(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒト対象における角膜ジストロフィー検出用反応混合物、及び角膜ジストロフィー検出方法を提供する。【解決手段】（Ａ）対象由来の生物学的サンプルから、第一ＴＧＦβＩ遺伝子配列を増幅しそして決定するための、少なくとも１つの第一増幅プライマー対と；（Ｂ）少なくとも４つの検出プローブのセットと；を含む、ヒト対象における角膜ジストロフィー検出用反応混合物であって、前記少なくとも４つの検出プローブのセットは、第一標識検出プローブ、第二標識検出プローブ、第三標識検出プローブ、及び第四標識検出プローブを含み、それぞれ、特定の配列からなる核酸配列を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）基材の先端に付着した対象の上皮細胞を提供することと；
（Ｂ）前記基材に付着した細胞を溶解する溶解液中で、前記基材の前記先端を撹拌することと；
（Ｃ）前記撹拌すること（Ｂ）が完了するとすぐに、前記溶解液から前記基材を除去することと；
（Ｄ）前記除去すること（Ｃ）の後に前記溶解液をインキュベートすることと；
（Ｅ）前記溶解液からゲノムＤＮＡを単離してｇＤＮＡ溶液を形成することと；
（Ｆ）少なくとも２つのオリゴヌクレオチドプライマー対及び前記ｇＤＮＡ溶液を使用して、ＴＧＦβＩ遺伝子中に存在する少なくとも２つのヌクレオチドの同一性を決定することと；
を含む、対象由来のサンプルにおける、角膜ジストロフィーに関連する少なくとも２つのゲノムのアレルの検出方法であって、
前記少なくとも２つのヌクレオチドは、角膜ジストロフィーに関連するそれぞれの独立した一塩基多型（ＳＮＰ）に相当するＴＧＦβＩ遺伝子のそれぞれの独立した位置に位置している、前記方法。
【請求項２】
ＴＧＦβＩ遺伝子中に存在する前記少なくとも２つのヌクレオチドは、ヒトゲノムにおいて、少なくとも１つのヌクレオチドにより分離されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも２つのオリゴヌクレオチドプライマー対の少なくとも１対は、配列番号１を含むヌクレオチド配列を有するフォワードＰＣＲプライマー及び配列番号２を含むヌクレオチド配列を有するリバースＰＣＲプライマーを含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
前記少なくとも２つのオリゴヌクレオチドプライマー対の少なくとも１対は、配列番号４３を含むヌクレオチド配列を有するフォワードＰＣＲプライマー及び配列番号４４を含むヌクレオチド配列を有するリバースＰＣＲプライマーを含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記少なくとも２つのオリゴヌクレオチドプライマー対は、第一増幅プライマー対及び第二増幅プライマー対を含み、
前記第一増幅プライマー対は、配列番号１を含むヌクレオチド配列を有するフォワードＰＣＲプライマー及び配列番号２を含むヌクレオチド配列を有するリバースＰＣＲプライマーを含み、そして、前記第二増幅プライマー対は、配列番号４３を含むヌクレオチド配列を有するフォワードＰＣＲプライマー及び配列番号４４を含むヌクレオチド配列を有するリバースＰＣＲプライマーを含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記決定すること（Ｆ）が、
（ｉ）配列番号２５を含むヌクレオチド配列を有する第一野生型検出プローブ、及び配列番号２６、配列番号４８、又は配列番号４９を含むヌクレオチド配列を有する第一変異型検出プローブと；
（ｉｉ）配列番号４５又は配列番号４７を含むヌクレオチド配列を有する第二野生型検出プローブ、及び配列番号４６又は配列番号５０を含むヌクレオチド配列を有する第二変異型検出プローブと；
を使用することをさらに含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
（Ａ）少なくとも１つの第一増幅プライマー対及び少なくとも１つの第二増幅プライマー対を含む反応混合液を使用して、ヒト対象由来の生物学的サンプルから、第１２４位アミノ酸残基をコードするヌクレオチドを含む第一ＴＧＦβＩ遺伝子配列及び第５５５位アミノ酸残基をコードするヌクレオチドを含む第二ＴＧＦβＩ遺伝子配列を含む、少なくとも２つのＴＧＦβＩ遺伝子配列を増幅することと；
（Ｂ）第一検出オリゴヌクレオチドプローブ対の第一検出プローブを前記第一ＴＧＦβＩ遺伝子配列にハイブリダイズすることと；
（Ｃ）第二検出オリゴヌクレオチドプローブ対の第二検出プローブを前記第二ＴＧＦβＩ遺伝子配列にハイブリダイズすることと；
（Ｄ）前記第一検出オリゴヌクレオチドプローブ対及び前記第二検出オリゴヌクレオチドプローブ対を含む少なくとも２つの検出プローブ対の使用に基づいて、前記第一ＴＧＦβＩ遺伝子配列及び／又は前記第二ＴＧＦβＩ遺伝子配列中の、１又はそれ以上の変異を検出することと；
を含む、角膜ジストロフィーの検出方法。
【請求項８】
前記第一ＴＧＦβＩ遺伝子配列及び／又は前記第二ＴＧＦβＩ遺伝子配列中の前記１又はそれ以上の変異を検出することが、前記第一ＴＧＦβＩ遺伝子配列及び／又は前記第二ＴＧＦβＩ遺伝子配列中の２又はそれ以上の変異を検出することを含み、そして前記２又はそれ以上の変異は、ヒトゲノムにおいて、少なくとも１つのヌクレオチドにより分離されている、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記少なくとも第一増幅プライマー対が、第一増幅プライマー及び第二増幅プライマーを含み、前記第一増幅プライマーが、配列番号１のヌクレオチド配列を含み、そして前記第二増幅プライマーが、配列番号２のヌクレオチド配列を含む、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
前記少なくとも第二増幅プライマー対が、第三増幅プライマー及び第四増幅プライマーを含み、前記第三増幅プライマーが、配列番号４３のヌクレオチド配列で表され、そして前記第四増幅プライマーが、配列番号４４のヌクレオチド配列で表される、請求項７〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記第一増幅プライマー対が、第一増幅プライマー及び第二増幅プライマーを含み、
前記第一増幅プライマーが、配列番号１のヌクレオチド配列を含み、
前記第二増幅プライマーが、配列番号２のヌクレオチド配列を含み、
前記第二増幅プライマー対が、第三増幅プライマー及び第四増幅プライマーを含み、
前記第三増幅プライマーが、配列番号４３のヌクレオチド配列を含み、そして
前記第四増幅プライマーが、配列番号４４のヌクレオチド配列を含む、
請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１２】
前記１又はそれ以上の変異のうちの１つは、コードされたＴＧＦＢＩタンパク質における、第１２４位アミノ酸での、システインに変異したアルギニン（Ｒ１２４Ｃ）、ヒスチジンに変異したアルギニン（Ｒ１２４Ｈ）、及び／又はロイシンに変異したアルギニン（Ｒ１２４Ｌ）に相当する、請求項７〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記１又はそれ以上の変異のうちの１つは、コードされたＴＧＦＢＩタンパク質における、第５５５位アミノ酸での、トリプトファンに変異したアルギニン（Ｒ５５５Ｗ）、及び／又はグルタミンに変異したアルギニン（Ｒ５５５Ｑ）に相当する、請求項７〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記少なくとも２つの検出オリゴヌクレオチドプローブ対の各々が、それぞれ、第一検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第二検出オリゴヌクレオチドプローブを含み、前記第一検出オリゴヌクレオチドプローブ及び前記第二検出オリゴヌクレオチドプローブが、配列番号２５〜２６、配列番号２５及び４８、配列番号２５及び４９、配列番号２７〜２８、配列番号２９〜３０、配列番号３１〜３２、配列番号３３〜３４、配列番号３５〜３６、配列番号３７〜３８、配列番号３９〜４０、配列番号４１〜４２、配列番号４５〜４６及び配列番号４６〜４７、配列番号４５及び５０、並びに配列番号４７及び５０から成る群からそれぞれ選択されるヌクレオチド配列対を含む、請求項７〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記第一検出オリゴヌクレオチドプローブ対が、第一検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第二検出オリゴヌクレオチドプローブを含み、前記第一検出オリゴヌクレオチドプローブ及び前記第二検出オリゴヌクレオチドプローブは、それぞれ、配列番号２５及び配列番号２６のヌクレオチド配列対を含む、請求項７〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記第二検出オリゴヌクレオチドプローブ対が、第三検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第四検出オリゴヌクレオチドプローブを含み、前記第三検出オリゴヌクレオチドプローブ及び前記第四検出オリゴヌクレオチドプローブが、それぞれ、配列番号４５及び配列番号４６のヌクレオチド配列対を含む、請求項７〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記第二検出オリゴヌクレオチドプローブ対が、第三検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第四検出オリゴヌクレオチドプローブを含み、前記第三検出オリゴヌクレオチドプローブ及び前記第四検出オリゴヌクレオチドプローブが、それぞれ、配列番号４７及び配列番号４６のヌクレオチド配列対を含む、請求項７〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記第二検出オリゴヌクレオチドプローブ対が、第三検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第四検出オリゴヌクレオチドプローブを含み、前記第三検出オリゴヌクレオチドプローブ及び前記第四検出オリゴヌクレオチドプローブが、それぞれ、配列番号２５及び配列番号４８のヌクレオチド配列対を含む、請求項７〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記第二検出オリゴヌクレオチドプローブ対が、第三検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第四検出オリゴヌクレオチドプローブを含み、前記第三検出オリゴヌクレオチドプローブ及び前記第四検出オリゴヌクレオチドプローブが、それぞれ、配列番号２５及び配列番号４９のヌクレオチド配列対を含む、請求項７〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記第二検出オリゴヌクレオチドプローブ対が、第三検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第四検出オリゴヌクレオチドプローブを含み、前記第三検出オリゴヌクレオチドプローブ及び前記第四検出オリゴヌクレオチドプローブが、それぞれ、配列番号４５及び配列番号５０のヌクレオチド配列対を含む、請求項７〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記第二検出オリゴヌクレオチドプローブ対が、第三検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第四検出オリゴヌクレオチドプローブを含み、前記第三検出オリゴヌクレオチドプローブ及び前記第四検出オリゴヌクレオチドプローブが、それぞれ、配列番号４７及び配列番号５０のヌクレオチド配列対を含む、請求項７〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記第一検出プローブが、第一標識に結合しており、そして前記第二検出プローブが、第二標識に結合している、請求項７〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記第一標識が、ＶＩＣであり、そして前記第二標識が、ＦＡＭである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ハイブリダイズすること（Ｂ）及び前記ハイブリダイズすること（Ｃ）が、同じ溶液中で同時に実行される、請求項７に記載の方法。
【請求項２５】
前記ハイブリダイズすること（Ｂ）及び前記ハイブリダイズすること（Ｃ）が、同じ溶液中又は異なる溶液中で同時に又は異なる時間に実行される、請求項７に記載の方法。
【請求項２６】
（Ａ）（１）対象由来の生物学的サンプルから、第１２４位アミノ酸残基をコードするヌクレオチドを含む、少なくとも２つのＴＧＦβＩ遺伝子配列の第一ＴＧＦβＩ遺伝子配列を、及び（２）対象由来の生物学的サンプルから、第５５５位アミノ酸残基をコードするヌクレオチドを含む、少なくとも２つのＴＧＦβＩ遺伝子配列の第二ＴＧＦβＩ遺伝子配列を、増幅しそして決定するための、第一増幅プライマー対及び第二増幅プライマー対の少なくとも１つと；
（Ｂ）少なくとも２つの検出プローブ対と；
を含む、ヒト対象における角膜ジストロフィー検出用反応混合物であって、前記少なくとも２つの検出プローブ対の各々における検出プローブが、前記少なくとも２つのＴＧＦβＩ遺伝子配列の少なくとも１つとハイブリダイズする、前記反応混合物。
【請求項２７】
前記第一増幅プライマー対が、第一増幅プライマー及び第二増幅プライマーを含み、前記第一増幅プライマーが、配列番号１のヌクレオチド配列を含み、そして、前記第二増幅プライマーが、配列番号２のヌクレオチド配列を含む、請求項２６に記載の反応混合物。
【請求項２８】
前記第二増幅プライマー対が、第三増幅プライマー及び第四増幅プライマーを含み、前記第三増幅プライマーが、配列番号４３のヌクレオチド配列を含み、そして、前記第四増幅プライマーが、配列番号４４のヌクレオチド配列を含む、請求項２６又は２７に記載の反応混合物。
【請求項２９】
前記少なくとも２つの検出プローブ対の少なくとも１つが使用され、コードされたＴＧＦＢＩタンパク質における、第１２４位アミノ酸での、システインに変異したアルギニン（Ｒ１２４Ｃ）、ヒスチジンに変異したアルギニン（Ｒ１２４Ｈ）、及び／又はロイシンに変異したアルギニン（Ｒ１２４Ｌ）に相当する変異を検出する、請求項２６〜２８のいずれか一項に記載の反応混合物。
【請求項３０】
前記少なくとも２つの検出プローブ対の少なくとも１つが使用され、コードされたＴＧＦＢＩタンパク質における、第５５５位アミノ酸での、トリプトファンに変異したアルギニン（Ｒ５５５Ｗ）、及び／又はグルタミンに変異したアルギニン（Ｒ５５５Ｑ）に相当する変異を検出する、請求項２６〜２９のいずれか一項に記載の反応混合物。
【請求項３１】
前記少なくとも２つの検出プローブ対のそれぞれの検出プローブ対が、それぞれ、第一検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第二検出オリゴヌクレオチドプローブを含み、前記第一検出オリゴヌクレオチドプローブ及び前記第二検出オリゴヌクレオチドプローブは、配列番号２５〜２６、配列番号２５及び４８、配列番号２５及び４９、配列番号２７〜２８、配列番号２９〜３０、配列番号３１〜３２、配列番号３３〜３４、配列番号３５〜３６、配列番号３７〜３８、配列番号３９〜４０、配列番号４１〜４２、配列番号４５〜４６及び配列番号４６〜４７、配列番号４５及び５０、並びに配列番号４７及び５０から成る群からそれぞれ選択されるヌクレオチド配列対を含む、請求項２６〜３０のいずれか一項に記載の反応混合物。
【請求項３２】
前記少なくとも２つの検出プローブ対の１つが、第一検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第二検出オリゴヌクレオチドプローブを含み、前記第一検出オリゴヌクレオチドプローブ及び前記第二検出オリゴヌクレオチドプローブが、それぞれ、配列番号２５及び配列番号２６のヌクレオチド配列対を含む、請求項２６〜３１のいずれか一項に記載の反応混合物。
【請求項３３】
前記少なくとも２つの検出プローブ対の１つが、第一検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第二検出オリゴヌクレオチドプローブを含み、前記第一検出オリゴヌクレオチドプローブ及び前記第二検出オリゴヌクレオチドプローブが、それぞれ、配列番号４５及び配列番号４６のヌクレオチド配列対を含む、請求項２６〜３２のいずれか一項に記載の反応混合物。
【請求項３４】
前記少なくとも２つの検出プローブ対の１つが、第一検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第二検出オリゴヌクレオチドプローブを含み、前記第一検出オリゴヌクレオチドプローブ及び前記第二検出オリゴヌクレオチドプローブが、それぞれ、配列番号４７及び配列番号４６のヌクレオチド配列対を含む、請求項２６〜３２のいずれか一項に記載の反応混合物。
【請求項３５】
前記少なくとも２つの検出プローブ対の１つが、第一検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第二検出オリゴヌクレオチドプローブを含み、前記第一検出オリゴヌクレオチドプローブ及び前記第二検出オリゴヌクレオチドプローブが、それぞれ、配列番号２５及び配列番号４８のヌクレオチド配列対を含む、請求項２６〜３４のいずれか一項に記載の反応混合物。
【請求項３６】
前記少なくとも２つの検出プローブ対の１つが、第一検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第二検出オリゴヌクレオチドプローブを含み、前記第一検出オリゴヌクレオチドプローブ及び前記第二検出オリゴヌクレオチドプローブが、それぞれ、配列番号２５及び配列番号４９のヌクレオチド配列対を含む、請求項２６〜３５のいずれか一項に記載の反応混合物。
【請求項３７】
前記少なくとも２つの検出プローブ対の１つが、第一検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第二検出オリゴヌクレオチドプローブを含み、前記第一検出オリゴヌクレオチドプローブ及び前記第二検出オリゴヌクレオチドプローブが、それぞれ、配列番号４５及び配列番号５０のヌクレオチド配列対を含む、請求項２４〜３６のいずれか一項に記載の反応混合物。
【請求項３８】
前記少なくとも２つの検出プローブ対の１つが、第一検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第二検出オリゴヌクレオチドプローブを含み、前記第一検出オリゴヌクレオチドプローブ及び前記第二検出オリゴヌクレオチドプローブが、それぞれ、配列番号４７及び配列番号５０のヌクレオチド配列対を含む、請求項２４〜３６のいずれか一項に記載の反応混合物。
【請求項３９】
前記少なくとも２つの検出プローブの第一検出プローブが、第一標識に結合しており、そして前記少なくとも２つの検出プローブの第二検出プローブが、第二標識に結合している、請求項２６〜３８のいずれか一項に記載の反応混合物。
【請求項４０】
前記第一標識が、ＶＩＣであり、そして前記第二標識が、ＦＡＭである、請求項３９に記載の反応混合物。
【請求項４１】
（Ａ）対象由来の生物学的サンプルから、ＴＧＦβＩ遺伝子配列を増幅しそして決定するための、少なくとも１つの第一増幅プライマー対と；
（Ｂ）少なくとも３つの検出プローブのセットと；
を含む、ヒト対象における角膜ジストロフィー検出用反応混合物であって、前記少なくとも３つの検出プローブのセットのうちの１つの検出プローブが、前記ＴＧＦβＩ遺伝子配列に曝露された場合に、前記ＴＧＦβＩ遺伝子配列にハイブリダイズする、前記反応混合物。
【請求項４２】
前記ＴＧＦβＩ遺伝子配列が、前記対象の前記生物学的サンプル由来の、第１２４位アミノ酸残基をコードするヌクレオチドを含む、請求項４１に記載の反応混合物。
【請求項４３】
前記少なくとも３つの検出プローブのセットが、配列番号２５〜４２及び４８〜４９からなる群から選択される少なくとも１つの検出プローブを含む、請求項４１又は４２に記載の反応混合物。
【請求項４４】
前記少なくとも３つの検出プローブのセットが、配列番号２５〜４２及び４８〜４９からなる群から選択される少なくとも２つ又はそれ以上の検出プローブを含む、請求項４１〜４３のいずれか一項に記載の反応混合物。
【請求項４５】
前記少なくとも３つの検出プローブのセットが、配列番号２５〜４２及び４８〜４９からなる群から選択される少なくとも３つ又はそれ以上の検出プローブを含む、請求項４１〜４４のいずれか一項に記載の反応混合物。
【請求項４６】
前記少なくとも３つの検出プローブのセットが、配列番号２５の第一検出プローブ及び配列番号２６の第二検出プローブを含む、請求項４１〜４５のいずれか一項に記載の反応混合物。
【請求項４７】
前記少なくとも３つの検出プローブのセットが、配列番号４８及び配列番号４９からなる群から選択される第三検出プローブを含む、請求項４６に記載の反応混合物。
【請求項４８】
前記少なくとも３つの検出プローブのセットが、第三検出プローブとは異なりそして配列番号４８及び配列番号４９からなる群から選択される第四検出プローブを含む、請求項４７に記載の反応混合物。
【請求項４９】
前記少なくとも３つの検出プローブのセットが、配列番号２６及び４８〜４９からなる群から選択される少なくとも２つ又はそれ以上の検出プローブを含む、請求項４１〜４５のいずれか一項に記載の反応混合物。
【請求項５０】
前記第一増幅プライマー対が、第一増幅プライマー及び第二増幅プライマーを含み、前記第一増幅プライマーが、配列番号１のヌクレオチド配列を含み、そして前記第二増幅プライマーが、配列番号２のヌクレオチド配列を含む、請求項４１〜４９のいずれか一項に記載の反応混合物。
【請求項５１】
（Ｃ）前記生物学的サンプルから第二ＴＧＦβＩ遺伝子配列を増幅しそして決定するための少なくとも１つの第二増幅プライマー対と；
（Ｄ）少なくとも３つの検出プローブの第二セットと；
をさらに含み、前記少なくとも３つの検出プローブの第二セットのうちの１つの検出プローブが、前記第二ＴＧＦβＩ遺伝子配列に曝露された場合に、前記第二ＴＧＦβＩ遺伝子配列にハイブリダイズする、請求項４１〜５０のいずれか一項に記載の反応混合物。
【請求項５２】
前記第二ＴＧＦβＩ遺伝子配列が、前記対象の前記生物学的サンプル由来の、第５５５位アミノ酸残基をコードするヌクレオチドを含む、請求項５１に記載の反応混合物。
【請求項５３】
前記少なくとも３つの検出プローブの第二セットが、配列番号４５〜４７及び５０からなる群から選択される少なくとも１つの検出プローブを含む、請求項５１又は５２に記載の反応混合物。
【請求項５４】
前記少なくとも３つの検出プローブの第二セットが、配列番号４５〜４７及び５０からなる群から選択される少なくとも２つ又はそれ以上の検出プローブを含む、請求項５１〜５３のいずれか一項に記載の反応混合物。
【請求項５５】
前記少なくとも３つの検出プローブの第二セットが、配列番号４５〜４７及び５０からなる群から選択される少なくとも３つ又はそれ以上の検出プローブを含む、請求項５１〜５４のいずれか一項に記載の反応混合物。
【請求項５６】
前記少なくとも３つの検出プローブの第二セットが、配列番号４５又は配列番号４７である第一検出プローブ、配列番号４６である第二検出プローブ、及び配列番号５０である第三検出プローブを含む、請求項５１〜５５のいずれか一項に記載の反応混合物。
【請求項５７】
前記第二増幅プライマー対が、第三増幅プライマー及び第四増幅プライマーを含み、前記第三増幅プライマーが、配列番号４３のヌクレオチド配列を含み、そして前記第四増幅プライマーが、配列番号４４のヌクレオチド配列を含む、請求項５１〜５６のいずれか一項に記載の反応混合物。
【請求項５８】
前記ＴＧＦβＩ遺伝子配列が、前記対象の前記生物学的サンプル由来の、第５５５位アミノ酸残基をコードするヌクレオチドを含む、請求項４１に記載の反応混合物。
【請求項５９】
前記少なくとも３つの検出プローブのセットが、配列番号４５〜４７及び５０からなる群から選択される少なくとも１つの検出プローブを含む、請求項４１又は５８に記載の反応混合物。
【請求項６０】
前記少なくとも３つの検出プローブのセットが、配列番号４５〜４７及び５０からなる群から選択される少なくとも２つ又はそれ以上の検出プローブを含む、請求項４１及び５８〜５９のいずれか一項に記載の反応混合物。
【請求項６１】
前記少なくとも３つの検出プローブのセットが、配列番号４５〜４７及び５０からなる群から選択される少なくとも３つ又はそれ以上の検出プローブを含む、請求項４１及び５８〜６０のいずれか一項に記載の反応混合物。
【請求項６２】
前記少なくとも３つの検出プローブのセットが、配列番号４５又は配列番号４７である第一検出プローブ、配列番号４６である第二検出プローブ、及び配列番号５０である第三検出プローブを含む、請求項４１及び５８〜６１のいずれか一項に記載の反応混合物。
【請求項６３】
（Ａ−１）少なくとも１つの第一増幅プライマー対及び少なくとも３つの検出プローブのセットを含む反応混合物を使用して、ヒト対象の生物学的サンプルから、第一ＴＧＦβＩ遺伝子配列を増幅することと；
（Ｂ−１）少なくとも３つの検出プローブのセットの第一検出プローブを前記第一ＴＧＦβＩ遺伝子配列にハイブリダイズすることと；
（Ｃ−１）（ｉ）前記少なくとも３つの検出プローブのセットの前記第一検出プローブの、前記第一ＴＧＦβＩ遺伝子配列へのハイブリダイゼーション、並びに（ｉｉ）第一ＴＧＦβＩ遺伝子配列にハイブリダイズするための、前記少なくとも３つの検出プローブのセットの第二及び第三検出プローブの不成功、に基づいて、前記第一ＴＧＦβＩ遺伝子配列中の変異を検出することと；
を含む、角膜ジストロフィー検出方法。
【請求項６４】
前記反応混合物が、請求項４１〜５０及び５８〜６２のいずれか一項に記載の反応混合物を含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
（Ａ−２）同じ反応混合物を使用して、前記生物学的サンプルから、第二ＴＧＦβＩ遺伝子配列を増幅することと、ここで、前記反応混合物は、少なくとも１つの第二増幅プライマー対及び少なくとも３つの検出プローブの第二セットを含ものとし；
（Ｂ−２）前記少なくとも３つの検出プローブの第二セットの第一検出プローブを前記第二ＴＧＦβＩ遺伝子配列にハイブリダイズすることと；
（Ｃ−２）（ｉ）前記少なくとも３つの検出プローブの第二セットの前記第一検出プローブの、第二ＴＧＦβＩ遺伝子配列へのハイブリダイゼーション、並びに（ｉｉ）前記第二ＴＧＦβＩ遺伝子配列にハイブリダイズするための、前記少なくとも３つの検出プローブの第二セットの第二検出プローブ及び第三検出プローブの不成功、に基づいて、前記第二ＴＧＦβＩ遺伝子配列中の変異を検出することと；
をさらに含む、請求項６３又は６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記反応混合物が、請求項５１〜５７のいずれか一項に記載の反応混合物を含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記増幅すること（Ａ−１）、前記増幅すること（Ａ−２）、前記ハイブリダイズすること（Ｂ−１）、前記ハイブリダイズすること（Ｂ−２）、前記検出すること（Ｃ−１）、及び前記検出すること（Ｃ−２）が、前記生物学的サンプルの同じアリコートを用いて実行される、請求項６５又は６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記第一ＴＧＦβＩ遺伝子配列を増幅すること（Ａ−１）及び前記第二ＴＧＦβＩ遺伝子配列を増幅すること（Ａ−２）が、同時に実行される、請求項６５〜６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
前記ハイブリダイズすること（Ｂ−１）及び前記ハイブリダイズすること（Ｂ−２）が、同時に実行される、請求項６５〜６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
前記検出すること（Ｃ−１）及び前記検出すること（Ｃ−２）が、同時に実行される、請求項６５〜６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
ヒト対象におけるヘテロ接合性角膜ジストロフィーの検出を通して、前記対象におけるレーザー眼科手術後の合併症のリスクを予測するための、請求項７〜７０のいずれかに記載の反応混合物の使用。
【請求項７２】
前記レーザー眼科手術が、レーシック及びエキシマレーザー手術のうちの１つを含む、請求項７１に記載の使用。
【請求項７３】
（Ａ）基材の先端に付着したヒト対象の上皮細胞を提供することと；
（Ｂ）前記基材に付着した細胞を溶解する溶解液中で前記基材の前記先端を撹拌することと；
（Ｃ）前記撹拌すること（Ｂ）が完了するとすぐに、前記溶解液から前記基材を除去することと；
（Ｄ）前記除去すること（Ｃ）の後に、前記溶解液をインキュベートすることと；
（Ｅ）前記溶解液からゲノムＤＮＡを単離して、ｇＤＮＡ溶液を形成することと；
（Ｆ）少なくとも１つの第一プライマー対、少なくとも３つの検出プローブのセット、及び前記ｇＤＮＡ溶液を使用して、前記ｇＤＮＡ溶液を前記少なくとも３つの検出プローブに同時に曝露することにより、ＴＧＦβＩ遺伝子中に存在する少なくとも１つのヌクレオチドの同一性を決定することと；
を含む、ヒト対象由来のサンプルにおける角膜ジストロフィーに関連するゲノム変異の検出方法であって、
前記少なくとも１つのヌクレオチドが、角膜ジストロフィーに関連する一塩基多型（ＳＮＰ）に相当する前記ＴＧＦβＩ遺伝子の特定の位置に位置し、そして、
前記少なくとも３つの検出プローブのセットのうち少なくとも２つの検出プローブの各々が、前記ＴＧＦβＩ遺伝子の特定の位置の異なる変異を検出するように設計されている、前記方法。
【請求項７４】
（Ｇ）少なくとも１つの第二プライマー対、少なくとも３つの検出プローブの第二セット、及び前記ｇＤＮＡ溶液を使用して、前記ｇＤＮＡ溶液を前記少なくとも３つの検出プローブのセット及び前記少なくとも３つの検出プローブの第二セットに同時に曝露することにより、前記ＴＧＦβＩ遺伝子中に存在する少なくとも１つの第二ヌクレオチドの同一性を決定すること
をさらに含み、
前記少なくとも１つの第二ヌクレオチドが、前記少なくとも１つのヌクレオチドの位置から独立している、角膜ジストロフィーに関連する第二一塩基多型（ＳＮＰ）に相当するＴ前記ＧＦβＩ遺伝子の第二の特定の位置に位置しており、そして、
前記少なくとも３つの検出プローブの前記第二セットのうちの少なくとも２つの検出プローブが、前記ＴＧＦβＩ遺伝子の前記第二の特定の位置のそれぞれの変異を検出するように設計されている、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記決定すること（Ｆ）及び前記決定すること（Ｇ）が、同時に実行される、請求項７５に記載の方法。
【請求項７６】
前記決定すること（Ｆ）及び前記決定すること（Ｇ）が、同じｇＤＮＡ溶液を使用して実行される、請求項７４又は７５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、全体として疾患関連の遺伝子アレルの単離及び検出方法に関する。特に、本出願は、アベリノ角膜ジストロフィーに関連するアレルの改良された検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
リアルタイムＰＣＲは、実質的に同一の配列を有する核酸配列間の相違を検出するために使用されることができる。示差的に標識された蛍光核酸プローブ、例えば、一方は野生型配列に結合しそして一方は変異体配列に結合するものの使用により、ヒトのゲノムにおける単一ヌクレオチドの変化を迅速かつ確実に検出することができる。この解決力は、一塩基多型（ＳＮＰ）、すなわち、タンパク質のコード配列及び／又は非コード配列内に見出される単一の塩基変化がヒト疾患と相関している医学的診断に適用されている。
【０００３】
しかし、リアルタイムＰＣＲ分析は、高品質のサンプルの収集及び単離に大きく依存する。質の悪いサンプル収集及び／又は単離は、より長いアッセイ条件及びリアルタイムＰＣＲ試薬のより多い使用を必要とし、その両方がコスト増加及び生産性の低下につながる。また、リアルタイムＰＣＲの一塩基多型検出アッセイの失敗は、追加サンプルを収集する必要性をもたらす可能性があり、それは時間と資源においてさらに大きな損失を引き起こす。
【０００４】
従って、アッセイの全体的な成功率を向上させる、改良されたサンプル収集及び単離をもたらす方法は、アッセイに必要な試薬を削減し、そして後になってからの追加のサンプル収集の必要性を減少し、非常に望ましい。また、サンプル材料のより少ない量でリアルタイムＰＣＲ ＳＮＰ検出アッセイを実施するための方法もまた、高品質サンプルの収集及び単離に伴う課題を減少させる。
【０００５】
角膜ジストロフィーは、最初に患者の角膜の中央に視力障害を呈する、常染色体優性遺伝性疾患であることがある。視力障害は角膜の周辺部に向かって広がり、年齢が上がるにつれて、患者の視力を悪化させる。アベリノ角膜ジストロフィー、果粒状角膜ジストロフィー、格子状１型角膜ジストロフィー、ティール−ベンケ、及びレイス・バックラー角膜ジストロフィー（Reis-bucklers corneal dystrophy）を含む、複数の種類の角膜ジストロフィーの特徴付けがされている。角膜ジストロフィーは、少なくともいくつかのケースでは、βＩＧ−Ｈ３タンパク質（ＴＧＦβＩタンパク質、ＴＧＦＢＩタンパク質、及びケラトエピセリン（keratoepithelin）としても知られている）をコードするトランスフォーム増殖因子β誘導（transforming growth factor beta induced）（ＴＧＦβＩとも略される）遺伝子の変異により引き起こされることが知られている。
