本明細書で開示される方法は、本明細書で開示されるマウスを生じさせるのに使用されてもよい。キメラヒト／非ヒトＣＤ４、ＣＤ８α及び／又はＣＤ８β  Ｔ細胞共受容体ポリペプチド、ヒト（化）ＴＣＲα／βタンパク質、並びにキメラＭＨＣ  ＩＩ複合体及びＭＨＣ  Ｉ（加えて、ヒト又はヒト化β２ミクログロブリン）を発現している非ヒト動物を、（ａ）まず、各個々のヒト（化）遺伝子を、個々のＥＳ細胞に相同組換えによりそれぞれ導入し、各個々の非ヒト動物を、このようなＥＳ細胞から生じさせ、その後に、生じた各非ヒト動物を、任意の順序で育種すること、（ｂ）全てのヒト（化）遺伝子を、１つのＥＳ細胞に連続的な相同組換えにより導入し、ついで、非ヒト動物を、このようなＥＳ細胞から生じさせること、又は、（ｃ）ＥＳ細胞のいくつかの座における連続的な相同組換えと育種との組み合わせにより生じさせてもよい。また、本明細書で開示される動物を、必要に応じて、他の動物との最初の育種の子孫を育種することによって生じさせてもよい。育種及び／又は相同組換えは、任意の好ましい順序で達成されてよい。
【００３２】
また、抗原に特異的なヒトＴＣＲ可変ドメインを非ヒト動物から単離する方法であって、本明細書で提供される非ヒト動物又は本明細書で開示される方法により生産された非ヒト動物から、その抗原に結合するＴ細胞又はＴＣＲタンパク質を単離することを含む、方法が提供される。いくつかの実施形態では、方法は、抗原に結合するＴＣＲα及び／若しくはＴＣＲβ可変ドメインをコードする第１及び／若しくは第２の核酸を特定すること、並びに／又は１つ若しくは２つ以上のベクターを含む細胞を、ベクターの発現に十分な条件において培養することを更に含んでいてよく、ベクターは、第１及び／又は第２の核酸とそれぞれ同一又は実質的に同一の第３及び／又は第４の核酸を含み、これら第３及び／又は第４の核酸は、例えば、ヒトＴＣＲ定常領域遺伝子、例えば、それぞれ、ＴＣＲα定常領域遺伝子及び／又はＴＣＲβ定常遺伝子領域と共に、インフレームにクローニングされる。本明細書で開示される遺伝子改変（再配列ヒトＴＣＲα及び／又はＴＣＲβ可変領域遺伝子を含んでもよい）を含む組織及び細胞、並びに、本明細書で記載されるように改変された非ヒト動物から単離されたこのような組織又は細胞により発現されるこのようなヒトＴＣＲ可変ドメインをコードする核酸も提供される。また、（１）本明細書で開示されるヒトＴＣＲ可変ドメイン、例えば、ヒト再配列ＴＣＲα又はヒト再配列ＴＣＲβ可変領域遺伝子をコードする核酸配列を含み、適切なヒトＴＣＲ定常領域遺伝子、例えば、ＴＣＲα定常領域遺伝子又はＴＣＲβ定常領域遺伝子それぞれにインフレームでクローニングされた、リコンビナント核酸、例えば、発現ベクター、（２）このような核酸（例えば、発現ベクター）を含むホスト細胞、並びに、（３）ホスト細胞により発現されるＴＣＲも含まれる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるリコンビナント核酸は、例えば、本明細書で開示されるように遺伝子改変された非ヒト動物又はそれから単離された組織に由来し、ヒトＴＣＲδ定常領域遺伝子又はＴＣＲγ定常領域遺伝子と、それぞれインフレームにクローニングされた、ヒト再配列ＴＣＲδ可変領域遺伝子又はＴＣＲγ可変領域遺伝子を含む。
【００３３】
非ヒト動物においてヒト化Ｔ細胞応答を生じさせる方法も提供される。方法は、概ね、本明細書に記載されたように遺伝子改変された非ヒト動物、又は、本明細書に記載されたように実質的にヒト化されたＴ細胞免疫系を有する非ヒト動物を、抗原、例えば、ヒト抗原、例えば、ヒト腫瘍抗原、ヒト細菌病原体、ヒトウイルス病原体等により、免疫化することを含む。いくつかの実施形態では、免疫化された非ヒト動物は、全ての機能的なヒトＴＣＲＶα遺伝子セグメントの少なくとも５０％及び／若しくは全ての機能的なヒトＴＣＲＶβ遺伝子セグメントの少なくとも５０％を発現し、並びに／又は、全て若しくは実質的に全ての機能的なヒトＴＣＲＶα遺伝子セグメント及び／若しくは全て若しくは実質的に全ての機能的なヒトＴＣＲＶβ遺伝子セグメントを含む。
【００３４】
抗原に対して特異的なヒトＴＣＲを単離するｉｎ  ｖｉｔｒｏ法も提供され、この方法は、概ね、（ａ）非ヒト動物の第２の細胞との接触、及び、（ｂ）抗原とのインキュベーション後に、非ヒト動物の第１の細胞の活性化を検出することを含む。この場合、第１の細胞は、キメラヒト／非ヒトＴ細胞共受容体、並びに、（ｉ）キメラヒト／非ヒトＴＣＲα鎖及び（ｉｉ）キメラヒト／非ヒトＴＣＲβ鎖のいずれか又は両方を発現しており、第２の細胞は、キメラヒト／非ヒトＭＨＣポリペプチドを発現している。方法は、第１の細胞から、ＴＣＲ又はそれをコードする核酸を単離することを更に含んでもよい。
【００３５】
本明細書で開示されるｉｎ  ｖｉｔｒｏ法では、抗原は、腫瘍抗原、ウイルス抗原、自己抗原、又は細菌抗原でもよい。いくつかの実施形態では、非ヒト動物は、げっ歯類、例えば、ラット又はマウスである。また、本明細書において、本明細書に記載されたように遺伝子改変された非ヒト動物、又は、本明細書に記載されたように実質的にヒト化されたＴ細胞免疫系を有する非ヒト動物から単離された、組織、Ｔ細胞、ＴＣＲ（例えば、可溶性ＴＣＲ）、又は、ＴＣＲの全て若しくは一部をコードする核酸、このようなＴ細胞に由来するハイブリドーマ又はクアドローマも提供される。
【００３６】
また、例えば、非ヒト動物の第１及び第２の細胞を含む組成物であって、第１の細胞が、キメラヒト／非ヒトＴ細胞共受容体、並びに場合により、（ｉ）キメラヒト／非ヒトＴＣＲα鎖及び（ｉｉ）キメラヒト／非ヒトＴＣＲβ鎖のいずれか又は両方を発現しており、第２の細胞が、キメラヒト／非ヒトＴ細胞共受容体と会合するキメラヒト／非ヒトＭＨＣポリペプチドを発現している、組成物が提供される。いくつかの実施形態では、第１の細胞は、非ヒトＴ細胞である。他の実施形態では、第２の細胞は、非ヒト抗原提示細胞である。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
遺伝子改変非ヒト動物であって、
（ａ）キメラＣＤ４共受容体、並びに／又はキメラＣＤ８αポリペプチド及びキメラＣＤ８βポリペプチドを含むキメラＣＤ８共受容体であって、
前記キメラＣＤ４共受容体が、第１のヌクレオチド配列によりコードされ、前記キメラＣＤ８αポリペプチドが、第２のヌクレオチド配列によりコードされ、前記キメラＣＤ８βポリペプチドが、第３のヌクレオチド配列によりコードされ、
前記キメラＣＤ４共受容体が、ヒトＣＤ４の細胞外部分又はその一部並びに非ヒトＣＤ４共受容体の少なくとも膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを含み、
前記キメラＣＤ８αポリペプチドが、ヒトＣＤ８αの細胞外部分又はその一部並びに非ヒトＣＤ８αの少なくとも膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを含み、
前記キメラＣＤ８βポリペプチドが、ヒトＣＤ８βの細胞外部分又はその一部並びに非ヒトＣＤ８βの少なくとも膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを含む、キメラＣＤ４共受容体及び／又はキメラＣＤ８共受容体と、
（ｂ）ヒト化ＴＣＲα鎖及びヒト化ＴＣＲβ鎖であって、
前記ヒト化ＴＣＲα鎖が、少なくとも１つのヒトＶαセグメント及び少なくとも１つのヒトＪαセグメントを含み、非ヒトＴＣＲα定常遺伝子配列に操作可能に連結している非再配列Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α可変遺伝子座に由来し、前記ヒト化ＴＣＲβ鎖が、少なくとも１つのヒトＶβセグメント、少なくとも１つのヒトＤβセグメント、及び少なくとも１つのヒトＪβセグメントを含み、非ヒトＴＣＲβ定常遺伝子配列に操作可能に連結している非再配列ＴＣＲβ可変遺伝子座に由来する、ヒト化ＴＣＲα鎖及びヒト化ＴＣＲβ鎖と、任意選択で、
（ｃ）キメラＭＨＣ  ＩＩαポリペプチド及びキメラＭＨＣ  ＩＩβポリペプチド、並びに／又はキメラＭＨＣ  Ｉポリペプチドを含むキメラＭＨＣ  ＩＩ複合体であって、
前記キメラＭＨＣ  ＩＩαポリペプチドが、第１の核酸配列によりコードされ、前記キメラＭＨＣ  ＩＩβポリペプチドが、第２の核酸配列によりコードされ、前記キメラＭＨＣ  Ｉポリペプチドが、第３の核酸配列によりコードされ、
前記キメラＭＨＣ  ＩＩαポリペプチドが、ヒトＨＬＡクラスＩＩαポリペプチドの細胞外部分（又はその一部）並びに非ヒトＭＨＣ  ＩＩαポリペプチドの少なくとも膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを含み、
前記キメラＭＨＣ  ＩＩβポリペプチドが、ヒトＨＬＡクラスＩＩβポリペプチドの細胞外部分（又はその一部）並びに非ヒトＭＨＣ  ＩＩβポリペプチドの少なくとも膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを含み、
前記キメラＭＨＣ  Ｉポリペプチドが、ヒトＨＬＡクラスＩポリペプチドの細胞外部分（又はその一部）並びに非ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドの膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを含み、
前記キメラＭＨＣ  ＩＩ複合体が、前記キメラＣＤ４共受容体と会合し、かつ／又は前記キメラＭＨＣ  Ｉポリペプチドが、前記キメラＣＤ８共受容体と会合している、キメラＭＨＣ  ＩＩ複合体と、を含む、遺伝子改変非ヒト動物。
（項目２）
生殖細胞系ゲノム中に、
（ａ）前記第１、第２、及び第３のヌクレオチド配列と、
（ｂ）非ヒトＴＣＲα定常遺伝子配列に操作可能に連結している前記非再配列Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α可変遺伝子座、及び非ヒトＴＣＲβ定常遺伝子配列に操作可能に連結している前記非再配列ＴＣＲβ可変遺伝子座と、
（ｃ）前記第１、第２、及び第３の核酸配列と、を含む、項目１に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目３）
前記第１のヌクレオチド配列が、内在性ＣＤ４  Ｔ細胞共受容体座に存在し、かつ／又は前記第２のヌクレオチド配列が、内在性ＣＤ８α  Ｔ細胞共受容体座に存在し、前記第３のヌクレオチド配列が、内在性ＣＤ８β  Ｔ細胞共受容体座に存在する、項目１又は２に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目４）
前記キメラＣＤ４ポリペプチドが、ヒトＣＤ４ポリペプチドのＤ１、Ｄ２、及びＤ３ドメインを含み、かつ／又は前記キメラＣＤ８αポリペプチドが、ヒトＣＤ８αポリペプチドのＩｇＶ様ドメインを含み、前記キメラＣＤ８βポリペプチドが、ヒトＣＤ８βポリペプチドのＩｇＶ様ドメインを含む、項目１〜３のいずれか一項に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目５）
前記第１の核酸配列が、内在性非ヒトＭＨＣ  ＩＩα座に存在し、前記第２の核酸配列が、内在性非ヒトＭＨＣ  ＩＩβ座に存在し、かつ／又は前記第３の核酸配列が、内在性非ヒトＭＨＣ  Ｉ座に存在する、項目１〜４のいずれか一項に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目６）
前記キメラＭＨＣ  ＩＩαポリペプチドが、ヒトＨＬＡクラスＩＩα１及びα２ドメインを含み、前記キメラＭＨＣ  ＩＩβポリペプチドが、ヒトＨＬＡクラスＩＩβ１及びβ２ドメインを含み、かつ／又は前記ＭＨＣ  Ｉポリペプチドが、ヒトＨＬＡクラスＩα１、α２、及びα３ドメインを含む、項目１〜５のいずれか一項に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目７）
前記第１の核酸配列が、内在性非ヒトＭＨＣ  ＩＩαプロモータ及び調節エレメントの制御調節下で発現され、前記第２の核酸配列が、内在性非ヒトＭＨＣ  ＩＩβプロモータ及び調節エレメントの制御調節下で発現され、かつ／又は前記第３の核酸配列が、内在性非ヒトＭＨＣ  Ｉプロモータ及び調節エレメントの制御調節下で発現される、項目１〜６のいずれか一項に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目８）
前記キメラＭＨＣ  ＩＩαポリペプチドが、内在性非ヒトＭＨＣ  ＩＩαポリペプチドの膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを含み、前記キメラＭＨＣ  ＩＩβポリペプチドが、内在性非ヒトＭＨＣ  ＩＩβポリペプチドの膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを含み、かつ／又は、前記キメラＭＨＣ  Ｉポリペプチドが、内在性非ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドの膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを含む、項目１〜７のいずれか一項に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目９）
前記キメラＭＨＣ  ＩＩαポリペプチドが、ヒトＨＬＡ−ＤＲαタンパク質、ヒトＨＬＡ−ＤＱαタンパク質、又はヒトＨＬＡ−ＤＰαタンパク質の細胞外部分又はその一部を含み、
前記キメラＭＨＣ  ＩＩβポリペプチドが、ヒトＨＬＡ−ＤＲβタンパク質、ヒトＨＬＡ−ＤＱβタンパク質、若しくはヒトＨＬＡ−ＤＰβタンパク質の細胞外部分又はその一部を含み、かつ／又は、
前記キメラＭＨＣ  Ｉポリペプチドが、ヒトＨＬＡ−Ａタンパク質、ヒトＨＬＡ−Ｂタンパク質、又はヒトＨＬＡ−Ｃタンパク質の細胞外部分若しくはその一部を含む、項目１〜８のいずれか一項に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目１０）
前記キメラＭＨＣ  ＩＩαポリペプチドが、ヒトＨＬＡ−ＤＲαタンパク質の細胞外部分若しくはその一部を含み、
前記キメラＭＨＣ  ＩＩβポリペプチドが、ヒトＨＬＡ−ＤＲβタンパク質の細胞外部分若しくはその一部を含み、かつ／又は、
前記キメラＭＨＣ  Ｉポリペプチドが、ヒトＨＬＡ−Ａポリペプチドの細胞外部分若しくはその一部を含む、項目１〜９のいずれか一項に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目１１）
前記キメラＭＨＣ  Ｉポリペプチドが、ヒトＨＬＡ−Ａ２ポリペプチドのα１、α２、及びα３ドメインを含む、項目１〜１０のいずれか一項に記載の遺伝子改変非ヒト動物。（項目１２）
前記キメラＭＨＣ  Ｉポリペプチドが、ヒトＨＬＡ−Ａ２．１ポリペプチドのα１、α２、及びα３ドメインを含む、項目１〜１１のいずれか一項に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目１３）
前記キメラＭＨＣ  ＩＩαポリペプチドが、マウスＨ−２Ｅαポリペプチドの膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを含み、
前記キメラＭＨＣ  ＩＩβポリペプチドが、マウスＨ−２Ｅβポリペプチドの膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを含み、かつ／又は、
前記キメラＭＨＣ  Ｉポリペプチドが、マウスＨ−２Ｋポリペプチドの膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを含む、項目１〜１２のいずれか一項に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目１４）
前記非再配列ＴＣＲα可変遺伝子座が、ヒトＶα遺伝子セグメントの完全なレパートリ及びヒトＪα遺伝子セグメントの完全なレパートリを含み、かつ／又は前記非再配列ＴＣＲβ可変遺伝子座が、ヒトＶβ遺伝子セグメントの完全なレパートリ、ヒトＤβ遺伝子セグメントの完全なレパートリ、及びヒトＪβ遺伝子セグメントの完全なレパートリを含む、項目１〜１３のいずれか一項に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目１５）
前記ヒトＶα及びＪα遺伝子セグメントが再配列して、再配列ヒトＶα／Ｊα配列を形成し、かつ／又は前記ヒトＶβ、Ｄβ、及びＪβ遺伝子セグメントが再配列して、再配列ヒトＶβ／Ｄβ／Ｊβ配列を形成している、項目１〜１４のいずれか一項に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目１６）
前記非ヒト動物が、Ｔ細胞の表面において、ヒトＴＣＲα可変領域及び／又はヒトＴＣＲβ可変領域を含むＴ細胞受容体を発現している、項目１〜１５のいずれか一項に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目１７）
内在性非ヒトＶα及びＪαセグメントが再配列して、再配列Ｖα／Ｊα配列を形成することができず、かつ／又は内在性非ヒトＶβ、Ｄβ、及びＪβセグメントが再配列して、再配列Ｖβ／Ｄβ／Ｊβ配列を形成することができない、項目１〜１６のいずれか一項に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目１８）
前記動物が、機能的な内在性非ヒトＴＣＲα可変座を欠いており、かつ／又は機能的な内在性非ヒトＴＣＲβ可変座を欠いている、項目１〜１７のいずれか一項に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目１９）
前記内在性非ヒトＴＣＲα可変座が、全て若しくは実質的に全ての機能的な内在性Ｖα遺伝子セグメントを欠いており、かつ／又は全て若しくは実質的に全ての機能的な内在性Ｊα遺伝子セグメントを欠いており、かつ／又は、
前記内在性非ヒトＴＣＲβ可変座が、（ａ）全て若しくは実質的に全ての機能的な内在性Ｖβ遺伝子セグメントを欠いており、（ｂ）全て若しくは実質的に全ての機能的な内在性Ｄβ遺伝子セグメントを欠いており、（ｃ）全て若しくは実質的に全ての機能的な内在性Ｊβ遺伝子セグメントを欠いており、又は（ｄ）（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）の任意の組み合わせである、項目１〜１８のいずれか一項に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目２０）
前記第１のヌクレオチド配列が、内在性ＣＤ４  Ｔ細胞共受容体座に存在し、前記第２のヌクレオチド配列が、内在性ＣＤ８α  Ｔ細胞共受容体座に存在し、前記第３のヌクレオチド配列が、内在性ＣＤ８β  Ｔ細胞共受容体座に存在し、
前記非再配列ＴＣＲα可変遺伝子座が、内在性ＴＣＲα可変遺伝子座に存在し、前記非再配列ＴＣＲβ可変遺伝子座が、内在性ＴＣＲβ可変遺伝子座に存在し、
前記第１の核酸配列が、内在性非ヒトＭＨＣ  ＩＩα座に存在し、前記第２の核酸配列が、内在性非ヒトＭＨＣ  ＩＩβ座に存在し、前記第３の核酸配列が、内在性非ヒトＭＨＣ  Ｉ座に存在する、項目１〜１９のいずれか一項に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目２１）
前記第１のヌクレオチド配列が、内在性非ヒトＣＤ４プロモータ及び調節エレメントの制御調節下で発現され、前記第２のヌクレオチド配列が、内在性非ヒトＣＤ８αプロモータ及び調節エレメントの制御調節下で発現され、前記第３のヌクレオチド配列が、内在性非ヒトＣＤ８βプロモータ及び調節エレメントの制御調節下で発現され、
前記非再配列ＴＣＲα可変遺伝子座が、内在性ＴＣＲαプロモータ及び調節エレメントの制御調節下で発現され、前記非再配列ＴＣＲβ可変遺伝子座が、内在性ＴＣＲβプロモータ及び調節エレメントの制御調節下で発現され、
前記第１の核酸配列が、内在性非ヒトＭＨＣ  ＩＩαプロモータ及び調節エレメントの制御調節下で発現され、前記第２の核酸配列が、内在性非ヒトＭＨＣ  ＩＩβプロモータ及び調節エレメントの制御調節下で発現され、前記第３の核酸配列が、内在性非ヒトＭＨＣ  Ｉプロモータ及び調節エレメントの制御調節下で発現される、項目２０に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目２２）
（ａ）前記ヒトＣＤ４ポリペプチドの細胞外部分（又はその一部）をコードする配列が、内在性非ヒトＣＤ４共受容体ポリペプチドの細胞外部分（又はその一部）をコードする配列を置き換え、内在性非ヒトＣＤ４共受容体座において、内在性非ヒトＣＤ４膜貫通及び細胞質ドメインコード配列に操作可能に連結して、前記第１のヌクレオチド配列を形成しており、
ヒトＣＤ８αポリペプチドの細胞外部分（又はその一部）をコードする配列が、内在性非ヒトＴ細胞ＣＤ８αポリペプチドの細胞外部分（又はその一部）をコードする配列を置き換え、内在性非ヒトＣＤ８α座において、内在性非ヒトＣＤ８α膜貫通及び細胞質ドメインコード配列に操作可能に連結して、前記第２のヌクレオチド配列を形成しており、かつ／又は、
ヒトＣＤ８βポリペプチドの細胞外部分（又はその一部）をコードするヌクレオチド配列が、内在性非ヒトＴ細胞ＣＤ８βポリペプチドの細胞外部分（又はその一部）をコードする配列を置き換え、内在性ＣＤ８β座において、内在性非ヒトＣＤ８β膜貫通及び細胞質ドメインコード配列に操作可能に連結して、前記第３のヌクレオチド配列を形成しており、
（Ｂ）前記非再配列ＴＣＲα可変遺伝子座が、１つ又は２つ以上の内在性Ｖα及び／又はＪα遺伝子セグメントを、内在性ＴＣＲα可変遺伝子座において置き換え、前記非再配列ＴＣＲβ可変遺伝子座が、１つ又は２つ以上の内在性Ｖβ、Ｄβ、及び／又はＪβ遺伝子セグメントを、内在性ＴＣＲβ可変遺伝子座において置き換え、かつ／又は、
（Ｃ）ヒトＨＬＡクラスＩＩαポリペプチドの細胞外部分（又はその一部）をコードする配列が、内在性非ヒトＭＨＣ  ＩＩαポリペプチドの細胞外部分（又はその一部）をコードする配列を置き換え、内在性非ヒトＭＨＣ  ＩＩα座において、内在性ＭＨＣ  ＩＩαポリペプチド膜貫通及び細胞質ドメインコード配列に操作可能に連結して、前記第１の核酸配列を形成しており、
ヒトＨＬＡクラスＩＩβポリペプチドの細胞外部分（又はその一部）をコードする配列が、内在性非ヒトＭＨＣ  ＩＩβポリペプチドの細胞外部分（又はその一部）をコードする配列を置き換え、内在性非ヒトＭＨＣ  ＩＩβ座において、内在性ＭＨＣ  ＩＩβポリペプチド膜貫通及び細胞質ドメインコード配列に操作可能に連結して、前記第２の核酸配列を形成しており、かつ／又は
ヒトＨＬＡクラスＩポリペプチドの細胞外部分（又はその一部）をコードする配列が、内在性非ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドの細胞外部分（又はその一部）をコードする配列を置き換え、内在性非ヒトＭＨＣ  Ｉ座において、内在性ＭＨＣ  Ｉポリペプチド膜貫通及び細胞質ドメインコード配列に操作可能に連結して、前記第３の核酸配列を形成している、項目１〜２１のいずれか一項に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目２３）
前記動物が、（ａ）内在性ＣＤ４及び／若しくはＣＤ８共受容体座それぞれからの機能的な内在性非ヒトＣＤ４及び／若しくはＣＤ８共受容体、（ｂ）内在性ＴＣＲα座からの内在性ＴＣＲα可変ドメイン、（ｃ）内在性ＴＣＲβ座からの内在性ＴＣＲβ可変ドメイン、並びに／又は（ｄ）内在性ＭＨＣ座からの内在性ＭＨＣポリペプチドの細胞外ドメインを、細胞表面上で発現していない、項目１〜２２のいずれか一項に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目２４）
ヒトβ２ミクログロブリンのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするβ２ミクログロブリン座を更に含み、前記非ヒト動物が、ヒト又はヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドを発現している、項目１〜２３のいずれか一項に記載の遺伝子改変非ヒト動物。（項目２５）
前記非ヒト動物が、内在性非ヒトβ２ミクログロブリン座からの機能的な内在性非ヒト動物β２ミクログロブリンポリペプチドを発現していない、項目１〜２４のいずれか一項に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目２６）
前記β２ミクログロブリン座が、内在性非ヒトβ２ミクログロブリン調節エレメントに操作可能に連結している、項目２４又は２５に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目２７）
前記β２ミクログロブリン座が、ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエキソン２、エキソン３、及びエキソン４で示されるヌクレオチド配列を含む、項目２４〜２６のいずれか一項に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目２８）
前記β２ミクログロブリン座が、非ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエキソン１で示されるヌクレオチド配列を更に含む、項目２４〜２７のいずれか一項に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目２９）
前記ヌクレオチド配列が、げっ歯類のβ２ミクログロブリン遺伝子のエキソン１で示されるヌクレオチド配列を更に含む、項目２４〜２８のいずれか一項に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目３０）
前記動物が、げっ歯類である、項目１〜２９のいずれか一項に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目３１）
前記動物が、マウスである、項目１〜３０のいずれか一項に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目３２）
前記動物が、マウスであり、前記マウスが、
キメラＴ細胞ＣＤ４、ＣＤ８α、及びＣＤ８β共受容体ポリペプチドであって、各々がそれぞれ、ＣＤ４、ＣＤ８α、及びＣＤ８βマウス膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを含む、キメラＴ細胞ＣＤ４、ＣＤ８α、及びＣＤ８β共受容体ポリペプチドと、
Ｔ細胞の表面上における、ヒトＴＣＲα可変領域及びヒトＴＣＲβ可変領域を含むＴ細胞受容体と、
キメラＭＨＣ  ＩＩα、ＭＨＣ  ＩＩβ、及びＭＨＣ  Ｉポリペプチドであって、各々がそれぞれ、ヒトＨＬＡクラスＩＩα、ＨＬＡクラスＩＩβ、及びＨＬＡクラスＩポリペプチドの細胞外部分を含む、キメラＭＨＣ  ＩＩα、ＭＨＣ  ＩＩβ、及びＭＨＣ  Ｉポリペプチドと、ヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドと、を発現している、項目２４〜３１のいずれか一項に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目３３）
前記第１の核酸配列が、キメラヒト／マウスＨＬＡ−ＤＲ／Ｈ−２Ｅポリペプチドのα鎖をコードし、前記第２のヌクレオチド配列が、キメラヒト／マウスＨＬＡ−ＤＲ／Ｈ−２Ｅポリペプチドのβ鎖をコードし、前記第３の核酸配列が、キメラヒト／マウスＨＬＡ−Ａ／Ｈ−２Ｋポリペプチドをコードし、前記マウスが、ＨＬＡ−Ａ／Ｈ−２Ｋ及びＨＬＡ−ＤＲ／Ｈ−２Ｅタンパク質を発現している、項目３１又は項目３２に記載の遺伝子改変マウス。
（項目３４）
（ａ）前記非ヒト動物のゲノム内に、キメラＣＤ４共受容体をコードする第１のヌクレオチド配列、並びに／又はキメラＣＤ８α共受容体をコードする第２のヌクレオチド配列、及びキメラＣＤ８βポリペプチドをコードする第３のヌクレオチド配列を導入することであって、
前記第１のヌクレオチド配列が、非ヒトＣＤ４共受容体の少なくとも膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインに操作可能に連結しているヒトＣＤ４の細胞外部分又はその一部をコードし、
前記第２のヌクレオチド配列が、ヒトＣＤ８αの細胞外部分若しくはその一部並びに非ヒトＣＤ８αの少なくとも膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインをコードし、
前記第３のヌクレオチド配列が、ヒトＣＤ８βの細胞外部分若しくはその一部並びに非ヒトＣＤ８βの少なくとも膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインをコードする、ことと、
（ｂ）前記非ヒト動物のゲノム内に、少なくとも１つのヒトＶαセグメント及び少なくとも１つのヒトＪαセグメントを含み、非ヒトＴＣＲα定常遺伝子配列に操作可能に連結している非再配列Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α可変遺伝子座、並びに／又は少なくとも１つのヒトＶβセグメント、少なくとも１つのヒトＤβセグメント、及び少なくとも１つのヒトＪβセグメントを含み、非ヒトＴＣＲβ定常遺伝子配列に操作可能に連結している非再配列ＴＣＲβ可変遺伝子座を挿入することと、任意選択で、
（ｃ）前記ゲノム内に、キメラＭＨＣ  ＩＩαポリペプチドをコードする第１の核酸配列、キメラＭＨＣ  ＩＩβポリペプチドをコードする第２の核酸配列、及び／又はキメラＭＨＣ  Ｉポリペプチドをコードする第３の核酸配列を配置することであって、
前記第１の核酸配列が、ヒトＨＬＡクラスＩＩαポリペプチドの細胞外部分（又はその一部）並びに非ヒトＭＨＣ  ＩＩαポリペプチドの少なくとも膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインをコードし、
前記第２の核酸配列が、ヒトＨＬＡクラスＩＩβポリペプチドの細胞外部分（又はその一部）並びに非ヒトＭＨＣ  ＩＩβポリペプチドの少なくとも膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインをコードし、
前記第３の核酸配列が、ヒトＨＬＡクラスＩポリペプチドの細胞外部分（又はその一部）並びに非ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドの膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインをコードする、こと、並びに／又は、
（ｄ）前記非ヒト動物の前記ゲノム内に、ヒト又はヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードするβ２ミクログロブリン座を付加すること、を含む、項目１〜３３のいずれか一項に記載の遺伝子改変非ヒト動物を生産する方法。
（項目３５）
（ａ）前記第１、第２、及び／又は第３のヌクレオチド配列それぞれを前記非ヒト動物のゲノム内に導入することが、（ｉ）内在性ＣＤ４座において、内在性非ヒトＣＤ４ポリペプチドの細胞外部分（又はその一部）をコードするヌクレオチド配列を、ヒトＣＤ４ポリペプチドの細胞外部分（又はその一部）をコードするヌクレオチド配列により、前記ヒトＣＤ４ポリペプチドの細胞外部分（又はその一部）をコードする前記ヌクレオチド配列が前記内在性非ヒトＣＤ４膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインをコードする配列と操作可能に連結している状態にあるように、置き換えること、（ｉｉ）内在性ＣＤ８α座において、内在性非ヒトＣＤ８αポリペプチドの細胞外部分（又はその一部）をコードするヌクレオチド配列を、ヒトＣＤ８αポリペプチドの細胞外部分（又はその一部）をコードするヌクレオチド配列により、前記ヒトＣＤ８αポリペプチドの細胞外部分（又はその一部）をコードする前記ヌクレオチド配列が前記内在性非ヒトＣＤ８α膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインをコードする配列と操作可能に連結している状態にあるように、置き換えること、並びに／又は（ｉｉｉ）内在性ＣＤ８β座において、内在性非ヒトＣＤ８βポリペプチドの細胞外部分（又はその一部）をコードするヌクレオチド配列を、ヒトＣＤ８βポリペプチドの細胞外部分（又はその一部）をコードするヌクレオチド配列により、前記ヒトＣＤ８βポリペプチドの細胞外部分（又はその一部）をコードする前記ヌクレオチド配列が前記内在性非ヒトＣＤ８β膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインをコードする配列と操作可能に連結している状態にあるように、置き換えることを含み、
（ｂ）前記非再配列ＴＣＲα座及び／又は非再配列ＴＣＲβ座をそれぞれ、前記動物の前記ゲノム内に挿入することが、（ｉ）内在性非ヒトＴＣＲα可変遺伝子座を、少なくとも１つのヒトＶαセグメント及び少なくとも１つのヒトＪαセグメントを含む非再配列ＴＣＲα可変遺伝子座により置き換えて、ヒト化ＴＣＲα可変遺伝子座を生成することであって、前記ヒト化ＴＣＲα可変遺伝子座が、内在性非ヒトＴＣＲα定常領域に操作可能に連結している、こと、並びに／又は（ｉｉ）内在性非ヒトＴＣＲβ可変遺伝子座を、少なくとも１つのヒトＶβセグメント、少なくとも１つのヒトＤβセグメント、及び少なくとも１つのヒトＪβセグメントを含む非再配列ＴＣＲβ可変遺伝子座により置き換えて、ヒト化ＴＣＲβ可変遺伝子座を生成することであって、前記ヒト化ＴＣＲβ可変遺伝子座が、内在性非ヒトＴＣＲβ定常領域に操作可能に連結していること、を含み、
（ｃ）前記第１、第２、及び／又は第３の核酸配列をそれぞれ、前記非ヒト動物の前記ゲノム内に配置することが、（ｉ）内在性非ヒトＭＨＣ  ＩＩα座において、非ヒトＭＨＣ  ＩＩαポリペプチドの細胞外部分（又はその一部）をコードするヌクレオチド配列を、ヒトＨＬＡクラスＩＩαポリペプチドの細胞外部分（又はその一部）をコードするヌクレオチド配列により、前記ヒトＨＬＡクラスＩＩαポリペプチドの細胞外部分（又はその一部）をコードする前記ヌクレオチド配列が、前記内在性非ヒトＭＨＣ  ＩＩα膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインをコードする配列と操作可能に連結している状態にあるように、置き換えること、（ｉｉ）内在性非ヒトＭＨＣ  ＩＩβ座において、非ヒトＭＨＣ  ＩＩβポリペプチドの細胞外部分（又はその一部）をコードするヌクレオチド配列を、ヒトＨＬＡクラスＩＩβポリペプチドの細胞外部分（又はその一部）をコードするヌクレオチド配列により、前記ヒトＨＬＡクラスＩＩβポリペプチドの細胞外部分（又はその一部）をコードする前記ヌクレオチド配列が、前記内在性非ヒトＭＨＣ  ＩＩβ膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインをコードする配列と操作可能に連結している状態にあるように、置き換えること、並びに／又は（ｉｉｉ）内在性非ヒトＭＨＣ  Ｉ座において、非ヒトＭＨＣ
Ｉポリペプチドの細胞外部分（又はその一部）をコードするヌクレオチド配列を、ヒトＨＬＡクラスＩポリペプチドの細胞外部分（又はその一部）をコードするヌクレオチド配列により、前記ヒトＨＬＡクラスＩポリペプチドの細胞外部分（又はその一部）をコードする前記ヌクレオチド配列が、前記内在性非ヒトＭＨＣ  Ｉ膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインをコードする配列と操作可能に連結している状態にあるように、置き換えることを含み、かつ／又は、
（ｄ）ヒト又はヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードする前記β２ミクログロブリン座を前記非ヒト動物のゲノム内に付加することが、前記内在性非ヒトβ２ミクログロブリン座において、非ヒトβ２ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、前記ヒト又はヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列により置き換えることを含む、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記置き換える工程が、非ヒトＥＳ細胞における相同組換えを含み、これにより、任意の順序で、前記非ヒトＥＳ細胞のゲノム内に、前記第１、第２、及び第３のヌクレオチド配列が導入され、前記非再配列ＴＣＲα座及び非再配列ＴＣＲβ座が挿入され、前記第１、第２、及び第３の核酸配列が配置され、前記β２ミクログロブリン座が付加される、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
非ヒト動物を前記非ヒトＥＳ細胞から生じさせることを更に含む、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
前記導入する工程が、任意の順序で、
第１の非ヒト動物において、内在性ＣＤ４座で、内在性非ヒトＣＤ４ポリペプチドの細胞外部分（又はその一部）をコードするヌクレオチド配列を、ヒトＣＤ４ポリペプチドの細胞外部分（又はその一部）をコードするヌクレオチド配列により、前記ヒトＣＤ４ポリペプチドの細胞外部分（又はその一部）をコードする前記ヌクレオチド配列が前記内在性非ヒトＣＤ４膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインをコードする配列と操作可能に連結している状態にあるように、置き換えることと、
第２の非ヒト動物において、内在性ＣＤ８α座で、内在性非ヒトＣＤ８αポリペプチドの細胞外部分（又はその一部）をコードするヌクレオチド配列を、ヒトＣＤ８αポリペプチドの細胞外部分（又はその一部）をコードするヌクレオチド配列により、前記ヒトＣＤ８αポリペプチドの細胞外部分（又はその一部）をコードする前記ヌクレオチド配列が前記内在性非ヒトＣＤ８α膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインをコードする配列と操作可能に連結している状態にあるように、置き換えることと、内在性ＣＤ８β座において、内在性非ヒトＣＤ８βポリペプチドの細胞外部分（又はその一部）をコードするヌクレオチド配列を、ヒトＣＤ８βポリペプチドの細胞外部分（又はその一部）をコードするヌクレオチド配列により、前記ヒトＣＤ８βポリペプチドの細胞外部分（又はその一部）をコードする前記ヌクレオチド配列が前記内在性非ヒトＣＤ８β膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインをコードする配列と操作可能に連結している状態にあるように、置き換えることとを含み、
前記挿入する工程が、任意の順序で、
第３の非ヒト動物において、内在性非ヒトＴＣＲα可変遺伝子座を、少なくとも１つのヒトＶαセグメント及び少なくとも１つのヒトＪαセグメントを含む非再配列ヒト化ＴＣＲα可変遺伝子座により置き換えて、ヒト化ＴＣＲα可変遺伝子座を生成することであって、前記ヒト化ＴＣＲα可変遺伝子座が、内在性非ヒトＴＣＲα定常領域に操作可能に連結している、ことと、
第４の非ヒト動物において、内在性非ヒトＴＣＲβ可変遺伝子座を、少なくとも１つのヒトＶβセグメント、少なくとも１つのヒトＤβセグメント、及び少なくとも１つのヒトＪβセグメントを含む非再配列ヒト化ＴＣＲβ可変遺伝子座により置き換えて、ヒト化ＴＣＲβ可変遺伝子座を生成することであって、前記ヒト化ＴＣＲβ可変遺伝子座が、内在性非ヒトＴＣＲβ定常領域に操作可能に連結している、ことと、を含み、
前記配置する工程が、任意の順序で、
第５の非ヒト動物において、内在性非ヒトＭＨＣ  ＩＩα座で、非ヒトＭＨＣ  ＩＩαポリペプチドの細胞外部分（又はその一部）をコードするヌクレオチド配列を、ヒトＨＬＡクラスＩＩαポリペプチドの細胞外部分（又はその一部）をコードするヌクレオチド配列により、前記ヒトＨＬＡクラスＩＩαポリペプチドの細胞外部分（又はその一部）をコードする前記ヌクレオチド配列が前記内在性非ヒトＭＨＣ  ＩＩα膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインをコードする配列と操作可能に連結している状態にあるように、置き換えることと、
前記第５の非ヒト動物において、内在性非ヒトＭＨＣ  ＩＩβ座で、非ヒトＭＨＣ  ＩＩβポリペプチドの細胞外部分（又はその一部）をコードするヌクレオチド配列を、ヒトＨＬＡクラスＩＩβポリペプチドの細胞外部分（又はその一部）をコードするヌクレオチド配列により、前記ヒトＨＬＡクラスＩＩβポリペプチドの細胞外部分（又はその一部）をコードする前記ヌクレオチド配列が前記内在性非ヒトＭＨＣ  ＩＩβ膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインをコードする配列と操作可能に連結している状態にあるように、置き換えて、第７の非ヒト動物を生じさせることと、
前記第５の非ヒト動物において、内在性非ヒトＭＨＣ  Ｉ座で、非ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドの細胞外部分（又はその一部）をコードするヌクレオチド配列を、ヒトＨＬＡクラスＩポリペプチドの細胞外部分（又はその一部）をコードするヌクレオチド配列により、前記ヒトＨＬＡクラスＩポリペプチドの細胞外部分（又はその一部）をコードする前記ヌクレオチド配列が前記内在性非ヒトＭＨＣ  Ｉ膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインをコードする配列と操作可能に連結している状態にあるように、置き換えて、第８の非ヒト動物を生じさせることとを含み、かつ／又は、
前記付加する工程が、
第６の非ヒト動物において、内在性非ヒトβ２ミクログロブリン座で、非ヒトβ２ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、ヒト又はヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列により置き換えることを含み、任意の順序で、前記第１、第２、第３、第４、第５、及び第６の非ヒト動物を育種することにより、非ヒト動物のゲノム内に、前記第１、第２、及び第３のヌクレオチド配列が導入され、前記非再配列ＴＣＲα座及び非再配列ＴＣＲβ座が挿入され、前記第１、第２、及び第３の核酸配列が配置され、かつ／又は前記β２ミクログロブリン座が付加される、項目３４又は３５に記載の方法。
（項目３９）
前記内在性ＣＤ４座における前記置換えが、第１の非ヒトＥＳ細胞の内在性ＣＤ４座における相同組換えを含み、
前記内在性ＣＤ８α及びＣＤ８β座における前記置換えが、任意の順序で、第２の非ヒトＥＳ細胞内の内在性ＣＤ８α及びＣＤ８β座における連続的な相同組換えを含み、
前記内在性ＴＣＲα可変遺伝子座における前記置換えが、第３の非ヒトＥＳ細胞内の内在性ＴＣＲα可変遺伝子座における相同組換えを含み、
前記内在性ＴＣＲβ可変遺伝子座における前記置換えが、第４の非ヒトＥＳ細胞内の内在性ＴＣＲβ可変遺伝子座における相同組換えを含み、
前記内在性ＭＨＣ  ＩＩα、ＭＨＣ  ＩＩβ、及びＭＨＣ  Ｉ座における置換えが、任意の順序で、第５の非ヒトＥＳ細胞内の内在性ＭＨＣ  ＩＩα、ＭＨＣ  ＩＩβ、及びＭＨＣ  Ｉ座における相同組換えを含み、
前記β２ミクログロブリン座における置換えが、第６の非ヒトＥＳ細胞内の内在性β２ミクログロブリン座における相同組換えを含む、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
育種前に、前記第１、第２、第３、第４、第５、及び第６の非ヒト動物を、前記第１、第２、第３、第４、第５、及び第６の非ヒトＥＳ細胞からそれぞれ生じさせることを更に含む、項目３８に記載の方法。
（項目４１）
前記非ヒト動物が、マウスである、項目３４〜４０のいずれか一項に記載の方法。
（項目４２）
抗原に特異的なヒトＴＣＲ可変ドメインを非ヒト動物から得る方法であって、項目１〜３３のいずれか一項に記載の非ヒト動物又は項目３４〜４１のいずれか一項に記載の方法により生産された非ヒト動物から、前記抗原に結合するＴ細胞又はＴＣＲタンパク質を単離することを含む、方法。
（項目４３）
ＴＣＲα可変ドメインをコードする第１の核酸、及び／又はＴＣＲβ可変ドメインをコードする第２の核酸を特定することを更に含み、それらの各可変ドメインが、Ｔ細胞により発現されるか、又は前記ＴＣＲタンパク質の抗原結合部位の一部を形成している、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
項目４３において特定された前記第１の核酸と同一若しくは実質的に同一の第３の核酸、及び／又は項目４３において特定された前記第２の核酸と同一若しくは実質的に同一の第４の核酸の発現に十分な条件において、細胞を培養することを更に含み、前記第３及び第４の核酸が、同じか又は異なる発現ベクターに存在している、項目４３に記載の方法。（項目４５）
抗原に対して特異的なヒトＴＣＲ可変ドメインを生成するｉｎ  ｖｉｔｒｏ法であって、（ａ）非ヒト動物の非ヒト抗原提示細胞との接触、及び（ｂ）前記抗原とのインキュベーションの後に、非ヒトＴ細胞の活性化を検出することを含み、前記非ヒトＴ細胞が、キメラヒト／非ヒトＴ細胞共受容体、並びに（ｉ）キメラヒト／非ヒトＴＣＲα鎖及び（ｉｉ）キメラヒト／非ヒトＴＣＲβ鎖のいずれか一方又は両方を発現しており、前記非ヒト抗原提示細胞が、キメラヒト／非ヒトＭＨＣポリペプチドを発現している、方法。
（項目４６）
前記Ｔ細胞からの、ヒトＴＣＲα可変ドメイン及び／若しくはヒトＴＣＲβ可変ドメイン、又は前記ヒトＴＣＲα可変ドメイン及び／若しくはヒトＴＣＲβ可変ドメインをそれぞれコードする第１及び／若しくは第２の核酸を単離することを更に含む、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
前記抗原が、腫瘍抗原である、項目４２〜４６のいずれか一項に記載の方法。
（項目４８）
前記抗原が、ウイルス抗原である、項目４２〜４７のいずれか一項に記載の方法。
（項目４９）
前記非ヒト動物が、マウスである、項目４２〜４８のいずれか一項に記載の方法。
（項目５０）
項目４２〜４９のいずれか一項に記載の方法により単離又は検出された前記Ｔ細胞から生成されたハイブリドーマ。
（項目５１）
項目４２〜４９のいずれか一項に記載の方法により取得又は生成されたヒトＴ細胞受容体可変ドメイン。
（項目５２）
項目４３〜４４及び項目４６〜４９のいずれか一項に記載の方法により単離された核酸。
（項目５３）
項目５２に記載の核酸と同一又は実質的に同一の核酸を含む細胞。
（項目５４）
項目５２に記載の核酸を含み、前記核酸が、ヒトＴＣＲβ可変ドメインをコードする配列を含む、発現ベクター。
（項目５５）
前記発現ベクターが、ヒトＴＣＲα可変ドメインをコードする核酸に操作可能に連結している状態にある、ＴＣＲα定常遺伝子をコードする配列を更に含む、項目５４に記載の発現ベクター。
（項目５６）
項目５２に記載の核酸を含み、前記核酸が、ヒトＴＣＲβ可変ドメインをコードする配列を含む、発現ベクター。
（項目５７）
前記発現ベクターが、前記ヒトＴＣＲβ可変ドメインをコードする前記核酸に操作可能に連結している状態にある、ＴＣＲβ定常遺伝子をコードする配列を更に含む、項目５６に記載の発現ベクター。
（項目５８）
非ヒト動物の第１及び第２の細胞を含む組成物であって、前記第１の細胞が、キメラヒト／非ヒトＴ細胞共受容体、並びに、任意選択で、（ｉ）キメラヒト／非ヒトＴＣＲα鎖及び（ｉｉ）キメラヒト／非ヒトＴＣＲβ鎖のいずれか一方又は両方を発現しており、前記第２の細胞が、前記キメラヒト／非ヒトＴ細胞共受容体と会合するキメラヒト／非ヒトＭＨＣポリペプチドを発現している、組成物。
（項目５９）
前記第１の細胞が、非ヒトＴ細胞である、項目５８に記載の組成物。
（項目６０）
前記第２の細胞が、非ヒト抗原提示細胞である、項目５８又は５９に記載の組成物。
（項目６１）
抗原を更に含む、項目５８〜６０のいずれか一項に記載の組成物。
（項目６２）
項目１〜３３のいずれか一項に記載の非ヒト動物、又は、項目３４〜４１のいずれか一項に記載の方法により生産された非ヒト動物から単離された細胞。
（項目６３）
前記細胞が、Ｔ細胞である、項目６２に記載の細胞。
（項目６４）
前記細胞が、抗原提示細胞である、項目６２に記載の細胞。
（項目６５）
核酸配列が、ＴＣＲ可変ドメイン又はＭＨＣ細胞外ドメインをコードする配列を含む、項目６２〜６４のいずれか一項に記載の細胞から単離された、核酸配列。
（項目６６）
非ヒト動物においてヒト化Ｔ細胞応答を生じさせる方法であって、項目１〜３３のいずれか一項に記載の非ヒト動物、又は項目３４〜４１のいずれか一項に記載の方法により生産された非ヒト動物を、抗原により免疫化することを含む、方法。
（項目６７）
前記抗原が、ヒト抗原又はヒト腫瘍抗原である、項目６６に記載の方法。
（項目６８）
前記非ヒト動物が、全ての機能的なヒトＴＣＲＶα遺伝子セグメントの少なくとも５０％、及び／又は全ての機能的なヒトＴＣＲＶβ遺伝子セグメントの少なくとも５０％を発現する、項目６６又は６７に記載の方法。
（項目６９）
前記非ヒト動物のＴ細胞受容体レパートリが、全て若しくは実質的に全ての機能的なヒトＴＣＲＶα遺伝子セグメント、及び／又は全て若しくは実質的に全ての機能的なヒトＴＣＲＶβ遺伝子セグメントを含む、項目６６〜６８のいずれか一項に記載の方法。
（項目７０）
前記ＴＣＲα定常領域遺伝子又はＴＣＲβ定常領域遺伝子がそれぞれ、ヒトＴＣＲα定常領域遺伝子又はヒトＴＣＲβ定常領域遺伝子である、項目５５又は項目５７に記載の発現ベクター。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】ヒト化ＴＣＲアルファ及びベータタンパク質、ヒト化β２ミクログロブリンと複合体化したヒト化ＭＨＣクラスＩ、並びにヒト化ＣＤ８ヘテロ二量体を含むヒト化Ｔ細胞受容体複合体（左パネル）と、ヒト化ＴＣＲアルファ及びベータタンパク質、ヒト化ＭＨＣクラスＩＩヘテロ二量体、並びにヒト化ＣＤ４を含むＴ細胞受容体複合体（右パネル）との模式図（ノンスケール）である。ヒト化ＭＨＣにより提示された抗原は、円として示される。マウス領域は、塗りつぶした形状として示され、一方、ヒト領域は、縞状の形状として示される。
【００３８】
【図２Ａ】例示的なキメラＭＨＣ  Ｉ及びＭＨＣ  ＩＩ座、例えば、キメラＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２Ｋ座（図２Ａ）、キメラＨＬＡ−ＤＲ２／Ｈ−２Ｅ座（図２Ｂ）、及びヒト化β２Ｍ座（図２Ｃ）の模式図（ノンスケール）である。特に断らない限り、ヒト配列は、塗りつぶしていない形状として示され、マウス配列は、塗りつぶした形状として示される。縞状の形状は、内在性座ではないマウス系統から得られたＨ−２Ｅのエキソン１を表わす（実施例１．３及び図３Ｂを参照のこと）。ｌｏｘＰが導入されたネオマイシンホスホトランスフェラーゼカセットは、矢印の標識で示される。
【図２Ｂ】例示的なキメラＭＨＣ  Ｉ及びＭＨＣ  ＩＩ座、例えば、キメラＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２Ｋ座（図２Ａ）、キメラＨＬＡ−ＤＲ２／Ｈ−２Ｅ座（図２Ｂ）、及びヒト化β２Ｍ座（図２Ｃ）の模式図（ノンスケール）である。特に断らない限り、ヒト配列は、塗りつぶしていない形状として示され、マウス配列は、塗りつぶした形状として示される。縞状の形状は、内在性座ではないマウス系統から得られたＨ−２Ｅのエキソン１を表わす（実施例１．３及び図３Ｂを参照のこと）。ｌｏｘＰが導入されたネオマイシンホスホトランスフェラーゼカセットは、矢印の標識で示される。
【図２Ｃ】例示的なキメラＭＨＣ  Ｉ及びＭＨＣ  ＩＩ座、例えば、キメラＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２Ｋ座（図２Ａ）、キメラＨＬＡ−ＤＲ２／Ｈ−２Ｅ座（図２Ｂ）、及びヒト化β２Ｍ座（図２Ｃ）の模式図（ノンスケール）である。特に断らない限り、ヒト配列は、塗りつぶしていない形状として示され、マウス配列は、塗りつぶした形状として示される。縞状の形状は、内在性座ではないマウス系統から得られたＨ−２Ｅのエキソン１を表わす（実施例１．３及び図３Ｂを参照のこと）。ｌｏｘＰが導入されたネオマイシンホスホトランスフェラーゼカセットは、矢印の標識で示される。
【００３９】
