(57)【要約】      （修正有）【課題】腎臓移植における急性拒絶を評価するための組成物および方法の提供。【解決手段】腎臓同種移植を受けた個人において、急性拒絶（ＡＲ）の診断に使用するため、非ＡＲの診断に使用するため、またはＡＲを発症するリスクの診断に使用するための方法であって、ａ）前記個人からの生体サンプルにおいてＣＥＡＣＡＭ４、ならびにＣＦＬＡＲ、ＤＵＳＰ１、ＩＦＮＧＲ１、ＩＴＧＡＸ、ＭＡＰＫ９、ＮＡＭＰＴ、ＮＫＴＲ、ＰＳＥＮ１、ＲＮＦ１３０、ＲＹＢＰ、ＥＰＯＲ、ＧＺＭＫ、ＲＡＲＡ、ＲＨＥＢ、ＲＸＲＡ等から選択される６〜１６の間の他の遺伝子のレベルを測定して遺伝子発現結果を得ること；ならびにｂ）各遺伝子に対するＡＲサンプル由来の単一の参照発現ベクターと各遺伝子に対する非ＡＲサンプル由来の単一の参照発現ベクターとを含んでなる参照標準を使用し、診断のために前記遺伝子発現結果が前記参照標準と比較されることを含んでなる、方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
腎臓同種移植を受けた個人において（ＡＲ）の診断に使用するため、非ＡＲの診断に使用するため、またはＡＲを発症するリスクの診断に使用するための方法であって、
ａ）前記個人からの生体サンプルにおいてＣＥＡＣＡＭ４、ならびにＣＦＬＡＲ、ＤＵＳＰ１、ＩＦＮＧＲ１、ＩＴＧＡＸ、ＭＡＰＫ９、ＮＡＭＰＴ、ＮＫＴＲ、ＰＳＥＮ１、ＲＮＦ１３０、ＲＹＢＰ、ＥＰＯＲ、ＧＺＭＫ、ＲＡＲＡ、ＲＨＥＢ、ＲＸＲＡ、およびＳＬＣ２５Ａ３７から選択される６〜１６の間の他の遺伝子のレベルを測定して遺伝子発現結果を得ること；ならびに
ｂ）各遺伝子に対するＡＲサンプル由来の単一の参照発現ベクターと各遺伝子に対する非ＡＲサンプル由来の単一の参照発現ベクターとを含んでなる参照標準を使用し、診断のために前記遺伝子発現結果が前記参照標準と比較されることを含んでなる、方法。
【請求項２】
前記個人が２３歳以上の成人である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記個人が小児または２３歳未満の若年成人である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
６〜１６の間の他の遺伝子がＣＦＬＡＲ、ＤＵＳＰ１、ＩＦＮＧＲ１、ＩＴＧＡＸ、ＭＡＰＫ９、ＮＡＭＰＴ、ＮＫＴＲ、ＰＳＥＮ１、ＲＮＦ１３０、ＲＹＢＰ、ＥＰＯＲ、ＧＺＭＫ、ＲＡＲＡ、ＲＨＥＢ、ＲＸＲＡ、およびＳＬＣ２５Ａ３７を含んでなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記測定工程が前記サンプルの遺伝子発現結果をマイクロアレイチップでアッセイすることまたは前記サンプルの遺伝子発現結果をｑＰＣＲを用いてアッセイすることを含んでなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記測定工程が前記サンプルの遺伝子発現結果をビーズでアッセイすることを含んでなる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記測定工程が前記サンプルの遺伝子発現結果をナノ粒子でアッセイすることを含んでなる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記生体サンプルが血液サンプルである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記血液サンプルが末梢血白血球または末梢血単核サンプルである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記血液サンプルが全血である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較が、７０％を超える感度でのＡＲの予測を含んでなる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較が、７０％を超える特異度でのＡＲの予測を含んでなる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較が、７０％を超える陽性的中率（ｐｐｖ）でのＡＲの予測を含んでなる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較が、７０％を超える陰性的中率（ｎｐｖ）でのＡＲの予測を含んでなる、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
腎臓移植の急性拒絶（ＡＲ）の処置のための個人の同定において使用する方法であって、
ａ）前記個人からの生体サンプルにおいてＣＥＡＣＡＭ４、ならびにＣＦＬＡＲ、ＤＵＳＰ１、ＩＦＮＧＲ１、ＩＴＧＡＸ、ＭＡＰＫ９、ＮＡＭＰＴ、ＮＫＴＲ、ＰＳＥＮ１、ＲＮＦ１３０、ＲＹＢＰ、ＥＰＯＲ、ＧＺＭＫ、ＲＡＲＡ、ＲＨＥＢ、ＲＸＲＡ、およびＳＬＣ２５Ａ３７から選択される６〜１６の間の他の遺伝子のレベルを測定して遺伝子発現結果を得ること；および
ｂ）各遺伝子に対するＡＲサンプル由来の単一の参照発現ベクターと各遺伝子に対する非ＡＲサンプル由来の単一の参照発現ベクターとを含んでなる参照標準を使用し、同定のために前記遺伝子発現結果が前記参照標準と比較されることを含んでなる、方法。
【請求項１６】
前記個人が２３歳以上の成人である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記個人が小児または２３歳未満の若年成人である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
６〜１６の間の他の遺伝子がＣＦＬＡＲ、ＤＵＳＰ１、ＩＦＮＧＲ１、ＩＴＧＡＸ、ＭＡＰＫ９、ＮＡＭＰＴ、ＮＫＴＲ、ＰＳＥＮ１、ＲＮＦ１３０、ＲＹＢＰ、ＥＰＯＲ、ＧＺＭＫ、ＲＡＲＡ、ＲＨＥＢ、ＲＸＲＡ、およびＳＬＣ２５Ａ３７を含んでなる、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記測定工程が前記サンプルの遺伝子発現結果をマイクロアレイチップでアッセイすることまたは前記サンプルの遺伝子発現結果をｑＰＣＲを用いてアッセイすることを含んでなる、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記測定工程が前記サンプルの遺伝子発現結果をビーズでアッセイすることを含んでなる、請求項１５〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記測定工程が前記サンプルの遺伝子発現結果をナノ粒子でアッセイすることを含んでなる、請求項１５〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記生体サンプルが血液サンプルである、請求項１５〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記血液サンプルが末梢血白血球または末梢血単核細胞である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記血液サンプルが全血である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較が、７０％を超える感度でのＡＲの予測を含んでなる、請求項１５〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較が、７０％を超える特異度でのＡＲの予測を含んでなる、請求項１５〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記比較工程が、７０％を超える陽性的中率（ｐｐｖ）でのＡＲの予測を含んでなる、請求項１５〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較が、７０％を超える陰性的中率（ｎｐｖ）でのＡＲの予測を含んでなる、請求項１５〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
腎臓同種移植を受けた個人において急性拒絶（ＡＲ）の診断に使用するためのシステムであって、
ａ）前記個人由来の生体サンプルにおいてＣＥＡＣＡＭ４、ならびにＣＦ  ＣＦＬＡＲ、ＤＵＳＰ１、ＩＦＮＧＲ１、ＩＴＧＡＸ、ＭＡＰＫ９、ＮＡＭＰＴ、ＮＫＴＲ、ＰＳＥＮ１、ＲＮＦ１３０、ＲＹＢＰ、ＥＰＯＲ、ＧＺＭＫ、ＲＡＲＡ、ＲＨＥＢ、ＲＸＲＡ、およびＳＬＣ２５Ａ３７から選択される６〜１６の他の遺伝子のレベルを測定して遺伝子発現結果を得るための遺伝子発現評価素子；ならびに
ｂ）診断のために前記遺伝子発現結果と前記参照標準を比較するための、単一の腎臓移植センターにおける各遺伝子に対するＡＲサンプル由来の単一の参照発現ベクターと、単一の腎臓移植センターにおける各遺伝子に対する非ＡＲサンプル由来の単一の参照発現ベクターとを含んでなる参照標準素子と
を含んでなる、システム。
【請求項３０】
前記遺伝子発現評価素子がマイクロアレイチップまたはｑＰＣＲ装置を含んでなる、請求項２９に記載のシステム。
【請求項３１】
前記遺伝子発現評価素子がビーズを含んでなる、請求項３０に記載のシステム。
【請求項３２】
前記遺伝子発現評価素子がナノ粒子を含んでなる、請求項２９〜３１のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項３３】
前記参照標準素子がコンピューター生成される、請求項２９〜３２のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項３４】
前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較がコンピューターまたは個人により行われる、請求項２９〜３３のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項３５】
前記個人が２３歳以上の成人である、請求項２９〜３４のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項３６】
前記個人が小児または２３歳未満の若年成人である、請求項２９〜３４のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項３７】
６〜１６の他の遺伝子がＣＦＬＡＲ、ＤＵＳＰ１、ＩＦＮＧＲ１、ＩＴＧＡＸ、ＭＡＰＫ９、ＮＡＭＰＴ、ＮＫＴＲ、ＰＳＥＮ１、ＲＮＦ１３０、ＲＹＢＰ、ＥＰＯＲ、ＧＺＭＫ、ＲＡＲＡ、ＲＨＥＢ、ＲＸＲＡ、およびＳＬＣ２５Ａ３７を含んでなる請求項２９〜３６のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項３８】
前記生体サンプルが血液サンプルである、請求項２９〜３７のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項３９】
前記血液サンプルが末梢血白血球または末梢血単核細胞である、請求項３８に記載のシステム。
【請求項４０】
前記血液サンプルが全血である、請求項３８に記載のシステム。
【請求項４１】
前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較が７０％を超える感度でＡＲを予測する、請求項２９〜４０のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項４２】
前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較が７０％を超える特異度でＡＲを予測する、請求項２９〜４１のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項４３】
前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較が７０％を超える陽性的中率（ｐｐｖ）でＡＲを予測する、請求項２９〜４２のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項４４】
前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較が７０％を超える陰性的中率（ｎｐｖ）でＡＲを予測する、請求項２９〜４３のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項４５】
腎臓同種移植を受けた個人において急性拒絶（ＡＲ）の診断に使用するためのキットであって、
ａ）前記個人由来の生体サンプルにおいてＣＥＡＣＡＭ４、ならびにＣＦＬＡＲ、ＤＵＳＰ１、ＩＦＮＧＲ１、ＩＴＧＡＸ、ＭＡＰＫ９、ＮＡＭＰＴ、ＮＫＴＲ、ＰＳＥＮ１、ＲＮＦ１３０、ＲＹＢＰ、ＥＰＯＲ、ＧＺＭＫ、ＲＡＲＡ、ＲＨＥＢ、ＲＸＴＡ、およびＳＬＣ２５Ａ３７から選択される６〜１６の他の遺伝子のレベルを評価して遺伝子発現結果を得るための遺伝子発現評価素子；
ｂ）単一の腎臓移植センターにおける各遺伝子に対するＡＲサンプル由来の単一の参照発現ベクターと、単一の腎臓移植センターにおける各遺伝子に対する非ＡＲサンプル由来の単一の参照発現ベクターとを含んでなる参照標準素子；および
ｃ）前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較を含んでなるＡＲを診断するための説明書一式
を含んでなる、キット。
【請求項４６】
前記個人が２３歳以上の成人である、請求項４５に記載のキット。
【請求項４７】
前記個人が２３歳未満の小児または若年成人である、請求項４５に記載のキット。
【請求項４８】
６〜１６の他の遺伝子がＣＦＬＡＲ、ＤＵＳＰ１、ＩＦＮＧＲ１、ＩＴＧＡＸ、ＭＡＰＫ９、ＮＡＭＰＴ、ＮＫＴＲ、ＰＳＥＮ１、ＲＮＦ１３０、ＲＹＢＰ、ＥＰＯＲ、ＧＺＭＫ、ＲＡＲＡ、ＲＨＥＢ、ＲＸＲＡ、およびＳＬＣ２５Ａ３７を含んでなる、請求項４５〜４７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項４９】
前記遺伝子発現評価素子がマイクロアレイチップで前記サンプルの遺伝子発現結果をアッセイすることを含んでなる、請求項４５〜４８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５０】
前記遺伝子発現評価素子がビーズで前記サンプルの遺伝子発現結果をアッセイすることを含んでなる、請求項４５〜４９のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５１】
前記遺伝子発現評価素子がナノ粒子で前記サンプルの遺伝子発現結果をアッセイすることを含んでなる、請求項４５〜５０のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５２】
前記生体サンプルが血液サンプルである、請求項４５〜５０のいずれか一項に記載にキット。
【請求項５３】
前記血液サンプルが末梢血白血球または末梢血単核細胞である、請求項５２に記載のキット。
【請求項５４】
前記血液サンプルが全血である、請求項５２に記載のキット。
【請求項５５】
前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較が７０％を超える感度でＡＲを予測する、請求項４５〜５４のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５６】
前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較が７０％を超える特異度でＡＲを予測する、請求項４５〜５５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５７】
前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較が７０％を超える陽性的中率（ｐｐｖ）でＡＲを予測する、請求項４５〜５６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５８】
前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較が７０％を超える陰性的中率（ｎｐｖ）でＡＲを予測する、請求項４５〜５７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５９】
前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較がコンピューターまたは個人により行われる、請求項４５〜５８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項６０】
腎臓同種移植を受けた個人由来の生体サンプルにおいてＣＥＡＣＡＭ４、ならびにＣ  ＣＦＬＡＲ、ＤＵＳＰ１、ＩＦＮＧＲ１、ＩＴＧＡＸ、ＭＡＰＫ９、ＮＡＭＰＴ、ＮＫＴＲ、ＰＳＥＮ１、ＲＮＦ１３０、ＲＹＢＰ、ＥＰＯＲ、ＧＺＭＫ、ＲＡＲＡ、ＲＨＥＢ、ＲＸＲＡ、およびＳＬＣ２５Ａ３７から選択される６〜１６の他の遺伝子のレベルを測定することにより得られる遺伝子発現結果と比較するための参照標準を含んでなり、単一の腎臓移植センターにおける各遺伝子に対するＡＲサンプル由来の単一の参照発現ベクターと、単一の腎臓移植センターにおける各遺伝子に対する非ＡＲサンプル由来の単一の参照発現ベクターとを含んでなり、前記遺伝子発現と前記参照標準の比較が、前記個人において急性拒絶（ＡＲ）の診断に使用するため、非ＡＲの診断に使用するため、またはＡＲを発症するリスクの診断に使用するためのものである、製品。
【請求項６１】
前記個人が２３歳以上の成人である、請求項６０に記載の製品。
【請求項６２】
前記個人が小児または２３歳未満の若年成人である、請求項６０に記載の製品。
【請求項６３】
６〜１６の他の遺伝子がＣＦＬＡＲ、ＤＵＳＰ１、ＩＦＮＧＲ１、ＩＴＧＡＸ、ＭＡＰＫ９、ＮＡＭＰＴ、ＮＫＴＲ、ＰＳＥＮ１、ＲＮＦ１３０、ＲＹＢＰ、ＥＰＯＲ、ＧＺＭＫ、ＲＡＲＡ、ＲＨＥＢ、ＲＸＲＡ、およびＳＬＣ２５Ａ３７を含んでなる、請求項６０〜６２のいずれか一項に記載の製品。
【請求項６４】
ＣＥＡＣＡＭ４および６〜１６の他の遺伝子のレベルを測定することが、前記サンプルの遺伝子発現結果をマイクロアレイチップでアッセイすること、または前記サンプルの遺伝子発現結果をｑＰＣＲを用いてアッセイすることを含んでなる、請求項６０〜６３のいずれか一項に記載の製品。
【請求項６５】
ＣＥＡＣＡＭ４および６〜１６の他の遺伝子のレベルを測定することが、前記サンプルの遺伝子発現結果をビーズでアッセイすることを含んでなる、請求項６０〜６４のいずれか一項に記載の製品。
【請求項６６】
ＣＥＡＣＡＭ４および６〜１６の他の遺伝子のレベルを測定することが、前記サンプルの遺伝子発現結果をナノ粒子でアッセイすることを含んでなる、請求項６０〜６５のいずれか一項に記載の製品。
【請求項６７】
前記生体サンプルが血液サンプルである、請求項６０〜６６のいずれか一項に記載の製品。
【請求項６８】
前記血液サンプルが末梢血白血球または末梢血単核細胞である、請求項６７に記載の製品。
【請求項６９】
前記血液サンプルが全血である、請求項６７に記載の製品。
【請求項７０】
前記遺伝子発現と前記参照標準の比較が、７０％を超える感度でのＡＲの予測を含んでなる、請求項６０〜６９のいずれか一項に記載の製品。
【請求項７１】
前記遺伝子発現と前記参照標準の比較が、７０％を超える特異度でのＡＲの予測を含んでなる、請求項６０〜７０のいずれか一項に記載の製品。
【請求項７２】
前記遺伝子発現と前記参照標準の比較が、７０％を超える陽性的中率（ｐｐｖ）でのＡＲの予測を含んでなる、請求項６０〜７１のいずれか一項に記載の製品。
【請求項７３】
前記遺伝子発現と前記参照標準の比較が、７０％を超える陰性的中率（ｎｐｖ）でのＡＲの予測を含んでなる、請求項６０〜７２のいずれか一項に記載の製品。
【請求項７４】
腎臓移植患者のための処置の方法であって、
ａ）前記個人からの生体サンプルにおいてＣＥＡＣＡＭ４、ならびにＣＦＬＡＲ、ＤＵＳＰ１、ＩＦＮＧＲ１、ＩＴＧＡＸ、ＭＡＰＫ９、ＮＡＭＰＴ、ＮＫＴＲ、ＰＳＥＮ１、ＲＮＦ１３０、ＲＹＢＰ、ＥＰＯＲ、ＧＺＭＫ、ＲＡＲＡ、ＲＨＥＢ、ＲＸＲＡ、およびＳＬＣ２５Ａ３７から選択される６〜１６の間の他の遺伝子のレベルを測定して遺伝子発現結果を得ること；
ｂ）各遺伝子に対するＡＲサンプル由来の単一の参照発現ベクターと各遺伝子に対する非ＡＲサンプル由来の単一の参照発現ベクターとを含んでなる参照標準を使用し、前記遺伝子発現結果が前記参照標準と比較され、それにより、被験者を腎臓移植のＡＲを有するまたは腎臓移植のＡＲを有なさいとして同定すること；
ｃ）腎臓移植のＡＲを有する被験者では治療上有効な量の１種類以上の治療薬の投与を増やし、腎臓移植のＡＲを有さない被験者では治療上有効な量の１種類以上の治療薬の投与を維持し、または腎臓移植のＡＲを有さない被験者では治療上有効な量の１種類以上の治療薬の投与を減らすことを含んでなる試験を指示することを含んでなる、方法。
【請求項７５】
前記個人が２３歳以上の成人である、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記個人が小児または２３歳未満の若年成人である、請求項７４に記載の方法。
【請求項７７】
６〜１６の他の遺伝子がＣＦＬＡＲ、ＤＵＳＰ１、ＩＦＮＧＲ１、ＩＴＧＡＸ、ＭＡＰＫ９、ＮＡＭＰＴ、ＮＫＴＲ、ＰＳＥＮ１、ＲＮＦ１３０、ＲＹＢＰ、ＥＰＯＲ、ＧＺＭＫ、ＲＡＲＡ、ＲＨＥＢ、ＲＸＲＡ、およびＳＬＣ２５Ａ３７を含んでなる、請求項７４〜７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７８】
前記測定工程が前記サンプルの遺伝子発現結果をマイクロアレイチップでアッセイすること、または前記サンプルの遺伝子発現結果をｑＰＣＲを用いてアッセイすることを含んでなる、請求項７４〜７７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７９】
前記測定工程が前記サンプルの遺伝子発現結果をビーズでアッセイすることを含んでなる、請求項７４〜７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８０】
前記測定工程が前記サンプルの遺伝子発現結果をナノ粒子でアッセイすることを含んでなる、請求項７４〜７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８１】
前記生体サンプルが血液サンプルである、請求項７４〜８０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８２】
前記血液サンプルが末梢血白血球または末梢血単核細胞である、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記血液サンプルが全血である、請求項８１に記載の方法。
【請求項８４】
前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較が、７０％を超える感度でのＡＲの予測を含んでなる、請求項７４〜８３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８５】
前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較が、７０％を超える特異度でのＡＲの予測を含んでなる、請求項７４〜８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８６】
前記比較工程が７０％を超える陽性的中率（ｐｐｖ）でのＡＲの予測を含んでなる、請求項７４〜８５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８７】
前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較が、７０％を超える陰性的中率（ｎｐｖ）でのＡＲの予測を含んでなる、請求項７４〜８６のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、分類子遺伝子セットの遺伝子発現プロファイルを用いて腎臓移植の急性拒絶を評価するための方法、組成物、およびキットに関する。記載の方法および組成物は、レシピエントの年齢、移植センター、ＲＮＡソース、アッセイ、末期腎疾患の原因、併存症、免疫抑制使用などの外的交絡因子に依存しない。
【背景技術】
【０００２】
ドナーから宿主レシピエントへの臓器移植は、特定の医療行為および治療計画の一要素である。移植後には、レシピエントによる移植片拒絶を回避する必要がある。ドナー臓器の生存力を維持するためには、一般に免疫抑制療法が用いられる。しかしながらやはり、固形臓器移植拒絶はなお起こり得る。
【０００３】
臓器移植拒絶は、超急性、急性、境界急性、準臨床急性、または慢性として分類される。腎臓を含むほとんどの臓器では、臓器拒絶は、その臓器の生検を行うことでしか明白に診断できない。しかしながら、実用上の理由のため、生検は急性拒絶が疑われる場合にいつも行われるわけではない。さらに、生検にはサンプリングおよび解釈によりバイアスがかかる場合があり(Furness, P.N. et al. Transplantation 2003, 76, 969-973; Furness, P.N. Transplantation 2001, 71, SS31-36)、それらは予測されない。適時に傷害を検出することは、同種移植の健康および長期生存を保証するために重要である。
【０００４】
臓器移植レシピエントは直面する主要な臨床問題の１つは、患者の同種免疫閾値および急性移植片拒絶のリスクを連続的にモニタリングするために使用可能な高感度、特異的、かつ、非侵襲的なアッセイが無いことである。極めて冗長かつ非特異的な機能性マーカーの上昇（例えば、移植片の機能不全を示す手段としての血清クレアチニンの上昇）が急性拒絶を示唆し得る。しかしながら、腎臓移植では、監視生検時の予期されない診断(Racusen, L. C. et al. Kidney International 1999, 55, 713-723; Solez, K. et al. Am. J. Transplant. 2008, 8, 753-760; Naesens, M. et al. Am. J. Transplant. 2012, 12, 2730-2743)まで、血清クレアチニンのドリフトにより、損傷が検出されずに持続する（準臨床急性拒絶）という認識が高まっている(Lerut, E. et al. Transplantation 2007, 83, 1416-1422; Sigdel, T. K. et al. J. Am. Soc. Nephrol. 2012, 23, 750-763; Moreso, F. et al. Am. J. Transplant. 2006, 6, 747-752; Moreso, F. et al. Transplantation 2012, 93, 41-46; Heilman, R. L. et al. Am. J. Transplant. 2010, 10, 563-570)。
【０００５】
急性移植片拒絶（ＡＲ）の検出を高い特異度（ＡＲのリスクの低い患者において侵襲的プロトコールの生検を少なくするため）かつ高感度（ＡＲのリスクの高い患者臨床監視を高めるため）で、現在可能なものよりも早く可能とするアッセイシリーズは、ＡＲを緩和するとともに寛解期患者および安定疾患患者に対する免疫抑制プロトコールを軽減するための適時な臨床的介入をもたらす。多くのアッセイは、レシピエントの年齢、併存症、移植センター、免疫抑制使用、および／または末期腎疾患の原因など依存すると思われる。本明細書では、これらの変数に依存しないアッセイの開発を通してこの問題に対する解決策を記載する。
【０００６】
本明細書に引用されている全ての特許、特許出願、刊行物、文書、および文献は、特に断りのない限り、引用することによりそれらの全内容が本明細書の一部とされる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Furness, P.N. et al. Transplantation 2003, 76, 969-973
【非特許文献２】Furness, P.N. Transplantation 2001, 71, SS31-36
【非特許文献３】Racusen, L. C. et al. Kidney International 1999, 55, 713-723
【非特許文献４】Solez, K. et al. Am. J. Transplant. 2008, 8, 753-760
【非特許文献５】Naesens, M. et al. Am. J. Transplant. 2012, 12, 2730-2743
【非特許文献６】Lerut, E. et al. Transplantation 2007, 83, 1416-1422
【非特許文献７】Sigdel, T. K. et al. J. Am. Soc. Nephrol. 2012, 23, 750-763
【非特許文献８】Moreso, F. et al. Am. J. Transplant. 2006, 6, 747-752
【非特許文献９】Moreso, F. et al. Transplantation 2012, 93, 41-46
【非特許文献１０】Heilman, R. L. et al. Am. J. Transplant. 2010, 10, 563-570
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の簡単な概要
本明細書では、ある個人を腎臓移植の急性拒絶（ＡＲ）のリスクが高いとして、および／または急性拒絶のリスクが低いもしくはリスクが無い（非ＡＲ）として分類するための組成物および方法が開示される。これらの組成物および方法は、分類子遺伝子セットの遺伝子発現レベルを含んでなり、小児患者および成人患者の両方でこのような分類に使用できる。
【０００９】
よって、一態様において、本発明は、腎臓同種移植を受けた個人において急性拒絶（ＡＲ）の診断において使用する、非ＡＲの診断に使用するため、またはＡＲを発症するリスクの診断に使用するための方法であって、ａ）前記個人からの生体サンプルにおいてＣＦＬＡＲ、ＤＵＳＰ１、ＩＦＮＧＲ１、ＩＴＧＡＸ、ＭＡＰＫ９、ＮＡＭＰＴ、ＮＫＴＲ、ＰＳＥＮ１、ＲＮＦ１３０、ＲＹＢＰ、ＥＰＯＲ、ＧＺＭＫ、ＲＡＲＡ、ＲＨＥＢ、ＲＸＲＡ、およびＳＬＣ２５Ａ３７から選択される６〜１６の間の他の遺伝子のレベルを測定して遺伝子発現結果を得ること；およびｂ）各遺伝子に対するＡＲサンプル由来の単一の参照発現ベクターと各遺伝子に対する非ＡＲサンプル由来の単一の参照発現ベクターとを含んでなる参照標準を使用し、前記遺伝子発現結果が前記参照標準と相関されることを含んでなる方法を提供する。本明細書の実施形態のいずれにおいても、個人は２３歳以上の成人であり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、個人は小児または２３歳未満の若年成人であり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、６〜１６の他の遺伝子は、ＣＦＬＡＲ、ＤＵＳＰ１、ＩＦＮＧＲ１、ＩＴＧＡＸ、ＭＡＰＫ９、ＮＡＭＰＴ、ＮＫＴＲ、ＰＳＥＮ１、ＲＮＦ１３０、ＲＹＢＰ、ＥＰＯＲ、ＧＺＭＫ、ＲＡＲＡ、ＲＨＥＢ、ＲＸＲＡ、およびＳＬＣ２５Ａ３７を含んでなり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、前記測定工程は、前記サンプルの遺伝子発現結果をマイクロアレイチップでアッセイすることを含んでなり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、前記測定工程は、前記サンプルの遺伝子発現結果をｑＰＣＲを用いてアッセイすることを含んでなり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、前記測定工程は、前記サンプルの遺伝子発現結果をビーズでアッセイすることを含んでなり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、前記測定工程は、前記サンプルの遺伝子発現結果をナノ粒子でアッセイすることを含んでなり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、前記測定工程は、前記サンプルの遺伝子発現結果を、有孔質または非孔質であり得、かつ、サイズに幅があり得る固相表面でアッセイすることを含んでなり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、生体サンプルは、全血サンプルであり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、生体サンプルは、血液サンプルであり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、血液サンプルは、末梢血白血球であり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、血液サンプルは、末梢血単核細胞であり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較は、７０％を超える感度でのＡＲの予測を含んでなり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較は、７０％を超える特異度でのＡＲの予測を含んでなり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較は、７０％を超える陽性的中率（ｐｐｖ）でのＡＲの予測を含んでなり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較は、７０％を超える陰性的中率（ｎｐｖ）でのＡＲの予測を含んでなり得る。
【００１０】
別の態様において、本発明は、腎臓移植の急性拒絶（ＡＲ）の処置のための個人の同定において使用する方法であって、ａ）前記個人からの生体サンプルにおいてＣＥＡＣＡＭ４、ならびにＣＦＬＡＲ、ＤＵＳＰ１、ＩＦＮＧＲ１、ＩＴＧＡＸ、ＭＡＰＫ９、ＮＡＭＰＴ、ＮＫＴＲ、ＰＳＥＮ１、ＲＮＦ１３０、ＲＹＢＰ、ＥＰＯＲ、ＧＺＭＫ、ＲＡＲＡ、ＲＨＥＢ、ＲＸＲＡ、およびＳＬＣ２５Ａ３７から選択される６〜１６の間の他の遺伝子のレベルを測定して遺伝子発現結果を得ること；およびｂ）各遺伝子に対するＡＲサンプル由来の単一の参照発現ベクターと各遺伝子に対する非ＡＲサンプル由来の単一の参照発現ベクターとを含んでなる参照標準を使用し、同定のために前記遺伝子発現結果が前記参照標準と相関されることを含んでなる方法を提供する。本明細書の実施形態のいずれにおいても、個人は、２３歳以上の成人であり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、個人は、小児または２３歳未満の若年成人であり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、６〜１６の他の遺伝子は、ＣＦＬＡＲ、ＤＵＳＰ１、ＩＦＮＧＲ１、ＩＴＧＡＸ、ＭＡＰＫ９、ＮＡＭＰＴ、ＮＫＴＲ、ＰＳＥＮ１、ＲＮＦ１３０、ＲＹＢＰ、ＥＰＯＲ、ＧＺＭＫ、ＲＡＲＡ、ＲＨＥＢ、ＲＸＲＡ、およびＳＬＣ２５Ａ３７を含んでなり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、前記測定工程は、前記サンプルの遺伝子発現結果をマイクロアレイチップでアッセイすることを含んでなり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、前記測定工程は、前記サンプルの遺伝子発現結果をビーズでアッセイすることを含んでなり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、前記測定工程は、前記サンプルの遺伝子発現結果をナノ粒子でアッセイすることを含んでなり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、前記測定工程は、前記サンプルの遺伝子発現結果を、有孔質または非孔質であり得、かつ、サイズに幅があり得る固相表面でアッセイすることを含んでなり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、生体サンプルは、血液サンプルであり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、血液サンプルは、末梢血白血球であり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、血液サンプルは、末梢血単核細胞であり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、生体サンプルは、全血サンプルであり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較は、７０％を超える感度でのＡＲの予測を含んでなり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較は、７０％を超える特異度でのＡＲの予測を含んでなり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、前記比較工程は、７０％を超える陽性的中率（ｐｐｖ）でのＡＲの予測を含んでなり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較は、７０％を超える陰性的中率（ｎｐｖ）でのＡＲの予測を含んでなり得る。
