(57)【要約】【課題】ハンチンチンの発現を修飾し、そしてハンチントン病および／またはその症状を治療し、予防し、遅らせ、または軽減するための方法の提供。【解決手段】特定の配列の少なくとも８個の隣接した核酸塩基を含む、１２個〜３０個の連結した連結したヌクレオシドからなる修飾されたオリゴヌクレオチドを含む化合物または組成物を投与して、動物（ヒト）におけるハンチンチンｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を減少させるための方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
SEQ ID NO: 6、9、10、11、12、13、14、15、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、32、33、35、または36に記載された配列の少なくとも8個の隣接した核酸塩基を含む、12個〜30個の連結した連結したヌクレオシドからなる修飾されたオリゴヌクレオチドを含む化合物。
【請求項２】
SEQ ID NOsは、SEQ ID NO: 12、22、28、30、32、または33からなる群のいずれかであ
る、請求項1に記載の化合物
【請求項３】
修飾されたオリゴヌクレオチドが、15〜25個の連結したヌクレオシドからなる、請求項1に記載の化合物。
【請求項４】
修飾されたオリゴヌクレオチドが、18〜21個の連結したヌクレオシドからなる、請求項1に記載の化合物。
【請求項５】
連結したヌクレオシドが、SEQ ID NO: 1のヌクレオチド4384-4403、4605-4624、4607-4626、4608-4627、4609-4628、4610-4629、4617-4636、4622-4639、4813-4832、4814-4833、4823-4842、4860-4877、4868-4887、4925-4944、4928-4947、4931-4950、4931-4948、4955-4974、4960-4977、5801-5820、5809-5828、5809-5826、101088-101105、115066-115085、4607-4626、4608-4627、4609-4628、4610-4629、4813-4832、4862-4881、5809-5828
および4928-4947から選択される領域中で相補的な少なくとも8個の連続した核酸塩基を含む、12〜30個の連結したヌクレオシドからなる、修飾されたオリゴヌクレオチドをふくむ化合物。
【請求項６】
核酸塩基配列が、SEQ ID NO: 6、9、10、11、12、13、14、15、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、32、33、35、または36において記載される配列の、少
なくとも15個の隣接した核酸塩基を含む、請求項3に記載の化合物。
【請求項７】
配列番号が、SEQ ID NO: 12、22、28、30、32、または33からなる群のいずれかである
、請求項6に記載の化合物。
【請求項８】
核酸塩基配列が、SEQ ID NO: 6、9、10、11、12、13、14、15、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、32、33、35、または36において記載される配列の少な
くとも18個の隣接した核酸塩基を含む、請求項4に記載の化合物。
【請求項９】
配列番号が、SEQ ID NO: 12、22、28、30、32、または33からなる群のいずれかである
、請求項8に記載の化合物。
【請求項１０】
修飾されたオリゴヌクレオチドが、一本鎖オリゴヌクレオチドである、請求項1に記載
の化合物。
【請求項１１】
修飾されたオリゴヌクレオチドの核酸塩基配列が、SEQ ID NO 1に対して少なくとも90
％相補的である、請求項1に記載の化合物。
【請求項１２】
修飾されたオリゴヌクレオチドの核酸塩基配列が、SEQ ID NO 1に対して少なくとも95
％相補的である、請求項1に記載の化合物。
【請求項１３】
修飾されたオリゴヌクレオチドの核酸塩基配列が、SEQ ID NO 1に対して100％相補的である、請求項1に記載の化合物。
【請求項１４】
少なくとも1つのヌクレオシド間結合が、修飾ヌクレオシド間結合である、請求項1に記載の化合物。
【請求項１５】
各ヌクレオシド間結合が、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、請求項14に記載の化合物。
【請求項１６】
修飾されたオリゴヌクレオチドの少なくとも1つのヌクレオシドが、修飾糖を含む、請
求項1に記載の化合物。
【請求項１７】
少なくとも1つの修飾糖が、2環糖である、請求項16に記載の化合物。
【請求項１８】
少なくとも1つの2環糖のそれぞれが、4'-CH2-N(R)-O-2'ブリッジを含み、ここでRは、
独立して、H、C1〜C12アルキル、または保護基である、請求項17に記載の化合物。
【請求項１９】
少なくとも1つの2環糖のぞれぞれが、4'-CH(CH3)-O-2'ブリッジを含む、請求項17に記
載の化合物。
【請求項２０】
少なくとも1つの修飾糖が、2'-O-メトキシエチル基を含む、請求項16に記載の化合物。
【請求項２１】
少なくとも1つのテトラヒドロピラン修飾ヌクレオシドを含み、ここで、テトラヒドロ
ピラン環は、フラノース環を置換する、請求項1に記載の化合物。
【請求項２２】
少なくとも1つのテトラヒドロピラン修飾ヌクレオシドのそれぞれが、以下の構造：
【化１】
2020115894.tif 000100
を有し、ここで、Bxは、場合により保護されたヘテロ環式塩基部分である、請求項21に記載の化合物。
【請求項２３】
少なくとも1つのヌクレオシドが、修飾核酸塩基を含む、請求項1に記載の化合物。
【請求項２４】
修飾核酸塩基が、5-メチルシトシンである、請求項23に記載の化合物。
【請求項２５】
修飾されたオリゴヌクレオチドが：
連結したデオキシヌクレオシドからなるギャップ部分；
連結したヌクレオシドからなる5'ウィング部分；そして
連結したヌクレオシドからなる3'ウィング部分；
を含み、ここでギャップ部分は、5'ウィング部分と3'ウィング部分との間に位置し、そしてそれぞれのウィング部分のそれぞれのヌクレオシドは修飾糖を含む、請求項1に記載の
化合物。
【請求項２６】
修飾されたオリゴヌクレオチドが：  10個の連結したデオキシヌクレオシドからなるギャップ部分；
5個の連結したヌクレオシドからなる5'ウィング部分；そして
5個の連結したヌクレオシドからなる3'ウィング部分；
を含み、ここでギャップ部分は、5'ウィング部分と3'ウィング部分との間に位置し、それぞれのウィング部分のそれぞれのヌクレオシドが2'-O-メトキシエチル糖を含み；そして
それぞれのヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である、請求項25に記載の化合物。
【請求項２７】
修飾されたオリゴヌクレオチドが：
8個の連結したデオキシヌクレオシドからなるギャップ部分；
5個の連結したヌクレオシドからなる5'ウィング部分；そして
5個の連結したヌクレオシドからなる3'ウィング部分；
を含み、ここでギャップ部分は、5'ウィング部分と3'ウィング部分との間に位置し、それぞれのウィング部分のそれぞれのヌクレオシドが2'-O-メトキシエチル糖を含み；そして
それぞれのヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である、請求項25に記載の化合物。
【請求項２８】
修飾されたオリゴヌクレオチドが：
8個の連結したデオキシヌクレオシドからなるギャップ部分；
6個の連結したヌクレオシドからなる5'ウィング部分；そして
6個の連結したヌクレオシドからなる3'ウィング部分；
を含み、ここでギャップ部分は、5'ウィング部分と3'ウィング部分との間に位置し、それぞれのウィング部分のそれぞれのヌクレオシドは、2'-O-メトキシエチル糖を含み；そし
てそれぞれのヌクレオシド間結合はホスホロチオエート結合である、請求項25に記載の化合物。
【請求項２９】
修飾されたオリゴヌクレオチドが、20個の連結したヌクレオシドからなる、請求項1に
記載の化合物。
【請求項３０】
請求項1〜29のいずれかの化合物またはその塩、および少なくとも1つの薬学的に許容可能な担体または希釈剤を含む、組成物。
【請求項３１】
動物に対して、請求項1〜29のいずれかの化合物または組成物を投与することを含む方
法。
【請求項３２】
動物がヒトである、請求項31に記載の方法。
【請求項３３】
化合物を投与することにより、ハンチントン病の進行を予防し、処置し、軽減しまたは遅らせる、請求項31に記載の方法。
【請求項３４】
化合物または組成物と、第2の薬剤とを共投与することを含む、請求項31に記載の方法
。
【請求項３５】
化合物または組成物と、第2の薬剤とを、付随して投与する、請求項34に記載の方法。
【請求項３６】
投与が、CNSに対するものである、請求項31に記載の方法。
【請求項３７】
動物におけるハンチンチンmRNAまたはタンパク質の発現を減少させるための方法であって、その動物に対して請求項1〜29のいずれかの化合物または組成物を投与して、動物に
おけるハンチンチンmRNAまたはタンパク質の発現することを含む、前記方法。
【請求項３８】
動物がヒトである、請求項37に記載の方法。
【請求項３９】
ハンチンチンmRNAまたはタンパク質発現を減少させることは、ハンチントン病の進行を予防し、治療し、軽減しまたは遅らせる、請求項37に記載の方法。
【請求項４０】
化合物または組成物と、第2の薬剤とを共投与することを含む、請求項37に記載の方法
。
【請求項４１】
化合物または組成物と第2の薬剤とが、付随して投与される. 請求項40に記載の方法。
【請求項４２】
投与がCNSに対するものである、請求項37に記載の方法。
【請求項４３】
ハンチントン病を有するヒトを治療する方法であって、その疾患を有するヒトを同定し、そしてそのヒトに対して請求項1〜29のいずれかに記載される治療的有効量の化合物ま
たは組成物を投与し、それによりハンチントン病についてそのヒトを治療することを含む、前記方法。
【請求項４４】
治療が、ヒトにおける情動不安、協調不足、意図せず開始される運動、意図せず完了されない運動、歩行不安定、舞踏病、硬直、身もだえするような運動、異常姿位、不安定性、異常な顔貌、そしゃく困難、嚥下困難、発話困難、発作、睡眠障害、計画性低下、柔軟性低下、抽象的思考低下、ルール習得低下、適切な動作の開始の低下、不適切な動作の阻害の低下、短期記憶の低下、長期記憶の低下、パラノイア、見当識障害、精神錯乱、幻覚、認知症、不安、抑鬱症、感情鈍麻、自己中心性、攻撃性、強迫行動、易刺激性、自殺念慮、脳容量の低下、筋萎縮、心不全、グルコース耐性の低下、体重減少、骨粗鬆症、および精巣萎縮の少なくとも1つを減少させる、請求項43に記載の方法。
【請求項４５】
化合物または組成物と第2の薬剤とを共投与することを含む、請求項43に記載の方法。
【請求項４６】
化合物または組成物と、第2の薬剤とを、付随して投与する、請求項45に記載の方法。
【請求項４７】
投与がCNSに対するものである、請求項43に記載の方法。
【請求項４８】
ヒトに対して、請求項1〜29のいずれかに記載の治療的有効量の化合物を投与する工程
、それによりハンチントン病を弱めさせまたは予防する工程、を含む、ハンチントン病を弱めまたは予防する方法。
【請求項４９】
化合物または組成物と第2の薬剤とを共投与することを含む、請求項48に記載の方法。
【請求項５０】
化合物または組成物と第2の薬剤とを付随して投与する、請求項49に記載の方法。
【請求項５１】
投与がCNSに対するものである、請求項48に記載の方法。
【請求項５２】
ハンチントン病の症状を軽減することを必要とするヒトに対して、12〜30個の連結したヌクレオシドからなるSEQ ID NO:1に対して特異的にハイブリダイズする修飾されたオリ
ゴヌクレオチドを含む化合物を投与して、それによりヒトにおけるハンチントン病の症状を軽減することを含む、ハンチントン病の症状を軽減するための方法。
【請求項５３】
ハンチントン病に関連する症状の進行速度を減少させることが必要なヒトに対して、12〜30個の連結したヌクレオシドからなるSEQ ID NO:1に対して特異的にハイブリダイズする修飾されたオリゴヌクレオチドを含む化合物を投与して、それによりヒトにおけるハン
チントン病の症状の進行速度を減少させる、ハンチントン病に関連する症状の進行速度を減少させるための方法。
【請求項５４】
ハンチントン病に関連する症状により示される分解を反転させることを必要とするヒトに対して、12〜30個の連結したヌクレオシドからなるSEQ ID NO:1に対して特異的にハイ
ブリダイズする修飾されたオリゴヌクレオチドを含む化合物を投与して、それによりヒトにおいてハンチントン病の症状により示される分解を反転させる、ハンチントン病に関連する症状により示される分解を反転させるための方法。
【請求項５５】
修飾されたオリゴヌクレオチドが、一本鎖オリゴヌクレオチドである、請求項52、53、または54に記載の方法。
【請求項５６】
修飾されたオリゴヌクレオチドの核酸塩基配列が、SEQ ID NO 1に対して少なくとも90
％相補的である、請求項52、53、または54に記載の方法。
【請求項５７】
修飾されたオリゴヌクレオチドの核酸塩基配列が、SEQ ID NO 1に対して少なくとも95
％相補的である、請求項52、53、または54に記載の方法。
【請求項５８】
修飾されたオリゴヌクレオチドの核酸塩基配列が、SEQ ID NO 1に対して100％相補的である、請求項52、53、または54に記載の方法。
【請求項５９】
修飾されたオリゴヌクレオチドが、20個の連結したヌクレオシドからなる、請求項52、53、または54に記載の方法。
【請求項６０】
症状が、少なくとも1つの身体的症状、少なくとも1つの認知症状、少なくとも1つの精神
医学的症状、そして少なくとも1つの末梢症状のうちの少なくとも1つである、請求項52、53、または54に記載の方法。
【請求項６１】
少なくとも1つの身体的症状が、情動不安、協調不足、意図せず開始される運動、意図
せず完了されない運動、歩行不安定、舞踏病、硬直、身もだえするような運動、異常姿位、不安定性、異常な顔貌、そしゃく困難、嚥下困難、発話困難、発作、および睡眠障害からなる群から選択される、請求項60に記載の方法。
【請求項６２】
少なくとも1つの認知症状が、計画性低下、柔軟性低下、抽象的思考低下、ルール習得
低下、適切な動作の開始の低下、不適切な動作の阻害の低下、短期記憶の低下、長期記憶の低下、パラノイア、見当識障害、精神錯乱、幻覚および認知症からなる群から選択される、請求項60に記載の方法。
【請求項６３】
少なくとも1つの精神医学的症状が、不安、抑鬱症、感情鈍麻、自己中心性、攻撃性、
強迫行動、易刺激性および自殺念慮からなる群から選択される、請求項60に記載の方法。
【請求項６４】
少なくとも1つの末梢症状、脳容量の低下、筋萎縮、心不全、グルコース耐性の低下、
体重減少、骨粗鬆症、および精巣萎縮からなる群から選択される、請求項60に記載の方法。
【請求項６５】
化合物が、SEQ ID NO: 6、9、10、11、12、13、14、15、18、19、20、21、22、23、24
、25、26、27、28、29、30、32、33、35、または36に記載された配列の少なくとも12個の隣接した核酸塩基を含む、12〜30個の連結したヌクレオシドからなる修飾されたオリゴヌクレオチドを含む、請求項52〜64のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６６】
化合物が、SEQ ID NO: 12、22、28、30、32、または33に記載される配列の少なくとも12個の隣接した核酸塩基を含む12〜30個の連結したヌクレオシドからなる修飾されたオリ
ゴヌクレオチドを含む、請求項1〜29のいずれかに記載される化合物。
【請求項６７】
動物に対して、治療的有効量の請求項1〜29のいずれかに記載される化合物を投与し、
それによりハンチンチンの発現を阻害することにより、ハンチンチンと関連する疾患または症状を有する動物を治療する際に使用するための、請求項1〜29のいずれかに記載され
る化合物
【請求項６８】
疾患または症状が、神経学的障害である、請求項67に記載の化合物。
【請求項６９】
疾患または症状がハンチントン病である、請求項68に記載の化合物。
【請求項７０】
動物がヒトである、請求項67に記載の化合物。
【請求項７１】
動物に対して治療的有効量の化合物を投与し、それによりハンチンチンの発現を阻害することにより、ハンチンチンと関連する疾患または症状を有する動物において使用するための、SEQ ID NO: 6、9、10、11、12、13、14、15、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、32、33、35、または36において記載される配列の少なくとも8個の隣接した核酸塩基を含む、12〜30個の連結したヌクレオシドからなる修飾されたオリゴヌクレオチドを含む化合物。
【請求項７２】
動物に対して治療的有効量の化合物を投与して、ハンチントン病の進行を予防し、治療し、軽減し、または遅らせることにより、ハンチンチンに関連した疾患または症状を有する動物において使用するための、SEQ ID NO: 6、9、10、11、12、13、14、15、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、32、33、35、または36において記載され
る配列の少なくとも8個の隣接した核酸塩基を含む12〜30個の連結したヌクレオシドから
なる修飾されたオリゴヌクレオチドを含む化合物。
【請求項７３】
動物に対して治療的有効量の化合物を投与して、それによりハンチンチンの発現を阻害することにより、ハンチンチンに関連した疾患または症状を有する動物において使用するための、SEQ ID NO: 12、22、28、30、32、または33において記載される配列の少なくと
も8個の隣接した核酸塩基を含む12〜30個の連結したヌクレオシドからなる修飾されたオ
リゴヌクレオチドを含む化合物。
【請求項７４】
動物に対して治療的有効量の化合物を投与して、ハンチントン病の進行を予防し、治療し、軽減し、または遅らせることにより、ハンチンチンに関連した疾患または症状を有する動物において使用するための、SEQ ID NO: 12、22、28、30、32、または33において記
載された配列の少なくとも8個の隣接した核酸塩基を含む12〜30個の連結したヌクレオシ
ドからなる修飾されたオリゴヌクレオチドを含む化合物。
【請求項７５】
動物に対して治療的有効量の化合物を投与して、それによりハンチンチンの発現を阻害することにより、ハンチンチンに関連した疾患または症状を有する動物において使用するための、SEQ ID NO: 1のヌクレオチド4384-4403、4605-4624、4607-4626、4608-4627、4609-4628、4610-4629、4617-4636、4622-4639、4813-4832、4814-4833、4823-4842、4860-4877、4868-4887、4925-4944、4928-4947、4931-4950、4931-4948、4955-4974、4960-4977、5801-5820、5809-5828、5809-5826、101088-101105、115066-115085、4607-4626、4608-4627、4609-4628、4610-4629、4813-4832、4862-4881、5809-5828および4928-4947から選択される領域内部において相補的な少なくとも8個の隣接した核酸塩基部分を含む、12〜30個の連結したヌクレオシドからなる修飾されたオリゴヌクレオチドを含む化合物。
【請求項７６】
動物に対して治療的有効量の化合物を投与して、ハンチントン病の進行を予防し、治療し、軽減し、または遅らせることにより、ハンチンチンに関連した疾患または症状を有する動物において使用するための、SEQ ID NO: 1のヌクレオチド4384-4403、4605-4624、4607-4626、4608-4627、4609-4628、4610-4629、4617-4636、4622-4639、4813-4832、4814-4833、4823-4842、4860-4877、4868-4887、4925-4944、4928-4947、4931-4950、4931-4948、4955-4974、4960-4977、5801-5820、5809-5828、5809-5826、101088-101105、115066-115085、4607-4626、4608-4627、4609-4628、4610-4629、4813-4832、4862-4881、5809-5828および4928-4947から選択される領域内部において相補的な少なくとも8個の隣接した
核酸塩基部分を含む、12〜30個の連結したヌクレオシドからなる修飾されたオリゴヌクレオチドを含む化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表
本件出願は、電子フォーマットの配列表とともに出願される。配列表は、2010年9月8日に作成された456 Kbのサイズの「BIOL0113WOSEQ.txt」という名前のファイルとして提供
される。配列表の電子フォーマット中の情報は、その全体を参照により本明細書中に援用される.
発明の分野
動物におけるハンチンチンmRNAおよびタンパク質発現を現象させるための方法、化合物、および組成物が本明細書中で提供される。そのような方法、化合物、および組成物は、たとえば、ハンチントン病を治療し、予防し、または改善するために有用である。
【背景技術】
【０００２】
ハンチントン病（HD）は、ハンチンチンタンパク質中において異常な長いポリグルタミン（PolyQ）管をコードするCAGトリヌクレオチドリピートの発現により引き起こされる、破壊的な常染色体性優性、神経変性性疾患である。ハンチントン病遺伝子は、1993年に初めてマッピングされ（The Huntington's disease Collaborative Research Group. Cell.
1993, 72:971-83）、遺伝子、IT15、からなり、それがHD染色体上に広がりそして不安定である多型トリヌクレオチドリピートを含有していた。正常サイズ範囲のCAGリピートは
、メンデルの対立遺伝子として通常は遺伝するが、拡張したHDリピートは、減数分裂遺伝を通じて不安定であり、そしてHD患者において正常サイズ範囲（6〜34リピート単位）を
超えて拡張していることが見いだされた。
【０００３】
正常のハンチンチンタンパク質および変異型ハンチンチンタンパク質は両方とも、主としてニューロンの細胞質に局在している（DiFiglia et al., Neuron 1995, 14:1075-81）。過剰なポリグルタミン長の結果として、ハンチンチンタンパク質CNSニューロンの細胞
質中および核中で凝集物を形成する（Davies et al., Cell 1997, 90:537-548）。トランスジェニック動物および遺伝子修飾細胞株を両方とも使用して、拡張されたpolyQリピー
トのハンチンチンの局在およびプロセシングに対する作用を調べた。しかしながら、凝集物自体の形成が本質的に細胞傷害性の工程であるか、あるいは細胞機能障害の結果であるかどうかは、依然としてわかっていない。
【０００４】
HDは、進行性の舞踏病、精神医学的変化、および知能低下により特徴付けられる。この優性症状は、男性および女性に等しく影響を与え、そしてすべての種族において生じる（Gusella and MacDonald, Curr. Opin. Neurobiol. 1995 5:656-62）。HDの症候は、多く
の脳領域におけるニューロンの死のためであるが、大脳基底核線条体、特に尾状核、において最も一般的であり、それは進行性の細胞喪失の勾配を生じ、それが究極的には全体の構造を破壊する。ハンチンチンをコードする遺伝子は偏在性で発現されるが（Strong, T.V. et al., Nat. Genet. 1995, 5:259-263）、選択的細胞喪失および繊維性星状細胞増加症が脳内、特に大脳基底核線条体の尾部および被殻において、そしてHD患者の大脳皮質において（Vonsattel, J-P. et al., Neuropathol. Exp. Neurol. 1985, 44:559-577）、そしてより低い程度で、海馬において（Spargo, E. et al., J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry 1993, 56:487-491）、そして
視床腹部において（Byers, R.K. et al., Neurology 1973, 23:561-569）、観察される。
【０００５】
ハンチンチンは、正常な発生に必須であり、そして細胞生存遺伝子と考えることができる（Nasir et al., Human Molecular Genetics, Vol 5, 1431-1435）。ハンチンチンの正常な機能は、不完全に特定された状態のままであるが、タンパク質-タンパク質相互作用
に基づいて、細胞骨格に結合しているようであり、そして神経発生に必要とされる様である（Walling et al., J. Neurosci Res. 1998, 54:301-8）。ハンチンチンは、アポトー
シス細胞死の中心的な働きをすることが知られている重要なシステインプロテアーゼ、アポパイン、により、アポトーシスにより特異的に切断される。切断速度は、より長いポリグルタミン束により切断されるが、このことは、不適切なアポトーシスがHDの基礎にあることを示唆している。
【０００６】
アンチセンス技術は、特定の遺伝子産物の発現を減少させるための有効な手段として生じており、そしてしたがって、ハンチンチン発現の修飾のために、多数の治療用途、診断用途、および研究用途において有用であることを証明することができる（U.S. Patent Publication Nos. 2008/0039418および2007/0299027)。
【０００７】
ハンチンチンの発現を修飾するアンチセンス化合物は、上述した発行された特許出願において開示される。しかしながら、追加的なそのような化合物についての必要で在り続ける。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】U.S. Patent Publication No. 2008/0039418
【特許文献２】U.S. Patent Publication No. 2007/0299027
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】The Huntington's disease Collaborative Research Group. Cell. 1993, 72:971-83
【非特許文献２】DiFiglia et al., Neuron 1995, 14:1075-81
【非特許文献３】Davies et al., Cell 1997, 90:537-548
【非特許文献４】Gusella and MacDonald, Curr. Opin. Neurobiol. 1995 5:656-62
【非特許文献５】Strong, T.V. et al., Nat. Genet. 1995, 5:259-263
【非特許文献６】Vonsattel, J-P. et al., Neuropathol. Exp. Neurol. 1985, 44:559-577
【非特許文献７】Spargo, E. et al., J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry 1993, 56:487-491
【非特許文献８】Byers, R.K. et al., Neurology 1973, 23:561-569
【非特許文献９】Nasir et al., Human Molecular Genetics, Vol 5, 1431-1435
【非特許文献１０】Walling et al., J. Neurosci Res. 1998, 54:301-8
【発明の概要】
【００１０】
ハンチンチンの発現を修飾し、そしてハンチントン病および／またはその症状を治療し、予防し、遅らせ、または軽減するための、方法、化合物、および組成物を、本明細書中で提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図1：線条体内組織内でのハンチンチンmRNA発現の、マウス脳内でのISIS 387898濃度とのPK/PD関連性。C57/BL6マウスに、1回ボーラスの50μgのISIS 387898を投与し、そして組織内におけるハンチンチンmRNA発現並びにアンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度を測定した。ISIS 387898のEC50も算出した。
【図２】図2：線条体内組織におけるハンチンチンmRNA発現と、様々な時点でのISIS 387898濃度の比較。C57/BL6マウスに1回ボーラスの50μgのISIS 387898を投与し、そして組織内におけるハンチンチンmRNA発現並びにアンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度を測定した。ISIS 387898の作用期間（htt mRNA発現により測定したもの）（点線）は、組織内におけるオリゴヌクレオチドの濃度（実線）の後もより長く観察された。
【図３】図3：前頭皮質組織におけるハンチンチンmRNA発現の、マウス脳におけるISIS 387898濃度とのPK/PD関連性。BACHDマウスに75μgのISIS 387898の脳室内注入を2週間投与し、そしてハンチンチンmRNA発現並びに組織内におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度を測定した。ISIS 387898のEC50もまた算出した。
【図４】図4：前頭皮質組織におけるにおけるハンチンチンmRNA発現と、様々な時点でのISIS 387898濃度の比較。BACHDマウスに75μgのISIS 387898の脳室内注入を2週間投与し、そしてハンチンチンmRNA発現並びに組織内におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度を測定した。ISIS 387898の作用期間（htt mRNA 発現により測定したもの）（点線）は、組織内におけるオリゴヌクレオチドの濃度（実線）の後もより長く観察された。
【図５】図5：後部皮質組織におけるハンチンチンmRNA発現と、様々な時点でのISIS 388241濃度の比較。BACHDマウスに50μgのISIS 388241の脳室内注入を2週間投与し、そしてハンチンチンmRNA発現並びに組織内におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度を測定した。ISIS 388241の作用期間（htt mRNA 発現により測定したもの）（点線）は、組織内におけるオリゴヌクレオチドの濃度（実線）の後もより長く観察された。
【図６】図6:後部皮質組織におけるハンチンチンmRNA発現と、様々な時点でのISIS 443139濃度の比較。BACHDマウスに50μgのISIS 443139の脳室内注入を2週間投与し、そしてハンチンチンmRNA発現並びに組織内におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度を測定した。ISIS 443139の作用期間（htt mRNA 発現により測定したもの）（点線）は、組織内におけるオリゴヌクレオチドの濃度（実線）の後もより長く観察された。
【図７】図7：ローターロッドアッセイを使用した、BACHDマウスの運動筋肉能力に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド処置の作用。BACHDマウスを、50μg/日ICVのISIS 388241またはPBSにより、2週間処置した。非-トランスジェニック同腹子の対照群を、ISIS 388241またはPBSを用いて同様に処置した。その後、速度を上げるローターロッドアッセイを行った。動物を2 RPMの速度のローターロッド上に配した；ローターロッドを5分間かけて40 RPMにまで加速させた。落下するまでの期間を記録した。6ヶ月齢での基準値を処置の前に取り、そして所定の時点は、アッセイを行った時のマウスの齢である。バーは、ISIS 388241で処置されたBACHDマウスにより（黒)；PBSで処置されたBACHDマウスにより（ハッシュ化)；およびPBSで処置された非-トランスジェニック同腹子により（白）；落下するまでの期間を秒で示したものである。ISIS 388241-処置マウスは、落下するまでの期間が長いことが示され、そしてしたがって、PBS対照と比較して、ローターロッド上での運動筋肉能力が改善されたことが示された。
【図８】図8：アンチセンスオリゴヌクレオチド処置のR6/2マウスの脳重量に対する作用。6ヶ月齢のR6/2マウスを、50μg/日ICVのISIS 388817または対照オリゴヌクレオチドISIS 141923またはPBSにより4週間処置した。非-トランスジェニック同腹子の対照群を、ISIS 388817またはPBSを用いて同様に処置した。8週齢の症状を発生する前のR6/2マウスの対照群を研究に含ませ、そして何も処置を与えなかった。バーは、8週齢の非処置R6/2マウス；ISIS 141923で処置したR6/2マウス；PBSで処置したR6/2マウス；ISIS 388817で処置したR6/2マウス；PBSで処置した非-トランスジェニック同腹子；そしてISIS 388817で処置した非-トランスジェニック同腹子；の脳重量を示す。PBS対照と比較して、ISIS 388817で処置したR6/2マウスの脳重量に増加が見られた。
【図９】図9：オープンフィールドアッセイを用いた、アンチセンスオリゴヌクレオチド-処置したYAC128マウスの行動特性決定。5ヶ月齢のYAC128マウスを、50μg/日のICVのISIS 388241または対照オリゴヌクレオチドISIS 141923またはPBSを用いて14日間処置した。非-トランスジェニックFVB/NJ 同腹子の対照群を研究に含ませ、そして何も処置を与えなかった。マウスをオープンフィールドアリーナに配置し、光ビームの中断を使用して、30分のテストセッションにわたり水平移動および垂直移動を測定する。データは、活性モニターソフトウェアを使用して解析し、アリーナ内での全歩行（回廊）移動とアリーナ中央部内での移動とを、不安の測定値として調べた。バーは、FVB/NJマウス、PBSで処置したYAC128、そしてISIS 388241で処置したYAC128マウスが、フィールド中央部で過ごした秒数を示す。ISIS 388241で処置したYAC128マウスは、中央部でより長い時間を過ごし、そしてしたがって、PBS対照と比較して、不安-の傾向がより低いとみなされた。
【図１０】図10；高架式十字迷路アッセイを用いた、アンチセンスオリゴヌクレオチド-処置したYAC128マウスの行動特性決定。5ヶ月齢のYAC128マウスを、50μg/日ICVのISIS 388241または対照オリゴヌクレオチドISIS 141923により、またはPBSにより、14日間処置した。非-トランスジェニックFVB/NJ同腹子の対照群を、非処置対照として含ませた。マウスを、それぞれが65×6.25 cmおよび地面から上50 cmに持ち上げられた部分を測定する、2本の開放されたアーム部および2本の閉じられたアーム部からなる装置の中央部に配置された。装置上でのマウスの位置および開放されたアーム部で過ごした時間の量を5分間のテストセッションにわたり、不安の測定値として記録した。バーは、FVB/NJ対照、PBSで処置したYAC128、およびISIS 388241で処置したYAC128マウスが、開放されたアーム部で過ごした時間の割合を示す。ISIS 388241で処置したYAC128マウスは、開放されたアーム部でより長い時間を過ごし、そしてしたがってPBS対照と比較して、不安-の傾向がより低いとみなされた。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
上述の一般的な記載および以下の詳細な記載の両方共例示的で説明のためのものであり、そして請求項に記載された発明を限定するものではないことが理解されるべきである。本明細書中において、単数形の使用には、そうではないと記載されていない限り、複数形も含まれる。本明細書中で使用する場合、“または”の使用は、そうではないと記載されていない限り、“および／または”を意味する。さらに、用語“含む”並びにたとえば“が含まれる”および“含む”などのその他の形態の使用は、限定的ではない。同様に、“構成要素”または“成分”などの用語は、そうではないと記載されていない限り、1ユニ
ットを含む構成要素および成分、および1以上のサブユニットを含む複数の構成要素およ
び成分の両方を意図している。
【００１３】
本明細書中で使用される節の見出しは、組織化の目的のためのものであり、そして記載される主題を限定するものとは解釈されない。特許、特許出願、文献、書籍、および論文を含む（しかしこれらに限定されない）、本件出願で引用されるすべての文献、または文献の部分、は、本明細書中で検討された文献の部分並びにそれらの全体を参照することにより、明示的に援用される。
【００１４】
定義
具体的な定義が提示されない場合、本明細書中で記載される、関連して使用される用語体系、そしてその手法および技術、分析化学、合成有機化学、そして医薬および製薬化学は、当該技術分野において周知のものであり、そして一般的に使用されるものである。標準的な技術は、化学合成、および化学解析のために使用することができる。許容される場合、すべての特許、出願、公開された出願およびその他の刊行物、GENBANKアクセッショ
ンNumbersおよびNational Center for Biotechnology Information（NCBI）などのデータベースを介して得ることができる関連する配列情報や本明細書中の開示全体を参照したその他のデータは、本明細書中で検討された文献の部分、ならびにその全体を参照することにより援用される。
【００１５】
そうではないと示されない限り、以下の用語は、以下の意味を有る:
