(57)【要約】      （修正有）【課題】特にがんに関する、免疫療法で使用するためのペプチド、核酸、及び細胞の提供。さらには単独で、又はその他の腫瘍関連ペプチドとの組み合わせで、抗腫瘍免疫応答を刺激するワクチン組成物の活性医薬品成分の役割を果たす、腫瘍関連細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）ペプチドエピトープの提供。【解決手段】ヒト腫瘍細胞から単離したＨＬＡクラスＩ及びＨＬＡクラスＩＩ分子に由来する、７０個を超える新規ペプチド配列と、それらの変異型。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜配列番号４、配列番号６〜配列番号６５、および配列番号７６〜配列番号８４、および配列番号９２からなる群から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項２】
ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）のクラスＩまたはクラスＩＩ分子に結合する能力を有する、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
請求項１または２に記載のペプチドにおいて、修飾され、Ｎ末端および／またはＣ末端で最大４アミノ酸伸長され、および／または非ペプチド結合が導入されているものである、ペプチド。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチドが、融合タンパク質の一部であり、ＨＬＡ−ＤＲ抗原関連不変鎖（Ｉｉ）のＮ末端アミノ酸に融合し、または抗体に融合しているものである、ペプチド。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチドをコードする核酸。
【請求項６】
ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの組み合わせである、請求項に５に記載の核酸。
【請求項７】
請求項５または６に記載の核酸の発現能力がある発現ベクター。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチド、請求項５または６に記載の核酸、または請求項７に記載の発現ベクターを含む、医薬品。
【請求項９】
請求項５または６に記載の核酸または請求項７に記載の発現ベクターを含んでなり、ヒト胚性幹細胞でない宿主細胞。
【請求項１０】
前記細胞が、樹状細胞または抗原提示細胞である、請求項９に記載の宿主細胞。
【請求項１１】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチドまたは薬学的に許容可能なその塩と、薬学的に許容可能な、好ましくは水性である、緩衝液、結合因子、ブラスチング剤、希釈剤、フレーバー、潤滑剤、およびサイトカインなどの免疫刺激または免疫調節物質、免疫修飾物質、アジュバント、および免疫調節特性がある治療剤などの、担体および／または賦形剤の群から選択される少なくとも１つのその他の成分とを含んでなる医薬組成物。
【請求項１２】
請求項９または１０に記載の宿主細胞を培養するステップと、ペプチドを宿主細胞またはその培養液から単離するステップとを含んでなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチドを生成する方法。
【請求項１３】
ＣＴＬまたはＴｈ細胞を、適切な抗原提示細胞の表面に発現される抗原負荷ヒトクラスＩまたはＩＩ  ＭＨＣ分子に、前記ＣＴＬを抗原特異的様式で活性化するのに十分な時間にわたり生体外で接触させるステップを含んでなる、活性化細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）またはＴヘルパー細胞（Ｔｈ細胞）を生成するインビトロ法であって、前記抗原が、請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチドである、インビトロ法。
【請求項１４】
前記抗原が、十分な量の前記抗原を前記抗原提示細胞に接触させることで、適切な抗原提示細胞の表面に発現されるクラスＩまたはＩＩＭＨＣ分子上に負荷される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記抗原提示細胞が、請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチドを発現する能力がある発現ベクターを含んでなる、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法によって生成される活性化細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）またはＴヘルパー細胞（Ｔｈ細胞）であって、請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチドを異常に発現する細胞を選択的に認識する、ＣＴＬまたはＴｈ細胞。
【請求項１７】
請求項１６に記載の活性化細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）またはＴヘルパー細胞（Ｔｈ細胞）由来のＴＣＲまたはｓＴＣＲまたはそのフラグメントの可変領域をクローニングするステップと、前記ＴＣＲまたはｓＴＣＲまたはそのフラグメントを適切な宿主および／または発現系で発現させるステップとを含んでなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチドに対して特異的なＴＣＲまたはｓＴＣＲまたはそのフラグメントを生成するためのインビトロ法。
【請求項１８】
請求項１または２に記載ペプチドに、または請求項１または２に記載のペプチドとＭＨＣ分子との複合体に結合もしくは特異的に結合する、抗体もしくはそのフラグメント、タンパク質、核酸、ペプチド、または、ＴＣＲもしくはｓＴＣＲまたはそのフラグメントを含む、単離された結合因子。
【請求項１９】
患者における標的細胞の死滅剤であって、前記標的細胞が、請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチドを異常に発現および／または提示するものであり、前記剤が、請求項１６に記載の細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）またはＴｈ細胞の有効数が前記患者に投与されるものである、剤。
【請求項２０】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチド、請求項５または６に記載の核酸、請求項７に記載の発現ベクター、請求項９〜１０に記載の細胞、請求項１６に記載の活性化細胞傷害性Ｔリンパ球、または請求項１８に記載の抗体またはＴＣＲまたはｓＴＣＲが医薬として使用される薬剤であって、前記医薬ががんに対して有効である、薬剤。
【請求項２１】
前記医薬がワクチンである、請求項２０に記載の薬剤。
【請求項２２】
前記がんが、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、肺がん、胃がん、および／または神経膠芽腫から選択される、請求項２０または２１に記載の薬剤。
【請求項２３】
ヒトにおける養子細胞療法のための、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項２４】
請求項１８に記載のＴ細胞受容体で組換え的に形質移入された、自系または同種異系ヒト細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）またはＴヘルパー細胞（Ｔｈ細胞）。
【請求項２５】
（ａ）以下のａ１〜ａ７からなる群から選択される実体：
（ａ１）請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離ペプチド、
（ａ２）請求項１８に記載のＴ細胞受容体、ｓＴＣＲまたはそのフラグメント、
（ａ３）請求項４に記載の融合タンパク質、
（ａ４）請求項５または６に記載の核酸、
（ａ５）請求項７に記載の発現ベクター、
（ａ６）請求項９〜１０のいずれか一項に記載の宿主細胞、および
（ａ７）請求項１６に記載の活性化細胞傷害性Ｔリンパ球またはＴヘルパー細胞、および
（ｂ）薬学的に許容できる担体、および任意選択的に、
（ｃ）薬学的に許容可能な賦形剤、緩衝液、結合剤、ブラスチング剤、希釈剤、フレーバー、潤滑剤、およびサイトカインなどの免疫刺激または免疫調節物質、免疫修飾物質、アジュバント、および免疫調節特性がある治療剤の群から選択される、少なくとも１つのその他の成分
を含んでなる医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫療法で使用するためのペプチド、核酸、および細胞に関する。特に、本発明は、がんの免疫療法に関する。本発明は、単独で、またはその他の腫瘍関連ペプチドとの組み合わせで、抗腫瘍免疫応答を刺激するワクチン組成物の活性医薬品成分の役割を果たす、腫瘍関連細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）ペプチドエピトープにさらに関する。本発明は、抗腫瘍免疫応答を引き起こすためのワクチン組成物で使用し得る、ヒト腫瘍細胞のＨＬＡクラスＩおよびＨＬＡクラスＩＩ分子に由来する６７個の新規ペプチド配列と、それらの変異型とに関する。
【背景技術】
【０００２】
肺がんは、男性と女性の双方で、がん関連死の最大要因である。世界的に、肺がんは、発生率と死亡率の双方の観点から、最も一般的ながんである。２００８年には１６１万件の新規症例があり、１３８万人が肺がんのために死亡した。罹患率は、ヨーロッパおよび北米で最大である。
【０００３】
１９８７年以来、毎年、より多くの女性が、乳がんよりも肺がんのために死亡している。死亡率は、男性では１９９１年から２００３年にかけて、毎年、約１．９％顕著に低下し続けている。女性の肺がん死亡率は、数十年間にわたって継続的に増大した後、平坦域に近づいている。肺がん死亡率におけるこれらの傾向は、過去３０年間にわたる喫煙率の低下を反映する。
【０００４】
米国国立がん研究所（ＮＣＩ）によれば、２０１３年には、米国で、推定２３０，０００件の新規肺がん症例と、肺がんに起因する１６０，０００人の死亡が、予測されている。
【０００５】
肺がんは、治療目的で、小細胞（１３％、ＳＣＬＣ）または非小細胞（８７％、ＮＳＣＬＣ）に、臨床的に分類される。予後は、通常、不良である。肺がんのある全ての人々の内、１５％が診断後５年間生存する。病期は、診断の時点で進行していることが多い。診察時に、ＮＳＣＬＣ症例の３０〜４０％は第ＩＶ期であり、ＳＣＬＣの６０％は第ＩＶ期である。
【０００６】
治療の選択肢は、がんのタイプ（小細胞または非小細胞）と病期によって決定され、外科手術、放射線療法、化学療法、そしてベバシズマブ（アバスチン（登録商標））やエルロチニブ（タルセバ（登録商標））などの標的生物学的療法が挙げられる。局在性のがんでは、通常は、外科手術が一般に選択される治療法である。最近の研究は、早期の非小細胞肺がんの生存期間が、外科手術に続く化学療法によって改善されることを示唆する。疾患は、通常は、発見時までに広がっているので、放射線療法および化学療法が、時に外科手術との併用で使用されることが多い。化学療法は、単独でまたは放射線と組み合わされて一般に選択される、通常の小細胞肺がん治療法であり；このレジメンでは、患者の大部分が寛解を経験し、それは症例によっては長期にわたる。
【０００７】
主に外科的手法および併用療法の進歩のおかげで、肺がんの１年間相対生存率は、１９７５年〜１９７９年の３７％から、２００２年の４２％にわずかに増大した。しかし、全ての病期を合わせた５年間生存率は、１６％に過ぎない。疾患が依然として局在性の時点で検出された症例では、生存率は４９％である；しかし１６％の肺がんのみがこの初期段階で診断される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記にもかかわらず、重篤な副作用をもたらすこともある過剰な化学療法剤またはその他の薬剤を使用せずに、患者の福利を改善する、肺がん、特に非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、胃がんなどのがん、および異なる表現型の脳腫瘍のための、新しい効果的かつ安全な治療法の選択肢に対する必要性がなおもある。
【０００９】
本発明は、非侵襲様式で患者の免疫系を刺激して抗腫瘍剤として作用する、ペプチドを利用する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の第１の態様では、本発明は、配列番号１〜配列番号６５、および配列番号７６〜配列番号８４、および配列番号９２の群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるペプチド、または配列番号１〜配列番号６５、および配列番号７６〜配列番号８４、および配列番号９２と、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％相同的な（好ましくは少なくとも８０％または少なくとも９０％同一の）それらの変異配列に関し、前記変異型は、前記ペプチドまたは薬学的に許容可能なそれらの塩と交差反応するＴ細胞を誘導し、前記ペプチドは完全長ポリペプチドでない。
