(57)【要約】      （修正有）【課題】ＰＣＲを１サイクルあたり２０秒未満で、効率と収量を向上させて行うための方法、デバイス、およびキットの提供。【解決手段】増幅中の生体サンプル中の標的核酸配列を増幅する方法であって、熱安定性ポリメラーゼおよび前記標的核酸配列を増幅するように構成されたプライマーを前記生体サンプルに添加する工程であって、前記ポリメラーゼが少なくとも０．５μＭの濃度で提供され、前記プライマーがそれぞれ少なくとも２μＭの濃度で提供される工程と、エクストリーム温度サイクリングプロファイルを使用して、複数の増幅サイクルにわたり少なくとも変性温度と伸長温度との間で前記生体サンプルを熱的にサイクリングすることによるポリメラーゼ連鎖反応によって、前記標的核酸配列を増幅する工程であって、各サイクルが１サイクルあたり２０秒未満のサイクル時間で完了する工程とを含む方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
増幅中の生体サンプル中の標的核酸配列を増幅する方法であって、
熱安定性ポリメラーゼおよび前記標的核酸配列を増幅するように構成されたプライマー
を前記生体サンプルに添加する工程であって、前記ポリメラーゼが少なくとも０．５μＭ
の濃度で提供され、前記プライマーがそれぞれ少なくとも２μＭの濃度で提供される工程
と、
エクストリーム温度サイクリングプロファイルを使用して、複数の増幅サイクルにわた
り少なくとも変性温度と伸長温度との間で前記生体サンプルを熱的にサイクリングするこ
とによるポリメラーゼ連鎖反応によって、前記標的核酸配列を増幅する工程であって、各
サイクルが１サイクルあたり２０秒未満のサイクル時間で完了する工程と
を含む方法。
【請求項２】
各サイクルが、１サイクルあたり２秒未満で完了する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
傾斜速度が、少なくとも２００℃／秒である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記傾斜速度が、少なくとも３００℃／秒である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記傾斜速度が、少なくとも４００℃／秒である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
プラトーが、Ｃｐの後の少なくとも２０サイクルにある、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
それぞれの前記プライマーの濃度が、２．５μＭより大きい、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記伸長温度とは異なるアニーリング温度をさらに含み、
前記増幅する工程により１００ｂｐより大きいアンプリコンが生成し、
前記エクストリーム温度サイクリングプロファイルが、塩基対で表された伸長の長さ（
アンプリコンの長さ−プライマーの長さ）を、塩基／秒で表された前記熱安定性ポリメラ
ーゼの伸長速度で割った値にほぼ等しい時間の前記伸長温度での保持を包含する、請求項
１のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記増幅する工程が、前記伸長温度と同じかまたはそれよりも低いアニーリング温度を
さらに包含し、前記増幅する工程が、前記アニーリング温度での０．０５〜０．９秒間の
保持を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記Ｍｇ＋＋濃度が、少なくとも４ｍＭである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ポリメラーゼおよび前記プライマーの濃度がある倍率で増加し、前記サイクル時間
が前記倍率で割られる、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記エクストリーム温度プロファイルが、
アニーリング時間＝ｋ１／［プライマー］
（式中、ｋ１は、定数であり、［プライマー］は、各プライマーの濃度である。）
によって定義されるアニーリング時間を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ｋ１が、実験的に決定される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記温度サイクリングプロファイルが、
伸長時間＝ｋ２（伸長の長さ）／（［ポリメラーゼ］＊（ポリメラーゼ速度））
（式中、ｋ２は、比例定数であり、［ポリメラーゼ］は、前記ポリメラーゼの前記濃度で
あり、ポリメラーゼ速度は、ヌクレオチド／秒で表されたポリメラーゼの塩基を取り込む
速度である。）
によって定義される前記伸長温度における時間を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
ｋ２が、実験的に決定される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記標的核酸が、少なくとも７０％の効率で増幅される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
増幅中の生体サンプル中の標的核酸配列を増幅する方法であって、
熱安定性ポリメラーゼおよび前記標的核酸配列を増幅するように構成されたプライマー
を前記生体サンプルに添加する工程であって、前記ポリメラーゼとプライマーの比率が、
（約０．０３〜約０．４のポリメラーゼ）：（プライマーの総濃度）であり、前記ポリメ
ラーゼの濃度が少なくとも０．５μＭである工程と、
エクストリーム温度サイクリングプロファイルを使用して、複数の増幅サイクルにわた
り少なくとも変性温度と伸長温度との間で前記生体サンプルを熱的にサイクリングするこ
とによるポリメラーゼ連鎖反応によって、前記標的核酸配列を増幅する工程であって、各
サイクルが２０秒未満で完了する工程と
を含む方法。
【請求項１８】
各サイクルが、１０秒未満で完了する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
各サイクルが、５秒未満で完了する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
各サイクルが、２秒未満で完了する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記標的核酸が、ゲノムＤＮＡである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記生体サンプルが、真核生物のゲノムＤＮＡを含有する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
前記ポリメラーゼが、少なくとも１．０μＭの濃度で提供されるＫｌｅｎＴａｑである
、請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
非特異的増幅が、検出可能なレベル未満である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２５】
プライマーの総濃度が、少なくとも５μＭである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２６】
ＰＣＲを行うためのデバイスであって、
ＰＣＲサンプルを保持するためのサンプル容器と、
前記サンプルを加熱する手段と、
前記サンプルを冷却する手段と、
前記サンプルを加熱する手段および前記サンプルを冷却する手段に前記サンプル容器を
繰り返し晒して、前記サンプルを少なくとも２００℃／秒の傾斜速度で熱的にサイクリン
グする制御手段と
を含むデバイス。
【請求項２７】
モニタリング位置で前記サンプルを光学的に励起して前記サンプルに蛍光を発生させる
手段と、励起された増幅中の前記サンプルの前記蛍光を検出する手段とをさらに含む、請
求項２６に記載のデバイス。
【請求項２８】
前記傾斜速度が、少なくとも３００℃／秒である、請求項２７に記載のデバイス。
【請求項２９】
前記傾斜速度が、少なくとも４００℃／秒である、請求項２８に記載のデバイス。
【請求項３０】
前記加熱手段が高温の水槽であり、前記冷却手段が低温の水槽である、請求項２６に記
載のデバイス。
【請求項３１】
前記デバイスが、マイクロ流体システムである、請求項２６に記載のデバイス。
【請求項３２】
前記サンプル容器が、
標的核酸と、
ｄＮＴＰと、
少なくとも０．５μＭの濃度で提供されるポリメラーゼと、
少なくとも２μＭの濃度でそれぞれ提供される、前記標的核酸を増幅するように構成さ
れた一対のプライマーと
を含む、請求項２６に記載のデバイス。
【請求項３３】
標的核酸に対してＰＣＲを行うためのキットであって、
ｄＮＴＰと、
少なくとも０．５μＭの濃度で提供されるポリメラーゼと、
少なくとも２μＭの濃度でそれぞれ提供される、前記標的核酸を増幅するように構成さ
れた一対のプライマーと
を含むキット。
【請求項３４】
温度サイクリングプロファイルを使用してＰＣＲを行うための説明書をさらに含み、各
サイクルが１サイクルあたり２０秒未満のサイクル時間で完了する、請求項３３に記載の
キット。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、分子生物学において広く使用されている技術であ
る。その名称は、その主要な構成要素の１つである、インビトロでの酵素的複製によって
ＤＮＡ断片を増幅するのに使用されるＤＮＡポリメラーゼに由来する。ＰＣＲが進行する
につれて、生成したＤＮＡ（アンプリコン）はそれ自身、複製のためのテンプレートとし
て使用される。それにより連鎖反応が始まり、ＤＮＡテンプレートが指数関数的に増幅す
る。ＰＣＲを用いれば、ＤＮＡ断片の単一のコピーまたは少数のコピーを数桁を越えて増
幅して、数百万またはそれより多くのＤＮＡ断片のコピーを生成することが可能になる。
ＰＣＲは、熱安定性ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、および一対のプライマーを用いる。
【０００２】
ＰＣＲは概念的には３つの反応に分けられ、各反応は通常、それぞれ３つの温度で所定
期間起こると考えられる。このようなＰＣＲの「平衡パラダイム」は、サイクルごとに３
つの温度で３つの期間にわたり起こる３つの反応（変性、アニーリング、および伸長）に
よって容易に理解される。しかし、この平衡パラダイムは、物理学的な実態とはあまりよ
く合致しない。即時の温度変化が起こらない、すなわちサンプルの温度を変化させるには
時間がかかる。さらに、個々の反応速度が温度に応じて変動し、一度プライマーのアニー
リングが起これば、それに続いてポリメラーゼ伸長が即座に起こる。特に迅速ＰＣＲ（ｒ
ａｐｉｄ  ＰＣＲ）の場合、反応速度と温度が常に変化するという動力学的パラダイムが
より正確である。生成物が変性しプライマーがアニールしさえすれば、ＰＣＲ中に温度を
一定に保つことは必ずしも必要ではない。ＰＣＲの動力学的パラダイムのもとでは、生成
物の変性、プライマーのアニーリング、およびポリメラーゼ伸長は、一時的に重複し、そ
れらの速度は温度に応じて連続的に変動する場合がある。平衡パラダイムのもとでは、サ
イクルは、それぞれ所定期間保持される３つの温度によって定義されるが、それに対して
動力学的パラダイムは、遷移速度と標的温度を必要とする。図１５ａ〜１５ｂに、平衡パ
ラダイムと動力学的パラダイムの例示的な時間／温度プロファイルを示す。しかし、これ
らの温度プロファイルは単に例示的なものであって、いくつかのＰＣＲの実行においては
、必要な温度が２つだけになるようにアニーリング工程と伸長工程とが一緒になっている
ことが理解される。
【０００３】
パラダイムが正しいか間違っているかということではなく、これらは有用性の点で異な
っている。平衡パラダイムは理解が簡単であり、工学的な見方および機器製造に向いてい
る。動力学的パラダイムは、生化学、迅速サイクルＰＣＲ、および融解曲線分析により大
きく関連する。
【０００４】
１９８０年代後半にＰＣＲが最初に広まったとき、そのプロセスは遅かった。典型的な
プロトコールは、変性は９４℃で１分、アニーリングは５５℃で２分、および伸長は７２
℃で３分であった。温度間の遷移時間が含まれる場合、８分のサイクルが典型的であり、
その結果、３０サイクルが完了するのに４時間を要した。サイクル時間の２５パーセント
が温度遷移に費やされていた。サイクル速度が増加するにつれて、温度遷移に費やされる
時間の比率も増加することから、動力学的パラダイムがますます重要となっていった。迅
速サイクルＰＣＲ中、通常、温度は変化している。短い生成物（＜１００ｂｐ）の迅速サ
イクルＰＣＲの場合、時間の１００％が温度遷移に費やされる場合があり、保持時間は必
要ではない。より長い生成物の迅速サイクルＰＣＲの場合、温度を最適な伸長温度で保持
することを含む場合がある。
【０００５】
用語「迅速ＰＣＲ」は、相対的な場合と曖昧な場合のそれぞれの意味がある。１時間の
ＰＣＲは、４時間と比べれば迅速であるが、１５分と比べると遅い。さらに、より高いテ
ンプレート濃度で開始したり、またはより少ないサイクルを使用したりすれば、ＰＣＲプ
ロトコールをより短くできる。より具体的な尺度は、各サイクルに必要な時間である。し
たがって、１９９４年に、「迅速サイクルＰＣＲ」（または「迅速サイクリング」）は、
１０〜３０分で完了する３０サイクルと定義され（１）、この場合、それぞれのサイクル
は２０〜６０秒になる。これらの各段階間で温度に傾斜をつけるのに時間を要するため、
この各サイクルの実際の時間は、多くの場合、変性、アニーリング、および伸長に関して
プログラムされた時間の合計よりも長い。１９９０年代初頭における初期の研究で、温度
制御にキャピラリーチューブと熱風を使用した迅速サイクリングの実行可能性が確立され
た。長年かけて、システムはより速くなり、変性、アニーリング、および伸長の動力学的
な必要条件がより明確になってきた。
【０００６】
初期の迅速システムの１つにおいて、チャンバー内には、ヘアドライヤーからの加熱要
素およびファン、熱電対、ならびにキャピラリーチューブ中のＰＣＲサンプルが同梱され
ていた（２）。ファンは、熱電対およびキャピラリーを通過する加熱空気の迅速フローを
生じさせた。熱電対の熱的応答をサンプルと合致させることにより、温度が変化している
間でさえも熱電対の温度を厳密にサンプルの温度に合わせて変化させた。空気の熱伝導率
は低いが、キャピラリーによって晒された大きい表面積に対して空気を迅速に移動させる
ことは、変性、アニーリング、および伸長温度間でサンプルをサイクリングさせるのに十
分であった。電子制御器により温度をモニターし、加熱要素への出力を調節することによ
り求められるタイミングとサイクル数が達成された。冷却するために、制御器によりソレ
ノイドを活性化することにより、入口を外気に向かって開いて、別の方法で閉じたチャン
バーに冷却空気を導入した。
【０００７】
キャピラリー／空気システムを使用すれば、温度を迅速に変化させることができる。低
熱質量チャンバー、循環空気、およびガラスキャピラリー中のサンプルを使用して、わず
か１０分のＰＣＲ（各２０秒の３０サイクル）の後に、５００ｂｐより大きいＰＣＲ生成
物をエチジウムブロマイドで染色したゲルで可視化した（３）。生成物の収量は、伸長時
間とポリメラーゼ濃度の影響を受けた。３０秒サイクル時間（伸長は、７０℃から８０℃
の間で約１０秒）の場合、ポリメラーゼ濃度を反応液１０μｌあたり０．１ユニットから
０．８ユニットに増加させるにつれてバンドの強度も増加した。ポリメラーゼのユニット
の定義は紛らわしいことがあることが知られている。天然型Ｔａｑポリメラーゼの場合、
０．４Ｕ／１０μｌは、典型的な迅速サイクリング条件下では約１．５ｎＭである（５０
）。
【０００８】
迅速プロトコールで使用される変性温度およびアニーリング温度における保持時間は、
瞬時または「０」秒である。すなわち、温度−時間プロファイルは、変性およびアニーリ
ングの際の温度の急激な上昇は示すが最高温度および最低温度の保持は示さない。変性お
よびアニーリングは、極めて急速に起こる場合がある。
【０００９】
迅速かつ正確な温度制御は、ＰＣＲに必要な温度および時間の分析的研究を可能にする
。例示的なヒトゲノムＤＮＡの５３６ｂｐのフラグメント（β−グロビン）の場合、９１
℃から９７℃の間の変性温度が、１秒未満から１６秒までの変性時間と同等に有効であっ
た。しかし、実際には１６秒よりも長い変性時間は生成物の収量を減少させることが見出
された。プライマーのアニーリングにかかる時間が制限される限りは、５０〜６０℃のア
ニーリング温度で特異的生成物が優れた収量で得られた。すなわち、変性からアニーリン
グへの迅速な冷却と１秒未満のアニーリング時間によって最良の特異性が得られた。７５
〜７９℃の伸長温度で収量は最大になり、最大約４０秒の伸長時間で増加した。
【００１０】
この初期の研究の結論は以下の通りである。１）ＰＣＲ生成物の変性は極めて迅速であ
