(57)【要約】【課題】ヒトのがんの１種または複数の症状の処置および／または寛解のための改善された化学療法組成物を提供すること。【解決手段】カルシウムチャネルアンタゴニストを含む１種または複数の選択される降圧剤と組み合わせた、または１種もしくは複数の従来の化学療法もしくは抗がんレジメンと組み合わせた１種または複数のｉＮＯＳ経路阻害化合物を用いて、１種または複数の哺乳動物のがんを処置するための方法、特に、ヒトの乳がんを処置するための方法が開示されている。これらの組成物を含む特定の治療用製剤、ならびに難治性、転移性および再燃性がんの処置における、特にヒトトリプルネガティブ乳がんにおける処置抵抗性を管理または反転するためのそれらの使用のための方法も開示されている。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
関連出願への相互参照
この出願は、２０１４年４月８日に出願された米国仮特許出願第６１／９７６，９５６号（係属中；代理人管理番号３７１８２．１７０）に対する優先権を主張する；この内容は、それへの参照を表現することによってその全体が本明細書に具体的に援用される。
【０００２】
連邦政府支援の研究または開発に関する陳述
本発明は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）によって授与された助成金Ｒ０１−ＣＡ１３８１９７の下、政府の支援により為された。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
共同研究契約についての関係者の名称
適用なし。
【０００４】
発明の分野
本発明は、全般的に、医学および腫瘍学の分野に関する。特に、本発明は、ヒトのがんの１種または複数の症状の処置および／または寛解のための改善された化学療法組成物を提供する。実例的な実施形態において、ｉＮＯＳ経路の１種または複数のエフェクターの投与を用いる、ヒトの乳がんを処置するための方法が提供される。例示的な実施形態において、例えば、単独で、またはカルシウムチャネルアンタゴニストを含む１種もしくは複数の降圧剤と組み合わせたＮＧ−モノメチル−Ｌ−アルギニン（Ｌ−ＮＭＭＡ；Ｃ９Ｈ２ＯＮ４Ｏ４；ＭＷ２４８．２８）を含むｉＮＯＳ阻害剤の製剤が、哺乳動物の乳がんの処置のため、特に、従来の化学療法薬に対し抵抗性である疾患の難治性形態であり、その予後が不良である、ヒトにおけるトリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）の処置のための治療用製剤として提供される。
【背景技術】
【０００５】
乳がん生物学における著しい進歩にもかかわらず、進行性乳がんの処置における進展は限定的であり、過去数十年間にわたり、処置抵抗性転移性乳がんを有する女性の全生存期間の変化は殆どない。処置抵抗性および現在の治療法の失敗のために、およそ４０，０００名の転移性乳がんの女性が毎年死亡していることに注目されたい。発癌の古典的モデルは、突然変異の正しい組み合わせを蓄積することによりいかなる細胞も形質転換され得るという、ランダムまたは「確率論的」として説明することができる。代替モデルは、細胞の亜集団またはクローンが、発癌を駆動する自己再生および細胞不均一性に寄与する分化の能力を含む、鍵となる幹様特性を保持するというものである。このような腫瘍内クローン不均一性を支持する実験的証拠は、Ｄｉｃｋらによってヒトの白血病において最初に報告された。続いて、これらの概念は、ヒトの乳がんが、ＣＤ４４＋／ＣＤ２４−／ｌｏｗ３の細胞表面発現によって特徴付けられる幹様細胞によって駆動されたことを実証するいくつかのグループによって固形腫瘍へと拡張された。固形がんの大規模配列決定解析は、個々の腫瘍内の広範な不均一性のさらなる証拠をもたらした。ＥＮＲＥＦ１３。この腫瘍内不均一性は、処置抵抗性および処置失敗の主要な寄与因子となり得る。異なる亜集団は、腫瘍適合を助長し、ダーウィン淘汰により治療失敗を導き得る不均一なタンパク質機能に関連し得る。したがって、不均一な巨大腫瘍内の幹様特性を有する細胞の亜集団は、腫瘍惹起および再発の原因となることが示された。
【０００６】
３グループが最近、独立的に、神経膠芽腫（ＧＢＭ）、扁平上皮皮膚腫瘍および腸管腺腫における系列追跡実験によって、幹様特性を有する細胞の存在の直接的かつ機能的な証拠をもたらし、がんの階層的性質をさらに実証した。これらの独立的なグループは、巨大腫瘍内の細胞のごく一部が、クローン原性潜在力を有し、この部分が、化学療法に対し本質的に抵抗性であることを確認する。
【０００７】
トリプルネガティブ乳がん
トリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）は、承認された標的化治療選択肢がない、エストロゲン（ＥＲα）、プロゲステロン（ＰＲ）およびヒト上皮増殖因子（ＨＥＲ−２）受容体を欠く侵襲性かつ致死的形態のがんである。多数の進歩にもかかわらず、処置抵抗性および転移は、ＴＮＢＣ患者における主な死亡原因である。従来の処置に対する抵抗性および転移の発生は、腫瘍惹起能力を有する細胞の亜集団から生じ得る。化学療法後の残留腫瘍は、自己再生能力および間葉系特色を呈するＣＤ４４＋／ＣＤ２４−／ｌｏｗ細胞が濃縮されている。これらのがん幹細胞（ＣＳＣ）は、腫瘍成長の再惹起および転移播種に役立ち得る。よって、従来の化学療法および抗ＣＳＣ化合物によるコンビナトリアル処置が、腫瘍負荷、再発および遠隔臓器への転移の低下に必要とされるであろう。残念ながら、かかる組み合わせは、診療所における日常的な使用に現在利用できない。
【０００８】
現在、ＴＮＢＣに標的化処置は存在しない。誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）は、乳腺腫瘍の侵襲性を促進することが判明した。以前の研究は、高い内在性ｉＮＯＳ発現が、不十分なＴＮＢＣ患者生存率と相関し、これを予測することを実証した。しかし、乳がんの処置において現在までに為された進歩にもかかわらず、臨床医は依然として、その処置、特に、ＴＮＢＣの処置における使用のための化学療法において活性な新規薬剤の開発の必要がまだ相当にあることに同意する。
【０００９】
実際に、依然として、過剰増殖障害、特に、従来の化学療法薬に対し抵抗性となった乳がんの処置において有効な、新たな薬剤の著しく満たされていない医学的な必要がある。
【００１０】
乳がん患者における高血圧共存症
高血圧は、乳がんの女性における病的状態を増強する最も一般的な障害の１種である（Ｓａｒｆａｔｉら、２０１３年；Ｇａｍｐｅｎｒｉｅｄｅｒら、２０１４年）。化学療法誘導性の高血圧症は、転移性およびＴＮＢＣにおける患者死亡率を増加させる共通効果である（Ｃａｍｅｒｏｎら、２０１３年；Ｆａｎら、２０１４年）。よって、化学療法投与の有害な高血圧性副作用に対抗することができる１種または複数の降圧薬の同時投与は、患者の健康を改善し、生存を増加させるための重要な考察を表す。
【００１１】
本発明は、ＴＮＢＣを処置するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏモデルの両方におけるカルシウムチャネル遮断薬（伝統的な降圧薬として診療所において現在使用されている）の同時投与の相乗効果を実証した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】ＣＡＭＥＲＯＮ，Ｄら、Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌ．（２０１３年９月）１４（１０）：９３３〜９４２
【非特許文献２】ＧＡＭＰＥＮＲＩＥＤＥＲ，ＳＰら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（２０１４年１月）３４（１）：２２７〜２３３
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、哺乳動物のがん、特に転移性またはＴＮＢＣ等、ヒトの乳がんを処置するための化学療法剤として、単独で、または１種もしくは複数のカルシウムイオンアンタゴニスト（スローチャネル型遮断薬）と組み合わせてｉＮＯＳ阻害剤の製剤を提供することにより、関連する腫瘍学および製薬分野に固有の上述および他の満たされていない不備に取り組む。本発明は、かかる処置を必要とする患者に予想外の利益を有利にもたらす、新たながん処置モダリティにおいてｉＮＯＳ阻害化合物を使用し、再度目的化する（ｒｅｐｕｒｐｏｓｅ）方法も提供する。
【００１４】
全体的および一般的な意味において、本発明はまず、それを必要とする哺乳動物におけるがんの１種または複数の症状を処置および／または寛解するための医薬組成物を提供する。例示的な実施形態において、かかる化学療法製剤は、１）単独で、２）ａ）カルシウムチャネルアンタゴニスト等、治療有効量の１種もしくは複数の降圧剤；ｃ）１種もしくは複数の従来の化学療法的、治療的、診断的もしくは対症的化合物；ｂ）カルシウムチャネルアンタゴニスト等、治療有効量の１種もしくは複数の降圧剤と組み合わせて、または３）ｂ）由来の降圧剤およびｃ）由来の１種もしくは複数の従来の化合物と共に、治療有効量の少なくとも第１のｉＮＯＳ阻害化合物を含む。
【００１５】
本発明の実施において、例示的なｉＮＯＳ阻害化合物は、ＮＧ−モノメチル−Ｌ−アルギニン［Ｌ−ＮＭＭＡ］、（Ｎ−［［３−（アミノメチル）フェニル］メチル］−エタンイミドアミド）［１４００Ｗ］、（Ｎ５−［イミノ（ニトロアミノ）メチル］−Ｌ−オルニチンメチルエステル）［Ｌ−ＮＡＭＥ］ならびにこれらの塩、誘導体および組み合わせを限定することなく含む。
【００１６】
同様に、本発明の実施において、例示的なカルシウムチャネルアンタゴニストは、アムロジピン、フェロジピン、ラシジピン、ニカルジピン、ニバルジピン（ｎｉｖａｌｄｉｐｉｎｅ）、アゼルニジピンおよびこれらの組み合わせからなる群より選択される１種または複数の降圧剤を限定することなく含む。
【００１７】
実例的な実施形態において、本発明者は、１種または複数のｉＮＯＳ阻害剤および１種または複数のカルシウムチャネルアンタゴニストが同時投与されると、相乗的治療転帰を達成することができることを実証した。かかる一実施形態において、ｉＮＯＳ阻害剤、Ｌ−ＮＭＭＡおよびカルシウムチャネルアンタゴニスト、アムロジピンベシレート（ＮＯＲＶＡＳＣ（登録商標）、３−エチル−５−メチル（±）−２−［（２−アミノエトキシ）メチル］４−（２−クロロフェニル）−１，４−ジヒドロ−６−メチル−３，５−ピリジンジカルボキシレート、モノベンゼンスルホネート；Ｃ２０Ｈ２５ＣＩＮ２Ｏ５・Ｃ６Ｈ６Ｏ３Ｓ；ＭＷ＝５６７．１）がＴＮＢＣ細胞株に同時投与されると、特に驚くべき予想外の相乗作用が得られた。
【００１８】
任意選択で、本発明の組成物は、１種もしくは複数の追加的な別個のｉＮＯＳ阻害剤および／または１種もしくは複数の追加的な別個の降圧剤および／または１種もしくは複数の追加的な別個の従来の処置をさらに含むこともできる。
【００１９】
ある特定の実施形態において、本発明者は、１種または複数の降圧剤、抗新生物剤、細胞傷害剤、細胞増殖抑制剤もしくは化学療法剤またはこれらのいずれかの組み合わせを限定することなく含む、１種または複数の追加的な活性成分と共に製剤化された１種または複数のｉＮＯＳ阻害化合物を含む同時治療の製剤を考慮する。
【００２０】
例示的な化学療法剤は、シクロホスファミド、ドキソルビシン、５−フルオロウラシル、ドセタキセル、パクリタキセル、トラスツズマブ、メトトレキセート、エピルビシン、シスプラチン、カルボプラチン、ビノレルビン、カペシタビン、ゲムシタビン、ミトキサントロン、イクサベピロン（ｉｓａｂｅｐｉｌｏｎｅ）、エリブリン、ラパチニブ、カルムスチン、ナイトロジェンマスタード、サルファマスタード、プラチンテトラニトレート、ビンブラスチン、エトポシド、カンプトテシン、トポイソメラーゼ阻害剤（トポイソメラーゼＩおよびＩＩ阻害剤を含む）、およびこれらの誘導体、アナログ、塩、活性代謝物または１種もしくは複数の組み合わせ等、抗がん化合物を限定することなく含む。
【００２１】
例示的な治療剤は、免疫調節剤、神経活性剤（ｎｅｕｒｏａｃｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔ）、抗炎症剤、抗高脂血症剤、ホルモン、受容体アゴニストもしくはアンタゴニストまたは抗感染剤、またはタンパク質、ペプチド、抗体、酵素、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、リボザイム、ホルモン、補助因子、ステロイド、アンチセンス分子から選択される化合物、およびこれらの組み合わせのうち１種または複数を限定することなく含む。
【００２２】
同様に、本明細書に開示されている化学療法製剤の投与は、処置を受けている哺乳動物への治療有効量の放射線の投与を限定することなく含む、１種または複数の追加的ながん治療によりさらに増大させることができる。
【００２３】
本発明の実施において、開示されている化学療法組成物は、処置レジメンを担当する医療提供者によって必要と判断される通りに、単回投与で、あるいは１または複数週間から１または複数箇月間の期間にわたる複数回投与で動物に全身的に投与することができる。
【００２４】
好ましくは、本明細書に開示されているｉＮＯＳ阻害性抗がん組成物は、哺乳動物宿主細胞、特にヒト宿主細胞への投与に適した、１種または複数の薬学的に許容される担体、バッファー、希釈剤、ビヒクル、賦形剤またはこれらのいずれかの組み合わせをさらに含む。
【００２５】
別の実施形態において、本発明は、それを必要とする動物におけるがんの１種または複数の症状を処置または寛解するための方法を提供する。かかる方法は、全体的および一般的な意味において、動物におけるがんの１種または複数の症状の処置または寛解に十分な時間、本明細書に開示されている化学療法組成物のうち１種または複数の有効量を、それを必要とする動物に投与するステップを少なくとも含む。
【００２６】
別の実施形態において、本発明は、哺乳動物被験体におけるがんの１種または複数の症状を処置または寛解するための方法を提供する。全体的および一般的な意味において、本方法は、被験体におけるがんの１種または複数の症状の処置または寛解に有効な時間、本明細書に開示されている化学療法組成物のうち１種または複数の治療有効量を、それを必要とする哺乳動物被験体に投与するステップを少なくとも含む。
【００２７】
ある特定の実施形態において、本発明者は、開示されている化学療法製剤が、例えば、がんが、処置抵抗性トリプルネガティブ乳がんとして診断または同定される状態を含む、がんが、難治性、転移性、再燃性または処置抵抗性がんとして診断または同定される状態において特に有用であると考えている。
【００２８】
本発明は、それを必要とする動物におけるがんの１種または複数の症状を処置または寛解する方法も提供する。かかる方法は、一般に、動物におけるがんの１種または複数の症状の処置または寛解に十分な時間、有効量の本明細書に開示されている少なくとも第１の化学療法用ｉＮＯＳ阻害製剤またはそのアナログ、アゴニスト、アンタゴニストもしくは誘導体もしくは塩を単独で、または１種もしくは複数のカルシウムチャネルアンタゴニストと組み合わせて動物に（全身的に、または動物の身体内もしくは周囲の１つもしくは複数の領域もしくは部位に局所的に）投与するステップを少なくとも含む。
【００２９】
さらなる態様において、本発明は、動物におけるがん細胞または腫瘍の成長を阻害するための方法も提供する。本方法は、全体的および一般的な意味において、がん細胞または腫瘍の成長の阻害に有効な量および時間で、それを必要とする動物の身体の１個または複数の細胞または組織に、本明細書に開示されている化学療法用ｉＮＯＳ阻害製剤のうち１種または複数の量を提供するステップを含む。
【００３０】
別の態様において、本発明は、被験体、好ましくは、ヒトにおけるがんを処置するための方法を提供する。全体的および一般的な意味において、本方法は、一般に、本明細書に開示されているｉＮＯＳ阻害性化学療法製剤のうち１種または複数の治療有効量を単独で、あるいは本明細書に開示されている１種もしくは複数の抗高血圧性カルシウムチャネルアンタゴニスト化合物等、１種もしくは複数のカルシウムチャネルアンタゴニスト、１種もしくは複数の追加の化学療法剤、治療有効量の電離放射線またはこれらのいずれかの組み合わせと組み合わせて、それを必要とする被験体に投与するステップを含む。被験体に同時投与することができる例示的な追加の組成物は、１種または複数の従来の抗がん薬を限定することなく含む。あるいは、本発明の方法は、腫瘍切除等、１種もしくは複数の外科的介入を含むこともできる、または治療的に有効な電離放射線（すなわち、放射線療法）の１種もしくは複数のクールをさらに任意選択で含むことができる。
【００３１】
本発明は、哺乳動物におけるがんの１種または複数の症状を処置または寛解する方法も提供する。かかる方法は、一般に、哺乳動物におけるがんの１種または複数の症状の処置または寛解に十分な時間、本明細書に開示されている有効量のｉＮＯＳ阻害性化学療法製剤を単独で、または１種もしくは複数の降圧薬、特にカルシウムチャネルアンタゴニストと組み合わせて、単独で、または１種もしくは複数の従来の化学療法剤とさらに組み合わせて哺乳動物に投与するステップを含む。
【００３２】
本発明は、動物被験体におけるがんの治療における使用のための医薬組成物であって、本明細書に開示されているｉＮＯＳ阻害性化学療法製剤のうち１種または複数を単独で、または１種もしくは複数のカルシウムチャネルアンタゴニストと組み合わせて含む組成物も提供し、ヒト被験体における悪性乳がんの１種または複数の症状を処置または寛解するためのかかる使用を含むことができる。
【００３３】
本発明は、乳がん、肺がん、前立腺がん、線維肉腫、滑膜肉腫、膵臓がんおよび他の形態の疾患を限定することなく含む哺乳動物のがんの１種または複数の形態を有する、有すると疑われる、またはそうであると診断された動物の身体内または周囲の１個または複数の哺乳動物細胞を変更、影響、破壊または殺傷する方法も提供する。かかる方法は、一般に、動物におけるがんの１種または複数の症状の処置および／または寛解に十分な時間、１個または複数の動物細胞に、開示されているｉＮＯＳ阻害性化学療法組成物のうち１種または複数の治療有効量を単独で、または特にカルシウムチャネルアンタゴニストを含む１種もしくは複数の降圧薬（ａｎｔｉｈｙｐｅｐｒｔｅｎｓｉｖｅ）と組み合わせて提供するステップを含む。
【００３４】
本明細書において、かかる細胞、組織、臓器および／または身体内の過剰増殖細胞成長の過程に関与する少なくとも１種の構成成分、経路、酵素またはステップの変更、モジュレート、制御、増加および／または減弱に有効な時間、それを必要とする被験体の１個または複数の細胞、組織および／または臓器に、開示されているｉＮＯＳ阻害性化学療法組成物のうち１種または複数（ｏｎｅ  ｏｆ  ｍｏｒｅ）の有効量を単独で、または１種もしくは複数のカルシウムチャネルアンタゴニストと組み合わせて提供することにより、動物の身体内または周囲で成長する過剰増殖細胞の過程に関与する少なくとも１種の構成成分、経路、酵素またはステップを変更、モジュレート、制御、増加および／または減弱する方法も提供される。
【００３５】
本明細書において、ヒトの乳がんおよびヒトの治療抵抗性トリプルネガティブ乳がんを限定することなく含む哺乳動物のがんの少なくとも１種の症状を処置および／または寛解する方法がさらに提供される。
【００３６】
ｉＮＯＳ阻害化合物およびその製剤
本明細書に記す通り、本発明のｉＮＯＳ阻害性化学療法製剤は、単一のがん処置モダリティとして用いることができる、あるいは、１種または複数のタンパク質、ペプチド、ポリペプチド（酵素、抗体、抗原、抗原結合性断片等を限定することなく含む）；ＲＮＡ分子（ｓｉＲＮＡ、ｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびリボザイム等の触媒ＲＮＡその他を限定することなく含む）、ＤＮＡ分子（オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、遺伝子、コード配列（ＣＤＳ）、イントロン、エクソン、プラスミド、コスミド、ファージミド、バキュロウイルス、ベクター［ウイルスベクター、ビリオン、ウイルス粒子その他を限定することなく含む］を限定することなく含む）；ペプチド核酸、検出剤、画像化剤、造影剤、検出可能ガス、放射性核種その他、および１種または複数の追加の化学療法剤、外科的介入（例えば、腫瘍切除）、放射線療法その他、または罹患患者のための多因子性もしくは多巣性処置プランの一部としてのこれらのいずれかの組み合わせを限定することなく含む、１種または複数の追加の化学療法薬、診断用試薬および／またはその他と組み合わせることができる。
【００３７】
本発明の化学療法製剤は、１種または複数のリポソーム、粒子、脂質複合体を限定することなく含む、ｉＮＯＳ阻害性化学療法製剤の送達を助ける、容易にするまたは改善するための１種または複数の追加的な構成成分をさらに任意選択で含むこともでき、１種または複数の結合剤、細胞表面活性薬剤、界面活性剤、脂質複合体、ニオソーム（ｎｉｏｓｏｍｅ）、エトソーム（ｅｔｈｏｓｏｍｅ）、トランスフェロソーム（ｔｒａｎｓｆｅｒｏｓｏｍｅ）、リン脂質、スフィンゴ脂質、スフィンゴソームまたはこれらのいずれかの組み合わせをさらに任意選択で含むことができ、１種または複数のナノ粒子、マイクロ粒子、ナノカプセル、マイクロカプセル、ナノスフェア、マイクロスフェアまたはこれらのいずれかの組み合わせを含む医薬品製剤内に任意選択で提供することができる。
【００３８】
医薬組成物は、１種または複数の薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤またはこれらのいずれかの組み合わせと混合することもでき、リポソーム、界面活性剤、ニオソーム、エトソーム、トランスフェロソーム、リン脂質、スフィンゴソーム、ナノ粒子、マイクロ粒子またはこれらのいずれかの組み合わせを含むようにさらに任意選択で製剤化することができる。
【００３９】
好ましくは、本明細書に開示されている化学療法製剤は、約４．２〜約８．２のｐＨにおいて少なくとも実質的に安定的となり、より好ましくは、約５〜約７．５のｐＨにおいて実質的に安定的となるであろう。好ましくは、活性成分は、これらが投与される動物の生理的条件において実質的に活性となるであろう。
【００４０】
化学療法の方法および使用
本発明の別の重要な態様は、例えば、トリプルネガティブ乳がん等の処置抵抗性乳がんを含む乳がんの１種または複数の形態の症状を処置または寛解するための、開示されているｉＮＯＳ阻害性化学療法製剤を使用するための方法に関係する。かかる方法は、一般に、罹患哺乳動物における乳がんの処置（あるいはその１種または複数の症状の寛解）に十分な量および時間で、開示されている抗がん組成物のうち１種または複数を哺乳動物（特に、それを必要とするヒト）に投与するステップを含む。
【００４１】
ある特定の実施形態において、本明細書に記載されている化学療法製剤は、がん処置の必要に応じて、単一の処置モダリティ（単回投与として、あるいは数時間から数日間または数週間の期間にわたり複数回投与で）において動物に提供することができる。あるいは、一部の実施形態において、数週間から数箇月間またはより長い期間、処置を継続すること、または治療の１種もしくは複数の追加的な様式と組み合わせてこれを含むことが望ましい場合がある。他の実施形態において、１種または複数の現存するまたは従来の処置レジメンと組み合わせて治療を提供することが望ましい場合がある。
【００４２】
本発明は、がんの１種または複数の症状の治療および／または寛解のための医薬の製造における、開示されている化学療法組成物のうち１種または複数の使用、特に、ヒトの乳がん等、哺乳動物のがんの１種または複数の症状の処置および／または寛解のための医薬の製造における使用も提供する。
【００４３】
本発明は、がんの処置、特に、ヒトの処置抵抗性トリプルネガティブ乳がんの処置のための医薬の製造における、開示されているｉＮＯＳ阻害剤／カルシウムチャネルアンタゴニスト製剤のうち１種または複数の使用も提供する。
【００４４】
治療用キット
開示されているｉＮＯＳ阻害製剤のうち１種または複数および特定のがん処置モダリティにおいてキットを使用するための説明書を含む治療用キットも、本発明の好ましい態様を表す。これらのキットは、１種もしくは複数の追加的な抗がん化合物、１種もしくは複数の診断用試薬または１種もしくは複数の追加的な治療用化合物、医薬品その他をさらに任意選択で含むことができる。
【００４５】
本発明のキットは、商品流通のために包装することができ、動物への化学療法組成物（複数可）の送達に適合された１種または複数の送達装置（例えば、シリンジ、注射剤その他）をさらに任意選択で含むことができる。かかるキットは、典型的に、医薬組成物（複数可）を配置し、好ましくは適宜分注することができる少なくとも１個のバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジまたは他の容器を含む。第２の医薬品も提供される場合、本キットは、該第２の組成物を配置することができる第２の別個の容器を含有することもできる。あるいは、本明細書に開示されている複数の医薬組成物は、懸濁物または溶液等、単一の混合物において調製することができ、バイアル、フラスコ、シリンジ、カテーテル、カニューレ、ボトルまたは他の適した単一の容器等、単一の容器において包装することができる。
【００４６】
本発明のキットは、典型的に、例えば、所望のバイアル（複数可）または他の容器（複数可）を保持して、破損、太陽光への曝露もしくは他の望ましくない因子を最小化もしくは防止する、またはキット内に含まれている組成物（複数可）の即時使用を可能にすることができる射出またはブロー成形されたプラスチック容器等、商品販売のために緊密に閉じ込めたバイアル（複数可）または他の容器（複数可）を含有または保持するように適合された保持機構を含むこともできる。
【００４７】
医薬品製剤
ある特定の実施形態において、本発明は、単独での、あるいは診断、予防および／または治療の１種または複数の他のモダリティと組み合わせた、動物の１個または複数の細胞または組織への送達のための薬学的に許容される製剤における１種または複数の化学療法および／または診断用化合物の製剤に関係する。種々の処置レジメンにおいて本明細書に記載されている特定の組成物を使用するための適した投薬および処置レジメンの開発と同様に、薬学的に許容される賦形剤および担体溶液の製剤は、当業者に周知である。
