(57)【要約】【課題】人工細胞を用いた環境検出が望まれている。【解決手段】環境を検出するセンサー分子とセンサー分子の周囲に形成された細胞親和性膜とを備える、人工細胞が提供される。【選択図】図１
2020171204.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
環境を検出するセンサー分子と、
前記センサー分子の周囲に形成された細胞親和性膜とを備える人工細胞。
【請求項２】
前記細胞親和性膜は、脂質二重膜である、請求項１に記載の人工細胞。
【請求項３】
前記環境は、細胞凝集体の内部の環境である、請求項１又は２に記載の人工細胞。
【請求項４】
前記センサー分子は、前記凝集体の内部の環境に応じて発光が異なる請求項１〜３のいずれか一項に記載の人工細胞。
【請求項５】
前記センサー分子は、
前記凝集体の内部の温度に応じて発光が異なる温度感受性蛍光プローブ、
前記凝集体の内部のｐＨに応じて発光が異なるｐＨ感受性蛍光プローブ、
前記凝集体の内部のＯ２濃度に応じて発光が異なるＯ２感受性蛍光プローブ、
前記凝集体の内部の圧力に応じて発光が異なる圧力感受性蛍光プローブ、
前記凝集体に薬物が混入された場合に、前記薬物と反応して発光する薬物感受性蛍光プローブ、及び、
前記凝集体に含まれる細胞の代謝物と反応して発光する代謝物感受性蛍光プローブ
の少なくとも１つを有する請求項４に記載の人工細胞。
【請求項６】
前記人工細胞の比重と細胞の比重との差は、前記人工細胞の比重と水の比重との差よりも小さい、請求項１〜５のいずれか一項に記載の人工細胞。
【請求項７】
環境を検出するセンサー分子と前記センサー分子の周囲に形成された細胞親和性膜を有する人工細胞を撮像することと、
前記撮像されたセンサー分子の情報を用いて、前記センサー分子の環境を評価することとを含む、評価方法。
【請求項８】
前記細胞親和性膜は、脂質二重膜である、請求項７に記載の評価方法。
【請求項９】
前記環境は、細胞凝集体の内部の環境である、請求項７または８に記載の評価方法。
【請求項１０】
さらに、前記人工細胞と、複数の細胞とを混合し、凝集させて前記凝集体を生成することを備える請求項９に記載の評価方法。
【請求項１１】
前記センサー分子は、前記凝集体の内部の温度に応じて発光が異なる温度感受性蛍光プローブを含み、
前記環境を評価する際に、前記凝集体内部の温度を評価する請求項９または１０に記載の評価方法。
【請求項１２】
前記センサー分子は、前記凝集体の内部のｐＨに応じて発光が異なるｐＨ感受性蛍光プローブを含み、
前記環境を評価する際に、前記凝集体内部のｐＨを評価する請求項９〜１１のいずれか一項に記載の評価方法。
【請求項１３】
前記センサー分子は、前記凝集体の内部のＯ２濃度に応じて発光が異なるＯ２感受性蛍光プローブを含み、
前記環境を評価する際に、前記凝集体内部のＯ２濃度を評価する請求項９〜１２のいずれか一項に記載の評価方法。
【請求項１４】
前記センサー分子は、前記凝集体の内部の圧力に応じて発光が異なる圧力感受性蛍光プローブを含み、
前記環境を評価する際に、前記凝集体内部の圧力を評価する請求項９〜１３のいずれか一項に記載の評価方法。
【請求項１５】
前記センサー分子は、前記凝集体に薬物が混入された場合に、前記薬物と反応して発光する薬物感受性蛍光プローブを含み、
前記環境を評価する際に、前記凝集体内部に前記薬物が到達したことを評価する請求項９〜１４のいずれか一項に記載の評価方法。
【請求項１６】
前記環境を評価する際に、前記凝集体に前記薬物が混入された時刻と、前記凝集体の内部の前記位置に配置された前記薬物感受性蛍光プローブから発せられた光を検出した時刻との時間差に基づいて、前記薬物が前記凝集体の内部に浸透する速度を評価する請求項１５に記載の評価方法。
【請求項１７】
前記センサー分子は、前記凝集体に含まれる細胞の代謝物と反応して発光する代謝物感受性蛍光プローブを含み、
前記環境を評価する際に、前記凝集体内部において、前記細胞の代謝物が存在するかどうかを評価する請求項９〜１６のいずれか一項に記載の評価方法。
【請求項１８】
前記凝集体に含まれる細胞に対する前記人工細胞の割合は１％以上１０％未満である請求項９〜１７のいずれか一項に記載の評価方法。
【請求項１９】
さらに、前記凝集体に含まれる細胞及び前記人工細胞を分散させることと、
前記分散された前記細胞及び前記人工細胞から、前記人工細胞を選別して回収することとを備える請求項１０〜１８のいずれか一項に記載の評価方法。
【請求項２０】
環境を検出するセンサー分子と前記センサー分子の周囲に形成された細胞親和性膜を有する人工細胞の、前記センサー分子を撮像する撮像部と、
前記撮像部により撮像されたセンサー分子の情報を用いて、前記センサー分子の環境を評価する評価部とを備える、評価装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、評価装置、及び、人工細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞に親和性のある膜である、例えば脂質二重膜を用いた人工細胞が知られている（特許文献１）。また、細胞の塊を観察することが知られている（特許文献２、特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００１−１８１２１３