るため、変性温度を保持する必要はない、２）プライマーのアニーリングは極めて急速に
起こる場合があるため、アニーリング温度の保持は必要ではない場合がある、および３）
必要な伸長時間は、ＰＣＲ生成物の長さとポリメラーゼ濃度によって決まる。また迅速サ
イクルＰＣＲは、温度を正確に制御しさえすれば、より速いだけでなく、特異性および収
量に関してもより優れている（４、５）。ＰＣＲの速度は、利用され得る生化学によって
制限されないが、サンプルの温度を厳密にまたは迅速に制御しない機器によっては制限さ
れる。
【００１１】
しかし、現行の実験室用ＰＣＲ機器の多くは、瞬時の変性時間およびアニーリング時間
に関する性能はあまり高くなく、多くは「０」秒の保持期間のプログラミングすら不可能
である。コニカルチューブの壁を介して熱が移動することによる時間遅延、低い表面積対
体積の比率、および大きいサンプルの加熱のために、ほとんどの機器は、サンプルが確実
に望ましい温度に達するようにするために変性時間およびアニーリング時間の延長に頼ら
ざるを得ない。これらの時間遅延により、時間経過に対する正確な温度が不確定になる。
その結果、市販品における再現性は悪く、市販品間でのばらつきが大きい（６）。多くの
機器は、温度遷移中に著しい温度の変動を示す（７、８）。温度のアンダーシュートおよ
び／またはオーバーシュートは、試みられたサンプル体積に依存するソフトウェアでの予
測ではほとんど解決しない慢性的な問題である。このような難点は、経時的に変化する場
合がある機器の熱的性質によってさらに悪化する。
【００１２】
時間が経って、「薄壁」管における漸進的な改善、サンプル間のより高い伝導熱分布、
低熱質量のブロック、および他の「速い」改変により、従来のヒートブロック機器はより
速くなりつつある。それにもかかわらず、これらのシステムにとって、６０秒未満でサイ
クルを完了させる程度に迅速にサイクリングすることはめったにない。ほんの少数のヒー
トブロックシステムが６０秒未満のサイクルを達成できるが、通常は制限された温度範囲
での２温度サイクリングに限定される。サンプル容器を平板化すれば、抵抗加熱と空気冷
却によって（９）、または一定温度に維持された加熱ゾーン間をフレキシブルなチューブ
でサンプルを移動させることによって迅速サイクリングを達成できる（米国特許第６，７
０６，６１７号）。
【００１３】
ＰＣＲ用の空気／キャピラリーシステムの商業用バージョンは１９９１年から利用でき
（１）、リアルタイムＰＣＲ用のものは１９９６年から利用できるようになった（１０、
１１）。他の機器の迅速サイクリング性能は、初めて２０〜６０秒のサイクルを実証した
空気／キャピラリーの標準品と比較されることが多い。不思議なことに、長年にわたりキ
ャピラリー／空気システムをより遅く運用する傾向があるが、おそらくこれは、多くの使
用者による「０」秒の変性時間およびアニーリング時間への不信感を反映しているのであ
ろう。また熱で活性化される酵素は長い活性化期間も必要とすることから、「速い」活性
化酵素が使用されたとしても運転時間も二倍になることが多い。迅速サイクリングからの
別の妥協点は、プラスチックキャピラリーの使用である。これらのキャピラリーは機器と
熱的に適合していないため、標的温度に達するまで変性およびアニーリング時の２０秒の
保持が必要になることが多い（１２）。
【００１４】
マイクロシステムにおいて、ＰＣＲのサイクル時間をさらに減少させるいくつかの進歩
が起こっており、この場合、処理される体積は当然ながら小さい（１３、１４）。しかし
、高い表面積対体積比を有するサンプルチャンバーを用いたとしても、加熱要素が高い熱
質量を有し、チャンバーの外部にある場合、サイクルは長くなる場合がある（１５）。サ
ンプル近傍で薄膜の抵抗加熱器と温度センサーを用いることにより、１０〜３０分の増幅
が達成できる（１６、１７）。
【００１５】
低熱質量システムの冷却は、通常、受動的な熱拡散および／または強制空気によってな
されるが、いくつかの興味深い加熱方法が開発されている。赤外線放射は、温度のモニタ
リングのための較正された赤外線高温測定（１９）を用いて加熱に使用できる（１８）。
あるいは、ガラスキャピラリー上の薄い金属膜が、迅速サイクリングのための抵抗加熱要
素と温度センサーの両方として役立つ場合がある（２０）。最後に、電解質の抵抗による
ＰＣＲ溶液の直接のジュール加熱と温度モニタリングが考えられ、キャピラリーで実施も
されている（２１）。上記の方法はいずれも、固定されたサンプルに熱を移動させたり、
固定されたサンプルから熱を移動させたりするものである。
【００１６】
静止サンプルへの熱伝達、および静止サンプルからの熱伝達の代わりに、異なる温度の
槽へ、または固定された温度ゾーンを有するチャネルを介してサンプルを物理的に移動さ
せてもよい。ＰＣＲの流体がチャネル内で変性温度、アニーリング温度、および伸長温度
で維持された様々なセグメントを通過するマイクロ流体工学的な方法が普及するようにな
ってきた。連続流型ＰＣＲは、３つの温度ゾーンを行き来する蛇行チャネル内（２２）で
、さらに半径が徐々に増加または減少する３つの温度セクターを通過するループ内で実証
されている（２３）。蛇行レイアウトを有する改変型は、ＰＣＲの動力学的パラダイムに
より厳密に適合させるために、等温ゾーンの代わりに固定された熱勾配を使用している（
２４）。ＰＣＲに必要なマイクロチャネルの長さを制限するために、いくつかのシステム
は、二方向性の圧力駆動のフロー（２５）、空気力学（２６）、または動電学的な力（２
７）によって温度ゾーン間で前後にサンプルを往復させる。直線的なサンプル往復の代わ
りに、単一の円形のチャネルを、強磁性流体として（２８）、または対流によって（２９
）駆動するサンプルの動きと共に使用できる。連続流方式を包含するマイクロシステムＰ
ＣＲの考えられる利点の１つは、サイクル速度である。
【００１７】
いくつかのマイクロシステムはそれでもなお６０秒より長いサイクルを必要とするが、
多くは、迅速サイクルＰＣＲの２０〜６０秒のサイクル範囲で稼働する（１３、３０）。
赤外線加熱の場合、１６〜３７秒の範囲の最小のサイクル時間が報告されている（１８、
１９）。金属でコーティングされたキャピラリーは、４０秒のＰＣＲサイクルを達成して
おり（２０）、一方で直接の電解質加熱は、２１秒のサイクルで増幅した（２０）。閉ル
ープ対流型ＰＣＲの場合、２４〜４２秒の範囲の最小のサイクル時間が報告されている（
２９、３１）。いくつかのグループは、ＰＣＲサイクル時間を、１９９０年に最初に実証
された迅速サイクルＰＣＲの元の定義よりも速い２０秒未満に短くすることに注目してき
た。静止サンプルの薄膜抵抗加熱は、２５μｌのサンプルではサイクル時間を１７秒に短
くし（３２）、１００ｎｌのサンプルでは８．５秒に短くした（１７）。連続流システム
は、熱勾配ＰＣＲ（２４）とサンプル往復（２６）を用いて１２〜１４秒のサイクルを達
成したが、強磁性流体ループにより９秒のサイクルでのＰＣＲが成功したことが主張され
ている（２８）。ガラス基板およびプラスチック基板による連続流システムは、様々なサ
イズのＰＣＲ生成物で６．９秒（２２）および５．２秒（２３）のサイクル時間を達成し
ている。アルミニウム基板を介した交互の熱水および冷水の伝導により、油の下で１μｌ
の液滴を５．２５秒のサイクルで増幅した（３３）。同様に、多孔質の銅ブロックを介し
た水の伝導により、５μｌのサンプルを４．６秒のサイクルで増幅した（３４）。蒸気圧
によって増大した１μｌの反応プラグの連続流デバイスは、３秒のサイクルを達成した（
３５）。加えて、ペルチエ素子の間に挟まれたガリウムにキャピラリーを浸漬することに
よって、キャピラリー中で大腸菌のＳｔｘバクテリオファージの８５ｂｐのフラグメント
を２．７秒のサイクルで増幅することを主張する報告がなされている（３６）。あるいは
、加圧した熱いガスおよび冷たいガスでサイクリングしたキャピラリーでのＰＣＲ増幅に
より、２．６秒のサイクルが達成された（４８）。
【００１８】
表１に、最初に「迅速ＰＣＲ」を定義した２０秒のサイクルより短い時間にＰＣＲサイ
クル時間を最小化するための研究を要約する。過去２０年にわたり、サイクル速度をさら
に向上させた新しいプロトタイプ機器が開発されてきた。しかし、実用的なＰＣＲ性能（
効率および収量）が不十分であることが多い。一般的な原則として、サイクルが短くなれ
ばなるほど、ＰＣＲの成功に求められることは、より高い開始濃度で使用される標的（細
菌、ファージ、多コピープラスミド、またはさらにはＰＣＲ生成物）の複雑度がどれだけ
低いかに関わってくる（例えば、初発サンプルとして５ｎｇのアンプリコンが使用された
米国特許第６，２１０，８８２号を参照）。実際に、表１で列挙した研究のうち、２０秒
未満のサイクルで例えばヒトＤＮＡなどの複雑な真核ＤＮＡを使用したものは皆無である
。成功が求められる前にほとんど増幅しなくてもいいように、初発のテンプレート分子の
コピー数が極めて高いことが多い（例えば、１μｌあたり１８０，０００，０００のλフ
ァージのコピー）。さらに、多くの研究において、特に高いテンプレート濃度を用いた環
境での肯定的な結果の有効性に関して、テンプレート非含有対照がないことが疑問視され
ることもない。ある機器に注目した報告は、熱的サイクリングデバイスの設計およびモデ
リングについて広範に調べており、最後の短時間ＰＣＲの実証では、高濃度の複雑度が低
い標的を使用している。ＰＣＲサンプル非存在下でのモデリングおよび測定に基づいて、
加熱速度および冷却速度（最大１７５℃／秒）が報告されている（１７）。
【表１】
2020115878.tif 000002
【００１９】
サイクル時間を短くする方法の１つは、温度サイクリングの必要条件を簡易化するため
にＰＣＲプロトコールにバリエーションを導入することである。より長いプライマーはよ
り高いＴｍを有するため、アニーリング温度が高くなる場合がある。生成物の長さとその
Ｔｍを制限することによって、生成物のＴｍをわずかに超えた温度まで変性温度を低くで
きる。より高いアニーリング温度とより低い変性温度とを組み合わせることにより、増幅
の成功に必要な温度範囲を減少させる。また３工程サイクリング（変性、アニーリング、
および伸長）を２工程（変性および併合されたアニール／伸長工程）に減らすことも、温
度サイクリングの必要条件を簡易化する。温度範囲の減少と２工程サイクリングはいずれ
も、表１に記載された２０秒未満のサイクル時間を用いた研究において典型的である。し
かし、併合されたアニール／伸長工程が、７０℃よりも低い温度から、ポリメラーゼが最
も活性化する最適な８０℃までの温度で行われる場合、２工程サイクリングはポリメラー
ゼ伸長速度を遅くする場合がある。ポリメラーゼ伸長速度は、約７０〜８０℃までの温度
では対数線形を示し、６０〜１２０ｂｐ／秒の最大値が報告されている（５０）。
【００２０】
プロトコールのバリエーションを用いたとしても、サイクル時間が２０秒未満である場
合、対照反応と比較して、増幅効率および収量は不十分であることが多い（２２、２３）
。これらのより速いＰＣＲに向けられた努力は工学面に偏りすぎているようであり、生化
学面はほとんど注目されていない。サイクル時間が２０秒から２秒に短くなるにつれて、
ＰＣＲ収量は減少し、最終的には収量ゼロになるが、これは、単純な標的を高コピー数で
用いた場合でさえもロバスト性が欠如することを反映している。
【００２１】
表１で開示された様々な参考文献に記載の機器は、反応条件が合えば極めて速いＰＣＲ
に適している場合がある。本明細書において開示されたように、プライマー、ポリメラー
ゼ、およびＭｇ＋＋の濃度を高めることに注目することにより、反応ロバスト性と収量を
保持しつつ「エクストリームＰＣＲ（ｅｘｔｒｅｍｅ  ＰＣＲ）」（２０秒未満のサイク
ル（１０分未満で３０サイクル）のＰＣＲ）が実現化される。
【発明の概要】
【００２２】
本発明の一態様において、増幅中の生体サンプル中の標的核酸配列を増幅する方法が提
供され、本方法は、熱安定性ポリメラーゼおよび標的核酸配列を増幅するように構成され
たプライマーを生体サンプルに添加する工程であって、該ポリメラーゼが少なくとも０．
５μＭの濃度で提供され、該プライマーがそれぞれ、少なくとも２μＭの濃度で提供され
る工程と、エクストリーム温度サイクリングプロファイルを使用して、複数の増幅サイク
ルにわたり少なくとも変性温度と伸長温度との間で生体サンプルを熱的にサイクリングす
ることによるポリメラーゼ連鎖反応によって、標的核酸配列を増幅する工程であって、各
サイクルが１サイクルあたり２０秒未満で完了する工程とを含む。
【００２３】
本発明の他の態様において、増幅中の生体サンプル中の標的核酸配列を増幅する方法が
提供され、該方法は、熱安定性ポリメラーゼおよび標的核酸配列を増幅するように構成さ
れたプライマーを生体サンプルに添加する工程であって、該ポリメラーゼとプライマーの
比率は、（約０．０３〜約０．４のポリメラーゼ）：（プライマーの総濃度）であり、該
ポリメラーゼの濃度が少なくとも０．５μＭである工程と、エクストリーム温度サイクリ
ングプロファイルを使用して、複数の増幅サイクルにわたり少なくとも変性温度と伸長温
度との間で生体サンプルを熱的にサイクリングすることによるポリメラーゼ連鎖反応によ
って、標的核酸配列を増幅する工程であって、各サイクルが２０秒未満で完了する工程と
を含む。
【００２４】
本発明のさらに他の態様において、ＰＣＲを行うためのデバイスが提供され、該デバイ
スは、ＰＣＲサンプルを保持するためのサンプル容器と、サンプルを加熱する手段と、サ
ンプルを冷却する手段と、サンプルを加熱する手段およびサンプルを冷却する手段にサン
プル容器を繰り返し晒して、サンプルを少なくとも２００℃／秒の傾斜速度で熱的にサイ
クリングするための制御手段とを含む。
【００２５】
さらなる一実施形態において、標的核酸でＰＣＲを行うためのキットが提供され、該キ
ットは、ｄＮＴＰと、少なくとも０．５μＭの濃度で提供されるポリメラーゼと、少なく
とも２μＭの濃度でそれぞれ提供される、標的核酸を増幅するように構成された一対のプ
ライマーとを含む。
【００２６】
以下に記載された、現在認識される本発明を実行するにあたり最良の形態を例示した好
ましい実施形態の詳細な説明を考察すれば、本発明の追加の特徴が当業者に明らかになる
であろう。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１ａ】エクストリームＰＣＲを行うための略図である。
【図１ｂ】水槽中の１つのサンプルチューブをモニタリングするためのリアルタイム機能を有するエクストリームＰＣＲを行うための例示的なデバイスを示す図である。
【図１ｃ】３温度サイクリングを用いた例示的なエクストリームＰＣＲを行うためのデバイスを示す図である。
【図１ｄ】温度参照キャピラリーを共に示した図１ｂにおけるデバイスの光学素子の拡大図である。
【図２ａ】図１ｂのサンプルホルダーの位置（点線）にサンプル温度（直線）を重ね合わせたグラフである。
【図２ｂ】図１ｂに示したデバイスを使用したエクストリームＰＣＲの温度を示したグラフである。
【図２ｃ】図２ｂとの比較のために示された回転式のＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒを使用した迅速サイクルＰＣＲの温度を示したグラフである。
【図３ａ】図２ｂの温度プロファイルを使用して増幅した、エクストリームＰＣＲ生成物（点線）および迅速サイクルＰＣＲ生成物（二点鎖線）の微分融解曲線をエクストリームサイクリングの陰性対照（直線）および迅速サイクリングの陰性対照（一点鎖線）と共に示すグラフである。
【図３ｂ】図３ａの同じサンプルの２％ＳｅａＫｅｍ  ＬＥアガロースゲルの写真であり、レーン１および８はサイズマーカーであり、レーン２および３は３０秒のエクストリームＰＣＲの結果得られた生成物であり、レーン４は３０秒のエクストリームＰＣＲのテンプレート非含有対照であり、レーン５および６は１２分のＰＣＲの結果得られた生成物であり、レーン７は１２分のＰＣＲのテンプレート非含有対照である。
【図３ｃ】図３ａおよび３ｂで示されたのと同じ生成物を増幅したエクストリームＰＣＲの温度の軌跡（点線）を、同じ反応のリアルタイムモニタリング（直線）と共に示すグラフである。
【図４ａ】温度制御により伸長速度を増加させたエクストリームＰＣＲの温度の軌跡を示すグラフである。
【図４ｂ】図１ｂのサンプルホルダーの位置（直線）にサンプル温度（点線）を重ね合わせた、図４ａの部分拡大図である。
【図４ｃ】ＩＲＬ１０ＲＢの５８ｂｐのアンプリコンの負の微分融解曲線（−ｄＦ／ｄＴ）を示すグラフであり、ＡＡ（直線）、ＡＧ（一点鎖線）、およびＧＧ（点線）の遺伝子型が示される。
【図５ａ】エクストリームＰＣＲを使用して、ポリメラーゼ濃度対プライマー濃度対ＰＣＲ生成物濃度をプロットした３次元グラフである。
【図５ｂ】図５ａで使用されたエクストリームＰＣＲの温度の軌跡を示すグラフである。
【図５ｃ】図５ａからの４μＭのＫｌｅｎｔａｑポリメラーゼ（ＫＴ  ＰＯＬ）生成物の負の微分融解曲線を示すグラフである。
【図５ｄ】図５ａに基づき１０μＭのプライマー濃度で様々なポリメラーゼ濃度を使用したエクストリームＰＣＲの結果を示すアガロースゲルの写真である。
