(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒト多能性幹細胞からの胚体内胚葉形成を促進するための方法と、分化した胚体内胚葉からの胃オルガノイド又は胃組織形成を促進するための方法の提供。【解決手段】ａ）前駆細胞内の１つ以上のシグナル伝達経路を活性化するステップであって、前記１つ以上のシグナル伝達経路が、ＷＮＴシグナル伝達経路、ＷＮＴ／ＦＧＦシグナル伝達経路、ＦＧＦシグナル伝達経路、又はそれらの組み合わせから選択されるステップと、ｂ）前記前駆細胞内のＢＭＰシグナル伝達経路を阻害するステップと、ｃ）前記前駆細胞にレチノイン酸を投与するステップとを含む、胃組織の形成を誘導する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）前駆細胞内の１つ以上のシグナル伝達経路を活性化するステップであって、前記１つ以上のシグナル伝達経路が、ＷＮＴシグナル伝達経路、ＷＮＴ／ＦＧＦシグナル伝達経路、ＦＧＦシグナル伝達経路、又はそれらの組み合わせから選択される、ステップと；
ｂ）前記前駆細胞内のＢＭＰシグナル伝達経路を阻害するステップと；
ｃ）前記前駆細胞にレチノイン酸を投与するステップと
を含む、胃組織の形成を誘導する方法。
【請求項２】
前記前駆細胞が、胚性幹細胞、胚性生殖細胞、人工多能性幹細胞、中胚葉細胞、胚体内胚葉細胞、後方内胚葉細胞、後方内胚葉細胞、及び後腸細胞、好ましくは多能性幹細胞に由来する胚体内胚葉、より好ましくは、胚性幹細胞、成体幹細胞、又は人工多能性幹細胞から選択される多能性幹細胞に由来する胚体内胚葉から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記前駆細胞が、アクチビン、成長因子のＴＧＦ−βスーパーファミリーのＢＭＰサブグループ；ノーダル、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＢＭＰ４、Ｗｎｔ３ａ、及びそれらの組み合わせから選択される１つ以上の分子に多能性幹細胞を接触させるステップから得られる胚体内胚葉である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
前記ＦＧＦシグナル伝達経路が、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１３、ＦＧＦ１４、ＦＧＦ１５、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２２、及びＦＧＦ２３からなる群から選択される１つ以上の分子、好ましくはＦＧＦ４、より好ましくは約５０〜約１５００ｎｇ／ｍｌの濃度のＦＧＦ４から選択される薬剤を使用して活性化される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ＷＮＴシグナル伝達経路が、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１、及びＷｎｔ１６からなる群から選択される１つ以上の分子、好ましくはＷｎｔ３ａ、より好ましくは約５０〜約１５００ｎｇ／ｍｌの濃度のＷｎｔ３ａから選択される薬剤を使用して活性化される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記活性化させるステップが、特定の活性化時間にわたってＷｎｔ３ａ及びＦＧＦ４の両方に前記前駆細胞を接触させるステップを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記阻害するステップが、ＢＭＰ経路を阻害する薬剤に前記前駆細胞を接触させるステップを含み、前記薬剤が、ノギン、ドルソモルフィン、ＬＤＮ１８９、ＤＭＨ−１、及びそれらの組み合わせから選択され、好ましくは前記前駆細胞は約５０〜約１５００ｎｇ／ｍｌの濃度のＢＭＰ阻害薬に接触させる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ステップａ）〜ｃ）が、前腸スフェロイドの形成を生じさせるのに十分な時間にわたって実施され、好ましくはステップａ）及びｂ）がステップｃ）より前に実施される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ステップｃ）の前記レチノイン酸が約０．２ｕＭ〜約２０ｕＭ、好ましくは約２．０ｕＭの量で投与され、好ましくはステップｃ）が、前記前腸スフェロイドにおいてＰｄｘ１／Ｓｏｘ１の発現が検出されるまで実施される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ステップａ）及びｂ）が約１〜約４日間実施され、ステップｃ）が約３〜約５日間実施され、好ましくはステップａ）〜ｃ）が、前腸スフェロイドの形成を生じさせるのに十分な時間にわたって実施され、前記前腸スフェロイドをＥＧＦに接触させるステップをさらに含み、好ましくは前記ＥＧＦに対する曝露が、前記胃スフェロイドを直径１ｍｍ超、又は直径２ｍｍ超、又は直径３ｍｍ超又は直径４ｍｍ超に増加させるのに十分な濃度及び時間の長さである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
三次元組織構造の形成のため前記活性化した前駆細胞をインビトロで培養するステップをさらに含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記活性化させるステップ及び阻害するステップがインビトロで行われる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記活性化時間と前記阻害時間とが重複している、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記活性化時間と前記阻害時間とが重複しない、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記活性化時間が約２４〜約１２０時間である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
１つ以上の前駆細胞からインビトロで作製された胃組織を含む組成物。
【請求項１７】
前記１つ以上の前駆細胞が、胚性幹細胞、胚性生殖細胞、人工多能性幹細胞、中胚葉細胞、胚体内胚葉細胞、後方内胚葉細胞、及び後腸細胞からなる群から選択される、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
ａ）多能性幹細胞から胚体内胚葉（ＤＥ）を作成するステップと；
ｂ）ＦＧＦ経路を活性化する薬剤、ＷＮＴ経路を活性化させる薬剤、ＢＭＰ経路を阻害する薬剤、及びレチノイン酸に前記胚体内胚葉を接触させるステップであって、それにより後方前腸を生じさせるステップと；
ｃ）ＥＧＦ、レチノイン酸、ＷＮＴ経路を活性化させる薬剤、及びＢＭＰ経路を阻害する薬剤に前記後方前腸を接触させるステップであって、それにより胃底部組織を生じさせるステップと
を含む、胃底部組織を含む胃オルガノイドを作成する方法。
【請求項１９】
ａ）多能性幹細胞から胚体内胚葉（ＤＥ）を作成するステップと；
ｂ）ＦＧＦ経路を活性化する薬剤、ＷＮＴ経路を活性化させる薬剤、ＢＭＰ経路を阻害する薬剤、及びレチノイン酸に前記胚体内胚葉を接触させるステップであって、それにより後方前腸を生じさせるステップと；
ｃ）ＥＧＦ、レチノイン酸、及びＢＭＰ経路を阻害する薬剤に前記後方前腸を接触させるステップであって、それにより前庭部組織を生じさせるステップと
を含む、前庭部組織を含む胃オルガノイドを作成する方法。
【請求項２０】
１つ以上の前駆細胞からインビトロで作製された胃組織を含むキット。
【請求項２１】
ａ）胃細胞又は組織を化合物に接触させるステップであって、前記胃細胞又は組織が１つ以上の前駆細胞からインビトロで作製される、ステップと；
ｂ）前記胃細胞又は組織による前記化合物の吸収レベルを検出するステップと
を含む、胃細胞又は組織の吸収効果を同定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦支援研究に関する記載
本発明は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）の助成によるＤＫ０８０８２３、ＤＫ０９２４５６、及びＧＭ０６３４８３に基づく連邦政府の支援を受けて行われた。政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
優先権の主張
本願は、あらゆる目的から、２０１４年５月２８日に出願された“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  Ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ  Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  Ｃｅｌｌｓ  ｉｎｔｏ  Ｇａｓｔｒｉｃ  Ｔｉｓｓｕｅｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ”と題されるＷｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌに対する米国仮特許出願第６２／００３，７１９号明細書に対する優先権及びその利益を主張する。
【０００３】
本明細書には、幹細胞を指向性分化によって特定の組織又は器官に変換することに関する方法及びシステムが開示される。詳細には、ヒト多能性幹細胞からの胚体内胚葉形成を促進するための方法及びシステムが開示される。また、分化した胚体内胚葉からの胃オルガノイド又は胃組織形成を促進するための方法及びシステムも開示される。
【背景技術】
【０００４】
胃の機能及び構造は、多種多様な生息場所及び食事に適応して哺乳類種間で大きく異なる。結果的に、非ヒトの胃発生及び疾患モデルには著しい限界がある。例えば、細菌ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  Ｐｙｌｏｒｉ）は世界人口の５０％に感染し、１０％が消化性潰瘍疾患を発症し、及び１〜２％１〜３が胃癌を発症する。胃疾患は、消化性潰瘍疾患及び胃癌を含め、世界人口の１０％が罹患し、概して慢性ピロリ菌（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）感染に起因する。ピロリ菌（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）誘発性疾患の現在のモデルは、感染に対するヒトの反応と同じ病態生理学的特徴を呈しない動物モデルに頼っており４、胃細胞株は生体内での胃上皮の細胞上及び構造上の複雑性を欠いている。従って、ヒトで起こるとおりのピロリ菌（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）感染の効果を研究するのに適したモデルはない。成体胃幹細胞を使用した最近の進歩により、インビトロでげっ歯類胃上皮を成長させることが可能であるが５、ヒト患者からこれらの細胞を入手しようとすれば外科的手術が必要となり得る。さらに、かかる方法は、ヒト胃の胚発生又は間質−上皮相互作用のモデル化には使用できない。胚発生及び成体胃の構造が種によって異なるため、マウスモデルはこの器官の器官形成及び発病研究に準最適なものとなる。従って、ヒト胃の発生及び疾患の根底にある機構を解明し、且つかかる疾患のヒト治療に有用な新規治療を同定するための、ロバストなインビトロシステムが必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
当該技術分野において必要とされているのは、所望の特定のタイプの組織又は生物、詳細には前述の目的の１つ以上に用いることのできる胃組織を作り出すため、ヒト多能性幹細胞などの前駆細胞の終着点を正確に制御する方法及びシステムである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
胃オルガノイドの形態などの胃細胞及び／又は胃組織の形成を誘導する方法が開示される。胃細胞及び／又は組織の形成は、前駆細胞内の１つ以上のシグナル伝達経路を活性化及び／又は阻害することによって実施され得る。また、前駆細胞に由来する開示される胃細胞、胃組織、及び／又は胃オルガノイドの使用方法も開示される。
【０００７】
当業者は、以下に説明する図面が例示目的に過ぎないことを理解するであろう。図面は、いかなる形であれ本教示の範囲を限定することを意図するものではない。
【０００８】
この特許又は出願ファイルは、色彩を付して作成された少なくとも１つの図面を含んでいる。色彩図面が付された、この特許又は特許出願公開の写しは、請求及び必要な手数料の納付に基づいて、当局によって提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、胃スフェロイドにおけるＳｏｘ２／Ｃｄｘ２／Ｂ−カテニンの発現及びＲＡの効果を示す。
【図２】図２Ａ〜図２Ｅは、ｈＰＳＣから三次元胃オルガノイドへの分化を指向させるために使用されるインビトロ培養系の概略図（図２Ａ）、Ｓｏｘ２、Ｐｄｘ１及びＣｄｘ２を用いたマウスＥ１０．５胚のホールマウント免疫蛍光染色による発生中の後方前腸器官の確定マーカー（図２Ｂ）、ＲＡの存在下及び非存在下におけるＰＤＸ１発現（図２Ｃ）、後方前腸スフェロイドがｈＧＯに成長する間の形態学的変化を示す実体顕微鏡写真（図２Ｄ）、並びにＥ１４．５及びＥ１８．５及び同等のｈＧＯ発生段階におけるマウス前庭部の発生の比較（図２Ｅ）を示す。
【図３】図３Ａ〜図３Ｄは、Ｐ１２前庭部、Ｅ１８．５前庭部及びｄ３４オルガノイドにおけるＭｕｃ５ＡＣ、ＴＦＦ２、ＧＳＩＩ  ＵＥＡＩ、及びＣＨＧＡ発現（図３Ａ）、ｈＧＯの発生中の成長、形態形成、及び細胞型特異化におけるＥＧＦの種々の役割の概略図（図３Ｂ）、ＤＯＸ有り及び無しでの胃オルガノイドにおけるガストリン、グレリン、５−ＨＴ、及びＣｈｒＡの発現（図３Ｃ）、及び複数のＥＧＦ濃度におけるＮＥＵＲＯＧ３の相対発現（図３Ｄ）を示す。
【図４】図４Ａ〜図４Ｄは、ｄ３４オルガノイド、Ｅ１８．５前庭部、及びＰ１２前庭部におけるＳＯＸ９  Ｋｉ６７発現（図４Ａ）、明視野顕微鏡法及び免疫蛍光染色法を用いて可視化したオルガノイドのピロリ菌（Ｈ．Ｐｙｌｏｒｉ）感染（図４Ｂ）、癌遺伝子ｃ−Ｍｅｔの免疫沈降（図４Ｃ）、及びＥｄＵ取込みによって計測した、ｈＧＯ上皮における細胞増殖（図４Ｄ）を示す。
【図５】図５Ａ〜図５Ｄは、ノギンの存在下及び非存在下におけるＧＳＫ３β阻害薬ＣＨＩＲ９９０２１及び組換えＷＮＴ３Ａの存在下でのＳｏｘ２及びＣｄｘ２発現（図５Ａ）、明視野顕微鏡法を用いて可視化したＣＨＩＲ誘導性の腸管形態形成及びスフェロイド生成（図５Ｂ）、単層培養物の免疫蛍光染色によるＣＨＩＲ／ＦＧＦ処理した内胚葉におけるＣＤＸ２誘導及びノギン処理及びＣＨＩＲ／ＦＧＦ／ノギン処理した内胚葉におけるＳＯＸ２誘導の評価（図５Ｃ）、ＢＭＰ標的遺伝子ＭＳＸ１／２のｑＰＣＲ解析（図５Ｄ）、及びＢＭＰ２の存在下及び非存在下におけるＳＯＸ２及びＣＤＸ２発現を示す。
【図６】図６Ａ〜図６Ｇは、２つのｈＥＳＣ株（Ｈ１及びＨ９）及び１つのｉＰＳＣ株（７２．３）の間のスフェロイド形成及び特徴を比較する表（図６Ａ）、Ｈ１及びｉＰＳＣ  ７２．３細胞株に由来する３４日目ｈＧＯの免疫蛍光染色（図６Ｂ）、３４日目ｈＧＯにおける器官上皮細胞型定量化（図６Ｃ）、人工多能性幹細胞株ｉＰＳＣ  ７２．３の特徴付け（図６Ｄ〜図６Ｇ）を示す。
【図７】図７Ａ〜図７Ｄは、前腸パターン形成実験の概略説明図（図７Ａ）、前腸単層培養物から生成されるスフェロイドの数がＲＡによって増加することを示す明視野像（図７Ｂ）、Ｈｎｆ１βタンパク質が前腸の後方部分に局在化している１４体節期胚の免疫蛍光像を示す図１ｄの弱拡大像（図７Ｃ）、ＲＡで処理した前腸スフェロイドにおける遺伝子発現のｑＰＣＲ解析（図７Ｄ）を示す。
【図８】図８は、ｈＧＯ分化後期における明視野像及び免疫染色を示す。
【図９】図９は、インビボでの前庭部発生の４つの胎生期（Ｅ１２．５、Ｅ１４．５、Ｅ１６．５及びＥ１８．５）及び１つの生後期（Ｐ１２）の間におけるマウス前庭部及びヒト胃オルガノイドが発生する間の転写因子発現を示す。
【図１０】図１０は、Ｅ１２．５前庭部及び１３日目ｈＧＯにおけるｐＨＨ３／Ｅ−Ｃａｄ／ＤＡＰＩ発現及びａＰＣＣ／Ｅ−ＣＡＤ／ＤＡＰＩ発現を示す。
【図１１】図１１Ａ〜図１１Ｃは、前庭部間葉系転写因子ＢＡＰＸ１の発現（図１１Ａ）及び間葉細胞型マーカーの染色（図１１Ｃ）を示す。
【図１２】図１２は、インビボでの胃前庭部内分泌細胞発生を示す。
【図１３】図１３Ａ〜図１３Ｂは、汎内分泌マーカーＣＨＧＡの染色（図１３Ａ）及び内分泌マーカーＣＨＧＡ、ガストリン、グレリン、及びソマトスタチンの発現（図１３Ｂ）を示す。
【図１４】図１４は、胃オルガノイドの指向性分化の方法の概要を示す。この分化過程の各ステップを代表的な実体顕微鏡写真と共に示す。
【図１５】図１５は、マウス胃の概略図並びに前胃、胃底部、前庭部、及び十二指腸における既知の領域マーカーの計測を示す。
【図１６】図１６は、前胃、胃底部、前庭部、及び十二指腸における新規領域マーカーの計測を示す。
【図１７】図１７は、胃底部特異化プロトコル並びに対照、Ｗｎｔ１００、Ｗｎｔ５００及びＣＨＩＲ処理細胞におけるＧＡＰＤＨ、Ｇａｔａ４、Ａｘｉｎ２、Ｓｏｘ２、Ｐｄｘ１、及びＣｄｘ２の計測を示す。ｙ軸は相対遺伝子発現を表す。
【図１８】図１８は、胃底部プロトコルにおけるＡｘｉｎ２、ＩＲＸ２、ＩＲＸ３、Ｐｉｔｘ１、及びＩＲＸ４の計測を示す。ｙ軸は相対遺伝子発現を表す。
【図１９】図１９は、胚体内胚葉からの腸組織、胃底部組織、及び前庭部組織の形成を示す概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
特に注記されない限り、用語は、関連技術分野の当業者による従来の用法に従い理解されるものとする。
【００１１】
本明細書で使用されるとき、用語「全能性幹細胞」（オムニポテント幹細胞としても知られる）は、胚細胞型及び胚体外細胞型に分化することのできる幹細胞である。かかる細胞は、生存能力のある完全な生物を構築することができる。これらの細胞は卵細胞と精細胞の融合によって作られる。受精卵の最初の数回の分裂によって作られる細胞もまた全能性である。
【００１２】
