(57)【要約】      （修正有）【課題】中枢神経系（ＣＮＳ）における酵素欠損症に罹患した対象を治療するための融合抗体、及び融合抗体を含む医薬組成物の提供。【解決手段】本明細書の二機能性の融合抗体は、内因性血液脳関門（ＢＢＢ）受容体に対する抗体、および、ムコ多糖症ＩＩＩ型（ＭＰＳ−ＩＩＩ）で欠損している酵素を含む。本明細書の融合抗体は、Ｎ−スルフォグルコサミンスルフォヒドロラーゼ（ＳＧＳＨ）、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（ＮＡＧＬＵ）、ヘパリン−α−グルコサミニドＮ−アセチルトランスフェラーゼ（ＨＧＳＮＡＴ）、またはＮ−アセチルグルコサミン−６−スルファターゼ（ＧＮＳ）を含む。ＣＮＳにおける酵素欠損症の治療方法は、本明細書の融合抗体の全身投与を含む。【選択図】図１２
2020171284.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）免疫グロブリン重鎖のアミノ酸配列および（ｂ）免疫グロブリン重鎖のアミノ酸配列にＮ−スルフォグルコサミンスルフォヒドロラーゼ（ＳＧＳＨ）のアミノ末端で共有結合されたＳＧＳＨのアミノ酸配列を含む融合タンパク質を含む、融合抗体であって、ＳＧＳＨが、単体としてのその活性に比べその活性の少なくとも２０％を維持し、ここで融合抗体が免疫グロブリン軽鎖をさらに含み、かつ該融合抗体が内因性ＢＢＢ受容体に対する抗体とＳＧＳＨとの融合抗体であり、該内因性ＢＢＢ受容体に対する抗体が、抗インスリン受容体抗体、抗トランスフェリン受容体抗体、抗レプチン受容体抗体、抗リポタンパク質受容体抗体、および抗ＩＧＦ受容体抗体からなる群から選択されるものである、融合抗体。
【請求項２】
ヘパラン硫酸からの硫酸基の加水分解を触媒する、請求項１に記載の融合抗体。
【請求項３】
スルファターゼ修飾因子タイプ１（ＳＵＭＦ１）により翻訳後修飾されている、請求項１に記載の融合抗体。
【請求項４】
翻訳後修飾がシステインからホルミルグリシンへの変換を含む、請求項３に記載の融合抗体。
【請求項５】
ホルミルグリシンを含む、請求項１に記載の融合抗体。
【請求項６】
該融合タンパク質がさらに、ＳＧＳＨのアミノ酸配列と、免疫グロブリン重鎖のアミノ酸配列のカルボキシ末端との間にリンカーを含む、請求項１に記載の融合抗体。
【請求項７】
該融合抗体のＳＧＳＨ比活性が少なくとも１０００ユニット／ｍｇである、請求項１に記載の融合抗体。
【請求項８】
ＳＧＳＨおよび免疫グロブリンがそれぞれ、単体としてのその活性に比べ、その活性の少なくとも２０％を保持している、請求項１に記載の融合抗体。
【請求項９】
免疫グロブリン重鎖がＩｇＧの免疫グロブリン重鎖である、請求項１に記載の融合抗体。
【請求項１０】
免疫グロブリン重鎖がＩｇＧ１クラスの免疫グロブリン重鎖である、請求項１に記載の融合抗体。
【請求項１１】
免疫グロブリン重鎖が、配列番号１に示されるＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号２に示されるＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号３に示されるＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、請求項１に記載の融合抗体。
【請求項１２】
免疫グロブリン軽鎖がκまたはλクラスの免疫グロブリン軽鎖である、請求項１に記載の融合抗体。
【請求項１３】
治療的有効量の、請求項１に記載の融合抗体、および医薬的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項１４】
請求項１に記載の融合抗体をコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１５】
配列番号１４の核酸配列を含む、請求項１４に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１６】
請求項１４に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項１７】
配列番号１４の核酸配列を含む、請求項１６に記載のベクター。
【請求項１８】
請求項１６に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１９】
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、請求項１８に記載の宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１３年７月２２日に出願された米国仮特許出願第６１／８５７，１４０号の利益を主張するものであり、この仮出願の内容全体は参照により本明細書に引用される。
【０００２】
配列表
本出願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩフォーマットで提出した配列表を含み、この配列表全体は参照により本明細書に引用される。該ＡＳＣＩＩの写しは２０１４年５月１４日に作成され、名称が２８５７０＿７１３＿６０１＿ＳＬ．ｔｘｔであり、サイズが８４キロバイトである。
【背景技術】
【０００３】
ムコ多糖症（ＭＰＳ）ＩＩＩ型は、ＭＰＳ−ＩＩＩ、またはサンフィリッポ症候群とも称され、主に中枢神経系（ＣＮＳ）に影響を及ぼす遺伝性代謝疾患である。ＭＰＳ  ＩＩＩは、グリコサミノグリカンと称される長鎖糖分子を分解するために必要な酵素の欠損が原因で起こる。ＭＰＳ−ＩＩＩには大きく４種類ある。Ａ型（ＭＰＳ−ＩＩＩＡ）は、リソソーム酵素であるＮ−スルフォグルコサミンスルフォヒドロラーゼ（ＳＧＳＨ）の欠損が原因で起こり、該酵素は、スルファミダーゼまたはＮ−ヘパランスルファターゼとも称され、ヘパラン硫酸グリコサミノグリカン（ＧＡＧｓ）を分解する働きをする。ＳＧＳＨは、ヘパラン硫酸の非還元末端グルコサミニド残基からのＮ−結合硫酸基の加水分解を起こす。Ｂ型（ＭＰＳ−ＩＩＩＢ）は、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（ＮＡＧＬＵ）の欠損が原因で起こる。Ｃ型（ＭＰＳ−ＩＩＩＣ）は、ヘパリン−α−グルコサミニドＮ−アセチルトランスフェラーゼ（ＨＧＳＮＡＴ）の欠損が原因で起こる。Ｄ型（ＭＰＳ−ＩＩＩＤ）は、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−スルファターゼ（ＧＮＳ）の欠損が原因で起こる。これらの酵素レベルの不足は、例えば末梢組織およびＣＮＳにおいて、グリコサミノグリカンの病的な蓄積をもたらす。しかし、ＭＰＳ−ＩＩＩの臨床的特徴はほぼ例外なく神経学的である。症状は、若年期に始まり、痴呆に進行する行動障害、および発達退行、次いで１０代または２０代での死亡が含まれる。一般的に、ＭＰＳ−ＩＩＩのようなリソソーム貯蔵障害の治療には、欠損している組み換え酵素を用いた静脈内酵素補充療法が挙げられる。しかし、全身投与された組み換え酵素は血液脳関門（ＢＢＢ）を通過しないため、ＣＮＳにおける疾患の効果にほとんど影響を及ぼさない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本明細書は、スルファミダーゼ、すなわちＮ−スルフォグルコサミンスルフォヒドロラーゼ（「ＳＧＳＨ」）欠損症に罹患した対象を治療するための方法および組成物について記載する。いくつかの態様において、本明細書に記載の方法は、治療的有効量の、二機能性の融合抗体またはタンパク質を全身投与することにより、ＳＧＳＨをＣＮＳへ送達することを特徴とする。いくつかの態様において、二機能性の融合抗体は、内因性血液脳関門（ＢＢＢ）受容体に対する抗体およびＳＧＳＨのアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、二機能性の融合抗体は、遺伝的にＳＧＳＨと融合したヒトインスリン抗体（ＨＩＲ  Ａｂ）（「ＨＩＲ  Ａｂ−ＳＧＳＨ融合抗体」）である。いくつかの態様において、ＨＩＲ  Ａｂ−ＳＧＳＨ融合抗体は、ＳＧＳＨ酵素活性を保持しながらも、インスリン受容体の細胞外ドメインに結合し、血液脳関門（「ＢＢＢ」）を超えてＣＮＳ内へ輸送される。いくつかの態様において、ＨＩＲ  Ａｂは、ＢＢＢ上の内因性インスリン受容体に結合し、ＳＧＳＨを脳内に輸送する分子的トロイの木馬として働く。いくつかの態様において、全身投与に用いられるＨＩＲ  Ａｂ−ＳＧＳＨ融合抗体の治療的に有効な全身用量は、一部、本明細書に記載されるように、末梢血からの融合抗体の特異的なＣＮＳ取り込み特性に基づいている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
ある態様において、本明細書は、治療が必要な対象の中枢神経系におけるＳＧＳＨ欠損症の治療方法であり、治療的有効用量の、ＳＧＳＨ活性を有する融合抗体を該対象に全身投与することを特徴とする方法を提供する。いくつかの態様において、融合抗体は、免疫グロブリン重鎖のアミノ酸配列、ＳＧＳＨのアミノ酸配列、および免疫グロブリン軽鎖のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、融合抗体は、内因性ＢＢＢ受容体（例えば、ヒトインスリン受容体）の細胞外ドメインに結合し、ヘパラン硫酸の非還元末端グルコサミニド残基からのＮ−結合硫酸基の加水分解を触媒する。いくつかの態様において、ＳＧＳＨのアミノ酸配列は、免疫グロブリン重鎖のアミノ酸配列のカルボキシ末端と共有結合している。
【０００６】
いくつかの態様において、融合抗体は、スルファターゼ修飾因子タイプ１（ＳＵＭＦ１）により翻訳後修飾されている。いくつかの態様において、翻訳後修飾は、システインからホルミルグリシンへの変換を含む。いくつかの態様において、融合抗体はホルミルグリシンを含む。
【０００７】
いくつかの態様において、ＳＧＳＨは、単体（ｓｅｐａｒａｔｅ  ｅｎｔｉｔｙ）としてのその活性に比べ、その活性の少なくとも２０％の活性を保持している。いくつかの態様において、ＳＧＳＨおよび免疫グロブリンはそれぞれ、単体としてのその活性に比べ、その活性の少なくとも２０％を保持している。
【０００８】
いくつかの態様において、少なくとも約１０μｇのＳＧＳＨ酵素が脳へ送達される。いくつかの態様において、少なくとも約２０μｇのＳＧＳＨ酵素が脳へ送達される。いくつかの態様において、少なくとも約３０μｇのＳＧＳＨ酵素が脳へ送達される。いくつかの態様において、少なくとも約４０μｇのＳＧＳＨ酵素が脳へ送達される。いくつかの態様において、少なくとも約５０μｇのＳＧＳＨ酵素が脳へ送達される。いくつかの態様において、少なくとも約１００μｇのＳＧＳＨ酵素が脳へ送達される。いくつかの態様において、少なくとも約２００μｇのＳＧＳＨ酵素が脳へ送達される。いくつかの態様において、少なくとも約３００μｇのＳＧＳＨ酵素が脳へ送達される。いくつかの態様において、少なくとも約４００μｇのＳＧＳＨ酵素が脳へ送達される。いくつかの態様において、少なくとも約５００μｇのＳＧＳＨ酵素が脳へ送達される。いくつかの態様において、少なくとも約１０００μｇのＳＧＳＨ酵素が脳へ送達される。いくつかの態様において、少なくとも約５μｇのＳＧＳＨ酵素が脳へ送達される。いくつかの態様において、少なくとも約１μｇのＳＧＳＨ酵素が脳へ送達される。いくつかの態様において、少なくとも約０．５μｇのＳＧＳＨ酵素が脳へ送達される。いくつかの態様において、少なくとも約０．１μｇのＳＧＳＨ酵素が脳へ送達される。
【０００９】
いくつかの態様において、体重５０ｋｇ当たりで標準化すると（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ  ｐｅｒ  ５０  ｋｇ  ｂｏｄｙ  ｗｅｉｇｈｔ）、少なくとも約２００μｇのＳＧＳＨ酵素が脳へ送達される。いくつかの態様において、体重５０ｋｇ当たりで標準化すると、少なくとも約２５０μｇのＳＧＳＨ酵素が脳へ送達される。いくつかの態様において、体重５０ｋｇ当たりで標準化すると、少なくとも約３００μｇのＳＧＳＨ酵素が脳へ送達される。いくつかの態様において、体重５０ｋｇ当たりで標準化すると、少なくとも約４００μｇのＳＧＳＨ酵素が脳へ送達される。いくつかの態様において、体重５０ｋｇ当たりで標準化すると、少なくとも約５００μｇのＳＧＳＨ酵素が脳へ送達される。いくつかの態様において、体重５０ｋｇ当たりで標準化すると、少なくとも約１０００μｇのＳＧＳＨ酵素が脳へ送達される。いくつかの態様において、体重５０ｋｇ当たりで標準化すると、少なくとも約２０００μｇのＳＧＳＨ酵素が脳へ送達される。いくつかの態様において、体重５０ｋｇ当たりで標準化すると、少なくとも約１５０μｇのＳＧＳＨ酵素が脳へ送達される。いくつかの態様において、体重５０ｋｇ当たりで標準化すると、少なくとも約１００μｇのＳＧＳＨ酵素が脳へ送達される。いくつかの態様において、体重５０ｋｇ当たりで標準化すると、少なくとも約５０μｇのＳＧＳＨ酵素が脳へ送達される。いくつかの態様において、体重５０ｋｇ当たりで標準化すると、少なくとも約１０μｇのＳＧＳＨ酵素が脳へ送達される。
【００１０】
いくつかの態様において、融合抗体の治療的有効用量は少なくとも約０．５ｍｇ／Ｋｇ体重を含む。いくつかの態様において、融合抗体の治療的有効用量は少なくとも約０．６ｍｇ／Ｋｇ体重を含む。いくつかの態様において、融合抗体の治療的有効用量は少なくとも約０．７ｍｇ／Ｋｇ体重を含む。いくつかの態様において、融合抗体の治療的有効用量は少なくとも約０．８ｍｇ／Ｋｇ体重を含む。いくつかの態様において、融合抗体の治療的有効用量は少なくとも約０．９ｍｇ／Ｋｇ体重を含む。いくつかの態様において、融合抗体の治療的有効用量は少なくとも約１ｍｇ／Ｋｇ体重を含む。いくつかの態様において、融合抗体の治療的有効用量は少なくとも約２ｍｇ／Ｋｇ体重を含む。いくつかの態様において、融合抗体の治療的有効用量は少なくとも約５ｍｇ／Ｋｇ体重を含む。いくつかの態様において、融合抗体の治療的有効用量は少なくとも約０．４ｍｇ／Ｋｇ体重を含む。いくつかの態様において、融合抗体の治療的有効用量は少なくとも約０．３ｍｇ／Ｋｇ体重を含む。いくつかの態様において、融合抗体の治療的有効用量は少なくとも約０．２ｍｇ／Ｋｇ体重を含む。いくつかの態様において、融合抗体の治療的有効用量は少なくとも約０．１ｍｇ／Ｋｇ体重を含む。
【００１１】
いくつかの態様において、融合抗体の治療的有効用量は少なくとも約１０００ユニット（ｕｎｉｔ）／Ｋｇ体重を含む。いくつかの態様において、融合抗体の治療的有効用量は少なくとも約１５００ユニット／Ｋｇ体重を含む。いくつかの態様において、融合抗体の治療的有効用量は少なくとも約２０００ユニット／Ｋｇ体重を含む。いくつかの態様において、融合抗体の治療的有効用量は少なくとも約３０００ユニット／Ｋｇ体重を含む。いくつかの態様において、融合抗体の治療的有効用量は少なくとも約４０００ユニット／Ｋｇ体重を含む。いくつかの態様において、融合抗体の治療的有効用量は少なくとも約５０００ユニット／Ｋｇ体重を含む。いくつかの態様において、融合抗体の治療的有効用量は少なくとも約１０，０００ユニット／Ｋｇ体重を含む。いくつかの態様において、融合抗体の治療的有効用量は少なくとも約１５，０００ユニット／Ｋｇ体重を含む。いくつかの態様において、融合抗体の治療的有効用量は少なくとも約２０，０００ユニット／Ｋｇ体重を含む。いくつかの態様において、融合抗体の治療的有効用量は少なくとも約２５，０００ユニット／Ｋｇ体重を含む。いくつかの態様において、融合抗体の治療的有効用量は少なくとも約９００ユニット／Ｋｇ体重を含む。いくつかの態様において、融合抗体の治療的有効用量は少なくとも約８００ユニット／Ｋｇ体重を含む。いくつかの態様において、融合抗体の治療的有効用量は少なくとも約７００ユニット／Ｋｇ体重を含む。いくつかの態様において、融合抗体の治療的有効用量は少なくとも約６００ユニット／Ｋｇ体重を含む。いくつかの態様において、融合抗体の治療的有効用量は少なくとも約５００ユニット／Ｋｇ体重を含む。いくつかの態様において、融合抗体の治療的有効用量は少なくとも約４００ユニット／Ｋｇ体重を含む。いくつかの態様において、融合抗体の治療的有効用量は少なくとも約３００ユニット／Ｋｇ体重を含む。いくつかの態様において、融合抗体の治療的有効用量は少なくとも約２００ユニット／Ｋｇ体重を含む。いくつかの態様において、融合抗体の治療的有効用量は少なくとも約１００ユニット／Ｋｇ体重を含む。
【００１２】
いくつかの態様において、融合抗体のＳＧＳＨ比活性は少なくとも１０００ユニット／ｍｇタンパク質である。いくつかの態様において、融合抗体のＳＧＳＨ比活性は少なくとも１５００ユニット／ｍｇである。いくつかの態様において、融合抗体のＳＧＳＨ比活性は少なくとも２０００ユニット／ｍｇである。いくつかの態様において、融合抗体のＳＧＳＨ比活性は少なくとも３０００ユニット／ｍｇである。いくつかの態様において、融合抗体のＳＧＳＨ比活性は少なくとも４０００ユニット／ｍｇである。いくつかの態様において、融合抗体のＳＧＳＨ比活性は少なくとも５０００ユニット／ｍｇである。いくつかの態様において、融合抗体のＳＧＳＨ比活性は少なくとも１０，０００ユニット／ｍｇである。いくつかの態様において、融合抗体のＳＧＳＨ比活性は少なくとも１２，０００ユニット／ｍｇである。いくつかの態様において、融合抗体のＳＧＳＨ比活性は少なくとも１５，０００ユニット／ｍｇである。
【００１３】
いくつかの態様において、全身投与は、非経口投与、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、経鼻投与、動脈内投与、経皮投与、または吸入投与である。
【００１４】
いくつかの態様において、融合抗体はキメラ抗体である。いくつかの態様において、融合抗体はヒト化抗体である。
【００１５】
いくつかの態様において、免疫グロブリン重鎖はＩｇＧの免疫グロブリン重鎖である。いくつかの態様において、免疫グロブリン重鎖はＩｇＧ１クラスの免疫グロブリン重鎖である。
【００１６】
いくつかの態様において、融合抗体の免疫グロブリン重鎖は、４以下の単一アミノ酸突然変異を含む配列番号１のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、６以下の単一アミノ酸突然変異を含む配列番号２のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ２、または３以下の単一アミノ酸突然変異を含む配列番号３のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ３を含み、ここで該単一アミノ酸突然変異は、置換、欠失、または挿入である。
【００１７】
別の態様において、融合抗体の免疫グロブリン重鎖は、３以下の単一アミノ酸突然変異を含む配列番号１のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、６以下の単一アミノ酸突然変異を含む配列番号２のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ２、および３以下の単一アミノ酸突然変異を含む配列番号３のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ３を含む。
【００１８】
別の態様において、融合抗体の免疫グロブリン重鎖は、３以下の単一アミノ酸突然変異を含む配列番号１のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、６以下の単一アミノ酸突然変異を含む配列番号２のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ２、および１つの単一アミノ酸突然変異を含む配列番号３のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ３を含む。
【００１９】
別の態様において、融合抗体の免疫グロブリン重鎖は、１つの単一アミノ酸突然変異を含む配列番号１のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、１つの単一アミノ酸突然変異を含む配列番号２のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ２、および１つの単一アミノ酸突然変異を含む配列番号３のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ３を含む。
【００２０】
別の態様において、融合抗体の免疫グロブリン重鎖は、配列番号１のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ２、または配列番号３のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ３を含む。
【００２１】
さらなる態様において、融合抗体の免疫グロブリン重鎖は、配列番号１のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ２、および配列番号３のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ３を含む。
【００２２】
いくつかの態様において、免疫グロブリン軽鎖はκまたはλクラスの免疫グロブリン軽鎖である。
【００２３】
いくつかの態様において、融合抗体の免疫グロブリン軽鎖は、３以下の単一アミノ酸突然変異を含む配列番号４のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、５以下の単一アミノ酸突然変異を含む配列番号５のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ２、または５以下の単一アミノ酸突然変異を含む配列番号６のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ３を含み、ここで該単一アミノ酸突然変異は、置換、欠失、または挿入である。
【００２４】
別の態様において、融合抗体の免疫グロブリン軽鎖は、３以下の単一アミノ酸突然変異を含む配列番号４のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、５以下の単一アミノ酸突然変異を含む配列番号５のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ２、および５以下の単一アミノ酸突然変異を含む配列番号６のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ３を含む。
【００２５】
別の態様において、融合抗体の免疫グロブリン軽鎖は、３以下の単一アミノ酸突然変異を含む配列番号４のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、３以下の単一アミノ酸突然変異を含む配列番号５のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ２、および３以下の単一アミノ酸突然変異を含む配列番号６のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ３を含む。
【００２６】
別の態様において、融合抗体の免疫グロブリン軽鎖は、１つの単一アミノ酸突然変異を含む配列番号４のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、１つの単一アミノ酸突然変異を含む配列番号５のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ２、および１つの単一アミノ酸突然変異を含む配列番号６のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ３を含む。
【００２７】
別の態様において、融合抗体の免疫グロブリン軽鎖は、配列番号４のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ２、または配列番号６のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ３を含む。
【００２８】
さらなる態様において、融合抗体の免疫グロブリン軽鎖は、配列番号４のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ２、および配列番号６のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ３を含む。
【００２９】
いくつかの態様において、融合抗体の免疫グロブリン重鎖は、配列番号１のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ２、および配列番号３のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ３を含み、かつ、免疫グロブリン軽鎖は、配列番号４のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ２、および配列番号６のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ３を含む。
【００３０】
いくつかの態様において、融合抗体の免疫グロブリン重鎖は配列番号７と少なくとも９０％同一であり、かつ、軽鎖免疫グロブリンのアミノ酸配列は配列番号８と少なくとも９０％同一である。
【００３１】
いくつかの態様において、融合抗体の免疫グロブリン重鎖は配列番号７と少なくとも９５％同一であり、かつ、軽鎖免疫グロブリンのアミノ酸配列は配列番号８と少なくとも９５％同一である。
【００３２】
いくつかの態様において、融合抗体の免疫グロブリン重鎖は配列番号７を含み、かつ、軽鎖免疫グロブリンのアミノ酸配列は配列番号８を含む。
【００３３】
いくつかの態様において、ＳＧＳＨは配列番号９と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ＳＧＳＨは配列番号９と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ＳＧＳＨは配列番号９のアミノ酸配列を含む。
【００３４】
別の態様において、融合抗体の免疫グロブリン重鎖のアミノ酸配列は配列番号７と少なくとも９０％同一、軽鎖免疫グロブリンのアミノ酸配列は配列番号８と少なくとも９０％同一であり、かつ、ＳＧＳＨのアミノ酸配列は配列番号９と少なくとも９５％同一であるかまたは配列番号９を含む。
【００３５】
別の態様において、融合抗体の免疫グロブリン重鎖のアミノ酸配列は配列番号８を含み、免疫グロブリン軽鎖のアミノ酸配列は配列番号８を含み、かつ、ＳＧＳＨのアミノ酸配列は配列番号９を含む。
【００３６】
いくつかの態様において、本明細書における融合抗体は、内因性ＢＢＢ受容体媒介輸送系の結合によりＢＢＢを通過する。いくつかの態様において、融合抗体は、インスリン受容体、トランスフェリン受容体、レプチン受容体、リポタンパク質受容体、およびインスリン様成長因子（ＩＧＦ）受容体からなる群から選択される内因性ＢＢＢ受容体を介してＢＢＢを通過する。いくつかの態様において、融合抗体はインスリン受容体の結合によりＢＢＢを通過する。
【００３７】
いくつかの態様において、全身投与は、非経口投与、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、経鼻投与、動脈内投与、経皮投与、または吸入投与である。
【００３８】
いくつかの態様において、中枢神経系におけるＳＧＳＨ欠損症は、ムコ多糖症ＩＩＩＡ型（ＭＰＳ−ＩＩＩＡ）またはサンフィリッポ症候群Ａ型である。
【００３９】
いくつかの態様において、本明細書は、治療が必要な対象の中枢神経系におけるＮ−スルフォグルコサミンスルフォヒドロラーゼ（ＳＧＳＨ）欠損症の治療方法であり、該方法が、治療的有効用量の、ＳＧＳＨ活性を有する融合抗体を該対象に全身投与することを特徴とし、融合抗体が、（ａ）免疫グロブリン軽鎖およびＳＧＳＨのアミノ酸配列を含む融合タンパク質、ならびに（ｂ）免疫グロブリン重鎖を含み、融合抗体が血液脳関門（ＢＢＢ）を通過する方法を提供する。いくつかの態様において、ＳＧＳＨのアミノ酸配列は、免疫グロブリン軽鎖のアミノ酸配列のカルボキシ末端と共有結合している。
【００４０】
いくつかの態様において、本明細書は、治療が必要な対象の中枢神経系におけるＳＧＳＨ欠損症の治療方法であり、該方法が、治療的有効用量の、ＳＧＳＨ活性を有する融合抗体を該対象に全身投与することを特徴とし、融合抗体が、（ａ）配列番号１０と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む融合タンパク質、および（ｂ）免疫グロブリン軽鎖を含む方法を提供する。いくつかの態様において、融合抗体は内因性ＢＢＢ受容体の細胞外ドメインに結合する。いくつかの態様において、内因性ＢＢＢ受容体はヒトインスリン受容体である。いくつかの態様において、融合抗体は、ヘパラン硫酸からのＮ−結合硫酸エステルの加水分解を触媒する。いくつかの態様において、融合タンパク質は、配列番号１０と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、融合タンパク質は配列番号１０のアミノ酸配列を含む。
【００４１】
いくつかの態様において、本明細書は、ＳＧＳＨ活性を有する融合抗体であり、（ａ）配列番号１０と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む融合タンパク質、および（ｂ）免疫グロブリン軽鎖を含む融合抗体を提供する。いくつかの態様において、融合抗体は内因性ＢＢＢ受容体の細胞外ドメインに結合する。いくつかの態様において、内因性ＢＢＢ受容体はヒトインスリン受容体である。いくつかの態様において、融合抗体は内因性ＢＢＢ受容体に結合する抗体である。いくつかの態様において、融合抗体はヒトインスリン受容体に結合する抗体である。いくつかの態様において、融合抗体は、ヘパラン硫酸からのＮ−結合硫酸エステルの加水分解を触媒する。いくつかの態様において、融合タンパク質は、配列番号１０と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、融合タンパク質は、配列番号１０のアミノ酸配列を含む。