【図３Ａ】ヒト化ＭＨＣ  Ｉ及びＭＨＣ  ＩＩ遺伝子を含むヒト化ＭＨＣ座を生じさせる戦略を示す図である。図３Ａに示された特定の実施形態では、生じたマウスのＭＨＣ座は、キメラＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２Ｋ及びＨＬＡ−ＤＲ２／Ｈ−２Ｅ配列（Ｈ２−Ｋ＋／１６６６  ＭＨＣ−ＩＩ＋／６１１２）を含み、Ｈ２−Ｄ配列（Ｈ２−Ｄ＋／ｄｅｌｅｔｅ）及びＨ−２Ａ配列を欠いている（遺伝子操作スキームにより、Ｈ−２Ａの欠失ももたらされる。実施例１．２を参照のこと）。ヒト化の各段階においてＥＳ細胞に導入された大型標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）又はＣｒｅリコンビナーゼ構築物は、矢印の右側に示される。ＭＡＩＤ又は４桁の数字は、改変されたアレルＩＤナンバーを意味する。図３Ｂは、例示的なＨＬＡ−ＤＲ２／Ｈ−２Ｅ大型標的化ベクターの模式図（ノンスケール）である。特に断らない限り、ヒト配列は、塗りつぶしていない形状として示され、マウス配列は、塗りつぶした形状として示される。縞状の形状は、内在性座ではないマウス系統から得られたＨ−２Ｅのエキソン１を表わす（実施例１．３を参照のこと）。ｌｏｘＰが導入されたヒグロマイシンカセットは、矢印の標識として示される。図３Ｃは、キメラヒト／マウスＭＨＣ座の例示的な遺伝子型の模式図（ノンスケール）である（＊＊は、全てのマウス系統に存在しない、例えば、Ｃ５７ＢＬ／６又は１２９マウス系統に存在しないＨ−２Ｌ遺伝子を表わす）。この場合、内在性マウスＨ−２Ｋ及びＨ−２Ｅ座はそれぞれ、キメラヒト／マウスＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２Ｋ及びＨＬＡ−ＤＲ２／Ｈ−２Ｅ座（縞状の形状）により置き換えられ、Ｈ−２Ａ及びＨ−２Ｄ座は欠失され（破線で囲われた塗りつぶしていない形状）、残りの座は、内在性マウス遺伝子である（実線で囲われた濃い形状）。
【図３Ｂ】ヒト化ＭＨＣ  Ｉ及びＭＨＣ  ＩＩ遺伝子を含むヒト化ＭＨＣ座を生じさせる戦略を示す図である。図３Ａに示された特定の実施形態では、生じたマウスのＭＨＣ座は、キメラＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２Ｋ及びＨＬＡ−ＤＲ２／Ｈ−２Ｅ配列（Ｈ２−Ｋ＋／１６６６  ＭＨＣ−ＩＩ＋／６１１２）を含み、Ｈ２−Ｄ配列（Ｈ２−Ｄ＋／ｄｅｌｅｔｅ）及びＨ−２Ａ配列を欠いている（遺伝子操作スキームにより、Ｈ−２Ａの欠失ももたらされる。実施例１．２を参照のこと）。ヒト化の各段階においてＥＳ細胞に導入された大型標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）又はＣｒｅリコンビナーゼ構築物は、矢印の右側に示される。ＭＡＩＤ又は４桁の数字は、改変されたアレルＩＤナンバーを意味する。図３Ｂは、例示的なＨＬＡ−ＤＲ２／Ｈ−２Ｅ大型標的化ベクターの模式図（ノンスケール）である。特に断らない限り、ヒト配列は、塗りつぶしていない形状として示され、マウス配列は、塗りつぶした形状として示される。縞状の形状は、内在性座ではないマウス系統から得られたＨ−２Ｅのエキソン１を表わす（実施例１．３を参照のこと）。ｌｏｘＰが導入されたヒグロマイシンカセットは、矢印の標識として示される。図３Ｃは、キメラヒト／マウスＭＨＣ座の例示的な遺伝子型の模式図（ノンスケール）である（＊＊は、全てのマウス系統に存在しない、例えば、Ｃ５７ＢＬ／６又は１２９マウス系統に存在しないＨ−２Ｌ遺伝子を表わす）。この場合、内在性マウスＨ−２Ｋ及びＨ−２Ｅ座はそれぞれ、キメラヒト／マウスＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２Ｋ及びＨＬＡ−ＤＲ２／Ｈ−２Ｅ座（縞状の形状）により置き換えられ、Ｈ−２Ａ及びＨ−２Ｄ座は欠失され（破線で囲われた塗りつぶしていない形状）、残りの座は、内在性マウス遺伝子である（実線で囲われた濃い形状）。
【図３Ｃ】ヒト化ＭＨＣ  Ｉ及びＭＨＣ  ＩＩ遺伝子を含むヒト化ＭＨＣ座を生じさせる戦略を示す図である。図３Ａに示された特定の実施形態では、生じたマウスのＭＨＣ座は、キメラＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２Ｋ及びＨＬＡ−ＤＲ２／Ｈ−２Ｅ配列（Ｈ２−Ｋ＋／１６６６  ＭＨＣ−ＩＩ＋／６１１２）を含み、Ｈ２−Ｄ配列（Ｈ２−Ｄ＋／ｄｅｌｅｔｅ）及びＨ−２Ａ配列を欠いている（遺伝子操作スキームにより、Ｈ−２Ａの欠失ももたらされる。実施例１．２を参照のこと）。ヒト化の各段階においてＥＳ細胞に導入された大型標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）又はＣｒｅリコンビナーゼ構築物は、矢印の右側に示される。ＭＡＩＤ又は４桁の数字は、改変されたアレルＩＤナンバーを意味する。図３Ｂは、例示的なＨＬＡ−ＤＲ２／Ｈ−２Ｅ大型標的化ベクターの模式図（ノンスケール）である。特に断らない限り、ヒト配列は、塗りつぶしていない形状として示され、マウス配列は、塗りつぶした形状として示される。縞状の形状は、内在性座ではないマウス系統から得られたＨ−２Ｅのエキソン１を表わす（実施例１．３を参照のこと）。ｌｏｘＰが導入されたヒグロマイシンカセットは、矢印の標識として示される。図３Ｃは、キメラヒト／マウスＭＨＣ座の例示的な遺伝子型の模式図（ノンスケール）である（＊＊は、全てのマウス系統に存在しない、例えば、Ｃ５７ＢＬ／６又は１２９マウス系統に存在しないＨ−２Ｌ遺伝子を表わす）。この場合、内在性マウスＨ−２Ｋ及びＨ−２Ｅ座はそれぞれ、キメラヒト／マウスＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２Ｋ及びＨＬＡ−ＤＲ２／Ｈ−２Ｅ座（縞状の形状）により置き換えられ、Ｈ−２Ａ及びＨ−２Ｄ座は欠失され（破線で囲われた塗りつぶしていない形状）、残りの座は、内在性マウス遺伝子である（実線で囲われた濃い形状）。
【００４０】
【図４Ａ】マウスＴＣＲα座のヒト化についての、漸進的な戦略を示す図である（ノンスケール）。この場合、ＴＣＲα可変領域遺伝子セグメントは、欠失したマウス座（ＭＡＩＤ１５４０）の最初のヒト化の上流で連続的に付加される。マウス配列は、塗りつぶした形状により示される。ヒト配列は、塗りつぶしていない形状により示される。ＭＡＩＤは、改変されたアレルＩＤナンバーを意味する。ＴＲＡＶ＝ＴＣＲ  Ｖαセグメント、ＴＲＡＪ＝ＴＣＲ  Ｊαセグメント（ｈＴＲＡＪ＝ヒトＴＲＡＪ）、ＴＲＡＣ＝ＴＣＲ  Ｃαドメイン、ＴＣＲＤ＝ＴＣＲδ。
【図４Ｂ】マウスＴＣＲβ座のヒト化についての、漸進的な戦略を示す図である（ノンスケール）。この場合、ＴＣＲβ可変領域遺伝子セグメントは、欠失したマウスＴＣＲβ可変座に連続的に付加される。マウス配列は、塗りつぶした形状により示される。ヒト配列は、塗りつぶしていない形状により示される。ＭＡＩＤは、改変されたアレルＩＤナンバーを意味する。ＴＲＢＶ又はＴＣＲＢＶ＝ＴＣＲβＶセグメント。
【００４１】
【図５Ａ】キメラＣＤ４座の模式図（ノンスケール）を示す図である。ヒトコードエキソンは、縞状の形状により表される。マウスコードエキソンは、塗りつぶした形状により表される。非コードエキソンは、塗りつぶしていない形状により表される。免疫グロブリン様ドメイン（Ｉｇ）、膜貫通（ＴＭ）、細胞質（ＣＹＴ）、及びシグナルペプチド（シグナル）コードエキソン、並びに、３’非翻訳領域（ＵＴＲ）が示される。ｌｏｘＰが導入された（ｌｏｘＰ）ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（Ｐｇｋ−ｎｅｏ）カセットは、矢印の標識で示される。
【図５Ｂ】キメラＣＤ８ａ及びＣＤ８ｂ座の模式図（ノンスケール）を示す図である。ヒトコードエキソンは、縞状の形状により表される。マウスコードエキソンは、塗りつぶした形状により表される。非コードエキソンは、塗りつぶしていない形状により表される。免疫グロブリン様ドメイン（ＩｇＶ）、膜貫通（ＴＭ）、細胞質（ＣＹＴ）、及びシグナルペプチド（シグナル）コードエキソン、並びに３’非翻訳領域（ＵＴＲ）が示される。ｌｏｘＰが導入された（ｌｏｘＰ）ヒグロマイシン（Ｈｙｇ）及びネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（Ｐｇｋ−ｎｅｏ）カセットは、矢印の標識で示される。
【００４２】
【図６Ａ】コントロールマウス又は、ヒト化ＭＨＣ  Ｉ、ＭＨＣ  ＩＩα及びβ、ＴＣＲα及びβ、ＣＤ４、ＣＤ８α及びβ、並びにβ２Ｍ（ＴＭ  Ｉ／ＩＩ  Ｂ  Ｃ４／８）座を含むマウスから単離された胸腺細胞の、シングレットでゲーティングされ、（図６Ａ）抗マウスＣＤ１９抗体及び抗マウスＣＤ３抗体、（図６Ｂ）抗マウスＣＤ１９抗体及び抗マウスＦ４／８０抗体、又は（図６Ｃ）抗マウスＣＤ８α抗体及び抗マウスＣＤ４抗体（左パネル）若しくは抗ヒトＣＤ８α抗体及び抗ヒトＣＤ４抗体（右パネル）により染色された、ＦＡＣＳコンタープロットを示す図である。
【図６Ｂ】コントロールマウス又は、ヒト化ＭＨＣ  Ｉ、ＭＨＣ  ＩＩα及びβ、ＴＣＲα及びβ、ＣＤ４、ＣＤ８α及びβ、並びにβ２Ｍ（ＴＭ  Ｉ／ＩＩ  Ｂ  Ｃ４／８）座を含むマウスから単離された胸腺細胞の、シングレットでゲーティングされ、（図６Ａ）抗マウスＣＤ１９抗体及び抗マウスＣＤ３抗体、（図６Ｂ）抗マウスＣＤ１９抗体及び抗マウスＦ４／８０抗体、又は（図６Ｃ）抗マウスＣＤ８α抗体及び抗マウスＣＤ４抗体（左パネル）若しくは抗ヒトＣＤ８α抗体及び抗ヒトＣＤ４抗体（右パネル）により染色された、ＦＡＣＳコンタープロットを示す図である。
【図６Ｃ】コントロールマウス又は、ヒト化ＭＨＣ  Ｉ、ＭＨＣ  ＩＩα及びβ、ＴＣＲα及びβ、ＣＤ４、ＣＤ８α及びβ、並びにβ２Ｍ（ＴＭ  Ｉ／ＩＩ  Ｂ  Ｃ４／８）座を含むマウスから単離された胸腺細胞の、シングレットでゲーティングされ、（図６Ａ）抗マウスＣＤ１９抗体及び抗マウスＣＤ３抗体、（図６Ｂ）抗マウスＣＤ１９抗体及び抗マウスＦ４／８０抗体、又は（図６Ｃ）抗マウスＣＤ８α抗体及び抗マウスＣＤ４抗体（左パネル）若しくは抗ヒトＣＤ８α抗体及び抗ヒトＣＤ４抗体（右パネル）により染色された、ＦＡＣＳコンタープロットを示す図である。
【００４３】
【図７Ａ】コントロールマウス、又はヒト化ＭＨＣ  Ｉ、ＭＨＣ  ＩＩα及びβ、ＴＣＲα及びβ、ＣＤ４、ＣＤ８α及びβ、並びにβ２Ｍ（ＴＭ  Ｉ／ＩＩ  Ｂ  Ｃ４／８）座を含むマウスから単離された胸腺細胞の、ＣＤ１９＋細胞、Ｆ４／８０＋細胞、又はＣＤ３＋細胞でゲーティングされ、（図７Ａ、７Ｂ）抗ヒトＢ２Ｍ抗体又は抗マウスＨ−２Ｄ抗体、（図７Ｃ、図７Ｄ）抗ＨＬＡ−Ａ２抗体又は抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体、（図７Ｅ、図７Ｆ）抗Ｈ−２Ｄ抗体及び抗ＩＡＩＥ抗体、又は、（図７Ｇ）抗マウスＣＤ４抗体及び抗ヒトＣＤ４抗体（上側）、抗マウスＣＤ８α抗体及び抗ヒトＣＤ８α抗体（中央）、並びに抗マウスＣＤ８β抗体及び抗ヒトＣＤ８β抗体（下側）により染色された、ＦＡＣＳコンタープロットを示す図である。
【図７Ｂ】コントロールマウス、又はヒト化ＭＨＣ  Ｉ、ＭＨＣ  ＩＩα及びβ、ＴＣＲα及びβ、ＣＤ４、ＣＤ８α及びβ、並びにβ２Ｍ（ＴＭ  Ｉ／ＩＩ  Ｂ  Ｃ４／８）座を含むマウスから単離された胸腺細胞の、ＣＤ１９＋細胞、Ｆ４／８０＋細胞、又はＣＤ３＋細胞でゲーティングされ、（図７Ａ、７Ｂ）抗ヒトＢ２Ｍ抗体又は抗マウスＨ−２Ｄ抗体、（図７Ｃ、図７Ｄ）抗ＨＬＡ−Ａ２抗体又は抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体、（図７Ｅ、図７Ｆ）抗Ｈ−２Ｄ抗体及び抗ＩＡＩＥ抗体、又は、（図７Ｇ）抗マウスＣＤ４抗体及び抗ヒトＣＤ４抗体（上側）、抗マウスＣＤ８α抗体及び抗ヒトＣＤ８α抗体（中央）、並びに抗マウスＣＤ８β抗体及び抗ヒトＣＤ８β抗体（下側）により染色された、ＦＡＣＳコンタープロットを示す図である。
【図７Ｃ】コントロールマウス、又はヒト化ＭＨＣ  Ｉ、ＭＨＣ  ＩＩα及びβ、ＴＣＲα及びβ、ＣＤ４、ＣＤ８α及びβ、並びにβ２Ｍ（ＴＭ  Ｉ／ＩＩ  Ｂ  Ｃ４／８）座を含むマウスから単離された胸腺細胞の、ＣＤ１９＋細胞、Ｆ４／８０＋細胞、又はＣＤ３＋細胞でゲーティングされ、（図７Ａ、７Ｂ）抗ヒトＢ２Ｍ抗体又は抗マウスＨ−２Ｄ抗体、（図７Ｃ、図７Ｄ）抗ＨＬＡ−Ａ２抗体又は抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体、（図７Ｅ、図７Ｆ）抗Ｈ−２Ｄ抗体及び抗ＩＡＩＥ抗体、又は、（図７Ｇ）抗マウスＣＤ４抗体及び抗ヒトＣＤ４抗体（上側）、抗マウスＣＤ８α抗体及び抗ヒトＣＤ８α抗体（中央）、並びに抗マウスＣＤ８β抗体及び抗ヒトＣＤ８β抗体（下側）により染色された、ＦＡＣＳコンタープロットを示す図である。
【図７Ｄ】コントロールマウス、又はヒト化ＭＨＣ  Ｉ、ＭＨＣ  ＩＩα及びβ、ＴＣＲα及びβ、ＣＤ４、ＣＤ８α及びβ、並びにβ２Ｍ（ＴＭ  Ｉ／ＩＩ  Ｂ  Ｃ４／８）座を含むマウスから単離された胸腺細胞の、ＣＤ１９＋細胞、Ｆ４／８０＋細胞、又はＣＤ３＋細胞でゲーティングされ、（図７Ａ、７Ｂ）抗ヒトＢ２Ｍ抗体又は抗マウスＨ−２Ｄ抗体、（図７Ｃ、図７Ｄ）抗ＨＬＡ−Ａ２抗体又は抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体、（図７Ｅ、図７Ｆ）抗Ｈ−２Ｄ抗体及び抗ＩＡＩＥ抗体、又は、（図７Ｇ）抗マウスＣＤ４抗体及び抗ヒトＣＤ４抗体（上側）、抗マウスＣＤ８α抗体及び抗ヒトＣＤ８α抗体（中央）、並びに抗マウスＣＤ８β抗体及び抗ヒトＣＤ８β抗体（下側）により染色された、ＦＡＣＳコンタープロットを示す図である。
【図７Ｅ】コントロールマウス、又はヒト化ＭＨＣ  Ｉ、ＭＨＣ  ＩＩα及びβ、ＴＣＲα及びβ、ＣＤ４、ＣＤ８α及びβ、並びにβ２Ｍ（ＴＭ  Ｉ／ＩＩ  Ｂ  Ｃ４／８）座を含むマウスから単離された胸腺細胞の、ＣＤ１９＋細胞、Ｆ４／８０＋細胞、又はＣＤ３＋細胞でゲーティングされ、（図７Ａ、７Ｂ）抗ヒトＢ２Ｍ抗体又は抗マウスＨ−２Ｄ抗体、（図７Ｃ、図７Ｄ）抗ＨＬＡ−Ａ２抗体又は抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体、（図７Ｅ、図７Ｆ）抗Ｈ−２Ｄ抗体及び抗ＩＡＩＥ抗体、又は、（図７Ｇ）抗マウスＣＤ４抗体及び抗ヒトＣＤ４抗体（上側）、抗マウスＣＤ８α抗体及び抗ヒトＣＤ８α抗体（中央）、並びに抗マウスＣＤ８β抗体及び抗ヒトＣＤ８β抗体（下側）により染色された、ＦＡＣＳコンタープロットを示す図である。
【図７Ｆ】コントロールマウス、又はヒト化ＭＨＣ  Ｉ、ＭＨＣ  ＩＩα及びβ、ＴＣＲα及びβ、ＣＤ４、ＣＤ８α及びβ、並びにβ２Ｍ（ＴＭ  Ｉ／ＩＩ  Ｂ  Ｃ４／８）座を含むマウスから単離された胸腺細胞の、ＣＤ１９＋細胞、Ｆ４／８０＋細胞、又はＣＤ３＋細胞でゲーティングされ、（図７Ａ、７Ｂ）抗ヒトＢ２Ｍ抗体又は抗マウスＨ−２Ｄ抗体、（図７Ｃ、図７Ｄ）抗ＨＬＡ−Ａ２抗体又は抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体、（図７Ｅ、図７Ｆ）抗Ｈ−２Ｄ抗体及び抗ＩＡＩＥ抗体、又は、（図７Ｇ）抗マウスＣＤ４抗体及び抗ヒトＣＤ４抗体（上側）、抗マウスＣＤ８α抗体及び抗ヒトＣＤ８α抗体（中央）、並びに抗マウスＣＤ８β抗体及び抗ヒトＣＤ８β抗体（下側）により染色された、ＦＡＣＳコンタープロットを示す図である。
【図７Ｇ】コントロールマウス、又はヒト化ＭＨＣ  Ｉ、ＭＨＣ  ＩＩα及びβ、ＴＣＲα及びβ、ＣＤ４、ＣＤ８α及びβ、並びにβ２Ｍ（ＴＭ  Ｉ／ＩＩ  Ｂ  Ｃ４／８）座を含むマウスから単離された胸腺細胞の、ＣＤ１９＋細胞、Ｆ４／８０＋細胞、又はＣＤ３＋細胞でゲーティングされ、（図７Ａ、７Ｂ）抗ヒトＢ２Ｍ抗体又は抗マウスＨ−２Ｄ抗体、（図７Ｃ、図７Ｄ）抗ＨＬＡ−Ａ２抗体又は抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体、（図７Ｅ、図７Ｆ）抗Ｈ−２Ｄ抗体及び抗ＩＡＩＥ抗体、又は、（図７Ｇ）抗マウスＣＤ４抗体及び抗ヒトＣＤ４抗体（上側）、抗マウスＣＤ８α抗体及び抗ヒトＣＤ８α抗体（中央）、並びに抗マウスＣＤ８β抗体及び抗ヒトＣＤ８β抗体（下側）により染色された、ＦＡＣＳコンタープロットを示す図である。
【００４４】
【図８】コントロールマウス、又はヒト化ＭＨＣ  Ｉ、ＭＨＣ  ＩＩα及びβ、ＴＣＲα及びβ、ＣＤ４、ＣＤ８α及びβ、並びにβ２Ｍ（ＴＭ  Ｉ／ＩＩ  Ｂ  Ｃ４／８）を含むマウスから単離された胸腺細胞の、ＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞でゲーティングされ、抗マウスＦｏｘＰ３抗体及び抗マウスＣＤ２５抗体により染色された、ＦＡＣＳコンタープロットを示す図である。
【００４５】
【図９Ａ】コントロールマウス、又はヒト化ＭＨＣ  Ｉ、ＭＨＣ  ＩＩα及びβ、ＴＣＲα及びβ、ＣＤ４、ＣＤ８α及びβ、並びにβ２Ｍ（ＴＭ  Ｉ／ＩＩ  Ｂ  Ｃ４／８）座を含むマウスから単離された脾細胞の、シングレットにＣＤ３＋細胞、ＣＤ４＋  Ｔ細胞、又はＣＤ８＋  Ｔ細胞でゲーティングされ、（図９Ａ）抗マウスＣＤ１９及び抗マウスＣＤ３抗体、（図９Ｂ）抗マウスＣＤ１９及び抗マウスＦ４／８０抗体、又は（図９Ｃ）抗マウスＣＤ４及び抗マウスＣＤ８α抗体（左）若しくは抗ヒトＣＤ４及び抗ヒトＣＤ８α抗体（右）、又は（図９Ｄ、図９Ｅ）抗マウスＣＤ４４及び抗マウスＣＤ６２Ｌ抗体により染色された、ＦＡＣＳコンタープロットを示す図である。
【図９Ｂ】コントロールマウス、又はヒト化ＭＨＣ  Ｉ、ＭＨＣ  ＩＩα及びβ、ＴＣＲα及びβ、ＣＤ４、ＣＤ８α及びβ、並びにβ２Ｍ（ＴＭ  Ｉ／ＩＩ  Ｂ  Ｃ４／８）座を含むマウスから単離された脾細胞の、シングレットにＣＤ３＋細胞、ＣＤ４＋  Ｔ細胞、又はＣＤ８＋  Ｔ細胞でゲーティングされ、（図９Ａ）抗マウスＣＤ１９及び抗マウスＣＤ３抗体、（図９Ｂ）抗マウスＣＤ１９及び抗マウスＦ４／８０抗体、又は（図９Ｃ）抗マウスＣＤ４及び抗マウスＣＤ８α抗体（左）若しくは抗ヒトＣＤ４及び抗ヒトＣＤ８α抗体（右）、又は（図９Ｄ、図９Ｅ）抗マウスＣＤ４４及び抗マウスＣＤ６２Ｌ抗体により染色された、ＦＡＣＳコンタープロットを示す図である。
【図９Ｃ】コントロールマウス、又はヒト化ＭＨＣ  Ｉ、ＭＨＣ  ＩＩα及びβ、ＴＣＲα及びβ、ＣＤ４、ＣＤ８α及びβ、並びにβ２Ｍ（ＴＭ  Ｉ／ＩＩ  Ｂ  Ｃ４／８）座を含むマウスから単離された脾細胞の、シングレットにＣＤ３＋細胞、ＣＤ４＋  Ｔ細胞、又はＣＤ８＋  Ｔ細胞でゲーティングされ、（図９Ａ）抗マウスＣＤ１９及び抗マウスＣＤ３抗体、（図９Ｂ）抗マウスＣＤ１９及び抗マウスＦ４／８０抗体、又は（図９Ｃ）抗マウスＣＤ４及び抗マウスＣＤ８α抗体（左）若しくは抗ヒトＣＤ４及び抗ヒトＣＤ８α抗体（右）、又は（図９Ｄ、図９Ｅ）抗マウスＣＤ４４及び抗マウスＣＤ６２Ｌ抗体により染色された、ＦＡＣＳコンタープロットを示す図である。
【図９Ｄ】コントロールマウス、又はヒト化ＭＨＣ  Ｉ、ＭＨＣ  ＩＩα及びβ、ＴＣＲα及びβ、ＣＤ４、ＣＤ８α及びβ、並びにβ２Ｍ（ＴＭ  Ｉ／ＩＩ  Ｂ  Ｃ４／８）座を含むマウスから単離された脾細胞の、シングレットにＣＤ３＋細胞、ＣＤ４＋  Ｔ細胞、又はＣＤ８＋  Ｔ細胞でゲーティングされ、（図９Ａ）抗マウスＣＤ１９及び抗マウスＣＤ３抗体、（図９Ｂ）抗マウスＣＤ１９及び抗マウスＦ４／８０抗体、又は（図９Ｃ）抗マウスＣＤ４及び抗マウスＣＤ８α抗体（左）若しくは抗ヒトＣＤ４及び抗ヒトＣＤ８α抗体（右）、又は（図９Ｄ、図９Ｅ）抗マウスＣＤ４４及び抗マウスＣＤ６２Ｌ抗体により染色された、ＦＡＣＳコンタープロットを示す図である。
【図９Ｅ】コントロールマウス、又はヒト化ＭＨＣ  Ｉ、ＭＨＣ  ＩＩα及びβ、ＴＣＲα及びβ、ＣＤ４、ＣＤ８α及びβ、並びにβ２Ｍ（ＴＭ  Ｉ／ＩＩ  Ｂ  Ｃ４／８）座を含むマウスから単離された脾細胞の、シングレットにＣＤ３＋細胞、ＣＤ４＋  Ｔ細胞、又はＣＤ８＋  Ｔ細胞でゲーティングされ、（図９Ａ）抗マウスＣＤ１９及び抗マウスＣＤ３抗体、（図９Ｂ）抗マウスＣＤ１９及び抗マウスＦ４／８０抗体、又は（図９Ｃ）抗マウスＣＤ４及び抗マウスＣＤ８α抗体（左）若しくは抗ヒトＣＤ４及び抗ヒトＣＤ８α抗体（右）、又は（図９Ｄ、図９Ｅ）抗マウスＣＤ４４及び抗マウスＣＤ６２Ｌ抗体により染色された、ＦＡＣＳコンタープロットを示す図である。
【００４６】
【図１０Ａ】コントロールマウス、又はヒト化ＭＨＣ  Ｉ、ＭＨＣ  ＩＩα及びβ、ＴＣＲα及びβ、ＣＤ４、ＣＤ８α及びβ、並びにβ２Ｍ（ＴＭ  Ｉ／ＩＩ  Ｂ  Ｃ４／８）座を含むマウスから単離された脾細胞の、ＣＤ１９＋細胞、Ｆ４／８０＋細胞、又はＣＤ３＋細胞でゲーティングされ、（図１０Ａ、１０Ｂ）抗ヒトＢ２Ｍ又は抗マウスＨ−２Ｄ抗体、（図１０Ｃ、図１０Ｄ）抗ＨＬＡ−２Ａ又は抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体、（図１０Ｅ、図１０Ｆ）抗Ｈ−２Ｄ及びＩＡＩＥ抗体、又は（図１０Ｇ）抗マウスＣＤ４及び抗ヒトＣＤ４抗体（上側）、抗マウスＣＤ８α及び抗ヒトＣＤ８β抗体（中央）、並びに抗マウスＣＤ８β及び抗ヒトＣＤ８β抗体（下側）により染色された、ＦＡＣＳコンタープロットを示す図である。
【図１０Ｂ】コントロールマウス、又はヒト化ＭＨＣ  Ｉ、ＭＨＣ  ＩＩα及びβ、ＴＣＲα及びβ、ＣＤ４、ＣＤ８α及びβ、並びにβ２Ｍ（ＴＭ  Ｉ／ＩＩ  Ｂ  Ｃ４／８）座を含むマウスから単離された脾細胞の、ＣＤ１９＋細胞、Ｆ４／８０＋細胞、又はＣＤ３＋細胞でゲーティングされ、（図１０Ａ、１０Ｂ）抗ヒトＢ２Ｍ又は抗マウスＨ−２Ｄ抗体、（図１０Ｃ、図１０Ｄ）抗ＨＬＡ−２Ａ又は抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体、（図１０Ｅ、図１０Ｆ）抗Ｈ−２Ｄ及びＩＡＩＥ抗体、又は（図１０Ｇ）抗マウスＣＤ４及び抗ヒトＣＤ４抗体（上側）、抗マウスＣＤ８α及び抗ヒトＣＤ８β抗体（中央）、並びに抗マウスＣＤ８β及び抗ヒトＣＤ８β抗体（下側）により染色された、ＦＡＣＳコンタープロットを示す図である。
【図１０Ｃ】コントロールマウス、又はヒト化ＭＨＣ  Ｉ、ＭＨＣ  ＩＩα及びβ、ＴＣＲα及びβ、ＣＤ４、ＣＤ８α及びβ、並びにβ２Ｍ（ＴＭ  Ｉ／ＩＩ  Ｂ  Ｃ４／８）座を含むマウスから単離された脾細胞の、ＣＤ１９＋細胞、Ｆ４／８０＋細胞、又はＣＤ３＋細胞でゲーティングされ、（図１０Ａ、１０Ｂ）抗ヒトＢ２Ｍ又は抗マウスＨ−２Ｄ抗体、（図１０Ｃ、図１０Ｄ）抗ＨＬＡ−２Ａ又は抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体、（図１０Ｅ、図１０Ｆ）抗Ｈ−２Ｄ及びＩＡＩＥ抗体、又は（図１０Ｇ）抗マウスＣＤ４及び抗ヒトＣＤ４抗体（上側）、抗マウスＣＤ８α及び抗ヒトＣＤ８β抗体（中央）、並びに抗マウスＣＤ８β及び抗ヒトＣＤ８β抗体（下側）により染色された、ＦＡＣＳコンタープロットを示す図である。
【図１０Ｄ】コントロールマウス、又はヒト化ＭＨＣ  Ｉ、ＭＨＣ  ＩＩα及びβ、ＴＣＲα及びβ、ＣＤ４、ＣＤ８α及びβ、並びにβ２Ｍ（ＴＭ  Ｉ／ＩＩ  Ｂ  Ｃ４／８）座を含むマウスから単離された脾細胞の、ＣＤ１９＋細胞、Ｆ４／８０＋細胞、又はＣＤ３＋細胞でゲーティングされ、（図１０Ａ、１０Ｂ）抗ヒトＢ２Ｍ又は抗マウスＨ−２Ｄ抗体、（図１０Ｃ、図１０Ｄ）抗ＨＬＡ−２Ａ又は抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体、（図１０Ｅ、図１０Ｆ）抗Ｈ−２Ｄ及びＩＡＩＥ抗体、又は（図１０Ｇ）抗マウスＣＤ４及び抗ヒトＣＤ４抗体（上側）、抗マウスＣＤ８α及び抗ヒトＣＤ８β抗体（中央）、並びに抗マウスＣＤ８β及び抗ヒトＣＤ８β抗体（下側）により染色された、ＦＡＣＳコンタープロットを示す図である。
【図１０Ｅ】コントロールマウス、又はヒト化ＭＨＣ  Ｉ、ＭＨＣ  ＩＩα及びβ、ＴＣＲα及びβ、ＣＤ４、ＣＤ８α及びβ、並びにβ２Ｍ（ＴＭ  Ｉ／ＩＩ  Ｂ  Ｃ４／８）座を含むマウスから単離された脾細胞の、ＣＤ１９＋細胞、Ｆ４／８０＋細胞、又はＣＤ３＋細胞でゲーティングされ、（図１０Ａ、１０Ｂ）抗ヒトＢ２Ｍ又は抗マウスＨ−２Ｄ抗体、（図１０Ｃ、図１０Ｄ）抗ＨＬＡ−２Ａ又は抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体、（図１０Ｅ、図１０Ｆ）抗Ｈ−２Ｄ及びＩＡＩＥ抗体、又は（図１０Ｇ）抗マウスＣＤ４及び抗ヒトＣＤ４抗体（上側）、抗マウスＣＤ８α及び抗ヒトＣＤ８β抗体（中央）、並びに抗マウスＣＤ８β及び抗ヒトＣＤ８β抗体（下側）により染色された、ＦＡＣＳコンタープロットを示す図である。
【図１０Ｆ】コントロールマウス、又はヒト化ＭＨＣ  Ｉ、ＭＨＣ  ＩＩα及びβ、ＴＣＲα及びβ、ＣＤ４、ＣＤ８α及びβ、並びにβ２Ｍ（ＴＭ  Ｉ／ＩＩ  Ｂ  Ｃ４／８）座を含むマウスから単離された脾細胞の、ＣＤ１９＋細胞、Ｆ４／８０＋細胞、又はＣＤ３＋細胞でゲーティングされ、（図１０Ａ、１０Ｂ）抗ヒトＢ２Ｍ又は抗マウスＨ−２Ｄ抗体、（図１０Ｃ、図１０Ｄ）抗ＨＬＡ−２Ａ又は抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体、（図１０Ｅ、図１０Ｆ）抗Ｈ−２Ｄ及びＩＡＩＥ抗体、又は（図１０Ｇ）抗マウスＣＤ４及び抗ヒトＣＤ４抗体（上側）、抗マウスＣＤ８α及び抗ヒトＣＤ８β抗体（中央）、並びに抗マウスＣＤ８β及び抗ヒトＣＤ８β抗体（下側）により染色された、ＦＡＣＳコンタープロットを示す図である。
【図１０Ｇ】コントロールマウス、又はヒト化ＭＨＣ  Ｉ、ＭＨＣ  ＩＩα及びβ、ＴＣＲα及びβ、ＣＤ４、ＣＤ８α及びβ、並びにβ２Ｍ（ＴＭ  Ｉ／ＩＩ  Ｂ  Ｃ４／８）座を含むマウスから単離された脾細胞の、ＣＤ１９＋細胞、Ｆ４／８０＋細胞、又はＣＤ３＋細胞でゲーティングされ、（図１０Ａ、１０Ｂ）抗ヒトＢ２Ｍ又は抗マウスＨ−２Ｄ抗体、（図１０Ｃ、図１０Ｄ）抗ＨＬＡ−２Ａ又は抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体、（図１０Ｅ、図１０Ｆ）抗Ｈ−２Ｄ及びＩＡＩＥ抗体、又は（図１０Ｇ）抗マウスＣＤ４及び抗ヒトＣＤ４抗体（上側）、抗マウスＣＤ８α及び抗ヒトＣＤ８β抗体（中央）、並びに抗マウスＣＤ８β及び抗ヒトＣＤ８β抗体（下側）により染色された、ＦＡＣＳコンタープロットを示す図である。
【００４７】
【図１１】コントロールマウス、又はヒト化ＭＨＣ  Ｉ、ＭＨＣ  ＩＩα及びβ、ＴＣＲα及びβ、ＣＤ４、ＣＤ８α及びβ、並びにβ２Ｍ（ＴＭ  Ｉ／ＩＩ  Ｂ  Ｃ４／８）を含むマウスから単離された脾細胞の、ＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞でゲーティングされ、抗マウスＦｏｘＰ３及び抗マウスＣＤ２５抗体により染色された、ＦＡＣＳコンタープロットを示す図である。
【００４８】
【図１２】コントロールマウス、又はヒト化ＭＨＣ  Ｉ、ＭＨＣ  ＩＩα及びβ、ＴＣＲα及びβ、ＣＤ４、ＣＤ８α及びβ、並びにβ２Ｍ（ＴＭ  Ｉ／ＩＩ  Ｂ  Ｃ４／８）座を含むマウスからの単離、並びにペプチドの不存在下（２００ｋの細胞のみ；ｘ軸）又は１０μｇ／ｍＬ若しくは１μｇ／ｍＬ  ＭＡＧＥ−Ａ３ペプチドの存在下（ｘ軸）でのインキュベーション後での、酵素結合免疫吸着スポットアッセイにおける、ＩＦＮ−γを生成する脾細胞数（ウェルあたりのスポット（平均＋ＳＤ）；ｙ軸）を示す図である。
【００４９】
【図１３Ａ】コントロール、又はヒト化ＭＨＣ  Ｉ、ＭＨＣ  ＩＩα及びβ、ＴＣＲα及びβ、ＣＤ４、ＣＤ８α及びβ、並びにβ２Ｍ（ＴＭ  Ｉ／ＩＩ  Ｂ  Ｃ４／８）座を含むマウスのいずれかにおける、急性アームストロング株のウイルス感染の進行を示す図である。実験のタイムラインは、図の上側に示され、両マウス系統についての感染後の種々の日数でのウイルス力価の測定は、下側のグラフに示される。
【図１３Ｂ】コントロール、又はヒト化ＭＨＣ  Ｉ、ＭＨＣ  ＩＩα及びβ、ＴＣＲα及びβ、ＣＤ４、ＣＤ８α及びβ、並びにβ２Ｍ（ＴＭ  Ｉ／ＩＩ  Ｂ  Ｃ４／８）座を含むマウスのいずれかにおける、慢性クローン１３系統のウイルス感染の進行を示す図である。実験のタイムラインは、図の上側に示され、両マウス系統についての感染後２１日目でのウイルス力価の測定は、下側のグラフに示される。未感染若しくは慢性感染ＴＭ  Ｉ／ＩＩ  Ｂ  Ｃ４／８又はコントロールＢ６マウスからのＴ細胞を、抗ＰＤ１抗体、抗Ｌａｇ３抗体、及び抗Ｔｉｍ３抗体（図１３Ｃ；ｘ軸）により染色した。この図は、陽性染色細胞の定量を示す図である（陽性細胞（％）；ｙ軸）。
【図１３Ｃ】コントロール、又はヒト化ＭＨＣ  Ｉ、ＭＨＣ  ＩＩα及びβ、ＴＣＲα及びβ、ＣＤ４、ＣＤ８α及びβ、並びにβ２Ｍ（ＴＭ  Ｉ／ＩＩ  Ｂ  Ｃ４／８）座を含むマウスのいずれかにおける、慢性クローン１３系統のウイルス感染の進行を示す図である。実験のタイムラインは、図の上側に示され、両マウス系統についての感染後２１日目でのウイルス力価の測定は、下側のグラフに示される。未感染若しくは慢性感染ＴＭ  Ｉ／ＩＩ  Ｂ  Ｃ４／８又はコントロールＢ６マウスからのＴ細胞を、抗ＰＤ１抗体、抗Ｌａｇ３抗体、及び抗Ｔｉｍ３抗体（図１３Ｃ；ｘ軸）により染色した。この図は、陽性染色細胞の定量を示す図である（陽性細胞（％）；ｙ軸）。
【００５０】
【図１４】先の急性アームストロング株感染後の、コントロール又はＴＭ  Ｉ／ＩＩ  Ｂ  Ｃ４／８マウスのいずれかにおける、慢性クローン１３系統ウイルス感染の進行を示す図である。実験のタイムラインは、図の上側に示され、感染後３１日目でのウイルス力価の測定は、下側のグラフに示される。モック感染マウスを、更なるコントロールとして、実験に含めた。
【００５１】
【図１５Ａ】ＨＬＡ−Ａ２限定（ＧＰＣ１０−１８；Ｎ６９−７７；Ｚ４９−５８）、Ｈ２Ｄｂ限定（ＧＰ３３−４１）、オボアルブミン、又はインキュベーションのみのＬＣＭＶペプチドに対する応答においてＩＦＮ−γを生成し、コントロール動物（図１５Ａ）、又はヒト化ＭＨＣ  Ｉ、ＭＨＣ  ＩＩα及びβ、ＴＣＲα及びβ、ＣＤ４、ＣＤ８α及びβ、並びにβ２Ｍ（ＴＭ  Ｉ／ＩＩ  Ｂ  Ｃ４／８）座を含むマウス（図１５Ｂ）のいずれかから単離された、ＣＤ８＋細胞数を示す図である（ｙ軸；ＩＦＮ−γ陽性細胞）。各マウスを、モック感染させ（ｍｏｃｋ；各群ｎ＝１）、又は急性アームストロング株感染（Ａｒｍ；各群ｎ＝３）させた。ヒト化ＭＨＣ  Ｉ、ＭＨＣ  ＩＩα及びβ、ＴＣＲα及びβ、ＣＤ４、ＣＤ８α及びβ、並びにβ２Ｍ（ＴＭ  Ｉ／ＩＩ  Ｂ  Ｃ４／８）座を含むマウス又はコントロールＢ６動物における、感染のタイムコース（感染後日数；ｘ軸）中に、示されたペプチド（ＯＶＡ、ＧＰ３３、ＮＰ６９、ＧＰＣ１０、ＧＰＣ４４７、又はＺ４９）での刺激後のＩＦＮγ＋ＣＤ８＋リンパ球の割合（％）（ｙ軸）は、図１５Ｃ及び図１５Ｄにそれぞれ示される。
【図１５Ｂ】ＨＬＡ−Ａ２限定（ＧＰＣ１０−１８；Ｎ６９−７７；Ｚ４９−５８）、Ｈ２Ｄｂ限定（ＧＰ３３−４１）、オボアルブミン、又はインキュベーションのみのＬＣＭＶペプチドに対する応答においてＩＦＮ−γを生成し、コントロール動物（図１５Ａ）、又はヒト化ＭＨＣ  Ｉ、ＭＨＣ  ＩＩα及びβ、ＴＣＲα及びβ、ＣＤ４、ＣＤ８α及びβ、並びにβ２Ｍ（ＴＭ  Ｉ／ＩＩ  Ｂ  Ｃ４／８）座を含むマウス（図１５Ｂ）のいずれかから単離された、ＣＤ８＋細胞数を示す図である（ｙ軸；ＩＦＮ−γ陽性細胞）。各マウスを、モック感染させ（ｍｏｃｋ；各群ｎ＝１）、又は急性アームストロング株感染（Ａｒｍ；各群ｎ＝３）させた。ヒト化ＭＨＣ  Ｉ、ＭＨＣ  ＩＩα及びβ、ＴＣＲα及びβ、ＣＤ４、ＣＤ８α及びβ、並びにβ２Ｍ（ＴＭ  Ｉ／ＩＩ  Ｂ  Ｃ４／８）座を含むマウス又はコントロールＢ６動物における、感染のタイムコース（感染後日数；ｘ軸）中に、示されたペプチド（ＯＶＡ、ＧＰ３３、ＮＰ６９、ＧＰＣ１０、ＧＰＣ４４７、又はＺ４９）での刺激後のＩＦＮγ＋ＣＤ８＋リンパ球の割合（％）（ｙ軸）は、図１５Ｃ及び図１５Ｄにそれぞれ示される。
【図１５Ｃ】ＨＬＡ−Ａ２限定（ＧＰＣ１０−１８；Ｎ６９−７７；Ｚ４９−５８）、Ｈ２Ｄｂ限定（ＧＰ３３−４１）、オボアルブミン、又はインキュベーションのみのＬＣＭＶペプチドに対する応答においてＩＦＮ−γを生成し、コントロール動物（図１５Ａ）、又はヒト化ＭＨＣ  Ｉ、ＭＨＣ  ＩＩα及びβ、ＴＣＲα及びβ、ＣＤ４、ＣＤ８α及びβ、並びにβ２Ｍ（ＴＭ  Ｉ／ＩＩ  Ｂ  Ｃ４／８）座を含むマウス（図１５Ｂ）のいずれかから単離された、ＣＤ８＋細胞数を示す図である（ｙ軸；ＩＦＮ−γ陽性細胞）。各マウスを、モック感染させ（ｍｏｃｋ；各群ｎ＝１）、又は急性アームストロング株感染（Ａｒｍ；各群ｎ＝３）させた。ヒト化ＭＨＣ  Ｉ、ＭＨＣ  ＩＩα及びβ、ＴＣＲα及びβ、ＣＤ４、ＣＤ８α及びβ、並びにβ２Ｍ（ＴＭ  Ｉ／ＩＩ  Ｂ  Ｃ４／８）座を含むマウス又はコントロールＢ６動物における、感染のタイムコース（感染後日数；ｘ軸）中に、示されたペプチド（ＯＶＡ、ＧＰ３３、ＮＰ６９、ＧＰＣ１０、ＧＰＣ４４７、又はＺ４９）での刺激後のＩＦＮγ＋ＣＤ８＋リンパ球の割合（％）（ｙ軸）は、図１５Ｃ及び図１５Ｄにそれぞれ示される。
【図１５Ｄ】ＨＬＡ−Ａ２限定（ＧＰＣ１０−１８；Ｎ６９−７７；Ｚ４９−５８）、Ｈ２Ｄｂ限定（ＧＰ３３−４１）、オボアルブミン、又はインキュベーションのみのＬＣＭＶペプチドに対する応答においてＩＦＮ−γを生成し、コントロール動物（図１５Ａ）、又はヒト化ＭＨＣ  Ｉ、ＭＨＣ  ＩＩα及びβ、ＴＣＲα及びβ、ＣＤ４、ＣＤ８α及びβ、並びにβ２Ｍ（ＴＭ  Ｉ／ＩＩ  Ｂ  Ｃ４／８）座を含むマウス（図１５Ｂ）のいずれかから単離された、ＣＤ８＋細胞数を示す図である（ｙ軸；ＩＦＮ−γ陽性細胞）。各マウスを、モック感染させ（ｍｏｃｋ；各群ｎ＝１）、又は急性アームストロング株感染（Ａｒｍ；各群ｎ＝３）させた。ヒト化ＭＨＣ  Ｉ、ＭＨＣ  ＩＩα及びβ、ＴＣＲα及びβ、ＣＤ４、ＣＤ８α及びβ、並びにβ２Ｍ（ＴＭ  Ｉ／ＩＩ  Ｂ  Ｃ４／８）座を含むマウス又はコントロールＢ６動物における、感染のタイムコース（感染後日数；ｘ軸）中に、示されたペプチド（ＯＶＡ、ＧＰ３３、ＮＰ６９、ＧＰＣ１０、ＧＰＣ４４７、又はＺ４９）での刺激後のＩＦＮγ＋ＣＤ８＋リンパ球の割合（％）（ｙ軸）は、図１５Ｃ及び図１５Ｄにそれぞれ示される。
【発明を実施するための形態】
【００５２】
本明細書において、ヒト化Ｔ細胞共受容体（例えば、ヒト化ＣＤ４及び／又はＣＤ８（例えば、ＣＤ８α及び／又はＣＤ８β））、ヒト化Ｔ細胞共受容体に結合するヒト若しくはヒト化主要組織適合複合体（例えば、ヒト又はヒト化ＭＨＣ  ＩＩ（例えば、ＭＨＣ  ＩＩα及び／又はＭＨＣ  ＩＩβ鎖）及び／又はＭＨＣ  Ｉ（例えば、ＭＨＣ  Ｉα）、及び場合により、ヒト又はヒト化β２ミクログロブリン）を発現するように遺伝子操作された非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、マウス又はラット）、並びに胚、組織、及びそれらを発現する細胞が開示される。本明細書で開示された非ヒト動物の免疫系の細胞アームの発達は、コントロール動物と同等である。例えば、胸腺及び脾臓は、同様の絶対数の胸腺細胞及びＣＤ３＋細胞を含む。このことは、ヒトＴＣＲ（α及びβ）とキメラヒト／マウスＭＨＣ  Ｉ分子との両方を含むように改変された他の非ヒト動物とは全く対照的である。例えば、Ｌｉ（２０１０）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １６：１０２９〜１０３５及び補足資料を参照のこと。このような動物は、野生型コントロール動物だけでなく、ヒトＴＣＲのみで改変された動物、及びキメラヒト／マウスＭＨＣ  Ｉ分子のみで改変された動物と比較して、Ｔ細胞集団の減少を示した（上記文献）。したがって、本明細書において、ヒト化ＣＤ４共受容体及びヒト化ＭＨＣ  ＩＩ及び／又はヒト化ＣＤ８共受容体及びヒト化ＭＨＣ  Ｉ、並びに場合により、ヒト化ＴＣＲを共発現するように操作された非ヒト動物が提供される。少なくとも１つのヒト化Ｔ細胞共受容体（例えば、ヒト化ＣＤ４及び／又はＣＤ８）、ヒト化Ｔ細胞共受容体と会合する少なくとも１つのヒト化ＭＨＣ（例えば、ヒト化ＣＤ４及び／又はＣＤ８とそれぞれ会合するヒト化ＭＨＣ  ＩＩ及び／又はＭＨＣ  Ｉ）、及び／又はヒト化ＴＣＲを発現する遺伝子操作動物を生産するための方法も提供される。ヒトの治療剤を開発するために、実質的にヒト化されたＴ細胞免疫応答を開始する遺伝子操作動物を使用するための方法も提供される。
実質的にヒト化されたＴ細胞免疫応答
【００５３】
本明細書において、実質的にヒト化されたＴ細胞免疫応答を開始するように遺伝子改変された非ヒト動物が開示される。本明細書で開示されたマウスは、少なくとも１つのヒト若しくはヒト化Ｔ細胞共受容体、少なくとも１つのヒト若しくはヒト化Ｔ細胞共受容体と会合することができる少なくとも１つのヒト若しくはヒト化主要組織適合複合体（ＭＨＣ）、及び／又はヒト若しくはヒト化Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現し、そのヒト又はヒト化Ｔ細胞受容体は、好ましくは、ヒト又はヒト化Ｔ細胞共受容体と会合しているヒト又はヒト化ＭＨＣに関して提示された抗原を認識することができ、ヒト又はヒト化ＴＣＲを発現する非ヒト細胞、例えば、非ヒトＴ細胞に活性化シグナルを提供することができる。ヒト又はヒト化Ｔ細胞共受容体、ヒト若しくはヒト化ＴＣＲ、及び／又はヒト若しくはヒト化ＭＨＣは、非ヒト動物のゲノムによりコードされてもよい。好ましい実施形態では、抗原による免疫化に基づいて、非ヒト動物は、抗原のＨＬＡ限定エピトープを、ヒトＴＣＲ遺伝子セグメント、例えば、ヒトＴＣＲαＶセグメント、ヒトＴＣＲαＪセグメント、ヒトＴＣＲβＶセグメント、ヒトＴＣＲβＤセグメント、及び／又はヒトＴＣＲβＪセグメントから得られるＴＣＲに提示する。
【００５４】
したがって、本発明には、ゲノムが、（例えば、内在性座において）ヒト化Ｔ細胞共受容体ポリペプチド（例えば、ＣＤ４又はＣＤ８ポリペプチド）をコードするヌクレオチド配列であって、キメラＴ細胞共受容体ポリペプチドが、本明細書に記載されたアミノ酸配列の保存的アミノ酸置換を含む、ヌクレオチド配列、及び／又はヒト化Ｔ細胞共受容体ポリペプチドと会合するヒト化ＭＨＣポリペプチドをコードする核酸配列であって、ヒト化ＭＨＣポリペプチドが、本明細書に記載されたアミノ酸配列の保存的アミノ酸置換を含む、核酸配列を含む、遺伝子改変非ヒト動物が包含される。
【００５５】
保存的アミノ酸置換は、類似する化学的特性（例えば、電荷又は疎水性）を有する側鎖Ｒ基を有する別のアミノ酸残基による、アミノ酸残基の置換を含む。保存的アミノ酸置換は、保存的置換をコードするヌクレオチド変化を導入するようにヌクレオチド配列を改変することによって実現することができる。一般的には、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の対象となる機能性、例えば、ＭＨＣ  ＩＩ又はＭＨＣ  Ｉそれぞれと会合し、例えば、これらに結合し、例えば、ＭＨＣ提示抗原に対するＴＣＲの感度を向上させることができるＣＤ４又はＣＤ８の能力を、実質的に変化させないであろう。類似する化学的特性を有する側鎖を有するアミノ酸の基の例は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンなどの脂肪族側鎖；セリン及びスレオニンなどの脂肪族水酸基側鎖；アスパラギン及びグルタミンなどのアミド含有側鎖；フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンなどの芳香族側鎖；リジン、アルギニン、及びヒスチジンなどの塩基性側鎖；アスパラギン酸及びグルタミン酸などの酸性側鎖；並びにシステイン及びメチオニンなどの硫黄含有側鎖が挙げられる。保存的アミノ酸置換基としては、例えば、バリン／ロイシン／イソロイシン、フェニルアラニン／チロシン、リジン／アルギニン、アラニン／バリン、グルタミン酸／アスパラギン酸、及びアスパラギン／グルタミンが挙げられる。いくつかの実施形態では、保存的アミノ酸置換は、例えば、アラニンスキャニング突然変異で使用するように、タンパク質中の任意の天然残基と、アラニンとの置換であり得る。いくつかの実施形態では、参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｏｎｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（（１９９２）Ｅｘｈａｕｓｔｉｖｅ  Ｍａｔｃｈｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｎｔｉｒｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：１４４３〜４５）に開示されたＰＡＭ２５０対数尤度行列内の正の値を有する保存的置換が行われる。いくつかの実施形態では、置換は、中程度の保存的置換であり、その置換はＰＡＭ２５０対数尤度行列内で非負値を有する。
【００５６】
当業者であれば、本明細書に記載されたヒト化Ｔ細胞共受容体ポリペプチド、ヒト化ＭＨＣポリペプチド、及び／又は、ＴＣＲ可変領域をコードする核酸残基に加えて、遺伝情報の縮重のために、他の核酸が、本発明のポリペプチドをコードしてもよいことを理解するであろう。したがって、そのゲノム中に、ヒト化Ｔ細胞共受容体ポリペプチド（例えば、ＣＤ４又はＣＤ８ポリペプチド）をコードするヌクレオチド配列、ヒト非再配列遺伝子セグメントを含む非再配列Ｔ細胞受容体可変遺伝子座（例えば、ＴＣＲα及び／又はＴＣＲβ）、及び／又は、保存的アミノ酸置換を含むヒト化Ｔ細胞共受容体ポリペプチドを会合することができるヒト化ＭＨＣポリペプチドをコードする核酸配列を含む遺伝子改変非ヒト動物に加えて、ゲノムが、遺伝情報の縮重のために、本明細書に記載されたものとは異なる、ヒト化Ｔ細胞共受容体ポリペプチド（例えば、ＣＤ４又はＣＤ８ポリペプチド）をコードするヌクレオチド配列、ヒト非再配列遺伝子セグメントを含む非再配列Ｔ細胞受容体可変遺伝子座（例えば、ＴＣＲα及び／又はＴＣＲβ）、及び／又は、ヒト化Ｔ細胞共受容体ポリペプチドと会合することができるヒト化ＭＨＣポリペプチドをコードする核酸配列を含む、非ヒト動物も提供される。
【００５７】
配列の同一性は、ヌクレオチド及び／又はアミノ酸の配列同一性を測定するために使用できる、当該技術分野において周知の数多くの種々のアルゴリズムにより決定されてもよい。本明細書に記述されたいくつかの実施形態では、同一性は、１０．０のｏｐｅｎ  ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ、０．１のｅｘｔｅｎｄ  ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙを使用するＣｌｕｓｔａｌＷ  ｖ．１．８３（ｓｌｏｗ）アライメントを用い、かつＧｏｎｎｅｔ類似度マトリックス（ＭａｃＶｅｃｔｏｒ（商標）１０．０．２、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ  Ｉｎｃ．，２００８）を用いて決定される。配列の同一性について比較した配列の長さは、特定の配列に依存する。様々な実施形態において、同一性は、成熟タンパク質の配列をＮ末端からＣ末端まで比較することによって決定される。様々な実施形態において、キメラヒト／非ヒト配列をヒト配列に対して比較するとき、キメラヒト／非ヒト配列のヒト部分（非ヒト部分ではない）は、ヒト配列とキメラヒト／非ヒト配列のヒト部分との間の同一性のレベルを確認する目的で比較する（例えば、キメラヒト／マウスタンパク質のヒトエクトドメインをヒトタンパク質のヒトエクトドメインに対して比較する）ために使用される。
【００５８】
配列、例えば、ヌクレオチド又はアミノ酸の配列への言及において、「ホモロジー」又は「相同的」という用語は、最適なアライメント及び比較に基づいて、２つの配列が、例えば、少なくとも約７５％のヌクレオチド又はアミノ酸、例えば、少なくとも約８０％のヌクレオチド又はアミノ酸、例えば、少なくとも約９０〜９５％のヌクレオチド又はアミノ酸、例えば、９７％超のヌクレオチド又はアミノ酸において同一であることを意味する。当業者であれば、最適な遺伝子標的化のために、標的化構築物は、内在性ＤＮＡ配列に相同なアーム（すなわち、「ホモロジーアーム」）を含有する必要があり、このため、相同組換えが、標的化構築物と標的化内在性配列との間で生じ得ることを理解するであろう。
【００５９】
「操作可能に連結している」という用語は、そのように記載されたコンポーネントがその意図された方法で機能することを可能にする関係にある並置を意味する。このように、タンパク質をコードする核酸配列は、調節配列（例えばプロモータ、エンハンサ、サイレンサ配列等）に作動可能に連結させてもよく、それにより、適切な転写調節が維持される。加えて、本発明のキメラ又はヒト化タンパク質の様々な部分は、細胞中でのタンパク質の適切なフォールディング、プロセッシング、標的化、発現、及び他の機能性を保持するように操作可能に連結していてもよい。特に断らない限り、本発明のキメラ又はヒト化タンパク質の様々なドメインは、互いに操作可能に連結している。
【００６０】
遺伝子置換への言及において「置換え」という用語は、外来性遺伝子材料を内在性遺伝子座に配置することにより、内在性遺伝子の全て又は一部を、オルソロガス又はホモログな核酸配列により置き換えることを意味する。以下の実施例において実証されたように、一実施形態において、マウスＣＤ４又はＣＤ８（ＣＤ８α及び／又はＣＤ８β）ポリペプチドの部分をコードする内在性座の核酸配列は、ヒトＣＤ４又はＣＤ８（ＣＤ８α及び／又はＣＤ８β）ポリペプチドの部分をコードするヌクレオチド配列それぞれにより置き換えられた。
【００６１】
例えば、機能的なポリペプチドへの言及において、本明細書で使用する場合、「機能的な」は、ポリペプチドが天然タンパク質に通常関連する少なくとも１つの生体活性を維持していることを意味する。例えば、本発明のいくつかの実施形態では、内在性座での置き換え（例えば、内在性非ヒトＣＤ４又はＣＤ８座での置換え）により、機能的な内在性ポリペプチドを発現することができない遺伝子座がもたらされる。
ヒト化Ｔ細胞共受容体
【００６２】
本明細書において、少なくとも１つのヒト又はヒト化Ｔ細胞受容体、例えば、ＣＤ４、ＣＤ８α、及び／又はＣＤ８βを発現している、非ヒト動物が開示される。したがって、本明細書で開示された非ヒト動物は、第１、第２、及び／又は第３のヌクレオチド配列のうちの少なくとも１つを含み、それらはそれぞれ、ヒト又はヒト化ＣＤ４ポリペプチド、ヒト又はヒト化ＣＤ８αポリペプチド、及びヒト又はヒト化ＣＤ８βポリペプチドから選択される、種々のヒト又はキメラヒト／非ヒトＴ細胞共受容体ポリペプチドをコードする。本明細書において、第１、第２、第３の指定の使用は、本明細書で開示された非ヒト動物を、３つ全てのヌクレオチド配列が必要であると限定すると解釈されるべきではなく、又は任意の順序で、共受容体ヌクレオチド配列のいずれかが存在すると解釈されるべきである。したがって、本明細書で開示された非ヒト動物は、ヒト若しくはヒト化ＣＤ４及び／又はヒト若しくはヒト化ＣＤ８（例えば、ヒト若しくはヒト化ＣＤ８α及び／又はＣＤ８β）ポリペプチドをコードする１つ又はそれ以上の核酸配列を含んでもよい。
【００６３】
一実施形態において、本明細書で開示された非ヒト動物は、ヒト又はヒト化ＣＤ４ポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列を含む。別の実施形態では、本明細書で開示された非ヒト動物は、ヒト又はヒト化ＣＤ８αポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列と、ヒト又はヒト化ＣＤ８βポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列とを含む。別の実施形態では、本明細書で開示された非ヒト動物は、ヒト又はヒト化ＣＤ８α及びＣＤ８βポリペプチドをコードする第１及び第２のヌクレオチド配列を含み、ヒト又はヒト化ＣＤ４ポリペプチドをコードする第３のヌクレオチド配列を更に含む。
ヒト又はヒト化ＣＤ４
【００６４】
様々な実施形態において、本発明は、遺伝子改変非ヒト動物であって、そのゲノム中に、例えば、内在性ＣＤ４座において、ヒト又はヒト化ＣＤ４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、これにより、動物が、ヒト又はヒト化ＣＤ４ポリペプチドを発現している、遺伝子改変非ヒト動物を概ね提供する。
【００６５】
ヒトＣＤ４遺伝子は、第１２番染色体上に位置しており、１０個のエキソンを含有すると考えられる。ＣＤ４遺伝子は、この遺伝子のエキソン２及び３によりコードされるアミノ末端疎水性シグナル配列を有するタンパク質をコードする。タンパク質は、４つの細胞外免疫グロブリン様ドメイン、Ｉｇ１〜Ｉｇ４を含み、それぞれ一般的に、Ｄ１〜Ｄ４ドメインとも呼ばれる。Ｍａｄｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ａｎｄ  ｍｏｕｓｅ  Ｔ４  ｇｅｎｅｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：９１５５〜５９。Ｄ１ドメインは、エキソン３（シグナルペプチド下流の配列）及びエキソン４によりコードされると考えられる。一方、Ｄ２、Ｄ３、及びＤ４は、別の各エキソン−エキソン５、６、及び７それぞれによりコードされる（図５Ａを参照のこと：Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、及びＤ４ドメインは、Ｉｇ１、Ｉｇ２、Ｉｇ３、及びＩｇ４とそれぞれ指定された配列によりコードされる）。Ｌｉｔｔｍａｎ（１９８７）Ｔｈｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣＤ４  ａｎｄ  ＣＤ８  Ｇｅｎｅｓ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：５６１〜８４；Ｈａｎｎａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  ＣＤ４  Ｇｅｎｅ  ｉｎ  Ｍａｔｕｒｅ  ＣＤ４＋ＣＤ８−  ａｎｄ  Ｉｍｍａｔｕｒｅ  ＣＤ４＋ＣＤ８＋  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｉｎ
Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｍｉｃｅ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４（２）：１０８４〜９４；Ｍａｄｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（上記参照）。Ｔ細胞と抗原提示細胞との間の接触領域などの高タンパク質濃度の領域において、分子は、対向するＤ４ドメイン間の相互作用により、ホモ二量体化する傾向がある。Ｚａｍｏｙｓｋａ（１９９８）ＣＤ４  ａｎｄ  ＣＤ８：ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎ  ａｎｄ  ｏｆ
ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ？  Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：８２〜８７；Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｄｉｍｅｒｉｃ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ
ａｎｄ  ｓｅｇｍｅｎｔａｌ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＣＤ４，Ｎａｔｕｒｅ  ３８７：５２７；Ｍｏｌｄｏｖａｎ
ｅｔ  ａｌ．（２００２）ＣＤ４  Ｄｉｍｅｒｓ  Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｔｈｅ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  Ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  Ｔ  Ｃｅｌｌ
Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：６２６１〜６８。
【００６６】
ＣＤ４のＤ１ドメインは、免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメインに類似しており、Ｄ２ドメインの一部と共に、例えば、ＭＨＣ  ＩＩ共受容体結合部位において、ＭＨＣ  ＩＩと結合する（会合する）と考えられる。Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｏｎｔａｃｔ  ｓｉｔｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ＣＤ４  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｗｉｔｈ  Ｃｌａｓｓ  ＩＩ  ＭＨＣ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：２１６〜２５。次に、ＭＨＣ  ＩＩは、ＭＨＣ  ＩＩα２とβ２ドメインとの間の接合部における疎水性クレバスにおいて、Ｔ細胞共受容体ＣＤ４と相互作用する。Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｒｅｉｎｈｅｒｚ（２００２）Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｂｏｕｎｄ  ｔｏ  ＭＨＣ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３８：１０３９〜４９。
【００６７】
ＣＤ４共受容体のドメインＤ３及びＤ４は、これら２つのドメインの置換によりＴＣＲに結合するＣＤ４の能力が抑制されるため、ＴＣＲ−ＣＤ３複合体と相互作用すると考えられる。Ｖｉｇｎａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｔｈｅ  Ｔｗｏ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ
