(57)【要約】      （修正有）【課題】フェーズ・アンビギュイティに由来する曖昧さを排除した高精度のＤＮＡタイピング方法及びキットを提供することを目的とする。【解決手段】本発明は、（１）ヒトゲノム塩基配列におけるＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ，ＨＬＡ−Ｃ，ＨＬＡ−ＤＱＡ１，ＨＬＡ−ＤＱＢ１，ＨＬＡ−ＤＰＡ１及びＨＬＡ−ＤＰＢ１の各遺伝子の上流領域及び下流領域に各々特異的にアニールするプライマーセットならびにＨＬＡ−ＤＲＢ１のエクソン２及び３’側の非翻訳領域に特異的にアニールするプライマーセットを準備するステップ；（２）前記プライマーセットを用いて被検試料（ＤＮＡ）をＰＣＲ増幅するステップ；（３）ＰＣＲ増幅された産物の塩基配列を決定するステップ；及び（４）任意に、データベースとのホモロジー検索を実施するステップを含むことを特徴とする、ＨＬＡのＤＮＡタイピング方法を提供する。【選択図】図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトゲノム塩基配列におけるＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＱＡ１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１、ＨＬＡ−ＤＰＡ１及びＨＬＡ−ＤＰＢ１の各遺伝子の上流領域及び下流領域に各々特異的にアニールするプライマーセット、ならびにＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のためのプライマーセットを含むプライマーセットであって、
前記ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のためのプライマーセットが、
（ａ）配列番号：９、１０又は３１の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーと、配列番号１１又は３２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーとを含む、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のＤＲ１型のためのプライマーセット；
（ｂ）配列番号：１２又は３１の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーと、配列番号１１又は３３の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーとを含む、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のＤＲ２型のためのプライマーセット；
（ｃ）配列番号：１３又は３４の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーと、配列番号１４又は３２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーとを含む、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のＤＲ３型のためのプライマーセット；
（ｄ）配列番号：１５又は３１の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーと、配列番号１６又は３２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーとを含む、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のＤＲ４型のためのプライマーセット；
（ｅ）配列番号：１３又は３１の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーと、配列番号１４、３５又は３６の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーとを含む、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のＤＲ５型のためのプライマーセット；
（ｆ）配列番号：１３又は３１の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーと、配列番号１４、３２又は３７の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーとを含む、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のＤＲ６型のためのプライマーセット；
（ｇ）配列番号：１７又は３８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーと、配列番号１８又は３６の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーとを含む、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のＤＲ７型のためのプライマーセット；
（ｈ）配列番号：１３又は３１の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーと、配列番号１４又は３９の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーとを含む、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のＤＲ８型のためのプライマーセット；
（ｉ）配列番号：１９又は３８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーと、配列番号２０又は３６の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーとを含む、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のＤＲ９型のためのプライマーセット；及び、
（ｊ）配列番号：２１又は３１の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーと、配列番号２２又は３２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーとを含む、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のＤＲ１０型のためのプライマーセット、を含むことを特徴とするプライマーセット。
【請求項２】
ＨＬＡ−Ａ遺伝子のためのプライマーセットが、配列番号：１又は２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーと、配列番号：３の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーとを含む、請求項１に記載のプライマーセット。
【請求項３】
ＨＬＡ−Ｂ遺伝子のためのプライマーセットが、配列番号：４の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーと、配列番号：５の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーとを含む、請求項１に記載のプライマーセット。
【請求項４】
ＨＬＡ−Ｃ遺伝子のためのプライマーセットが、配列番号：６又は７の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーと、配列番号：８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーとを含む、請求項１に記載のプライマーセット。
【請求項５】
ＨＬＡ−ＤＰＡ１遺伝子のためのプライマーセットが、配列番号：２３又は４０の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーと、配列番号２４又は４１の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーとを含む、請求項１に記載のプライマーセット。
【請求項６】
ＨＬＡ−ＤＰＢ１遺伝子のための前記プライマーセットが、配列番号：２５、４２又は４４の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーと、配列番号２６、４３又は４５の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーとを含む、請求項１に記載のプライマーセット。
【請求項７】
ＨＬＡ−ＤＱＡ１遺伝子のためのプライマーセットが、配列番号：２７又は４６の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーと、配列番号２８又は４７の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーとを含む、請求項１に記載のプライマーセット。
【請求項８】
ＨＬＡ−ＤＱＢ１遺伝子のためのプライマーセットが、配列番号：２９又は４８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーと、配列番号３０、４９又は５０の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーとを含む、請求項１に記載のプライマーセット。
【請求項９】
（１）請求項１から８のいずれか一項に記載のプライマーセットを用いて被検試料（ＤＮＡ）をＰＣＲ増幅するステップ；
（２）ＰＣＲ増幅された産物の塩基配列を決定するステップ；及び
（３）任意に、データベースとのホモロジー検索を実施するステップを含むことを特徴とする、ＨＬＡのＤＮＡタイピング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、大量並列シークエンサーを用いたＨＬＡ遺伝子のＤＮＡタイピングのための方法及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの主要組織適合遺伝子複合体（Ｍａｊｏｒ  Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  Ｃｏｍｐｌｅｘ；ＭＨＣ）であるヒト白血球抗原（Ｈｕｍａｎ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ；ＨＬＡ）は、病原体等の外来タンパク質由来ペプチド、および自己タンパク質由来ペプチドをＴ細胞に提示することにより免疫応答の誘導に深く関わっているが、主なものとして６種類の抗原が知られている。ほぼすべての細胞で発現しているクラスＩ分子（ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ）と、主として免疫系の細胞で発現しているクラスＩＩ分子（ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＨＬＡ−ＤＰ）である。
【０００３】
