(57)【要約】【課題】細胞塊の評価不良を抑制することが求められている。【解決手段】薬物を吸収する機能を有する第１部分と、第１部分とは異なる第２部分とを含む細胞塊に滴下される薬物のうち、前記第１部分に到達した前記薬物の量を推定する推定部と、推定部により推定された第１部分に到達した薬物の量と、細胞塊に吸収される薬物の量とを用いて、第１部分の吸収能を算出する算出部とを備える、算出装置が提供される。【選択図】図１
2020171203.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬物を吸収する機能を有する第１部分と、前記第１部分とは異なる第２部分とを含む細胞塊に滴下される前記薬物のうち、前記第１部分に到達した前記薬物の量を推定する推定部と、
前記推定部により推定された前記第１部分に到達した前記薬物の量と、前記細胞塊に吸収される薬物の量とを用いて、前記第１部分の吸収能を算出する算出部とを備える、算出装置。
【請求項２】
前記推定部は、前記第２部分に関する情報を用いて、前記第１部分に到達した前記薬物の量を推定する請求項１に記載の算出装置。
【請求項３】
前記第２部分に関する情報は、前記第２部分に関する細胞の密度である、請求項２に記載の算出装置。
【請求項４】
前記第２部分は、複数の細胞及び前記複数の細胞を取り囲む細胞外基質を有し、
前記第２部分に関する前記情報は、前記細胞の密度及び前記細胞外基質の密度の少なくとも一方に関する情報を含む請求項２に記載の算出装置。
【請求項５】
前記第２部分に関する前記情報は、前記第２部分に含まれる前記細胞の数を計数することにより算出された、前記細胞の密度に関する情報を含む請求項３又は４に記載の算出装置。
【請求項６】
前記第２部分に関する情報は、前記細胞外基質に含まれるコラーゲンの量を用いて算出された、前記細胞外基質の密度に関する情報を含む請求項３〜５のいずれか一項に記載の算出装置。
【請求項７】
前記第２部分に関する前記情報は、前記第１部分の外縁から前記細胞の塊の外縁までの、前記第２部分の厚さに関する情報を含む請求項２〜６のいずれか一項に記載の算出装置。
【請求項８】
前記第１部分と前記第２部分とは、同一の多様性幹細胞から分化した細胞を含む請求項１〜７のいずれか一項に記載の算出装置。
【請求項９】
前記第１部分は、３次元培養された小腸組織である請求項１〜８のいずれか一項に記載の算出装置。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の算出装置と、
前記第１部分に吸収された前記薬物の量を検出する検出部とを備える検出装置。
【請求項１１】
前記検出部は、前記細胞の塊に加えられた、前記薬物を含む薬液の濃度を検出し、前記検出された前記薬液の濃度を用いて前記第１部分に吸収された前記薬物の量を検出する請求項１０に記載の検出装置。
【請求項１２】
前記検出部は、前記第１部分に吸収された前記薬物に含まれる蛍光色素から発せられる光を検出し、前記検出された光の光量を用いて前記第１部分に吸収された前記薬物の量を検出する請求項１０に記載の検出装置。
【請求項１３】
さらに、前記細胞の塊を光学的に検出する光学検出部を備え、
前記算出部は、染色された前記第１部分の外縁を構成する細胞を前記光学検出部で検出することによって計測された、前記第１部分の表面積を用いて、前記細胞の塊の薬物吸収能を算出する請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の検出装置。
【請求項１４】
薬物を吸収する機能を有する第１部分と、前記第１部分とは異なる第２部分とを含む細胞塊に滴下される前記薬物のうち、前記第１部分に到達した前記薬物の量を推定することと、
前記推定された、前記第１部分に到達した前記薬物の量と、前記細胞塊に吸収される薬物の量とを用いて、前記第１部分の吸収能を算出することとを備える算出方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
細胞の塊を観察することが知られている。例えば、特許文献１もしくは特許文献２が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００２】
【特許文献１】ＵＳ２０１１１３３１５７９４Ａ
【特許文献２】ＵＳ２０１２１３３６４９２８Ａ
【発明の概要】
【０００３】
本実施形態の第１の態様に従えば、薬物を吸収する機能を有する第１部分と、第１部分とは異なる第２部分とを含む細胞塊に滴下される前記薬物のうち、第１部分に到達した薬物の量を推定する推定部と、推定部により推定された第１部分に到達した薬物の量と、細胞塊に吸収される薬物の量とを用いて、第１部分の吸収能を算出する算出部とを備える、算出装置が提供される。