Ｐｒｏｘｉｍａｌ  Ｄｏｍａｉｎｓ  ｏｆ  ＣＤ４  Ｉｎｔｅｒａｃｔ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：２０９７〜２１０７。ＣＤ４分子は、二量体として存在し、この分子のＤ４ドメイン中の残り部分は、ＣＤ４二量体化を担うと考えられる。Ｍｏｌｄｏｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）ＣＤ４
Ｄｉｍｅｒｓ  Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｔｈｅ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  Ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：６２６１〜６８。
【００６８】
ＣＤ４遺伝子のエキソン８は、膜貫通ドメインをコードする。一方、この遺伝子の残り部分は、細胞質ドメインをコードする。ＣＤ４細胞質ドメインは、多くの別の機能を有する。例えば、ＣＤ４の細胞質ドメインは、チロシンキナーゼＬｃｋをリクルートする。Ｌｃｋは、ＣＤ４及びＣＤ８細胞質ドメインと会合されるＳｒｃファミリーキナーゼであり、同じＭＨＣへの共受容体及びＴＣＲの同時結合により、ＴＣＲ複合体のＣＤ３及びζ鎖の増大したチロシンリン酸化がもたらされる。次に、この増大により、Ｔ細胞活性化における役割を果たす他の因子のリクルートがもたらされる。Ｉｔａｎｏらは、ＣＤ４の細胞質テイルもＣＤ４＋ＣＤ８＋  Ｔ細胞のＣＤ４＋系統への分化を促進することを、トランスジェニックマウスにおいて、ＣＤ８細胞外ドメイン及びＣＤ４細胞質テイルを含むハイブリッドタンパク質を設計し、同タンパク質の発現を試験することにより、提唱した。Ｉｔａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｔｈｅ  Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  Ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ＣＤ４  Ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｔｈｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ＣＤ４  Ｌｉｎｅａｇｅ  Ｔ  Ｃｅｌｌｓ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：７３１〜４１。ハイブリッドタンパク質の発現により、ＭＨＣ  Ｉ特異的ＣＤ４系統Ｔ細胞の発達がもたらされた（上記文献）。
【００６９】
ＣＤ４共受容体は、ＨＩＶウイルスに対する主な受容体である考えられ、ＣＤ４＋  Ｔ細胞枯渇は、疾患進行の指標である。ＣＤ４の細胞質テイルは、ＨＩＶ誘引アポトーシスにおいて、ＣＤ４＋  Ｔ細胞へのアポトーシスシグナルを伝達するために必須であると考えられる。具体的には、ＣＤ４とＬｃｋとの相互作用は、これらの細胞におけるＨＩＶ誘引アポトーシスを強化することが示された。Ｃｏｒｂｅｉｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）ＨＩＶ−ｉｎｄｕｃｅｄ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ｒｅｑｕｉｒｅｓ  ｔｈｅ  ＣＤ４  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  Ｔａｉｌ  ａｎｄ  Ｉｓ  Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ  ｂｙ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤ４  ｗｉｔｈ  ｐ５６ｌｃｋ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：３９〜４８。
【００７０】
Ｔ細胞は、胸腺において、未成熟なＣＤ４−／ＣＤ８−（ダブルネガティブ又はＤＮ）胸腺細胞からＣＤ４＋／ＣＤ８＋（ダブルポジティブ又はＤＰ）胸腺細胞に進行して発達する。同胸腺細胞は、最終的に、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋（シングルポジティブ又はＳＰ）Ｔ細胞のいずれかになるためのポジティブ選択を受ける。ＤＰ胸腺細胞は、ＭＨＣ  Ｉ限定ＴＣＲからのシグナルを受けて、ＣＤ８＋  Ｔ細胞に分化する。一方、ＤＰ胸腺細胞は、ＭＨＣ  ＩＩ限定ＴＣＲからのシグナルを受けて、ＣＤ４＋  Ｔ細胞に分化する。ＣＤ４＋又はＣＤ８＋  Ｔ細胞のいずれかへのその分化をもたらすＤＰ細胞が受け取る合図は、数多くの研究の対象であった。ＣＤ４／ＣＤ８系統選択のための様々なモデルが提唱されており、Ｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｌｉｎｅａｇｅ  ｆａｔｅ  ａｎｄ
ｉｎｔｅｎｓｅ  ｄｅｂａｔｅ：ｍｙｔｈｓ，ｍｏｄｅｌｓ  ａｎｄ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ＣＤ４−ｖｅｒｓｕｓ  ＣＤ８−ｌｉｎｅａｇｅ  ｃｈｏｉｃｅ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：７８８〜８０１において、レビューされている。
【００７１】
ポジティブ選択の結果としての特定のＴ細胞共受容体の不活性化は、転写調節の産物である。ＣＤ４について、ＣＤ４のエキソン１の上流１３ｋｂに位置するエンハンサにより、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔ細胞におけるＣＤ４発現をアップレギュレーションされることが示されている。Ｋｉｌｌｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＣＤ４  ｒｅｓｃｕｅｓ  ｈｅｌｐｅｒ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｌａｃｋｉｎｇ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ＣＤ４，ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：１５４７〜５３。マウスＣＤ４遺伝子の第１のイントロン内に位置するシス作用性転写サイレンサは、ＣＤ４＋  Ｔ細胞以外の細胞におけるＣＤ４の発現をサイレンスするために機能する。Ｓｉｕ
ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ａ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｓｉｌｅｎｃｅｒ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣＤ４  ｇｅｎｅ，ＥＭＢＯ  Ｊ．１３：３５７０〜３５７９。
【００７２】
ＣＤ４系統選択を制御する重要な転写調節因子（例えば、プロモータ、エンハンサ、サイレンサ等）が、以前に開発されたヒトＣＤ４を発現するトランスジェニックマウスの複数の系統では損なわれていたため、これらのマウスでは、正常なＴ細胞系統発達を反復することができず、ＣＤ４を発現するＣＤ４＋  Ｔ細胞以外の免疫細胞が生じた。例えば、Ｌａｗ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｈｕｍａｎ  ＣＤ４  Ｒｅｓｔｏｒｅｓ  Ｎｏｒｍａｌ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｍｉｃｅ  Ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｉｎ  ＣＤ４，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９：１２３３〜４２（ＣＤ８＋  Ｔ細胞及びＢ細胞におけるＣＤ４発現）；Ｆｕｇｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＨＬＡ−ＤＲ４  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ＣＤ４  ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ  ｔｈｅ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎβ−ｃｈａｉｎ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ａｎｄ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ａｎ  ＨＬＡ−Ｄ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：６１５１〜５５（全てのＣＤ３＋胸腺細胞及びＢ細胞におけるＣＤ４発現）を参照のこと。このため、一実施形態において、Ｔ細胞発達及び系統選択を受けることができるＴ細胞を動物に生じさせるために、内在性マウスプロモータ及び他の調節エレメントを保持している、遺伝子改変動物を開発する利益が存在する場合がある。
【００７３】
このため、様々な実施形態において、本発明は、例えば、その内在性Ｔ細胞共受容体座（例えば、ＣＤ４座）において、キメラヒト／非ヒトＴ細胞共受容体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、遺伝子改変非ヒト動物を提供する。一実施形態において、キメラポリペプチドのヒト部分は、ヒトＴ細胞共受容体の全て又は実質的に全ての細胞外部分（又はその一部、例えば、１つ又はそれ２つ以上の細胞外ドメイン、例えば、少なくとも２つの連続的な細胞外ドメイン）を含む。一実施形態において、キメラポリペプチドの非ヒト部分は、非ヒトＴ細胞共受容体の膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを含む。一実施形態において、非ヒト動物は、機能的なキメラＴ細胞共受容体ポリペプチドを発現している。このため、一態様において、本発明は、遺伝子改変非ヒト動物であって、その内在性ＣＤ４座において、キメラヒト／非ヒトＣＤ４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、キメラポリペプチドのヒト部分が、ヒトＣＤ４の全て又は実質的に全ての細胞外部分を含み、非ヒト部分が、非ヒトＣＤ４の少なくとも膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを含み、動物が、機能的なキメラＣＤ４ポリペプチドを発現している、遺伝子改変非ヒト動物を提供する。一態様において、非ヒト動物は、ヒト化ＣＤ４ポリペプチド、すなわち、キメラヒト／非ヒトＣＤ４ポリペプチドのみを発現しており、機能的な内在性非ヒトＣＤ４タンパク質を、その内在性ＣＤ４座から発現していない。
【００７４】
一実施形態において、キメラヒト／非ヒトＣＤ４ポリペプチドのヒト部分は、ヒトＣＤ４ポリペプチドの全て又は実質的に全ての細胞外部分を含む。別の実施形態では、キメラヒト／非ヒトＣＤ４ポリペプチドのヒト部分は、ヒトＣＤ４ポリペプチドの全て又は実質的に全てのＭＨＣ  ＩＩ結合ドメイン（例えば、ヒトＤ１及びＤ２ドメインの実質的な部分）を少なくとも含む。一実施形態において、キメラヒト／非ヒトＣＤ４ポリペプチドのヒト部分は、ヒトＣＤ４ポリペプチドの全て又は実質的に全てのＤ１、Ｄ２、及びＤ３ドメインを含む。更に別の実施形態では、キメラヒト／非ヒトＣＤ４ポリペプチドのヒト部分は、ＣＤ４の全て又は実質的に全ての免疫グロブリン様ドメイン、例えば、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、及びＤ４と呼ばれるドメインを含む。更に別の実施形態では、キメラヒト／非ヒトＣＤ４ポリペプチドのヒト部分は、そのヒト部分において、ＭＨＣ  ＩＩ及び／又はＴ細胞受容体の細胞外部分との相互作用を担う、全て又は実質的に全てのヒトＣＤ４配列を含む。更に別の実施形態では、キメラヒト／非ヒトＣＤ４ポリペプチドのヒト部分は、ＭＨＣ  ＩＩ及び／又はＴ細胞受容体の可変ドメインとの相互作用を担う、ヒトＣＤ４の全て又は実質的に全ての細胞外部分を含む。したがって、一実施形態において、キメラＣＤ４ポリペプチドのヒト部分をコードするヌクレオチド配列は、ヒトＣＤ４の全て又は実質的に全てのドメインＤ１〜Ｄ２のコード配列（例えば、ヒトＣＤ４遺伝子のエキソン３及びエキソン４〜５の一部）を含む。別の実施形態では、キメラＣＤ４ポリペプチドのヒト部分をコードするヌクレオチド配列は、ヒトＣＤ４の全て又は実質的に全てのＤ１〜Ｄ３のコード配列（例えば、ヒトＣＤ４のエキソン３及びエキソン４〜６の一部）を含む。このため、一実施形態において、キメラヒト／非ヒトＣＤ４をコードするヌクレオチド配列は、ヒトＣＤ４の全て又は実質的に全てのＤ１〜Ｄ３ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む。別の実施形態では、キメラＣＤ４ポリペプチドのヒト部分をコードするヌクレオチド配列は、ヒトＣＤ４遺伝子のＤ１〜Ｄ４のコード配列を含む。別の実施形態では、ヌクレオチド配列は、マウスＣＤ４シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列、例えば、マウス遺伝子のエキソン２〜３の部分によりコードされる領域を含んでもよい。別の実施形態では、ヌクレオチド配列は、ヒトＣＤ４シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでもよい。一実施形態において、キメラヒト／非ヒトＣＤ４ポリペプチドは、配列番号：７８で示されるアミノ酸配列を含み、キメラポリペプチドのヒト部分は、配列番号：７８のアミノ酸２７〜３１９付近（配列番号：７９に別に示される）に広がっている。
【００７５】
一実施形態において、非ヒト動物は、キメラヒト／非ヒトＣＤ４ポリペプチド配列を発現している。一実施形態において、キメラＣＤ４配列のヒト部分は、１つ又は２つ以上の保存的又は非保存的な改変を含む。
【００７６】
一態様において、ヒトＣＤ４配列を発現している非ヒト動物であって、ヒトＣＤ４配列が、ヒトＣＤ４配列に対して、少なくとも約８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である、非ヒト動物が提供される。特定の実施形態では、ヒトＣＤ４配列は、実施例に記載されたヒトＣＤ４配列に対して、少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である。一実施形態において、ヒトＣＤ４配列は、１つ又は２つ以上の保存的置換を含む。一実施形態において、ヒトＣＤ４配列は、１つ又は２つ以上の非保存的置換を含む。
【００７７】
いくつかの実施形態では、キメラＣＤ４の一部、例えば、ヒト部分は、本明細書で示された実質的に全ての配列（例えば、本明細書で示された実質的に全てのタンパク質ドメイン）を含んでもよい。実質的に全ての配列は、タンパク質の特定の部分（例えば、特定の機能的なドメイン等）を表わすと考えられる、アミノ酸の８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％を概ね含む。当業者であれば、機能的なドメインの限度は、使用されるアライメント及びドメイン予測法に応じてわずかに変動する場合があることを、理解するであろう。
【００７８】
一態様において、キメラヒト／非ヒトＣＤ４ポリペプチドの非ヒト部分は、非ヒトＣＤ４ポリペプチドの少なくとも膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを含む。ＣＤ４細胞質ドメインにより提供される重要な機能のために、遺伝子操作動物における内在性非ヒト（例えば、マウス）配列の保持により、共受容体の適切な細胞内シグナル伝達及び他の機能の保存が確保される。一実施形態において、非ヒト動物は、マウスであり、非ヒトＣＤ４ポリペプチドは、マウスＣＤ４ポリペプチドである。具体的なマウスＣＤ４配列が実施例に記載されているが、それから得られる任意の好適な配列、例えば、保存的／非保存的アミノ酸置換を含む配列が、本明細書に包含される。一実施形態において、キメラＣＤ４共受容体の非ヒト部分は、ヒト化されていない内在性ＣＤ４の任意の配列を含む。
【００７９】
本明細書に記載された非ヒト動物は、その内在性座において、キメラヒト／非ヒトＣＤ４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでもよい。一態様において、これにより、ヒトＣＤ４ポリペプチドの一部をコードするヌクレオチド配列による、内在性ＣＤ４遺伝子の一部の置換えがもたらされる。一実施形態において、このような置換えは、例えば、非ヒトＣＤ４の全て又は実質的に全ての細胞外ドメインをコードする内在性ヌクレオチド配列、例えば、非ヒトＣＤ４の全て又は実質的に全ての第１の免疫グロブリン様ドメイン（すなわち、Ｄ１）を少なくともコードする配列（例えば、非ヒトＣＤ４の全て又は実質的に全てのドメインＤ１〜Ｄ２をコードする配列、例えば、非ヒトＣＤ４の全て又は実質的に全てのドメインＤ１〜Ｄ３をコードする配列、例えば、非ヒトＣＤ４の全て又は実質的に全てのドメインＤ１〜Ｄ４をコードする配列）の、同じドメインをコードするヒトヌクレオチド配列による置換えである。一実施形態において、置換えにより、ＭＨＣ
ＩＩ及び／又はＴ細胞受容体の細胞外部分との相互作用を担うヒトＣＤ４配列を含むキメラタンパク質がもたらされる。更に別の実施形態では、置換えにより、ＭＨＣ  ＩＩ及び／又はＴ細胞受容体の可変ドメインとの相互作用を担うヒトＣＤ４配列を含むキメラタンパク質がもたらされる。一実施形態において、置換えは、非ヒトＣＤ４ポリペプチドの少なくとも膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインをコードするＣＤ４は配列の置換えを含まない。このため、一態様において、非ヒト動物は、内在性非ヒトＣＤ４座から、キメラヒト／非ヒトＣＤ４ポリペプチドを発現している。更に別の実施形態では、置換えにより、配列番号：７８に示されるポリペプチド配列を含むタンパク質がもたらされる。
【００８０】
一実施形態において、本明細書に記載されたキメラヒト／非ヒトＣＤ４座（例えば、キメラヒト／げっ歯類ＣＤ４座、例えば、キメラヒト／マウスＣＤ４座）のヌクレオチド配列が提供される。一態様において、キメラヒト／非ヒト（例えば、ヒト／げっ歯類、例えば、ヒト／マウス）ＣＤ４配列は、内在性非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、マウス）ＣＤ４座に位置するため、第１のＣＤ４エキソンの上流に位置するＣＤ４エンハンサエレメントを保持している。一実施形態において、内在性非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、マウス）ＣＤ４座における置換えは、例えば、ＣＤ４ポリペプチドのＤ１をコードするエキソン３並びにＤ１の残り部分及びＤ２〜Ｄ３をコードするエキソン４〜６の一部の置換えを含む。このため、一態様において、キメラＣＤ４座は、非ヒト（例えば、マウス）ＣＤ４遺伝子のイントロン１に位置するシス作用性サイレンサを保持している。このため、一実施形態において、キメラ座は、内在性非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、マウス）ＣＤ４プロモータ及び調節エレメントを保持している。別の実施形態では、キメラ座は、適切なＣＤ４発現、ＣＤ４＋  Ｔ細胞発達、ＣＤ４系統選択、及び共受容体機能を可能にする程度に、ヒトプロモータ及び調節エレメントを含有してもよい。このため、いくつかの態様では、本発明の動物は、適切な系統選択及びＴ細胞発達を変化させない遺伝子改変を含む。一態様において、本発明の動物（例えば、げっ歯類、例えば、マウス）は、ＣＤ４を正常に発現している細胞以外の免疫細胞上に、キメラＣＤ４ポリペプチドを発現していない。一態様において、動物は、Ｂ細胞又は成熟ＣＤ８＋  Ｔ細胞上に、ＣＤ４を発現していない。一実施形態において、置換えにより、ＣＤ４発現の適切な空間的及び時間的調節を可能にするエレメントの保持がもたらされる。
【００８１】
様々な実施形態において、本明細書に記載されたキメラＣＤ４座から機能的なキメラＣＤ４タンパク質を発現している非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、マウス又はラット）は、細胞表面、例えば、Ｔ細胞表面上に、キメラタンパク質を提示している。一実施形態において、非ヒト動物は、ヒトにおいて観察されるとの同じ細胞分布において、細胞表面上に、キメラＣＤ４タンパク質を発現している。一態様において、本発明のＣＤ４タンパク質は、第２の細胞、例えば、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上に発現されたＭＨＣ
ＩＩタンパク質と相互作用することができる。
ヒト又はヒト化ＣＤ８
【００８２】
様々な実施形態において、本発明は、遺伝子改変非ヒト動物であって、そのゲノム中に、例えば、内在性ＣＤ８座において、ヒト又はヒト化ＣＤ８ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、これにより、動物が、ヒト又はヒト化ＣＤ８ポリペプチドを発現している、遺伝子改変非ヒト動物を概ね提供する。様々な実施形態において、本発明は、非ヒト動物であって、そのゲノム中に、例えば、内在性ＣＤ８座において、ヒト又はヒト化ＣＤ８αポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、及び／又は、ヒト又はヒト化ＣＤ８βポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、非ヒト動物を提供する。このため、本発明の遺伝子改変非ヒト動物は、ヒト又はヒト化ＣＤ８α、及び／又は、ヒト又はヒト化ＣＤ８βポリペプチドを発現している。
【００８３】
ヒトＣＤ８タンパク質は、典型的には、細胞表面上に、２つのポリペプチドＣＤ８α及びＣＤ８βのヘテロ二量体として発現される。ただし、ジスルフィド結合したホモ二量体及びホモ多量体も、（例えば、ＣＤ８ααを発現する、ＮＫ細胞及び腸のγδ  Ｔ細胞において）検出されている。ヒトＣＤ８α及びＣＤ８βをコードする遺伝子は、第２番染色体上において、互いに近接して位置している。Ｎａｋａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｒｅｃｅｎｔ  Ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔｗｏ  Ｈｕｍａｎ  ＣＤ８β−ｃｈａｉｎ  ｇｅｎｅｓ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１９１９〜２７。ＣＤ８αタンパク質は、リーダペプチド、免疫グロブリンＶ様領域、ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、及び細胞質テイルを含む。Ｎｏｒｍｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｌｙ  Ｓｐｌｉｃｅｄ  ｍＲＮＡ  Ｅｎｃｏｄｅｓ  ａ  Ｓｅｃｒｅｔｅｄ  Ｆｏｒｍ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  ＣＤ８α．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  ＣＤ８α  ｇｅｎｅ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４２：３３１２〜１９。ＣＤ８α遺伝子のエキソン／イントロンは、図５Ｂに模式的に示されている。
【００８４】
ヒトＣＤ８β遺伝子は、第２番染色体上のＣＤ８α遺伝子の上流に存在する。ＣＤ８β遺伝子の選択的スプライシングにより生成される複数のアイソフォームが報告されている。ここで、１つのアイソフォームは、膜貫通ドメインを欠いており、分泌タンパク質を生成すると予測される。Ｎｏｒｍｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ａ  ｓｅｃｏｎｄ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｏｆ  ＣＤ８  ｉｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ，ＥＭＢＯ  Ｊ．７：３４３３〜３９。ＣＤ８β遺伝子のエキソン／イントロンも、図５Ｂに模式的に示されている。
【００８５】
膜結合ＣＤ８βタンパク質は、Ｎ末端シグナル配列、続けて、免疫グロブリンＶ様ドメイン、短い細胞外ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、及び細胞質テイルを含有する。Ｌｉｔｔｍａｎ（１９８７）Ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣＤ４  ａｎｄ  ＣＤ８  ｇｅｎｅｓ，Ａｎｎ  Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：５６１〜８４を参照のこと。ヒンジ領域は、拡張したグリコシル化部位である。同部位は、そのコンホーメーションを維持し、タンパク質をプロテアーゼによる開裂から保護すると考えられる。Ｌｅａｈｙ（１９９５）Ａ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｖｉｅｗ  ｏｆ  ＣＤ４  ａｎｄ  ＣＤ８，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．９：１７〜２５。
【００８６】
ＣＤ８タンパク質は、通常、細胞障害性Ｔ細胞上に発現されており、ＭＨＣ  Ｉ分子と相互作用する。相互作用は、ＭＨＣ  Ｉのα３ドメインに結合するＣＤ８により媒介される。ただし、ＭＨＣクラスＩのＣＤ８への結合性は、ＴＣＲのＭＨＣクラスＩへの結合性より約１００倍弱く、ＣＤ８結合は、ＴＣＲ結合の親和性を向上させる。Ｗｏｏｌｄｒｉｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）ＭＨＣ  Ｃｌａｓｓ  Ｉ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｓｕｐｅｒｅｎｈａｎｃｅｄ  ＣＤ８  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  Ｂｙｐａｓｓ  ｔｈｅ  Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ  ｆｏｒ  Ｃｏｇｎａｔｅ  ＴＣＲ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｎｏｎｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  Ａｃｔｉｖａｔｅ  ＣＴＬｓ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８４：３３５７〜３３６６。
【００８７】
ＭＨＣクラスＩ分子に結合するＣＤ８は、種特異的である。ＣＤ８のマウスホモログであるＬｙｔ−２は、α３ドメインにおいてＨ−２Ｄｄ分子に結合することが示されたが、ＨＬＡ−Ａ分子には結合しなかった。Ｃｏｎｎｏｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｔｈｅ  Ｌｙｔ−２  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｓ  Ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｃｌａｓｓ  Ｉ  α３  Ｄｏｍａｉｎ  ｉｎ  Ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６８：３２５〜３４１。差動的な結合は、おそらく、ヒトとマウスとの間で保存されなかった、ＣＤ８におけるＣＤＲ様決定因子（ＣＤＲ１様及びＣＤＲ２様）のためであった。Ｓａｎｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ＣＤ８  ｔｈａｔ  Ａｆｆｅｃｔ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ＨＬＡ  Ｃｌａｓｓ  Ｉ  ａｎｄ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉ−ＣＤ８  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４：３７１〜３７９；Ｖｉｔｉｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＨＬＡ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ
Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｍｉｃｅ  Ｃａｒｒｙｉｎｇ  ａ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ｈｕｍａｎ−Ｍｏｕｓｅ  Ｃｌａｓｓ  Ｉ  Ｍａｊｏｒ  Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  Ｃｏｍｐｌｅｘ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：１００７〜１０１５；及び、Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ
ｂｅｔｗｅｅｎ  ｈｕｍａｎ  ＣＤ８αα  ａｎｄ  ＨＬＡ−Ａ２，Ｎａｔｕｒｅ  ３８７：６３０〜６３４。ＣＤ８は、α３ドメインの保存領域（２２３〜２２９位）において、ＨＬＡ−Ａ２に結合することが、報告されている。ＨＬＡ−Ａにおける１つの置換（Ｖ２４５Ａ）は、ＣＤ８のＨＬＡ−Ａへの結合性を低下させ、それと共に、Ｔ細胞媒介性溶解が大きく減少した。Ｓａｌｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９），Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ｉｎ  ｔｈｅ  α３  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ＨＬＡ−Ａ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ａｆｆｅｃｔｓ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ＣＤ８，Ｎａｔｕｒｅ  ３３８：３４５〜３４８。一般的には、ＨＬＡ−Ａ分子のα３ドメインにおける多型も、ＣＤ８への結合に影響を及ぼす（上記文献）。マウスにおいて、Ｈ−２Ｄｄにおける残基２２７でのアミノ酸置換は、マウスＬｙｔ−２のＨ−２Ｄｄへの結合に影響を及ぼし、変異Ｈ−２Ｄｄによりトランスフェクションされた細胞は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞により溶解されなかった。Ｐｏｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ａｔ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ２２７  ｏｆ  Ｈ−２  ｃｌａｓｓ  Ｉ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ａｂｒｏｇａｔｅｓ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｂｙ  ＣＤ８−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ，ｂｕｔ  ｎｏｔ  ＣＤ８−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ，ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ、Ｎａｔｕｒｅ  ３３７：７３〜７５。このため、ヒト又はヒト化ＣＤ８の発現は、ヒト又はヒト化ＭＨＣ  Ｉにより提示された抗原に対するＴ細胞応答を研究するために有益である場合がある。
【００８８】
ＣＤ４と同様に、ＣＤ８の細胞質ドメインは、チロシンキナーゼＬｃｋと相互作用し、次に、Ｔ細胞活性化をもたらす。Ｌｃｋは、ＣＤ８αの細胞質ドメインと相互作用すると考えられるが、この相互作用は、ＣＤ８βの細胞質ドメインの存在により調節されると考えられる。ＣＤ８β細胞質ドメインの変異又は欠失により、ＣＤ８α関連Ｌｃｋ活性の低下がもたらされるためである。Ｉｒｉｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｔｈｅ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ＣＤ８β  Ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  Ｌｃｋ  Ｋｉｎａｓｅ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ＣＤ８  Ｔ  ｃｅｌｌ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：１８３〜９１。Ｌｃｋ活性の低下は、Ｔ細胞発達の障害に関連した（上記文献）。
【００８９】
適切な細胞、例えば、細胞傷害性Ｔ細胞上でのＣＤ８の発現は、ＣＤ８座全体に位置する各種のエンハンサエレメントにより、密接に調節される。例えば、ＤＮＡｓｅ  Ｉ過感受性の少なくとも４つの領域は、多くの場合、レギュレータ結合性に関連しており、ＣＤ８座において特定されている。Ｈｏｓｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ａ  ＣＤ８  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｔｈａｔ  ｄｉｒｅｃｔｓ  ｓｕｂｓｅｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤ８  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：４２７０〜８１。ＣＤ８座におけるこれらのＤＮＡｓｅＩ過感受性領域の発見により、少なくとも５つのエンハンサエレメントが特定され、ＣＤ８座全体に広がっており、ＤＰ、ＣＤ８  ＳＰ  Ｔ細胞、又はγδＴＣＲを発現している細胞を含めた様々な系統のＴ細胞におけるＣＤ８α及び／又はβの発現を調節している。例えば、Ｋｉｏｕｓｓｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ａｎｄ  ＣＤ４，ＣＤ８Ａ，ａｎｄ  ＣＤ８Ｂ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ
ｔｈｙｍｉｃ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．２：９０９〜９１９、及び、オンラインＥｒｒａｔｕｍ；Ｅｌｌｍｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｓｔａｇｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｅｎｈａｎｃｅｒｓ  Ｒｅｇｕｌａｔｅ  ＣＤ８  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  Ｔｈｙｍｏｃｙｔｅｓ  ａｎｄ  ｉｎ  Ｔｈｙｍｕｓ−Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ９：４８５〜９６を参照のこと。
【００９０】
このため、ヒト又はヒト化ＣＤ４遺伝子改変動物についての内在性ＣＤ４プロモータ及び調節エレメントを維持することにより得られる利益と同様に、いくつかの実施形態では、ヒト又はヒト化ＣＤ８の発現を制御するであろう内在性マウスプロモータ及び調節エレメントを保持している遺伝子改変非ヒト動物を開発する利益が存在する場合がある。本明細書に記載されたように、ＣＤ８α及び／又はβタンパク質をコードする内在性非ヒト配列のヒト又はヒト化ＣＤ８α及び／又はβタンパク質をコードする配列による置換えを含む、遺伝子改変動物を作製する特定の利益が存在する場合がある。
【００９１】
様々な実施形態において、本発明は、遺伝子改変非ヒト動物であって、そのゲノム中に、例えば、その内在性ＣＤ８座において、キメラヒト／非ヒトＣＤ８ポリペプチド（例えば、ＣＤ８α及び／又はβポリペプチド）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含み、ポリペプチドのヒト部分が、ヒトＣＤ８ポリペプチド（例えば、ＣＤ８α及び／又はβ）の全て又は実質的に全ての細胞外部分（又はその一部、例えば、細胞外ドメイン）を含み、非ヒト部分が、非ヒトＣＤ８（例えば、ＣＤ８α及び／又はβ）の少なくとも膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを含み、動物が、キメラＣＤ８ポリペプチド（例えば、ＣＤ８α及び／又はβポリペプチド）を発現している、遺伝子改変非ヒト動物を提供する。このため、一実施形態において、本発明は、遺伝子改変非ヒト動物であって、その内在性非ヒトＣＤ８座において、キメラヒト／非ヒトＣＤ８αポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列と、キメラヒト／非ヒトＣＤ８βポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列とを含み、第１のヌクレオチド配列が、ヒトＣＤ８αポリペプチドの全て又は実質的に全ての細胞外部分並びに非ヒトＣＤ８αポリペプチドの少なくとも膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインをコードする配列を含み、第２のヌクレオチド配列が、ヒトＣＤ８βポリペプチドの全て又は実質的に全ての細胞外部分並びに非ヒトＣＤβポリペプチドの少なくとも膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインをコードする配列を含み、動物が、機能的なキメラヒト／非ヒトＣＤ８タンパク質を発現している、遺伝子改変非ヒト動物を提供する。一態様において、非ヒト動物は、ヒト化ＣＤ８ポリペプチド（例えば、キメラヒト／非ヒトＣＤ８α及び／又はβポリペプチド）のみを発現し、内在性ＣＤ８座から、対応する機能的な非ヒトＣＤ８ポリペプチドを発現していない。
【００９２】
一実施形態において、キメラヒト／非ヒトＣＤ８αポリペプチドは、そのヒト部分において、ヒトＣＤ８αポリペプチドの全て又は実質的に全ての細胞外部分を含む。一実施形態において、キメラＣＤ８αポリペプチドのヒト部分は、ヒトＣＤ８αポリペプチドの少なくともＭＨＣ  Ｉ結合ドメインを含む。一実施形態において、キメラＣＤ８αポリペプチドのヒト部分は、少なくともヒトＣＤ８αの全て又は実質的に全ての免疫グロブリンＶ様ドメインの配列を含む。一実施形態において、キメラＣＤ８αポリペプチドのヒト部分をコードするヌクレオチド配列は、ヒトＣＤ８αポリペプチドの細胞外部分をコードするエキソンを少なくとも含む。一実施形態において、ヌクレオチド配列は、Ｉｇ  Ｖ様ドメインをコードするエキソンを少なくとも含む。一実施形態において、ヒトＣＤ８αポリペプチドの細胞外部分は、膜貫通ドメイン又は細胞質ドメインではないポリペプチドの部分を包含する領域である。一実施形態において、キメラヒト／非ヒトＣＤ８αポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、マウス）ＣＤ８αシグナルペプチドをコードする配列を含む。あるいは、ヌクレオチド配列は、ヒトＣＤ８βシグナル配列をコードする配列を含んでもよい。一実施形態において、キメラヒト／非ヒトＣＤ８αポリペプチドは、配列番号：８８に示されるアミノ酸配列を含み、キメラポリペプチドのヒト部分は、配列番号：８８のアミノ酸２８〜１７９に示される（配列番号：８９に別に表わされる）。
【００９３】
同様に、一実施形態において、キメラヒト／非ヒトＣＤ８βポリペプチドは、そのヒト部分において、ヒトＣＤ８βポリペプチドの全て又は実質的に全ての細胞外部分を含む。一実施形態において、キメラＣＤ８βポリペプチドのヒト部分は、ヒトＣＤ８βの全て又は実質的に全ての免疫グロブリンＶ様ドメインの配列を含む。一実施形態において、キメラＣＤ８βポリペプチドのヒト部分をコードするヌクレオチド配列は、ヒトＣＤ８βポリペプチドの細胞外部分をコードするエキソンを少なくとも含む。一実施形態において、キメラヒト／非ヒトＣＤ８βポリペプチドのヒト部分をコードするヌクレオチド配列は、ヒトＣＤ８βのＩｇＧ  Ｖ様ドメインをコードするエキソンを少なくとも含む。一実施形態において、キメラヒト／非ヒトＣＤ８βポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、マウス）ＣＤ８βシグナルペプチドをコードする配列を含む。あるいは、ヌクレオチド配列は、ヒトＣＤ８βシグナル配列をコードする配列を含んでもよい。一実施形態において、キメラヒト／非ヒトＣＤ８βポリペプチドは、配列番号：８３に示されるアミノ酸配列を含み、キメラポリペプチドのヒト部分は、配列番号：８３のアミノ酸１５〜１６５に示される（配列番号：８４に別に表わされる）。
【００９４】
一実施形態において、非ヒト動物は、キメラヒト／非ヒトＣＤ８α及び／又はＣＤ８βポリペプチドを発現している。一実施形態において、キメラヒト／非ヒトＣＤ８α及び／又はβポリペプチドのヒト部分は、１つ又は２つ以上の保存的又は非保存的な改変を含む。
【００９５】
一態様において、ヒトＣＤ８α及び／又はβポリペプチド配列を発現している非ヒト動物であって、ヒトＣＤ８α及び／又はβポリペプチド配列が、ヒトＣＤ８α及び／又はβポリペプチド配列それぞれに対して、少なくとも約８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である、非ヒト動物が提供される。特定の実施形態では、ヒトＣＤ８α及び／又はβポリペプチド配列は、実施例に記載された各ヒトＣＤ８α及び／又はβポリペプチド配列に対して、少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である。一実施形態において、ヒトＣＤ８α及び／又はβポリペプチド配列は、１つ又は２つ以上の保存的置換を含む。一実施形態において、ヒトＣＤ８α及び／又はβポリペプチド配列は、１つ又は２つ以上の非保存的置換を含む。
【００９６】
いくつかの実施形態では、キメラＣＤ８の一部、例えば、ヒト部分は、本明細書で示された実質的に全ての配列（例えば、本明細書で示された実質的に全てのタンパク質ドメイン）を含んでもよい。実質的に全ての配列は、一般的には、タンパク質の特定の部分（例えば、特定の機能的なドメイン等）を表わすと考えられるアミノ酸の８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％を含む。当業者であれば、機能的なドメインの限度は、使用されるアライメント及びドメイン予測法に応じてわずかに変動する場合があることを、理解するであろう。
【００９７】
一態様において、キメラヒト／非ヒトＣＤ８α及び／又はβポリペプチドの非ヒト部分は、非ヒトＣＤ８α及び／又はβポリペプチドそれぞれの膜貫通ドメイン及び／又は細胞質ドメインを少なくとも含む。ＣＤ８細胞質ドメインにより提供される重要な機能のために、遺伝子操作動物における内在性非ヒト（例えば、マウス）配列の保持により、共受容体の適切な細胞内シグナル伝達及び他の機能の保存が確保される。一実施形態において、非ヒト動物は、マウスであり、非ヒトＣＤ８α及び／又はβポリペプチドはそれぞれ、マウスＣＤ８α及び／又はβポリペプチドである。具体的なマウスＣＤ８α及び／又はβ配列が実施例に記載されているが、それから得られる任意の適切な配列、例えば、保存的／非保存的アミノ酸置換を含む配列が、本明細書に包含される。一実施形態において、非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、マウス）は、ヒト化されていない任意の内在性配列を保持している。
【００９８】
本明細書に記載された非ヒト動物は、その内在性座において、キメラヒト／非ヒトＣＤ８α及び／又はβポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでもよい。一態様において、これにより、ヒトＣＤ８αポリペプチドの一部をコードするヌクレオチド配列による、内在性ＣＤ８α遺伝子の一部の置換え、及び／又は、ヒトＣＤ８βポリペプチドの一部をコードするヌクレオチド配列による、内在性ＣＤ８β遺伝子の一部の置換えがもたらされる。一実施形態において、このような置換えは、非ヒトＣＤ８α及び／又はβの全て又は実質的に全ての細胞外部分をコードする内在性ヌクレオチド配列の、同じ配列をコードするヒトヌクレオチド配列を有するヒトヌクレオチドによる置換えである。一実施形態において、このような置換えは、非ヒトＣＤ８α及び／又はβの全て又は実質的に全ての免疫グロブリンＶ様ドメインを少なくともコードする内在性ヌクレオチド配列の、同じものをコードするヒトヌクレオチド配列による置換えである。一実施形態において、置換えは、非ヒトＣＤ８α及び／又はβポリペプチドの膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインをコードするＣＤ８α及び／又はβ配列の置換えを含まない。このため、非ヒト動物は、内在性非ヒトＣＤ８座から、キメラヒト／非ヒトＣＤ８α及び／又はβポリペプチドを発現している。更に別の実施形態では、置換えにより、配列番号：８８及び／又は８４それぞれに示されるポリペプチド配列を含むＣＤ８α及び／又はβタンパク質がもたらされる。
【００９９】
一実施形態において、キメラヒト／非ヒトＣＤ８座（例えば、キメラげっ歯類ＣＤ８座、例えば、キメラマウスＣＤ８座）のヌクレオチド配列が提供される。一態様において、キメラヒト／非ヒト（例えば、ヒト／げっ歯類、例えば、ヒト／マウス）ＣＤ８α及び／又はβ配列は、各内在性非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、マウス）ＣＤ８α及び／又はβ座に位置するため、内在性ＣＤ８α及び／又はβプロモータ及び調節エレメントを保持している。別の実施形態では、キメラ座は、適切なＣＤ８α及び／又はβ発現（適切な空間的及び時間的なタンパク質発現）、ＣＤ８＋  Ｔ細胞発達、ＣＤ８系統選択、及び共受容体機能を可能にする程度に、ヒトＣＤ８α及び／又はβプロモータ及び調節エレメントを含有してもよい。このため、一態様において、本発明の動物は、適切な系統選択及びＴ細胞発達を変化させない遺伝子改変を含む。一態様において、本発明の動物（例えば、げっ歯類、例えば、マウス）は、ＣＤ８を正常に発現している細胞以外の免疫細胞において、キメラＣＤ８タンパク質を発現していない。例えば、動物は、Ｂ細胞又は成熟ＣＤ４＋  Ｔ細胞上に、ＣＤ８を発現していない。一実施形態において、置換えにより、ＣＤ８α及び／又はβ発現の適切な空間的及び時間的調節を可能にするエレメントの保持がもたらされる。
【０１００】
様々な実施形態において、本明細書に記載されたキメラＣＤ８座から機能的なキメラＣＤ８タンパク質（例えば、ＣＤ８αβ又はＣＤ８αα）を発現している非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、マウス又はラット）は、細胞表面上に、キメラタンパク質を提示している。一実施形態において、非ヒト動物は、ヒトにおいて観察されるのと同じ細胞分布において、細胞表面上に、キメラＣＤ８タンパク質を発現している。一態様において、本発明のＣＤ８タンパク質は、第２の細胞表面上に発現されたＭＨＣ  Ｉタンパク質と相互作用することができる。
ヒト又はヒト化Ｔ細胞受容体
【０１０１】
本明細書において、実質的にヒト化されたＴ細胞免疫系を含む、遺伝子改変非ヒト動物が開示される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示された非ヒト動物は、例えば、そのゲノム中に、（ａ）キメラヒト／非ヒトＴ細胞共受容体をコードするヌクレオチド配列であって、キメラＴ細胞共受容体ポリペプチドのヒト部分がヒトＴ細胞共受容体の細胞外ドメインをコードする配列によりコードされ、ヒトＴ細胞共受容体の細胞外ドメインをコードする配列が、非ヒトＴ細胞共受容体の膜貫通ドメイン及び／又は細胞質ドメインをコードする配列を含むヌクレオチドに操作可能に連結している、ヌクレオチド配列と、（ｂ）少なくとも１つのヒトＶセグメント、場合により、少なくとも１つのヒトＤセグメント、及び少なくとも１つのヒトＪセグメントを含む非再配列Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）可変遺伝子領域であって、ＴＣＲ可変領域遺伝子の非再配列Ｖ、場合によりＤ、及びＪセグメントが組み換えられて、非ヒトＴＣＲ定常遺伝子配列に操作可能に連結している再配列遺伝子を形成している、非再配列ＴＣＲ可変遺伝子領域と、（ｃ）キメラヒト／非ヒトＭＨＣポリペプチドをコードする核酸配列であって、キメラＭＨＣポリペプチドのヒト部分がキメラＴ細胞共受容体ポリペプチドのヒト部分と会合するヒトＭＨＣポリペプチドの細胞外ドメインを含む、核酸配列とを含む。場合により、非ヒト動物は、ヒト又はヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドも含む。
【０１０２】
したがって、様々な実施形態において、本発明は、概ね、遺伝子改変非ヒト動物であって、非ヒト動物が、ゲノム中に、非再配列ヒト化ＴＣＲ可変遺伝子座、例えば、再配列ＴＣＲ可変遺伝子配列を形成するように組み換えることができるヒトＴＣＲ可変セグメントを含む非再配列ヒトＴＣＲ可変遺伝子領域を含む、遺伝子改変非ヒト動物を提供する。本明細書で使用する場合、ＴＣＲ座又はＴＣＲ遺伝子座（例えば、ＴＣＲα座又はＴＣＲβ座）は、ＴＣＲコード領域（非再配列Ｖ（Ｄ）Ｊ配列、エンハンサ配列、定常配列、及び任意の上流若しくは下流（ＵＴＲ、調節領域等）、又は反転ＤＮＡ配列（イントロン等）を含むＴＣＲコード領域全体を含む）を含むゲノムＤＮＡを意味する。ＴＣＲ可変座、ＴＣＲ可変領域、又はＴＣＲ可変遺伝子座（例えば、ＴＣＲα可変遺伝子座又はＴＣＲβ可変遺伝子座）は、ＴＣＲ可変領域セグメント（Ｖ（Ｄ）Ｊ領域）を含むが、ＴＣＲ定常配列、及び様々な実施形態において、エンハンサ配列を除くゲノムＤＮＡを意味する。他の配列は、遺伝子操作（例えば、選択カセット、制限部位等）の目的で、ＴＣＲ可変遺伝子座に含まれてもよく、これらは、本明細書に包含される。
【０１０３】
Ｔ細胞は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ；マウス）又はヒト白血球抗原（ＨＬＡ；ヒト）複合体と会合する、抗原提示細胞表面上の小さな抗原決定因子におけるエピトープに結合する。Ｔ細胞は、Ｔ細胞表面上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体により、これらのエピトープに結合する。Ｔ細胞受容体は、２種類の鎖：α（アルファ）及びβ（ベータ）鎖又はγ（ガンマ）及びδ（デルタ）鎖から構成されるヘテロ二量体構造である。α鎖は、（ヒト又はマウスの第１４番染色体上の）α座内に位置する核酸配列によりコードされる。同座は、δ座全体も包含する。β鎖は、（マウスの第６番染色体又はヒトの第７番染色体上の）β座内に位置する核酸配列によりコードされる。Ｔ細胞の大部分は、αβＴＣＲを有する。一方、少数のＴ細胞は、γδＴＣＲを有する。ＴＣＲと、ＭＨＣクラスＩ（ＣＤ８＋  Ｔ細胞に対して提示）及びＭＨＣクラスＩＩ（ＣＤ４＋  Ｔ細胞に対して提示）分子との相互作用は、図１に示される（塗りつぶされた記号は、非ヒト配列を表わし、縞状の記号は、ヒト配列を表わす。本発明のＴＣＲタンパク質の１つの特定の実施形態を示す）。
【０１０４】
Ｔ細胞受容体α及びβポリペプチド（及び同様に、γ及びδポリぺプチド）は、ジスルフィド結合を介して、互いに結合している。ＴＣＲを構成する２つのポリペプチドはそれぞれ、定常及び可変領域を含む細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞質テイル（膜貫通ドメイン及び細胞質テイルは、定常領域の一部でもある）を含有する。ＴＣＲの可変領域は、その抗原特異性を決定し、免疫グロブリンと同様に、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。また、免疫グロブリン遺伝子と同様に、Ｔ細胞受容体可変遺伝子座（例えば、ＴＣＲα及びＴＣＲβ座）は、数多くの非再配列Ｖ（Ｄ）Ｊセグメント（可変（Ｖ）、結合（Ｊ）、及びＴＣＲβ及びδにおいて、多様性（Ｄ）セグメント）を含有する。胸腺におけるＴ細胞発達中に、ＴＣＲα可変遺伝子座は、再配列を受ける。これにより生じるＴＣＲα鎖は、ＶＪセグメント（Ｖα／Ｊα配列）の特定の組み合わせによりコードされる。そして、ＴＣＲβ可変遺伝子座は、再配列を受ける。これにより生じるＴＣＲβ鎖は、ＶＤＪセグメント（Ｖβ／Ｄβ／Ｊβ配列）の特定の組み合わせによりコードされる。