本明細書で使用されるとき、用語「多能性幹細胞（ＰＳＣ）」は、生体のほぼあらゆる細胞型に分化することのできる任意の細胞、即ち、内胚葉（胃の内膜、胃腸管、肺）、中胚葉（筋肉、骨、血液、泌尿生殖器）、及び外胚葉（表皮組織及び神経系）を含む３つの胚葉（胚上皮）のいずれかに由来する細胞を包含する。ＰＳＣは、着床前（ｐｒｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）胚盤胞の内部細胞塊細胞の子孫であってもよく、又はある種の遺伝子を強制的に発現させることによる、非多能性細胞、例えば成体体細胞の誘導を通じて得られてもよい。多能性幹細胞は、当業者が容易に理解するであろうとおり、任意の好適な供給源に由来し得る。多能性幹細胞の供給源の例としては、ヒト、げっ歯類、ブタ、ウシを含めた哺乳類供給源が挙げられるが、それに限定されるものではない。
【００１３】
本明細書で使用されるとき、用語「人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）」は、ｉＰＳ細胞と省略されることも多く、ある種の遺伝子の「強制」発現を誘導することによって通常非多能性の細胞、例えば成体体細胞から人工的に得られる多能性幹細胞の一種を指す。
【００１４】
本明細書で使用されるとき、用語「胚性幹細胞（ＥＳＣ）」は、ＥＳ細胞と省略されることも多く、初期胚である胚盤胞の内部細胞塊から得られる多能性の細胞を指す。本発明の目的上、用語「ＥＳＣ」は、時に胚性生殖細胞もさらに包含して広義に用いられる。
【００１５】
本明細書で使用されるとき、用語「前駆細胞」は、１つ以上の前駆細胞が自己再生能力又は１つ以上の特殊化した細胞型に分化する能力を獲得する本明細書に記載される方法において使用することのできる任意の細胞を包含する。一部の実施形態において、前駆細胞は多能性であるか、又は多能性になることが可能である。一部の実施形態において、前駆細胞は、多能性を獲得するため外部因子（例えば成長因子）の処理に供される。一部の実施形態において、前駆細胞は、全能性（又はオムニポテント）幹細胞；多能性幹細胞（人工又は非人工）；多分化能幹細胞；少分化能幹細胞及び単分化能幹細胞であり得る。一部の実施形態において、前駆細胞は、胚、乳児、小児、又は成人に由来し得る。一部の実施形態において、前駆細胞は、遺伝子操作又はタンパク質／ペプチド処理によって多能性が付与されるように処理に供された体細胞であり得る。
【００１６】
発生生物学において、細胞分化は、それほど特殊化していない細胞がより特殊化した細胞型になる過程である。本明細書で使用されるとき、用語「指向性分化」は、それほど特殊化していない細胞が特定の特殊化した標的細胞型になる過程を表す。特殊化した標的細胞型の特殊性は、初期細胞の運命を定義付け又は改変するために用い得る任意の適用可能な方法により決定することができる。例示的方法としては、限定はされないが、遺伝子操作、化学的処理、タンパク質処理、及び核酸処理が挙げられる。
【００１７】
本明細書で使用されるとき、用語「細胞構成物」は、個々の遺伝子、タンパク質、遺伝子を発現するｍＲＮＡ、及び／又は任意の他の可変的な細胞成分又はタンパク質活性、例えば、典型的には当業者によって生物学的実験（例えばマイクロアレイ又は免疫組織化学による）で例えば計測されるタンパク質修飾（例えばリン酸化）の程度である。生物系、一般的なヒト疾患の根底にある生化学的過程の複雑なネットワークに関する重要な発見、並びに遺伝子発見及び構造決定は、現在、研究過程の一環としての細胞構成物存在量データの適用によるものであり得る。細胞構成物存在量データは、バイオマーカーを同定し、疾患サブタイプを区別し、及び毒性機構を同定する助けとなり得る。
【００１８】
幹細胞は全ての多細胞生物に見られる。幹細胞は、有糸細胞分裂によって自己複製し、且つ多様な特殊化した細胞型に分化する能力によって特徴付けられる。大まかな２種類の哺乳類幹細胞は、１）胚盤胞の内部細胞塊から単離される胚性幹細胞、及び２）成体組織に見られる成体幹細胞である。発生中の胚では、幹細胞はあらゆる特殊化した胚組織に分化し得る。成体生物では、幹細胞及びプロジェニター細胞は生体の修復システムとして働き、特殊化した細胞を補充し、また血液、皮膚、又は胃組織などの再生器官の正常な代謝回転を維持する。
【００１９】
現在、幹細胞は、筋肉又は神経などの様々な組織の細胞と一致する特徴を有する特殊化した細胞へと、細胞培養によって成長させ、転換することができる。医学療法においては、臍帯血及び骨髄を含めた種々の供給源からの高度に可塑性の成体幹細胞が日常的に用いられている。治療的クローニングによって作成される胚細胞株及び自己胚性幹細胞もまた、将来的な治療法の有望な候補として提案されている。
【００２０】
幹細胞の古典的定義は、典型的には２つの特性：自己複製、即ち未分化状態を維持しつつ多数の細胞分裂周期を経る能力と、発生能、特殊化した細胞型に分化する能力とを指し示している。一部の実施形態において、幹細胞は全能性又は多能性のいずれかであり、即ち幹細胞は任意の成熟細胞型を生じることが可能であり、しかし多分化能又は単分化能プロジェニター細胞が幹細胞と称されることもある。
【００２１】
発生能は幹細胞の潜在的分化能力（異なる細胞型に分化する潜在能力）を特定する。全能性幹細胞（オムニポテント幹細胞としても知られる）は、胚細胞型及び胚体外細胞型に分化することができる。これらの細胞は、生存能力のある完全な生物を構築することができる。これらの細胞は卵細胞と精細胞の融合によって作られる。受精卵の最初の数回の分裂によって作られる細胞もまた全能性である。多能性幹細胞（ＰＳＣ）は全能性細胞の子孫であり、ほぼあらゆる細胞、即ち、内胚葉（胃の内膜、胃腸管、肺）、中胚葉（筋肉、骨、血液、泌尿生殖器）、及び外胚葉（表皮組織及び神経系）を含む３つの胚葉のいずれかに由来する細胞に分化することができる。多分化能幹細胞は幾つもの細胞に分化し得るが、但し近縁の細胞ファミリーのものに限られる。少分化能幹細胞は、リンパ球系又は骨髄系幹細胞などのほんの数種の細胞に分化し得るのみである。単分化能細胞は、それ自体の、唯一つの細胞型のみを作り出すことができ、しかし自己複製の特性を有し、それによって非幹細胞と区別される（例えば筋幹細胞）。
【００２２】
胚性幹細胞及び人工多能性幹細胞は、ヒト疾患を研究する能力及び動物モデルにおいて治療上有効な代替組織を作成する能力にかつてない影響を与えている。
【００２３】
発生生物学において、細胞分化は、それほど特殊化していない細胞がより特殊化した細胞型になる過程である。ヒトＰＳＣから治療的細胞型への分化を指向させようとする取り組みの成功のほとんどは、胚器官発生の研究に基づいている。例としては、肝細胞及び膵内分泌細胞の作成が挙げられ、これらの細胞は肝疾患及び糖尿病の動物モデルにおいて機能上の潜在能力を示している。同様に、ＰＳＣから腸への分化は、壊死性腸炎、炎症性腸疾患及び短腸症候群などの疾患に治療利益をもたらし得る。
【００２４】
上記で考察したとおり、多能性幹細胞は、３つの胚葉：内胚葉（胃の内膜、胃腸管、肺）、中胚葉（筋肉、骨、血液、泌尿生殖器）、及び外胚葉（表皮組織及び神経系）のいずれかに分化する潜在能力を有する。従って、多能性幹細胞は任意の胎児又は成体細胞型を生じることができる。しかしながら、特定の多能性幹細胞の運命は、数多くの細胞シグナル伝達経路及び数多くの因子によって制御される。さらに、多能性幹細胞は潜在的に胎盤などの胚体外組織に寄与する能力を有しないため、単独では胎児又は成体動物に発育することができない。
【００２５】
現在までに、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）から胃組織は作成されていない。ＰＳＣを肺、肝、膵及び腸細胞に分化させる取り組みの成功は、これらの器官の胚発生の理に適った分子的理解に依存している６〜１０。残念ながら、当該技術分野における問題は、内胚葉形成に続く胃発生の理解に相違が多くあることである。従って、ｈＰＳＣから胃組織への分化を指向させるため、前腸の特異化及びパターン形成、胃の特異化、並びに最後に胃上皮成長及び分化を含めた幾つかの重要な胃発生初期段階を調節するシグナル伝達経路が本出願人によって同定された。加えて、より機能的で複雑な三次元組織を作成するため、本出願人は、前腸管の形態形成並びに腺及び小窩を含む胃上皮構造の形成を含めた、胃発生中に起こる幾つかの形態形成過程を誘導することを目指した。
【００２６】
本明細書に記載されるとおり、時系列の成長因子操作を用いて培養下で胎生期胃組織発生を模倣する方法及びシステムが構築される。詳細には、ＰＳＣ、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）及び人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の両方から胃組織への分化をインビトロで指向させる方法及びシステムが構築される。これらの因子は、胎児腸発生を近似する段階：アクチビン誘導性の胚体内胚葉（ＤＥ）形成と；ＦＧＦ／Ｗｎｔ／ＢＭＰ誘導性の後方前腸パターン形成（ｐａｔｔｅｒｉｎｇ）と、最後に、胃腺及び胃小窩、増殖帯、表層及び前庭部粘液細胞、並びにガストリン、グレリン、及びソマトスタチンを発現する内分泌細胞を含む機能性の胃細胞型及び形態への胃組織成長、形態形成及び細胞分化を促進するレチノイン酸及びＥＦＧシグナル伝達の調節によって得られるプロガストリック（pro−gastric）培養系とを経てインビトロでのヒト腸の発生を指向させた。
【００２７】
本出願人は、ヒトＰＳＣから胃細胞、胃組織、及び／又は複雑な構造及び細胞組成を伴う三次元胃組織（ｈＧＯ）への効率的な段階的分化を可能にする新規胎生期シグナル伝達経路を同定した。本出願人はさらに、発生中のｈＧＯがマウスの発生中の前庭部とほぼ同一の分子的及び形態学的分化段階を経ること、及び得られる胃オルガノイドが、正常な前庭部上皮及び胎児期／生後期の胃と同等の三次元構成を成す一連の粘液細胞、内分泌細胞、及びプロジェニター細胞を含有し得ることを見出した。
【００２８】
開示されるヒト胃細胞、胃組織及び／又は胃オルガノイド（ｈＧＯ）は、ヒト胃の発生、生理機能の新規機構を同定するためのインビトロシステムとして使用されてもよく、及びピロリ菌（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）に対する胃上皮の病態生理学的反応のモデルとして使用されてもよい。開示される胃細胞、胃組織及び／又は胃ｈＧＯ及び方法は、創薬及び早期胃癌のモデル化に新しい機会をもたらす。さらに、本明細書には、ヒト胚前腸の初めての三次元作製が開示され、これは、肺及び膵臓を含む他の前腸器官組織の作成に向けた有望な出発点である。
【００２９】
一態様において、前駆細胞から胃細胞、胃組織、及び／又は胃ｈＧＯの形成を誘導する方法が開示される。この方法は、ａ）前駆細胞内の１つ以上のシグナル伝達経路（１つ以上のシグナル伝達経路は、ＷＮＴシグナル伝達経路、ＷＮＴ／ＦＧＦシグナル伝達経路、及びＦＧＦシグナル伝達経路から選択される）を活性化するステップであって、それにより前駆細胞の子孫である胃細胞、胃組織及び／又は胃ｈＧＯを入手するステップを含み得る。この方法は、前駆細胞内の１つ以上のシグナル伝達経路を阻害するステップｂ）をさらに含み得る。阻害される１つ以上のシグナル伝達経路はＢＭＰシグナル伝達経路を含み得る。
【００３０】
この方法は、前駆細胞をレチノイン酸に接触させるステップをさらに含み得る。前駆細胞をレチノイン酸に接触させるステップは、上記の活性化させるステップ及び阻害するステップの後に行われ得る。
【００３１】
この方法は、胃オルガノイドの直径を直径約１ｍｍ超、又は直径約２ｍｍ超、又は直径約３ｍｍ超、又は直径約ｍｍ４超に増加させるのに十分な濃度及び／又は時間の長さで胃オルガノイドをＥＧＦに接触させるステップをさらに含み得る。
【００３２】
一態様において、１つ以上のシグナル伝達経路は、Ｗｎｔシグナル伝達経路、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達、Ｗｎｔ／ＡＰＣシグナル伝達、及びＷｎｔ／ＰＣＰ経路シグナル伝達から選択され得る。
【００３３】
一態様において、Ｗｎｔシグナル伝達経路を活性化させるステップは、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１、及びＷｎｔ１６からなる群から選択される１つ以上の分子に前駆細胞を接触させるステップを含み得る。
【００３４】
一態様において、ＦＧＦシグナル伝達経路を活性化させるステップは、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ７  ＦＧＦ８、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１３、ＦＧＦ１４、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２２、及びＦＧＦ２３からなる群から選択される１つ以上の分子に前駆細胞を接触させるステップを含み得る。
【００３５】
一態様において、ＢＭＰシグナル伝達経路を阻害するステップは、前駆細胞をＢＭＰ阻害薬に接触させるステップを含み得る。一態様において、ＢＭＰ阻害薬は、ドルソモルフィン、ＬＤＮ１８９、ＤＭＨ−１、ノギン及びそれらの組み合わせから選択され得る。一態様において、ＢＭＰ阻害薬はノギンであり得る。
【００３６】
一態様において、活性化させるステップは、インキュベーション時間と称される特定の時間にわたって前駆細胞をＷｎｔ３ａ、ＦＧＦ４、及びＢＭＰ阻害薬に接触させるステップを含み得る。接触させるステップは同時に行われてもよく、又は他の態様では、接触させるステップは逐次行われてもよい。
【００３７】
一態様において、胚体内胚葉を含み得る前駆細胞に、１）Ｗｎｔ３ａ又はＧＳＫ阻害薬（例えば、ＣＨＩＲＯＮ）と２）ＦＧＦ４との組み合わせを含み得るシグナル伝達剤を第１のインキュベーション時間にわたって接触させてもよい。第１のインキュベーション時間はＢＭＰ阻害薬をさらに含み得る。第１のインキュベーション時間の後、前駆細胞を第２のインキュベーション時間に供してもよく、ここでは前駆細胞をレチノイン酸（ＲＡ）に接触させる。一態様において、第１のインキュベーション時間と第２のインキュベーション時間とは重複する。一部の実施形態において、第１のインキュベーション時間と第２のインキュベーション時間とは重複しない。
【００３８】
一態様において、第１及び／又は第２のインキュベーション時間、及び／又は第１及び第２のインキュベーション時間の合計は、２４〜１２０時間、又は約３６〜約１０８時間、又は約４８〜約９６時間、又は約６０〜約８４時間であり得る。一態様において、第１のインキュベーション時間は少なくとも約２４時間であり得る。
【００３９】
一態様において、第２のインキュベーション時間（ここでは前駆細胞をＲＡに接触させ得る）は第１のインキュベーション時間の約７２時間後に開始する。さらなる態様において、第２のインキュベーション時間は、培養物が前駆細胞から前腸スフェロイドを形成した後に開始する。次に、例えば前腸スフェロイドをＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に適用することにより、前腸スフェロイドを胃オルガノイドの形成に好適な成長条件下の三次元マトリックスに移し得る。Ｍａｔｒｉｇｅｌに移した後、前腸スフェロイドは第３のインキュベーション時間にわたってＲＡと接触させ、ここでは継続的な３Ｄ成長が起こり得る。次にスフェロイドを第４のインキュベーション時間にわたってＥＧＦに接触させてもよく、この第４のインキュベーション時間は第３のインキュベーション時間と重複してもよい。第３のインキュベーション時間は約２４時間であり得る。
【００４０】
一態様において、前駆細胞は、５０〜１５００ｎｇ／ｍｌ、又は約１００〜約１２００ｎｇ／ｍｌ、又は約２００〜約１０００ｎｇ／ｍｌ、又は約３００〜約９００ｎｇ／ｍｌ、又は約４００〜約８００ｎｇ／ｍｌ、又は約５００〜約７００ｎｇ／ｍｌの濃度のＷｎｔ３ａに接触させてもよい。
【００４１】
一態様において、前駆細胞は、胚性幹細胞、胚性生殖細胞、人工多能性幹細胞、中胚葉細胞、胚体内胚葉細胞、後方内胚葉細胞、及び後腸細胞から選択され得る。
【００４２】
一態様において、前駆細胞は、多能性幹細胞に由来する胚体内胚葉細胞であり得る。
【００４３】
一態様において、前駆細胞は、胚性幹細胞、胚性幹細胞、又は人工多能性幹細胞などの多能性幹細胞であり得る。
【００４４】
一態様において、胚体内胚葉細胞は、アクチビン、成長因子のＴＧＦ−βスーパーファミリーのＢＭＰサブグループ；ノーダル、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＢＭＰ４、Ｗｎｔ３ａ、及びそれらの組み合わせから選択される１つ以上の分子に多能性幹細胞を接触させることによって得られ得る。
【００４５】
一態様において、胃組織は１つ以上の前駆細胞からインビトロで作製され得る。
【００４６】
一態様において、１つ以上の前駆細胞は、胚性幹細胞、中胚葉細胞、胚体内胚葉細胞、後方内胚葉細胞、前方内胚葉細胞、前腸細胞、及び後腸細胞から選択され得る。
【００４７】
一態様において、多能性幹細胞は、限定はされないが、ヒト多能性幹細胞、又はマウス多能性幹細胞を含めた、哺乳類多能性幹細胞であり得る。
【００４８】
一態様において、ヒト多能性幹細胞は、ヒト胚性幹細胞、ヒト胚性生殖細胞、及びヒト人工多能性幹細胞から選択され得る。
【００４９】
一態様において、１つ以上の前駆細胞からインビトロで作製された胃細胞、組織、又はオルガノイドを含むキットが提供される。
【００５０】
一態様において、胃細胞又は組織の吸収効果を同定する方法が提供される。この方法は、前駆細胞に由来する胃細胞、組織、又はオルガノイドを化合物に接触させるステップと；前記胃細胞又は組織による化合物の吸収レベルを検出するステップとを含み得る。
【００５１】
一態様において、胃細胞又は組織に対する化合物の毒性を同定する方法が提供される。この方法は、前駆細胞に由来する胃細胞、組織、又はオルガノイドを化合物に接触させるステップと；前記胃細胞又は組織による化合物の吸収レベルを検出するステップとを含み得る。
【００５２】
一態様において、デノボで作成された三次元ヒト胃オルガノイド（ｈＧＯ）を含む組成物、及びヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）の指向性分化によってそれを作る方法が開示される。かかるｈＧＯは、胃発生並びにピロリ菌（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）感染中に起こる初期イベントのモデル化に使用し得る。
【００５３】
