(57)【要約】      （修正有）【課題】栄養素複合体、及びグルコース取込み阻害活性又はＳＲＥＢＰ（ステロール調節エレメント結合タンパク質）阻害活性を有する剤の提供。【解決手段】式（１）（式中、Ｒは脂肪族基である）によって表される化合物、並びに、前記化合物を含む経口組成物、エネルギー代謝の調節剤、グルコース取込みの阻害剤、ＳＲＥＢＰの阻害剤、代謝性疾患の予防、改善及び治療用剤。2020128343.tif 000015【選択図】図１Ａ
2020128343.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（１）：
【化１】
2020128343.tif 000013
（式中、Ｒは脂肪族基である）によって表される化合物、その塩又は溶媒和物。
【請求項２】
Ｒが脂肪族鎖である、請求項１に記載の化合物、その塩又は溶媒和物。
【請求項３】
Ｒが不飽和脂肪族鎖である、請求項１若しくは２に記載の化合物、その塩又は溶媒和物。
【請求項４】
ＲがＣ１５〜２５不飽和脂肪族鎖である、請求項３に記載の化合物、その塩又は溶媒和物。
【請求項５】
前記化合物が式（１Ａ）：
【化２】
2020128343.tif 000014
によって表されるものである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物、その塩又は溶媒和物。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の化合物、その塩又は溶媒和物からなる群から選択される少なくとも１種を含む経口組成物。
【請求項７】
医薬組成物、食品添加組成物又は食品組成物である、請求項６に記載の経口組成物。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の化合物、その塩又は溶媒和物からなる群から選択される少なくとも１種を含むエネルギー代謝の調節剤。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の化合物、その塩、水和物及び溶媒和物からなる群から選択される少なくとも１種を含むグルコース取込みの阻害剤。
【請求項１０】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の化合物、その塩、水和物及び溶媒和物からなる群から選択される少なくとも１種を含むＳＲＥＢＰ（ステロール調節エレメント結合タンパク質）の阻害剤。
【請求項１１】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の化合物、その塩、水和物及び溶媒和物からなる群から選択される少なくとも１種を含む代謝性疾患の予防、改善又は治療用剤。
【請求項１２】
前記代謝性疾患が糖尿病、脂質異常症、高血圧、肥満、脂肪肝及びメタボリックシンドロームからなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１１に記載の剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、栄養素複合体、及びグルコース取込み阻害活性又はＳＲＥＢＰ（ステロール調節エレメント結合タンパク質）阻害活性を有する剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
炭水化物、脂質、アミノ酸及びビタミンは、生物の生活に不可欠な栄養素の一部である。一方、共有結合的に複合体化した複数の栄養素からなる多数の医薬及び機能性食品が存在する。例えば、臨床的に使用される脂質酸化防止剤であるニコチン酸トコフェロールは、ビタミンＥ及びＢ３の合成複合体である。別の例は、ビタミンＣ及びグルコースの複合体であるＡＡ−２Ｇである。化粧品及びサプリメントの成分として使用される、この長時間作用型プロドラッグは酵素的に代謝され、ビタミンＣ及びグルコースを徐々に放出する。これら２つの例によって例示される栄養素複合体は、個々の成分の混合物よりも大きな効力、及び完全に非天然の化学物質よりも予測可能な安全性プロファイルを示す傾向がある。多数の栄養素複合体が生物においても自然発生する。例えば、アラキドン酸及びグリシンの複合体であるＮＡ−Ｇｌｙは、Ｔ型カルシウムチャネル及び脂肪酸アミドヒドロラーゼの阻害を含む、親栄養素とは異なる役割を果たす。
【図面の簡単な説明】
【０００３】
【図１Ａ】分子１の化学構造を示す図である。
【図１Ｂ】分子１の用量応答曲線を示す図である。分子１は、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の転写を活性化する内在性ＳＲＥＢＰの能力を抑制した。ＩＣ５０値は、４パラメーターロジスティックモデル適合曲線から５．６μＭと推定された。試験濃度の分子１において、β−ガラクトシダーゼ活性は検出可能な変化を示さなかった。
【図１Ｃ】ジペプチド２及び二成分複合体（３〜５）の化学構造を示す図である。
【図１Ｄ】分子１〜分子５のＳＲＥＢＰ阻害活性を示す図である。ルシフェラーゼ活性を２４時間のインキュベーション後に１０μＭの濃度で測定した。各々の単一成分（ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、グルコサミン及びジペプチド２）又はそれらの混合物は、分子１より弱い活性を示した。二成分複合体（３〜５）も分子１より弱い活性を示した。
【図２Ａ】ＳＲＥＢＰ−２の成熟に対する分子１の影響を示す図である。ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、様々な時間にわたって分子１（１０μＭ）又は２５−ヒドロキシコレステロール（５μＭ）で処理し、ＳＲＥＢＰ−２抗体を用いたウエスタンブロットによって細胞溶解物を分析した。ＳＲＥＢＰ−２の前駆体型及び成熟型の位置を右側に示す。
【図２Ｂ】ＳＲＥＢＰ−２の成熟に対する輸送体阻害剤の影響を示す図である。グルコース輸送体（ＧＬＵＴ）阻害剤フロレチン（１００μＭ）又はナトリウム−グルコース輸送タンパク質（ＳＧＬＴ）阻害剤フロリジン（１００μＭ）を、分子１（１０μＭ）の存在下又は非存在下でＣＨＯ−Ｋ１細胞の培養培地に添加した。２４時間のインキュベーション後に、ＳＲＥＢＰ−２抗体を用いたウエスタンブロットによって細胞溶解物を分析した。ＳＲＥＢＰ−２の前駆体型及び成熟型の位置を右側に示す。