【００１１】
本発明は、配列番号１〜配列番号６５、および配列番号７６〜配列番号８４、および配列番号９２の群から選択される配列を含んでなる本発明のペプチド、または配列番号１〜配列番号６５、および配列番号７６〜配列番号８４、および配列番号９２と、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％相同的な（好ましくは少なくとも８０％または少なくとも９０％同一の）それらの変異型にさらに関し、前記ペプチドまたはそれらの変異型は、配列番号１〜配列番号６５、および配列番号７８〜配列番号８４、および配列番号９２では、８〜１００、好ましくは８〜３０、最も好ましくは８〜１４アミノ酸、配列番号７６および７７では、１２〜１００、好ましくは１２〜３０、最も好ましくは１２〜１８アミノ酸の全長を有する。
【００１２】
次の表は、本発明によるペプチド、それらのそれぞれの配列番号、およびこれらのペプチドの予期される原料タンパク質を示す。表１ａ、１ｂ、および１ｃの全てのペプチドは、ＨＬＡＡ＊０２対立遺伝子に結合し、表１ｄのペプチドはＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子に結合する。表１ｃのペプチドは、胃がんおよびまたは神経膠芽腫の診断および／または治療において、さらに有用である。
【００１３】
表１ｄのクラスＩＩペプチドは、ＭＭＰ１２またはＰＯＳＴＮを過剰発現または過剰提示する、胃がんおよびその他のがんの診断および／または治療において、さらに有用である。
【００１４】
したがって、本発明は、特に、配列番号７６に記載の配列を含んでなる本発明のペプチド、または配列番号７６と、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％相同的な（好ましくは少なくとも８０％または少なくとも９０％同一の）それらの変異型に関し、前記ペプチドまたはそれらの変異型は、１２〜１００、好ましくは１２〜３０、最も好ましくは１２〜１８アミノ酸の全長を有する。本発明は、特に、配列番号７６に記載の配列からなる本発明のペプチドに関する。
【００１５】
また、本発明は、特に、配列番号７７に記載の配列を含んでなる本発明のペプチド、または配列番号７７と、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％相同的な（好ましくは少なくとも８０％または少なくとも９０％同一の）それらの変異型に関し、前記ペプチドまたはそれらの変異型は、１２〜１００、好ましくは１２〜３０、最も好ましくは１２〜１８アミノ酸の全長を有する。本発明は、特に、配列番号７７に記載の配列からなる、本発明のペプチドに関する。
【００１６】
【表１】
2020010686.tif 000002
【００１７】
【表２】
2020010686.tif 000003
【００１８】
【表３】
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【００１９】
【表４】
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【００２０】
【表５】
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【００２１】
【表６】
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【００２２】
本発明は、ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩまたはＩＩの分子に結合する能力を有する、本発明によるペプチドにさらに関する。
【００２３】
本発明は、本発明によるペプチドにさらに関し、前記ペプチドは、配列番号１〜配列番号６５、および配列番号７６〜配列番号８４、および配列番号９２に記載のアミノ酸配列からなり、またはそれから本質的になる。
【００２４】
本発明は、本発明によるペプチドにさらに関し、前記ペプチドは、修飾されおよび／または非ペプチド結合を含む。
【００２５】
本発明は、本発明によるペプチドにさらに関し、前記ペプチドは、特にＨＬＡ−ＤＲ抗原関連不変鎖（Ｉｉ）のＮ末端アミノ酸に融合した、または例えば樹状細胞に対して特異的な抗体などの抗体に融合した（またはその配列中に融合した）、融合タンパク質の一部である。
【００２６】
本発明は、本発明によるペプチドをエンコードする核酸にさらに関する。
【００２７】
本発明は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの組み合わせである、本発明による核酸にさらに関する。
【００２８】
本発明は、本発明による核酸を発現する能力がある、発現ベクターにさらに関する。
【００２９】
本発明は、医療で使用するための、本発明によるペプチド、本発明による核酸、または本発明による発現ベクターにさらに関する。
【００３０】
本発明は、本発明による抗体、およびそれらを生成する方法にさらに関する。
【００３１】
本発明は、本発明によるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、特に可溶性ＴＣＲ（ｓＴＣＲ）、およびそれらを生成する方法にさらに関する。
【００３２】
本発明は、前述のような本発明による核酸または発現ベクターを含んでなる宿主細胞にさらに関する。
【００３３】
本発明は、抗原提示細胞である、本発明による宿主細胞にさらに関する。
【００３４】
本発明は、抗原提示細胞が樹状細胞である、本発明による宿主細胞にさらに関する。
【００３５】
本発明は、本発明によるペプチドを生成する方法にさらに関し、方法は、本発明による宿主細胞を培養するステップと、宿主細胞またはその培養液からペプチドを単離するステップとを含んでなる。
【００３６】
本発明は、活性化細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を生成するインビトロ法にさらに関し、方法は、生体外ＣＴＬを、適切な抗原提示細胞の表面に発現される抗原負荷ヒトクラスＩまたはＩＩＭＨＣ分子に、前記ＣＴＬを抗原特異的様式で活性化するのに十分な時間にわたり接触させるステップを含んでなり、前記抗原は本発明による任意のペプチドである。
【００３７】
本発明は、十分な量の抗原を抗原提示細胞に接触させることで、適切な抗原提示細胞の表面に発現されるクラスＩまたはＩＩＭＨＣ分子上に、抗原が負荷される、本発明による方法にさらに関する。
【００３８】
本発明は、抗原提示細胞が、配列番号１〜配列番号９２、好ましくは配列番号１〜配列番号６５、および配列番号７６〜配列番号８４、および配列番号９２を含有する前記ペプチド、または前記変異型アミノ酸配列を、発現する能力がある発現ベクターを含んでなる、本発明による方法にさらに関する。
【００３９】
本発明は、本発明による方法によって生成される活性化細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）にさらに関し、それは、本発明によるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを異常に発現する細胞を選択的に認識する。
【００４０】
本発明は、患者において標的細胞を死滅させる方法にさらに関し、その標的細胞は、本発明による任意のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを異常に発現し、方法は、本発明による細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の有効数を患者に投与するステップを含んでなる。
【００４１】
本発明は、記載される任意のペプチド、本発明による核酸、本発明による発現ベクター、本発明による細胞、または本発明による活性化細胞傷害性Ｔリンパ球の、薬剤としての、または薬剤の製造における、使用にさらに関する。
【００４２】
本発明は、前記薬剤がワクチンである、本発明による使用にさらに関する。
【００４３】
本発明は、薬剤が、がんに対して有効である、本発明による使用にさらに関する。
【００４４】
本発明は、前記がん細胞が、肺がん細胞、胃、胃腸、結腸直腸、膵臓または腎臓のがん細胞、および神経膠芽腫細胞である、本発明による使用にさらに関する。
【００４５】
本発明は、肺、胃、胃腸、結腸直腸、膵臓または腎臓のがん、および神経膠芽腫の診断および／または予後診断で使用し得る、本発明によるペプチドベースの特定のマーカータンパク質および生物マーカーにさらに関する。
【００４６】
さらに本発明は、がん治療のためのこれらの新規標的の使用に関する。
【００４７】
免疫応答の刺激は、宿主免疫系によって外来性として認識された抗原の存在に依存する。腫瘍関連抗原の存在の発見は、宿主の免疫系を用いて、腫瘍成長に介入する可能性を高めた。免疫系の体液性および細胞性アームの双方を活用する様々な機構が、がん免疫療法のために目下探究されている。
【００４８】
細胞性免疫応答の特定の要素は、腫瘍細胞を特異的に認識して破壊する能力がある。腫瘍浸潤性細胞集団からの、または末梢血からの細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の単離は、がんに対する自然免疫防御において、このような細胞が重要な役割を果たすことを示唆する。特に、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）を保有して、細胞質ゾル内に位置するタンパク質または欠陥リボソーム産物（ＤＲＩＰＳ）に由来する、通常は８〜１０のアミノ酸残基のペプチドのクラスＩ分子を認識するＣＤ８陽性Ｔ細胞が、この応答において重要な役割を果たす。ヒトのＭＨＣ分子はまた、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）とも称される。
【００４９】
ＭＨＣ分子には、２つのクラスがある：核を有するほとんどの細胞にあるＭＨＣクラスＩ分子。ＭＨＣ分子は、それぞれ、重鎖と、β−２−ミクログロブリン（ＭＨＣクラスＩ受容体）またはαおよびａβ鎖（ＭＨＣクラスＩＩ受容体）とから、構成される。それらの三次元立体構造は結合溝をもたらし、それはペプチドとの非共有結合相互作用のために使用される。ＭＨＣクラスＩは、大部分が内在性タンパク質である、ＤＲＩＰおよびより大型のペプチドのタンパク質分解的切断から得られる、ペプチドを提示する。ＭＨＣクラスＩＩ分子は、大部分はプロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）に見られ、エンドサイトーシス過程でＡＰＣに取り込まれて引き続きプロセシングされる、外来性または膜貫通タンパク質のペプチドを主に提示する。ペプチドおよびＭＨＣクラスＩ分子複合体が、適切なＴＣＲ（Ｔ細胞受容体）を有するＣＤ８陽性細胞傷害性Ｔリンパ球によって認識される一方で、ペプチドとＭＨＣクラスＩＩ分子の複合体は、適切なＴＣＲを有するＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞によって認識される。その結果、ＴＣＲ、ペプチド、およびＭＨＣは、化学量論的に１：１：１の量で存在することが良く知られている。
【００５０】
ＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞は、ＣＤ８陽性細胞傷害性Ｔ細胞による、効果的な応答の誘導と維持において重要な役割を果たす。腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に由来するＣＤ４陽性Ｔ細胞エピトープの同定は、抗腫瘍免疫応答を始動させるための医薬品開発に非常に重要である（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｑｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｇｎｊａｔｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。腫瘍部位では、Ｔヘルパー細胞がＣＴＬ親和性サイトカイン環境を維持し（Ｍｏｒｔａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）、例えば、ＣＴＬ、ＮＫ細胞、マクロファージ、顆粒球などのエフェクター細胞を引きつける（Ｈｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。
【００５１】
炎症不在下では、ＭＨＣクラスＩＩ分子の発現は、免疫系細胞、特に、例えば、単球、単球由来細胞、マクロファージ、樹状細胞などのプロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）に主に限定される。がん患者では、腫瘍細胞が、ＭＨＣクラスＩＩ分子を発現することが驚くことに発見された（Ｄｅｎｇｊｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。