一態様において、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）の指向性分化によってインビトロでｈＧＯを作成する方法が開示される。このヒト胃組織は、ヒト胃の発生及び疾患のモデル化に使用し得る。三次元腸管構造を形成するように胚体内胚葉（ＤＥ）を誘導する方法もまた開示される。一態様において、これは、ＦＧＦ及びＷＮＴシグナル伝達を活性化する一方で、同時にＢＭＰシグナル伝達を阻害して前腸運命を促進し得ることによって実施され得る。次に前腸スフェロイドをレチノイン酸及びＥＧＦシグナル伝達の操作によって後方前腸及び胃の運命となるように指向させると、ｈＧＯがもたらされ得る。
【００５４】
ｈＧＯの発生は、胃腺及び胃小窩、増殖帯、表層及び前庭部粘液細胞、並びにガストリン、グレリン及びソマトスタチンを発現する内分泌細胞を形成するマウス前庭部の発生とほぼ同じ分子的な及び形態形成上の変化を経るものであり得る。ｈＧＯを使用してヒト胃発生をモデル化することにより、ＥＧＦシグナル伝達が転写因子ＮＥＵＲＯＧＥＮＩＮ  ３の上流で内分泌細胞発生を抑制することが決定されている。本出願人はさらに、ｈＧＯが、ｃ−Ｍｅｔシグナル伝達及び上皮増殖の急速な活性化を含め、ピロリ菌（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）によって惹起される胃疾患の初期段階を忠実に再現することを見出した。合わせると、これらの研究は、ヒト胃の発生及び疾患の根底にある機構を解明するための新規のロバストなインビトロシステムを描き出している。
【００５５】
胚細胞に由来する多能性幹細胞
一態様において、本方法は、多能性であるか、又は多能性になるよう誘導することのできる幹細胞を入手するステップを含み得る。一部の実施形態において、多能性幹細胞は胚性幹細胞に由来し、一方で胚性幹細胞は初期哺乳類胚の全能性細胞に由来するもので、インビトロで無制限の未分化増殖が可能である。胚性幹細胞は、初期胚である胚盤胞の内部細胞塊に由来する多能性幹細胞である。未分化胚芽細胞から胚性幹細胞を得る方法は、当該技術分野において周知である。例えば、本明細書にある種の細胞型が例示されるが、当業者であれば、本明細書に記載される方法及びシステムを任意の幹細胞に適用可能であることを理解するであろう。
【００５６】
本発明において実施形態で使用し得るさらなる幹細胞としては、限定はされないが、国立幹細胞バンク（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ：ＮＳＣＢ）、カリフォルニア大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）のヒト胚性幹細胞研究センター（Ｈｕｍａｎ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ）、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ（ＵＣＳＦ）；Ｗｉ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＷＩＳＣ細胞バンク；ウィスコンシン大学幹細胞及び再生医学センター（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｃｅｎｔｅｒ：ＵＷ−ＳＣＲＭＣ）；Ｎｏｖｏｃｅｌｌ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）；Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ  ＡＢ（Ｇｏｔｅｂｏｒｇ、スウェーデン）；ＥＳ  Ｃｅｌｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐｔｅ  Ｌｔｄ（シンガポール）；テクニオン−イスラエル工科大学（Ｔｅｃｈｎｉｏｎ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｉｓｒａｅｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（Ｈａｉｆａ、イスラエル）が管理するデータベース；並びにプリンストン大学（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）及びペンシルバニア大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）が管理する幹細胞データベースによって提供されるか、又はそれに記載されるものが挙げられる。本発明において実施形態で使用し得る例示的胚性幹細胞としては、限定はされないが、ＳＡ０１（ＳＡ００１）；ＳＡ０２（ＳＡ００２）；ＥＳ０１（ＨＥＳ−１）；ＥＳ０２（ＨＥＳ−２）；ＥＳ０３（ＨＥＳ−３）；ＥＳ０４（ＨＥＳ−４）；ＥＳ０５（ＨＥＳ−５）；ＥＳ０６（ＨＥＳ−６）；ＢＧ０１（ＢＧＮ−０１）；ＢＧ０２（ＢＧＮ−０２）；ＢＧ０３（ＢＧＮ−０３）；ＴＥ０３（１３）；ＴＥ０４（１４）；ＴＥ０６（１６）；ＵＣ０１（ＨＳＦ１）；ＵＣ０６（ＨＳＦ６）；ＷＡ０１（Ｈ１）；ＷＡ０７（Ｈ７）；ＷＡ０９（Ｈ９）；ＷＡ１３（Ｈ１３）；ＷＡ１４（Ｈ１４）が挙げられる。
【００５７】
一部の実施形態において、幹細胞は、追加的な特性を取り入れるためさらに修飾されてもよい。例示的な修飾細胞株としては、限定はされないが、Ｈ１  ＯＣＴ４−ＥＧＦＰ；Ｈ９  Ｃｒｅ−ＬｏｘＰ；Ｈ９  ｈＮａｎｏｇ−ｐＧＺ；Ｈ９  ｈＯｃｔ４−ｐＧＺ；Ｈ９  ｉｎ  ＧＦＰｈＥＳ；及びＨ９  Ｓｙｎ−ＧＦＰが挙げられる。
【００５８】
胚性幹細胞に関するさらなる詳細については、例えば、Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，“Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅｓ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｓ”，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２（５３９１）：１１４５−１１４７；Ａｎｄｒｅｗｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，“Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ（ＥＳ）ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｅｍｂｒｙｏｎａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ（ＥＣ）ｃｅｌｌｓ：ｏｐｐｏｓｉｔｅ  ｓｉｄｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓａｍｅ  ｃｏｉｎ”，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  Ｔｒａｎｓ  ３３：１５２６−１５３０；Ｍａｒｔｉｎ  １９８０，“Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ”，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０９（４４５８）：７６８−７７６；Ｅｖａｎｓ  ａｎｄ  Ｋａｕｆｍａｎ，１９８１，“Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｓ”，Ｎａｔｕｒｅ  ２９２（５８１９）：１５４−１５６；Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，“Ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｆｅｅｄｅｒ  ｃｅｌｌｓ”，Ｌａｎｃｅｔ  ３６５（９４７１）：１６３６−１６４１；（これらの各々は本明細書によって全体として本明細書に援用される）を参照することができる。
【００５９】
代替的な多能性幹細胞は、有性生殖する生物の配偶子を生じる細胞である胚性生殖細胞（ＥＧＣ）に由来し得る。ＥＧＣは、後期胚の生殖堤に見られる始原生殖細胞に由来し、胚性幹細胞の特性の多くを有する。胚における始原生殖細胞が発生すると、成体において生殖配偶子（精子又は卵子）を生じる幹細胞となる。マウス及びヒトでは、適切な条件下で組織培養において胚性生殖細胞を成長させることが可能である。ＥＧＣ及びＥＳＣは両方ともに多能性である。本発明の目的上、用語「ＥＳＣ」は広義に用いられ、時にＥＧＣを包含する。
【００６０】
人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）
一部の実施形態において、ｉＰＳＣは、ある種の幹細胞関連遺伝子を非多能性細胞、例えば成体線維芽細胞にトランスフェクトすることによって得られる。トランスフェクションは、典型的にはレトロウイルスなどのウイルスベクターを用いて達成される。トランスフェクトされる遺伝子としては、マスター転写調節因子Ｏｃｔ−３／４（Ｐｏｕｆ５１）及びＳｏｘ２が挙げられるが、他の遺伝子が誘導効率を増進させることも考えられる。３〜４週間後、少数のトランスフェクト細胞が形態学的及び生化学的に多能性幹細胞と類似したものになり始め、典型的には、形態学的選択、倍加時間によるか、又はレポーター遺伝子及び抗生物質選択によって単離される。本明細書で使用されるとき、ｉＰＳＣとしては、限定はされないが、マウスにおける第１代ｉＰＳＣ、第２代ｉＰＳＣ、及びヒト人工多能性幹細胞を挙げることができる。一部の実施形態では、レトロウイルス系を使用して、４つの中心的遺伝子：Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及びｃ−Ｍｙｃを使用してヒト線維芽細胞を多能性幹細胞に形質転換し得る。代替的実施形態では、レンチウイルス系を使用して、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、及びＬＩＮ２８で体細胞を形質転換する。ｉＰＳＣにおいてその発現を誘導し得る遺伝子としては、限定はされないが、Ｏｃｔ−３／４（例えば、Ｐｏｕ５ｆｌ）；Ｓｏｘ遺伝子ファミリーの特定のメンバー（例えば、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３、及びＳｏｘ１５）；Ｋｌｆファミリーの特定のメンバー（例えば、Ｋｌｆ１、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ４、及びＫｌｆ５）、Ｍｙｃファミリーの特定のメンバー（例えば、Ｃ−ｍｙｃ、Ｌ−ｍｙｃ、及びＮ−ｍｙｃ）、Ｎａｎｏｇ、及びＬＩＮ２８が挙げられる。
【００６１】
一部の実施形態では、非ウイルスベースの技術を用いてｉＰＳＣを作成し得る。一部の実施形態では、アデノウイルスを使用して必要な４つの遺伝子をマウスの皮膚及び肝細胞のＤＮＡに運び込み、胚性幹細胞と同一の細胞をもたらすことができる。アデノウイルスはそれ自体の遺伝子のいずれも標的宿主と一体化することがないため、腫瘍を作り出す危険性がなくなる。一部の実施形態では、いかなるウイルストランスフェクション系も全くなしに、プラスミドによって再プログラム化を達成することができ、しかし効率は極めて低い。他の実施形態では、タンパク質の直接送達を用いてｉＰＳＣが作成され、従ってウイルス又は遺伝子修飾の必要がなくなる。一部の実施形態では、同様の方法論を用いてマウスｉＰＳＣの作成が可能である：ポリアルギニンアンカーによって細胞に供給される特定のタンパク質による細胞の反復的な処理が、多能性を誘導するのに十分であった。一部の実施形態において、多能性誘導遺伝子の発現はまた、低酸素条件下においてＦＧＦ２で体細胞を処理することによっても増加させることができる。
【００６２】
胚性幹細胞に関するさらなる詳細は、例えば、Ｋａｊｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，“Ｖｉｒｕｓ  ｆｒｅｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ  ａｎｄ  ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ  ｅｘｃｉｓｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒｓ”，Ｎａｔｕｒｅ  ４５８：７７１−７７５；Ｗｏｌｔｊｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，“ｐｉｇｇｙＢａｃ  ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｓ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｔｏ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ”，Ｎａｔｕｒｅ  ４５８：７６６−７７０；Ｏｋｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，“Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｕｓｅ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｗｉｔｈｏｕｔ  Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ”，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２２（５９０３）：９４９−９５３；Ｓｔａｄｔｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，“Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｗｉｔｈｏｕｔ  Ｖｉｒａｌ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ”，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２２（５９０３）：９４５−９４９；及びＺｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，“Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ４（５）：３８１−３８４；（これらの各々は本明細書によって全体として本明細書に援用される）を参照することができる。
【００６３】
一部の実施形態において、例示的ｉＰＳ細胞株としては、限定はされないが、ｉＰＳ−ＤＦ１９−９；ｉＰＳ−ＤＦ１９−９；ｉＰＳ−ＤＦ４−３；ｉＰＳ−ＤＦ６−９；ｉＰＳ（Ｆｏｒｅｓｋｉｎ）；ｉＰＳ（ＩＭＲ９０）；及びｉＰＳ（ＩＭＲ９０）が挙げられる。
【００６４】
ｉＰＳＣはＥＳＣと同様の様式で完全分化型組織に分化する能力を有したことが示されている。例えば、ｉＰＳＣは、βＩＩＩ−チューブリン、チロシンヒドロキシラーゼ、ＡＡＤＣ、ＤＡＴ、ＣｈＡＴ、ＬＭＸ１Ｂ、及びＭＡＰ２を発現するニューロンに分化した。カテコールアミン関連酵素の存在は、ｉＰＳＣがｈＥＳＣと同様にドーパミン作動性ニューロンに分化可能であり得ることを示唆し得る。幹細胞関連遺伝子は分化後に下方制御されることが示された。また、ｉＰＳＣが、自発的に拍動し始めた心筋細胞に分化し得ることも示されている。心筋細胞は、ＴｎＴｃ、ＭＥＦ２Ｃ、ＭＹＬ２Ａ、ＭＹＨＣβ、及びＮＫＸ２．５を発現した。幹細胞関連遺伝子は分化後に下方制御された。
【００６５】
胃の器官及び発生
本出願人の発明以前には、胚性幹細胞及び／又はｉＰＳＣなどの前駆細胞を胃組織に変換するために利用可能なシステムはなかった。
【００６６】
一部の実施形態において、ＥＳＣ及びｉＰＳＣなどのＰＳＣは、初めに胚体内胚葉（ＤＥ）、次に三次元腸管構造（前腸スフェロイド）、その次に後方前腸／胃組織の形成を介して三次元胃オルガノイド（ｈＧＯ）へと、段階的な形で指向性分化を経る。
【００６７】
一部の実施形態において、ＥＳＣ及びｉＰＳＣなどのＰＳＣは非段階的な形で指向性分化を経て、ここではＤＥ形成を促進するための分子（例えば、成長因子、リガンド）及び続く組織形成のための分子が同時に加えられる。
【００６８】
胚体内胚葉
胃の上皮は、胚体内胚葉（ＤＥ）と呼ばれる単層の細胞に由来する。前方ＤＥは前腸並びに肺、食道、胃、肝臓及び膵臓を含めたその関連器官を形成し、後方ＤＥは中腸及び後腸を形成して、これは小腸及び大腸並びに泌尿生殖器系の部位を形成する。ＤＥはインビボで消化管及び気道の上皮を生じる。マウス、ヒヨコ及びカエルの胚を使用した研究からは、原腸胚期におけるＤＥの前後パターンの確立が、続く前腸及び後腸発生に必須であることが示唆される。一部の実施形態において、ＥＳＣ及びｉＰＳＣなどのＰＳＣは、初めに胚体内胚葉（ＤＥ）、次に前方／前腸上皮（例えば、前腸スフェロイド）、その次に胃組織へと、段階的な形で指向性分化を経る。この過程には、ＢＭＰ、Ｗｎｔ及びＦＧＦシグナル伝達経路が決定的に重要であると考えられている。ＷＮＴ及びＦＧＦの活性化は腸管形態形成を促進する働きをし、及びＢＭＰシグナル伝達の阻害は前腸運命を促進する。前腸の単層立方上皮は初めに多列円柱上皮、次に胃上皮を含む腺及び小窩並びに絨毛の基部にある増殖帯（これは予定プロジェニタードメイン（presumptive progenitor domain）に対応する）へと発生する。
【００６９】
インビトロでＤＥから胃組織への分化を指向させるためのロバストで効率的なプロセスが確立される。一部の実施形態において、指向性分化は、ｉＰＳＣ及び／又はＤＥ細胞における特定のシグナル伝達経路を選択的に活性化することによって実現される。一部の実施形態において、このシグナル伝達経路は、限定はされないが、Ｗｎｔシグナル伝達経路、Ｗｎｔ／ＡＰＣシグナル伝達経路、ＦＧＦシグナル伝達経路、ＴＧＦ−βシグナル伝達経路、ＢＭＰシグナル伝達経路；ＥＧＦシグナル伝達経路、及びレチノイン酸シグナル伝達経路を含めた、胃組織の発生において活性なものである。
【００７０】
