(57)【要約】【課題】実際の産業（医療現場）利用に適した肺炎桿菌及び近縁菌種の菌株識別法を提供すること、並びにそれに用いるプライマーセットを提供すること。【解決手段】肺炎桿菌及び近縁菌種の染色体遺伝子配列上の、（１）genomic isletを構成するORF及び（２）genomic island中に存在するhyper variableなORFを構成するORＦの有無を任意の順で検出し、これらORFの有無の組み合わせによる肺炎桿菌及び近縁菌種の菌株識別のための方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
肺炎桿菌及び近縁菌種の染色体遺伝子配列上の、
（１）genomic isletを構成するORF、及び
（２）genomic island中に存在するhyper variableなORFを構成するORF、
の有無を任意の順で検出し、これらORFの有無の組み合わせにより遺伝子型別分類を行うステップを含む、肺炎桿菌及び近縁菌種の菌株識別のための方法。
【請求項２】
前記（１）のgenomic isletを構成するORFがKPHS_23160、KPHS_25730、KPHS_14300、A7321_12080、KPHS_05620、A7321_12740、KPHS_27850、KPHS_19280、PMK1_04123、ABY63_05860、KPNIH10_15035、PMK1_03738、KPHS_04610、KPHS_05440、KPHS_10130、KPHS_12340、KPHS_12360、KPHS_14360、KPHS_17140、KPHS_22680、KPHS_27840、KPHS_28160、KPHS_30110、KPHS_33080、KPHS_35440、KPHS_44950、KPHS_45270、BB751_16465、BB751_24340、KPNIH10_06180、KPNIH10_06335、KPNIH10_06350、KPNIH10_10880、KPNIH10_13265、A7321_01305、A7321_14925、KPHS_22950、KPHS_34550、KPHS_35720、KPHS_49450、KPHS_51010、A7321_00110、A7321_01475、A7321_03820、A7321_09350、A7321_15655、KPNIH29_02070、KPNIH29_25465、AM275_13120及びPMK1_02643からなる群より選ばれる少なくとも１種のORFであり、前記（２）のgenomic island中に存在するhyper variableなORFがAXK16_16575、Kpn2146_5469、KPHS_34600、KPHS_12700、KPHS_01250、KPHS_10080、KPHS_12370、KPHS_25140、KPHS_30440、KPHS_34840、KPHS_34850、KPHS_35110、KPHS_35580、N559_1651、Kpn2146_6120、KPNJ1_02432、KPNJ2_02710及びKPR0928_21110からなる群より選ばれる少なくとも１種のORFである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記（１）のORFにおけるgenomic islandがKPHS_23160、KPHS_25730、KPHS_14300、A7321_12080、KPHS_05620、A7321_12740、KPHS_27850、KPHS_19280、PMK1_04123、ABY63_05860、KPNIH10_15035、PMK1_03738、KPHS_04610、KPHS_05440、KPHS_10130、KPHS_12340、KPHS_12360、KPHS_14360、KPHS_17140、KPHS_22680、KPHS_27840、KPHS_28160、KPHS_30110、KPHS_33080、KPHS_35440、KPHS_44950、KPHS_45270、BB751_16465、BB751_24340、KPNIH10_06180、KPNIH10_06335、KPNIH10_06350、KPNIH10_10880、KPNIH10_13265、A7321_01305、A7321_14925、KPHS_22950、KPHS_34550、KPHS_35720、KPHS_49450、KPHS_51010、A7321_00110、A7321_01475、A7321_03820、A7321_09350、A7321_15655、KPNIH29_02070、KPNIH29_25465、AM275_13120及びPMK1_02643からなる群より選ばれる少なくとも４種のORFであり、前記（２）のgenomic island中に存在するhyper variableなORFがAXK16_16575、Kpn2146_5469、KPHS_34600、KPHS_12700、KPHS_01250、KPHS_10080、KPHS_12370、KPHS_25140、KPHS_30440、KPHS_34840、KPHS_34850、KPHS_35110、KPHS_35580、N559_1651、Kpn2146_6120、KPNJ1_02432、KPNJ2_02710及びKPR0928_21110からなる群より選ばれる少なくとも４種のORFである請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記（１）のORFにおけるgenomic islandがKPHS_23160、KPHS_25730、KPHS_14300、A7321_12080、KPHS_05620、A7321_12740、KPHS_27850、KPHS_19280、PMK1_04123、ABY63_05860、KPNIH10_15035及びPMK1_03738の１２種のORFであり、前記（２）のgenomic island中に存在するhyper variableなORFがAXK16_16575、Kpn2146_5469、KPHS_34600及びKPHS_12700の４種のORFである請求項１に記載の方法。
【請求項５】
配列表の配列番号１と２、配列番号３と４、配列番号５と６、配列番号７と８、配列番号９と１０、配列番号１１と１２、配列番号１３と１４、配列番号１５と１６、配列番号１７と１８、配列番号１９と２０、配列番号２０と２１、配列番号２１と２２、配列番号２３と２４に示された１２組の塩基配列の組み合わせ（但し、上記塩基配列は、２塩基以下の塩基の付加、置換、欠失及び／又は挿入を有していてもよい）からなる１２組のプライマーを用いて、PCR法により前記（１）のORFの検出を行い、配列番号１０１と１０２、配列番号１０３と１０４、配列番号１０５と１０６、配列番号１０７と１０８に示された４組の塩基配列の組み合わせ（但し、上記塩基配列は、２塩基以下の塩基の付加、置換、欠失及び／又は挿入を有していてもよい）からなる４組のプライマーを用いて、PCR法により前記（１）及び（２）のORFの検出を行う、請求項２〜４の何れか１項に記載の方法。
【請求項６】
上記塩基配列が、塩基の付加、置換、欠失及び／又は挿入を有していない、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記PCR法がマルチプレックスPCR法である、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
前記（１）及び（２）のORF有無の検出結果を、それぞれ１（有）と０（無）に置き換えて２進法コード化する、請求項１〜７の何れか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記２進法コード化した結果をさらに１０進法コード化する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記近縁菌種がKlebsiella quasipneumoniae及びKlebsiella variicolaである、請求項１〜９の何れか１項に記載の方法。
【請求項１１】
配列表の配列番号１と２、配列番号３と４、配列番号５と６、配列番号７と８、配列番号９と１０、配列番号１１と１２、配列番号１３と１４、配列番号１５と１６、配列番号１７と１８、配列番号１９と２０、配列番号２０と２１、配列番号２１と２２、配列番号２３と２４に示された１２組の塩基配列の組み合わせ（但し、上記塩基配列は、２塩基以下の塩基の付加、置換、欠失及び／又は挿入を有していてもよい）からなる１２組のプライマーと、配列番号１０１と１０２、配列番号１０３と１０４、配列番号１０５と１０６、配列番号１０７と１０８に示された４組の塩基配列の組み合わせ（但し、上記塩基配列は、２塩基以下の塩基の付加、置換、欠失及び／又は挿入を有していてもよい）からなる４組のプライマーを含む肺炎桿菌及び近縁菌種の菌株識別のためのプライマーセット。