【００５２】
例えば、マウスなどの哺乳類動物モデルにおいて、ＣＴＬエフェクター細胞（すなわちＣＤ８陽性Ｔリンパ球）の不在下であっても、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）の分泌による血管新生阻害を通じて腫瘍発現を阻害するには、ＣＤ４陽性Ｔ細胞で十分であることが示された。
【００５３】
さらに、ＨＬＡクラスＩＩ分子によって提示される腫瘍関連抗原からのペプチドを認識するＣＤ４陽性Ｔ細胞が、抗体（Ａｂ）応答の誘導を通じて、腫瘍の進行を抑制し得ることが示された。
【００５４】
ＨＬＡクラスＩ分子に結合する腫瘍関連ペプチドとは対照的に、少数の瘍関連抗原（ＴＡＡ）のクラスＩＩリガンドのみが、これまでに記載されている。
【００５５】
ＨＬＡクラスＩＩ分子の構成的発現は、通常、免疫系細胞に限定されるので、原発性腫瘍からクラスＩＩペプチドを直接単離する可能性が、可能であるとは考えられなかった。しかしＤｅｎｇｊｅｌ  ｅｔ  ａｌ．は、腫瘍からいくつかのＭＨＣクラスＩＩエピトープを直接同定するのに成功した（国際公開第２００７／０２８５７４号パンフレット、欧州特許第１７６００８８Ｂ１号明細書；（Ｄｅｎｇｊｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００６））。
【００５６】
腫瘍特異的細胞傷害性Ｔリンパ球によって認識される抗原、すなわちそれらのエピトープは、酵素、受容体、転写因子などの全てのタンパク質クラスに由来する分子であり得て、それらは、それぞれの腫瘍細胞で発現され、同一起源の未変化細胞と比較して上方制御される。
【００５７】
ＣＤ８およびＣＤ４依存性の双方のタイプの応答は、抗腫瘍効果に共同して相乗的に寄与するので、ＣＤ８＋ＣＴＬ（リガンド：ＭＨＣクラスＩ分子＋ペプチドエピトープ）、またはＣＤ４陽性Ｔヘルパー細胞（リガンド：ＭＨＣクラスＩＩ分子＋ペプチドエピトープ）のどちらかによって認識される、腫瘍関連抗原の同定および特性解析は、腫瘍ワクチンの開発に重要である。
【００５８】
本発明はまた、（配列番号７６および７７に記載の）２つの新しい非常に有用なＭＨＣクラスＩＩペプチドにも関する。これらのペプチドは、特に、ＭＭＰ１２およびＰＯＳＴＮをそれぞれ過剰発現および／または過剰提示する、胃がん、ＮＳＣＬＣ、およびその他のがんの診断および／または治療において有用である。
【００５９】
本発明はまた、配列番号７６または７７に記載の本発明のＭＨＣクラスＩＩペプチドのいわゆる鎖長変異型にも関する。上述したように、配列番号７６に記載のペプチドは、アミノ酸配列ＩＮＮＹＴＰＤＭＮＲＥＤＶＤＹＡＩＲ（ＭＭＰ１２−ペプチド）からなり、配列番号７７に記載のペプチドは、アミノ酸配列ＴＮＧＶＩＨＶＶＤＫＬＬＹＰＡＤＴ（ＰＯＳＴＮ−００２−ペプチド）からなる。鎖長変異型は、通常Ｎおよび／またはＣ末端が延長され（１〜５個、好ましくは１〜１０個のアミノ酸）、またはＮおよび／またはＣ末端が短縮された（１〜５個のアミノ酸）ペプチドであり、それは依然としてＭＨＣに結合して、本明細書に記載されるような細胞性免疫応答を引き起こし得る。現状技術で知られているように、クラスＩＩタンパク質へのペプチド結合はサイズに制約がなく、１１〜３０個のアミノ酸長で変動し得る。ＭＨＣクラスＩＩ分子中のペプチド結合溝は両端が開いており、それは長さが相対的により長いペプチドの結合を可能にする。「コア」の９残基長の断片がペプチド認識に最も寄与するが、側面に位置する領域もまた、クラスＩＩ対立遺伝子に対するペプチドの特異性に重要である（例えば、Ｍｅｙｄａｎ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ  ａｌｌｅｌｅｓ  ｂｙ  ｔｅｍｐｏｒａｌ  ｍｏｔｉｆ  ｍｉｎｉｎｇ．ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２０１３；１４  Ｓｕｐｐｌ  ２：Ｓ１３．Ｅｐｕｂ  ２０１３  Ｊａｎ  ２１を参照されたい）。当業者は、利用可能な（例えば上述の）多数のソフトウェアツールを使用して結合モチーフを特定でき、したがって鎖長変異型を生成するために、配列番号７６または７７に記載のＭＨＣクラスＩＩペプチドを伸長および／または欠失させる可能性を同定するであろう。
【００６０】
ペプチドが細胞性免疫応答を始動する（引き起こす）ためには、それはＭＨＣ分子に結合しなくてはならない。この方法は、ＭＨＣ分子の対立遺伝子と、ペプチドのアミノ酸配列の特定の多形性とに依存する。ＭＨＣクラスＩ結合ペプチドは、通常は８〜１２アミノ酸残基長であり、通常は、ＭＨＣ分子の対応する結合溝と相互作用するそれらの配列中に、２つの保存残基（「アンカー」）を含有する。このようにして、各ＭＨＣ対立遺伝子は、どのペプチドが結合溝と特異的に結合し得るかを決定する、「結合モチーフ」を有する。
【００６１】
ＭＨＣクラスＩ依存免疫反応では、ペプチドは腫瘍細胞によって発現される特定のＭＨＣクラスＩ分子に結合できるだけでなく、それらはまた、特有のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を有するＴ細胞によって認識されなくてはならない。
【００６２】
腫瘍特異的細胞傷害性Ｔリンパ球によって認識される抗原、すなわちそれらのエピトープは、酵素、受容体、転写因子などの全てのタンパク質クラスに由来する分子であり得て、それはそれぞれの腫瘍細胞で発現されて、同一起源の非改変細胞と比較して、上方制御される。
【００６３】
腫瘍関連抗原の現行の分類は、次の主要グループを含んでなる：
ａ）がん−精巣抗原：Ｔ細胞によって認識され得る、これまでに同定された最初のＴＡＡはこのクラスに属し、元々はがん−精巣（ＣＴ）抗原と称されたが、それは、そのメンバーが組織学的に異なるヒト腫瘍で発現し、正常組織では精巣の精母細胞／精原細胞のみに存在し、時として胎盤に存在するためである。精巣の細胞は、クラスＩおよびＩＩのＨＬＡ分子を発現しないので、これらの抗原は正常組織のＴ細胞によって認識され得ず、したがって免疫学的に腫瘍特異的と見なされる。ＣＴ抗原の周知の例は、ＭＡＧＥファミリーメンバーまたはＮＹ−ＥＳＯ−１である。
ｂ）分化抗原：これらのＴＡＡは、腫瘍と、それから腫瘍が生じる正常組織との間で共有され；ほとんどは、メラノーマおよび正常なメラノサイトに見られる。これらのメラノサイト系関連タンパク質の多くは、メラニン生合成に関与し、したがって腫瘍特異的でないが、それでもなおがん免疫療法のために広く利用されている。例としては、黒色腫に対するチロシナーゼとＭｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１、または前立腺がんに対するＰＳＡが挙げられるが、これに限定されるものではない。
ｃ）過剰発現されるＴＡＡ：広範に発現されるＴＡＡをエンコードする遺伝子は、組織学的に異なるタイプの腫瘍で、ならびに多数の正常組織で、概してより低い発現レベルで検出されている。正常組織によってプロセシングされ潜在的に提示されるエピトープの多くは、Ｔ細胞認識閾値レベルに満たない可能性がある一方で、腫瘍細胞におけるそれらの過剰発現は、先に確立された免疫寛容を破壊することで抗がん応答を引き起こし得る。このクラスのＴＡＡの顕著な例は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ、ＴｅｌｏｍｅｒａｓｅまたはＷＴ１である。
ｄ）腫瘍特異的抗原：これらのユニークなＴＡＡは、正常な遺伝子（β−カテニン、ＣＤＫ４など）の変異から生じる。これらの分子変化のいくつかは、腫瘍性形質転換および／または進行に関連する。腫瘍特異的抗原は、通常、正常組織に対する自己免疫反応のリスクなしに、強力な免疫応答を誘導できる。他方、これらのＴＡＡは、ほとんどの場合、その上でそれらが同定されたまさにその腫瘍のみと関係があり、通常は、多くの個々の腫瘍間で共有されない。
ｅ）異常な翻訳後修飾から生じるＴＡＡ：このようなＴＡＡは、特異的でなく腫瘍で過剰発現もされないが、それでもなお、腫瘍で主に活性である翻訳後プロセスによって腫瘍関連になる、タンパク質から生じてもよい。このクラスの例は、腫瘍でＭＵＣ１のような新規エピトープをもたらす改変グリコシル化パターンから、または腫瘍特異的であってもなくてもよい分解中のタンパク質スプライシング事象から生じる。
ｆ）腫瘍ウイルスタンパク質：これらのＴＡＡはウイルスタンパク質であり、それらは発がん過程で重要な役割を果たしてもよく、外来性である（ヒト由来でない）ため、それらはＴ細胞応答を誘起し得る。このようなタンパク質の例は、ヒト乳頭腫１６型ウイルスタンパク質Ｅ６およびＥ７であり、これらは子宮頸がんで発現される。
【００６４】
タンパク質が、細胞傷害性Ｔリンパ球によって腫瘍特異的または腫瘍関連抗原として認識され、治療で利用されるためには、特定の必要条件が満たされなくてはならない。抗原は、主に腫瘍細胞によって発現されるべきであり、健常組織によって発現されずまたは比較的少量発現され、または別の好ましい実施形態では、ペプチドは、健常組織と比較して、腫瘍細胞によって過剰提示されるべきである。それぞれの抗原は、ある種の腫瘍に存在するだけでなく、高い濃度（すなわち、細胞あたりの各ペプチドコピー数）で存在することも、さらに望ましい。腫瘍特異的および腫瘍関連抗原は、例えば、細胞周期制御またはアポトーシス抑制における機能のために、正常細胞から腫瘍細胞への形質転換に直接関与するタンパク質に、由来することが多い。さらに、形質転換の直接原因となるタンパク質の下流標的が、上方制御されてもよく、したがって間接的に腫瘍関連であってもよい。このような間接的腫瘍関連抗原はまた、ワクチン接種アプローチの標的であってもよい（Ｓｉｎｇｈ−Ｊａｓｕｊａ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。どちらの場合も、腫瘍関連抗原に由来するこのようなペプチド（「免疫原性ペプチド」）は、生体外または生体内でＴ細胞応答をもたらすべきであるので、抗原のアミノ酸配列中にエピトープが存在することが必須である。
【００６５】
基本的に、ＭＨＣ分子に結合できるあらゆるペプチドが、Ｔ細胞エピトープとして機能してもよい。生体外または生体内Ｔ細胞応答誘導のための必要条件は、対応するＴＣＲがあるＴ細胞の存在、およびこの特定のエピトープに対する免疫寛容の不在である。
【００６６】
したがって、ＴＡＡは、腫瘍ワクチン開発のための出発点である。ＴＡＡを同定して特性決定する方法は、患者または健常者から単離され得るＣＴＬの使用に基づき、またはそれらは、腫瘍および正常組織間の差次的転写プロファイル、または差次的ペプチド発現パターンの作成に基づく。
【００６７】
しかし、腫瘍組織またはヒト腫瘍細胞系で過剰発現され、またはこのような組織または細胞系で選択的に発現される遺伝子の同定は、免疫療法においてこれらの遺伝子から転写される抗原の使用に関する、正確な情報を提供しない。これは、これらの抗原のエピトープの個々の亜集団のみが、このような用途に適するためであり、その理由は、対応するＴＣＲがあるＴ細胞が存在しなくてはならず、この特定のエピトープに対する免疫寛容が不在または最小でなくてはならないからである。したがって本発明の非常に好ましい実施形態では、それに対する機能性および／または増殖性Ｔ細胞がある、過剰にまたは選択的に提示されるペプチドのみを選択することが、重要である。このような機能性Ｔ細胞は、特異的抗原による刺激時にクローン増殖し得てエフェクター機能を果たすことができるＴ細胞（「エフェクターＴ細胞」）と定義される。
【００６８】
本発明によるＴＣＲおよび抗体の場合、基礎となるペプチドの免疫原性は二次的である。本発明によるＴＣＲおよび抗体では、提示が決定的要素である。
【００６９】
Ｔヘルパー細胞は、抗腫瘍免疫において、ＣＴＬのエフェクター機能を統合する上で重要な役割を果たす。ＴＨ１型のＴヘルパー細胞応答を始動するＴヘルパー細胞エピトープは、ＣＤ８陽性キラーＴ細胞のエフェクター機能を支持し、それは、それらの細胞表面に腫瘍関連ペプチド／ＭＨＣ複合体を提示する腫瘍細胞に向けられた、細胞傷害機能を含む。このようにして腫瘍関連Ｔヘルパー細胞ペプチドエピトープは、単独で、またはその他の腫瘍関連ペプチドとの組み合わせで、抗腫瘍免疫応答を刺激するワクチン組成物の活性医薬品成分の役割を果たし得る。
【００７０】
がんに対するさらなる用途は、以下の本発明によるペプチドタンパク質の説明で開示される。
【００７１】
ＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＡ（ＡＢＣ１）、メンバー１３（ＡＢＣＡ１３）