ＤＥの発生及び／又は一般に腸の発生に関係するシグナル伝達経路の機能に関するさらなる詳細については、例えば、Ｚｏｒｎ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ，２００９，“Ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ  ｅｎｄｏｄｅｒｍ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｏｒｇａｎ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ”，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ２５：２２１−２５１；Ｄｅｓｓｉｍｏｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，“ＦＧＦ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｓ  ｎｅｃｅｓｓａｒｙ  ｆｏｒ  ｅｓｔａｂｌｉｓｈｉｎｇ  ｇｕｔ  ｔｕｂｅ  ｄｏｍａｉｎｓ  ａｌｏｎｇ  ｔｈｅ  ａｎｔｅｒｉｏｒ−ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ  ａｘｉｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ”，Ｍｅｃｈ  Ｄｅｖ  １２３：４２−５５；ＭｃＬｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，“Ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｗｎｔ／｛ｂｅｔａ｝−ｃａｔｅｎｉｎ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｎｔｅｒｉｏｒ  ｅｎｄｏｄｅｒｍ  ｉｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｌｉｖｅｒ  ａｎｄ  ｐａｎｃｒｅａｓ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ”．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１３４：２２０７−２２１７；Ｗｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｍｅｌｔｏｎ，２０００，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２７：１５６３−１５７２；ｄｅ  Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ”，Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ６０（７）：１３２２−１３３２；Ｓａｎｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，“Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｐａｔｈｗａｙｓ  ｉｎ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ”，Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０：６９５−７２３；Ｌｏｇａｎ  ａｎｄ  Ｎｕｓｓｅ，２００４，“Ｔｈｅ  Ｗｎｔ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ”，Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０：７８１−８１０；Ｔａｉｐａｌｅｌ  ａｎｄ  Ｂｅａｃｈｙｌ，２００１，“Ｔｈｅ  Ｈｅｄｇｅｈｏｇ  ａｎｄ  Ｗｎｔ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ”，Ｎａｔｕｒｅ  ４１１：３４９−３５４；Ｇｒｅｇｏｒｉｅｆｆ  ａｎｄ  Ｃｌｅｖｅｒｓ，２００５，“Ｗｎｔ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ：ｆｒｏｍ  ｅｎｄｏｄｅｒｍ  ｔｏ  ｃａｎｃｅｒ”，Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖ．１９：８７７−８９０；（これらの各々は本明細書によって全体として本明細書に援用される）を参照することができる。
【００７１】
多能性細胞（例えば、ｉＰＳＣ又はＥＳＣ）から胚体内胚葉を作製する任意の方法を本明細書に記載される方法に適用することが可能である。一部の実施形態において、多能性細胞は桑実胚に由来する。一部の実施形態において、多能性幹細胞は幹細胞である。これらの方法において使用される幹細胞としては、限定はされないが、胚性幹細胞を挙げることができる。胚性幹細胞は胚内部細胞塊に由来してもよく、又は胚生殖堤に由来してもよい。胚性幹細胞又は生殖細胞は、限定はされないが、ヒトを含めた様々な哺乳類種を含め、種々の動物種を起源とし得る。一部の実施形態では、ヒト胚性幹細胞を使用して胚体内胚葉が作製される。一部の実施形態では、ヒト胚性生殖細胞を使用して胚体内胚葉が作製される。一部の実施形態では、ｉＰＳＣを使用して胚体内胚葉が作製される。
【００７２】
一部の実施形態において、多能性幹細胞からＤＥ細胞への分化過程において１つ以上の成長因子が使用される。分化過程で使用される１つ以上の成長因子としては、ＴＧＦ−βスーパーファミリーからの成長因子を挙げることができる。かかる実施形態において、１つ以上の成長因子は、ノーダル／アクチビン及び／又は成長因子のＴＧＦ−βスーパーファミリーのＢＭＰサブグループを含む。一部の実施形態において、１つ以上の成長因子は、ノーダル、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＢＭＰ４、Ｗｎｔ３ａ又はこれらの成長因子のいずれかの組み合わせからなる群から選択される。
【００７３】
一部の実施形態において、胚性幹細胞又は人工多能性細胞及びｉＰＳＣは、１つ以上の成長因子によって６時間以上；１２時間以上；１８時間以上；２４時間以上；３６時間以上；４８時間以上；６０時間以上；７２時間以上；８４時間以上；９６時間以上；１２０時間以上；１５０時間以上；１８０時間以上；又は２４０時間以上にわたり処理される。
【００７４】
一部の実施形態において、胚性幹細胞又は生殖細胞及びｉＰＳＣは、１０ｎｇ／ｍｌ以上；２０ｎｇ／ｍｌ以上；５０ｎｇ／ｍｌ以上；７５ｎｇ／ｍｌ以上；１００ｎｇ／ｍｌ以上；１２０ｎｇ／ｍｌ以上；１５０ｎｇ／ｍｌ以上；２００ｎｇ／ｍｌ以上；５００ｎｇ／ｍｌ以上；１，０００ｎｇ／ｍｌ以上；１，２００ｎｇ／ｍｌ以上；１，５００ｎｇ／ｍｌ以上；２，０００ｎｇ／ｍｌ以上；５，０００ｎｇ／ｍｌ以上；７，０００ｎｇ／ｍｌ以上；１０，０００ｎｇ／ｍｌ以上；又は１５，０００ｎｇ／ｍｌ以上の濃度の１つ以上の成長因子によって処理される。一部の実施形態において、成長因子の濃度は処理全体を通じて一定のレベルに維持される。他の実施形態において、成長因子の濃度は処理する間に変化させる。一部の実施形態において、成長因子は、種々のＨｙＣｌｏｎｅ濃度でウシ胎仔セリン（ＦＢＳ）を含む培地中に懸濁される。当業者であれば、本明細書に記載されるレジメンを単独又は組み合わせの任意の既知の成長因子に適用可能であることを理解するであろう。２つ以上の成長因子が使用されるとき、各成長因子の濃度は独立に変えてもよい。
【００７５】
一部の実施形態において、胚体内胚葉細胞がエンリッチされた細胞集団が使用される。一部の実施形態において、胚体内胚葉細胞は単離され、又は実質的に精製される。一部の実施形態において、単離され、又は実質的に精製された胚体内胚葉細胞は、ＯＣＴ４、ＡＦＰ、ＴＭ、ＳＰＡＲＣ及び／又はＳＯＸ７マーカーと比べてより高度にＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、及び／又はＣＸＲＣ４マーカーを発現する。
【００７６】
胚体内胚葉を含む細胞集団をエンリッチする方法もまた企図される。一部の実施形態において、胚体内胚葉細胞は、胚体内胚葉細胞の表面上に存在するが混合細胞集団中の他の細胞の表面上には存在しない分子に結合する試薬にそれらの細胞を接触させて、次に試薬に結合した細胞を単離することにより、混合細胞集団から単離し、又は実質的に精製することができる。特定の実施形態において、胚体内胚葉細胞の表面上に存在する細胞構成物はＣＸＣＲ４である。
【００７７】
本発明のさらに他の実施形態は、ＣＸＣＲ４抗体、ＳＤＦ−１リガンド又は他のＣＸＣＲ４リガンドに関し、これらは、エンリッチされた、単離された、又は実質的に精製された形態の胚体内胚葉細胞を入手するために使用することができる。例えば、親和性に基づく分離又は磁気に基づく分離などの方法においてＣＸＣＲ４抗体、ＳＤＦ−１リガンド又は別のＣＸＣＲ４リガンドを試薬として使用して、該試薬に結合する胚体内胚葉細胞の調製物をエンリッチし、単離し、又は実質的に精製することができる。
【００７８】
一部の実施形態において、胚体内胚葉細胞及びｈＥＳＣは１つ以上の成長因子で処理される。かかる成長因子には、ＴＧＦ−βスーパーファミリーの成長因子が含まれ得る。かかる実施形態において、１つ以上の成長因子はノーダル／アクチビン及び／又は成長因子のＴＧＦ−βスーパーファミリーのＢＭＰサブグループを含む。一部の実施形態において、１つ以上の成長因子は、ノーダル、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＢＭＰ４、Ｗｎｔ３ａ又はこれらの成長因子のいずれかの組み合わせからなる群から選択される。
【００７９】
本発明において使用し得るＤＥ細胞を入手し又は作り出すためのさらなる方法としては、限定はされないが、Ｄ’Ａｍｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．に対する米国特許第７，５１０，８７６号明細書；Ｆｉｓｋ  ｅｔ  ａｌ．に対する米国特許第７，３２６，５７２号明細書；Ｋｕｂｏｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ  ｅｎｄｏｄｅｒｍ  ｆｒｏｍ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ”，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３１：１６５１−１６６２；Ｄ’Ａｍｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，“Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ  ｅｎｄｏｄｅｒｍ”，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２３：１５３４−１５４１；及びＡｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，“Ｔｈｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ  ｅｎｄｏｄｅｒｍ  ｌｉｎｅａｇｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ：ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ＨＮＦ３／ｆｏｒｋｈｅａｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ”，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１９：１３０１−１３１５；（これらの各々は本明細書によって全体として本明細書に参照により援用される）に記載されるものが挙げられる。
【００８０】
後方化ＤＥの指向性分化
一部の実施形態では、アクチビン誘導性胚体内胚葉（ＤＥ）がＦＧＦ／Ｗｎｔ／ノギン誘導性前方内胚葉パターン形成、前腸特異化及び形態形成、並びに最後にプロガストリック培養系をさらに経ることにより、表層粘液細胞、粘液腺細胞、内分泌、及びプロジェニター細胞を含めた機能性の胃細胞型への胃組織成長、形態形成及び細胞分化が促進され得る。一部の実施形態では、ヒトＰＳＣを、粘液、内分泌、及びプロジェニター細胞型を含む胃上皮にインビトロで分化するように効率的に指向させる。特定のタイプの胃組織形成を促進するため、任意の発生段階で成長因子などの分子を加え得ることは理解されるであろう。
【００８１】
一部の実施形態では、ＤＥの前方化内胚葉細胞が１つ以上の特殊化した細胞型へとさらに発生する。
【００８２】
一部の実施形態において、可溶性ＦＧＦ及びＷｎｔリガンド並びにＢＭＰ拮抗薬を使用して培養下で初期前腸特異化を模倣し、ｉＰＳＣ又はＥＳＣから発生したＤＥを指向性分化によって、主要な前庭部胃細胞型の全てを効率的に生じる前腸上皮に変換する。ヒトにおいては、ＤＥの指向性分化は、胃発生に重要な特定のシグナル伝達経路を選択的に活性化させることによって実現する。
【００８３】
インビトロでのヒト胃（ｓｔｏｍａｃｈ）／胃（ｇａｓｔｒｉｃ）の発生は、胎児期の腸発生；内胚葉形成、前方内胚葉パターン形成、前腸形態形成、胎児期の胃、前庭部及び胃底部発生、上皮形態形成、予定プロジェニタードメインの形成、及び胃の機能性細胞型への分化を近似する段階で起こる。
【００８４】
当業者は、任意のＦＧＦリガンドと組み合わせた任意のＷｎｔシグナル伝達タンパク質の発現を改変すると、本発明における指向性分化が生じ得ることを理解するであろう。一部の実施形態において、この改変は、Ｗｎｔ３、詳細にはＷｎｔ３ａの過剰発現である。一部の実施形態において、この改変は、Ｗｎｔ１又は他のＷｎｔリガンドの過剰発現である。
【００８５】
当業者は、ＦＧＦシグナル伝達経路のシグナル伝達活性を改変することと組み合わせてＷｎｔシグナル伝達経路のシグナル伝達活性を改変すると、本発明における指向性分化が生じ得ることを理解するであろう。一部の実施形態において、この改変は、前述の経路を活性化する小分子モジュレーターの使用による。例えば、Ｗｎｔ経路の小分子モジュレーターには、限定はされないが、塩化リチウム；２−アミノ−４，６−二置換ピリミジン（ヘテロ）アリールピリミジン；ＩＱ１；ＱＳ１１；ＮＳＣ６６８０３６；ＤＣＡ  β−カテニン；２−アミノ−４−［３，４−（メチレンジオキシ）−ベンジル−アミノ］−６−（３−メトキシフェニル）ピリミジンが含まれた。
【００８６】
代替的実施形態において、Ｗｎｔ及び／又はＦＧＦシグナル伝達経路に関連する細胞構成物、例えば、これらの経路の天然阻害因子又は拮抗物質を阻害して、Ｗｎｔ及び／又はＦＧＦシグナル伝達経路の活性化をもたらすことができる。
【００８７】
一部の実施形態において、細胞構成物は他の細胞構成物又は外因性分子によって阻害される。Ｗｎｔシグナル伝達の例示的な天然阻害因子としては、限定はされないが、Ｄｋｋ１、ＳＦＲＰタンパク質及びＦｒｚＢが挙げられる。一部の実施形態において、外因性分子としては、限定はされないが、ＷＡＹ−３１６６０６；ＳＢ−２１６７６３；又はＢＩＯ（６−ブロモインジルビン−３’−オキシム）などの小分子を挙げることができる。
【００８８】
さらなる詳細については、例えば、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａ  ｓｍａｌｌ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ａｇｏｎｉｓｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｗｎｔ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ”，Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ．４４（１３）：１９８７−１９９０（２００５）；Ｍｉｙａｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｗｎｔ／ｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ／ＣＢＰ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｍａｉｎｔａｉｎｓ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｍｕｒｉｎｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ”，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１０４（１３）：５６６８−５６７３（２００７）；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｍａｌｌ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｓｙｎｅｒｇｉｓｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｗｎｔ／ｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ”，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１０４（１８）：７４４４−７４４８（２００７）；Ｎｅｉｉｅｎｄａｍ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａｎ  ＮＣＡＭ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ＦＧＦ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｇｏｎｉｓｔ，ｔｈｅ  ＦＧＬ−ｐｅｐｔｉｄｅ，ｉｎｄｕｃｅｓ  ｎｅｕｒｉｔｅ  ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｉｎ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｒａｔ  ｎｅｕｒｏｎｓ”，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．９１（４）：９２０−９３５（２００４）；Ｓｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ  ＰＤＺ  ｄｏｍａｉｎ”，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４４（４７）：１５４９５−１５５０３（２００５）；Ｃｏｇｈｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ−３  ｍｏｄｕｌａｔｅ  ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ”，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．７（１０）：７９３−８０３（２０００）；Ｃｏｇｈｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ−３  ｍｏｄｕｌａｔｅ  ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ”，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｂｉｏｌｏｇｙ  ７（１０）：７９３−８０３；及びＰａｉ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  ｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ  ａｎｄ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｃｏｌｏｎ  ｃｅｌｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｉｎｖａｓｉｖｅｎｅｓｓ”，Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ．１５（５）：２１５６−２１６３（２００４）；（これらの各々は本明細書によって全体として参照により援用される）が参照される。