【００１１】
別の態様において、本発明は、腎臓同種移植を受けた個人において急性拒絶（ＡＲ）の診断に使用するためのシステムであって、ａ）前記個人由来の生体サンプルにおいてＣＥＡＣＡＭ４、ならびにＣＦ  ＣＦＬＡＲ、ＤＵＳＰ１、ＩＦＮＧＲ１、ＩＴＧＡＸ、ＭＡＰＫ９、ＮＡＭＰＴ、ＮＫＴＲ、ＰＳＥＮ１、ＲＮＦ１３０、ＲＹＢＰ、ＥＰＯＲ、ＧＺＭＫ、ＲＡＲＡ、ＲＨＥＢ、ＲＸＲＡ、およびＳＬＣ２５Ａ３７から選択される６〜１６の他の遺伝子のレベルを測定して遺伝子発現結果を得るための遺伝子発現評価素子；およびｂ）診断のために前記遺伝子発現結果と前記参照標準を相関させるための、各遺伝子に対するＡＲサンプル由来の単一の参照発現ベクターと、各遺伝子に対する非ＡＲサンプル由来の単一の参照発現ベクターとを含んでなる参照標準素子とを含んでなるシステムを提供する。本明細書の実施形態のいずれにおいても、遺伝子発現評価素子は、マイクロアレイチップを含んでなり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、遺伝子発現評価素子は、ビーズを含んでなり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、遺伝子発現評価素子は、ナノ粒子を含んでなり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、前記測定工程は、前記サンプルの遺伝子発現結果を、有孔質または非孔質であり得、かつ、サイズに幅があり得る固相表面でアッセイすることを含んでなり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、参照標準素子は、コンピューター生成され得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、前記参照標準に対する前記遺伝子発現結果は、コンピューターまたは個人により行うことができる。本明細書の実施形態のいずれにおいても、個人は、２３歳以上の成人であり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、個人は、小児または２３歳未満の若年成人であり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、６〜１６の他の遺伝子は、ＣＦＬＡＲ、ＤＵＳＰ１、ＩＦＮＧＲ１、ＩＴＧＡＸ、ＭＡＰＫ９、ＮＡＭＰＴ、ＮＫＴＲ、ＰＳＥＮ１、ＲＮＦ１３０、ＲＹＢＰ、ＥＰＯＲ、ＧＺＭＫ、ＲＡＲＡ、ＲＨＥＢ、ＲＸＲＡ、およびＳＬＣ２５Ａ３７を含んでなり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、生体サンプルは、血液サンプルであり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、血液サンプルは、末梢血白血球であり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、血液サンプルは、末梢血単核細胞であり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、生体サンプルは、全血サンプルであり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較は、７０％を超える感度でＡＲを予測し得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較は、７０％を超える特異度でＡＲを予測し得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較は、７０％を超える陽性的中率（ｐｐｖ）でＡＲを予測し得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較は、７０％を超える陰性的中率（ｎｐｖ）でＡＲを予測し得る。
【００１２】
別の態様において、本発明は、腎臓同種移植を受けた個人において急性拒絶（ＡＲ）の診断に使用するためのキットであって、ａ）前記個人由来の生体サンプルにおいてＣＥＡＣＡＭ４、ならびにＣＦＬＡＲ、ＤＵＳＰ１、ＩＦＮＧＲ１、ＩＴＧＡＸ、ＭＡＰＫ９、ＮＡＭＰＴ、ＮＫＴＲ、ＰＳＥＮ１、ＲＮＦ１３０、ＲＹＢＰ、ＥＰＯＲ、ＧＺＭＫ、ＲＡＲＡ、ＲＨＥＢ、ＲＸＴＡ、およびＳＬＣ２５Ａ３７から選択される６〜１６の他の遺伝子のレベルを評価して遺伝子発現結果を得るための遺伝子発現評価素子；ｂ）各遺伝子に対するＡＲサンプル由来の単一の参照発現ベクターと、各移植センターに対する非ＡＲサンプル由来の単一の参照発現ベクターとを含んでなる参照標準素子；およびｃ）前記遺伝子発現結果と前記参照標準の相関を含んでなるＡＲを診断するための説明書一式を含んでなるキットを提供する。本明細書の実施形態のいずれにおいても、個人は、２３歳以上の成人であり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、個人は、小児または２３歳未満の若年成人であり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、６〜１６の他の遺伝子は、ＣＦＬＡＲ、ＤＵＳＰ１、ＩＦＮＧＲ１、ＩＴＧＡＸ、ＭＡＰＫ９、ＮＡＭＰＴ、ＮＫＴＲ、ＰＳＥＮ１、ＲＮＦ１３０、ＲＹＢＰ、ＥＰＯＲ、ＧＺＭＫ、ＲＡＲＡ、ＲＨＥＢ、ＲＸＲＡ、およびＳＬＣ２５Ａ３７を含んでなり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、遺伝子発現評価素子は、前記サンプルの遺伝子発現結果をマイクロアレイチップでアッセイすることを含んでなり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、遺伝子発現評価素子は、前記サンプルの遺伝子発現結果をビーズでアッセイすることを含んでなり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、遺伝子発現評価素子は、前記サンプルの遺伝子発現結果をナノ粒子でアッセイすることを含んでなり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、前記測定工程は、前記サンプルの遺伝子発現結果を、有孔質または非孔質であり得、かつ、サイズに幅があり得る固相表面でアッセイすることを含んでなり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、生体サンプルは、血液サンプルであり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、生体サンプルは、全血サンプルであり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、血液サンプルは、末梢血白血球であり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、血液サンプルは、末梢血単核細胞であり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較は、７０％を超える感度でＡＲを予測し得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較は、７０％を超える特異度でＡＲを予測し得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較は、７０％を超える陽性的中率（ｐｐｖ）でＡＲを予測し得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較は、７０％を超える陰性的中率（ｎｐｖ）でＡＲを予測し得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較は、コンピューターまたは個人により行うことができる。
【００１３】
別の態様において、本発明は、腎臓同種移植を受けた個人由来の生体サンプルにおいてＣＥＡＣＡＭ４、ならびにＣＦＬＡＲ、ＤＵＳＰ１、ＩＦＮＧＲ１、ＩＴＧＡＸ、ＭＡＰＫ９、ＮＡＭＰＴ、ＮＫＴＲ、ＰＳＥＮ１、ＲＮＦ１３０、ＲＹＢＰ、ＥＰＯＲ、ＧＺＭＫ、ＲＡＲＡ、ＲＨＥＢ、ＲＸＲＡ、およびＳＬＣ２５Ａ３７から選択される６〜１６の他の遺伝子のレベルを測定することにより得られる遺伝子発現結果と比較するための参照標準を含んでなり、単一の腎臓移植センターにおける各遺伝子に対するＡＲサンプル由来の単一の参照発現ベクターと、各遺伝子に対する非ＡＲサンプル由来の単一の参照発現ベクターとを含んでなり、前記遺伝子発現と前記参照標準の相関が、前記個人において急性拒絶（ＡＲ）の診断、非ＡＲの診断、またはＡＲを発症するリスクの診断に使用するためのものである、製品を提供する。本明細書の実施形態のいずれにおいても、個人は、２３歳以上の成人であり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、個人は、小児または２３歳未満の若年成人であり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、６〜１６の他の遺伝子は、ＣＦＬＡＲ、ＤＵＳＰ１、ＩＦＮＧＲ１、ＩＴＧＡＸ、ＭＡＰＫ９、ＮＡＭＰＴ、ＮＫＴＲ、ＰＳＥＮ１、ＲＮＦ１３０、ＲＹＢＰ、ＥＰＯＲ、ＧＺＭＫ、ＲＡＲＡ、ＲＨＥＢ、ＲＸＲＡ、およびＳＬＣ２５Ａ３７を含んでなり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、ＣＥＡＣＡＭ４および６〜１６の他の遺伝子のレベルを測定することは、前記サンプルの遺伝子発現結果をマイクロアレイチップでアッセイすることを含んでなり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、ＣＥＡＣＡＭ４および６〜１６の他の遺伝子のレベルを測定することは、前記サンプルの遺伝子発現結果をビーズでアッセイすることを含んでなり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、ＣＥＡＣＡＭ４および６〜１６の他の遺伝子のレベルを測定することは、前記サンプルの遺伝子発現結果をナノ粒子でアッセイすることを含んでなり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、前記測定工程は、前記サンプルの遺伝子発現結果を、有孔質または非孔質であり得、かつ、サイズに幅があり得る固相表面でアッセイすることを含んでなり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、生体サンプルは、血液サンプルである。本明細書の実施形態のいずれにおいても、生体サンプルは、全血サンプルである。本明細書の実施形態のいずれにおいても、血液サンプルは、末梢血白血球であり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、血液サンプルは、末梢血単核細胞であり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、前記遺伝子発現と前記参照標準の比較は、７０％を超える感度でのＡＲの予測を含んでなり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、前記遺伝子発現と前記参照標準の比較は、７０％を超える特異度でのＡＲの予測を含んでなり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、前記遺伝子発現と前記参照標準の比較は、７０％を超える陽性的中率（ｐｐｖ）でのＡＲの予測を含んでなり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、前記遺伝子発現と前記参照標準の比較は、７０％を超える陰性的中率（ｎｐｖ）でのＡＲの予測を含んでなり得る。
【００１４】
別の態様において、本発明は、腎臓移植患者のための処置の方法であって、ａ）前記個人からの生体サンプルにおいてＣＥＡＣＡＭ４、ならびにＣＦＬＡＲ、ＤＵＳＰ１、ＩＦＮＧＲ１、ＩＴＧＡＸ、ＭＡＰＫ９、ＮＡＭＰＴ、ＮＫＴＲ、ＰＳＥＮ１、ＲＮＦ１３０、ＲＹＢＰ、ＥＰＯＲ、ＧＺＭＫ、ＲＡＲＡ、ＲＨＥＢ、ＲＸＲＡ、およびＳＬＣ２５Ａ３７から選択される６〜１６の間の他の遺伝子のレベルを測定して遺伝子発現結果を得ること；ｂ）各遺伝子に対するＡＲサンプル由来の単一の参照発現ベクターと各遺伝子に対する非ＡＲサンプル由来の単一の参照発現ベクターとを含んでなる参照標準を使用し、前記遺伝子発現結果が前記参照標準と比較され、それにより、被験者を腎臓移植のＡＲを有するまたは腎臓移植のＡＲを有なさいとして同定すること；およびｃ）腎臓移植のＡＲを有する被験者では治療上有効な量の１種類以上の治療薬の投与を増やし、腎臓移植のＡＲを有さない被験者では治療上有効な量の１種類以上の治療薬の投与を維持し、または腎臓移植のＡＲを有さない被験者では治療上有効な量の１種類以上の治療薬の投与を減らすことを含んでなる試験を指示することを含んでなる方法を提供する。本明細書の実施形態のいずれにおいても、個人は、２３歳以上の成人であり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、個人は、小児または２３歳未満の若年成人であり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、６〜１６の他の遺伝子は、ＣＦＬＡＲ、ＤＵＳＰ１、ＩＦＮＧＲ１、ＩＴＧＡＸ、ＭＡＰＫ９、ＮＡＭＰＴ、ＮＫＴＲ、ＰＳＥＮ１、ＲＮＦ１３０、ＲＹＢＰ、ＥＰＯＲ、ＧＺＭＫ、ＲＡＲＡ、ＲＨＥＢ、ＲＸＲＡ、およびＳＬＣ２５Ａ３７を含んでなり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、前記測定工程は、前記サンプルの遺伝子発現結果をマイクロアレイチップでアッセイすることを含んでなり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、前記測定工程は、前記サンプルの遺伝子発現結果をビーズでアッセイすることを含んでなり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、前記測定工程は、前記サンプルの遺伝子発現結果をナノ粒子でアッセイすることを含んでなり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、前記測定工程は、前記サンプルの遺伝子発現結果を、有孔質または非孔質であり得、かつ、サイズに幅があり得る固相表面でアッセイすることを含んでなり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、生体サンプルは、血液サンプルであり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、血液サンプルは、末梢血白血球であり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、血液サンプルは、末梢血単核細胞であり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、生体サンプルは、全血サンプルであり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較は、７０％を超える感度でのＡＲの予測を含んでなり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較は、７０％を超える特異度でのＡＲの予測を含んでなり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、前記比較工程は、７０％を超える陽性的中率（ｐｐｖ）でのＡＲの予測を含んでなり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較は、７０％を超える陰性的中率（ｎｐｖ）でのＡＲの予測を含んでなり得る。
【００１５】
別の態様において、本発明は、腎臓同種移植を受けた個人において非急性拒絶（非ＡＲ）の診断における使用方法であって、ａ）前記個人由来の生体サンプルにおいてＣＥＡＣＡＭ４、ならびにＣＦＬＡＲ、ＤＵＳＰ１、ＩＦＮＧＲ１、ＩＴＧＡＸ、ＭＡＰＫ９、ＮＡＭＰＴ、ＮＫＴＲ、ＰＳＥＮ１、ＲＮＦ１３０、ＲＹＢＰ、ＥＰＯＲ、ＧＺＭＫ、ＲＡＲＡ、ＲＨＥＢ、ＲＸＲＡ、およびＳＬＣ２５Ａ３７から選択される６〜１６の他の遺伝子のレベルを測定して遺伝子発現結果を得ること；およびｂ）各遺伝子に対するＡＲサンプル由来の単一の参照発現ベクターと各遺伝子に対する非ＡＲサンプル由来の単一の参照発現ベクターとを含んでなる参照標準を使用し、前記遺伝子発現結果が前記参照標準と相関されることを含んでなる方法を提供する。本明細書の実施形態のいずれにおいても、個人は、２３歳以上の成人であり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、個人は、小児または２３歳未満の若年成人であり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、６〜１６の他の遺伝子は、ＣＦＬＡＲ、ＤＵＳＰ１、ＩＦＮＧＲ１、ＩＴＧＡＸ、ＭＡＰＫ９、ＮＡＭＰＴ、ＮＫＴＲ、ＰＳＥＮ１、ＲＮＦ１３０、ＲＹＢＰ、ＥＰＯＲ、ＧＺＭＫ、ＲＡＲＡ、ＲＨＥＢ、ＲＸＲＡ、およびＳＬＣ２５Ａ３７を含んでなり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、前記測定工程は、前記サンプルの遺伝子発現結果をマイクロアレイチップでアッセイすることを含んでなり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、前記測定工程は、前記サンプルの遺伝子発現結果をビーズでアッセイすることを含んでなり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、前記測定工程は、前記サンプルの遺伝子発現結果をナノ粒子でアッセイすることを含んでなり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、前記測定工程は、前記サンプルの遺伝子発現結果を、有孔質または非孔質であり得、かつ、サイズに幅があり得る固相表面でアッセイすることを含んでなり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、生体サンプルは、全血サンプルであり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、生体サンプルは、血液サンプルであり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、血液サンプルは、末梢血白血球であり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、血液サンプルは、末梢血単核細胞であり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較は、７０％を超える感度での非ＡＲの予測を含んでなり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較は、７０％を超える特異度での非ＡＲの予測を含んでなり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較は、７０％を超える陽性的中率（ｐｐｖ）での非ＡＲの予測を含んでなり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較は、７０％を超える陰性的中率（ｎｐｖ）での非ＡＲの予測を含んでなり得る。
【００１６】
別の態様において、本発明は、腎臓移植の非急性拒絶（非ＡＲ）の処置のための個人の同定において使用する方法であって、ａ）前記個人由来の生体サンプルにおいてＣＥＡＣＡＭ４、ならびにＣＦＬＡＲ、ＤＵＳＰ１、ＩＦＮＧＲ１、ＩＴＧＡＸ、ＭＡＰＫ９、ＮＡＭＰＴ、ＮＫＴＲ、ＰＳＥＮ１、ＲＮＦ１３０、ＲＹＢＰ、ＥＰＯＲ、ＧＺＭＫ、ＲＡＲＡ、ＲＨＥＢ、ＲＸＲＡ、およびＳＬＣ２５Ａ３７６から選択される〜１６の他の遺伝子のレベルを測定して遺伝子発現結果を得ること；およびｂ）単一の腎臓移植センターにおける各遺伝子に対するＡＲサンプル由来の単一の参照発現ベクターと、単一の腎臓移植センターにおける各遺伝子に対する非ＡＲサンプル由来の単一の参照発現ベクターとを含んでなる参照標準を使用し、前記遺伝子発現結果が同定のために前記参照標準と相関されることを含んでなる方法を提供する。本明細書の実施形態のいずれにおいても、個人は、２３歳以上の成人であり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、個人は、小児または２３歳未満の若年成人であり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、６〜１６の他の遺伝子は、ＣＦＬＡＲ、ＤＵＳＰ１、ＩＴＧＡＸ、ＮＡＭＰＴ、ＮＫＴＲ、ＰＳＥＮ１、ＥＰＯＲ、ＧＺＭＫ、ＲＡＲＡ、ＲＨＥＢ、およびＳＬＣ２５Ａ３７を含んでなり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、前記測定工程は、前記サンプルの遺伝子発現結果をマイクロアレイチップでアッセイすることを含んでなり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、前記測定工程は、前記サンプルの遺伝子発現結果をビーズでアッセイすることを含んでなり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、前記測定工程は、前記サンプルの遺伝子発現結果をナノ粒子でアッセイすることを含んでなり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、前記測定工程は、前記サンプルの遺伝子発現結果を、有孔質または非孔質であり得、かつ、サイズに幅があり得る固相表面でアッセイすることを含んでなり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、生体サンプルは、全血サンプルであり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、生体サンプルは、血液サンプルであり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、血液サンプルは、末梢血白血球であり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、血液サンプルは、末梢血単核細胞であり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較は、７０％を超える感度での非ＡＲの予測を含んでなり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較は、７０％を超える特異度での非ＡＲの予測を含んでなり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、前記比較工程は、７０％を超える陽性的中率（ｐｐｖ）での非ＡＲの予測を含んでなり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較は、７０％を超える陰性的中率（ｎｐｖ）での非ＡＲの予測を含んでなり得る。
【００１７】
別の態様において、本発明は、腎臓同種移植を受けた個人における非急性拒絶（非ＡＲ）の診断に使用するためのシステムであって、ａ）前記個人由来の生体サンプルにおいてＣＥＡＣＡＭ４、ならびにＣＦＬＡＲ、ＤＵＳＰ１、ＩＦＮＧＲ１、ＩＴＧＡＸ、ＭＡＰＫ９、ＮＡＭＰＴ、ＮＫＴＲ、ＰＳＥＮ１、ＲＮＦ１３０、ＲＹＢＰ、ＥＰＯＲ、ＧＺＭＫ、ＲＡＲＡ、ＲＨＥＢ、ＲＸＲＡ、およびＳＬＣ２５Ａ３７から選択される６〜１６の他の遺伝子のレベルを測定して遺伝子発現結果を得るための遺伝子発現評価素子；およびｂ）診断のために前記遺伝子発現結果と前記参照標準を相関させるための、単一の腎臓移植センターにおける各遺伝子に対するＡＲサンプル由来の単一の参照発現ベクターと、単一の腎臓移植センターにおける各遺伝子に対する非ＡＲサンプル由来の単一の参照発現ベクターとを含んでなる参照標準素子とを含んでなるシステムを提供する。本明細書の実施形態のいずれにおいても、遺伝子発現評価素子は、マイクロアレイチップを含んでなり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、遺伝子発現評価素子は、ビーズを含んでなり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、遺伝子発現評価素子は、ナノ粒子を含んでなり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、前記測定工程は、前記サンプルの遺伝子発現結果を、有孔質または非孔質であり得、かつ、サイズに幅があり得る固相表面でアッセイすることを含んでなり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、参照標準素子は、コンピューター生成され得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、前記参照標準に対する前記遺伝子発現結果は、コンピューターまたは個人により行われ得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、個人は、２３歳以上の成人であり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、個人は、小児または２３歳未満の若年成人であり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、６〜１６の他の遺伝子は、ＣＦＬＡＲ、ＤＵＳＰ１、ＩＦＮＧＲ１、ＩＴＧＡＸ、ＭＡＰＫ９、ＮＡＭＰＴ、ＮＫＴＲ、ＰＳＥＮ１、ＲＮＦ１３０、ＲＹＢＰ、ＥＰＯＲ、ＧＺＭＫ、ＲＡＲＡ、ＲＨＥＢ、ＲＸＲＡ、およびＳＬＣ２５Ａ３７を含んでなり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、生体サンプルは、全血サンプルであり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、生体サンプルは、血液サンプルであり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、血液サンプルは、末梢血白血球であり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、血液サンプルは、末梢血単核細胞であり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較は、７０％を超える感度で非ＡＲを予測し得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較は、７０％を超える特異度で非ＡＲを予測し得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較は、７０％を超える陽性的中率（ｐｐｖ）で非ＡＲを予測し得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較は、７０％を超える陰性的中率（ｎｐｖ）で非ＡＲを予測し得る。
【００１８】
別の態様において、本発明は、腎臓同種移植を受けた個人における非拒絶（非ＡＲ）の診断に使用するためのキットであって、ａ）前記個人由来の生体サンプルにおいてＣＥＡＣＡＭ４、ならびにＣＦＬＡＲ、ＤＵＳＰ１、ＩＦＮＧＲ１、ＩＴＧＡＸ、ＭＡＰＫ９、ＮＡＭＰＴ、ＮＫＴＲ、ＰＳＥＮ１、ＲＮＦ１３０、ＲＹＢＰ、ＥＰＯＲ、ＧＺＭＫ、ＲＡＲＡ、ＲＨＥＢ、ＲＸＲＡ、およびＳＬＣ２５Ａ３７から選択される６〜１６の他の遺伝子のレベルを測定して遺伝子発現結果を得るための遺伝子発現評価素子；ｂ）単一の腎臓移植センターにおける各遺伝子に対するＡＲサンプル由来の単一の参照発現ベクターと、単一の腎臓移植センターにおける各遺伝子に対する非ＡＲサンプル由来の単一の参照発現ベクターとを含んでなる参照標準素子；およびｃ）ＡＲを診断するための説明書一式を含んでなり、前記遺伝子発現結果と参照標準の相関を含んでなるキットを提供する。本明細書の実施形態のいずれにおいても、個人は、２３歳以上の成人であり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、個人は、小児または２３歳未満の若年成人であり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、６〜１６の他の遺伝子は、ＣＦＬＡＲ、ＤＵＳＰ１、ＩＦＮＧＲ１、ＩＴＧＡＸ、ＭＡＰＫ９、ＮＡＭＰＴ、ＮＫＴＲ、ＰＳＥＮ１、ＲＮＦ１３０、ＲＹＢＰ、ＥＰＯＲ、ＧＺＭＫ、ＲＡＲＡ、ＲＨＥＢ、ＲＸＲＡ、およびＳＬＣ２５Ａ３７を含んでなり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、遺伝子発現評価素子は、前記サンプルの遺伝子発現結果をマイクロアレイチップでアッセイすることを含んでなり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、遺伝子発現評価素子は、前記サンプルの遺伝子発現結果をビーズでアッセイすることを含んでなり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、遺伝子発現評価素子は、前記サンプルの遺伝子発現結果をナノ粒子でアッセイすることを含んでなり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、前記測定工程は、前記サンプルの遺伝子発現結果を、有孔質または非孔質であり得、かつ、サイズに幅があり得る固相表面でアッセイすることを含んでなり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、生体サンプルは、全血サンプルであり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、生体サンプルは、血液サンプルであり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、血液サンプルは、末梢血白血球であり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、血液サンプルは、末梢血単核細胞であり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較は、７０％を超える感度で非ＡＲを予測し得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較は、７０％を超える特異度で非ＡＲを予測し得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較は、７０％を超える陽性的中率（ｐｐｖ）で非ＡＲを予測し得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較は、７０％を超える陰性的中率（ｎｐｖ）で非ＡＲを予測し得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較は、コンピューターまたは個人により行うことができる。
【００１９】
別の態様において、本発明は、腎臓同種移植を受けた個人由来の生体サンプルにおいてＣＥＡＣＡＭ４、ならびにＣＦＬＡＲ、ＤＵＳＰ１、ＩＦＮＧＲ１、ＩＴＧＡＸ、ＭＡＰＫ９、ＮＡＭＰＴ、ＮＫＴＲ、ＰＳＥＮ１、ＲＮＦ１３０、ＲＹＢＰ、ＥＰＯＲ、ＧＺＭＫ、ＲＡＲＡ、ＲＨＥＢ、ＲＸＲＡ、およびＳＬＣ２５Ａ３７から選択される６〜１６の他の遺伝子のレベルを測定することにより得られる遺伝子発現結果と比較するための参照標準を含んでなり、単一の腎臓移植センターにおける各遺伝子に対するＡＲサンプル由来の単一の参照発現ベクターと、単一の腎臓移植センターにおける各遺伝子に対する非ＡＲサンプル由来の単一の参照発現ベクターとを含んでなり、前記遺伝子発現と前記参照標準の相関が、前記個人において非急性拒絶（非ＡＲ）の診断に使用するためのものである製品を提供する。本明細書の実施形態のいずれにおいても、個人は、２３歳以上の成人であり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、個人は、小児または２３歳未満の若年成人であり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、６〜１６の他の遺伝子は、ＣＦＬＡＲ、ＤＵＳＰ１、ＩＦＮＧＲ１、ＩＴＧＡＸ、ＭＡＰＫ９、ＮＡＭＰＴ、ＮＫＴＲ、ＰＳＥＮ１、ＲＮＦ１３０、ＲＹＢＰ、ＥＰＯＲ、ＧＺＭＫ、ＲＡＲＡ、ＲＨＥＢ、ＲＸＲＡ、およびＳＬＣ２５Ａ３７を含んでなり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、ＣＥＡＣＡＭ４および６〜１６の他の遺伝子のレベルを測定することは、前記サンプルの遺伝子発現結果をマイクロアレイチップでアッセイすることを含んでなり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、ＣＥＡＣＡＭ４および６〜１６の他の遺伝子のレベルを測定することは、前記サンプルの遺伝子発現結果をビーズでアッセイすることを含んでなり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、ＣＥＡＣＡＭ４および６〜１６の他の遺伝子のレベルを測定することは、前記サンプルの遺伝子発現結果をナノ粒子でアッセイすることを含んでなり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、前記測定工程は、前記サンプルの遺伝子発現結果を、有孔質または非孔質であり得、かつ、サイズに幅があり得る固相表面でアッセイすることを含んでなり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、生体サンプルは、全血サンプルである。本明細書の実施形態のいずれにおいても、生体サンプルは、血液サンプルである。本明細書の実施形態のいずれにおいても、血液サンプルは、末梢血白血球であり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、血液サンプルは、末梢血単核細胞であり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、前記遺伝子発現と前記参照標準の比較は、７０％を超える感度での非ＡＲの予測を含んでなり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、前記遺伝子発現と前記参照標準の比較は、７０％を超える特異度での非ＡＲの予測を含んでなり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、前記遺伝子発現と前記参照標準の比較は、７０％を超える陽性的中率（ｐｐｖ）での非ＡＲの予測を含んでなり得る。本明細書の実施形態のいずれにおいても、前記遺伝子発現と前記参照標準の比較は、７０％を超える陰性的中率（ｎｐｖ）での非ＡＲの予測を含んでなり得る。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、世界８か所の移植センターからの４３８名のユニークな成人／小児腎臓移植患者での腎臓移植における急性拒絶の評価(Assessment of Acute Rejection in Renal Transplantation)（ＡＡＲＴ）研究計画を記載する。