【特許文献２】ＵＳ２０１１３３１５７９４Ａ
【特許文献３】ＵＳ２０１２１３３６４９２８Ａ
【発明の概要】
【０００４】
本実施形態の第１の態様に従えば、環境を検出するセンサー分子と、センサー分子の周囲に形成された細胞親和性膜とを備える人工細胞が提供される。
本実施形態の第２の態様に従えば、環境を検出するセンサー分子と前記センサー分子の周囲に形成された細胞親和性膜を有する人工細胞を撮像することと、
前記撮像されたセンサー分子の情報を用いて、前記センサー分子の環境を評価することとを含む、評価方法が提供される。
本実施形態の第３の態様に従えば、環境を検出するセンサー分子とセンサー分子の周囲に形成された細胞親和性膜を有する人工細胞の、センサー分子を撮像する撮像部と、撮像部により撮像されたセンサー分子の情報を用いて、センサー分子の環境を評価する評価部とを備える、評価装置が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】図１は、本実施形態にかかる評価装置１の概略図である。
【図２】図２は、細胞スフェロイドの内部に位置する細胞が置かれている環境を評価するための手順を示すフローチャートである。
【図３】図３（ａ）は、自然沈降を利用した細胞スフェロイドの作製方法を示す概念図である。図３（ｂ）は、３Ｄプリンタを利用した細胞スフェロイドの作製方法を示す概念図である。図３（ｃ）は、足場を利用した細胞スフェロイドの作製方法を示す概念図である。
【図４】図４は、細胞スフェロイドの概略図及び断面図である。
【図５】図５は、自然沈降を利用した細胞スフェロイドの作製方法により作製された細胞スフェロイドの画像及びそれに基づいた模式図を示した説明図である。
【図６】図６は、細胞スフェロイドに薬剤を添加して毒性試験を行う場合の概略説明図である。
【図７】図７は、薬剤が細胞スフェロイドの内部に浸透する速度を算出するための測定の概略説明図である。
【図８】図８は、センサー内包細胞を回収する方法のフローチャートである。
【図９】図９は、センサー分子を内包する人工細胞の作製方法を示す概略図である。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
以下の記載においては、ＸＹＺ直交座標系を設定し、このＸＹＺ直交座標系に基づいて位置関係を説明している。Ｚ軸方向は、例えば鉛直方向に設定され、Ｘ軸方向及びＹ軸方向は、例えば、水平方向に平行で互いに直交する方向に設定される。
【０００７】
本明細書において、複数の細胞が３次元的に凝集した細胞の凝集体を細胞の塊と呼んでいる。細胞の塊の例として、組織切片、細胞スフェロイド、オルガノイド等が挙げれられる。なお、細胞スフェロイドとは、３次元培養された細胞の３次元塊であり、構造機能的に細胞同士が接着し、細胞凝集体内で物質の行き来が行われる、複数の細胞から構成される塊である。オルガノイドとは、臓器の特色の一部を備えている、小さくて単純化された細胞の集まりである。オルガノイドは、例えば、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞などの多能性幹細胞を原料として、細胞培養の条件を制御しつつ細胞を分化させることにより、３次元的に試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で作製することができる。また、細胞の塊には、２次元的に広がった細胞（例えば、細胞シート）も含まれる。細胞シートは単層でもよいし、積層されたものでも複数の層のあるものでも構わない。
【０００８】
本明細書において、環境に応じて異なる発光特性や発色特性を示す分子をセンサー分子と呼び、センサー分子を内包した人工細胞又は細胞をセンサー内包細胞と呼ぶ。人工細胞は、センサー分子の周囲に形成された細胞親和性膜を備える。細胞親和性膜は細胞に親和性のある膜であり、後述のように、細胞親和性膜には脂質二重膜、高分子膜などが含まれる。以下の実施形態においては、細胞親和性膜として、脂質二重膜を例に挙げて説明する。人工細胞に用いる脂質二重膜は、センサー分子の周囲の一部分に配置されていても構わない。脂質二重膜が機能を有していても構わない。例えば、センサー分子の周囲の配置される脂質二重膜に穴を開け、脂質二重膜の外と内とで物質の移動を可能としても構わない。例えば、Ｓａｔｏｓｈｉ  Ｆｕｊｉｉ，  Ｔｏｍｏａｋｉ  Ｍａｔｓｕｕｒａ，  Ｔａｋｅｓｈｉ  Ｓｕｎａｍｉ，Ｙａｓｕａｋｉ  Ｋａｚｕｔａ，  ａｎｄ  Ｔｅｔｓｕｙａ  ＹｏｍｏによるＰＮＡＳ  Ｏｃｔｏｂｅｒ  １５，  ２０１３  １１０  （４２）  １６７９６−１６８０１の”  Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  α−ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｌｉｐｏｓｏｍｅ  ｄｉｓｐｌａｙ”に記載されている。後述する通り、人工細胞と細胞とを混ぜた細胞と人工細胞との凝集体を作製する場合に、人工細胞の表面は脂質二重膜で覆われているために、細胞が凝集体を形成する場合において、脂質二重膜と細胞との親和性がたかい。そのために、人工細胞を含んだ凝集体を作製することが可能である。本明細書においては、細胞とセンサー内包細胞との凝集体も細胞スフェロイドと呼んでいる。