ヒトでは、膜貫通輸送体のＡＴＰ−結合カセット（ＡＢＣ）ファミリーは、少なくとも４８の遺伝子と、７つの遺伝子サブファミリーを有する。予測されたＡＢＣＡ１３タンパク質は５，０５８個のアミノ酸残基からなり、これまでに記載された中では、最大のＡＢＣタンパク質である（Ｐｒａｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。Ｋｎｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．は、ＡＢＣＡ１３タンパク質が、マウスおよびヒトの海馬および皮質で発現されると判定し、これらの双方の領域は、統合失調症および双極性障害に関連がある（Ｋｎｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。ＡＢＣＡ１３遺伝子は染色体７ｐ１２．３に位置するが、この領域は、膵臓に影響を及ぼす遺伝性疾患（シュバッハマン・ダイアモンド症候群）、ならびにＴ細胞腫瘍浸潤および転移（ＩＮＭ７）に関与する遺伝子座を含有し、したがってこれらの病態の位置的候補である（Ｐｒａｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。
【００７２】
マトリックスメタロペプチダーゼ１２（マクロファージエラスターゼ）（ＭＭＰ１２）
ヒトメタロエラスターゼ（ＨＭＥ）またはマクロファージメタロエラスターゼ（ＭＭＥ）としてもまた知られているＭＭＰ１２は、エラスチン分解能力が認められている亜鉛エンドペプチダーゼである。それとは別に、これは、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、プロテオグリカンなどのその他のマトリックスタンパク質、およびα−１−アンチトリプシンなどの非マトリックスタンパク質に及ぶ、幅広い基質範囲を有する。喘息、肺気腫、および慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）では、ＭＭＰ１２が、肺胞破壊および気道再構築に寄与してもよい（Ｃａｔａｌｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｗａｌｌａｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。ＭＭＰ１２は、マクロファージ移動に関与するとされており、プラスミノーゲンからアンギオスタチンを生成し得ることから、血管新生阻害に寄与する（Ｃｈａｋｒａｂｏｒｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｃｈａｎｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｓａｎｇ，１９９８）。その他のメタロプロテイナーゼと同様に、ＭＭＰ１２は、胎芽形成、創傷治癒、および月経周期のような生理学的過程に関与するが（Ｃｈａｋｒａｂｏｒｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｌａｂｉｅｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）、組織破壊の病理過程にもまた関与する。
【００７３】
いくつかの例では、データは少数の患者に基づくが、文献には、ＭＭＰ１２が、がんで頻繁に過剰発現されるという豊富な証拠がある（Ｄｅｎｙｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｈａｇｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２００９；Ｖａｚｑｕｅｚ−Ｏｒｔｉｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｙｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。しかし、臨床パラメータおよび予後に対するＭＭＰ１２過剰発現の影響について、データには議論の余地がある。それは、マトリックス溶出に関与し、したがって転移に関与してもよい一方で、それはまた、血管新生に悪影響を及ぼすアンギオスタチンの生成を通じて、腫瘍成長を阻害し得る（Ｇｏｒｒｉｎ−Ｒｉｖａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｇｏｒｒｉｎ  Ｒｉｖａｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。
【００７４】
肺がんでは、ＭＭＰ１２発現の帰結には、議論の余地がある。上皮細胞内のＭＭＰ１２の過剰発現は、炎症誘発性肺再構築で報告されている。ＭＭＰ１２の上方制御は、肺気腫から肺がんへの移行において役割を有してもよい（Ｑｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。動物実験は、ストロマまたはマクロファージによるＭＭＰ１２発現が、肺腫瘍の成長を抑制することを示唆する（Ａｃｕｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｈｏｕｇｈｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。しかし、肺腫瘍内のＭＭＰ１２の過剰発現が、再発、転移性疾患、および切除術後のより短い再発なし生存期間に相関するという報告もある（Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｈｏｆｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。
【００７５】
ジストニン（ＤＳＴ）
ＤＳＴ（ＢＰＡＧ１−ｅ）は、接着結合プラークタンパク質のプラキンタンパク質ファミリーのメンバーをコードする。ＢＰＡＧ１−ｅは、上皮組織で発現されて、ケラチン含有中間フィラメントを半接着斑（ＨＤ）に固着させる。ＨＤは、重層上皮および複合上皮内の上皮間質付着を促進する、多タンパク質接着複合体である。それらの機能の調節は、その中で細胞が基質から剥離して、運動性表現型を獲得する、創傷治癒およびがん浸潤におけるケラチノサイトの分化および移動などの、多様な生物学的過程において非常に重要である（Ｌｉｔｊｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。
【００７６】
悪性黒色腫は、悪性度の最も高い腫瘍タイプの１つである。ＢＰＡＧ１は、ヒト黒色腫細胞系（Ａ３７５およびＧ３６１）、および正常ヒトメラノサイトで発現される。黒色腫患者の血清中の抗ＢＰＡＧ１自己抗体レベルは、健常ボランティアの血清中よりも有意に高かった（ｐ＜０．０１）。抗ＢＰＡＧ１自己抗体は、黒色腫診断のための有望なマーカーであってもよい（Ｓｈｉｍｂｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。ＤＳＴは、乳がん浸潤と関連があった（Ｓｃｈｕｅｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。ＢＰＡＧ１遺伝子は、鼻咽頭がんＮＰＣの増殖、アポトーシス、浸潤、および転移に関与する可能性が高い（Ｆａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。
【００７７】
マトリックス−リモデリング関連５（ＭＸＲＡ５）
アドリカンとしてもまた知られているＭＸＲＡ５は、接着プロテオグリカンをコードして、ＥＣＭ再構築および細胞−細胞接着に関与する一群の遺伝子に属する（Ｒｏｄｎｉｎｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。ＭＸＲＡ５のがんにおける機能は知られていないが、皮膚、脳、肺、および卵巣などの多様な組織から得られた腫瘍で、ＭＸＲＡ５中の体細胞突然変異が同定されている。ＲＴ−ＰＣＲがアドリカン（ＭＸＲＡ５）について実施され、正常な結腸組織と比較して、結腸がんにおける過剰発現のマイクロアレイ所見が確認された（１３個の結腸直腸腫瘍および１３個の正常組織）（Ｚｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。最近の研究では、マトリックス−リモデリング関連５が、ＮＳＣＬＣ中で２番目に頻繁に変異する遺伝子であった（１番目はＴＰ５３）（Ｘｉｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。
【００７８】
サイクリン依存性キナーゼ４（ＣＤＫ４）／サイクリン依存性キナーゼ６（ＣＤＫ６）
ＣＤＫ４は、Ｓｅｒ／Ｔｈｒタンパク質キナーゼファミリーのメンバーである。これは、細胞周期Ｇ１相の進行に重要な、タンパク質キナーゼ複合体の触媒性サブユニットである。このキナーゼの活性は、細胞周期中のＧ１相からＳ相への転移に限定され、その発現は、主に転写レベルで調節される（Ｘｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。ＣＤＫ４およびＣＤＫ６酵素、そして例えばサイクリンなどのそれらの調節因子は、胎芽形成、恒常性、および発がんにおいて重要な役割を果たす（Ｇｒａｆ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。
【００７９】
肺がん組織では、正常組織と比較して、ＣＤＫ４タンパク質の発現レベルが有意に増大した（Ｐ＜０．００１）。ＣＤＫ４発現がより高い患者は、ＣＤＫ４発現が低い患者よりも、顕著により短い全生存期間を有した。多変量解析は、ＣＤＫ４の発現レベルが、肺がんのある患者の生存期間に対する、独立した予後指標（Ｐ＜０．００１）であることを示唆した。さらにＣＤＫ４発現の抑制は、細胞周期制御因子ｐ２１の発現もまた有意に上昇させた（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１ａ）。内在性Ｋ−Ｒａｓ発がん遺伝子を発現する肺細胞では、Ｃｄｋ４の除去によって、即時に老化反応が誘導されたが、Ｃｄｋ２またはＣｄｋ６の除去では誘導されなかった。単一Ｃｄｋ４対立遺伝子を発現する肺、またはその他のＫ−Ｒａｓ発現組織では、このような応答は起こらなかった。コンピュータ断層撮影スキャニングによって検出可能な、進行した腫瘍内のＣｄｋ４対立遺伝子を標的化することもまた、老化を誘導して腫瘍の進行を妨げる（Ｐｕｙｏｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。
【００８０】
ヘテロ核内リボ核タンパク質Ｈ１（Ｈ）（ＨＮＲＮＰＨ１）／ヘテロ核内リボ核タンパク質Ｈ２（Ｈ’）（ＨＮＲＮＰＨ２）
これらの遺伝子は、広範に発現されるヘテロ核内リボ核タンパク質（ｈｎＲＮＰ）のサブファミリーに属する。ｈｎＲＮＰはＲＮＡ結合タンパク質であり、それらはヘテロ核ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）と複合体形成する。これらのタンパク質は、核内のプレｍＲＮＡに付随して、ｍＲＮＡ前駆体プロセッシングと、ｍＲＮＡ代謝および輸送のその他の側面とに影響を与えるようである。
【００８１】
ｈｎＲＮＰＨ活性は、幹細胞パターンの再活性化を反映して、アポトーシス回避および侵襲性をはじめとする、高悪性度腫瘍挙動の複数の重要な側面を媒介するかもしれない、スプライシング発がんスイッチの中心としての悪性神経膠腫の発病と進行に関与するようである（Ｌｅｆａｖｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。ｈｎＲＮＰＨまたはＡ−Ｒａｆの低分子干渉ＲＮＡ媒介ノックダウンは、ＭＳＴ２依存アポトーシスをもたらした。対照的に、ｈｎＲＮＰＨまたはＡ−Ｒａｆのどちらかの強制発現は、エトポシドによって誘導されるアポトーシスを部分的に相殺した（Ｒａｕｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。ｈｎＲＮＰＨ／Ｈ’の上方制御は、例えば、膵臓の腺がん、肝細胞がん、および胃がんなどの、常態では低レベルの細胞質ｈｎＲＮＰＨ／Ｈ’を発現する少数の組織に見られる（Ｈｏｎｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。
【００８２】
テトラトリコペプチドリピート、アンキリンリピートおよびコイルドコイル含有２（ＴＡＮＣ２）
ＴＡＮＣファミリーはＴＡＮＣ１およびＴＡＮＣ２を含んでなり、それは２００５年に同定された（Ｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。マウスにおけるＴＡＮＣ１欠乏症は、海馬の棘突起密度を低下させ、空間的学習を損なった一方で、ＴＡＮＣ２欠乏症は、胚性致死を引き起こしたので、ＴＡＮＣファミリータンパク質は、樹状突起棘、空間的学習、および胚発生の調節に関与する。対照的に、培養神経細胞内のＴＡＮＣ１およびＴＡＮＣ２の過剰発現は、樹状突起棘および興奮性シナプスの密度を高める。ＴＡＮＣ１および２タンパク質は、主に脳で発現され、その中では、かなりの割合のタンパク質が小胞膜内に位置する（Ｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。
【００８３】
リングフィンガータンパク質２１３（ＲＮＦ２１３）
ＲＮＦ２１３は、Ｃ３ＨＣ４タイプのＲＩＮＧフィンガードメインを含有するタンパク質をコードして、これは２つの亜鉛原子を結合する特化したタイプのＺｎフィンガーであり、タンパク質−タンパク質相互作用の仲介に関与すると考えられる。
【００８４】