【０００４】
本実施形態の第２の態様に従えば、薬物を吸収する機能を有する第１部分と、第１部分とは異なる第２部分とを含む細胞塊に滴下される薬物のうち、第１部分に到達した薬物の量を推定することと、推定された、第１部分に到達した薬物の量と、細胞塊に吸収される薬物の量とを用いて、第１部分の吸収能を算出することとを備える、算出方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】図１は、本実施形態にかかる算出装置１の概略図である。
【図２】図２は、ウェルプレートＷＰ内の小腸オルガノイド１２０を示す概略図である。
【図３】図３はオルガノイドの臓器構造部分における薬物の吸収量を算出する手順を示すフローチャートである。
【図４】図４は、第１部分１２１の表面における薬物Ｄの濃度を推定する手順を示すフローチャートである。
【図５】図５は、Ｈｅｓ１陽性細胞を利用することにより、小腸の腸管上皮を選択的に染色することができることを示す説明図である。
【図６】図６は、小腸オルガノイド１２０の第１部分１２１の、小腸の絨毛に相当する複数の突起１２１Ｖを示す概略図である。
【図７】図７は、第２部分１２２における薬物Ｄの浸透しやすさを説明するための説明図である。
【図８】図８は、検量線を取得するための計測装置２００の概略図である。
【図９】図９は、検量線の一例を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
以下の記載においては、ＸＹＺ直交座標系を設定し、このＸＹＺ直交座標系に基づいて位置関係を説明している。Ｚ軸方向は、例えば鉛直方向に設定され、Ｘ軸方向及びＹ軸方向は、例えば、水平方向に平行で互いに直交する方向に設定される。
【０００７】
本明細書において、複数の細胞が３次元的に凝集した細胞の凝集体を細胞の塊もしくは細胞塊と呼んでいる。細胞の塊の例とは、組織切片、細胞スフェロイド、オルガノイド等が挙げられる。また、本明細書において、臓器の特色の一部を備えている、小さくて単純化された細胞の集まりを、オルガノイドと呼んでいる。オルガノイドは、例えば、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞などの多能性幹細胞を原料として、細胞培養の条件を制御しつつ細胞を分化させることにより、３次元的に試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で作製することができる。例えば、小腸、脳、肝臓、膵臓、胃、肺、腎臓など、様々な臓器のオルガノイドを作製することができることが知られている。作製されるオルガノイドは作製状態を指標にして確認しても構わない。例えば、オルガノイド内に管腔構造を形成しているか否かを指標に用いても構わない。
【０００８】
同一の環境の下で同一の手法を用いてオルガノイドを作製したとしても、多様性幹細胞の分化効率がそれぞれ異なるため、同一のオルガノイドを作製することはできない。また多様性幹細胞を分化させる際に、目的の臓器を構成する細胞への分化効率が必ずしも１００％とはならない。そのため、作製されたオルガノイドには、目的の臓器を構成する細胞以外の細胞も含まれていることがある。また、作製されたオルガノイドは実際の臓器ほど機能的ではない。しかしながら、３次元培養により作製されたオルガノイドは、活性を長時間維持できるという利点があるとともに、薬物を投与した際に、臓器に近い反応を示すという利点がある。そのため、例えば、創薬開発などの分野において、実際の臓器の状態に近いオルガノイドを用いて、生体に対する安全性、吸収及び代謝の評価等を行いたいという要求がある。
【０００９】
作製されたオルガノイドは、目的の臓器を構成する臓器構造部分と、その他の構造部分とを含んでいる。その他の構造部分は、目的の臓器を構成する細胞以外の細胞や細胞外基質（ＥＣＭ）等によって構成されている。臓器構造部分は、その他の構造部分によって取り囲まれている。オルガノイドに薬物を投与した際に、投与した薬物の全てが臓器構造部分まで到達できるわけではなく、その他の構造部分が薬物の浸透等に与える影響を考慮する必要がある。
【００１０】
以下に示す実施形態においては、オルガノイドのその他の構造部分が薬物の浸透等に与える影響を考慮して、オルガノイドの臓器構造部分における薬物の吸収能を算出する薬物吸収能算出装置（以下、単に算出装置という）について説明する。
【００１１】
まず、図１を参照しつつ、本開示に係る算出装置１について説明する。算出装置１は、多光子励起顕微鏡１０と、制御部１１と、表示部１２と、入力部１３と、高速液体クロマトグラフＨＰＬＣとを主に備えている。