【００４２】
いくつかの態様において、本明細書は、ＳＧＳＨ活性を有する融合抗体であり、（ａ）免疫グロブリン重鎖およびＳＧＳＨのアミノ酸配列を含む融合タンパク質、および（ｂ）免疫グロブリン軽鎖を含む融合抗体を提供する。いくつかの態様において、ＳＧＳＨのアミノ酸配列は、免疫グロブリン重鎖のアミノ酸配列のカルボキシ末端と共有結合している。いくつかの態様において、本明細書は、ＳＧＳＨ活性を有する融合抗体であり、（ａ）免疫グロブリン軽鎖およびＳＧＳＨのアミノ酸配列を含む融合タンパク質、および（ｂ）免疫グロブリン重鎖を含む融合抗体を提供する。いくつかの態様において、ＳＧＳＨのアミノ酸配列は、免疫グロブリン軽鎖のアミノ酸配列のカルボキシ末端と共有結合している。いくつかの態様において、融合抗体は、内因性ＢＢＢ受容体の細胞外ドメインに結合する。いくつかの態様において、内因性ＢＢＢ受容体はヒトインスリン受容体である。いくつかの態様において、融合抗体は内因性ＢＢＢ受容体に結合する抗体である。いくつかの態様において、融合抗体はヒトインスリン受容体に結合する抗体である。いくつかの態様において、融合抗体は、ヘパラン硫酸からのＮ−結合硫酸エステルの加水分解を触媒する。
【００４３】
いくつかの態様において、本明細書における融合タンパク質はさらに、ＳＧＳＨのアミノ酸配列と、免疫グロブリン重鎖のアミノ酸配列のカルボキシ末端との間にリンカーを含む。
【００４４】
いくつかの態様において、本明細書は、治療的有効量の本明細書に記載の融合抗体、および医薬的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物を提供する。
【００４５】
いくつかの態様において、本明細書は、本明細書に記載の融合抗体をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。いくつかの態様において、単離されたポリヌクレオチドは配列番号１４の核酸配列を含む。いくつかの態様において、本明細書は、本明細書で提供する単離されたポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。いくつかの態様において、本明細書は、配列番号１４の核酸配列を含むベクターを提供する。いくつかの態様において、本明細書は、本明細書に記載のベクターを含む宿主細胞を提供する。いくつかの態様において、宿主細胞はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。いくつかの態様において、本明細書は、治療が必要な対象の中枢神経系におけるＳＧＳＨ欠損症の治療方法であり、該方法が、治療的有効用量の、ＳＧＳＨ活性を有する融合抗体を該対象に全身投与することを特徴とし、融合抗体が、（ａ）免疫グロブリン重鎖およびＳＧＳＨのアミノ酸配列を含む融合タンパク質、および（ｂ）免疫グロブリン軽鎖を含む方法を提供する。いくつかの態様において、ＳＧＳＨのアミノ酸配列は、免疫グロブリン重鎖のアミノ酸配列のカルボキシ末端と共有結合している。いくつかの態様において、本明細書は、治療が必要な対象の中枢神経系におけるＳＧＳＨ欠損症の治療方法であり、該方法が、治療的有効用量の、ＳＧＳＨ活性を有する融合抗体を該対象に全身投与することを特徴とし、融合抗体が、（ａ）免疫グロブリン軽鎖およびＳＧＳＨのアミノ酸配列を含む融合タンパク質、および（ｂ）免疫グロブリン重鎖を含む方法を提供する。いくつかの態様において、ＳＧＳＨのアミノ酸配列は、免疫グロブリン軽鎖のアミノ酸配列のカルボキシ末端と共有結合している。いくつかの態様において、融合抗体は、内因性ＢＢＢ受容体の細胞外ドメインに結合する。いくつかの態様において、内因性ＢＢＢ受容体はヒトインスリン受容体である。いくつかの態様において、融合抗体は、内因性ＢＢＢ受容体に結合する抗体である。いくつかの態様において、融合抗体はヒトインスリン受容体に結合する抗体である。いくつかの態様において、融合抗体は、ヘパラン硫酸からのＮ−結合硫酸エステルの加水分解を触媒する。
【００４６】
いくつかの態様において、本明細書は、ＣＮＳにおける酵素欠損症に罹患した対象を治療するための方法および組成物を提供する。いくつかの態様において、本明細書に記載の方法は、治療的有効量の、二機能性の融合抗体またはタンパク質を全身投与することにより、ムコ多糖症ＩＩＩ型（ＭＰＳ−ＩＩＩ）で欠損している酵素をＣＮＳへ送達することを特徴とする。いくつかの態様において、二機能性の融合抗体は、内因性血液脳関門（ＢＢＢ）受容体に対する抗体およびＭＰＳ−ＩＩＩで欠損している酵素のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、二機能性の融合抗体は、遺伝的に該酵素と融合したヒトインスリン抗体（ＨＩＲ  Ａｂ）である。いくつかの態様において、融合抗体は、酵素活性を保持しながらも、インスリン受容体の細胞外ドメインに結合し、ＢＢＢを超えてＣＮＳ内へ輸送される。いくつかの態様において、融合抗体は、ＢＢＢ上の内因性インスリン受容体へ結合し、該酵素を脳内に輸送する分子的トロイの木馬として働く。いくつかの態様において、全身投与に用いられる融合抗体の治療的に有効な全身用量は、一部、本明細書に記載されるように、末梢血からの融合抗体の特異的なＣＮＳ取り込み特性に基づいている。
【００４７】
ある態様において、本明細書は、治療が必要な対象の中枢神経系における酵素欠損症の治療方法であり、該方法が、治療的有効用量の融合抗体を該対象に全身投与することを特徴とし、融合抗体が、免疫グロブリン重鎖のアミノ酸配列、ＭＰＳ−ＩＩＩで欠損している酵素のアミノ酸配列、および免疫グロブリン軽鎖のアミノ酸配列を含む方法を提供する。いくつかの態様において、融合抗体は、内因性ＢＢＢ受容体（例えば、ヒトインスリン受容体）の細胞外ドメインに結合する。いくつかの態様において、該酵素のアミノ酸配列は、免疫グロブリン重鎖のアミノ酸配列のカルボキシ末端と共有結合している。
【００４８】
いくつかの態様において、ＭＰＳ−ＩＩＩで欠損している酵素はリソソーム酵素である。
【００４９】
いくつかの態様において、ＭＰＳ−ＩＩＩで欠損している酵素は、Ｎ−スルフォグルコサミンスルフォヒドロラーゼ（ＳＧＳＨ）、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（ＮＡＧＬＵ）、ヘパリン−α−グルコサミニドＮ−アセチルトランスフェラーゼ（ＨＧＳＮＡＴ）、またはＮ−アセチルグルコサミン−６−スルファターゼ（ＧＮＳ）である。
【００５０】
いくつかの態様において、融合抗体は、スルファターゼ修飾因子タイプ１（ＳＵＭＦ１）により翻訳後修飾されている。いくつかの態様において、翻訳後修飾は、システインからホルミルグリシンへの変換を含む。いくつかの態様において、融合抗体はホルミルグリシンを含む。
【００５１】
いくつかの態様において、融合抗体は、ヘパラン硫酸からのＮ−結合硫酸エステルの加水分解を触媒するか、Ｎ−アセチル−α−Ｄ−グルコサミニド中のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基の加水分解を触媒するか、ヘパラン硫酸のグルコサミン残基のアセチル化を触媒するか、またはヘパラン硫酸の６−硫酸基の加水分解を触媒する。
【００５２】
いくつかの態様において、前記酵素は、単体としてのその活性に比べ、その活性の少なくとも２０％を保持している。いくつかの態様において、酵素および免疫グロブリンはそれぞれ、単体としてのその活性に比べ、その活性の少なくとも２０％を保持している。いくつかの態様において、酵素は、単体としてのその活性に比べ、その活性の少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、または９５％を保持している。いくつかの態様において、酵素および免疫グロブリンはそれぞれ、単体としてのその活性に比べ、その活性の少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、または９５％を保持している。
【００５３】
いくつかの態様において、少なくとも約１０μｇの前記酵素が脳へ送達される。いくつかの態様において、少なくとも約２０μｇの酵素が脳へ送達される。いくつかの態様において、少なくとも約３０μｇの酵素が脳へ送達される。いくつかの態様において、少なくとも約４０μｇの酵素が脳へ送達される。いくつかの態様において、少なくとも約５０μｇの酵素が脳へ送達される。いくつかの態様において、少なくとも約１００μｇの酵素が脳へ送達される。いくつかの態様において、少なくとも約２００μｇの酵素が脳へ送達される。いくつかの態様において、少なくとも約３００μｇの酵素が脳へ送達される。いくつかの態様において、少なくとも約４００μｇの酵素が脳へ送達される。いくつかの態様において、少なくとも約５００μｇの酵素が脳へ送達される。いくつかの態様において、少なくとも約１０００μｇの酵素が脳へ送達される。いくつかの態様において、少なくとも約５μｇの酵素が脳へ送達される。いくつかの態様において、少なくとも約１μｇの酵素が脳へ送達される。いくつかの態様において、少なくとも約０．５μｇの酵素が脳へ送達される。いくつかの態様において、少なくとも約０．１μｇの酵素が脳へ送達される。
【００５４】
いくつかの態様において、体重５０ｋｇ当たりで標準化すると、少なくとも約２００μｇの酵素が脳に送達される。いくつかの態様において、体重５０ｋｇ当たりで標準化すると、少なくとも約２５０μｇの酵素が脳に送達される。いくつかの態様において、体重５０ｋｇ当たりで標準化すると、少なくとも約３００μｇの酵素が脳に送達される。いくつかの態様において、体重５０ｋｇ当たりで標準化すると、少なくとも約４００μｇの酵素が脳に送達される。いくつかの態様において、体重５０ｋｇ当たりで標準化すると、少なくとも約５００μｇの酵素が脳に送達される。いくつかの態様において、体重５０ｋｇ当たりで標準化すると、少なくとも約１０００μｇの酵素が脳に送達される。いくつかの態様において、体重５０ｋｇ当たりで標準化すると、少なくとも約２０００μｇの酵素が脳に送達される。いくつかの態様において、体重５０ｋｇ当たりで標準化すると、少なくとも約１５０μｇの酵素が脳に送達される。いくつかの態様において、体重５０ｋｇ当たりで標準化すると、少なくとも約１００μｇの酵素が脳に送達される。いくつかの態様において、体重５０ｋｇ当たりで標準化すると、少なくとも約５０μｇの酵素が脳に送達される。いくつかの態様において、体重５０ｋｇ当たりで標準化すると、少なくとも約１０μｇの酵素が脳に送達される。
【００５５】
いくつかの態様において、融合抗体の治療的有効用量は少なくとも約０．５ｍｇ／Ｋｇ体重を含む。いくつかの態様において、融合抗体の治療的有効用量は少なくとも約０．６ｍｇ／Ｋｇ体重を含む。いくつかの態様において、融合抗体の治療的有効用量は少なくとも約０．７ｍｇ／Ｋｇ体重を含む。いくつかの態様において、融合抗体の治療的有効用量は少なくとも約０．８ｍｇ／Ｋｇ体重を含む。いくつかの態様において、融合抗体の治療的有効用量は少なくとも約０．９ｍｇ／Ｋｇ体重を含む。いくつかの態様において、融合抗体の治療的有効用量は少なくとも約１ｍｇ／Ｋｇ体重を含む。いくつかの態様において、融合抗体の治療的有効用量は少なくとも約２ｍｇ／Ｋｇ体重を含む。いくつかの態様において、融合抗体の治療的有効用量は少なくとも約５ｍｇ／Ｋｇ体重を含む。いくつかの態様において、融合抗体の治療的有効用量は少なくとも約０．４ｍｇ／Ｋｇ体重を含む。いくつかの態様において、融合抗体の治療的有効用量は少なくとも約０．３ｍｇ／Ｋｇ体重を含む。いくつかの態様において、融合抗体の治療的有効用量は少なくとも約０．２ｍｇ／Ｋｇ体重を含む。いくつかの態様において、融合抗体の治療的有効用量は少なくとも約０．１ｍｇ／Ｋｇ体重を含む。
【００５６】
いくつかの態様において、融合抗体の治療的有効用量は少なくとも約１０００ユニット／Ｋｇ体重を含む。いくつかの態様において、融合抗体の治療的有効用量は少なくとも約１５００ユニット／Ｋｇ体重を含む。いくつかの態様において、融合抗体の治療的有効用量は少なくとも約２０００ユニット／Ｋｇ体重を含む。いくつかの態様において、融合抗体の治療的有効用量は少なくとも約３０００ユニット／Ｋｇ体重を含む。いくつかの態様において、融合抗体の治療的有効用量は少なくとも約４０００ユニット／Ｋｇ体重を含む。いくつかの態様において、融合抗体の治療的有効用量は少なくとも約５０００ユニット／Ｋｇ体重を含む。いくつかの態様において、融合抗体の治療的有効用量は少なくとも約１０，０００ユニット／Ｋｇ体重を含む。いくつかの態様において、融合抗体の治療的有効用量は少なくとも約１５，０００ユニット／Ｋｇ体重を含む。いくつかの態様において、融合抗体の治療的有効用量は少なくとも約２０，０００ユニット／Ｋｇ体重を含む。いくつかの態様において、融合抗体の治療的有効用量は少なくとも約２５，０００ユニット／Ｋｇ体重を含む。いくつかの態様において、融合抗体の治療的有効用量は少なくとも約９００ユニット／Ｋｇ体重を含む。いくつかの態様において、融合抗体の治療的有効用量は少なくとも約８００ユニット／Ｋｇ体重を含む。いくつかの態様において、融合抗体の治療的有効用量は少なくとも約７００ユニット／Ｋｇ体重を含む。いくつかの態様において、融合抗体の治療的有効用量は少なくとも約６００ユニット／Ｋｇ体重を含む。いくつかの態様において、融合抗体の治療的有効用量は少なくとも約５００ユニット／Ｋｇ体重を含む。いくつかの態様において、融合抗体の治療的有効用量は少なくとも約４００ユニット／Ｋｇ体重を含む。いくつかの態様において、融合抗体の治療的有効用量は少なくとも約３００ユニット／Ｋｇ体重を含む。いくつかの態様において、融合抗体の治療的有効用量は少なくとも約２００ユニット／Ｋｇ体重を含む。いくつかの態様において、融合抗体の治療的有効用量は少なくとも約１００ユニット／Ｋｇ体重を含む。
【００５７】
いくつかの態様において、融合抗体の酵素比活性は少なくとも１０００ユニット／ｍｇタンパク質である。いくつかの態様において、融合抗体の酵素比活性は少なくとも１５００ユニット／ｍｇである。いくつかの態様において、融合抗体の酵素比活性は少なくとも２０００ユニット／ｍｇである。いくつかの態様において、融合抗体の酵素比活性は少なくとも３０００ユニット／ｍｇである。いくつかの態様において、融合抗体の酵素比活性は少なくとも４０００ユニット／ｍｇである。いくつかの態様において、融合抗体の酵素比活性は少なくとも５０００ユニット／ｍｇである。いくつかの態様において、融合抗体の酵素比活性は少なくとも１０，０００ユニット／ｍｇである。いくつかの態様において、融合抗体の酵素比活性は少なくとも１２，０００ユニット／ｍｇである。いくつかの態様において、融合抗体の酵素比活性は少なくとも１５，０００ユニット／ｍｇである。
【００５８】
いくつかの態様において、全身投与は、非経口投与、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、経鼻投与、動脈内投与、経皮投与、または吸入投与である。
【００５９】
いくつかの態様において、融合抗体はキメラ抗体である。いくつかの態様において、融合抗体はヒト化抗体である。
【００６０】
いくつかの態様において、免疫グロブリン重鎖はＩｇＧの免疫グロブリン重鎖である。いくつかの態様において、免疫グロブリン重鎖はＩｇＧ１クラスの免疫グロブリン重鎖である。
【００６１】
いくつかの態様において、融合抗体の免疫グロブリン重鎖は、４以下の単一アミノ酸突然変異を含む配列番号１のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、６以下の単一アミノ酸突然変異を含む配列番号２のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ２、または３以下の単一アミノ酸突然変異を含む配列番号３のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ３を含み、ここで該単一アミノ酸突然変異は、置換、欠失、または挿入である。
【００６２】
別の態様において、融合抗体の免疫グロブリン重鎖は、３以下の単一アミノ酸突然変異を含む配列番号１のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、６以下の単一アミノ酸突然変異を含む配列番号２のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ２、および３以下の単一アミノ酸突然変異を含む配列番号３のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ３を含む。
【００６３】
別の態様において、融合抗体の免疫グロブリン重鎖は、３以下の単一アミノ酸突然変異を含む配列番号１のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、６以下の単一アミノ酸突然変異を含む配列番号２のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ２、および１つの単一アミノ酸突然変異を含む配列番号３のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ３を含む。
【００６４】
別の態様において、融合抗体の免疫グロブリン重鎖は、１つの単一アミノ酸突然変異を含む配列番号１のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、１つの単一アミノ酸突然変異を含む配列番号２のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ２、および１つの単一アミノ酸突然変異を含む配列番号３のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ３を含む。
【００６５】
別の態様において、融合抗体の免疫グロブリン重鎖は、配列番号１のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ２、または配列番号３のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ３を含む。
【００６６】
さらなる態様において、融合抗体の免疫グロブリン重鎖は、配列番号１のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ２、および配列番号３のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ３を含む。
【００６７】
いくつかの態様において、免疫グロブリン軽鎖はκまたはλクラスの免疫グロブリン軽鎖である。
【００６８】
いくつかの態様において、融合抗体の免疫グロブリン軽鎖は、３以下の単一アミノ酸突然変異を含む配列番号４のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、５以下の単一アミノ酸突然変異を含む配列番号５のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ２、または５以下の単一アミノ酸突然変異を含む配列番号６のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ３を含み、ここで該単一アミノ酸突然変異は、置換、欠失、または挿入である。
【００６９】
別の態様において、融合抗体の免疫グロブリン軽鎖は、３以下の単一アミノ酸突然変異を含む配列番号４のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、５以下の単一アミノ酸突然変異を含む配列番号５のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ２、および５以下の単一アミノ酸突然変異を含む配列番号６のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ３を含む。
【００７０】
別の態様において、融合抗体の免疫グロブリン軽鎖は、３以下の単一アミノ酸突然変異を含む配列番号４のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、３以下の単一アミノ酸突然変異を含む配列番号５のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ２、および３以下の単一アミノ酸突然変異を含む配列番号６のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ３を含む。
【００７１】
別の態様において、融合抗体の免疫グロブリン軽鎖は、１つの単一アミノ酸突然変異を含む配列番号４のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、１つの単一アミノ酸突然変異を含む配列番号５のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ２、および１つの単一アミノ酸突然変異を含む配列番号６のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ３を含む。
【００７２】
別の態様において、融合抗体の免疫グロブリン軽鎖は、配列番号４のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ２、または配列番号６のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ３を含む。
【００７３】
さらなる態様において、融合抗体の免疫グロブリン軽鎖は、配列番号４のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ２、および配列番号６のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ３を含む。
【００７４】
いくつかの態様において、融合抗体の免疫グロブリン重鎖は、配列番号１のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ２、および配列番号３のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ３を含み、かつ、免疫グロブリン軽鎖は、配列番号４のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ２、および配列番号６のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ３を含む。
【００７５】
いくつかの態様において、融合抗体の免疫グロブリン重鎖は配列番号７と少なくとも９０％同一であり、かつ、軽鎖免疫グロブリンのアミノ酸配列は配列番号８と少なくとも９０％同一である。
【００７６】
いくつかの態様において、融合抗体の免疫グロブリン重鎖は配列番号７と少なくとも９５％同一であり、かつ、軽鎖免疫グロブリンのアミノ酸配列は配列番号８と少なくとも９５％同一である。
【００７７】
いくつかの態様において、融合抗体の免疫グロブリン重鎖は配列番号７を含み、かつ、軽鎖免疫グロブリンのアミノ酸配列は配列番号８を含む。
【００７８】
いくつかの態様において、前記酵素は、配列番号９、配列番号１７、配列番号１９、または配列番号２１と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、酵素は、配列番号９、配列番号１７、配列番号１９、または配列番号２１と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、酵素は、配列番号９、配列番号１７、配列番号１９、または配列番号２１のアミノ酸配列を含む。
【００７９】
いくつかの態様において、本明細書における融合抗体は、内因性ＢＢＢ受容体媒介輸送系の結合によりＢＢＢを通過する。いくつかの態様において、融合抗体は、インスリン受容体、トランスフェリン受容体、レプチン受容体、リポタンパク質受容体、およびインスリン様成長因子（ＩＧＦ）受容体からなる群から選択される内因性ＢＢＢ受容体を介してＢＢＢを通過する。いくつかの態様において、融合抗体はインスリン受容体の結合によりＢＢＢを通過する。
【００８０】
いくつかの態様において、全身投与は、非経口投与、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、経鼻投与、動脈内投与、経皮投与、または吸入投与である。
【００８１】
いくつかの態様において、中枢神経系における酵素欠損症は、ムコ多糖症ＩＩＩＡ型（ＭＰＳ−ＩＩＩＡ）、ムコ多糖症ＩＩＩＢ型（ＭＰＳ−ＩＩＩＢ）、ムコ多糖症ＩＩＩＣ型（ＭＰＳ−ＩＩＩＣ）、またはムコ多糖症ＩＩＩＤ型（ＭＰＳ−ＩＩＩＤ）である。
【００８２】
いくつかの態様において、本明細書は、治療が必要な対象の中枢神経系における酵素欠損症の治療方法であり、該方法が、治療的有効用量の融合抗体を該対象に全身投与することを特徴とし、融合抗体が、（ａ）免疫グロブリン軽鎖およびムコ多糖症ＩＩＩ型（ＭＰＳ−ＩＩＩ）で欠損している酵素のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、ならびに（ｂ）免疫グロブリン重鎖を含み、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過する方法を提供する。いくつかの態様において、該酵素のアミノ酸配列は、免疫グロブリン軽鎖のアミノ酸配列のカルボキシ末端と共有結合している。
【００８３】
いくつかの態様において、本明細書は、治療が必要な対象の中枢神経系における酵素欠損症の治療方法であり、該方法が、治療的有効用量の融合抗体を該対象に全身投与することを特徴とし、融合抗体が、（ａ）配列番号１０、配列番号１８、配列番号２０、または配列番号２２と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む融合タンパク質、および（ｂ）免疫グロブリン軽鎖を含む方法を提供する。いくつかの態様において、融合抗体は内因性ＢＢＢ受容体の細胞外ドメインに結合する。いくつかの態様において、内因性ＢＢＢ受容体はヒトインスリン受容体である。いくつかの態様において、融合抗体は、ヘパラン硫酸からのＮ−結合硫酸エステルの加水分解を触媒するか、Ｎ−アセチル−α−Ｄ−グルコサミニド中のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基の加水分解を触媒するか、ヘパラン硫酸のグルコサミン残基のアセチル化を触媒するか、またはヘパラン硫酸の６−硫酸基の加水分解を触媒する。いくつかの態様において、融合タンパク質は、配列番号１０、配列番号１８、配列番号２０、または配列番号２２と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、融合タンパク質は、配列番号１０、配列番号１８、配列番号２０、または配列番号２２のアミノ酸配列を含む。
【００８４】
いくつかの態様において、本明細書は、（ａ）配列番号１０、配列番号１８、配列番号２０、または配列番号２２と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む融合タンパク質、および（ｂ）免疫グロブリン軽鎖を含む融合抗体を提供する。いくつかの態様において、融合抗体は内因性ＢＢＢ受容体の細胞外ドメインに結合する。いくつかの態様において、内因性ＢＢＢ受容体はヒトインスリン受容体である。いくつかの態様において、融合抗体は内因性ＢＢＢ受容体に結合する抗体である。いくつかの態様において、融合抗体はヒトインスリン受容体に結合する抗体である。いくつかの態様において、融合抗体は、ヘパラン硫酸からのＮ−結合硫酸エステルの加水分解を触媒するか、Ｎ−アセチル−α−Ｄ−グルコサミニド中のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基の加水分解を触媒するか、ヘパラン硫酸のグルコサミン残基のアセチル化を触媒するか、またはヘパラン硫酸の６−硫酸基の加水分解を触媒する。いくつかの態様において、融合タンパク質は、配列番号１０、配列番号１８、配列番号２０、または配列番号２２と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、融合タンパク質は、配列番号１０、配列番号１８、配列番号２０、または配列番号２２のアミノ酸配列を含む。
【００８５】
いくつかの態様において、本明細書は、（ａ）免疫グロブリン重鎖およびムコ多糖症ＩＩＩ型（ＭＰＳ−ＩＩＩ）で欠損している酵素のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、ならびに（ｂ）免疫グロブリン軽鎖を含む融合抗体を提供する。いくつかの態様において、該酵素のアミノ酸配列は、免疫グロブリン重鎖のアミノ酸配列のカルボキシ末端と共有結合している。いくつかの態様において、本明細書は、（ａ）免疫グロブリン軽鎖およびムコ多糖症ＩＩＩ型（ＭＰＳ−ＩＩＩ）で欠損している酵素のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、ならびに（ｂ）免疫グロブリン重鎖を含む融合抗体を提供する。いくつかの態様において、該酵素のアミノ酸配列は、免疫グロブリン軽鎖のアミノ酸配列のカルボキシ末端と共有結合している。いくつかの態様において、融合抗体は内因性ＢＢＢ受容体の細胞外ドメインに結合する。いくつかの態様において、内因性ＢＢＢ受容体はヒトインスリン受容体である。いくつかの態様において、融合抗体は内因性ＢＢＢ受容体に結合する抗体である。いくつかの態様において、融合抗体はヒトインスリン受容体に結合する抗体である。いくつかの態様において、融合抗体は、ヘパラン硫酸からのＮ−結合型硫酸エステルの加水分解を触媒するか、Ｎ−アセチル−α−Ｄ−グルコサミニド中のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基の加水分解を触媒するか、ヘパラン硫酸のグルコサミン残基のアセチル化を触媒するか、またはヘパラン硫酸の６−硫酸基の加水分解を触媒する。
