(57)【要約】      （修正有）【課題】癌治療において治療目的で使用することができる抗上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）抗体及び抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の提供。【解決手段】以下のａ）からｃ）の特性を有する抗ヒトＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合部分。ａ）特定のアミノ酸配列内のエピトープに結合するか、又は、競合結合アッセイにおいて、特定のアミノ酸配列を有するＥＧＦＲ変異体ＩＩＩとの結合に関して、別の特定のアミノ酸配列を有する第２の抗ヒトＥＧＦＲ抗体と競合する。ｂ）表面プラズモン共鳴法により測定した場合に、一定以下の解離定数（Ｋｄ）で、前記とは別の特定のアミノ酸配列を有するＥＧＦＲと結合する。ｃ）インビボヒト非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）異種移植アッセイにおいて、前記抗ｈＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合部分と同一の用量と頻度で投与されＥＧＦＲに非特異的なヒトＩｇＧ抗体と比較して、一定以上の割合で腫瘍増殖を阻害する。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ヒト上皮成長因子受容体（抗ｈＥＧＦＲ）抗体又はその抗原結合部分であって、
ａ）アミノ酸配列ＣＧＡＤＳＹＥＭＥＥＤＧＶＲＫＣ（配列番号４５）内のエピトープに結合するか、又は競合結合アッセイにおいて上皮成長因子受容体変異体ＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）（配列番号３３）との結合に関して第２の抗ｈＥＧＦＲ抗体と競合し、ここで前記第２の抗ＥＧＦＲ抗体は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号５に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む；
ｂ）表面プラズモン共鳴法により測定した場合に、約１×１０−６Ｍ以下の解離定数（Ｋｄ）でＥＧＦＲ（１−５２５）（配列番号４７）と結合し；および
ｃ）インビボヒト非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）異種移植アッセイにおいて、前記ＮＳＣＬＣ異種移植アッセイにおいて、ＥＧＦＲに特異的ではないヒトＩｇＧ抗体と比較して少なくとも約５０％の腫瘍増殖阻害率％（ＴＧＩ％）で腫瘍増殖を阻害する、ここで、前記抗ｈＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合部分と同一の用量と頻度でＥＧＦＲに非特異的なヒトＩｇＧ抗体を投与される、
前記抗体又はその抗原結合部分。
【請求項２】
表面プラズモン共鳴法により測定した場合に、約１×１０−６Ｍ〜約１×１０−１０ＭのＫｄでＥＧＦＲ（１−５２５）（配列番号４７）と結合する請求項１に記載の抗体又はその抗原結合部分。
【請求項３】
表面プラズモン共鳴法により測定した場合に、約１×１０−６Ｍ〜約１×１０−７ＭのＫｄでＥＧＦＲ（１−５２５）（配列番号４７）と結合する請求項１に記載の抗体又はその抗原結合部分。
【請求項４】
表面プラズモン共鳴法により測定した場合に、約８．２×１０−９Ｍ以下のＫｄでＥＧＦＲｖＩＩＩ（配列番号３３）と結合する請求項１から３のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合部分。
【請求項５】
表面プラズモン共鳴法により測定した場合に、約８．２×１０−９Ｍ〜約６．３×１０−１０ＭのＫｄでＥＧＦＲｖＩＩＩ（配列番号３３）と結合する請求項１から３のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合部分。
【請求項６】
表面プラズモン共鳴法により測定した場合に、約８．２×１０−９Ｍ〜約２．０×１０−９ＭのＫｄでＥＧＦＲｖＩＩＩ（配列番号３３）と結合する請求項１から３のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合部分。
【請求項７】
インビボヒト非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）異種移植アッセイにおいて、ＥＧＦＲに非特異的なヒトＩｇＧ抗体と比較して、腫瘍増殖を少なくとも約６０％阻害する請求項１から６のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合部分。
【請求項８】
インビボヒト非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）異種移植アッセイにおいて、ＥＧＦＲに非特異的なヒトＩｇＧ抗体と比較して、腫瘍増殖を少なくとも約７０％阻害する請求項１から６のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合部分。
【請求項９】
インビボヒト非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）異種移植アッセイにおいて、ＥＧＦＲに非特異的なヒトＩｇＧ抗体と比較して、腫瘍増殖を少なくとも約８０％阻害する請求項１から６のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合部分。
【請求項１０】
前記抗体又はその抗原結合部分が、配列番号１２に記載のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３ドメイン、配列番号１１に記載のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２ドメイン及び配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１ドメインと；配列番号８に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３ドメイン、配列番号７に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２ドメイン及び配列番号６に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１ドメインとを含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合部分。
【請求項１１】
前記抗体又はその抗原結合部分が、配列番号９に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号５に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合部分。
【請求項１２】
配列番号１５に記載のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１３に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む請求項１から９のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合部分。
【請求項１３】
配列番号４０に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３ドメイン、配列番号３９に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２ドメイン及び配列番号３８に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１ドメインと；
配列番号３７に記載のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３ドメイン、配列番号３６に記載のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２ドメイン及び配列番号３５に記載のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１ドメインと
を含む抗ｈＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合部分。
【請求項１４】
５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６及び７８から構成される群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と；５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７及び７９から構成される群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む抗ｈＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合部分。
【請求項１５】
配列番号１０、１１及び１２；配列番号１６、１７及び１８；配列番号１０、１１及び１９；配列番号２０、１１及び１２；配列番号２１、３及び２２；配列番号１６、１７及び１９；配列番号２、３及び４；配列番号１０、３及び１２；配列番号８０、１１及び１８；配列番号８０、３及び１８；配列番号２０、３及び１２；配列番号８０、１１及び１２；並びに配列番号８１、１１及び２２から構成される群から選択される重鎖ＣＤＲセット（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）と；
配列番号６、７及び８；配列番号２３、２４及び２５；配列番号２６、２７及び２８；配列番号２９、３０及び３１；配列番号６、７及び８４；配列番号８２、８３及び３１；並びに配列番号８２、２７及び８５から構成される群から選択される軽鎖ＣＤＲセット（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）を含む抗ｈＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合部分であって、
前記抗体又はその抗原結合部分が、配列番号２、３及び４の重鎖ＣＤＲセットと、配列番号６、７及び８の軽鎖ＣＤＲセットを同時に含むことはない前記抗ｈＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合部分。
【請求項１６】
配列番号４１に記載のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域及び／又は配列番号４３に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む、請求項１から１５のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合部分。
【請求項１７】
前記抗体又はその抗原結合部分が、ヒトＩｇＧ定常領域、ヒトＩｇＭ定常領域、ヒトＩｇＥ定常領域及びヒトＩｇＡ定常領域から構成される群から選択される重鎖免疫グロブリン定常領域を含む、請求項１から１５のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合部分。
【請求項１８】
前記ＩｇＧ定常領域が、ＩｇＧ１定常領域、ＩｇＧ２定常領域、ＩｇＧ３定常領域及びＩｇＧ４定常領域から構成される群から選択される請求項１７に記載の抗体又はその抗原結合部分。
【請求項１９】
前記抗体が、多重特異性抗体である、請求項１から１８のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合部分。
【請求項２０】
前記抗体又はその抗原結合部分が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ジスルフィド結合したＦｖ、ｓｃＦｖ、シングルドメイン抗体及びダイアボディから構成される群から選択される、請求項１から１９のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合部分。
【請求項２１】
前記抗体又はその抗原結合部分が、造影剤と結合している、請求項１から２０のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合部分。
【請求項２２】
前記造影剤が、放射性標識物質、酵素、蛍光標識物質、発光標識物質、生物発光標識物質、磁気標識物質及びビオチンから構成される群から選択される、請求項２１に記載の抗体又はその抗原結合部分。
【請求項２３】
前記放射性標識物質が、インジウムである請求項２２に記載の抗体又はその抗原結合部分。
【請求項２４】
請求項１から２３のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合部分と、医薬的に許容可能な担体とを含有する医薬組成物。
【請求項２５】
請求項１から２３のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合部分を少なくとも１個の薬物と結合させた抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）。
【請求項２６】
前記少なくとも１個の薬物が、抗アポトーシス剤、有糸分裂阻害剤、抗腫瘍性抗生物質、免疫調節剤、遺伝子治療用核酸、アルキル化剤、抗血管新生薬、代謝拮抗剤、ホウ素含有剤、化学療法剤、ホルモン剤、抗ホルモン剤、コルチコステロイド、感光性治療剤、オリゴヌクレオチド、放射性核種剤、放射線増感剤、トポイソメラーゼ阻害剤及びチロシンキナーゼ阻害剤から構成される群から選択される、請求項２５に記載のＡＤＣ。
【請求項２７】
前記有糸分裂阻害剤が、ドラスタチン、アウリスタチン、メイタンシノイド及び植物アルカロイドから構成される群から選択される、請求項２６に記載のＡＤＣ。
【請求項２８】
前記アウリスタチンが、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）又はモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）である、請求項２７に記載のＡＤＣ。
【請求項２９】
前記メイタンシノイドが、ＤＭ１、ＤＭ２、ＤＭ３及びＤＭ４から構成される群から選択される、請求項２７に記載のＡＤＣ。
【請求項３０】
前記抗腫瘍性抗生物質が、アクチノマイシン、アントラサイクリン、カリケアマイシン及びデュオカルマイシンから構成される群から選択される、請求項２６に記載のＡＤＣ。
【請求項３１】
請求項２５から３０のいずれか一項に記載のＡＤＣを複数個含むＡＤＣ混合物と、医薬的に許容可能な担体とを含有する医薬組成物。
【請求項３２】
前記ＡＤＣ混合物が、２〜４の平均薬物対抗体比（ＤＡＲ）を有する、請求項３１に記載の医薬組成物。
【請求項３３】
前記ＡＤＣ混合物が、各々２〜８のＤＡＲを有するＡＤＣを含む、請求項３１に記載の医薬組成物。
【請求項３４】
癌をもつ対象の治療方法であって、前記癌をもつ対象を治療するように、請求項２４又は３１から３３のいずれか一項に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項３５】
前記癌が、乳癌、肺癌、膠芽腫、前立腺癌、膵臓癌、結腸癌、頭頸部癌及び腎臓癌から構成される群から選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記癌が、扁平上皮癌である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記扁平上皮癌が、肺扁平上皮癌又は頭頸部扁平上皮癌である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記癌が、トリプルネガティブ乳癌である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３９】
前記癌が、非小細胞肺癌である、請求項３４に記載の方法。
【請求項４０】
前記癌が、ＥＧＦＲ過剰発現を特徴とする、請求項３４から３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
固形腫瘍をもつ対象における固形腫瘍増殖の阻害又は抑制方法であって、前記固形腫瘍増殖を阻害又は抑制するように、前記固形腫瘍をもつ対象に請求項２４又は３１から３３のいずれか一項に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
【請求項４２】
固形腫瘍をもつ対象における固形腫瘍増殖の阻害又は抑制方法であって、前記固形腫瘍増殖を阻害又は抑制するように、前記固形腫瘍をもつ対象に有効量の請求項１から２３又は２５から３０のいずれか一項に記載の抗体又はＡＤＣを投与することを含む、方法。
【請求項４３】
前記固形腫瘍が、ＥＧＦＲを発現する固形腫瘍又はＥＧＦＲｖＩＩＩ陽性固形腫瘍である、請求項４１又は４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記固形腫瘍がＥＧＦＲを過剰発現する固形腫瘍である、請求項４１又は４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記固形腫瘍が、非小細胞肺癌又は膠芽腫である、請求項４１から４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記抗体、ＡＤＣ又は医薬組成物を別の薬剤又は別の療法と併用投与する、請求項３４から４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記別の薬剤が、抗ＰＤ１抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、テモゾロミド、ｂｃｌ−ｘｌ阻害剤、イブルチニブ、ドゥベリシブ、イデラリシブ、ベネトクラックス及びニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＭＰＴ）阻害剤から構成される群から選択される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記別の療法が、放射線である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
前記別の薬剤が、化学療法剤である、請求項４６に記載の方法。
【請求項５０】
請求項１から２３のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合部分をコードする単離核酸。
【請求項５１】
請求項５０に記載の核酸を含むベクター。
【請求項５２】
請求項５１に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項５３】
原核細胞又は真核細胞である請求項５２に記載の宿主細胞。
【請求項５４】
前記真核細胞が、動物細胞、原生動物細胞、植物細胞及び真菌細胞から構成される群から選択される、請求項５３に記載の宿主細胞。
【請求項５５】
前記動物細胞が、哺乳動物細胞、昆虫細胞及び鳥類細胞から構成される群から選択される請求項５４に記載の宿主細胞。
【請求項５６】
前記哺乳動物細胞が、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞及びＳｐ２／０細胞から構成される群から選択される、請求項５５に記載の宿主細胞。
【請求項５７】
抗ｈＥＧＦＲ抗体をアウリスタチンと結合させた抗ｈＥＧＦＲ抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）であって、前記抗体が配列番号１２のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３ドメイン、配列番号１１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２ドメイン及び配列番号１０のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１ドメインと；配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３ドメイン、配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２ドメイン及び配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１ドメインとを含む前記抗ｈＥＧＦＲ抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）。
【請求項５８】
前記抗体が、配列番号９に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、請求項５７に記載のＡＤＣ。
【請求項５９】
前記抗体が、ＩｇＧ重鎖免疫グロブリン定常領域を含む、請求項５７又は５８に記載のＡＤＣ。
【請求項６０】
前記ＩｇＧが、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４重鎖免疫グロブリン定常領域である、請求項５９に記載のＡＤＣ。
【請求項６１】
前記アウリスタチンが、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）又はモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）である、請求項５７から６０のいずれか一項に記載のＡＤＣ。
【請求項６２】
前記抗体が、配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１３のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む、請求項５７又は５８に記載のＡＤＣ。
【請求項６３】
前記抗体が、マレイミドカプロイル、バリン−シトルリン、ｐ−アミノベンジルアルコール（ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢＡ）を含むリンカーにより前記アウリスタチンと共有結合している、請求項６１に記載のＡＤＣ。
【請求項６４】
前記ＡＤＣが、放射性標識物質を含む、請求項５７から６３のいずれか一項に記載のＡＤＣ。
【請求項６５】
前記放射性標識物質が、インジウムである、請求項６４に記載のＡＤＣ。
【請求項６６】
請求項５７から６５のいずれか一項に記載のＡＤＣと、医薬的に許容可能な担体とを含有する医薬組成物。
【請求項６７】
請求項５７から６５のいずれか一項に記載のＡＤＣを含むＡＤＣ混合物を含有する医薬組成物であって、前記ＡＤＣ混合物における平均薬物対抗体比（ＤＡＲ）の範囲が２〜４である、医薬組成物。
【請求項６８】
抗ｈＥＧＦＲ抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を含むＡＤＣ混合物と、医薬的に許容可能な担体とを含有する医薬組成物であって、前記ＡＤＣ混合物は平均薬物対抗体比（ＤＡＲ）が２〜４であり、前記ＡＤＣは配列番号１２のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３ドメイン、配列番号１１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２ドメイン及び配列番号１０のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１ドメインと；配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３ドメイン、配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２ドメイン及び配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１ドメインとを含む抗ｈＥＧＦＲ抗体と、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）を結合させたものである、医薬組成物。
【請求項６９】
前記抗体の重鎖可変領域が配列番号９に記載のアミノ酸配列を含み、前記抗ＥＧＦＲ抗体の軽鎖可変領域が配列番号５に記載のアミノ酸配列を含む、請求項６８に記載の医薬組成物。
【請求項７０】
前記抗体が、ＩｇＧ重鎖免疫グロブリン定常領域を含む、請求項６８又は６９に記載の医薬組成物。
【請求項７１】
前記ＩｇＧが、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４重鎖免疫グロブリン定常領域である請求項７０に記載の医薬組成物。
【請求項７２】
前記抗体が、配列番号１５に記載のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１３のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む請求項６８又は６９に記載の医薬組成物。
【請求項７３】
前記ＭＭＡＥが、マレイミドカプロイル、ｖａｌ−ｃｉｔ、ＰＡＢＡを含むリンカーにより前記抗体と結合している、請求項６８から７２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項７４】
癌をもつ対象の治療方法であって、前記癌をもつ対象を治療するように、請求項６８から７３のいずれか一項に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項７５】
前記癌が、乳癌、肺癌、膠芽腫、前立腺癌、膵臓癌、結腸癌、頭頸部癌及び腎臓癌から構成される群から選択される、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記癌が、扁平上皮癌である、請求項７４に記載の方法。
【請求項７７】
前記扁平上皮癌が、肺扁平上皮癌又は頭頸部扁平上皮癌である、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記癌が、トリプルネガティブ乳癌である、請求項７４に記載の方法。
【請求項７９】
前記癌が、非小細胞肺癌である、請求項７４に記載の方法。
【請求項８０】
前記癌が、ＥＧＦＲ過剰発現を特徴とする、請求項７４から７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８１】
固形腫瘍をもつ対象における固形腫瘍増殖の阻害又は抑制方法であって、前記固形腫瘍増殖が阻害又は抑制されるように、前記固形腫瘍をもつ対象に請求項６６から７３のいずれか一項に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
【請求項８２】
前記固形腫瘍が、非小細胞肺癌又は膠芽腫である、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記固形腫瘍が、扁平上皮癌である、請求項８１に記載の方法。
【請求項８４】
前記固形腫瘍が、ＥＧＦＲｖＩＩＩ陽性固形腫瘍又はＥＧＦＲを発現する固形腫瘍である、請求項８１から８３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８５】
前記固形腫瘍が、ＥＧＦＲを過剰発現する、請求項８１から８３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８６】
前記医薬組成物を別の薬剤又は別の療法と併用投与する、請求項７４から８５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８７】
前記別の薬剤が抗ＰＤ１抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、テモゾロミド、ｂｃｌ−ｘｌ阻害剤、イブルチニブ、ドゥベリシブ、イデラリシブ、ベネトクラックス及びニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＭＰＴ）阻害剤から構成される群から選択される、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記別の療法が、放射線である、請求項８６に記載の方法。
【請求項８９】
前記別の薬剤が、化学療法剤である、請求項８６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
ヒト上皮成長因子受容体（ＨＥＲ−１又はＥｒｂ−Ｂ１とも言い、本願では「ＥＧＦＲ」と言う。）はｃ−ｅｒｂＢ癌原遺伝子によりコードされる１７０ｋＤａ膜貫通型受容体であり、固有のチロシンキナーゼ活性を示す（Ｍｏｄｊｔａｈｅｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ７３：２２８−２３５（１９９６）；Ｈｅｒｂｓｔ  ａｎｄ  Ｓｈｉｎ，Ｃａｎｃｅｒ  ９４：１５９３−１６１１（２００２））。ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースエントリーＰ００５３３はヒトＥＧＦＲの配列を提供している。ＥＧＦＲはチロシンキナーゼ介在性シグナル伝達経路を介して多数の細胞内プロセスを調節し、限定されないが、細胞増殖、分化、細胞生存、アポトーシス、血管新生、有糸分裂及び転移を制御するシグナル伝達経路の活性化が挙げられる（Ａｔａｌａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  １４：１３４６−１３６３（２００３）；Ｔｓａｏ  ａｎｄ  Ｈｅｒｂｓｔ，Ｓｉｇｎａｌ  ４：４−９（２００３）；Ｈｅｒｂｓｔ  ａｎｄ  Ｓｈｉｎ，Ｃａｎｃｅｒ  ９４：１５９３−１６１１（２００２）；Ｍｏｄｊｔａｈｅｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ７３：２２８−２３５（１９９６））。
【０００２】
ＥＧＦＲの公知リガンドとしては、ＥＧＦ、ＴＧＦＡ／ＴＧＦ−α、アンフィレグリン、エピジェン／ＥＰＧＮ、ＢＴＣ／ベタセルリン、エピレグリン／ＥＲＥＧ及びＨＢＥＧＦ／ヘパリン結合性ＥＧＦが挙げられる。リガンドがＥＧＦＲと結合すると、受容体ホモ及び／又はヘテロ二量化と主要な細胞質残基の自己リン酸化を引き起こす。リン酸化したＥＧＦＲはＧＲＢ２等のアダプタータンパク質を動員し、その結果、少なくとも以下の主要な下流シグナル伝達カスケード、即ちＲＡＳ−ＲＡＦ−ＭＥＫ−ＥＲＫ、ＰＩ３キナーゼ−ＡＫＴ、ＰＬＣγ−ＰＫＣ及びＳＴＡＴモジュールを含む複雑な下流のシグナル伝達カスケードを活性化する。この自己リン酸化は更にそれ自体のホスホチロシン結合性ＳＨ２ドメインを介してリン酸化チロシンと会合する複数の他のタンパク質による下流の活性化とシグナル伝達を誘発する。これらの下流のシグナル伝達タンパク質はＭＡＰＫ、Ａｋｔ及びＪＮＫ経路を始めとする複数のシグナル伝達カスケードを開始し、細胞増殖をもたらす。リガンドがＥＧＦＲと結合すると、ＮＦ−κＢシグナル伝達カスケードを活性化する場合もある。リガンド結合は更にＲＧＳ１６等の他のタンパク質を直接リン酸化し、そのＧＴＰａｓｅ活性を活性化し、潜在的にＥＧＦ受容体シグナル伝達をＧタンパク質共役型受容体シグナル伝達と連動させる。リガンド結合は更にＭＵＣ１をリン酸化し、ＳＲＣ及びＣＴＮＮＢ１／β−カテニンとのその相互作用を亢進する。
【０００３】
膀胱癌、脳腫瘍、頭頸部癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、結腸癌、前立腺癌及び腎臓癌を含む多数のヒト悪性病態でＥＧＦＲの過剰発現が報告されている。（Ａｔａｌａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  １４：１３４６−１３６３（２００３）；Ｈｅｒｂｓｔ  ａｎｄ  Ｓｈｉｎ，Ｃａｎｃｅｒ  ９４：１５９３−１６１１（２００２）；及びＭｏｄｊｔａｈｅｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ７３：２２８−２３５（１９９６））。これらの病態の多くにおいて、ＥＧＦＲの過剰発現は患者の予後不良と相関又は関連する。（Ｈｅｒｂｓｔ  ａｎｄ  Ｓｈｉｎ，Ｃａｎｃｅｒ  ９４：１５９３−１６１１（２００２）；及びＭｏｄｊｔａｈｅｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ７３：２２８−２３５（１９９６））。悪性細胞よりも一般に低レベルではあるが、ＥＧＦＲは正常組織、特に皮膚、肺及び胃腸管の上皮組織の細胞でも発現される（Ｈｅｒｂｓｔ  ａｎｄ  Ｓｈｉｎ，Ｃａｎｃｅｒ  ９４：１５９３−１６１１（２００２））。
【０００４】
ＥＧＦＲ遺伝子の増幅（即ちＥＧＦＲ遺伝子の複数のコピー）を含む腫瘍はかなりの割合のものがｄｅ２−７ＥＧＦＲ、ΔＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ又はΔ２−７（本願ではこれらの用語を同義に使用する。）と呼ばれる前記受容体の短縮型（Ｗｉｋｓｔｒａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｖｉｒｏｌ．４，１４８−１５８）を同時発現する（Ｏｌａｐａｄｅ−Ｏｌａｏｐａ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．８２，１８６−９４）。ｄｅ２−７ＥＧＦＲに見られる再構成の結果、エキソン２〜７にまたがる８０１ヌクレオチドを欠失するインフレーム成熟ｍＲＮＡが生成される（Ｗｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９，２９６５−９；Ｙａｍａｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．８１，７７３−９；Ｙａｍａｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８，１８１６−２０；及びＳｕｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７，８６０２−６）。対応するＥＧＦＲタンパク質は細胞外領域の残基６〜２７３からなる２６７アミノ酸を欠失すると共に、融合接合部に新規グリシン残基をもつ（Ｓｕｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）。この欠失とグリシン残基の挿入が相俟って欠失界面にユニークな接合部ペプチドが生成される（Ｓｕｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）。
【０００５】
ＥＧＦＲｖＩＩＩは神経膠腫、乳癌、肺癌、卵巣癌及び前立腺癌を含む多数の腫瘍種で報告されている（Ｗｉｋｓｔｒａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７，４１３０−４０；Ｏｌａｐａｄｅ−Ｏｌａｏｐａ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．８２，１８６−９４；Ｗｉｋｓｔｒａｎｄ，ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５，３１４０−８；Ｇａｒｃｉａ  ｄｅ  Ｐａｌａｚｚｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３，３２１７−２０）。この短縮型受容体はリガンドと結合しないが、構成的活性が低く、ヌードマウスで腫瘍異種移植片として増殖させた神経膠腫細胞に有意な増殖効果を付与し（Ｎｉｓｈｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１，７７２７−３１）、ＮＩＨ３Ｔ３細胞（Ｂａｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．６，１２５１−９）とＭＣＦ−７細胞を形質転換させることができる。神経膠腫細胞でｄｅ２−７ＥＧＦＲにより利用される細胞内メカニズムは完全には解明されていないが、アポトーシスの低下（Ｎａｇａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６，５０７９−８６）と増殖の若干の亢進（Ｎａｇａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）を伴うことが報告されている。この短縮型受容体の発現は腫瘍細胞に限定されているので、抗体療法の高度に特異的な標的となる。
【０００６】
抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は化学的リンカーを介して抗体を細胞毒性薬と結合させた新規類の治療薬である。ＡＤＣの治療概念は抗体の結合能を薬物と結び付けるものであり、標的表面抗原との結合により薬物を腫瘍細胞に送達するために抗体を使用する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｍｏｄｊｔａｈｅｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ７３：２２８−２３５（１９９６）
【非特許文献２】Ｈｅｒｂｓｔ  ａｎｄ  Ｓｈｉｎ，Ｃａｎｃｅｒ  ９４：１５９３−１６１１（２００２）
【非特許文献３】Ａｔａｌａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  １４：１３４６−１３６３（２００３）
【非特許文献４】Ｔｓａｏ  ａｎｄ  Ｈｅｒｂｓｔ，Ｓｉｇｎａｌ  ４：４−９（２００３）
【非特許文献５】Ｗｉｋｓｔｒａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｖｉｒｏｌ．４，１４８−１５８
【非特許文献６】Ｏｌａｐａｄｅ−Ｏｌａｏｐａ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．８２，１８６−９４
【非特許文献７】Ｗｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９，２９６５−９
【非特許文献８】Ｙａｍａｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．８１，７７３−９
【非特許文献９】Ｙａｍａｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８，１８１６−２０
【非特許文献１０】Ｓｕｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７，８６０２−６
【非特許文献１１】Ｗｉｋｓｔｒａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７，４１３０−４０
【非特許文献１２】Ｗｉｋｓｔｒａｎｄ，ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５，３１４０−８
【非特許文献１３】Ｇａｒｃｉａ  ｄｅ  Ｐａｌａｚｚｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３，３２１７−２０
【非特許文献１４】Ｎｉｓｈｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１，７７２７−３１
【非特許文献１５】Ｂａｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．６，１２５１−９
【非特許文献１６】Ｎａｇａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６，５０７９−８６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、癌治療において治療目的で使用することができる抗ＥＧＦＲ抗体及びＡＤＣが当技術分野で依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
ある種の態様において、本発明はＥＧＦＲｖＩＩＩと特異的に結合する抗ＥＧＦＲ抗体及び抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を提供する。
【００１０】
１実施形態において、本発明は抗ヒト上皮成長因子受容体（抗ｈＥＧＦＲ）抗体又はその抗原結合部分であって、アミノ酸配列ＣＧＡＤＳＹＥＭＥＥＤＧＶＲＫＣ（配列番号４５）内のエピトープに結合するか、又は競合結合アッセイにおいて上皮成長因子受容体変異体ＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）（配列番号３３）との結合に関して第２の抗ｈＥＧＦＲ抗体と競合し、ここで、前記第２の抗ＥＧＦＲ抗体は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号５に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む；表面プラズモン共鳴法により測定した場合に、約１×１０−６Ｍ以下の解離定数（Ｋｄ）でＥＧＦＲ（１−５２５）（配列番号４７）と結合し；およびインビボヒト非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）異種移植アッセイにおいて、前記ＮＳＣＬＣ異種移植アッセイにおいて、ＥＧＦＲに特異的ではないヒトＩｇＧ抗体と比較して少なくとも約５０％の腫瘍増殖阻害率％（ＴＧＩ％）で腫瘍増殖を阻害する、ここで、前記抗ｈＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合部分と同一の用量と頻度でＥＧＦＲに非特異的なヒトＩｇＧ抗体を投与される、ものに関する。
【００１１】
本発明のある種の実施形態において、前記抗体又はその抗原結合部分は、表面プラズモン共鳴法により測定した場合に、約１×１０−６Ｍ〜約１×１０−１０ＭのＫｄでＥＧＦＲ（１−５２５）（配列番号４７）と結合する。
【００１２】
本発明の他の実施形態において、前記抗体又はその抗原結合部分は、表面プラズモン共鳴法により測定した場合に、約１×１０−６Ｍ〜約１×１０−７ＭのＫｄでＥＧＦＲ（１−５２５）（配列番号４７）と結合する。
【００１３】
ある種の実施形態において、前記抗体又はその抗原結合部分は、表面プラズモン共鳴法により測定した場合に、約８．２×１０−９Ｍ以下のＫｄでＥＧＦＲｖＩＩＩ（配列番号３３）と結合する。その他の実施形態において、前記抗体又はその抗原結合部分は、表面プラズモン共鳴法により測定した場合に、約８．２×１０−９Ｍ〜約６．３×１０−１０ＭのＫｄでＥＧＦＲｖＩＩＩ（配列番号３３）と結合する。所定の実施形態において、前記抗体又はその抗原結合部分は、表面プラズモン共鳴法により測定した場合に、約８．２×１０−９Ｍ〜約２．０×１０−９ＭのＫｄでＥＧＦＲｖＩＩＩ（配列番号３３）と結合する。
【００１４】
本発明の更に他の実施形態において、前記抗体又はその抗原結合部分は、インビボヒト非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）異種移植アッセイにおいて、ＥＧＦＲに非特異的なヒトＩｇＧ抗体と比較して、腫瘍増殖を少なくとも約６０％阻害する。
【００１５】
ある種の実施形態において、本発明はインビボヒト非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）異種移植アッセイにおいて、ＥＧＦＲに非特異的なヒトＩｇＧ抗体と比較して、腫瘍増殖を少なくとも約７０％阻害する抗体又はその抗原結合部分に関する。ある種の実施形態において、前記抗体又はその抗原結合部分は、インビボヒト非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）異種移植アッセイにおいて、ＥＧＦＲに非特異的なヒトＩｇＧ抗体と比較して、腫瘍増殖を少なくとも約８０％阻害する。
【００１６】
所定の実施形態において、前記抗体又はその抗原結合部分は、配列番号１２に記載のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３ドメイン、配列番号１１に記載のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２ドメイン及び配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１ドメインと；配列番号８に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３ドメイン、配列番号７に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２ドメイン及び配列番号６に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１ドメインとを含む。更に別の実施形態において、前記抗体又はその抗原結合部分は、配列番号９に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号５に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。他の実施形態において、前記抗体又はその抗原結合部分は、配列番号４１に記載のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域及び／又は配列番号４３に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む。別の実施形態において、前記抗体又はその抗原結合部分は、配列番号１５に記載のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１３に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。別の実施形態では、前記抗体又はその抗原結合部分をアウリスタチンと結合させる。
【００１７】
本発明は更に、ある種の実施形態において、本願に記載するもの等の抗体又はその抗原結合部分をコードする単離核酸を提供する。
【００１８】
本発明は更に、ある種の実施形態において、配列番号４０に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３ドメイン、配列番号３９に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２ドメイン及び配列番号３８に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１ドメインと；配列番号３７に記載のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３ドメイン、配列番号３６に記載のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２ドメイン及び配列番号３５に記載のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１ドメインを含む抗ｈＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合部分を包含する。
【００１９】
ある種の実施形態において、本発明は５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６及び７８から構成される群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と；５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７及び７９から構成される群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む抗ｈＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合部分に関する。
【００２０】
他の実施形態において、本発明は配列番号１０、１１及び１２；配列番号１６、１７及び１８；配列番号１０、１１及び１９；配列番号２０、１１及び１２；配列番号２１、３及び２２；配列番号１６、１７及び１９；配列番号２、３及び４；配列番号１０、３及び１２；配列番号８０、１１及び１８；配列番号８０、３及び１８；配列番号２０、３及び１２；配列番号８０、１１及び１２；並びに配列番号８１、１１及び２２から構成される群から選択される重鎖ＣＤＲセット（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）と；配列番号６、７及び８；配列番号２３、２４及び２５；配列番号２６、２７及び２８；配列番号２９、３０及び３１；配列番号６、７及び８４；配列番号８２、８３及び３１；並びに配列番号８２、２７及び８５から構成される群から選択される軽鎖ＣＤＲセット（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）を含む抗ｈＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合部分を包含する（但し、前記抗体又はその抗原結合部分が、配列番号２、３及び４の重鎖ＣＤＲセットと、配列番号６、７及び８の軽鎖ＣＤＲセットを同時に含むことはない。）。所定の実施形態において、前記抗体又はその抗原結合部分は、配列番号４１に記載のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域及び／又は配列番号４３に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む。
【００２１】
本発明の所定の実施形態において、前記抗体又はその抗原結合部分は、ヒトＩｇＧ定常領域、ヒトＩｇＭ定常領域、ヒトＩｇＥ定常領域及びヒトＩｇＡ定常領域から構成される群から選択される重鎖免疫グロブリン定常領域を含む。所定の実施形態において、前記ＩｇＧ定常領域はＩｇＧ１定常領域、ＩｇＧ２定常領域、ＩｇＧ３定常領域及びＩｇＧ４定常領域から構成される群から選択される。他の実施形態において、前記抗体は多重特異性抗体である。
【００２２】
本発明の他の実施形態において、前記抗体又はその抗原結合部分は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ジスルフィド結合したＦｖ、ｓｃＦｖ、シングルドメイン抗体及びダイアボディを含む。
【００２３】
本発明の更に他の実施形態では、前記抗体又はその抗原結合部分を造影剤と結合させる。本発明のある種の実施形態において、前記造影剤は、放射性標識物質、酵素、蛍光標識物質、発光標識物質、生物発光標識物質、磁気標識物質及びビオチンから構成される群から選択される。本発明の他の実施形態において、前記放射性標識物質は、インジウムである。更に他の実施形態において、本発明は前記抗体又はその抗原結合部分と、医薬的に許容可能な担体とを含有する医薬組成物を包含する。
【００２４】
本発明は更に、所定の実施形態では、本願に記載する抗体又はその抗原結合部分を少なくとも１個の薬物と結合させた抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を包含する。ある種の実施形態において、前記抗体は抗ヒト上皮成長因子受容体（抗ｈＥＧＦＲ）抗体又はその抗原結合部分であり、アミノ酸配列ＣＧＡＤＳＹＥＭＥＥＤＧＶＲＫＣ（配列番号４５）内のエピトープに結合するか、又は競合結合アッセイにおいて上皮成長因子受容体変異体ＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）（配列番号３３）との結合に関して第２の抗ｈＥＧＦＲ抗体と競合し、ここで前記第２の抗ＥＧＦＲ抗体は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号５に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、；表面プラズモン共鳴法により測定した場合に、約１×１０−６Ｍ以下の解離定数（Ｋｄ）でＥＧＦＲ（１−５２５）（配列番号４７）と結合し；およびインビボヒト非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）異種移植アッセイにおいて、前記ＮＳＣＬＣ異種移植アッセイにおいて、ＥＧＦＲに特異的ではないヒトＩｇＧ抗体と比較して少なくとも約５０％の腫瘍増殖阻害率％（ＴＧＩ％）で腫瘍増殖を阻害する、ここで、前記抗ｈＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合部分と同一の用量と頻度でＥＧＦＲに非特異的なヒトＩｇＧ抗体を投与される、本発明の１実施形態において、前記少なくとも１個の薬物は、抗アポトーシス剤、有糸分裂阻害剤、抗腫瘍性抗生物質、免疫調節剤、遺伝子治療用核酸、アルキル化剤、抗血管新生薬、代謝拮抗剤、ホウ素含有剤、化学療法剤、ホルモン剤、抗ホルモン剤、コルチコステロイド、感光性治療剤、オリゴヌクレオチド、放射性核種剤、放射線増感剤、トポイソメラーゼ阻害剤及びチロシンキナーゼ阻害剤から構成される群から選択される。ある種の実施形態において、前記有糸分裂阻害剤は、ドラスタチン、アウリスタチン、メイタンシノイド及び植物アルカロイドである。ある種の実施形態において、前記薬物はドラスタチン、アウリスタチン、メイタンシノイド及び植物アルカロイドである。アウリスタチンの１例はモノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）又はモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）である。メイタンシノイドの例としては、限定されないが、ＤＭ１、ＤＭ２、ＤＭ３及びＤＭ４が挙げられる。ある種の実施形態において、前記抗腫瘍性抗生物質は、アクチノマイシン、アントラサイクリン、カリケアマイシン及びデュオカルマイシンから構成される群から選択される。ある種の実施形態において、前記アクチノマイシンはピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）である。
【００２５】
本発明は更に、所定の実施形態において、抗ＥＧＦＲ抗体をアウリスタチンと結合させたＡＤＣを包含し、前記抗体は配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン及び配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含む重鎖可変領域と；配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン及び配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインとを含む軽鎖可変領域を含む。１実施形態において、前記抗体は配列番号９に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。更に別の実施形態において、本発明は配列番号１５に記載のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１３のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体又はその抗原結合部分を包含する。
【００２６】
本発明は更に、所定の実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体を少なくとも１個の薬物（例えばＭＭＡＥが挙げられるが、これに限定するものではない。）と結合させたＡＤＣを包含し、薬物１〜８分子を抗体と結合させる。１実施形態では、薬物１〜４分子をＡＤＣの抗体と結合させる。１実施形態では、薬物２〜４分子をＡＤＣの抗体と結合させる。
【００２７】
本発明は更に、所定の実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体を少なくとも１個の薬物と結合させたＡＤＣを包含し、前記薬物はマレイミドカプロイル、バリン−シトルリンリンカーを介して結合させている。別の実施形態において、前記薬物はマレイミドカプロイル、バリン−シトルリン、ｐ−アミノベンジルオキシカルバモイル（ＰＡＢＡ）リンカーを介して薬物と結合させている。
【００２８】
本発明は更に、所定の実施形態では、リンカー（例えばマレイミドカプロイル、バリン−シトルリン）を介して抗ＥＧＦＲ  ＩｇＧ１抗体をモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）と共有結合させたＡＤＣを包含する。ある種の実施形態において、前記抗体は配列番号９に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号５に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。ある種の実施形態では、ＭＭＡＥ１〜４分子を抗体と連結する。
【００２９】
本発明は更に、所定の実施形態では、抗ＥＧＦＲ  ＩｇＧ１抗体をマレイミドカプロイル、バリン−シトルリン、ｐ−アミノベンジルオキシカルバモイル−モノメチルアウリスタチンＥ（ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢＡ−ＭＭＡＥ）と共有結合させたＡＤＣを包含し、前記抗体は配列番号９に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号５に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、ＭＭＡＥ１〜４分子を前記抗体と連結する。ある種の実施形態において、前記抗体は配列番号１５に記載のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１３に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。ある種の実施形態では、ＭＭＡＥ２〜４分子を前記抗体と連結する。ある種の実施形態では、図１１に示すように前記ＥＧＦＲ抗体をｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢＡ−ＭＭＡＥと連結する。
【００３０】
本発明は更に、所定の実施形態では、ヒトＥＧＦＲに特異的なＩｇＧ１抗体と、ＭＭＡＥと、ＭＭＡＥを前記抗体に共有結合させるリンカーを含むＥＧＦＲ特異的ＡＤＣを包含する。ある種の実施形態において、前記抗体は配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン及び配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含む重鎖可変領域と；配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン及び配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインとを含む軽鎖可変領域を含む。１実施形態において、前記抗体は配列番号９に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。更に別の実施形態において、本発明は配列番号１５に記載のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１３のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体又はその抗原結合部分を包含する。
【００３１】