【図２Ｃ】分子１による細胞グルコース取込みの阻害を示す図である。蛍光標識グルコース類似体２−ＮＢＤＧの取込みを、ヒトＣａｃｏ−２細胞を用いて測定した。細胞をＮＢＤＧ（２００μＭ）及び様々な濃度の分子１（３μＭ〜３０μＭ）、分子３（３μＭ〜３０μＭ）又は陽性対照フロレチン（１００μＭ〜５００μＭ）で同時に処理した。十分に洗浄した後、細胞の蛍光を蛍光プレートリーダーにより測定した（励起：４９０ｎｍ；発光：５３０ｎｍ）。
【図２Ｄ】分子１によるＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）の活性化を示す図である。Ｈｅｐａ  １−６細胞を分子１（１０μＭ）、フロレチン（１００μＭ）又は分子３（１０μＭ）で処理し、ホスホ−Ｔｈｒ１７２  ＡＭＰＫに特異的な抗体を用いたウエスタンブロットによって細胞溶解物を分析した。分子１がフロレチンと同様にＡＭＰＫリン酸化を活性化することが明白である。
【図３Ａ】絶食マウスにおけるグルコース負荷試験（分子１及びグルコースの経口同時投与）を示す図である。分子１（６．２５μｍｏｌ）又は分子３（６．２５μｍｏｌ）を、水（２５０μＬ）中のグルコース（１２．５ｍｇ）と同時に絶食マウス（ｎ＝３）に同時投与した。
【図３Ｂ】絶食マウスにおけるグルコース負荷試験（グルコース経口投与前の分子１による前処理）を示す図である。分子１（６．２５μｍｏｌ）又は分子３（６．２５μｍｏｌ）を、水（２５０μＬ）中のグルコース（１２．５ｍｇ）の経口投与の１０分前に絶食マウス（ｎ＝３）に経口投与した。血液サンプルを指定の時点で採取し、血糖自己モニタリングキットによって分析した。
【発明を実施するための形態】
【０００４】
一態様では、本開示は、栄養素複合体を提供する。一実施形態では、本開示は、栄養素複合体を含む、経口組成物、エネルギー代謝の調節剤、グルコース取込みの阻害剤、ＳＲＥＢＰの阻害剤、代謝性疾患の予防、改善及び治療用剤を提供する。
【０００５】
一態様では、本開示は、多価不飽和脂肪酸、グルコサミン及び／又はアミノ酸の複合体を提供する。別の態様では、本開示は、経口組成物、エネルギー代謝の調節剤、グルコース取込みの阻害剤、ＳＲＥＢＰ（ステロール調節エレメント結合タンパク質）の阻害剤、代謝性疾患の予防、改善及び治療用剤を提供する。
【０００６】
他の態様では、本開示は、多価不飽和脂肪酸、グルコサミン及びアミノ酸の複合体である栄養素複合体を提供する。本開示は、該栄養素複合体を含む、経口組成物、エネルギー代謝の調節剤、グルコース取込みの阻害剤、ＳＲＥＢＰ（ステロール調節エレメント結合タンパク質）の阻害剤、代謝性疾患の予防、改善及び治療用剤も提供する。
【０００７】
本開示は以下の実施の形態を含む。
［項目１］
式（１）：
【化１】
2020128343.tif 000003
（式中、Ｒは脂肪族基である）によって表される化合物、その塩又は溶媒和物。
［項目２］
Ｒが脂肪族鎖である、項目１に記載の化合物、その塩又は溶媒和物。
［項目３］
Ｒが不飽和脂肪族鎖である、項目１若しくは２に記載の化合物、その塩又は溶媒和物。
［項目４］
ＲがＣ１５〜２５不飽和脂肪族鎖である、項目３に記載の化合物、その塩又は溶媒和物。
［項目５］
上記化合物が式（１Ａ）：
【化２】
2020128343.tif 000004
によって表されるものである、項目１〜４のいずれか一項に記載の化合物、その塩又は溶媒和物。
［項目６］
項目１〜５のいずれか一項に記載の化合物、その塩又は溶媒和物からなる群から選択される少なくとも１種を含む経口組成物。
［項目７］
医薬組成物、食品添加組成物又は食品組成物である、項目６に記載の経口組成物。
［項目８］
項目１〜５のいずれか一項に記載の化合物、その塩又は溶媒和物からなる群から選択される少なくとも１種を含むエネルギー代謝の調節剤。
［項目９］
項目１〜５のいずれか一項に記載の化合物、その塩、水和物及び溶媒和物からなる群から選択される少なくとも１種を含むグルコース取込みの阻害剤。
［項目１０］
項目１〜５のいずれか一項に記載の化合物、その塩、水和物及び溶媒和物からなる群から選択される少なくとも１種を含むＳＲＥＢＰ（ステロール調節エレメント結合タンパク質）の阻害剤。
［項目１１］
項目１〜５のいずれか一項に記載の化合物、その塩、水和物及び溶媒和物からなる群から選択される少なくとも１種を含む代謝性疾患の予防、改善又は治療用剤。
［項目１２］
上記代謝性疾患が糖尿病、脂質異常症、高血圧、肥満、脂肪肝及びメタボリックシンドロームからなる群から選択される少なくとも１種である、項目１１に記載の剤。
【０００８】
１．  定義
本明細書で使用される場合、「含む」（"comprises," "comprising," "includes," "including,"）、「含有する」（"contains," "containing,"）という用語、及びそれらの任意の変化形は、非排他的な包含を含むことを意図するものである。これは、これらの移行語（transitional terms）が包括的又は非限定的（open-ended）であり、付加的な列挙されていない要素又は方法工程を除外しないことを意味する。
【０００９】
本開示の化合物は、上記に一般的に記載されるものを含み、本明細書に開示されるクラス、サブクラス及び種によって更に説明される。
【００１０】
「官能基」又は「置換基」という用語は、本明細書で使用される場合、炭化水素の親鎖上の１つ以上の水素原子に置き換わり、得られる新たな分子の一部分となる原子又は原子団を指す。本明細書全体を通して使用される場合、「部分」又は「成分」という用語は、別の分子と連結している、その活性を保持する機能分子の大部分を指す。本明細書で使用される場合、「官能基」、「置換基」という用語又はそれらの任意の同義語は、その保護形態及び非保護形態を包含することが意図される。
【００１１】
「炭化水素」という用語は、本明細書で使用される場合、共有結合している水素原子及び炭素原子を含む化合物を指す。
【００１２】
本明細書の「炭化水素基」という用語は、１つ以上の水素原子（特定の基に必要とされる）を炭化水素から除去することによって形成される一般化された基を指す。さらに、「炭化水素鎖」という用語は直鎖、分岐鎖又は環式アルキル、アルケニル又はアルキニル基の任意の組合せ、及びそれらの任意の組合せを指す。具体的には、一価の「炭化水素基」という用語は、本明細書で使用される場合、水素原子を炭化水素から除去することによって形成される一価の基を指す。また、二価の「炭化水素基」という用語は、２つの水素原子を炭化水素から（２つの水素原子を１つの炭素原子から又は１つの水素原子を２つの異なる炭素原子の各々から）除去することによって形成される基を指す。
【００１３】