【００８６】
いくつかの態様において、本明細書における融合タンパク質はさらに、前記酵素のアミノ酸配列と、免疫グロブリン重鎖のアミノ酸配列のカルボキシ末端との間にリンカーを含む。
【００８７】
いくつかの態様において、本明細書は、治療的有効量の本明細書に記載の融合抗体、および医薬的に許容される賦形剤を含む医薬組成物を提供する。
【００８８】
いくつかの態様において、本明細書は、本明細書に記載の融合抗体をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。いくつかの態様において、単離されたポリヌクレオチドは、配列番号１４、配列番号２３、配列番号２４、または配列番号２５の核酸配列を含む。いくつかの態様において、本明細書は、本明細書における単離されたポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。いくつかの態様において、本明細書は、配列番号１４、配列番号２３、配列番号２４、または配列番号２５の核酸配列を含むベクターを提供する。いくつかの態様において、本明細書は、本明細書に記載のベクターを含む宿主細胞を提供する。いくつかの態様において、宿主細胞はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。
【００８９】
いくつかの態様において、本明細書は、治療が必要な対象の中枢神経系における酵素欠損症の治療方法であり、該方法が、治療的有効用量の融合抗体を該対象に全身投与することを特徴とし、融合抗体が、（ａ）免疫グロブリン重鎖およびムコ多糖症ＩＩＩ型（ＭＰＳ−ＩＩＩ）で欠損している酵素のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、ならびに（ｂ）免疫グロブリン軽鎖を含む方法を提供する。いくつかの態様において、該酵素のアミノ酸配列は、免疫グロブリン重鎖のアミノ酸配列のカルボキシ末端と共有結合している。いくつかの態様において、本明細書は、治療が必要な対象の中枢神経系における酵素欠損症の治療方法であり、該方法が、治療的有効用量の融合抗体を該対象に全身投与することを特徴とし、融合抗体が、（ａ）免疫グロブリン軽鎖およびムコ多糖症ＩＩＩ型（ＭＰＳ−ＩＩＩ）で欠損している酵素のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、ならびに（ｂ）免疫グロブリン重鎖を含む方法を提供する。いくつかの態様において、該酵素のアミノ酸配列は、免疫グロブリン軽鎖のアミノ酸配列のカルボキシ末端と共有結合している。いくつかの態様において、融合抗体は内因性ＢＢＢ受容体の細胞外ドメインに結合する。いくつかの態様において、内因性ＢＢＢ受容体はヒトインスリン受容体である。いくつかの態様において、融合抗体は内因性ＢＢＢ受容体に結合する抗体である。いくつかの態様において、融合抗体はヒトインスリン受容体に結合する抗体である。いくつかの態様において、融合抗体は、ヘパラン硫酸からのＮ−結合型硫酸エステルの加水分解を触媒するか、Ｎ−アセチル−α−Ｄ−グルコサミニド中のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基の加水分解を触媒するか、ヘパラン硫酸のグルコサミン残基のアセチル化を触媒するか、またはヘパラン硫酸の６−硫酸基の加水分解を触媒する。
【００９０】
参照による引用
本明細書に記載のすべての刊行物、特許、および特許出願は、各刊行物、特許、または特許出願が、具体的にかつ個々に、参照により引用されることを示されているのと同じ範囲まで、参照により本明細書に引用される。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
本態様の新規な特徴を、特許請求の範囲に詳細に記載する。本態様の特徴および利点は、本態様の原理を利用した例示的態様を記載した以下の詳細な説明、および以下に添付した図面を参照することにより、よりよく理解されよう。
【００９２】
【図１】融合抗体が、分子的トロイの木馬（ＴＨ）として働く内因性ＢＢＢ受容体（Ｒ）の細胞外ドメインに対する抗体、およびリソソーム酵素（Ｅ）であるＳＧＳＨを含む、「分子的トロイの木馬」戦略の概略図。一旦ＢＢＢの裏で脳細胞へ入ると、融合抗体のＳＧＳＨ部分は、次いでヘパラン硫酸（Ｓ）を分解可能な生成物（Ｐ）に変換する。
【００９３】
【図２】典型的なＨＩＲ  Ａｂ−ＳＧＳＨ融合抗体は、成熟ＳＧＳＨのアミノ末端と、ＨＩＲ  Ａｂの重鎖のＣＨ３領域のカルボキシル末端との融合により形成される。
【００９４】
【図３】ヒト肝臓ｃＤＮＡおよびＳＧＳＨ特異的プライマー（表２）からＰＣＲにより生成した、１．５ｋｂのヒトＳＧＳＨ  ｃＤＮＡ（レーン３）のアガロースゲルのエチジウムブロミド染色。レーン１および２：それぞれ、Ｌａｍｂｄａ  ＨｉｎｄＩＩＩで消化したＤＮＡ標準、およびＰｈｉＸ１７４  ＨａｅＩＩＩで消化したＤＮＡ標準。
【００９５】
【図４】重鎖（ＨＣ）融合遺伝子、軽鎖（ＬＣ）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子、およびネオマイシン耐性（Ｎｅｏ）遺伝子をコードする、４つの別々のタンデム発現カセットをコードし、遺伝的に設計されたタンデムベクター（ＴＶ）であり、ＴＶ−ＨＩＲＭＡｂ−ＳＧＳＨと示される。他のエレメントは、アンピシリン耐性遺伝子（ａｍｐ）および複製起点（ｏｒｉ）を含む。重鎖および軽鎖発現カセットの、５’側にはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターが隣接し、３’側にはウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリ−Ａ配列が隣接している。ＤＨＦＲ発現カセットの、５’側にはシミアンウイルス（ＳＶ）４０プロモーターが隣接し、３’側にはＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ポリ−Ａ配列が隣接している。
【００９６】
【図５】ヒトインスリン受容体の細胞外ドメインに対する典型的なヒトインスリン受容体抗体からの免疫グロブリン重鎖可変領域のアミノ酸配列。下線を付した配列は、それぞれシグナルペプチド、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３である。ヒトＩｇＧ１から得た重鎖定常領域をイタリック体で示す。
【００９７】
【図６】ヒトインスリン受容体の細胞外ドメインに対する典型的なヒトインスリン受容体抗体からの免疫グロブリン軽鎖可変領域のアミノ酸配列。下線を付した配列は、それぞれシグナルペプチド、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３である。ヒトκ軽鎖に由来する定常領域をイタリック体で示す。
【００９８】
【図７】ヒトインスリン受容体の細胞外ドメインに対する典型的なヒトインスリン受容体抗体の重鎖および軽鎖からのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３アミノ酸配列を示す表。
【００９９】
【図８】最初の２０アミノ酸のシグナルペプチドを含まない（成熟ＳＧＳＨ）、ＳＧＳＨ（ＮＰ＿０００１９０）のアミノ酸配列。
【０１００】
【図９】典型的なヒトインスリン受容体抗体重鎖と成熟ヒトＳＧＳＨとの融合体のアミノ酸配列。下線を付した配列は、順に、ＩｇＧシグナルペプチド、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、および、重鎖のカルボキシ末端とＳＧＳＨのアミノ末端とを結合するペプチドリンカー（Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）である。イタリック体の配列は、ヒトＩｇＧ１から得た重鎖定常領域に対応する。太字の配列はヒトＳＧＳＨに対応する。
【０１０１】
【図１０】分子量標準（レーン１および４）、精製されたＨＩＲＭＡｂ（レーン２）、および精製されたＨＩＲＭＡｂ−ＳＧＳＨ融合タンパク質（レーン３）の還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ。
【０１０２】
【図１１】抗ヒト（ｈ）ＩｇＧ一次抗体（左パネル）または抗ヒトＳＧＳＨ一次抗血清（右パネル）のいずれかを用いたウェスタンブロット。ＨＩＲＭＡｂ−ＳＧＳＨ融合タンパク質の免疫反応性を、キメラＨＩＲＭＡｂおよび組み換えＳＧＳＨと比較する。ＨＩＲＭＡｂ−ＳＧＳＨ融合タンパク質とＨＩＲＭＡｂはいずれも、抗ｈＩｇＧウエスタンにおいて同一の軽鎖を有する。ＨＩＲＭＡｂ−ＳＧＳＨ融合重鎖は抗ｈＩｇＧと抗ヒトＳＧＳＨ抗体のいずれとも反応するが、ＨＩＲＭＡｂ重鎖は抗ｈＩｇＧ抗体のみと反応する。組み換えＳＧＳＨは抗ヒトＳＧＳＨ抗体のみと反応する。
【０１０３】
【図１２】ＨＩＲ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）への、キメラＨＩＲＭＡｂまたはＨＩＲＭＡｂ−ＳＧＳＨ融合タンパク質のいずれかの結合は、飽和しうる。分子量の差を標準化した後の、ＨＩＲ  ＥＣＤに結合するＨＩＲＭＡｂ−ＳＧＳＨのＥＤ５０（０．３３±０．０５ｎＭ）は、キメラＨＩＲＭＡｂの結合のＥＤ５０（０．１９±０．０２ｎＭ）と同等である。
【０１０４】
【図１３】（Ａ）ＳＧＳＨ蛍光定量的酵素アッセイは、２段階アッセイである。基質である４−メチルウンベリフェリル−α−Ｄ−Ｎ−スルフォグルコサミニド（ＭＵ−α−ＧｌｃＮＳ）は、ＳＧＳＨにより、メチルウンベリフェリル−α−Ｄ−グルコサミニド（ＭＵ−α−ＧｌｃＮＨ２）に変換され、次いで、２段階目の酵素であるα−グルコサミニダーゼにより、蛍光生成物である４−メチルウンベリフェロン（４−ＭＵ）に変換される。（Ｂ）３０〜３００ｎｇのＨＩＲＭＡｂ−ＳＧＳＨ融合タンパク質を添加することによる、４−ＭＵ生成物の線形生成。データは、３回の平均±標準偏差である。
【０１０５】
【図１４】成体アカゲザルにおいて、１９μｇ／ｋｇの融合タンパク質を単回静脈注射した後、ＴＣＡで沈殿可能な［１２５Ｉ］−ＨＩＲＭＡｂ−ＳＧＳＨ融合タンパク質の血漿濃度（ｎｇ／ｍＬ）を１４０分間にわたって時間に対しプロットする。
【発明を実施するための形態】
【０１０６】
（発明の詳細な説明）
血液脳関門（ＢＢＢ）は、全身投与されたリソソーム酵素（例えば組み換えＳＧＳＨ）の中枢神経系への送達を妨げる深刻な障壁である。本明細書に記載の方法および組成物は、治療的に意義のあるレベルの、ムコ多糖症ＩＩＩ型（ＭＰＳ−ＩＩＩ）で欠損している酵素、例えば、ＳＧＳＨ、ＮＡＧＬＵ、ＨＧＳＮＡＴ、ＧＮＳを、ＢＢＢを超えてＣＮＳへ送達する上で重要な因子に対処する：１）ＭＰＳ−ＩＩＩで欠損している酵素が内因性ＢＢＢ輸送体上の輸送体を介してＢＢＢを通過できるようにするための、該酵素の修飾、２）ＢＢＢ輸送をもたらすために必要な修飾をした後も、酵素活性を保持することによる、全身投与された修飾酵素のＣＮＳ内への取り込み量および速度。本明細書に記載の方法および組成物の様々な態様は、（１）内因性ＢＢＢ受容体の細胞外ドメインに対する免疫グロブリン（重鎖または軽鎖）に、介在配列有りまたは無しで融合した酵素（すなわち、ＳＧＳＨ活性を有するタンパク質）を含む融合抗体を提供することにより、そして（２）ＣＮＳにおける取り込みおよび比活性に基づいて、該融合抗体の治療的に有効な全身用量を確立することにより、これらの因子に対処する。いくつかの態様において、内因性ＢＢＢ受容体に対する抗体は、ヒトインスリン受容体に対する抗体（ＨＩＲ  Ａｂ）である。
【０１０７】
従って、本明細書は、治療が必要な対象に、治療的有効用量の、二機能性のＢＢＢ受容体Ａｂ−酵素融合抗体を全身投与することにより、中枢神経系における酵素（例えばＳＧＳＨ）欠損症を治療するための組成物および方法であり、該融合抗体が、酵素活性を有し、ヒトインスリン受容体などの内因性ＢＢＢ受容体輸送体の細胞外ドメインに選択的に結合する、組成物および方法を提供する。
【０１０８】
（定義）
本明細書で用いられる「治療」または「治療する」としては、治療効果および／または予防効果を達成することが挙げられる。治療効果は、治療される原因となる障害または病状の根絶または改善を意味する。例えば、ＭＰＳ−ＩＩＩＡに罹患した個体において、治療効果としては、障害の進行の部分的もしくは完全な停止、または障害の部分的もしくは完全な好転が挙げられる。また、治療効果は、患者が依然として病状に罹患している可能性があるという事実があっても、患者において改善が認められるように、原因となる病状に関連する１つ以上の生理的または精神的症状の根絶または改善によっても達成される。治療の予防効果としては、病状の予防、病状の進行の遅延（例えば、リソソーム貯蔵障害の進行の遅延）、または病状が発生する可能性の低減が挙げられる。本明細書で用いられる「治療する」または「治療」は、予防を含む。
【０１０９】
本明細書で用いられる用語「有効量」は、全身投与されると、ＣＮＳにおいて有益なもしくは所望の結果、例えば、有益なもしくは所望の臨床結果、または認知、記憶、気分の改善、または他の所望のＣＮＳの結果を達成するために十分な量であり得る。有効量は、予防効果をもたらす量でもあり、例えば、病的または望ましくない病状の発現を、遅延、軽減、または排除する量である。該病状としては、限定されるものではないが、精神遅滞、難聴、および神経変性が挙げられる。有効量は、１回以上の投与で施行することができる。治療に関して、本明細書における組成物の「有効量」は、障害、例えば神経障害の進行を、緩和、改善、安定化、逆転、または遅延させるために充分な量である。「有効量」は、単独で用いられるか、または、疾患もしくは障害を治療するために使用される１つ以上の薬剤と併用して用いられる、本明細書におけるいずれかの組成物の量であってよい。本態様の意味の範囲内で、治療薬の「有効量」は、患者の主治医または獣医師により決定されるであろう。該量は当業者により容易に確立され、本態様に従って投与されると治療効果を  であろう。治療的有効量がどれくらいの量になるかに影響する因子としては、投与される融合抗体の酵素比活性、その吸収プロフィール（例えば、脳内へのその取り込み速度）、障害を発症してからの経過時間、ならびに治療下の個体の、年齢、健康状態、他の疾患状態の存在および栄養状態が挙げられる。さらに、患者が摂取している可能性のある他の薬物は、投与される治療薬の治療的有効量の決定に影響するであろう。
【０１１０】
本明細書で用いられる「対象」または「個体」は、動物、例えば哺乳類である。いくつかの態様において、「対象」または「個体」はヒトである。いくつかの態様において、対象はＭＰＳ−ＩＩＩＡに罹患している。
【０１１１】
いくつかの態様において、融合抗体を含む医薬組成物は、「末梢に投与される（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｌｙ）」か、または「末梢投与される（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｌｙ  ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ）」。本明細書で用いられるこれらの用語は、ＣＮＳに直接投与するのではなく、すなわち、薬剤を、血液脳関門の脳とは異なる側に接触させる、個体への薬剤、例えば治療薬の任意の投与形態を指す。本明細書で用いられる「末梢投与」としては、静脈内投与、動脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、腹腔内投与、経皮投与、吸入による投与、経頬（ｔｒａｎｓｂｕｃｃａｌ）投与、鼻腔内投与、直腸投与、経口投与、非経口投与、舌下投与、または経鼻投与が挙げられる。
【０１１２】
本明細書における「医薬的に許容される担体」または「医薬的に許容される賦形剤」は、それ自体は、組成物を摂取している個体に有害な抗体の産生を誘導しない、任意の担体を指す。そのような担体は当業者に周知である。医薬的に許容される担体／賦形剤についての徹底的な議論は、Remington's Pharmaceutical Sciences, Gennaro, AR, ed., 20th edition, 2000: Williams and Wilkins PA, USA.に見ることができる。典型的な医薬的に許容される担体としては、塩、例えば、鉱酸塩（例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩等）、および有機酸の塩（例えば、酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩等）を挙げることができる。例えば、本明細書に記載の組成物は、液体形態で提供されてよく、０．０１〜１％のポリソルベート−８０等の界面活性剤、またはマンニトール、ソルビトールもしくはトレハロース等の糖質添加剤を含むまたは含まない、様々なｐＨ（５〜８）の生理食塩水ベースの水溶液に製剤化されてよい。通常用いられる緩衝液としては、ヒスチジン緩衝液、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、またはクエン酸緩衝液が挙げられる。
【０１１３】
「組換え宿主細胞」または「宿主細胞」は、挿入に用いられる方法、例えば、直接取り込み、形質導入、ｆ接合（ｆ−ｍａｔｉｎｇ）、または、組換え宿主細胞を作製するための当該技術分野で公知の他の方法を問わず、外因性ポリヌクレオチドを含む細胞を指す。外因性ポリヌクレオチドは、組み込まれていない（ｎｏｎｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ）ベクター、例えばプラスミドとして維持されてよく、あるいは宿主ゲノムに組み込まれていてよい。
【０１１４】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを指し、本明細書において互換的に用いられる。すなわち、ポリペプチドに向けた記載は、ペプチドについての記載、およびタンパク質についての記載に同様に適用され、逆もまた同様である。これらの用語は、天然のアミノ酸ポリマー、および、１つ以上のアミノ酸残基が非天然のアミノ酸、例えばアミノ酸類似体であるアミノ酸ポリマーに適用される。本明細書で用いられるこれらの用語は、アミノ酸残基が共有結合性のペプチド結合により結合している全長のタンパク質（すなわち、抗原）を含む、任意の長さのアミノ酸鎖を包含する。
【０１１５】
用語「アミノ酸」は、天然および非天然のアミノ酸、ならびに天然のアミノ酸と類似の様式で機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣剤を指す。天然にコードされているアミノ酸は、２０種類の通常のアミノ酸（アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリン）、ならびにピロリシン（ｐｙｒｏｌｙｓｉｎｅ）およびセレノシステインである。アミノ酸類似体は、天然のアミノ酸と同じ基本的な化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基に結合したα炭素を有する化合物、例えばホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。該類似体は、修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）または修飾されたペプチド主鎖を有するが、天然のアミノ酸と同じ基本的な化学構造を保持している。
【０１１６】
アミノ酸は、一般に知られているその３文字記号、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）により推奨されている１文字記号のいずれかによって、本明細書において言及されることがある。同様に、ヌクレオチドは、一般に許容されているその１文字表記によって言及されることがある。
【０１１７】
用語「核酸」は、デオキシリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、またはリボヌクレオチド、および、１本または２本鎖形態のいずれかであるそのポリマーを指す。特に限定しない限り、該用語は、基準核酸と類似の結合特性を有し、かつ、天然のヌクレオチドと類似の様式で代謝される、天然ヌクレオチドの既知の類似体を含む核酸を包含する。別段特に限定しない限り、該用語は、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、アンチセンス技術で用いられるＤＮＡの類似体（ホスホロチオエート、ホスホロアミデート等）を含むオリゴヌクレオチド類似体も指す。別段指示しない限り、特定の核酸配列は、明示的に示した配列のみならず、保存的に修飾されたその変異体（限定されるものではないが、縮重コドン置換を含む）および相補的配列も黙示的に包含する。特に、縮重コドン置換は、１つ以上の選択した（またはすべての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を生成することにより達成し得る（Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991)、Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985)、およびCassol et al. (1992); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)）。
【０１１８】
用語「単離された」および「精製された」は、実質的または本質的に、その自然環境から取り出され、またはその自然環境において濃縮された物質を指す。例えば、単離された核酸は、通常はこれに隣接している核酸、またはサンプル中の他の核酸もしくは成分（タンパク質、脂質等）から分離されたものであり得る。別の例において、ポリペプチドが、実質的に、その自然環境から取り出されている、あるいはその自然環境において濃縮されている場合、該ポリペプチドは精製されている。核酸およびタンパク質の精製および単離方法は、当該技術分野で周知である。
【０１１９】
血液脳関門
一態様において、本明細書は、内因性ＢＢＢ受容体／輸送体上の受容体媒介輸送を介して血液脳関門（ＢＢＢ）を通過できる免疫グロブリンと融合した、ＭＰＳ−ＩＩＩで欠損している酵素（例えばＳＧＳＨ）を利用する、組成物および方法を提供する。標的化のための典型的な内因性輸送体は、ＢＢＢ上のインスリン受容体である。ＢＢＢインスリン受容体は、血中インスリン、および、ＨＩＲＭＡｂのような、ある種のペプチド模倣モノクローナル抗体（ＭＡｂ）の脳内への輸送を仲介する。内因性リガンドまたはペプチド模倣ＭＡｂのいずれかにより、標的となり得る他の内因性輸送体としては、ＢＢＢトランスフェリン受容体、ＢＢＢインスリン様成長因子（ＩＧＦ）受容体、ＢＢＢレプチン受容体、またはＢＢＢ低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体が挙げられる。該組成物および方法は、ＳＧＳＨを、末梢血から血液脳関門を超えてＣＮＳ内へ輸送するために有用である。本明細書において、「血液脳関門」は、末梢循環と脳および脊髄との間の障壁を指し、該障壁は、脳の毛細血管内皮細胞膜内の密着結合により形成され、脳内への分子の輸送を制限する極めて密着した障壁を作り出す：ＢＢＢは、分子量６０Ｄａの尿素程度の小さい分子でさえ制限できるほど密着している。脳内の血液脳関門、脊髄内の血液脊髄関門、および網膜内の血液網膜関門は、中枢神経系（ＣＮＳ）内の隣接する毛細血管関門であり、まとめて血液脳関門またはＢＢＢと称される。
【０１２０】
ＢＢＢは、脳およびＣＮＳのための新たな神経治療薬、診断薬、および研究手段の開発を制限している。ほとんどの巨大分子治療薬、例えば組換えタンパク質、アンチセンス薬、遺伝子医薬品、精製された抗体、またはＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）ベースの薬剤は、薬理学的に意義のある量でＢＢＢを通過しない。一般的に、小分子薬剤はＢＢＢを通過できると仮定されているが、実際には、ＢＢＢを越える輸送は欠如しているため、すべての低分子薬剤の＜２％が脳内で活性である。薬理学的に意義のある量でＢＢＢを通過するためには、分子は、脂溶性でなければならず、分子量が４００ダルトン（Ｄａ）未満である必要があり、大部分の低分子は、これら２つの分子的特徴を持っていない。従って、治療用、診断用、または研究用となる可能性があるほとんどの分子は、薬理学的に活性な量でＢＢＢを通過しない。ＢＢＢを迂回するために、侵襲的な経頭蓋薬物送達戦略、例えば脳室内（ＩＣＶ）注入、脳内（ＩＣ）投与、および対流強化拡散法（ＣＥＤ）が用いられる。脳への経頭蓋薬物送達は、高価で侵襲的な上、ほとんど効果が無い。ＩＣＶ経路は、髄腔内（ＩＴ）経路とも呼ばれ、ＳＧＳＨを、ＩＣＶ経路で投与される薬剤に典型的な脳実質内ではなく、脳の上衣または髄膜表面のみに送達する。脳内でのタンパク質拡散効率は非常に低いため、ＳＧＳＨのような酵素のＩＣ投与は、局所的な送達しかもたらさない。同様に、拡散による薬物透過は限られているため、ＣＥＤ経路は、カテーテル先端近傍の脳において局所的な送達しかもたらさない。
【０１２１】
本明細書に記載の方法は、これらの、侵襲性が高く、かつ一般的に満足できない、ＢＢＢを迂回する方法の代替案を提供し、該代替案は、本明細書に記載のＨＩＲＭＡｂ−ＳＧＳＨ融合抗体組成物を全身投与すると、機能的なＳＧＳＨが、末梢血からＣＮＳ内へ、ＢＢＢを通過できるようにする。本明細書に記載の方法は、所望の二機能性のＨＩＲＭＡｂ−ＳＧＳＨ融合抗体を、末梢血からＣＮＳ内へ輸送するために、ＢＢＢ上のインスリン受容体（例えばヒトインスリン受容体）の発現を利用する。
【０１２２】
内因性受容体
グルコースまたはアミノ酸のような、血中のある種の内因性低分子は、水溶性であり、ある種のＢＢＢ担体系上の担体介在輸送（ＣＭＴ）により、ＢＢＢをまだ透過することができる。例えば、グルコースは、ＧＬＵＴ１グルコース輸送体上のＣＭＴを介してＢＢＢを透過する。Ｌ−ＤＯＰＡのような治療用のアミノ酸を含むアミノ酸は、ＬＡＴ１大型中性アミノ酸輸送体上のＣＭＴを介してＢＢＢを透過する。同様に、血中のある種の内因性巨大分子、例えば、インスリン、トランスフェリン、インスリン様成長因子、レプチン、または低密度リポタンパク質は、ある種のＢＢＢ受容体系上の受容体介在トランスサイトーシス（ＲＭＴ）により、ＢＢＢを透過することができる。例えば、インスリンは、インスリン受容体上のＲＭＴを介してＢＢＢを透過する。トランスフェリンは、トランスフェリン受容体上のＲＭＴを介してＢＢＢを透過する。インスリン様成長因子は、インスリン様成長因子受容体上のＲＭＴを介してＢＢＢを透過し得る。レプチンは、レプチン受容体上のＲＭＴを介してＢＢＢを透過し得る。低密度リポタンパク質は、低密度リポタンパク質受容体上の輸送を介してＢＢＢを透過し得る。
【０１２３】
ＢＢＢは、インスリン受容体を含め、いくつかの高分子を血液から脳へ輸送できるようにする特異的受容体を有することが示されている。特に、インスリン受容体は、本明細書に記載のＨＩＲ  Ａｂ−ＳＧＳＨ融合抗体のための輸送体として適している。本明細書に記載のＨＩＲ−ＳＧＳＨ融合抗体は、ヒトインスリン受容体の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に結合する。
【０１２４】
インスリン受容体、およびその細胞外のインスリン結合ドメイン（ＥＣＤ）は、当該技術分野で、構造的および機能的に広く特徴付けられている。例えば、Yip et al. (2003), J Biol. Chem, 278(30):27329-27332、およびWhittaker et al.(2005), J Biol Chem, 280(22):20932-20936を参照のこと。ヒトインスリン受容体のアミノ酸およびヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ＿０００２０８に見ることができる。
【０１２５】
インスリン受容体媒介輸送系に結合する抗体
ＭＰＳ−ＩＩＩで欠損している酵素（例えばＳＧＳＨ）を、ＣＮＳへ送達する非侵襲的なアプローチの一つは、ＳＧＳＨを、インスリン受容体のＥＣＤに選択的に結合する抗体と融合することである。それにより、ＢＢＢ上に発現したインスリン受容体は、ＢＢＢを超えてＳＧＳＨを輸送するベクターとして働くことができる。ある種のＥＣＤ特異抗体は、内因性リガンドを模倣し得ることから、特異的受容体系上の輸送を介して細胞膜障壁を通過する。そのようなインスリン受容体抗体は、図１に概略的に示すように、分子的「トロイの木馬」または「ＴＨ」として働く。ＳＧＳＨは、単独では通常、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過しない。しかし、ＳＧＳＨをＴＨと融合すると、ＩＲのような、脳内のＢＢＢと脳細胞膜の両方に発現している内因性ＢＢＢ受容体上の輸送により、該酵素は、ＢＢＢおよび脳細胞膜を通過できる（図１）。
【０１２６】
従って、抗体および他の高分子は通常、脳から排除されるという事実にもかかわらず、それらが、ＢＢＢ上に発現した受容体、例えばインスリン受容体の細胞外ドメインに対し特異性を有する場合、それらは、分子を脳実質内へ送達する有用な媒体となり得る。いくつかの態様において、ＨＩＲ  Ａｂ−ＳＧＳＨ融合抗体は、ヒトＢＢＢ  ＨＩＲ上の外表面エピトープを結合し、この結合は、該融合抗体が、ヒトＢＢＢインスリン受容体により仲介される輸送反応を介してＢＢＢを通過できるようにする。