【図２Ａ】図２Ａは、ペナルティ付きロジスティック回帰による、１５の遺伝子を用いた４センターからの１９２名の患者における急性拒絶（ＡＲ）の予測を示すグラフである。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ペナルティ付きロジスティック回帰による、１５の遺伝子を用いた４センターからの１９２名の患者における急性拒絶（ＡＲ）の予測を示すグラフである。
【図３】図３Ａは、１５の遺伝子がペナルティ付きロジスティック回帰により細胞性拒絶および体液性拒絶を検出することを示すグラフである。図３Ｂは、ペナルティ付きロジスティック回帰による１５の遺伝子を用いたＡＲおよび非ＡＲの検出は移植後の時間と交絡がないことを示す。
【図４】図４Ａ〜Ｂは、生検がＡＲエピソードを証明する２年〜０か月前、または生検がＡＲエピソードを証明した０〜１６か月後に採取された１５６の小児および成人サンプルに関するＡＲの予測確率を示す。図４Ａは、成人サンプル集団における１５の遺伝子の発現が、ペナルティ付きロジスティック回帰によりＡＲに関して、生検最大３３か月前、生検１か月後までＡＲを指示することを示す。図４Ｂは、１０のうち５つの遺伝子の発現が、ロジスティック回帰により、ＡＲ生検の最大３か月前、生検後に成人サンプル集団においてＡＲを予測することを示す。
【図５】図５は、修正系統的プロファイラー（ｋＳＡＳ）のワークフローを示す。図５Ａは、サンプルがバッチ効果補正の必要なく、ＡＲ参照およびＳＴＡ参照との全体的類似性に基づいて分類できることを示す。図５Ｂは、ｋＳＡＳ（修正系統的プロファイラー）をｑＰＣＲデータからＡＲ相対リスクモデルまでのワークフローにどのように適合させるかを示す。
【図６】図６Ａ〜Ｂは、部分最小二乗判別分析(partial least square Discriminant analysis)（ｐｌｓＤＡ）による１７の遺伝子を用いた１４３の成人サンプルにおけるＡＲと非ＡＲの分類を示す。１７の遺伝子を用い、ｐｌｓＤＡにより、４か所からの１４３の成人血液サンプル（コホート１）においてＡＲを予測した。６Ａは、各採取場所におけるＡＲと非ＡＲの平均［％］予測確率が、その場所でもＡＲの方が有意に高いこと（ｐ＜０．０００１）、および非ＡＲサンプルではＡＲ予測の閾値（予測確率ＡＲ＝５０％）に達しなかったことを示す。６Ｂは、トレーニングセットにおけるＡＲの受信者動作特性(receiver operating characteristic)（ＲＯＣ）ＡＵＣは０．９４（９５％ＣＩ０．９１〜０．９８）であったことを示す。
【図７】図７Ａ〜Ｃは、１７の遺伝子を用いた１２４の成人および小児サンプルにおけるＡＲと非ＡＲの分類を示す。フリューダイムでの固定ｐｌｓＤＡ  １７遺伝子モデルを用いた、１２４の成人および小児ＡＲおよび非ＡＲ血液サンプル（コホート２）における独立バリデーション。２２／２３のＡＲは正確にＡＲと分類され、１００／１０１の非ＡＲが正確に非ＡＲと分類された。７Ａ：各サンプルで、表現型（ＡＲと非ＡＲ）および患者の年齢（成人；小児）により分離した［％］予測ＡＲ確率が示される。７Ｂ：全サンプルの平均予測ＡＲ確率は、非ＡＲに対してＡＲで有意に高かった（ｐ＜０．０００１）。７Ｃ：１７遺伝子ＡＲモデルに関するＲＯＣ分析は、ＡＲ予測に関して高い感度および特異度を示した（ＡＵＣ＝０．９５［９５％ＣＩ０．８８〜１．０］）。
【図８】図８は、１７の遺伝子を用いた１９１の成人および小児サンプルにおけるＡＲの予測を示す。１９１の一連の血液サンプル（コホート３）を、ＡＲを確認した生検前６か月以内（ＡＲ前）または生検後（ＡＲ後）にプロファイリングした。７４のＡＲサンプル、および１１７のＡＲ生検前および生検後サンプル、ならびに２１６の非ＡＲ／安定サンプルを含む各群において、ＡＲおよび非ＡＲの平均出現率を示す。柱内にアッセイによって計算されたＡＲの平均予測確率スコアを示す。１７遺伝子腎臓ＡＲ予測モデルは、ＡＲ前３か月以内に採取されたサンプルの６２．９％でＡＲを予測し、極めて高い平均ＡＲスコアであった（９６．４％±０．０８）。ＡＲスコアは、ＡＲ後３か月以内に採取されたサンプルの５１．６％で持続し、この場合にも極めて高い平均予測ＡＲスコアであり（９４．６％±０．１４）；非ＡＲサンプルの８３．８％は、常に非ＡＲと予測された（平均予測ＡＲ確率＝８．２％±０．１２）。平均ＡＲスコアは、ＡＲ前サンプル（０〜３か月）と非ＡＲ／安定サンプルの間で有意に異なっていた（ｐ＝３．７２Ｅ−４７）。
【図９】図９Ａ〜Ｃは、１７の遺伝子を用いたｋＳＡＳアルゴリズムの開発を示す。個々のサンプルのＡＲリスクスコアとＡＲリスクカテゴリーを提供するためのｋＳＡＳを開発した。図９Ａは、未知のサンプルにおける１７遺伝子腎臓ＡＲ予測アッセイモデルの発現値が、ピアソン相関により対応するＡＲ参照値および非ＡＲ参照値と相関が見出されたことを示し；図９Ｂは、１００サンプルからの１７遺伝子ＡＲアッセイ生成ＱＰＣＲデータがトレーニングセット（ｎ＝３２）と独立バリデーションセット（ｎ＝６８）に分類されたことを示し；１７遺伝子腎臓ＡＲ予測アッセイモデルからの１３の１２遺伝子モデルは、各サンプルに関する数的統合ＡＲリスクスコアを生成し、それらを高リスクＡＲ（統合ＡＲリスクスコア≧９）、低リスクＡＲ（統合ＡＲリスクスコア≦−９）および中間（統合ＡＲリスクスコア＜９、および＞−９）カテゴリー９Ｃの３群に類別した。
【図１０】図１０Ａ〜Ｃは、ｋＳＡＳを用いた１００サンプルにおける１７遺伝子ＡＲ予測アッセイの成績を示す。図１０Ａは、予測統合ＡＲリスクスコアが各サンプルに関して計算され、ＡＲ予測アッセイは、４か所の異なるサンプル採取場所、および成人／小児レシピエント年齢で、３６／３９のＡＲを高リスクＡＲとして（９２．３％；リスクスコア≧９）、４３／４６の非ＡＲを低リスクＡＲとして（９３．５％、リスクスコア≦−９）正確に分類し；残りの１１サンプルは中間に分類された（リスクスコア＜９、＞−９）ことを示す。図１０Ｂは、統合ＡＲ−リスクスコア［％］は非ＡＲに対してＡＲで有意に高かった（ｐ＜０．０００１）ことを示す。図１０Ｃは、ＲＯＣ分析がＡＲ予測アッセイの高い感度および特異度を示したことを示す；ＡＵＣ＝０．９３（９５％ＣＩ０．８６〜０．９）。
【図１１Ａ】図１１Ａ〜Ｄは、フリューダイムＱＰＣＲデータにおける交絡因子分析およびデータの正規化を示す。１４３のＡＲおよび非ＡＲ成人サンプル（コホート１）由来のＱＰＣＲデータの、４３の拒絶遺伝子に関する主成分分析（ＰＣＡ）は、表現型（図１１Ｂ）によるよりもむしろサンプル採取場所（図１１Ａ）によるサンプル分離を明らかにした。混合ＡＮＯＶＡによるＱＰＣＲデータの正規化は、遺伝子発現に対するサンプル採取場所の主要な影響を補正し（図１１Ｃ）、ＡＲおよび非ＡＲへのサンプルの分離をもたらした（図１１Ｄ）。ＰＣＡは、４３の遺伝子の相対的遺伝子発現値（ｄＣｔ  １８Ｓ）を用いて行った。混合ＡＮＯＶＡモデルは、ランダムカテゴリー因子としてのサンプル採取場所、ＲＮＡソースおよびチップと、カテゴリー因子としての表現型を用いて構築した。各球は一サンプルを表し；記号はサンプル採取場所を表し（＊＝ＵＰＭＣ；Δ＝ＵＣＬＡ；Ｘ＝ＣＰＭＣ；＃＝ＥＭＯＲＹ）；この図はまた、生検診断に基づく患者の表現型（ＡＲ；非ＡＲ）も表す。
【図１１Ｂ】図１１Ａ〜Ｄは、フリューダイムＱＰＣＲデータにおける交絡因子分析およびデータの正規化を示す。１４３のＡＲおよび非ＡＲ成人サンプル（コホート１）由来のＱＰＣＲデータの、４３の拒絶遺伝子に関する主成分分析（ＰＣＡ）は、表現型（図１１Ｂ）によるよりもむしろサンプル採取場所（図１１Ａ）によるサンプル分離を明らかにした。混合ＡＮＯＶＡによるＱＰＣＲデータの正規化は、遺伝子発現に対するサンプル採取場所の主要な影響を補正し（図１１Ｃ）、ＡＲおよび非ＡＲへのサンプルの分離をもたらした（図１１Ｄ）。ＰＣＡは、４３の遺伝子の相対的遺伝子発現値（ｄＣｔ  １８Ｓ）を用いて行った。混合ＡＮＯＶＡモデルは、ランダムカテゴリー因子としてのサンプル採取場所、ＲＮＡソースおよびチップと、カテゴリー因子としての表現型を用いて構築した。各球は一サンプルを表し；記号はサンプル採取場所を表し（＊＝ＵＰＭＣ；Δ＝ＵＣＬＡ；Ｘ＝ＣＰＭＣ；＃＝ＥＭＯＲＹ）；この図はまた、生検診断に基づく患者の表現型（ＡＲ；非ＡＲ）も表す。
【図１１Ｃ】図１１Ａ〜Ｄは、フリューダイムＱＰＣＲデータにおける交絡因子分析およびデータの正規化を示す。１４３のＡＲおよび非ＡＲ成人サンプル（コホート１）由来のＱＰＣＲデータの、４３の拒絶遺伝子に関する主成分分析（ＰＣＡ）は、表現型（図１１Ｂ）によるよりもむしろサンプル採取場所（図１１Ａ）によるサンプル分離を明らかにした。混合ＡＮＯＶＡによるＱＰＣＲデータの正規化は、遺伝子発現に対するサンプル採取場所の主要な影響を補正し（図１１Ｃ）、ＡＲおよび非ＡＲへのサンプルの分離をもたらした（図１１Ｄ）。ＰＣＡは、４３の遺伝子の相対的遺伝子発現値（ｄＣｔ  １８Ｓ）を用いて行った。混合ＡＮＯＶＡモデルは、ランダムカテゴリー因子としてのサンプル採取場所、ＲＮＡソースおよびチップと、カテゴリー因子としての表現型を用いて構築した。各球は一サンプルを表し；記号はサンプル採取場所を表し（＊＝ＵＰＭＣ；Δ＝ＵＣＬＡ；Ｘ＝ＣＰＭＣ；＃＝ＥＭＯＲＹ）；この図はまた、生検診断に基づく患者の表現型（ＡＲ；非ＡＲ）も表す。
【図１１Ｄ】図１１Ａ〜Ｄは、フリューダイムＱＰＣＲデータにおける交絡因子分析およびデータの正規化を示す。１４３のＡＲおよび非ＡＲ成人サンプル（コホート１）由来のＱＰＣＲデータの、４３の拒絶遺伝子に関する主成分分析（ＰＣＡ）は、表現型（図１１Ｂ）によるよりもむしろサンプル採取場所（図１１Ａ）によるサンプル分離を明らかにした。混合ＡＮＯＶＡによるＱＰＣＲデータの正規化は、遺伝子発現に対するサンプル採取場所の主要な影響を補正し（図１１Ｃ）、ＡＲおよび非ＡＲへのサンプルの分離をもたらした（図１１Ｄ）。ＰＣＡは、４３の遺伝子の相対的遺伝子発現値（ｄＣｔ  １８Ｓ）を用いて行った。混合ＡＮＯＶＡモデルは、ランダムカテゴリー因子としてのサンプル採取場所、ＲＮＡソースおよびチップと、カテゴリー因子としての表現型を用いて構築した。各球は一サンプルを表し；記号はサンプル採取場所を表し（＊＝ＵＰＭＣ；Δ＝ＵＣＬＡ；Ｘ＝ＣＰＭＣ；＃＝ＥＭＯＲＹ）；この図はまた、生検診断に基づく患者の表現型（ＡＲ；非ＡＲ）も表す。
【図１２】２６７の成人および小児サンプルにおけるＡＲおよび非ＡＲ特異的遺伝子の同定のための方法を示す。ＡＲ予測のための最終的な１７の腎臓ＡＲ遺伝子の発見は、合計４３の遺伝子、すなわち、本発明者らがこれまでに同定した１０の小児ＡＲ遺伝子；成人および小児移植拒絶における新規な発見に関する３３の候補遺伝子、について行ったマイクロ流体ハイスループットフリューダイムＱＰＣＲからの２６７の成人および小児血液サンプル（コホート１、コホート２）由来の遺伝子発現データにて行った。１４３のＡＲおよび非ＡＲサンプルの成人セットにおいて小児の１０遺伝子を確認すると、ＡＲが８７．４％で正確に予測された。２６７のＡＲおよび非ＡＲサンプル（コホート１、コホート２）の成人および小児のデータセットを合わせたもので、新規な発見およびバリデーションを行った。スチューデントのＴ検定、ＡＮＯＶＡおよびペナルティ付きロジスティック回帰の結果、１０の拒絶セットと合わせてＡＲ予測のための１７の遺伝子の最終選択を定義した７つのさらなる遺伝子が定義される。等しい事前確率の部分最小二乗判別分析によれば、１７の遺伝子は、１４３サンプルのトレーニングセット（コホート１；ＡＵＣ＝０．９４４）ならびに事前の分析には含まれなかった（ＡＵＣ＝０．９４８）１２４サンプルの独立バリデーションセット（コホート２）において、高い感度および特異度でＡＲを予測した。この分析に用いた遺伝子発現データは、サンプル採取場所、ＲＮＡソース、および混合ＡＮＯＶＡモデルを用いた実行に関してさらに正規化したフリューダイムＱＰＣＲプラットフォームから１８Ｓに対するｄＣｔ値を表した。
【図１３】図１３Ａ〜Ｄは、１７の遺伝子を用いた、各参加センターにおけるＡＲと非ＡＲの個々の分類を示す。ＲＯＣ分析は、異なるサンプル採取場所での腎臓ＡＲ予測アッセイの成績を評価するために、ＡＡＲＴ試験に含まれる各移植センターに関して行った。エモリー大学で採取されたＡＲと非ＡＲについて計算されたＡＵＣは０．８７６５（９５％ＣＩ０．７５３８〜０．９９９３）（図１３Ａ；ｎ＝４２）；ＵＰＭＣで採取されたＡＲと非ＡＲについては０．９８２５（９５％ＣＩ０．９６０８〜１．０）（１３Ｂ；ｎ＝８１）、ＵＣＬＡで採取されたＡＲと非ＡＲについては０．９３６０（９５％ＣＩ０．８６４８〜１．０）（１３Ｃ、ｎ＝４４）、およびＣＰＭＣで採取されたＡＲと非ＡＲについては１．０（９５％ＣＩ１．０〜１．０）であった（図１３Ｄ、ｎ＝３５）。最後のものは、ＡＲサンプルが２つだけというアンバランスなデータセットであり、腎臓ＡＲ予測アッセイ成績が過剰適合した可能性がある。各ＲＯＣ曲線の隣の表は、評価された各センターでのサンプルの分布を示す。
【図１４】図１４Ａ〜Ｂは、１７の遺伝子はｐｌｓＤＡにより抗体媒介性および細胞媒介性ＡＲを検出し、ＡＲと非ＡＲの分類は移植後の時間に依存しないことを示す。図１４Ａは、明確な抗体媒介性拒絶（ＡＭＲ、Ｃ４Ｄ陽性生検染色、ＤＳＡ＋）だけを有する１９名の患者のサブセットにおける固定された１７遺伝子腎臓ＡＲ予測アッセイモデルによるＡＲの予測確率が、明確な細胞媒介性拒絶（ＡＣＲ、Ｃ４ｄ−およびＤＳＡ−）を有する５１名の患者のサブセットと比較され；この固定された１７遺伝子モデルは、体液性ＡＲと細胞性ＡＲを等しく検出する（１４Ａ、ｐｌｓＤＡ、ｐ＝０．９９０６；平均ＡＣＲ＝８０．８４％±４．４；平均ＡＭＲ＝８０．７５％±６．６）ことを示す。図１４Ｂは、同様に、１７固定遺伝子ｐｌｓＤＡモデルは、非ＡＲ患者中のＡＲに関しては一貫して低い予測確率で、また、ＡＲ患者群中、一貫して高いＡＲ予測確率で、移植後の時間に依存せずにＡＲを予測したことを示す（図１４Ｂは、ｐｌｕｓ  ＳＥＭの平均予測確率を示す）。３つの移植後時間カテゴリー（０〜６か月、６か月〜１年、＞１年）のうち１つに入るサンプルに関して平均ＡＲ予測確率を計算し、スチューデントのＴ検定により比較し；ｐ値は有意性に達しなかった（ｐ＞０．０５）。
【図１５】図１５Ａ〜Ｃは、１７遺伝子の生物学的基礎を示す。経路解析およびネットワーク解析は、ＱＰＣＲによるＡＲサンプルおよび非ＡＲサンプルにおける遺伝子発現に見られる相関を裏付ける遺伝子の強い生物学的相関を示した。図１５Ａは、１７の遺伝子と有意に（ｐ＜０．０５）関連があったのがアポトーシスの調節、免疫表現型および細胞表面タンパク質であったことを示し；図１５Ｂは、インジェヌイティー・パスウェイ・アナリシス(Ingenuity Pathway Analyses)（ＩＰＡ、Ｑｉａｇｅｎ、レッドウッド・シティ、ＣＡ）が、１７のうち１１の遺伝子の、癌、細胞死および細胞生存における一般的役割をさらに実証した（ｐ＜０．０５）ことを示す。図１５Ｃは、さらなるネットワーク解析が１７のうち７つの遺伝子が調節相互作用の単一のネットワークを形成したことを示したことを示す。
【図１６】図１６は、複数の異なるタイプの臓器移植拒絶にわたる共通の拒絶モジュールに相当する、臓器移植拒絶において過剰発現されることが判明した１２の遺伝子を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明者らは、腎臓移植を受けた個人が移植臓器の急性拒絶（ＡＲ）を受けているかどうか、またはその後受けるかどうかを決定することができる遺伝子発現プロファイルを発見した。これらの遺伝子発現プロファイルは、レシピエントの年齢、移植センター、ＲＮＡソース、アッセイ、末期腎疾患の原因、併存症、免疫抑制使用などに依存しない。本明細書に記載の発明は、腎臓同種移植を受けた個人においてＡＲまたは非ＡＲを評価するための方法、ならびに腎臓移植におけるＡＲの処置のための個人を同定する方法を提供する。本発明はまた、これらのシステムの成分としてのマイクロアレイチップの使用を含む、腎臓同種移植においてＡＲを評価するためのシステムを記載する。本発明はさらに、腎臓同種移植を受けた個人においてＡＲおよびＡＲの確率を評価するための、これらのシステムに基づくキットを提供する。
【００２２】
定義
本明細書を説明する目的で、以下の定義が当てはまり、適切な場合、単数で用いられる用語はその複数も含み、逆もそうである。以下に示される定義が、引用することにより本明細書の一部とされる文書と矛盾する場合には、以下に示される定義が優位とすべきである。
【００２３】
「急性拒絶」「急性同種移植片拒絶」または「ＡＲ」は、移植組織が免疫学的に外来となる場合の、組織／臓器移植レシピエントの免疫系による拒絶である。ＡＲは、レシピエントの免疫細胞による移植組織への浸潤を特徴とし、免疫細胞はそれらのエフェクター機能を遂行し、移植組織を破壊する。ＡＲはまた、抗体媒介性拒絶（ＡＭＲ）と呼ばれる診断であるドナー特異的抗体の生成も特徴とし得る。ＡＲは、超急性、急性、境界急性、または準臨床ＡＲとしてさらに分類することができる。超急性拒絶の誘導は一般に急速で、人では一般に移植手術後数分から数時間内に起こる。ＡＲの誘導は人では一般に、移植手術後数ヶ月以内、多くの場合にはおよそ６〜１２か月で起こる。境界急性および準臨床ＡＲは、軽度炎症性アロ応答の結果である。一般に、ＡＲは、ラパマイシン、シクロスポリンＡ、抗ＣＤ４０Ｌモノクローナル抗体などの免疫抑制薬で処置、阻害、または抑制することができる。
【００２４】
「非急性拒絶」または「非ＡＲ」または「安定」または「ＳＴＡ」は、本明細書では互換的に使用される。非ＡＲ／ＳＴＡは、移植後ＡＲが低リスクまたはリスク無しの患者を表す。非ＡＲは、組織移植レシピエントにとって免疫学的に外来である移植組織の長期移植片生着を特徴とし得る。
【００２５】
用語「腎臓同種移植」は、ある個人から別の個人への腎臓移植を意味する。
【００２６】
本明細書で使用する場合、「遺伝子」は、エキソン配列および（場合により）イントロン配列を含むポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含んでなる核酸を意味する。用語「イントロンとは、タンパク質に翻訳されず、ＤＮＡ分子中のエキソン間に一般に見られる、所与の遺伝子中に存在するＤＮＡ配列を意味する。さらに、遺伝子は、場合によりその天然プロモーター（すなわち、非組換え細胞において遺伝子のエキソンおよびイントロンが作動可能なように連結されているプロモーター）、および関連の調節配列を含んでよく、かつ、ＡＵＧ開始部位の上流配列、非翻訳リーダー配列、シグナル配列、下流非翻訳配列、転写開始配列および終結配列、ポリアデニル化シグナル、翻訳開始および終結配列、リボソーム結合部位などを含んでも含まなくてもよい。
【００２７】
用語「参照」は、観測値が比較できる既知値または既知値のセットを意味する。一実施形態では、参照は、移植片生着表現型における遺伝子の遺伝子発現の値（またはレベル）を意味する。別の実施形態では、参照は、移植片欠損表現型における遺伝子の遺伝子発現の値（またはレベル）である。
【００２８】
本明細書で使用する場合、「参照発現ベクター」は、参照標準を意味する。一実施形態では、参照発現ベクターは、ＡＲサンプルに関して、所与の移植センターにおいて各発現遺伝子に対して作出された参照標準である。別の実施形態では、参照発現ベクターは、非ＡＲサンプルに関して、所与の移植センターにおいて各発現遺伝子に対して作出された参照標準である。別の実施形態では、参照発現ベクターは、ＡＲサンプルに関して、移植センター間の各発現遺伝子に対して作出された参照標準である。別の実施形態では、参照発現ベクターは、非ＡＲサンプルに関して、移植センター間の各発現遺伝子に対して作出された参照標準である。
【００２９】
「個人」または「被験者」は、「患者」であり得る。「患者」は、治療医の医療行為の下にある「個人」を意味する。患者は男性であっても女性であってもよい。一実施形態では、患者は、腎臓移植を受けている。別の実施形態では、患者は腎臓移植を受け、臓器拒絶を受けている。さらに別の実施形態では、患者は腎臓移植を受け、ＡＲを受けている。
【００３０】
「患者部分集団」およびその文法的変形形態は、本明細書で使用する場合、ある患者のサブセットを他から、それが属するより広い疾病カテゴリーにおいて識別する１以上の明瞭な測定可能なおよび／または識別可能な特徴を有することを特徴とする患者のサブセットを意味する。
【００３１】
用語「サンプル」は、本明細書で使用する場合、ゲノム情報を含む、個人から得られるまたは個人に由来する組成物を意味する。一実施形態では、サンプルは全血である。一実施形態では、サンプルは血液である。別の実施形態では、サンプルは末梢血白血球である。別の実施形態では、サンプルは末梢血単核細胞である。別の実施形態では、サンプルは組織生検である。別の実施形態では、サンプルは、移植臓器由来の組織生検である。別の実施形態では、サンプルは、レシピエントにおける移植前の臓器由来の組織生検である。
【００３２】
本明細書で使用する場合、「マイクロアレイ」は、集中的場所におけるヌクレオチド配列のコレクションの配置を意味する。アレイは、ガラス、プラスチック、またはケイ素から構成される表面などの固相基板であり得る。これらのヌクレオチド配列は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその任意の順列であり得る。ヌクレオチド配列はまた、遺伝子由来の部分配列、プライマー、全遺伝子配列、非コード配列、コード配列、公開配列、既知配列、または新規配列であり得る。
【００３３】
「予測する」および「予測」とは、本明細書で使用する場合、その結果が１００％の確実性で起こることを意味するものではなく、その結果が起こらないことより起こる可能性が高いことを意味するものとする。「予測する」または「予測を行う」ために採られる行為は、結果が起こらないことより起こる可能性が高い確率の決定を含み得る。このような決定または予測を行うためには、本明細書に記載の複数の因子の評価を使用することができる。
【００３４】
「比較する」または「比較」とは、第１の分析の結果を第２および／または第３の分析の結果と何らかの方法で相関させることを意味する。例えば、１の分析の結果を用い、その結果が第３の結果よりも第２の結果に類似性が高いと分類してもよい。ある個人由来の生体サンプルのＡＲ評価の実施形態に関して、それらの結果を用いて、その個人がＡＲ応答を受けているかどうか決定してもよい。ある個人由来の生体サンプルの非ＡＲ評価の実施形態に関して、それらの結果を用いて、その個人が非ＡＲ応答を受けているかどうか決定してもよい。
【００３５】
用語「評価」および「決定」は、任意の測定形態を意味して互換的に使用され、定量的および定性的両方の測定を含む。例えば、「評価」は相対であっても絶対的であってもよい。
【００３６】
用語「診断」は、本明細書では、分子状態または病的状態、疾患の同定または分類を意味して使用される。例えば、「診断」は、臓器拒絶の同定を意味する場合がある。「診断」はまた、ＡＲなどの臓器拒絶の特定のサブタイプの分類を意味する場合もある。
【００３７】
本明細書で使用する場合、「処置」は、処置される個人の自然経過を変化させる試みでの臨床的介入を意味する。処置の望ましい効果には、疾患またはその病態もしくは症状の発生または再発の予防、疾患の病態または症状の緩和、疾患の任意の直接的または間接的な病理学的帰結の軽減、疾患進行速度の減速、病的状態の改善または消散、および予後改善の達成が含まれる。特定の実施形態では、処置は、個人におけるＡＲの疾患進行速度の減速、病的状態の改善または消散、および予後改善の達成を意味する。いくつかの実施形態では、処置は、１以上の治療薬の治療計画の投与を修正または変更する臨床的介入を意味する。
【００３８】
「約」という場合、本明細書の値またはパラメーターは、その値またはパラメーターそれ自体に対する具体例を含む（および記載する）。例えば、「約Ｘ」という記載は、「Ｘ」の記載を含む。用語「約」は、所与の値が所望の結果に影響を及ぼさずに終点より「少し上」または「少し下」であってもよいことを示すことにより、数値範囲終点に柔軟性を持たせるために使用される。濃度、量、および他の数値データは、本明細書では範囲形式で表現または提示される場合がある。このような範囲形式は単に便宜上および簡潔さのために使用されるものであり、範囲の限界として明示された数値を含むだけでなく、各数値および部分範囲が明示されているかのうように個々の数値またはその範囲内に包含される部分範囲の全ても含むと柔軟に解釈されるべきであると理解されるべきである。
【００３９】
本明細書に記載の本発明の態様および実施形態は、態様および実施形態「を含んでなる」、「からなる」および「から本質的になる」を含むと理解される。本明細書に記載の全ての組成物および本明細書に記載の組成物を用いた全ての方法に関して、これらの組成物は、挙げられている成分もしくは工程を含んでなり得るか、または挙げられている成分もしくは工程「から本質的になり得る」かのいずれかである。組成物が挙げられている成分「から本質的になる」と記載されている場合、本組成物は挙げられている成分を含み、処置される病態に実質的に影響を及ぼさない他の成分を含み得るが、明示的に挙げられている成分以外に、治療される病態に実質的に影響しない他のいずれの成分も含まず；または本組成物治療される病態に実質的に影響を及ぼす、挙げられているもの以外の付加的成分を含む場合には、本組成物は処置される病態に実質的に影響を及ぼすに十分な濃度もしくは量の付加的成分を含まない。方法が挙げられている工程「から本質的になる」と記載されている場合、その方法は挙げられている工程を含み、かつ、処置される病態に実質的に影響を及ぼさない他の工程を含んでよいが、その方法は明示的に挙げられている工程以外に、処置される病態に実質的に影響を及ぼす他のいずれの工程も含まない。限定されない具体例として、組成物がある成分「から本質的になる」と記載されている場合、その組成物は、任意の量の薬学上許容可能な担体、ビヒクル、または希釈剤、および処置される病態に実質的に影響を及ぼさない他のこのような成分をさらに含んでよい。
【００４０】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用する場合、単数形「a」、「an」および「the」は、そうではないことが明示されない限り、複数の指示対象を含む。
【００４１】
一般技術
そうではないことが定義されない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の熟練者により共通に理解されているものと同じ意味を有する。
【００４２】
本発明の実施は、特に断りのない限り、タンパク質生物学、タンパク質化学、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、および免疫学の従来技術を用い、これらは当業者の技術の範囲内である。このような技術は、“Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 第２版 (Sambrook et al., 1989); “Current Protocols in Molecular Biology” (Ausubel et al.編, 1987, 定期更新); “PCR: The Polymerase Chain Reaction”, (Mullis et al.編, 1994);およびSingleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 第２版, J. Wiley & Sons (New York, N.Y. 1994)などの文献に十分に説明されている。
【００４３】
腎臓同種移植レシピエント
腎臓同種移植レシピエントは、いずれの年齢であってもよい。いくつかの実施形態では、個人は小児である。一実施形態では、小児は乳児である。別の実施形態では、小児は幼児である。他の実施形態では、個人は２３歳未満の若年成人である。いくつかの実施形態では、個人はおよそ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、または２２歳である。さらなる実施形態では、個人は２３歳を超える成人である。いくつかの実施形態では、個人は、およそ２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、６７、６８、６９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００歳である。一実施形態では、腎臓同種移植レシピエントは女性である。別の実施形態では、腎臓同種移植レシピエントは男性である。
【００４４】
腎臓移植手術／手術は、特殊設計の治療施設または移植センターで行うことができる。移植センターは世界のどこに位置していてもよい。一実施形態では、移植センターはアメリカ合衆国にある。いくつかの実施形態では、移植センターはエモリー大学（アトランタ、ジョージア州）、カルフォルニア大学ロサンゼルス校（ロサンゼルス、ＣＡ）、ピッツバーグ大学（ピッツバーグ、ＰＡ）、カリフォルニア・パシフィック・メディカルセンター（サンフランシスコ、ＣＡ）、またはカルフォルニア大学サンフランシスコ校（サンフランシスコ、ＣＡ）である。他の実施形態では、移植センターはヨーロッパにある。一実施形態では、移植センターは、大学病院（バルセロナ、スペイン）である。さらなる実施形態では、移植センターはメキシコにある。一実施形態では、移植センターは、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｏ  ｄｅ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｃｉｏｎ  ｅｎ  Ｎｅｆｒｏｌｏｇｉａ、Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｉｎｆａｎｔｉｌ  ｄｅ  Ｍｅｘｉｃｏ（メキシコシティ、メキシコ）である。
【００４５】
腎臓同種移植レシピエントからの生体サンプルの採取
生体サンプルは、腎臓同種移植を受けた個人から採取する。いくつかの実施形態では、腎臓同種移植レシピエントは、ＡＲの外面的症状はない。他の実施形態では、腎臓同種移植レシピエントは、ＡＲの症状を示す。限定されるものではないが、全血、血液、血清、血漿、尿、粘液、唾液、脳脊髄液、組織、生検およびそれらの組合せを含むいずれのタイプの生体サンプルを採取してもよい。一実施形態では、生体サンプルは全血である。一実施形態では、生体サンプルは血液である。いくつかの実施形態では、血液サンプルは末梢血である。別の実施形態では、生体サンプルは末梢血単核細胞である。いくつかの実施形態では、生体サンプルは末梢血リンパ球である。いくつかの実施形態では、生体サンプルは組織生検である。
【００４６】
腎臓同種移植レシピエント由来の生体サンプルの採取は、臓器移植後のいずれの時点で行ってもよい。いくつかの実施形態では、生体サンプルは、ＰＡＸｇｅｎｅ（商標）チューブ（Ｑｉａｇｅｎから入手可能）中に採取することができる。他の実施形態では、生体サンプルは、ＲＮＡ分解を防ぐためにＲＮアーゼ阻害剤の入ったコレクションチューブ中に採取することができる。いくつかの実施形態では、生体サンプルは、慣例のプロトコール監視検査(protocol surveillance examination)の際に採取する。他の実施形態では、生体サンプルは、治療臨床医にその個人がＡＲ応答を受けていると疑う理由が合った場合に採取される。
【００４７】
腎臓同種移植レシピエントから採取される生体サンプルは、ＡＲサンプルは非ＡＲサンプルの参照を作成する場合、同じ患者由来の同時的腎臓同種移植生検と対となるようにすればよい。一般に、腎臓同種移植生検は、生体サンプル採取の４８時間以内にレシピエントから採取する。いくつかの実施形態では、生検は、移植時に採取する。他の実施形態では、生検は、移植後２４か月以内に採取する。一実施形態では、生検は、移植後約３か月；移植後約６か月；移植後約１２か月；移植後約１８か月；または移植後約２４か月で採取してよい。生検および／または生体サンプルは移植後のいずれの時点で採取してもよいので、これらの時点は限定として見なされるべきでない。むしろこれらの時点は、慣例の監視が大多数の腎臓同種移植レシピエントにおいて行われる可能性の最も高い移植後の期間を示すために提供される。さらに、これらの時点は、ＡＲ応答が生じる可能性の最も高い移植後の期間を示す。
【００４８】
採取された各腎臓同種移植生検は、Ｂａｎｆｆ分類システム(Solez, K. et al. Am. J. Transplant., 2008, 8, 753-760; Mengel, M. et al. Am. J. Transplant. 2012, 12, 563-570)に従ってスコア化してもよい。このシステムは、観察された腎臓生検サンプルの病状を正常病歴、超急性拒絶、境界性変化、急性拒絶、慢性同種移植腎症、およびその他の変化として分類する。このＢａｎｆｆ分類は腎臓移植病状の標準を設定し、新規の抗拒絶薬の国際的臨床試験において広く使用されている。本明細書に記載されるように、「急性拒絶」（ＡＲ）は、Ｂａｎｆｆ尿細管炎スコア（ｔ）が１以下かつ間質性浸潤物スコアが０以下の生検サンプルに関して定義され；「安定」（「ＳＴＡ」）／「非ＡＲ」は、ＡＲの不在（非ＡＲ）または他の任意の実質的病状の不在を示す生検サンプルに関して定義され；また「その他」は、Ｂａｎｆｆグレード分類のＡＲの不在を示すが、慢性同種移植損傷、慢性カルシニュリン阻害剤毒性、ＢＫウイルス感染、または他の移植片損傷のＢａｎｆｆ判定基準のいずれかを満たすサンプルに関して定義される。
【００４９】
生体サンプルにおける遺伝子発現の評価
腎臓同種移植レシピエントから採取された生体サンプルは、ＡＲ応答を受けている個人で差次的に発現される遺伝子のレベルを評価するために使用することができる。遺伝子発現を測定する種々の技術は当業者に公知である。１つの非限定的方法は、採取した生体サンプルからＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成することである。ｃＤＮＡは、標的遺伝子（すなわち、ＡＲ応答を受けている個人において差次的に発現される遺伝子）に特異的なプライマーまた標識プライマーを用いて増幅し、次に、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）を用いて分析することができる。ＢｉｏＭａｒｋ（フリューダイム、サザンサンフランシスコ、ＣＡ）またはＡＢＩ  ｖｉｉａ７（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、フォスターシティ、ＣＡ）などのｑＰＣＲプラットフォームが使用可能である。
【００５０】
いくつかの実施形態では、遺伝子特異的プライマーまたはｄＮＴＰ、好ましくはｄＮＴＰのいずれか一方を、合成されるｃＤＮＡが標識されるように標識する。標識とは、それらの存在が、シグナル生成系のメンバーを含んでなり、従って、直接的に、またはシグナル生成系の１以上の付加的メンバーとの組合せ作用を介して検出可能である。直接検出可能な標識の例としては、ヌクレオチドモノマー単位、例えば、ｄＮＴＰまたはプライマーのモノマー単位に組み込まれた、通常には共有結合された同位元素部分および蛍光部分が含まれる。対象とする同位元素部分または標識としては、３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉなどが含まれる。対象とする蛍光部分または標識としては、クマリンおよびその誘導体、例えば、７−アミノ−４−メチルクマリン、アミノクマリン、ボディパイＦＬなどのボディパイ色素、カスケードブルー、フルオレセインおよびその誘導体、例えば、フルオレセインイソチオシアネート、オレゴングリーン、ローダミン色素、例えば、テキサスレッド、テトラメチルローダミン、エオジンおよびエリスロシン、シアニン色素、例えば、Ｃｙ３およびＣｙ５、大ランタニドイオンの環状キレート、例えば、クァンタム(quantum）色素（商標）、蛍光エネルギー移動色素、例えば、チアゾールオレンジ−エチジウムヘテロ二量体、ＴＯＴＡＢなどが含まれる。標識はまた、同じ系の１以上の付加的メンバーと協調して作用して検出可能なシグナルをもたらすシグナル生成系のメンバーであってもよい。このような標識の例は、リガンド、例えば、ビオチン、フルオレセイン、ジゴキシゲニン、抗原、多価陽イオン、キレーター基などのような特異的結合対のメンバーであり、これらのメンバーはシグナル生成系の付加的メンバーと特異的に結合し、その付加的メンバーは直接的または間接的のいずれかで検出可能なシグナル、例えば、蛍光部分または基質を発色生成物に変換することができる酵素部分とコンジュゲートさせた抗体、例えば、アルカリ性ホスファターゼコンジュゲート抗体などを提供する。また、標識核酸は標識プライマーの存在下でＰＣＲを行うことによっても作製することができる。米国特許第５，９９４，０７６号は、単に修飾プライマーおよびそのｄＮＴＰのその教示のために引用することにより本明細書の一部とされる。