【００１２】
多光子励起顕微鏡１０は、照明部１００と、光学系１２０と、受光部１４０と、試料Ｓが置かれる可動ステージ１６０とを主に備えている。多光子励起顕微鏡１０は、２つ以上の光子を１つの蛍光分子にほぼ同時に衝突させて蛍光分子を励起させる多光子励起過程を利用した顕微鏡である。多光子励起過程を利用する場合には、１つの蛍光分子を１光子が励起させる１光子励起過程と比べて、励起波長を２倍以上に設定することができる。そのため、可視光レーザや紫外光レーザよりも波長が長く、生体組織の透過性に優れる近赤外光レーザを用いることができる。
【００１３】
また、多光子励起過程は、２つ以上の光子が１つの蛍光分子にほぼ同時に衝突したときに起こる事象であるので、多光子励起過程が起きるためには、光子が時間的、場所的に集中していなければならない。そのため、多光子励起顕微鏡の光源としては、後述のように、光子を時間的に集中させることができるパルスレーザが用いられる。さらに、多光子励起過程は、レーザ光の光子が局所的に集中する焦点位置近傍で発生する。そのため、多光子励起顕微鏡１０を用いることにより、必然的に、レーザ光の焦点位置近傍に位置する細胞から発せられる蛍光を観測することができる。
【００１４】
照明部１００は、パルスレーザ１０１を有している。パルスレーザ１０１は、いわゆるフェムト秒レーザであり、数十フェムト秒〜数百フェムト秒のパルス幅のレーザ光を発生させることができる。本実施形態ではチタンサファイアレーザが用いられている。パルスレーザ１０１は、赤外から近赤外領域（波長約７００ｎｍ〜約１３００ｎｍ）のレーザ光を発生させることができる。
【００１５】
図１に示されるように、光学系１２０は、ダイクロイックミラーＤＭと、ミラーＭと、２つのガルバノミラーＧＭ１、ＧＭ２と、４つのレンズＬ１〜Ｌ４と、対物レンズＯＢとを備える。また、対物レンズＯＢは、対物レンズＯＢをＺ軸方向に移動させる移動機構ＯＢ１を備えている。移動機構ＯＢ１が対物レンズＯＢをＺ軸方向に移動させることで、対物レンズＯＢの焦点位置をＺ方向に移動させることができる。
【００１６】
次にレーザ光の光路について説明する。パルスレーザ１０１から照射されたレーザ光は、レンズＬ１、Ｌ２に向かって直進する。レンズＬ１、Ｌ２はビームエクスパンダ―の役割を持っており、レンズＬ１に入射する光のビームの直径よりも大きい直径のビームをＬ２から出射することができる。レンズＬ１，Ｌ２を通ったレーザ光は、１対のガルバノミラーＧＭ１，ＧＭ２に入射する。ガルバノミラーＧＭ１，ＧＭ２は、往復瑶動可能な走査ミラーであり、２つのガルバノミラーＧＭ１，ＧＭ２を組み合わせることにより、レーザ光をＸ−Ｙ方向に走査できる。
【００１７】
２つのガルバノミラーＧＭ１、ＧＭ２を出たレーザ光は、レンズＬ３，Ｌ４を通った後、ミラーＭにより上方にむけて反射され、ダイクロイックミラーＤＭを透過して対物レンズＯＢに入射し、試料Ｓに照射される。ダイクロイックミラーＤＭは、パルスレーザ１０１からのレーザ光（波長約７００ｎｍ〜約１３００ｎｍ）を透過させ、パルスレーザ１０１からのレーザ光よりも波長の短い光（例えば、後述の多光子励起過程により発生する蛍光）を反射する特性を有する。試料Ｓにおいて、２つ以上の光子が１つの蛍光分子にほぼ同時に衝突して蛍光分子を励起させる多光子励起過程により、パルスレーザ１０１からのレーザ光の波長よりも短い波長の蛍光が放出される。多光子励起過程により発生した蛍光の一部は、光路を逆に進んで、ダイクロイックミラーＤＭにより反射されて、受光部１４０に入る。
【００１８】
受光部１４０は、光電子増倍管ＰＭＴを有し、試料Ｓに含まれる細胞から発せられる蛍光の強度を計測する。可動ステージ１６０は、図１のＸＹ平面に平行な上面１６１Ｕを有するステージ１６１と、ステージ１６１をＸ方向、Ｙ方向及びＺ方向に移動させる移動機構１６２とを備えている。ステージ１６１の上面１６１Ｕには、試料Ｓが入ったウェルプレートＷＰが配置される。ウェルプレートＷＰは、透明な板状の部材であり、その表面には複数のくぼみ（ウェルＷ）が２次元的に配置されている。それぞれのウェルＷは、試験管またはシャーレとして利用することができる。移動機構１６２は、制御部１１の制御のもとで、ステージ１６１のＸ方向の位置、Ｙ方向の位置、Ｚ方向の位置をそれぞれ調整することができる。これにより、ステージ１６１の上面１６１Ｕに置かれたウェルプレートＷＰの位置を調整することができ、ウェルプレートＷＰ内の所望のウェルＷに入れられた試料Ｓに対してレーザ光を照射することができる。
【００１９】