【０１２７】
用語「抗体」は、天然か、または、部分的もしくは完全に合成的に製造された、免疫グロブリンを表す。該用語は、抗原結合ドメインであるか、または抗原結合ドメインに相同である、結合ドメインを有する、任意のポリペプチドまたはタンパク質も含む。ＣＤＲ移植抗体も、該用語により考慮される。
【０１２８】
「自然抗体」および「自然免疫グロブリン」は、通常、２本の同一の軽（Ｌ）鎖および２本の同一の重（Ｈ）鎖からなる、約１５０，０００ダルトンのヘテロ４量体糖タンパク質である。一般的に、各軽鎖は、１つの共有結合性のジスルフィド結合により重鎖と結合しているが、ジスルフィド結合の数は、様々な免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の間で異なる。各重鎖および軽鎖は、規則的な間隔で配置された鎖内ジスルフィド架橋も有する。各重鎖は、その一方の端に、可変領域（「ＶＨ」）と、それに続く複数の定常領域（「ＣＨ」）を有する。各軽鎖は、一方の端に可変領域（「ＶＬ」）を、もう一方の端に定常領域（「ＣＬ」）を有し、軽鎖の定常領域は重鎖の１番目の定常領域と並び、軽鎖の可変領域は重鎖の可変領域と並ぶ。特定のアミノ酸残基は、軽鎖可変領域と重鎖可変領域との間の接触面を形成すると考えられる。
【０１２９】
用語「可変領域」は、ファミリーメンバー間（すなわち、異なるアイソフォーム間または異なる種において）で配列が大幅に異なるタンパク質ドメインを指す。抗体に関して、用語「可変領域」は、特定の抗原に対する特定の各抗体の結合および特異性に用いられる、抗体の可変領域を指す。しかし、可変性は、抗体の可変領域全体に均一に分布しているのではない。可変性は、軽鎖可変領域内と重鎖可変領域内の両方にある、超可変領域と呼ばれる３つの部分に集中している。可変領域の、より高度に保存された部分は、「フレームワーク領域」または「ＦＲ」と呼ばれる。修飾されていない重鎖および軽鎖の可変領域はそれぞれ、４つのＦＲ（それぞれ、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４）を含み、該ＦＲは、主にβシート構造をとって、３つの超可変領域でつながっており、該超可変領域は、該βシート構造をつなぐループを形成し、場合によっては、該βシート構造の一部を形成する。各鎖内の超可変領域は、ＦＲによりごく近接してまとまり、別の鎖からの超可変領域と共にまとまって、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.(1991), pages 647-669を参照）。定常領域は、抗体と抗原との結合には直接関与しないが、様々なエフェクター機能、例えば、抗体依存性細胞毒性への抗体の関与を示す。
【０１３０】
本明細書において、用語「超可変領域」は、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、抗原に相補的に直接結合し、それぞれＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３として知られている、３つの「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基を含む。
【０１３１】
軽鎖可変領域において、ＣＤＲは、一般的に、およそ残基２４−３４（ＣＤＲＬ１）、５０−５６（ＣＤＲＬ２）、および８９−９７（ＣＤＲＬ３）に対応し、重鎖可変領域において、ＣＤＲは、一般的に、およそ残基３１−３５（ＣＤＲＨ１）、５０−６５（ＣＤＲＨ２）、および９５−１０２（ＣＤＲＨ３）に対応し（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.(1991)）、および／または、「超可変ループ」からの残基（すなわち、軽鎖可変領域内の残基２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）、および９１−９６（Ｌ３）、ならびに、重鎖可変領域内の残基２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）、および９６−１０１（Ｈ３）（Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901 917(1987)）。
【０１３２】
本明細書において、「可変フレームワーク領域」または「ＶＦＲ」は、抗原結合ポケットまたは抗原結合溝の一部を形成し、および／または、抗原と接触し得る、フレームワーク残基を指す。いくつかの態様において、フレームワーク残基は、抗原結合ポケットまたは抗原結合溝の一部であるループを形成する。ループ中のアミノ酸残基は、抗原に接触してもしなくてもよい。ある態様において、ＶＦＲのループアミノ酸は、抗体、抗体重鎖、または抗体軽鎖の三次元構造を調べることにより決定される。溶媒が接近可能なアミノ酸の位置は、ループを形成する可能性が高い、および／または抗体可変領域において抗原接触をもたらす可能性が高いことから、三次元構造は、そのような位置について解析し得る。一部の、溶媒が接近可能な位置は、アミノ酸配列の多様性を許容することができ、他のもの（例えば構造的位置）は多様性に乏しいことがある。抗体可変領域の三次元構造は、結晶構造またはタンパク質モデリングから導くことができる。いくつかの態様において、ＶＦＲは、Kabat et al., 1991により定義される位置である、重鎖可変領域のアミノ酸位置７１〜７８に対応するアミノ酸位置を含むか、実質的に該アミノ酸位置からなるか、または該アミノ酸位置からなる。いくつかの態様において、ＶＦＲは、ＣＤＲＨ２とＣＤＲＨ３との間に位置するフレームワーク領域３の部分を形成する。ＶＦＲは、標的抗原と接触するためによい位置にあるループを形成するか、または、抗原結合ポケットの一部を形成することができる。
【０１３３】
免疫グロブリンの重鎖の定常領域のアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンを、異なるクラスに割り当てることができる。免疫グロブリンには、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭの５つの主要なクラスがあり、これらのいくつかはさらに、サブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、およびＩｇＡ２に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常領域（Ｆｃ）はそれぞれ、α、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造および三次元構造は、よく知られている。
【０１３４】
任意の脊椎動物種からの抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、その定常領域のアミノ酸配列に基づいて、「κ」および「λ」と呼ばれる、２つの明確に異なる種類のうちの１つに割り当てることができる。
【０１３５】
本明細書に記載の抗体または融合抗体に関して、用語「選択的に結合する」（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ  ｂｉｎｄ）、「選択的に結合した」（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ  ｂｉｎｄｉｎｇ）、「特異的に結合する」（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ｂｉｎｄｓ）、または「特異的に結合した」（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ｂｉｎｄｉｎｇ）は、抗体または融合抗体とその標的抗原との結合を指し、その解離定数（Ｋｄ）は約１０−６Ｍ、またはそれ未満、すなわち、１０−７、１０−８、１０−９、１０−１０、１０−１１または１０−１２Ｍである。
【０１３６】
本明細書において、用語「抗体」は、抗原と特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ以上のフラグメントも意味すると理解される（一般的には、Holliger et al., Nature Biotech. 23(9) 1126-1129(2005)を参照）。そのような抗体の非限定的例としては、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、およびＣＨ１ドメインからなる一価のフラグメント（ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）であるＦａｂフラグメント、（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋により結合する２つのＦａｂフラグメントを含む二価のフラグメント（ｂｉｖａｌｅｎｔ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）であるＦ（ａｂ’）２フラグメント、（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント、（ｉｖ）抗体の単一アーム（ｓｉｎｇｌｅ  ａｒｍ）のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント（Ward et al., (1989) Nature 341:544 546）、および（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメインＶＬおよびＶＨは、別々の遺伝子によりコードされるが、組換え法を用いて、合成リンカーにより連結することができ、該合成リンカーは、ＶＬ領域およびＶＨ領域が組み合わさって一価の分子（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる；例えば、Bird et al. (1988) Science 242:423 426、およびHuston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879 5883、およびOsbourn et al. (1998) Nat. Biotechnol. 16:778を参照）を形成する１本鎖タンパク質としてこれらを生成することを可能にする。そのような一本鎖抗体も、用語抗体に包含されるものとする。完全なＩｇＧ分子または他のアイソタイプをコードする発現ベクターを作製するため、具体的なｓｃＦｖの任意のＶＨ配列およびＶＬ配列を、ヒト免疫グロブリン定常領域のｃＤＮＡまたはゲノム配列と結合することができる。ＶＨおよびＶＬは、タンパク質化学または組換えＤＮＡ技術のいずれかを用いて、免疫グロブリンのＦａｂ、Ｆｖ、または他のフラグメントを作製するために用いることもできる。ダイアボディのような、一本鎖抗体の他の形態も包含される。
【０１３７】
「Ｆ（ａｂ’）２」および「Ｆａｂ’」部分は、免疫グロブリン（モノクローナル抗体）を、ペプシンおよびパパインのようなプロテアーゼで処理することにより生成させることができ、該部分は、免疫グロブリンを、２本の各Ｈ鎖内のヒンジ領域の間に存在するジスルフィド結合の近くで消化することにより生じる抗体フラグメントを含む。例えば、パパインは、ＩｇＧを、２本の各Ｈ鎖内のヒンジ領域の間に存在するジスルフィド結合の上流で切断して、２つの相同な抗体フラグメントを生じ、ここに、ＶＬ（Ｌ鎖可変領域）およびＣＬ（Ｌ鎖定常領域）からなるＬ鎖、およびＶＨ（Ｈ鎖可変領域）およびＣＨγ１（Ｈ鎖の定常領域内のγ１領域）からなるＨ鎖フラグメントが、それらのＣ末端領域でジスルフィド結合を介してつながっている。これら２つの相同な抗体フラグメントはそれぞれ、Ｆａｂ’と呼ばれる。ペプシンは、ＩｇＧを、２本の各Ｈ鎖内のヒンジ領域の間に存在するジスルフィド結合の下流で切断して、上記のＦａｂ’がヒンジ領域でつながっているフラグメントよりもわずかに大きい抗体フラグメントを生じる。この抗体フラグメントは、Ｆ（ａｂ’）２と呼ばれる。
【０１３８】
Ｆａｂフラグメントは、軽鎖の定常領域、および重鎖の１番目の定常領域（ＣＨ１）も含む。Ｆａｂ’フラグメントは、抗体ヒンジ領域からの１つ以上のシステインを含め、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端に数残基が付加されている点で、Ｆａｂフラグメントと異なる。本明細書において、Ｆａｂ’−ＳＨは、定常領域のシステイン残基が遊離チオール基を有するＦａｂ’の名称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントは、当初、Ｆａｂ’フラグメントの間にヒンジシステインを有する、Ｆａｂ’フラグメントの対として生成された。抗体フラグメントの他の化学結合も知られている。
【０１３９】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識部位および抗原結合部位を含む、最小限の抗体フラグメントである。この領域は、密で非共有結合的に会合した、１つの重鎖可変領域および１つの軽鎖可変領域の二量体からなる。各可変領域の３つの超可変領域が相互作用して、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面上の抗原結合部位を規定するのは、この立体配置である。合計で６つの超可変領域が、抗体へ抗原結合特異性を付与する。しかし、単一の可変領域（または抗原に特異的な３つの超可変領域のみを含むＦｖの半分）でさえ、完全な結合部位よりも親和性は低いものの、抗原を認識し結合する能力を有する。
【０１４０】
「一本鎖Ｆｖ」または「ｓＦｖ」抗体フラグメントは、抗体のＶＨ、ＶＬ、または、ＶＨとＶＬドメインの両方を含み、ここで両ドメインは１本鎖ポリペプチド内に存在する。いくつかの態様において、Ｆｖポリペプチドはさらに、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間に、ポリペプチドリンカーを含み、ｓＦｖが、抗原結合に望ましい構造を形成できるようにする。ｓＦｖの総説については、例えばPluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269 315 (1994)を参照のこと。
【０１４１】
「キメラ」抗体は、異なる哺乳類の組み合わせからの抗体を含む。哺乳類は、例えば、ウサギ、マウス、ラット、ヤギ、またはヒトであってよい。異なる哺乳類の組み合わせとしては、ヒトおよびマウス起源からのフラグメントの組み合わせが挙げられる。
【０１４２】
いくつかの態様において、本明細書に記載の抗体はモノクローナル抗体（ＭＡｂ）、典型的には、マウスモノクローナル抗体のヒト化により得られる、キメラヒト−マウス抗体である。該抗体は、例えば、抗原投与に応答して特異的ヒト抗体を産生するように「設計された」遺伝子導入マウスから得られる。この技術では、内因性の重鎖および軽鎖遺伝子座の標的破壊を含む胚性幹細胞株に由来するマウスの系統に、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子座のエレメントを導入する。遺伝子導入マウスは、ヒト抗原に特異的なヒト抗体を合成することができ、ヒト抗体分泌ハイブリドーマを産生するために、該マウスを用いることができる。
【０１４３】
ヒトにおける使用のために、ＨＩＲ  Ａｂは、ヒトに投与された場合に、有意に免疫原性とならないような十分なヒト配列、例えば、約８０％ヒトおよび約２０％マウス、約８５％ヒトおよび約１５％マウス、約９０％ヒトおよび約１０％マウス、約９５％ヒトおよび５％マウス、約９５％を越えるヒトおよび約５％未満のマウス、または１００％ヒト配列を含むことが好ましい。ＨＩＲ  ＭＡｂの、より高度にヒト化された形態も設計することができ、該ヒト化ＨＩＲ  Ａｂは、マウスＨＩＲ  Ａｂに匹敵する活性を有し、本明細書に記載の態様に用いることができる。例えば、２００２年１１月２７日に出願された米国特許出願公報２００４０１０１９０４、および２００５年２月１７日に出願された米国特許出願公報２００５０１４２１４１を参照のこと。本態様で用いる十分なヒト配列を有するヒトＢＢＢインスリン受容体に対するヒト化抗体は、例えば、Boado et al. (2007), Biotechnol Bioeng, 96(2):381-391に記載されている。
【０１４４】
典型的な態様において、ＨＩＲ抗体またはそれから由来する融合抗体（例えば、ＨＩＲ−ＳＧＨＳ、ＨＩＲ−ＮＧＬＵ、ＨＩＲ−ＨＧＳＮＡＴ、ＨＩＲ−ＧＮＳ）は、図７（配列番号１−３）に記載のＨＣ  ＣＤＲ、またはその変異体の、少なくとも１つの配列に相当するＣＤＲを含む免疫グロブリン重鎖を含む。例えば、１、２、３、４、５もしくは６以下の単一アミノ酸突然変異を含む配列番号１のアミノ酸配列に対応するＨＣ  ＣＤＲ１、１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０以下の単一アミノ酸突然変異を含む配列番号２のアミノ酸配列に対応するＨＣ  ＣＤＲ２、または、１もしくは２以下の単一アミノ酸突然変異を含む配列番号３のアミノ酸配列に対応するＨＣ  ＣＤＲ３、ここで該単一アミノ酸突然変異は、置換、欠失、または挿入である。
【０１４５】
別の態様において、ＨＩＲ  Ａｂまたは融合Ａｂ（例えば、ＨＩＲ  Ａｂ−ＳＧＨＳ、ＨＩＲ  Ａｂ−ＮＧＬＵ、ＨＩＲ−Ａｂ  ＨＧＳＮＡＴ、ＨＩＲ  Ａｂ−ＧＮＳ）は、そのアミノ酸配列が、（図５に示す）配列番号７と少なくとも５０％同一である（すなわち、少なくとも５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００％以下の任意の他のパーセント同一である）免疫グロブリンＨＣを含む。
【０１４６】
いくつかの態様において、ＨＩＲ  Ａｂまたは融合Ａｂ（例えば、ＨＩＲ  Ａｂ−ＳＧＨＳ、ＨＩＲ  Ａｂ−ＮＧＬＵ、ＨＩＲ  Ａｂ−ＨＧＳＮＡＴ、ＨＩＲ  Ａｂ−ＧＮＳ）は、図７（配列番号４−６）に記載のＬＣ  ＣＤＲ、またはその変異体の、少なくとも１つの配列に対応するＣＤＲを含む免疫グロブリン軽鎖を含む。例えば、１、２、３、４もしくは５以下の単一アミノ酸突然変異を含む配列番号４のアミノ酸配列に対応するＬＣ  ＣＤＲ１、１、２、３もしくは４以下の単一アミノ酸突然変異を含む配列番号５のアミノ酸配列に対応するＬＣ  ＣＤＲ２、または、１、２、３、４もしくは５以下の単一アミノ酸突然変異を含む配列番号６のアミノ酸配列に対応するＬＣ  ＣＤＲ３。
【０１４７】
別の態様において、ＨＩＲ  Ａｂまたは融合Ａｂ（例えば、ＨＩＲ  Ａｂ−ＳＧＨＳ、ＨＩＲ  Ａｂ−ＮＧＬＵ、ＨＩＲ  Ａｂ−ＨＧＳＮＡＴ、ＨＩＲ  Ａｂ−ＧＮＳ）は、そのアミノ酸配列が、（図６に示す）配列番号８と少なくとも５０％同一である（すなわち、少なくとも５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００％以下の任意の他のパーセント同一である）免疫グロブリンＬＣを含む。
【０１４８】
さらに別の態様において、ＨＩＲ  Ａｂまたは融合Ａｂ（例えば、ＨＩＲ  Ａｂ−ＳＧＨＳ、ＨＩＲ  Ａｂ−ＮＧＬＵ、ＨＩＲ  Ａｂ−ＨＧＳＮＡＴ、ＨＩＲ  Ａｂ−ＧＮＳ）は、上記のＨＩＲ重鎖およびＨＩＲ軽鎖のいずれかに対応する重鎖と軽鎖の両方を含む。
【０１４９】
本明細書のＨＩＲ抗体は、グリコシル化されていても、されていなくてもよい。抗体がグリコシル化される場合は、抗体の機能に有意に影響しない任意のパターンのグリコシル化を用いてよい。グリコシル化は、抗体が作られる細胞に特有のパターンで起こり得、細胞タイプによって異なってもよい。例えば、マウス骨髄腫細胞により産生されるモノクローナル抗体のグリコシル化パターンは、トランスフェクトしたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞により産生されるモノクローナル抗体のグリコシル化パターンと異なり得る。いくつかの態様において、抗体は、トランスフェクトしたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞により産生されるパターンでグリコシル化される。
【０１５０】
当業者は、現在の技術により、莫大な数の候補ＨＩＲ  Ａｂまたは既知ＨＩＲ  Ａｂの配列変異体を、（例えばインビトロで）容易に作製することができ、標的抗原、例えば、ヒトインスリン受容体のＥＣＤ、またはその単離されたエピトープとの結合について容易にスクリーニングすることができることを、十分理解するであろう。抗体配列変異体のウルトラハイスループットスクリーニングの一例については、例えば、（オンラインで発行された）Fukuda et al. (2006)「In vitro evolution of single-chain antibodies using mRNA display」Nuc. Acid Res., 34(19)を参照のこと。Chen et al. (1999)「In vitro scanning saturation mutagenesis of all the specificity determining residues in an antibody binding site」Prot Eng, 12(4): 349-356も参照のこと。インスリン受容体ＥＣＤは、例えばColoma et al. (2000) Pharm Res, 17:266-274に記載されているように精製することができ、ＨＩＲ  Ａｂ、および既知のＨＩＲ  ＡｂのＨＩＲ  Ａｂ配列変異体をスクリーニングするために用いられる。
【０１５１】
従って、いくつかの態様において、二機能性の分子である組み換え融合抗体を作製するために、所望のレベルのヒト配列を有する遺伝的に設計されたＨＩＲ  Ａｂを、ＭＰＳ−ＩＩＩで欠損している酵素（例えばＳＧＳＨ）と融合する。例えば、ＨＩＲ  Ａｂ−ＳＧＳＨ融合抗体は、（ｉ）ヒトインスリン受容体の細胞外ドメインに結合し、（ｉｉ）ヘパラン硫酸中の硫酸エステル結合の加水分解を触媒し、（ｉｉｉ）ＢＢＢ  ＨＩＲ上の輸送を介してＢＢＢを通過することができ、かつ、末梢投与に続いて、一旦脳内に入ると、ＳＧＳＨ活性を保持することができる。
【０１５２】
Ｎ−スルフォグルコサミンスルフォヒドロラーゼ（ＳＧＳＨ）
組み換えＳＧＳＨの全身投与（例えば、静脈注射による）が、ＭＰＳ−ＩＩＩＡに罹患した患者のＣＮＳにおけるＳＧＳＨの欠損を救うことは期待できない。ＳＧＳＨはＢＢＢを通過せず、ＢＢＢを越える酵素の輸送の欠如により、末梢投与された後、ＣＮＳにおいて意義のある治療効果を有することが妨げられる。しかし、本発明者らは、ＨＩＲ  ＡｂなどのＢＢＢを通過する抗体とＳＧＳＨが（例えば、共有結合性のリンカーにより）融合すると、この酵素が、非侵襲的な末梢投与経路（例えば、静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、腹腔内投与、または経口投与でさえ）をたどって、血液からＣＮＳに入ることができるようになることを見いだした。ＨＩＲ  Ａｂ−ＳＧＳＨ融合抗体の投与は、末梢血から脳内へのＳＧＳＨ活性の送達を可能にする。本明細書は、ＣＮＳにおけるＳＧＳＨ欠損症を治療するために治療的に有効なＨＩＲ  Ａｂ−ＳＧＳＨ融合抗体の全身用量を決定することについて記載する。本明細書に記載されているように、ＨＩＲ  Ａｂ−ＳＧＳＨ融合抗体の適切な全身用量は、ＨＩＲ  Ａｂ−酵素融合抗体のＣＮＳ取り込み特性および酵素活性の、定量的な決定に基づいて確立される。
【０１５３】
ヘパラン硫酸は、中枢神経系内の乏突起膠細胞で合成される硫酸化グリコサミノグリカンである。本明細書において、ＳＧＳＨ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＰ＿０００１９０に記載のヒトＳＧＳＨ配列）は、ヘパラン硫酸からのＮ−結合硫酸エステルの加水分解を触媒することができる、任意の天然または人工酵素を指す。
【０１５４】
ＳＧＳＨは、ＳＧＳＨ酵素活性の発現のために特定の翻訳後修飾を必要とする、スルファターゼファミリーのメンバーである。ＳＧＳＨ酵素の活性は、ホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）とも称されるスルファターゼ修飾因子タイプ１（ＳＵＭＦ１）により、（シグナルペプチドを含む無傷なＳＧＳＨタンパク質の）Ｃｙｓ−７０がホルミルグリシン残基に変換されると活性化される。いくつかの態様において、ＳＧＳＨを含む融合抗体は、スルファターゼ修飾因子タイプ１（ＳＵＭＦ１）により翻訳後修飾されている。いくつかの態様において、翻訳後修飾は、システインからホルミルグリシンへの変換を含む。いくつかの態様において、融合抗体は、ホルミルグリシン残基を含むＳＧＳＨを含む。
【０１５５】
いくつかの態様において、ＳＧＳＨは、ヒトＳＧＳＨのアミノ酸配列と少なくとも５０％同一である（すなわち、少なくとも５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００％以下の任意の他のパーセント同一である）アミノ酸配列を有し、ヒトＳＧＳＨは、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＰ＿０００１９０に記載の５０２アミノ酸のタンパク質であるか、または、２０アミノ酸のシグナルペプチドを欠き、かつ配列番号９（図８）に対応する、その４８２アミノ酸サブ配列である。ヒトＳＧＳＨの構造機能相関は研究されており、Scott et al. (1995),「Cloning of the sulphamidase gene and identification of mutations in Sanfilippo A syndrome」, Nature Genetics, 11:465-467に記載されているように、Ｃｙｓ−７０は、翻訳後修飾のためにスルファターゼにおいて保存されている残基である。Ａｓｐ−５１残基は、Gliddon et al. (2004),「Purification and characterization of recombinant murine sulfamidase」, Molec. Genet. Metab. 83:239-245に記載されているように、二価陽イオンの結合に関与する。Ｎ−結合グリコシル化部位は、アミノ酸付番方式が２０アミノ酸のシグナルペプチドを含む、DiNatale et al. (2001),「Heparan N-sulfatase: in vitro mutagenesis of potential N-glycosylation sites」, Biochem. Biophys. Res. Comm. 280:1251-1257に記載されているように、Ａｓｎ−４１、Ａｓｎ−１４２、Ａｓｎ−１５１、Ａｓｎ−２６４、およびＡｓｎ−４１３に存在する。
【０１５６】
いくつかの態様において、ＳＧＳＨは、（図８に示す）配列番号９と少なくとも５０％同一である（すなわち、少なくとも５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００％以下の任意の他のパーセント同一である）アミノ酸配列を有する。配列番号９などの標準的なＳＧＳＨ配列の配列変異体は、例えば、特定のドメインに対応する全配列または具体的なサブ配列のランダム変異導入法により、生成され得る。あるいは、上記のものなどＳＧＳＨの機能に不可欠であることが知られている残基への突然変異を防ぎながらも、部位特異的突然変異誘発法を反復して実施することができる。さらに、ＳＧＳＨ配列の複数の変異体の生成において、厳密なランダム変異導入法により生成するであろう機能しない配列変異体の数を大幅に減らすため、突然変異寛容性予測プログラムを用いることができる。タンパク質配列内のアミノ酸置換のタンパク質機能への影響を予測する様々なプログラム（例えば、ＳＩＦＴ、ＰｏｌｙＰｈｅｎ、ＰＡＮＴＨＥＲ  ＰＳＥＣ、ＰＭＵＴ、およびＴｏｐｏＳＮＰ）は、例えば、Henikoff et al. (2006),「Predicting the Effects of Amino Acid Substitutions on Protein Function」, Annu. Rev. Genomics Hum. Genet., 7:61-80に記載されている。ＳＧＳＨ配列変異体は、当該技術分野で既知の蛍光定量的酵素アッセイにより、ＳＧＳＨ活性／ＳＧＳＨ活性の保持についてスクリーニングすることができる（Karpova et al. (1996): A fluorimetric enzyme assay for the diagnosis of Sanfilippo disease type A (MPS IIIA), J. Inher. Metab. Dis. 19: 278-285）。従って、当業者は、上記のように、当該技術分野で所定の方法により、ＳＧＳＨ配列変異体の極めて多様な「ライブラリー」を作製しスクリーニングすることにより、非常に多くの使用可能なＳＧＳＨ配列変異体を得ることができることを、十分理解するであろう。
【０１５７】
配列相同性パーセント（ｐｅｒｃｅｎｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ）は、通常の方法によって決定される。例えば、Altschul et al., Bull. Math. Bio. 48:603 (1986)、およびHenikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1992)を参照のこと。簡潔に述べると、２つのアミノ酸配列を並べて、ギャップオープニングペナルティー（ｇａｐ  ｏｐｅｎｉｎｇ  ｐｅｎａｌｔｙ）を１０で用い、ギャップエクステンションペナルティー（ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ）を１で用い、かつ、Henikoff and Henikoff（前記）の「ＢＬＯＳＵＭ６２」スコアリングマトリックスを用いてアライメントスコアを最適化する。次いで、相同性パーセントを、（［完全な一致の総数］／［より長い配列の長さ＋２つの配列を並べるためにより長い配列に導入されたギャップの数］）（１００）として計算する。