【００８９】
一部の実施形態では、Ｗｎｔ及び／又はＦＧＦシグナル伝達経路に関連する細胞構成物を標的化するｓｉＲＮＡ及び／又はｓｈＲＮＡを使用してこれらの経路が活性化される。当業者であれば、標的細胞構成物には、限定はされないが、ＳＦＲＰタンパク質；ＧＳＫ３、Ｄｋｋ１、及びＦｒｚＢが含まれ得ることを理解するであろう。
【００９０】
ＲＮＡｉベースの技術に関するさらなる詳細については、例えば、Ｃｏｕｚｉｎ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９８：２２９６−２２９７；ＭｃＭａｎｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．３，７３７−７４７；Ｈａｎｎｏｎ，Ｇ．Ｊ．，２００２，Ｎａｔｕｒｅ  ４１８，２４４−２５１；Ｐａｄｄｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ２，１７−２３；Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００１．ＥＭＢＯ  Ｊ．２０：６８７７−６８８８；Ｔｕｓｃｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１３：３１９１−３１９７；Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅｘｐｒｅｓｓ  ２９７：２０５６−２０６０；（これらの各々は本明細書によって全体として参照により援用される）を参照することができる。
【００９１】
線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）は、血管新生、創傷治癒、及び胚発生に関与する成長因子のファミリーである。ＦＧＦはヘパリン結合タンパク質であり、細胞表面関連ヘパラン硫酸プロテオグリカンとの相互作用はＦＧＦシグナル伝達に必須であることが示されている。ＦＧＦは多種多様な細胞及び組織の増殖及び分化プロセスにおける中心的存在である。ヒトにおいては、ＦＧＦファミリーの２２個のメンバーが同定されており、その全てが構造上関係のあるシグナル伝達分子である。メンバーＦＧＦ１〜ＦＧＦ１０は全て線維芽細胞成長因子受容体（ＦＧＦＲ）に結合する。ＦＧＦ１は酸性線維芽細胞成長因子としても知られ、ＦＧＦ２は塩基性線維芽細胞成長因子しても知られる。ＦＧＦホモログ因子１〜４（ＦＨＦ１〜ＦＨＦ４）としても知られるメンバーＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１３、及びＦＧＦ１４は、ＦＧＦと比べて機能上の特徴的差異を有することが示されている。これらの因子は顕著に類似した配列相同性を有するが、それらはＦＧＦＲに結合せず、ＦＧＦと無関係の細胞内過程に関与する。この集団は「ｉＦＧＦ」としても知られる。メンバーＦＧＦ１６〜ＦＧＦ２３は比較的新しく、それほど十分には特徴付けられていない。ＦＧＦ１５はヒトＦＧＦ１９のマウスオルソログである（従ってヒトＦＧＦ１５は存在しない）。ヒトＦＧＦ２０はアフリカツメガエルＦＧＦ−２０（ＸＦＧＦ−２０）とのその相同性に基づき同定された。他のＦＧＦの局所的活性と対照的に、ＦＧＦ１５／ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２１及びＦＧＦ２３は、より全身性の効果を有する。
【００９２】
一部の実施形態において、当業者は、任意のＦＧＦをＷｎｔシグナル伝達経路のタンパク質と併せて使用し得ることを理解するであろう。一部の実施形態において、可溶性ＦＧＦとしては、限定はされないが、ＦＧＦ４、ＦＧＦ２、及びＦＧＦ３を挙げることができる。
【００９３】
一部の実施形態において、ＦＧＦシグナル伝達経路の細胞構成物は、他の細胞構成物又は外因性分子によって阻害される。ＦＧＦシグナル伝達の例示的な天然阻害因子としては、限定はされないが、スプラウティー（Ｓｐｒｏｕｔｙ）タンパク質ファミリー及びスプレッド（Ｓｐｒｅｄ）タンパク質ファミリーを挙げることができる。上記で考察したとおり、タンパク質、小分子、核酸を使用してＦＧＦシグナル伝達経路を活性化することができる。
【００９４】
当業者は、Ｗｎｔ及びＦＧＦシグナル伝達経路に関連して本明細書に記載される方法及び組成物が例として提供されることを理解するであろう。同様の方法及び組成物を本明細書に開示される他のシグナル伝達経路に適用可能である。
【００９５】
一部の実施形態において、ＤＥ培養物は、本明細書に記載されるシグナル伝達経路の１つ以上の分子によって６時間以上；１２時間以上；１８時間以上；２４時間以上；３６時間以上；４８時間以上；６０時間以上；７２時間以上；８４時間以上；９６時間以上；１２０時間以上；１５０時間以上；１８０時間以上；２００時間以上、２４０時間以上；２７０時間以上；３００時間以上；３５０時間以上；４００時間以上；５００時間以上；６００時間以上；７００時間以上；８００時間以上；９００時間以上；１，０００時間以上；１，２００時間以上；又は１，５００時間以上処理され得る。
【００９６】
一部の実施形態において、ＤＥ培養物は、１０ｎｇ／ｍｌ以上；２０ｎｇ／ｍｌ以上；５０ｎｇ／ｍｌ以上；７５ｎｇ／ｍｌ以上；１００ｎｇ／ｍｌ以上；１２０ｎｇ／ｍｌ以上；１５０ｎｇ／ｍｌ以上；２００ｎｇ／ｍｌ以上；５００ｎｇ／ｍｌ以上；１，０００ｎｇ／ｍｌ以上；１，２００ｎｇ／ｍｌ以上；１，５００ｎｇ／ｍｌ以上；２，０００ｎｇ／ｍｌ以上；５，０００ｎｇ／ｍｌ以上；７，０００ｎｇ／ｍｌ以上；１０，０００ｎｇ／ｍｌ以上；又は１５，０００ｎｇ／ｍｌ以上の濃度の本明細書に記載されるシグナル伝達経路の１つ以上の分子によって処理される。一部の実施形態において、シグナル伝達分子の濃度は処理全体を通じて一定に維持される。他の実施形態において、シグナル伝達経路の分子の濃度は処理する間に変化させる。一部の実施形態において、本発明におけるシグナル伝達分子は、ＤＭＥＭ及びウシ胎仔セリン（ＦＢＳ）を含む培地中に懸濁される。ＦＢＳは、２％以上；５％以上；１０％以上；１５％以上；２０％以上；３０％以上；又は５０％以上の濃度であってもよい。当業者であれば、本明細書に記載されるレジメン（ｒｅｇｉｍｅｎｔ）が、限定はされないがＷｎｔ及びＦＧＦシグナル伝達経路における任意の分子を含めた、単独又は組み合わせの本明細書に記載されるシグナル伝達経路の任意の既知の分子に適用可能であることを理解するであろう。
【００９７】
２つ以上のシグナル伝達分子を使用してＤＥ培養物を処理する実施形態において、それらのシグナル伝達分子は同時に又は別々に加えることができる。２つ以上の分子を使用するとき、各々の濃度は独立に変化させてもよい。
【００９８】
ＰＳＣからＤＥ培養物への、及び続いて様々な中間的成熟胃細胞型への分化は、発生段階特異的細胞マーカーの存在によって決定し得る。一部の実施形態では、代表的な細胞構成物の発現を用いてＤＥ形成が決定される。代表的な細胞構成物としては、限定はされないが、ＣＭＫＯＲ１、ＣＸＣＲ４、ＧＰＲ３７、ＲＴＮ４ＲＬ１、ＳＬＣ５Ａ９、ＳＬＣ４０Ａ１、ＴＲＰＡ１、ＡＧＰＡＴ３、ＡＰＯＡ２、Ｃ２０ｏｒｆ５６、Ｃ２１ｏｒｆ１２９、ＣＡＬＣＲ、ＣＣＬ２、ＣＥＲ１、ＣＭＫＯＲ１、ＣＲＩＰ１、ＣＸＣＲ４、ＣＸｏｒｆ１、ＤＩＯ３、ＤＩＯ３０Ｓ、ＥＢ−１、ＥＨＨＡＤＨ、ＥＬＯＶＬ２、ＥＰＳＴＩ１、ＦＧＦ１７、ＦＬＪ１０９７０、ＦＬＪ２１１９５、ＦＬＪ２２４７１、ＦＬＪ２３５１４、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＱ１、ＧＡＴＡ４、ＧＰＲ３７、ＧＳＣ、ＬＯＣ２８３５３７、ＭＹＬ７、ＮＰＰＢ、ＮＴＮ４、ＰＲＳＳ２、ＲＴＮ４ＲＬ１、ＳＥＭＡ３Ｅ、ＳＩＡＴ８Ｄ、ＳＬＣ５Ａ９、ＳＬＣ４０Ａ１、ＳＯＸ１７、ＳＰＯＣＫ３、ＴＭＯＤ１、ＴＲＰＡ１、ＴＴＮ、ＡＷ１６６７２７、ＡＩ８２１５８６、ＢＦ９４１６０９、ＡＩ９１６５３２、ＢＣ０３４４０７、Ｎ６３７０６及びＡＷ７７２１９２を挙げることができる。
【００９９】
ＤＥ形成の検出に好適なさらなる細胞構成物については、例えば、２００５年６月２３日に出願された米国特許出願第１１／１６５，３０５号明細書；２００５年１２月２２日に出願された米国特許出願第１１／３１７，３８７号明細書；２００４年１２月２３日に出願された米国特許出願第１１／０２１，６１８号明細書；２００５年４月２６日に出願された米国特許出願第１１／０２１，６１８号明細書、同第１１／１１５，８６８号明細書；２００５年１２月２２日に出願された米国特許出願第１１／３１７，３８７号明細書；２００６年６月２３日に出願された米国特許出願第１１／４７４，２１１号明細書；２００５年６月２３日に出願された米国特許出願第１１／１６５，３０５号明細書；２００８年８月２９日に出願された米国特許出願第１１／５８７，７３５号明細書；２００８年２月２８日に出願された米国特許出願第１２／０３９，７０１号明細書；２００９年３月３０日に出願された米国特許出願第１２／４１４，４８２号明細書；２００９年６月２日に出願された米国特許出願第１２／４７６，５７０号明細書；２００８年７月２１日に出願された米国特許出願第１２／０９３，５９０号明細書；２００９年１０月２０日に出願された米国特許出願第１２／５８２，６００号明細書；（これらの各々は本明細書によって全体として本明細書における参照に援用される）を参照することができる。
【０１００】
一部の実施形態では、ＤＥをＦＧＦ４及びＷｎｔ３ａ＋ノギンと共にある期間、例えば、１２時間以上；１８時間以上；２４時間以上；３６時間以上；４８時間以上；６０時間以上；又は９０時間以上インキュベートした後の前腸形成の傾向を明らかにするため、ＳＯＸ２の発現が用いられる。一部の実施形態では、ＣＤＸ２の発現の長期化によって計測するとき安定した前方内胚葉表現型を達成するため、より長いインキュベーション時間が必要である。かかる実施形態において、インキュベーション時間は６０時間以上；７２時間以上；８４時間以上；９６時間以上；１０８時間以上；１２０時間以上；１４０時間以上；１６０時間以上；１８０時間以上；２００時間以上；２４０時間以上；又は３００時間以上であり得る。
【０１０１】
或いは、一部の実施形態では、細胞構成物、例えばＣＤＸ２などの後腸マーカーの欠如を用いて指向性の前腸形成を明らかにすることができる。一部の実施形態では、胃の転写因子ＰＤＸ１、ＫＬＦ５、及びＳＯＸ９を使用して胃の発生を表すことができる。一部の実施形態では、ＧＡＴＡ４及び／又はＧＡＴＡ６タンパク質発現を使用して胃の発生を表すことができる。これらの実施形態において、インキュベーション時間は１２時間以上；１８時間以上；２４時間以上；３６時間以上；４８時間以上；６０時間以上；又は９０時間以上であり得る。或いは、インキュベーション時間は６０時間以上；７２時間以上；８４時間以上；９６時間以上；１０８時間以上；１２０時間以上；１４０時間以上；１６０時間以上；１８０時間以上；２００時間以上；２４０時間以上；又は３００時間以上であり得る。
【０１０２】
一部の実施形態では、関連するシグナル伝達経路の分子を標的化する一次及び／又は二次抗体を使用した免疫組織化学によって細胞構成物の存在量データ、例えばタンパク質及び／又は遺伝子発現レベルが決定される。他の実施形態では、マイクロアレイ解析によって細胞構成物の存在量データ、例えばタンパク質及び／又は遺伝子発現レベルが決定される。
【０１０３】
さらにそれに代えて、形態学的変化を用いて指向性分化の進行を表すことができる。一部の実施形態において、前腸スフェロイドがさらなる成熟のため三次元培養条件にさらに供され得る。加えて、胃オルガノイドを６日以上；７日以上；９日以上；１０日以上；１２日以上；１５日以上；２０日以上；２５日以上；２８日以上；３２日以上；３６日以上；４０日以上；４５日以上；５０日以上；又は６０日以上観察することができる。
【０１０４】
多能性幹細胞の指向性分化
一部の実施形態では、多能性幹細胞は「ワンステップ」プロセスによって胃細胞型に変換される。例えば、多能性幹細胞をＤＥ培養物に分化させることのできる１つ以上の分子（例えばアクチビンＡ）が、ＤＥ培養物の指向性分化を促進することのできる追加的な分子（例えば、Ｗｎｔ３ａ／ＦＧＦ４アクチベーター及びＢＭＰ阻害薬）と組み合わされることにより、多能性幹細胞が直接処理される。
【０１０５】
有用性及びキットの実施形態
一部の実施形態では、本明細書に記載される胃組織又は関連細胞型を使用して、ピロリ菌（Ｈ．Ｐｙｌｏｒｉ）の胃取り込み及び／又は輸送及び／又は処理機構に関して薬物をスクリーニングすることができる。例えば、これは、最も容易に吸収される又は有効な薬物をスクリーニングするためハイスループット方式で行うことができ、薬物の胃取り込み及び胃毒性を試験するために行われる第１相臨床試験を増強することができる。これには、小分子、ペプチド、代謝産物、塩の細胞周囲及び細胞内輸送機構が含まれ得る。本明細書に開示される胃組織はさらに、生体適合性を評価するための、胃組織との接触が意図される任意の薬剤及び／又は装置との適合性の評価に使用され得る。
【０１０６】
一部の実施形態では、本明細書に記載される胃細胞、胃組織及び／又は胃ｈＧＯを使用して、正常なヒト胃発生の分子基盤を同定することができる。
【０１０７】
一部の実施形態では、本明細書に記載される胃細胞、胃組織及び／又は胃ｈＧＯを使用して、ヒト胃発生に影響を与える先天的欠陥の分子基盤を同定することができる。
【０１０８】
一部の実施形態では、本明細書に記載される胃細胞、胃組織及び／又は胃ｈＧＯを使用して、遺伝子突然変異によって引き起こされる胃の先天的欠陥を修正することができる。詳細には、ｉＰＳＣ技術及び本明細書に記載される遺伝的に正常な胃組織又は関連細胞型を使用して、ヒト胃発生に影響を与える突然変異を修正することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載される胃組織又は関連細胞型を使用して代替組織を作成することができる。遺伝性疾患の例としては、限定はされないが、Ｎｅｕｒｏｇ３突然変異及び腸内分泌異常（enteric anendocrinosis）、ＰＴＦ１ａ突然変異及び新生児糖尿病、胃の腸内分泌細胞に影響する（ｅffｅct)ＰＤＸ１突然変異が挙げられる。
【０１０９】
一部の実施形態では、本明細書に記載される胃細胞、胃組織及び／又は胃ｈＧＯを使用して、消化性潰瘍疾患、メネトリエ病などの疾患又は病態のための、又は胃癌患者のための代替胃組織を作成することができる。
【０１１０】
一部の実施形態では、本明細書に記載される胃細胞、胃組織及び／又は胃ｈＧＯを使用して、ヒト宿主上皮及び宿主免疫とのミクロビオティック(microbiotic)な相互作用を研究することができる。
【０１１１】
一部の実施形態では、本明細書に記載される胃組織又は関連細胞型、詳細には腸内分泌細胞を使用して、胃内分泌によって媒介される摂食行動、代謝のホルモン調節を研究することができる。
【０１１２】
一部の実施形態では、本明細書に記載される胃細胞、胃組織及び／又は胃ｈＧＯ、詳細にはホルモンガストリン又はグレリンを産生する腸内分泌細胞を使用して、例えば、肥満症、メタボリックシンドローム、又は２型糖尿病の患者における代謝調節を研究し、改善することができる。
【０１１３】
一部の実施形態では、本明細書に記載される胃細胞、胃組織及び／又は胃ｈＧＯを使用して、それを必要としている対象における任意の損傷した又は摘出された胃組織を置換することができる。
【０１１４】
一部の実施形態では、本明細書に記載される胃細胞、胃組織及び／又は胃ｈＧＯを使用して、胃組織に作用する任意の薬物の毒性及び有効性をスクリーニングすることができる。
【０１１５】
本明細書に記載される胃細胞、胃組織及び／又は胃ｈＧＯを使用して化合物の吸収レベルを決定する一部の実施形態では、この化合物を胃細胞、胃組織及び／又は胃ｈＧＯとある化合物と接触させ；及び胃細胞、胃組織及び／又は胃ｈＧＯによる化合物の吸収レベルを定量化することができる。一部の実施形態において、化合物は、放射性同位元素、蛍光標識及び／又は一次若しくは二次可視マーカーで標識されてもよい。
【０１１６】
一部の実施形態では、本明細書に記載される胃細胞、胃組織及び／又は胃ｈＧＯを含み且つ前述の有用性の１つ以上に基づく診断キット又はパッケージが開発される。
【０１１７】
本発明が詳細に説明されているが、添付の特許請求の範囲に定義される本発明の範囲から逸脱することなく改良例、変形例、及び均等な実施形態が可能であることは明らかであろう。さらには、本開示における例は全て非限定的な例として提供されることが理解されなければならない。
【実施例】
【０１１８】
以下の非限定的な例は、本明細書に開示される本発明の実施形態をさらに説明するため提供される。当業者は、以下の例に開示される技術が、本発明の実施において良好に機能することが見出された手法に相当し、従ってその実施のための態様の例を成すものと見なし得ることを理解しなければならない。しかしながら、当業者は、本開示に鑑みて、開示される具体的な実施形態において多くの変更を行うことができ、それでもなお本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく同様の又は類似した結果を達成し得ることを理解しなければならない。
【０１１９】
多能性幹細胞培養