更に他の実施形態において、本発明は本願に記載するＡＤＣを複数含むＡＤＣ混合物と医薬的に許容可能な担体とを含有する医薬組成物を包含する。ある種の実施形態において、前記ＡＤＣ混合物は平均薬物対抗体比（ＤＡＲ）が２〜４である。他の実施形態において、前記ＡＤＣ混合物は各々ＤＡＲが２〜８であるＡＤＣを含む。ある種の実施形態において、前記ＡＤＣ混合物は平均薬物対抗体比（ＤＡＲ）が約２．４〜約３．６である。
【００３２】
ある種の実施形態において、本発明は癌をもつ対象の治療方法として、前記癌をもつ対象を治療するように、本願に記載する医薬組成物を前記対象に投与することを含む方法を包含する。１実施形態において、前記癌は乳癌、肺癌、膠芽腫、前立腺癌、膵臓癌、結腸癌、頭頸部癌及び腎臓癌から構成される群から選択される。１実施形態において、前記癌は乳癌、肺癌、膠芽腫、前立腺癌、膵臓癌、結腸癌、大腸癌、頭頸部癌、中皮腫、腎臓癌、扁平上皮癌、トリプルネガティブ乳癌及び非小細胞肺癌から構成される群から選択される。１実施形態において、前記癌は乳癌である。１実施形態において、前記癌は肺癌である。１実施形態において、前記癌は前立腺癌である。１実施形態において、前記癌は膵臓癌である。１実施形態において、前記癌は結腸癌である。１実施形態において、前記癌は頭頸部癌である。１実施形態において、前記癌は腎臓癌である。１実施形態において、前記癌は大腸癌である。１実施形態において、前記癌は中皮腫である。１実施形態において、前記癌は扁平上皮癌である。１実施形態において、前記癌はトリプルネガティブ乳癌である。１実施形態において、前記癌は非小細胞肺癌である。ある種の実施形態において、前記扁平上皮癌は肺扁平上皮癌又は頭頸部扁平上皮癌である。
【００３３】
更に別の実施形態において、前記癌はＥＧＦＲの増幅を含み、又はＥＧＦＲを過剰発現する。ある種の実施形態において、前記癌はＥＧＦＲ過剰発現を特徴とする。ある種の実施形態において、前記癌はＥＧＦＲ増幅を特徴とする。
【００３４】
本発明は更に、ある種の実施形態において、固形腫瘍をもつ対象における固形腫瘍増殖の阻害又は抑制方法として、前記固形腫瘍増殖を阻害又は抑制するように、前記固形腫瘍をもつ対象に本願に記載する医薬組成物を投与することを含む方法を包含する。ある種の実施形態において、前記固形腫瘍はＥＧＦＲ過剰発現を特徴とする。ある種の実施形態において、前記固形腫瘍はＥＧＦＲ増幅を特徴とする。
【００３５】
本発明の１実施形態において、本発明は固形腫瘍をもつ対象における固形腫瘍増殖の阻害又は抑制方法として、前記固形腫瘍増殖を阻害又は抑制するように、前記固形腫瘍をもつ対象に有効量の本願に記載する抗体又はＡＤＣを投与することを含む方法を包含する。
【００３６】
ある種の実施形態において、前記固形腫瘍はＥＧＦＲを発現する固形腫瘍又はＥＧＦＲｖＩＩＩ陽性固形腫瘍である。他の実施形態において、前記固形腫瘍は、非小細胞肺癌又は膠芽腫である。他の実施形態において、前記固形腫瘍は、扁平上皮癌である。
【００３７】
本発明の１実施形態において、本発明は癌をもつ対象の治療方法として、抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合部分を少なくとも１個のアウリスタチンと結合させた有効量のＡＤＣを投与することを含む方法を提供し、前記抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合部分は、ＩｇＧアイソタイプであり、配列番号１２に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号１１に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン及び配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含む重鎖可変領域と、配列番号８に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号７に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン及び配列番号６に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含む軽鎖可変領域を含む。ある種の実施形態では、前記抗体又はその抗原結合部分をｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢＡ−ＭＭＡＥと連結している。
【００３８】
ある種の実施形態において、本発明は癌をもつ対象の治療方法として、本願に記載する医薬組成物を別の薬剤又は別の療法と併用投与することを含む方法を包含する。ある種の実施形態において、前記別の薬剤は、抗ＰＤ１抗体（例えばペンブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ（Ｒ））ないしニボルマブ）、抗ＣＴＬＡ−４抗体（例えばイピリムマブ）、イブルチニブ、ドゥベリシブ、イデラリシブ、ベネトクラックス及びテモゾロミドから構成される群から選択される。ある種の実施形態において、前記別の療法は、放射線である。ある種の実施形態において、前記別の薬剤は、抗ＰＤ１抗体（例えばペンブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ（Ｒ））ないしニボルマブ）である。ある種の実施形態において、前記別の薬剤は、抗ＣＴＬＡ−４抗体（例えばイピリムマブ）である。ある種の実施形態において、前記別の薬剤はイブルチニブである。ある種の実施形態において、前記別の薬剤はドゥベリシブである。ある種の実施形態において、前記別の薬剤はイデラリシブである。ある種の実施形態において、前記別の薬剤はベネトクラックスである。ある種の実施形態において、前記別の薬剤はテモゾロミドである。
【００３９】
本発明は更に、ある種の実施形態において、本願に記載するもの等の抗体又はその抗原結合部分をコードする単離核酸を提供する。更に、本発明は前記核酸を含むベクターと、前記ベクターを含む宿主細胞、例えば原核細胞又は真核細胞（例えば動物細胞、原生動物細胞、植物細胞及び真菌細胞）を包含する。本発明の実施形態において、前記動物細胞は哺乳動物細胞、昆虫細胞及び鳥類細胞から構成される群から選択される。１実施形態において、前記哺乳動物細胞はＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞及びＳｐ２／０細胞から構成される群から選択される。
【００４０】
ある種の実施形態において、本発明は抗ｈＥＧＦＲ抗体をアウリスタチンと結合させた抗ｈＥＧＦＲ抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）に関し、前記抗体は配列番号１２のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３ドメイン、配列番号１１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２ドメイン及び配列番号１０のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１ドメインと；配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３ドメイン、配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２ドメイン及び配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１ドメインとを含む。１実施形態において、前記抗体は配列番号９に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。更に別の実施形態において、前記抗体はＩｇＧ重鎖免疫グロブリン定常領域を含む。更に別の実施形態において、前記ＩｇＧは、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４重鎖免疫グロブリン定常領域である。
【００４１】
１実施形態において、本発明は前記アウリスタチンが、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）又はモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）である、ＡＤＣを包含する。１実施形態において、本発明は前記アウリスタチンが、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）であるＡＤＣを包含する。１実施形態において、本発明は前記アウリスタチンが、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）である、ＡＤＣを包含する。
【００４２】
別の実施形態において、本発明は配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１３のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【００４３】
本発明の更に別の実施形態において、前記抗ＥＧＦＲ抗体はマレイミドカプロイル、バリン−シトルリン、ｐ−アミノベンジルアルコール（ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢＡ）を含むリンカーを介して前記アウリスタチンと共有結合している。
【００４４】
１実施形態において、本発明は抗ＥＧＦＲと放射性標識物質（例えばインジウム）を含むＡＤＣを包含する。
【００４５】
１実施形態では、本願に記載する抗ＥＧＦＲ抗体を少なくとも１個のピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）と共有結合させる。ある種の実施形態では、図２１に示すように本願に開示する抗ＥＧＦＲ抗体をＰＢＤと連結する（即ちＳＧＤ−１８８２）。
【００４６】
所定の実施形態において、本発明は本願に記載するＡＤＣと医薬的に許容可能な担体とを含有する医薬組成物に関する。ある種の実施形態において、本発明は本願に記載するＡＤＣを含むＡＤＣ混合物を含有する医薬組成物に関し、前記ＡＤＣ混合物における平均薬物対抗体比（ＤＡＲ）の範囲は２〜４である。ある種の実施形態において、前記ＡＤＣ混合物における平均薬物対抗体比（ＤＡＲ）の範囲は２．４〜３．６である。
【００４７】
１実施形態において、本発明は抗ｈＥＧＦＲ抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を含むＡＤＣ混合物と医薬的に許容可能な担体とを含有する医薬組成物に関し、前記ＡＤＣ混合物は、平均薬物対抗体比（ＤＡＲ）が２〜４であり、前記ＡＤＣは配列番号１２のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３ドメイン、配列番号１１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２ドメイン及び配列番号１０のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１ドメインと、配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３ドメイン、配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２ドメイン及び配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１ドメインとを含む、抗ｈＥＧＦＲ抗体にモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）を結合させたものである。
【００４８】
１実施形態において、前記抗体の重鎖可変領域は配列番号９に記載のアミノ酸配列を含み、前記抗ＥＧＦＲ抗体の軽鎖可変領域は配列番号５に記載のアミノ酸配列を含む。
【００４９】
本発明の他の実施形態において、前記抗体はＩｇＧ重鎖免疫グロブリン定常領域を含む。その他の実施形態において、本発明はＩｇＧ１又はＩｇＧ４重鎖免疫グロブリン定常領域を含む抗体を包含する。１実施形態において、本発明はＩｇＧ１アイソタイプである抗体を包含する。
【００５０】
更に別の実施形態において、本発明は配列番号１５に記載のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１３のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体を包含する。１実施形態において、本発明はマレイミドカプロイル、ｖａｌ−ｃｉｔ、ＰＡＢＡリンカーによりＭＭＡＥを前記抗体と結合させる。
【００５１】
本発明の１実施形態において、本発明は癌をもつ対象の治療方法として、前記癌をもつ対象を治療するように、本願に記載する抗体又はＡＤＣを含有する医薬組成物を前記対象に投与することを含む方法を提供する。１実施形態において、前記癌は乳癌、肺癌、膠芽腫、前立腺癌、膵臓癌、結腸癌、頭頸部癌及び腎臓癌から構成される群から選択される。１実施形態において、前記癌は乳癌、肺癌、膠芽腫、前立腺癌、膵臓癌、結腸癌、大腸癌、頭頸部癌、中皮腫、腎臓癌、扁平上皮癌、トリプルネガティブ乳癌及び非小細胞肺癌から構成される群から選択される。更に別の実施形態において、前記癌はＥＧＦＲの増幅を含み、又はＥＧＦＲを過剰発現する。１実施形態において、前記扁平上皮癌は肺扁平上皮癌又は頭頸部扁平上皮癌である。１実施形態において、前記癌はＥＧＦＲを過剰発現する癌である。１実施形態において、前記癌はＥＧＦＲ増幅を特徴とする。１実施形態において、前記癌は乳癌である。１実施形態において、前記癌は肺癌である。１実施形態において、前記癌は前立腺癌である。１実施形態において、前記癌は膵臓癌である。１実施形態において、前記癌は結腸癌である。１実施形態において、前記癌は頭頸部癌である。１実施形態において、前記癌は腎臓癌である。１実施形態において、前記癌は大腸癌である。１実施形態において、前記癌は中皮腫である。１実施形態において、前記癌は扁平上皮癌である。１実施形態において、前記癌はトリプルネガティブ乳癌である。１実施形態において、前記癌は非小細胞肺癌である。ある種の実施形態において、前記扁平上皮癌は肺扁平上皮癌又は頭頸部扁平上皮癌である。
【００５２】
また、ある種の実施形態において、本発明は固形腫瘍をもつ対象における固形腫瘍増殖の阻害又は抑制方法を提供し、前記方法は前記固形腫瘍増殖を阻害又は抑制するように、前記固形腫瘍をもつ対象に本願に記載する医薬組成物を投与することを含む。１実施形態において、前記固形腫瘍は、非小細胞肺癌又は膠芽腫である。更に別の実施形態において、前記固形腫瘍はＥＧＦＲｖＩＩＩ陽性腫瘍又はＥＧＦＲを発現する固形腫瘍である。更に別の実施形態において、前記固形腫瘍はＥＧＦＲを過剰発現する固形腫瘍である。更に別の実施形態において、前記固形腫瘍はＥＧＦＲが増幅している腫瘍である。１実施形態において、前記固形腫瘍はＥＧＦＲが増幅している非小細胞肺癌である。１実施形態において、前記固形腫瘍はＥＧＦＲが過剰発現している非小細胞肺癌である。１実施形態において、前記固形腫瘍はＥＧＦＲが増幅している膠芽腫である。１実施形態において、前記固形腫瘍はＥＧＦＲが過剰発現している膠芽腫である。
【００５３】
ある種の実施形態において、本発明は投与を必要とする対象（例えば癌又は固形腫瘍をもつ対象）に本願に記載する医薬組成物を投与する併用療法を提供する。別の薬剤又は別の療法の投与と同時、投与前又は投与後に本願に記載する医薬組成物を投与することができる。ある種の実施形態において、前記別の薬剤は、抗ＰＤ１抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、テモゾロミド、ｂｃｌ−ｘｌ阻害剤及びニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＭＰＴ）阻害剤から構成される群から選択される。更に他の実施形態において、前記別の薬剤は、化学療法剤である。ある種の実施形態において、前記別の療法は、放射線である。他の実施形態において、前記別の薬剤はイブルチニブ（Ｉｍｂｒｕｖｉｃａ（Ｒ），Ｐｈａｒｍａｃｙｃｌｉｃｓ）である。他の実施形態において、前記別の薬剤はドゥベリシブである。他の実施形態において、前記別の薬剤はイデラリシブ（Ｚｙｄｅｌｉｇ（Ｒ），Ｇｉｌｅａｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）である。他の実施形態において、前記別の薬剤はベネトクラックス（ＡＢＴ−１９９／ＧＤＣ−０１９９，ＡｂｂＶｉｅ，Ｉｎｃ．）である。ある種の実施形態において、前記別の薬剤は、抗ＰＤ１抗体（例えばペンブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ（Ｒ））ないしニボルマブ）である。ある種の実施形態において、前記別の薬剤は抗ＣＴＬＡ−４抗体（例えばイピリムマブ）である。ある種の実施形態において、前記別の薬剤はテモゾロミドである。
【００５４】
ある種の実施形態において、本発明は本願に記載する抗体の抗原結合領域（例えばＣＤＲ）又は本願に記載するｓｃＦｖを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に関する。ある種の実施形態において、本発明は、配列番号４０に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号３９に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン及び配列番号３８に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含む重鎖可変領域と；配列番号３７に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号３６に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン及び配列番号３５に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインとを含む重鎖可変領域を含むＣＡＲに関する。
【００５５】
ある種の実施形態において、本発明は配列番号１２に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号１１に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン及び配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含む重鎖可変領域と；配列番号８に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号７に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン及び配列番号６に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含む重鎖可変領域を含むＣＡＲに関する。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】Ａｂ１（配列番号１及び５）及びＡｂＡ（配列番号９及び５）の重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列を示す。ＶＨ領域及びＶＬ領域内のＣＤＲ配列を四角で囲み、Ａｂ１  ＶＨ配列とＡｂＡ  ＶＨ配列の不一致部分を影付きで示す。
【図２】Ａｂ１（配列番号１３及び１４）及びＡｂＡ（配列番号１３及び１５）の全長軽鎖及び重鎖を示す。重鎖におけるＡｂ１配列とＡｂＡ配列の不一致部分を影付きで示す。
【図３】複数のＡｂ１変異体抗体をＡｂ１及びＡｂ２と比較したＢｉａｃｏｒｅ結合アッセイ親和性測定値をまとめた表である。ＥＧＦＲ（１−５２５）とＥＧＦＲｖＩＩＩを結合解析に使用した。図３に示すｋａ（Ｍ−１ｓ−１）は抗体が抗原と会合して抗体／抗原複合体を形成する際の速度定数を意味し、ｋｄ（ｓ−１）は抗体が抗体／抗原複合体から解離する際の解離速度定数を意味し、Ｋｄ（Ｍ）は平衡解離定数を意味する。
【図４】ＦＡＣＳ解析の結果をまとめたグラフであり、ＡｂＡはＡ４３１腫瘍細胞（ヒト扁平上皮癌細胞）との結合がＡｂ１よりも改善されたが、Ａｂ２と比較すると結合親和性が低いことが明らかである。
【図５】ＦＡＣＳ競合アッセイの結果を示し、Ａｂ１変異体抗体はＡｂ１と同一のＥＧＦＲエピトープを認識することが分かる。
【図６】Ａｂ１及びＡｂ１変異体抗体とＥＧＦＲ（１−５２５）の結合の結果をまとめたものである。黒丸はＡｂ１又はＡｂ２（対照）を表し、黒丸はＡｂ１変異体抗体を表す。円はグループ１及びグループ２を表し、図７にデータをまとめる。
【図７】種々の細胞株でＡｂ１及びＡｂ１変異体抗体の活性をインビトロ試験したウェスタンブロット分析の結果を示す。ＳＣＣ−１５からの細胞（図７Ａ）とＨ２９２細胞を実施例４に記載するような条件に暴露し、抗ホスホチロシンＥＧＦＲ（ｐＹ  ＥＧＦＲ）、抗ＥＧＦＲ（ｔｏｔ  ＥＧＦＲ（全長ＥＧＦＲ））及び抗アクチン（アクチン）抗体を使用してウェスタンブロット分析により分析した。図７ＡはＡｂ１、Ａｂ２及びＡｂ１変異体抗体がＳＣＣ−１５細胞においてＥＧＦＲのＥＧＦ介在性チロシンリン酸化を阻害する能力を表す結果を示す。図７ＢはＡｂ１、Ａｂ２及びＡｂ１変異体抗体がＨ２９２細胞においてＥＧＦＲのＥＧＦ介在性チロシンリン酸化を阻害する能力を表す結果を示す。
【図８】Ａｂ１、Ａｂ２及びＡｂ１変異体を使用したｐＥＧＦＲ  ＥＬＩＳＡアッセイの結果（図８Ａ）と、Ａ４３１阻害試験でＡｂ２及びＡｂＰと比較したＡｂ１の阻害レベル（図８Ｂ）をグラフにより示す。図８ＡのＹ軸は４５０ｎｍにおける光学密度（ＯＤ）である。
【図９】ＦＡＣＳ結合アッセイを使用して野生型ＥＧＦＲを発現する正常ヒト上皮角化細胞とＡｂ１、Ａｂ２及びＡｂ１変異体抗体の結合を試験した結果をグラフにより示す。
【図１０】ＡｂＡ、ＡｂＧ、ＡｂＫ、ＡｂＭ及びＡｂＰがヒトＮＳＣＬＣ癌異種移植片において腫瘍増幅を阻害する能力をＡｂ１、Ａｂ２及びヒトＩｇＧ（ｈｕＩｇＧ）対照と比較したマウス異種移植片阻害アッセイの結果をグラフにより示す。矢印は各種抗体の投与時点を示す。
【図１１】ＡｂＡ−マレイミドカプロイル−ｖｃ−ＰＡＢＡ−ＭＭＡＥ  ＡＤＣ（本願では「ＡｂＡ−ｖｃＭＭＡＥ」と称する。）の構造を示す。
【図１２】ＡｂＡ−ｖｃＭＭＡＥの精製の疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）分析の結果を示す。
【図１３】ＡｂＡ−ｖｃＭＭＡＥのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）分析の結果を示す。
【図１４】抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣを使用した２種類のマウス異種移植片阻害アッセイの結果をグラフにより示す。図１４ＡはヒトＮＳＣＬＣ癌異種移植片に由来するＮＣＩ−Ｈ１７０３細胞における腫瘍増幅の阻害を比較したマウス異種移植片阻害アッセイの結果を示し、ＡｂＡ−ｖｃＭＭＡＥの阻害がＡｂ１及びＡｂ１−ｍｃＭＭＡＦ  ＡＤＣと比較して増加していることが明らかである。図１４ＢはヒトＮＳＣＬＣ癌異種移植片に由来するＥＢＣ−１細胞における腫瘍増幅の阻害を比較したマウス異種移植片阻害アッセイの結果を示し、ＡｂＡ−ｖｃＭＭＡＥの阻害がＡｂ１及びＡｂ１−ｍｃＭＭＡＦ  ＡＤＣと比較して増加していることが明らかである。矢印は抗体の投与時点を示す。
【図１５】抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣを使用したマウス異種移植片阻害アッセイの結果をグラフにより示す。図１５ＡはＮＣＩ−Ｈ２９２細胞における腫瘍増殖の阻害を比較したマウス異種移植片阻害アッセイの結果を示し、精製ＡｂＡ−ｖｃＭＭＡＥ（ＡｂＡ−ｖｃＭＭＡＥｐ）及びＡｂＡ−ｖｃＭＭＡＥによる阻害が精製Ａｂ１−ｖｃＭＭＡＥ（Ａｂ１−ｖｃＭＭＡＥｐ）、Ａｂ１−ｖｃＭＭＡＥ、精製Ａｂ１−ｍｃＭＭＡＦ  ＡＤＣ（Ａｂ１−ｍｃＭＭＡＦｐ）及びＡｂ１−ｍｃＭＭＡＦ（３種類の対照と比較）と比較して増加していることが明らかである。図１５ＢはＮＣＩ−Ｈ２９２細胞における腫瘍増殖の阻害を比較したマウス異種移植片阻害アッセイの結果を示し、ＡｂＡ−ｖｃＭＭＡＥの阻害活性が精製ＡｂＡ−ｖｃＭＭＡＥ（ＡｂＡ−ｖｃＭＭＡＥｐ）と比較して増加し、ＡｂＡ−ｖｃＭＭＡＥの阻害活性が精製Ａｂ１−ｖｃＭＭＡＥ（Ａｂ１−ｖｃＭＭＡＥｐ）、Ａｂ１−ｖｃＭＭＡＥ、Ａｂ１−ｍｃＭＭＡＦ及びＡｂ１−ｍｃＭＭＡＦｐと比較して増加していることが明らかである。図１５Ａ及びＢの分子の投与量は括弧内に示す（即ち３ｍｇ／ｋｇ又は６ｍｇ／ｋｇ）。矢印は抗体又はＡＤＣの投与時点を示す。図１５の対照２はＥＧＦＲと結合しない抗破傷風毒素抗体である陰性対照を表す。
【図１６】Ａｂ１変異体重鎖可変領域（ＶＨ）ライブラリーデザイン（図１６Ａ）及びＡｂ１変異体軽鎖可変領域（ＶＬ）ライブラリーデザイン（図１６Ｂ）のアミノ酸配列を示す。
【図１７】ＥＧＦＲの模式図であり、Ａｂ１及びＡｂ２が結合する領域を示す。
【図１８】抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣを使用した（ＮＣＩ−Ｈ２９２（ＮＳＣＬＣ）細胞による）マウス異種移植片阻害アッセイの結果をグラフにより示す。分子の投与量を括弧内に示す（即ち３ｍｇ／ｋｇ又は６ｍｇ／ｋｇ）。矢印は抗体又はＡＤＣの投与時点を示す。
【図１９】抗ＥＧＦＲ  ＭＭＡＥ及びＭＭＡＦ  ＡＤＣを使用したマウス膠芽腫異種移植片阻害アッセイの結果をグラフにより示す。図１９の分子の投与量を括弧内に示す（即ち１ｍｇ／ｋｇ）。矢印は抗体又はＡＤＣの投与時点を示す。図１９の対照２はＥＧＦＲと結合しない抗破傷風毒素抗体である陰性対照を表す。
【図２０】図２０Ａ及びＢは１１１Ｉｎで標識したＡｂＡ、Ａｂ１又は対照抗体を使用して２種類の腫瘍モデル（夫々ＳＷ４８（図２０Ａ）及びＥＢＣ１（図２０Ｂ）腫瘍モデル）でＥＧＦＲを発現する腫瘍による抗体取込み効率を比較した単一光子放射断層撮影（ＳＰＥＣＴ）画像アッセイの結果をグラフにより示す。
【図２１】マレイミドカプロイル−バリン−アラニンリンカーを介して抗体（Ａｂ）と結合させたＰＢＤ二量体（ＳＧＤ−１８８２）（全体をＳＧＤ−１９１０と称する。）の構造を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５７】
本発明の各種態様は抗ＥＧＦＲ抗体及び抗体フラグメント、抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣ、並びにその医薬組成物、更にこのような抗体及びフラグメントを作製するための核酸、組換え発現ベクター及び宿主細胞に関する。ヒトＥＧＦＲを検出するため、ヒトＥＧＦＲ活性を（インビトロ又はインビボで）阻害するため、更に上皮癌、乳癌、大腸癌、頭頸部癌（例えば膠芽腫）、肺癌、腎臓癌、膵臓癌、中皮腫、扁平上皮癌（例えば肺扁平上皮癌又は頭頸部扁平上皮癌）、トリプルネガティブ乳癌、非小細胞肺癌及び前立腺癌等の癌を治療するために本願に記載する抗体又はＡＤＣを使用する方法も本発明の対象とする。
【００５８】
Ｉ．定義
本発明を理解し易くするために、先ず所定の用語を定義する。更に、当然のことながら、パラメータの数値又は数値範囲を記載する場合には、記載する数値の中間の数値及び範囲も本発明に含むものとする。
【００５９】
「抗上皮成長因子（ＥＧＦ）受容体抗体」又は「抗ＥＧＦＲ抗体」なる用語は本願では同義に使用し、ＥＧＦＲと特異的に結合する抗体を意味する。着目抗原（即ちＥＧＦＲ）と「結合する」抗体とは、前記抗原を発現する細胞を標的とするのに有用となるような十分な親和性で前記抗原と結合することができる抗体である。好ましい実施形態において、前記抗体はヒトＥＧＦＲ（ｈＥＧＦＲ）と特異的に結合する。抗ＥＧＦＲ抗体の例は下記実施例１に開示する。特に指定しない限り、「抗ＥＧＦＲ抗体」なる用語は野生型ＥＧＦＲ又はＥＧＦＲの任意変異体（例えばＥＧＦＲｖＩＩＩ）と結合する抗体を意味するものとする。
【００６０】
野生型ヒトＥＧＦＲのアミノ酸配列を配列番号３２として以下に示し、同配列中、シグナルペプチド（アミノ酸残基１−２４）は下線で示し、細胞外領域のアミノ酸残基（ＥＣＤ，アミノ酸残基２５−６４５）は太字で強調する。ＥＧＦＲの短縮型野生型ＥＣＤ（本願ではＥＧＦＲ（１−５２５）とも言う。）は配列番号４７に対応し、配列番号３２のアミノ酸と等価である。野生型ＥＧＦＲの成熟型はこのタンパク質からシグナルペプチドを除いたもの、即ち配列番号３２のアミノ酸残基２５〜１２１０に対応する。
【００６１】
【化１】
2020039360.tif 000003
【００６２】
シグナル配列（下線部）を含めたヒトＥＧＦＲのＥＣＤのアミノ酸配列を配列番号３４として以下に示す。
【００６３】
【化２】
2020039360.tif 000004
【００６４】
ＥＧＦＲの全体構造を図１７に示す。ＥＧＦＲのＥＣＤは４領域からなる（Ｃｏｃｈｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２８７，１４７−１５８）。領域Ｉ及びＩＩＩはリガンドの高親和性結合部位の形成に寄与することが示唆されている。領域ＩＩ及びＩＶはシステインリッチなラミニン様領域であり、タンパク質折畳みを安定化させ、予想されるＥＧＦＲ二量化界面を含む。
【００６５】
ＥＧＦＲ遺伝子増幅を伴う遺伝子再構成の結果としてＥＧＦＲ変異体が生じると思われる。
【００６６】
ヒト癌に最も一般的に存在するＥＧＦＲの変異体はＥＧＦＲｖＩＩＩである（Ｋｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｎｄｏｃｒ  Ｒｅｌａｔ  Ｃａｎｃｅｒ．８（２）：８３−９６（２００１））。遺伝子増幅過程でＥＧＦＲの細胞外領域に２６７アミノ酸の欠失が生じ、融合接合部にグリシン残基が挿入される。従って、ＥＧＦＲｖＩＩＩは野生型ＥＧＦＲの細胞外領域のアミノ酸６〜２７３を欠失し、接合部にグリシン残基が挿入されている。ＥＧＦＲのＥＧＦＲｖＩＩＩ変異体は細胞外領域の２６７アミノ酸残基を欠失し、欠失接合部にグリシンが挿入されている。ＥＧＦＲｖＩＩＩアミノ酸配列を配列番号３３として以下に示す（ＥＣＤは太字で強調し、配列番号４６に対応し、シグナル配列は下線で示す。）。
【００６７】
【化３】
2020039360.tif 000005
【００６８】
ＥＧＦＲｖＩＩＩは構成的シグナル伝達によりリガンド非依存的に腫瘍進行に寄与する。ＥＧＦＲｖＩＩＩは正常組織で発現されることは知られていない（Ｗｉｋｓｔｒａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５５（１４）：３１４０−３１４８（１９９５）；Ｏｌａｐａｄｅ−Ｏｌａｏｐａ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．８２（１）：１８６−９４（２０００））が、乳癌、神経膠腫、ＮＳＣＬ癌、卵巣癌及び前立腺癌を含む腫瘍細胞で顕著な発現を示す（Ｗｉｋｓｔｒａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５５（１４）：３１４０−３１４８（１９９５）；Ｇｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．９８（３）：３５７−６１（２００２）；Ｗｉｋｓｔｒａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５５（１４）：３１４０−３１４８（１９９５）；Ｍｏｓｃａｔｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５（２３）：５５３６−９（１９９５）；Ｇａｒｃｉａ  ｄｅ  Ｐａｌａｚｚｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３（１４）：３２１７−２０（１９９３）；Ｍｏｓｃａｔｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５（２３）：５５３６−９（１９９５）；及びＯｌａｐａｄｅ−Ｏｌａｏｐａ  ｅｔ  ａｌ．２（１）：１８６−９４（２０００））。
【００６９】
本願で使用する「ＥＧＦＲの生物活性」とはＥＧＦＲの全ての固有の生物学的性質を意味し、限定されないが、上皮成長因子（ＥＧＦ）との結合、腫瘍増殖因子α（ＴＧＦα）との結合、ホモ二量化、ＪＡＫ２キナーゼ活性の活性化、ＭＡＰＫキナーゼ活性の活性化、及び膜貫通型受容体タンパク質チロシンキナーゼ活性の活性化が挙げられる。
【００７０】
抗体又はＡＤＣと第２の化学種の相互作用に関して本願で使用する「特異的結合」又は「特異的に結合する」なる用語はこの相互作用が前記化学種上の特定の構造（例えば抗原決定基又はエピトープ）の存在に依存することを意味し、例えば、抗体はタンパク質一般を認識するのではなく、特定のタンパク質構造を認識してこれと結合する。抗体又はＡＤＣがエピトープ「Ａ」に特異的である場合、標識した「Ａ」と前記抗体を含有する反応混合物中にエピトープＡ（又は遊離した未標識のＡ）を含む分子が存在するならば、標識したＡが前記抗体又はＡＤＣと結合する量は減少する。
【００７１】
本願で使用する「ｈＥＧＦＲと特異的に結合する」又は「ｈＥＧＦＲとの特異的結合」なる表現は抗ＥＧＦＲ抗体又はＡＤＣがＡｂ１又はＡｂ１  ＡＤＣと比較して同等以上の親和性でｈＥＧＦＲと相互作用できることを意味する。
【００７２】
本願で使用する「ＥＧＦＲ（１−５２５）との特異的結合」又は「ＥＧＦＲ（１−５２５）と特異的に結合する」なる用語はＥＧＦＲ（１−５２５）と結合し、表面プラズモン共鳴法により測定した場合の解離定数（ＫＤ）が２．３×１０−６Ｍ以下である抗体又はＡＤＣを意味する。
【００７３】
「抗体」なる用語は、一般に２本の重（Ｈ）鎖と２本の軽（Ｌ）鎖の４本のポリペプチド鎖から構成される免疫グロブリン（Ｉｇ）分子、又はＩｇ分子の本質的な標的結合特徴を保持するその任意の機能的フラグメント、突然変異体、変異体もしくは誘導体を広義に意味する。このような突然変異体、変異体又は誘導体抗体フォーマットは当分野で公知である。その非限定的な実施形態について以下に説明する。
【００７４】
全長抗体において、各重鎖は重鎖可変領域（本願ではＨＣＶＲ又はＶＨと略称する。）と重鎖定常領域から構成される。重鎖定常領域はＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３の３個のドメインから構成される。各軽鎖は軽鎖可変領域（本願ではＬＣＶＲ又はＶＬと略称する。）と軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は１個のドメインＣＬから構成される。ＶＨ及びＶＬ領域は更に相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域とその間に配置されたフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる保存度の高い領域に区分することができる。各ＶＨ及びＶＬはアミノ末端からカルボキシ末端に向かってＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順に配置された３個のＣＤＲと４個のＦＲから構成される。免疫グロブリン分子は任意タイプ（例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）及びクラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）又はサブクラスとすることができる。
【００７５】
本願で使用する抗体の「抗原結合部分」（又は単に「抗体部分」）なる用語は抗原（例えばｈＩＬ−１３）と特異的に結合する能力を保持する抗体の１個以上のフラグメントを意味する。全長抗体のフラグメントにより抗体の抗原結合機能を実施できることが示されている。このような抗体の実施形態は２種以上の異なる抗原と特異的に結合する二重特異性、デュアル特異性又は多重特異性フォーマットでもよい。抗体の「抗原結合部分」なる用語に含まれる結合フラグメントの例としては、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインから構成される１価フラグメントであるＦａｂフラグメント；（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド橋により連結された２個のＦａｂフラグメントからなる２価フラグメントであるＦ（ａｂ’）２フラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨドメインとＣＨ１ドメインから構成されるＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体のシングルアームのＶＬドメインとＶＨドメインから構成されるＦｖフラグメント；（ｖ）単一可変ドメインから構成されるｄＡｂフラグメント（本願に援用するＷａｒｄ  ｅｔ  ａｌ，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６，Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＣＴ公開ＷＯ９０／０５１４４Ａ１）；並びに（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。更に、ＦｖフラグメントのＶＬ及びＶＨの２つのドメインは別々の遺伝子によりコードされるが、組換え法を使用して合成リンカーにより結合し、ＶＬ領域とＶＨ領域が対合して１価分子を形成する１本のタンパク鎖として作製することができる（１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）と言う；例えばＢｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；及びＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３参照。）。このような１本鎖抗体も抗体の「抗原結合部分」なる用語に含むものとする。本発明のある種の実施形態では、ｓｃＦｖ分子を融合タンパク質に組込んでもよい。ダイアボディ等の他の形態の１本鎖抗体も含む。ダイアボディはＶＨドメインとＶＬドメインが１本のポリペプチド鎖上で発現される２価の二重特異性抗体であるが、非常に短いリンカーを使用するため、同一鎖上の２つのドメイン間で対合することができず、これらのドメインは別の鎖の相補性ドメインと対合し、２つの抗原結合部位を形成する（例えばＨｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８；Ｐｏｌｊａｋ，Ｒ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１−１１２３参照。）。このような抗体結合部分は当分野で公知である（Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｄｕｂｅｌ  ｅｄｓ．，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（２００１）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．７９０  ｐｐ．（ＩＳＢＮ  ３−５４０−４１３５４−５）。
【００７６】
本願で使用する「抗体コンストラクト」なる用語はリンカーポリペプチド又は免疫グロブリン定常領域に連結された１個以上の本発明の抗原結合部分を含むポリペプチドを意味する。リンカーポリペプチドはペプチド結合により結合した２個以上のアミノ酸残基を含み、１個以上の抗原結合部分と連結するために使用される。このようなリンカーポリペプチドは当分野で周知である（例えばＨｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８；Ｐｏｌｊａｋ，Ｒ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１−１１２３参照。）。免疫グロブリン定常領域とは重鎖又は軽鎖定常領域を意味する。ヒトＩｇＧ重鎖及び軽鎖定常領域アミノ酸配列の例は当分野で公知であり、以下の通りである。
【００７７】
【表１】
2020039360.tif 000006
【００７８】
更に、抗体又はその抗原結合部分は、前記抗体又はその抗原結合部分と１個以上の他のタンパク質又はペプチドの共有的又は非共有的結合により形成されるより大きな免疫接着分子の一部でもよい。このような免疫接着分子の例としてはストレプトアビジンコア領域を使用して形成される四量体ｓｃＦｖ分子（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ６：９３−１０１）や、システイン残基、マーカーペプチド及びＣ末端ポリヒスチジンタグを使用して形成される２価ビオチン化ｓｃＦｖ分子（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：１０４７−１０５８）が挙げられる。Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２フラグメント等の抗体部分は夫々全長抗体のパパイン又はペプシン消化等の慣用技術を使用して全長抗体から作製することができる。更に、抗体、抗体部分及び免疫接着分子は本願に記載するような標準組換えＤＮＡ技術を使用して取得することができる。
【００７９】
本願で使用する「単離抗体」とは異なる抗原特異性をもつ他の抗体を実質的に含まない抗体を意味する（例えばＥＧＦＲと特異的に結合する単離抗体はＥＧＦＲ以外の抗原と特異的に結合する抗体を実質的に含まない。）。しかし、ＥＧＦＲと特異的に結合する単離抗体は他の抗原（例えば他の種に由来するＥＧＦＲ分子）と交差反応性をもつ場合がある。更に、単離抗体は他の細胞材料及び／又は化学物質を実質的に含まない場合がある。
【００８０】
「ヒト化抗体」なる用語は非ヒト種（例えばマウス）に由来する重鎖及び軽鎖可変領域配列を含むが、ＶＨ及び／又はＶＬ配列の少なくとも一部が「ヒト様」の程度を増すように、即ちヒト生殖細胞系列可変配列との類似性を増すように改変された抗体を意味する。特に、「ヒト化抗体」なる用語は着目抗原と免疫特異的に結合し、実質的にヒト抗体のアミノ酸配列をもつフレームワーク（ＦＲ）領域と、実質的に非ヒト抗体のアミノ酸配列をもつ相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む抗体又はその変異体、誘導体、アナログもしくはフラグメントである。ＣＤＲに関連して本願で使用する「実質的に」なる用語は非ヒト抗体ＣＤＲのアミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％一致するアミノ酸配列をもつＣＤＲを意味する。ヒト化抗体はＣＤＲ領域の全部又は実質的に全部が非ヒト免疫グロブリン（即ちドナー抗体）のＣＤＲ領域に対応し、フレームワーク領域の全部又は実質的に全部がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のフレームワーク領域である少なくとも１個、典型的には２個の可変ドメイン（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＦａｂＣ、Ｆｖ）の実質的に全部を含む。好ましくは、ヒト化抗体は更に免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含む。所定の実施形態において、ヒト化抗体は軽鎖と重鎖の少なくとも可変領域を含む。抗体は更に重鎖のＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４領域を含んでいてもよい。所定の実施形態において、ヒト化抗体はヒト化軽鎖のみを含む。他の実施形態において、ヒト化抗体はヒト化重鎖のみを含む。特定の実施形態において、ヒト化抗体は軽鎖のヒト化可変領域及び／又はヒト化重鎖のみを含む。
【００８１】
ヒト化抗体はＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＥを含む任意クラスの免疫グロブリンと、限定されないが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含む任意アイソタイプから選択することができる。ヒト化抗体は２種以上のクラス又はアイソタイプに由来する配列を含むことができ、当分野で周知の技術を使用して所望のエフェクター機能を最適化するように特定の定常領域を選択することができる。
【００８２】
「Ｋａｂａｔナンバリング」、「Ｋａｂａｔ定義」及び「Ｋａｂａｔラベリング」なる用語を本願では同義に使用する。これらの用語は当分野で認知されており、抗体又はその抗原結合部分の重鎖及び軽鎖可変領域において他のアミノ酸残基よりも可変度の高い（即ち超可変性の）アミノ酸残基のナンバリングシステムを意味する（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９７１）Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．１９０：３８２−３９１及びＫａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２）。重鎖可変領域では、超可変領域はＣＤＲ１のアミノ酸３１〜３５位、ＣＤＲ２のアミノ酸５０〜６５位、及びＣＤＲ３のアミノ酸９５〜１０２位に位置する。軽鎖可変領域では、超可変領域はＣＤＲ１のアミノ酸２４〜３４位、ＣＤＲ２のアミノ酸５０〜５６位、及びＣＤＲ３のアミノ酸８９〜９７位に位置する。
【００８３】
本願で使用する「ＣＤＲ」なる用語は抗体可変領域配列内の相補性決定領域を意味する。重鎖（ＨＣ）と軽鎖（ＬＣ）の可変領域の各々に３個ずつＣＤＲが存在し、可変領域の各々でＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３（又は特定的にＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２、ＨＣ  ＣＤＲ３、ＬＣ  ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２及びＬＣ  ＣＤＲ３）と呼称される。本願で使用する「ＣＤＲセット」なる用語は抗原と結合することが可能な単一の可変領域に存在する３個１組のＣＤＲを意味する。これらのＣＤＲの厳密な境界は種々のシステムにより種々に定義されている。Ｋａｂａｔにより記載されているシステム（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９８７）及び（１９９１））は抗体の任意可変領域に適用可能な明確な残基ナンバリングシステムを規定するのみならず、３個のＣＤＲを定義する厳密な残基境界を規定する。これらのＣＤＲをＫａｂａｔ  ＣＤＲと言う場合がある。Ｃｈｏｔｈｉａら（Ｃｈｏｔｈｉａ  ＆  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）及びＣｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７７−８８３（１９８９））はＫａｂａｔ  ＣＤＲ内の所定のサブ部分がアミノ酸配列レベルでは多様性に富んでいるにも拘わらず、ほぼ同一のペプチド主鎖構造をとることを見いだした。これらのサブ部分はＬ１、Ｌ２及びＬ３又はＨ１、Ｈ２及びＨ３と呼ばれ、ここで「Ｌ」及び「Ｈ」は夫々軽鎖領域と重鎖領域を表す。これらの領域をＣｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲと呼ぶ場合があり、その境界はＫａｂａｔ  ＣＤＲとオーバーラップする。Ｋａｂａｔ  ＣＤＲとオーバーラップするＣＤＲを定義する他の境界はＰａｄｌａｎ（ＦＡＳＥＢ  Ｊ．９：１３３−１３９（１９９５））とＭａｃＣａｌｌｕｍ（Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２６２（５）：７３２−４５（１９９６））により記載されている。上記システムの１種に厳密には従わないとしても、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲとオーバーラップする更に他のＣＤＲ境界定義もあり、特定残基もしくは残基群又はＣＤＲ全体が抗原結合に有意に影響を与えないという予想又は実験結果に基づいて短くしたものや長くしたものがある。本願で使用する方法はこれらのシステムのいずれに従って定義されたＣＤＲも使用することができるが、好ましい実施形態はＫａｂａｔ又はＣｈｏｔｈｉａの定義によるＣＤＲを使用する。
【００８４】
本願で使用する「フレームワーク」又は「フレームワーク配列」なる用語は可変領域からＣＤＲを除いた残りの配列を意味する。ＣＤＲ配列の厳密な定義は種々のシステムにより決定することができるので、フレームワーク配列の意味は相応に種々に解釈される。６個のＣＤＲ（軽鎖のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２及びＣＤＲ−Ｌ３と重鎖のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２及びＣＤＲ−Ｈ３）は軽鎖及び重鎖のフレームワーク領域を更に各鎖で４個のサブ領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４）に分割し、ＣＤＲ１はＦＲ１とＦＲ２の間、ＣＤＲ２はＦＲ２とＦＲ３の間、ＣＤＲ３はＦＲ３とＦＲ４の間に位置する。個々のサブ領域をＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３又はＦＲ４と特定せずに、単にフレームワーク領域と言う場合もあるが、その場合には、１本の天然型免疫グロブリン鎖の可変領域内のＦＲ全体を意味する。本願で使用するＦＲとは４個のサブ領域の１個を意味し、ＦＲｓとはフレームワーク領域を構成する４個のサブ領域の２個以上を意味する。
【００８５】
ヒト化抗体のフレームワーク領域とＣＤＲ領域は親配列に厳密に対応する必要はなく、例えばその部位のＣＤＲ又はフレームワーク残基がドナー抗体又はコンセンサスフレームワークのいずれにも対応しないように少なくとも１個のアミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失によりドナー抗体ＣＤＲ又はコンセンサスフレームワークに突然変異を誘発してもよい。しかし、好ましい１実施形態において、このような突然変異は広範囲にならない。通常では、ヒト化抗体残基の少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％が親ＦＲ及びＣＤＲ配列に対応する。本願で使用する「コンセンサスフレームワーク」なる用語はコンセンサス免疫グロブリン配列中のフレームワーク領域を意味する。本願で使用する「コンセンサス免疫グロブリン配列」なる用語は近縁免疫グロブリン配列のファミリーに最高頻度で存在するアミノ酸（又はヌクレオチド）から形成される配列を意味する（例えばＷｉｎｎａｋｅｒ，Ｆｒｏｍ  Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  Ｃｌｏｎｅｓ（Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ  １９８７参照。）。免疫グロブリンファミリーにおいて、コンセンサス配列の各位置はこのファミリーでこの位置に最高頻度で存在するアミノ酸により占められる。２種類のアミノ酸が同等の高頻度で存在する場合には、どちらをコンセンサス配列に加えてもよい。
【００８６】
ペプチド又はポリペプチド配列に関する「アミノ酸配列一致度百分率（％）」は特定ペプチド又はポリペプチド配列と候補配列を整列させ、保存置換を配列一致度の一部として考慮せずに必要に応じて最大の配列一致度百分率に達するようにギャップを導入した後にこのペプチド又はポリペプチド配列中のアミノ酸残基と一致する候補配列中のアミノ酸残基の百分率として定義される。アミノ酸配列一致度を決定する目的での整列は例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア等の公共入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して当業者に公知の各種方法により実施することができる。当業者は比較する配列の全長にわたって最大アラインメントを達成するために必要な任意アルゴリズムを含めてアラインメントの測定に適したパラメータを決定することができる。１実施形態において、本発明は配列番号１〜３１、３５〜４０又は５０〜８５のいずれか１種に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の一致度をもつアミノ酸配列を包含する。
【００８７】
「多価抗体」なる用語は本願では２個以上の抗原結合部位を含む抗体の意味で使用する。ある種の実施形態において、多価抗体は３個以上の抗原結合部位をもつように作製することができ、一般には天然型抗体以外のものである。
【００８８】
「多重特異性抗体」なる用語は２種以上の無関係の抗原と結合することが可能な抗体を意味する。１実施形態において、多重特異性抗体は２種の無関係の抗原と結合することが可能な二重特異性抗体であり、例えばＥＧＦＲ（例えばＥＧＦＲｖＩＩＩ）とＣＤ３とに結合する二重特異性抗体又はその抗原結合部分である。
【００８９】
「デュアル可変ドメイン」又は「ＤＶＤ」なる用語は本願では同義に使用し、２個以上の抗原結合部位を含み、四価以上の結合性タンパク質である抗原結合性タンパク質である。このようなＤＶＤは単一特異性（即ち１種の抗原と結合可能）でもよいし、多重特異性（即ち２種以上の抗原と結合可能）でもよい。２本の重鎖ＤＶＤポリペプチドと２本の軽鎖ＤＶＤポリペプチドを含むＤＶＤ結合性タンパク質をＤＶＤＩｇと呼ぶ。ＤＶＤＩｇの各半分は重鎖ＤＶＤポリペプチド及び軽鎖ＤＶＤポリペプチドと、２個の抗原結合部位を含む。各結合部位は重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含み、抗原結合部位１個当たり合計６個のＣＤＲが抗原結合に関与する。１実施形態では、本願に記載するＣＤＲを抗ＥＧＦＲ  ＤＶＤで使用する。
【００９０】
「キメラ抗原受容体」又は「ＣＡＲ」なる用語は少なくとも（１）抗原結合領域（例えば抗体の重鎖又は軽鎖可変領域）と、（２）ＣＡＲをＴ細胞に固定するための膜貫通領域と、（３）１個以上の細胞内シグナル伝達領域を含む組換えタンパク質を意味する。
【００９１】
「活性」なる用語は抗体（例えばｈＥＧＦＲ抗原と結合する抗ｈＥＧＦＲ抗体）もしくはＡＤＣの抗原との結合特異性／親和性及び／又は抗体（例えばｈＥＧＦＲと結合してｈＥＧＦＲの生物活性を阻害する抗ｈＥＧＦＲ抗体）の中和力価等の活性を包含し、例えばＥＧＦＲを発現する細胞株（例えばヒト肺癌細胞株Ｈ２９２）におけるＥＧＦＲのリン酸化の阻害、又はＥＧＦＲを発現する細胞株（例えばヒトＨ２９２肺癌細胞、ヒトＨ１７０３肺癌細胞株又はヒトＥＢＣ１肺癌細胞）の増殖の阻害が挙げられる。
【００９２】
本願で使用する「非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）異種移植アッセイ」なる用語は抗ＥＧＦＲ抗体又はＡＤＣが腫瘍増殖（例えば更なる増殖）を阻害できるか否か及び／又は免疫不全マウスへのＮＳＣＬＣ細胞の移植に起因する腫瘍増殖を抑制できるか否かを調べるために使用されるインビボアッセイを意味する。ＮＳＣＬＣ異種移植アッセイは腫瘍が所望のサイズ（例えば２００〜２５０ｍｍ３）まで増殖するようにＮＳＣＬＣ細胞を免疫不全マウスに移植後、抗体又はＡＤＣを前記マウスに投与し、抗体又はＡＤＣが腫瘍増殖を阻害及び／又は抑制できるか否かを調べる。ある種の実施形態では、対照抗体、例えば腫瘍細胞と特異的に結合しないヒトＩｇＧ抗体（又はその集合）、例えば癌に関連しない抗原に特異的な抗体又は非癌性材料（例えば正常ヒト血清）から得られる抗体と比較した腫瘍増殖阻害百分率（％ＴＧＩ）により前記抗体又はＡＤＣの活性を測定する。このような実施形態では、抗体（又はＡＤＣ）と対照抗体を同一用量、同一頻度及び同一経路でマウスに投与する。１実施形態において、ＮＳＣＬＣ異種移植アッセイで使用されるマウスは重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）マウス及び／又は無胸腺ＣＤ−１ヌードマウスである。ＮＳＣＬＣ異種移植アッセイで使用することができるＮＳＣＬＣ細胞の例としては、限定されないが、Ｈ２９２細胞（例えばＮＣＩＨ２９２［Ｈ２９２］（ＡＴＣＣ（Ｒ）ＣＲＬ１８４８（ＴＭ））が挙げられる。
【００９３】
「エピトープ」なる用語は抗体又はＡＤＣが結合する抗原の領域を意味する。ある種の実施形態において、エピトープ決定基はアミノ酸、糖側鎖、ホスホリル又はスルホニル等の化学的に活性な表面分子群を含み、ある種の実施形態では、特定の三次元構造特徴及び／又は特定の電荷特徴をもつ場合がある。ある種の実施形態では、タンパク質及び／又は巨大分子の複雑な混合物中でその標的抗原を優先的に認識する場合に抗体は抗原と特異的に結合すると言う。特定の実施形態において、本発明の抗体は（ｈＥＧＦＲの成熟形のアミノ酸残基２８７〜３０２に対応する）アミノ酸配列ＣＧＡＤＳＹＥＭＥＥＤＧＶＲＫＣ（配列番号４５）により表されるエピトープと結合する。
【００９４】
本願で使用する「表面プラズモン共鳴」なる用語は例えばＢＩＡｃｏｒｅシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，スウェーデン及びＰｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用してバイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の変化の検出によりリアルタイム生体特異的相互作用の解析を可能にする光学現象を意味する。詳細な説明については、Ｊｏｎｓｓｏｎ，Ｕ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ａｎｎ．Ｂｉｏｌ．Ｃｌｉｎ．５１：１９−２６；Ｊｏｎｓｓｏｎ，Ｕ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １１：６２０−６２７；Ｊｏｈｎｓｓｏｎ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．８：１２５−１３１；及びＪｏｈｎｎｓｏｎ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８：２６８−２７７参照。１実施形態において、表面プラズモン共鳴は実施例２に記載する方法に従って測定される。
【００９５】
本願で使用する「ｋｏｎ」又は「ｋａ」なる用語は抗体が抗原と会合して抗体／抗原複合体を形成する際の速度定数を意味するものである。
【００９６】
本願で使用する「ｋｏｆｆ」又は「ｋｄ」なる用語は抗体が抗体／抗原複合体から解離する際の解離速度定数を意味するものである。
【００９７】
本願で使用する「ＫＤ」なる用語は特定の抗体−抗原相互作用（例えばＡｂＡ抗体とＥＧＦＲ）の平衡解離定数を意味するものである。ＫＤはｋａ／ｋｄにより計算される。
【００９８】
本願で使用する「競合結合」なる用語は第３の分子（例えば抗原）上の結合部位に関して第１の抗体が第２の抗体と競合する状況を意味する。１実施形態では、ＦＡＣＳ解析を使用して２種の抗体間の競合結合を測定する。
【００９９】
「競合結合アッセイ」なる用語は２種以上の抗体が同一エピトープと結合するか否かを判定するために使用されるアッセイである。１実施形態において、競合結合アッセイは標識抗体の蛍光シグナルが非標識抗体の導入により低下するか否かを調べることにより、２種以上の抗体が同一エピトープと結合するか否かを判定するために使用される競合蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）アッセイであり、同一エピトープに関して競合している場合には蛍光レベルが低下する。競合結合ＦＡＣＳアッセイの１例を実施例３に示し、（ＥＧＦＲｖＩＩＩを発現する）Ｕ８７ＭＧ細胞を使用した競合ＦＡＣＳアッセイについて記載する。