【０００６】
アベリノ角膜ジストロフィーを患うヘテロ接合患者は、年齢とともに視力の喪失を増加させており、人生の晩年において重症化する（severe in the later years of life）。対照的に、ホモ接合の患者は、６歳までに深刻さを示し、視力の損失を完了する。アベリノ角膜ジストロフィーは、角膜ジストロフィーの特殊な種類として１９８８年頃に最初に認識された。その前は、顆粒状角膜ジストロフィーとして誤分類されがちであった。今日では、アベリノ角膜ジストロフィーは、世界中で最も一般的な間質角膜ジストロフィーの形態であることが知られている。韓国では、アベリノ角膜ジストロフィーは、おおよそ８７０人に１人の有病率（prevalence）を有すると考えられている（Lee, J. H. et al., Ophthalmic Epidemiol., 17:160, 2010参照; Holland, E. J. et al., Ophthalmology, 99:1564, 1992; Kennedy, S. M. et al., Br. J. Ophthalmol., 80:489, 1996; Dolmetsch, A. M. et al., Can. J. Ophthalmol., 31:29, 1996; Afshari, N. A. et al., Arch. Ophthalmol., 119:16, 2001; Stewart, H. S. Hum. Mutat., 14:126, 1999も参照）。
【０００７】
これまでに、（例えば、野生型βＩＧ−Ｈ３アレル１つと変異体βＩＧ−Ｈ３アレル１つとを有する）ヘテロ接合個体は、レーシック手術後の視力喪失の加速に対して非常に影響を受けやすいことが発見されている。特に、手術２年後の角膜の不透明度（opacity）の増加が、これらの悪性が深刻化している（increasing aggressiveness）患者で確認され、最終的には、視力の完全な喪失をもたらす（Jun, R. M. et al., Opthalmology, 111:463, 2004）。以前は、目の手術は、レーシック又はエキシマレーザー手術が角膜ジストロフィーを患う患者の視界の混濁（vision blurriness）を取り除くであろうことを期待して行われていた。レーシック手術の仮定の数３０万例について、アベリノ角膜ジストロフィーを患っているヘテロ接合患者の最小推定の１／１０００に基づくと、３００人がその視力を失っているであろう。レーシック手術を受けた患者は、主に生産活動を行っている２０歳代、３０歳代である。したがって、彼らの視力喪失は、社会と経済との両方に深刻なトラブルを引き起こす。
【０００８】
また、米国では２０００年のレーシック手術の承認後、レーシック手術を受けたアベリノ角膜ジストロフィーを患っているアフリカ系アメリカ人の患者が失明することが発見されており、これにより、世界中で多くの同様のケースが発生する可能性があることが推測される。
【０００９】
従って、レーシック手術によるアベリノ角膜ジストロフィーの進行を防止するためにアベリノ角膜ジストロフィーの正確な診断が必要とされるが、アベリノ角膜ジストロフィーの診断は、単に角膜混濁の顕微鏡的観察（例えば、細隙灯検査（slit-lamp examination））により行っており、したがって、多くの場合、医師が患者の潜在症状を見落とし、視力喪失をもたらすレーシック手術を実行する。従って、角膜ジストロフィーの迅速かつ正確な遺伝子診断が求められている。
【００１０】
アベリノ角膜ジストロフィーの原因であるβＩＧ−Ｈ３遺伝子における変異検出用ＤＮＡチップが開発された（韓国特許公開第１０−２００７−００７６５３２号公報）。しかし、ＤＮＡチップを使用するアベリノ角膜ジストロフィーの診断は、不利益なことに、サンプル中のＤＮＡを増幅する工程、ＤＮＡチップに増幅したＤＮＡをハイブリダイズする工程、ハイブリダイズされたＤＮＡチップを洗浄する工程、及び肯定的な応答を検出する工程を含む複数工程を必要とする。
【００１１】
前記背景を考慮すると、当該技術分野において必要とされるものは、角膜ジストロフィーに関連する多数の変異アレルの改良された検出方法である。
【発明の概要】
【００１２】
本開示は、ヒトの疾患に関連する１つ又はそれ以上のアレルの改良された検出方法を提供する。以下に記載する方法は、対象に関する医療情報を得るアッセイの実施に関連する時間と費用とを減少させる。例えば、いくつかの実施態様では、改良された方法は、患者に対して低い費用で、アベリノ角膜ジストロフィーに関連するゲノムマーカーの同日の検出（same-day detection）を可能にする。
【００１３】
いくつかの実施態様では、対象由来のサンプルにおける、角膜ジストロフィーに関連する１つ又はそれ以上のゲノムのアレルの改良された検出方法を提供し、この方法は、（Ａ）基材の先端に付着した対象の上皮細胞を提供することと；（Ｂ）基材に付着した細胞を溶解する溶解液中で、基材の先端を撹拌することと；（Ｃ）撹拌すること（Ｂ）が完了するとすぐに、溶解液から基材を除去することと；（Ｄ）除去すること（Ｃ）の後に溶解液をインキュベートすることと；（Ｅ）溶解液からゲノムＤＮＡを単離してｇＤＮＡ溶液を形成することと；（Ｆ）少なくとも２つのオリゴヌクレオチドプライマー対及びｇＤＮＡ溶液を使用して、ＴＧＦβＩ遺伝子中に存在する少なくとも２つのヌクレオチドの同一性を決定することとを含み、ここで、前記少なくとも２つのヌクレオチドは、角膜ジストロフィーに関連するそれぞれの独立した一塩基多型（ＳＮＰ）に相当するＴＧＦβＩ遺伝子のそれぞれの独立した位置に位置している。
【００１４】
いくつかの実施態様では、ＴＧＦβＩ遺伝子中に存在する少なくとも２つのヌクレオチドは、ヒトゲノムにおいて、少なくとも１つのヌクレオチドにより分離されている。
【００１５】
いくつかの実施態様では、少なくとも２つのオリゴヌクレオチドプライマー対の少なくとも１対は、配列番号１を含むヌクレオチド配列を有するフォワードＰＣＲプライマー及び配列番号２を含むヌクレオチド配列を有するリバースＰＣＲプライマーを含む。
【００１６】
いくつかの実施態様では、少なくとも２つのオリゴヌクレオチドプライマー対の少なくとも１対は、配列番号４３を含むヌクレオチド配列を有するフォワードＰＣＲプライマー及び配列番号４４を含むヌクレオチド配列を有するリバースＰＣＲプライマーを含む。
【００１７】
いくつかの実施態様では、少なくとも２つのオリゴヌクレオチドプライマー対は、第一増幅プライマー対及び第二増幅プライマー対を含む。第一増幅プライマー対は、配列番号１を含むヌクレオチド配列を有するフォワードＰＣＲプライマー及び配列番号２を含むヌクレオチド配列を有するリバースＰＣＲプライマーを含む。第二増幅プライマー対は、配列番号４３を含むヌクレオチド配列を有するフォワードＰＣＲプライマー及び配列番号４４を含むヌクレオチド配列を有するリバースＰＣＲプライマーを含む。
【００１８】
いくつかの実施態様では、決定すること（Ｆ）は、（ｉ）配列番号２５を含むヌクレオチド配列を有する第一野生型検出プローブ、及び配列番号２６、配列番号４８、又は配列番号４９を含むヌクレオチド配列を有する第一変異型検出プローブと、（ｉｉ）配列番号４５又は配列番号４７を含むヌクレオチド配列を有する第二野生型検出プローブ、及び配列番号４６又は配列番号５０を含むヌクレオチド配列を有する第二変異型検出プローブとを使用することをさらに含む。
【００１９】
いくつかの実施態様では、本開示は、角膜ジストロフィーの検出方法を提供し、この方法は、（Ａ）少なくとも１つの第一増幅プライマー対及び少なくとも１つの第二増幅プライマー対を含む反応混合液を使用して、ヒト対象由来の生物学的サンプルから、第１２４位アミノ酸残基をコードするヌクレオチドを含む第一ＴＧＦβＩ遺伝子配列及び第５５５位アミノ酸残基をコードするヌクレオチドを含む第二ＴＧＦβＩ遺伝子配列を含む少なくとも２つのＴＧＦβＩ遺伝子配列を増幅することと；（Ｂ）第一検出オリゴヌクレオチドプローブ対の第一検出プローブを第一ＴＧＦβＩ遺伝子配列にハイブリダイズすることと；（Ｃ）第二検出オリゴヌクレオチドプローブ対の第二検出プローブを第二ＴＧＦβＩ遺伝子配列にハイブリダイズすることと；（Ｄ）第一検出オリゴヌクレオチドプローブ対及び第二検出オリゴヌクレオチドプローブ対を含む少なくとも２つの検出プローブ対の使用に基づいて、第一ＴＧＦβＩ遺伝子配列及び／又は第二ＴＧＦβＩ遺伝子配列中の１又はそれ以上の変異を検出することとを含む。
【００２０】
いくつかの実施態様では、第一ＴＧＦβＩ遺伝子配列及び／又は第二ＴＧＦβＩ遺伝子配列中の１又はそれ以上の変異を検出することは、第一ＴＧＦβＩ遺伝子配列及び／又は第二ＴＧＦβＩ遺伝子配列中の２又はそれ以上の変異を検出することを含み、そして２又はそれ以上の変異は、ヒトゲノムにおいて、少なくとも１つのヌクレオチドにより分離されている。
【００２１】
いくつかの実施態様では、少なくとも第一増幅プライマー対は、第一増幅プライマー及び第二増幅プライマーを含み、第一増幅プライマーは、配列番号１のヌクレオチド配列を含み、そして第二増幅プライマーは、配列番号２のヌクレオチド配列を含む。
【００２２】
いくつかの実施態様では、少なくとも第二増幅プライマー対は、第三増幅プライマー及び第四増幅プライマーを含み、第三増幅プライマーは、配列番号４３のヌクレオチド配列で表され、そして第四増幅プライマーは、配列番号４４のヌクレオチド配列で表される。
【００２３】
いくつかの実施態様では、第一増幅プライマー対は、第一増幅プライマー及び第二増幅プライマーを含み、第一増幅プライマーは、配列番号１のヌクレオチド配列を含み、第二増幅プライマーは、配列番号２のヌクレオチド配列を含み、第二増幅プライマー対は、第三増幅プライマー及び第四増幅プライマーを含み、第三増幅プライマーは、配列番号４３のヌクレオチド配列を含み、そして第四増幅プライマーは、配列番号４４のヌクレオチド配列を含む。
【００２４】
いくつかの実施態様では、１又はそれ以上の変異のうちの１つは、コードされたＴＧＦＢＩタンパク質における、第１２４位アミノ酸での、システインに変異したアルギニン（Ｒ１２４Ｃ）、ヒスチジンに変異したアルギニン（Ｒ１２４Ｈ）、及び／又はロイシンに変異したアルギニン（Ｒ１２４Ｌ）に相当する。
【００２５】
いくつかの実施態様では、１又はそれ以上の変異のうちの１つは、コードされたＴＧＦＢＩタンパク質における、第５５５位アミノ酸での、トリプトファンに変異したアルギニン（Ｒ５５５Ｗ）、及び／又はグルタミンに変異したアルギニン（Ｒ５５５Ｑ）に相当する。
【００２６】
いくつかの実施態様では、少なくとも２つの検出オリゴヌクレオチドプローブ対の各々は、それぞれ、第一検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第二検出オリゴヌクレオチドプローブを含み、第一検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第二検出オリゴヌクレオチドプローブは、配列番号２５〜２６、配列番号２５及び４８、配列番号２５及び４９、配列番号２７〜２８、配列番号２９〜３０、配列番号３１〜３２、配列番号３３〜３４、配列番号３５〜３６、配列番号３７〜３８、配列番号３９〜４０、配列番号４１〜４２、配列番号４５〜４６及び配列番号４６〜４７、配列番号４５及び５０、並びに配列番号４７及び５０から成る群からそれぞれ選択されるヌクレオチド配列対を含む。
【００２７】
いくつかの実施態様では、第一検出オリゴヌクレオチドプローブ対は、第一検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第二検出オリゴヌクレオチドプローブを含み、第一検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第二検出オリゴヌクレオチドプローブは、それぞれ、配列番号２５及び配列番号２６のヌクレオチド配列対を含む。
【００２８】
いくつかの実施態様では、第二検出オリゴヌクレオチドプローブ対は、第三検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第四検出オリゴヌクレオチドプローブを含み、第三検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第四検出オリゴヌクレオチドプローブは、それぞれ、配列番号４５及び配列番号４６のヌクレオチド配列対を含む。
【００２９】
いくつかの実施態様では、第二検出オリゴヌクレオチドプローブ対は、第三検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第四検出オリゴヌクレオチドプローブを含み、第三検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第四検出オリゴヌクレオチドプローブは、それぞれ、配列番号４７及び配列番号４６のヌクレオチド配列対を含む。
【００３０】
いくつかの実施態様では、第二検出オリゴヌクレオチドプローブ対は、第三検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第四検出オリゴヌクレオチドプローブを含み、第三検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第四検出オリゴヌクレオチドプローブは、それぞれ、配列番号２５及び配列番号４８のヌクレオチド配列対を含む。
【００３１】
いくつかの実施態様では、第二検出オリゴヌクレオチドプローブ対は、第三検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第四検出オリゴヌクレオチドプローブを含み、第三検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第四検出オリゴヌクレオチドプローブは、それぞれ、配列番号２５及び配列番号４９のヌクレオチド配列対を含む。
【００３２】
いくつかの実施態様では、第二検出オリゴヌクレオチドプローブ対は、第三検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第四検出オリゴヌクレオチドプローブを含み、第三検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第四検出オリゴヌクレオチドプローブは、それぞれ、配列番号４５及び配列番号５０のヌクレオチド配列対を含む。
【００３３】
いくつかの実施態様では、第二検出オリゴヌクレオチドプローブ対は、第三検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第四検出オリゴヌクレオチドプローブを含み、第三検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第四検出オリゴヌクレオチドプローブは、それぞれ、配列番号４７及び配列番号５０のヌクレオチド配列対を含む。
【００３４】
いくつかの実施態様では、第一検出プローブは、第一標識に結合しており、そして第二検出プローブは、第二標識に結合している。
【００３５】
いくつかの実施態様では、第一標識は、ＶＩＣであり、そして第二標識は、ＦＡＭである。
【００３６】
いくつかの実施態様では、ハイブリダイズすること（Ｂ）及びハイブリダイズすること（Ｃ）は、同じ溶液中で同時に実行される。
【００３７】
いくつかの実施態様では、ハイブリダイズすること（Ｂ）及びハイブリダイズすること（Ｃ）は、同じ溶液中又は異なる溶液中で同時に又は異なる時間に実行される。
【００３８】
いくつかの実施態様では、本開示は、ヒト対象における角膜ジストロフィー検出用反応混合物を提供し、この反応混合物は、（Ａ）（１）対象由来の生物学的サンプルから、第１２４位アミノ酸残基をコードするヌクレオチドを含む、少なくとも２つのＴＧＦβＩ遺伝子配列の第一ＴＧＦβＩ遺伝子配列を、及び（２）対象由来の生物学的サンプルから、第５５５位アミノ酸残基をコードするヌクレオチドを含む、少なくとも２つのＴＧＦβＩ遺伝子配列の第二ＴＧＦβＩ遺伝子配列を増幅し、そして決定するための、第一増幅プライマー対及び第二増幅プライマー対の少なくとも１つと、（Ｂ）少なくとも２つの検出プローブ対と、を含み、少なくとも２つの検出プローブ対の各々における検出プローブは、少なくとも２つのＴＧＦβＩ遺伝子配列の少なくとも１つとハイブリダイズする。
【００３９】
いくつかの実施態様では、第一増幅プライマー対は、第一増幅プライマー及び第二増幅プライマーを含み、第一増幅プライマーは、配列番号１のヌクレオチド配列を含み、そして、第二増幅プライマーは、配列番号２のヌクレオチド配列を含む。
【００４０】
いくつかの実施態様では、第二増幅プライマー対は、第三増幅プライマー及び第四増幅プライマーを含み、第三増幅プライマーは、配列番号４３のヌクレオチド配列を含み、そして、第四増幅プライマーは、配列番号４４のヌクレオチド配列を含む。
【００４１】
いくつかの実施態様では、少なくとも２つの検出プローブ対の少なくとも１つが使用され、コードされたＴＧＦＢＩタンパク質における、第１２４位アミノ酸での、システインに変異したアルギニン（Ｒ１２４Ｃ）、ヒスチジンに変異したアルギニン（Ｒ１２４Ｈ）、及び／又はロイシンに変異したアルギニン（Ｒ１２４Ｌ）に相当する変異を検出する。
【００４２】
いくつかの実施態様では、少なくとも２つの検出プローブ対の少なくとも１つが使用され、コードされたＴＧＦＢＩタンパク質における、第５５５位アミノ酸での、トリプトファンに変異したアルギニン（Ｒ５５５Ｗ）、及び／又はグルタミンに変異したアルギニン（Ｒ５５５Ｑ）に相当する変異を検出する。
【００４３】
いくつかの実施態様では、少なくとも２つの検出プローブ対のそれぞれの検出プローブ対は、それぞれ、第一検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第二検出オリゴヌクレオチドプローブを含み、第一検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第二検出オリゴヌクレオチドプローブは、配列番号２５〜２６、配列番号２５及び４８、配列番号２５及び４９、配列番号２７〜２８、配列番号２９〜３０、配列番号３１〜３２、配列番号３３〜３４、配列番号３５〜３６、配列番号３７〜３８、配列番号３９〜４０、配列番号４１〜４２、配列番号４５〜４６及び配列番号４６〜４７、配列番号４５及び５０、並びに配列番号４７及び５０から成る群からそれぞれ選択されるヌクレオチド配列対を含む。
【００４４】
いくつかの実施態様では、少なくとも２つの検出プローブ対の１つは、第一検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第二検出オリゴヌクレオチドプローブを含み、第一検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第二検出オリゴヌクレオチドプローブは、それぞれ、配列番号２５及び配列番号２６のヌクレオチド配列対を含む。
【００４５】
いくつかの実施態様では、少なくとも２つの検出プローブ対の１つは、第一検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第二検出オリゴヌクレオチドプローブを含み、第一検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第二検出オリゴヌクレオチドプローブは、それぞれ、配列番号４５及び配列番号４６のヌクレオチド配列対を含む。
【００４６】
いくつかの実施態様では、少なくとも２つの検出プローブ対の１つは、第一検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第二検出オリゴヌクレオチドプローブを含み、第一検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第二検出オリゴヌクレオチドプローブは、それぞれ、配列番号４７及び配列番号４６のヌクレオチド配列対を含む。
【００４７】
いくつかの実施態様では、少なくとも２つの検出プローブ対の１つは、第一検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第二検出オリゴヌクレオチドプローブを含み、第一検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第二検出オリゴヌクレオチドプローブは、それぞれ、配列番号２５及び配列番号４８のヌクレオチド配列対を含む。
【００４８】
いくつかの実施態様では、少なくとも２つの検出プローブ対の１つは、第一検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第二検出オリゴヌクレオチドプローブを含み、第一検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第二検出オリゴヌクレオチドプローブは、それぞれ、配列番号２５及び配列番号４９のヌクレオチド配列対を含む。
【００４９】
いくつかの実施態様では、少なくとも２つの検出プローブ対の１つは、第一検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第二検出オリゴヌクレオチドプローブを含み、第一検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第二検出オリゴヌクレオチドプローブは、それぞれ、配列番号４５及び配列番号５０のヌクレオチド配列対を含む。
【００５０】
いくつかの実施態様では、少なくとも２つの検出プローブ対の１つは、第一検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第二検出オリゴヌクレオチドプローブを含み、第一検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第二検出オリゴヌクレオチドプローブは、それぞれ、配列番号４７及び配列番号５０のヌクレオチド配列対を含む。
【００５１】
いくつかの実施態様では、少なくとも２つの検出プローブの第一検出プローブは、第一標識に結合しており、そして少なくとも２つの検出プローブの第二検出プローブは、第二標識に結合している。
【００５２】
いくつかの実施態様では、第一標識は、ＶＩＣであり、そして第二標識は、ＦＡＭである。
【００５３】
いくつかの実施態様では、本開示は、ヒト対象における角膜ジストロフィー検出用反応混合物を提供し、この反応混合物は、（Ａ）対象由来の生物学的サンプルから、ＴＧＦβＩ遺伝子配列を増幅しそして決定するための、少なくとも１つの第一増幅プライマー対と、（Ｂ）少なくとも３つの検出プローブのセットとを含み、少なくとも３つの検出プローブのセットのうちの１つの検出プローブは、ＴＧＦβＩ遺伝子配列に曝露された場合に、ＴＧＦβＩ遺伝子配列にハイブリダイズする。
【００５４】
いくつかの実施態様では、ＴＧＦβＩ遺伝子配列は、対象の生物学的サンプル由来の、第１２４位アミノ酸残基をコードするヌクレオチドを含む。
【００５５】
いくつかの実施態様では、少なくとも３つの検出プローブのセットは、配列番号２５〜４２及び４８〜４９からなる群から選択される少なくとも１つの検出プローブを含む。
【００５６】
いくつかの実施態様では、少なくとも３つの検出プローブのセットは、配列番号２５〜４２及び４８〜４９からなる群から選択される少なくとも２つ又はそれ以上の検出プローブを含む。
【００５７】
いくつかの実施態様では、少なくとも３つの検出プローブのセットは、配列番号２５〜４２及び４８〜４９からなる群から選択される少なくとも３つ又はそれ以上の検出プローブを含む。
【００５８】
いくつかの実施態様では、少なくとも３つの検出プローブのセットは、配列番号２５の第一検出プローブ及び配列番号２６の第二検出プローブを含む。
【００５９】
いくつかの実施態様では、少なくとも３つの検出プローブのセットは、配列番号４８及び配列番号４９からなる群から選択される第三検出プローブを含む。
【００６０】
いくつかの実施態様では、少なくとも３つの検出プローブのセットは、第三検出プローブとは異なりそして配列番号４８及び配列番号４９からなる群から選択される第四検出プローブを含む。
【００６１】
いくつかの実施態様では、少なくとも３つの検出プローブのセットは、配列番号２６及び４８〜４９からなる群から選択される少なくとも２つ又はそれ以上の検出プローブを含む。
【００６２】
いくつかの実施態様では、第一増幅プライマー対は、第一増幅プライマー及び第二増幅プライマーを含み、第一増幅プライマーは、配列番号１のヌクレオチド配列を含み、そして第二増幅プライマーは、配列番号２のヌクレオチド配列を含む。
【００６３】
いくつかの実施態様では、反応混合物は、（Ｃ）生物学的サンプルから第二ＴＧＦβＩ遺伝子配列を増幅しそして決定するための少なくとも１つの第二増幅プライマー対と、（Ｄ）少なくとも３つの検出プローブの第二セットとをさらに含み、少なくとも３つの検出プローブの第二セットのうちの１つの検出プローブは、第二ＴＧＦβＩ遺伝子配列に曝露された場合に、第二ＴＧＦβＩ遺伝子配列にハイブリダイズする。
【００６４】
いくつかの実施態様では、第二ＴＧＦβＩ遺伝子配列は、対象の生物学的サンプル由来の、第５５５位アミノ酸残基をコードするヌクレオチドを含む。
【００６５】
いくつかの実施態様では、少なくとも３つの検出プローブの第二セットは、配列番号４５〜４７及び５０からなる群から選択される少なくとも１つの検出プローブを含む。
【００６６】
いくつかの実施態様では、少なくとも３つの検出プローブの第二セットは、配列番号４５〜４７及び５０からなる群から選択される少なくとも２つ又はそれ以上の検出プローブを含む。
【００６７】
いくつかの実施態様では、少なくとも３つの検出プローブの第二セットは、配列番号４５〜４７及び５０からなる群から選択される少なくとも３つ又はそれ以上の検出プローブを含む。
【００６８】
いくつかの実施態様では、少なくとも３つの検出プローブの第二セットは、配列番号４５又は配列番号４７である第一検出プローブ、配列番号４６である第二検出プローブ、及び配列番号５０である第三検出プローブを含む。
【００６９】
いくつかの実施態様では、第二増幅プライマー対は、第三増幅プライマー及び第四増幅プライマーを含み、第三増幅プライマーは、配列番号４３のヌクレオチド配列を含み、そして第四増幅プライマーは、配列番号４４のヌクレオチド配列を含む。
【００７０】
いくつかの実施態様では、ＴＧＦβＩ遺伝子配列は、対象の生物学的サンプル由来の、第５５５位アミノ酸残基をコードするヌクレオチドを含む。
【００７１】
いくつかの実施態様では、少なくとも３つの検出プローブのセットは、配列番号４５〜４７及び５０からなる群から選択される少なくとも１つの検出プローブを含む。
【００７２】
いくつかの実施態様では、少なくとも３つの検出プローブのセットは、配列番号４５〜４７及び５０からなる群から選択される少なくとも２つ又はそれ以上の検出プローブを含む。
【００７３】
いくつかの実施態様では、少なくとも３つの検出プローブのセットは、配列番号４５〜４７及び５０からなる群から選択される少なくとも３つ又はそれ以上の検出プローブを含む。
【００７４】
いくつかの実施態様では、少なくとも３つの検出プローブのセットは、配列番号４５又は配列番号４７である第一検出プローブ、配列番号４６である第二検出プローブ、及び配列番号５０である第三検出プローブを含む。
【００７５】
いくつかの実施態様では、本開示は、角膜ジストロフィー検出方法を提供し、この方法は、（Ａ−１）少なくとも１つの第一増幅プライマー対及び少なくとも３つの検出プローブのセットを含む反応混合物を使用して、ヒト対象の生物学的サンプルから、第一ＴＧＦβＩ遺伝子配列を増幅することと；（Ｂ−１）少なくとも３つの検出プローブのセットの第一検出プローブを第一ＴＧＦβＩ遺伝子配列にハイブリダイズすることと；（Ｃ−１）（ｉ）少なくとも３つの検出プローブのセットの第一検出プローブの第一ＴＧＦβＩ遺伝子配列へのハイブリダイゼーション、並びに（ｉｉ）第一ＴＧＦβＩ遺伝子配列にハイブリダイズするための、少なくとも３つの検出プローブのセットの第二及び第三検出プローブの不成功、に基づいて、第一ＴＧＦβＩ遺伝子配列中の変異を検出することとを含む。
【００７６】
いくつかの実施態様では、この方法は、（Ａ−２）同じ反応混合物を使用して、生物学的サンプルから、第二ＴＧＦβＩ遺伝子配列を増幅することと、ここで、反応混合物は、少なくとも１つの第二増幅プライマー対及び少なくとも３つの検出プローブの第二セットを含み；（Ｂ−２）少なくとも３つの検出プローブの第二セットの第一検出プローブを第二ＴＧＦβＩ遺伝子配列にハイブリダイズすることと；（Ｃ−２）（ｉ）少なくとも３つの検出プローブの第二セットの第一検出プローブの第一ＴＧＦβＩ遺伝子配列へのハイブリダイゼーション、並びに（ｉｉ）並びに（ｉｉ）第二ＴＧＦβＩ遺伝子配列にハイブリダイズするための、少なくとも３つの検出プローブの第二セットの第二検出プローブ及び第三検出プローブの不成功、に基づいて、第二ＴＧＦβＩ遺伝子配列中の変異を検出することとをさらに含む。
【００７７】
いくつかの実施態様では、増幅すること（Ａ−１）、増幅すること（Ａ−２）、ハイブリダイズすること（Ｂ−１）、ハイブリダイズすること（Ｂ−２）、検出すること（Ｃ−１）、及び検出すること（Ｃ−２）は、生物学的サンプルの同じアリコートを用いて実行される。
【００７８】
いくつかの実施態様では、第一ＴＧＦβＩ遺伝子配列を増幅すること（Ａ−１）及び第二ＴＧＦβＩ遺伝子配列を増幅すること（Ａ−２）は、同時に実行される。
【００７９】
いくつかの実施態様では、ハイブリダイズすること（Ｂ−１）及びハイブリダイズすること（Ｂ−２）は、同時に実行される。
【００８０】
いくつかの実施態様では、検出すること（Ｃ−１）及び検出すること（Ｃ−２）は、同時に実行される。
【００８１】
いくつかの実施態様では、反応混合物は、上記の特徴のいくつかを有している。簡潔にするために、前記の詳細はここでは繰り返されない。
【００８２】
いくつかの実施態様では、本開示は、ヒト対象におけるヘテロ接合性角膜ジストロフィーの検出を通して対象におけるレーザー眼科手術後の合併症のリスクを予測するための、上記のいずれかに記載されるような反応混合物の使用を提供する。
【００８３】
いくつかの実施態様では、レーザー眼科手術は、レーシック及びエキシマレーザー手術のうちの１つを含む。
【００８４】
いくつかの実施態様では、本開示は、ヒト対象由来のサンプルにおける角膜ジストロフィーに関連するゲノム変異の検出方法を提供し、この方法は、（Ａ）基材の先端に付着したヒト対象の上皮細胞を提供することと；（Ｂ）基材に付着した細胞を溶解する溶解液中で基材の先端を撹拌することと；（Ｃ）撹拌すること（Ｂ）が完了するとすぐに、溶解液から基材を除去することと；（Ｄ）除去すること（Ｃ）の後に溶解液をインキュベートすることと；（Ｅ）溶解液からゲノムＤＮＡを単離してｇＤＮＡ溶液を形成することと；（Ｆ）少なくとも１つの第一プライマー対、少なくとも３つの検出プローブのセット、及びｇＤＮＡ溶液を使用して、ｇＤＮＡ溶液を少なくとも３つの検出プローブに同時に曝露することにより、ＴＧＦβＩ遺伝子中に存在する少なくとも１つのヌクレオチドの同一性を決定することとを含み、少なくとも１つのヌクレオチドは、角膜ジストロフィーに関連する一塩基多型（ＳＮＰ）に相当するＴＧＦβＩ遺伝子の特定の位置に位置し、そして、少なくとも３つの検出プローブのセットのうち少なくとも２つの検出プローブの各々は、ＴＧＦβＩ遺伝子の特定の位置の異なる変異を検出するように設計されている。
【００８５】
いくつかの実施態様では、この方法は、（Ｇ）少なくとも１つの第二プライマー対、少なくとも３つの検出プローブの第二セット、及びｇＤＮＡ溶液を使用して、ｇＤＮＡ溶液を少なくとも３つの検出プローブのセット及び少なくとも３つの検出プローブの第二セットに同時に曝露することにより、ＴＧＦβＩ遺伝子中に存在する少なくとも１つの第二ヌクレオチドの同一性を決定することをさらに含み、少なくとも１つの第二ヌクレオチドは、少なくとも１つのヌクレオチドの位置から独立している、角膜ジストロフィーに関連する第二一塩基多型（ＳＮＰ）に相当するＴＧＦβＩ遺伝子の第二の特定の位置に位置しており、そして、少なくとも３つの検出プローブの第二セットのうちの少なくとも２つの検出プローブは、ＴＧＦβＩ遺伝子の第二の特定の位置のそれぞれの変異を検出するように設計されている。
【００８６】
いくつかの実施態様では、決定すること（Ｆ）及び決定すること（Ｇ）が、同時に実行される。
【００８７】
いくつかの実施態様では、決定すること（Ｆ）及び決定すること（Ｇ）は、同じｇＤＮＡ溶液を使用して実行される。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１Ａ−１Ｂ】いくつかの実施態様による、疾患に関連するゲノムのアレル検出用の改善された方法１００を示す。
【００８９】
【図２】いくつかの実施態様による、アベリノ角膜ジストロフィーに関連する一塩基多型のリアルタイムＰＣＲ検出用に有用なフォワード及びリバースプライマー対の配列リスト（配列番号１〜２４）を提供している。
【００９０】
【図３】いくつかの実施態様による、アベリノ角膜ジストロフィーに関連する一塩基多型のリアルタイムＰＣＲ検出用に有用な野生型及び変異型検出プローブ対の配列リスト（配列番号２５〜４２）を提供している。
【００９１】
【図４】図５〜８に示されているアレル検出実験において使用されるプローブ配列及びプライマーのリストを提供している。
【００９２】
【図５】図４に記載されたプローブを用いた、Ｒ１２４Ｃ、Ｒ１２４Ｈ、Ｒ１２４Ｌ、Ｒ５５５Ｗ、及びＲ５５５Ｑ変異体の検出に関する実験データを提供している。図５Ａは、示された試薬混合物及び示されたサイクリング条件を用いた（右のパネル）、アレル識別プロットのランを提供する（左のパネル）。図５Ｂは、正常対照と比較した様々な変異体に関するリアルタイムＰＣＲプロットを提供する。図５Ｃは、ホモ接合対照と比較した様々な変異体に関するリアルタイムＰＣＲプロットを提供する。
【００９３】
【図６】図４に記載されたプローブを用いた、Ｒ１２４Ｃ、Ｒ１２４Ｈ、Ｒ１２４Ｌ、Ｒ５５５Ｗ、及びＲ５５５Ｑ変異体の検出に関する実験データを提供している。図６Ａは、示された試薬混合物及び示されたサイクリング条件を用いた（右のパネル）、アレル識別プロットのランを提供する（左のパネル）。図６Ｂは、正常対照と比較した様々な変異体に関するリアルタイムＰＣＲプロットを提供する。図５Ｃは、ホモ接合対照と比較した様々な変異体に関するリアルタイムＰＣＲプロットを提供する。