【０００９】
上述のように、３次元培養は２次元培養と比較して、立体構造を持ったより複雑な系を構築することが可能であり、より生体内に類似した環境を構築することが可能である。そのため、細胞スフェロイドやオルガノイドのような３次元培養された細胞の塊を、基礎研究、創薬研究、再生医療などの分野において応用したいという要求がある。それに伴って、細胞の塊に含まれる細胞の状態を評価することが望まれている。２次元培養された細胞とは異なり、細胞スフェロイドの内部に位置する細胞は、その周囲全体を他の細胞に取り囲まれており、細胞スフェロイドの外部の環境とは接していない。そのため、細胞スフェロイドの内部に位置する細胞は、細胞スフェロイドの外部の環境とは異なる環境にあると言える。
【００１０】
細胞スフェロイドの内部に位置する細胞に対して、毒性試験を行う場合等において、対象となる細胞がどのような環境に置かれているのかを評価することは重要である。
【００１１】
図１を参照しつつ、本開示に係る評価装置１について説明する。評価装置１は、後述のように、細胞スフェロイドの内部に位置するセンサー内包細胞に含まれるセンサー分子から発せられる光を検出し、検出された光に基づいて、細胞スフェロイドの内部の環境を評価する装置である。評価装置１は、多光子励起顕微鏡１０と、制御部１１と、表示部１２と、入力部１３とを主に備えている。
【００１２】
多光子励起光学顕微鏡１０は、照明部１００と、光学系１２０と、受光部１４０と、試料Ｓが置かれる可動ステージ１６０とを主に備えている。多光子励起顕微鏡１０は、２つ以上の光子を１つの蛍光分子にほぼ同時に衝突させて蛍光分子を励起させる多光子励起過程を利用した顕微鏡である。多光子励起過程を利用する場合には、１つの蛍光分子を１光子が励起させる１光子励起過程と比べて、励起波長を２倍以上に設定することができる。そのため、可視光レーザや紫外光レーザよりも波長が長く、生体組織の透過性に優れる近赤外光レーザを用いることができる。
【００１３】
また、多光子励起過程は、２つ以上の光子が１つの蛍光分子にほぼ同時に衝突したときに起こる事象であるので、多光子励起過程が起きるためには、光子が時間的、場所的に集中していなければならない。そのため、多光子励起顕微鏡の光源としては、後述のように、光子を時間的に集中させることができるパルスレーザが用いられる。さらに、多光子励起過程は、レーザ光の光子が局所的に集中する焦点位置近傍で発生する。そのため、多光子励起顕微鏡１０を用いることにより、必然的に、レーザ光の焦点位置近傍に位置するセンサー内包細胞に含まれるセンサー分子を選択的に励起させて、励起したセンサー分子から発せられる蛍光を観測することができる。
【００１４】
照明部１００は、パルスレーザ１０１を有している。パルスレーザ１０１は、いわゆるフェムト秒レーザであり、数十フェムト秒〜数百フェムト秒のパルス幅のレーザ光を発生させることができる。本実施形態ではチタンサファイアレーザが用いられている。パルスレーザ１０１は、赤外から近赤外領域（波長約７００ｎｍ〜約１３００ｎｍ）のレーザ光を発生させることができる。
【００１５】
図１に示されるように、光学系１２０は、ダイクロイックミラーＤＭと、ミラーＭと、２つのガルバノミラーＧＭ１、ＧＭ２と、４つのレンズＬ１〜Ｌ４と、対物レンズＯＢとを備える。また、対物レンズＯＢは、対物レンズＯＢをＺ軸方向に移動させる移動機構ＯＢ１を備えている。移動機構ＯＢ１が対物レンズＯＢをＺ軸方向に移動させることで、対物レンズＯＢの焦点位置をＺ方向に移動させることができる。
【００１６】
次にレーザ光の光路について説明する。パルスレーザ１０１から照射されたレーザ光は、レンズＬ１、Ｌ２に向かって直進する。レンズＬ１、Ｌ２はビームエクスパンダ―の役割を持っており、レンズＬ１に入射する光のビームの直径よりも大きい直径のビームをＬ２から出射することができる。レンズＬ１，Ｌ２を通ったレーザ光は、１対のガルバノミラーＧＭ１，ＧＭ２に入射する。ガルバノミラーＧＭ１，ＧＭ２は、往復瑶動可能な走査ミラーであり、２つのガルバノミラーＧＭ１，ＧＭ２を組み合わせることにより、レーザ光をＸ−Ｙ方向に走査できる。
【００１７】
２つのガルバノミラーＧＭ１、ＧＭ２を出たレーザ光は、レンズＬ３，Ｌ４を通った後、ミラーＭにより上方にむけて反射され、ダイクロイックミラーＤＭを透過して対物レンズＯＢに入射し、試料Ｓに照射される。ダイクロイックミラーＤＭは、パルスレーザ１０１からのレーザ光（波長約７００ｎｍ〜約１３００ｎｍ）を透過させ、パルスレーザ１０１からのレーザ光よりも波長の短い光（例えば、後述の多光子励起過程により発生する蛍光）を反射する特性を有する。試料Ｓにおいて、２つ以上の光子が１つの蛍光分子にほぼ同時に衝突して蛍光分子を励起させる多光子励起過程により、パルスレーザ１０１からのレーザ光の波長よりも短い波長の蛍光が放出される。多光子励起過程により発生した蛍光の一部は、光路を逆に進んで、ダイクロイックミラーＤＭにより反射されて、受光部１４０に入る。
【００１８】