【０１００】
本願で使用する「標識抗体」なる用語は結合性タンパク質（例えば抗体）の同定を可能にする標識物質を組込んだ抗体又はその抗原結合部分を意味する。好ましくは、標識物質は検出可能なマーカーであり、例えば放射性標識アミノ酸を組込む方法や、標識アビジン（例えば光学的方法もしくは比色法により検出可能な蛍光マーカー又は酵素活性を付加したストレプトアビジン）により検出可能なビオチニル部分をポリペプチドに結合する方法が挙げられる。ポリペプチドの標識物質の例としては限定されないが、放射性同位体ないし放射性核種（例えば３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１７７Ｌｕ、１６６Ｈｏ又は１５３Ｓｍ）、蛍光標識物質（例えばＦＩＴＣ、ローダミン及びランタニド蛍光体）、酵素標識物質（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光マーカー、ビオチニル基、二次レポーターにより認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えばロイシンジッパー対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）、及び磁性物質（例えばガドリニウムキレート剤）が挙げられる。
【０１０１】
「抗体薬物コンジュゲート」又は「ＡＤＣ」なる用語は抗体又はその抗原結合フラグメント等の結合性タンパク質を１個以上の化学的薬物（本願では薬剤とも言う。）と化学的に連結したものを意味し、このような薬物は場合により治療剤又は細胞毒性剤でもよい。好ましい１実施形態において、ＡＤＣは抗体と、細胞毒性薬又は治療薬と、前記薬物を前記抗体に結合又は連結させるリンカーを含む。ＡＤＣは通常では１〜８の任意数の薬物を抗体に結合しており、２、４、６又は８の薬物負荷種が挙げられる。ＡＤＣに含むことができる薬物の非限定的な例は有糸分裂阻害剤、抗腫瘍性抗生物質、免疫調節剤、遺伝子治療用ベクター、アルキル化剤、抗血管新生薬、代謝拮抗剤、ホウ素含有剤、化学療法剤、ホルモン剤、抗ホルモン剤、コルチコステロイド、感光性治療剤、オリゴヌクレオチド、放射性核種剤、トポイソメラーゼ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤及び放射線増感剤である。
【０１０２】
「抗上皮成長因子抗体薬物コンジュゲート」、「抗ＥＧＦＲ抗体薬物コンジュゲート」又は「抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣ」なる用語は本願では同義に使用され、ＥＧＦＲと特異的に結合する抗体を１個以上の化学物質と結合させたＡＤＣを意味する。１実施形態において、前記抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣは抗体ＡｂＡをアウリスタチン（例えばＭＭＡＥ又はＭＭＡＦ）と結合させたものである。抗体ＡｂＡの軽鎖と重鎖に対応するアミノ酸配列を夫々配列番号１３及び配列番号１５に示す。
【０１０３】
本願で使用する「アウリスタチン」なる用語は有糸分裂阻害剤のファミリーを意味する。アウリスタチン誘導体も「アウリスタチン」なる用語の定義に含まれる。アウリスタチンの例としては、限定されないが、アウリスタチンＥ（ＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、及びドラスタチンの合成アナログが挙げられる。１実施形態では、本願に記載する抗ＥＧＦＲ抗体をアウリスタチンと結合させ、抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣを形成する。
【０１０４】
本願で使用する「ＡｂＡ−ｖｃＭＭＡＥ」なる用語はマレイミドカプロイル、バリン−シトルリン、ｐ−アミノベンジルオキシカルバモイル（ＰＡＢＡ）リンカーを介して抗体ＡｂＡをモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）と結合させたＡＤＣの意味で使用する。ＡｂＡ−ｖｃＭＭＡＥを図１１に示す。
【０１０５】
本願で使用する「ｍｃＭＭＡＦ」なる用語はマレイミドカプロイル−モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）のリンカー／薬物組合せの意味で使用する。
【０１０６】
「薬物対抗体比」又は「ＤＡＲ」なる用語はＡＤＣの抗体に結合した薬物（例えばアウリスタチン）の数を意味する。ＡＤＣのＤＡＲは１〜８とすることができるが、抗体上の連結部位数に応じてそれ以上（例えば１０）とすることも可能である。ＤＡＲなる用語は個々の抗体に負荷される薬物の数の意味で使用する場合もあるし、あるいは１群のＡＤＣの平均ＤＡＲの意味で使用する場合もある。
【０１０７】
本願で使用する「望ましくないＡＤＣ種」なる用語は薬物負荷数の異なるＡＤＣ種から分離すべき任意薬物負荷種を意味する。１実施形態において、望ましくないＡＤＣ種なる用語は６以上の薬物負荷種、即ちＤＡＲ６、ＤＡＲ７、ＤＡＲ８及びＤＡＲ８超（即ち６、７、８又は８超の薬物負荷種）等のＤＡＲが６以上のＡＤＣを意味することができる。別の実施形態において、望ましくないＡＤＣ種なる用語は８以上の任意薬物負荷種、即ちＤＡＲ８及びＤＡＲ８超（即ち８又は８超の薬物負荷種）等のＤＡＲが８以上のＡＤＣを意味することができる。
【０１０８】
本願で使用する「ＡＤＣ混合物」なる用語は不均一なＤＡＲ分布のＡＤＣを含有する組成物を意味する。１実施形態において、ＡＤＣ混合物は、ＤＡＲ分布が１〜８、例えば２、４、６及び８（即ち２、４、６及び８の薬物負荷種）のＡＤＣを含有する。特に、１、３、５及び７のＤＡＲも混合物に含むような分解生成物でもよい。更に、混合物内のＡＤＣは、ＤＡＲが８超でもよい。ＡＤＣ混合物は分子鎖間ジスルフィド還元後に結合させることにより得られる。１実施形態において、ＡＤＣ混合物は、ＤＡＲが４以下（即ち４以下の薬物負荷種）のＡＤＣと、ＤＡＲが６以上（即ち６以上の薬物負荷種）のＡＤＣを併有する。
【０１０９】
「癌」なる用語は無制御な細胞増殖を典型的な特徴とする哺乳動物の生理的状態を意味又は表現するものである。癌の例としては、限定されないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫及び白血病又はリンパ系悪性腫瘍が挙げられる。このような癌のより具体的な例としては、膠芽腫、非小細胞肺癌、肺癌、結腸癌、大腸癌、頭頸部癌、乳癌（例えばトリプルネガティブ乳癌）、膵臓癌、扁平上皮腫瘍、扁平上皮癌（例えば肺扁平上皮癌又は頭頸部扁平上皮癌）、肛門癌、皮膚癌及び外陰癌が挙げられる。１実施形態では、ＥＧＦＲ遺伝子の増幅により、ＥＧＦＲの短縮型であるＥＧＦＲｖＩＩＩを発現する腫瘍をもつ患者に本発明の抗体又はＡＤＣを投与する。１実施形態では、ＥＧＦＲを過剰発現する可能性のある固形腫瘍をもつ患者に本発明の抗体又はＡＤＣを投与する。１実施形態では、扁平上皮非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）をもつ患者に本発明の抗体又はＡＤＣを投与する。１実施形態では、進行固形腫瘍を含む固形腫瘍をもつ患者に本発明の抗体又はＡＤＣを投与する。
【０１１０】
本願で使用する「ＥＧＦＲを発現する腫瘍」なる用語はＥＧＦＲタンパク質を発現する腫瘍を意味する。１実施形態において、腫瘍におけるＥＧＦＲ発現は腫瘍細胞膜の免疫組織化学染色を使用して判定され、腫瘍試料中でバックグラウンドレベルを上回る免疫組織化学染色が検出されるならば、この腫瘍はＥＧＦＲを発現する腫瘍であると判断される。腫瘍におけるＥＧＦＲの発現の検出方法は当分野で公知であり、例えばＥＧＦＲ  ｐｈａｒｍＤｘ（ＴＭ）Ｋｉｔ（Ｄａｋｏ）が挙げられる。一方、「ＥＧＦＲ陰性腫瘍」は免疫組織化学技術により測定した場合に、腫瘍試料中でバックグラウンドを上回るＥＧＦＲ膜染色のない腫瘍として定義される。
【０１１１】
本願で使用する「ＥＧＦＲｖＩＩＩ陽性腫瘍」なる用語はＥＧＦＲｖＩＩＩタンパク質を発現する腫瘍を意味する。１実施形態において、腫瘍におけるＥＧＦＲｖＩＩＩ発現は腫瘍細胞膜の免疫組織化学染色を使用して判定され、腫瘍試料中でバックグラウンドレベルを上回る免疫組織化学染色が検出されるならば、この腫瘍はＥＧＦＲｖＩＩＩを発現する腫瘍であると判断される。腫瘍におけるＥＧＦＲの発現の検出方法は当分野で公知であり、免疫組織化学アッセイが挙げられる。一方、「ＥＧＦＲｖＩＩＩ陰性腫瘍」は免疫組織化学技術により測定した場合に、腫瘍試料中でバックグラウンドを上回るＥＧＦＲｖＩＩＩ膜染色のない腫瘍として定義される。
【０１１２】
「過剰発現する」、「過剰発現」又は「過剰発現している」なる用語は同義であり、通常では癌細胞において正常細胞に比較して検出可能な高レベルで転写又は翻訳される遺伝子を意味する。従って、過剰発現とは（転写亢進、転写後プロセシング、翻訳、翻訳後プロセシング、安定性改変及びタンパク質分解改変に起因する）タンパク質及びＲＮＡの過剰発現と、タンパク質トラフィックパターン改変（核内転座増加）及び例えば基質の酵素加水分解増加の場合のような機能活性亢進に起因する局所過剰発現の両者を意味する。従って、過剰発現とはタンパク質又はＲＮＡ濃度を意味する。過剰発現は正常細胞又は比較細胞に比較して５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はそれ以上とすることもできる。ある種の実施形態では、ＥＧＦＲを過剰発現する可能性のある固形腫瘍を治療するために本発明の抗ＥＧＦＲ抗体又はＡＤＣを使用する。
【０１１３】
本願で使用する「投与する」なる用語は治療目的（例えばＥＧＦＲ関連障害の治療）を達成するために物質（例えば抗ＥＧＦＲ抗体又はＡＤＣ）を送達することを意味するものである。投与方式は非経口、経腸及び局所とすることができる。非経口投与は通常では注射による方法であり、限定されないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、関節腔内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管支、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内及び胸骨内注射及び輸液が挙げられる。
【０１１４】
本願で使用する「併用療法」なる用語は２種以上の治療物質（例えば抗ＥＧＦＲ抗体又はＡＤＣと別の治療剤）の投与を意味する。前記別の治療剤は抗ＥＧＦＲ抗体又はＡＤＣの投与と同時、投与前又は投与後に投与することができる。
【０１１５】
本願で使用する「有効量」又は「治療有効量」なる用語は障害（例えば癌）もしくはその１種以上の症状の重症度及び／もしくは持続期間を低減もしくは改善するため、障害の進行を予防するため、障害の退縮を誘導するため、障害に伴う１種以上の症状の再発、発現、発症もしくは進行を予防するため、障害を検出するため、又は別の療法（例えば予防剤又は治療剤）の予防もしくは治療効果を強化もしくは改善するために十分な薬物（例えば抗体又はＡＤＣ）の量を意味する。有効量の抗体又はＡＤＣは例えば腫瘍増殖を阻害（例えば腫瘍体積の増加を抑制）、腫瘍増殖を抑制（例えば腫瘍体積を減少）、癌細胞数を減少、及び／又は癌に伴う症状の１種以上をある程度まで緩和することができる。有効量は例えば無病生存率（ＤＦＳ）を改善すること、全生存率（ＯＳ）を改善すること、又は再発確率を低下させることができる。
【０１１６】
以下のサブセクションでは本発明の種々の態様を更に詳細に説明する。
【０１１７】
ＩＩ．抗ＥＧＦＲ抗体
本発明の１態様はＡｂ１及び当分野で公知の他の抗体よりも改善された特徴（例えばＥＧＦＲとの結合親和性の増加）をもつ抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合部分を提供する。本発明の別の態様は本願に記載する抗ＥＧＦＲ抗体と少なくとも１個の薬物（限定されないが、例えばアウリスタチン）を含む抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）に関する。本発明の抗体又はＡＤＣは限定されないが、ＥＧＦＲｖＩＩＩを発現する腫瘍細胞と結合する、ＥＧＦＲを発現する腫瘍細胞上の野生型ＥＧＦＲと結合する、ＥＧＦＲ上のエピトープＣＧＡＤＳＹＥＭＥＥＤＧＶＲＫＣ（配列番号４５）を認識する、正常ヒト上皮角化細胞上のＥＧＦＲと結合する、及びマウスモデルにおける異種移植片腫瘍増殖を抑制又は阻害する等の特徴をもつ。
【０１１８】
Ａｂ１（抗体１）はヒト化抗ＥＧＦＲ抗体である。Ａｂ１の軽鎖及び重鎖配列を夫々配列番号１３及び配列番号１４に記載する（本願に援用する米国特許出願公開第２０１２０１８３４７１号も参照。）。Ａｂ１の軽鎖可変領域は配列番号５に記載し、配列番号６に記載のＣＤＲ１アミノ酸配列と、配列番号７に記載のＣＤＲ２アミノ酸配列と、配列番号８に記載のＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。Ａｂ１の重鎖可変領域は配列番号１に記載し、配列番号２に記載のＣＤＲ１アミノ酸配列と、配列番号３に記載のＣＤＲ２アミノ酸配列と、配列番号４に記載のＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。
【０１１９】
一般に、本発明のＡｂ１変異体抗体は親抗体Ａｂ１のエピトープ特異性を保持する。従って、１実施形態において、本発明の抗ＥＧＦＲ抗体は配列番号４５に記載のＥＧＦＲにおけるエピトープと結合することができ、及び／又はＥＧＦＲとの結合に関してＡｂ１と競合することができる。各種実施形態において、前記結合は後記実施例３に記載するプロトコールに従って検定することができる。本発明の好ましい１実施形態において、前記抗ＥＧＦＲ抗体はＡｂ１と競合し、ＥＧＦＲの１−５２５（配列番号４７）との結合親和性が改善され、例えば表面プラズモン共鳴法により測定した場合に、解離定数（Ｋｄ）が約１×１０−６Ｍ〜約１×１０−１０Ｍである。
【０１２０】
１実施形態において、本発明はＡｂ１の変異体であり、改善された特徴（例えば後記実施例に記載するように、改善された結合親和性や、ＮＳＣＬＣ腫瘍細胞増殖のインビボ阻害能）をもつ抗ＥＧＦＲ抗体に関する。これらの新規抗体を本願では総称して「Ａｂ１変異体抗体」と言う。一般に、Ａｂ１変異体抗体はＡｂ１と同一のエピトープ特異性を保持する。従って、１実施形態において、本発明の抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合部分は、配列番号４５に記載のアミノ酸配列内のエピトープと結合し、競合結合アッセイでＥＧＦＲｖＩＩＩとの結合に関して配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号５に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、抗ＥＧＦＲ抗体と競合する。Ａｂ１とは対照的に、本発明の抗ＥＧＦＲ抗体はヌードマウスでのＨ２９２ヒト非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）異種移植アッセイにおいて、腫瘍増殖をインビボ阻害もしくは抑制することができ、及び／又は正常ヒト上皮角化細胞上の野生型ＥＧＦＲと結合することができる。各種実施形態において、本発明の抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合フラグメントはＥＧＦＲの生物学的機能を調節することが可能である。上記態様の他の実施形態において、前記抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合フラグメントはＥＧＦＲｖＩＩＩと結合し、ＥＧＦＲを過剰発現する細胞上のＥＧＦＲと結合し、ＥＧＦＲ上のエピトープＣＧＡＤＳＹＥＭＥＥＤＧＶＲＫＣ（配列番号４５）を認識する。別の実施形態において、前記抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合フラグメントはＥＧＦＲｖＩＩＩ接合部ペプチドとは異なるエピトープにおいてＥＧＦＲｖＩＩＩと結合する。上記態様のその他の実施形態において、前記抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合フラグメントはＥＧＦＲとの結合に関してセツキシマブと競合しない。後記実施例に記載するＡｂＡ抗体及びＡｂ１変異体は以下の特徴をもつ。
【０１２１】
即ち、本発明は競合結合アッセイでＡｂ１と競合することができるが、腫瘍増殖を阻害又は抑制するのにより有効である抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合部分を包含する。１実施形態において、本発明の抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合部分は、アミノ酸配列ＣＧＡＤＳＹＥＭＥＥＤＧＶＲＫＣ（配列番号４５）内のエピトープと結合することができ、競合結合アッセイで上皮成長因子受容体変異体ＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）（配列番号３３）との結合に関してＡｂ１（即ち配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号５に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、抗ＥＧＦＲ抗体）と競合することができる。
【０１２２】
１実施形態において、本発明の抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合部分は、表面プラズモン共鳴法により測定した場合に、約１×１０−６Ｍ以下の解離定数（Ｋｄ）でＥＧＦＲ（１−５２５）（配列番号４７）と結合する。あるいは、前記抗体又はその抗原結合部分は、表面プラズモン共鳴法により測定した場合に、約１×１０−６Ｍ〜約１×１０−１０ＭのＫｄでＥＧＦＲ（１−５２５）（配列番号４７）と結合する。あるいは、前記抗体又はその抗原結合部分は、表面プラズモン共鳴法により測定した場合に、約１×１０−６Ｍ〜約１×１０−７ＭのＫｄでＥＧＦＲ（１−５２５）（配列番号４７）と結合する。あるいは、本発明の抗体又はその抗原結合部分は、表面プラズモン共鳴法により測定した場合に、約１×１０−６Ｍ〜約５×１０−１０ＭのＫｄ、約１×１０−６Ｍ〜約１×１０−９ＭのＫｄ、約１×１０−６Ｍ〜約５×１０−９ＭのＫｄ、約１×１０−６Ｍ〜約１×１０−８ＭのＫｄ、約１×１０−６Ｍ〜約５×１０−８ＭのＫｄ、約５．９×１０−７Ｍ〜約１．７×１０−９ＭのＫｄ、約５．９×１０−７Ｍ〜約２．２×１０−７ＭのＫｄでＥＧＦＲ（１−５２５）（配列番号４７）と結合する。ある種の実施形態において、本発明の抗体及び抗原結合フラグメントの解離定数（Ｋｄ）は１実施形態ではＡｂ１の解離定数よりも小さく且つ抗ＥＧＦＲ抗体であるセツキシマブの速度よりも大きい。
【０１２３】
本発明の抗ＥＧＦＲ抗体及びその抗原結合部分の１つの利点は、前記抗体がＥＧＦＲｖＩＩＩを発現する腫瘍細胞と結合できるという点である。ＥＧＦＲｖＩＩＩは所定種の癌に関係があるが、当分野で公知の多くの抗ＥＧＦＲ抗体（例えばセツキシマブ）はＥＧＦＲｖＩＩＩを発現する腫瘍における腫瘍増殖を阻害又は抑制するのに有効ではない。従って、１実施形態において、本発明の抗体又はその抗原結合部分は、表面プラズモン共鳴法により測定した場合に、約８．２×１０−９Ｍ以下のＫｄでＥＧＦＲｖＩＩＩ（配列番号３３）と結合する。あるいは、本発明の抗体又はその抗原結合部分は、表面プラズモン共鳴法により測定した場合に、約８．２×１０−９Ｍ〜約６．３×１０−１０ＭのＫｄ、約８．２×１０−９Ｍ〜約２．０×１０−９ＭのＫｄ、約２．３×１０−９Ｍ〜約１．５×１０−１０ＭのＫｄでＥＧＦＲｖＩＩＩ（配列番号３３）と結合する。
【０１２４】
本発明の抗体は１実施形態において、インビボ異種移植片マウスモデルにおいて腫瘍増殖を阻害又は抑制することができる。例えば、本発明の抗体又はその抗原結合部分は、インビボヒト非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）異種移植アッセイにおいて、ＥＧＦＲに非特異的なヒトＩｇＧ抗体と比較して、腫瘍増殖を少なくとも約５０％阻害することができる。ある種の実施形態において、本発明の抗体又はその抗原結合部分は、インビボヒト非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）異種移植アッセイにおいて、同一の用量と投与周期で投与した場合にＥＧＦＲに非特異的なヒトＩｇＧ抗体と比較して、腫瘍増殖を少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％又は少なくとも約８０％阻害又は抑制することができる。ある種の実施形態において、本発明の抗体又はその抗原結合部分は、インビボヒト非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）異種移植アッセイにおいて、同一の用量と投与周期で投与した場合にＥＧＦＲに非特異的なヒトＩｇＧ抗体と比較して、腫瘍増殖を約８０％〜約９０％、又は約８４％〜約９０％、又は約８８％〜約９０％阻害又は抑制することができる。
【０１２５】
本願で使用する「異種移植アッセイ」なる用語はヒト細胞を拒絶しない免疫不全マウスの皮下又は腫瘍の原発巣である臓器種にヒト腫瘍細胞を移植するヒト腫瘍異種移植アッセイを意味する。
【０１２６】
なお、上記特徴を併有する抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合部分も本発明の実施形態とみなす。例えば、本発明の抗体は表面プラズモン共鳴法により測定した場合に、約１×１０−６Ｍ以下の解離定数（Ｋｄ）でＥＧＦＲ（１−５２５）（配列番号４７）と結合し、アミノ酸配列ＣＧＡＤＳＹＥＭＥＥＤＧＶＲＫＣ（配列番号４５）内のエピトープと結合し、競合結合アッセイで上皮成長因子受容体変異体ＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）（配列番号３３）との結合に関してＡｂ１（即ち配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号５に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、抗ＥＧＦＲ抗体）と競合することができる。
【０１２７】
ある種の実施形態において、前記抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合部分は、アミノ酸配列ＣＧＡＤＳＹＥＭＥＥＤＧＶＲＫＣ（配列番号４５）内のエピトープと結合し、競合結合アッセイで上皮成長因子受容体変異体ＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）（配列番号３３）との結合に関してＡｂ１（即ち配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号５に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、抗ＥＧＦＲ抗体）と競合し、表面プラズモン共鳴法により測定した場合に、約８．２×１０−９Ｍ以下のＫｄでＥＧＦＲｖＩＩＩ（配列番号３３）と結合する。
【０１２８】
ある種の実施形態において、前記抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合部分は、アミノ酸配列ＣＧＡＤＳＹＥＭＥＥＤＧＶＲＫＣ（配列番号４５）内のエピトープと結合し、競合結合アッセイで上皮成長因子受容体変異体ＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）（配列番号３３）との結合に関してＡｂ１（即ち配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号５に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、抗ＥＧＦＲ抗体）と競合し、インビボ異種移植片マウスモデルにおいて腫瘍増殖を阻害又は抑制する。より具体的には、本発明の抗体又はその抗原結合部分は、インビボヒト非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）異種移植アッセイにおいて、同一の用量と投与周期で投与した場合にＥＧＦＲに非特異的なヒトＩｇＧ抗体と比較して、腫瘍増殖を少なくとも約５０％阻害することができる。あるいは、本発明の抗体又はその抗原結合部分は、インビボヒト非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）異種移植アッセイにおいて、同一の用量と投与周期で投与した場合にＥＧＦＲに非特異的なヒトＩｇＧ抗体と比較して、腫瘍増殖を少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％又は少なくとも約８０％阻害又は抑制することができる。ある種の実施形態において、本発明の抗体又はその抗原結合部分は、インビボヒト非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）異種移植アッセイにおいて、同一の用量と投与周期で投与した場合にＥＧＦＲに非特異的なヒトＩｇＧ抗体と比較して、腫瘍増殖を約８０％〜約９０％、又は約８４％〜約９０％、又は約８８％〜約９０％阻害又は抑制することができる。
【０１２９】
上記特徴のいずれかを併有する抗体を本発明の態様とする。以下に詳述する本発明のＡＤＣも上記特徴のいずれかをもつことができる。
【０１３０】
１実施形態において、本発明は配列番号４０に記載のアミノ酸配列を含むＬＣ  ＣＤＲ３ドメイン、配列番号３９に記載のアミノ酸配列を含むＬＣ  ＣＤＲ２ドメイン、及び配列番号３８に記載のアミノ酸配列を含むＬＣ  ＣＤＲ１ドメインと、配列番号３７に記載のアミノ酸配列を含むＨＣ  ＣＤＲ３ドメイン、配列番号３６に記載のアミノ酸配列を含むＨＣ  ＣＤＲ２ドメイン、及び配列番号３５に記載のアミノ酸配列を含むＨＣ  ＣＤＲ１ドメインを含む抗ｈＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合部分を包含する。
【０１３１】
１実施形態において、本発明は５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６及び７８から構成される群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７及び７９から構成される群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む抗ｈＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合部分を包含する。
【０１３２】
１実施形態において、本発明は配列番号１０、１１及び１２；配列番号１６、１７及び１８；配列番号１０、１１及び１９；配列番号２０、１１及び１２；配列番号２１、３及び２２；配列番号１６、１７及び１９；配列番号２、３及び４；配列番号１０、３及び１２；配列番号８０、１１及び１８；配列番号８０、３及び１８；配列番号２０、３及び１２；配列番号８０、１１及び１２；並びに配列番号８１、１１及び２２から構成される群から選択されるＨＣ  ＣＤＲセット（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）と；配列番号６、７及び８；配列番号２３、２４及び２５；配列番号２６、２７及び２８；配列番号２９、３０及び３１；配列番号６、７及び８４；配列番号８２、８３及び３１；並びに配列番号８２、２７及び８５から構成される群から選択されるＬＣ軽鎖ＣＤＲセット（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）を含む抗ｈＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合部分を包含する（但し、前記抗体又はその抗原結合部分が、配列番号２、３及び４のＨＣ  ＣＤＲセットと配列番号６、７及び８のＬＣ  ＣＤＲセットを同時に含むことはない）。
【０１３３】
好ましくは、本発明の抗ＥＧＦＲ抗体は例えば当分野で公知の複数のインビトロ及びインビボアッセイのいずれか１種により評価した場合にＥＧＦＲ活性を低下又は中和させる高い能力を示す。例えば、ＥＧＦＲを発現する細胞株（例えばｈ２９２細胞株）におけるＥＧＦＲのリン酸化の阻害を測定することができる。ある種の実施形態において、前記単離抗体又はその抗原結合部分は、ヒトＥＧＦＲと結合し、前記抗体又はその抗原結合部分は、表面プラズモン共鳴法により測定した場合に、約５．９×１０−７Ｍ以下のＫＤ速度定数でヒトＥＧＦＲ（ＥＧＦＲ１−５２５）から解離する。あるいは、前記抗体又はその抗原結合部分は、表面プラズモン共鳴法により測定した場合に、約４．２×１０−７ＭのＫＤ速度定数でヒトＥＧＦＲ（１−５２５）から解離することができる。あるいは、前記抗体又はその抗原結合部分は、表面プラズモン共鳴法により測定した場合に、約２．５×１０−７Ｍの概算ＫＤ速度定数のｋｏｆｆ速度定数でヒトＥＧＦＲ（１−５２５）から解離することができる。ある種の実施形態において、本発明の抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合部分は、５．９×１０−７Ｍ〜５×１０−９ＭのＫＤ速度定数をもつ。
【０１３４】
あるいは、前記抗体又はその抗原結合部分は、表面プラズモン共鳴法により測定した場合に、約６．１×１０−９Ｍ以下のＫＤ速度定数でヒトＥＧＦＲｖＩＩＩから解離することができる。あるいは、前記抗体又はその抗原結合部分は、表面プラズモン共鳴法により測定した場合に、約３．９×１０−９Ｍ以下のＫＤ速度定数でヒトＥＧＦＲｖＩＩＩから解離することができる。あるいは、前記抗体又はその抗原結合部分は、表面プラズモン共鳴法により測定した場合に、約２．３×１０−９Ｍ以下のＫＤ速度定数でヒトＥＧＦＲｖＩＩＩから解離することができる。
【０１３５】
１実施形態において、本発明は抗体ＡｂＡである抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合部分に関する。ＡｂＡはＥＧＦＲとの結合親和性がＡｂ１よりも改善されており、更にＡｂ１に比較してユニークなインビトロ及びインビボ特徴を示す。ＡｂＡはインビトロ角化細胞結合アッセイにおいてＡｂ１よりも著しく高い親和性でＥＧＦＲと結合する。更に、ＡｂＡは異種移植Ｈ２９２細胞アッセイで腫瘍増殖を阻害又は抑制することができる。特に、ＡｂＡはインビトロ及びインビボ特徴が改善され、ＡｂＡよりも結合親和性が高かった他のＡｂ１変異体抗体と同等である。ＡｂＡは他のＡｂ１変異体抗体と比較して結合親和性が低い（例えば図３のＡｂＰ及びＡｂＱとＡｂＡを対比参照。）にも拘わらず、インビボアッセイにおける細胞増殖阻害は同等であった。
【０１３６】
「ＡｂＡ」なる用語はＡｂＡの少なくとも６個のＣＤＲをもつＩｇＧ抗体を包含するものである。ＡｂＡ抗体はＡｂ１と同一の軽鎖をもつが、重鎖は親抗体Ａｂ１に対して６カ所のアミノ酸配列変異（重鎖の可変領域に４カ所のアミノ酸変異と定常領域に２カ所の変異）を含む。ＡｂＡ抗体は配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン及び配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含む重鎖可変領域と、配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン及び配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインとを含む軽鎖可変領域を含む。ＡｂＡの重鎖可変領域は配列番号９に記載のアミノ酸配列と配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域により表される。抗体ＡｂＡの全長重鎖を配列番号１５に記載のアミノ酸配列に示し、抗体ＡｂＡの全長軽鎖を配列番号１３に記載のアミノ酸配列に示す（図２参照。）。ＡｂＡの重鎖の核酸配列を以下に示す。
【０１３７】
【化４】
2020039360.tif 000007
【０１３８】
ＡｂＡの軽鎖の核酸配列を以下に示す。
【０１３９】
【化５】
2020039360.tif 000008
【０１４０】
１実施形態において、本発明は抗体ＡｂＢである抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合部分に関する。前記ＡｂＢ抗体は配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン及び配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含む重鎖可変領域と、配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン及び配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインとを含む軽鎖可変領域を含む。その他の実施形態において、本発明は配列番号６４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号６５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をもつ抗体を提供する。
【０１４１】
１実施形態において、本発明は抗体ＡｂＣである抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合部分に関する。前記ＡｂＣ抗体は配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン及び配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含む重鎖可変領域と、配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン及び配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインとを含む軽鎖可変領域を含む。その他の実施形態において、本発明は配列番号６６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号６７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をもつ抗体を提供する。
【０１４２】
１実施形態において、本発明は抗体ＡｂＤである抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合部分に関する。前記ＡｂＤ抗体は配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン及び配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含む重鎖可変領域と、配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号８３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン及び配列番号８２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含む軽鎖可変領域を含む。その他の実施形態において、本発明は配列番号６８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号６９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をもつ抗体を提供する。
【０１４３】
１実施形態において、本発明は抗体ＡｂＥである抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合部分に関する。前記ＡｂＥ抗体は配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン及び配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含む重鎖可変領域と、配列番号８５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン及び配列番号８２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含む軽鎖可変領域を含む。その他の実施形態において、本発明は配列番号５０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号５１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をもつ抗体を提供する。
【０１４４】
１実施形態において、本発明は抗体ＡｂＦである抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合部分に関する。前記ＡｂＦ抗体は配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン及び配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含む重鎖可変領域と、配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン及び配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインとを含む軽鎖可変領域を含む。その他の実施形態において、本発明は配列番号５２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号５３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をもつ抗体を提供する。
【０１４５】
１実施形態において、本発明は抗体ＡｂＧである抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合部分に関する。前記ＡｂＧ抗体は配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン及び配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含む重鎖可変領域と、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン及び配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含む軽鎖可変領域を含む。その他の実施形態において、本発明は配列番号７２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号７３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をもつ抗体を提供する。
【０１４６】
１実施形態において、本発明は抗体ＡｂＨである抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合部分に関する。前記ＡｂＨ抗体は配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン及び配列番号８０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含む重鎖可変領域と、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン及び配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含む軽鎖可変領域を含む。その他の実施形態において、本発明は配列番号５４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号５５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をもつ抗体を提供する。
【０１４７】
１実施形態において、本発明は抗体ＡｂＪである抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合部分に関する。前記ＡｂＪ抗体は配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン及び配列番号８０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含む重鎖可変領域と、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン及び配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含む軽鎖可変領域を含む。その他の実施形態において、本発明は配列番号５６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号５７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をもつ抗体を提供する。
【０１４８】
１実施形態において、本発明は抗体ＡｂＫである抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合部分に関する。前記ＡｂＫ抗体は配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン及び配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含む重鎖可変領域と、配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン及び配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含む軽鎖可変領域を含む。その他の実施形態において、本発明は配列番号７４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号７５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をもつ抗体を提供する。
【０１４９】
１実施形態において、本発明は抗体ＡｂＬである抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合部分に関する。前記ＡｂＬ抗体は配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン及び配列番号８０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含む重鎖可変領域と、配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン及び配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含む軽鎖可変領域を含む。その他の実施形態において、本発明は配列番号５８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号５９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をもつ抗体を提供する。
【０１５０】
１実施形態において、本発明は抗体ＡｂＭである抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合部分に関する。前記ＡｂＭ抗体は配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン及び配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含む重鎖可変領域と、配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン及び配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含む軽鎖可変領域を含む。その他の実施形態において、本発明は配列番号７６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号７７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をもつ抗体を提供する。
【０１５１】
１実施形態において、本発明は抗体ＡｂＮである抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合部分に関する。前記ＡｂＮ抗体は配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン及び配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含む重鎖可変領域と、配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン及び配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含む軽鎖可変領域を含む。その他の実施形態において、本発明は配列番号６０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号６１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をもつ抗体を提供する。
【０１５２】
１実施形態において、本発明は抗体ＡｂＯである抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合部分に関する。前記ＡｂＯ抗体は配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン及び配列番号８０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含む重鎖可変領域と、配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン及び配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含む軽鎖可変領域を含む。その他の実施形態において、本発明は配列番号６２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号６３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をもつ抗体を提供する。
【０１５３】
１実施形態において、本発明は抗体ＡｂＰである抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合部分に関する。前記ＡｂＰ抗体は配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン及び配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含む重鎖可変領域と、配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン及び配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含む軽鎖可変領域を含む。その他の実施形態において、本発明は配列番号７８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号７９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をもつ抗体を提供する。
【０１５４】
１実施形態において、本発明は抗体ＡｂＱである抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合部分に関する。前記ＡｂＱ抗体は配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン及び配列番号８１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含む重鎖可変領域と、配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン及び配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含む軽鎖可変領域を含む。その他の実施形態において、本発明は配列番号７０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号７１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をもつ抗体を提供する。
【０１５５】
後記実施例で表１に記載するように、Ａｂ１変異体抗体配列はＡｂ１  ＥＧＦＲエピトープとの結合を改善させるＣＤＲ領域に相当するアミノ酸コンセンサス配列を提供する。従って、１実施形態において、本発明は配列番号４０に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号３９に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン及び配列番号３８に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含む軽鎖可変領域と、配列番号３７に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号３６に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン及び配列番号３５に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインとを含む重鎖可変領域を含む抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合部分に関する。
【０１５６】
１実施形態において、前記抗上皮成長因子受容体（抗ＥＧＦＲ抗）抗体又はその抗原結合部分は、５０、５２、５３、５６、５８、６０、６２、６４、６６及び６８から構成される群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７及び６９から構成される群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
【０１５７】
別の実施形態において、本発明の抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合部分は、配列番号１２、１８、１９及び２２に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメインと、配列番号１１又は１７に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメインと、配列番号１０、１６、２０及び２１に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含む重鎖可変領域と；配列番号８、２５、２８及び３１に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメインと、配列番号７、２４、２７及び３０に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメインと、配列番号６、２３、２６及び２９に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含む軽鎖可変領域を含む。
【０１５８】
リン酸化及び増殖アッセイの結果、本願に記載する抗体はＥＧＦＲ介在性リン酸化と腫瘍細胞増殖を阻害することが実証された。例えば、実施例６に記載するように、本発明のＥＧＦＲ抗体（試験したもの）は腫瘍細胞増殖をインビボで阻害することが分かった。
【０１５９】
上記抗ＥＧＦＲ抗体ＣＤＲ配列は、本発明に従って単離され、下表１〜３に示すＣＤＲ配列を含むポリペプチドを含むＥＧＦＲ結合タンパク質の新規ファミリーを確立する。
【０１６０】
ｈＥＧＦＲに対して好ましいＥＧＦＲ結合及び／又は中和活性をもつＣＤＲを作製及び選択するためには、抗体又はその抗原結合部分を作製してこれらの抗体又はその抗原結合部分のＥＧＦＲ結合及び／又は中和特性を評価する方法として当分野で公知の標準方法を使用することができ、限定されないが、本願に具体的に記載する方法が挙げられる。
【０１６１】
ある種の実施形態において、前記抗体はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ又はＩｇＤ定常領域等の重鎖定常領域を含む。ある種の実施形態において、前記抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合部分は、ヒトＩｇＧ定常領域、ヒトＩｇＭ定常領域、ヒトＩｇＥ定常領域及びヒトＩｇＡ定常領域から構成される群から選択される重鎖免疫グロブリン定常領域を含む。その他の実施形態において、前記抗体又はその抗原結合部分は、ＩｇＧ１重鎖定常領域、ＩｇＧ２重鎖定常領域、ＩｇＧ３定常領域又はＩｇＧ４重鎖定常領域を含む。好ましくは、前記重鎖定常領域はＩｇＧ１重鎖定常領域又はＩｇＧ４重鎖定常領域である。更に、前記抗体はκ軽鎖定常領域又はλ軽鎖定常領域のいずれかの軽鎖定常領域を含むことができる。好ましくは、前記抗体κ軽鎖定常領域を含む。あるいは、前記抗体部分は例えばＦａｂフラグメント又は１本鎖Ｆｖフラグメントとすることができる。
【０１６２】
ある種の実施形態において、前記抗ＥＧＦＲ抗体結合部分はＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ジスルフィド結合したＦｖ、ｓｃＦｖ、シングルドメイン抗体又はダイアボディである。
【０１６３】
ある種の実施形態において、前記抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合部分は、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）である。
【０１６４】
ある種の実施形態において、前記抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合部分は、配列番号４１に記載のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域及び／又は配列番号４３に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む。
【０１６５】
抗体エフェクター機能を改変するようにＦｃ部分のアミノ酸残基を置換することは従来記載されている（本願に援用するＷｉｎｔｅｒら．米国特許第５，６４８，２６０号及び５，６２４，８２１号）。抗体のＦｃ部分は複数の重要なエフェクター機能に介在し、例えばサイトカイン誘導、ＡＤＣＣ、貪食作用、補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）並びに抗体及び抗原−抗体複合体の半減期／クリアランス速度が挙げられる。これらのエフェクター機能は治療目的に応じて治療用抗体に望ましい場合もあるが、不必要または有害な場合もある。ある種のヒトＩｇＧアイソタイプ、特にＩｇＧ１及びＩｇＧ３は夫々ＦｃγＲ及び補体Ｃ１ｑと結合することによりＡＤＣＣ及びＣＤＣに介在する。胎児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）は抗体の循環半減期を決定する重要な要素である。更に別の実施形態では、抗体のエフェクター機能を改変するように抗体の定常領域（例えば抗体のＦｃ領域）の少なくとも１個のアミノ酸残基を置換する。
【０１６６】
本発明の１実施形態は本願に記載する抗体の結合領域（例えばＡｂＡの重鎖及び／又は軽鎖ＣＤＲ）を含む組換えキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を包含する。本願に記載するような組換えＣＡＲはヒト白血球抗原（ＨＬＡ）に非依存的にＴ細胞特異性を抗原に再指向させるために使用することができる。従って、本発明のＣＡＲは対象の腫瘍を認識して攻撃するようにヒト対象自身の免疫細胞を改変し易くするために免疫療法で使用することができる（例えばＣＡＲ技術に関して各々本願に援用する米国特許第６，４１０，３１９号；８，３８９，２８２号；８，８２２，６４７号；８，９０６，６８２号；８，９１１，９９３号；８，９１６，３８１号；８，９７５，０７１号；及び米国特許出願公開第ＵＳ２０１４０３２２２７５号参照。）。この種の免疫療法は養子免疫療法（ＡＣＴ）と呼ばれ、治療を必要とする対象における癌を治療するために使用することができる。
【０１６７】
本発明の抗ＥＧＦＲ  ＣＡＲはＥＧＦＲ（例えばＥＧＦＲｖＩＩＩ）に特異的な細胞外抗原結合ドメインと、ＣＡＲをＴ細胞に固定するために使用される膜貫通ドメインと、１個以上の細胞内シグナル伝達ドメインを含むことが好ましい。本発明の１実施形態において、前記ＣＡＲはＴ細胞受容体のα、β又はζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７及びＣＤ１５４から構成される群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインを含む。本発明の１実施形態において、前記ＣＡＲは共刺激ドメイン（例えばＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ５、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）及び４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）から構成される群から選択されるタンパク質の機能的シグナル伝達ドメインを含む共刺激ドメイン）を含む。本発明のある種の実施形態において、前記ＣＡＲは本願に記載するＣＤＲ又は可変領域（例えばＡｂＡ抗体に由来するＣＤＲ又は可変領域）を含むｓｃＦｖと、膜貫通ドメインと、共刺激ドメイン（例えばＣＤ２８又は４−１ＢＢに由来する機能的シグナル伝達ドメイン）と、ＣＤ３に由来する機能的シグナル伝達ドメイン（例えばＣＤ３−ｚｅｔａ）を含むシグナル伝達ドメインを含む。
【０１６８】
ある種の実施形態において、本発明は本願に記載する抗体又は本願に記載するｓｃＦｖの抗原結合領域（例えばＣＤＲ）を含むＣＡＲを含むＴ細胞（ＣＡＲ  Ｔ細胞とも言う。）を包含する。
【０１６９】
本発明のある種の実施形態において、前記ＣＡＲは配列番号４０に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号３９に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン及び配列番号３８に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含む重鎖可変領域と、配列番号３７に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号３６に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン及び配列番号３５に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインとを含む重鎖可変領域を含む。