高速液体クロマトグラフＨＰＬＣは、高速液体クロマトグラフィを利用して、定性分析及び／又は定量分析を行う分析装置である。定性分析とは、試料の中にどのような成分が含まれているのかを分析することであり、定量分析とは、試料の中に含まれる各成分の量を分析することである。なお、高速液体クロマトグラフィとは、試料の液体の移動相をポンプなどによって加圧してカラムを通過させ、分析種を固定相及び移動相との相互作用（吸着、分配、イオン交換、サイズ排除など）の差を利用して高性能に分離して検出する方法である。高速液体クロマトグラフＨＰＬＣは、公知のものを利用することができる。例えば、特開平１０−１９８７１号、実開昭６０−１２３６６３号に記載されている。
【００２０】
制御部１１は、多光子励起顕微鏡１０の各部（照明部１００、光学系１２０、受光部１４０、可動ステージ１６０）及び高速液体クロマトグラフＨＰＬＣの動作を制御する。また、制御部１１は、入力部１３を通じて光学顕微鏡１０の各部及び高速液体クロマトグラフＨＰＬＣに対する設定及び指示を受け付ける。制御部１１は光学顕微鏡１０の各部及び高速液体クロマトグラフＨＰＬＣに対する設定及び指示を受け付けるための設定画面を表示部１２に表示させる。入力部１３は、各種指示情報を入力する不図示のマウス、キーボード、ジョイスティック、タッチパネルなどを有する。表示部１２は設定画面、指示画面、計測画面、計測結果などを表示する表示画面を有する。
【００２１】
制御部１１は、ガルバノミラーＧＭ１、ＧＭ２の駆動を制御することによってレーザ光の照射位置（焦点位置）をＸ−Ｙ方向に走査することができる。さらに、制御部１１は、光学系１２０の焦点深さを変えることによって、レーザ光の焦点位置のＺ方向の位置を調整することができる。このようにして、制御部１１は、レーザ光の焦点位置をＸ−Ｙ−Ｚ方向に走査させることができる。これにより、制御部１１は、レーザ光を各位置に照射したときに、受光部１４０で受光される蛍光の強度を用いて、蛍光の強度分布の３次元マッピングを取得することができ、取得された３次元マッピングの画像を表示部１２に表示させることができる。
【００２２】
なお、制御部１１は、専用のハードウェアにより形成されていてもよく、パーソナルコンピュータに所定のプログラムを実装することにより形成されていてもよい。制御部１１と多光子励起顕微鏡１０とは、必ずしも一体の装置として形成されていなくてもよい。例えば、制御部１１は、有線又は無線により多光子励起顕微鏡１０に通信可能に接続されたコンピュータであってもよい。
【００２３】
次に、算出装置１を用いて、オルガノイドの臓器構造部分における薬物の吸収量を算出する方法について図３を参照しつつ説明する。以下の説明においては、オルガノイドとして、小腸オルガノイドを例に挙げて説明する。小腸の腸管による吸収は細胞間隙を通るパラセルラールートと腸管上皮細胞の細胞膜を通して透過するトランスセルラールートがある。一般的に薬剤は難溶解性、脂溶性のためトランスセルラールートを介した単純拡散により吸収されるため、本実施形態では例えばこの吸収能を評価する。吸収能はこれに限られず、例えば、辻彰による、化学と生物、Ｖｏｌ．２０，  Ｎｏ．  １１、Ｐ７１７−７２６に記載された“薬剤の消化管吸収”に記載されている吸収能を評価しても構わない。また、吸収される薬物としては、例えばペニシリン等の抗生物質である。もちろん薬物はこれに限られない。なお、図２に示されるように、小腸オルガノイド１２０は、ウェルプレートＷＰ内の１つのウェルＷの内部に配置されている。なお、ウェルＷの内部は培養液１３０で満たされており、小腸オルガノイド１２０は、培養液１３０の中に配置されている。小腸オルガノイド１２０は、臓器構造部分である腸管領域に対応する第１部分１２１と、その他の構造部分に対応する第２部分１２２とを有している。第２部分１２２は、複数の細胞１２３と、細胞外基質１２４とを含んでいる。第１部分１２１と第２部分１２２とは、同じ多様性幹細胞から分化することにより形成されたものである。例えば、細胞１２３は、第１部分１２１を構成する細胞と、同じ多様性幹細胞から分化した細胞である。
【００２４】
図３に示されるように、小腸オルガノイド１２０が入っていないウェルＷに培養液１３０を入れ、さらに所定量の薬物Ｄを加える（Ｓ１０１）。以下の説明では、薬物Ｄを添加した培養液を培養液１３０Ｄと記載する。次に、培養液１３０Ｄの一部をサンプリングして、高速液体クロマトグラフＨＰＬＣを用いて薬物Ｄを添加した培養液１３０Ｄに含まれる薬物Ｄの濃度Ｃ１を測定する（Ｓ１０２）。次に、小腸オルガノイド１２０が入ったウェルＷの培養液１３０を、薬物Ｄを添加した培養液１３０Ｄと全量交換する（Ｓ１０３）。培養液１３０Ｄで満たされたウェルＷに、小腸オルガノイド１２０が入った状態で、一定時間静置する（Ｓ１０４）。その後、培養液１３０Ｄの一部をサンプリングして、高速液体クロマトグラフＨＰＬＣを用いて培養液１３０Ｄに含まれる薬物Ｄの濃度Ｃ２を測定する（Ｓ１０５）。