“2'-O-メトキシエチル”（同様に2'-MOEおよび2'-O(CH2)2-OCH3）は、フロシル環の2'位のO-メトキシ-エチル修飾のことをいう。2'-O-メトキシエチル修飾糖は、修飾糖である。
【００１６】
“2'-O-メトキシエチルヌクレオチド”は、2'-O-メトキシエチル修飾糖成分を含むヌクレオチドを意味する。
“5-メチルシトシン”は、5'位に結合されたメチル基により修飾されたシトシンを意味する。5-メチルシトシンは、修飾核酸塩基である。
【００１７】
“活性医薬剤”は、個体に問うよされた場合に治療的利益をもたらす医薬組成物中の物質または複数の物質を意味する。たとえば、特定の態様において、ハンチンチンを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、活性医薬剤である。
【００１８】
“活性標的領域”または“標的領域”は、1またはそれ以上の活性アンチセンス化合物
が標的とする領域を意味する。“活性アンチセンス化合物”は、標的核酸レベルまたはタンパク質レベルを低下させるアンチセンス化合物を意味する。
【００１９】
“付随して投与する”は、2種類の薬剤の両方ともの薬理学的作用が患者の体内で同時
に現れる、2種類の薬剤を何らかの手法で同時に投与することを意味する。付随的な投与
は、両方の薬剤が、単一の医薬組成物中で投与されること、同一の投与剤形中で投与されること、または同一の投与経路により投与されること、は必要とされない。両方の薬剤の作用は、同時に現れることを必要としない。この作用は、期間について重複することのみを必要とし、そして同一の外延を有することを必要としない。
【００２０】
“投与する”は、医薬剤を個体に対して提供することを意味し、そして医療専門家による投与および自分での投与が含まれる（しかし、これらには限定されない）。
“軽減”は、関連する疾患、症状、または状態少なくとも1つの指標、兆候、または症
状を少なくすることをいう。指標の重大性は、主観的測定または客観的測定により決定することができ、当業者には公知である。
【００２１】
“動物”は、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、およびサルおよびチンパンジーを含む（しかしこれらには限定されない）非-ヒト類人猿、を含む（しかしこれらに
は限定されない）、ヒトまたは非-ヒト動物のことをいう。
【００２２】
“アンチセンス活性”は、その標的核酸に対するアンチセンス化合物のハイブリダイズに寄与する検出可能なまたは測定可能な活性を意味する。特定の態様において、アンチセンス活性は、標的核酸またはそのような標的核酸によりコードされるタンパク質の量または発現の減少である。
【００２３】
“アンチセンス化合物”は、水素結合を介して標的核酸に対するハイブリダイゼーションを生じることができるオリゴマー化合物を意味する。
“アンチセンス阻害”は、アンチセンス化合物の非存在下での標的核酸レベルまたは標的タンパク質レベルと比較して、標的核酸と相補的なアンチセンス化合物の存在下での標的核酸レベルまたは標的タンパク質レベルが減少することを意味する。
【００２４】
“アンチセンスオリゴヌクレオチド”は、標的核酸の対応する領域またはセグメントに対するハイブリダイゼーションを可能にする核酸塩基配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドを意味する。
【００２５】
“2環糖”は、2つの非-ジェミナル（geminal；一つの原子に同種原子が二つ結合した）環原子の架橋により修飾されたフロシル環を意味する。2環糖は、修飾糖である。
“2環式核酸”または“BNA”は、ヌクレオシドまたはヌクレオチドを意味し、ここでヌクレオシドまたはヌクレオチドのフラノース部分に、フラノース環上の2つの炭素原子を
接続し、それにより2環式環系を形成するブリッジが含まれる。
【００２６】
“キャップ構造”または“末端キャップ成分”は、アンチセンス化合物のいずれかの末
端に取り込まれた化学修飾を意味する。
“化学的に異なる領域”は、ある場合には同一のアンチセンス化合物の別の領域とは化学的に異なる、アンチセンス化合物の領域のことをいう。たとえば、2'-O-メトキシエチ
ルヌクレオチドを有する領域は、2'-O-メトキシエチル修飾を有さないヌクレオチドを有
する領域とは化学的に異なる。
【００２７】
“キメラアンチセンス化合物”は、少なくとも2つの化学的に異なる領域を有するアン
チセンス化合物を意味する。
“同時投与”は、2つまたはそれ以上の医薬剤を個体に対して投与することを意味する
。2つまたはそれ以上の医薬剤は、単一の医薬組成物中の物であっても、または別個の医
薬組成物中のものであってもよい。2つまたはそれ以上の医薬剤のそれぞれを、同一のま
たは異なる投与経路を介して投与することができる。同時投与は、同時並行的な投与または連続的な投与を意味する。
【００２８】
“相補性”は、第1の核酸の核酸塩基と第2の核酸の核酸塩基との間の対合の能力のことを意味する。
“隣接する核酸塩基”は、互いにすぐとなりあう核酸塩基を意味する。
【００２９】
“希釈剤”は、薬理学的活性を欠損するが、しかし医薬的に必要であるかまたは所望される有効成分組成物を意味する。たとえば、注射された組成物中の希釈剤は、たとえば、生理食塩水溶液などの液体であってもよい。
【００３０】
“投与量”は、単回投与で、または特定の期間で、与えられる特定量の医薬剤を意味する。特定の態様において、投与量は、1、2、またはそれ以上のボーラス、錠剤、または注射で投与することができる。たとえば、皮下投与が好ましい特定の態様において、所望される投与量は、単回注射により容易には適合されない用量を必要とし、したがって、2つ
またはそれ以上の注射を使用して所望の投与量を達成することができる。特定の態様において、医薬剤は、延長された期間にわたりまたは連続的に、注入により投与される。投与量は、時間、日数、週数、または月数あたりの医薬剤の量として言及することができる。
【００３１】
“有効量”は、その活性医薬剤を必要とする個体において所望の生理学的結果をもたらすために十分な活性医薬剤の量を意味する。有効量は、治療される個体の健康状態および身体的状態、治療される個体の分類学上のグループ、組成物の製剤化、個体の医学的状態の評価、およびその他の関連する因子、に依存して、個体間で変化してもよい。
【００３２】
“ハンチンチン核酸”は、ハンチンチンをコードするいずれかの核酸を意味する。たとえば、特定の態様において、ハンチンチン核酸には、ハンチンチンをコードするDNA配列
、ハンチンチンをコードするDNA（イントロンおよびエクソンを含むゲノムDNAを含む）から転写されるRNA配列、およびハンチンチンをコードするmRNA配列、が含まれる。“ハンチンチンmRNA”は、ハンチンチンタンパク質をコードするmRNAを意味する。
【００３３】
“完全に相補的な”または“100％相補的な”は、第1の核酸の核酸塩基配列のそれぞれの核酸塩基が、第2の核酸の第2の核酸塩基配列における相補的な核酸塩基を有することを意味する。特定の態様において、第1の核酸は、アンチセンス化合物であり、そして標的
核酸が第2の核酸である。
【００３４】
“ギャップマー”は、RNase H切断をサポートする複数のヌクレオシドを有する内部領
域が、1またはそれ以上のヌクレオシドを有する外部領域の間に位置しているキメラアン
チセンス化合物であり、ここで内部領域を含むヌクレオシドがヌクレオシドとは化学的に異なるものであるか、または外部領域を含むヌクレオシドである。内部領域は、“ギャッ
プセグメント”と呼ばれる場合があり、そして外部領域は“ウィングセグメント”と呼ばれる場合がある。
【００３５】
“ギャップ-が広がった”は、1〜6個のヌクレオシドを有する5'ウィング部分と3'ウィ
ング部分の間にありそしてすぐに隣接して位置する、12個またはそれ以上の隣接する2'-
デオキシリボヌクレオシドのギャップ部分を有するキメラアンチセンス化合物を意味する。
【００３６】
“ハイブリダイゼーション”は、相補的核酸分子のアニーリングを意味する。特定の態様において、相補的な核酸分子には、アンチセンス化合物および標的核酸が含まれる。
“すぐに隣接する”は、すぐに隣接する要素間に、介在性の要素が存在しないことを意味する。
【００３７】
“個体”は、処置または治療のために選択されるヒトまたは非-ヒト動物を意味する。
“ヌクレオシド間結合”は、ヌクレオシド間の化学的結合のことをいう。
“連結したヌクレオシド”は、互いに結合された隣接するヌクレオシドのことを意味する。
【００３８】
“ミスマッチ”または“非-相補的核酸塩基”は、第1の核酸の核酸塩基が第二の核酸または標的核酸の対応する核酸塩基と対合することができない場合をいう。
“修飾ヌクレオシド間結合”は、天然に生じるヌクレオシド間結合（すなわち、ホスホジエステルヌクレオシド間結合）からの置換またはいずれかの変化をいう。
【００３９】
“修飾核酸塩基”は、アデニン、シトシン、グアニン、チミジン、またはウラシル以外のいずれかの核酸塩基をいう。“非修飾核酸塩基”は、プリン塩基アデニン（A）および
グアニン（G）、そして、ピリミジン塩基チミン（T）、シトシン（C）、およびウラシル
（U）を意味する。
【００４０】
“修飾ヌクレオチド”は、独立して、修飾糖成分、修飾ヌクレオシド間結合、または修飾核酸塩基を有するヌクレオチドを意味する。“修飾核酸塩基”は、独立して、修飾糖成分または修飾核酸塩基を有するヌクレオシドを意味する。
【００４１】
“修飾されたオリゴヌクレオチド”は、少なくとも1つの修飾ヌクレオチドを含むオリ
ゴヌクレオチドを意味する。
“修飾糖”は、天然糖からの置換または変化のことをいう。
【００４２】
“モチーフ”は、アンチセンス化合物中の化学的に異なる領域のパターンを意味する。
“天然に生じるヌクレオシド間結合”は、3'から5'へのホスホジエステル結合を意味する。
【００４３】
“天然の糖成分”は、DNA（2'-H）またはRNA（2'-OH）中に見いだされる糖を意味する
。
“核酸”は、モノマーヌクレオチドから構成される分子をいう。核酸には、リボ核酸（RNA）、デオキシリボ核酸（DNA）、一本鎖核酸、二本鎖核酸、低分子干渉リボ核酸（siRNA）、およびmicroRNA（miRNA）が含まれる。核酸はまた、単一分子内に、これらの要素の組み合わせを含んでもよい。
【００４４】
“核酸塩基”は、別の核酸の塩基と対合することができるヘテロ環式成分を意味する。
“核酸塩基配列”は、いずれかの糖、結合、または核酸塩基修飾とは無関係な隣接した核酸塩基の順番を意味する。
【００４５】
“ヌクレオシド”は、糖に結合した核酸塩基を意味する。
“ヌクレオチド”は、ヌクレオシドの糖部分に共有結合したホスホネート基を有するヌクレオシドを意味する。
【００４６】
“オリゴマー化合物”または“オリゴマー”は、核酸分子の少なくとも領域とハイブリダイゼーションすることができる、結合したモノマーサブユニットのポリマーを意味する。
【００４７】
“オリゴヌクレオチド”は、互いに独立して修飾されていても修飾されていなくてもよい、連結したヌクレオシドのポリマーを意味する。
“非経口投与”は、注射または注入を介した投与を意味する。非経口投与には、皮下投与、静脈内投与、筋肉内投与、動脈内投与、腹腔内投与、または頭蓋内投与、たとえば、くも膜下腔投与または脳室内投与が含まれる。投与は、連続的、または慢性的、または短時間、または断続的であってもよい。
【００４８】
“ペプチド”は、少なくとも2つのアミノ酸がアミド結合により結合することにより形
成される分子を意味する。ペプチドは、ポリペプチドおよびタンパク質をいう。
“医薬組成物”は、個体に対して投与するために適切な物質の混合物を意味する。たとえば、医薬組成物は、1またはそれ以上の活性医薬剤および滅菌水溶液を含んでもよい。
【００４９】
“医薬的に許容可能な塩”は、アンチセンス化合物の、生理学的にそして医薬的に許容可能な塩、すなわち、親オリゴヌクレオチドの所望の生物学的活性を残し、そして親オリゴヌクレオチドに対して所望されない毒物学的作用を付与しない塩、を意味する。
【００５０】
“ホスホロチオエート結合”は、ホスホジエステル結合が非-架橋性酸素原子の一つが
イオウ原子と置換することにより修飾される、ヌクレオシド間の結合を意味する。ホスホロチオエート結合は、修飾ヌクレオシド間結合である。
【００５１】
“部分”は、核酸の規定数の隣接する（すなわち、結合した）核酸塩基を意味する。特定の態様において、部分は、標的核酸の規定数のこの隣接した核酸塩基である。特定の態様において、部分は、アンチセンス化合物の規定数の個の隣接した核酸塩基である。
【００５２】
“予防する”は、数分から無期限までの期間、疾患、障害、または疾患の始まりまたは発症を遅らせまたは未然に防ぐことをいう。“予防する”はまた、疾患、障害、または症状の発症のリスクを軽減することも意味する。
【００５３】
“プロドラッグ”は、内在性の酵素またはその他の化学物質または条件の作用により、生体内または生体の細胞内において活性化型に変換される、活性化型で調整される治療剤を意味する。
【００５４】
“副作用”は、所望の作用以外の処置に起因する生理学的応答を意味する。特定の態様において、副作用には、注射部位反応、肝臓機能試験異常、腎臓機能異常、肝臓毒性、腎臓毒性、中枢神経系異常、筋症、および不快感が含まれる。たとえば、血清中のアミノトランスフェラーゼレベルの増加が、肝臓毒性または肝臓機能異常を示唆する可能性がある。たとえば、ビリルビンの増加は、肝臓毒性または肝臓機能異常を示唆することができる。
【００５５】
“一本鎖オリゴヌクレオチド”は、相補鎖に対してハイブリダイズしないオリゴヌクレオチドを意味する。
“特異的にハイブリダイズ可能”は、アンチセンスオリゴヌクレオチドと標的核酸との間で十分な程度の相補性を有して所望の作用を誘導するが、一方特異的な結合が望まれる条件下、すなわち、in vivoでのアッセイおよび治療処置の場合の生理学的条件下、非-標的核酸に対して最小の作用しか示さないかまたは作用を示さない、アンチセンス化合物のことをいう。
【００５６】
“標的化”または“標的とされた”は、標的核酸に対して特異的にハイブリダイズしそして所望の作用を誘導する、アンチセンス化合物の設計および選択のプロセスのことを意味する。
【００５７】
“標的核酸”、“標的RNA”、そして“標的RNA転写物”はすべて、アンチセンス化合物により標的とすることができる核酸のことをいう。
“標的セグメント”は、アンチセンス化合物が標的とする標的核酸のヌクレオチド配列のことを意味する。“5'標的部位”は、標的セグメントの最も5'側のヌクレオチドのことをいう。“3'標的部位”は、標的セグメントの最も3'側のヌクレオチドのことをいう。
【００５８】
“治療有効量”は、個体に対して治療的利益をもたらす医薬剤の量を意味する。
“治療する”は、医薬組成物を投与して、疾患、障害、または症状の変化または改善をもたらすことをいう。
【００５９】
“非修飾ヌクレオチド”は、天然に生じる核酸塩基、糖成分、およびヌクレオシド間結合からなるヌクレオチドを意味する。特定の態様において、非修飾ヌクレオチドは、RNA
ヌクレオチド（すなわち、β-D-リボヌクレオシド）またはDNAヌクレオチド（すなわち、β-D-デオキシリボヌクレオシド）である。 
【００６０】
特定の態様
特定の態様は、ハンチンチン発現を阻害するための方法、化合物、および組成物を提供する。
【００６１】
特定の態様は、ハンチンチン核酸を標的化するアンチセンス化合物を提供する。特定の態様において、ハンチンチン核酸は、GENBANKアクセッションNo. NM_002111.6（本明細書中SEQ ID NO: 1として援用される）、ヌクレオチド462000〜634000で短縮化されたGENBANKアクセッションNo. NT_006081.17（本明細書中SEQ ID NO: 2として援用される）、GENBANKアクセッションNo. NM_010414.1（本明細書中SEQ ID NO: 3として援用される）、ヌク
レオチド698000〜866000で短縮化されたGENBANKアクセッションNo. NW_001109716.1の相
補鎖（本明細書中SEQ ID NO: 4として援用される）、そしてGENBANKアクセッションNo. NM_024357.2（本明細書中SEQ ID NO: 5として援用される）にしめされる配列のいずれかである。
【００６２】
特定の態様は、12〜30個の連結したヌクレオシドからなる修飾されたオリゴヌクレオチドを含む化合物を提供し、ここで連結したヌクレオシドは、SEQ ID NOs: 6、9、10、11、12、13、14、15、18、19、20、21、23、24、25、26、27、28、29、30、32、33、35、36、10、11、12、13、18、22、32で記載された核酸塩基配列の中から選択される配列の少なくとも8個の隣接した核酸塩基を含む。特定の態様において、修飾されたオリゴヌクレオチ
ドは、SEQ ID NOs: 6、9、10、11、12、13、14、15、18、19、20、21、23、24、25、26、27、28、29、30、32、33、35、36、10、11、12、13、18、22、32で記載された核酸塩基配列の中から選択される配列の、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、また
は少なくとも12個の隣接した核酸塩基を含む。特定の態様において、核酸塩基配列は、SEQ ID NOs: 24、25、26、6、12、28、21、22、32、13に記載された配列である。特定の態
様において、修飾されたオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NOs: 12、22、28、30、32、およ
び33で記載された核酸塩基配列の中から選択される配列の中から、少なくとも9個、少な
くとも10個、少なくとも11個、または少なくとも12個の隣接した核酸塩基を含む。
【００６３】
特定の態様は、15〜25個の連結したヌクレオシドからなる修飾されたオリゴヌクレオチドを含む化合物を提供し、ここで連結したヌクレオシドは、SEQ ID NOs: 6、9、10、11、12、13、14、15、18、19、20、21、23、24、25、26、27、28、29、30、32、33、35、36、10、11、12、13、18、22、32で記載される核酸塩基配列の中から選択される配列の少なくとも8個の隣接した核酸塩基を含む。特定の態様において、修飾されたオリゴヌクレオチ
ドは、SEQ ID NOs: 6、9、10、11、12、13、14、15、18、19、20、21、23、24、25、26、27、28、29、30、32、33、35、36、10、11、12、13、18、22、32で記載された核酸塩基配列の中から選択される配列の少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なく
とも12個、少なくとも13個、少なくとも14個または少なくとも15個の隣接した核酸塩基を含む。特定の態様において、核酸塩基配列は、SEQ ID NOs: 24、25、26、6、12、28、21
、22、32、13で記載されたものである。特定の態様において、修飾されたオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NOs: 12、22、28、30、32、および33で記載された核酸塩基配列の中から選択される配列の少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、
少なくとも13個、少なくとも14個または少なくとも15個の隣接した核酸塩基を含む。
【００６４】
特定の態様は、18〜21個の連結したヌクレオシドからなる修飾されたオリゴヌクレオチドを含む化合物を提供し、ここで連結したヌクレオシドはSEQ ID NOs: 6、9、10、11、12、13、14、15、18、19、20、21、23、24、25、26、27、28、29、30、32、33、35、36、10、11、12、13、18、22、および32で記載された核酸塩基配列の中から選択される配列の少なくとも8個の隣接した核酸塩基を含む。特定の態様において、修飾されたオリゴヌクレ
オチドは、SEQ ID NOs: 6、9、10、11、12、13、14、15、18、19、20、21、23、24、25、26、27、28、29、30、32、33、35、36、10、11、12、13、18、22および32で記載された核酸塩基配列の中から選択される配列の少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個
、少なくとも12個、少なくとも13個、少なくとも14個、少なくとも15個、少なくとも16個、少なくとも17個または少なくとも18個の隣接した核酸塩基を含む。特定の態様において、核酸塩基配列は、SEQ ID NOs: 24、25、26、6、12、28、21、22、32、13に記載された
ものである。特定の態様において、修飾されたオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NOs: 12、22、28、30、32、および33で記載された核酸塩基配列の中から選択される配列の少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、少なくとも13個、少なくと
も14個、少なくとも15個、少なくとも16個、少なくとも17個、または少なくとも18個の隣接した核酸塩基を含む。
【００６５】
特定の態様は、12〜30個の連結したヌクレオシドからなる修飾されたオリゴヌクレオチドを含む化合物を提供し、ここで連結したヌクレオシドは、SEQ ID NO: 1のヌクレオチド4384-4403、4605-4624、4607-4626、4608-4627、4609-4628、4610-4629、4617-4636、4622-4639、4813-4832、4814-4833、4823-4842、4860-4877、4868-4887、4925-4944、4928-4947、4931-4950、4931-4948、4955-4974、4960-4977、5801-5820、5809-5828、5809-5826、101088-101105、115066-115085、4607-4626、4608-4627、4609-4628、4610-4629、4813-4832、4862-4881、5809-5828、4928-4947から選択される領域中で相補的な、少なくとも8個の隣接した核酸塩基部分を含む。特定の態様において、領域は、SEQ ID NO: 1の4384-4403、4609-4628、4610-4629、4860-4877、4862-4881、4925-4944、4928-4947、4931-4950、4955-4974、及ぼい5809-5828から選択される。特定の態様において、領域は、4862-4881、4609-4628、5809-5828、5809-5826、5801-5820、および4955-4974から選択される。
特定の態様において、修飾されたオリゴヌクレオチドは、本明細書中で記載された領域内の、相補的な少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも個11、または少なくとも12個
の隣接した核酸塩基部分を有する。
【００６６】
特定の態様は、15〜25個の連結したヌクレオシド修飾されたオリゴヌクレオチドを含む化合物を提供し、ここで連結したヌクレオシドは、SEQ ID NO: 1のヌクレオチド4384-4403、4609-4628、4610-4629、4860-4877、4862-4881、4925-4944、4928-4947、4931-4950、4955-4974、および5809-5829から選択された領域中で相補的な、少なくとも8個の隣接し
た核酸塩基部分を含む。特定の態様において、修飾されたオリゴヌクレオチドは、本明細書中で記載された領域中で相補的な、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個
、少なくとも12個、少なくとも13個、または少なくとも15個の隣接した核酸塩基部分を有する。
【００６７】
特定の態様は、15〜25個の連結したヌクレオシド修飾されたオリゴヌクレオチドからなる修飾されたオリゴヌクレオチドを含む化合物を提供し、ここで連結したヌクレオシドは、ヌクレオチド4862-4881、4609-4628、5809-5828、5809-5826、5801-5820、および4955-4974から選択された領域内で相補的な、少なくとも8個の隣接した核酸塩基部分を含む。
特定の態様において、修飾されたオリゴヌクレオチドは、本明細書中で記載された領域内で相補的な、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、少な
くとも13個、または少なくとも15個の隣接した核酸塩基部分を有する。
【００６８】
特定の態様は、18〜21個の連結したヌクレオシド修飾されたオリゴヌクレオチドからなる修飾されたオリゴヌクレオチドを含む化合物を提供し、ここで連結したヌクレオシドは、SEQ ID NO: 1のヌクレオチド4384-4403、4609-4628、4610-4629、4860-4877、4862-4881、4925-4944、4928-4947、4931-4950、4955-4974、および5809-5829から選択された領域内で相補的な、少なくとも8個の隣接した核酸塩基部分を含む。特定の態様において、修
飾されたオリゴヌクレオチドは、本明細書中で記載された領域内で相補的な、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、少なくとも13個、少なくとも14個、少なくとも15個、少なくとも16個、少なくとも17個、または少なくとも18個の隣接
した核酸塩基部分を有する。
【００６９】
特定の態様は、18〜21個の連結したヌクレオシド修飾されたオリゴヌクレオチドからなる修飾されたオリゴヌクレオチドを含む化合物を提供し、ここで連結したヌクレオシドは、ヌクレオチド4862-4881、4609-4628、5809-5828、5809-5826、5801-5820、および4955-4974から選択された領域中で相補的な、少なくとも8個の隣接した核酸塩基部分を含む。
特定の態様において、修飾されたオリゴヌクレオチドは、本明細書中で記載される領域内で相補的な、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、少な
くとも13個、少なくとも14個、少なくとも15個、少なくとも16個、少なくとも17個、または少なくとも18個の隣接した核酸塩基部分を有する。
【００７０】
特定の態様において、修飾されたオリゴヌクレオチドは、一本鎖修飾オリゴヌクレオチドからなる。
特定の態様において、修飾されたオリゴヌクレオチドは、20個の連結したヌクレオシドからなる。
【００７１】
特定の態様において、修飾されたオリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は、SEQ ID NO: 1、2、3、4 または5の核酸塩基配列の全長にわたり、少なくとも90％相補的である。特定
の態様において、修飾されたオリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は、SEQ ID NO: 1、2、3、4または5の核酸塩基配列の全長にわたり、少なくとも95％相補的である。特定の態様において、修飾されたオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO: 1、2、3、4または5の核酸塩基配列の全長にわたり、少なくとも99％相補的である。特定の態様において、修飾されたオリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は、SEQ ID NO: 1、2、3、4または5の核酸塩基配列の全長にわたり、100％相補的である。
【００７２】
特定の態様において、化合物は、少なくとも1つの修飾ヌクレオシド間結合を有する。
特定の態様において、ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。
【００７３】
特定の態様において、化合物は、修飾糖を含む少なくとも1つのヌクレオシドを有する
。特定の態様において、少なくとも1つの修飾糖は、2環糖である。特定の態様において、少なくとも1つの2環糖は、4'-CH(CH3)-O-2'ブリッジを含む。特定の態様において、少な
くとも1つの修飾糖は、2'-O-メトキシエチルを含む。
【００７４】
特定の態様において、化合物は、少なくとも1つの少なくとも1つのテトラヒドロピラン修飾ヌクレオシドを含み、ここでテトラヒドロピラン環は、フラノース環を置換する。特定の態様において、少なくとも1つのテトラヒドロピラン修飾ヌクレオシドが、以下の構
造：
【００７５】
【化１】
2020115894.tif 000002
【００７６】
を有し、ここでBxは場合により保護されているヘテロ環式塩基部分である。
特定の態様において、化合物は、修飾核酸塩基を含む少なくとも1つのヌクレオシドを
有する。特定の態様において、修飾核酸塩基は、5-メチルシトシンである。
特定の態様において、化合物の修飾されたオリゴヌクレオチドは、以下のもの；
(i）連結したデオキシヌクレオシドからなるギャップ部分；
(ii）連結したヌクレオシドからなる5'ウィング部分；
(iii）連結したヌクレオシドからなる3'ウィング部分；
を含み、ここでギャップ部分が5'ウィング部分と3'ウィング部分との間に位置し、そしてそれぞれのウィング部分のそれぞれのヌクレオシドが修飾糖を含む。
【００７７】
特定の態様において、化合物の修飾されたオリゴヌクレオチドは、以下のもの：
(i）10個の連結したデオキシヌクレオシドからなるギャップ部分；
(ii）5個の連結したヌクレオシドからなる5'ウィング部分；
(iii）5個の連結したヌクレオシドからなる3'ウィング部分；
を含み、ここでギャップ部分が5'ウィング部分と3'ウィング部分の間にそれらとすぐに隣接するように位置し、そしてそれぞれのウィング部分のそれぞれのヌクレオシドが2'-O-
メトキシエチル糖を含み；そしてそれぞれのヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である。
【００７８】
特定の態様において、化合物の修飾されたオリゴヌクレオチドは、以下のもの：
(i）8個の連結したデオキシヌクレオシドからなるギャップ部分；
(ii）6個の連結したヌクレオシドからなる5'ウィング部分；
(iii）6個の連結したヌクレオシドからなる3'ウィング部分；
を含み、ここでギャップ部分が5'ウィング部分と3'ウィング部分との間にそれらとすぐに隣接するように位置し、それぞれのウィング部分のそれぞれのヌクレオシドが2'-O-メト
キシエチル糖を含み；そしてそれぞれのヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である。
【００７９】
特定の態様において、化合物の修飾されたオリゴヌクレオチドは、以下のもの：
(i）8個の連結したデオキシヌクレオシドからなるギャップ部分；
(ii）5個の連結したヌクレオシドからなる5'ウィング部分；
(iii）5個の連結したヌクレオシドからなる3'ウィング部分；
を含み、ここでギャップ部分が5'ウィング部分と3'ウィング部分との間にそれらとすぐに隣接するように位置し、それぞれのウィング部分のそれぞれのヌクレオシドが2'-O-メト
キシエチル糖を含み；そしてそれぞれのヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合を含む。
【００８０】
特定の態様が、本明細書中で記載された様な化合物またはその塩、および薬学的に許容可能な担体または希釈剤を含む組成物を提供する。特定の態様において、組成物は、SEQ ID NOs: 6、9、10、11、12、13、14、15、18、19、20、21、23、24、25、26、27、28、29、30、32、33、35、36、10、11、12、13、18、22および32に記載された核酸塩基配列の中から選択される核酸塩基配列の少なくとも12個の隣接した核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する12〜30個の連結したヌクレオシド修飾されたオリゴヌクレオチドまたはその塩および薬学的に許容可能な担体または希釈剤をを含む。
【００８１】
特定の態様は、本明細書中で記載された化合物、またはその塩、および薬学的に許容可能な担体または希釈剤を含む組成物を提供する。特定の態様において、組成物は、SEQ ID
NOs: 12、22、28、30、32、および33で記載される核酸塩基配列の中から選択される核酸塩基配列の少なくとも12個の隣接した核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する12〜30個の連結したヌクレオシド修飾されたオリゴヌクレオチドまたはその塩、および薬学的に許容可能な担体または希釈剤を含む。 
【００８２】
特定の態様は、ハンチントン病を治療し、予防し、または軽減する方法を提供する。
特定の態様は、本明細書中で記載された化合物を動物に対して投与することを含む方法を提供する。特定の態様において、この方法は、動物に対して、SEQ ID NOs: 6、9、10、11、12、13、14、15、18、19、20、21、23、24、25、26、27、28、29、30、32、33、35、36、10、11、12、13、18、22および32に記載された核酸塩基配列の中から選択された核酸塩基配列の少なくとも8個の隣接した核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する12〜30個の連
結したヌクレオシド修飾されたオリゴヌクレオチドを投与することを含む。
【００８３】
特定の態様は、本明細書中で記載された化合物を、動物に対して投与することを含む方法を提供する。特定の態様において、この方法は、動物に対して、SEQ ID NOs:12、22、28、30、32、および33に記載された核酸塩基配列の中から選択される核酸塩基配列の少な
くとも8個の隣接した核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する12〜30個の連結したヌクレオ
シド修飾されたオリゴヌクレオチドを投与することを含む。 
【００８４】
特定の態様において、動物がヒトである。
特定の態様において、投与することにより、本明細書中において記載されるハンチントン病の進行を予防し、治療し、軽減しまたは遅らせる。
【００８５】
特定の態様において、化合物は、第2の薬剤と共投与される。
特定の態様において、化合物および第2の薬剤は、付随して投与される。
特定の態様において、投与することは、非経口投与である。特定の態様において、非経口投与は、頭蓋内投与である。特定の態様において、頭蓋内投与は、くも膜下投与または脳室内投与である。
【００８６】
特定の態様は、動物に対して本明細書中で記載される化合物または組成物を投与し、動物におけるハンチンチンmRNAまたはタンパク質の発現を減少させることを含む、動物におけるハンチンチンmRNAまたはタンパク質の発現を減少させる方法をさらに提供する。特定
の態様において、動物がヒトである。特定の態様において、ハンチンチンmRNAまたはタンパク質の発現を減少させることは、ハンチントン病の進行を予防し、治療し、軽減し、または遅らせる。
【００８７】
特定の態様は、疾患を有するヒトを同定し、そしてそのヒトに対して治療的有効量の本明細書中で記載された化合物または組成物を投与することを含む、ハンチントン病を有するヒトを処置するための方法を提供する。特定の態様において、処置は、情動不安、協調不足、意図せず開始される運動、意図せず完了されない運動、歩行不安定、舞踏病、硬直、身もだえするような運動、異常姿位、不安定性、異常な顔貌、そしゃく困難、嚥下困難、発話困難、発作、睡眠障害、計画性低下、柔軟性低下、抽象的思考低下、ルール習得低下、適切な動作の開始の低下、不適切な動作の阻害の低下、短期記憶の低下、長期記憶の低下、パラノイア、見当識障害、精神錯乱、幻覚、認知症、不安、抑鬱症、感情鈍麻、自己中心性、攻撃性、強迫行動、易刺激性、自殺念慮、脳容量の低下、筋萎縮、心不全、グルコース耐性の低下、体重減少、骨粗鬆症、および精巣萎縮からなる群から選択される症状を低下させる。
【００８８】
ヒトに対して、治療的有効量の本明細書中で記載された化合物または組成物を投与し、それにより、ハンチントン病を低下しまたは予防することを含む、ハンチントン病を低下させまたは予防するための方法をさらに提供する。
【００８９】
ハンチントン病の症状を軽減させることが必要なヒトに対して、12〜30個の連結したヌクレオシド修飾されたオリゴヌクレオチドを含む化合物を投与することを含む、ハンチントン病の症状を軽減させるための方法をさらに提供し、ここで修飾されたオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:1、2、3、4または5に対して特異的にハイブリダイズし、それにより
ヒトにおけるハンチントン病の症状を軽減する。
【００９０】
ハンチントン病に関連する症状の進行速度を低下させることが必要なヒトに対して、12〜30個の連結したヌクレオシド修飾されたオリゴヌクレオチドを含む化合物を投与することを含む、ハンチントン病に関連する症状の進行速度を低下させるための方法をさらに提供し、ここで修飾されたオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO: 1、2、3、4または5に対して特異的にハイブリダイズし、それによりヒトにおけるハンチントン病の症状の進行速度を低下させる。
【００９１】
ハンチントン病に関連する症状により示される分解を反転させることを必要とするヒトに対して、12〜30個の連結したヌクレオシド修飾されたオリゴヌクレオチドを含む化合物を投与することを含む、ハンチントン病に関連する症状により示される分解を反転させるための方法をさらに提供し、ここで修飾されたオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:1、2、3、4または5に対して特異的にハイブリダイズし、それによりヒトにおけるハンチントン病の症状により示される分解を反転させる。
【００９２】