【０１７０】
本発明のある種の実施形態において、前記ＣＡＲは配列番号１２に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号１１に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン及び配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含む重鎖可変領域と、配列番号８に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号７に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン及び配列番号６に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含む重鎖可変領域を含む。
【０１７１】
本発明の１実施形態は標識抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗体部分を包含し、前記抗体は誘導体化されているか又は１個以上の機能的分子（例えば別のペプチド又はタンパク質）と連結されている。例えば、標識抗体は本発明の抗体又は抗体部分を（別の抗体（例えば二重特異性抗体又はダイアボディ）、検出可能な物質、薬剤、前記抗体もしくは抗体部分と別の分子の会合に介在することができるタンパク質もしくはペプチド（例えばストレプトアビジンコア領域又はポリヒスチジンタグ）、並びに／又は有糸分裂阻害剤、抗腫瘍性抗生物質、免疫調節剤、遺伝子治療用ベクター、アルキル化剤、抗血管新生薬、代謝拮抗剤、ホウ素含有剤、化学療法剤、ホルモン剤、抗ホルモン剤、コルチコステロイド、感光性治療剤、オリゴヌクレオチド、放射性核種剤、トポイソメラーゼ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、放射線増感剤及びその組合せから構成される群から選択される細胞毒性剤もしくは治療剤等の１個以上の他の分子体と（化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合的会合又は他の方法により）機能的に連結することにより得ることができる。
【０１７２】
抗体又はその抗体部分を誘導体化することができる有用な検出可能な物質としては蛍光化合物が挙げられる。検出可能な蛍光物質の例としては、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、５−ジメチルアミン−１−ナフタレンスルホニルクロリド、フィコエリスリン等が挙げられる。アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ等の検出可能な酵素で抗体を誘導体化してもよい。検出可能な酵素で抗体を誘導体化する場合には、酵素が検出可能な反応生成物を生成するために使用する他の試薬を加えることにより抗体を検出する。例えば、検出可能な物質として西洋ワサビペルオキシダーゼが存在する場合には、過酸化水素とジアミノベンジジンを加えて検出可能な着色反応生成物を得る。抗体をビオチンで誘導体化し、アビジン又はストレプトアビジンとの結合の間接的測定により検出してもよい。
【０１７３】
１実施形態では、本発明の抗体を造影剤と結合させる。本願に記載する組成物及び方法で使用することができる造影剤の例としては、限定されないが、放射性標識物質（例えばインジウム）、酵素、蛍光標識物質、発光標識物質、生物発光標識物質、磁気標識物質及びビオチンが挙げられる。
【０１７４】
１実施形態では、前記抗体又はＡＤＣを限定されないが、インジウム（１１１Ｉｎ）等の放射性標識物質と連結する。１１１インジウムはＥＧＦＲ陽性腫瘍の同定用として本願に記載する抗体又はＡＤＣを標識するために使用することができる。ある種の実施形態において、本願に記載する抗ＥＧＦＲ抗体（又はＡＤＣ）は二官能性シクロヘキシルジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）キレートである二官能性キレート剤を介して１１１Ｉで標識される（各々本願に援用する米国特許第５，１２４，４７１号、５，４３４，２８７号及び５，２８６，８５０号参照。）。
【０１７５】
本発明の別の実施形態は前記抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合部分に１個以上の糖残基を含むグリコシル化結合性タンパク質を提供する。胎児インビボタンパク質産生は更に翻訳後修飾と呼ばれるプロセシングを受ける場合がある。特に、酵素により糖（グリコシル）残基を付加することができ、グリコシル化と呼ばれるプロセスである。得られたタンパク質はオリゴ糖側鎖が共有結合しており、グリコシル化タンパク質又は糖タンパク質と呼ばれる。抗体はＦｃドメインと可変ドメインに１個以上の糖残基をもつ糖タンパク質である。Ｆｃドメインの糖残基はＦｃドメインのエフェクター機能に大きな影響を与えるが、抗体の抗原結合や半減期には殆ど影響を与えない（Ｒ．Ｊｅｆｆｅｒｉｓ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２１（２００５），ｐｐ．１１−１６）。他方、可変ドメインのグリコシル化は抗体の抗原結合活性に影響を与える場合がある。可変ドメインのグリコシル化は恐らく立体障害により抗体結合親和性に負の影響を与える可能性があり（Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９３）３０：１３６１−１３６７）、あるいは抗原との親和性を増す可能性がある（Ｗａｌｌｉｃｋ，Ｓ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９８８）１６８：１０９９−１１０９；Ｗｒｉｇｈｔ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．（１９９１）１０：２７１７−２７２３）。
【０１７６】
本発明の１態様は結合性タンパク質のＯ結合型又はＮ結合型グリコシル化部位を突然変異させたグリコシル化部位突然変異体の作製に関する。当業者は周知標準技術を使用してこのような突然変異体を作製することができる。生物活性を維持しながら結合活性を増減させたグリコシル化部位突然変異体も本発明の目的である。
【０１７７】
更に別の実施形態では、本発明の抗ＥＧＦＲ抗体又は抗原結合部分のグリコシル化を改変する。例えば、非グリコシル化抗体を作製することができる（即ちこの抗体はグリコシル化されていない）。例えば抗体の抗原との親和性を増すようにグリコシル化を改変することができる。このような糖鎖修飾は例えば抗体配列内の１箇所以上のグリコシル化部位を改変することにより実施することができる。例えば、１箇所以上の可変領域グリコシル化部位を除去することによりこの部位のグリコシル化を排除するように１箇所以上のアミノ酸置換を行うことができる。このような非グリコシル化により抗体の抗原との親和性を増すことができる。このようなアプローチはＰＣＴ公開ＷＯ２００３０１６４６６Ａ２、並びに米国特許第５，７１４，３５０号及び６，３５０，８６１号に更に詳細に記載されており、各々その開示内容全体を本願に援用する。
【０１７８】
上記に加え、又は上記の代わりに、フコシル残基量の少ない低フコシル化抗体やバイセクティングＧｌｃＮＡｃ構造の多い抗体等の改変型グリコシル化タイプをもつ本発明の改変型抗ＥＧＦＲ抗体を作製することができる。このような改変型グリコシル化パターンは抗体のＡＤＣＣ能を増すことが実証されている。このような糖鎖修飾は例えばグリコシル化機序を改変させた宿主細胞で抗体を発現させることにより実施することができる。グリコシル化機序を改変させた細胞は当分野で従来記載されており、グリコシル化を改変させた抗体を産生するように本発明の組換え抗体を発現させる宿主細胞として使用することができる。例えば、各々その開示内容全体を本願に援用するＳｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３−２６７４０；Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：１７６−１並びにヨーロッパ特許第ＥＰ１，１７６，１９５号；ＰＣＴ公開ＷＯ０３／０３５８３５；ＷＯ９９／５４３４２  ８０参照。
【０１７９】
タンパク質グリコシル化は着目タンパク質のアミノ酸配列と、タンパク質を発現させる宿主細胞に依存する。生物によって異なるグリコシル化酵素（例えばグリコシルトランスフェラーゼやグリコシダーゼ）が産生され、利用可能な基質（ヌクレオチド糖類）も異なる場合がある。このような要因により、タンパク質グリコシル化パターンとグリコシル残基の組成は特定のタンパク質を発現させる宿主系によって異なる場合がある。本発明で有用なグリコシル残基としては、限定されないが、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、ｎ−アセチルグルコサミン及びシアリル酸が挙げられる。グリコシル化結合性タンパク質はグリコシル化パターンがヒトのパターンとなるようなグリコシル残基を含むことが好ましい。
【０１８０】
タンパク質グリコシル化が異なると、タンパク質特性も異なる場合がある。例えば、酵母等の微生物宿主で産生され、酵母内因性経路を利用してグリコシル化された治療用タンパク質の効力はＣＨＯ細胞株等の哺乳動物細胞で発現される同一タンパク質と比較して低下する場合がある。このような糖タンパク質は更にヒトにおいて免疫原性となる場合があり、投与後にインビボ半減期が短くなる場合がある。ヒト及び他の動物における特定の受容体は特定のグリコシル残基を認識し、血流からのタンパク質の迅速なクリアランスを助長する場合がある。他の有害な影響としては、タンパク質折畳み、溶解度、プロテアーゼ感受性、トラフィッキング、輸送、区画化、分泌、他のタンパク質もしくは因子による認識、抗原性又はアレルゲン性の変化が挙げられる。従って、実施者は特定のグリコシル化組成及びパターン（例えばヒト細胞又は所期対象動物の種特異的細胞で発現されるものと同一又は少なくとも同様のグリコシル化組成及びパターン）をもつ治療用タンパク質を優先的に選択することができる。
【０１８１】
宿主細胞とは異なるグリコシル化タンパク質を発現させるには、異種グリコシル化酵素を発現するように宿主細胞を遺伝子改変することにより実施することができる。組換え技術を使用して実施者はヒトタンパク質グリコシル化を示す抗体又はその抗原結合部分を作製することができる。例えば、非天然型グリコシル化酵素を発現するように酵母株が遺伝子改変され、これらの酵母株で産生されるグリコシル化タンパク質（糖タンパク質）が動物細胞、特にヒト細胞と同一のタンパク質グリコシル化を示すように改変されている（米国特許公開第２００４００１８５９０号及び２００２０１３７１３４号並びにＰＣＴ公開ＷＯ２００５１００５８４Ａ２）。
【０１８２】
多数の技術のいずれにより抗体を作製してもよい。例えば、重鎖及び軽鎖をコードする発現ベクターを標準技術により宿主細胞にトランスフェクションして宿主細胞から発現させる。「トランスフェクション」なる用語の各種語形は原核又は真核宿主細胞に外来ＤＮＡを導入するために広く使用されている多様な技術を包含するものであり、例えばエレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿法、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクション等が挙げられる。原核宿主細胞又は真核宿主細胞のどちらでも抗体を発現させることが可能であるが、真核細胞（特に哺乳動物細胞）は原核細胞よりも正しく折り畳まれた免疫学的に活性な抗体を組み立てて分泌する可能性が高いので、真核細胞で抗体を発現させることが好ましく、哺乳動物宿主細胞が最も好ましい。
【０１８３】
本発明の組換え抗体を発現させるために好ましい哺乳動物宿主細胞としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（Ｕｒｌａｕｂ  ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ，（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６−４２２０に記載されているｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ細胞と、例えばＲ．Ｊ．Ｋａｕｆｍａｎ  ａｎｄ  Ｐ．Ａ．Ｓｈａｒｐ（１９８２）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１−６２１に記載されているようなＤＨＦＲ選択マーカーの併用を含む）、ＮＳ０ミエローマ細胞、ＣＯＳ細胞及びＳＰ２細胞が挙げられる。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターを哺乳動物宿主細胞に導入する場合には、宿主細胞における抗体の発現を可能にするため、又はより好ましくは宿主細胞を増殖させる培養培地への抗体の分泌を可能にするために十分な時間にわたって宿主細胞を培養することにより抗体を産生させる。標準タンパク質精製法を使用して培養培地から抗体を回収することができる。
【０１８４】
ＦａｂフラグメントやｓｃＦｖ分子等の機能的抗体フラグメントを作製するために宿主細胞を使用することもできる。当然のことながら、上記手順の変形も本発明の範囲に含まれる。例えば、本発明の抗体の軽鎖及び／又は重鎖のいずれかの機能的フラグメントをコードするＤＮＡを宿主細胞にトランスフェクトすることが望ましい場合がある。着目抗原との結合に必要ない軽鎖及び重鎖の一方又は両方をコードするＤＮＡの一部又は全部を除去するために組換えＤＮＡ技術を使用してもよい。このような短縮型ＤＮＡ分子から発現される分子も本発明の抗体に含まれる。更に、標準化学架橋法により本発明の抗体を第２の抗体と架橋させることにより、一方の重鎖と一方の軽鎖が本発明の抗体であり、他方の重鎖と軽鎖が着目抗原以外の抗原に特異的である２価抗体を作製してもよい。
【０１８５】
本発明の抗体又はその抗原結合部分の組換え発現に好ましいシステムでは、抗体重鎖と抗体軽鎖の両方をコードする組換え発現ベクターをリン酸カルシウムトランスフェクション法によりｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ細胞に導入する。組換え発現ベクター内で、遺伝子の高レベル転写を誘導するように抗体重鎖及び軽鎖遺伝子を各々ＣＭＶエンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター調節エレメントと機能的に連結する。メトトレキサート選択／増幅を使用してベクターをトランスフェクトされたＣＨＯ細胞の選択を可能にするＤＨＦＲ遺伝子も組換え発現ベクターに組込む。選択された形質転換宿主細胞を培養し、抗体重鎖及び軽鎖を発現させ、無傷の抗体を培養培地から回収する。標準分子生物学技術を使用して組換え発現ベクターを作製し、宿主細胞にトランスフェクトし、形質転換細胞を選択し、宿主細胞を培養し、培養培地から抗体を回収する。更に、本発明は組換え抗体が合成されるまで宿主細胞を適切な培養培地で培養することにより本発明の組換え抗体を合成する方法を提供する。本発明の組換え抗体は本願に開示するアミノ酸配列に対応する核酸分子を使用して作製することができる。１実施形態では、配列番号８６及び／又は８７に記載の核酸分子を組換え抗体の作製に使用する。前記方法は更に培養培地から組換え抗体を単離する工程を含むことができる。
【０１８６】
ＩＩＩ．抗ＥＧＦＲ抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）
本願に記載する抗ＥＧＦＲ抗体を薬物部分と結合させて抗ＥＧＦＲ抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を形成してもよい。抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は腫瘍関連抗原（例えばＥＧＦＲを発現する腫瘍）等の標的組織に１個以上の薬物部分を選択的に送達することができるため、疾患（例えば癌）の治療において抗体の治療効力を増すことができる。従って、ある種の実施形態において、本発明は治療（例えば癌の治療）用の抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣを提供する。
【０１８７】
本発明の抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣはＥＧＦＲ抗体（即ちＥＧＦＲと特異的に結合する抗体）を１個以上の薬物部分と連結したものである。ＡＤＣの特異性は抗体（即ち抗ＥＧＦＲ抗体）の特異性により決定される。１実施形態では、ＥＧＦＲを発現する形質転換癌細胞に体内で送達される１個以上の細胞毒性薬と抗ＥＧＦＲ抗体を連結する。
【０１８８】
本発明の抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣで使用することができる薬物の例と、抗体と１個以上の薬物を結合させるために使用することができるリンカーの例を以下に挙げる。「薬物」、「薬剤」及び「薬物部分」なる用語は本願では同義に使用する。「連結」及び「結合」なる用語も本願では同義に使用し、抗体と薬物部分を共有結合させることを意味する。
【０１８９】
所定の実施形態において、前記ＡＤＣは下式（式Ｉ）：
Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）ｎ    （Ｉ）
で表され、式中、Ａｂは抗体（例えば抗ＥＧＦＲ抗体ＡｂＡ）であり、（Ｌ−Ｄ）はリンカー−薬物部分である。リンカー−薬物部分はリンカーであるＬ−と、例えば標的細胞（例えばＥＧＦＲを発現する細胞）に対する細胞増殖抑制作用、細胞傷害作用又は他の治療作用をもつ薬物部分である−Ｄから構成され、ｎは１〜２０の整数である。所定の実施形態において、ｎは１〜８、１〜７、１〜６、１〜５、１〜４、１〜３、１〜２、又は１である。ＡＤＣのＤＡＲは式Ｉに記載する「ｎ」と等価である。１実施形態において、前記ＡＤＣは式Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）ｎで表され、式中、Ａｂは抗ＥＧＦＲ抗体（例えばＡｂＡ）であり、Ｌはリンカー、例えばバリン−シトルリン（ｖｃ）であり、Ｄは薬物（例えばＭＭＡＦやＭＭＡＥ等のアウリスタチン）であり、ｎは２〜４（ＤＡＲ２〜４に等価）である。本発明のＡＤＣで使用することができる薬物（式ＩのＤ）及びリンカー（式ＩのＬ）と代替ＡＤＣ構造について以下に更に詳細に説明する。
【０１９０】
Ａ．抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣ：結合用薬物の例
１個以上の薬物を着目細胞（例えばＥＧＦＲを発現する癌細胞）に標的送達するためにＡＤＣで抗ＥＧＦＲ抗体を使用することができる。本発明の抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣは例えば１個以上の薬物を特定細胞に送達する際に抗癌治療で頻繁に認められる副作用を減らすことができる標的療法を実現する。
【０１９１】
アウリスタチン
本発明の抗ＥＧＦＲ抗体（例えばＡｂＡ抗体）を少なくとも１個のアウリスタチンと結合させてもよい。アウリスタチンは微小管ダイナミクス及びＧＴＰ加水分解を妨害して細胞分裂を阻害することにより抗癌作用をもつことが一般に示されている１群のドラスタチンアナログを表す。例えば、アウリスタチンＥ（米国特許第５，６３５，４８３号）は抗癌薬であるビンクリスチンと同一のチューブリン上の部位に結合することによりチューブリン重合を阻害する化合物である海洋天然物ドラスタチン１０の合成アナログである（Ｇ．Ｒ．Ｐｅｔｔｉｔ，Ｐｒｏｇ．Ｃｈｅｍ．Ｏｒｇ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ，７０：１−７９（１９９７））。ドラスタチン１０、アウリスタチンＰＥ及びアウリスタチンＥは４種のアミノ酸からなる直鎖ペプチドであり、そのうちの３種はドラスタチン類の化合物に特有である。有糸分裂阻害剤のアウリスタチンサブクラスの具体的な実施形態としては、限定されないが、モノメチルアウリスタチンＤ（ＭＭＡＤないしアウリスタチンＤ誘導体）、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥないしアウリスタチンＥ誘導体）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦないしアウリスタチンＦ誘導体）、アウリスタチンＦフェニレンジアミン（ＡＦＰ）、アウリスタチンＥＢ（ＡＥＢ）、アウリスタチンＥＦＰ（ＡＥＦＰ）及び５−ベンゾイル吉草酸ＡＥエステル（ＡＥＶＢ）が挙げられる。アウリスタチン誘導体の合成と構造は各々本願に援用する米国特許出願公開第２００３−００８３２６３号、２００５−０２３８６４９号及び２００５−０００９７５１号；国際特許公開第ＷＯ０４／０１０９５７号、国際特許公開第ＷＯ０２／０８８１７２号、並びに米国特許第６，３２３，３１５号；６，２３９，１０４号；６，０３４，０６５号；５，７８０，５８８号；５，６６５，８６０号；５，６６３，１４９号；５，６３５，４８３号；５，５９９，９０２号；５，５５４，７２５号；５，５３０，０９７号；５，５２１，２８４号；５，５０４，１９１号；５，４１０，０２４号；５，１３８，０３６号；５，０７６，９７３号；４，９８６，９８８号；４，９７８，７４４号；４，８７９，２７８号；４，８１６，４４４号；及び４，４８６，４１４号に記載されている。
【０１９２】
１実施形態では、本発明の抗ＥＧＦＲ抗体（例えばＡｂＡ）を少なくとも１個のＭＭＡＥ（モノメチルアウリスタチンＥ）と結合させる。モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ，ベドチン）はチューブリンの重合を阻止することにより細胞分裂を阻害する。毒性が非常に強いため、薬物のまま使用することができない。最近の癌治療開発では、癌細胞中の特定のマーカー発現を認識してＭＭＡＥをこの癌細胞に誘導するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）と連結されている。１実施形態において、ＭＭＡＥを抗ＥＧＦＲ抗体に連結するリンカーは細胞外液（即ち細胞の外部の媒体又は環境）中では安定しているが、ＡＤＣが特定の癌細胞抗原と結合してこの癌細胞に侵入すると、カテプシンにより切断され、毒性のＭＭＡＥを放出し、強力な有糸分裂阻害メカニズムを活性化させる。
【０１９３】
１実施形態では、本願に記載の抗ＥＧＦＲ抗体（例えばＡｂＡ）を少なくとも１個のＭＭＡＦ（モノメチルアウリスタチンＦ）と結合させる。モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）はチューブリンの重合を阻止することにより細胞分裂を阻害する。Ｃ末端荷電フェニルアラニン残基をもつため、荷電していないその対応物であるＭＭＡＥに比較して細胞傷害活性が低い。毒性が非常に強いため、薬物のまま使用することはできないが、癌細胞に誘導するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）と連結することができる。１実施形態において、抗ＥＧＦＲ抗体とのリンカーは細胞外液中では安定しているが、コンジュゲートが腫瘍細胞に侵入すると、カテプシンにより切断され、有糸分裂阻害メカニズムを活性化させる。
【０１９４】
ＭＭＡＦ及びＭＭＡＥの構造を以下に示す。
【０１９５】
【化６】
2020039360.tif 000009
【０１９６】
更にＡｂＡ−ｖｃＭＭＡＥの１例を図１１に示す。特に、図１１は抗体（例えばＡｂＡ）を１個の薬物と連結し、従って、ＤＡＲが１である状況を示す。ある種の実施形態において、前記ＡＤＣはＤＡＲが２〜８、あるいは２〜４となる。
【０１９７】
他の結合用薬物
ＡＤＣで使用することができる薬物、即ち本発明の抗ＥＧＦＲ抗体と結合させることができる薬物の例としては、有糸分裂阻害剤、抗腫瘍性抗生物質、免疫調節剤、遺伝子治療用ベクター、アルキル化剤、抗血管新生薬、代謝拮抗剤、ホウ素含有剤、化学療法剤、ホルモン剤、グルココルチコイド、感光性治療剤、オリゴヌクレオチド、放射性同位体、放射線増感剤、トポイソメラーゼ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤及びその組合せが挙げられる。
【０１９８】
１．有糸分裂阻害剤
１態様では、癌の治療用ＡＤＣを形成するために抗ＥＧＦＲ抗体を１個以上の有糸分裂阻害剤と結合させてもよい。本願で使用する「有糸分裂阻害剤」なる用語は癌細胞に特に重要な生物学的プロセスである有糸分裂又は細胞分裂を阻止する細胞毒性剤及び／又は治療剤を意味する。有糸分裂阻害剤は、多くの場合には微小管重合又は微小管脱重合に作用することにより、細胞分裂を妨害するように微小管を崩壊させる。従って、１実施形態では、チューブリン重合を阻害することにより微小管形成を妨害する１個以上の有糸分裂阻害剤と本発明の抗ＥＧＦＲ抗体を結合させる。１実施形態において、本発明のＡＤＣで使用される有糸分裂阻害剤は、Ｉｘｅｍｐｒａ（イクサベピロン）である。本発明の抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣで使用することができる有糸分裂阻害剤を以下に挙げる。上記アウリスタチンも有糸分裂阻害剤の部類に含まれる。
【０１９９】
ａ．ドラスタチン
本発明の抗ＥＧＦＲ抗体を少なくとも１個のドラスタチンと結合させてＡＤＣを形成することができる。ドラスタチンはインド洋アメフラシＤｏｌａｂｅｌｌａ  ａｕｒｉｃｕｌａｒｉａから単離された短いペプチド化合物である（Ｐｅｔｔｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９７６，９８，４６７７参照。）。ドラスタチンの例としてはドラスタチン１０とドラスタチン１５が挙げられる。ドラスタチン１５はＤｏｌａｂｅｌｌａ  ａｕｒｉｃｕｌａｒｉａに由来する７サブユニットのデプシペプチドであり、同一生物に由来する５サブユニットペプチドである抗チューブリン剤ドラスタチン１０と構造的に近縁の強力な有糸分裂阻害剤である。従って、１実施形態において、本発明の抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣは本願に記載するような抗ＥＧＦＲ抗体と、少なくとも１個のドラスタチンを含む。上記アウリスタチンはドラスタチン１０の合成誘導体である。
【０２００】
ｂ．メイタンシノイド
本発明の抗ＥＧＦＲ抗体を少なくとも１個のメイタンシノイドと結合させてＡＤＣを形成することができる。メイタンシノイドは、高等植物であるニシキギ科（Ｃｅｌａｓｔｒａｃｅａｅ）、クロウメモドキ科（Ｒｈａｍｎａｃｅａｅ）及びトウダイグサ科（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａｃｅａｅ）と所定種の苔類のメンバーから最初に単離された強力な抗腫瘍剤である（Ｋｕｐｃｈａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９４：１３５４−１３５６［１９７２］；Ｗａｎｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．３９０：［１９７３］；Ｐｏｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．４６：６６０−６６６［１９８３］；Ｓａｋａｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．５１：８４５−８５０［１９８８］；及びＳｕｗａｎｂｏｒｉｒｕｘ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ  ４６：１１７−１２０［１９９０］）。メイタンシノイドは、微小管タンパク質であるチューブリンの重合を阻害することにより有糸分裂を阻害し、微小管の形成を妨害することが示唆されている（例えば米国特許第６，４４１，１６３号及びＲｅｍｉｌｌａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１８９，１００２−１００５（１９７５）参照。）。メイタンシノイドは、腫瘍細胞増殖を阻害することが細胞培養モデルを使用してインビトロで示されると共に、実験動物システムを使用してインビボでも示されている。更に、メイタンシノイドの細胞毒性は例えばメトトレキサート、ダウノルビシン及びビンクリスチン等の従来の化学療法剤の１，０００倍である（例えば米国特許第５，２０８，０２０号参照。）。
【０２０１】
メイタンシノイドとしては、メイタンシン、メイタンシノール、メイタンシノールのＣ３エステル、並びに他のメイタンシノールアナログ及び誘導体が挙げられる（例えば各々本願に援用する米国特許第５，２０８，０２０号及び６，４４１，１６３号参照。）。メイタンシノールのＣ３エステルは天然型でも合成により誘導したものでもよい。更に、天然及び合成Ｃ３メイタンシノールエステルはいずれも単純なカルボン酸とのＣ３エステル又はＮ−メチル−Ｌ−アラニンの誘導体とのＣ３エステルとして分類することができ、後者のほうが前者よりも細胞毒性が強い。合成メイタンシノイドアナログは例えばＫｕｐｃｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２１，３１−３７（１９７８）に記載されている。
【０２０２】
本発明のＡＤＣで使用するのに適したメイタンシノイドは、天然原料から単離することもできるし、合成により生産することもできるし、半合成的に生産することもできる。更に、メイタンシノイドは、最終的なコンジュゲート分子に十分な細胞毒性が維持される限り、任意の適切な方法で修飾することができる。この点で、メイタンシノイドは、抗体を連結できる適切な官能基をもたない。メイタンシノイドを抗体と連結してコンジュゲートを形成するには連結部分を利用することが望ましく、これについてはセクションＩＩＩ．Ｂに詳述する。メイタンシノイドの１例であるメルタンシン（ＤＭ１）の構造を以下に示す。
【０２０３】
【化７】
2020039360.tif 000010
【０２０４】
メイタンシノイドの代表例としては、限定されないが、ＤＭ１（Ｎ２’−デアセチル−Ｎ２’−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）メイタンシン；別称メルタンシン、メイタンシノイド薬１；ＩｍｍｕｎｏＧｅｎ，Ｉｎｃ．；Ｃｈａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５２：１２７も参照。）、ＤＭ２、ＤＭ３（Ｎ２’−デアセチル−Ｎ２’−（４−メルカプト−１−オキソペンチル）メイタンシン）、ＤＭ４（（４−メチル−４−メルカプト−１−オキソペンチル）メイタンシン）及びメイタンシノール（合成メイタンシノイドアナログ）が挙げられる。メイタンシノイドの他の例は本願に援用する米国特許第８，１４２，７８４号に記載されている。
【０２０５】
アンサマイトシンは種々の細菌原料から単離された１群のメイタンシノイド抗生物質である。これらの化合物は強力な抗腫瘍活性をもつ。代表例としては、限定されないが、アンサマイトシンＰ１、アンサマイトシンＰ２、アンサマイトシンＰ３及びアンサマイトシンＰ４が挙げられる。
【０２０６】
本発明の１実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体を少なくとも１個のＤＭ１と結合させる。１実施形態では、ＥＧＦＲ抗体を少なくとも１個のＤＭ２と結合させる。１実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体を少なくとも１個のＤＭ３と結合させる。１実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体を少なくとも１個のＤＭ４と結合させる。
【０２０７】
ｄ．植物アルカロイド
本発明の抗ＥＧＦＲ抗体を少なくとも１個の植物アルカロイド（例えばタキサン又はビンカアルカロイド）と結合させてもよい。植物アルカロイドはある種の植物から生産される化学療法薬である。ビンカアルカロイドはニチニチソウ（ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ  ｒｏｓｅａ）から生産され、タキサンはタイヘイヨウイチイ（ｔａｘｕｓ）の樹皮から生産される。ビンカアルカロイド及びタキサンはいずれも抗微小管剤とも呼ばれており、以下に更に詳細に記載する。
【０２０８】
タキサン
本願に記載する抗ＥＧＦＲ抗体を少なくとも１個のタキサンと結合させてもよい。本願で使用する「タキサン」なる用語は微小管作用のメカニズムをもち、タキサン環構造と細胞増殖抑制作用に必要な立体特異的側鎖を含む構造をもつ類の抗新生物剤を意味する。親水性誘導体と疎水性誘導体の両者を含む種々の公知誘導体も「タキサン」なる用語に含まれる。タキサン誘導体としては、限定されないが、各々本願に援用する国際特許出願第ＷＯ９９／１８１１３号に記載のガラクトース及びマンノース誘導体；ＷＯ９９／１４２０９に記載のピペラジノ及び他の誘導体；ＷＯ９９／０９０２１、ＷＯ９８／２２４５１及び米国特許第５，８６９，６８０号に記載のタキサン誘導体；ＷＯ９８／２８２８８に記載の６−チオ誘導体；米国特許第５，８２１，２６３号に記載のスルフェンアミド誘導体；並びに米国特許第５，４１５，８６９号に記載のタキソール誘導体が挙げられる。タキサン化合物はこれまでにいずれも本願に援用する米国特許第５，６４１，８０３号、５，６６５，６７１号、５，３８０，７５１号、５，７２８，６８７号、５，４１５，８６９号、５，４０７，６８３号、５，３９９，３６３号、５，４２４，０７３号、５，１５７，０４９号、５，７７３，４６４号、５，８２１，２６３号、５，８４０，９２９号、４，８１４，４７０号、５，４３８，０７２号、５，４０３，８５８号、４，９６０，７９０号、５，４３３，３６４号、４，９４２，１８４号、５，３６２，８３１号、５，７０５，５０３号及び５，２７８，３２４号にも記載されている。タキサンのその他の例としては、限定されないが、ドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ；Ｓａｎｏｆｉ  Ａｖｅｎｔｉｓ）、パクリタキセル（Ａｂｒａｘａｎｅ又はＴａｘｏｌ；Ａｂｒａｘｉｓ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ）及びナノ粒子パクリタキセル（ＡＢＩ−００７／Ａｂｒａｘｅｎｅ；Ａｂｒａｘｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）が挙げられる。
【０２０９】
１実施形態では、本発明の抗ＥＧＦＲ抗体を少なくとも１個のドセタキセルと結合させる。１実施形態では、本発明の抗ＥＧＦＲ抗体を少なくとも１個のパクリタキセルと結合させる。
【０２１０】
ビンカアルカロイド
１実施形態では、前記抗ＥＧＦＲ抗体を少なくとも１個のビンカアルカロイドと結合させる。ビンカアルカロイドはチューブリンに作用して微小管の形成を妨害することにより癌細胞の分裂能を阻害する機能をもつ類の細胞周期特異的薬物である。本発明のＡＤＣで使用することができるビンカアルカロイドの例としては、限定されないが、ビンデシン硫酸塩、ビンクリスチン、ビンブラスチン及びビノレルビンが挙げられる。
【０２１１】
２．抗腫瘍性抗生物質
癌の治療用として本発明の抗ＥＧＦＲ抗体を１個以上の抗腫瘍性抗生物質と結合させてもよい。本願で使用する「抗腫瘍性抗生物質」なる用語はＤＮＡに干渉することにより細胞増殖を阻止し、微生物から生産される抗新生物薬を意味する。多くの場合、抗腫瘍性抗生物質はＤＮＡ鎖を分解するか又はＤＮＡ合成を減速もしくは停止させる。本発明の抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣに含むことができる抗腫瘍性抗生物質の例としては、限定されないが、アクチノマイシン（例えばピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン）、アントラサイクリン、カリケアマイシン及びデュオカルマイシンが挙げられ、以下に更に詳細に記載する。
【０２１２】
ａ．アクチノマイシン
本発明の抗ＥＧＦＲ抗体を少なくとも１個のアクチノマイシンと結合させてもよい。アクチノマイシンはストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）の細菌から単離された抗腫瘍性抗生物質のサブクラスである。アクチノマイシンの代表例としては、限定されないが、アクチノマイシンＤ（Ｃｏｓｍｅｇｅｎ［別称アクチノマイシン、ダクチノマイシン、アクチノマイシンＩＶ、アクチノマイシンＣ１］、Ｌｕｎｄｂｅｃｋ，Ｉｎｃ．）、アントラマイシン、チカマイシンＡ、ＤＣ−８１、マゼトラマイシン、ネオトラマイシンＡ、ネオトラマイシンＢ、ポロトラマイシン、プロトラカルシンＢ、ＳＧ２２８５、シバノマイシン、シビロマイシン及びトマイマイシンが挙げられる。１実施形態では、本発明の抗ＥＧＦＲ抗体を少なくとも１個のピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）と結合させる。ＰＢＤの例としては、限定されないが、アントラマイシン、チカマイシンＡ、ＤＣ−８１、マゼトラマイシン、ネオトラマイシンＡ、ネオトラマイシンＢ、ポロトラマイシン、プロトラカルシンＢ、ＳＧ２０００（ＳＪＧ−１３６）、ＳＧ２２０２（ＺＣ−２０７）、ＳＧ２２８５（ＺＣ−４２３）、シバノマイシン、シビロマイシン及びトマイマイシンが挙げられる。従って、１実施形態では、本発明の抗ＥＧＦＲ抗体を少なくとも１個のアクチノマイシン（例えばアクチノマイシンＤ）又は少なくとも１個のＰＢＤ（例えばピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）二量体）と結合させる。
【０２１３】
ＰＢＤの構造は例えば各々その開示内容全体を本願に援用する米国特許出願公開第２０１３／００２８９１７号及び２０１３／００２８９１９号、並びにＷＯ２０１１／１３０５９８Ａ１に記載されている。ＰＢＤの一般構造を以下に示す。
【０２１４】
【化８】
2020039360.tif 000011
【０２１５】
ＰＢＤはその芳香環Ａ及びピロロ環Ｃの両者における置換基の数、種類及び位置と、Ｃ環の飽和度が種々に異なる。Ｂ環には、一般にＤＮＡのアルキル化に関与する求電子中心であるＮ１０−Ｃ１１位にイミン（Ｎ＝Ｃ）、カルビノールアミン（ＮＨ−ＣＨ（ＯＨ））又はカルビノールアミンメチルエーテル（ＮＨ−ＣＨ（ＯＭｅ））が存在する。全ての公知天然物はキラルＣ１１α位に（Ｓ）配置をもつため、Ｃ環からＡ環に向かって見たときに右にねじれた構造をとる。本願に例示するＰＢＤを本発明の抗ＥＧＦＲ抗体と結合させることができる。本発明の抗ＥＧＦＲ抗体と結合させることができるＰＢＤのその他の例は例えば各々その開示内容全体を本願に援用する米国特許出願公開第２０１３／００２８９１７Ａ１号及び２０１３／００２８９１９Ａ１号、米国特許第７，７４１，３１９Ｂ２号、並びにＷＯ２０１１／１３０５９８Ａ１及びＷＯ２００６／１１１７５９Ａ１に記載されている。
【０２１６】
下式ＩＩを有する代表的なＰＢＤ二量体を本発明の抗ＥＧＦＲ抗体と結合させることができる。
【０２１７】
【化９】
2020039360.tif 000012
式中、Ｒ２は式ＩＩＩ：
【０２１８】
【化１０】
2020039360.tif 000013
で表され、式中、ＡはＣ５−７アリール基であり、Ｘは−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）−、及び−Ｎ（ＲＮ）−［式中、ＲＮはＨ、Ｃ１−４アルキル及び（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｍＣＨ３から構成される群から選択され、但し、ｍは１〜３である。］から構成される群から選択されるリンカー単位と連結される基であり：
（ｉ）Ｑ１は単結合であり、Ｑ２は単結合及び−Ｚ−（ＣＨ２）ｎ−（式中、Ｚは単結合、Ｏ、Ｓ及びＮＨから構成される群から選択され、ｎは１〜３である。）から構成される群から選択され；あるいは
（ｉｉ）Ｑ１は−ＣＨ＝ＣＨ−であり、Ｑ２は単結合であり；
Ｒ１２はハロ、ニトロ、シアノ、Ｃ１−１２アルコキシ、Ｃ３−２０ヘテロシクロアルコキシ、Ｃ５−２０アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、アルキルアルコキシ、アリールアルコキシ、アルキルアリールオキシ、ヘテロアリールアルコキシ、アルキルヘテロアリールオキシ、Ｃ１−７アルキル、Ｃ３−７ヘテロシクリル及びビスオキシ−Ｃ１−３アルキレンから構成される群から選択される１個以上の置換基で場合により置換されたＣ５−１０アリール基であり；
Ｒ６及びＲ９は独立してＨ、Ｒ、ＯＨ、ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲＲ’、ニトロ、Ｍｅ３Ｓｎ及びハロから構成される群から選択され；
但し、Ｒ及びＲ’は独立して場合により置換されたＣ１−１２アルキル基、Ｃ３−２０ヘテロシクリル基及びＣ５−２０アリール基から構成される群から選択され；
Ｒ７はＨ、Ｒ、ＯＨ、ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＨＲＲ’、ニトロ、Ｍｅ３Ｓｎ及びハロから構成される群から選択され；
（ａ）Ｒ１０はＨであり、Ｒ１１はＯＨ、ＯＲＡであり、但し、ＲＡはＣ１−４アルキルであり；あるいは
（ｂ）Ｒ１０とＲ１１はそれらが結合している窒素原子と炭素原子の間に窒素−炭素二重結合を形成し；あるいは
（ｃ）Ｒ１０はＨであり、Ｒ１１はＳＯｚＭであり、但し、ｚは２又は３であり；
Ｒ１１はＯ、Ｓ、ＮＨ及び芳香環から構成される群から選択される１個以上のヘテロ原子を鎖中に含んでいてもよいＣ３−１２アルキレン基であり；
Ｙ及びＹ’はＯ、Ｓ及びＮＨから構成される群から選択され；
Ｒ６’、Ｒ７’、Ｒ９’は夫々Ｒ６、Ｒ７及びＲ９と同一の基から選択され、Ｒ１０’及びＲ１１’はＲ１０及びＲ１１と同一であり、各Ｍは１価の医薬的に許容可能なカチオンであり、あるいは２つのＭ基は一緒になって２価の医薬的に許容可能なカチオンとなる。
【０２１９】
本願で使用する「場合により置換され」なる用語は親基が置換されていなくてもよいし、置換されていてもよいという意味である。
【０２２０】
特に指定しない限り、本願で使用する「置換」なる用語は親基が１個以上の置換基をもつことを意味する。「置換基」なる用語は本願では従来通りの意味で使用し、親基と共有結合、又は必要に応じて縮合した化学部分を意味する。多様な置換基が周知であり、その形成方法と種々の親基への導入方法も周知である。
【０２２１】
Ｃ１−１２アルキル：本願で使用する「Ｃ１−１２アルキル」なる用語は炭素原子数１〜１２の炭化水素化合物の炭素原子から水素原子を取除くことにより得られる１価部分を意味し、脂肪族でも脂環族でもよく、飽和でも不飽和（例えば部分不飽和、完全不飽和）でもよい。即ち、「アルキル」なる用語は以下に記載するサブクラスであるアルケニル、アルキニル、シクロアルキル等を包含する。
【０２２２】
飽和アルキル基の例としては、限定されないが、メチル（Ｃ１）、エチル（Ｃ２）、プロピル（Ｃ３）、ブチル（Ｃ４）、ペンチル（Ｃ５）、ヘキシル（Ｃ６）及びヘプチル（Ｃ７）が挙げられる。
【０２２３】
飽和直鎖アルキル基の例としては、限定されないが、メチル（Ｃ１）、エチル（Ｃ２）、ｎ−プロピル（Ｃ３）、ｎ−ブチル（Ｃ４）、ｎ−ペンチル（アミル）（Ｃ５）、ｎ−ヘキシル（Ｃ６）及びｎ−ヘプチル（Ｃ７）が挙げられる。
【０２２４】
飽和分岐鎖アルキル基の例としては、イソプロピル（Ｃ３）、イソブチル（Ｃ４）、ｓｅｃ−ブチル（Ｃ４）、ｔｅｒｔ−ブチル（Ｃ４）、イソペンチル（Ｃ５）及びネオペンチル（Ｃ５）が挙げられる。
【０２２５】
Ｃ３−２０ヘテロシクリル：本願で使用する「Ｃ３−２０ヘテロシクリル」なる用語は複素環式化合物の環原子から水素原子を取除くことにより得られる１価部分を意味し、前記部分は環原子数３〜２０であり、そのうち１〜１０個が環ヘテロ原子である。各環は環原子数３〜７であり、そのうち１〜４個が環ヘテロ原子であることが好ましい。
【０２２６】
この文脈で下付き文字（例えばＣ３−２０、Ｃ３−７、Ｃ５−６等）は炭素原子であるか又はヘテロ原子であるかに関係なく、環原子数又は環原子数の範囲を表す。例えば、本願で使用する「Ｃ５−６ヘテロシクリル」なる用語は環原子数５又は６のヘテロシクリル基を意味する。
【０２２７】
Ｎ１：アジリジン（Ｃ３）、アゼチジン（Ｃ４）、ピロリジン（テトラヒドロピロール）（Ｃ５）、ピロリン（例えば３−ピロリン、２，５−ジヒドロピロール）（Ｃ５）、２Ｈ−ピロール又は３Ｈ−ピロール（イソピロール、イソアゾール）（Ｃ５）、ピペリジン（Ｃ６）、ジヒドロピリジン（Ｃ６）、テトラヒドロピリジン（Ｃ６）、アゼピン（Ｃ７）；Ｏ１：オキシラン（Ｃ３）、オキセタン（Ｃ４）、オキソラン（テトラヒドロフラン）（Ｃ５）、オキソール（ジヒドロフラン）（Ｃ５）、オキサン（テトラヒドロピラン）（Ｃ６）、ジヒドロピラン（Ｃ６）、ピラン（Ｃ６）、オキセピン（Ｃ７）；Ｓ１：チイラン（Ｃ３）、チエタン（Ｃ４）、チオラン（テトラヒドロチオフェン）（Ｃ５）、チアン（テトラヒドロチオピラン）（Ｃ６）、チエパン（Ｃ７）；Ｏ２：ジオキソラン（Ｃ５）、ジオキサン（Ｃ６）及びジオキセパン（Ｃ７）；Ｏ３：トリオキサン（Ｃ６）；Ｎ２：イミダゾリジン（Ｃ５）、ピラゾリジン（ジアゾリジン）（Ｃ５）、イミダゾリン（Ｃ５）、ピラゾリン（ジヒドロピラゾール）（Ｃ５）、ピペラジン（Ｃ６）；Ｎ１Ｏ１：テトラヒドロオキサゾール（Ｃ５）、ジヒドロオキサゾール（Ｃ５）、テトラヒドロイソオキサゾール（Ｃ５）、ジヒドロイソオキサゾール（Ｃ５）、モルホリン（Ｃ６）、テトラヒドロオキサジン（Ｃ６）、ジヒドロオキサジン（Ｃ６）、オキサジン（Ｃ６）；Ｎ１Ｓ１：チアゾリン（Ｃ５）、チアゾリジン（Ｃ５）、チオモルホリン（Ｃ６）；Ｎ２Ｏ１：オキサジアジン（Ｃ６）；Ｏ１Ｓ１：オキサチオール（Ｃ５）及びオキサチアン（チオキサン）（Ｃ６）；並びにＮ１Ｏ１Ｓ１：オキサチアジン（Ｃ６）。
【０２２８】
置換の単環式ヘテロシクリル基の例としては、環状糖類、例えばアラビノフラノース、リキソフラノース、リボフラノース及びキシロフラノース等のフラノース類（Ｃ５）や、アロピラノース、アルトロピラノース、グルコピラノース、マンノピラノース、グロピラノース、イドピラノース、ガラクトピラノース及びタロピラノース等のピラノース類（Ｃ６）に由来するものが挙げられる。
【０２２９】
Ｃ５−２０アリール：本願で使用する「Ｃ５−２０アリール」なる用語は芳香族化合物の芳香環原子から水素原子を取除くことにより得られる１価部分を意味し、この部分は環原子数３〜２０である。各環は環原子数５〜７が好ましい。
【０２３０】
この文脈で下付き文字（例えばＣ３−２０、Ｃ５−７、Ｃ５−６等）は炭素原子であるか又はヘテロ原子であるかに関係なく、環原子数又は環原子数の範囲を表す。例えば、本願で使用する「Ｃ５−６アリール」なる用語は環原子数５又は６のアリール基を意味する。
【０２３１】
１実施形態では、本発明の抗ＥＧＦＲ抗体を下式：
【０２３２】
【化１１】
2020039360.tif 000014
を有するＰＢＤ二量体と結合させることができ、上記構造はＰＢＤ二量体であるＳＧ２２０２（ＺＣ−２０７）を表し、リンカーＬを介して本発明の抗ＥＧＦＲ抗体と結合される。ＳＧ２２０２（ＺＣ−２０７）は例えばその開示内容全体を本願に援用する米国特許出願公開第２００７／０１７３４９７号に開示されている。
【０２３３】
別の実施形態では、図２１に示すように薬物リンカーを介してＰＢＤ二量体であるＳＧＤ−１８８２を本発明の抗ＥＧＦＲ抗体と結合させる。ＳＧＤ−１８８２はその開示内容全体を本願に援用するＳｕｔｈｅｒｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｂｌｏｏｄ  １２２（８）：１４５５及び米国特許出願公開第２０１３／００２８９１９号に開示されている。図２１に示すように、ｍｃ−ｖａｌ−ａｌａ−ジペプチドリンカーを介してＰＢＤ二量体であるＳＧＤ−１８８２を抗体と結合させることができる（図２１では全体をＳＧＤ−１９１０と称する。）。ある種の実施形態では、本願に開示するような抗ＥＧＦＲ抗体を図２１に示すＰＢＤ二量体と結合させる。従って、別の実施形態において、本発明は図２１に示すようにｍｃ−ｖａｌ−ａｌａ−ジペプチドリンカーを介してＰＢＤ二量体と結合させた本願に開示するような抗ＥＧＦＲ抗体を包含する。ある種の実施形態において、本発明は配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン及び配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含む重鎖可変領域と、配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン及び配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインとを含む軽鎖可変領域を含む抗ＥＧＦＲ抗体を、限定されないが、図２１に示すＰＢＤ二量体等のＰＢＤと結合させたものを包含する。ある種の実施形態において、本発明は配列番号９に記載のアミノ酸配列により表されるＡｂＡの重鎖可変領域と、配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む抗ＥＧＦＲ抗体を、限定されないが、図２１の典型的ＰＢＤ二量体等のＰＢＤと結合させたものを包含する。
【０２３４】
ｂ．アントラサイクリン
本発明の抗ＥＧＦＲ抗体を少なくとも１個のアントラサイクリンと結合させてもよい。アントラサイクリンはストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）の細菌から単離された抗腫瘍性抗生物質のサブクラスである。代表例としては、限定されないが、ダウノルビシン（Ｃｅｒｕｂｉｄｉｎｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ドキソルビシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ，Ｂｅｄｆｏｒｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；別称ドキソルビシン塩酸塩、ヒドロキシダウノルビシン及びＲｕｂｅｘ）、エピルビシン（Ｅｌｌｅｎｃｅ，Ｐｆｉｚｅｒ）及びイダルビシン（Ｉｄａｍｙｃｉｎ；Ｐｆｉｚｅｒ  Ｉｎｃ．）が挙げられる。従って、１実施形態では、本発明の抗ＥＧＦＲ抗体を少なくとも１個のアントラサイクリン（例えばドキソルビシン）に結合させる。
【０２３５】
ｃ．カリケアマイシン
本発明の抗ＥＧＦＲ抗体を少なくとも１個のカリケアマイシンと結合させてもよい。カリケアマイシンは土壌生物Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ｅｃｈｉｎｏｓｐｏｒａに由来するエンジイン抗生物質のファミリーである。カリケアマイシンはＤＮＡの副溝と結合し、２本鎖ＤＮＡの切断を引き起こし、他の化学療法剤の１００倍の強さで細胞死をもたらす（Ｄａｍｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ３：３８６）。本発明で薬物コンジュゲートとして使用することができるカリケアマイシンの製造は米国特許第５，７１２，３７４号；５，７１４，５８６号；５，７３９，１１６号；５，７６７，２８５号；５，７７０，７０１号；５，７７０，７１０号；５，７７３，００１号；及び５，８７７，２９６号に記載されている。使用することができるカリケアマイシンの構造類似体としては、限定されないが、γ１Ｉ、α２Ｉ、α３Ｉ、Ｎ−アセチル−γ１Ｉ、ＰＳＡＧ及びθＩ１が挙げられる（Ｈｉｎｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５３：３３３６−３３４２（１９９３），Ｌｏｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５８：２９２５−２９２８（１９９８）並びに米国特許第５，７１２，３７４号；５，７１４，５８６号；５，７３９，１１６号；５，７６７，２８５号；５，７７０，７０１号；５，７７０，７１０号；５，７７３，００１号；及び５，８７７，２９６号）。従って、１実施形態では、本発明の抗ＥＧＦＲ抗体を少なくとも１個のカリケアマイシンと結合させる。
【０２３６】
ｄ．デュオカルマイシン
本発明の抗ＥＧＦＲ抗体を少なくとも１個のデュオカルマイシンと結合させてもよい。デュオカルマイシンはストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）の細菌から単離された抗腫瘍性抗生物質のサブクラスである（Ｎａｇａｍｕｒａ  ａｎｄ  Ｓａｉｔｏ（１９９８）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，Ｖｏｌ．３４，Ｎｏ．１２参照。）。デュオカルマイシンはＤＮＡの副溝と結合し、Ｎ３位のヌクレオ塩基アデニンをアルキル化する（Ｂｏｇｅｒ（１９９３）Ｐｕｒｅ  ａｎｄ  Ａｐｐｌ  Ｃｈｅｍ  ６５（６）：１１２３；及びＢｏｇｅｒ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ（１９９５）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９２：３６４２）。デュオカルマイシンの合成アナログとしては、限定されないが、アドゼレシン、ビゼレシン及びカルゼレシンが挙げられる。従って、１実施形態では、本発明の抗ＥＧＦＲ抗体を少なくとも１個のデュオカルマイシンに結合させる。
【０２３７】
ｅ．他の抗腫瘍性抗生物質
上記以外に本発明の抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣで使用することができるその他の抗腫瘍性抗生物質としては、ブレオマイシン（Ｂｌｅｎｏｘａｎｅ，Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）、マイトマイシン及びプリカマイシン（別称ミトラマイシン）が挙げられる。
【０２３８】
３．免疫調節剤
１態様では、本発明の抗ＥＧＦＲ抗体を少なくとも１個の免疫調節剤と結合させてもよい。本願で使用する「免疫調節剤」なる用語は免疫応答を刺激又は調節することができる物質を意味する。１実施形態において、免疫調節剤は対象の免疫応答を強化する免疫刺激剤である。別の実施形態において、免疫調節剤は対象の免疫応答を防止又は抑制する免疫抑制剤である。免疫調節剤は骨髄性細胞（単球、マクロファージ、樹状細胞、巨核球及び顆粒球）又はリンパ細胞（Ｔ細胞、Ｂ細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞）及びその任意の分化細胞を調節することができる。代表例としては、限定されないが、カルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）とレバミゾール（Ｅｒｇａｍｉｓｏｌ）が挙げられる。本発明のＡＤＣで使用することができる免疫調節剤の他の例としては、限定されないが、癌ワクチン、サイトカイン及び免疫調節遺伝子治療が挙げられる。
【０２３９】
ａ．癌ワクチン
本発明の抗ＥＧＦＲ抗体を癌ワクチンと結合させてもよい。本願で使用する「癌ワクチン」なる用語は腫瘍特異的免疫応答を誘発する組成物（例えば腫瘍抗原やサイトカイン）を意味する。癌ワクチンを投与することにより、又は本発明の場合には抗ＥＧＦＲ抗体と癌ワクチンを含むＡＤＣを投与することにより、対象自身の免疫系から応答を誘発する。好ましい実施形態では、免疫応答の結果として生体内の腫瘍細胞（例えば原発巣又は転移巣腫瘍細胞）が根絶する。癌ワクチンの使用は一般に例えば特定の癌細胞の表面に存在するか又は癌形成を助長することが分かっている特定の感染性物質の表面に存在する特定の抗原又は抗原群を投与するものである。所定の実施形態において、癌ワクチンの使用は予防目的であり、他の実施形態において、その使用は治療目的である。本発明の抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣで使用することができる癌ワクチンの非限定的な例としては、組換え２価ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）ワクチンタイプ１６及び１８ワクチン（Ｃｅｒｖａｒｉｘ，ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、組換え４価ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タイプ６、１１、１６及び１８ワクチン（Ｇａｒｄａｓｉｌ，Ｍｅｒｃｋ  ＆  Ｃｏｍｐａｎｙ）、並びにシプリューセルＴ（Ｐｒｏｖｅｎｇｅ，Ｄｅｎｄｒｅｏｎ）が挙げられる。従って、１実施形態では、本発明の抗ＥＧＦＲ抗体を免疫刺激剤又は免疫抑制剤である少なくとも１個の癌ワクチンと結合させる。
【０２４０】
ｂ．サイトカイン
本発明の抗ＥＧＦＲ抗体を少なくとも１個のサイトカインと結合させてもよい。「サイトカイン」なる用語は一般にある細胞集団により放出され、細胞内メディエーターとして別の細胞に作用するタンパク質を意味する。サイトカインは腫瘍部位の免疫エフェクター細胞と間質細胞を直接刺激し、細胞傷害性エフェクター細胞による腫瘍細胞認識を強化する（Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ｍａｒｇｏｌｉｎ（２０１１）Ｃａｎｃｅｒｓ  ３：３８５６）。多数の動物腫瘍モデル試験の結果、サイトカインは広い抗腫瘍活性をもつことが立証されており、癌治療用の多数のサイトカイン療法アプローチに応用されている（Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ｍａｒｇｏｌｉ，前出）。近年では、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８及びＩＬ−２１を含む多数のサイトカインが進行癌をもつ患者の臨床試験に入っている（Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ｍａｒｇｏｌｉ，前出）。
【０２４１】
本発明のＡＤＣで使用することができるサイトカインの例としては、限定されないが、副甲状腺ホルモン；サイロキシン；インスリン；プロインスリン；リラキシン；プロリラキシン；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）及び黄体形成ホルモン（ＬＨ）等の糖タンパク質ホルモン類；肝細胞増殖因子；線維芽細胞増殖因子；プロラクチン；胎盤性ラクトゲン；腫瘍壊死因子；ミュラー管抑制物質；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮細胞増殖因子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；ＮＧＦ等の神経成長因子；血小板増殖因子；トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）；インスリン様成長因子Ｉ及びＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘導因子；インターフェロンα、β及びγ等のインターフェロン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）；顆粒球マクロファージ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）；顆粒球−ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）；ＩＬ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２等のインターロイキン（ＩＬ）；腫瘍壊死因子；並びにＬＩＦ及びキットリガンド（ＫＬ）を含む他のポリペプチド因子が挙げられる。本願で使用するサイトカインなる用語は天然原料又は組換え細胞培養に由来するタンパク質と、天然型配列サイトカインの生物学的に活性な等価物を包含する。従って、１実施形態において、本発明は本願に記載する抗ＥＧＦＲ抗体とサイトカインを含むＡＤＣを提供する。