【００２５】
前述のように、薬物Ｄの濃度Ｃ１は、小腸オルガノイド１２０と接触する前の培養液１３０Ｄに含まれる薬物Ｄの濃度である。薬物Ｄの濃度Ｃ２は、小腸オルガノイド１２０と一定時間接触した後の、培養液１３０Ｄに含まれる薬物Ｄの濃度である。小腸オルガノイド１２０が薬物Ｄを吸収したことに起因して、濃度Ｃ１と濃度Ｃ２との間に濃度差が生じている。なお、小腸オルガノイド１２０のうち、その他の構造部分に対応する第２部分１２２においては、薬物Ｄはほぼ吸収されず、腸管領域に対応する第１部分１２１において薬物Ｄが吸収される。そのため、小腸オルガノイド１２０の薬物吸収能を精確に評価するためには、培養液１３０Ｄの薬物Ｄの濃度ではなく、小腸オルガノイド１２０の第１部分１２１の表面における薬物Ｄの濃度を考慮する必要がある。なぜならば、薬物Ｄを吸収する第１部分１２１は、その周囲を第２部分１２２に取り囲まれており、第２部分１２２の外側である培養液１３０の薬物Ｄの濃度と、第２部分１２２の内側である第１部分１２１の表面における薬物Ｄの濃度とは異なるからである。
【００２６】
そこで、算出装置１は、後述の手順に基づいて、第１部分１２１の表面における薬物Ｄの濃度を推定し（Ｓ１０６）、推定された第１部分１２１の表面における薬物Ｄの濃度の変化を用いて、小腸オルガノイド１２０の薬物Ｄの吸収能を算出する（Ｓ１０７）。
【００２７】
次に、上述のステップＳ１０６に関連して、第１部分１２１の表面における薬物Ｄの濃度を推定する手順について図４を参照しつつ説明する。まず、小腸オルガノイド１２０の第１部分１２１を多光子励起顕微鏡１０により観察して、小腸オルガノイド１２０の第１部分１２１を撮像する。制御部１１は、撮像された画像情報を用いて、第１部分１２１の形状、体積、表面積などを算出する（Ｓ２０１）。なお、制御装置１１は、画像情報から第１部分１２１の表面積を算出する。例えば、Ｚ位置の異なる複数の画像を用いた画像情報から、第１部分１２１の３次元形状を算出し、算出された第１部分１２１の形状から第１部分１２１の表面積を算出しても構わない。また、制御装置１１は、図６のような画像の第１部分１２１から第１部分１２１の近似形状を算出しても構わない。例えば、図６の画像の第１部分１２１の重心位置からの第１部分の輪郭までの距離を算出する。この場合に、重心位置から10度間隔で360度方向の第１部分１２１の輪郭までの距離を算出する。算出された、輪郭までの距離から平均距離を求め、平均距離を半径とする円と近似しても構わない。また、第１部分１２１の三次元形状を、平均距離を半径とする球体としても構わない。なお、重心位置から１０度間隔で輪郭までの距離を算出したが、算出する角度は１０度に限られない。また、制御装置１１は、画像情報から第１部分１２１の体積を算出する。上述のように第１部分１２１の３次元形状を算出し、算出された第１部分１２１の形状から第１部分１２１の体積を算出しても構わない。また、近似した形状を用いて算出され体積を、第１部分１２１の体積としても構わない。
【００２８】
なお、小腸オルガノイド１２０の第１部分１２１の撮像画像を用いて、制御部１１が第１部分１２１の形状、体積、表面積などを算出するためには、第１部分１２１と第２部分１２２との境界を明確にする必要がある。例えば、第１部分１２１の上皮細胞の自家蛍光を利用して第１部分１２１と第２部分１２２との境界を明確にすることができる。あるいは、腸管上皮マーカ発現細胞として公知である、Ｈｅｓ１陽性細胞を利用することができる。Ｈｅｓ１陽性細胞を利用することにより、小腸の腸管上皮を選択的に染色することができることが知られている（図５参照）。染色方法は、例えば、免疫蛍光染色方を利用する。これにより、第１部分１２１と第２部分１２２との境界を明確にすることができる。あるいは、その他の公知の腸管上皮マーカ発現細胞として、例えば佐藤俊朗による、生化学第８５巻第９号，ｐｐ．７４３―７４８，２０１に記載された“腸管上皮幹細胞”に記載されているＤｌｌ１，  Ｂｍｉ１，  Ｌｇｒ５を利用することもできる。
【００２９】