【０１０５】
胸腺ストローマとの相互作用により、胸腺細胞が、複数の発達段階を受けるようにトリガーされる。同段階は、様々な細胞表面マーカーの発現により特徴付けられる。胸腺における様々な発達段階での特徴的な細胞表面マーカーの概要は、表１に表わされる。ＴＣＲβ可変遺伝子座での再配列は、ＤＮ２段階において始まり、ＤＮ４段階の間に終了する。一方、ＴＣＲα可変遺伝子座の再配列は、ＤＰ段階において生じる。ＴＣＲβ座再配列の完了後、細胞は、細胞の表面において、サロゲートα鎖、ｐＴαと共に、ＴＣＲβ鎖を発現する。Ｊａｎｅｗａｙ’ｓ  Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ７，７ｔｈ  Ｅｄ．，Ｍｕｒｐｈｙ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，Ｇａｒｌａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００８を参照のこと。
【表１】
2020115896.tif 000002
【０１０６】
ナイーブなＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔ細胞は、胸腺を出て、末梢リンパ器官（例えば、脾臓）に入る。ここにおいて、同Ｔ細胞は、抗原に曝されて、活性化し、クローン的に増殖し、数多くのエフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）、例えば、細胞傷害性Ｔ細胞、ＴＲＥＧ細胞、ＴＨ１７細胞、ＴＨ１細胞、ＴＨ２細胞等に分化する。感染後に、数多くのＴ細胞が、メモリＴ細胞として持続し、セントラルメモリＴ細胞（Ｔｃｍ）又はエフェクターメモリＴ細胞（Ｔｅｍ）のいずれかとして分類される。Ｓａｌｌｕｓｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｔｗｏ  ｓｕｂｓｅｔｓ  ｏｆ  ｍｅｍｏｒｙ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ
ｗｉｔｈ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｈｏｍｉｎｇ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌｓ  ａｎｄ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ，Ｎａｔｕｒｅ  ４０１：７０８〜１２及びＭａｃｋａｙ（１９９９）Ｄｕａｌ  ｐｅｒｓｏｎａｌｉｔｙ  ｏｆ  ｍｅｍｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ４０１：６５９〜６０によるコメント。Ｓａｌｌｕｓｔｏ及び同僚は、最初の感染後に、Ｔｅｍ細胞が、エフェクター機能を有する末梢組織において、抗原刺激メモリＴ細胞の容易に利用可能なプールを提供する一方で、Ｔｃｍ細胞が、末梢リンパ器官において、二次的負荷があったときに、新たなエフェクターＴ細胞になり得る、抗原刺激メモリＴ細胞を提供する、と提唱した。全てのメモリＴ細胞は、ＣＤ４５のＣＤ４５ＲＯアイソフォームを発現している（ナイーブなＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＡアイソフォームを発現している）一方で、Ｔｃｍは、Ｌ−セレクチン（ＣＤ６２Ｌとしても公知）及びＣＣＲ７＋の発現により特徴付けられる。これらの発現は、末梢リンパ器官及びリンパ節への結合及びこれらにおけるシグナル伝達に重要である。上記。このため、末梢リンパ器官において見出される全てのＴ細胞（例えば、ナイーブなＴ細胞、Ｔｃｍ細胞等）は、ＣＤ６２Ｌを発現している。ＣＤ４５ＲＯに加えて、全てのメモリＴ細胞は、数多くの様々な細胞表面マーカー、例えば、ＣＤ４４を発現することが公知である。Ｔ細胞上の様々な細胞表面マーカーの概要については、Ｊａｎｅｗａｙ’ｓ  Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １０、上記を参照のこと。
【０１０７】
ＴＣＲ可変ドメインは、主に抗原認識において機能するが、定常ドメインの細胞外部分、並びに、ＴＣＲの膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインも、重要な機能を果たす。完全なＴＣＲ受容体複合体は、α及びβ又はγ及びδポリペプチドより多くを必要とする。必要とされる更なる分子は、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、及びＣＤ３ε、並びにζ鎖ホモ二量体（ζζ）を含む。ＴＣＲβ再配列の完了時に、細胞がＴＣＲβ／ｐＴαを発現している場合、このプレＴＣＲ複合体は、細胞表面上に、ＣＤ３と共に存在している。細胞表面上のＴＣＲα（又はｐＴα）は、その膜貫通ドメイン中に２つの塩基性残基を有する。その内の１つは、ＣＤ３γεヘテロ二量体をリクルートし、他方は、その各酸性残基により、ζζをリクルートする。ＴＣＲβは、ＣＤ３δεヘテロ二量体をリクルートすると考えられる更なる塩基性残基を、その膜貫通ドメイン中に有する。例えば、Ｋｕｈｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｄｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｆｏｒｍ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＴＣＲ／ＣＤ３  Ｃｏｍｐｌｅｘ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２４：１３３〜３９；Ｗｕｃｈｅｒｐｆｅｎｎｉｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔ−ｃｅｌｌ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ：Ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｉｎｔｏ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ，Ｌｉｇａｎｄ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ．Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：ａ００５１４０を参照のこと。ＴＣＲαβヘテロ二量体、ＣＤ３γε、ＣＤ３δε、及びζζを含むアッセンブリ複合体は、Ｔ細胞表面上に発現される。膜貫通ドメイン中の極性残基は、既存の小胞体についての品質管理として機能することが示唆されている。ＣＤ３サブユニットの不存在下において、ＴＣＲ鎖は、ＥＲ中で保持され、分解が標的化されることが証明されている。例えば、Ｃａｌｌ  ａｎｄ  Ｗｕｃｈｅｒｐｆｅｎｎｉｇ（２００５）Ｔｈｅ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ：Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  ｉｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：１０１〜２５を参照のこと。
【０１０８】
ＴＣＲαβヘテロ二量体（又はＴＣＲγδヘテロ二量体）自体がシグナル伝達活性を欠くため、アッセンブリ複合体のＣＤ３及びζ鎖は、ＴＣＲシグナル伝達のためのコンポーネントを提供する。ＣＤ３鎖は、１つの免疫受容体チロシン系活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）をそれぞれ有し、一方で、ζ鎖は、３つのタンデムなＩＴＡＭを含有する。ＩＴＡＭは、関連するキナーゼによりリン酸化され得るチロシン残基を含有する。このため、アッセンブリＴＣＲ−ＣＤ３複合体は、１０個のＩＴＡＭモチーフを含有する。例えば、Ｌｏｖｅ  ａｎｄ  Ｈａｙｅｓ（２０１０）ＩＴＡＭ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ
ｂｙ  ｔｈｅ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ．Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：ｅ００２４８５を参照のこと。ＴＣＲ結合後、ＩＴＡＭモチーフは、ＳｒｃファミリーチロシンキナーゼＬｃｋ及びＦｙｎによりリン酸化される。同リン酸化により、シグナル伝達カスケードが開始され、Ｒａｓ活性化、カルシウム動員、アクチン細胞骨格再配列、及び転写因子活性化がもたされ、全てが、最終的に、Ｔ細胞の分化、増殖、及びエフェクター作用をもたらす。上記。Ｊａｎｅｗａｙ’ｓ  Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ、上記も参照のこと。両方とも、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１０９】
加えて、ＴＣＲβ膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインは、ミトコンドリア標的化及びアポトーシス誘引に役割を有すると考えられる。実際に、天然のＮ末端トランケートＴＣＲβ分子は、胸腺細胞に存在している。Ｓｈａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−−β  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｔａｒｇｅｔ
ｔｈｅ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｅ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ，Ｂｌｏｏｄ  １１３：３５３０〜４１。このため、複数の重要な機能が、ＴＣＲ定常領域により提供される（同領域は、様々な実施形態において、細胞外ドメイン並びに膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインの一部を含む）。そして、様々な実施形態において、この領域の構造は、ヒト化ＴＣＲ又はそれを発現する遺伝子改変非ヒト動物を設計する際に、考慮されるべきである。
【０１１０】
再配列Ｔ細胞受容体配列のためのマウストランスジェニックが、当該技術分野において公知である。本発明は、遺伝子改変非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラット、マウス）であって、ヒトＴ細胞受容体可変ドメインをコードする核酸配列を形成するために再配列することができる非再配列ヒト又はヒト化Ｔ細胞可変遺伝子座を含み、再配列ヒト可変ドメイン及び非ヒト（例えば、マウス又はラット）定常領域を含むＴ細胞を含む動物を含む、遺伝子改変非ヒト動物に関する。また、本発明は、ヒトＴ細胞受容体可変領域配列の多様なレパートリを生成することができる、非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラット、マウス）を提供する。このため、本発明は、対象となる抗原に対する応答において、完全にヒト可変ドメインを有するＴＣＲを発現し、このＴＣＲが対象となる抗原のエピトープに結合する、非ヒト動物を提供する。いくつかの実施形態では、様々な抗原（ＡＰＣにより提示される抗原を含むが、これに限定されない）と反応することができる、多様なＴ細胞受容体レパートリを生成する、非ヒト動物が提供される。
【０１１１】
一実施形態において、本発明は、遺伝子改変非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラット、マウス）であって、そのゲノム中に、非再配列ヒトＴＣＲ可変領域セグメント（Ｖ（Ｄ）Ｊセグメント）を含み、非再配列ヒトＴＣＲ可変領域セグメントが、内在性非ヒト（例えば、げっ歯類）ＴＣＲ可変遺伝子座（例えば、ＴＣＲα、β、δ、及び／又はγ可変遺伝子座）において、内在性非ヒトＴＣＲ可変領域セグメントを置き換える、遺伝子改変非ヒト動物を提供する。一実施形態において、非再配列ヒトＴＣＲ可変遺伝子座は、内在性非ヒトＴＣＲ可変遺伝子座を置き換える。
【０１１２】
別の実施形態では、本発明は、遺伝子改変非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラット、マウス）であって、そのゲノム中に、非再配列ヒトＴＣＲ可変領域セグメント（Ｖ（Ｄ）Ｊセグメント）を含み、非再配列ヒトＴＣＲ可変領域セグメントが、非ヒトＴＣＲ定常領域遺伝子配列に操作可能に連結して、ヒト化ＴＣＲ座をもたらし、ヒト化ＴＣＲ座が、内在性非ヒトＴＣＲ座以外のゲノム部位に存在する、遺伝子改変非ヒト動物を提供する。このため、一実施形態において、非ヒトＴＣＲ定常領域遺伝子配列に操作可能に連結している再配列ヒトＴＣＲ可変領域セグメントを含む導入遺伝子を含む、非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、マウス、ラット）も提供される。
【０１１３】
一態様において、本発明の遺伝子改変非ヒト動物は、そのゲノム中に、ヒトＴＣＲ可変領域セグメントを含む一方で、ＴＣＲ定常領域をコードする非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、マウス、ラット）ＴＣＲ定常遺伝子配列を保持している。様々な実施形態において、ＴＣＲ定常ドメインは、ＴＣＲの膜貫通ドメイン及び細胞質テイルを含む。このため、本発明の様々な実施形態において、遺伝子改変非ヒト動物は、内在性非ヒトＴＣＲ膜貫通ドメイン及び細胞質テイルを保持している。他の実施形態では、非ヒト動物は、例えば、非ヒト非内在性ＴＣＲの膜貫通ドメイン及び細胞質テイルをコードする非ヒト非内在性ＴＣＲ定常遺伝子配列を含む。上記で示されたように、ＴＣＲの定常ドメインは、抗原刺激Ｔ細胞活性化中に開始されるシグナル伝達カスケードに関与している。このため、内在性ＴＣＲ定常ドメインは、Ｔ細胞中において、各種の非ヒトアンカー及びシグナル伝達タンパク質と相互作用する。このため、一態様において、本発明の遺伝子改変非ヒト動物は、各種の内在性非ヒトアンカー又はシグナル伝達分子、例えば、ＣＤ３分子（例えば、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε）、ζ鎖、Ｌｃｋ、Ｆｙｎ、ＺＡＰ−７０等をリクルートする能力を保持しているヒト化Ｔ細胞受容体を発現している。ＴＣＲ複合体にリクルートされる分子の非限定的な列記は、上記Ｊａｎｅｗａｙ’ｓ  Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙに記載されている。堅牢な免疫応答を進行させ、同応答を可能にする、非ヒト動物におけるＴ細胞発達及びＴ細胞分化プロセスの能力は、少なくとも一部において、内在性マウス座における可変領域の配置及びマウス定常ドメインの維持による場合があることが考えられる。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、非ヒト動物であって、そのゲノム中に、非再配列ヒトＴＣＲα可変領域セグメントを含み、非再配列ヒトＴＣＲα可変領域セグメントが、非ヒトＴＣＲα定常領域遺伝子セグメントに操作可能に連結して、ヒト化ＴＣＲα座をもたらす、非ヒト動物が提供される。一実施形態において、ヒト化ＴＣＲα座は、内在性非ヒトＴＣＲα座以外のゲノム部位に存在する。別の実施形態では、非再配列ヒトＴＣＲα可変領域セグメントは、内在性非ヒトＴＣＲα可変領域セグメントを置き換える一方で、内在性非ヒトＴＣＲα定常領域遺伝子配列を保持している。一実施形態において、非再配列ヒトＴＣＲα可変遺伝子座は、内在性非ヒトＴＣＲα可変遺伝子座を置き換える。いくつかの実施形態では、非再配列ヒトＴＣＲα可変遺伝子座による内在性非ヒトＴＣＲα可変領域遺伝子座の置換えは、ＴＣＲδ可変遺伝子座の欠失又は不活性化を含む。他の実施形態では、非再配列ヒトＴＣＲα遺伝子座による内在性非ヒトＴＣＲα可変領域遺伝子の置換えは、非再配列ヒトＴＣＲδ可変領域セグメントによる内在性ＴＣＲδ可変遺伝子座の置換えを含む。いくつかの実施形態では、動物は、内在性非ヒトＴＣＲβ可変領域及び定常領域遺伝子配列を保持している。このため、動物は、キメラヒト／非ヒト（すなわち、ヒト化）ＴＣＲα鎖及び非ヒトＴＣＲβ鎖を含むＴＣＲを発現している。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、非ヒト動物であって、そのゲノム中に、非再配列ヒトＴＣＲδ可変領域セグメントを含み、非再配列ヒトＴＣＲδ可変領域セグメントが、非ヒトＴＣＲδ定常領域遺伝子配列に操作可能に連結して、ヒト化ＴＣＲδ座をもたらす、非ヒト動物が提供される。一実施形態において、ヒト化ＴＣＲδ座は、内在性非ヒトＴＣＲδ座以外のゲノム部位に存在する。別の実施形態では、非再配列ヒトＴＣＲδ可変領域セグメントは、内在性非ヒトＴＣＲδ可変領域セグメントを置き換える一方で、内在性非ヒトＴＣＲδ定常領域遺伝子配列を保持している。一実施形態において、非再配列ヒトＴＣＲδ可変遺伝子座は、内在性非ヒトＴＣＲδ可変遺伝子座を置き換える。
【０１１６】
他の実施形態では、非ヒト動物であって、そのゲノム中に、非再配列ヒトＴＣＲβ可変領域セグメントを含み、非再配列ヒトＴＣＲβ可変領域セグメントが、非ヒトＴＣＲβ定常領域遺伝子配列に操作可能に連結して、ヒト化ＴＣＲβ座をもたらす、非ヒト動物が提供される。一実施形態において、ヒト化ＴＣＲβ座は、内在性非ヒトＴＣＲβ座以外のゲノム部位に存在する。別の実施形態では、非再配列ヒトＴＣＲβ可変領域セグメントは、内在性非ヒトＴＣＲβ可変領域セグメントを置き換える一方で、内在性非ヒトＴＣＲβ定常領域遺伝子配列を保持している。一実施形態において、非再配列ヒトＴＣＲβ可変遺伝子座は、内在性非ヒトＴＣＲβ可変遺伝子座を置き換える。いくつかの実施形態では、動物は、内在性非ヒトＴＣＲα可変領域及び定常領域遺伝子配列を保持している。このため、動物は、キメラヒト／非ヒト（すなわち、ヒト化）ＴＣＲβ鎖及び非ヒトＴＣＲα鎖を含むＴＣＲを発現している。
【０１１７】
いくつかの特定の実施形態では、本発明は、遺伝子改変非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、マウス又はラット）であって、そのゲノム中に、（ａ）少なくとも１つのヒトＶαセグメント及び少なくとも１つのヒトＪαセグメントを含み、内在性非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、マウス又はラット）ＴＣＲα定常遺伝子配列に操作可能に連結している非再配列Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α可変遺伝子座、（ｂ）少なくとも１つのヒトＶβセグメント、少なくとも１つのヒトＤβセグメント、及び少なくとも１つのヒトＪβセグメントを含み、内在性非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、マウス又はラット）ＴＣＲβ定常領域遺伝子配列に操作可能に連結している非再配列ＴＣＲβ可変遺伝子座、並びに／又は、（ｃ）少なくとも１つのヒトＶδセグメント、少なくとも１つのヒトＤδセグメント、及び少なくとも１つのヒトＪδセグメントを含み、内在性非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、マウス又はラット）ＴＣＲδ定常領域遺伝子配列に操作可能に連結している非再配列ＴＣＲδ可変遺伝子座を含む、遺伝子改変非ヒト動物を提供する。本明細書で提供される別の非ヒト動物は、そのゲノム中に、（ａ）少なくとも１つのヒトＶαセグメント及び少なくとも１つのヒトＪαセグメントを含み、内在性非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、マウス又はラット）ＴＣＲα定常遺伝子配列に操作可能に連結している非再配列Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α可変遺伝子座、（ｂ）少なくとも１つのヒトＶβセグメント、少なくとも１つのヒトＤβセグメント、及び少なくとも１つのヒトＪβセグメントを含み、内在性非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、マウス又はラット）ＴＣＲβ定常領域遺伝子配列に操作可能に連結している非再配列ＴＣＲβ可変遺伝子座、（ｃ）少なくとも１つのヒトＶδセグメント、少なくとも１つのヒトＤδセグメント、及び少なくとも１つのヒトＪδセグメントを含み、内在性非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、マウス又はラット）ＴＣＲδ定常領域遺伝子配列に操作可能に連結している非再配列ＴＣＲδ可変遺伝子座、並びに／又は、（ｄ）少なくとも１つのヒトＶγセグメント及び少なくとも１つのヒトＪγセグメントを含み、内在性非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、マウス又はラット）ＴＣＲγ定常領域遺伝子配列に操作可能に連結している非再配列ＴＣＲγ可変遺伝子座を含む。
【０１１８】
本発明の様々な実施形態において、非再配列ヒト又はヒト化ＴＣＲ可変遺伝子座（例えば、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、及び／又はＴＣＲδ可変遺伝子座）は、非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、マウス又はラット）の生殖細胞系に含まれる。様々な実施形態において、非再配列ヒトＴＣＲ  Ｖ（Ｄ）Ｊセグメント（例えば、Ｖα及びＪα；Ｖβ及びＤβ及びＪβ；Ｖδ及びＤδ及びＪδ；Ｖγ及びＪγセグメント）によるＴＣＲ  Ｖ（Ｄ）Ｊセグメントの置換えは、内在性非ヒトＴＣＲ可変座（又は複数の同可変座）においてである。この場合、非再配列ヒトＶ及びＪ並びに／又はＶ及びＤ及びＪセグメントは、非ヒトＴＣＲ定常領域遺伝子配列に操作可能に連結している。
【０１１９】
本発明のいくつかの実施形態では、非ヒト動物は、非再配列ヒト又はヒト化ＴＣＲα可変遺伝子座の２つのコピー、非再配列ヒト又はヒト化ＴＣＲβ可変遺伝子座の２つのコピー、並びに／又は、非再配列ヒト又はヒト化ＴＣＲδ可変遺伝子座の２つのコピーを含む。このため、非ヒト動物は、１つ又は２つ以上の非再配列ヒト又はヒト化ＴＣＲα、ＴＣＲβ、及び／又はＴＣＲδ可変遺伝子座について、ホモ接合性である。本発明のいくつかの実施形態では、非ヒト動物は、非再配列ヒト又はヒト化ＴＣＲα可変遺伝子座の１つのコピー、非再配列ヒト又はヒト化ＴＣＲβ可変遺伝子座の１つのコピー、並びに／又は、非再配列ヒト又はヒト化ＴＣＲδ可変遺伝子座の１つのコピーを含む。このため、非ヒト動物は、非再配列ヒト又はヒト化ＴＣＲα、ＴＣＲβ、及び／又はＴＣＲδ可変遺伝子座について、ヘテロ接合性である。他の実施形態では、非ヒト動物は、非再配列ヒト又はヒト化ＴＣＲγ可変遺伝子座について、ヘテロ接合性又はホモ接合性である。
【０１２０】
一実施形態において、ヒト可変領域セグメント（例えば、ヒトＶα及びＪαセグメント）を含む非再配列ＴＣＲα可変遺伝子座は、ヒト可変領域セグメントが、対応する非ヒト可変領域セグメントを置き換えるように、非ヒトゲノム中に位置する。一実施形態において、ヒト可変領域セグメントを含む非再配列ＴＣＲα可変遺伝子座は、内在性ＴＣＲα可変遺伝子座を置き換える。一態様において、内在性非ヒトＶα及びＪαセグメントは再配列して、再配列Ｖα／Ｊα配列を形成することができない。このため、一態様において、非再配列ＴＣＲα可変遺伝子座におけるヒトＶα及びＪαセグメントは再配列して、再配列ヒトＶα／Ｊα配列を形成することができる。
【０１２１】
同様に、一実施形態において、ヒト可変領域セグメント（例えば、ヒトＶβ、Ｄβ、及びＪβセグメント）を含む非再配列ＴＣＲβ可変遺伝子座は、ヒト可変領域セグメントが、対応する非ヒト可変領域セグメントを置き換えるように、非ヒトゲノム中に位置する。一実施形態において、ヒト可変領域セグメントを含む非再配列ＴＣＲβ可変遺伝子座は、内在性ＴＣＲβ可変遺伝子座を置き換える。一態様において、内在性非ヒトＶβ、Ｄβ、及びＪβセグメントは再配列して、再配列Ｖβ／Ｄβ／Ｊβ配列を形成することができない。このため、一態様において、非再配列ＴＣＲβ可変遺伝子座におけるヒトＶβ、Ｄβ、及びＪβセグメントは再配列して、再配列ヒトＶβ／Ｄβ／Ｊβ配列を形成することができる。
【０１２２】
一実施形態において、ヒト可変領域セグメント（例えば、ヒトＶδ、Ｄδ、及びＪδセグメント）を含む非再配列ＴＣＲδ可変遺伝子座は、ヒト可変領域セグメントが、対応する非ヒト可変領域セグメントを置き換えるように、非ヒトゲノム中に位置する。一実施形態において、ヒト可変領域セグメントを含む非再配列ＴＣＲδ可変遺伝子座は、内在性ＴＣＲδ可変遺伝子座を置き換える。一態様において、内在性非ヒトＶδ、Ｄδ、及びＪδセグメントは再配列して、再配列Ｖδ／Ｄδ／Ｊδ配列を形成することができない。このため、一態様において、非再配列ＴＣＲδ可変遺伝子座におけるヒトＶδ、Ｄδ、及びＪδセグメントは再配列して、再配列ヒトＶδ／Ｄδ／Ｊδ配列を形成することができる。
【０１２３】
一実施形態において、ヒト可変領域セグメント（例えば、ヒトＶγ及びＪγセグメント）を含む非再配列ＴＣＲγ可変遺伝子座は、ヒト可変領域セグメントが、対応する非ヒト可変領域セグメントを置き換えるように、非ヒトゲノム中に位置する。一実施形態において、ヒト可変領域セグメントを含む非再配列ＴＣＲγ可変遺伝子座は、内在性ＴＣＲγ可変遺伝子座を置き換える。一態様において、内在性非ヒトＶα及びＪαセグメントは再配列して、再配列Ｖγ／Ｊγ配列を形成することができない。このため、一態様において、非再配列ＴＣＲγ可変遺伝子座におけるヒトＶγ及びＪγセグメントは再配列して、再配列ヒトＶγ／Ｊγ配列を形成することができる。
【０１２４】
更に別の実施形態では、ヒト可変領域セグメントを含む非再配列ＴＣＲα、β、δ、及び／又はγ可変遺伝子座は両方とも、各内在性ＴＣＲα、β、δ、及びγ可変遺伝子座を置き換える。一態様において、内在性非ヒトＶα及びＪαセグメントは再配列して、再配列Ｖα／Ｊα配列を形成することができず、内在性非ヒトＶβ、Ｄβ、及びＪβセグメントは再配列して、再配列Ｖβ／Ｄβ／Ｊβ配列を形成することができず、内在性非ヒトＶδ、Ｄδ、及びＪδセグメントは再配列して、再配列Ｖδ／Ｄδ／Ｊδ配列を形成することができず、かつ／又は、内在性非ヒトＶγ及びＪγセグメントは再配列して、再配列Ｖγ／Ｊγ配列を形成することができない。このため、一態様において、非再配列ＴＣＲα可変遺伝子座におけるヒトＶα及びＪαセグメントは再配列して、再配列ヒトＶα／Ｊα配列を形成することができ、非再配列ＴＣＲβ可変遺伝子座におけるヒトＶβ、Ｄβ、及びＪβセグメントは再配列して、再配列ヒトＶβ／Ｄβ／Ｊβ配列を形成することができ、非再配列ＴＣＲδ可変遺伝子座におけるヒトＶδ、Ｄδ、及びＪδセグメントは再配列して、再配列ヒトＶδ／Ｄδ／Ｊδ配列を形成することができ、かつ／又は、非再配列ＴＣＲα可変遺伝子座におけるヒトＶγ及びＪγセグメントは再配列して、再配列ヒトＶγ／Ｊγ配列を形成することができる。
【０１２５】
本発明のいくつかの態様では、ヒト化ＴＣＲα、ＴＣＲβ、及び／又はＴＣＲδ遺伝子座（非再配列ヒトＴＣＲα、ＴＣＲβ、及び／又はＴＣＲδ可変遺伝子座を含む）を含む非ヒト動物は、内在性非ヒトＴＣＲα、ＴＣＲβ、及び／又はＴＣＲδ可変遺伝子座を保持している。一実施形態において、内在性非ヒトＴＣＲα、ＴＣＲβ、及び／又はＴＣＲδ可変遺伝子座は、機能的でない遺伝子座である。一実施形態において、機能的でない遺伝子座は、不活性化された遺伝子座、例えば、反転した遺伝子座である（例えば、可変遺伝子座のコード核酸配列は、定常領域配列に対して、反転した向きにあり、これにより、反転した遺伝子座からの可変領域セグメントを利用して、再配列に成功することができない）。一実施形態において、ヒト化ＴＣＲα、ＴＣＲβ、及び／又はＴＣＲδ可変遺伝子座は、それぞれ、内在性非ヒトＴＣＲα、ＴＣＲβ、及び／又はＴＣＲδ可変遺伝子座と、内在性非ヒトＴＣＲα、ＴＣＲβ、及び／又はＴＣＲδ定常遺伝子座との間に位置している。同様の染色体再配列は、ヒト又は非ヒトＴＣＲγを、非ヒト動物のゲノム内に、例えば、ＴＣＲγ座に配置するために行われてもよい。
【０１２６】
ヒト及びマウスＴＣＲ座のＶ及びＪ並びに／又はＶ、Ｄ、及びＪセグメントの数、命名法、位置、及び他の態様は、国際免疫遺伝情報システム（ＩＭＧＴ）のウェブサイトにおいて利用可能なＩＭＧＴデータベースを使用して確認されてもよい。マウスＴＣＲα可変座は、約１．５メガ塩基対であり、合計１１０個のＶα及び６０個のＪαセグメントを含む。ヒトＴＣＲα可変座は、約１メガ塩基対であり、合計５４個のＶα及び６１個のＪαセグメントを含み、４５個のＶα及び５０個のＪαが、機能的であると考えられる。特に断らない限り、明細書全体を通して言及されるヒトＶ（Ｄ）Ｊセグメント数は、Ｖ（Ｄ）Ｊセグメントの合計数を意味する。本発明の一実施形態において、遺伝子改変非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、マウス又はラット）は、少なくとも１つのヒトＶα及び少なくとも１つのヒトＪαセグメントを含む。一実施形態において、非ヒト動物は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２３、２５、３０、３５、４０、４５、４８、５０、又は最大５４個のヒトＶαセグメントを含むヒト化ＴＣＲα座を含む。いくつかの実施形態では、ヒト化ＴＣＲα座は、２、８、２３、３５、４８、又は５４個のヒトＶαセグメントを含む。このため、いくつかの実施形態では、非ヒト動物におけるヒト化ＴＣＲα座は、ヒトＶαの５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％を含んでもよく、いくつかの実施形態では、ヒトＶαの約２％、約３％、約１５％、約６５％、約９０％、又は１００％を含んでもよい。
【０１２７】
一実施形態において、非ヒト動物は、ヒトＶα４０〜Ｖα４１（Ｖαセグメントは、「ＴＲＡＶ」又は「ＴＣＲＡＶ」とも呼ばれる）の連続的なヒト配列を含むＤＮＡフラグメントと、６１個のヒトＪαセグメント（Ｊαセグメントは、「ＴＲＡＪ」又は「ＴＣＲＡＪ」とも呼ばれる）の連続的なヒト配列を含むＤＮＡフラグメントとを含むヒト化ＴＣＲα座を含む。一実施形態において、非ヒト動物は、ヒトＴＲＡＶ３５〜ＴＲＡＶ４１の連続的なヒト配列を含むＤＮＡフラグメントと、６１個のヒトＴＲＡＪの連続的なヒト配列を含むＤＮＡフラグメントとを含むヒト化ＴＣＲα座を含む。一実施形態において、非ヒト動物は、ヒトＴＲＡＶ２２〜ＴＲＡＶ４１の連続的なヒト配列を含むＤＮＡフラグメントと、６１個のヒトＴＲＡＪの連続的なヒト配列を含むＤＮＡフラグメントとを含むヒト化ＴＣＲα座を含む。一実施形態において、非ヒト動物は、ヒトＴＲＡＶ１３−２〜ＴＲＡＶ４１の連続的なヒト配列を含むＤＮＡフラグメントと、６１個のヒトＴＲＡＪの連続的なヒト配列を含むＤＮＡフラグメントとを含むヒト化ＴＣＲα座を含む。一実施形態において、非ヒト動物は、ヒトＴＲＡＶ６〜ＴＲＡＶ４１及び６１個のヒトＴＲＡＪの連続的なヒト配列を含むＤＮＡフラグメントを含むヒト化ＴＣＲα座を含む。一実施形態において、非ヒト動物は、ヒトＴＲＡＶ１−１〜ＴＲＡＶ４１及び６１個のヒトＴＲＡＪの連続的なヒト配列を含むＤＮＡフラグメントを含むヒト化ＴＣＲα座を含む。様々な実施形態において、ヒトＴＣＲα可変領域セグメントの連続的なヒト配列を含むＤＮＡフラグメントは、制限酵素部位、選択カセット、エンドヌクレアーゼ部位、又は、遺伝子座のヒト化プロセス中にクローニング及び選択を容易にするために挿入される他の部位も含む。様々な実施形態において、これらの更なる部位は、ＴＣＲα座における様々な遺伝子の適切な機能（例えば、再配列、スプライシング等）と干渉しない。
【０１２８】
一実施形態において、ヒト化ＴＣＲα座は、６１個のヒトＪαセグメント又はヒトＪαセグメントの１００％を含む。特定の実施形態では、ヒト化ＴＣＲα座は、８個のヒトＶαセグメントと、６１個のＪαセグメントとを含む。別の特定の実施形態では、ヒト化ＴＣＲα座は、２３個のヒトＶαセグメントと、６１個のＪαセグメントとを含む。別の特定の実施形態では、ヒト化ＴＣＲα座は、ヒトＶα及びＪαセグメントの完全なレパートリ、すなわち、α座によりコードされる全てのヒト可変α領域遺伝子セグメント、又は、５４個のヒトＶα及び６１個のＪαセグメントを含む。様々な実施形態において、非ヒト動物は、内在性非ヒトＶα又はＪαセグメントを、ＴＣＲα座において何ら含まない。
【０１２９】
マウスＴＣＲβ可変座は、約０．６メガ塩基対であり、合計３３個のＶβ、２個のＤβ、及び１４個のＪβセグメントを含む。ヒトＴＣＲβ可変座は、約０．６メガ塩基対であり、合計６７個のＶβ、２個のＤβ、及び１４個のＪβセグメントを含む。本発明の一実施形態において、遺伝子改変非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、マウス又はラット）は、少なくとも１つのヒトＶβ、少なくとも１つのヒトＤβ、及び少なくとも１つのヒトＪαセグメントを含む。一実施形態において、非ヒト動物は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２３、２５、３０、３５、４０、４５、４８、５０、５５、６０、又は最大６７個のヒトＶβセグメントを含むヒト化ＴＣＲβ座を含む。いくつかの実施形態では、ヒト化ＴＣＲβ座は、８、１４、４０、６６、又は６７個のヒトＶβセグメントを含む。このため、いくつかの実施形態では、非ヒト動物におけるヒト化ＴＣＲβ座は、ヒトＶβの５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％を含んでもよく、いくつかの実施形態では、ヒトＶβの約２０％、約６０％、約１５％、約９８％、又は１００％を含んでもよい。
【０１３０】
一実施形態において、非ヒト動物は、ヒトＶβ１８〜Ｖβ２９−１（Ｖβセグメントは、「ＴＲＢＶ」又は「ＴＣＲＢＶ」とも呼ばれる）の連続的なヒト配列を含むＤＮＡフラグメントを含むヒト化ＴＣＲβ座を含む。一実施形態において、非ヒト動物は、ヒトＴＲＢＶ１８〜ＴＲＢＶ２９−１の連続的なヒト配列を含むＤＮＡフラグメントと、ヒトＤβ１−Ｊβ１（すなわち、ヒトＤβ１−Ｊβ１−１−Ｊβ１−６セグメント）の連続的なヒト配列を含む別箇のＤＮＡフラグメントと、ヒトＤβ２−Ｊβ２（すなわち、ヒトＤβ２−Ｊβ２−１−Ｊβ２−７セグメント）の連続的なヒト配列を含む別箇のＤＮＡフラグメントとを含むヒト化ＴＣＲβ座を含む。一実施形態において、非ヒト動物は、ヒトＴＲＢＶ６−５〜ＴＲＢＶ２９−１の連続的なヒト配列を含むＤＮＡフラグメントと、ヒトＤβ１−Ｊβ１（すなわち、ヒトＤβ１−Ｊβ１−１−Ｊβ１−６セグメント）の連続的なヒト配列を含む別箇のＤＮＡフラグメントと、ヒトＤβ２−Ｊβ２（すなわち、ヒトＤβ２−Ｊβ２−１−Ｊβ２−７セグメント）の連続的なヒト配列を含む別箇のＤＮＡフラグメントとを含むヒト化ＴＣＲβ座を含む。一実施形態において、非ヒト動物は、ヒトＴＲＢＶ１〜ＴＲＢＶ２９−１の連続的なヒト配列を含むＤＮＡフラグメントと、ヒトＤβ１−Ｊβ１の連続的なヒト配列を含む別箇のＤＮＡフラグメントと、ヒトＤβ２−Ｊβ２の連続的なヒト配列を含む別箇のＤＮＡフラグメントとを含むヒト化ＴＣＲβ座を含む。一実施形態において、非ヒト動物は、ヒトＴＲＢＶ１〜ＴＲＢＶ２９−１の連続的なヒト配列を含むＤＮＡフラグメントと、ヒトＤβ１−Ｊβ１の連続的なヒト配列を含む別箇のＤＮＡフラグメントと、ヒトＤβ２−Ｊβ２の連続的なヒト配列を含む別箇のＤＮＡフラグメントと、ヒトＴＲＢＶ３０の配列を含む別箇のＤＮＡフラグメントとを含むヒト化ＴＣＲβ座を含む。様々な実施形態において、ヒトＴＣＲβ可変領域セグメントの連続的なヒト配列を含むＤＮＡフラグメントは、制限酵素部位、選択カセット、エンドヌクレアーゼ部位、又は、遺伝子座のヒト化プロセス中にクローニング及び選択を容易にするように挿入される他の部位も含む。様々な実施形態において、これらの更なる部位は、ＴＣＲβ座における様々な遺伝子の適切な機能（例えば、再配列、スプライシング等）と干渉しない。
【０１３１】
一実施形態において、ヒト化ＴＣＲβ座は、１４個のヒトＪβセグメント又はヒトＪβセグメントの１００％、及び、２個のヒトＤβセグメント又はヒトＪβセグメントの１００％を含む。別の実施形態では、ヒト化ＴＣＲβ座は、少なくとも１つのヒトＶβセグメント、例えば、１４個のヒトＶβセグメントと、全てのマウスＤβ及びＪβセグメントとを含む。特定の実施形態では、ヒト化ＴＣＲβ座は、１４個のヒトＶβセグメントと、２個のヒトＤβセグメントと、１４個のＪβセグメントとを含む。別の特定の実施形態では、ヒト化ＴＣＲβ座は、ヒトＶβ、Ｄβ、及びＪβセグメントの完全なレパートリ、すなわち、β座によりコードされる全てのヒト可変β領域遺伝子セグメント、又は、６７個のヒトＶβ、２個のヒトＤβ、及び１４個のＪβセグメントを含む。一実施形態において、非ヒト動物は、１つ（例えば、５’）非ヒトＶβセグメントを、ヒト化ＴＣＲβ座において含む。様々な実施形態において、非ヒト動物は、内在性非ヒトＶβ、Ｄβ、及びＪβセグメントを、ＴＣＲβ座において何ら含まない。
【０１３２】
非ヒト動物（例えば、げっ歯類）が、ヒトＴＣＲα及びＴＣＲβ（及び場合により、ヒトＴＣＲδ及びＴＣＲγ）可変領域セグメントのレパートリ（例えば、可変領域セグメントの完全なレパートリ）を含む様々な実施形態において、様々なセグメントのレパートリ（例えば、様々なセグメントの完全なレパートリ）が、様々な抗原に対するＴＣＲ分子の多様なレパートリを生成するために、動物により利用される。
【０１３３】
様々な態様において、非ヒト動物は、例えば、プロモータ配列、リーダー配列、遺伝子間配列、調節配列等を含む非再配列ヒトゲノム可変座におけるのと同様に配置され、ヒトゲノムＴＣＲ可変座におけるのと同様に配置された、Ｖ、Ｄ、及びＪ又はＤ及びＪ又はＶ及びＪ又はＶセグメントを含むヒトゲノムＴＣＲ可変座の連続的な部分を含む。他の態様では、様々なセグメントは、非再配列非ヒトゲノムＴＣＲ可変座におけるのと同様に配置される。ヒト化ＴＣＲα、β、δ、及び／又はγ座の様々な実施形態において、ヒト化座は、例えば、定常領域に近接するヒトゲノムに位置するヒト可変座のＶセグメントのフラグメントと並置され、ヒト可変座の上流端においてヒトゲノムに位置するヒト可変座のＶセグメントのフラグメントと並置された、ヒトゲノム中に現れない２つ以上のヒトゲノムセグメントを含み得る。
【０１３４】
マウス及びヒトの両方において、ＴＣＲδ遺伝子セグメントは、ＴＣＲα座と共に位置している（図４Ａ上側を参照のこと。四角で囲われたＴＣＲＤ領域）。ＴＣＲδＪ及びＤセグメントは、ＶαセグメントとＪαセグメントとの間に位置している。一方、ＴＣＲδＶセグメントは、ＴＣＲα座全体に広がっており、主に、様々なＶαセグメントの中に位置している。様々なＴＣＲδセグメントの数及び位置は、ＩＭＧＴデータベースから決定され得る。ＴＣＲα座内のＴＣＲδ遺伝子セグメントのゲノム配列のために、ＴＣＲα座における成功した再配列により、ＴＣＲδ遺伝子セグメントが欠失され、又は、不活性化される場合がある。
【０１３５】
本発明のいくつかの実施形態では、非再配列ヒトＴＣＲα可変遺伝子座を含む非ヒト動物は、少なくとも１つのヒトＶδセグメント、例えば、最大で、ヒトＶδセグメントの完全なレパートリも含む。このため、いくつかの実施形態では、内在性ＴＣＲα可変遺伝子座の置換えにより、少なくとも１つの非ヒトＶδセグメントのヒトＶδセグメントによる置換えがもたらされる。他の実施形態では、本発明の非ヒト動物は、ヒトＶδ、Ｄδ、及びＪδセグメントの完全なレパートリを、非再配列ヒト化ＴＣＲα座に含む。更に他の実施形態では、非ヒト動物は、完全な非再配列ヒトＴＣＲδ座を、非再配列ヒト化ＴＣＲα座（すなわち、ヒト可変領域セグメント並びにヒトエンハンサ及び定常領域を含むＴＣＲδ座）に含む。完全な非再配列ＴＣＲδ座を含む非再配列ヒト化ＴＣＲα座を構築するための例示的な実施形態は、参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第９，１１３，６１６号に示されている。
【０１３６】
更に別の実施形態では、本発明の非ヒト動物は、非再配列ヒト化ＴＣＲγ座、例えば、少なくとも１つのヒトＶγ及び少なくとも１つのヒトＪγセグメント（例えば、ヒトＶγ及びヒトＪγ可変領域セグメントの完全なレパートリ）を含むＴＣＲγ座を含む。ヒトＴＣＲγ座は、ヒトの第７番染色体に存在し、一方、マウスヒトＴＣＲγ座は、マウスの第１３番染色体に存在する。ＴＣＲγ座の更なる詳細については、ＩＭＧＴデータベースを参照のこと。
【０１３７】
一態様において、本明細書に記載されたヒト化ＴＣＲα及びβ可変遺伝子座（及び場合により、ヒト化ＴＣＲδ／γ可変遺伝子座）を含む非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、マウス又はラット）は、ヒト可変領域及び非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、マウス又はラット）定常領域を含むヒト化Ｔ細胞受容体を、Ｔ細胞表面上に発現している。いくつかの態様では、非ヒト動物は、各種の提示された抗原を認識するヒト化Ｔ細胞受容体の多様なレパートリを発現することができる。
【０１３８】
本発明の様々な実施形態において、本明細書に記載されたヒト化Ｔ細胞受容体ポリペプチドは、ヒトリーダー配列を含む。代替的な実施形態では、ヒト化ＴＣＲ受容体の核酸配列は、ヒト化ＴＣＲポリペプチドが非ヒトリーダー配列を含むように操作される。
【０１３９】
本明細書で記載されるヒト化ＴＣＲポリペプチドは、内在性非ヒト調節エレメント（例えば、げっ歯類の調節エレメント）、例えば、プロモータ、サイレンサ、エンハンサ等の制御下において発現されてもよい。本明細書で記載されるヒト化ＴＣＲポリペプチドは、ヒト調節エレメントの制御下において、代替的に発現されてもよい。様々な実施形態において、本明細書に記載された非ヒト動物は、ヒトゲノム中にｉｎ  ｓｉｔｕにおいて、通常見出される全ての調節配列及び他の配列を更に含む。
【０１４０】
様々な実施形態において、ヒト化ＴＣＲタンパク質のヒト可変領域は、同じ細胞又は別の細胞の表面上の種々のタンパク質と相互作用することができる。一実施形態において、ヒト化ＴＣＲのヒト可変領域は、第２の細胞、例えば、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上に抗原を提示するＭＨＣタンパク質（例えば、ＭＨＣクラスＩ又はＩＩタンパク質）と相互作用する。いくつかの実施形態では、ＭＨＣ  Ｉ又はＩＩタンパク質は、非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、マウス又はラット）タンパク質である。他の実施形態では、ＭＨＣ  Ｉ又はＩＩタンパク質は、ヒト（化）タンパク質である。一態様において、第２の細胞、例えば、ＡＰＣは、ヒト又はヒト化ＭＨＣ分子を発現している内在性非ヒト細胞である。種々の実施形態では、第２の細胞は、ヒトＭＨＣ分子を発現しているヒト細胞である。
【０１４１】
一態様において、非ヒト動物は、非ヒト定常領域を有するヒト化ＴＣＲ細胞受容体を、Ｔ細胞の表面上に発現しており、受容体は、Ｔ細胞において発現された非ヒト分子、例えば、アンカー又はシグナル伝達分子（例えば、ＣＤ３分子、ζ鎖、又はＴＣＲにＣＤ３分子若しくはζ鎖によりアンカーする他のタンパク質）と相互作用することができる。このため、一態様において、（ａ）（ｉ）本明細書で記載されるヒト化ＴＣＲα鎖及び本明細書で記載されるヒト化ＴＣＲβ鎖を含むＴＣＲ、並びに、（ｉｉ）本明細書で記載されるキメラ共受容体を発現している非ヒトＴ細胞と、（ｂ）本明細書で記載されるキメラＭＨＣ  Ｉ及び／又はキメラＭＨＣ  ＩＩに結合した抗原を含む非ヒト抗原提示細胞とを含む、細胞複合体が提供される。一実施形態において、非ヒト定常ＴＣＲα及びＴＣＲβ鎖は、非ヒトゼータ（ζ）鎖ホモ二量体及びＣＤ３ヘテロ二量体と複合体化される。一実施形態において、細胞複合体は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞複合体である。一実施形態において、細胞複合体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞複合体である。
【０１４２】
様々な実施形態において、本明細書で記載される非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、マウス又はラット）は、胸腺発達を受けて、ＤＮ１〜ＤＮ２〜ＤＮ３〜ＤＮ４〜ＤＰ、そして、〜ＣＤ４又はＣＤ８  ＳＰ  Ｔ細胞に進行することができるＴ細胞を生じる。本発明の非ヒト動物のこのようなＴ細胞は、胸腺発達の特定の段階の間にＴ細胞により典型的に生成される細胞表面分子（例えば、ＣＤ２５、ＣＤ４４、Ｋｉｔ、ＣＤ３、ｐＴα等）を発現している。このため、一実施態様において、本明細書で記載される非ヒト動物は、胸腺発達のＤＮ３段階において、ＴＣＲβと複合体化されるｐＴαを発現してもよい。本明細書で記載される非ヒト動物は、胸腺発達を受けて、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔ細胞を生じさせることができるＴ細胞を生じる。
【０１４３】
様々な実施形態において、本明細書で記載される非ヒト動物は、末梢においてＴ細胞分化を受けることができるＴ細胞を生じる。いくつかの実施形態では、本明細書で記載される非ヒト動物は、エフェクターＴ細胞、例えば、ＣＴＬ（細胞傷害性Ｔリンパ球）、ＴＨ１、ＴＨ２、ＴＲＥＧ、ＴＨ１７等を生じることができる。このため、これらの実施形態では、本明細書で記載される非ヒト動物は、特定のＴ細胞種に典型的な種々の機能を満たす、例えば、外来抗原を認識し、同抗原に結合し、応答するエフェクターＴ細胞を生じる。様々な実施形態において、本明細書で記載される非ヒト動物は、ＭＨＣ  Ｉ分子に関して発現されるサイトゾル病原体のペプチドフラグメントを提示している細胞を殺傷し、細胞内小胞中で分解され、マクロファージの表面上のＭＨＣ  ＩＩ分子により提示される抗原由来のペプチドを認識し、マクロファージが微生物を殺傷するように誘引し、Ｂ細胞分化を駆動させるサイトカインを生成し、オプソンニン化抗体を生成するようにＢ細胞を活性化させ、上皮細胞が感染部位に好中球をリクルートするケモカインを生成するように誘引する；等を行うエフェクターＴ細胞を生じる。
【０１４４】
更なる実施形態では、本明細書で記載される非ヒト動物は、末梢において、例えば、脾臓において、ＣＤ３＋  Ｔ細胞を含む。他の態様では、本明細書で記載される非ヒト動物は、対象となる抗原に対する応答において、メモリＴ細胞の集団を生じることができる。例えば、非ヒト動物は、抗原、例えば、対象となる抗原（例えば、ワクチン開発のために試験される抗原等）に対する、セントラルメモリＴ細胞（Ｔｃｍ）及びエフェクターメモリＴ細胞（Ｔｅｍ）の両方を生じる。
【０１４５】
十分なシグナル（例えば、ノッチシグナル）を受容しないＤＮ１及びＤＮ２細胞は、Ｂ細胞、骨髄細胞（例えば、樹状細胞）、マスト細胞、及びＮＫ細胞に発達する場合がある。例えば、Ｙａｓｈｉｒｏ−Ｏｈｔａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｎｏｔｃｈ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅａｒｌｙ  ｔｈｙｍｏｃｙｔｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２２：２６１〜６９を参照のこと。いくつかの実施形態では、本明細書で記載される非ヒト動物は、Ｂ細胞、骨髄細胞（例えば、樹状細胞）、マスト細胞、及びＮＫ細胞を発達させる。いくつかの実施形態では、本明細書で記載される非ヒト動物は、胸腺において、樹状細胞集団を発達させる。
【０１４６】
Ｔ細胞の表面上に発現されるＴ細胞受容体の優勢種は、ＴＣＲα／βであり、ＴＣＲδ／γを発現している細胞は少数である。本発明のいくつかの実施形態では、ヒト化ＴＣＲα及び／又はβ座を含む非ヒト動物のＴ細胞は、ＴＣＲα／β及びＴＣＲδ／γ座の利用、例えば、野生型動物に類似するＴＣＲα／β及びＴＣＲδ／γ座の利用を示す（例えば、本明細書で記載される非ヒト動物のＴ細胞は、ＴＣＲα／β及びＴＣＲδ／γタンパク質を、野生型動物により発現されたものと同等の割合で発現する）。このため、いくつかの実施形態では、ヒト化ＴＣＲα／β及び内在性非ヒトＴＣＲδ／γ座を含む非ヒト動物は、全ての遺伝子座の利用を示す。
ヒト又はヒト化ＭＨＣ分子
【０１４７】
様々な実施形態において、本明細書では、遺伝子改変非ヒト動物であって、少なくとも１つのヒト化Ｔ細胞共受容体、ヒト化共受容体と会合する少なくとも１つのヒト化ＭＨＣ、及び場合により、ヒト化ＴＣＲを共発現し、ヒト化ＭＨＣにより提示されたペプチドを認識し、同ペプチドを結合することに基づいて、ヒト化共受容体と共に、ヒト化ＴＣＲ及びキメラＴ細胞共受容体ポリペプチドを発現する細胞に、活性化シグナルを提供する、遺伝子改変非ヒト動物が提供される。したがって、本明細書で開示される非ヒト動物は、第１、第２、及び／又は第３の核酸配列のうちの少なくとも１つを含み、それらはそれぞれ、ヒト又はヒト化ＭＨＣ  ＩＩαポリペプチド、ヒト又はヒト化ＭＨＣ  ＩＩβポリペプチド、及びヒト又はヒト化ＭＨＣ  Ｉαポリペプチドからなる群から選択される、種々のヒト又はヒト化ＭＨＣポリペプチドをコードする。非ヒト動物は、場合により、ヒト又はヒト化β２ミクログロブリンも含む。本明細書において、第１、第２、及び第３の指定の使用は、本明細書で開示される非ヒト動物が、３つ全ての核酸配列を必要とするものであるかのように、限定して解釈されるべきではなく、又は、ヒト又はヒト化ＭＨＣポリペプチドのいずれかの存在を任意の特定の順序に限定するものと解釈されるべきではない。
【０１４８】
したがって、いくつかの実施形態では、本明細書で開示される非ヒト動物は、例えば、ヒト又はキメラＣＤ８αポリペプチド及びヒト又はキメラＣＤ８βポリペプチドをコードする第１及び第２のヌクレオチド配列、少なくとも１つのヒトＶαセグメント及び少なくとも１つのヒトＪαセグメントを含み、非ヒトＴＣＲα定常遺伝子配列に操作可能に連結している非再配列Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α可変遺伝子座、及び／又は、少なくとも１つのヒトＶβセグメント、少なくとも１つのヒトＤβセグメント、及び少なくとも１つのヒトＪβセグメントを含み、非ヒトＴＣＲβ定常遺伝子配列に操作可能に連結している非再配列ＴＣＲβ可変遺伝子座、並びに場合により、例えば、ヒト又はヒト化ＭＨＣ  Ｉαポリペプチド及びヒト又はヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードする第１及び第２の核酸配列を含んでもよい。他の実施形態では、本明細書で開示される非ヒト動物は、例えば、キメラＣＤ４ポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列、少なくとも１つのヒトＶαセグメント及び少なくとも１つのヒトＪαセグメントを含み、非ヒトＴＣＲα定常遺伝子配列に操作可能に連結している非再配列Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α可変遺伝子座、及び／又は、少なくとも１つのヒトＶβセグメント、少なくとも１つのヒトＤβセグメント、及び少なくとも１つのヒトＪβセグメントを含み、非ヒトＴＣＲβ定常遺伝子配列に操作可能に連結している非再配列ＴＣＲβ可変遺伝子座、並びに場合により、例えば、ヒト又はヒト化ＭＨＣ  ＩＩαポリペプチド及びヒト又はヒト化ＭＨＣ  ＩＩβポリペプチドをコードする第１及び第２の核酸配列を含んでもよい。いくつかの実施形態では、本明細書で開示される非ヒト動物は、例えば、キメラＣＤ４ポリペプチド、キメラＣＤ８αポリペプチド、及びキメラＣＤ８βポリペプチドをコードする第１、第２、及び第３のヌクレオチド配列、少なくとも１つのヒトＶαセグメント及び少なくとも１つのヒトＪαセグメントを含み、非ヒトＴＣＲα定常遺伝子配列に操作可能に連結している非再配列Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α可変遺伝子座、及び／又は、少なくとも１つのヒトＶβセグメント、少なくとも１つのヒトＤβセグメント、及び少なくとも１つのヒトＪβセグメントを含み、非ヒトＴＣＲβ定常遺伝子配列に操作可能に連結している非再配列ＴＣＲβ可変遺伝子座、並びに場合により、例えば、ヒト又はヒト化ＭＨＣ  ＩＩαポリペプチド、ヒト又はヒト化ＭＨＣ  ＩＩβポリペプチド、ヒト又はヒト化ＭＨＣ  Ｉαポリペプチド、及びヒト又はヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードする第１、第２、第３、及び第４の核酸配列を含んでもよい。