【０２４２】
ｃ．コロニー刺激因子（ＣＳＦ）
本発明の抗ＥＧＦＲ抗体を少なくとも１個のコロニー刺激因子（ＣＳＦ）と結合させてもよい。コロニー刺激因子（ＣＳＦ）は骨髄が赤血球を産生するのを助長する成長因子である。癌治療法（例えば化学療法）によっては（感染と戦う役割をもつ）白血球に影響を与えるものがあるため、白血球値の維持と免疫系の強化を助長するためにコロニー刺激因子を導入することができる。新しい骨髄が白血球の産生を開始し易くするために骨髄移植後にコロニー刺激因子を使用してもよい。本発明の抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣで使用することができるＣＳＦの代表例としては、限定されないが、エリスロポエチン（Ｅｐｏｅｔｉｎ）、フィルグラスチム（Ｎｅｏｐｏｇｅｎ（別称顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）；Ａｍｇｅｎ，Ｉｎｃ．）、サルグラモスチム（Ｌｅｕｋｉｎｅ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子及びＧＭ−ＣＳＦ）；Ｇｅｎｚｙｍｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、プロメガポエチン及びオプレルベキン（組換えＩＬ−１１；Ｐｆｉｚｅｒ，Ｉｎｃ．）が挙げられる。従って、１実施形態において、本発明は本願に記載する抗ＥＧＦＲ抗体とＣＳＦを含むＡＤＣを提供する。
【０２４３】
４．遺伝子治療
本発明の抗ＥＧＦＲ抗体を遺伝子治療用に（直接又は担体を介して間接的に）少なくとも１個の核酸と結合させてもよい。遺伝子治療とは一般に遺伝子材料で疾患を治療するように遺伝子材料を細胞に導入することを意味する。遺伝子治療は免疫調節剤に関連するので、対象が癌細胞増殖を抑制又は癌細胞を死滅させる自然治癒力を刺激するために使用される。１実施形態において、本発明の抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣは癌に関連する突然変異又は他の機能低下（例えば短縮型）遺伝子に置換えるために使用される機能的な治療用遺伝子をコードする核酸を含む。他の実施形態において、本発明の抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣは癌を治療するための治療用タンパク質をコードする核酸又はそれ以外でその産生を可能にする核酸を含む。治療用遺伝子をコードする核酸を抗ＥＧＦＲ抗体と直接結合させてもよいし、あるいは担体を介して抗ＥＧＦＲ抗体と結合させてもよい。遺伝子治療用に核酸を送達するために使用できる担体の例としては、限定されないが、ウイルスベクターやリポソームが挙げられる。
【０２４４】
５．アルキル化剤
本発明の抗ＥＧＦＲ抗体を１個以上のアルキル化剤と結合させてもよい。アルキル化剤はアルキル基をＤＮＡに結合する類の抗新生物性化合物である。本発明のＡＤＣで使用することができるアルキル化剤の例としては、限定されないが、アルキルスルホネート、エチレンイミン、メチルアミン誘導体、エポキシド、ナイトロジェンマスタード、ニトロソウレア、トリアジン及びヒドラジンが挙げられる。
【０２４５】
ａ．アルキルスルホネート
本発明の抗ＥＧＦＲ抗体を少なくとも１個のアルキルスルホネートと結合させてもよい。アルキルスルホネートは一般式：Ｒ−ＳＯ２−Ｏ−Ｒ１のアルキル化剤のサブクラスであり、式中、Ｒ及びＲ１は典型的にはアルキル基又はアリール基である。アルキルスルホネートの代表例としては、限定されないが、ブスルファン（Ｍｙｌｅｒａｎ，ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ；Ｂｕｓｕｌｆｅｘ  ＩＶ，ＰＤＬ  ＢｉｏＰｈａｒｍａ，Ｉｎｃ．）が挙げられる。
【０２４６】
ｂ．ナイトロジェンマスタード
本発明の抗ＥＧＦＲ抗体を少なくとも１個のナイトロジェンマスタードと結合させてもよい。このサブクラスの抗癌性化合物の代表例としては、限定されないが、クロラムブシル（Ｌｅｕｋｅｒａｎ，ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ，Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ；Ｎｅｏｓａｒ，Ｐｆｉｚｅｒ，Ｉｎｃ．）、エストラムスチン（エストラムスチンリン酸エステルナトリウムないしＥｓｔｒａｃｙｔ，Ｐｆｉｚｅｒ，Ｉｎｃ．）、イホスファミド（Ｉｆｅｘ，Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）、メクロレタミン（Ｍｕｓｔａｒｇｅｎ，Ｌｕｎｄｂｅｃｋ  Ｉｎｃ．）及びメルファラン（ＡｌｋｅｒａｎないしＬ−Ｐａｍないしフェニルアラニンマスタード；ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）が挙げられる。
【０２４７】
ｃ．ニトロソウレア
本発明の抗ＥＧＦＲ抗体を少なくとも１個のニトロソウレアと結合させてもよい。ニトロソウレアは脂溶性のアルキル化剤のサブクラスである。代表例としては、限定されないが、カルムスチン（ＢＣＮＵ［別称ＢｉＣＮＵ，Ｎ，Ｎ−ビス（２−クロロエチル）−Ｎ−ニトロソウレアないし１，３−ビス（２−クロロエチル）−１−ニトロソウレア］，Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）、フォテムスチン（別称Ｍｕｐｈｏｒａｎ）、ロムスチン（ＣＣＮＵないし１−（２−クロロエチル）−３−シクロヘキシル−１−ニトロソウレア、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）、ニムスチン（別称ＡＣＮＵ）及びストレプトゾシン（Ｚａｎｏｓａｒ，Ｔｅｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）が挙げられる。
【０２４８】
ｄ．トリアジン及びヒドラジン
本発明の抗ＥＧＦＲ抗体を少なくとも１個のトリアジン又はヒドラジンと結合させてもよい。トリアジン及びヒドラジンは窒素含有アルキル化剤のサブクラスである。所定の実施形態において、これらの化合物は自然分解し、あるいは代謝させることができ、核酸、ペプチド及び／又はポリペプチドへのアルキル基の移動を助長するアルキルジアゾニウム中間体を生成し、変異原性作用、発癌性作用又は細胞傷害作用を生じる。代表例としては、限定されないが、ダカルバジン（ＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅ，Ｂａｙｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．）、プロカルバジン（Ｍｕｔａｌａｎｅ，Ｓｉｇｍａ−Ｔａｕ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）及びテモゾロミド（Ｔｅｍｏｄａｒ，Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｐｌｏｕｇｈ）が挙げられる。
【０２４９】
ｅ．他のアルキル化剤
本発明の抗ＥＧＦＲ抗体を少なくとも１個のエチレンイミン、メチルアミン誘導体又はエポキシドと結合させてもよい。エチレンイミンは典型的には少なくとも１個のアジリジン環を含むアルキル化剤のサブクラスである。エポキシドは環原子数が３個のみの環状エーテルとして特徴付けられるアルキル化剤のサブクラスである。
【０２５０】
エチレンイミンの代表例としては、限定されないが、チオテパ（Ｔｈｉｏｐｌｅｘ，Ａｍｇｅｎ）、ジアジコン（別称アジリジニルベンゾキノン（ＡＺＱ））及びマイトマイシンＣが挙げられる。マイトマイシンＣはアジリジン環を含む天然物であり、ＤＮＡとの架橋により細胞毒性を誘導すると思われる（Ｄｏｒｒ  ＲＴ，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９８５；４５：３５１０；Ｋｅｎｎｅｄｙ  ＫＡ，ｅｔ  ａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９８５；４５：３５４１）。メチルアミン誘導体とそのアナログの代表例としては、限定されないが、アルトレタミン（Ｈｅｘａｌｅｎ，ＭＧＩ  Ｐｈａｒｍａ，Ｉｎｃ．）別称ヘキサメチルアミン及びヘキサスタットが挙げられる。この類の抗癌性化合物のエポキシドの代表例としては、限定されないが、ジアンヒドロガラクチトールが挙げられる。ジアンヒドロガラクチトール（１，２：５，６−ジアンヒドロデュルシトール）はアジリジンと化学的に近縁であり、一般に上記と同様のメカニズムによりアルキル基の移動を助長する。ジブロモデュルシトールは加水分解されてジアンヒドロガラクチトールとなるので、エポキシドのプロドラッグである（Ｓｅｌｌｅｉ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  Ｒｅｐ．１９６９；５３：３７７）。
【０２５１】
６．抗血管新生薬
１態様では、本願に記載する抗ＥＧＦＲ抗体を少なくとも１個の抗血管新生薬と結合させる。抗血管新生薬は新しい血管の増殖を阻害する。抗血管新生薬は種々の方法でその効果を発揮する。所定の実施形態において、これらの薬剤は成長因子がその標的に到達するのを妨害する。例えば、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）は細胞表面上の特定の受容体と結合することにより血管新生の開始に関与する主要なタンパク質の１種である。従って、ＶＥＧＦとその対応する受容体との相互作用を妨げる所定の抗血管新生薬はＶＥＧＦが血管新生を開始するのを防ぐ。他の実施形態において、これらの薬剤は細胞内シグナル伝達カスケードを妨害する。例えば、細胞表面上の特定の受容体がトリガされると、他の化学的シグナルのカスケードが開始され、血管の増殖が促進される。従って、例えば細胞増殖に寄与する細胞内シグナル伝達カスケードを助長することが知られているある種の酵素（例えば所定のチロシンキナーゼ）は癌治療の標的である。他の実施形態において、これらの薬剤は細胞間シグナル伝達カスケードを妨害する。更に他の実施形態において、これらの薬剤は細胞増殖を活性化及び促進する特定の標的を不能にし、又は血管細胞の増殖を直接妨害する。多くの直接及び間接的な阻害作用をもつ３００種を越える物質で血管新生阻害特性が発見されている。
【０２５２】
本発明のＡＤＣで使用することができる抗血管新生薬の代表例としては、限定されないが、アンギオスタチン、ＡＢＸ  ＥＧＦ、Ｃ１−１０３３、ＰＫＩ−１６６、ＥＧＦワクチン、ＥＫＢ−５６９、ＧＷ２０１６、ＩＣＲ−６２、ＥＭＤ５５９００、ＣＰ３５８、ＰＤ１５３０３５、ＡＧ１４７８、ＩＭＣ−Ｃ２２５（Ｅｒｂｉｔｕｘ）、ＺＤ１８３９（Ｉｒｅｓｓａ）、ＯＳＩ−７７４、エルロチニブ（ｔａｒｃｅｖａ）、アンギオスタチン、アレスチン、エンドスタチン、ＢＡＹ１２−９５６６単剤及びフルオロウラシル又はドキソルビシンとの併用、カンスタチン、カルボキシアミドトリオゾール単剤及びパクリタキセルとの併用、ＥＭＤ１２１９７４、Ｓ−２４、ビタキシン、ジメチルキサンテノン酢酸、ＩＭ８６２、インターロイキン−１２、インターロイキン−２、ＮＭ−３、ＨｕＭＶ８３３、ＰＴＫ７８７、ＲｈｕＭａｂ、アンギオザイム（リボザイム）、ＩＭＣ−１Ｃ１１、Ｎｅｏｖａｓｔａｔ、マリマスタット、プリノマスタット、ＢＭＳ−２７５２９１、ＣＯＬ−３、ＭＭ１２７０、ＳＵ１０１、ＳＵ６６６８、ＳＵ１１２４８、ＳＵ５４１６、パクリタキセルとの併用、ゲムシタビンとの併用、シスプラチン単剤及びイリノテカンとの併用、シスプラチン単剤及び放射線、テコガラン、テモゾロミド及びＰＥＧインターフェロンα２ｂとの併用、テトラチオモリブデート、ＴＮＰ−４７０、サリドマイド、ＣＣ−５０１３単剤及びタキソテールとの併用、タムスタチン、２−メトキシエストラジオール、ＶＥＧＦトラップ、ｍＴＯＲ阻害剤（デフォロリムス、エベロリムス（Ａｆｉｎｉｔｏｒ，Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、及びテムシロリムス（Ｔｏｒｉｓｅｌ，Ｐｆｉｚｅｒ，Ｉｎｃ．））、チロシンキナーゼ阻害剤（例えばエルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ，Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）、イマチニブ（Ｇｌｅｅｖｅｃ，Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ゲフィチニブ（Ｉｒｅｓｓａ，ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ダサチニブ（Ｓｐｒｙｃｅｌ，Ｂｒｙｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）、スニチニブ（Ｓｕｔｅｎｔ，Ｐｆｉｚｅｒ，Ｉｎｃ．）、ニロチニブ（Ｔａｓｉｇｎａ，Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ラパチニブ（Ｔｙｋｅｒｂ，ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ソラフェニブ（Ｎｅｘａｖａｒ，Ｂａｙｅｒ  ａｎｄ  Ｏｎｙｘ）、ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ））が挙げられる。
【０２５３】
７．代謝拮抗剤
本発明の抗ＥＧＦＲ抗体を少なくとも１個の代謝拮抗剤と結合させてもよい。代謝拮抗剤は細胞内の正常物質に非常によく似た型の化学療法治療薬である。細胞が代謝拮抗剤を細胞内代謝に取込むと、結果は細胞にマイナスとなり、例えば細胞は分裂できなくなる。代謝拮抗剤は妨害する物質に従って分類される。本発明のＡＤＣで使用することができる代謝拮抗剤の例としては、限定されないが、以下に詳述するような葉酸拮抗剤（例えばメトトレキサート）、ピリミジン拮抗剤（例えば５−フルオロウラシル、フロクスウリジン、シタラビン、カペシタビン及びゲムシタビン）、プリン拮抗剤（例えば６−メルカプトプリン及び６−チオグアニン）及びアデノシンデアミナーゼ阻害剤（例えばクラドリビン、フルダラビン、ネララビン及びペントスタチン）が挙げられる。
【０２５４】
ａ．葉酸拮抗剤
本発明の抗ＥＧＦＲ抗体を少なくとも１個の葉酸拮抗剤と結合させてもよい。葉酸拮抗剤は葉酸と構造的に類似する代謝拮抗剤のサブクラスである。代表例としては、限定されないが、メトトレキサート、４−アミノ葉酸（別称アミノプテリン及び４−アミノプテロイン酸）、ロメトレキソール（ＬＭＴＸ）、ペメトレキセド（Ａｌｉｍｐｔａ，Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、及びトリメトレキサート（Ｎｅｕｔｒｅｘｉｎ，Ｂｅｎ  Ｖｅｎｕｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）が挙げられる。
【０２５５】
ｂ．プリン拮抗剤
本発明の抗ＥＧＦＲ抗体を少なくとも１個のプリン拮抗剤と結合させてもよい。プリンアナログはプリン類として知られるグループの化合物と構造的に類似する代謝拮抗剤のサブクラスである。プリン拮抗剤の代表例としては、限定されないが、アザチオプリン（Ａｚａｓａｎ，Ｓａｌｉｘ；Ｉｍｕｒａｎ，ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、クラドリビン（Ｌｅｕｓｔａｔｉｎ［別称２−ＣｄＡ］，Ｊａｎｓｓｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）、メルカプトプリン（Ｐｕｒｉｎｅｔｈｏｌ［別称６−メルカプトエタノール］，ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、フルダラビン（Ｆｌｕｄａｒａ，Ｇｅｎｚｙｍｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ペントスタチン（Ｎｉｐｅｎｔ，別称２’−デオキシコホルマイシン（ＤＣＦ））、６−チオグアニン（Ｌａｎｖｉｓ［別称チオグアニン］，ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）が挙げられる。
【０２５６】
ｃ．ピリミジン拮抗剤
本発明の抗ＥＧＦＲ抗体を少なくとも１個のピリミジン拮抗剤と結合させてもよい。ピリミジン拮抗剤はプリン類として知られるグループの化合物と構造的に類似する代謝拮抗剤のサブクラスである。ピリミジン拮抗剤の代表例としては、限定されないが、アザシチジン（Ｖｉｄａｚａ，Ｃｅｌｇｅｎｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、カペシタビン（Ｘｅｌｏｄａ，Ｒｏｃｈｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、シタラビン（別称シトシンアラビノシド及びアラビノシルシトシン，Ｂｅｄｆｏｒｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、デシタビン（Ｄａｃｏｇｅｎ，Ｅｉｓａｉ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、５−フルオロウラシル（Ａｄｒｕｃｉｌ，Ｔｅｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ；Ｅｆｕｄｅｘ，Ｖａｌｅａｎｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ）、５−フルオロ−２’−デオキシウリジン５’−リン酸（ＦｄＵＭＰ）、５−フルオロウリジン三リン酸及びゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ，Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ）が挙げられる。
【０２５７】
８．ホウ素含有剤
本発明の抗ＥＧＦＲ抗体を少なくとも１個のホウ素含有剤と結合させてもよい。ホウ素含有剤は細胞増殖を妨害する類の癌治療用化合物である。ホウ素含有剤の代表例としては、限定されないが、ボロフィシンとボルテゾミブ（Ｖｅｌｃａｄｅ，Ｍｉｌｌｅｎｉｕｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）が挙げられる。
【０２５８】
９．化学保護剤
本発明の抗ＥＧＦＲ抗体を少なくとも１個の化学保護剤と結合させてもよい。化学保護薬は化学療法の特定の毒性作用から生体を保護するのに役立つ類の化合物である。投与した化学療法薬で癌細胞を治療できるようにすると同時に化学療法薬の毒性作用から健康な細胞を保護するために種々の化学療法薬と共に化学保護剤を投与することができる。代表的な化学保護剤としては、限定されないが、シスプラチンの累積投与に伴う腎毒性を軽減するために使用されるアミフォスチン（Ｅｔｈｙｏｌ，Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ，Ｉｎｃ．）、アントラサイクリン（Ｔｏｔｅｃｔ）の投与に起因する血管外漏出の治療と、抗腫瘍性抗生物質ドキソルビシン（Ｚｉｎｅｃａｒｄ）の投与に起因する心臓関連合併症の治療に使用されるデクスラゾキサン（Ｔｏｔｅｃｔ，Ａｐｒｉｃｕｓ  Ｐｈａｒｍａ；Ｚｉｎｅｃａｒｄ）、及びイホスファミドによる化学療法治療中の出血性膀胱炎を予防するために使用されるメスナ（Ｍｅｓｎｅｘ，Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）が挙げられる。
【０２５９】
１０．ホルモン剤
本発明の抗ＥＧＦＲ抗体を少なくとも１個のホルモン剤と結合させてもよい。ホルモン剤（合成ホルモンを含む）は内分泌系の内因的に産生されるホルモンの産生又は活性を妨害する化合物である。所定の実施形態において、これらの化合物は細胞増殖を妨害し、又は細胞毒性作用を生じる。非限定的な例としては、アンドロゲン、エストロゲン、酢酸メドロキシプロゲステロン（Ｐｒｏｖｅｒａ，Ｐｆｉｚｅｒ，Ｉｎｃ．）及びプロゲスチンが挙げられる。
【０２６０】
１１．抗ホルモン剤
本発明の抗ＥＧＦＲ抗体を少なくとも１個の抗ホルモン剤と結合させてもよい。「抗ホルモン」剤はある種の内因性ホルモンの産生を抑制及び／又は機能を妨害する薬剤である。１実施形態において、抗ホルモン剤はアンドロゲン、エストロゲン、プロゲステロン及びゴナドトロピン放出ホルモンから構成される群から選択されるホルモンの活性を妨害することにより、種々の癌細胞の増殖を妨害する。抗ホルモン剤の代表例としては、限定されないが、アミノグルテチミド、アナストロゾール（Ａｒｉｍｉｄｅｘ，ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ビカルタミド（Ｃａｓｏｄｅｘ，ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、酢酸シプロテロン（Ｃｙｐｒｏｓｔａｔ，Ｂａｙｅｒ  ＰＬＣ）、デガレリクス（Ｆｉｒｍａｇｏｎ，Ｆｅｒｒｉｎｇ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、エキセメスタン（Ａｒｏｍａｓｉｎ，Ｐｆｉｚｅｒ  Ｉｎｃ．）、フルタミド（Ｄｒｏｇｅｎｉｌ，Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ  Ｌｔｄ）、フルベストラント（Ｆａｓｌｏｄｅｘ，ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ゴセレリン（Ｚｏｌｏｄｅｘ，ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、レトロゾール（Ｆｅｍａｒａ，Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ロイプロリド（Ｐｒｏｓｔａｐ）、ルプロン、酢酸メドロキシプロゲステロン（Ｐｒｏｖｅｒａ，Ｐｆｉｚｅｒ  Ｉｎｃ．）、酢酸メゲストロール（Ｍｅｇａｃｅ，Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、タモキシフェン（Ｎｏｌｖａｄｅｘ，ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、及びトリプトレリン（Ｄｅｃａｐｅｔｙｌ，Ｆｅｒｒｉｎｇ）が挙げられる。
【０２６１】
１２．コルチコステロイド
本発明の抗ＥＧＦＲ抗体を少なくとも１個のコルチコステロイドと結合させてもよい。コルチコステロイドは炎症を抑えるために本発明のＡＤＣで使用することができる。コルチコステロイドの１例としては、限定されないが、グルココルチコイド、例えばプレドニゾン（Ｄｅｌｔａｓｏｎｅ，Ｐｆｉｚｅｒ，Ｉｎｃ．の系列会社であるＰｈａｒｍａｃｉａ  ＆  Ｕｐｊｏｈｎ  Ｃｏｍｐａｎｙ  ）が挙げられる。
【０２６２】
１３．感光性治療剤
本発明の抗ＥＧＦＲ抗体を少なくとも１個の感光性治療剤と結合させてもよい。感光性治療剤とは投与した細胞に特定波長の電磁放射線を照射して死滅させるように構成することができる化合物を包含する。治療に適した化合物は組織に侵入する波長の電磁放射線を吸収する。好ましい実施形態において、前記化合物は十分に活性化されると細胞又は組織に対して毒性となる光化学作用を生じることが可能な非毒性形態で投与される。他の好ましい実施形態において、これらの化合物は癌組織に保持され、正常組織から容易に排出される。非限定的な例としては種々の色素及び染料が挙げられる。
【０２６３】
１４．オリゴヌクレオチド
本発明の抗ＥＧＦＲ抗体を少なくとも１個のオリゴヌクレオチドと結合させてもよい。オリゴヌクレオチドは遺伝情報のプロセシングを妨害することにより作用する短い核酸鎖からなる。所定の実施形態において、ＡＤＣで使用されるオリゴヌクレオチドは未修飾の１本鎖及び／又は２本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ分子であり、他の実施形態において、これらの治療用オリゴヌクレオチドは化学的に修飾された１本鎖及び／又は２本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ分子である。１実施形態において、ＡＤＣで使用されるオリゴヌクレオチドは比較的短く（１９〜２５ヌクレオチド）、細胞に存在する核酸標的のプール全体において固有の核酸配列とハイブリダイズする。重要なオリゴヌクレオチド技術をいくつか挙げると、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を含む）、アプタマー、ＣｐＧオリゴヌクレオチド及びリボザイムが挙げられる。
【０２６４】
ａ．アンチセンスオリゴヌクレオチド
本発明の抗ＥＧＦＲ抗体を少なくとも１個のアンチセンスオリゴヌクレオチドと結合させてもよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドはワトソン・クリックハイブリダイゼーションによりＲＮＡと結合するようにデザインされている。所定の実施形態において、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドはＥＧＦＲのある領域、ドメイン、部分又はセグメントをコードするヌクレオチドに相補的である。所定の実施形態において、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは約５〜約１００ヌクレオチド、約１０〜約５０ヌクレオチド、約１２〜約３５ヌクレオチド、及び約１８〜約２５ヌクレオチドを含む。所定の実施形態において、前記オリゴヌクレオチドはＥＧＦＲ遺伝子のある領域、部分、ドメイン又はセグメントに対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は少なくとも１００％相同である。所定の実施形態では、ＥＧＦＲ遺伝子の連続する少なくとも１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０又は１００ヌクレオチドにわたって実質的な配列相同が存在する。好ましい実施形態において、これらのアンチセンスオリゴヌクレオチドのサイズは１２〜２５ヌクレオチド長であり、アンチセンスオリゴヌクレオチドの大半は１８〜２１ヌクレオチド長である。オリゴヌクレオチドが標的ＲＮＡと結合したときにＲＮＡの機能を阻害するために利用することができるメカニズムには複数のものがある（Ｃｒｏｏｋｅ  ＳＴ．（１９９９）．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１４８９，３０−４２）。最も明確に定義されているアンチセンスメカニズムによると、ＲＮａｓｅ  ＨやＲＮＡ干渉メカニズムに関連するヌクレアーゼ等の内因性細胞内ヌクレアーゼにより標的ＲＮＡが切断される。一方、スプライシングや翻訳停止の調節等の非触媒メカニズムにより標的遺伝子の発現を阻害するオリゴヌクレオチドも遺伝子機能の強力且つ選択的なモジュレーターであり得る。
【０２６５】
最近多くの注目を集めている別のＲｎａｓｅ依存性アンチセンスメカニズムはＲＮＡｉである（Ｆｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）．Ｎａｔｕｒｅ，３９１，８０６−８１１．；Ｚａｍｏｒｅ  ＰＤ．（２００２）．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９６，１２６５−１２６９．）。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は２本鎖ＲＮＡが配列特異的に遺伝子発現を阻害する翻訳後プロセスである。所定の実施形態において、ＲＮＡｉ作用は比較的長い２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の導入により行われるが、好ましい実施形態において、このＲＮＡｉ作用は短い２本鎖ＲＮＡ、例えば短い干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）及び／又はマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の導入により行われる。更に別の実施形態において、ＲＮＡｉは標的遺伝子に相補的なｄｓＲＮＡを産生するプラスミドを導入することにより行うこともできる。上記実施形態の各々において、２本鎖ＲＮＡは細胞内の特定の標的配列の遺伝子発現を妨害するようにデザインされている。一般に、このメカニズムはリボヌクレアーゼを相同のｍＲＮＡ標的に誘導する短いＲＮＡにｄｓＲＮＡを変換し（要旨，Ｒｕｖｋｕｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９４：７９７（２００１））、その後、対応する内因性ｍＲＮＡを分解することにより、遺伝子発現を調節する。特に、ｄｓＲＮＡは抗増殖性をもつため、治療用途での利用も想定できることが報告されている（Ａｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ８８：９０６（１９９１））。例えば、合成ｄｓＲＮＡはマウスにおいて腫瘍増殖を抑制することが示されており（Ｌｅｖｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６２：３５７−３６１（１９６９））、白血病マウスの治療で有効であり（Ｚｅｌｅｚｎｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．１３０：１２６−１２８（１９６９））、マウス皮膚に化学的に誘導した腫瘍形成を阻害する（Ｇｅｌｂｏｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １６７：２０５−２０７（１９７０））。従って、好ましい１実施形態において、本発明は乳癌の治療用としてＡＤＣにおけるアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用を提供する。他の実施形態において、本発明はアンチセンスオリゴヌクレオチド治療を開始するための組成物及び方法として、ｄｓＲＮＡによりＥＧＦＲの標的細胞発現をｍＲＮＡレベルで妨害する組成物及び方法を提供する。上記で使用するｄｓＲＮＡとは天然型ＲＮＡ、部分的に精製されたＲＮＡ、組換え生産されたＲＮＡ、合成ＲＮＡ、並びに非標準的なヌクレオチド、非ヌクレオチド材料、ヌクレオチドアナログ（例えばロックト核酸（ＬＮＡ））、デオキシリボヌクレオチド及びその任意の組合せを含むことにより天然型ＲＮＡとは相違する改変型ＲＮＡを意味する。本発明のＲＮＡは本願に記載するアンチセンスオリゴヌクレオチドによる調節に介在できるという点で天然型ＲＮＡと十分に似ていることだけが必要とされる。
【０２６６】
ｂ．アプタマー
本発明の抗ＥＧＦＲ抗体を少なくとも１個のアプタマーと結合させてもよい。アプタマーは他の分子との結合能に基づいてランダムプールから選択された核酸分子である。抗体と同様に、アプタマーは非常に強い親和性と特異性で標的分子と結合することができる。多くの実施形態において、アプタマーは標的タンパク質と相互作用できるように複雑で配列依存的な三次元形状をとるため、抗体−抗原相互作用と同様に強く結合した複合体を形成し、このタンパク質の機能を妨害する。アプタマーは特に標的タンパク質と強く特異的に結合することができるため、分子標的治療としての利用可能性が特筆される。
【０２６７】
ｃ．ＣｐＧオリゴヌクレオチド
本発明の抗ＥＧＦＲ抗体を少なくとも１個のＣｐＧオリゴヌクレオチドと結合させてもよい。細菌及びウイルスＤＮＡはヒトにおいて自然免疫と特異的免疫の両者の強力なアクチベーターであることが知られている。これらの免疫学的特徴は細菌ＤＮＡに存在するメチル化されていないＣｐＧジヌクレオチドモチーフと関係があるとされている。これらのモチーフはヒトではまれであるため、ヒト免疫系はこれらのモチーフを感染の初期徴候として認識した後、免疫応答を開始する能力を進化させている。従って、抗腫瘍免疫応答を開始するためにこのＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドを利用することができる。
【０２６８】
ｄ．リボザイム
本発明の抗ＥＧＦＲ抗体を少なくとも１個のリボザイムと結合させてもよい。リボザイムは約４０〜１５５ヌクレオチド長の触媒ＲＮＡ分子である。リボザイムは特定のＲＮＡ分子を認識して切断することができるため、治療薬の有力な候補となる。代表例としてはアンギオザイムが挙げられる。
【０２６９】
１５．放射性核種剤（放射性同位体）
本発明の抗ＥＧＦＲ抗体を少なくとも１個の放射性核種剤と結合させてもよい。放射性核種剤は放射性崩壊することができる不安定な核を特徴とする成分を含む。放射性核種治療の成功の基盤は放射性核種が十分な濃度であることと癌細胞に長時間留まることに依存する。他の考慮すべき因子としては、放射性核種の半減期、放出される粒子のエネルギー、及び放出される粒子の最大飛程が挙げられる。好ましい実施形態において、治療剤は１１１Ｉｎ、１７７Ｌｕ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２１１Ａｔ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、９０Ｙ、Ｉ２５Ｉ、Ｉ３１Ｉ、３２Ｐ、３３Ｐ、４７Ｓｃ、１１１Ａｇ、６７Ｇａ、１４２Ｐｒ、１５３Ｓｍ、１６１Ｔｂ、１６６Ｄｙ、１６６Ｈｏ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９Ｒｅ、２１２Ｐｂ、２２３Ｒａ、２２５Ａｃ、５９Ｆｅ、７５Ｓｅ、７７Ａｓ、８９Ｓｒ、９９Ｍｏ、１０５Ｒｈ、Ｉ０９Ｐｄ、１４３Ｐｒ、１４９Ｐｍ、１６９Ｅｒ、１９４Ｉｒ、１９８Ａｕ、１９９Ａｕ及び２１１Ｐｂから構成される群から選択される放射性核種である。オージェ放出粒子と共に実質的に崩壊する放射性核種も好ましい。例えば、Ｃｏ−５８、Ｇａ−６７、Ｂｒ−８０ｍ、Ｔｃ−９９ｍ、Ｒｈ−１０３ｍ、Ｐｔ−１０９、Ｉｎ−１１１  １、Ｓｂ−１１９、Ｉ−１２５、Ｈｏ−１６１、Ｏｓ−１８９ｍ及びＩｒ−１９２である。有用なβ粒子放出核種の崩壊エネルギーは好ましくはＤｙ−１５２、Ａｔ−２１１、Ｂｉ−２１２、Ｒａ−２２３、Ｒｎ−２１９、Ｐｏ−２１５、Ｂｉ−２１１、Ａｃ−２２５、Ｆｒ−２２１、Ａｔ−２１７、Ｂｉ−２１３及びＦｍ−２５５である。有用なα粒子放出放射性核種の崩壊エネルギーは好ましくは２，０００〜１０，０００ｋｅＶ、より好ましくは３，０００〜８，０００ｋｅＶ、最も好ましくは４，０００〜７，０００ｋｅＶである。その他の使用できる可能性のある放射性同位体としては、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、７５Ｂｒ、１９８Ａｕ、２２４Ａｃ、１２６Ｉ、１３３Ｉ、７７Ｂｒ、１１３ｍＩｎ、９５Ｒｕ、９７Ｒｕ、Ｉ０３Ｒｕ、１０５Ｒｕ、１０７Ｈｇ、２０３Ｈｇ、１２１ｍＴｅ、１２２ｍＴｅ、１２５ｍＴｅ、１６５Ｔｍ、Ｉ６７Ｔｍ、１６８Ｔｍ、１９７Ｐｔ、１０９Ｐｄ、１０５Ｒｈ、１４２Ｐｒ、１４３Ｐｒ、１６１Ｔｂ、！６６Ｈｏ、１９９Ａｕ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５１Ｃｒ、５９Ｆｅ、７５Ｓｅ、２０１Ｔｌ、２２５Ａｃ、７６Ｂｒ、Ｉ６９Ｙｂ等が挙げられる。
【０２７０】
１６．放射線増感剤
本発明の抗ＥＧＦＲ抗体を少なくとも１個の放射線増感剤と結合させてもよい。本願で使用する「放射線増感剤」なる用語は放射線増感剤を投与する細胞の電磁放射線感受性を増強するため、及び／又は電磁放射線で治療可能な疾患の治療を促進するために治療有効量を動物に投与される分子、好ましくは低分子量分子として定義される。放射線増感剤は放射線治療に対する癌細胞の感受性を高めるが、一般には正常細胞に対する影響が非常に少ない薬剤である。従って、放射線増感剤は放射性標識抗体又はＡＤＣと併用することができる。放射線増感剤を加えると、放射性標識抗体又は抗体フラグメントを単独投与した場合に比較して効力を増強することができる。放射線増感剤はＤ．Ｍ．Ｇｏｌｄｂｅｒｇ（ｅｄ．），Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）に記載されている。放射線増感剤の例としてはゲムシタビン、５−フルオロウラシル、タキサン及びシスプラチンが挙げられる。
【０２７１】
放射線増感剤はＸ線の電磁放射により活性化することができる。Ｘ線により活性化される放射線増感剤の代表例としては、限定されないが、メトロニダゾール、ミソニダゾール、デスメチルミソニダゾール、ピモニダゾール、エタニダゾール、ニモラゾール、マイトマイシンＣ、ＲＳＵ１０６９、ＳＲ４２３３、Ｅ０９、ＲＢ６１４５、ニコチンアミド、５−ブロモデオキシウリジン（ＢＵｄＲ）、５−ヨードデオキシウリジン（ＩＵｄＲ）、ブロモデオキシシチジン、フルオロデオキシウリジン（ＦＵｄＲ）、ヒドロキシ尿素、シスプラチン、並びに治療薬として有効なそのアナログ及び誘導体が挙げられる。あるいは、光線力学療法（ＰＤＴ）を使用して放射線増感剤を活性化してもよい。光線力学療法用放射線増感剤の代表例としては、限定されないが、ヘマトポルフィリン誘導体、Ｐｈｏｔｏｆｒｉｎ（Ｒ）、ベンゾポルフィリン誘導体、ＮＰｅ６、スズエチオポルフィリン（ＳｎＥＴ２）、フェオホルビドａ、バクテリオクロロフィルａ、ナフタロシアニン、フタロシアニン、亜鉛フタロシアニン、並びに治療薬として有効なそのアナログ及び誘導体が挙げられる。
【０２７２】
１６．トポイソメラーゼ阻害剤
本発明の抗ＥＧＦＲ抗体を少なくとも１個のトポイソメラーゼ阻害剤と結合させてもよい。トポイソメラーゼ阻害剤は正常な細胞周期中にＤＮＡ鎖のホスホジエステル主鎖の切断と再結合を触媒することによりＤＮＡ構造の変化を制御する酵素であるトポイソメラーゼ酵素（トポイソメラーゼＩ及びＩＩ）の作用を妨害するようにデザインされた化学療法剤である。ＤＮＡトポイソメラーゼＩ阻害剤の代表例としては、限定されないが、カンプトテシンとその誘導体であるイリノテカン（ＣＰＴ−１１，Ｃａｍｐｔｏｓａｒ，Ｐｆｉｚｅｒ，Ｉｎｃ．）及びトポテカン（Ｈｙｃａｍｔｉｎ，ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）が挙げられる。ＤＮＡトポイソメラーゼＩＩ阻害剤の代表例としては、限定されないが、アムサクリン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピポドフィロトキシン、エリプチシン、エピルビシン、エトポシド、ラゾキサン及びテニポシドが挙げられる。
【０２７３】
１７．チロシンキナーゼ阻害剤
本発明の抗ＥＧＦＲ抗体を少なくとも１個のチロシンキナーゼ阻害剤と結合させてもよい。チロシンキナーゼはリン酸基をアミノ酸チロシンに結合するように機能する細胞内の酵素である。タンパク質チロシンキナーゼが機能できないようにすることにより、腫瘍増殖を抑制することができる。本発明のＡＤＣで使用することができるチロシンキナーゼの例としては、限定されないが、アキシチニブ、ボスチニブ、セジラニブ、ダサチニブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、イマチニブ、ラパチニブ、レスタウルチニブ、ニロチニブ、セマキサニブ、スニチニブ及びバンデタニブが挙げられる。
【０２７４】
１８．他の薬剤
本発明のＡＤＣで使用することができる他の薬剤の例としては、限定されないが、アブリン（例えばアブリンＡ鎖）、α毒素、アブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、アマトキシン、クロチン、クルシン、ジアンチンタンパク質、ジフテリア毒素（例えばジフテリアＡ鎖及びジフテリア毒素の非結合性活性フラグメント）、デオキシリボヌクレアーゼ（Ｄｎａｓｅ）、ゲロニン、ミトゲリン、モデシンＡ鎖、ツルレイシ（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、ネオマイシン、オンコナーゼ、フェノマイシン、ヨウシュヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ及びＰＡＰ−Ｓ）、ポークウィード抗ウイルスタンパク質、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）内毒素、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素（例えば（緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来）外毒素Ａ鎖）、レストリクトシン、リシンＡ鎖、リボヌクレアーゼ（Ｒｎａｓｅ）、サボンソウ（ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、サポリン、αサルシン、ブドウ球菌腸毒素（Ｓｔａｐｈｙｌｃｏｃｃａｌ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ）Ａ、破傷風毒素、シスプラチン、カルボプラチン及びオキサリプラチン（Ｅｌｏｘａｔｉｎ，Ｓａｎｏｆｉ  Ａｖｅｎｔｉｓ）、プロテアソーム阻害剤（例えばＰＳ−３４１［ボルテゾミブないしＶｅｌｃａｄｅ］）、ＨＤＡＣ阻害剤（ボリノスタット（Ｚｏｌｉｎｚａ，Ｍｅｒｃｋ  ＆  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．）、ベリノスタット、エンチノスタット、モセチノスタット及びパノビノスタット）、ＣＯＸ−２阻害剤、置換尿素、熱ショックタンパク質阻害剤（例えばゲルダナマイシンとその多数のアナログ）、副腎皮質抑制剤、並びにトリコテセン（例えばＷＯ９３／２１２３２参照。）が挙げられる。その他の薬剤としては、アスパラギナーゼ（Ｅｓｐａｒ，Ｌｕｎｄｂｅｃｋ  Ｉｎｃ．）、ヒドロキシ尿素、レバミゾール、ミトタン（Ｌｙｓｏｄｒｅｎ，Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）及びトレチノイン（Ｒｅｎｏｖａ，Ｖａｌｅａｎｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．）も挙げられる。
【０２７５】
なお、本発明の抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣで使用することができるものとして上記に挙げた群の薬物部分は例示した薬物が２種以上の分類に含まれる場合もあるという点で限定的ではなく、例えばアンサミトシンは有糸分裂阻害剤であると同時に抗腫瘍性抗生物質でもある。
【０２７６】
上記薬物部分の全ての立体異性体、即ちＤのキラル炭素におけるＲ配置とＳ配置のあらゆる組合せも本発明の化合物に含まれる。
【０２７７】
本願に記載する抗ＥＧＦＲ抗体と上記薬剤（即ち抗体と結合していない状態の薬剤）を併用療法で使用してもよい。１実施形態では、癌を治療するために抗ＥＧＦＲ抗体又はＡＤＣを上記薬剤のいずれかと併用療法で併用し、その場合、抗ＥＧＦＲ抗体又はＡＤＣの投与前、投与と同時又は投与後に前記薬剤を対象に投与する。
【０２７８】
Ｂ．抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣ：リンカーの例
抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣは抗ＥＧＦＲ抗体と少なくとも１個の薬物を含み、前記抗体と前記少なくとも１個の薬剤をリンカーにより結合させる。本願で使用する「リンカー」なる用語は２価でも３価以上でもよく、抗体を薬物部分に結合するために使用される化学部分を意味する。リンカーは連結成分を１個含むものでもよいし、複数の成分を含むものでもよい。
【０２７９】
例えば、前記リンカーは例えば抗体の活性部位の遮蔽を避けるため又はＡＤＣの溶解度を改善するために薬物連結を延長する部分であるスペーサーを含むことができる。リンカーの成分の他の例としてはストレッチャー単位とアミノ酸単位が挙げられる。
【０２８０】
薬物を抗体と結合させる方法としては、酵素切断不能なマレイミドリンカー又は単純な切断可能なジスルフィドリンカーを介する鎖間システインジスルフィドの還元アルキル化と、切断可能な直鎖アミノ酸によるリジンのアシル化の２種類の方法が広く使用されている。
【０２８１】
１態様において、リンカーは抗体を薬物部分と共有結合させる。抗体及び薬物と結合するための反応性官能基をもつリンカーを使用してＡＤＣを作製する。例えば、抗体のシステインチオール又はアミン（例えばＮ末端又はリジン等のアミノ酸側鎖）はリンカーの官能基と結合を形成することができる。
【０２８２】
１態様において、リンカーは抗体上に存在する遊離システインと反応して共有結合を形成することが可能な官能基をもつ。このような反応性官能基の非限定的な例としては、マレイミド、ハロアセトアミド、α−ハロアセチル、スクシンイミドエステル、４−ニトロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、テトラフルオロフェニルエステル等の活性化エステル、酸無水物、酸塩化物、スルホニルクロリド、イソシアネート及びイソチオシアネートが挙げられる。例えばＫｌｕｓｓｍａｎ，ｅｔ  ａｌ（２００４），Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １５（４）：７６５−７７３の７６６頁の結合法を参照されたい。
【０２８３】
所定の実施形態において、リンカーは抗体上に存在する求電子基と反応することが可能な官能基をもつ。このような求電子基の例としては、限定されないが、アルデヒド基とケトンカルボニル基が挙げられる。所定の実施形態において、前記リンカーの反応性官能基のヘテロ原子は抗体上の求電子基と反応し、抗体単位と共有結合を形成することができる。このような反応性官能基の非限定的な例としては、限定されないが、ヒドラジド、オキシム、アミノ、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレート及びアリールヒドラジドが挙げられる。
【０２８４】
リンカー成分の例としては、６−マレイミドカプロイル、マレイミドプロパノイル（「ＭＰ」）、バリン−シトルリン（「ｖａｌ−ｃｉｔ」ないし「ｖｃ」）、アラニン−フェニルアラニン（「ａｌａ−ｐｈｅ」）、ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル（「ＰＡＢ」）、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルチオ）ペンタノエート（「ＳＰＰ」）及び４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１カルボキシレート（「ＭＣＣ」）が挙げられる。
【０２８５】
１態様では、マレイミドカプロイル（「ｍｃ」）、バリン−シトルリン（ｖａｌ−ｃｉｔないし「ｖｃ」）及びＰＡＢＡ（別称「ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢＡリンカー」）を含むリンカーを介して抗ＥＧＦＲ抗体をアウリスタチン（例えばＭＭＡＥ）と結合させる。マレイミドカプロイルは抗ＥＧＦＲ抗体とのリンカーとして機能し、切断できない。ｖａｌ−ｃｉｔはリンカーのアミノ酸単位であるジペプチドであり、プロテアーゼ、特にプロテアーゼカテプシンＢによりリンカーを切断することができる。従って、リンカーのｖａｌ−ｃｉｔ成分は細胞内環境に暴露されると、ＡＤＣからアウリスタチンを放出する手段となる。リンカー内でｐ−アミノベンジルアルコール（ＰＡＢＡ）はスペーサーとして機能し、自壊性であるため、ＭＭＡＥを放出することができる。ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢＡ−ＭＭＡＥリンカーの構造を図１１に示す。
【０２８６】
適切なリンカーとしては、例えば切断可能なリンカーと切断不能なリンカーが挙げられる。リンカーは薬物の放出を容易にする「切断可能なリンカー」とすることができる。切断可能なリンカーの非限定的な例としては、（例えばヒドラゾンを含む）酸感受性リンカー、プロテアーゼ感受性（例えばペプチダーゼ感受性）リンカー、光感受性リンカー又はジスルフィド含有リンカーが挙げられる（Ｃｈａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５２：１２７−１３１（１９９２）；米国特許第５，２０８，０２０号）。切断可能なリンカーは一般に細胞内条件下で切断され易い。適切な切断可能なリンカーとしては、例えばリソソームプロテアーゼ又はエンドソームプロテアーゼ等の細胞内プロテアーゼにより切断可能なペプチドリンカーが挙げられる。典型的な実施形態において、前記リンカーはバリン−シトルリン（ｖａｌ−ｃｉｔ）又はフェニルアラニン−リジン（ｐｈｅ−ｌｙｓ）リンカー等のジペプチドリンカーとすることができる。
【０２８７】
リンカーは治療に有効であるために十分な程度に細胞外で安定であることが好ましい。細胞内に輸送又は送達する前にＡＤＣは安定し、無傷のままであること、即ち抗体が薬物部分と結合した状態に保たれることが好ましい。標的細胞の外側で安定なリンカーが一旦細胞の内側に入ると、所定の有効な速度で切断することができる。従って、有効なリンカーは（ｉ）抗体の特異的結合性を維持し；（ｉｉ）薬物部分の送達、例えば細胞内送達を可能にし；（ｉｉｉ）薬物部分の治療効果、例えば細胞毒性効果を維持する。
【０２８８】
１実施形態において、リンカーはリンカーが切断されると、治療に有効であるために十分に抗体から薬物が細胞内環境に放出されるように、細胞内条件下で切断可能である。所定の実施形態において、前記切断可能なリンカーはｐＨ感受性であり、即ち所定のｐＨ値での加水分解に感受性である。一般に、前記ｐＨ感受性リンカーは酸性条件下で加水分解性である。例えば、リソソームにおいて加水分解性の酸感受性リンカー（例えばヒドラゾン、セミカルバゾン、チオセミカルバゾン、ｃｉｓ−アコニットアミド、オルトエステル、アセタール、ケタール等）を使用することができる（例えば米国特許第５，１２２，３６８号；５，８２４，８０５号；５，６２２，９２９号；Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，１９９９，Ｐｈａｒｍ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ８３：６７−１２３；Ｎｅｖｉｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１４６５３−１４６６１参照。）。このようなリンカーは血液中のような中性ｐＨ条件下で比較的安定であるが、リソソームの近似ｐＨであるｐＨ５．５又は５．０未満では不安定である。ある種の実施形態において、前記加水分解性リンカーはチオエーテルリンカー（例えばアシルヒドラゾン結合を介して治療剤と結合したチオエーテル）である（例えば米国特許第５，６２２，９２９号参照。）。
【０２８９】
他の実施形態において、前記リンカーは還元条件下で切断可能である（例えばジスルフィドリンカー）。種々のリンカーが当分野で公知であり、例えばＳＡＴＡ（Ｎ−スクシンイミジル−５−アセチルチオアセテート）、ＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート）、ＳＰＤＢ（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）ブチレート）及びＳＭＰＴ（Ｎ−スクシンイミジルオキシカルボニル−α−メチル−α−（２−ピリジルジチオ）トルエン）、ＳＰＤＢ及びＳＭＰＴを使用して形成できるものが挙げられる。（例えばＴｈｏｒｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４７：５９２４−５９３１；Ｗａｗｒｚｙｎｃｚａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ：Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｉｎ  Ｒａｄｉｏｉｍａｇｅｒｙ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ（Ｃ．Ｗ．Ｖｏｇｅｌ  ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕ．Ｐｒｅｓｓ，１９８７）参照。米国特許第４，８８０，９３５号も参照。）。
【０２９０】
所定の実施形態において、前記リンカーは細胞内環境（例えばリソソーム又はエンドソーム又はカベオラ内）に存在する切断剤（例えば酵素）により切断可能である。前記リンカーは例えば細胞内ペプチダーゼ又はプロテアーゼ酵素（限定されないが、リソソーム又はエンドソームプロテアーゼ）により切断可能なペプチドリンカーである。所定の実施形態において、前記ペプチドリンカーは少なくとも２アミノ酸長又は少なくとも３アミノ酸長である。切断剤としては、カテプシンＢ及びＤとプラスミンが挙げられ、いずれもジペプチド薬物誘導体を加水分解して活性な薬物を標的細胞の内側に放出することが知られている（例えばＤｕｂｏｗｃｈｉｋ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，１９９９，Ｐｈａｒｍ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ８３：６７−１２３参照。）。ＥＧＦＲを発現する細胞に存在する酵素により切断可能なペプチドリンカーが最も一般的である。このようなリンカーの例は例えばその開示内容全体を全目的で本願に援用する米国特許第６，２１４，３４５号に記載されている。特定の１実施形態において、細胞内プロテアーゼにより切断可能なペプチドリンカーはＶａｌ−Ｃｉｔリンカー又はＰｈｅ−Ｌｙｓリンカーである（例えばｖａｌ−ｃｉｔリンカーによるドキソルビシンの合成について記載している米国特許第６，２１４，３４５号参照。）。治療剤の細胞内タンパク分解放出を使用する１つの利点は治療剤をコンジュゲートにすると一般に低濃度になり、コンジュゲートの血清安定性が一般に高いという点である。
【０２９１】
他の実施形態において、前記リンカーはマロネートリンカー（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１５：１３８７−９３）、マレイミドベンゾイルリンカー（Ｌａｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｏｒｇ−Ｍｅｄ−Ｃｈｅｍ．３（１０）：１２９９−１３０４）、又は３’−Ｎ−アミドアナログ（Ｌａｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｏｒｇ−Ｍｅｄ−Ｃｈｅｍ．３（１０）：１３０５−１２）である。
【０２９２】
更に他の実施形態において、前記リンカー単位は切断不能であり、例えば抗体分解により薬物を放出する。その開示内容全体を本願に援用する米国公開第２００５０２３８６４９号参照。切断不能なリンカーを含むＡＤＣは、ＡＤＣが実質的に細胞の外側に維持され、標的細胞表面の所定の受容体と相互作用し、ＡＤＣの結合により特定の細胞内シグナル伝達経路を開始（又は防止）するようにデザインすることができる。
【０２９３】
所定の実施形態において、前記リンカーは実質的に親水性のリンカー（例えばＰＥＧ４Ｍａｌ及びスルホ−ＳＰＤＢ）である。親水性リンカーはＭＤＲ（多剤耐性）又は機能的に同様のトランスポーターにより耐性癌細胞から薬物が押し出される程度を弱めるために使用することができる。
【０２９４】
他の実施形態において、リンカーは切断されると細胞成長及び／又は細胞増殖を直接又は間接的に抑制するように機能する。例えば、所定の実施形態において、前記リンカーは切断されるとインターカレート剤として機能することができ、高分子生合成（例えばＤＮＡ複製、ＲＮＡ転写、及び／又はタンパク質合成）を阻害する。
【０２９５】
他の実施形態において、前記リンカーは隣接細胞へのリンカー−薬物及び／又は薬物単独の拡散によりバイスタンダー殺傷（隣接細胞の殺傷）を助長するようにデザインされる。他の実施形態において、前記リンカーは細胞内移行を促進する。
【０２９６】
立体障害のあるジスルフィドが存在することにより、特定のジスルフィド結合の安定性を増し、ＡＤＣの力価を上げることができる。従って、１実施形態において、前記リンカーは立体障害のあるジスルフィド結合を含む。立体障害のあるジスルフィドとは特定の分子環境内に存在するジスルフィド結合を意味し、このような環境は一般には同一分子又は化合物内の原子がジスルフィド結合の還元を阻止又は少なくとも部分的に抑制するような特定の空間配置又は向きに配置されていることを特徴とする。従って、嵩高な（又は立体障害をもたらす）化学部分及び／又は嵩高なアミノ酸側鎖がジスルフィド結合に近接して存在すると、ジスルフィド結合の還元の原因となる潜在的相互作用にジスルフィド結合が加わるのを阻止又は少なくとも部分的に抑制する。
【０２９７】
特に、上記リンカー種は相互に限定的ではない。例えば、１実施形態において、本願に記載する抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣで使用されるリンカーは細胞内移行を促進する切断不能なリンカーである。
【０２９８】
所定の実施形態において、前記ＡＤＣは下式（式Ｉ）：
Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）ｎ  （Ｉ）
を有するもの又はその医薬的に許容可能な塩もしくは溶媒和物であり、式中、Ａｂは抗体（例えば抗ＥＧＦＲ抗体ＡｂＡ）であり、（Ｌ−Ｄ）はリンカー−薬物部分である。リンカー−薬物部分はリンカーであるＬ−と、例えば標的細胞（例えばＥＧＦＲを発現する細胞）に対する細胞増殖抑制作用、細胞傷害作用又は他の治療作用をもつ薬物部分である−Ｄから構成され、ｎは１〜２０の整数である。
【０２９９】
所定の実施形態において、ｎは１〜８、１〜７、１〜６、１〜５、１〜４、１〜３、１〜２又は１である。
【０３００】
所定の実施形態において、−Ｄ部分は同一である。更に別の実施形態において、−Ｄ部分は相互に異なる。
【０３０１】
上記のように、リンカーは単一の部分でもよいし、２以上の成分を含むものでもよい。従って、所定の実施形態において、前記ＡＤＣは下式（ＩＩ）：
Ａｂ−（Ａａ−Ｗｗ−Ｙｙ−Ｄ）ｎ  （ＩＩ）
を有するもの又はその医薬的に許容可能な塩もしくは溶媒和物であり、式中、Ａｂは抗体（例えば抗ＥＧＦＲ抗体ＡｂＡ）であり、−Ａａ−Ｗｗ−Ｙｙ−は３成分以上を含むリンカー（Ｌ）であり、−Ａ−は場合により存在するストレッチャー単位であり、ａは０又は１であり、各−Ｗ−は独立してアミノ酸単位（又は所定の実施形態ではグルクロニド単位、米国公開番号２０１２／０１０７３３２Ａ１も参照。）であり、ｗは０〜１２の整数であり、−Ｙ−は自壊性スペーサー単位であり、ｙは０、１又は２であり、−Ｄは例えば標的細胞（例えばＥＧＦＲを発現する細胞）に対する細胞増殖抑制作用、細胞傷害作用又は他の治療作用をもつ薬物部分であり、ｎは１〜２０の整数である。
【０３０２】
所定の実施形態において、リンカー成分は抗体を別のリンカー成分又は薬物部分と連結する「ストレッチャー単位」（Ａ）を含む。ストレッチャー単位の非限定的な例を以下に示す（但し、波線は抗体、薬物又はその他のリンカー成分との共有結合部位を示す）。
【０３０３】
【化１２】
2020039360.tif 000015
【０３０４】