なお、図６に示されるように、小腸オルガノイド１２０の第１部分１２１は、小腸の絨毛に相当する複数の突起１２１Ｖを有している。小腸オルガノイドの第１部分１２１の大きさは例えば、１ｍｍよりも小さい。小腸オルガノイドの第１部分１２１の外周に例えば数十〜１００μｍの第２部分を有している。上述のように、第１部分１２１と第２部分１２２との境界を明確にすることにより、制御部１１は第１部分１２１の突起１２１Ｖの形状を判別することができる。制御部１１は、撮像された画像情報を用いて、各突起１２１Ｖの先端と小腸オルガノイド１２０の外周１２０Ｇとの間の距離Ｌを算出することができる。制御部１１は、算出された距離Ｌの平均を用いて、第１部分１２１を取り巻く第２部分１２２の厚さを算出することができる。図６において、第２部分１２２の厚さが距離Ｌの平均厚さで均一だと仮定して、第１部分１２１の周囲に第２部分１２２の厚さを算出しても構わない。また、図６において、外周１２０Ｇの外形を円などの所定の形状と近似しても構わない。複雑な突起１２Ｖを有している場合においても、画像情報から簡便な計算で第１部分１２１と外周１２０Ｇとの間の距離を算出することができる。
【００３０】
次に、多光子励起顕微鏡１０が第２部分１２２を観察することによって得られた撮像画像の画像情報を用いて、制御部１１が第２部分１２２に含まれる細胞１２３の密度を算出する（Ｓ２０２）。図７に示されるように、第２部分１２２は主に細胞１２３と細胞外基質１２４とを含んでいる。細胞外基質１２４は、細胞の外側に存在する基質（マトリクス）であり、コラーゲン、ヒアルロン酸、プロテオグリカン、フィブロネクチン、ラミニン等を含んでいる。培養液１３０Ｄに含まれる薬物Ｄは、細胞１２３の内部にはほとんど浸透せず、細胞外基質１２４を通って第１部分１２１に浸透する。そのため、細胞１２３は、第２部分１２２における薬物Ｄの浸透を阻害していると言える。つまり、第２部分１２２に含まれる細胞１２３の密度が高くなると、細胞外基質１２４の密度が低くなるため、第２部分１２２において薬物Ｄが浸透しづらくなる。逆に、第２部分１２２に含まれる細胞１２３の密度が低くなると、細胞外基質１２４の密度が高くなるため、第２部分１２２において薬物Ｄが浸透しやすくなる。本実施形態においては、例えば、第２部分１２２に含まれる細胞の１２３の密度は、数％〜６０％である。
【００３１】
細胞１２３又は細胞１２３の核を色素により染色して、多光子励起顕微鏡１０により撮像することにより、撮像画像の画像情報を用いて、制御部１１が第２部分１２２に含まれる細胞１２３の密度を算出することができる。あるいは、自家蛍光を利用して、細胞１２３の核を多光子励起顕微鏡１０により撮像することにより、撮像画像の画像情報を用いて、制御部１１が第２部分１２２に含まれる細胞１２３の密度を算出することができる。
【００３２】
次に、制御部１１は、培養液１３０Ｄに含まれる薬物Ｄの濃度Ｃ１、Ｃ２から、小腸オルガノイド１２０の第１部分１２１の表面における薬物Ｄの濃度Ｐ１、Ｐ２を算出する（Ｓ２０３）。このとき、制御部１１は、第２部分１２２に含まれる細胞１２３の密度と、第２部分１２２の厚さの平均を用いて、予め求めておいた検量線から、小腸オルガノイド１２０の第１部分１２１の表面における薬物Ｄの濃度Ｐ１、Ｐ２を算出する。これにより、培養液１３０Ｄに含まれる薬物Ｄの濃度が濃度Ｃ１であるときに、腸管領域に対応する第１部分１２１まで浸透する薬物Ｄの濃度Ｐ１と、培養液１３０Ｄに含まれる薬物Ｄの濃度が濃度Ｃ２であるときに、腸管領域に対応する第１部分１２１まで浸透する薬物Ｄの濃度Ｐ２とをそれぞれ推定することができる。そのため、これらの濃度Ｐ１，Ｐ２を用いて、小腸オルガノイド１２０の薬物吸収能を精確に評価することができる。
【００３３】
上記の検量線は、以下のような手順で取得することができる。図８は、検量線を取得するための計測装置２００の概略図である。計測装置２００は、第１容器２１１と、第２容器２１２と、第１容器２１１と第２容器２１２との境界部分にコラーゲン膜２２０を固定する固定部２３０と、高速液体クロマトグラフＨＰＬＣと、第１容器２１１及び第２容器２１２にそれぞれ設けられた攪拌機２４０とを備えている。第１容器２１１及び第２容器２１２は、いずれも液体を入れることができる容器である。第１容器２１１と第２容器２１２とは、コラーゲン膜２２０を介して互いに隣り合うように配置されている。高速液体クロマトグラフＨＰＬＣは、第１容器２１１及び第２容器２１２と連結されており、第１容器２１１及び第２容器２１２の内部の液体をサンプリングすることができる。
【００３４】