ヒト胚性幹細胞株ＷＡ０１（Ｈ１）及びＷＡ０９（Ｈ９）をＷｉＣｅｌｌから入手した。ＥＳＣ株及びｉＰＳＣ株は、ｍＴｅｓＲ１培地（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）においてＨＥＳＣ適格Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上でフィーダーフリー条件でコロニーとして維持した。細胞は４日毎にｄｉｓｐａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて常法で継代した。
【０１２０】
ＤＥ誘導
（図１４に要約する）Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で被覆した２４ウェルプレートのｍＴｅｓＲ１培地＋ＲＯＣＫ阻害薬Ｙ２７６３２（１０μＭ；Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）においてヒトＥＳ及びｉＰＳ細胞を単一細胞としてウェル当たり１５０，０００細胞でプレーティングした。ＲＯＣＫ阻害薬は、分化のためのプレーティング後の幹細胞の生存を増強する。翌日から開始して、漸増濃度の０％、０．２％、及び２．０％既知組成ウシ胎仔血清（ｄＦＢＳ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有するＲＰＭＩ  １６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において細胞をアクチビンＡ（１００ｎｇ  ｍｌ−１；Ｃｅｌｌ  Ｇｕｉｄａｎｃｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）で３日間処理した。
【０１２１】
胚体内胚葉（ＤＥ）の分化
ＰＳＣを分化させるため、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（マトリゲル）で被覆した２４ウェルディッシュにおいて、ＲＯＣＫ阻害薬Ｙ−２７６３２（１０μＭ；Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）を含むｍＴｅｓＲ１にウェル当たり１５０，０００細胞の密度でａｃｃｕｔａｓｅ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して単一細胞としてプレーティングした。翌日、以前記載されているとおりＰＳＣはＤＥに分化した１１、３５。漸増濃度の０％、０．２％、及び２．０％既知組成ウシ胎仔血清（ｄＦＢＳ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有するＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において細胞をアクチビンＡ（１００ｎｇ  ｍｌ−１；Ｃｅｌｌ  Ｇｕｉｄａｎｃｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）に３日間曝露した。加えて、ＤＥ誘導の初日にＢＭＰ４（５０ｎｇ  ｍｌ−１；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を添加した。
【０１２２】
内胚葉パターン形成及び腸管形態形成
ＤＥ誘導に続き、２．０％ｄＦＢＳを含むＲＰＭＩ  １６４０において細胞を成長因子／拮抗薬で３日間処理した。後方前腸スフェロイドを作成するため、ノギン（２００ｎｇ  ｍｌ−１；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）と、ＦＧＦ４（５００ｎｇ  ｍｌ−１；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）と、ＷＮＴ３Ａ（５００ｎｇ  ｍｌ−１；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）又はＣＨＩＲ９９０２１（２μＭ；Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）のいずれかとでＤＥを３日間処理した。ＣＨＩＲ９９０２１は、Ｗｎｔシグナル伝達経路を刺激する小分子である。最終日にＲＡ（２μＭ；Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加する。三次元成長及び前庭部の特異化。後方前腸スフェロイドを以前記載されているとおりＭａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に包埋し１０、１２、続いて、Ｎ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｂ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｌ−グルタミン、１０μＭ  ＨＥＰＥＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン、及びＥＧＦ（１００ｎｇ  ｍｌ−１；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を補足したアドバンストＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において成長させた。前庭部の特異化のため、三次元成長の最初の３日間にＲＡ及びノギンを添加した。内分泌細胞の特異化のため、３０日目にＥＧＦ濃度を１０ｎｇ  ｍｌ−１に下げる。
【０１２３】
内胚葉パターン形成及び前腸スフェロイド作成
ＤＥ誘導に続き、２．０％ｄＦＢＳ及び成長因子：ＷＮＴ３Ａ（５００ｎｇ  ｍｌ−１；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＣＨＩＲ９９０２１（２μＭ；Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）；ＦＧＦ４（５００ｎｇ  ｍｌ−１；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、及びノギン（２００ｎｇ  ｍｌ−１；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含むＲＰＭＩ  １６４０培地において細胞を培養した。培地は毎日交換した。３日後、ＷＮＴ３Ａ（又はＣＨＩＲ９９０２１）、ＦＧＦ４、及びノギンの組み合わせにより、培養ウェルに浮遊前腸スフェロイドがもたらされた。前腸内胚葉の後方化のため、ＷＮＴ／ＦＧＦ／ノギン処理の３日目にＲＡ（２μＭ；Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加した。
【０１２４】
胃オルガノイドの三次元培養
スフェロイドを以前記載されているとおりの三次元インビトロ培養系に移した５、１０、１２。簡潔に言えば、スフェロイドを回収し、５０μｌ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に再懸濁し、及び三次元ドロップレットでプレーティングした。組織培養インキュベーターにおいてＭａｔｒｉｇｅｌを１０〜１５分間固化させた後、腸培地：Ｎ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｂ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｌ−グルタミン、１０μＭ  ＨＥＰＥＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン、及びＥＧＦ（１００ｎｇ  ｍｌ−１；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含むアドバンストＤＭＥＭ／Ｆ１２でスフェロイドをオーバーレイした。最初の３日間、この腸培地にＲＡ及びノギンを添加した。培地は必要に応じて３〜４日毎に取り替えた。２０日目、オルガノイドを回収し、約１：１２希釈で新鮮なＭａｔｒｉｇｅｌにリプレーティングした。
【０１２５】
ｄｏｘ誘導性ｈＮＥＵＲＯＧ３  ｈＥＳＣ株の作成
過剰発現コンストラクトを作成するため、Ｇａｔｅｗａｙ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）法を用いてｈＮＥＵＲＯＧ３  ｃＤＮＡ（ダナ・ファーバー／ハーバード癌センターＤＮＡリソースコア（Ｄａｎａ−Ｆａｒｂｅｒ／Ｈａｒｖａｒｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ  ＤＮＡ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｏｒｅ；クローンＨｓＣＤ００３４５８９８）をｐＩｎｄｕｃｅｒ２０レンチウイルスベクター（Ｔ．Ｗｅｓｔｂｒｏｏｋから供与された３６）にクローニングした。高力価レンチウイルス粒子はＣＣＨＭＣウイルスベクターコアによって作製された。ＡｃｃｕｔａｓｅでＨ１  ｈＥＳＣを分離し、１０μＭ  Ｙ−２７６３２を含むｍＴｅｓＲ１に単一細胞懸濁液としてプレーティングし、レンチウイルスに４時間曝露した。ｍＴｅｓＲ１は毎日取り替え、２日後、培地にＧ４１８（２００μｇ  ｍｌ−１）を添加して組み込みクローンを選択した。Ｇ４１８耐性細胞は抗生物質において無限に維持したが、他の場合には通常どおり培養して継代した。
【０１２６】
ｉＰＳＣ株の作成及び特徴付け
初代ヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）は新生児ヒト包皮組織から培養し、シンシナティ大学皮膚科学科（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ）を通じて２人のドナーから入手し、及びＳｕｓａｎｎｅ  Ｗｅｌｌｓ  ＰｈＤから供与いただいた。１０％ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を補足したＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からなる線維芽細胞培地においてＨＦＦを培養し、継代第５代と第８代との間の再プログラム化に使用した。本研究に使用したＥＢＮＡ１／ＯｒｉＰベースのエピソームプラスミドｐＣＬＸＥ−ｈＯｃｔ３／４−ｓｈｐ５３、ｐＣＬＸＥ−ｈＳｏｘ２−Ｋｌｆ４、ｐＣＬＸＥ−ｈＬｍｙｃ−Ｌｉｎ２８、及びｐＣＬＸＥ−ＧＦＰは以前記載されており３７、Ａｄｄｇｅｎｅから入手した（ＩＤ番号：それぞれ２７０７７、２７０７８、２７０８０、及び２７０８２）。最適化されたヒト皮膚線維芽細胞Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキット（ＶＰＤ−１００１；Ｌｏｎｚａ）をエピソームプラスミドによるＨＦＦのトランスフェクションに使用した。簡潔に言えば、各トランスフェクションについて、室温において２００×ｇで１０分間遠心して１×１０６個のＨＦＦをペレット化し、１００μｌの室温Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ溶液に再懸濁し、１．２５μｇの各エピソームプラスミドをヌクレオフェクトした（プログラムＵ２０）。２回のトランスフェクションからの細胞（合計２×１０６細胞）を、１０ｃｍ組織培養プレートの線維芽細胞培地にリプレーティングし、３７℃／５％ＣＯ２で培養した。トランスフェクションの６日後、１．０７×１０６個の照射マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）が入ったゼラチン被覆１０ｃｍディッシュの線維芽細胞培地に４．５×１０５個のＨＦＦをリプレーティングした。トランスフェクション後７日目に開始して、細胞に毎日、２０％ノックアウト血清代替物、１ｍＭ  Ｌ−グルタミン、０．１ｍＭ  β−メルカプトエタノール、０．１ｍＭ  非必須アミノ酸、及び４ｎｇ  ｍｌ−１塩基性ＦＧＦ（全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから）を補足したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を供給した。約２週間後、ｈＥＳＣ様の形態を有する孤立したコロニーを手動で切り出し、ｈＥＳＣ適格ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で被覆された組織培養ディッシュのｍＴｅｓＲ１培地（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にリプレーティングした。ｍＴｅＳＲ１／ｍａｔｒｉｇｅｌ培養に適応させた後、自発的分化が最小限の、ロバストな増殖及びｈＥＳＣ様の形態を維持したｉＰＳＣを、凍結保存及び特徴付けのため拡大した。
【０１２７】
標準的な中期の広がり及びＧバンド核型がＣＣＨＭＣ細胞遺伝学研究所（ＣＣＨＭＣ  Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）によって決定された。奇形腫形成のため、６ウェルディッシュの３つのウェルのｉＰＳＣを組み合わせて、氷冷ＤＭＥＭ／Ｆ１２中に穏やかに再懸濁した。注射の直前に、約３３％の終濃度となるようにｍａｔｒｉｇｅｌを添加し、免疫不全ＮＯＤ／ＳＣＩＤ  γ  Ｃ−／−マウスに細胞を皮下注射した。６〜１２週間以内に腫瘍が形成された。切除した奇形腫を固定し、パラフィンに包埋し、組織学的検査のため切片をヘマトキシリン及びエオシンで染色した。
【０１２８】
胃オルガノイドの例示的プロトコル
以下の表は、前駆細胞から胃オルガノイドを発生させるための例示的処理プロトコルを示す。
【０１２９】
【表１−１】
2020115872.tif 000002
【表１−２】
2020115872.tif 000003
【０１３０】
胃底部特異化プロトコル
本出願人は、初めに、胎生期において胃底部で特異的に発現するが前庭部では発現しない遺伝子を同定しようとした。Ｅ１４．５マウス胚の消化管を顕微解剖し、４つの領域に分けた：前胃（食道を含む）、胃底部、前庭部、及び十二指腸。図１５を参照のこと。次にこれらの領域の領域形成マーカーをｑＰＣＲによって分析した。図１５は、種々の領域で発現することが知られる対照遺伝子の発現を示す。胃底部及び前庭部は、そのＳｏｘ２及びＧａｔａ４の高発現、並びにＰ６３及びＣｄｘ２の欠如によって前胃及び十二指腸と区別することができる。重要なことに、Ｐｄｘ１（前庭部のマーカー）は胃底部と比べて前庭部組織においてはるかに高いレベルで発現し、正確な解剖を指示するものである。
【０１３１】
胚体マウス内胚葉及び成体ヒト胃組織の公開されているマイクロアレイデータセットのバイオインフォマティクス解析を使用して、胃底部で優先的に発現し得るが前庭部では発現しない候補遺伝子のリストを作成した。Ｅ１４．５マウスセグメントにおけるこれらの推定マーカーの発現をｑＰＣＲによって調べた。Ｉｒｘ１、Ｉｒｘ２、Ｉｒｘ３、Ｉｒｘ５、及びＰｉｔｘ１が、実に、前庭部と比べて胃底部においてより高いレベルで発現する。従ってこれらのマーカーは、ｈＰＳＣ由来の前腸培養物における胃底部特異化の指標として使用し得る。図１６を参照のこと。
【０１３２】
次に、胃オルガノイド分化プロトコルの６〜９日目における胃底部−前庭部パターン形成の調節におけるＷｎｔシグナル伝達の機能を試験した。Ｗｎｔ３ａ（１００ｎｇ／ｍＬ及び５００ｎｇ／ｍＬで）の添加はスフェロイド遺伝子発現に何ら効果を有しなかったが、それはまた、実にＷｎｔ標的遺伝子Ａｘｉｎ２の発現も誘導した。従って、小分子ＣＨＩＲ９９０２１（ＣＨＩＲ；２ｕＭ）の効果を試験した。ＣＨＩＲ９９０２１は受容体非依存的にＷｎｔシグナル伝達を刺激する。ＣＨＩＲへの曝露によりＰｄｘ１発現レベルのロバストな抑制がもたらされ、これは胃底部特異化と一致した。ＣＨＩＲは腸マーカーＣｄｘ２の発現を誘導しなかった。図１７を参照のこと。図１８は、Ｐｄｘ１の抑制と一致して、ＣＨＩＲへの曝露が胃底部特異的マーカーＩＲＸ３及びＩＲＸ５の高レベルの発現を誘導したことを示す。
【０１３３】
ピロリ菌（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）感染
ピロリ菌（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）株Ｇ２７３８及びＣａｇＡが欠損している突然変異体Ｇ２７株（ΔＣａｇＡ）３９を、以前記載されているとおり４０、コロンビア寒天基礎培地（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、５％ウマ血液（Ｃｏｌｏｒａｄｏ  Ｓｅｒｕｍ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、５μｇ  ｍｌ−１、バンコマイシン及び１０μｇ  ｍｌ−１トリメトプリムからなる血液寒天プレートで成長させた。オルガノイド注入のため、ピロリ菌（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）をブルセラブロスに１×１０９細菌ｍｌ−１の濃度で再懸濁し、Ｎａｎｏｊｅｃｔ  ＩＩ（Ｄｒｕｍｍｏｎｄ）微量注入器装置にロードした。約２００ｎｌ（２×１０５細菌を含有する）を各オルガノイドの管腔に直接注入し、注射を受けたオルガノイドを２４時間培養した。陰性対照としてはブルセラブロスを注入した。
【０１３４】
材料及び方法
免疫蛍光染色
全ての組織を４％パラホルムアルデヒドに、凍結処理用には室温で１時間又はパラフィン処理用には４℃で一晩のいずれかで固定した。凍結切片については、組織を３０％スクロース中に４℃で一晩保護し、次ＯＣＴ（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ）に包埋し、１０μｍに切り出した。パラフィン切片については、組織を段階的エタノール系列、続いてキシレンで処理し、次にパラフィン包埋し、７μｍに切り出した。組織培養細胞は室温で１５分間固定し、直接染色した。染色については、凍結スライドを室温に解凍し、ＰＢＳ中に再水和させる一方で、パラフィンスライドを脱パラフィン化して抗原回復に供した。スライドをＰＢＳ＋０．５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ中の５％正常ロバ血清（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）において室温で３０分間ブロックした。一次抗体（「方法」の表１に掲載）をブロッキング緩衝液中に希釈し、４℃で一晩インキュベートした。スライドをＰＢＳで洗浄し、二次抗体と共に室温で１時間インキュベートし、Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ−Ｇ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用してカバースリップをマウントした。Ｎｉｋｏｎ  Ａ１Ｒｓｉ倒立共焦点顕微鏡で共焦点像を取得した。