【０１４９】
様々な実施形態において、本明細書では、遺伝子改変非ヒト動物、例えば、げっ歯類（例えば、マウス又はラット）であって、そのゲノム中に、ヒト又はヒト化ＭＨＣ  Ｉポリペプチドをコードする核酸配列、及び／又は、ヒト又はヒト化ＭＨＣ  ＩＩタンパク質をコードする核酸配列を含む、遺伝子改変非ヒト動物が提供される。ＭＨＣ  Ｉ核酸配列は、部分的にヒト及び部分的に非ヒト、例えば、キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  ＩポリペプチドであるＭＨＣ  Ｉポリペプチドをコードしてもよい。ＭＨＣ  ＩＩ核酸配列は、部分的にヒト及び部分的に非ヒト、例えば、キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  ＩＩタンパク質であるＭＨＣ  ＩＩタンパク質（例えば、キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  ＩＩα及びβポリペプチドを含む）をコードしてもよい。いくつかの態様では、動物は、内在性ＭＨＣ  Ｉ及び／又は内在性ＭＨＣ  ＩＩポリペプチド、例えば、機能的な内在性ＭＨＣ  Ｉ及び／又はＭＨＣ  ＩＩポリペプチドを、細胞表面上に発現していない。いくつかの実施形態では、動物の細胞表面上に発現されたＭＨＣ  Ｉ及び／又はＭＨＣ  ＩＩ分子は、キメラＭＨＣ  Ｉ及び／又はＭＨＣ  ＩＩ分子のみである。
【０１５０】
ゲノム中に、例えば、内在性座において、キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドをコードする核酸配列を含む遺伝子改変非ヒト動物が、米国特許出願公開第２０１３０１１１６１７号及び同第２０１３０１８５８１９号に開示されている。同公報は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。ゲノム中に、例えば、内在性座において、ヒト化、例えば、キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  ＩＩポリペプチドをコードする核酸配列を含む遺伝子改変非ヒト動物が、米国特許第８，８４７，００５号及び米国特許出願公開第２０１３０１８５８２０号に開示されている。同公報はそれぞれ、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。ゲノム中に、例えば、内在性座において、キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドをコードする核酸配列を含み、かつ、ゲノム中に、例えば、内在性座において、ヒト化、例えば、キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  ＩＩポリペプチドをコードする核酸配列を含む遺伝子改変非ヒト動物が、米国特許出願公開第２０１４０２４５４６７号に開示されている。同公報は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１５１】
様々な実施形態において、本明細書では、遺伝子改変非ヒト動物であって、そのゲノム中に、例えば、１つ又は２つ以上の内在性ＭＨＣ座において、キメラヒト／非ヒトＭＨＣ
Ｉポリペプチドをコードする第１の核酸配列であって、キメラＭＨＣ  Ｉポリペプチドのヒト部分が、ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドの細胞外部分（又はその一部、例えば、１つ又は２つ以上の細胞外ドメイン）を含む、第１の核酸配列、キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  ＩＩαポリペプチドをコードする第２の核酸配列であって、キメラＭＨＣ  ＩＩαポリペプチドのヒト部分が、ヒトＭＨＣ  ＩＩαポリペプチドの細胞外部分（又はその一部、例えば、１つ又は２つ以上の細胞外ドメイン）を含む、第２の核酸配列、並びに／又は、キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  ＩＩβポリペプチドをコードする第３の核酸配列であって、キメラＭＨＣ  ＩＩβポリペプチドのヒト部分が、ヒトＭＨＣ  ＩＩβポリペプチドの細胞外部分（又はその一部、例えば、１つ又は２つ以上の細胞外ドメイン）を含む、第３の核酸配列を含み、非ヒト動物が、その内在性非ヒトＭＨＣ座から、機能的なキメラヒト／非ヒトＭＨＣ  Ｉ及びＭＨＣ  ＩＩタンパク質を発現している、遺伝子改変非ヒト動物が提供される。一実施形態において、第１、第２、及び／又は第３の核酸配列はそれぞれ、内在性非ヒトＭＨＣ  Ｉ、ＭＨＣ  ＩＩα、及びＭＨＣ  ＩＩβ座に位置している。一実施形態において、非ヒト動物は、マウスであり、第１、第２、及び／又は第３の核酸配列は、マウス第１７番染色体における内在性マウスＭＨＣ座に位置する。一実施形態において、第１の核酸配列は、内在性非ヒトＭＨＣ  Ｉ座に位置している。一実施形態において、第２の核酸配列は、内在性非ヒトＭＨＣ  ＩＩα座に位置している。一実施形態において、第３の核酸配列は、内在性非ヒトＭＨＣ  ＩＩβ座に位置している。
【０１５２】
一実施形態において、非ヒト動物は、キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  Ｉ、ＭＨＣ  ＩＩα、及び／又はＭＨＣ  ＩＩβポリペプチドのみを発現しており、内在性非ヒトＭＨＣ座から、内在性非ヒトＭＨＣポリペプチド（例えば、機能的な内在性ＭＨＣ  Ｉ、ＩＩα、及び／又はＩＩβポリペプチド）を発現していない。一実施形態において、本明細書で記載される動物は、その細胞、例えば、抗原提示細胞等の表面上に、機能的なキメラＭＨＣ  Ｉ及び機能的なキメラＭＨＣ  ＩＩを発現している。一実施形態において、動物により細胞表面上に発現されたＭＨＣ  Ｉ及びＭＨＣ  ＩＩは、キメラＭＨＣ  Ｉ及びキメラＭＨＣ  ＩＩのみであり、動物は、細胞表面上に、内在性ＭＨＣ  Ｉ及びＭＨＣ  ＩＩを何ら発現していない。
【０１５３】
一実施形態において、キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドは、そのヒト部分において、例えば、ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドのペプチド結合クレフトを含む。一態様において、キメラポリペプチドのヒト部分は、ヒトＭＨＣ  Ｉの細胞外部分を含む。この実施形態では、キメラポリペプチドのヒト部分は、ヒトＭＨＣ  Ｉのα鎖の細胞外ドメインを含む。一実施形態において、キメラポリペプチドのヒト部分は、ヒトＭＨＣ  Ｉのα１及びα２ドメインを含む。別の実施形態では、キメラポリペプチドのヒト部分は、ヒトＭＨＣ  Ｉのα１、α２、及びα３ドメインを含む。
【０１５４】
一態様において、キメラＭＨＣ  ＩＩαポリペプチドのヒト部分及び／又はキメラＭＨＣ  ＩＩβポリペプチドのヒト部分は、ヒトＭＨＣ  ＩＩαポリペプチド及び／又はヒトＭＨＣ  ＩＩβポリペプチドのペプチド結合ドメインをそれぞれ含む。一態様において、キメラＭＨＣ  ＩＩα及び／又はβポリペプチドのヒト部分は、ヒトＭＨＣ  ＩＩα及び／又はβポリペプチドの細胞外部分をそれぞれ含む。一実施形態において、キメラＭＨＣ
ＩＩαポリペプチドのヒト部分は、ヒトＭＨＣ  ＩＩαポリペプチドのα１ドメインを含む。別の実施形態では、キメラＭＨＣ  ＩＩαポリペプチドのヒト部分は、ヒトＭＨＣ
ＩＩαポリペプチドのα１及びα２ドメインを含む。更なる実施形態では、キメラＭＨＣ  ＩＩβポリペプチドのヒト部分は、ヒトＭＨＣ  ＩＩβポリペプチドのβ１ドメインを含む。別の実施形態では、キメラＭＨＣ  ＩＩβポリペプチドのヒト部分は、ヒトＭＨＣ  ＩＩβポリペプチドのβ１及びβ２ドメインを含む。
【０１５５】
いくつかの実施形態では、ヒト又はヒト化ＭＨＣ  Ｉポリペプチドは、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｆ、又はＨＬＡ−Ｇ座のいずれかによりコードされる機能的なヒトＨＬＡ分子に由来していてもよい。ヒト又はヒト化ＭＨＣ  ＩＩポリペプチドは、ＨＬＡ−ＤＰ、−ＤＱ、及び−ＤＲ座のいずれかによりコードされる機能的なヒトＨＬＡ分子に由来していてもよい。一般的に使用されるＨＬＡ抗原及びアレルの列記は、参照により本明細書に組み込まれている、Ｓｈａｎｋａｒｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．（（２００４）Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ（ＨＬＡ）Ｓｙｓｔｅｍ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．４（２）：９１〜１０３）に記載されている。Ｓｈａｎｋａｒｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．には、当該技術分野に使用されるＨＬＡの専門用語の簡単な説明も示されている。ＨＬＡの専門用語及び様々なＨＬＡアレルに関する更なる情報は、Ｈｏｌｄｓｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｔｈｅ  ＨＬＡ  ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ２００８：ａ  ｓｕｍｍａｒｙ  ｏｆ  ＨＬＡ−Ａ，−Ｂ，−Ｃ，−ＤＲＢ１／３／４／５，ａｎｄ  ＤＱＢ１  ａｌｌｅｌｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ＨＬＡ−Ａ，−Ｂ，−Ｃ，−ＤＲ，ａｎｄ  −ＤＱ  ａｎｔｉｇｅｎｓ，Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  ７３：９５〜１７０及びＭａｒｓｈ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ｆｏｒ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＨＬＡ  ｓｙｓｔｅｍ，２０１０，Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  ７５：２９１〜４５５による最近の更新に見出すことができる。両文献とも、参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、ＭＨＣ  Ｉ又はＭＨＣ  ＩＩポリペプチドは、任意の機能的なヒトＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤＲ、又はＤＱ分子に由来していてもよい。このため、ヒト又はヒト化ＭＨＣ  Ｉ及び／又はＩＩポリペプチドは、本明細書で記載される任意の機能的なヒトＨＬＡ分子に由来していてもよい。いくつかの実施形態では、細胞表面上に発現される全てのＭＨＣ  Ｉ及び／又はＭＨＣ  ＩＩポリペプチドは、ヒトＨＬＡ分子に由来する部分を含む。
【０１５６】
数多くのヒトの疾患、例えば、ヒト自己免疫疾患に関連することが公知の特定の多型ＨＬＡアレルであるヒトＨＬＡ分子が、特に興味深い。実際に、関節リウマチ、Ｉ型糖尿病、橋本甲状腺病、多発性硬化症、重症筋無力症、グレーブス病、全身性エリテマトーデス、セリアック病、クローン病、潰瘍性大腸炎、及び他の自己免疫疾患の進行に関連する、ＨＬＡ座における特定の多型が特定されている。例えば、Ｗｏｎｇ  ａｎｄ  Ｗｅｎ（２００４）Ｗｈａｔ  ｃａｎ  ｔｈｅ  ＨＬＡ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｏｕｓｅ  ｔｅｌｌ  ｕｓ  ａｂｏｕｔ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｄｉａｂｅｔｅｓ？，Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  ４７：１４７６〜８７；Ｔａｎｅｊａ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ（１９９８）ＨＬＡ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｍｉｃｅ  ａｓ  Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  Ｍｏｕｓｅ  Ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０１：９２１〜２６；Ｂａｋｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００６），Ａ  ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＨＬＡ  ａｎｄ  ＳＮＰ  ｈａｐｌｏｔｙｐｅ  ｍａｐ  ｆｏｒ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅｘｔｅｎｄｅｄ  ｈｕｍａｎ  ＭＨＣ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３８：１１６６〜７２及び補足情報；並びに、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＭＨＣ  ａｎｄ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｎｅｔｗｏｒｋ（２００９）Ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｆ
ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｖａｒｉａｎｔｓ  ｗｉｔｈｉｎ
ｔｈｅ  ＭＨＣ  ｒｅｇｉｏｎ  ｆｏｒ  ７  ｉｍｍｕｎｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０６：１８６８０〜８５を参照のこと。このため、ヒト又はヒト化ＭＨＣ  Ｉ及び／又はＩＩポリプチドは、特定の疾患、例えば、自己免疫疾患に関連することが公知のヒトＨＬＡ分子に由来していてもよい。
【０１５７】
１つの具体的な態様では、ヒト又はヒト化ＭＨＣ  Ｉポリプチドは、ＨＬＡ−Ａに由来する。特定の実施形態では、ＨＬＡ−Ａポリペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２ポリペプチド（例えば、及びＨＬＡ−Ａ２．１ポリペプチド）である。一実施形態において、ＨＬＡ−Ａポリペプチドは、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１アレル、例えば、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１：０１：０１アレルによりコードされるポリペプチドである。ＨＬＡ−Ａ＊０２０１アレルは、北米人集団の間で一般的に使用される。本実施例では、この特定のＨＬＡ配列が記載されているが、任意の適切なＨＬＡ−Ａ配列、例えば、ヒト集団に示されるＨＬＡ−Ａ２の多型変異体、１つ又は２つ以上の保存的又は非保存的なアミノ酸改変を含む配列、遺伝情報の縮重によって本明細書で記載される配列とは異なる核酸配列等が、本明細書に包含される。
【０１５８】
別の具体的な態様では、キメラＭＨＣ  Ｉポリペプチドのヒト部分は、ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−Ｃから選択されるヒトＭＨＣ  Ｉに由来する。一態様において、ヒト部分は、ＨＬＡ−Ｂ、例えば、ＨＬＡ−Ｂ２７に由来する。別の態様では、ヒト部分は、ＨＬＡ−Ａ３、−Ｂ７、−Ｃｗ６等に由来する。
【０１５９】
１つの具体的な態様では、本明細書に記載されたヒト化ＭＨＣ  ＩＩα及びβポリペプチドのヒト部分は、ＨＬＡ−ＤＲ、例えば、ＨＬＡ−ＤＲ２から得られる。典型的には、ＨＬＡ−ＤＲα鎖は、単形性であり、例えば、ＨＬＡ−ＤＲ複合体のα鎖は、ＨＬＡ−ＤＲＡ遺伝子（例えば、ＨＬＡ−ＤＲα＊０１遺伝子）によりコードされる。一方、ＨＬＡ−ＤＲβ鎖は多形性である。このため、ＨＬＡ−ＤＲ２は、ＨＬＡ−ＤＲＡ遺伝子によりコードされるα鎖とＨＬＡ−ＤＲ１β＊１５０１遺伝子によりコードされるβ鎖とを含む。本実施例には、これらの特定のＨＬＡ配列が記載されているが、任意の適切なＨＬＡ−ＤＲ配列、例えば、ヒト集団に示される多型変異体、１つ又は２つ以上の保存的又は非保存的なアミノ酸改変を含む配列、遺伝情報の縮重によって本明細書に記載された配列とは異なる核酸配列等が、本明細書に包含される。
【０１６０】
キメラＭＨＣＩＩα及び／又はβポリペプチドのヒト部分は、一般的なヒトの疾患に関連することが公知のＨＬＡアレルの核酸配列によりコードされてもよい。このようなＨＬＡアレルは、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０１、−ＤＲＢ１＊０３０１、−ＤＱＡ１＊０５０１、−ＤＱＢ１＊０２０１、ＤＲＢ１＊１５０１、−ＤＲＢ１＊１５０２、−ＤＱＢ１＊０６０２、−ＤＱＡ１＊０１０２、−ＤＱＡ１＊０２０１、−ＤＱＢ１＊０２０２、−ＤＱＡ１＊０５０１、及びそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。ＨＬＡアレル／疾患関連性の概要については、参照により本明細書に組み込まれている、上記Ｂａｋｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）を参照のこと。
【０１６１】
一態様において、キメラヒト／非ヒトＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩα、及び／又はＭＨＣＩＩβポリペプチドの非ヒト部分は、内在性非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、マウス、ラット等）ＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩα、及び／又はＭＨＣＩＩβポリペプチドの膜貫通ドメイン及び／又は細胞質ドメインをそれぞれ含む。このため、キメラヒト／非ヒトＭＨＣＩポリペプチドの非ヒト部分は、内在性非ヒトＭＨＣＩポリペプチドの膜貫通ドメイン及び／又は細胞質ドメインを含んでもよい。キメラＭＨＣＩＩαポリペプチドの非ヒト部分は、内在性非ヒトＭＨＣＩＩαポリペプチドの膜貫通ドメイン及び／又は細胞質ドメインを含んでもよい。キメラヒト／非ヒトＭＨＣＩＩβポリペプチドの非ヒト部分は、内在性非ヒトＭＨＣＩＩβポリペプチドの膜貫通ドメイン及び／又は細胞質ドメインを含んでもよい。一態様において、非ヒト動物は、マウスであり、キメラＭＨＣＩポリペプチドの非ヒト部分は、マウスＨ−２Ｋタンパク質から得られる。一態様において、動物は、マウスであり、キメラＭＨＣＩＩα及びβポリペプチドの非ヒト部分は、マウスＨ−２Ｅタンパク質から得られる。このため、キメラＭＨＣＩポリペプチドの非ヒト部分は、マウスＨ−２Ｋから得られる膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを含んでもよく、キメラＭＨＣＩＩα及びβポリペプチドの非ヒト部分は、マウスＨ−２Ｅタンパク質から得られる膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを含んでもよい。特定のＨ−２Ｋ及びＨ−２Ｅ配列が実施例において企図されているが、任意の適切な配列、例えば、多型変異体、保存的／非保存的アミノ酸置換等が本明細書に包含されている。一態様において、非ヒト動物は、マウスであり、マウスは、そのＨ−２Ｄ座から、機能的な内在性ＭＨＣポリペプチドを発現していない。いくつかの実施形態では、マウスは、内在性Ｈ−２Ｄ座の全て又は一部を欠くように操作されている。他の態様では、マウスは、機能的な内在性マウスＭＨＣＩ及びＭＨＣＩＩを、細胞表面上に何ら発現していない。
【０１６２】
キメラヒト／非ヒトポリペプチドは、ヒト又は非ヒトリーダー（シグナル）配列を含むようにであってもよい。一実施形態において、キメラＭＨＣＩポリペプチドは、内在性ＭＨＣＩポリペプチドの非ヒトリーダー配列を含む。一実施形態において、キメラＭＨＣＩＩαポリペプチドは、内在性ＭＨＣＩＩαポリペプチドの非ヒトリーダー配列を含む。一実施形態において、キメラＭＨＣＩＩβポリペプチドは、内在性ＭＨＣＩＩβポリペプチドの非ヒトリーダー配列を含む。代替的な実施形態では、キメラＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩα、及び／又はＭＨＣＩＩβポリペプチドは、別の非ヒト動物、例えば、別のげっ歯類又は別のマウス系統からの、ＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩα、及び／又はＭＨＣＩＩβポリペプチドそれぞれの非ヒトリーダー配列を含む。このため、キメラＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩα、及び／又はＭＨＣＩＩβポリペプチドをコードする核酸配列は、非ヒトＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩα、及び／又はＭＨＣＩＩβリーダー配列をそれぞれコードする核酸配列に操作可能に連結していてもよい。更に別の実施形態では、キメラＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩα、及び／又はＭＨＣＩＩβポリペプチドは、ヒトＭＨＣＩ、ヒトＭＨＣＩＩα、及び／又はヒトＭＨＣＩＩβポリペプチドそれぞれのヒトリーダー配列（例えば、ヒトＨＬＡ−Ａ２、ヒトＨＬＡ−ＤＲα、及び／又はヒトＨＬＡ−ＤＲβ１＊１５０１それぞれのリーダー配列）を含む。
【０１６３】
キメラヒト／非ヒトＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩα、及び／又はＭＨＣＩＩβポリペプチドは、そのヒト部分において、ヒトＭＨＣＩ、ヒトＭＨＣＩＩα、及び／又はヒトＭＨＣＩＩβポリペプチドそれぞれの完全な又は実質的に完全な細胞外ドメインを含んでもよい。このため、ヒト部分は、ヒトＭＨＣＩ、ヒトＭＨＣＩＩα、及び／又はヒトＭＨＣＩＩβポリペプチド（例えば、ヒトＨＬＡ−Ａ２、ヒトＨＬＡ−ＤＲα、及び／又はヒトＨＬＡ−ＤＲβ１＊１５０１）の細胞外ドメインをコードするアミノ酸配列の少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも８５％、より好ましくは、少なくとも９０％、例えば、９５％以上を含んでもよい。一例において、ヒトＭＨＣＩ、ヒトＭＨＣＩＩα、及び／又はヒトＭＨＣＩＩβポリペプチドの実質的に完全な細胞外ドメインは、ヒトリーダー配列を欠いている。別の例では、キメラヒト／非ヒトＭＨＣＩ、キメラヒト／非ヒトＭＨＣＩＩα、及び／又はキメラヒト／非ヒトＭＨＣＩＩβポリペプチドは、ヒトリーダー配列を含む。
【０１６４】
更に、キメラＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩα、及び／又はＭＨＣＩＩβポリペプチドは、内在性非ヒトプロモータ及び調節エレメント、例えば、マウスＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩα、及び／又はＭＨＣＩＩβ調節エレメントそれぞれに操作可能に連結していてもよい（例えば、これらの調節エレメントの調節制御下で発現されてもよい）。このような配置は、非ヒト動物における、例えば、非ヒト動物における免疫応答中における、キメラＭＨＣＩ及び／又はＭＨＣＩＩポリペプチドの適切な発現を容易にするであろう。
【０１６５】
更なる実施形態では、本発明の非ヒト動物、例えば、げっ歯類、例えば、マウスは、（例えば、内在性β２ミクログロブリン座において）ヒト又はヒト化β２ミクログロブリンをコードする核酸配列を含む。ＭＨＣクラスＩ複合体のβ２ミクログロブリン又は軽鎖（「β２Ｍ」とも省略される）は、小型（１２ｋＤａ）の非グリコシル化タンパク質である。同タンパク質は、ＭＨＣＩα鎖を安定化するのに主に機能する。ヒト又はヒト化β２ミクログロブリン動物の発生は、米国特許出願公開第２０１３０１１１６１７号に詳細に記載されており、同公報は、参照により本明細書に組み込まれている。
【０１６６】
ヒト又はヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子全体に対応する核酸残基を含んでもよい。あるいは、ヌクレオチド配列は、ヒトβ２ミクログロブリンタンパク質のアミノ酸２１〜１１９に示されるアミノ酸配列（すなわち、成熟ヒトβ２ミクログロブリンに対応するアミノ酸残基）をコードする核酸残基を含んでもよい。代替的な実施形態では、ヌクレオチド配列は、ヒトβ２ミクログロブリンタンパク質のアミノ酸２３〜１１５に示されるアミノ酸配列、例えば、ヒトβ２ミクログロブリンタンパク質のアミノ酸２３〜１１９に示されるアミノ酸配列をコードする核酸残基を含んでもよい。ヒトβ２ミクログロブリンの核酸配列及びアミノ酸配列は、参照により本明細書に組み込まれている、上記Ｇｕｓｓｏｗ  ｅｔ  ａｌ．に記載されている。
【０１６７】
このため、ヒト又はヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドは、ヒトβ２ミクログロブリンポリペプチドのアミノ酸２３〜１１５に示されるアミノ酸配列、例えば、ヒトβ２ミクログロブリンポリペプチドのアミノ酸２３〜１１９に示されるアミノ酸配列、例えば、ヒトβ２ミクログロブリンポリペプチドのアミノ酸２１〜１１９に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。あるいは、ヒトβ２ミクログロブリンは、ヒトβ２ミクログロブリンポリペプチドのアミノ酸１〜１１９を含んでもよい。
【０１６８】
いくつかの実施形態では、ヒト又はヒト化β２ミクログロブリンをコードするヌクレオチド配列は、ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエキソン２〜エキソン４に示されるヌクレオチド配列を含む。あるいは、ヌクレオチド配列は、ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエキソン２、３、及び４に示されるヌクレオチド配列を含む。この実施形態では、エキソン２、３、及び４に示されるヌクレオチド配列は、遺伝子の正常な転写及び翻訳を可能にするように、操作可能に連結している。このため、一実施形態において、ヒト配列は、ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエキソン２〜エキソン４に対応するヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、ヒト配列は、ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエキソン２〜エキソン４の後ろ約２６７ｂｐに対応するヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、ヒト配列は、ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子の約２．８ｋｂを含む。
【０１６９】
このため、ヒト又はヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドは、ヒトβ２ミクログロブリンのエキソン２〜エキソン４に示されるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列、例えば、ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエキソン２〜エキソン４に対応するヌクレオチド配列によりコードされてもよい。あるいは、ポリペプチドは、ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエキソン２、３、及び４に示されるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列によりコードされてもよい。特定の実施形態では、ヒト又はヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドは、ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエキソン２〜エキソン４の後ろ約２６７ｂｐに対応するヌクレオチド配列によりコードされる。別の特定の実施形態では、ヒト又はヒト化ポリペプチドは、ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子の約２．８ｋｂを含むヌクレオチド配列によりコードされる。β２ミクログロブリン遺伝子のエキソン４が５’非翻訳領域を含有する場合、ヒト又はヒト化ポリペプチドは、β２ミクログロブリン遺伝子のエキソン２及び３を含むヌクレオチド配列によりコードされてもよい。
【０１７０】
遺伝子操作動物を生じさせる特定の核酸配列及びアミノ酸配列が本明細書で記載されているが、１つ又は２つ以上の保存的又は非保存的アミノ酸置換の配列又は遺伝情報の縮重によって本明細書に記載された配列とは異なる配列も提供されることが、当業者に理解されるであろう。
【０１７１】
したがって、ヒトβ２ミクログロブリン配列を発現している非ヒト動物であって、β２ミクログロブリン配列が、ヒトβ２ミクログロブリン配列と、少なくとも約８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である、非ヒト動物が提供される。特定の実施形態では、β２ミクログロブリン配列は、本明細書に記載されたヒトβ２ミクログロブリン配列と、少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である。一実施形態において、ヒトβ２ミクログロブリン配列は、１つ又は２つ以上の保存的置換を含む。一実施形態において、ヒトβ２ミクログロブリン配列は、１つ又は２つ以上の非保存的置換を含む。
【０１７２】
加えて、非ヒト動物であって、ヒト又はヒト化β２ミクログロブリンタンパク質をコードするヌクレオチド配列が、非ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエキソン１に示されるヌクレオチド配列も含む、非ヒト動物が提供される。このため、特定の実施形態では、非ヒト動物は、そのゲノム中に、ヒト又はヒト化β２ミクログロブリンをコードするヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチド配列は、非ヒトβ２ミクログロブリンのエキソン１並びにヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエキソン２、３、及び４を含む。このため、ヒト又はヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドは、非ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエキソン１並びにヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエキソン２、３、及び４（例えば、ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエキソン２及び３）によりコードされる。
【０１７３】
一実施形態において、本発明の非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、マウス）は、キメラＣＤ８タンパク質をコードするヌクレオチド配列に加えて、ヒト又はヒト化ＭＨＣＩタンパク質をコードする核酸配列を更に含む。これにより、動物のＴ細胞表面上で発現されたキメラＣＤ８タンパク質は、第２の細胞、例えば、抗原提示細胞の表面上で発現されたヒト又はヒト化ＭＨＣＩと会合、結合、及び／又は相互作用することができる。一実施形態において、ＭＨＣＩタンパク質は、ヒトＭＨＣＩポリペプチドの細胞外ドメインを含む。一実施形態において、動物は、ヒト又はヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドを更に含む。ヒト又はヒト化ＭＨＣＩポリペプチド、及び／又はβ２ミクログロブリンポリペプチドを発現している例示的な遺伝子改変動物が、米国特許出願公開第２０１３０１１１６１７号及び同第２０１３０１８５８１９号に記載されている。両公報は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれている。このため、一実施形態において、本明細書に記載されたキメラＣＤ８タンパク質を含む動物は、ヒト化ＭＨＣＩ複合体を更に含んでもよく、ヒト化ＭＨＣＩ複合体は、（１）ヒト化ＭＨＣＩポリペプチドであって、例えば、ヒト化ＭＨＣＩポリペプチドが、ヒトＭＨＣＩの細胞外ドメイン並びに内在性（例えば、マウス）ＭＨＣＩの膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを含み、例えば、ヒト化ＭＨＣＩが、ヒトＭＨＣＩポリペプチドのα１、α２及びα３ドメインを含む、ヒト化ＭＨＣＩポリペプチド、並びに（２）ヒト又はヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドを含む（例えば、動物は、そのゲノム中に、ヒトβ２ミクログロブリンのエキソン２、３、及び４に示されるヌクレオチド配列を含む）。一態様において、ヒト化ＭＨＣＩ及びヒト又はヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドは両方とも、内在性ＭＨＣＩ及びβ２ミクログロブリン座に位置するヌクレオチド配列によりそれぞれコードされる。一態様において、動物は、機能的な内在性ＭＨＣＩ及びβ２ミクログロブリンポリペプチドを発現していない。このため、動物により発現されたＭＨＣＩは、キメラヒト／非ヒト、例えば、ヒト／げっ歯類（例えば、ヒト／マウス）ＭＨＣＩポリペプチドであってもよい。キメラＭＨＣＩポリペプチドのヒト部分は、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、及びＨＬＡ−Ｃ、例えば、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ｂ２７、ＨＬＡ−Ｂ７、ＨＬＡ−Ｃｗ６からなる群から選択されるヒトＨＬＡクラスＩタンパク質、又はヒト集団に存在する任意の他のＨＬＡクラスＩ分子から得られてもよい。実施形態において、動物は、マウスである場合、キメラＭＨＣＩポリペプチドの非ヒト（すなわち、マウス）部分は、Ｈ−２Ｄ、Ｈ−２Ｋ、及びＨ−２Ｌから選択されるマウスＭＨＣＩタンパク質から得られてもよい。
【０１７４】
一実施形態において、本発明の非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、マウス）は、ヒト又はヒト化ＭＨＣＩＩタンパク質をコードするヌクレオチド配列を更に含む。これにより、動物のＴ細胞表面上に発現されたキメラＣＤ４タンパク質は、第２の細胞、例えば、抗原提示細胞の表面上で発現されたヒト又はヒト化ＭＨＣＩＩと相互作用することができる。一実施形態において、ＭＨＣＩＩタンパク質は、ヒトＭＨＣＩＩαポリペプチドの細胞外ドメイン及びヒトＭＨＣＩＩβポリペプチドの細胞外ドメインを含む。ヒト又はヒト化ＭＨＣＩＩポリペプチドを発現している例示的な遺伝子改変動物が、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれている、２０１４年９月３０日に発効された米国特許第８，８４７，００５号及び米国特許出願公開第２０１３０１８５８２０号に記載されている。このため、一実施形態において、本明細書に記載されたキメラＣＤ４タンパク質を含む動物は、ヒト化ＭＨＣＩＩタンパク質を更に含んでもよく、ヒト化ＭＨＣＩＩタンパク質は、（１）ヒトＭＨＣＩＩαの細胞外ドメイン並びに内在性、例えば、マウスＭＨＣＩＩの膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを含むヒト化ＭＨＣＩＩαポリペプチドであって、ヒトＭＨＣＩＩαの細胞外ドメインが、ヒトＭＨＣＩＩαのα１及びα２ドメインを含む、ヒト化ＭＨＣＩＩαポリペプチド、並びに（２）ヒトＭＨＣＩＩβ細胞外ドメイン並びに内在性、例えば、マウスＭＨＣＩＩの膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを含むヒト化ＭＨＣＩＩβポリペプチドであって、ヒトＭＨＣＩＩβ細胞外ドメインが、ヒトＭＨＣＩＩβのβ１及びβ２ドメインを含む、ヒト化ＭＨＣＩＩβポリペプチドを含む。一態様において、ヒト化ＭＨＣＩＩα及びβポリペプチドは両方とも、内在性ＭＨＣＩＩα及びβ座に位置する核酸配列によりそれぞれコードされる。一態様において、動物は、機能的な内在性ＭＨＣＩＩα及びβポリペプチドを発現していない。このため、動物により発現されたＭＨＣＩＩは、キメラヒト／非ヒト、例えば、ヒト／げっ歯類（例えば、ヒト／マウス）ＭＨＣＩＩタンパク質であってもよい。キメラＭＨＣＩＩタンパク質のヒト部分は、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱ、及びＨＬＡ−ＤＰ、例えば、ＨＬＡ−ＤＲ４、ＨＬＡ−ＤＲ２、ＨＬＡ−ＤＱ２．５、ＨＬＡ−ＤＱ８からなる群から選択されるヒトＨＬＡクラスＩＩタンパク質、又はヒト集団に存在する任意の他のＨＬＡクラスＩＩ分子から得られてもよい。動物がマウスである実施形態において、キメラＭＨＣＩＩポリペプチドの非ヒト（すなわち、マウス）部分は、Ｈ−２Ｅ及びＨ−２Ａから選択されるマウスＭＨＣＩＩタンパク質から得られてもよい。
【０１７５】
遺伝子改変非ヒト動物、例えば、げっ歯類、例えば、ラット又はマウスの様々な他の実施形態は、本開示並びに参照により本明細書に組み込まれている、米国特許出願公開第２０１３０１１１６１７号、同第２０１３０１８５８１９号、及び同第２０１３０１８５８２０号並びに米国特許第８，８４７，００５号の開示から、当業者に明らかとなるであろう。
【０１７６】
様々な実施形態において、本明細書に記載された遺伝子改変非ヒト動物は、細胞表面上に、ヒト又はヒト化ＭＨＣＩ及びＩＩを有し、その結果として、ヒト様の方法でＴ細胞のためのエピトープとしてペプチドを提示する細胞、例えば、ＡＰＣを生成するが、これは、複合体の実質的に全てのコンポーネントが、ヒトであるか、又はヒト化されているためである。本発明の遺伝子改変非ヒト動物は、免疫応答を引き起こす抗原及び抗原エピトープ（例えば、Ｔ細胞エピトープ、例えば、固有のヒトガンエピトープ）の特定のために、例えば、ワクチン開発に使用するために、ワクチン候補及び他のワクチン戦略の評価のために、ヒトの自己免疫を研究するために、ヒトの感染性疾患を研究するために、かつ更にはヒトＭＨＣ発現に基づくより良好な治療戦略を発明するために、ヒトの免疫系の機能をヒト化動物において研究するために使用され得る。
非ヒト動物、組織、及び細胞
【０１７７】
本発明の遺伝子改変非ヒト動物は、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ウシ（例えば、雌牛、雄牛、バッファロー）、シカ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ネコ、イヌ、フェレット、霊長類（例えば、マーモセット、アカゲザル）からなる群から選択されてもよい。好適な遺伝子改変可能ＥＳ細胞が容易に入手できない非ヒト動物については、遺伝子改変を含む非ヒト動物を作製するために、他の方法が利用される。このような方法は、例えば、非ＥＳ細胞生殖細胞系（例えば、線維芽細胞又は誘導多能性細胞）を改変すること、及び核移植を用いて、卵母細胞など好適な細胞に改変ゲノムを移植し、好適な条件下で非ヒト動物内で改変細胞（例えば、改変卵母細胞）を成熟させて胚を形成することを含む。
【０１７８】
一態様において、非ヒト動物は、哺乳類である。一態様において、非ヒト動物は、例えば、トビネズミ科又はネズミ上科の小型哺乳類である。一実施形態では、遺伝子改変動物は、げっ歯類である。一実施形態では、げっ歯類は、マウス、ラット、及びハムスターから選択される。一実施形態では、げっ歯類は、ネズミ上科から選択される。一実施形態では、遺伝子改変動物は、カンガルーハムスター科（例えば、マウス様ハムスター）、キヌゲネズミ科（例えば、ハムスター、新世界ラット及びマウス、ハタネズミ）、ネズミ科（真正マウス及びラット、スナネズミ、トゲマウス、タテガミネズミ）、アシナガマウス科（キノボリマウス、イワマウス、オジロラット、マダガスカルラット及びマウス）、トゲヤマネ科（例えば、トゲヤマネ）、及びメクラネズミ科（例えば、デバネズミ、タケネズミ、及びモグラネズミ）から選択される科に属する。特定の実施形態では、遺伝子改変げっ歯類は、真正マウス又はラット（ネズミ科）、スナネズミ、トゲマウス、及びタテガミネズミから選択される。一実施形態では、遺伝子改変マウスはネズミ科に属する。一実施形態において、動物は、げっ歯類である。特定の実施形態では、げっ歯類は、マウス及びラットから選択される。一実施形態では、この非ヒト動物はマウスである。
【０１７９】
一実施形態では、この非ヒト動物は、Ｃ５７ＢＬ／Ａ、Ｃ５７ＢＬ／Ａｎ、Ｃ５７ＢＬ／ＧｒＦａ、Ｃ５７ＢＬ／ＫａＬｗＮ、Ｃ５７ＢＬ／６、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／６ＢｙＪ、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ、Ｃ５７ＢＬ／１０、Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ、Ｃ５７ＢＬ／１０Ｃｒ、及びＣ５７ＢＬ／Ｏｌａから選択されるＣ５７ＢＬ系統のマウスであるげっ歯類である。別の実施形態では、マウスは、１２９Ｐ１、１２９Ｐ２、１２９Ｐ３、１２９Ｘ１、１２９Ｓ１（例えば、１２９Ｓ１／ＳＶ、１２９Ｓ１／ＳｖＩｍ）、１２９Ｓ２、１２９Ｓ４、１２９Ｓ５、１２９Ｓ９／ＳｖＥｖＨ、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）、１２９Ｓ７、１２９Ｓ８、１２９Ｔ１、１２９Ｔ２である系統からなる群から選択される１２９系統である（例えば、Ｆｅｓｔｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｒｅｖｉｓｅｄ  ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ｆｏｒ  ｓｔｒａｉｎ  １２９  ｍｉｃｅ，Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  １０：８３６を参照されたく、Ａｕｅｒｂａｃｈ
ｅｔ  ａｌ（２０００）Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｃｈｉｍｅｒａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  １２９／ＳｖＥｖ−  ａｎｄ  Ｃ５７ＢＬ／６−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅｓも参照のこと）。特定の実施形態では、遺伝子改変マウスは、上記１２９系統と上記Ｃ５７ＢＬ／６系統との混合物である。別の特定の実施形態では、マウスは、上記の１２９系統の混合、又は上記のＢＬ／６系統の混合である。特定の実施形態では、混合の１２９系統は、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）系統である。別の実施形態では、このマウスは、ＢＡＬＢ系統、例えばＢＡＬＢ／ｃ系統である。更に別の実施形態では、このマウスは、ＢＡＬＢ系統と別の上記系統との混合物である。本明細書で提供された非ヒト動物は、上記系統の任意の組み合わせから得られたマウスであってもよい。
【０１８０】
一実施形態では、この非ヒト動物はラットである。一実施形態では、ラットは、ウィスターラツト、ＬＥＡ系統、Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ系統、Ｆｉｓｃｈｅｒ系統、Ｆ３４４、Ｆ６、及びＤａｒｋ  Ａｇｏｕｔｉから選択される。一実施形態では、ラット系統は、ウィスター、ＬＥＡ、Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ、Ｆｉｓｃｈｅｒ、Ｆ３４４、Ｆ６、及びＤａｒｋ  Ａｇｏｕｔｉからなる群から選択される、２つ又はそれ以上の系統の混合体である。
【０１８１】
このため、本発明の一実施形態において、遺伝子改変マウスであって、マウスが、例えば、そのゲノム中に、例えば、その生殖細胞系ゲノム中に、（ａ）第１のキメラヒト／マウスＴ細胞共受容体ポリペプチド（例えば、ＣＤ４）をコードする第１のヌクレオチド配列、第２のキメラヒト／マウスＴ細胞共受容体ポリペプチド（例えば、ＣＤ８α）をコードする第２のヌクレオチド配列、及び／又は第３のキメラヒト／マウスＴ細胞共受容体ポリペプチド（例えば、ＣＤ８β）をコードする第３のヌクレオチド配列であって、各キメラＴ細胞共受容体ポリペプチドのマウス部分が、マウスＴ細胞共受容体の少なくとも膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを含み、各キメラポリペプチドのヒト部分が、ヒトＴ細胞共受容体の細胞外部分（又はその一部、例えば、１つ又は２つ以上の細胞外ドメイン）を含み、マウスが、第１、第２、及び／又は第３のキメラＴ細胞共受容体ポリペプチドを発現している、第１、第２、及び／又は第３のヌクレオチド配列、（ｂ）少なくとも１つのヒトＶαセグメント及び少なくとも１つのヒトＪαセグメントを含み、マウスＴＣＲα定常遺伝子配列に操作可能に連結している非再配列Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α可変遺伝子座、及び／又は少なくとも１つのヒトＶβセグメント、少なくとも１つのヒトＤβセグメント、及び少なくとも１つのヒトＪβセグメントを含み、マウスＴＣＲβ定常遺伝子配列に操作可能に連結している非再配列ＴＣＲβ可変遺伝子座、並びに場合により、（ｃ）第１のキメラヒト／マウスＭＨＣポリペプチド（例えば、ＭＨＣＩＩα）をコードする第１の核酸配列、第２のキメラヒト／マウスＭＨＣポリペプチド（例えば、ＭＨＣＩＩβ）をコードする第２の核酸配列、及び／又は第３のキメラヒト／マウスＭＨＣポリペプチド（例えば、ＭＨＣＩ）をコードする第３の核酸配列、並びにヒト又はヒト化β２ミクログロブリンをコードするβ２ミクログロブリン座であって、各キメラＭＨＣポリペプチドのヒト部分が、第１、第２、及び／又は第３のキメラＴ細胞共受容体ポリペプチドと会合するヒトＭＨＣポリペプチドの細胞外ドメインを含む（例えば、キメラＭＨＣＩＩ複合体のヒト部分（例えば、ヒト化ＭＨＣＩＩα及びβポリペプチド）が、キメラＣＤ４ポリペプチドと会合し、かつ／又はキメラＭＨＣＩポリペプチドのヒト部分（又はＭＨＣＩ複合体、例えば、ヒト化ＭＨＣＩα及びヒト（化）β２ミクログロブリン）が、キメラＣＤ８共受容体（例えば、ヒト化ＣＤ８α及びβポリペプチドと会合する）、第１、第２、及び／又は第３の核酸配列、並びに、β２ミクログロブリン座を含む、遺伝子改変マウスが提供される。
【０１８２】
本明細書において、遺伝子改変マウスであって、そのゲノム中に、例えば、その内在性ＣＤ４座において、キメラヒト／マウスＣＤ４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、キメラポリペプチドのマウス部分が、マウスＣＤ４ポリペプチドの膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを少なくとも含む、ヌクレオチド配列を含み、マウスが、キメラヒト／マウスＣＤ４を発現している、遺伝子改変マウスが提供される。一実施形態において、キメラポリペプチドのヒト部分は、ヒトＣＤ４ポリペプチドの全て又は実質的に全ての細胞外ドメインを少なくとも含む。一実施形態において、キメラポリペプチドのヒト部分は、ヒトＣＤ４タンパク質の全て又は実質的に全てのＤ１ドメインを少なくとも含む。一実施形態において、キメラポリペプチドのヒト部分は、少なくとも、ヒトＣＤ４タンパク質の全て又は実質的に全てのＤ１〜Ｄ２ドメイン、例えば、少なくとも、ヒトＣＤ４タンパク質の全て又は実質的に全てのＤ１〜Ｄ３ドメイン、例えば、ヒトＣＤ４タンパク質の全て又は実質的に全てのＤ１〜Ｄ４ドメインを含む。このため、一実施形態において、マウスは、内在性ＣＤ４座において、少なくともヒトＣＤ４遺伝子の全て又は実質的に全てのエキソン４、５、及び６を含むヌクレオチド配列、例えば、ヒトＣＤ４のＤ１ドメインの一部をコードするヒトＣＤ４遺伝子のエキソン３及びヒトＣＤ４遺伝子のエキソン４〜６の配列を含む。一実施形態において、マウスは、内在性ＣＤ４座において、ＭＨＣＩＩ及び／又はＴ細胞受容体の細胞外部分との相互作用を担うヒトＣＤ４配列を含むキメラヒト／マウスＣＤ４を含む。別の実施形態では、マウスは、内在性ＣＤ４座において、ＭＨＣＩＩ及び／又はＴ細胞受容体の可変ドメインとの相互作用を担うヒトＣＤ４配列を含むキメラヒト／マウスＣＤ４を含む。一実施形態において、ヌクレオチド配列は、マウスＣＤ４シグナルペプチドをコードする配列を含む。一実施形態において、マウスは、ヒトＣＤ４の細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列によるマウスＣＤ４の細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列の置換えを含む。別の実施形態では、マウスは、全て又は実質的に全てのマウスＣＤ４  Ｄ１ドメインを少なくともコードするヌクレオチド配列、例えば、全て又は実質的に全てのマウスＣＤ４  Ｄ１〜Ｄ２ドメインを少なくともコードするヌクレオチド配列、例えば、全て又は実質的に全てのマウスＣＤ４  Ｄ１〜Ｄ３ドメインを少なくともコードするヌクレオチド配列の、それらをコードするヒトヌクレオチド配列による置換えを含む。一実施形態において、キメラＣＤ４ポリペプチドのドメインは、図５Ａに模式的に表されるヌクレオチド配列によりコードされる。
【０１８３】
一実施形態において、マウスは、その内在性マウスＣＤ４座から、機能的な内在性マウスＣＤ４を発現していない。一実施形態において、本明細書に記載されたマウスは、マウスの生殖細胞系において、キメラヒト／マウスＣＤ４ヌクレオチド配列を含む。
【０１８４】
一実施形態において、マウスは、ヒト化されていない任意の内在性配列を保持しており、例えば、実施形態において、マウスは、全ての又は実質的に全てのＤ１〜Ｄ３ドメインをコードするヌクレオチド配列の置換えを含み、マウスは、マウスＣＤ４  Ｄ４ドメインをコードする内在性ヌクレオチド配列、並びにマウスＣＤ４の膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインをコードするヌクレオチド配列を保持している。
【０１８５】
一態様において、キメラヒト／マウスＣＤ４タンパク質を発現しているマウスは、マウスＣＤ４プロモータ及び調節配列を保持しており、例えば、キメラヒト／マウスＣＤ４をコードするマウスにおけるヌクレオチド配列は、マウス中において、内在性マウスＣＤ４プロモータ及び調節配列に操作可能に連結している。一態様において、本発明の遺伝子操作動物に保持されたこれらのマウス調節配列は、Ｔ細胞発達中の適切な段階において、キメラタンパク質の発現を調節する配列を含む。このため、一態様において、マウスは、Ｂ細胞又は成熟ＣＤ８＋Ｔ細胞上に、キメラＣＤ４を発現していない。一態様において、マウスはまた、内在性ＣＤ４を通常発現していない任意の細胞種、例えば、任意の免疫細胞種上にも、キメラＣＤ４を発現していない。
【０１８６】