【００５１】
ＡＲ応答を受けている腎臓同種移植レシピエントにおいて差次的に発現される遺伝子の例を表１に示す。一実施形態では、差次的発現遺伝子は、ｐ値が０．０５以下、または偽陽性率が５％以下により示され、かつ、有意であると見なすことができ、予測モデルの構築に使用することができる。別の実施形態では、絶対的変化倍率が１．５以上かつｐ値が０．０５以下であるか、または偽陽性率が５％以下である遺伝子が有意であると見なされ、予測モデルの構築に使用することができる。種々のタイプのソフトウエアが統計分析に使用可能である。このようなソフトウエアの一例は、Ｐａｒｔｅｋ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｓｕｉｔｅである。これらの遺伝子を統計分析にかけてＡＲの検出および／または予測のためのロバストなモデルを選択することができる。ペナルティ付きロジスティック回帰、サポートベクターマシーン、および等しい事前確率の部分最小二乗判別分析などの種々の分類モデルが使用可能である。実施例にさらに詳細に示すように、主成分分析を用いて生のｑＰＣＲデータを可視化することができ、ＡＮＯＶＡおよびスチューデントのＴ検定で有意に差次的に発現される遺伝子を検出することができ、また、Ｓｈｒｉｎｋｉｎｇ  Ｃｅｎｔｒｏｉｄｓを適用してＡＲサンプルと非ＡＲサンプル間を識別する遺伝子を特定することができる。
【００５２】
表１に挙げられている遺伝子から、患者の年齢、移植センター、ＲＮＡソース、アッセイ、末期腎疾患の原因、併存症、および／または免疫抑制使用とは無関係に患者をＡＲまたは非ＡＲとして分類することができる１７の遺伝子のサブセットが同定された。この１７遺伝子のセットは、小児患者においてＡＲの指標となることが従前に示されていた１０遺伝子の組合せ（ＣＦＬＡＲ、ＤＵＳＰ１、ＩＴＧＡＸ、ＲＮＦ１３０、ＰＳＥＮ１、ＮＫＴＲ、ＲＹＢＰ、ＮＡＭＰＴ、ＭＡＰＫ９、およびＩＦＮＧＲ１）、新たに定義された成人患者においてＡＲの指標となる６つの遺伝子（ＣＥＡＣＡＭ４、ＲＨＥＢ、ＧＺＭＫ、ＲＡＲＡ、ＳＬＣ２５Ａ３７、およびＥＰＯＲ）、およびレチノイドＸ受容体α（ＲＸＲＡ）から構成される。これらの遺伝子の配列は付表ＡおよびＢに示されている。本明細書に開示される遺伝子は、腎臓同種移植を受けた個人においてＡＲを診断する種々方法のため、処置のための患者を選択するため、ならびに本明細書に記載の他の使用のために使用することができる。
【００５３】
【表１】
2020039344.tif 000003
2020039344.tif 000004
2020039344.tif 000005
【００５４】
遺伝子発現を測定する別の非限定的方法はノーザンブロット法である。タンパク質をコードする遺伝子の遺伝子発現レベルはまた、ウエスタンブロット法などのタンパク質定量法を用いて決定することもできる。差次的発現遺伝子のレベルを測定するためのプロテオミクスアッセイの使用も本明細書に包含される。当業者は、遺伝子発現のレベルを測定するために標準的なプロテオミクスアッセイをどのように使用するかを知っている。
【００５５】
参照発現ベクター
本発明は、年齢、移植センター、ＲＮＡソース、アッセイ、末期腎疾患の原因、併存症、および／または免疫抑制使用に依存しない参照発現ベクターの作出を提供する。これらの参照発現ベクターの使用は、Ｐａｒｔｅｋなどの市販のソフトウエアパッケージまたはＲなどのオープンソースソフトウエアによって一般に必要とされるバッチ効果の除を必要としない。
【００５６】
データに対する有意な変量効果は移植センターの違いにより推定される。これらの変量効果は、種々の移植センターでの生体サンプル採取プロトコールおよび免疫抑制計画の違いから生じる。よって、個々の移植センター特異的ＡＲ予測モデルは、全移植センターの単一ＡＲ予測モデルよりも正確である。
【００５７】
実施例および付表に例示されるように、所与の移植センターに関して、ＡＲ予測モデルは、各遺伝子に対する、その移植センターで採取されたＡＲサンプルの第１の参照発現ベクター、および各遺伝子に対する、同じ移植センターで採取された非ＡＲサンプルの第２の参照発現ベクターを作出することによって開発することができる。参照発現ベクターを作出するために使用されるサンプルは、同種移植生検を用いて分類してもよい。次に、同じ移植センターで腎臓同種移植レシピエントから採取された生体サンプル（すなわち、「未知の」サンプル）から得られた差次的発現遺伝子の発現レベルをＡＲサンプルおよび非ＡＲサンプルの２つの参照発現ベクターと比較することができる。ＬｉｎｅａｇｅＰｒｏｆｉｌｅｒの修正バージョンであるｋＳＡＳなどのコンピュータープログラムを用い、ＡＲのリスクまたは非ＡＲのリスクを示す各評価遺伝子にカテゴリー的値またはスコアおよび／または数的値またはスコア（付表Ｃに示されるソースコード）を割り付けることができる。複数の遺伝子セットモデルが使用可能である。複数の遺伝子セットモデルを使用する利点は、明瞭に異なる値またはスコアを各遺伝子セットに割り付けられ、従って、単一の遺伝子モデルに基づくバイアスのリスクを最小限にすることである。
【００５８】
一実施形態では、ＡＲの診断のために２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、または１７の参照発現ベクターが存在する。関連の実施形態では、非ＡＲの診断のために２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、または１７の参照発現ベクターが存在する。１つの特定の実施形態では、ＡＲの診断のための１７の参照発現ベクターと非ＡＲの診断のための１７の参照発現ベクターが存在する。別の特定の実施形態では、ＡＲの診断のための１６の参照発現ベクターと非ＡＲの診断のための１６の参照発現ベクターが存在する。別の特定の実施形態では、ＡＲの診断のための１５の参照発現ベクターと非ＡＲの診断のための１５の参照発現ベクターが存在する。別の特定の実施形態では、ＡＲの診断のための１２の参照発現ベクターと非ＡＲの診断のための１２の参照発現ベクターが存在する。
【００５９】
一実施形態では、参照発現ベクターを作出るために、生体サンプルを採取し、未知のサンプルの分析の前に１２遺伝子モデルセットを用いてプロファイリングを行う。１２遺伝子モデルの例を表２に示す。別の実施形態では、生体サンプルを採取し、未知のサンプルの分析の前にＢＡＳＰ１、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ９、ＩＮＰＰ５Ｄ、ＩＳＧ２０、ＬＣＫ、ＮＫＧ７、ＰＳＭＢ９、ＲＵＮＸ３、およびＴＡＰ１を含んでなる１２遺伝子モデルセットを用いてプロファイリングを行う。一実施形態では、１２遺伝子セットは、ＣＦＬＡＲ、ＰＳＥＮ１、ＣＥＡＣＡＭ４、ＮＡＭＰＴ、ＲＨＥＢ、ＧＺＭＫ、ＮＫＴＲ、ＤＵＳＰ１、ＲＡＲＡ、ＩＴＧＡＸ、ＳＬＣ２５Ａ３７、およびＥＰＯＲから構成される。一実施形態では、１２遺伝子セットは、ＣＦＬＡＲ、ＰＳＥＮ１、ＣＥＡＣＡＭ４、ＮＡＭＰＴ、ＲＨＥＢ、ＧＺＭＫ、ＮＫＴＲ、ＤＵＳＰ１、ＩＴＧＡＸ、ＳＬＣ２５Ａ３７、ＲＸＲＡ、およびＥＰＯＲから構成される。一実施形態では、１２遺伝子セットは、ＣＦＬＡＲ、ＰＳＥＮ１、ＣＥＡＣＡＭ４、ＲＨＥＢ、ＧＺＭＫ、ＮＫＴＲ、ＤＵＳＰ１、ＲＡＲＡ、ＩＴＧＡＸ、ＳＬＣ２５Ａ３７、ＲＸＲＡ、およびＥＰＯＲから構成される。一実施形態では、１２遺伝子セットは、ＣＦＬＡＲ、ＰＳＥＮ１、ＣＥＡＣＡＭ４、ＮＡＭＰＴ、ＧＺＭＫ、ＮＫＴＲ、ＤＵＳＰ１、ＩＴＧＡＸ、ＳＬＣ２５Ａ３７、ＲＹＢＰ、ＲＸＲＡ、およびＥＰＯＲから構成される。一実施形態では、１２遺伝子セットは、ＣＦＬＡＲ、ＭＡＰＫ９、ＰＳＥＮ１、ＣＥＡＣＡＭ４、ＧＺＭＫ、ＮＫＴＲ、ＤＵＳＰ１、ＲＡＲＡ、ＳＬＣ２５Ａ３７、ＲＹＢＰ、ＲＸＲＡ、およびＥＰＯＲから構成される。一実施形態では、１２遺伝子セットは、ＣＦＬＡＲ、ＰＳＥＮ１、ＣＥＡＣＡＭ４、ＧＺＭＫ、ＮＫＴＲ、ＤＵＳＰ１、ＲＡＲＡ、ＩＴＧＡＸ、ＳＬＣ２５Ａ３７、ＲＹＢＰ、ＲＸＲＡ、およびＥＰＯＲから構成される。一実施形態では、１２遺伝子セットは、ＣＦＬＡＲ、ＭＡＰＫ９、ＰＳＥＮ１、ＣＥＡＣＡＭ４、ＮＡＭＰＴ、ＧＺＭＫ、ＮＫＴＲ、ＤＵＳＰ１、ＩＴＧＡＸ、ＳＬＣ２５Ａ３７、ＲＸＲＡ、およびＥＰＯＲから構成される。一実施形態では、１２遺伝子セットは、ＣＦＬＡＲ、ＰＳＥＮ１、ＣＥＡＣＡＭ４、ＮＡＭＰＴ、ＧＺＭＫ、ＮＫＴＲ、ＤＵＳＰ１、ＲＡＲＡ、ＩＴＧＡＸ、ＳＬＣ２５Ａ３７、ＲＹＢＰ、およびＥＰＯＲから構成される。一実施形態では、１２遺伝子セットは、ＣＦＬＡＲ、ＰＳＥＮ１、ＣＥＡＣＡＭ４、ＮＡＭＰＴ、ＧＺＭＫ、ＮＫＴＲ、ＤＵＳＰ１、ＲＡＲＡ、ＩＴＧＡＸ、ＳＬＣ２５Ａ３７、ＲＸＲＡ、およびＥＰＯＲから構成される。一実施形態では、１２遺伝子セットは、ＣＦＬＡＲ、ＭＡＰＫ９、ＰＳＥＮ１、ＣＥＡＣＡＭ４、ＧＺＭＫ、ＮＫＴＲ、ＤＵＳＰ１、ＲＡＲＡ、ＩＴＧＡＸ、ＳＬＣ２５Ａ３７、ＲＸＲＡ、およびＥＰＯＲから構成される。一実施形態では、１２遺伝子セットは、ＣＦＬＡＲ、ＭＡＰＫ９、ＰＳＥＮ１、ＣＥＡＣＡＭ４、ＧＺＭＫ、ＮＫＴＲ、ＤＵＳＰ１、ＲＡＲＡ、ＩＴＧＡＸ、ＳＬＣ２５Ａ３７、ＲＹＢＰ、およびＥＰＯＲから構成される。一実施形態では、１２遺伝子セットは、ＣＦＬＡＲ、ＭＡＰＫ９、ＰＳＥＮ１、ＣＥＡＣＡＭ４、ＮＡＭＰＴ、ＧＺＭＫ、ＮＫＴＲ、ＩＴＧＡＸ、ＳＬＣ２５Ａ３７、ＲＹＢＰ、ＲＸＲＡ、およびＥＰＯＲから構成される。一実施形態では、１２遺伝子セットは、ＣＦＬＡＲ、ＭＡＰＫ９、ＰＳＥＮ１、ＣＥＡＣＡＭ４、ＮＡＭＰＴ、ＧＺＭＫ、ＮＫＴＲ、ＤＵＳＰ１、ＲＡＲＡ、ＩＴＧＡＸ、ＳＬＣ２５Ａ３７、およびＥＰＯＲから構成される。一実施形態では、１２遺伝子セットは、ＢＡＳＰ１、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ９、ＩＮＰＰ５Ｄ、ＩＳＧ２０、ＬＣＫ、ＮＫＧ７、ＰＳＭＢ９、ＲＵＮＸ３、およびＴＡＰ１から構成される。
【００６０】
【表２】
2020039344.tif 000006
【００６１】
これらのサンプルのｑＰＣＲプロファイルを得た後に、全ＡＲサンプルおよび非ＡＲサンプルの平均発現を別に採り、アッセイした全遺伝子の２列参照を作成する。あるいは、個々のサンプルの代わりにプールしたＲＮＡ参照を使用しても十分であり得る。データを、第１列が遺伝子識別を含み、第２列がＡＲ参照を含み、第３列が非ＡＲ参照を含む３列参照ファイルとして保存する。この参照に用いた元のサンプルを再分析すれば、例えば、ＡＲサンプルと非ＡＲサンプル間の不十分な分類スコアのためにこれらの参照サンプル間に有意な変動が存在するかどうかを判定することができる。
【００６２】
別の実施形態では、参照発現ベクターを作出するために、生体サンプルを採取し、未知のサンプルの分析の前に、ＣＥＡＣＡＭ４、ＣＦＬＡＲ、ＤＵＳＰ１、ＩＴＧＡＸ、ＲＮＦ１３０、ＰＳＥＮ１、ＮＫＴＲ、ＲＹＢＰ、ＮＡＭＰＴ、ＭＡＰＫ９、ＩＦＮＧＲ１、ＲＨＥＢ、ＧＺＭＫ、ＲＡＲＡ、ＳＬＣ２５Ａ３７、ＥＰＯＲ、およびＲＸＲＡを含んでなる１７遺伝子モデルセットを用いてプロファイリングを行う。いくつかの態様では、生体サンプルを採取し、ＢＡＳＰ１、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ９、ＩＮＰＰ５Ｄ、ＩＳＧ２０、ＬＣＫ、ＮＫＧ７、ＰＳＭＢ９、ＲＵＮＸ３、およびＴＡＰ１を含んでなる表２の１２遺伝子モデルセットを用いてプロファイリングを行う。これらのサンプルは、移植センター特異的参照として役立つ。これらのサンプルのｑＰＣＲプロファイルを得た後に、全ＡＲサンプルおよび非ＡＲサンプルの平均発現を別に採り、アッセイした全遺伝子の２列参照を作成する。あるいは、個々のサンプルの代わりにプールしたＲＮＡ参照を使用しても十分であり得る。データを、第１列が遺伝子識別を含み、第２列がＡＲ参照を含み、第３列が非ＡＲ参照を含む３列参照ファイルとして保存する。この参照に用いた元のサンプルを再分析すれば、例えば、ＡＲサンプルと非ＡＲサンプル間の不十分な分類スコアのためにこれらの参照サンプル間に有意な変動が存在するかどうかを判定することができる。
【００６３】
「未知の」サンプルをＡＲまたは非ＡＲとして分類するために、「未知の」サンプルの発現プロファイルを参照ＡＲプロファイルおよび参照非ＡＲプロファイルと直接比較する。サンプル発現プロファイルが参照非ＡＲ発現プロファイルよりも参照ＡＲ発現プロファイルに密接に適合すれば、そのサンプルはＡＲとして分類される。ｚスコアを精度の一指標として計算することができる（実施例２参照）。発現プロファイルは、ｍＲＮＡの発現を評価することにより評価することができ、ｍＲＮＡの発現は、ｍＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡを評価得することにより評価することができる。
【００６４】
腎臓同種移植レシピエントにおけるＡＲ／非ＡＲを評定するための遺伝子発現の使用方法  本明細書に記載の差次的発現遺伝子は、ＡＲを受けているかもしくはＡＲを受けるであろう個人の診断のためまたは診断を助けるために使用することができる。発現された遺伝子はまた、ＡＲの進行の監視、ＡＲの緩解の監視、ＡＲに関して処置されるべきもしくはＡＲの処置を継続すべき患者の同定、ＡＲの処置の有効性の評定、ＡＲに関して監視されるべき患者の同定、および／またはＡＲのリスクの無い個人の同定のために使用することもできる。本明細書に記載の差次的発現遺伝子は、ＡＲを受けていない個人の診断のためまたは診断を助けるため、ＡＲを受けていない個人の診断のためまたは診断を助けるため、個人がＡＲを受けるまたはＡＲを受けないリスクの予測の診断のためまたは診断を助けるために使用することができる。
【００６５】
診断アレイは、腎臓同種移植レシピエントから採取された生体サンプル中に存在する差次的発現遺伝子を定量するために使用することができる。このアレイは、基板上に複数の不連続の既知領域を含んでなるＤＮＡコーティング基板を含み得る。これらのアレイは、粒子、ナノ粒子、ビーズ、ナノビーズ、または有孔質または非孔質であり得、かつ、サイズに幅があり得る他の固相表面を含んでなり得る。一実施形態では、アレイはマイクロアレイチップである。別の実施形態では、診断アレイはビーズを含んでなる。さらなる実施形態では、診断アレイはナノ粒子を含んでなる。さらなる実施形態では、診断アレイは微小流体技術を含んでなる。
【００６６】
本明細書で開示される差次的発現遺伝子を使用する１つの利益は、ＡＲの決定を高い精度で行うことができるということである。精度は感度（ＡＲ患者が正確に同定される精度）および特異度（非ＡＲ患者が正確に同定される精度）；それぞれ陽性的中率（ＰＰＶ）および陰性的中率（ＮＰＶ）によって表すことができる。
【００６７】
本明細書に示される実施形態では、差次的発現遺伝子を用いたＡＲの決定は、ＡＲの検出または予測に関して高精度である。本明細書に示される実施形態では、本方法は、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の精度を提供する。さらに、本明細書に示される実施形態では、本方法は、ＡＲの検出または予測に関して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の精度を提供する。
【００６８】
本明細書に示される実施形態では、差次的発現遺伝子を用いたＡＲの決定は、ＡＲの検出または予測に関して高感度である。本明細書に示される実施形態では、本方法は、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の感度を提供する。さらに、本明細書に示される実施形態では、本方法は、ＡＲの検出または予測に関して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の感度を提供する。
【００６９】
さらに、本明細書に示される実施形態では、差次的発現遺伝子を用いたＡＲの分析は、ＡＲの検出または予測に関して高い特異度である。本明細書に示される実施形態では、本方法は、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の特異度を提供する。さらに、本明細書に示される実施形態では、本方法は、ＡＲの検出または予測に関して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の特異度を提供する。
【００７０】
さらに、本明細書に示される実施形態では、差次的発現遺伝子を用いたＡＲの分析は、ＡＲの検出または予測に関してある陽性的中率（ＰＰＶ；真の陽性である陽性検査結果の割合／正確な診断）を有する。本明細書に示される実施形態では、本方法は、ＡＲの検出または予測に関して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のＰＰＶを提供する。また、本明細書に示される実施形態では、差次的発現遺伝子を用いたＡＲの分析は、ＡＲの検出または予測に関してある陰性的中率（ＮＰＶ；正確に診断される陰性検査結果を有する被験者の割合）を有する。本明細書に示される実施形態では、本方法は、ＡＲの検出または予測に関して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のＮＰＶを提供する。
【００７１】
腎臓同種移植レシピエント由来の生体サンプルの分析は、本明細書で開示される１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、１６以上、１７以上、１８以上、１９以上、２０以上、２１以上、２２以上、２３以上、２４以上、２５以上、２６以上、２７以上、２８以上、２９以上、３０以上、３１以上、３２以上、３３以上、３４以上、３５以上、３６以上、３７以上、３８以上、３９以上、４０以上、４１以上、４２以上、４３以上、４４以上、４５以上、４６以上、４７以上、４８以上、４９以上、５０以上、５１以上、５２以上、５３以上、５４以上、５５以上、５６以上、５７以上、５８以上、５９以上、６０以上、６１以上、６２以上、６３以上、６４以上、６５以上、６６以上、６７以上、６８以上、６９以上、７０以上、７１以上、７２以上、７３以上、７４以上、７５以上、７６以上、７７以上、７８以上、７９以上、８０以上、８１以上、８２以上、８３以上、８４以上、８５以上、８６以上、８７以上、８８以上、８９以上、９０以上、９１以上、９２以上、９３以上、９４以上、９５以上、９６以上、９７以上、９８以上、９９以上、１００以上、１０１以上、またはさらに１０２の本明細書差次的発現遺伝子の組合せの評価を含む。いくつかの実施形態では、明示された表１の範囲内の遺伝子の数の整数の全ての反復を含む約１〜約４３の遺伝子が、本明細書に記載の方法により腎臓同種移植レシピエント由来の生体サンプルから測定される。いくつかの実施形態では、明示された表２の範囲内の遺伝子の数の整数の全ての反復を含む約１〜約１２の遺伝子が、本明細書に記載の方法により腎臓同種移植レシピエント由来の生体サンプルから測定される。いくつかの実施形態では、明示された表３の範囲内の遺伝子の数の整数の全ての反復を含む約１〜約１０２の遺伝子が、本明細書に記載の方法により腎臓同種移植レシピエント由来の生体サンプルから測定される。
【００７２】
一実施形態では、腎臓同種移植レシピエント由来の差次的発現遺伝子の分析は、ＣＥＡＣＡＭ４、ならびにＣＦＬＡＲ、ＤＵＳＰ１、ＩＴＧＡＸ、ＲＮＦ１３０、ＰＳＥＮ１、ＮＫＴＲ、ＲＹＢＰ、ＮＡＭＰＴ、ＭＡＰＫ９、ＩＦＮＧＲ１、ＲＨＥＢ、ＧＺＭＫ、ＲＡＲＡ、ＳＬＣ２５Ａ３７、ＥＰＯＲ、およびＲＸＲＡからなる群から選択される６つの遺伝子のレベルを測定することを含んでなる。別の実施形態では、腎臓同種移植レシピエント由来の差次的発現遺伝子の分析は、ＣＥＡＣＡＭ４、ならびにＣＦＬＡＲ、ＤＵＳＰ１、ＩＴＧＡＸ、ＲＮＦ１３０、ＰＳＥＮ１、ＮＫＴＲ、ＲＹＢＰ、ＮＡＭＰＴ、ＭＡＰＫ９、ＩＦＮＧＲ１、ＲＨＥＢ、ＧＺＭＫ、ＲＡＲＡ、ＳＬＣ２５Ａ３７、ＥＰＯＲ、およびＲＸＲＡからなる群から選択される７つの遺伝子のレベルを測定することを含んでなる。さらなる実施形態では、腎臓同種移植レシピエント由来の差次的発現遺伝子の分析は、  ＣＥＡＣＡＭ４と、ＣＦＬＡＲ、ＤＵＳＰ１、ＩＴＧＡＸ、ＲＮＦ１３０、ＰＳＥＮ１、ＮＫＴＲ、ＲＹＢＰ、ＮＡＭＰＴ、ＭＡＰＫ９、ＩＦＮＧＲ１、ＲＨＥＢ、ＧＺＭＫ、ＲＡＲＡ、ＳＬＣ２５Ａ３７、ＥＰＯＲ、およびＲＸＲＡからなる群から選択される８つの遺伝子のレベルを測定することを含んでなる。別の実施形態では、腎臓同種移植レシピエント由来の差次的発現遺伝子の分析は、ＣＥＡＣＡＭ４、ならびにＣＦＬＡＲ、ＤＵＳＰ１、ＩＴＧＡＸ、ＲＮＦ１３０、ＰＳＥＮ１、ＮＫＴＲ、ＲＹＢＰ、ＮＡＭＰＴ、ＭＡＰＫ９、ＩＦＮＧＲ１、ＲＨＥＢ、ＧＺＭＫ、ＲＡＲＡ、ＳＬＣ２５Ａ３７、ＥＰＯＲ、およびＲＸＲＡからなる群から選択される９つの遺伝子のレベルを測定することを含んでなる。さらに別の実施形態では、腎臓同種移植レシピエント由来の差次的発現遺伝子の分析は、ＣＥＡＣＡＭ４、ならびにＣＦＬＡＲ、ＤＵＳＰ１、ＩＴＧＡＸ、ＲＮＦ１３０、ＰＳＥＮ１、ＮＫＴＲ、ＲＹＢＰ、ＮＡＭＰＴ、ＭＡＰＫ９、ＩＦＮＧＲ１、ＲＨＥＢ、ＧＺＭＫ、ＲＡＲＡ、ＳＬＣ２５Ａ３７、ＥＰＯＲ、およびＲＸＲＡからなる群から選択される１０の遺伝子のレベルを測定することを含んでなる。さらなる実施形態では、腎臓同種移植レシピエント由来の差次的発現遺伝子の分析は、ＣＥＡＣＡＭ４、ならびにＣＦＬＡＲ、ＤＵＳＰ１、ＩＴＧＡＸ、ＲＮＦ１３０、ＰＳＥＮ１、ＮＫＴＲ、ＲＹＢＰ、ＮＡＭＰＴ、ＭＡＰＫ９、ＩＦＮＧＲ１、ＲＨＥＢ、ＧＺＭＫ、ＲＡＲＡ、ＳＬＣ２５Ａ３７、ＥＰＯＲ、およびＲＸＲＡからなる群から選択される１１の遺伝子のレベルを測定することを含んでなる。別の実施形態では、腎臓同種移植レシピエント由来の差次的発現遺伝子の分析は、ＣＥＡＣＡＭ４、ならびにＣＦＬＡＲ、ＤＵＳＰ１、ＩＴＧＡＸ、ＲＮＦ１３０、ＰＳＥＮ１、ＮＫＴＲ、ＲＹＢＰ、ＮＡＭＰＴ、ＭＡＰＫ９、ＩＦＮＧＲ１、ＲＨＥＢ、ＧＺＭＫ、ＲＡＲＡ、ＳＬＣ２５Ａ３７、ＥＰＯＲ、およびＲＸＲＡからなる群から選択される１２の遺伝子のレベルを測定することを含んでなる。さらなる実施形態では、腎臓同種移植レシピエント由来の差次的発現遺伝子の分析は、ＣＥＡＣＡＭ４、ならびにＣＦＬＡＲ、ＤＵＳＰ１、ＩＴＧＡＸ、ＲＮＦ１３０、ＰＳＥＮ１、ＮＫＴＲ、ＲＹＢＰ、ＮＡ���ＰＴ、ＭＡＰＫ９、ＩＦＮＧＲ１、ＲＨＥＢ、ＧＺＭＫ、ＲＡＲＡ、ＳＬＣ２５Ａ３７、ＥＰＯＲ、およびＲＸＲＡからなる群から選択される１３の遺伝子のレベルを測定することを含んでなる。別の実施形態では、腎臓同種移植レシピエント由来の差次的発現遺伝子の分析は、ＣＥＡＣＡＭ４、ならびにＣＦＬＡＲ、ＤＵＳＰ１、ＩＴＧＡＸ、ＲＮＦ１３０、ＰＳＥＮ１、ＮＫＴＲ、ＲＹＢＰ、ＮＡＭＰＴ、ＭＡＰＫ９、ＩＦＮＧＲ１、ＲＨＥＢ、ＧＺＭＫ、ＲＡＲＡ、ＳＬＣ２５Ａ３７、ＥＰＯＲ、およびＲＸＲＡからなる群から選択される１４の遺伝子のレベルを測定することを含んでなる。さらなる実施形態では、腎臓同種移植レシピエント由来の差次的発現遺伝子の分析は、ＣＥＡＣＡＭ４、ならびにＣＦＬＡＲ、ＤＵＳＰ１、ＩＴＧＡＸ、ＲＮＦ１３０、ＰＳＥＮ１、ＮＫＴＲ、ＲＹＢＰ、ＮＡＭＰＴ、ＭＡＰＫ９、ＩＦＮＧＲ１、ＲＨＥＢ、ＧＺＭＫ、ＲＡＲＡ、ＳＬＣ２５Ａ３７、ＥＰＯＲ、およびＲＸＲＡからなる群から選択される１５の遺伝子のレベルを測定することを含んでなる。別の実施形態では、腎臓同種移植レシピエント由来の差次的発現遺伝子の分析は、ＢＡＳＰ１、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ９、ＩＮＰＰ５Ｄ、ＩＳＧ２０、ＬＣＫ、ＮＫＧ７、ＰＳＭＢ９、ＲＵＮＸ３、およびＴＡＰ１のレベルを測定することを含んでなる。
【００７３】
さらなる実施形態では、腎臓同種移植レシピエント由来の差次的発現遺伝子の分析は、表２から選択される１２の遺伝子の組合せのレベルを測定することを含んでなる。
【００７４】
さらなる実施形態では、腎臓同種移植レシピエント由来の差次的発現遺伝子の分析は、遺伝子ＣＥＡＣＡＭ４、ＣＦＬＡＲ、ＤＵＳＰ１、ＩＴＧＡＸ、ＲＮＦ１３０、ＰＳＥＮ１、ＮＫＴＲ、ＲＹＢＰ、ＮＡＭＰＴ、ＭＡＰＫ９、ＩＦＮＧＲ１、ＲＨＥＢ、ＧＺＭＫ、ＲＡＲＡ、ＳＬＣ２５Ａ３７、ＥＰＯＲ、およびＲＸＲＡのレベルを測定することを含んでなる。補正されたこの１７遺伝子セットは、サンプルの８８％をＡＲとして、サンプルの９５％を非ＡＲとして予測する。いくつかの実施形態では、合計１７遺伝子の発現レベルが測定される。
【００７５】
さらなる実施形態では、腎臓同種移植レシピエント由来の差次的発現遺伝子の分析は、遺伝子ＢＡＳＰ１、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ９、ＩＮＰＰ５Ｄ、ＩＳＧ２０、ＬＣＫ、ＮＫＧ７、ＰＳＭＢ９、ＲＵＮＸ３、およびＴＡＰ１のレベルを測定することを含んでなる。
【００７６】
別の実施形態では、腎臓同種移植レシピエント由来の差次的発現遺伝子の分析は、遺伝子ＣＥＡＣＡＭ４、ＣＦＬＡＲ、ＤＵＳＰ１、ＩＴＧＡＸ、ＮＡＭＰＴ、ＮＫＴＲ、ＰＳＥＮ１、ＥＰＯＲ、ＧＺＭＫ、ＲＡＲＡ、ＲＨＥＢ、およびＳＬＣ２５Ａ３７のレベルを測定することを含んでなる。この遺伝子セットは、８６％感度および９０％特異度でＡＲを分類する。
【００７７】
別の実施形態では、本明細書に記載の差次的発現遺伝子の分析は、腎臓同種移植に対する慢性損傷を予測するために有用である。慢性損傷は一般に、最も多くはドナー臓器に対して生じた持続的免疫応答による移植臓器における長期機能欠失として表される。一態様において、差次的発現遺伝子は、被験者由来の組織生検サンプルにおいて評定される。別の態様において、組織生検における差次的発現遺伝子の測定は、免疫組織化学的技術、本明細書に記載の核酸法、またはタンパク質検出法（例えば、ウエスタンブロット法）または当技術分野で公知の他の一般的な遺伝子発現法によって行うこともできる。別の態様において、ＣＥＡＣＡＭ４、ならびにＣＦＬＡＲ、ＤＵＳＰ１、ＩＦＮＧＲ１、ＩＴＧＡＸ、ＭＡＰＫ９、ＮＡＭＰＴ、ＮＫＴＲ、ＰＳＥＮ１、ＲＮＦ１３０、ＲＹＢＰ、ＥＰＯＲ、ＧＺＭＫ、ＲＡＲＡ、ＲＨＥＢ、ＲＸＲＡ、およびＳＬＣ２５Ａ３７から選択される６〜１６の他の遺伝子のレベルが、ＡＲの評価のために、腎臓同種移植を受けた個人に由来する組織生検において測定される。別の態様において、ＣＥＡＣＡＭ４、ならびにＢＡＳＰ１、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ９、ＩＮＰＰ５Ｄ、ＩＳＧ２０、ＬＣＫ、ＮＫＧ７、ＰＳＭＢ９、ＲＵＮＸ３、およびＴＡＰ１から選択される６〜１６の他の遺伝子のレベルが、ＡＲの評価のために、腎臓同種移植を受けた個人に由来する組織生検において測定される。別の態様において、表１からの、明示された範囲内の遺伝子の数の整数の全ての反復を含む約１〜約４３の遺伝子のレベルが、ＡＲの評価のために、腎臓同種移植を受けた個人に由来する組織生検において測定される。別の実施形態では、表３からの、明示された範囲内の遺伝子の数の整数の全ての反復を含む約１〜約１０２の遺伝子が、ＡＲの評価のために、腎臓同種移植を受けた個人に由来する組織生検において測定される。
【００７８】
いくつかの実施形態では、統合遺伝子モデルが用いられる。すなわち、上記のような複数の遺伝子セットが使用され、各遺伝子セットはカテゴリー的値もしくはスコアおよび／または数的値またはスコアを提供する。このように、統合モデルは、単一の遺伝子セットに偏りを持たない。ＡＲのリスクが高い患者のうち９１％が正確にＡＲと分類された。ＡＲのリスクが低い患者のうち９２％が正確に非ＡＲと分類された。
【００７９】
本発明の差次的発現遺伝子はまた、ＡＲの処置のための個人を同定するために使用することができる。いくつかの実施形態では、この個人はＡＲ症状の進行または緩解に関して監視される。いくつかの実施形態では、この個人はＡＲ症状の発症前または発症時にＡＲに関して処置される。いくつかの実施形態では、この処置は、コルチコステロイド療法である。他の実施形態では、この処置は、ムロモナブ−ＣＤ３（Ｏｒｔｈｏｃｌｏｎｅ  ＯＫＴ３）などの抗Ｔ細胞抗体の投与である。さらなる実施形態では、この処置は、血漿交換と抗ＣＤ２０抗体の投与の組合せである。場合によっては、処置が継続されるべきかどうかを決定するためまたは処置が有効であるかどうかをみるために監視が行われる。
【００８０】
本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態では、これらの方法はＡＲ応答の予測に用途を持つ。これらの方法では、被験者はまず、対象の方法に従ってＡＲに関して監視され、次に、監視結果に少なくとも部分的に基づいて決定されたプロトコールを用いて処置される。一実施形態では、被験者は、本明細書に記載の方法の１つに従って急性拒絶の有無に関して監視される。被験者は次に、監視工程の結果を用いてその適合性が決定されるプロトコールを用いて処置することができる。例えば、被験者が次の１〜６か月以内に急性拒絶応答を示すと予測される場合、急性拒絶の治療／予防に関して当技術分野で公知のように、免疫抑制療法を調整、例えば、増強または薬物の変更を行うことができる。同様に、被験者がその時および短期的に急性拒絶を受けていないと予測される場合、薬物毒性の可能性を軽減するために免疫抑制療法を低減することができる。本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態では、被験者は、移植片の受容または移植後に急性拒絶に関して監視される。被験者は、移植重要後１回または連続的に、例えば、毎週、毎月、隔月、半年ごと、毎年などにスクリーニングすることができる。いくつかの実施形態では、被験者は、急性拒絶エピソードの発生前に監視される。他の実施形態では、被験者は、急性拒絶エピソードの発生後に監視される。
【００８１】
本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態では、本方法は、ＡＲの治療を必要とする被験者の治療パラダイムまたは治療計画の変更または変化に用途を持つ。非限定的免疫抑制療法またはそれを必要とする被験者の治療に有用な治療薬の例としては、ステロイド（例えば、プレドニゾン（デルタゾン）、プレドニゾロン、メチル−プレドニゾロン（メドロール、ソルメドロール））、抗体（例えば、ムロモナブ−ＣＤ３（Ｏｒｔｈｏｃｌｏｎ−ＯＫＴ３）、抗胸腺細胞免疫グロブリン（ＡＴＧＡＭ、サイモグロブリン）、ダクリズマブ（ゼナパックス）、バシリキシマブ（シムレクト）、リツキシマブ、サイトメガロウイルス免疫グロブリン（サイトガム）、免疫グロブリン（ポリガム））、カルシニュリン阻害剤（例えば、シクロスポリン（サンディミュン）、タクロリムス（プログラフ））、細胞増殖阻害薬（例えば、ミコフェノール酸モフェチル（セルセプト）、アザチオプリン（イムラン））、ＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン（ラパミューン、シロリムス）、エベロリムス（セルチカン））、またはそれらの併用療法を含んでなる。
【００８２】
被験者が本発明に記載の方法を用いてＡＲを持たないと同定されるいくつかの実施形態では、被験者は、抗増殖薬（例えば、ミコフェノール酸モフェチルおよび／またはアザチオプリン）、カルシニュリン阻害剤（例えば、シクロスポリンおよび／またはタクロリムス）、ステロイド（例えば、プレドニゾン、プレドニゾロン、および／またはメチルプレドニゾロン）またはそれらの組合せの投与を含んでなる免疫抑制標準治療維持療法に留まることができる。例えば、本発明に記載の方法を用いてＡＲを持たないと同定された被験者は、低用量のプレドニゾン（例えば、約０．１ｍｇ・ｋｇ−１・ｄ−１〜約１ｍｇ・ｋｇ−１・ｄ−１）、低用量のシクロスポリン（例えば、約４ｍｇ・ｋｇ−１・ｄ−１〜約８ｍｇ・ｋｇ−１・ｄ−１）、および低用量のミコフェノラート（例えば、約１〜１．５ｇ  １日２回）の投与を含んでなる維持療法におくことができる。別の例では、本発明に記載の方法を用いてＡＲを持たないと同定された被験者は、ステロイド療法から離脱させ、低用量のシクロスポリン（例えば、約４ｍｇ・ｋｇ−１・ｄ−１〜約８ｍｇ・ｋｇ−１・ｄ−１）、および低用量のミコフェノラート（例えば、約１〜１．５ｇ  １日２回）の投与を含んでなる維持療法におくことができる。別の例では、本発明に記載の方法を用いてＡＲを持たないと同定された被験者は、本明細書に記載の全ての免疫抑制療法から離脱させることができる。
【００８３】
被験者が本発明に記載の方法を用いてＡＲを有すると同定されるいくつかの実施形態では、被験者は、救済療法または高用量のステロイド（例えば、プレドニゾン、プレドニゾロン、および／またはメチルプレドニゾロン）、高用量のポリクローナルまたはモノクローナル抗体（例えば、ムロモナブ−ＣＤ３（ＯＫＴ３）、抗胸腺細胞免疫グロブリン、ダクリズマブ、リツキシマブ、バシリキシマブ、サイトメガロウイルス免疫グロブリン、および／または免疫グロブリン）、高用量の抗増殖薬（例えば、ミコフェノール酸モフェチルおよび／またはアザチオプリン）、またはそれらの組合せの投与を含んでなる免疫抑制薬の増強におくことができる。
【００８４】
いくつかの実施形態では、被験者が本発明に記載の方法を用いてＡＲを持たないと同定されるか、またはＡＲを持つと同定される場合の療法の経過は、移植後の時間および拒絶の重篤度、治療医、および移植センターに依存する。
【００８５】
よって、本発明の差次的発現遺伝子および本明細書に記載の方法論を用い、当業者は、腎臓同種移植レシピエントにおいてＡＲを診断すること、腎臓同種移植レシピエントにおいて非ＡＲを診断すること、ＡＲの診断を助けること、ＡＲのリスクに関する診断を助けること、ＡＲの進行を監視すること、ＡＲの緩解を監視すること、ＡＲに関して処置すべきまたはＡＲに関する処置を継続すべき個人を同定すること、ＡＲの処置の有効性を評定すること、および／またはＡＲ症状に関して監視すべき個人を同定することが可能である。
【００８６】
いくつかの実施形態では、本発明の差次的発現遺伝子および本明細書に記載の方法論は、抗体媒介性ＡＲの層別化または同定に使用することができる。他の実施形態では、本発明の差次的発現遺伝子および本明細書に記載の方法論は、Ｔ細胞媒介性ＡＲの層別化または同定に使用することができる。本明細書で提供される遺伝子は、いくつかの態様では、それらがＢ細胞で発現されるか、またはＴ細胞で発現されるかもしくは活性化Ｔ細胞の既知のマーカーであるので、Ｂ細胞またはＴ細胞媒介性ＡＲの同定に有用である。
【００８７】
ＡＲの診断、検出、または予測のためのキット
本発明はさらに、ＡＲの診断、検出、および予測のアッセイキットを提供する。本キットは、腎臓同種移植を受けた個人由来の生体サンプルにおいてＡＲに関連する差次的発現遺伝子のレベルを測定するための遺伝子発現評価素子を含んでなる。いくつかの実施形態では、本キットは、生体サンプルにおいて対象とする差次的発現遺伝子のレベルを測定するための試薬を含んでなる。いくつかの実施形態では、本キットは、生体サンプルにおける差次的発現遺伝子の測定のための１以上の固相表面を含んでなる組成物を含んでなる。一実施形態では、固相表面は、マイクロアレイチップを含んでなる。別の実施形態では、固相表面は、ビーズを含んでなる。さらなる実施形態では、固相表面は、ナノ粒子を含んでなる。一実施形態では、本キットは、ＣＥＡＣＡＭ４、ならびにＣＦＬＡＲ、ＤＵＳＰ１、ＩＴＧＡＸ、ＲＮＦ１３０、ＰＳＥＮ１、ＮＫＴＲ、ＲＹＢＰ、ＮＡＭＰＴ、ＭＡＰＫ９、ＩＦＮＧＲ１、ＲＨＥＢ、ＧＺＭＫ、ＲＡＲＡ、ＳＬＣ２５Ａ３７、ＥＰＯＲ、およびＲＸＲＡから選択される少なくとも６、７、８、９、１０、または１１の他の遺伝子の測定のための１以上の固相表面を含んでなる組成物を含んでなる。いくつかの実施形態では、合計１７の遺伝子の発現レベルが測定される。
【００８８】
本キットはさらに、腎臓同種移植を受けた個人のＡＲの診断において使用するための参照標準素子を含んでなる。いくつかの実施形態では、参照標準素子は、単一の移植センターまたは複数の移植センターの腎臓同種移植レシピエントから得られた各差次的発現遺伝子に対するＡＲサンプル由来の単一の参照発現ベクターを含んでなる。いくつかの実施形態では、参照標準素子は、単一の移植センターまたは複数の移植センターの腎臓同種移植レシピエントから得られた各差次的発現遺伝子に対する非ＡＲサンプル由来の単一の参照発現ベクターを含んでなる。参照標準素子は、ＡＲを有するレシピエントを診断するために腎臓同種移植レシピエントからの遺伝子発現と比較するために使用される。