【００９４】
【図７】図４に記載されたプローブを用いた、Ｒ１２４Ｃ、Ｒ１２４Ｈ、Ｒ１２４Ｌ、Ｒ５５５Ｗ、及びＲ５５５Ｑ変異体の検出に関する実験データを提供している。図７は、示された試薬混合物及び示されたサイクリング条件を用いた（右のパネル）、アレル識別プロットのランを提供する（左のパネル）。
【００９５】
【図８】図４に記載されたプローブを用いた、Ｒ１２４Ｃ、Ｒ１２４Ｈ、Ｒ１２４Ｌ、Ｒ５５５Ｗ、及びＲ５５５Ｑ変異体の検出に関する実験データを提供している。具体的には、図８は、示された試薬混合物及び示されたサイクリング条件を用いた（右のパネル）、アレル識別プロットのランを提供する。アレル識別プロット（左のパネル）中の記号「Ｂ」は、リアルタイムＰＣＲアッセイを実施する前に溶解バッファで前処理されたサンプルを示している。アレル識別プロット（左のパネル）中の記号「ＤＷ−Ａ」は、リアルタイムＰＣＲを実施する前に蒸留水で前処理されたサンプルを示している。異なるサンプル点を囲む円は、検出された各々のアレルに関して（左のパネル参照）、それぞれ、対応した２つのサンプル「Ｂ」及び「ＤＷ−Ａ」を示しており、各々の円の中には２つの点が存在し、１つはサンプル「Ｂ」であり、そして１つは「ＤＷ−Ａ」である。
【発明の詳細な説明】
【００９６】
Ｉ．序論
疾患関連ＳＮＰの検出は、様々な医学的状態の診断及び予後のためにますます重要なツールとなっている。例えば、ＴＧＦβＩ遺伝子のエクソン４における単一ヌクレオチドの変化の存在が、アベリノ角膜ジストロフィーと強く関連している。このＳＮＰのヘテロ接合の個体が、レーシック手術後の視力喪失のリスクが高いことが見出された。レーシックは多くの人々のクオリティオブライフを大きく向上させる医療処置であるが、Ｇ／Ａ ＴＧＦβＩ ＳＮＰを保有する個体については、失明につながる可能性がある、４〜１８月の期間にわたる段階的な視力障害の原因となる。視力障害は、より長い又はより短い期間で発生する可能性がある。幸いなことに、スクリーニングにより、レーシック処置を避けるべきである変異を有する個体を同定することができる。
【００９７】
本開示は、改良された、サンプル単離、調製、及び分析方法の発見に少なくとも部分的に基づいている。いくつかの実施態様では、前記方法は、例えば、アッセイが失敗した又は追加のフォローアップテストを実行する必要がある場合、患者サンプルの再使用を可能にするために提供される。いくつかの実施態様では、これらの改良された方法は、患者の口腔粘膜（buccal membrane）から剥離（sloughed-off）した細胞を保有する基材（例えば、レーヨンが先端に付いた（a rayon-tipped）又は綿が先端に付いたアプリケーター（cotton-tipped applicator））を、溶解液中で（高温で２０分間延長されたインキュベーションよりもむしろ）室温で３０〜４５秒間静かに回転させる工程を含む。次に、前記溶解液を４５℃で３０分間インキュベートし、溶解性を改善させそしてゲノムサンプルの収率を向上させる。有利には、前記のレーヨンが先端に付いた又は綿が先端に付いたアプリケーターを、その後、再テスト用に使用されるゲノムＤＮＡの再単離用に保存することができる（例えば、凍結又は冷蔵）。
【００９８】
いくつかの実施態様において、本明細書で提供される改良は、リアルタイムＰＣＲ検出アッセイ用のゲノムＤＮＡテンプレートのより少ない量の使用を通して提供される。いくつかの実施態様では、これは、実施されるリアルタイムＰＣＲのサイクルを増加させること（例えば約４０サイクル）、及び／又は９５℃で３秒の変性サイクルの時間を用いることにより達成される。有利なことには、必要なサンプル量がこれらの方法によって減少することから、リアルタイムＰＣＲに必要な試薬の量もまた減少する。診断アッセイにおいて使用される多くの試薬が特許に守られているので（proprietary）、試薬は高価である可能性がある。使用される試薬の量の減少により、試薬に関連するコストもまた有意に削減することができる。
【００９９】
これらの個々の工程の各々を実施するための特定の条件（サンプルハンドリング、インキュベーション温度、反応ボリューム、反応サイクル数、反応サイクル時間、反応サイクル温度）の組み合わせが、本明細書に記載される疾患関連ＳＮＰ、例えばＴＧＦβＩ遺伝子のエクソン４中に発見されたアベリノ角膜ジストロフィー関連ＳＮＰの検出方法を実施するために使用されることが期待される。
【０１００】
ＩＩ．定義の選択
本明細書中で使用される用語「発明」又は「本発明」は、本発明の特定の実施態様のいずれかに限定することを意図せず、特許請求の範囲及び明細書に記載したように、本発明の任意の及び全ての実施態様に一般に適用される。
【０１０１】
本明細書で使用される場合、文脈が特に明確に指示しない限りは、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は複数の参照（plural references）を含む。したがって、例えば、「方法（the method）」の参照は、本開示を読めば当業者に明らかとなるであろう本明細書に記載の種類の方法及び／又は工程の１つ又は複数を含む。
【０１０２】
本明細書で使用される用語「多型」及びその変形は、異なるゲノム又は個体間の、２又はそれ以上の選択的なゲノム配列又はアレルの発生を意味する。用語「遺伝子変異」又は「遺伝的変異」及びその変形は、多型を含む。
【０１０３】
本明細書で使用される用語「一塩基多型」（「ＳＮＰ」）とその変形は、アレル間で変化するヌクレオチドの１つの部位を意味する。一塩基多型（ＳＮＰ）は、単一塩基の変化又は点変異であるが、個体間の遺伝的変異をもたらすいわゆる「インデル（indel）」変
異（ヌクレオチドの挿入又は欠失）を含む。人間の全ての遺伝的変異の約９０％を構成するＳＮＰは、３億塩基のヒトゲノムに沿って１００〜３００塩基毎に発生する。しかし、ＳＮＰは、ウイルスのような他の生物においてははるかに頻繁に発生する可能性がある。ＳＮＰは、ゲノムのコード又は非コード領域において生じる可能性がある。コード領域中のＳＮＰは、タンパク質産物のアミノ酸配列を変更することができ又は変更しないこともできる。非コード領域中のＳＮＰは、プロモーター又はプロセシング部位を変更することができ、遺伝子の転写及び／又はプロセシングに影響を及ぼす可能性がある。個人が関心のあるゲノム領域に特定のＳＮＰを有するかどうかを知ることにより、種々の疾患のための、診断、予防、及び治療用途の開発用の十分な情報を提供することができる。いくつかの実施態様において、本開示は、アベリノ角膜ジストロフィーに関連するＴＧＦβＩ遺伝子のエクソン４に位置するグアニンからアデニンのＳＮＰの検出に関する。
【０１０４】
用語「プライマー」及びその変形は、ＰＣＲ反応においてＤＮＡ合成の開始点として作用するオリゴヌクレオチドを意味する。プライマーの長さは、通常、約１５〜約３５ヌクレオチドでありそして標的配列に相補的な領域にハイブリダイズする。
【０１０５】
用語「プローブ」及びその変形（例えば、検出プローブ）は、ＰＣＲ反応において標的核酸にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを意味する。標的配列は、分析されるべきである核酸の領域を意味しそして目的の多型部位を含む。
【０１０６】
特に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、一般的に、本発明が属する当業者によって理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似又は同等の任意の方法及び材料が、本発明の実施又は試験において使用されることができるが、方法及び材料の様々な実施態様は、本明細書に具体的に記載されている。
【０１０７】
ＩＩＩ．サンプル調製
いくつかの実施態様において、本開示は、リアルタイムＰＣＲの一塩基多型検出アッセイで使用されるゲノムサンプルの改良された単離方法を提供する。いくつかの実施態様では、改良された方法１００は、図１で説明されている工程の組み合わせを使用する。
【０１０８】
いくつかの実施態様では、前記方法は、対象からの細胞サンプルを提供する工程を含む。いくつかの実施態様において、細胞は、患者の細胞表面を基材上に細胞を可逆的に固定化することが可能な基材に接触させることによって収集される。
【０１０９】
開示された方法は、様々なサンプルから得られた様々な細胞型に適用可能である。いくつかの実施態様では、開示された方法で使用するための細胞型としては、上皮細胞、内皮細胞、結合組織細胞、骨格筋細胞、内分泌細胞、心臓細胞、尿路細胞、メラノサイト、ケラチノサイト、血球、白血球、軟膜、血液細胞、有毛細胞（例えば、毛根細胞を含む）、及び／又は唾液腺細胞（salival cells）が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施態様では、細胞は上皮細胞である。いくつかの実施態様において、細胞は；被膜下血管周囲（subcapsular-perivascular）（上皮型１）；ペール（pale）（上皮型２）；中間（intermediate）（上皮型３）；暗（dark）（上皮型４）；未分化（undifferentiated）（上皮型５）；及び大髄質（large-medullary）（上皮型６）である。いくつかの実
施態様において、細胞は、口腔上皮細胞（例えば、口腔内スワップ（buccal swap）を使
用して収集された上皮細胞）である。いくつかの実施態様では、開示される方法において使用される細胞のサンプルは、上記の特定の細胞型の任意の組み合わせを含む。
【０１１０】
いくつかの実施態様において、方法は、対象からの細胞のサンプルを提供する工程（１０２）を含む。いくつかの実施態様において、提供される細胞は、口腔上皮細胞である。
【０１１１】
細胞サンプルは、対象の細胞の基材への可逆的結合を可能にする様々な方法のいずれかによって収集される。いくつかの実施態様では、基材は、基材に細胞を可逆的に結合するために、対象の細胞を含有するサンプルとの物理的相互作用において用いられる。いくつかの実施態様では、基材に細胞を可逆的に結合するために、被検者の身体との物理的相互作用に直接的に用いられる。いくつかの実施態様では、サンプルは口腔細胞サンプルでありそして口腔細胞のサンプルは、膜から除去される細胞を可逆的に固定化することが可能な基材を用いて対象の口腔粘膜（例えば、頬の内側）に接触させることによって収集される。前記実施態様では、綿棒（swab）は、人の歯のブラッシングに相当する力を用いて対象の頬の内側に擦り付けられる（例えば、力又は圧力の軽い量）。対象の細胞が基材に可逆的に結合することを可能にする任意の方法を、開示された方法で使用することが意図される。
【０１１２】
いくつかの実施態様において、サンプルは、有利には、非侵襲的な方法で収集されそして前記サンプル収集はどこにおいても及びほとんど誰によっても達成される。例えば、いくつかの実施態様において、サンプルは、診療所、対象の自宅、又はレーシック手術が行われている又は行われるべき機関で採取される。いくつかの実施態様では、患者、患者の医師、看護師若しくは医師のアシスタント、又は他の臨床担当者がサンプルを収集する。
【０１１３】
いくつかの実施態様では、基材は、細胞が可逆的に結合する様々な材料のいずれかで製造されている。典型的な基材は、レーヨン、綿、シリカ、エラストマー、セラック、アンバー、天然若しくは合成ゴム、セルロース、ベークライト（ＢＡＫＥＬＩＴＥ）、ナイロン（ＮＹＬＯＮ）、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアクリロニトリル、又は他の材料あるいはこれらの組み合わせから製造されたものを含む。いくつかの実施態様では、基材はレーヨンの先端又は綿の先端を有する綿棒である。
【０１１４】
基材の先端（例えば、レーヨン綿棒又は綿の綿棒の先端）を、次いで、約１０秒〜６０秒（１分）、又は約２０秒〜６０秒、約２０秒〜約４５秒、若しくは約２０秒〜約３０秒、約１５秒〜約６０秒、約１５秒〜約４５秒、若しくは約１５秒〜約３０秒、約１０秒〜約６０秒、約１０秒〜約４５秒、約１０秒〜約３０秒、約１０秒〜約１５秒、若しくは約１０秒〜約２０秒溶解液中で撹拌する。いくつかの実施態様では、撹拌は、約６０秒又は約１分間生じる。いくつかの実施態様では、撹拌は１分未満（例えば、６０秒未満）の間生じる。いくつかの実施態様では、撹拌は１５秒、２０秒、３０秒、４５秒、６０秒、９０秒、１２０秒間、またはそれ以上より多くない時間生じる。いくつかの実施態様では、撹拌は４５秒間以下生じる。いくつかの実施態様では、撹拌は３０秒間以下生じる。いくつかの実施態様では、撹拌は２０秒間以下生じる。いくつかの実施態様では、撹拌は１５秒間以下生じる。
【０１１５】
いくつかの実施態様において、撹拌は、溶解液中の基材の任意の移動を含む。いくつかの実施態様において、後の時点で及び／又はそれ以降の時間の単離のために口腔細胞の複数が基材に固定されたままであるように、基材の先端（例えば、レーヨン綿棒又は綿の綿棒の先端部）を溶解液中で静かに移動させる。溶解液中の前記の動きは、いくつかの口腔細胞が溶解液中に分散されることを可能にする一方で前記先端部に複数の前記口腔細胞が基材に固定されたままであるような溶解液中の基材の渦運動（swirling motions）、左右の動き（side to side motions）、上下の動き（up and down motions）、及び／又は浸漬する動き（dipping motion）、又は任意の他の動きを含む。
【０１１６】
いくつかの実施態様では、撹拌工程は、例えば、室温で例えば、約１５℃〜約３０℃、約１８℃〜約２８℃、約１８℃〜２５℃、又は約２０℃〜約２５℃で実施される。
【０１１７】
撹拌後、基材（例えば、レーヨン綿棒又は綿の綿棒の先端部）は除去され、そしていくつかの実施態様では、再テスト又はさらなる（異なる又は追加の）テストに備えて後の使用のために貯蔵される。いくつかの実施態様では、基材（例えば、レーヨンの先端又は綿の先端を備えるバッカル綿棒（buccal swab））を容器に入れそして凍結保存する。いくつかの実施態様では、基材（例えば、レーヨンの先端又は綿の先端を備えるバッカル綿棒）を冷蔵する。いくつかの実施態様では、基材は、１つ又はそれ以上の追加の抽出のために未だ有用なままで維持される一方で、様々な温度のいずれか及び様々な時間のいずれかで貯蔵される。
【０１１８】
いくつかの実施態様では、サンプルを含有する基材は、０週、１週、２週、３週、４週、５週、６週、７週、８週、９週、１０週、１１週、若しくは１２週又はそれ以上の間保存されている。いくつかの実施態様では、サンプルを含有する基材は、０週〜１２週、１週〜１２週、２週〜１２週、３週〜１２週、４週〜１２週、５週〜１２週、６週〜１２週、７週〜１２週、８週〜１２週、９週、１０週〜１２週、又は１１週〜１２週の間貯蔵されている及び／又は貯蔵可能である。いくつかの実施態様では、サンプルを含有する基材は、１、２、３、４、５、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、３０、若しくは３６月又はそれ以上の間貯蔵される。いくつかの実施態様では、サンプルを含有する基材は、１月〜３６月、２月〜３６月、３月〜３６月、４月〜３６月、５月〜３６月、６月〜３６月、７月〜３６月、８月〜３６月、９月〜３６月、１０月〜３６月、１２月〜３６月、１４月〜３６月、１６月〜３６月、１８月〜３６月の間貯蔵される。いくつかの実施態様では、サンプルを含有する基材は、１月〜３０月、２月〜３０月、３月〜３０月、４月〜３０月、５月〜３０月、６月〜３０月、７月〜３０月、８月〜３０月、９月〜３０月、１０月〜３０月、１２月〜３０月、１４月〜３０月、１６月〜３０月、１８月〜３０月の間貯蔵される。いくつかの実施態様では、サンプルを含有する基材は、１月〜２４月、２月〜２４月、３月〜２４月、４月〜２４月、５月〜２４月、６月〜２４月、７月〜２４月、８月〜２４月、９月〜２４月、１０月〜２４月、１２月〜２４月、１４月〜２４月、１６月〜２４月、１８月〜２４月の間貯蔵される。いくつかの実施態様では、サンプルを含有する基材は、１月〜２２月、２月〜２２月、３月〜２２月、４月〜２２月、５月〜２２月、６月〜２２月、７月〜２２月、８月〜２２月、９月〜２２月、１０月〜２２月、１２月〜２２月、１４月〜２２月、１６月〜２２月、１８月〜２２月の間貯蔵される。いくつかの実施態様では、サンプルを含有する基材は、１月〜２０月、２月〜２０月、３月〜２０月、４月〜２０月、５月〜２０月、６月〜２０月、７月〜２０月、８月〜２０月、９月〜２０月、１０月〜２０月、１２月〜２０月、１４月〜２０月、１６月〜２０月、１８月〜２０月の間貯蔵される。いくつかの実施態様では、サンプルを含有する基材は、１月〜１８月、２月〜１８月、３月〜１８月、４月〜１８月、５月〜１８月、６月〜１８月、７月〜１８月、８月〜１８月、９月〜１８月、１０月〜１８月、１２月〜１８月、１４月〜１８月、１６月〜１８月、又は１７月〜１８月の間貯蔵される。いくつかの実施態様では、サンプルを含有する基材は、１月〜１２月、２月〜１２月、３月〜１２月、４月〜１２月、５月〜１２月、６月〜１２月、７月〜１２月、８月〜１２月、９月〜１２月、１０月〜１２月、又は１１月〜１２月の間貯蔵される。
【０１１９】
いくつかの実施態様では、サンプルを含有する基材は、約２℃、約３℃、約４℃、約５℃、約６℃、約７℃、又は約８℃で貯蔵される。いくつかの実施態様では、サンプルを含有する基材は、約２℃〜約８℃、約３℃〜約８℃、約４℃〜約８℃、約５℃〜約８℃、約６℃〜約８℃、約７℃〜約８℃で貯蔵される。いくつかの実施態様では、サンプルを含有する基材は、約−２５℃、約−２４℃、約−２３℃、約−２２℃、約−２１℃、約−２０℃、約−１９℃、約−１８℃、約−１７℃、約−１６℃、又は約−１５℃で貯蔵される。いくつかの実施態様では、サンプルを含有する基材は、約−２５℃〜約−１５℃、約−２２℃〜約−１７℃、約−２０℃〜約−１５℃、又は約−２５℃〜約−２０℃で貯蔵される。いくつかの実施態様では、サンプルを含有する基材は、約−９０℃、約−８９℃、約−８８℃、約−８７℃、約−８６℃、約−８５℃、約−８４℃、約−８３℃、約−８２℃、約−８１℃、約−８０℃、約−７９℃、約−７８℃、約−７７℃、約−７６℃、約−７５℃、約−７４℃、約−７３℃、約−７２℃、約−７１℃、約−７０℃、約−６９℃、約−６８℃、約−６７℃、約−６６℃、又は約−６５℃で貯蔵される。いくつかの実施態様では、サンプルを含有する基材は、約−９０℃〜約−６５℃、約−８５℃〜約−６５℃、約−８０℃〜約−６５℃、約−７５℃〜約−６５℃、又は約−７０℃〜約−６５℃で貯蔵される。いくつかの実施態様では、サンプルを含有する基材は、−９０℃〜−６５℃で貯蔵される。
【０１２０】
いくつかの実施態様では、サンプルを含有する基材は、１回又はそれ以上凍結解凍され（例えば、凍結された後、サンプルを含有する基材を解凍し、本発明の方法に使用してそして再凍結する）及び／又は本発明に使用される。いくつかの実施態様では、サンプルを含有する基材は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又はそれ以上の回数凍結解凍される。いくつかの実施態様では、サンプルを含有する基材は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又はそれ以上の回数使用される。いくつかの実施態様では、サンプルを含有する基材は、１〜２０回、２〜２０回、３〜２０回、４〜２０回、５〜２０回、６〜２０回、７〜２０回、８〜２０回、９〜２０回、１０〜２０回、１１〜２０回、１２〜２０回、１３〜２０回、１４〜２０回、１５〜２０回、１６〜２０回、１７〜２０回、１８〜２０回、１９〜２０回、５〜１５回、５〜１０回、１〜１０回、又は１〜５回凍結解凍される。いくつかの実施態様では、サンプルを含有する基材は、１〜２０回、２〜２０回、３〜２０回、４〜２０回、５〜２０回、６〜２０回、７〜２０回、８〜２０回、９〜２０回、１０〜２０回、１１〜２０回、１２〜２０回、１３〜２０回、１４〜２０回、１５〜２０回、１６〜２０回、１７〜２０回、１８〜２０回、１９〜２０回、５〜１５回、５〜１０回、１〜１０回、１〜５回、１〜４回、１〜３回、又は１〜２回使用される。
【０１２１】
いくつかの実施態様では、サンプルを含有する基材は、室温で又は約１５℃〜約３０℃で１週間貯蔵される。いくつかの実施態様では、サンプルを含有する基材は、約２℃〜約８℃又は約４℃で約１、２、又は３週間貯蔵される。いくつかの実施態様では、サンプルを含有する基材は、約−２５℃〜約−１５℃又は約−２０℃で約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２月の間貯蔵される。いくつかの実施態様では、サンプルを含有する基材は、約−９０℃〜約−６５℃又は約−８０℃で約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２月の間貯蔵される。
【０１２２】
有利に及び驚くべきことに、基材から抽出された細胞数の減少は、個々の細胞からの核酸の抽出物の増加によって相殺されることが見出された。いくつかの実施態様では、増加した抽出物は、標準的な慣行（standard practices）と比較して細胞を長時間インキュベーションすること、標準的な慣行と比較して高い温度で細胞をインキュベーションすること、又はその組み合わせにより達成される。
【０１２３】
いくつかの実施態様では、細胞の核酸の抽出物の増加は、標準的な慣行と比較して増加させた又はより長い期間の抽出物インキュベーションを実施することにより達成される。いくつかの実施態様では、抽出物インキュベーションは、約４５分間、例えば４５±５、４５±１０、４５±１５、又は４５±２０分間実施される。いくつかの実施態様においては、抽出物インキュベーションは、約２５分〜約６５分、約３０分〜約６０分、約３５分〜約５５分、約４５分〜約６５分、約４５分〜約５５分、又は約４０分〜約５０分の間実施される。抽出物インキュベーション時間は、約２５分、約３０分、約３５分、約４０分、約４５分、約５０分、約５５分、約６０分、又は約６５分である。
【０１２４】
いくつかの実施態様では、細胞の核酸の抽出物の増加は、標準的な慣行と比較して増加した又は高い温度の抽出物インキュベーションにより達成される。いくつかの実施態様では、抽出物インキュベーションは、約４５℃、例えば４５±２℃、４５±５℃、又は４５±１０℃で実施される。いくつかの実施態様では、抽出物インキュベーション温度は、約３５℃〜約５５℃、約４０℃〜約５０℃、又は約４３℃〜約４７℃である。いくつかの実施態様では、抽出物インキュベーション温度は、約４３℃、約４４℃、約４５℃、約４６℃、約４７℃、約４８℃、約４９℃、約５０℃、約５１℃、約５２℃、約５３℃、約５４℃、又は約５５℃である。いくつかの実施態様では、１より多い抽出温度が使用される。例えば、いくつかの実施態様では、基準温度は、抽出の一部のために使用され、そして、上昇させた温度が抽出の別の部分のために使用される。
【０１２５】
いくつかの実施態様では、実質的に少ない数の細胞が基材から次に続く本発明のシステム及び方法の溶解のために放出される。いくつかの実施態様では、細胞の少なくとも１個、細胞の少なくとも２個、細胞の少なくとも５個、細胞の少なくとも１０個、細胞の少なくとも１５個、細胞の少なくとも２０個、細胞の少なくとも５０個、細胞の少なくとも７５個、細胞の少なくとも１００個、細胞の少なくとも１２５個、細胞の少なくとも１５０個、細胞の少なくとも１７５個、細胞の少なくとも２００個、細胞の少なくとも２５０個、細胞の少なくとも３００個、細胞の少なくとも３５０個、細胞の少なくとも４００個、細胞の少なくとも４５０個、細胞の少なくとも５００個、又はそれ以上が撹拌中に基材から放出される。
【０１２６】
いくつかの実施態様では、純度約０．５５〜２．００、約０．６〜約２．００、約０．７〜約２．００、約０．８〜約２．００、約０．９〜約２．００、約１．０〜約２．００、約１．１〜約２．００、約１．２〜約２．００、約１．３〜約２．００、約１．４〜約２．００、約１．５〜約２．００、約１．６〜約２．００、約１．７〜約２．００、約１．８〜約２．００、又は約１．９〜約２．００の核酸約１ｎｇ／μＬ〜約５０ｎｇ／μＬ、約１ｎｇ／μＬ〜約４０ｎｇ／μＬ、約１ｎｇ／μＬ〜約３０ｎｇ／μＬ、約１ｎｇ／μＬ〜約２０ｎｇ／μＬ、約１ｎｇ／μＬ〜約１０ｎｇ／μＬ、約１ｎｇ／μＬ〜約５ｎｇ／μＬ、約１ｎｇ／μＬ〜約４ｎｇ／μＬ、約１ｎｇ／μＬ〜約３ｎｇ／μＬ、約１ｎｇ／μＬ〜約２ｎｇ／μＬが、記載される方法を用いて単一の対象から採用される（得られる）。いくつかの実施態様では、純度約０．５５〜２．００を有する１ｎｇ／μＬ〜５０ｎｇ／μＬが、記載される方法を用いて単一の対象から採用される（得られる）。
【０１２７】
ＩＶ．溶解液
様々な溶解液が記載されておりそして当業者に公知である。これらの周知の溶解液のうちのいくつかは、本方法に使用することができ、サンプルから核酸を単離する。典型的な溶解液は、市販されているもの、例えばＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ（登録商標）、ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）、ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ（登録商標）及び他の製造業者によって販売されているもの、並びに実験室の環境で当業者により生成することができるものが含まれる。溶解バッファもまた十分に記載されており、そして溶解バッファは記載された方法、例えば、Molecular Cloning (three volume set, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2012)及びCurrent Protocols (Genetics and Genomics; Molecular Biology; 2003-2013)に記載されたもの、を用いた使用を見出すことができ、これらの文献の両方は全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
【０１２８】
細胞溶解は、細胞内の核酸を回収するために一般的に実施される方法である。多くの場合、細胞を溶解液、一般に界面活性剤を含むアルカリ溶液と、又は溶菌酵素溶液と接触させる。前記溶解液は、典型的には、塩、界面活性剤、及びバッファ、並びに当業者が使用することを理解するであろう他の薬剤を含む。完全な及び／又は部分的な溶解後、核酸は溶解液から回収される。
【０１２９】
いくつかの実施態様では、細胞は、ｐＨ約４〜約１０、約５〜約９、約６〜約８、又は約７〜約９のｐＨ範囲で水溶液バッファ中で再懸濁される。
【０１３０】
いくつかの実施態様では、バッファ塩の濃度は約１０ｍＭ〜約２００ｍＭ、約１０ｍＭ〜約１００ｍＭ、又は約２０ｍＭ〜約８０ｍＭである。
【０１３１】
いくつかの実施態様では、バッファは、キレート剤、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）又はエチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）をさらに含む。
【０１３２】
いくつかの実施態様では、溶解液は、細胞からの核酸の放出を支援する他の化合物、例えばこれには限定されないが例としてスクロースを含むポリオール、並びに糖アルコール例えばマルチトール、ソルビトール、キシリトール、エリスリトール、及び／又はイソマルトをさらに含む。いくつかの実施態様では、ポリオールは、約２％〜約１５％ｗ／ｗ、又は約５％〜約１５％ｗ／ｗ、又は約５％〜約１０％ｗ／ｗの範囲である。
【０１３３】
いくつかの実施態様では、溶解液は、界面活性剤例えばＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、ＳＤＳ、ＣＴＡＢ、Ｘ−１１４、ＣＨＡＰＳ、ＤＯＣ、及び／又はＮＰ−４０をさらに含むが、これらに限定されない。いくつかの実施態様では、前記の界面活性剤は、約１％〜約５％ｗ／ｗ、約１％〜約４％ｗ／ｗ、又は約１％〜約３％ｗ／ｗの範囲である。
【０１３４】
実施態様では、溶解液はカオトロープ（chaotropes）例えば尿素、ドデシル硫酸ナトリウム、及び／又はチオ尿素をさらに含むがこれらに限定されない。いくつかの実施態様では、カオトロープは、約０．５Ｍ〜８Ｍ、又は約１Ｍ〜約６Ｍ、約２Ｍ〜約６Ｍ、又は約１Ｍ〜３Ｍの範囲の濃度で使用されている。
【０１３５】
いくつかの実施態様では、溶解液は、追加の溶解試薬の１種又はそれ以上をさらに含み、例えば、溶解試薬は当該分野で周知である。いくつかの実施態様では、溶解試薬は、細胞壁溶解酵素例えばリゾチームを含むが、これには限定されない。いくつかの実施態様において、溶解試薬は、アルカリ性界面活性剤溶液、例えば０．５％ドデシル硫酸ナトリウムを含む０．１水酸化ナトリウム水溶液を含む。
【０１３６】
いくつかの実施態様では、溶解液は水性糖溶液、例えばスクロース溶液及びキレート化剤例えばＥＤＴＡ例えばＳＴＥＴバッファをさらに含む。特定の実施態様において、溶解試薬は、細胞懸濁液と所望の２倍の濃度を有する溶解液等量とを混合することによって調製される（例えば０．２水酸化ナトリウム、１．０％ドデシル硫酸ナトリウム）。
【０１３７】
いくつかの実施態様では、所望の程度の溶解が達成された後、溶解液と溶解した細胞とを含む混合物を中和又はクエンチ剤と接触させ、溶解試薬が所望の生成物に悪影響を与えないような条件に調整する。いくつかの実施態様では、ｐＨを約５〜約９、約６〜約８、約５〜約７、約６〜約７、又は約６．５〜７．５に調整し、例えばこれには限定されないが核酸を含む細胞内容物の分解を最小化及び／又は防止する。いくつかの実施態様では、溶解試薬がアルカリ性溶液を含む場合、中和試薬は、酸性バッファ例えばアルカリ金属酢酸塩／酢酸バッファを含む。いくつかの実施態様では、溶解条件例えば温度及び溶解試薬の組成物は、核酸を含むがこれに限定されるものではない所望の生成物の劣化を最小限に抑えながら、溶解が実質的に完了するように選択される。
【０１３８】
いくつかの実施態様では、第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、又は第二十溶解液が本方法に使用される。いくつかの実施態様では、使用される溶解バッファは、約１０μＬ、約２０μＬ、約３０μＬ、約４０μＬ、約５０μＬ、約６０μＬ、約７０μＬ、約８０μＬ、約９０μＬ、約１００μＬ、約１２０μＬ、約１３０μＬ、約１４０μＬ、約１５０μＬ、約１６０μＬ、約１７０μＬ、約１８０μＬ、約１９０μＬ、約２００μＬ、約２２０μＬ、約２３０μＬ、約２４０μＬ、約２５０μＬ、約２６０μＬ、約２７０μＬ、約２８０μＬ、約２９０μＬ、約３００μＬ、約３２０μＬ、約３３０μＬ、約３４０μＬ、約３５０μＬ、約３６０μＬ、約３７０μＬ、約３８０μＬ、約３９０μＬ、約４００μＬ、約４５０μＬ、約５００μＬ、約５５０μＬ、約６００μＬ、約６５０μＬ、約７００μＬ、約７５０μＬ、約８００μＬ、約８５０μＬ、約９００μＬ、約９５０μＬ、約１０００μＬ、約１５００μＬ、又は約２０００μＬである。いくつかの実施態様では、溶解バッファは、約１０μＬ〜約１０００μＬ、約１０μＬ〜約８００μＬ、約１０μＬ〜約６００μＬ、約１０μＬ〜約４００μＬ、約２０μＬ〜約４００μＬ、約５０μＬ〜約３００μＬ、約５０μＬ〜約２００μＬ、約５０μＬ〜約４００μＬ、約１００μＬ〜約４００μＬ、約１０μＬ〜約３００μＬ、約１００μＬ〜約２００μＬである。
【０１３９】
他の公知の及び通常の方法の組み合わせと同様に上記の任意の組み合わせが当業者によって使用されることができ、前記の組合せは、本発明によって意図される。
【０１４０】
Ｖ．溶解液からの核酸の精製
いくつかの実施態様では、例えば、ゲノムＤＮＡを含むがこれに限定されない核酸は、その後の分析を実施する前に、溶解バッファから単離される。いくつかの実施態様では、核酸は、追加の分析例えばこれには限定されないがリアルタイムＰＣＲ分析を実施する前に、溶解バッファから単離される。少量の核酸の単離に有用な様々な任意の方法が、開示された方法の様々な実施態様によって使用される。これらには、沈殿、ゲル濾過、密度勾配、及び固相結合が含まれるが、これらに限定されない。前記の方法は、例えば、全ての目的のために本明細書に参照として組み込まれる、Molecular Cloning (three volume set, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2012)及びCurrent Protocols (Genetics and Genomics; Molecular Biology; 2003-2013)に記載されている。
【０１４１】
核酸の沈殿は、当業者に知られている周知の単離方法である。様々な固相結合法（solid phase binding methods）もまた、当該技術分野で公知であり、ビーズ、（例えば、シリカ、磁性体）、カラム、膜、又は他の様々な当該技術分野で公知の物理的形態を含む固相結合法を含むがこれらに限定されない。いくつかの実施態様では、開示された方法において使用される固相は、可逆的に核酸と結合する。前記の固相の例は、少なくとも２種の固相の混合物であるいわゆる「混合床（mixed-bed）」固相を含み、各々のそれらは、異