【００４８】
ある特定の状況において、動物の身体内または周囲の１個または複数の細胞、組織または臓器に皮下、非経口、静脈内、筋肉内、くも膜下腔内、経口、腹腔内、経皮、外用、経口もしくは経鼻吸入、または直接的注射を限定することなく含む、１種または複数の標準送達装置により適宜製剤化された医薬品ビヒクルにおいて開示されている化学療法組成物を送達することが望ましいであろう。
【００４９】
投与方法は、これらのそれぞれの全体がその明確な参照により本明細書に特に組み込まれる、米国特許第５，５４３，１５８号、同第５，６４１，５１５号および同第５，３９９，３６３号に記載されているモダリティを含むこともできる。遊離塩基または薬理学的に許容される塩としての活性化合物の溶液は、滅菌水において調製することができ、ヒドロキシプロピルセルロース等、１種または複数の界面活性剤と適宜混合することができる。グリセロール、液体ポリエチレングリコール、油またはこれらの混合物において分散を調製することもできる。貯蔵および使用の通常条件下で、これらの調製物は、微生物の成長を防止するための保存料を含有する。
【００５０】
注射用水溶液の投与のため、限定することなく、必要に応じて溶液を適宜緩衝することができ、液体希釈剤はまず、十分な食塩水またはグルコースにより等張性にする。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下、経皮、真皮下および／または腹腔内投与に特に適している。これに関して、本発明の組成物は、例えば、無菌水性培地、バッファー、希釈剤等を含む、１種または複数の薬学的に許容されるビヒクルにおいて製剤化することができる。例えば、活性成分（複数可）の所与の投薬量を、特定の容量の等張性溶液（例えば、等張性のＮａＣｌベースの溶液）に溶解し、続いて提案される投与部位に注射する、または静脈内注入に適したビヒクルにおいてさらに希釈することができる（例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」第１５版、１０３５〜１０３８および１５７０〜１５８０頁を参照）。投薬量のある程度の変動は、処置されている被験体の状態、処置の範囲および投与部位に応じて必然的に生じるであろうが、にもかかわらず投与責任者は、医学および製薬分野における通常の知識を使用して、個々の被験体に適切な正しい投薬レジメンを決定することができるであろう。
【００５１】
無菌注射用組成物は、必要に応じて、上に列挙されている他の成分のうちいくつかと共に、必要とされる量の開示されている組成物を適切な溶媒に取り込み、続いて滅菌濾過することにより調製することができる。一般に、分散物は、基本分散媒および上に列挙されているもの由来の必要とされる他の成分を含有する無菌ビヒクルに選択された滅菌活性成分（複数可）を取り込むことにより調製することができる。本明細書に開示されている組成物は、中性または塩形態で製剤化することもできる。
【００５２】
薬学的に許容される塩は、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基により生成）を含み、これは、限定されないが、塩酸もしくはリン酸等の無機酸または限定されないが、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸その他等の有機酸により生成される。遊離カルボキシル基により生成される塩は、限定されないが、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウムまたは水酸化鉄（ＩＩＩ）等の無機塩基およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインその他等の有機塩基に由来することもできる。製剤化により、溶液は、投薬製剤と適合性の様式で、企図される適用に有効な量で投与されるであろう。製剤は、徐放カプセル、ハイドロゲル、コロイド、粘稠性ゲル、経皮試薬、鼻腔内および吸入製剤その他を含む、注射用溶液、外用調製物、経口製剤等、種々の剤形で容易に投与される。
【００５３】
本明細書に開示されている化学療法薬の量、投薬量レジメン、製剤および投与は、本教示の利益を有する当業者の技能範囲内であろう。しかし、治療有効（すなわち、薬学的有効）量の開示されている組成物の投与は、限定されないが、かかる手順を受ける患者に所望の利益をもたらすのに十分な量の送達される薬剤の単一の注射等の、単回投与によって達成することができる可能性がある。あるいは、一部の状況において、選択された個体へのかかる組成物の投与を監督する医師によって決定され得る通り、相対的に短い、またはさらには相対的に延長された期間にわたり、組成物の複数回または逐次投与を与えることが望ましい場合がある。
【００５４】
典型的には、本明細書に記載されている組成物のうち１種または複数の製剤は、第１の活性薬剤の少なくとも化学療法において有効な量を含有するであろう。好ましくは、製剤は、少なくとも約０．００１％の各活性成分、好ましくは少なくとも約０．０１％の活性成分を含有することができるが、活性成分（複数可）のパーセンテージは、当然ながら変動することができ、製剤全体に基づいて約０．０１〜約９０重量％もしくは容量％、または約０．１〜約８０重量％もしくは容量％、またはより好ましくは約０．２〜約６０重量％もしくは容量％の量において簡便に存在することができる。当然、各組成物における活性化合物（複数可）の量は、化合物のいずれか所与の単位用量において適した投薬量が得られるような仕方で調製することができる。溶解度、バイオアベイラビリティ、生物学的ｔ１／２、投与経路、製品有効期間および他の薬理学的検討事項等の因子は、かかる医薬品製剤の調製の技術分野の当業者によって考慮され、したがって、種々の投薬量および処置レジメンが望ましくなり得る。
【００５５】
本明細書に開示されている化学療法組成物の投与は、例えば、米国特許第５，５４３，１５８号、同第５，６４１，５１５号、および同第５，３９９，３６３号（これらのそれぞれは、その全体がその明確な参照により本明細書に特に組み込まれる）に記載されている、非経口、静脈内、筋肉内またはさらには腹腔内投与を限定することなく含む、いずれか有効な方法によって投与することができる。遊離塩基または薬理学的に許容される塩としての活性化合物の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロース等、界面活性剤と適宜混合された水において、または他の同様の様式で調製することができる。注射用投与に適合された医薬品形態は、米国特許第５，４６６，４６８号（これはその全体が、その明確な参照により本明細書に特に組み込まれる）に記載されているものを限定することなく含む、無菌水溶液または分散、および無菌注射用溶液または分散の即時調製のための無菌粉末を含む。あらゆる事例において、形態は、無菌でなければならず、容易なシリンジ通過性（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度まで流動性でなければならない。これは、製造および貯蔵条件下で少なくとも十分に安定的でなければならず、ウイルス、細菌、真菌その他等、微生物の汚染作用から保護されなければならない。
【００５６】
担体（複数可）は、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールその他またはこれらの組み合わせ）、１種もしくは複数の植物油またはこれらのいずれかの組み合わせを限定することなく含む、溶媒または分散媒であり得るが、追加の薬学的に許容される構成成分が含まれてもよい。
【００５７】
本明細書に開示されている医薬品製剤の適切な流動性は、例えば、レシチン等、コーティングの使用により、分散の場合は必要とされる粒子径の維持により、界面活性剤の使用により、またはこれらの技法のいずれかの組み合わせにより維持することができる。微生物の作用の阻害または防止は、１種または複数の抗細菌または抗真菌剤、例えば、限定されないが、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールその他によってもたらすことができる。多くの場合、等張性剤、例えば、限定されないが、１種もしくは複数の糖もしくは塩化ナトリウムまたはこれらのいずれかの組み合わせを含むことが好ましいであろう。注射用組成物の延長された吸収は、組成物における、吸収を遅延させる薬剤、例えば、限定されないが、モノステアリン酸アルミニウム、ゼラチンまたはこれらの組み合わせの使用によりもたらすことができる。
【００５８】
全身的投与は、本発明の多くの実施形態において有効であると考えられるが、本明細書に開示されている製剤が、身体における１種または複数の臓器、組織または細胞型への直接的な注射に適しているとも考えられる。開示されている組成物の投与は、関連する医学技術分野の当業者に公知の手段を含む、適した手段を使用して行うことができる。
【００５９】
本明細書に開示されている医薬品製剤は、ヒト、またはさらには霊長類または哺乳動物における使用のみに決して限定されない。ある特定の実施形態において、本明細書に開示されている方法および組成物は、鳥類、両生類、爬虫類または他の動物種を使用して用いることができる。しかし、好ましい実施形態において、本発明の組成物は、好ましくは、種々の診断および／または治療レジメンにおいて、哺乳動物、特にヒトへの投与のために製剤化される。本明細書に開示されている組成物は、選択された家畜、外来または飼育動物、コンパニオンアニマル（ペットその他を含む）、非ヒト霊長類および動物学的またはその他の捕獲標本その他を限定することなく含む、獣医学的投与に許容される製剤において提供することもできる。
本明細書は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
１）化学療法において有効な量の第１のｉＮＯＳ阻害剤と、
２）治療有効量の、以下：
ａ）第１の降圧剤、
ｂ）第１の化学療法剤、または
ｃ）ａ）およびｂ）の組み合わせと
を含む、医薬組成物。
（項目２）
前記第１のｉＮＯＳ阻害剤が、ＮＧ−モノメチル−Ｌ−アルギニン［Ｌ−ＮＭＭＡ］、（Ｎ−［［３−（アミノメチル）フェニル］メチル］−エタンイミドアミド）［１４００Ｗ］または（Ｎ５−［イミノ（ニトロアミノ）メチル］−Ｌ−オルニチンメチルエステル）［Ｌ−ＮＡＭＥ］を含む、項目１に記載の医薬組成物。
（項目３）
前記第１の降圧剤が、第１のカルシウムチャネルアンタゴニストを含む、項目１または項目２に記載の医薬組成物。
（項目４）
前記第１の降圧剤が、アムロジピン、アラニジピン、アゼルニジピン、バルニジピン、ベニジピン、シルニジピン（ｃｌｉｎｉｄｉｐｉｎｅ）、クレビジピン、ジルチアゼム、エホニジピン、フェンジリン、フェロジピン、ガロパミル、イスラジピン、ラシジピン、レルカニジピン、マニジピン、ニカルジピン、ニフェジピン、ニモジピン、ニソルジピン、ニトレンジピン、ニバルジピン、プラニジピンおよびベラパミルからなる群より選択される第１のカルシウムチャネルアンタゴニストを含む、前記項目のいずれかに記載の医薬組成物。
（項目５）
３）第２の別個のｉＮＯＳ阻害剤をさらに含む、前記項目のいずれかに記載の医薬組成物。
（項目６）
ｄ）免疫調節剤、神経活性剤、抗炎症剤、抗高脂血症剤、ホルモン、受容体アゴニスト、受容体アンタゴニスト、抗感染剤、タンパク質、ペプチド、抗体、抗原結合性断片、酵素、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、リボザイム、ホルモン、補助因子、ステロイド、アンチセンス分子、第２の別個の降圧剤、第２の別個の化学療法剤またはこれらのいずれかの組み合わせのうち１種または複数をさらに含む、前記項目のいずれかに記載の医薬組成物。
（項目７）
前記第１の化学療法剤が、１種もしくは複数の抗新生物性化合物、１種もしくは複数の細胞傷害性化合物、１種もしくは複数の細胞増殖抑制化合物またはこれらのいずれかの組み合わせを含む、前記項目のいずれかに記載の医薬組成物。
（項目８）
前記第１の化学療法剤が、シクロホスファミド、ドキソルビシン、５−フルオロウラシル、ドセタキセル、パクリタキセル、トラスツズマブ、メトトレキセート、エピルビシン、シスプラチン、カルボプラチン、ビノレルビン、カペシタビン、ゲムシタビン、ミトキサントロン、イクサベピロン（ｉｓａｂｅｐｉｌｏｎｅ）、エリブリン、ラパチニブ、カルムスチン、ナイトロジェンマスタード、サルファマスタード、プラチンテトラニトレート、ビンブラスチン、エトポシド、カンプトテシンおよびこれらのいずれかの組み合わせからなる群より選択される、前記項目のいずれかに記載の医薬組成物。
（項目９）
ｉ）前記第１のｉＮＯＳ阻害剤が、Ｌ−ＮＭＭＡを含み、ｉｉ）前記第１の降圧剤が、アムロジピンを含む、または前記第１の化学療法剤が、ドセタキセルを含む、前記項目のいずれかに記載の医薬組成物。
（項目１０）
ｉ）前記第１のｉＮＯＳ阻害剤が、Ｌ−ＮＭＭＡを含み、ｉｉ）前記第１の降圧剤が、アムロジピンを含み、ｉｉｉ）前記第１の化学療法剤が、ドセタキセルを含む、前記項目のいずれかに記載の医薬組成物。
（項目１１）
リポソーム、界面活性剤、ニオソーム、エトソーム、トランスフェロソーム、リン脂質、スフィンゴソーム、ナノ粒子、マイクロ粒子またはこれらのいずれかの組み合わせをさらに含む、前記項目のいずれかに記載の医薬組成物。
（項目１２）
薬学的に許容される担体、バッファー、希釈剤、ビヒクル、賦形剤またはこれらのいずれかの組み合わせをさらに含む、前記項目のいずれかに記載の医薬組成物。
（項目１３）
哺乳動物投与のため、好ましくは、ヒト投与のために製剤化されている、前記項目のいずれかに記載の医薬組成物。
（項目１４）
前記組成物と、それを必要とするヒトへの前記組成物の投与のための少なくとも第１のセットの説明書とを含む治療用キットの一部として適合および構成されている、前記項目のいずれかに記載の医薬組成物。
（項目１５）
哺乳動物のがんの１種または複数の症状の治療、予防または寛解における使用のための、前記項目のいずれかに記載の医薬組成物。
（項目１６）
ヒトの乳がん、特に、ヒトの治療抵抗性、転移性またはトリプルネガティブ乳がんの１種または複数の症状の治療、予防または寛解における使用のための、前記項目のいずれかに記載の医薬組成物。
（項目１７）
治療における使用のための、項目１〜１６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目１８）
哺乳動物被験体におけるがんの処置における使用のための、項目１〜１６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目１９）
哺乳動物におけるがんの１種または複数の症状を処置または寛解するための医薬の製造における、項目１〜１３のいずれか一項に記載の医薬組成物の使用。
（項目２０）
ヒトの乳がん、特に、難治性、処置抵抗性、再燃性、転移性またはトリプルネガティブ乳がんを処置するための医薬の製造における、項目１９に記載の使用。
（項目２１）
処置または寛解を必要とする動物におけるがんの１種または複数の症状を処置または寛解する方法であって、前記動物における前記がんの前記１種または複数の症状の処置または寛解に十分な時間、有効量の項目１〜１６のいずれか一項に記載の医薬組成物を前記動物に投与するステップを含む、方法。
（項目２２）
前記がんが、難治性、転移性、再燃性または処置抵抗性のがんとして診断されるか、あるいは同定される、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記がんが、処置抵抗性または転移性のがん、特に、処置抵抗性、トリプルネガティブヒト乳がんとして診断されるか、あるいは同定される、項目２１または項目２２に記載の方法。
（項目２４）
治療有効量の放射線を前記動物に投与するステップをさらに含む、項目２１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
前記医薬組成物が、単回投与で、あるいは１もしくは複数日間の期間にわたる、１もしくは複数週間の期間にわたる、または１もしくは複数箇月間またはそれより長い期間にわたる一連の複数回投与で、前記動物に全身的に投与される、項目１９〜２４のいずれか一項に記載の方法。
（項目２６）
前記医薬組成物が、項目１〜１６のいずれか一項に記載の第２の別個の化学療法剤または第２の別個のｉＮＯＳ阻害剤をさらに含む、項目１９〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【００６０】
本発明の原理の理解を促すために、次に、図面において図解されている実施形態または実施例を参照し、これを説明するために特定の術語が使用される。そうであるにもかかわらず、本発明の範囲の限定がこれにより企図されないことが理解されよう。記載されている実施形態におけるいかなる変更およびさらなる修正、ならびに本明細書に記載されている本発明の原理のいかなるさらなる適用も、本発明が関連する技術分野の当業者が通常思い付くものと考えられる。
【００６１】
次の図面は、本明細書の一部を構成し、本発明のある特定の態様を実証するように含まれている。本願は、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含有する。カラー図面（複数可）を備える本特許または特許出願公開のコピーは、依頼および必要料金の支払い後に、特許商標庁（Ｐａｔｅｎｔ  ａｎｄ  Ｔｒａｄｅｍａｒｋ  Ｏｆｆｉｃｅ）によって供給されるであろう。本発明は、同様の参照数字が同様の要素を同定する添付の図面と併せた次の説明を参照することにより、より十分に理解することができる。添付の図面を次に示す。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１Ａ−Ｄ】図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃ、図１Ｄ、図１Ｅおよび図１Ｆは、増強されたＮＯＳ２発現が、浸潤性ＴＮＢＣにおける不十分な患者生存と相関することを図解する。Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）データベースのＯｎｃｏｍｉｎｅがんマイクロアレイ解析（図１Ａおよび図１Ｂ）。図１Ａ：非ＴＮＢＣに対して浸潤性ＴＮＢＣにおけるより高いＮＯＳ２  ｍＲＮＡ発現。Ｐ＝３．８５Ｅ−５、ｔ検定。図１Ｂ：高いＮＯＳ２発現は、浸潤性乳癌における５年目の死亡と相関する。Ｐ＝０．０３７、ｔ検定。Ｖａｎ  ｄｅ  Ｖｉｊｖｅｒ（ｎ＝６９；ｐ＝０．０４）（図１Ｃ）およびＣｕｒｔｉｓ（ｎ＝２６０；ｐ＝０．０１）（図１Ｄ）（ウィルコクソン検定）乳房データベースにおけるカプラン・マイヤー生存解析は、高いＮＯＳ２発現が、ＴＮＢＣ患者のより悪い全生存期間と相関することを示す。（図１Ｅ）ｉＮＯＳタンパク質発現に関するＴＮＢＣヒト試料の免疫組織化学的解析。弱い〜中等度（３〜４）、中等度〜強い（５〜６）および強い（７）は、生存のさらなる解析のために確立されたカットオフであった。数個の試料は、腫瘍（Ｔ）および間質（Ｓ）細胞の両方における発現を示した（元の光学対物レンズ：２０×）。ＮＯＳ２指向性ｓｈＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ１）または空ベクター（ＥＶ）のいずれかをトランスフェクトされたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、それぞれｉＮＯＳ染色の陰性および陽性対照として使用した（元の光学対物レンズ：１０×）。対比染色：ヘマトキシリン。図１Ｆ：ｉＮＯＳ発現増加は、低ｉＮＯＳ発現と比較して低い患者生存に関連する。ＴＮＢＣヒト患者試料のカプラン・マイヤー生存解析（ｎ＝８３）。Ｐ＝０．０５、ログランク検定。
【図１Ｅ−Ｆ】図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃ、図１Ｄ、図１Ｅおよび図１Ｆは、増強されたＮＯＳ２発現が、浸潤性ＴＮＢＣにおける不十分な患者生存と相関することを図解する。Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）データベースのＯｎｃｏｍｉｎｅがんマイクロアレイ解析（図１Ａおよび図１Ｂ）。図１Ａ：非ＴＮＢＣに対して浸潤性ＴＮＢＣにおけるより高いＮＯＳ２  ｍＲＮＡ発現。Ｐ＝３．８５Ｅ−５、ｔ検定。図１Ｂ：高いＮＯＳ２発現は、浸潤性乳癌における５年目の死亡と相関する。Ｐ＝０．０３７、ｔ検定。Ｖａｎ  ｄｅ  Ｖｉｊｖｅｒ（ｎ＝６９；ｐ＝０．０４）（図１Ｃ）およびＣｕｒｔｉｓ（ｎ＝２６０；ｐ＝０．０１）（図１Ｄ）（ウィルコクソン検定）乳房データベースにおけるカプラン・マイヤー生存解析は、高いＮＯＳ２発現が、ＴＮＢＣ患者のより悪い全生存期間と相関することを示す。（図１Ｅ）ｉＮＯＳタンパク質発現に関するＴＮＢＣヒト試料の免疫組織化学的解析。弱い〜中等度（３〜４）、中等度〜強い（５〜６）および強い（７）は、生存のさらなる解析のために確立されたカットオフであった。数個の試料は、腫瘍（Ｔ）および間質（Ｓ）細胞の両方における発現を示した（元の光学対物レンズ：２０×）。ＮＯＳ２指向性ｓｈＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ１）または空ベクター（ＥＶ）のいずれかをトランスフェクトされたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、それぞれｉＮＯＳ染色の陰性および陽性対照として使用した（元の光学対物レンズ：１０×）。対比染色：ヘマトキシリン。図１Ｆ：ｉＮＯＳ発現増加は、低ｉＮＯＳ発現と比較して低い患者生存に関連する。ＴＮＢＣヒト患者試料のカプラン・マイヤー生存解析（ｎ＝８３）。Ｐ＝０．０５、ログランク検定。
【図２Ａ−Ｃ】図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｃ、図２Ｄ、図２Ｅおよび図２Ｆは、ＴＮＢＣ細胞株の腫瘍形成能におけるｉＮＯＳ阻害剤の効果を図解する。１４００ＷおよびＬ−ＮＭＭＡで９６時間処置したＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＳＵＭ１５９細胞株の増殖（図２Ａおよび図２Ｂ）、一次（図２Ｃ）および二次（図２Ｄ）マンモスフェアならびに遊走指数（図２Ｅおよび図２Ｆ）。結果をビヒクルに対して正規化した。データは、平均±ＳＥＭとして示される。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５、一元配置ＡＮＯＶＡおよびボンフェローニの事後検定。
【図２Ｄ−Ｆ】図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｃ、図２Ｄ、図２Ｅおよび図２Ｆは、ＴＮＢＣ細胞株の腫瘍形成能におけるｉＮＯＳ阻害剤の効果を図解する。１４００ＷおよびＬ−ＮＭＭＡで９６時間処置したＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＳＵＭ１５９細胞株の増殖（図２Ａおよび図２Ｂ）、一次（図２Ｃ）および二次（図２Ｄ）マンモスフェアならびに遊走指数（図２Ｅおよび図２Ｆ）。結果をビヒクルに対して正規化した。データは、平均±ＳＥＭとして示される。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５、一元配置ＡＮＯＶＡおよびボンフェローニの事後検定。
【図３Ａ−Ｄ】図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｃ、図３Ｄ、図３Ｅ、図３Ｆ、図３Ｇ、図３Ｈ、図３Ｉおよび図３Ｊは、ｉＮＯＳノックダウンが、ＨＩＦ１αおよび小胞体（ＥＲ）ストレス／ＴＧＦβ／ＡＦＴ４／ＡＴＦ３クロストークにおける二重の影響によって腫瘍形成能およびＥＭＴを損なうことを示す。空ベクター（ｓｈＲＮＡ−ＥＶ）と比較した、２種の異なるＮＯＳ２指向性ｓｈＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ１、ｓｈＲＮＡ２）をトランスフェクトされたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞における増殖（図３Ａ）、遊走（図３Ｂ）および自己再生能力（一次および二次マンモスフェア）（図３Ｃ）。１４００Ｗ（図３Ｄ）およびｓｈＲＮＡ媒介性ＮＯＳ２ノックダウン（図３Ｅ）で処置したＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＳＵＭ１５９細胞株におけるＮＯＳアイソフォーム（ｉＮＯＳ、ｅＮＯＳ、ｎＮＯＳ）およびＥＭＴ転写因子のウエスタンブロット解析。選択的ｉＮＯＳ阻害は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＳＵＭ１５９細胞における低酸素（ＨＩＦ１α）、ＥＲストレスマーカー（ＩＲＥ１α、ＡＴＦ４）（図３Ｆ）、ホスホＳｍａｄ２／３、Ｓｍａｄ２／３および成熟ＴＧＦβタンパク質レベル（図３Ｇ）を低下させた。図３Ｈ：組換えＴＧＦβ１（１０ｎｇ／ｍＬ、２４時間）は、ＭＣＦ１０ＡにおけるＰＥＲＫ／ｅＩＦ２α／ＡＴＦ４／ＡＴＦ３軸を活性化する。図３Ｉ：ＭＣＦ１０Ａ細胞における２４時間の組換えＴＧＦβ１（１０ｎｇ／ｍＬ）および１４００Ｗ（４ｍＭ）の同時処置によるＰＥＲＫ／ｅＩＦ２α／ＡＴＦ４／ＡＴＦ３軸における効果。９６時間のｓｉＲＮＡ媒介性ＮＯＳ２ノックダウン（ｓｉＲＮＡ２０）ＭＣＦ１０Ａ細胞におけるｉＮＯＳ、ＡＴＦ４、ＡＴＦ３および成熟ＴＧＦβタンパク質レベル。図３Ｊ：選択的ｉＮＯＳ阻害は、ＨＩＦ１α、ＥＲストレス（ＩＲＥ１α／ＸＢＰ１）、ならびにＡＴＦ４、ＡＴＦ３およびＴＧＦβの間のクロストークにおける影響によりＥＭＴおよび腫瘍細胞遊走を損なうと仮定される。結果を空ベクターに対して正規化した。データは、平均±ＳＥＭとして示される。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１。一元配置ＡＮＯＶＡおよびボンフェローニの事後検定。