【図６ａ】１９ゲージのステンレス鋼チューブ中で行われたエクストリームＰＣＲの温度の軌跡を示すグラフである。
【図６ｂ】図６ａのエクストリーム温度サイクルによって生産されたＰＣＲ生成物のゲルの写真である。
【図７ａ】長い（１秒の）併合されたアニール／伸長工程を用いたエクストリームＰＣＲの温度の軌跡を示すグラフである。
【図７ｂ】１０２ｂｐの生成物にエクストリームＰＣＲを使用して、ポリメラーゼ濃度対プライマー濃度対ＰＣＲ生成物濃度をプロットした３次元グラフである。
【図８ａ】１秒の併合されたアニール／伸長工程を使用して２２６ｂｐの生成物を増幅するのに使用されるエクストリームＰＣＲの温度プロファイルを示すグラフである。
【図８ｂ】４秒の併合されたアニール／伸長工程を使用して４２８ｂｐの生成物を増幅するのに使用されるエクストリームＰＣＲの温度プロファイルを示すグラフである。
【図８ｃ】図８ａから得られたリアルタイムの結果と、２秒のアニール／伸長工程を使用した類似の温度の軌跡を示すグラフであり、それぞれテンプレート非含有対照を包含する。
【図８ｄ】図８ｂから得られたリアルタイムの結果と、５秒のアニール／伸長工程を使用した類似の温度の軌跡を示すグラフであり、それぞれテンプレート非含有対照を包含する。
【図９ａ】異なる開始濃度でのＫＣＮＥ１の４５ｂｐのフラグメントの増幅曲線を示すグラフである。
【図９ｂ】図９ａからのデータのＣｑ対ｌｏｇ１０（最初のテンプレートのコピー数）のプロットである。反応は５連で行われた。
【図９ｃ−９ｄ】ＮＱＯ１の１０２ｂｐのフラグメントの増幅が示されていることを除いては図９ａ〜９ｂと同様のグラフである。
【図１０ａ】３００ｂｐの生成物にエクストリームＰＣＲを使用して（２０サイクル、１サイクルあたり４．９秒）、ポリメラーゼ濃度対プライマー濃度対ＰＣＲ生成物濃度をプロットした３次元グラフである。
【図１０ｂ】ＫＡＰＡ２Ｇ  ＦＡＳＴポリメラーゼおよび１〜５秒の伸長時間を使用した５００ｂｐの合成テンプレートのＰＣＲ増幅に関する蛍光対サイクル数のプロットである。
【図１０ｃ】数種のＫｌｅｎＴａｑポリメラーゼ濃度およびＫＡＰＡ２Ｇ  ＦＡＳＴポリメラーゼに関する伸長した長さ対最小の伸長時間のプロットである。
【図１１ａ】１００ｂｐのサイズを有する生成物のＰＣＲ増幅に関する蛍光対サイクル数のプロットである。
【図１１ｂ】２００ｂｐのサイズを有する生成物のＰＣＲ増幅に関する蛍光対サイクル数のプロットである。
【図１１ｃ】３００ｂｐのサイズを有する生成物のＰＣＲ増幅に関する蛍光対サイクル数のプロットである。
【図１１ｄ】４００ｂｐのサイズを有する生成物のＰＣＲ増幅に関する蛍光対サイクル数のプロットである。
【図１１ｅ】５００ｂｐのサイズを有する生成物のＰＣＲ増幅に関する蛍光対サイクル数のプロットである。
【図１２ａ】様々なマグネシウム濃度を使用したエクストリームＰＣＲの３５サイクル後における、ＡＫＡＰ１０の６０ｂｐのフラグメントの負の微分融解曲線を示すグラフである。
【図１２ｂ】図１２ａの負の微分融解曲線で示されたＰＣＲ生成物のゲルの写真である。
【図１３ａ】５ｍＭのＭｇ＋＋と共に様々なサイクル時間を使用した３５サイクル後における、ＡＫＡＰ１０の６０ｂｐのフラグメントの負の微分融解曲線を示すグラフである。サイクル時間は、０．３２秒（直線）、０．４２秒（二点鎖線）、０．５２秒（一点鎖線）、および０．６２秒（点線）であった。サイクル時間には、６０°の槽中での０．１〜０．４秒の保持時間が包含される。
【図１３ｂ】図１３ａの負の微分融解曲線で示されたＰＣＲ生成物のゲルの写真である。
【図１４ａ】３種の異なる機器：（１）エクストリームＰＣＲ、（２）ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）、および（３）ＣＦＸ９６（ＢｉｏＲａｄ）で増幅した場合の、ＡＫＡＰ１０の６０ｂｐのフラグメントの負の微分融解曲線を示すグラフである。
【図１４ｂ】図１４ａの負の微分融解曲線で示されたＰＣＲ生成物のゲルの写真である。
【図１５ａ−１５ｂ】ＰＣＲの平衡パラダイム（図１５ａ）および動力学的パラダイム（図１５ｂ）に関する例示的なプロファイルを示すグラフである。黒く塗り潰された部分は、熱的サイクリング中の核酸の変性を示し、斜線部分はアニーリングを示し、白一色の部分は伸長を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本明細書で使用される場合、用語「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、１つまたは
複数を意味し、状況が不適切でない限り複数形を包含するものと定義される。範囲は、本
明細書では、「およその」１つの特定の値から、および／または「およその」別の特定の
値までと表される場合がある。用語「約」は、本明細書では、およそ、ほぼ、だいたい、
または概ねを意味するものとして使用される。用語「約」が数値範囲と共に使用される場
合、「約」は、明示された数値よりも上および下に境界を広げることによりその範囲を修
正する。一般的に、用語「約」は、本明細書では、述べられている値よりも５％の偏差で
上および下に数値を修正するために使用される。このような範囲が示される場合、他の実
施形態は、１つの特定の値から、および／または他の特定の値までを包含する。同様に、
接頭語「約」の使用によって値が近似値として示される場合、特定の値により他の実施形
態が形成されるものと理解されよう。さらに、それぞれの範囲の端点は、他方の端点と関
連して、かつ他方の端点とは独立してどちらも有意であることが理解されよう。
【００２９】
単語「または」は、本明細書で使用される場合、具体的に列挙されたもののうちいずれ
か１つのものを意味し、さらにその列挙されたもののいずれかの組み合わせも包含する。
【００３０】
「サンプル」は、動物；動物からの組織または臓器；細胞（対象内の細胞、対象から直
接採取した細胞、または培養物中で維持された細胞もしくは培養細胞株からの細胞のいず
れか）；細胞溶解産物（または溶解産物画分）または細胞抽出物；細胞、細胞材料、また
はウイルス材料から誘導された１種または複数の分子（例えばポリペプチドまたは核酸）
を含有する溶液；または本明細書で説明されているようなアッセイされる天然に存在する
核酸もしくは天然に存在しない核酸を含有する溶液を意味する。またサンプルは、細胞、
細胞成分、または核酸を含有する任意の体液または排出物（例えば、これらに限定されな
いが、血液、尿、便、唾液、涙、胆汁など）であってもよい。
【００３１】
語句「核酸」は、本明細書で使用される場合、天然に存在する、または合成のオリゴヌ
クレオチドもしくはポリヌクレオチドを指し、これらは、ＤＮＡまたはＲＮＡまたはＤＮ
Ａ−ＲＮＡハイブリッド、一本鎖または二本鎖、センスまたはアンチセンスかどうかにか
かわらず、ワトソン−クリック塩基対形成によって相補的核酸にハイブリダイズ可能なも
のである。また本発明の核酸は、ヌクレオチド類似体（例えば、ＢｒｄＵ、ｄＵＴＰ、７
−デアザ−ｄＧＴＰ）、およびヌクレオシド間の非ホスホジエステル結合（例えば、ペプ
チド核酸（ＰＮＡ）またはチオジエステル結合）を包含していてもよい。特に、核酸とし
ては、これらに限定されないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｇＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｄ
ｓＤＮＡ、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【００３２】
「プローブ」、「プライマー」、または「オリゴヌクレオチド」は、相補配列を含有す
る第二のＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子（「標的」）と塩基対を形成できる限定された配列
の一本鎖のＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子を意味する。その結果得られたハイブリッドの安
定性は、長さ、ＧＣ含量、最隣接のスタッキングエネルギー、および発生する塩基対形成
の程度によって決まる。塩基対形成の程度は、例えばプローブと標的分子との相補性の程
度などのパラメーター、およびハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーの程度
の影響を受ける。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーの程度は、例えば温度、
塩濃度、および例えばホルムアミドなどの有機分子の濃度といったパラメーターの影響を
受け、当業者に公知の方法によって決定される。プローブ、プライマー、およびオリゴヌ
クレオチドは、当業者に周知の方法で、放射性標識、蛍光標識、または非放射性標識のい
ずれかによって検出できるように標識されていてもよい。ｄｓＤＮＡ結合色素（二本鎖Ｄ
ＮＡに結合すると、一本鎖ＤＮＡに結合するかまたは溶液中で遊離状態である場合よりも
強い蛍光を発する色素）を使用して、ｄｓＤＮＡを検出することができる。「プライマー
」は、ポリメラーゼによって伸長するように特異的に構成されるが、それに対して「プロ
ーブ」または「オリゴヌクレオチド」は、そのように構成されていてもよいし、または構
成されなくてもよいことが理解されている。
【００３３】
「特異的にハイブリダイズする」は、プローブ、プライマー、またはオリゴヌクレオチ
ドが、高いストリンジェンシー条件下で実質的に相補的な核酸（例えばサンプル核酸）を
認識し物理的に相互作用して（すなわち塩基対を形成して）、他の核酸とは実質的に塩基
対を形成しないことを意味する。
【００３４】
「高いストリンジェンシー条件」は、６５℃の温度で、０．５ＭのＮａＨＰＯ４、ｐＨ
７．２、７％ＳＤＳ、１ｍＭのＥＤＴＡ、および１％ＢＳＡ（Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｖ）を
含有する緩衝液中で、または４２℃の温度で、４８％ホルムアミド、４．８×ＳＳＣ、０
．２Ｍのトリス−Ｃｌ、ｐＨ７．６、１×デンハルト溶液、１０％硫酸デキストラン、お
よび０．１％ＳＤＳを含有する緩衝液中で、長さが少なくとも４０ヌクレオチドのＤＮＡ
プローブを使用した結果起こるハイブリダイゼーションと同等のハイブリダイゼーション
が起こる条件を意味する。例えばＰＣＲ、ノーザン、サザン、またはインサイチュハイブ
リダイゼーション、ＤＮＡ配列決定などの高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーシ
ョンのための他の条件は、分子生物学分野の当業者にとって周知である（４７）。
【００３５】
例示的な実施形態において、２０秒未満のサイクル時間を用いたＰＣＲ、いくつかの実
施形態では１０秒未満、５秒未満、２秒未満、１秒未満、および０．５秒未満のサイクル
時間を使用したＰＣＲのための方法およびキットが提供される。これらのサイクル時間を
用いれば、３０サイクルのＰＣＲは、それぞれ１０分未満、５分未満、２．５分未満、１
分未満、３０秒未満、および１５秒未満で完了する。ＰＣＲ速度が速くなればなるほど、
プライマー濃度とポリメラーゼ濃度とが増加することによりＰＣＲ効率および収量が維持
される。
【００３６】
ＰＣＲの３要素反応（プライマーのアニーリング、ポリメラーゼ伸長、およびテンプレ
ート変性）のどれが不十分になっても、ＰＣＲの効率および収量が制限される場合がある
。例えば、プライマーがテンプレートの９５％にしかアニールしない場合、たとえそのテ
ンプレートの１００％が変性してプライマーが結合したテンプレートの１００％が伸長し
て全長生成物になったとしても、ＰＣＲ効率が９５％よりも大きくなることはできない。
同様に、伸長効率がわずか９５％である場合も、可能な最大のＰＣＲ効率は９５％でしか
ない。ＰＣＲ生成物濃度をサイクルごとに２倍にするためには、全ての要素が、１００％
の達成率を得なければならない。以降の段落で、変性、アニーリング、および伸長を順次
考察する。
【００３７】
遅いＰＣＲ（６０秒未満のサイクル）、迅速ＰＣＲ（２０〜６０秒のサイクル）、およ
びエクストリームＰＣＲ（２０秒未満のサイクル）の温度サイクリングにおいて、ＰＣＲ
の失敗に関する一般的な原因は、不十分な変性である。目標は、各サイクルでの変性を完
全に行い、プライマーのアニーリングで定量的なテンプレートが利用できるようにするこ
とである。ＰＣＲ前の最初のテンプレートの変性、特にゲノムＤＮＡの変性は通常、ＰＣ
Ｒ中の増幅生成物の変性よりもより厳しい条件を必要とする。元の迅速サイクルＰＣＲの
最適化（４）は、テンプレートを沸騰させた後に行われているが、これは、最初のゲノム
ＤＮＡを確実に変性させる優れた方法である。不完全な最初の変性は、高いＴｍを有する
標的、特に高い安定性のフランキング領域を有する標的の場合に起こる場合がある（３７
）。そのために、特に、変性中のわずかな温度差がＰＣＲ効率に影響を与える場合、例え
ばゲノムの挿入または欠失に関して、定量的ＰＣＲの性能が損なわれる場合がある（３７
〜３９）。先に行われた沸騰または制限消化（３７）が望ましくなく、より高い変性温度
がポリメラーゼ性能を損なう場合、生成物のＴｍを下げるアジュバントを使用して変性を
補助してもよい。
【００３８】
変性のための初期設定の標的温度として９４℃が使用されることが多いが、それが最適
であることはめったにない。ＰＣＲ生成物は、主にＧＣ含量と長さに応じて４０℃より高
い温度範囲で融解する（４３）。ＰＣＲ生成物が、より低い変性温度が使用できるように
十分低い温度で融解する場合、低い変性標的温度は、速度の利点と特異性の利点の両方を
有する。変性温度が低ければ低いほど、サンプルはより速く変性温度に到達でき、より速
くＰＣＲを行うことができる。より高い変性温度で発生し得る生成物は二本鎖のままであ
り、プライマーのアニーリングに利用できないと予想されるため、これらの発生し得る全
ての生成物を排除することによりさらに特異性が高められる。高いＴｍの生成物を増幅す
るために、標的温度を９４℃より高くする必要がある場合がある。しかし、現行の熱安定
性ポリメラーゼのほとんどは９７℃より高温で変性し始め、ＰＣＲ溶液は標高に応じて９
５℃から１００℃の間で沸騰する場合があるため、温度を高める余地がさほどない。１価
の塩およびＭｇ＋＋濃度を低くすると、生成物のＴｍが下がる。同様に、ｄＵＴＰおよび
／または７−デアザ−ｄＧＴＰを取り込むことによっても生成物のＴｍは下がるが、ポリ
メラーゼ伸長速度を減少させる場合がある。ほとんどの独自のＰＣＲの「エンハンサー」
は、生成物のＴｍを下げて高いＴｍの生成物の変性（および増幅）を可能にする単純な有
機物質である。これらのなかでも最も一般的に普及しているものは、ＤＭＳＯ、ベタイン
、グリセロール、エチレングリコール、およびホルムアミドである。Ｔｍを下げることに
加えて、これらの添加剤のうちいくつかは、ＰＣＲ混合物の沸点も上昇させる（特に高い
標高で有用である）。エンハンサー濃度が増加するにつれ、生成物のＴｍは下がるが、ポ
リメラーゼ阻害が増加する場合がある。
【００３９】
しかし、エクストリームサイクリング条件下であっても変性が律速である必要はない。
なぜなら、温度が生成物のＴｍからわずかしか上回っていなくても、ＤＮＡの巻き戻しが
最初に極めて速く起こる（１０〜１００ミリ秒）ためである。変性は、増幅生成物のＴｍ
よりも測定が困難な２〜３℃高い温度で迅速に起こるが、アンプリコンの完全な変性はお
そらく０．１秒未満で起こる。複数のドメインで生成物が融解する場合、標的の変性温度
は、最も高い融解ドメインよりも２〜３℃高いと予想される。サンプルがこの温度に到達
する限りは、長い生成物であったとしても変性は極めて速い。キャピラリーおよび水槽を
使用すれば（４０）、２０ｋＢを超えるＰＣＲ生成物の完全な変性が１秒未満で起こる（
５２）。生成物のＴｍおよび融解ドメインは、例示的には、ＤＮＡ色素および高解像度融
解を用いて実験的に決定される（４１）。Ｔｍの推測はソフトウェアでの予測により達成
できるが（４２）、その精度は限定的である。さらに、観察されたＴｍは、例えば塩濃度
および任意の色素やアジュバントの存在などの局所的な反応条件に強く依存する。したが
って、観察されたＴｍは通常、より反応条件に適合されている。
【００４０】
効率への影響がなければ、変性への接近速度は、可能な限り速くてもよく、例えば図２
ａおよび図６ａで示されるように２００〜４００℃／秒であってもよい。これらの速度で
は、変性温度に到達するのに約０．１〜０．２秒しか要さない。しかし、標的温度に接近
するときのより遅い速度は、標的温度を上回る危険を減少させ、起こり得るポリメラーゼ
の不活性化または溶液の沸騰を回避する。より遅い接近温度を達成する例示的な方法の１
つは、標的温度よりも５〜１０℃高い温度の高温槽にサンプルを浸すことである。標的と
槽温度との温度差により指数関数的な接近曲線が定められ、差が小さくなるにつれてこの
接近曲線は自動的に遅くなる。温度を連続的にモニタリングすることによって、変性の目