ＨＬＡクラスＩ抗原は高度な多型性を示すα鎖と多型性がほとんど無いβ２−ミクログロブリンからなり、ＨＬＡクラスＩＩ抗原は高度な多型が存在するβ鎖と多型性が少ないα鎖から成る。クラスＩ分子のα鎖はＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃの各遺伝子にコードされ、クラスＩＩ抗原のβ鎖はＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１、ＨＬＡ−ＤＰＢ１、α鎖はＨＬＡ−ＤＲＡ１、ＨＬＡ−ＤＱＡ１、ＨＬＡ−ＤＰＡ１遺伝子にコードされている。遺伝子レベルでは、ＨＬＡクラスＩ抗原ではα鎖をコードしている遺伝子のエクソン２とエクソン３が高度な多型性を示し、ＨＬＡクラスＩＩ抗原ではβ鎖をコードしている遺伝子のエクソン２が高度な多型性を示す。
【０００４】
ＨＬＡをコードしている遺伝子領域はヒト第６染色体短腕部６ｐ２１．３に位置し、テロメア側からセントロメア側に向けて、クラスＩ領域（ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−Ｂ等）、クラスＩＩＩ領域、クラスＩＩ領域（ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＱＡ１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１、ＨＬＡ−ＤＰＡ１、ＨＬＡ−ＤＰＢ１等）の順に並び、多くの遺伝子が非常に高い密度でコードされており、輸血や移植及び様々な疾患との関連性が報告されてきている。クラスＩＩＩ領域にはＨＬＡ遺伝子は存在せず、補体成分や腫瘍壊死因子（Ｔｕｍｏｒ  Ｎｅｃｒｏｓｉｓ  Ｆａｃｔｏｒ；ＴＮＦ）等の遺伝子が存在している。
【０００５】
ＨＬＡ−ＤＲ抗原のβ鎖をコードするＨＬＡ−ＤＲＢ遺伝子領域には５種類の構造多型が確認されている。ＤＲ１型やＤＲ１０型では、同一染色体上にＨＬＡ−ＤＲＢ１の他にＨＬＡ−ＤＲＢ６やＨＬＡ−ＤＲＢ９などの偽遺伝子が位置する。ＤＲ２型では、同一染色体上にＨＬＡ−ＤＲＢ１の他にＨＬＡ−ＤＲＢ５（ＤＲ５１）遺伝子やＨＬＡ−ＤＲＢ６やＨＬＡ−ＤＲＢ９などの偽遺伝子が位置する。ＤＲ３、ＤＲ５およびＤＲ６型では、ＨＬＡ−ＤＲＢ１の他に同一染色体上にＨＬＡ−ＤＲＢ３（ＤＲ５２）遺伝子やＨＬＡ-ＤＲＢ２やＨＬＡ−ＤＲＢ９などの偽遺伝子が位置する。ＤＲ４、ＤＲ７およびＤＲ９型では、ＨＬＡ−ＤＲＢ１の他に同一染色体上にＨＬＡ−ＤＲＢ４（ＤＲ５３）遺伝子やＨＬＡ-ＤＲＢ７、ＨＬＡ-ＤＲＢ８やＨＬＡ−ＤＲＢ９などの偽遺伝子が位置する。これらに対して、ＤＲ８型では、同一染色体上にＨＬＡ−ＤＲＢ１以外のＨＬＡ−ＤＲＢ遺伝子は位置しない。
【０００６】
各アリルのエクソンには多型性を示す複数の領域が存在し、ある多型領域の塩基配列（アミノ酸配列）が、複数のアリルに共通であることも多い。すなわち各ＨＬＡアリルは複数の多型領域の組み合わせにより規定される。ＨＬＡクラスＩ抗原ではエクソン内の多型領域のみならず、同一の塩基配列をもつエクソン２あるいはエクソン３が、複数のアリルに共通であることもある。
【０００７】
ＨＬＡには高度な多型が存在するため対立遺伝子（アリル）の種類が極めて多いことも知られ、それらの表記法も決められている。即ち、血清学的ＨＬＡ型を判別する第１区域（２桁レベル）、同一の血清学的ＨＬＡ型内でアミノ酸置換を伴うアリルを判別する第２区域（４桁レベル）、アミノ酸変異を伴わない塩基置換が認められるアリルを判別する第３区域（６桁レベル）、及びＨＬＡ分子をコードする遺伝子領域外（イントロン）での塩基置換を伴うアリルを判別する第４区域（８桁レベル）である。
【０００８】
骨髄移植の際には、移植希望者とドナーのＨＬＡタイプが４桁レベルで完全適合すれば移植の成功率が向上し、重度のＧＶＨＤ頻度が低下すると言われている。逆に、ＨＬＡ型が４桁レベルで不一致であると拒絶反応が起こる等の不具合を生じる危険性が高くなる。従って、ＨＬＡタイピングを正確かつ高精度に実施することが臨床的にも極めて重要である。
【０００９】
ＨＬＡ遺伝子におけるＤＮＡタイピング法として、ポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＰＣＲ）に基づくＳＢＴ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｂａｓｅｄ  Ｔｙｐｉｎｇ）法やＳＳＯ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）−Ｌｕｍｉｎｅｘ法が主流となっている。
これら従来のＤＮＡタイピング法は、多数のサンプルを迅速にタイピングできるという長所はあるが、多型領域やクラスＩ遺伝子の場合はエクソンの染色体上のシス・トランスの位置関係を正確に決めることができないこともあるため、フェーズ・アンビギュイティ（ｐｈａｓｅ  ａｍｂｉｇｕｉｔｙ）が生じ、高精度なＨＬＡタイピングが難しい場合があった。
また、従来の方法は、各遺伝子のエクソン領域を中心とするＰＣＲを用いたＤＮＡタイピング法であるため、イントロン領域やプロモーター領域における塩基置換を見逃してしまい、その結果、遺伝子構造は他の発現ＨＬＡ遺伝子と変わらないが、発現が抑制されるヌル（ｎｕｌｌ）アリルの検出を見逃す可能性があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開平１１−２１６０００号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｌｉｎｄ  Ｃ．等、Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第７１巻、１０３３−１０４２頁（２０１０年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、フェーズ・アンビギュイティに由来する曖昧さを排除した高精度のＤＮＡタイピング方法及びキットを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、クラスＩのＨＬＡ分子であるＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−ＣならびにクラスＩＩのＨＬＡ分子であるＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＱＡ１，ＨＬＡ−ＤＱＢ１，ＨＬＡ−ＤＰＡ１及びＨＬＡ−ＤＰＢ１について、それらのＨＬＡ遺伝子を特異的に増幅しうるＰＣＲプライマーを新たに設計し、好適なＰＣＲ条件を設定して、大量並列シークエンシング技術を駆使するという新しい着想に基づき、上記課題を解決すべく検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
【００１４】
即ち本発明は、以下のステップを含むＨＬＡのＤＮＡタイピング方法を提供する。
（１）ヒトゲノム塩基配列におけるＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ，ＨＬＡ−Ｃ，ＨＬＡ−ＤＱＡ１，ＨＬＡ−ＤＱＢ１，ＨＬＡ−ＤＰＡ１及びＨＬＡ−ＤＰＢ１の各遺伝子の上流領域及び下流領域に各々特異的にアニールするプライマーセットならびにＨＬＡ−ＤＲＢ１のエクソン２及び３’側の非翻訳領域に特異的にアニールするプライマーセットを準備するステップ；
（２）前記プライマーセットを用いて被検試料（ＤＮＡ）をＰＣＲ増幅するステップ；（３）ＰＣＲ増幅された産物の塩基配列を決定するステップ；及び
（４）データベースとのホモロジー検索を実施するステップ。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の方法は１分子からのＨＬＡ遺伝子のＤＮＡタイピングに必要な全塩基配列が得られるので、シス・トランスの位置関係が不明なフェーズ・アンビギュイティが排除された究極のＤＮＡタイピング法である。これにより、移植の際の移植希望者とドナー候補との間における高精度なＨＬＡの一致が実現される。
ＨＬＡ遺伝子のプロモーター領域、エクソン領域、イントロン領域など周辺領域を含む遺伝子全塩基配列が決定されるので、全く発現していない、あるいは発現が抑制されているｎｕｌｌアリルや新規アリルの検出が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】（ａ）ＨＬＡクラスＩ遺伝子構造と分子構造との関連性を示す図である。（ｂ）ＨＬＡクラスＩ遺伝子のプロモーター領域の構造を示す図である。猪子英俊、笹月健彦、十字猛夫  監修、「移植・輸血検査学」、講談社サイエンティフィック、２００４年、第３５頁から引用した。
【図２】（ａ）ＨＬＡクラスＩＩ遺伝子構造と分子構造との関連性を示す図である。（ｂ）ＨＬＡクラスＩＩ遺伝子のプロモーター領域の構造を示す図である。猪子英俊、笹月健彦、十字猛夫  監修、「移植・輸血検査学」、講談社サイエンティフィック、２００４年、第４６頁〜第４７頁から引用した。
【図３】ＨＬＡ−ＤＲ遺伝子領域を示す図である。猪子英俊、笹月健彦、十字猛夫  監修、「移植・輸血検査学」、講談社サイエンティフィック、２００４年、第４８頁から引用した。
【図４】実施例１で増幅したＰＣＲ産物の増幅状況を示すアガロースゲル電気泳動像を示す図である。
【図５】ＨＬＡ遺伝子の遺伝子構造とＰＣＲプライマーを設計した位置を示す模式図である（括弧内には、当該領域で設計したプライマーの配列番号を記した）。
【図６】実施例２で増幅したＨＬＡ遺伝子のＰＣＲ増幅状況を示すアガロースゲル電気泳動像を示す図である。
【図７】実施例３における３種類のＤＮＡ抽出法による各ＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動像を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明のＤＮＡタイピング方法をステップ毎に詳細に説明する。
（１）プライマーセット準備ステップ
本発明のＤＮＡタイピング方法においては、まず、ヒトゲノム塩基配列におけるＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ，ＨＬＡ−Ｃ，ＨＬＡ−ＤＱＡ１，ＨＬＡ−ＤＱＢ１，ＨＬＡ−ＤＰＡ１及びＨＬＡ−ＤＰＢ１の各遺伝子の上流領域及び下流領域に各々特異的にアニールするプライマーセットならびにＨＬＡ−ＤＲＢ１のエクソン２及び３’側の非翻訳領域に特異的にアニールするプライマーセットを準備する。
ＨＬＡ遺伝子が存在する領域を含むヒト第６染色体（６ｐ２１．３）のゲノム塩基配列は既に解明されており、その遺伝子構造及び発現産物（ＨＬＡ分子）の構造との関連も知られている（図１と図２参照）。
【００１８】
即ち、古典的ＨＬＡクラスＩ分子と言われるＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−Ｃの遺伝子は７個又は８個のエクソンを含んでおり（図１（ａ））、エクソン１の外側には２種類のエンハンサーやプロモーター領域があって発現が調節されている（図１（ｂ））。
さらに、エクソン２、３及び４において多型領域が多数存在することも知られているため、従来のＤＮＡタイピング方法では、特にエクソン２及び３に基づいて作成されたプライマーを用いたＰＣＲが行なわれ、それに伴って前述したようにフェーズ・アンビギュイティの問題が生じていた。
また、古典的ＨＬＡクラスＩＩ分子と言われるＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱ及びＨＬＡ−ＤＰはα鎖とβ鎖から構成され、それぞれの遺伝子は５個又は６個のエクソンを含んでおり（図２（ａ））、エクソン１の外側にはプロモーター領域があって発現が調節されている（図２（ｂ））。
さらに、エクソン２及び３において多型領域が多数存在することも知られているため、従来のＤＮＡタイピング方法では、特にエクソン２に基づいて作成されたプライマーを用いたＰＣＲが行なわれ、それに伴って前述したようにフェーズ・アンビギュイティの問題が生じていた。