受光部１４０は、光電子増倍管ＰＭＴを有し、試料Ｓに含まれるセンサー内包細胞内のセンサー分子から発せられる蛍光の強度を計測する。可動ステージ１６０は、図１のＸＹ平面に平行な上面１６１Ｕを有するステージ１６１と、ステージ１６１をＸ方向、Ｙ方向及びＺ方向に移動させる移動機構１６２とを備えている。ステージ１６１の上面１６１Ｕには、試料Ｓが入ったウェルプレートＷＰが配置される。ウェルプレートＷＰは、透明な板状の部材であり、その表面には複数のくぼみ（ウェルＷ）が２次元的に配置されている。それぞれのウェルＷは、試験管またはシャーレとして利用することができる。移動機構１６２は、制御部１１の制御のもとで、ステージ１６１のＸ方向の位置、Ｙ方向の位置、Ｚ方向の位置をそれぞれ調整することができる。これにより、ステージ１６１の上面１６１Ｕに置かれたウェルプレートＷＰの位置を調整することができ、ウェルプレートＷＰ内の所望のウェルＷに入れられた試料Ｓに対してレーザ光を照射することができる。
【００１９】
制御部１１は、多光子励起顕微鏡１０の各部（照明部１００、光学系１２０、受光部１４０、可動ステージ１６０）の動作を制御するとともに、入力部１３を通じて多光子励起顕微鏡１０の各部に対する設定及び指示を受け付ける。制御部１１は、多光子励起顕微鏡１０の各部に対する設定及び指示を受け付けるための設定画面を表示部１２に表示させる。入力部１３は、各種指示情報を入力する不図示のマウス、キーボード、ジョイスティック、タッチパネルなどを有する。表示部１２は設定画面、指示画面、計測画面、計測結果などを表示する表示画面を有する。
【００２０】
制御部１１は、ガルバノミラーＧＭ１、ＧＭ２の駆動を制御することによってレーザ光の照射位置（焦点位置）をＸ−Ｙ方向に走査することができる。さらに、制御部１１は、光学系１２０の焦点深さを変えることによって、レーザ光の焦点位置のＺ方向の位置を調整することができる。このようにして、制御部１１は、レーザ光の焦点位置をＸ−Ｙ−Ｚ方向に走査させることができる。これにより、制御部１１は、レーザ光を各位置に照射したときに、受光部１４０で受光される蛍光の強度に基づいて、蛍光の強度分布の３次元マッピングを取得することができ、取得された３次元マッピングの画像を表示部１２に表示させることができる。
【００２１】
なお、制御部１１は、専用のハードウェアにより形成されていてもよく、パーソナルコンピュータに所定のプログラムを実装することにより形成されていてもよい。制御部１１と多光子励起顕微鏡１０とは、必ずしも一体の装置として形成されていなくてもよい。例えば、制御部１１は、有線又は無線により多光子励起顕微鏡１０に通信可能に接続されたコンピュータであってもよい。
【００２２】
次に、図２を参照しつつ、細胞スフェロイドの内部に位置する細胞が置かれている環境を評価するための手順について説明する。
【００２３】
まず、細胞に対して一定の割合で、センサー内包細胞を混ぜ（Ｓ１０１）、細胞及びセンサー内包細胞を凝集させて（Ｓ１０２）、細胞の凝集体である細胞スフェロイドを作製する。上述のように、センサー分子とは、環境に応じて異なる発光特性や発色特性を示す分子である。センサー分子の一例として、温度センサータンパク質ｔｓＧＦＰが挙げられる。温度センサータンパク質ｔｓＧＦＰは、サルモネラ菌のもつ温度感知タンパク質ＴｌｐＡのコイルドコイル領域と、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）とを適切に融合させて形成される。温度センサータンパク質ｔｓＧＦＰは、３７℃付近の温度の変化を鋭敏に感知して蛍光の変化を起こすことが知られている。なお、温度センサータンパク質ｔｓＧＦＰは、後述の方法により、人工細胞の内部に導入することもできるが、遺伝子導入により細胞内に導入することもできる。
【００２４】
次に、評価装置１は、多光子励起顕微鏡１０を用いて、細胞スフェロイドの内部に位置するセンサー内包細胞に含まれるセンサー分子から発せられる光を検出する（Ｓ１０３）。そして、評価装置１は、検出された光に基づいて、細胞スフェロイドの内部の環境を評価する（Ｓ１０４）。ここでは、センサー分子が上述の温度センサータンパク質ｔｓＧＦＰである場合を例に挙げて説明する。温度センサータンパク質ｔｓＧＦＰは、波長約４００ｎｍの蛍光（第１の蛍光）と、波長約４８０ｎｍの蛍光（第２の蛍光）を放出する。そして、第１の蛍光の強度及び第２の蛍光の強度が、それぞれ、環境の温度に応じて変化することが知られており、特に、約３７℃の温度の前後で、２つの蛍光の強度比が大きく変化することが知られている。具体的には、約３７℃前後の温度において、環境の温度が高くなるにつれて、第１の蛍光の強度は減少し、第２の蛍光の強度は増加する。このような、環境の温度と、第１、第２の蛍光の強度との相関を利用することにより、第１の蛍光の強度、第２の蛍光の強度、及び／又は第１の蛍光の強度と第２の蛍光の強度との強度比を計測して、細胞スフェロイドの内部の環境の温度を評価することができる。
【００２５】