標が達成されたら次の相（アニーリングまで冷却すること）が始動する。まとめると、Ｐ
ＣＲにおける完全な生成物の変性は、生成物の最も高い融解ドメイン温度よりも２〜３℃
高い温度で０．２秒未満を必要とし、可能な限り迅速に、例示的には４０〜４００℃／秒
で変性温度に接近し得る。変性は最初に起こるため、その速度は生成物の濃度にのみ依存
し、効率（または変性される生成物のパーセンテージ）は生成物の濃度とは無関係である
。
【００４１】
低品質のＰＣＲでは、不完全なかつ／または間違ったプライマーのアニーリングが生じ
る場合がある。全てのテンプレート部位にプライマーが結合しない場合に、効率が低くな
る。さらに、望ましくない部位でプライマー結合が起こる場合、別の生成物が生産される
場合がある。目標は、実質的に、各サイクルで望ましい部位でのみ完全なプライマーのア
ニーリングを達成し、ポリメラーゼ伸長のために定量的なプライマーが結合したテンプレ
ートを提供することである。
【００４２】
２０〜６０秒のサイクルを用いた迅速ＰＣＲプロトコールは、５００ｎＭのプライマー
のＴｍよりも５℃低い温度で１秒未満のアニーリング時間を提唱している（５２）。２０
秒未満のサイクルを試みた機器の場合のプライマー濃度は、それぞれ２００〜１，０００
ｎＭの範囲である（表１）。これらの濃度は、長いアニーリング時間が使用される従来の
ＰＣＲ（６０秒未満のサイクル）で使用される濃度に類似している。プライマー濃度を低
くすることは、特異性を向上させるために使用されることが多く、プライマー濃度を増加
させることは、非特異的増幅に関する懸念のために考慮されることはまれである。しかし
、迅速サイクリングを用いる場合、特異性の向上はより短いアニーリング時間に起因して
いる（５）。この傾向が継続すれば、エクストリームＰＣＲの極めて短いアニーリング時
間は、高いプライマー濃度を容認するものと想像できる。アニーリングを促進するために
、２０〜６０秒のサイクルの場合、プライマーのＴｍよりも５℃低いアニーリング温度が
推奨される。Ｔｍは、増幅で使用されるのと同じ緩衝液条件下で飽和させたＤＮＡ色素お
よびオリゴヌクレオチドを使用した融解分析によって最もよく実験的に測定される。プラ
イマーを、ダングリング末端（ｄａｎｇｌｉｎｇ  ｅｎｄ）として５’−伸長部分を有す
るその相補標的と組み合わせることにより、そのテンプレートにアニールしたプライマー
の安定性を最適に概算し、融解分析が行われる。
【００４３】
変性と対照的に、アニーリング効率はプライマー濃度に依存する。プライマーのアニー
リングは、極めて速いサイクル速度で制限的になる場合がある。プライマーのアニーリン
グは、２番目に起こる反応であり、プライマー濃度と標的濃度の両方に依存する。しかし
、多くのＰＣＲにおいて、プライマー濃度は標的濃度よりもかなり高く、実際的にはアニ
ーリングは擬似的に最初に起こり、プライマー濃度にのみ依存する。このケースにおいて
、プライマーが結合した生成物の比率（アニーリング効率）は、プライマー濃度にのみ依
存して生成物濃度には依存しないことから、より高いプライマー濃度は、より短いアニー
リング時間を可能にすると予想される。さらに、理論にとらわれずにいえば、その関係は
直線的であると考えられる。アニーリング時間がより短くなればなるほど、ＰＣＲの効率
および収量を維持するためにはプライマー濃度の増加が必要になる。例えば、迅速サイク
リングは、プライマーのＴｍよりも５℃低い温度で約１〜３秒のアニーリングを可能にす
る（３）。エクストリームＰＣＲにおいて、このアニーリング時間（Ｔｍ−５℃、または
それより低い温度で）を１０倍短くする場合、プライマー濃度を１０倍増加させれば類似
のプライマー結合効率が期待される。有効なアニーリング時間が次第に短くなるにつれて
、プライマー濃度もほぼ同じ倍率で次第に高くなるべきである。典型的な迅速ＰＣＲプロ
トコールは、５００ｎＭの各プライマーを使用する。エクストリームＰＣＲにおいてアニ
ーリング時間が３倍から４０倍短くなると、同じプライマー結合効率を得るのに必要なプ
ライマー濃度は、各プライマーで１，５００〜２０，０００ｎＭである。これは、プライ
マーの合計で３，０００〜４０，０００ｎＭと同等であり、表１に記載されたいずれのプ
ライマー濃度よりも高い。これは、先に行われた試みで２０秒未満のサイクリングでの効
率が不十分であることの理由の１つは、不十分なプライマー濃度の後に起こる不十分なア
ニーリング効率であることを示唆している。エクストリームＰＣＲでは、プライマー濃度
をそれぞれ１．５〜２０μＭに増加させることにより、０．０５〜０．３秒のアニーリン
グ時間にもかかわらず優れたアニーリング効率を達成している。増加させたプライマー濃
度を使用すれば、アニーリング時間の短縮を相殺して同じアニーリング効率を達成するこ
とが可能なため、さらにより短いアニーリング時間でさらにより高いプライマー濃度を考
慮できる。市販されているほとんどの機器は少なくとも１秒の保持時間を必要とし、わず
かな機器が「０」秒の保持時間を許容することが知られているが、わずかな秒の保持時間
を許容する市販の機器はない。エクストリームＰＣＲのいくつかの実例について、０．１
秒または０．０１秒きざみの保持時間が望ましい場合がある。
【００４４】
効率を犠牲にすることなくアニーリング速度を増加させアニーリング時間を短くする別
の方法は、Ｍｇ＋＋濃度を増加させることである。アニーリング速度は、イオン強度の増
加に伴い増加し、プライマーのアニーリングを包含するハイブリダイゼーション速度を増
加させるには２価カチオンが特に有効であることが当分野において知られている。
【００４５】
例示的には、アニーリングの標的温度への接近速度は、可能な限り速くてもよい。例え
ば、２００〜８００℃／秒で（図２ａおよび図６ａ）、０．０５〜０．２秒でアニーリン
グ温度に到達することが可能である。また迅速な冷却も、全長生成物の再ハイブリダイゼ
ーションを最小化する。冷却中に二重鎖増幅生成物が形成される程度になると、プライマ
ーは二重鎖生成物にアニールできないため、ＰＣＲ効率は低下する。これはＰＣＲ初期で
はめったに起こらないが、生成物濃度が増加するにつれて、冷却中に二重鎖がますます形
成されるようになる。ＳＹＢＲ（登録商標）グリーンＩを用いた連続的なモニタリングか
ら、このような生成物の再アニーリングが、ＰＣＲがプラトーになる主な原因である場合
があることが示唆される（４４）。
【００４６】
ポリメラーゼ伸長も時間を必要とし、伸長時間が短い場合にＰＣＲ効率を限定する場合
がある。より長い生成物は、ＰＣＲ中により長い伸長時間を必要とすることが知られてお
り、推定上全ての生成物の伸長を完了させるために、ＰＣＲの最後に数分の最終的な伸長
が付け足されることが多い。長い生成物のための通常のアプローチは、伸長にかかる時間
を長くすることである。プライマーのアニーリングおよびポリメラーゼ伸長が同じ温度で
行われる２工程サイクリングのいくつかのケースと同様に、より低い伸長温度を使用する
ことにより必要な時間がさらに長くなる。
【００４７】
最適なＰＣＲ効率のためには、各サイクルにおけるプライマーが結合したテンプレート
の実質的に完全な伸長が必要である。ほとんどのポリメラーゼ伸長速度は、温度に伴い所
定の最大値まで増加する。Ｔａｑポリメラーゼの場合、最大値は７５〜８０℃で約１００
ヌクレオチド／秒であり、温度が１０℃低下するごとに約４倍減少する（５０）。５３６
ｂｐのベータグロビン生成物の場合、迅速サイクルＰＣＲでは７６℃が最適であることが
見出された（４）。近年、商業的な要求に応じて、全体のＰＣＲ時間を短くできるより速
いポリメラーゼが導入されつつあり、これは、このようなポリメラーゼが、より長い生成
物のための伸長保持時間を不要にするかまたは短くできることを示唆している。
【００４８】
より速いポリメラーゼ伸長速度の代替策またはそれを補強する策として、ポリメラーゼ
濃度を増加させると必要な伸長時間が短くなることが発見された。５００ｎＭの各プライ
マーと共に、ＰＣＲにおいて標準的なＴａｑポリメラーゼ濃度（０．０４Ｕ／μｌ）また
は１．５ｎＭ（４９）を使用すると仮定すれば、各プライマーがテンプレートに結合する
場合、一度にテンプレートの０．１５％が伸長する程度のポリメラーゼしか存在していな
いため、新しいプライマーが結合したテンプレート全てを伸長させるためにはポリメラー
ゼをそれらに何度も再利用することが必要となる。ポリメラーゼ濃度を増加させることに
より、プライマーが結合した有効なテンプレートのより多くが一度に伸長され、テンプレ
ート全てを伸長させるのに必要な時間を短くするが、これはおそらく、より速い伸長速度
によるのではなく、いずれの時点においてもプライマーが結合したテンプレートのより高
い比率を伸長することによるものと予想される。
【００４９】
一次近似によれば、小さいＰＣＲ生成物の場合（１００ｂｐ未満）、必要な重合時間は
、酵素の重合速度（それ自身が温度の関数である）およびポリメラーゼ濃度に正比例する
ようである。また必要な時間は、伸長させようとするテンプレートの長さ（生成物の長さ
からプライマーの長さを引いた長さ）に反比例する。ポリメラーゼ活性を、ＰＣＲにおい
て標準的な活性である０．０４Ｕ／μｌの２０〜３００倍に増加させることにより、２０
秒未満のサイクルを用いたエクストリームＰＣＲは、特異的生成物の高い収量を達成でき
る。すなわち、０．８〜１２Ｕ／μｌ（１〜１６μＭのＫｌｅｎＴａｑ）の活性は、０．
１〜１．０秒の併合されたアニール／伸長時間を用いた２工程のエクストリームＰＣＲを
可能にする。これまでに使用された最大のポリメラーゼ活性は、０．５Ｕ／μｌであった
（表１）。エクストリームＰＣＲの実例で使用される２工程ＰＣＲの場合、７０〜７５℃
での併合されたアニール／伸長工程がより速い重合速度にとって有利である。さらに、２
工程ＰＣＲは温度サイクリングを簡易化するため、エクストリームサイクリング（２０秒
未満のサイクル）の実例では典型的には２工程ＰＣＲが使用され、迅速なアニーリングと
迅速な伸長の両方が、併合されたアニール／伸長工程の間に起こらなければならない。そ
れゆえに、実例では増加させたプライマー濃度と増加させたポリメラーゼ濃度の両方が使
用され、その結果として、エクストリーム２温度サイクリング下でロバストなＰＣＲがも
たらされる。例示的には、以下に記載される実施例で例示されるように、５０〜７５℃で
０．０５〜５．０秒の併合されたアニール／伸長時間を用いる場合、それぞれ１．５〜２
０μＭのプライマー濃度と、任意の標準的なポリメラーゼの０．４〜１２Ｕ／μｌのポリ
メラーゼ濃度（０．５〜１６μＭのＫｌｅｎＴａｑ）とが必要である。アニーリングおよ
び伸長の両方に対して１つのＰＣＲサイクリングセグメントしかないため、エクストリー
ムＰＣＲ条件は、例示的にはプライマー濃度とポリメラーゼ濃度の両方を増加させること
によって両方のプロセスを強化することを必要とする。
【００５０】
また、エクストリーム３温度サイクリングも想定され、その場合、アニーリング工程お
よび伸長工程は異なる温度で別々に維持される。このケースにおいて、アニーリング工程
および伸長工程に配分される時間を個々に制御して、具体的な要求に合わせることが可能
である。例えば、アニーリング時間のみが短く（０．０５〜０．２秒）伸長時間が比較的
長く維持される場合（例示的には１、２、５、１０または１５秒）、効率的なＰＣＲのた
めにはプライマー濃度だけを増加させればよい。あるいは、伸長時間は短いが（７０〜８
０℃の範囲内で１秒未満）、アニーリング時間は長い場合、効率的なＰＣＲを達成するた
めにはポリメラーゼ濃度だけを増加させればよいと考えられる。効率的なＰＣＲとは、例
示的には少なくとも７０％の効率、より例示的には少なくとも８０％の効率、さらには少
なくとも９０％もの効率を有するものと理解される。
【００５１】
１００ｂｐよりも長い生成物の場合、エクストリームＰＣＲを使用した効率的な伸長は
、高いポリメラーゼ濃度と増加させた伸長時間との組み合わせを必要とする場合がある。
ポリメラーゼが過量に存在する場合、例示的には、最小の時間は、塩基の伸長の長さ（生
成物の長さからプライマーの長さを引いた長さと定義される）を塩基／秒単位のポリメラ
ーゼ伸長速度で割った値であるはずである。しかし、これまで述べてきたように、ポリメ
ラーゼが飽和しているのは通常、テンプレート濃度がポリメラーゼ濃度よりも大きくなる
前、ＰＣＲの開始時のみである。サイクル時間を短くする方法の１つは、ポリメラーゼの
最大温度近傍、典型的には７０〜８０℃で、２温度ＰＣＲを使用することである。必要な
伸長時間は、リアルタイムＰＣＲを使用して定量サイクル、すなわちＣｑをモニタリング
することによって実験的に決定できる。例えば、７５℃で１００塩基／秒のポリメラーゼ
伸長速度では、ポリメラーゼ濃度が過量である場合、２００ｂｐの生成物は、約２秒を要
すると予想される。同様に、４００ｂｐの生成物は、これと同じポリメラーゼを使用した
場合、その濃度が、伸長されるテンプレートの濃度よりも高い限りは約４秒を要すると予
想される。ポリメラーゼが過量ではない場合、より多くのポリメラーゼを添加することに
よって、より多くのテンプレートが同時に伸長されて、ポリメラーゼ濃度に比例して必要
な伸長時間を短くすることが可能になる。
【００５２】
任意のＤＮＡ分析方法の有用性は、どれだけ速く行うことができるか、どれだけ多くの
情報が得られるか、およびどの程度難しいかによって決まる。従来のクローニング技術と
比較して、ＰＣＲは速くかつ簡単である。迅速サイクルＰＣＲおよびエクストリームＰＣ
Ｒは、必要な時間の連続的な短縮に重点を置いている。リアルタイムＰＣＲは、各サイク
ルでデータを得ることにより情報量を増加させる。ＰＣＲ中またはＰＣＲ後に融解分析を
行って、温度を増加させながらＤＮＡハイブリダイゼーションを連続的にモニターできる
。
【００５３】
ＰＣＲの平衡パラダイムおよび動力学的パラダイムに戻るって考えると（図１５ａ〜１
５ｂ）、１００ｂｐ未満の生成物のエクストリームＰＣＲは、動力学的モデルがよく当て
はまることが実証されている。温度は常に変化しており、変性、アニーリング、および伸
長の速度は温度依存性であることから、ＰＣＲの適切な評価は、温度全域にわたる各要素
の反応速度を統合することでしか得られない。１００ｂｐより大きい生成物の場合、より
長い伸長時間を要する場合があり、反応速度論モデルと平衡モデルのどちらの要素でも適
切である。
【００５４】
本明細書に記載の少なくとも１つの実施形態に従って反応条件が構成される場合、いく
つかの実施形態に関して例示すれば、２秒未満のサイクル時間を用いて、完全な増幅のた
めに１分未満で、極めて速い速度でＰＣＲを行うことができることが発見された。例示的
には、このエクストリームＰＣＲに、増加させたポリメラーゼ濃度とプライマー濃度との
様々な組み合わせが使用される。いずれの特定の理論にとらわれずにいえば、過剰な濃度
のプライマーは、概して完全なプライマーのアニーリングを可能にし、それによってＰＣ
Ｒ効率を増加させると考えられる。同様にいずれの特定の理論にとらわれずにいえば、ポ
リメラーゼ濃度を増加させることによっても、より完全な伸長がもたらされるためにＰＣ
Ｒ効率が向上すると考えられる。ポリメラーゼ濃度を増加させることにより、アニールし
たプライマーへの結合が促進され、さらに完全な伸長の前にポリメラーゼが離れた場合で
も再結合が促進される。以下に記載の実施例で、複雑な真核生物ゲノムＤＮＡを用いて開
始した場合でもエクストリームＰＣＲが成功したことを示す。
【００５５】
以下に記載される実施例ではＫｌｅｎＴａｑを使用したが、類似の活性を有する任意の
熱安定性ポリメラーゼが、ポリメラーゼ伸長速度を考慮した類似の方式でエクストリーム
ＰＣＲで性能を発揮すると考えられる。本明細書で提示されたように、例示的には酵素の
活性化率（ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｒａｔｅ）の差で調節することにより濃度を増加させて使
用した場合、エクストリームＰＣＲを可能にすると予想されるポリメラーゼの市販の調製
物としては、例えば、Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ、Ｋａｐａ２Ｇ  ＦＡＳＴ、ＫＯＤ  Ｐｈｕｓ
ｉｏｎ、天然のまたはクローニングしたサーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａ
ｑｕａｔｉｃｕｓ）のポリメラーゼ、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ、ＧｏＴａｑ、およびＦ
ａｓｔ  Ｓｔａｒｔが挙げられる。
【００５６】
２秒のサイクル時間を可能にする現行の市販のＰＣＲ機器はないため、システム４を組
み立てて、エクストリームＰＣＲの構想の証明試験を行った。しかし、システム４は例示
的なものであり、迅速に熱サイクリング可能な他のシステムも本開示の範囲内であること
が理解される。図１ａで示されるように、９５．５℃（本発明の実施例が行われた場所で
あるユタ州ソルトレイクシティでの沸騰水の温度）の高温の水槽１０、および３０〜６０
℃の低温の水槽１４を使用して、サンプル容器２０中に入れられた１〜５μｌのサンプル