「脂肪族」又は「脂肪族基」という用語は、本明細書で使用される場合、完全に飽和しているか、若しくは１つ以上の不飽和単位を含有する直鎖（すなわち、非分岐）若しくは分岐、置換若しくは非置換の炭化水素鎖、又は完全に飽和しているか、若しくは１つ以上の不飽和単位を含有するが、芳香族ではない単環式炭化水素若しくは二環式炭化水素（本明細書で「炭素環」、「脂環式」又は「シクロアルキル」とも称される）であって、分子の残りの部分に対して単一の付着点を有するものを指す。
【００１４】
「不飽和」という用語は、本明細書で使用される場合、部分が１つ以上の不飽和単位を有することを指す。
【００１５】
「溶媒和物」という用語は、本明細書で使用される場合、溶質及び溶媒によって形成され、溶媒が溶質の生物活性を妨げない様々な化学量論の複合体を指す。好適な溶媒としては、例えばエタノール、酢酸等が挙げられる。「水和物」という用語は、本明細書で使用される場合、溶媒が水である上記で規定される溶媒和物を指す。
【００１６】
本明細書及び対象の特許請求の範囲において使用される場合、数量を指定していない単数形（singular forms "a," "an," and "the"）が、文脈上明らかに他の指示がない限り、複数の指示対象を含むことに留意すべきである。
【００１７】
２．  化合物、その塩、水和物又は溶媒和物
一実施形態では、本開示は、式（１）：
【化３】
2020128343.tif 000005
（式中、Ｒは脂肪族基である）によって表される化合物、その塩、溶媒和物に関する。
【００１８】
一実施形態では、脂肪族基は鎖（直鎖又は分岐鎖）、より好ましくは直鎖である。他の実施形態では、脂肪族基は不飽和炭化水素鎖である。上記のような脂肪族基は１５〜２５、好ましくは１７〜２５、より好ましくは１７〜２３、更により好ましくは１９〜２３、特に好ましくは２１の炭素数を有し得る。脂肪族基の具体例には、カルボキシル基を多価不飽和脂肪酸から除去することによって得られる基が含まれ得る。多価不飽和脂肪酸の具体例としては、ｎ−３脂肪酸、ｎ−６脂肪酸及びｎ−９脂肪酸が挙げられるが、これらに限定されない。多価不飽和脂肪酸は、ｎ−３脂肪酸であるのが好ましい。ｎ−３脂肪酸は、例えばα−リノレン酸、ステアリドン酸、エイコサテトラエン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸及びドコサヘキサエン酸である。
【００１９】
一実施形態では、本開示は、式（１Ａ）：
【化４】
2020128343.tif 000006
によって表される化合物を提供する。
【００２０】
式（１）によって表される化合物には、その立体異性体及び光学異性体が含まれる。一実施形態では、本開示は、式（１Ｂ）：
【化５】
2020128343.tif 000007
（式中、Ｒは上記で規定される通りである）によって表される化合物を提供する。
【００２１】
式（１）によって表される化合物の塩は、酸性塩であっても又は塩基性塩であってもよい。酸性塩の例としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の無機酸塩、並びに酢酸塩、プロピオン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸塩及びｐ−トルエンスルホン酸塩等の有機酸塩が挙げられるが、これらに限定されない。塩基性塩の例としては、ナトリウム塩及びカリウム塩等のアルカリ金属塩；カルシウム塩及びマグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩；アンモニウム塩；並びにモルホリン、ピペリジン、ピロリジン、モノアルキルアミン、ジアルキルアミン、トリアルキルアミン、モノ（ヒドロキシアルキル）アミン、ジ（ヒドロキシアルキル）アミン及びトリ（ヒドロキシアルキル）アミン等の有機アミン塩が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２２】
式（１）によって表される化合物の溶媒和物形態の溶媒の例としては、水及び有機溶媒（例えばエタノール、グリセロール、酢酸）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２３】
式（１）によって表される化合物は、様々な方法によって合成することができる。具体的には、式（１）によって表される化合物は、ウギ反応によって合成することができる。式（１）によって表される化合物は、例えば下記のような「合成例」に従って合成することができる。
【００２４】
３．  使用
本開示の一実施形態は、活性成分（式（１）によって表される化合物、その塩、水和物及び溶媒和物からなる群から選択される少なくとも１種）を含む、組成物又は剤、例えば経口組成物、エネルギー代謝の調節剤、グルコース取込みの阻害剤、ＳＲＥＢＰ（ステロール調節エレメント結合タンパク質）の阻害剤、代謝性疾患の予防、改善及び治療用剤に関する。これらの使用分野は特定の分野に限定されず、医薬、試薬、食品組成物（健康食品及びサプリメントを含む）、化粧品及び経口組成物として使用することができる。
【００２５】
経口組成物の例としては、医薬組成物、食品添加組成物又は食品組成物が挙げられる。
【００２６】
代謝性疾患の例としては、糖尿病、脂質異常症、高血圧、肥満、脂肪肝及びメタボリックシンドロームが挙げられる。
【００２７】
本開示の組成物又は剤は、活性成分を含有する必要があり、特定の剤に限定されず、別の成分を含有していてもよい。別の成分は特定の成分に限定されず、その例としては、基剤、担体、溶媒、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、増粘剤、保湿剤、着色料、香料及びキレート剤が挙げられる。別の成分は、薬理学的に許容可能であるか、又は食品衛生法に基づいて許容可能な成分であり得る。
【００２８】
本開示の組成物又は剤の使用様式は特定の様式に限定されず、種類に応じて適切な使用様式を用いることができる。本開示の剤は、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ（例えば、培養細胞を含有する培地に添加することによって）又はｉｎ  ｖｉｖｏ（例えば、動物に給餌又は動物に投与することによって）で使用することができる。
【００２９】
本開示の組成物又は剤の適用対象は特定の対象に限定されず、その例としては、ヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ及びシカ等の様々な哺乳動物、並びに動物細胞が挙げられる。動物細胞の種類は特定の細胞に限定されず、その例としては、血液細胞、造血幹細胞／前駆細胞、配偶子（精子、卵子）、線維芽細胞、上皮細胞、血管内皮細胞、神経細胞、肝細胞、ケラチノサイト、筋細胞、表皮細胞、内分泌細胞、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、組織幹細胞及び癌細胞が挙げられる。