特定の態様において、症状は、身体的症候、認知症候、精神医学的症候、または末梢症候である。特定の態様において、症状は、情動不安、協調不足、意図せず開始される運動、意図せず完了されない運動、歩行不安定、舞踏病、硬直、身もだえするような運動、異常姿位、不安定性、異常な顔貌、そしゃく困難、嚥下困難、発話困難、発作、および睡眠障害、からなる群から選択される身体的症状である。特定の態様において、症状は、計画性低下、柔軟性低下、抽象的思考低下、ルール習得低下、適切な動作の開始の低下、不適切な動作の阻害の低下、短期記憶の低下、長期記憶の低下、パラノイア、見当識障害、精神錯乱、幻覚および認知症、からなる群から選択される認知症状である。特定の態様において、症状は、不安、抑鬱症、感情鈍麻、自己中心性、攻撃性、強迫行動、易刺激性および自殺念慮、からなる群から選択される精神医学的症状である。特定の態様において、症
状は、 脳容量の低下、筋萎縮、心不全、グルコース耐性の低下、体重減少、骨粗鬆症、
および精巣萎縮、からなる群から選択される末梢症状である。
【００９３】
ハンチントン病の処置、予防、または軽減のための医薬の調整のための方法および化合物もまた提供される。
特定の態様は、ハンチントン病を治療し、軽減し、または予防するための医薬の製造における、本明細書中において記載された化合物の使用を提供する。
【００９４】
特定の態様は、本明細書中で記載された追加の薬剤または治療との組み合わせ治療により、本明細書中において記載されたハンチントン病を治療し、予防しまたは軽減する際に使用するための、本明細書中において記載された化合物を提供する。薬剤または治療法を、共投与することができ、または付随して投与することができる。
【００９５】
特定の態様は、本明細書中で記載された追加の薬剤または治療法との組み合わせ治療により、本明細書中において記載されたハンチントン病を治療し、予防しまたは軽減するための医薬の製造における、本明細書中において記載された化合物の使用を提供する。薬剤または治療法を、共投与することができ、または付随して投与することができる。
【００９６】
特定の態様は、本明細書中において記載される追加の薬剤または治療法を引き続いて投与される患者において、本明細書中において記載されるハンチントン病を治療し、予防しまたは軽減するための医薬の製造における、本明細書中において記載される化合物の使用を提供する。
【００９７】
特定の態様は、本明細書中において記載されるハンチントン病を治療し、予防しまたは軽減するためのキットであって、以下のもの：
(i）本明細書中で記載された化合物；およびその代わりに
(ii）本明細書中において記載される追加の薬剤または治療法；
を含むキットを提供する。
【００９８】
本明細書中において記載されるキットには、本明細書中において記載される組み合わせ治療により、本明細書中において記載されるハンチントン病を治療し、予防しまたは軽減するためのキッチを使用するための説明書がさらに含まれてもよい。
【００９９】
特定の態様は、動物に対して治療的有効量の化合物を投与して、それによりハンチンチンの発現を阻害することにより、ハンチンチンに関連した疾患または症状を有する動物を治療する際に使用するための、12〜30個の連結したヌクレオシド修飾されたオリゴヌクレオチドを含む化合物を提供し、ここで連結したヌクレオシドは、SEQ ID NO: 6、9、10、11、12、13、14、15、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、32、33、35、または36に示される配列の少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11
、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、または少なくとも20個の隣接した核酸塩基を含む。特定の態様において、疾患または症状は、神経学的障害である。特定の態様において、疾患または症状は、ハンチントン病である。特定の態様において、動物がヒトである。
【０１００】
特定の態様は、ハンチンチンに関連した疾患または症状を有する動物に対して治療的有効量の化合物を投与して、ハンチントン病の進行を予防し、治療し、軽減しまたは遅らせることにより、その動物において使用するための、12〜30個の連結したヌクレオシド修飾されたオリゴヌクレオチドを含む化合物を提供し、ここで連結したヌクレオシドは、SEQ ID NO: 6、9、10、11、12、13、14、15、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28
、29、30、32、33、35、または36に示される配列の少なくとも8、少なくとも9、少なくと
も10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、または少なくとも20個の隣接した核酸塩基を含む。
【０１０１】
特定の態様は、ハンチンチンに関連した疾患または症状を有する動物に対して治療的有効量の化合物と投与し、それによりハンチンチンの発現を阻害することにより、その動物において使用するための、12〜30個の連結したヌクレオシド修飾されたオリゴヌクレオチドを含む化合物を提供し、ここで連結したヌクレオシドは、SEQ ID NO: 12、22、28、30
、32、または33に示される配列の少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19。または少なくとも20個の隣接した核酸塩基を含む。特定の態様において、疾患または症状は、神経学的障害である。特定の態様において、疾患または症状は、ハンチントン病である。特定の態様において、動物がヒトである。
【０１０２】
特定の態様は、ハンチンチンに関連した疾患または症状を有する動物に対して、治療的有効量の化合物を投与して、ハンチントン病の進行を予防し、治療し、軽減し、または遅らせることにより、その動物において使用するための、12〜30個の連結したヌクレオシド修飾されたオリゴヌクレオチドの連結したヌクレオシド修飾されたオリゴヌクレオチドを含む化合物を提供し、ここで連結したヌクレオシドは、SEQ ID NO: 12、22、28、30、32
、または33に示される配列の、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、または少なくとも20個の隣接した核酸塩基を含む。
【０１０３】
特定の態様は、ハンチンチンに関連した疾患または症状を有する動物に対して、治療的有効量の化合物を投与して、それによりハンチンチンの発現を阻害することにより、その動物において使用するための、12〜30個の連結したヌクレオシド修飾されたオリゴヌクレオチドを含む化合物を提供し、ここで連結したヌクレオシドは、SEQ ID NO: 1のヌクレオチド4384-4403、4605-4624、4607-4626、4608-4627、4609-4628、4610-4629、4617-4636
、4622-4639、4813-4832、4814-4833、4823-4842、4860-4877、4868-4887、4925-4944、4928-4947、4931-4950、4931-4948、4955-4974、4960-4977、5801-5820、5809-5828、5809-5826、101088-101105、115066-115085、4607-4626、4608-4627、4609-4628、4610-4629
、4813-4832、4862-4881、5809-5828および4928-4947から選択される領域中で相補的な、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、少なくとも13個、少なくとも14個、少なくとも15個、少なくとも16個、少なくとも17個、少なくとも18個、少なくとも19個、または少なくとも20個の隣接した核酸塩基部分を含む。
【０１０４】
特定の態様は、ハンチンチンに関連した疾患または症状を有する動物に対して、治療的有効量の化合物を投与して、ハンチントン病の進行を予防し、治療し、軽減しまたは遅らせることにより、その動物において使用するための、12〜30個の連結したヌクレオシド修飾されたオリゴヌクレオチドを含む化合物を提供し、ここで連結したヌクレオシドは、SEQ ID NO: 1のヌクレオチド4384-4403、4605-4624、4607-4626、4608-4627、4609-4628、4610-4629、4617-4636、4622-4639、4813-4832、4814-4833、4823-4842、4860-4877、4868-4887、4925-4944、4928-4947、4931-4950、4931-4948、4955-4974、4960-4977、5801-5820、5809-5828、5809-5826、101088-101105、115066-115085、4607-4626、4608-4627、4609-4628、4610-4629、4813-4832、4862-4881、5809-5828および4928-4947から選択される領域中で相補的な、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、少なくとも個13個、少なくとも14個、少なくとも15個、少なくとも16個、少なくとも17個、少なくとも18個、少なくとも19個、または少なくとも20個の隣接した核酸塩基部分を含む。
【０１０５】
アンチセンス化合物
オリゴマー化合物には、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、オリゴヌクレオチド類似体、オリゴヌクレオチド模倣体、アンチセンス化合物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびsiRNAが含まれるが、これらには限定されない。オリゴマー化合物は、標
的核酸に対して“アンチセンス”であってもよく、このことは標的核酸に対して水素結合を介してハイブリダイゼーションを受けることができることを意味する。
【０１０６】
特定の態様において、アンチセンス化合物は、5'→3'の方向で記述する場合、アンチセンス化合物が標的とする標的核酸の標的セグメントの逆相補鎖を含む、核酸塩基配列を有する。特定のそのようた態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、5'→3'の方向で記述する場合、アンチセンスオリゴヌクレオチドが標的とする標的核酸の標的セグメントの逆相補鎖を含む、核酸塩基配列を有する。
【０１０７】
特定の態様において、ハンチンチン核酸を標的とするアンチセンス化合物は、12〜30個のヌクレオチドの長さである。言い換えると、アンチセンス化合物は、12〜30個の連結された核酸塩基である。その他の態様において、アンチセンス化合物は、8〜80個、12〜50
個、15〜30個、18〜24個、19〜22個、または20個の連結された核酸塩基からなる修飾されたオリゴヌクレオチドを含む。特定のそのような態様において、アンチセンス化合物は、長さにして8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、または80個の連結された核酸塩基からなる修飾されたオリゴヌクレオチドを含み、または上記の値のいずれか2つに
より規定される範囲の長さの修飾されたオリゴヌクレオチドを含む。
【０１０８】
特定の態様において、アンチセンス化合物は、短いまたは短縮された修飾されたオリゴヌクレオチドを含む。短いまたは短縮された修飾されたオリゴヌクレオチドは、5'末端から1ヌクレオシドを削除したもの（5'短縮型）、または3'末端から1ヌクレオシドを削除したもの（3'短縮型）であってもよい。短いまたは短縮されたオリゴヌクレオチドは、5'末端から2ヌクレオシドを削除したものであってもよく、または3'末端から2ユニットを削除したものであってもよい。あるいは、削除されたヌクレオシドは、修飾されたオリゴヌクレオチドの全体を通じて、たとえば、5'末端から1ヌクレオシドを削除したアンチセンス
化合物および3'末端から1ヌクレオシドを削除したアンチセンス化合物の全体を通じて、
分散されていてもよい。
【０１０９】
追加の1ヌクレオシドが長くされたオリゴヌクレオチド中に存在する場合、追加のヌク
レオシドが、オリゴヌクレオチドの5'末端または3'末端に位置していてもよい。2つまた
はそれ以上の追加のヌクレオシドが存在する場合、追加されたヌクレオシドは、互いに隣接していてもよく、たとえば、オリゴヌクレオチドの5'末端に2ヌクレオシドが追加され
たオリゴヌクレオチド（5'付加）、または3'末端に2ヌクレオシドが追加されたオリゴヌ
クレオチド（3'付加）を有するものであってもよい。あるいは、付加されたヌクレオシドは、アンチセンス化合物の全体を通じて、たとえば、5'末端に1ヌクレオシドを追加する
オリゴヌクレオチドおよび3'末端に1サブユニットを追加するオリゴヌクレオチド中の全
体を通じて、分散されていてもよい。
【０１１０】
アンチセンス化合物、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、の長さを増加または減少させることができおよび／または活性を除くことなくミスマッチ塩基を導入することができる。たとえばWoolf et al.（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7305-7309, 1992）に
おいて、13〜25個の長さの核酸塩基のアンチセンスオリゴヌクレオチドの一連のものを、卵母細胞注射モデルにおける標的RNAの切断を導入する能力について試験した。8または11
個のミスマッチ塩基をアンチセンスオリゴヌクレオチドの両末端のそばに有する25核酸塩基の長さのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ミスマッチを1つも含有しないアンチセ
ンスオリゴヌクレオチドと比較して低い程度ではあったが、標的mRNAの特異的な切断を起こすことができた。同様に、標的特異的切断を、1個または3個のミスマッチを有するものを含む13個の核酸塩基のアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して、達成した。
【０１１１】
Gautschi et al（J. Natl. Cancer Inst. 93:463-471, March 2001）は、bcl-2 mRNAに対して100％の相補性を有しそしてbcl-xL mRNAに対して3個のミスマッチを有するオリゴ
ヌクレオチドが、in vitroおよびin vivoにおいてbcl-2およびbcl-xLの両方の発現を減少させる能力を有することを示した。さらに、このオリゴヌクレオチドが、in vivoで強力
な抗-腫瘍活性を有することを示した。
【０１１２】
Maher and Dolnick（Nuc. Acid. Res. 16:3341-3358,1988）は、タンデムに並んだ14個の核酸塩基のアンチセンスオリゴヌクレオチドの一連のものおよびタンデムに並んだアンチセンスオリゴヌクレオチドの2つまたは3つの配列を含む28個および42個の核酸塩基のアンチセンスオリゴヌクレオチドについて、それぞれ、ウサギ網状赤血球アッセイにおいてヒトDHFRの翻訳を捕捉する能力について試験した。3つの14核酸塩基のアンチセンスオリ
ゴヌクレオチド単独のそれぞれが、28個または42個の核酸塩基のアンチセンスオリゴヌクレオチドと比較してより穏やかなレベルではあったが、翻訳を阻害することができた。
【０１１３】
アンチセンス化合物モチーフ
特定の態様において、ハンチンチン核酸を標的とするアンチセンス化合物は、阻害活性の亢進、標的核酸に対する結合親和性の増加、またはin vivoヌクレアーゼによる分解に
対する耐性などの、アンチセンス化合物特性を付与するようなパターンまたはモチーフで配置された化学的に修飾されたサブユニットを有する。
【０１１４】
キメラアンチセンス化合物は、典型的には、ヌクレアーゼ分解に対する耐性の上昇、細胞取り込みの増加、標的核酸に対する結合親和性の増加、および／または阻害活性の増加を付与するように修飾された少なくとも1つの領域を含有する。キメラアンチセンス化合
物の第2の領域は、場合により、細胞エンドヌクレアーゼRNase Hに対する気質として機能してもよく、RNA：DNA二重鎖のRNA鎖を切断する。
【０１１５】
ギャップマーモチーフを有するアンチセンス化合物は、キメラアンチセンス化合物と考えられる。ギャップマーにおいて、RNaseH切断をサポートする複数のヌクレオチドを有する内部領域は、内部領域のヌクレオシドとは化学的に異なる複数のヌクレオチドを有する外部領域の間に位置する。ギャップマーモチーフを有するアンチセンスオリゴヌクレオチドの場合、ウィング部分が修飾されたヌクレオシドを含むのに対して、ギャップ部分は、一般的に、エンドヌクレアーゼ切断のための基質として機能する。特定の態様において、ギャップマーの領域は、それぞれ異なる領域を含む様々な糖成分により、差別化される。ギャップマーの領域を識別するために使用する糖成分の種類には、いくつかの態様において、β-D-リボヌクレオシド、β-D-デオキシリボヌクレオシド、2'-修飾ヌクレオシド（
そのような2'-修飾ヌクレオシドには、2'-MOE、および2'-O-CH3、などが含まれていても
よい）、および2環糖修飾ヌクレオシド（そのような2環糖修飾ヌクレオシドには、4'-(CH2)n-O-2'ブリッジ、ここでn=1またはn=2、を有する物が含まれていてもよい）が含まれていてもよい。好ましくは、それぞれの異なる領域は、均一な糖成分を含む。ウィング-ギ
ャップ-ウィングモチーフは、しばしば“X-Y-Z”と記載され、ここで“X”は5'ウィング
領域の長さを示し、“Y”はギャップ領域の長さを示し、そして“Z”は3'ウィング領域の長さを示す。本明細書中で使用される場合、“X-Y-Z”として記載されるギャップマーは
、ギャップ部分が5'ウィング部分および3'ウィング部分のぞれぞれにすぐに隣接して位置するような配置を有する。このように、5'ウィング部分とギャップセグメントとのあいだ
、またはギャップ部分と3'ウィング部分との間に、介在性のヌクレオチドは存在しない。本明細書中で記載されるアンチセンス化合物のいずれかは、ギャップマーモチーフを有していてもよい。いくつかの態様において、XおよびZは同一であり、その他の態様においては、それらは異なる。好ましい態様において、Yは8〜15個のヌクレオチドである。X、YまたはZは、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、25個、30個またはそれ以上のヌクレオチドのいずれか出会ってもよい。このように、ギャップマーには、たとえば5-10-5、4-8-4、4-12-3、4-12-4、3-14-3、2-13-5、2-16-2、1-18-1、3-10-3、2-10-2、1-10-1、2-8-2、6-8-6または5-8-5が含まれるが、これらには限定されない。
【０１１６】
特定の態様において、ウィング-ギャップまたはギャップ-ウィング構造としてのアンチセンス化合物は、“ウィングマー”モチーフ、すなわち、ギャップマー構造に関して上述したX-YまたはY-Z構造を有する。このように、ウィングマー構造には、たとえば5-10、8-4、4-12、12-4、3-14、16-2、18-1、10-3、2-10、1-10、8-2、2-13、または5-13が含まれるが、これらには限定されない。
【０１１７】
特定の態様において、ハンチンチン核酸を標的とするアンチセンス化合物は、5-10-5ギャップマーモチーフを有する。
特定の態様において、ハンチンチン核酸を標的とするアンチセンス化合物は、6-8-6ギ
ャップマーモチーフを有する。
【０１１８】
特定の態様において、ハンチンチン核酸を標的とするアンチセンス化合物は、5-8-5ギ
ャップマーモチーフを有する。
特定の態様において、ハンチンチン核酸を標的とするアンチセンス化合物は、ギャップに広がったモチーフを有する。
【０１１９】
特定の態様において、ハンチンチン核酸を標的とするギャップに広がったアンチセンスオリゴヌクレオチドは、5個の化学的に修飾されたヌクレオシドのウィング部分にすぐに
隣接しそしてそのあいだに位置する10個の2'-デオキシリボヌクレオチドのギャップ部分
を有する。特定の態様において、化学的修飾は、2'-糖修飾を含む。別の態様において、
化学的修飾は、2'-MOE糖修飾を含む。
【０１２０】
特定の態様において、ハンチンチン核酸を標的とするギャップに広がったアンチセンスオリゴヌクレオチドは、5個の化学的に修飾されたヌクレオシドのウィング部分にすぐに
隣接しそしてそのあいだに位置する8個の2'-デオキシリボヌクレオチドのギャップ部分を有する。特定の態様において、化学的な修飾は、2'-糖修飾を含む。別の態様において、
化学的な修飾は、2'-MOE糖修飾を含む。
【０１２１】
特定の態様において、ハンチンチン核酸を標的とするギャップに広がったアンチセンスオリゴヌクレオチドは、6個の化学的に修飾されたヌクレオシドのウィング部分に理すぐ
に隣接しそしてその間に位置する、8個の2'-デオキシリボヌクレオチドのギャップ部分を有する。特定の態様において、化学的な修飾は、2'-糖修飾を含む。別の態様において、
化学的な修飾は、2'-MOE糖修飾を含む。
【０１２２】
標的核酸、標的領域、およびヌクレオチド配列
ハンチンチンをコードするヌクレオチド配列には、以下のものが含まれるが、これらには限定されない：GENBANKアクセッションNo. NM_002111.6、GENBANK（登録商標）には2006年5月31日に初めて寄託され、本明細書中ではSEQ ID NO: 1として援用される；ヌクレオチド462000〜634000が短縮されたGENBANKアクセッションNo. NT_006081.17、GENBANK（登録商標）には2004年8月19日に初めて寄託され、そして本明細書中ではSEQ ID NO: 2とし
て援用される；GENBANKアクセッションNo. NM_010414.1、GENBANK（登録商標）には2004
年3月23日に初めて寄託され、そして本明細書中ではSEQ ID NO: 3として援用される；ヌ
クレオチド698000〜866000で短縮されたGENBANKアクセッションNo. NW_001109716.1の相
補鎖、GENBANK（登録商標）には2006年7月14日に初めて寄託され、そして本明細書中ではSEQ ID NO: 4として援用される、そしてGENBANKアクセッションNo. NM_024357.2、GENBANK（登録商標）には2008年6月5日に初めて寄託され、そして本明細書中ではSEQ ID NO: 5
として援用される。
【０１２３】
本明細書中に含まれる実施例中のそれぞれのSEQ ID NO に記載される配列は、糖成分、ヌクレオシド間結合、または核酸塩基に対するいずれかの修飾とは独立していることが理解される。このように、SEQ ID NOにより定義されるアンチセンス化合物は、独立して、
糖成分、ヌクレオシド間結合、または核酸塩基に対して1またはそれ以上の修飾を含んで
もよい。Isis Number（Isis No）により記載されるアンチセンス化合物は、核酸塩基配列とモチーフとの組み合わせを示す。
【０１２４】
特定の態様において、標的領域は、標的核酸の構造的に規定された領域である。たとえば、標的領域は、3' UTR、5' UTR、エクソン、イントロン、エクソン/イントロン接合部
、コード領域、翻訳開始領域、翻訳終止領域、またはその他の規定の核酸領域、を含んでもよい。ハンチンチンに関して構造的に規定された領域は、NCBIなどの配列データベースからアクセッション番号により得ることができ、そしてそのような情報を本明細書中に参照により援用する。特定の態様において、標的領域は、標的領域内の1つの標的セグメン
トの5'標的部位から標的領域内の別の標的セグメントの3'標的部位までの配列を含むことができる。
【０１２５】
標的化には、アンチセンス化合物がハイブリダイズして、それにより所望の作用を生じる少なくとも1つの標的セグメントの決定が含まれる。特定の態様において、所望の効果
は、mRNA標的核酸レベルの減少である。特定の態様において、所望の効果は、標的核酸によりコードされるタンパク質レベルの減少または標的核酸と関連した表現型変化である。
【０１２６】
標的領域は、1またはそれ以上の標的セグメントを含有してもよい。標的領域内の複数
の標的セグメントは、オーバーラップしていてもよい。あるいは、それらは、オーバーラップしていなくてもよい。特定の態様において、標的領域内の標的セグメントは、わずか約300個のヌクレオチドにより隔てられている。特定の態様において、標的領域内の標的
セグメントは、標的核酸上の250個、200個、150個、100個、90個、80個、70個、60個、50個、40個、30個、20個、または10個のヌクレオチド、標的核酸上の約250個、約200個、約150個、約100個、約90個、約80個、約70個、約60個、約50個、約40個、約30個、約20個、または約10個のヌクレオチド、標的核酸上のわずか250個、わずか200個、わずか150個、
わずか100個、わずか90個、わずか80個、わずか70個、わずか60個、わずか50個、わずか40個、わずか30個、わずか20個、またはわずか10個のヌクレオチド、標的核酸上のわずか
約250個、わずか約200個、わずか約150個、わずか約100個、わずか約90個、わずか約80個、わずか約70個、わずか約60個、わずか約50個、わずか約40個、わずか約30個、わずか約20個、またはわずか約10個のヌクレオチド、の多数のヌクレオチドにより隔てられており、あるいは前述の値のいずれか2つにより規定される範囲である多数のヌクレオチドによ
り隔てられる。特定の態様において、標的領域内の標的セグメントは、標的核酸上のわずか5個のヌクレオチドまたはわずか約5個のヌクレオチドにより隔てられている。特定の態様において、標的セグメントは、隣接している。本明細書中で列挙した5'標的部位または3'標的部位のいずれかである開始核酸を有する範囲により綺麗される標的領域が意図される。
【０１２７】
適切な標的セグメントは、5' UTR、コード領域、3' UTR、イントロン、エクソン、また
はエクソン/イントロン接合部の内部に見出すことができる。開始コドンまたは停止コド
ンを含有する標的セグメントもまた、適切な標的セグメントである。適切な標的セグメントは、開始コドンまたは停止コドン等の特定の構造的により規定された領域を、特異的に除くことができる。
【０１２８】
適切な標的セグメントの決定には、標的核酸の配列を、ゲノム全体でその他の配列と比較することが含まれていてもよい。たとえば、BLASTアルゴリズムを使用して、異なる核
酸の中での共通性の領域を同定することができる。この比較は、選択された標的核酸以外の配列（すなわち、非-標的配列または標的配列外）に対して非特異的様式でハイブリダ
イズすることができる、アンチセンス化合物配列の選択を阻害することができる。
【０１２９】
活性標的領域内のアンチセンス化合物の活性（例えば、標的核酸レベルの％減少により規定される）において、バリエーションが存在していてもよい。特定の態様において、ハンチンチンmRNAレベルの減少は、ハンチンチン発現の阻害の指標である。ハンチンチンタンパク質のレベルの減少もまた、標的mRNA発現の阻害の指標である。さらに、表現型変化は、ハンチンチン発現の阻害の指標である。たとえば、脳のサイズの正常までの増加、運動協調性の改善、断続的な筋肉の痙攣（dystonia）の減少、易刺激性および／または不安の減少、記憶力の改善、または精力の増加、その他の表現型変化をアッセイすることができる。その他の表現型指標、例えば、ハンチントン病に関連する症候、もまた、以下に記載されるように評価することができる。
【０１３０】
ハイブリダイゼーション
いくつかの態様において、ハイブリダイゼーションは、本明細書中で開示されるアンチセンス化合物と、ハンチンチン核酸とのあいだで生じる。ハイブリダイゼーションの最も一般的なメカニズムは、核酸分子の相補的核酸塩基とのあいだの水素結合（例えば、ワトソン-クリック水素結合、フーグスティーン水素結合または逆フーグスティーン水素結合
）が関与する。
【０１３１】
ハイブリダイゼーションは、様々な条件下で生じることができる。ストリンジェントな条件は、配列-依存性であり、そしてハイブリダイズされる核酸分子の性質および組成に
より決定される。
【０１３２】
標的核酸に対して特異的にハイブリダイズするかどうかを決定する方法は、当該技術分野において周知である。特定の態様において、本明細書中で提供されるアンチセンス化合物は、ハンチンチン核酸と特異的にハイブリダイズする。
【０１３３】
相補性
アンチセンス化合物および標的核酸は、アンチセンス化合物の十分な数の核酸塩基が標的核酸の対応する核酸塩基と水素結合し、それにより所望の作用（例えば、例えばハンチンチン核酸などの標的核酸のアンチセンス阻害）を生じることができる場合に、互いに相補的である。
【０１３４】
アンチセンス化合物は、ハンチンチン核酸の1またはそれ以上のセグメントとハイブリ
ダイズすることができ、その結果として介在性のセグメントまたは隣接するセグメントがハイブリダイゼーション事象に関与しない（例えば、ループ構造、ミスマッチ、またはヘアピン構造）。
【０１３５】
特定の態様において、本明細書中で提供されるアンチセンス化合物、またはその特定の部分、は、ハンチンチン核酸、標的領域、標的セグメント、またはそれらの特定の部分に対して、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、
95％、96％、97％、98％、99％、または100％相補的であるか、または少なくとも70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97
％、98％、99％、または100％相補的である。アンチセンス化合物の標的核酸との％相補
性は、通常の方法を使用して決定することができる。
【０１３６】
たとえば、アンチセンス化合物の20個の核酸塩基のうちの18個が標的領域に対して相補的であり、そしてしたがって特異的にハイブリダイズすることができるアンチセンス化合物は、90％の相補性を示す。この例において、残りの相補的ではない核酸塩基は、相補的な核酸塩基とクラスターを形成しまたは点在することができ、互いに隣接する必要はなく、また相補的な核酸塩基に対して隣接する必要もない。このように、標的核酸と完全に相補的である2つの領域により挟まれている4個の相補的ではない核酸塩基を有する長さが18個の核酸塩基であるアンチセンス化合物は、標的核酸と全体で77.8％の相補性を有し、そしてしたがって、本発明の範囲に包含される。アンチセンス化合物の標的核酸の領域との％相補性は、当該技術分野において知られているBLASTプログラム（basic local alignment search tools）およびPowerBLASTプログラム（Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403 410；Zhang and Madden, Genome Res., 1997, 7, 649 656）を使用して、日常的に決定することができる。％相補性、配列同一性または相補性は、たとえば、Gapプ
ログラム（Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.）により、Smith and Watermanのアルゴリズム（Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482 489）を使用する初期設定を使用して、決定することができる。
【０１３７】
特定の態様において、本明細書中で提供されるアンチセンス化合物、またはその特定の部分、は、標的核酸、またはその特定の部分に対して完全に相補的（すなわち、100％相
補的）である。たとえば、アンチセンス化合物は、ハンチンチン核酸、または標的領域、または標的セグメントまたはその標的配列に対して完全に相補的であってもよい。本明細書中で使用される場合、“完全に相補的”は、アンチセンス化合物のそれぞれの核酸塩基が、標的核酸の対応する核酸塩基と正確な塩基対合をすることができることを意味する。たとえば、20個の核酸塩基アンチセンス化合物は、アンチセンス化合物に対して完全に相補的な標的核酸の対応する20個の核酸塩基部分が存在する限りにおいて、400個の核酸塩
基の長さの標的配列に対して完全に相補的である。完全に相補的なは、第1の核酸および
／または第2の核酸の特定の部分を参照して、使用することもできる。たとえば、30個の
核酸塩基アンチセンス化合物の20個の核酸塩基部分は、400個の核酸塩基の長さの標的配
列に対して“完全に相補的”であることができる。30個の核酸塩基オリゴヌクレオチドの20個の核酸塩基部分は、標的配列が対応する20個の核酸塩基部分を有し、それぞれの核酸塩基がアンチセンス化合物の20個の核酸塩基部分に対して相補的ならば、標的配列に対して完全に相補的である。同時に、全体の30個の核酸塩基アンチセンス化合物は、アンチセンス化合物の残りの10個の核酸塩基もまた標的配列に対して相補的であるかどうかに依存して、標的配列に対して完全に相補的であってもよく、または完全に相補的ではなくてもよい。
【０１３８】
非-相補的な核酸塩基の位置は、アンチセンス化合物の5'末端または3'末端であっても
よい。あるいは、非-相補的な核酸塩基または核酸塩基は、アンチセンス化合物の内部位
置であってもよい。2つまたはそれ以上の非-相補的な核酸塩基が存在する場合、それらは隣接（すなわち、連結）していてもよく、または隣接していなくてもよい。一態様において、非-相補的な核酸塩基は、ギャップマーアンチセンスオリゴヌクレオチドのウィング
部分に位置している。
【０１３９】
特定の態様において、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、または20個の長さの核酸塩基または12個まで、13個まで、14個まで、15個まで、16個まで、17個まで
、18個まで、19個まで、または20個までの長さの核酸塩基であるアンチセンス化合物は、標的核酸、例えばハンチンチン核酸、またはその特定の部分との関連で、わずか4個、わ
ずか3個、わずか2個、またはわずか1個の非-相補的な核酸塩基を含む。
【０１４０】
特定の態様において、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、または30個の長さの核酸塩基、または12個まで、13個まで、14個まで、15個まで、16個まで、17個まで、18個まで、19個まで、20個まで、21個まで、22個まで、23個まで、24個まで、25個まで、26個まで、27個まで、28個まで、29個まで、または30個までの長さの核酸塩基であるアンチセンス化合物は、標的核酸、例えばハンチンチン核酸、またはその特定の部分との関連で、わずか6個、
わずか5個、わずか4個、わずか3個、わずか2個、またはわずか1個の非-相補的な核酸塩基を含む。
【０１４１】
本明細書中で提供されるアンチセンス化合物にもまた、標的核酸の部分に対して相補的なものが含まれる。本明細書中で使用される場合、“部分”は、標的核酸の領域またはセグメント中の、規定数の隣接する（すなわち、連結する）核酸塩基のことをいう。“部分”はまた、アンチセンス化合物の規定数の隣接した核酸塩基のこともいう。特定の態様において、アンチセンス化合物は、標的セグメントの少なくとも8個の核酸塩基部分に対し
て相補的である。特定の態様において、アンチセンス化合物は、標的セグメントの少なくとも12個の核酸塩基部分に対して相補的である。特定の態様において、アンチセンス化合物は、標的セグメントの少なくとも15個の核酸塩基部分に対して相補的である。同様に、少なくとも9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個
、またはそれ以上の標的セグメントの核酸塩基部分、またはこれらの値のうちのいずれか2つにより規定される範囲の標的セグメントの核酸塩基部分に対して相補的なアンチセン
ス化合物も意図される。
【０１４２】
同一性
本明細書中中で提供されるアンチセンス化合物はまた、特定のヌクレオチド配列、SEQ ID NO、に対する規定の％同一性を有するものであってもよく、または特定のIsis番号に
より示される化合物、またはその部分であってもよい。本明細書中で使用される場合、アンチセンス化合物は、同一の核酸塩基対合能力を有する場合、本明細書中で開示される配列と同一である。たとえば、開示されたDNA配列のチミジンの代わりにウラシルを含有す
るRNAは、ウラシルおよびチミジンはともにアデニンと対合するため、DNA配列と同一であると考えられる。本明細書中に記載されたアンチセンス化合物の短縮型または延長型、並びに本明細書中で提供されたアンチセンス化合物と比較して同一ではない塩基を有する化合物もまた、企図される。同一ではない塩基は、互いに隣接していてもよく、あるいはアンチセンス化合物全体にわたり分散されていてもよい。アンチセンス化合物の％同一性は、比較されるべき配列と比較して、同一の塩基対合を有する塩基数に従って算出される。
【０１４３】
特定の態様において、アンチセンス化合物、またはその部分は、本明細書中で開示される1またはそれ以上のアンチセンス化合物あるいはSEQ ID NOs、またはその部分と、少な
くとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％または100％同一
である。
【０１４４】
修飾
ヌクレオシドは、塩基-糖の組み合わせである。ヌクレオシドの核酸塩基（塩基として
も知られる）部分は、通常は、ヘテロ環式塩基部分である。ヌクレオチドは、さらにヌクレオシドの糖部分に対して共有結合しているリン酸基が含まれるヌクレオシドである。ペントフラノシル糖が含まれるヌクレオシドについて、リン酸基は、糖の2'、3'または5'ヒドロキシ部分に結合していてもよい。オリゴヌクレオチドは、隣接するヌクレオシドが互
いに共有結合して、直鎖重合化オリゴヌクレオチドを形成することを通じて形成される。オリゴヌクレオチド構造中で、リン酸基は、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間結合を形成するものとして一般的に言及される。
【０１４５】
アンチセンス化合物に対する修飾は、ヌクレオシド間結合、糖成分、または核酸塩基に対する置換または変化を企図する。修飾アンチセンス化合物は、しばしば、たとえば、細胞取り込みの亢進、核酸標的に対する親和性の亢進、ヌクレアーゼの存在下での安定性の増加、または阻害活性の増加、等の好ましい特性のため、天然型以上に好ましい。
【０１４６】