【０１５８】
当業者であれば、２つのアミノ酸配列を並べるために多くの確立されたアルゴリズムが入手可能であることを十分理解しているであろう。ピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）とリップマン（Ｌｉｐｍａｎ）の「ＦＡＳＴＡ」類似性検索アルゴリズムは、本明細書で開示されているアミノ酸配列と他のペプチドのアミノ酸配列によって共有されている相同性のレベルを調べるための適切なタンパク質アライメント法である。ＦＡＳＴＡアルゴリズムは、Pearson and Lipman, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)、およびPearson, Meth. Enzymol. 183:63 (1990)に記載されている。簡潔に述べると、ＦＡＳＴＡは、最初に、保存的アミノ酸置換、挿入、または欠失を考慮することなく、最も高密度の相同性（ｋｔｕｐ変数が１の場合）または相同性の対（ｋｔｕｐ＝２の場合）のいずれかを有するテスト配列と、問い合わせ配列（例えば、配列番号９または配列番号１６）によって共有されている領域を同定することによって配列類似性を特徴付ける。次いで、アミノ酸置換マトリックスを用いて、全ての対になったアミノ酸の類似性を比較することによって、最も高密度の相同性を有する１０の領域をリスコアし（ｒｅｓｃｏｒｅｄ）、該領域の末端を「切り取り（ｔｒｉｍｍｅｄ）」、最も高いスコアに寄与している残基のみを含むようにする。「カットオフ」値（配列の長さおよびｋｔｕｐ値に基づいて所定の式によって計算される）を越えるスコアを有するいくつかの領域がある場合は、切り取られた（ｔｒｉｍｍｅｄ）最初の領域を調べて、該領域を連結してギャップを含む近似のアライメントを形成することができるかどうか決定する。最終的に、アミノ酸挿入および欠失を考慮する、ニードルマン（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ）−ブンシュ（Ｗｕｎｓｃｈ）−セラーズ（Ｓｅｌｌｅｒｓ）アルゴリズム（Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:444 (1970)、Sellers, SIAM J. Appl. Math. 26:787 (1974)）の修正を用いて、２つのアミノ酸配列の最も高スコアの領域を並べる。ＦＡＳＴＡ分析用の例示的パラメーターは：ｋｔｕｐ＝１、ギャップオープニングペナルティー＝１０、ギャップエクステンションペナルティー＝１、および置換マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２である。Pearson, Meth. Enzymol. 183:63 (1990)のＡｐｐｅｎｄｉｘ２に説明されているように、スコアリングマトリックスファイル（「ＳＭＡＴＲＩＸ」）を修正することによって、ＦＡＳＴＡプログラムにこれらのパラメーターを導入することができる。
【０１５９】
本態様は、本明細書で開示されているアミノ酸配列と比較して保存的アミノ酸変化を有するタンパク質も含む。例えば、通常のアミノ酸の中で、「保存的アミノ酸置換」は、下記の群のそれぞれの範囲内のアミノ酸の中での置換によって説明される：（１）グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン、（２）フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン、（３）セリンおよびスレオニン、（４）アスパラギン酸およびグルタミン酸、（５）グルタミンおよびアスパラギン、ならびに（６）リジン、アルギニンおよびヒスチジン。ＢＬＯＳＵＭ６２表はタンパク質配列セグメントの約２，０００の局所的多重アライメントに由来するアミノ酸置換マトリックスであり、５００群を超える関連タンパク質の高度に保存された領域を表している（Henikoff and Henikoff, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89:10915 (1992)）。従って、ＢＬＯＳＵＭ６２置換頻度は、本態様のアミノ酸配列に導入されてよい保存的アミノ酸置換を規定するために用いることができる。（上記のような）化学的性質のみに基づいてアミノ酸置換を設計することが可能であるが、用語「保存的アミノ酸置換」は、好ましくは−１を越えるＢＬＯＳＵＭ６２値によって表される置換を指す。例えば、０、１、２、または３のＢＬＯＳＵＭ６２値によって置換が特徴付けられている場合、アミノ酸置換は保存的である。このシステムに従うと、好ましい保存的アミノ酸置換は、少なくとも１（例えば、１、２または３）のＢＬＯＳＵＭ６２値によって特徴付けられ、一方、より好ましい保存的アミノ酸置換は、少なくとも２（例えば、２または３）のＢＬＯＳＵＭ６２値によって特徴付けられる。
【０１６０】
配列が本態様の組成物および方法において機能を有するために十分な生物学的タンパク質活性を保持している限り、アミノ酸配列は付加的な残基、例えば付加的なＮ末端またはＣ末端アミノ酸を含んでよく、本明細書で開示されている配列の１つに依然として本質的に記載されていることも理解されるであろう。
【０１６１】
α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（ＮＡＧＬＵ）
組み換えＮＡＧＬＵの全身投与（例えば、静脈注射による）が、ＭＰＳ−ＩＩＩＡに罹患した患者のＣＮＳにおけるＮＡＧＬＵの欠損を救うことは期待できない。ＮＡＧＬＵはＢＢＢを通過せず、ＢＢＢを越える酵素の輸送の欠如により、末梢投与された後、ＣＮＳにおいて意義のある治療効果を有することが妨げられる。しかし、本発明者らは、ＨＩＲ  ＡｂなどのＢＢＢを通過する抗体とＮＡＧＬＵが（例えば、共有結合性のリンカーにより）融合すると、この酵素が、非侵襲的な末梢投与経路（例えば、静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、腹腔内投与、または経口投与でさえ）をたどって、血液からＣＮＳに入ることができるようになることを見いだした。ＨＩＲ  Ａｂ−ＮＡＧＬＵ融合抗体の投与は、末梢血から脳内へのＮＡＧＬＵ活性の送達を可能にする。本明細書は、ＣＮＳにおけるＮＡＧＬＵ欠損症を治療するために治療的に有効なＨＩＲ  Ａｂ−ＮＡＧＬＵ融合抗体の全身用量を決定することについて記載する。本明細書に記載されているように、ＨＩＲ  Ａｂ−ＮＡＧＬＵ融合抗体の適切な全身用量は、ＨＩＲ  Ａｂ−酵素融合抗体のＣＮＳ取り込み特性および酵素活性の、定量的な決定に基づいて確立される。
【０１６２】
本明細書において、ＮＡＧＬＵ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＰ＿０００２５４に記載のヒトＮＡＧＬＵ配列）は、Ｎ−アセチル−α−Ｄ−グルコサミニド中のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基の加水分解を触媒することができる、任意の天然または人工酵素を指す。
【０１６３】
いくつかの態様において、ＮＡＧＬＵは、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＰ＿０００２５４に記載のタンパク質、ヒトＮＡＧＬＵのアミノ酸配列と少なくとも５０％同一である（すなわち、少なくとも５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００％以下の任意の他のパーセント同一である）アミノ酸配列を有する。いくつかの態様において、ＮＡＧＬＵは、配列番号１７と少なくとも５０％同一である（すなわち、少なくとも５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００％以下の任意の他のパーセント同一である）アミノ酸配列を有する。配列番号１７などの標準的なＮＡＧＬＵ配列の配列変異体は、例えば、特定のドメインに対応する全配列または具体的なサブ配列のランダム変異導入法により、生成され得る。あるいは、上記のものなどＮＡＧＬＵの機能に不可欠であることが知られている残基への突然変異を防ぎながらも、部位特異的突然変異誘発法を反復して実施することができる。さらに、ＮＡＧＬＵ配列の複数の変異体の生成において、厳密なランダム変異導入法により生成するであろう機能しない配列変異体の数を大幅に減らすため、突然変異寛容性予測プログラムを用いることができる。タンパク質配列内のアミノ酸置換のタンパク質機能への影響を予測する様々なプログラム（例えば、ＳＩＦＴ、ＰｏｌｙＰｈｅｎ、ＰＡＮＴＨＥＲ  ＰＳＥＣ、ＰＭＵＴ、およびＴｏｐｏＳＮＰ）は、例えば、Henikoff et al. (2006),「Predicting the Effects of Amino Acid Substitutions on Protein Function」, Annu. Rev. Genomics Hum. Genet., 7:61-80に記載されている。ＮＡＧＬＵ配列変異体は、当該技術分野で公知の蛍光定量的酵素アッセイにより、ＮＡＧＬＵ活性／ＮＡＧＬＵ活性の保持についてスクリーニングすることができる。従って、当業者は、上記のように、当該技術分野で所定の方法により、ＮＡＧＬＵ配列変異体の極めて多様な「ライブラリー」を作製しスクリーニングすることにより、非常に多くの使用可能なＮＡＧＬＵ配列変異体が得ることができることを、十分理解するであろう。
【０１６４】
ヘパリン−α−グルコサミニドＮ‐アセチルトランスフェラーゼ（ＨＧＳＮＡＴ）
組み換えＨＧＳＮＡＴの全身投与（例えば、静脈注射による）が、ＭＰＳ−ＩＩＩＡに罹患した患者のＣＮＳにおけるＨＧＳＮＡＴの欠損を救うことは期待できない。ＨＧＳＮＡＴはＢＢＢを通過せず、ＢＢＢを越える酵素の輸送の欠如により、末梢投与された後、ＣＮＳにおいて意義のある治療効果を有することが妨げられる。しかし、本発明者らは、ＨＩＲ  ＡｂなどのＢＢＢを通過する抗体とＨＧＳＮＡＴが（例えば、共有結合性のリンカーにより）融合すると、この酵素が、非侵襲的な末梢投与経路（例えば、静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、腹腔内投与、または経口投与でさえ）をたどって、血液からＣＮＳに入ることができるようになることを見いだした。ＨＩＲ  Ａｂ−ＨＧＳＮＡＴ融合抗体の投与は、末梢血から脳内へのＨＧＳＮＡＴ活性の送達を可能にする。本明細書は、ＣＮＳにおけるＨＧＳＮＡＴ欠損症を治療するために治療的に有効なＨＩＲ  Ａｂ−ＨＧＳＮＡＴ融合抗体の全身用量を決定することについて記載する。本明細書に記載されているように、ＨＩＲ  Ａｂ−ＨＧＳＮＡＴ融合抗体の適切な全身用量は、ＨＩＲ  Ａｂ−酵素融合抗体のＣＮＳ取り込み特性および酵素活性の、定量的な決定に基づいて確立される。
【０１６５】
本明細書において、ＨＧＳＮＡＴ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＰ＿６８９６３２に記載のヒトＨＧＳＮＡＴ配列）は、ヘパラン硫酸からのグルコサミン残基のアセチル化を触媒することができる、任意の天然または人工酵素を指す。
【０１６６】
いくつかの態様において、ＨＧＳＮＡＴは、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＰ＿６８９６３２に記載のタンパク質、ヒトＨＧＳＮＡＴのアミノ酸配列と少なくとも５０％同一である（すなわち、少なくとも５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００％以下の任意の他のパーセント同一である）アミノ酸配列を有する。いくつかの態様において、ＨＧＳＮＡＴは、配列番号１９と少なくとも５０％同一である（すなわち、少なくとも５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００％以下の任意の他のパーセント同一である）アミノ酸配列を有する。配列番号１９などの標準的なＨＧＳＮＡＴ配列の配列変異体は、例えば、特定のドメインに対応する全配列または具体的なサブ配列のランダム変異導入法により、生成され得る。あるいは、上記のものなどＨＧＳＮＡＴの機能に不可欠であることが知られている残基への突然変異を防ぎながらも、部位特異的突然変異誘発法を反復して実施することができる。さらに、ＨＧＳＮＡＴ配列の複数の変異体の生成において、厳密なランダム変異導入法により生成するであろう機能しない配列変異体の数を大幅に減らすため、突然変異寛容性予測プログラムを用いることができる。タンパク質配列内のアミノ酸置換のタンパク質機能への影響を予測する様々なプログラム（例えば、ＳＩＦＴ、ＰｏｌｙＰｈｅｎ、ＰＡＮＴＨＥＲ  ＰＳＥＣ、ＰＭＵＴ、およびＴｏｐｏＳＮＰ）は、例えば、Henikoff et al. (2006),「Predicting the Effects of Amino Acid Substitutions on Protein Function」, Annu. Rev. Genomics Hum. Genet., 7:61-80に記載されている。ＨＧＳＮＡＴ配列変異体は、当該技術分野で公知の蛍光定量的酵素アッセイにより、ＨＧＳＮＡＴ活性／ＨＧＳＮＡＴ活性の保持についてスクリーニングすることができる。従って、当業者は、上記のように、当該技術分野で所定の方法により、ＨＧＳＮＡＴ配列変異体の極めて多様な「ライブラリー」を作製しスクリーニングすることにより、非常に多くの使用可能なＨＧＳＮＡＴ配列変異体が得ることができることを、十分理解するであろう。
【０１６７】
組み換えＧＮＳの全身投与（例えば、静脈注射による）が、ＭＰＳ−ＩＩＩＡに罹患した患者のＣＮＳにおけるＧＮＳの欠損を救うことは期待できない。ＧＮＳはＢＢＢを通過せず、ＢＢＢを越える酵素の輸送の欠如により、末梢投与された後、ＣＮＳにおいて意義のある治療効果を有することが妨げられる。しかし、本発明者らは、ＨＩＲ  ＡｂなどのＢＢＢを通過する抗体とＧＮＳが（例えば、共有結合性のリンカーにより）融合すると、この酵素が、非侵襲的な末梢投与経路（例えば、静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、腹腔内投与、または経口投与でさえ）をたどって、血液からＣＮＳに入ることができるようになることを見いだした。ＨＩＲ  Ａｂ−ＧＮＳ融合抗体の投与は、末梢血から脳内へのＧＮＳ活性の送達を可能にする。本明細書は、ＣＮＳにおけるＧＮＳ欠損症を治療するために治療的に有効なＨＩＲ  Ａｂ−ＧＮＳ融合抗体の全身用量を決定することについて記載する。本明細書に記載されているように、ＨＩＲ  Ａｂ−ＧＮＳ融合抗体の適切な全身用量は、ＨＩＲ  Ａｂ−酵素融合抗体のＣＮＳ取り込み特性および酵素活性の、定量的な決定に基づいて確立される。
【０１６８】
本明細書において、ＧＮＳ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＰ＿００２０６７に記載のヒトＧＮＳ配列）は、ヘパラン硫酸からの６−硫酸基の加水分解を触媒することができる、任意の天然または人工酵素を指す。
【０１６９】
いくつかの態様において、ＧＮＳは、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＰ＿００２０６７に記載のタンパク質、ヒトＧＮＳのアミノ酸配列と少なくとも５０％同一である（すなわち、少なくとも５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００％以下の任意の他のパーセント同一である）アミノ酸配列を有する。いくつかの態様において、ＧＮＳは、配列番号２１と少なくとも５０％同一である（すなわち、少なくとも５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００％以下の任意の他のパーセント同一である）アミノ酸配列を有する。配列番号２１などの標準的なＧＮＳ配列の配列変異体は、例えば、特定のドメインに対応する全配列または具体的なサブ配列のランダム変異導入法により、生成され得る。あるいは、上記のものなどＧＮＳの機能に不可欠であることが知られている残基への突然変異を防ぎながらも、部位特異的突然変異誘発法を反復して実施することができる。さらに、ＧＮＳ配列の複数の変異体の生成において、厳密なランダム変異導入法により生成するであろう機能しない配列変異体の数を大幅に減らすため、突然変異寛容性予測プログラムを用いることができる。タンパク質配列内のアミノ酸置換のタンパク質機能への影響を予測する様々なプログラム（例えば、ＳＩＦＴ、ＰｏｌｙＰｈｅｎ、ＰＡＮＴＨＥＲ  ＰＳＥＣ、ＰＭＵＴ、およびＴｏｐｏＳＮＰ）は、例えば、Henikoff et al. (2006),「Predicting the Effects of Amino Acid Substitutions on Protein Function」, Annu. Rev. Genomics Hum. Genet., 7:61-80に記載されている。ＧＮＳ配列変異体は、当該技術分野で公知の蛍光定量的酵素アッセイにより、ＧＮＳ活性／ＧＮＳ活性の保持についてスクリーニングすることができる。従って、当業者は、上記のように、当該技術分野で所定の方法により、ＧＮＳ配列変異体の極めて多様な「ライブラリー」を作製しスクリーニングすることにより、非常に多くの使用可能なＧＮＳ配列変異体が得ることができることを、十分理解するであろう。
【０１７０】
組成物
本明細書に記載の二機能性の融合抗体は、それらの別々の構成タンパク質の活性、例えば、ＢＢＢを通過できる抗体（例えばＨＩＲ  Ａｂ）と、ＢＢＢ上の内因性受容体の細胞外ドメイン（例えばＩＲ  ＥＣＤ）との結合、および、ＭＰＳ−ＩＩＩで欠損している酵素（例えばＳＧＳＨ）の酵素活性を高い割合で保持していることが見いだされている。本明細書に記載の任意のタンパク質をコードするｃＤＮＡおよび発現ベクターの構築、ならびに、それらの発現および精製については、当業者に周知されており、本明細書の例えば実施例１〜３、ならびにBoadoら(2007), Biotechnol Bioeng 96:381-391、米国特許出願番号１１／０６１，９５６および米国特許出願番号１１／２４５，７１０に詳細に記載されている。
【０１７１】
本明細書には、本明細書に記載されているように、内因性ＢＢＢ受容体に対する抗体（例えばＨＩＲ  Ａｂ）を含み、ＢＢＢを通過でき、ＳＧＳＨと融合されている、二機能性の融合抗体が記載されており、ここに、該内因性ＢＢＢ受容体に対する抗体は、血液脳関門を通過することができ、ＳＧＳＨのそれぞれが、単体としてのそれらの活性に比べ、平均してそれらの活性の少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９９、または１００％を保持している。いくつかの態様において、本明細書は、ＨＩＲ  ＡｂおよびＳＧＳＨのそれぞれが、単体としてのそれらの活性に比べ、平均してそれらの活性の少なくとも約５０％を保持している、ＨＩＲ  Ａｂ−ＳＧＳＨ融合抗体を提供する。いくつかの態様において、本明細書は、ＨＩＲ  ＡｂおよびＳＧＳＨのそれぞれが、単体としてのそれらの活性に比べ、平均してそれらの活性の少なくとも約６０％を保持している、ＨＩＲ  Ａｂ−ＳＧＳＨ融合抗体を提供する。いくつかの態様において、本明細書は、ＨＩＲ  ＡｂおよびＳＧＳＨのそれぞれが、単体としてのそれらの活性に比べ、平均してそれらの活性の少なくとも約７０％を保持している、ＨＩＲ  Ａｂ−ＳＧＳＨ融合抗体を提供する。いくつかの態様において、本明細書は、ＨＩＲ  ＡｂおよびＳＧＳＨのそれぞれが、単体としてのそれらの活性に比べ、平均してそれらの活性の少なくとも約８０％を保持している、ＨＩＲ  Ａｂ−ＳＧＳＨ融合抗体を提供する。いくつかの態様において、本明細書は、ＨＩＲ  ＡｂおよびＳＧＳＨのそれぞれが、単体としてのそれらの活性に比べ、平均してそれらの活性の少なくとも約９０％を保持している、融合ＨＩＲ  Ａｂ−ＳＧＳＨ融合抗体を提供する。いくつかの態様において、ＨＩＲ  Ａｂは、単体としてのその活性に比べ、その活性の少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９９、または１００％を保持しており、ＳＧＳＨは、単体としてのその活性に比べ、その活性の少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９９、または１００％を保持している。従って、本明細書には、ＢＢＢを通過できる、二機能性のＨＩＲ  Ａｂ−ＳＧＳＨ融合抗体を含む組成物が記載されており、ここに、構成要素であるＨＩＲ  ＡｂおよびＳＧＳＨのそれぞれは、融合抗体の一部として、別々のタンパク質としてのそれらの活性に比べ、平均してそれらの活性の少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９９、または１００％の活性、すなわち、それぞれＨＩＲ結合およびＳＧＳＨ活性を保持している。ＨＩＲ  Ａｂ−ＳＧＳＨ融合抗体は、本明細書に記載の任意のＨＩＲ抗体およびＳＧＳＨを含む融合タンパク質を指す。
【０１７２】
本明細書の任意の態様において、ＨＩＲ  Ａｂは、本明細書に記載の内因性ＢＢＢ受容体に対する抗体、例えば、トランスフェリン受容体、レプチン受容体、リポタンパク質受容体またはインスリン様成長因子（ＩＧＦ）受容体に対する抗体、または、他の類似の内因性ＢＢＢ受容体媒介輸送系に置き換えてよい。
【０１７３】
本明細書に記載の融合抗体において、抗体とＳＧＳＨとの間の共有結合は、融合抗体がＩＲのＥＣＤに結合し血液脳関門を通過できるようにし、ＳＧＳＨがその活性の治療的に有用な部分を保持することができるようにする限り、抗体重鎖または軽鎖のカルボキシ末端またはアミノ末端、および、ＳＧＳＨのアミノ末端またはカルボキシ末端へのものであってよい。いくつかの態様において、共有結合は、抗体のＨＣとＳＧＳＨとの間、または、抗体のＬＣとＳＧＳＨとの間である。任意の適切な結合、例えば、軽鎖のカルボキシ末端とＳＧＳＨのアミノ末端、重鎖のカルボキシ末端とＳＧＳＨのアミノ末端、軽鎖のアミノ末端とＳＧＳＨのアミノ末端、重鎖のアミノ末端とＳＧＳＨのアミノ末端、軽鎖のカルボキシ末端とＳＧＳＨのカルボキシ末端、重鎖のカルボキシ末端とＳＧＳＨのカルボキシ末端、軽鎖のアミノ末端とＳＧＳＨのカルボキシ末端、または、重鎖のアミノ末端とＳＧＳＨのカルボキシ末端を用いることができる。いくつかの態様において、結合は、ＨＣのカルボキシ末端からＳＧＳＨのアミノ末端へのものである。
【０１７４】
ＳＧＳＨは、リンカーにより、標的抗体（例えばＭＡｂ、ＨＩＲ−ＭＡｂ）と融合するか、または共有結合してよい。末端アミノ酸間の結合は、融合されたアミノ酸配列の一部を形成する、介在するペプチドリンカー配列により達成することができる。ペプチド配列リンカーは、長さが、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１０より多いアミノ酸であってよい。いくつかの好ましい態様を含むいくつかの態様において、ペプチドリンカーは、長さが、２０、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１未満のアミノ酸である。いくつかの好ましい態様を含むいくつかの態様において、ペプチドリンカーは、長さが、少なくとも０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０のアミノ酸である。いくつかの態様において、ＳＧＳＨは標的抗体に直接結合されるため、長さが０アミノ酸である。いくつかの態様において、ＳＧＳＨを標的抗体に結合するリンカーはない。
【０１７５】
いくつかの態様において、リンカーは、任意の組み合わせまたは順序で、グリシン、セリン、および／またはアラニン残基を含む。一部の例では、リンカー内のグリシン、セリン、およびアラニン残基を組み合わせた割合は、リンカー内の残基の総数の、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、または９５％である。いくつかの好ましい態様において、リンカー内のグリシン、セリン、およびアラニン残基を組み合わせた割合は、リンカー内の残基の総数の、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、または９５％である。いくつかの態様において、任意の数のアミノ酸（天然または合成アミノ酸を含む）の組み合わせを、リンカーに用いることができる。いくつかの態様において、３アミノ酸のリンカーが用いられる。いくつかの態様において、リンカーは配列Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒを有する。いくつかの態様において、２アミノ酸のリンカーは、任意の組み合わせまたは順序で、グリシン、セリン、および／またはアラニン残基を含む（例えばＧｌｙ−Ｇｌｙ、Ｓｅｒ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ、Ｓｅｒ−Ｓｅｒ、Ａｌａ−Ａｌａ、Ｓｅｒ−Ａｌａ、またはＡｌａ−Ｓｅｒリンカー）。いくつかの態様において、２アミノ酸のリンカーは、１のグリシン、セリン、および／またはアラニン残基、ならびに他のアミノ酸（例えばＳｅｒ−Ｘ、ここでＸは任意の既知のアミノ酸である）からなる。さらに別の態様において、２アミノ酸のリンカーは、ｇｌｙ、ｓｅｒ、またはａｌａを除く、任意の２アミノ酸（例えばＸ−Ｘ）からなる。
【０１７６】
本明細書に記載されているように、いくつかの態様において、長さが２アミノ酸を越えるリンカー。本明細書でさらに記載するように、該リンカーは、任意の組み合わせまたは順序で、グリシン、セリン、および／またはアラニン残基も含んでよい。いくつかの態様において、リンカーは、１のグリシン、セリン、および／またはアラニン残基、ならびに、他のアミノ酸（例えばＳｅｒ−ｎＸ、ここでＸは任意の既知のアミノ酸であり、ｎはアミノ酸の数である）からなる。さらに別の態様において、リンカーは任意の２アミノ酸からなる（例えばＸ−Ｘ）。いくつかの態様において、前記の任意の２アミノ酸は、任意の組み合わせまたは順序で、かつ、それらの間に介在する可変数のアミノ酸内で、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、またはＡｌａである。ある態様の一例において、リンカーは少なくとも１のＧｌｙからなる。ある態様の一例において、リンカーは少なくとも１のＳｅｒからなる。ある態様の一例において、リンカーは少なくとも１のＡｌａからなる。いくつかの態様において、リンカーは少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０のＧｌｙ、Ｓｅｒ、および／またはＡｌａ残基からなる。好ましい態様において、リンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３または他のバリエーションなどの任意の組み合わせまたは数の繰り返し配列にて、ＧｌｙおよびＳｅｒを含む。
【０１７７】
本態様に用いるためのリンカーは、当該技術分野で公知の任意の方法を用いることによって設計されてよい。例えば、融合タンパク質の設計において、最適なアミノ酸リンカーを決定するための複数の公的に入手可能なプログラムがある。タンパク質の配列および所望の長さのリンカーのユーザーによる入力に基づいて、最適なリンカーのアミノ酸配列を自動的に生成する公的に入手可能なコンピュータープログラム（例えばＬＩＮＫＥＲプログラム）が、本方法および組成物に用いられてよい。しばしば、タンパク質設計に用いるために最適なタンパク質リンカーを予測するために、該プログラムはタンパク質サブドメインを連結する天然のリンカーの観察される傾向を用いることができる。一部の例では、該プログラムは、最適なリンカーを予測する他の方法を用いる。本態様のためのリンカーを予測するために適したいくつかのプログラムの例は、当該技術分野で記載されており、例えば、Xue et al. (2004) Nucleic Acids Res. 32, W562-W565（機能性の融合タンパク質を構築するためのリンカー配列の設計を支援するためのＬＩＮＫＥＲプログラムへのインターネットリンクを提供しているウェブサーバー版）、George and Heringa, (2003), Protein Engineering, 15(11):871-879（リンカー（ｌｉｎｋｅｒ）プログラムへのインターネットリンクを提供し、タンパク質リンカーの合理的設計を記載している）、Argos, (1990), J. Mol. Biol. 211:943-958、Arai et al. (2001) Protein Engineering, 14(8):529-532、Crasto and Feng, (2000) Protein Engineering 13(5):309-312を参照のこと。
【０１７８】
ペプチドリンカー配列は、プロテアーゼ切断部位を含んでもよいが、これはＳＧＳＨの活性に必要ではなく、実際、これらの態様の利点は、一旦ＢＢＢを越えると、二機能性のＨＩＲ  Ａｂ−ＳＧＳＨ融合抗体が、切断なしに、輸送と活性の両方について、部分的にまたは完全に活性であることである。図９は、ＨＣが、そのカルボキシ末端で、３アミノ酸の「Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−ｓｅｒ」リンカーを介して、ＳＧＳＨのアミノ末端と融合されている、ＨＩＲ  Ａｂ−ＳＧＳＨ融合抗体のアミノ酸配列（配列番号１０）の典型的な態様を示す。いくつかの態様において、図８に示すように、融合されたＳＧＳＨ配列は、その２０アミノ酸のシグナルペプチドを欠いている。
【０１７９】