研究グループは、初めて、もやもや病に対する遺伝的感受性におけるＲＮＦ２１３の関与を示唆する証拠を提供した（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１ｂ）。別の研究は、漢人母集団において、ＲＮＦ２１３遺伝子が、もやもや病感受性に関連することを示した（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。
【００８５】
溶質輸送体ファミリー３４（リン酸ナトリウム）、メンバー２（ＳＬＣ３４Ａ２）
ＳＬＣ３４Ａ２は、ｐＨ感受性ナトリウム依存性リン酸輸送体である。十分に分化した腫瘍におけるＳＬＣ３４Ａ２遺伝子発現の上方制御は、卵巣発がんにおける細胞分化過程を反映してもよく、卵巣がんの診断および予後診断のための潜在的マーカーの役割を果たし得る（Ｓｈｙｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。ＲＴ−ＰＣＲは、乳頭甲状腺がんにおけるＳＬＣ３４Ａ２の発現増大を確認した（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０ｂ）。乳がん組織にはまた、正常組織と比較して、ＳＬＣ３４Ａ２遺伝子発現の顕著な増大もあった（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０ａ）。
【００８６】
ＳＥＴおよびＭＹＮＤドメイン含有３（ＳＭＹＤ３）
ヒストンＨ３リジン４特異的メチルトランスフェラーゼであるＳＭＹＤ３の上方制御が、結腸直腸がん（ＣＲＣ）および肝細胞がん（ＨＣＣ）の増殖において、重要な役割を果たすことが以前報告された。別の研究では、ほとんどの乳がん組織でもまた、ＳＭＹＤ３の発現が上昇することが明らかにされた。ＣＲＣおよびＨＣＣと同様に、この遺伝子に対する低分子干渉ＲＮＡによるＳＭＹＤ３のサイレンシングは、乳がん細胞の成長阻害をもたらし、ＳＭＹＤ３発現の増大もまた、乳がん細胞の増殖に必須であることが示唆された（Ｈａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。ＲＮＡ干渉によるＳＭＹＤ３のノックダウンは、ｃ−Ｍｅｔ発現を下方制御し、ＨＧＦによって誘導される細胞移動および浸潤を阻害する（Ｚｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。ＳＭＹＤ３は、ＨｅＬａ細胞増殖および移動／浸潤において重要な役割を果たし、それはヒト子宮頸がんにおける有用な治療標的であってもよい（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００８ｂ）。
【００８７】
アルド−ケト還元酵素ファミリー１、メンバーＣ１（ＡＫＲ１Ｃ１）
ＡＫＲ１Ｃ１とＡＫＲ１Ｃ２は、７つのアミノ酸残基のみが異なる（Ｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。ＡＫＲ１Ｃ１およびＡＫＲ１Ｃ２は、アンドロゲン、エストロゲン、およびプロゲステロンの活性と、対応する受容体の占有およびトランス活性化とを調節する（Ｐｅｎｎｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｓｔｅｃｋｅｌｂｒｏｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。肝臓特異的であるＡＫＲ１Ｃ４を除くＡＫＲ１Ｃ酵素は、異なる正常および病的組織で発現され、したがって肺、乳房、前立腺、子宮内膜のがん、骨髄性白血病などのいくつかの疾患に関連した（Ｂｒｏｚｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｂｙｒｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。シスプラチンに対する感受性は、上皮性肺がん細胞系（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０ｂ）およびＮＳＣＬＣ患者における、ＡＫＲ１Ｃレベルと関係するようであった（Ｋｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２；Ｓｔｅｗａｒｔ，２０１０）。したがって、ＡＫＲ１Ｃの過剰発現は、ヒト非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）における、予後不良および化学療法抵抗性の指標である（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。ＡＫＲ１Ｃ２の過剰発現はまた、前立腺がんにおける疾患進行に関連する（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。ＲＮＡｉによるＡＫＲ１Ｃ２発現の枯渇は、生体内および生体外で腫瘍形成を阻害し、それはＡＫＲ１Ｃ２  ｓｉＲＮＡが、肝がん発症遮断において重要な役割を果たすかもしれないことを強く示唆する（Ｄｏｎｇ−Ｄｏｎｇ，２００７）。
【００８８】
レティキュロカルビン１、ＥＦ−ハンドカルシウム結合ドメイン（ＲＣＮ１）／レティキュロカルビン３、ＥＦ−ハンドカルシウム結合ドメイン（ＲＣＮ３）
レティキュロカルビン１は、ＥＲの管腔内に位置するカルシウム結合タンパク質である。免疫組織化学的検査は、胎児および成人の様々な臓器におけるＲＣＮの広範な分布を実証し、大部分は、内分泌および外分泌器官にあった。ＲＣＮの過剰発現は、腫瘍形成、腫瘍浸潤、および薬剤耐性で役割を有してもよい（Ｆｕｋｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。レティキュロカルビン１（ＲＣＮ１）は、内皮（ＥＣ）および前立腺がん（ＰＣａ）の双方の細胞系上にある、細胞表面関連タンパク質である。細胞表面のＲＣＮ１発現は、骨髄内皮細胞の腫瘍壊死因子α処理によって、上方制御された（Ｃｏｏｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。ＲＣＮ１は、結腸直腸がん（ＣＲＣ）において上方制御され、がん細胞内またはがん細胞近くの間質細胞内に局在する。それは、ＣＲＣマーカーの新規候補であり得る（Ｗａｔａｎａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。ＲＣＮ３は、分泌経路に局在する複数ＥＦハンドＣａ２＋結合タンパク質のＣＲＥＣ（Ｃａｂ４５／レティキュロカルビン／ＥＲＣ４５／カルメニン）ファミリーのメンバーである（Ｔｓｕｊｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。乏突起膠腫中では、ＲＣＮ３が、潜在的に重要な候補遺伝子として示唆される。しかしＲＣＮ３の機能については、ほとんど知られていない（Ｄｒｕｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。
【００８９】
インターロイキン８（ＩＬ８）
ＩＬ８は、炎症応答の主要な媒介物の１つである、ＣＸＣファミリーのケモカインである。このケモカインは、いくつかの細胞型によって分泌される。これは化学誘引物質として機能し、強力な血管新生因子でもある。ＣＸＣ（ＥＬＲ＋）ケモカイン様ＩＬ８は、血管新生を誘導し、ＮＳＣＬＣなどの血管新生表現型を有するがんにおいて、重要であってもよい（Ａｒｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。最近、腫瘍由来ＩＬ８は、原発腫瘍（乳がん、大腸がん、および黒色腫腫瘍）に戻る循環腫瘍細胞の誘引剤の機能を果たして、より高悪性度の腫瘍表現型をもたらすことが分かった（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。ＩＬ−８レベルは、診断前数年間の肺がんリスクと関係がある。ＩＬ−８とＣＲＰの組み合わせは、引き続く肺がん予測におけるより確固とした生物マーカーである（Ｐｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。ＫＲＡＳまたはＥＧＦＲの活性化変異は、ＮＳＣＬＣにおけるＩＬ−８発現を上方制御して；ＩＬ−８は、男性喫煙者高齢患者からのＮＳＣＬＣ、胸膜が関与するＮＳＣＬＣ、およびＫＲＡＳ変異腺がんで高度に発現され；ＩＬ−８は、発がん性ＫＲＡＳ駆動ＮＳＣＬＣ中で、細胞の成長および移動における役割を果たす（Ｓｕｎａｇａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。
【００９０】
ピリミジン性受容体Ｐ２Ｙ、Ｇ−タンパク質共役型、６（Ｐ２ＲＹ６）
Ｐ２ＲＹ６は、Ｇタンパク質共役型受容体ファミリーに属する。このファミリーは、場合によっては、様々なアデノシンおよびウリジンヌクレオチドと重複する、異なる薬理学的選択性がある、いくつかの受容体サブタイプを有する。Ｐ２Ｙ６サブタイプは、胎盤で特に高レベルで発現され、Ｐ２Ｙ６が胎盤機能において重要な役割を果たすことが示唆される。しかし、胎盤内のＰ２Ｙ６の細胞局在は、知られていない。Ｐ２Ｙ６は、栄養膜の発達、分化、および新生物において、重要な役割を果たしてもよい（Ｓｏｍｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。肺上皮の炎症応答におけるピリミジン活性化Ｐ２Ｙ受容体の重要な役割が、示唆された（Ｓｃｈａｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。
【００９１】
ＨＥＣＴ、ＵＢＡおよびＷＷＥドメイン含有１、Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼ（ＨＵＷＥ１）
ＨＵＷＥ１は、ＨＥＣＴＥ３ユビキチンリガーゼファミリーのメンバーをコードする。ＨＥＣＴドメインはＣ末端にあり、中間体ユビキチン−チオエステル結合を形成する活性部位システインを含有する。
【００９２】
ＡＲＦ−ＢＰ１（ＨＵＷＥ１）は、ＡＲＦのｐ５３非依存性およびｐ５３依存性の双方の腫瘍サプレッサー機能に重要な媒介物である。したがって、ＡＲＦ−ＢＰ１は、ｐ５３状態にかかわりなく、腫瘍内の治療的介入の潜在的標的の役割を果たしてもよい（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００５ａ）。ＡＲＦ−ＢＰ１の不活性化は、ｐ５３を安定化してアポトーシスを誘導した（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。ＨＵＷＥ１（ＨｅｃｔＨ９）は、複数のヒト腫瘍で過剰発現されて、腫瘍細胞のサブセットの増殖に必須である（Ａｄｈｉｋａｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１ａ）。乳がんでは、ＨＵＷＥ１は、関連予後因子および臨床転帰と有意に相関した（Ｃｏｎｆａｌｏｎｉｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。
【００９３】
バーシカン（ＶＣＡＮ）
ＶＣＡＮは、アグリカン／バーシカンプロテオグリカンファミリーのメンバーである。ＶＣＡＮは、ヒアルロナン、テネイシン、フィビュリン−１、フィブロネクチン、ＣＤ４４およびＬ−セレクチン、フィブリリン、インテグリン、およびリンクタンパク質をはじめとする、細胞外基質のいくつかの分子と関わりがあることが知られている（Ｚｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。ＶＣＡＮは、多様な組織で発現される。これは組織成長の初期段階で高度に発現され、組織成熟後にはその発現が低下する。その発現はまた、創傷修復および腫瘍成長においても上昇する（Ｇｈｏｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。ＲＮＡ干渉によるヒト肺腺がん（Ａ５４９）細胞内のＶＣＡＮノックダウンは、生体内で腫瘍成長を有意に阻害したが、生体外では阻害しなかった（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。ＶＣＡＮは、ｐ５３の直接標的である。ＶＣＡＮの高度発現はまた、初期段階前立腺がんの、そして乳がんの、腫瘍周囲間質組織でも発見されており、それは高悪性度腫瘍挙動と関連付けられている（Ｙｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。
【００９４】
ドローシャ、リボヌクレアーゼＩＩＩ型（ＤＲＯＳＨＡ）