化学的に修飾されたヌクレオシドを使用して、その標的核酸に対する短くされたかまたは短縮されたアンチセンスオリゴヌクレオチドの結合親和性を増加させることもできる。結果的に、そのような化学的に修飾されたヌクレオシドを有するより短いアンチセンス化合物を用いて、対比できる結果を、得ることができる。
【０１４７】
修飾ヌクレオシド間結合
天然に存在するRNAおよびDNAのヌクレオシド間結合は、3'→5'ホスホジエステル結合である。1またはそれ以上の修飾された、すなわち、天然に存在しない、ヌクレオシド間結
合を有するアンチセンス化合物は、たとえば、細胞取り込みの亢進、標的核酸に対する親和性の亢進、そしてヌクレアーゼ存在下での安定性の増加、などの好ましい特性のため、天然に存在するヌクレオシド間結合を有するアンチセンス化合物以上にしばしば選択される。
【０１４８】
修飾ヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドには、リン原子を維持するヌクレオシド間結合、並びにリン原子を有さないヌクレオシド間結合が含まれる。代表的なリン含有ヌクレオシド間結合には、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、ホスホールアミデート、およびホスホロチオエートが含まれるが、これらには限定されない。リン-含有結合および非-リン-含有結合の調製方法は、周知である。
【０１４９】
特定の態様において、ハンチンチン核酸を標的とするアンチセンス化合物は、1または
それ以上の修飾ヌクレオシド間結合を含む。特定の態様において、修飾ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である。特定の態様において、アンチセンス化合物のそれぞれのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。
【０１５０】
修飾糖成分
アンチセンス化合物は、場合により、糖基が修飾される、1またはそれ以上のヌクレオ
シドを含有することができる。そのような糖修飾ヌクレオシドは、ヌクレアーゼ安定性の亢進、結合親和性の増加、またはいくつかのその他の有益な生物学的特性を、アンチセンス化合物に対してもたらすことができる。特定の態様において、ヌクレオシドは、科学的に修飾されたリボフラノース環成分を含む。化学的に修飾されたリボフラノース環の実施例には、限定されるわけではないが、置換基の付加（5'および2'置換基、2環式核酸（BNA）を形成するための非-ジェミナルの環原子の架橋、S、N（R）、またはC（R1）（R）2（R＝H、C1〜C12アルキルまたは保護基）によるリボシル環酸素原子の置換およびこれらの組み合わせが含まれる。化学的に修飾された糖の例には、2'-F-5'-メチル置換ヌクレオシド（PCT国際出願WO 2008/101157（2008年8月21日公開）を参照、その他の開示された5',2'-bis置換ヌクレオシドに関して）あるいは2'-位での更なる置換を含むリボシル環酸素原子のSでの置換（公開されたU.S.特許出願US2005-0130923（2005年6月16日公開）を参照）またはあるいはBNAの5'-置換（PCT国際出願WO 2007/134181（2007年11月22日公開）を参照
、LNAがたとえば5'-メチル基または5'-ビニル基により置換されたもの）、が含まれる。
【０１５１】
修飾糖成分を有するヌクレオシドの例には、限定されるわけではないが、5'-ビニル、5
'-メチル（RまたはS）、4'-S、2'-F、2'-OCH3および2'-O（CH2）2OCH3置換基を含むヌク
レオシドが含まれる。2'位での置換は、アリル、アミノ、アジド、チオ、O-アリル、O-C1〜C10アルキル、OCF3、O（CH2）2SCH3、O（CH2）2-O-N（Rm）（Rn）、およびO-CH2-C（＝O）-N（Rm）（Rn）、から選択することもでき、ここでRmおよびRnはそれぞれ独立して、Hまたは置換または非置換のC1〜C10アルキルである。
【０１５２】
2環式核酸（BNAs）の例には、限定されるわけではないが、4'と2'リボシル基とのあい
だのブリッジを含むヌクレオシドが含まれる。特定の態様において、本明細書中において提供されるアンチセンス化合物には、ブリッジが以下の式のイトツを含む1またはそれ以
上のBNAヌクレオシドが含まえる：4'-（CH2）-O-2'（LNA)；4'-（CH2）-S-2'；4'-（CH2
）-O-2'（LNA）；4'-（CH2）2-O-2'（ENA）；4'-C（CH3）2-O-2'（PCT/US2008/068922を
参照）；4'-CH（CH3）-O-2'および4'-CH（CH2OCH3）-O-2'（U.S.特許7,399,845（2008年7月15日に発行）を参照）；4'-CH2-N（OCH3）-2'（PCT/US2008/064591を参照）；4'-CH2-O-N（CH3）-2'（公開されたU.S.特許出願US2004-0171570（2004年9月2日公開）を参照）；4'-CH2-N（R）-O-2'（U.S.特許7,427,672（2008年9月23日発行）を参照；4'-CH2-C（CH3
）-2'および4'-CH2-C（=CH2）-2'（PCT/US2008/066154を参照）；およびRは、独立して、H、C1〜C12アルキル、または保護基である。上述したBNAのそれぞれには、たとえばα-L-リボフラノースおよびβ-D-リボフラノース（PCT国際出願PCT/DK98/00393（1999年3月25
日にWO 99/14226として公開）を参照）を含む様々な立体化学的な糖構造が含まれる。
【０１５３】
特定の態様において、ヌクレオシドを、リボシル環を糖代理物により置換することにより修飾する。その様な修飾には、限定的ではないが、リボシル環を、代理の環系（しばしばDNA類似体とも呼ばれるもの）、例えば、モルホリノ環、シクロヘキセニル環、シクロ
ヘキシル環、またはテトラヒドロピラニル環、例えば以下の式の一つを有するもの：
【０１５４】
【化２】
2020115894.tif 000003
などにより置換することが含まれる。
【０１５５】
多数のその他の2環糖代替物環系および3環糖代替物環もまた、当該技術分野において知られており、それらを使用して、アンチセンス化合物への導入のためにヌクレオシドを修飾することができる（例えば、レビュー記事：Leumann, J.C, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2002, 10, 841-854を参照）。そのような環系は、様々な追加の置換を受けて、活性を亢進することができる。
【０１５６】
修飾糖の調製のための方法は、当業者に周知である。
修飾糖成分を有するヌクレオチドにおいて、核酸塩基成分（天然、修飾、またはそれらの組み合わせ）を、適切な核酸標的とのハイブリダイゼーションのために維持する。
【０１５７】
特定の態様において、ハンチンチン核酸を標的とするアンチセンス化合物は、修飾糖成分を有する1またはそれ以上のヌクレオチドを含む。特定の態様において、修飾糖成分は
、2'-MOEである。特定の態様において、2'-MOE修飾ヌクレオチドは、ギャップマーモチーフ中に配置される。
【０１５８】
修飾核酸塩基
核酸塩基（または塩基）修飾または置換は、天然に存在する非修飾核酸塩基または合成
非修飾核酸塩基からは構造的に識別されるが、しかしながら機能的には互いに互換的である。天然の核酸塩基および修飾核酸塩基は両方共、水素結合に関与することができる。そのような核酸塩基修飾は、ヌクレアーゼ安定性、結合親和性、またはいくつかのその他の有利な生物学的特性を、アンチセンス化合物に対して付与することができる。修飾核酸塩基には、合成の核酸塩基および天然の核酸塩基、たとえば、5-メチルシトシン（5-me-C）が含まれる。5-メチルシトシン置換を含む特定の核酸塩基置換は、標的核酸に対するアンチセンス化合物の結合親和性を増加させるために、特に有用である。たとえば、5-メチルシトシン 置換は、核酸二重鎖の安定性を0.6〜1.2℃増加させることが示された（Sanghvi, Y.S., Crooke, S.T. and Lebleu, B., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278）。
【０１５９】
追加の非修飾核酸塩基には、5-ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、2-アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの6-メチルおよびその他のアルキル、アデニンおよびグアニンの2-プロピルおよびその他のアルキル誘導体、2-チオウラシル、2-チオチミンおよび2-チオシトシン、5-ハロウラシルおよびシトシン、ピリミジン塩基の5-プロピニル（-C≡C-CH3）ウラシルおよびシトシンおよびその他のアルキニル誘導体、6-
アゾウラシル、シトシンおよびチミン、5-ウラシル（シュードウラシル）、4-チオウラシル、8-ハロ、8-アミノ、8-チオール、8-チオアルキル、8-ヒドロキシおよびその他の8-置換アデニンおよびグアニン、5-ハロ、特に5-ブロモ、5-トリフルオロメチルおよびその他の5-置換ウラシルおよびシトシン、7-メチルグアニンおよび7-メチルアデニン、2-F-アデニン、2-アミノ-アデニン、8-アザグアニンおよび8-アザアデニン、7-デアザグアニンお
よび7-デアザアデニンおよび3-デアザグアニンおよび3-デアザアデニンが含まれる。
【０１６０】
ヘテロ環式塩基成分には、プリン塩基またはピリミジン塩基がその他のヘテロ環、たとえば 7-デアザ-アデニン、7-デアザグアノシン、2-アミノピリジンおよび2-ピリドンにより置換されるものも含まれてもよい。アンチセンス化合物の結合親和性を上昇させるために特に有用な核酸塩基には、5-置換ピリミジン、6-アザピリミジンおよび2アミノプロピ
ルアデニン、5-プロピニルウラシルおよび5-プロピニルシトシンを含むN-2、N-6およびO-6置換プリン、が含まれる。
【０１６１】
特定の態様において、ハンチンチン核酸を標的とするアンチセンス化合物はｋ1または
それ以上の修飾核酸塩基を含む。特定の態様において、ハンチンチン核酸を標的とするギャップ-が広がったアンチセンスオリゴヌクレオチドは、1またはそれ以上の修飾核酸塩基を含む。特定の態様において、修飾核酸塩基は、5-メチルシトシンである。特定の態様において、各シトシンは、5-メチルシトシンである。
【０１６２】
医薬組成物を製剤化するための組成物および方法  アンチセンスオリゴヌクレオチドは、医薬組成物または製剤を製造するため、医薬的に許容可能な活性物質または不活性物質と混合することができる。医薬組成物の製剤化のための組成物および方法は、投与経路、疾患の程度、または投与される投与量を含む（しかしこれらには限定されない）、多数の基準に依存する。
【０１６３】
ハンチンチン核酸を標的とするアンチセンス化合物を、アンチセンス化合物を適切な医薬的に許容可能な希釈剤またはキャリアと組み合わせることにより、医薬組成物中で使用することができる。医薬的に許容可能な希釈剤には、リン酸-緩衝化塩類溶液（PBS）が含まれる。PBSは、非傾向的に送達される組成物において使用するために適した希釈剤であ
る。したがって、一態様において、本明細書中に記載された方法において、ハンチンチン核酸を標的とするアンチセンス化合物および医薬的に許容可能な希釈剤を含む医薬組成物を使用する。特定の態様において、医薬的に許容可能な希釈剤は、PBSである。特定の態
様において、アンチセンス化合物は、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【０１６４】
アンチセンス化合物を含む医薬組成物は、ヒトを含む動物に対して投与するに際して、生物学的に活性な代謝物またはその残留物を（直接的または間接的に）提供することができる、医薬的に許容可能な塩、エステル、またはそのようなエステルの塩、またはいずれかその他のオリゴヌクレオチドを包含する。したがって、たとえば、開示は、アンチセンス化合物の医薬的に許容可能な塩、プロドラッグ、そのようなプロドラッグの医薬的に許容可能な塩、およびその他の生物学的同等物にも関する。適切な医薬的に許容可能な塩には、ナトリウム塩およびカリウム塩が含まれるが、これらには限定されない。
【０１６５】
プロドラッグには、生体内の内在性ヌクレアーゼにより切断されて、活性のアンチセンス化合物が形成される、アンチセンス化合物の一方の端部または両端に追加のヌクレオシドを取り込むことが含まれていてもよい。
【０１６６】
複合体化アンチセンス化合物
アンチセンス化合物は、結果として得られるアンチセンスオリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、または細胞取り込みを亢進する、1またはそれ以上の成分または複合体と共有
結合していてもよい。典型的な複合体基には、コレステロール成分および脂質成分が含まれる。さらなる複合体基には、炭水化物、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオロセイン、ローダミン、クマリン、および色素が含まれる。
【０１６７】
アンチセンス化合物は、アンチセンス化合物の一方または両方の端部に一般的には結合され、たとえば、ヌクレアーゼ安定性等の特性を亢進する、1またはそれ以上の安定化基
を有するように、修飾することもできる。安定化基には、キャップ構造が含まれる。これらの末端修飾は、末端核酸を有するアンチセンス化合物がエンドヌクレアーゼ分解されることから保護し、そして細胞内での送達および／または局在化を補助することができる。キャップは、5'-末端（5'-キャップ）、または3'-末端（3'-キャップ）に存在していてもよく、または両方の末端に存在していてもよい。キャップ構造は、当該技術分野においては周知であり、そしてたとえば、逆向きデオキシ脱塩基キャップが含まれる。アンチセンス化合物の一方または両方の端部をキャップして、ヌクレアーゼ安定性を付与することができるさらなる3'および5'-安定化基には、WO 03/004602（2003年1月16日に発行）に開示されるものが含まれる。
【０１６８】
細胞培養およびアンチセンス化合物処置
レベル、活性またはハンチンチンの発現核酸に対するアンチセンス化合物の作用は、多様な細胞型においてin vitroで試験することができる。そのような懐石に使用される細胞型は、商業的供給者（たとえば、American Type Culture Collection, Manassus, VA；Zen-Bio. Inc., Research Triangle Park, NC；Clonetics Corporation, Walkersville, MD）から利用可能であり、そして細胞は供給者の指示書に従って、商業的に利用可能な試薬（たとえば、Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA）を使用して、培養される。例示的な細胞型には、、HepG2細胞、Hep3B細胞、初代肝細胞、A549細胞、GM04281線維芽
細胞およびLLC-MK2細胞が含まれるが、これらには限定されない。
【０１６９】
アンチセンスオリゴヌクレオチドのIn vitro試験
その他のアンチセンス化合物を用いた処置のために適切に修飾することができる、細胞をアンチセンスオリゴヌクレオチドにより処置するための方法が、本明細書中に記載される。
【０１７０】
一般的に、細胞をアンチセンスオリゴヌクレオチドにより処置し、その場合細胞は培養中にて約60〜80％コンフルエンスに達する。
培養細胞中にアンチセンスオリゴヌクレオチドを導入するために一般的に使用されている試薬の一つには、カチオン性脂質トランスフェクション試薬LIPOFECTIN（登録商標）（Invitrogen, Carlsbad, CA）が含まれる。アンチセンスオリゴヌクレオチドをOPTI-MEM（登録商標） 1（Invitrogen, Carlsbad, CA）中でLIPOFECTIN（登録商標）と混合し、アンチセンスオリゴヌクレオチドの所望の最終濃度および100 nMのアンチセンスオリゴヌクレオチドあたり典型的には2〜12μg/mLの範囲であるLIPOFECTIN（登録商標）濃度を達成す
る。
【０１７１】
アンチセンスオリゴヌクレオチドを培養細胞中に導入するために使用される別の試薬には、LIPOFECTAMINE 2000（登録商標）（Invitrogen, Carlsbad, CA）が含まれる。アンチセンスオリゴヌクレオチドを、OPTI-MEM（登録商標） 1血清減少培地（Invitrogen, Carlsbad, CA）中LIPOFECTAMINE 2000（登録商標）と混合し、アンチセンスオリゴヌクレオチドの所望の濃度および100 nMのアンチセンスオリゴヌクレオチドあたり典型的には2〜12
μg/mLの範囲であるLIPOFECTAMINE（登録商標）濃度を達成する。
【０１７２】
アンチセンスオリゴヌクレオチドを培養細胞中に導入するために使用される別の試薬には、Cytofectin（登録商標）（Invitrogen, Carlsbad, CA）が含まれる。アンチセンスオリゴヌクレオチドを、OPTI-MEM（登録商標） 1血清減少培地（Invitrogen, Carlsbad, CA）中Cytofectin（登録商標）と混合し、アンチセンスオリゴヌクレオチドの所望の濃度および100 nMのアンチセンスオリゴヌクレオチドあたり2〜12μg/mLの範囲のCytofectin（
登録商標）濃度を達成する。
【０１７３】
アンチセンスオリゴヌクレオチドを培養細胞中に導入するために使用される別の技術には、エレクトロポレーションが含まれる。
細胞を、日常的な方法によりアンチセンスオリゴヌクレオチドにより処置する。細胞を、典型的にはアンチセンスオリゴヌクレオチド処置の16〜24時間後に回収し、その時点で標的核酸のRNAまたはタンパク質レベルを当該技術分野において知られておりそして本明
細書中で記載された方法により測定される。一般的には、処置を複数回繰り返して行う場合、データを、繰り返し処置の平均として示す。
【０１７４】
使用されるアンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度は、細胞株ごとに異なる。特定の細胞株に対する最適アンチセンスオリゴヌクレオチド濃度を測定するための方法は、当該技術分野において周知である。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、LIPOFECTAMINE2000（
登録商標）、リポフェクチンまたはCytofectinとともに使用される場合、典型的には、1 nM〜300 nMの範囲の濃度で使用される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、エレクトロポレーションを使用してトランスフェクトする場合、625〜20,000 nMの範囲のより高い濃度で使用する。
【０１７５】
RNA単離
RNA解析を、全細胞RNAまたはポリ（A）＋mRNAに対して行うことができる。RNA単離の方法は、当該技術分野において周知である。RNAは、たとえば、製造者の推奨するプロトコ
ルに従って、TRIZOL（登録商標）試薬（Invitrogen, Carlsbad, CA）を使用して当該技術分野において周知な方法を使用して調製される。
【０１７６】
標的レベルまたは発現の阻害の解析
ハンチンチン核酸のレベルまたは発現の阻害を、当該技術分野において知られている様々な様式でアッセイすることができる。たとえば、標的核酸レベルを、例えば、ノザンブロット解析、競合的ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、または定量的リアルタイムPCRにより定量することができる。RNA解析を、全細胞RNAまたはポリ（A）＋mRNAで行うことができ
る。RNA単離の方法は、当該技術分野において周知である。ノザンブロット解析は、当該
地術分野において一般的なものでもある。定量的リアルタイムPCRを、PE-Applied Biosystems（Foster City, CA）から入手でるき商業的に利用可能なABI PRISM（登録商標）7600、7700、また7900 配列検出システムを使用して、そして製造者の指示書に従って使用し
て、容易に行うことができる。
【０１７７】
標的RNAレベルの定量的リアルタイムPCR解析 
標的RNAレベルの定量を、ABI PRISM（登録商標）7600、7700、または7900配列検出システム（PE-Applied Biosystems, Foster City, CA）を製造者の指示書に従って使用して、定量的リアルタイムPCRにより行うことができる。定量的リアルタイムPCRの方法は、当該技術分野において周知である。
【０１７８】
リアルタイムPCRの前に、単離されたRNAを、逆転写（RT）反応に供し、それにより相補的なDNA（cDNA）を製造し、それをその後リアルタイムPCR増幅のための基質として使用する。RT反応およびリアルタイムPCR反応を、同一のサンプルウェル中で連続的に行う。RT
試薬およびリアルタイムPCR試薬を、Invitrogen（Carlsbad, CA）から得る。RT反応、リ
アルタイム-PCR反応を、当業者に周知な方法により行う。
【０１７９】
リアルタイムPCRにより得られた遺伝子（またはRNA）標的の量は、発現が一定な遺伝子（例えばシクロフィリンA）の発現レベルを使用するか、またはRIBOGREEN（登録商標）（Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA）を使用して全RNAを定量することにより、正規化され
る。シクロフィリンAの発現は、標的と同時に実行するか、多重化するか、または別個に
実行することにより、リアルタイムPCRにより定量化する。全RNAを、RIBOGREEN（登録商
標）RNA定量試薬（Invitrogen, Inc., Eugene, OR）を使用して定量する。RIBOGREEN（登録商標）を使用したRNA定量の方法は、Jones, L.J., et al,（Analytical Biochemistry,
1998, 265, 368-374）に教示される。CYTOFLUOR（登録商標）4000装置（PE Applied Biosystems）を使用して、RIBOGREEN（登録商標）蛍光を測定する。
【０１８０】
プローブおよびプライマを、ハンチンチン核酸に対してハイブリダイズするように設計する。リアルタイムPCRプローブおよびプライマーを設計する方法は、are当該技術分野において周知であり、そしてPRIMER EXPRESS（登録商標）ソフトウェア（Applied Biosystems, Foster City, CA）などのソフトウェアを使用することが含まれる。
【０１８１】
タンパク質レベルの解析
ハンチンチン核酸のアンチセンス阻害を、ハンチンチンタンパク質レベルを測定することにより評価することができる。ハンチンチンのタンパク質レベルを、例えば免疫沈降法、ウェスタンブロット解析（イムノブロッティング）、酵素結合イムノソーベントアッセイ（ELISA）、定量的タンパク質アッセイ、タンパク質活性アッセイ（たとえば、カスパーゼ活性アッセイ）、免疫組織化学、免疫細胞化学または蛍光-活性化細胞ソーティング
（FACS）などの、当該技術分野において周知な様々な方法で評価し、または定量化することができる。標的に対する抗体を、MSRS抗体カタログ（Aerie Corporation, Birmingham,
MI）などの様々な供給源から同定しそして入手することができ、または当該技術分野に
おいて周知な、従来のモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の作成方法を介して調製することができる。ヒトおよびラットハンチンチンの検出のために有用な抗体は、商業的に利用可能である。
【０１８２】
アンチセンス化合物のIn vivo試験
アンチセンス化合物、たとえば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、を、動物において試験して、ハンチンチンの発現を阻害し、そして表現型変化を生成するそれらの能力を評価する。試験を、正常な動物においてあるいは実験的疾患モデルにおいて行うことができる。動物に対する投与のため、アンチセンスオリゴヌクレオチドを、リン酸-緩衝化塩類
溶液などの医薬的に許容可能な希釈剤中で製剤化する。投与には、非経口投与経路が含まれる。アンチセンスオリゴヌクレオチドによる処置期間の後、RNAを組織から単離し、そ
してハンチンチン核酸発現の変化を測定する。ハンチンチンタンパク質レベルの変化も測定する。
【０１８３】
特定の化合物 
約1700個の新たに設計された様々な長さ、モチーフおよびバックボーン組成物のアンチセンス化合物を、いくつかの細胞型においてin vitroでのヒトハンチンチンmRNAに対するそれらの作用について試験した。新規な化合物を、in vitroにおいて最も強力なアンチセンス化合物の一つと以前に特定されたISIS 387916を含む約250個の以前に設計した化合物と比較した（例えば、U.S.特許出願公開Nos. 2008/0039418および2007/0299027）。約1700個の新たに設計されたアンチセンス化合物のうち、約60個の化合物を、ISIS 387916と比較したin vitro強度に基づいて、さらなる研究のために選択した。選択された化合物を、以前に設計されたISIS 388241およびISIS 387916と比較して、全身性耐容性（実施例3を
参照）およびBACHDマウスの脳における活性および耐容性（実施例4を参照）について試験した。これらの研究から、SEQ ID NO: 6、9、10、11、12、13、14、15、18、19、20、21
、23、24、25、26、27、28、29、30、32、33、35、36、10、11、12、13、18、22または32で記載された配列の核酸塩基配列を有する化合物を、高い耐容性および高いin vivo強度
を有するものとして選択された。それらの相補的な配列の理由で、化合物は、SEQ ID NO:
1の領域4384-4403、4605-4624、4607-4626、4608-4627、4609-4628、4610-4629、4617-4636、4622-4639、4813-4832、4814-4833、4823-4842、4860-4877、4868-4887、4925-4944、4928-4947、4931-4950、4931-4948、4955-4974、4960-4977、5801-5820、5809-5828、5809-5826、101088-101105、115066-115085、4607-4626、4608-4627、4609-4628、4610-4629、4813-4832、4862-4881、5809-5828または4928-4947に対して相補的である。特定の態様において、本明細書中でさらに記載されるように列挙された領域を標的とする化合物は、本明細書中でさらに記載されるようにSEQ ID NOsで記載された配列のいくつかの核酸塩基部分を有する修飾されたオリゴヌクレオチドを含む。特定の態様において、列挙されたSEQ ID NOsに記載される列挙された領域を標的とする化合物または列挙されたSEQ ID NOsに記載される配列の核酸塩基部分を有する化合物は、本明細書中でさらに記載されるように、様々な長さのものであってもよく、そして本明細書中で記載されるように、様々なモチーフの一つを有していてもよい。特定の態様において、列挙されたSEQ ID NOsに記載される領域を標的とする化合物または列挙されたSEQ ID NOsに記載される配列の核酸塩基部分を有する化合物は、ISIS NOs: ISIS 419628、ISIS 419637、ISIS 419640、ISIS 419641、ISIS  451541、ISIS 419642、ISIS 436665、ISIS 436671、ISIS 436684、ISIS 436689
、ISIS 436754、ISIS 437168、ISIS 437175、ISIS 437441、ISIS 437442、ISIS 437507、ISIS 437527、ISIS 443139、ISIS 444578、ISIS 444584、ISIS 444591、ISIS 444607、ISIS 444608、ISIS 444615、ISIS 444618、ISIS 444627、ISIS 444652、ISIS 444658、ISIS 444659、ISIS 444660、ISIS 444661、またはISIS 444663により示される様な、特定の長さおよびモチーフを有する。
【０１８４】
高いin vivo強度および耐容性を有するものとして上述される化合物を、ついで、SEQ ID NO: 7、8、11、16、17に記載される配列の核酸塩基配列を有するいくつかの追加の化合物とあわせて、ラットにおいてCNSボーラス注射により試験して、神経毒性をさらに評価
した（実施例5を参照）。これらのうち、SEQ ID NO: 24、25、26、6、12、28、21、22、32または13に記載される配列の核酸塩基配列を有する10個の化合物を、高い耐容性を有す
るものとして選択する。それらの相補的な配列のため、化合物は、SEQ ID NO: 1の領域4384-4403、4609-4628、4610-4629、4860-4877、4862-4881、4925-4944、4928-4947、4931-4950、4955-4974、または5809-5829に対して相補的である。特定の態様において、本明細書中でさらに記載されるように、列挙された領域を標的とする化合物は、本明細書中でさらに記載されるように、SEQ ID NOsにおいて記載される配列のいくつかの核酸塩基部分を
有する、修飾されたオリゴヌクレオチドを含む。特定の態様において、列挙された領域を標的とする化合物または列挙されたSEQ ID NOsに記載される配列核酸塩基部分を有する化合物は、本明細書中でさらに記載されるように、様々な長さのものであってもよく、そして本明細書中でさらに記載されるように、様々なモチーフの一つを有するものであってもよい。特定の態様において、列挙されたSEQ ID NOsに記載された配列の領域を標的とする化合物または列挙されたSEQ ID NOsに記載された配列の核酸塩基部分を有する化合物は、ISIS NOs: ISIS 419640、ISIS 419641、ISIS 419642、ISIS 436665、ISIS 436671、ISIS 436689、ISIS 437507、ISIS 443139、ISIS 444591、およびISIS 444661により示された、特定の長さおよびモチーフを有する。選択された化合物を、BACHDマウスにおいてICV投与することにより、以前に設計した化合物ISIS 388241と比較した。
【０１８５】
ついで、追加の研究を、高いin vivo強度および耐容性を有するものとして、上述した
化合物に対して行った。追加の研究を、神経毒性をさらに評価するためにに設計した。研究には、野生型マウスにおけるICV投与（実施例16を参照）およびラットにおけるボーラ
ス投与（実施例17を参照）が含まれた。SEQ ID NOs: 12、22、28、30、32、および33を、高い神経耐容性を有するものとして選択した。それらの相補的な配列により、化合物は、SEQ ID NO: 1の領域4862-4881、4609-4628、5809-5828、5809-5826、5801-5820、および4955-4974に対して相補的である。特定の態様において、本明細書中でさらに記載された様な列挙された領域を標的とする化合物は、本明細書中でさらに記載されたSEQ ID NOsに記載された配列のいくつかの核酸塩基部分を有する修飾されたオリゴヌクレオチドを含む。特定の態様において、列挙された領域を標的とする化合物または列挙されたSEQ ID NOsに示される配列核酸塩基部分を有する化合物は、本明細書中でさらに記載されたような様々な長さのものであってもよく、そして、本明細書中でさらに記載されたような様々なモチーフの一つを有するものであってもよい。特定の態様において、領域を標的とする化合物または列挙されたSEQ ID NOsに記載される配列の核酸塩基部分を有する化合物は、特異的な長さを有し、そしてISIS 388241、ISIS 443139、ISIS 436671、ISIS 444591、ISIS 437527、ISIS 444584、ISIS 444652、およびISIS 436689により示されるようなモチーフを有する。
【０１８６】
したがって、改良された特徴を有するアンチセンス化合物が、本明細書中で提供される。特定の態様において、本明細書中でさらに記載される様なSEQ ID NO: 1のヌクレオチドの領域を標的とするか、またはその様な領域と特異的にハイブリダイズ可能である修飾されたオリゴヌクレオチドを含む化合物が、本明細書中で提供される。
【０１８７】
特定の態様において、本明細書中で記載される化合物は、本明細書中で記載されるヒト線維芽細胞細胞株に対して送達する場合に7μM未満、6μM未満、5μM未満、4μM未満、3
μM未満、2μM未満、1μM未満、のin vitro IC50、またはボーラス注射により10μg未満、9μg未満、8μg未満、7.5μg未満、7.4μg未満、7.0μg未満、6μg未満、5μg未満、4
μg未満、3μg未満、または2μg未満、のED50の少なくとも1つを有するため、効果的である。本明細書中で記載されたように、ICV注入は、本明細書中で記載された化合物につい
て、3〜4倍高いED50値を結果として生じる可能性がある。特定の態様において、本明細書中で記載される化合物は、整理食塩水処置動物と比較して、わずか4倍、3倍、または2倍
のALT値またはAST値の上昇；わずか30％、20％、15％、12％、10％、5％または2％の肝臓重量、脾臓重量または腎臓の上昇；または対照と比較して、わずか350％、300％、275％
、250％、200％、150％または100％のAIF1レベルの上昇；少なくとも1つの上昇を有する
ことにより示されるように、非常に耐容性である。
【０１８８】
特定の症状 
特定の態様において、本明細書中で記載された1またはそれ以上の医薬組成物を投与す
ることを含む、個体を治療する方法が、本明細書中で提供される。特定の態様において、
個体は、ハンチントン病を有する。
【０１８９】
以下の実施例に示されるように、本明細書中で記載される様なハンチンチンを標的とする化合物は、ハンチントン病の生理学的症状の重症度を軽減することが示された。特定の実験において、化合物は、退行の速度を低下させ、例えば、動物は、症状を経験し続けるが、しかし症状は、非処置動物と比較して、重症度がより低かった。しかしながら、別の実験において、化合物は、時間と共に機能の再生を生じるようである；例えば、より長い期間処置した動物は、より短時間、化合物の投与を受けた動物よりも、重症度の低い症状を経験した。上述したように、ハンチントン病は、時間とともに症状の重症度が増加することが典型的な、進行性の疾患である。したがって、以下に例示される化合物が、機能を回復する能力は、疾患の症状が、本明細書中で記載されたような化合物での処置により、好転しうることを示している。
【０１９０】
したがって、ハンチントン病に関連する症状を軽減させることが必要な被験体において、ハンチントン病に関連する症状を軽減するための方法が、本明細書中で提供される。特定の態様において、ハンチントン病に関連する症状の開始速度を低下させるための方法が提供される。特定の態様において、ハンチントン病に関連する症状の重症度を低下させるための方法を提供する。特定の態様において、ハンチントン病に関連する症状の改善により示されるような、神経学的機能を再生するための方法が提供される。そのような態様において、方法は、必要とする個体に対して、ハンチンチン核酸を標的とする治療的有効量の化合物を投与することを含む。
【０１９１】
ハンチントン病は、多数の身体的症状、神経学的症状、精神医学的症状、および／または末梢的症状により特徴付けられる。ハンチントン病に関連すべき当業者に対して知られているいずれかの症状は、上述の方法において上記に説明したように、改良されるかまたは調節される。特定の態様において、症状は、身体的症状からなる群から選択される、情動不安、協調不足、意図せず開始される運動、意図せず完了されない運動、歩行不安定、舞踏病、硬直、身もだえするような運動、異常姿位、不安定性、異常な顔貌、そしゃく困難、嚥下困難、発話困難、発作、および睡眠障害である。特定の態様において、症状は、認知症状からなる群から選択される、計画性低下、柔軟性低下、抽象的思考低下、ルール習得低下、適切な動作の開始の低下、不適切な動作の阻害の低下、短期記憶の低下、長期記憶の低下、パラノイア、見当識障害、精神錯乱、幻覚および認知症である。特定の態様において、症状は、精神医学的症状からなる群から選択される、不安、抑鬱症、感情鈍麻、自己中心性、攻撃性、強迫行動、易刺激性および自殺念慮である。特定の態様において、症状は、末梢症状からなる群から選択される、脳容量の低下、筋萎縮、心不全、グルコース耐性の低下、体重減少、骨粗鬆症、および精巣萎縮である。
【０１９２】
特定の態様において、症状は、情動不安である。特定の態様において、症状は、協調不足である。特定の態様において、症状は、意図せず開始される運動である。特定の態様において、症状は、意図せず完了されない運動である。特定の態様において、症状は、歩行不安定である。特定の態様において、症状は、舞踏病である。特定の態様において、症状は、硬直である。特定の態様において、症状は、身もだえするような運動である。特定の態様において、症状は、異常姿位である。特定の態様において、症状は、不安定性である。特定の態様において、症状は、異常な顔貌である。特定の態様において、症状は、そしゃく困難である。特定の態様において、症状は、嚥下困難である。特定の態様において、症状発話困難である。特定の態様において、症状は、発作である。特定の態様において、症状は、睡眠障害である。
【０１９３】
特定の態様において、症状は、計画性低下である。特定の態様において、症状は、柔軟性低下である。特定の態様において、症状は、抽象的思考低下である。特定の態様におい
て、症状は、ルール習得低下である。特定の態様において、症状は、適切な動作の開始の低下である。特定の態様において、症状は、不適切な動作の阻害の低下である。特定の態様において、症状は、短期記憶の低下である。特定の態様において、症状は、長期記憶の低下である。特定の態様において、症状は、パラノイアである。特定の態様において、症状は、見当識障害である。特定の態様において、症状は、精神錯乱である。特定の態様において、症状は、幻覚である。特定の態様において、症状は、認知症.