【００８９】
いくつかの実施形態では、比較はコンピューターにより行われる。他の実施形態では、比較は、個人により行われる。一実施形態では、比較は、医師により行われる。各移植センターの参照標準は上記のようにして作成することができる。
【００９０】
いくつかの実施形態では、コンピューターは、ＡＲ応答の誘導の予測、ＡＲ応答の診断、および被験者におけるＡＲ応答の特性決定のうちの少なくとも１つをユーザーに出力するように構成されており、この出力は、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、または１７の遺伝子の遺伝子発現結果を対照参照発現プロファイルと比較することにより決定される。
【００９１】
本キットはまた、アッセイの使用に関する説明書を含んでなる。
【００９２】
ＡＲの診断、検出、または予測のためのシステム
本発明はさらに、ＡＲの診断、検出、および予測のためのシステムを提供する。本システムは、腎臓同種移植を受けた個人由来の生体サンプルにおいてＡＲに関連する差次的発現遺伝子のレベルを測定するための遺伝子発現評価素子を含んでなる。一実施形態では、本システムは、マイクロアレイチップを含んでなる。別の実施形態では、システムは、ビーズを含んでなる。さらなる実施形態では、システムは、ナノ粒子を含んでなる。種々の実施形態では、システムは、ＣＥＡＣＡＭ４、ならびにＣＦＬＡＲ、ＤＵＳＰ１、ＩＴＧＡＸ、ＲＮＦ１３０、ＰＳＥＮ１、ＮＫＴＲ、ＲＹＢＰ、ＮＡＭＰＴ、ＭＡＰＫ９、ＩＦＮＧＲ１、ＲＨＥＢ、ＧＺＭＫ、ＲＡＲＡ、ＳＬＣ２５Ａ３７、ＥＰＯＲ、およびＲＸＲＡから選択される少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６の他の遺伝子の測定のための遺伝子発現評価素子を含んでなる。いくつかの実施形態では、合計１７の遺伝子の発現レベルが測定される。
【００９３】
特定の実施形態では、遺伝子発現評価素子は、遺伝子発現結果を生成するために、ＣＥＡＣＡＭ４、ならびにＣＦＬＡＲ、ＤＵＳＰ１、ＩＴＧＡＸ、ＲＮＦ１３０、ＰＳＥＮ１、ＮＫＴＲ、ＲＹＢＰ、ＮＡＭＰＴ、ＭＡＰＫ９、ＩＦＮＧＲ１、ＲＨＥＢ、ＧＺＭＫ、ＲＡＲＡ、ＳＬＣ２５Ａ３７、ＥＰＯＲ、およびＲＸＲＡから選択される少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６の他の遺伝子を選択的に増幅するように設計された標識遺伝子プライマーまたは標識プローブを含んでなる。いくつかの実施形態では、標識は、非天然である。他の実施形態では、遺伝子プライマーまたはプローブは、標識を含むように共有結合的に修飾される。関連の実施形態では、標識は、蛍光団または放射性標識からなる群から選択することができる。
【００９４】
本システムは、腎臓同種移植を受けた個人においてＡＲを評定するための参照標準素子をさらに含んでなる。いくつかの実施形態では、参照標準素子は、単一の移植センターの腎臓同種移植レシピエントから得られた各差次的発現遺伝子に対するＡＲサンプル由来の単一の参照発現ベクターを含んでなる。いくつかの実施形態では、参照標準素子は、単一の移植センターの腎臓同種移植レシピエントから得られた各差次的発現遺伝子に対する非ＡＲサンプル由来の単一の参照発現ベクターを含んでなる。参照標準素子は、ＡＲを有するレシピエントを診断するために、腎臓同種移植レシピエントからの遺伝子発現と比較するために使用される。いくつかの実施形態では、比較は、コンピューターにより行われる。他の実施形態では、比較は、個人により行われる。一実施形態では、比較は、医師により行われる。各移植センターの参照標準は上記のようにして作成することができる。
【００９５】
ＡＲの診断、検出、または予測のための組成物
本発明は、腎臓同種移植を受けた個人由来の生体サンプルにおいてＡＲに関連する差次的発現遺伝子のレベルを測定するための１以上の固相表面を含んでなる組成物を提供する。いくつかの実施形態では、組成物は製品である。一実施形態では、製品は、腎臓同種移植を受けた個人由来の生体サンプルにおいて差次的発現遺伝子のレベルを測定するための参照標準を含んでなる。いくつかの実施形態では、固相表面は、差次的発現遺伝子のｃＤＮＡの付着を提供する。他の実施形態では、固相表面は、差次的発現遺伝子の増幅のためのプライマーまたは標識プライマーの付着を提供する。特定の実施形態では、固相表面は、本明細書に開示される少なくとも１、１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、１６以上、１７以上、１８以上、１９以上、２０以上、２１以上、２２以上、２３以上、２４以上、２５以上、２６以上、２７以上、２８以上、２９以上、３０以上、３１以上、３２以上、３３以上、３４以上、３５以上、３６以上、３７以上、３８以上、３９以上、４０以上、４１以上、４２以上、４３以上、４４以上、４５以上、４６以上、４７以上、４８以上、４９以上、５０以上、５１以上、５２以上、５３以上、５４以上、５５以上、５６以上、５７以上、５８以上、５９以上、６０以上、６１以上、６２以上、６３以上、６４以上、６５以上、６６以上、６７以上、６８以上、６９以上、７０以上、７１以上、７２以上、７３以上、７４以上、７５以上、７６以上、７７以上、７８以上、７９以上、８０以上、８１以上、８２以上、８３以上、８４以上、８５以上、８６以上、８７以上、８８以上、８９以上、９０以上、９１以上、９２以上、９３以上、９４以上、９５以上、９６以上、９７以上、９８以上、９９以上、１００以上、１０１以上、またはさらには１０２の遺伝子の測定を可能とする。一実施形態では、表１からの、明示された範囲内の遺伝子の数の整数の全ての反復を含む約１〜約４３の遺伝子が、ＡＲの評価のために、腎臓同種移植を受けた個人由来の生体サンプルにおいて測定される。別の実施形態では、表３からの、明示された範囲内の遺伝子の数の整数の全ての反復を含む約１〜約１０２の遺伝子が、ＡＲの評価のために、腎臓同種移植を受けた個人由来の生体サンプルにおいて測定される。別の実施形態では、最低７つの遺伝子が、ＡＲの評価のために測定される。別の実施形態では、最大１７の遺伝子が、ＡＲの評価のために測定される。
【００９６】
１つの特定の実施形態では、本発明は、ＣＥＡＣＡＭ４、ならびにＣＦＬＡＲ、ＤＵＳＰ１、ＩＴＧＡＸ、ＲＮＦ１３０、ＰＳＥＮ１、ＮＫＴＲ、ＲＹＢＰ、ＮＡＭＰＴ、ＭＡＰＫ９、ＩＦＮＧＲ１、ＲＨＥＢ、ＧＺＭＫ、ＲＡＲＡ、ＳＬＣ２５Ａ３７、ＥＰＯＲ、およびＲＸＲＡからなる群から選択される６つの遺伝子の遺伝子発現レベルの測定のための１以上の固相表面を含む組成物を提供する。別の実施形態では、組成物は、ＣＥＡＣＡＭ４、ならびにＣＦＬＡＲ、ＤＵＳＰ１、ＩＴＧＡＸ、ＲＮＦ１３０、ＰＳＥＮ１、ＮＫＴＲ、ＲＹＢＰ、ＮＡＭＰＴ、ＭＡＰＫ９、ＩＦＮＧＲ１、ＲＨＥＢ、ＧＺＭＫ、ＲＡＲＡ、ＳＬＣ２５Ａ３７、ＥＰＯＲ、およびＲＸＲＡからなる群から選択される７つの遺伝子の遺伝子発現レベルを測定するための１以上の固相表面を含む。さらなる実施形態では、組成物は、ＣＥＡＣＡＭ４、ならびにＣＦＬＡＲ、ＤＵＳＰ１、ＩＴＧＡＸ、ＲＮＦ１３０、ＰＳＥＮ１、ＮＫＴＲ、ＲＹＢＰ、ＮＡＭＰＴ、ＭＡＰＫ９、ＩＦＮＧＲ１、ＲＨＥＢ、ＧＺＭＫ、ＲＡＲＡ、ＳＬＣ２５Ａ３７、ＥＰＯＲ、およびＲＸＲＡからなる群から選択される８つの遺伝子の遺伝子発現レベルを測定するための１以上の固相表面を含む。別の実施形態では、組成物は、ＣＥＡＣＡＭ４、ならびにＣＦＬＡＲ、ＤＵＳＰ１、ＩＴＧＡＸ、ＲＮＦ１３０、ＰＳＥＮ１、ＮＫＴＲ、ＲＹＢＰ、ＮＡＭＰＴ、ＭＡＰＫ９、ＩＦＮＧＲ１、ＲＨＥＢ、ＧＺＭＫ、ＲＡＲＡ、ＳＬＣ２５Ａ３７、ＥＰＯＲ、およびＲＸＲＡからなる群から選択される９つの遺伝子の遺伝子発現レベルを評価するための１以上の固相表面を含む。さらに別の実施形態では、組成物は、ＣＥＡＣＡＭ４、ならびにＣＦＬＡＲ、ＤＵＳＰ１、ＩＴＧＡＸ、ＲＮＦ１３０、ＰＳＥＮ１、ＮＫＴＲ、ＲＹＢＰ、ＮＡＭＰＴ、ＭＡＰＫ９、ＩＦＮＧＲ１、ＲＨＥＢ、ＧＺＭＫ、ＲＡＲＡ、ＳＬＣ２５Ａ３７、ＥＰＯＲ、およびＲＸＲＡからなる群から選択される１０の遺伝子の遺伝子発現レベルを測定するための１以上の固相表面を含む。さらなる実施形態では、組成物は、ＣＥＡＣＡＭ４、ならびにＣＦＬＡＲ、ＤＵＳＰ１、ＩＴＧＡＸ、ＲＮＦ１３０、ＰＳＥＮ１、ＮＫＴＲ、ＲＹＢＰ、ＮＡＭＰＴ、ＭＡＰＫ９、ＩＦＮＧＲ１、ＲＨＥＢ、ＧＺＭＫ、ＲＡＲＡ、ＳＬＣ２５Ａ３７、ＥＰＯＲ、およびＲＸＲＡからなる群から選択される１１の遺伝子の遺伝子発現レベルを測定するための１以上の固相表面を含む。別の実施形態では、組成物は、ＣＥＡＣＡＭ４、ならびにＣＦＬＡＲ、ＤＵＳＰ１、ＩＴＧＡＸ、ＲＮＦ１３０、ＰＳＥＮ１、ＮＫＴＲ、ＲＹＢＰ、ＮＡＭＰＴ、ＭＡＰＫ９、ＩＦＮＧＲ１、ＲＨＥＢ、ＧＺＭＫ、ＲＡＲＡ、ＳＬＣ２５Ａ３７、ＥＰＯＲ、およびＲＸＲＡからなる群から選択される１２の遺伝子の遺伝子発現レベルを測定するための１以上の固相表面を含む。さらなる実施形態では、組成物は、ＣＥＡＣＡＭ４、ならびにＣＦＬＡＲ、ＤＵＳＰ１、ＩＴＧＡＸ、ＲＮＦ１３０、ＰＳＥＮ１、ＮＫＴＲ、ＲＹＢＰ、ＮＡＭＰＴ、ＭＡＰＫ９、ＩＦＮＧＲ１、ＲＨＥＢ、ＧＺＭＫ、ＲＡＲＡ、ＳＬＣ２５Ａ３７、ＥＰＯＲ、およびＲＸＲＡからなる群から選択される１３の遺伝子の遺伝子発現レベルを測定するための１以上の固相表面を含む。別の実施形態では、組成物は、ＣＥＡＣＡＭ４、ならびにＣＦＬＡＲ、ＤＵＳＰ１、ＩＴＧＡＸ、ＲＮＦ１３０、ＰＳＥＮ１、ＮＫＴＲ、ＲＹＢＰ、ＮＡＭＰＴ、ＭＡＰＫ９、ＩＦＮＧＲ１、ＲＨＥＢ、ＧＺＭＫ、ＲＡＲＡ、ＳＬＣ２５Ａ３７、ＥＰＯＲ、およびＲＸＲＡからなる群から選択される１４の遺伝子の遺伝子発現レベルを測定するための１以上の固相表面を含む。さらなる実施形態では、組成物は、ＣＥＡＣＡＭ４、ならびにＣＦＬＡＲ、ＤＵＳＰ１、ＩＴＧＡＸ、ＲＮＦ１３０、ＰＳＥＮ１、ＮＫＴＲ、ＲＹＢＰ、ＮＡＭＰＴ、ＭＡＰＫ９、ＩＦＮＧＲ１、ＲＨＥＢ、ＧＺＭＫ、ＲＡＲＡ、ＳＬＣ２５Ａ３７、ＥＰＯＲ、およびＲＸＲＡからなる群から選択される１５の遺伝子の遺伝子発現レベルを測定するための１以上の固相表面を含む。さらなる実施形態では、組成物は、ＣＥＡＣＡＭ４、ならびにＣＦＬＡＲ、ＤＵＳＰ１、ＩＴＧＡＸ、ＲＮＦ１３０、ＰＳＥＮ１、ＮＫＴＲ、ＲＹＢＰ、ＮＡＭＰＴ、ＭＡＰＫ９、ＩＦＮＧＲ１、ＲＨＥＢ、ＧＺＭＫ、ＲＡＲＡ、ＳＬＣ２５Ａ３７、ＥＰＯＲ、およびＲＸＲＡの遺伝子発現レベルを測定するための１以上の固相表面を含む。いくつかの実施形態では、合計１７の遺伝子の発現レベルが測定される。別の実施形態では、組成物は、ＣＥＡＣＡＭ４、ＣＦＬＡＲ、ＤＵＳＰ１、ＩＴＧＡＸ、ＮＡＭＰＴ、ＮＫＴＲ、ＰＳＥＮ１、ＥＰＯＲ、ＧＺＭＫ、ＲＡＲＡ、ＲＨＥＢ、およびＳＬＣ２５Ａ３７の遺伝子発現レベルを測定するための１以上の固相表面を含む。
【００９７】
【表３】
2020039344.tif 000007
2020039344.tif 000008
2020039344.tif 000009
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【００９８】
ＡＲと非ＡＲの分類のための相関に基づくアルゴリズム用のソフトウエア
本明細書に記載の相関に基づく分析は、ＡｌｔＡｎａｌｙｚｅバージョン２．０．８以降を用いて行うことができる。ＬｉｎｅａｇｅＰｒｏｆｉｌｅｒは、オープンソースソフトウエアＡｌｔＡｎａｌｙｚｅ(http://code.google.com/p/altanalyze/downloads, version 2.0.8 or higher)のグラフィック・ユーザー・インターフェースから、また、スタンドアロンｐｙｔｈｏｎスクリプトとして(https://github.com/nsalomonis/LineageProfilerIterate)入手可能である。ＡｌｔＡｎａｌｙｚｅは、http://www.altanalyze.orgからダウンロードし、ハードドライブに抽出し、初回起動の後にプロンプト（現在、ＥｎｓＭａｒｔ６５）が表示された際に最新のヒトデータベースとともにインストールすることができる。あるいは、ＬｉｎｅａｇｅＰｒｏｆｉｌｅｒ・ファンクションは、このソフトウエアのコマンドラインバージョンを、https://github.com/nsalomonis/LineageProfilerIterateで入手可能なgene model discoveryのオプションとともに用いて実行することもできる。ＬｉｎｅａｇｅＰｒｏｆｉｌｅｒのスタンドアロン・グラフィック・ユーザー・インターフェース・バージョンおよびコマンド・ライン・バージョンの実行命令は、http://code.google.com/p/altanalyze/wiki/SampleClassificationに記載されている。ＬｉｎｅａｇｅＰｒｏｆｉｌｅｒのソースコードは、本明細書に記載の実施形態で使用するために修正され、ＬｉｎｅａｇｅＰｒｏｆｉｌｅｒ  Ｉｔｅｒａｔｅとなっている。本明細書で使用する場合、修正版ＬｉｎｅａｇｅＰｒｏｆｉｌｅｒであるＬｉｎｅａｇｅＰｒｏｆｉｌｅｒ  ＩｔｅｒａｔｅおよびｋＳＡＳは互換的に使用される。ｋＳＡＳのソースコードは、付表Ｃに示されている。このソフトウエアを用いて、所与のサンプルセットに関する定量的発現値を、特定の疾患クラス、表現型、または処置カテゴリーに属すとして分類することができる。簡単に述べると、このアルゴリズムはこれを、所与のサンプルに関する発現値の入力セットを２以上参照条件と相関させることにより行う。このサンプルを参照と直接相関させるというよりも、既知のクラスに属するサンプルを用いて高い程度の予測成功をもたらすことが従前に確認されているモデルファイルから遺伝子のサブセットを選択することができる。このアルゴリズムはまた、別のまたは新たな遺伝子モデルを発見するために新たなデータに適用することもできる。
【００９９】
以下の実施例は例示目的で示される。これらは本発明の特定の態様および実施形態を示すことを意図し、本発明を何ら限定するものではない。
【実施例】
【０１００】
実施例１：腎臓移植における急性拒絶を評定するための組成物および方法の開発のための研究計画
異なる年齢、異なる免疫抑制、および移植センター特異的プロトコールを受けたレシピエントにおける急性拒絶（ＡＲ）診断および予測のための簡単な血液ＱＰＣＲ検査を開発するために、腎臓移植における急性拒絶（ＡＡＲＴ）の評定試験を、世界８か所の腎臓移植センターでの共同努力において計画し、４３８名の成人および小児腎臓移植患者由来の５５８の末梢血（ＰＢ）サンプルを使用した。
【０１０１】
図１は、世界８か所の移植センターからの４３８名のユニークな成人／小児腎臓移植患者における腎臓移植における急性拒絶（ＡＡＲＴ）の評定研究計画を示す：エモリー、ＵＣＬＡ、ＵＰＭＣ、ＣＰＭＣ、ＵＣＳＦ、およびバルセロナが寄与した成人サンプル、メキシコ、およびスタンフォード小児サンプル。ＡＲ  ＱＰＣＲ分析については、サンプルを４つのコホート：遺伝子モデル化のためのコホート１  ｎ＝１４３成人サンプル；独立ＡＲバリデーションのためのコホート２  ｎ＝１２４成人／小児サンプル；ＡＲ予測のためのコホート３  ｎ＝１９１成人／小児サンプル；最終的なＡＲアッセイ固定および臨床解釈のためのコホート４：ｎ＝１００成人／小児サンプルに分けた。
【０１０２】
臨床経過観察受診の際に移植レシピエントから横断的に血液サンプルを採取し、同時腎臓同種移植生検と照合させた。本ＡＡＲＴ試験に参加したセンターは、スタンフォード大学（スタンフォード；ｎ＝１６２小児サンプル）；Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｏ  ｄｅ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｃｉｏｎ  ｅｎ  Ｎｅｆｒｏｌｏｇｉａ，Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｉｎｆａｎｔｉｌ  ｄｅ  Ｍｅｘｉｃｏ（Ｍｅｘ；ｎ＝２３小児サンプル）；エモリー大学、アトランタ、ジョージア州（エモリー、ｎ＝４３成人サンプル）；カリフォルニア大学ロサンゼルス校、ロサンゼルス、ＣＡ（ＵＣＬＡ、ｎ＝１０５成人サンプル）；ピッツバーグ大学、ピッツバーグ、ＰＡ（ＵＰＭＣ、＝１３２成人サンプル）；カリフォルニア・パシフィック・メディカルセンター、サンフランシスコ、ＣＡ（ＣＰＭＣ、ｎ＝３７成人サンプル）；カリフォルニア大学サンフランシスコ校、サンフランシスコ、ＣＡ、（ＵＣＳＦ、ｎ＝４０成人サンプル）；ベルビッジェ大学病院、バルセロナ、スペイン（バルセロナ、ｎ＝１６サンプル）であった。サンプルを、遺伝子選択とモデルトレーニングのための１４３のＡＲおよび非ＡＲ成人サンプル（コホートＩ）のトレーニングセット、ＡＲ検出用の遺伝子のバリデーションのための１２４のＡＲおよび非ＡＲ成人（＞２１歳）および小児（＜２１歳）サンプル（コホート２）の第１バリデーションセット、およびＡＲ予測の評価のための、拒絶生検の前と後の６か月以内に一連の採取を行った１９１の成人および小児サンプル（コホート３）の第２の予測的バリデーションセットに分けた。これらの３コホートを構成する血液サンプルを同時にマイクロ流体ハイスループットフリューダイムＱＰＣＲプラットフォーム（Ｂｉｏｍａｒｋ、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ  Ｉｎｃ．、サンフランシスコ、ＣＡ）で、合計４３の遺伝子に関して測定した。ＡＲの非侵襲的検出のための１７遺伝子の最終的な腎臓ＡＲ予測アッセイは、新規な数学アルゴリズム（ｋＳＡＳ）の開発を伴うＡＢＩ  ＱＰＣＲプラットフォームにて、１００の成人および小児サンプル（コホート４）の独立バリデーションセットに固定された（図１−研究計画、および表４、表５、患者の人口統計）。
【０１０３】
【表４】
2020039344.tif 000012
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【０１０４】
【表５】
2020039344.tif 000014
実施例２：血液サンプル
ユニークな小児（移植時のレシピエントの年齢＝０．８〜２１．９歳；ｎ＝２００）および成人（移植時のレシピエントの年齢＝２３〜７８歳；ｎ＝３１５）腎臓移植レシピエントに由来する末梢血サンプル（ｎ＝５１８）を、生検により確認された急性腎臓同種移植片拒絶の非侵襲的診断のための一般末梢血遺伝子パネルの開発に用いた。２００サンプルの小児コホートのうち１７７サンプルは、１２の米国移植センターから組織学的にグレード分類されたＡＲを有する患者と有さない患者の両方が組み入れられた前向き多施設共同ＮＩＨ／ＮＩＡＩＤ助成臨床試験の一環として従前に得られたものであった（ＳＮＳ０１；ＮＣＴ００１４１０３７；www.ClinicalTrials.gov; Li, L., et al. Am. J. Transplant. 2012, 12, 2710-2718）。残りの２３サンプルは、本試験のためにｔｈｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｏ  ｄｅ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｃｉｏｎ  ｅｎ  Ｎｅｆｒｏｌｏｇｉａ、Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｉｎｆａｎｔｉｌ  ｄｅ  Ｍｅｘｉｃｏからのみ得られたものであった。３１５サンプルの成人コホートのうち、米国およびヨーロッパの６か所の移植センターからサンプルが得られた（ｎ＝４８：エモリー大学、アトランタ、ジョージア州、外科（エモリー）；ｎ＝９７：カリフォルニア大学ロサンゼルス校、ロサンゼルス、ＣＡ、免疫遺伝学センター（ＵＣＬＡ）；ｎ＝９２：ピッツバーグ大学、ピッツバーグ、ＰＡ、Ｅ．Ｓｔａｒｚｌ移植センター（ピッツバーグ）；ｎ＝３９：カリフォルニア・パシフィック・メディカルセンター、サンフランシスコ、ＣＡ（ＣＰＭＣ）；ｎ＝２３：カリフォルニア大学サンフランシスコ校、サンフランシスコ、ＣＡ、腎臓科（ＵＣＳＦ）；ｎ＝１６：ベルビッジェ大学病院、腎臓移植ユニット  バルセロナ、スペイン（バルセロナ））。本試験は全ての現地ＩＲＢ委員会により承認され、全患者がインフォームド・コンセントにより参加に同意した。
【０１０５】
本試験の各末梢血サンプルは、同じ患者からの同時（４８時間以内）腎臓同種移植生検と対となるようにした。監視生検は全ての患者から、移植時、移植後３、６、１２、および２４か月の時点、ならびに移植片の機能不全が疑われた時点で得た。各生検が決定的な表現型診断を有する限り、同じ患者からの複数の末梢血−生検対を使用した。各生検は、Ｂａｎｆｆ分類(Solez, K. et al. Am. J. Transplant., 2008, 8, 753-760; Mengel, M. et al. Am. J. Transplant. 2012, 12, 563-570)に従い、各登録臨床サイトに関して、中央の病理学者によりスコア化された。末梢血−生検対は、「急性拒絶」（ＡＲ；ｎ＝１３０）、「安定」（非ＡＲ）または「その他」診断（その他）として類別された。「急性拒絶」は、Ｂａｎｆｆ尿細管炎スコア（ｔ）が≧１であり、間質性浸潤物スコアが≧０であるサンプルに対して定義された。「安定」は、ＡＲまたは他の任意の実質的病態の不在を示すサンプルに関して定義された。「その他」は、サンプルに関して定義された。Ｂａｎｆｆによりグレード分類されたＡＲの不在を示すが、慢性同種移植損傷（ＣＡＩ；サンプルのＩＦＴＡグレードは≧１である；ｎ＝５１）、慢性カルシニュリン阻害剤毒性（ＣＮＩＴ；ｎ＝１９）、ＢＫウイルス感染（ＢＫＶ；ｎ＝３）、または他の移植片損傷（ＯＧＩ；ｎ＝１５３）のＢａｎｆｆ判定基準のいずれかを満たすサンプルに関して定義される。
【０１０６】
実施例３：患者
成人および小児セットＩ
表５は成人および小児セットＩを示す。
【０１０７】
一例では、小児サンプルと成人サンプルを合わせたものを、テスト（ｎ＝２３６；１４３名の成人、９３名の小児）およびバリデーション（ｎ＝２９２；２０８名の成人、８４名の小児、表５）のための２群に分けた。
【０１０８】
成人および小児セットＩＩ
別の例では、小児サンプルと成人サンプルを合わせたものをトレーニングおよびテスト（ｎ＝１４３名の成人）、バリデーション（ｎ＝１２４；５９名の成人、６５名の小児）、および独立予測（ｎ＝１９１；１３０名の成人、６１名の小児、表４）のための３群に分けた。
【０１０９】
成人および小児セットＩＩＩ
別の例では、小児サンプルと成人サンプルを合わせたものをバリデーションのために１００サンプルに分けた（７７名の成人、２３名の小児、表４）。
【０１１０】
実施例４：血液サンプルの採取およびＲＮＡの処理
血液サンプルの採取
血液は、２．５ｍＬのＰＡＸｇｅｎｅ（商標）血液ＲＮＡチューブ（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉＸ、Ｑｉａｇｅｎ、バレンシア、ＣＡ）または末梢血リンパ球（ＰＢＬ）単離用のフィコールチューブに採取した。ＰＢＬサンプルは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘシステムでのマイクロアレイ・ディスカバリーにのみ使用した。ＰＡＸｇｅｎｅ（商標）チューブにはＰｒｅＡｎａｌｙｔｉｘの列に基づく方法キット（Ｑｉａｇｅｎ）またはＰＢＬサンプルにはＲＮｅａｓｙ（Ｑｉａｇｅｎ）を製造者のプロトコール従って用いて全ＲＮＡを抽出した。
【０１１１】
ＲＮＡ抽出
全ＲＮＡを、２１００バイオアナライザーにてＲＮＡ  ６０００  Ｎａｎｏ  ＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）キット（両方ともＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、サンタクララ、ＣＡ）を用いてＲＮＡの完全性に関して評価した。なお、好適なＲＮＡはＲＮＡ  ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ  ｎｕｍｂｅｒ（ＲＩＮ）が７を超える場合と定義される(Fleige, S. and Pfaffl, M. W. Mol. Aspects. Med. 2006, 27, 126-139.; Schroeder, A. et al. BMC Mol. Biol. 2006, 7, 3)。
【０１１２】
ｃＤＮＡの合成
ｃＤＮＡの合成は、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩ第1鎖ｃＤＮＡ合成キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスバッド、ＣＡ）を製造者のプロトコールに従って用い、末梢血サンプルからの抽出品質のｍＲＮＡ２５０ｎｇを用いて行った。
【０１１３】
実施例５：ＱＰＣＲ
マイクロ流体ＱＰＣＲのための全ＲＮＡサンプルの調製
マイクロ流体ｑＰＣＲ分析向けのサンプルは、特異的標的増幅のためのｃＤＮＡ合成からの１．５２ｎｇ（相対量）の全ＲＮＡとサンプル希釈溶液を用い、フリューダイムプロトコール（Ｆｌｕｉｄｇｍ、サウスサンフランシスコ、ＣＡ）に従い、１８Ｓを除く各検討遺伝子に対する個々のＡＢＩ  Ｔａｑｍａｎアッセイをプールしたものを用いて調製した。簡単に述べれば、１．５２ｎｇのｃＤＮＡを用い、プールしたＴａｑｍａｎアッセイをＴａｑｍａｎ  ＰｒｅＡｍｐ  Ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ（ＡＢＩ）と複合化して、最終容量５μＬで特異的標的増幅を行った。増幅は、サーマルサイクラー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｖａｐｏ−Ｐｒｏｔｅｃｔ、ハンブルク、ドイツ）にて１８サイクルの後に達成された。次に、サンプルを無菌水（Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールズバッド、ＣＡ）で１：５希釈した。
【０１１４】
ＱＰＣＲ
マイクロ流体ｑＰＣＲは、９６．９６  Ｄｙｎａｍｉｃ  Ａｒｒａｙ（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）にて、製造者のプロトコールに概説されているように、各ｍＲＮＡに対するＴａｑｍａｎ  Ａｓｓａｙｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、フォスターシティ、ＣＡ）、Ｔａｑｍａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、およびローディング試薬（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）とともに、特異的標的増幅から得られた２．２５μＬの希釈サンプルを用いて行った。このチップをプライムし、ＨＸ  ＩＦＣ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）によってロードし、製造者のプロトコール（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）に示されているように、ＢｉｏＭａｒｋ（Ｆｌｕｉｄｇｍ）にて遺伝子発現データ採取用のデフォルトパラメーターを用い、ｑＰＣＲを行った。標準比較Ｃｔ値を使用し、内部対照参照としての１８Ｓと外部比較参照としてのＵｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを用い、遺伝子発現の相対的変化倍率値を求めた（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖｅｎｌｏ、Ｌｉｍｂｕｒｇ）。
【０１１５】
ＡＢＩ  ＱＰＣＲ
標準プロトコールは、ＡＢＩ  ７９００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ＳｙｓｔｅｍまたはＶｉｉＡ７（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で、標準条件（９５℃で１０分、９５℃で１５秒、６０℃で３０秒の４０サイクル）および遺伝子発現アッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用するｑＰＣＲ反応に従った。ＲＮＡ発現の相対量は比較Ｃｔ法を用いて算出した。発現値は、リボソームＲＮＡ内部参照およびＵｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ（Ｑｉａｇｅｎ．）を用いて１８Ｓに対して正規化した。
【０１１６】
実施例６：データの前処理および正規化
マイクロ流体ＱＰＣＲデータ／前処置および正規化
フリューダイムハイスループットマイクロ流体ｑＰＣＲ技術を用いて４３の遺伝子のより大きな遺伝子パネルの発現を測定するために２３６の成人および小児サンプルからのＲＮＡで行った４２，７９２のｑＰＣＲ反応から得られた生のＣｔ値を、６つの９６．９６マイクロ流体チップ（フリューダイム）から採取した。フリューダイムリアルタイムＰＣＲ分析ソフトウエアによりＣｔ値を抽出し、エクセル（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｏｆｆｉｃｅ  ２０１２、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ、ＣＡ）にアップロードした。テクニカルレプリケートに関する平均Ｃｔ値は、反復に関する標準偏差が＜０．５であった場合に計算した。Ｃｔ値は、ΔＣｔ（ｄＣｔ）法(Livak, K. J. and Schmittgen, T. D. Methods 2001, 25, 402-408)を用い、内在対照遺伝子に対して正規化した。４つの異なる対照遺伝子、リボゾーム１８Ｓ、βアクチン（ＡＣＴＢ）、グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、およびβ−２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）を検定した。１８Ｓが全てのサンプルで最小の変動を示したことから、それをｄＣｔ値の計算のために選択した。欠損値は５個の近傍を用いるＫ近傍法(K nearest neighbor)（ＫＮＮ；Troyanskaya, O. et al. Bioinformatics 2001, 17, 520-525）により入力した。生のｑＰＣＲデータの可視化は、Ｐａｒｔｅｋ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｓｕｉｔｅ  ｖ．  ６．６（Ｐａｒｔｅｋ  Ｉｎｃ．、ＵＳＡ）にて、教師なしの主成分分析(Principal Component Analysis)（ＰＣＡ）および階層的クラスタリングを用いて行った。遺伝子発現の交絡因子はＰＣＡおよび分散分析（ＡＮＯＶＡ）により特定し、Ｐａｒｔｅｋ（カテゴリー因子と数値因子を組み合わせた混合モデルＡＮＯＶＡ）でのバッチ効果除去のより、また、ＳＶＡＲパッケージ内のコンバットファンクション(combat function)とともに経験ベイズ法を使用することにより補正した。この方法は小規模なサンプルのアウトライアーに対してロバストなものである(Chapelle, O., Haffner, P., and Vapnik, V. N. IEEE Trans. Neural Netw. 1999, 10, 1055-1064)。次に、４３遺伝子のより大きなパネルのための正規化発現データを、以下に概略を示すように、ＡＲと非ＡＲの間の差次的発現遺伝子の同定のため、また、異なる年齢群のＡＲの機序のより良い理解のため、また、ＡＲの最高の予測力、感度、および特異度を有する遺伝子の選択ために用いた。
【０１１７】
Ｐａｒｔｅｋにおけるバッチ効果除去を用いたマイクロ流体ＱＰＣＲデータにおける交絡因子の補正
１４３のＡＲおよび非ＡＲサンプルの成人データセットにおいて、サンプル間の差次的遺伝子発現に対するＲＮＡソース、ＰＣＲプレートのテクニカル効果、および移植センターの外的効果を混合ＡＮＯＶＡモデルで評価した。ＲＮＡソース、ＰＣＲプレート、および移植センターはランダムカテゴリー因子として含まれ、表現型（ＡＲ、非ＡＲ）はカテゴリー因子として含まれていた。各因子に関してｐ値を計算し、＜０．０５のｐ値は、特定の遺伝子の差次的発現がＡＮＯＶＡに含まれた因子のいずれか１つに関連していたことを示した。ＡＮＯＶＡモデルに基づくＰａｒｔｅｋのバッチ効果除去の特徴は、マイクロアレイチップが異なるバッチでハイブリダイズされた場合にマイクロアレイデータにおける差次的遺伝子発現の効果を除去するように初期設計されていた。次に、この特徴を用いて、ＲＮＡソース、ＰＣＲプレート、および移植センターのｐ値が１となるようにデータを調整する混合４元配置ＡＮＯＶＡモデルを構築することにより、ＲＮＡソース、ＰＣＲ  プレート、および移植センターの望ましくないランダム因子に関して補正を行う。この方法では、これらの因子による遺伝子発現の違いは無く、表現型のｐ値は最大となった（図１１Ａ〜Ｄ）。
【０１１８】
４３の拒絶遺伝子に関する１４３のＡＲおよび非ＡＲ成人サンプル（コホート１）からのＱＰＣＲデータの主成分分析（ＰＣＡ）により、表現型（図１１Ｂ）によるよりもむしろサンプル採取場所によるサンプル分離が明らかとなった（図１１Ａ）。混合ＡＮＯＶＡによるＱＰＣＲデータの正規化は、遺伝子発現に対するサンプル採取場所の主要な効果を補正し（図１１Ｃ）、ＡＲおよび非ＡＲへのサンプルの分離をもたらした（図１１Ｄ）。ＰＣＡは、４３の遺伝子の相対的遺伝子発現値（ｄＣｔ  １８Ｓ）を用いて行った。混合ＡＮＯＶＡモデルは、ランダムカテゴリー因子としてサンプル採取場所、ＲＮＡソースおよびチップ、ならびにカテゴリー因子として表現型を用いて構築した。各球は一サンプルを表し；記号はサンプル採取場所を表し（＊＝ＵＰＭＣ；Δ＝ＵＣＬＡ；Ｘ＝ＣＰＭＣ；＃＝エモリー）；この図はまた生検診断に基づく患者表現型（ＡＲ；非ＡＲ）も表す。
【０１１９】
Ｒにおける経験ベイズ法を用いたマイクロ流体ＱＰＣＲデータの交絡因子の補正
１４３ＡＲおよび非ＡＲサンプルの成人データセットにおける変数選択の前に、バッチ効果を除去するためにＳＶＡ  Ｒパッケージのコンバットファンクションとともに経験ベイズ法を用い、４３遺伝子の発現を正規化した。この方法は小規模サンプルのアウトライアーに対してロバストなものである。
【０１２０】
Ａｂｉ  ＱＰＣＲデータの処理および正規化
１７遺伝子の発現を測定するための１００の成人および小児サンプルに由来するＲＮＡで行ったＡＢＩ  ＱＰＣＲ反応から得られた生のＣｔ値を、３８４ウェルプレートから採取した。ＡＢＩ  ｖｉｉａ７  ＰＣＲ分析ソフトウエアによりＣｔ値を抽出し、エクセル（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｏｆｆｉｃｅ  ２０１２、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ、ＣＡ）にアップロードした。テクニカルレプリケートに関する平均Ｃｔ値は、反復に関する標準偏差が＜０．５であった場合に計算した。Ｃｔ値は、ここに記載の方法(Livak, K. J. and Schmittgen, T. D. Methods 2001, 25, 402-408)を用い、Δｔ値（ｄＣｔ）の計算のために内部対照遺伝子としてのリボゾーム１８Ｓ  ＲＮＡに対して、さらにまた、ΔΔＣｔ値（ｄｄＣｔ）の計算のためにヒトＵｎｉｖｅｒｓａｌ  ＲＮＡ（Ｑｉａｇｅｎ）に対して正規化した。
【０１２１】
実施例７：ＡＲおよび非ＡＲ特異的遺伝子の選択法
合計４３の遺伝子を、ＡＲおよび非ＡＲ特異的遺伝子の選択に用いた。遺伝子は、小児および成人移植拒絶における従前のマイクロアレイ試験(Li, L. et al. Am. J. Transplant. 2012, 12, 2710-2718; Naesens, M. et al. Kidney Int. 2011, 80, 1364-1376; Sarwal, M. et al. N. Engl. J. Med. 2003, 349, 125-138)に基づき、安定な同種移植（表２）に比べて差次的に変更されかつＡＲに関連していることが確認されたものである。これら合計４３の遺伝子のうち、１０（ＣＦＬＡＲ、ＤＵＳＰ１、ＩＦＮＧＲ１、ＩＴＧＡＸ、ＭＡＰＫ９、ＮＡＭＰＴ、ＮＫＴＲ、ＰＳＥＮ１、ＲＮＦ１３０およびＲＹＢＰ）は、小児腎臓移植においてＡＲの予測モデルの開発に焦点を当てた従前の研究で同定されたものである(Li, L. et al. Am. J. Transplant. 2012, 12, 2710-2718)。残りの３３遺伝子は、種々のタイプの実質臓器移植の安定同種移植に比べてＡＲにおいて、マイクロアレイデータのメタ分析で決定した際に差次的に変更されていた(Khatri et al. JEM, 2013, 出版者受理済み)。