の温度を変化させる。例示的な水槽１０、１４は４．５クォートのステンレス鋼製ドレッ
シング用ジャー（Ｌａｂ  Ｓａｆｅｔｙ  Ｓｕｐｐｌｙ、番号４１６３４）であるが、い
くつかの実施例では５００ｍｌのガラスビーカーを使用して、磁気撹拌しながら電気ホッ
トプレート１２、１６（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｓｏｔｅｍｐデジタル
ホットプレート（番号１１−３００−４９ＳＨＰ）で加熱が行われる。しかし、他の実施
形態が、サンプルを加熱したり冷却したりするのに使用され得ることが理解される。図１
ａに示される実施形態において、サンプル容器２０は、ガラス／プラスチック複合材の反
応チューブ（ＢｉｏＦｉｒｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、番号１７２０、内径０．８ｍｍ
および外径１．０ｍｍ）である。しかし、他の実施例では、サンプル容器２０として、皮
下注射針（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ、番号３０５１８７、内径０．０４２イン
チ、外径０．０７５インチ）と、ステンレス鋼管材料で構成されＢｉｏＦｉｒｅチューブ
のプラスチックの頂上部に適合させたステンレス鋼／プラスチック複合材の反応チューブ
（Ｓｍａｌｌ  Ｐａｒｔｓ、内径０．０４２インチ／外径０．０７５インチ、内径０．０
３５インチ／外径０．０４２インチ、または内径０．０２６５インチ／外径０．０３５イ
ンチ）とを使用した。その他のサンプル容器も本発明の範囲内であるが、大きい表面積対
体積比を有し、速い熱伝達速度を有するサンプル容器が望ましい。所定の実施形態に関し
て、金属管材料の開放端をガス炎を使用して赤色から白色に加熱し、万力で圧縮すること
によって密封した。リアルタイムＰＣＲの場合、光学的に透明であるか、または光学的に
透明な部分を有するチューブが望ましい。短時間の遠心分離によりサンプルを各チューブ
の底部に沈降させた。
【００５７】
サンプル容器２０は、アーム２１によりステッピングモーターのシャフト２６に取り付
けられたチューブホルダー２２によって保持される。反応溶液が６．５〜７．５ｃｍの半
径で保持されるように２〜５個のサンプル容器２０を保持するためのチューブホルダー２
２を、黒いデルリン（Ｄｅｌｒｉｎ）プラスチックから機械製作した（図１ａでは１つの
サンプル容器２０のみを図示したが、このようなサンプル容器２０の列が存在してもよい
）。図１ａでは図示されていないが、熱電対（Ｏｍｅｇａ  ｔｙｐｅ  Ｔ  ｐｒｅｃｉｓ
ｉｏｎ細線熱電対、番号５ＳＲＴＣ−ＴＴ−Ｔ−４０−３６、３６インチのリード線、０
．００３インチの直径、テフロン（登録商標）製絶縁材を有する）を使用して、温度を測
定できる。図１ｂと類似したチューブホルダーおよびアームを示す図１ｄを参照すれば（
同様の数値は類似の構成要素を示す）、２つのサンプル容器を保持するように設計された
チューブホルダー２２２が存在しており、チューブホルダー２２２における一方の場所は
熱電対２２８によって占められている。本明細書で説明される実施形態のいずれにおいて
も、図１ｄで示されるように、任意の数のサンプル容器２０または２２０を熱電対と共に
使用してもよいし、熱電対熱電対なしで使用してもよいことが理解される。熱電対による
増幅および線状化は、Ａｎａｌｏｇ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ＡＤ５９５チップ（示さず）を用
いて行われる。まず、Ｔ型電圧＝（ＡＤ５９５の出力／２４７．３）−１１μＶに従って
、ＡＤ５９５の出力から熱電対の電圧を計算した。次いで、Ｔ型熱電対の電圧／温度相関
に関するアメリカ国立標準技術研究所の係数を使用して熱電対の電圧を温度に変換した。
アナログシグナルをデジタル化し（ＰＣＩｅ−６３６３収集ボード）、ＣＰＵ４０にイン
ストールされたＬａｂＶｉｅｗソフトウェア（バージョン２０１０、Ｎａｔｉｏｎａｌ  
Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で処理し、ユーザーインターフェース４２に表示した。例示的
には、ステッパーの動きを８７〜９２℃および６０〜７５℃で動的に引き起こすか、また
はコンピューターで制御された期間にわたり各水槽中にステッパーを保持してもよい。典
型的には３０〜５０サイクルが行われる。
【００５８】
チューブホルダー２２中の全てのサンプル容器２０が水槽１０と水槽１４との間を素早
く移動して、サンプルが入っている各サンプル容器２０の一部が完全に浸されるように、
ステッピングモーター２４（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｏｔｉｏｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、番号Ｈ
Ｔ２３−４０１、３Ｖ、３Ａ）が水槽１０と水槽１４との間に配置される。ステッピング
モーター２４は、例示的には４ＳＸ−４１１ｎｕＤｒｉｖｅ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓ
ｔｒｕｍｅｎｔｓ、示さず）で作動し、ＰＣＩ−７３４４運動制御器とＣＰＵ４０にイン
ストールされたＮＩ−Ｍｏｔｉｏｎソフトウェア（バージョン８．２、Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）とで制御される。ステッピングモーター２４は、水槽１０と
水槽１４との間を約０．１秒で回転する。図２ａは、９０℃および５０℃でステッパーの
動きが引き起こされた運転に関して、サンプル容器２０の位置の軌跡（点線）の上にサン
プルの温度の軌跡（直線）を重ねて示す。図２からわかるように、５０℃よりも低い温度
にいくつかのオーバーシュートがあるが、これは水槽１４からサンプル容器２０に移動さ
せるのに必要な時間によるものと推定される。したがって、上記で論じられたように、い
くらかより高い温度でステッピングモーター２４を始動させることが望ましい場合がある
。以下の実施例において、示された温度は、到達したサンプルの温度であって、トリガー
温度ではない。図２ａから計算された最大の加熱速度は３８５℃／秒であり、最大の冷却
速度は３３３℃／秒である。例示的には、エクストリームＰＣＲは、少なくとも２００℃
／秒の傾斜速度で行ってもよい。他の実施形態において、傾斜速度は、３００℃／秒であ
ってもよいし、またはそれよりも大きくてもよい。
【００５９】
いくつかの実施例では、システム４はまた、リアルタイムモニタリングのために構成さ
れる。図１ａで示されるように、リアルタイムモニタリングの場合、サンプル容器２０が
ステッピングモーター２４により高温の水槽１０から低温の水槽に移動したとき、このモ
ニタリング位置を保ちながら、または保たずにサンプル容器２０が光ファイバーチップ５
０を通過するように、光学素子ブロック２５の光ファイバーチップ５０がサンプル容器２
０上に取り付けられる。この例示的な実施形態において、光ファイバーチップは、水槽の
上の空気中に提供される。熱的サイクリングデバイス４をＣＰＵ４０によって制御してユ
ーザーインターフェース４２に表示してもよい。
【００６０】
図１ｂは、図１ａに類似した実施形態を示す。ホットプレート２１２および２１６は、
高温の水槽２１０および低温の水槽２１４の温度を制御するために備えられている。ステ
ッピングモーター２２４は、例示的にはアルミニウムで作製されたアーム２２１とチュー
ブホルダー２２２を動かしてサンプル容器２２０と熱電対２２８（図１ｄに示される）を
動かすために備えられている。しかし、この実施形態において、ブロック２５４を配置さ
せることにより、光ファイバーケーブル２５２のチップ２５０は水槽２１４中に保持され
る。光ファイバーケーブル２５２は、ポート２４８を介して水槽２１４に入り、光学素子
ブロック２２５にシグナルを与える。熱的サイクリングデバイス２０４をＣＰＵ２４０に
よって制御してユーザーインターフェース２４２に表示してもよい。
【００６１】
Ｏｃｅａｎ  ＯｐｔｉｃｓのＬＬＳ−４５５ＬＥＤ光源２５６からの光を、光ファイバ
ーケーブル２５２（Ｏｃｅａｎ  ＯｐｔｉｃｓのＰ６００−２−ＵＶ−ＶＩＳ、ファイバ
ーコア直径６００μｍ）によって４４０＋／−２０ｎｍの励起干渉フィルター、ビーム分
割のための４５８ｎｍのダイクロイックフィルターおよび４９０＋／−５ｎｍの放出フィ
ルター（全てＳｅｍｒｏｃｋより、示さず）を備えたＨａｍａｍａｔｓｕ  Ｏｐｔｉｃｓ
の光学素子ブロック２５８に導いた。より低温の水槽中に配置されたきに、１つのサンプ
ルのキャピラリーからおよそ１〜２ｍｍの距離で一列に置かれた別の光ファイバーケーブ
ル（示さず）を用いて、キャピラリーの落射蛍光照明が達成された。放出検出は、Ｈａｍ
ａｍａｔｓｕのＰＭＴ６２を用いて行われた。
【００６２】
図１ｃは、３温度ＰＣＲのための例示的なシステム３０４を示す。９５．５℃の高温の
水槽３１０、３０〜６０℃の低温の水槽３１４、および７０〜８０℃の中程度の温度の水
槽３１３を使用して、サンプル容器３２０中に入れられている１〜５μｌのサンプルの温
度を変化させ、磁気撹拌しながら３つの電気ホットプレート３１２、３１６、および３１
８で加熱する。サンプル容器３２０は、アーム３２１でステッピングモーター３２４に取
り付けられたチューブホルダー３２２によって保持される。また熱電対３２８も、チュー
ブホルダー３２２によって保持される。ステッピングモーター３２４が回転するときに、
アーム３２１を持ち上げることができる。光ファイバーチップ３５０は、例示的には、中
程度の温度の水槽３１３中に提供されるが、図１ａの場合のように空気中に置かれていて
もよいことが理解される。この例示的な実施形態の構成のために、３つの水槽３１０、３
１３、および３１４を互いに等距離で設けることは不可能であった。したがって、サンプ
ルの冷却は高温の水槽３１０と低温の水槽３１４との間でなされることが望ましく、それ
に対してサンプルの加熱は、サンプルがその他の水槽間を移動することによってなされる
ために、高温の水槽３１０と低温の水槽３１４との間に最も大きいスペースを設けた。し
かし、この構成は単なる例示であり、他の構成も本開示の本質の範囲内であることが理解
される。２つのステッピングモーターが同時に使用されるために（一方はキャピラリーを
水から持ち上げるためであり、もう一方は水槽間を移動させるためである）、それぞれの
角運動を最小化することにより、槽間の運動時間を短くできる。２つの水槽によるシステ
ムでは、槽間でサンプルを移動させるのに必要なステッパーの角運動は、２７０度よりも
大きい。しかし、３つの水槽によるシステムでは、サンプルを持ち上げるステッピングモ
ーターは４５度未満で横断する必要があり、一方でサンプルを水槽間で移動させるステッ
パーは、わずか９０度またはそれ未満で移動する必要がある。また水槽は、必要な角運動
をさらに制限するために円形のセクター（扇形のくさび）として構成されてもよい。角運
動を最小化することにより、水槽間の移動時間が短くなる。１００ミリ秒未満の移動時間
、または５０ミリ秒未満もの移動時間が想定される。このシステム３０４の他の構成要素
は図１ａ〜ｂに示されるシステム４、２０４と類似しており、図１ｃでは示されていない
。
【実施例１】
【００６３】
特に他の指定がない限り、５０ｍＭのトリス（２５℃でｐＨ８．３）、３ｍＭのＭｇＣ
ｌ２、２００μＭの各ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）、５００μ
ｇ／ｍｌの非アセチル化ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）、２％（ｖ／ｖ）グリセロー
ル（Ｓｉｇｍａ）、５０ｎｇの精製ヒトゲノムＤＮＡ、および１×ＬＣＧｒｅｅｎ（登録
商標）プラス（ＢｉｏＦｉｒｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を含有する５μｌの反応体積
でＰＣＲを行った。プライマー濃度およびポリメラーゼ濃度は、具体的な実験プロトコー
ルに従って変更した。Ｋｌｅｎｔａｑ１（商標）ＤＮＡポリメラーゼをＡＢ  Ｐｅｐｔｉ
ｄｅｓ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯまたはワシントン大学（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）のＷａｙｎ
ｅ  Ｂａｒｎｅｓのいずれかから得た。ＫｌｅｎＴａｑの分子量は６２．１ｋＤであり、
２８０ｎｍにおける吸光係数は、配列から計算した場合、６９，１３０Ｍ−１ｃｍ−１で
ある（米国特許第５，４３６，１４９号）。質量分析法で、優勢な分子量は６２ｋＤであ
ることが確認され、変性ポリアクリルアミドゲルで、主要なバンドは合計で８０％より高
い純度を有することが示された。吸光度および純度を使用して濃度を計算したところ、１
０％グリセロール中、８０μＭのストックであることが示された。最終的なポリメラーゼ
濃度は、典型的には０．２５〜１６μＭであった。１μＭのＫｌｅｎＴａｑは、０．７５
Ｕ／μｌに等しく、この場合の１ユニットは、活性化サケ精子ＤＮＡを用いて７２℃で３
０分で合成された生成物１０ｎｍｏｌと定義される。ユタ大学のコア施設でプライマーを
合成し、脱塩し、濃度をＡ２６０によって決定した。各プライマーの最終濃度は、典型的
には２．５〜２０μＭの間で様々であった。
【００６４】
プライマーＣＣＣＡＴＴＣＡＡＣＧＴＣＴＡＣＡＴＣＧＡＧＴＣ（配列番号１）および
ＴＣＣＴＴＣＴＣＴＴＧＣＣＡＧＧＣＡＴ（配列番号２）を使用して、ヒトゲノムＤＮＡ
からＫＣＮＥ１の４５ｂｐのフラグメントを増幅した。これらのプライマーは変異体ｒｓ
番号１８０５１２８（ｃ．２５３Ｇ＞Ａ）を間に挟み、配列：ＣＣＣＡＴＴＣＡＡＣＧＴ
ＣＴＡＣＡＴＣＧＡＧＴＣＣ（Ｇ／Ａ）ＡＴＧＣＣＴＧＧＣＡＡＧＡＧＡＡＧＧＡ（配列
番号３）を増幅した。
【００６５】
図３ａには、図１ａに示されるデバイスを使用したエクストリームＰＣＲによって生成
したＰＣＲ生成物の融解曲線が示され、この場合、０．６４μＭのＫｌｅｎＴａｑおよび
１０μＭの各プライマーを使用して、図２ｂで示されるように９１℃から５０℃の間で、
３５サイクルおよび２８秒の総増幅時間でサイクリングされた。各サイクルは０．８秒を
要した。さらに図３ａには、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒでの迅速サイクリングによって生成
した同じアンプリコンの融解曲線も示され、この場合、０．０６４μＭのＫｌｅｎＴａｑ
および０．５μＭの各プライマーを使用して、３５サイクルおよび１２分の総増幅時間で
、９０℃から５０℃の間でサイクリングされた（図２ｃ）。各サイクルは１０．３秒を要
した。図２ｂおよび２ｃでは時間の尺度が異なるため、図２ｂの全体のエクストリームＰ
ＣＲプロトコールは、それに対応する迅速サイクルの２サイクル未満で完了することに留
意されたい。両方の反応により、類似のＴｍを有しゲル電気泳動で強いバンドを示すアン
プリコンが生産されたのに対し（図３ｂ）、陰性対照は融解分析またはゲル電気泳動のど
ちらによっても増幅は示されなかった。この実例において、エクストリームＰＣＲ条件は
、ゲルで分析したところ（図３ｂ）、迅速サイクルＰＣＲ条件よりも高い収量を示した。
融解曲線におけるＴｍの０．５℃の差は、ポリメラーゼ貯蔵緩衝液中のグリセロール含量
から生じる、各反応液におけるグリセロールの量の違いに起因すると考えられる（ＰＣＲ
におけるグリセロールの最終濃度は、エクストリーム条件下では１．３％であり、迅速条
件下では０．１％であった）。また、図３ｂからも、アンプリコンのサイズが類似してお
り、予測通りであったことが確認される。加えて、ポリメラーゼ濃度とプライマー濃度と
が高いにもかかわらず、反応は特異的のようであり、非特異的生成物は認められなかった
。しかし、高解像度融解分析では３種の遺伝子型を区別することはできなかった。プライ
マーの総濃度に対するポリメラーゼの化学量論的なパーセンテージは、エクストリームＰ
ＣＲの場合は３％であり、迅速サイクルＰＣＲの場合は６．４％であった。
【００６６】
１μＭのポリメラーゼ、１０μＭの各プライマー、および１．３％グリセロールを使用
して、４５ｂｐのＫＣＮＥ１の反応をリアルタイムでモニタリングした。図１ａのデバイ
スを使用して、２つの水槽間の空気中のサンプルを各サイクルでモニターした。密封され
たチャンバーの空気の温度を７０℃に保持し、各サイクル０．２秒でサンプルを調査した
。温度参照キャピラリーで測定しながら、サンプルを図３ｃで示されるように６０℃から
９０℃の間でサイクリングした。位置決めと測定の時間が追加されたために、サイクル時
間が０．８秒から１．１２秒に増加した。したがって、５０サイクルは５６秒で完了した
。約３０サイクルでの、すなわち約３４秒後の蛍光の増加から、増幅が認められた（図３
ｃ）。測定のためにサンプルが空気中にあり、ポリメラーゼの伸長速度が制限される間も
、温度はほぼ６０℃に保たれた。