特定の態様において、症状は、不安である。特定の態様において、症状は、抑鬱症である。特定の態様において、症状は、感情鈍麻である。特定の態様において、症状は、自己中心性である。特定の態様において、症状は、攻撃性である。特定の態様において、症状は、強迫行動である。特定の態様において、症状は、易刺激性である。特定の態様において、症状は、自殺念慮である。
【０１９４】
特定の態様において、症状は、脳容量の低下である。特定の態様において、症状は、筋萎縮である。特定の態様において、症状は、心不全である。特定の態様において、症状は、グルコース耐性の低下である。特定の態様において、症状は、体重減少である。特定の態様において、症状は、骨粗鬆症である。特定の態様において、症状は、精巣萎縮である。
【０１９５】
特定の態様において、ハンチントン病の症候は、定量可能であってもよい。たとえば、骨粗鬆症は、たとえば、骨密度スキャンにより、測定しそして定量化することができる。そのような症候のため、特定の態様において、症状は、約15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95または99％、またはこれらの値のいずれか2つ
により規定される範囲にまで減少させることができる。
【０１９６】
特定の態様において、本明細書中で記載されたような1またはそれ以上の医薬組成物を
投与することを含む、個体を治療するための方法を提供する。特定の態様において、個体は、ハンチントン病を有する。
【０１９７】
特定の態様において、ハンチンチン核酸を標的とするアンチセンス化合物の投与は、少なくとも約15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95または99％、またはこれらの値のいずれか2つにより規定される範囲にまで、ハンチンチン発
現の減少を生じる。
【０１９８】
特定の態様において、ハンチンチンを標的とするアンチセンス化合物を含む医薬組成物は、ハンチントン病に罹患しているかまたはかかりやすい患者を治療するための医薬の調製のために使用される。
【０１９９】
特定の態様において、本明細書中に記載される方法には、SEQ ID NO: 6、9、10、11、12、13、14、15、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、32、33、35、36、10、11、12、13、18、22または32に記載される配列の、本明細書中に記載される様な
隣接した核酸塩基部分を有する修飾されたオリゴヌクレオチドを含む化合物を投与することが含まれる。特定の態様において、本明細書中に記載される方法には、SEQ ID NOs: 12、22、28、30、32、および33に記載された配列の、本明細書中に記載される様な隣接した核酸塩基部分を有する修飾されたオリゴヌクレオチドを含む化合物を投与することが含まれる。
【０２００】
投与
特定の態様において、本明細書中にて記載される化合物および組成物は、非経口的に投与される。
【０２０１】
特定の態様において、非経口投与は、注入である。注入は、慢性的な注入であっても、または持続的な注入であっても、または短時間の注入であっても、あるいは周期的な注入であってもよい。特定の態様において注入された医薬剤は、ポンプにより送達される。特定の態様において、非経口投与は、注射によるものである。
【０２０２】
特定の態様において、化合物および組成物が、CNSに対して送達される。特定の態様に
おいて、化合物および組成物は、脳脊髄液に送達される。特定の態様において、化合物および組成物は、脳実質に投与される。特定の態様において、化合物および組成物を、くも膜下腔投与または脳室内投与により、動物に対して送達する。本明細書中で記載されたような中枢神経系内部での化合物および組成物の広範な分布を、実質内投与、くも膜下腔投与または脳室内投与により、達成することができる。
【０２０３】
特定の態様において、非経口投与は、注射によるものである。注射は、シリンジまたはポンプにより送達することができる。特定の態様において、注射は、ボーラス注射である。特定の態様において、注射は、組織、例えば大脳基底核線条体、尾状、皮質、海馬および小脳に対して直接的に投与される。 
【０２０４】
ハンチンチンmRNA発現を阻害するためのアンチセンス化合物の中央値有効濃度（EC50）を、ICV注入またはボーラス注射のいずれかの後に算出した（実施例9および10を参照）。線条体内注射後の化合物についてのEC50を、0.45μg/gと決定された。ICV 投与後のEC50
は、26.4μg/gと決定された。
【０２０５】
したがって、特定の態様において、本明細書中に記載される化合物または組成物の送達は、化合物または組成物の薬物動態プロファイルに影響を与えることができる。特定の態様において、本明細書中で記載された化合物または組成物の標的化組織への注射は、化合物または組成物の注入と比較して、化合物または組成物の薬物動態プロファイルを改善する。特定の態様において、化合物または組成物の注射は、広範な拡散と比較して、強度を向上し、結果として同様の薬理を得るためにより少ない化合物または組成物を必要とすることになる。特定の態様において、同様の薬理は、標的mRNAおよび／または標的タンパク質が下方制御される期間（たとえば、作用期間）のことをいう。特定の態様において、ボーラス注射などの医薬品を特異的に局在化する方法は、中央値有効濃度（EC50）を約50倍低下させた（たとえば、組織中で濃度が50分の1になることは、同一のまたは類似の薬物
動態作用を達成するために必要とされる）。特定の態様において、例えばボーラス注射により、医薬品を特異的に局在化するための方法は、中央値有効濃度（EC50）を、20、25、30、35、40、45 または50倍低下させた。特定の態様において、医薬剤は、本明細書中で
さらに記載されたように、アンチセンス化合物である。特定の態様において、標的化組織は、脳組織である。特定の態様において、標的化組織は、大脳基底核線条体組織である。
特定の態様において、EC50を低下させることにより、薬理学的結果を達成することが必要な患者において、薬理学的結果を達成するために必要とされる用量を低下させるため、EC50を低下させることが好ましい。
【０２０６】
脳組織におけるMOEギャップマーオリゴヌクレオチドの半減期は、約20日である（実施
例9〜11を参照）。ハンチンチンmRNAの阻害により測定される作用期間は、脳内において
長期化される（実施例9および10を参照）。2週間にわたるアンチセンスオリゴヌクレオチドの脳室内注入により、投与の終了後少なくとも91日のあいだBACHDマウスの大脳基底核
線条体組織において、少なくとも50％のハンチンチンmRNAの阻害を生じる。ボーラス注射による投与は、同様の作用期間を生じる。
【０２０７】
特定の態様において、本明細書中で記載された化合物または組成物のCNSへの送達は、
少なくとも91日のあいだ標的mRNAおよび／または標的タンパク質の47％の下方制御を生じ
る。特定の態様において、化合物または組成物の送達は、少なくとも20日、少なくとも30日、少なくとも40日、少なくとも50日、少なくとも60日、少なくとも70日、少なくとも80日、少なくとも85日、少なくとも90日、少なくとも95日、少なくとも100日、少なくとも110日、少なくとも120日のあいだ、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、
少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、または少なくとも75％の標的mRNAおよび／または標的タンパク質の下方制御を生じる。特定の態様において、CNSへの送達は、 実質内 投与、
くも膜下腔投与、または脳室内投与による。
【０２０８】
特定の態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、毎月1回、2ヶ月に1回、90
日ごと、3ヶ月ごと、6ヶ月ごと、1年に2回、または1年に1回、注射または注入により送達する。
【０２０９】
特定の組み合わせ治療
特定の態様において、1またはそれ以上の医薬組成物を、1またはそれ以上のその他の医薬剤と同時投与する。特定の態様において、そのような1またはそれ以上のその他の医薬
剤は1またはそれ以上の医薬組成物本明細書中で記載されたように、同一の疾患、障害、
または症状を治療するために設計される。特定の態様において、そのような1またはそれ
以上のその他の医薬剤は、1またはそれ以上の医薬組成物本明細書中で記載されたように
、異なる疾患、障害、または症状を治療するように設計される。特定の態様において、そのような1またはそれ以上のその他の医薬剤は、本明細書中で記載されたように、1またはそれ以上の医薬組成物の望ましくない副作用を治療するために設計される。特定の態様において、1またはそれ以上の医薬組成物を、別の医薬剤とともに同時投与し、別の医薬剤
の望ましくない作用を治療する。特定の態様において、1またはそれ以上の医薬組成物を
、別の医薬剤と同時投与し、組み合わせ効果を生じる。特定の態様において、1またはそ
れ以上の医薬組成物を別の医薬剤と同時投与し、相乗的作用を生じる。
【０２１０】
特定の態様において、1またはそれ以上の医薬組成物および1またはそれ以上のその他の医薬剤を、同時に投与する。特定の態様において、1またはそれ以上の医薬組成物および1またはそれ以上のその他の医薬剤を、別々の時に投与する。特定の態様において、1また
はそれ以上の医薬組成物および1またはそれ以上のその他の医薬剤を、単一剤形中に一緒
に調整する。特定の態様において、1またはそれ以上の医薬組成物および1またはそれ以上のその他の医薬剤を、べつべつに調製する。
【０２１１】
特定の態様において、医薬組成物と同時投与することができる医薬剤には、抗精神病薬、例えば、ハロペリドール、クロルプロマジン、クロザピン、クエチアピン（quetapine
）、およびオランザピン；抗鬱剤、例えば、フルオキセチン、セルトラリン塩酸塩、ベンラファクシンおよびノルトリプチリン；精神安定剤、例えば、ベンゾジアゼピン、クロナゼパム、パロキセチン、ベンラファクシン、およびβ-ブロッカー；気分安定剤、例えば
、リチウム、バルプロエート、ラモトリジン、およびカルバマゼピン；まひ薬、例えば、ボツリヌス毒素；および／または、（しかしこれらには限定されない）テトラベナジン（Xenazine）、クレアチン、コエンザイムQ10、トレハロース、ドコサヘキサエン酸、ACR16、エチル-EPA、アトモキセチン、シタロプラム、ジメボン（dimebon）、メマンチン、フ
ェニル酪酸ナトリウム、ラメルテオン、ウルソジオール、ジプレキサ、ゼナシン（xenasine）、チアプリド、リルゾール、アマンタジン、[123I]MNI-420、アトモキセチン、テト
ラベナジン、ジゴキシン、デキストロメトルファン、ワルファリン、アルプロザム（alprozam）、ケトコナゾール、オメプラゾール、およびミノサイクリンを含む、その他の実験的薬剤；が含まれる。
【実施例】
【０２１２】
限定的ではない開示および参照による援用
本明細書中で記載される特定の化合物、組成物および方法は、特定の態様にしたがって具体的に記載されたが、一方で以下の事例は本明細書中で記載された化合物の説明のためにのみ機能し、それを限定することを意図しない。本件出願において記載される参考文献のそれぞれは、その全体を参照により本明細書中に援用される。
【０２１３】
実施例1：ヒトハンチンチン遺伝子配列を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド
ヒトハンチンチン遺伝子配列を標的とする、様々な長さ、モチーフ、そしてバックボーン組成の約1700種の新たに設計したアンチセンス化合物を、いくつかの細胞型におけるin
vitroでのヒトハンチンチンmRNAに対するそれらの作用について試験した。これらのギャップマーは、ホスホロチオエート結合のみであるヌクレオシド間結合（表1に記載）また
はホスホロチオエートとホスホジエステル結合であるヌクレオシド間結合（表5に記載）
によりさらに設計した。多数の新たに設計されたオリゴおよび2つのベンチマークオリゴ
ヌクレオチド（以前に設計され開示されたもの）は、表1および表5に提示される。
【０２１４】
完全にホスホロチオエートヌクレオシド間結合であるギャップマー
表1に示される化合物の特定のものは、5-10-5 MOE、6-8-6 MOE、または5-8-5 MOEのモ
チーフを有する。5-10-5ギャップマーは、20個の連結したヌクレオシドを有し、ここで中央部ギャップ部分は10個の2'-デオキシヌクレオシドを有し、そしてそれぞれ5個のヌクレオシドを有するウィングが両側（5'方向および3'方向）に配置される。6-8-6ギャップマ
ーは、20個の連結したヌクレオシドを有し、ここで中央部ギャップ部分は、8個の2'-デオキシヌクレオシドを有し、そしてそれぞれ6個のヌクレオシドを有するウィングが両側（5'方向および3'方向）に配置される。5-8-5ギャップマーは、18個の連結したヌクレオシドを有し、ここで中央部ギャップ部分は、8個の2'-デオキシヌクレオシドを有し、そしてそれぞれ5個のヌクレオシドを有するウィングが両側（5'方向および3'方向）に配置される
。表1に列挙されるすべてのギャップマーについて、5'ウィング部分のそれぞれのヌクレ
オシドおよび3'ウィング部分のそれぞれのヌクレオシドは、2'-MOE修飾を有する。各ギャップマー全体を通じたヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート（P=S）ヌクレオシド
間結合である。それぞれのギャップマー全体を通じたすべてのシトシンは、5-メチルシトシンである。表1におけるそれぞれのギャップマーは、SEQ ID NO: 1（GENBANKアクセッションNo. NM_002111.6）またはSEQ ID NO: 2（ヌクレオチド462000〜634000が短縮された
、GENBANKアクセッションNo. NT_006081.17）を標的とする。‘開始部位'は、ヒト遺伝子配列中のギャップマーが標的とする最も5'側のヌクレオチドを示す。‘停止部位'は、ヒ
ト遺伝子配列中のギャップマーが標的とする最も3'側のヌクレオチドを示す。
【０２１５】
【表１】
2020115894.tif 000004
マウス、アカゲザルおよびラットのハンチンチン遺伝子配列を有する表1のギャップマ
ーの相補性が、表2、表3、および表4においてさらに記載される。
【０２１６】
表2のギャップマーは、マウスハンチンチンmRNA（GENBANKアクセッションNo. NM_010414.1、本明細書中ではSEQ ID NO: 3と記載される）と相補的である。‘マウス標的開始部
位'は、マウスmRNA中のギャップマーが標的とする最も5'側のヌクレオチドを示す。‘マ
ウス標的停止部位'は、マウスmRNA中のギャップマーが標的とする最も3'側のヌクレオチ
ドを示す。‘ヒト標的開始部位'は、ヒト遺伝子配列中のギャップマーが標的とする最も5'側のヌクレオチドを示す。‘ヒト標的停止部位'は、遺伝子配列中のギャップマーが標的
とする最も3'側のヌクレオチドを示す。‘ミスマッチ数'は、ヒトオリゴヌクレオチドと
マウスmRNA配列との間でのミスマッチの数を示す。
【０２１７】
【表２】
2020115894.tif 000005
表3のギャップマーは、アカゲザルハンチンチンゲノム配列（ヌクレオチド698000〜866000が短縮されたGENBANKアクセッションNo. NW_001109716.1の相補物、本明細書中ではSEQ ID NO: 4と記載される）と相補的である。‘アカゲザル標的開始部位'は、アカゲザル
遺伝子配列中のギャップマーが標的とする最も5'側のヌクレオチドを示す。‘アカゲザル標的停止部位'は、アカゲザル遺伝子配列中のギャップマーが標的とする最も3'側のヌク
レオチドを示す。‘ヒト標的開始部位'は、ヒト遺伝子配列中のギャップマーが標的とす
る最も5'側のヌクレオチドを示す。‘ヒト標的停止部位'は、ヒト遺伝子配列中のギャッ
プマーが標的とする最も3'側のヌクレオチドを示す。‘ミスマッチ数'は、ヒトオリゴヌ
クレオチドとアカゲザル遺伝子配列との間でのミスマッチの数を示す。
【０２１８】
【表３】
2020115894.tif 000006
表4のギャップマーは、ラットハンチンチンmRNA（GENBANKアクセッションNo. NM_024357.2、本明細書中ではSEQ ID NO: 5と記載される）と相補的である。‘ラット標的開始部
位'は、ラットmRNA中のギャップマーが標的とする最も5'側のヌクレオチドを示す。‘ラ
ット標的停止部位'は、ラットmRNA中のギャップマーが標的とする最も3'側のヌクレオチ
ドを示す。‘ヒト標的開始部位'は、ヒト遺伝子配列中のギャップマーが標的とする最も5'側のヌクレオチドを示す。‘ヒト標的停止部位'は、ヒト遺伝子配列中のギャップマーが標的とする3'側のヌクレオチドを示す。‘ミスマッチ数'は、ヒトオリゴヌクレオチドと
ラットmRNA配列との間でのミスマッチ数を示す。
【０２１９】
【表４】
2020115894.tif 000007
ホスホロチオエートヌクレオシド間結合とホスホジエステルヌクレオシド間結合との混合を有するギャップマー
表5におけるキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドは、5-10-5 MOEギャップマーとし
て設計された。5-10-5ギャップマーは、20個の連結したヌクレオシドを有し、ここで中央部ギャップ部分は、10個の2'-デオキシヌクレオチドを有し、そしてそれぞれ5個のヌクレオシドを有するウィングが両側（5'方向および3'方向）に配置される。5'ウィング部分のそれぞれのヌクレオシドおよび3'ウィング部分のそれぞれのヌクレオシドは、2'-MOE修飾を有する。中央部ギャップ部分内部のヌクレオシド間結合、ギャップ部分を5'ウィング部分または3'ウィング部分に結合する結合、そしてそれぞれのウィング部分の最も5'側のヌクレオシドおよび最も3'側のヌクレオシドについての結合が、すべて、ホスホロチオエート（P=S）結合である；5'ウィング部分および3'ウィング部分の両方のヌクレオシドの残
りを結合するヌクレオシド間結合が、ホスホジエステル結合である；すなわち、ギャップマーは、混合バックボーンを有する。それぞれのギャップマーの全体を通じてすべてのシトシンは、5-メチルシトシンである。表5におけるそれぞれのギャップマーは、ヒトmRNA配列（GENBANKアクセッションNo. NM_002111.6、本明細書中でSEQ ID NO: 1と示される）
を標的とする。‘開始部位’は、ヒトmRNA中のギャップマーが標的とする最も5'側のヌクレオチドを示すが。‘停止部位’は、ヒトmRNA中のギャップマーが標的とする最も3'側のヌクレオチドを示す。
【０２２０】
【表５】
2020115894.tif 000008
表5中のギャップマーの、マウスハンチンチン遺伝子配列、アカゲザルハンチンチン遺
伝子配列およびラットハンチンチン遺伝子配列との相補性は、表6、表7、および表8にさ
らに記載される。
【０２２１】
表6のギャップマーは、マウスハンチンチンmRNA（GENBANKアクセッションNo. NM_010414.1；SEQ ID NO: 3）と相補的である。‘マウス標的開始部位’は、マウスmRNA中のギャ
ップマーが標的とする最も5'側のヌクレオチドを示す。‘マウス標的停止部位’は、マウスmRNA中のギャップマーが標的とする最も3'側のヌクレオチドを示す。‘ヒト標的開始部位’は、ヒトmRNA（GENBANKアクセッションNo. NM_002111.6）中のギャップマーが標的とする最も5'側のヌクレオチドを示す。‘ヒト標的停止部位’は、ヒトmRNA（GENBANKアク
セッションNo. NM_002111.6）中のギャップマーが標的とする最も3'側のヌクレオチドを
示す。 ‘ミスマッチ数'は、ヒトオリゴヌクレオチドとマウスmRNA配列との間でのミスマッチ数を示す。
【０２２２】
【表６】
2020115894.tif 000009
表7のギャップマーは、アカゲザルハンチンチンゲノム配列（ヌクレオチド698000〜866000で短縮されたGENBANKアクセッションNo. NW_001109716.1の相補物；SEQ ID NO: 4）と相補的である。‘アカゲザル標的開始部位’は、アカゲザル遺伝子配列中のギャップマーが標的とする最も5'側のヌクレオチドを示す。‘アカゲザル標的停止部位’は、アカゲザル遺伝子配列中のギャップマーが標的とする最も3'側のヌクレオチドを示す。‘ヒト標的開始部位’は、ヒトmRNA（GENBANKアクセッションNo. NM_002111.6）中のギャップマーが標的とする最も5'側のヌクレオチドを示す。‘ヒト標的停止部位’は、ヒトmRNA（GENBANKアクセッションNo. NM_002111.6）中のギャップマーが標的とする最も3'側のヌクレオチドを示す。‘ミスマッチ数’は、ヒトオリゴヌクレオチドとアカゲザル遺伝子配列との間でのミスマッチ数を示す。
【０２２３】
【表７】
2020115894.tif 000010
表8のギャップマーは、ラットハンチンチンmRNA（GENBANKアクセッションNo. NM_024357.2；SEQ ID NO: 5）と相補的である。‘ラット標的開始部位’は、ラットmRNA中のギャ
ップマーが標的とする最も5'側のヌクレオチドを示す。‘ラット標的停止部位’は、ラットmRNA中のギャップマーが標的とする最も3'側のヌクレオチドを示す。‘ヒト標的開始部位’は、ヒトmRNA（GENBANKアクセッションNo. NM_002111.6）中のギャップマーが標的とする最も5'側のヌクレオチドを示す。‘ヒト標的停止部位’は、ヒトmRNA（GENBANKアク
セッションNo. NM_002111.6）中のギャップマーが標的とする最も3'側のヌクレオチドを
示す。 ‘ミスマッチ数’は、ヒトオリゴヌクレオチドとラットmRNA配列との間でのミス
マッチ数を示す。
【０２２４】
【表８】
2020115894.tif 000011
実施例2：in vitroでのヒトハンチンチンmRNAの用量依存的アンチセンス阻害
様々な長さ、モチーフ、そしてバックボーン組成の約1700種の新たに設計したアンチセンス化合物を、いくつかの細胞型におけるin vitroでのヒトハンチンチンmRNAに対するそれらの作用について試験した。これらの化合物は、in vivoにおいてかなり強力な化合物
であることが以前に決定された化合物ISIS 387916を含む、約250種の以前に設計した化合物を比較された。この実施例において示されるように、ISIS 419640、ISIS 419641、ISIS
419642、ISIS 436665、ISIS 436671、ISIS 436689、ISIS 437507、ISIS 443139、ISIS 444591、ISIS 444661、ISIS 437527、ISIS 444584、およびISIS 444652、および以前に設
計されたISIS 388241が、ベンチマーク化合物ISIS 387916と比較して、in vitroで同様またはよりより強力であることが見出された。
【０２２５】
A.  GM04281線維芽細胞 
ウェル当たり25,000個の細胞の密度での培養されたGM04281線維芽細胞を、エレクトロ
ポレーションを、500 nM、1000 nM、2000 nM、4000 nM、または8000 nMのアンチセンスオリゴヌクレオチドとともに使用して、トランスフェクトした。約16時間の処置期間の後、RNAを細胞から単離し、そしてハンチンチンmRNAレベルを定量的リアルタイムPCRにより測定した。ヒトプライマープローブセットRTS2617（フォワード配列CTCCGTCCGGTAGACATGCT
、本明細書中でSEQ ID NO: 37と示される；リバース配列GGAAATCAGAACCCTCAAAATGG、本明細書中でSEQ ID NO: 38と示される；プローブ配列TGAGCACTGTTCAACTGTGGATATCGGGAX、本
明細書中でSEQ ID NO: 39と示される）を使用して、mRNAレベルを測定した。ハンチンチ
ンmRNAレベルを、RIBOGREEN（登録商標）により測定されるように、全RNA含量に従って調整した。結果を、非処置対照細胞と比較したハンチンチンmRNAの％阻害として、表9にお
いて示し、そしてハンチンチンmRNAレベルのアンチセンスオリゴヌクレオチド-媒介性用
量依存性の減少を示す。
【０２２６】
それぞれのオリゴヌクレオチドの50％最大阻害濃度（IC50）もまた、表9において示さ
れ、そして使用したオリゴヌクレオチドの濃度をそれぞれの濃度で達成されたハンチンチンmRNA発現の％阻害に対してプロットすることにより算出し、そして対照と比較してハンチンチンmRNA発現の50％阻害が達成されるオリゴヌクレオチドの濃度を注記する。IC50は、μMで表記される。
【０２２７】
【表９】
2020115894.tif 000012
ISIS 387916、ISIS 388241、およびISIS 437507を、in vitroでのヒトハンチンチンmRNAに対するそれらの作用についてさらに試験した。培養された線維芽細胞を、上述した方
法と同様の手順で試験した。結果は、表10において、非処置対照細胞と比較したハンチンチンmRNAの％阻害として示され、そしてハンチンチンmRNAレベルのアンチセンスオリゴヌクレオチド-媒介性用量依存性の減少を示す。それぞれのアンチセンスオリゴヌクレオチ
ドのIC50もまた、表10中にμMとして示される。
【０２２８】
【表１０】
2020115894.tif 000013
ISIS 387916、ISIS 388241、およびISIS 437507を、in vitroでのヒトハンチンチンmRNAに対するそれらの作用についてさらに試験した。培養されたGM04281線維芽細胞を、上述した方法と同様の手順で試験された。結果を、表11中に、非処置対照細胞と比較したハンチンチンmRNAの％阻害として示され、そしてハンチンチンmRNAレベルのアンチセンスオリゴヌクレオチド-媒介性用量依存性の減少を示す。それぞれのアンチセンスオリゴヌクレ
オチドのIC50もまた、表11中にμMで示される。
【０２２９】
【表１１】
2020115894.tif 000014
ISIS 387916、ISIS 388241、ISIS 419641、およびISIS 436754を、in vitroでのヒトハンチンチンmRNAに対するそれらの作用についてさらに試験した。培養されたGM04281線維芽細胞を、上述した方法と同様の手順で試験した。結果は、表12において、非処置対照細胞非処置対照細胞と比較したハンチンチンmRNAの％阻害として示され、そしてハンチンチンmRNAレベルのアンチセンスオリゴヌクレオチド-媒介性用量依存性の減少を示す。それ
ぞれのアンチセンスオリゴヌクレオチドのIC50もまた、表12においてμMとして示される
。
【０２３０】
【表１２】
2020115894.tif 000015
ISIS 387916、ISIS 388241、およびISIS 437507を、in vitroでのヒトハンチンチンmRN
Aに対するそれらの作用についてさらに試験した。ウェル当たり25,000個の細胞の密度で
の培養されたGM04281線維芽細胞を、エレクトロポレーションを、250 nM、500 nM、1000 nM、2000 nM、4000 nMまたは8000 nMのアンチセンスオリゴヌクレオチドとともに使用し
て、トランスフェクトした。約16時間の処置期間の後、RNAを細胞から単離し、そしてハ
ンチンチンmRNAレベルを定量的リアルタイムPCRにより測定した。ヒトプライマープロー
ブセットRTS2617を使用して、mRNAレベルを測定した。ハンチンチンmRNAレベルを、RIBOGREEN（登録商標）により測定されるように、全RNA含量に従って調整した。結果を、非処
置対照細胞と比較したハンチンチンmRNAの％阻害として、表13において示し、そしてハンチンチンmRNAレベルのアンチセンスオリゴヌクレオチド-媒介性用量依存性の減少を示す
。それぞれのアンチセンスオリゴヌクレオチドのIC50は、表13においてμMで示される。
【０２３１】
【表１３】
2020115894.tif 000016
ISIS 387916、ISIS 388241、ISIS 419628、ISIS 419629、ISIS 419637、ISIS 436684、ISIS 443139、ISIS 444584、ISIS 444615、ISIS 444627、ISIS 444652、ISIS 444658、ISIS 444659、ISIS 444660、およびISIS 444661は、in vitroでのヒトハンチンチンmRNAに
対するそれらの作用について、さらに試験した。ウェル当たり25,000細胞の密度での培養されたGM04281線維芽細胞をエレクトロポレーションを、156.25 nM、312.5 nM、625 nM、1250 nM、または2500 nMのアンチセンスオリゴヌクレオチドとともに使用して、トランスフェクトした。約16時間の処置期間の後、RNAを細胞から単離し、そしてハンチンチンmRNAレベルを、定量的リアルタイムPCRにより測定した。ヒトプライマープローブセットRTS2617を使用して、mRNAレベルを測定した。ハンチンチンmRNAレベルを、RIBOGREEN（登録商標）により測定されるように、全RNA含量に従って調節した。結果は、表14中に、非処置
対照細胞と比較したハンチンチンmRNAの％阻害として示され、そしてハンチンチンmRNAレベルのアンチセンスオリゴヌクレオチド-媒介性用量依存性の減少を示す。示されるデー
タは、2回の実験の平均である。それぞれのアンチセンスオリゴヌクレオチドのIC50もま
た、表14においてμMで示される。
【０２３２】
【表１４】
2020115894.tif 000017
ISIS 387916、ISIS 436671、ISIS 444661、ISIS 419641、およびISIS 436665を、in vitroでのヒトハンチンチンmRNAに対するそれらの作用についてさらに試験した。ウェル当
たり25,000個の細胞の密度での培養されたGM04281線維芽細胞を、エレクトロポレーショ
ンを、13.6719 nM、27.3438 nM、54.6875 nM、109.375 nM、218.75 nM、437.5 nM、875 nM、1750 nM、3500 nM、または7000 nMのアンチセンスオリゴヌクレオチドとともに使用して、トランスフェクトした。約16時間の処置期間の後、RNAを細胞から単離し、そしてハ
ンチンチンmRNAレベルを定量的リアルタイムPCRにより測定した。ヒトプライマープロー
ブセットRTS2617を使用して、mRNAレベルを測定した。ハンチンチンmRNAレベルを、RIBOGREEN（登録商標）により測定されるように、全RNA含量に従って調整した。結果を、非処
置対照細胞と比較したハンチンチンmRNAの％阻害として、表15において示し、そしてハンチンチンmRNAレベルのアンチセンスオリゴヌクレオチド-媒介性用量依存性の減少を示す
。それぞれのアンチセンスオリゴヌクレオチドのIC50は、表15においてμMで示される。
【０２３３】
【表１５−１】
2020115894.tif 000018
ISIS 387916、ISIS 388241、ISIS 437168、およびISIS 437175を、in vitroでのヒトハンチンチンmRNAに対するそれらの作用についてさらに試験した。ウェル当たり25,000個の細胞の密度での培養されたGM04281線維芽細胞を、エレクトロポレーションを、エレクトロポレーションを250 nM、500 nM、1000 nM、2000 nM、4000 nM、および8000 nMのアンチセンスオリゴヌクレオチドとともに使用して、トランスフェクトした。約16時間の処置期間の後、RNAを細胞から単離し、そしてハンチンチンmRNAレベルを定量的リアルタイムPCRにより測定した。ヒトプライマープローブセットRTS2617を使用して、mRNAレベルを測定
した。結果を、非処置対照細胞と比較したハンチンチンmRNAの％阻害として、表15.1において示し、そしてハンチンチンmRNAレベルのアンチセンスオリゴヌクレオチド-媒介性用
量依存性の減少を示す。それぞれのアンチセンスオリゴヌクレオチドのIC50は、表15.1においてμMで示される。
【０２３４】
【表１５−２】
2020115894.tif 000019
ISIS 387916、ISIS 388241、ISIS 437441、およびISIS 437442を、in vitroでのヒトハンチンチンmRNAに対するそれらの作用についてさらに記載した。培養されたGM04281線維
芽細胞を、上述した手法と同様の手法で試験した。結果を、非処置対照細胞と比較したハンチンチンmRNAの％阻害として、表15.2 において示し、そしてハンチンチンmRNAレベル
のアンチセンスオリゴヌクレオチド-媒介性用量依存性の減少を示す。それぞれのアンチ
センスオリゴヌクレオチドのIC50は、表15.2においてμMで示される。
【０２３５】
【表１５−３】
2020115894.tif 000020