なる溶液条件下での核酸の限度容量、そして異なる条件下；例えば、全ての目的のために本明細書にその全体が参照として組み込まれる米国特許出願公開第２００２／０００１８１２号明細書、での核酸を放出する能力及び／又は限度容量を有する。開示された方法による核酸の固相の親和性は、典型的には、基材への溶質を結合するために使用される多くの手段のいずれかを介してであることができる。前記の手段の例は、イオン性相互作用（例えば、陰イオン交換クロマトグラフィー）及び疎水性相互作用（例えば、逆相クロマトグラフィー）、ｐＨ値の差及び変化、塩の差及び変化（例えば、濃度変化、カオトロピック塩／エージェント）が含まれるが、これらに限定されない。ｐＨに基づいた固相の典型的な例は、これには限定されないがＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＣｈａｒｇｅＳｗｉｔｃｈ Ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ Ｂｕｃｃａｌ Ｋｉｔ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｂｅａｄｓにおいて使用されているものを含み、これは低ｐＨ（＜６．５）で核酸に結合し、そして高ｐＨ（＞８．５）で核酸を放出し、そしてモノ−アミノ−Ｎ−アミノエチル（ＭＡＮＡＥ）は７．５より低いｐＨで核酸と結合し、そして８より大きいｐＨで核酸を放出する。典型的なイオン交換系基材（ion exchange based substrates）としては、ＰＨＡＲＭＡＣＩＡ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ.Ｊ.）からの、ＤＥＡ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭ、Ｑ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭ、及びＤＥＡＥ−ＳＥＰＨＡＤＥＸＴＭ、Ｄｏｗ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｄｌａｎｄ，Ｍｉｃｈ.）からのＤＯＷＥＸ（登録商標）Ｉ、Ｒｏｈｍ＆Ｈａａｓ（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ.）からのＡＭＢＥＲＬＩＴＥ（登録商標）、Ｄｕｏｌｉｔｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ, Ｉｎ.（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｏｈｉｏ）からのＤＵＯＬＩＴＥ（登録商標）、ＤＩＡＬＯＮ ＴＩ及びＤＩＡＬＯＮ ＴＩＩが含まれるが、これらに限定されない。
【０１４２】
任意の個々の方法が、単独での又は他の方法と組み合わせた使用が意図され、そして前記の有用な組み合わせは当業者には周知であり、よく理解されている。
【０１４３】
ＶＩ．核酸分析
開示された方法は、核酸例えば、ゲノム分析を含む様々な核酸分析のためのゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を単離するために使用される。いくつかの実施態様では、前記の分析は、様々な遺伝的変異の検出を含み、この遺伝的変異は、欠失、挿入、トランジション、及びトランスバージョンが含むが、これらに限定されない。いくつかの実施態様では、変異は一塩基多型（ＳＮＰ）である。
【０１４４】
前記の単離された核酸例えばこれには限定されないがゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）の様々な分析方法は、当該技術分野で公知であり、そして核酸の構成（nucleic acid compositions）が分析され当業者に公知である様々な方法並びにＰＣＲ法例えばリアルタイムＰＣＲ分析、マイクロアレイ分析、ハイブリダイゼーション分析、及び核酸シーケンス分析を含む。例えば、Molecular Cloning (three volume set, Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 2012)及びCurrent Protocols (Genetics and Genomics; Molecular Biology; 2003-2013)参照。
【０１４５】
ａ．リアルタイムＰＣＲ
リアルタイムＰＣＲアッセイの設計のために、いくつかの部分は、多くの場合、アンプリコンと頻繁に呼ばれる、プライマーの２つによって挟まれその後増幅されるＤＮＡ断片を含み、プライマーの２つ及び検出プローブの１つ又は複数が使用されるべきである。
【０１４６】
リアルタイムＰＣＲは、配列特異的様式でゲノムのアレルに結合する短いポリヌクレオチド（検出プローブと称する）と結合する蛍光色素の視覚的な放出に依存している。単一ヌクレオチドが異なるリアルタイムＰＣＲプローブは、異なる波長で蛍光を発するプローブの結合及び検出によるリアルタイムＰＣＲアッセイにおいて区別することができる。リアルタイムＰＣＲは、検出用途（診断用途）、定量化用途、及びジェノタイピング用途における使用を見出す。
【０１４７】
リアルタイムＰＣＲ実施のための関連するいくつかの方法は、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プローブ（米国特許第５，２１０，０１５号明細書及び米国特許第５，４８７，９７２号明細書、並びにLee et al., Nucleic Acids Res. 21:3761-6, 1993）、分子ビーコンプローブ（molecular beacon probes）（米国特許第５，９２５，５１７号明細書及び米国
特許第６，１０３，４７６号明細書、並びにTyagi and Kramer, Nat. Biotechnol. 14:303-8, 1996）、自己プローブ化アンプリコン（self-probing amplicons）（ｓｃｏｒｐｉｏｎｓ）（米国特許第６，３２６，１４５号明細書、及びWhitcombe et al., Nat. Biotechnol. 17:804-7, 1999）、Ａｍｐｌｉｓｅｎｓｏｒ（Chen et al., Appl. Environ. Microbiol. 64:4210-6, 1998）、Ａｍｐｌｉｆｌｕｏｒ（米国特許第６，１１７，６３５号明細書、及びNazarenko et al., Nucleic Acids Res. 25:2516-21, 1997）、置換ハイブリダイゼーションプローブ（displacement hybridization probes）（Li et al., Nucleic Acids Res. 30:E5, 2002）、ＤｚｙＮＡ−ＰＣＲ（Todd et al., Clin. Chem. 46:625-30, 2000）、蛍光制限酵素検出（fluorescent restriction enzyme detection）（Cairnset al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 318:684-90, 2004）、並びに近接ハイブリダイゼーションプローブ（adjacent hybridization probes）（米国特許第６，１７４，６７０号明細書、及びWittwer et al., Biotechniques 22:130- 1, 134-8, 1997）に依存するアッセイを含むものが、当該技術分野において公知である。
【０１４８】
いくつかの例では、リアルタイムＰＣＲは、例えばＳＮＰを含むがこれに限定されるものではない遺伝子変異の様々な検出をもたらすことができる。いくつかの実施態様では、特定の遺伝子候補（gene candidates）におけるＳＮＰの検出は、繋留消光部分（tethered quenching moiety）を使用することによる蛍光分子の分子内消光の使用に基づいて、リアルタイムＰＣＲを用いて行われる。したがって、例示的な実施態様によれば、リアルタイムＰＣＲ法はまた、分子ビーコン技術の使用を含む。分子ビーコン技術は、関心のあるＤＮＡ標的に結合することによってその蛍光を復元される内部消光蛍光体を用いたヘアピン状分子を利用する（例えば、Kramer, R. et al. Nat. Biotechnol. 14:303-308, 1996参照）。いくつかの実施態様では、蓄積しているＰＣＲ産物に対する分子ビーコンプローブの増加された結合は、ゲノムＤＮＡにおけるＳＮＰの存在を特異的に検出するために使用される。
【０１４９】
多くの適切なジェノタイピング手順の１つは、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アレル識別アッセイである。このアッセイのいくつかの例では、プローブの５’末端で蛍光レポーター色素によりそしてプローブの３’末端でクエンチャーダイ（quencher dye）により標識されるオリゴヌクレオチドプローブが利用される。インタクトプローブ（intact probe）に対するクエンチャーの近接は、レポーター用の低い蛍光を維持する。ＰＣＲ反応の間、ＤＮＡポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性がプローブを切断し、そして色素とクエンチャーとを分離する。これは、レポーターの蛍光の増加をもたらす。ＰＣＲ産物の蓄積は、レポーター色素の蛍光の増加を監視することにより直接的に検出される。プローブが標的にハイブリダイズしそしてＰＣＲの間に増幅されている場合にのみ、ＤＮＡポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性が、レポーターとクエンチャーとの間でプローブを切断する。プローブは、標的ＳＮＰ位置にまたがり（straddle）、特定のＳＮＰアレルが存在する場合にのみ核酸分子にハイブリダイズするように設計されている。
【０１５０】
例として、ＴＧＦβＩ遺伝子のエクソン４に位置するアベリノ角膜ジストロフィー関連ＳＮＰを増幅するために、米国特許出願公開第２０１２／００７７２００号に記載されているように、フォワード及びリバースのＰＣＲプライマー対が設計された（図２の配列番号１〜２４）。いくつかの実施態様では、その中に開示されているフォワード及びリバースプライマー対のいずれかが、本明細書で開示されている改良された方法で使用されている。好ましい実施態様では、配列番号１（フォワード）及び配列番号２（リバース）のプライマー対が、本明細書で開示されている改良された方法で使用される。
【０１５１】
ＴＧＦβＩ遺伝子のエクソン４におけるグアニンからアデニンへの変異を検出するために、米国特許出願公開第２０１２／００７７２００号に記載されているように、図３に示される配列番号２５〜４２によるヌクレオチド配列を有する、野生型（「Ｇ」）及びアベリノ角膜ジストロフィー関連変異（「Ａ」）検出用に蛍光標識されたリアルタイムＰＣＲプローブ対が設計された。いくつかの実施態様では、野生型及び変異型プローブのいずれかが、本明細書中に開示される改良された方法において使用される。好ましい実施態様では、配列番号２５（野生型）及び配列番号２６（変異体）の野生型及び変異体プローブ対が、本明細書で提供される改善された方法において使用される。疾患関連アレルから野生型アレルを識別するために、野生型プローブはＶＩＣで標識し、そして変異型プローブはＦＡＭで標識した。相補的な遺伝子断片への結合を促進するようにマイナーグルーブバインダー（ＭＧＢ）をプローブに結合した。
【０１５２】
ｂ．リアルタイムＰＣＲサイクル
リアルタイムＰＣＲ法は、増幅のための方法の一部として、様々な工程又はサイクルを含む。これらのサイクルは、二本鎖核酸を変性させる工程、フォワードプライマー、リバースプライマー、及び標的ゲノムＤＮＡ配列の検出プローブをアニーリングする工程、そしてアニーリングされたフォワードプライマー及びリバースプライマーから第二鎖ＤＮＡを合成（すなわち、複製）する工程を含む。この３段階のプロセスは、本明細書ではサイクルと称する。
【０１５３】
いくつかの実施態様では、約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、又は６０サイクルが採用される。いくつかの実施態様では、約１０〜約６０サイクル、約２０〜約５０サイクル、又は約３０〜約４０サイクルが採用される。いくつかの実施態様では、４０サイクルが採用される。
【０１５４】
いくつかの実施態様では、二本鎖核酸の変性工程は、約１秒〜約５秒、約２秒〜約５秒、又は約３秒〜約４秒の間、約８０℃〜１００℃、約８５℃〜約９９℃、約９０℃〜約９５℃の温度で生じる。いくつかの実施態様では、二本鎖核酸の変性工程は、約３秒の間、９５℃の温度で生じる。
【０１５５】
いくつかの実施態様では、フォワードプライマー、リバースプライマー、及び標的ゲノムＤＮＡ配列の検出プローブをアニーリングする工程は、約１５秒〜約４５秒、約２０秒〜約４０秒、約２５秒〜約３５秒の間、約４０℃〜約８０℃、約５０℃〜約７０℃、約５５℃〜約６５℃で生じる。いくつかの実施態様では、フォワードプライマー、リバースプライマー、及び標的ゲノムＤＮＡ配列の検出プローブをアニーリングする工程は、約３０秒の間、約６０℃で生じる。
【０１５６】
いくつかの実施態様では、アニーリングされたフォワードプライマー及びリバースプライマーから第二鎖ＤＮＡを合成（すなわち、複製）する工程は、約１５秒〜約４５秒、約２０秒〜約４０秒、約２５秒〜約３５秒の間、約４０℃〜約８０℃、約５０℃〜約７０℃、約５５℃〜約６５℃で生じる。いくつかの実施態様では、フォワードプライマー、リバースプライマー、及び標的ゲノムＤＮＡ配列の検出プローブをアニーリングする工程は、約３０秒の間、約６０℃で生じる。
【０１５７】
いくつかの実施態様では、本明細書に記載される本方法に従って調製したゲノムＤＮＡサンプルの約１μＬ、約２μＬ、約３μＬ、約４μＬ、又は約５μＬが、３０Ｘ、３５Ｘ、４０Ｘ、４５Ｘ、５０Ｘ、又は１００ＸのリアルタイムＰＣＲアッセイミックスのわずか約０．０５μＬ、約０．１０μＬ、約０．１５μＬ、約０．２０μＬ、約０．２５μＬ、又は約０．２５μＬ及び蒸留水と組み合わされＰＣＲマスターミックスを形成することが見出された。いくつかの実施態様では、ＰＣＲマスターミックスは、約５μＬ、約６μＬ、約７μＬ、約８μＬ、約９μＬ、約０μＬ、約１１μＬ、約１２μＬ、約１３μＬ、約１４μＬ、約１５μＬ、約１６μＬ、約１７μＬ、約１８μＬ、約１９μＬ、若しくは約２０μＬ又はそれ以上の最終体積を有する。いくつかの実施態様では、上記のように調製されたゲノムＤＮＡサンプル２μＬが、４０ＸのリアルタイムＰＣＲアッセイミックスのわずか０．１５μＬ及び蒸留水２．８５μＬと組み合わされることが見出された。
【０１５８】
例示的な反応が本明細書に記載されているが、当業者は、プローブの設計に基づいて、温度と時間を変更する方法を理解するであろう。また、本方法は、前記の時間及び温度の任意の組み合わせを意図する。
【０１５９】
ｃ．ＰＣＲプライマー及びプライマー設計
いくつかの実施態様において、プライマーは、実験室の設定において試験されそして設計される。いくつかの実施態様において、プライマーは、インシリコ方法（in silico methods）に基づいて、コンピュータによって設計される。プライマー配列は、アンプリコン又は増幅される標的核酸配列の配列に基づいている。より短いアンプリコンは、典型的には、より長いアンプリコンと比較して、より効率的に複製しそしてより効率的な増幅につながる。
【０１６０】
プライマーの設計において、当業者は、二次構造の考慮事項と同様に設計されるプライマーのＧＣ及びＡＴ含量に基づき（増加されたＧＣ含量は、二次構造の増加をもたらす可能性がある）、融解温度（melting temperature）（Ｔｍ；プライマー標的二重鎖の半分が解離しそして一本鎖になるとされ、そして二本鎖の安定性の指標となる温度；Ｔｍの増加は安定性の増加を示す）を考慮に入れる必要があることを理解するであろう。ＴＭは、当該技術分野において公知の様々な方法を用いて計算されそして当業者は前記の様々なＴＭの計算方法を容易に理解するであろう；前記方法は例えばこれには限定されないが、promega.com/techserv/tools/biomath/calc11.htmでワールドワイドウェブで使用可能なＴＭ計算機のようなオンラインで使用可能なものが含まれる。プライマーの特異性は、Ｔａｑポリメラーゼにより伸長する部分である３’末端配列と組み合わせたその完全な配列によって定義される。いくつかの実施態様では、３’末端は、誤った増幅産物の偽プライミング（false-priming）及び生成を軽減するために、標的配列のどこにも見られない、固
有のヌクレオチド少なくとも５〜７個を有していなければならない。フォワード及びリバースプライマーは、典型的には、同様の効率で標的と結合する。いくつかの例では、ツール例えばＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ（ncbi.nlm.nih.govのワールドワイドウェブ上に位置する
）がアラインメントを実行するために使用され、プライマー設計を支援する。
【０１６１】
当業者は、標的核酸配列についてのプライマー設計についての基本、並びに前記の方法に対して広範な教示を持つ様々なリファレンスマニュアル及びテキスト、例えば、Molecular Cloning (three volume set, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2012)及びCurrent Protocols (Genetics and Genomics; Molecular Biology; 2003-2013)及びReal-time PCR in Microbiology: From Diagnostics to Characterization (Ian M. MacKay, Calster Academic Press; 2007); primerdigital.com/tools/PrimerAnalyser.htmlのワールドワイドウェブ上で使用可能なプライマーアナライザーＪａｖａツール、及びKalendar R, et al. (Genomics, 98(2): 137-144 (2011))を十分に承知しており、これらの全てが全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
【０１６２】
プライマー設計の追加の観点は、プライマーの複雑性（primer complexity）又は言語的配列複雑性（linguistic sequence complexity）である（Kalendar R, et al. (Genomics, 98(2): 137-144 (2011)参照）。多大な言語的配列複雑性を有しているプライマー（例えばヌクレオチドの配列及び組成）は、典型的にはより有効である。いくつかの実施態様では、言語的配列複雑性の計算方法は、単純反復配列（simple sequence repeats）、不完全直接又は逆方向反復（imperfect direct or inverted repeats）、ポリプリン及びポリピリミジン三本鎖ｃＤＮＡ構造（triple-stranded cDNA structures）、及び四本鎖構造（four-stranded structures）（例えば、Ｇ四重鎖）を含む低複雑領域の検出のために、比較配列間の保存領域を探索するために使用される。いくつかの実施態様では、言語的複雑性（ＬＣ）測定は、アルファベットキャパシティーＬ−グラム法（alphabet-capacity L-gram method）（A. Gabrielian, A. Bolshoy, Computer & Chemistry 23:263-274 (1999)及びY.L. Orlov, V.N. Potapov, Complexity: an internet resource for analysis of DNA sequence complexity, Nucleic Acids Res. 32: W628-W633(2004)参照）を用いて全長配列に沿って実施され、配列の長さについての期待された値の合計（Ｅ）により除算された、配列における１〜Ｌの大きさの言葉（ｗｏｒｄ）の観察された範囲（ｘｉ）の合計として計算される。いくつかのＧリッチ（及びＣリッチ）核酸配列は、Ｇカルテットのスタックを含有する四本鎖ＤＮＡ構造に折り畳まれる（quadruplex.orgでのワールドワイドウェブ参照）。いくつかの例では、これらの四重鎖は、ＤＮＡ分子２個又は４個の分子間集合、Ｇ塩基２つを含む配列の二量体化により、又はグアニンの４ブロックを含む一本鎖分子間の折り畳みにより形成される（P.S. Ho, PNAS, 91:9549-9553 (1994); I.A. Il'icheva, V.L. Florent'ev, Russian Journal of Molecular Biology 26:512-531 (1992); D. Sen, W. Gilbert, Methods Enzymol. 211:191-199 (1992); P.A. Rachwal, K.R. Fox, Methods 43:291-301 (2007); S. Burge, G.N. Parkinson, P. Hazel, A.K. Todd, K. Neidle, Nucleic Acids Res. 34:5402-5415 (2006); A. Guedin, J. Gros, P. Alberti, J. Mergny, Nucleic Acids Res. 38:7858-7868 (2010); O. Stegle, L. Payet, J.L. Mergny, D.J. MacKay, J.H. Leon, Bioinformatics 25:i374-i382 (2009)参照。いくつかの例では、これらは、それらの低言語的複雑性のためにプライマー設計から排除される、（ＴＴＡＧＧＧ）４についてＬＣ＝３２％。）。
【０１６３】
これらの方法は、ＣＧ含量及び融解温度に関する、ＧＣスキュー（GC skew）、（Ｇ−Ｃ）／（Ｇ＋Ｃ）、ＡＴスキュー、（Ａ−Ｔ）／（Ａ＋Ｔ）、ＣＧ−ＡＴスキュー、（Ｓ−Ｗ）／（Ｓ＋Ｗ）、又はプリン−ピリミジン（Ｒ−Ｙ）／（Ｒ＋Ｙ）スキューを有する配列におけるパターン分析用の様々なバイオインフォマティクスツールを含み、そして言語的配列複雑性プロファイルを決定するためのツールを提供する。例えば、ｎ塩基（ｎは正の整数である）のスライディングウィンドウにおけるＧＣスキューは、ウインドウにおける全配列についての、Ｇがグアニンの総数でありＣがシトシンの総数である式（Ｇ−Ｃ）／（Ｇ＋Ｃ）に従って、１塩基のステップを用いて計算される（Y. Benita, et al., Nucleic Acids Res. 31:e99 (2003)）。負のＧＣ−スキュー値はＣ塩基の過剰を示すのに対し、正のＧＣ−スキュー値は、Ｇ塩基の過剰を示した。同様に、他のスキューが順次算出される。前記の及び他の方法は、いくつかの実施態様では、プライマーの複雑性を決定するために使用される。
【０１６４】
非限定的な例の実施態様によれば、リアルタイムＰＣＲは、エキソヌクレアーゼプライマー（ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ）を用いて実施される。前記の実施態様では、プライマーは、熱安定性ポリメラーゼ例えばＴａｑのエキソヌクレアーゼ活性を利用して、増幅反応中に存在する二重標識プローブを切断する（例えばWittwer, C. et al. Biotechniques 22:130-138, 1997参照）。ＰＣＲ産物と相補的である一方で、このアッセイで
使用されたプライマープローブは、ＰＣＲプライマーとは異なり、そして蛍光可能な分子と蛍光を消光することができる分子との両方で二重標識されている。プローブがインタクトである場合、ＤＮＡプローブ内の蛍光シグナルの分子内消光が少ないシグナルをもたらす。蛍光分子が増幅中にＴａｑのエキソヌクレアーゼ活性によって遊離されると、消光が大幅に減少しそして蛍光シグナルの増加をもたらす。非限定的な例として、蛍光プローブは、６−カルボキシ−蛍光部分などが挙げられる。代表的なクエンチャーは、ブラックホールクエンチャー１部分（Black Hole Quencher 1 moiety）などが挙げられる。
【０１６５】
様々なＰＣＲプライマーが、開示された方法における使用を見出すことができる。例示的なプライマーは、本明細書に記載したものを含むがこれらに限定されない。開示された方法における使用のためのプライマーはまた、米国特許出願公開第２０１２００７７２００号において見出され、本出願は全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施態様では、本開示の方法において使用されるためのＰＣＲプライマーは、これに限定されるものではないが、以下の表１のリストを含み、そしてＴＧＦβＩ遺伝子の検出における使用を見出す。表２及び３は、primerdigital.com/tools/PrimerAnalyser.htmlでのワールドワイドウェブを使用して掲載されたような、各々のプライマーのた
めの生物物理学的パラメータを提供する。
【表１】
2020039339.tif 000002
【表２】
2020039339.tif 000003
【表３】
2020039339.tif 000004
【０１６６】
いくつかの実施態様において、開示された方法で使用するためのリアルタイムＰＣＲプライマーは、言語的配列複雑性の少なくとも７０％、少なくとも７２％、少なくとも７５％、少なくとも７７％、少なくとも８０％、少なくとも８２％、少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％を有する。
【０１６７】
ｄ．検出プローブ設計及び検出プローブ
様々な検出プローブが開示された発明と一緒の使用を見出すことができそしてジェノタイピング及び／又は定量化のために用いられる。当業者に一般的に採用される検出プロ―ブは、加水分解プローブ（ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ、５’ヌクレアーゼプローブ、又は二重標識プローブとしても公知である）、ハイブリダイゼーションプローブ、及びスコーピオンプライマー、（プライマーを組み合わせそして検出プローブは１つの分子内にある）が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施態様では、検出プローブの設計は、プローブが用いられたＰＣＲプライマーと互換性があるように、所望のプローブの標的に基づいて当業者によって決定される（例えば、プライマー及びプローブは、リアルタイムＰＣＲアッセイにおいてお互いの機能を妨害してはならない）。いくつかの実施態様では、プローブは、効果的なシグナルの生成を促進するために、プライマーよりも高いＴｍを有するように設計される。Ｔｍは、当該技術分野で公知の様々な方法のいずれかを使用して計算され、当業者はＴｍを計算するための様々な方法を容易に理解するであろう；前記の方法には、オンラインツールで使用可能なもの例えば、promega.com/techserv/tools/biomath/calc11.htm.でのワールドワイドウェブで使用可能な計算機が含まれる。いくつかの実施態様では、検出プローブの増加したＴｍは、プライマーがポリメラーゼによって伸長される前に検出プローブが結合していることを提供する。
【０１６８】
いくつかの実施態様において、検出プローブは、様々な修飾を含む。いくつかの実施態様では、検出プローブには核酸残基の修飾、例えば２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド修飾、ホスホロチオエート骨格修飾、ホスホロジチオエート骨格修飾、ホスホロアミデート骨格修飾、メチルホスホネート骨格修飾、３’末端リン酸修飾、及び／又は３’アルキル置換が含まれるが、これらに限定されない。
【０１６９】
いくつかの実施態様では、検出プローブは、修飾のために、標的配列に対する増加した親和性を有する。前記の検出プローブは、化学修飾を含む検出プローブと同様に、長さが増加した検出プローブを含む。前記の修飾は、２’−フルオロ（２’−デオキシ−２’−フルオロ−ヌクレオシド）修飾、ＬＮＡ（ロックド核酸）、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＺＮＡ（ジッパー核酸）、モルホリノ、メチルホスホネート、ホスホロアミド酸、ポリカチオン複合体、及び２’−ピレン修飾を含むがこれらに限定されない。いくつかの実施態様において、検出プローブは、２’フルオロ修飾（別名、２’−デオキシ−２’−フルオロ−ヌクレオシド）、ＬＮＡ（ロックド核酸）、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＺＮＡ（ジッパー核酸）、モルホリノ、メチルホスホネート、ホスホロアミド酸、及び／又はポリカチオン複合体を含む修飾の１つ又はそれ以上を含む。
【０１７０】
いくつかの実施態様において、検出プローブは、検出可能な部分、例えば当業者に公知の任意の検出可能な部分と本明細書で記載したものとを含む。前記の検出可能な部分は、例えば蛍光標識及び化学発光標識を含むがこれらに限定されない。前記の検出可能な部分の例としてはまた、ＦＲＥＴ対の群を含むことができる。いくつかの実施態様において、検出プローブは、検出可能な実体（detectable entity）を含んでいる。
【０１７１】
蛍光標識の例としては、ＡＭＣＡ、ＤＥＡＣ（７−ジエチルアミノクマリン−３−カルボン酸）、７−ヒドロキシ−４−メチルクマリン−３；ＭＣＡ（７−メトキシクマリン−４−酢酸）；７−メトキシクマリン−３；ＡＭＦ（４’−（アミノメチル）フルオレセイン）；５−ＤＴＡＦ（５−（４，６−ジクロロトリアジニル）アミノフルオレセイン）；６−ＤＴＡＦ（６−（４，６−ジクロロトリアジニル）アミノフルオレセイン）；６−ＦＡＭ（６−カルボキシフルオレセイン；ａｋａ ＦＡＭ；ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＦＡＭＴＭを含む）；ＴａｑＭａｎ ＶＩＣ（登録商標）；５（６）−ＦＡＭカダベリン；５−ＦＡＭカダベリン；５（６）−ＦＡＭエチレンジアミン；５−ＦＡＭエチレンジアミン；５−ＦＩＴＣ（ＦＩＴＣ異性体Ｉ；フルオレセイン−５−イソチオシアネート）；５−ＦＩＴＣカダベリン；フルオレセイン−５−マレイミド；５−ＩＡＦ（５−ヨードアセトアミドフルオレセイン）；６−ＪＯＥ（６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ―２’，７’−ジメトキシフルオレセイン）；５−ＣＲｌ １０−（５−カルボキシローダミン１１０）；６−ＣＲｌ １０−（６−カルボキシローダミン１１０）；５−ＣＲ６Ｇ（５−カルボキシローダミン６Ｇ）；６−ＣＲ６Ｇ（６−カルボキシローダミン６Ｇ）；５（６）−カルボキシローダミン６Ｇカダベリン；５（６）−カルボキシローダミン６Ｇエチレンジアミン；５−ＲＯＸ（５−カルボキシ−Ｘ−ローダミン）；６−ＲＯＸ（６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン）；５−ＴＡＭＲＡ（５−カルボキシテトラメチルローダミン）；６−ＴＡＭＲＡ（６−カルボキシテトラメチルローダミン）；５−ＴＡＭＲＡカダベリン；６−ＴＡＭＲＡカダベリン；５−ＴＡＭＲＡエチレンジアミン；６−ＴＡＭＲＡエチレンジアミン；５−ＴＭＲ Ｃ６マレイミド；６−ＴＭＲ Ｃ６マレイミド；ＴＲ Ｃ２マレ
イミド；ＴＲカダベリン；５−ＴＲＩＴＣ；Ｇ異性体（テトラメチルローダミン−５−イソチオシアネート）；６−ＴＲＩＴＣ；Ｒ異性体（テトラメチルローダミン−６−イソチオシアネート）；ダンシルカダベリン（５−ジメチルアミノナフタレン−１−（Ｎ−（５−アミノペンチル））スルホンアミド）；ＥＤＡＮＳ Ｃ２マレイミド；フルオレスカミン（fluorescamine）；ＮＢＤ；及びピロメテン（pyrromethene）並びにそれらの誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７２】
化学発光標識の例は、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔ ａｎｄ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（例えば全体が参照として本明細書に組み込まれるSambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (3rd ed.) (2001)参照）と共に用いられる標識を含むが、これらに限定されない。例としては、−（２’−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３”−ホスホリルオキシ）フェニル−１，２−ジオキセタン（ＡＭＰＰＤ）；アクリジニウムエステル、及びアダマンチル安定化１，２−ジオキセタン並びにそれらの誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７３】
プローブの標識は、当該技術分野で公知である。標識プローブは、増幅中に増幅された領域内でハイブリダイズするために使用される。プローブは修飾され、増幅用プライマーとして作用することから回避する。検出プローブは蛍光色素の２つを用いて標識され、１つは、他の色素の蛍光を消光することができるものである。色素の１つがプローブの５’末端に結合され、そして他方は、内部部位に結合されており、プローブは、非ハイブリダイズ状態（non-hybridized state）にあるときに消光が起こる。
【０１７４】
典型的には、リアルタイムＰＣＲプローブは、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）に関与している染料の対（レポーター色素とアクセプター色素）から成り、それによってアクセプター色素は、レポーター色素の発光を消光する。一般に、蛍光標識したプローブはアンプリコン定量の特異性を高める。
【０１７５】
開示された方法のいくつかの実施態様において使用されるリアルタイムＰＣＲはまた、本開示を考慮して、当業者によって決定されるように、ハイブリダイゼーションプローブ（すなわち、検出プローブ）の１つ以上の使用を含む。非限定的な例として、前記のハイブリダイゼーションプローブとしては、記載された方法において提供されたものの１つ又はそれ以上が含まれるが、これには限定されない。例示的プローブ例えばＨＥＸチャネル（HEX channel）及び／又はＦＡＭチャネル（FAM channel）プローブは、当業者により理解される。
【０１７６】
例示的な実施態様によれば、検出プローブ及びプライマーは、好都合には、例えばプライマー設計ソフトウェアを用いたインシリコ分析、並びにＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅ
ｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）に寄託さ