【００１９】
本発明では、古典的クラスＩ分子（ＨＬＡ−Ａ，ＨＬＡ−Ｂ，ＨＬＡ−Ｃ）ならびに古典的クラスＩＩ分子のＨＬＡ−ＤＱＡ１，ＨＬＡ−ＤＱＢ１，ＨＬＡ−ＤＰＡ１及びＨＬＡ−ＤＰＢ１の遺伝子領域の全て（エクソンのみならず、イントロン、５’側と３’側の非翻訳領域、プロモーター領域も含む）、ＨＬＡ−ＤＲＢ１のエクソン２から３’側の非翻訳領域を含む遺伝子領域をＰＣＲ増幅できるプライマーセットを調製し、それを用いてＰＣＲ増幅したＰＣＲ産物を後述する次世代シークエンシングに供するので、フェーズ・アンビギュイティ等の不確実さを排除でき、ｎｕｌｌアリルの有無も正確に検知することができる。
【００２０】
具体的には、下記表１〜表４に掲げるＰＣＲプライマーセットを調製する。
表１における配列番号１〜３は、ＭＨＣクラスＩα鎖であるＨＬＡ−Ａ遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）において、ＨＬＡ−Ａ遺伝子の全領域（プロモーター、エクソン及びイントロンを含む）を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
【００２１】
配列番号１は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第２９，９０９，４８７番目から第２９，９０９，５１４番目に相当する塩基配列を持つ。
配列番号２は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第２９，９０９，４８７番目から第２９，９０９，５１４番目に相当する塩基配列を持つ。
配列番号３は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第２９，９１４，９２５番目から第２９，９１４，９５２番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物の予測される長さは約５，５００塩基（ｂｐ）である。
【００２２】
表１における配列番号４〜５は、ＭＨＣクラスＩα鎖であるＨＬＡ−Ｂ遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）において、ＨＬＡ−Ｂ遺伝子の全領域（プロモーター、エクソン及びイントロンを含む）を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
【００２３】
配列番号４は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３１，３２５，７９６番目から第３１，３２５，８２０番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
配列番号５は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３１，３２１，２１２番目から第３１，３２１，２３５番目に相当する塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物の予測される長さは約４，６００塩基（ｂｐ）である。
【００２４】
表１における配列番号６〜８は、ＭＨＣクラスＩα鎖であるＨＬＡ−Ｃ遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）において、ＨＬＡ−Ｃ遺伝子の全領域（プロモーター、エクソン及びイントロンを含む）を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
【００２５】
配列番号６は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３１，２４０，８６８番目から第３１，２４０，８９２番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
配列番号７は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３１，２４０，８６８番目から第３１，２４０，８９２番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
配列番号８は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３１，２３６，９９１番目から第３１，２３６，１１４番目に相当する塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物の予測される長さは約４，８００塩基（ｂｐ）である。
【００２６】
【表１】
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【００２７】
表２における配列番号９〜１１は、ＭＨＣクラスＩＩβ鎖であるＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のＨＬＡ−ＤＲ１サブタイプ遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）において、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のエクソン２から３’非翻訳領域を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
【００２８】
配列番号９は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３２，５５２，１３１番目から第３２，５５２，１５６番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
配列番号１０は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３２，５５２，１３１番目から第３２，５５２，１５６番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
配列番号１１は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３２，５４６，６０９番目から第３２，５４６，６２９番目に相当する塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物の予測される長さは約５，２００塩基（ｂｐ）である。
【００２９】
表２における配列番号３１、３２は、ＭＨＣクラスＩＩβ鎖であるＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のＨＬＡ−ＤＲ１、ＨＬＡ−ＤＲ４、ＨＬＡ−ＤＲ６（ＤＲ１３）、ＨＬＡ−ＤＲ１０サブタイプ遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）において、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子の５’非翻訳領域からエクソン２を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
【００３０】
配列番号３１は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３２，５５８，１１０番目から第３２，５５８，１３３番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
配列番号３２は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３２，５５１，９７４番目から第３２，５５１，９９９番目に相当する塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物の予測される長さはＨＬＡ−ＤＲ１サブタイプで約６，１００塩基（ｂｐ）、ＨＬＡ−ＤＲ４サブタイプで約９，１００塩基（ｂｐ）、ＨＬＡ−ＤＲ６（ＤＲ１３）サブタイプで約８，９００塩基（ｂｐ）、ＨＬＡ−ＤＲ１０サブタイプで約８，９００塩基（ｂｐ）である。
【００３１】
表２における配列番号１１と１２は、ＭＨＣクラスＩＩβ鎖であるＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のＨＬＡ−ＤＲ２サブタイプ遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）において、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のエクソン２から３’非翻訳領域を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
【００３２】
配列番号１１は上記の通りである。
配列番号１２は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３２，５５２，１３０番目から第３２，５５２，１５１番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物の予測される長さは約５，５００塩基（ｂｐ）である。
【００３３】
表３における配列番号３１と３３は、ＭＨＣクラスＩＩβ鎖であるＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のＨＬＡ−ＤＲ２（ＤＲ１５）サブタイプ遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）において、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子の５’非翻訳領域からエクソン２を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
【００３４】
配列番号３１は上記の通りである。
配列番号３３は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３２，５５１，９７４番目から第３２，５５１，９９９番目に相当する塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物の予測される長さは約６，１００塩基（ｂｐ）である。
【００３５】
表２における配列番号１３と１４は、ＭＨＣクラスＩＩβ鎖であるＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のＨＬＡ−ＤＲ３、ＨＬＡ−ＤＲ５、ＨＬＡ−ＤＲ６、ＨＬＡ−ＤＲ８サブタイプ遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）において、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のエクソン２から３’非翻訳領域を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
【００３６】
配列番号１３は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３２，５５２，１３７番目から第３２，５５２，１６０番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