ISIS 387916、ISIS 388241、ISIS 437175、およびISIS 437527を、in vitroでのヒトハンチンチンmRNAに対するそれらの作用についてさらに試験した。培養されたGM04281線維
芽細胞を、上述の手法と同様の手法で試験した。結果を、非処置対照細胞と比較したハンチンチンmRNAの％阻害として、表15.3において示し、そしてハンチンチンmRNAレベルのアンチセンスオリゴヌクレオチド-媒介性用量依存性の減少を示す。それぞれのアンチセン
スオリゴヌクレオチドのIC50は、表15.3においてμMで示される。
【０２３６】
【表１５−４】
2020115894.tif 000021
B.  A549細胞 
実施例1において記載されたアンチセンスオリゴヌクレオチドのいくつかを、in vitro
で、ヒトハンチンチンmRNAに対するそれらの作用について試験した。ウェル当たり4,000
個の細胞の密度での培養されたA549細胞を、リポフェクチントランスフェクション試薬を7.4074 nM、22.222 nM、66.667 nM、または200 nMのアンチセンスオリゴヌクレオチドと
ともに使用して、トランスフェクトした。約16時間の処置期間の後、RNAを細胞から単離
し、そしてハンチンチンmRNAレベルを定量的リアルタイムPCRにより測定した。ヒトプラ
イマープローブセットRTS2617を使用して、mRNAレベルを測定した。ハンチンチンmRNAレ
ベルを、RIBOGREEN（登録商標）により測定されるように、全RNA含量に従って調整した。結果を、非処置対照細胞と比較したハンチンチンmRNAの％阻害として、表16において示し、そしてハンチンチンmRNAレベルアンチセンスオリゴヌクレオチド-媒介性用量依存性の
減少を示す。それぞれのアンチセンスオリゴヌクレオチドのIC50は、表16においてnMで示される。
【０２３７】
【表１６】
2020115894.tif 000022
ISIS 387916、ISIS 388241、およびISIS 437507を、in vitroでのヒトハンチンチンmRNAに対するそれらの作用についてさらに試験した。ウェル当たり20,000個の細胞の密度で
培養されたA549細胞を、エレクトロポレーションを250 nM、500 nM、1000 nM、2000 nM、4000 nMまたは8000 nMのアンチセンスオリゴヌクレオチドとともに使用して、トランスフェクトした。約16時間の処置期間の後、RNAを細胞から単離し、そしてハンチンチンmRNA
レベルを定量的リアルタイムPCRにより測定した。ヒトプライマープローブセットRTS2617を使用して、mRNAレベルを測定した。ハンチンチンmRNAレベルを、RIBOGREEN（登録商標
）により測定されるように、全RNA含量に従って調整した。結果を、非処置対照細胞と比
較したハンチンチンmRNAの％阻害として、表17において示し、そしてハンチンチンmRNAレベルのアンチセンスオリゴヌクレオチド-媒介性用量依存性の減少を示す。それぞれのア
ンチセンスオリゴヌクレオチドのIC50は、表17においてμMで示される。
【０２３８】
【表１７】
2020115894.tif 000023
C.  LLC-MK2細胞
実施例1において記載されそしてヒトハンチンチン核酸を標的とするアンチセンスオリ
ゴヌクレオチドのいくつかを、in vitroでアカゲザルハンチンチンmRNAに対するそれらの作用について試験した。ウェル当たり25,000細胞の密度での培養されたLLC-MK2細胞を、
エレクトロポレーションを625 nM、1250 nM、2500 nM、5000 nM、10,000 nM、または20,000 nMのアンチセンスオリゴヌクレオチドとともに使用して、トランスフェクトした。約16時間の処置期間の後、RNAを細胞から単離し、そしてハンチンチンmRNAレベルを定量的リアルタイムPCRにより測定した。ヒトプライマープローブセットRTS2686（フォワード配列GTCTGAGCCTCTCTCGGTCAA、本明細書中SEQ ID NO: 40と示されれる；リバース配列AAGGGATGCTGGGCTCTGT、本明細書中SEQ ID NO: 41と示される；プローブ配列AGCAAAGCTTGGTGTCTTGGCACTGTTAGTX、本明細書中SEQ ID NO: 42と示される）を使用して、mRNAレベルを測定した。ハンチンチンmRNAレベルを、RIBOGREEN（登録商標）により測定されるように、全RNA含量に従って調整した。結果を、表18において示し、非処置対照細胞と比較したハンチンチンmRNAの％阻害として、ハンチンチンmRNAレベルのアンチセンスオリゴヌクレオチド-媒
介性用量依存性の減少を示す。それぞれのアンチセンスオリゴヌクレオチドのIC50は、表18においてμMで示される。
【０２３９】
【表１８】
2020115894.tif 000024
ISIS 387916、ISIS 388241、ISIS 436684、ISIS 437168、ISIS 437175、ISIS 437441、ISIS 437507、ISIS 437527、ISIS 444578、ISIS 444584、ISIS 444591、およびISIS 444607を、in vitroでのアカゲザルハンチンチンmRNAに対するそれらの作用についてさらに試験した。培養されたLLC-MK2細胞を、上述した方法と同様の手順で試験した。結果を、非
処置対照細胞と比較したハンチンチンmRNAの％阻害として、表19において示し、ハンチンチンmRNAレベルのアンチセンスオリゴヌクレオチド-媒介性用量依存性の減少を示す。それぞれのアンチセンスオリゴヌクレオチドのIC50は、表19においてμMとして示される。
【０２４０】
【表１９】
2020115894.tif 000025
ISIS 387916、ISIS 388241、ISIS 444608、ISIS 444615、ISIS 444618、ISIS 444627、ISIS 444652、ISIS 444658、ISIS 444659、ISIS 444660、およびISIS 444661を、in vitroでのアカゲザルハンチンチンmRNAに対するそれらの作用についてさらに試験した。培養
されたLLC-MK2細胞を、上述した方法と同様の手順で試験した。結果を、非処置対照細胞
と比較したハンチンチンmRNAの％阻害として、表20において示し、ハンチンチンmRNAレベルのアンチセンスオリゴヌクレオチド-媒介性用量依存性の減少を示す。それぞれのアン
チセンスオリゴヌクレオチドのIC50は、表20においてμMで示される。
【０２４１】
【表２０】
2020115894.tif 000026
ISIS 387916、ISIS 419627、ISIS 419628、ISIS 419629、ISIS 419630、ISIS 419636、ISIS 419637、ISIS 419640、ISIS 419641、およびISIS 419642を、in vitroでのアカゲザルハンチンチンmRNAに対するそれらの作用についてさらに試験した。ウェル当たり3,000
細胞の密度での培養されたLLC-MK2細胞を、リポフェクチントランスフェクション試薬を6.25 nM、12.5 nM、25 nM、50 nM、100 nM、または200 nMのアンチセンスオリゴヌクレオ
チドとともに使用してトランスフェクトした。約16時間の処置期間の後、RNAを細胞から
単離し、そしてハンチンチンmRNAレベルを定量的リアルタイムPCRにより測定した。ヒト
プライマープローブセットRTS2686を使用して、mRNAレベルを測定した。ハンチンチンmRNAレベルを、RIBOGREEN（登録商標）により測定されるように、全RNA含量に従って調整し
た。結果を、非処置対照細胞と比較したハンチンチンmRNAの％阻害として、表21において示し、ハンチンチンmRNAレベルのアンチセンスオリゴヌクレオチド-媒介性用量依存性の
減少を示す。それぞれのアンチセンスオリゴヌクレオチドのIC50は、表21においてnMで示される。
【０２４２】
【表２１】
2020115894.tif 000027
ISIS 387916、ISIS 419641、およびISIS 436689を、in vitroアカゲザルハンチンチンmRNAに対するそれらの作用についてさらに試験した。ウェル当たり3,000細胞の密度での培養されたLLC-MK2細胞を、LipofectAMINE2000トランスフェクション試薬を6.25 nM、12.5 nM、25 nM、50 nM、100 nM、または200 nMのアンチセンスオリゴヌクレオチドとともに使用して、トランスフェクトした。約16時間の処置期間の後、RNAを細胞から単離し、そし
てハンチンチンmRNAレベルを定量的リアルタイムPCRにより測定した。ヒトプライマープ
ローブセットRTS2686を使用して、mRNAレベルを測定した。ハンチンチンmRNAレベルを、RIBOGREEN（登録商標）により測定されるように、全RNA含量に従って調整した。結果を、
非処置対照細胞と比較したハンチンチンmRNAの％阻害として、表22において示し、ハンチンチンmRNAレベルのアンチセンスオリゴヌクレオチド-媒介性用量依存性の減少を示す。
それぞれのアンチセンスオリゴヌクレオチドのIC50は、表22においてnMで示される。
【０２４３】
【表２２】
2020115894.tif 000028
ISIS 387916、ISIS 388241、ISIS 436665、ISIS 436671、およびISIS 436689を、in vitroでのアカゲザルハンチンチンmRNAに対するそれらの作用についてさらに試験した。ウ
ェル当たり3,000細胞の密度での培養されたLLC-MK2細胞を、リポフェクチントランスフェクション試薬を4.6875 nM、9.375 nM、18.75 nM、37.5 nM、75 nM、または150 nMのアン
チセンスオリゴヌクレオチドとともに使用して、トランスフェクトした。約16時間の処置期間の後、RNAを細胞から単離し、そしてハンチンチンmRNAレベルを定量的リアルタイムPCRにより測定した。ヒトプライマープローブセットRTS2686を使用して、mRNAレベルを測
定した。ハンチンチンmRNAレベルを、RIBOGREEN（登録商標）により測定されるように、
全RNA含量に従って調整した。結果を、非処置対照細胞と比較したハンチンチンmRNAの％
阻害として、表23において示し、ハンチンチンmRNAレベルのアンチセンスオリゴヌクレオチド-媒介性用量依存性の減少を示す。それぞれのアンチセンスオリゴヌクレオチドのIC50は、表23においてnMで示される。
【０２４４】
【表２３】
2020115894.tif 000029
D.  BACHDトランスジェニックマウス肝細胞
実施例1において記載されそしてヒトハンチンチン核酸を標的とするアンチセンスオリ
ゴヌクレオチドのいくつかを、in vitroでのヒトハンチンチンmRNAに対するそれらの作用について試験した。ウェル当たり10,000細胞の密度での培養されたBACHDマウス肝細胞を
、サイトフェクチントランスフェクション試薬を7.4074 nM、22.222 nM、66.667 nM、ま
たは200 nMのアンチセンスオリゴヌクレオチドとともに使用して、トランスフェクトした。約16時間の処置期間の後、RNAを細胞から単離し、そしてハンチンチンmRNAレベルを定
量的リアルタイムPCRにより測定した。ヒトプライマープローブセットRTS2617を使用して、mRNAレベルを測定した。ハンチンチンmRNAレベルを、RIBOGREEN（登録商標）により測
定されるように、全RNA含量に従って調整した。結果を、非処置対照細胞と比較したハン
チンチンmRNAの％阻害として、表24において示し、ハンチンチンmRNAレベルのアンチセンスオリゴヌクレオチド-媒介性用量依存性の減少を示す。示されるデータは、2回の実験の平均である。それぞれのアンチセンスオリゴヌクレオチドのIC50は、表24においてnMで示される。
【０２４５】
【表２４】
2020115894.tif 000030
ISIS 387916、ISIS 388241、およびISIS 419641を、in vitroでのヒトハンチンチンmRNAに対するそれらの作用についてさらに試験した。ウェル当たり10,000細胞の密度での培
養されたBACHDマウス肝細胞を、サイトフェクチントランスフェクション試薬を12.5 nM、25 nM、50 nM、100 nMまたは200 nMのアンチセンスオリゴヌクレオチドとともに使用して、トランスフェクトした。約16時間の処置期間の後、RNAを細胞から単離し、そしてハン
チンチンmRNAレベルを定量的リアルタイムPCRにより測定した。ヒトプライマープローブ
セットRTS2617を使用して、mRNAレベルを測定した。ハンチンチンmRNAレベルを、RIBOGREEN（登録商標）により測定されるように、全RNA含量に従って調整した。結果を、非処置
対照細胞と比較したハンチンチンmRNAの％阻害として、表25において示し、ハンチンチンmRNAレベルのアンチセンスオリゴヌクレオチド-媒介性用量依存性の減少を示す。それぞ
れのアンチセンスオリゴヌクレオチドのIC50は、表25においてnMで示される。
【０２４６】
【表２５】
2020115894.tif 000031
ISIS 387916、ISIS 388241、ISIS 419641、ISIS 436665、ISIS 436671、およびISIS 436689を、in vitroでのヒトハンチンチンmRNAに対するそれらの作用についてさらに試験した。培養されたBACHDマウス肝細胞を、上述した方法と同様に試験した。結果を、非処置
対照細胞と比較したハンチンチンmRNAの％阻害として、表26において示し、ハンチンチンmRNAレベルのアンチセンスオリゴヌクレオチド-媒介性用量依存性の減少を示す。それぞ
れのアンチセンスオリゴヌクレオチドのIC50は、表26においてnMで示される。
【０２４７】
【表２６】
2020115894.tif 000032
ISIS 387916、ISIS 419640、ISIS 419641、およびISIS 419642を、in vitroでのマウスハンチンチンmRNAに対するそれらの作用についてさらに試験した。ウェル当たり20,000細胞の密度での培養されたBACHDマウス肝細胞を、サイトフェクチントランスフェクション
試薬を6.667 nM、20 nM、60 nM、または180 nMのアンチセンスオリゴヌクレオチドとともに使用して、トランスフェクトした。約16時間の処置期間の後、RNAを細胞から単離し、
そしてハンチンチンmRNAレベルを定量的リアルタイムPCRにより測定した。マウスプライ
マープローブセットRTS2633（フォワード配列CAGAGCTGGTCAACCGTATCC、本明細書中SEQ ID
NO: 43と示される；リバース配列GGCTTAAACAGGGAGCCAAAA、本明細書中SEQ ID NO: 44と
示される；プローブ配列ACTTCATGATGAGCTCGGAGTTCAACX、本明細書中SEQ ID NO: 45と示される）を使用して、mRNAレベルを測定した。ハンチンチンmRNAレベルを、RIBOGREEN（登
録商標）により測定されるように、全RNA含量に従って調整した。結果を、非処置対照細
胞と比較したハンチンチンmRNAの％阻害として、表27において示し、ハンチンチンmRNAレベルのアンチセンスオリゴヌクレオチド-媒介性用量依存性の減少を示す。それぞれのア
ンチセンスオリゴヌクレオチドのIC50は、表27においてnMで示される。
【０２４８】
【表２７】
2020115894.tif 000033
実施例3：BACHDマウスにおけるハンチンチンmRNAに対する、アンチセンスオリゴヌクレオチドの全身性投与
約1700種の新たに設計したアンチセンス化合物の中から、全身性耐容性スクリーニングにおいて試験するためのISIS 387916と比較したin vitro強度に基づいて、66種の化合物
を選択した。
【０２４９】
BACHDマウスを、ISISオリゴヌクレオチドにより処置し、そして様々な代謝マーカーのレベルの変化について評価し、並びに肝臓におけるハンチンチンmRNAの阻害の変化について評価した。体重、器官重量において、または代謝マーカーレベルにおいて不都合な変化
を生じたアンチセンスオリゴヌクレオチドが、さらなる研究において利用するために適切ではないものとみなした。
【０２５０】
研究1
処置
各4匹の19群のBACHDマウスに、12.5 mg/kgのISIS 387916、ISIS 388241、ISIS 419629
、ISIS 419637、ISIS 436684、ISIS 444578、ISIS 444584、ISIS 444591、ISIS 444607、ISIS 444608、ISIS 444615、ISIS 444618、ISIS 444627、ISIS 444652、ISIS 444658、ISIS 444659、ISIS 444660、ISIS 444661、またはISIS 444663を、1週間に2回、2週間にわ
たり、腹腔内に注射した。4匹のマウスの対照群に、PBSを、1週間に2回、2週間にわたり
、腹腔内に注射した。最終投与の2日後に、マウスをイソフルレンを用いて麻酔し、そし
て血漿回収のために放血し、その後頸椎脱臼を行い、器官を回収した。
【０２５１】
RNA解析
RNAを、ハンチンチンmRNAレベルのリアルタイムPCR解析用に肝臓組織から抽出した。ヒト変異型ハンチンチンmRNAレベルを、ヒトプライマープローブセットRTS2617を使用して
測定した。マウス正常ハンチンチンレベルを、マウスプライマープローブセットRTS2633
を使用して測定した。結果を、表28および表29に示し、そしてPBS対照と比較して、ヒト
ハンチンチン発現レベルおよびマウスハンチンチン発現レベルの％阻害としてそれぞれ算出した。すべてのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトハンチンチンmRNAレベルの顕著な阻害を引き起こす。ISIS 388241は、マウスハンチンチンmRNA（SEQ ID NO: 3）と比
較して3つ以上のミスマッチを有し、そして従って対照と比較して、マウスmRNAレベルの
顕著な阻害を示さなかった。
【０２５２】
【表２８】
2020115894.tif 000034
【０２５３】
【表２９】
2020115894.tif 000035
器官重量測定
肝臓重量、脾臓重量および腎臓重量を、研究の最後に測定し、そして体重で正規化した生理食塩水対照の％として、表30において示す。
【０２５４】
【表３０】
2020115894.tif 000036
肝臓機能の評価
ISISオリゴヌクレオチドの上述したマウスの肝臓機能に対する効果を評価するため、トランスアミナーゼの血漿濃度を、自動化臨床化学解析装置（Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY）を使用して測定した。アラニントランスアミナーゼ（ALT）およびアスパラ
ギン酸トランスアミナーゼ（AST）の測定値を、IU/Lで示し、そして結果を表31に示す。
【０２５５】
【表３１】
2020115894.tif 000037
研究2
処置
各4匹の14群のBACHDマウスに、12.5 mg/kgまたは50 mg/kgのISIS 419581、ISIS 419602、ISIS 419628、ISIS 419629、ISIS 419640、ISIS 419641、またはISIS 419642を、1週間に2回、2週間にわたり、腹腔内に注射した。4匹のBACHDマウスのグループには、12.5 mg/kgのISIS 387916を1週間に2回、2週間にわたり、腹腔内に注射した。4匹のマウスの対照
群には、PBSを、1週間に2回、2週間にわたり、腹腔内に注射した。最終投与ののち2日後
に、マウスを、イソフルレンを用いて麻酔し、そして血漿回収のために放血し、その後頸椎脱臼を行い、器官を回収した。
【０２５６】
RNA解析
RNAを、ハンチンチンmRNAレベルのリアルタイムPCR解析用に肝臓組織から抽出した。ヒト変異型ハンチンチンmRNAレベルを、ヒトプライマープローブセットRTS2617を使用して
測定した。マウス正常ハンチンチンレベルを、マウスプライマープローブセットRTS2633
を使用して測定した。結果を、表32および表33に示し、そしてPBS対照と比較して、ヒト
ハンチンチン発現レベルおよびマウスハンチンチン発現レベルの％阻害としてそれぞれ算出した。
【０２５７】
【表３２】
2020115894.tif 000038
【０２５８】
【表３３】
2020115894.tif 000039
器官重量測定  肝臓重量、脾臓重量および腎臓重量を、研究の最後に測定し、そして体重で正規化した生理食塩水対照の％として、表34において示す。
【０２５９】
【表３４】
2020115894.tif 000040
肝臓機能の評価
ISISオリゴヌクレオチドの上述したマウスの肝臓機能に対する効果を評価するため、トランスアミナーゼの血漿濃度を、自動化臨床化学解析装置（Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY）を使用して測定した。ALTおよびASTの測定値を、IU/Lで示し、そして結果を表35に示す。
【０２６０】
【表３５】
2020115894.tif 000041
研究3 
処置
各4匹の18群のBACHDマウスに、12.5 mg/kgまたは50 mg/kgのISIS 388250、ISIS 388251、ISIS 388263、ISIS 388264、ISIS 419641、ISIS 436645、ISIS 436649、ISIS 436668、またはISIS 436689を、1週間に2回、2週間にわたり、腹腔内に注射した。4匹のBACHDマウスのグループには、12.5 mg/kgのISIS 388241を、1週間に2回、2週間にわたり、腹腔内に注射した。4匹のマウスの対照群には、PBSを、1週間に2回、2週間にわたり、腹腔内に注
射した。最終投与ののち2日後に、マウスを、イソフルレンを用いて麻酔し、そして血漿
回収のために放血し、その後頸椎脱臼を行い、器官を回収した。
【０２６１】
RNA解析
RNAを、ハンチンチンmRNAレベルのリアルタイムPCR解析用に肝臓組織から抽出した。ヒト変異型ハンチンチンmRNAレベルを、ヒトプライマープローブセットRTS2617を用いて測
定した。マウス正常ハンチンチンレベルを、マウスプライマープローブセットRTS2633を
用いて測定した。結果を、表36および表37に示し、そしてPBS対照と比較して、ヒトハン
チンチン発現レベルおよびマウスハンチンチン発現レベルの％阻害としてそれぞれ算出した。すべてのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトハンチンチンmRNAレベルの顕著な阻害を引き起こす。ISIS 388241、ISIS 388250、ISIS 388251、ISIS 388263、ISIS 388264、およびISIS 436645は、マウスハンチンチンmRNA（SEQ ID NO: 3）と比較して3つ以上
のミスマッチを有し、そして従って対照と比較して、マウスmRNAレベルの顕著な阻害を示さなかった。ISIS 436649およびISIS 436689は、マウスハンチンチンmRNA（SEQ ID NO: 3）と比較して3つ以上のミスマッチを有し、そして従って対照と比較して、マウスmRNAレ
ベルの顕著な阻害を示さなかった。
【０２６２】
【表３６】
2020115894.tif 000042
【０２６３】
【表３７】
2020115894.tif 000043
器官重量測定
肝臓重量、脾臓重量および腎臓重量を、研究の最後に測定し、そして体重で正規化した生理食塩水対照の％として、表38において示す。ISIS 388263およびISIS 436645で処理したマウスは、PBS対照と比較して、50 mg/kg投与に際して、肝臓重量の増加を生じた。
【０２６４】
【表３８】
2020115894.tif 000044
肝臓機能の評価
ISISオリゴヌクレオチドの上述したマウスの肝臓機能に対する効果を評価するため、トランスアミナーゼの血漿濃度を、自動化臨床化学解析装置（Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY）を使用して測定した。アラニントランスアミナーゼ（ALT）およびアスパラ
ギン酸トランスアミナーゼ（AST）の測定値を、IU/Lで示し。そして結果を表39に示す。
【０２６５】
【表３９】
2020115894.tif 000045
研究4
処置
各4匹の18群のBACHDマウスに、腹腔内に12.5 mg/kまたは50 mg/kgのISIS 388241、ISIS
437123、ISIS 437132、ISIS 437140、ISIS 437442、ISIS 437446、ISIS 437477、ISIS 437478、またはISIS 437490 1週間に2回、2週間にわたり、腹腔内に注射した。4匹のBACHDマウスのグループには、12.5 mg/kgのISIS 387916を1週間に2回、2週間にわたり、腹腔内に注射した。4匹のマウスの対照群には、PBSを、1週間に2回、2週間にわたり、腹腔内に
注射した。最終投与ののち2日後に、マウスを、イソフルレンを用いて麻酔し、そして血
漿回収のために放血し、その後頸椎脱臼を行い、器官を回収した。
【０２６６】
RNA解析
RNAを、ハンチンチンmRNAレベルのリアルタイムPCR解析用に肝臓組織から抽出した。ヒト変異型ハンチンチンmRNAレベルを、ヒトプライマープローブセットRTS2617を使用して
測定した。マウス正常ハンチンチンレベルを、マウスプライマープローブセットRTS2633
を使用して測定した。結果を、表40および表41に示し、そしてPBS対照と比較して、ヒト
ハンチンチン発現レベルおよびマウスハンチンチン発現レベルの％阻害としてそれぞれ算出した。ISIS 388241およびISIS 437490は、マウスハンチンチンmRNA（SEQ ID NO: 3）と比較して3つよりも多いミスマッチを有し、そしてしたがって、対照と比較して、マウスmRNAレベルの顕著な阻害を示さなかった。ISIS 437132は、マウスハンチンチンmRNA（SEQ ID NO: 3）と比較して3つのミスマッチを有し、そしてしたがって、対照と比較して、マ
ウスmRNAレベルの顕著な阻害を示さなかった。ISIS 437123およびISIS 437140は、マウスハンチンチンmRNA（SEQ ID NO: 3）と比較して2つのミスマッチを有し、そして対照と比
較して、マウスmRNAレベルの顕著な阻害を示さなかった。
【０２６７】
【表４０】
2020115894.tif 000046
【０２６８】
【表４１】
2020115894.tif 000047
器官重量測定
肝臓重量、脾臓重量および腎臓重量を、研究の最後に測定し、そして体重は、体重で正規化した生理食塩水対照の％として、表42中に示される。
【０２６９】
【表４２】
2020115894.tif 000048
肝臓機能の評価
ISISオリゴヌクレオチドの上述したマウスの肝臓機能に対する影響を評価するため、トランスアミナーゼの血漿濃度を、自動化臨床化学解析装置（Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY）を使用して測定した。アラニントランスアミナーゼ（ALT）およびアスパラ
ギン酸トランスアミナーゼ（AST）の測定値は、IU/Lで表し、そして結果を表43に示す。
【０２７０】
【表４３】
2020115894.tif 000049
研究5
処置
各4匹の11群のBACHDマウスに、12.5 mg/kgのISIS 388241、ISIS 419640、ISIS 419641
、ISIS 419642、ISIS 436665、ISIS 436671、ISIS 436689、ISIS 437507、ISIS 443139、ISIS 444591、またはISIS 444661を、1週間に2回、2週間にわたり、腹腔内に注射した。4匹のマウスの対照群に、リン酸緩衝塩類溶液（PBS）を、1週間に2回、2週間にわたり、腹腔内を注射した。最終投与ののち2日後に、マウスを、イソフルレンを用いて麻酔し、そ
して血漿回収のために放血し、その後頸椎脱臼を行い、器官を回収した。
【０２７１】
RNA解析
RNAを、ハンチンチンmRNAレベルのリアルタイムPCR解析用に肝臓組織から抽出した。ヒト変異型ハンチンチンmRNAレベルを、ヒトプライマープローブセットRTS2617を使用して
測定した。マウス正常ハンチンチンレベルを、マウスプライマープローブセットRTS2633
を使用して測定した。結果を、表44および表45に示し、そしてPBS対照と比較して、ヒト
ハンチンチン発現レベルおよびマウスハンチンチン発現レベルの％阻害としてそれぞれ算出した。すべてのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトハンチンチンmRNAレベルの顕著な阻害を示さなかった。ISIS 388241、ISIS 437507、およびISIS 443139は、マウスハ
ンチンチンmRNA（SEQ ID NO: 3）と比較して3つよりも多いミスマッチを有し、そしてしたがって対照と比較して、マウスmRNAレベルの顕著な阻害を示さなかった。ISIS 436689
は、マウスハンチンチンmRNA（SEQ ID NO: 3）と比較して3つのミスマッチを有し、そし
て対照と比較して、マウスmRNAレベルの顕著な阻害を示さなかった。
【０２７２】
【表４４】
2020115894.tif 000050
【０２７３】
【表４５】
2020115894.tif 000051
体重および器官重量の測定
マウスの体重を、研究の開示時点および1週間に2回、測定した。マウスの体重を表46に示し、そして研究の開始時に測定された体重に対する％変化として表す。結果は、これらのオリゴヌクレオチドによる処置は、研究を通じてマウスの体重において有害な変化を生じなかったことを示す。
【０２７４】
【表４６】
2020115894.tif 000052
肝臓重量、脾臓重量および腎臓重量を、研究の最後に測定し、そして体重は、体重で正規化した生理食塩水対照の％として表47に示される。
【０２７５】
【表４７】
2020115894.tif 000053
肝臓機能の評価
ISISオリゴヌクレオチドの上述したマウスの肝臓機能に対する影響を評価するため、トランスアミナーゼの血漿濃度を、自動化臨床化学解析装置（Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY）を使用して測定した。ALTおよびASTの測定値は IU/Lで表した。ビリルビン
およびアルブミンの血漿レベルもまた、同一の臨床的化学物質解析装置を使用して測定し、そしてg/dLで表した。結果を、表48に示す。
【０２７６】
【表４８】
2020115894.tif 000054
腎臓機能の測定
ISISオリゴヌクレオチドの上述したマウスの腎臓機能に対する影響を評価するため、血中尿素窒素（BUN）およびクレアチニンのの血漿濃度を、自動化臨床化学解析装置（Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY）を使用して測定した。結果を、表49においてmg/dLで示す。
【０２７７】
【表４９】
2020115894.tif 000055
その他の代謝パラメータの測定
ISISオリゴヌクレオチドの上述したマウスにおけるその他の代謝機能に対する影響を評価するため、グルコース、コレステロールおよびトリグリセリドの血漿濃度を、自動化臨床化学解析装置（Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY）を使用して測定した。結果を
、表50において示し、mg/dLで表し、そしてこれらのオリゴヌクレオチドによる処置が、
対照群と処置群とのあいだで、これらの代謝マーカーのレベルの有害な変化を何も生じなかった。
【０２７８】
【表５０】
2020115894.tif 000056
実施例4：ハンチンチンmRNAに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの、BACHDマウスの大脳基底核線条体に対するボーラス投与
BACHDマウスを、規定のマウス脳領域、大脳基底核線条体、に対して、ヒトハンチンチ
ンmRNA発現およびマウスハンチンチンmRNA発現に対する脳組織におけるオリゴヌクレオチド活性をスクリーニングすることを目的として、ボーラス投与を介してISISオリゴヌクレオチドにより処理した。
【０２７９】
処置および手術
各4匹のBACHDマウスのグループに、大脳基底核線条体中に3μg、10μgまたは25μg濃度を1回ボーラス注射として送達されるISIS 388241、ISIS 419628、ISIS 419637、ISIS 419640、ISIS 419641、ISIS 419642、ISIS 436665、ISIS 436671、ISIS 436684、ISIS 436689、ISIS 436754、ISIS 437168、ISIS 437175、ISIS 437441、ISIS 437442、ISIS 437507