れた遺伝子及びゲノムの利用可能なヌクレオチドデータベースに対する相互参照を使用して選択される。いくつかの追加的なガイドラインが、いくつかの実施態様において、プライマー及び／又はプローブの選択のために使用されることができる。例えば、いくつかの実施態様において、プライマー及びプローブは、それらが互いに近くにあるものの重複しないように選択される。いくつかの実施態様において、プライマーは、同じ（又は近いＴＭ）（例えば、約５８℃〜約６０℃）を有することができる。いくつかの実施態様では、プローブのＴＭは、プライマーのＴＭのために選択されたものよりも約１０℃高い。いくつかの実施態様では、プローブ及びプライマーの長さは、約１７〜３９塩基対などであるように選択される。これら及び他のガイドラインは、適切なプライマー及び／又はプローブを選択する際に、いくつかの場合において当業者により使用されている。
【０１７７】
本発明の方法において使用するためのプローブとしては、以下の表４に示す例示的なプローブが含まれるが、これらに限定されない。
【表４】
2020039339.tif 000005
【０１７８】
ＶＩＩ．診断テスト
いくつかの実施態様において、診断テストは、様々な変異の検出により遺伝的条件の１つ又はそれ以上を決定するために使用される。いくつかの実施態様において、診断テストは、特定の条件が、例えば物理的な症状、徴候及び／又は症状、並びに家族歴情報に基づいて疑われる場合に、診断を確定するために使用される。いくつかの実施態様では、診断テストの結果は、任意の患者に対する適切な治療計画の決定において医学分野の当業者を支援し、そしてより個人化されさらにより効果的な治療計画を可能にする。いくつかの実施態様において、治療計画は、当業者によって決定されるような、様々な薬剤治療、外科的治療、ライフスタイルの変化、又はそれらの組み合わせのいずれかを含む。
【０１７９】
開示された方法により得られた核酸は、変異、例えば欠失、挿入、トランスバージョン及びトランジションを検出するためのテストを含む様々な診断テストに有用である。いくつかの実施態様では、前記の診断は、発現されるべき病気のために２コピーを必要とする病気について遺伝子の１コピーを保有する影響を受けていない個体を同定するのに有用であり、遺伝子の１コピーを保有する影響を受けていない個体の同定における情報は、治療計画、着床前遺伝子診断、出生前診断検査、新生児スクリーニング、家系ＤＮＡテスト（遺伝的系譜目的）、成人発症型障害例えばハンチントン病予測用の前駆症状テスト、成人発症型がん及びアルツハイマー病発症リスク推定用前駆症状テスト、症候性個体の確定診断（confirmational diagnosis of a symptomatic individual）、及び／又は法医学/同
一性試験の開発における使用を見出すことができる。いくつかの実施態様では、本方法は、角膜ジストロフィーの検出における使用を見出すことができる。いくつかの実施態様では、角膜ジストロフィーは、例えば、アベリノ角膜ジストロフィー関連ＳＮＰ、例えば、ＴＧＦβＩ遺伝子のＲ１２４突然変異をもたらすもの（例えば、これには限定されないが、Ｃ（Ｇ／Ａ）Ｃ ＳＮＰとも称されるＴＧＦβＩ遺伝子の第４１８位ヌクレオチドのＧ
からＡへのトランジションにより引き起こされるＲ１２４Ｈ突然変異を含む）の検出を通して検出される。いくつかの実施態様では、角膜ジストロフィーは、例えば、顆粒状角膜ジストロフィー関連ＳＮＰ、例えば、ＴＧＦβＩ遺伝子のＲ５５５突然変異をもたらすもの（例えば、これには限定されないが、（Ｃ／Ｔ）ＧＧ ＳＮＰとも称されるＴＧＦβＩ遺伝子の第１６６３位ヌクレオチドのＣからＴへのトランジションにより引き起こされるＲ５５５Ｗ突然変異を含む）の検出を通して検出される。いくつかの実施態様では、角膜ジストロフィーは、例えば、格子型ジストロフィー関連ＳＮＰ、例えば、ＴＧＦβＩ遺伝子のＲ１２４及び／又は６２６突然変異をもたらすもの（例えば、これには限定されないが、（Ｃ／Ｔ）ＧＣ ＳＮＰとも称されるＴＧＦβＩ遺伝子の第４１７位ヌクレオチドのＣからＴへのトランジション、又はＴＧＦβＩ遺伝子の第１９２４位ヌクレオチドのＡからＣへのトランジションにより引き起こされるＨ６２６Ｐ突然変異を含む）の検出を通して検出される。いくつかの実施態様では、角膜ジストロフィーは、例えば、レイス・バックラー角膜ジストロフィー関連ＳＮＰ、例えば、ＴＧＦβＩ遺伝子のＲ１２４突然変異をもたらすもの（例えば、これには限定されないが、Ｃ（Ｇ／Ｔ）Ｃ ＳＮＰとも称されるＴＧＦβＩ遺伝子の第４１８位ヌクレオチドのＧからＴへのトランジションにより引き起こされるＲ１２４Ｌ突然変異を含む）の検出を通して検出される。いくつかの実施態様では、角膜ジストロフィーは、例えば、ティール−ベンケ角膜ジストロフィー関連ＳＮＰ、例えば、ＴＧＦβＩ遺伝子のＲ５５５突然変異をもたらすもの（例えば、これには限定されないが、Ｃ（Ｇ／Ａ）Ｇ ＳＮＰとも称されるＴＧＦβＩ遺伝子の第１６６４位ヌクレオチドのＧからＡへのトランジションにより引き起こされるＲ５５５Ｑ突然変異を含む）の検出を通して検出される。
【０１８０】
いくつかの実施態様では、新生児スクリーニングは、遺伝的障害を識別するためにのみ使用される任意の出生後遺伝子スクリーニングを含む。いくつかの実施態様では、新生児スクリーニングは、遺伝的疾患の識別における使用を見出し、治療計画が人生の早い段階で決定される。前記のテストとしては、フェニルケトン尿症（phenylketonuria）及び先天性甲状腺機能低下症（congenital hypothyroidism）のために幼児をテストすることが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８１】
いくつかの実施態様では、保因者テスト（carrier testing）は、遺伝子変異の単一のコピーを保有する人の識別用に使用される。いくつかのケースでは、コピー２つが存在する場合に、変異は遺伝的障害を引き起こす可能性がある。いくつかのケースでは、コピー１つが遺伝病を引き起こすのに十分である。いくつかのケースでは、コピー２つの存在が、特定の治療計画について例えばアベリノ突然変異の存在下で及び外科的処置実行前のスクリーニングで禁忌とされており（contra-indicated）、任意の患者のために追及する適切な治療計画を保証する。いくつかの実施態様では、前記の情報はまた、個々の生殖力検討（contemplating procreation）のために有用でありそして個々の患者並びに患者の血
縁者に重要なアドバイスを提供する医学分野の当業者を支援するのと同様に個人の詳細な情報を得たうえでの決断（informed decision）を支援する。
【０１８２】
いくつかの実施態様では、テストの予測の及び／又は前駆症状の種類は、様々な障害に関連する遺伝的変異を検出するために使用される。いくつかのケースでは、これらのテストは、遺伝性疾患を持つ家族を有するがテスト時には障害のない特徴を示す可能性がある人に有用である。いくつかの実施態様では、予測テストは、例えば特定の種類のがんを含むがこれには限定されない遺伝的背景を有する障害の発症の機会を増加させる変異を同定する。いくつかの実施態様では、発症前検査は、任意の物理的な徴候や症状が現れる前に、人が、遺伝性疾患を発症するかどうかを決定するのに有用である。予測及び発症前検査テストの結果は、特定の障害を発症する人のリスクに関する情報を提供し、患者並びに患者の血縁者にとって、適切な医療処置計画に関する意思決定を行う助けとなる。いくつかの実施態様では、予測テストはまた、アベリノ角膜ジストロフィー存在下での禁忌であるＬＡＳＩＫ手術、及び／又はその他の屈折矯正手術、例えばこれらに限定されないが、フォトセラピューティックケラテクトミー（ＰＴＫ）、及び／又はフォトリフラクティブケラテクトミー（ＰＲＫ））の実施のような特定の治療計画において禁忌となる変異を検出するために使用される。例えば、アベリノ角膜ジストロフィーを示す患者は、ＬＡＳＩＫ手術、又はその他の屈折矯正手術を受けるべきではない。
【０１８３】
いくつかの実施態様において、診断テストはまた、薬物応答における遺伝的変異の影響を決定する遺伝子テストを含む薬理ゲノミクスを含む。前記の薬理ゲノミクス分析からの情報は、適切な治療計画の決定及び開発における使用が見出される。医学分野の当業者は、適切な治療計画を設計する際の遺伝子変異の存在及び／又は不存在に関する情報を使用する。
【０１８４】
いくつかの実施態様において、その遺伝子プロファイルが本開示の方法を用いて決定される疾患は、眼疾患、がん、糖尿病（diabetes mellitus）、高血圧症、統合失調症、並びに最も一般的な先天性奇形、例えば口唇裂（cleft lip）、口蓋裂（cleft palate）、神経管欠陥（neural tube defects）、軟骨無形成症（Achondroplasia）、α−１アンチトリプシン欠損症（Alpha-1 Antitrypsin Deficiency）、抗リン脂質症候群（Antiphospholipid Syndrome）、自閉症、常染色体優性多発性嚢胞腎病（Autosomal Dominant Polycystic Kidney Disease）、シャルコー・マリー・トゥース（Charcot-Marie-Tooth）、大腸癌、猫鳴き症候群（Cri du chat）、クローン病、嚢胞性線維症（Cystic fibrosis）、有痛脂肪症（Dercum Disease）、ダウン症、デュアン症候群（Duane Syndrome）、デュシェンヌ筋ジストロフィー（Duchenne Muscular Dystrophy）、第Ｖ因子ライデン血栓形成（Factor V Leiden Thrombophilia）、家族性高コレステロール血症（Familial Hypercholesterolemia）、家族性地中海熱（Familial Mediterranean Fever）、脆弱Ｘ症候群（Fragile X Syndrome）、ゴーシェ病（Gaucher Disease）、ヘモクロマトーシス（Hemochromatosis）、血友病（Hemophilia）、全前脳症（Holoprosencephaly）、ハンチントン病、クラインフェルター症候群（Klinefelter syndrome）、マルファン症候群（Marfan syndrome）、筋緊張性ジストロフィー（Myotonic Dystrophy）、神経線維腫症（Neurofibromatosis）、ヌーナン症候群（Noonan Syndrome）、骨形成不全症（Osteogenesis imperfecta）、パーキンソン病（Parkinson's disease）、フェニルケトン尿症、ポーランド異常（Poland Anomaly）、ポルフィリン症（Porphyria）、早老症（Progeria）、網膜色素変性症（Retinitis Pigmentosa）、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）（Severe Combined Immunodeficiency）、鎌状赤血球症（Sickle cell disease）、脊髄性筋萎縮症（Spinal Muscular Atrophy）、テイ・サックス（Tay-Sachs）、サラセミア（Thalassemia）、トリメチルアミン尿症（Trimethylaminuria）、ターナー症候群（Turner Syndrome）、口蓋心顔面症候群（Velocardiofacial）、ＷＡＧＲ症候群（WAGR Syndrome）、ウィルソン病（Wilson Disease）、並びに遺伝的要素を有するその他の疾患が含まれるがこれらに限定されない。眼
疾患及び／又は眼の要素を含む疾患は、霰粒腫（chalazion）、麦粒腫（stye）、睫毛乱生症（trichiasis）、内反（entropion）、外反（ectropion）、兎眼（lagophthalmos）、眼瞼炎（bleharitis）、涙嚢炎（dacryocystitis）、眼窩蜂巣炎（orbital cellulitis）、翼状片（ptergium）、翼状片角膜ジストロフィー（pterygiumcorneal dystrophy）、結膜炎（conjuctivitis）、新生児眼炎（ophtalmia neonatorum）、細菌性角膜潰瘍（bacterial corneal ulcer）、真菌性角膜潰瘍（fungal corneal ulcer）、緑内障（glaucoma）、フックスジストロフィー（Fuchs Dystrophy）、円錐角膜（keratoconus）、進行性黄斑変性症（Advanced Macular Degeneration）、網膜色素変性症（Retinitis pigmentosa
）、白内障（cataracts）、網膜障害、黄斑変性症、糖尿病性の眼の問題（例えば、糖尿病性網膜症）、眼瞼裂狭小−眼瞼下垂−逆内眼角贅皮症候群（blepharophimosis-ptosis-epicanthus-inversus syndrome）（ＢＰＥＳ）、眼皮膚白皮症（oculocutaneous albinism）、マルファン症候群（Marfan syndrome）、スティックラー症候群（Stickler syndrome）、及びＣＨＡＲＧＥ（欠損症、心臓異常、後鼻孔閉鎖症、成長と発達の遅延、生殖器
／泌尿器の異常、耳の異常又は難聴）を含むが、これらに限定されない。角膜ジストロフィーは、アベリノ角膜ジストロフィー、果粒状角膜ジストロフィー、格子状１型角膜ジストロフィー、フックスジストロフィー、ティール−ベンケ、及びレイス・バックラー角膜ジストロフィーを含むが、これらに限定されない。がんとしては、癌腫、肉腫、芽細胞腫、リンパ腫、白血病、生殖細胞腫瘍、及び起源が不明のがんが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施態様では、がんとしては、頭頸部、皮膚、結腸、経口、神経膠芽腫、胸部、喉頭、食道、内皮細胞、子宮内膜、卵巣、肺、泌尿生殖器、直腸、前立腺、腎臓、黒色腫、腎臓、膵臓、消化管、血液、肝臓、子宮、脳、及びウイルス誘導性のがん例えばパピローマウイルス誘発性のものが含まれるが、これらに限定されない。
【０１８５】
いくつかの実施態様では、本方法は、個人の遺伝子プロファイルの決定に使用されたゲノムＤＮＡを提供することにより、個別化医療処置計画の開発における使用を見出す。いくつかの実施態様では、前記の遺伝子プロファイル情報は、治療計画を開発及び／又は決定するために当業者によって使用される。いくつかの実施態様において、記載された方法により単離された核酸において同定された様々な遺伝的変異及び変異の存在及び／又は不存在は、個別化医療処置計画又は計画の一部として、当業者によって使用される。例えば、いくつかの実施態様では、開示された方法を用いて得られた情報は、データベース又は他の確立された情報と比較され、特定の疾患の診断を決定する及び／又は治療計画を決定する。いくつかのケースでは、特定の患者における遺伝子変異の有無に関する情報は、データベース又は他の権威ある情報源と比較され、提案された治療計画に対する決定をする。いくつかの場合において、遺伝子変異の存在は、特定の治療計画を追求することを示す。いくつかのケースでは、遺伝子変異の不存在は、特定の治療計画を追求しないことを示す。
【０１８６】
いくつかの実施態様では、特定の遺伝子変異の存在及び／又は不存在に関する情報は、治療的実体での治療の治療効果を決定するため、並びに治療的実体での治療のための治療計画を調整するために使用される。いくつかの実施態様では、遺伝子変異の存在及び／又は不存在に関する情報は、治療計画を追求するかどうかを決定するために使用される。いくつかの実施態様では、遺伝子変異の存在及び／又は不存在に関する情報は、治療計画を継続するか否かを決定するために使用される。いくつかの実施態様では、遺伝子変異の存在及び／又は不存在は、治療計画を中止するかどうかを決定するために使用される。他の実施態様では、遺伝子変異の存在及び／又は不存在は、治療計画を変更するかどうかを決定するために使用される。いくつかの実施態様では、遺伝子変異の存在及び／又は不存在は、治療計画の一部として投与される治療の投薬量を増加又は減少させるかどうかを決定するために使用される。他の実施態様では、遺伝子変異の存在及び／又は不存在は、治療計画の一部として投与される治療の投与頻度を変更するかどうかを決定するために使用される。いくつかの実施態様では、遺伝子変異の存在及び／又は不存在は、一日当たりの、週当たりの投薬数、治療の一日当たりの回数を変更するかどうかを決定するために使用される。いくつかの実施態様では、遺伝子変異の存在及び／又は不存在は、治療の投薬量を変更するかどうかを決定するために使用される。いくつかの実施態様において、遺伝子変異の存在及び／又は不存在は、治療計画を開始する前及び／又は治療計画を開始した後に決定される。いくつかの実施態様では、遺伝子変異の存在及び／又は不存在は、遺伝子変異の有無に関する所定の基準情報と比較されそして決定される。
【０１８７】
いくつかの実施態様では、遺伝子変異の１つ又はそれ以上の存在及び／又は不存在の複合体（composite）は、開示された方法を用いて生成され、前記の複合体は、複数の遺伝
子変異の存在及び／又は不存在に関する情報の任意の集合を含む。いくつかの実施態様において、遺伝子変異の２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、２０以上、３０以上、又は４０以上の存在及び／又は不存在が検査され、複合体の生成に使用される。いくつかの実施態様における例示的な情報は、核酸及び／又はタンパク質の遺伝子変異の両方に関する組み合わせの、又は核酸若しくはタンパク質の情報が含まれる。一般に、複合体は、遺伝子変異の存在及び／又は不存在に関する情報を含む。いくつかの実施態様では、前記の複合材料は、所定の基準情報と比較されそして治療計画が、追求、維持、又は中止される。
【０１８８】
いくつかの実施態様では、角膜ジストロフィーは、例えば、これらに限定されないが、アベリノ角膜ジストロフィー関連ＳＮＰ、果粒状角膜ジストロフィー関連ＳＮＰ、格子状ジストロフィー関連ＳＮＰ、レイス・バックラー角膜ジストロフィー関連ＳＮＰ、及び／又はティール−ベンケ角膜ジストロフィー関連ＳＮＰから選択されるＳＮＰの２、３、４、又は５つの検出を通して検出される。いくつかの実施態様では、角膜ジストロフィーは、果粒状角膜ジストロフィー関連ＳＮＰ、格子状ジストロフィー関連ＳＮＰ、レイス・バックラー角膜ジストロフィー関連ＳＮＰ、及び／又はティール−ベンケ角膜ジストロフィー関連ＳＮＰと組み合わせて、例えば、アベリノ角膜ジストロフィー関連ＳＮＰの検出を通して検出される。いくつかの実施態様では、角膜ジストロフィーは、アベリノ角膜ジストロフィー関連ＳＮＰ、格子状ジストロフィー関連ＳＮＰ、レイス・バックラー角膜ジストロフィー関連ＳＮＰ、及び／又はティール−ベンケ角膜ジストロフィー関連ＳＮＰと組み合わせて、例えば、果粒状角膜ジストロフィー関連ＳＮＰの検出を通して検出される。いくつかの実施態様では、角膜ジストロフィーは、アベリノ角膜ジストロフィー関連ＳＮＰ、果粒状角膜ジストロフィー関連ＳＮＰ、レイス・バックラー角膜ジストロフィー関連ＳＮＰ、及び／又はティール−ベンケ角膜ジストロフィー関連ＳＮＰと組み合わせて、例えば、格子状ジストロフィー関連ＳＮＰの検出を通して検出される。いくつかの実施態様では、角膜ジストロフィーは、アベリノ角膜ジストロフィー関連ＳＮＰ、果粒状角膜ジストロフィー関連ＳＮＰ、格子状ジストロフィー関連ＳＮＰ、及び／又はレイス・バックラー角膜ジストロフィー関連ＳＮＰと組み合わせて、例えば、ティール−ベンケ角膜ジストロフィー関連ＳＮＰの検出を通して検出される。
【０１８９】
いくつかの実施態様では、角膜ジストロフィーは、例えば、アベリノ角膜ジストロフィー関連ＳＮＰから選択されるＳＮＰの２、３、４、５、及び／又は６個の検出を通して検出される。いくつかの実施態様では、ＳＮＰは、ヒトＴＧＦβＩ遺伝子によりコードされているポリペプチドの第１２４、５５５、及び／又は６２６位の突然変異をもたらすＳＮＰを含む。これらの突然変異は、ＴＧＦβＩ遺伝子のＲ１２４突然変異をもたらすもの（例えば、Ｃ（Ｇ／Ａ）Ｃ ＳＮＰとも称されるＴＧＦβＩ遺伝子の第４１８位ヌクレオチ
ドのＧからＡへのトランジションにより引き起こされるＲ１２４Ｈ突然変異を含むが、これらに限定されない）、果粒状角膜ジストロフィー関連ＳＮＰ、例えば、ＴＧＦβＩ遺伝子のＲ５５５突然変異をもたらすもの（例えば、（Ｃ／Ｔ）ＧＧ ＳＮＰとも称されるＴ
ＧＦβＩ遺伝子の第１６６３位ヌクレオチドのＣからＴへのトランジションにより引き起こされるＲ５５５Ｗ突然変異を含むが、これらに限定されない）、格子状ジストロフィー関連ＳＮＰ、例えば、ＴＧＦβＩ遺伝子のＲ１２４突然変異をもたらすもの（例えば、（Ｃ／Ｔ）ＧＣ ＳＮＰとも称されるＴＧＦβＩ遺伝子の第４１７位ヌクレオチドのＣから
Ｔへのトランジションにより引き起こされるＲ１２４Ｃ突然変異を含むが、これらに限定されない）、レイス・バックラー角膜ジストロフィー関連ＳＮＰ、例えば、ＴＧＦβＩ遺伝子のＲ１２４突然変異をもたらすもの（例えば、Ｃ（Ｇ／Ｔ）Ｃ ＳＮＰとも称される
ＴＧＦβＩ遺伝子の第４１８位ヌクレオチドのＧからＴへのトランジションにより引き起こされるＲ１２４Ｌ突然変異を含むが、これらに限定されない）、及び／又はティール−ベンケ角膜ジストロフィー関連ＳＮＰ、例えば、ＴＧＦβＩ遺伝子のＲ５５５突然変異をもたらすもの（例えば、Ｃ（Ｇ／Ａ）Ｇ ＳＮＰとも称されるＴＧＦβＩ遺伝子の第１６
６４位ヌクレオチドのＧからＡへのトランジションにより引き起こされるＲ５５５Ｑ突然変異を含むが、これらに限定されない）を含む。いくつかの実施態様では、角膜ジストロフィーは、果粒状角膜ジストロフィー関連ＳＮＰ、例えば、ＴＧＦβＩ遺伝子のＲ５５５突然変異をもたらすもの（例えば、（Ｃ／Ｔ）ＧＧ ＳＮＰとも称されるＴＧＦβＩ遺伝
子の第１６６３位ヌクレオチドのＣからＴへのトランジションにより引き起こされるＲ５５５Ｗ突然変異を含むが、これらに限定されない）と組み合わせて、アベリノ角膜ジストロフィー関連ＳＮＰ、例えば、ＴＧＦβＩ遺伝子のＲ１２４突然変異をもたらすもの（例えば、Ｃ（Ｇ／Ａ）Ｃ ＳＮＰとも称されるＴＧＦβＩ遺伝子の第４１８位ヌクレオチド
のＧからＡへのトランジションにより引き起こされるＲ１２４Ｈ突然変異を含むが、これらに限定されない）、の検出を通して検出される。いくつかの実施態様では、角膜ジストロフィーは、例えば、アベリノ角膜ジストロフィー関連ＳＮＰ、例えば、ＴＧＦβＩ遺伝子のＨ６２６Ｐ突然変異をもたらすもの（例えば、ＴＧＦβＩ遺伝子の第１９２４位ヌクレオチドのＡからＣへのトランジションにより引き起こされるＨ６２６Ｐ突然変異を含むが、これらに限定されない）、の検出を通して検出される。
【０１９０】
いくつかの実施態様では、角膜ジストロフィーは、例えば、Ｒ１２４Ｃ、Ｒ１２４Ｈ、Ｒ１２４Ｌ、Ｒ５５５Ｗ、Ｒ５５５Ｑ、及び／又はＨ６２６Ｐの２、３、４、５、及び／又は６個の検出を通して検出される。いくつかの実施態様では、角膜ジストロフィーは、例えば、Ｒ１２４Ｃ、Ｒ１２４Ｈ、Ｒ１２４Ｌ、Ｒ５５５Ｗ、及び／又はＲ５５５Ｑの２、３、４、及び／又は５つの検出を通して検出される。いくつかの実施態様では、角膜ジストロフィーは、Ｒ１２４Ｈ、Ｒ１２４Ｌ、Ｒ５５５Ｗ、及び／又はＲ５５５Ｑの１つ以上と組み合わせて、例えば、Ｒ１２４Ｃの検出を通して検出される。いくつかの実施態様では、角膜ジストロフィーは、Ｒ１２４Ｃ、Ｒ１２４Ｌ、Ｒ５５５Ｗ、及び／又はＲ５５５Ｑの１つ以上と組み合わせて、例えば、Ｒ１２４Ｈの検出を通して検出される。いくつかの実施態様では、角膜ジストロフィーは、Ｒ１２４Ｃ、Ｒ１２４Ｈ、Ｒ１２４Ｌ、及び／又はＲ５５５Ｑの１つ以上と組み合わせて、例えば、Ｒ５５５Ｗの検出を通して検出される。いくつかの実施態様では、角膜ジストロフィーは、Ｒ１２４Ｃ、Ｒ１２４Ｈ、Ｒ１２４Ｌ、及び／又はＲ５５５Ｗの１つ以上と組み合わせて、例えば、Ｒ５５５Ｑの検出を通して検出される。いくつかの実施態様では、Ｒ１２４Ｈは、Ｒ５５５Ｗと組み合わせて検出される。いくつかの実施態様では、角膜ジストロフィーは、Ｒ１２４Ｃ、Ｒ１２４Ｈ、Ｒ１２４Ｌ、Ｒ５５５Ｗ、及び／又はＲ５５５Ｑの１つ以上と組み合わせて、例えば、Ｈ２６２Ｐの検出を通して検出される。いくつかの実施態様では、Ｒ１２４Ｃ、Ｒ１２４Ｈ、Ｒ１２４Ｌ、Ｒ５５５Ｗ、及び／又はＲ５５５Ｑの全てが検出される。いくつかの実施態様では、Ｒ１２４Ｃ、Ｒ１２４Ｈ、Ｒ１２４Ｌ、Ｒ５５５Ｗ、Ｒ５５５Ｑ、及び／又はＨ６２６Ｐの全てが検出される。
【０１９１】
ＶＩＩＩ．診断キット
いくつかの実施態様では、上記の試薬のいずれか又は全ては、診断キットにパッケージされる。前記キットは、本明細書に記載される、プライマー、プローブ、バッファ、及び／又は他の試薬のいずれか及び／又は全てを任意の組み合わせで含む。いくつかの実施態様では、キットは、Ｒ１２４Ｃ、Ｒ１２４Ｈ、Ｒ１２４Ｌ、Ｒ５５５Ｗ、Ｒ５５５Ｑ、及び／又はＨ６２６Ｐの２、３、４、５、及び／又は６個の検出用の試薬を含む。いくつかの実施態様では、キットは、Ｒ１２４Ｃ、Ｒ１２４Ｈ、及びＲ１２４Ｌの検出用の試薬を含む。いくつかの実施態様では、キットは、Ｒ５５５Ｗ及びＲ５５５Ｑの検出用の試薬を含む。いくつかの実施態様では、キットは、Ｒ１２４Ｃの検出用の試薬を含む。いくつかの実施態様では、キットは、Ｒ１２４Ｈの検出用の試薬を含む。いくつかの実施態様では、キットは、Ｒ１２４Ｌの検出用の試薬を含む。いくつかの実施態様では、キットは、Ｒ５５５Ｗの検出用の試薬を含む。いくつかの実施態様では、キットは、Ｒ５５５Ｑの検出用の試薬を含む。
【０１９２】
いくつかの実施態様では、キットは、Ｒ１２４Ｃ、Ｒ１２４Ｈ、Ｒ１２４Ｌ、Ｒ５５５Ｗ、Ｒ５５５Ｑ、及び／又はＨ６２６Ｐの２、３、４、５、及び／又は６個の検出用のプライマー及びプローブを含む。いくつかの実施態様では、キットは、Ｒ１２４Ｃ、Ｒ１２４Ｈ、Ｒ１２４Ｌ、Ｒ５５５Ｗ、及びＲ５５５Ｑの２、３、４、及び／又は５個の検出用のプライマー及びプローブを含む。いくつかの実施態様では、キットは、Ｒ１２４Ｃ、Ｒ１２４Ｈ、及びＲ１２４Ｌの検出用のプライマー及びプローブを含む。いくつかの実施態様では、キットは、Ｒ５５５Ｗ及びＲ５５５Ｑの検出用のプライマー及びプローブを含む。いくつかの実施態様では、キットは、Ｒ１２４Ｃの検出用のプライマー及びプローブを含む。いくつかの実施態様では、キットは、Ｒ１２４Ｈの検出用のプライマー及びプローブを含む。いくつかの実施態様では、キットは、Ｒ１２４Ｌの検出用のプライマー及びプローブを含む。いくつかの実施態様では、キットは、Ｒ５５５Ｗの検出用のプライマー及びプローブを含む。いくつかの実施態様では、キットは、Ｒ５５５Ｑの検出用のプライマー及びプローブを含む。いくつかの実施態様では、キットは、Ｈ６２６Ｐの検出用のプライマー及びプローブを含む。
【０１９３】
いくつかの実施態様では、キット中の試薬は、凍結乾燥粉末として含まれている。いくつかの実施態様では、キット中の試薬は、リコンストラクション（reconstitution）用指示書と一緒に凍結乾燥粉末として含まれている。いくつかの実施態様では、キット中の試薬は、液体として含まれている。いくつかの実施態様では、試薬は、プラスチック及び／又はガラスバイアル、又は他の適当な容器に含まれている。いくつかの実施態様では、プライマー及びプローブは、全てキット内の個別の容器に収容されている。いくつかの実施態様では、プライマーは、１つの容器に一緒に包装され、プローブは、別の容器に一緒に包装されている。いくつかの実施態様では、プライマー及びプローブは、単一の容器内に一緒に包装されている。
【０１９４】
いくつかの実施態様では、キットは、対照ｇＤＮＡ及び／又はＤＮＡサンプルをさらに含む。いくつかの実施態様では、含まれている対照ＤＮＡサンプルは、ＴＧＦＢＩ Ｒ１
２４正常である。いくつかの実施態様では、含まれている対照ＤＮＡサンプルは、Ｒ１２４Ｃ、Ｒ１２４Ｈ、Ｒ１２４Ｌ、Ｒ５５５Ｗ、Ｒ５５５Ｑ、及び／又はＨ６２６Ｐを含む、検出されている突然変異に相当する。いくつかの実施態様では、ＴＧＦＢＩ Ｒ１２４
正常に相当する対照ＤＮＡサンプルとＲ１２４Ｃ、Ｒ１２４Ｈ、Ｒ１２４Ｌ、Ｒ５５５Ｗ、Ｒ５５５Ｑ、及び／又はＨ６２６Ｐに相当する突然変異ＤＮＡサンプルとが含まれる。いくつかの実施態様では、ＴＧＦＢＩ Ｒ１２４正常に相当する対照ＤＮＡサンプルとＲ
１２４Ｃ、Ｒ１２４Ｈ、Ｒ１２４Ｌ、Ｒ５５５Ｗ、及び／又はＲ５５５Ｑに相当する突然変異ＤＮＡサンプルとが含まれる。いくつかの実施態様では、ＴＧＦＢＩ Ｒ１２４正常
に相当する対照ＤＮＡサンプルとＲ１２４Ｃ、Ｒ１２４Ｈ、及び／又はＲ１２４Ｌに相当する突然変異ＤＮＡサンプルとが含まれる。いくつかの実施態様では、ＴＧＦＢＩ Ｒ１
２４正常に相当する対照ＤＮＡサンプルとＲ５５５Ｗ及び／又はＲ５５５Ｑに相当する突然変異ＤＮＡサンプルとが含まれる。いくつかの実施態様では、ＴＧＦＢＩ Ｒ１２４正
常に相当する対照ＤＮＡサンプルとＲ１２４Ｃに相当する突然変異ＤＮＡサンプルとが含まれる。いくつかの実施態様では、ＴＧＦＢＩ Ｒ１２４正常に相当する対照ＤＮＡサン
プルとＲ１２４Ｈに相当する突然変異ＤＮＡサンプルとが含まれる。いくつかの実施態様では、ＴＧＦＢＩ Ｒ１２４正常に相当する対照ＤＮＡサンプルとＲ１２４Ｌに相当する
突然変異ＤＮＡサンプルとが含まれる。いくつかの実施態様では、ＴＧＦＢＩ Ｒ１２４
正常に相当する対照ＤＮＡサンプルとＲ５５５Ｗに相当する突然変異ＤＮＡサンプルとが含まれる。いくつかの実施態様では、ＴＧＦＢＩ Ｒ１２４正常に相当する対照ＤＮＡサ
ンプルとＲ５５５Ｑに相当する突然変異ＤＮＡサンプルとが含まれる。いくつかの実施態様では、ＴＧＦＢＩ Ｒ１２４正常に相当する対照ＤＮＡサンプルとＨ６２６Ｐに相当す
る突然変異ＤＮＡサンプルとが含まれる。いくつかの実施態様では、対照ＤＮＡサンプルの濃度は、５ｎｇ／μＬ、１０ｎｇ／μＬ、２０ｎｇ／μＬ、３０ｎｇ／μＬ、４０ｎｇ／μＬ、５０ｎｇ／μＬ、６０ｎｇ／μＬ、７０ｎｇ／μＬ、８０ｎｇ／μＬ、９０ｎｇ／μＬ、１００ｎｇ／μＬ、１１０ｎｇ／μＬ、１２０ｎｇ／μＬ、１３０ｎｇ／μＬ、１４０ｎｇ／μＬ、１５０ｎｇ／μＬ、１６０ｎｇ／μＬ、１７０ｎｇ／μＬ、１８０ｎｇ／μＬ、１９０ｎｇ／μＬ、又は２００ｎｇ／μＬである。いくつかの実施態様では、対照ＤＮＡサンプルの濃度は、５０ｎｇ／μＬ、１００ｎｇ／μＬ、１５０ｎｇ／μＬ、又は２００ｎｇ／μＬである。対照ＤＮＡサンプルの濃度は、１００ｎｇ／μＬである。いくつかの実施態様では、対照ＤＮＡサンプルは、同じ濃度を有している。いくつかの実施態様では、対照ＤＮＡサンプルは、異なる濃度を有している。
【０１９５】
いくつかの態様において、キットは、バッファ、例えばＧＴＸｐｒｅｓｓ ＴＡＱＭＡ
Ｎ（登録商標）試薬混合物、又は任意の同等のバッファをさらに含むことができる。いくつかの実施態様では、バッファは、本明細書に記載される任意のバッファを含む。
【０１９６】
いくつかの実施態様では、キットは、クローニングに使用するための試薬、例えばベクター（例えば、Ｍ１３ベクターを含む）をさらに含むことができる。
【０１９７】
いくつかの実施態様では、キットは、ＤＮＡの精製に使用するための試薬をさらに含む。
【０１９８】
いくつかの実施態様では、キットは、対象における角膜ジストロフィー検出用キットを使用するための指示書をさらに含む。いくつかの実施態様では、これらの指示書は、本明細書に記載されたプロトコルの様々な観点を含む。
【実施例】
【０１９９】
実施例１：ＤＮＡ抽出（ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔ Ａｌｌ Ｒｅａｇｅｎｔｓ，Ｔｈｅｒｍ
ｏＦｉｓｈｅｒ）
以下に記載するようにそして本明細書において提供される開示に従って、ＤＮＡを口腔上皮又は毛根又は全血から抽出した。
【０２００】
口腔上皮又は毛根由来のＤＮＡ抽出のために、サンプルをまず１×ＰＢＳ ３００μＬ
で前処理した。次に、３０μＬの溶解液をチューブに添加し、そして混合物をボルテックスした。次に、混合物を９５℃で３分間インキュベートした。次に、ＤＮＡ Ｓｔａｂｉ
ｌｉｚｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ライフテクノロジーズ／サーモサイエンティフィック
製、米国）３０μＬを添加し、そして混合物をボルテックスした。次に、混合物を１３，０００ＲＰＭで１分間遠心分離した。
【０２０１】
全血由来のＤＮＡ抽出のために、全血３μＬから続けて、サンプルをまず１×ＰＢＳ 
３００μＬで前処理した。次に、３０μＬの溶解液をチューブに添加し、そして混合物をボルテックスした。次に、混合物を９５℃で３分間インキュベートした。次に、ＤＮＡ 
Ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ライフテクノロジーズ／サーモサイエンテ
ィフィック製、米国）３０μＬを添加し、そして混合物をボルテックスした。次に、混合物を１３，０００ＲＰＭで１分間遠心分離した。
【０２０２】
上記の手順が完了した後、ＤＮＡ濃度を市販のＴｅｃａｎ（登録商標）Ｉｎｆｉｎｉｔｅ（登録商標）２００ ＰＲＯ ＮａｎｏＱｕａｎｔを用いて読み取った。定量のために、溶出液１００μＬを透明な９６ウェルプレートにピペットで移した。次に、調製したブランク溶液１００μＬをウェルＨ１２に十分に添加した。その後、濃度をＮａｎｏＱｕａｎｔから提供されたメーカーの指示書を使用して読み取った。
【０２０３】
反応混合物を、下記表５及び６に記載されているプローブ及びプライマーを使用して調製した。
【表５】
2020039339.tif 000006
【表６】
2020039339.tif 000007
【０２０４】
例示的な反応混合物中で使用される成分及び比率を以下の表７に示す。
【表７】
2020039339.tif 000008
【０２０５】
例示的なＰＣＲサイクリング条件を以下の表８に示す。
【表８】
2020039339.tif 000009
【０２０６】
上記のプロトコルを図４〜８において提供されているリアルタイムＰＣＲのデータを作成するために使用した。
【参考文献】
【０２０７】
全ての表題とセクションの指定は、明確かつ参照のみを目的として使用され、決して限定と考えるべきではない。例えば、当業者は、本明細書に記載される本発明の精神及び範囲に応じて異なる適切な表題の様々な観点を組み合わせることの有用性を理解するであろう。
【０２０８】