配列番号１４は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３２，５４６，６０９番目から第３２，５４６，６２９番目に相当する塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物の予測される長さは約５，１００塩基（ｂｐ）である。
【００３７】
表２における配列番号３４と３２は、ＭＨＣクラスＩＩβ鎖であるＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のＨＬＡ−ＤＲ３サブタイプ遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）において、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子の５’非翻訳領域からエクソン２を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
【００３８】
配列番号３４は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３２，５５８，１１０番目から第３２，５５８，１３３番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
配列番号３２は上記の通りである。
これらのプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物の予測される長さは約８，９００塩基（ｂｐ）である。
【００３９】
表２における配列番号１５と１６は、ＭＨＣクラスＩＩβ鎖であるＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のＨＬＡ−ＤＲ４サブタイプ遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）において、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のエクソン２から３’非翻訳領域を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
【００４０】
配列番号１５は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３２，５５２，１３１番目から第３２，５５２，１５７番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
配列番号１６は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３２，５４６，６０９番目から第３２，５４６，６２９番目に相当する塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物の予測される長さは約６，２００塩基（ｂｐ）である。
【００４１】
表２における配列番号３１と３５は、ＭＨＣクラスＩＩβ鎖であるＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のＨＬＡ−ＤＲ５（ＤＲ１１）サブタイプ遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）において、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子の５’非翻訳領域からエクソン２を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
【００４２】
配列番号３１は上記の通りである。
配列番号３５は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３２，５５１，９７４番目から第３２，５５１，９９９番目に相当する塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物の予測される長さは約８，９００塩基（ｂｐ）である。
【００４３】
表２における配列番号３１と３６は、ＭＨＣクラスＩＩβ鎖であるＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のＨＬＡ−ＤＲ５（ＤＲ１２）サブタイプ遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）において、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子の５’非翻訳領域からエクソン２を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
【００４４】
配列番号３１は上記の通りである。
配列番号３６は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３２，５５１，９７４番目から第３２，５５１，９９９番目に相当する塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物の予測される長さは約８，９００塩基（ｂｐ）である。
【００４５】
【表２】
2020010698.tif 000004
【００４６】
表３における配列番号３１と３７は、ＭＨＣクラスＩＩβ鎖であるＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のＨＬＡ−ＤＲ６（ＤＲ１４）サブタイプ遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）において、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子の５’非翻訳領域からエクソン２を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
【００４７】
配列番号３１は上記の通りである。
配列番号３７は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３２，５５１，９７４番目から第３２，５５１，９９９番目に相当する塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物の予測される長さは約８，９００塩基（ｂｐ）である。
【００４８】
表３における配列番号１７と１８は、はＭＨＣクラスＩＩβ鎖であるＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のＨＬＡ−ＤＲ７サブタイプ遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）において、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のエクソン２から３’非翻訳領域を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
【００４９】
配列番号１７は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３２，５５２，１３７番目から第３２，５５２，１６０番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
配列番号１８は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３２，５４６，６０６番目から第３２，５４６，６２９番目に相当する塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物の予測される長さは約５，１００塩基（ｂｐ）である。
【００５０】
表３における配列番号３８と３６は、ＭＨＣクラスＩＩβ鎖であるＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のＨＬＡ−ＤＲ７、ＨＬＡ−ＤＲ９サブタイプ遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）において、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子の５’非翻訳領域からエクソン２を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
【００５１】
配列番号３８は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３２，５５８，１１０番目から第３２，５５８，１３３番目に相当する相補的な塩基配列を持つ。
配列番号３６は上記の通りである。
これらのプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物の予測される長さは約１１，４００塩基（ｂｐ）である。
【００５２】
表３における配列番号３１と３９は、ＭＨＣクラスＩＩβ鎖であるＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のＨＬＡ−ＤＲ８サブタイプ遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）において、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子の５’非翻訳領域からエクソン２を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
【００５３】
配列番号３１は上記の通りである。
配列番号３９は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３２，５５１，９７４番目から第３２，５５１，９９９番目に相当する塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物の予測される長さは約８，９００塩基（ｂｐ）である。
【００５４】
表３における配列番号１９と２０は、はＭＨＣクラスＩＩβ鎖であるＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のＨＬＡ−ＤＲ９サブタイプ遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）において、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のエクソン２から３’非翻訳領域を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
【００５５】
配列番号１９は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３２，５５２，１３７番目から第３２，５５２，１６０番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
配列番号２０は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３２，５４６，６０９番目から第３２，５４６，６２９番目に相当する塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物の予測される長さは約５，１００塩基（ｂｐ）である。
【００５６】
表３における配列番号２１と２２は、ＭＨＣクラスＩＩβ鎖であるＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のＨＬＡ−ＤＲ１０サブタイプ遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）において、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のエクソン２から３’非翻訳領域を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