【０１２２】
実施例８：ＡＲと非ＡＲの間の差次的発現遺伝子の同定方法
ＡＲと非ＡＲの間で有意に差次的に発現される遺伝子を検出するため、および年齢群間のＡＲの機序理解を助けるために、一元配置および多元配置ＡＮＯＶＡ、有意に異なる分散の場合にはウェルチ補正を伴う対応のないスチューデントのｔ検定、および多重比較に関して補正するための偽陽性率（ＦＤＲ）の算出を用いた；＜０．０５のｐ値またはＦＤＲ＜５％を有意と見なした（図１２）。
【０１２３】
実施例９：ＡＲおよび非ＡＲを識別する遺伝子の同定方法
１４３の成人サンプルにおけるこれまでに公開されている遺伝子の評価
より大きな４３遺伝子のパネルに由来するこれまでに公開されている１０遺伝子パネル（ＣＦＬＡＲ、ＤＵＳＰ１、ＩＦＮＧＲ１、ＩＴＧＡＸ、ＭＡＰＫ９、ＮＡＭＰＴ、ＮＫＴＲ、ＰＳＥＮ１、ＲＮＦ１３０およびＲＹＢＰ；Li, L. et al., Am. J. Transplant 2012, 12, 2710-2718）を、１４３サンプルの成人検定データセットにおいてＡＲ表現型の識別および予測のために用いた（図１２）。
【０１２４】
２３６の成人および小児サンプルにおける新規な遺伝子の同定
年齢、移植センター、およびＲＮＡソースに依存せず、最小数の遺伝子を用いてＡＲの高い予測力を有する新規な遺伝子パネルを定義するために、２３６サンプルの成人データおよび小児データを合わせたセットに、Ｓｈｒｉｎｋｉｎｇ  Ｃｅｎｔｒｏｉｄｓ(Tibshirani, R. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2002, 99, 6567-6572; Storey, J. D. and Tibshirani, R. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2003, 100, 9440-9445)、前進的および後退的選択、および遺伝的アルゴリズム(Zhu, Z. et al., IEEE Trans. Syst. Man. Cybern. B Cybern. 2007, 37, 70-76)を適用した。加えて、徹底的な検索を適用し、２３６のサンプルにおいて分析した４３の遺伝子から５遺伝子のあり得る全ての組合せを検索することによって上位ランク遺伝子を定義した。Ｓｈｒｉｎｋｉｎｇ  Ｃｅｎｔｒｏｉｄｓアプローチにおいて、４３の遺伝子からあり得る全ての遺伝子組合せを、最小数の遺伝子セットを５、最大数の遺伝子セットを２０として、１遺伝子刻みで一度に検定した。遺伝子をそれらのＡＲ予測確率に関して交差検証（１−ＬＬＯＣＶ）によって検定した。合計１８７２のモデルを、１１７の異なるアルゴリズムを用いて検定した。結果を、遺伝子の数、および５遺伝子から４３遺伝子の範囲の同じ遺伝子組合せのＡＵＣに従ってランク付けした。結果として最高の平均ＡＵＣを有する組合せを選択した。前進的選択（ステップアップ）および遺伝的アルゴリズムにおいて、遺伝子パネルの増加数を検定した：ｎ＝５、７、１０、１２、１３、１５、１７、および２０をそれぞれ上記のような１１７の異なるアルゴリズムを用いて検定した。結果を比較し、これらのモデルの少なくとも５０％で選択された最終遺伝子を選んだ。この遺伝的アルゴリズムでは、遺伝子パネルが無作為に選択された初期集団を、各遺伝子が少なくとも５０回検定されるように定義した。以下の集団を検定した：下式：
【数１】
2020039344.tif 000015
【０１２５】
（式中、Ｎは初期集団サイズであり、ｎは遺伝子パネルのサイズであり、５０はある遺伝子が初期集団に現れなければならない回数を表し、４３は引き出される遺伝子の合計数である）（図１２）に従い、ｎ＝５、７、１０、１２、１３、１７、および２０の遺伝子パネルについてそれぞれ４３０、３０８、２１５、１８０、１６６、１２７、および１０８。
【０１２６】
１４３の成人サンプルにおける新規な遺伝子の同定
変数選択の前に、バッチ効果を除去するために、経験ベイズ法をＳＶＡ  Ｒパッケージのコンバットファンクションとともに用いることによって遺伝子を正規化した。この方法は小規模なサンプルのアウトライアーに対してロバストなものである。このデータは、１４３の観測値および４３の遺伝子と、疎であることから、本発明者らは、Ｒパッケージを用いて患者サンプルを分類するためにペナルティ付きロジスティック回帰を使用した。このアプローチにより、回帰係数の正確な推定値だけでなく、各患者の確率推定値も得られる。本発明者らは、評価のためのＣｏｏｒｄｉｎａｔｅ  Ｄｅｓｃｅｎｔによる一般線形モデルに関する正側化パスを用いた（図１２）。
【０１２７】
実施例１０：ＡＲおよび非ＡＲを判別するための遺伝子の評価方法
遺伝子選択を、ＡＲの判別および予測に関して、等しいおよび比例する事前確率を有する判別分析(Discriminant Analyses)（ＤＡ）、サポートベクターマシーン(Support Vector Machine)（ＳＶＭ）、ロジスティック回帰(logistic regression)（ＬＲ）および等しい事前確率の部分最小二乗ＤＡ(Chapelle, O. et al., IEEE Trans. Neural Netw. 1999, 10, 1055-1064; Brown, M. P. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 2000, 97, 262-267)の、核関数ラジアル基底関数(radial basis function)（ｒｂｆ）、部分最小二乗（partial least square）（ｐｌｓ）ＤＡ(Perez-Enciso, M. and Tenenhaus, M. Hum. Genet. 2003, 112, 581-592; Gottfries, J. et al., Dementia 1995, 6, 83-88)との併用によって評価した。ＳＶＭ分類では、経験分類誤差の最小化と幾何学幅の最大化を同時に行うことによってＡＲと非ＡＲの最も広い分離を与えた決定面を定義する最良の一般非線形ベクター（「サポートベクター」）を見出すために、正側化パスラジアル基底関数（ｒｂｆ）を使用する。ＳＶＭは、特徴（遺伝子）およびサンプル数の希薄なデータセットに対して十分な性能を示す(Nouretdinov, I. et al., Neuroimage 2011, 56, 809-813)。第一種過誤を最小にするために、データセットを分離したトレーニングセットとテストセットに分けるのではなく、１０分の１レベル一個抜き交差検証(a ten-fold one level leave one-out cross validation)（１−ＬＬＯＣＶ）を行った。成人データセットと小児データセットを合わせたものでこれらの遺伝子による予測力、感度、および特異度を評定するために、各分類法にＡＲの曲線下面積（ＡＵＣ）および事後確率を与えた。各遺伝子選択アプローチから最高のＡＲ予測力、最高の感度、および最高の特異度を有する遺伝子を、ＡＢＩプラットフォーム（Ａｂｉ  ｖｉｉａ７、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、フォスターシティ、ＣＡ）でのｑＰＣＲ用の１７遺伝子の最終選択のために比較した。必要な場合には、ＡＲと非ＡＲを比較するスチューデントのＴ検定およびＡＮＯＶＡからのｐ値およびＦＤＲ値を使用した。最終遺伝子選択のワークフローを図１２に示す。
【０１２８】
実施例１１：フリューダイムＱＰＣＲデータにおけるＡＲと非ＡＲの分類のためのアルゴリズムの開発方法
１７遺伝子を用いた２３６の小児および成人サンプルにおけるアルゴリズムの同定
合計１２２の分類アルゴリズムを、選択された遺伝子（合計１７）を用い、２レベル一個抜きネステッド交差検証(two level-leave one out nested cross validation)（２−ＬＬＯＣＶ）および５アウター、５インナーのデータ分割で検定した。「インナー」交差検証(cross validation)（ＣＶ）は、予測因子変数と最適モデルパラメーター選択のために行い、「アウター」ＣＶは、分類子に関して総合的精度推定値を得るために用いた。「インナー」ＣＶは、テストセットの提供に適用される最適モデルを選択するために、テストデータとして提供されなかったトレーニングデータで行った。２３６サンプルで検定された分類モデルは、判別関数および等しいまたは比例する事前確率、ユークリッド距離測度、平均ユークリッド距離測度またはコサイン非類似性距離測度および５個の近傍を用いるＫＮＮ、等しいまたは比例する事前確率、ＬＲ、およびＳＶＭを用いる最近傍重心を含んだ。
【０１２９】
１７遺伝子を用いた１４３の成人サンプルにおけるアルゴリズムの同定
合計１２２の分類アルゴリズムを、１４３の成人サンプルにおいて、選択された遺伝子（合計１７）を用い、２レベル一個抜きネステッド交差検証（２−ＬＬＯＣＶ）および１０アウター、１０インナーのデータ分割で検定した。「インナー」交差検証（ＣＶ）は、予測因子変数と最適モデルパラメーター選択のために行い、「アウター」ＣＶは、分類子に関して総合的精度推定値を得るために用いた。「インナー」ＣＶは、テストセットの提供に適用される最適モデルを選択するために、テストデータとして提供されなかったトレーニングデータで行った。１４３サンプルで検定された分類モデルは、等しいまたは比例する事前確率を用いる部分最小二乗判別分析および線形判別分析、サポートベクターマシーン、ユークリッド距離測度、平均ユークリッド距離測度またはコサイン非類似性距離測度および５個の近傍を用いるＫＮＮ、等しいまたは比例する事前確率、およびＬＲを用いる最近傍重心を含んだ。上位モデルを１４３サンプルにおいて、１−ＬＬＯＣＶを用いて評価した。精度の尺度は、正解率、感度、特異度、ＮＰＶ、ＰＰＶ、および受信者動作者曲線下面積（ＡＵＣ）であった。
【０１３０】
１５遺伝子を用いた１４３の成人サンプルにおけるアルゴリズムの同定
本発明者らは、ＡＲと非ＡＲを分類するために、ブートストラップサンプル（２９テスト、１１４トレーニング、置換によるサンプリング）を用い、１００のＥｌａｓｔｉｃ  Ｎｅｔロジスティック回帰モデルを４３の遺伝子に当てはめた。各ブートストラップに関して、ネステッド交差検証ループは、逸脱度に従ってλの最良値を推定した。Ｅｌａｓｔｉｃ−Ｎｅｔのαパラメーターは推奨値の．９５に固定された。これらの遺伝子のランク付けを行うために、本発明者らは、各遺伝子が１００ブートストラップにおいてＥｌａｓｔｉｃ−Ｎｅｔにより選択された回数を数えた。ブートストラップサンプルのそれぞれについて、Ｅｌａｓｔｉｃ−Ｎｅｔは４３の遺伝子のサブセットを非ゼロ係数に当てはめる。１００のブートストラップモデルの実行の後、本発明者らは最大数の非ゼロ係数を有するＫ遺伝子を選択した。第２工程において、予測成績（分類率、感度、特異度、ＰＰｖ、ＮＰｖ）のバイアスのない推定を得るために、本発明者らは、λに対するネステッド交差検証を用い、この場合には工程１で選択されたＫ遺伝子のセットのみを用いて、別のセットの１００ブートストラップＥｌａｓｔｉｃ−Ｎｅｔ分類を復興した。本発明者らは分類率、感度、特異度、陽性的中率（ＰＰｖ）および陰性的中率（ＮＰｖ）を報告する。
【０１３１】
実施例１２：フリューダイムおよびＡＢＩ  ＱＰＣＲデータにおけるＡＲおよび非ＡＲの判別および予測のためのアルゴリズムの開発方法
相関に基づくＡＲおよび非ＡＲ分類の開発
各患者サンプルについてピアソンの相関係数（ρ）を計算するために、ΔＣｔ値をクエリーサンプルとして用い、ＡＲ分類サンプルまたは非ＡＲ分類サンプルのいずれかに関する平均遺伝子ΔＣｔ値と比較した
【０１３２】
各患者サンプルについてピアソンの相関係数（ρ）を計算するために、ΔΔＣｔ値をクエリーサンプルとして用い、ＡＲ分類サンプルまたは非ＡＲ分類サンプルのいずれかに関する平均遺伝子ΔΔＣｔ値と比較した。
【０１３３】
Ｚスコアは、次のように、各サンプルρに関して、全サンプル比較からの全ρ値の平均（μ）および標準偏差（σ）に関して計算する。
【数２】
2020039344.tif 000016
【０１３４】
サンプルを、サンプルＡＲおよび非ＡＲ  ｚスコアの比較（ＡＲまたは非ＡＲにおいてはより大きなｚ）に基づきＡＲまたは非ＡＲとして分類した。これらの関数はＡｌｔＡｎａｌｙｚｅのＬｉｎｅａｇｅＰｒｏｆｉｌｅｒＩｔｅｒａｔｅ．ｐｙモジュールに見出すことができる。
【０１３５】
相関分析は、適用可能であれば、４、５、６、７、８、９、１０、１１および１２遺伝子セットの、全てのあり得る組合せに関して行った。ＡＢＩ分析に関する最良レポートモデルを、サイズの異なる遺伝子セットを比較する場合には、全サンプルのうち正確に分類された患者サンプルのパーセンテージに基づきスコア化した。
【０１３６】
ＡＲと非ＡＲの分類のための相関に基づくアルゴリズムとしてのＬｉｎｅａｇｅＰｒｏｆｉｌｅｒの開発
ＬｉｎｅａｇｅＰｒｏｆｉｌｅｒ（ＬＰ）の名称の新たな相関に基づくオープンソースのアルゴリズムを用い、さらなるｑＰＣＲ評価のために最適な遺伝子モデルの発見のためにさらなる修正を行った。ＬＰの入力はΔΔＣｔ正規化患者サンプルｑＰＣＲ値および２つの参照ｑＰＣＲプロファイル（ＡＲ参照プロファイルおよび非ＡＲ参照プロファイル）である。この分析は５つの工程からなる：工程１：評価した遺伝子のパネルに対してＲＮＡ発現値のマトリックスをインポートする；工程２：各遺伝子について、全ＡＲサンプルからの単一の参照発現ベクター（平均）および全非ＡＲサンプルに対する単一の参照発現ベクターを作出し、保存する；工程３：各ｑＰＣＲセット（遺伝子セット）に関して分析した遺伝子のあり得る全ての組合せを同定する；工程４：患者サンプルを分類するために、各遺伝子セットについて各患者ＲＮＡプロファイルを参照ＡＲプロファイルおよび参照非ＡＲプロファイルと直接比較する（ＬＰを使用）；および工程５：関連の参照プロファイルに関して上位予後リストを同定するために、既知のＡＲおよび非ＡＲ状態に基づく遺伝子セットをランク付けする。１７遺伝子由来の、４〜１２の範囲の数種類の長さの遺伝子セットを、各独特な測定プラットフォーム（フリューダイムまたはＡＢＩ）のため、およびあり得る全ての組合せのために作出した。フリューダイム分析については、全遺伝子で開始して上位スコアモデルを反復同定し、さらにその後の全てのモデルの導出を分析する最適化関数が書かれていた。最も成績のよい遺伝子セットを同定した後、これらの遺伝子セットを固定し、別個のバリデーションデータセットに適用した。対応する参照発現プロファイルを用いた既存のまたは新たなデータセットの分析は、オープンソースソフトウエアＡｌｔＡｎａｌｙｚｅバージョン２．０．８(http://www.altanalyze.org)にてＬＰ関数を用いて行うことができる（図４Ａ〜Ｂ）。
【０１３７】
ＡＲと非ＡＲの分類のための相関に基づくアルゴリズムとしてのｋＳＡＳの開発
サンプルのＡＲまたは非ＡＲとしてのロバストなリスク層別化のため、ｋＳＡＳという名称の新規な相関に基づくアルゴリズムを開発した。大規模なデータセットが評価される発見および交差検証における好適なアプローチである経験ベイズ法およびＡＮＯＶＡなどの方法により外的交絡因子を補正するのではなく、数、サンプル採取場所に依存しない、従って通常の臨床現場により適用度の高いサンプルの正確な前向き予測を可能とする、１７遺伝子パネルに固定されたＡＲおよび非ＡＲ  ＱＰＣＲ参照プロファイルを適用するためにｋＳＡＳを開発した。ｋＳＡＳでは、患者サンプル、および２つの参照ＱＰＣＲプロファイル（１つは既知のＡＲ用、１つは既知の非ＡＲ用）においてＱＰＣＲ  ｄＣｔ（１８Ｓ）値を使用する。ｋＳＡＳ分析は、トレーニングおよびテストのために５つの主要工程を含んでなる：１）全サンプルに対して１７遺伝子ｄＣｔ（１８Ｓ）発現マトリックスをインポートする、２）各遺伝子に対する既知のＡＲ発現ベクターおよび非ＡＲ発現ベクターを定義する；３）全遺伝子で開始して上位スコアモデルを反復同定する最適化関数を用いてあり得る全ての遺伝子の組合せを同定する；４）各患者について得られた全てのモデルを参照ＡＲおよび非ＡＲプロファイルと比較して、相関度（ピアソン相関係数）に基づき患者サンプルを分類する；５）上位予後リストを同定するために、相関により遺伝子セットをランク付けする。各患者サンプルについてピアソンの相関係数（ρ）を計算するために、本発明者らは、クエリーサンプルの各遺伝子のｄＣｔ（１８Ｓ）値を、ＡＲまたは非ＡＲいずれかの参照の同じ遺伝子の平均ｄＣｔ（１８Ｓ）値と比較する。得られた各遺伝子モデルについて、ＡＲ  ρ−非ＡＲ  ρ×１０を計算することによりリスクスコアを算出した。得られた全てのモデルリスクスコアを合計し、各サンプルに関する統合ＡＲリスクスコアを得た。サンプルは、サンプルＡＲおよび非ＡＲリスクスコア（ＡＲまたは非ＡＲにおいてより大きな相関）の比較に基づきＡＲまたは非ＡＲとして分類された。相関分析は、適用可能であれば、４、５、６、７、８、９、１０、１１および１２遺伝子セットのあり得る全ての組合せについて行った。最良レポートモデルを、サイズの異なる遺伝子セットを比較する場合には、全てのサンプルのうち正確に分類された患者サンプルのパーセンテージに基づきスコア化した。遺伝子セットの例は表２にある。ＡＲおよび非ＡＲプロファイルにおける採取場所に関連する変動に取り組むためには、各採取場所に対する個別のＡＲ参照および非ＡＲ参照は、各モデルについての相関により導かれたリスクスコアを算定する場合には、各個人サンプル比較のための最も相関の高い場所参照対を選択するために単一の表に示した（図９Ａ〜Ｃ）。
【０１３８】
相関に基づくＡＲと非ＡＲの分類のための新規参照データの作出
新規移植センターに関して参照を使用するためには、未知のサンプルの分析の前に、同じ方法で未知のサンプルとして採取されＡＲまたは非ＡＲとして分類される血液を採取し、推奨される１２遺伝子モデルセット（下記参照）を用いてプロファイリングを行うべきである。機械およびサンプル採取センターのバイアスがこれまでに見られていたことから、これらのサンプルは移植センター特異的参照として役立つ。十分な数のサンプルに対してｑＰＣＲプロファイルを得た後に、全てのＡＲサンプルおよび非ＡＲサンプルの平均発現を個別に採り、アッセイした全ての遺伝子について２列参照を作成した。あるいは、個々のサンプルの代わりにプールしたＲＮＡ参照の使用でも十分なはずである。このデータは、第１列が遺伝子ＩＤを含み、第２および第３列がそれぞれＡＲ参照および非ＡＲ参照を含む、３列タブ区切りテキストファイルとして保存する。まず、これらの参照サンプル間に有意な変動性が存在するかどうか（例えば、ＡＲサンプルと非ＡＲサンプル間の不十分な分類スコア）を決定するためのこの参照に用いたオリジナルサンプルの再分析が奨励される。
【０１３９】
実施例１３：フリューダイムおよびＡＢＩ  ＱＰＣＲデータにおけるＡＲおよび非ＡＲの判別および予測のための相関に基づくアルゴリズムの評価方法
非移植データにおけるｋＳＡＳの評価
ｋＳＡＳをＡＲ患者および非ＡＲ患者のデータに適用する前に、本発明者らは、従前に記載されている、ＧＥＩＣＡＭ／９９０６臨床試験から得られた８１４サンプルに適用された５０の乳癌予後マーカー遺伝子のＱＰＣＲ分析に対してこのアプローチを評価した。ｋＳＡＳは、無作為に選択した患者テストセット（２７２の患者サンプル）を、残りのサンプルで参照作成（トレーニング）を行った後に、５つの明瞭に異なる予後乳癌群に上手く分類することができ、５０全てのマーカー遺伝子を用いて成功率は＞８５％であった。２４および２５遺伝子のより小さな予後遺伝子モデルもまた、トレーニングセットにおいてより高いパーセンテージ（９０．０％対８５．６％）およびテストセットにおいて同等の精度（８３．１〜８３．８％）で患者を分類することができた。
【０１４０】
１４３の成人フリューダイムＱＰＣＲデータにおけるｋＳＡＳの評価
本発明者らは、１４３の成人サンプル（コホート１）の同じ正規化データセットでｋＳＡＳを評価した。参照ＡＲプロファイルおよび参照非ＡＲプロファイルをコホート１のランダム２／３トレーニングサンプルセットから、４３全ての遺伝子について得た。次に、このトレーニングセットを、上位スコア遺伝子モデルを同定するために、サイズの等しい１０のＡＲ／非ＡＲ  ２／３および１／３セットにプログラムによりさらに再分割した。このトレーニングセットからの最高スコアモデルを、トレーニングセットＡＲ参照プロファイルおよび非ＡＲ参照プロファイルを用いて、オリジナル１／３トレーニングセットで評価した。
【０１４１】
１００の成人および小児ＡＢＩ  ｖｉｉａ  ＱＰＣＲデータによるにおけるｋＳＡＳの評価
本発明者らは、１００の成人および小児サンプルにおいて、ｋＳＡＳにより定義された１３全ての１２遺伝子モデルの、単一の遺伝子モデルに基づくものではないが１３全ての１２遺伝子モデルを含む、各患者についての単一の信頼スコアを提供する組合せ能を評価した。本発明者らは、１００のＡＲおよび非ＡＲサンプル（２６のＡＲ、４２の非ＡＲ）の合わせたデータセットに関する統合ＡＲリスクスコアを算出した。統合ＡＲリスク分析  は、１３の１２遺伝子モデルによって患者が非ＡＲと予測された回数を、同じ患者がＡＲと予測された回数から差し引くことによって、各患者に関する数的ＡＲリスクスコア（−１３〜１３）を生成した。この統合リスクスコアに基づき、患者は高リスクＡＲ、低リスクＡＲまたは中リスクとして類別することができる。高リスクＡＲのカットオフは統合スコア≧９であり、低リスクＡＲは統合スコア≦−９であった。統合スコア≧−７および≦７の患者は中リスクと見なされた（図９Ｃ）。
【０１４２】
実施例１４：ＡＲと非ＡＲの分類のための相関に基づくアルゴリズムのためのソフトウエアの開発方法
本明細書に記載の相関に基づく分析は、ＡｌｔＡｎａｌｙｚｅバージョン２．０．８以降を用いて行うことができる。ＬｉｎｅａｇｅＰｒｏｆｉｌｅｒは、オープンソースソフトウエアＡｌｔＡｎａｌｙｚｅ(http://code.google.com/p/altanalyze/downloads, version 2.0.8 or higher)のグラフィック・ユーザー・インターフェースから、また、スタンドアロンｐｙｔｈｏｎスクリプトとして(https://github.com/nsalomonis/LineageProfilerIterate)入手可能である。ＡｌｔＡｎａｌｙｚｅは、http://www.altanalyze.orgからダウンロードし、ハードドライブに抽出し、初回起動の後にプロンプト（現在、ＥｎｓＭａｒｔ６５）が表示された際に最新のヒトデータベースとともにインストールすることができる。あるいは、ＬｉｎｅａｇｅＰｒｏｆｉｌｅｒ・ファンクションは、このソフトウエアのコマンドラインバージョンを、https://github.com/nsalomonis/LineageProfilerIterateで入手可能なgene model discoveryのオプションとともに用いて実行することもできる。ＬｉｎｅａｇｅＰｒｏｆｉｌｅｒのスタンドアロン・グラフィック・ユーザー・インターフェース・バージョンおよびコマンド・ライン・バージョンの実行命令は、http://code.google.com/p/altanalyze/wiki/SampleClassificationに記載されている。ＬｉｎｅａｇｅＰｒｏｆｉｌｅｒのソースコードは、本明細書に記載の実施形態で使用するために修正され、ＬｉｎｅａｇｅＰｒｏｆｉｌｅｒ  Ｉｔｅｒａｔｅとなっている。本明細書で使用する場合、修正版ＬｉｎｅａｇｅＰｒｏｆｉｌｅｒであるＬｉｎｅａｇｅＰｒｏｆｉｌｅｒ  ＩｔｅｒａｔｅおよびｋＳＡＳは互換的に使用される。ｋＳＡＳのソースコードは、付表Ｃに示されている。このソフトウエアを用いて、所与のサンプルセットに関する定量的発現値を、特定の疾患クラス、表現型、または処置カテゴリーに属すとして分類することができる。簡単に述べると、このアルゴリズムはこれを、所与のサンプルに関する発現値の入力セットを２以上参照条件と相関させることにより行う。このサンプルを参照と直接相関させるというよりも、既知のクラスに属するサンプルを用いて高い程度の予測成功をもたらすことが従前に確認されているモデルファイルから遺伝子のサブセットを選択することができる。このアルゴリズムはまた、別のまたは新たな遺伝子モデルを発見するために新たなデータに適用することもできる。
【０１４３】
ΔＣｔ値（ｄＣｔ）を用いたｋＳＡＳにおけるＡＲおよび非ＡＲ分類のための発現ファイルの開発
ＡＲ分類は、ＡＲおよび非ＡＲ判別遺伝子のパネルに関するｑＰＣＲにより誘導される発現値を対照１８Ｓ遺伝子とともに用いて実行される。ＡＢＩ  ｖｉｉａ７プラットフォームにてｑＰＣＲから生成したΔＣｔ値（１８Ｓと比較）がこのアルゴリズムの未知のサンプル入力として使用される。さらに、参照ＡＲプロファイルおよび参照非ＡＲプロファイル（ｄＣｔ）を含む参照ファイルもこのソフトウエアに供給される。
【０１４４】
ΔＣｔ値（ｄＣｔ）を用いたｋＳＡＳにおけるＡＲおよび非ＡＲ分類のための発現ファイルの開発
ＡＲ分類は、ＡＲおよび非ＡＲ判別遺伝子のパネルに関するＱＰＣＲにより誘導される発現値を、対照１８Ｓ遺伝子とともに用いて実行される。ＡＢＩ  ｖｉｉａ７プラットフォームにてＱＰＣＲから生成した、１８ＳおよびユニバーサルヒトＲＮＡとの比較によるΔΔＣｔ値がこのアルゴリズムの未知のサンプル入力として使用される。さらに、参照ＡＲプロファイルおよび参照非ＡＲプロファイル（ｄｄＣｔ）を含む参照ファイルもＱＰＣＲデータから導かれる。
【０１４５】
ΔＣｔ値を用いたｋＳＡＳにおけるＡＲ分類のための発現ファイルの作成
発現ファイルは、file extension .txt.を有するタブ区切りテキストファイル形式の正規化発現値（ｑＰＣＲΔＣｔ値）からなる。このファイルの第１列は、参照ファイルの第１列に一致するＩＤ（遺伝子記号）を含み、第１行はサンプル名を含み、残りのデータは正規化発現値（すなわち、ΔＣｔ値）からなる。
【０１４６】
参照ファイルは、発現ファイルに見られるものと同じ値の範囲でのＡＲ  ｑＰＣＲΔＣｔ値と非ＡＲ  ｑＰＣＲΔＣｔ値の複合体である。このファイルの全ての遺伝子記号は、発現ファイルに存在するものと一致すべきである。ソフトウエアの実行の際に、参照ファイルと発現ファイルの値が全体的に低い相関を示す場合（＜９０％）には警告が与えられる。理想的には、報告される相関係数の範囲は０．９２〜０．９６またはそれを超えるべきである。そうではない場合には、試験を繰り返すかまたはさらなる品質対照に関して評価する必要のある場合がある。
【０１４７】
ΔΔＣｔ値を用いたｋＳＡＳにおけるＡＲ分類のための発現ファイルの作成
発現ファイルは、file extension .txt.を有するタブ区切りテキストファイル形式の正規化発現値（ｑＰＣＲΔΔＣｔ値）からなる。このファイルの第１列は、参照ファイルの第１列に一致するＩＤ（遺伝子記号）を含み、第１行はサンプル名を含み、残りのデータは正規化発現値（すなわち、ΔΔＣｔ値）からなる。
【０１４８】
参照ファイルは、発現ファイルに見られるものと同じ値の範囲でのＡＲ  ｑＰＣＲΔΔＣｔ値と非ＡＲ  ｑＰＣＲΔΔＣｔ値の複合体である。このファイルの全ての遺伝子記号は、発現ファイルに存在するものと一致すべきである。ソフトウエアの実行の際に、参照ファイルと発現ファイルの値が全体的に低い相関を示す場合（＜９０％）には警告が与えられる。理想的には、報告される相関係数の範囲は０．９２〜０．９６またはそれを超えるべきである。そうではない場合には、試験を繰り返すかまたはさらなる品質対照に関して評価する必要のある場合がある。
【０１４９】
グラフィック・ユーザー・インターフェースを介したｋＳＡＳにおけるＡＲおよび非ＡＲ分類のためのｋＳＡＳの使用
このアルゴリズムもまた、オープンソース分析パッケージＡｌｔＡｎａｌｙｚｅで利用可能であり、別にインストールする必要はない。ＡｌｔＡｎａｌｙｚｅは、いくつかの異なる分析機能を含む大きなトランスクリプトーム分析ツールキットである。ＡｌｔＡｎａｌｙｚｅは大規模データベースのインストールを必要とするので、スクリプトのコマンドラインバージョンの使用が勧められる。
【０１５０】
ＡｌｔＡｎａｌｙｚｅの最新バージョンをインストールするためには、以下の５工程に従えばよい：１）http://code.google.com/p/altanalyze/downloadsへ行く；２）所与のオペレーティングシステムに適当な最新バージョンを探し当て、ダウンロードリンクに従う；３）ハードドライブおよびアクセス可能な場所にに.zipまたは.dmgファイルを抽出する；４）ＡｌｔＡｎａｌｙｚｅプログラムフォルダを開き、実行可能なAltAnalyze.exe（ウィンドウズ(登録商標)）または等価なものをダブルクリックする；５）小規模データベース（例えば、トウモロコシ(Zea mays)）をダウンロードする手順を行い、“Download/update all gene-set analysis databases”のオプションの選択を解除する（提供されている遺伝子注釈はサンプルの分類には必要とされない）。
【０１５１】
入力ファイルは、未知のサンプル用の発現ファイルからなる。参照ファイルは、参照ＡＲサンプルおよび参照非ＡＲサンプル用の発現ファイルからなる。
【０１５２】
モデルファイルは、参照入力ファイルおよび発現入力ファイルの両方で一致するが、遺伝子セットのサブセットに相当しない遺伝子記号からなる。標準的なＡＲ分類パネルは、１３の１２遺伝子モデルからなる。このファイルは毎回の分析に再使用することができる。
【０１５３】
ｋＳＡＳの出力は、全ての参照プロファイルに関連するスコアを含むタブ区切りテキストファイルである。この結果ファイルは、トレーニングセットサンプルの分析のために作成された。
【０１５４】
コマンドラインオプションを介したＡＲおよび非ＡＲ分類のためのｋＳＡＳの使用
ＬｉｎｅａｇｅＰｒｏｆｉｌｅｒＩｔｅｒａｔｅ／ｋＳＡＳスクリプトがダウンロードされれば、それを容易にアクセス可能な場所に移動するべきである。次に、ターミナルウィンドウを開かなければならない（ＰＣでのコマンドプロンプトとも呼ばれる）。ターミナルまたはコマンドプロンプトウィンドウを開くための所与のオペレーティングシステムに対する命令は、オンラインで容易に見つけることができる。次に、ターミナルウィンドウでは、ディレクトリからＬｉｎｅａｇｅＰｒｏｆｉｌｅｒＩｔｅｒａｔｅ／ｋＳＡＳスクリプトを含むフォルダにアクセスすべきである。
【０１５５】
入力ファイル、参照ファイル、およびモデルファイルの３つのファイルを作成する。
【０１５６】
ΔＣｔ発現値を分析するために、入力ファイルおよび参照ファイル用の、ΔＣｔ値を含む３ファイルの記憶位置をＬｉｎｅａｇｅＰｒｏｆｉｌｅｒＩｔｅｒａｔｅ／ｋＳＡＳに提供する。コマンド−−ｉは、サンプルΔＣｔ発現値用である。コマンド−−ｒは、参照発現ファイル用である。コマンド−−ｍは、提供された１３の１２遺伝子モデル用である。このコマンドを実行した後、種々の印刷物が見られる。この時に結果を指定の結果ディレクトリに保存する。
【０１５７】
ΔΔＣｔ発現値を分析するために、入力ファイルおよび参照ファイル用の、ΔΔＣｔ値を含む３ファイルの記憶位置をＬｉｎｅａｇｅＰｒｏｆｉｌｅｒＩｔｅｒａｔｅ／ｋＳＡＳに提供する。コマンド−−ｉは、サンプルΔΔＣｔ発現値用である。コマンド−−ｒは、参照発現ファイル用である。コマンド−−ｍは、提供された１３の１２遺伝子モデル用である。このコマンドを実行した後、種々の印刷物が見られる。この時に結果を指定の結果ディレクトリに保存する。
【０１５８】
ＡｌｔＡｎａｌｙｚｅのｋＳＡＳの実行
上記の手順を用いてＡｌｔＡｎａｌｙｚｅをインストールした後、入力データの分析を実行することができる。このために、適当な発現、参照、およびモデルファイルが必要である。
【０１５９】
ΔＣｔ値を用いてｋＳＡＳを実行するためには、以下の６工程に従えばよい：１）ＡｌｔＡｎａｌｙｚｅを開き、“Begin Analysis”を選択する；２）プラットフォーム分析メニューの“Continue”を選択する；３）“Additional Analyses”を選択し、継続する；４）“Lineage Analysis”を選択し、継続する；４）発現ファイル（ｄＣｔ）、参照ファイル（ｄＣｔ）およびモデルファイルを提供し、継続する；５）分類分析の進行が印刷される；および６）完了したら、継続を選択し、結果フォルダが発現ファイルの記憶場所に提示される。
【０１６０】
ΔΔＣｔ値を用いてｋＳＡＳを実行するためには、以下の６工程に従えばよい：１）ＡｌｔＡｎａｌｙｚｅを開き、“Begin Analysis”を選択する；２）プラットフォーム分析メニューの“Continue”を選択する；３）“Additional Analyses”を選択し、継続する；４）“Lineage Analysis”を選択し、継続する；４）発現ファイル（ｄｄＣｔ）、参照ファイル（ｄｄＣｔ）およびモデルファイルを提供し、継続する；５）分類分析の進行が印刷される；および６）完了したら、継続を選択し、結果フォルダが発現ファイルの記憶場所に提示される。
【０１６１】
ｋＳＡＳにおいて生成された結果の解釈
複数のフィールドがフォルダサンプル分類内の結果ファイルに提示される。タブ区切りテキストファイルはエクセルで開くことができる。データは次のように提示される：
Ａ列：サンプル−サンプル名を示す
Ｂ列：ＡＲ予測ヒット−ＡＲが予測されるモデルの数を示す
Ｃ列：非ＡＲ予測ヒット−非ＡＲが予測されるモデルの数を示す
Ｄ列：コンポジット予後スコア−Ｂ〜Ｃ列のスコアを合わせたもの
Ｅ列：Ｚスコアの差の中央値−Ｇ〜Ｓ列のＺスコアの中央値
Ｆ列：予後リスク−総合的予測リスク評定
Ｇ〜Ｓ列：ＡＲ予測ヒット−各サンプルおよびモデルについての個々のスコア
【０１６２】
予後リスク（Ｆ列）は、サンプルを「高リスクＡＲ」、「中リスクＡＲ」および「低リスクＡＲ」として表示する。「低リスクＡＲ」は、履歴により証明された安定移植片を有する個人に最もよく類似し、「高リスクＡＲ」は、生検により証明されたＡＲ移植片に最もよく類似すると見なされる。中リスクは、予後評価において１３のモデル間でいずれかの不一致があるサンプルに割り当てられる。
【０１６３】
ＵＣＳＦからの４０サンプルにおいて、生検により証明されたＡＲ一サンプルは、１３の全遺伝子セットのうち、ＡＲとして８遺伝子セットの予測および非ＡＲとして５遺伝子セットの予測を示し、各遺伝子セットは１２遺伝子から構成された。従って、このサンプルは不確定リスクとして見なされた。
【０１６４】
実施例１５：成人および小児ＡＲと非ＡＲの間で差次的に発現される遺伝子
２３６の成人および小児ＡＲサンプルと非ＡＲサンプルの間で差次的に発現される遺伝子  成人と小児の両方でＡＲ患者を非ＡＲ患者から識別し、ＡＲの非侵襲的検出のためのロバストなバイオマーカーを提供した遺伝子を同定するために、マイクロ流体ハイスループットｑＰＣＲプラットフォームフリューダイム（Ｂｉｏｍａｒｋ、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ  Ｉｎｃ．）にて、成人および小児患者由来の２３６の血液サンプルで、上記で定義された４３遺伝子（４２遺伝子とハウスキーピング遺伝子であるリボソームＲＮＡ１８Ｓ）の発現の同時測定を行った。教師なしのＰＣＡおよびＡＮＯＶＡによって評価した場合、患者が同種移植を受けた特定の移植センター（「センター」）は、拒絶状態に関する患者の分離を説明する最大の変数であることが判明した。教師なしのＰＣＡによれば、移植センターにより分離したサンプルは、未補正のデータセットにおいて表現型（ＡＲと非ＡＲ）により推論される遺伝子発現の違いを無効にすることが判明した。除去されるランダムカテゴリー因子として移植センター、ＲＮＡソース、およびｑＰＣＲチップ、残すカテゴリー因子として表現型（ＡＲ、非ＡＲ）が含まれた混合ＡＮＯＶＡモデルを用いてデータを補正すると、移植センターによりサンプルを分離することなく、むしろ表現型によりサンプルを分離した遺伝子発現が得られた。この正規化セットの分析により、これらの遺伝子の大規模サブセットがＡＲと非ＡＲの間で差次的に発現されたことが示された（スチューデントのＴ検定：ｎ＝３２、ｐ＜０．０５）。
【０１６５】
２６７の成人および小児ＡＲサンプルと非ＡＲサンプルの間で差次的に発現される遺伝子  合計３１の遺伝子が、２６７の成人および小児両方のＡＲと非ＡＲの間で差次的に発現された（コホート１、ｎ＝１４３；コホート２、ｎ＝１２４；ＦＤＲ＜５％、ボンフェローニ事後検定を伴うＡＮＯＶＡ）。興味深いことに、８／１０遺伝子の小児パネルは、成人サンプルにおいて有意に異なっていた（ｐ＜０．０５）。
【０１６６】
実施例１６：１０遺伝子を用いたＡＲサンプルと非ＡＲサンプルの分類