【００３０】
本開示の経口組成物は、本開示の効果が悪影響を受けない限りにおいて、活性成分以外の成分を含有していてもよい。成分の例としては、薬理学的に許容可能な担体及び食品衛生法に基づいて許容可能な担体が挙げられる。
【００３１】
本開示の経口組成物は、好ましくは医薬組成物、食品添加組成物（すなわち、製造、調理又は食事の際に別の食品組成物又は食品材料に添加することによって使用される組成物）又は食品組成物として使用することができる。
【００３２】
本開示の経口組成物が医薬組成物である場合、組成物は活性成分に加えて、薬学的に許容可能な基剤、担体、添加剤（例えば溶媒、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤等）等を必要に応じて含有し、通常の手順に従って丸剤、丸錠（round tablets）、散剤、液体、懸濁液、エマルション、顆粒又はカプセル等の医薬製剤へと調製されるのが好ましい。
【００３３】
さらに、本開示の経口組成物が食品添加組成物である場合、組成物は活性成分に加えて、食品衛生法に基づいて許容可能な基剤、担体、添加剤、又は食品添加物として使用される他の既知の成分若しくは材料を含有していてもよい。さらに、食品添加組成物の形態の例としては、凍結乾燥固体、粉末、フレーク、顆粒又はブロック、より具体的には、調味料、香辛料、ふりかけ（ご飯の上に振りかける乾燥食品）、ケーキ又はアイスクリーム等のお菓子、カナッペのトッピング材料、及び飲料添加物（例えば、牛乳に溶解又は分散させる飲料添加物）が挙げられるが、特にこれらに限定されない。これらの食品添加組成物は、通常の手順に従って調製することができる。
【００３４】
さらに、本開示の経口組成物が食品組成物である場合、組成物は、例えば食品衛生法に基づいて許容可能な基剤、担体、添加剤、又は食品として使用される他の成分若しくは材料を、活性成分に加えて組み込むことによって得られる。特に、かかる組成物の例としては、抗肥満（より具体的には、体重増加抑制、脂肪増加抑制等）加工食品、飲料、健康食品（栄養素機能強調表示を有する食品、特定保健用食品等）、サプリメント及び病人食が挙げられる。具体的な食品形態の例としては、錠剤、丸剤、フレーク及びスナック状形態などの圧縮成形食品形態、ソフトカプセル、ハードカプセル、マイクロカプセル又はコーティング固体等のカプセル、ヨーグルト等の乳製品、水等の液体に溶解させる固形飲料、顆粒飲料、粉末飲料、並びに直接食べられる粒状の食品及び薄いフレーク状の食品が挙げられるが、これらに特に限定されない。
【００３５】
本開示の剤の剤形は特定の剤形に限定されず、使用形態に応じて適切な剤形を用いることができる。本開示の剤を動物に投与する際の剤形の例としては、錠剤、カプセル、顆粒、粉末、細粒、シロップ、腸溶剤、徐放性カプセル、チュアブル錠、ドロップ、丸剤、内用液、トローチ剤、徐放性剤及び徐放性顆粒等の経口剤、並びに点鼻剤、吸入剤、肛門坐剤、挿入剤、浣腸剤及びゼリー等の局所剤が挙げられる。加えて、本開示の剤は固体調製物、半固体調製物又は液体のいずれであってもよい。
【００３６】
本開示の組成物又は剤中の活性成分の含量は、例えば使用様式、適用対象及び適用対象の状態に応じて異なり、限定されず、例えば０．０００１重量％〜１００重量％、好ましくは０．００１重量％〜５０重量％であり得る。
【００３７】
本開示の組成物又は剤が生体に適用される場合、その適用（例えば投与、摂取、接種）量は、所望の効果を発揮することができる有効量である限りにおいて限定されず、概して活性成分の量として１日当たり０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０００ｍｇ／ｋｇである。この適用量に関して、本開示の組成物又は剤は、好ましくは１日に１回又は２、３回適用され、適用量を年齢、状態及び症状に応じて適切に増加又は減少させることができる。
【実施例】
【００３８】
以下の項に本開示の技術の例示的な例を詳細に記載する。これらの例示的な例は、読者に本明細書で論考される一般的な主題を紹介するために与えられ、開示の概念の範囲を限定することを意図するものではない。以下の項の詳細な記載及び添付の図面は、本開示の実施例を示すが、本開示の限定に用いられるものではない。
【００３９】
１．  材料及び方法
特に明記しない限り、次の「実験例」の項に記載される細胞培養、アッセイ、試験及び分析は、以下のように行った。
【００４０】
細胞培養
ＣＨＯ−Ｋ１細胞は、加湿５％ＣＯ２インキュベーター内で培地Ａ（１００単位／ｍＬペニシリン、１００ｍｇ／ｍＬ硫酸ストレプトマイシン及び５％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清を添加したハムＦ−１２培地及びＤＭＥＭの１：１混合物）中、３７℃で維持した。Ｈｅｐａ  １−６細胞は、加湿５％ＣＯ２インキュベーター内で培地Ｂ（１００単位／ｍＬペニシリン、１００ｍｇ／ｍＬ硫酸ストレプトマイシン及び１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清を添加したＤＭＥＭ）中、３７℃で維持した。Ｃａｃｏ−２細胞は、加湿５％ＣＯ２インキュベーター内で培地Ｃ（１００単位／ｍＬペニシリン、１００ｍｇ／ｍＬ硫酸ストレプトマイシン、１％非必須アミノ酸及び１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清を添加したＤＭＥＭ）中、３７℃で維持した。
【００４１】
ルシフェラーゼレポーターアッセイ