本明細書において引用される全ての参考文献は、それぞれ個々の刊行物又は特許若しくは特許出願が具体的かつ個別に全ての目的のためにその全体が参照により組み込まれることが示された場合と同じ程度に、その全体が、全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
【０２０９】
当業者には明らかであるように、本出願の多くの修正及び変形が、その精神及び範囲から逸脱することなく行われることが可能である。本明細書に記載の特定の実施態様及び実施例は例としてのみ提供され、そして、出願は、特許請求の範囲が権利を有する等価物の全範囲とともに、添付の請求項によってのみ限定されるものである。
【０２１０】
TGFβI gene sequence (NCBI Reference number NG_012646.1):
1 gcttgcccgt cggtcgctag ctcgctcggt gcgcgtcgtc ccgctccatg gcgctcttcg
61 tgcggctgct ggctctcgcc ctggctctgg ccctgggccc cgccgcgacc ctggcgggtc
121 ccgccaagtc gccctaccag ctggtgctgc agcacagcag gctccggggc cgccagcacg
181 ggtaagccga gccgcctggc caggggctgc ggaaggtcag gtagtcgggg ctcggagcgc
241 aagccgctgg gggcattgaa ctgggctggg ggcgcagggg acaaagcccg aactaaaaac
301 cttgcagcat ggagcgctcg gacaccagcc ctgcacgcgg tggaaggaga gagggaggga
361 ggtggaggac catggaggga aagcgggagg ccgccgcttt gtagaaggga gtggggaagt
421 ggaccagaga ctttcgacgc aggccaagag cctgagacgg acagcgcttt cagcttctcc
481 tcccagccac tgcagaaagg gggaaatggc aactctttgg ccataatcac cgtgggaggg
541 tgccaagggc aaagcccacc cagcagtaca cctattccaa cccagccagg cccccggcca
601 gcgactccag acaagaacct gggccacaca cggtggcagc atctaaggtg ccccaggctc
661 ctgtgctcct ggccaggccc tgcactcaga cactgctggc acccgacact gctctctggg
721 tacagcaagg gcaatgtggc acttcttgtc ctgcccgatg aagagcagga gaatgcactg
781 ggccctcaca cacactgttc aaatggggaa actgagtcct gagtggttcc actttcccac
841 agtcctgaag tgtgcactgg agccaggatt ggagtctgtc ttaaagtaat agctgggttt
901 gtaaatgtag gacactatca ttgcaggaat tcctttgaga ccctgaagat gtgttggctt
961 taggagacaa actcaagcag aaggtctggt ctgatagtgg ccctaatact gacccaggca
1021 gaggcaggca acatttctac ctcaaaaacc aggccatacc tgcgtcacaa atacccaggc
1081 tttgctgcag cttccagcct acctggttgc accaacttct ttttcataac taggtaaaac
1141 tatatatgag tagaatcttg tagtgactcc tcagaggaag cctaaatacc atcggggtct
1201 ggcgttcaca cccacaagca atgcccaaac ctccaagaga ctgggcagat ctgtgctcaa
1261 atcaaaactc attgttgggg gtgatagagt tgacttcaca ggccctgaaa gtcttggctc
1321 cttgcactag gagtgctctg ggtacgggta caggctgccc cttgtagggc atagttgctc
1381 ttgtttcctc tacttgtggc tttatggtct aggcctttca ggagtttggg gctctggcgg
1441 agagggcctg ctgggagcac atctggccac cctgcagagt gaaatcaaac caggcctggc
1501 tgcaacctca acaccctcct ggaaagagga gaatactggg gatatcctgg ggtctttctg
1561 gaagtgggag aatcagcttt gacttgggca gtgtgcagaa tagagtgagg ggggatgtca
1621 gaaagatgag agggatatga ggcctcaaca tcaaaatgca agcacctggc atttttatta
1681 tctctgccca cctctccgtt ggtctctctg cctttcctgc caatgaattg tgttatgttt
1741 gggtgcctca atttgcctag gagggttcta tttcttctgt atcttcgcca ctaagtcagg
1801 agaagatcct tatagcatgc cctgcaacag tgtcacctgt aagggcatct ctctgcacag
1861 ccacagtgaa ggatcctcaa aggtattgag ggctttccat caagagccat ctttacagca
1921 aacctctttc ccttcagagc ccagaagagt gctgaccagc tggaaaacag ggtttttttc
1981 ttaaatgcag atgctcttga ttatgagttc cagatattag atcaacttcc ccaccatacc
2041 cctgcaggca aagcctctta attagcttcc tgcagcacag ctggaaaggc ctattgtaat
2101 ctgtgatggg cagagtaatc taagaagtca caggagcacc cctgtcccag tagaatctgg
2161 atgcgcaggc acatgaacca tggcaaaatg gttgcaggca cagttgtatt tactctgatc
2221 taactgtccc tgttaatgcc acagggctgc ctggcctggc acacagggct gtggcgcctt
2281 gtgcaaatgg ataacgttgt tctagctcca gcctttcatt caaagtgaaa actgttagaa
2341 agggaaggaa aactttgcta ttttaaggaa ttgtagcgtg ctgcctgata tgaaggaaga
2401 aataacagct gtgccttgct tgtgcgcagc actcgattgc cgcttttgct ttcgacctca
2461 ccacaacaca gtgagatcta ctgttcatgt tcccatttta caggaggtga aactgcagct
2521 tagtgaggta gagagtgact tagttcagac acagaatgct gttgggagag taataactat
2581 gatatggtct cttgactccc agctatatct gtgttgctat agggaagggg aaaaataata
2641 ctgaaagaga agtaaaaata caatcacact tccaaacatc aaccaccaaa aactgaactg
2701 aatttcctga agcacttggt tttcaaatct aagctgaaca tcaatgctgt tattcttgag
2761 gcccagaagc aacttgctca tttcaattaa gcttcagcat gaacttccta tgtacacagc
2821 ccacccacac tccccgatgt gagaaggaga gggtcacagc cgcccccagc ctctgctgct
2881 gccacaagga cagcagcagt ggaaacattc agcaaaggaa tgttggagcc acatccacaa
2941 gagactcact gaagattcgc caaacgccta cggaaagtgg cagggaattc attgacagta
3001 attgtttcct gcttgatcag attgaagagc ttctgggatt ctgtaacaat aaataggacc
3061 gggggctgga gtatggccag caaggactct tcaggggtta ttcagggact gtctaacctg
3121 tgaatcctag gcagcaaaca gaaaccaggt attcagaaat ctggaggatt tggtcaggcc
3181 cagctaggac tagggaggca tgggcctctg ctggctgtgg tcccttctcc agccttcact
3241 tctcttgtcc ctagatcctt acatggattc attaatgctc attgtccctc ctgggcccac
3301 tcactttcac ctgttgaaca aaaaactggc caagaggtga cagtcatatc accgcagaag
3361 agacagggca gagaaatgaa ggggcagaat ggactcccac ccaaaagcct gactctgaat
3421 atttgagaat tgttcaagtt cctgcagagg aatcatgatg gggacagtag gtgtagtttt
3481 tactgcaata ttggtgtctt cttaacaaat acgctgcaca tcaagtgatg tctgtggatg
3541 gcattcttaa agtaacaggg aaattgatgt taaagaaata cttcatcctt tgggtgatac
3601 ctgaagttct ctgagcttgg aggtcttgtg aaagccctca gtattgtttg ttttatttgc
3661 tttcctctga cttgtgattc agtcagatgc atgcctgcct ctggctcagg aagatcaacc
3721 ctctcctgac tgaccacgcc tctcctgact gaccacgtag cacagcagct tcctttccct
3781 aggggctcct aatgaagctt tcacaatcac ctggcctgag cacagtttgg gtcaggactt
3841 ggtatacttg aaaaaaacat gcaaaaccaa aatcctgtgg ttctggaaaa ggcttcttag
3901 cagaaccccc agacatttac actctgcttt ttcacagggt ccctgaggat tctttggatc
3961 tgggtagttt ggggagcagt attttcaaca agttcatttc gtgctccttc tacaccctgc
4021 ctggatgcta ggccccatct agaatgtgaa caacagaaca aggcagaaca cttgtcctca
4081 aggttctgtt gagtgttaga tgcagagaag agacaccccc cacctccccg catcacttac
4141 aggaattctg tttggaaccc aacatcaaat aaggaccgta tccactgtca gaggatggga
4201 agcagcatgt catctgggac attggagaaa ggctcctggg ggaagtggga cttgagctgt
4261 gatctaagta atgaacaact gagagttaaa tgggagagca tcccctatca gggtcctgag
4321 agcaaccagc catggtttaa accagctata aagcctcggg tttataggat agacagtaac
4381 aatggcttgt ctttgggagc caagcagctg gtccaggcat gcagagcatg tctgtatgga
4441 gagctgcctg agagatgctt ttgtttacac ttatcaattg cccatgtcaa agaaggatat
4501 gtacatgaag ttacatcagt atgtaagaga gattttaaca atttttgcag gggaagcttt
4561 catgggggct gatgggaatc taggtaaaca gaaccaaagt ctaaacccaa gatatcccca
4621 gtaccaagac tgaaatgact ctctcctcta tctctagaaa gttccagtga cccaaggagg
4681 caaacacgat gggagtcatt aaagtggggt ggacgtgctg atcatcttcc taattctgct
4741 gcttttgttt tcagccccaa cgtgtgtgct gtgcagaagg ttattggcac taataggaag
4801 tacttcacca actgcaagca gtggtaccaa aggaaaatct gtggcaaatc aacgtgagta
4861 tctgtaacca gccaggagac caagctgtat gcacgctggc tgcagttccc cagggcctgg
4921 gccagccttc tagaaggtca ggttgcctaa aaagccatga agatgcatgt gcgaacatgt
4981 ctgggacctg cgtgctaggg agtggcattt ttaggaagct ggccaatttt gttttgcatt
5041 tttaaggctg ctgacaagac ttggagacat ttttcagggc tggtttgggt ttgcaagaaa
5101 catgaaacac tgcgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtttctc aatcctcata aaataataca
5161 gatatgcagt ggagaagcca ccagcatgtg actctggaaa agaaagccca ttggtgaatc
5221 tgtactaaag aatgccatcc ctatcttaca gtcctaaggt aaacacccca aaaagactta
5281 gagcactaaa catatgcaga ttatgagaca gcatagcata taatatttgc acagacttcc
5341 tcattcaaac cctagctcta cctgggccag tcgattcatc tttagaaccc tccattgctt
5401 tacctgaaaa gttcgtataa caaaaggacc caccttatgg ggttgttaca aggattgaat
5461 gaaataatgt acataagaga ctgaatatgg tgcccagcat atatcagtgc tcaataaatg
5521 ctagctacta ttattattat caccctagat ttgcaaatct agaccacaca agcagaagta
5581 agagtgccaa cggggtgtgg accagtgtgg ttacaatagg gcttgttgat gtctgtttca
5641 gcaaggaggg aggcagcttt taccccactg cccagctccc tggtggaatc aggtgcatgt
5701 tctaacaatt ctggggaaac ctaatctgtt ttggcactgt caacagatct caaagctggc
5761 tgtctcctat agctaggaag atgtgtatga caaatctcct gagccacttg tgaaggcctg
5821 accttcctcc tgtctccata cataatggga tgattaagaa actctaagcc actctcttaa
5881 gcacttttca atgttaggga tttttaagtt tattgttgtg acattgcttt tgagcagaca
5941 tctcctccaa tttaatagcc aactgaaaga agagaaaatg ctctttcctt aaactgtatg
6001 tggaaataaa tattccaatg tgtgaccctg attatgttag gcaattagca atcctaatat
6061 gaattgaggg aagttgggat tcatggcaca gctggggaga taccagcagt ccctgggagc
6121 ctgtccaggg caggtccatg gcagcttgct ccatgcctga ttgacagccc agcctgcaag
6181 ctaaaagttg agtgagctag gaggacacac tgccaagatt cagctaacag acacccagcg
6241 atattcttgc tgctatgaac aaaaggagac tatgcaaatt atacaccacc cattcttcca
6301 ggatgcctga cttaaaaaat aagaaaaaag atgggccggg cacagtggct cacgcctgta
6361 atcccaacac tttgggaggc cgaggtgggc ggatcacaag gtcaggagac agagaccatc
6421 ctggctaaca tggtgaaacc ccgtctctac taaaaaaata caaaaatatt agcgggcgtg
6481 gtggcgggca cctgtagtcc cagctactcg ggaggctgag gcaggagaat ggcgtgaacc
6541 tgggaggcgg agcttgcagt gagccaagat cgtgccactg cagtccagcc tgggtgacag
6601 agtgagacac cgtctcaaaa aaaaaaaaaa aaaaagaaaa gaaaaccttt agtactgatt
6661 gattttttcc catgtgtgta tattatctac tcaaattaac aattaattac ttaattaaac
6721 acaaagccag gcctcaccta attgcttctt ggaaggtgac cagagtgcta gtgccaagca
6781 aacaactctt ctatatctca agagccctgg gcttcagagg gccatctttt ttgttaattc
6841 aagtttctct gaaaatggag acccgtttat gatgacaagc tggctacagg gtagcatctg
6901 ccacactgtt tcgggggtgc cgctgggctg aagcatttgc ccagctagtt aacaatagct
6961 cgataacatt ccctatcagt gtccaggctg agaatactgt cagtgatgag tcgccttggc
7021 tcttgtacct gtatctttgt gtgccaggac aaggcacaag caacagagct gtgtgttgcc
7081 aaaatgttcc tgatgagcag gtcaacccct cgggggcagg tttggatatg ataatgtggt
7141 gatgtggtgg cgcagctccc ttacccagtg agcacaaggg gagtcctcta ggaaaaggaa
7201 gaaatgtctg gatgaggtgg ggagatgggg ttcagagtgg actcaggcaa agcccgatgc
7261 ccagtcccag ctgttggcct agtctcacaa agccagaagg atatgacatt tacattcaac
7321 tcttgaattt gtggccactg ctttgggcaa cttcaaagag agaaaatgaa gatagaaaaa
7381 tattatttga tataaaactt ctaggacaag agaggccctt cctggaacat tacatgtagt
7441 attaggaagg tggagctgcc ctggaaaaga tccagagaac tcagagagag gaagaggtgg
7501 aacccatctc tgttcttgta gagagctcag taagagtggc ttggcagggc tcctgtgtac
7561 ctgagaccaa gaccagtgag gaggctactg tctgaccacc atacggtcag aattcagtgc
7621 catgggtggt caggtgggaa ggggagagga ctgtgctggc tggagttgat gttatcctgg
7681 ggaaagtagg tccctagatg cctttagttg agtgaggagc agactgggaa atgggagcac
7741 agtagtggtt ggggcaaaaa ggactgtctc tgcatgaggt ccataggcag ttggaatttt
7801 ctcagcaaga ctccagagaa ggaggctgga gcagaggtgt atgttgggat gaaaaggagt
7861 aaagtatcat gggggaggag gcagctcagg ttgtcaaggg tcaagaaacc agaaggagaa
7921 tttcaccttg gaagcagaca acgggtacca agcatacagg ggaatacttt gtggtgagag
7981 gtcacacaga gatacaggag ccgacctggt gagacaggag cctggagcca cctgcctgct
8041 tttgtgaggc cccagactcc actgctatca tcaggtgaag ctctgttgcc tgcacacaaa
8101 agcttttctg catttacaaa gagagaaggg cctgagtttc tggtgcaatg cgtcaagctg
8161 acatatggac tttattacag gaagtggtta ccagtgggtc cctatttagt ggctgttatt
8221 gtgaatttta ttgttcggaa attcacttta gcatttattt cagatcctaa atagcaccgg
8281 agtgatacaa tggctaatca aacaaagagg gctgtgggga gcagacagtc agcatccccc
8341 tctgtgattt caggccctgg tttgattagt agccataaaa ttttttacgt gtggcacttt
8401 gagcaaaggt gcaggaaatt gtggtcagga agcctggctg cctctcgaca ggcttccttt
8461 gtgctagccc cagggagagg aggcctattt aacagccaag tccaagttga catcatggga
8521 ctggaatagt catagcagga gctcagacat cataaacgtg gcatagggag ggctggtgga
8581 ggagctagcg ggtatgggtg gcagctattc attccaaaag tcttgaaatt gtttcacgag
8641 caacacattt cacaagtgcg aagcccttct ctggagccaa gatgagctgg cagagcactc
8701 ctgtttctct agtagcaagt gttcctttgc ccaggggcaa aaatattaat actccttcag
8761 cactgcatta atgcttaaag atttaacttt taaagagatc agctggtgca tggtcgagct
8821 tttccatcag ctggcagggc tttttcagta ggtgtccttc tgggcagggc actggggaca
8881 gctgacgtga aggtgaagaa gagctgtcgt tttcctccct tatatcccac aaccttggtc
8941 ccaagaggaa aaaaaagaag atggtgagaa gtcatccaag cagaccccag acccatacta
9001 gtgcctcctt tcctgtttca tatccctgtg cagccagctg ggatctcttg aataatctgc
9061 tctgggggca ctgagattgg acatacacca aacagcggag atcgaccaaa cgcctctgtt
9121 gggcagtgtt tcctgagggt tctgtcccat tctgtaaact aggaggctga ctagctgaca
9181 aggaatttta ttctgttggg tatttacatg aacctatgtg ccacctgggg taagaccctg
9241 tggtaggtag aaacatgact tcccaaaaat gtccacatcc taatctctaa ttctgtaaat
9301 atattccctt actggaaaaa gagactttgc aggtgtgatt aaattaagga tcataagagg
9361 gagagattat ccaggattat ttgatgagtc taatataatc atcagggtac ttaaaagagg
9421 gaggcaggct gtgcctggtg gttcacgcct ttaatcccag cactttggga gactgaggcg
9481 agcgggtcac gaggacagga gttggagacc agcctgacca acatggtgaa actccccctc
9541 tagtaaaaaa aaaaatacaa aaattagcca ggcatggtgg tacacacctg taatcccagc
9601 tactcaggag gctgaggcgg gagaattgct tgaacccagg aggcagaggt tgtggtgagc
9661 tgagatcgca ccactgccct ccagcctggg caacagagca agactccatc tcaaaaaaaa
9721 aaaaagaggg aggcagtggg atcagagtca gagaaggcaa cgtgatgatg aaagctgaca
9781 tttgagtgat gcaaccacaa gccaaggaat gcaggcagct tctcaaagct ggaaaggacg
9841 agcaatggat tcttccctac agcctctgtg aggaatgcag cctttgattt taaccccata
9901 aggccgattt ctgactctag cctctggaat tgtaagataa tttgcatgat ctcaagccac
9961 taaatttgtg gtaatttgtc acagaaagca atgggaagcc aacacaggcc ttatttgttg
10021 acttatagat gcatttttct ttatttcaat gtacttttat caatggtctc atgtagggta
10081 ttgctttcaa tgaagatatt aacatagttt caactttaag gtttatatct ggagtttctt
10141 tagaagcttc acaactgacc acttagtaaa cagtaagcat ctgttaagtg cttctcatat
10201 gtaagttcat tcaattctca caatcacact ataagataaa tatgattatt agcccattta
10261 cagatgagga gacaggctca aaagactttt atgcaacctg gtcaaagtca ttcactggta
10321 agctgaggag gtctgtccac ttccttttgc tgcccccagg gggtatcaag cctggcagtt
10381 agtgtcagcg acttaggagg tgaacaagtg agcaggcctg taggacctgg ctaaactgcc
10441 ccaggtctct gtctacagcc tcaaacctgt ggctgtgggt cccagagaca aggcctcctc
10501 agcatcagag aaggatgcct ttgtctcagg gtcatcaacc ttctccaggt tgctcacccc
10561 ctgctgtaaa ggggatcccc aagaccgctc atcagacaag gagcttggga actgaggaga
10621 cacagtcagc ctccaggagt gcccaaaatg ccctcacatg ctgcatacag attgccacaa
10681 ataaagtaca tccacattct gaagactctg tcctcatcac caaccaggct ggcccctggt
10741 gagggctgta gtggttgagg cctttgttgg tagacagtag gttaaagcaa gccatgattt
10801 tctattggga ggcttcagaa tcagctcagc tgtgtttcca agaccaggag ggcagaaagc
10861 aaaccatccc aggcaagcag tccatgggcc atgtcagatg tctagacgtt atgggtctgt
10921 gtttgctctg ccattcctct cggaaactat gatgccctgt atggtttacc ttcagtcaca
10981 ggtgactggc ctacagggcc attccttgtt ccaacgactt ctcgagtata attaatcccc
11041 aggcatttac ggccagagca gccggccaaa tccgtgaagt gcagtggttg ttttaaatta
11101 tattaacttc ttggaaactt attttaggga gagaaaactc agtacttctc tctatccaat
11161 cttgagtaaa aatgttagaa gggactggtg gagagcctcc cagacatccc tacacataga
11221 ctttgggttg acattatctc tttgcacctt ccttgaaact ttcttctaaa ttaggtgcct
11281 tccctaattt aggcaccttc ccagtactag tctgtgacct gttaggaacc aggccacaca
11341 gcaggagttg agtggcaggg agtgagcatt attgcctgag ctccgcctcc tgtcagatca
11401 gcagtggcat tagattctca tagcagtccg aatactattg tgaactgtgc gtgtaaggga
11461 tctagcttgt gcattcctta tgagaatcta atgcccgatg gtctgagatg gaagagtttc
11521 ataccaaaac caccccttcc ccctgccacc atctggggaa atattgtcta ccacgaaact
11581 gatccctggt gccaaaaagg ttggggaccg ctgtcctaag ggatctgctt tttctgacct
11641 gaggtttttc tttattagac tgtatctggc tgaggagaag cctgaagcct ttaatcggaa
11701 cagctttggc tgatgagatt agattcagaa accaacagat tggtcttttc tatgcaggga
11761 agcctaggaa ctggggggct atggctggga agccccctat tgtttccatc ctttcctatg
11821 ttcatcctgg aggaatggca tcagacccat gcctctgtga ttgctcccag cccatccaac
11881 cacagcatct atgttctgcc tgggaccagg gccagggagc atggcacact gagctgagta
11941 taaggagagt ggagcaggcc actgccagcc cagaaaattt tggtcaaagt tgcctgaaat
12001 cttctcagcc ttcgattcac agctgctctc tgctgctctg gggccatgca gaccagttca
12061 gaaaagagtt aatttgttgg ggcagttgga ggcaggtgga ctgccagctt tgacaccttc
12121 ccagcccaca ggctgctgca ctggggctga aggcgtggct aacccctgca cacctagaga
12181 gtgacagaga tgccagactg ggcagcagga aggcaagagg attaagagag agcttcctgg
12241 ctgaaagcca cactcggtta accaggaaaa agcccttggc acgagaagac tcagtggcct
12301 gagggactga gccttggttg ttgggcatgt gctgcataag ccatccatgt gtgacagtag
12361 agtgtagtcc agccactgtg ggacatgggt gctgaaagac cacatggaga ggaacagtga
12421 gtgctgacaa gggctagcct tgatcacttt ggagacaccc cctgtgtctt ctagatgtca
12481 gactttccaa atctgtctgc tatcctccaa acgtgcattt tcaagagcaa tggaaaaagg