【０１３５】
ＲＮＡ単離及びｑＰＣＲ
Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ  ＲＮＡ  ＩＩキット（Ｍａｃｈｅｒｙ−Ｎａｇｅｌ）を使用して組織から全ＲＮＡを単離した。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＶＩＬＯ  ｃＤＮＡ合成キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造者のプロトコルに従い使用して、１００ｎｇ  ＲＮＡから逆転写を実施した。ＣＦＸ−９６リアルタイムＰＣＲ検出システム（ＢｉｏＲａｄ）でＱｕａｎｔｉｔｅｃｔ  ＳｙｂｒＧｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してｑＰＣＲを行った。ΔΔＣＴ法を用いて分析を実施した。ＰＣＲプライマーはｑＰｒｉｍｅｒＤｅｐｏｔ（ｈｔｔｐ：／／ｐｒｉｍｅｒｄｅｐｏｔ．ｎｃｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）の配列を使用して設計しており、表２に掲載する。
【０１３６】
免疫沈降及びウエスタンブロット分析
ピロリ菌（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）に感染させたオルガノイドを氷冷ＰＢＳ中においてＭａｔｒｉｇｅｌから回収し、１５０ｇで５分間遠心した。プロテアーゼ阻害薬（Ｒｏｃｈｅ）を補足したＭ−ＰＥＲ哺乳類タンパク質抽出試薬（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中に組織を溶解させた。細胞溶解物からの１０μｇ全タンパク質を抗ｃ−Ｍｅｔ抗体（２μｇ；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ４５６０）によって４℃で１６時間免疫沈降させた。次にプロテインＡ／Ｇアガロースビーズ（２０μｌ；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を添加し、試料を４℃で１６時間インキュベートした。免疫沈降物をＰＢＳで３回洗浄し、次に、β−メルカプトエタノール（４０μｌ；ＢｉｏＲａｄ）を含有するＬａｅｍｍｌｉローディング緩衝液に再懸濁した。試料を４〜２０％トリス−グリシン勾配ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で泳動させ、８０Ｖで３．５時間泳動させた。ゲルをニトロセルロース膜（Ｗｈａｔｍａｎ  Ｐｒｏｔｒａｎ、０．４５μｍ）に１０５Ｖで１．５時間転写した。膜をＫＰＬ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒブロック溶液（Ｋｉｒｋｅａａｒｄ＆Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）において室温で１時間ブロックし、次に一次抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。使用した一次抗体：抗ホスホチロシン（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ｓｃ−７０２０；１：１００）、抗ｃ−Ｍｅｔ（Ａｂｃａｍ、ａｂ５９８８４；１：１００）、及び抗ピロリ菌（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）ＣａｇＡ（Ａｂｃａｍ、ａｂ９０４９０；１：１００）。膜を洗浄し、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ抗マウス６８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；１：１０００）二次抗体においてインキュベートした。Ｏｄｙｓｓｅｙ赤外線イメージングソフトウェアシステム（Ｌｉｃｏｒ）を使用してブロットを画像化した。
【０１３７】
考察
ｈＰＳＣは胚体内胚葉（ＤＥ）に分化した１１。ＤＥはインビボで胃腸管及び気道の上皮を生じる。全ての内胚葉器官の発生における次の２つの重要なイベントは、前後（Ａ−Ｐ）軸に沿ったＤＥのパターン形成及び腸管形態形成であり、前方におけるＳｏｘ２＋前腸及び後方におけるＣｄｘ２＋中・後腸の形成がもたらされる（Ｅ８．５、１４体節期マウス胚、図１Ａにおいて強調表示されるとおり）。この形態形成及び内胚葉と中胚葉との間の組織相互作用は、インビボ及びインビトロの両方で適切な器官形成にとって決定的に重要であるものと思われる。ＷＮＴ３ＡとＦＧＦ４とは、以下の３つのことを行うため相乗作用することが以前実証されている：ｈＰＳＣ由来のＤＥを後方化し、間葉の拡大を促進し、及び中・後腸マーカーＣＤＸ２を発現する腸管様構造の構築を誘導する１０、１２。図１Ａは、ｅ８．５（１４体節期）マウス胚においてＳｏｘ２タンパク質が前腸内胚葉を特徴付け、及びＣｄｘ２タンパク質が中／後腸内胚葉を特徴付けることを示す。図１Ｂは、ＢＭＰを阻害すると中／後腸運命が抑制され、前腸マーカーＳＯＸ２の発現が促進されたことを示す。培地単独（対照）又は指示される成長因子／拮抗薬を含む培地において３日間曝露したｈＰＳＣ−ＤＥ培養物におけるパターン形成マーカーのＰＣＲ解析。ＷＮＴとＦＧＦとを合わせた活性は、既報告のとおりＣｄｘ２発現を誘導し１０、一方、ＢＭＰ拮抗薬ノギンはＣｄｘ２発現を抑制し、高レベルの前腸マーカーＳＯＸ２を誘導するのに十分であった。＊、対照と比較してｐ＜０．０５。＊＊、ＷＮＴ／ＦＧＦと比較してｐ＜０．００５。図１Ｃは、Ｗｎｔ／ＦＧＦ／ノギンを用いて作成された前腸スフェロイドが、高レベルのＣＤＸ２を有するＷｎｔ及びＦＧＦ単独で作成したスフェロイドと比較したとき、ホールマウント免疫蛍光染色及びｍＲＮＡによって高レベルのＳＯＸ２タンパク質を有することを示す。＊、ｐ＜１．０×１０−６。図１Ｄは、ｅ８．５、１４体節期マウス胚における後方前腸が胃及び膵臓を生じ、高レベルのＨｎｆ１βタンパク質を有することを示す。図１Ｅは、スフェロイド作成ステップの最終日に培養物をＲＡに曝露すると、ＳＯＸ２発現上皮においてＨＮＦ１βの発現が誘導され、後方前腸スフェロイドの形成がもたらされることを示す。＊、ｐ＜０．００５。図１Ｆは、前方及び後方前腸内胚葉の両方の形成におけるノギン及びＲＡのパターン形成効果を要約する系統図を示す。スケールバー、１００μｍ。エラーバーは標準偏差を表す。
【０１３８】
【表２】
2020115872.tif 000004
【０１３９】
【表３】
2020115872.tif 000005
【０１４０】
ｈＰＳＣ由来のＤＥにおける前腸構造の形成を促進するため、本出願人は、ＷＮＴ／ＦＧＦが腸管形態形成を刺激する能力を、後方内胚葉運命の促進におけるそれらの役割と分離しようとした。発生モデル生物によるインビボ研究に基づき１３、１４、Ａ−Ｐパターン形成の調節におけるＢＭＰシグナル伝達の機能を試験し、本出願人は、ＷＮＴ／ＦＧＦが後腸プログラムを惹起するのにＢＭＰ活性を必要とすることを見出した。具体的には、ＢＭＰシグナル伝達を拮抗薬ノギンで阻害すると、ＷＮＴ／ＦＧＦの存在下であっても、ＤＥ培養物において３日後にＣＤＸ２が抑制され、前腸マーカーＳＯＸ２が誘導された（図１Ｂ〜図１Ｃ及び図５）。重要なことに、ＢＭＰシグナル伝達の阻害は、ＷＮＴ／ＦＧＦが間葉の拡大及び腸管構造の構築を促進する能力、従ってＳＯＸ２＋前腸スフェロイドの形成をもたらす能力には何ら効果を有しなかった。
【０１４１】
図５は、後方運命を促進するには、ＷＮＴ及びＦＧＦの活性化と並行してＢＭＰシグナル伝達が必要であることを示す。図５Ａは、ＧＳＫ３β阻害薬ＣＨＩＲ９９０２１（ＣＨＩＲ；２μＭ）が組換えＷＮＴ３Ａと同じ後方化効果を誘導したことを示し、この効果はＢＭＰ阻害によって遮断することができる。図５Ｂは、ＣＨＩＲが腸管形態形成を誘導したことを示し、ＷＮＴ３Ａと同じようにスフェロイド生成が起こる。図５Ｃは単層培養物の免疫蛍光染色を示し、これから、ＣＨＩＲ／ＦＧＦ処理した内胚葉における高いＣＤＸ２誘導効率並びにノギン処理及びＣＨＩＲ／ＦＧＦ／ノギン処理した内胚葉におけるＳＯＸ２誘導が確認される。図５Ｄは、ＢＭＰ標的遺伝子ＭＳＸ１／２のｑＰＣＲ解析を示し、これは、Ｗｎｔ／ＦＧＦに応答したＢＭＰ活性の増加はなく、しかし標的遺伝子はノギンに応答して抑制されることを示しており、内因性ＢＭＰシグナル伝達の存在が実証される。図５Ｅは、ＢＭＰ２（１００ｎｇ  ｍＬ−１）を添加してもＷｎｔ／ＦＧＦが内胚葉を後方化する能力の代わりにはならず、又はその能力は増強されなかったことを示す。これらのデータは、Ｗｎｔ／ＦＧＦの後方化効果がＢＭＰシグナル伝達の上方制御によって媒介されることはなく、しかし内因性ＢＭＰ活性は実に必要であることを示している。スケールバー、図５Ｂでは１ｍｍ；図５Ｃでは１００μｍ。エラーバーは標準偏差を表す。
【０１４２】
スフェロイド形態形成は、ｈＥＳＣ株及びｈｉＰＳＣ株の両方においてロバストなプロセスであり（図６Ａ）、９０％超のスフェロイド細胞がＳＯＸ２を発現し（図１Ｃ）、前腸系統への効率的な特異化を示している。従って、ＷＮＴ、ＦＧＦ及びＢＭＰの間の新しいエピスタシス関係が本出願人によって同定されており、ここでは３つ全ての経路が協働して中・後腸運命を促進する一方、ＷＮＴ及びＦＧＦは、ＢＭＰと別個に、内胚葉及び中胚葉から腸管構造への構築を駆動する働きをする。
【０１４３】
図２Ａ〜図２Ｇは、胃オルガノイド分化が効率的且つ細胞株非依存的プロセスであることを示す。図２Ａ、２つのｈＥＳＣ株（Ｈ１及びＨ９）及び１つのｉＰＳＣ株（７２．３）の間のスフェロイド形成及び特徴を比較する表。図２Ｂ、Ｈ１及びｉＰＳＣ  ７２．３細胞株に由来する３４日目ｈＧＯの免疫蛍光染色。ｉＰＳＣ由来のオルガノイドは、ｈＥＳＣに由来するものと同じ形態学的及び分子的特徴を呈する。図２Ｃ、３４日目ｈＧＯにおける器官上皮細胞型定量化。上皮の９０％超が前庭部であり（ＰＤＸ１発現及び欠損したＰＴＦ１Ａ発現によって指示される）、一方、ＣＤＸ２（腸）、アルブミン（肝臓）及びｐ６３（扁平上皮）を含めた、内胚葉に由来する他の器官に関連するマーカーの発現は５％未満である。図２ｄ〜ｇ、人工多能性幹細胞株ｉＰＳＣ  ７２．３の特徴付け。図２Ｄ、ｉＰＳＣ  ７２．３は、Ｈ１  ｈＥＳＣ株と比較したとき多能性幹細胞コロニーの正常な形態学的特徴を呈し、及び図２Ｅ、正常な４６；ＸＹ核型を有する。図２Ｆ、ｉＰＳＣ  ７２．３は多能性マーカーＯＣＴ３／４及びＮＡＮＯＧを発現し、及び図２Ｇ、インビボ奇形腫アッセイにおいて内胚葉、中胚葉、及び外胚葉系統への分化により多能性を実証する。スケールバー、１００μｍ。エラーバーは標準偏差を表す。
【０１４４】
インビボでは、胃の胃底部及び前庭部ドメインの両方が、膵臓、肝臓及び十二指腸に加えて、Ｓｏｘ２＋前腸内胚葉の後方セグメントから生じる。ＳＯＸ２＋前腸スフェロイドを胃系統に指向させるため、本出願人は、後方前腸運命を促進するシグナル伝達経路を同定しようとした。本出願人は、後方前腸に由来する器官の発生におけるその役割を考え１５〜１７、レチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達に注目した。インビボでは、後方前腸はＨｎｆ１βの発現によって特徴付けられる（図１Ｄ。本出願人は、パターン形成／スフェロイド作成段階（ＦＧＦ４／ＷＮＴ３Ａ／ノギン）の最終日（５〜６日目）にＲＡに２４時間曝露すると、後方前腸マーカーのロバストな活性化及びＳＯＸ２／ＨＮＦ１β＋後方前腸スフェロイドの形成がもたらされることを突き止めた（図１Ｅ及び図７）。従って、ＲＡ、ＷＮＴ、ＦＧＦ、及びＢＭＰシグナル伝達経路の正確な時間的且つコンビナトリアルな操作により、三次元後方前腸スフェロイドの作成が可能となる。
【０１４５】
図７Ａ〜図７Ｄは、レチノイン酸が前腸内胚葉を後方化することを示す。図７Ａは、前腸パターン形成実験の概略説明図を示す。ＤＥ培養物をＷｎｔ（ＣＨＩＲ）／ＦＧＦ／ノギンで３日間処理してＳｏｘ２陽性前腸スフェロイドを作成したことを示し、ＲＡはパターン形成の３日目に２４時間添加する。図７Ｂは、前腸単層培養物から生成されるスフェロイドの数がＲＡによって増加することを示す明視野像を示す。図７Ｃは、Ｈｎｆ１βタンパク質が前腸の後方部分に局在化している１４体節期胚の免疫蛍光像を示す図１Ｄの弱拡大像を示す。胚のうち枠で囲んだ領域が図１Ｄに示される。図７Ｄは、ＲＡで処理した前腸スフェロイドにおける遺伝子発現のｑＰＣＲ解析を示す。後方前腸マーカーＨＮＦ１β及びＨＮＦ６は、ＲＡに２４時間曝露することによってロバストに誘導される。＊、ｐ＜０．０５。スケールバー、図７Ｂでは１ｍｍ；図７Ｃでは１００μｍ。エラーバーは標準偏差を表す。
【０１４６】
後方前腸を個別的な器官系統に指向させる分子機構については、ほとんど解明されていない。発生初期、予定器官域が個別的な遺伝子発現パターンによって特徴付けられる：Ｓｏｘ２＋胃底部、Ｓｏｘ２／Ｐｄｘ１＋前庭部、Ｐｄｘ１／Ｐｔｆ１α＋膵臓、及びＰｄｘ１／Ｃｄｘ２＋十二指腸（図２Ｂ）。本出願人はこれらの分子マーカーを使用して、後方前腸スフェロイド培養物を胃系統に指向させるシグナル伝達経路を同定した。スフェロイドを三次元培養条件に移した後、ＲＡによって７２時間さらに処理すると（６〜９日目）、高いＳＯＸ２発現を維持しつつ、ＰＤＸ１  ｍＲＮＡレベルの１００倍超の増加が生じた（図２Ｃ）。重要なことに、膵臓特異的マーカーＰＴＦ１αの発現は誘導されなかったため、他の研究で観察されたとおりの９、ＲＡ処理が膵臓運命を促進することはなかった。これらのデータは、ＲＡシグナル伝達と三次元成長との組み合わせが後方前腸スフェロイドを初期前庭部運命の指標であるＳＯＸ２／ＰＤＸ１＋上皮に効率的に指向させることを実証している。
【０１４７】
図２は、概して、ヒト前庭部胃オルガノイドの特異化及び成長を示す。エラーバーは標準偏差を表す。図２Ａは、ｈＰＳＣから三次元胃オルガノイドへの分化を指向させるために使用されるインビトロ培養系の概略図を示し、図２Ｂは、Ｓｏｘ２、Ｐｄｘ１及びＣｄｘ２を用いたマウスＥ１０．５胚のホールマウント免疫蛍光染色による発生中の後方前腸器官の確定マーカーを示す。Ｓｏｘ２及びＰｄｘ１の共発現は胃上皮の遠位部分、予定前庭部（ａ）にユニークであり、Ｓｏｘ２発現は胃底部（ｆ）を特徴付け、Ｐｄｘ１（及びＰｔｆ１ａ）の発現は背側膵（ｄｐ）及び腹側膵（ｖｐ）を特徴付け、及びＰｄｘ１／Ｃｄｘ２の共発現は十二指腸（ｄ）を特徴付ける。図２Ｃは、三次元マトリックスにおいてＲＡ（２μＭ）の存在下で３日間培養された後方前腸スフェロイドが、発生中の前庭部と同様に、高レベルのＰＤＸ１及びＳＯＸ２を共発現し、膵臓マーカーＰＴＦ１αは発現しなかったことを示す（＊、ｐ＜０．０５）。図２Ｄは、後方前腸（ｆｏｒｇｕｔ）スフェロイドから胃オルガノイドに成長する間の形態学的変化を明らかにする実体顕微鏡写真を示す。４週間までに、ｈＧＯの上皮は複雑な腺状構造を呈した（スケールバー、５００μｍ）。図２Ｅは、Ｅ１４．５及びＥ１８．５並びに同等のｈＧＯ発生段階における発生中のマウス前庭部の比較を示す。両方のマウス前庭部及びｈＧＯにおいて初期多列上皮にＳｏｘ２及びＰｄｘ１が共発現する。後期になると、上皮がより成熟した腺状構造に変わることに伴いＳｏｘ２は下方制御される。Ｐｄｘ１はインビボで成体期全体を通じて、及びｈＧＯにおいて調べた全ての段階で前庭部に維持される（図２Ｅのスケールバーは１００μｍ）。
【０１４８】
本出願人は、ＳＯＸ２／ＰＤＸ１＋スフェロイドを使用して、初期胃上皮の成長及び形態形成を促進する経路を同定し、高濃度のＥＧＦ（１００ｎｇ  ｍＬ−１）がヒト前庭部胃オルガノイド（ｈＧＯ）のロバストな成長を促進するのに十分であったことを見出した。３〜４週間の間に、直径１００μｍ未満のスフェロイドが直径２〜４ｍｍのオルガノイドに成長した。後の培養段階で（約２７日目）、ｈＧＯ上皮は、胎生期胃発生の後期を連想させる一連の形態形成上の変化を経て、その間に単純で扁平な多列上皮が精巧で複雑な腺上皮に移行した（図２Ｄ）。前腸スフェロイドの初期成長はＥＧＦに依存する（データは示さず）；さらに、上皮の拡大及び腺への形態形成は、２７日目に培地からＥＧＦを取り除くと起こらない（図８）。これらの結果は、胃粘膜の適切な成長の促進におけるＥＧＦの重要な役割を指摘する既発表の知見を裏付けている１９、２０。
【０１４９】
図８は、胃オルガノイドにおける腺形態形成にＥＧＦが必要であることを示す。明視野像及び免疫染色は、ｈＧＯ分化の後期における上皮形態形成及び腺形成にＥＧＦが必要であることを実証している。２７日目、腺形態形成前に成長培地からＥＧＦを取り除くと、ｈＧＯ上皮は単純な立方体様構造を保ち、これは腺を形成することはできない。スケールバー、１００μｍ。
【０１５０】
ｈＧＯ成長を胎生期マウス胃の発生と比較することにより、ｈＧＯ発生がインビボでの胃の器官形成に驚くほど類似していることが明らかになった。初期には（マウスにおけるＥ１２〜１４及び１３日ｈＧＯ）、両方ともに上皮が多列であり、管腔面の方に集中した有糸分裂細胞を含有しており（図９及び図１０）、分裂間期核移動プロセスが示される２１。初期ｈＧＯは適切に極性化し、頂端マーカーａＰＫＣの発現によって大まかに説明される二次管腔を含有する２２（図１０）。
【０１５１】
Ｅ１６．５から生後初期の間に、前庭部は、腺及び小窩からなる高度に構造化された機構を呈する単層円柱上皮に変わる（図２Ｅ及び図９）。インビトロで１３〜３４日の間、ｈＧＯ上皮は同様の移行を経て、胎児後期前庭部と同様の腺状構造を有する高円柱上皮を形成する（図２Ｅ）。転写因子Ｓｏｘ２、Ｐｄｘ１、Ｇａｔａ４及びＫｌｆ５の発現を解析すると、インビボ及びインビトロの両方でこれらの形態形成過程を伴うステレオタイプな時間空間的発現パターンが明らかになった（図９）。初期には、これらの因子は全て、未成熟の多列上皮において共発現する。しかしながら後期になると、上皮が初期の腺及び小窩を形成することに伴いＳｏｘ２発現が下方制御され、一方で他の因子の発現は無限に維持される。これらのデータに基づくと、１３日目ｈＧＯがＥ１２〜１４マウス前庭部と同様の発生段階に相当する一方、３４日目ｈＧＯは胎児後期〜出生後初期の前庭部に一層近いことが推定される。さらに、ｈＧＯは正常な胚発生を再現すること、並びに前庭部発生中に起こる分子過程及び形態形成過程は、げっ歯類とヒトとの間で保存されていることが結論付けられる。
【０１５２】