【請求項１２】
前記近縁菌種がKlebsiella quasipneumoniae及びKlebsiella variicolaである、請求項１１項に記載のプライマーセット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肺炎桿菌（クレブシエラ・ニューモニエ、Klebsiella pneumoniae）及び近縁菌種のクローン同定法及び／又は菌株識別法ならびにこれに用いるプライマーセットに関する。
【背景技術】
【０００２】
肺炎桿菌は、尿路感染症や肺炎などの呼吸器感染症の起因菌の一つとして問題となっている病原細菌である。特に、近年、第三世代セファロスポリン耐性を獲得した基質特異性拡張型β-ラクタマーゼ（ESBL）産生肺炎桿菌や、カルバペネム耐性肺炎桿菌など、薬剤耐性を示す株が増加しつつあり、これによる院内感染例の増加が問題視されている。
欧州や米国の医療機関では、カルバペネム分解酵素であるカルバペネマーゼを産生し、且つSequence Type 258（ST258）に属する肺炎桿菌の増加と蔓延が深刻な課題となっている。しかし、本邦で分離される肺炎桿菌の株の特徴は欧米とは異なり、分離株のSTがST258のような特定のSTに偏ることは少なく、多種多様なSTに分類される。また、薬剤耐性株も欧米ほどの蔓延はみられず、厚生労働省院内感染対策サーベイランス事業の集計によると、国内の主要な病院で分離される肺炎桿菌のうち、2017年時点で第三世代セファロスポリン耐性株の割合は8.9％、カルバペネム耐性株の割合は１％以下であり、我が国では、この現状を今後も維持する必要がある。
【０００３】
なお、肺炎桿菌は近年分類が見直され、近縁な菌種としてKlebsiella variicolaとKlebsiella quasipneumoniaeが存在する。これら２菌種も本発明の適用範囲に含まれる。
【０００４】
また、院内感染が疑われる場合には、感染ルートを特定するために、異なる患者から分離された菌株が遺伝的に同一か否かを判定する必要がある。そのために菌株が保有するゲノムの特徴を検出し菌株を特定するが、これをタイピングという。
肺炎桿菌のタイピングの方法としては、従来、パルスフィールドゲル電気泳動法が多用されている。パルスフィールドゲル電気泳動法は菌の染色体ＤＮＡ中に複数存在する制限酵素切断サイトの位置と切断長に多型性があることを利用し、その電気泳動パターンとして菌株の遺伝子型を決定する方法で、実施には３日以上かかるが、再現性が高いことから肺炎桿菌の菌株識別の定法とされる。
【０００５】
しかし、パルスフィールドゲル電気泳動法は、複雑なバンドパターンを比較することにより判定する必要があるため、主観的な要素が入りがちである。また、同時に泳動した菌株でさえもバンドパターンに微妙な差が生じることがあり、その場合は、遺伝子型が同一か否かを判断するには熟練者が必要となる。したがって、異なる時刻または別の実験室で得られたパルスフィールドゲル電気泳動法の結果を比較する方法により、複数の分離株の遺伝子型が同等か否かを判定することは非常に困難であった。
【０００６】
他方、特許文献１には、黄色ブドウ球菌の遺伝子型別分類法及びこれに用いるプライマーセットが、特許文献２には、緑膿菌の遺伝子型別分類法及びこれに用いるプライマーセットが、特許文献３には、アシネトバクター属菌の遺伝子型別分類法及びこれに用いるプライマーセットが、特許文献４には、大腸菌の遺伝子型別分類法及びこれに用いるプライマーセットが、特許文献５には、Clostridium difficileの遺伝子型別分類法及びこれに用いるプライマーセットが記載されている
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１１−１２０５２８号公報
【特許文献２】特開２０１３−１４６２４４号公報
【特許文献３】特開２０１４−２０７８９５号公報
【特許文献４】特開２０１６−４９１０９号公報
【特許文献５】特開２０１９−４８１１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
肺炎桿菌は、腸内細菌科に属するグラム陰性桿菌であり、健常者の腸管の正常細菌叢を構成するありふれた細菌の一つである。しかし、健常者において尿路感染症の起因菌となるだけでなく、細菌に対する感染防御能力の低下した易感染者や高齢者などにおいてしばしば肺炎などの原因となる病原菌である。また、本菌による市中発症の重篤な肝膿瘍や敗血症などの報告も増加し、臨床的重要性が高い。それに加え、薬剤耐性を獲得したクローンも複数出現し、医療現場における感染制御が課題となっている。そこで、薬剤耐性菌対策や効果的な感染制御を実施する上で、集団感染発生時の感染ルートの特定や、感染規模の把握をすることが重要であり、そのために、分離菌株の分子疫学解析が必要となる。院内感染が疑われる事例では菌のクローナルな伝播を確認するため、multilocus sequence typing (MLST)法やパルスフィールドゲル(PFGE)電気泳動法という方法が用いられることが多い。MLST法は染色体上の少なくとも7カ所の塩基配列を決定する必要があり、コストが高くなる。パルスフィールドゲル電気泳動法は染色体DNAを酵素処理した後、特殊な電気泳動装置による解析を必要とするため、実施に時間がかかる。加えて、複雑なバンドパターンの比較を行う必要があるため、さらに、異なる日時に電気泳動した株を比較するには専用のソフトウェアが必要であり、医療現場で実施することは困難である。
【０００９】
本発明は、上記実情に鑑みて、迅速かつ容易な肺炎桿菌及び近縁菌種の菌株識別のための手法を開発し、より実際の産業（医療現場）利用に適した肺炎桿菌の菌株識別のための方法を提供することを目的としている。また本発明は、さらに上記菌株識別のための方法に用いるプライマーセットを提供することをもその目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
肺炎桿菌タイピングの標準法であるMLST法菌株識別能が低いが、全ゲノムデータを比較検討すると肺炎桿菌のMLST型（sequence type、ST型）が同一となるような近縁なクローンの場合、染色体上の多様性が低いことが示されている。従って、単純に外来遺伝子islandを検出しただけでは菌株識別能を上げることは困難であり、菌株による保有状態が大きく異なるhyper variableな検出部位を探す必要がある。この点にも注意を払いつつ、本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討し、データベース上に蓄積されつつある多数の肺炎桿菌の染色体の塩基配列データを比較検討して、臨床分離株におけるORFの保有パターンを調査した結果、PFGEレベル及び株レベルでの識別に有効なORFの発見に成功した。具体的には、本発明者らは、（１）染色体遺伝子配列上の、genomic isletを構成するORFならびに（２）染色体遺伝子配列上のgenomic island中に存在するhyper variableなORFの有無を任意の順で検出し、これらORFの有無の組み合わせにより遺伝子型別分類を行うことにより、より有効に肺炎桿菌及び近縁菌種の遺伝子型別分類を行うことができることを見出した。
【００１１】
即ち、本発明によれば、肺炎桿菌及び近縁菌種の染色体遺伝子配列上の、（１）genomic isletを構成するORF、及び（２）genomic island中に存在するhyper variableなORFを構成するORFの有無を任意の順で検出し、これらORFの有無の組み合わせにより遺伝子型別分類を行うステップを含む、肺炎桿菌及び近縁菌種の菌株識別のための方法が提供される。
【００１２】
ここに挙げたORFは遺伝子の読み枠の意味であるが、開始コドンと終止コドンにはさまれたおよそ99bp以上の領域を示しており、タンパク質に翻訳されるものと翻訳されないものを含む。
【００１３】