コラーゲン膜２２０は、第２部分１２２を模したものであり、コラーゲン膜２２０の内部には、複数の細胞１２３が所定の密度で分布している。所定の厚さのコラーゲン膜２２０を固定部２３０に固定した後、第１容器２１１に、所定の濃度の薬物Ｄを含む培養液１３０を入れ、第２容器２１２に、薬物Ｄを添加していない培養液１３０を入れる。第１容器２１１に入れられた培養液１３０に含まれる薬物Ｄはコラーゲン膜２２０を浸透して第２容器に移動することができる。攪拌機２４０で第１容器２１１及び第２容器２１２に入れられた培養液を攪拌しつつ、一定時間が経過した後、第１容器２１１内の培養液１３０に含まれる薬物Ｄの濃度と、第２容器２１２内の培養液１３０に含まれる薬物Ｄの濃度とを、高速液体クロマトグラフＨＰＬＣにより測定する。第１容器２１１に入れられる培養液１３０中の薬物Ｄの初期濃度を変更しつつ、同様の測定を行うことにより、上記コラーゲン膜２２０に対応した検量線を取得することができる。さらに、コラーゲン膜２２０の膜厚、及び、その中に含まれる細胞１２３の密度を調整した複数のコラーゲン膜２２０を用意して、各コラーゲン膜２２０に関して上記の測定を行うことにより、各コラーゲン膜２２０に対応した複数の検量線を取得することができる。これにより、上述のステップＳ２０２において、制御部１１は、第２部分１２２に含まれる細胞１２３の密度と、第２部分１２２の厚さの平均に基づいて、上記検量線を用いて、培養液１３０Ｄに含まれる薬物Ｄの濃度Ｃ１、Ｃ２から、小腸オルガノイド１２０の第１部分１２１の表面における薬物Ｄの濃度Ｐ１、Ｐ２を算出することができる。図９に、検量線の一例を示している。細胞外基質の密度（ｇ／ｃｍ３）と薬物の分子量（ＭＷ）と透過量（ｍｌ・ｍｉｎ）に基づいた、検量線を作成することができる。検量線の作成する手法は、例えば土生拓史・酒井清孝・金森敏幸・新保外志夫による、化学工学論文集  第２４巻  第２号（１９９８）に記載された“異なる製膜条件により得られたコラーゲンゲル膜の溶質透過性から推測される膜構造”に記載されている手法を用いることもできる。もちろん、これ以外の公知の手法を用いても構わない。
【００３５】
このように、算出装置１は小腸オルガノイド１２０の第１部分１２１の表面における薬物Ｄの濃度を算出することができるので、小腸オルガノイド１２０の薬物吸収能を精確に評価することができる。また、予め取得した検量線を用いて、培養液１３０Ｄに含まれる薬物Ｄの濃度Ｃ１、Ｃ２から、小腸オルガノイド１２０の第１部分１２１の表面における薬物Ｄの濃度Ｐ１、Ｐ２を算出しているので、測定を迅速に行うことができる。
【００３６】
また、上述のように、算出装置１は、第１部分１２１と第２部分１２２との境界を明確にすることにより、第１部分１２１の体積を算出することが可能となる。そのため、算出装置１は、第１部分１２１の単位体積当たりの薬物Ｄの吸収能を評価することができる。第１部分１２１の吸収能とは、単位体積あたり薬物Ｄが吸収される能力である。ここで吸収とは、薬物Ｄが第１部分１２１に取り込まれることをいう。吸収が、薬物Ｄが取り込まれる工程以外の公知の工程を含んでも構わない。例えば、薬物Ｄの分解工程を含んでも構わない。また、例えば、薬物Ｄの消化工程を含んでも構わない。また、第１部分１２１の吸収能を、薬物Ｄの分解能力としても構わない。また、第２部分１２２に吸収する能力があっても構わない。例えば、第２部分１２２が薬物Ｄを取り込み、第１部分１２１でも薬物Ｄを取り込んでも構わない。また、この場合に、第１部分１２１と第２部分１２２とで異なる機能があっても構わない。例えば、第１部分１２１のみに薬物Ｄを分解する工程を含んでも構わない。
【００３７】
また、上述の説明においては、制御部１１は、複数の突起１２１Ｖの先端と小腸オルガノイド１２０の外周１２０Ｇとの間の距離Ｌをそれぞれ算出し、算出された距離Ｌの平均を用いて、第１部分１２１を取り巻く第２部分１２２の厚さを算出していた。ここで、制御部１１は、算出された距離Ｌを用いて、第１部分１２１が小腸オルガノイド１２０内のどの位置に位置しているのかを推定することができる。そこで、第１部分１２１が小腸オルガノイド１２０内でいずれかの方向に片寄っている場合等には、複数の突起１２１Ｖの先端と小腸オルガノイド１２０の外周１２０Ｇとの間の距離Ｌの平均ではなく、複数の突起１２１Ｖの先端と小腸オルガノイド１２０の外周１２０Ｇとの間の距離Ｌの最小値を用いて、第２部分１２２の厚さを算出してもよい。
【００３８】
以上説明した実施形態は、あくまでも例示であって、請求の範囲に係る発明を限定するものではない。また、上記の実施形態の中で説明された特徴の組み合わせの全てが必須であるとは限らない。
【００３９】