ストレッチャー単位（Ａ）が存在する場合には、抗体をアミノ酸単位（−Ｗ−）（存在する場合）、スペーサー単位（−Ｙ−）（存在する場合）、又は薬物（−Ｄ）と連結することができる（式ＩＩ参照。）。本願に記載する抗ＥＧＦＲ抗体に自然に又は化学的操作により存在させることができる有用な官能基としては、限定されないが、スルフヒドリル基、アミノ基、ヒドロキシル基、糖鎖のアノマーヒドロキシル基、及びカルボキシル基が挙げられる。適切な官能基はスルフヒドリル基とアミノ基である。１例において、スルフヒドリル基は抗ＥＧＦＲ抗体の分子内ジスルフィド結合の還元により生成することができる。別の実施形態において、スルフヒドリル基は抗ＥＧＦＲ抗体のリジン部分のアミノ基を２−イミノチオラン（トラウト試薬）又は他のスルフヒドリル基生成試薬と反応させることにより生成することができる。ある種の実施形態において、前記抗ＥＧＦＲ抗体は組換え抗体であり、１個以上のリジン部分をもつように作製される。ある種の他の実施形態において、前記組換え抗ＥＧＦＲ抗体は更にスルフヒドリル基（例えば更にシステイン）をもつように作製される。
【０３０５】
１実施形態において、前記ストレッチャー単位は前記抗体の硫黄原子と結合を形成する。硫黄原子は抗体のスルフヒドリル基に由来することができる。本実施形態の代表的なストレッチャー単位は下記のような式ＩＩＩａ及びＩＩＩｂの大括弧の内側に示される。
【０３０６】
【化１３】
2020039360.tif 000016
式中、Ｌ−、−Ｗ−、−Ｙ−、−Ｄ、ｗ及びｙは上記の通りであり、Ｒ１７は−Ｃ１−Ｃ１０アルキレン−、−Ｃ１−Ｃ１０アルケニレン−、−Ｃ１−Ｃ１０アルキニレン−、カルボシクロ−、−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ８アルキレン）−、Ｏ−（Ｃ１−Ｃ８アルケニレン）−、−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ８アルキニレン）−、−アリーレン−、−Ｃ１−Ｃ１０アルキレン−アリーレン−、−Ｃ２−Ｃ１０アルケニレン−アリーレン、−Ｃ２−Ｃ１０アルキニレン−アリーレン、アリーレン−Ｃ１−Ｃ１０アルキレン−、−アリーレン−Ｃ２−Ｃ１０アルケニレン−、−アリーレン−Ｃ２−Ｃ１０アルキニレン−、−Ｃ１−Ｃ１０アルキレン−（カルボシクロ）−、−Ｃ２−Ｃ１０アルケニレン−（カルボシクロ）−、Ｃ２−Ｃ１０アルキニレン−（カルボシクロ）−、−（カルボシクロ）−Ｃ１−Ｃ１０アルキレン−、−（カルボシクロ）−Ｃ２−Ｃ１０アルケニレン−、−（カルボシクロ）−Ｃ２−Ｃ１０アルキニレン、−ヘテロシクロ−、−Ｃ１−Ｃ１０アルキレン−（ヘテロシクロ）−、−Ｃ２−Ｃ１０アルケニレン−（ヘテロシクロ）−、−Ｃ２−Ｃ１０アルキニレン−（ヘテロシクロ）−、−（ヘテロシクロ）−Ｃ１−Ｃ１０アルキレン−、−（ヘテロシクロ）−Ｃ２−Ｃ１０アルケニレン−、−（ヘテロシクロ）−Ｃ１−Ｃ１０アルキニレン−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ−又は−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ−ＣＨ２−から選択され、ｒは１〜１０の整数であり、単独又は別の基の一部としての前記アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、アリール基、炭素環基、カルボシクロ基、ヘテロシクロ基及びアリーレン基は場合により置換されている。所定の実施形態において、単独又は別の基の一部としての前記アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、アリール基、炭素環基、カルボシクロ基、ヘテロシクロ基及びアリーレン基は置換されていない。所定の実施形態において基、Ｒ１７は−Ｃ１−Ｃ１０アルキレン−、−カルボシクロ−、−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ８アルキレン）−、−アリーレン−、−Ｃ１−Ｃ１０アルキレン−アリーレン−、−アリーレン−Ｃ１−Ｃ１０アルキレン−、−Ｃ１−Ｃ１０アルキレン−（カルボシクロ）−、−（カルボシクロ）−Ｃ１−Ｃ１０アルキレン−、−Ｃ３−Ｃ８ヘテロシクロ−、−Ｃ１−Ｃ１０アルキレン−（ヘテロシクロ）−、−（ヘテロシクロ）−Ｃ１−Ｃ１０アルキレン−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ−及び−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）−ＣＨ２−から選択され、ｒは１〜１０の整数であり、前記アルキレン基は置換されておらず、その他の基は場合により置換されている。
【０３０７】
ストレッチャー単位の１例は下記のようにＲ１７が−（ＣＨ２）５−である式ＩＩＩａの単位である（Ｕ．Ｓ．８，３０９，０９３も参照。）。
【０３０８】
ストレッチャー単位の別の例は下記のように式ＩＩＩａ中、Ｒ１７が−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ−ＣＨ２−であり、ｒが２であるものである（本願に援用するＵ．Ｓ．８，３０９，０９３も参照。）。
【０３０９】
【化１４】
2020039360.tif 000017
【０３１０】
ストレッチャー単位の別の例は式ＩＩＩａ中、Ｒ１７がアリーレン−又はアリーレン−Ｃ１−Ｃ１０アルキレン−であるものである。所定の実施形態において、前記アリール基は置換されていないフェニル基である。更に、ストレッチャー単位の別の例は下記のように式ＩＩＩｂ中、Ｒ１７が−（ＣＨ２）５−であるものである（本願に援用するＵ．Ｓ．８，３０９，０９３も参照。）。
【０３１１】
【化１５】
2020039360.tif 000018
【０３１２】
ある種の実施形態において、前記ストレッチャー単位は抗ＥＧＦＲ抗体単位の硫黄原子とストレッチャー単位の硫黄原子の間のジスルフィド結合を介して抗ＥＧＦＲ抗体と連結されている。本実施形態の代表的なストレッチャー単位は式ＩＶ（下記参照、更に本願に援用するＵ．Ｓ．８，３０９，０９３も参照。）の大括弧の内側に示され、式中、Ｒ１７、Ｌ−、−Ｗ−、−Ｙ−、−Ｄ、ｗ及びｙは上記の通りである。
【０３１３】
【化１６】
2020039360.tif 000019
【０３１４】
なお、文脈により特に指定しない限り、下式（本願に援用するＵ．Ｓ．８，３０９，０９３も参照。）のＳ部分は抗体の硫黄原子を表す。
【０３１５】
【化１７】
2020039360.tif 000020
【０３１６】
更に他の実施形態において、前記ストレッチャーは抗体の第１級又は第２級アミノ基と結合を形成することができる反応性部位を含む。これらの反応性部位の例としては、限定されないが、スクシンイミドエステル、４−ニトロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、テトラフルオロフェニルエステル等の活性化エステル、酸無水物、酸塩化物、スルホニルクロリド、イソシアネート及びイソチオシアネートが挙げられる。本実施形態の代表的なストレッチャー単位は式Ｖａ及びＶｂ（下記参照（本願に援用するＵ．Ｓ．８，３０９，０９３も参照。））の大括弧の内側に示され、式中、Ｒ１７、Ｌ−、−Ｗ−、−Ｙ−、−Ｄ、ｗ及びｙは上記の通りである。
【０３１７】
【化１８】
2020039360.tif 000021
【０３１８】
所定の実施形態において、前記ストレッチャーは抗体上に存在させることができる修飾糖鎖の（−ＣＨＯ）基に対して反応性の反応性部位を含む。例えば、過ヨウ素酸ナトリウム等の試薬を使用して糖鎖を温和に酸化させ、Ｋａｎｅｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．２：１３３−４１に記載されているもの等のヒドラジド、オキシム、第１級又は第２級アミン、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレート及びアリールヒドラジド等の官能基を含むストレッチャーと得られた酸化糖鎖の（−ＣＨＯ）単位をを縮合させることができる。本実施形態の代表的なストレッチャー単位は式ＶＩａ、ＶＩｂ及びＶＩｃ（下記参照（本願に援用するＵ．Ｓ．８，３０９，０９３も参照。））の大括弧の内側に示され、式中、Ｒ１７、Ｌ−、−Ｗ−、−Ｙ−、−Ｄ、ｗ及びｙは上記の通りである。
【０３１９】
【化１９】
2020039360.tif 000022
【０３２０】
所定の実施形態において、リンカー成分は「アミノ酸単位」（Ｗ）を含む。所定のこのような実施形態において、前記アミノ酸単位はプロテアーゼによるリンカーの切断を可能にし、リソソーム酵素等の細胞内プロテアーゼに暴露されると、イムノコンジュゲートから薬物を放出し易くなる（Ｄｏｒｏｎｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１：７７８−７８４）。アミノ酸単位の例としては、限定されないが、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド及びペンタペプチドが挙げられる。ジペプチドの例としては、限定されないが、バリン−シトルリン（ｖｃないしｖａｌ−ｃｉｔ）、アラニン−フェニルアラニン（ａｆないしａｌａ−ｐｈｅ）、フェニルアラニン−リジン（ｆｋないしｐｈｅ−ｌｙｓ）、フェニルアラニン−ホモリジン（ｐｈｅ−ｈｏｍｏｌｙｓ）、及びＮ−メチル−バリン−シトルリン（Ｍｅ−ｖａｌ−ｃｉｔ）が挙げられる。トリペプチドの例としては、限定されないが、グリシン−バリン−シトルリン（ｇｌｙ−ｖａｌ−ｃｉｔ）とグリシン−グリシン−グリシン（ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ）が挙げられる。アミノ酸単位は天然型アミノ酸及び／又は微量アミノ酸及び／又はシトルリン等の非天然型アミノ酸アナログであるアミノ酸残基を含むことができる。アミノ酸単位は特定の酵素（例えば腫瘍関連プロテアーゼ、カテプシンＢ、Ｃ及びＤ、又はプラスミンプロテアーゼ）により酵素切断されるようにデザインし、最適化することができる。
【０３２１】
１実施形態において、前記アミノ酸単位Ｗはバリン−シトルリン（ｖｃないしｖａｌ−ｃｉｔ）である。別の態様において、前記アミノ酸単位はフェニルアラニン−リジン（即ちｆｋ）である。アミノ酸単位の更に別の態様において、前記アミノ酸単位はＮ−メチル−バリン−シトルリンである。更に別の態様において、前記アミノ酸単位は５−アミノ吉草酸、ホモフェニルアラニン−リジン、テトライソキノリンカルボキシレート−リジン、シクロヘキシルアラニン−リジン、イソニペコチン酸−リジン、βアラニン−リジン、グリシン−セリン−バリン−グルタミン及びイソニペコチン酸である。
【０３２２】
あるいは、所定の実施形態において、−Ｗ−はグルクロニド単位であり、ストレッチャー単位とスペーサー単位が存在する場合にはストレッチャー単位をスペーサー単位に連結し、スペーサー単位が存在しない場合にはストレッチャー単位を薬物部分に連結し、ストレッチャー単位とスペーサー単位が存在しない場合にはリンカー単位を薬物に連結する。グルクロニド単位はβ−グルクロニダーゼ酵素により切断することができる部位を含む（本願に援用するＵＳ２０１２／０１０７３３２も参照。）。所定の実施形態において、前記グルクロニド単位は下記のような式のグリコシド結合（−Ｏ’−）を介して自壊性基（Ｚ）と連結された糖部分（Ｓｕ）を含む（本願に援用するＵＳ２０１２／０１０７３３２も参照。）。
【０３２３】
【化２０】
2020039360.tif 000023
【０３２４】
グリコシド結合（−Ｏ’−）は典型的にはヒトリソソームβ−グルクロニダーゼにより切断可能な結合等のβ−グルクロニダーゼ切断部位である。グルクロニド単位に関連して「自壊性基」なる用語は、２又は３個の分離した化学部分（即ち（グリコシド結合を介して）糖部分と、（直接又はスペーサー単位を介して間接的に）薬物部分と、所定の実施形態では（直接又はストレッチャー単位を介して間接的に）リンカーと）を共有結合させて安定な分子にすることが可能な二官能性又は三官能性の化学部分を意味する。自壊性基は糖部分との結合が切断されると、第１の化学部分（例えばスペーサー単位又は薬物単位）から自然に分離する。
【０３２５】
所定の実施形態において、前記糖部分（Ｓｕ）はピラノース等の環状ヘキソース又はフラノース等の環状ペントースである。所定の実施形態において、前記ピラノースはグルクロニド又はヘキソースである。前記糖部分は通常ではβ−Ｄ配座である。特定の１実施形態において、前記ピラノースはβ−Ｄ−グルクロニド部分（即ちβ−グルクロニダーゼにより切断可能なグリコシド結合を介して自壊性基−Ｚ−と連結されたβ−Ｄ−グルクロン酸）である。所定の実施形態において、前記糖部分は置換されていない（例えば天然型環状ヘキソース又は環状ペントース）。他の実施形態において、前記糖部分は置換のβ−Ｄ−グルクロニド（即ち水素、ヒドロキシル、ハロゲン、硫黄、窒素又は低級アルキル等の１個以上の基で置換されたグルクロン酸）とすることができる。
【０３２６】
所定の実施形態において、前記グルクロニド単位は下記のような式の一方を有する（本願に援用するＵＳ２０１２／０１０７３３２も参照。）。
【０３２７】
【化２１】
2020039360.tif 000024
式中、Ｓｕは糖部分であり、グリコシド結合はＳｕと自壊性基Ｚの間に酸素結合を含み、各Ｒは独立して水素、ハロ（例えばクロロ、ブロモ、フルオロ等）、−ＣＮ、−ＮＯ２、又は他の電子吸引基もしくは電子供与基であり、但し、グルクロニド単位（特にＺ）はグリコシド結合が切断されると、自壊する。所定の実施形態において、各Ｒは独立して水素、ハロ（例えばクロロ、ブロモ、フルオロ等）、−ＣＮ又は−ＮＯ２である。
【０３２８】
所定の実施形態において、前記グルクロニド単位は下記のような式の一方を有する（本願に援用するＵＳ２０１２／０１０７３３２も参照。）。
【０３２９】
【化２２】
2020039360.tif 000025
式中、Ｓｕは糖部分であり、グリコシド結合（−Ｏ’−）はＳｕと自壊性基Ｚの間に酸素結合を含み、各Ｒは独立して水素である。
【０３３０】
所定の実施形態において、前記自壊性基（Ｚ）は糖部分と、（直接又はスペーサー単位を介して間接的に）薬物と、（直接又はストレッチャー単位を介して間接的に）リンカーとに共有結合している。所定の実施形態において、薬物リンカーコンジュゲートは下記のような式を有する（本願に援用するＵＳ２０１２／０１０７３３２も参照。）。
【０３３１】
【化２３】
2020039360.tif 000026
式中、Ｓｕ、Ｏ’、Ｚ、Ｙ、ｙ、Ｄ、Ａ及びａは本願に記載する通りである。典型的にはこのような薬物−リンカーコンジュゲート１〜２０個をリンカーと連結することができる。
【０３３２】
所定の実施形態において、前記グルクロニド単位を含むＡＤＣは下記のような式の一方で表され（本願に援用するＵＳ２０１２／０１０７３３２も参照。）、式中、Ｓｕ、Ｙ、ｙ、Ｄ、Ａ、ａ及びＬは本願に記載する通りである。
【０３３３】
【化２４】
2020039360.tif 000027
【０３３４】
所定の実施形態において、前記グルクロニド単位を含むＡＤＣは下記のような式で表され（本願に援用するＵＳ２０１２／０１０７３３２も参照。）、式中、Ｙ、ｙ、Ｄ、Ａ、ａ及びＬは本願に記載する通りである。
【０３３５】
【化２５】
2020039360.tif 000028
【０３３６】
所定の実施形態において、前記グルクロニド単位を含むＡＤＣは下記のような式で表され（本願に援用するＵＳ２０１２／０１０７３３２も参照。）、式中、Ｙ、ｙ、Ｄ及びＬは本願に記載する通りである。
【０３３７】
【化２６】
2020039360.tif 000029
【０３３８】
所定の実施形態において、前記グルクロニド単位を含むＡＤＣは下記のような式で表され（本願に援用するＵＳ２０１２／０１０７３３２も参照。）、式中、Ｙ、ｙ、Ｄ及びＬは本願に記載する通りである。
【０３３９】
【化２７】
2020039360.tif 000030
【０３４０】
所定の実施形態において、前記グルクロニド単位を含むＡＤＣは下記のような式で表され（ＵＳ２０１２／０１０７３３２Ａ１も参照。）、式中、Ｄは本願に記載する通りであり、ｍＡｂはモノクローナル抗体である。
【０３４１】
【化２８】
2020039360.tif 000031
【０３４２】
スペーサー単位（−Ｙ−）が存在する場合でアミノ酸単位が存在する場合には、前記スペーサー単位は前記アミノ酸単位（又はグルクロニド単位、本願に援用するＵＳ２０１２／０１０７３３２も参照。）を薬物部分に連結する。あるいは、アミノ酸単位が存在しない場合には、スペーサー単位はストレッチャー単位を薬物部分に連結する。アミノ酸単位とストレッチャー単位のどちらも存在しない場合には、スペーサー単位は薬物単位を抗体単位に連結することもできる。
【０３４３】
スペーサー単位は一般に非自壊性又は自壊性の２種類がある。非自壊性スペーサー単位はアミノ酸単位（又はグルクロニド単位）が抗体薬物コンジュゲートから特に酵素により切断された後にスペーサー単位の一部又は全部が薬物部分と結合した状態に保たれるものである。非自壊性スペーサー単位の例としては、限定されないが、（グリシン−グリシン）スペーサー単位とグリシンスペーサー単位が挙げられる（いずれも下記スキーム１で表される（本願に援用するＵ．Ｓ．８，３０９，０９３も参照。））。
【０３４４】
【化２９】
2020039360.tif 000032
【０３４５】
グリシン−グリシンスペーサー単位又はグリシンスペーサー単位を含むコンジュゲートが酵素（例えば腫瘍細胞関連プロテアーゼ、癌細胞関連プロテアーゼ又はリンパ球関連プロテアーゼ）により酵素切断されると、グリシン−グリシン−薬物部分又はグリシン−薬物部分はＬ−Ａａ−Ｗｗ−から切断される。１実施形態では、標的細胞内で独立した加水分解反応が生じ、グリシン−薬物部分の結合が切断され、薬物が放出される。
【０３４６】
所定の実施形態において、非自壊性スペーサー単位（−Ｙ−）は−Ｇｌｙ−である。所定の実施形態において、非自壊性スペーサー単位（−Ｙ−）は−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−である。
【０３４７】
１実施形態では、スペーサー単位が不在である（ｙ＝０）薬物−リンカーコンジュゲート又はその医薬的に許容可能な塩もしくは溶媒和物を提供する。
【０３４８】
あるいは、自壊性スペーサー単位を含むコンジュゲートは薬物部分を放出させることができる。自壊性スペーサー単位は第１の部分との結合が切断されると、第２の化学部分から自然に分離する。
【０３４９】
所定の実施形態において、−Ｙｙ−はフェニレン部分がＱｍで置換されたｐ−アミノベンジルアルコール（ＰＡＢ）単位であり、但し、Ｑは−Ｃ１−Ｃ８アルキル、−Ｃ１−Ｃ８アルケニル、−Ｃ１−Ｃ８アルキニル、−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ８アルキル）、−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ８アルケニル）、−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ８アルキニル）、−ハロゲン、−ニトロ又は−シアノであり、ｍは０〜４の整数である。単独又は別の基の一部としての前記アルキル基、アルケニル基及びアルキニル基は場合により置換されていてもよい。
【０３５０】
所定の実施形態において、−Ｙ−はＰＡＢ基であり、ＰＡＢ基のアミノ窒素原子を介して−Ｗｗ−と連結されると共に、カーボネート基、カルバメート基又はエーテル基を介して−Ｄと直接結合している。特定の理論又はメカニズムに拘泥するものではないが、下記スキーム２（Ｕ．Ｓ．８，３０９，０９３も参照。）はＴｏｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６７：１８６６−１８７２により記載されているようにカルバメート基又はカーボネート基を介して−Ｄと直接結合したＰＡＢ基の予想される薬物放出メカニズムを示す。
【０３５１】
【化３０】
2020039360.tif 000033
【０３５２】
スキーム２において、Ｑは−Ｃ１−Ｃ８アルキル、−Ｃ１−Ｃ８アルケニル、−Ｃ１−Ｃ８アルキニル、−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ８アルキル）、−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ８アルケニル）、−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ８アルキニル）、−ハロゲン、−ニトロ又は−シアノであり、ｍは０〜４の整数であり、ｐは１〜約２０である。単独又は別の基の一部としての前記アルキル基、アルケニル基及びアルキニル基は場合により置換されていてもよい。
【０３５３】
自壊性スペーサーの他の例としては、限定されないが、ＰＡＢ基と電子的に類似する芳香族化合物が挙げられ、例えば２−アミノイミダゾール−５−メタノール誘導体（Ｈａｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．９：２２３７）及びオルト又はパラアミノベンジルアセタールが挙げられる。アミド結合が加水分解すると環化するスペーサーを使用することができ、例えば、置換及び非置換の４−アミノ酪酸アミド（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２：２２３）、適切に置換されたビシクロ［２．２．１］及びビシクロ［２．２．２］環系（Ｓｔｏｒｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９７２，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９４：５８１５）並びに２−アミノフェニルプロピオン酸アミド（Ａｍｓｂｅｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５５：５８６７）が挙げられる。グリシンのα位を置換されたアミン含有薬物の脱離（Ｋｉｎｇｓｂｕｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２７：１４４７）も自壊性スペーサーの例である。
【０３５４】
１態様において、スペーサー単位（−Ｙｙ−）は式（Ｘ）−（ＸＩＩ）（下記参照（Ｕ．Ｓ．８，３０９，０９３も参照。））により表され、式中、Ｑは−Ｃ１−Ｃ８アルキル、−Ｃ１−Ｃ８アルケニル、−Ｃ１−Ｃ８アルキニル、−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ８アルキル）、−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ８アルケニル）、−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ８アルキニル）、−ハロゲン、−ニトロ又は−シアノであり、ｍは０〜４の整数である。
【０３５５】
【化３１】
2020039360.tif 000034
【０３５６】
自壊性スペーサーの他の例としては、限定されないが、ＰＡＢ基と電子的に類似する芳香族化合物が挙げられ、例えば２−アミノイミダゾール−５−メタノール誘導体（例えばＨａｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．９：２２３７参照。）及びオルト又はパラアミノベンジルアセタールが挙げられる。アミド結合が加水分解すると環化するスペーサーを使用することができ、例えば、置換及び非置換の４−アミノ酪酸アミド（例えばＲｏｄｒｉｇｕｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２：２２３参照。）、適切に置換されたビシクロ［２．２．１］及びビシクロ［２．２．２］環系（例えばＳｔｏｒｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９７２，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９４：５８１５参照。）並びに２−アミノフェニルプロピオン酸アミド（例えばＡｍｓｂｅｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５５：５８６７参照。）が挙げられる。グリシンのα位を置換されたアミン含有薬物の脱離（例えばＫｉｎｇｓｂｕｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２７：１４４７参照。）も自壊性スペーサーの例である。
【０３５７】
他の適切なスペーサー単位はその開示内容を本願に援用する米国特許出願公開第２００５−０２３８６４９号に開示されている。
【０３５８】
ＡＤＣの作製の別のアプローチは抗ＥＧＦＲ抗体を薬物部分に連結するヘテロ二官能性架橋剤を使用する方法である。使用することができる架橋剤の例としては、Ｎ−スクシンイミジル４−（５−ニトロ−２−ピリジルジチオ）ペンタノエート又は高水溶性アナログであるＮ−スルホスクシンイミジル４−（５−ニトロ−２−ピリジルジチオ）ペンタノエート、Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）ブチレート（ＳＰＤＢ）、Ｎ−スクシンイミジル−４−（５−ニトロ−２−ピリジルジチオ）ブチレート（ＳＮＰＢ）及びＮ−スルホスクシンイミジル−４−（５−ニトロ−２−ピリジルジチオ）ブチレート（ＳＳＮＰＢ）、Ｎ−スクシンイミジル−４−メチル−４−（５−ニトロ−２−ピリジルジチオ）ペンタノエート（ＳＭＮＰ）、Ｎ−スクシンイミジル−４−（５−Ｎ，Ｎ−ジメチルカルボキサミド−２−ピリジルジチオ）ブチレート（ＳＣＰＢ）又はＮ−スルホスクシンイミジル４−（５−Ｎ，Ｎ−ジメチルカルボキサミド−２−ピリジルジチオ）ブチレート（ＳＳＣＰＢ）が挙げられる。本発明の抗体は架橋剤であるＮ−スクシンイミジル４−（５−ニトロ−２−ピリジルジチオ）ペンタノエート、Ｎ−スルホスクシンイミジル４−（５−ニトロ−２−ピリジルジチオ）ペンタノエート、ＳＰＤＢ、ＳＮＰＢ、ＳＳＮＰＢ、ＳＭＮＰ、ＳＣＰＢ又はＳＳＣＰＢで修飾することができ、その後、チオール部分を含むやや過剰の特定の薬物と反応させると、優れた収率でＡＤＣが得られる。架橋剤は下記のような式の化合物が好ましい（本願に援用する米国特許第６，９１３，７４８も参照。）。
【０３５９】
【化３２】
2020039360.tif 000035
式中、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は同一又は異なり、Ｈ、メチル、エチル、又は炭素原子数３〜６の直鎖、分岐鎖もしくは環状アルキル基であり、ｎは０又は１〜４の整数であり、Ｘ及びＹは同一又は異なりＨ、ＣＯＮＲ４Ｒ５又はＮＯ２であり、但し、ＸとＹが同時にＨであることはなく、Ｒ４及びＲ５は同一又は異なり、各々Ｈ、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル又はｔｅｒｔ−ブチルであり、ＺはＳＯ３−Ｍ＋又はＨであり、但し、Ｍ＋は金属イオン又はテトラアルキルアンモニウムイオンを表し、但し、Ｘ及び／又はＹがＮＯ２であるとき、ＺはＨ以外のものである。その他のヘテロ二官能性架橋剤とこのような架橋剤を使用したＡＤＣの作製方法は特に本願に援用する米国特許第６，９１３，７４８号に記載されている。
【０３６０】
１実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体を薬物に結合してＡＤＣを形成するために荷電リンカー（別称プロチャージリンカー）を使用する。荷電リンカーとしては、細胞プロセシング後に荷電状態となるリンカーが挙げられる。細胞プロセシング後に特定のＡＤＣのリンカー又は薬物に荷電基が存在すると、複数の利点が得られ、例えば（ｉ）ＡＤＣの水溶解度が高くなり、（ｉｉ）水溶液中の濃度を上げて操作でき、（ｉｉｉ）抗体１個当たり多数の薬物分子を連結できるので、潜在的に力価が高くなり、（ｉｖ）荷電コンジュゲート種を標的細胞の内側に維持することが可能になるので、力価が高くなり、（ｖ）多剤耐性細胞の感受性が改善され、荷電薬物種を細胞から運び出せなくなる。所定の適切な荷電又はプロチャージ架橋剤の例とその合成は米国特許第８，２３６，３１９号の図１〜１０に示されており、本願に援用する。荷電又はプロチャージ架橋剤はＡＤＣ、特に２〜２０個の薬物を結合させたＡＤＣの溶解度を有意に上昇させるスルホネート、ホスフェート、カルボキシル又は第４級アミン置換基を含むものが好ましい。プロチャージ部分を含むリンカーから作製したコンジュゲートはコンジュゲートが細胞内で代謝された後に１個以上の荷電部分を生成する。
【０３６１】
別の実施形態において、本発明のＡＤＣは下記のような式を有するリンカーを含む（本願に援用する米国特許第８，２３６，３１９も参照。）。
【０３６２】
【化３３】
2020039360.tif 000036
式中、Ｙ’は抗体との反応を可能にする官能基を表し；Ｑはジスルフィド、チオエーテル、チオエステル、ペプチド、ヒドラゾン、エステル、エーテル、カルバメート又はアミド結合を介して薬物との連結を可能にする官能基を表し；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０は同一又は異なり、Ｈ、炭素原子数１〜６の直鎖アルキル基、炭素原子数３〜６の分岐鎖もしくは環状アルキル基、炭素原子数２〜６の直鎖、分岐鎖もしくは環状アルケニル基もしくはアルキニル基、限定されないが、ＳＯ３−、Ｘ−ＳＯ３−、ＯＰＯ３２−、Ｘ−ＯＰＯ３２−、ＰＯ３２−、Ｘ−ＰＯ３２−、ＣＯ２−等のアニオン、限定されないが、窒素含有複素環、Ｎ＋Ｒ１１Ｒ１２Ｒ１３もしくはＸ−Ｎ＋Ｒ１１Ｒ１２Ｒ１３等のカチオン又はフェニルであり、但し、Ｒ１１、Ｒ１２及びＲ１３は同一又は異なり、Ｈ、炭素原子数１〜６の直鎖アルキル基又は炭素原子数３〜６の分岐鎖もしくは環状アルキル基であり、Ｘはフェニル又は炭素原子数１〜６の直鎖アルキル基又は炭素原子数３〜６の分岐鎖もしくは環状アルキル基を表し；ｌ、ｍ及びｎは０又は１〜４の整数であり；Ａはフェニル又は置換のフェニルであり、置換基は炭素原子数１〜６の直鎖アルキル基、又は炭素原子数３〜６の分岐鎖もしくは環状アルキル基、又は限定されないが、ＳＯ３−、Ｘ−ＳＯ３−、ＯＰＯ３２−、Ｘ−ＯＰＯ３２−、ＰＯ３２−、Ｘ−ＰＯ３２−、ＣＯ２−等のアニオンと、限定されないが、窒素含有複素環、Ｎ＋Ｒ１１Ｒ１２Ｒ１３もしくはＸ−Ｎ＋Ｒ１１Ｒ１２Ｒ１３等のカチオンから選択される荷電置換基であり、なお、Ｘは上記と同義であり；ｇは０又は１であり；Ｚは場合により存在する式（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｐ（式中、ｐは０又は２〜約１０００の整数である。）のポリエチレンオキシ単位又はＦ１−Ｅ１−Ｐ−Ｅ２−Ｆ２であり、式中、Ｅ１及びＥ２は同一又は異なり、Ｃ＝Ｏ、Ｏ又はＮＲ１４であり、但し、Ｒ１４はＨ、炭素原子数１〜６の直鎖アルキル基、炭素原子数３〜６の分岐鎖もしくは環状アルキル基、炭素原子数２〜６の直鎖、分岐鎖もしくは環状アルケニル基もしくはアルキニル基であり；Ｐは２〜２０アミノ酸長のペプチド単位であり、Ｅ１又はＥ２は末端窒素、末端炭素又はペプチドのアミノ酸の１個の側鎖を介してペプチドと連結することができ；Ｆ１及びＦ２は同一又は異なり、場合により存在する式（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｐ（式中、ｐは０又は２〜約１０００の整数である。）のポリエチレンオキシ単位であり、但し、ＺがＦ１−Ｅ１−Ｐ−Ｅ２−Ｆ２以外のものであるとき、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０の少なくとも１個は荷電置換基であり、あるいはｇが１であるとき、Ａ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０の少なくとも１個は荷電置換基である。
【０３６３】
前記組成物及び方法で使用することができるリンカーのその他の例としては、バリン−シトルリン、マレイミドカプロイル、アミノ安息香酸、ｐ−アミノベンジルカルバモイル（ＰＡＢ）、リソソーム酵素で切断可能なリンカー、マレイミドカプロイル−ポリエチレングリコール（ＭＣ（ＰＥＧ）６−ＯＨ）、Ｎ−メチル−バリン−シトルリン、Ｎ−スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ブタノエート（ＳＰＤＢ）、及びＮ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）が挙げられる（ＵＳ２０１１／００７６２３２も参照。）。本発明で使用される別のリンカーとしては、アビジン−ビオチン含有ＡＤＣを提供するためのアビジン−ビオチン結合が挙げられ（米国特許第４，６７６，９８０号、ＰＣＴ公開番号ＷＯ１９９２／０２２３３２Ａ２、ＷＯ１９９４／０１６７２９Ａ１、ＷＯ１９９５／０１５７７０Ａ１、ＷＯ１９９７／０３１６５５Ａ２、ＷＯ１９９８／０３５７０４Ａ１、ＷＯ１９９９／０１９５００Ａ１、ＷＯ２００１／０９７８５Ａ２、ＷＯ２００１／０９０１９８Ａ１、ＷＯ２００３／０９３７９３Ａ２、ＷＯ２００４／０５００１６Ａ２、ＷＯ２００５／０８１８９８Ａ２、ＷＯ２００６／０８３５６２Ａ２、ＷＯ２００６／０８９６６８Ａ１、ＷＯ２００７／１５００２０Ａ１、ＷＯ２００８／１３５２３７Ａ１、ＷＯ２０１０／１１１１９８Ａ１、ＷＯ２０１１／０５７２１６Ａ１、ＷＯ２０１１／０５８３２１Ａ１、ＷＯ２０１２／０２７４９４Ａ１及びＥＰ７７６７１Ｂ１も参照。）、所定のこのようなリンカーはビオチニダーゼ切断に耐性である。本発明で使用することができるその他のリンカーとしては、コヘシン・ドックリンを含むＡＤＣを提供するためのコヘシン／ドックリン対が挙げられる（ＰＣＴ公開番号ＷＯ２００８／０９７８６６Ａ２、ＷＯ２００８／０９７８７０Ａ２、ＷＯ２００８／１０３９４７Ａ２及びＷＯ２００８／１０３９５３Ａ２参照。）。
【０３６４】
本発明で使用されるその他のリンカーは非ペプチドポリマーを含むことができる（例としては、限定されないが、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、多糖類、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、ＰＬＡ（ポリ（乳酸））、ＰＬＧＡ（ポリ（乳酸−グリコール酸））及びその組合せが挙げられ、好ましいポリマーはポリエチレングリコールである。）（ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１１／０００３７０も参照。）。その他のリンカーもＷＯ２００４−０１０９５７、米国公開第２００６００７４００８号、米国公開第２００５０２３８６４９号、及び米国公開第２００６００２４３１７号に記載されており、各々その開示内容全体を本願に援用する。
【０３６５】
メイタンシノイドを含むＡＤＣでは、連結部分を化学的に連結するための位置としてメイタンシノイド上の多数の位置を利用することができる。１実施形態において、メイタンシノイドは、反応性化学基を含む連結部分を含み、前記連結部分がジスルフィド結合を含み、前記化学反応基がＮ−スクシンイミジル又はＮ−スルホスクシンイミジルエステルを含むメイタンシノールとそのアナログのＣ３エステルである。例えば、ヒドロキシル基をもつＣ３位、ヒドロキシメチル基で修飾されたＣ１４位、ヒドロキシ基で修飾されたＣ１５位及びヒドロキシ基をもつＣ２０位はいずれも有用である。連結部分はメイタンシノールのＣ３位に連結されることが最も好ましい。
【０３６６】
リンカーを介して薬物を抗体に結合させるのは当分野で公知の任意技術により実施することができる。薬物とリンカーを抗体と共有結合させるには多数の異なる反応が利用可能である。これはリジンのアミン基、グルタミン酸及びアスパラギン酸の遊離カルボン酸基、システインのスルフヒドリル基並びに芳香族アミノ酸の種々の部分を含む抗体のアミノ酸残基の反応により実施することができる。最も広く使用されている非特異的な共有結合法の１つはカルボジイミド反応により化合物のカルボキシ（アミノ）基を抗体のアミノ（又はカルボキシ）基に連結する方法である。更に、化合物のアミノ基を抗体のアミノ基に連結するためにジアルデヒドやイミドエステル等の二官能性試薬が使用されている。薬物と抗体の結合にはシッフ塩基反応も利用可能である。この方法はグリコール基又はヒドロキシ基を含む薬物の過ヨウ素酸酸化により、アルデヒドを形成した後、結合剤と反応させる。抗体のアミノ基とのシッフ塩基の形成により結合が生じる。薬物を抗体に共有結合させるためのカップリング剤としてイソチオシアネートを使用することもできる。他の技術も当業者に公知であり、本発明の範囲に含まれる。
【０３６７】
ある種の実施形態では、リンカーの前駆体である中間体を適当な条件下で薬物と反応させる。ある種の実施形態では、薬物又は中間体の反応性基を使用する。薬物と中間体又は誘導体化した薬物の反応の生成物をその後、適当な条件下で抗ＥＧＦＲ抗体と反応させる。典型的なリンカー、ストレッチャー単位、アミノ酸単位、自壊性スペーサー単位の合成と構造については各々本願に援用する米国特許出願公開第２００３００８３２６３号、２００５０２３８６４９号及び２００５０００９７５１号に記載されている。
【０３６８】
ＡＤＣの安定性は質量分析法、ＨＰＬＣ及び分離／分析技術であるＬＣ／ＭＳ等の標準分析技術により測定することができる。
【０３６９】
ＩＶ．抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣの精製
一定のＤＡＲをもつＡＤＣを回収するようにＡＤＣの精製を実施することができる。例えば、薬物対抗体比（ＤＡＲ）が最適（例えばＤＡＲが４以下）であるＡＤＣから薬物負荷量の多いＡＤＣを分離するためにＨＩＣ樹脂を使用することができる。１実施形態では、疎水性樹脂をＡＤＣ混合物に加え、望ましくないＡＤＣ、即ち薬物負荷量の多いＡＤＣを樹脂に結合させて混合物から選択的に除去できるようにする。ある種の実施形態において、ＡＤＣの分離はＡＤＣ混合物（例えば４以下のＡＤＣ薬物負荷種と６以上のＡＤＣ薬物負荷種の混合物）から除去しようとする薬物負荷種と結合させるために十分な量の疎水性樹脂とＡＤＣ混合物を接触させることにより実施することができる。除去しようとするＡＤＣ種（例えば６以上の薬物負荷種）を樹脂と結合させてＡＤＣ混合物中の他方のＡＤＣ種から除去できるように樹脂とＡＤＣ混合物を混合する。この方法で使用する樹脂量は、望ましい薬物負荷種との有意結合を生じないように、除去しようとする種と樹脂の重量比に従って選択される。従って、平均ＤＡＲ５．５を４未満まで減らすような方法を使用することができる。更に、任意の望ましい範囲の薬物負荷種（例えば４以下の薬物負荷種、３以下の薬物負荷種、２以下の薬物負荷種、１以下の薬物負荷種）を含むＡＤＣを単離するために、本願に記載する精製方法を使用することができる。
【０３７０】
ある種の分子種はこの種と疎水性樹脂の疎水性相互作用に基づいて表面と結合する。１実施形態において、本発明の方法は疎水性樹脂とＡＤＣの混合物の混合に依存する精製法に関し、混合物への樹脂の添加量によりどの種（例えばＤＡＲが６以上のＡＤＣ）が結合するかが決定される。発現システム（例えば哺乳動物発現システム）から抗体の産生及び精製後に抗体を還元し、結合反応により薬物と結合させる。得られるＡＤＣ混合物は多くの場合にはＤＡＲが例えば１〜８の範囲のＡＤＣを含む。１実施形態において、前記ＡＤＣ混合物は４以下の薬物負荷種と６以上の薬物負荷種を含む。本発明の方法によると、薬物負荷量の多いＡＤＣ（例えば６以上の薬物負荷種を含むＡＤＣ）から４以下の薬物負荷種を含むＡＤＣを選択・分離するように、限定されないが、バッチ法等の方法によりＡＤＣ混合物を精製することができる。特に、本願に記載する精製方法はＤＡＲが任意の望ましい範囲（例えばＤＡＲが４以下、ＤＡＲが３以下、ＤＡＲが２以下）であるＡＤＣを単離するために使用することができる。
【０３７１】
従って、１実施形態では、ＡＤＣ混合物と接触させる疎水性樹脂の量が６以上の薬物負荷種を結合させるために十分でありながら、４以下の薬物負荷種の有意結合を生じさせないような量となるように、４以下の薬物負荷種と６以上の薬物負荷種を含むＡＤＣ混合物を疎水性樹脂と接触させて樹脂混合物を形成し；抗体をアウリスタチンと結合させたＡＤＣを含む組成物であって、６以上の薬物負荷種が１５％未満である組成物を得るように疎水性樹脂をＡＤＣ混合物から除去する。別の実施形態において、本発明の方法はＡＤＣ混合物と接触させる疎水性樹脂の量が６以上の薬物負荷種を結合させるために十分でありながら、４以下の薬物負荷種の有意結合を生じさせないような量となるように、４以下の薬物負荷種と６以上の薬物負荷種を含むＡＤＣ混合物を疎水性樹脂と接触させて樹脂混合物を形成する工程と；抗体をアウリスタチンと結合させたＡＤＣを含む組成物であって、６以上の薬物負荷種が１５％未満であり且つ疎水性樹脂重量がＡＤＣ混合物中の６以上の薬物負荷種の３〜１２倍である組成物を得るように疎水性樹脂をＡＤＣ混合物から除去する工程を含む。
【０３７２】
本願に記載するＡＤＣ分離方法はバッチ精製法を使用して実施することができる。バッチ精製法は一般に、容器内でＡＤＣ混合物を疎水性樹脂に加える工程と、混合する工程と、その後、樹脂を上清から分離する工程を含む。例えば、バッチ精製の関連では、疎水性樹脂を望ましい平衡化バッファー中で調製することができ、又は望ましい平衡化バッファーで平衡化することができる。こうして疎水性樹脂のスラリーを得ることができる。次にＡＤＣ混合物をスラリーと接触させ、分離しようとするＡＤＣの特定種を疎水性樹脂に吸着させる。次に、例えば濾過又はスラリーを沈殿させて上清から除去することにより、疎水性樹脂材料と結合しない望ましいＡＤＣを含有する溶液をスラリーから分離する。得られたスラリーを１以上の洗浄工程に供することができる。結合したＡＤＣを溶出させるためには、塩濃度を下げることができる。１実施形態において、本発明で使用する方法は５０ｇ以下の疎水性樹脂を利用する。
【０３７３】
従って、ＡＤＣ混合物と接触させる疎水性樹脂の量が６以上の薬物負荷種を結合させるために十分でありながら、４以下の薬物負荷種の有意結合を生じさせないような量となるように、４以下の薬物負荷種と６以上の薬物負荷種を含むＡＤＣ混合物を疎水性樹脂と接触させて樹脂混合物を形成し；抗体をアウリスタチンと結合させたＡＤＣを含む組成物であって、６以上の薬物負荷種が１５％未満である組成物を得るように疎水性樹脂をＡＤＣ混合物から除去するために、バッチ法を使用することができる。別の実施形態では、ＡＤＣ混合物と接触させる疎水性樹脂の量が６以上の薬物負荷種を結合させるために十分でありながら、４以下の薬物負荷種の有意結合を生じさせないような量となるように、４以下の薬物負荷種と６以上の薬物負荷種を含むＡＤＣ混合物を疎水性樹脂と接触させて樹脂混合物を形成し；抗体をアウリスタチンと結合させたＡＤＣを含む組成物であって、６以上の薬物負荷種が１５％未満であり且つ疎水性樹脂重量がＡＤＣ混合物中の６以上の薬物負荷種の３〜１２倍である組成物を得るように疎水性樹脂をＡＤＣ混合物から除去するために、バッチ法を使用する。
【０３７４】
あるいは、別の実施形態では、循環法を使用して精製を実施することができ、この方法では樹脂を容器に充填し、分離しようとするＡＤＣの特定種が除去されるまでＡＤＣ混合物を疎水性樹脂に流す。その後、（所望のＡＤＣ種を含む）上清を容器から排出させ、樹脂を洗浄工程に供することができる。
【０３７５】
ＡＤＣ混合物と接触させる疎水性樹脂の量が６以上の薬物負荷種を結合させるために十分でありながら、４以下の薬物負荷種の有意結合を生じさせないような量となるように、４以下の薬物負荷種と６以上の薬物負荷種を含むＡＤＣ混合物を疎水性樹脂と接触させて樹脂混合物を形成し；抗体をアウリスタチンと結合させたＡＤＣを含む組成物であって、６以上の薬物負荷種が１５％未満である組成物を得るように疎水性樹脂をＡＤＣ混合物から除去するために、循環法を使用することができる。別の実施形態では、ＡＤＣ混合物と接触させる疎水性樹脂の量が６以上の薬物負荷種を結合させるために十分でありながら、４以下の薬物負荷種の有意結合を生じさせないような量となるように、４以下の薬物負荷種と６以上の薬物負荷種を含むＡＤＣ混合物を疎水性樹脂と接触させて樹脂混合物を形成し；抗体をアウリスタチンと結合させたＡＤＣを含む組成物であって、６以上の薬物負荷種が１５％未満であり且つ疎水性樹脂重量がＡＤＣ混合物中の６以上の薬物負荷種の３〜１２倍である組成物を得るように疎水性樹脂をＡＤＣ混合物から除去するために、循環法を使用する。
【０３７６】
あるいは、所定の望ましいＤＡＲをもつＡＤＣを主体とする組成に達するようにＡＤＣ混合物を精製するためにフロースルー法を使用することができる。フロースルー法では、樹脂を容器（例えばカラム）に充填し、望ましいＡＤＣ種が樹脂と実質的に結合せずに樹脂を通過し、望ましくないＡＤＣ種が樹脂と結合するように、充填した樹脂にＡＤＣ混合物を流す。フロースルー法はシングルパスモード（目的のＡＤＣ種は容器の樹脂を１回通過した結果として得られる。）又はマルチパスモード（目的のＡＤＣ種は容器の樹脂を複数回通過した結果として得られる。）で実施することができる。フロースルー法は選択した樹脂重量が望ましくないＡＤＣ集団と結合し、望ましいＡＤＣ（例えばＤＡＲ２〜４）が樹脂を通過し、１回又は複数回通過後にフロースルー中で回収されるように実施される。
【０３７７】
ＡＤＣ混合物と接触させる疎水性樹脂の量が６以上の薬物負荷種を結合させるために十分でありながら、４以下の薬物負荷種の有意結合を生じさせないような量となるように、４以下の薬物負荷種と６以上の薬物負荷種を含むＡＤＣ混合物を疎水性樹脂と接触させ、抗体をアウリスタチンと結合させた望ましいＡＤＣ（例えばＤＡＲ２〜４）を含有する組成物であって、６以上の薬物負荷種が１５％未満である組成物を得るように４以下の薬物負荷種を１回又は複数回通過させた後に回収するために、フロースルー法を使用することができる。別の実施形態では、ＡＤＣ混合物と接触させる疎水性樹脂の量が６以上の薬物負荷種を結合させるために十分でありながら、４以下の薬物負荷種の有意結合を生じさせないような量となるように、４以下の薬物負荷種と６以上の薬物負荷種を含むＡＤＣ混合物を疎水性樹脂に流すことにより前記ＡＤＣ混合物を前記樹脂と接触させ、抗体をアウリスタチンと結合させたＡＤＣを含む組成物であって、６以上の薬物負荷種が１５％未満であり且つ疎水性樹脂重量がＡＤＣ混合物中の６以上の薬物負荷種の３〜１２倍である組成物を得るように４以下の薬物負荷種を１回又は複数回通過させた後に回収するために、フロースルー法を使用する。
【０３７８】
フロースルー工程後に、（洗浄濾液中に存在する）望ましいＤＡＲ範囲のＡＤＣを更に回収するために樹脂を洗浄液で１回以上洗浄してもよい。例えば、目的のＤＡＲをもつＡＤＣを更に回収するために導電率を漸減させて複数回の洗浄を使用することができる。その後、目的のＤＡＲをもつＡＤＣの回収を改善するように、樹脂の洗浄から得られた溶出物をフロースルー工程から得られた濾液と合わせることができる。
【０３７９】
上記バッチ法、循環法及びフロースルー法はＡＤＣの高薬物負荷種と低薬物負荷種を分離するために疎水性樹脂の使用を基礎とする。疎水性樹脂はＡＤＣの疎水性と相互作用する疎水性基を含む。ＡＤＣ上の疎水性基は疎水性樹脂内の疎水性基と相互作用する。タンパク質は疎水性が高いほど、疎水性樹脂と強く相互作用する。
【０３８０】
疎水性樹脂は一般に疎水性リガンド（例えばアルキル又はアリール基）を結合させる基材（例えば架橋アガロース又は合成コポリマー材料）を含む。多くの疎水性樹脂が市販されている。例としては、限定されないが、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＴＭ）６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  ｗｉｔｈ  ｌｏｗ  ｏｒ  ｈｉｇｈ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＡＢ，スウェーデン）；Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＴＭ）Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＡＢ，スウェーデン）；Ｏｃｔｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＴＭ）Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＡＢ，スウェーデン）；Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（ＴＭ）ＥＭＤ  Ｐｒｏｐｙｌ又はＦｒａｃｔｏｇｅｌ（ＴＭ）ＥＭＤ  Ｐｈｅｎｙｌカラム（Ｅ．Ｍｅｒｃｋ，ドイツ）；Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ（ＴＭ）Ｍｅｔｈｙｌ又はＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ（ＴＭ）．ｔ−Ｂｕｔｙｌ  Ｓｕｐｐｏｒｔｓ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）；ＷＰ  ＨＩ−Ｐｒｏｐｙｌ（Ｃ３）（ＴＭ）（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）；及びＴｏｙｏｐｅａｒｌ（ＴＭ）ｅｔｈｅｒ、ｈｅｘｙｌ、ｐｈｅｎｙｌ又はｂｕｔｙｌ（ＴｏｓｏＨａａｓ，ＰＡ）が挙げられる。１実施形態において、前記疎水性樹脂はブチル疎水性樹脂である。別の実施形態において、前記疎水性樹脂はフェニル疎水性樹脂である。別の実施形態において、前記疎水性樹脂はヘキシル疎水性樹脂、オクチル疎水性樹脂又はデシル疎水性樹脂である。１実施形態において、前記疎水性樹脂はｎ−ブチルリガンドをもつメタクリル酸ポリマー（例えばＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（Ｒ）Ｂｕｔｙｌ−６００Ｍ）である。
【０３８１】
望ましいＤＡＲをもつ組成物を得るためのその他のＡＤＣ混合物精製方法はその開示内容全体を本願に援用する米国出願第１４／２１０，６０２号（米国特許出願公開第ＵＳ２０１４／０２８６９６８号）に記載されている。
【０３８２】
Ｖ．抗ＥＧＦＲ抗体及び抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣの使用
本発明の抗体及び抗体部分（及びＡＤＣ）はヒトＥＧＦＲ活性をインビボで中和できることが好ましい。従って、本発明の抗体が交差反応するＥＧＦＲをもつヒト対象又は他の哺乳動物対象において例えばｈＥＧＦＲを含む細胞中でｈＥＧＦＲ活性を阻害するために本発明のこのような抗体及び抗体部分を使用することができる。１実施形態において、本発明はｈＥＧＦＲ活性の阻害方法として、ｈＥＧＦＲ活性が阻害されるようにｈＥＧＦＲを本発明の抗体又は抗体部分と接触させる段階を含む方法を提供する。例えば、ｈＥＧＦＲを含むか又は含む疑いのある細胞培養液中で本発明の抗体又は抗体部分を培養培地に加え、培養液中のｈＥＧＦＲ活性を阻害することができる。
【０３８３】
別の実施形態において、本発明は対象、有利にはＥＧＦＲ活性が有害である疾患又は障害に罹患した対象におけるｈＥＧＦＲ活性の低減方法に関する。本発明はこのような疾患又は障害に罹患した対象におけるＥＧＦＲ活性の低減方法を提供し、前記方法は前記対象におけるＥＧＦＲ活性を低減するように本発明の抗体又は抗体部分を前記対象に投与する段階を含む。好ましくは、前記ＥＧＦＲはヒトＥＧＦＲであり、前記対象はヒト対象である。あるいは、前記対象は本発明の抗体と結合できるＥＧＦＲを発現する哺乳動物とすることができる。更に、前記対象は（例えばＥＧＦＲの投与又はＥＧＦＲトランスジーンの発現により）ＥＧＦＲが導入されている哺乳動物である。本発明の抗体は治療目的でヒト対象に投与することができる。更に、本発明の抗体は獣医学的な目的又はヒト疾患の動物モデルとしてこのような抗体と結合できるＥＧＦＲを発現する非ヒト哺乳動物に投与することができる。後者に関して、このような動物モデルは本発明の抗体の治療効力を評価（例えば用量及び投与クールを試験）するために有用であると思われる。
【０３８４】
本願で使用する「ＥＧＦＲ活性が有害である障害」なる用語はこのような障害に罹患している対象におけるＥＧＦＲの存在が前記障害の病態生理に関与していること又は前記障害の増悪に寄与する因子であることが分かっているか又はその疑いのある疾患及び他の障害を包含するものである。従って、ＥＧＦＲ活性が有害である障害とはＥＧＦＲ活性の低下が前記障害の症状及び／又は進行を緩和すると予想される障害である。このような障害は例えば障害に罹患している対象の体液中のＥＧＦＲの濃度の上昇（例えば対象の腫瘍、血清、血漿、滑液等におけるＥＧＦＲの濃度の上昇）により判定することができ、例えば上記のような抗ＥＧＦＲ抗体を使用して検出することができる。本発明の抗体（例えばＡｂＡ）又はその抗原結合フラグメントで治療することができる障害の非限定的な例としては、以下に記載する障害が挙げられる。例えば、適切な障害としては、限定されないが、種々の癌が挙げられ、限定されないが、乳癌、肺癌、神経膠腫、前立腺癌、膵臓癌、結腸癌、頭頸部癌及び腎臓癌が挙げられる。本願に開示する組成物及び方法を使用して治療することができる癌の他の例としては、扁平上皮癌（例えば肺扁平上皮癌又は頭頸部扁平上皮癌）、トリプルネガティブ乳癌、非小細胞肺癌、大腸癌及び中皮腫が挙げられる。１実施形態において、本願に開示する抗体及びＡＤＣは固形腫瘍を治療するため、例えばＥＧＦＲを過剰発現しているか又はＥＧＦＲ陽性である固形腫瘍の増殖を抑制するため又はその大きさを縮小するために使用される。１実施形態において、本発明はＥＧＦＲが増幅している肺扁平上皮癌の治療に関する。１実施形態において、本願に開示する抗体及びＡＤＣはＥＧＦＲが増幅している頭頸部扁平上皮癌を治療するために使用される。別の実施形態において、本願に開示する抗体及びＡＤＣはトリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）を治療するために使用される。本願に記載する疾患及び障害は本発明の抗ＥＧＦＲ抗体又はＡＤＣに加え、このような抗ＥＧＦＲ抗体又はＡＤＣを含有する医薬組成物により治療することができる。
【０３８５】
ある種の実施形態において、本願に開示する抗体及びＡＤＣは高濃度の上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を示す可能性の高い進行固形腫瘍種を治療するために、治療を必要とする対象に投与される。このような腫瘍の例としては、限定されないが、頭頸部扁平上皮癌、非小細胞肺癌、トリプルネガティブ乳癌、大腸癌及び多形性膠芽腫が挙げられる。
【０３８６】
ある種の実施形態において、本発明は固形腫瘍をもつ対象における固形腫瘍増殖の阻害又は抑制方法を包含し、前記方法は前記固形腫瘍増殖を阻害又は抑制するように、前記固形腫瘍をもつ対象に本願に記載する抗ＥＧＦＲ抗体又はＡＤＣに投与する段階を含む。ある種の実施形態において、前記固形腫瘍は、非小細胞肺癌又は膠芽腫である。その他の実施形態において、前記固形腫瘍はＥＧＦＲｖＩＩＩ陽性腫瘍又はＥＧＦＲを発現する固形腫瘍である。その他の実施形態において、前記固形腫瘍はＥＧＦＲが増幅している固形腫瘍又はＥＧＦＲを過剰発現する固形腫瘍である。ある種の実施形態では、多形性膠芽腫をもつ対象に本願に記載する抗ＥＧＦＲ抗体又はＡＤＣを単独投与又は別の薬剤（例えば放射線及び／又はテモゾロミド）と併用投与する。
【０３８７】
ある種の実施形態において、本発明はＥＧＦＲを発現する腫瘍又はＥＧＦＲを過剰発現する腫瘍（又はＥＧＦＲｖＩＩＩを発現する腫瘍）として同定された固形腫瘍をもつ対象における固形腫瘍増殖の阻害又は抑制方法を包含し、前記方法は前記固形腫瘍増殖を阻害又は抑制するように、前記固形腫瘍をもつ対象に本願に記載する抗ＥＧＦＲ抗体又はＡＤＣを投与する段階を含む。ＥＧＦＲを発現する腫瘍（例えばＥＧＦＲを過剰発現する腫瘍）の同定方法は当分野で公知であり、ＦＤＡに認可されている試験や検証アッセイが挙げられる。例えば、ＥＧＦＲ  ｐｈａｒｍＤｘ（ＴＭ）アッセイ（Ｄａｋｏ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａ，Ｉｎｃ．）は組織学的評価を定期的に予定されている正常及び新生物組織におけるＥＧＦＲ発現を同定するために使用される定性的免疫組織化学（ＩＨＣ）キットシステムである。ＥＧＦＲ  ｐｈａｒｍＤｘはＥＧＦＲを発現する細胞においてＥＧＦＲ（ＨＥＲ１）タンパク質を特異的に検出する。更に、ＰＣＲアッセイもＥＧＦＲを過剰発現する腫瘍を同定するために使用することができる。例えば、これらのアッセイは変異体ＥＧＦＲ遺伝子（例えば配列番号３３）及び／又はｃＤＮＡに特異的なプライマーを使用し、前記ＥＧＦＲ遺伝子／ｃＤＮＡ又はその一部を増幅させることができる。増幅されたＰＣＲ産物をその後、例えば当分野で公知の標準方法を使用してゲル電気泳動により分析し、ＰＣＲ産物の寸法を求めることができる。このような試験は本願に記載する方法及び組成物で治療することが可能な腫瘍を同定するために使用することができる。
【０３８８】
当分野で利用可能なあらゆる遺伝子治療法を本発明に従って使用することができる。遺伝子治療法の一般論については、Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  １２：４８８−５０５；Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ，１９９１，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ３：８７−９５；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ，１９９３，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３−５９６；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９２６−９３２（１９９３）；及びＭｏｒｇａｎ  ａｎｄ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，１９９３，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７；Ｍａｙ，１９９３，ＴＩＢＴＥＣＨ  １１（５）：１５５−２１５参照。組換えＤＮＡ技術分野で広く知られている方法のうちで使用できる方法はＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９３）；及びＫｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９０）に記載されている。種々の遺伝子治療法の詳細な説明は本願に援用するＵＳ２００５００４２６６４Ａ１に記載されている。
【０３８９】
別の態様において、本願は対象におけるＥＧＦＲ関連障害の治療（例えば治癒、抑制、改善、発症の遅延もしくは予防、又は反復もしくは再発の予防）又は予防方法に関する。前記方法はＥＧＦＲ関連障害を治療又は予防するために十分な量のＥＧＦＲ結合剤（特に拮抗剤）、例えば本願に記載するような抗ＥＧＦＲ抗体又はそのフラグメントを前記対象に投与する段階を含む。ＥＧＦＲ拮抗剤（例えば抗ＥＧＦＲ抗体又はそのフラグメント）は前記対象に単独投与することもできるし、本願に記載するような他の治療法と併用投与することもできる。
【０３９０】
このような疾患を治療するために本発明の抗体又はＡＤＣ又はその抗原結合部分を単独使用又は併用することができる。当然のことながら、本発明の抗体又はその抗原結合部分は、単独で使用することもできるし、別の薬剤（例えば治療剤）と併用することもでき、前記別の薬剤はその目的に合わせて当業者により選択される。例えば、前記別の薬剤は本発明の抗体により治療しようとする疾患又は病態を治療するために有用であると当分野で認められている治療剤とすることができる。前記別の薬剤は治療用組成物に有益な属性を付与する薬剤（例えば組成物の粘度を変化させる薬剤）とすることもできる。