【００６７】
図３ｃで観察されるように、この反応は、約２５サイクルの定量サイクル（Ｃｑ）を有
するが、少なくとも５０サイクルまではプラトーにはならないようである。またこの反応
は６４サイクル後に停止したため、アンプリコンの量が増加し続け、かなり後にならない
とプラトーに達しない場合もある。理論にとらわれずにいえば、プライマー濃度を増加さ
せることにより、収量を向上させ、さらに、プラトーを例示的にはＣｑ後に２０サイクル
、より例示的にはＣｑ後に２５サイクルまたはそれより多くのサイクル遅延させることが
できると考えられる。
【実施例２】
【００６８】
この実施例では、インターロイキン１０ベータ受容体中のＡ＞Ｇ変異体（ｒｓ番号２８
３４１６７）を間に挟む５８ｂｐのフラグメントを、プライマーＣＴＡＣＡＧＴＧＧＧＡ
ＧＴＣＡＣＣＴＧＣ（配列番号４）およびＧＧＴＡＣＴＧＡＧＣＴＧＴＧＡＡＡＧＴＣＡ
ＧＧＴＴ（配列番号５）を用いて増幅し、以下のアンプリコン：ＣＴＡＣＡＧＴＧＧＧＡ
ＧＴＣＡＣＣＴＧＣＴＴＴＴＧＣＣ（Ａ／Ｇ）ＡＡＧＧＧＡＡＣＣＴＧＡＣＴＴＴＣＡＣ
ＡＧＣＴＣＡＧＴＡＣＣ（配列番号６）を生成した。実施例１で説明したようにして、図
１ａに示される機器を使用してエクストリームＰＣＲを行った。１μＭのポリメラーゼ、
１０μＭの各プライマー、および１．３％グリセロールを使用した（全プライマーに対す
るポリメラーゼのパーセンテージは５％）。ポリメラーゼがより高い伸長速度を有する場
合、ポリメラーゼ伸長のために温度を７０〜８０℃に増加させるために、様々な位置決定
プロトコールを使用した。アニーリング温度に達した後、モニターするために空気中で即
座に位置決定する代わりに、伸長温度に達するまでサンプルを高温の水槽に移した。次い
でサンプルを高温の水槽の真上の空気中に配置させて、図４ａおよび４ｂに示した温度サ
イクルを生じさせることにより、７０℃から７７℃の間の最適な温度でより速いポリメラ
ーゼ伸長を可能にした。３種の異なる遺伝子型をそれぞれ、０．９７秒のサイクルを使用
して３９サイクルを３８秒で完了させるエクストリームＰＣＲによって増幅した。エクス
トリームＰＣＲの後、ＬＣ２４キャピラリーが適合するように改変されたＨＲ−１機器で
各遺伝子型の高解像度融解曲線を得た。図４ｃから明らかなように、３種の遺伝子型全て
が予想通りに増幅され、区別された。
【実施例３】
【００６９】
実施例１における反応混合物はエクストリームＰＣＲおよび迅速サイクルＰＣＲの両方
で同じであるが、見たところ図３ａで観察されるＴｍのシフトの原因と思われるポリメラ
ーゼおよびプライマーの量、ならびにグリセロール濃度のわずかな差が認められた。この
実施例およびこの先全ての実施例において、グリセロール濃度は、必要に応じてその濃度
を均一化することにより２％に保持された。エクストリームＰＣＲの場合、１μＭのポリ
メラーゼおよび１０μＭの各プライマーを使用し、迅速サイクルＰＣＲの場合、０．０６
４μＭのポリメラーゼおよび０．５μＭの各プライマーを使用した。上記で論じられたよ
うに、より速いアニーリング時間は、プライマー特異性の向上をもたらすと考えられる。
この特異性の向上に伴い、増加させたプライマー濃度を使用してもよく、それにより、プ
ライマーの結合が促進されてアニーリング時間が短くなると考えられる。同様に、増加さ
せたポリメラーゼ濃度によりアニールしたプライマーへの結合も促進されて、完全な伸長
の前にポリメラーゼが離れた場合に、不完全なアンプリコンへの再結合も促進される。加
えて、ポリメラーゼ濃度が高ければ高いほど、ＰＣＲの後半でさえもより大量のプライマ
ーが結合したテンプレートが一度に伸長でき、１つのポリメラーゼが伸長させなければな
らないテンプレート数が少なくなるため、全体の伸長時間が短くなる。
【００７０】
図５ａに、様々なポリメラーゼ濃度およびプライマー濃度を用いたエクストリームＰＣ
Ｒサイクリングの結果を要約する。この実施例において、インターロイキン１０ベータ受
容体の４９ｂｐのフラグメントを、プライマーＧＧＧＡＧＴＣＡＣＣＴＧＣＴＴＴＴＧＣ
Ｃ（配列番号７）およびＴＡＣＴＧＡＧＣＴＧＴＧＡＡＡＧＴＣＡＧＧＴＴＣＣ（配列番
号８）、ならびに３ｍＭのＭｇＣｌ２を用いて増幅して、ＧＧＧＡＧＴＣＡＣＣＴＧＣＴ
ＴＴＴＧＣＣＡＡＡＧＧＧＡＡＣＣＴＧＡＣＴＴＴＣＡＣＡＧＣＴＣＡＧＴＡ（配列番号
９）を生成した。各エクストリームＰＣＲ反応で、図１ｂに示されるデバイスを、リアル
タイムでモニタリングせずに使用した。図５ｂで示されるように、２６秒より少し短い総
反応時間（０．７３秒のサイクル）で、９０℃から６３℃の間で３５サイクルで温度をサ
イクリングした。図５ａで示されるようにポリメラーゼおよびプライマーの量を変更した
こと以外は、実施例１で論じられた通りの反応条件を用いた。図５ａの縦軸は、ＨＲ−１
機器で正規化しないで得られた融解曲線の負の微分プロットのピークとして数値化したも
のである。０．５μＭのポリメラーゼでは、いずれのレベルのプライマー濃度でも実質的
に増幅は観察されなかった。しかし、１．０μＭのポリメラーゼでは、５μＭおよびそれ
を超えるプライマー濃度で認識できるレベルの増幅が観察された。ポリメラーゼレベルが
増加するにつれて、アンプリコンの量も最大約４μＭのレベルまで増加する。８μＭのポ
リメラーゼでは、アンプリコンの量はプライマー濃度に応じてプラトーになるかまたは低
下し、より低いプライマー濃度では１６μＭで有意な低下がみられた。これらの４９ｂｐ
の生成物の場合のエクストリーム温度サイクリング条件下では、ポリメラーゼの好ましい
濃度範囲は、プライマー濃度に応じて、約１μＭから８μＭの間であり、より具体的には
２μＭから８μＭの間であると考えられる。
【００７１】
同様に、２．５μＭのプライマー濃度ではほとんど増幅が観察されなかった。しかし、
５μＭのプライマーでは、２〜８μＭのＫｌｅｎＴａｑ濃度を用いたところ増幅が成功し
、増幅は濃度の増加に伴い向上し続けた。約１０〜２０μＭのプライマー濃度を用いたと
ころ優れた増幅が達成された。図５ｃは、４μＭのＫｌｅｎＴａｑで様々なプライマー濃
度を用いた場合の融解曲線を示し、一方で図５ｄは、プライマー濃度を１０μＭに保持し
ながらポリメラーゼ濃度を変更したときの生成物のサイズを実証している。高濃度のポリ
メラーゼおよびプライマーにもかかわらず、非特異的増幅は観察されていない。
【００７２】
理論にとらわれずにいえば、酵素の量もプライマーの量も閾値を超えているのであれば
、酵素の量とプライマーの量との比率が、エクストリームＰＣＲサイクリングにとって重
要であると考えられる。上記の量は、各プライマーをベースにして示されることに留意さ
れたい。ポリメラーゼが二重鎖になったプライマーのそれぞれに結合することを考えれば
、プライマーの総濃度が最も重要である場合がある。ＫｌｅｎＴａｑの場合、好適な比率
は０．０３〜０．４（プライマーの総濃度に対して３〜４０％の酵素）であり、例示的に
は最小で約０．５μＭのＫｌｅｎＴａｑ濃度であり、より例示的には、エクストリームＰ
ＣＲの場合、約１．０μＭである。プライマーは、等モル量で提供されてもよいし、また
は非対称ＰＣＲの場合のように一方が過量に提供されてもよい。最適なポリメラーゼ：プ
ライマーのパーセンテージはまた、温度サイクリング条件と生成物のサイズにも依存し得
る。例えば、標準的な（遅い）温度サイクリングは、かなり低いプライマーに対するポリ
メラーゼのパーセンテージを使用することが多く、典型的には、１．５ｎＭ（０．０４Ｕ
／μｌ）のポリメラーゼ（４９）および０．１５％のパーセンテージの１，０００ｎＭの
プライマーの総濃度が使用され、これは、エクストリームＰＣＲに関して有効であると見
出されたパーセンテージよりも１０倍以上低い。
【実施例４】
【００７３】
熱の移動とサイクル速度を増加させるために、１９ゲージの鋼の皮下注射針で８μＭの
ポリメラーゼおよび２０μＭの各プライマーを用いて、実施例３におけるのと同じＰＣＲ
標的を増幅した。全プライマーに対するポリメラーゼのパーセンテージは２０％であった
。図１ｂの機器で増幅を行ったところ、各０．４６秒で３５サイクル（図６ａ）、９１℃
から５９〜６３℃の間のサイクリングを使用して、１６秒で増幅が完了した。サイクリン
グ中の最大の加熱速度は４０７℃／秒であり、最大の冷却速度は８１５℃／秒であったこ
とから、保持を行わずに４００℃／秒より速い傾斜速度でＰＣＲを実行できることが実証
された。４％ＮｕＳｉｅｖｅの３：１アガロースゲルでの生成物分析により、正しいサイ
ズの強い特異的なバンドが現れた（図６ｂ）。テンプレート非含有対照は、４９ｂｐで生
成物を示さなかったが、陽性サンプルに類似した顕著な量のプライマーバンドを示した。
【実施例５】
【００７４】
プライマーＣＴＣＴＧＴＧＣＴＴＴＣＴＧＴＡＴＣＣＴＣＡＧＡＧＴＧＧＣＡＴＴＣＴ
（配列番号１０）およびＣＧＴＣＴＧＣＴＧＧＡＧＴＧＴＧＣＣＣＡＡＴＧＣＴＡＴＡ（
配列番号１１）、ならびにリアルタイム要素を用いない図１ｂの機器を使用して、ＮＱＯ
１遺伝子の１０２ｂｐのフラグメントを増幅した。ポリメラーゼ濃度を０．２５から４μ
Ｍの間で変更し、各プライマー濃度を０．５から８μＭの間で変更した。併合されたアニ
ール／伸長期での伸長がポリメラーゼにとってより最適な温度で起こるように、より高温
で（低出力で７０秒）アニールするようにプライマーを設計した。これらの温度でのより
速い重合速度は、より長い生成物の増幅を可能にすると期待された。より低温の水槽を７
２℃に制御して、アニール／伸長期の終了を温度ではなく時間（１秒）で誘発した。３０
サイクルの間の７２℃から９０℃の間のサイクリングには、１．９３秒のサイクルを使用
したところ５８秒を要した（図７ａ）。図７ａで観察されるように、サンプルの温度は、
空気を通って高温の水槽まで移動する間にアニール／伸長温度から約３℃低くなる。図７
ｂは、図５ａに示されるように融解曲線を定量することによって得られた増幅した生成物
の量を示す。融解曲線分析では、８４℃のＴｍを有する唯一の生成物が示された。０．２
５μＭのポリメラーゼまたは１μＭの各プライマーでは極めてわずかな生成物しか観察さ
れなかった。２μＭの各プライマーでもある程度の増幅は起こり、最良の増幅は２〜４μ
Ｍのポリメラーゼおよび８μＭの各プライマーで起こる。２〜４μＭのプライマー濃度で
は、ポリメラーゼ濃度が増加するにつれて収量は減少するが、これは８μＭのプライマー
濃度では観察されなかった。熱的サイクリングおよび標的長さが実施例３とは異なるが、
プライマーの総濃度に対するポリメラーゼ濃度が、３．１から５０％のときに最良の増幅
が起こる。
【実施例６】
【００７５】
図１ｂに示される機器をリアルタイムモニタリングしながら使用して、ＢＢＳ２遺伝子
の１３５ｂｐおよび３３７ｂｐのフラグメントをエクストリームＰＣＲにより増幅した。
エクストリームＰＣＲに対する生成物の長さの影響と、様々なプライマーの起こり得る交
絡的影響の調整を研究するために、まず共通の５’末端伸長部分を有するプライマーを使
用してゲノムＤＮＡからフラグメントを増幅した。１３５ｂｐのフラグメントの場合、プ
ライマーは、ＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣ
ＡＣＡＡＡＡＡＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＴＴＡＡＡＴＡＣＧ（配列番号１２）およびＧＡＧ
ＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧ
ＡＧＡＡＡＡＡＣＣＡＧＡＧＣＴＡＡＡＧＧＧＡＡＧ（配列番号１３）であった。３３７
ｂｐのフラグメントの場合、プライマーは、ＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣ
ＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＡＡＡＡＧＣＴＧＧＴＧＴＣＴＧＣＴＡＴＡＧＡＡ
ＣＴＧＡＴＴ（配列番号１４）およびＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧ
ＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＡＧＴＴＧＣＣＡＧＡＧＣＴＡ
ＡＡＧＧＧＡＡＧＧ（配列番号１５）であった。ゲノムＤＮＡからの標準的なＰＣＲ増幅
の後に、プライマーおよびｄＮＴＰをＥｘｏＳＡＰ−ＩＴ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、ＣＡ
）によって分解し、続いてＱｕｉｃｋＳｔｅｐ（商標）２ＰＣＲ精製キット（カタログ番
号３３６１７、Ｅｄｇｅ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を
使用してＰＣＲ生成物を精製した。ＰＣＲ生成物をおよそ１００万倍に希釈し、標準的な
リアルタイムＰＣＲにより得られたＣｑを等しくすることにより等しい濃度に調節し、２
５サイクルのＣｑ（反応液１０μｌあたりおよそ１０，０００コピー）を達成した。
【００７６】
総体積５μｌの増幅したテンプレートの１，０００コピーに、２μＭのポリメラーゼお
よび２％グリセロールと共に共通のプライマーＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡ
ＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＡＡＡＡ（配列番号１６）およびＧＡＧＡＧＡＧ
ＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＡ
ＡＡＡ（配列番号１７）をそれぞれ２μＭで使用してエクストリームＰＣＲを行った。１
３５ｂｐのＢＢＳ２フラグメントからは２２６ｂｐの生成物が得られ、（プライマーに応
じて）１７６塩基または１８５塩基の伸長を必要としたが、３３７ｂｐのＢＢＳ２フラグ
メントからは４２８ｂｐのＰＣＲ生成物が得られ、３７８塩基または３８７塩基の伸長を
必要とした。アガロースゲルで、さらに融解分析によって特異的増幅を検証した。図８ａ
に、２２６ｂｐの生成物に使用された、７５℃の１秒の併合されたアニール／伸長および
８７℃の変性を含むエクストリームＰＣＲの温度プロファイルを示す。さらに同じ温度で
２秒のアニール／伸長期も行った（軌跡示さず）。図８ｃに示されたこれらの増幅に関す
るリアルタイムＰＣＲの結果から、１秒の伸長を用いた場合、２秒の伸長と比較してＣｑ
が約５サイクル高くシフトしたことが明らかになったが、これはおそらく伸長時間が短く
なるにつれて効率も減少したことを反映しているものと思われる。図８ｂに、７５℃の４
秒の併合されたアニール／伸長および８７℃の変性を示し、これは、４２８ｂｐの生成物
に使用されたエクストリームＰＣＲの温度プロファイルを示す。さらに同じ温度で５秒の
アニール／伸長期も行った（軌跡示さず）。図８ｄに示されたこれらの増幅に関するリア
ルタイムＰＣＲの結果から、４秒の伸長を用いた場合、５秒の伸長と比較してＣｑが約２
サイクル高くシフトしたことが明らかになったが、これはおそらく伸長時間が短くなるに
つれて効率も減少したことを反映しているものと思われる。
【実施例７】
【００７７】
実施例５のＮＱＯ１の１０２ｂｐのフラグメントおよび実施例１のＫＣＮＥ１の４５ｂ
ｐのフラグメントに関して、ヒトゲノムＤＮＡの希釈系列を使用して、ＮＱＯ１には２μ
ＭのＫｌｅｎＴａｑおよび８μＭの各プライマー、ならびにＫＮＣＥ１には８μＭのＫｌ
ｅｎＴａｑおよび２０μＭの各プライマーを使用して、図１ｂのリアルタイム機器を使用
してＰＣＲの定量性能を評価した。図９ａおよび図９ｂでみられるように、少なくとも４
０のダイナミックレンジを用いたところ、標準曲線から計算された増幅効率は、ＮＱＯ１
では９５．８％であり、ＫＣＮＥ１では９１．７％であった。テンプレート不使用の対照
反応では、５０サイクル後に増幅は起こらず、単一コピーの複製物（平均コピー数は、１
反応あたり１．５コピー）は、増幅曲線の形状および強度においてより高い濃度と類似し
ていた（図９Ａおよび図９Ｃ）。０．１５コピー／反応の平均コピー数では、二項展開に
より計算された０．１３コピー／反応の期待値を用いたところ、（ＮＱＯ１の試験とＫＣ
ＮＥ１の試験の両方を合わせた）１７の反応のうち２つの反応が陽性であった。
【実施例８】
【００７８】
リアルタイムＰＣＲを使用する際、様々な生成物の長さに応じた伸長時間が必要である
（図１０ａ〜ｃ）。様々なプライマーの起こり得る交絡的影響を調整するため、１００〜
５００ｂｐの合成テンプレートと共に以下の共通の高いＴｍ（７７℃）を有するプライマ
ーを使用した。
ACTCGCACGAACTCACCGCACTCC（配列番号１８）およびGCTCTCACTCGCACTCTCACGCACA（配列番
号１９）
【００７９】
合成テンプレート配列は以下の通りである。
１００ｂｐのテンプレート：
ACTCGCACGAACTCACCGCACTCCGGATGGATTGTGAAGAGGCCCAAGATACTGGTCATATTATCCTTTGATCTAGCTCT
CACTCGCACTCTCACGCACA（配列番号２０）
【００８０】