12541 attggacttg atggaatgca gcaagagtcc taggtctgtt actacctacc tatgacctta
12601 agaaactcct tcacccctca gaacccttac agctttcttt ctgattctat cctgagttac
12661 tctactccaa gctgagactt ttctgcttag atctatccct tcctcctaaa cccccaacct
12721 ccatttctcc tggtgtcttt ctttacacac ccctcagcat acacacacac ctagccacag
12781 gaaccaatga gttaatattt gaggagttgg ttttcttttg tcctcaatga gatcctggtg
12841 aggccacttg agctgttcag ctcccttgcg gtattttggg gatggaactc agaagccaac
12901 aatatagaaa aagagtcttt ggccagcttt cccaggggct ccatgccata gagagtactg
12961 cacccgtgtg cacagggggc cctgacatga ggactttgag gataacacta ttcctccaac
13021 tctgcttcag catctccatg gattttcaca cagacacttt aggaaagaaa ctaagtttgg
13081 ggggacttga cctaatccca catcacagcc ccagtaatac agccctggaa tttatcacag
13141 aaagcctaga atcccatgca tatcccatgc atatgcatcc ctagtcctat gggttcaagg
13201 cttggagctc tccctggatt tagctgggaa aagttggcag acagttcttc tctgtcttct
13261 agaaatatgg actagaatcg tgagtgtgag attgcaagta acttttaaaa tcatctagtt
13321 taacttcacc ccatttcata gaccaagaaa ctgagaccag agagagaaat ggactttcaa
13381 gttcaccctg ctagttactg atggatcaca agtcaaatct cctgattcta gcactgtttc
13441 tcttacacca caccaccttt gaaagtgtgt caatcaaatc ttactttagt tgcagaggat
13501 gactttagtt tctgaagata aaattgtgag tcaatcaaga tgagtcccaa gacaatagcc
13561 tgtttagccc ttataagttc agggatgaaa ggttagaaag aaacaggatg gaaggaggac
13621 tggagaaaaa aacaaaagag gaaggaagga ggaggaagca aacaggaaaa aaaaagaatg
13681 tgcatagctt gtcactcctc agtcatttcc tgggagccca tttctagcaa agtgacagct
13741 gcaactccct ggccacctga gcatcttagc tgatctgtct ctgaaacacc ccctggagaa
13801 cagatgaatc aggcttcatc ttcgcttaac taagtcttcc ctgagacgac tccatttaaa
13861 tgaacaagag caggatttcc tgggcacact gagagcacct tccagaggcc cctccagagc
13921 cctaaagcct gtatttcttc cagtcggcct gtttctttcc tggtgatgtc attaaacgcc
13981 ctttgagagt cccacagtga gcagttctgc ggtaaaaccc gctgcaatta aagtctgagt
14041 cctttcctgt ctcaaagggc atattcatat agaagaaagg aaaaggaagg actggctgtt
14101 tgcatttggt tccaggcctg ttgagtagag gtcgtgctca ctccaccgaa ggtacagggt
14161 agccttcagc agaacctggg gatttggttt taagcaagtc tttcttaggt gtgggctttc
14221 agaacacttc cttccttgca atattatttg aaattctcag tgttttagcc gtccccagaa
14281 tattggttcg ttaaagctgt gtatttcaga tctccagaca gtggtcactg tttgtatatt
14341 ttcaatttca aaccagaaaa caaaagttct tattgattac tttttttatt taaaaaataa
14401 aaagtaagta tcttcgtaag aggagctttg ttttaatttt aaagtttaaa atttgattgt
14461 gaagacagag aaaaacttga tgattgtaga tatattcccc tctttggcta ttcaatcaga
14521 gaactagaaa atcatgagag atttaatgac cactgcctga tacacatatg tgttttacag
14581 atgaggaaac tgagacccag agagatgatg aaattggctg aggatggccc agctggtcag
14641 tgaaagactc agagccagag ctggtgcagg gctctttcta ttccttcctg ttccctttca
14701 ggaacactca ccatcggctt tcctgtgaat aatgttgaga taaaatcctt ggtgcattat
14761 gttttctagt cacaacattg actaggctgc cagagtcctc tgttctccca gttggttggc
14821 tgtaggtgtt ggcagccgcc aggagcattc tacagaacag aggaggagtg agactctcct
14881 tgctcaggaa aggcagacct atgacttagc aaataactcc taagaggaga gtgtttcacc
14941 caccattcct cttccttggc tgtggaggca acttagtgga gaggggccag atgacctgtg
15001 aggaacagtg aagccctgcc taacacaatg tatggttgtc ttgttacaga gtcatcagct
15061 acgagtgctg tcctggatat gaaaaggtcc ctggggagaa gggctgtcca gcaggtgaat
15121 gaatcctccg ggccttgcct gttggtgtgg gtggaaggga atggtgggag agaggagtac
15181 ccacataaaa ggcagcagag tgtgaatggg ggcagtggca caaggacatg gcattctccc
15241 cacgtgccca ctggccccag gctctatgcg aggggctgag gaatggaagc tggaaacagc
15301 gcatttcctg agctgctcct cctggcctcc ttaccacact ggtggagtag actccaactg
15361 tggcctgtcc atgcccttcc cagcaggcac aggctcaggc tcaggctctt ggcctctgcc
15421 tctggctggg agtgattcta aacacatcca gcagggtcag cctgatagcc catcagtttc
15481 cgatcagctc tgctagagag ccgatgggat gtgggaggag ggggtcactg gtgggctggc
15541 aaccccaagc catccccatc tccctctgtg tctaaacttg gccctttgga gttcggtagg
15601 gagaagagcc ataggccagg tgggctcacc cagagtcagc agagagtccc acaaatggtt
15661 gcactgggcg aaagacagca tggcacctgt gaattttatt agagcttttc ttttagtgct
15721 acacacaagt gactgtacag gggagttagt attttgtttt aattttgaaa tagagtcatc
15781 ttttggtatc tgcgggggat tgattctagg acccattcta ggatgccata tcctcagatg
15841 ttcaagtccc tgatataaag tggtatagta tttgcatgta atctatgcat attcttccat
15901 gtactttaaa tcatctcaag attacttata ataccaaata taatgtaaat cctatgtaag
15961 tagttgttat accctctttt aaatttttgt attatctttt attgtatttc aaaaaatatt
16021 tttggtccat gtttagttga atctgtgggt gaagaaccca cagatacgaa gggccaactg
16081 tattggctat ttttttagtt aagaatgtga gactgaggcc aggcgcagtg gctcatgcct
16141 ttgattccag cactttggga ggccaagagg ggacgatcac ctgagccaag aattcgagac
16201 cagcagcccg tgcaacatag tgagaccttg tctcttaaag attgtgagac tgggctgggc
16261 acggtggctc acgcctgtaa tcctagcact ttgggaggcc aaggcaggtg gatcaactga
16321 ggtcaggagt ttgagatcag cctggctaac atagtgaaac tctgtctcta ctaaaaatac
16381 aaaaaaatta gctgggtgtg gtggtgggcg cctataatcc cagctactca ggaggctgag
16441 gcaggagaat cgcttgtatc caggaggcgg aggttgcagt gagctgagat agggccgttg
16501 cactccagcc tgggcaagaa gagcaaaact ccatctcaaa aataaataaa taaataaata
16561 aataaatcat gagactgaga cataacagga aggagggcaa tttggttggt tccaaggttc
16621 ctagagtatg tgatgggaga ggttggtgcg ggtggggcca tggaggtact gactcaagtg
16681 gagggacagg tggggaaatg ggatgggaaa agaagattga ccttagaagg ggagctcaac
16741 ctctgaaccc taatttcaga cccttcaaaa tgaatattaa gctcattttg gtctaagaaa
16801 caaaaaacaa atgaacatga aactcatttt ggtcttataa ggtctgagaa accccttcta
16861 aacttcaagc tgctttaaga aataacattt tattacctgc aaatacacac agtactttgg
16921 agatttataa tagtctctta ttctaataga agccattagg gaaccagttt caataaacag
16981 gtaaatctgt aagactagtt tgtaattagg atatctgttt ccagtgtcca ttcctgcctc
17041 tgttatctaa atgtctggga acaagagctg tgctctgctg tgtttaaaat gattaaaaat
17101 caccaattag ttgagttcac gtagacaggc atttgactta ttgagttgtt ttaagaagac
17161 tataacaagc cttaagcccc ccagaaacag cctgtctttg ggctttccca catgcctcct
17221 cgtcctctcc acctgtagat gtaccgtgct ctctgtcaga gaagggaggg tgtggttggg
17281 ctggaccccc agaggccatc cctccttctg tcttctgctc ctgcagccct accactctca
17341 aacctttacg agaccctggg agtcgttgga tccaccacca ctcagctgta cacggaccgc
17401 acggagaagc tgaggcctga gatggagggg cccggcagct tcaccatctt cgcccctagc
17461 aacgaggcct gggcctcctt gccagctgtg agatgacctc cgtctgcccg ggggactctt
17521 atggggaact gccttacttc cccgaggggt gggcatgatg aatgggagtc tgcagtcatt
17581 tcctactgtt tcaggaagct ttctccttaa ccccttagaa aaggctgtgg aacttgagct
17641 aaaatatgtc ttaccaggtt gcgtctaatg ccccccgttc cctactgggc agaaagactt
17701 gggtgcttcc tgaggaggga tccttggcag aagagaggcc tgggctcacg agggctgaga
17761 acatgtttcc cagagttgca aggacccatc tcttaaacac agagtctgca gcccctaact
17821 gacaccctgt ccttcctcct aggaagtgct ggactccctg gtcagcaatg tcaacattga
17881 gctgctcaat gccctccgct accatatggt gggcaggcga gtcctgactg atgagctgaa
17941 acacggcatg accctcacct ctatgtacca gaattccaac atccagatcc accactatcc
18001 taatggggta ggggatcccc agccatactg catggccctt ggtgcataat gaacccattt
18061 ctgttccatg tgtgggctgg tttctggggt ttaagctgta gacaacccac cctctttgtg
18121 cctgcttctc cttgggccct ctattccaca gcttgtggaa cccacatttt gctactgtgt
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18241 tcatccttgc tgcttctctg ggcagattgt aactgtgaac tgtgcccggc tgctgaaagc
18301 cgaccaccat gcaaccaacg gggtggtgca cctcatcgat aaggtcatct ccaccatcac
18361 caacaacatc cagcagatca ttgagatcga ggacaccttt gagacccttc gggtaaggga
18421 ctgccctggg tggaggccca ggcttgggac acattgcctc ccaagagggg cctagcagga
18481 actcttctgc aggagaggta gaggatggct cctgtagggg aacatagagc aggttcccct
18541 gaatgccctt gaacatggag aattcattga ccagacattc agcttgacct aacctgtgaa
18601 attctccatc ttctttataa agtgttccct tccttgcctc ccctggaaag gtcagtggtg
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18721 ggcagttccc acatggggta ctagaataaa tggcctatca ggctgtgtgt gctttgggat
18781 cacatgtccc caccctagga ccctggttcc aaccatacgc atgttctctt ggagcccaga
18841 acagcagaga agccaccagt gtggacacag aagtcaaggg tctgatttcc agcctggctt
18901 ctgactgctc tggggccgca ggaatacggt tccttccccc atgcccagca ggcatttgtc
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19021 caggctgccc tgtcagggtt tttgccttga ttcaaggaga acttcctaac cacaaaggat
19081 acaagtggga gtgaggcgga ccctccctag agatctccaa cacagagaga caaacacgct
19141 ggggctggct ggcactgaca ggcctcgcag gtgtggatgg ctgttagctg ggagcttcgc
19201 tgtctaagct cctctcccat gcttttcttc tgggttgctc gaaggacggg ggtctgcaag
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19321 tcctcttact gtttagattt ggtaaatatt tcttccttcc ctcttctgac cctccatttt
19381 gccgatcttt ccttcttata acacatactt actaggtacc tgctacttcc cgggtgggcc
19441 tatgtgccag gagtatagag gtgaacaagg aaggcaaagt tctattctca gtagagctaa
19501 tactctatct ggagagagac aacaaacaaa tcaacaaggt agccaggggc tgtgataatt
19561 tatgtcaagt gggcaggtaa atcgggagtg acagtagtgc agggaggatt ggaaagtcag
19621 ggagttctct ctggaggagg tggcttttga tctgcagcct aaaggatgag aatgggtcca
19681 ttatacaaaa tgctggggca agagcacacc cagtagaggg gagagtaata gcaaaggctc
19741 agggcaggaa gggcaaggga gaggccagtg ggtgaggtca catgtgaagg gcatacaatg
19801 ggcaaagaca aggccagagt ggccaggccc aatcctccag gacttgcaga cctgggaaag
19861 agtgcatctc catcctggga gcagcaggaa accactcagg cctttagaag atccttctgg
19921 cagctgtgta gagaatgggt ggtgtgatcc ttccatgcat gggctcatgt acgtgattac
19981 cagtaactgt cgagtgacag tgtgaggagg gctgcaagcc atgagtgtag gcacagcaga
20041 cagactcacc tttgtctggc ggtgagatgg ggtgggaagt gtgccaagtt gacctcccaa
20101 agaaatgata ttttagtgga agaatgaata gaatcagaga agcaaagtaa gagggaagag
20161 cagagaggac agcagggaca aggacttggg ggcaggaaga ggaaaggcag gttaaggaca
20221 tgaaagatgg ccaggctggc tggagctcag gcccagcaag gccccctggg ggccatggtc
20281 atgggtgagc ttgggtttgg cttctgtttt cgtcttgggc ttctgtgaaa gcctcgagcc
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20401 ggagcactcc atcttctctc ctccccacag gctgctgtgg ctgcatcagg gctcaacacg
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20761 gagggctgac tacagaatcc agcagctttt gtctgggaga gctggactga agagaggcat
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20881 aaggccagag caaggctaat aggtagagca acagcttaca ggtgtggggg tggcagatac
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21541 gacctctgaa aggccatgag cacaaagctg ctgcctgagt cccctgaaat gcagggtacg
21601 ccccaggtct ctgatgtacc ccaccacact tttcctctca aacatattcc aggatcactt
21661 gatttctttt gaatctattt aaacccaccg tgtcaatgtg ctatataaaa tgtctaatgc
21721 atttcagaca ccctatacat ctatacattt aaagtgttct ccttctatct gtgcagggat
21781 gggaaagggc atatttctga aagcacagat gggaagacgg gatttgttcc gtgtccaggt
21841 gattatggta cctctatgcg cctggccggc actggggaca gaggccatga aaatgaatac
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21961 gttgttggga tctgatttgg tgagtgcaat gacagagata ctcacagcac aaaatgggga
22021 atgagggcgg gcattgggac acacatagcc ttaaggggcc caaaggcttt tagaactgta
22081 ttccctatta aaacatgatt tgcacagagc acattctttg ctttggagac ctcagaactc
22141 cttactatag gccgggcatg gttataatcc cagcactttg ggaagccaag gcgggcagat
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22261 aaaatacaaa aattagctgg gtgtggtggt ggccacctgt aatcccagct actcaggagg
22321 ctgaggtagg agaatcactt gaacctggga ggcagaagtt gcaataagcc cagatcatgc
22381 cactgcactc cagcctgggc aacaaagcta gactctctca aaagaaaaaa acaaaacaaa
22441 acaaaacaaa acaaaaaaaa ctccttatta taaactgtaa gaaaaaaaag gcccctactt
22501 cgtccctttt gcaaatctgc cttttcctac tcactaacca gctggttcag agcaaggaca
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22741 gcaggttcct ctaccacatc gtggacttca ccttccttct ctaagaagct caatccccaa
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23221 aaataaatta ttatacttac tatttatggg tgtggtgaat gggatggcaa aggccaagtc
23281 ttactgatca ccaaacctta agatatatcc tggcagctag tagacccttg ggctaaatga
23341 acagaaaact ggacaaataa agtgtacaca aataactcaa agctgtcatt tgtacacttt
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24181 ggaggggaaa ttcagagatc tttgggcgac ttccctgcct ggacccagct cacagcttct
24241 cggccactgc aaatgtgtgg gttgtgacca gactgatgtg tcttgagctt caggcttgca
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24661 gaatgtgccc tgaccaagca gcccacaggg cctgggacag aggctgatct ctgcctaact
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24781 gatgacacaa gcccgctggg ccccagcagt gtttagaggg gttgttgact cacgagatga
24841 cattcctgct gatgtgtgtc atgccctggg gtggatgaat gataaatgaa aacagcgctt
24901 ttaacttttg aacccacttt ctccttcctt gtagccaaga cactatttga attggctgca
24961 gagtctgatg tgtccacagc cattgacctt ttcagacaag ccggcctcgg caatcatctc
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25381 gggtcacttg ccaatgtata gtcaagaggt cagagtgagg gtacagctga gctgcagccc
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25501 actccaaaca cccttgatta tctggatctt ctttaattct ccatagaaga taccagatgt
25561 taaggaatat tggcagcttc acttggtttc tcaatccctg tttccaaact caaggaggga
25621 tgggcttttt cactgtattt atctctcatc actctcttca ttgcaggagc acatctctct
25681 ggacctaacc atcacccttt cttgtagatg gaacccctcc aattgatgcc catacaagga
25741 atttgcttcg gaaccacata attaaagacc agctggcctc taagtatctg taccatggac
25801 agaccctgga aactctgggc ggcaaaaaac tgagagtttt tgtttatcgt aatgtaagtt
25861 ctgggtccta aatcatgctc ctgggaagct ccttactgtg ggacttgtat tagtgtaaaa
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26281 gaagtacaac tcaacatagc tcttgcctgg gaccaaccag caccatttgg ctaaagatgg
26341 ttatcatctg ttaaacaaag aaataaataa atgggttcaa cgtatttatt tcaacattgt
26401 caatggacct catgtgtaac tgatattctc attatgggac ctctgtgtga ctttattggg
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26521 tacatcattt tatcccagcc ttaataaccc atcccagtgt atactccttc atcttcatgg
26581 ataatgaccc tgctacatgc tctgaacaaa tcaggaggcc cctcgtggaa gtataaccag
26641 tcctttcttt ctctgtccct cttctgtgca gagcctctgc attgagaaca gctgcatcgc
26701 ggcccacgac aagaggggga ggtacgggac cctgttcacg atggaccggg tgctgacccc
26761 cccaatgggg actgtcatgg atgtcctgaa gggagacaat cgctttaggt aattagttcc
26821 atccccgggt ggagcttctg cccagtggtc atgctggagt gggatgtggg gccccagcta
26881 tttgtcaagc tttcttctac cttggggatt caattaacac tagcagtgca ctgctgcgac
26941 cttccagact tgggatgggg aaaaggcaag ggtcgccttg aaagcttaca ttgggaagaa
27001 gggttacttc taagagtgta atcttcacat gcatgggaag cagggagggg ggactacatt
27061 tttatgactg aagtgcaagg aaaacatcac cctctcattg taaagctcca agtgagccaa
27121 gagcacatag tttacagtgc acgatgagcc tctcactctc tgcgcagtat ctgtttattg
27181 caactgaagc acccttgtga gtttgttttc ttgcccggct atctccattt ctgacttgct
27241 cattcacctt ggggtgctgt catattgaat gtttccctgt cactgacttc agccacctgc
27301 acaagggctt ggagaccaca cccctctgcc ctcccagaat catatccctg gaggctcagc
27361 tagtctctgg gtcagccata cctctgccct ttcttttccc tcctttctcc tgtggcctct
27421 gacgtctggc catttaacag agcttagcat ttttgctggg tggagagagc tggagcctgg
27481 aatcactccc tctttgtgca tacggagggc atgaaaacca aggtgtgtgc attccagtgg
27541 cctggactct actatcctca gtggtgaggt atttaaggaa aatacctctc agcgtggtga
27601 ggtatttaag gaaaatacct gttgacaggt gacattttct gtgtgtgtat ctacagcatg
27661 ctggtagctg ccatccagtc tgcaggactg acggagaccc tcaaccggga aggagtctac
27721 acagtctttg ctcccacaaa tgaagccttc cgagccctgc caccaagaga acggagcaga
27781 ctcttgggta aagaccaact taagtacacg tctccatttt tctaaagtag tgatccctca
27841 gggccccagc agcaaacagt tggcacatca aggattgact tgaagggatt ttatgacaag
27901 actattagtg aaagagtggg cgggactaaa ggaactagca aaggatgagg ccaaccaggg
27961 actagcaacc ctgggaagcc tttactaccc ctaggcctgg gggaatggga ggatgagagc
28021 aggaaccagg gaggtcatga gccttggaca agggcacaga acagcagcca gagccatgtg
28081 cagccagcca ctgtcagaac catgcaaggg ggaccactca gcgccccagc ctccctctca
28141 gacagttgcc atctgggtct cttgttggct gatgcgagag caggagggag cccactgatg
28201 cagttcatag agctcagcct cctgggcagg aaaccgggca gagaggagta gaaaagaatt
28261 aagggtggct gcgaccagcc cagtcactga ggcacgtttc ccactggaga cctatgagca
28321 cagtgataat aaagccagtt acctgcactg actatccctc cagacaaaag ctttcccaag
28381 aagttagtca tggctctgag agatctagtt gaggatgttt ggcaggggat ctagtggtta