本明細書で開示された遺伝子改変マウスは、そのゲノム中に、例えば、その内在性ＣＤ８座において、キメラヒト／マウスＣＤ８αポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列、及びキメラヒト／マウスＣＤ８βポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列を含んでもよい。一実施形態において、第１のヌクレオチド配列は、ヒトＣＤ８αポリペプチドの全て又は実質的に全ての細胞外部分、並びにマウスＣＤ８αポリペプチドの少なくとも膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインをコードする配列を含み、第２のヌクレオチド配列は、ヒトＣＤ８βポリペプチドの全て又は実質的に全ての細胞外部分、並びにマウスＣＤ８βポリペプチドの少なくとも膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインをコードする配列を含み、マウスは、機能的なキメラヒト／マウスＣＤ８タンパク質を発現している。一実施形態において、第１のヌクレオチド配列は、ヒトＣＤ８αポリペプチドの免疫グロブリンＶ様ドメインを少なくともコードする配列、及びマウスＣＤ８αポリペプチドの残り部分の配列を含み、第２のヌクレオチド配列は、ヒトＣＤ８βポリペプチドの免疫グロブリンＶ様ドメインを少なくともコードする配列、及びマウスＣＤ８βポリペプチドの残り部分の配列を含む。一実施形態において、第１のヌクレオチド配列は、ヒトＣＤ８αポリペプチドのＭＨＣＩ結合ドメインを少なくとも含む。一実施形態において、第１及び第２のヌクレオチド配列は、ヒトＣＤ８αポリペプチド及び／又はＣＤ８βポリペプチドの細胞外部分をそれぞれコードするエキソンを少なくとも含む。一実施形態において、ヒトＣＤ８αポリペプチド及び／又はヒトＣＤ８βポリペプチドの細胞外部分は、膜貫通ドメイン又は細胞質ドメインではない、ヒトＣＤ８αポリペプチド及び／又はＣＤ８βポリペプチドの部分を包含する領域である。一実施形態において、キメラＣＤ８αポリペプチドのドメインは、図５Ｂに模式的に表されるヌクレオチド配列によりコードされる。一実施形態において、キメラＣＤ８βポリペプチドのドメインは、図５Ｂに模式的に表されるヌクレオチド配列によりコードされる。一実施形態において、キメラヒト／マウスＣＤ８αポリペプチド及び／又はＣＤ８βポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、マウスＣＤ８α及び／又はＣＤ８βシグナルペプチドをそれぞれコードする配列を含む。あるいは、ヌクレオチド配列は、ヒトＣＤ８α及び／又はＣＤ８βシグナルペプチドをコードする配列を含んでもよい。一実施形態において、マウスは、全て又は実質的に全てのヒトＣＤ８α及び／又はＣＤ８β細胞外ドメインをそれぞれコードするヌクレオチド配列による、全て又は実質的に全てのマウスＣＤ８α及び／又はＣＤ８β細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列の置換えを含む。
【０１８７】
一実施形態において、マウスは、その内在性ＣＤ８座から、機能的な内在性マウスＣＤ８α及び／又はＣＤ８βポリペプチドを発現していない。一実施形態において、本明細書に記載されたマウスは、その生殖細胞系において、キメラヒト／マウスＣＤ８配列を含む。
【０１８８】
一態様において、キメラヒト／マウスＣＤ８α及び／又はＣＤ８βポリペプチドを発現しているマウスは、マウスＣＤ８α及び／又はＣＤ８βプロモータ及び調節配列を保持しており、例えば、マウスにおいて、キメラヒト／マウスＣＤ８をコードするヌクレオチド配列は、内在性マウスＣＤ８プロモータ及び調節配列に操作可能に連結している。一態様において、マウスに保持されたこれらの調節配列は、Ｔ細胞発達の適切な段階において、ＣＤ８タンパク質発現を調節する配列を含む。一態様において、遺伝子改変マウスは、Ｂ細胞若しくは成熟ＣＤ４＋Ｔ細胞上、又は内在性ＣＤ８を通常発現していない任意の細胞、例えば、免疫細胞上に、キメラＣＤ８を発現していない。
【０１８９】
本発明はまた、遺伝子改変マウスであって、そのゲノム中に、非再配列ヒト又はヒト化ＴＣＲ可変遺伝子座、例えば、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲδ、及び／又はＴＣＲγ可変遺伝子座を含む、遺伝子改変マウスも提供する。いくつかの実施形態では、非再配列ヒト又はヒト化ＴＣＲ可変遺伝子座は、内在性マウスＴＣＲ可変遺伝子座を置き換える。他の実施形態では、非再配列ヒト又はヒト化ＴＣＲ可変遺伝子座は、対応する内在性マウスＴＣＲ座以外のゲノム中の部位に存在する。いくつかの実施形態では、ヒト又はヒト化非再配列ＴＣＲ可変遺伝子座は、マウスＴＣＲ定常領域に操作可能に連結している。
【０１９０】
一実施形態において、遺伝子改変マウスであって、マウスが、そのゲノム中に、少なくとも１つのヒトＶαセグメント及び少なくとも１つのヒトＪαセグメントを含み、マウスＴＣＲα定常遺伝子配列に操作可能に連結している非再配列Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α可変遺伝子座、並びに少なくとも１つのヒトＶβセグメント、少なくとも１つのヒトＤβセグメント、及び少なくとも１つのヒトＪβセグメントを含み、マウスＴＣＲβ定常遺伝子配列に操作可能に連結している非再配列ＴＣＲβ可変遺伝子座を含む、遺伝子改変マウスが提供される。ある特定の実施形態では、マウスは、そのゲノム中に、ヒトＶαセグメントの完全なレパートリ及びヒトＪαセグメントの完全なレパートリを含み、マウスＴＣＲα定常遺伝子配列に操作可能に連結している非再配列ＴＣＲα可変遺伝子座と、ヒトＶβセグメントの完全なレパートリ、ヒトＤβセグメントの完全なレパートリ、及びヒトＪβセグメントの完全なレパートリを含み、マウスＴＣＲβ定常遺伝子配列に操作可能に連結している非再配列ＴＣＲβ可変遺伝子座とを含む。
【０１９１】
いくつかの実施形態では、ヒトＴＣＲα可変領域セグメントを含む非再配列ＴＣＲα可変遺伝子座は、内在性マウスＴＣＲα可変遺伝子座を置き換え、ヒトＴＣＲβ可変領域セグメントを含む非再配列ＴＣＲβ可変遺伝子座は、内在性マウスＴＣＲβ可変遺伝子座を置き換える。いくつかの実施形態では、内在性マウスＶα及びＪαセグメントは、再配列して、再配列Ｖα／Ｊα配列を形成することができず、内在性マウスＶβ、Ｄβ、及びＪβセグメントは、再配列して、再配列Ｖβ／Ｄβ／Ｊβ配列を形成することができない。いくつかの実施形態では、ヒトＶα及びＪαセグメントは、再配列して、再配列ヒトＶα／Ｊα配列を形成し、ヒトＶβ、Ｄβ、及びＪβセグメントは、再配列して、再配列ヒトＶβ／Ｄβ／Ｊβ配列を形成する。
【０１９２】
本発明はまた、遺伝子改変マウスであって、そのゲノム中に、キメラＭＨＣポリペプチドをコードする核酸配列を含み、キメラＭＨＣポリペプチドのヒト部分が、本明細書で開示されたキメラＴ細胞共受容体のヒト細胞外ドメインと会合している、遺伝子改変マウスに関する。本明細書で開示された遺伝子改変マウスは、キメラヒト／マウスＭＨＣＩをコードする第１の核酸配列、キメラヒト／マウスＭＨＣＩＩαをコードする第２の核酸配列、並びに／又はキメラヒト／マウスＭＨＣＩＩβポリペプチドをコードする第３の核酸配列を含んでもよい。キメラＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩα、及び／又はＭＨＣＩＩβのヒト部分は、ヒトＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩα、及びＭＨＣＩＩβの細胞外ドメインをそれぞれ含んでもよい。一実施形態において、マウスは、その内在性マウスＭＨＣ座から、機能的なキメラヒト／マウスＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩα、及びＭＨＣＩＩβポリペプチドを発現している。一実施形態において、マウスは、その内在性マウスＭＨＣ座から、機能的なマウスＭＨＣポリペプチド、例えば、機能的なマウスＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩα、及びＭＨＣＩＩβポリペプチドを発現していない。他の実施形態では、マウスにより細胞表面上に発現されるＭＨＣＩ及びＭＨＣＩＩのみがキメラＭＨＣＩ及びＩＩである。
【０１９３】
一実施形態において、キメラヒト／マウスＭＨＣＩポリペプチドのヒト部分は、ヒトＭＨＣＩ（例えば、ヒトＨＬＡ−Ａ、例えば、ヒトＨＬＡ−Ａ２、例えば、ヒトＨＬＡ−Ａ２．１）のペプチド結合ドメイン又は細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態では、マウスは、その内在性マウスＭＨＣＩ座から、内在性マウスＭＨＣＩポリペプチドのペプチド結合ドメイン又は細胞外ドメインを発現していない。ヒトＭＨＣＩのペプチド結合ドメインは、α１及びα２ドメインを含んでもよい。あるいは、ヒトＭＨＣＩのペプチド結合ドメインは、α１、α２、及びα３ドメインを含んでもよい。一態様において、ヒトＭＨＣＩの細胞外ドメインは、ヒトＭＨＣＩ  α鎖の細胞外ドメインを含む。一実施形態において、内在性マウスＭＨＣＩ座は、Ｈ−２Ｋ（例えば、Ｈ−２Ｋｂ）座であり、キメラＭＨＣＩポリペプチドのマウス部分は、マウスＨ−２Ｋ（例えば、Ｈ−２Ｋｂ）ポリぺプチドの膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを含む。このため、一実施形態において、本発明のマウスは、その内在性マウスＭＨＣＩ座において、キメラヒト／マウスＭＨＣＩをコードする核酸配列を含み、キメラポリペプチドのヒト部分は、ヒトＨＬＡ−Ａ２（例えば、ＨＬＡ−Ａ２．１）ポリペプチドの細胞外ドメインを含み、マウス部分は、マウスＨ−２Ｋ（例えば、Ｈ−２Ｋｂ）ポリぺプチドの膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを含み、マウスは、キメラヒト／マウスＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２Ｋｂタンパク質を発現している。他の実施形態では、キメラＭＨＣＩポリペプチドのマウス部分は、他のマウスＭＨＣＩ、例えば、Ｈ−２Ｄ、Ｈ−２Ｌ等から得られてもよい。キメラＭＨＣＩポリペプチドのヒト部分は、他のヒトＭＨＣＩ、例えば、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ等から得られてもよい。一態様において、マウスは、その内在性マウスＨ−２Ｋ座から、機能的な内在性Ｈ−２Ｋポリペプチドを発現していない。一実施形態において、マウスは、そのＨ−２Ｄ座から、機能的な内在性ＭＨＣポリペプチドを発現していない。いくつかの実施形態では、マウスは、内在性Ｈ−２Ｄ座の全て又は一部を欠くように操作されている。他の実施形態では、マウスにより細胞表面上に発現されたＭＨＣＩポリペプチドだけがキメラヒト／マウスＭＨＣＩポリペプチドである。
【０１９４】
一実施形態において、キメラヒト／マウスＭＨＣＩＩαポリペプチドのヒト部分は、ヒトＭＨＣＩＩαのペプチド結合ドメイン又は細胞外ドメインを含み、キメラヒト／マウスＭＨＣＩＩβポリペプチドのヒト部分は、ヒトＭＨＣＩＩβのペプチド結合ドメイン又は細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態では、マウスは、内在性マウス座（例えば、Ｈ−２Ａ及び／又はＨ−２Ｅ座）から、内在性マウスα及び／又はβポリペプチドのペプチド結合ドメイン又は細胞外ドメインを発現していない。いくつかの実施形態では、マウスは、Ｈ−２Ａｂ１、Ｈ−２Ａａ、Ｈ−２Ｅｂ１、Ｈ−２Ｅｂ２、Ｈ−２Ｅａ、及びそれらの組み合わせを含む機能的なＭＨＣクラスＩＩ分子をコードする遺伝子を欠いているゲノムを含む。いくつかの実施形態では、マウスにより細胞表面上に発現されたＭＨＣＩＩポリペプチドのみがキメラヒト／マウスＭＨＣＩＩポリペプチドのみである。ヒトＭＨＣＩＩαポリペプチドのペプチド結合ドメインは、α１ドメインを含んでもよく、ヒトＭＨＣＩＩβポリペプチドのペプチド結合ドメインは、β１ドメインを含んでもよい。このため、キメラＭＨＣＩＩ複合体のペプチド結合ドメインは、ヒトα１及びβ１ドメインを含んでもよい。ヒトＭＨＣＩＩαポリペプチドの細胞外ドメインは、α１及びα２ドメインを含んでもよく、ヒトＭＨＣＩＩβポリペプチドの細胞外ドメインは、β１及びβ２ドメインを含んでもよい。このため、キメラＭＨＣＩＩ複合体の細胞外ドメインは、ヒトα１、α２、β１、及びβ２ドメインを含んでもよい。一実施形態において、キメラＭＨＣＩＩ複合体のマウス部分は、マウスＭＨＣＩＩ、例えば、マウスＨ−２Ｅの膜貫通ドメイン及び細胞質ドメイン（例えば、マウスＨ−２Ｅα及びβ鎖の膜貫通ドメイン及び細胞質ドメイン）を含む。このため、一実施形態において、本発明のマウスは、その内在性マウスＭＨＣＩＩ座において、キメラヒト／マウスＭＨＣＩＩαをコードする核酸配列を含み、キメラＭＨＣＩＩαポリペプチドのヒト部分は、ヒトＭＨＣＩＩのα鎖（例えば、ＨＬＡ−ＤＲ２のα鎖）から得られる細胞外ドメインを含み、マウス部分は、マウスＭＨＣＩＩ（例えば、Ｈ−２Ｅ）のα鎖から得られる膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを含み、マウスは、その内在性マウスＭＨＣＩＩ座において、キメラヒト／マウスＭＨＣＩＩβをコードする核酸配列を含み、キメラＭＨＣＩＩβポリペプチドのヒト部分は、ヒトＭＨＣＩＩのβ鎖（例えば、ＨＬＡ−ＤＲ２のβ鎖）から得られる細胞外ドメインを含み、マウス部分は、マウスＭＨＣ（例えば、Ｈ−２Ｅ）のβ鎖から得られる膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを含み、例えば、マウスは、キメラヒト／マウスＨＬＡ−ＤＲ２／Ｈ−２Ｅタンパク質を発現している。他の実施形態では、キメラＭＨＣＩＩタンパク質のマウス部分は、他のマウスＭＨＣＩＩ、例えば、Ｈ−２Ａ等から得られてもよく、キメラＭＨＣＩＩタンパク質のヒト部分は、他のヒトＭＨＣＩＩ、例えば、ＨＬＡ−ＤＱ等から得られてもよい。一態様において、マウスは、その内在性マウス座から、機能的な内在性Ｈ−２Ａ及びＨ−２Ｅポリペプチドを発現していない（例えば、マウスは、Ｈ−２Ａｂ１、Ｈ−２Ａａ、Ｈ−２Ｅｂ１、Ｈ−２Ｅｂ２、及���Ｈ−２Ｅａポリペプチドを発現していない）。いくつかの実施形態では、マウスは、細胞表面上での任意の内在性ＭＨＣＩ又はＭＨＣＩＩ分子の発現を欠いている。
【０１９５】
様々な態様において、遺伝子改変非ヒト動物又は、非ヒト動物から得られた細胞、胚、若しくは組織により発現されたヒト又はヒト化β２ミクログロブリンは、内在性及び／又はヒトのβ２ミクログロブリンの全ての機能的態様を保存している。例えば、ヒト又はヒト化β２ミクログロブリンは、ＭＨＣＩポリペプチド（例えば、内在性非ヒト又はヒトＭＨＣＩポリペプチド）のα鎖に結合することが好ましい。ヒト又はヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドは、任意の他の分子、例えば、受容体、アンカー、又は内在性非ヒト及び／若しくはヒトβ２ミクログロブリン（例えば、ＨＦＥなど）と会合するシグナル伝達分子に結合するか、これらをリクルートするか、ないしは会合してもよい。
【０１９６】
遺伝子改変動物（例えば、げっ歯類、例えば、マウス又はラット）に加えて、組織又は細胞が、本明細書に記載されたような非ヒト動物から得られ、異種性β２ミクログロブリン遺伝子又はβ２ミクログロブリン配列、すなわち、核酸配列及び／又はアミノ酸配列を含む、組織又は細胞もまた提供される。一実施形態において、異種性β２ミクログロブリン遺伝子又はβ２ミクログロブリン配列は、ヒト若しくはヒト化β２ミクログロブリン遺伝子、又はヒト若しくはヒト化β２ミクログロブリン配列である。好ましくは、細胞は、有核細胞である。細胞は、ＭＨＣＩ複合体を発現することが既知の任意の細胞、例えば、抗原提示細胞であってもよい。前記細胞により発現されたヒト又はヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドは、内在性非ヒトＭＨＣＩ（例えば、げっ歯類ＭＨＣＩ）と相互作用して、機能的なＭＨＣＩ複合体を形成してもよい。得られたＭＨＣＩ複合体は、Ｔ細胞、例えば、細胞傷害性Ｔ細胞と相互作用することができてもよい。このように、本明細書に記載されたような非ヒト動物からの細胞とＴ細胞とのｉｎ  ｖｉｒｔｏ複合体もまた提供される。
【０１９７】
ヒト又はヒト化β２ミクログロブリン遺伝子又は配列と、更なるヒト又はヒト化配列、例えば、現在開示されているキメラＭＨＣＩポリペプチドを含む、非ヒト細胞もまた提供される。このような例において、ヒト又はヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドは、例えば、キメラヒト／非ヒトＭＨＣＩポリペプチドと相互作用してもよく、機能的なＭＨＣＩ複合体が形成されてよい。いくつかの態様では、このような複合体は、Ｔ細胞、例えば、ヒト又は非ヒトＴ細胞上のＴＣＲと相互作用することができる。このため、本明細書に記載されたとおり非ヒト動物からの細胞と、ヒト又は非ヒトＴ細胞とのｉｎ  ｖｉｒｔｏ複合体もまた提供される。
【０１９８】
本開示の別の態様は、本明細書に記載された異種性β２ミクログロブリン遺伝子又はβ２ミクログロブリン配列を含む、げっ歯類の胚（例えば、マウス又はラットの胚）である。一実施形態において、胚は、異種性β２ミクログロブリン遺伝子又はβ２ミクログロブリン配列を含むＥＳドナー細胞と、宿主胚細胞とを含む。異種性β２ミクログロブリン遺伝子又はβ２ミクログロブリン配列は、ヒト又はヒト化β２ミクログロブリン遺伝子又はβ２ミクログロブリン配列である。
【０１９９】
本発明はまた、本明細書に記載されたとおりの非ヒト動物の染色体又はそのフラグメントを含む（例えば、染色体又はそのフラグメントは、ヒト又はヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む）非ヒト細胞を包含する。非ヒト細胞は、本明細書に記載されたとおり非ヒト動物の核を含んでもよい。一実施形態において、非ヒト細胞は、核移植の結果として、染色体又はそのフラグメントを含む。
【０２００】
一態様において、異種性β２ミクログロブリン遺伝子又はβ２ミクログロブリン配列を含む非ヒト誘導多能性細胞が提供される。一実施形態において、誘導多能性細胞は、本明細書に記載されたような非ヒト動物から得られる。一実施形態において、異種性β２ミクログロブリン遺伝子又はβ２ミクログロブリン配列は、ヒト又はヒト化遺伝子又は配列である。
【０２０１】
本発明のいくつかの実施形態では、本明細書に記載されたマウスは、マウスのプロフェッショナル抗原提示細胞、例えば、Ｂ細胞、単球／マクロファージ、及び／又は樹状細胞上にのみ、キメラヒト／マウスＭＨＣＩＩを発現している。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されたマウスは、１つ又は２つ以上のヒト抗原に対して、免疫応答、例えば、細胞性免疫応答を引き起こす。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されたマウスは、１つ又は２つ以上のヒト抗原に対して、ヒト化Ｔ細胞応答を引き起こす。
【０２０２】
遺伝子組み換えされた非ヒト動物に加えて、非ヒト胚（例えば、げっ歯類、例えば、マウス又はラット胚）もまた提供され、この胚は、本明細書に記述されるように非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、マウス又はラット）に由来するドナーＥＳ細胞を含む。一態様において、胚は、キメラＣＤ４遺伝子、キメラＣＤ８（例えば、ＣＤ８α及び／又はＣＤ８β）遺伝子、ヒト化ＭＨＣＩ（例えば、ＭＨＣＩα）核酸配列、ヒト化ＭＨＣＩＩ（例えば、ＭＨＣＩＩα及び／又はＭＨＣＩＩβ）核酸配列、非再配列ヒト化ＴＣＲ（例えば、ＴＣＲα及び／若しくはＴＣＲβ、又はＴＣＲδ及び／若しくはＴＣＲγ）座、並びに／又はヒト若しくはヒト化β２ミクログロブリン遺伝子配列を含むＥＳドナー細胞と、宿主胚細胞とを含む。
【０２０３】
また、組織であって、組織が、本明細書に記載された非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、マウス又はラット）から得られ、キメラＣＤ４タンパク質、キメラＣＤ８タンパク質（例えば、キメラＣＤ８α及び／又はＣＤ８βタンパク質）、ヒト化ＴＣＲポリペプチド（例えば、ＴＣＲα及び／若しくはＴＣＲβ、又はＴＣＲδ及び／若しくはＴＣＲγポリペプチド）、ヒト化ＭＨＣＩポリペプチド（例えば、ＭＨＣＩα）、ヒト化ＭＨＣＩＩポリペプチド（例えば、ＭＨＣＩＩα及び／若しくはＭＨＣＩＩβポリペプチド）、並びに／又はヒト若しくはヒト化β２ミクログロブリンを発現している、組織も提供される。
【０２０４】
一態様において、キメラヒト／非ヒトＣＤ４分子を製造するための方法であって、本明細書に記載されるようにヌクレオチド構築物からキメラＣＤ４タンパク質を、単独の細胞中で発現させることを含む、方法が提供される。一実施形態において、ヌクレオチド構築物は、ウイルスベクターである。特定の実施形態では、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。一実施形態では、細胞は、ＣＨＯ、ＣＯＳ、２９３、ＨｅＬａ、及びウイルス核酸配列を発現する網膜細胞（例えば、ＰＥＲＣ．６（商標）細胞）から選択される。
【０２０５】
一態様において、キメラＣＤ４タンパク質を発現している細胞が提供される。一実施形態では、細胞は、本明細書に記述されるようにキメラＣＤ４配列を含む発現ベクターを含む。一実施形態では、細胞は、ＣＨＯ、ＣＯＳ、２９３、ＨｅＬａ、及びウイルス核酸配列を発現する網膜細胞（例えば、ＰＥＲＣ．６（商標）細胞）から選択される。
【０２０６】
本明細書に記述されるように非ヒト動物によって作製されるキメラＣＤ４分子もまた提供され、一実施形態では、このキメラＣＤ４分子は、ヒトＣＤ４タンパク質の細胞外ドメインの全て又は実質的に全てのアミノ酸配列、並びに、例えば、マウスＣＤ４タンパク質など非ヒトＣＤ４タンパク質から少なくとも膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを含む。別の実施形態では、本明細書に記載されたような非ヒト動物により製造されたキメラＣＤ４分子であり、キメラＣＤ４分子が、少なくとも、ヒトＣＤ４の全て又は実質的に全てのＤ１ドメイン、例えば、少なくとも、ヒトＣＤ４の全て又は実質的に全てのＤ１〜Ｄ２ドメイン、例えば、少なくとも、ヒトＣＤ４の全て又は実質的に全てのＤ１〜Ｄ３ドメインのアミノ酸配列、例えば、ＭＨＣＩＩ及び／又はＴＣＲの細胞外ドメインとの結合を担うヒトＣＤ４のアミノ酸配列、例えば、ＭＨＣＩＩ及び／又はＴＣＲの可変ドメインとの結合を担うヒトＣＤ４のアミノ酸配列を含み、タンパク質の残り部分（例えば、膜貫通ドメイン、細胞質ドメイン、ヒト化されていない細胞外ドメインの任意の部分）が、内在性非ヒトタンパク質配列から得られる、キメラＣＤ４分子が提供される。例示的なキメラヒト／非ヒトＣＤ４ポリペプチドは、配列番号：７８に示されるアミノ酸配列を含み、キメラポリペプチドのヒト部分は、（配列番号：７９に別に示される）配列番号：７８のアミノ酸２７〜３１９の辺りに広がっている。
【０２０７】
一態様において、キメラヒト／非ヒトＣＤ８分子（例えば、ＣＤ８α及び／又はＣＤ８β）を製造するための方法であって、本明細書に記載されたようなヌクレオチド構築物から、キメラＣＤ８ポリペプチドを、単独の細胞中で発現させることを含む、方法が提供される。一実施形態において、ヌクレオチド構築物は、ウイルスベクターである。特定の実施形態では、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。一実施形態では、細胞は、ＣＨＯ、ＣＯＳ、２９３、ＨｅＬａ、及びウイルス核酸配列を発現する網膜細胞（例えば、ＰＥＲＣ．６（商標）細胞）から選択される。
【０２０８】
一態様において、キメラＣＤ８タンパク質を発現している細胞が提供される。一実施形態において、細胞は、本明細書に記載されるようにキメラＣＤ８配列を含む発現ベクターを含む。一実施形態において、細胞は、ＣＨＯ、ＣＯＳ、２９３、ＨｅＬａ、及びウイルス核酸配列を発現している網膜細胞（例えば、ＰＥＲＣ．６（商標）細胞）から選択される。
【０２０９】
本明細書に記載されるように非ヒト動物により製造されたキメラＣＤ８分子も提供され、キメラＣＤ８分子は、ヒトＣＤ８タンパク質（例えば、ＣＤ８α及び／又はＣＤ８β）からの全て又は実質的に全ての細胞外ドメイン、並びに非ヒトＣＤ８タンパク質、例えば、マウスＣＤ８タンパク質からの膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを少なくとも含む。例示的なキメラＣＤ８αポリペプチドは、配列番号：８８に示され、例示的なキメラＣＤ８βタンパク質は、配列番号：８３に示される。
【０２１０】
本明細書に記載されるように非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、マウス又はラット）により製造されたヒト化ＴＣＲタンパク質も提供され、ヒト化ＴＣＲタンパク質は、ヒト可変領域と、非ヒト定常領域とを含む。このため、ヒト化ＴＣＲタンパク質は、ヒト相補性決定領域（すなわち、ヒトＣＤＲ１、２、及び３）を、その可変ドメイン及び非ヒト定常領域に含む。また、本明細書に記載された非ヒト動物により生成されるヒトＴＣＲ可変ドメインをコードする核酸もまた提供される。
【０２１１】
加えて、本明細書に記述されるように、非ヒト動物から単離された非ヒト細胞が提供される。一実施形態では、細胞はＥＳ細胞である。一実施形態において、細胞は、Ｔ細胞、例えば、ＣＤ４＋  Ｔ細胞である。一実施形態において、細胞は、ヘルパーＴ細胞（ＴＨ細胞）である。一実施形態において、ＴＨ細胞は、エフェクターＴＨ細胞、例えば、ＴＨ１細胞又はＴＨ２細胞である。一実施形態では、細胞は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞である。一実施形態では、細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞である。ヒト可変領域及び非ヒト定常領域を含むＴＣＲタンパク質を発現している非ヒト細胞もまた提供される。ＴＣＲタンパク質は、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、又はこれらの組み合わせを含んでもよい。一実施形態において、細胞は、Ｔ細胞、例えば、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋  Ｔ細胞である。加えて、本明細書で提供された非ヒトＴ細胞は、その細胞表面上に、（ａ）ヒトＴ細胞共受容体の細胞外ドメインを含み、非ヒトＴ細胞共受容体の膜貫通ドメイン及び／又は細胞内ドメインに操作可能に連結している、キメラヒト／非ヒトＴ細胞共受容体、例えば、キメラＣＤ４ポリペプチド又はキメラＣＤ８ポリペプチド、並びに（ｂ）ヒト可変領域及び非ヒト定常領域を含むＴＣＲタンパク質を発現していてもよい。
【０２１２】
別の実施形態では、細胞は、抗原提示細胞である。一実施形態において、抗原提示細胞は、ヒト化ＭＨＣＩ分子上に抗原を提示する。別の実施形態では、抗原提示細胞は、プロフェッショナル抗原提示細胞、例えば、Ｂ細胞、樹状細胞、及びマクロファージである。別の実施形態では、抗原提示細胞は、ヒト化ＭＨＣＩ及び／又はヒト化ＭＨＣＩＩ分子上に抗原を提示する。
【０２１３】
一態様において、キメラヒト／非ヒトＭＨＣＩ及びＭＨＣＩＩタンパク質（例えば、ＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２Ｋ及びＨＬＡ−ＤＲ２／Ｈ−２Ｅタンパク質）を発現している細胞が提供される。一態様において、細胞は、そのＨ−２Ｄ座から、機能的な内在性ＭＨＣポリペプチドを発現していないマウス細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、内在性Ｈ−２Ｄ座の全て又は一部を欠くように操作されたマウス細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、その表面上に、機能的な内在性ＭＨＣＩ及びＭＨＣＩＩポリペプチドを何ら発現していないマウス細胞である。一実施形態において、細胞は、本明細書に記載されるようにキメラＭＨＣクラスＩ配列及びキメラＭＨＣクラスＩＩ配列を含む発現ベクターを含む。一実施形態において、細胞は、ＣＨＯ、ＣＯＳ、２９３、ＨｅＬａ、及びウイルス核酸配列を発現する網膜細胞（例えば、ＰＥＲＣ．６（商標）細胞）から選択される。
【０２１４】
本明細書に記載されたＨＬＡ−ＤＲ２の細胞外ドメインを含むキメラＭＨＣＩＩ複合体は、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体により検出することができる。このため、キメラヒト／非ヒトＭＨＣＩＩポリペプチドを提示している細胞は、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体を使用して、検出及び／又は選択することができる。本明細書に記載されたＨＬＡ−Ａ２の細胞外ドメインを含むキメラＭＨＣＩ複合体は、抗ＨＬＡ−Ａ、例えば、抗ＨＬＡ−Ａ２抗体を使用して検出することができる。このため、キメラヒト／非ヒトＭＨＣＩポリペプチドを提示している細胞は、抗ＨＬＡ−Ａ抗体を使用して、検出及び／又は選択することができる。他のＨＬＡアレルを認識する抗体は、市販されるか、又は生成することができ、検出／選択に使用されてもよい。
【０２１５】
以下の実施例では、ゲノムがキメラヒト／マウスＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２Ｋ及びＨＬＡ−ＤＲ２／Ｈ−２Ｅタンパク質をコードする核酸配列でそれぞれ、マウスＨ−２Ｋ及びＨ−２Ａ及びＨ−２Ｅタンパク質をコードする核酸配列の置換えを含む遺伝子操作動物が記載されているが、当業者であれば、類似する戦略を使用して、他のヒトＭＨＣＩ及びＩＩ遺伝子（他のＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、及びＨＬＡ−Ｃ、並びに他のＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＰ、及びＨＬＡ−ＤＱ遺伝子）を含むキメラを導入することができることを理解するであろう。複数のキメラヒト／非ヒト（例えば、ヒト／げっ歯類、例えば、ヒト／マウス）ＭＨＣＩ及びＭＨＣＩＩ遺伝子を内在性ＭＨＣ座に含むこのような動物もまた提供される。このようなキメラＭＨＣＩ及びＭＨＣＩＩタンパク質の例は、米国特許出願公開第２０１３０１１１６１７号、同第２０１３０１８５８１９号、同第２０１３０１８５８２０号、及び同第２０１４０２４５４６７号、並びに米国特許第８，８４７，００５号に記載され、それぞれが参照により本明細書に組み込まれている。
【０２１６】
また、本明細書に記載されるように非ヒト動物の染色体又はそのフラグメントを含む非ヒト細胞もまた提供される。一実施形態において、非ヒト細胞は、記載されるように非ヒト動物の核を含む。一実施形態において、非ヒト細胞は、核移植の結果として、染色体又はそのフラグメントを含む。
【０２１７】
一態様において、本明細書に記載されるように、キメラＣＤ４ポリペプチドをコードする遺伝子、キメラＣＤ８ポリペプチド（例えば、ＣＤ８α及び／又はＣＤ８βポリペプチド）をコードする遺伝子、ヒト化ＭＨＣＩポリペプチド（例えば、ＭＨＣＩα及び／又はβ２ミクログロブリン）をコードする遺伝子、ヒト化ＭＨＣＩＩポリペプチド（例えば、ＭＨＣＩＩα及び／又はＭＨＣＩＩβ）をコードする遺伝子、並びに／又はヒト化ＴＣＲα及び／若しくはＴＣＲβポリペプチドをコードする非再配列ヒト化ＴＣＲ座を含む非ヒト誘導多能性細胞が提供される。一実施形態において、誘導多能性細胞は、本明細書に記載されるように非ヒト動物から得られる。
【０２１８】
一態様において、本明細書に記載されるように非ヒト動物の細胞から得られた、ハイブリドーマ又はクアドローマが提供される。一実施形態において、非ヒト動物は、マウス又はラットである。
実質的にヒト化されたＴ細胞免疫応答を開始する遺伝子改変非ヒト動物の製造
【０２１９】
本明細書に記載された遺伝子操作非ヒト動物（例えば、遺伝子操作げっ歯類、例えば、マウス又はラット）を製造するための方法もまた提供される。概ね、方法は、（ａ）非ヒト動物のゲノム内に、キメラヒト／非ヒトＴ細胞共受容体ポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列、第２のキメラヒト／非ヒトＴ細胞共受容体ポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列、及び／又は第３のキメラヒト／非ヒトＴ細胞共受容体ポリペプチドをコードする第３のヌクレオチド配列を導入することであって、各キメラＴ細胞共受容体ポリペプチドの非ヒト部分が、非ヒトＴ細胞共受容体の膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを少なくとも含み、各キメラポリペプチドのヒト部分が、ヒトＴ細胞共受容体の細胞外部分（又はその一部）を含む、ことと、（ｂ）非ヒト動物のゲノム内に、少なくとも１つのヒトＶαセグメント及び少なくとも１つのヒトＪαセグメントを含み、非ヒトＴＣＲα定常遺伝子配列に操作可能に連結している非再配列Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α可変遺伝子座、並びに／若しくは少なくとも１つのヒトＶβセグメント、少なくとも１つのヒトＤβセグメント、及び少なくとも１つのヒトＪβセグメントを含み、非ヒトＴＣＲβ定常遺伝子配列に操作可能に連結している、非再配列ＴＣＲβ可変遺伝子座を挿入することと、任意選択的に、（ｃ）ゲノム内に、第１のキメラヒト／非ヒトＭＨＣポリペプチドをコードする第１の核酸配列、第２のキメラヒト／非ヒトＭＨＣポリペプチドをコードする第２の核酸配列、及び／若しくは第３のキメラヒト／非ヒトＭＨＣポリペプチドをコードする第３の核酸配列を配置すること、並びに／又は（ｄ）非ヒト動物のゲノム内に、ヒト若しくはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードするβ２ミクログロブリン座を付加すること、を含む。いくつかの実施形態では、導入する工程、挿入する工程、及び／又は配置する工程は、Ｔ細胞共受容体の細胞外ドメイン、ＴＣＲの可変ドメイン、ＭＨＣポリペプチドの細胞外ドメイン、又はβ２ミクログロブリンの一部をコードする配列を標的化することと、これらを、ヒトＴ細胞共受容体の細胞外ドメイン、ヒトＴＣＲの可変ドメイン、ヒトＭＨＣの細胞外ドメイン、及び／又はβ２ミクログロブリンのヒト部分によりそれぞれ置き換えることと、を含む。
【０２２０】
他の実施形態では、導入すること、挿入すること、配置すること、及び／又は付加することは、同じ種の動物を交雑、例えば、交配させることを含んでもよい。他の実施形態では、導入すること、挿入すること、配置すること、及び／又は付加することは、ＥＳ細胞中での連続的な相同組換えを含む。いくつかの実施形態では、ＥＳ細胞は、１つ又は２つ以上であるが、全てではない所望の遺伝子改変を含むように遺伝子改変された非ヒト動物から得られ、このようなＥＳ細胞中での相同組換えにより、遺伝子改変が完了する。他の実施形態では、導入すること、挿入すること、配置すること、及び／又は付加することは、交雑と、ＥＳ細胞中での相同組換えとの組み合わせ、例えば、動物を同じ種の別の（又は複数の）動物と交雑させることを含んでもよく、動物の一部又は全部が、一回の相同組換え又は連続的な相同組換えイベントにより、遺伝子改変されたＥＳ細胞から生じてもよく、一部のＥＳ細胞は、本明細書で開示された遺伝子改変のうち１つ又は２つ以上を含む非ヒト動物から単離されてもよい。
【０２２１】
いくつかの実施形態では、方法は、実施例に記述されるように、ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）技術を使用して作製された標的化構築物を利用し、この構築物をＥＳ細胞に導入し、標的化されたＥＳ細胞クローンをＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を使用してマウス胚に導入する。標的化構築物は、置き換えられる内在性配列を標的化する５’及び／又は３’ホモロジーアーム、（内在性配列を置き換える）インサート配列、並びに１つ又は２つ以上の選択カセットを含んでもよい。選択カセットは、対象となる構築物が組み込まれた細胞（例えば、ＥＳ細胞）の選択を容易にするために標的化構築物内に挿入されたヌクレオチド配列である。多数の好適な選択カセットが当該技術分野において既知である。一般的には、選択カセットは、特定の抗生物質（例えば、Ｎｅｏ、Ｈｙｇ、Ｐｕｒ、ＣＭ、ＳＰＥＣ等）の存在下においてポジティブ選択を可能にする。加えて、選択カセットは、組み換え部位に隣接してもよく、これは、リコンビナーゼ酵素による処理の際に選択カセットの欠失を可能にする。一般的に用いられる組み換え部位は、それぞれＣｒｅ及びＦｌｐ酵素によって認識されるｌｏｘＰ及びＦｒｔであるが、その他は当該技術分野において周知である。選択カセットは、コード領域の外側の構築物内のどこに位置してもよい。一実施形態において、選択カセットは、５’端のヒトＤＮＡフラグメントに位置している。別の実施形態では、選択カセットは、ヒトＤＮＡフラグメントの３’端に位置している。別の実施形態では、選択カセットは、ヒトＤＮＡフラグメント内に位置している。別の実施形態では、選択カセットは、ヒトＤＮＡフラグメントのイントロン内に位置している。別の実施形態では、選択カセットは、ヒトとマウスとのＤＮＡフラグメントの接合部に位置している。
【０２２２】
一実施形態において、遺伝子操作非ヒト動物を製造するための方法により、内在性ＣＤ４座において、キメラヒト／非ヒトＣＤ４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む動物がもたらされる。一実施形態において、本発明は、本明細書に記載されたキメラヒト／非ヒトＣＤ４ポリペプチドを発現するように、非ヒト動物のＣＤ４座を改変する方法を含む。一実施形態において、本発明は、非ヒト動物、例えば、マウスの内在性ＣＤ４座において、内在性非ヒトＣＤ４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を導入すること、例えば、内在性非ヒトＣＤ４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、キメラヒト／マウスＣＤ４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列により置き換えることを含む、キメラヒト／マウスＣＤ４ポリペプチドを発現するように、マウスのＣＤ４座を改変する方法を提供する。方法の一態様において、キメラヒト／マウスＣＤ４ポリペプチドは、ヒトＣＤ４ポリペプチドの全て又は実質的に全ての細胞外ドメインと、内在性マウスＣＤ４ポリペプチドの少なくとも膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインとを含む。方法の別の態様では、キメラヒト／マウスＣＤ４ポリペプチドは、ヒトＣＤ４ポリペプチドの全て又は実質的に全てのＤ１〜Ｄ２ドメインを含む。更に別の実施形態では、キメラヒト／マウスＣＤ４ポリペプチドは、ヒトＣＤ４ポリペプチドの全て又は実質的に全てのＤ１〜Ｄ３ドメインを含む。更に別の実施形態では、キメラヒト／マウスＣＤ４ポリペプチドは、ＭＨＣＩＩ及び／又はＴ細胞受容体の細胞外ドメインとの相互作用を担うヒトＣＤ４の全て又は実質的に全てのアミノ酸配列を含む。更に別の実施形態では、キメラヒト／マウスＣＤ４ポリペプチドは、ＭＨＣＩＩ及び／又はＴ細胞受容体の可変ドメインとの相互作用を担うヒトＣＤ４の全て又は実質的に全てのアミノ酸配列を含む。
【０２２３】
このため、キメラヒト／非ヒトＣＤ４を含む遺伝子改変動物を生じさせるためのヌクレオチド構築物が提供される。一態様において、ヌクレオチド配列は、５’及び３’ホモロジーアーム、ヒトＣＤ４遺伝子配列（例えば、ヒトＣＤ４細胞外ドメイン遺伝子配列、例えば、ヒトＣＤ４の全て又は実質的に全てのドメインＤ１〜Ｄ２の遺伝子配列、例えば、ヒトＣＤ４の全て又は実質的に全てのドメインＤ１〜Ｄ３及び／又はＤ２〜Ｄ３の遺伝子配列、例えば、ヒトＣＤ４の全て又は実質的に全てのドメインＤ１〜Ｄ４の遺伝子配列）を含むＤＮＡフラグメント、及び組換え部位に隣接する選択カセットを含む。一実施形態において、ヒトＣＤ４遺伝子配列は、ヒトＣＤ４のイントロン及びエキソンを含むゲノム配列である。一実施形態において、ホモロジーアームは、非ヒト（例えば、マウス）ＣＤ４ゲノム配列に対して相同的である。本発明の例示的な構築物は、図５Ａに示される。
【０２２４】
いくつかの実施形態では、方法により、内在性ＣＤ８座において、キメラヒト／非ヒトＣＤ８α及び／又はＣＤ８βポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む動物がもたらされる。一実施形態において、本発明は、本明細書に記載されたキメラヒト／非ヒトＣＤ８ポリペプチドを発現するように、非ヒト動物のＣＤ８座を改変する方法を提供する。一態様において、非ヒト動物、例えば、マウスの内在性ＣＤ８座において、内在性非ヒトＣＤ８ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を導入すること、例えば、内在性非ヒトＣＤ８ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、キメラヒト／マウスＣＤ８ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列により置き換えることを含む、キメラヒト／マウスＣＤ８ポリペプチドを発現するように、マウスのＣＤ８座を改変する方法が提供される。ＣＤ８ポリペプチドは、ＣＤ８α、ＣＤ８β、及びこれらの組み合わせから選択されてもよい。一態様において、キメラポリペプチドは、ヒトＣＤ８ポリペプチドの全て又は実質的に全ての細胞外ドメインと、内在性マウスＣＤ８ポリペプチドの少なくとも膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインとを含む。
【０２２５】
このため、ヒト／非ヒトＣＤ８を含む遺伝子改変動物を生じさせるためのヌクレオチド構築物も提供される。一態様において、ヌクレオチド構築物の配列は、５’及び３’ホモロジーアーム、ヒトＣＤ８α又はＣＤ８β配列を含むＤＮＡフラグメント、及び組換え部位に隣接する選択カセットを含む。いくつかの実施形態では、ヒト配列は、ヒトＣＤ８α又はＣＤ８βのイントロン及びエキソン、例えば、ヒトＣＤ８α又はＣＤ８βの細胞外ドメインをそれぞれコードするエキソンを含む。一実施形態において、ホモロジーアームは、非ヒトＣＤ８α又はＣＤ８β配列に対して相同性である。ＣＤ８α又はＣＤ８βの例示的な構築物は、図５Ｂに示される。
【０２２６】
ＣＤ８α及びＣＤ８βをコードする遺伝子の染色体局在が近いために、２つの遺伝子の連続的な標的化により、ヒト化に成功する機会が改善される。一実施形態において、標的化戦略は、本明細書に記載されたキメラＣＤ８β構築物をＥＳ細胞内に導入することと、標的化ＥＳ細胞からマウスを生じさせることと、マウスから遺伝子改変ＥＳ細胞を得ることと、本明細書に記載されたキメラＣＤ８β構築物を前記遺伝子改変ＥＳ細胞内に導入することとを含む。別の実施形態では、標的化戦略は、本明細書に記載されたキメラＣＤ８β構築物をＥＳ細胞内に導入することと、キメラＣＤ８β構築物が組み込まれている細胞を選択することと、本明細書に記載されたキメラＣＤ８α構築物を、キメラＣＤ８β構築物が組み込まれ、これを保有しているＥＳ細胞内に導入することと、キメラＣＤ８α及びＣＤ８βの両方が組み込まれた細胞を選択することとを含む。この実施形態の一態様において、選択する工程は、様々な選択マーカーを利用して行われる。代替的な実施形態では、ＣＤ８αのヒト化が、最初に達成され得る。遺伝子ターゲティングの完了時、遺伝子改変非ヒト動物のＥＳ細胞をスクリーニングして、当該技術分野において既知の多様な方法（例えば、Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２１（６）：６５２〜６５９に記載されたアレルアッセイの変更）により、対象となる外来性ヌクレオチド配列の組み込みの成功、又は外来性ポリペプチドの発現を確認することができる。
【０２２７】
いくつかの実施形態では、遺伝子改変非ヒト動物を製造するための方法により、ゲノムが、ヒト化非再配列ＴＣＲ座（例えば、ヒト化非再配列ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲδ、及び／又はＴＣＲγ座）を含む、動物がもたらされる。一実施形態において、ヒト可変領域及び非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、マウス又はラット）定常領域を含むＴ細胞受容体をＴ細胞の表面上に発現している、遺伝子改変非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、マウス又はラット）を製造するための方法が提供される。この場合、方法は、第１の非ヒト動物において、内在性非ヒトＴＣＲα可変遺伝子座を挿入すること、例えば、内在性非ヒトＴＣＲα可変遺伝子座を、少なくとも１つのヒトＶαセグメント及び少なくとも１つのヒトＪαセグメントを含む非再配列ヒト化ＴＣＲα可変遺伝子座により置き換えることであって、ヒト化ＴＣＲα可変遺伝子座が内在性ＴＣＲα定常領域に操作可能に連結している、ことと、第２の非ヒト動物において、内在性非ヒトＴＣＲβ可変遺伝子座を挿入すること、例えば、内在性非ヒトＴＣＲβ可変遺伝子座を、少なくとも１つのヒトＶβセグメント、１つのヒトＤβセグメント、及び１つのヒトＪβセグメントを含む非再配列ヒト化ＴＣＲβ可変遺伝子座により置き換えることであって、ヒト化ＴＣＲβ可変遺伝子座が内在性ＴＣＲβ定常領域に操作可能に連結している、ことと、第１及び第２の非ヒト動物を交雑させて、ヒト可変領域及び非ヒト定常領域を含むＴ細胞受容体を発現する非ヒト動物を得ることとを含む。他の実施形態では、本発明は、ゲノムがヒト化非再配列ＴＣＲα座を含む遺伝子改変非ヒト動物、又はゲノムがヒト化非再配列ＴＣＲβ座を含む非ヒト動物を製造する方法を提供する。様々な実施形態において、置換えは、内在性座において行われる。様々な実施形態において、方法は、進歩したヒト化戦略を含み、更なる可変領域セグメントを含む構築物が、ＥＳ細胞内に、ヒト化のその後の各工程において導入され、最終的に、ヒト可変領域セグメントの完全なレパートリを含むマウスがもたらされる（例えば、図４Ａ及び図４Ｂを参照のこと）。
【０２２８】
本開示はまた、本明細書に記載されたヒト化ＴＣＲタンパク質を発現するように、非ヒト動物のＴＣＲ可変遺伝子座（例えば、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲδ、及び／又はＴＣＲγ遺伝子座）を改変する方法を提供する。一実施形態において、本発明は、ヒト化ＴＣＲタンパク質をＴ細胞の表面上に発現するように、ＴＣＲ可変遺伝子座を改変する方法を提供し、方法は、非ヒト動物において、内在性非ヒトＴＣＲ可変遺伝子座を挿入すること、例えば、内在性非ヒトＴＣＲ可変遺伝子座を、非再配列ヒト化ＴＣＲ可変遺伝子座により置き換えることを含む。ＴＣＲ可変遺伝子座がＴＣＲα可変遺伝子座である一実施形態において、非再配列ヒト化ＴＣＲ可変遺伝子座は、少なくとも１つのヒトＶαセグメント及び少なくとも１つのヒトＪαセグメントを含む。ＴＣＲ可変遺伝子座がＴＣＲβ可変遺伝子座である一実施形態において、非再配列ヒト化ＴＣＲ可変遺伝子座は、少なくとも１つのヒトＶβセグメント、少なくとも１つのヒトＤβセグメント、及び１つのヒトＪβセグメントを含む。様々な態様において、非再配列ヒト化ＴＣＲ可変遺伝子座は、対応する内在性非ヒトＴＣＲ定常領域に操作可能に連結している。
【０２２９】
このため、ヒト化ＴＣＲ可変領域遺伝子を含む遺伝子改変動物を生じさせるためのヌクレオチド構築物もまた提供される。一態様において、ヌクレオチド構築物は、５’及び３’ホモロジーアーム、ヒトＴＣＲ可変領域遺伝子セグメントを含むヒトＤＮＡフラグメント、及び組換え部位に隣接する選択カセットを含む。一実施形態において、ヒトＤＮＡフラグメントは、ＴＣＲα遺伝子フラグメントであり、同フラグメントは、少なくとも１つのヒトＴＣＲα可変領域セグメントを含む。別の実施形態では、ヒトＤＮＡフラグメントは、ＴＣＲβフラグメントであり、同フラグメントは、少なくとも１つのヒトＴＣＲβ可変領域遺伝子セグメントを含む。一態様において、少なくとも１つのホモロジーアームは、非ヒトホモロジーアームであり、同アームは、非ヒトＴＣＲ座（例えば、非ヒトＴＣＲα又はＴＣＲβ座）に対して相同性である。
【０２３０】
本発明の様々な態様において、キメラヒト／非ヒトＭＨＣＩ及びＭＨＣＩＩポリペプチドをコードする配列は、内在性非ヒトＭＨＣ座（例えば、マウスＨ−２Ｋ及び／又はＨ−２Ｅ座）に位置している。一実施形態において、これにより、内在性ＭＨＣ遺伝子又はその一部の配置、例えば、ヒト又はヒト化ＭＨＣＩポリペプチドをコードする核酸配列による、内在性ＭＨＣ遺伝子又はその一部の置換えがもたらされる。ＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩα、及びＭＨＣＩＩβポリペプチドをコードする核酸配列が、染色体上で互いに近接して位置しているため、１つの動物において、ＭＨＣＩ及びＭＨＣＩＩ両方のヒト化の最も高い成功を達成するために、ＭＨＣＩ及びＭＨＣＩＩ座は、連続的に標的化されるべきである。こうして、本明細書に記載されるようなキメラヒト／非ヒトＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩα、及びＭＨＣＩＩβポリペプチドをコードする核酸配列を含む遺伝子改変非ヒト動物を生じさせる方法もまた本明細書において提供される。
【０２３１】
こうして、キメラヒト／非ヒトＭＨＣを含む遺伝子改変動物を生じさせるためのヌクレオチド構築物が提供される。一態様において、核酸構築物は、５’及び３’非ヒトホモロジーアーム、ヒトＭＨＣ遺伝子配列（例えば、ヒトＨＬＡ−Ａ２又はヒトＨＬＡ−ＤＲ遺伝子配列）を含むヒトＤＮＡフラグメント、及び組換え部位に隣接する選択カセットを含む。一実施形態において、ヒトＤＮＡフラグメントは、ヒトＭＨＣ遺伝子（例えば、ヒトＨＬＡ−Ａ２又はヒトＨＬＡ−ＤＲ２遺伝子）のイントロン及びエキソンの両方を含むゲノムフラグメントである。一実施形態において、非ヒトホモロジーアームは、非ヒトＭＨＣ座（例えば、ＭＨＣＩ又はＭＨＣＩＩ座）に対して相同性である。
【０２３２】
一実施形態において、５’及び３’非ヒトホモロジーアームは、内在性非ヒト（例えば、マウス）ＭＨＣクラスＩ又はクラスＩＩ遺伝子座の５’及び３’位置（例えば、マウスＭＨＣＩ遺伝子の第１のリーダー配列の５’及びα３エキソンの３’、又はマウスＨ−２Ａｂ１遺伝子の上流及びマウスＨ−２Ｅａ遺伝子の下流）それぞれにおけるゲノム配列を含む。一実施形態において、内在性ＭＨＣクラスＩ座は、マウスＨ−２Ｋ、Ｈ−２Ｄ、及びＨ−２Ｌから選択される。特定の実施形態では、内在性ＭＨＣクラスＩ座は、マウスＨ−２Ｋである。一実施形態において、内在性ＭＨＣＩＩ座は、マウスＨ−２Ｅ及びＨ−２Ａから選択される。一実施形態において、操作ＭＨＣＩＩ構築物により、マウスＨ−２Ｅ及びＨ−２Ａ遺伝子両方の置換えが可能となる。一実施形態において、マウスは、そのＨ−２Ｄ座から、機能的な内在性ＭＨＣポリペプチドを発現していない。いくつかの実施形態では、マウスは、内在性Ｈ−２Ｄ座の全て又は一部を欠くように操作されている。別の実施形態では、マウスは、機能的な内在性ＭＨＣＩ及びＭＨＣＩＩポリペプチドを、細胞表面上に何ら発現していない。一実施形態において、マウスにより細胞表面上に発現されるＭＨＣＩ及びＭＨＣＩＩだけが、キメラヒト／マウスＭＨＣＩ及びＭＨＣＩＩである。
【０２３３】
本開示はまた、ゲノムが、ヒト又はヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードするβ２ミクログロブリン座を含む、遺伝子操作非ヒト動物（例えば、遺伝子操作げっ歯類、例えば、マウス又はラット）を製造する方法を提供する。一態様において、方法により、ゲノムが、内在性β２ミクログロブリン座において、ヒト又はヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、遺伝子操作げっ歯類、例えば、マウスがもたらされる。場合によっては、マウスは、機能的なマウスβ２ミクログロブリンを、内在性マウスβ２ミクログロブリン座から発現していない。いくつかの態様では、方法は、本明細書に記述されるように、例えば、ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）技術を使用して作製された標的化構築物を利用し、この構築物をＥＳ細胞に導入し、標的化されたＥＳ細胞クローンをＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を使用してマウス胚に導入する。
【０２３４】
遺伝子操作非ヒト動物を生成するために使用されるヌクレオチド構築物もまた提供される。ヌクレオチド構築物は、５’及び３’非ヒトホモロジーアーム、ヒトβ２ミクログロブリン配列を含むヒトＤＮＡフラグメント、及び組換え部位に隣接する選択カセットを含んでもよい。一実施形態において、ヒトＤＮＡフラグメントは、ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のイントロン及びエキソンの両方を含むゲノムフラグメントである。一実施形態において、非ヒトホモロジーアームは、非ヒトβ２ミクログロブリン座に対して相同性である。ゲノムフラグメントは、ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエキソン２、３、及び４を含んでもよい。一例において、ゲノムフラグメントは、５’から３’へ、ヒトβ２ミクログロブリン配列の全てである、エキソン２、イントロン、エキソン３、イントロン、及びエキソン４を含む。選択カセットは、β２ミクログロブリンコード領域の外側の構築物内のどこに位置してもよい。例えば、選択カセットは、ヒトβ２ミクログロブリンのエキソン４の３’に位置してもよい。５’及び３’非ヒトホモロジーアームは、内在性非ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のゲノム配列５’及び３’をそれぞれ含んでもよい。別の実施形態では、５’及び３’非ヒトホモロジーアームは、内在性非ヒト遺伝子のエキソン２のゲノム配列５’と、内在性非ヒト遺伝子のエキソン４の３’をそれぞれ含む。