０日目に、ＣＨＯ−Ｋ１細胞を１ウェル当たり１．０×１０４細胞で９６ウェルプレートの培地Ａ中に添加した。１日目に、細胞に２０／１の比率のＳＲＥ−１駆動ルシフェラーゼレポータープラスミド（ｐＳＲＥ−Ｌｕｃ）及び構成的活性型アクチンプロモーターを有するβ−ｇａｌレポータープラスミド（ｐＡｃ−β−ｇａｌ）を、ＦｕＧＥＮＥ  ＨＤ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Promega）を製造業者のプロトコルに指示されるように用いて同時トランスフェクトした。１２時間のインキュベーション後に細胞をＰＢＳで洗浄し、次いで特定の試験化合物を含有する培地Ｄ（１００単位／ｍＬペニシリン、１００ｍｇ／ｍＬ硫酸ストレプトマイシン、５％（ｖ／ｖ）脂質除去（lipid-depleted）血清、５０μＭコンパクチン及び５０μＭメバロン酸リチウムを添加したハムＦ−１２培地及びＤＭＥＭの１：１混合物）中でインキュベートした。ＤＭＳＯ中の各化合物のストック溶液を調製し、培地Ａに添加して１０００倍（ｖ／ｖ）希釈（０．１％ＤＭＳＯ）とした。２４時間のインキュベーション後に、Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（Promega）を用いた凍結融解により各ウェル内の細胞を溶解させ、アリコートをルシフェラーゼ活性及びβ−ｇａｌ活性の測定に使用した。ルシフェラーゼ活性はＳｔｅａｄｙ−Ｇｌｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Promega）を用いて測定し、β−ｇａｌ活性はβ−Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Promega）を用いて測定した。ルシフェラーゼ活性をβ−ｇａｌ活性に対して正規化した。
【００４２】
ウエスタンブロット分析
インキュベーションの終了後に細胞を冷ＰＢＳで３回洗浄し、バッファーＡ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％（ｖ／ｖ）Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０、０．５％（ｗ／ｖ）デオキシコール酸ナトリウム、８Ｍ尿素及びプロテアーゼ阻害剤カクテル（ナカライテスク株式会社））を用いて溶解させた。細胞溶解物を２５Ｇニードルに２０回通し、７０００×ｇにて４℃で１０分間遠心分離した。上清を新たなチューブに移した。得られた溶解物を０．２０体積の６×ＳＤＳサンプルバッファー（ナカライテスク株式会社）と混合し、室温で１時間インキュベートした。サンプルを４％〜１５％Ｔｒｉｓ−ＨＣｌプレキャストＳＤＳ  ＰＡＧＥゲル（BIO-RAD）上で分離し、特異抗体を用いてブロットした。特定のバンドを、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＬＡＳ  ５００（GE Healthcare）上で増強化学発光（ＥＣＬ  Ｐｒｉｍｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ、GE Healthcare）を用いて可視化した。
【００４３】
グルコース取込みアッセイ
グルコース取込みを、Ｇｌｕｃｏｓｅ  Ｕｐｔａｋｅ  Ｃｅｌｌ−Ｂａｓｅｄ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Cayman Chemical）を用いて決定した。０日目に、Ｃａｃｏ−２細胞を１ウェル当たり１．０×１０４細胞で９６ウェルプレートの培地Ｃ中に添加した。培地を１、２日に１回交換し、培養を２１日間行った。次いで、細胞を培地Ｅ（１００単位／ｍＬペニシリン、１００ｍｇ／ｍＬ硫酸ストレプトマイシンを添加したグルコース不含ＤＭＥＭ）中で６０分間飢餓状態にした。細胞をＰＢＳで洗浄した後、特定の試験化合物（１０００倍希釈、０．１％ＤＭＳＯ）及び２−ＮＢＤＧ（２００  Ｍ）を含有する培地Ｅ中で３時間インキュベートした。冷Ｃｅｌｌ−Ｂａｓｅｄ  Ａｓｓａｙ  Ｂｕｆｆｅｒ（Cayman Chemical）で３回十分に洗浄した後、蛍光強度をマイクロプレートリーダー（ＭＴＰ−８８０）によって４９０ｎｍ励起及び５３０ｎｍ発光で測定した。グルコース取込みをＤＭＳＯ対照に対して％で定量化した。
【００４４】
マウスグルコース負荷試験
試験前に雄性ＩＣＲマウスを２４時間絶食させた。分子１又は分子３をグルコースの経口投与と同時に又はその前に経口投与した。（ｉ）同時投与：分子１又は分子３（６．２５μｍｏｌ）を伴う又は伴わない蒸留水（２５０μＬ）中のＤ−グルコース１２．５ｍｇをマウスに経口投与した。（ｉｉ）前処理：蒸留水（２５０μＬ）中の分子１又は分子３（６．２５μｍｏｌ）を、蒸留水（２５０μＬ）中のＤ−グルコース（１２．５ｍｇ）の投与の１０分前に経口投与した。Ｄ−グルコース投与の５分後、１５分後、３０分後、６０分後、９０分後及び１２０分後に尾から採血し（５μＬ）、血糖自己モニタリングキット（エーディア株式会社）を用いてグルコースレベルについて評価した。２つの例の間の連続変数の変化を、対応のあるｔ検定を用いて評価した。
【００４５】
２．  実験例
２．１．  栄養素指向（Nutrient Oriented）化学ライブラリーの構築
共有結合栄養素複合体のコンビナトリアル化学合成が、独特の比較的安全な生物活性分子を含む可能性がある重点的な（focused）化学ライブラリーをもたらすと仮定した。かかるライブラリーを構築するために、ケトン又はアルデヒド、アミン、イソシアニド及びカルボン酸が関与し、ビスアミドを形成する四成分反応であるウギ反応を用いた（スキーム１）。
【００４６】
スキーム１．  栄養素指向化学ライブラリーの構築
【化６】
2020128343.tif 000008
【００４７】
ウギ反応を化学ライブラリー構築に用いることは、新しくはない。多数の他の研究で化学ライブラリーが多成分ワンポット反応により生成されている。それにもかかわらず、栄養素複合体のライブラリーの構築にウギ反応が用いられたことはない。反応成分は主に、総合ビタミン剤に含まれることが多い栄養素又はその前駆体から選ばれた：カルボン酸成分としての２０個の脂肪酸及び３個のビタミン；アミン成分としてのグルコサミン及びビタミン、２個のモノアミン、４個のアミノ酸及び２個の生物活性ペプチド（ＶＰＰ及びカルノシン）；グリシン、バリン、フェニルアラニンに相当する３個のアルデヒド；並びにグリシンエステル末端を形成するイソシアノ酢酸エチル。
【００４８】
２．２．  ライブラリー化合物の合成例
ライブラリー化合物の合成の典型的な手順は、以下のようにまとめられる。ＥｔＯＨ（０．５ｍＬ）及び飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（０．１ｍＬ）中のアミン（０．１４ｍｍｏｌ）、カルボン酸（０．１４ｍｍｏｌ）及びアルデヒド（０．１４ｍｍｏｌ）の溶液に酢酸イソシアノエチル（isocyanoethylacetate）（０．１４ｍｍｏｌ）を添加し、２時間撹拌した。反応混合物をＰＴＬＣプレートに置き、ＣＨＣｌ３−ＭｅＯＨを用いて分離した。
【００４９】
例えば、代表的な化合物（分子１）：
【化７】
2020128343.tif 000009