本発明の肺炎桿菌及び近縁菌種の菌株識別のための方法においては、前記（１）のgenomic isletを構成するORFがKPHS_23160、KPHS_25730、KPHS_14300、A7321_12080、KPHS_05620、A7321_12740、KPHS_27850、KPHS_19280、PMK1_04123、ABY63_05860、KPNIH10_15035、PMK1_03738、KPHS_04610、KPHS_05440、KPHS_10130、KPHS_12340、KPHS_12360、KPHS_14360、KPHS_17140、KPHS_22680、KPHS_27840、KPHS_28160、KPHS_30110、KPHS_33080、KPHS_35440、KPHS_44950、KPHS_45270、BB751_16465、BB751_24340、KPNIH10_06180、KPNIH10_06335、KPNIH10_06350、KPNIH10_10880、KPNIH10_13265、A7321_01305、A7321_14925、KPHS_22950、KPHS_34550、KPHS_35720、KPHS_49450、KPHS_51010、A7321_00110、A7321_01475、A7321_03820、A7321_09350、A7321_15655、KPNIH29_02070、KPNIH29_25465、AM275_13120及びPMK1_02643からなる群より選ばれる少なくとも１種（より好ましくは少なくとも４種、特に好ましくはKPHS_23160、KPHS_25730、KPHS_14300、A7321_12080、KPHS_05620、A7321_12740、KPHS_27850、KPHS_19280、PMK1_04123、ABY63_05860、KPNIH10_15035及びPMK1_03738の１２種）のORFであることが好ましく、前記（２）のgenomic island中に存在するORFがAXK16_16575、Kpn2146_5469、KPHS_34600、KPHS_12700、KPHS_01250、KPHS_10080、KPHS_12370、KPHS_25140、KPHS_30440、KPHS_34840、KPHS_34850、KPHS_35110、KPHS_35580、N559_1651、Kpn2146_6120、KPNJ1_02432、KPNJ2_02710及びKPR0928_21110からなる群より選ばれる少なくとも１種（より好ましくは少なくとも３種、特に好ましくはAXK16_16575、Kpn2146_5469、KPHS_34600及びKPHS_12700の４種）のORFであることが好ましい。
【００１４】
また、本発明の菌株識別のための方法は配列表の配列番号１と２、配列番号３と４、配列番号５と６、配列番号７と８、配列番号９と１０、配列番号１１と１２、配列番号１３と１４、配列番号１５と１６、配列番号１７と１８、配列番号１９と２０、配列番号２１と２２、配列番号２３と２４に示された１２組の塩基配列の組み合わせ（但し、上記塩基配列は、２塩基以下の塩基の付加、置換、欠失及び／又は挿入を有していてもよい）からなる１２組のプライマーを用いて、PCR法により前記（１）のORFの検出を行い、配列番号１０１と１０２、配列番号１０３と１０４、配列番号１０５と１０６、配列番号１０７と１０８に示された４組の塩基配列の組み合わせ（但し、上記塩基配列は、２塩基以下の塩基の付加、置換、欠失及び／又は挿入を有していてもよい）からなる４組のプライマーを用いて、PCR法により前記（２）のORFの検出を行うことによって実施することができる。
【００１５】
上記の通り、上記プライマーには、２塩基以下の塩基の付加、置換、欠失及び／又は挿入が有ってもよいが、高精度に遺伝子型別分類する観点からは、前記プライマーに塩基の付加、置換、欠失及び／又は挿入はないことが好ましい。
【００１６】
前記PCR法としてマルチプレックスPCR法を採用すると、遺伝子型別分類のコストを抑えることができる。
【００１７】
前記（１）及び（２）のORF有無の検出結果を、それぞれ１（有）と０（無）に置き換えて２進法コード化すると、検出結果が数値化され見やすくなる。
前記２進法コード化した結果をさらに１０進法コード化することで、結果の桁数が少なくなり、結果がより判別しやすくなるとともに、他の日時、他の検査室等で得られた結果と正確に比較することが可能となる。
【００１８】
さらに本発明によれば、配列番号１と２、配列番号３と４、配列番号５と６、配列番号７と８、配列番号９と１０、配列番号１１と１２、配列番号１３と１４、配列番号１５と１６、配列番号１７と１８、配列番号１９と２０、配列番号２１と２２、配列番号２３と２４に示された１２組の塩基配列の組み合わせ（但し、上記塩基配列は、２塩基以下の塩基の付加、置換、欠失及び／又は挿入を有していてもよい）からなる１２組のプライマー、配列番号１０１と１０２、配列番号１０３と１０４、配列番号１０５と１０６、配列番号１０７と１０８に示された４組の塩基配列の組み合わせ（但し、上記塩基配列は、２塩基以下の塩基の付加、置換、欠失及び／又は挿入を有していてもよい）からなる６組のプライマーを含む、肺炎桿菌及び近縁菌種の遺伝子型別分類用プライマーセットが提供される。
【００１９】
上記の通り、上記プライマーには、２塩基以下の塩基の付加、置換、欠失及び／又は挿入が有ってもよいが、高精度に遺伝子型別分類する観点からは、前記プライマーに塩基の付加、置換、欠失及び／又は挿入はないことが好ましい。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、肺炎桿菌及び近縁菌種の菌株識別を、特殊な装置や作業者の熟練を要さずに簡便に、迅速、客観的かつ高精度に行うことができるため、肺炎桿菌及び近縁菌種の院内感染の発生を速やかに検出し、院内感染の広がりの防止を達成することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、実施例１の電気泳動写真を示す。図１において、「ＰＣ」はポジティブコントロールの略であり、「１ ２・・・・」などと記載された数値は分離株の番号を示している。また「Ｍ」は５０ｂｐラダーを示す。
【図２】図２は、実施例２の電気泳動写真を示す。図２において、「ＰＣ」はポジティブコントロールの略であり、「１ ２・・・・」などと記載された数値は分離株の番号を示している。また「Ｍ」は５０ｂｐラダーを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、本発明について具体的に説明する。
本発明に係る肺炎桿菌及び近縁菌種の菌株識別のための方法は、肺炎桿菌及び近縁菌種の染色体遺伝子配列上の、（１）genomic isletを構成するORF、及び（２）染色体遺伝子配列上のgenomic island中に存在するhyper variableなORFの有無を任意の順で検出し、これらORFの有無の組み合わせにより遺伝子型別分類を行うステップを含む、これら２種類の由来の異なるORFの保有の有無の組み合わせにより遺伝子型別分類を行うステップを有することを特徴としている。以下、これらのORFについて説明する。
【００２３】
（肺炎桿菌の遺伝的特徴）
肺炎桿菌の遺伝的バックグラウンドを系統的に分類する方法として、パルスフィールドゲル電気泳動法やmultilocus sequence typing（MLST）解析が利用されている。
【００２４】
MLST解析では7カ所のハウスキーピング遺伝子(adk, atpA, dxr, glyA, recA, soda, tpi)の塩基配列を決定し、その多型性に基づいてsequence type (ST)を決めることでクローンの識別を行う。また近縁なSTの集団を集めたclonal complex (CC)としてクローン性を判定することもある。なお、ST型またはCCを推定するにはgenomic isletの保有パターンを検出することが有効であることが黄色ブドウ球菌、緑膿菌、アシネトバクター属菌、大腸菌及びClostridium difficileでは示されていたが、肺炎桿菌でも同様の手法が有効であるか否かはこれまでは不明であった。
【００２５】
肺炎桿菌はヒト腸管常在菌の一つであり長らくヒトと共生関係にあることから、さまざまな遺伝的バックグラウンドを持つものが存在する。臨床分離された実際の野生株における遺伝的バックグラウンドの調査結果（種々のORFの検出結果を含む）は文献として個々の研究施設における断片的な情報として利用できるが、それのみでは、最低限のORFを検出することにより肺炎桿菌の菌株識別法を開発するには十分でない。
【００２６】
そこで本発明者は、臨床分離された肺炎桿菌を収集しMLST解析を行い、それらの遺伝的バックグラウンドの調査を行った。その結果、日本で臨床分離される肺炎桿菌には多様なST型に分類される株が存在することが判明し、院内感染を起こしたクローン同定のためにはST型を識別できる程度の菌株識別能を有する試験法を構築する必要がある。
【００２７】
［（１）genomic isletを構成するORF］
前記のST型を区別するためには、肺炎桿菌においてもgenomic isletを構成するORFを検出することが有用であることがわかった（下記表１参照）。genomic isletとは、細菌の染色体遺伝子配列同士を比較した場合に、5kbp程度、またはそれ以下の大きさで配列が異なる部分を言い、これは染色体遺伝子配列全体に散在しており、個体の生存確率に影響せず、進化の過程で取り残されたものと考えられる。
【００２８】