【図３Ｅ−Ｇ】図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｃ、図３Ｄ、図３Ｅ、図３Ｆ、図３Ｇ、図３Ｈ、図３Ｉおよび図３Ｊは、ｉＮＯＳノックダウンが、ＨＩＦ１αおよび小胞体（ＥＲ）ストレス／ＴＧＦβ／ＡＦＴ４／ＡＴＦ３クロストークにおける二重の影響によって腫瘍形成能およびＥＭＴを損なうことを示す。空ベクター（ｓｈＲＮＡ−ＥＶ）と比較した、２種の異なるＮＯＳ２指向性ｓｈＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ１、ｓｈＲＮＡ２）をトランスフェクトされたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞における増殖（図３Ａ）、遊走（図３Ｂ）および自己再生能力（一次および二次マンモスフェア）（図３Ｃ）。１４００Ｗ（図３Ｄ）およびｓｈＲＮＡ媒介性ＮＯＳ２ノックダウン（図３Ｅ）で処置したＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＳＵＭ１５９細胞株におけるＮＯＳアイソフォーム（ｉＮＯＳ、ｅＮＯＳ、ｎＮＯＳ）およびＥＭＴ転写因子のウエスタンブロット解析。選択的ｉＮＯＳ阻害は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＳＵＭ１５９細胞における低酸素（ＨＩＦ１α）、ＥＲストレスマーカー（ＩＲＥ１α、ＡＴＦ４）（図３Ｆ）、ホスホＳｍａｄ２／３、Ｓｍａｄ２／３および成熟ＴＧＦβタンパク質レベル（図３Ｇ）を低下させた。図３Ｈ：組換えＴＧＦβ１（１０ｎｇ／ｍＬ、２４時間）は、ＭＣＦ１０ＡにおけるＰＥＲＫ／ｅＩＦ２α／ＡＴＦ４／ＡＴＦ３軸を活性化する。図３Ｉ：ＭＣＦ１０Ａ細胞における２４時間の組換えＴＧＦβ１（１０ｎｇ／ｍＬ）および１４００Ｗ（４ｍＭ）の同時処置によるＰＥＲＫ／ｅＩＦ２α／ＡＴＦ４／ＡＴＦ３軸における効果。９６時間のｓｉＲＮＡ媒介性ＮＯＳ２ノックダウン（ｓｉＲＮＡ２０）ＭＣＦ１０Ａ細胞におけるｉＮＯＳ、ＡＴＦ４、ＡＴＦ３および成熟ＴＧＦβタンパク質レベル。図３Ｊ：選択的ｉＮＯＳ阻害は、ＨＩＦ１α、ＥＲストレス（ＩＲＥ１α／ＸＢＰ１）、ならびにＡＴＦ４、ＡＴＦ３およびＴＧＦβの間のクロストークにおける影響によりＥＭＴおよび腫瘍細胞遊走を損なうと仮定される。結果を空ベクターに対して正規化した。データは、平均±ＳＥＭとして示される。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１。一元配置ＡＮＯＶＡおよびボンフェローニの事後検定。
【図３Ｈ−Ｊ】図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｃ、図３Ｄ、図３Ｅ、図３Ｆ、図３Ｇ、図３Ｈ、図３Ｉおよび図３Ｊは、ｉＮＯＳノックダウンが、ＨＩＦ１αおよび小胞体（ＥＲ）ストレス／ＴＧＦβ／ＡＦＴ４／ＡＴＦ３クロストークにおける二重の影響によって腫瘍形成能およびＥＭＴを損なうことを示す。空ベクター（ｓｈＲＮＡ−ＥＶ）と比較した、２種の異なるＮＯＳ２指向性ｓｈＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ１、ｓｈＲＮＡ２）をトランスフェクトされたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞における増殖（図３Ａ）、遊走（図３Ｂ）および自己再生能力（一次および二次マンモスフェア）（図３Ｃ）。１４００Ｗ（図３Ｄ）およびｓｈＲＮＡ媒介性ＮＯＳ２ノックダウン（図３Ｅ）で処置したＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＳＵＭ１５９細胞株におけるＮＯＳアイソフォーム（ｉＮＯＳ、ｅＮＯＳ、ｎＮＯＳ）およびＥＭＴ転写因子のウエスタンブロット解析。選択的ｉＮＯＳ阻害は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＳＵＭ１５９細胞における低酸素（ＨＩＦ１α）、ＥＲストレスマーカー（ＩＲＥ１α、ＡＴＦ４）（図３Ｆ）、ホスホＳｍａｄ２／３、Ｓｍａｄ２／３および成熟ＴＧＦβタンパク質レベル（図３Ｇ）を低下させた。図３Ｈ：組換えＴＧＦβ１（１０ｎｇ／ｍＬ、２４時間）は、ＭＣＦ１０ＡにおけるＰＥＲＫ／ｅＩＦ２α／ＡＴＦ４／ＡＴＦ３軸を活性化する。図３Ｉ：ＭＣＦ１０Ａ細胞における２４時間の組換えＴＧＦβ１（１０ｎｇ／ｍＬ）および１４００Ｗ（４ｍＭ）の同時処置によるＰＥＲＫ／ｅＩＦ２α／ＡＴＦ４／ＡＴＦ３軸における効果。９６時間のｓｉＲＮＡ媒介性ＮＯＳ２ノックダウン（ｓｉＲＮＡ２０）ＭＣＦ１０Ａ細胞におけるｉＮＯＳ、ＡＴＦ４、ＡＴＦ３および成熟ＴＧＦβタンパク質レベル。図３Ｊ：選択的ｉＮＯＳ阻害は、ＨＩＦ１α、ＥＲストレス（ＩＲＥ１α／ＸＢＰ１）、ならびにＡＴＦ４、ＡＴＦ３およびＴＧＦβの間のクロストークにおける影響によりＥＭＴおよび腫瘍細胞遊走を損なうと仮定される。結果を空ベクターに対して正規化した。データは、平均±ＳＥＭとして示される。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１。一元配置ＡＮＯＶＡおよびボンフェローニの事後検定。
【図４Ａ−Ｂ】図４Ａ、図４Ｂ、図４Ｃおよび図４Ｄは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１異種移植片における腫瘍惹起および肺転移の減少を示す。図４Ａ：Ｌ−ＮＡＭＥ（８０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）の毎日の注射後の、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳房異種移植片（ｎ＝５／群）の腫瘍体積。二元配置ＡＮＯＶＡおよびボンフェローニの事後検定。図４Ｂ：腫瘍組織から単離されたがん細胞の一次および二次ＭＳＦＥ。スチューデントのｔ検定。図４Ｃ：限界希釈方法によってアッセイした、腫瘍細胞の腫瘍惹起能力。フィッシャーの直接検定。図４Ｄ：ビヒクルおよびＬ−ＮＡＭＥ処置マウスの肺におけるＭＤＡ−ＭＢ−２３１  Ｌ／Ｇ腫瘍細胞のルミネセンス。スチューデントのｔ検定。結果をビヒクルに対して正規化した。データは、平均±ＳＥＭとして示される。＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５。
【図４Ｃ−Ｄ】図４Ａ、図４Ｂ、図４Ｃおよび図４Ｄは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１異種移植片における腫瘍惹起および肺転移の減少を示す。図４Ａ：Ｌ−ＮＡＭＥ（８０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）の毎日の注射後の、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳房異種移植片（ｎ＝５／群）の腫瘍体積。二元配置ＡＮＯＶＡおよびボンフェローニの事後検定。図４Ｂ：腫瘍組織から単離されたがん細胞の一次および二次ＭＳＦＥ。スチューデントのｔ検定。図４Ｃ：限界希釈方法によってアッセイした、腫瘍細胞の腫瘍惹起能力。フィッシャーの直接検定。図４Ｄ：ビヒクルおよびＬ−ＮＡＭＥ処置マウスの肺におけるＭＤＡ−ＭＢ−２３１  Ｌ／Ｇ腫瘍細胞のルミネセンス。スチューデントのｔ検定。結果をビヒクルに対して正規化した。データは、平均±ＳＥＭとして示される。＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５。
【図５Ａ−Ｃ】図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図５Ｅおよび図５Ｆは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１異種移植片におけるＬ−ＮＭＭＡのｉｎ  ｖｉｖｏ効果を図解する。図５Ａ：ビヒクル、Ｌ−ＮＭＭＡ、化学療法および組み合わせで処置したＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳房異種移植片（ｎ＝１０／群）の腫瘍体積。二元配置ＡＮＯＶＡおよびボンフェローニの事後検定。図５Ｂ：ビヒクル、Ｌ−ＮＭＭＡ、ドセタキセルおよび組み合わせ群におけるＫｉ６７染色の実例的な画像。元の光学対物レンズ：１０×。対比染色：ヘマトキシリン。図５Ｃ：腫瘍異種移植片の細胞増殖は、Ｋｉ６７陽性細胞として描写される。１０個の異なる視野から１，０００個の細胞を計数し、パーセンテージを決定した。図５Ｄ：ケモ（Ｃｈｅｍｏ）およびコンボ（Ｃｏｍｂｏ）群における核切断型カスパーゼ−３染色；１０個の異なる視野から１，０００個の細胞を計数し、パーセンテージを決定した。図５Ｅ：腫瘍組織から単離された乳がん細胞の一次および二次ＭＳＦＥ。一元配置ＡＮＯＶＡおよびボンフェローニの事後検定。図５Ｆ：限界希釈方法によってアッセイした腫瘍細胞の腫瘍惹起能力。フィッシャーの直接検定。結果をビヒクルに対して正規化した。データは、平均±ＳＥＭとして示される。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５。
【図５Ｄ−Ｅ】図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図５Ｅおよび図５Ｆは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１異種移植片におけるＬ−ＮＭＭＡのｉｎ  ｖｉｖｏ効果を図解する。図５Ａ：ビヒクル、Ｌ−ＮＭＭＡ、化学療法および組み合わせで処置したＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳房異種移植片（ｎ＝１０／群）の腫瘍体積。二元配置ＡＮＯＶＡおよびボンフェローニの事後検定。図５Ｂ：ビヒクル、Ｌ−ＮＭＭＡ、ドセタキセルおよび組み合わせ群におけるＫｉ６７染色の実例的な画像。元の光学対物レンズ：１０×。対比染色：ヘマトキシリン。図５Ｃ：腫瘍異種移植片の細胞増殖は、Ｋｉ６７陽性細胞として描写される。１０個の異なる視野から１，０００個の細胞を計数し、パーセンテージを決定した。図５Ｄ：ケモ（Ｃｈｅｍｏ）およびコンボ（Ｃｏｍｂｏ）群における核切断型カスパーゼ−３染色；１０個の異なる視野から１，０００個の細胞を計数し、パーセンテージを決定した。図５Ｅ：腫瘍組織から単離された乳がん細胞の一次および二次ＭＳＦＥ。一元配置ＡＮＯＶＡおよびボンフェローニの事後検定。図５Ｆ：限界希釈方法によってアッセイした腫瘍細胞の腫瘍惹起能力。フィッシャーの直接検定。結果をビヒクルに対して正規化した。データは、平均±ＳＥＭとして示される。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５。
【図５Ｆ】図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図５Ｅおよび図５Ｆは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１異種移植片におけるＬ−ＮＭＭＡのｉｎ  ｖｉｖｏ効果を図解する。図５Ａ：ビヒクル、Ｌ−ＮＭＭＡ、化学療法および組み合わせで処置したＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳房異種移植片（ｎ＝１０／群）の腫瘍体積。二元配置ＡＮＯＶＡおよびボンフェローニの事後検定。図５Ｂ：ビヒクル、Ｌ−ＮＭＭＡ、ドセタキセルおよび組み合わせ群におけるＫｉ６７染色の実例的な画像。元の光学対物レンズ：１０×。対比染色：ヘマトキシリン。図５Ｃ：腫瘍異種移植片の細胞増殖は、Ｋｉ６７陽性細胞として描写される。１０個の異なる視野から１，０００個の細胞を計数し、パーセンテージを決定した。図５Ｄ：ケモ（Ｃｈｅｍｏ）およびコンボ（Ｃｏｍｂｏ）群における核切断型カスパーゼ−３染色；１０個の異なる視野から１，０００個の細胞を計数し、パーセンテージを決定した。図５Ｅ：腫瘍組織から単離された乳がん細胞の一次および二次ＭＳＦＥ。一元配置ＡＮＯＶＡおよびボンフェローニの事後検定。図５Ｆ：限界希釈方法によってアッセイした腫瘍細胞の腫瘍惹起能力。フィッシャーの直接検定。結果をビヒクルに対して正規化した。データは、平均±ＳＥＭとして示される。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５。
【図６Ａ−Ｃ】図６Ａ、図６Ｂ、図６Ｃ、図６Ｄおよび図６Ｅは、ＴＮＢＣの同所性マウスモデルにおけるＬ−ＮＭＭＡの臨床関連用量レジメンを示す。図６Ａ：本研究において提案される１サイクルの用量率を与えたマウス（ｎ＝５）の平均収縮期圧。一元配置ＡＮＯＶＡおよびボンフェローニの事後検定。図６Ｂ：１サイクル処置の最後の注射から３０分および２４時間後のマウスの平均収縮期圧（ｎ＝５）。一元配置ＡＮＯＶＡおよびボンフェローニの事後検定。図６Ｃ：ビヒクル、アムロジピン、ドセタキセルおよび組み合わせ（ドセタキセル＋Ｌ−ＮＭＭＡ）で処置したＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳房異種移植片（ｎ＝１０／群）の腫瘍体積。二元配置ＡＮＯＶＡおよびボンフェローニの事後検定。図６Ｄ：ビヒクル、化学療法およびコンボ処置したＭＤＡ−ＭＢ−２３１異種移植片を有するマウスのカプラン・マイヤー生存曲線。ウィルコクソン検定。図６Ｅ：ビヒクル、アムロジピン、ドセタキセルおよび組み合わせ（ドセタキセル＋Ｌ−ＮＭＭＡ）で処置したＳＵＭ１５９乳房異種移植片の腫瘍体積。二元配置ＡＮＯＶＡおよびボンフェローニの事後検定。データは、平均±ＳＥＭとして示される。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図６Ｄ−Ｅ】図６Ａ、図６Ｂ、図６Ｃ、図６Ｄおよび図６Ｅは、ＴＮＢＣの同所性マウスモデルにおけるＬ−ＮＭＭＡの臨床関連用量レジメンを示す。図６Ａ：本研究において提案される１サイクルの用量率を与えたマウス（ｎ＝５）の平均収縮期圧。一元配置ＡＮＯＶＡおよびボンフェローニの事後検定。図６Ｂ：１サイクル処置の最後の注射から３０分および２４時間後のマウスの平均収縮期圧（ｎ＝５）。一元配置ＡＮＯＶＡおよびボンフェローニの事後検定。図６Ｃ：ビヒクル、アムロジピン、ドセタキセルおよび組み合わせ（ドセタキセル＋Ｌ−ＮＭＭＡ）で処置したＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳房異種移植片（ｎ＝１０／群）の腫瘍体積。二元配置ＡＮＯＶＡおよびボンフェローニの事後検定。図６Ｄ：ビヒクル、化学療法およびコンボ処置したＭＤＡ−ＭＢ−２３１異種移植片を有するマウスのカプラン・マイヤー生存曲線。ウィルコクソン検定。図６Ｅ：ビヒクル、アムロジピン、ドセタキセルおよび組み合わせ（ドセタキセル＋Ｌ−ＮＭＭＡ）で処置したＳＵＭ１５９乳房異種移植片の腫瘍体積。二元配置ＡＮＯＶＡおよびボンフェローニの事後検定。データは、平均±ＳＥＭとして示される。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図７Ａ−Ｂ】図７Ａおよび図７Ｂは、ｉＮＯＳ阻害剤で処置したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞におけるマンモスフェアの代表的な画像を示す。１４００Ｗ、Ｌ−ＮＭＭＡ（ビヒクル、１、２、４ｍＭ）およびＬ−ＮＡＭＥ（ビヒクル、１、２、５ｍＭ）による９６時間の処置後の一次（図７Ａ）および二次（図７Ｂ）マンモスフェアの実例的な画像。
【図８Ａ−Ｂ】図８Ａおよび図８Ｂは、ｉＮＯＳ阻害剤で処置したＳＵＭ１５９細胞におけるマンモスフェアの代表的な画像を示す。１４００Ｗ、Ｌ−ＮＭＭＡ（ビヒクル、１、２、４ｍＭ）およびＬ−ＮＡＭＥ（ビヒクル、１、２、５ｍＭ）による９６時間の処置後の一次（図８Ａ）および二次（図８Ｂ）マンモスフェアの実例的な画像。
【図９Ａ−Ｂ】図９Ａ、図９Ｂ、図９Ｃ、図９Ｄおよび図９Ｅは、ＴＮＢＣ細胞株の腫瘍形成能におけるＬ−ＮＡＭＥならびにマイクロモル濃度の１４００ＷおよびＬ−ＮＭＭＡの効果を示す。Ｌ−ＮＡＭＥで処置したＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＳＵＭ１５９細胞株の増殖（図９Ａ）、一次（図９Ｂ）および二次（図９Ｃ）マンモスフェア。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＳＵＭ１５９細胞の遊走指数におけるマイクロモル濃度の１４００Ｗ（図９Ｄ）およびＬ−ＮＭＭＡ（図９Ｅ）の影響。結果をビヒクルに対して正規化した。データは、平均±ＳＥＭとして示される。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５、一元配置ＡＮＯＶＡおよびボンフェローニの事後検定。
【図９Ｃ−Ｄ】図９Ａ、図９Ｂ、図９Ｃ、図９Ｄおよび図９Ｅは、ＴＮＢＣ細胞株の腫瘍形成能におけるＬ−ＮＡＭＥならびにマイクロモル濃度の１４００ＷおよびＬ−ＮＭＭＡの効果を示す。Ｌ−ＮＡＭＥで処置したＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＳＵＭ１５９細胞株の増殖（図９Ａ）、一次（図９Ｂ）および二次（図９Ｃ）マンモスフェア。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＳＵＭ１５９細胞の遊走指数におけるマイクロモル濃度の１４００Ｗ（図９Ｄ）およびＬ−ＮＭＭＡ（図９Ｅ）の影響。結果をビヒクルに対して正規化した。データは、平均±ＳＥＭとして示される。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５、一元配置ＡＮＯＶＡおよびボンフェローニの事後検定。
【図９Ｅ】図９Ａ、図９Ｂ、図９Ｃ、図９Ｄおよび図９Ｅは、ＴＮＢＣ細胞株の腫瘍形成能におけるＬ−ＮＡＭＥならびにマイクロモル濃度の１４００ＷおよびＬ−ＮＭＭＡの効果を示す。Ｌ−ＮＡＭＥで処置したＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＳＵＭ１５９細胞株の増殖（図９Ａ）、一次（図９Ｂ）および二次（図９Ｃ）マンモスフェア。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＳＵＭ１５９細胞の遊走指数におけるマイクロモル濃度の１４００Ｗ（図９Ｄ）およびＬ−ＮＭＭＡ（図９Ｅ）の影響。結果をビヒクルに対して正規化した。データは、平均±ＳＥＭとして示される。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５、一元配置ＡＮＯＶＡおよびボンフェローニの事後検定。
【図１０Ａ−Ｃ】図１０Ａ、図１０Ｂ、図１０Ｃ、図１０Ｄ、図１０Ｅ、図１０Ｆおよび図１０Ｇは、ｉＮＯＳ阻害剤で処置したＴＮＢＣ細胞株における遊走、ならびにＮＯＳアイソフォーム、ＥＭＴ転写因子および低酸素のウエスタンブロットを示す。（図１０Ａ）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＳＵＭ１５９細胞株におけるＬ−ＮＡＭＥによる処置後の腫瘍細胞遊走。１４００Ｗ（図１０Ｂ）およびＬ−ＮＭＭＡ（図１０Ｃ）で処置したＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＳＵＭ１５９細胞におけるＮＯＳアイソフォーム（ｉＮＯＳ、ｅＮＯＳおよびｎＮＯＳ）のウエスタンブロット解析。マイクロモル濃度の１４００Ｗ（図１０Ｄ）またはＬ−ＮＭＭＡ（図１０Ｅ）による処置後のＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＳＵＭ１５９細胞におけるＥＭＴマーカータンパク質レベル。（図１０Ｆ）Ｌ−ＮＡＭＥで処置したＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＳＵＭ１５９細胞株におけるＮＯＳアイソフォームおよびＥＭＴ転写因子のウエスタンブロット解析。（図１０Ｇ）１４００Ｗで処置したＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＳＵＭ１５９細胞におけるβ−アクチンと比べたＨＩＦ１αタンパク質レベルの定量化。結果をビヒクルに対して正規化した。データは、平均±ＳＥＭとして示される。＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５、一元配置ＡＮＯＶＡおよびボンフェローニの事後検定。
【図１０Ｄ−Ｆ】図１０Ａ、図１０Ｂ、図１０Ｃ、図１０Ｄ、図１０Ｅ、図１０Ｆおよび図１０Ｇは、ｉＮＯＳ阻害剤で処置したＴＮＢＣ細胞株における遊走、ならびにＮＯＳアイソフォーム、ＥＭＴ転写因子および低酸素のウエスタンブロットを示す。（図１０Ａ）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＳＵＭ１５９細胞株におけるＬ−ＮＡＭＥによる処置後の腫瘍細胞遊走。１４００Ｗ（図１０Ｂ）およびＬ−ＮＭＭＡ（図１０Ｃ）で処置したＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＳＵＭ１５９細胞におけるＮＯＳアイソフォーム（ｉＮＯＳ、ｅＮＯＳおよびｎＮＯＳ）のウエスタンブロット解析。マイクロモル濃度の１４００Ｗ（図１０Ｄ）またはＬ−ＮＭＭＡ（図１０Ｅ）による処置後のＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＳＵＭ１５９細胞におけるＥＭＴマーカータンパク質レベル。（図１０Ｆ）Ｌ−ＮＡＭＥで処置したＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＳＵＭ１５９細胞株におけるＮＯＳアイソフォームおよびＥＭＴ転写因子のウエスタンブロット解析。（図１０Ｇ）１４００Ｗで処置したＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＳＵＭ１５９細胞におけるβ−アクチンと比べたＨＩＦ１αタンパク質レベルの定量化。結果をビヒクルに対して正規化した。データは、平均±ＳＥＭとして示される。＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５、一元配置ＡＮＯＶＡおよびボンフェローニの事後検定。
【図１０Ｇ】図１０Ａ、図１０Ｂ、図１０Ｃ、図１０Ｄ、図１０Ｅ、図１０Ｆおよび図１０Ｇは、ｉＮＯＳ阻害剤で処置したＴＮＢＣ細胞株における遊走、ならびにＮＯＳアイソフォーム、ＥＭＴ転写因子および低酸素のウエスタンブロットを示す。（図１０Ａ）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＳＵＭ１５９細胞株におけるＬ−ＮＡＭＥによる処置後の腫瘍細胞遊走。１４００Ｗ（図１０Ｂ）およびＬ−ＮＭＭＡ（図１０Ｃ）で処置したＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＳＵＭ１５９細胞におけるＮＯＳアイソフォーム（ｉＮＯＳ、ｅＮＯＳおよびｎＮＯＳ）のウエスタンブロット解析。マイクロモル濃度の１４００Ｗ（図１０Ｄ）またはＬ−ＮＭＭＡ（図１０Ｅ）による処置後のＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＳＵＭ１５９細胞におけるＥＭＴマーカータンパク質レベル。（図１０Ｆ）Ｌ−ＮＡＭＥで処置したＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＳＵＭ１５９細胞株におけるＮＯＳアイソフォームおよびＥＭＴ転写因子のウエスタンブロット解析。（図１０Ｇ）１４００Ｗで処置したＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＳＵＭ１５９細胞におけるβ−アクチンと比べたＨＩＦ１αタンパク質レベルの定量化。結果をビヒクルに対して正規化した。データは、平均±ＳＥＭとして示される。＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５、一元配置ＡＮＯＶＡおよびボンフェローニの事後検定。
【図１１Ａ−Ｅ】図１１Ａ、図１１Ｂ、図１１Ｃ、図１１Ｄ、図１１Ｅ、図１１Ｆ、図１１Ｇ、図１１Ｈおよび図１１Ｉは、ＮＯＳ２ノックダウンが、細胞腫瘍形成能、ＥＭＴ転写因子、スプライシングされたＸＢＰ１およびＳｍａｄ２／３シグナリングを減少させることを示す。ＥＲストレスおよびＴＧＦβの間のクロストーク。空ベクター（ｓｈＲＮＡ−ＥＶ）と比較した、２種の異なるＮＯＳ２指向性ｓｈＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ１、ｓｈＲＮＡ２）をトランスフェクトされたＳＵＭ１５９細胞の増殖（図１１Ａ）、遊走（図１１Ｂ）ならびに一次および二次マンモスフェア（図１１Ｃ）。図１１Ｄ：ｓｈＲＮＡ媒介ＮＯＳ２ノックダウンＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＳＵＭ１５９細胞におけるＥＭＴ転写因子ＳｎａｉｌおよびＳｌｕｇ。図１１Ｅ：９６時間の２種の異なるＮＯＳ２指向性ｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ１８、ｓｉＲＮＡ２０；１００ｎＭ  ｓｉＲＮＡ）をトランスフェクトされたＳＵＭ１５９細胞において、Ｚｅｂ１およびＴｗｉｓｔ１タンパク質レベルの変化が確認された。図１１Ｆ：１４００Ｗで９６時間処置したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞由来のスプライシングされていないＸＢＰ１（ｕＸＢＰ１）、スプライシングされたＸＢＰ１（ｓＸＢＰ１）およびβ−アクチンＲＴ−ＰＣＲ  ｃＤＮＡアンプリコン。図１１Ｇ：タンパク質−タンパク質相互作用解析（ＳＴＲＩＮＧ  ９．１）は、ＮＯＳ２、ＴＧＦβ１およびＡＴＦ４／ＡＴＦ３軸の間のリンクを解読した。図１１Ｈ：ｉＮＯＳ阻害剤１４００Ｗは、組換えＴＧＦβ１（１０ｎｇ／ｍＬ）による７２時間の処置下のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞におけるＳｍａｄ２／３シグナリングを低下させることができる。図１１Ｉ：ツニカマイシン（Ｔｕｎｉｃａｍｉｃｙｎ）（５μＭ）は、ＡＴＦ４／ＡＴＦ３転写因子によるＥＲストレスおよびＴＧＦβの間のクロストークを確認した。結果を空ベクターに対して正規化した。データは、平均±ＳＥＭとして示される。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５、一元配置ＡＮＯＶＡおよびボンフェローニの事後検定。