は、以下のように合成した。
【００５０】
水（５ｍＬ）及びＥｔＯＨ（０．５ｍＬ）中のＤ−（＋）−グルコサミン塩酸塩（１５０ｍｇ）、ＤＨＡ（２４５μＬ）、フェニルアセトアルデヒド（phenylacetoaldehyde）（８２μＬ）及びＬｉＯＨ・Ｈ２Ｏ（３０ｍｇ）の溶液にイソシアノ酢酸エチル（７７μＬ）を添加した。２時間撹拌した後、反応混合物をシリカゲルカラムに投入し、ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ（１００：０→８０：２０）で溶出させて、分子１（２５．８ｍｇ、収率５．１％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：  ７．３９〜７．２６（５Ｈ，ｍ）、６．７１〜６．４６（１Ｈ，ｍ）、５．６３〜５．２９（１２Ｈ，ｍ）、４．７４〜４．６７（１Ｈ，ｍ）、４．２３〜４．１３（２Ｈ，ｍ）、４．０５〜３．９８（１Ｈ，ｍ）、３．９７〜３．９６（１Ｈ，ｍ）、３．９０〜３．８８（２Ｈ，ｍ）、３．８０〜３．７２（２Ｈ，ｍ）、３．６２〜３．５９（１Ｈ，ｍ）、３．４７〜３．３９（１Ｈ，ｍ）、２．８６〜２．８０（１０Ｈ，ｍ）、２．５３〜２．３０（４Ｈ，ｍ）、２．０７（２Ｈ，ｑｕｉｎｔｅｔ  ｏｆ  ｄｏｕｂｌｅｔ，Ｊ＝１．２，０．６Ｈｚ）、１．２６（３Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝２２．８，７．２Ｈｚ）、０．９７（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ）。
１３Ｃ−ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：  １７６．２０、１７４．３８、１７３．３２、１７２．７１、１７０．２９、１７０．２７、１３７．８９、１３７．４４、１３２．０６、１２９．４８、１２９．２０、１２９．１８、１２９．１４、１２９．０２、１２８．９５、１２８．５９、１２８．５３、１２８．３１、１２８．３０、１２８．２７、１２８．２６、１２８．２４、１２８．２３、１２８．２１、１２８．１６、１２８．１１、１２７．９０、１２７．８９、１２７．４８、１２７．３９、１２７．０３、９３．９７、９３．１０、７５．３７、７１．８２、７１．６８、７１．２６、７１．１２、６８．７１、６５．１８、６２．７１、６２．４９、６２．１８、６２．０３、６１．７７、６１．６６、５８．３９、４２．０６、４１．７８、３５．５６、３５．２０、３４．１４、３４．１０、２５．６８、２５．６７、２５．６６、２５．６４、２５．６３、２５．５４、２２．６８、２２．５８、２０．５７、１４．２９、１４．１１、１４．１０。
ＨＲＭＳ（ＦＡＢ，ｍ／ｚ，［Ｍ＋Ｎａ］＋）算出値Ｃ４１Ｈ５８Ｎ２Ｏ９Ｎａ：７４５．４０４０、実測値７４５．４０４３。
【００５１】
ケトン又はアルデヒド、アミン、イソシアニド及びカルボン酸のコンビナトリアル並行ウギ反応により３０８個の栄養素複合体が得られた。所望の生成物の純度をＬＣ−ＭＳによって確認し、反応収率は２．７％〜８３％の範囲であった。
【００５２】
２．３．  分子１のＳＲＥＢＰ阻害活性
これらの栄養素複合体に期待される生物活性の１つは、哺乳動物細胞におけるエネルギー代謝の調節であった。概念実証のために、脂質生成のマスター転写因子であるステロール調節エレメント結合タンパク質（ＳＲＥＢＰ）のレポーター遺伝子を用いてライブラリーをスクリーニングした。ＳＲＥＢＰは、哺乳動物エネルギー代謝経路のはるか下流に位置するため、ＳＲＥＢＰレポーター遺伝子活性が無数の細胞代謝変化の指標となる。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）−Ｋ１細胞に、ホタルルシフェラーゼの発現が３つのＳＲＥＢＰ結合部位によって制御されるＳＲＥＢＰレポーター遺伝子をトランスフェクトした。構成的活性型β−Ｇａｌレポーター遺伝子も正規化を目的として同時トランスフェクトした。１０μＭの化合物で初期スクリーニングを行い、２４時間のインキュベーション後に、ＳＲＥＢＰの既知の内在性阻害剤である２５−ヒドロキシコレステロール（ＨＣ）よりも高いＳＲＥＢＰ阻害を示すスクリーニングヒットを選択した。繰り返し実験により、明らかな用量依存性を示す５個の複合体を特定した。５個の複合体のうち、最も強力な分子はＤＨＡ、グルコサミン及びフェニルアラニン−グリシンジペプチドから構成される分子１であった（図１Ａ）。したがって、分子１の更なる調査に全力を注いだ。
【００５３】
ＳＲＥＢＰレポーター遺伝子に対する分子１のＩＣ５０値は、５．６μＭと推定されたが、β−Ｇａｌレポーター遺伝子に対するその影響は、３０μＭまで検出不可能であった（図１Ｂ）。１０μＭでのＳＲＥＢＰを阻害する各成分（ＤＨＡ、グルコサミン（ＧｌｕｃＮ）及びフェニルアラニン−グリシンジペプチド２）の能力を検査した（図１Ｄ）。ＤＨＡは、以前に報告されているように僅かに活性があることが見出されたが、他の２つは本質的に不活性であった。重要なことには、３つの成分の混合物の活性は、ＤＨＡと同程度に低かった。
【００５４】
２．４．  比較化合物の合成及びそのＳＲＥＢＰ阻害活性
分子１の３つの部分構造を、成分の２つを組み合わせることによって化学合成した（分子３〜分子５）（図１Ｃ）。
【００５５】
分子３：
【化８】
2020128343.tif 000010
は、以下のように合成した。
【００５６】
ＤＭＦ（１ｍＬ）中のＤＨＡ（３５μＬ）、ＤＬ−フェニルアラニルグリシンエチルエステル２（３０ｍｇ）及びＨＡＴＵ（４２ｍｇ）の溶液にＤＩＥＡ（８０μＬ）を添加した。１時間撹拌した後、反応混合物を水（５ｍＬ）でクエンチし、ＥｔＯＡｃ（２ｍＬ×３）によって抽出した。有機層を飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ３で乾燥させ、真空濃縮して粗生成物を得た。粗生成物を、ｎ−ヘキサン／ＥｔＯＡｃ（９５：５→８０：２０）を用いたフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製して、３（３６．４ｍｇ、収率６１％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：  ８．４６〜８．３８（１Ｈ，ｍ）、８．０９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ）、７．１８〜７．１７（５Ｈ，ｍ）、５．３６〜５．１７（１２Ｈ，ｍ）、４．５８〜４．４８（１Ｈ，ｍ）、４．０９（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝７．２Ｈｚ）、３．８８〜３．７８（２Ｈ，ｍ）、３．０３（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１３．８，４．２）、２．８５〜２．６８（１０Ｈ，ｍ）、２．５２〜２．００（６Ｈ，ｍ）、１．１９（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ）、０．９１（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ）。