臨床分離株におけるgenomic islet保有状況を調査した結果を表１に示す。KPHS_23160〜PMK1_02643は個々のgenomic isletの識別記号である。
【表１−１】
2020115793.tif 000002
【表１−２】
2020115793.tif 000003
【００２９】
表１は臨床分離株のST型と（１）genomic isletを構成するORFの関係を調査した結果である。１は検出を、０は検出されなかったことを示す。表１からわかるように、肺炎桿菌のST型の異なる株ではgenomic islet (KPHS_23160〜PMK1_02643)の保有パターンが異なっている。
【００３０】
肺炎桿菌においては多様なクローンが臨床分離されることが示されており、集団感染の解析においては、主にgenomic islet検出によるタイピングによって菌株識別能が得られる。
【００３１】
なお、KPHSと数字の組合せ（KPHS_01250等）はHS11286 (Accession No. CP003200)に登録されているORF名を意味し、
A7321と数字の組合せ（A7321_00110等）はW14 (Accession No. CP015753)に登録されているORF名を意味し、
PMK1と数字の組合せ（PMK1_02643はPMK1等）(Accession No. CP008929)に登録されているORF名を意味し、
ABY63と数字の組合せ（ABY63_05860等）はCAV1392 (Accession No. CP011578)に登録されているORF名を意味し、
KPNIH10と数字の組合せ（KPNIH10_06180等）はKPNIH10 (Accession No. CP007727)に登録されているORF名を意味し、
BB751と数字の組合せ（BB751_16465等）はKp_Goe_149832 (Accession No. CP018695)に登録されているORF名を意味し、
KPNIH29と数字の組合せ（KPNIH29_25465等）はKPNIH29 (Accession No. CP009863)に登録されているORF名を意味し、
AM275と数字の組合せ（AM275_13120等）はUCLAOXA232KP_Pt0 (Accession No. CP012560)に登録されているORF名を意味する。
例えばKPHS_01250 ORFはHS11286株のみにしか存在しないわけではなく、例えば菌株番号４においても検出され、それから派生した菌株や、それとは異なる系統の肺炎桿菌においても存在する可能性がある。
【００３２】
なお、ORF  KPHS_23160は配列表の配列番号１（フォワード）及び２（リバース）のプライマーを使用することで、PCRにより検出可能であり、
ORF  KPHS_25730は配列表の配列番号３（フォワード）及び４（リバース）のプライマーを使用することで、PCRにより検出可能であり、
ORF  KPHS_14300は配列表の配列番号５（フォワード）及び６（リバース）のプライマーを使用することで、PCRにより検出可能であり、
ORF  A7321_12080は配列表の配列番号７（フォワード）及び８（リバース）のプライマーを使用することで、PCRにより検出可能であり、
ORF  KPHS_05620は配列表の配列番号９（フォワード）及び１０（リバース）のプライマーを使用することで、PCRにより検出可能であり、
ORF  A7321_12740は配列表の配列番号１１（フォワード）及び１２（リバース）のプライマーを使用することで、PCRにより検出可能であり、
ORF  KPHS_27850は配列表の配列番号１３（フォワード）及び１４（リバース）のプライマーを使用することで、PCRにより検出可能であり、
ORF  KPHS_19280は配列表の配列番号１５（フォワード）及び１６（リバース）のプライマーを使用することで、PCRにより検出可能であり、
ORF  PMK1_04123は配列表の配列番号１７（フォワード）及び１８（リバース）のプライマーを使用することで、PCRにより検出可能であり、
ORF  ABY63_05860は配列表の配列番号１９（フォワード）及び２０（リバース）のプライマーを使用することで、PCRにより検出可能であり、
ORF  KPNIH10_15035は配列表の配列番号２１（フォワード）及び２２（リバース）のプライマーを使用することで、PCRにより検出可能であり、
ORF  PMK1_03738は配列表の配列番号２３（フォワード）及び２４（リバース）のプライマーを使用することで、PCRにより検出可能であり、
ORF  KPHS_04610は配列表の配列番号２５（フォワード）及び２６（リバース）のプライマーを使用することで、PCRにより検出可能であり、
ORF  KPHS_05440は配列表の配列番号２７（フォワード）及び２８（リバース）のプライマーを使用することで、PCRにより検出可能であり、
ORF  KPHS_10130は配列表の配列番号２９（フォワード）及び３０（リバース）のプライマーを使用することで、PCRにより検出可能であり、
ORF  KPHS_12340は配列表の配列番号３１（フォワード）及び３２（リバース）のプライマーを使用することで、PCRにより検出可能であり、
ORF  KPHS_12360は配列表の配列番号３３（フォワード）及び３４（リバース）のプライマーを使用することで、PCRにより検出可能であり、
ORF  KPHS_14360は配列表の配列番号３５（フォワード）及び３６（リバース）のプライマーを使用することで、PCRにより検出可能であり、
ORF  KPHS_17140は配列表の配列番号３７（フォワード）及び３８（リバース）のプライマーを使用することで、PCRにより検出可能であり、
ORF  KPHS_22680は配列表の配列番号３９（フォワード）及び４０（リバース）のプライマーを使用することで、PCRにより検出可能であり、
ORF  KPHS_27840は配列表の配列番号４１（フォワード）及び４２（リバース）のプライマーを使用することで、PCRにより検出可能であり、
ORF  KPHS_28160は配列表の配列番号４３（フォワード）及び４４（リバース）のプライマーを使用することで、PCRにより検出可能であり、
ORF  KPHS_30110は配列表の配列番号４５（フォワード）及び４６（リバース）のプライマーを使用することで、PCRにより検出可能であり、
ORF  KPHS_33080は配列表の配列番号４７（フォワード）及び４８（リバース）のプライマーを使用することで、PCRにより検出可能であり、
ORF  KPHS_35440は配列表の配列番号４９（フォワード）及び５０（リバース）のプライマーを使用することで、PCRにより検出可能であり、
ORF  KPHS_44950は配列表の配列番号５１（フォワード）及び５２（リバース）のプライマーを使用することで、PCRにより検出可能であり、
ORF  KPHS_45270は配列表の配列番号５３（フォワード）及び５４（リバース）のプライマーを使用することで、PCRにより検出可能であり、
ORF  BB751_16465は配列表の配列番号５５（フォワード）及び５６（リバース）のプライマーを使用することで、PCRにより検出可能であり、
ORF  BB751_24340は配列表の配列番号５７（フォワード）及び５８（リバース）のプライマーを使用することで、PCRにより検出可能であり、
ORF  KPNIH10_06180は配列表の配列番号５９（フォワード）及び６０（リバース）のプライマーを使用することで、PCRにより検出可能であり、
ORF  KPNIH10_06335は配列表の配列番号６１（フォワード）及び６２（リバース）のプライマーを使用することで、PCRにより検出可能であり、
ORF  KPNIH10_06350は配列表の配列番号６３（フォワード）及び６４（リバース）のプライマーを使用することで、PCRにより検出可能であり、
ORF  KPNIH10_10880は配列表の配列番号６５（フォワード）及び６６（リバース）のプライマーを使用することで、PCRにより検出可能であり、
ORF  KPNIH10_13265は配列表の配列番号６７（フォワード）及び６８（リバース）のプライマーを使用することで、PCRにより検出可能であり、
ORF  A7321_01305は配列表の配列番号６９（フォワード）及び７０（リバース）のプライマーを使用することで、PCRにより検出可能であり、
ORF  A7321_14925は配列表の配列番号７１（フォワード）及び７２（リバース）のプライマーを使用することで、PCRにより検出可能であり、
ORF  KPHS_22950は配列表の配列番号７３（フォワード）及び７４（リバース）のプライマーを使用することで、PCRにより検出可能であり、
ORF  KPHS_34550は配列表の配列番号７５（フォワード）及び７６（リバース）のプライマーを使用することで、PCRにより検出可能であり、