ドローシャは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と相互作用して、ＲＮＡｉ経路の一部として相補的メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の切断を誘導することで、多種多様なその他の遺伝子を調節する細胞によって天然に発現される、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、または短いＲＮＡ分子のプロセッシング開始に関与するクラス２ＲＮａｓｅ  ＩＩＩ酵素である。マイクロＲＮＡ分子は、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡとして知られている長いＲＮＡ一次転写産物として合成され、それはドローシャによって切断されて、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡとして知られている、約７０塩基対長の特徴的なステムループ構造が生じる（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。ドローシャは、マイクロプロセッサ複合体と称されるタンパク質複合体の一部として存在し、それは二本鎖ＲＮＡ結合タンパク質パシャ（ＤＧＣＲ８とも称される）（Ｄｅｎｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）もまた含有し、それはドローシャ活性に必須であり、適切なプロセッシングに必要なｐｒｉ−ｍｉＲＮＡの一本鎖フラグメントを結合できる（Ｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。ヒトドローシャは、それがリボソームＲＮＡ前駆体プロセッシングに関与する核ｄｓＲＮＡリボヌクレアーゼと同定された２０００年に、クローン化された（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。ドローシャは、同定およびクローン化された、最初のヒトＲＮａｓｅ  ＩＩＩ酵素であった。ｍｉＲＮＡのプロセッシングと活性に関与するその他の２つのヒト酵素は、ダイサーおよびアルゴノートタンパク質である。ドローシャおよびパシャはどちらも細胞核に局在し、そこでｐｒｉ−ｍｉＲＮＡからｐｒｅ−ｍｉＲＮＡへのプロセッシングが起こる。次に、この後者の分子は、細胞質内でＲＮａｓｅダイサーによってさらにプロセシングされて、成熟ｍｉＲＮＡになる（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。ドローシャおよびその他のｍｉＲＮＡプロセッシング酵素は、がんの予後に重要であってもよい（Ｓｌａｃｋ  ａｎｄ  Ｗｅｉｄｈａａｓ，２００８）。
【００９５】
プレクストリン相同ドメイン含有、ファミリーＡ（ホスホイノシチド結合特異的）メンバー８（ＰＬＥＫＨＡ８）
ホスファチジルイノシトール−４−リン酸アダプター２（ＦＡＰＰ２＝ＰＬＥＫＨＡ８）の遺伝子は、小胞の成熟およびトランスゴルジ体から原形質膜への輸送に関与するとされているプレクストリン相同領域がある、細胞質脂質トランスフェラーゼをコードする（Ｃａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。ＦＡＰＰ２遺伝子を標的とするリボザイムの大腸がん細胞への導入は、Ｆａｓ作動性抗体の存在下で、それらのアポトーシスを誘導した。また、ＦＡＰＰ２  ｓｉＲＮＡ形質移入神経膠腫および乳房腫瘍細胞は、アポトーシスに顕著な増大を示した（Ｔｒｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。その後の研究は、ゴルジ装置におけるスフィンゴ糖脂質代謝に関与する、脂質輸送タンパク質としてのＦＡＰＰ２の役割に脚光を当てた（Ｄ’Ａｎｇｅｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。ホスホイノシトール４−リン酸アダプタータンパク質２（ＦＡＰＰ２）は、スフィンゴ糖脂質（ＧＳＬ）生成に重要な役割を果たし、そのＣ末端領域を使用して、新規合成グルコシルセラミドをさらなる同化処理のために、シスゴルジ体内の細胞質ゾルに面するグルコシルセラミドシンターゼから搬出する（Ｋａｍｌｅｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。
【００９６】
アセチルＣｏＡカルボキシラーゼα（ＡＣＡＣＡ）
ＡＣＡＣＡは、脂肪酸合成の律速段階であるアセチルＣｏＡからマロニルＣｏＡへのカルボキシル化を触媒する、ビオチン含有酵素である（Ｔｏｎｇ  ａｎｄ  Ｈａｒｗｏｏｄ，Ｊｒ．，２００６）。ＡＣＡＣＡの上方制御は複数のヒトがんで認識されており、迅速な成長と増殖のために、脂質生成を促進してがん細胞の要求を満たす。したがってＡＣＡＣＡは、がん介入のための強力な標的として効果的であるかもしれず、代謝疾患治療のために開発された阻害剤が、がん治療のための潜在的治療薬になり得る（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０ａ）。２つの研究が、ＲＮＡ干渉によるＡＣＡＣＡのサイレンシングが、ＦＡＳＮ遺伝子発現のサイレンシング後に観察されたのとほぼ同程度に、成長阻害を引き起こして細胞死を誘導することを示している（Ｂｒｕｓｓｅｌｍａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｃｈａｊｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。ＡＣＡＣＡのアロステリック阻害剤であるＴＯＦＡ（５−テトラデシルオキシ−２−フロ酸）は、肺がん細胞ＮＣＩ−Ｈ４６０と大腸がん細胞ＨＣＴ−８およびＨＣＴ−１５に対して細胞傷害性であり、アポトーシスを誘導する（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００９ａ）。別の非常に強力なＡＣＡＣＡ阻害剤であるソラフェンＡは、脂質生成をブロックして、前立腺がん細胞内の脂肪酸酸化を促進する。がん細胞は、増殖を停止して究極的に死滅する（Ｂｅｃｋｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。これらの知見は、マロニルＣｏＡの蓄積を以外に、脂質生成それ自体の阻害が、がん細胞死滅を引き起こしてもよく、最終的にＡＣＡＣＡが、抗腫瘍療法の標的であってもよいことを示唆する（Ｂｒｕｓｓｅｌｍａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。
【００９７】
インテグリン、α１１（ＩＴＧＡ１１）
インテグリンは、細胞の増殖、分化、および生存をはじめとする、多様な細胞および発達過程、ならびに発がん、がん細胞浸潤、および転位において、重要な役割を果たす。インテグリンα１１（ＩＴＧＡ１１／α１１）は、間質線維芽細胞に局在し、通常、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）で過剰発現される。α１１  ｍＲＮＡは、肺腺がんおよび扁平上皮がんの双方で過剰発現された（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。α１１は、線維芽細胞が生体内でＮＳＣＬＣ細胞の成長を促進する能力において重要な役割を果たし、このような活性は、ある程度、そのＩＧＦ２発現の調節によって媒介されることが報告されている（Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。ＮＳＣＬＣ患者の臨床病理学的特徴では、ｈＭＴＨ１、ＳＰＤ、ＨＡＢＰ２、ＩＴＧＡ１１、ＣＯＬ１１Ａ１、およびＣＫ−１９の過剰発現が、病理学的病期と有意に相関した（ｐ＜０．０５）。さらに、ｈＭＴＨ１、ＳＰＤ、ＩＴＧＡ１１、およびＣＯＬ１１Ａ１の過剰発現は、リンパ節転移および予後不良と相関した（Ｃｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。
【００９８】
コラーゲン、ＸＩＩ型、α１（ＣＯＬ１２Ａ１）
ＣＯＬ１２Ａ１遺伝子は、ＦＡＣＩＴ（中断された三重らせんがある原線維関連コラーゲン）コラーゲンファミリーのメンバーである、ＸＩＩ型コラーゲンのα鎖をコードする。ＸＩＩ型コラーゲンは、Ｉ型コラーゲンに結合して見られるホモ三量体であり、結合は、コラーゲンＩ原線維と周囲のマトリックスの間の相互作用を修飾すると考えられる（Ｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）。ＣＯＬ１２Ａ１は基底膜調節に関与して、原線維とその他の基質要素の間に、特異的分子橋を提供してもよい（Ｔｈｉｅｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。ＣＯＬ１２Ａ１は、心臓、胎盤、肺、骨格筋、および膵臓（Ｄｈａｒｍａｖａｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）で、関節軟骨および骨端軟骨をはじめとする多様な結合組織（Ｇｒｅｇｏｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｗａｌｃｈｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ｗａｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）で、発現される。ＣＯＬ１２Ａ１は、マイクロサテライト不安定性が低いまたは皆無である安定グループと比較して、マイクロサテライト不安定性が高い腫瘍において下方制御された（Ｏｒｔｅｇａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。
【００９９】
エラスターゼ、好中球発現（ＥＬＡＮＥ）
ＥＬＡ２（エラスターゼ２、好中球）としてもまた知られている好中球エラスターゼ（または白血球エラスターゼ）は、キモトリプシンと同じファミリーのセリンプロテイナーゼであり、広範な基質特異性を有する。それは炎症中に好中球によって分泌されて、細菌および宿主組織を破壊する（Ｂｅｌａａｏｕａｊ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。慢性閉塞性肺疾患の発症における主要な当事者であるヒト好中球エラスターゼ（ＥＬＡＮＥ）は、最近、非小細胞肺がん進行に関与しているとされている。これは、（ｉ）細胞内で、例えばアダプター分子インスリン受容体基質−１（ＩＲＳ−１）を排除する、（ｉｉ）細胞表面で、ＣＤ４０などの受容体を加水分解する、（ｉｉｉ）細胞外空隙内で、エラスチンフラグメント、すなわちがん細胞侵襲性および血管新生を強力に刺激するモルフォエラストキンを生成する、のいくつかのレベルで作用し得る（Ｍｏｒｏｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。好中球エラスターゼは、腫瘍細胞内のエンドソーム区画にアクセスして、インスリン受容体基質−１（ＩＲＳ−１）を分解することで、ヒトおよびマウス肺腺がんの双方で腫瘍細胞増殖を直接誘導した（Ｈｏｕｇｈｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。
【０１００】
セルピンペプチダーゼ阻害剤、分岐群Ｂ（卵白アルブミン）、メンバー３（ＳＥＲＰＩＮＢ３）
ＳＥＲＰＩＮＢ３とも称される扁平上皮細胞がん抗原（ＳＣＣＡ）は、セリンプロテアーゼ阻害剤（セルピン）の高分子量ファミリーのメンバーである（Ｓｕｍｉｎａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）。頭頸部組織がんおよびその他の上皮性がんにおける、高レベルが報告されている（Ｔｏｒｒｅ，１９９８）。ＳＣＣＡは、腫瘍周囲組織と比較して、腫瘍内で過剰発現されることが報告されており、ＨＣＣの組織学的検出のための潜在的マーカーとしての役割が示唆される（Ｐｏｎｔｉｓｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。セルピンＢ３／Ｂ４、特にセルピンＢ４は、異常な上皮性増殖において重要な役割を果たすようである。セルピンＢ３／Ｂ４の評価は、特に肺がんに対する感受性が増大している患者において、疾患進行を予測する上での予後診断的的価値を有し得る（Ｃａｌａｂｒｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。ＳＣＣＡ１（ＳＥＲＰＩＮＢ３）は、リソソーム損傷によって誘導される細胞死を阻害する一方で、細胞死受容体アポトーシス経路とは独立してカスパーゼ−８を活性化することで、細胞をＥＲストレスに対して感作させる（Ｕｌｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。いくつかの所見は、ＳＥＲＰＩＮＢ３が、表皮バリア中断の誘導において重要な役割を果たすことを示唆する。ＳＥＲＰＩＮＢ３は、表皮内バリア機能の主要決定要因であってもよい（Ｋａｔａｇｉｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。
【０１０１】
キネシンファミリーメンバー２６Ｂ（ＫＩＦ２６Ｂ）
キネシンは、真核生物細胞に見られる、モータータンパク質のクラスに属するタンパク質である。キネシンは、微小管フィラメントに沿って移動し、ＡＴＰの加水分解によってエネルギー供給される（したがってキネシンはＡＴＰアーゼである）。キネシンファミリー遺伝子であるＫｉｆ２６ｂは、Ｓａｌｌ１の下流標的である（Ｎｉｓｈｉｎａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。Ｋｉｆ２６ｂは、尿管芽に接触する間葉細胞の付着を調節するので、腎臓発生に必須である。Ｋｉｆ２６ｂの生体外過剰発現は、非筋肉ミオシンとの相互作用を通じて細胞接着の増大を引き起こした（Ｔｅｒａｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２；Ｕｃｈｉｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。