【０２３５】
本発明の別の態様は、本明細書に記載されたヒト又はヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドを発現するように、非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、マウス又はラット）のβ２ミクログロブリン座を改変する方法に関する。ヒト又はヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドを発現するように、非ヒト動物、例えば、マウスのβ２ミクログロブリン座を改変する１つの方法は、内在性β２ミクログロブリン座において、マウスβ２ミクログロブリンをコードするヌクレオチド配列を、ヒト又はヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列により置き換えることを含む。このような方法の一実施形態において、非ヒト動物、例えば、マウスは、機能的なβ２ミクログロブリンポリペプチドを、内在性非ヒト、例えば、マウスβ２ミクログロブリン座から発現していない。いくつかの特定の実施形態では、ヒト又はヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエキソン２〜４に示されるヌクレオチド配列を含む。他の実施形態では、ヒト又はヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエキソン２、３、及び４に示されるヌクレオチド配列を含む。
【０２３６】
本明細書に記載されたヒト化座の様々な例示的な実施形態は、図２〜図５に提示される。
【０２３７】
遺伝子ターゲティングの完了時、ＥＳ細胞又は遺伝子改変非ヒト動物をスクリーニングして、所望の外因性ヌクレオチド配列の成功した取り込み又は外因性ポリペプチドの発現を確認する。数多くの手法が、当業者に既知であり、サザンブロット、ロングＰＣＲ、定量ＰＣＲ（例えば、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）を使用するリアルタイムＰＣＲ）、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ノーザンブロット、フローサイトメトリー、ウェスタン分析、免疫細胞化学、免疫組織化学等が挙げられる（が、これらに限定されない）。一例において、対象となる遺伝子改変を有する非ヒト動物（例えば、マウス）は、Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２１（６）：６５２〜６５９に記載されたアレルアッセイの変形例を使用して、マウスアレルの喪失及び／又はヒトアレルの獲得をスクリーニングすることにより特定され得る。遺伝子改変動物中の特定のヌクレオチド又はアミノ酸配列を特定する他のアッセイは、当業者に既知である。
【０２３８】
いくつかの実施形態では、本明細書において、動物は、交雑により生じる。
【０２３９】
１つの非限定的な態様では、例えば、本明細書に記載されたキメラヒト／非ヒトＣＤ８並びにヒト化ＭＨＣＩ及び／又はβ２ミクログロブリンを含む非ヒト動物は、本明細書に記載されるように、キメラＣＤ８座（例えば、キメラＣＤ８α及び／又はβ座）を含む動物を、ヒト化ＭＨＣＩ及び／又はβ２ミクログロブリン座を含む動物と交雑させることにより生成することができる。動物はまた、ヒト化ＭＨＣＩ及び／又はβ２ミクログロブリン座を含む動物のＥＳ細胞内に、キメラＣＤ８（例えば、キメラＣＤ８α及び／又はβ）をコードするヌクレオチド配列を、例えば、内在性ＣＤ８座（例えば、キメラＣＤ８α及び／又はβ座）での置換のために導入すること、又はキメラＣＤ８座（例えば、キメラＣＤ８α及び／又はβ座）を含む動物のＥＳ細胞内に、ヒト化ＭＨＣＩ及び／又はβ２ミクログロブリンをコードするヌクレオチド配列を導入することにより生成することができる。
【０２４０】
いくつかの実施形態では、キメラＣＤ８座を含む動物は、まず、ヒト化ＴＣＲ可変遺伝子座を含む動物と交雑されて、ヒト化ＣＤ８及びＴＣＲ可変領域座を含む動物を生じさせてもよく、ついで、この動物が、ヒト化ＭＨＣＩ及び／又はβ２ミクログロブリン座を含む動物と交雑されて、ヒト化ＭＨＣＩ、ＴＣＲ可変遺伝子、及び／又はβ２ミクログロブリン座を含む動物を生成することができる。あるいは、まず、ヒト化ＭＨＣＩ及び／又はβ２ミクログロブリン座を含む動物が、ヒト化ＴＣＲ可変遺伝子座を含む動物と交雑されて、ヒト化ＭＨＣＩ及びＴＣＲ可変領域座を含む動物を生成することができ、ついで、この動物が、キメラＣＤ８座を含む動物と交雑されて、ヒト化ＭＨＣＩ、ＴＣＲ可変遺伝子、及び／又はβ２ミクログロブリン座それぞれを含む動物を生成することができる。
【０２４１】
一態様において、キメラヒト／非ヒトＣＤ４及びヒト化ＭＨＣＩＩを含む非ヒト動物は、本明細書に記載されたように、キメラＣＤ４座を含む動物を、ヒト化ＭＨＣＩＩ座を含む動物と交雑させることにより生成することができる。動物は、例えば、内在性ＣＤ４座における置換のために、ヒト化ＭＨＣＩＩ座を含む動物のＥＳ細胞内に、キメラＣＤ４をコードするヌクレオチド配列を導入すること、又はキメラＣＤ４座を含む動物のＥＳ細胞内に、ヒト化ＭＨＣＩＩをコードするヌクレオチド配列を導入することによっても生成することができる。
【０２４２】
いくつかの実施形態では、まず、キメラＣＤ４座を含む動物は、ヒト化ＴＣＲ可変遺伝子座を含む動物と交雑されて、ヒト化ＣＤ４及びＴＣＲ可変領域座を含む動物を生成することができ、ついで、この動物が、ヒト化ＭＨＣＩＩ座を含む動物と交雑されて、ヒト化ＣＤ４、ＭＨＣＩＩ、及びＴＣＲ可変遺伝子座を含む動物を生成することができる。あるいは、まず、含んでいるヒト化ＭＨＣＩＩ座を含む動物が、ヒト化ＴＣＲ可変遺伝子座を含む動物と交雑されて、ヒト化ＭＨＣＩＩ及びＴＣＲ可変領域座を含む動物を生成することができ、ついで、この動物が、キメラＣＤ４座を含む動物と交雑されて、ヒト化ＭＨＣＩＩ、ＴＣＲ可変遺伝子、及び／又はβ２ミクログロブリン座をそれぞれ含む動物を生成することができる。
【０２４３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されたキメラヒト／非ヒトＣＤ８並びにヒト化ＭＨＣＩ及び／又はβ２ミクログロブリンを含む非ヒト動物は、本明細書に記載されるようにキメラＣＤ４座含む動物、及びヒト化ＭＨＣＩＩ座を含む動物と交雑されて、キメラＣＤ４及びＣＤ８ポリペプチド並びにヒト化ＭＨＣＩ（及び／又はβ２ミクログロブリン）及びＭＨＣＩＩ分子を含む非ヒト動物を生成することができる。いくつかの実施形態では、キメラヒト／非ヒトＣＤ４及びＣＤ８ポリペプチド並びにヒト化ＭＨＣＩ及びＭＨＣＩＩ分子を含む動物は、ヒト化ＴＣＲ可変ドメインを含む動物と交雑されて、実質的にヒト化されたＴ細胞免疫系、例えば、キメラヒト／非ヒトＣＤ４及びＣＤ８ポリペプチド、ヒト化ＭＨＣＩ（及び／又はβ２ミクログロブリン）及びＭＨＣＩＩ分子、並びにヒト化ＴＣＲ可変ドメインを含む動物を生成することができる。
【０２４４】
本明細書に記載された遺伝子改変非ヒト動物（例えば、マウス）の任意のものは、キメラヒト／非ヒトＣＤ８（例えば、ＣＤ８α及び／又はＣＤ８β）、キメラヒト／非ヒトＣＤ４、ヒト又はヒト化ＭＨＣＩ、ヒト又はヒト化β２ミクログロブリン、ヒト又はヒト化ＭＨＣＩＩ（例えば、ＭＨＣＩＩα及び／又はＭＨＣＩＩβ）、並びにヒト又はヒト化ＴＣＲ（例えば、ＴＣＲα及び／又はＴＣＲβ）をコードする遺伝子の１つ又は２つのコピーを含んでもよい。したがって、動物は、これらの遺伝子のうちいずれか又は全てについて、ヘテロ接合性又はホモ接合性でもよい。
実質的にヒト化されたＴ細胞免疫応答を開始する遺伝子改変非ヒト動物の使用
【０２４５】
ヒト化ＣＤ４及びＭＨＣＩＩかヒト化ＣＤ８及びＭＨＣＩ（及びβ２ミクログロブリン）のいずれか一方又は両方を含む、遺伝子改変非ヒト動物、例えば、げっ歯類、例えば、マウス又はラットは、Ｔ細胞（それぞれＣＤ４＋  Ｔ細胞又はＣＤ８＋  Ｔ細胞）に対して、ヒト様の方法で、ペプチドを提示する。これは、複合体の実質的に全てのコンポーネントが、ヒトであるか、又はヒト化されているためである。本発明の遺伝子改変非ヒト動物を使用して、免疫応答を引き起こす抗原及び抗原エピトープ（例えば、Ｔ細胞エピトープ、例えば、固有のヒトガンエピトープ）の特定のために、例えば、ワクチン開発に使用するために、ヒト病原体又はガン抗原に対して高い親和性のＴ細胞（すなわち、ヒトＭＨＣＩ複合体に関する抗原に高い結合活性で結合するＴ細胞）の特定のために、例えば、適応Ｔ細胞療法に使用するために、ワクチン候補及び他のワクチン戦略の評価のために、ヒトの自己免疫を研究するために、ヒトの感染性疾患を研究するために、かつ更にはヒトＭＨＣ及びＣＤ４／ＣＤ８発現に基づくより良好な治療戦略を考案するために、ヒトの免疫系の機能をヒト化動物において研究することができる。
【０２４６】
このように、様々な実施形態において、本発明の遺伝子操作動物は、ヒトにおける免疫応答を開始する抗原の能力を評価するために、かつ抗原の多様性を生じさせ、ヒトワクチン開発に使用することができる特定の抗原を特定するためにとりわけ有用である。
【０２４７】
一態様において、ペプチドがヒトにおける細胞性免疫応答を引き起こすか否かを判定する方法が提供され、方法は、本明細書に記載されるように遺伝子改変非ヒト動物をペプチドに曝すことと、非ヒト動物に免疫応答を開始させることと、非ヒト動物において、本明細書に記載されるようにキメラヒト／非ヒトＭＨＣＩ又はＩＩ分子により提示されたペプチドの配列に結合する細胞（例えば、ヒトＣＤ８又はＣＤ４をそれぞれ含むＣＤ８＋  Ｔ細胞又はＣＤ４＋  Ｔ細胞）を検出することと、を含む。一実施形態において、曝露後の非ヒト動物は、ペプチドを結合する、ＭＨＣクラスＩ限定ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を含む。別の実施形態では、曝露後の非ヒト動物は、ペプチドを結合する、ＭＨＣＩＩ限定ＣＤ４＋  Ｔ細胞を含む。
【０２４８】
一態様において、ヒトＴ細胞エピトープを特定するための方法であって、本明細書に記載されるように非ヒト動物を、推定のＴ細胞エピトープを含む抗原に曝すことと、非ヒト動物に免疫応答を開始させることと、非ヒト動物から、エピトープを結合するＭＨＣクラスＩ又はＭＨＣクラスＩＩ限定Ｔ細胞を単離することと、前記Ｔ細胞によって結合したエピトープを特定することと、を含む、方法が提供される。
【０２４９】
一態様において、ヒトにおけるＴ細胞応答を生じさせる抗原を特定するための方法であって、推定の抗原を、本明細書に記載されたマウスに曝すことと、マウスに免疫応答を生じさせることと、ＨＬＡクラスＩ又はクラスＩＩ限定分子によって結合した抗原を特定することと、を含む、方法が提供される。
【０２５０】
一態様において、推定の抗原がヒトの免疫系への曝露時に、ＨＬＡクラスＩ又はクラスＩＩ限定免疫応答を生じさせるであろうエピトープを含有するか否かを判定するための方法であって、本明細書に記載されるように、マウスを推定の抗原に曝すことと、マウスにおいて、抗原特異的ＨＬＡクラスＩ又はクラスＩＩ限定免疫応答を測定することと、を含む、方法が提供される。
【０２５１】
加えて、本明細書に記載された遺伝子操作非ヒト動物は、Ｔ細胞受容体、例えば、高結合活性Ｔ細胞受容体の特定に有用であってもよく、同受容体は、対象となる抗原、例えば、腫瘍又は別の疾患の抗原を認識する。方法は、本明細書に記載された非ヒト動物を抗原に曝すことと、非ヒト動物に抗原に対する免疫応答を開始させることと、非ヒト動物から、ヒト又はヒト化ＭＨＣＩ又はＭＨＣＩＩにより提示された抗原を結合するＴ細胞受容体を含むＴ細胞を単離することと、前記Ｔ細胞受容体の配列を決定することと、を含んでもよい。
【０２５２】
機能的なヒトＴＣＲ  Ｖ（Ｄ）Ｊ遺伝子セグメントの多様なレパートリを発現する非ヒト動物は、ヒトの疾患の研究に有用であり得る。したがって、一実施形態において、本明細書に記載された遺伝子操作非ヒト動物は、ヒトにおいて発現されるＴＣＲレパートリに実質的に類似するＴＣＲレパートリを発現してもよく、例えば、本明細書で開示された非ヒト動物のＴＣＲレパートリは、全ての機能的なヒトＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、及び／又はＴＣＲδ遺伝子セグメントの、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、又は少なくとも約９９％から得ることができる。いくつかの実施形態では、開示されるような非ヒト動物は、以下から得られるＴＣＲレパートリを発現する。
（ｉ）全ての機能的なヒトＴＣＲＶα遺伝子セグメントの、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、若しくは少なくとも約９９％、
（ｉｉ）全ての機能的なヒトＴＣＲＪα遺伝子セグメントの、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、若しくは少なくとも約９９％、
（ｉｉｉ）全ての機能的なヒトＴＣＲＶβ遺伝子セグメントの、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、若しくは少なくとも約９９％、
（ｉｖ）全ての機能的なヒトＴＣＲＤβ遺伝子セグメントの、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、若しくは少なくとも約９９％、及び／又は
（ｖ）全ての機能的なヒトＴＣＲＪβ遺伝子セグメントの、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、若しくは少なくとも約９９％。
【０２５３】
一実施形態において、マウスは、全て又は実質的に全ての機能的なヒトＴＣＲＶα遺伝子セグメントを含み、全て又は実質的に全ての機能的なヒトＴＣＲＶβ遺伝子セグメントを含む、Ｔ細胞レパートリを生成する。一実施形態において、本明細書で提供されたマウスは、ヒトにおいてヒトＴ細胞により利用されるヒトＴＣＲＶα及び／又はＶβ遺伝子の頻度とそれぞれ同様の頻度で、ヒトＴＣＲＶα及び／又はＶβ遺伝子を利用する。非ヒト動物のＴＣＲレパートリにおいて発現された遺伝子セグメントを検出する方法は、例えば、フローサイトメトリー法及び／又はシークエンシング法（例えば、リアルタイムＰＣＲ、次世代シークエンシング等）を含む。
【０２５４】
一実施形態において、推定ヒト治療によるＴ細胞の活性化を判定するための方法であって、本明細書に記載されるように遺伝子改変動物を、推定ヒト治療に曝す（又は、例えば、このような動物のヒト又はヒト化ＭＨＣＩＩ又はＭＨＣＩ発現細胞を推定治療のペプチド配列に曝す）ことと、ヒト又はヒト化ＭＨＣ／ペプチド複合体を提示している遺伝子改変動物の細胞を、遺伝子改変動物の細胞を結合することができるキメラヒト／非ヒト（例えば、ヒト／マウス）ＣＤ４又はＣＤ８を含むＴ細胞に曝すことと、遺伝子改変動物のペプチド提示細胞により誘引されるＴ細胞の活性化を測定することと、を含む、方法が提供される。
【０２５５】
ヒト病原体又は新生物からの抗原及び抗原エピトープを特定する能力に加えて、本発明の遺伝子改変動物を使用して、ヒトの自己免疫疾患、例えば、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症等に関連する自己抗原を特定することができる。また、本発明の遺伝子改変動物を使用して、ヒトの自己免疫疾患の様々な態様を研究することができ、自己免疫疾患モデルとして利用することができる。
【０２５６】
様々な実施形態において、本発明の遺伝子改変非ヒト動物は、その表面上にヒト化ＴＣＲ分子を有するＴ細胞が生成され、その結果として、ヒト様式で、ＭＨＣ複合体により、それらに提示されたペプチドを認識すると考えられる。本明細書に記載された遺伝子改変非ヒト動物を使用して、ヒトＴ細胞の発達及び機能、並びに免疫寛容のプロセスを研究し、ヒトワクチン候補を試験し、ＴＣＲ遺伝子療法のための特定の特異性を有するＴＣＲを生じさせ、疾患関連抗原（例えば、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対するＴＣＲライブラリを生じさせる等を行うことができる。
【０２５７】
Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞）は、対象となる抗原、例えば、ウイルス抗原、細菌抗原、腫瘍抗原等又はそれを提示する細胞を攻撃し、これらの破壊をもたらすことを指向することができるので、当該技術分野におけるＴ細胞療法にますます関心が高まっている。ガンＴ細胞療法における最初の研究は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ：腫瘍抗原に対する反応性を有するＴ細胞をおそらく含む腫瘍塊中のリンパ球集団）を、腫瘍細胞塊から単離し、Ｔ細胞増殖因子を使用してそれらをｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖させ、適応Ｔ細胞移植と呼ばれるプロセスにおいて、それらを患者に戻すことを目的としていた。例えば、Ｒｅｓｔｉｆｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ
ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ：ｈａｒｎｅｓｓｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １２：２６９〜８１；Ｌｉｎｎｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｓｕｃｃｅｓｓ，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１３１：１８０６〜１６を参照のこと。しかしながら、これらの治療の成功は、現在のところ、メラノーマ及び腎細胞ガン腫に限られ、ＴＩＬ適応移植は、規定された腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を特異的に対象とするわけではない。上記Ｌｉｎｎｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．参照。
【０２５８】
対象となる抗原、例えば、ＴＡＡを標的化するためにＴ細胞が選択されるか、又はプログラムされるかのいずれか一方であるＴＣＲ遺伝子療法を開始する試みが行われてきた。現在のＴＣＲ遺伝子療法は、特定の抗原、例えば、腫瘍関連抗原を対象とするＴＣＲの配列の特定に依拠している。例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ及び同僚は、メラノーマ患者から得られた末梢血リンパ球をメラノーマ関連抗原であるＭＡＲＴ−１エピトープに特異的なＴＣＲα及びβ鎖をコードする遺伝子で形質導入し、得られた増殖リンパ球を適応Ｔ細胞療法に使用した、複数の研究を公表している。Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  ｈｕｍａｎ  ａｎｄ  ｍｏｕｓｅ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｎｏｒｍａｌ  ｔｉｓｓｕｅｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｃｏｇｎａｔｅ  ａｎｔｉｇｅｎ，Ｂｌｏｏｄ  １１４：５３５〜４６、Ｍｏｒｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  Ａｆｔｅｒ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１４：１２６〜２９。ＭＡＲＴ−１特異的ＴＣＲは、ＴＩＬ療法後に腫瘍縮小を経験した患者から単離された。しかしながら、このようなＴＣＲ、特に、（おそらく治療的に最も有用であると思われる）高結合活性ＴＣＲの特定は、大部分の腫瘍抗原が自己抗原である事実により分かりにくくなり、これらの抗原を標的化するＴＣＲは、多くの場合、削除されるか、又は主に免疫寛容のために最適以下の親和性を有するかのいずれかである。
【０２５９】
様々な実施形態において、本発明は、非再配列ヒトＴＣＲ可変遺伝子座をそのゲノム中に含む遺伝子操作非ヒト動物を提供することにより、この問題を解決する。本明細書に記載された非ヒト動物は、ヒト化Ｔ細胞受容体の多様なレパートリを有するＴ細胞を生成することができる。このため、本明細書に記載された非ヒト動物は、ヒト化Ｔ細胞受容体、例えば、適応Ｔ細胞移植に使用するための高結合活性ヒト化Ｔ細胞受容体の多様なレパートリのソースであってもよい。
【０２６０】
このため、一実施形態において、本発明は、ヒト抗原に対するＴ細胞受容体を生じさせる方法であって、本明細書に記載された非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、マウス又はラット）を、対象となる抗原により免疫化することと、動物に免疫応答を開始させることと、動物から、対象となる抗原に対する特異性を有する活性化Ｔ細胞を単離することと、抗原特異的Ｔ細胞により発現されたＴ細胞受容体の核酸配列を決定することとを含む、方法を提供する。
【０２６１】
一実施形態において、本発明は、対象となる抗原（例えば、疾患関連抗原）に特異的なヒトＴ細胞受容体を生じさせる方法であって、本明細書に記載された非ヒト動物を、対象となる抗原により免疫化することと、動物に免疫応答を開始させることと、動物から、対象となる抗原に反応性を有するＴ細胞を単離することと、Ｔ細胞により発現されたヒトＴＣＲ可変領域の核酸配列を決定することと、ヒトＴＣＲ可変領域を、ヒトＴＣＲ定常領域の核酸配列を含むヌクレオチド構築物内に、ヒトＴＣＲ可変領域がヒトＴＣＲ定常領域に操作可能に連結しているように、クローニングすることと、構築物から、対象となる抗原に特異的なヒトＴ細胞受容体を発現させることとを含む、方法を提供する。一実施形態において、Ｔ細胞を単離する工程、Ｔ細胞により発現されたヒトＴＣＲ可変領域の核酸配列を決定する工程、ヒトＴＣＲ可変領域をヒトＴＣＲ定常領域の核酸配列を含むヌクレオチド構築物内にクローニングする工程、及びヒトＴ細胞受容体を発現させる工程は、当業者に既知の標準的な技術を使用して行われる。
【０２６２】
一実施形態において、対象となる抗原に特異的なＴ細胞受容体をコードするヌクレオチド配列が、細胞中に発現される。一実施形態において、ＴＣＲを発現している細胞は、ＣＨＯ、ＣＯＳ、２９３、ＨｅＬａ、ＰＥＲＣ．６（商標）細胞等から選択される。
【０２６３】
対象となる抗原は、疾患又は状態を引き起こすか、又はこれらに関連していることが既知の任意の抗原、例えば、腫瘍関連抗原、ウイルス、細菌、又は他の病原体起源の抗原等であってもよい。多くの腫瘍関連抗原が、当該技術分野において既知である。腫瘍関連抗原の選択は、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（Ａ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）ペプチドデータベース（ａｒｃｈｉｖｅ．ｃａｎｃｅｒｉｍｍｕｎｉｔｙ．ｏｒｇ／ｐｅｐｔｉｄｅｄａｔａｂａｓｅ／Ｔｃｅｌｌｅｐｉｔｏｐｅｓ．ｈｔｍ）において提示されている。本発明のいくつかの実施形態では、対象となる抗原は、ヒト抗原、例えば、ヒト腫瘍関連抗原である。いくつかの実施形態では、抗原は、細胞種特異的細胞内抗原であり、Ｔ細胞受容体は、抗原を発現している細胞を殺傷するのに使用される。
【０２６４】
一実施形態において、本明細書では、対象となる抗原、例えば、腫瘍関連抗原に対する特異性を有するＴ細胞を特定する方法であって、本明細書に記載された非ヒト動物を、対象となる抗原により免疫化することと、動物に免疫応答を開始させることと、非ヒト動物から、抗原に対する特異性を有するＴ細胞を単離することとを含む、方法が提供される。
【０２６５】
本発明は、適応Ｔ細胞療法のための新規な方法を提供する。このため、本明細書において、対象（例えば、哺乳類の対象、例えば、ヒトの対象）における疾患又は状態（例えば、ガン）を処置し、又は寛解させる方法であって、本明細書に記載された非ヒト動物を、疾患又は状態に関連する抗原により免疫化することと、動物に免疫応答を開始させることと、動物から、抗原特異的Ｔ細胞集団を単離することと、単離された抗原特異的Ｔ細胞を、対象に注入することとを含む方法が提供される。一実施形態において、本発明は、ヒトの対象における疾患又は状態を処置し、又は寛解させる方法であって、本明細書に記載された非ヒト動物を、対象となる抗原（例えば、疾患又は状態関連抗原、例えば、腫瘍関連抗原）により免疫化することと、動物に免疫応答を開始させることと、動物から、抗原特異的Ｔ細胞集団を単離することと、Ｔ細胞受容体の核酸配列（例えば、抗原特異的Ｔ細胞により発現された、ヒト再配列ＴＣＲα及び／又はヒト再配列ＴＣＲβ可変領域遺伝子をコードする第１及び／又は第２の核酸配列；ヒト再配列ＴＣＲδ可変領域遺伝子又はＴＣＲγ可変領域遺伝子をコードする第３及び／又は第４の核酸配列）を決定することと、Ｔ細胞受容体の核酸配列、例えば、ヒト再配列ＴＣＲα可変領域遺伝子、ヒト再配列ＴＣＲβ可変領域遺伝子、ＴＣＲδ可変領域遺伝子、又はＴＣＲγ可変領域遺伝子をそれぞれコードする第１、第２、第３、及び／又は第４の核酸配列を、発現ベクター（例えば、レトロウイルスベクター）内にクローニングすることであって、例えば、任意選択的に、ヒト再配列ＴＣＲα可変領域遺伝子、ヒト再配列ＴＣＲβ可変領域遺伝子、ＴＣＲδ可変領域遺伝子、又はＴＣＲγ可変領域遺伝子それぞれをコードする第１、第２、第３、及び／又は第４の核酸配列がそれぞれ、ヒトＴＣＲα定常遺伝子、ヒトＴＣＲβ定常遺伝子、ＴＣＲδ定常遺伝子、又はＴＣＲγ定常遺伝子とインフレームにクローニングされる、ことと、ベクターを、対象から得られたＴ細胞内に、Ｔ細胞が抗原特異的Ｔ細胞受容体を発現するように、導入することと、Ｔ細胞を対象に注入することとを含む、方法を提供する。一実施形態において、Ｔ細胞受容体の核酸配列は、対象から得られたＴ細胞内への導入前に、更にヒト化され、例えば、非ヒト定常領域をコードする配列は、ヒトＴＣＲ定常領域に更に似るように改変される（例えば、非ヒト定常領域は、ヒト定常領域により置き換えられる）。いくつかの実施形態では、疾患又は状態は、ガンである。いくつかの実施形態では、抗原特異的Ｔ細胞集団は、対象への注入前に増殖される。いくつかの実施形態では、対象の免疫細胞集団は、抗原特異的Ｔ細胞の注入前に、免疫枯渇される。いくつかの実施形態では、抗原特異的ＴＣＲは、高結合活性ＴＣＲ、例えば、腫瘍関連抗原に対する高結合活性ＴＣＲである。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞である。他の実施形態では、疾患又は状態は、ウイルス又は細菌により引き起こされる。
【０２６６】
別の実施形態では、疾患又は状態は、自己免疫疾患である。ＴＲＥＧ細胞は、自己抗原に対する寛容を維持し、病的な自己反応性を防止するＴ細胞の部分集団である。このため、本明細書において、本明細書に記載された本発明の非ヒト動物における、抗原特異的ＴＲＥＧの発生に依拠する自己免疫疾患を処置する方法が提供される。
【０２６７】
また、本明細書において、対象における疾患若しくは状態（例えば、ガン）を処置し、又は寛解させる方法であって、対象からの疾患又は状態により影響を受けた細胞（例えば、ガン細胞）を、非ヒト動物内に導入することと、動物に、細胞に対する免疫応答を開始させることと、動物から、細胞に対する反応性を有するＴ細胞集団を単離することと、Ｔ細胞により発現されたＴ細胞受容体可変ドメインの核酸配列を決定することと、Ｔ細胞受容体可変ドメインコード配列を、ベクター内に（例えば、ヒトＴＣＲ定常遺伝子に対してインフレームに、かつ、同遺伝子に操作可能に連結して）クローニングすることと、ベクターを、対象から得られたＴ細胞内に導入することと、Ｔ細胞受容体を有する対象のＴ細胞を、対象内に注入することとを含む、方法も提供される。
【０２６８】
また、本明細書において、ヒトＴＣＲ可変ドメイン（例えば、ＴＣＲα及び／又はβ可変ドメイン）をコードする核酸配列を製造するための、本明細書に記載されたような非ヒト動物の使用が提供される。一実施形態において、ヒトＴＣＲ可変ドメインをコードする核酸配列を製造するための方法であって、本明細書に記載された非ヒト動物を、対象となる抗原により免疫化することと、非ヒト動物に、対象となる抗原に対する免疫応答を開始させることと、対象となる抗原に結合するヒトＴＣＲ可変ドメインをコードする核酸配列をそれから得ることとを含む、方法が提供される。一実施形態において、方法は、非ヒトＴＣＲ定常領域に操作可能に連結しているヒトＴＣＲ可変ドメインをコードする核酸配列を製造することを更に含み、方法は、本明細書に記載された非ヒト動物からＴ細胞を単離することと、それから、非ヒト定常領域ＴＣＲ定常領域に連結しているＴＣＲ可変ドメインをコードする核酸配列を得ることと、ＴＣＲ可変ドメインをコードする核酸配列（例えば、ヒト再配列ＴＣＲα可変領域遺伝子、ヒト再配列ＴＣＲβ可変領域遺伝子、ＴＣＲδ可変領域遺伝子、又はＴＣＲγ可変領域遺伝子をそれぞれコードする第１、第２、第３、又は第４の核酸配列）を、適切なヒト定常領域（例えば、それぞれヒトＴＣＲα定常領域遺伝子、ヒトＴＣＲβ定常領域遺伝子、ＴＣＲδ定常領域遺伝子、又はＴＣＲγ定常領域遺伝子）とインフレームにクローニングすることとを含む。
【０２６９】
このため、本明細書において、本明細書に記載された非ヒト動物において生成され、例えば、ヒト再配列Ｖα／Ｊα遺伝子配列及び再配列ヒトＶβＤβＪβ遺伝子配列によりそれぞれコードされた、ＴＣＲ可変領域の核酸配列、例えば、再配列ＴＣＲ可変核酸配列、例えば、再配列ＴＣＲα及び／又はＴＣＲβ可変領域核酸配列が提供される。また、このような再配列ＴＣＲ可変領域の核酸配列によりコードされた、ＴＣＲ可変領域のアミノ酸配列も提供される。本明細書に記載された非ヒト動物において得られた、このような再配列ＴＣＲ可変領域の核酸配列（ＴＣＲα及び／又はＴＣＲβ可変領域の核酸配列）は、ヒトＴＣＲ定常領域（ＴＣＲα及び／又はＴＣＲβ定常領域）と操作可能に連結してクローニングされてもよく、本明細書に記載されたヒトにおける様々な使用に、例えば、ヒトの治療として利用されてもよい。
【０２７０】
また、本明細書において、非ヒト動物を、対象となる抗原（例えば、腫瘍関連抗原）により免疫化することと、非ヒト動物に免疫応答を開始させることと、動物から、対象となる抗原に対する反応性を有するＴ細胞を得ることと、Ｔ細胞から、対象となる抗原に結合するヒト化ＴＣＲタンパク質又はヒトＴＣＲ可変ドメインをコードする核酸配列を得ることと、ヒト化ＴＣＲタンパク質又はヒトＴＣＲ可変ドメインをコードする核酸配列を、ヒトの治療に利用することとを含む、ヒトの治療を行うための、本明細書に記載された非ヒト動物の使用もまた提供される。
【０２７１】
このため、ヒトの治療を行う方法であって、本明細書に記載された非ヒト動物を、対象となる抗原により免疫化することと、非ヒト動物に免疫応答を開始させることと、動物から、対象となる抗原に対する反応性を有するＴ細胞を得ることと、Ｔ細胞から、対象となる抗原に結合するヒト化Ｔ細胞受容体をコードする核酸配列を得ることと、ヒト化（又は完全にヒト）Ｔ細胞受容体を、ヒトの治療に利用することとを含む、方法も提供される。
【０２７２】
一実施形態において、ヒトの治療は、対象となる核酸配列を有する（例えば、対象となる核酸をトランスフェクション、又は形質導入、ないしは導入された）Ｔ細胞（例えば、ヒトＴ細胞、例えば、ヒトの対象から得られたＴ細胞）である。これにより、Ｔ細胞は、対象となる抗原に対して親和性を有するヒト化ＴＣＲタンパク質を発現する。一態様において、治療が利用される対象は、特定の疾患又は状態の治療を必要とし、抗原は、疾患又は状態に関連している。一態様において、Ｔ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞であり、抗原は、腫瘍関連抗原であり、疾患又は状態は、ガンである。一態様において、Ｔ細胞は、対象から得られる。
【０２７３】
別の実施形態では、ヒトの治療は、Ｔ細胞受容体である。一実施形態において、治療受容体は、可溶性Ｔ細胞受容体である。使用治療剤のための可溶性Ｔ細胞受容体又はＴＣＲ可変領域を生成するために、多くの努力が繰り広げられてきた。可溶性Ｔ細胞受容体の生成は、再配列ＴＣＲ可変領域を得ることに依拠する。１つのアプローチは、ＴＣＲα及びＴＣＲβを含む一本鎖ＴＣＲを設計し、ｓｃＦｖ免疫グロブリンフォーマットと同様に、それを、リンカーを介して融合させることである（例えば、国際公開第２０１１／０４４１８６号を参照のこと）。得られたｓｃＴｖは、ｓｃＦｖと同様であれば、熱安定性で可溶性の形態のＴＣＲα／β結合タンパク質を提供すると考えられる。代替的なアプローチは、ＴＣＲβ定常ドメインを有する可溶性ＴＣＲを設計すること（例えば、Ｃｈｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｔｈｒｅｅ−ｄｏｍａｉｎ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９１：１２６５４〜５８を参照のこと）と、非ネイティブなジスルフィド結合を、ＴＣＲ定常ドメイン間の界面に操作すること（Ｂｏｕｌｔｅｒ  ａｎｄ  Ｊａｋｏｂｓｅｎ（２００５）Ｓｔａｂｌｅ，ｓｏｌｕｂｌｅ，ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ，ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：ｎｏｖｅｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｏｒ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｔｉｇｅｎｓ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １４２：４５４〜６０にレビューされている。米国特許第７，５６９，６６４号も参照のこと）と、を含んでいた。他のフォーマットの可溶性Ｔ細胞受容体が記載されている。本明細書に記載された非ヒト動物を使用して、対象となる抗原に対して高い親和性で結合するＴ細胞受容体の配列を決定し、その後に、配列に基づいて、可溶性Ｔ細胞受容体を設計することができる。
【０２７４】
非ヒト動物により発現されたＴＣＲ受容体配列から得られた可溶性Ｔ細胞受容体を使用して、対象となるタンパク質、例えば、ウイルス、細菌、又は腫瘍関連タンパク質の機能を遮断することができる。あるいは、可溶性Ｔ細胞受容体は、感染細胞又はガン細胞を殺傷し得る部分、例えば、細胞殺傷分子（例えば、化学療法剤）、トキシン、放射線核種、プロドラッグ、抗体等に融合されてもよい。可溶性Ｔ細胞受容体はまた、免疫調節分子、例えば、サイトカイン、ケモカイン等に融合されてもよい。可溶性Ｔ細胞受容体はまた、免疫阻害性分子、例えば、Ｔ細胞がＴ細胞により認識された抗原を有する他の細胞を殺傷するのを阻害する分子にも融合されてもよい。免疫阻害性分子に融合したこのような可溶性Ｔ細胞受容体は、例えば、自己免疫を遮断するのに使用され得る。可溶性Ｔ細胞受容体に融合することができる様々な例示的な免疫阻害性分子が、参照により本明細書に組み込まれている、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｌａｎｉｅｒ（２０００）Ｉｍｍｕｎｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９０：８４〜８９にレビューされている。
【０２７５】
本発明はまた、ヒトＴＣＲ再配列、Ｔ細胞発達、Ｔ細胞活性化、免疫寛容等を含む、ヒトＴＣＲに関する免疫応答を研究するための方法を提供する。
【０２７６】
ワクチン候補を検査する方法もまた提供される。一実施形態において、ワクチンが、免疫応答（例えば、Ｔ細胞の増殖、サイトカイン放出等）を活性化し、エフェクター並びにメモリＴ細胞（例えば、セントラル及びエフェクターメモリＴ細胞）の発生をもたらすこととなるかどうかを判定する方法が本明細書において提供される。
【０２７７】
一態様において、キメラＣＤ８タンパク質をその表面上に有するＴ細胞と、キメラＣＤ８に結合する第２の細胞とを含む、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ調製物が提供される。一実施形態において、第２の細胞は、ＭＨＣＩポリペプチド、例えば、キメラヒト／非ヒトＭＨＣＩタンパク質を発現している細胞である。一実施形態において、第１の細胞の表面上のキメラＣＤ８は、第２の細胞の表面上のキメラＭＨＣＩと相互作用する。一実施形態において、キメラＣＤ８タンパク質は、内在性細胞質ゾル分子、例えば、内在性細胞質ゾルシグナル伝達分子（例えば、内在性Ｌｃｋ等）との相互作用を維持している。
【０２７８】
一態様において、キメラＣＤ４タンパク質をその表面上に有するＴ細胞と、キメラＣＤ４に結合する第２の細胞と、を含む、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ調製物が提供される。一実施形態において、第２の細胞は、ＭＨＣＩＩポリペプチド、例えば、キメラヒト／非ヒトＭＨＣＩＩタンパク質を発現している細胞、例えば、ＡＰＣである。一実施形態において、第１の細胞の表面上のキメラＣＤ４は、第２の細胞の表面上のキメラＭＨＣＩＩと相互作用する。一実施形態において、キメラＣＤ４タンパク質は、内在性細胞質ゾル分子、例えば、内在性細胞質ゾルシグナル伝達分子（例えば、内在性Ｌｃｋ等）との相互作用を維持している。
【０２７９】
本明細書に記載された遺伝子改変動物、すなわち、ヒト又はヒト化Ｔ細胞共受容体（例えば、キメラヒト／非ヒトＣＤ４又はＣＤ８）を含み、任意選択的に、ヒト若しくはヒト化ＭＨＣＩＩ又はＩタンパク質を更に含む動物の他の使用は、本開示から明らかであろう。
【実施例】
【０２８０】
以下の実施例は、本発明の方法及び組成物を製造し、使用する方法を、当業者に説明するために提供されるものであり、本発明者らが発明とみなすものの範囲を限定することを意図するものではない。使用された数字（例えば、量、温度など）に対する精度を確保する努力がなされたが、ある程度の実験誤差及び偏差が考慮されるべきである。実施例は、当業者には周知であろう従来の方法の詳細な説明を含まない（分子クローニング技術など）。別途記載のない限り、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏で示され、圧力は大気又はほぼ大気である。
実施例１：ヒト化ＭＨＣマウスの生成
【０２８１】
ヒト化ＭＨＣＩ及びＭＨＣＩＩ座、これに加えて、対応する更なる内在性ＭＨＣＩ及びＭＨＣＩＩ座欠失（ＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２Ｋ、ＨＬＡ−ＤＲ２／Ｈ−２Ｅ、Ｈ−２Ａ−ｄｅｌ、Ｈ−２Ｄ−ｄｅｌ）を含むマウスを操作する際に関与する様々な工程を図３Ａに示す。工程の詳細な説明を以下に示す。
実施例１．１：ヒト化ＭＨＣＩマウスの生成及び特徴決定
【０２８２】
ヒト化ＭＨＣＩマウスの生成は、参照により本明細書に組み込まれている、米国特許出願公開第２０１３０１１１６１７号で以前に記載されている。簡潔に説明すると、ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）技術を使用して、ヒト及びマウスの細菌人工染色体（ＢＡＣ）ＤＮＡからの固有の標的化ベクターの構築により、マウスＨ−２Ｋ遺伝子を、１回の工程でヒト化した（例えば、米国特許第６，５８６，２５１号及びＶａｌｅｎｚｕｅｌａ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｃｏｕｐｌｅ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２１（６）：６５２〜６５９を参照のこと）。マウスＢＡＣクローンＲＰ２３−１７３ｋ２１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのＤＮＡを、相同組換えにより改変して、マウスＨ−２Ｋ遺伝子のα１、α２、及びα３ドメインをコードするゲノムＤＮＡを、ヒトＨＬＡ−Ａ遺伝子のα１、α２、及びα３サブユニットをコードするヒトゲノムＤＮＡにより置き換えた（図２Ａ）。
【０２８３】
具体的には、マウスＨ−２Ｋ遺伝子のα１、α２、及びα３サブユニットをコードするゲノム配列を、ヒトＨＬＡ−Ａ＊０２０１遺伝子のα１、α２、及びα３ドメインをコードするヒトゲノムＤＮＡにより、１回の標的化イベントにおいて、ｌｏｘＰ部位に隣接するヒグロマイシンカセットと、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含めたマウスＨ−２Ｋ座の配列５’を含有する５’マウスホモロジーアームと、マウスＨ−２Ｋ  α３コード配列のゲノム配列３’を含有する３’マウスホモロジーアームとを含む標的化ベクターを使用して、置き換えた。
【０２８４】
５’から３’へ内在性Ｈ−２Ｋ遺伝子座を標的化するための最終的な構築物は、（１）５’ＵＴＲを含む内在性Ｈ−２Ｋ遺伝子の約２００ｂｐのマウスゲノム配列５’を含有する５’ホモロジーアーム、（２）ＨＬＡ−Ａ＊０２０１リーダー配列を含む約１３３９ｐのヒトゲノム配列、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１リーダー／α１イントロン、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１  α１エキソン、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１  α１〜α２イントロン、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１  α２エキソン、約３１６ｂｐのα２〜α３イントロンの５’端、（３）５’ｌｏｘＰ部位、（４）ヒグロマイシンカセット、（５）３’ｌｏｘＰ部位、（６）約３０４ｂｐのα２〜α３イントロンの３’端を含む約５８０ｂｐのヒトゲノム配列、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１  α３エキソン、及び（７）マウスＨ−２Ｋ  α３と膜貫通コード配列との間のイントロンを含む約２００ｂｐのマウスゲノム配列を含有する３’ホモロジーアームを含んだ。標的化ベクターの５’でのマウス／ヒト配列の接合点における１４９個のヌクレオチド配列を、配列番号：９０に示し、標的化ベクターの３’でのヒト／マウス配列の接合点における１５９個のヌクレオチド配列を、配列番号：９１に示す。この標的化ベクターによる相同組換えにより、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１遺伝子のα１、α２、及びα３ドメインをコードするヒトゲノムＤＮＡを含有し、内在性マウスＨ−２Ｋ膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインのコード配列に操作可能に連結している改変マウスＨ−２Ｋ座を作製した。同改変マウスＨ−２Ｋ座により、翻訳時に、キメラヒト／マウスＭＨＣクラスＩタンパク質の形成がもたらされる。標的化構築物に存在する選択カセットは、当該技術分野において既知の様々な方法を使用して、後に除去されてもよい。
【０２８５】
標的化ＢＡＣ  ＤＮＡを使用して、マウスＦ１Ｈ４  ＥＳ細胞をエレクトロポレーションし、キメラＭＨＣクラスＩタンパク質を有核細胞（例えば、Ｔ及びＢリンパ球、マクロファージ、好中球）の表面上に発現するマウスを生じさせるための改変ＥＳ細胞を作製した（例えば、図３Ａに示されたスキームの工程１を参照のこと）。ヒトＨＬＡ配列の挿入を含有するＥＳ細胞を、定量ＴＡＱＭＡＮ（商標）アッセイにより特定した（上記Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ  ｅｔ  ａｌ．（２００３））。
【０２８６】
キメラＭＨＣＩを発現するマウスを生じさせるために、本明細書に記載された標的化ＥＳ細胞を、ドナーＥＳ細胞として使用し、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法によって、８細胞段階マウス胚に導入した（例えば、米国特許第７，２９４，７５４号及びＰｏｕｅｙｍｉｒｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｆ０  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｍｉｃｅ  ｔｈａｔ  ａｒｅ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｆｕｌｌｙ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｄｏｎｏｒ  ｇｅｎｅ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  ＥＳ  ｃｅｌｌｓ  ａｌｌｏｗｉｎｇ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ａｎａｌｙｓｅｓ  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２５（１）：９１〜９９を参照のこと）。キメラＭＨＣクラスＩ遺伝子を独立して有するＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）（完全にドナーＥＳ細胞から得られたＦ０マウス）を、特異的なヒトＨＬＡ−Ａ＊０２０１遺伝子配列の存在を検出するアレルアッセイ（上記Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ  ｅｔ  ａｌ．）の改変を使用した遺伝子型判定によって特定する。この方法により生じたヘテロ接合性マウスを、ホモ接合性に交雑させる。キメラＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２Ｋの発現を、ＨＬＡ−Ａ及びＨ−２Ｋに特異的な抗体を使用するフローサイトメトリーにより確認する。
【０２８７】
キメラＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２Ｋを含む上述の標的化ＥＳ細胞を、実施例１．２〜１．３で記載された更なる遺伝子操作工程に使用して、ヒト化ＭＨＣＩ及びＭＨＣＩＩ座の両方を含み、内在性ＭＨＣＩ及びＭＨＣＩＩ座を欠いているマウスを生じさせた（図３Ａを参照のこと）。
実施例１．２：ＭＨＣＩ及びＭＨＣＩＩ座欠失を含むマウスＥＳ細胞の生成
【０２８８】
内在性ＭＨＣＩＩ座の欠失は、参照により本明細書に組み込まれている、米国特許出願公開第２０１３０１１１６１６号に記載されている。簡潔に説明すると、内在性ＭＨＣクラスＩＩ  Ｈ−２Ａｂ１、Ｈ−２Ａａ、Ｈ−２Ｅｂ１、Ｈ−２Ｅｂ２、及びＨ−２Ｅａ遺伝子の欠失を導入するための標的化ベクターを、ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）遺伝子操作技術（例えば、米国特許第６，５８６，２５１号及び上記Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ  ｅｔ  ａｌ．を参照のこと）を使用して作製した。細菌人工染色体（ＢＡＣ）ＲＰ２３−４５８ｉ２２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ＤＮＡを改変して、内在性ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子Ｈ−２Ａｂ１、Ｈ−２Ａａ、Ｈ−２Ｅｂ１、Ｈ−２Ｅｂ２、及びＨ−２Ｅａを欠失させた。
【０２８９】
具体的には、上流及び下流のホモロジーアームを、Ｈ−２Ａｂ１遺伝子の位置５’及びＨ−２Ｅａ遺伝子の３’それぞれからのマウスＢＡＣ  ＤＮＡのＰＣＲにより得た。これらのホモロジーアームを使用して、細菌相同組換え（ＢＨＲ）により、ＭＨＣクラスＩＩ座の遺伝子Ｈ−２Ａｂ１、Ｈ−２Ａａ、Ｈ−２Ｅｂ１、Ｈ−２Ｅｂ２、及びＨ−２Ｅａを含む約７９ｋｂのＲＰ２３−４５８ｉ２２を欠失させたカセットを作製した。この領域を、ｌｏｘ２３７２部位に隣接するネオマイシンカセットにより置き換えた。最終的な標的化ベクターは、５’から３’に向かって、内在性ＭＨＣクラスＩＩ座のＨ−２Ａｂ１遺伝子に対するマウスゲノム配列５’を含む２６ｋｂのホモロジーアーム、５’ｌｏｘ２３７２部位、ネオマイシンカセット、３’ｌｏｘ２３７２部位、及び内在性ＭＨＣクラスＩＩ座のＨ−２Ｅａ遺伝子に対するマウスゲノム配列３’を含む６３ｋｂのホモロジーアームを含んだ。
【０２９０】
（上述の）ＢＡＣ  ＤＮＡ標的化ベクターを使用して、ヒト化ＭＨＣＩ座を含むマウスＥＳ細胞（上記実施例１．１から、例えば、図３Ａの工程２を参照）をエレクトロポレーションして、内在性ＭＨＣクラスＩＩ座の欠失を含む改変ＥＳ細胞を作製した（Ｈ−２Ａ及びＨ−２Ｅの両方を欠失させた）。欠失した内在性ＭＨＣクラスＩＩ座を含有する陽性ＥＳ細胞を、ＴＡＱＭＡＮ（商標）プローブを使用する定量ＰＣＲアッセイにより特定した（Ｌｉｅ  ａｎｄ  Ｐｅｔｒｏｐｏｕｌｏｓ（１９９８）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：４３〜４８）。欠失させた遺伝子座の上流領域を、プライマー５１１１Ｕ  Ｆ（ＣＡＧＡＡＣＧＣＣＡＧＧＣＴＧＴＡＡＣ、配列番号：１）及び５１１１Ｕ  Ｒ（ＧＧＡＧＡＧＣＡＧＧＧＴＣＡＧＴＣＡＡＣ、配列番号：２）並びにプローブ５１１１Ｕ  Ｐ（ＣＡＣＣＧＣＣＡＣＴＣＡＣＡＧＣＴＣＣＴＴＡＣＡ、配列番号：３）を使用して、ＰＣＲにより確認した。一方、欠失させた遺伝子座の下流領域を、プライマー５１１１Ｄ  Ｆ（ＧＴＧＧＧＣＡＣＣＡＴＣＴＴＣＡＴＣＡＴＴＣ、配列番号：４）及び５１１１Ｄ  Ｒ（ＣＴＴＣＣＴＴＴＣＣＡＧＧＧＴＧＴＧＡＣＴＣ、配列番号：５）並びにプローブ５１１１Ｄ  Ｐ（ＡＧＧＣＣＴＧＣＧＡＴＣＡＧＧＴＧＧＣＡＣＣＴ、配列番号：６）を使用して確認した。標的化ベクターからのネオマイシンカセットの存在を、プライマーＮＥＯＦ（ＧＧＴＧＧＡＧＡＧＧＣＴＡＴＴＣＧＧＣ、配列番号：７）及びＮＥＯＲ（ＧＡＡＣＡＣＧＧＣＧＧＣＡＴＣＡＧ、配列番号：８）並びにプローブＮＥＯＰ（ＴＧＧＧＣＡＣＡＡＣＡＧＡＣＡＡＴＣＧＧＣＴＧ、配列番号：９）を使用して確認した。上流欠失点にわたるヌクレオチド配列（配列番号：１０）は、欠失点に存在するカセット配列に続けて連結している（以下の丸かっこ内に含まれる）欠失点の内在性マウス配列の上流を示し、以下を含んだ。（ＴＴＴＧＴＡＡＡＣＡ  ＡＡＧＴＣＴＡＣＣＣ  ＡＧＡＧＡＣＡＧＡＴ  ＧＡＣＡＧＡＣＴＴＣ  ＡＧＣＴＣＣＡＡＴＧ  ＣＴＧＡＴＴＧＧＴＴ  ＣＣＴＣＡＣＴＴＧＧ  ＧＡＣＣＡＡＣＣＣＴ）ＡＣＣＧＧＴＡＴＡＡ  ＣＴＴＣＧＴＡＴＡＡ  ＧＧＴＡＴＣＣＴＡＴ  ＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴ  ＡＴＧＣＡＴＧＧＣＣ  ＴＣＣＧＣＧＣＣＧＧ。下流欠失点にわたるヌクレオチド配列（配列番号：１１）は、（以下の丸かっこ内に含まれる）欠失点の内在性マウス配列の下流を含む連続的なカセット配列を示し、以下を含んだ。ＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧ  ＣＣＧＧＣＧＣＧＣＣ  ＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴ  ＡＴＡＡＧＧＴＡＴＣ  ＣＴＡＴＡＣＧＡＡＧ  ＴＴＡＴＣＴＣＧＡＧ（ＣＡＣＡＧＧＣＡＴＴ  ＴＧＧＧＴＧＧＧＣＡ  ＧＧＧＡＴＧＧＡＣＧ  ＧＴＧＡＣＴＧＧＧＡ  ＣＡＡＴＣＧＧＧＡＴ  ＧＧＡＡＧＡＧＣＡＴ  ＡＧＡＡＴＧＧＧＡＧ  ＴＴＡＧＧＧＡＡＧＡ）。
【０２９１】
上述のＭＨＣＩヒト化及び内在性ＭＨＣＩＩ欠失の両方を含むＥＳ細胞の生成に続いて、ｌｏｘが導入された（loxed）ネオマイシンカセットを、ＣＲＥを使用して除去した（
例えば、図３Ａの工程３を参照のこと）。具体的には、Ｃｒｅリコンビナーゼをコードするプラスミドを、ＥＳ細胞内にエレクトロポレーションして、ネオマイシンカセットを除去した。Ｎｅｏカセットは、当該技術分野において既知の他の方法を使用して除去してもよい。
【０２９２】
マウスＨ−２Ｄ座を欠失させるために、ＢＨＲを使用して、マウスＢＡＣクローンｂＭＱ−２１８Ｈ２１（Ｓａｎｇｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を改変して、Ｈ−２Ｄ遺伝子の３７５６ｂｐ（ＡＧＴ開始コドンからＴＧＡ終止コドンの３ｂｐ下流まで、マウスＨ−２Ｄのエキソン１〜８）を、５’から３’まで、５’ｌｏｘｐ部位、ＵｂＣプロモータ、ネオマイシン遺伝子、及び３’ｌｏｘｐ部位とインフレームにＬａｃＺ遺伝子を含有する６，０８５ｂｐのカセットにより置き換える。
【０２９３】
（上述の）ＢＡＣ  ＤＮＡ標的化ベクターを使用して、上記ヒト化ＭＨＣＩ座及びマウスＭＨＣＩＩの欠失を含むマウスＥＳ細胞をエレクトロポレーションした（例えば、図３Ａの工程４を参照のこと）。欠失した内在性Ｈ−２Ｄ座を含有する陽性ＥＳ細胞を、上述のとおり、定量ＰＣＲアッセイにより特定した。表２は、定量ＰＣＲアッセイに使用されたプライマー及びプローブを含む。
【表２】
2020115896.tif 000003
実施例１．３：キメラヒト／マウスＭＨＣＩＩ座の導入
【０２９４】