２００ｂｐのテンプレート：
ACTCGCACGAACTCACCGCACTCCTCAATGCTGACAAATCGAAAGAATAGGAATAGCGTAATTACTAGAGGACTCCAATA
TAGTATATTACCCTGGTGACCGCCTGTACTGTAGGAACACTACCGCGGTTATATTGACAGCTTAGCAATCTACCCTGTTG
GGATCTGTTTAAGTGGCTCTCACTCGCACTCTCACGCACA（配列番号２１）
【００８１】
３００ｂｐのテンプレート：
ACTCGCACGAACTCACCGCACTCCCCTTCGAATATAAAGTACGACATTACTAGCAATGACAGTTCCAGGATTTAAGAAAG
TAGTGTTCCACATCAATGCATATCCAGTGAAAGCATAACGTCAAAAAAAGCCTGGCACCGTTCGCGATCTGGACTTACTT
AGATTTGTTGTAGTCAAGCCGGCTATCAGCGATTTATCCCGGAAACACATACTAGTGAGTTATTTGTATGTTACCTAGAA
TAGCTGTCACGAATCACTAATACATTCACCCACCAGCTCTCACTCGCACTCTCACGCACA（配列番号２２）
【００８２】
４００ｂｐのテンプレート：
ACTCGCACGAACTCACCGCACTCCTGAATACAAGACGACAGTCCTGATTATATTTTCATTTAATTACGCCAATTTAATTA
TGATGAATATTAACGGAATTAAATATGTATTGATAAGTACTAAGTAATGGTTTACCCACGGCGATCTATATGCAAGGGAA
ACATTAACAAATTTAAACATCTGATGTGGACAAAACTTGTAATGTGGTATAGTTAAAAATATAGGTTTCAGGGACACGTA
AGTATCTATCTTGAATGTTTAAGTAGGTCCTGTCTACCATTCTGAAATTTAGAAAATCGCGTTCATCGGGCTGTCGGCTA
CACCTCAGAAAACCATTTCGTGTTGCACAGGAGGAACTTTCGAGGGTTCGTATGAGCTCTCACTCGCACTCTCACGCACA
（配列番号２３）
【００８３】
５００ｂｐのテンプレート：
ACTCGCACGAACTCACCGCACTCCACCGCTTGACGACGTAGGGTATTTGGTATCTGAATCTACTCATTTACCTACATACT
GAAGATTTTGCGATCGTCTAATATATTGGACTAATGCCCGATTTCTGATCAATTACTCTAGGCGATACTTCATCGCTGGC
CTTATTTGGATTTTGCTCAAGTGCTAAACTCTCTGCGCGTCAATACTAGTCTGACATCAGTCAAGACCTGCTATCTGAAA
ACTACTAGAGAGATATACCTAACAACTTTAGTGGATAAATCAGGTCTGGAGATTGTCATATAATGCCACTAGGGTCAGAA
GGCTGTGTCAAAGTTAGTGGTTAGTAGGTCTCCGCTCTGCGGTACTATTCTTATATTCTCTTACTATGCATCAAACAAAA
TAGAATGCATAGACAAACCGCCTGCCAAGTTTACAAGATAACTTGCGTATAGGTTTATAAGGGTTCTTCTGTATCGCTCT
CACTCGCACTCTCACGCACA（配列番号２４）
【００８４】
まず、中程度の長さの３００ｂｐの生成物に関して、４秒の併合されたアニール／伸長
セグメントを１サイクルあたり４．９秒で使用して、プライマーおよびポリメラーゼの最
適な濃度を決定した（図１０ａ）。次いで全ての生成物の長さに関して、同一のプライマ
ー濃度（４μＭ）およびポリメラーゼ濃度（２μＭ）を使用して、最小の伸長時間を決定
した（図１１ａ〜ｅ）。生成物の長さに応じて、伸長時間が増加すると、さらなる変化が
観察されなくなるまでの定量サイクル（Ｃｑ）がわずかに減少したことから、効率的なＰ
ＣＲに必要な最小の伸長時間が示された。例えば、図１０Ｂに、ＫＡＰＡ２Ｇ（商標）Ｆ
ＡＳＴポリメラーゼ（Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した５００ｂｐの生成物
に関する増幅曲線を示す。ＫＡＰＡ２Ｇ  ＦＡＳＴポリメラーゼを使用した場合の最小の
伸長時間は３秒であり、これに対してＫｌｅｎＴａｑ１（Ｔａｑポリメラーゼの欠失突然
変異体、ＡＢ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）を使用した場合は７秒であった。ポリメラーゼの同一
性が一定に維持される場合、より長い生成物はより長い伸長時間を必要とした（図１０ｃ
）。ＫｌｅｎＴａｑ１ポリメラーゼの場合、６０ｂｐごとに約１秒を要し、一方でＫＡＰ
Ａ２Ｇ  ＦＡＳＴポリメラーゼの場合、１５８ｂｐごとに１秒を要する。これらの２種の
ポリメラーゼは十分な濃度で市販されているが、その他ほとんどのポリメラーゼはこのよ
うな高濃度では市販されていないために、これらのポリメラーゼが選ばれたことに留意さ
れたい。伸長に必要な時間は、伸長させようとする長さに直接的かつ直線的に依存してお
り、ポリメラーゼ濃度およびポリメラーゼ速度とは反比例することが理解される。これら
の３種のパラメーターを関連付ける比例定数（ｋ２）は、以下のように定義することがで
きる。
必要な伸長時間＝ｋ２＊（伸長の長さ）／（［ポリメラーゼ］＊（ポリメラーゼ速度））
【実施例９】
【００８５】
エクストリームＰＣＲ時間は、高いＭｇ＋＋濃度を用いて短くすることもできる。プラ
イマー：ＧＣＴＴＧＧＡＡＧＡＴＴＧＣＴＡＡＡＡＴＧＡＴＡＧＴＣＡＧＴＧ（配列番号
２５）およびＴＴＧＡＴＣＡＴＡＣＴＧＡＧＣＣＴＧＣＴＧＣＡＴＡＡ（配列番号２６）
を用いてＡＫＡＰ１０の６０ｂｐのフラグメントを増幅し、アンプリコンＧＣＴＴＧＧＡ
ＡＧＡＴＴＧＣＴＡＡＡＡＴＧＡＴＡＧＴＣＡＧＴＧＡＣ（Ａ／Ｇ）ＴＴＡＴＧＣＡＧＣ
ＡＧＧＣＴＣＡＧＴＡＴＧＡＴＣＡＡ（配列番号２７）を生成した。
【００８６】
各反応は、体積１μｌで、３５サイクルを時間ベースで制御して（９４℃の水槽中で０
．０７秒、６０℃の水槽中で０．１〜０．４秒）、２〜７ｍＭのＭｇＣｌ２を使用して行
われた。サンプル体積は１μｌであり、５ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ、２０μＭのプライマ
ー、および８μＭのポリメラーゼを含んでいた。１サイクルあたり０．４２秒のプロトコ
ールを使用したところ、ＭｇＣｌ２が２〜３ｍＭのときに、融解曲線（図１２ａ）および
ゲル（図１２ｂ）で生成物は観察されなかった。４ｍＭで最低限の生成物が存在したが、
５〜７ｍＭのＭｇＣｌ２で増幅した後に大量の生成物が観察された。５ｍＭのＭｇＣｌ２
では、０．３２秒のサイクル時間を用いた場合、融解曲線（図１３ａ）およびゲル（図１
３ｂ）で生成物は観察されなかったが、０．４２秒、０．５２秒、および０．６２秒のサ
イクル時間では大量の生成物が示され、このことは、１５秒（１４．７秒で３５サイクル
）で行われたＰＣＲにおいて特異的な高収量の６０ｂｐの生成物が得られることを実証し
ている。したがって、例示的なＭｇ＋＋濃度は、少なくとも４ｍＭ、少なくとも５ｍＭ、
少なくとも６ｍＭ、少なくとも７ｍＭ、またはそれより高く、これらの例示的なＭｇ＋＋
濃度は、本明細書で説明される実施形態のいずれかと共に使用できることが理解される。
【実施例１０】
【００８７】
エクストリームＰＣＲで使用される高濃度のプライマーおよびポリメラーゼは、より遅
いサイクル速度で使用すると有害作用を有する場合がある。それぞれ３２倍または１０６
倍遅い迅速サイクルまたはブロックベースの機器では、非特異的生成物が生じた。図１４
ａ〜ｂは、実施例９で使用されたＡＫＡＰ１０の６０ｂｐの生成物の増幅を比較した結果
を示すが、この場合、増幅は、２０μＭの各プライマー、８μＭのＫｌｅｎＴａｑ、およ
び１０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡを使用して、（１）およそ１７秒の総時間をもたらす９４
°で０．５秒および６０°で０．２秒の設定時間を用いたエクストリームＰＣＲ、（２）
およそ９分の総時間をもたらす９４°で１０秒の最初の変性、続いて０秒で８５°および
０秒で６０°のサイクルの設定時間を使用した迅速サイクルＰＣＲ（Ｒｏｃｈｅ  Ｌｉｇ
ｈｔＣｙｃｌｅｒ）、および（３）およそ３０分の総時間をもたらす９４°で１０秒の最
初の変性、続いて８５°で０秒および６０°で５秒の温度サイクリングを用いた旧来の（
ブロック）温度サイクリング（ＢｉｏＲａｄ  ＣＦＸ９６）を４０サイクルで使用して行
われた。示されたように、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒの迅速サイクリングでさえもかなりの
非特異的増幅を生じたが、エクストリームサイクリング条件では単一の融解ピークと、ゲ
ルにおける最小の非特異的増幅が達成された。
【００８８】
また注目すべきことに、エクストリームＰＣＲでは、高いプライマー濃度およびポリメ
ラーゼ濃度によっても収量が強化される。比較のために定量的ＰＣＲを使用したところ、
エクストリームＰＣＲは迅速サイクルＰＣＲと比較して３０倍を超える量の生成物を生産
した（データ示さず）。
【００８９】
実施例１〜１０は全て、図１ａ〜１ｄで説明されている１つまたは複数のデバイス、ま
たはこれらの構成にわずかな改変を施したものを使用して行われた。しかし、本明細書で
説明される方法および反応は、様々な機器で起こる場合があることが理解される。これら
の実施例で使用される水槽およびチューブは、濃度を高めたプライマーおよびポリメラー
ゼの作用を研究するのに十分な迅速な温度変化をもたらす。しかし、他の実施形態が商業
的により好適である場合がある。低容量および高い表面積対体積比のマイクロ流体システ
ムが、エクストリームＰＣＲによく適している場合がある。このようなシステムは、エク
ストリームＰＣＲで使用される高濃度のプライマーおよびポリメラーゼで求められる迅速
な温度変化を可能にする。マイクロ流体システムは、サンプルを変性ゾーン、アニーリン
グゾーン、および伸長温度ゾーンに繰り返し通す小型化されたチャネルを取り入れたマイ
クロフローシステム（３５、５３）を包含する。これらのシステムのいくつかは、複雑度
がより低い標的で３秒もの速いサイクル時間の有効なＰＣＲであることがすでに実証され
ている。ポリメラーゼが少なくとも０．５μＭの濃度で提供され、プライマーはそれぞれ
少なくとも２μＭの濃度で提供される場合、このようなシステムでより複雑な標的を増幅
できることが期待される。また定置式のＰＣＲチップおよびＰＣＲ液滴形成システム（５
４）は、１ｎｌまたはそれ未満もの小さい体積が可能であり、さらに極めて迅速なサイク
リングを許容するほど十分に低くできることから、プライマーおよびプローブの濃度の増
加によって利益を得る場合もある。より遅いサイクル速度でより高いプライマー濃度を用
いることに伴う特異性を損なうことなく増加させたプライマー濃度およびポリメラーゼ濃
度を利用できるほど十分速く機器の温度がサイクリングするのであれば、本発明にとって
正確な機器は重要ではないことが理解される。
【００９０】
上記の実施例はいずれもＰＣＲを用いたが、ＰＣＲは単なる例示であり、ＰＣＲ以外の
核酸増幅方法にも増加したプライマー濃度および酵素濃度とより短い増幅時間との組み合
わせが想定されることが理解される。規模を増加させることができる例示的な酵素活性と
しては、重合（ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素）、ライゲー
ション、へリックスの巻き戻し（ヘリカーゼ）、またはエキソヌクレアーゼ活性（５’か
ら３’または３’から５’）、鎖の置換および／もしくは切断、エンドヌクレアーゼ活性
、ならびにＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドのＲＮＡ消化（ＲＮアーゼＨ）が挙げられる。増
幅反応としては、これらに限定されないが、ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応、
転写介在増幅（例えば転写ベースの増幅システム、自家持続配列複製法、および核酸配列
ベースの増幅など）、鎖置換増幅、全ゲノム増幅、多置換増幅、アンチセンスＲＮＡ増幅
、ループ介在増幅、線形結合増幅（ｌｉｎｅａｒ−ｌｉｎｋｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔ
ｉｏｎ）、ローリングサークル増幅、分岐増幅（ｒａｍｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｍｐｌｉ
ｆｉｃａｔｉｏｎ）、等温オリゴヌクレオチド増幅、ヘリカーゼ連鎖反応、および連続侵
入シグナル増幅（ｓｅｒｉａｌ  ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｓｉｇｎａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａ
ｔｉｏｎ）などが挙げられる。
【００９１】
一般的には、酵素活性が変化すると、同じ倍率で増幅時間は反比例して変化する。プラ
イマーを包含する反応の場合、プライマー濃度が変化すると、同じ倍率で増幅時間は反比
例して変化する。プライマーと酵素の両方が増幅に必要な場合、反応速度を最大化するた
めには酵素濃度とプライマー濃度の両方を変化させるべきである。増幅サイクルの固有の
セグメント（例えば、３温度ＰＣＲ中の固有の温度）でプライマーのアニーリングが起こ
る場合、そのセグメントにおいてプライマーのアニーリングが十分に完了するのに必要な
時間は、プライマー濃度と反比例すると予想される。同様に、増幅サイクルの固有のセグ
メント（例えば、３温度ＰＣＲ中の固有の温度）で酵素活性が必要な場合、そのセグメン
トにおいて酵素的なプロセスが十分に完了するのに必要な時間は、所定の範囲内で酵素濃
度に反比例すると予想される。プライマー濃度または酵素濃度の変更は、それら個々のセ
グメントに要する時間を変化させるのに使用でき、または同じ条件下で（例えば２温度Ｐ
ＣＲにおいて、または等温反応プロセス中に）その両方が起こる場合、１つの反応が反応
速度を制限しないように両方の濃度の変更が必要であることが予想される。増幅プロセス
をさらに加速するために、Ｍｇ＋＋濃度の増加を酵素濃度およびプライマー濃度の増加と
組み合わせて使用してもよい。より高いＭｇ＋＋濃度は、プライマーのアニーリングの速
度を増加させ、かつ核酸増幅で使用される多くの酵素反応にかかる時間を短くする。
【００９２】
より高いＭｇ＋＋、酵素、およびプライマーの濃度は、より短い増幅時間またはセグメ
ントと共に使用される場合、特に有用である。時間を短くしないでより高い濃度を使用す
ると、いくつかのケースにおいて、反応の「ストリンジェンシー」が低下するために非特
異的な増幅生成物が生じる場合がある。増幅時間またはセグメント時間（秒）を短くする
ことは、増加した反応物濃度によるストリンジェンシーの損失を埋め合わせるように見え
るより高いストリンジェンシーを導入する。逆に言えば、増幅時間またはセグメント時間
を増加させることによりこれらのより低い濃度を相殺すれば、反応物濃度を低下させるこ
とによって試薬のコストを最小化できる。
【００９３】
ポリメラーゼ濃度を増加させることにより、長時間のＰＣＲ、例示的には標的が５〜５
０ｋｂである場合のＰＣＲに必要な時間を短くできる。大きい標的を増幅するには、典型
的には１０分〜３０分の伸長期間が使用されるが、これはなぜなら、１）ポリメラーゼが
単一の標的の伸長を完了させるため、および２）再利用された酵素が、追加のプライマー
が結合したテンプレートを重合させるためにそのような時間が必要になるほど大きい標的
が長いためである。ＰＣＲの開始時には、利用可能な酵素のほうがプライマーが結合した
テンプレート分子よりも多く存在するため、このようなポリメラーゼの再利用は必要ない
。しかし、対数期が終わる前でも、ポリメラーゼ分子の数が限界になることがしばしばあ
り、酵素の再利用が必要である。ポリメラーゼ濃度を増加させることによって、高いプラ
イマー濃度に起因する収量増加を維持しつつ必要な伸長期間を５分未満まで、場合によっ
ては２分未満まで短くできる。実際の酵素の速度は増加しないが、それほど再利用は必要
ではなく、必要な最小の時間は、ほぼ直線的に酵素濃度の影響を受ける。
【００９４】
プライマー濃度とポリメラーゼ濃度とを増加させることによりサイクルシーケンシング
時間も短くできる。典型的には、標準的なサイクルシーケンシングにおいて、プライマー
濃度は０．１６μＭであり、併合されたアニール／伸長期間は５０〜６０℃で１０分であ
る。プライマー濃度とポリメラーゼ濃度とを１０倍増加させることによって、アニール／
伸長に必要な時間をおよそ１０倍短くできる。長いＰＣＲとサイクルシーケンシングの両
方において、予想される必要な時間は、ポリメラーゼまたはプライマー濃度のどちらか限