【図１１Ｆ−Ｉ】図１１Ａ、図１１Ｂ、図１１Ｃ、図１１Ｄ、図１１Ｅ、図１１Ｆ、図１１Ｇ、図１１Ｈおよび図１１Ｉは、ＮＯＳ２ノックダウンが、細胞腫瘍形成能、ＥＭＴ転写因子、スプライシングされたＸＢＰ１およびＳｍａｄ２／３シグナリングを減少させることを示す。ＥＲストレスおよびＴＧＦβの間のクロストーク。空ベクター（ｓｈＲＮＡ−ＥＶ）と比較した、２種の異なるＮＯＳ２指向性ｓｈＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ１、ｓｈＲＮＡ２）をトランスフェクトされたＳＵＭ１５９細胞の増殖（図１１Ａ）、遊走（図１１Ｂ）ならびに一次および二次マンモスフェア（図１１Ｃ）。図１１Ｄ：ｓｈＲＮＡ媒介ＮＯＳ２ノックダウンＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＳＵＭ１５９細胞におけるＥＭＴ転写因子ＳｎａｉｌおよびＳｌｕｇ。図１１Ｅ：９６時間の２種の異なるＮＯＳ２指向性ｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ１８、ｓｉＲＮＡ２０；１００ｎＭ  ｓｉＲＮＡ）をトランスフェクトされたＳＵＭ１５９細胞において、Ｚｅｂ１およびＴｗｉｓｔ１タンパク質レベルの変化が確認された。図１１Ｆ：１４００Ｗで９６時間処置したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞由来のスプライシングされていないＸＢＰ１（ｕＸＢＰ１）、スプライシングされたＸＢＰ１（ｓＸＢＰ１）およびβ−アクチンＲＴ−ＰＣＲ  ｃＤＮＡアンプリコン。図１１Ｇ：タンパク質−タンパク質相互作用解析（ＳＴＲＩＮＧ  ９．１）は、ＮＯＳ２、ＴＧＦβ１およびＡＴＦ４／ＡＴＦ３軸の間のリンクを解読した。図１１Ｈ：ｉＮＯＳ阻害剤１４００Ｗは、組換えＴＧＦβ１（１０ｎｇ／ｍＬ）による７２時間の処置下のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞におけるＳｍａｄ２／３シグナリングを低下させることができる。図１１Ｉ：ツニカマイシン（５μＭ）は、ＡＴＦ４／ＡＴＦ３転写因子によるＥＲストレスおよびＴＧＦβの間のクロストークを確認した。結果を空ベクターに対して正規化した。データは、平均±ＳＥＭとして示される。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５、一元配置ＡＮＯＶＡおよびボンフェローニの事後検定。
【図１２Ａ−Ｂ】図１２Ａ、図１２Ｂ、図１２Ｃおよび図１２Ｄは、ｓｈＲＮＡ媒介性ＮＯＳ２ノックダウン細胞におけるマンモスフェアの代表的な画像および創傷治癒アッセイを示す。２種の異なるＮＯＳ２指向性ｓｈＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ１、ｓｈＲＮＡ２）または空ベクター（ｓＲＮＡ−ＥＶ）をトランスフェクトされたＳＵＭ１５９およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞における一次および二次マンモスフェア（図１２Ａおよび図１２Ｂ）ならびに遊走（創傷治癒アッセイ）（図１２Ｃおよび図１２Ｄ）の実例的な画像。
【図１２Ｃ−Ｄ】図１２Ａ、図１２Ｂ、図１２Ｃおよび図１２Ｄは、ｓｈＲＮＡ媒介性ＮＯＳ２ノックダウン細胞におけるマンモスフェアの代表的な画像および創傷治癒アッセイを示す。２種の異なるＮＯＳ２指向性ｓｈＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ１、ｓｈＲＮＡ２）または空ベクター（ｓＲＮＡ−ＥＶ）をトランスフェクトされたＳＵＭ１５９およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞における一次および二次マンモスフェア（図１２Ａおよび図１２Ｂ）ならびに遊走（創傷治癒アッセイ）（図１２Ｃおよび図１２Ｄ）の実例的な画像。
【図１３Ａ−Ｂ】図１３Ａ、図１３Ｂ、図１３Ｃ、図１３Ｄ、図１３Ｅおよび図１３Ｆは、ＳＵＭ１５９異種移植片におけるＬ−ＮＭＭＡのｉｎ  ｖｉｖｏ効果を示す。図１３Ａ：ビヒクル、Ｌ−ＮＭＭＡ、化学療法および組み合わせで処置したＳＵＭ１５９乳房異種移植片（ｎ＝１０／群）の腫瘍体積。二元配置ＡＮＯＶＡおよびボンフェローニの事後検定。図１３Ｂ：ビヒクル、Ｌ−ＮＭＭＡ、化学療法（ドセタキセル）および組み合わせ群におけるＫｉ６７染色の実例的な画像。元の光学対物レンズ：１０×。対比染色：ヘマトキシリン。（図１３Ｃ）腫瘍異種移植片の細胞増殖は、Ｋｉ６７陽性細胞として描写される。１０個の異なる視野から１，０００個の細胞を計数し、パーセンテージを決定した。一元配置ＡＮＯＶＡおよびボンフェローニの事後検定。腫瘍組織から単離された乳がん細胞の一次および二次ＭＳＦＥ（図１３Ｄおよび図１３Ｅ）。一元配置ＡＮＯＶＡおよびボンフェローニの事後検定。図１３Ｆ：限界希釈方法によってアッセイされた腫瘍細胞の腫瘍惹起能力。フィッシャーの直接検定。結果をビヒクルに対して正規化した。データは、平均±ＳＥＭとして示される。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５。
【図１３Ｃ−Ｅ】図１３Ａ、図１３Ｂ、図１３Ｃ、図１３Ｄ、図１３Ｅおよび図１３Ｆは、ＳＵＭ１５９異種移植片におけるＬ−ＮＭＭＡのｉｎ  ｖｉｖｏ効果を示す。図１３Ａ：ビヒクル、Ｌ−ＮＭＭＡ、化学療法および組み合わせで処置したＳＵＭ１５９乳房異種移植片（ｎ＝１０／群）の腫瘍体積。二元配置ＡＮＯＶＡおよびボンフェローニの事後検定。図１３Ｂ：ビヒクル、Ｌ−ＮＭＭＡ、化学療法（ドセタキセル）および組み合わせ群におけるＫｉ６７染色の実例的な画像。元の光学対物レンズ：１０×。対比染色：ヘマトキシリン。（図１３Ｃ）腫瘍異種移植片の細胞増殖は、Ｋｉ６７陽性細胞として描写される。１０個の異なる視野から１，０００個の細胞を計数し、パーセンテージを決定した。一元配置ＡＮＯＶＡおよびボンフェローニの事後検定。腫瘍組織から単離された乳がん細胞の一次および二次ＭＳＦＥ（図１３Ｄおよび図１３Ｅ）。一元配置ＡＮＯＶＡおよびボンフェローニの事後検定。図１３Ｆ：限界希釈方法によってアッセイされた腫瘍細胞の腫瘍惹起能力。フィッシャーの直接検定。結果をビヒクルに対して正規化した。データは、平均±ＳＥＭとして示される。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５。
【図１４Ａ】図１４Ａ、図１４Ｂ、図１４Ｃ、図１４Ｄ、図１４Ｅおよび図１４Ｆは、血漿および腫瘍組織におけるＮＭＭＡレベルを示す。Ｌ−ＮＭＭＡ処置された異種移植片におけるＣＤ４４＋／ＣＤ２４−／ｌｏｗ集団。ビヒクル、Ｌ−ＮＭＭＡ、ドセタキセルおよび組み合わせ（ドセタキセル＋Ｌ−ＮＭＭＡ）で処置したマウスのＳＵＭ１５９（図１４Ａ）およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１（図１４Ｂ）異種移植片腫瘍組織から単離されたＣＤ４４＋／ＣＤ２４−／ｌｏｗ細胞のフローサイトメトリー解析（％親）。図１４Ｃおよび図１４Ｄ：ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる、血漿および腫瘍組織（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＳＵＭ１５９異種移植片）におけるメチルアルギニンのレシオメトリック定量化（ｒａｔｉｏｍｅｔｒｉｃ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（スチューデントのｔ検定）。図１４Ｅ：ｉＮＯＳは、Ｌ−アルギニンのＬ−シトルリン＋一酸化窒素（ＮＯ）への反応を触媒する。シトルリンＳＵＭ１５９異種移植片組織ＬＣ−ＭＳ／ＭＳのレシオメトリック定量化（スチューデントのｔ検定）。図１４Ｆ：Ｌ−ＮＭＭＡおよび１４００Ｗ（４ｍＭ）で０．５、２、６および２４時間処置したＳＵＭ１５９細胞における総一酸化窒素産生。結果をビヒクルに対して正規化した。データは、平均±ＳＥＭとして示される。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５、一元配置ＡＮＯＶＡおよびボンフェローニの事後検定。
【図１４Ｂ】図１４Ａ、図１４Ｂ、図１４Ｃ、図１４Ｄ、図１４Ｅおよび図１４Ｆは、血漿および腫瘍組織におけるＮＭＭＡレベルを示す。Ｌ−ＮＭＭＡ処置された異種移植片におけるＣＤ４４＋／ＣＤ２４−／ｌｏｗ集団。ビヒクル、Ｌ−ＮＭＭＡ、ドセタキセルおよび組み合わせ（ドセタキセル＋Ｌ−ＮＭＭＡ）で処置したマウスのＳＵＭ１５９（図１４Ａ）およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１（図１４Ｂ）異種移植片腫瘍組織から単離されたＣＤ４４＋／ＣＤ２４−／ｌｏｗ細胞のフローサイトメトリー解析（％親）。図１４Ｃおよび図１４Ｄ：ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる、血漿および腫瘍組織（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＳＵＭ１５９異種移植片）におけるメチルアルギニンのレシオメトリック定量化（ｒａｔｉｏｍｅｔｒｉｃ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（スチューデントのｔ検定）。図１４Ｅ：ｉＮＯＳは、Ｌ−アルギニンのＬ−シトルリン＋一酸化窒素（ＮＯ）への反応を触媒する。シトルリンＳＵＭ１５９異種移植片組織ＬＣ−ＭＳ／ＭＳのレシオメトリック定量化（スチューデントのｔ検定）。図１４Ｆ：Ｌ−ＮＭＭＡおよび１４００Ｗ（４ｍＭ）で０．５、２、６および２４時間処置したＳＵＭ１５９細胞における総一酸化窒素産生。結果をビヒクルに対して正規化した。データは、平均±ＳＥＭとして示される。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５、一元配置ＡＮＯＶＡおよびボンフェローニの事後検定。
【図１４Ｃ−Ｄ】図１４Ａ、図１４Ｂ、図１４Ｃ、図１４Ｄ、図１４Ｅおよび図１４Ｆは、血漿および腫瘍組織におけるＮＭＭＡレベルを示す。Ｌ−ＮＭＭＡ処置された異種移植片におけるＣＤ４４＋／ＣＤ２４−／ｌｏｗ集団。ビヒクル、Ｌ−ＮＭＭＡ、ドセタキセルおよび組み合わせ（ドセタキセル＋Ｌ−ＮＭＭＡ）で処置したマウスのＳＵＭ１５９（図１４Ａ）およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１（図１４Ｂ）異種移植片腫瘍組織から単離されたＣＤ４４＋／ＣＤ２４−／ｌｏｗ細胞のフローサイトメトリー解析（％親）。図１４Ｃおよび図１４Ｄ：ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる、血漿および腫瘍組織（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＳＵＭ１５９異種移植片）におけるメチルアルギニンのレシオメトリック定量化（ｒａｔｉｏｍｅｔｒｉｃ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（スチューデントのｔ検定）。図１４Ｅ：ｉＮＯＳは、Ｌ−アルギニンのＬ−シトルリン＋一酸化窒素（ＮＯ）への反応を触媒する。シトルリンＳＵＭ１５９異種移植片組織ＬＣ−ＭＳ／ＭＳのレシオメトリック定量化（スチューデントのｔ検定）。図１４Ｆ：Ｌ−ＮＭＭＡおよび１４００Ｗ（４ｍＭ）で０．５、２、６および２４時間処置したＳＵＭ１５９細胞における総一酸化窒素産生。結果をビヒクルに対して正規化した。データは、平均±ＳＥＭとして示される。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５、一元配置ＡＮＯＶＡおよびボンフェローニの事後検定。
【図１４Ｅ−Ｆ】図１４Ａ、図１４Ｂ、図１４Ｃ、図１４Ｄ、図１４Ｅおよび図１４Ｆは、血漿および腫瘍組織におけるＮＭＭＡレベルを示す。Ｌ−ＮＭＭＡ処置された異種移植片におけるＣＤ４４＋／ＣＤ２４−／ｌｏｗ集団。ビヒクル、Ｌ−ＮＭＭＡ、ドセタキセルおよび組み合わせ（ドセタキセル＋Ｌ−ＮＭＭＡ）で処置したマウスのＳＵＭ１５９（図１４Ａ）およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１（図１４Ｂ）異種移植片腫瘍組織から単離されたＣＤ４４＋／ＣＤ２４−／ｌｏｗ細胞のフローサイトメトリー解析（％親）。図１４Ｃおよび図１４Ｄ：ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる、血漿および腫瘍組織（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＳＵＭ１５９異種移植片）におけるメチルアルギニンのレシオメトリック定量化（ｒａｔｉｏｍｅｔｒｉｃ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（スチューデントのｔ検定）。図１４Ｅ：ｉＮＯＳは、Ｌ−アルギニンのＬ−シトルリン＋一酸化窒素（ＮＯ）への反応を触媒する。シトルリンＳＵＭ１５９異種移植片組織ＬＣ−ＭＳ／ＭＳのレシオメトリック定量化（スチューデントのｔ検定）。図１４Ｆ：Ｌ−ＮＭＭＡおよび１４００Ｗ（４ｍＭ）で０．５、２、６および２４時間処置したＳＵＭ１５９細胞における総一酸化窒素産生。結果をビヒクルに対して正規化した。データは、平均±ＳＥＭとして示される。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５、一元配置ＡＮＯＶＡおよびボンフェローニの事後検定。
【図１５Ａ−Ｆ】図１５Ａ、図１５Ｂ、図１５Ｃ、図１５Ｄ、図１５Ｅおよび図１５Ｆは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の増殖におけるカルシウムチャネルアンタゴニストの効果を示す（増殖減少のパーセンテージをバーの上に示す）。
【図１６Ａ−Ｆ】図１６Ａ、図１６Ｂ、図１６Ｃ、図１６Ｄ、図１６Ｅおよび図１６Ｆは、ＳＵＭ１５９細胞の細胞増殖におけるカルシウムチャネルアンタゴニストの効果を示す（増殖減少のパーセンテージをバーの上に示す）。
【図１７Ａ−Ｂ】図１７Ａおよび図１７Ｂは、トリプルネガティブ乳がんのアムロジピンマウスモデルの抗腫瘍活性を図解する。
【図１８Ａ−Ｂ】図１８Ａおよび図１８Ｂは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＳＵＭ１５９細胞の遊走が、「創傷治癒」アッセイによって評価されたことを示す。簡潔に説明すると、６ウェルプレートにおいて、コンフルエンスまで成長培地に３×１０５個の細胞を蒔いた。単層の細胞を、低血清条件（１％）で７２時間および阻害剤の存在下で通常の成長培地において２４時間（合計９６時間）、１４００Ｗ（０、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１、２、４ｍＭ）で処置した。続いて、細胞単層に「創傷」を作製した。０および１２時間目に画像を撮影した。ソフトウェアＩｍａｇｅ  Ｊにより、創傷治癒能力を決定した。３回の独立的実験においてデータを複製した。結果をビヒクルに対して正規化した。
【図１９Ａ−Ｂ】図１９Ａおよび図１９Ｂは、上皮間葉系（ＥＭＴ）誘導因子における選択的ｉＮＯＳ阻害の効果が、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＳＵＭ１５９細胞株のウエスタンブロットによって検査されたことを示す。細胞を１４００Ｗ（０．１、１、１０、１００μＭ；１、２、４ｍＭ）で９６時間処置した。ｉＮＯＳ（Ｎ−２０）およびＴｗｉｓｔ１（Ｌ−２１）（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、Ｓｎａｉｌ（Ｃ１５Ｄ３）、Ｓｌｕｇ（Ｃ１９Ｇ７）およびＴＣＦ８／Ｚｅｂ１（Ｄ８０Ｄ３）（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）（１：１０００希釈）に対する抗体を用いたウエスタンブロットにより、ｉＮＯＳおよびＥＭＴ誘導因子のタンパク質レベルを決定した。β−アクチン（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ；１：２０００）をロード対照として使用した。
【図２０Ａ−Ｂ】図２０Ａ、図２０Ｂ、図２０Ｃおよび図２０Ｄは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＳＵＭ１５９細胞（３×１０６）が、雌ＳＣＩＤベージュマウス（ｎ＝１０／群）の右の乳腺脂肪パッドに注射されたことを示す。臨床関連用量レジメンは、Ｌ−ＮＭＭＡ（１日目に４００ｍｇ／ｋｇ、およびさらに４日間にわたり２００ｍｇ／ｋｇ、経口経管栄養による）および０日目のアムロジピン（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、毎日、６日間）と組み合わせる１２時間前のドセタキセル（２０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、０日目）の２サイクルからなった。ドセタキセル単独および生理食塩水（ｉ．ｐ．）＋滅菌水（経口経管栄養）を対照として使用した。Ｌ−ＮＭＭＡおよびドセタキセルの組み合わせは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＳＵＭ１５９異種移植片における腫瘍成長を減少させることができた（図２０Ａおよび図２０Ｄ）。アムロジピン（Ａｍｌｏｐｉｄｉｎｅ）は、Ｌ−ＮＭＭＡ誘導性の血圧増加を防止した（図２０Ｂ）。この用量レジメンは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１異種移植片におけるドセタキセル単独と比較して生存も改善した（図２０Ｃ）。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図２０Ｃ−Ｄ】図２０Ａ、図２０Ｂ、図２０Ｃおよび図２０Ｄは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＳＵＭ１５９細胞（３×１０６）が、雌ＳＣＩＤベージュマウス（ｎ＝１０／群）の右の乳腺脂肪パッドに注射されたことを示す。臨床関連用量レジメンは、Ｌ−ＮＭＭＡ（１日目に４００ｍｇ／ｋｇ、およびさらに４日間にわたり２００ｍｇ／ｋｇ、経口経管栄養による）および０日目のアムロジピン（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、毎日、６日間）と組み合わせる１２時間前のドセタキセル（２０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、０日目）の２サイクルからなった。ドセタキセル単独および生理食塩水（ｉ．ｐ．）＋滅菌水（経口経管栄養）を対照として使用した。Ｌ−ＮＭＭＡおよびドセタキセルの組み合わせは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＳＵＭ１５９異種移植片における腫瘍成長を減少させることができた（図２０Ａおよび図２０Ｄ）。アムロジピン（Ａｍｌｏｐｉｄｉｎｅ）は、Ｌ−ＮＭＭＡ誘導性の血圧増加を防止した（図２０Ｂ）。この用量レジメンは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１異種移植片におけるドセタキセル単独と比較して生存も改善した（図２０Ｃ）。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【発明を実施するための形態】
【００６３】
配列の簡単な説明：
配列番号１は、本発明の一態様に従った使用のための、例示的なＤＮＡオリゴヌクレオチドフォワードプライマーである。
【００６４】
配列番号２は、本発明の一態様に従った使用のための、例示的なＤＮＡオリゴヌクレオチドリバースプライマーである。
【００６５】
配列番号３は、本発明の一態様に従った使用のための、例示的なＤＮＡオリゴヌクレオチドフォワードプライマーである。
【００６６】
配列番号４は、本発明の一態様に従った使用のための、例示的なＤＮＡオリゴヌクレオチドリバースプライマーである。
【００６７】
実例的な実施形態の説明
本発明の実例的な実施形態を後述する。明確さのために、本明細書に実際の実施の全ての特色を記載している訳ではない。いずれかのかかる実際の実施形態の開発において、実施毎に変動するシステム関連およびビジネス関連の制約によるコンプライアンス等、開発者の特異的な目標を達成するための多数の実施特異的決定を為さなければならないことが当然ながら認められよう。さらに、かかる開発努力は、複雑かつ時間がかかり得るが、本開示の利益を有する当業者にとって日常的な試みであることが認められよう。
【００６８】
本発明者と共同研究者らは、幹様特性を有する乳がん細胞が、従来の治療法に対して本質的に抵抗性であったことを実証する最初のグループの１つであった。これらの初期の観察以来、他のグループは、従来の化学療法および放射線療法に対するこれらの細胞の抵抗性を確立することによりこの見解を確認した。これらおよび他の研究も、幹様細胞集団の増加が、より悪い予後に関連するという本発明者らの知見を支持した。これらの知見は、基礎臨床的意味を有する。がん治療薬の現在の開発は、大部分は、動物モデルまたは臨床治験において巨大腫瘍退縮を引き起こす能力を有する薬剤の同定に基づくが、活発に循環するまたは完全に分化した細胞を殺傷することにより腫瘍退縮を誘発する薬物に対する排他的な着目は、治療抵抗性細胞の決定的な集団を温存する可能性がある。これらの観察結果は最近、乳がんへと拡張され、本発明者は、巨大原発性腫瘍内の化学療法抵抗性細胞の亜集団が、一連の異なる適合性機構により転移する傾向を有することを示した。
【００６９】
本発明者は、患者乳がん生検材料からの腫瘍原性シグネチャーも同定し、その後、この遺伝子セットから処置抵抗性の新規標的を同定するための機能的アプローチを使用した。腫瘍原性シグネチャーにおける４７７種の遺伝子のｓｈＲＮＡノックダウンを使用して、ハイスループットマンモスフェア形成効率（ＭＳＦＥ）スクリーニングを行った。このアプローチは、２種の標的タンパク質、ＲＰＬ３９およびＭＬＦ２を同定した。ＲＰＬ３９は、精子形成およびタンパク質翻訳において提案された役割を有する、Ｘ染色体（ＸＱ２４）上に位置する６０Ｓリボソーム複合体の構成成分として以前に認識された。ＭＬＦ２は、第１２染色体上に位置し、染色体異常および細胞性防御応答に関与し得る。がんにおけるＲＰＬ３９の役割についてほとんど知られていないが、ＭＬＦ２に関してはさらに限られた知識しか利用できない。Ｓｅｒ１４４、１５２および２３８ならびに体細胞突然変異（Ｐｈｅ８０Ｃｙｓ）におけるＭＬＦ２の一連のアミノ酸修飾は、結腸直腸がんに関連付けられた。注目すべきことに、ＲＰＬ３９およびＭＬＦ２過剰発現は、細胞遊走、増殖およびマンモスフェア形成を増加させ、がんにおけるこれら２種の遺伝子の潜在的に重要な機能を示唆する。ＲＰＬ３９およびＭＬＦ２の機構の包括的な理解は、新規がん標的としてのこれら２種の遺伝子の確認に著しく必須である。Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）データベースを使用したＲＰＬ３９およびＭＬＦ２の相互排他性解析により、ＲＰＬ３９およびＭＬＦ２は、排他的に同時に生じる（ｐ＜０．００００１）ことが見いだされ、両遺伝子に共有される機構的経路を示唆する。マイクロアレイ解析を使用して、「シルデナフィル（バイアグラ）の細胞性効果」、すなわち、一酸化窒素（ＮＯ）シグナリングを、ＲＰＬ３９およびＭＬＦ２の両方を関連付けた主要経路として同定した。次に、ＲＰＬ３９およびＭＬＦ２の過剰発現によりｉＮＯＳ（誘導型一酸化窒素合成酵素）タンパク質を誘導し、ＲＰＬ３９およびＭＬＦ２のｓｉＲＮＡ（低分子干渉リボ核酸）サイレンシングによりｉＮＯＳタンパク質レベルを低下させることにより、ＮＯシグナリングの役割を確認した。文献において、乳がん生物学におけるＮＯＳシグナリングの役割は、広範に研究されていない。現在までの報告は、高いＮＯ濃度が、がん細胞に対し細胞傷害性である一方、より低いＮＯ濃度が、腫瘍成長を増強し得ることを示唆する。
【００７０】
処置抵抗性および肺転移における役割を果たす、２種の新規がん遺伝子（ＲＰＬ３９およびＭＬＦ２）が以前に同定された。ＮＯシグナリングの上方調節が、両遺伝子に共通の機構的経路であることが示された。ＬＮＭＭＡによるＮＯシグナリングの阻害は、ヒトＴＮＢＣ細胞株における処置抵抗性細胞の数および肺転移を縮小することが示された。
【００７１】
医薬品製剤
本発明の医薬品製剤は、ヒト患者への投与のために特に製剤化される、１種または複数の賦形剤、バッファーまたは希釈剤をさらに含むことができる。組成物は、１種または複数のマイクロスフェア、マイクロ粒子、ナノスフェアまたはナノ粒子をさらに任意選択で含むことができ、がん、特に乳がんのための処置を受けるヒトの１個または複数の細胞、組織、臓器または身体への投与のために製剤化することができる。
【００７２】
薬学的に許容される賦形剤および担体溶液の製剤は、例えば、経口、非経口、静脈内、鼻腔内、腫瘍内および筋肉内投与経路を限定することなく含む、種々の処置レジメンにおいて本明細書に記載されている特定の組成物を使用するための適した投薬および処置レジメンの開発と同様に、当業者に周知である。
【００７３】
典型的には、本発明のｉＮＯＳ阻害性化学療法製剤は、少なくとも約０．１％の活性化合物またはそれ超を含有するように製剤化することができるが、活性成分（複数可）のパーセンテージは、当然ながら変動し得、便宜的に、製剤全体の重量または容量の約１または２％〜約７０％または８０％またはそれ超の間であり得る。当然、各診断または治療に有用な組成物における活性化合物（複数可）の量は、診断または治療剤の適した投薬量が、本明細書に開示されている化学療法製剤のいずれか所与の単位用量で得られるような仕方で調製することができる。溶解度、バイオアベイラビリティ、生物学的半減期、投与経路、製品有効期間および他の薬理学的検討事項等の因子は、かかる医薬品製剤を調製する技術分野の当業者によって考慮され、したがって、種々の投薬量および処置レジメンが望ましくなり得る。
【００７４】