いくつかの態様において、本明細書のＨＩＲ  Ａｂ−ＳＧＳＨ融合抗体は、ＨＣとＬＣの両方を含む。いくつかの態様において、ＨＩＲ  Ａｂ−ＳＧＳＨ融合抗体は一価の抗体である。別の態様において、本明細書の実施例セクションに記載されているように、ＨＩＲ  Ａｂ−ＳＧＳＨ融合抗体は二価の抗体である。
【０１８０】
いくつかの態様において、ＨＩＲ  Ａｂ−ＳＧＳＨ融合抗体の一部として用いられるＨＩＲ  Ａｂは、グリコシル化されていることも、されていないこともあり、いくつかの態様において、抗体は、例えば、ＣＨＯ細胞内での合成によりもたらされるグリコシル化パターンでグリコシル化されている。
【０１８１】
本明細書において、「活性」は、生理的活性（例えば、ＢＢＢを通過する能力、および／または治療活性）、ＩＲ  ＥＣＤに対するＨＩＲ  Ａｂの結合親和性、またはＳＧＳＨの酵素活性を含む。
【０１８２】
ＢＢＢを越えるＨＩＲ  Ａｂ−ＳＧＳＨ融合抗体の輸送は、標準的な方法により、ＨＩＲ  Ａｂ単独のＢＢＢを越える輸送と比較することができる。例えば、モデル動物、例えば、霊長類のような哺乳類によるＨＩＲ  Ａｂ−ＳＧＳＨ融合抗体の薬物動態および脳取り込みを用いることができる。同様に、ＳＧＳＨ活性を決定する標準モデルは、ＳＧＳＨの機能を、単独の場合と、ＨＩＲ  Ａｂ−ＳＧＳＨ融合抗体の一部としての場合と比較するために用いることもできる。例えば、ＳＧＳＨ対ＨＩＲ  Ａｂ−ＳＧＳＨ融合抗体の酵素活性を立証する実施例４を参照のこと。ＨＩＲ  Ａｂ−ＳＧＳＨ融合抗体対ＨＩＲ  Ａｂ単独について、ＩＲ  ＥＣＤに対する結合親和性を比較することができる。例えば、本明細書の実施例４を参照のこと。
【０１８３】
本明細書は、本明細書に記載されている１つ以上のＨＩＲ  Ａｂ−ＳＧＳＨ融合抗体、および医薬的に許容される賦形剤を含む医薬組成物も含む。医薬的に許容される担体／賦形剤についての徹底的な議論は、Remington's Pharmaceutical Sciences, Gennaro, AR, ed., 20th edition, 2000: Williams and Wilkins PA, USAに見ることができる。本態様の医薬組成物は、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、腹腔内注射、経口投与、直腸投与、経頬投与、経肺投与、経皮投与、鼻腔内投与、または、末梢投与の任意の他の適切な経路を含む、任意の末梢経路を介した投与に適した組成物を含む。
【０１８４】
本明細書の組成物は、特に注射に適しており、例えば、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、または腹腔内投与用の医薬組成物として適している。本明細書の水性組成物は、医薬的に許容される担体または水性媒体中に溶解または分散されてよい、本態様の組成物の有効量を含む。語句「医薬的にまたは薬理学的に許容される」は、必要に応じて、動物、例えばヒトに投与された場合に、有害な、アレルギー性の、または他の有害な反応を起こさない分子実体（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｎｔｉｔｉｅｓ）および組成物を指す。本明細書において、「医薬的に許容される担体」は、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、ならびに、等張剤および吸収遅延剤等を含む。そのような媒体および薬剤を医薬活性物質に用いることは、当該技術分野で周知である。活性成分と適合しない場合を除き、任意の従来の媒体または薬剤を治療用組成物に用いることが考慮される。補助的な活性成分を組成物に含めることもできる。
【０１８５】
注射用組成物のための典型的な医薬的に許容される担体としては、塩、例えば、鉱酸塩（例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩等）、および有機酸の塩（例えば、酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩等）を挙げることができる。例えば、本明細書の組成物は、液体形態で提供されてよく、０．０１〜１％のポリソルベート−８０等の界面活性剤、またはマンニトール、ソルビトールもしくはトレハロース等の糖質添加剤を含むまたは含まない、様々なｐＨ（５〜８）の生理食塩水ベースの水溶液に製剤化されてよい。通常用いられる緩衝液としては、ヒスチジン緩衝液、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、またはクエン酸緩衝液が挙げられる。いくつかの態様において、本明細書の医薬組成物は、単糖、例えばグルコースまたはデキストロースを含む。例えば、融合抗体は、デキストロース約０．１％、約０．５％、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、約２０％またはそれより多い、デキストロースおよび／またはグルコースの溶液で投与することができる。いくつかの態様において、組成物は、約５％（ｗ／ｖまたはｖ／ｖ）の濃度で、グルコースおよび／またはデキストロースを含み得る。例えば、通常の保存および使用条件下で、血漿およびＣＳＦグルコースレベルが有意に変化し低血糖を示す場合、これらの調合液は、微生物の増殖を防ぐ防腐剤を含み得る。様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等により、微生物の活動の阻止をもたらすことができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましいであろう。吸収を遅延する物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物に用いることにより、注射用組成物の延長された吸収をもたらすことができる。
【０１８６】
ヒト投与用の調合液は、ＦＤＡが要求する無菌状態、発熱性、一般的安全性、および純度基準および他の規制機関の基準に適合する。活性化合物は、一般的に、非経口投与用に製剤化される、例えば、静脈内、筋肉内、皮下、病巣内、または腹腔内経路を介する注射用に製剤化されるであろう。活性要素または活性成分を含む水性組成物の製造は、本開示に照らして当業者に知られるであろう。典型的には、そのような組成物は、注射物質、液体溶液としても液体懸濁液としても、製造することができ、注射の前に液体を加えて溶液または懸濁液を調製するのに用いるために適した固形を製造することもでき、調合液を乳化させることもできる。
【０１８７】
無菌注射溶液は、適切な溶媒中の必要量の活性化合物を必要に応じて上に挙げた様々な他の成分と組み合わせ、次いでろ過滅菌することにより製造される。一般的には、分散剤は、様々な無菌活性成分を、基本的分散媒質および上に挙げた必要な他の成分を含む無菌媒体に組み込むことにより製造される。無菌注射溶液を製造するための無菌粉末の場合は、製造方法には、活性成分および任意の追加の所望の成分の粉末をその予め濾過滅菌した溶液から生成する真空乾燥および凍結乾燥技術が含まれる。
【０１８８】
製剤化されると、溶液は、投与製剤と適合するように、本明細書に記載の基準に基づく治療的に活性な量で全身投与されるであろう。製剤は、様々な剤形、例えば上記の注射溶液の形で容易に投与されるが、薬剤放出カプセルなども用いることができる。
【０１８９】
投与される医薬組成物の適切な品質、処置回数、および単位用量は、本明細書に記載されているように、ＨＩＲ  Ａｂ−ＳＧＳＨ融合抗体のＣＮＳ取り込み特性に、ならびに、治療する対象、対象の状態、および所望の効果に応じて変化するであろう。いずれにしても、投与担当者は、個々の対象に対する適切な用量を決定するであろう。
【０１９０】
非経口投与、例えば静脈内または筋肉内注射用に製剤化した化合物に加え、限定されるものではないが、以下を含む本態様の他の代替投与法も用いることができる：皮膚内投与（米国特許第５，９９７，５０１号、第５，８４８，９９１号、および第５，５２７，２８８号を参照）、肺投与（米国特許第６，３６１，７６０号、第６，０６０，０６９号、および第６，０４１，７７５号を参照）、バッカル投与（米国特許第６，３７５，９７５号、および第６，２８４，２６２号を参照）、経皮的投与（米国特許第６，３４８，２１０号、および第６，３２２，８０８号）、および経粘膜投与（米国特許第５，６５６，２８４号を参照）。そのような投与方法は当該技術分野で周知である。点鼻液またはスプレー、エアロゾル、または吸入剤等の、本態様の鼻内投与を用いることもできる。点鼻液は、通常、滴剤またはスプレー剤で鼻腔に投与するよう設計された水性溶液である。点鼻液は、多くの点で鼻汁と同様であるように製造される。従って、水性点鼻液は、通常、等張であり、ｐＨ５．５〜６．５を維持するためにわずかに緩衝化されている。さらに、必要であれば、点眼薬および適切な薬剤安定剤に用いるものと同様の抗菌性保存剤を製剤に含めてもよい。様々な市販の点鼻剤が知られており、これには、例えば抗生物質および抗ヒスタミン剤が含まれ、喘息の予防に用いられる。
【０１９１】
他の投与方法に適したさらなる製剤には坐剤およびペッサリーが含まれる。直腸ペッサリーまたは坐剤を用いることもできる。坐剤は、直腸または尿道へ挿入するための、通常薬を含んでいる、様々な重量および形状の固体剤形である。挿入後に坐剤は腔内液中で軟化し、融解または溶解する。坐剤用の従来の結合剤および担体は、一般的に、例えばポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドを含み、そのような坐剤は、任意の適切な範囲、例えば０．５％〜１０％、好ましくは１％〜２％の範囲の活性成分を含む混合物から形成することができる。
【０１９２】
経口製剤は、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムのような、通常用いられる賦形剤を含む。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル、持続放出製剤または粉末の形態をとる。ある特定の態様において、経口医薬組成物は、不活性希釈剤もしくは吸収可能な食用担体を含むことになるか、ハードもしくはソフトシェルゼラチンカプセルに封入されるか、錠剤に圧縮されるか、または食事療法の食品に直接組み込むことができる。経口治療投与用の活性化合物は、賦形剤と共に組み込まれてよく、摂取可能な錠剤、バッカル錠、トローチ、カプセル、エリキシル剤、懸濁液、シロップ剤、ウエハース等の形態で用いることができる。そのような組成物および製剤は、少なくとも０．１％の活性化合物を含むことができる。組成物および製剤の割合は、もちろん変化し、便宜的に、単位の重量の約２〜約７５％の間、または約２５〜６０％の間であってよい。そのような治療的に有用な組成物中の活性化合物の量は、適切な用量が得られるような量である。
【０１９３】
錠剤、トローチ、丸薬、カプセル等は以下のものを含んでもよい：結合剤、例えばトラガカント・ゴム、アカシア、コーンスターチ、またはゼラチン；賦形剤、例えば第二リン酸カルシウム；崩壊剤、例えばコーンスターチ、ジャガイモデンプン、アルギン酸等；滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウム；および甘味料、例えばスクロース、ラクトース、またはサッカリンを加えてもよく、または香味剤、例えばペパーミント、ウインターグリーン油、またはチェリー香味料。単位剤形がカプセル剤である場合は、上記の種類の物質に加えて液体担体を含んでもよい。様々な他の物質は、コーティングとして、または用量単位の物理的形状を他の方法で修飾するために存在してもよい。例えば、錠剤、丸薬、またはカプセルをセラック、糖、またはその両方でコートしてもよい。エリキシル剤のシロップは、甘味料として活性化合物スクロース、防腐剤としてメチレンおよびプロピルパラベン、色素、および香味剤、例えばチェリーまたはオレンジ香味料を含んでもよい。ある態様において、経口医薬組成物は、胃の環境から活性成分を保護するために腸溶コートしてもよく、腸溶コーティング法および製剤は当該技術分野で周知である。
【０１９４】
方法
本明細書は、治療的有効量の、本明細書に記載の融合抗体を全身投与することにより、ＢＢＢを越えてＣＮＳへ、有効用量の、ＭＰＳ−ＩＩＩで欠損している酵素（例えばＳＧＳＨ）を送達する方法について記載する。いくつかの態様において、本明細書の融合抗体はＨＩＲ  Ａｂ−ＳＧＳＨである。本明細書に記載されているように、ＨＩＲ  Ａｂ−ＳＧＳＨ融合抗体の送達のための適切な全身用量は、そのＣＮＳ取り込み特性およびＳＧＳＨ比活性に基づいている。ＳＧＳＨ欠損症に罹患した対象へのＨＩＲ  Ａｂ−ＳＧＳＨ融合抗体の全身投与は、ＣＮＳへＳＧＳＨを非侵襲的に送達する有用なアプローチである。さらに、本明細書は、治療的有効量の、本明細書に記載の融合抗体を全身投与することにより、対象におけるＭＰＳ−ＩＩＩを治療する（例えば、治療的に処置する）方法について記載する。いくつかの態様において、治療は治療的処置である。いくつかの態様において、治療は、ＭＰＳ−ＩＩＩの１つ以上の症状を軽減する。いくつかの態様において、治療は、ＭＰＳ−ＩＩＩの１つ以上の症状を、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％軽減する。
【０１９５】
融合抗体の治療的に有効な全身用量である融合抗体の量は、本明細書に記載されているように、投与される融合抗体のＣＮＳの取り込み特性、例えば、全身投与された用量の内、ＣＮＳで取り込まれる割合に一部依存する。
【０１９６】
いくつかの態様において、全身投与されるＨＩＲ  Ａｂ−ＳＧＳＨ融合抗体の１％（すなわち、約０．３％、０．４％、０．４８％、０．６％、０．７４％、０．８％、０．９％、１．０５、１．１、１．２、１．３％、１．５％、２％、２．５％、３％、または約０．３％〜約３％の任意の％）が、末梢血からＢＢＢを越えるその取り込みの結果として、脳へ送達される。いくつかの態様において、ＨＩＲ  Ａｂ−ＳＧＳＨ融合抗体の全身投与された用量の、少なくとも０．５％（すなわち、約０．３％、０．４％、０．４８％、０．６％、０．７４％、０．８％、０．９％、１．０５、１．１、１．２、１．３％、１．５％、２％、２．５％、３％、または約０．３％〜約３％の任意の％）が、全身投与後２時間以内、すなわち、１．８、１．７、１．５、１．４、１．３、１．２、１．１、０．９、０．８、０．６、０．５、または約０．５〜約２時間の任意の時間に、脳へ送達される。
【０１９７】
従って、いくつかの態様において、本明細書は、ＢＢＢを通過する融合抗体の量が、対象の脳において、少なくとも０．５ｎｇのＳＧＳＨタンパク質／ｍｇタンパク質（例えば、対象の脳において、０．５、１、３、１０、３０、５０、または０．５〜５０ｎｇの任意の他の値のＳＧＳＨタンパク質／ｍｇタンパク質）をもたらすように、５〜５０ｋｇのヒトへ、治療的有効量の、本明細書に記載の融合抗体を全身投与する方法を提供する。
【０１９８】
いくつかの態様において、対象の脳へ送達される酵素（例えばＳＧＳＨ）活性の総ユニット数は、脳１グラム当たり、少なくとも５０ミリユニットである（例えば、脳１グラム当たり、少なくとも１００、３００、１０００、３０００、１００００、３００００、５００００、または約５０〜５０，０００ミリユニットの任意の他のＳＧＳＨ総ユニット数の、送達されるＳＧＳＨ活性）。
【０１９９】
いくつかの態様において、治療的に有効な全身用量は、少なくとも５０００、１００００、３００００、１０００００、３０００００、１００００００、５００００００、または、約５，０００〜５，０００，０００ユニットの任意の他の全身用量の酵素（例えばＳＧＳＨ）活性を含む。
【０２００】
別の態様において、治療的に有効な全身用量は、少なくとも約１０００ユニットの酵素（例えばＳＧＳＨ）活性／ｋｇ体重、少なくとも約１０００、３０００、１００００、３００００、１０００００、または約１，０００〜１００，０００ユニットの任意の他のユニット数の酵素活性／ｋｇ体重である。
【０２０１】
当業者は、本明細書の融合抗体の治療的に有効な全身用量の質量が、その酵素（例えばＳＧＳＨ）比活性に一部依存することを十分理解するであろう。いくつかの態様において、融合抗体の比活性は少なくとも１，０００Ｕ／ｍｇタンパク質、少なくとも約１５００、２５００、３５００、６０００、７５００、９０００、または、約１，０００ユニット／ｍｇ〜約１０，０００ユニット／ｍｇの任意の他の比活性値である。
【０２０２】
従って、本明細書の融合抗体の比活性、および治療される対象の体重を十分考慮すると、融合抗体の全身用量は少なくとも５ｍｇ、例えば、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、１００、３００、または、約５ｍｇ〜約５００ｍｇの任意の他の値の融合抗体（例えばＨＩＲ  Ａｂ−ＳＧＳＨ）であり得る。
【０２０３】
本明細書で用いられている用語「全身投与」または「末梢投与」は、ＣＮＳへの直接投与ではない任意の投与方法、すなわち、身体的な穿通またはＢＢＢの破壊を含まない任意の投与方法を含む。「全身投与」は、限定されるものではないが、静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、腹腔内投与、鼻腔内投与、経頬投与、経皮投与、直腸投与、経肺投与（吸入）、または経口投与を含む。本明細書に記載されているように、任意の適切な融合抗体が用いられてよい。
【０２０４】
本明細書において、ＳＧＳＨ欠損症は、サンフィリッポ症候群Ａ型またはＭＰＳ−ＩＩＩＡとして知られる１つ以上の病状を含む。ＳＧＳＨ欠損症は、脳および他の臓器内で起こる、ヘパラン硫酸の蓄積により特徴付けられる。
【０２０５】
本明細書の組成物、例えばＨＩＲ  Ａｂ−ＳＧＳＨ融合抗体は、併用療法の一部として投与されてよい。該併用療法は、ＳＧＳＨ欠損症に罹患している患者に典型的に見られる症状の治療または軽減のための他の治療と組み合わせた本態様の組成物の投与を含む。本態様の組成物が他のＣＮＳ障害の方法または組成物と組み合わせて用いられる場合、本態様の組成物と付加的な方法または組成物の任意の組み合わせが用いられてよい。従って、例えば、本態様の組成物が他のＣＮＳ障害治療薬と組み合わせて用いられる場合、その２つは、同時に、連続的に、重複する持続期間、類似した、同一の、または異なる頻度等で投与されてよい。いくつかの場合には、本態様の組成物を１つ以上の他のＣＮＳ障害治療薬と組み合わせて含有する組成物が用いられるであろう。
【０２０６】
いくつかの態様では、組成物、例えばＨＩＲ  Ａｂ−ＳＧＳＨ融合抗体は、他の薬剤と、同一の製剤内または別々の組成物として患者に同時投与される。例えば、本明細書の融合抗体は、同様にヒト血液脳関門を越えてＳＧＳＨ以外の組換えタンパク質を送達するように設計された他の融合タンパク質と共に製剤化されてよい。さらに、融合抗体は、他の巨大分子または小分子と組み合わせて製剤化されてよい。
【０２０７】
下記の特定の実施例は、単に説明の目的で提供されていると解釈されるべきであり、いかなる場合であっても決して本開示の残りの部分を限定するものではない。これ以上詳述しなくても、当業者であれば、本明細書の記載に基づいて、本態様をその最大限の範囲まで利用することができると考えられる。本明細書で引用されている全ての出版物は、それらの全体において参照することによって本明細書に援用される。参照がＵＲＬなどの識別名またはアドレスでなされている場合、該識別名は変化してよく、インターネット上の特定の情報は現れたり消えたりしうるが、インターネットを検索することによって等価な情報を見ることができると理解されるべきである。それに対する参照は、該情報が入手可能であり、公に普及していることを証明するものである。
【実施例】
【０２０８】
実施例１．ＨＩＲ  Ａｂ−ＧＵＳＢ融合タンパク質の発現および機能解析
スライ症候群とも称されるＭＰＳ−ＶＩＩで変異しているリソソーム酵素は、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）である。ＭＰＳ−ＶＩＩは、脳内のグリコサミノグリカンの蓄積をもたらす。ＧＵＳＢ酵素はＢＢＢを通過しないため、ＭＰＳ−ＶＩＩの酵素補充療法（ＥＲＴ）は、脳の治療に有効ではないようである。ＢＢＢを通過するヒトＧＵＳＢを再設計する試みにおいて、ＨＩＲ  Ａｂ−ＧＵＳＢ融合タンパク質プロジェクトを開始した。
【０２０９】
２２アミノ酸のシグナルペプチドおよび１８アミノ酸のカルボキシル末端プロペプチドを含む、ヒトＧＵＳＢタンパク質（ＮＰ＿０００１７２）のアミノ酸Ｍｅｔ１−Ｔｈｒ６５１に対応するヒトＧＵＳＢ  ｃＤＮＡを、逆転写（ＲＴ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびカスタムオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）によってクローン化した。ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル電気泳動で分離し、ヒトＧＵＳＢ  ｃＤＮＡに対応する〜２．０ｋｂの予想される主要な単一バンドを単離した。クローン化されたヒトＧＵＳＢを真核細胞発現プラスミドに挿入し、このＧＵＳＢ発現プラスミドをｐＣＤ−ＧＵＳＢと命名した。プラスミドの完全な発現カセットを双方向ＤＮＡシーケンシング（ｂｉ−ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）によって確認した。６ウェルフォーマット中、ＣＯＳ細胞をｐＣＤ−ＧＳＵＢでトランスフェクトすると、馴化培地中、７日で高ＧＵＳＢ酵素活性をもたらし（表１、実験Ａ）、これにより機能性のヒトＧＵＳＢ  ｃＤＮＡが成功裏に設計されたことが立証された。ＧＵＳＢ酵素活性を、市販の４−メチルウンベリフェリル−β−Ｌ−グルクロニド（ＭＵＧｌｃＵ）を用いた蛍光定量的アッセイで決定した。この基質をＧＵＳＢによって４−メチルウンベリフェロン（４−ＭＵ）に加水分解し、発光波長４５０ｎｍおよび励起波長３６５ｎｍを用いた蛍光光度計で４−ＭＵを蛍光定量的に検出する。既知量の４−ＭＵで検量線を作成した。アッセイは３７℃で６０分間インキュベーション、ｐＨ＝４．８で行い、グリシン−炭酸塩緩衝液（ｐＨ＝１０．５）の添加によって停止した。
【０２１０】
ＨＩＲ  Ａｂの重鎖（ＨＣ）のカルボキシル末端が、２２アミノ酸のＧＵＳＢシグナルペプチドを含まず、１８アミノ酸のカルボキシル末端ＧＵＳＢプロペプチドを含まないヒトＧＵＳＢのアミノ末端と融合されている融合タンパク質を発現する、新たなｐＣＤ−ＨＣ−ＧＵＳＢプラスミド発現プラスミドを設計した。ＧＵＳＢ  ｃＤＮＡを、ｐＣＤ−ＧＵＳＢをテンプレートとして用いたＰＣＲによってクローン化した。オープンリーディングフレームを維持し、かつ、ＨＩＲ  Ａｂ  ＨＣのＣＨ３領域のカルボキシル末端と、酵素の２２アミノ酸のシグナルペプチドを含まないＧＵＳＢのアミノ末端の間にＳｅｒ−Ｓｅｒリンカーを導入するために、フォワードＰＣＲプライマーに「ＣＡ」ヌクレオチドを導入させた。ＧＵＳＢリバースＰＣＲプライマーに、成熟ヒトＧＵＳＢタンパク質の末端Ｔｈｒの直後にストップコドン「ＴＧＡ」を導入させる。ｐＣＤ−ＨＣ−ＧＵＳＢの発現カセットのＤＮＡシーケンシングは、７１４ｎｔのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、９ｎｔのコザック部位（Ｋｏｚａｋ  ｓｉｔｅ）（ＧＣＣＧＣＣＡＣＣ）、３，２２８ｎｔのＨＣ−ＧＵＳＢ融合タンパク質オープンリーディングフレーム、および３７０ｎｔのウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）転写終結配列を含む４，３２１ヌクレオチド（ｎｔ）を包含した。プラスミドは、１９アミノ酸のＩｇＧシグナルペプチド、４４３アミノ酸のＨＩＲＭＡｂ  ＨＣ、２アミノ酸のリンカー（Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）、および酵素シグナルペプチドおよびカルボキシル末端プロペプチドを含まない６１１アミノ酸のヒトＧＵＳＢで構成される、１，０７５アミノ酸タンパク質をコードしていた。ＧＵＳＢ配列は、ヒトＧＵＳＢ（ＮＰ＿０００１７２）のＬｅｕ２３−Ｔｈｒ６３３と１００％同一であった。グリコシル化されていない重鎖融合タンパク質の予想される分子量は１１９，３０６Ｄａであり、予想される等電点（ｐＩ）は７．８３である。
【０２１１】
ＣＯＳ細胞を６ウェルクラスターディッシュに蒔き、ｐＣＤ−ＬＣおよびｐＣＤ−ＨＣ−ＧＵＳＢで二重トランスフェクトされたが、ここでｐＣＤ−ＬＣはキメラＨＩＲ  Ａｂの軽鎖（ＬＣ）をコードしている発現プラスミドである。トランスフェクションはリポフェクタミン２０００を用いて行い、１：２．５のμｇＤＮＡ：μＬリポフェクタミン２０００の比率とし、馴化無血清培地を３日および７日に採取した。しかし、ｐＣＤ−ＨＣ−ＧＵＳＢおよびｐＣＤ−ＬＣ発現プラスミドによるＣＯＳ細胞の二重トランスフェクション後、ＧＵＳＢ酵素活性の特異的増加はなかった（表１、実験Ｂ）。しかし、培地のＩｇＧは、ヒトＩｇＧ特異的ＥＬＩＳＡによって測定すると、わずか２３±２ｎｇ／ｍＬであったため、培地中の低ＧＵＳＢ活性はＨＩＲＭＡｂ−ＧＵＳＢ融合タンパク質の低分泌に起因しうるものであった。従って、ＣＯＳ細胞トランスフェクションを１０ｘＴ５００プレートまでスケールアップし、ＨＩＲＭＡｂ−ＧＵＳＢ融合タンパク質をプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。ＩｇＧウエスタンブロッティングは、融合タンパク質重鎖のサイズの予想された増加を示した。しかし、ＨＩＲＭＡｂ−ＧＵＳＢ融合タンパク質のＧＵＳＢ酵素活性は低く、６．１±０．１ｎｍｏｌ／ｈｒ／μｇタンパク質であった。対照的に、ヒト組換えＧＵＳＢの比活性は２，０００ｎｍｏｌ／ｈｒ／μｇタンパク質である［Sands et al (1994) Enzyme replacement therapy for murine mucopolysaccharidosis type VII. J Clin Invest 93, 2324-2331］。これらの結果は、ＧＵＳＢをＨＩＲ  ＡｂのＨＣのカルボキシル末端と融合した後、ＨＩＲ  Ａｂ−ＧＵＳＢ融合タンパク質のＧＵＳＢ酵素活性が、＞９５％失われたことを立証した。ＨＩＲ  Ａｂ−ＧＵＳＢ融合タンパク質とＨＩＲの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）の結合親和性を、ＥＬＩＳＡで試験した。ＨＩＲ  ＥＣＤで永続的にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を無血清培地（ＳＦＭ）中で培養し、ＨＩＲ  ＥＣＤをコムギ胚芽凝集素アフィニティーカラムで精製した。ＨＩＲ  ＥＣＤを９６ウェルディッシュに蒔き、ＨＩＲ  Ａｂ、およびＨＩＲ  Ａｂ−ＧＵＳＢ融合タンパク質とＨＩＲ  ＥＣＤの結合を、ビオチン化抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ヤギ二次抗体で検出し、次いでアビジンおよびビオチン化ペルオキシダーゼで検出した。最大の結合の５０％を与えるタンパク質の濃度であるＥＤ５０を、非線形回帰分析で決定した。ＨＩＲ受容体アッセイは、６１１アミノ酸のＧＵＳＢをＨＩＲＭＡｂ重鎖のカルボキシル末端と融合した後、ＨＩＲに対する親和性に減少がないことを示した。ＨＩＲ  ＡｂとＨＩＲ  ＥＣＤの結合のＥＤ５０は０．７７±０．１０ｎＭであり、ＨＩＲ  Ａｂ−ＧＵＳＢ融合タンパク質の結合のＥＤ５０は０．８１±０．０４ｎＭであった。
【０２１２】
要約すると、ＨＩＲ  Ａｂ  ＨＣのカルボキシル末端へのＧＵＳＢの融合は、ＨＩＲへの融合タンパク質の結合親和性を減少させなかった。しかし、融合タンパク質のＧＵＳＢ酵素活性は、＞９５％減少した。
【０２１３】
ＨＩＲ  ＡｂとＧＵＳＢの融合タンパク質を成功裏に産生する試みにおいて、ＧＵＳＢシグナルペプチドを含む成熟ヒトＧＵＳＢのカルボキシル末端をＨＩＲ  ＡｂのＨＣのアミノ末端と融合する新たなアプローチを行った。この融合タンパク質をＧＵＳＢ−ＨＩＲ  Ａｂと命名した。第一のステップは、この新たな融合タンパク質をコードする新たな発現プラスミドを設計することであり、このプラスミドをｐＣＤ−ＧＵＳＢ−ＨＣと命名した。ｐＣＤ−ＧＵＳＢ−ＨＣプラスミドは、その１９アミノ酸のシグナルペプチドを含まないＨＩＲＭＡｂの重鎖（ＨＣ）のアミノ末端が、２２アミノ酸のＧＵＳＢシグナルペプチドは持つが、１８アミノ酸のカルボキシル末端ＧＵＳＢプロペプチドは持たないヒトＧＵＳＢのカルボキシル末端と融合された融合タンパク質を発現する。ｐＣＤ−ＧＵＳＢベクターは、２２アミノ酸のＧＵＳＢシグナルペプチドは持つが、ＧＵＳＢカルボキシル末端において１８アミノ酸のプロペプチドを欠くＧＵＳＢタンパク質を発現するＧＵＳＢ  ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅のためのテンプレートとして用いられる。ｐＣＤ−ＧＵＳＢにおけるＧＵＳＢの１８アミノ酸のカルボキシル末端プロペプチドは、部位特異的突然変異誘発法（ＳＤＭ）によって除去した。後者は、ＧＵＳＢのＴｈｒ６３３残基の３’−隣接領域上にＡｆｅＩ部位を生じ、ｐＣＤ−ＧＵＳＢ−ＡｆｅＩと命名した。次いで、カルボキシル末端プロペプチドを、（ＧＵＳＢの３’−非コード領域上に位置する）ＡｆｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで除去した。１９アミノ酸のＩｇＧシグナルペプチドは含まず、ＨＩＲＭＡｂ  ＨＣストップコドンは含むＨＩＲＭＡｂ  ＨＣオープンリーディングフレームは、ＨＩＲＭＡｂ  ＨＣ  ｃＤＮＡをテンプレートとして用いたＰＣＲによって作製した。ＰＣＲによって作製されたＨＩＲＭＡｂ  ＨＣ  ｃＤＮＡをｐＣＤ−ＧＵＳＢ−ＡｆｅＩのＡｆｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入し、ｐＣＤ−ＧＵＳＢ−ＨＣを形成した。ＧＵＳＢのカルボキシル末端とＨＩＲＭＡｂ  ＨＣのアミノ末端との間のＳｅｒ−Ｓｅｒリンカーを、ＡｆｅＩ部位内に、ＨＩＲＭＡｂ  ＨＣ  ｃＤＮＡのクローニングに用いられるＰＣＲプライマーによって導入した。ｐＣＤ−ＧＵＳＢ−ＨＣ発現カセットのＤＮＡシーケンシングは、プラスミドが、２２アミノ酸のＧＵＳＢシグナルペプチド、６１１アミノ酸のＧＵＳＢ、２アミノ酸のリンカー（Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）、および４４３アミノ酸のＨＩＲＭＡｂ  ＨＣからなる１，０７８アミノ酸のタンパク質を発現したことを示した。ＧＵＳＢ配列は、ヒトＧＵＳＢ（ＮＰ＿０００１７２）のＭｅｔ１−Ｔｈｒ６３３と１００％同一であった。