図９は、マウス前庭部及びヒト胃オルガノイドの発生中の転写因子発現の比較を示す。インビボ前庭部発生の４つの胎生期（Ｅ１２．５、Ｅ１４．５、Ｅ１６．５及びＥ１８．５）及び１つの生後期（Ｐ１２）を転写因子発現について分析した：Ｓｏｘ２、Ｐｄｘ１、Ｇａｔａ４、Ｋｌｆ５、及びＦｏｘＦ１。インビトロｈＧＯ発生の２つの段階（１３日目及び３４日目）で同じマーカーを分析し、オルガノイド発生がインビボで起こるものと似ていることが明らかになった。前庭部発生初期には、上皮マーカーＳｏｘ２は遍在的に発現するが、後期になると、他の上皮転写因子、Ｐｄｘ１、Ｇａｔａ４及びＫｌｆ５が発生全体を通じて持続的な発現を呈する一方で、Ｓｏｘ２は下方制御される。初期及び後期の両方のｈＧＯが、上皮を取り囲むＦｏｘＦ１陽性間葉細胞を含有する。スケールバー、１００μｍ。図１０は、初期ヒト胃オルガノイドがステレオタイプな構造及び核挙動を呈することを示す。１３日目、ｈＧＯは、Ｅ１２．５マウス前庭部と同様に、頂端マーカーａＰＫＣ及び側底マーカーＥ−カドヘリンによって特徴付けられる頂低極性を示す多列上皮を含有する。さらに、オルガノイド上皮内に、頂端膜によって覆われた二次管腔（白色矢印）が見られる。Ｅ１２．５マウス前庭部及び７日目ｈＧＯの両方ともに、細胞の頂端部分のみにおける有糸分裂核ｐＨＨ３の存在によって示される分裂間期核移動を経るものと見られる。スケールバー、５０μｍ。
【０１５３】
前腸スフェロイドは、以前記載された中・後腸スフェロイドと同様の間葉成分を含有した１０。胃オルガノイドに分化する間、間葉は拡大し、ＦＯＸＦ１及びＢＡＰＸ１を含めた、前庭部間葉発生に関連する重要な転写因子を発現する（図１０及び図１１）。後期になると、ｈＧＯ間葉は、概して、未成熟胃間葉の指標であるビメンチン＋粘膜下線維芽細胞及びそれより少数のＡＣＴＡ２＋上皮下筋線維芽細胞からなる（図１１）。ｈＧＯは、インビボで起こるような分化した平滑筋層を形成しない。ＥＧＦを除いていかなる外因性因子も存在しない中でのかかるロバストな上皮形態形成を考えると、間葉が上皮発生において役割を果たしている可能性があるように思われる。従って、上皮が間葉のロバストな分化を促進しないように見えることは意外である。これは、胃の間葉分化においては他の刺激、恐らくは機械的な刺激が役割を果たしていることを示唆している。
【０１５４】
図１１は、胃オルガノイドにおける間葉系分化を示す。図１１Ａは、前庭部間葉系転写因子ＢＡＰＸ１の時間的発現解析を示す。その既知の胚発現パターンと同様に、ＢＡＰＸ１はｈＧＯ分化初期において上方制御され、次に機能性細胞型マーカーの発現と一致して下方制御される。図１１Ｂは、間葉細胞型マーカーの染色により、３４日目ｈＧＯがＦＯＸＦ１／ビメンチン陽性粘膜下線維芽細胞及びより少数のビメンチン／ＡＬＰＨＡ−ＳＭ−アクチン（ＳＭＡ）発現上皮下線維芽細胞を含有することが明らかになることを示す。ｈＧＯは、インビボ前庭部におけるＳＭＡ／デスミン陽性細胞によって示されるロバストな平滑筋層を欠いている。スケールバー、１００μｍ。エラーバーは標準偏差を表す。
【０１５５】
前庭部に見られる主要な機能性細胞型は、胃上皮を覆う保護粘液層を分泌する粘液細胞、並びにホルモンを分泌して胃腸の生理機能及び代謝恒常性を調節する内分泌細胞である２４。３４日目までに、ｈＧＯは、管腔に粘液を分泌し且つそのインビボ対応物と同じ高円柱形態を有する表層粘液細胞（ＭＵＣ５ＡＣ／ＵＥＡＩ＋）を含有する。ｈＧＯはまた、ＴＦＦ２／ＧＳＩＩ＋前庭部腺細胞も含有し、前庭部粘液系統における適切な分化が示される（図３Ａ）。加えて、ｈＧＯでは、基底部に限局された増殖帯及びＳＯＸ９発現によって示されるプロジェニター細胞ニッチが発生し（図４Ａ）、しかし上皮の増殖指数は可変的であり、１〜１０％の範囲である。従って、インビトロｈＧＯは、前駆細胞型及び分化細胞型の両方を含む生理学的胃上皮を含有する。
【０１５６】
図４は、ヒト胃オルガノイドがピロリ菌（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）感染に対して急性応答を呈することを示す。図４Ａは、２８日目のｈＧＯが、胎生後期及び出生後のマウス前庭部と同様に、初期腺の底部の方に限られた増殖細胞（Ｋｉ６７によって特徴付けられる）及びＳＯＸ９＋プロジェニター細胞を含有したことを示す。図４Ｂは、ｈＧＯを使用してピロリ菌（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）感染のヒト特異的疾患過程をモデル化したことを示す。細菌はｈＧＯの管腔に微量注入し、注入２４時間後に管腔の細菌を明視野顕微鏡法（黒色の矢印）及び免疫蛍光染色によって可視化した。図４Ｃは癌遺伝子ｃ−Ｍｅｔの免疫沈降を示し、ピロリ菌（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）がｃ−Ｍｅｔのロバストな活性化（チロシンリン酸化）を誘導したこと、及びこれがＣａｇＡ依存的過程であることを実証する。さらに、ＣａｇＡはヒト胃上皮細胞においてｃ−Ｍｅｔと直接相互作用する。図４Ｄは、２４時間以内にピロリ菌（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）感染が、ＥｄＵ取込みによって計測して、ｈＧＯ上皮において増殖細胞数の２倍の増加を引き起こしたことを示す。＊、ｐ＜０．０５。スケールバー、ａでは１００μｍ；ｂでは２５μｍ。エラーバーはｓ．ｅ．ｍ．を表す。
【０１５７】
図３は、ヒト胃オルガノイドが正常な分化前庭部細胞型を含有し、ヒト胃発生のモデル化に使用し得ることを実証する。図３Ａは、ｈＧＯが主要な前庭部細胞系統を全て含有することを実証する。３４日目のｈＧＯは表層粘液細胞（Ｍｕｃ５ＡＣ）及び粘液腺細胞（ＴＦＦ２）を有するとともに、表層粘液ＵＥＡＩと粘液腺細胞ＧＳＩＩとを区別するレクチン染色を有する。ｈＧＯはまた、クロモグラニンＡ（ＣＨＧＡ）によって特徴付けられるとおりの内分泌細胞も含有する。図３Ｂは、ｈＧＯの発生中の成長、形態形成、及び細胞型特異化におけるＥＧＦの種々の役割の概略図である。腺形成の発生初期には高レベルのＥＧＦが必要であったが、しかしながらそれは、発生後期には内分泌分化を抑制した；従って、３０日目にＥＧＦ濃度を低下させて内分泌細胞を発生させた。図３Ｃは、ガストリン、グレリン、及びセロトニン（５−ＨＴ）を含め、ＥＧＦの使用を中止するとｈＧＯにおいて全ての主要な内分泌性ホルモンが発現することを示す。図３Ｄは、高レベルのＥＧＦがＮＥＵＲＯＧ３発現を抑制することを示す。３０日目にＥＧＦ濃度を低下させると、ｑＰＣＲによって３４日目に計測されるＮＥＵＲＯＧ３発現の大幅な増加がもたらされたことから、内分泌特異化においてＥＧＦがＮＥＵＲＯＧ３の上流で作用することが示される。＊、ｐ＜０．０５。図３Ｅは、ＮＥＵＲＯＧ３がＥＧＦの下流で作用して内分泌細胞運命を誘導することを示す。ｄｏｘ誘導性システムを使用したＮＥＵＲＯＧ３の強制的発現は、高ＥＧＦ（１００ｎｇ  ｍＬ−１）の内分泌抑制効果を打ち消すのに十分であった。ｈＧＯは３０日目にｄｏｘ（１μｇ  ｍＬ−１）に２４時間曝露し、３４日目に分析した。ｄｏｘ処理したオルガノイドは、ＣｈｒＡ発現内分泌細胞のロバストな誘導を呈した。スケールバー、１００μｍ。エラーバーは標準偏差を表す。
【０１５８】
また、３４日目ｈＧＯには、ガストリン、グレリン、ソマトスタチン、及びセロトニンを発現する前庭部における４つの主要な内分泌細胞型を含め、クロモグラニン−Ａ（ＣＨＧＡ）＋内分泌細胞も豊富にある（図３Ｃ及び図１２）。興味深いことに、本発明者らは、高レベルのＥＧＦが内分泌細胞形成を抑制し、１００ｎｇ  ｍｌ−１でオルガノイド当たり１個未満の内分泌細胞となったことを観察した。対照的に、３０〜３４日目まで低レベルのＥＧＦ（１０ｎｇ  ｍｌ−１）で培養したｈＧＯでは豊富な内分泌細胞が発生した（図１３）。さらに、高ＥＧＦはまた、内分泌産生転写因子ＮＥＵＲＯＧ３の発現も阻害した（図３Ｄ）。ＮＥＵＲＯＧ３は膵臓及び腸において広く研究されており２５〜２８、ほとんどの胃内分泌系統の形成に必要である２９、３０。これらのデータは、ＮＥＵＲＯＧ３の上流での胃内分泌細胞特異化におけるＥＧＦＲシグナル伝達の新規阻害効果を示唆している。このモデルを試験するため、本出願人は、ドキシサイクリン誘導性ｈＮＥＵＲＯＧ３過剰発現ｈＥＳＣ株を使用し、ＮＥＵＲＯＧ３発現が高ＥＧＦ（１００ｎｇ  ｍｌ−１）の内分泌阻害効果に打ち勝つのに十分であり、ＣＨＧＡ＋内分泌細胞のロバストな形成がもたらされたことを見出した（図３Ｅ及び図１３）。これらの知見から、本発明者らは、ＥＧＦがＮＥＵＲＯＧ３の抑制によって内分泌プロジェニター細胞の形成を阻害すること、及びＮＥＵＲＯＧ３がヒト胃内分泌細胞の特異化に十分であることを結論付けた。
【０１５９】
図１２は、インビボでの胃前庭部内分泌細胞発生を示す。前庭部における内分泌細胞分化は、初めはＥ１８．５で明らかとなるが、生後期（Ｐ１２が示される）にはより決定的となる。初期には、ガストリン、グレリン、ソマトスタチン、及びセロトニン（５−ＨＴ）を含め、全ての予想される胃内分泌サブタイプが明らかである。スケールバー、１００μｍ。図１３は、ＥＧＦシグナル伝達がＮＥＵＲＯＧ３依存性胃内分泌特異化プログラムを抑制することを示す。図１３Ａは、汎内分泌マーカーＣＨＧＡに関する染色によって示されるとおり、高濃度のＥＧＦ（１００ｎｇ  ｍＬ−１）に維持したｈＧＯが３４日目に内分泌細胞をほとんど有しなかったことを示す。２４日目にＥＧＦ濃度を低下させると（１０ｎｇ  ｍＬ−１）、胃上皮に、より生理学的な数の内分泌細胞がもたらされた。図１３Ｂは、ＥＧＦによる内分泌分化抑制がＮＥＵＲＯＧ３の上流で起こるかどうかを試験するための、ｄｏｘ誘導性ＮＥＵＲＯＧ３過剰発現トランス遺伝子を安定にトランスフェクトしたｈＥＳＣ株からのｈＧＯの作成を示す。ｈＧＯは高ＥＧＦ（１００ｎｇ  ｍＬ−１）に維持し、次に３０日目にドキシサイクリン（１μｇ  ｍＬ−１）で２４時間処理し、次に３４日目に分析した。ｄｏｘ処理ｈＧＯは内分泌マーカーＣＨＧＡ、ガストリン、グレリン、及びソマトスタチンのロバストな活性化を示し、内分泌形態のＣＨＧＡ陽性（図３Ａ）、グレリン陽性、及びソマトスタチン陽性細胞を含有する。＊、ｐ＜０．０５。スケールバー、１００μｍ。エラーバーは標準偏差を表す。
【０１６０】
臨床的エビデンスが示すところによれば、ピロリ菌（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）媒介性疾患においては前庭部の優勢なコロニー形成が重要な役割を有する３１、３２。従って、本出願人は、病原体ピロリ菌（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）に対するヒト胃の病態生理学的反応のモデル化にｈＧＯを使用し得るかどうかを試験した。正常な宿主−病原体インターフェースを模倣するため、本発明者らは、ピロリ菌（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）をオルガノイドの管腔へのマイクロインジェクションによって上皮の管腔表面に直接導入し、上皮のシグナル伝達及び増殖を計測した（図４）。免疫蛍光法によって、ｈＧＯ上皮に緊密に結合した細菌が観察された（図４Ｂ）。２４時間以内に、本出願人は、胃癌遺伝子ｃ−Ｍｅｔのロバストな活性化３３及び上皮細胞増殖の２倍の増加を含めた、ピロリ菌（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）に対する有意な上皮反応を観察した。ピロリ菌（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）ビルレンス因子ＣａｇＡは、疾患の発病において中心的な役割を果たす。既発表の研究と一致して３４、本出願人は、ＣａｇＡがオルガノイド上皮細胞に移動し、ｃ−Ｍｅｔと複合体を形成することを実証した（図４Ｃ）。さらに、ＣａｇＡを欠く非病原性ピロリ菌（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）株をｈＧＯに注入すると上皮反応が解消されたことから、ピロリ菌（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）媒介性のヒトの発病におけるこの因子の重要性が裏付けられる。従って、ｈＧＯは、ピロリ菌（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）に対するその病態生理学的反応ゆえに、ピロリ菌（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）によって媒介されるヒト胃疾患を惹起するイベントについて解明するための前例のないモデルとなる。
【０１６１】
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３６．Ｍｅｅｒｂｒｅｙ，Ｋ．  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｈｅ  ｐＩＮＤＵＣＥＲ  ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ｔｏｏｌｋｉｔ  ｆｏｒ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０８，３６６５−３６７０  （２０１１）．
３７．Ｏｋｉｔａ，Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．  Ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｎｏｎｖｉｒａｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ｔｏ  ｇｅｎｅｒａｔｅ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ−ｆｒｅｅ  ｈｕｍａｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｃｏｒｄ  ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌｓ．  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ３１，４５８−４６６  （２０１３）．
３８．Ｃｏｖａｃｃｉ，Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  １２８−ｋＤａ  ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｏｆ  Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｄｕｏｄｅｎａｌ  ｕｌｃｅｒ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０，５７９１−５７９５  （１９９３）．
３９．Ａｍｉｅｖａ，Ｍ．  Ｒ．，Ｓａｌａｍａ，Ｎ．  Ｒ．，Ｔｏｍｐｋｉｎｓ，Ｌ．  Ｓ．＆Ｆａｌｋｏｗ，Ｓ．  Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ  ｅｎｔｅｒ  ａｎｄ  ｓｕｒｖｉｖｅ  ｗｉｔｈｉｎ  ｍｕｌｔｉｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｖａｃｕｏｌｅｓ  ｏｆ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ．  Ｃｅｌｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ４，６７７−６９０  （２００２）．
４０．Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ，Ｍ．  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｇａｓｔｒｉｃ  Ｓｏｎｉｃ  Ｈｅｄｇｅｈｏｇ  ａｃｔｓ  ａｓ  ａ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ．  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １４２，１１５０−１１５９．ｅ６  （２０１２）．
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年4月28日(2020.4.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ＦＧＦシグナル伝達経路を活性化する薬剤としてＦＧＦ４と、ＷＮＴシグナル伝達経路を活性化する薬剤としてＷｎｔ３ａ又はＣＨＩＲ９９０２１と、ＢＭＰシグナル伝達経路を阻害する薬剤としてノギンを、哺乳類の胚体内胚葉細胞に接触させて、前腸スフェロイドを形成するステップと、
ｂ）ステップａ）の前腸スフェロイドにレチノイン酸を接触させて、後方前腸スフェロイドを形成するステップと、
ｃ）ステップｂ）の後方前腸スフェロイドにレチノイン酸、ＥＧＦ及びノギンを接触させて前庭部組織を含む胃組織を形成するステップと
を含む、
インビトロで、前庭部組織を含む胃組織の形成を誘導する方法。
【手続補正書】
【提出日】令和2年5月25日(2020.5.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビトロで、哺乳類の胚体内胚葉細胞から、前腸スフェロイド、後方前腸スフェロイドへの指向性分化を経て形成される前庭部組織又は胃底部組織を含む胃組織をさらに成長させ、分化させて得られる胃オルガノイドであって、
前記胃オルガノイドは三次元構造であり、管腔を有するとともに、
表層に胃腺、胃小窩、及び増殖帯を含む粘膜構造を有する、胃オルガノイド。
【請求項２】
前記胚体内胚葉細胞が、多能性幹細胞に由来する、請求項１に記載の胃オルガノイド。
【請求項３】
前庭部組織を含む胃オルガノイドが、管腔面に腺上皮を有する二次管腔を有する、請求項１又は２に記載の胃オルガノイド。
【請求項４】
前庭部組織を含む胃オルガノイドが、表層粘液細胞、粘液腺細胞、前庭部腺細胞及び内分泌細胞を含む、請求項１〜３のいずれか一項に胃オルガノイド。
【請求項５】
前庭部組織を含む胃オルガノイドが、ガストリン、グレリン、ソマトスタチン及びセロトニンをそれぞれ発現する内分泌細胞を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の胃オルガノイド。
【請求項６】
前庭部組織を含む胃オルガノイドでは、Ｐｄｘ１の発現が維持されている、請求項１〜５のいずれか一項に記載の胃オルガノイド。
【請求項７】
前庭部組織を含む胃オルガノイドが、平滑筋層を欠く、請求項１〜６のいずれか一項に記載の胃オルガノイド。