サポートベクターマシーンによる１０遺伝子を用いた成人ＡＲサンプルと非ＡＲサンプルの分類
異なる採取センター、性別、血液ＲＮＡサンプルソース、およびレシピエント年齢でのＡＲ分類に関するこれらの遺伝子セットの潜在的有効性を評価するために、ＰａｒｔｅｋおよびＲにおいて利用可能な２つの異なる分類アプローチを利用した。Ｐａｒｔｅｋでは、ＳＶＭアルゴリズム（コストパラメーターｃ＝７０１、核関数＝ラジアル基底関数exp(-gamma ||x-y||^2)ここでgamma＝３）、Ｒでは、Ｅｌａｓｔｉｃ−Ｎｅｔを用いるペナルティ付きロジスティック回帰を、サンプルのＡＲまたは非ＡＲへの分類に適用した。両分類アルゴリズムとも二元分類子であり、ＳＶＭは２つのクラスを分離する境界を最大化するように設計され、従って、トレーニングされたモデルは、所見のデータに対して、データを過剰適合することなく、十分な一般化を行う。しかしながら、ＳＶＭは非確率論的分類子であり、個々の予測精度スコアを提供しない。ロジスティック回帰は、各サンプルに対して予測的確率スコアを提供する。これらの方法は、生検読み取りと臨床機能が一致した１４３の成人ＡＲ（ｎ＝４７）および非ＡＲ（ｎ＝９６）サンプルのテストセットにおいて、小児および若年成人血液サンプルでのＡＲ検出に関して従前にバリデートされた（ＡＲ検出に関して９２％精度、９１％感度、および９４％特異度）、従前に公表された１０遺伝子小児モデル（ＣＦＬＡＲ、ＤＵＳＰ１、ＩＦＮＧＲ１、ＩＴＧＡＸ、ＭＡＰＫ９、ＮＡＭＰＴ、ＮＫＴＲ、ＰＳＥＮ１、ＲＮＦ１３０、およびＲＹＢＰ）を用いて、センターに関して正規化されたデータに適用した。上記のＳＶＭを用い、同じ１０遺伝子は、１４３サンプルの成人データセットに適用した場合に、８７％精度、７０％感度、および９６％特異度で成人におけるＡＲを検出した。
【０１６７】
ロジスティック回帰による１０遺伝子を用いたＡＲ生検の最大６か月前および１か月後の小児サンプルにおけるＡＲの検出
生検により証明されたＡＲを有する４０名の患者について、ＡＲ生検の最大７か月前（ｎ＝２７）および６か月後まで（ｎ＝３０）に採取した小児同種移植レシピエントからの一連のサンプルが利用可能であった。小児５遺伝子発現モデル（ＤＵＳＰ１、ＮＡＭＰＴ、ＰＳＥＮ１、ＭＡＰＫ９、およびＮＫＴＲ）により、ＡＲの生検の最大６か月前（平均スコア０〜３か月＝８８％；平均スコア３〜６か月＝５８％）および１か月後まで（平均スコア＝６３％）、高いＡＲ予測スコアが明らかになった。４０の適合ＡＲサンプルの平均スコアは９１％であった。ＡＲ生検後１か月以降に採取されたサンプルでは、ＡＲの平均予測スコアは３か月で４２％、＞３か月後で４８％であった（図３Ｂ）。
【０１６８】
実施例１７：１５遺伝子を用いたＡＲサンプルと非ＡＲサンプルの分類
ペナルティ付きロジスティック回帰による１５遺伝子を用いた１４３の成人ＡＲサンプルと非ＡＲサンプルの分類
精度および感度を改善するために、さらに３２遺伝子の成人検定セットに対する影響を、年齢非依存的ＡＲ予測アルゴリズムを開発するために含めることができるさらなる遺伝子の選択のためのペナルティ付きロジスティック回帰を用いて調べた。結果として、３２遺伝子から１５のさらなる遺伝子が選択された（ＣＥＡＣＡＭ４、ＳＬＣ２５Ａ３７、ＲＡＲＡ、ＣＸＣＬ１０、ＧＺＢ、ＩＬ２ＲＢ、ＲＨＥＢ、Ｃ１ｏｒｆ３８、ＥＰＯＲ、ＧＺＭＫ、ＡＢＴＢ１、ＮＦＥ２、ＦＯＸＰ３、ＭＰＰ１、およびＭＡＰ２Ｋ３）。これらのさらなる遺伝子の使用により、ペナルティ付きロジスティック回帰による成人データセットにおけるＡＲの予測に改善がもたらされた（９２％精度、８６％感度、および９４％特異度）。５サンプル（非ＡＲが２、ＡＲが３）だけが不正確な分類であった。このペナルティ付きロジスティック回帰モデルにおけるＡＲ予測のθは５０％であり、これらのサンプルの分類が、サンプルをＡＲと表示するために＞５０％の確率スコアで、また、サンプルを非ＡＲと表示するために＜５０％の確率スコアで達成されたことを示した（図２Ａ）。
【０１６９】
ペナルティ付きロジスティック回帰による１５遺伝子を用いた４９の成人ＡＲサンプルと非ＡＲサンプルの分類
４９サンプルの独立セットでの成人１５遺伝子モデルの成績を検定した。サンプルは、採血時に生検により確認された病状レポートを有する８名のＡＲ患者と６名の非ＡＲ患者を含んだ。残りの２０サンプルは、血液サンプル採取時に適合した生検を持たなかった患者（Ｎ．Ａ．、ｎ＝２２）、またはＢＫ腎症患者（ＢＫ、ｎ＝２）に加え、急性尿細管腎炎（ＡＴＮ、ｎ＝３）、急性薬物毒性（ＣＮＩＴ、ｎ＝４）を含む、もしくは生検時に慢性同種移植損傷を示していた（ＩＦ／ＴＡ、ｎ＝４）、他の形態の移植片機能不全を受けていた患者（ｎ＝１３）から採取された。未知の表現型の患者に由来するこれら２２サンプルに、サンプル採取の前または後に生検により証明された拒絶を持っていたものは無かった。遺伝子発現を用いたところ、全ての非ＡＲサンプルが正確に非ＡＲと予測され、８のうち５のＡＲサンプルが正確にＡＲと分類された。ＡＲと他起源の移植片機能不全の間の予測スコアは、ＡＲの方が有意に高かった（ｐ＝０．０１６２）。未知の表現型（Ｎ．Ａ．）を有する患者由来の全てのサンプルは非ＡＲと予測された（図２Ｂ）。
【０１７０】
ペナルティ付きロジスティック回帰による１５遺伝子を用いた成人における抗体媒介性急性拒絶および細胞媒介性急性拒絶の均等検出
大部分のＡＲサンプルは、細胞性拒絶と体液性拒絶の混合型である。ドナー特異的抗体(donor specific antibody)（ＤＳＡ）データは、全ての場合で生検時には得られなかった。抗体媒介性拒絶(antibody-mediated rejection)（ＡＭＲ、Ｃ４Ｄ陽性生検染色、ＤＳＡ＋）のみを示した患者５名のサブセットを用い、予測スコアを、明らかな細胞媒介性拒絶（ＡＣＲ、Ｃ４ｄ−、ＤＳＡ−；ｎ＝３３）のみを有する患者と比較した。純粋な抗体媒介性拒絶エピソードおよび細胞媒介性拒絶エピソードの数は比較的少なかったものの、２つのＡＲサブグループにおける平均ＡＲ予測スコアの比較により、このモデルはＡＭＲおよびＡＣＲを、高い予測確率（平均スコアＡＭＲ＝８２．９％±０．１６；平均スコアＡＣＲ＝８９．５％±０．１２；ｐ＝０．４１３）で均等に検出したことが明らかになった（図２）。図２Ａは、１４３のＡＲおよび非ＡＲ成人患者におけるＡＲの予測確率を示す。図２Ｂは、４９の独立した患者（ＡＲ８、非ＡＲ６、移植片不全１３、および未知２２）におけるＡＲの予測確率を示す。
【０１７１】
ペナルティ付きロジスティック回帰による１５遺伝子を用いた成人腎臓レシピエント由来の血液におけるＡＲ生検３か月前および１か月後のＡＲの予測
生検により証明されたＡＲを有する患者のサブセット（ｎ＝５９）に関して、ＡＲ生検の最大２年前（ｎ＝２３）および１．５年後（ｎ＝１９）に採取した一連の血液サンプルが利用可能であった。遺伝子発現により、ＡＲは、この成人集団においてＡＲに関する生検の最大３か月前および１か月後まで示された（平均ＡＲ確率０〜３か月前＝４３％；平均ＡＲ確率０〜１か月後＝５０％）。ＡＲ生検の３か月前または１か月後を超えて採取された血液サンプルでは、本遺伝子発現モデルを用いてＡＲを検出する確率がそれぞれ２４％および２４％の確率に落ちた。１７の適合ＡＲサンプルの平均スコアは８２％であった（図３Ａ）。
【０１７２】
実施例１８：サポートベクターマシンによる１７遺伝子を用いたＡＲと非ＡＲの分類
レシピエント年齢に依存せずにＡＲを検出するために、９３の末梢血サンプル（ＡＲ２２、非ＡＲ７１）からなる小児および若年成人患者の独立したサブセットからのｑＰＣＲデータ(Li, L. et al. Am. J. Transplant. 2012, 12, 2710-2718)を、成人移植レシピエントからの１４３のサンプル（ＡＲ４７、非ＡＲ９６）と合わせた。Ｓｈｒｉｎｋｉｎｇ  Ｃｅｎｔｒｏｉｄｓを用い、患者をＡＲまたは非ＡＲに分類した１７遺伝子のセットを、ＳＶＭアルゴリズムを分類のためのコストパラメーター＝７０１、カーネル＝ｒｂｆ、およびγ＝３とともに用いて同定した。この１７遺伝子モデルは、ＳＶＭを用い、２３６の小児、若年成人、および成人患者の複合データセットで、９４％精度、８８％感度、および９５％特異度でＡＲを検出した。この１７遺伝子セットは１０の小児遺伝子（ＣＦＬＡＲ、ＤＵＳＰ１、ＩＴＧＡＸ、ＲＮＦ１３０、ＰＳＥＮ１、ＮＫＴＲ、ＲＹＢＰ、ＮＡＭＰＴ、ＭＡＰＫ９、およびＩＦＮＧＲ１）の組合せ、新たに定義された１５の成人遺伝子のうち６（ＣＥＡＣＡＭ４、ＲＨＥＢ、ＧＺＭＫ、ＲＡＲＡ、ＳＬＣ２５Ａ３７、およびＥＰＯＲ）、ならびにレチノイドＸ受容体α（ＲＸＲＡ）を使用した。これらの１７遺伝子を用いたところ、６９のＡＲサンプルのうち８サンプルだけが不正確に非ＡＲと予測され、１６９の非ＡＲサンプルのうち８サンプルだけが不正確にＡＲと予測された。明らかに、成人特異的遺伝子と小児特異的遺伝子の組合せは、高い精度、感度、および特異度を持った年齢非依存性のＡＲの予測の開発に必要である。
【０１７３】
実施例１９：等しい事前確率の部分最小二乗判別分析による１７遺伝子を用いたＡＲと非ＡＲの分類
等しい事前確率の部分最小二乗判別分析による１７遺伝子を用いた１４３の成人ＡＲサンプルと非ＡＲサンプルの分類
腎臓ＡＲ予測アッセイを定義するための最終的な１７遺伝子は、小児１０遺伝子パネル（ＤＵＳＰ１、ＣＦＬＡＲ、ＩＴＧＡＸ、ＮＡＭＰＴ、ＭＡＰＫ９、ＲＮＦ１３０、ＩＦＮＧＲ１、ＰＳＥＮ１、ＲＹＢＰ、ＮＫＴＲ）と成人拒絶に有益なさらなる７遺伝子（ＳＬＣ２５Ａ３７、ＣＥＡＣＡＭ４、ＲＡＲＡ、ＲＸＲＡ、ＥＰＯＲ、ＧＺＭＫ、ＲＨＥＢ）からなった（図１２）；これらの１７遺伝子は、レシピエント異年齢間でＡＲを識別するために最適な成績を示し：１４３の成人サンプルのトレーニングセット（コホート１）では、１７遺伝子は３９／４７のサンプルを正確にＡＲ予測し、８７／９６のサンプルを正確に非ＡＲと予測し、等しい事前確率の部分最小二乗判別分析において感度８３％、および特異度９１％が得られた（ｐｌｓＤＡ；図６Ａ〜Ｂ）。平均予測ＡＲ確率は、各センターにおいてＡＲと非ＡＲを比較すると高い有意性で異なっていた（ＣＰＭＣ：ｐ＜０．０００１；エモリー：ｐ＝０．００２；ＵＰＭＣ：ｐ＜０．０００１；ＵＣＬＡ：ｐ＜００００１）（図６Ａ）。１７遺伝子の受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線下の総面積は、ｐｌｓＤＡによればＡＵＣ＝０．９４（９５％ＣＩ０．９１〜０．９８；ｐ＜０．０００１）であった（図６Ｂ）。
【０１７４】
等しい事前確率の部分最小二乗判別分析による１７遺伝子を用いた独立した１２４の成人および小児レシピエントの分類
成人および小児の両レシピエントにおいて非ＡＲ表現型からＡＲを識別するための１７遺伝子腎臓ＡＲ予測アッセイモデルを独立にバリデートするために、本発明者らは、フリューダイムプラットフォームでも行った、成人（ｎ＝５９）および小児（ｎ＝６５）を合わせた１２４の独立したサンプルのセット（コホート２；後向きバリデーション）におけるその成績を検定した。１７遺伝子腎臓ＡＲ予測アッセイモデルは、２１／２３のサンプルをＡＲとして正確に予測し、ＢＫウイルス腎炎患者４名を含む１００／１０１のサンプルを非ＡＲと正確に予測し（図７Ａ）、アッセイ感度９１．３％および特異度９９．０１％が得られた。２つの誤分類ＡＲサンプルのうちの１つは、重度の慢性傷害を有し（ＩＦ／ＴＡグレードＩＩＩ）、拒絶時に生検サンプルにおけるグローバルな退縮は＞３３％であった。トレーニングセット（コホート１）で見られるように、ＡＲの平均予測確率は、バリデーションセット（コホート２）のＡＲサンプル（８０．５５％）と非ＡＲサンプル（９．２％）の間でも有意に異なっており（ｐ＜０．０００１；図７Ｂ）；ＢＫＶ群のＡＲの平均予測確率は１２．７６％と低かった。１２４サンプルのＲＯＣ分析の結果はＡＵＣ＝０．９４７９（９５％ＣＩ０．８８〜１．０）であった（図７Ｃ）。各サンプル採取場所における１７遺伝子腎臓ＡＲ予測アッセイモデルの成績を評価するために、本発明者らは、コホート１およびコホート２からのエモリー（ｎ＝４２）、ＵＰＭＣ（ｎ＝８１）、ＵＣＬＡ（ｎ＝４４）およびＣＰＭＣ（ｎ＝３５）における予測のためのＲＯＣ  ＡＵＣを計算した。移植センターによるアッセイの成績は、個々のＲＯＣ  ＡＵＣは４か所全てのセンターについて＞０．８であることを示した（図１３Ａ〜Ｄ）。
【０１７５】
等しい事前確率の部分最小二乗判別分析による１７遺伝子を用いた抗体媒介性急性拒絶と細胞媒介性急性拒絶の均等検出
フリューダイムプラットフォームで分析された大部分のＡＲサンプルは、いくらかの細胞性拒絶と体液性拒絶の混合状態または関連の慢性変化を示した。固定された１７遺伝子モデルによって評定した場合、明らかな抗体媒介拒絶（ＡＭＲ、Ｃ４Ｄ＋生検染色、ＤＳＡ＋）のみを有する１９名の患者と明らかな細胞媒介性拒絶（ＡＣＲ、Ｃ４ｄ−およびＤＳＡ−、およびＢａｎｆｆ  ｔ−およびｉスコア＞１）を有する５１名の患者の間でＡＲ予測スコアに違いは見られなかった（ｐｌｓＤＡ；ｐ＝０．９９０６；平均ＡＣＲ＝８０．８４％±４．４；平均ＡＭＲ＝８０．７５％±６．６；図１４Ａ）。
【０１７６】
等しい事前確率の部分最小二乗判別分析による１７遺伝子を用いたＡＲの分類は移植後時間に依存しない
移植後拒絶の時間が１７遺伝子の予測精度に影響をしたかどうかを評価するために、移植後０〜６か月、６〜１２か月の間、および＞１年に採取されたＡＲサンプルおよび非ＡＲサンプルにおける予測ＡＲ確率を評価したところ、移植後の時間による影響を認めなかった（図１４Ｂ）。
【０１７７】
１７遺伝子は等しい事前確率の部分最小二乗判別分析により１９１サンプルにおいて臨床移植片機能不全前に生検により確認されるＡＲを予測する
１７遺伝子腎臓ＡＲ予測アッセイモデルの予測性を評価するために、生検適合ＡＲエピソード（ｎ＝７４）の前（０．２〜６．８か月、ｎ＝６５）または後（０．２〜７か月；ｎ＝５２）のいずれかに採取した１９１の血液サンプル（コホート３；前向きバリデーション）を分析した。ＡＲ生検の０〜３か月前の血液サンプルを有する患者（ｎ＝３５）のうち、安定な移植片機能の時点で、６２．９％（２２／３５）が極めて高いＡＲ予測スコア（９６．４％±０．８）を有しており（図８）、経過観察時に安定な移植片機能を有しかつＡＲを示さない患者のスコアよりも有意に高かった（１９．４％±０．３；ｐ＜０．０００１）。ＡＲ処置の０〜３か月後に採取された血液サンプルを有する患者（ｎ＝３１）のうち、５１．６％（１６／３１）はなお高いＡＲスコアを有しており（８６％±０．１７）；１５／３１サンプルはＡＲ処置の０〜３か月後にＡＲ閾値より低いＡＲスコアを示した（６．５９％±０．１３％）。低いＡＲ予測スコアを有する患者のクレアチニンレベルが１．８±０．４ｍｇ／ｄＬであるのに対して、高いＡＲ予測スコアを有する患者の血清クレアチニンレベルは２．０４±０．４ｍｇ／ｄＬであったことから、前者はＡＲ処置に奏効した患者ｎ相当すると思われる（図８）。
【０１７８】
実施例２０：ｋＳＡＳによるＡＲと非ＡＲの分類
標準的ＱＰＣＲのためのＡＢＩ  ｖｉｉａ７  ＱＰＣＲプラットフォームの選択
フリューダイムプラットフォームなどのハイスループットＱＰＣＲプラットフォームは、診断用バイオマーカーパネルの発見および初期開発のために極めて好適であるが、費用効果がある性能を得るためには大きなサンプルサイズおよび遺伝子数が必要である。従って、変動のあるより少ないサンプル数のための、カスタマイズ可能な形式と費用効果のある性能を有する臨床適用可能なアッセイを開発するために、１７遺伝子モデルを４４名のＡＲ患者および５６名の非ＡＲ患者から採取した１００サンプルを用い、標準的ｑＰＣＲ（ＡＢＩ  ｖｉｉａ７、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、フォスターシティ、ＣＡ）により分析した。これらの遺伝子セットを臨床分析（スケーラビリティ、コスト、マシンアベイラビリティ、プロトコールの簡素性）に関して最適化するため、下流での発見およびバリデーションのためにＡＢＩ  ｑＰＣＲプラットフォームを用いた。
【０１７９】
ｋＳＡＳによる１０遺伝子を用いた成人および小児のＡＲと非ＡＲの分類
発見のため、ｋＳＡＳ分析は２か所の成人センター（ＵＣＳＦおよびピッツバーグ）と１か所の小児センター（ＳＮＳ）に制限した。この分析により、両成人センターおよび小児センターで８９％の割合でＡＲ状態を分類することができた７遺伝子モデル（ＣＦＬＡＲ、ＤＵＳＰ１、ＩＦＮＧＲ１、ＩＴＧＡＸ、ＭＡＰＫ９、ＮＫＴＲ、およびＲＹＢＰ）が得られた。もう１つの３〜１０遺伝子のモデルサイズは、最終的な７遺伝子のセットよりも全体的な成績が低かった。成人に関して合わせた分類率は、１６のＡＲサンプルおよび１６の非ＡＲサンプル（感度＝８８％、特異度＝７５％）に基づけば８１％精度となり、小児セットでは、２２のＡＲサンプルおよび１５５の非ＡＲサンプル（感度＝９１％、感度＝９０％）に基づけば、９０％精度となった。
【０１８０】
ｋＳＡＳによる１７遺伝子を用いたＡＲと非ＡＲの分類
従前に発見された１０の小児遺伝子に加え、フリューダイム分析から同定された７つの成人分類子遺伝子（ＣＥＡＣＡＭ４、ＥＰＯＲ、ＧＺＭＫ、ＲＡＲＡ、ＲＨＥＢ、ＲＸＲＡ、およびＳＬＣ２５Ａ３７）をＡＢＩ遺伝子パネルに加えた。これら１７遺伝子の配列をゲノムＤＮＡ配列として付表Ａに示す。これらの遺伝子のほとんど全てが、１４３の患者フリューダイムｑＰＣＲデータセットを、ｋＳＡＳを用いて再分析した際にも高い値の予後マーカーとして同定された。この大きなＡＢＩ遺伝子セット分析は、最初は、ＡＲまたは非ＡＲ状態が確認された成人患者の血液サンプルに限られた。これら１７の小児および成人遺伝子から性能の改良された遺伝子サブセットを同定するために、まず、２か所のセンター（ＵＣＳＦおよびピッツバーグ）から採取されたｋＳＡＳ  ｑＰＣＲデータを再適用した。あり得る全ての１７遺伝子の組合せ（１モデル当たり３〜１７遺伝子）に関してこれらのセンターからの総合分類率を合わせると、９０％の割合（８８％感度、９４％特異度）で性能を発揮する１２の異なる遺伝子の組合せをそれぞれ含む１３のモデルセットが得られた表２。
【０１８１】
これらの遺伝子モデルの独立検証として、このモデルセットを成人および小児患者（それぞれバルセロナおよびメキシコ）の新たなセットならびに１か所のトレーニングセンター（ＵＣＳＦ）からの独立した患者の第２セットに対して検定した。発見分析からのＡＲおよび非ＡＲ発現参照（以前のＵＣＳＦサンプル）を用いたＵＣＳＦ患者の分析により、７６〜８６％の範囲のバリデーション率が得られた。全ての新規サンプルからの結果を統合した場合、上位モデル分類率は８８％（８６％感度、９０％特異度）となり、成人サンプルと小児サンプルの間の分類率は同等であった。この上位１２遺伝子モデル（ＣＦＬＡＲ、ＰＳＥＮ１、ＣＥＡＣＡＭ４、ＮＡＭＰＴ、ＲＨＥＢ、ＧＺＭＫ、ＮＫＴＲ、ＤＵＳＰ１、ＲＡＲＡ、ＩＴＧＡＸ、ＳＬＣ２５Ａ３７、およびＥＰＯＲ）は、小児分類セット（ＣＦＬＡＲ、ＰＳＥＮ１、ＮＡＭＰＴ、ＮＫＴＲ、およびＤＵＳＰ１）からの５遺伝子を含み、年齢、人口統計、誘導、維持免疫抑制、併存症、または交絡する移植片病状とは無関係にＡＲ状態を分類する。実験的に予測される相互作用に関して評価したところ、これらの遺伝子の過半数が直接的または間接的に関連していた。
【０１８２】
ｋＳＡＳによる１７遺伝子を用いた１００の成人および小児サンプルに関するＡＲリスクスコアの計算
複数のモデルアプローチが各遺伝子セットに対して異なるスコアを与えたことから、各患者の単一の遺伝子モデルを偏らせない信頼スコアを提供するこれらのモデルの組み合わせた能力を評価した。この統合ＡＲリスク分析は各患者についてスコア（−１３〜１３）を生成し、ＡＲのリスクを示す（１３＝高リスク、−１３＝極めて低リスク）。「高リスクのＡＲ」の患者のうち、９１％（３４名中３１）が正確にＡＲと分類され、「極めて低リスクのＡＲ」の患者については、９２％（３８名中３５）が正確に非ＡＲと分類された。残りの患者（ｎ＝１５）は不確定リスクを有すると予測された（図１０Ａ）。
【０１８３】
平均算出ＡＲリスクスコアは、ｋＳＡＳを用いれば、ＡＲでは非ＡＲに比べて有意に高かった（ｐ＜０．０００１）（図１０Ｂ）。
【０１８４】
計算されたＡＵＣは、明確なｋＳＡＳ判定（高リスクＡＲ、低リスクＡＲ、ｎ＝８５）に関して０．９３（９５％ＣＩ０．８６〜０．９９）であった（図１０Ｃ）。
【０１８５】
示されたアッセイの強度は、末梢血サンプルにおいてＡＲを検出する、その高いＰＰＶ  （９２．３％）である。現在、移植に利用可能な唯一の診断検査は、中等度／重度の急性細胞性心臓拒絶（ＩＳＨＬＴ  ３Ａ）の不在を検出するが、ＡＲの存在の検出に関する性能は低い（ＰＰＶ＝６．８％）(Deng et al., 2006, Am J. Transplant 6:150-160)。同様に、閉塞性冠動脈疾患を評価するための血液遺伝子発現検査（Ｃｏｒｕｓ（登録商標）Ｃａｄ、ＣＡＲＤＩＯＤＸ（登録商標）、パロ・アルト、ＣＡ）は、多施設共同バリデーション試験において４６％のＰＰＶを示した(Rosenberg et al, 2010, Ann Intern Med 153:425-434)。拒絶の時点でＡＲを検出するための高感度のアッセイ（現行のゴールドスタンダードにより診断）に加え、このアッセイはまた、１２症例で準臨床拒絶を検出し、移植片機能不全および組織学的ＡＲの最大３か月前に採取されたサンプルの＞６０％において臨床ＡＲを予測し；準臨床および臨床ＡＲは慢性拒絶および移植片欠損の前兆であるので、これは拒絶検査の重要な能力である(Nasesens et al., 2012, Am J Transpalnt 12: 2730-2743)。適応同種免疫応答を評価するための、循環中のドナー特異的抗体または記憶エフェクターＴ細胞のいずれかを評価する現行の免疫監視ツールは、ＡＲの潜在リスクを予測するためのそれらの有用性を示したが(Loupy et al, 2013, N Engl J Med 369: 1215-1216;およびBestard et al, 2013 Kidney Int 84: 1226-1236)、それらの検出は必ずしも進行中の免疫介在性同種移植損傷に置き換えられず、さらに、これらのエフェクター機構は生検により証明されるＡＲの前またはその時点で常に検出されるわけではない。さらに、ほとんどのセンターは目下のところ準臨床ＡＲを検出する手段としてプロトコール生検を行っておらず、従って、これらは多くが検出されないままである。本明細書で提供されるアッセイによる慣例の移植後監視はＡＲを予測し、適時の介入で組織損傷を制限し、コスト集約的な透析へ戻る患者の数を最小にすることにより医療システムへの金融負担を低減することができる。
【０１８６】
実施例２１：ＡＲと非ＡＲ分類のための１７遺伝子の生物学
経験的に予測される相互作用に関して評価した場合、過半数の遺伝子は共通の分子経路、特に、アポトーシスの調節、免疫表現型および細胞表面により直接的または間接的に互いに関連付けられた（図１５ａ〜１５ｃ）。小児ＡＲに関して末梢バイオマーカーとして従前に評価された、大部分が単球系譜の末梢血細胞で発現されることが知られている１０遺伝子に加え、さらなる末梢７ＡＲ遺伝子のうち６遺伝子はまた、末梢循環中の活性化単球（ＲＸＲＡ、ＲＡＲＡ、ＣＥＡＣＡＭ４）、内皮細胞（ＥＰＯＲ、ＳＬＣ２５Ａ３７）およびＴ細胞（ＧＺＭＫ）によっても発現された。１７のうち１１の遺伝子は細胞死、および細胞生存ネットワークに共通の役割を果たしていた（フィッシャーの正確確率検定、ｐ＜０．０５；ＩＰＡ；図１５ｃ）。
【０１８７】
実施例２１：一臓器抜き分析(leave-one-organ-out analysis)を用いた共通拒絶モジュール(common rejection module)（ＣＲＭ）の同定
共通拒絶モジュールは、腎臓、肺、心臓、および肝臓移植患者由来の２３６の独立した生検サンプルからの全ゲノム発現データを分析することにより同定した。各データセットはｇｃＲＭＡ正規化を行った(Irizarray, E. et al. Nucleic Acids Res. 2003, 31, e15参照)。移植データベースを、サイズ効果を組み合わせる、また、≦２０％のＦＤＲで１０２の遺伝子（表３に列挙）を同定するｐ値を組み合わせるメタ分析法により分析した。異なる臓器の反復組合せが得られる、一度に一臓器を抜き取る反復をそれぞれメタ分析により分析したところ、全ての臓器で過剰発現される、ＢＡＳＰ１、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ９、ＩＮＰＰ５Ｄ、ＩＳＧ２０、ＬＣＫ、ＮＫＧ７、ＰＳＭＢ９、ＲＵＮＸ３、およびＴＡＰ１を含んでなる１２遺伝子が明らかになった（図１６）。
【０１８８】
付表Ｃ：ＬｉｎｅａｇｅＰｒｏｆｉｌｅｒ  Ｉｔｅｒａｔｅソースコード
2020039344.tif 000017
【０１８９】
"""
このスクリプトは、１以上の遺伝子モデルが与えられた場合に、２つの参照のうち１つと比較してサンプルタイプを同定するためにＬｉｎｅａｇｅＰｒｏｆｉｌｅｒアルゴリズム（相関に基づく分類法）を反復する。主関数はｒｕｎＬｉｎｅａｇｅＰｒｏｆｉｌｅｒである。
【０１９０】
このプログラムは以下のアクションを実行する：
１）３列（ＩＤ、生物学的群１、群２）およびヘッダー行（生物学的群の名称）を含むタブ区切り参照発現ファイルをインポートする。
２）遺伝子ＩＤ（列１）、サンプル名（行１）および正規化発現値（例えばΔＣＴ値）を含むタブ区切り発現ファイルをインポートする。
３）（任意選択−既存モデルのインポート）カンマ区切りの分析用遺伝子モデルを含むタブ区切りファイルをインポートする。
４）（任意選択−新たなモデルの発見）供給されたモデルサイズ変数（例えば−−ｓ  ７）に対して遺伝子モデルのあり得る全ての組合せを同定する。
５）供給されたまたは同定された遺伝子モデルを反復して、新規なまたは既知のサンプルタイプに関して予測を得る。
６）全ての分析モデルに関する予測結果をフォルダSampleClassificationにエクスポートする。
７）（任意選択）サイズ−−ｓのあり得る全てのモデル組合せに関する上位２０スコアおよびモデルを印刷する。
2020039344.tif 000018
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【０１９１】
2020039344.tif 000050
【図１】
2020039344.tif 000051
【図２Ａ】
2020039344.tif 000052
【図２Ｂ】
2020039344.tif 000053
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2020039344.tif 000057
【図７】
2020039344.tif 000058
【図８】
2020039344.tif 000059
【図９】
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【図１０】
2020039344.tif 000061
【図１１Ａ】
2020039344.tif 000062
【図１１Ｂ】
2020039344.tif 000063
【図１１Ｃ】
2020039344.tif 000064
【図１１Ｄ】
2020039344.tif 000065
【図１２】
2020039344.tif 000066
【図１３】
2020039344.tif 000067
【図１４】
2020039344.tif 000068
【図１５】
2020039344.tif 000069
【図１６】
2020039344.tif 000070
【手続補正書】
【提出日】令和1年11月12日(2019.11.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腎臓同種移植を受けた個人において急性拒絶（ＡＲ）の診断を補助する、非急性拒絶(ＡＲ)の診断を補助する、または急性拒絶(ＡＲ)を発症するリスクの診断を補助する方法であって、
ａ）前記個人からの生体サンプルにおいてＣＥＡＣＡＭ４、ならびにＣＦＬＡＲ、ＤＵＳＰ１、ＩＦＮＧＲ１、ＩＴＧＡＸ、ＭＡＰＫ９、ＮＡＭＰＴ、ＮＫＴＲ、ＰＳＥＮ１、ＲＮＦ１３０、ＲＹＢＰ、ＥＰＯＲ、ＧＺＭＫ、ＲＡＲＡ、ＲＨＥＢ、ＲＸＲＡ、およびＳＬＣ２５Ａ３７から選択される６〜１６の間の他の遺伝子のレベルを測定して遺伝子発現結果を得ること；ならびに
ｂ）各遺伝子に対する急性拒絶(ＡＲ)サンプル由来の単一の参照発現ベクターと各遺伝子に対する非急性拒絶(ＡＲ)サンプル由来の単一の参照発現ベクターとを含んでなる参照標準を使用し、診断の補助のために前記遺伝子発現結果を前記参照標準と比較すること、並びに
ｃ）前記遺伝子発現結果が前記参照標準における急性拒絶(ＡＲ)サンプルデータにより近い場合は監視を高める若しくは維持するか、または治療薬の投与を増やす若しくは維持することを補助し、又は、前記遺伝子発現結果が前記参照標準における非急性拒絶(ＡＲ)サンプルデータにより近い場合は監視を減らす若しくは治療薬の投与を減らすことを補助する、
ことを含んでなる、前記方法。
【請求項２】
前記監視を高めることが生検であるか、又は前記治療薬が抗拒絶薬である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記個人が２３歳以上の成人である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記個人が小児または２３歳未満の若年成人である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
６〜１６の間の他の遺伝子がＣＦＬＡＲ、ＤＵＳＰ１、ＩＦＮＧＲ１、ＩＴＧＡＸ、ＭＡＰＫ９、ＮＡＭＰＴ、ＮＫＴＲ、ＰＳＥＮ１、ＲＮＦ１３０、ＲＹＢＰ、ＥＰＯＲ、ＧＺＭＫ、ＲＡＲＡ、ＲＨＥＢ、ＲＸＲＡ、およびＳＬＣ２５Ａ３７を含んでなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記測定工程が前記サンプルの遺伝子発現結果をマイクロアレイチップでアッセイすることまたは前記サンプルの遺伝子発現結果をｑＰＣＲを用いてアッセイすることを含んでなる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記測定工程が前記サンプルの遺伝子発現結果をビーズでアッセイすることを含んでなる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記測定工程が前記サンプルの遺伝子発現結果をナノ粒子でアッセイすることを含んでなる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記生体サンプルが血液サンプルである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記血液サンプルが末梢血白血球または末梢血単核サンプルである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記血液サンプルが全血である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較が、７０％を超える感度での急性拒絶（ＡＲ）の予測を含んでなる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較が、７０％を超える特異度での急性拒絶（ＡＲ）の予測を含んでなる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較が、７０％を超える陽性的中率（ｐｐｖ）での急性拒絶（ＡＲ）の予測を含んでなる、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較が、７０％を超える陰性的中率（ｎｐｖ）での急性拒絶（ＡＲ）の予測を含んでなる、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
腎臓移植の急性拒絶（ＡＲ）の処置のための個人の同定を補助する方法であって、
ａ）前記個人からの生体サンプルにおいてＣＥＡＣＡＭ４、ならびにＣＦＬＡＲ、ＤＵＳＰ１、ＩＦＮＧＲ１、ＩＴＧＡＸ、ＭＡＰＫ９、ＮＡＭＰＴ、ＮＫＴＲ、ＰＳＥＮ１、ＲＮＦ１３０、ＲＹＢＰ、ＥＰＯＲ、ＧＺＭＫ、ＲＡＲＡ、ＲＨＥＢ、ＲＸＲＡ、およびＳＬＣ２５Ａ３７から選択される６〜１６の間の他の遺伝子のレベルを測定して遺伝子発現結果を得ること；および
ｂ）各遺伝子に対する急性拒絶（ＡＲ）サンプル由来の単一の参照発現ベクターと各遺伝子に対する非急性拒絶（ＡＲ）サンプル由来の単一の参照発現ベクターとを含んでなる参照標準を使用し、同定のために前記遺伝子発現結果を前記参照標準と比較すること、並びに
ｃ）前記遺伝子発現結果が前記参照標準における急性拒絶(ＡＲ)サンプルデータにより近い場合は、前記被験体を腎臓移植の急性拒絶(ＡＲ）のための処置について同定することを補助すること、
を含んでなる、前記方法。
【請求項１７】
前記個人が２３歳以上の成人である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記個人が小児または２３歳未満の若年成人である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
６〜１６の間の他の遺伝子がＣＦＬＡＲ、ＤＵＳＰ１、ＩＦＮＧＲ１、ＩＴＧＡＸ、ＭＡＰＫ９、ＮＡＭＰＴ、ＮＫＴＲ、ＰＳＥＮ１、ＲＮＦ１３０、ＲＹＢＰ、ＥＰＯＲ、ＧＺＭＫ、ＲＡＲＡ、ＲＨＥＢ、ＲＸＲＡ、およびＳＬＣ２５Ａ３７を含んでなる、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記測定工程が前記サンプルの遺伝子発現結果をマイクロアレイチップでアッセイすることまたは前記サンプルの遺伝子発現結果をｑＰＣＲを用いてアッセイすることを含んでなる、請求項１６〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記測定工程が前記サンプルの遺伝子発現結果をビーズでアッセイすることを含んでなる、請求項１６〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記測定工程が前記サンプルの遺伝子発現結果をナノ粒子でアッセイすることを含んでなる、請求項１６〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記生体サンプルが血液サンプルである、請求項１６〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記血液サンプルが末梢血白血球または末梢血単核細胞である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記血液サンプルが全血である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較が、７０％を超える感度での急性拒絶（ＡＲ）の予測を含んでなる、請求項１６〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較が、７０％を超える特異度での急性拒絶（ＡＲ）の予測を含んでなる、請求項１６〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記比較工程が、７０％を超える陽性的中率（ｐｐｖ）での急性拒絶（ＡＲ）の予測を含んでなる、請求項１６〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較が、７０％を超える陰性的中率（ｎｐｖ）での急性拒絶（ＡＲ）の予測を含んでなる、請求項１６〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
腎臓同種移植を受けた個人において急性拒絶（ＡＲ）の診断に使用するためのシステムであって、
ａ）前記個人由来の生体サンプルにおいてＣＥＡＣＡＭ４、ならびにＣＦ  ＣＦＬＡＲ、ＤＵＳＰ１、ＩＦＮＧＲ１、ＩＴＧＡＸ、ＭＡＰＫ９、ＮＡＭＰＴ、ＮＫＴＲ、ＰＳＥＮ１、ＲＮＦ１３０、ＲＹＢＰ、ＥＰＯＲ、ＧＺＭＫ、ＲＡＲＡ、ＲＨＥＢ、ＲＸＲＡ、およびＳＬＣ２５Ａ３７から選択される６〜１６の他の遺伝子のレベルを測定して遺伝子発現結果を得るための遺伝子発現評価素子；ならびに
ｂ）診断のために前記遺伝子発現結果と参照標準を比較するための、単一の腎臓移植センターにおける各遺伝子に対する急性拒絶（ＡＲ）サンプル由来の単一の参照発現ベクターと、単一の腎臓移植センターにおける各遺伝子に対する非急性拒絶（ＡＲ）サンプル由来の単一の参照発現ベクターとを含んでなる参照標準素子と
を含んでなり、ここで前記遺伝子発現評価素子は有孔質または非孔質であってもよい、固相表面である、システム。
【請求項３１】