【０２１４】
６ウェルフォーマット中、ＣＯＳ細胞をｐＣＤ−ＬＣおよびｐＣＤ−ＧＵＳＢ−ＨＣ発現プラスミドで二重トランスフェクトすると、ｐＣＤ−ＬＣおよびｐＣＤ−ＨＣ−ＧＵＳＢプラスミドでの二重トランスフェクションに比べ、馴化培地中、７日でより高いＧＵＳＢ酵素活性をもたらした（表１、実験Ｃ）。しかし、ＥＬＩＳＡによって測定した７日目の馴化培地中の培地のヒトＩｇＧ濃度がわずか１３±２ｎｇ／ｍＬであったため、ＧＵＳＢ−ＨＩＲＭＡｂ融合タンパク質もＣＯＳ細胞によって分泌されにくいものであった。ＣＯＳ細胞トランスフェクションを１０ｘＴ５００プレートまでスケールアップし、ＧＵＳＢ−ＨＩＲＭＡｂ融合タンパク質をプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、融合されたタンパク質重鎖のサイズの予想された増加を示した。精製されたＧＵＳＢ−ＨＩＲＭＡｂ融合タンパク質のＧＵＳＢ酵素活性は高く、２２６±８ｎｍｏｌ／ｈｒ／μｇタンパク質であり、これはＨＩＲＭＡｂ−ＧＵＳＢ融合タンパク質の特異的ＧＵＳＢ酵素活性よりも３７倍高い。しかし、ＨＩＲ受容体アッセイは、ＧＵＳＢをＨＩＲＭＡｂ重鎖のアミノ末端と融合した後、ＨＩＲに対する親和性が著しく減少し、受容体結合親和性の９５％の減少をもたらすことを示した。ＨＩＲ  ＡｂとＨＩＲ  ＥＣＤの結合のＥＤ５０は０．２５±０．０３ｎＭであり、ＨＩＲ  Ａｂ−ＧＵＳＢ融合タンパク質の結合のＥＤ５０は４．８±０．４ｎＭであった。
【０２１５】
要約すると、ＨＩＲ  Ａｂ  ＨＣのアミノ末端へのＧＵＳＢの融合は、融合タンパク質のＧＵＳＢ酵素活性の保持をもたらしたが、ＨＩＲへのＧＵＳＢ−ＨＩＲ  Ａｂ融合タンパク質の結合の９５％の減少を引き起こした。対照的に、ＨＩＲ  Ａｂ  ＨＣのカルボキシル末端へのＧＵＳＢの融合は、ＨＩＲへのＨＩＲ  Ａｂ−ＧＵＳＢ融合タンパク質の結合親和性の減少をもたらさなかった。しかし、この融合タンパク質のＧＵＳＢ酵素活性は＞９５％減少した。これらの知見は、ＩｇＧ−酵素融合タンパク質の二機能性、すなわち、ＩｇＧ部分と同種抗原との高親和性結合、および高い酵素活性が保持されるような方法で、リソソーム酵素とＩｇＧ分子を融合する技術の、予測できない性質を示している。
表１．トランスフェクション後のＣＯＳ細胞におけるＧＵＳＢ酵素活性［平均±標準偏差（ｎ＝３ディッシュ／時点）］
【表１】
2020171284.tif 000003
【０２１６】
実施例２．ＨＩＲ  Ａｂ−ＧＣＲ融合タンパク質の発現および機能解析
ゴーシェ病（ＧＤ）で変異しているリソソーム酵素は、β−グルコセレブロシダーゼ（ＧＣＲ）である。ＧＤの神経細胞障害性の形態はＣＮＳに影響を及ぼし、これにより、脳内でＧＣＲ酵素活性が欠如するため、脳細胞内でリソソーム内封入体が蓄積することになる。ＧＤの酵素補充療法（ＥＲＴ）は、ＧＣＲ酵素がＢＢＢを通過しないことから、脳の治療に有効ではない。ＢＢＢを通過させるためにヒトＧＣＲを再設計する一環として、ＨＩＲ  Ａｂ−ＧＣＲ融合タンパク質プロジェクトを、酵素活性について設計し、発現し、試験した。３９アミノ酸のシグナルペプチドを含まない、ヒトＧＣＲタンパク質（ＮＰ＿０００１４８）のアミノ酸Ａｌａ４０−Ｇｌｎ５３６に対応するヒトＧＣＲ  ｃＤＮＡを、営利ＤＮＡ作製会社でカスタム合成した。ＧＣＢ  ｃＤＮＡを、シグナルペプチドからＴＧＡストップコドンまでを含まない、ＧＣＢのオープンリーディングフレームを含む１５２２ヌクレオチド（ｎｔ）で構成した。５’末端には、ＳｔｕＩ制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥ）配列を付加し、３’末端には、ＧＣＲ  ｍＲＮＡの３’−非翻訳領域からの１４ｎｔフラグメントの後にＨｉｎｄＩＩＩ  ＲＥ部位を続けた。ＧＣＲ遺伝子内の内在するＨｉｎｄＩＩＩおよびＳｔｕＩ部位を、アミノ酸配列を変化させないように突然変異させた。ＧＣＲ遺伝子を、ＳｔｕＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて、供給業者により提供されたｐＵＣプラスミドから切り離して、ＨＩＲ  Ａｂ重鎖をコードする真核細胞発現プラスミドのＨｐａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入し、この発現プラスミドをｐＣＤ−ＨＣ−ＧＣＲと命名した。この発現プラスミドは、ＨＩＲ  ＡｂのＨＣとＧＣＲとの間の３アミノ酸のリンカー（Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）により、ＨＩＲ  Ａｂの重鎖（ＨＣ）のカルボキシル末端と、３９アミノ酸のＧＣＲシグナルペプチドを含まないヒトＧＣＲのアミノ末端を融合した、融合タンパク質を発現する。ＤＮＡシーケンシングにより、ｐＣＤ−ＨＣ−ＧＣＲ発現カセットを同定した。発現カセットを、２１３４ｎｔのＣＭＶプロモーター配列、２，８８９ｎｔの発現カセット、および３６７ＢＧＨポリＡ配列を含む、５，３９０ｎｔで構成した。プラスミドに、１９アミノ酸のＩｇＧシグナルペプチド、４４３アミノ酸のＨＩＲＭＡｂ  ＨＣ、３アミノ酸のリンカー（Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）、および、該酵素シグナルペプチドを含まない４９７アミノ酸のヒトＧＣＲからなる、９６３アミノ酸のタンパク質をコードさせた。ＧＣＲ配列は、ヒトＧＣＲ（ＮＰ＿０００１４８）のＡｌｓ４０−Ｇｌｎ５３６と１００％同一であった。グリコシル化されていない重鎖融合タンパク質の予想される分子量は１０４，４４０Ｄａであり、予想される等電点（ｐＩ）は８．４２である。
【０２１７】
ＨＩＲ  Ａｂ−ＧＣＲ融合タンパク質を、一過性にトランスフェクトしたＣＯＳ細胞内で発現させた。ＣＯＳ細胞を６ウェルクラスターディッシュに蒔き、キメラＨＩＲ  Ａｂの軽鎖（ＬＣ）をコードする発現プラスミドであるｐＣＤ−ＬＣ、およびｐＣＤ−ＨＣ−ＧＣＲで二重トランスフェクトした。リポフェクタミン  ２０００を用いて、１：２．５、ｕｇＤＮＡ：ｕＬリポフェクタミン  ２０００の比でトランスフェクションを行い、馴化無血清培地を３および７日に採取した。無血清培地（ＳＦＭ）への融合タンパク質の分泌を、ヒトＩｇＧ  ＥＬＩＳＡによりモニターした。馴化培地を深層ろ過により清澄し、ＨＩＲ  Ａｂ−ＧＣＲ融合タンパク質をプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。融合タンパク質の純度を還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認し、融合タンパク質を、ヒトＩｇＧまたはヒトＧＣＲのいずれかに対する一次抗体を用いたウェスタンブロッティングにより同定した。ＩｇＧ抗体とＧＣＲ抗体はいずれも、ＨＩＲ  Ａｂ−ＧＣＲ融合タンパク質の１３０ｋＤａ重鎖と反応した。
【０２１８】
組み換えＧＣＲの酵素アッセイについて以前に記載されているように（J.B. Novo, et al, Generation of a Chinese hamster ovary cell line producing recombinant human glucocerebrosidase, J. Biomed. Biotechnol., Article ID 875383, 1-10, 2012）、融合タンパク質のＧＣＲ酵素活性を、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルコピラノシド（４−ＭＵＧ）を酵素基質として用いて、蛍光定量的酵素アッセイで測定した。ＧＣＲ酵素アッセイを、終濃度５ｍＭの４−ＭＵＧを用いて、０．２５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および０．２５％タウロコール酸ナトリウムを含むクエン酸／リン酸緩衝液／ｐＨ＝５．５中で行い、３７℃で６０分間インキュベートした。酵素活性を、０．１Ｍ  グリシン／０．１Ｍ  ＮａＯＨを加えることにより、停止させた。ＧＣＲ酵素は、４−ＭＵＧ基質を、生成物である４−メチルウンベリフェロン（４−ＭＵ）に変換する。４−ＭＵ（０．０３〜３ｎｍｏｌ／チューブ）を用いて、アッセイ検量線を作成した。酵素活性をユニット／ｍｇタンパク質として報告し、ここで１ユニット＝１ｕｍｏｌ／分である。組み換えヒトＧＣＲの酵素活性は、４０ユニット／ｍｇである（Novo et al, 2012）。しかし、ＨＩＲ  Ａｂ−ＧＣＲ融合タンパク質のＧＣＲ酵素活性は、組み換えＧＣＲの比活性に比べ９９％低下した、わずか０．０７ユニット／ｍｇであった。
【０２１９】
実施例１および２は、生物学的活性のあるＩｇＧ−リソソーム酵素融合タンパク質の設計が予測不可能であることを示している。いずれの場合も、ＧＵＳＢまたはＧＣＲのいずれかと、ＨＩＲ  Ａｂの重鎖のカルボキシル末端を融合すると、酵素活性の＞９５％を失うことになる。以下の実施例に、ＳＧＳＨ酵素活性が、ＨＩＲ  Ａｂの重鎖のカルボキシル末端との融合後に保存されているという、驚くべき知見について記載した。
【０２２０】
実施例３．ヒトＨＩＲ  Ａｂ重鎖−ＳＧＳＨ融合タンパク質発現ベクターの構築
ＭＰＳ−ＩＩＩＡで変異しているリソソーム酵素は、ＳＧＳＨである。ＭＰＳ−ＩＩＩＡは、脳内にヘパラン硫酸の蓄積をもたらす。Hemsley et al. (2009)（Examination of intravenous and intra-CSF protein delivery for treatment of neurological disease」, Eur. J. Neurosci., 29:1197-1214）に記載されているように、ＳＧＳＨ酵素がＢＢＢを通過しないため、ＭＰＳ−ＩＩＩＡの酵素補充療法は脳の治療に有効ではない。ＢＢＢを通過することができ、かつ酵素活性を示すことができる、二機能性の分子を開発するために、ＳＧＳＨをＨＩＲ  Ａｂと融合した。一態様において、成熟ＳＧＳＨのアミノ末端を、ＨＩＲ  Ａｂの各重鎖のカルボキシル末端と融合した（図２）。
【０２２１】
ＳＧＳＨをＨＩＲ  Ａｂと融合すると、ＳＧＳＨの酵素活性が保持されるかどうか不明であった。実施例１に記載のＩｇＧ−ＧＵＳＢ融合タンパク質の経験は、当該技術の予測できない性質を示すと共に、ＩｇＧ−酵素融合タンパク質を構築すると、ＩｇＧ部分またはリソソーム酵素部分が生物学的活性を弱める可能性を示している。小胞体内でアミノ末端近傍のＣｙｓ残基（配列番号１０のＣｙｓ−５１４）が翻訳後修飾を受ける、タンパク質の翻訳後修飾があるまでＳＧＳＨ酵素が触媒活性になり、ＳＧＳＨをＨＩＲ  Ａｂと融合すると、その過程が損なわれるかどうか知られていなかったため、ＳＧＳＨの状況はさらに複雑である。ＳＧＳＨはスルファターゼファミリーのメンバーであり、小胞体内で、ホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）とも称されるスルファターゼ修飾因子タイプ１（ＳＵＭＦ１）により、特定のＣｙｓ残基がホルミルグリシン残基に変換されると、酵素活性が活性化される（Fraldi et al. (2007),「SUMF1 enhances sulfatase activities in vivo in five sulfatase deficiencies」, Biochem. J., 403: 305-312.）。この、内在性のシステインのホルミルグリシン残基への変換がないと、酵素はほとんど活性を持たない。例えば、ＨＩＲへの融合タンパク質の高親和性結合を保持する一環として、ＳＧＳＨをＨＩＲ  ＡｂのＨＣのカルボキシル末端と融合したならば、ＩｇＧ重鎖は宿主細胞内で翻訳された後３次元構造に折り畳まれ、次いで融合タンパク質のＳＧＳＨ部分が折り畳まれるであろう。ＨＩＲ  Ａｂ  ＨＣ−ＳＧＳＨ融合タンパク質のＳＧＳＨ部分が、小胞体内のＳＧＳＨ−修飾因子により認識され活性化されるであろう３次元構造に折り畳まれ、ＨＩＲ  Ａｂ−ＳＧＳＨ融合タンパク質において、完全なＳＧＳＨ酵素活性の発現をもたらすかどうかは不明であった。
【０２２２】
ヒトＳＧＳＨ  ｍＲＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ受託＃ＮＭ＿０００１９９）のヌクレオチド配列に由来するオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、ヒトＳＧＳＨのｃＤＮＡを作製した。表２に記載のＯＤＮ、および市販のヒト肝臓ポリＡ＋ＲＮＡを用いて、逆転写（ＲＴ）ＰＣＲにより、そのシグナルペプチドＡｒｇ２１−Ｌｅｕ−５０２を含まないヒトＳＧＳＨをコードするｃＤＮＡを作製した。タンデムベクター（ＴＶ）発現プラスミドにおいて、ヒトＩｇＧ１のＣＨ３領域を含むオープンリーディングフレーム（ｏｒｆ）を維持し、かつ、ヒトＩｇＧ１−ＣＨ３とＳＧＳＨ  ｃＤＮＡとの間にＳｅｒ−Ｓｅｒリンカーを導入するために、フォーワード（ＦＯＲ）ＯＤＮプライマーに、５’−隣接領域上に「ＣＣ」を持たせた。リバース（ＲＥＶ）ＯＤＮは、ＳＧＳＨ  ｏｒｆの末端に相補的であり、そのストップコドンＴＧＡを含む。ＲＴ−ＰＣＲを完了し、アガロースゲル電気泳動により、ＳＧＳＨ  ｏｒｆ  ｃＤＮＡに対応する〜１．５ｋｂの予測された単一バンドを検出し（図３、レーン３）、ゲルで精製した。発現ベクターへ直接挿入するために、フォーワードおよびリバースＯＤＮの両方をリン酸化する。図４で概説したＴＶ−ＨＩＲＭＡｂ−ＳＧＳＨを形成するために、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いて、前駆体ＴＶであるｐＵＴＶ−１のＨｐａＩ部位へＳＧＳＨ  ｃＤＮＡを挿入した。ｐＵＴＶ−１を、ＨｐａＩで線状にし、セルフライゲーションを防ぐために、アルカリホスファターゼで消化した。ＴＶ−ＨＩＲＭＡｂ−ＳＧＳＨは、ＨＩＲＭＡｂ−ＳＧＳＨ融合タンパク質のそれぞれ軽鎖（ＬＣ）と重鎖（ＨＣ）の両方の遺伝子の後に、マウスジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子を包含する、タンデムベクターである。ＨＩＲＭＡｂ−ＳＧＳＨ融合タンパク質の軽鎖および重鎖の遺伝子は、ＣＭＶプロモーターにより駆動され、ｏｒｆの後にウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化配列がある。ＤＨＦＲ遺伝子は、ＳＶ４０プロモーターの影響下にあり、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ポリアデニル化終止配列を含む。Ｍｉｄｌａｎｄ（Ｍｉｄｌａｎｄ、ＴＸ）により合成されたカスタムＯＤＮを用いて、Ｓｅｑｕｅｔｅｃｈ  Ｃｏｒｐ（Ｍｏｕｎｔａｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）において実施した双方向ＤＮＡシーケンシングにより、ＴＶ−ＨＩＲＭＡｂ−ＳＧＳＨプラスミドのＤＮＡ配列を確認した。両鎖をシーケンシングすることにより、プラスミドの完全な発現カセットを確認した。各ＨＣのカルボキシル末端へのＳＧＳＨモノマーの融合を、図２に示す。
表２．ヒトＳＧＳＨ  ｍＲＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ＿０００１９９）に由来する、シグナルペプチドを含まないヒトＳＧＳＨのＲＴ−ＰＣＲクローニングの設計、およびＨＩＲＭＡｂ−ＳＧＳＨ発現ベクターの設計に用いたオリゴデオキシヌクレオチドプライマー
【表２】
2020171284.tif 000004
【０２２３】
ＴＶ−ＨＩＲＭＡｂ−ＳＧＳＨプラスミドのＤＮＡシーケンシングは、ＬＣ遺伝子の発現カセット、ＨＣ−ＳＧＳＨ遺伝子、およびＤＨＦＲ遺伝子を網羅する、１０，０００ヌクレオチド（ｎｔ）を包含した（図４）。５’末端から始めて、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、９ｎｔの完全なコザック部位、ＧＣＣＧＣＣＡＣＣ（配列番号１３のｎｔ  １〜９）、７０５ｎｔのＬＣのオープンリーディングフレーム（ｏｒｆ）（配列番号１３のｎｔ  １０〜７１４）、次いでウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリＡ配列、次いでリンカー配列、次いでタンデムＣＭＶプロモーター、次いで完全なコザック部位（配列番号１４のｎｔ  １〜９）、次いで２，８４１ｎｔのＨＩＲＭＡｂ  ＨＣ−ＳＧＳＨ融合タンパク質ｏｒｆ（配列番号１４のｎｔ  １０〜２８５０）、次いでタンデムＢＧＨポリＡ配列、次いでＳＶ４０プロモーター、次いで完全なコザック部位（配列番号１５のｎｔ  １〜９）、次いで５６４ｎｔのＤＨＦＲ  ｏｒｆ（配列番号１５のｎｔ  １０〜５７３）、次いでＢ型肝炎ウイルスポリＡ配列から、プラスミドを構成した（図４）。ＴＶに、２０アミノ酸のシグナルペプチドを含む２３４アミノ酸のＨＩＲＭＡｂ  ＬＣ（配列番号８）、および、ＨＩＲＭＡｂ  ＨＣとＳＧＳＨの９４６アミノ酸のタンパク質融合タンパク質（配列番号１０）をコードさせた。１９アミノ酸のＩｇＧシグナルペプチド、４４２アミノ酸のＨＩＲＭＡｂ  ＨＣ、３アミノ酸のリンカー（Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）、および、該酵素のシグナルペプチドを含まない４８２アミノ酸のヒトＳＧＳＨから、融合タンパク質ＨＣを構成した。グリコシル化されていない重鎖融合タンパク質の予想される分子量は１０３，４１２Ｄａであり、予想される等電点（ｐＩ）は７．４４である。該融合タンパク質のＳＧＳＨドメイン内のＲ４５６Ｈ多型を除いて、ＨＣ融合タンパク質のＳＧＳＨドメインのアミノ酸配列は、ヒトＳＧＳＨ（ＮＰ＿０００１９０）のアミノ酸２１〜５０２の配列と１００％同一であり、ここで該付番方式はＳＧＳＨの２０アミノ酸のシグナルペプチドを含んでいる。該残基は、高頻度でアルギニン（ＲまたはＡｒｇ）残基であるが、ヒスチジン（ＨまたはＨｉｓ）残基も知られている。Ｒ４５６Ｈ多型は、ＳＧＳＨの酵素活性に重大な影響を及ぼさない（Montfort et al. (2004), Expression and functional characterization of human mutant sulfamidase in insect cells, Mol. Genet. Metab. 83: 246-251）。ＴＶは、１８７アミノ酸のタンパク質（配列番号１６）である選択遺伝子ＤＨＦＲの生成物もコードする。
【０２２４】
実施例４．ＴＶ−ＨＩＲＭＡｂ−ＳＧＳＨを用いたチャイニーズハムスター卵巣細胞の安定なトランスフェクション
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を、１ｘＨＴサプリメント（ヒポキサンチンおよびチミジン）を含む無血清ＨｙＱ  ＳＦＭ４ＣＨＯユーティリティ（Ｕｔｉｌｉｔｙ）培地（ＨｙＣｌｏｎｅ）中で培養した。ＣＨＯ細胞（５ｘ１０６の生細胞）を、５μｇのＰｖｕＩで線状にしたＴＶ−ＨＩＲＭＡｂ−ＳＧＳＨプラスミドＤＮＡと共にエレクトロポレーションした。次いで、細胞−ＤＮＡ懸濁液を氷上で１０分間インキュベートした。ＢｉｏＲａｄのＣＨＯ細胞用のプリセット・プロトコール、すなわち、１５ｍｓｅｃおよび１６０ボルトのパルスを有する方形波で細胞をエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後、細胞を氷上で１０分間インキュベートした。細胞懸濁液を５０ｍＬ培地に移し、１ウェル当たり１２５μｌで４ｘ９６ウェルプレートに蒔いた（１ウェル当たり１０，０００細胞）。１研究当たり、計１０回のエレクトロポレーションおよび４，０００ウェルを行った。
【０２２５】
エレクトロポレーション（ＥＰ）後、ＣＨＯ細胞を３７℃で８％ＣＯ２のインキュベーター内に置いた。ＴＶ内のｎｅｏ遺伝子の存在のために、トランスフェクトされた細胞株は最初にＧ４１８で選択した。ＴＶ−ＨＩＲＭＡｂ−ＳＧＳＨはＤＨＦＲ遺伝子も含むため（図４）、トランスフェクトされた細胞は２０ｎＭメトトレキサート（ＭＴＸ）およびＨＴ欠乏培地によっても選別することができた。ＥＰ後約２１日で目に見えるコロニーが検出された時点で、ＥＬＩＳＡによるヒトＩｇＧ用に馴化培地をサンプリングした。ＥＬＩＳＡで高ヒトＩｇＧシグナルを示すウェルを、９６ウェルプレートから１ｍＬのＨｙＱ  ＳＦＭ４ＣＨＯ−Ｕｔｉｌｉｔｙを含む２４ウェルプレートへ移した。２４ウェルプレートを３７℃で８％ＣＯ２のインキュベーターに戻した。翌週、ＩｇＧ  ＥＬＩＳＡを２４ウェルプレート内のクローンに対して行った。これを、６ウェルプレートからＴ７５フラスコ、ならびに最終的にはオービタルシェーカー上の６０ｍＬおよび１２５ｍＬの正方形のプラスチック瓶まで繰り返した。この段階で、最終ＭＴＸ濃度は８０ｎＭであり、培地中のＨＩＲＭＡｂ−ＳＧＳＨ融合タンパク質の尺度である培地のＩｇＧ濃度は、１０６／ｍＬの細胞密度で＞１０ｍｇ／Ｌである。
【０２２６】
希釈クローニング（ＤＣ）用に選択されたクローンを、インキュベーター内のオービタルシェーカーから取り出し、無菌フードに移した。４０ｘ９６ウェルプレート内の４，０００ウェルに、１ウェル当たり１細胞（ＣＰＷ）の細胞密度で蒔くことができるように、５％透析ウシ胎児血清（ｄ−ＦＢＳ）およびペニシリン／ストレプトマイシンを含むＦ−１２Ｋ培地中で細胞を５００ｍＬまで希釈し、最終希釈度を１ｍＬ当たり８細胞とした。無菌フード内で細胞懸濁液を調製した時点で、８チャネルピペッターまたは高精度ピペッターシステムを用いて１２５μＬ分量を９６ウェルプレートの各ウェルに分注した。プレートを３７℃で８％ＣＯ２のインキュベーターに戻した。１細胞／ウェルまで希釈した細胞は、血清なしでは生存できない。６日目または７日目に、ＤＣプレートをインキュベーターから取り出し、無菌フードに移し、そこで５％透析ウシ胎児血清（ｄ−ＦＢＳ）を含む１２５μｌのＦ−１２Ｋ培地を各ウェルに加えた。この時点で、この選択培地は、５％ｄ−ＦＢＳ、３０ｎＭ  ＭＴＸおよび０．２５ｍｇ／ｍＬジェネテシンを含んでいた。最初の１ＣＰＷプレーティングから２１日目、ヒトＩｇＧ  ＥＬＩＳＡ用に、ロボット装置を用いて４，０００ウェルのそれぞれから一定分量を取り出した。ＤＣプレートをインキュベーターから取り出し、無菌フードに移し、そこで９６ウェルプレートの１ウェル当たり１００μｌの培地を取り出し、８チャネルピペッターまたは高精度ピペッターシステムを用いて新たな無菌サンプル９６ウェルプレートに移した。
【０２２７】
最初の１ＣＰＷプレーティングから２０日目に、４０ｘ９６ウェルイムノアッセイプレートに、１００μＬの１μｇ／ｍＬの一次抗体溶液、マウス抗ヒトＩｇＧの０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３溶液を蒔いた。プレートを４℃の冷蔵庫内で一晩インキュベートする。翌日、ＥＬＩＳＡプレートを１ｘＴＢＳＴで５回洗浄し、１００μＬの１μｇ／ｍＬの二次抗体溶液およびブロッキング緩衝液を加えた。プレートを１ｘＴＢＳＴで５回洗浄する。１００μＬの１ｍｇ／ｍＬの４−ニトロフェニルホスフェートジ（２−アミノ−２−エチル−１，３−プロパンジオール）塩の０．１Ｍグリシン緩衝液中溶液を、９６ウェルイムノアッセイプレートに加える。マイクロプレートリーダーでプレートを読んだ。アッセイにより、４，０００ウェル／実験についてのＩｇＧ出力データが得られた。最も生産性の高い２４〜４８ウェルをさらなる増殖用に選択した。
【０２２８】
１ＣＰＷ  ＤＣからの最も生産性の高い２４ウェルプレートを無菌フードに移し、６ウェルディッシュ、Ｔ７５フラスコ、およびオービタルシェーカー上の１２５ｍＬの正方形のプラスチック瓶を通じて徐々にサブクローニングした。このプロセスの間、細胞の遠心分離の最終段階で血清をゼロまで減少させ、ＳＦＭへ再懸濁した。
【０２２９】
上記の手順を、２回目の希釈クローニングで、０．５〜１細胞／ウェル（ＣＰＷ）で繰り返した。この段階で、およそ４０％のウェルが何らかの細胞増殖を示し、増殖を示している全てのウェルはヒトＩｇＧを分泌もした。これらの結果により、これらの手順で１ウェル当たり平均１細胞のみが蒔かれ、ＣＨＯ細胞株が単一細胞から生ずることが確認された。
【０２３０】
１０ｍｇ／Ｌの培地濃度で、１〜２百万細胞／ｍＬの細胞密度で、安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞により、ＨＩＲ  Ａｂ−ＳＧＳＨ融合タンパク質は、培地へ大量に分泌された。融合タンパク質遺伝子およびＳＵＭＦ１をコードする遺伝子で宿主細胞を二重トランスフェクトしていないにもかかわらず、安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞により、ＨＩＲ  Ａｂ−ＳＧＳＨ融合タンパク質が多く産生されることが観察された。トランスフェクトされた宿主細胞により馴化された培地への、ＳＧＳＨの分泌を検出するためには、ＳＧＳＨ遺伝子でトランスフェクトされた細胞を、ＳＵＭＦ１補助因子で共トランスフェクトする必要があった（Fraldi et al. (2007),「SUMF1 enhances sulfatase activities in vivo in five sulfatase deficiencies」, Biochem. J., 403: 305-312）。ＳＧＳＨおよびＩｇＧ−ＳＧＳＨ融合タンパク質を設計する予想外の利点は、ＳＵＭＦ１で共トランスフェクトする必要なしに、宿主細胞が融合タンパク質を分泌することである。
【０２３１】
プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにより、ＣＨＯ由来ＨＩＲＭＡｂ−ＳＧＳＨ融合タンパク質を精製した。図１０に示すように、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、ＨＩＲＭＡｂ−ＳＧＳＨ融合タンパク質の純度を確認した。ＨＩＲＭＡｂ単独でも、ＨＩＲＭＡｂ−ＳＧＳＨ融合タンパク質でも、ＨＣおよびＬＣタンパク質のみが検出される。ヒトＩｇＧ（図１１、左パネル）、またはヒトＳＧＳＨ（図１１、右パネル）に対する一次抗体を用いたウェスタンブロッティングにより、融合タンパク質を同定した。ＭＷ標準の移動度に基づいて、ＨＩＲＭＡｂ−ＳＧＳＨ重鎖および軽鎖の分子量（ＭＷ）、ならびに、ＨＩＲＭＡｂ重鎖および軽鎖のＭＷを、線形回帰により推定した。ＳＧＳＨをＨＩＲＭＡｂ重鎖と融合していることから、ＨＩＲＭＡｂ−ＳＧＳＨ融合重鎖のサイズ（１３６ｋＤａ）は、ＨＩＲＭＡｂの重鎖のサイズ（６２ｋＤａ）よりも大きい。ＨＩＲＭＡｂ−ＳＧＳＨ融合タンパク質およびＨＩＲＭＡｂ抗体は同一の軽鎖を用いることから、軽鎖のサイズ（２７ｋＤａ）は、両方のタンパク質で同一である。ウェスタンブロットのＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける移動度に基づくと、図２に示すヘテロ４量体ＨＩＲＭＡｂ−ＳＧＳＨ融合タンパク質の推定されるＭＷは３２５ｋＤａである。
【０２３２】
実施例５．二機能性のＩｇＧ−ＳＧＳＨ融合タンパク質のＨＩＲ結合とＳＧＳＨ活性の分析
ＨＩＲ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に対する融合タンパク質の親和性を、ＥＬＩＳＡで測定した。以前Coloma et al. (2000) Pharm Res, 17:266-274に記載されているように、無血清培地（ＳＦＭ）中で、ＨＩＲ  ＥＣＤで永続的にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を培養し、コムギ胚芽凝集素アフィニティーカラムを用いて、ＨＩＲ  ＥＣＤを精製した。Ｎｕｎｃ−Ｍａｘｉｓｏｒｂ  ９６ウェルディッシュにＨＩＲ  ＥＣＤを蒔き、ビオチン化抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ヤギ二次抗体、次いでアビジンおよびビオチン化ペルオキシダーゼ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）を用いて、ＨＩＲ  ＥＣＤへの、ＨＩＲ  ＡｂまたはＨＩＲ  Ａｂ−ＳＧＳＨ融合タンパク質の結合を検出した。非線形回帰分析により、ＨＩＲ  ＡｂまたはＨＩＲ  Ａｂ−ＳＧＳＨ融合タンパク質の、最大の結合の５０％を与える濃度であるＥＤ５０を決定した。ＨＩＲへの結合のＥＤ５０は２９±３ｎｇ／ｍＬであり、ＨＩＲへのＨＩＲ  Ａｂ−ＳＧＳＨ融合タンパク質の結合のＥＤ５０は１０７±１７ｎｇ／ｍＬである（図１２）。ＨＩＲ  ＡｂのＭＷは１５０ｋＤａであり、ＨＩＲ  Ａｂ−ＳＧＳＨ融合タンパク質のＭＷは３２５ｋＤａである。従って、分子量の差を標準化した後の、ＨＩＲ  ＥＣＤへの、キメラＨＩＲ  ＡｂまたはＨＩＲ  Ａｂ−ＳＧＳＨ融合タンパク質の結合は同等であり、ＥＤ５０はそれぞれ、０．１９±０．０２ｎＭと０．３３±０．０５ｎＭであった（図１２）。これらの知見は、ＳＧＳＨ分子がＩｇＧの両重鎖のカルボキシル末端と融合されているにもかかわらず、ＨＩＲに結合するＨＩＲ  Ａｂ−ＳＧＳＨ融合タンパク質の親和性が保持されていることを示している。
【０２３３】