ORF  KPHS_35720は配列表の配列番号７７（フォワード）及び７８（リバース）のプライマーを使用することで、PCRにより検出可能であり、
ORF  KPHS_49450は配列表の配列番号７９（フォワード）及び８０（リバース）のプライマーを使用することで、PCRにより検出可能であり、
ORF  KPHS_51010は配列表の配列番号８１（フォワード）及び８２（リバース）のプライマーを使用することで、PCRにより検出可能であり、
ORF  A7321_00110は配列表の配列番号８３（フォワード）及び８４（リバース）のプライマーを使用することで、PCRにより検出可能であり、
ORF  A7321_01475は配列表の配列番号８５（フォワード）及び８６（リバース）のプライマーを使用することで、PCRにより検出可能であり、
ORF  A7321_03820は配列表の配列番号８７（フォワード）及び８８（リバース）のプライマーを使用することで、PCRにより検出可能であり、
ORF  A7321_09350は配列表の配列番号８９（フォワード）及び９０（リバース）のプライマーを使用することで、PCRにより検出可能であり、
ORF  A7321_15655は配列表の配列番号９１（フォワード）及び９２（リバース）のプライマーを使用することで、PCRにより検出可能であり、
ORF  KPNIH29_02070は配列表の配列番号９３（フォワード）及び９４（リバース）のプライマーを使用することで、PCRにより検出可能であり、
ORF  KPNIH29_25465は配列表の配列番号９５（フォワード）及び９６（リバース）のプライマーを使用することで、PCRにより検出可能であり、
ORF  AM275_13120は配列表の配列番号９７（フォワード）及び９８（リバース）のプライマーを使用することで、PCRにより検出可能であり、
ORF  PMK1_02643は配列表の配列番号９９（フォワード）及び１００（リバース）のプライマーを使用することで、PCRにより検出可能である。
上記ORFを検出することで、容易にST型の区別ができる。
【００３３】
またこれらを、後述するPCR及び電気泳動の条件を利用して検出した場合には、目的とするＤＮＡ断片が増幅しやすく、またエクストラバンドが現れにくい。
【００３４】
以上では、PCR法によりgenomic isletのORF（１）を検出することを主に説明してきたが、genomic isletのORF（１）はその他の方法によっても検出可能であり、たとえばハイブリダイゼーションによって検出可能である。
【００３５】
［（２）genomic islandを構成するORF］
肺炎桿菌の中には、臨床検体からの分離頻度の比較的高いクローンが存在することが知られている。分離頻度の高いクローンは地理的、時間的に関連性の乏しい院内感染事例間においても分離されることがしばしばあるため、クローン識別より高い識別能力を有する菌株識別法が必要となる。
【００３６】
近年ゲノムの解読が進み、肺炎桿菌には５〜１００個の外来遺伝子からなる遺伝子クラスターが見いだされる。このクラスターをgenomic islandという。genomic islandには溶原ファージや病原アイランド、耐性アイランドに加え機能が不明なものが含まれる。個々のgenomic islandはおよそ５ｋｂｐ程度、またはそれ以上の大きさで、５〜１００個のORFから構成されている。genomic islandにはモザイク状にORFが組み合わされ、genomic island内のORFの構成に多様性が見られる場合と、株が異なってもORF構成がほとんど同じで多様性が見られない場合がある。
【００３７】
しかし、肺炎桿菌にはさまざまな株が存在する。実際の野生株における遺伝子型の調査結果（種々のORFの検出結果を含む）は文献あるいはゲノム情報を担う塩基配列データベースとして個々の断片的な情報として利用できるが、それのみでは最低限のORFを検出することによる肺炎桿菌の菌株同定法を開発するには十分でない。
【００３８】
そこで本発明者はGenBankに登録された肺炎桿菌の塩基配列情報及び臨床分離株のドラフトゲノムデータを利用し、種々のgenomic islandのORFを検出するためのプライマーを設計し、多様な遺伝的バックグラウンドを持つ肺炎桿菌について、それらの保有するgenomic island領域のORFの構成について検討した。
【００３９】
ゲノムデータベース登録株における全塩基配列データの精査、及び臨床分離株によるORF保有確認実験を繰り返した結果、genomic island領域のORFをいくつか組み合わせて検出することが、肺炎桿菌の菌株識別に有効であることが明らかとなった。
【００４０】
その結果AXK16_16575、Kpn2146_5469、KPHS_34600、KPHS_12700、KPHS_01250、KPHS_10080、KPHS_12370、KPHS_25140、KPHS_30440、KPHS_34840、KPHS_34850、KPHS_35110、KPHS_35580、N559_1651、Kpn2146_6120、KPNJ1_02432、KPNJ2_02710及びKPR0928_21110を検出の対象とすると、肺炎桿菌の菌株の遺伝的背景の相違を高精度で識別することができることを本発明者は見出した（下記表２参照）。上記のORFを検出することによって、ほとんどのクローンにおいて菌株識別能力の向上が達成された。これらのgenomic islandを構成するORFをすべて検出することで最大の菌株識別能力が実現される。
【００４１】
なお、AXK16と数字の組合せ（AXK16_16575等）はKP38731 (Accession No. CP014294)に登録されているORF名を意味し、
Kpn2146と数字の組合せ（Kpn2146_6120等）はATCC_BAA-2146 (Accession No. CP006659)に登録されているORF名を意味し、
KPHSと数字の組合せ（KPHS_34600等）はHS11286 (Accession No. CP003200)に登録されているORF名を意味し、
N559と数字の組合せ（N559_1651等）はGCA_000445405 (Accession No. CP006656)に登録されているORF名を意味し、
KPNJ1と数字の組合せ（KPNJ1_02432等）は30660-NJST258_1 (Accession No. CP006923)に登録されているORF名を意味し、
KPNJ2と数字の組合せ（KPNJ2_02710等）は30684-NJST258_2 (Accession No. CP006918)に登録されているORF名を意味し、
KPR0928と数字の組合せ（KPR0928_21110等）はKPR0928 (Accession No. CP008831)に登録されているORF名を意味する。
例えばAXK16_16575 ORFはKP38731株のみにしか存在しないわけではなく、例えば菌株番号５においても検出されるため、それから派生した菌株や、それとは異なる系統の肺炎桿菌においても存在する可能性がある。
【００４２】
臨床分離株におけるgenomic island保有状況を調査した結果を表２に示す。臨床分離株においても菌株に特異的なORF保有パターンを示すことが明らかとなった。なお、以下の表２のAXK16_16575〜KPR0298_21110は、個々のORFを含む遺伝子の識別記号である。
【表２】
2020115793.tif 000004
【００４３】
なお、ORF AXK16_16575は配列表の配列番号１０１（フォワード）及び１０２（リバース）のプライマーを使用することで、PCRにより検出可能であり、
ORF Kpn2146_5469は配列表の配列番号１０３（フォワード）及び１０４（リバース）のプライマーを使用することで、PCRにより検出可能であり、
ORF KPHS_34600は配列表の配列番号１０５（フォワード）及び１０６（リバース）のプライマーを使用することで、PCRにより検出可能であり、
ORF KPHS_12700は配列表の配列番号１０７（フォワード）及び１０８（リバース）のプライマーを使用することで、PCRにより検出可能であり、
ORF KPHS_01250は配列表の配列番号１０９（フォワード）及び１１０（リバース）のプライマーを使用することで、PCRにより検出可能であり、
ORF KPHS_10080は配列表の配列番号１１１（フォワード）及び１１２（リバース）のプライマーを使用することで、PCRにより検出可能であり、
ORF KPHS_12370は配列表の配列番号１１３（フォワード）及び１１４（リバース）のプライマーを使用することで、PCRにより検出可能であり、
ORF KPHS_25140は配列表の配列番号１１５（フォワード）及び１１６（リバース）のプライマーを使用することで、PCRにより検出可能であり、