【０３９１】
更に当然のことながら、本発明に含まれる併用剤はその所期目的に有用な併用剤である。以下に記載する薬剤は例示の目的であり、限定的ではない。本発明の一部である併用剤は本発明の抗体と、以下のリストから選択される少なくとも１種の別の薬剤とすることができる。併用剤は形成される組成物がその所期機能を発揮できる限り、２種以上の別の薬剤を含むものでもよく、例えば２種又は３種の別の薬剤を含むものでもよい。
【０３９２】
併用療法は、１種以上のＥＧＦＲ拮抗剤、例えば抗ＥＧＦＲ抗体又はそのフラグメントと、１種以上の別の治療剤、例えば本願により詳細に記載するような１種以上のサイトカイン及び成長因子阻害剤、免疫抑制剤、抗炎症剤（例えば全身性抗炎症剤）、抗線維形成剤、代謝阻害剤、酵素阻害剤及び／もしくは細胞毒性剤もしくは細胞増殖抑制剤、有糸分裂阻害剤、抗腫瘍性抗生物質、免疫調節剤、遺伝子治療用ベクター、アルキル化剤、抗血管新生薬、代謝拮抗剤、ホウ素含有剤、化学療法剤、ホルモン剤、抗ホルモン剤、コルチコステロイド、感光性治療剤、オリゴヌクレオチド、放射性核種剤、トポイソメラーゼ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤又は放射線増感剤との合剤化及び／又は併用投与とすることができる。
【０３９３】
特定の実施形態では、本願に記載する抗ＥＧＦＲ結合タンパク質（例えば抗ＥＧＦＲ抗体）を抗癌剤又は抗新生物剤と併用する。「抗癌剤」及び「抗新生物剤」なる用語は癌性増殖等の悪性腫瘍を治療するために使用される薬物を意味する。薬物療法は単独で使用してもよいし、外科手術や放射線治療等の他の治療法と併用してもよい。患部臓器の種類に応じて複数類の薬物を併用してもよい。例えば、乳癌は一般にエストロゲンにより刺激され、性ホルモンを不活性化する薬物で治療することができる。同様に、前立腺癌は男性ホルモンであるアンドロゲンを不活性化させる薬物で治療することができる。本発明の抗ＥＧＦＲ抗体又はＡＤＣと併用することができる抗癌剤としては、特に以下の薬剤が挙げられる。
【０３９４】
【表２】
2020039360.tif 000037
2020039360.tif 000038
2020039360.tif 000039
2020039360.tif 000040
【０３９５】
上記抗癌剤以外に、セクションＩＩに記載した薬剤と本願に記載する抗ＥＧＦＲ抗体及びＡＤＣを併用投与してもよい。更に、上記抗癌剤を本発明のＡＤＣで使用してもよい。
【０３９６】
特定の実施形態では、ＥＧＦＲ活性に関連する疾患を治療するために前記抗ＥＧＦＲ抗体又はＡＤＣを単独投与することもできるし、抗体と共働又は相乗作用する別の抗癌剤と併用投与することもできる。このような抗癌剤としては、例えば当分野で周知の薬剤（例えば細胞毒素、化学療法剤、低分子及び放射線）が挙げられる。抗癌剤の例としては、限定されないが、Ｐａｎｏｒｅｘ（Ｇｌａｘｏ−Ｗｅｌｃｏｍｅ）、Ｒｉｔｕｘａｎ（ＩＤＥＣ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｈｏｆｆｍａｎ  ｌａ  Ｒｏｃｈｅ）、Ｍｙｌｏｔａｒｇ（Ｗｙｅｔｈ）、Ｃａｍｐａｔｈ（Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ）、Ｚｅｖａｌｉｎ（ＩＤＥＣ  ａｎｄ  Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  ＡＧ）、Ｂｅｘｘａｒ（Ｃｏｒｉｘａ／ＧＳＫ）、Ｅｒｂｉｔｕｘ（Ｉｍｃｌｏｎｅ／ＢＭＳ）、Ａｖａｓｔｉｎ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）及びＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｈｏｆｆｍａｎ  ｌａ  Ｒｏｃｈｅ）が挙げられる。他の抗癌剤としては、限定されないが、その開示内容を本願に援用する米国特許第７，５９８，０２８号及び国際公開第ＷＯ２００８／１００６２４号に開示されているものが挙げられる。１種以上の抗癌剤を本発明の抗体又はその抗原結合部分の投与と同時、投与前又は投与後に投与することができる。
【０３９７】
本発明の特定の実施形態では、対象における白血病等の癌を治療するために、本願に記載する抗ＥＧＦＲ抗体又はＡＤＣをｂｃｌ−ｘｌ阻害剤やＢｃｌ−２（Ｂ細胞性リンパ腫２）阻害剤（例えばＡＢＴ−１９９（ベネトクラックス））等のアポトーシス剤との併用療法で使用することができる。１実施形態では、癌を治療するために、本願に記載する抗ＥＧＦＲ抗体又はＡＤＣをｂｃｌ−ｘｌ阻害剤との併用療法で使用することができる。１実施形態では、癌を治療するために、本願に記載する抗ＥＧＦＲ抗体又はＡＤＣをベネトクラックスとの併用療法で使用することができる。
【０３９８】
本発明の特定の実施形態では、治療を必要とする対象を治療するために、本願に記載する抗ＥＧＦＲ抗体又はＡＤＣをＮＡＭＰＴの阻害剤（本願に援用するＵＳ２０１３／０３０３５０９；ＡｂｂＶｉｅ，Ｉｎｃ．における阻害剤の例を参照。）との併用療法で使用することができる。ＮＡＭＰＴ（別称前記Ｂ細胞コロニー増強因子（ＰＢＥＦ）及びビスファチン）はニコチンアミドのホスホリボシル化を触媒する酵素であり、ＮＡＤを救済する２つの経路の一方における律速酵素である。本発明の１実施形態では、対象における癌を治療するために、本願に記載する抗ＥＧＦＲ抗体及びＡＤＣをＮＡＭＰＴ阻害剤と併用投与する。
【０３９９】
本発明の特定の実施形態では、本願に記載する抗ＥＧＦＲ抗体又はＡＤＣをトポイソメラーゼ阻害剤であるイリノテカンの活性代謝産物であるＳＮ−３８との併用療法で使用することができる。
【０４００】
本発明の他の実施形態では、乳癌、卵巣癌及び非小細胞肺癌を含む癌を治療するために、本願に記載する抗ＥＧＦＲ抗体又はＡＤＣをＰＡＲＰ（ポリＡＤＰリボースポリメラーゼ）阻害剤（例えばベリパリブ）との併用療法で使用することができる。
【０４０１】
本願に記載する抗ＥＧＦＲ抗体又は抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣと併用投与及び／又は合剤化することができる別の治療剤のその他の例としては、限定されないが、吸入ステロイド薬；β作動薬（例えば短時間作用型又は長時間作用型β作動薬）；ロイコトリエン又はロイコトリエン受容体の拮抗剤；ＡＤＶＡＩＲ等の併用薬；ＩｇＥ阻害剤、例えば抗ＩｇＥ抗体（例えばＸＯＬＡＩＲ（Ｒ）、オマリズマブ）；ホスホジエステラーゼ阻害剤（例えばＰＤＥ４阻害剤）；キサンチン；抗コリン薬；クロモリン等のマスト細胞安定剤；ＩＬ−４阻害剤；ＩＬ−５阻害剤；エオタキシン／ＣＣＲ３阻害剤；ヒスタミン又はＨ１、Ｈ２、Ｈ３及びＨ４を含むその受容体の拮抗剤；並びにプロスタグランジンＤ又はその受容体（ＤＰ１及びＣＲＴＨ２）の拮抗剤の１種以上が挙げられる。このような併用剤は例えば喘息及び他の呼吸器系障害を治療するために使用することができる。本願に記載する抗ＥＧＦＲ抗体又は抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣと併用投与及び／又は合剤化することができる別の治療剤の他の例としては、限定されないが、テモゾロミド、イブルチニブ、ドゥベリシブ及びイデラリシブの１種以上が挙げられる。１種以上の抗ＥＧＦＲ抗体又はそのフラグメントと併用投与及び／又は合剤化することができる治療剤のその他の例としては、特にＴＮＦ拮抗剤（例えばＴＮＦ受容体の可溶性フラグメント、例えばｐ５５又はｐ７５ヒトＴＮＦ受容体又はその誘導体、例えば７５ｋＤ  ＴＮＦＲ−ＩｇＧ（７５ｋＤ  ＴＮＦ受容体−ＩｇＧ融合タンパク質，ＥＮＢＲＥＬ））；ＴＮＦ酵素拮抗剤、例えばＴＮＦ変換酵素（ＴＡＣＥ）阻害剤；ムスカリン受容体拮抗剤；ＴＧＦ−β拮抗剤；インターフェロンγ；ピルフェニドン；化学療法剤、例えばメトトレキサート、レフルノミドもしくはシロリムス（ラパマイシン）又はそのアナログ（例えばＣＣＩ−７７）；ＣＯＸ２及びｃＰＬＡ２阻害剤；ＮＳＡＩＤｓ；免疫調節剤；ｐ３８阻害剤、ＴＰＬ−２、ＭＫ−２及びＮＦｋＢ阻害剤の１種以上が挙げられる。
【０４０２】
他の好ましい併用剤はサイトカイン抑制性抗炎症薬（ＣＳＡＩＤｓ）；他のヒトサイトカイン又は成長因子（例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−３１、インターフェロン、ＥＭＡＰ−ＩＩ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ及びエンドセリン−１）並びにこれらのサイトカイン及び成長因子の受容体の抗体又は拮抗剤である。本発明の抗体又はその抗原結合部分は、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ６９、ＣＤ８０（Ｂ７．１）、ＣＤ８６（Ｂ７．２）、ＣＤ９０、ＣＴＬＡ、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、又はＣＤ１５４（ｇｐ３９又はＣＤ４０Ｌ）を含むそれらのリガンド等の細胞表面分子に対する抗体と併用することができる。
【０４０３】
治療剤の好ましい併用剤は炎症カスケードの種々の点に介入することができ、好ましい例としては、キメラヒト化又はヒトＴＮＦ抗体等のＴＮＦ拮抗剤、アダリムマブ（ＨＵＭＩＲＡ；Ｄ２Ｅ７；本願に援用するＰＣＴ公開番号ＷＯ９７／２９１３１及び米国特許第６，０９０，３８２号）、ＣＡ２（Ｒｅｍｉｃａｄｅ（ＴＭ））、ＣＤＰ５７１、及び可溶性ｐ５５又はｐ７５  ＴＮＦ受容体、その誘導体（ｐ７５ＴＮＦＲ１ｇＧ（Ｅｎｂｒｅｌ（ＴＭ））又はｐ５５ＴＮＦＲ１ｇＧ（レネルセプト））、並びにＴＮＦ変換酵素（ＴＡＣＥ）阻害剤が挙げられ、同様にＩＬ−１阻害剤（インターロイキン−１変換酵素阻害剤、ＩＬ−１ＲＡ等）も同じ理由から有効であると思われる。他の好ましい併用剤としてはインターロイキン４が挙げられる。
【０４０４】
本発明の医薬組成物は「治療有効量」又は「予防有効量」の本発明の抗体又は抗体部分を含有することができる。「治療有効量」とは投与時点及び必要な期間にわたって望ましい治療結果を達成するために有効な量を意味する。抗体又は抗体部分の治療有効量は当業者が決定することができ、個体の疾患状態、年齢、性別及び体重と、抗体又は抗体部分が望ましい応答を個体に誘発する能力によって異なる。治療有効量とは治療に有益な作用が抗体又は抗体部分の毒性又は有害な作用を上回るような量でもある。「予防有効量」とは投与時点及び必要な期間にわたって望ましい予防結果を達成するために有効な量を意味する。一般的に、予防投与は疾患以前又は疾患の初期段階の対象で使用するので、予防有効量は治療有効量よりも少なくなる。
【０４０５】
最適な所望の応答（例えば治療又は予防応答）が得られるように投与レジメンを調節することができる。例えば、単回ボーラスを投与してもよいし、時間をかけて数回に分けて投与してもよいし、治療状況の緊急性に応じて用量を比例的に増減してもよい。投与し易さと均等性から用量単位形態で非経口組成物を製剤化すると特に有利である。本願で使用する用量単位形態とは治療しようとする哺乳動物対象に単位用量として適した物理的に別個の単位を意味し、各単位は必要な医薬担体と共に所望の治療効果を生じるように計算された所定量の活性化合物を含む。本発明の用量単位形態の規格は（ａ）活性化合物の独自の特性と達成しようとする特定の治療又は予防効果と、（ｂ）個体における過敏症の治療を考慮してこのような活性化合物を配合する技術に固有の制限により決定され、直接依存する。
【０４０６】
本発明のＡＤＣ、抗体又は抗体部分の治療又は予防有効量の範囲の非限定的な例は０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは１〜１０ｍｇ／ｋｇである。１実施形態において、本願に記載する抗体及びＡＤＣの用量は１〜６ｍｇ／ｋｇであり、本願に記載する個々の用量、例えば１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ及び６ｍｇ／ｋｇを含む。別の実施形態において、本願に記載する抗体及びＡＤＣの用量は１〜２００μｇ／ｋｇであり、本願に記載する個々の用量、例えば１μｇ／ｋｇ、２μｇ／ｋｇ、３μｇ／ｋｇ、４μｇ／ｋｇ、５μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ、２０μｇ／ｋｇ、３０μｇ／ｋｇ、４０μｇ／ｋｇ、５０μｇ／ｋｇ、６０μｇ／ｋｇ、８０μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ、１２０μｇ／ｋｇ、１４０μｇ／ｋｇ、１６０μｇ／ｋｇ、１８０μｇ／ｋｇ及び２００μｇ／ｋｇを含む。なお、用量値は緩和しようとする病態の種類と重症度により異なる。更に当然のことながら、任意の特定の対象について、特定の用量レジメンは個々の必要と組成物の投与者又は投与の管理者の専門的判断に従って経時的に調節すべきであり、本願に記載する用量範囲は単に例示であり、本発明の組成物の範囲又は実施を制限するものではない。
【０４０７】
１実施形態では、投与を必要とする対象（例えば癌をもつ対象）に本願に記載する抗ＥＧＦＲ抗体（例えばＡｂＡ）又はその抗原結合部分をＡＤＣとして０．１〜３０ｍｇ／ｋｇの用量で投与する。別の実施形態では、投与を必要とする対象（例えば癌をもつ対象）に前記抗ＥＧＦＲ抗体（例えばＡｂＡ）又はその抗原結合部分をＡＤＣとして１〜１５ｍｇ／ｋｇの用量で投与する。別の実施形態では、投与を必要とする対象（例えば癌をもつ対象）に前記抗ＥＧＦＲ抗体（例えばＡｂＡ）又はその抗原結合部分をＡＤＣとして１〜１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与する。別の実施形態では、投与を必要とする対象（例えば癌をもつ対象）に前記抗ＥＧＦＲ抗体（例えばＡｂＡ）又はその抗原結合部分をＡＤＣとして２〜３の用量で投与する。別の実施形態では、投与を必要とする対象（例えば癌をもつ対象）に前記抗ＥＧＦＲ抗体（例えばＡｂＡ）又はその抗原結合部分をＡＤＣとして１〜４ｍｇ／ｋｇの用量で投与する。
【０４０８】
１実施形態では、投与を必要とする対象（例えば癌をもつ対象）に本願に記載する抗ＥＧＦＲ抗体（例えばＡｂＡ）又はその抗原結合部分をＡＤＣとして１〜２００μｇ／ｋｇの用量で投与する。別の実施形態では、投与を必要とする対象（例えば癌をもつ対象）に前記抗ＥＧＦＲ抗体（例えばＡｂＡ）又はその抗原結合部分をＡＤＣとして５〜１５０μｇ／ｋｇの用量で投与する。別の実施形態では、投与を必要とする対象（例えば癌をもつ対象）に前記抗ＥＧＦＲ抗体（例えばＡｂＡ）又はその抗原結合部分をＡＤＣとして５〜１００μｇ／ｋｇの用量で投与する。別の実施形態では、投与を必要とする対象（例えば癌をもつ対象）に前記抗ＥＧＦＲ抗体（例えばＡｂＡ）又はその抗原結合部分をＡＤＣとして５〜９０μｇ／ｋｇの用量で投与する。別の実施形態では、投与を必要とする対象（例えば癌をもつ対象）に前記抗ＥＧＦＲ抗体（例えばＡｂＡ）又はその抗原結合部分をＡＤＣとして５〜８０μｇ／ｋｇの用量で投与する。別の実施形態では、投与を必要とする対象（例えば癌をもつ対象）に前記抗ＥＧＦＲ抗体（例えばＡｂＡ）又はその抗原結合部分をＡＤＣとして５〜７０μｇ／ｋｇの用量で投与する。別の実施形態では、投与を必要とする対象（例えば癌をもつ対象）に前記抗ＥＧＦＲ抗体（例えばＡｂＡ）又はその抗原結合部分をＡＤＣとして５〜６０μｇ／ｋｇの用量で投与する。別の実施形態では、投与を必要とする対象（例えば癌をもつ対象）に前記抗ＥＧＦＲ抗体（例えばＡｂＡ）又はその抗原結合部分をＡＤＣとして１０〜８０μｇ／ｋｇの用量で投与する。
【０４０９】
１実施形態では、投与を必要とする対象（例えば癌をもつ対象）に本願に記載する抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣ（例えばＡｂＡ−ｖｃ−ＭＭＡＥ）を１〜６ｍｇ／ｋｇの用量で投与する。別の実施形態では、投与を必要とする対象（例えば癌をもつ対象）に本願に記載する抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣ（例えばＡｂＡ−ｖｃ−ＭＭＡＥ）を５〜４ｍｇ／ｋｇの用量で投与する。別の実施形態では、投与を必要とする対象（例えば癌をもつ対象）に本願に記載する抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣ（例えばＡｂＡ−ｖｃ−ＭＭＡＥ）を１．８〜２．４ｍｇ／ｋｇの用量で投与する。別の実施形態では、投与を必要とする対象（例えば癌をもつ対象）に本願に記載する抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣ（例えばＡｂＡ−ｖｃ−ＭＭＡＥ）を１〜４ｍｇ／ｋｇの用量で投与する。別の実施形態では、投与を必要とする対象（例えば癌をもつ対象）に本願に記載する抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣ（例えばＡｂＡ−ｖｃ−ＭＭＡＥ）を約１ｍｇ／ｋｇの用量で投与する。別の実施形態では、投与を必要とする対象（例えば癌をもつ対象）に本願に記載する抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣ（例えばＡｂＡ−ｖｃ−ＭＭＡＥ）を３〜６ｍｇ／ｋｇの用量で投与する。別の実施形態では、投与を必要とする対象（例えば癌をもつ対象）に本願に記載する抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣ（例えばＡｂＡ−ｖｃ−ＭＭＡＥ）を３ｍｇ／ｋｇの用量で投与する。別の実施形態では、投与を必要とする対象（例えば癌をもつ対象）に本願に記載する抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣ（例えばＡｂＡ−ｖｃ−ＭＭＡＥ）を２〜３ｍｇ／ｋｇの用量で投与する。別の実施形態では、投与を必要とする対象（例えば癌をもつ対象）に本願に記載する抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣ（例えばＡｂＡ−ｖｃ−ＭＭＡＥ）を６ｍｇ／ｋｇの用量で投与する。
【０４１０】
別の実施形態では、投与を必要とする対象（例えば癌をもつ対象）に薬物（例えばＰＢＤ）と結合させた本願に記載する抗ＥＧＦＲ抗体（ＡＤＣ）を１〜２００μｇ／ｋｇの用量で投与する。別の実施形態では、投与を必要とする対象（例えば癌をもつ対象）に本願に記載する抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣを５〜１００μｇ／ｋｇの用量で投与する。別の実施形態では、投与を必要とする対象（例えば癌をもつ対象）に本願に記載する抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣを５〜９０μｇ／ｋｇの用量で投与する。別の実施形態では、投与を必要とする対象（例えば癌をもつ対象）に本願に記載する抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣを５〜８０μｇ／ｋｇの用量で投与する。別の実施形態では、投与を必要とする対象（例えば癌をもつ対象）に本願に記載する抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣを５〜７０μｇ／ｋｇの用量で投与する。別の実施形態では、投与を必要とする対象（例えば癌をもつ対象）に本願に記載する抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣを５〜６０μｇ／ｋｇの用量で投与する。
【０４１１】
上記用量は本願に開示する抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣ又は抗体の投与に有用であると思われる。
【０４１２】
別の態様において、本願は試料（例えば血清、血漿、組織、生検等の生体試料）におけるＥＧＦＲの有無のインビトロ検出方法を提供する。本方法は障害（例えば癌）を診断するために使用することができる。前記方法は、（ｉ）前記試料又は対照試料を本願に記載するような抗ＥＧＦＲ抗体又はそのフラグメントと接触させる段階と；（ｉｉ）前記抗ＥＧＦＲ抗体又はそのフラグメントと前記試料又は前記対照試料の複合体の形成を検出し、前記対照試料に比較して前記試料中の複合体の形成に統計的に有意な差がある場合には前記試料中にＥＧＦＲが存在すると判断する段階を含む。
【０４１３】
本発明の抗ヒトＥＧＦＲ抗体又はその部分（及びそのＡＤＣ）はヒトＥＧＦＲと結合することができるので、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）又は免疫組織化学法等の従来のイムノアッセイを使用して（例えば血清や血漿等の生体試料中で）ヒトＥＧＦＲを検出するために使用することができる。１態様において、本発明は生体試料中のヒトＥＧＦＲの検出方法として、生体試料を本発明の抗体又はその部分と接触させる段階と、ヒトＥＧＦＲと結合した抗体（又は抗体部分）又は未結合抗体（又は抗体部分）を検出することにより、生体試料中のヒトＥＧＦＲを検出する段階を含む方法を提供する。結合した抗体又は未結合抗体の検出を容易にするために抗体を検出可能な物質で直接又は間接的に標識する。適切な検出可能な物質としては、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質及び放射性物質が挙げられる。適切な酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、−ガラクトシダーゼ又はアセチルコリンエステラーゼが挙げられ、適切な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンとアビジン／ビオチンが挙げられ、適切な蛍光物質の例としてはウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド又はフィコエリスリンが挙げられ、発光物質の１例としてはルミノールが挙げられ、適切な放射性物質の例としては、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１７７Ｌｕ、１６６Ｈｏ又は１５３Ｓｍが挙げられる。
【０４１４】
抗体を標識する代わりに、検出可能な物質で標識したｒｈＥＧＦＲ標準と未標識抗ヒトＥＧＦＲ抗体を利用する競合イムノアッセイによりヒトＥＧＦＲを生物体液中で定量することができる。このアッセイでは、生体試料と標識ｒｈＥＧＦＲ標準と抗ヒトＥＧＦＲ抗体を混合し、未標識抗体と結合した標識ｒｈＥＧＦＲ標準の量を測定する。生体試料中のヒトＥＧＦＲの量は抗ＥＧＦＲ抗体と結合した標識ｒｈＥＧＦＲ標準の量に反比例する。同様に、検出可能な物質で標識したｒｈＥＧＦＲ標準と未標識抗ヒトＥＧＦＲ抗体を利用する競合イムノアッセイにより生体試料中でヒトＥＧＦＲを定量することもできる。
【０４１５】
更に別の態様において、本願はＥＧＦＲの存在のインビボ検出（例えば対象におけるインビボ撮像）方法を提供する。本方法は障害（例えばＥＧＦＲに関連する障害）を診断するために使用することができる。本方法は、（ｉ）本願に記載するような抗ＥＧＦＲ抗体又はそのフラグメントとＥＧＦＲの結合を可能にする条件下で前記抗体又はフラグメントを対象又はコントロール対象に投与する段階と；（ｉｉ）前記抗体又はフラグメントとＥＧＦＲの複合体の形成を検出し、前記コントロール対象に比較して前記対象における複合体の形成に統計的に有意な差がある場合にはＥＧＦＲが存在すると判断する段階を含む。
【０４１６】
ＶＩ．医薬組成物
本発明は更に本発明の抗体又はその抗原結合部分又はＡＤＣと、医薬的に許容可能な担体とを含有する医薬組成物を提供する。本発明の抗体又はＡＤＣを含有する医薬組成物は限定されないが、障害の診断、検出もしく監視用、障害もしくは１種以上のその症状の予防、治療、管理もしくは改善用、及び／又は研究用に使用される。特定の１実施形態において、組成物は本発明の１種以上の抗体を含有する。別の実施形態において、前記医薬組成物は本発明の１種以上の抗体又はＡＤＣと、ＥＧＦＲ活性が有害である障害を治療するための本発明の抗体又はＡＤＣ以外の１種以上の予防剤又は治療剤を含有する。前記予防剤又は治療剤は障害又は１種以上のその症状の予防、治療、管理又は改善に有用であることが分かっているもの、これらの用途に既に使用されているもの又は現在使用されているものが好ましい。これらの実施形態によると、前記組成物は更に担体、希釈剤又は賦形剤を含有することができる。
【０４１７】
本発明の抗体及び抗体部分又はＡＤＣは対象に投与するのに適した医薬組成物に配合することができる。一般に、前記医薬組成物は本発明の抗体又は抗体部分と医薬的に許容可能な担体とを含有する。本願で使用する「医薬的に許容可能な担体」とは生理的に適合可能な任意のあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤、抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤等を包含する。医薬的に許容可能な担体の例としては、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等の１種以上とその組合せが挙げられる。多くの場合には、等張剤、例えば糖類、多価アルコール類（例えばマンニトール、ソルビトール）、又は塩化ナトリウムを組成物に加えることが好ましい。医薬的に許容可能な担体は更に抗体又は抗体部分又はＡＤＣの保存期間又は有効性を強化する湿潤剤、乳化剤、防腐剤又は緩衝剤等の添加剤を微量含有することができる。
【０４１８】
１実施形態において、本発明は抗ＥＧＦＲ抗体薬物コンジュゲートと、ショ糖と、ポリソルベート８０と、ヒスチジンを含有する凍結乾燥製剤に関し、前記製剤はｐＨ約５〜７であり、前記抗ＥＧＦＲ抗体薬物コンジュゲートは抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合部分をモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）に結合させたものである。１実施形態において、本発明は更に本願に記載するような抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合部分をアウリスタチン（例えばＭＭＡＥ）と結合させた抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣと、糖類（例えばショ糖）と、界面活性剤（例えばポリソルベート８０等のポリソルベート）と、ヒスチジンを含有する凍結乾燥製剤を提供する。１実施形態において、前記凍結乾燥製剤はヒスチジン１〜２０ｍｇと、糖類約３２０〜４１０ｍｇと、界面活性剤約０．１〜０．９ｍｇと、本願に記載するような抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合部分をアウリスタチン（例えばＭＭＡＥ）と結合させた抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣ約１〜１５０ｍｇを含有する。本発明は更に本願に記載するような抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合部分をアウリスタチン（例えばＭＭＡＥ）と結合させた抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣ約１〜１００ｍｇ／ｍｌと、ヒスチジン約１〜１０ｍｇ／ｍＬと、糖類（例えばショ糖）約５０〜９０ｍｇ／ｍｌと、界面活性剤（例えばポリソルベート８０）約０．０１〜０．２ｍｇ／ｍｌを含有する水性製剤を提供する。
【０４１９】
種々の送達システムが知られており、本発明の１種以上の抗体もしくはＡＤＣを投与するため、又は本発明の１種以上の抗体と障害もしくは１種以上のその症状の予防、管理、治療もしくは改善に有用な予防剤もしくは治療剤の組合せを投与するために使用することができ、例えばリポソーム、微粒子、マイクロカプセル、抗体もしくは抗体フラグメントを発現することが可能な組換え細胞への封入、受容体介在型エンドサイトーシス（例えばＷｕ  ａｎｄ  Ｗｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２（１９８７）参照。）、レトロウイルスもしくは他のベクターの一部としての核酸の構築等が挙げられる。本発明の予防剤又は治療剤の投与方法としては、限定されないが、非経口投与（例えば皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内及び皮下）、硬膜外投与、腫瘍内投与、及び粘膜投与（例えば鼻腔内及び経口経路）が挙げられる。更に、例えばインヘラー又はネブライザーの使用及びエアゾール化剤による製剤化により経肺投与を利用することができる。例えば各々その開示内容全体を本願に援用する米国特許第６，０１９，９６８号、５，９８５，３２０号、５，９８５，３０９号、５，９３４，２７２号、５，８７４，０６４号、５，８５５，９１３号、５，２９０，５４０号及び４，８８０，０７８号、並びにＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／１９２４４、ＷＯ９７／３２５７２、ＷＯ９７／４４０１３、ＷＯ９８／３１３４６及びＷＯ９９／６６９０３参照。１実施形態では、Ａｌｋｅｒｍｅｓ  ＡＩＲ（Ｒ）経肺薬物送達技術（Ａｌｋｅｒｍｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ．）を使用して本発明の抗体、併用治療剤又は組成物を投与する。特定の１実施形態では、本発明の予防剤又は治療剤を筋肉内、静脈内、腫瘍内、経口、鼻腔内、経肺又は皮下投与する。前記予防剤又は治療剤は任意の従来の経路により投与することができ、例えば輸液又はボーラス注射や、上皮又は粘膜皮膚内面（例えば口腔粘膜、直腸粘膜及び腸粘膜等）からの吸収により投与することができ、他の生物活性剤と一緒に投与してもよい。投与は全身でも局所でもよい。
【０４２０】
特定の１実施形態では、治療を必要とする領域に本発明の予防剤又は治療剤を局所投与することが望ましい場合があり、これは限定されないが、例えば局所輸液、注射又はインプラントにより実施することができ、前記インプラントはサイラスティックメンブレン、ポリマー、繊維状基材（例えばＴｉｓｓｕｅｌ（Ｒ））又はコラーゲン基材等のメンブレン及び基剤を含む多孔質又は非多孔質材料からなる。１実施形態では、障害又はその症状を予防、治療、管理及び／又は改善するために有効量の本発明の１種以上の抗体拮抗剤を対象の患部に局所投与する。別の実施形態では、障害又は１種以上のその症状を予防、治療、管理及び／又は改善するために有効量の本発明の１種以上の抗体を有効量の本発明の抗体以外の１種以上の治療薬（例えば１種以上の予防剤又は治療剤）と共に対象の患部に局所投与する。
【０４２１】
別の実施形態では、本発明の予防剤又は治療剤を制御放出又は持続放出システムで送達することができる。１実施形態では、制御又は持続放出を達成するためにポンプを使用することができる（Ｌａｎｇｅｒ，前出；Ｓｅｆｔｏｎ，１９８７，ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０；Ｂｕｃｈｗａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８０，Ｓｕｒｇｅｒｙ  ８８：５０７；Ｓａｕｄｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４参照。）。別の実施形態では、本発明の治療薬の制御又は持続放出を達成するためにポリマー材料を使用することができる（例えばＭｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，Ｌａｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｗｉｓｅ（ｅｄｓ．），ＣＲＣ  Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．（１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，Ｓｍｏｌｅｎ  ａｎｄ  Ｂａｌｌ（ｅｄｓ．），Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４）；Ｒａｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｐｅｐｐａｓ，１９８３，Ｊ．，Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：６１参照；更にＬｅｖｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１９０；Ｄｕｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１；Ｈｏｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７  １：１０５）；米国特許第５，６７９，３７７号；米国特許第５，９１６，５９７号；米国特許第５，９１２，０１５号；米国特許第５，９８９，４６３号；米国特許第５，１２８，３２６号；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９９／１５１５４；及びＰＣＴ公開番号ＷＯ９９／２０２５３も参照。）。持続放出製剤で使用されるポリマーの例としては、限定されないが、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（アクリル酸）、エチレン・酢酸ビニル共重合体、ポリ（メタクリル酸）、ポリグリコリド（ＰＬＧ）、ポリ酸無水物、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアクリルアミド、ポリ（エチレングリコール）、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ラクチド・グリコリド共重合体（ＰＬＧＡ）及びポリオルトエステルが挙げられる。好ましい１実施形態において、持続放出製剤で使用されるポリマーは不活性であり、浸出性不純物を含まず、保存安定性であり、無菌であり、生分解性である。更に別の実施形態では、制御又は持続放出システムを予防剤又は治療剤に近接して配置することができ、従って、全身用量の一部だけで済む（例えばＧｏｏｄｓｏｎ，ｉｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，前出，ｖｏｌ．２，ｐｐ．１１５−１３８（１９８４）参照。）。
【０４２２】
制御放出システムはＬａｎｇｅｒ（１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３）の論文に記載されている。本発明の１種以上の治療剤を含有する持続放出製剤を製造するには当業者に公知の任意技術を使用することができる。例えば各々その開示内容全体を本願に援用する米国特許第４，５２６，９３８号、ＰＣＴ公開ＷＯ９１／０５５４８、ＰＣＴ公開ＷＯ９６／２０６９８、Ｎｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，“Ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ  Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｈｙ  ｏｆ  ａ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｏｌｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｘｅｎｏｇｒａｆｔ  Ｕｓｉｎｇ  ａ  Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ−Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｇｅｌ，”  Ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ＆  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ３９：１７９−１８９，Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，“Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｌｕｎｇ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｌｏｎｇ−Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｅｍｕｌｓｉｏｎｓ，”  ＰＤＡ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＆  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ５０：３７２−３９７，Ｃｌｅｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，“Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  ｆｏｒ  ａ  ｂＦＧＦ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｏｒ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，”  Ｐｒｏ．Ｉｎｔ’ｌ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｍａｔｅｒ．２４：８５３−８５４，及びＬａｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，“Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｏｒ  Ｌｏｃａｌ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，”  Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ’ｌ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｍａｔｅｒ．２４：７５９−７６０参照。
【０４２３】
本発明の組成物が予防剤又は治療剤をコードする核酸である特定の１実施形態では、適切な核酸発現ベクターの一部として前記核酸を構築し、例えばレトロウイルスベクターの使用（米国特許第４，９８０，２８６号参照。）により、又は直接注射により、又は微粒子照射の使用（例えば遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ，Ｄｕｐｏｎｔ）により、又は脂質もしくは細胞表面受容体もしくはトランスフェクト剤のコーティングにより、又は核に侵入することが知られているホメオボックス様ペプチドと連結しての投与により、細胞内に入るように投与することにより、コードされる予防剤又は治療剤の発現を促進するために、前記核酸をインビボ投与することができる（例えばＪｏｌｉｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１８６４−１８６８参照。）。あるいは、核酸を細胞内に導入し、相同組換えにより発現させるように宿主細胞ＤＮＡに組込むことができる。
【０４２４】
本発明の医薬組成物はその所期投与経路に適合するように製剤化される。投与経路の例としては、限定されないが、非経口（例えば静脈内、皮内、皮下）、経口、鼻腔内（例えば吸入）、経皮（例えば局所）、経粘膜及び経直腸投与が挙げられる。特定の１実施形態では、ヒトに静脈内、皮下、筋肉内、経口、鼻腔内又は局所投与するのに適した医薬組成物として通常の手順に従って組成物を製剤化する。一般に、静脈内投与用組成物は滅菌等張水性緩衝液を溶媒とする溶液である。必要に応じて溶解補助剤と、注射部位の痛みを緩和するためにリグノカイン等の局所麻酔薬も組成物に加えてもよい。
【０４２５】
本発明の方法が組成物の鼻腔内投与を含む場合には、エアゾール形態、スプレー、ミスト又は滴剤として組成物を製剤化することができる。特に、本発明に従って使用する予防剤又は治療剤は適切な噴射剤（例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素又は他の適切なガス）を利用して加圧パック又はネブライザーからエアゾールスプレーとして簡便に送達することができる。加圧エアゾールの場合には、定量を送達するようにバルブを配置することにより用量単位を計量することができる。インヘラー又はインサフレーターで使用する（例えばゼラチンから構成される）カプセル及びカートリッジは化合物と乳糖やデンプン等の適切な粉末基剤の粉末混合物を充填して製剤化することができる。
【０４２６】
本発明の方法が経口投与を含む場合には、錠剤、カプセル剤、カシェ剤、ゲルカプセル剤、溶液剤、懸濁剤等として組成物を経口製剤化することができる。錠剤又はカプセル剤は結合剤（例えばα化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン又はヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えば乳糖、微結晶セルロース又はリン酸水素カルシウム）；滑沢剤（例えばステアリン酸マグネシウム、タルク又はシリカ）；崩壊剤（例えばジャガイモデンプン又はデンプングリコール酸ナトリウム）；又は湿潤剤（例えばラウリル硫酸ナトリウム）等の医薬的に許容可能な賦形剤を使用して従来の手段により製造することができる。錠剤は当分野で周知の方法によりコーティングしてもよい。経口投与用液体製剤は限定されないが、溶液、シロップ又は懸濁液の形態をとることができ、あるいは使用前に水又は他の適切な媒体で構成する乾燥製剤としてもよい。このような液体製剤は懸濁化剤（例えばソルビトールシロップ、セルロース誘導体又は水素添加食用油）；乳化剤（例えばレシチン又はアラビアガム）；非水性媒体（例えばアーモンド油、油性エステル、エチルアルコール又は分留植物油）；及び防腐剤（例えばｐ−ヒドロキシ安息香酸メチル、ｐ−ヒドロキシ安息香酸プロピル又はソルビン酸）等の医薬的に許容可能な添加剤を使用して従来の手段により製造することができる。製剤には更に必要に応じて緩衝塩類、着香剤、着色剤及び甘味剤を加えてもよい。経口投与用製剤は予防剤又は治療剤の遅延放出、制御放出又は持続放出に適するように製剤化することができる。
【０４２７】
本発明の方法はエアゾール化剤を加えて製剤化した組成物の（例えばインヘラー又はネブライザーの使用による）経肺投与を含むことができる。例えば各々その開示内容全体を本願に援用する米国特許第６，０１９，９６８号、５，９８５，３２０号、５，９８５，３０９号、５，９３４，２７２号、５，８７４，０６４号、５，８５５，９１３号、５，２９０，５４０号及び４，８８０，０７８号；並びにＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／１９２４４、ＷＯ９７／３２５７２、ＷＯ９７／４４０１３、ＷＯ９８／３１３４６及びＷＯ９９／６６９０３参照。特定の１実施形態では、Ａｌｋｅｒｍｅｓ  ＡＩＲ（Ｒ）経肺薬物送達技術（Ａｌｋｅｒｍｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ．）を使用して本発明の抗体、併用治療薬及び／又は組成物を投与する。
【０４２８】
本発明の方法は非経口投与用に製剤化された組成物の注射（例えばボーラス注射又は連続輸液）による投与を含むことができる。防腐剤を加えて（例えばアンプル又はマルチドーズ容器に収容した）単位用量形態の注射用製剤とすることができる。前記組成物は油性又は水性媒体で懸濁液、溶液又は乳剤の形態にしてもよく、懸濁化剤、安定剤及び／又は分散剤等の製剤化剤を添加することができる。あるいは、活性成分は使用前に適切な媒体（例えば滅菌パイロジェンフリー水）で再構成する粉末形態でもよい。
【０４２９】
本発明の方法は更にデポ製剤として製剤化された組成物の投与を含むことができる。このような長時間作用型製剤は移植（例えば皮下又は筋肉内）又は筋肉内注射により投与することができる。従って、例えば、前記組成物は適切なポリマー又は疎水性材料を使用して（例えば許容可能な油を分散媒とする乳剤として）製剤化してもよいし、イオン交換樹脂を使用して製剤化してもよいし、難溶性誘導体として（例えば難溶性塩として）製剤化してもよい。
【０４３０】
本発明の方法は中性又は塩形態として製剤化された組成物の投与も包含する。医薬的に許容可能な塩としては、塩酸、リン酸、酢酸、蓚酸、酒石酸等から誘導されるもの等のアニオンと共に形成される塩と、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、水酸化第２鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、ブロカイン等から誘導されるもの等のカチオンと共に形成される塩が挙げられる。
【０４３１】
一般に、組成物の成分は活性剤の量を指示したアンプルやサシェ等の気密容器に入れて（例えば乾燥凍結乾燥粉末又は無水濃縮物として）単位用量形態で別々に又は混合して提供される。投与方式が輸液の場合には、無菌医薬グレード水又は生理食塩水を充填した輸液ボトルを使用して組成物を分配することができる。投与方式が注射の場合には、投与前に成分を混合できるように滅菌注射用水又は生理食塩水のアンプルを提供することができる。
【０４３２】
特に、本発明は薬剤の量を指示したアンプルやサシェ等の気密容器に本発明の予防剤、治療剤又は医薬組成物の１種以上をパッケージングすることも提案する。１実施形態では、本発明の予防剤、治療剤又は医薬組成物の１種以上を気密容器に入れて乾燥無菌凍結乾燥粉末又は無水濃縮物として供給し、対象に投与するのに適した濃度まで（例えば水又は生理食塩水で）再構成することができる。本発明の予防剤、治療剤又は医薬組成物の１種以上を気密容器に入れて乾燥無菌凍結乾燥粉末として少なくとも５ｍｇ、少なくとも１０ｍｇ、少なくとも１５ｍｇ、少なくとも２５ｍｇ、少なくとも３５ｍｇ、少なくとも４５ｍｇ、少なくとも５０ｍｇ、少なくとも７５ｍｇ又は少なくとも１００ｍｇの単位用量で供給することが好ましい。本発明の凍結乾燥予防剤、治療剤又は医薬組成物は元の容器に入れたまま２℃〜８℃で保存すべきであり、本発明の予防剤、治療剤又は医薬組成物は再構成後１週間以内、５日以内、７２時間以内、４８時間以内、２４時間以内、１２時間以内、６時間以内、５時間以内、３時間以内、又は１時間以内に投与すべきである。代替実施形態において、本発明の予防剤、治療剤又は医薬組成物の１種以上は薬剤の量と濃度を指示した気密容器に入れて液体形態で供給される。投与する組成物の液体形態を気密容器に入れて少なくとも０．２５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも０．５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１ｍｇ／ｍｌ、少なくとも２．５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも８ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも２５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも７５ｍｇ／ｍｌ又は少なくとも１００ｍｇ／ｍｌで供給することが好ましい。前記液体形態は元の容器に入れたまま２℃〜８℃にて保存すべきである。
【０４３３】
本発明の抗体及び抗体部分は非経口投与に適した医薬組成物に配合することができる。前記抗体又は抗体部分は０．１〜２５０ｍｇ／ｍｌの抗体を含有する注射溶液として製造することが好ましい。注射溶液はフリントガラス又はアンバーガラスのバイアル、アンプル又はプレフィルドシリンジに収容した液体又は凍結乾燥剤形から構成することができる。緩衝液はＬ−ヒスチジン（１〜５０ｍＭ）、最適には５〜１０ｍＭでｐＨ５．０〜７．０（ｐＨ６．０が最適）とすることができる。他の適切な緩衝液としては、限定されないが、琥珀酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム又はリン酸カリウムが挙げられる。溶液の毒性を０〜３００ｍＭ（液体剤形では１５０ｍＭが最適）の濃度に調節するために塩化ナトリウムを使用することができる。凍結乾燥剤形には凍結保護剤、主に０〜１０％（０．５〜１．０％が最適）のショ糖を加えることができる。他の適切な凍結保護剤としては、トレハロースと乳糖が挙げられる。凍結乾燥剤形には嵩高剤、主に１〜１０％（２〜４％が最適）のマンニトールを加えることができる。液体及び凍結乾燥剤形のどちらにも安定剤、主に１〜５０ｍＭ（５〜１０ｍＭが最適）のＬ−メチオニンを使用することができる。他の適切な嵩高剤としては、グリシン、アルギニンが挙げられ、０〜０．０５％ポリソルベート８０（０．００５〜０．０１％が最適）として添加することができる。その他の界面活性剤としては、限定されないが、ポリソルベート２０及びＢＲＩＪ界面活性剤が挙げられる。非経口投与用注射溶液として製造される本発明の抗体及び抗体部分を含有する医薬組成物は更に治療用タンパク質（例えば抗体）の吸収又は分散を増すために使用されるもの等のアジュバントとして有用な薬剤を含有することができる。特に有用なアジュバントはＨｙｌｅｎｅｘ（Ｒ）（組換えヒトヒアルロニダーゼ）等のヒアルロニダーゼである。注射溶液にヒアルロニダーゼを加えると、非経口投与、特に皮下投与後のヒト生体利用性が改善される。注射部位体積を増す（即ち＞１ｍｌ）と共に、痛みと不快感を減らし、注射部位反応の発生を最小限にすることができる。（本願に援用するＷＯ２００４０７８１４０、ＵＳ２００６１０４９６８参照。）。
【０４３４】
本発明の組成物は種々の剤形にすることができる。これらの剤形としては、例えば液体、半液体及び個体剤形が挙げられ、具体的には溶液（例えば注射溶液及び輸液溶液）、分散液又は懸濁液、錠剤、丸剤、散剤、リポソーム及び座剤が挙げられる。好ましい剤形は所期投与方式と治療用途によって異なる。典型的な好ましい組成物はヒトを他の抗体で受動免疫するために使用されるものと似た組成等の注射溶液又は輸液溶液の形態である。好ましい投与方式は非経口（例えば静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内）である。好ましい１実施形態では、抗体を静脈内輸液又は注射により投与する。別の好ましい実施形態では、抗体を筋肉内又は皮下注射により投与する。
【０４３５】
治療用組成物は一般に製造・保存条件下で無菌・安定でなければならない。前記組成物は溶液、マイクロエマルション、分散液、リポソーム又は高薬物濃度に適した他の規則的構造として製剤化することができる。無菌注射溶液は必要に応じて上記成分の１種又は組合せと共に適切な溶媒に必要量の活性化合物（即ち抗体又は抗体部分）を配合した後、濾過滅菌することにより製造することができる。一般に、塩基性分散媒と上記成分から選択される必要な他の成分を含有する滅菌媒体に活性化合物を配合することにより分散液を調製する。無菌注射溶液を調製するための無菌凍結乾燥粉末の場合には、好ましい製造方法は真空乾燥法と噴霧乾燥法であり、予め製造した活性成分と他の望ましい任意成分の無菌濾過溶液からその粉末を得る。例えばレシチン等のコーティングの使用により、分散液の場合には必要な粒度の維持により、更には界面活性剤の使用により、溶液の適正な流動性を維持することができる。吸収を遅らせる薬剤（例えばモノステアリン酸塩やゼラチン）を組成物に加えることにより注射用組成物の長時間吸収を実現することができる。
【０４３６】
本発明の抗体及び抗体部分又はＡＤＣは当分野で公知の種々の方法により投与することができるが、多くの治療用途に好ましい投与経路／方式は皮下注射、静脈内注射又は輸液である。当業者に自明の通り、投与経路及び／又は方式は所望される結果によって異なる。ある種の実施形態において、活性化合物はインプラント、経皮パッチ及びマイクロカプセル送達システムを含む制御放出製剤のように、化合物が迅速に放出されないようにする担体を用いて製造することができる。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル及びポリ乳酸等の生分解性生体適合性ポリマーを使用することができる。このような製剤の多くの製造方法が特許付与されており、又は一般に当業者に公知である。例えばＳｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７８参照。
【０４３７】
ある種の実施形態では、例えば不活性希釈剤又は同化性可食担体を使用して本発明の抗体又は抗体部分又はＡＤＣを経口投与することができる。化合物（及び必要に応じて他の成分）をハード又はソフトシェルゼラチンカプセルに封入してもよいし、錠剤に圧縮してもよいし、対象の食事に直接添加してもよい。経口治療投与には、化合物に賦形剤を添加し、服用可能な錠剤、バッカル錠、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、ウエハース剤等として使用することができる。非経口投与以外で本発明の化合物を投与するには、その不活性化を防ぐ材料で化合物をコーティングするか、このような材料と併用投与することが必要な場合がある。
【０４３８】
他の実施形態では、本発明の抗体又は抗体部分又はＡＤＣをポリマー種と結合させ、本発明の抗体又は抗体部分が血管透過性・滞留性亢進（ＥＰＲ効果）を享受するために十分な寸法を前記ポリマー種により本発明の抗体又は抗体部分に付与することができる（ＰＣＴ公開番号ＷＯ２００６／０４２１４６Ａ２、米国公開第２００４／００２８６８７Ａ１号、２００９／０２８５７５７Ａ１号及び２０１１／０２１７３６３Ａ１号、並びに米国特許第７，６９５，７１９も参照（各々その開示内容全体を全目的で本願に援用する。））。
【０４３９】
補助活性化合物も組成物に配合することができる。ある種の実施形態では、ＥＧＦＲ活性が有害である障害を治療するために有用な１種以上の別の治療剤と本発明の抗体又は抗体部分又はＡＤＣを合剤化及び／又は併用投与する。例えば、他の標的と結合する１種以上の別の抗体（例えばサイトカイン又は細胞表面分子と結合する抗体）と本発明の抗ｈＥＧＦＲ抗体又は抗体部分又はＡＤＣを合剤化及び／又は併用投与することができる。更に、本発明の１種以上の抗体を上記治療剤の２種以上と併用してもよい。このような併用療法は投与する治療剤を少ない用量で利用できるため、種々の単独療法に伴う毒性や合併症の可能性を避けることができるという利点がある。      
【０４４０】
ある種の実施形態では、当分野で公知の半減期を延長する担体とＥＧＦＲに対する抗体又はＡＤＣ又はそのフラグメントを連結する。このような担体しては、限定されないが、Ｆｃ領域、ポリエチレングリコール及びデキストランが挙げられる。このような担体は例えば全目的で本願に援用する米国出願第０９／４２８，０８２号及び公開ＰＣＴ出願第ＷＯ９９／２５０４４号に記載されている。
【０４４１】
当業者に容易に理解される通り、本願に記載する本発明の方法の他の適切な変形及び応用も自明であり、本発明の範囲又は本願に開示する実施形態から逸脱しない限り、適切な等価物を使用して実施できる。以上、本発明を詳細に記載したが、単に例証の目的であって限定的ではない以下の実施例を参照することにより更に明瞭に理解されよう。
【実施例】
【０４４２】
実施例１：改良型抗ＥＧＦＲ抗体の同定
抗体１
抗体１（Ａｂ１）はヒト化抗ＥＧＦＲ抗体である。Ａｂ１の重鎖可変領域（ＶＨ）アミノ酸配列を以下に配列番号１として示す。Ａｂ１のＶＨ  ＣＤＲアミノ酸配列は以下に下線で示し、ＧＹＳＩＳＳＤＦＡＷＮ（ＶＨ  ＣＤＲ１；配列番号２）；ＹＩＳＹＳＧＮＴＲＹＱＰＳＬＫＳ（ＶＨ  ＣＤＲ２；配列番号３）；及びＡＧＲＧＦＰＹ（ＶＨ  ＣＤＲ３；配列番号４）である。
【０４４３】
【化３４】
2020039360.tif 000041
【０４４４】
Ａｂ１の軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列を以下に配列番号５として示す。Ａｂ１のＶＬ  ＣＤＲアのミノ酸配列は以下に下線で示し、ＨＳＳＱＤＩＮＳＮＩＧ（ＶＬ  ＣＤＲ１；配列番号６）；ＨＧＴＮＬＤＤ（ＶＬ  ＣＤＲ２；配列番号７）；及びＶＱＹＡＱＦＰＷＴ（ＶＬ  ＣＤＲ３；配列番号８）である。
【０４４５】
【化３５】
2020039360.tif 000042
【０４４６】
Ａｂ１よりも改善された特性をもつ抗ＥＧＦＲ抗体を同定するためのスクリーニングを実施した。Ａｂ１変異体の同定の詳細を以下に記載する。
【０４４７】
Ａｂ１変異体ＶＬ及びＶＨライブラリーの作製
Ａｂ１の変異体重鎖又は軽鎖可変領域を含む３種の１本鎖（ｓｃＦｖ）ライブラリーをスクリーニングすることによりＡｂ１変異体抗体を同定した。ｓｃＦｖライブラリーの１つはＡｂ１変異体重鎖可変領域を含み（即ちＡｂ１変異体重鎖可変領域とＡｂ１軽鎖可変領域を含むｓｃＦｖ）、第２のｓｃＦｖライブラリーはＡｂ１変異体軽鎖可変領域を含むものとした（即ちＡｂ１変異体軽鎖可変領域とＡｂ１重鎖可変領域を含むｓｃＦｖ）。Ａｂ１変異体ＶＨ及びＶＬ領域を合わせて第３のｓｃＦｖライブラリーとした後、スクリーニングを複数ラウンド実施し、結合親和性がＡｂ１よりも高いＶＨ及びＶＬ  Ａｂ１変異体の組合せを選択した。Ａｂ１変異体ＶＨ及びＶＬライブラリーのデザインを図１６に示す。
【０４４８】
変異体Ａｂ１  ＶＨ領域を作製するために、Ａｂ１のＶＨとＶＨ４−４（配列番号９３）及びＶＨ４−ｂ生殖細胞系列配列の整列に少なくとも部分的に基づいて１２個のアミノ酸残基を突然変異に選択した（突然変異アミノ酸残基を「Ｘ」で示した図１６Ａ参照。）。ヒト生殖細胞系列配列とＡｂ１配列に基づいてＰ１０１Ｄ置換（図１６Ａに「Ｚ」で示す）も導入した。上記コドン使用によると、１２個の残基（図１６Ａの「Ｘ」残基）を標的とすることにより、１０９ライブラリーで大半のＶＨ  Ａｂ１変異体はクローン１個当たりの突然変異残基が４個以下になると計算された。図１６Ａに記載するように、Ｎ末端ピログルタミン酸形成を防ぐためにフレームワーク残基１個（Ｑ１Ｅ）も置換させた。
【０４４９】
変異体Ａｂ１  ＶＬ領域を作製するために、Ａｂ１のＶＬ領域とＩＧＫＶ１−１２（Ｌ５）生殖細胞系列配列の整列に少なくとも部分的に基づいて１１個のアミノ酸残基を突然変異に選択した（図１６Ｂに「Ｘ」で記した残基参照。）（ＩＧＫＶ１−１２は配列番号９４に記載する。）。３３位と５２位の残基（図１６Ｂに夫々「１」と「２」で示す）は多様性を制限するようにデザインした。３３位の残基はＬ、Ｖ、Ｉ又はＦに制限し、５２位の残基はＳ、Ａ、Ｔ及びＰに制限した。
【０４５０】
Ｂｅｎａｔｕｉｌ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ，ａｎｄ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２３（４）：１５５−１５９に記載されている形質転換法を使用して上記に基づく酵母ライブラリーを作製した。
【０４５１】
ｓｃＦｖ  Ａｂ１変異体ライブラリーのスクリーニング
Ａｂ１変異体ＶＨ又はＶＬ領域を含む１本鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）を夫々のライブラリーから発現させ、ｓｃＦｖが短縮型野生型（ｗｔ）ヒトＥＧＦＲ１−５２５と突然変異体ＥＧＦＲ（ＣＡ）に結合する能力に基づいてスクリーニングした。ＥＧＦＲ（ＣＡ）は２９５位と３０７位にシステイン→アラニン突然変異を含むＥＧＦＲ変異体である（Ｇａｒｒｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  １０６（１３）：５０８２−５０８７参照。）。約１×１０９個のクローンを含むライブラリーをスクリーニングした。