【００５７】
配列番号２１は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３２，５５２，１３７番目から第３２，５５２，１５９番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
配列番号２２は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３２，５４６，４０３番目から第３２，５４６，４３５番目に相当する塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物の予測される長さは約５，４００塩基（ｂｐ）である。
【００５８】
【表３】
2020010698.tif 000005
【００５９】
表４における配列番号２３と２４は、はＭＨＣクラスＩＩα鎖であるＨＬＡ−ＤＰＡ１遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）において、ＨＬＡ−ＤＰＡ１遺伝子の全領域（プロモーター、エクソン及びイントロンを含む）を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
【００６０】
配列番号２３は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３３，０４１，４７８番目から第３３，０４１，５０２番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
配列番号２４は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３３，０３１，８８８番目から第３３，０３１，９１１番目に相当する塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物の予測される長さは約９，６００塩基（ｂｐ）である。
【００６１】
表４における配列番号４０と４１は、ＭＨＣクラスＩＩα鎖であるＨＬＡ−ＤＰＡ１遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）において、ＨＬＡ−ＤＰＡ１遺伝子の全領域（プロモーター、エクソン及びイントロンを含む）を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
【００６２】
配列番号４０は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３３，０４１，５７３番目から第３３，０４１，５９６番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
配列番号４１は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３３，０３１，８８８番目から第３３，０３１，９１２番目に相当する塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物の予測される長さは約９，６００塩基（ｂｐ）である。
【００６３】
表４における配列番号２５と２６は、ＭＨＣクラスＩＩβ鎖であるＨＬＡ−ＤＰＢ１遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）において、ＨＬＡ−ＤＰＢ１遺伝子の全領域（プロモーター、エクソン及びイントロンを含む）を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
【００６４】
配列番号２５は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３３，０４３，０５６番目から第３３，０４３，０７９番目に相当する塩基配列を持つ。
配列番号２６は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３３，０５５，４７６番目から第３３，０５５，４９９番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物の予測される長さは約１２，４００塩基（ｂｐ）である。
【００６５】
表４における配列番号４２と４３は、ＭＨＣクラスＩＩβ鎖であるＨＬＡ−ＤＰＢ１遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）において、ＨＬＡ−ＤＰＢ１遺伝子の５’非翻訳領域からエクソン２を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
【００６６】
配列番号４２は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３３，０４３，１６８番目から第３３，０４３，１９１番目に相当する塩基配列を持つ。
配列番号４３は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３３，０４９，０８４番目から第３３，０４９，１０７番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物の予測される長さは約５，９００塩基（ｂｐ）である。
【００６７】
表４における配列番号４４と４５は、ＭＨＣクラスＩＩβ鎖であるＨＬＡ−ＤＰＢ１遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）において、ＨＬＡ−ＤＰＢ１遺伝子のエクソン２から３’非翻訳領域を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
【００６８】
配列番号４４は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３３，０４８，１８２番目から第３３，０４８，２０７番目に相当する塩基配列を持つ。
配列番号４５は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３３，０５５，４２８番目から第３３，０５５，４５３番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物の予測される長さは約７，２００塩基（ｂｐ）である。
【００６９】
表４における配列番号２７と２８は、ＭＨＣクラスＩＩα鎖であるＨＬＡ−ＤＱＡ１遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）において、ＨＬＡ−ＤＱＡ１遺伝子の全領域（プロモーター、エクソン及びイントロンを含む）を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
【００７０】
配列番号２７は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３２，６０４，３１８番目から第３２，６０４，３３８番目に相当する塩基配列を持つ。
配列番号２８は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３２，６１１，６８１番目から第３２，６１１，７０１番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物の予測される長さは約７，４００塩基（ｂｐ）である。
【００７１】
表４における配列番号４６と４７は、ＭＨＣクラスＩＩα鎖であるＨＬＡ−ＤＱＡ１遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）において、ＨＬＡ−ＤＱＡ１遺伝子の全領域（プロモーター、エクソン及びイントロンを含む）を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
【００７２】
配列番号４６は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３２，６０４，４６９番目から第３２，６０４，４８８番目に相当する塩基配列を持つ。
配列番号４７は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３２，６１１，９３６番目から第３２，６１１，９５６番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物の予測される長さは約７，４００塩基（ｂｐ）である。
【００７３】
表４における配列番号２９と３０は、ＭＨＣクラスＩＩβ鎖であるＨＬＡ−ＤＱＢ１遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）において、ＨＬＡ−ＤＱＢ１遺伝子の全領域（プロモーター、エクソン及びイントロンを含む）を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
【００７４】
配列番号２９は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３２，６２６，５４５番目から第３２，６２６，５６８番目に相当する塩基配列を持つ。
配列番号３０は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３２，６３５，６１２番目から第３２，６３５，６３７番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物の予測される長さは約９，１００塩基（ｂｐ）である。
【００７５】
表４における配列番号２９、３０、４８〜５０は、ＭＨＣクラスＩＩβ鎖であるＨＬＡ−ＤＱＢ１遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）において、ＨＬＡ−ＤＱＢ１遺伝子の全領域（プロモーター、エクソン及びイントロンを含む）を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
【００７６】
配列番号２９と４８は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３２，６２６，５４５番目から第３２，６２６，５６８番目に相当する塩基配列を持つ。
配列番号３０、４９、５０は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３２，６３５，６１２番目から第３２，６３５，６３７番目に相当する相補的な塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物の予測される長さは約９，１００塩基（ｂｐ）である。
【００７７】
【表４】
2020010698.tif 000006
【００７８】
これらのプライマーは、当該分野で通常用いられている手法により調製することができる。また、表１及び表２に記載したプライマーセットは最も好ましい例を示したものであり、本発明の方法においては、ＨＬＡの各遺伝子全領域を上流側及び下流側から挟み込む位置にアニール可能なフォワード（Ｆｏｒｗａｒｄ）プライマーとリバース（Ｒｅｖｅｒｓｅ）プライマーとのセットであれば同様に使用することができる。
【００７９】
（２）ＰＣＲ増幅ステップ
本発明の方法では、前記ステップ（１）で準備したプライマーセットを用い、被検試料（ＤＮＡ）をＰＣＲ増幅する。