用いられている組成物の特定の量および開示されているｉＮＯＳ阻害性化学療法製剤を用いる組成物の特定の投与時間または投薬量レジメンは、本教示の利益を有する当業者の技能範囲内であろう。しかし、開示されている製剤の診断または治療有効量の投与は、かかる処置を受ける患者に所望の化学療法利益をもたらすのに有効な時間、本製剤の１または複数の用量の投与によって達成することができる可能性がある。かかる投薬レジメンは、特定の状態または患者、がんの程度等に応じて、化学療法薬の投与を監督する医師によって決定され得る。
【００７５】
典型的には、開示されている組成物における活性成分の製剤は、所与の患者の特定の治療レジメンの有効量を含有するであろう。好ましくは、製剤は、少なくとも約０．１％の各活性成分を含有することができるが、活性成分（複数可）のパーセンテージは、当然ながら変動し得、製剤全体に基づいて、約０．５〜約８０重量％もしくは容量％または約１〜約７０重量％もしくは容量％またはより好ましくは、約２〜約５０重量％もしくは容量％の量で便宜的に存在することができる。当然、活性化合物（複数可）の量は、適した投薬量が化合物のいずれか所与の単位用量で得られるような仕方で調製することができる。溶解度、バイオアベイラビリティ、生物学的ｔ１／２、投与経路、製品有効期間および他の薬理学的検討事項等の因子は、かかる医薬品製剤を調製する技術分野の当業者によって考慮され、したがって、種々の投薬量および処置レジメンが望ましくなり得る。
【００７６】
医薬の調製のための組成物
本発明の別の重要な態様は、脊椎動物の哺乳動物等、動物における様々な疾患、機能不全または欠乏の症状を処置または寛解するための医薬の調製において開示されている組成物（およびこれらを含む製剤）を使用するための方法に関係する。開示されている組成物の使用は、ヒトにおける１種または複数種類のがんの化学療法処置、特に、ヒトの女性におけるＴＮＢＣの処置において特に考慮される。
【００７７】
かかる使用は、一般に、罹患した哺乳動物におけるがんの１種または複数の症状の処置、緩和または寛解に十分な量および時間での、それを必要とする哺乳動物への、開示されているｉＮＯＳ阻害性化学療法組成物のうち１種または複数の投与を含む。
【００７８】
開示されている化学療法剤のうち１種または複数を含む医薬品製剤も、本発明の一部、特に、哺乳動物の乳がんの１種または複数の症状の治療または寛解における使用のため、特に、ヒトの女性におけるＴＮＢＣの１種または複数の症状の治療または寛解における使用のための少なくとも第１の薬学的に許容される賦形剤をさらに含む組成物を形成する。
【００７９】
化学療法薬およびその製剤
一酸化窒素（ＮＯ）は、濃度依存性腫瘍促進および抗腫瘍効果を有する、がん細胞および腫瘍内で多面的効果を示す生物活性分子である。ＮＯは、３種の異なる一酸化窒素合成酵素（ＮＯＳ）アイソフォームによって産生される：ニューロン性（ｎＮＯＳ／ＮＯＳ１）、誘導性（ｉＮＯＳ／ＮＯＳ２）および内皮（ｅＮＯＳ／ＮＯＳ３）。ｉＮＯＳ発現の増加が、乳がんならびに肺、結腸、メラノーマおよび神経膠芽腫等の他の異なるがんにおいて見出された。以前の報告は、乳がん患者における高いｉＮＯＳ発現、侵襲性および予後不良の間の相関を実証した。ｉＮＯＳ発現の増加は、最近、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、ＣＤ４４、ｃ−Ｍｙｃ（７）の誘導による、また、部分的に転写因子Ｅｔｓ−１の活性化による、基底様（ｂａｓａｌ−ｌｉｋｅ）エストロゲン受容体陰性乳がん患者における生存低下の予後因子として仮定された。本発明において、内在性ｉＮＯＳ発現の増強が、ＣＳＣ自己再生特性および腫瘍細胞遊走のモジュレーションにより腫瘍再燃および転移を促進することにより、不十分な患者生存を駆動することが仮定された。従来の化学療法と組み合わせて、内在性ｉＮＯＳの阻害が、残留ＴＮＢＣ細胞の侵襲性および間葉系特色および遠隔臓器への転移の数を低下させ、これにより、ＴＮＢＣ患者の生存を改善することがさらに仮定された。
【００８０】
次の実施例において、選択的ｉＮＯＳ阻害剤１４００Ｗ（Ｎ−［［３−（アミノメチル）フェニル］メチル］−エタンイミドアミド）、ならびに２種の汎ＮＯＳ阻害剤、Ｌ−ＮＭＭＡ（ＮＧ−モノメチル−Ｌ−アルギニン）およびＬ−ＮＡＭＥ（Ｎ５−［イミノ（ニトロアミノ）メチル］−Ｌ−オルニチンメチルエステル）を含む、異なる小分子阻害剤によるｉＮＯＳの阻害が実証された。Ｌ−ＮＭＭＡは、心原性ショックに関して数百名の患者において広範に研究されており、このことは、広範な臨床前検査の必要がなく、そのヒト臨床治験への即時変換を容易にする。
【００８１】
アムロジピン
アムロジピンは、血管平滑筋および心筋へのカルシウムイオンの膜貫通流入を阻害するジヒドロピリジンカルシウムアンタゴニストである。実験データは、アムロジピンが、ジヒドロピリジンおよび非ジヒドロピリジン結合部位の両方に結合することを示唆する。心筋および血管平滑筋の収縮過程は、特異的イオンチャネルを通ったこれらの細胞への細胞外カルシウムイオンの移動に依存する。アムロジピンは、選択的に細胞膜を横切るカルシウムイオン流入を阻害し、血管におけるより優れた効果が、治療用量でインタクトな動物において見られた。血清カルシウム濃度は、アムロジピンによって影響されない。生理的ｐＨ範囲内で、アムロジピンは、イオン化化合物（ｐＫａ＝８．６）であり、それとカルシウムチャネル受容体との動態学的相互作用は、効果の漸進的な発生をもたらす、受容体結合部位との漸進的な会合および解離速度によって特徴付けられる。
【００８２】
アムロジピンは、血管平滑筋に直接的に作用して、末梢血管抵抗性の低下および血圧の低下を引き起こす、末梢動脈血管拡張薬である。アムロジピンが狭心症を軽減する正確な機構は、十分に描写されていないが、次のものを含むと考えられる：
【００８３】
労作性狭心症：労作性狭心症患者において、アムロジピンは、心臓が働きかける総末梢抵抗性（後負荷）を低下させ、いずれか所与の運動レベルにおける心筋仕事量、よって、心筋酸素要求量を低下させる。
【００８４】
血管攣縮性狭心症：アムロジピンは、実験動物モデルおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏのヒト冠血管において、カルシウム、カリウムエピネフリン、セロトニンおよびトロンボキサンＡ２アナログに応答して、冠動脈および細動脈において狭窄を遮断し血流を回復することが実証された。この冠攣縮阻害は、血管攣縮性（プリンツメタル型または異型）狭心症におけるアムロジピンの有効性の原因となる。
【００８５】
例示的な定義
本発明に従って、ポリヌクレオチド、核酸セグメント、核酸配列その他として、人の手によって全体的にまたは部分的に天然供給源から得られる、化学合成される、修飾される、または他の仕方で調製もしくは合成される、ＤＮＡ（ゲノムまたはゲノム外ＤＮＡが挙げられ、これらに限定されない）、遺伝子、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ＲＮＡ（ｒＲＮＡ、ｍＲＮＡおよびｔＲＮＡが挙げられるがこれらに限定されない）、ヌクレオシドおよび適した核酸セグメントが挙げられるがこれらに限定されない。
【００８６】
他に規定がなければ、本明細書に使用されているあらゆる技術および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本発明の実施または検査において、本明細書に記載されているものと同様のまたは等価ないかなる方法および組成物を使用してもよいが、好ましい方法および組成物が本明細書に記載されている。本発明の目的のため、明確さおよび参照の容易さのために次の用語が下に定義されている：
【００８７】
長年にわたる特許法の慣習に従って、単語「ａ」および「ａｎ」は、特許請求の範囲を含む本願において使用される場合、「１または複数」を表す。
【００８８】
用語「約」および「およそ」は、本明細書において、互換的であり、一般に、所与の数の前後の数の範囲および列挙されている数の範囲内のあらゆる数を指すものと理解されたい（例えば、「約５〜１５」は、他に断りがなければ「約５〜約１５」を意味する）。さらに、本明細書におけるあらゆる数値範囲は、範囲内の全整数のそれぞれを含むものと理解されたい。
【００８９】
「生体適合性」は、生細胞に曝露されたときに、細胞の生存周期（ｌｉｖｉｎｇ  ｃｙｃｌｅ）の変化、細胞の増殖速度の変化または細胞傷害性効果等、細胞において望ましくない効果を引き起こすことなく、細胞の適切な細胞活性を支持するであろう材料を指す。
【００９０】
本明細書において、用語「バッファー」は、バッファーを含む溶液または組成物に酸またはアルカリが添加された際のｐＨのゆらぎに抵抗する、１種または複数の組成物またはその水溶液を含む。ｐＨ変化に対するこの抵抗性は、かかる溶液の緩衝特性によるものであり、該組成物に含まれる１種または複数の特異的化合物の機能であり得る。よって、緩衝活性を示す溶液または他の組成物は、バッファーまたはバッファー溶液と称される。バッファーは、一般に、溶液または組成物のｐＨを維持する無制限の能力を持つ訳ではなく；むしろ、典型的には、ある一定範囲内のｐＨ、例えば、約５〜７のｐＨを維持することができる。
【００９１】
本明細書において、用語「担体」は、関連する動物への投与に薬学的に許容される、または適用できる場合は、治療もしくは診断目的に許容される、いずれかの溶媒（複数可）、分散媒、コーティング（複数可）、希釈剤（複数可）、バッファー（複数可）、等張性剤（ｉｓｏｔｏｎｉｃ  ａｇｅｎｔ）（複数可）、溶液（複数可）、懸濁物（複数可）、コロイド（複数可）、不活性物質（ｉｎｅｒｔ）（複数可）その他またはこれらの組み合わせを含むことが企図される。
【００９２】
用語「有効量」は、本明細書において、疾患もしくは状態を処置もしくは寛解することができる、または他の仕方で企図される治療効果を生じることができる量を指す。
【００９３】
用語「例えば（ｆｏｒ  ｅｘａｍｐｌｅまたはｅ．ｇ．）」は、本明細書において、単なる例として、限定を企図することなく使用され、本明細書において明確に列挙されている項目のみを言うものと解釈するべきではない。
【００９４】
本明細書において、語句「処置を必要とする」は、患者が処置を必要とする（または１種もしくは複数の仕方で処置から利益を得る）という、医師または獣医師等、介護者によって下される判断を指す。かかる判断は、介護者の専門知識の分野における種々の因子に基づいて下すことができ、患者が、本明細書に表記されているもの等、１種または複数の化合物または医薬組成物によって処置できる疾患状態の結果として病気であるという知識を含むことができる。
【００９５】
本明細書において、用語「キット」は、少なくとも１セットの本発明の試薬、構成成分または薬学的に製剤化された組成物を含む、携帯式自己完結型封入物の変種を説明するために使用することができる。任意選択で、かかるキットは、例えば、研究室または臨床適用における、封入組成物の１または複数セットの使用説明書を含むことができる。
【００９６】
用語「天然に存在する」は、本明細書において、物体に適用される場合、物体が天然において見出され得るという事実を指す。例えば、天然における供給源から単離することができ、研究室において人の手で意図的に修飾されていない、生物（ウイルスを含む）に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、天然に存在する。本明細書において、古典的遺伝学に従って選択的に繁殖されてきた可能性がある研究室の齧歯類系統は、天然に存在する動物とみなされる。
【００９７】
本明細書において、用語「核酸」は、ポリデオキシリボヌクレオチド（２−デオキシ−Ｄ−リボースを含有）、ポリリボヌクレオチド（Ｄ−リボースを含有）、およびプリンもしくはピリミジン塩基のＮ−グリコシドまたは修飾プリンもしくはピリミジン塩基（脱塩基部位を含む）である他のいずれかの種類のポリヌクレオチドのうち１または複数種類を含む。用語「核酸」は、本明細書において、典型的には、サブユニット間のホスホジエステル結合によって、場合によっては、ホスホロチオエート、メチルホスホネートその他によって共有結合した、リボヌクレオシドまたはデオキシリボヌクレオシドのポリマーも含む。「核酸」は、一本および二本鎖ＤＮＡならびに一本および二本鎖ＲＮＡを含む。例示的な核酸は、ｇＤＮＡ；ｈｎＲＮＡ；ｍＲＮＡ；ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎＯＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）および小分子（ｓｍａｌｌ  ｔｅｍｐｏｒａｌ）ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）その他ならびにこれらのいずれかの組み合わせを限定することなく含む。
【００９８】
本明細書において、用語「患者」（「レシピエント」、「宿主」または「被験体」とも互換的に称される）は、本明細書で述べられている血管アクセス装置のうち１種または複数のためのレシピエントとして機能することができるいずれかの宿主を指す。ある特定の態様において、レシピエントは、いずれかの動物種（好ましくは、人類等の哺乳動物種）を表すことが企図される脊椎動物となるであろう。ある特定の実施形態において、「患者」は、飼育された家畜、群集性（ｈｅｒｄｉｎｇ）または移動性の動物または鳥類、エキゾチックまたは動物学的標本およびコンパニオンアニマル、ペット、および獣医学専門家のケア下のいずれかの動物を限定することなく含む、ヒトおよび非ヒト霊長類、鳥類、爬虫類、両生類、ウシ、イヌ、ヤギ、キャビン（ｃａｖｉｎｅ）、カラス、エピン（ｅｐｉｎｅ）、ウマ、ネコ、ヤギ、ウサギ（ｌａｐｉｎｅ）、ウサギ（ｌｅｐｏｒｉｎｅ）、オオカミ、マウス、ヒツジ、ブタ、ラシン（ｒａｃｉｎｅ）、キツネその他が挙げられるがこれらに限定されない、いずれかの動物宿主を指す。
【００９９】
語句「薬学的に許容される」は、ヒトに投与されたときに、特に、ヒトの眼に投与されたときに、アレルギー性または同様の有害反応を生じない分子実体および組成物を指す。活性成分としてタンパク質を含有する水性組成物の調製は、本技術分野で十分に理解されている。典型的には、かかる組成物は、液体の溶液または懸濁物のいずれかとして、注射剤として調製される。あるいは、これらは、注射前の液体中の溶液または懸濁物に適した固体形態で調製することができる。
【０１００】
本明細書において、「薬学的に許容される塩」は、親化合物の所望の生物学的活性を保持し、いかなる望まれない毒物学的効果も付与しない塩を指す。かかる塩の例として、無機酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸その他により生成される酸付加塩；および有機酸、例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パモ（ｐａｍｏｉｃ）（エンボン（ｅｍｂｏｎｉｃ））酸、アルギン酸、ナフトエ酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ポリガラクツロン酸等により生成される塩；亜鉛、カルシウム、ビスマス、バリウム、マグネシウム、アルミニウム、銅、コバルト、ニッケル、カドミウムその他等、多価金属カチオンを有する塩；Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミンまたはエチレンジアミンから生成される有機カチオンにより生成される塩；ならびにこれらの組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１０１】
本明細書において、用語「ポリペプチド」は、単数の「ポリペプチド」および複数の「ポリペプチド」を包含することが企図され、２個またはそれを超えるアミノ酸のいずれかの鎖（単数または複数）を含む。よって、本明細書において、「ペプチド」、「ジペプチド」、「トリペプチド」、「タンパク質」、「酵素」、「アミノ酸鎖」および「連続するアミノ酸配列」が挙げられるがこれらに限定されない用語は全て、「ポリペプチド」の定義内に包含され、用語「ポリペプチド」は、これらの用語のいずれかの代わりにまたはそれと互換的に使用することができる。この用語は、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、誘導体化、タンパク質分解切断、翻訳後プロセシングまたは１個もしくは複数の天然に存在しないアミノ酸の包含による修飾が挙げられるがこれらに限定されない、１種または複数の翻訳後修飾を受けたポリペプチドをさらに含む。従来の命名法が、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド構造の技術分野に存在する。例えば、１文字および３文字略語が、アミノ酸を記載するために広く用いられている：アラニン（Ａ；Ａｌａ）、アルギニン（Ｒ；Ａｒｇ）、アスパラギン（Ｎ；Ａｓｎ）、アスパラギン酸（Ｄ；Ａｓｐ）、システイン（Ｃ；Ｃｙｓ）、グルタミン（Ｑ；Ｇｌｎ）、グルタミン酸（Ｅ；Ｇｌｕ）、グリシン（Ｇ；Ｇｌｙ）、ヒスチジン（Ｈ；Ｈｉｓ）、イソロイシン（Ｉ；Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌ；Ｌｅｕ）、メチオニン（Ｍ；Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｆ；Ｐｈｅ）、プロリン（Ｐ；Ｐｒｏ）、セリン（Ｓ；Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔ；Ｔｈｒ）、トリプトファン（Ｗ；Ｔｒｐ）、チロシン（Ｙ；Ｔｙｒ）、バリン（Ｖ；Ｖａｌ）およびリシン（Ｋ；Ｌｙｓ）。本明細書に記載されているアミノ酸残基は、「Ｌ」異性体型であることが好ましい。しかし、ポリペプチドの所望の特性が保持されるのであれば、「Ｄ」異性体型の残基を、任意のＬ−アミノ酸残基の代わりに使用することができる。
【０１０２】
本明細書において、用語「防止する」、「防止すること」、「防止」、「抑制する」、「抑制すること」および「抑制」は、本明細書において、疾患状態のいずれかの症状、側面または特徴を防止するための、疾患状態の臨床症状の発生に先立つ、単独での、または医薬組成物に含有された化合物の投与を指す。かかる防止および抑制は、医学的に有用であるとみなされるために絶対的である必要はない。
【０１０３】
「タンパク質」は、「ペプチド」および「ポリペプチド」と互換的に本明細書において使用されており、合成的に、組換えにより、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏで産生されたペプチドおよびポリペプチドの両方、ならびに核酸配列が宿主動物またはヒト被験体に投与された後にｉｎ  ｖｉｖｏで発現されたペプチドおよびポリペプチドを含む。用語「ポリペプチド」は、好ましくは、約２〜約２０アミノ酸残基の長さの短いペプチド、約１０〜約１００アミノ酸残基の長さのオリゴペプチドおよび約１００アミノ酸残基またはそれを超える長さを含むより長いポリペプチドの長さを含む、いずれかのアミノ酸鎖の長さを指すことが企図される。さらに、この用語は、酵素、すなわち、少なくとも１個のアミノ酸ポリマーを含む機能的生体分子を含むことも企図される。本発明のポリペプチドおよびタンパク質は、翻訳後修飾されるまたはされたポリペプチドおよびタンパク質も含み、骨格アミノ酸鎖に付加されたいずれかの糖または他の誘導体（複数可）またはコンジュゲート（複数可）を含む。
【０１０４】
「精製された」は、本明細書において、多くの他の化合物または実体から分離されたことを意味する。化合物または実体は、部分的に精製されても、実質的に精製されても、または純粋であってもよい。化合物または実体は、実質的にあらゆる他の化合物または実体から除去された場合に、すなわち、好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９％を超えて純粋である場合に、純粋であるとみなされる。部分的にまたは実質的に精製された化合物または実体は、これが天然に見出される材料、例えば、細胞タンパク質および／または核酸等の細胞材料の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％または少なくとも８０％から除去され得る。
【０１０５】
用語「被験体」は、本明細書において、本発明に係る組成物による処置を提供することができる、霊長類等の哺乳動物を含む生物を説明する。開示されている処置方法から利益を得ることができる哺乳動物種として、類人猿；チンパンジー；オランウータン；ヒト；サル；イヌおよびネコ等、飼育動物；ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギおよびニワトリ等、家畜；ならびにマウス、ラット、モルモットおよびハムスター等、他の動物が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１０６】
本明細書において、構成成分の量に関連した用語「実質的に含まない」または「本質的に含まない」は、好ましくは、約１０重量パーセント未満、好ましくは約５重量パーセント未満、より好ましくは約１重量パーセント未満の化合物を含有する組成物を指す。好ましい実施形態において、これらの用語は、約０．５重量パーセント未満、約０．１重量パーセント未満または約０．０１重量パーセント未満を指す。
【０１０７】
本明細書において、用語「プラスミド」または「ベクター」は、遺伝物質（すなわち、核酸）で構成された遺伝的構築物を指す。典型的には、プラスミドまたはベクターは、細菌宿主細胞、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉにおいて機能的である複製起点と、プラスミドを含んでいる細菌宿主細胞を検出するための選択可能マーカーとを含有する。本発明のプラスミドおよびベクターは、適した発現細胞において挿入されたコード配列が転写および翻訳され得るように配置された、本明細書に記載されている１種または複数の遺伝的エレメントを含むことができる。加えて、プラスミドまたはベクターは、１種または複数の天然および／または人工供給源から得られるまたはこれに由来するセグメントを含む、１種または複数の核酸セグメント、遺伝子、プロモーター、エンハンサー、アクチベーター、多重クローニング領域またはこれらのいずれかの組み合わせを含むことができる。
【０１０８】
用語「本質的に配列番号Ｘに表記されている配列」は、該配列が、配列番号Ｘの一部に実質的に対応し、配列番号Ｘのヌクレオチド（またはアミノ酸）と同一ではなく、またその生物学的な機能上の等価物でもないヌクレオチド（またはポリペプチド配列の場合はアミノ酸）を比較的少数有することを意味する。用語「生物学的な機能上の等価物」は、本技術分野で十分に理解されており、本明細書において詳細にさらに定義されている。したがって、本明細書に提供されるヌクレオチド配列のうち１種または複数と同一または機能的に等価であるヌクレオチドの約８５％〜約９０％；またはより好ましくは約９１％〜約９５％；またはさらにより好ましくは約９６％〜約９９％を有する配列が、本発明の実施において有用であると特に考えられる。
【０１０９】
本発明に適した標準ハイブリダイゼーション条件は、例えば、５０％ホルムアミド、５×デンハルト溶液、５×ＳＳＣ、２５ｍＭリン酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡにおける４２℃で１６時間のハイブリダイゼーションに続く、所望の量のバックグラウンドシグナルを除去するための６０℃の０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液による１時間の逐次的洗浄を含む。本発明のためのより低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、例えば、３５％ホルムアミド、５×デンハルト溶液、５×ＳＳＣ、２５ｍＭリン酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡまたはＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡにおける４２℃で１６時間のハイブリダイゼーションに続く、５５℃の０．８×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳによる逐次的洗浄を含む。当業者であれば、条件を容易に調整して、所望のレベルのストリンジェンシーを得ることができることを認識するであろう。
【０１１０】
当然、本発明は、本明細書において特に表記されている特異的ヌクレオチド配列のうち少なくとも１種または複数と相補的、本質的に相補的および／または実質的に相補的である核酸セグメントも包含する。「相補的」である核酸配列は、標準ワトソン・クリックの相補性の法則に従って塩基対形成することができる核酸配列である。本明細書において、用語「相補的な配列」は、上に表記されている同じヌクレオチド比較によって評価することができる、または直ぐ上に記載されている条件等、比較的ストリンジェントな条件下で本明細書に開示されている特異的核酸セグメントのうち１種もしくは複数とハイブリダイズすることができると定義される、実質的に相補的である核酸配列を意味する。
【０１１１】
上述の通り、本発明のプローブおよびプライマーは、いかなる長さのものであってもよい。例えば、第１の残基は１、第２の残基は２などのように、配列に数値を割り当てることにより、所与の配列内に含有されるあらゆるプローブまたはプライマーを定義するアルゴリズムを提案することができる：