、ISIS 437527、ISIS 443139、ISIS 444578、ISIS 444584、ISIS 444591、ISIS 444607、ISIS 444608、ISIS 444615、ISIS 444618、ISIS 444627、ISIS 444652、ISIS 444658、ISIS 444659、ISIS 444660、ISIS 444661またはISIS 444663を投与した。
【０２８０】
4匹のBACHDマウスの対照群を、PBSにより同様に処置した。ISIS 388241を、各4匹の7グループのマウスにおいて投与し、そして示される結果は、データの平均である。ISIS 419628を、各4匹の2グループのBACHDマウスに投与し、そして示された結果は、8匹のマウス
に由来するデータの平均である。ボーラス投与の7日後、マウスを、イソフルレンを用い
て麻酔し、そして器官を取り出した。動物を頚椎脱臼させ、そして組織の切片のための脳を取り出した。 
【０２８１】
RNA解析
RNAを、ハンチンチンmRNAレベルのリアルタイムPCR解析のために、大脳基底核線条体組織から抽出した。ヒト変異型ハンチンチンmRNAレベルを、ヒトプライマープローブセット
RTS2617を使用して測定した。マウス正常ハンチンチンmRNAレベルを、マウスプライマー
プローブセットRTS2633を使用して測定した。ヒトハンチンチンmRNAレベルに関する結果
を、表51中にて提示し、そして、PBS対照群と比較して％阻害を表示する。すべてのアン
チセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトハンチンチンmRNAレベルの用量依存的な阻害を生じる。マウスハンチンチンmRNAレベルについての結果を、表52に示し、そしてPBS対照群と
比較した％阻害として表す。
【０２８２】
各オリゴヌクレオチドのヒトハンチンチンmRNAおよびマウスハンチンチンmRNAに対する有効用量（ED50）は、使用されるオリゴヌクレオチド濃度対いずれかの種のハンチンチンmRNA発現レベルの％阻害とをプロッティングすることにより、そして対応する対照と比較して、ハンチンチンmRNA発現の50％阻害がそれぞれの種に関して達成された濃度に注目することにより、算出した。各アンチセンスオリゴヌクレオチドについてのED50（μg）も
また、ヒトハンチンチンmRNAおよびマウスハンチンチンmRNAに関してそれぞれ表51および表52に示す。
【０２８３】
ISIS 388241、ISIS 436684、ISIS 436754、ISIS 437175、ISIS 437507、ISIS 443139、およびISIS 444584はそれぞれ、マウスハンチンチンmRNA（SEQ ID NO: 3）と比較して8塩基対またはそれ以上のミスマッチを有し、そしてしたがって対照と比較して、マウスmRNAレベルの顕著な阻害を示さない。ISIS 437168およびISIS 437441は、マウスハンチンチンmRNA（SEQ ID NO: 3と比較して）2つのミスマッチを有し、そして対照と比較して、マウ
スmRNAレベルの顕著な阻害を示さない。ISIS 436689は、マウスハンチンチンmRNA（SEQ ID NO: 3）と比較して3つのミスマッチを有し、そして、対照と比較して、マウスmRNAレベルの顕著な阻害を示さない。
【０２８４】
【表５１】
2020115894.tif 000057
【０２８５】
【表５２】
2020115894.tif 000058
アスタリスクをつけた10種の化合物は、ISIS 388241と比較して改善されたED50を有し
た。
【０２８６】
実施例5：ラットの大脳基底核線条体組織における、アンチセンスオリゴヌクレオチド
のボーラス投与の神経毒性作用についてのアッセイ
約30種の化合物を、高耐容性および高強度を有するものとして選択した。ついで、化合物を、ついで、ラットにおいてCNSボーラス注射により試験し、さらに神経毒性について
評価した。
【０２８７】
Sprague-Dawleyラットのそれぞれを、CNS毒性の測定としてミクログリアマーカーAIF1
の誘導についてスクリーニングすることを目的として、規定の脳領域、大脳基底核線条体、へのボーラス投与を介してISISオリゴヌクレオチドにより処置した。
【０２８８】
処置および手術
4匹のSprague-Dawleyラットのグループに、大脳基底核線条体中に50μg濃度を1回ボー
ラス注射として送達されるISIS 387916、ISIS 388241、ISIS 419627、ISIS 419628、ISIS
419629、ISIS 419630、ISIS 419636、ISIS 419637、ISIS 419640、ISIS 419641、ISIS 419642、ISIS 436665、ISIS 436668、ISIS 4196671、ISIS 436684、ISIS 436689、ISIS 436754、ISIS 443168、ISIS 437175、ISIS 437441、ISIS 437442、ISIS 437507、ISIS 437527、ISIS 443139、ISIS 444578、ISIS 444584、ISIS 444591、ISIS 444607、ISIS 444608、ISIS 444615、ISIS 444618、ISIS 444627、ISIS 444652、ISIS 444658、ISIS 444659、ISIS 444660、ISIS 444661、またはISIS 444663を、投与した。
【０２８９】
4匹のラットの対照群を、PBSにより同様に処理した。4匹のラットのグループを、陰性
対照群としてTNF-αに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドである、ISIS 104838によ
り同様に処置した。ISIS 387916は、4匹のラット、4グループのそれぞれにおいて投与し
、そして示された結果は、16匹のラットから得られたデータの平均である。ISIS 419628
は、4匹のラット、2グループのそれぞれにおいて投与し、そして示された結果は、8匹の
ラットから得られたデータの平均である。ISIS 419629、ISIS 444584およびISIS 444618
は、全身性投与研究（実施例3）において毒性指標を有したものであるが、本研究におい
ても試験した。ボーラス投与の7日後に、ラットを、イソフルレンを用いて麻酔し、そし
て器官を取り出した。動物を頚椎脱臼させ、そして大脳基底核線条体組織の切片のための脳を取り出した。
【０２９０】
AIF1発現レベルのRNA解析
RNAを、AIF1 mRNAレベルのリアルタイムPCR解析のために、大脳基底核線条体組織から
抽出した。ラットAIF1レベルを、ラットプライマープローブセットrAif1_LTS00219（フォワード配列AGGAGAAAAACAAAGAACACCAGAA、本明細書中SEQ ID NO: 46と示される；リバース配列CAATTAGGGCAACTCAGAAATAGCT、本明細書中SEQ ID NO: 47と示される；プローブ配列CCAACTGGTCCCCCAGCCAAGAX、本明細書中SEQ ID NO: 48と示される）を使用して測定した。結果を、PBS対照のAIF1発現と比較して、AIF1発現の％として算出し、それを表53に示した
。ISIS 419629、ISIS 444584、およびISIS 444618は、全身性投与研究（実施例3）における毒性指標を示したものであるが、本研究においても同様に毒性指標を有した（生理食塩水対照と比較して300％高い）。その後の研究により、ISIS 444584は、神経耐容性であり、そしてわずかな毒性指標を示すことが示された（実施例16および実施例17）。
【０２９１】
【表５３】
2020115894.tif 000059
ハンチンチン発現レベルのRNA解析  RNAを、ハンチンチンmRNAレベルのリアルタイムPCR解析のために、大脳基底核線条体組
織から抽出した。ラットハンチンチンmRNAレベルを、ラットプライマープローブセットrHtt_LTS00343（フォワード配列CAGAGCTGGTGAACCGTATCC、本明細書中SEQ ID NO: 49と示さ
れる；リバース配列GGCTTAAGCAGGGAGCCAAAA、本明細書中SEQ ID NO: 50と示される；プローブ配列ACTTCATGATGAGCTCGGAGTTCAACX、本明細書中SEQ ID NO: 51と示される）を使用して、測定した。結果を、PBS対照のハンチンチン発現と比較して、ハンチンチン発現の減
少％として算出し、それを表54に示した。ISIS 388241、ISIS 436684、ISIS 436754、ISIS 437175、ISIS 437507、およびISIS 443139はそれぞれ、ラット遺伝子配列（SEQ ID NO:
5）と比較して6塩基対またはそれ以上のミスマッチを有し、そしてしたがって対照と比
較して、ラットmRNAレベルの顕著な阻害を示さない。ISIS 419640、ISIS 419641、ISIS 419642、ISIS 436665、ISIS 436668、ISIS 437442、ISIS 444615、およびISIS 444627はそれぞれ、ラット遺伝子配列（SEQ ID NO: 5）と比較して1つのミスマッチを有し、そして
対照と比較して、ラットmRNAレベルの顕著な阻害を示さない。ISIS 437168およびISIS 437441は、ラット遺伝子配列（SEQ ID NO: 5）と比較して2つのミスマッチを有し、そして
対照と比較して、ラットmRNAレベルの顕著な阻害を示さない。ISIS 436689およびISIS 444584は、ラット遺伝子配列（SEQ ID NO: 5）と比較して3つのミスマッチを有し、そして
対照と比較して、ラットmRNAレベルの顕著な阻害を示さない。
【０２９２】
【表５４】
2020115894.tif 000060
実施例6：ハンチンチンmRNAに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの脳室内投与〜BACHDマウスにおける耐容性研究
選択された化合物を、以前に設計した化合物ISIS 388241と、BACHDマウスにおいてICV
投与により比較した。
【０２９３】
選択された化合物＋ベンチマーク388241は、in vitroおよび全身性の強度および耐容性、並びにCNS強度および耐容性に基づいて、選択した。
BACHDマウスを、マウスにおけるICV投与の耐容性を評価することを目的として、規定のマウス脳領域、右側脳室、に対する脳室内（ICV）投与を介して、ISISオリゴヌクレオチ
ドにより処置した。
【０２９４】
処置および手術
5匹のBACHDマウスのグループのそれぞれに、Alzet 2002ポンプを用いて12μL/日の速度で2週間にわたり150μg/日をICVに送達される、ISIS 388241、ISIS 437507、ISIS 443139、ISIS 419640、ISIS 419641、ISIS 419642、ISIS 444591、ISIS 436665、ISIS 436671、ISIS 444661、またはISIS 436689を投与した。4匹のBACHDマウスの対照群を、PBSにより
同様に処置した。マウスに対して、以下のようにしてポンプを外科的に移植した：ポンプの移植のため、マウスを個別に3％イソフルレンを用いて麻酔した。2週間後、マウスを再び麻酔し、そしてポンプを外科的に取り除いた。ついで、動物をさらに2週間かけて回復
させ、その後安楽死させた。
【０２９５】
マウスの体重を処置および回復期間のあいだ毎週測定した。4週間後、マウスをイソフ
ルレンおよび頚椎脱臼を使用して安楽死させた。前頭部および後頭部から組織を得るために脳を取り出した。
【０２９６】
RNA解析
RNAを、ハンチンチンmRNAレベルのリアルタイムPCR解析のため、前頭皮質の右半球およびカニューレ部位小脳後葉部分から抽出した。ヒト変異型ハンチンチンmRNAレベルを、ヒトプライマープローブセットRTS2617を使用して測定した。マウス正常ハンチンチンmRNA
レベルを、マウスプライマープローブセットRTS2633を使用して測定した。結果を、対照
と比較してヒトハンチンチンmRNA発現およびマウスハンチンチンmRNA発現の％阻害として算出し、表56および表57においてそれぞれ示す。すべてのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトハンチンチンmRNAレベルの顕著な阻害を生じる。ISIS 388241、ISIS 437507、およびISIS 443139はそれぞれ、マウスハンチンチンmRNA（SEQ ID NO: 3）と比較して8塩基対またはそれ以上のミスマッチを有し、そしてしたがって、対照と比較して、マウスmRNAレベルの顕著な阻害を示さない。ISIS 444591は、マウスハンチンチンmRNA（SEQ ID NO: 3）と比較して1つのミスマッチを有し、そして対照と比較して、マウスmRNAレベルの顕著な阻害を示さない。ISIS 436689は、マウスハンチンチンmRNA（SEQ ID NO: 3）と比較
して3つのミスマッチを有し、そして、対照と比較して、マウスmRNAレベルの顕著な阻害
を示さない。
【０２９７】
【表５５】
2020115894.tif 000061
【０２９８】
【表５６】
2020115894.tif 000062
【０２９９】
【表５７】
2020115894.tif 000063
体重測定
マウスの体重を、研究の開始時およびその後は1週間に1回、測定した。マウスの体重を表58に示し、そして研究の開始時に測定した体重と比較した％変化として表す。体重は、アンチセンスオリゴヌクレオチドのICV投与に対するマウスの耐容性の測定値と考えられ
た。‘n.d.'は、その時点で利用可能なデータが存在しなかったことを意味する。
【０３００】
【表５８】
2020115894.tif 000064
マウスの生存
マウスの生存を、全研究期間にわたり評価した。以下の表59は、ISISオリゴヌクレオチドおよび対照により処置したマウスグループの生存パターンを示す。
【０３０１】
【表５９】
2020115894.tif 000065
実施例7：C57/BL6マウスにおける、ハンチンチンに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの脳室内投与 
野生型C57/BL6マウスを、これらのマウスにおけるマウスハンチンチンに対するオリゴ
ヌクレオチドの強度を評価することを目的として、ISISオリゴヌクレオチドを用いて、脳室内（ICV）投与を介して、規定のマウス脳領域、右側脳室、に対して処置した。
【０３０２】
処置および手術
各10匹のC57/BL6マウスのグループに対して、50μg/日をAlzet 2002ポンプを用いて0.5
μL/日の速度で7日間または14日間ICVに送達される、ISIS 408737（5' TCCTAGTGTTACATTACCGC 3'（SEQ ID NO: 52）、開始部位SEQ ID NO: 3の5263）を投与した。6匹のC57/BL6マウスの対照群を、PBSにより同様に処置した。マウスに対して、以下のようにしてポンプ
を外科的に移植した：簡単に述べると、Alzet浸透圧ポンプ（Model 2002）を、製造者の
指示書に従って組み立てた。ポンプをアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有する溶液で充填し、そして移植の24時間前に、37℃にて一晩、インキュベートした。動物を3％イソ
フルレンにより麻酔し、そして定位固定フレーム中に配置した。外科手術部位を消毒した後、頭蓋骨上で正中切開を行い、背部に皮下ポケットを作り、そこに事前に充填した浸透圧ポンプを移植した。小型のキリ穴を、右側脳室上に頭蓋骨を通して開けた。プラスチックカテーテルを介して浸透圧ポンプに対して接続したカニューレを、脳室内に配置し、そしてLoctite接着剤を使用して適した位置に接着した。切開を縫合により閉じた。アンチ
センスオリゴヌクレオチドまたはPBSを7または14日間注入し、ポンプを取り出した後に、その後動物を、Institutional Animal Care and Use Committeeにより承認された人道的
なプロトコルに従って安楽死させた。脳および脊髄の組織を回収し、液体窒素中で瞬間的に凍結した。凍結する前に、脳組織をマウス脳マトリクスを使用して5つの部分（S1、S2
、S3、S4、およびS5）に横方向に切断した。部分1〜5は、約互いに2 mmずつ離れており、S1が最も前部であり、そしてS5が最も後部であった。
【０３０３】
RNA解析およびタンパク質解析
全RNAを、ハンチンチンmRNAレベルのリアルタイムPCR解析のため、RNeasy Mini prep kit（Qiagen）を使用して、RNeasy Protect Mini Kit（Qiagen, Mississauga, ON, Canada）によりマウス脳および脊髄から抽出した。Q-PCR反応を、ABI Prism 7700配列検出器（Applied Biosystems）上で行いそして解析した。マウスハンチンチンmRNAレベルを、マウ
スプライマープローブセットABI # Mm01213820_m1（Applied Biosystems）を使用して測
定し、そしてペプチジルプロリルイソメラーゼA mRNAレベルに対して正規化した。タンパク質溶解物を、以前に記載されたように（Li S.H. and Li X.J.、Methods in Molecular Biology（2008）、217:1940-6029）、マウス脳スラブから調製した。溶解物を3〜8％のtris-酢酸ゲル上で泳動し、そしてiBlotドライブロッティングシステム（Invitrogen）を使用して転写した。ブロットを、抗-βチューブリン（Chemicon）およびマウスハンチンチ
ンタンパク質に対して特異的に反応するモノクローナルMAB2166抗体（Millipore）を用いてプローブ化した。イムノブロットを、Odyssey V3.0 softwareを使用して定量化した。
【０３０４】
結果をPBS対照と比較した％減少として表60に示し、そしてday 7およびday 14の両方で、アンチセンスオリゴヌクレオチドにより、ハンチンチンmRNAおよびタンパク質レベルの顕著な阻害を示した。
【０３０５】
【表６０】
2020115894.tif 000066
実施例8：カニクイザルにおける、ハンチンチンmRNAに対するアンチセンスオリゴヌク
レオチドの脳室内投与  カニクイザルを、ハンチンチンmRNA発現に対する脳組織におけるオリゴヌクレオチドの活性をスクリーニングすることを目的として、ISISオリゴヌクレオチドを用いて、脳室内（ICV）投与を介して、規定の脳領域、側脳室、に対して処置した。
【０３０６】
処置および手術
各3頭のカニクイザルの2グループに対して、0.05 ml/時間の速度で4週間、個別の歩行
可能なポンプ（Pegasus Vario）によりICV送達される、0.635 mg/ml（1.5 mg/日）または1.67 mg/ml（4 mg/日）のISIS 436689のいずれかを投与した。2頭のカニクイザルの対照
群に対して、PBSにより同様に投与した。グループには、ISIS 436689を両側性に投与した。1頭の動物に対して、右脳室にISIS 436689を4 mg/日用量で片側性に投与した。
【０３０７】
動物を、注入を行う前に、手術から10日間回復させた。手術後の回復期間のあいだ、動物を、0.05 mL/hの流速で、脳室当たり1個の歩行可能な注入ポンプを使用して、PBSをICV注入しながら維持した。回復期間の最後に、それぞれのカニューレを霊長類用ジャケット（Lomir, PJ-02NB）中に配置した個別の歩行可能なポンプ（Pegasus Vario）に対して接
続した。ポンプを、注入期間の完了まで、接続したままにした。4週間の投与後、動物を
安楽死させ、そして脳、肝臓および腎臓を回収した。
【０３０８】
htt mRNAのRNA解析
RNAを、ハンチンチンmRNAレベルのリアルタイムPCR解析のため、前部尾状核、後部尾状核、側頭皮質、頭頂皮質、視床下部、中脳、海馬、および脊髄、並びに肝臓および腎臓から抽出した。ハンチンチンmRNAレベルを、ヒトプライマープローブセットRTS2617を使用
して測定し、そしてサルシクロフィリンAレベルに対して正規化した。結果を、PBS対照と比較して、ハンチンチンmRNA発現の％阻害として算出し、そして表61に示す。ISIS 436689は、CNSにおいてヒトハンチンチンmRNAレベルの顕著な阻害を生じる。
【０３０９】
【表６１】
2020115894.tif 000067
実施例9:1回ボーラス投与を介したC57/BL6マウスの大脳基底核線条体におけるISIS 387898の半減期の測定   C57/BL6マウスに、大脳基底核線条体組織におけるハンチンチンmRNA発現に対するアン
チセンスオリゴヌクレオチドの半減期および作用期間を測定することを目的として、大脳基底核線条体に対して1回ボーラスとして、ISIS 387898を投与した。
【０３１０】
処置
40匹のC57/BL6マウスを、実施例5において記載される方法と同様の方法において、50μgの1回ボーラスとして送達した、ISIS 387898（5' CTCGACTAAAGCAGGATTTC 3'（SEQ ID NO: 53)；開始部位はSEQ ID NO: 1の4042および開始位置はSEQ ID NO: 3の4001）により処
置した。8匹の対照C57/BL6マウスを、同様の手法でPBSにより処置した。各4匹のマウスのグループを、様々な時点で安楽死させ、そして大脳基底核線条体組織を実施例5に記載さ
れる方法と同様の方法で取り出した。
【０３１１】
RNA解析
RNAを、ハンチンチンmRNAレベルのリアルタイムPCR解析のため、抽出した。大脳基底核線条体組織から、マウス正常ハンチンチンmRNAレベルを、マウスプライマープローブセットRTS2633を使用して測定した。結果を、表62に示し、そしてday 7でのPBS対照グループ
と比較して、％阻害としてあらわした。ISIS 387898の阻害作用は、少なくとも91日延長
されることが観察された。
【０３１２】
【表６２】
2020115894.tif 000068
脳におけるアンチセンスオリゴヌクレオチド濃度の解析：
脳組織を細かく切断し、秤量し、ホモジナイズし、そしてフェノール／クロロホルム液-液抽出法を使用して抽出した。この次に、キャピラリーゲル電気泳動動電学的注射の前
に、フェニル-結合カラム上の上清の固相抽出を行う。P/ACE MDQキャピラリー電気泳動装置（Beckman Coulter, Fullerton, CA）をゲル-充填キャピラリー電気泳動解析のために
使用した。オリゴヌクレオチドピークを、260 nmのUV吸収により検出した。
【０３１３】
脳内でのISIS 387898の濃度（μg/g）を、PBS対照の％として、ヒトハンチンチンの発
現に対してプロットした（表63および図1）。ハンチンチンmRNAの発現の50％阻害を達成するISIS 387898の濃度（EC50）を、算出した。EC50を、0.45μg/gであると決定した。脳組織におけるISIS 387898の時間依存的濃度および対応する％ハンチンチンmRNA発現をプ
ロットし（表64および図2）そしてオリゴヌクレオチドの半減期を、21日と算出した。
【０３１４】
【表６３】
2020115894.tif 000069
【０３１５】
【表６４】
2020115894.tif 000070
実施例10:ICV投与を介してBACHDマウスの側脳室におけるISIS 387898の半減期の測定
BACHDマウスに対して、脳組織におけるハンチンチンmRNA発現に対するアンチセンスオ
リゴヌクレオチドに対する半減期および作用期間を測定することを目的として、ICVによ
り脳の側脳室に対してISIS 387898を投与した。
【０３１６】
処置
28匹のBACHDマウスを、実施例9において記載されるのと同様の手法において、75μg/日でICV投与により2週間にわたり送達した、ISIS 387898により処置した。28匹の対照BACHDマウスを、実施例9において記載されるのと同様の手法において、PBSにより処置した。処置グループおよび対照グループの両方から得たそれぞれ4匹のマウスのグループを、隔週
の時点で安楽死させ、そして前頭皮質組織を、実施例9に記載される方法と同様の方法に
おいて抽出した。
【０３１７】
RNA解析
RNAを、ハンチンチンmRNAレベルのリアルタイムPCR解析のため、カニューレ部位に対して前部および後部両方の右半球から抽出した。ヒト変異型ハンチンチンmRNAレベルを、ヒトプライマープローブセットRTS2617を使用して測定した。マウス正常ハンチンチンmRNA
レベルを、マウスプライマープローブセットRTS2633を使用して測定した。ヒト変異型ハ
ンチンチンmRNA発現レベルを、表65に示し、そしてPBS対照グループにおいて測定された
％阻害の平均と比較した％阻害として表す。マウス正常ハンチンチンmRNA発現レベルを表66に示し、そしてPBS対照グループにおいて測定された％阻害の平均と比較した、％阻害
として表す。ISIS 387898の阻害作用は、91日間にわたり延長されたことが観察された。
【０３１８】
【表６５】
2020115894.tif 000071
【０３１９】
【表６６】
2020115894.tif 000072
脳内におけるアンチセンスオリゴヌクレオチド濃度の解析:
脳組織を、実施例9に記載される方法と同様の方法で処理した。脳の前頭皮質におけるISIS 387898の濃度（μg/g）を、ヒトハンチンチンの阻害に対してPBS対照の％としてプロットし（表67および図3）、そしてEC50を、26.4μg/gと算出した。脳組織における時間-
依存性のISIS 387898濃度もまた、プロットし（表68および図4）、そしてオリゴヌクレオチドのを21日と算出した。
【０３２０】
【表６７】
2020115894.tif 000073
【０３２１】
【表６８】
2020115894.tif 000074
実施例11:ICV投与を介したBACHDマウスの側脳室におけるISIS 388241およびISIS 443139の半減期の測定 
BACHDマウスに、組織におけるハンチンチンmRNA発現に対するアンチセンスオリゴヌク
レオチドの半減期および作用期間を測定することを目的として、脳の側脳室に対してICV
により、ISIS 388241またはISIS 443139を投与した。
【０３２２】
処置
20匹のBACHDマウスを、実施例9に記載される方法と同様の方法において、50μg/日で2
週間にわたり、ICV投与により送達した、ISIS 38241により処置した。20匹のBACHDマウスを、実施例9に記載される方法と同様の方法において、50μg/日で2週間にわたり、ICV投
与により送達した、ISIS 443139により処置した。20匹の対照BACHDマウスを、実施例9に
記載される方法と同様の方法において、PBSにより処置した。処置グループおよび対照グ
ループの両方に由来する各4匹のマウスのグループを、1週間おきの間隔で安楽死させ、そして組織を、実施例9に記載される方法と同様の方法で抽出した。
【０３２３】
RNA解析
RNAを、ハンチンチンmRNAレベルのリアルタイムPCR解析のため、前頭部および後頭部の両方からカニューレ部位まで、右半球から抽出した。ヒト変異型ハンチンチンmRNAレベルを、ヒトプライマープローブセットRTS2617を使用して測定した。結果を表69に示し、そ
してPBS対照群において測定された平均と比較して、％阻害として表す。ISIS 388241およびISIS 443139両方の阻害活性は、少なくとも16週間にわたり延長されたことが観察され
た。
【０３２４】
ISIS 388241、およびその混合バックボーン対応物、ISIS 443139、は両方共、マウスハンチンチンmRNA（SEQ ID NO: 5）とは3つ以上のミスマッチを有し、そしてしたがって、
対照と比較して、マウスmRNAレベルの顕著な阻害を示さなかった。
【０３２５】
【表６９】
2020115894.tif 000075
脳におけるアンチセンスオリゴヌクレオチド濃度の解析：
脳組織を、実施例9に記載された方法と同様の方法で処理した。後頭部脳組織におけるISIS 388241の時間-依存的濃度をプロットし（表70および図5）、そしてオリゴヌクレオチドの半減期を20日と算出した。後頭部脳組織におけるISIS 443139の時間-依存的濃度をプロットし（表71および図6）、そしてオリゴヌクレオチドの半減期を20日と算出した。
【０３２６】
【表７０】
2020115894.tif 000076
【０３２７】
【表７１】
2020115894.tif 000077
実施例12：変異型ヒトハンチンチンのBACHDマウスの運動筋肉能力に対するアンチセン
ス阻害の作用
BACHDマウスを、ハンチンチンmRNA発現に対するオリゴヌクレオチドのその運動筋肉能
力に対する作用をローターロッドアッセイを介して評価することを目的として、脳室内（ICV）投与を介してISISオリゴヌクレオチドにより処置した。
【０３２８】
処置
加速性ローターロッドアッセイを、Ugo Basileローターロッド上で行った。動物を2 RPMのスピートのローターロッド上に配置し、ローターロッドを5分間かけて40 RPMまで加速した。落下するまでの期間を記録した。落下するまでの期間を、動物がローターロッドから落下するか、または動物その走るのをやめ、ローターロッドにぶら下がり、そしてその上で回転するかのいずれかで定義される。6ヶ月齢のBACHDマウスおよびそれらの非-トラ
ンスジェニック同腹子を、処置の前に1週間、ローターロッド上で走るように訓練した。
これは、試行の間に20分間の休憩時間を含む、各5分間の3回連続の試行から構成された。15匹のBACHDマウスのグループを、12μL/日の速度で2週間にわたりAlzet 2002ポンプでICV送達した、50μg/日のISIS 388241で処置した。マウスに対して、実施例6の方法と同様
の方法でポンプを外科的に移植した。14匹のBACHDマウスの対照群を、同様にPBSにより処置した。9匹の非-トランスジェニック同腹子の対照群を、同様にPBSにより処置した。
【０３２９】
ローターロッド運動性能アッセイ
処置期間の最後に、ポンプを取り出し、そして2週間後に、最初の処置後ローターロッ
ドアッセイを行った。ローターロッド行動を、マウスが11ヶ月齢になるまで毎月解析した。各月に、1日あたり3回の試行を2日間行うため、動物をローターロッド上に配置した。
結果を、図7ならびに、落下するまでの期間（秒）として表した表72に示す。6ヶ月齢でのベースライン値を処置の前にとり、そして所定の時点は、アッセイを行ったマウスの週齢である。データは、ISIS 388241によるBACHDマウスの処置は、非処置BACHDマウスにおい
て観察された場合、落下するまでの期間が増加したことを示す。
【０３３０】
【表７２】
2020115894.tif 000078
実施例13：変異型ヒトハンチンチンmRNAおよび野生型マウスハンチンチンmRNAのアンチセンス阻害のBACHDマウスの運動筋肉能力に対する作用
BACHDマウスを、ハンチンチンmRNA発現に対するオリゴヌクレオチドのその運動筋肉能
力に対する作用をローターロッドアッセイを介して評価することを目的として、脳室内（ICV）投与を介してISISオリゴヌクレオチドにより処置した。
【０３３１】
処置
加速性ローターロッドアッセイを、Ugo Basileローターロッド上で行った。動物を2 RPMのスピードのローターロッド上に配置し、ローターロッドを5分間かけて40 RPMまで加速した。落下するまでの期間を記録した。落下するまでの期間を、動物がローターロッドから落下するか、またはその走るのをやめ、ローターロッドにぶら下がり、そしてその上で回転するかのいずれかで定義される。2ヶ月齢のBACHDマウスおよびそれらの非-トランス
ジェニック同腹子を、処置の前に1週間、ローターロッド上で走るように訓練した。これ
は、試行の間に20分間の休憩時間を含む、各5分間の3回連続の試行から構成された。各17〜21匹のBACHDマウスのグループを、0.5μL/時間の速度で2週間にわたりAlzet 2002ポン
プでICV送達された、50μg/日のISIS 388241、75μg/日のISIS 408737、または75μg/日
のISIS 387898で処置した。マウスに対して、実施例6で記載された方法と同様の方法で、ポンプを外科的に移植した。20匹のBACHDマウスの対照群を、同様の方法でPBSにより処置した。非-トランスジェニック対照マウスのグループはまた、ISISオリゴヌクレオチドま
たはPBSにより、同一様式で投与される。
【０３３２】
ローターロッド運動性能アッセイ
処置期間の最後に、ポンプを取り出し、そして2週間後に、-処置ローターロッドアッセイを行った。ローターロッド行動を、マウスが10ヶ月齢になるまで毎月解析した。各月に、1日当たり3〜5回の試行走を3日間行うため、動物をローターロッド上に配置した。結果を、落下前の期間を秒として表した表73に示す。2ヶ月齢でのベースライン値を処置の前
にとり、そして所定の時点はアッセイを行ったマウスの週齢である。ISIS 387898（表に