ＰＣＲ増幅反応は、通常のプロトコールに従って実施される。具体的には次の通りである。
１．被検試料の形態に応じて、当該試料からＤＮＡを抽出する。
２．抽出したＤＮＡを定量し、適宜プライマー濃度を設定して反応液を調製する。
３．反応条件を設定してＰＣＲ反応を実施する。
例：熱変性ステップ（通常は９２〜９７℃）
アニーリングステップ（通常は５５〜７２℃）
伸長ステップ（通常は６５〜８０℃）
本発明の方法では、ＨＬＡ−ＤＲＢ１を除くＨＬＡ遺伝子の場合、前記アニーリングステップの温度を約６０℃とするのが好ましい。約６０℃でアニーリングさせることにより、対立遺伝子を等比率で（均一に）生成させることができる。また、ＨＬＡ−ＤＲＢ１では前記アニーリングステップの温度を約７０℃とするのが好ましい。約７０℃でアニーリングさせることにより、目的のＤＲサブタイプのみを特異的に生成させることができる。
４．得られたＰＣＲ産物を精製し、次の塩基配列決定ステップに供する。
【００８０】
（３）塩基配列決定ステップ。
次に、前記ステップ（２）で生成されたＰＣＲ産物（増幅ＤＮＡ）の塩基配列を決定する。このステップは、いわゆる次世代シークエンス（あるいは超高速シークエンス）と呼ばれている手法を用いて実施するのが好ましい。次世代シークエンスに関しては、例えば、「実験医学」第２７巻、第１号、２００９年（羊土社）等を参照されたい。
【００８１】
本明細書では、ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）のゲノムシークエンサーＦＬＸシステムで採用されているパイロシークエンスに基づいて配列決定する方法を以下に記載する。
１．前記ステップ（２）で得られたＰＣＲ産物をネブライザーにより約５００塩基ほどに断片化する。
２．その断片化されたＤＮＡ断片の末端にＤＮＡアダプターを付加する。
３．ＤＮＡアダプターを付加したＤＮＡ断片を一本鎖ＤＮＡ断片にした後、アダプターを介してビーズに結合させる、得られたビーズを油中水型エマルジョンに包み込む（１ビーズに１つのＤＮＡ断片が結合したマイクロリアクター環境が形成される）。
【００８２】
４．エマルジョンＰＣＲ反応を実施し、各ビーズ上に各ＤＮＡ断片のコピーを形成させる（各ＤＮＡ断片は各々のマイクロリアクター内でクローナルに増幅されるので、他の配列との競合もなく、多数の断片の増幅が同時に並列的に実施できる）。ついで、エマルジョンを破壊して増幅されたＤＮＡ断片を有するビーズを回収する。
５．ビーズを濃縮し、ピコタイタープレートにローディングする（１ウェルに１個のビーズが入るサイズである）。
６．各々のビーズについて、ポリメラーゼが酵素反応するときに生じるピロリン酸を、ルシフェラーゼによる蛍光反応で検出し、発光の強度とパターンからＤＮＡの塩基配列を決定する。４種類の核酸（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ）を一定の順序で加える、添加した核酸に応じた化学発光パターンを記録し、そのシグナル強度と位置情報との組み合わせにより塩基配列を決定する。
【００８３】
（４）ＤＮＡタイピングステップ
次いで、前記ステップ（３）で得られた塩基配列を、既知のＨＬＡ対立遺伝子の塩基配列データベースのデータと比較することにより、被検試料に含まれていたＤＮＡのアリル型（８桁まで）が決定される。
【００８４】
本発明の方法は、前記表１に記載したプライマーセットを代表例とする。ＨＬＡクラスＩやＨＬＡ−ＤＲＢ１を除くＨＬＡクラスＩＩの各遺伝子全領域、ならびにＨＬＡ−ＤＲＢ１のエクソン２から3’非翻訳領域を挟み込む位置にプライマーを設定し、ほぼ全領域に渡って増幅したＤＮＡの配列決定をすることに特徴を有し、それによってフェーズ・アンビギュイティ（不確実さ）を排除し、ｎｕｌｌアリルに関する情報を得ることもできる。
【実施例】
【００８５】
以下に具体例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定
されるものではない。
【００８６】
（実施例１）
［実験方法］
１．既に抽出されているゲノムＤＮＡを鋳型として、各ＨＬＡクラスＩ遺伝子特異的プライマーセット（表１参照：配列番号１〜８）を用いてＰＣＲ反応を行った。具体的な手順は次の通りである。
（１）ＰＣＲ増幅はＰｒｉｍｅ  ＳＴＡＲ  ＧＸＬポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ）を用いた。すなわち、５０  ｎｇのゲノムＤＮＡ溶液に、４  μＬの５ｘＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＧＸＬ緩衝液、１．６  μＬのｄＮＴＰ溶液、４μＬ（１ｐｍｏｌ／μＬ）ずつのＰＣＲプライマー、０．８μＬのＰｒｉｍｅ  ＳＴＡＲ  ＧＸＬポリメラーゼを加え、反応液の全量を滅菌水にて２０μＬに調整した。
（２）これを９４度で２分間の保温後、続いて９８度で１０秒間、６０度で２０秒間、６８度で５分間の３ステップを１工程として、これを３０回繰り返した。なお、このＰＣＲ増幅にはＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた。ＰＣＲ後に、アガロースゲル電気泳動によりＰＣＲ産物の増幅状況を確認した。その泳動像を図４に示した。
【００８７】
２．ＰＣＲ産物の塩基配列を決定した。具体的には次の通り行った。
（１）ＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）の標準プロトコールにしたがって精製した。
（２）ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ  ｄｓＤＮＡ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の標準プロトコールにしたがって濃度を測定した。
（３）精製したＰＣＲ産物を５００ｎｇ／１００μＬの濃度に調整し、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（ＧＳ）Ｊｕｎｉｏｒ（Ｒｏｃｈｅ）の標準プロトコールにしたがって、ｒａｐｉｄライブラリーの作製、エマルジョンＰＣＲ、シークエンシングをおこない、１サンプルあたり１万リードの塩基配列を得た。
（４）それら配列をＧＳ  ｄｅ  ｎｏｖｏ  Ａｓｓｅｍｂｌｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）にて結合・編集させ、その後ＤＮＡデータベース上の既知塩基配列とのホモロジー検索により、ＨＬＡ遺伝子のアリルを同定した。
【００８８】
［考察］
ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−Ｃにおいて、それぞれ５．５ｋｂ、４．６ｋｂおよび４．８ｋｂを特異的に増幅するＰＣＲプライマーを設計した。ＰＣＲ条件の検討ならびにそれらＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動から、各ＨＬＡクラスＩ遺伝子におけるＰＣＲ産物ともに、目的の分子量の位置に単一の増幅産物が得られた（図４）。またＰＣＲ産物の塩基配列をサンガー法により決定した結果、既報と矛盾しないＨＬＡアリルが得られたことから、本ＰＣＲ系はＨＬＡタイピングに使用しうることが確認された。
【００８９】
ＨＬＡ−Ｂ＊４０：０２ホモ接合３検体ならびに従来のＤＮＡタイピング法にてフェーズ・アンビギュイティの見られるアリルの組み合わせ（Ｂ＊４０とＢ＊５５）を含むＨＬＡ−Ｂ＊４０：０２ヘテロ接合１７検体を用いてＨＬＡ−Ｂ遺伝子由来のＰＣＲ産物をＧＳ  ＪｕｎｉｏｒによりＨＬＡタイピングをおこなった結果、全ての検体からＨＬＡ−Ｂ＊４０：０２：０１：０１を検出し、ヘテロ接合１７検体では１５種類の既知アリルに加え、２種類の新規アリルを検出した。特に、フェーズ・アンビギュイティの見られるアリルの組み合わせ（Ｂ＊４０とＢ＊５５）の１検体については、ＨＬＡ−Ｂ＊４０：０２：０１：０１とＨＬＡ−Ｂ＊５５：０２：０１：０１にタイピングすることができた。よって本法は、フェーズ・アンビギュイティのない８桁レベルのＨＬＡタイピングを可能とするとともに、ｎｕｌｌアリルの原因となるプロモーターやイントロン内の塩基置換や挿入・欠失を効率よく検出するための優れたツールである。
【００９０】
（実施例２）
［実験方法］
１．既に抽出されているゲノムＤＮＡを鋳型として、ＨＬＡクラスＩ及びＨＬＡクラスＩＩの各遺伝子特異的プライマーセット（表１〜４参照：配列番号１〜８、９〜２２、３１〜５０）を用いてＰＣＲ反応を行った。具体的な手順は次の通りである。
（１）ＰＣＲ増幅はＰｒｉｍｅ  ＳＴＡＲ  ＧＸＬポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ）を用いた。すなわち、５０  ｎｇのゲノムＤＮＡ溶液に、４  μＬの５ｘＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＧＸＬ緩衝液、１．６  μＬのｄＮＴＰ溶液、１から７  μＬ（４  ｐｍｏｌ／μＬ）のＰＣＲプライマー、０．８  μＬのＰｒｉｍｅ  ＳＴＡＲ  ＧＸＬポリメラーゼを加え、反応液の全量を滅菌水にて２０  μＬに調整した。
（２）これを９４度で２分間の保温後、続いて９８度で１０秒間、７０度で５分間の２ステップを１工程として、これを３０回繰り返した。なお、このＰＣＲ増幅にはＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた。ＰＣＲ後に、アガロースゲル電気泳動によりＰＣＲ産物の増幅状況を確認した。その泳動像を図６に示した。
【００９１】
２．ＰＣＲ産物の塩基配列を決定した。具体的には次の通り行った。
（１）ＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）の標準プロトコールにしたがって精製した。
（２）ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ  ｄｓＤＮＡ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の標準プロトコールにしたがって濃度を測定した。
（３）精製したＰＣＲ産物を１００  ｎｇの濃度に調整し、Ｉｏｎ  Ｐｅｒｓｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｍａｃｈｉｎｅ（Ｉｏｎ  ＰＧＭ）（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の標準プロトコールにしたがって、フラグメントライブラリーの作製、エマルジョンＰＣＲ、シークエンシングをおこない、１サンプルあたり３０万リードの塩基配列を得た。
（４）それら配列をＧＳ  Ｄｅ  Ｎｏｖｏ  Ａｓｓｅｍｂｌｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）にて結合・編集させ、その後ＤＮＡデータベース上の既知塩基配列とのホモロジー検索により、ＨＬＡ遺伝子のアリルを同定した。
【００９２】
［結果及び考察］
１．ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１の５’非翻訳領域からエクソン２、ＨＬＡ−ＤＲＢ１のエクソン２から３’非翻訳領域、ＨＬＡ−ＤＱＢ１、ＨＬＡ−ＤＰＢ１の５’非翻訳領域からエクソン２及びＨＬＡ−ＤＰＢ１のエクソン２から３’非翻訳領域において、それぞれ４ｋｂから１２ｋｂを特異的に増幅するＰＣＲプライマーを設計した。ＰＣＲ条件の検討ならびにそれらＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動から、ＨＬＡクラスＩ及びＨＬＡクラスＩＩの各遺伝子におけるＰＣＲ産物ともに、目的の分子量の位置に単一の増幅産物が得られた（図６）。またＰＣＲ産物の塩基配列をサンガー法により決定した結果、既報と矛盾しないＨＬＡアリルが得られたことから、本ＰＣＲ系はＨＬＡタイピングに使用しうることが改めて確認された。