前記固相表面がマイクロアレイチップ、ｑＰＣＲ装置、ビーズ若しくはナノ粒子を含んでなる若しくは備えてなるか、又は、マイクロアレイチップ、ｑＰＣＲ装置、ビーズ若しくはナノ粒子からなる群から選択される、請求項３０に記載のシステム。
【請求項３２】
前記参照標準素子がコンピューター生成される、請求項３０又は３１に記載のシステム。
【請求項３３】
前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較がコンピューターまたは個人により行われる、請求項３０〜３２のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項３４】
前記個人が２３歳以上の成人である、請求項３０〜３３のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項３５】
前記個人が小児または２３歳未満の若年成人である、請求項３０〜３３のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項３６】
６〜１６の他の遺伝子がＣＦＬＡＲ、ＤＵＳＰ１、ＩＦＮＧＲ１、ＩＴＧＡＸ、ＭＡＰＫ９、ＮＡＭＰＴ、ＮＫＴＲ、ＰＳＥＮ１、ＲＮＦ１３０、ＲＹＢＰ、ＥＰＯＲ、ＧＺＭＫ、ＲＡＲＡ、ＲＨＥＢ、ＲＸＲＡ、およびＳＬＣ２５Ａ３７を含んでなる請求項３０〜３５のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項３７】
前記生体サンプルが血液サンプルである、請求項３０〜３６のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項３８】
前記血液サンプルが末梢血白血球または末梢血単核細胞である、請求項３７に記載のシステム。
【請求項３９】
前記血液サンプルが全血である、請求項３７に記載のシステム。
【請求項４０】
前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較が７０％を超える感度で急性拒絶（ＡＲ）を予測する、請求項３０〜３９のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項４１】
前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較が７０％を超える特異度で急性拒絶（ＡＲ）を予測する、請求項３０〜４０のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項４２】
前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較が７０％を超える陽性的中率（ｐｐｖ）で急性拒絶（ＡＲ）を予測する、請求項３０〜４１のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項４３】
前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較が７０％を超える陰性的中率（ｎｐｖ）で急性拒絶（ＡＲ）を予測する、請求項３０〜４２のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項４４】
腎臓同種移植を受けた個人において急性拒絶（ＡＲ）の診断に使用するためのキットであって、
ａ）前記個人由来の生体サンプルにおいてＣＥＡＣＡＭ４、ならびにＣＦＬＡＲ、ＤＵＳＰ１、ＩＦＮＧＲ１、ＩＴＧＡＸ、ＭＡＰＫ９、ＮＡＭＰＴ、ＮＫＴＲ、ＰＳＥＮ１、ＲＮＦ１３０、ＲＹＢＰ、ＥＰＯＲ、ＧＺＭＫ、ＲＡＲＡ、ＲＨＥＢ、ＲＸＴＡ、およびＳＬＣ２５Ａ３７から選択される６〜１６の他の遺伝子のレベルを評価して遺伝子発現結果を得るための遺伝子発現評価素子；
ｂ）単一の腎臓移植センターにおける各遺伝子に対する急性拒絶（ＡＲ）サンプル由来の単一の参照発現ベクターと、単一の腎臓移植センターにおける各遺伝子に対する非急性拒絶（ＡＲ）サンプル由来の単一の参照発現ベクターとを含んでなる参照標準素子；および
ｃ）前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較を含んでなる急性拒絶（ＡＲ）を診断するための説明書一式
を含んでなり、ここで前記遺伝子発現評価素子は有孔質または非孔質であってもよい、固相表面である、キット。
【請求項４５】
前記個人が２３歳以上の成人である、請求項４４に記載のキット。
【請求項４６】
前記個人が２３歳未満の小児または若年成人である、請求項４４に記載のキット。
【請求項４７】
６〜１６の他の遺伝子がＣＦＬＡＲ、ＤＵＳＰ１、ＩＦＮＧＲ１、ＩＴＧＡＸ、ＭＡＰＫ９、ＮＡＭＰＴ、ＮＫＴＲ、ＰＳＥＮ１、ＲＮＦ１３０、ＲＹＢＰ、ＥＰＯＲ、ＧＺＭＫ、ＲＡＲＡ、ＲＨＥＢ、ＲＸＲＡ、およびＳＬＣ２５Ａ３７を含んでなる、請求項４４〜４６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項４８】
前記固相表面がマイクロアレイチップ、ｑＰＣＲ装置、ビーズ若しくはナノ粒子を含んでなる若しくは備えてなるか、又は、マイクロアレイチップ、ｑＰＣＲ装置、ビーズ若しくはナノ粒子からなる群から選択される、請求項４４〜４７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項４９】
前記生体サンプルが血液サンプルである、請求項４４〜４８のいずれか一項に記載にキット。
【請求項５０】
前記血液サンプルが末梢血白血球または末梢血単核細胞である、請求項４９に記載のキット。
【請求項５１】
前記血液サンプルが全血である、請求項４９に記載のキット。
【請求項５２】
前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較が７０％を超える感度で急性拒絶（ＡＲ）を予測する、請求項４４〜５１のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５３】
前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較が７０％を超える特異度で急性拒絶（ＡＲ）を予測する、請求項４４〜５２のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５４】
前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較が７０％を超える陽性的中率（ｐｐｖ）で急性拒絶（ＡＲ）を予測する、請求項４４〜５３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５５】
前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較が７０％を超える陰性的中率（ｎｐｖ）で急性拒絶（ＡＲ）を予測する、請求項４４〜５４のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５６】
前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較がコンピューターまたは個人により行われる、請求項４４〜５５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５７】
腎臓同種移植を受けた個人由来の生体サンプルにおいてＣＥＡＣＡＭ４、ならびにＣ  ＣＦＬＡＲ、ＤＵＳＰ１、ＩＦＮＧＲ１、ＩＴＧＡＸ、ＭＡＰＫ９、ＮＡＭＰＴ、ＮＫＴＲ、ＰＳＥＮ１、ＲＮＦ１３０、ＲＹＢＰ、ＥＰＯＲ、ＧＺＭＫ、ＲＡＲＡ、ＲＨＥＢ、ＲＸＲＡ、およびＳＬＣ２５Ａ３７から選択される６〜１６の他の遺伝子のレベルを測定することにより得られる遺伝子発現結果と比較するための参照標準を含んでなり、単一の腎臓移植センターにおける各遺伝子に対する急性拒絶（ＡＲ）サンプル由来の単一の参照発現ベクターと、単一の腎臓移植センターにおける各遺伝子に対する非急性拒絶（ＡＲ）サンプル由来の単一の参照発現ベクターとを含んでなり、前記遺伝子発現と前記参照標準の比較が、前記個人において急性拒絶（ＡＲ）の診断に使用するため、非急性拒絶（ＡＲ）の診断に使用するため、または急性拒絶（ＡＲ）を発症するリスクの診断に使用するためのものである、製品。
【請求項５８】
前記個人が２３歳以上の成人である、請求項５７に記載の製品。
【請求項５９】
前記個人が小児または２３歳未満の若年成人である、請求項５７に記載の製品。
【請求項６０】
６〜１６の他の遺伝子がＣＦＬＡＲ、ＤＵＳＰ１、ＩＦＮＧＲ１、ＩＴＧＡＸ、ＭＡＰＫ９、ＮＡＭＰＴ、ＮＫＴＲ、ＰＳＥＮ１、ＲＮＦ１３０、ＲＹＢＰ、ＥＰＯＲ、ＧＺＭＫ、ＲＡＲＡ、ＲＨＥＢ、ＲＸＲＡ、およびＳＬＣ２５Ａ３７を含んでなる、請求項５７〜５９のいずれか一項に記載の製品。
【請求項６１】
ＣＥＡＣＡＭ４および６〜１６の他の遺伝子のレベルを測定することが、前記サンプルの遺伝子発現結果をマイクロアレイチップでアッセイすること、または前記サンプルの遺伝子発現結果をｑＰＣＲを用いてアッセイすることを含んでなる、請求項５７〜６０のいずれか一項に記載の製品。
【請求項６２】
ＣＥＡＣＡＭ４および６〜１６の他の遺伝子のレベルを測定することが、前記サンプルの遺伝子発現結果をビーズでアッセイすることを含んでなる、請求項５７〜６１のいずれか一項に記載の製品。
【請求項６３】
ＣＥＡＣＡＭ４および６〜１６の他の遺伝子のレベルを測定することが、前記サンプルの遺伝子発現結果をナノ粒子でアッセイすることを含んでなる、請求項５７〜６２のいずれか一項に記載の製品。
【請求項６４】
前記生体サンプルが血液サンプルである、請求項５７〜６３のいずれか一項に記載の製品。
【請求項６５】
前記血液サンプルが末梢血白血球または末梢血単核細胞である、請求項６４に記載の製品。
【請求項６６】
前記血液サンプルが全血である、請求項６４に記載の製品。
【請求項６７】
前記遺伝子発現と前記参照標準の比較が、７０％を超える感度での急性拒絶（ＡＲ）の予測を含んでなる、請求項５７〜６６のいずれか一項に記載の製品。
【請求項６８】
前記遺伝子発現と前記参照標準の比較が、７０％を超える特異度での急性拒絶（ＡＲ）の予測を含んでなる、請求項５７〜６７のいずれか一項に記載の製品。
【請求項６９】
前記遺伝子発現と前記参照標準の比較が、７０％を超える陽性的中率（ｐｐｖ）での急性拒絶（ＡＲ）の予測を含んでなる、請求項５７〜６８のいずれか一項に記載の製品。
【請求項７０】
前記遺伝子発現と前記参照標準の比較が、７０％を超える陰性的中率（ｎｐｖ）での急性拒絶（ＡＲ）の予測を含んでなる、請求項５７〜６９のいずれか一項に記載の製品。
【請求項７１】
腎臓移植患者である被験者のための処置を補助する方法であって、
(i)以下の試験、すなわち
ａ）前記被験者からの生体サンプルにおいてＣＥＡＣＡＭ４、ならびにＣＦＬＡＲ、ＤＵＳＰ１、ＩＦＮＧＲ１、ＩＴＧＡＸ、ＭＡＰＫ９、ＮＡＭＰＴ、ＮＫＴＲ、ＰＳＥＮ１、ＲＮＦ１３０、ＲＹＢＰ、ＥＰＯＲ、ＧＺＭＫ、ＲＡＲＡ、ＲＨＥＢ、ＲＸＲＡ、およびＳＬＣ２５Ａ３７から選択される６〜１６の間の他の遺伝子のレベルを測定して遺伝子発現結果を得ること；及び
ｂ）各遺伝子に対する急性拒絶(ＡＲ）サンプル由来の単一の参照発現ベクターと各遺伝子に対する非急性拒絶（ＡＲ）サンプル由来の単一の参照発現ベクターとを含んでなる参照標準を使用し、前記遺伝子発現結果を前記参照標準と比較し、それにより、前記被験者を腎臓移植の急性拒絶(ＡＲ）を有するまたは腎臓移植の急性拒絶(ＡＲ）を有しないとして同定すること；
を含んでなる試験を指示し、
(ii)上記試験の結果に基づき、
ｃ）腎臓移植の急性拒絶(ＡＲ）を有する被験者では治療上有効な量の１種類以上の治療薬の投与を増やすことを補助し、腎臓移植の急性拒絶(ＡＲ）を有さない被験者では治療上有効な量の１種類以上の治療薬の投与を維持することを補助し、または腎臓移植の急性拒絶(ＡＲ）を有さない被験者では治療上有効な量の１種類以上の治療薬の投与を減らすことを補助する
ことを含んでなる、前記方法。
【請求項７２】
腎臓移植患者である被験者のための処置を補助する方法であって、
(i)以下の試験、すなわち
ａ）前記被験者からの生体サンプルにおいてＣＥＡＣＡＭ４、ならびにＣＦＬＡＲ、ＤＵＳＰ１、ＩＦＮＧＲ１、ＩＴＧＡＸ、ＭＡＰＫ９、ＮＡＭＰＴ、ＮＫＴＲ、ＰＳＥＮ１、ＲＮＦ１３０、ＲＹＢＰ、ＥＰＯＲ、ＧＺＭＫ、ＲＡＲＡ、ＲＨＥＢ、ＲＸＲＡ、およびＳＬＣ２５Ａ３７から選択される６〜１６の間の他の遺伝子のレベルを測定して遺伝子発現結果を得ること；及び
ｂ）各遺伝子に対する急性拒絶(ＡＲ）サンプル由来の単一の参照発現ベクターと各遺伝子に対する非急性拒絶(ＡＲ）サンプル由来の単一の参照発現ベクターとを含んでなる参照標準を使用し、前記遺伝子発現結果を前記参照標準と比較し、それにより、前記被験者を腎臓移植の急性拒絶(ＡＲ）を有するまたは腎臓移植の急性拒絶(ＡＲ）を有しないとして同定すること；
を含んでなる試験を行い、
(ii)上記試験の結果に基づき、
ｃ）腎臓移植の急性拒絶(ＡＲ）を有する被験者では治療上有効な量の１種類以上の治療薬の投与を増やすことを補助し、腎臓移植の急性拒絶(ＡＲ）を有さない被験者では治療上有効な量の１種類以上の治療薬の投与を維持することを補助し、または腎臓移植の急性拒絶(ＡＲ）を有さない被験者では治療上有効な量の１種類以上の治療薬の投与を減らすことを補助する、前記方法。
【請求項７３】
前記被験者が２３歳以上の成人である、請求項７１又は７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記被験者が小児または２３歳未満の若年成人である、請求項７１又は７２に記載の方法。
【請求項７５】
６〜１６の他の遺伝子がＣＦＬＡＲ、ＤＵＳＰ１、ＩＦＮＧＲ１、ＩＴＧＡＸ、ＭＡＰＫ９、ＮＡＭＰＴ、ＮＫＴＲ、ＰＳＥＮ１、ＲＮＦ１３０、ＲＹＢＰ、ＥＰＯＲ、ＧＺＭＫ、ＲＡＲＡ、ＲＨＥＢ、ＲＸＲＡ、およびＳＬＣ２５Ａ３７を含んでなる、請求項７１〜７４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７６】
前記測定工程が前記サンプルの遺伝子発現結果をマイクロアレイチップでアッセイすること、または前記サンプルの遺伝子発現結果をｑＰＣＲを用いてアッセイすることを含んでなる、請求項７１〜７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
前記測定工程が前記サンプルの遺伝子発現結果をビーズでアッセイすることを含んでなる、請求項７１〜７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７８】
前記測定工程が前記サンプルの遺伝子発現結果をナノ粒子でアッセイすることを含んでなる、請求項７１〜７７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７９】
前記生体サンプルが血液サンプルである、請求項７１〜７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８０】
前記血液サンプルが末梢血白血球または末梢血単核細胞である、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記血液サンプルが全血である、請求項７９に記載の方法。
【請求項８２】
前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較が、７０％を超える感度での急性拒絶（ＡＲ）の予測を含んでなる、請求項７１〜８１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８３】
前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較が、７０％を超える特異度での急性拒絶（ＡＲ）の予測を含んでなる、請求項７１〜８２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８４】
前記比較工程が７０％を超える陽性的中率（ｐｐｖ）での急性拒絶（ＡＲ）の予測を含んでなる、請求項７１〜８３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８５】
前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較が、７０％を超える陰性的中率（ｎｐｖ）での急性拒絶（ＡＲ）の予測を含んでなる、請求項７１〜８４のいずれか一項に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９１】
2020039344.tif 000071
本発明は以下の実施形態を包含する。 
[１]  腎臓同種移植を受けた個人（被験体）において（ＡＲ）の診断に使用するため、非ＡＲの診断に使用するため、またはＡＲを発症するリスクの診断に使用するための方法であって、
ａ）前記個人からの生体サンプルにおいてＣＥＡＣＡＭ４、ならびにＣＦＬＡＲ、ＤＵＳＰ１、ＩＦＮＧＲ１、ＩＴＧＡＸ、ＭＡＰＫ９、ＮＡＭＰＴ、ＮＫＴＲ、ＰＳＥＮ１、ＲＮＦ１３０、ＲＹＢＰ、ＥＰＯＲ、ＧＺＭＫ、ＲＡＲＡ、ＲＨＥＢ、ＲＸＲＡ、およびＳＬＣ２５Ａ３７から選択される６〜１６の間の他の遺伝子のレベルを測定して遺伝子発現結果を得ること；ならびに
ｂ）各遺伝子に対するＡＲサンプル由来の単一の参照発現ベクターと各遺伝子に対する非ＡＲサンプル由来の単一の参照発現ベクターとを含んでなる参照標準を使用し、診断のために前記遺伝子発現結果が前記参照標準と比較されることを含んでなる、方法。   
[２]  前記個人が２３歳以上の成人である、実施形態１に記載の方法。   
[３]  前記個人が小児または２３歳未満の若年成人である、実施形態１に記載の方法。   
[４]  ６〜１６の間の他の遺伝子がＣＦＬＡＲ、ＤＵＳＰ１、ＩＦＮＧＲ１、ＩＴＧＡＸ、ＭＡＰＫ９、ＮＡＭＰＴ、ＮＫＴＲ、ＰＳＥＮ１、ＲＮＦ１３０、ＲＹＢＰ、ＥＰＯＲ、ＧＺＭＫ、ＲＡＲＡ、ＲＨＥＢ、ＲＸＲＡ、およびＳＬＣ２５Ａ３７を含んでなる、実施形態１〜３のいずれかに記載の方法。   
[５]  前記測定工程が前記サンプルの遺伝子発現結果をマイクロアレイチップでアッセイすることまたは前記サンプルの遺伝子発現結果をｑＰＣＲを用いてアッセイすることを含んでなる、実施形態１〜４のいずれかに記載の方法。   
[６]  前記測定工程が前記サンプルの遺伝子発現結果をビーズでアッセイすることを含んでなる、実施形態１〜５のいずれかに記載の方法。   
[７]  前記測定工程が前記サンプルの遺伝子発現結果をナノ粒子でアッセイすることを含んでなる、実施形態１〜６のいずれかに記載の方法。   
[８]  前記生体サンプルが血液サンプルである、実施形態１〜７のいずれかに記載の方法。   
[９]  前記血液サンプルが末梢血白血球または末梢血単核サンプルである、実施形態８に記載の方法。   
[１０]  前記血液サンプルが全血である、実施形態８に記載の方法。   
[１１]  前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較が、７０％を超える感度でのＡＲの予測を含んでなる、実施形態１〜１０のいずれかに記載の方法。   
[１２]  前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較が、７０％を超える特異度でのＡＲの予測を含んでなる、実施形態１〜１１のいずれかに記載の方法。   
[１３]  前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較が、７０％を超える陽性的中率（ｐｐｖ）でのＡＲの予測を含んでなる、実施形態１〜１２のいずれかに記載の方法。   
[１４]  前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較が、７０％を超える陰性的中率（ｎｐｖ）でのＡＲの予測を含んでなる、実施形態１〜１３のいずれかに記載の方法。   
[１５]  腎臓移植の急性拒絶（ＡＲ）の処置のための個人の同定において使用する方法であって、
ａ）前記個人からの生体サンプルにおいてＣＥＡＣＡＭ４、ならびにＣＦＬＡＲ、ＤＵＳＰ１、ＩＦＮＧＲ１、ＩＴＧＡＸ、ＭＡＰＫ９、ＮＡＭＰＴ、ＮＫＴＲ、ＰＳＥＮ１、ＲＮＦ１３０、ＲＹＢＰ、ＥＰＯＲ、ＧＺＭＫ、ＲＡＲＡ、ＲＨＥＢ、ＲＸＲＡ、およびＳＬＣ２５Ａ３７から選択される６〜１６の間の他の遺伝子のレベルを測定して遺伝子発現結果を得ること；および
ｂ）各遺伝子に対するＡＲサンプル由来の単一の参照発現ベクターと各遺伝子に対する非ＡＲサンプル由来の単一の参照発現ベクターとを含んでなる参照標準を使用し、同定のために前記遺伝子発現結果が前記参照標準と比較されることを含んでなる、方法。   
[１６]  前記個人が２３歳以上の成人である、実施形態１５に記載の方法。   
[１７]  前記個人が小児または２３歳未満の若年成人である、実施形態１５に記載の方法。   
[１８]  ６〜１６の間の他の遺伝子がＣＦＬＡＲ、ＤＵＳＰ１、ＩＦＮＧＲ１、ＩＴＧＡＸ、ＭＡＰＫ９、ＮＡＭＰＴ、ＮＫＴＲ、ＰＳＥＮ１、ＲＮＦ１３０、ＲＹＢＰ、ＥＰＯＲ、ＧＺＭＫ、ＲＡＲＡ、ＲＨＥＢ、ＲＸＲＡ、およびＳＬＣ２５Ａ３７を含んでなる、実施形態１５〜１７のいずれかに記載の方法。   
[１９]  前記測定工程が前記サンプルの遺伝子発現結果をマイクロアレイチップでアッセイすることまたは前記サンプルの遺伝子発現結果をｑＰＣＲを用いてアッセイすることを含んでなる、実施形態１５〜１８のいずれかに記載の方法。   
[２０]  前記測定工程が前記サンプルの遺伝子発現結果をビーズでアッセイすることを含んでなる、実施形態１５〜１９のいずれかに記載の方法。   
[２１]  前記測定工程が前記サンプルの遺伝子発現結果をナノ粒子でアッセイすることを含んでなる、実施形態１５〜２０のいずれかに記載の方法。   
[２２]  前記生体サンプルが血液サンプルである、実施形態１５〜２１のいずれかに記載の方法。   
[２３]  前記血液サンプルが末梢血白血球または末梢血単核細胞である、実施形態２２に記載の方法。   
[２４]  前記血液サンプルが全血である、実施形態２２に記載の方法。   
[２５]  前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較が、７０％を超える感度でのＡＲの予測を含んでなる、実施形態１５〜２４のいずれかに記載の方法。   
[２６]  前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較が、７０％を超える特異度でのＡＲの予測を含んでなる、実施形態１５〜２５のいずれかに記載の方法。   
[２７]  前記比較工程が、７０％を超える陽性的中率（ｐｐｖ）でのＡＲの予測を含んでなる、実施形態１５〜２６のいずれかに記載の方法。   
[２８]  前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較が、７０％を超える陰性的中率（ｎｐｖ）でのＡＲの予測を含んでなる、実施形態１５〜２７のいずれかに記載の方法。   
[２９]  腎臓同種移植を受けた個人において急性拒絶（ＡＲ）の診断に使用するためのシステムであって、
ａ）前記個人由来の生体サンプルにおいてＣＥＡＣＡＭ４、ならびにＣＦ  ＣＦＬＡＲ、ＤＵＳＰ１、ＩＦＮＧＲ１、ＩＴＧＡＸ、ＭＡＰＫ９、ＮＡＭＰＴ、ＮＫＴＲ、ＰＳＥＮ１、ＲＮＦ１３０、ＲＹＢＰ、ＥＰＯＲ、ＧＺＭＫ、ＲＡＲＡ、ＲＨＥＢ、ＲＸＲＡ、およびＳＬＣ２５Ａ３７から選択される６〜１６の他の遺伝子のレベルを測定して遺伝子発現結果を得るための遺伝子発現評価素子；ならびに
ｂ）診断のために前記遺伝子発現結果と前記参照標準を比較するための、単一の腎臓移植センターにおける各遺伝子に対するＡＲサンプル由来の単一の参照発現ベクターと、単一の腎臓移植センターにおける各遺伝子に対する非ＡＲサンプル由来の単一の参照発現ベクターとを含んでなる参照標準素子と
を含んでなる、システム。   
[３０]  前記遺伝子発現評価素子がマイクロアレイチップまたはｑＰＣＲ装置を含んでなる、実施形態２９に記載のシステム。   
[３１]  前記遺伝子発現評価素子がビーズを含んでなる、実施形態３０に記載のシステム。   
[３２]  前記遺伝子発現評価素子がナノ粒子を含んでなる、実施形態２９〜３１のいずれかに記載のシステム。   
[３３]  前記参照標準素子がコンピューター生成される、実施形態２９〜３２のいずれかに記載のシステム。   
[３４]  前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較がコンピューターまたは個人により行われる、実施形態２９〜３３のいずれかに記載のシステム。   
[３５]  前記個人が２３歳以上の成人である、実施形態２９〜３４のいずれかに記載のシステム。   
[３６]  前記個人が小児または２３歳未満の若年成人である、実施形態２９〜３４のいずれかに記載のシステム。   
[３７]  ６〜１６の他の遺伝子がＣＦＬＡＲ、ＤＵＳＰ１、ＩＦＮＧＲ１、ＩＴＧＡＸ、ＭＡＰＫ９、ＮＡＭＰＴ、ＮＫＴＲ、ＰＳＥＮ１、ＲＮＦ１３０、ＲＹＢＰ、ＥＰＯＲ、ＧＺＭＫ、ＲＡＲＡ、ＲＨＥＢ、ＲＸＲＡ、およびＳＬＣ２５Ａ３７を含んでなる実施形態２９〜３６のいずれかに記載のシステム。   
[３８]  前記生体サンプルが血液サンプルである、実施形態２９〜３７のいずれかに記載のシステム。   
[３９]  前記血液サンプルが末梢血白血球または末梢血単核細胞である、実施形態３８に記載のシステム。   
[４０]  前記血液サンプルが全血である、実施形態３８に記載のシステム。   
[４１]  前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較が７０％を超える感度でＡＲを予測する、実施形態２９〜４０のいずれかに記載のシステム。   
[４２]  前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較が７０％を超える特異度でＡＲを予測する、実施形態２９〜４１のいずれかに記載のシステム。   
[４３]  前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較が７０％を超える陽性的中率（ｐｐｖ）でＡＲを予測する、実施形態２９〜４２のいずれかに記載のシステム。   
[４４]  前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較が７０％を超える陰性的中率（ｎｐｖ）でＡＲを予測する、実施形態２９〜４３のいずれかに記載のシステム。   
[４５]  腎臓同種移植を受けた個人において急性拒絶（ＡＲ）の診断に使用するためのキットであって、
ａ）前記個人由来の生体サンプルにおいてＣＥＡＣＡＭ４、ならびにＣＦＬＡＲ、ＤＵＳＰ１、ＩＦＮＧＲ１、ＩＴＧＡＸ、ＭＡＰＫ９、ＮＡＭＰＴ、ＮＫＴＲ、ＰＳＥＮ１、ＲＮＦ１３０、ＲＹＢＰ、ＥＰＯＲ、ＧＺＭＫ、ＲＡＲＡ、ＲＨＥＢ、ＲＸＴＡ、およびＳＬＣ２５Ａ３７から選択される６〜１６の他の遺伝子のレベルを評価して遺伝子発現結果を得るための遺伝子発現評価素子；
ｂ）単一の腎臓移植センターにおける各遺伝子に対するＡＲサンプル由来の単一の参照発現ベクターと、単一の腎臓移植センターにおける各遺伝子に対する非ＡＲサンプル由来の単一の参照発現ベクターとを含んでなる参照標準素子；および
ｃ）前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較を含んでなるＡＲを診断するための説明書一式
を含んでなる、キット。   
[４６]  前記個人が２３歳以上の成人である、実施形態４５に記載のキット。   
[４７]  前記個人が２３歳未満の小児または若年成人である、実施形態４５に記載のキット。   
[４８]  ６〜１６の他の遺伝子がＣＦＬＡＲ、ＤＵＳＰ１、ＩＦＮＧＲ１、ＩＴＧＡＸ、ＭＡＰＫ９、ＮＡＭＰＴ、ＮＫＴＲ、ＰＳＥＮ１、ＲＮＦ１３０、ＲＹＢＰ、ＥＰＯＲ、ＧＺＭＫ、ＲＡＲＡ、ＲＨＥＢ、ＲＸＲＡ、およびＳＬＣ２５Ａ３７を含んでなる、実施形態４５〜４７のいずれかに記載のキット。   
[４９]  前記遺伝子発現評価素子がマイクロアレイチップで前記サンプルの遺伝子発現結果をアッセイすることを含んでなる、実施形態４５〜４８のいずれかに記載のキット。   
[５０]  前記遺伝子発現評価素子がビーズで前記サンプルの遺伝子発現結果をアッセイすることを含んでなる、実施形態４５〜４９のいずれかに記載のキット。   
[５１]  前記遺伝子発現評価素子がナノ粒子で前記サンプルの遺伝子発現結果をアッセイすることを含んでなる、実施形態４５〜５０のいずれかに記載のキット。   
[５２]  前記生体サンプルが血液サンプルである、実施形態４５〜５０のいずれかに記載にキット。   
[５３]  前記血液サンプルが末梢血白血球または末梢血単核細胞である、実施形態５２に記載のキット。   
[５４]  前記血液サンプルが全血である、実施形態５２に記載のキット。   
[５５]  前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較が７０％を超える感度でＡＲを予測する、実施形態４５〜５４のいずれかに記載のキット。   
[５６]  前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較が７０％を超える特異度でＡＲを予測する、実施形態４５〜５５のいずれかに記載のキット。   
[５７]  前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較が７０％を超える陽性的中率（ｐｐｖ）でＡＲを予測する、実施形態４５〜５６のいずれかに記載のキット。   
[５８]  前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較が７０％を超える陰性的中率（ｎｐｖ）でＡＲを予測する、実施形態４５〜５７のいずれかに記載のキット。   
[５９]  前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較がコンピューターまたは個人により行われる、実施形態４５〜５８のいずれかに記載のキット。   
[６０]  腎臓同種移植を受けた個人由来の生体サンプルにおいてＣＥＡＣＡＭ４、ならびにＣ  ＣＦＬＡＲ、ＤＵＳＰ１、ＩＦＮＧＲ１、ＩＴＧＡＸ、ＭＡＰＫ９、ＮＡＭＰＴ、ＮＫＴＲ、ＰＳＥＮ１、ＲＮＦ１３０、ＲＹＢＰ、ＥＰＯＲ、ＧＺＭＫ、ＲＡＲＡ、ＲＨＥＢ、ＲＸＲＡ、およびＳＬＣ２５Ａ３７から選択される６〜１６の他の遺伝子のレベルを測定することにより得られる遺伝子発現結果と比較するための参照標準を含んでなり、単一の腎臓移植センターにおける各遺伝子に対するＡＲサンプル由来の単一の参照発現ベクターと、単一の腎臓移植センターにおける各遺伝子に対する非ＡＲサンプル由来の単一の参照発現ベクターとを含んでなり、前記遺伝子発現と前記参照標準の比較が、前記個人において急性拒絶（ＡＲ）の診断に使用するため、非ＡＲの診断に使用するため、またはＡＲを発症するリスクの診断に使用するためのものである、製品。   
[６１]  前記個人が２３歳以上の成人である、実施形態６０に記載の製品。   
[６２]  前記個人が小児または２３歳未満の若年成人である、実施形態６０に記載の製品。   
[６３]  ６〜１６の他の遺伝子がＣＦＬＡＲ、ＤＵＳＰ１、ＩＦＮＧＲ１、ＩＴＧＡＸ、ＭＡＰＫ９、ＮＡＭＰＴ、ＮＫＴＲ、ＰＳＥＮ１、ＲＮＦ１３０、ＲＹＢＰ、ＥＰＯＲ、ＧＺＭＫ、ＲＡＲＡ、ＲＨＥＢ、ＲＸＲＡ、およびＳＬＣ２５Ａ３７を含んでなる、実施形態６０〜６２のいずれかに記載の製品。   
[６４]  ＣＥＡＣＡＭ４および６〜１６の他の遺伝子のレベルを測定することが、前記サンプルの遺伝子発現結果をマイクロアレイチップでアッセイすること、または前記サンプルの遺伝子発現結果をｑＰＣＲを用いてアッセイすることを含んでなる、実施形態６０〜６３のいずれかに記載の製品。   
[６５]  ＣＥＡＣＡＭ４および６〜１６の他の遺伝子のレベルを測定することが、前記サンプルの遺伝子発現結果をビーズでアッセイすることを含んでなる、実施形態６０〜６４のいずれかに記載の製品。   
[６６]  ＣＥＡＣＡＭ４および６〜１６の他の遺伝子のレベルを測定することが、前記サンプルの遺伝子発現結果をナノ粒子でアッセイすることを含んでなる、実施形態６０〜６５のいずれかに記載の製品。   
[６７]  前記生体サンプルが血液サンプルである、実施形態６０〜６６のいずれかに記載の製品。   
[６８]  前記血液サンプルが末梢血白血球または末梢血単核細胞である、実施形態６７に記載の製品。   
[６９]  前記血液サンプルが全血である、実施形態６７に記載の製品。   
[７０]  前記遺伝子発現と前記参照標準の比較が、７０％を超える感度でのＡＲの予測を含んでなる、実施形態６０〜６９のいずれかに記載の製品。   
[７１]  前記遺伝子発現と前記参照標準の比較が、７０％を超える特異度でのＡＲの予測を含んでなる、実施形態６０〜７０のいずれかに記載の製品。   
[７２]  前記遺伝子発現と前記参照標準の比較が、７０％を超える陽性的中率（ｐｐｖ）でのＡＲの予測を含んでなる、実施形態６０〜７１のいずれかに記載の製品。   
[７３]  前記遺伝子発現と前記参照標準の比較が、７０％を超える陰性的中率（ｎｐｖ）でのＡＲの予測を含んでなる、実施形態６０〜７２のいずれかに記載の製品。   
[７４]  腎臓移植患者のための処置の方法であって、
ａ）前記個人からの生体サンプルにおいてＣＥＡＣＡＭ４、ならびにＣＦＬＡＲ、ＤＵＳＰ１、ＩＦＮＧＲ１、ＩＴＧＡＸ、ＭＡＰＫ９、ＮＡＭＰＴ、ＮＫＴＲ、ＰＳＥＮ１、ＲＮＦ１３０、ＲＹＢＰ、ＥＰＯＲ、ＧＺＭＫ、ＲＡＲＡ、ＲＨＥＢ、ＲＸＲＡ、およびＳＬＣ２５Ａ３７から選択される６〜１６の間の他の遺伝子のレベルを測定して遺伝子発現結果を得ること；
ｂ）各遺伝子に対するＡＲサンプル由来の単一の参照発現ベクターと各遺伝子に対する非ＡＲサンプル由来の単一の参照発現ベクターとを含んでなる参照標準を使用し、前記遺伝子発現結果が前記参照標準と比較され、それにより、被験者を腎臓移植のＡＲを有するまたは腎臓移植のＡＲを有なさいとして同定すること；
ｃ）腎臓移植のＡＲを有する被験者では治療上有効な量の１種類以上の治療薬の投与を増やし、腎臓移植のＡＲを有さない被験者では治療上有効な量の１種類以上の治療薬の投与を維持し、または腎臓移植のＡＲを有さない被験者では治療上有効な量の１種類以上の治療薬の投与を減らすことを含んでなる試験を指示することを含んでなる、方法。   
[７５]  前記個人が２３歳以上の成人である、実施形態７４に記載の方法。   
[７６]  前記個人が小児または２３歳未満の若年成人である、実施形態７４に記載の方法。   
[７７]  ６〜１６の他の遺伝子がＣＦＬＡＲ、ＤＵＳＰ１、ＩＦＮＧＲ１、ＩＴＧＡＸ、ＭＡＰＫ９、ＮＡＭＰＴ、ＮＫＴＲ、ＰＳＥＮ１、ＲＮＦ１３０、ＲＹＢＰ、ＥＰＯＲ、ＧＺＭＫ、ＲＡＲＡ、ＲＨＥＢ、ＲＸＲＡ、およびＳＬＣ２５Ａ３７を含んでなる、実施形態７４〜７６のいずれかに記載の方法。   
[７８]  前記測定工程が前記サンプルの遺伝子発現結果をマイクロアレイチップでアッセイすること、または前記サンプルの遺伝子発現結果をｑＰＣＲを用いてアッセイすることを含んでなる、実施形態７４〜７７のいずれかに記載の方法。   
[７９]  前記測定工程が前記サンプルの遺伝子発現結果をビーズでアッセイすることを含んでなる、実施形態７４〜７８のいずれかに記載の方法。   
[８０]  前記測定工程が前記サンプルの遺伝子発現結果をナノ粒子でアッセイすることを含んでなる、実施形態７４〜７９のいずれかに記載の方法。   
[８１]  前記生体サンプルが血液サンプルである、実施形態７４〜８０のいずれかに記載の方法。   
[８２]  前記血液サンプルが末梢血白血球または末梢血単核細胞である、実施形態８１に記載の方法。   
[８３]  前記血液サンプルが全血である、実施形態８１に記載の方法。   
[８４]  前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較が、７０％を超える感度でのＡＲの予測を含んでなる、実施形態７４〜８３のいずれかに記載の方法。   
[８５]  前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較が、７０％を超える特異度でのＡＲの予測を含んでなる、実施形態７４〜８４のいずれかに記載の方法。   
[８６]  前記比較工程が７０％を超える陽性的中率（ｐｐｖ）でのＡＲの予測を含んでなる、実施形態７４〜８５のいずれかに記載の方法。   
[８７]  前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較が、７０％を超える陰性的中率（ｎｐｖ）でのＡＲの予測を含んでなる、実施形態７４〜８６のいずれかに記載の方法。