１３Ｃ−ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：  １７１．８４、１７１．２９、１６９．５６、１３７．８８、１３１．４４、１２９．０３、１２８．９９、１２８．００、１２７．９６、１２７．９１、１２７．８７、１２７．８２、１２７．７９、１２７．７８、１２７．７６、１２７．７３、１２７．６２、１２７．５８、１２６．０３、６０．３１、５３．４３、４０．６３、３７．４９、３４．８９、２５．１０、２５．０９、２５．０８、２５．００、２５．００、２２．８５、１９．９２、１４．００、１３．９４。
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ，ｍ／ｚ，［Ｍ＋Ｎａ］＋）算出値Ｃ３５Ｈ４８Ｎ２Ｏ４Ｎａ：５８３．３５０６３、実測値５８３．３５００８。
【００５７】
分子４：
【化９】
2020128343.tif 000011
は、以下のように合成した。
【００５８】
ＥｔＯＨ（２ｍＬ）中のＤＨＡ（９８μＬ）、Ｄ−グルコサミン塩酸塩（６０ｍｇ）及びＤＩＥＡ（５３μＬ）の溶液にＤＭＴ−ＭＭ（９３ｍｇ）を添加し、３時間撹拌した。反応混合物をＰＴＬＣプレートに置き、ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ（８０：２０）を用いて分離して、分子４（９．８ｍｇ、収率７．２％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：  ７．５７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ）、６．４３〜６．３８（１Ｈ，ｍ）、５．５６〜５．２５（１２Ｈ，ｍ）、４．８２〜４．７７（１Ｈ，ｍ）、４．５８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．４Ｈｚ）、４．５３（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ）、４．４３（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝４．８Ｈｚ）、３．７５〜３．６６（１Ｈ，ｍ）、３．６４〜３．５５（３Ｈ，ｍ）、３．５２〜３．４４（２Ｈ，ｍ）、２．８５〜２．７７（１０Ｈ，ｍ）、２．２２〜２．２８（２Ｈ，ｍ）、２．１２〜２．１９（２Ｈ，ｍ）、１．９９〜２．０６（２Ｈ，ｍ）、０．９２（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ）。
１３Ｃ−ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：  １６１．７８、１３１．４５、１２９．０４、１２９．００、１２８．０６、１２８．０２、１２７．８１、１２７．７９、１２７．７７、１２７．７５、１２７．６７、１２７．６０、１２６．８４、９０．４９、７１．０４、７０．３４、６９．６７、６４．２８、６１．０２、３１．１７、２５．１１、２５．１０、２５．０５、２５．０１、２４．３７、２２．９５、２１．９７、１４．０２。
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ，ｍ／ｚ，［Ｍ＋Ｎａ］＋）算出値Ｃ２８Ｈ４３ＮＯ６Ｎａ：５１２．２９８２６、実測値５１２．２９８３０。
【００５９】
分子５：
【化１０】
2020128343.tif 000012
は、以下のように合成した。
【００６０】
水（２ｍＬ）中のＤ−グルコサミン塩酸塩（１０７ｍｇ）、ホウ酸（３１ｍｇ）、フェニルアセトアルデヒド（６６μＬ）及びＬｉＯＨ・Ｈ２Ｏ（２１ｍｇ）の溶液にイソシアノ酢酸エチル（４０μＬ）を添加した。２時間撹拌した後、反応混合物をＰＴＬＣプレートに置き、ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ（８０：２０）を用いて分離して、分子５（１０．５ｍｇ、収率５．３％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：  ８．７６〜８．２４，（１Ｈ，ｍ）、７．３３〜７．１６（５Ｈ，ｍ）、６．６７〜６．０９（１Ｈ，ｍ）、４．９７〜４．９１（２Ｈ，ｍ）、４．８９〜４．７４（１Ｈ，ｍ）、４．５１〜４．３０（１Ｈ，ｍ）、４．０９（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝７．２Ｈｚ）、３．８８〜３．７７（２Ｈ，ｍ）、３．７５〜３．４８（１Ｈ，ｍ），３．４８〜３．２０（６Ｈ，ｍ，Ｈ２Ｏピーク重なり）３．０９〜２．９８（２Ｈ，ｍ）、２．９８〜２．７１（１Ｈ，ｍ）、１．２１〜１．１８（３Ｈ，ｍ）。
１３Ｃ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：  １７４．３９、１７４．０４、１６９．８６、１６９．５８、１３７．８２、１３７．６７、１２９．３２、１２９．０７、１２９．０４、１２８．９１、１２８．２０、１２７．９３、９１．３３、８９．６４、７６．７０、７５．９６、７３．５７、７２．１１、７１．９２、７１．７２、７０．６３、６９．６７、６９．４７、６３．０８、６１．０７、６０．９９、６０．４１、６０．３１、４０．６３、４０．５７、３３．５５、３３．０７、１３．９５、１３．８４。
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ，ｍ／ｚ，［Ｍ＋Ｎａ］＋）算出値Ｃ１９Ｈ２８Ｎ２Ｏ８Ｎａ：４３５．１７３７９、実測値４３５．１７３９０。
【００６１】
ＤＨＡを含有する分子３及び分子５は、ＤＨＡと同様の活性を示したが、これらの部分構造は、１０μＭで明らかな阻害活性を発揮することができなかった（図１Ｄ）。これらの結果から、３つ全ての成分の共有結合的複合体化が分子１の強力な活性に必要とされることが示される。