例えば、２光子励起過程により温度センサータンパク質ｔｓＧＦＰを励起させて、波長約４８０ｎｍの第２の蛍光の強度を測定する場合を考える。この場合には、蛍光波長の約２倍の波長の励起光を照射する。そこで、照明部１００のパルスレーザ１０１から、波長約９６０ｎｍのレーザ光を発生させて、ウェルプレートＷＰのウェルＷに入れられた試料Ｓに照射する。上述のように、２光子励起過程は、２つの光子が１つの蛍光分子にほぼ同時に衝突したときに起こる事象であるので、レーザ光の焦点位置近傍に位置するセンサー内包細胞に含まれる温度センサータンパク質ｔｓＧＦＰが選択的に励起される。励起された温度センサータンパク質ｔｓＧＦＰから発せられる波長約４８０ｎｍの第２の蛍光の強度を受光部１４０により計測することにより、センサー内包細胞が配置されている位置における細胞スフェロイド内部の温度を評価することができる。また、上述のようにして、レーザ光の焦点位置をＸ−Ｙ−Ｚ方向に走査することにより、細胞スフェロイドの内部の温度の分布を評価することができる。
【００２６】
次に、上述のステップＳ１０１、Ｓ１０２に関連して、細胞スフェロイドを作製する方法について説明する。細胞スフェロイドを作製する方法として、種々の方法が知られている。例えば、自然沈降を利用した方法、３Ｄプリンタを用いる方法、足場を用いる方法等が挙げられる。
【００２７】
図３（ａ）を参照しつつ、自然沈降を利用した細胞スフェロイドの作製方法について説明する。まず、水などの液体溶媒中に、細胞とセンサー内包細胞とを一定の比率で混合した懸濁液を、丸底ウェルプレートなどの容器内に入れて静置する。自然沈降により、細胞及びセンサー内包細胞が容器の底面に集まってくる。これを数日間培養することにより、細胞スフェロイドを作製することができる。
【００２８】
本明細書においては、物質の密度（単位体積あたりの質量）と、基準となる標準物質（ここでは、４℃の純水）の密度との比として、比重を定義する。センサー内包細胞の比重が、細胞の比重と比べて大きい場合には、自然沈降により細胞及びセンサー内包細胞が容器の底面に集まって細胞スフェロイドが作製される際に、細胞スフェロイドの下部にセンサー内包細胞が集中しやすくなる。逆に、センサー内包細胞の比重が、細胞の比重と比べて小さい場合には、細胞スフェロイドの上部にセンサー内包細胞が集中しやすくなる。そのため、自然沈降を利用した細胞スフェロイドの作製方法においては、センサー内包細胞の比重と細胞の比重との差を小さくすることにより、センサー内包細胞を細胞スフェロイドの内部にランダムに配置させることができる。例えば、細胞懸濁液の液体溶媒として水を用いている場合には、センサー内包細胞の比重と細胞の比重の差を、細胞の比重と細胞懸濁液の液体溶媒である水の比重の差よりも小さくすることにより、センサー内包細胞を細胞スフェロイドの内部にランダムに配置させることができる。
【００２９】
次に、図３（ｂ）を参照しつつ、３Ｄプリンタを用いた細胞スフェロイドの作製方法について説明する。３Ｄプリンタとは、３次元の物体を一層ずつ積層させながら造形する積層造形装置である。３Ｄプリンタの装置の構成は、例えばＵＳ２０１６／００４６８３２Ａ１に記載されている。本実施形態においては、３Ｄプリンタは、細胞の懸濁液を噴射する噴射装置Ａと、センサー内包細胞の懸濁液を噴射する噴射装置Ｂとを有している。噴射装置Ａと噴射装置Ｂは不図示の指示装置により指示され、ＸＹＺ方向に移動することにより、所定の位置に細胞もしくはセンサー内容細胞を所定の位置に噴射することができる。噴射装置Ａと噴射装置Ｂを固定して、噴射される細胞をＸＹＺ方向に移動させても構わない、もちろん、噴射装置Ａと噴射装置Ｂと噴射される細胞とを両方移動させても構わない。噴射装置Ａが細胞の懸濁液を噴射して細胞の層を形成する。その際、噴射装置Ｂが所望の位置にセンサー内包細胞の懸濁液を噴射して、細胞の層の一部にセンサー内包細胞を配置する。これにより、部分的にセンサー内包細胞が含まれた細胞の層が形成される。このような細胞の層を積層させ、数日間培養することにより、細胞スフェロイドを作製することができる。３Ｄプリンタを用いることにより、所望の形状の細胞の層を形成して積層させることができるため、所望の形状の細胞スフェロイドを作製することができる。また、センサー内包細胞の懸濁液を噴射する噴射装置Ｂにおいて、噴射位置や噴射量を調整することができるので、センサー内包細胞の位置、個数などを任意に調整することができる。
【００３０】
次に、図３（ｃ）を参照しつつ、足場を用いた細胞スフェロイドの作製方法について説明する。まず、コラーゲンなどのポリマーや生分解性のハイドロゲルなどで作られた多孔質の立体的な足場を用意する。足場の大きさは、細胞の大きさよりも大きく（ミリメートルスケール以上）、その表面には内径が数十ミクロン〜数百ミクロン程度の複数の孔が形成されている。このような足場の表面及び孔の内部に、センサー内包細胞を固定する。そして、センサー内包細胞が固定された足場に細胞を播種し、数日間培養することにより、細胞スフェロイドを作製することができる。培養された細胞は、足場の孔の内部にも広がるため、できあがった細胞スフェロイドの内部には、センサー内包細胞が位置づけられる。
【００３１】
いずれの方法を用いた場合であっても、細胞スフェロイドの内部に、センサー内包細胞をランダムに配置させることができる（図４参照）。また、いずれの方法を用いた場合であっても、細胞スフェロイドに含まれる細胞に対するセンサー内包細胞の割合を任意に調整することができる。例えば、細胞スフェロイドに含まれる細胞に対するセンサー内包細胞の割合を、1％以上１０％未満（例えば、２％〜５％）に設定することができる。細胞スフェロイドに含まれる細胞に対するセンサー内包細胞の割合を調整することで、例えばセンサー内包細胞の増える場合の、細胞同士のｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎの不足を調整することができる。