Karpova et al. (1996)（A fluorimetric enzyme assay for the diagnosis of Sanfilippo disease type A (MPS IIIA), J. Inher. Metab. Dis. 19: 278-285）により開発され、アッセイの基質に４−メチルウンベリフェリル−α−Ｎ−スルフォ−Ｄ−グルコサミニド（ＭＵ−αＧｌｃＮＳ）を使用する、２段階蛍光定量的酵素アッセイを用いて、ＳＧＳＨ酵素活性を測定した。該基質はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）によりカスタム合成され、該基質の構造を図１３Ａに概説する。該基質は、ＳＧＳＨにより、４−メチルウンベリフェリル−α−Ｄ−グルコサミニド（ＭＵ−αＧｌｃＮＨ２）に加水分解され、これは次いで、市販の酵母α−グルコシダーゼ中のα−グルコサミニダーゼ副活性（ｓｉｄｅ−ａｃｔｉｖｉｔｙ）により、蛍光生成物である４−メチルウンベリフェロン（４−ＭＵ）に加水分解される（図１３Ａ）。０．０３Ｍ  バルビタールナトリウム／０．０３Ｍ  酢酸ナトリウム／０．１３Ｍ  ＮａＣｌ／ｐＨ＝５．５／０．０２％アジ化ナトリウム中、３７℃で１７時間、ＨＩＲＭＡｂ−ＳＧＳＨ融合タンパク質（３０、１００、または３００ｎｇ）、およびＭＵ−αＧｌｃＮＳ基質をインキュベーションすることにより、アッセイを行った。マッキルベイン緩衝液、および０．１ユニットの酵母α−グルコシダーゼを加え、３７℃で２４時間インキュベーションを続けた。０．５Ｍ  炭酸ナトリウム／ｐＨ＝１０．７を加えることにより、反応を停止した。３６５ｎｍ励起フィルターおよび４５０ｎｍ発光フィルターが付いたＦａｒｒａｎｄ蛍光光度計を用いて、蛍光を測定した。蛍光ユニットからｎｍｏｌ／チューブに換算できるようにする、０．０３〜３．０ｎｍｏｌ／チューブの４−ＭＵ生成物を用いて、検量線を作成した。１ユニット＝最初の１７時間のインキュベーションの間に生成した４−ＭＵ生成物のｎｍｏｌ（Karpova et al, 1996）として、酵素活性を、ＨＩＲＭＡｂ−ＳＧＳＨ融合タンパク質のユニット／ｍｇタンパク質として測定した。アッセイは融合タンパク質の質量に対して直線性を有し（図１３Ｂ）、平均酵素活性は４，７１２±３８８ユニット／ｍｇタンパク質であった。同じアッセイによる６０ｋＤａの組み換えヒトＳＧＳＨのＳＧＳＨ酵素比活性は、１５，０００ユニット／ｍｇタンパク質である（Urayama et al. (2008): Mannose 6-phosphate receptor-mediated transport of sulfamidase across the blood-brain barrier in the newborn mouse. Mol Ther 16: 1261-1266.）。しかし、ＳＧＳＨを、３２５ｋＤａのヘテロ４量体ＩｇＧ−ＳＧＳＨ融合タンパク質（図２）として再設計すると、ＳＧＳＨのＭＷは６０ｋＤａであるのに対して、ＳＧＳＨの有効ＭＷは１６３ｋＤａである。分子量の差を標準化した後の有効ＳＧＳＨ比活性は１２，８００ユニット／ｍｇタンパク質であり、これは、組み換えＳＧＳＨの酵素活性の８５％である。従って、ＩｇＧ−ＧＵＳＢ融合タンパク質で観察された結果とは対照的に（表１）、ＨＩＲ  ＡｂのＨＣのカルボキシル末端へのＳＧＳＨの融合は、ＳＧＳＨ酵素の酵素活性にわずかな影響しか与えなかった。ＳＧＳＨは、ＳＧＳＨ酵素活性の発現のために特定の翻訳後修飾を必要とするスルファターゼファミリーのメンバーであることから、ＣＨＯ由来ＨＩＲ  Ａｂ−ＳＧＳＨ融合タンパク質の高いＳＧＳＨ酵素活性は驚くべきことである。ホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）とも称されるスルファターゼ修飾因子タイプ１（ＳＵＭＦ１）により、Ｃｙｓ−５０がホルミルグリシン残基に変換されると、ＳＧＳＨ酵素の活性が活性化される。安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞により産生されるＨＩＲＭＡｂ−ＳＧＳＨ融合タンパク質においてＳＧＳＨの酵素活性が保持されることは、ＨＩＲＭＡｂ重鎖と融合しているにもかかわらず、宿主細胞内でＳＧＳＨ酵素が活性化されることを示している。
【０２３４】
実施例６．ＳＧＳＨおよび標的抗体を連結するアミノ酸リンカー
成熟ヒトＳＧＳＨは、ＨＩＲ  ＡｂのＨＣのカルボキシル末端と、３アミノ酸のリンカー、（図９で下線を付した）Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒで融合している。任意の数のリンカーのバリエーションがＳｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒリンカーの代わりに用いられる。３アミノ酸のリンカーは保持されてよいが、アミノ酸配列は代わりのアミノ酸、例えばＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ、Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ、または２０の天然アミノ酸の任意の数の組み合わせに変化してよい。または、リンカーは２、１、または０のアミノ酸に減らされる。０アミノ酸のリンカーの場合、ＳＧＳＨのアミノ末端はＨＩＲ  ＡｂのＨＣのカルボキシル末端と直接融合されている。代わりに、リンカーの長さは３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または２０アミノ酸まで伸長される。融合タンパク質の設計における最適なアミノ酸リンカーを決定するための複数の公的に入手可能なプログラムがあるため、そのようなリンカーは当該技術分野で周知である。頻繁に用いられるリンカーは、反復配列におけるＧｌｙおよびＳｅｒの様々な組み合わせ、例えば（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３、または他のバリエーションを含む。
【０２３５】
実施例７．サンフィリッポＡ型線維芽細胞におけるＨＩＲ  Ａｂ−ＳＧＳＨ融合タンパク質の生物学的活性およびリソソーム分布
ＳＧＳＨ酵素は、ヘパラン硫酸ＧＡＧからの硫酸基を加水分解し、これにより、細胞内の他の酵素よるＧＡＧのその後の分解が可能となる。サンフィリッポＡ型線維芽細胞（ＭＰＳ−ＩＩＩＡ線維芽細胞）において、ＧＡＧからの硫酸エステルの放出に対する、ＨＩＲＭＡｂ−ＳＧＳＨ融合タンパク質を用いた処理の効果を試験した。細胞を、Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｃａｍｄｅｎ、ＮＪ）から入手し、６ウェルクラスターディッシュ内でコンフルエントになるまで培養し、次いで、３５Ｓを用いたパルス・チェイス実験を行った。パルスの段階では、コンフルエントな細胞を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、加湿インキュベーター内で、１０％透析ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む１ｍＬの低濃度硫酸エステルハムＦ１２培地、および、４７μＣｉ／ｍＬの［３５Ｓ］硫酸ナトリウムと、３７℃で４８時間インキュベートした。培地を吸引し、ウェルをＰＢＳで洗浄して、加湿インキュベーター内で、細胞を、通常の１０％ＦＢＳを含む放射能のないＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（１ｍＬ／ウェル）、および、様々な濃度のＨＩＲＭＡｂ−ＳＧＳＨ融合タンパク質と、３７℃で４８時間インキュベートした。培地を吸引し、細胞をＰＢＳで洗浄した。３７℃で４分間、０．４ｍＬ／ウェルの０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡを用いて、細胞をウェルから取り出し、このステップにより、細胞表面に付着していた放射能は取り除かれることから、リソソームのＧＡＧには取り込まれない。細胞を無血清培地中に懸濁してトリプシン反応を停止し、１０００ｇで遠心分離する。上清を取り出して廃棄し、細胞ペレットを、０．４ｍＬの１Ｎ  ＮａＯＨ中に、６０℃で１時間可溶化する。ビシンコニン酸（ＢＣＡ）タンパク質アッセイを用いて、タンパク質含有量を測定する。Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ液体シンチレーションカウンターを用いて、Ｕｌｔｉｍａ−ｇｏｌｄ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ中で、３５Ｓ放射能を測定した。ＣＰＭ放射能をｍｇタンパク質ウェルで割り、ＣＰＭ／ｍｇタンパク質としてデータを報告した（表３）。本研究は、ＨＩＲＭＡｂ−ＳＧＳＨ融合タンパク質の準治療濃度（０．２５〜０．５μｇ／ｍＬ）が、ＭＰＳ−ＩＩＩＡ線維芽細胞において硫酸エステルでラベルされたＧＡＧを、７２％〜８３％減少させることを示している。
【０２３６】
ＭＰＳ−ＩＩＩＡ線維芽細胞における硫酸化ＧＡＧの減少は、ＨＩＲＭＡｂ−ＳＧＳＨ融合タンパク質が、標的細胞により取り込まれるだけでなく、標的細胞のリソソーム画分にトリアージされる（ｔｒｉａｇｅｄ）ことを示唆している。このことを、共焦点顕微鏡検査により確認した。ＭＰＳ−ＩＩＩＡ線維芽細胞を、ＨＩＲＭＡｂ−ＳＧＳＨ融合タンパク質と６〜２４時間インキュベートし、次いで洗浄し、４％パラホルムアルデヒド中で固定し、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で透過処理し、ヒトＳＧＳＨに対するウサギ一次抗体、およびヒトリソソーム膜タンパク質１型（ＬＡＭＰ１）に対するマウス一次抗体とインキュベートした後、抗マウスＩｇＧ，ロバ，Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ−４８８コンジュゲート（緑チャネル）、および、抗ウサギＩｇＧ，ロバ，Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ−５９４コンジュゲート（赤チャネル）とインキュベーションした。洗浄したスライドを、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で染色し、洗浄し、風乾し、Ｐｒｏｌｏｎｇ  Ｇｏｌｄ  Ａｎｔｉｆａｄｅ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）へ封入した。Ｌｅｉｔｚ  Ｐ１  Ａｐｏ  １００Ｘ  ｏｉｌ液浸対物レンズ、ならびに、アルゴン（４７６および４８８ｎｍ）、ニューダイオード（ｎｅｗ  ｄｉｏｄｅ）（５６１ｎｍ）、および、ヘリウム−ネオン（６３３ｎｍ）レーザーをそれぞれ利用するＬｅｉｃａ共焦点レーザー走査アダプターが付いたＬｅｉｃａ  ＴＣＳ  ＳＰ２  ＡＯＢＳ倒立蛍光顕微鏡を用いて、共焦点顕微鏡検査を行った。ＳＧＳＨ免疫反応性を赤チャネルで検出し、細胞内のＬＡＭＰ１免疫反応性を緑チャネルで検出した。ＳＧＳＨとＬＡＭＰ１の免疫反応性が重複していることは、ＨＩＲＭＡｂ−ＳＧＳＨ融合タンパク質が、ＭＰＳＩＩＩＡ線維芽細胞に取り込まれた後に、リソソーム画分へトリアージされることを示す。アイソタイプコントロール抗体でラベルした細胞において、免疫反応性はなかった。
表３．ＨＩＲＭＡｂ−ＳＧＳＨ融合タンパク質で処理したＭＰＳ−ＩＩＩＡ線維芽細胞におけるＧＡＧの減少
【表３】
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【０２３７】
実施例８．霊長類の脳へのＳＧＳＨの受容体媒介輸送
アカゲザルにおいて、インビボでのＨＩＲＭＡｂ−ＳＧＳＨ融合タンパク質のＢＢＢ透過を評価した。融合タンパク質のＨＩＲＭＡｂドメインは、アカゲザルのような旧世界霊長類のインスリン受容体と交差反応するが、リスザルのような新世界ザルのインスリン受容体、または、マウスのインスリン受容体とは交差反応しない。従って、脳へのインビボ送達は、アカゲザルにおいて評価した。［１２５Ｉ］−モノヨウ化−ボルトン・ハンター試薬を用いて、比活性が３．７μＣｉ／μｇとなるように、ＨＩＲＭＡｂ−ＳＧＳＨ融合タンパク質を放射性ラベルした。トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）による［１２５Ｉ］−ＨＩＲＭＡｂ−ＳＧＳＨ融合タンパク質の沈殿性は、−７０℃で保管している間、ラベル後少なくとも８日間は＞９７％であった。ラベルをする前に、０．０１Ｍ  酢酸ナトリウム／１４０ｍＭ  ＮａＣｌ／ｐＨ＝５．５／０．００１％Ｔｗｅｅｎ−８０、およびＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａｃｅｌ−３０Ｋ遠心ろ過ユニットを用いて、融合タンパク質の緩衝液交換を行った。Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５の１ｘ２８ｃｍカラムを用いたゲルろ過、および、０．０１Ｍ  酢酸ナトリウム／１４０ｍＭ  ＮａＣｌ／ｐＨ＝５．５／０．００１％  Ｔｗｅｅｎ−８０の溶出緩衝液を用いて、ラベルされたＨＩＲＭＡｂ−ＳＧＳＨ融合タンパク質を精製した。ＭＰＩ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｍａｔｔａｗａｎ，ＭＩ）において、１７．３ｋｇの成熟雌アカゲザルを調査した。該動物に、静脈内ボーラスにより、３０秒間にわたって、左大腿静脈に、１２００μＣｉの［１２５Ｉ］−ＨＩＲＭＡｂ−ＳＧＳＨ融合タンパク質を静脈内（ＩＶ）注射した。ＨＩＲＭＡｂ−ＳＧＳＨ融合タンパク質の注入量（ＩＤ）は１９μｇ／ｋｇであった。筋肉内ケタミンにより該動物を麻酔した。すべての手順は、米国国立衛生研究所により承認、公布された、実験動物の管理と使用に関する指針に従い実施した。総血漿［１２５Ｉ］放射能（ＤＰＭ／ｍＬ）、および、１０％冷ＴＣＡで沈殿する血漿放射能を測定するため、静脈内薬物投与の２、５、１５、３０、６０、９０、および１４０分後に、大腿静脈血漿を採取した。該動物を安楽死させ、主要組織（心臓、肝臓、脾臓、肺、骨格筋、および大網脂肪）のサンプルを摘出、秤量し、放射能測定用に加工した。頭蓋を開け、脳を摘出した。放射能を測定するために、前頭皮質灰白質、小脳灰白質、および脈絡叢のサンプルを摘出した。Ｗｉｚａｒｄ  ｍｏｄｅｌ  １４７０  ｇａｍｍａ  ｃｏｕｎｔｅｒを用いて、１２５Ｉ放射能について、血漿および組織サンプルを分析した。注射した融合タンパク質の比活性に基づいて、血漿中のＴＣＡで沈殿可能な［１２５Ｉ］放射能（ＤＰＭ／ｍＬ）をｎｇ／ｍＬに換算し、融合タンパク質の血漿濃度に、二項指数方程式％ＩＤ／ｍＬ＝Ａ１ｅ−ｋ１ｔ＋Ａ２ｅ−ｋ２ｔを当てはめた。滞留時間の中央値（ＭＲＴ）、分布容積の中央値（Ｖｃ）、定常状態分布容積（Ｖｓｓ）、血漿濃度曲線下面積（ＡＵＣ）、および全身クリアランス（ＣＬ）を算出するために、切片（Ａ１、Ａ２）および傾き（ｋ１、ｋ２）を用いた。非線形回帰分析には、ＢＭＤＰ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  Ｌｔｄ、Ｃｏ��ｋ、Ｉｒｅｌａｎｄ）のＡＲサブルーチンを使用した。データを１／（％ＩＤ／ｍＬ）２で重み付けした。
【０２３８】
ＢＢＢを越えるＨＩＲＭＡｂ−ＳＧＳＨ融合タンパク質の輸送を確認する毛細血管枯渇（ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）分析用に、前頭皮質のサンプル（〜２グラム）を摘出した。毛細血管枯渇法では、後血管区画（ｐｏｓｔ−ｖａｓｃｕｌａｒ  ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）から、脳内の血管組織を分離する。γ−グルタミルトランスフェラーゼまたはアルカリホスファターゼのような、脳毛細血管に特異的な酵素の比活性の測定に基づくと、後血管上清は、脳血管系の＞９５％を枯渇している。血管区画（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）と後血管区画を分離するため、組織グラインダーに入れた８ｍＬの冷ＰＢＳ中で、脳をホモジナイズした。８ｍＬの冷４０％デキストラン（７０ｋＤａ、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）をホモジネートに加え、放射能を測定するためにホモジネートの一部を採取した。固定角ローターを用いて、３２００ｇ、４℃で１０分間、ホモジネートを遠心分離した。脳微小血管系はペレットとして定量的に沈殿するため、後血管上清は毛細血管を枯渇した脳実質の尺度となる。ホモジネートと共に、血管ペレットおよび血管上清を、１２５Ｉ放射能についてカウントした。３フラクションのそれぞれについて、脳フラクション中の総［１２５Ｉ］放射能（ＤＰＭ／グラム脳）を、１４０分での末梢血漿中の総［１２５Ｉ］放射能（ＤＰＭ／μＬ血漿）で割った比から、分布容積（ＶＤ）を決定した。１０％冷ＴＣＡで沈殿可能な後血管上清中の放射能の割合を測定した。
【０２３９】
雄アカゲザルに、［１２５Ｉ］−ＨＩＲＭＡｂ−ＳＧＳＨ融合タンパク質（１２００μＣｉ、３２４μｇ）を静脈注射し、ＴＣＡで沈殿可能な［１２５Ｉ］−ＨＩＲＭＡｂ−ＳＧＳＨ融合タンパク質の血漿濃度の経時変化を図１４に示す。静脈注射の２、５、１５、３０、６０、９０、および１４０分後に、ＴＣＡで沈殿可能な総血漿放射能の割合は、それぞれ、９６±１％、９５±１％、９４±１％、８９±１％、８４±２％、７９±１％、および７２±２％であった。表４に示す薬物動態的（ＰＫ）パラメーターを与えるために、ＴＣＡで沈殿可能な融合タンパク質の血漿プロフィールに、二項指数方程式を当てはめた。６２±４分の平均滞留時間、分布容積の中央値（Ｖｃ）より２．５倍大きい全身の分布容積（Ｖｓｓ）、および、高い全身クリアランス速度（１．１１±０．０３ｍＬ／ｍｉｎ／ｋｇ）で、［１２５Ｉ］−ＨＩＲＭＡｂ−ＳＧＳＨ融合タンパク質は血漿から迅速に除去される（表４）。
表４．ＨＩＲＭＡｂ−ＳＨＳＨ融合タンパク質の薬物動態的パラメーター
【表４】
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図１４の血漿プロフィールから算出したパラメーター
非特異的なヒトＩｇＧ１アイソタイプコントロール抗体の脳ＶＤ（２０±６μｌ／グラム）に比べ、注射１４０分後の総脳ホモジネート中のＨＩＲＭＡｂ−ＳＧＳＨ融合タンパク質の分布容積（ＶＤ）（７８２±３６μＬ／グラム）は大きい（表５）。ＩｇＧ１アイソタイプコントロール抗体の脳ＶＤは、脳の血液容量内に隔離されており、かつ、ＢＢＢを通過しない分子の脳取り込みを表す。後血管上清中のＨＩＲＭＡｂ−ＳＧＳＨ融合タンパク質のＶＤ（６６６±７１μＬ／グラム）は、脳の血管ペレット内のＨＩＲＭＡｂ−ＳＧＳＨ融合タンパク質のＶＤ（２４±１７μＬ／グラム）より大きく（表５）、このことは、ＨＩＲＭＡｂ−ＳＧＳＨ融合タンパク質の大部分が、ＢＢＢを通過し脳実質を透過したことを示している。後血管上清放射能のＴＣＡ沈殿が９５．９±０．７％である（表５）ことから、後血管上清中の放射能は、ラベルされた代謝物ではなく、無傷なＨＩＲＭＡｂ−ＳＧＳＨ融合タンパク質を表している。
表５．ＨＩＲＭＡｂ−ＳＧＳＨ融合タンパク質の脳取り込みの毛細血管枯渇分析
【表５】
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平均値±標準偏差
静脈注射により融合タンパク質を投与し、注射の１４０分後に脳の測定を行った。後血管上清中の放射能は、冷１０％トリクロロ酢酸で沈殿可能な９５．９±０．７％であった。ヒトＩｇＧ１アイソタイプコントロール抗体に対するホモジネートＶＤは、以前に報告されている（Boado, R.J.; Pardridge, W.M. Comparison of blood-brain barrier transport of GDNF and an IgG-GDNF fusion protein in the Rhesus monkey. Drug Metab. Disp. 2009, 37, 2299-2304）。
【０２４０】
成熟アカゲザルの脳は１００グラムの重さがあることから、ＨＩＲＭＡｂ−ＳＧＳＨ融合タンパク質の組織取り込みを、１００グラム湿組織重量当たりの注入量（ＩＤ）の％として表す（表６）。血漿からのＨＩＲＭＡｂ−ＳＧＳＨ融合タンパク質の除去を担う主要組織は、肝臓および脾臓である（表６）。ＨＩＲＭＡｂ−ＳＧＳＨ融合タンパク質の大脳皮質取り込みは、０．８１±０．０７％ＩＤ／１００グラム脳である（表６）。
表６．アカゲザルにおけるＨＩＲＭＡｂ−ＳＧＳＨ融合タンパク質の組織取り込み
【表６】
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データは、３サンプルの平均値±標準偏差である。
【０２４１】
要約すると、霊長類を用いた本研究は、ＨＩＲＭＡｂ−ＳＧＳＨ融合タンパク質が、静脈投与の後、末梢組織により取り込まれるため、血漿から迅速に除去されることを示している。しかし、ＳＧＳＨ単独とは異なり、ＨＩＲＭＡｂ−ＳＧＳＨ融合タンパク質は、迅速にＢＢＢを透過する（表５および６）。逆に言うと、ＳＧＳＨ単独はＢＢＢを通過しない（Urayama, A.; Grubb, J.H.; Sly, W.S.; Banks, W.A. Mannose 6-phosphate receptor-mediated transport of sulfamidase across the blood-brain barrier in the newborn mouse. Mol Ther. 2008, 16, 1261-1266）。
【０２４２】
実施例９．ヒト脳へのＳＧＳＨの受容体媒介輸送
サンフィリッポＡ型またはＭＰＳ−ＩＩＩＡは、リソソーム酵素であるスルファミダーゼ（ＳＧＳＨ）をコードする遺伝子の欠損が原因で起こる、リソソーム貯蔵障害である。ＳＧＳＨを欠くと、ヘパラン硫酸のような、ある種のＧＡＧが細胞内に蓄積する。脳内のヘパラン硫酸の蓄積は、重度の行動障害、一般的に７歳までに言語障害、一般的に１２歳までに車椅子生活を招く歩行障害、および、平均１８歳での死亡を含む、ＭＰＳ−ＩＩＩＡの臨床症状をもたらす（Valstar et al. (2010): Mucopolysaccharidosis Type IIIA: clinical spectrum and genotype-phenotype correlations. Ann. Neurol. 68:876-887）。
【０２４３】
ＳＧＳＨ  ｍＲＮＡのヌクレオチド配列、およびヒトＳＧＳＨタンパク質のアミノ酸配列は、既知である（Scott et al. (1995), Cloning of the sulphamidase gene and identification of mutations in Sanfilippo A syndrome, Nature Genetics, 11:465-467）。該配列は、ＭＰＳ−ＩＩＩＡの酵素補充療法（ＥＲＴ）用の組み換えＳＧＳＨの製造を可能にする。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞により産生されるＳＧＳＨは、１５ユニット／μｇ酵素の比活性を有する（Urayama et al. (2008), Mannose 6-phosphate receptor-mediated transport of sulfamidase across the blood-brain barrier in the newborn mouse, Mol. Ther. 16: 1261-1266）。ＳＧＳＨ比活性を、上記と同じ２段階蛍光定量的酵素アッセイにより測定した（Karpova et al. (1996) A fluorimetric enzyme assay for the diagnosis of Sanfilippo disease type A (MPS IIIA), J. Inher. Metab. Dis. 19: 278-285）。組み換えＳＧＳＨを用いたＭＰＳ−ＩＩＩＡのＥＲＴの問題は、他の巨大分子薬剤と同様に、ＳＧＳＨがＢＢＢを通過しないため、静脈内に投与される場合に、ＭＰＳ−ＩＩＩＡの有効な治療とならないことである（Hemsley et al. (2009) Examination of intravenous and intra-CSF protein delivery for treatment of neurological disease, Eur. J. Neurosci. 29: 1197-1214）。ＢＢＢを越えるＳＧＳＨの輸送は欠如していることから、多量の酵素を全身注射して、脳内でＳＧＳＨを増加させるのは困難である。従って、ＭＰＳ−ＩＩＩＡ患者において、組み換えＳＧＳＨを用いた静脈内ＥＲＴが、脳に有益な効果を与えるとは期待できない。ＭＰＳ−ＩＩＩＡに罹患した犬の脳へＳＧＳＨを直接脳室内注入（ＩＣＶ）することにより、ＢＢＢを迂回する目的で、脳室へ酵素を注入した（Jolly et al. (2011), Intracisternal enzyme replacement therapy in lysosomal storage diseases: routes of absorption into brain, Neuropathol Appl. Neurobiol. 37: 414-422）。ＩＣＶ経路による脳への薬物送達は、脳の上衣または髄膜表面のみに薬剤を分布させることがよく知られており、これはまさに、ＳＧＳＨをＩＣＶ投与した後に、ＭＰＳ−ＩＩＩＡに罹患した犬において観察されたことである。
【０２４４】
ＩＣＶ酵素投与は、脳内に慢性的なカテーテルの埋め込みを必要とする、侵襲的方法である。ＭＰＳ−ＩＩＩＡ患者の脳へＳＧＳＨを送達する好ましいアプローチは、受容体媒介輸送（ＲＭＴ）を介してＢＢＢを通過させるために再設計したＳＧＳＨの形態の静脈内注入を用いることである。ＨＩＲＭＡｂ−ＳＧＳＨ融合タンパク質は、ヒトインスリン受容体への高親和性結合を保持しており、これは、ＳＧＳＨが、ＢＢＢを透過し、内因性ＢＢＢインスリン受容体上のＲＭＴを介して、血液から脳へ入ることを可能にする。アカゲザルにおいて、ＨＩＲＭＡｂ−ＳＧＳＨ融合タンパク質の脳取り込みは、１００グラム脳当たり、注入量（ＩＤ）の１％である（表６）。該レベルの融合タンパク質の脳取り込みを前提として、ＨＩＲＭＡｂ−ＳＧＳＨ融合タンパク質を静脈投与した後の脳内のＳＧＳＨ酵素活性を算出することができ、脳における正常な内因性ＳＧＳＨ酵素活性と比べることができる。ＳＧＳＨ融合タンパク質のＳＧＳＨ比活性は５０００ユニット／ｍｇ融合タンパク質（実施例４）であり、かつ、５０ｋｇのヒトに、５ｍｇ／ｋｇのＩｇＧ−ＳＧＳＨ融合タンパク質を静脈内投与すると仮定すると、注入量は、２５０ｍｇ、または１，２５０，０００ユニットの融合タンパク質に等しい。アカゲザルにおいて、ＨＩＲＭＡｂ−ＳＧＳＨ融合タンパク質の脳取り込みは、〜１％  ＩＤ／１００グラム脳（表６）であり、アカゲザルの脳は１００グラムの重さがある。従って、ＨＩＲＭＡｂ−ＳＧＳＨ融合タンパク質の脳取り込みは、静脈注射された用量の約１％であり、これは、３ｍｇ／ｋｇの融合タンパク質を投与された５０ｋｇのヒトにおける、１２，５００ユニット／脳に等しい。該レベルの脳ＳＧＳＨ酵素活性は、ヒト脳が約１，０００グラムの重さがあることから、１２．５ユニット／グラム脳に等しく、また、１グラムの脳が約１００ｍｇのタンパク質に等しいことから、０．１２５ユニット／ｍｇ脳タンパク質の脳ＳＧＳＨ酵素活性に等しい。正常脳におけるＳＧＳＨ酵素活性は、０．１２ユニット／ｍｇタンパク質（Tomatsu, S.; Vogler, C.; Montano, A.M.; Gutierrez, M.; Oikawa, H.; Dung, V.C.; Orii, T.; Noguchi, A.; Sly, W.S. Murine model (Galnstm(C76S)slu) of MPS IVA with missense mutation at the active site cysteine conserved among sulfatase proteins. Mol. Genet. Metab. 2007, 91, 251-258）から、１．４ユニット／ｍｇタンパク質（Fraldi et al. (2007) Functional correction of CNS lesions in an MPS-IIIA mouse model by intracerebral AAV-mediated delivery of sulfamidase and SUMF1 genes, Human Mol. Genet 16: 2693-2702）に及ぶ。従って、３ｍｇ／ｋｇのＨＩＲＭＡｂ−ＳＧＳＨ融合タンパク質の用量の投与は、脳内で、正常な内因性ＳＧＳＨ酵素活性の１０〜１００％のＳＧＳＨ酵素活性のレベルをもたらす。リソソーム貯蔵障害に罹患した患者において、標準的な人のわずか１〜２％の細胞酵素活性をもたらす酵素補充療法は、疾病の兆候および症状を発症しない（J. Muenzer and A. Fisher, Advances in the treatment of mucopolysaccharidosis type I, N. Engl J Med, 350: 1932-1934, 2004）。これらの考察は、約３ｍｇ／ｋｇ、または、１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲のＨＩＲＭＡｂ−ＳＧＳＨ融合タンパク質の全身用量で、ＨＩＲＭＡｂ−ＳＧＳＨ融合タンパク質を静脈内注射すると、ヒト脳に、臨床的に意義のあるＳＧＳＨ酵素を補充すること��できることを示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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