ORF KPHS_30440は配列表の配列番号１１７（フォワード）及び１１８（リバース）のプライマーを使用することで、PCRにより検出可能であり、
ORF KPHS_34840は配列表の配列番号１１９（フォワード）及び１２０（リバース）のプライマーを使用することで、PCRにより検出可能であり、
ORF KPHS_34850は配列表の配列番号１２１（フォワード）及び１２２（リバース）のプライマーを使用することで、PCRにより検出可能であり、
ORF KPHS_35110は配列表の配列番号１２３（フォワード）及び１２４（リバース）のプライマーを使用することで、PCRにより検出可能であり、
ORF KPHS_35580は配列表の配列番号１２５（フォワード）及び１２６（リバース）のプライマーを使用することで、PCRにより検出可能であり、
ORF N559_1651は配列表の配列番号１２７（フォワード）及び１２８（リバース）のプライマーを使用することで、PCRにより検出可能であり、
ORF Kpn2146_6120は配列表の配列番号１２９（フォワード）及び１３０（リバース）のプライマーを使用することで、PCRにより検出可能であり、
ORF KPNJ1_02432は配列表の配列番号１３１（フォワード）及び１３２（リバース）のプライマーを使用することで、PCRにより検出可能であり、
ORF KPNJ2_02710は配列表の配列番号１３３（フォワード）及び１３４（リバース）のプライマーを使用することで、PCRにより検出可能であり、
ORF KPR0928_21110は配列表の配列番号１３５（フォワード）及び１３６（リバース）のプライマーを使用することで、PCRにより検出可能である。
【００４４】
またこれらを、後述するPCR及び電気泳動の条件を利用して検出した場合には、ＤＮＡが増幅しやすく、またエクストラバンドが現れにくい。
【００４５】
以上では、PCR法によりgenomic islandを構成するORF（２）を検出することを主に説明してきたが、genomic islandを構成するORF（２）はその他の方法によっても検出可能であり、たとえばハイブリダイゼーションによって検出可能である。
【００４６】
［ORF検出手段］
上述した、肺炎桿菌の染色体遺伝子配列上の、genomic isletを構成するORF（１）及びgenomic islandを構成するORF（２）の保有の有無の検出は、任意の順で行うことができる。具体的には、これらORFを各ORF毎に任意の順に検出してもよく、または、複数のORF毎に任意の順にまとめて検出してもよく、あるいは、全てのORFを同時に検出してもよい。ORFを検出する手段としては、PCR及びハイブリダイゼーションが挙げられる。
【００４７】
＜PCR＞
各ORF毎に別々に検出する場合には、たとえば、検出対象のORF毎にそれぞれ対応する１組のプライマー（フォワードプライマー及びリバースプライマー）を用いて、独立した系で、肺炎桿菌のDNA抽出サンプルとともに、real time PCR反応などを行い、PCR増幅産物の生成シグナル蛍光などをリアルタイムに検出する。
【００４８】
また、複数のORF毎にまとめて検出する場合には、複数のORFにそれぞれ対応する複数組のプライマー（フォワードプライマー及びリバースプライマーの組）を混合し、同一の反応系に入れてPCR反応を行うマルチプレックスPCRが実施可能である。この場合には、PCR産物の長さが電気泳動後に独立した明瞭なバンドとして他と識別可能となるようにプライマーの位置を設定することで、各ORFに対応するPCR増幅産物の有無は、反応後の液を電気泳動、たとえば、アガロースゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動などで泳動して得られたバンドの有無によって確認することができる。
【００４９】
全てのORFを同時に検出する場合には、たとえばmicro arrayを応用してORFを検出する。micro arrayによる検出では、各ORFとハイブリダイズするプローブをmicro arrayの各wellに作成しておき、培養菌からカラム抽出あるいはフェノール−クロロホルム抽出によって精製されたＤＮＡをハイブリダイズさせ、未反応のＤＮＡを洗浄した後、２本鎖ＤＮＡと結合する蛍光色素でラベルし、蛍光を捉える機械で測定することで目的のORFが検出可能となる。
【００５０】
また、次世代シーケンサーを用いて、全ゲノム塩基配列を解析し、コンピューター上で上記ORFを検出することもできる。
これらのうちでは、複数のORFを簡便な手法で効率よくまとめて検出できる点から、マルチプレックスPCRが好ましいが、それと同等の結果が得られる他の解析装置も利用可能である。
【００５１】
（プライマーの設計）
肺炎桿菌ゲノムを構成するORFは部位によってPCRの増幅効率が異なり、マルチプレックスPCRに適したプライマーを設計するには、実際にPCR及びマルチプレックスPCRに使用し、機能することと増幅効率を確認しながら設計を進める必要がある。さらに、上記genomic isletを構成するORF（１）及びgenomic islandを構成するORF（２）については塩基配列が90％程度相同なORFが臨床分離株やデータベース上に見られることから、これらの相同なORFも検出できるよう変異の少ない部分にプライマーを設計することで、臨床分離されることの多いほとんどの肺炎桿菌に汎用的に使用できるとともに突然変異の影響を受けにくいプライマーとする。突然変異の影響を避けられない可能性がある場合は、同じ長さのPCR産物を生成する他のプライマーセットを設定し、同一のORFを検出可能な複数のプライマーセットを混合する事で補正することもできる。
【００５２】
上記genomic isletを構成するORF（１）及びgenomic islandを構成するORF（２）を検出するプライマーの設計にあたっては、プライマー自身が折れ曲がって相補的になっている部分が結合して２重鎖を形成したり、異なるプライマー同士が、互いに相補的になっている部分において結合して２量体またはそれ以上の結合体を形成したりしないような配列にする。
【００５３】
さらに、マルチプレックスPCRで検出することを考慮し、プライマーのGC比をおよそ50％とし、Tm値を合わせるよう工夫することが好ましい。また、増幅効率と、電気泳動の際に短時間で分離可能なよう、PCR増幅産物サイズがおよそ50bp〜2000bp、好ましくは70bp〜600bpとなるように調整することが望ましい。なお、同じ反応系で検出するORFにおいては、PCR増幅産物のサイズが同じにならないようにプライマーを設計することが不可欠である。
【００５４】
上記のような条件を設定することでマルチプレックスPCRにおいて再現性の高い増幅結果が得られるプライマー及びプライマーセットを得ることができる。このようなプライマーの設計は、市販のソフトウェアあるいはウエブを通じて自由に入手し利用可能なソフトウェアにより行うことができるが、実際にPCRを行い、増幅を確認することで、実用的なプライマーとなる。
【００５５】
具体的には、上記（１）と（２）のORFの項目でそれぞれ述べたように、
（１）genomic isletを構成するORFのためのプライマーとして１２組のプライマー、
（２）genomic island中に存在するhyper variableなORFためのプライマーとして４組のプライマー、
の合計１６組のプライマー（配列表の配列番号１〜２４、１０１〜１０８）を本発明者は設計した。
【００５６】
なお、上記プライマーセットを用いてマルチプレックスPCRを行う場合には、下記表３にprimer mixtureとして示すように、６組のプライマーセットを組み合わせて混合した反応系、及び下記表４にprimer mixtureとして示すように、１０組のプライマーセットを組み合わせて混合した反応系にてPCRを実施することが望ましい。なお、肺炎桿菌のクローン識別と菌株識別は同時に実施しても、別々に実施しても良い。
【００５７】
【表３】
2020115793.tif 000005
【００５８】
【表４】
2020115793.tif 000006
【００５９】
以上に示した具体的なプライマーは、標的ORFを増幅するために最適化された配列であり、これらのプライマーに２塩基程度の付加、置換、欠失及び／又は挿入といった変更があっても、プライマーとしての機能は失われず、PCRによって標的ORFを増幅することができる。付加とは、表に示されたプライマーの５’側または３’側の末端に塩基が追加されることをいい、挿入とは、前記の末端ではなく、プライマーの内側において、塩基と塩基の間に塩基が追加されることを言う。但し、塩基配列の３’末端に２塩基以下の塩基の付加又は置換を有する場合は、付加又は置換後の塩基配列の３’末端の塩基は標的ORFと相補的であることが好ましい。