【０１０２】
強直症、進行性ホモログ（マウス）（ＡＮＫＨ）
ＡＮＫＨ（進行性強直症のヒトホモログ）は、細胞膜を通じた無機ピロリン酸（ＰＰｉ）輸送を調節する（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００８ａ）。いくつかのデータは、ＡＮＫＨの生体外および生体内発現および機能が低酸素環境で抑制されること、そして効果がＨＩＦ−１によって調節されることを示唆する（Ｚａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。ヒトＡＮＫＨ遺伝子は、組織特異的様式で生体内で発現され、ｍＲＮＡ発現の最大レベルは、脳、心臓、および骨格筋に見られる（Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。ＡＮＫＨ遺伝子の変異は、常染色体優性頭蓋骨幹端異形成症と関連付けられている（Ｋｏｒｎａｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。ＡＮＫＨは、増幅のない子宮頸がん細胞系と比較して、増幅のある細胞系で有意に上方制御された（Ｋｌｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。染色体アーム５ｐ上の領域のゲノム増幅が、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）で頻繁に観察されており、このアーム上の複数発がん遺伝子の存在が暗示される。Ｃｏｅ  ｅｔ  ａｌ．は、従来のスクリーニングによる検出を回避した微小欠失の同定と、新規推定発がん遺伝子としてのＴＲＩＯおよびＡＮＫＨの同定を記載した（Ｃｏｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。
【０１０３】
核外ＲＮＡ輸送因子１（ＮＸＦ１）
ヒト細胞では、ｍＲＮＡ輸送因子ＮＸＦ１は、核質内および核膜孔複合体にある（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１ｂ）。核内転写部位から細胞質内翻訳部位へのｍＲＮＡの輸送は、真核生物の遺伝子発現における必須過程である。ヒト細胞内では、ｍＲＮＡ輸送因子ＮＸＦ１（ＴＡＰとしてもまた知られている）が、ｍＲＮＡ、ｍＲＮＡアダプタータンパク質、核膜孔複合体のフェニルアラニン−グリシン（ＦＧ）リピートに同時に結合することで、ｍＲＮＡ転写物に同伴して核を出る（Ｋｅｌｌｙ  ａｎｄ  Ｃｏｒｂｅｔｔ，２００９）。ＮＸＦ１は、ＮＰＣを通じてタンパク質カーゴ、ｔＲＮＡ、およびマイクロＲＮＡを輸送するカリオフェリンタンパク質と、構造的または機構的類似点を有しない多ドメインタンパク質であることから、核輸送因子の中でもユニークである。ＮＸＦ１によるｍＲＮＡ輸送は、ＧＴＰａｓｅ  Ｒａｎとは無関係に起こる過程である（Ｇｒｕｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。ｍＲＮＰの核外輸出は、ｍＲＮＰに結合し、ＦＧ−ヌクレオポリンとの一過性の相互作用によって、核孔（ＮＰＣ）中心チャンネルを通じたそれらの移行を媒介する、ＮＸＦ１などの輸送因子によって媒介される（Ｗｉｃｋｒａｍａｓｉｎｇｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。ｍＲＮＡは、ＮＸＦ１／ＴＡＰが関与するバルク輸送経路、または染色体領域メンテナンス１（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｒｅｇｉｏｎ  ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  １）（ＣＲＭ１）が関与するより特化した経路のどちらかによって、輸送され得る（Ｓｉｄｄｉｑｕｉ  ａｎｄ  Ｂｏｒｄｅｎ，２０１２）。
【０１０４】
Ｇタンパク質シグナル伝達制御因子４（ＲＧＳ４）
ＲＧＳ４は、ＧＴＰアーゼ加速タンパク質の機能を果して、μおよびδオピオイド受容体（それぞれＭＯＲおよびＤＯＲ）シグナル伝達を調節する。ＲＧＳ４のオピオイド作動薬誘導低下は、ユビキチン−プロテアソーム経路を通じて起こり、モルヒネ依存状態における細胞恒常性維持に寄与してもよい（Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｔｒａｙｎｏｒ，２０１１）。ＲＧＳ４は、β−細胞機能の調節において重要な役割を果たす（Ｒｕｉｚ，Ｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。Ｘｉｅ  ｅｔ  ａｌ．は、ＲＧＳ４が、転移カスケードの重要な段階である乳がんの移動および浸潤の新規サプレッサーであると提言した（Ｘｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。ＲＧＳ４は、甲状腺がんで過剰発現された。甲状腺がん細胞におけるその発現レベルの効果的な下方制御は、甲状腺がん細胞の生存度を有意に減衰させ、甲状腺発がんにおけるＲＧＳ４の重要な役割が示唆される（Ｎｉｋｏｌｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。ＲＧＳ４は、ヒト膵臓腫瘍細胞系で差次的に発現されて、膵臓がんの局所性腫瘍浸潤と肝臓転移の可能なマーカー遺伝子であることが分かった（Ｎｉｅｄｅｒｇｅｔｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。ＲＧＳ４の過剰発現は、Ｇタンパク質媒介ｐ３８ＭＡＰＫ活性化を選択的に阻害し、結果的に、上皮細胞の増殖、移動、および血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）発現を低下させることで、肺上皮細胞管形成を遅延させ変化させた（Ａｌｂｉｇ  ａｎｄ  Ｓｃｈｉｅｍａｎｎ，２００５）。
【０１０５】
グルタミン−フルクトース−６−リン酸トランスアミナーゼ２（ＧＦＰＴ２）
ＧＦＰＴ２は、神経突起伸長、初期神経細胞発生、神経ペプチドシグナル伝達／合成、およびニューロン受容体に関与する（Ｔｏｎｄｒｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。ＧＦＰＴ２中の遺伝的変異は、ＩＩ型糖尿病および糖尿病性腎障害に関連する（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。さらにＧＦＰＴ２中のＳＮＰの結合は、酸化経路の調節に関与する遺伝子が、糖尿病性慢性腎不全の大きな要因になり得ることを示唆する（Ｐｒａｓａｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。ＧＦＰＴ２遺伝子のＤＮＡメチル化は、原発性急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）サンプル中で検証された。複数のＣｐＧアイランドのメチル化がある患者は、より好ましくない全生存期間を有した（Ｋｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。ＧＦＰＴ２は、グルタミン代謝において役割を有し、間葉細胞系でより高度に発現されることが観察された。グルタミン代謝は、腫瘍進行において重要な役割を果たしてもよく、細胞代謝経路の阻害が、エピジェネティック療法の一形態であってもよい（Ｓｉｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。
【０１０６】
脳内皮細胞接着分子（ＣＥＲＣＡＭ）
ＣＥＲＣＡＭは、内皮細胞表面に局在し（Ｓｔａｒｚｙｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）、家族性特発性側弯症と関連があると同定された９ｑ候補領域である、染色体９ｑ３４．１１上にマップされる（Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。ＣＥＥＣＡＭ１遺伝子は、神経系内および唾液腺、膵臓、肝臓、および胎盤などのいくつかの分泌組織で幅広く転写される（Ｓｃｈｅｇｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。ＣＥＲＣＡＭタンパク質は、ＣｏｌＧａｌＴ酵素ＧＬＴ２５Ｄ１およびＧＬＴ２５Ｄ２に、構造的に類似する。しかしその機能は依然として分かっていないが、関連するＧＬＴ２５Ｄ１タンパク質と機能的に異なるようであり、タンパク質は、ＧＬＴ２５Ｄ１およびＧＬＴ２５Ｄ２タンパク質のようなグリコシルトランスフェラーゼとしては、機能しない（Ｐｅｒｒｉｎ−Ｔｒｉｃａｕｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。
【０１０７】
ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−α−Ｄ−ガラクトサミン：ポリペプチドＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ２（ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２）（ＧＡＬＮＴ２）
ＧＡＬＮＴ２は、ゴルジ体中でペプチドのムチンタイプＯ−グリコシル化の第一段階を触媒する。これらの酵素は、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）を、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃから標的タンパク質中のセリンまたはスレオニンのヒドロキシル基に転移する（Ｐｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。ＧＡＬＮＴ２は、検査された膵臓、結腸、胃、および乳房からのヒト腺がん細胞系のほとんどまたは全てにおいて、低レベルで構成的に発現された（Ｓｕｔｈｅｒｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。研究は、Ｏ−グリカンおよびＧＡＬＮＴ遺伝子が、多様な生物学的機能およびヒト疾患発症において、重要な役割を果たすことを示した。上皮性卵巣がん（Ｔｅｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）および冠動脈疾患（Ｗｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）のリスクは、ＧＡＬＮＴ２の単一ヌクレオチド多形性と関連付けられている。グリコシルトランスフェラーゼ活性の特定の変化に起因する、細胞表面糖タンパク質の異常なグリコシル化は、通常は、がんの浸潤および転移に関係する。ＧＡＬＮＴ２は、胃がん（Ｈｕａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）、肝細胞がん（ＨＣＣ）（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１ｂ）、およびヒト悪性神経膠腫（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１ａ）における、腫瘍の移動と浸潤に関与する。
【０１０８】
ヘテロ核内リボ核タンパク質Ｍ（ＨＮＲＮＰＭ）
ＨＮＲＮＰＭ遺伝子は、広範に発現されるヘテロ核内リボ核タンパク質（ｈｎＲＮＰ）のサブファミリーに属する。ＨＮＲＮＰＭは、ヒトｈｎＲＮＰ複合体の豊富な構成要素であり、それは、それ自身のｍＲＮＡ前駆体スプライシングを調節することで（Ｈａｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）、または代案の線維芽細胞成長因子受容体２のスプライシング調節に影響を及ぼすことで（Ｈｏｖｈａｎｎｉｓｙａｎ  ａｎｄ  Ｃａｒｓｔｅｎｓ，２００７）、ｍＲＮＡ前駆体のスプライシングに影響を及ぼし得る。生体外精製スプライソソームのプロテオミクス解析は、プレスプライセオソームＨ複合体中に、およびスプライソソーム集合全体にわたり、ＨＮＲＮＰＭを検出した（Ｒａｐｐｓｉｌｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｗａｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。ＨＮＲＮＰＭは、ＣＤＣ５Ｌ／ＰＬＲＧ１スプライセオソーム部分複合体との相互作用を通じて、スプライソソーム機構に関与する（Ｌｌｅｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。ヒトがん細胞では、いくつかの結果が、ＩＭＰ−３およびＨＮＲＮＰＭの細胞質保持が、増殖に顕著な低下をもたらすことを示す。核ＩＭＰ−３−ＨＮＲＮＰＭ複合体は、ＣＣＮＤ１、Ｄ３、およびＧ１の効率的合成と、ヒトがん細胞増殖に重要である（Ｒｉｖｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。