【０４５２】
Ａｂ１はＥＧＦＲ（ＣＡ）と結合するが、ｗｔＥＧＦＲとは実質的に結合しないので、初期ラウンドのスクリーニングではＥＧＦＲ（ＣＡ）を使用し、ＥＧＦＲ（ＣＡ）との結合親和性（ｋｏｎ、ｋｏｆｆ又はその両方）がＡｂ１よりも改善されたＡｂ１変異体重鎖及び軽鎖を同定した。一方、後期ラウンドのスクリーニングではＥＧＦＲ（１−５２５）を使用し、ＥＧＦＲ（１−５２５）との結合親和性（ｋｏｎ、ｋｏｆｆ又はその両方）がＡｂ１よりも改善されたＡｂ１変異体を同定した。
【０４５３】
磁気ビーズソーティング（ＭＡＣＳ（磁気細胞分離技術））及びＦＡＣＳに基づくアッセイの２種類の方法を使用してライブラリースクリーニングを実施した（ＭＡＣＳ及びＦＡＣＳについては、例えば，Ｃｈａｏ  ｅｔ  ａｌ（２００６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  １：７５５−７６５；Ｆｅｌｄｈａｕｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２１：１６３−１７０；及びＶａｎＡｎｔｗｅｒｐ（２０００）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１６：３１−３７参照。）。磁気ビーズ濃縮に基づくスクリーニングを少なくとも２ラウンド実施した後にフローサイトメトリーソーティングに基づくスクリーニングを少なくとも３ラウンド実施した（Ｆｅｌｄｈａｕｓ  ａｎｄ  Ｓｉｅｇｅｌ，Ｃｈ．１７  ｏｆ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，２ｎｄ  ｅｄ．，ｅｄ．Ｈａｗｌｅｙ  ａｎｄ  Ｈａｗｌｅｙ，ｖｏｌ．２６３）。平衡とｋｏｆｆ選択を使用し、Ａｂ１よりも結合性が改善されたｓｃＦｖを同定した。
【０４５４】
Ａｂ１よりも結合性が改善されたＡｂ１変異体ＶＨ及びＶＬ領域について合計３種のライブラリーをスクリーニングした。Ａｂ１変異体ＶＨ及びＶＬライブラリーを使用して４〜５ラウンドのスクリーニングを実施し、併合Ａｂ１変異体ＶＨ／ＶＬライブラリーで５〜６ラウンドを実施した。Ａｂ１変異体ＶＬライブラリーと、Ａｂ１変異体ＶＨライブラリーと、Ａｂ１変異体ＶＨ及びＶＬの併合ライブラリーのスクリーニングの結果、ＥＧＦＲ（ＥＧＦＲ（１−５２５）とＥＧＦＲ（ＣＡ））との結合親和性がＡｂ１よりも高いＡｂ１変異体ＶＨ及びＶＬ領域を含むｓｃＦｖが同定された。
【０４５５】
改良型抗体の同定
ＥＧＦＲ（１−５２５）との特異的結合を含めて結合特性が改善されたと同定された１５種のＡｂ１変異体ｓｃＦｖをＩｇＧタンパク質（具体的にはＩｇＧ１抗体）の作製に選択した。本願ではこれらの１５種のＡｂ１変異体抗体について記載し、抗体Ａ（全文を通して「ＡｂＡ」と言う。）（ＶＨ配列番号９；ＶＬ配列番号５参照。）、抗体Ｂ（本願では「ＡｂＢ」と言う。）（ＶＨ配列番号６４；ＶＬ配列番号６５参照。）、抗体Ｃ（本願では「ＡｂＣ」と言う。）（ＶＨ配列番号６６；ＶＬ配列番号６７参照。）、抗体Ｄ（本願では「ＡｂＤ」と言う。）（ＶＨ配列番号６８；ＶＬ配列番号６９参照。）、抗体Ｅ（本願では「ＡｂＥ」と言う。）（ＶＨ配列番号５０；ＶＬ配列番号５１参照。）、抗体Ｆ（本願では「ＡｂＦ」と言う。）（ＶＨ配列番号５２；ＶＬ配列番号５３参照。）、抗体Ｇ（本願では「ＡｂＧ」と言う。）（ＶＨ配列番号７２；ＶＬ配列番号７３参照。）、抗体Ｈ（本願では「ＡｂＨ」と言う。）（ＶＨ配列番号５４；ＶＬ配列番号５５参照。）、抗体Ｊ（本願では「ＡｂＪ」と言う。）（ＶＨ配列番号５６；ＶＬ配列番号５７参照。）、抗体Ｋ（本願では「ＡｂＫ」と言う。）、抗体Ｌ（本願では「ＡｂＬ」と言う。）（ＶＨ配列番号５８；ＶＬ配列番号５９参照。）、抗体Ｍ（本願では「ＡｂＭ」と言う。）（ＶＨ配列番号７６；ＶＬ配列番号７７参照。）、抗体Ｎ（本願では「ＡｂＮ」と言う。）（ＶＨ配列番号６０；ＶＬ配列番号６１参照。）、抗体Ｏ（本願では「ＡｂＯ」と言う。）（ＶＨ配列番号６２；ＶＬ配列番号６３参照。）及び抗体Ｐ（本願では「ＡｂＰ」と言う。）（ＶＨ配列番号７８；ＶＬ配列番号７９参照。）である。ＶＨ及びＶＬライブラリーから選択したクローンを夫々Ａｂ１  ＶＬ又はＶＨ領域と対合させた（ＡｂＡ、ＡｂＢ、ＡｂＣ、ＡｂＤ、ＡｂＥ及びＡｂＦ参照。）。
【０４５６】
Ａｂ１変異体抗体のＶＨ領域のアミノ酸配列を以下に示す。ＣＤＲは下線で示し、Ａｂ１に対するアミノ酸置換を太字で強調する。
【０４５７】
【化３６】
2020039360.tif 000043
2020039360.tif 000044
【０４５８】
Ａｂ１変異体抗体のＶＬ領域のアミノ酸配列を以下に示す。ＣＤＲは下線で示し、Ａｂ１に対するアミノ酸置換を太字で強調する。
【０４５９】
【化３７】
2020039360.tif 000045
2020039360.tif 000046
2020039360.tif 000047
【０４６０】
１５種のＡｂ１変異体ＶＨ及び／又はＶＬ領域の核酸配列を全長ＩｇＧ抗体の発現用の発現ベクターにサブクローニングした（いずれも本願に援用する米国特許第８，１８７，８３６号及び米国特許第８，４５５，２１９号に開示されているベクター及び方法を参照。）。標準方法に従って抗体発現ベクターをＨＥＫ２９３細胞に一時的にトランスフェクトした（Ｄｕｒｏｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．３０（２；ｅ９）参照。）。Ａｂ１変異体の各々の重鎖の発現に使用したリーダー配列のアミノ酸配列はＭＥＦＧＬＳＷＬＦＬＶＡＩＬＫＧＶＱＣ（配列番号８８）とし、Ａｂ１変異体の各々の軽鎖の発現のリーダー配列に使用したアミノ酸配列はＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＦＰＧＳＲＣ（配列番号８９）とした。次に親和性及び機能評価のためにＡｂ１抗体変異体をプロテインＡクロマトグラフィーにより培地から精製した。
【０４６１】
抗体ＡｂＡ
同定されたＡｂ１変異体抗体の１つはＡｂＡであった。ＡｂＡは軽鎖可変領域配列がＡｂ１（配列番号５）と同一であり、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３アミノ酸配列（夫々配列番号６、７及び８に記載）も同一であった。
【０４６２】
ＡｂＡのＶＨアミノ酸配列を配列番号９に示す。ＡｂＡのＶＨ  ＣＤＲアミノ酸配列はＧＹＳＩＳＲＤＦＡＷＮ（ＣＤＲ１；配列番号１０）；ＹＩＳＹＮＧＮＴＲＹＱＰＳＬＫＳ（ＣＤＲ２；配列番号１１）；及びＡＳＲＧＦＰＹ（ＣＤＲ３；配列番号１２）であり、下線で示す。ＡｂＡとＡｂ１の重鎖可変領域で相違する残基は以下に太字で示す。
【０４６３】
【化３８】
2020039360.tif 000048
【０４６４】
図１及び２はＡｂ１とＡｂＡのＶＨ及びＶＬ領域（図１）と全長重鎖及び軽鎖（図２）のアミノ酸配列の整列を示す。Ａｂ１とＡｂＡの軽鎖アミノ酸配列は同一である（配列番号１３）。一方、Ａｂ１とＡｂＡの重鎖アミノ酸配列はこれらの２種の配列間で６アミノ酸の相違があり、そのうち３個はＣＤＲに位置する。Ａｂ１  ＶＨアミノ酸配列とＡｂＡ  ＶＨアミノ酸配列の相違を図１に影付きで示すが、ＶＨ  ＣＤＲの各々に存在する。ＡｂＡの重鎖可変領域のＣＤＲ１ドメインにはセリン（Ａｂ１）からアルギニンへのアミノ酸置換があった。重鎖可変領域のＣＤＲ２ドメインにはＡｂ１のセリンからＡｂＡのアスパラギンへのアミノ酸置換があった。最後に、重鎖可変領域のＣＤＲ３にはＡｂ１のグリシンからＡｂＡのセリンへのアミノ酸置換があった。ＡｂＡ内のアミノ酸置換の２カ所は重鎖の定常領域に位置する（Ｄ３５４ＥとＬ３５６Ｍ）。ＡｂＡにおけるＦｃ領域アミノ酸突然変異はｚ，ａアロタイプからｚ，非ａアロタイプへのヒトＩｇＧアロタイプ変異に相当する。他の変異に加え、例えば図１に記載するように、最初のアミノ酸はグルタミン（Ｑ）からグルタミン酸（Ｅ）に置換していた。
【０４６５】
Ａｂ１変異体抗体配列とＡｂ１配列の比較
表１はＡｂ１と比較したＡｂ１変異体抗体ＡｂＡ、ＡｂＧ、ＡｂＫ、ＡｂＭ及びＡｂＰの重鎖及び軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列の整列を示す。表２はＡｂ１、ＡｂＡ、ＡｂＧ、ＡｂＫ、ＡｂＭ及びＡｂＰの抗ＥＧＦＲ抗体ＣＤＲコンセンサス配列の比較を示す。表１及び３の空欄は残基がＡｂ１と同一であることを示す。
【０４６６】
【表３】
2020039360.tif 000049
【０４６７】
【表４】
2020039360.tif 000050
【０４６８】
表２に示すように、Ａｂ１変異体抗体ＡｂＡ、ＡｂＧ、ＡｂＫ、ＡｂＭ、ＡｂＰは各々ＣＤＲ３の重鎖可変領域にグリシンの代わりにセリン残基をもつ（表２に太字／下線で示す）。
【０４６９】
Ａｂ１と抗体ＡｂＢ、ＡｂＣ、ＡｂＤ、ＡｂＥ、ＡｂＦ、ＡｂＨ、ＡｂＪ、ＡｂＬ、ＡｂＮ、ＡｂＯ及びＡｂＱのＶＨ及びＶＬ  ＣＤＲ配列の比較を表３に示す。表３に示すＣＤＲ変異に加え、ＡｂＧはＶＨのフレームワーク２領域内にアミノ酸残基置換がある。
【０４７０】
【表５】
2020039360.tif 000051
2020039360.tif 000052
【０４７１】
Ａｂ１変異体抗体の特性決定を以下の実施例２〜８に記載する。
【０４７２】
実施例２：抗ＥＧＦＲ抗体の結合解析
Ｂｉａｃｏｒｅ解析
３種の組換えＥＧＦＲ、具体的には野生型ＥＧＦＲ細胞外領域（ＥＣＤ）（ＥＧＦＲ１−６４５）（配列番号３４）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ（ＥＧＦＲ（１−２９）−Ｇ−（２９８−６４５）（配列番号４６））及び短縮型野生型ＥＧＦＲ１−５２５（ＥＧＦＲ１（１−５２５）（配列番号４７））に対するＡｂ１、Ａｂ２（セツキシマブと同一の６個のＣＤＲアミノ酸配列をもつ抗体）、及び実施例１で同定された抗ＥＧＦＲ抗体の親和性を比較するためにＢｉａｃｏｒｅ解析を実施した。Ａｂ２は夫々配列番号４８及び４９として示すようなＡｂ２の重鎖及び軽鎖アミノ酸配列を含み、標準方法に従って作製した。
【０４７３】
Ａｂ１とＡｂ２はどちらも抗ＥＧＦＲ抗体であるが、性質が異なり、独自のエピトープと結合する。Ａｂ２はＥＧＦＲのＬ２ドメインと結合し（Ｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ７２（１２）１−７；Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ７：３０１）、Ａｂ１はＥＧＦＲのＣＲ１ドメイン（ドメインＩＩ）のアミノ酸残基２８７−３０２と結合する（Ｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）７２（１２）１−７；Ｊｏｈｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ  ＢｉｏｌＣｈｅｍ  ２７９：３０３７５−３０３８４）。ＥＧＦＲのドメインＩＩはＥＧＦＲの拡大した配座に現れる（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ７：３０１）。図１７はＥＧＦＲの全体の構造ドメイン編成の模式図であり、Ａｂ２及びＡｂ１のエピトープが何処に位置するかを大まかに示す。Ａｂ２と異なり、Ａｂ１はＥＧＦＲ  ＥＣＤ（配列番号３４）と結合しない（又は非常に弱く結合する。）。Ａｂ１は活性化野生型ＥＧＦＲと結合することができ、ＥＧＦＲｖＩＩＩとのインビボ結合親和性がＡｂ２よりも高い。従って、本願に記載する実験ではＡｂ２を対照とし、Ａｂ１とは異なるエピトープに結合し、異なる結合親和性特徴をもつ第２の抗ＥＧＦＲ抗体として使用した。
【０４７４】
ＣＭ５センサーチップと共にＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００を使用してＢｉａｃｏｒｅ解析を実施し、標準アミンカップリングキットを製造業者（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の指示に従って使用してアミノ基を介してチップに固定化した抗ヒトＦｃ抗体を利用して試験抗体を捕捉した。要約すると、ＣＭ５チップ表面をＥＤＣ／ＮＨＳで活性化させた。ヤギ抗ヒトＦｃ特異的ポリクローナル抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）で２５μｇ／ｍＬまで希釈し、活性化させた表面に注入し、固定化を行った。バイオセンサー表面の未反応部分をエタノールアミンでブロッキングした。Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００は抗体とその抗原の相互作用を含む生体分子相互作用を検出、特性決定及び定量するための表面プラズモン共鳴に基づくバイオセンサーである。抗原を８０μＬ／分で３分間注入した後、１５分間解離させた。試験したＥＧＦＲ  ＥＣＤはＥＧＦＲのアミノ酸１−６４５をｍｙｃとヒスチジンタグに融合したものとした（ＥＧＦＲ（１−６４５）−ＬＥＳＲＧＰＦ−Ｍｙｃ−ＮＭＨＴＧ−６Ｈｉｓ（「ＬＥＳＲＧＰＦ」（配列番号９０）；「６Ｈｉｓ」（配列番号９１））。ＥＧＦＲｖＩＩＩ変異体もｍｙｃとヒスチジンタグに融合し（ＥＧＦＲ（１−２９）−Ｇ−（２９８−６４５）−ＬＥＳＲＧＰＦ−Ｍｙｃ−ＮＭＨＴＧ−６Ｈｉｓ）、ＥＣＤ  ＥＧＦＲ１−５２５も同様とした（ＥＧＦＲ１（１−５２５）−ＳＲＧＰＦ−Ｍｙｃ−ＮＭＨＴＧ−６Ｈｉｓ（「ＳＲＧＰＦ」（配列番号９２））。Ｂｉａｃｏｒｅ解析で使用したランニングバッファーはＨＢＳ−ＥＰ＋：１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ，ｐＨ７．５，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，３ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０とした。
【０４７５】
Ｂｉａｃｏｒｅ結合解析からの結果を図３に示す。試験したＡｂ１変異体抗体のうち、ＡｂＫは短縮型ＥＧＦＲ（１−５２５）との結合親和性が最大であり、ＫＤは１．７×１０−９Ｍであり、Ａｂ１のＫＤの１３００倍であった。図３に記載するように、ＡｂＥは短縮型ＥＧＦＲ（１−５２５）との測定可能な親和性が最低であり、ＫＤは５．９×１０−７Ｍであり、Ａｂ１のＫＤの約４倍に過ぎなかった。ＡｂＡは短縮型ＥＧＦＲ（１−５２５）とのＫＤの１０倍の改善を示した（ＫＤ  ２．３×１０−６Ｍ（Ａｂ１）に対してＫＤ  ２．２×１０−７Ｍ（ＡｂＡ））。Ａｂ１と比較した短縮型ＥＧＦＲ１−５２５に対するＡｂＢ、ＡｂＣ、ＡｂＤ、ＡｂＦ、ＡｂＧ、ＡｂＨ、ＡｂＪ、ＡｂＬ、ＡｂＭ、ＡｂＮ、ＡｂＯ及びＡｂＰのＫＤ比も図３に示す。
【０４７６】
Ａｂ１変異体抗体であるＡｂ１及びＡｂ２のＥＧＦＲｖＩＩＩとの結合親和性も試験した。図３に示すように、全てのＡｂ１変異体はＥＧＦＲｖＩＩＩとの結合親和性がＡｂ１よりも高かった。例えば、ＡｂＡは２．３×１０−９ＭのＫＤでＥＧＦＲｖＩＩＩから解離したが、Ａｂ１は解離定数ＫＤが９．４×１０−９Ｍであった。従って、ＡｂＡは（解離定数により判定した場合に）親和性がＡｂ１の４倍であった。
【０４７７】
Ａｂ１と比較して短縮型ＥＧＦＲ（１−５２５）との解離定数が高かったＡｂ１変異体抗体はＥＧＦＲｖＩＩＩとの親和性で必ずしも同一の増加を示さなかった。例えば、図３に記載するように、Ａｂ１と比較したＥＧＦＲｖＩＩＩとの親和性の増加はＡｂＯが最大（６３倍）であったが、Ａｂ１と比較した短縮型ＥＧＦＲ（１−５２５）との親和性の増加はＡｂＫが最大（１３００倍超）であった。別の例では、図３に記載するように、ＡｂＧはＡｂ１変異体抗体のうちでＥＧＦＲｖＩＩＩとの結合が２番目に高かった（４７倍超増加）が、Ａｂ１と比較した短縮型ＥＧＦＲ（１−５２５）との親和性は６番目（２６３倍増加）であった。
【０４７８】
Ａｂ１変異体の多くはＥＧＦＲ１−５２５及びＥＧＦＲｖＩＩＩの両者との親和性がＡｂ２よりも低く、例えば短縮型ＥＧＦＲ（１−５２５）とのＫＤは４．０×１０−９ＭであることがＢｉａｃｏｒｅ試験で判明した。
【０４７９】
Ｂｉａｃｏｒｅ解析の結果、Ａｂ１もＡｂ１変異体抗体もＥＧＦＲの全長ＥＣＤ（ＥＧＦＲアミノ酸１−６４５）とは結合しないことが判明した。他方、Ａｂ２はＥＧＦＲのＥＣＤと結合した。従って、Ａｂ１変異体と野生型ＥＧＦＲ  ＥＣＤの結合はＡｂ１と同様に存在しないか又は取るに足らないことが認められたにも拘わらず、Ａｂ１変異体では短縮型受容体ＥＧＦＲ（１−５２５）との結合親和性が増加した。
【０４８０】
ＦＡＣＳ（蛍光活性化セルソーティング）解析
ＦＡＣＳ解析を実施し、腫瘍細胞（Ａ４３１細胞）とのＡｂＡの結合特性をＡｂ１及びＡｂ２と比較検討した。ＦＡＣＳ解析を使用し、蛍光強度と細胞数を測定し、フローサイトメトリーソフトウェアを使用する解析により得られた蛍光強度（即ち幾何平均の値）を細胞に結合した抗体の量とした。具体的には、幾何平均の値を求めることにより、結合した抗体の量により表される抗体の結合活性を評価した。
【０４８１】
約８０％コンフルエントで細胞解離バッファーを使用してＡ４３１細胞をフラスコから回収した。回収したＡ４３１細胞をＰＢＳ／１％ＦＢＳ（胎仔ウシ血清）（ＦＡＣＳバッファー）で１回洗浄後、ＦＡＣＳバッファーに細胞２．５×１０６個／ｍＬとなるように再懸濁した。丸底９６ウェルプレートにウェル当たり細胞１００μＬを加えた。１０倍濃度の抗体１０μＬを使用した（最終濃度を図４に示す）。ウェルをＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、ＦＡＣＳバッファーで希釈した二次抗体（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ４８８）５０μＬに再懸濁した。プレートを４℃で１時間インキュベートし、ＦＡＣＳバッファーで２回洗浄した。細胞をＰＢＳ／１％ホルムアルデヒド１００μＬに再懸濁し、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＬＳＲＩＩフローサイトメーターで解析した。ＷｉｎＬｉｓｔフローサイトメトリー解析ソフトウェアを使用してデータを解析した。
【０４８２】
Ａｂ１、Ａｂ２及びＡｂＡとＡ４３１腫瘍細胞との結合のＦＡＣＳ解析結果を図４に示し、細胞と共にインキュベートした抗体濃度に対する幾何平均を示す。図４から明らかなように、ＡｂＡはＡｂ１よりもＡ４３１腫瘍細胞上のＥＧＦＲとの結合性が高いが、ＡｂＡはＡｂ２に比較すると結合親和性が低かった。図４のデータは各抗体とその抗原との直接結合を表す。
【０４８３】
図３及び４から明らかなように、ＡｂＡはＥＧＦＲとの結合親和性が高く、ＥＧＦＲ濃度の高い細胞（Ａ４３１腫瘍細胞）との結合性がＡｂ１よりも増加した。ＡｂＡはＡ４３１細胞との結合性に比較すると、ＥＧＦＲ濃度の低い細胞との結合性（データは示さず）の増加が少ないことも分かった。
【０４８４】
実施例３：抗ＥＧＦＲ抗体のエピトープ解析
実施例１で同定された抗ＥＧＦＲ抗体が抗体Ａｂ１と同一のエピトープをもつか否か、あるいはＡｂ１変異体抗体であるＡｂＡ、ＡｂＧ、ＡｂＫ、ＡｂＭ及びＡｂＰ内のアミノ酸置換がエピトープ結合性に影響を与えるか否かを検討する試験を実施した。
【０４８５】
競合アッセイ解析
Ａｂ１、Ａｂ２及び対照１抗体（抗ＣＤ２０抗体（陰性対照として使用したリツキシマブ（Ｒｏｃｈｅ）））と比較して改良型抗ＥＧＦＲ抗体のエピトープ特異性を検討するために競合結合ＦＡＣＳアッセイを使用した。ＥＧＦＲｖＩＩＩを発現するＵ８７ＭＧ細胞（ヒト膠芽腫細胞株（Ａ．Ｓｃｏｔｔ，Ｌｕｄｗｉｇ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈから入手）（Ｕ８７ＭＧ細胞はＡＴＴＣからＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１４（ＴＭ）として入手可能；例えばＵ−８７ＭＧ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  ｈｕｍａｎ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈも参照。）を使用した。約８０％コンフルエントで細胞解離バッファーを使用してフラスコからＵ８７ＭＧ細胞を回収した。細胞をＰＢＳ／１％ＦＢＳ（胎仔ウシ血清）（ＦＡＣＳバッファー）で１回洗浄後、細胞２．５×１０６個／ｍＬをＦＡＣＳバッファーに再懸濁した。丸底９６ウェルプレートにウェル当たり細胞１００μＬを加えた。競合ＦＡＣＳでは、（競合抗体の存在下又は不在下に）フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）を最終濃度１００ｎＭで加えることによりＡｂ１を蛍光標識した後、ウェルをＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、ＰＢＳ／１％ホルムアルデヒド１００μＬに懸濁し、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＬＳＲＩＩフローサイトメーターで解析した。蛍光を４８８ｎＭで測定した。
【０４８６】
競合アッセイの結果を図５に示すが、蛍光の幾何平均計算値は未標識Ａｂ１変異体抗体濃度の上昇と共に減少したので、試験したＡｂ１変異体抗体（即ちＡｂＡ、ＡｂＧ、ＡｂＫ、ＡｂＭ及びＡｂＰ）はＡｂ１と同一のエピトープ（「拡大した」ＥＧＦＲ配座に現れるＥＧＦＲのドメインＩＩ）を認識したことが分かる。結果によると、Ａｂ２とＡｂ１の間又はＡｂ２とＡｂ１変異体抗体の間に競合は認められなかったので、Ａｂ１／ＡｂＡ／ＡｂＧ／ＡｂＫ／ＡｂＭ／ＡｂＰエピトープはＡｂ２エピトープと相違することも明らかである。対照１抗体は前記細胞との結合に関してＦＩＴＣ標識Ａｂ１と競合できなかったので、対照１抗体も競合アッセイでＡｂ１エピトープとの検出可能な結合を示さなかった。
【０４８７】
画像解析
ＥＧＦＲを発現する腫瘍による抗体取込み効率を評価するために、１１１Ｉｎで標識したＡｂＡを使用してＳＰＥＣＴ画像アッセイを実施した（例えばＫｈａｌｉｌ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｉｎｇ，Ｖｏｌ．２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ  ７９６０２５，ｐ．１−１５参照。）。免疫組織化学的解析によるＥＧＦＲ発現レベルが中等度であることから、ＳＷ４８細胞（結腸腫瘍細胞；ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ−２３１（ＴＭ））とＥＢＣ−１細胞（ＥＢＣ−１細胞はＪａｐａｎｅｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  Ｂａｎｋ（Ｉｄ  Ｎｏ．ＲＣＢ１９６５）（日本、東京）から入手したヒト肺扁平上皮癌細胞株に由来する。）の２種類の腫瘍細胞株を選択した。これらの腫瘍細胞をマウスに注入後に標識ＡｂＡ抗体、標識Ａｂ又は標識陰性対照（非ＥＧＦＲ結合性ＩｇＧ）を投与した後、注入後４時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、１２０時間及び１６８時間の時点でｎａｎｏＳＰＥＣＴ／ＣＴを使用してマウスからＳＰＥＣＴ／ＣＴ画像を取得した。全標識抗体は尾静脈注射により投与した。抗体の血液クリアランスの差を考慮し、腫瘍対血液の比としてデータを報告する。図２０Ａ及び２０Ｂに示す結果によると、マウスにおけるＳＷ４８（図２０Ａ）及びＥＢＣ−１（図２０Ｂ）細胞のどちらもＡｂ１及びＩｇＧ対照と比較してＡｂＡ取込み率が高いことが分かる。ＥＧＦＲ発現レベルの低いモデルであるＥＢＣ１モデル（図２０Ｂ）では、Ａｂ１取込み率はＩｇＧ対照と同等であったが、ＡｂＡ取込み率はＡｂ１又は陰性対照のどちらよりも高かった。図２０に示す結果によると、ＡｂＡはＥＧＦＲを発現する特定の腫瘍を標的にできることが明らかである。（ＥＧＦＲ発現レベルが高いことが分かっている扁平上皮癌固形腫瘍（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−１５５５）に由来する）Ａ４３１腫瘍細胞を使用した場合もＡｂＡでは同様の画像結果が認められた。
【０４８８】
実施例４：腫瘍細胞株における抗ＥＧＦＲ抗体活性のインビトロ解析
ＳＣＣ−１５及びＨ２９２腫瘍細胞株におけるＥＧＦＲシグナル伝達のインビトロ解析
扁平上皮癌細胞（ＳＣＣ）−１５（ＡＴＣＣ（Ｒ）ＣＲＬ−１６２３（ＴＭ））とＨ２９２細胞（肺癌細胞株；ＡＴＣＣ（Ｒ）ＣＲＬ−１８４８（ＴＭ））を使用するウェスタンブロット解析により、Ａｂ１、Ａｂ２、ＡｂＡ、ＡｂＢ、ＡｂＣ、ＡｂＤ、ＡｂＧ、ＡｂＫ、ＡｂＭ及びＡｂＰが腫瘍細胞株においてＥＧＦＲのＥＧＦ介在性チロシンリン酸化をインビトロ阻害する能力を評価した。ＳＣＣ−１５細胞とＨ２９２細胞はいずれも野生型ＥＧＦＲを発現する。野生型ＥＧＦＲを発現する腫瘍細胞において抗体投与によりｐＥＧＦＲのダウンレギュレーションが誘導されるならば、これらの抗体はこの受容体を介するシグナル伝達の阻害に少なくとも部分的に関与していると判断される。ＳＣＣ−１５細胞（ヒト舌扁平上皮癌）は形質転換角化細胞であり、Ａｂ１にインビボで感受性である。ＳＣＣ−１５細胞はＡｂ１にインビボ感受性であるが、Ｈ２９２（ヒト非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ））細胞はＥＧＦＲのＥＧＦ介在性チロシンリン酸化のＡｂ１阻害にインビトロ及びインビボのいずれでも耐性である。従って、ＡｂＡ、ＡｂＢ、ＡｂＣ、ＡｂＤ、ＡｂＧ、ＡｂＫ、ＡｂＭ及びＡｂＰが腫瘍細胞においてＥＧＦＲシグナル伝達をインビトロ阻害する能力を試験するためにこれらの２種の細胞株を使用した。
【０４８９】
細胞を２４ウェルプレートにウェル当たり６０，０００〜８０，０００個又は６ウェル組織培養プレートにウェル当たり１００，０００〜２００，０００個の割合で播種した。細胞を増殖培地で一晩インキュベートした。必要に応じて３７℃で２４時間血清飢餓後、細胞を抗体と共に３７℃で１時間インキュベートした後、３７℃にて１０分間組換えヒトＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）で刺激した。次に細胞を氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、コンプレートミニプロテアーゼインヒビターカクテル（Ｒｏｃｈｅ）と０．１％ＮＰ４０（Ｔｅｒｇｉｔｏｌ−ｔｙｐｅ  ＮＰ−４０；ノニルフェノキシポリエトキシエタノール）を添加した細胞溶解バッファー（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｇｙ）１００〜２００μＬ／ウェルで溶解させた。−８０℃で少なくとも２０分間急速冷凍後、細胞溶解液を１４，０００ｒｐｍで１０分間４℃にて遠心分離することにより清澄化した。清澄化した試料溶解液のタンパク質濃度をＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ（Ｐｉｅｒｃｅ＿Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で測定した。４−１２％ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ，ミディゲル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して細胞溶解液（１０μｇ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開し、ｉＢｌｏｔ  Ｄｒｙ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してニトロセルロースメンブレンに転写した。ブロットを５％脱脂粉乳／Ｔｗｅｅｎ−トリス緩衝生理食塩水（ＴＴＢＳ）で室温にて１時間ブロッキングし、ＴＴＢＳで３回洗浄後、適切な一次抗体（リン酸化ＥＧＦＲの検出用には抗ホスホチロシン（４Ｇ１０）ビオチンコンジュゲート，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，１０００倍希釈液を使用し、全長ＥＧＦＲの検出用にはウサギ抗ＥＧＦＲ，Ｌｉｆｅｓｐａｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，２０００倍希釈液を使用し、内部対照アクチンの検出用にはウサギ抗Ｐａｎアクチン，Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０００倍希釈液）と共に４℃にて一晩インキュベートした。一次抗体と共に一晩インキュベーション後、ブロットをＴＴＢＳで５分間３回洗浄した後、全長ＥＧＦＲとアクチンの検出にはロバ抗ウサギ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，２０００倍希釈液）を使用し、リン酸化ＥＧＦＲの検出にはストレプトアビジン−ＨＲＰコンジュゲート（ＫＰＬ，１０００倍希釈液）を使用して室温で１時間インキュベートした。その後、ブロットをＴＴＢＳで３回洗浄し、Ｗｅｓｔ  Ｄｕｒａ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ基質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で処理した。ＬＡＳ−４０００スキャナー（富士フィルム社）を使用してスキャンによりブロットを可視化した。
【０４９０】
Ａｂ２を陽性対照（即ちＥＧＦＲリン酸化の阻害剤）として使用し、対照１抗体を陰性対照（即ちＥＧＦＲと結合しないので、リン酸化ＥＧＦＲに影響を与えない対照）として使用した。
【０４９１】
ＳＣＣ−１５細胞を使用したインビトロ試験のウェスタンブロット解析の結果を図７Ａに示すが、リン酸化ＥＧＦＲの有意ダウンレギュレーションの不在から明らかなように、Ａｂ１と抗体ＡｂＡ、ＡｂＢ、ＡｂＣ及びＡｂＤはＳＣＣ−１５細胞においてＥＧＦＲシグナル伝達を有意に阻害できなかったことが分かる。他方、図７Ａに示すように、抗体ＡｂＧ、ＡｂＫ、ＡｂＰ及びＡｂＭはリン酸化ＥＧＦＲが減少し、リン酸化ＥＧＦＲレベルは陰性対照及びＡｂ１よりも低く、陽性対照（Ａｂ２）レベルと同等であったことから、これらの抗体はＳＣＣ−１５細胞においてＥＧＦＲ活性をインビトロ低下させることが判明した。このように、多数のＡｂ１変異体がＡｂ１に比較してインビトロ活性を獲得した。
【０４９２】
Ｈ２９２細胞を使用したインビトロ試験のウェスタンブロット解析の結果を図７Ｂに示す。図７Ｂの結果によると、Ａｂ１と抗体ＡｂＡ、ＡｂＢ、ＡｂＣ及びＡｂＤはＨ２９２細胞においてＥＧＦＲシグナル伝達のインビトロ阻害を殆ど示さず、Ａｂ２と抗体ＡｂＧ、ＡｂＫ、ＡｂＭ及びＡｂＰに比較してリン酸化ＥＧＦＲの有意な減少はないことが分かる。抗体ＡｂＧ、ＡｂＫ、ＡｂＭ及びＡｂＰはＨ２９２細胞におけるＥＧＦＲのチロシンリン酸化の阻害（図７Ｂ参照。）にはＡｂ１よりも有効であった。図７Ｂに示すように、Ａｂ２（陽性対照）もＥＧＦＲリン酸化を阻害したが、Ａｂ２に比較した結果から明らかなように、陰性対照（対照１抗体）はリン酸化の検出可能な阻害を示さなかった。
【０４９３】
以下に記載するように、ＡｂＡは野生型ＥＧＦＲ陽性細胞（Ｈ２９２）におけるＥＧＦＲリン酸化のインビトロ阻害に比較的機能しないことが分かったが、ＡｂＡは同一条件下で試験した抗体Ａｂ１と比較してこれらの細胞のリン酸化をインビボ阻害することができた。
【０４９４】
即ち、図７Ａ及び７Ｂに示すインビトロ結果によると、ＡｂＡ、ＡｂＢ、ＡｂＣ、ＡｂＤ、ＡｂＧ、ＡｂＫ、ＡｂＭ及びＡｂＰは（Ａｂ１に比較して）ＥＧＦＲとの結合性が増加したにも拘わらず、試験した腫瘍細胞株においてＥＧＦ介在性シグナル伝達をインビトロで有意に阻害又は抑制することができたのはＡｂ１変異体抗体のうちの一部のみ（即ちＡｂＧ、ＡｂＫ、ＡｂＭ及びＡｂＰ）であった。一般に、表面プラズモン共鳴法により測定した場合、試験したＡｂ１変異体抗体がＳＣＣ−１５及びＨ２９２細胞においてＥＧＦＲのＥＧＦ介在性チロシンリン酸化をインビトロ阻害する能力はＥＧＦＲｖＩＩＩ及び短縮型ＥＧＦＲ（１−５２５）の両者との親和性の上昇に相関した。
【０４９５】
図６はＡｂ１、Ａｂ２及びＡｂ１変異体抗体のＥＧＦＲ（１−５２５）との結合親和性をまとめたものである。図６の２つの円の輪郭線は抗体がＨ２９２細胞又はＳＣＣ−１５細胞においてＥＧＦＲリン酸化を阻害する能力（ＥＧＦＲ活性の阻害を示す）に関する上記インビトロ結果（又は同様の試験の結果）を表す。図６に示すように、Ａｂ１変異体抗体は図７に示す結果に基づいて試験腫瘍細胞株でＥＧＦＲシグナル伝達をインビトロ阻害しないもの（Ａｂ１、ＡｂＡ、ＡｂＢ、ＡｂＤ、ＡｂＥ及びＡｂＦ；図６でグループ１と指定）と、図７に示すように試験腫瘍細胞株でＥＧＦＲシグナル伝達をインビトロ阻害するもの（ＡｂＧ、ＡｂＨ、ＡｂＬ、ＡｂＫ、ＡｂＪ、ＡｂＭ、ＡｂＮ、ＡｂＯ及びＡｂＰ；図６でグループ２と指定）の２つのグループ（グループ１及び２）に分類することができた。図６で比較すると、全てのＡｂ１変異体抗体はＥＧＦＲ（１−５２５）との親和性がＡｂ１に比較して高く、図７に示す結果から明らかなように、Ｋｄが１×１０−４ｓ−１未満のもの（グループ２）はＥＧＦＲシグナル伝達を有意にインビトロ阻害することができた。図６に示すように、Ａｂ１の成熟プロセスの結果、主に解離速度の高いＡｂ１変異体が得られた。
【０４９６】
Ａ４３１腫瘍細胞株のインビトロ解析
Ａ４３１ヒト上皮癌細胞を使用してリン酸化ＥＧＦＲ  ＥＬＩＳＡアッセイによりＡｂ１とＡｂ１変異体抗体がＥＧＦＲのＥＧＦ介在性リン酸化を阻害する能力も試験した。Ａ４３１細胞は野生型ＥＧＦＲを発現する。
【０４９７】
コラーゲンをコーティングした９６ウェルディッシュでウェル当たり２０，０００個の割合で細胞を増殖培地に播種した。２４時間後に、細胞を無血清培地で洗浄し、４時間血清飢餓状態にした。必要に応じて細胞をモノクローナル抗体で１時間前処理した後、組換えＥＧＦで１０分間３７℃にて刺激した。ＥＧＦ刺激後、細胞を氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、プロテアーゼ阻害剤を添加した細胞溶解バッファー１００μＬ／ウェルで溶解させ、−８０℃で少なくとも２０分間急速凍結した。ウェルに抗ＥＧＦＲ抗体（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ，ｐａｒｔ  ｎｕｍｂｅｒ  ８４１４０２，０．８μｇ／ｍＬ）５０μＬをプレコーティングした後、ＢＳ／１％ ＢＳＡで１時間処理してブロッキングし、Ｔｗｅｅｎ−トリス緩衝生理食塩水（ＴＴＢＳ）で３回洗浄することにより捕捉用プレートを作製した。捕捉用プレートに細胞溶解液を加え、４℃で一晩インキュベートした。プレートをＴＴＢＳで５回洗浄し、ｐＴｒｙ−西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＤＹＣ１０９５）と共に１時間インキュベートした。プレートをＴＴＢＳで５回洗浄し、３，３，５，５−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）１００μＬを各ウェルに加え、発色するまで室温でインキュベートした。１Ｎ  ＨＣｌの添加により反応を停止し、ＯＤを４５０ｎｍで読み取った。
【０４９８】
Ａ４３１阻害試験の結果を図８Ａ及び８Ｂに示すが、Ａｂ１変異体抗体はＡ４３１細胞においてＥＧＦＲ活性を阻害する能力に幅のあることが分かる。図８Ａに示すように、Ａｂ１と変異体ＡｂＡ、ＡｂＢ、ＡｂＣ、ＡｂＤ、ＡｂＥ及びＡｂＦは抗体濃度が１３３３ｎＭであっても（ＥＧＦＲのＥＧＦ介在性リン酸化により測定した場合に）Ａ４３１細胞におけるＥＧＦＲシグナル伝達の阻害に無効であった。他方、Ａｂ１変異体抗体であるＡｂＧ、ＡｂＨ、ＡｂＪ、ＡｂＫ、ＡｂＬ、ＡｂＭ、ＡｂＮ、ＡｂＯ、ＡｂＰ及びＡｂＱはＡｂ２に比較すると高濃度ではあるが、ＥＧＦＲリン酸化を阻止するのにＡｂ１よりも有効であった。ＥＧＦＲと結合しない対照１抗体はＡ４３１細胞のＥＧＦＲ阻害に無効であった。
【０４９９】
図８Ｂは抗体Ａｂ１、ＡｂＰ及びＡｂ２について図８Ａに示したデータを更に詳しく示す。図８Ｂから明らかなように、Ａｂ１はＡｂ２又はＡｂＰに比較して低レベル、即ち平均１０％以下の阻害を示した。Ａｂ１はＡ４３１細胞においてＥＧＦＲシグナル伝達を阻害する際のＩＣ５０値が１３３３ｎＭ超であったが、ＡｂＰはＩＣ５０値が４０ｎＭ超であり、Ａｂ１よりも改善された。Ａｂ２はＩＣ５０値が２．３ｎＭ超であった。
【０５００】
実施例５：インビトロ角化細胞結合アッセイにおける抗ＥＧＦＲ抗体のＦＡＣｓ解析
正常ヒト表皮角化（ＮＨＥＫ）細胞とのＡｂ１変異体抗体の結合親和性を検討するために角化細胞ＦＡＣｓ結合アッセイを実施した。ＮＨＥＫ細胞は野生型ＥＧＦＲを発現する。
【０５０１】
約８０％コンフルエント時にトリプシンを使用して細胞を回収し、中和し、ＰＢＳ／１％ＦＢＳ（ＦＡＣＳバッファー）で１回洗浄後、ＦＡＣＳバッファーに２．５×１０６個／ｍＬの割合で再懸濁した。丸底９６ウェルプレートにウェル当たり細胞１００μＬを加えた。１０倍濃度（最終濃度を図に示す）のＡｂ１０μＬを加え、プレートを４℃で１時間インキュベートした。ウェルをＦＡＣＳバッファーで２回洗浄後、ＦＡＣＳバッファーで希釈した二次抗体（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ４８８）５０μＬに再懸濁した。プレートを４℃で１時間インキュベートした後、ＦＡＣＳバッファーで２回洗浄した。次に細胞をＰＢＳ／１％ホルムアルデヒド１００μＬに再懸濁し、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＬＳＲＩＩフローサイトメーターで解析した。ＷｉｎＬｉｓｔフローサイトメトリー解析ソフトウェアを使用してデータを解析した。
【０５０２】
インビトロ角化細胞結合アッセイの結果を図９に示すが、標識ＡｂＡ、ＡｂＧ、ＡｂＫ、ＡｂＭ及びＡｂＰ抗体の濃度が増加するにつれて角化細胞へのＥＧＦＲの結合により蛍光測定値が増加したことが分かる。陽性対照としてＡｂ２を使用した処、ＮＨＥＫ細胞への抗体の添加に伴って蛍光が増加した。Ａｂ１は抗体濃度が高くても著しく低レベルの結合しか示さなかった。
【０５０３】
図９に示す結果によると、試験したＡｂ１変異体抗体は角化細胞上の野生型ＥＧＦＲと結合し、正常ヒト表皮角化細胞との親和性がＡｂ１（及び陰性対照である対照１抗体）よりも高いことが分かる。図９の結果から、抗体ＡｂＡ、ＡｂＧ、ＡｂＫ、ＡｂＭ及びＡｂＰはＡｂ２に比較して正常ヒト表皮角化細胞との結合性が低いことも明らかである。これらの結果から、Ａｂ１変異体抗体はＡｂ１よりも良好に角化細胞上の野生型ＥＧＦＲと結合できることが分かる。
【０５０４】
実施例６：腫瘍上の抗ＥＧＦＲ抗体のインビボ解析
マウス異種移植アッセイを使用して腫瘍の増殖に及ぼすＡｂ１変異体抗体のインビボ影響を評価した。
【０５０５】
ＳＣＩＤ及び無胸腺ＣＤ−１ヌードマウスをＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）から入手した。ケージ１個当たりマウス１０匹を収容した。到着時のマウスの体重は１８〜２０ｇであった。全実験は実験動物管理評価認定協会により認定された施設で米国国立衛生研究所実験動物の管理と使用に関する指針のガイドラインに従って実施した。各皮下試験では、生存可能な細胞を０日目にマウスの右脇腹に皮下接種した。注射容量はＳ−ＭＥＭとＭａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）の１：１混液０．２ｍＬとした。腫瘍は約２００〜２５０ｍｍ３にサイズマッチングさせた。腫瘍のサイズマッチング当日又は２４時間後に治療を開始した。ヒトＩｇＧ混合物対照を陰性対照として使用した（ヒト血清と同様の精製ヒトＩｇＧ；Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）。マウスは治療開始時に体重約２５ｇであった。週２〜３回腫瘍体積を推算した。電子キャリパーにより腫瘍の長さ（Ｌ）と幅（Ｗ）を測定し、次式：Ｖ＝（Ｌ×Ｗ２）／２に従って体積を計算した。腫瘍体積が３，０００ｍｍ３に達した時点又は皮膚潰瘍が発生した時点でマウスを安楽死させた。投与前に適量の抗体ストックをリン酸緩衝生理食塩水で希釈した。図に示すように薬物を腹腔内投与した。異種移植試験ではＨ２９２（ヒト非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ））細胞を使用した。
【０５０６】
インビボ実験の結果によると、Ａｂ１変異体抗体であるＡｂＡ、ＡｂＧ、ＡｂＫ、ＡｂＭ及びＡｂＰはＡｂ１に比較して腫瘍増殖を有意に阻害することができた（図１０参照。）。Ａｂ１変異体抗体はＡｂ１に比較して応答期間の持続性を増すこともでき、例えば（同一の用量及び投与スケジュールに従って）腫瘍細胞に注射後、Ａｂ１は５００ｍｍ３未満の腫瘍体積を約１８日間維持したのに対して、ＡｂＡは５００ｍｍ３未満の腫瘍体積を２９日間維持した。図１０に示すように、ＡｂＡを注射したマウスは２０日目に腫瘍体積が約３００ｍｍ３であったが、Ａｂ１を注射したマウスは２０日目に腫瘍体積が７００ｍｍ３であった。２９日目まで、ＡｂＡを注射したマウスは２０日目のサイズ（即ち約３００ｍｍ３）と同等の体積の腫瘍を示したが、Ａｂ１を注射したマウスは腫瘍体積が約１０００ｍｍ３まで増加した。
【０５０７】
図１０に示した結果を数値化するために腫瘍増殖阻害百分率（％ＴＧＩ）を計算した。図１０に示した抗体の％ＴＧＩは以下の通りである。
ＡｂＡ＝７４
ＡｂＧ＝８８
ＡｂＫ＝９０
ＡｂＭ＝８４
ＡｂＰ＝８６
Ａｂ１＝３１
Ａｂ２＝７３。
【０５０８】
％ＴＧＩ値はヒトＩｇＧ対照を投与したマウスの腫瘍体積と比較した数値である。上記のように、Ａｂ１はヒトＩｇＧ対照と比較して３１％のＴＧＩであったが、ＡｂＡのＴＧＩ計算値は７４％であった。特に、Ａｂ１変異体抗体はＡｂ２と比較して同等以上の％ＴＧＩを示した。
【０５０９】
ＡｂＡは（図１０に示すように）Ｈ２９２異種移植片腫瘍モデルにおいてインビボで応答の持続性を増すと共に腫瘍体積を減少させることができたが、実施例４及び図７に示すように、同一細胞株でＥＧＦＲのリン酸化をインビトロ阻害することはできなかった。抗体ＡｂＡはＥＧＦＲ（１−５２５）及びＥＧＦＲｖＩＩＩとの結合親和性が低いにも拘わらず、インビボ活性も抗体ＡｂＧ、ＡｂＫ、ＡｂＭ及びＡｂＰと同等であった（図３参照。）。従って、ＡｂＡはインビトロ細胞シグナル伝達阻害を殆ど〜全く示さなかったにも拘わらず、ＡｂＡは親和性値が高い他の抗ＥＧＦＲ変異体抗体（例えばＡｂＫ、ＡｂＭ及びＡｂＰ）と同様にＨ２９２腫瘍細胞増殖をインビボで抑制又は阻害した。
【０５１０】
実施例７：ＡｂＡ  ＡＤＣを使用したインビボ腫瘍増殖阻害アッセイ
インビボマウス異種移植アッセイを使用してＡｂＡ−ｖｃＭＭＡＥ  ＡＤＣが腫瘍増殖を阻害する能力を検討した。本実施例で使用したＡｂＡ  ＡＤＣは実施例８に記載する方法に従ってコンジュゲートにしたが、本願に記載するバッチ精製法に従って精製しなかった。本実施例で使用したＡｂＡ  ＡＤＣ組成物の平均ＤＡＲは３．７であった。２種類の異なるＮＳＣＬＣ細胞株であるＮＣＩ−Ｈ１７０３とＥＢＣ１を使用して（実施例６に記載したアッセイと同様の）マウス異種移植アッセイを実施した。これらの２種類の異なる細胞株からの結果を図１４に示す。
【０５１１】
図１４Ａに示すように、ＡｂＡ−ｖｃＭＭＡＥ（用量１ｍｇ／ｋｇ体重）はＮＣＩ−Ｈ１７０３細胞における腫瘍体積減少と応答の持続性の増加に関してＡｂ１（用量１０ｍｇ／ｋｇ体重）及びｍｃリンカーによりＡｂ１とＭＭＡＦを結合させたＡｂ１  ＡＤＣと比較して良好であった。Ａｂ１単独（用量１０ｍｇ／ｋｇ）の場合には、用量１０ｍｇ／ｋｇで腫瘍増殖を阻害しなかった陰性対照である抗体対照２（抗破傷風毒素抗体）と同様に腫瘍体積抑制は全く得られなかった。
【０５１２】
ＥＢＣ１細胞を使用して異種移植片マウスモデルでＡｂＡ−ｖｃＭＭＡＥ  ＡＤＣの効力も試験した。この試験の結果を図１４Ｂに示すが、ＡｂＡ−ｍｃＭＭＡＦ  ＡＤＣ（用量３ｍｇ／ｋｇ体重）は腫瘍体積減少と応答の持続性の増加に関してＡｂ１（用量３ｍｇ／ｋｇ体重）及びｍｃリンカーによりＡｂ１とＭＭＡＦを結合させたＡｂ１  ＡＤＣ（用量３ｍｇ／ｋｇ体重）と比較して良好であった。
【０５１３】
要するに、図１４の結果の結果によると、２種類の異なるＡｂＡアウリスタチンＡＤＣ（ＡｂＡ−ｖｃＭＭＡＥとＡｂＡ−ｍｃＭＭＡＦ）はＡｂ１単独又はＡｂ１−ＭＭＡＦ  ＡＤＣと比較してインビボでの腫瘍体積減少と応答の持続性の増加に有効であった。
【０５１４】
実施例８：精製抗ＥＧＦＲ抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）
バリン−シトルリン（ｖｃ）リンカーを介してＡｂＡ抗体をモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）と連結させた抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を作製した。このＡＤＣ（ＡｂＡ−ｖｃＭＭＡＥと言う。）の模式図を図１１に示す。
【０５１５】
ＡｂＡ抗体とｖｃＭＭＡＥの結合はＡｂＡの部分的還元から開始した後にＶａｌ−Ｃｉｔ−ＭＭＡＥ（ｖｃＭＭＡＥ）と反応させた。ＴＣＥＰ（ＴＣＥＰ：ｍＡｂのモル当量は２．１）の添加後に０℃で一晩インキュベートすることによりＡｂＡ抗体（２０ｍｇ／ｍＬ）を部分的に還元した。次に還元反応液を２０℃まで加温した。全チオールを結合させるために、最終的なｖｃＭＭＡＥ：還元Ｃｙｓモル比が１．１５となるようにｖｃＭＭＡＥを加えた。結合反応は１０％ｖ／ｖのＤＭＳＯの存在下で実施し、２０℃で６０分間進行させた。
【０５１６】
結合反応後、過剰の遊離Ｎ（アセチル）−システイン（ｖｃＭＭＡＥ添加量に対して２当量）を加えて未反応のｖｃＭＭＡＥをクエンチし、Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＭＭＡＥ付加物を生成した。Ｃｙｓクエンチ反応は２０℃で約３０分間進行させた。Ｃｙｓでクエンチした反応混合液を以下のように精製した。
【０５１７】
バッチ精製
バッチ精製法を使用してＡｂＡ  ＡＤＣを精製した。反応混合液を適量の水洗Ｂｕ−ＨＩＣ樹脂（トヨパール；東ソー株式会社）で処理し、即ち混合液に７倍重量の樹脂を加えた。樹脂／反応混合液を適当な時間撹拌し、薬物コンジュゲート生成物の除去について分析用疎水性相互作用クロマトグラフィーによりモニターし、粗目ポリプロピレンフィルターで濾過し、２ベッド体積の緩衝液（０．２８Ｍ塩化ナトリウム，７ｍＭリン酸カリウム，ｐＨ７）で洗浄した。濾液とリンス液を合わせ、生成物プロファイルをＨＩＣ  ＨＰＬＣにより分析した。濾液とリンス液を合わせ、限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）により１０倍体積量の１５ｎＭヒスチジン緩衝液で１５ｍＭヒスチジン，ｐＨ６に緩衝液を交換した。
【０５１８】
結合及び精製後、得られたＡＤＣ混合物の解析を実施した。試料を採取し、疎水性相互作用クロマトグラフィー−高性能液体クロマトグラフィー（ＨＩＣ−ＨＰＬＣ）を使用して解析した。使用したカラムはＴＳＫｇｅｌ  Ｂｕｔｙｌ−ＮＰＲカラム（４．６ｍｍ  ＩＤ×３．５ｃｍ，２．５μｍ，３０℃；東ソー株式会社，日本）とし、流速０．８ｍＬ／ｍｉｎで使用した。移動相はＡ：２５ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４，ｐＨ７，１．５Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ及びＢ：２５ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４，ｐＨ７（７５％）／ＩＰＡ（２５％）とした。使用したグラジエントは２分間０％Ｂ相、１２分間で０→１００％Ｂ、１分間保持とした。
【０５１９】
ＵＶ解析を使用してタンパク質含量を解析した。ＨＩＣ微量分析によると、下表４と図１２に示すように、ＡｂＡ−ｖｃＭＭＡＥで得られた平均薬物対抗体比（ＤＡＲ）は３．１であった。平均ＤＡＲは０、１、２、３、４、５、６、７及び８のＡＤＣ生成物を合計し、ＰＡ％（ＰＡ％は必要な薬物負荷によるＡ２８０におけるピーク下面積測定値により決定されるピーク面積である。）を乗じて１００で割ることにより求めた。
【０５２０】
【表６】
2020039360.tif 000053
【０５２１】
表４及び図１２から明らかなように、ＡｂＡ−ｖｃＭＭＡＥのバッチ精製の結果、ＤＡＲは２〜４となった。初期平均ＤＡＲは４．１であり、精製後の最終平均ＤＡＲは３．１であった。
【０５２２】
ＡｂＡ−ｖｃＭＭＡＥ  ＡＤＣ混合物を更にサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により分析した。東ソーＴＳＫｇｅｌ  ＧＳ３０００ＳＷＸＬカラム（７．５８×３０ｃｍ，５μｍ）を使用してＳＥＣ  ＨＰＬＣを実施した。０．３ｍＬ／ｍｉｎの流速を使用した。移動相は９２．５％の２５ｍＭ  Ｎａ２ＰＯ４，ｐＨ６．８，３５０ｍＭ  ＮａＣｌと７．５％のイソプロピルアルコール（ＩＰＡ）とした。希釈剤を移動相とし、ＵＶ２１４ｎｍにて分析を実施した。２１４ｎｍにおけるＳＥＣｐａ％結果を表５に示す。ＳＥＣ結果を図１３に示す。
【０５２３】
【表７】
2020039360.tif 000054
【０５２４】
従って、ＡｂＡ−ｖｃＭＭＡＥのバッチ精製の結果、ＤＡＲは２〜４となり、平均は３．１であった。
【０５２５】
実施例９：ＡｂＡ−ＭＭＡＥ  ＡＤＣを使用したインビボ腫瘍増殖阻害アッセイ
実施例８に記載したように、組成物内のＡＤＣの平均ＤＡＲが３．１となるようにＡｂＡ−ｖｃＭＭＡＥの精製組成物を製造した。次に肺癌異種移植片モデルを使用して精製ＡｂＡ  ＡＤＣ組成物が腫瘍増殖をインビボ阻害するのに有効であるか否かを検討するために精製ＡＤＣを試験した。より具体的には、異種移植片腫瘍増殖阻害アッセイを実施し、ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞（ヒトＮＳＣＬＣ癌細胞株）に及ぼす精製ＡｂＡ−ｖｃＭＭＡＥ（Ａｂ１−ｖｃＭＭＡＥｐ）の効果を評価した。
【０５２６】
図１５Ａに示す結果から明らかなように、ＡｂＡ−ｖｃＭＭＡＥｐ（用量３ｍｇ／ｋｇ体重）は未精製ＡｂＡ−ｖｃＭＭＡＥと比較した場合にＮＣＩ−Ｈ２９２細胞において腫瘍体積減少と応答の持続時間の延長（応答の持続性の増加）に有効であった。同様に、図１５Ｂから明らかなように、精製ＡｂＡ−ｖｃＭＭＡＥｐ（用量６ｍｇ／ｋｇ体重）はＡｂＡ−ｖｃＭＭＡＥの未精製形と比較した場合に腫瘍増殖の阻害にも有効であった。図１５Ａ及び１５Ｂに示すように、精製ＡｂＡ−ｖｃＭＭＡＥは更に陰性対照２抗体（単独又はＭＭＡＥとのコンジュゲート）、未精製又は精製形態のＡｂ１とＭＭＡＥ又はＭＭＡＦとのコンジュゲートよりも腫瘍体積減少と応答の持続時間の延長に有効であった。対照２抗体はＥＧＦＲと結合しない抗破傷風毒素抗体である。
【０５２７】
ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞（肺癌細胞株；ＡＴＣＣ（Ｒ）ＣＲＬ−１８４８（ＴＭ））に及ぼす精製ＡｂＡ−ｖｃＭＭＡＥ（Ａｂ１−ｖｃＭＭＡＥｐ）の効果を評価する別の試験では、精製ＡｂＡ−ｖｃＭＭＡＥを用量３ｍｇ／ｋｇ及び６ｍｇ／ｋｇで同様の用量のＡｂ１−ｍｃＭＭＡＦと比較試験した。ＮＳＣＬＣ腫瘍モデルにおけるこの第２の試験の結果を図１８に示すが、精製ＡｂＡ−ｖｃＭＭＡＥｐはＡｂＡ−ｖｃＭＭＡＥと比較した場合に腫瘍増殖の阻害により有効であったことが明らかである。
【０５２８】
実施例１０：ＡｂＡ−ｖｃＭＭＡＥのフロースルー法精製
フロースルー法を使用し、抗体当たりのｖｃ−ＭＭＡＥ分子の薬物負荷を減らしてＡｂＡ−ｖｃＭＭＡＥ  ＡＤＣを含有する組成物を製造した。ＡｂＡ−ｖｃＭＭＡＥ  ＡＤＣの製造については実施例７で上述した通りである。
【０５２９】
一定範囲のＤＡＲ（１〜８）のＡＤＣを含有するＡｂＡ−ｖｃＭＭＡＥの組成物のフロースルー精製法を実施した。先ず、Ｂｕ−ＨＩＣ樹脂の５ｍＬカラムを約２８ｍＭ  ＮａＣｌ，７ｍＭリン酸カリウム，ｐＨ７で平衡化した。次に１．９５Ｍ  ＮａＣｌ，５０ｍＭリン酸カリウム，ｐＨ７を使用して反応混合液をその体積の６倍に希釈し、樹脂１ｍＬ当たりタンパク質約１００ｍｇの割合で流速１ｍＬ／ｍｉｎ（滞留時間約５分間又は線流速３６ｃｍ／ｈ）にて樹脂に注入した。イソプロパノール１部と２８ｍＭ  ＮａＣｌ，７ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７）１０部（体積基準）から構成されるリンス液をリンス液として約１２カラム体積分流した。約１カラム体積後に開始してＵＶシグナルが平衡状態になった後まで生成物を採取した（フラクションとして採取してもよい）。ＨＩＣ  ＨＰＬＣによりフラクションを分析し、所望のアリコートを集めてプールし、ＴＦＦ（タンジェンシャルフロー濾過）により濃縮し、１０倍体積量のヒスチジン緩衝液で１５ｍＭヒスチジン，ｐＨ６に交換した。下表６は精製前後の反応混合液の精製結果を示す。
【０５３０】
【表８】
2020039360.tif 000055
【０５３１】
実施例８に記載したバッチ精製と比較すると、樹脂に対するタンパク質の負荷量は各精製方式（バッチ精製とフロースルー精製）で同等であった。バッチ精製法では、力価調整換算でＡＤＣに対して樹脂２．２６倍重量を使用した。樹脂の密度は約０．２３ｇ／ｍｌであった。   従って、例えばＡＤＣ１０ｇを使用した場合には、樹脂９８．２ｍｌを使用した。使用した負荷量は（１０ｇ×１０００ｍｌ／Ｌ）／９８．２ｍｌ＝１０２ｇ／Ｌの負荷量であった。フロースルー精製実験は１００ｇ／Ｌの負荷量を目標とする。フロースルー精製のリンス液を１０ｖ／ｖ％ＩＰＡとした以外はどちらの場合も負荷液とリンス液は同一とした。
【０５３２】
実施例８に記載したバッチ精製法を使用して得られた精製ＡｂＡ−ｖｃＭＭＡＥ組成物と上記フロースルー法を使用して得られた精製ＡｂＡ−ｖｃＭＭＡＥ組成物の比較を表７に示す。
【０５３３】
【表９】
2020039360.tif 000056
【０５３４】
要するに、例えば表７に示すように、フロースルー精製法とバッチ精製法はどちらもＤＡＲが２〜４のＡＤＣ約８０％を含有する組成物を得るのに成功し、しかもＤＡＲが０〜１又は５〜８のＡＤＣの量は組成物中のＡＤＣ総数の約２０％未満に制限されていた。
【０５３５】
実施例１１：ＡｂＡ  ＭＭＡＥ  ＡＤＣを使用したインビボ腫瘍増殖阻害アッセイ
インビボマウス異種移植アッセイを使用してＡｂＡ−ｖｃＭＭＡＥ  ＡＤＣが膠芽腫腫瘍増殖を阻害する能力を検討した。（ＥＧＦＲｖＩＩＩを発現する）Ｕ８７ＭＧｄｅ２−７細胞を使用して（実施例６で実施したアッセイと同様の）マウス異種移植アッセイを実施した。Ｕ８７細胞はヒト悪性神経膠腫（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＨＴＢ−１４（ＴＭ））に由来する。この試験では、腫瘍細胞を５０％Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）と混合し、０日目に細胞３×１０６個を６〜８週齢Ｎｕ／Ｎｕ雌性マウスの脇腹に皮下接種した（Ｎｕ／Ｎｕ雌性マウスはＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）から入手した）。電子キャリパーにより腫瘍の長さ（Ｌ）と幅（Ｗ）を測定し、次式：Ｖ＝（Ｌ×Ｗ２）／２に従って体積を計算した。腫瘍体積が３，０００ｍｍ３に達した時点又は皮膚潰瘍が発生した時点でマウスを安楽死させた。図１９に示す結果から明らかなように、ＡｂＡ−ｖｃＭＭＡＥｐは陰性対照（対照２抗体；抗破傷風抗体）よりも膠芽腫細胞増殖の阻害に有効であった。
【０５３６】
【表１０】
2020039360.tif 000057
2020039360.tif 000058
2020039360.tif 000059
【０５３７】
文献援用
本願の随所に引用する全文献、特許、係属中の特許出願及び公開特許は特に本願に援用する。
【０５３８】
等価物
本願に記載する本発明の特定の実施形態の多くの等価物も当業者に認識され、あるいは単なる日常的な実験により確認できよう。このような等価物も以下の特許請求の範囲に含むものとする。
【図１】
2020039360.tif 000060
【図２】
2020039360.tif 000061
【図３】
2020039360.tif 000062
【図４】
2020039360.tif 000063
【図５】
2020039360.tif 000064
【図６】
2020039360.tif 000065
【図７Ａ】
2020039360.tif 000066
【図７Ｂ】
2020039360.tif 000067
【図８Ａ】
2020039360.tif 000068
【図８Ｂ】
2020039360.tif 000069
【図９】
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【図１０】
2020039360.tif 000071
【図１１】
2020039360.tif 000072
【図１２−１】
2020039360.tif 000073
【図１２−２】
2020039360.tif 000074
【図１３−１】
2020039360.tif 000075
【図１３−２】
2020039360.tif 000076
【図１４Ａ】
2020039360.tif 000077
【図１４Ｂ】
2020039360.tif 000078
【図１５Ａ】
2020039360.tif 000079
【図１５Ｂ】
2020039360.tif 000080
【図１６】
2020039360.tif 000081
【図１７】
2020039360.tif 000082
【図１８】
2020039360.tif 000083
【図１９】
2020039360.tif 000084
【図２０Ａ】
2020039360.tif 000085
【図２０Ｂ】
2020039360.tif 000086
【図２１】
2020039360.tif 000087
【配列表】
2020039360000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年12月23日(2019.12.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ヒト上皮成長因子受容体（抗ｈＥＧＦＲ）抗体又はその抗原結合部分であって、
ａ）アミノ酸配列ＣＧＡＤＳＹＥＭＥＥＤＧＶＲＫＣ（配列番号４５）内のエピトープに結合するか、又は競合結合アッセイにおいて上皮成長因子受容体変異体ＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）（配列番号３３）との結合に関して第２の抗ｈＥＧＦＲ抗体と競合し、ここで前記第２の抗ＥＧＦＲ抗体は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号５に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む；
ｂ）表面プラズモン共鳴法により測定した場合に、約１×１０−６Ｍ以下の解離定数（Ｋｄ）でＥＧＦＲ（１−５２５）（配列番号４７）と結合し；および
ｃ）インビボヒト非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）異種移植アッセイにおいて、前記ＮＳＣＬＣ異種移植アッセイにおいて、ＥＧＦＲに特異的ではないヒトＩｇＧ抗体と比較して少なくとも約５０％の腫瘍増殖阻害率％（ＴＧＩ％）で腫瘍増殖を阻害する、ここで、前記抗ｈＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合部分と同一の用量と頻度でＥＧＦＲに非特異的なヒトＩｇＧ抗体を投与される、
前記抗体又はその抗原結合部分。