【００９３】
２．従来のＤＮＡタイピング法にてフェーズ・アンビギュイティの見られるアリルの組み合わせを含む４検体を用いてＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１の５’非翻訳領域からエクソン２、ＨＬＡ−ＤＲＢ１のエクソン２から３’非翻訳領域、ＨＬＡ−ＤＱＢ１、ＨＬＡ−ＤＰＢ１の５’非翻訳領域からエクソン２及びＨＬＡ−ＤＰＢ１のエクソン２から３’非翻訳領域の各遺伝子由来のＰＣＲ産物をＩｏｎ  ＰＧＭによりＨＬＡタイピングをおこなった。その結果、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１については、遺伝子領域全体のタイピングが可能であった。ＨＬＡ−ＤＰＢ１については、エクソン部分のみのタイピングが可能であった。さらに、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１の各遺伝子では、新規アリルを検出した。よって本法は、フェーズ・アンビギュイティのない８桁レベルのＨＬＡタイピングを可能とするとともに、ｎｕｌｌアリルの原因となるプロモーターやイントロン内の塩基置換や挿入・欠失を効率よく検出するための優れたツールである。
【００９４】
（実施例３）
［実験方法］
１．Ｂｕｃｃａｌ  Ｃｅｌｌ  ＤＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，ＢｕｃｃａｌＱｕｉｃｋ（ＴＲＩＭＧＥＮ）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。
２．Ｂｕｃｃａｌ  Ｃｅｌｌ  ＤＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，ＢｕｃｃａｌＱｕｉｃｋ（ＴＲＩＭＧＥＮ）を用いて抽出したゲノムＤＮＡをさらにイソプロパノールならびにエタノールにて精製した。
３．ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（キアゲン）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。
４．項目１〜３にて抽出したゲノムＤＮＡそれぞれ３検体を用いて、実施例１及び実施例２と同様の実験方法によりＨＬＡ−Ａ，ＨＬＡ−Ｂ，ＨＬＡ−Ｃ，ＨＬＡ−ＤＱＢ１特異的プライマーセット（表１及び表４参照：配列番号１〜８、２９、３０、４８〜５０）を用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ後に、アガロースゲル電気泳動によりＰＣＲ産物の増幅状況を確認した。その泳動像を図７に示した。
【００９５】
［実験結果と考察］
図７のレーン１〜３は実験方法１にて抽出した場合、レーン４〜６は実験方法２にて抽出した場合、レーン７〜９は実験方法３にて抽出した場合のＰＣＲ産物の増幅状況を示す。実験方法１にて抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として用いたＰＣＲ増幅はいずれの遺伝子とも実験方法３にて抽出したものと遜色なく目的のＰＣＲ産物が得られた。実験方法３では採血を伴うが、実験方法１では口腔粘膜から細胞を採取できることから、本発明の方法を用いれば、採血が不可能な場合でもＨＬＡタイピングが十分に可能であることが証明された。
【００９６】
本発明は、以下の態様を包含する。
（第１項）
（１）ヒトゲノム塩基配列におけるＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ，ＨＬＡ−Ｃ，ＨＬＡ−ＤＱＡ１，ＨＬＡ−ＤＱＢ１，ＨＬＡ−ＤＰＡ１及びＨＬＡ−ＤＰＢ１の各遺伝子の上流領域及び下流領域に各々特異的にアニールするプライマーセットならびにＨＬＡ−ＤＲＢ１のエクソン２及び３’側の非翻訳領域に特異的にアニールするプライマーセットを準備するステップ；
（２）前記プライマーセットを用いて被検試料（ＤＮＡ）をＰＣＲ増幅するステップ；
（３）ＰＣＲ増幅された産物の塩基配列を決定するステップ；及び
（４）任意に、データベースとのホモロジー検索を実施するステップを含むことを特徴とする、ＨＬＡのＤＮＡタイピング方法。
(第２項）
前記遺伝子がＨＬＡ−Ａ遺伝子であり、前記プライマーセットが配列番号：１、２及び３の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択される、第１項に記載の方法。
(第３項）
前記遺伝子がＨＬＡ−Ｂ遺伝子であり、前記プライマーセットが配列番号：４及び５の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである、第１項に記載の方法。
(第４項）
前記遺伝子がＨＬＡ−Ｃ遺伝子であり、前記プライマーセットが配列番号：６、７及び８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択される、第１項に記載の方法。
(第５項）
前記遺伝子がＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のＤＲ１型であり、前記プライマーセットが配列番号：９、１０、１１、３１及び３２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択される、第１項に記載の方法。
(第６項）
前記遺伝子がＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のＤＲ２型であり、前記プライマーセットが配列番号：１１、１２、３１及び３３の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択される、第１項に記載の方法。
(第７項）
前記遺伝子がＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のＤＲ３型であり、前記プライマーセットが配列番号：１３、１４、３２及び３４の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択される、第１項に記載の方法。
(第８項）
前記遺伝子がＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のＤＲ４型であり、前記プライマーセットが配列番号：１５、１６、３１及び３２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択される、第１項に記載の方法。
(第９項）
前記遺伝子がＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のＤＲ５型であり、前記プライマーセットが配列番号：１３、１４、３１、３５及び３６の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択される、第１項に記載の方法。
(第１０項）
前記遺伝子がＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のＤＲ６型であり、前記プライマーセットが配列番号：１３、１４、３１、３２及び３７の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択される、第１項に記載の方法。
(第１１項）
前記遺伝子がＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のＤＲ７型であり、前記プライマーセットが配列番号：１７、１８、３６及び３８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択される、第１項に記載の方法。
(第１２項）
前記遺伝子がＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のＤＲ８型であり、前記プライマーセットが配列番号：１３、１４、３１及び３９の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択される、第１項に記載の方法。
(第１３項）
前記遺伝子がＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のＤＲ９型であり、前記プライマーセットが配列番号：１９、２０、３６及び３８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択される、第１項に記載の方法。
(第１４項）
前記遺伝子がＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のＤＲ１０型であり、前記プライマーセットが配列番号：２１、２２、３１及び３２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択される、第１項に記載の方法。
(第１５項）
前記遺伝子がＨＬＡ−ＤＰＡ１遺伝子であり、前記プライマーセットが配列番号：２３、２４、４０及び４１の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択される、第１項に記載の方法。
(第１６項）
前記遺伝子がＨＬＡ−ＤＰＢ１遺伝子であり、前記プライマーセットが配列番号：２５、２６、４２、４３、４４及び４５の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択される、第１項に記載の方法。
(第１７項）
前記遺伝子がＨＬＡ−ＤＱＡ１遺伝子であり、前記プライマーセットが配列番号：２７、２８、４６及び４７の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択される、第１項に記載の方法。
(第１８項）
前記遺伝子がＨＬＡ−ＤＱＢ１遺伝子であり、前記プライマーセットが配列番号：２９、３０、４８、４９及び５０の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択される、第１項に記載の方法。
(第１９項）
配列番号：１、２及び３の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択されるフォワードプライマー及びリバースプライマーを含む、ＨＬＡ−Ａ遺伝子のＤＮＡタイピング用プライマーセット。
(第２０項）
配列番号：４及び５の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択されるフォワードプライマー及びリバースプライマーを含む、ＨＬＡ−Ｂ遺伝子のＤＮＡタイピング用プライマーセット。
(第２１項）
配列番号：６、７及び８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択されるフォワードプライマー及びリバースプライマーを含む、ＨＬＡ−Ｃ遺伝子のＤＮＡタイピング用プライマーセット。
(第２２項）
配列番号：９、１０、１１、３１及び３２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択されるフォワードプライマー及びリバースプライマーを含む、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のＤＲ１型のＤＮＡタイピング用プライマーセット。