ｎ〜ｎ＋ｙ（式中、ｎは、１から配列の最後の数までの整数であり、ｙは、プローブまたはプライマーの長さマイナス１であり、ｎ＋ｙは、配列の最後の数を超えない）。よって、２５塩基対のプローブまたはプライマー（すなわち、「２５−ｍｅｒ」）に関して、プローブまたはプライマーのコレクションは、配列の長さ全体にわたる、塩基１〜２５、塩基２〜２６、塩基３〜２７、塩基４〜２８等に対応する。同様に、３５塩基対プローブまたはプライマー（すなわち、「３５−ｍｅｒ」）に関して、例示的なプライマーまたはプローブ配列は、配列の長さ全体にわたる、塩基１〜３５、塩基２〜３６、塩基３〜３７、塩基４〜３８等に対応する配列を限定することなく含む。同様に、４０−ｍｅｒに関して、かかるプローブまたはプライマーは、第１の塩基対〜ｂｐ４０、配列の第２のｂｐ〜ｂｐ４１、第３のｂｐ〜ｂｐ４２等のヌクレオチドに対応し得る一方、５０−ｍｅｒに関して、かかるプローブまたはプライマーは、ｂｐ１〜ｂｐ５０、ｂｐ２〜ｂｐ５１、ｂｐ３〜ｂｐ５２、ｂｐ４〜ｂｐ５３等へと拡張するヌクレオチド配列に対応し得る。「処置すること」または「の処置」は、本明細書において、被験体へのいずれかの種類の医学的または外科的管理の提供を指す。処置することとして、被験体への治療剤を含む組成物の投与を挙げることができるがこれに限定されない。「処置すること」は、疾患、障害もしくは状態または疾患、障害もしくは状態の１種もしくは複数の症状もしくは症状発現の治癒、反転、軽減、その重症度の低下、その進行の阻害またはその見込みの低下等の目的のための、被験体への本発明の化合物または組成物のいずれかの投与または適用を含む。ある特定の態様において、本発明の組成物は、予防的に、すなわち、状態のいずれかの症状または症状発現の発症前に投与することもでき、かかる予防が保証されている。典型的には、このような場合、被験体は、その後にかかる疾患または障害を発症する傾向の指標となる、家族歴、診療記録または１種もしくは複数の診断もしくは予後検査の完了のいずれかの結果として、かかる疾患または障害を発症する「リスクがある」と診断された被験体であろう。
【０１１２】
用語「治療的に実用的な期間」は、活性薬剤が治療的に有効となるために必要な期間を意味する。用語「治療的に有効」は、症状の重症度および／または頻度の低下、症状および／または根底にある原因の排除、症状および／またはその根底にある原因の出現の防止、ならびに損傷の改善または矯正を指す。
【０１１３】
「治療剤」は、被験体の標的化部位において所望の生物学的効果を生じることができる、いずれかの生理的または薬理学的活性物質であり得る。治療剤は、天然に存在するまたは合成もしくは組換え方法によって産生される、またはこれらのいずれかの組み合わせであり得る、化学療法剤、免疫抑制剤、サイトカイン、細胞傷害剤、核酸分解化合物（ｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）、放射性同位元素、受容体およびプロドラッグ活性化酵素であり得る。ビンカアルカロイド（例えば、ビンブラスチンおよびビンクリスチン）、アントラサイクリン（例えば、ドキソルビシンおよびダウノルビシン）、ＲＮＡ転写阻害剤（例えば、アクチノマイシン−Ｄ）および微小管安定化薬（例えば、パクリタキセル）等、古典的多剤抵抗性によって影響される薬物は、治療剤として特定の有用性を有することができる。サイトカインを治療剤として使用することもできる。かかるサイトカインの例は、リンホカイン、モノカインおよび伝統的ポリペプチドホルモンである。がん化学療法剤は、好ましい治療剤であり得る。抗がん剤および他の治療剤のより詳細な説明に関しては、当業者であれば、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  Ｄｅｓｋ  ＲｅｆｅｒｅｎｃｅおよびＧｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ「Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ
Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」第１０版、Ｈａｒｄｍａｎら編、２００１年が挙げられるがこれに限定されない、いくつもの指示マニュアルを参照する。
【０１１４】
「転写調節エレメント」は、単独で、または１種もしくは複数の他の核酸配列と組み合わせて転写を活性化するポリヌクレオチド配列を指す。転写調節エレメントは、例えば、１種もしくは複数のプロモーター、１種もしくは複数の応答エレメント、１種もしくは複数の負の調節エレメントおよび／または１種もしくは複数のエンハンサーを含むことができる。
【０１１５】
本明細書において、「転写因子認識部位」および「転写因子結合部位」は、しばしば直接的なタンパク質−ＤＮＡ結合の形態を採る、１種または複数の転写因子の配列特異的相互作用のための部位であると同定されるポリヌクレオチド配列（複数可）または配列モチーフ（複数可）を指す。典型的には、転写因子結合部位は、ＤＮＡフットプリンティング、ゲル移動度シフトアッセイその他によって同定することができ、および／または公知のコンセンサス配列モチーフに基づいてもしくは当業者に公知の他の方法によって予測することができる。
【０１１６】
「転写単位」は、少なくとも第１のシス作用性プロモーター配列に作動可能に連結され、任意選択で、構造遺伝子配列の効率的な転写に必要な１種または複数の他のシス作用性核酸配列に作動可能に連結された少なくとも第１の構造遺伝子と、プロモーターおよび／またはエンハンサーエレメントの制御下において作動可能に配置された構造遺伝子配列の適切な組織特異的および発生的転写に必要とされ得る、少なくとも第１の遠位調節エレメントと、効率的な転写および翻訳に必要ないずれか追加的なシス配列（例えば、ポリアデニル化部位（複数可）、ｍＲＮＡ安定性制御配列（複数可））等とを含むポリヌクレオチド配列を指す。
【０１１７】
用語「実質的に相補的」は、アミノ酸または核酸配列のいずれかを定義するために使用される場合、特定の対象配列、例えば、オリゴヌクレオチド配列が、選択された配列の全体または一部と実質的に相補的であり、よって、該選択された配列をコードするｍＲＮＡの一部に特異的に結合するであろうことを意味する。したがって、典型的に、配列は、ｍＲＮＡ「標的」配列と高度に相補的となり、配列の相補的な部分を通して約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９または約１０塩基など以下のミスマッチを有するであろう。多くの場合、配列が、正確なマッチになること、すなわち、オリゴヌクレオチドが特異的に結合する配列と完全に相補的となること、したがって、相補的ストレッチに沿ってミスマッチがないことが望ましくなり得る。したがって、高度に相補的な配列は、典型的に、ｍＲＮＡの標的配列領域に極めて特異的に結合し、したがって、標的ｍＲＮＡ配列のポリペプチド産物への翻訳の低下および／またはさらには阻害において高度に効率的となるであろう。
【０１１８】
実質的に相補的な核酸配列は、該核酸が特異的に結合する対応する核酸標的配列に対し約８０パーセントを超えて相補的（または「％正確なマッチ」）、より好ましくは、該核酸が特異的に結合する対応する標的配列に対し約８５パーセントを超えて相補的となるであろう。ある特定の態様において、上述の通り、本発明の実施における使用のために、さらにより実質的に相補的な核酸配列を有することが望ましくなり、かかる事例において、核酸配列は、該核酸が特異的に結合する対応する標的配列に対し約９０パーセントを超えて相補的となり、ある特定の実施形態において、該核酸が特異的に結合する対応する標的配列に対し約９５パーセントを超えて相補的であり得、さらには最大で、設計された核酸が特異的に結合する標的配列の全体または一部に対し約９６％、約９７％、約９８％、約９９％さらには約１００％を含む正確なマッチで相補的であり得る。
【０１１９】
開示されている核酸配列のいずれかのパーセント類似性またはパーセント相補性は、例えば、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＵＷＧＣＧ）から入手できるＧＡＰコンピュータプログラム、バージョン６．０を使用して配列情報を比較することにより決定することができる。ＧＡＰプログラムは、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（１９７０年）のアライメント方法を利用する。簡潔に説明すると、ＧＡＰプログラムは、２つの配列のうち短い方における記号（すなわち、ヌクレオチドまたはアミノ酸）の総数で割った、同様である整列された記号の数として類似性を定義する。ＧＡＰプログラムの好ましいデフォルトパラメータは、次のものを含む：（１）ヌクレオチドのための単項比較マトリクス（同一性に対し１、非同一性に対し０の値を含有）ならびにＧｒｉｂｓｋｏｖおよびＢｕｒｇｅｓｓ（１９８６年）の重み付き比較マトリクス、（２）ギャップ毎に３．０のペナルティおよび各ギャップにおける記号毎に追加的な０．１０ペナルティ；ならびに（３）末端ギャップに対しペナルティなし。
【０１２０】
本明細書において、用語「形質転換された細胞」は、該細胞への１種または複数の外来性ポリヌクレオチドの導入によってその核酸相補体が変更された宿主細胞を意味することが企図される。
【０１２１】
本明細書において、用語「形質転換」は、宿主細胞またはプロトプラストへと外来性ポリヌクレオチド配列（例えば、ウイルスベクター、プラスミドまたは組換えＤＮＡもしくはＲＮＡ分子）を導入する過程を一般に説明することが企図され、該外来性ポリヌクレオチドは、少なくとも第１の染色体に取り込まれる、または形質転換された宿主細胞内で自律的複製ができる。トランスフェクション、エレクトロポレーションおよび「ネイキッド」核酸取り込みは全て、１種または複数のポリヌクレオチドによる宿主細胞の形質転換に使用される技法の例を表す。
【０１２２】
本明細書において、用語「処置する」、「処置すること」および「処置」は、疾患状態のいずれかの症状、側面または特徴を低下または排除するための、疾患状態の臨床症状の発生後の、１種または複数の化合物（単独で、または１種もしくは複数の医薬組成物に含有されて）の投与を指す。かかる処置は、医学的に有用であるとみなされるために絶対的である必要はない。したがって、用語「処置」、「処置する」、「処置された」または「処置すること」は、その発症が、患者を苦しめる前であれ後であれ、その１種または複数の症状の治療、または疾患の程度もしくは重症度の寛解もしくは低下を指すことができる。
【０１２３】
ある特定の実施形態において、ハイブリダイゼーションアッセイにおける所与の標的配列の存在の決定において標識されたポリヌクレオチドプローブを用いる場合等、適切な検出可能マーカー（すなわち、「標識」）と組み合わせて、本発明の１種または複数の核酸セグメントを用いることが有利となるであろう。適したアッセイにおいて検出することができる、アビジン／ビオチン等、蛍光、放射性、酵素または他のリガンドを限定することなく含む、オリゴヌクレオチドプローブを標識するための、多種多様な適切な指標化合物および組成物が本技術分野で公知である。特定の実施形態において、放射性または他の環境に望ましくない試薬の代わりに、ウレアーゼ、アルカリホスファターゼまたはペルオキシダーゼ等、１種または複数の蛍光標識または酵素タグを用いることもできる。酵素タグの場合、ヒトの眼に見える試料を検出するための方法、または１種もしくは複数の相補的もしくは実質的に相補的な核酸配列を含有する試料との特異的ハイブリダイゼーションを同定するためのシンチグラフィー、蛍光定量法、分光光度法その他等の分析方法を提供するために用いることができる、比色分析的、色素形成的または蛍光発生的指標基質が公知である。２種またはそれを超える標識プローブが同時にまたは逐次的に検出されるいわゆる「マルチプレックス化」アッセイの場合、第１のオリゴヌクレオチドプローブを、第１の検出特性またはパラメータ（例えば、発光および／または励起スペクトル最大）を有する第１の標識で標識することが望ましい場合があり、これはまた、第２のオリゴヌクレオチドプローブを、第１の標識とは異なる（すなわち、別々のまたは識別可能な）第２の検出特性またはパラメータを有する第２の標識で標識した。特に、遺伝的増幅／検出プロトコールの文脈におけるマルチプレックス化アッセイの使用は、分子遺伝学技術分野の当業者に周知である。
【０１２４】
全体を通して使用されているセクション表題は、単なる構成上の目的のものであり、記載されている主題を限定するものと解釈するべきではない。特許、特許出願、論文、本および専門書が挙げられるがこれらに限定されない、本願に引用されているあらゆる文書または文書の一部は、あらゆる目的のため、それらの全体が参照により、これにより明確に本明細書に組み込まれる。組み込まれた文献および同様の資料のうち１種または複数が、本願における用語の定義とは矛盾する様式でその用語を定義する場合、本願を優先する。
【実施例】
【０１２５】
次の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含まれている。当業者であれば、次の実施例において開示されている技法が、本発明の実施において十分に機能することが本発明者によって発見された技法を表し、よって、その実施に好ましい様式を構成すると考えることができることを認めるべきである。しかし、当業者であれば、本開示を踏まえて、多くの変更が、開示されている特異的な実施形態において行われてもよく、依然として、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、類似または同様の結果を得ることができることを認めるべきである。
【０１２６】
（実施例１）
ＴＮＢＣに対する有効な標的化治療としてのｉＮＯＳ阻害
【０１２７】
上に記す通り、ＴＮＢＣは、有効な標的化治療がない、乳がんの侵襲性形態である。ｉＮＯＳは、腫瘍の侵襲性を増加させることにより、乳がん患者における不十分な生存に関連する。内在性ｉＮＯＳの阻害が、上皮間葉転換（ＥＭＴ）誘導因子のモジュレーションにより腫瘍惹起および転移を低下させることにより、ＴＮＢＣの侵襲性を減少させることが仮定された。
【０１２８】
本実施例は、ＴＮＢＣの標的化治療としてのｉＮＯＳ阻害剤の使用について記載する。８３種のヒトＴＮＢＣ組織においてｉＮＯＳタンパク質レベルを決定したところ、臨床転帰と相関した。ｉＮＯＳ阻害後に、増殖、マンモスフェア形成効率、遊走、ＥＭＴ転写因子をｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価した。内在性ｉＮＯＳ標的化を、ＴＮＢＣマウスモデルにおける潜在的な治療として評価した。
【０１２９】
遺伝子発現および免疫組織化学的解析により、高い内在性ｉＮＯＳ発現は、ＴＮＢＣ患者におけるより悪い予後に関連した。選択的ｉＮＯＳ（１４００Ｗ）および汎ＮＯＳ（Ｌ−ＮＭＭＡおよびＬ−ＮＡＭＥ）阻害剤は、ＥＭＴ転写因子（Ｓｎａｉｌ、Ｓｌｕｇ、Ｔｗｉｓｔ１およびＺｅｂ１）の阻害と共に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞増殖、ＣＳＣ自己再生および細胞遊走を縮小した。ＨＩＦ１α、小胞体ストレス（ＩＲＥ１α／ＸＢＰ１）ならびにＡＴＦ４／ＡＴＦ３およびＴＧＦβの間のクロストークの障害が観察された。ｉＮＯＳ阻害は、腫瘍成長を有意に低下させ、細胞増殖を減少させ、肺転移の数ならびに腫瘍惹起および自己再生能力を低下させた。ＴＮＢＣにおける腫瘍成長の減少および生存率の増強におけるＬ−ＮＭＭＡの成功に基づき、本発明者は、抗がん治療薬としての、全般にｉＮＯＳ阻害剤および特に汎ＮＯＳ阻害剤Ｌ−ＮＭＭＡ（これは心原性ショックのために既に広範に調査されている）に再度目的化することにより、有効な標的化治療レジメンを提案する。
【０１３０】
材料と方法
【０１３１】
Ｏｎｃｏｍｉｎｅ遺伝子発現データ解析。Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）データベース（ｎ＝５９３）のＯｎｃｏｍｉｎｅがんマイクロアレイデータベース解析により、ヒトのトリプルネガティブ乳がんにおけるＮＯＳ２  ｍＲＮＡ発現の相対レベルを調査した。２種の異なる遺伝子発現データセットの患者生存解析を得た。
【０１３２】
細胞培養。それぞれアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）およびＡｓｔｅｒａｎｄから、間葉系様トリプルネガティブ乳がん細胞株、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＳＵＭ１５９を購入した。他に指定がなければ、１４００Ｗ（０．１、１、１０、１００μＭ；１、２、４ｍＭ）、Ｌ−ＮＭＭＡ（０．１、１、１０、１００μＭ；１、２、４ｍＭ）またはＬ−ＮＡＭＥ（０．１、１、１０、１００μＭ；１、２、５ｍＭ）のいずれかで９６時間、細胞を毎日処置した。マンモスフェア形成効率（ＭＳＦＥ）、細胞増殖および遊走アッセイについて詳細に後述する。
【０１３３】
免疫組織化学的検査。ヒト患者、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＳＵＭ１５９同所性腫瘍組織のパラフィン包埋切片を、抗ｉＮＯＳ（１：５０希釈）または抗Ｋｉ６７（１：１００希釈）抗体のいずれかと共にインキュベートした。スライドをヘマトキシリンで対比染色した。追加的な情報は、下に含まれている。
【０１３４】
動物研究。標準研究室条件（２２℃；１２時間／１２時間の明／暗サイクルならびに食物および水に対する自由な利用）下に、雌ＳＣＩＤベージュマウス（４〜５週齢）を収容した。施設および連邦政府承認の実験動物の管理と使用（Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ）に関する指針を使用して、全動物手順および実験プロトコールを実行した。詳細な情報について後述する。
【０１３５】
統計解析。データは、平均±ＳＥＭとして示す。０．０５未満のｐ値を有意であるとみなした。
【０１３６】
試薬。Ｎ−［［３−（アミノメチル）フェニル］メチル］−エタンイミドアミド（１４００Ｗ）およびＮ５−［イミノ（ニトロアミノ）メチル］−Ｌ−オルニチンメチルエステル（Ｌ−ＮＡＭＥ）をＣａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌから購入した。チルアルギニン（ｔｉｌａｒｇｉｎｉｎｅ）（ＮＧ−モノメチル−Ｌ−アルギニン）（Ｌ−ＮＭＭＡ）は、Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ製であり、Ａｒｇｉｎｏｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓのご厚意によって供給された。ツニカマイシンおよび組換えヒトＴＧＦ−β１（ＣＨＯ細胞由来）は、それぞれＡｂｃａｍおよびＰｅｐｒｏｔｅｃｈから得た。抗ｉＮＯＳ（Ｎ−２０）、抗ｅＮＯＳ（Ｃ−２０）、抗ｎＮＯＳ（Ｒ−２０）、抗Ｔｗｉｓｔ１（Ｌ−２１）、抗Ｔｗｉｓｔ１（２Ｃ１ａ）、抗ＡＴＦ３（Ｃ−１９）および抗ＣＲＥＢ−２（Ｃ−２０）（ＡＴＦ４）抗体は、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．製であった。抗体、抗Ｓｎａｉｌ（Ｃ１５Ｄ３）、抗Ｓｌｕｇ（Ｃ１９Ｇ７）、抗ＴＣＦ８／Ｚｅｂ１（Ｄ８０Ｄ３）、抗ＰＥＲＫ（Ｃ３３Ｅ１０）、抗ＴＧＦβ、抗ホスホＳｍａｄ２（Ｓｅｒ４６５／４６７）／Ｓｍａｄ３（Ｓｅｒ４２３／４２５）（Ｄ６Ｇ１０）、抗Ｓｍａｄ２／３、抗ＩＲＥ１α（１４Ｃ１０）、抗ホスホＰＥＲＫ（Ｔｈｒ９８０）（１６Ｆ８）、抗ＰＥＲＫ（Ｃ３３Ｅ１０）、抗ホスホｅＩＦ２α（Ｓｅｒ５１）（１１９Ａ１１）、抗ｅＩＦ２α、抗β−アクチン（１３Ｅ５）、抗ウサギおよび抗マウスＩｇＧ（ＨＲＰに連結）は、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．から得た。抗ＨＩＦ１α（ＥＰ１２１５Ｙ）はＡｂｃａｍ製であった。免疫組織化学的検査に関して、抗Ｋｉ６７（ＳＰ６）はＡｂｃａｍ製であり、抗ｉＮＯＳ（Ｋ１３−Ａ）はＮｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓから購入し、抗切断型カスパーゼ−３（Ａｓｐ１７５）はＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ製であった。ＸＢＰ１およびβ−アクチンのＰＣＲプライマーは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製であった。マウス抗ヒトＣＤ２４−ＦＩＴＣ（クローンＭＬ５）およびマウス抗ヒトＣＤ４４−ＡＰＣ（クローンＧ４４−２６）は、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製であった。抗マウスＭＨＣクラスＩ（Ｈ−２Ｋｄ）−ＰＥ（クローンＳＦ１−１．１．１）は、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製であった。
【０１３７】
細胞培養およびマンモスフェア形成効率アッセイ。間葉系様トリプルネガティブ乳がん細胞株、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＳＵＭ１５９（それぞれアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関およびＡｓｔｅｒａｎｄから購入）は、それらのＥＭＴマーカー高発現、転移特性、ＣＤ４４＋／ＣＤ２４−細胞のパーセンテージ（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１：ほぼ８０〜９０％；ＳＵＭ１５９：ほぼ４０〜５０％）およびｉＮＯＳタンパク質レベルに基づき選択された。１０％ウシ胎仔血清（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および１％抗生物質−抗真菌薬（Ｇｉｂｃｏ）を補充したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｇｉｂｃｏ）において細胞を成長させた。ｉＮＯＳ阻害剤（１４００Ｗ、Ｌ−ＮＭＭＡおよびＬ−ＮＡＭＥ）のストック溶液を１×ＰＢＳにおいて作製した。細胞への添加に先立ち、細胞培養培地において阻害剤をさらに希釈した。他に指定がなければ、１４００Ｗ（０．１、１、１０、１００μＭ；１、２、４ｍＭ）、Ｌ−ＮＭＭＡ（０．１、１、１０、１００μＭ；１、２、４ｍＭ）またはＬ−ＮＡＭＥ（０．１、１、１０、１００μＭ；１、２、５ｍＭ）のいずれかにより９６時間、細胞を毎日処置した。マンモスフェア形成効率（ＭＳＦＥ）アッセイのため、２，０００（ＳＵＭ１５９）および５，０００（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）個の細胞／ウェルを、０．５％メチルセルロース（ＭｅｔｈｏＣｕｌｔ  Ｈ４１００、ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ならびに１０％ＭａｍｍｏＣｕｌｔ増殖サプリメント、４μｇ／ｍＬヘパリンおよび０．４８μｇ／ｍＬヒドロコルチゾン（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補充したＭａｍｍｏＣｕｌｔ基本培地において培養した。１、２および４ｍＭ（１４００ＷおよびＬ−ＮＭＭＡ）または１、２および５ｍＭ  Ｌ−ＮＡＭＥのいずれかによる９６時間の処置後に、一次マンモスフェア（ＭＳ）を、コロニーカウンター（ＧｅｌＣｏｕｎｔ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｏｐｔｒｏｎｉｃｘ）を使用してスキャンおよび計数した。マンモスフェア数を細胞数で割ることにより、一次ＭＳＦＥを評価した。一次ＭＳのトリプシン処置後に、処置なしで、０．５％メチルセルロースおよびマンモスフェア培地（上述の通り）において単一細胞を成長させた。二次ＭＳをスキャン、計数し、二次ＭＳＦＥを評価した。肺転移のマウスモデルのため、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、ルシフェラーゼ／ＧＦＰに基づく二重レポータープラスミドでトランスフェクトし、安定的クローン（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１  Ｌ／Ｇ）を１ｍｇ／ｍＬブラストサイジン（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）により選択した。
【０１３８】
細胞増殖アッセイ。細胞増殖におけるｉＮＯＳ阻害の効果をＷＳＴ−１方法によりアッセイした。簡潔に説明すると、５００（ＳＵＭ１５９）および１，０００（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）個の細胞／ウェルを９６ウェルプレートに蒔き、１、２および４ｍＭ（１４００ＷおよびＬ−ＮＭＭＡ）または１、２および５ｍＭ  Ｌ−ＮＡＭＥのいずれかで９６時間処置した。予め混合したＷＳＴ−１試薬（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を添加することにより、増殖速度を決定した。３７℃で３時間のインキュベーション後に、４５０ｎｍの吸光度を読み取った（参照波長６９０ｎｍ）。
【０１３９】
細胞遊走能力。「創傷治癒アッセイ」により細胞遊走を決定した。簡潔に説明すると、３×１０５個の細胞／ウェルを、コンフルエンスになるまで６ウェルプレートにおいて成長させた。単層における細胞を、飢餓条件下（１％血清）で７２時間、異なる濃度の１４００Ｗ、Ｌ−ＮＭＭＡおよびＬ−ＮＡＭＥで処置した。細胞増殖における影響を回避するために、低血清培地を、阻害剤の存在下の通常の成長培地によって２４時間にわたり交換した（合計９６時間）。続いて、１００μＬピペットチップを用いて細胞単層に「創傷」を作製した。画像を０時間目に撮影し、細胞に創傷を１２時間治癒させた。ソフトウェアＩｍａｇｅ  Ｊにより創傷治癒能力を決定した。データを３回の独立的実験において複製した。
【０１４０】
レンチウイルス媒介性ｓｈＲＮＡノックダウン。ＧＩＰＺ  ＮＯＳ２レンチウイルスｓｈＲＮＡクローン（ｓｈＲＮＡ１−Ｖ３ＬＨＳ＿３６０６９１；ｓｈＲＮＡ２−Ｖ２ＬＨＳ＿１１１７６９）およびＧＩＰＺレンチウイルス空ベクターｓｈＲＮＡ対照をＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＳＵＭ１５９細胞を、レンチウイルス粒子およびポリブレン（６μｇ／ｍＬ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で４８時間処置した。ｓｈＲＮＡを有する細胞クローンを、ピューロマイシン（２μｇ／ｍＬ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）により１週間選択した。次に、細胞を収集し、増殖、マンモスフェア、創傷治癒およびウエスタンブロットアッセイのために蒔いた。
【０１４１】