28441 cgggtggcta agaaaaatga ggaaggtaag agtatcttgc agcctgtgtt gggaggatta
28501 aataggatgc cacacacagg gccaggcaga cagcctggtc agtaatagcc atgacgatgg
28561 gggcgggggg agcaggaatg ggagttgcag tgtttagctc agatgcatgc ctgtgagaga
28621 tgcttccact ctcacagaaa gatgagacca aggaaaagga ggaggaagag gaaggacctt
28681 gacaaacctt ggggcccaca ttgtctacac ctcccttcct gctctagagc agaatagaaa
28741 gttcaggttg caggcagctc taagttgaat tcgtgtcctg tttaattttc tttattgcta
28801 aatgaatgcc tgtgtctgtg atgctgacgt atgttcctaa ggagagggga gaagttcatt
28861 ctgaacataa acttttcatc ctctctctgt ccagcaagaa tggaatattc cccaagtggc
28921 ctgagccagc ttggctttct ttttgttttc aattatgtgg gagttgagga gggggatggg
28981 aaaagcttcc caaacacacc ctcccccagg cctgaggcac ccctggggga cagagagtgt
29041 tagaggttgg tacaggtgtt agagatattg aaaggacatc ccatgcaccc caggggctgg
29101 tgtggctctg tacttccagg caatattttg tggaagggga accttgtcag ctccaggttg
29161 tggatgtttg aaaatcagtt ggtacccagt ggctccatcc tctggcaggc atgtggattt
29221 gtcaataacc aagtgaactc tccaaaataa gttaaaactt cctcccttct cagtttcaag
29281 atgctggaaa tagctgttca taagccctgg ggaaatttag ccctttggct ggtaatggga
29341 gtatccgaga tgagagggca gctggaaact ttcggaatga cctcccacac ttaatttggg
29401 aaatgcctct gcacctttat gggcaaccag atgcctgccc cagttgctgg agacactgat
29461 gtgggctgaa aggaatgctg agacgtgacg aggagagatg ctgcggaggg aatatccccc
29521 tcagccctga cctcatcggc tccatggctc ctccacagta cagctgtcta ctcttttaag
29581 ttctcccttc aggaaatagc catctcaaac agaatgtgca tttgagggca gaatgtgtaa
29641 atattgcact actgtgttat aaccgtcagg agccatgctg atgatgaaac gtcccagatg
29701 ccggtgctgg aaaggtccct ggctttccaa gcaaatattt atctcatgga aacatgagtc
29761 atactcacag aggagtatgg attaactcct tctcagcagc cagggagccc agcatcccag
29821 acagcatatt taacccagag gccaactgac tgctggggca gatttgtggt catgaacatg
29881 tgctttgtgt cctctgacca ttagacagat tgtgggtcac aacgttgagt atacagtggg
29941 agcttaataa gtgcttattc cctgggcagg gagttcttca tttcaggggt gaccacttac
30001 atcttctcct ctgggccctc cttgaccagg ctaattacca ttcttgggat taactctatc
30061 tccttttccc gcaacctgca ggagatgcca aggaacttgc caacatcctg aaataccaca
30121 ttggtgatga aatcctggtt agcggaggca tcggggccct ggtgcggcta aagtctctcc
30181 aaggtgacaa gctggaagtc agcttggtaa gtgtcctgca aatcaaaggc tggctaaatt
30241 tccccagggc agggctccag gacatatctc acccccagga tggaattata cacacacaac
30301 cttcaagttg cagcccgaat ctctgagtgt aattcgtcca aagaaaaaga gaaaagagaa
30361 gagggtcttc agggaaatca agtgagatca tagttagaca tgagtaagaa cttccagatt
30421 tacaagggaa tagagcatct gatttggcat ctgagagagg ctattagatc ttccttctct
30481 taaggaggtt gtaggcaact agttatgtga ctgaagagat cagtctgtac tcacaccatc
30541 ccacccccca aacccagggc ttcactgagt tgtaccatga accagaccat cccaagaggc
30601 tttttgagtt ctgacacttg ctctgtgagc cttcccttgc tctgcacatt gatgatataa
30661 ctttgtaact gcactaagag tgttcctaaa gcagatagcc agccgagctc cagaaatctc
30721 cctggctgca cctgcagagg ccactgaccc ctctgtggag ggaccgctct tcagtgtgtg
30781 gctggcttct actctctgct cctctctctt ggtcttcagc catccattgc tcaccagttt
30841 ctcacgagga gcataggaag atatgcatgt agggaggtag gcacggggat gacttgtttg
30901 actttagcag gtcattcaag aatctcctcg cacctggttt cagatgctgg ggtcctgtct
30961 gtcacaggct tctgtgcctc ctaccccctt gagtttgtca catggccctt caggaaggcc
31021 tgagatagat ttgccctggg tgggcctcct atgagaaaat cttaagtgag gcacccaggc
31081 aaaatggaaa gagccttttg cccagagcag gaagcctgtc ttccatttcc agctgttcca
31141 cctacttagc ttaaaagagg cacttcgcct gtcttcagtc tcagtctcag tctcctcttc
31201 tgtggaatgg gacaataata tctactctcc ttatcataca ctgctgtgag gactgagtgg
31261 atcacacaaa aaagcattat gtaaattgca aagtgctaaa tccacacagg agatttgaat
31321 taatccacca cactgaaggt ctgtcaaggg cagggactgt ttcattcacc agagtatccc
31381 cagtctaaca caggacttgg catatgaaaa gtgttcagta ggccgggtgc agtggctcat
31441 gcctgtaatc ccagcacttt gggaggccaa agtgggcgga tcatctgagg tcaggagttc
31501 aagtccagcc tggccaacgt ggtgaaacca catctctact aaaaatacaa aattagctgg
31561 gcgtggtggc acatgcctgt aatcacagct actctggagg ctgaggcagg agaatcactt
31621 gaacccagga ggcggaggtt gcagtgagtc gagatcatgc cactgcactc cagcctgggc
31681 gacaagattg aaactccatc tcaaaaacaa agaacaagga aaaaaacgaa aactgttcag
31741 taaacacttg ctgaatgaat aaaataaata tataaatgta taaataaatg ctctactttc
31801 aaccactact ctgtttttct tttagaaaaa caatgtggtg agtgtcaaca aggagcctgt
31861 tgccgagcct gacatcatgg ccacaaatgg cgtggtccat gtcatcacca atgttctgca
31921 gcctccaggt aagtgtcgca tccccactga ctctgcagcc agtccttttc ttcatgtggc
31981 agttggtgga gagaagaaaa actgttctaa acaatgatga gaataacatg taattgtgat
32041 agttaaactg tgcctatgtg actgattgca gagtgaattg ggagctgttg gttttgaatg
32101 caccacacta aggaatgtga ggacacattg ctctttgcgg agttgcccag ctatattagc
32161 tcccctcgga cacagcccag ttttctgtat tcgcgtggat gctgtccgcg cgattcccag
32221 cactcctctt acagcatctc acctcagtgt atgttccttg cctccagtgc agttgaacct
32281 cagtcctgcc tctcctcatg tgtgcattca cctttcttgg tgctctctcc ccatgggcca
32341 agttctacca tgagttatga aacattatgg agaaaacatg tctttggaaa tgtgagccag
32401 aaagcccacc agtgcccctc agtcacggtt gttatgaatg acatgctaat ggtttcactc
32461 tggtcaaacc tgccttttct ttcctcttca gccaacagac ctcaggaaag aggggatgaa
32521 cttgcagact ctgcgcttga gatcttcaaa caagcatcag cgttttccag ggtaagatgc
32581 ctgctaggtt tgcgcctagc ctgagcagcc tcaggtcctc tgtttgggcc atagaggagc
32641 ctctccagcc cctgtcttcc ttggctgctc cccagggctc tcttaaaact tctccccact
32701 cccactgagg catcctcagc cccagcctgt gtcaaattca gagtaaagaa ccaaggcaac
32761 tccctggctt tcatgggcca aagcgcaggc tttcacaccg aggcctctga gcctcagatc
32821 atggggaagt cactgctgga gagaacagac atagctctgg aagccatctg cccaagaggg
32881 cagcccatcc caagttcatc ttacagtggc caggcctgcc ctgagccggg gcctctgggt
32941 cactcttctg ctgtccatgg cattgcccat cctgggtgag gctggggctc tcctgggcac
33001 tgtatgtatt ctggatacag ggatactggg ctcgctatgt gtgtggagcc atcccttcct
33061 tgccccagcc ccacctccct ctcaaaccct ctctggctct ttctgagctt cctttcctgc
33121 tccccagctt gcccagtgct cagtgcccca cttggctctt ttgctacttc gggtcaggtg
33181 gagcctcttg ggaatgtgaa gtgccttaca gaaagattgc acttcaagag gagaggctgc
33241 agggagccat cctaaaccca gaggcctgga gcttactgtg tcactttact tttgtacaca33301 ggggtctcct tagtgccctc gagaaggatt cttggccctg agcttctact cctgaggcca
33361 cctctgtgca gccccagctc cctcaactct aggctgtagt ctcagtggga aagcctggct
33421 tgggggtctc ctaggaatgt ccacctgaag gcacacttga taggggcttg cacaacttat
33481 gtctgccaag gccacctgag gaactccctg gtgcctataa gttccacctt ccccttcctc
33541 ttcctcgccc cagcattttt tctgagtagg ggtggcaatg ggcaaagcca ttgtcataag
33601 cagttgcagg tataactttc actagaaaac ctgacacctt gtgttttctt tcaggcttcc
33661 cagaggtctg tgcgactagg tgagtctggt ctgggtttga agtcattgca gacctgttta
33721 ggccttaccc ccaagcaagc ccaagcctgc catctgctgt atatagataa gaacatcatg
33781 gtgcagtaaa agaagcctgg cctttggagt cagaacagca gggtgacttg gggtcagacc
33841 cagagcaccc catttccttc tctgtaagat gaggataata agagtaacaa ccttttaggg
33901 ttaaggtgag ttttcagctt aggaagtctg ggaatattgc aaagggcttg gcaggaaccc
33961 atggtgagga tctagttcca agttgatagg tacagaaaac cagaacatcg ggccttgagt
34021 aaagagtgaa gtttcacaaa ccacaaagca cctgctatgt gcaggagagc atggcagaag
34081 gaggctgctt ggccctggtc cttgagattc tgacagtgtc ctagacagac atggggagat
34141 ctgcacctat ttgacgttac caacttctct ttttcagccc ctgtctatca aaagttatta
34201 gagaggatga agcattagct tgaagcacta caggaggaat gcaccacggc agctctccgc
34261 caatttctct cagatttcca cagagactgt ttgaatgttt tcaaaaccaa gtatcacact
34321 ttaatgtaca tgggccgcac cataatgaga tgtgagcctt gtgcatgtgg gggaggaggg
34381 agagagatgt actttttaaa tcatgttccc cctaaacatg gctgttaacc cactgcatgc
34441 agaaacttgg atgtcactgc ctgacattca cttccagaga ggacctatcc caaatgtgga
34501 attgactgcc tatgccaagt ccctggaaaa ggagcttcag tattgtgggg ctcataaaac
34561 atgaatcaag caatccagcc tcatgggaag tcctggcaca gtttttgtaa agcccttgca
34621 cagctggaga aatggcatca ttataagcta tgagttgaaa tgttctgtca aatgtgtctc
34681 acatctacac gtggcttgga ggcttttatg gggccctgtc caggtagaaa agaaatggta
34741 tgtagagctt agatttccct attgtgacag agccatggtg tgtttgtaat aataaaacca
34801 aagaaacata
TGFβI gene protein product (βIG-H3 protein sequence; NCBI Reference number NG_012646.1):
MALFVRLLALALALALGPAATLAGPAKSPYQLVLQHSRLRGRQH
GPNVCAVQKVIGTNRKYFTNCKQWYQRKICGKSTVISYECCPGYEKVPGEKGCPAALP
LSNLYETLGVVGSTTTQLYTDRTEKLRPEMEGPGSFTIFAPSNEAWASLPAEVLDSLV
SNVNIELLNALRYHMVGRRVLTDELKHGMTLTSMYQNSNIQIHHYPNGIVTVNCARLL
KADHHATNGVVHLIDKVISTITNNIQQIIEIEDTFETLRAAVAASGLNTMLEGNGQYT
LLAPTNEAFEKIPSETLNRILGDPEALRDLLNNHILKSAMCAEAIVAGLSVETLEGTT
LEVGCSGDMLTINGKAIISNKDILATNGVIHYIDELLIPDSAKTLFELAAESDVSTAI
DLFRQAGLGNHLSGSERLTLLAPLNSVFKDGTPPIDAHTRNLLRNHIIKDQLASKYLY
HGQTLETLGGKKLRVFVYRNSLCIENSCIAAHDKRGRYGTLFTMDRVLTPPMGTVMDV
LKGDNRFSMLVAAIQSAGLTETLNREGVYTVFAPTNEAFRALPPRERSRLLGDAKELA
NILKYHIGDEILVSGGIGALVRLKSLQGDKLEVSLKNNVVSVNKEPVAEPDIMATNGV
VHVITNVLQPPANRPQERGDELADSALEIFKQASAFSRASQRSVRLAPVYQKLLERMK
H
【図１Ａ】
2020039339.tif 000010
【図１Ｂ】
2020039339.tif 000011
【図２】
2020039339.tif 000012
【図３】
2020039339.tif 000013
【図４】
2020039339.tif 000014
【図５Ａ】
2020039339.tif 000015
【図５Ｂ】
2020039339.tif 000016
【図５Ｃ】
2020039339.tif 000017
【図６Ａ】
2020039339.tif 000018
【図６Ｂ】
2020039339.tif 000019
【図６Ｃ】
2020039339.tif 000020
【図７】
2020039339.tif 000021
【図８】
2020039339.tif 000022
【配列表】
2020039339000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年11月22日(2019.11.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７６】
いくつかの実施態様では、この方法は、（Ａ−２）同じ反応混合物を使用して、生物学的サンプルから、第二ＴＧＦβＩ遺伝子配列を増幅することと、ここで、反応混合物は、少なくとも１つの第二増幅プライマー対及び少なくとも３つの検出プローブの第二セットを含み；（Ｂ−２）少なくとも３つの検出プローブの第二セットの第一検出プローブを第二ＴＧＦβＩ遺伝子配列にハイブリダイズすることと；（Ｃ−２）（ｉ）少なくとも３つの検出プローブの第二セットの第一検出プローブの第一ＴＧＦβＩ遺伝子配列へのハイブリダイゼーション、並びに（ｉｉ）第二ＴＧＦβＩ遺伝子配列にハイブリダイズするための、少なくとも３つの検出プローブの第二セットの第二検出プローブ及び第三検出プローブの不成功、に基づいて、第二ＴＧＦβＩ遺伝子配列中の変異を検出することとをさらに含む。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５７】
いくつかの実施態様では、本明細書に記載される本方法に従って調製したゲノムＤＮＡサンプルの約１μＬ、約２μＬ、約３μＬ、約４μＬ、又は約５μＬが、３０Ｘ、３５Ｘ、４０Ｘ、４５Ｘ、５０Ｘ、又は１００ＸのリアルタイムＰＣＲアッセイミックスのわずか約０．０５μＬ、約０．１０μＬ、約０．１５μＬ、約０．２０μＬ、約０．２５μＬ、又は約０．２５μＬ及び蒸留水と組み合わされＰＣＲマスターミックスを形成することが見出された。いくつかの実施態様では、ＰＣＲマスターミックスは、約５μＬ、約６μＬ、約７μＬ、約８μＬ、約９μＬ、約１０μＬ、約１１μＬ、約１２μＬ、約１３μＬ、約１４μＬ、約１５μＬ、約１６μＬ、約１７μＬ、約１８μＬ、約１９μＬ、若しくは約２０μＬ又はそれ以上の最終体積を有する。いくつかの実施態様では、上記のように調製されたゲノムＤＮＡサンプル２μＬが、４０ＸのリアルタイムＰＣＲアッセイミックスのわずか０．１５μＬ及び蒸留水２．８５μＬと組み合わされることが見出された。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９０】
いくつかの実施態様では、角膜ジストロフィーは、例えば、Ｒ１２４Ｃ、Ｒ１２４Ｈ、Ｒ１２４Ｌ、Ｒ５５５Ｗ、Ｒ５５５Ｑ、及び／又はＨ６２６Ｐの２、３、４、５、及び／又は６個の検出を通して検出される。いくつかの実施態様では、角膜ジストロフィーは、例えば、Ｒ１２４Ｃ、Ｒ１２４Ｈ、Ｒ１２４Ｌ、Ｒ５５５Ｗ、及び／又はＲ５５５Ｑの２、３、４、及び／又は５つの検出を通して検出される。いくつかの実施態様では、角膜ジストロフィーは、Ｒ１２４Ｈ、Ｒ１２４Ｌ、Ｒ５５５Ｗ、及び／又はＲ５５５Ｑの１つ以上と組み合わせて、例えば、Ｒ１２４Ｃの検出を通して検出される。いくつかの実施態様では、角膜ジストロフィーは、Ｒ１２４Ｃ、Ｒ１２４Ｌ、Ｒ５５５Ｗ、及び／又はＲ５５５Ｑの１つ以上と組み合わせて、例えば、Ｒ１２４Ｈの検出を通して検出される。いくつかの実施態様では、角膜ジストロフィーは、Ｒ１２４Ｃ、Ｒ１２４Ｈ、Ｒ１２４Ｌ、及び／又はＲ５５５Ｑの１つ以上と組み合わせて、例えば、Ｒ５５５Ｗの検出を通して検出される。いくつかの実施態様では、角膜ジストロフィーは、Ｒ１２４Ｃ、Ｒ１２４Ｈ、Ｒ１２４Ｌ、及び／又はＲ５５５Ｗの１つ以上と組み合わせて、例えば、Ｒ５５５Ｑの検出を通して検出される。いくつかの実施態様では、Ｒ１２４Ｈは、Ｒ５５５Ｗと組み合わせて検出される。いくつかの実施態様では、角膜ジストロフィーは、Ｒ１２４Ｃ、Ｒ１２４Ｈ、Ｒ１２４Ｌ、Ｒ５５５Ｗ、及び／又はＲ５５５Ｑの１つ以上と組み合わせて、例えば、Ｈ６２６Ｐの検出を通して検出される。いくつかの実施態様では、Ｒ１２４Ｃ、Ｒ１２４Ｈ、Ｒ１２４Ｌ、Ｒ５５５Ｗ、及び／又はＲ５５５Ｑの全てが検出される。いくつかの実施態様では、Ｒ１２４Ｃ、Ｒ１２４Ｈ、Ｒ１２４Ｌ、Ｒ５５５Ｗ、Ｒ５５５Ｑ、及び／又はＨ６２６Ｐの全てが検出される。
【手続補正書】
【提出日】令和1年11月28日(2019.11.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）対象由来の生物学的サンプルから、第一ＴＧＦβＩ遺伝子配列を増幅しそして決定するための、少なくとも１つの第一増幅プライマー対と；
（Ｂ）少なくとも４つの検出プローブのセットと；
を含む、ヒト対象における角膜ジストロフィー検出用反応混合物であって、前記少なくとも４つの検出プローブのセットは、第一標識検出プローブ、第二標識検出プローブ、第三標識検出プローブ、及び第四標識検出プローブを含み、前記第一標識検出プローブが配列番号２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、及び４１からなる群から選択される配列を含む核酸配列を含み、前記第二標識検出プローブが配列番号２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、及び４２からなる群から選択される配列を含む核酸配列を含み、前記第三標識検出プローブのヌクレオチド配列が配列番号４９からなり、そして前記第四標識検出プローブのヌクレオチド配列が配列番号４８からなる、前記反応混合物。
【請求項２】
前記少なくとも第１及び第２標識検出プローブが、配列番号２５の第一検出プローブ及び配列番号２６の第二検出プローブを含む、請求項１に記載の反応混合物。
【請求項３】
前記第一増幅プライマー対が、第一増幅プライマー及び第二増幅プライマーを含み、前記第一増幅プライマーが、配列番号１のヌクレオチド配列を含み、そして前記第二増幅プライマーが、配列番号２のヌクレオチド配列を含む、請求項１又は２に記載の反応混合物。
【請求項４】
（Ｃ）前記生物学的サンプルから第二ＴＧＦβＩ遺伝子配列を増幅しそして決定するための少なくとも１つの第二増幅プライマー対と；
（Ｄ）少なくとも３つの検出プローブの第二セットと；
をさらに含み、前記少なくとも３つの検出プローブの第二セットのうちの１つの検出プローブが、前記第二ＴＧＦβＩ遺伝子配列に曝露された場合に、前記第二ＴＧＦβＩ遺伝子配列にハイブリダイズする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の反応混合物。
【請求項５】
前記第一ＴＧＦβＩ遺伝子配列が、前記対象の前記生物学的サンプル由来の、第１２４位アミノ酸残基をコードするヌクレオチドを含み、前記第二ＴＧＦβＩ遺伝子配列が、前記対象の前記生物学的サンプル由来の、第５５５位アミノ酸残基をコードするヌクレオチドを含む、請求項４に記載の反応混合物。
【請求項６】
前記少なくとも３つの検出プローブの第二セットが、配列番号４５〜４７及び５０からなる群から選択される少なくとも３つ又はそれ以上の検出プローブを含む、請求項４又は５に記載の反応混合物。
【請求項７】
前記少なくとも３つの検出プローブの第二セットが、配列番号４５又は配列番号４７である第五検出プローブ、配列番号４６である第六検出プローブ、及び配列番号５０である第七検出プローブを含む、請求項４〜６のいずれか一項に記載の反応混合物。
【請求項８】
前記第二増幅プライマー対が、第三増幅プライマー及び第四増幅プライマーを含み、前記第三増幅プライマーが、配列番号４３のヌクレオチド配列を含み、そして前記第四増幅プライマーが、配列番号４４のヌクレオチド配列を含む、請求項４〜７のいずれか一項に記載の反応混合物。
【請求項９】
前記第一標識検出プローブのヌクレオチド配列が配列番号２５からなり、前記第二標識検出プローブのヌクレオチド配列が配列番号２６からなり、前記第三標識検出プローブのヌクレオチド配列が配列番号４９からなり、前記第四標識検出プローブのヌクレオチド配列が配列番号４８からなり、前記第五検出プローブのヌクレオチド配列が配列番号４５からなり、前記第六検出プローブのヌクレオチド配列が配列番号４６からなり、そして前記第七検出プローブのヌクレオチド配列が配列番号５０からなる、請求項７又は８に記載の反応混合物。
【請求項１０】
（Ａ−１）少なくとも１つの第一増幅プライマー対及び少なくとも４つの検出プローブのセットを含む反応混合物を使用して、ヒト対象の生物学的サンプルから、第一ＴＧＦβＩ遺伝子配列を増幅することであって、前記少なくとも４つの検出プローブのセットは、第一標識検出プローブ、第二標識検出プローブ、第三標識検出プローブ、及び第四標識検出プローブを含み、前記第一標識検出プローブが配列番号２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、及び４１からなる群から選択される配列を含む核酸配列を含み、前記第二標識検出プローブが配列番号２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、及び４２からなる群から選択される配列を含む核酸配列を含み、前記第三標識検出プローブのヌクレオチド配列が配列番号４９からなり、そして前記第四標識検出プローブのヌクレオチド配列が配列番号４８からなり；
（Ｂ−１）少なくとも４つの検出プローブのセットの第一検出プローブを前記第一ＴＧＦβＩ遺伝子配列にハイブリダイズすることと；
（Ｃ−１）（ｉ）前記少なくとも４つの検出プローブのセットの１つの検出プローブの、前記第一ＴＧＦβＩ遺伝子配列へのハイブリダイゼーション、並びに（ｉｉ）第一ＴＧＦβＩ遺伝子配列に対する、前記少なくとも４つの検出プローブのセットの他の３つの検出プローブのハイブリダイゼーションの欠如、に基づいて、前記第一ＴＧＦβＩ遺伝子配列中の変異を検出することと；
を含む、角膜ジストロフィー検出方法。
【請求項１１】
前記反応混合物が、請求項１〜９のいずれか一項に記載の反応混合物を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
（Ａ−２）同じ反応混合物を使用して、前記生物学的サンプルから、第二ＴＧＦβＩ遺伝子配列を増幅することと、ここで、前記反応混合物は、少なくとも１つの第二増幅プライマー対及び少なくとも３つの検出プローブの第二セットを含ものとし；
（Ｂ−２）前記少なくとも３つの検出プローブの第二セットの１つの検出プローブを前記第二ＴＧＦβＩ遺伝子配列にハイブリダイズすることと；
（Ｃ−２）（ｉ）前記少なくとも３つの検出プローブの第二セットの前記１つの検出プローブの、第二ＴＧＦβＩ遺伝子配列へのハイブリダイゼーション、並びに（ｉｉ）前記第二ＴＧＦβＩ遺伝子配列に対する、前記少なくとも３つの検出プローブの第二セットの他の２つの検出プローブのハイブリダイゼーションの欠如、に基づいて、前記第二ＴＧＦβＩ遺伝子配列中の変異を検出することと；
をさらに含む、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第一ＴＧＦβＩ遺伝子配列を増幅すること（Ａ−１）及び前記第二ＴＧＦβＩ遺伝子配列を増幅すること（Ａ−２）が、同時に実行される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ハイブリダイズすること（Ｂ−１）及び前記ハイブリダイズすること（Ｂ−２）が、同時に実行される、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記検出すること（Ｃ−１）及び前記検出すること（Ｃ−２）が、同時に実行される、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
（Ａ）基材の先端に付着したヒト対象の上皮細胞を提供することと；
（Ｂ）前記基材に付着した細胞を溶解する溶解液中で前記基材の前記先端を撹拌することと；
（Ｃ）前記撹拌すること（Ｂ）が完了するとすぐに、前記溶解液から前記基材を除去することと；
（Ｄ）前記除去すること（Ｃ）の後に、前記溶解液をインキュベートすることと；
（Ｅ）前記溶解液からゲノムＤＮＡを単離して、ｇＤＮＡ溶液を形成することと；
（Ｆ）少なくとも１つの第一プライマー対、少なくとも４つの検出プローブのセット、及び前記ｇＤＮＡ溶液を使用して、前記ｇＤＮＡ溶液を前記少なくとも４つの検出プローブに同時に曝露することにより、ＴＧＦβＩ遺伝子中に存在する少なくとも１つのヌクレオチドの同一性を決定することと；
を含む、ヒト対象由来のサンプルにおける角膜ジストロフィーに関連するゲノム変異の検出方法であって、
前記少なくとも４つの検出プローブのセットは、第一標識検出プローブ、第二標識検出プローブ、第三標識検出プローブ、及び第四標識検出プローブを含み、前記第一標識検出プローブが配列番号２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、及び４１からなる群から選択される配列を含む核酸配列を含み、前記第二標識検出プローブが配列番号２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、及び４２からなる群から選択される配列を含む核酸配列を含み、前記第三標識検出プローブのヌクレオチド配列が配列番号４９からなり、そして前記第四標識検出プローブのヌクレオチド配列が配列番号４８からなり、
前記少なくとも１つのヌクレオチドが、角膜ジストロフィーに関連する一塩基多型（ＳＮＰ）に相当する前記ＴＧＦβＩ遺伝子の特定の位置に位置し、そして、
前記少なくとも４つの検出プローブのセットのうち少なくとも３つの検出プローブの各々が、前記ＴＧＦβＩ遺伝子の特定の位置の異なる変異を検出するように設計されている、前記方法。
【請求項１７】
（Ｇ）少なくとも１つの第二プライマー対、少なくとも３つの検出プローブの第二セット、及び前記ｇＤＮＡ溶液を使用して、前記ｇＤＮＡ溶液を前記少なくとも４つの検出プローブのセット及び前記少なくとも３つの検出プローブの第二セットに同時に曝露することにより、前記ＴＧＦβＩ遺伝子中に存在する少なくとも１つの第二ヌクレオチドの同一性を決定すること
をさらに含み、
前記少なくとも１つの第二ヌクレオチドが、前記少なくとも１つのヌクレオチドの位置から独立している、角膜ジストロフィーに関連する第二一塩基多型（ＳＮＰ）に相当するＴ前記ＧＦβＩ遺伝子の第二の特定の位置に位置しており、そして、
前記少なくとも３つの検出プローブの前記第二セットのうちの少なくとも２つの検出プローブが、前記ＴＧＦβＩ遺伝子の前記第二の特定の位置のそれぞれの変異を検出するように設計されている、請求項１６に記載の方法。
【外国語明細書】
2020039339000001.pdf