【００６２】
２．５．  分子１の機構分析
作用機構についての洞察を得るために、分子１による処理時のＳＲＥＢＰタンパク質の状態を検査した。新たに合成されたＳＲＥＢＰは、小胞体（ＥＲ）膜上に局在化し、そこでＳＲＥＢＰのエスコートタンパク質（escort protein）であるＳＲＥＢＰ切断活性化タンパク質（ＳＣＡＰ）に結合する。低レベルの細胞ステロールでは、ＳＲＥＢＰ−ＳＣＡＰ複合体は、ＥＲからゴルジ装置へと輸送され、そこでＳＲＥＢＰがサイト１プロテアーゼ（Ｓ１Ｐ）及びサイト２プロテアーゼ（Ｓ２Ｐ）によって順次に切断され、ＳＲＥＢＰのＮＨ２末端転写因子ドメインが遊離する。成熟型は核へ移行し、そこで脂肪合成遺伝子を活性化する。ＳＲＥＢＰの活性化は、コレステロール及び２５−ヒドロキシコレステロール（２５−ＨＣ）がそれぞれＳＣＡＰ及びＩｎｓｉｇ（ＥＲアンカータンパク質）に結合することでＳＲＥＢＰ−ＳＣＡＰ複合体がＥＲ内に保持されるというネガティブフィードバックループによって厳密に調節される。ＣＨＯ−Ｋ１細胞におけるＳＲＥＢＰ−２のウエスタンブロット分析から、分子１が、６時間のインキュベーションまでは、２５−ＨＣとよく似て、成熟型の量を減少させ、かつ前駆体型を蓄積させることが示される（図２Ａ）。しかしながら、分子１による長期処理は前駆体の量を減少させたが、２５−ＨＣは前駆体の量を減少させず（図２Ａ）、分子１が２５−ＨＣとは異なる機構によってＳＲＥＢＰ−２を阻害することが示唆された。
【００６３】
分子１の比較的大きな構造（分子量：７２２．９２）から、その膜透過性を推定することにした。並行人工膜透過性アッセイ（ＰＡＭＰＡ）により、脂質注入人工膜を介した分子１の限られた透過性（平均Ｐａｐｐ：１．１９（１０−６ｃｍ／ｓ））が示された。この低い膜透過性から、分子１が細胞外タンパク質を標的とするか、又は細胞内に能動輸送されるという可能性が高まった。多数の研究から、栄養素及びビタミンの共有結合的複合体化が医薬の能動輸送を増大させることが示されている。
【００６４】
分子１におけるグルコース単位の存在から、分子１の活性に対するグルコース輸送体阻害剤の影響を検査することにした。グルコースは、２種類の輸送体：グルコース輸送体（ＧＬＵＴ）又はナトリウム−グルコース輸送タンパク質（ＳＧＬＴ）によって輸送されることが知られている。ＣＨＯ−Ｋ１細胞におけるＳＲＥＢＰ−２のウエスタンブロット分析により、代表的なＧＬＵＴ阻害剤であるフロレチンとの共インキュベーションが、ＳＲＥＢＰ−２のタンパク質レベルを減少させる分子１の能力を高めたが、代表的なＳＧＬＴ阻害剤であるフロリジンでは分子１の能力を高めることができないことが明らかになった（図２Ｂ）。重要なことには、フロリジンではなく、フロレチン単独が、ＣＨＯ−Ｋ１細胞におけるＳＲＥＢＰ−２の成熟型の量を減少させた（図２Ｂ）。これらの結果は、分子１がＧＬＵＴによって輸送されるのではなく、ＧＬＵＴを阻害することによってＳＲＥＢＰ−２活性化を弱めることを意味する。
【００６５】
この仮定を支持するために、次にＧＬＵＴ−２を発現するヒト腸細胞株である分化Ｃａｃｏ−２細胞のグルコース取込みを阻止する分子１の能力を検査した。分子１は、蛍光標識グルコース類似体２−ＮＢＤＧ（２−（Ｎ−（７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ）−２−デオキシグルコース）の細胞取込みを用量依存的に阻止したが、分子１の糖部分を欠く対照分子（分子３）は、殆ど影響を有しなかった。１０μＭでの分子１の阻害活性は、高濃度のフロレチンと同程度であった（図２Ｃ）。
【００６６】
細胞グルコース取込みの阻害は、通常は細胞内エネルギーの不足を引き起こし、細胞エネルギー及び栄養素状態のセンサーであるＡＭＰＫの活性化につながる。ＡＭＰＫの活性化がＳＲＥＢＰのリン酸化をもたらし、ＳＲＥＢＰの活性化が阻止されることも実証されている。ホスホ−ＡＭＰＫに対する抗体を用いたウエスタンブロット分析から、分子１（１０μＭ）によるＨｅｐａ１−６細胞の３時間の処理が、フロレチン（１００μＭ）を用いた場合と同程度にＡＭＰＫのＴｈｒ１７２リン酸化を誘導したが、グルコース取込みの阻害活性を欠く分子３が、ＡＭＰＫのリン酸化を誘導することができなかったことが示される。分子１がグルコース輸送体を阻害し、ＡＭＰＫを活性化することでＳＲＥＢＰ活性を低下させる可能性が非常に高い（図２Ｄ）。
【００６７】
２．６．  絶食マウスにおけるグルコース負荷試験
分子１のグルコース取込み阻害活性をマウスにおいて更に検査した。マウスを２４時間絶食させた後、典型的な甘味飲料製品に相当するグルコース溶液の経口投与を行った。分子１の経口同時投与（図３Ａ）又はグルコース投与の１０分前のその投与（図３Ｂ）は、血糖レベルの上昇を有意に抑制した。対照的に、グルコースセグメントを欠いた分子３は、検出可能な影響を示さなかった。実験の過程でマウスにおける分子１の即時毒性は見られなかった。これらの動物への影響は、培養細胞において観察されたグルコース取込み阻害と一致していた。
【００６８】
２．７．  結論
結論として、複数の栄養素及びビタミンの３０８個の共有結合複合体の重点的な化学ライブラリーは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでの新たなグルコース取込みの阻害剤としての分子１の発見につながった。この特定の栄養素複合体がグルコース取込みを阻止する機構は依然として不明である。恐らくは、分子１のグルコース部分は、グルコース輸送体によって認識され得るが、疎水性ＤＨＡ尾部及び嵩高いジペプチドセグメントが分子全体の輸送を妨げている可能性がある。それにもかかわらず、このような栄養素複合体の合成ライブラリーが、エネルギー代謝を調節する新規の化学ツールの非常に貴重な供給源となることが本研究から示される。
【図１Ａ】
2020128343.tif 000016
【図１Ｂ】
2020128343.tif 000017
【図１Ｃ】
2020128343.tif 000018
【図１Ｄ】
2020128343.tif 000019
【図２Ａ】
2020128343.tif 000020
【図２Ｂ】
2020128343.tif 000021
【図２Ｃ】
2020128343.tif 000022
【図２Ｄ】
2020128343.tif 000023
【図３Ａ】
2020128343.tif 000024
【図３Ｂ】
2020128343.tif 000025
【外国語明細書】
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