ｓｉＲＮＡ媒介性ＮＯＳ２ノックダウン。ＳＵＭ１５９およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に、スクランブルｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ１８（ｓ９６１８）またはｓｉＲＮＡ２０（ｓ９６２０）（Ｓｉｌｅｎｃｅｒ  Ｓｅｌｅｃｔ、Ａｍｂｉｏｎ）を９６時間トランスフェクトした。簡潔に説明すると、血清、抗生物質／抗真菌薬不含ＤＭＥＭ培地において、６ウェルプレート（１００，０００細胞／ウェル）において成長させた細胞に、リポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にパッケージしたＮＯＳ２  ｓｉＲＮＡまたはスクランブルｓｉＲＮＡ（１００ｎＭ）を６時間トランスフェクトした。完全ＤＭＥＭ培地を添加し、細胞を９６時間成長させた。
【０１４２】
ＳＵＭ１５９細胞における一酸化窒素産生。フェノールレッドおよび血清不含ＤＭＥＭ培地においてＬ−ＮＭＭＡまたは１４００Ｗで細胞を２４時間処置した。製造者の説明書に従った硝酸塩／亜硝酸塩蛍光定量的アッセイキット（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）による硝酸塩＋亜硝酸塩（総一酸化窒素）産生のため、細胞培養上清のアリコートを０、０．５、２、６および２４時間目に採取した。
【０１４３】
ウエスタンブロット。ｉＮＯＳ阻害剤ありまたはなしで、６ウェルプレートにおいて２．５×１０５細胞／ウェルの密度で細胞を９６時間培養した。１×溶解バッファー（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）および１×プロテアーゼ／ホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に細胞を再懸濁した。β−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有する４×ＬＤＳサンプルバッファー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）において試料（３０μｇタンパク質）を煮沸し、４〜２０％ポリアクリルアミドゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動に供した。タンパク質をニトロセルロース膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に転写し、１×Ｔｒｉｓ緩衝食塩水（ＴＢＳ）中５％脱脂粉乳と共に１時間インキュベートして非特異的結合を回避した。膜を一次抗体（１：１，０００希釈；抗β−アクチン、１：２，０００希釈）と共に一晩４℃でインキュベートした。洗浄および適切な二次抗体（１：２，０００希釈）との１時間のインキュベーション後に、膜を洗浄し、高感度化学発光基質と共にインキュベートした。オートラジオグラフィーフィルム（Ｄｅｎｖｉｌｌｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．）にタンパク質バンドを現像した。
【０１４４】
スプライシングされたＸＢＰ１のＲＴ−ＰＣＲ解析。製造者の説明書に従って、ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｃｒｏキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＳＵＭ１５９細胞から全ＲＮＡを抽出し、ｉＳｃｒｉｐｔ  ｃＤＮＡ合成キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いてｃＤＮＡを合成した。２．５Ｕ／μＬ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（ネイティブ、５Ｕ／μＬ）、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２（５０ｍＭ）および０．５μＭの各プライマーを用いて、ＰＣＲ増幅（５０ｎｇ  ｃＤＮＡ）を行った。プライマーは：
ＸＢＰ１−フォワード  ５’−ＧＧＧＴＣＣＡＡＧＴＴＧＴＣＣＡＧＡＡＴＧＣ−３’（配列番号１）
ＸＢＰ１−リバース  ５’−ＴＴＡＣＧＡＧＡＧＡＡＡＡＣＴＣＡＴＧＧＣ−３’（配列番号２）
β−アクチン−フォワード  ５’−ＣＴＧＧＡＡＣＧＧＴＧＡＡＧＧＴＧＡＣＡ−３’（配列番号３）
β−アクチン−リバース  ５’−ＡＡＧＧＧＡＣＴＴＣＣＴＧＴＡＡＣＡＡＴＧＣＡ−３’（配列番号４）であった。
ＰＣＲ条件は、１サイクルの９５℃５分間、２５サイクルの３０秒間９５℃、１分間５０℃および１分間６８℃、続いて１サイクルの６８℃５分間であった。２％アガロースにおいてｃＤＮＡアンプリコンを分離した。
【０１４５】
免疫組織化学的検査。ヒト患者、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＳＵＭ１５９同所性腫瘍組織のパラフィン包埋切片を、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ＝９．０）を使用した抗原修復（ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｔｒｉｅｖａｌ）に付し、過酸化水素を使用して５分間ブロッキングした。次に、ヒト患者試料および異種移植片腫瘍を、抗ｉＮＯＳ（１：５０希釈）、抗Ｋｉ６７（１：１００希釈）および抗切断型カスパーゼ−３（１：５０）抗体と共に１時間室温でインキュベートした。ペルオキシダーゼに基づくＥｎＶｉｓｉｏｎキット（Ｄａｋｏ）により試料を発色させ、陰性対照と比較して、偽陽性を排除した。スライドをヘマトキシリンで対比染色した。ｉＮＯＳスコア方法：強度（０〜３）：陰性、弱い、中等度、強い；分布（０〜４）：＜１０％、１０〜３０％、＞３０〜５０％、＞５０〜８０％、＞８０％。総スコアは、４群に分けることができる：陰性（０〜１）、弱い（２〜３）、中等度（４〜５）および強い（６〜７）。ＮＯＳ２指向性ｓｈＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ１）または空ベクター（ＥＶ）のいずれかをトランスフェクトしたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、それぞれｉＮＯＳ染色の陰性および陽性対照として使用した。
【０１４６】
動物研究。雌ＳＣＩＤベージュマウス（４〜５週齢）（Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、標準研究室条件（２２℃；１２時間／１２時間明／暗サイクルならびに食物および水に対する自由な利用）下に収容した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１またはＳＵＭ１５９細胞（３×１０６）のいずれかを右の乳腺脂肪パッドに注射した。腫瘍が、１５０〜２００ｍｍ３に達したら、マウスを次の通りに異なる群にランダム化した（ｎ＝１０／群）：１）ビヒクル（生理食塩水、ｉ．ｐ．）、２）Ｌ−ＮＭＭＡ（８０ｍｇ／ｋｇまたは２００ｍｇ／ｋｇのいずれか、ｉ．ｐ．、毎日）、３）ドセタキセル（２０ｍｇ／ｋｇ）、４）コンボ（Ｌ−ＮＭＭＡおよびドセタキセル）。
【０１４７】
肺転移防止研究のため、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１  Ｌ／Ｇ細胞を上述の通り植え込んだ。マウスをランダム化し、細胞注射の４８時間後に処置を開始した（ｎ＝５／群）：１）ビヒクル（生理食塩水、ｉ．ｐ．）、２）Ｌ−ＮＡＭＥ（８０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、毎日を３５日間）。ルシフェリンの以前の注射、肺を取り出し、冷ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１％抗生物質／抗真菌薬において洗浄した。次に、５０μＭルシフェリンを含有する冷ＤＭＥＭ培地において肺を１０分間インキュベートした。このプロトコールは、肺摘出およびルシフェリンへの曝露の間の時間経過を回避する。ＩＶＩＳ−２００  ｉｎ  ｖｉｖｏイメージングシステム（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｉｎｃ．）により、蛍光がん細胞を検出した。
【０１４８】
臨床関連用量レジメンは、Ｌ−ＮＭＭＡ（１日目に４００ｍｇ／ｋｇ、およびさらに４日間にわたり２００ｍｇ／ｋｇ、経口経管栄養による）および０日目のアムロジピン（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、毎日を６日間）と組み合わせる１２時間前の、ドセタキセル（２０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、０日目）の２サイクルからなった。ドセタキセル単独および生理食塩水（ｉ．ｐ．）＋滅菌水（経口経管栄養）を対照として使用した。
【０１４９】
それぞれＭＳＦＥおよび限界希釈アッセイにより、腫瘍組織から単離された単一細胞において、自己再生および腫瘍惹起能力を決定した。簡潔に説明すると、乳腺腫瘍組織を刻み、ＤＭＥＭ：Ｆ１２培地において１００Ｕ／ｍＬのコラゲナーゼ３型（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）および０．８Ｕ／ｍＬのディスパーゼ（Ｇｉｂｃｏ）により３７℃で４５分間消化した。上述の通り単離された単一細胞においてＭＳＦＥをアッセイした。ＳＣＩＤベージュマウス（ｎ＝１２／群）の乳腺脂肪パッドにおける腫瘍組織由来の５×１０４または２×１０４個の単離された細胞のいずれかを注射して、限界希釈アッセイ（ＬＤＡ）を行った。公表されている方法を使用して、ＣＤ４４＋／ＣＤ２４−／ｌｏｗ細胞集団のフローサイトメトリー解析をアッセイした。
【０１５０】
液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）による代謝物プロファイリング。動物研究（Ｌ−ＮＭＭＡ毎日投与）由来のＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＳＵＭ１５９異種移植片組織ならびに血漿試料を以前に記載されたとおりに（２）調製した。Ｌ−ＮＭＭＡ（２００ｍｇ／ｋｇ）を、雌ＳＣＩＤベージュマウス（ｎ＝５）に経管栄養によって経口投与した。Ｌ−ＮＭＭＡ投与の前（ベースライン、０時間）および後（０．５、２、１２、２４時間）に、血液を採取した。代謝物プロファイリングに使用したＬＣ−ＭＳ／ＭＳプラットフォームについては、以前に記載されている。メチルアルギニン（Ｌ−ＮＭＭＡ）およびシトルリンのレシオメトリック定量化は、血漿および腫瘍組織におけるイオン存在量レベルとして決定した。
【０１５１】
血圧測定。１５匹の雌ＳＣＩＤベージュマウスの血圧（ＢＰ）を３日間測定し（基礎ＢＰ）、その後、次の通りの１サイクルの臨床関連用量レジメン（ｎ＝５／群）で処置した：アムロジピン（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）６日間（０日目に開始）、Ｌ−ＮＭＭＡ（２００ｍｇ／ｋｇ、経管栄養）５日間（１日目に開始）および組み合わせ（Ｌ−ＮＭＭＡ＋アムロジピン）。コンピュータ化テールカフ（ｔａｉｌ  ｃｕｆｆ）モニター（ＢＰ−２０００  Ｓｅｒｉｅｓ  ＩＩ、Ｖｉｓｉｔｅｃｈ）を使用して、サイクル処置の最後の連続した３日間の、２０回の血圧測定のうち最後の１０回の平均を平均することにより、平均毎日血圧を決定した。
【０１５２】
統計解析。ＧｒａｐｈＰａｄ（商標）Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｗａｒｅ，Ｉｎｃ．）を使用して全データを解析した。データは、平均±ＳＥＭとして示す。２群間の統計的有意性は、両側スチューデントのｔ検定により解析した。３を超える群による実験は、一元配置ＡＮＯＶＡ（分散分析）と、続くボンフェローニの事後検定により解析した。腫瘍体積の統計解析は、二元配置ＡＮＯＶＡおよびボンフェローニの事後検定によって評価した。フィッシャーの直接検定を使用して、限界希釈アッセイにおける有意差を決定した。生存割合は、カプラン・マイヤー方法を使用して評価し、ウィルコクソンまたはログランク検定のいずれかによりさらに解析した。増殖、ＭＳＦＥ、遊走指数およびＫｉ６７染色は、ビヒクル群（１００％）に対して正規化する。０．０５未満のｐ値は、有意であるとみなした。
【０１５３】
結果
【０１５４】
増強されたｉＮＯＳ発現は、浸潤性ＴＮＢＣにおける不十分な患者生存と相関する。ｉＮＯＳは、異なるがん型における転移のメディエーターであると説明されてきた。上昇したｉＮＯＳ発現は、ＥＲα陰性乳がん患者における不十分な生存に関連付けられてきた。本発明者は、ＴＮＢＣにおける増強されたｉＮＯＳ発現が、不十分な患者生存および転移と相関すると仮定した。
【０１５５】
乳がんにおけるＮＯＳ２（ｉＮＯＳ  ｍＲＮＡ発現）発現のＯｎｃｏｍｉｎｅがんマイクロアレイデータベース解析を行った。Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）データベースの解析は、ＮＯＳ２  ｍＲＮＡ発現が、非ＴＮＢＣ（ｎ＝２５０）に対して浸潤性ＴＮＢＣ患者試料（ｎ＝４６）において有意により高いことを示した（倍数変化１．４２５、ｐ＝３．８５×１０−５、スチューデントのｔ検定）（図１Ａ）。患者生存解析は、浸潤性乳管癌患者（ｎ＝７９）におけるＮＯＳ２発現増加および５年目のより悪い生存の間の相関を実証した（倍数変化１．２７５、ｐ＝０．０３７、スチューデントのｔ検定）。これらのうち、４６種の試料がＴＮＢＣであった（ｎ＝３７、高ＮＯＳ２発現；ｎ＝９、低ｉＮＯＳ発現）（図１Ｂ）。本発明者および同僚らは、ＮＯＳ２発現が、ＴＮＢＣ患者の２種の追加的なデータベースにおいてより悪い生存と相関するか否かさらに試験した。Ｖａｎ  ｄｅ  Ｖｉｊｖｅｒ（ｎ＝６９試料）およびＣｕｒｔｉｓ（ｎ＝２６０試料）データベースの解析は、高いＮＯＳ２発現が、ＴＮＢＣ患者における生存に関連することを確認した（図１Ｃおよび図１Ｄ）。
【０１５６】
次に、本発明者および同僚らは、８３種の外科的に切除されたＴＮＢＣ原発性乳がん試料における免疫組織化学的検査によってｉＮＯＳタンパク質発現を試験し、公知の患者転帰と発現を相関させた。ｉＮＯＳは、主に細胞質性であるが、一部の細胞は、細胞質および核局在の両方を示した（図１Ｅ）。全体的なスコアは、ｉＮＯＳレベルが、１４種の試料（１６．９％）において弱い〜中等度（スコア３〜４）であり（図１Ｅ、図３および図４）、５０種の試料（６０．２％）において中等度〜強い（スコア５〜６）であり（図１Ｅ）、１９種の標本（２２．９％）において強い（スコア７）であったことを示した（図１Ｅ）。この層別化を使用して、カプラン・マイヤー解析を使用してｉＮＯＳ発現および患者生存の相関を解析した。ｍＲＮＡマイニング解析（ｍＲＮＡ  ｍｉｎｉｎｇ  ａｎａｌｙｓｉｓ）（図１Ｃおよび図１Ｄ）と一貫して、本発明者は、増強されたｉＮＯＳタンパク質レベルが、低いｉＮＯＳ発現と比較して（ｐ＝０．０５、カイ二乗検定）、より悪い患者生存に関連することを確認した（図１Ｆ）。これらの結果は、浸潤性ＴＮＢＣにおけるｍＲＮＡおよびタンパク質発現によるｉＮＯＳ増加が、不十分な患者生存に関連することを実証する。
【０１５７】
ｉＮＯＳの阻害は、ＴＮＢＣ細胞の腫瘍形成能を減少させる。本発明者および同僚らは、選択的ｉＮＯＳ阻害剤、１４００Ｗならびに汎ＮＯＳ阻害剤、Ｌ−ＮＭＭＡおよびＬ−ＮＡＭＥによる９６時間の処置後に、ＳＵＭ１５９およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株の増殖におけるｉＮＯＳ阻害の効果を評価した（図２Ａ）。高濃度の１４００Ｗ（１、２および４ｍＭ）は、両細胞株における増殖を有意に減少させることができた（図２Ａ）。Ｌ−ＮＡＭＥによる処置後に、同様の結果が観察された（図９Ａ）。最高濃度（４ｍＭ）のＬ−ＮＭＭＡは、両細胞株において抗増殖活性を示した（図２Ｂ）。
【０１５８】
処置に対する抵抗性および転移は、腫瘍成長の再惹起および転移播種に役立ち得る、不均一原発性がん内のがん幹細胞（ＣＳＣ）の亜集団から生じ得る。そこで、本発明者および同僚らは、マンモスフェア形成効率（ＭＳＦＥ）アッセイを使用することにより、がん幹細胞自己再生におけるｉＮＯＳ阻害の効果を調査した。ｉＮＯＳ阻害は、両細胞株において一次マンモスフェア（ＭＳ）のＭＳＦＥを減少させた（図２Ｃ）。Ｌ−ＮＡＭＥに対して同様の効果が見出された（図９Ｂ）。本発明者は、検査した全阻害剤に対して、両細胞株における二次ＭＳＦＥ低下を同定した（図２Ｄ；図９Ｃ）。知見は、浸潤性ＴＮＢＣにおける増強されたｉＮＯＳ発現を示すため（図１Ａ）、本発明者は、創傷治癒アッセイを使用して、細胞遊走におけるｉＮＯＳの役割をさらに調査した。１４００Ｗによる選択的ｉＮＯＳ阻害は、ミリモル濃度範囲（図２Ｅ）およびマイクロモル濃度範囲（図９Ｄ）で、両細胞株の遊走において著しい用量依存性減少を引き起こした。Ｌ−ＮＭＭＡで処置された細胞は、遊走能力の低下を示した（図２Ｆ）。マイクロモル濃度範囲のより低い濃度は、一貫せず、有効性が低かった（図９Ｅ）。Ｌ−ＮＡＭＥに対して同様の結果が見出された（図１０Ａ）。ｓｈＲＮＡ媒介性ｉＮＯＳ（ＮＯＳ２）ノックダウンＭＤＡ−ＭＢ−２３１（図３Ａ、図３Ｂおよび図３Ｃ）およびＳＵＭ１５９細胞（図１１Ａ、図１１Ｂおよび図１１Ｃ）において、これらの結果をさらに確認した。まとめると、結果は、基礎レベルのｉＮＯＳが、ＴＮＢＣ細胞株のＣＳＣ自己再生および遊走特性において主要な役割を有し、増殖においてより不明確な効果があることを示す。
【０１５９】
内在性ｉＮＯＳの抑制は、ＨＩＦ１αおよび小胞体（ＥＲ）ストレス／ＴＧＦβ／ＡＦＴ４／ＡＴＦ３クロストークを損なうことにより、ＥＭＴおよび細胞遊走を損なうことができる。極性化上皮細胞の間葉系細胞への分化転換（ＥＭＴ）は、腫瘍浸潤および転移中に誘起される。次に、本発明者は、ウエスタンブロットにより、間葉系様ＴＮＢＣ  ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＳＵＭ１５９細胞において、ＥＭＴ誘導性転写因子におけるｉＮＯＳ阻害の影響を考慮した。本発明者はまず、選択的または汎阻害のいずれかの後の、ＮＯＳアイソフォーム（ｉＮＯＳ、ｅＮＯＳおよびｎＮＯＳ）における影響を試験した（図３Ｄ；図１０Ｂ、図１０Ｃおよび図１０Ｆ）。この知見は、１４００Ｗによる選択的ｉＮＯＳ遮断が、両細胞株において、ミリモル濃度（図３Ｄ）およびマイクロモル濃度（図１０Ｄ）で、ＥＭＴ転写因子Ｓｎａｉｌ、ＳｌｕｇおよびＴｗｉｓｔ１のタンパク質レベルの低下を引き起こすことを明らかにした。Ｚｅｂ１タンパク質レベルは、ミリモル濃度で減少した（図３Ｄ）。一貫性は低いが、汎ＮＯＳ阻害剤に対して同様の結果が見出された（図１０Ｅおよび図１０Ｆ）。ｓｈＲＮＡによるｉＮＯＳノックダウンは、Ｚｅｂ１およびＴｗｉｓｔ１タンパク質レベルの減少と相関した（図３Ｅ）。ＳｎａｉｌおよびＳｌｕｇは、ＳＵＭ１５９においてのみ遮断された（図１１Ｄ）；本発明者は、２週間のクローン選択の後に、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１において同様の結果を見出した。Ｚｅｂ１およびＴｗｉｓｔ１の減少は、ＳＵＭ１５９細胞における一過性ｉＮＯＳノックダウンにより確認された（図１１Ｅ）。全体的に見て、これらのデータは、選択的ｉＮＯＳ阻害が、ＴＮＢＣ細胞株の遊走を効率的に減少させることを示唆し、これは、ＥＭＴ転写因子の減少と一貫して相関している。
【０１６０】
異なる経路が、ＥＭＴ誘導および腫瘍細胞転移の原因となり、それらのうち、一酸化窒素は、ＨＩＦ１αおよび小胞体（ＥＲ）ストレスの共通分母である。この知見は、選択的ｉＮＯＳ阻害が、両細胞株における低酸素（ＨＩＦ１α）（図３Ｆ；図１０Ｇ）ならびにＥＲストレスマーカーＩＲＥ１α／スプライシングされたＸＢＰ１（図３Ｆ；図１１Ｆ）およびＡＴＦ４の用量依存性減少をもたらしたことを示す（スプライシングされたＸＢＰ１は、ＳＵＭ１５９細胞において検出されなかった。データ図示せず）（図３Ｆ）。機能的タンパク質−タンパク質相互作用（ＳＴＲＩＮＧ  ９．１）解析は、ｉＮＯＳおよびＴＧＦβ１の間のリンクを明らかにした（図１１Ｇ）。研究は、１４００Ｗが、未決定の機構により、組換えＴＧＦβ１（１０ｎｇ／ｍＬ、７２時間）の非存在（図３Ｇ）および存在下（図１１Ｈ）で、ＴＧＦβシグナリング（ホスホＳｍａｄ２／３、Ｓｍａｄ２／３および成熟ＴＧＦβ）を阻害することができることを確認した。追加的なタンパク質−タンパク質相互作用解析は、ともにＴＧＦβと相互作用する転写因子を活性化するＡＴＦ４およびＡＴＦ３の間の相互作用を示した（図１１Ｇ）。実験は、ＡＴＦ４／ＡＴＦ３によるＥＲストレスおよびＴＧＦβの間のクロストークを確認した（図１１Ｉ）；同様に、組換えＴＧＦβ１（１０ｎｇ／ｍＬ、２４時間）は、ＰＥＲＫ／ｅＩＦ２α／ＡＴＦ４／ＡＴＦ３軸を誘導した（図３Ｈ）。結果は、ｉＮＯＳ阻害剤１４００Ｗ（４ｍＭ）および組換えＴＧＦβ１の２４時間の同時処置が、ＰＥＲＫ／ｅＩＦ２α経路とは独立して、ＴＧＦβ１によるＡＴＦ４およびＡＴＦ３タンパク質レベルの刺激を阻害することができることを示した。ｓｉＲＮＡ媒介性ｉＮＯＳ（ＮＯＳ２）ノックダウン細胞において、この結果をさらに確認した（図３Ｉ）。全体的に見て、これらのデータは、ｉＮＯＳ阻害が、ＥＲストレス（ＩＲＥ１α／ＸＢＰ１）ならびにＡＴＦ４、ＡＴＦ３およびＴＧＦβの間のクロストークを損なうことにより、ＥＭＴおよび腫瘍細胞遊走を損ない得ることを実証した。
【０１６１】
ｉＮＯＳ阻害は、腫瘍成長、腫瘍惹起能力を低下させ、トリプルネガティブ乳がんのマウスモデルにおいて肺転移を防止する。このｉｎ  ｖｉｔｒｏデータに基づき、本発明者は次に、ｉＮＯＳ阻害が、肺転移のマウスモデルにおける乳腺腫瘍細胞の腫瘍惹起および転移を防止できるか否かを調査した。８０ｍｇ／ｋｇ  Ｌ−ＮＡＭＥの毎日のｉ．ｐ．注射を、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１異種移植片を有するマウスに３５日間与えた。Ｌ−ＮＡＭＥは、腫瘍成長（ｐ＝０．００１）（図４Ａ）および一次ＭＳのＭＳＦＥ（図４Ｂ）を有意に低下させた。二次ＭＳＦＥも縮小したが、ビヒクル群と比較して有意ではなかった（図４Ｂ）。その上、腫瘍組織から単離された単一細胞（５×１０５または１×１０５細胞）を右の乳腺脂肪パッドに注射することにより、限界希釈アッセイ（ＬＤＡ）によりＣＳＣの腫瘍惹起能力を評価した。ビヒクル群の全動物（ｎ＝５）が、腫瘍を発生した一方、Ｌ−ＮＡＭＥによる処置は、５×１０５細胞により１．５週目に３／５腫瘍を生じた。Ｌ−ＮＡＭＥ処置群（０／５腫瘍）と比較して、１×１０５細胞による２．５週目のビヒクル群において同じ結果が観察された（ｐ＜０．０５、フィッシャーの直接検定）（図４Ｄ）。
【０１６２】
次に、本発明者は、ｉＮＯＳ阻害が、ＴＮＢＣ異種移植片モデルにおいて肺への転移を抑制できるか否かを試験した。ルシフェラーゼ／ＧＦＰに基づくＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１  Ｌ／Ｇ）異種移植片マウスモデルは、患者における肺への転移過程を模倣する。この肺転移モデルにおいて、細胞は、植え込みのほぼ３５日後に原発性腫瘍から肺へと転移する。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１  Ｌ／Ｇ細胞を、ＳＣＩＤマウスの右の乳腺脂肪パッドに注射し、８０ｍｇ／ｋｇ  Ｌ−ＮＡＭＥを３５日間毎日与えた。ルシフェリン存在下での肺のｅｘ  ｖｉｖｏイメージングは、Ｌ−ＮＡＭＥ群と比較してビヒクル群においてより高い蛍光を示した（図４Ｃ）。これらの結果は、毎日のＬ−ＮＡＭＥによるｉＮＯＳ阻害が、ＴＮＢＣマウスモデルにおける肺への転移を防止することもできることを示唆した。
【０１６３】
これらの結果を将来の臨床治験へと変換するために、汎ＮＯＳ阻害剤、Ｌ−ＮＭＭＡを追加の集中的研究のために選択した。Ｌ−ＮＭＭＡは、心原性ショックに関して以前に調査され、その適応症のために数千名の患者に投与されたが、本発明は、抗がん適応症に対するこの化合物の最初に報告された再度目的化を提供し、抗がん治療薬として有効となり得る前臨床用量を示唆するこれらの結果より前から存在するデータは殆どない。
【０１６４】
この問題を解くために、８０ｍｇ／ｋｇ  Ｌ−ＮＭＭＡの毎日の注射をまず、ＳＵＭ１５９異種移植片を有するマウスに、単独で、またはドセタキセル（２０ｍｇ／ｋｇ）と組み合わせて与えた。１０日後に、群間に差次的効果は観察されず、毎日の用量を２００ｍｇ／ｋｇまで増加させた。単独で、またはドセタキセルと組み合わせて投与されるＬ−ＮＭＭＡによって、腫瘍成長は効率的に遮断された（図１３Ａ）。本発明者は、免疫組織化学的検査により、これらの結果を腫瘍細胞増殖と相関させた（Ｋｉ６７）。Ｌ−ＮＭＭＡおよび組み合わせ群と比較して、ビヒクルおよび化学療法群においてより高い増殖速度（図１３Ｂおよび図１３Ｃ）が観察された。本発明者は次に、ＭＳＦＥアッセイにより、ＣＳＣ自己再生における影響を解析した。ドセタキセルは、乳腺腫瘍組織から単離された単一腫瘍細胞の一次および二次ＭＳＦＥの劇的な増加を示した。この増分は、Ｌ−ＮＭＭＡ（組み合わせ群）の添加により効率的に遮断された（図１３Ｄ）。フローサイトメトリー解析は、化学療法後にＣＤ４４＋／ＣＤ２４−／ｌｏｗ集団の僅かな増加を示した（図１４Ａ）。ＬＤＡは、ビヒクル、Ｌ−ＮＭＭＡ、ドセタキセルおよび組み合わせ群が、５×１０４細胞による７週目にそれぞれ１２／１２、４／１２、１２／１２、６／１２腫瘍を示すことを示した。９週目に、２×１０４細胞による異なる群として腫瘍惹起能力の有意な低下が観察され、それぞれビヒクル、Ｌ−ＮＭＭＡ、ドセタキセルおよび組み合わせにおいて７／１２、０／１２、３／１２、０／１２腫瘍を生じた（ｐ＜０．０５、フィッシャーの直接検定）（図１４Ｅ）。
【０１６５】