おいてヒト-マウスASOと表示される）は、マウスハンチンチンmRNAおよびヒトハンチンチンmRNAの両方ともについて、交差反応性であり、そしてしたがって、マウスにおいてヒト変異型ハンチンチンmRNAおよび野生型マウスハンチンチンmRNAの両方共を阻害しうる。ISIS 388241（表においてヒトASOと表示される）は、ヒトハンチンチンmRNAを特異的に標的とし、そしてマウスハンチンチンmRNAとは8塩基対ミスマッチを有する。したがって、ISIS 388241は、ヒト変異型ハンチンチンmRNAのみを特異的に阻害するが、マウスにおける野生型マウスハンチンチンmRNAを特異的には阻害しなかった。ISIS 408737（表においてマ
ウスASOと表示される）は、マウスハンチンチンmRNAを特異的に標的とし、そしてヒトハ
ンチンチンmRNAと7塩基対のミスマッチを有する。したがって、ISIS 408737は、野生型マウスハンチンチンmRNAのみを特異的に阻害するが、マウスにおけるヒト変異型ハンチンチンmRNAは特異的には阻害しなかった。‘Tg’はBACHDマウスを示し、‘非-Tg’は非-トラ
ンスジェニック対照マウスを示す。
【０３３３】
研究の結果は、ISIS 388241（Tg-ヒトASO）によるヒト変異型ハンチンチンmRNAの阻害
は、対照（Tg-PBS）と比較して、ローターロッドアッセイにおいてマウスの運動性能を顕著に向上させたことを示す。結果はまた、変異型ハンチンチンmRNAおよびマウスにおける野生型ハンチンチンmRNAの両方を標的とするISIS 387898（Tg-ヒト-マウスASO）によるマウスの処置は、マウスの運動筋肉能力に対する有害な作用を何ら引き起こさず、そして実際、対照（Tg-PBS）と比較して、ローターロッド運動性能を顕著に向上させたことを示す。ISIS 408737（Tg-マウスASO）により処置されたマウスは、このオリゴヌクレオチドが
変異型ハンチンチンmRNAを標的としないため、PBS対照と比較した場合、予測された通り
、ローターロッド運動性能の向上を示さなかった。非-トランスジェニック対照は、この
アッセイにおいて陽性対照として使用された。
【０３３４】
【表７３】
2020115894.tif 000079
実施例14：ハンチンチンmRNAのアンチセンス阻害のR6/2マウスの脳の大きさに対する作用
R6/2マウスを、ハンチンチンmRNA発現に対するオリゴヌクレオチドの脳重量および脳容量に対する作用を評価することを目的として、脳室内（ICV）投与を介してISISオリゴヌ
クレオチドにより処置した。
【０３３５】
処置
R6/2マウスを、ケージ当たり5匹までのグループで飼育した（混合遺伝子型、単一性別
）。すべてのマウスを、滅菌されたウッドチップの寝床で底部を覆った靴箱型のケージ中で飼育し、動物に乾燥した寝床を提供するために、必要に応じて頻繁に交換した。この基本的な環境は、すべてのマウス用に、遊び用トンネル、寸断された小巣（nestlet）、お
よびプラスチックの骨を追加した；すなわち、マウストンネル（琥珀色、公認、透明、BioServ Product# K3323）、Petite Green Gumabone（BioServ Product # K3214）および小巣（Hockley et al., Ann Neurol. 2002、51: 235-242）、を含有する環境的に向上され
たケージである。食餌および水は、そのケージ中でマウスに対して自由に利用可能とした。
【０３３６】
10匹の6ヶ月齢R6/2マウスのグループに対して、0.12μl/時間の速度で4週間Alzet 1004ポンプでICV送達した、50μg/日のISIS 388817を投与した。2匹の非-トランスジェニック同腹子のグループには、同様にして送達し50μg/日のISIS 388817を送達した。5匹のR6/2マウスの対照群には同様の方法で送達された50μg/日のISIS 141923を投与した。9匹のR6/2マウスの対照群は、同様の方法において送達されたPBSにより、投与した。8匹の非-ト
ランスジェニック同腹子のグループに、同様の方法で送達されたPBSを投与した。4匹の非処置8週齢の発症前のR6/2のグループもまた、研究に含まれた。
【０３３７】
脳重量測定
動物をイソフルレンで麻酔し、そしてその後経心臓氷-冷ソレンセソンのリン酸緩衝液
（SPB）の対照となり、そしてSPB中の4％により固定化した。
。脳を取り出し、そして前脳に対してすぐ吻側（嗅球を除去する）および小脳（脊髄）に対してすぐ尾側を冠状切断して、トリミングした。残りの脳を、mgで秤量した。結果は、図8中および表74に提示され、そしてISIS 388817によるR6/2マウス処理においてPBS対照
と比較して、脳重量を増加させる。
【０３３８】
【表７４】
2020115894.tif 000080
実施例15:ハンチンチンmRNAのアンチセンス阻害のYAC128マウスの不安動作に対する作
用
YAC128マウスを、オープンフィールドアッセイおよび高架式十字迷路アッセイにおいてそれらの性能により測定するように、ハンチンチンmRNA発現に対するオリゴヌクレオチドのこれらのマウスにおける不安に対する作用を評価することを目的として、脳室内（ICV
）投与を介してISISオリゴヌクレオチドにより処置した。
【０３３９】
処置
7匹の5ヶ月齢YAC128マウスのグループを、0.5μl/hrの速度で14日にわたり、Alzet 1004ポンプでICV送達された50μg/日のISIS 388241で処置した。4匹のYAC128マウスの対照群を、同様にPBSにより処置した。8匹の非-トランスジェニックFVB/NJ同腹子の対照群を研
究に含ませたが、何の処置も与えなかった。マウスに対して以下のようにしてポンプを外科的に移植した：簡単に述べると、Alzet浸透圧ポンプ（Model 2002）を、製造者の指示
書に従って組み立てた。ポンプをアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有する溶液で充填し、そして移植の24時間前に、37℃にて一晩、インキュベートした。動物を3％イソフル
レンにより麻酔し、そして定位固定フレーム中に配置した。外科手術部位を消毒した後、頭蓋骨上で正中切開を行い、背部に皮下ポケットを作り、そこに事前に充填した浸透圧ポンプを移植した。小型のキリ穴を、右側脳室上に頭蓋骨を通して開けた。プラスチックカテーテルを介して浸透圧ポンプに対して接続したカニューレを、脳室内に配置し、そしてLoctite接着剤を使用して適した位置に接着した。切開を縫合により閉じた。アンチセン
スオリゴヌクレオチドまたはPBSを7または14日間注入し、その後、ポンプを取り出した。動物をさらに2週間かけて回復させ、その後行動解析を行い、そしてマウスを最終的にはInstitutional Animal Care and Use Committeeにより承認された人道的なプロトコルに従って安楽死させた。脳および脊髄の組織を回収し、液体窒素中で瞬間的に凍結した。凍結する前に、脳組織をマウス脳マトリクスを使用して5つの部分（S1、S2、S3、S4、およびS5）に横方向に切断した。部分1〜5は、約互いに2 mmずつ離れており、S1が最も前部であ
り、そしてS5が最も後部であった。
【０３４０】
オープンフィールドアッセイ
マウスを、光ビーム中断を使用して30分間のテストセッションの間水平的移動および垂直的移動を測定する、オープンフィールドアリーナ（Med Associates）中に配置した。データを活性モニターソフトウェアを使用して解析し、アリーナ中での全回廊移動、そして不安の測定値としてのアリーナの中央部での移動を測定した。YAC128対照マウスは、それらの非-トランスジェニックの、不安-傾向のより少ないFVB/NJ同腹子と比較して、アリーナ中央部で過ごす時間がより少ないものと予想された。結果を、図9および表75に示し、
そしてYAC128マウスのアンチセンスオリゴヌクレオチドでの処置により、オープンフィー
ルドアッセイのパラメータに従って、これらのマウスにおいて不安が低下したことが示される。
【０３４１】
【表７５】
2020115894.tif 000081
高架式十字迷路アッセイ
装置は、2つの開放されたアーム部および2つの閉じられたアーム部からなり、65×6.25
cmを測定し、そして底部から50 cm上を評価した。マウスを装置の中央部に配置し、そしてそれらの位置を5分間のテストセッションにわたり記録した。YAC128対照マウスは、そ
れらの非-トランスジェニックの、不安-傾向のより少ないFVB/NJ同腹子と比較して、装置の開放されたアーム部にて過ごす時間がより短いことが予想された。結果を、図10および表76に示し、そしてそしてYAC128マウスのアンチセンスオリゴヌクレオチドでの処置により、高架式十字迷路アッセイのパラメータに従って、これらのマウスにおいて不安が低下したことが示される。
【０３４２】
【表７６】
2020115894.tif 000082
RNA解析およびタンパク質解析
全RNAを、ハンチンチンmRNAレベルのリアルタイムPCR解析のため、RNeasy Mini prep kit（Qiagen）を使用して、RNeasy Protect Mini Kit（Qiagen, Mississauga, ON, Canada）によりマウス脳および脊髄から抽出した。Q-PCR反応を、ABI Prism 7700配列検出器（Applied Biosystems）上で行いそして解析した。ヒトハンチンチンmRNAレベルを、ヒトプ
ライマープローブセットRTS2686を使用して測定し、そしてペプチジルプロリルイソメラ
ーゼA mRNAレベルに対して正規化した。
【０３４３】
タンパク質溶解物を、以前に記載されたように（Li S.H. and Li X.J.、Methods in Molecular Biology（2008）、217:1940-6029）、マウス脳スラブから調製した。溶解物を3
〜8％のtris-酢酸ゲル上で泳動し、そしてiBlotドライブロッティングシステム（Invitrogen）を使用して転写した。ブロットを、抗-βチューブリン（Chemicon）およびヒトハンチンチンタンパク質に対して特異的に反応するモノクローナルEM48抗体（Millipore）を
用いてプローブ化した。イムノブロットを、Odyssey V3.0 softwareを使用して定量化し
た。
【０３４４】
結果をPBS対照と比較した％減少として表77に示し、そしてアンチセンスオリゴヌクレ
オチドにより、ハンチンチンmRNAおよびタンパク質レベルの顕著な阻害を示す。
【０３４５】
【表７７】
2020115894.tif 000083
実施例16:C57/BL6マウスにおけるハンチンチンに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの脳室内投与 
C57/BL6マウスを、これらのマウスにおけるオリゴヌクレオチドの耐容性を評価するこ
とを目的として、右側脳室に対して脳室内（ICV）投与することを介してISISオリゴヌク
レオチドにより処置した。
【０３４６】
処置および手術
各5匹のC57/BL6マウスのグループに対して、0.5μL/日の速度で2週間にわたり、Alzet 2002ポンプでICV送達された150μg/日のISIS 387916、ISIS 437527、ISIS 444578、ISIS 444584、ISIS 444607、ISIS 444608、ISIS 444627、ISIS 444652、ISIS 444659、ISIS 444660、またはISIS 444661を投与した。6匹のC57/BL6マウスの対照群を、PBSにより同様に処置した。ポンプを移植しおよびオリゴヌクレオチド投与するための手順は、実施例6に
記載される通りである。
【０３４７】
動物をさらに2週間かけて回復させ、その後イソフルレンを使用して安楽死させた。脳
および脊髄の組織を回収し、液体窒素中で瞬間的に凍結した。凍結する前に、脳組織をマウス脳マトリクスを使用して5つの部分（S1、S2、S3、S4、およびS5）に横方向に切断し
た。部分1〜5は、約互いに2 mmずつ離れており、S1が最も前部であり、そしてS5が最も後部であった。
【０３４８】
RNA解析
全RNAを、脳のハンチンチンmRNAレベルのリアルタイムPCR解析のため、RNeasy Mini prep kit（Qiagen）を使用して、前頭皮質および後頭皮質から抽出した。RT-PCR反応を、ABI Prism 7700配列検出器（Applied Biosystems）上で行った。マウスハンチンチンmRNAレベルを、マウスプライマープローブセットRTS2633を使用して測定し、そしてシクロフィ
リンmRNAレベルに対して正規化した。結果をPBS対照と比較した％減少として表78に示し
た。ISIS 387916、ISIS 437527、ISIS 444627、およびISIS 444652はすべて、マウスハンチンチンmRNA（SEQ ID NO: 3）とのあいだで1つのミスマッチを有し、そしてしたがって
、対照と比較して、マウスmRNAレベルの顕著な阻害を示さなかった。
【０３４９】
ミクログリアマーカーAIF1もまた、マウスプライマープローブセットmAIF1_LTS00328（フォワード配列TGGTCCCCCAGCCAAGA、本明細書中にてSEQ ID NO: 54と示される；リバース配列CCCACCGTGTGACATCCA、本明細書中にてSEQ ID NO: 55と示される；プローブ配列AGCTATCTCCGAGCTGCCCTGATTGG、本明細書中にてSEQ ID NO: 56と示される）を使用して、RT-PCR解析により測定された。結果を表79に示し、そして試験されたISISオリゴヌクレオチドが炎症性応答を誘導しなかったことを示す。
【０３５０】
【表７８】
2020115894.tif 000084
【０３５１】
【表７９】
2020115894.tif 000085
体重測定
体重を、研究期間のあいだにわたり定期的な間隔で測定し、そして表80に示す。これらの体重は、耐容性の指標として使用された。ISIS 437527、ISIS 444584、およびISIS 444652により処置されたマウスは、研究期間のあいだにわたり一貫した体重を有し、そして
本研究において含まれるISISオリゴヌクレオチドのすべての中で最も耐容性であるとみなされた。‘n/a’は、そのマウスグループについてはデータがないことを示す。
【０３５２】
【表８０】
2020115894.tif 000086
実施例17:ラットの大脳基底核線条体組織における、アンチセンスオリゴヌクレオチド
のボーラス投与の神経毒性作用についてのアッセイ.
Sprague-Dawleyラットを、CNS毒性の測定としてミクログリアマーカーAIF1の誘導につ
いてスクリーニングすることを目的として、大脳基底核線条体へのボーラス投与を介してISISオリゴヌクレオチドにより処置した。
【０３５３】
処置および手術
4匹のSprague-Dawleyラットのグループに対して、1回ボーラスとして送達された25μg
、50μg、75μg、または100μgの濃度のISIS 388241、ISIS 443139、ISIS 436671、ISIS 437527、ISIS 444584、ISIS 444591、またはISIS 444652を投与した。
【０３５４】
4匹のラットのグループを、1回ボーラスとして送達された10μg、25μg、50μg、また
は75μgの濃度のISIS 387916により、同様に処置した。4匹のラットの対照群を、PBSにより同様に処置した。ボーラス投与の7日後、ラットをイソフルレンを使用して安楽死させ
、そして器官を取り出した。動物を頚椎脱臼させ、大脳基底核線条体組織の詳細な調査のために脳を取り出した。精密に湾曲したピンセット一対を、海馬の直前の脳中にまっすぐ下に配置し、皮質に横断方向の切り込みを作り、そしてその下の組織を鈍性切開した。精密に湾曲させたピンセットもう一対の先端を、海馬と嗅球とのあいだの中程の正中洞に沿ってまっすぐ下に配置し、縦方向の切り込みを作り、脳梁を鈍性切開により切断した。その後、最初の一対のピンセットを使用して、生じた皮質の一隅を反転させて、大脳基底核線条体および内包を暴露し、ついで内包を切断して大脳基底核線条体から取り去った。2
つめの一対のピンセットを湾曲した末端が大脳基底核線条体のいずれかの側面に接触するように配置し、それを押し下げて組織を単離した。最初の一対のピンセットを使用して、大脳基底核線条体の後部末端をつまみ、脳から大脳基底核線条体を取り出した。
【０３５５】
AIF1発現レベルのRNA解析
RNAを、AIF1 mRNAレベルのリアルタイムPCR解析のために、大脳基底核線条体組織から
抽出した。ラットAIF1レベルを、ラットプライマープローブセットrAif1_LTS00219を使用して測定した。結果を、PBS対照のAIF1発現と比較して、AIF1発現％として算出し、そし
て表81に示す。結果は、ISIS 388241、ISIS 443139、ISIS 436671、ISIS 444591、ISIS 437527、ISIS 444584、およびISIS 444652は、ラット脳において十分に耐容であったこと
を示す。
【０３５６】
【表８１】
2020115894.tif 000087
ハンチンチン発現レベルのRNA解析
RNAを、ハンチンチンmRNAレベルのリアルタイムPCR解析のため、大脳基底核線条体組織
から抽出した。ラットハンチンチンmRNAレベルを、ラットプライマープローブセットrHtt_LTS00343を使用して測定した。結果を、PBS対照のハンチンチン発現と比較したハンチンチン発現の減少％として算出し、そして表82に示す。ISIS 388241およびISIS 443139は、ラット遺伝子配列（SEQ ID NO: 5）とそれぞれ6塩基対またはそれ以上のミスマッチを有
し、そしてしたがって、対照と比較して、ラットmRNAレベルの顕著な阻害を示さない。ISIS 444584は、ラット遺伝子配列（SEQ ID NO: 5）と3つのミスマッチを有し、そしてしたがって、対照と比較して、ラットmRNAレベルの顕著な阻害を示さない。
【０３５７】
【表８２】
2020115894.tif 000088
実施例18:カニクイザル初代肝細胞における、ハンチンチンmRNAの用量-依存性アンチセンス阻害
ISIS 437527、ISIS 444584、およびISIS 444652を、様々な濃度で、カニクイザル初代
肝細胞において試験した。ベンチマークオリゴヌクレオチド、ISIS 387916およびISIS 388241もまた、比較のために含ませた。細胞を、ウェル当たり35,000細胞の密度でまき、そして39.0625 nM、78.125 nM、156.25 nM、312.5 nM、625 nM、1,250 nM、2,500 nM、5,000 nM、10,000 nM、および20,000 nMの濃度のそれぞれのアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて、エレクトロポレーションを使用してトランスフェクトした。約16時間後、RNA
を細胞から単離し、そしてハンチンチンmRNA転写物レベルを、プライマープローブセットRTS2686を使用した定量的リアルタイムPCRにより測定した。ハンチンチンmRNA転写物レベルを、RIBOGREEN（登録商標）により測定されるように、全RNA含量に対して正規化した。結果を、非処置対照細胞と比較して、ハンチンチンの％阻害として、表83において示す。対照オリゴヌクレオチド、ISIS 141923を、このアッセイに含ませ、そして予想されたよ
うに、ハンチンチンmRNAの阻害を示さなかった。
【０３５８】
ISIS 437527、ISIS 444584、およびISIS 444652は、ベンチマークオリゴヌクレオチド
、ISIS 388241と比較して、より低いIC50値を有した。ISIS 437527およびISIS 444652は
、ベンチマークオリゴヌクレオチド、ISIS 387916と比較して、同じくらい低いIC50値ま
たはより低いIC50値を有した。
【０３５９】
【表８３】
2020115894.tif 000089
実施例19：線条体内1回ボーラス投与を介した、BACHDマウスにおけるISISオリゴヌクレオチドの半減期の測定 
BACHDマウスに対して、大脳基底核線条体におけるハンチンチンmRNA発現に対するアン
チセンスオリゴヌクレオチドの作用期間、またはその半減期を測定することを目的として、大脳基底核線条体に対する1回ボーラスとして、ISISオリゴヌクレオチドを投与した。
【０３６０】
処置および手術
各25匹のBACDマウスのグループを、実施例4に記載された手順と同様の手順で、40μgの1回ボーラスとして送達される、ISIS 388241、ISIS 436689、ISIS 436671、またはISIS 444591で処置した。25匹のBACHDマウスの対照群を、同様の手順でPBSにより処置した。様
々な時点において、各グループ由来の5匹のマウスを安楽死させ、そして大脳基底核線条
体組織を取り出した。精密に湾曲したピンセット一対を、海馬の直前の脳中にまっすぐ下に配置し、皮質に横断方向の切り込みを作り、そしてその下の組織を鈍性切開した。精密に湾曲させたピンセットもう一対の先端を、海馬と嗅球とのあいだの中程の正中洞に沿ってまっすぐ下に配置し、縦方向の切り込みを作り、脳梁を鈍性切開により切断した。その後、最初の一対のピンセットを使用して、生じた皮質の一隅を反転させて、大脳基底核線条体および内包を暴露し、ついで内包を切断して大脳基底核線条体から取り去った。2つ
めの一対のピンセットを湾曲した末端が大脳基底核線条体のいずれかの側面に接触するように配置し、それを押し下げて組織を単離した。最初の一対のピンセットを使用して、大脳基底核線条体の後部末端をつまみ、脳から大脳基底核線条体を取り出した。
【０３６１】
RNA解析
RNAを、組織ハンチンチンmRNAレベルのリアルタイムPCR解析のため、大脳基底核線条体前部および後部から抽出した。ヒト変異型ハンチンチンmRNAレベルを、RTS2617を使用し
て測定した。マウス正常ハンチンチンmRNAレベルを、マウスプライマープローブセットRTS2633を使用して測定した。結果を表84および表85に示し、そしてweek 1、week 10、およびweek 20にて、PBS対照群の平均と比較した％阻害として表す。脳の前頭部におけるISISオリゴヌクレオチドの半減期を阻害データから算出し、そして表86に示す。
【０３６２】
【表８４】
2020115894.tif 000090
【０３６３】
【表８５】
2020115894.tif 000091
【０３６４】
【表８６】
2020115894.tif 000092
体重測定
体重を通常の間隔で測定し、そして研究の開始時のマウスの体重の％として表87に示す。これらの体重を、耐容性の指標として使用した。ISISオリゴヌクレオチドで処置したマウスのいずれにおいても、体重の不都合な変化は存在しなかった。
【０３６５】
【表８７】
2020115894.tif 000093
実施例20:Sprague DawleyラットにおけるISIS 437527のくも膜下腔投与の作用
Sprague Dawleyラットに対して、単回投与、繰り返し投与、または持続的注入のいずれかとして、くも膜下腔（IT）投与によりISIS 437527を投与した。
【０３６６】
処置および手術
ラットをイソフルレンを使用して安楽死させ、そして28-ゲージのポリウレタンカテー
テルを各ラットのIT腰部スペース中に配置した。カテーテルの基部末端を、投与軸受台に接着させ、それを皮膚を介してボーラス注射を与えたグループの動物に対して進展させた。持続的注入を受けるグループの動物のためのカテーテルを、ALZETポンプ（Model 2ML1
）に対して接続し、それを各動物の背部側の皮下ポケットに配置した。手術後に、動物は、セフチオフルナトリウム（5 mg/kg）および酒石酸ブトルファノール（0.05 mg/kg）の
単回筋肉内投与を受けた。持続的注入を受けるラットは、オリゴヌクレオチド投与をすぐに受け始めた。ボーラス注射を受ける動物には、少なくとも5日の手術回復期間を与え、
その後カテーテルの開存性を評価した。
【０３６７】
5匹のSprague Dawleyラットのグループに対して、くも膜下腔に送達される、350μgのISIS 437527の1回ボーラス注射を投与した。5匹のSprague Dawleyラットの別のグループに対して、1週間の経過のあいだに3回くも膜下腔に送達される、120μgのISIS 437527のボ
ーラス注射を投与した。5匹のSprague Dawleyラットの別のグループに対して、1週間の経過のあいだに3回くも膜下腔に送達される、350μgのISIS 437527のボーラス注射を投与した。5匹のSprague Dawleyラットの別のグループに対して、0.01 mL/時の速度で7日間持続的注入することにより送達される、50μg/日のISIS 437527を投与した。5匹のSprague Dawleyラットの対照群に対して、1週間の経過のあいだに3回くも膜下腔に送達される、PBS
のボーラス注射を投与した。各グループには、7日の回復期間を与え、その後ラットを安
楽死させた。脳および脊髄をすべてのグループから採取し、そして解析した。
【０３６８】
ハンチンチン発現レベルのRNA解析
RNAを、ハンチンチンmRNAレベルのリアルタイムPCR解析のため、前頭皮質、側頭皮質、および頸髄から抽出した。ラットハンチンチンmRNAレベルを、シクロフィリンレベルに対して正規化して、プライマープローブセットrHtt_LTS00343を使用して測定した。結果を
表88に示し、そしてPBS対照群の平均と比較した％阻害として表す。
【０３６９】
【表８８】
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AIF1発現レベルのRNA解析
RNAを、AIF1 mRNAレベルのリアルタイムPCR解析のため、前頭皮質、側頭皮質、および
頸髄から抽出した。ラットAIF1レベルを、ラットプライマープローブセットrAif1_LTS00219を使用して測定した。結果を、PBS対照のAIF1発現と比較してAIF1発現の％として算出
し、そして表89に示す。結果は、繰り返しITボーラス投与により、頸髄組織にて炎症を引き起こすことを示す。持続的IT投与および単回ITボーラス投与は、ラットにおいて良好な耐容性を示した。
【０３７０】
【表８９】
2020115894.tif 000095
実施例21:くも膜下腔投与を介したカニクイザルのCNS組織における、ISIS 436689の半
減期の測定
カニクイザルに対して、様々なCNS組織におけるハンチンチンmRNA発現に対するアンチ
センスオリゴヌクレオチドの半減期およひ作用期間を測定することを目的として、ISIS 436689をくも膜下腔（IT）に投与した。
【０３７１】
処置
研究を、Northern Biomedical Research, MIにて行った。処置の開始前に、サルを4週
間のあいだ隔離して飼育し、その間に血清化学および血液学の標準的なパネル、卵および寄生虫に関する糞便サンプルの調査、および結核試験を行なって、異常なサルまたは病気のサルをスクリーニング抽出した。サルに対して、皮下チタンアクセスポート（P.A.S. PORT（登録商標）Elite Plastic/Titanium portal with Ultra lock connector）に接続したポリウレタンカテーテルを使用して、くも膜下腔腰部カテーテルにより移植した。外部ポンプを使用した持続的注入のため、動物を麻酔して、投与装置をポートに接続した。動物を、0.04 mg/kgの投与量の硫酸アトロピンで、皮下注射により事前処置した。およそ15分後、8 mg/kgのケタミンHClの筋肉内投与を行い、鎮静を誘導した。動物を、麻酔の手術面に対してマスクし、挿管し、そして約1 L/分の酸素および2％のハロセンまたはイソフ
ルレンで維持した。動物に5 mg/kgのセフチオフルナトリウム抗生物質の単回筋肉内投与
を与えた。改変ニードルサポートの配置のため、ポートのそばに切開を行った。改変ニードルを、ポートに配置し、そして縫合して固定した。手術からの回復の際、ジャケットを動物に装着した。
【０３７２】
15頭のオスのカニクイザルに対して、1.67 mg/mLの濃度で2.4 mL/日の流速で、21日間
、4 mg/日のISIS 436689を投与した。3頭のカニクイザルの対照群に対して、同様の方法
で同一の期間、PBSを投与した。3頭のサルのグループにはそれぞれ、1日、2週間、4週間
、または8週間の回復期間を与え、その後安楽死させた。研究期間のあいだ、病気または
苦痛の兆候に関して、サルを毎日観察した。
【０３７３】
すべての動物を8.0 mg/kgのケタミンHClの筋肉内注射により鎮静し、ハロセンまたはイソフルレン／酸素混合物で維持し、そして200 IU/kgのヘパリンNaの静脈内ボーラスを与
えた。動物に対して、食塩水中0.001％亜硝酸ナトリウムにより、左心室を介して潅流し
た。
【０３７４】
犠死させる時点で、脳を、脳マトリクス中で3 mm厚の冠状スライスで切断した。いくつかの脳構造を4 mmバイオプシーパンチを使用してサンプリングした。各構造から1つの4 mm直径のサンプルを1.0 mLのRNAlater RNA安定化溶液（Qiagen, CA）を含有する2 mLのス
クリューキャップチューブ中に配置し、周囲温度にて1時間インキュベートし、その後凍
結した。隣接する6 mm直径のサンプルを、2 mLのスクリューキャップチューブ中に配置し、そして薬物動態解析用に凍結した。
【０３７５】
脊髄を頸部、胸部、そして腰部に分割し、そして脊髄の各領域の約3 mm厚の切片を、RNA解析および薬物動態解析用に採取した。これらのサンプルを、脳サンプルの場合と同様
の方法で処理した。
【０３７６】
肝臓のサンプルを、RNA解析および薬物動態解析用に採取した。これらのサンプルを、
上述した脳および脊髄の場合と同様の方法で処理した。
RNA解析
RNAを、ハンチンチンmRNAレベルのリアルタイムPCR解析のため、プライマープローブセットRTS2617を用いて、腰髄、胸髄、頸髄、前頭皮質、後頭皮質、小脳皮質、尾状組織、
海馬、中脳、および脳橋から抽出した。脊髄の様々な部分で測定された結果を、表90に示し、そして8週にPBS対照群において測定された結果と比較した％阻害として示す。脳の様々な部分で測定された結果を、表91に示し、そして8週にPBS対照群において測定された結果と比較した％阻害として示す。
【０３７７】
【表９０】
2020115894.tif 000096
【０３７８】
【表９１】
2020115894.tif 000097
ELISAによるオリゴヌクレオチド濃度測定
組織（20 mg）を細かく切断し、秤量し、そしてホモジナイズして、フェノール／クロ
ロホルムを使用して液体／液体抽出を行った。上清を取り出し、凍結乾燥し、そしてヒトEDTA血漿（1 mL）中で戻し、その後ハイブリダイゼーションELISA法を使用して解析した
。
【０３７９】
ISIS 436689を、標識された相補的な切断用プローブ（5'末端にジゴキシゲニン、そし
て3'末端にC18スペーサーとBioTEG）に対してハイブリダイゼーションすることにより、
組織中で検出した。ついで、複合体をニュートラアビジンでコートしたプレート上で捕捉し、そしてS1ヌクレアーゼを添加して、ハイブリダイズしなかった切断用プローブを消化した。ISIS 436689は切断用プローブを消化することから防御するため、消化されない切
断用プローブを、オリゴヌクレオチド濃度の測定として使用した。消化されない切断用プローブを、アルカリホスファターゼを結合した抗-ジゴキシゲニン抗体を使用し、その後
蛍光性基質読み取りを使用して検出した。オリゴヌクレオチド濃度を、回復期間のday 7
、day 20、day 34、そしてday 62において、脊髄の頸部、胸部、そして腰部において測定し、そして肝臓において測定し、そして表92に示す。これらの組織中のISIS 436689の半
減期を、このデータから算出し、そして表93に示す。データは、オリゴヌクレオチドが、全身性組織では無視できる程度の濃度だが、CNSでは主として濃縮されることを示してい
る。
【０３８０】
【表９２】
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【０３８１】
【表９３】
2020115894.tif 000099
【図１】
2020115894.tif 000101
【図２】
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【図３】
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【図４】
2020115894.tif 000104
【図５】
2020115894.tif 000105
【図６】
2020115894.tif 000106
【図７】
2020115894.tif 000107
【図８】
2020115894.tif 000108
【図９】
2020115894.tif 000109
【図１０】
2020115894.tif 000110
【配列表】
2020115894000001.app
【外国語明細書】
2020115894000001.pdf