【００３２】
図５は、上述の自然沈降を利用した方法により作製した細胞スフェロイドの画像、及びそれに基づく模式図を示している。なお、図５においては、センサー内包細胞の代わりに、緑色に発色する物質を内包させた細胞を用いており、このような発色物質を内包した細胞を一定の比率で細胞に混ぜることにより細胞スフェロイドを作製した。細胞スフェロイドの内部に、発色物質を内包した細胞がランダムに配置されていることが分かる。
【００３３】
上記の説明においては、温度センサーとしてのセンサー分子（温度感受性蛍光プローブ）の一例として、温度センサータンパク質ｔｓＧＦＰを挙げたが、他のセンサー分子を用いることもできる。温度センサーとしてのセンサー分子として、例えば、ｇＴＥＭＰと呼ばれる公知の蛍光タンパク質を用いることができる。ｇＴＥＭＰは、蛍光強度の温度依存性が大きい蛍光タンパク質と、蛍光強度の温度依存性が小さい蛍光タンパク質とを組み合わせたものであり、ｔｓＧＦＰと比べて幅広い温度範囲が測定でき、且つ、早い温度変化が測定可能である。また、ｐＨセンサーとしてのセンサー分子（ｐＨ感受性蛍光プローブ）として、例えば、ＭＩＴＯ−ＩＤ（登録商標）のｐＨセンサーを利用することができる。Ｏ２センサーとしてのセンサー分子（Ｏ２感受性蛍光プローブ）として、例えば、ＭＩＴＯ−ＩＤ（登録商標）のＯ２センサーを利用することができる。圧力センサーとしてのセンサー分子（圧力感受性蛍光プローブ）として、例えば、ｓｔＦＲＥＴを利用することができる。ｓｔＦＲＥＴに関しては、例えば、Ｆａｎｊｉｅ  Ｍｅｎｇ，  Ｔｈｏｍａｓ  Ｍ．  Ｓｕｃｈｙｎａ，  Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｓａｃｈｓ  によるＦＥＢＳ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２７５  （２００８）  ３０７２−３０８７の“Ａ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ−ｂａｓｅｄ  ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ｓｔｒｅｓｓ  ｓｅｎｓｏｒ  ｆｏｒ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｓｉｔｕ“に記載されている。細胞の代謝物と反応する代謝物センサーとしてのセンサー分子（代謝物感受性蛍光プローブ）として、例えば、ＡＴｅａｍを利用することができる。代謝物感受性蛍光プローブは、例えば、ＡＴＰ濃度に応じて蛍光の波長が変化する。ＡＴｅａｍに関しては、例えば、Ｈｉｒｏｍｉ  Ｉｍａｍｕｒａ，  Ｋｉｍ  Ｐ．  Ｈｕｙｎｈ  Ｎｈａｔ，  Ｈｉｒｏｋｏ  Ｔｏｇａｗａ，  Ｋｅｎｔａ  Ｓａｉｔｏ，  Ｒｙｏｔａ  Ｉｉｎｏ，  Ｙａｓｕｙｕｋｉ  Ｋａｔｏ−Ｙａｍａｄａ，  Ｔａｋｅｈａｒｕ  Ｎａｇａｉ，  ａｎｄ  Ｈｉｒｏｙｕｋｉ  ＮｏｊｉによるＰＮＡＳ  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  １５，  ２００９  １０６  （３７）  １５６５１−１５６５６の”Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＡＴＰ  ｌｅｖｅｌｓ  ｉｎｓｉｄｅ  ｓｉｎｇｌｅ  ｌｉｖｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ−ｂａｓｅｄ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ”に記載されている。これらのセンサー分子は、温度センサータンパク質ｔｓＧＦＰと同様に、後述の方法により、人工細胞の内部に導入することもできるが、遺伝子導入により細胞内に導入することもできる。
【００３４】
いずれのセンサー分子も、センサー内包細胞の内部に導入され、細胞スフェロイドの内部に配置される。センサー分子から発せられる蛍光を測定することにより、細胞スフェロイドの内部の、センサー内包細胞が置かれた位置における環境（温度、圧力、酸素濃度、ｐＨなど）に関する情報を得ることができる。
【００３５】
また、１つの人工細胞または細胞の内部に、複数のセンサー分子を導入することもできる。例えば、図６に示されるように、センサー内包細胞として、温度センサーとしてのセンサー分子と、薬剤センサーとしてのグルタチオンとが内部に導入された人工細胞を用いることができる。温度センサーとしてのセンサー分子には、上述のｔｓＧＦＰやｇＴＥＭＰを用いることができる。そして、細胞スフェロイドに所望の薬剤を添加して毒性試験を行う場合において、添加する薬剤に予め、グルタチオンと酵素反応することにより発色するようになる公知の蛍光プローブ（ＤＮＡＴ−Ｍｅ）を付加しておく。薬剤が細胞スフェロイドの内部に浸透して、センサー内包細胞の内部に到達すると、薬剤に付加されている蛍光プローブＤＮＡＴ−Ｍｅとグルタチオンとが酵素反応を起こす。