次に、単独で、またはドセタキセルと組み合わせて、異なるＴＮＢＣマウスモデルにおいてＬ−ＮＭＭＡの役割を調査した。ドセタキセル（２０ｍｇ／ｋｇ、０および２１日目）および２００ｍｇ／ｋｇ  Ｌ−ＮＭＭＡ（毎日）を、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１異種移植片を有するマウスに３１日間与えた。第一に、ビヒクルと比較してＬ−ＮＭＭＡ群において、腫瘍成長低下が見出されたが、ドセタキセルおよび組み合わせ群の間に変化はなかった（図５Ａ）。これらの結果は、免疫組織化学的検査によって見られる、Ｌ−ＮＭＭＡおよび組み合わせ群におけるより低い増殖速度とさらに相関していた（図５Ｂおよび図５Ｃ）。その上、ドセタキセル処置異種移植片におけるより高いアポトーシスレベルが見出された；これらの結果は、組み合わせ群と比べて高い増殖速度を相殺することができる（図５Ｄ）。ビヒクルおよび化学療法単独群と比較して、Ｌ−ＮＭＭＡおよび組み合わせの両方で一次ＭＳが少なかった。Ｌ−ＮＭＭＡ処置は、二次ＭＳを低下させることができたが、組み合わせ群に対し変化は観察されなかった（図５Ｅ）。フローサイトメトリー解析は、ＣＤ４４＋／ＣＤ２４−／ｌｏｗ集団の変化を示さなかった（図１４Ｂ）。ＬＤＡは、ビヒクル処置およびドセタキセル処置群が、それぞれ１２／１２および８／１２腫瘍を示し、５×１０４細胞により５週目にＬ−ＮＭＭＡ処置（１／１２）および組み合わせ処置（４／１２）異種移植片において有意な減少があったことを示した。６週間後に、ビヒクルおよびドセタキセル群（それぞれ６／１２および８／１２）と比較したＬ−ＮＭＭＡおよび組み合わせ群（それぞれ３／１２および５／１２）の両方の減少が観察された（ｐ＜０．０５、フィッシャーの直接検定）（図５Ｆ）。調査は、Ｌ−ＮＭＭＡ血漿レベルが、急速に排除される（図１４Ｃ）一方、処置完了の２４時間後に、これは腫瘍組織において蓄積し（図１４Ｄ）、ｉＮＯＳによるＬ−アルギニンのＬ−シトルリンおよびＮＯへの変換を阻害する（図１４Ｅ）ことを実証する。この阻害は、ＳＵＭ１５９細胞において見られる、総ＮＯ産生の減少を導いた（図１４Ｆ）。全体的に見て、これらの結果は、Ｌ−ＮＭＭＡによるｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉＮＯＳ阻害が、肺転移の有意な低下と共に、ＣＳＣの腫瘍成長、細胞増殖および腫瘍惹起能力を減少させたことを実証する。
【０１６６】
潜在的な臨床適用によるＬ−ＮＭＭＡおよびドセタキセルの効率的用量レジメン。臨床的には、Ｌ−ＮＭＭＡは、構成的ｅＮＯＳの阻害により、急性血圧（ＢＰ）上昇を引き起こす。そこで、２種の異なるＴＮＢＣマウスモデル（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＳＵＭ１５９異種移植片）における２サイクルの、降圧薬（本実施例ではアムロジピン）と共にｉＮＯＳ阻害剤（この場合はＬ−ＮＭＭＡ）の減弱された持続時間を有するレジメンについて記載する。２週間毎に２０ｍｇ／ｋｇの標準ドセタキセルを投与した。５日間、２００ｍｇ／ｋｇで、化学療法の２４時間後にＬ−ＮＭＭＡを与え、この投薬量は以前の臨床報告に匹敵する。カルシウムチャネル遮断薬アムロジピン（１０ｍｇ／ｋｇ、毎日６日間、ｉ．ｐ．）を使用して、血圧増分を打ち消した。経口Ｌ−ＮＭＭＡは、マウスにおける基礎レベル（１２０ｍｍＨｇ）と比較して、平均収縮期圧（１４７ｍｍＨｇ）を有意に増加させ、この上昇は、アムロジピン（１０ｍｇ／ｋｇ）によって効率的に反転された（図６Ａ）。このＢＰ上昇は、一過性のものであり、Ｌ−ＮＭＭＡの最後の注射の２４時間後に消失した（図６Ｂ）。
【０１６７】
Ｌ−ＮＭＭＡおよびドセタキセルの組み合わせは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１同所性モデルにおける腫瘍成長を減少させることができた（図６Ｃ）。この用量レジメンは、ドセタキセル処置群と比較して生存も改善した（ｐ＝０．０００１、ウィルコクソン検定）（図６Ｄ）。ＳＵＭ１５９異種移植片において同様の結果が見出された（図６Ｅ）。全体的に見て、データは、本明細書に提案される用量レジメンが、腫瘍成長の低下において有効であり、より優れた生存をもたらすことを示す。プロトコールの少なくとも一部のためにｉＮＯＳ阻害剤の投与を降圧薬と組み合わせることにより、一過的に増大するＢＰにおけるｉＮＯＳ阻害剤の厄介な有害副作用を最小化および／または回避することができる。
【０１６８】
ｉＮＯＳ阻害剤治療とドセタキセル等の１種または複数の従来の化学療法薬とのさらなる組み合わせは、追加の相乗的処置利益をもたらし、難治性、転移性およびＴＮＢＣ患者における処置抵抗性を克服するための新たな戦略を表す。
【０１６９】
本明細書に述べられている通り、ＴＮＢＣは、有効な標的化治療を欠く、極めて侵襲性かつ致死的形態のがんである。ＴＮＢＣ患者は、転移および腫瘍再燃のより高いリスクを示す。ｉＮＯＳレベルは、基底様エストロゲン受容体陰性乳がん患者におけるより悪い生存を予測し、がん幹細胞（ＣＳＣ）をモジュレートすることにより腫瘍の侵襲性および細胞の転移性傾向を増加させることが示唆された。本発明は、ｉＮＯＳ経路の阻害が、細胞増殖、ＣＳＣ自己再生および／または細胞遊走に影響することにより、ＴＮＢＣ細胞の腫瘍形成能を減少させることができることを実証する最初の報告である。本願に示すｉｎ  ｖｉｖｏ研究は、ＴＮＢＣ等、難治性がん患者を含むがん患者のための新規標的化治療としての、Ｌ−ＮＭＭＡ等、数種類の例示的な小分子ｉＮＯＳ阻害剤の有効性を実証し、これらの結果のヒトの臨床治験への即時変換の必要性を提供する。
【０１７０】
これらの例は、ＮＯＳ２が、浸潤性ＴＮＢＣにおいて共通して増加し、浸潤性乳癌患者の不十分な生存に関連することを実証した。８３種のヒトＴＮＢＣ患者試料における免疫組織化学的検査による高いｉＮＯＳタンパク質レベルも、患者転帰悪化と相関し、これが、ＥＲα陰性および浸潤性乳癌における初期報告と一貫することを実証した追加的なデータを示した。Ｖａｎ  ｄｅ  ＶｉｊｖｅｒおよびＣｕｒｔｉｓデータベースならびにヒトＴＮＢＣ患者試料のカプラン・マイヤー解析は、高いｉＮＯＳ発現が、ＴＮＢＣ患者における不十分な全生存期間に関連したことを強く示す。これらの観察結果は、ｉＮＯＳ発現増加が、がん患者のある特定のサブセットにおける予後不良を予測し得ることも確立する。
【０１７１】
ｉＮＯＳ発現は、乳がん細胞の腫瘍グレードおよび侵襲性の増加と相関している。本発明は、ＴＮＢＣ細胞のＣＳＣ自己再生、腫瘍惹起および遊走能力におけるｉＮＯＳの効果について記載する。ｉＮＯＳ阻害剤の抗腫瘍活性は、類表皮癌、経口、神経膠芽腫および乳がんにおいて以前に報告されており、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの知見と一貫する。ｉＮＯＳ発現増加は、神経膠芽腫細胞における腫瘍惹起を促進することにより、従来の処置に対する抵抗性に寄与するものと説明されてきた。その上、ｉＮＯＳは、ＥＲα陰性乳がんにおけるＣＤ４４およびｃ−Ｍｙｃをモジュレートすることにより、ＣＳＣ自己再生に影響し得る。本発明者は、初めて、ｉＮＯＳ阻害が、ＴＮＢＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏモデルの両方においてＣＳＣ自己再生および腫瘍惹起を減少させることを実証した。
【０１７２】
一酸化窒素は、内在性レベルに応じて転移性事象の促進または阻害のいずれかを行うことができる。転移におけるＮＯＳ阻害剤の役割は、以前に研究されているが、その根底にある機構は依然として不明である。初期研究は、汎ＮＯＳ阻害剤Ｌ−ＮＡＭＥが、マウス乳がんモデル（ＥＭＴ−６細胞）における腫瘍成長および肺転移を減少させることができることを実証した。同様に、Ｌ−ＮＡＭＥは、２種の転移性乳房細胞株（Ｃ３Ｌ５およびＣ１０）の浸潤および遊走潜在力を阻害した。転移性ヒト腺癌ＨＲＴ−１８細胞を用いた別の研究において、浸潤性は、５００μＭの選択的ｉＮＯＳ阻害剤１４００Ｗによる毎日の処置により実質的に減少した。さらに最近では、１４００Ｗは、口腔の腺様嚢胞癌のマウスモデルにおける自発的肺転移を著しく阻害することが示された。
【０１７３】
本実施例は、ｉＮＯＳ阻害が、ＴＮＢＣのｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおける細胞遊走および肺転移を減少させたことを実証した。ＮＯおよびｉＮＯＳが、ＩＬ−８およびＣＸＣケモカイン受容体４を誘導することにより、初期転移を導き得ることが示唆された。ＣＳＣは、細胞遊走および転移の増加をもたらす間葉系特色を呈する。ｉＮＯＳ阻害は、ＣＳＣ自己再生および腫瘍惹起を減少させ、したがって、この経路に対する阻害剤が、腫瘍細胞のさらに間葉系様の表現型への移行を反転し得ることを示す。細胞遊走における効果と一貫して、選択的ｉＮＯＳ阻害およびＮＯＳ２ノックダウンは、検査した全ＴＮＢＣ細胞株においてＥＭＴを駆動する転写因子を減少させた。
【０１７４】
ＥＭＴ転写因子の減少における内在性ｉＮＯＳ阻害の効果の機構をより十分に理解するために、ｉＮＯＳ選択的阻害剤、１４００Ｗの影響を解析した。ＥＭＴは、ＴＧＦβ、Ｗｎｔ／β−カテニン、Ｎｏｔｃｈ、Ｈｅｄｇｅｈｏｇおよび複数の増殖因子のような、異なるシグナル伝達経路によって促進され得る。ＥＭＴ転写因子（Ｓｎａｉｌ、Ｓｌｕｇ、Ｔｗｉｓｔ１またはＺｅｂ１）は、ｃ−Ｍｙｃ、Ｅｔｓ、ＨＩＦ１αまたはＮＦκＢのような、多様な中間エフェクターによって活性化される。その上、ＥＲストレスは、ＰＥＲＫ、ＸＢＰ１またはＧｒｐ７８の活性化による、甲状腺、肺胞上皮およびヒト腎近位尿細管細胞におけるＥＭＴに関連付けられてきた。興味深いことに、これらの共通点のないシグナリングネットワークの中で、ｉＮＯＳは、ＨＩＦ１αおよびＥＲストレスの間の共通分母である。内在性ｉＮＯＳ由来ＮＯ産生の阻害は、結腸癌細胞におけるＨＩＦ１α安定化およびタンパク質レベルを低下させることができた。とりわけ転写因子Ｔｗｉｓｔ１、Ｓｎａｉｌ、Ｓｌｕｇ、Ｚｅｂ１は、ＨＩＦ１αによって直接的または間接的に影響される。
【０１７５】
その上、低酸素は、ＥＲストレスおよび小胞体ストレス応答（ｕｎｆｏｌｄｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）（ＵＰＲ）を誘導し、これは最近、低酸素条件下でのＰＥＲＫ／ＡＴＦ４／ＬＡＭＰ３アームの活性化により、乳がん細胞における遊走およびスフェア形成に関連付けられてきた。結果は、ｉＮＯＳ阻害が、ＥＲストレスＡＴＦ４／ＡＴＦ３軸を介したＴＧＦβシグナリングの障害と相関することを示唆する。ＴＧＦβが、頭蓋冠骨芽細胞における分化を抑制するようにＡＴＦ４タンパク質レベルを刺激することが公知である。ＰＥＲＫ／ｅＩＦ２α軸を介したＥＲストレス等、ある特定の条件が、ＡＴＦ４を活性化することができ、これが続いて、ＡＴＦ３転写を誘導する一方、ＡＴＦ３それ自体は、Ｔｗｉｓｔ−１と協同してＴＧＦβ、マンモスフェア形成およびＥＭＴを増強させる活性化転写因子である。
【０１７６】
これらの結果の臨床実施への変換は、この新たな知見における次のステップを表す。Ｌ−ＮＭＭＡは、循環性ショックのいくつかの臨床治験において広範に研究されてきた汎ＮＯＳ阻害剤である。心原性ショック治験において、Ｌ−ＮＭＭＡは、安全であり、一過性の可逆的高血圧症以外に有害事象がほとんどないことが判明した。正常血圧患者において、Ｌ−ＮＭＭＡは、インターロイキン−２の注入に先立ち、転移性腎細胞癌患者に投与された。３および６ｍｇ／ｋｇの用量は、臨床的に明らかな副作用を誘導せず、ＢＰは未変化のままであった。１２ｍｇ／ｋｇの用量レベルにおいて、患者は、いかなる臨床症状もなく、最大２５ｍｍＨｇの収縮期ＢＰの増加を経験し、これはＬ−ＮＭＭＡ注入の停止の際に急速に正常化した。臨床適用性を有する安全かつ有効なレジメンを決定することは、これらの前臨床研究の主要な課題であった。本研究における用量率は、敗血症性ショック患者における以前の臨床治験に基づき、修正しつつ選択された。これらの結果は、腫瘍成長が、アムロジピンと共に与えた、化学療法後の５日間のＬ−ＮＭＭＡの減弱されたレジメンによって制限され得ることを実証した。Ｌ−ＮＭＭＡのランダム化プラセボ対照二重盲検研究が、最大１４日間まで、敗血症性ショック患者において以前に報告された。従ったレジメンは、２．５ｍｇ／ｋｇ／ｈｒの初期用量からなり、続いて異なる速度（０．５、１、２．５、５、７．５、１０、１５および２０ｍｇ／ｋｇ／ｈｒ）に調整された。抗がん治療薬としてのＬ−ＮＭＭＡの使用のための現在の投薬レジメンは、敗血症性ショックに関する文献において以前に報告されたものよりもはるかに低い。
【０１７７】
結論として、本実施例は、ＴＮＢＣ患者における内在性ｉＮＯＳ発現増強および不十分な生存の間の相関に関する新たな証拠を提供する。ｉＮＯＳ阻害剤による標的化治療は、腫瘍細胞増殖のみならず、ＣＳＣ自己再生および遊走も阻害し、腫瘍成長、腫瘍惹起および肺転移数を低下させることが実証された。転移性事象の阻害は、ＨＩＦ１α、ＥＲストレス（ＩＲＥ１α／スプライシングされたＸＢＰ１）およびＴＧＦβ／ＡＴＦ４／ＡＴＦ３軸の阻害による、ＥＭＴ転写因子の低下によるものである可能性がある。これらの結果から、本明細書に記載されている化合物を使用して、腫瘍成長を減少させ、ｉｎ  ｖｉｖｏの生存率を増強する標的化治療レジメンが定義され、ＴＮＢＣ患者におけるこの経路を標的化する臨床治験の重要性を確立する。
【０１７８】
（実施例２）
カルシウムチャネルアンタゴニストの効果
材料と方法
【０１７９】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏの細胞増殖アッセイ。間葉系様ＴＮＢＣ細胞株、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＳＵＭ１５９を、１０％ウシ胎仔血清および１％抗生物質−抗真菌薬を補充したＤＭＥＭにおいて成長させた。様々なカルシウムチャネルアンタゴニスト（アムロジピン、ニカルジピン、ニフェジピン、フェロジピン、イスラジピン、ジルチアゼム、ベラパミル、ラシジピン、ニソルジピン、ニトレンジピン、ニバルジピン、アゼルニジピン、バルニジピン、ベニジピン、エホニジピン、レルカニジピン、プラニジピン、マニジピン）のストック溶液をＤＭＳＯにおいて調製した。ＷＳＴ−１方法により細胞増殖における効果をアッセイした。簡潔に説明すると、１，０００（ＳＵＭ１５９）および２，０００（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）個の細胞／ウェルを９６ウェルプレートに蒔き、異なる濃度（０、１、５および１０μＭ）のカルシウムチャネルアンタゴニストで７２時間処置した。予め混合したＷＳＴ−１試薬を添加することにより、増殖速度を決定した。３７℃で３時間のインキュベーション後に、４５０ｎｍの吸光度を読み取った（参照波長６９０ｎｍ）。ビヒクル（１００％）に対して結果を正規化した。アンタゴニストは、増殖が≧３０％減少した場合、活性があるとみなした。
【０１８０】
動物研究。雌ＳＣＩＤベージュマウス（４〜５週齢）を標準研究室条件（２２℃；１２時間／１２時間の明／暗サイクルならびに食物および水に対する自由な利用）下に収容した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１またはＳＵＭ１５９細胞（３×１０６）のいずれかを右の乳腺脂肪パッドに注射した。腫瘍が、１５０〜２００ｍｍ３に達したら、マウスを次の通りの異なる群にランダム化した（ｎ＝５／群）：１）ビヒクル（生理食塩水、ｉ．ｐ．）、２）アムロジピン（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）、０および１４日目に２サイクル（６日間毎日、各サイクル）。あらゆる動物手順および実験プロトコールは、施設および連邦政府の実験動物の使用と管理に関する指針を十分に厳守することをもって承認された。
【０１８１】
結果
【０１８２】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏの細胞増殖。２種の異なるＴＮＢＣ細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＳＵＭ１５９）において、数種類のカルシウムチャネルアンタゴニストの抗増殖有効性を実証した。結果は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（図１５Ａ、図１５Ｂ、図１５Ｃ、図１５Ｄ、図１５Ｅおよび図１５Ｆ）およびＳＵＭ１５９（図１６Ａ、図１６Ｂ、図１６Ｃ、図１６Ｄ、図１６Ｅおよび図１６Ｆ）の両方において、アムロジピン、フェロジピン、ラシジピン、ニカルジピン、ニバルジピンおよびアゼルニジピンによる処置後に、増殖の用量依存性減少を示した。これらの図面において、増殖減少のパーセンテージは、バーの上に示す。
【０１８３】
動物研究。ＴＮＢＣのｉｎ  ｖｉｖｏモデルから得られたデータは、アムロジピン（１０ｍｇ／ｋｇ）の投与が、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＳＵＭ１５９同所性腫瘍の成長を制限することができることを示した（それぞれ図１７Ａおよび図１７Ｂ）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ結果から同定された最も有効なアンタゴニスト（アムロジピン、フェロジピン、ラシジピン、ニバルジピンおよびアゼルニジピン）を、ＴＮＢＣの適した動物モデル（例えば、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＳＵＭ１５９を含む）におけるｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍活性に関して検査することもできる。ほぼ２０ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．の用量を有効範囲内であるとみなした。
【０１８４】
参考文献：
次の参考文献は、本明細書に表記されているものを補足する例示的な手順上のまたは他の詳細を提供する程度まで、これらの全体が参照により本明細書に特に組み込まれる：
【表１−１】
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【表１−２】
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【表１−３】
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【表１−４】
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【表１−５】
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【表１−６】
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【表１−７】
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【表１−８】
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【表１−９】
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【０１８５】
本明細書に記載されている実施例および実施形態が、単なる説明目的のものであり、それを踏まえた様々な修正または変更が、当業者に示唆され、本願および添付の特許請求の範囲の精神および範囲内に含まれるべきであることを理解されたい。本明細書に引用されているあらゆる参考文献（刊行物、特許出願および特許を含む）は、各参考文献が、参照により組み込まれることが個々にかつ特に示され、本明細書にその全体が表記されているのと同じ程度まで、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書における値の範囲の列挙は、本明細書において他に断りがなければ、該範囲内に収まる別々の値のそれぞれを個々に指す簡単な方法として役立つことが単に企図されており、別々の値のそれぞれは、本明細書に個々に列挙されているかのように、本明細書に組み込まれている。
【０１８６】
要素（単数または複数）を参照した、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」または「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」等の用語を使用した、本発明のいずれかの態様または実施形態の本明細書における記載は、他に断りがなければ、または文脈と明らかに矛盾しなければ、該特定の要素（単数または複数）「からなる」、「から本質的になる」または「を実質的に含む」本発明の同様の態様または実施形態のための支持を提供することが企図される（例えば、特定の要素を含むと本明細書に記載されている組成物は、他に断りがなければ、または文脈と明らかに矛盾しなければ、該要素からなる組成物も記載すると理解されたい）。
【０１８７】
本明細書に開示および請求されている組成物および方法は全て、本開示を踏まえて過度な実験法を用いることなく、作製および実行することができる。実例的な実施形態の観点から本発明の組成物および方法を本明細書に記載してきたが、当業者には、本発明の精神、範囲および概念から逸脱することなく、組成物、方法および／または方法のステップもしくはステップの順番に変種を適用してよいことが明らかであろう。より詳細には、化学的および／または生理的に関連するある特定の化合物を、依然として同じまたは同様の結果を達成しながら、本明細書に記載されている化合物のうち１種または複数に置き換えてよいことが明らかであろう。関連技術分野の当業者の１名または複数にとって明らかな、あらゆるかかる置き換えおよび／または修正は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の精神、範囲および概念内であるとみなされる。
【図１Ａ−Ｄ】
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【図１Ｅ−Ｆ】
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【図２Ａ−Ｃ】
2020128445.tif 000013
【図２Ｄ−Ｆ】
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【図３Ａ−Ｄ】
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【図３Ｅ−Ｇ】
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【図３Ｈ−Ｊ】
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【図４Ａ−Ｂ】
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【図４Ｃ−Ｄ】
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【図５Ａ−Ｃ】
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【図５Ｄ−Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図６Ａ−Ｃ】
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【図６Ｄ−Ｅ】
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【図７Ａ−Ｂ】
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【図８Ａ−Ｂ】
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【図９Ａ−Ｂ】
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【図９Ｃ−Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図１０Ａ−Ｃ】
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【図１０Ｄ−Ｆ】
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【図１０Ｇ】
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【図１１Ａ−Ｅ】
2020128445.tif 000033
【図１１Ｆ−Ｉ】
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【図１２Ａ−Ｂ】
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【図１２Ｃ−Ｄ】
2020128445.tif 000036
【図１３Ａ−Ｂ】
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【図１３Ｃ−Ｅ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ−Ｄ】
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【図１４Ｅ−Ｆ】
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【図１５Ａ−Ｆ】
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【図１６Ａ−Ｆ】
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【図１７Ａ−Ｂ】
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【図１８Ａ−Ｂ】
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【図１９Ａ−Ｂ】
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【図２０Ａ−Ｂ】
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【図２０Ｃ−Ｄ】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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