(第２３項）
配列番号：１１、１２、３１及び３３の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択されるフォワードプライマー及びリバースプライマーを含む、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のＤＲ２型のＤＮＡタイピング用プライマーセット。
(第２４項）
配列番号：１３、１４、３２及び３４の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択されるフォワードプライマー及びリバースプライマーを含む、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のＤＲ３型のＤＮＡタイピング用プライマーセット。
(第２５項）
配列番号：１５、１６、３１及び３２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択されるフォワードプライマー及びリバースプライマーを含む、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のＤＲ４型のＤＮＡタイピング用プライマーセット。
(第２６項）
配列番号：１３、１４、３１、３５及び３６の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択されるフォワードプライマー及びリバースプライマーを含む、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のＤＲ５型のＤＮＡタイピング用プライマーセット。
(第２７項）
配列番号：１３、１４、３１、３２及び３７の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択されるフォワードプライマー及びリバースプライマーを含む、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のＤＲ６型のＤＮＡタイピング用プライマーセット。
(第２８項）
配列番号：１７、１８、３６及び３８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択されるフォワードプライマー及びリバースプライマーを含む、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のＤＲ７型のＤＮＡタイピング用プライマーセット。
(第２９項）
配列番号：１３、１４、３１及び３９の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択されるフォワードプライマー及びリバースプライマーを含む、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のＤＲ８型のＤＮＡタイピング用プライマーセット。
(第３０項）
配列番号：１９、２０、３６及び３８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択されるフォワードプライマー及びリバースプライマーを含む、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のＤＲ９型のＤＮＡタイピング用プライマーセット。
(第３１項）
配列番号：２１、２２、３１及び３２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択されるフォワードプライマー及びリバースプライマーを含む、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のＤＲ１０型のＤＮＡタイピング用プライマーセット。
(第３２項）
配列番号：２３、２４、４０及び４１の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択されるフォワードプライマー及びリバースプライマーを含む、ＨＬＡ−ＤＰＡ１遺伝子のＤＮＡタイピング用プライマーセット。
(第３３項）
配列番号：２５、２６、４２、４３、４４及び４５の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択されるフォワードプライマー及びリバースプライマーを含む、ＨＬＡ−ＤＰＢ１遺伝子のＤＮＡタイピング用プライマーセット。
(第３４項）
配列番号：２７、２８、４６及び４７の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択されるフォワードプライマー及びリバースプライマーを含む、ＨＬＡ−ＤＱＡ１遺伝子のＤＮＡタイピング用プライマーセット。
(第３５項）
配列番号：２９、３０、４８、４９及び５０の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択されるフォワードプライマー及びリバースプライマーを含む、ＨＬＡ−ＤＱＢ１遺伝子のＤＮＡタイピング用プライマーセット。
【図１】
2020010698.tif 000007
【図２】
2020010698.tif 000008
【図３】
2020010698.tif 000009
【図４】
2020010698.tif 000010
【図５】
2020010698.tif 000011
【図６】
2020010698.tif 000012
【図７】
2020010698.tif 000013
【配列表】
2020010698000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年9月11日(2019.9.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトゲノム塩基配列におけるＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＱＡ１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１、ＨＬＡ−ＤＰＡ１及びＨＬＡ−ＤＰＢ１の各遺伝子の上流領域及び下流領域に各々特異的にアニールするプライマーセット、ならびにＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のためのプライマーセットを含むプライマーセットであって、
前記ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のためのプライマーセットが、
（ａ）配列番号：９、１０又は３１の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーと、配列番号１１又は３２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーとを含む、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のＤＲ１型のためのプライマーセット；
（ｂ）配列番号：１２又は３１の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーと、配列番号１１又は３３の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーとを含む、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のＤＲ２型のためのプライマーセット；
（ｃ）配列番号：１３又は３４の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーと、配列番号１４又は３２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーとを含む、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のＤＲ３型のためのプライマーセット；
（ｄ）配列番号：１５又は３１の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーと、配列番号１６又は３２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーとを含む、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のＤＲ４型のためのプライマーセット；
（ｅ）配列番号：１３又は３１の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーと、配列番号１４、３５又は３６の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーとを含む、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のＤＲ５型のためのプライマーセット；
（ｆ）配列番号：１３又は３１の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーと、配列番号１４、３２又は３７の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーとを含む、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のＤＲ６型のためのプライマーセット；
（ｇ）配列番号：１７又は３８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーと、配列番号１８又は３６の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーとを含む、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のＤＲ７型のためのプライマーセット；
（ｈ）配列番号：１３又は３１の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーと、配列番号１４又は３９の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーとを含む、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のＤＲ８型のためのプライマーセット；
（ｉ）配列番号：１９又は３８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーと、配列番号２０又は３６の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーとを含む、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のＤＲ９型のためのプライマーセット；及び、
（ｊ）配列番号：２１又は３１の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーと、配列番号２２又は３２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーとを含む、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のＤＲ１０型のためのプライマーセット、を含むことを特徴とするプライマーセット。