蛍光プローブＤＮＡＴ−Ｍｅとグルタチオンとが酵素反応を起こすことにより、ＤＮＡＴ−Ｍｅが蛍光を発するようになるので、この蛍光を計測することにより、薬剤がセンサー内包細胞の内部に到達したことを確認することができる。なお、酵素反応は温度が適切でなければ（高すぎても低すぎても）起きにくい。そのため、温度センサーとしてもセンサー分子を用いて、センサー内包細胞の置かれた環境の温度を同時に測定することにより、計測された蛍光がグルタチオンとの間で酵素反応を起こした蛍光プローブＤＮＡＴ−Ｍｅから発せられたものかどうかを確認することができる。この場合に、温度を同時に測定することにより、酵素反応が起こらなかった場合に、適当な温度によるものかどうかを判断することができる。また、温度を同時に測定することにより反応効率を予測することが可能になるため酵素量を推定することができる。
【００３６】
上述のように、多光子励起顕微鏡１０を用いた場合には、レーザ光の焦点位置近傍に位置するセンサー内包細胞から発せられる蛍光を選択的に測定することができる。そのため、レーザ光の焦点位置に基づいて、蛍光が発せられたセンサー内包細胞の位置を特定することができ、細胞スフェロイドの表面からセンサー内包細胞までの距離を求めることができる。そこで、図７に示されるように、薬剤を添加してから、グルタチオンとの間で酵素反応を起こした蛍光プローブＤＮＡＴ−Ｍｅから発せられた蛍光を計測するまでの時間を測定することにより、薬剤が細胞スフェロイドの内部に浸透する速度を算出することができる。細胞スフェロイドの内部では、細胞と細胞との間が細胞外基質で満たされており、薬剤が細胞スフェロイドの内部に容易に浸透することができない。そのため、上述のように薬剤が細胞スフェロイドの内部に浸透する速度を直接的に求めることは、細胞スフェロイドの内部の環境（細胞と細胞との間にある細胞外基質の量など）を評価する上で非常に重要である。薬剤の反応結果は反応した時間により大きく変化するため、薬剤による反応結果を正しく評価するためには薬剤の反応開始時期を知る必要がある。
【００３７】
次に、図８を参照しつつ、センサー内包細胞を回収する方法について説明する。センサー内包細胞と細胞とを混ぜ合わせて凝集させることにより、細胞スフェロイドを作製していたが、細胞スフェロイドからセンサー内包細胞を取り出して回収することができれば、センサー内包細胞を再利用することができる。まず、コラーゲナーゼなどの酵素を用いて、細胞スフェロイドを分散させて単細胞化させる（Ｓ２０１）。次に、センサー内包細胞と細胞とを選別し（Ｓ２０２）、センサー内包細胞と細胞とをそれぞれ回収する（Ｓ２０３）。なお、必要に応じて、センサー内包細胞のみ、あるいは、細胞のみを回収することもできる。回収されたセンサー内包細胞または細胞は、再利用することができる。ここで、センサー内包細胞と細胞とを選別するために、予め、センサー内包細胞の内部に、鉄の微粒子などの磁性体の微粒子を混入しておくことができる。細胞スフェロイドを分散させて単細胞化させた後、細胞及びセンサー内包細胞を水などの液体溶媒中に分散させて懸濁液を作製する。この懸濁液が入った容器の外側からマグネットを近づけると、磁性体の微粒子が入ったセンサー内包細胞を磁力によりマグネットに引き寄せることができる。磁性体の微粒子が含まれていない細胞は、容器の底に沈降するので、細胞とセンサー内包細胞とを選別することができる。
【００３８】
あるいは、センサー内包細胞の内部に、予め、蛍光物質の微粒子を混入しておくこともできる。上述のように、細胞スフェロイドを分散させて単細胞化させた後、細胞及びセンサー内包細胞を所定の流路に沿って移動させる。流路を流れる細胞またはセンサー内包細胞に対して、励起光を照射して蛍光を観察する。予めセンサー内包細胞の内部に混入した蛍光物質からの蛍光が観察されるかどうかに応じて、細胞とセンサー内包細胞とを選別することができる。また、センサー内包細胞に含まれるセンサー分子の種類に応じて、センサー内包細胞に混入する蛍光物質の微粒子の種類を変えておくこともできる。この場合には、観察される蛍光の波長に基づいて、センサー内包細胞をさらに選別することができる。
【００３９】
次に、図９を参照しつつ、センサー分子を内包する人工細胞の作製方法について説明する。まず、脂質二重膜のシートを用意する。脂質二重膜とは、細胞膜の基本構造となる、リン脂質の膜である。隙間なく並んだリン脂質が疎水性部分を内側に、親水性部分を外側に向けた状態で、二重の層を形成している。脂質二重膜の表面は親水性をもつ。脂質二重膜の内部は脂肪酸に満ちており、膜の内外を遮断する障壁として機能している。脂質二重膜のシートとして、例えば人工脂質二重膜を用いることができる。人工脂質二重膜の作製は様々な手法を用いることができる。例えば、Ｒｙｕｊｉ  Ｋａｗａｎｏ，  Ｙｕｔａｒｏ  Ｔｓｕｊｉ，  Ｋｏｊｉ  Ｓａｔｏ，  Ｔｏｓｈｉｈｉｓａ  Ｏｓａｋｉ，  Ｋｏｋｉ  Ｋａｍｉｙａ，  Ｍｉｎａｋｏ  Ｈｉｒａｎｏ，  Ｔｏｒｕ  Ｉｄｅ，  Ｎｏｒｉｈｉｓａ  Ｍｉｋｉ＆  Ｓｈｏｊｉ  ＴａｋｅｕｃｈｉによるＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ｖｏｌｕｍｅ  ３，  Ａｒｔｉｃｌｅ  ｎｕｍｂｅｒ：  １９９５  （２０１３）の”  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｐａｒａｌｌｅｌ  Ｒｅｃｏｒｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｔｏｐｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｉｏｎ  Ｃｈａｎｎｅｌｓ”に記載されている。