上記説明においては、第２部分１２２を多光子励起顕微鏡１０により観察して、得られた画像情報を用いて、制御部１１が第２部分１２２に含まれる細胞１２３の密度を算出していた。しかしながら、本開示はそのような形態には限定されない。例えば、細胞１２３の密度ではなく、細胞外基質１２４のコラーゲンの含有量を計測し、それを用いて薬物Ｄの浸透しやすさを評価することもできる。上述のように、第２部分１２２に含まれる細胞外基質１２４の密度が低い場合には、第２部分１２２において薬物Ｄが浸透しづらくなる。つまり、細胞外基質１２４のコラーゲンの含有量が少ない場合には、第２部分１２２において薬物Ｄが浸透しづらくなる。逆に、第２部分１２２に含まれる細胞外基質１２４の密度が高い場合には、第２部分１２２において薬物Ｄが浸透しやすくなる。つまり、細胞外基質１２４のコラーゲンの含有量が多い場合には、第２部分１２２において薬物Ｄが浸透し易くなる。
【００４０】
細胞外基質１２４のコラーゲンの含有量を計測する手法として、例えば、細胞外基質１２４のコラーゲンの含有量を偏光顕微鏡で測定することが挙げられる。あるいは、細胞外基質１２４に含まれるコラーゲンを染色し、染色したコラーゲンを多光子励起顕微鏡等の光学顕微鏡で観察することによりコラーゲンの含有量を算出することができる。また、第２部分１２２の弾性率を計測し、測定された弾性率を用いてコラーゲンの含有量を測定することができる。
【００４１】
なお、上記の説明においては、細胞１２３の密度、及び、細胞外基質１２４のコラーゲンの含有量の少なくとも一方と、第２部分１２２の厚さとを用いて、第２部分１２２における薬物Ｄの浸透しやすさを評価していた。しかしながら、本開示はそのような形態には限られない。例えば、細胞１２３の密度、細胞外基質１２４のコラーゲンの含有量、及び第２部分１２２の厚さの少なくとも１つを用いて、第２部分１２２における薬物Ｄの浸透しやすさを評価してもよい。
【００４２】
上記実施形態においては、算出装置１は、培養液１３０Ｄに含まれる薬物Ｄの濃度の変化を測定することにより、第１部分１２１に吸収された薬物Ｄの吸収量を算出していた。しかしながら、本開示はそのような形態には限られない。例えば、薬物Ｄが自家蛍光を発する場合、又は、薬物Ｄに蛍光色素が添加されている場合には、多光子励起顕微鏡１０により、第１部分１２１に吸収された薬物Ｄから発せられる蛍光を検出することができる。この場合には、算出装置１（制御部１１）は、多光子励起顕微鏡１０で検出された蛍光の光量を用いて、第１部分１２１に吸収された薬物Ｄの量を算出することができる。
【００４３】
上記実施形態においては、算出装置１が多光子励起顕微鏡１０を含んでいたが、本開示はそのような形態には限定されない。例えば、多光子励起顕微鏡に代えて、コンフォーカル（共焦点）顕微鏡、ＯＣＴ（Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ  Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ：光干渉断層撮影）を用いることもできる。
【００４４】
上記実施形態においては、小腸オルガノイド１２０を例に挙げて説明したが、本開示にかかる算出装置１は、他の臓器のオルガノイドにも適用することができる。例えば、本開示にかかる算出装置１は、３次元培養された細胞の塊であって、薬物Ｄを吸収する機能を有する部分（第１部分）と、それ以外の機能を有する部分（第２部分）とを含む細胞の塊にも適用することができる。あるいは、本開示にかかる算出装置１は、薬物Ｄを吸収する機能を有する第１部分と、第１部分とは異なる第２部分とを含む細胞塊にも適用することができる。なお、第２部分は、第１部分と薬物Ｄに対する応答（吸収等の性質）が異なっていてもよく、第１部分と区別されるように異なる位置にあってもよい。
【００４５】
以上、添付図面を参照しながら、本発明に係る好適な実施形態や変形例について説明したが、本発明は係る例に限定されないことは言うまでもない。上述した例において示した各構成部材の諸形状や組み合わせ等は一例であって、本発明の主旨から逸脱しない範囲において設計要求等に基づき種々変更可能である。前述の実施形態の各構成要素は、適宜組み合わせることができる。また、一部の構成要素を用いない場合もある。また、法令が許容される限りにおいて、前述の各実施形態及び変形例などに関するすべての公開広報および米国特許の開示を援用して本文の記載の一部とする。前述した実施形態に基づいて当業者等によりなされる他の実施形態及び運用技術等は、すべて本実施形態の範囲に含まれる。
【符号の説明】
【００４６】
１      算出装置
１０    多光子励起顕微鏡
１１    制御部
１２    表示部
１３    入力部
１００  照明部
１２０  光学系
１４０  受光部
１６０  可動ステージ
【図１】
2020171203.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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