【００６０】
プライマーとして高い性能を発揮する観点からは、前記変更は、２塩基以下の付加、置換、欠失、挿入であることが好ましく、２塩基以下の付加または２塩基以下の５’側または３’側の末端における欠失であることがより好ましく、１塩基以下の標的ORFと相補的な塩基の付加または５’側または３’側の末端における１塩基以下の欠失であることが特に好ましい。一般的に、５’側の変更はプライマーとしての機能を失わせにくく、３’側の変更はプライマーの機能を失わせやすい傾向がある。
【００６１】
表３及び表４に示したプライマーセットに、例えば病原因子マーカや薬剤耐性遺伝子などを標的とした検出プライマーを加えて反応させることもできる。
【００６２】
＜ハイブリダイゼーション＞
ハイブリダイゼーションによりORFを検出する場合には、まず培養菌（肺炎桿菌）からカラム抽出あるいはフェノール−クロロホルム抽出によって精製されたＤＮＡをアルカリ変性し、ナイロンメンブレン、セルロースメンブレンあるいはマイクロプレートに定着させる。本発明で検出する各々のORFとハイブリダイズするプローブを作成する。プローブは人工合成ＤＮＡでも、上記で説明したプライマーを利用したPCRで作成しても良い。プローブはビオチン、ジゴキシゲニン、蛍光色素などを用いてラベルしておく。菌抽出ＤＮＡとプローブをハイブリダイズし、プローブのラベルに応じて、酵素付加、発色、発光などさせ、シグナルを捉える。これを各々の検出ORFについて実施する。
【００６３】
［ORF検出菌種同定及びクローン同定、並びに菌株識別法の実施方法］
以下、マルチプレックスPCRを行い、上記（１）〜（２）のORFのうち、上述した検出対象として好ましいORFを検出する場合を一例とし、本発明の肺炎桿菌のクローン同定法及び菌株同定の手順を説明する。
【００６４】
（菌種の同定）
便などの患者由来の検体から、DHL培地などの肺炎桿菌を分離可能な培地を用いて肺炎桿菌を分離する。その後、グラム染色による形態の確認、及び生化学性状の確認の確認、質量分析等により、肺炎桿菌と同定する。
【００６５】
肺炎桿菌であると同定された菌株を、肺炎桿菌を増殖可能な液体培地、あるいは寒天培地（普通寒天培地、トリプトソイ寒天培地培地等）を用いて37℃で１晩培養する。
【００６６】
（DNA抽出）
培養した菌体から、熱抽出、フェノール抽出、市販のDNA抽出キットによるDNA抽出、あるいは蒸留水またはTris-EDTAバッファーなどに菌体を懸濁し加熱して得られる熱抽出法などの方法でDNAを抽出し、PCR反応用の試料（テンプレート）とする。
【００６７】
（PCR反応）
マルチプレックスPCRで上記表３及び４に記載の、genomic isletを構成するORF（１）  １２個、genomic islandを構成するORF（２）  ４個の検出を行う。具体的には、検出対象のORF群に対応する数のプライマーの組（フォワードプライマー及びリバースプライマー）を、６組（ORF（１）用）及び１０組（ORF（１）用の６組とORF（２）用の４組）の２群に分け、それぞれの組毎に同一の反応チューブに入れ一括してPCR反応を行う。なお、菌種同定及びクローン同定と菌株識別は同時に実施しても、別々に実施しても良い。
【００６８】
（電気泳動）
およそ50bp〜600bpのDNA断片が充分に分離されるような条件下でアガロースゲルなどのゲルを用い、PCR増幅産物を電気泳動する。泳動距離は約5〜6 cmでよく、ミニゲルの場合100V、50分程度で充分分離可能である。電気泳動後、エチジウムブロマイドやサイバーグリーンなどで染色して写真撮影を行う。また、たとえばAgilent 2100 バイオアナライザや島津製作所MultiNAのような各種のキャピラリー型電気泳動装置等を用いてPCR産物を分離し画像化することも可能である。
【００６９】
（結果判定）
最大１１本または１０本のバンドが現れる。本発明の遺伝子型タイピング法ではバンドサイズがあらかじめわかっているため、それぞれの菌株及び反応系において目的のサイズのバンドがあるか否かを判定する。場合によっては目的のサイズ以外の非特異的なバンドが現れることがあるが、非特異と考えられるバンドは無視する。目的のサイズのバンド（各ORFに対応するバンド及びポジティブコントロールに対応するバンド）が増幅していれば１、増幅が見られない場合を０として２進法のコードを作成する。
【００７０】
このコードは（１）〜（２）の各ORFごとに作成してもよいし、または、すべてをまとめて一つのコードとして作成してもよいし、あるいは（１）〜（２）のORF及びbinary toxin (cdtA)、toxinA (tcdA)、toxinB (tcdB)をまとめて作成するなどしてもよい。本発の菌種同定及びクローン同定法が実際の医療の現場で使用される場合には、（１）〜（２）のORFすべてをまとめて一つのコードとして作成すると、桁数が大きくなって見にくいことから、いくつかのORFの結果はまとめて一つのコードとして作成することが好ましい。
【００７１】
ここで上述のとおり、（１）のORFの保有パターンはST型との相関が高く、ST型を推定するのに役立つ。（２）のORFの保有パターンを比較することで菌株識別が可能となる。
【００７２】
したがって、（１）のORF検出結果を一つのコードとして作成することが好ましく、（２）のORF検出結果は一つコードとして作成することが好ましい。
【００７３】
そして、たとえばこのようにして作成された２進法のコードを、より桁数を少なくして見やすくするため、たとえば１０進法に変換し、遺伝子型コードとする。以上のコード作成の一例を下記表５に示す。表５の例は図１の分離株番号１のものである。
【００７４】
【表５】
2020115793.tif 000007
【００７５】
まず、適切なプライマーを使用したPCR及び電気泳動により、試験対象の肺炎桿菌における各ORFの有無を検出し、それを２進法によりコード化する。そして、このコードを１０進法に変換し、遺伝子型コードを得る（コード）。
【００７６】
表５に示された例において、コード１及び２は（１）のORFの検出結果をまとめたものであるので、複数の肺炎桿菌について遺伝子型コードを作成した場合に、肺炎桿菌のST型に相当する数値となる。この数値から高病原性クローンや薬剤耐性クローンであるかどうかを判断することができる。コード３は菌株に固有のコードであり、計算上16種類の遺伝子型に分けることが可能である。コード３はほとんどの肺炎桿菌における菌株識別能が高くなるようORFが選択されている。
【００７７】
具体的には、たとえば、肺炎桿菌臨床分離株１６株における１６個のORF（KPHS_23160〜KPHS_12700）の保有の有無を、上記と同様にして２進法コード化、さらに１０進法コード化すると、下記表６のとおりである。
【００７８】
【表６】
2020115793.tif 000008
【００７９】
表６において、一番上の行は菌株の番号、上から２番目の行はMLST解析によるSequence type (ST)型である。
このように得られた遺伝子型コード同士を比較することで、異なる時期や施設で分離された菌株の特定であっても、容易かつ客観的に行うことができる。
【００８０】
【表７−１】
2020115793.tif 000009
【表７−２】
2020115793.tif 000010
【表７−３】
2020115793.tif 000011
【００８１】
表７はゲノムデータベース上のKlebsiella pneumoniae、Klebsiella quasipneumoniae及びKlebsiella variicola全ゲノム配列から予測されるコード1、コード2及びコード3である。表６に示されたORFの有無は、各ORFの配列をBLASTnによって検索して決定し、コード1〜コード3は表５に示された方法に従って計算した。
【００８２】
ST型の括弧内に付加してあるslvはsingle locus variantの略で、元のST型に近縁であることを示している。
【００８３】
さらに、本発明で検出の対象としているORFの大部分は、肺炎桿菌の病原性等に関連しないORFである。病原性に関連するなど、特定の機能を有するORFを含む遺伝子は、その肺炎桿菌が宿主内で増殖する確率を上げたり、あるいはその遺伝子産物が宿主の免疫システムのターゲットとなり、反対に生存確率を下げることがある。つまりこのような遺伝子は、肺炎桿菌の多くが持っている、あるいは反対にほとんど持っていないと考えられる。本発明では、このようなバイアスがかからないように適切なORFを選択して遺伝子型別分類を行っているのである。
以下、実施例に基づいて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００８４】
実施例１
ある病院で臨床分離された肺炎桿菌２２株について、下記の手順により、ORF検出による遺伝子型別分類を行った。