ここで、脂質二重膜のシートに対して水などの液体を注入することにより、脂質二重膜に包まれた内部空間に、液体が入れられた人工細胞を作製することは、確立された技術である。本実施形態では、上記の液体に代えて、所望のセンサー分子を混ぜた液体を用いることにより、脂質二重膜の内部空間にセンサー分子が配置されたセンサー内包細胞を作製することができる。なお、センサー内包細胞の比重が、細胞の比重に近くなるように、液体の比重を調整することができる。例えば、水などの液体に、センサー分子と、比重を調整するための物質（例えば、ショ糖など）を混ぜることもできる。
【００４０】
なお、本実施形態において、人工細胞を用いて細胞の凝集体の環境を測定していたがこれに限られない。人工細胞を生体に投与した場合、投与先の環境を測定してもかまわない。なお、上述の実施形態において、人工細胞に脂質二重膜を用いていたがこれに限られない。細胞に親和性ある膜である細胞親和性膜であれば構わない。例えば、高分子から作製される高分子膜でも構わない。例えば、ＰＨを測定する場合には、半透膜であることが望ましい。半透膜である場合には、プロトンのみを通し、それ以上の粒子を通さないことが望ましい。半透膜の材料としてはセロハン、アセチルセルロース、ポリアクリロニトリル、ポリスルホンなどが挙げられる。例えば、温度を測定する場合には、半透膜でない高分子膜でも構わない。また、細胞にセンサー分子を導入して、人工細胞としても構わない。
【００４１】
また、細胞と人工細胞とを含む凝集体を作製する場合に、細胞と人工細胞とが接着しなくても構わない。凝集体を作製する際に、細胞同士が接着し、接着した細胞で囲まれた空間に人工細胞が配置されるようにしても構わない。すなわち、細胞と人工細胞とを含む凝集体を作製時に、細胞のみからなる凝集体ができる程度の親和性の膜であれば、構わない。
【００４２】
以上説明した実施形態は、あくまでも例示であって、請求の範囲に係る発明を限定するものではない。また、上記の実施形態の中で説明された特徴の組み合わせの全てが必須であるとは限らない。例えば、センサー分子は上記実施形態において例示されたものには限られず、環境に応じて異なる発光特性や発色特性を示す分子を適宜使用することができる。また、複数の種類のセンサー分子を１つの人工細胞または細胞に導入することができ、センサー分子の組み合わせは、上記実施形態において説明した組み合わせに限定されるものではない。
【００４３】
上記実施形態においては、評価装置１が多光子励起顕微鏡１０を含んでいたが、本開示はそのような形態には限定されない。例えば、多光子励起顕微鏡に代えて、コンフォーカル（共焦点）顕微鏡、ＯＣＴ（Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ  Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ：光干渉断層撮影）を用いることもできる。また、細胞スフェロイドを作製する方法及び人工細胞の内部にセンサー分子を導入する方法は、上記の例には限られず、他の公知の方法を用いることもできる。
【００４４】
以上、添付図面を参照しながら、本発明に係る好適な実施形態や変形例について説明したが、本発明は係る例に限定されないことは言うまでもない。上述した例において示した各構成部材の諸形状や組み合わせ等は一例であって、本発明の主旨から逸脱しない範囲において設計要求等に基づき種々変更可能である。前述の実施形態の各構成要素は、適宜組み合わせることができる。また、一部の構成要素を用いない場合もある。また、法令が許容される限りにおいて、前述の各実施形態及び変形例などに関するすべての公開広報および米国特許の開示を援用して本文の記載の一部とする。前述した実施形態に基づいて当業者等によりなされる他の実施形態及び運用技術等は、すべて本実施形態の範囲に含まれる。
【符号の説明】
【００４５】
１      評価装置
１０    多光子励起顕微鏡
１１    制御部
１２    表示部
１３    入力部
１００  照明部
１２０  光学系
１４０  受光部
１６０  可動ステージ
【図１】
2020171204.tif 000003
【図２】
2020171204.tif 000004
【図３】
2020171204.tif 000005
【図４】
2020171204.tif 000006
【図５】
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【図６】
2020171204.tif 000008
【図７】
2020171204.tif 000009
【図８】
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【図９】
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