定的なほうに反比例する。
【００９５】
エクストリーム温度サイクリングとより高い濃度のプライマー、ポリメラーゼ、および
／またはＭｇ＋＋とを組み合わせることによって、大規模並列配列決定のための調製にお
いてプライマーとして使用されるリンカーがライゲーションしたフラグメントのＰＣＲを
、現行のものよりもかなり短い時間で完了させることができる。
【００９６】
上記した全ての用途において、より短い増幅時間で反応特異性が維持されるものと予想
される。当業者であれば、高いプライマー濃度およびポリメラーゼ濃度は非特異的増幅に
よる問題を引き起こすことを想像するであろうが、全体のサイクル時間および／または個
々のセグメント時間を最小化することにより、ＰＣＲの高い特異性および効率がもたらさ
れる。
【表２】
2020115878.tif 000003
【表３】
2020115878.tif 000004
【００９７】
表２に、エクストリームＰＣＲの具体的な条件を示す。同時に行われた標的のうち３種
に関するポリメラーゼおよびプライマー濃度の最適化実験以外の全てのデータが示される
。表３に、変数間の定量的な関係が詳述されている。必要なアニーリング時間をプライマ
ー濃度に関連付ける反比例関係はほぼ一定（ｋ１）であり、方程式（必要なアニーリング
時間）＝ｋ１／［プライマー］によって定義される。旧来の（標準）ＰＣＲ、迅速サイク
ルＰＣＲ、およびエクストリームＰＣＲの条件下でこれらの変数の典型的な値の範囲を使
用することにより反比例定数の範囲が得られ、その大部分は重複している（旧来のＰＣＲ
は０．７５〜３０、迅速サイクルＰＣＲは０．２〜１０、およびエクストリームＰＣＲは
１〜２０である）。この反比例定数によって、現行のものの範囲から外れる望ましいアニ
ーリング時間は、望ましい時間に必要なプライマー濃度を予測するのに使用できる。例え
ば、０．０１秒のアニーリング時間で５（秒＊μＭ）の定数を使用すれば、５００μＭの
プライマー濃度の計算が可能である。逆に言えば、０．０１μＭのプライマー濃度が望ま
しい場合、必要なアニーリング時間は５００秒と予想される。これらの条件は旧来のＰＣ
ＲおよびエクストリームＰＣＲ両方の範囲の外側であるが、これらの条件によりＰＣＲの
成功に有用なプライマー濃度とアニーリング時間との関係が予測される。旧来のＰＣＲ、
迅速サイクルＰＣＲ、およびエクストリームＰＣＲ全てにおいて適切なｋ１の範囲は、０
．５〜２０（秒×μＭ）であり、より好ましくは１〜１０（秒×μＭ）であり、最も好ま
しくは３〜６（秒×μＭ）である。
【００９８】
また類似の計算を行うことによっても、望ましい伸長時間と、ポリメラーゼ濃度、ポリ
メラーゼ速度、および増幅させようとする生成物の長さとを関連付けることができる。し
かし、長期にわたり様々な実験室で行われてきた旧来のＰＣＲ、迅速サイクルＰＣＲ、お
よびエクストリームＰＣＲに影響を与える多くの追加の変数（ポリメラーゼ、Ｍｇ＋＋、
緩衝液）については、本明細書において変数間の反比例関係を確立するために示されたよ
く制御されたエクストリームＰＣＲ条件を調べることが最善である場合がある。それによ
り、エクストリームＰＣＲ条件下でのポリメラーゼ濃度、ポリメラーゼ速度、生成物の長
さ、および必要な伸長時間を定量的に表すことができる。定義方程式は、（必要な伸長時
間）＝ｋ２（生成物の長さ）／（［ポリメラーゼ］＊（ポリメラーゼ速度））である。実
験的に決定されたｋ２は、上記の方程式において、温度、Ｍｇ＋＋、ポリメラーゼのタイ
プ、緩衝液、添加剤、およびｄｓＤＮＡ色素濃度を一定にした条件下での比例定数と定義
される。［ポリメラーゼ］および［プライマー］の二次元最適化がなされた３種のエクス
トリームＰＣＲ標的に関して、プライマー濃度全体にわたり成功した増幅の境界線にある
［ポリメラーゼ］を見極めて、他の３つの変数と関連付けることができる。表３で示され
るように、これらの３種の異なる標的に関するｋ２値は２未満の倍率で変化していること
から、ｋ２は定数であり、他方がわかっているときにある変数を予測するのに使用できる
と推測される。必要な伸長時間は、伸長の長さ（生成物の長さからプライマーの長さを引
いた長さ）に比例し、ポリメラーゼ速度とポリメラーゼ濃度に反比例する。ｋ２は（１／
μＭ）の単位で示され、本明細書において使用されるエクストリームＰＣＲ条件にとって
最適な値は、０．３〜０．７（１／μＭ）の範囲のうち０．５（１／μＭ）である。ポリ
メラーゼのタイプ、Ｍｇ＋＋濃度、または異なる緩衝液もしくは色素の状態の点で異なる
他の反応条件でも、類似のｋ２値が誘導される場合がある。
【００９９】
サンプル温度を急速に変化させることができるのであればどのような種類の容器でもエ
クストリームＰＣＲを行うことができる。標準的なチューブおよびキャピラリーに加えて
、油のストリーム中に懸濁した水性反応物の微小液滴または薄い２次元ウェーハが、優れ
た熱的接触をもたらす。エクストリームＰＣＲの速さに必要な温度制御のための優れた方
法は、空間的なセグメントを様々な温度で通過するサンプルストリームの連続流ＰＣＲ（
液滴として分散する、気泡で分離する、または他の手段で混合を防ぐことのいずれか）で
ある。
【０１００】
参考文献
【表４Ａ】
2020115878.tif 000005
【表４Ｂ】
2020115878.tif 000006
【表４Ｃ】
2020115878.tif 000007
【表４Ｄ】
2020115878.tif 000008
【表４Ｅ】
2020115878.tif 000009
【０１０１】
好ましい実施形態を参照しながら本発明を詳細に説明したが、以下の特許請求の範囲で
記載および定義された本発明の範囲および趣旨内にある変更形態および改変形態が存在す
る。
【図１ａ】
2020115878.tif 000010
【図１ｂ】
2020115878.tif 000011
【図１ｃ】
2020115878.tif 000012
【図１ｄ】
2020115878.tif 000013
【図２ａ】
2020115878.tif 000014
【図２ｂ】
2020115878.tif 000015
【図２ｃ】
2020115878.tif 000016
【図３ａ】
2020115878.tif 000017
【図３ｂ】
2020115878.tif 000018
【図３ｃ】
2020115878.tif 000019
【図４ａ】
2020115878.tif 000020
【図４ｂ】
2020115878.tif 000021
【図４ｃ】
2020115878.tif 000022
【図５ａ】
2020115878.tif 000023
【図５ｂ】
2020115878.tif 000024
【図５ｃ】
2020115878.tif 000025
【図５ｄ】
2020115878.tif 000026
【図６ａ】
2020115878.tif 000027
【図６ｂ】
2020115878.tif 000028
【図７ａ】
2020115878.tif 000029
【図７ｂ】
2020115878.tif 000030
【図８ａ】
2020115878.tif 000031
【図８ｂ】
2020115878.tif 000032
【図８ｃ】
2020115878.tif 000033
【図８ｄ】
2020115878.tif 000034
【図９ａ】
2020115878.tif 000035
【図９ｂ】
2020115878.tif 000036
【図９ｃ】
2020115878.tif 000037
【図９ｄ】
2020115878.tif 000038
【図１０ａ】
2020115878.tif 000039
【図１０ｂ】
2020115878.tif 000040
【図１０ｃ】
2020115878.tif 000041
【図１１ａ】
2020115878.tif 000042
【図１１ｂ】
2020115878.tif 000043
【図１１ｃ】
2020115878.tif 000044
【図１１ｄ】
2020115878.tif 000045
【図１１ｅ】
2020115878.tif 000046
【図１２ａ】
2020115878.tif 000047
【図１２ｂ】
2020115878.tif 000048
【図１３ａ】
2020115878.tif 000049
【図１３ｂ】
2020115878.tif 000050
【図１４ａ】
2020115878.tif 000051
【図１４ｂ】
2020115878.tif 000052
【図１５ａ】
2020115878.tif 000053
【図１５ｂ】
2020115878.tif 000054
【手続補正書】
【提出日】令和2年4月8日(2020.4.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸に対してＰＣＲを行うためのキットであって、
ｄＮＴＰと、
少なくとも０．５μＭの濃度で提供されるポリメラーゼと、
少なくとも２μＭの濃度でそれぞれ提供される、前記標的核酸を増幅するように構成された一対のプライマーと
を含むキット。
【請求項２】
それぞれの前記プライマーの濃度が、２．５μＭより大きい、請求項１に記載のキット。
【請求項３】
少なくとも４ｍＭの前記Ｍｇ＋＋をさらに含む、請求項１に記載のキット。
【請求項４】
各サイクルが１サイクルあたり２０秒未満のサイクル時間で完了する温度サイクリングプロファイルを使用してＰＣＲを行うための説明書をさらに含む、請求項１に記載のキット。
【請求項５】
前記サイクル時間が１サイクルあたり１０秒未満である、請求項４に記載のキット。
【請求項６】
前記ポリメラーゼが、少なくとも１．０μＭの濃度で提供されるＫｌｅｎＴａｑ（商標）である、請求項１に記載のキット。
【請求項７】
前記標的核酸が真核生物由来であり、真核生物ゲノムＤＮＡを増幅するように構成されている、請求項１に記載のキット。
【請求項８】
標的核酸に対してＰＣＲを行うためのキットであって、
ｄＮＴＰと、
熱安定性ポリメラーゼと、
前記標的核酸配列を増幅するように構成されたプライマーと
を含むキットであって、前記ポリメラーゼとプライマーの比率が、（約０．０３〜約０．４のポリメラーゼ）：（プライマーの総濃度）であり、前記ポリメラーゼの濃度が少なくとも０．５μＭである、キット。
【請求項９】
前記プライマーが少なくとも５μＭの総濃度である、請求項８に記載のキット。
【請求項１０】
前記ポリメラーゼが、少なくとも１．０μＭの濃度で提供されるＫｌｅｎＴａｑ（商標）である、請求項１に記載のキット。
【請求項１１】
各サイクルが１サイクルあたり２０秒未満のサイクル時間で完了する温度サイクリングプロファイルを使用してＰＣＲを行うための説明書をさらに含む、請求項８に記載のキット。
【請求項１２】
前記サイクル時間が１サイクルあたり１０秒未満である、請求項８に記載のキット。
【請求項１３】
前記標的核酸が真核生物由来であり、真核生物ゲノムＤＮＡを増幅するように構成されている、請求項８に記載のキット。
【請求項１４】
標的とする真核生物ＤＮＡに対してＰＣＲを行うための反応混合物であって、
ｄＮＴＰと、
少なくとも０．５μＭの濃度で提供されるポリメラーゼと、
少なくとも２μＭの濃度でそれぞれ提供される、前記標的とする真核生物ＤＮＡを増幅するように構成された一対のプライマーと、
真核生物ゲノムＤＮＡのサンプルを
を含む、反応混合物。
【請求項１５】
それぞれの前記プライマーの濃度が、２．５μＭより大きい、請求項１４に記載の反応混合物。
【請求項１６】
少なくとも４ｍＭの前記Ｍｇ＋＋をさらに含む、請求項１４に記載の反応混合物。
【請求項１７】
各サイクルが１サイクルあたり２０秒未満のサイクル時間で完了する温度サイクリングプロファイルを使用してＰＣＲを行うための説明書をさらに含む、請求項１４に記載の反応混合物。
【請求項１８】
前記サイクル時間が１サイクルあたり１０秒未満である、請求項１７に記載の反応混合物。
【請求項１９】
前記ポリメラーゼが、少なくとも１．０μＭの濃度で提供されるＫｌｅｎＴａｑ（商標）である、請求項１４に記載の反応混合物。
【手続補正書】
【提出日】令和2年6月19日(2020.6.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸に対してＰＣＲを行うためのキットであって、
ｄＮＴＰと、
少なくとも０．５μＭの濃度で提供されるポリメラーゼと、
少なくとも２μＭの濃度でそれぞれ提供される、前記標的核酸を増幅するように構成された一対のプライマーと
を含むキット。
【請求項２】
それぞれの前記プライマーの濃度が、２．５μＭより大きい、請求項１に記載のキット。
【請求項３】
少なくとも４ｍＭの前記Ｍｇ＋＋をさらに含む、請求項１に記載のキット。
【請求項４】
各サイクルが１サイクルあたり２０秒未満のサイクル時間で完了する温度サイクリングプロファイルを使用してＰＣＲを行うための説明書をさらに含む、請求項１に記載のキット。
【請求項５】
前記サイクル時間が１サイクルあたり１０秒未満である、請求項４に記載のキット。
【請求項６】
前記ポリメラーゼが、少なくとも１．０μＭの濃度で提供されるＫｌｅｎＴａｑ（商標）である、請求項１に記載のキット。
【請求項７】
前記標的核酸が真核生物由来であり、真核生物ゲノムＤＮＡを増幅するように構成されている、請求項１に記載のキット。
【請求項８】
標的核酸に対してＰＣＲを行うためのキットであって、
ｄＮＴＰと、
熱安定性ポリメラーゼと、
前記標的核酸配列を増幅するように構成されたプライマーと
を含むキットであって、前記ポリメラーゼとプライマーの比率が、（約０．０３〜約０．４のポリメラーゼ）：（プライマーの総濃度）であり、前記ポリメラーゼの濃度が少なくとも０．５μＭである、キット。
【請求項９】
前記プライマーが少なくとも５μＭの総濃度である、請求項８に記載のキット。
【請求項１０】
前記ポリメラーゼが、少なくとも１．０μＭの濃度で提供されるＫｌｅｎＴａｑ（商標）である、請求項１に記載のキット。
【請求項１１】
各サイクルが１サイクルあたり２０秒未満のサイクル時間で完了する温度サイクリングプロファイルを使用してＰＣＲを行うための説明書をさらに含む、請求項８に記載のキット。
【請求項１２】
前記サイクル時間が１サイクルあたり１０秒未満である、請求項８に記載のキット。
【請求項１３】
前記標的核酸が真核生物由来であり、真核生物ゲノムＤＮＡを増幅するように構成されている、請求項８に記載のキット。
【請求項１４】
標的とする真核生物ＤＮＡに対してＰＣＲを行うための反応混合物であって、
ｄＮＴＰと、
少なくとも０．５μＭの濃度で提供されるポリメラーゼと、
少なくとも２μＭの濃度でそれぞれ提供される、前記標的とする真核生物ＤＮＡを増幅するように構成された一対のプライマーと、
真核生物ゲノムＤＮＡのサンプルを
を含む、反応混合物。
【請求項１５】
それぞれの前記プライマーの濃度が、２．５μＭより大きい、請求項１４に記載の反応混合物。
【請求項１６】
少なくとも４ｍＭの前記Ｍｇ＋＋をさらに含む、請求項１４に記載の反応混合物。
【請求項１７】
各サイクルが１サイクルあたり２０秒未満のサイクル時間で完了する温度サイクリングプロファイルを使用してＰＣＲを行うための説明書をさらに含む、請求項１４に記載の反応混合物。
【請求項１８】
前記サイクル時間が１サイクルあたり１０秒未満である、請求項１７に記載の反応混合物。
【請求項１９】
前記ポリメラーゼが、少なくとも１．０μＭの濃度で提供されるＫｌｅｎＴａｑ（商標）である、請求項１４に記載の反応混合物。
【請求項２０】
ＰＣＲを行うためのデバイスであって、
ＰＣＲサンプルを保持するためのサンプル容器と、ここで、前記サンプル容器が、標的核酸と、ｄＮＴＰと、少なくとも０．５μＭの濃度で提供されるポリメラーゼと、少なくとも２μＭの濃度でそれぞれ提供される前記標的核酸を増幅するように構成された一対のプライマーとを含み、
前記サンプル容器中のサンプルの温度を変化させるための熱伝達デバイスと、ここで、前記熱伝達デバイスがジュール加熱および複数の温度ゾーンを含み、前記サンプル容器が前記温度ゾーンのそれぞれにおいて流路を画定し、
前記サンプルを少なくとも２００℃／秒の傾斜速度で繰り返し加熱および冷却するように前記熱伝達デバイスを制御するための温度制御器と、ここで、前記温度制御器が、前記温度ゾーンのそれぞれへの前記サンプルのフローを制御する、
を含むデバイス。
【請求項２１】
ＰＣＲを行うためのデバイスであって、
ＰＣＲサンプルを保持するためのサンプル容器と、ここで、前記サンプル容器が、標的核酸と、ｄＮＴＰと、少なくとも０．５μＭの濃度で提供されるポリメラーゼと、少なくとも２μＭの濃度でそれぞれ提供される前記標的核酸を増幅するように構成された一対のプライマーとを含み、
前記サンプル容器中のサンプルの温度を変化させるための熱伝達デバイスと、ここで、前記熱伝達デバイスが複数の温度ゾーンを含むヒートブロックであり、前記サンプル容器が前記温度ゾーンのそれぞれにおいて流路を画定し、
前記サンプルを少なくとも２００℃／秒の傾斜速度で繰り返し加熱および冷却するように前記熱伝達デバイスを制御するための温度制御器と、ここで、前記温度制御器が、前記温度ゾーンのそれぞれへの前記サンプルのフローを制御する、
を含むデバイス。