【００８５】
（肺炎桿菌の培養）
肺炎桿菌であると同定された２２の菌株を、ブルセラHK寒天培地を用いて37℃で二日間培養した。
【００８６】
（DNA抽出）
培養した菌から、市販のカラムDNA抽出キットを用いてDNAを抽出し、その20倍液をテンプレートDNAとした。
【００８７】
（PCR反応液の調製）
RocheのFastStart DNA polymeraseを説明書に従って使用した。その際、反応液量は20μlとした。反応液20μlの組成は、10×FastStart Taq Buffer 2μl、10mM dNTP Mix 0.4μl、FastStart Taq DNA polymerase 0.16μl、蒸留水15.24μl及びprimer mixtureを0.2μlである。これに、上記のDNA熱抽出サンプルを2μl（反応液の1/10量）加えた。
【００８８】
２本の反応チューブ、即ち、６組のプライマーを組み合わせた反応チューブ（反応系１）と、１０組のプライマーを組み合わせた反応チューブ（反応系２）を使用し、１６個のORFについて、マルチプレックスPCRを行った。プライマーの組み合わせ、及びその最終濃度は下記表８（反応系１）及び表９（反応系２）のとおりである。
【００８９】
反応系１
【表８】
2020115793.tif 000012
【００９０】
反応系２
【表９】
2020115793.tif 000013
【００９１】
（PCR反応）
サーマルサイクラー（ASTEC社製、GeneAtlas G02）に抽出DNAと反応液の混合液をセットし、最初に95℃で10分間処理し、その後、95℃ 30秒、60℃ 30秒、72℃ 2分のサイクルを30回繰り返した。サイクル反応終了後、PCR産物を15℃で保存した。
【００９２】
（電気泳動）
アガロースゲル（4% NuSieve 3:1 in TBE buffer）を用い、ミニゲルを作成し、100Vで60分間、3μlのPCR産物を電気泳動した。泳動距離は約5cmであった。電気泳動後、エチジウムブロマイドで染色し、写真撮影を行った。
【００９３】
（結果判定）
１反応につき反応系1では最大６本、反応系2では最大１０本のバンドが現れた。それぞれの菌株及び反応系において目的のサイズのバンドがあるか否かを判定し、目的のサイズのバンドが増幅していれば１、増幅が見られない場合を０として、上記表５と同様の２進法のコードを作成した。さらに２進法のコードを１０進法に変換し、遺伝子型コードとした。
結果を図１及び表１０に示す。
【００９４】
【表１０】
2020115793.tif 000014
【００９５】
表６において、前述のようにコード１及びコード２からST型が判明するが、コード３によって同一ST型の株がさらに識別されていることがわかる。
【００９６】
実施例２
以下、プライマー配列に２塩基程度の変更があった場合の実施例についてさらに具体的に説明する。
先の実施例と同じ、ある病院で臨床分離された肺炎桿菌１６株について、下記の手順により、ORF検出による遺伝子型別分類を行った。
【００９７】
（肺炎桿菌の培養）
肺炎桿菌であると同定された２２の菌株を、ブルセラHK寒天培地を用いて37℃で二日間培養した。
【００９８】
（DNA抽出）
培養した菌から、市販のカラムDNA抽出キットを用いてDNAを抽出し、その20倍液をテンプレートDNAとした。
【００９９】
（PCR反応液の調製）
RocheのFastStart DNA polymeraseを説明書に従って使用した。その際、反応液量は20μlとした。反応液20μlの組成は、10×FastStart Taq Buffer 2μl、10mM dNTP Mix 0.4μl、FastStart Taq DNA polymerase 0.16μl、蒸留水15.24μl及びprimer mixtureを0.2μlである。これに、上記のDNA熱抽出サンプルを2μl（反応液の1/10量）加えた。
【０１００】
２本の反応チューブ、即ち、６組のプライマーを組み合わせた反応チューブ（反応系１）と、１０組のプライマーを組み合わせた反応チューブ（反応系２）を使用し、１６個のORFについて、マルチプレックスPCRを行った。プライマーの組み合わせ、及びその最終濃度は下記表１１（反応系１）及び表１２（反応系２）のとおりである。
【０１０１】
反応系１
【表１１】
2020115793.tif 000015
【０１０２】
反応系２
【表１２】
2020115793.tif 000016
【０１０３】
なお、配列番号137は配列番号1に対して1塩基を置換したものであり、
配列番号138は配列番号2に対して2塩基を付加したものであり、
配列番号139は配列番号3に対して2塩基を削除したものであり、
配列番号140は配列番号4に対して2塩基を付加したものであり、
配列番号141は配列番号5に対して2塩基を置換したものであり、
配列番号142は配列番号6に対して1塩基を置換したものであり、
配列番号143は配列番号7に対して1塩基を挿入したものであり、
配列番号144は配列番号8に対して2塩基を付加したものであり、
配列番号145は配列番号9に対して2塩基を置換したものであり、
配列番号146は配列番号10に対して2塩基を付加したものであり、
配列番号147は配列番号11に対して1塩基を置換したものであり、
配列番号148は配列番号12に対して1塩基を挿入したものであり、
配列番号149は配列番号13に対して2塩基を付加したものであり、
配列番号150は配列番号14に対して2塩基を付加したものであり、
配列番号151は配列番号15に対して2塩基を置換したものであり、
配列番号152は配列番号16に対して2塩基を挿入したものであり、
配列番号153は配列番号17に対して1塩基を置換したものであり、
配列番号154は配列番号18に対して2塩基を付加したものであり、
配列番号155は配列番号19に対して1塩基を置換したものであり、
配列番号156は配列番号20に対して2塩基を付加したものであり、
配列番号157は配列番号21に対して2塩基を置換したものであり、
配列番号158は配列番号22に対して2塩基を挿入したものであり、
配列番号159は配列番号23に対して2塩基を挿入したものであり、
配列番号160は配列番号24に対して2塩基を削除したものであり、
配列番号161は配列番号101に対して2塩基を置換したものであり、
配列番号162は配列番号102に対して1塩基を置換したものであり、
配列番号163は配列番号103に対して2塩基を置換したものであり、
配列番号164は配列番号104に対して2塩基を付加したものであり、
配列番号165は配列番号105に対して2塩基を付加したものであり、
配列番号166は配列番号106に対して2塩基を付加したものであり、
配列番号167は配列番号107に対して2塩基を置換したものであり、
配列番号168は配列番号108に対して1塩基を挿入したものである。
【０１０４】
（PCR反応）
サーマルサイクラー（ASTEC社製、GeneAtlas G02）に抽出DNAと反応液の混合液をセットし、最初に95℃で10分間処理し、その後、95℃ 30秒、57℃ 30秒、72℃ 2分のサイクルを30回繰り返した。サイクル反応終了後、PCR産物を15℃で保存した。
【０１０５】
（電気泳動）
アガロースゲル（4% NuSieve 3:1 in TBE buffer）を用い、ミニゲルを作成し、100Vで50分間、2μlのPCR産物を電気泳動した。泳動距離は約5cmであった。電気泳動後、エチジウムブロマイドで染色し、写真撮影を行った。
【０１０６】
（結果判定）
１反応につき最大１０本のバンドが現れた。それぞれの菌株及び反応系において目的のサイズのバンドがあるか否かを判定し、目的のサイズのバンドが増幅していれば１、増幅が見られない場合を０として、上記表５と同様の２進法のコードを作成した。さらに２進法のコードを１０進法に変換し、遺伝子型コードとした。
【０１０７】
表６において、前述のようにコード１およびコード２からST型が判明するが、コード３によって同一ST型の株がさらに識別されていることがわかる。
結果を図２に示す。図１および表１０と同様の結果が得られた。
【産業上の利用可能性】
【０１０８】
本発明によれば、院内感染の原因として重要な病原細菌である肺炎桿菌及び近縁菌種の簡便且つ迅速な菌株識別が可能になる。特に、肺炎桿菌及び近縁菌種の院内感染の阻止、院内感染の広がりの防止等に本発明は有用である。
【０１０９】
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
【配列表フリーテキスト】
【０１１０】
配列番号１〜１６８：人工配列の説明：プライマー
【図１】
2020115793.tif 000017
【図２】
2020115793.tif 000018
【配列表】
2020115793000001.app