ヒト化ＨＬＡ−ＤＲ２／Ｈ−２Ｅを含むベクターを生成するために、まず、マウスＨ−２Ｅａ遺伝子を、２０１４年９月３０日付けで発効された、参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第８，８４７，００５号の記載に従って改変して、キメラＨ−２Ｅａ／ＨＬＡ−ＤＲＡ１＊０１タンパク質をコードする配列を含むベクターを生成した。
【０２９５】
マウスＨ−２Ｅａ遺伝子については、合成ヒトＨＬＡ−ＤＲ２  β鎖（ＤＲＢ１＊１５０１）を使用して、ＤＲβ１＊０２（１５０１）エキソン及びイントロンを含むベクターを生成し、細菌相同組換えを使用して、キメラＨ−２Ｅａ／ＨＬＡ−ＤＲＡ１＊０１タンパク質を含むベクター内で交換した。Ｈ−２Ｅｂ１遺伝子を、基本的に、米国特許公開第２０１３０１８５８２０号及び米国特許第８，８４７，００５号に記載されたように改変した。これらの公報はそれぞれ、参照により本明細書に組み込まれている。ヒグロマイシン選択カセットを使用した。
【０２９６】
得られたＨＬＡ−ＤＲ２／Ｈ−２Ｅ大型標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）を、図２Ｂ及び図３Ｂに示す。得られたＬＴＶＥＣの様々なヌクレオチド配列結合点（例えば、マウス／ヒト配列結合点、ヒト／マウス配列結合点、又はマウス若しくはヒト配列と選択カセットとの接合点）を、以下の表３にまとめ、配列表に列記する。その配置を、図３Ｂの模式図に示す。以下の表３において、アスタリスク（＊、表の凡例を参照のこと）で印を付けた配列を除いて、マウスの配列を、通常のフォントとする。ヒトの配列を、丸かっこで囲む。Ｌｏｘ配列を、イタリック体とする。クローニング工程中に導入される制限部位及び他のベクターに基づく配列（例えば、マルチプルクローニング部位等）をボールド文字とする。
【表３】
2020115896.tif 000004
アスタリスクで印を付けた配列は、Ｃ５７ＢＬ／６−ＢＡＬＢ／ｃ結合部配列であり、Ｃ５７ＢＬ／６配列を丸かっこで囲む。キメラＨ−２Ｅａ遺伝子のクローニング中に、Ｈ−２ＥａのＣ５７ＢＬ／６アレルのエキソン１及びイントロン１の残り部分を、Ｈ−２ＥａのＢＡＬＢ／ｃアレルからの同等の２６１６ｂｐ領域により置き換えた。Ｈ−２ＥａのＣ５７ＢＬ／６アレルのエキソン１がこの遺伝子を機能しなくする欠失を含有し、一方、Ｈ−２ＥａのＢＡＬＢ／ｃアレルのエキソン１は、機能的であるために、これを行った。より詳細な説明については、参照により本明細書に組み込まれている米国特許第８，８４７，００５号を参照のこと。
【０２９７】
上述した標的化ＢＡＣ  ＤＮＡを使用して、ヒト化ＭＨＣＩ（ＨＬＡ−Ａ２）並びにＭＨＣＩＩ及びＨ−２Ｄ欠失を含むマウスＥＳ細胞をエレクトロポレーションして、キメラＭＨＣＩ及びＭＨＣＩＩ遺伝子を発現し、機能的な内在性マウスＨ−２Ｅ、Ｈ−２Ａ、Ｈ−２Ｋ、及びＨ−２Ｄ座を欠いているマウスを生じさせるための改変ＥＳ細胞を作製した（例えば、図３Ａの工程５を参照のこと）。ヒトＨＬＡ配列の挿入を含有するＥＳ細胞を、表４におけるプライマー及びプローブを使用して、定量ＰＣＲ（ＴＡＱＭＡＮ（商標））アッセイにより特定した。
【表４】
2020115896.tif 000005
１この１つを除く全ての配列をｇａｉｎ−ｏｆ−ａｌｌｅｌｅアッセイにおいて使用する。
【０２９８】
選択カセットは、当業者によって既知の方法で除去され得る。例えば、キメラヒト／マウスＭＨＣクラスＩ座を有するＥＳ細胞を、Ｃｒｅを発現する構築物により、標的化構築物の挿入により導入された「ｌｏｘが導入された」選択カセットを除去するために、トランスフェクションすることができる（例えば、図３Ａの工程６を参照のこと）。選択カセットは、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現するマウスとの交配によって任意追加的に除去することができる。所望により、選択カセットをマウス内に保持する。
【０２９９】
本明細書に記載された全ての改変（図３ＡのＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２Ｋ、ＨＬＡ−ＤＲ２／Ｈ−２Ｅ、Ｈ−２Ａ−ｄｅｌ、Ｈ−２Ｄ−ｄｅｌ）を含有する標的化ＥＳ細胞を、個々の改変用に本明細書に記載されたプライマー／プローブを使用する上述の定量ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイを使用して検証した。更なるプライマー／プローブセットを使用して、カセット削除工程中に、反転クローンが対向する向きに存在するｌｏｘ部位により作製されなかったと判定した。
【０３００】
上述の標的化されたＥＳ細胞をドナーＥＳ細胞として使用し、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法によって８細胞段階マウス胚に導入した（例えば、米国特許第７，２９４，７５４号及び上記のＰｏｕｅｙｍｉｒｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）を参照のこと）。キメラＭＨＣクラス１及びＭＨＣＩＩ遺伝子を独立して有するＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）（完全にドナーＥＳ細胞から得られたＦ０マウス）を、特異的なヒト遺伝子配列の存在を検出するアレルアッセイ（上記のＶａｌｅｎｚｕｅｌａ  ｅｔ  ａｌ．）の改変を使用した遺伝子型判定によって特定した。得られたマウスにおけるＭＨＣ座の遺伝子型の模式図を図３Ｃに示す（＊＊は、全てのマウス系統に存在しないＨ−２Ｌ遺伝子を表わす）。キメラヒト／マウスＭＨＣＩ及びＭＨＣＩＩタンパク質両方の発現を、ヒトＨＬＡ−ＤＲ２及びＨＬＡ−Ａ２に特異的な抗体を使用して確認する。ヘテロ接合性マウスを、ホモ接合性に交雑する。
実施例１．４：ヒト化β２ミクログロブリンマウスの生成
【０３０１】
β２ミクログロブリンマウスの生成は、参照により本明細書に組み込まれている米国特許出願公開第２０１３０１１１６１７号に記載された。簡潔に説明すると、マウスβ２ミクログロブリン（β２ｍ）遺伝子を、ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）技術を使用するヒト及びマウス細菌人工染色体（ＢＡＣ）ＤＮＡからの固有の標的化ベクターの構築により、１回の工程においてヒト化した（例えば、米国特許第６，５８６，２５１号及び上記のＶａｌｅｎｚｕｅｌａ  ｅｔ  ａｌ．を参照のこと）。
【０３０２】
具体的には、標的化ベクターを、ＲＰＣＩ−２３ライブラリ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）由来の、ＢＡＣクローン８９Ｃ２４からのマウスβ２ｍ上流及び下流ホモロジーアームを含有する細菌相同組換えにより生成した。マウスホモロジーアームを操作して、エキソン２から非コードエキソン４の約２６７個のヌクレオチド上流に広がる２．８ｋｂのヒトβ２ｍ  ＤＮＡフラグメントに隣接させた（図２Ｃ）。リコンビナーゼ認識部位（例えば、ｌｏｘＰ部位）に隣接する薬剤選択カセット（ネオマイシン）を、標的化ベクター内に操作して、その後の選択を可能にした。最終的な標的化ベクターを直線化し、Ｆ１Ｈ４マウスＥＳ細胞系統内にエレクトロポレーションした（上記Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ  ｅｔ  ａｌ．）。
【０３０３】
（Ｃｒｅリコンビナーゼの導入により）薬剤選択カセットが除去された標的化されたＥＳ細胞クローンを、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法によって８細胞段階マウス胚に導入した（例えば、米国特許第７，２９４，７５４号及び上記Ｐｏｕｅｙｍｉｒｏｕ  ｅｔ  ａｌ．を参照のこと）。ヒト化β２ｍ遺伝子を有するＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）（ドナーＥＳ細胞に完全に由来するＦ０マウス）を、アレルアッセイ（上記Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ  ｅｔ  ａｌ．）の改変を使用するマウスアレルの損失及びヒトアレルの獲得についてのスクリーニングにより特定した。ヘテロ接合性マウスをホモ接合性に交雑する。ヒトβ２ミクログロブリンの発現を、ヒトβ２ミクログロブリンに特異的な抗体を使用するフローサイトメトリーにより確認した。
実施例２：ヒト化Ｔ細胞受容体マウスの生成
【０３０４】
内在性ＴＣＲ（α又はβ）可変座の欠失及び内在性Ｖ及びＪ又はＶ、Ｄ、及びＪセグメントの置換えを含むマウスを、ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）遺伝子操作技術（例えば、米国特許第６，５８６，２５１号及び上記Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ，Ｄ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（２００３）を参照のこと）を使用して作製する。この場合、細菌相同組換えを使用するＢＡＣライブラリから得られたヒト配列を使用して、マウスＥＳ細胞における内在性マウスＴＣＲ可変座に対してＬＴＶＥＣを標的化する標的化アームに隣接するヒトＴＣＲ可変座のゲノムフラグメントを含む大型標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）を作製する。ＴＣＲアルファ及びベータ座のヒト化の詳細な説明は、参照により本明細書に組み込まれている米国特許第９，１１３，６１６号に記載されている。ＬＴＶＥＣを再度直線化し、Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ  ｅｔ  ａｌ．に従って、マウスＥＳ細胞系統にエレクトロポレーションする。ＥＳ細胞を、ヒグロマイシン又はネオマイシン抵抗性について選択し、マウスアレルの損失又はヒトアレルの獲得をスクリーニングする。
【０３０５】
標的化ＥＳ細胞クローンを、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法によって、８細胞段階（又はそれより早期の）マウス胚に導入する（上記Ｐｏｕｅｙｍｉｒｏｕ  Ｗ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（２００７））。ヒト化ＴＣＲ座を有するＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）（ドナーＥＳ細胞に完全に由来するＦ０マウス）を、アレルアッセイ（上記Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ  ｅｔ  ａｌ．）の改変を使用する内在性ＴＣＲ可変アレルの損失及びヒトアレルの獲得についてのスクリーニングにより特定した。Ｆ０集団を遺伝子型判定し、ホモ接合性に交雑させた。ヒト化ＴＣＲα及び／又はＴＣＲβ可変座についてのマウスホモ接合性を、本明細書に記載されたように作製する。
実施例２．１：ＴＣＲアルファ座のヒト化
【０３０６】
１１０個のＶセグメント及び６０個のＪマウスセグメントに対応するマウスＴＣＲα座における１．５メガ塩基対のＤＮＡを、ヒトＴＣＲαの５４個のＶセグメント及び６１個のＪセグメントに対応する１メガ塩基対のＤＮＡにより、図４Ａに概略され、米国特許第９，１１３，６１６号に記載されている、進歩したヒト化戦略を使用して、置き換えた。ＴＣＲα座の進歩したヒト化戦略に使用される様々な標的化ベクターの結合部核酸配列を表５にまとめ、配列表に含ませる。
【表５】
2020115896.tif 000006
ヒトＴＣＲα可変領域セグメントを、ＩＭＧＴデータベースと同様にナンバリングする。各結合部において、少なくとも１００ｂｐ（各端から約５０ｂｐ）が配列表に含まれる。
【０３０７】
まず、マウスＢＡＣクローンＲＰ２３−６Ａ１４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのＤＮＡを、相同組換えにより改変し、内在性マウスＴＣＲα座のＴＣＲＡＪ１−ＴＣＲＡＪ２８領域を、Ｕｂ−ヒグロマイシンカセット、続けて、ｌｏｘＰ部位により置き換えるための標的化ベクターとして使用した。マウスＢＡＣクローンＲＰ２３−１１７ｉ１９（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのＤＮＡを、相同組換えにより改変し、内在性マウスＴＣＲα及びδ座のＴＣＲＡＶ１周囲（及びＴＣＲＡＶ１を含む）約１５ｋｂの領域を、ＰＧＫ−ネオマイシンカセット、続けて、ｌｏｘＰ部位により置き換えるための標的化ベクターとして使用した。二重標的化染色体（すなわち、これらの標的化ベクターの両方により標的化された１つの内在性マウスＴＣＲα座）を、当該技術分野において既知の核型分類及びスクリーニング法（例えば、ＴＡＱＭＡＮ（商標））により確認した。改変ＥＳ細胞を、ＣＲＥリコンビナーゼで処理することにより、２つのｌｏｘＰ部位間の領域（すなわち、ＴＣＲＡＶ１からＴＣＲＡＪ１の内在性マウスＴＣＲα座からなる領域）の欠失を媒介させ、１つのｌｏｘＰ部位、ネオマイシンカセット、並びにマウス定常及びエンハンサ領域のみを残した。この戦略により、欠失したマウスＴＣＲα／δ座（ＭＡＩＤ１５４０、図４Ａ、２番目の図）が生成された。
【０３０８】
ＴＣＲα用の第１のヒト標的化ベクターは、最初の２つの連続的なヒトＴＣＲα  Ｖ遺伝子セグメント（ＴＲＡＶ４０及び４１）及び６１個のＴＣＲαＪ（５０個が機能的である）遺伝子セグメントを含有した、ＣＴＤ２２１６ｐ１及びＣＴＤ２２８５ｍ０７  ＢＡＣクローン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からの、１９１，６６０ｂｐのヒトＤＮＡを有した。このＢＡＣを、３’マウスホモロジーアームのライゲーション用にＴＣＲα１遺伝子セグメント下流（３’）４０３ｂｐにＮｏｔ１部位を、５’マウスホモロジーアームのライゲーション用に５’ＡｓｉＳＩ部位を含有するように、相同組換えにより改変した。２種類のホモロジーアームを、このヒトフラグメントに対するライゲーションに使用した。３’ホモロジーアームは、ＲＰ２３−６Ａ１４  ＢＡＣクローンからの内在性マウスＴＣＲα配列を含有し、５’ホモロジーアームは、マウスＢＡＣクローンＲＰ２３−１１７ｉ１９からのマウスＴＣＲαＶの内在性ＴＣＲα配列５’を含有した。このマウス−ヒトキメラＢＡＣを、ヒトＴＣＲα遺伝子セグメントとマウスＴＣＲα座における上流のｌｏｘｐ−ｕｂ−ヒグロマイシン−ｌｏｘｐカセットの最初の挿入を行うための標的化ベクター（ＭＡＩＤ１６２６）として使用した。ＭＡＩＤ１６２６標的化ベクターについての結合部核酸配列（配列番号：４６〜４８）を表５に記載する。
【０３０９】
続けて、一連のヒト標的化ベクターを作製し、同ベクターの作製には、ｌｏｘＰ−ネオマイシン−ｌｏｘＰ及びｌｏｘＰ−ヒグロマイシン−ｌｏｘＰ（又はＭＡＩＤ１９７９について、ｆｒｔ−ヒグロマイシン−ｆｒｔ）選択カセットを交互に含む、マウスＢＡＣクローンＲＰ２３−１１７ｉ１９からのマウスＴＣＲαＶの内在性ＴＣＲα配列５’を含有した同じマウス５’アームを利用した。具体的な構築物は、米国特許第９，１１３，６１６号に記載され、図４Ａに示される。各挿入用の結合部配列は、表５及び配列表に含まれている。最終的なＴＣＲα座は、５’ｌｏｘｐ−ｕｂ−ネオマイシン−ｌｏｘＰカセットと、マウスＴＣＲα定常遺伝子及びエンハンサに操作可能に連結している、合計５４個のヒトＴＣＲαＶ（４５個が機能的である）及び６１個のヒトＴＣＲαＪ遺伝子セグメントを含んだ。ＭＡＩＤ１７７１標的化ベクター用の結合部核酸配列（配列番号：５７及び５８）を表５に記載する。
【０３１０】
進歩したヒト化工程の何れかにおいて、選択カセットを、Ｃｒｅ又はＦｌｐリコンビナーゼによる欠失により除去する。加えて、ヒトＴＣＲδ座を、ＴＣＲアルファ配列内に再導入してもよい。
実施例２．２：ＴＣＲβ可変座のヒト化
【０３１１】
３３個のＶマウスセグメント、２個のＤマウスセグメント、及び１４個のＪマウスセグメントに対応するマウスＴＣＲβ座における０．６メガ塩基対のＤＮＡを、ヒトＴＣＲβの６７個のＶマウスセグメント、２個のＤマウスセグメント、及び１４個のＪセグメントに対応する０．６メガ塩基対のＤＮＡにより、図４Ｂに概略され、米国特許第９，１１３，６１６号に記載されている、進歩したヒト化戦略を使用して、置き換えた。ＴＣＲβ座の進歩したヒト化戦略に使用される様々な標的化ベクターの結合部核酸配列を表６にまとめ、配列表に示した。
【表６】
2020115896.tif 000007
ヒトＴＣＲβ可変領域セグメントを、ＩＭＧＴデータベースと同様にナンバリングする。各結合部において、少なくとも１００ｂｐ（各端から約５０ｂｐ）が配列表に含まれる。
【０３１２】
具体的には、マウスＢＡＣクローンＲＰ２３−１５３ｐ１９（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのＤＮＡを、相同組換えにより改変し、内在性マウスＴＣＲβ座における３’トリプシノーゲン（ＴＲＹ）遺伝子クラスタのすぐ上流の１７ｋｂ領域（ＴＣＲＢＶ３０を含む）を、ＰＧＫ−ｎｅｏカセット、続けて、ｌｏｘＰ部位により置き換えるための標的化ベクターとして使用した。マウスＢＡＣクローンＲＰ２３−４６１ｈ１５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのＤＮＡを、相同組換えにより改変し、内在性マウスＴＣＲβ座における５’トリプシノーゲン（ＴＲＹ）遺伝子クラスタ下流の８３５５ｂｐ領域（ＴＣＲＢＶ２及びＴＣＲＢＶ３を含む）を、Ｕｂ−ヒグロマイシンカセット、続けて、ｌｏｘＰ部位により置き換えるための標的化ベクターとして使用した。二重標的化染色体（すなわち、両標的化ベクターにより標的化された１つの内在性マウスＴＣＲβ座）を、当該技術分野において既知の核型分類及びスクリーニング法（例えば、ＴＡＱＭＡＮ（商標））により確認した。改変ＥＳ細胞を、ＣＲＥリコンビナーゼで処理し、５’と３’とのｌｏｘＰ部位間の領域（ＴＣＲＢＶ２からＴＣＲＢＶ３０までの内在性マウスＴＣＲβ座からなる）の欠失を媒介させ、１つのｌｏｘＰ部位、ヒグロマイシンカセット、並びにマウスＴＣＲＢＤ、ＴＣＲＢＪ、定常、及びエンハンサ領域のみを残した。図４Ｂに示されたように、１つのマウスＴＣＲＶβを、トリプシノーゲン遺伝子の５’クラスタ上流に残し、１つのマウスＴＣＲＶβを、マウスＥβの下流に残した。
【０３１３】
ＴＣＲβ用の第１のヒト標的化ベクターは、最初の１４個の連続的なヒトＴＣＲβ  Ｖ遺伝子セグメント（ＴＲＢＶ１８−ＴＲＢＶ２９−１）を含有した、ＣＴＤ２５５９ｊ２  ＢＡＣクローン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からの、１２５，７８１ｂｐのヒトＤＮＡを有した。ＭＡＩＤ１６２５標的化ベクターについての結合部核酸配列（配列番号：５９〜６１）を、表６に記載する。
【０３１４】
マウスＴＣＲβ  Ｄセグメント及びＪセグメントをヒトＴＣＲβＤセグメント及びＪセグメントにより置き換えるために、マウスＢＡＣクローンＲＰ２３−３０２ｐ１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのＤＮＡ及びヒトＢＡＣクローンＲＰ１１−７０１Ｄ１４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのＤＮＡを、相同組換えにより改変し、上記ＴＣＲβＶミニ座（すなわち、ＭＡＩＤ１６２５）を含有した、ＥＳ細胞内での標的化ベクター（ＭＡＩＤ１７１５）として使用した。この改変は、内在性マウスＴＣＲβ座における約１８５４０ｂｐの領域（３’トリプシノーゲン遺伝子のポリＡ下流の１００ｂｐ〜マウスＴＣＲＢＤ１−Ｊ１、マウス定常１、及びマウスＴＣＲＢＤ２−Ｊ２を含んだＤ２クラスタにおけるＪセグメントから下流に１００ｂｐ）を、ヒトＴＣＲＢＤ１−Ｊ１、ｌｏｘＰ  Ｕｂ−ヒグロマイシン−ｌｏｘＰカセット、マウス定常１、ヒトＴＣＲＢＤ２−Ｊ２を含有する約２５４２５ｂｐの配列により置き換えた。二重標的化染色体（すなわち、両標的化ベクターにより標的化された１つの内在性マウスＴＣＲβ座）を、当該技術分野において既知の核型分類及びスクリーニング法（例えば、ＴＡＱＭＡＮ（商標））により確認した。改変ＥＳ細胞を、ＣＲＥリコンビナーゼで処理することにより、ヒグロマイシンカセットの欠失を媒介し、Ｄ１  Ｊクラスタ中のヒトＪセグメントから下流に、１つのｌｏｘＰ部位のみが残る。ＭＡＩＤ１７１５標的化ベクターについての結合部核酸配列（配列番号：６２〜６６）を、表６に記載する。
【０３１５】
続けて、一連のヒト標的化ベクターを作製し、同ベクターの作製には、マウスＢＡＣクローンＲＰ２３−４６１ｈ１５からのマウストリプシノーゲン遺伝子上流周囲の内在性ＴＣＲβ配列と、交互の選択カセットとを含有した同じマウス５’アームを利用した。具体的な構築物は、米国特許第９，１１３，６１６号に記載されており、図４Ｂに示される。各挿入用の結合部配列が表６及び配列表に含まれている。
【０３１６】
最終的に、マウスＴＣＲβ定常遺伝子及びエンハンサに操作可能に連結している合計６６個のヒトＴＣＲβＶ（４７個が機能的である）及びヒトＴＣＲβＤセグメント及びＪセグメントを含有するヒトＴＣＲβミニ座（ＭＡＩＤ１７９２）が生成された。ＭＡＩＤ１７９２標的化ベクター用の結合部核酸配列（配列番号：６９及び７０）を表６に記載する。
【０３１７】
マウスＴＣＲＢＶ３１は、ＴＣＲＢＣ２（第２のＴＣＲＢ定常領域配列）の約９．４ｋｂ  ３’に位置し、他のＴＣＲＢＶセグメントに対して反対向きにある。相当するヒトＶセグメントは、ＴＣＲＢＶ３０であり、これは、ヒトＴＣＲＢ座において、同様の位置に位置している。ＴＣＲＢＶ３１をヒト化するために、マウスＴＣＲＢＶ３１を含有するマウスＢＡＣクローンを、細菌相同組換えにより改変して、ＬＴＶＥＣ  ＭＡＩＤ６１９２を作製した。ＴＣＲＢＶ３１のエキソン１における開始コドンで開始するコード領域全体、イントロン、３’ＵＴＲ、及び組換えシグナル配列（ＲＳＳ）を、相同的なヒトＴＣＲＢＶ３０配列により置き換えた。図４Ｂに、ｈＴＣＲＢＶ３０遺伝子のエキソン１とエキソン２との間のイントロンに位置する選択カセットを示す。
【０３１８】
ＭＡＩＤ６１９２標的化ベクター用の結合部核酸配列（配列番号：７１及び７２）を表６に記載する。ＭＡＩＤ６１９２  ＤＮＡを、ＭＡＩＤ１７９２  ＥＳ細胞内にエレクトロポレーションし、細胞を、マウスＴＣＲＢ３１アレルの損失及びヒトＴＣＲＢ３０アレルの獲得についてスクリーニングする。
【０３１９】
同様の操作戦略を使用して、残った５’マウスＴＣＲβＶセグメントを、任意選択的に欠失させる。
【０３２０】
上記工程のうちいずれかにおいて、選択カセットを、Ｃｒｅ又はＦｌｐリコンビナーゼによる欠失により除去する。
【０３２１】
ヒト化ＴＣＲα可変座についてのマウスホモ接合性を、ヒト化ＴＣＲβ可変座に対してホモ接合性のマウスと交雑させて、ヒト化ＴＣＲα及びＴＣＲβ可変座を含む子孫を形成する。子孫を、ヒト化ＴＣＲα及びヒト化ＴＣＲβ座に対して、ホモ接合性に交雑させる。
【０３２２】
ヒト化ＴＣＲα及びＴＣＲβ可変座を含むマウスは、正常なＴ細胞発達を受け、各種の可変遺伝子セグメントから得られる可変ドメインを発現するＴ細胞受容体を含むことが確認される。
実施例３：Ｔ細胞共受容体座のヒト化
【０３２３】
ＣＤ４及びＣＤ８座（ＣＤ８アルファ及びＣＤ８ベータ座の両方）のヒト化は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれている、米国特許出願公開第２０１４０２４５４６６号に詳細に記載されている。
実施例３．１：ＣＤ４座のヒト化
【０３２４】
具体的には、マウスＣＤ４座を、ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）技術を使用するヒト及びマウス細菌人工染色体（ＢＡＣ）ＤＮＡからの固有の標的化ベクターの構築により、１回の工程において、ヒト化した（例えば、米国特許第６，５８６，２５１号及び上記Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）を参照のこと）。標的化ベクターを生成するために、細菌人工染色体（ＢＡＣ）ＤＮＡを使用する一連の細菌相同組換え（ＢＨＲ）及び他の操作工程を、米国特許出願公開第２０１４０２４５４６６号に詳細に記載されたように行った。
【０３２５】
ヒトＣＤ４標的化ベクターを、ＮｏｔＩにより直線化し、Ｆ１Ｈ４マウスＥＳ細胞内にエレクトロポレーションした。ヒト化ＣＤ４座を有する標的化ＥＳ細胞を、ネオマイシンカセット及びヒトＣＤ４遺伝子と、マウスＣＤ４遺伝子の１つのコピーとの存在を検出したアレルアッセイ（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ  ｅｔ  ａｌ．）の改変を使用する遺伝子型判定により特定した。
【０３２６】
ヒト化ＣＤ４標的化ベクターのＥＳ細胞へ組込みが成功した場合得られる最終的なヒト化ＣＤ４座を図５Ａに示す。ヒトイントロン３−ｌｏｘーｎｅｏカセット結合部（カセットの５’端）にわたる配列を、配列番号：７５に示し、ｌｏｘ−ｎｅｏカセット−ヒトイントロン３結合部（カセットの３’端）にわたる配列を配列番号：７６に示す。両配列を表７にも列記する。図５Ａに示されたｐｇｋ−ｎｅｏカセットを含むヒト化ＣＤ４片の完全な核酸配列を配列番号：７７に示す。ｐｇｋ−ｎｅｏカセットは、配列番号：７７の残基３０７〜２１７６に広がっている。２つのｌｏｘ部位は、残基２６７〜３００及び２１８２〜２２１５に位置している。一方、ヒト配列は、残基１〜２３４及び２２２２〜１８２６３に広がっている。完全なヒト化ＣＤ４タンパク質のアミノ酸配列を、アミノ酸２７〜３１９（配列番号：７９に示す）に広がるヒト配列と共に、配列番号：７８に示す。
【表７】
2020115896.tif 000008
ヒトの配列を、丸かっこで囲む。制限酵素部位（ＰＩ−Ｓｃｅ  Ｉ）を含有する配列をボールド文字とする。選択カセット配列を、イタリック体とする。
【０３２７】
ｌｏｘＰが導入されたネオマイシン抵抗性カセットを、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現するプラスミドのヒト化ＣＤ４座を含有するＥＳ細胞内へのエレクトロポレーションにより除去する。
【０３２８】
ヒト化ＣＤ４座を有し、抵抗性マーカーを有さない標的化ＥＳ細胞を、ネオマイシンカセットの不存在、ヒトＣＤ４遺伝子の１つのコピー及びマウスＣＤ４遺伝子の１つのコピーの存在を検出した遺伝子型判定により特定する。
【０３２９】
上記の標的化されたＥＳ細胞を、ドナーＥＳ細胞として使用し、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法によって８細胞段階マウス胚に導入した（例えば、米国特許第７，２９４，７５４号及びＰｏｕｅｙｍｉｒｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００７、上記）を参照のこと）。キメラＣＤ４遺伝子を独立して有するＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）（完全にドナーＥＳ細胞から得られたＦ０マウス）を、特異的なヒトＣＤ４遺伝子配列の存在を検出するアレルアッセイ（上記Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ  ｅｔ  ａｌ．）の改変を使用した遺伝子型判定によって特定した。ヒト化ＣＤ４タンパク質のＴ細胞表面上での発現を、抗ヒトＣＤ４抗体を使用して検出した。本明細書に記載されたヒト化ＣＤ４タンパク質に対してヘテロ接合性のマウスを、ホモ接合性に交雑させた。
実施例３．２：ＣＤ８座のヒト化
【０３３０】
ＣＤ８α及びＣＤ８β遺伝子は、ゲノム中に、例えば、マウス第６番染色体上に共局在しており、互いに約３７ｋｂ離れて位置している。強い関与により、１つの遺伝子、例えば、ＣＤ８βをまず導入し、続けて、第２の遺伝子、例えば、ＣＤ８αの導入による連続的な標的化を行う。ヒト化の具体的な詳細な工程は、参照により本明細書に組み込まれている、米国特許出願公開第２０１４０２４５４６６号に記載されている。
【０３３１】
簡潔に説明すると、マウスＣＤ８β座を、ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）技術を使用するマウス細菌人工染色体（ＢＡＣ）ＤＮＡからの固有の標的化ベクターの構築により、１回の工程でヒト化した。ＣＤ８エクトドメイン（イントロン１中の５’接合部〜イントロン３中の３’接合部）をコードするマウスエキソン２〜３の相同的なヒト配列による置換えを含有するように、ＢＡＣ  ＲＰ２３−４３１Ｍ６からのＤＮＡを、ＢＨＲにより改変して、大型の標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）ＭＡＩＤ１７３７を生成した（図５Ｂ）。ｌｏｘｐ−Ｕｂ−Ｈｙｇカセットを、イントロン３中の３’接合部に挿入した。得られたベクターの様々な接合部におけるヌクレオチド配列を、表８に列記し、配列表に示す。ヒト化ＣＤ８βタンパク質の完全なアミノ酸配列を、アミノ酸１５〜１６５に広がるヒト配列（配列番号：８４に示す）と共に、配列番号：８３に示す。
【表８】
2020115896.tif 000009
ヒト配列を、丸かっこで囲む。ｌｏｘ部位を、イタリック体とする。制限酵素部位、マルチプルクローニングサイト、及びベクター由来配列を、ボールド文字とする。
【０３３２】
標的化ベクターを、Ｆ１Ｈ４マウスＥＳ細胞内にエレクトロポレーションした。ヒト化ＣＤ８β座を有する標的化ＥＳ細胞を、ヒトＣＤ８β遺伝子の存在を検出したアレルアッセイ（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ  ｅｔ  ａｌ．）の改変を使用する遺伝子型判定により特定した。
【０３３３】
マウスＣＤ８α座もまた、ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）技術を使用するマウス細菌人工染色体（ＢＡＣ）ＤＮＡからの固有の標的化ベクターの構築により、１回の工程でヒト化された。ＣＤ８ａエクトドメイン（マウスエキソン１中のＡｌａコドン２７における５’接合部〜マウスイントロン２中の３’接合部）をコードするマウスエキソン１〜２の相同的なヒト配列（ヒトエキソン２中の５’接合部〜イントロン３中の３’接合部’（図５Ａ））による置換えを含有するように、ＢＡＣ  ＲＰ２３−４３１Ｍ６からのＤＮＡを、ＢＨＲにより改変して、大型の標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）ＭＡＩＤ１７３８を生成した。これにより、エキソン１の始めにマウスリーダー配列が保持される。ｌｏｘ２３７２−Ｕｂ−Ｎｅｏカセットを、ヒト／マウス配列の３’接合部に挿入した。得られたベクターの様々な接合部におけるヌクレオチド配列を、表９に列記し、配列表に示す。ヒト化ＣＤ８αポリペプチドの完全なアミノ酸配列を、アミノ酸２８〜１７９に広がるヒト配列（配列番号：８９に示す）と共に、配列番号：８８に示す。
【表９】
2020115896.tif 000010
ヒト配列を、丸かっこで囲む。ｌｏｘ部位を、イタリック体とする。制限酵素部位、マルチプルクローニングサイト、及びベクター由来配列を、ボールド文字とする。
【０３３４】
上述したヒト化ＣＤ８α標的化ベクターを、ヒト化ＣＤ８ｂ座を含有したマウスＥＳ細胞内にエレクトロポレーションして、ヒト化ＣＤ８ｂ及びＣＤ８ａ座を含む改変ＥＳ細胞を作製した（図５Ｂ）。ヒト化ＣＤ８ｂ及びＣＤ８ａ座を有する標的化ＥＳ細胞を、アレルアッセイ（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ  ｅｔ  ａｌ．）の改変を使用する遺伝子型判定により特定した。
【０３３５】
上述した標的化されたＥＳ細胞を、ドナーＥＳ細胞として使用し、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法によって８細胞段階マウス胚に導入した（例えば、米国特許第７，２９４，７５４号及び上記Ｐｏｕｅｙｍｉｒｏｕ  ｅｔ  ａｌ．を参照のこと）。キメラＣＤ８ｂ遺伝子及びキメラＣＤ８ａ遺伝子を有するＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）（完全にドナーＥＳ細胞から得られたＦ０マウス）を、特異的なヒトＣＤ８ｂ及びＣＤ８ａ遺伝子配列の存在を検出するアレルアッセイ（上記Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ  ｅｔ  ａｌ．）の改変を使用した遺伝子型判定によって特定した。
【０３３６】
ＣＤ８α及びＣＤ８β座における選択カセットは、当業者に既知の方法で除去され得る。本明細書に記載されたヒト化ＣＤ８α及びＣＤ８β座にヘテロ接合性のマウスを、ホモ接合性に交雑させた。ヒト化ＣＤ８α及びＣＤ８βのＴ細胞表面上での発現を、抗ヒトＣＤ８抗体を使用して検出する。
実施例４：ヒト化細胞性免疫系コンポーネントを含むマウスの生成
【０３３７】
ヒト化細胞性免疫系コンポーネントを含むマウスを生じさせるために、様々なコンポーネント、例えば、ＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩα及びβ、ＴＣＲα及びβ、ＣＤ４、ＣＤ８α及びβ、並びにβ２Ｍのヒト化にホモ接合性のマウスを、任意の組み合わせにおいて共に交雑させて、ヒト化されたＴ細胞免疫応答の様々なコンポーネントを有するマウスを作製することができる。例えば、ヒト化ＭＨＣＩを含むマウスを、ヒト化β２Ｍを含むマウスと交雑させて、ヒト化ＭＣＨＩ／β２Ｍを発現しているマウスを生じさせてもよい。様々なコンポーネント、例えば、ＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩα及びβ、ＴＣＲα及びβ、ＣＤ４、ＣＤ８α及びβ、並びにβ２Ｍのヒト化にホモ接合性のマウスを、当該技術分野において既知の方法を使用して、共に交雑させて、９つ全てのヒト化を含むマウス（「ＴＭ  Ｉ／ＩＩ  Ｂ  Ｃ４／８」マウス）を得る。マウスを、当該技術分野において既知の方法を使用して、ホモ接合性に交雑させる。あるいは、各ヒト化遺伝子を含む標的化ベクターを、連続的な標的化により、同じＥＳ細胞内に導入して、９つ全てのヒト化を含むＥＳ細胞を得ることができる。得られたＥＳ細胞を、上記実施例１〜３に記載されたＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法によって８細胞段階マウス胚に導入する。
実施例５：ヒト化細胞性免疫系コンポーネントを含むマウスの特徴決定
【０３３８】
ヒト化ＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩα及びβ、ＴＣＲα及びβ、ＣＤ４、ＣＤ８α及びβ、並びにヒト化β２Ｍについてホモ接合性のマウスを特徴決定した。具体的には、マウスからの脾臓及び胸腺を収集し、単細胞懸濁液を得た。懸濁液を、１２００ｒｐｍ、４℃で、５分間遠心分離して、細胞を沈殿させた。各組織からの細胞を、４ｍＬのＡＣＫ溶解バッファー（ＧＩＢＣＯ）により溶解させて、赤血球を溶解させた。細胞を、細胞ストレーナによりろ過し、遠心分離して沈殿させ、媒体中に再懸濁させ、カウントした。
【０３３９】
図６Ａ〜図６Ｃ及び図９Ａ〜図９Ｃに示されたＣＤ１９、ＣＤ３、ＣＤ４、及びＣＤ８αの細胞表面の発現を、蛍光体コンジュゲート抗体：抗マウスＣＤ３（１７Ａ２、ＢＤ）、抗マウスＣＤ１９（１Ｄ３、ＢＤ）、抗マウスＦ４／８０（ＢＭ８、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、抗マウスＣＤ８α（５３−６．７、ＢＤ）、抗マウスＣＤ４（ＲＭ４−５、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、抗ヒトＣＤ８α（ＳＫ１、ＢＤ）、及び抗ヒトＣＤ４（ＲＰＡ−Ｔ４、ＢＤ）を使用するＦＡＣＳにより分析した。図７Ａ〜図７Ｆ及び図１０Ａ〜図１０ＦにおけるマウスＨ２Ｄｂ、ヒトＨＬＡ分子（ＨＬＡ−Ａ２、Ｂ２ｍ、及びＨＬＡ−ＤＲ）、及びマウスＭＨＣ  ＩＡＩＥ分子の細胞表面の発現を、蛍光体コンジュゲート抗体：抗マウスＣＤ１９（６Ｄ５、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、抗マウスＦ４／８０（ＢＭ８、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、抗マウスＨ２Ｄｂ（ＫＨ９５、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、抗ヒトＨＬＡ−Ａ２（ＢＢ７．２、ＢＤ）、抗ヒトＨＬＡ−ＤＲ（Ｇ４６−６、ＢＤ）、抗ヒトＢ２−ミブログロブリン（mibroglobulin）（２Ｍ２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、及び抗マウスＩＡ
ＩＥ（Ｍ５／１１４．１５．２、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用するＦＡＣＳにより分析した。図７Ｇ及び図１０Ｇにおけるマウス及びヒトＣＤ４及びＣＤ８の細胞表面の発現を、蛍光体コンジュゲート抗体：抗マウスＣＤ３（１７Ａ２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、抗マウスＣＤ４（ＧＫ１．５、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗マウスＣＤ８α（５３−６．７、ＢＤ  ２）、抗マウスＣＤ８β（Ｈ３５−１７．２、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、抗ヒトＣＤ４（ＯＫＴ４、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、抗ヒトＣＤ８α（ＲＰＡ−Ｔ８、ＢＤ  ６）、抗ヒトＣＤ８β（２ＳＴ８．５Ｈ７、ＢＤ）を使用するＦＡＣＳにより分析した。図８及び図１１に示されたＦｏｘＰ３及びＣＤ２５の細胞表面の発現を、ＦＡＣＳ抗ＦｏｘＰ３（ＦＪＫ−１６ｓ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及び抗ＣＤ２５（ＰＣ６１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）により分析した。図９Ｄ〜図９Ｅに示されたＣＤ４４及びＣＤ６２Ｌの細胞表面の発現を、抗ＣＤ４４（ＩＭ７、ＢＤ）及び抗ＣＤ６２Ｌ（ＭＥＬ−１４、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用して分析した。
【０３４０】
全てのフローサイトメトリーを、ＢＤ  Ｆｏｒｔｅｓｓａを使用して行った。データを、ＦｌｏｗＪｏを使用して分析した。
【０３４１】
胸腺における発現を、図６Ａ〜図６Ｃ、図７Ａ〜Ｇ、及び図８に示す。胸腺細胞及びＣＤ３＋細胞の絶対数並びに胸腺Ｔ細胞の全体的な発達は、コントロールマウス及びヒト化ＴＭ  Ｉ／ＩＩ  Ｂ  Ｃ４／８マウスと同等であった（データを示さず）。図６Ａは、ヒト化細胞性免疫系を有するマウス（ＴＭ  Ｉ／ＩＩ  Ｂ  Ｃ４／８）の胸腺におけるＢ細胞及びＴ細胞の割合が、コントロールマウスにおいて見出された割合と同様であることを示している。ＴＭ  Ｉ／ＩＩ  Ｂ  Ｃ４／８マウスの胸腺におけるＦ４／８０細胞の頻度及び数を、コントロールマウスと比較した（図６Ｂ、データを示さず）。また、ヒト化ＣＤ４及びＣＤ８は、非ヒト化コントロールマウスにおけるマウスＣＤ４及びＣＤ８の発現と同様に、９つ全ての細胞性免疫遺伝子についてヒト化されたマウス（ＴＭ  Ｉ／ＩＩ  Ｂ  Ｃ４／８）の胸腺細胞上に発現される（図６Ｃ）。ヒト化β２Ｍは、ヒト化ＴＭ  Ｉ／ＩＩ  Ｂ  Ｃ４／８マウスにおけるＢ細胞及びマクロファージの表面上に発現される。一方、その発現は、コントロールマウスのＢ細胞及びマクロファージからは見られない（図７Ａ及び図７Ｂ）。同様に、ヒト化ＭＨＣＩ及びＩＩは、ヒト化ＴＭ  Ｉ／ＩＩ  Ｂ  Ｃ４／８マウスのＢ細胞及びマクロファージの両方の表面上に提示される（図７Ｃ及び図７Ｄ）。一方、マウスＭＨＣクラスＩ及びＩＩ分子は検出できなかった（図７Ｅ及び図７Ｆ）。ヒト化ＣＤ４、ＣＤ８α、及びＣＤ８βは、ヒト化ＴＭ  Ｉ／ＩＩ  Ｂ  Ｃ４／８マウスから得られたＣＤ３＋胸腺細胞の表面上に発現されるが、コントロールマウスにおけるＣＤ３＋胸腺細胞からは見られない（図７Ｇ）。ヒト化ＴＭ  Ｉ／ＩＩ  Ｂ  ＣＤ４／８は、レギュラトリーＴ細胞（Ｔｒｅｇ）（図８）、ＮＫ細胞（ＣＤ３３５＋ＣＤ３＋）及び単球（ＣＤ１１ｂ＋）を生じさせる（データを示さず）。
【０３４２】
脾臓における発現を、図９Ａ〜図９Ｄ及び図１０Ａ〜図１０Ｇに示す。細胞性免疫系コンポーネントについてヒト化されたマウス（ＴＭ  Ｉ／ＩＩ  Ｂ  Ｃ４／８）の脾臓は、同等の絶対数のＣＤ３＋細胞、並びに、ほぼ正常な割合のＢ細胞及びＴ細胞を含んだ（図９Ａ、データを示さず）。ＴＭ  Ｉ／ＩＩ  Ｂ  Ｃ４／８マウスの脾臓におけるＦ４／８０細胞の頻度及び数を、コントロールマウスと比較した（図９Ｂ、データを示さず）。細胞性免疫系コンポーネントについてヒト化されたマウス（ＴＭ  Ｉ／ＩＩ  Ｂ  Ｃ４／８）は、ヒト化ＣＤ４及びＣＤ８αを、ＣＤ３＋脾細胞上に発現した（図９Ｃ）。ヒト化ＴＭ  Ｉ／ＩＩ  Ｂ  Ｃ４／８マウスは、メモリエフェクター（ＣＤ４４＋ＣＤ６２Ｌ−）ＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔ細胞、並びにセントラルメモリ（ＣＤ４４＋ＣＤ６２Ｌ＋）ＣＤ８＋  Ｔ細胞を含んだ（図９Ｄ及び図９Ｅ）。
【０３４３】
図１０Ａ及び図１０Ｂに示されたように、ヒト化β２Ｍは、ヒト化ＴＭ  Ｉ／ＩＩ  Ｂ
Ｃ４／Ｂマウスの脾臓におけるＢ細胞及びマクロファージの表面上に発現される。一方、その発現及びマウスＭＨＣ分子の発現は、コントロールマウスの脾臓におけるＢ細胞及びマクロファージからは見られない。同様に、ヒト化ＭＨＣＩ及びＩＩは、ヒト化ＴＭ  Ｉ／ＩＩ  Ｂ  Ｃ４／Ｂマウスの脾臓におけるＢ細胞及びマクロファージの両方の表面上に提示される（図１０Ｃ及び図１０Ｄ）。一方、マウスＭＨクラスＩ及びＩＩ分子は検出されなかった（図１０Ｅ及び図１０Ｆ）。ヒト化ＣＤ４、ＣＤ８α、及びＣＤ８βは、ヒト化ＴＭ  Ｉ／ＩＩ  Ｂ  Ｃ４／８マウスから得られたＣＤ３＋脾細胞の表面上に発現されるが、コントロールマウスにおけるＣＤ３＋脾細胞からは見られない（図１０Ｇ）。ＴＭ  Ｉ／ＩＩ  Ｂ  Ｃ４／８マウスは、コントロールマウスと比較して、脾臓レギュラトリーＴ細胞の正常に近い発現を有し（図１１）、脾臓ＮＫ細胞（ＣＤ３３５＋ＣＤ３−）及び単球（ＣＤ１１ｂ＋）を発現する。
実施例６：ヒトペプチドによるＴ細胞に対する提示及び同Ｔ細胞の活性化の評価
【０３４４】
ヒト化された細胞性免疫系コンポーネントを含むマウスがヒト化Ｔ細胞免疫応答を示したかどうかを判定するために、ヒトＨＬＡ−Ａ２により特異的に提示されるペプチドであるＭＡＧＥ−Ａ３を提示し、ＭＡＧＥ−Ａ３に応答する、細胞性免疫系コンポーネントについてヒト化されたマウス（ＴＭ  Ｉ／ＩＩ  Ｂ  Ｃ４／８）からの脾細胞の能力を試験した。
【０３４５】
ヒトＨＬＡ−Ａ２により特異的に提示されるペプチドであるＭＡＧＥ−Ａ３を合成し（Ｃｅｌｔｅｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＰＢＳ中に希釈し、２００μｇのＭＡＧＥ−Ａ３が２００μＬのエマルションに含有されるように、フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ、Ｃｈｏｎｄｒｅｘ、Ｉｎｃ．）と等量で混合した。５０μＬのエマルションを、各動物に４スポットで注入した。２つのスポットをそれぞれ、ヒト化ＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩα及びβ、ＴＣＲα及びβ、ＣＤ４、ＣＤ８α及びβ、並びにβ２Ｍについてホモ接合性のマウス（ＴＭ  Ｉ／ＩＩ  Ｂ  ＣＤ４／８）、又は内在性ＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩα及びβ、ＴＣＲα及びβ、ＣＤ４、ＣＤ８α及びβ、並びにβ２Ｍを発現しているコントロールマウスの脇腹後部とし、２つのスポットをそれぞれ、これらのマウスの各肩付近とする。
【０３４６】
免疫化マウスからの脾臓懸濁液を得て、分離させる。赤血球を、ＡＣＫ溶解バッファー（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中において溶解させ、脾細胞を、ＲＰＭＩ完全培地中において懸濁させる。２×１０５個の単離された脾細胞を、ＭＡＧＥ−Ａ３ペプチドの不存在下において、又は１０μｇ／ｍＬ若しくは１μｇ／ｍＬの希釈されたＭＡＧＥ−３Ａペプチドの存在下において、５μｇ／ｍＬのマウスＩＦＮγ捕捉抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でコートされたＰＶＤＦプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）のウェルあたりに、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて試験した。ペプチドとの１６〜２０時間のインキュベーション後に、プレートを洗浄し、ビオチン化検出抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と共にインキュベートし、洗浄し、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（ＭａｂＴｅｃｈ）により処理し、洗浄し、ＴＭＢ基質（Ｍａｂｔｅｃｈ）により発色させ、ＡＩＤ  Ｅｌｉｓｐｏｔリーダーによりカウントする。
【０３４７】
遺伝子型当たりに１匹のマウスのみを示すが、各遺伝子型の複数のマウスを試験した。全てのサンプルを、エラーバーで示される標準偏差を伴って、トリプリケートで実行した。図１２に示されるように、ヒト化ＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩα及びβ、ＴＣＲα及びβ、ＣＤ４、ＣＤ８α及びβ、並びにβ２Ｍのそれぞれについてホモ接合性のマウス（ＴＭ  Ｉ／ＩＩ  Ｂ  ＣＤ４／８）からのサンプルのみが、ＨＬＡ−Ａ２特異的ペプチドＭＡＧＥ−Ａ３による処理後に、ＩＦＮγを分泌することにより応答した。このことは、これらのマウスからのＴ細胞が、ヒト化ＨＬＡ−Ａ２によるＭＡＧＥ−Ａ３の提示後に活性化されたことを示している。
実施例７：ＬＣＭＶ感染モデルを使用したＴ細胞機能の評価
【０３４８】
ヒト化された細胞性免疫系コンポーネントを含むマウスが感染に対して正常な応答を示したかどうかを判定するために、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）を取り除くヒト化マウスの能力を試験した。ＬＣＭＶは、マウス指向性ウイルスであり、感染の成り行きはウイルスの株に依存する。アームストロング株への暴露は、急性の感染をもたらし、マウスは、ウイルスに対するＴ細胞応答を迅速に開始し、約１週間で感染を取り除くことができる。他方では、クローン１３ウイルスを取り除くことはできず、Ｔ細胞は、「疲弊」になり（Ｔ細胞疲弊に関連するマーカー、例えば、ＰＤ１、Ｌａｇ３、Ｔｉｍ３を発現する）、慢性感染が確立される。ＣＤ８枯渇又はＭＨＣクラスＩ欠損マウスのアームストロング株による感染により、高ウイルス力価の維持がもたらされる（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：８０５６〜６３（１９９４））ことが示されている。このため、ウイルス感染が、Ｔ細胞活性に依存するので、ＬＣＭＶは、Ｔ細胞の機能を試験するための理想のモデルである。
【０３４９】
ヒト化された細胞性免疫系コンポーネント、例えば、ＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩα及びβ、ＴＣＲα及びβ、ＣＤ４、ＣＤ８α及びβ、並びにβ２Ｍを含むマウスが、正常なＴ細胞機能を示すかどうかを判定するために、コントロール及びヒト化（ＴＭ  Ｉ／ＩＩ  Ｂ  ＣＤ４／８）マウスの両方に、２×１０５ｆｆｕのアームストロングウイルス株を、ｉ．ｐ．で０日目に感染させた。３日目、６日目、９日目、及び１２日目に、臓器を収集し、ウイルス力価を測定した。図１３Ａに示されたように、コントロール及びヒト化マウスは両方とも、アームストロング感染を取り除くことができた。
【０３５０】
また、コントロール及びヒト化マウスの両方に、４．５×１０５ｆｆｕのクローン１３ウイルスも、ｉ．ｖ．で０日目に感染させ、２１日目に、臓器を収集し、ウイルス力価を測定した。図１３Ｂに示されるように、両マウス系統は、慢性ＬＣＭＶ感染を確立することができた。Ｔ細胞疲弊のマーカーであるＰＤ１、Ｌａｇ３、及びＴｉｍ３を発現するヒト化マウスの能力もまた測定した。血液を、未感染マウス及び感染後３週間の感染ヒト化マウスから採取し、ＰＥ−Ｃｙ７コンジュゲート抗ＰＤ１抗体（ＢＩＯＬＥＧＥＮＤ）、ＰｅｒＣｐＣｙ５．５コンジュゲートＬａｇ３抗体（ＢＩＯＬＥＧＥＮＤ）、及びＰＥコンジュゲートＴｉｍ３抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）によるフローサイトメトリーを使用して染色した。図１３Ｃにおけるデータは、示された受容体について陽性の細胞染色の定量である。ヒト化（ＴＭ  Ｉ／ＩＩ  Ｂ  ＣＤ４／８）マウス及びコントロールＢ６マウスは両方とも、Ｔ細胞疲弊の３つ全てのマーカーを、慢性ＬＣＭＶクローン１３株による感染後３週間で発現した。
【０３５１】
細胞性免疫系コンポーネントについてヒト化されたマウスにおけるメモリＴ細胞応答を評価するために、５匹のコントロールマウス及び４匹のヒト化マウスに、２×１０５ｆｆｕのアームストロングウイルス株を感染させ、１７日目に、４．５×１０５ｆｆｕのクローン１３株を重感染させた（ヒト化及びコントロールマウスのそれぞれ２匹を更なるコントロールとしてモック感染させた）。最初の感染後の３１日目に、臓器を収集し、ウイルス力価を分析した。図１４に示されるように、急性ＬＣＭＶ感染を経験したコントロールマウスの５／５及びヒト化マウスの３／４は、その後の慢性ＬＣＭＶ感染から保護された。このことは、インタクトなメモリＴ細胞が、これらの動物の中で応答していることを証明している。
【０３５２】
細胞性応答の性質を分析するために、コントロール及びヒト化マウスに、２×１０５ｆｆｕのアームストロングウイルス株を、０日目に感染させた。１０日目（図１５Ａ及び図１５Ｂ）又は感染後の示された時点（図１５Ｃ及び図１５Ｄ）に、細胞性応答の特異性を、ヒトＣＤ８＋  Ｔ細胞を活性化することが既知の３つのＨＬＡ−Ａ２限定ペプチド（ＧＰＣ１０−１８、Ｎ６９−７７、又はＺ４９−５８）（Ｂｏｔｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８１：２３０７〜１７を参照のこと）、又は、Ｈ−２Ｄｂバックグラウンドにおいてマウスにより認識される免疫優勢ＬＣＭＶペプチドドであるｇｐ３３を使用して分析した。具体的には、ＣＤ８＋  Ｔ細胞を、収集された脾臓から単離し、ペプチドでパルスした。ＣＤ８＋細胞生成インターフェロンγ（ＩＦＮγ）を、ＥＬＩＳｐｏｔにより（図１５Ａ及び図１５Ｂ）、又は細胞内ＩＦＮγについての染色により（図１５Ｃ及び図１５Ｄ）測定した。
【０３５３】
コントロール動物から単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞は、ｇｐ３３ペプチドにより特異的に活性化される（図１５Ａ）。一方、ヒト化動物から単離されたＣＤ８＋  Ｔ細胞は、ＨＬＡ−Ａ２限定ペプチドにより活性化される（図１５Ｂ）。ペプチドにより刺激された場合にＩＦＮγを発現する能力により観察されたとおり、ＣＤ８＋  Ｔ細胞活性化の時間的経過から、コントロール及びヒト化マウス両方のＣＤ８＋  Ｔ細胞が、感染後最初の２週間の間に増殖し、ウイルスが取り除かれた後には検出できなくなることが示されている（図１５Ｃ及び図１５Ｄ）。ｇｐ３３ペプチドに対する応答は、コントロール動物においてより強力であるように思われたが、ｇｐ３３は、既知の免疫優勢ＬＣＭＶエピトープであるが、免疫優勢ＨＬＡ−Ａ２限定ＬＣＭＶエピトープは特定されていなかったことに留意されたい。まとめると、ヒト化、又は実質的にヒト化されたＴ細胞免疫系を含む動物は、ＬＣＭＶ発現タンパク質を処理し、それらをヒト化ＭＨＣ分子上に提示し、Ｔ細胞をヒト化Ｔ細胞受容体を介して活性化させることができる。
等価物
【０３５４】
当業者は、単に日常的な実験を使用して、本明細書に記載の発明の特定の実施形態の多くの等価物を認識するか、確認することが可能であろう。かかる等価物は、以下の「特許請求の範囲」によって包含されることが意図される。
【０３５５】
本願全体を通して引用された全ての非特許文献、特許出願、及び特許の内容全体は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図７Ｇ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１０Ｇ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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