【０１０９】
バソヌクリン１（ＢＮＣ１）
バソヌクリンは、非常に限られた組織分布があるジンクフィンガータンパク質である（Ｔｓｅｎｇ，１９９８）。これまでのところ、バソヌクリンは、重層扁平上皮（皮膚、経口上皮、食道、膣、および角膜）の基底ケラチノサイトで、そして精巣および卵巣の配偶子形成細胞で、主に検出されている（Ｔｓｅｎｇ  ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎ，１９９４；Ｗｅｉｎｅｒ  ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎ，１９９８）。今や、バソヌクリンが、ｒＲＮＡ遺伝子（ｒＤＮＡ）の細胞型特異的転写因子であるというかなりの証拠がある。バソヌクリンのジンクフィンガーは、ｒＤＮＡプロモーター内の３つの進化的に保存された部位と相互作用する（Ｉｕｃｈｉ  ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎ，１９９９；Ｔｓｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。ＣｐＧメチル化によるエピジェネティックな調節は、腫瘍形成において、ならびにがん治療に対する応答において、重要な役割を有する。ＢＮＣ１は、放射線抵抗性のＨ１２９９ヒト非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）細胞系において、低メチル化された。Ｈ１２９９細胞内のＢＮＣ１  ｍＲＮＡ発現の抑制は、これらの細胞の電離放射線に対する抵抗性もまた低下させた（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０ａ）。ＢＮＣ１の異常なＤＮＡメチル化は、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）サンプルでもまた、検出された（Ｔｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。腎細胞がん（ＲＣＣ）では、ＢＮＣ１のメチル化は、腫瘍のサイズ、病期または等級とは無関係に、より不良な予後と関係した（Ｍｏｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。
【０１１０】
ＦＫ５０６結合タンパク質１０、６５ｋＤａ（ＦＫＢＰ１０）
ＦＫ５０６結合タンパク質１０（ＦＫＢＰ１０）は、ＦＫＢＰタイプのペプチジル−プロリルシス／トランスイソメラーゼファミリーに属する。それは小胞体内に位置して、分子シャペロンの機能を果たす（Ｉｓｈｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，２００８；Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。それは、肺の発達中に高度に発現され、肺傷害後に、細胞外基質タンパク質との協調様式で、再活性化され得る（Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。
【０１１１】
フリズルドファミリー受容体１（ＦＺＤ１）、フリズルドファミリー受容体２（ＦＺＤ２）、フリズルドファミリー受容体７（ＦＺＤ７）
遺伝子ＦＺＤ２、ＦＺＤ１、およびＦＺＤ７は、全てフリズルド遺伝子ファミリーに由来し；この遺伝子ファミリーのメンバーは、Ｗｎｔシグナル伝達タンパク質の受容体である、７つの膜貫通領域タンパク質をコードする。
【０１１２】
ＦＺＤ２遺伝子の発現は発生学的に調節されるようであり、胎児の腎臓および肺、そして成人の結腸および卵巣において、高レベルで発現される（Ｓａｇａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。
【０１１３】
ＦＺＤ１タンパク質は、シグナルペプチド、Ｎ末端細胞外領域内のシステイン富化ドメイン、７つの膜貫通ドメイン、およびＣ末端ＰＤＺドメイン結合モチーフを含有する。ＦＺＤ１転写物は、肺ならびに心臓、腎臓、膵臓、前立腺、および卵巣をはじめとする、様々な組織で発現される（Ｓａｇａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。フリズルド１および２受容体の発現は、乳がんにおいて上方制御されることが分かった（Ｍｉｌｏｖａｎｏｖｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。
【０１１４】
ＦＺＤ７タンパク質は、Ｎ末端シグナル配列、Ｆｚファミリーメンバーのシステイン富化細胞外ドメインの典型例である１０個のシステイン残基、７つの推定上の膜貫通ドメイン、およびＰＤＺドメイン結合モチーフがある細胞内Ｃ末端テールを含有する。ＦＺＤ７遺伝子の発現は、低分化型ヒト食道がんにおいて、ＡＰＣ機能を下方制御し、βカテニン媒介シグナルを増強してもよい（Ｓａｇａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。
【０１１５】
ＡＴＰアーゼ、Ｃａ＋＋輸送、心筋、速攣縮１（ＡＴＰ２Ａ１）、ＡＴＰアーゼ、Ｃａ＋＋輸送、心筋、速攣縮２（ＡＴＰ２Ａ２）
どちらの遺伝子（ＡＴＰ２Ａ１およびＡＴＰ２Ａ２）もＳＥＲＣＡＣａ（２＋）−ＡＴＰアーゼをコードする。筋小胞体（ＳＲ）１／ＥＲカルシウムＡＴＰアーゼ（ＳＥＲＣＡ）は、ＡＴＰ加水分解と、ＳＲ／ＥＲ膜を越えるカルシウム輸送とを連結するカルシウムポンプである（ＭａｃＬｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。ＳＥＲＣＡは、ＳＥＲＣＡ１（ＡＴＰ２Ａ１）、ＳＥＲＣＡ２（ＡＴＰ２Ａ２）、およびＳＥＲＣＡ３の３つの相同遺伝子によってコードされる（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。ＳＥＲＣＡが、アポトーシス、分化、および細胞増殖の過程に対してもまた、直接的影響を有してもよいことを示す、いくつかの証拠が浮上してきた（Ｃｈａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｓａｋｕｎｔａｂｈａｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。
【０１１６】
ＳＥＲＣＡ１をエンコードするＡＴＰ２Ａ１の変異は、増大する運動中の筋弛緩障害によって特徴付けられる、Ｂｒｏｄｙ病のいくつかの常染色体性劣性形態を引き起こす（Ｏｄｅｒｍａｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。
【０１１７】
ＡＴＰ２Ａ２は、異常な角質化と棘細胞離開によって特徴付けられる、稀な常染色体優性遺伝性皮膚疾患であるダリエー病と関係がある、ＡＴＰアーゼである（Ｈｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。ＡＴＰ２Ａ２の生殖細胞系変化は、肺および大腸がんに罹りやすくしてもよく、欠陥ＡＴＰ２Ａ２遺伝子は発がんに関与するかもしれない（Ｋｏｒｏｓｅｃ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。小細胞肺がん（Ｈ１３３９）およびアデノがん腫肺がん（ＨＣＣ）細胞系では、正常なヒト気管支上皮細胞系と比較して、ＥＲＣａ２＋の含有量が低下した。Ｃａ２＋含有量の低下は、カルシウムをＥＲに送り込むＳＥＲＣＡ２の発現低下と相関した（Ｂｅｒｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。ＡＴＰ２Ａ２は、結腸直腸がんＣＲＣ患者のための潜在的予後マーカーであり得る。それは循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）で検出され、術後再発は、遺伝子の過剰発現と有意に相関した（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。
【０１１８】
ラミニン、γ２（ＬＡＭＣ２）
細胞外基質糖タンパク質のファミリーであるラミニンは、基底膜の主要な非コラーゲン性構成物である。それらは、細胞接着、分化、移動、シグナル伝達、神経突起伸長、および転移をはじめとする、多種多様な生物学的過程に関与するとされている。ＬＡＭＣ２遺伝子は、基底膜領域の主要構成要素の１つであるラミニン−５の一部である、ラミニン−５γ２鎖をコードする。ＬＡＭＣ２は、胃がんにおいて、プロモーター脱メチル化によって頻繁に上方制御された（Ｋｗｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。ＬＡＭＣ２は、無血管黒色腫領域と比較して、血管性黒色腫領域で過剰発現されることが分かった（Ｌｕｇａｓｓｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。ＬＡＭＣ２は、膀胱がん転移の生物マーカーであり、その発現レベルは腫瘍悪性度と関係した（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００９ｂ）。ＬＡＭＢ３およびＬＡＭＣ２遺伝子は、３２の非ＳＣＬＣ細胞系の内２１（６６％）で同時発現されるが、１３のＳＣＬＣ細胞系ではその１つのみ（８％）で同時発現された。ＬＡＭＢ３およびＬＡＭＣ２遺伝子の同時発現はまた、検査された４症例の原発性非ＳＣＬＣ細胞の全てで観察されたが、対応する非がん性の肺細胞では観察されなかった（Ｍａｎｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。
【０１１９】
熱ショック７０ｋＤａタンパク質２（ＨＳＰＡ２）、熱ショック７０ｋＤａタンパク質８（ＨＳＰＡ８）
ＨＳＰＡ２は、乳がん（Ｍｅｓｔｉｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）、子宮頸がん（Ｇａｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０ａ）、膀胱尿路上皮がん（Ｇａｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０ｂ）、鼻咽頭がん（Ｊａｌｂｏｕｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）、および悪性腫瘍（Ｃｈｏｕｃｈａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）などのヒトがんのサブセットにおいて、異常なレベルで発現される潜在的がん促進タンパク質と同定されている。ＨＳＰＡ２遺伝子活性のいくらかのレベルはまた、数種のヒトがん（Ｓｃｉｅｇｌｉｎｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）に由来する細胞系でも観察された一方で、がん細胞内のＨＳＰＡ２遺伝子のサイレンシングは、成長停止と腫瘍形成性可能性低下をもたらした（Ｒｏｈｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｘｉａ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。さらにＨＳＰＡ２遺伝子の多形性は、肺がん発症リスクの増大と関係がある（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０ｂ）。ＨＳＰＡ２の過剰発現は、ヒト乳がん、子宮頸がん、および膀胱尿路上皮がんにおいて、細胞増殖の増大、芳しくない分化、およびリンパ節転位と相関する（Ｇａｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０ａ；Ｇａｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０ｂ；Ｍｅｓｔｉｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。
【０１２０】
ＨＳＰＡ８遺伝子は、熱誘導性メンバーと構成的発現メンバーの双方を含有する、熱ショックタンパク質７０ファミリーＨｓｃ７０のメンバーをコードする。ＨＳＰＡ８は新生ポリペプチドに結合して、正しいタンパク質折りたたみを促進する（Ｂｅｃｋｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）。Ｈｓｃ７０は分子シャペロンとして機能して、タンパク質の合成、折りたたみ、集合、細胞コンパートメント間輸送、および分解を助ける（Ｂｕｋａｕ  ａｎｄ  Ｈｏｒｗｉｃｈ，１９９８；Ｈａｒｔｌ  ａｎｄ  Ｈａｙｅｒ−Ｈａｒｔｌ，２００２）。Ｈｓｃ７０は非悪性乳腺細胞ならびに乳がん細胞（Ｋａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｖａｒｇａｓ−Ｒｏｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）で発現され、化学療法抵抗性がん細胞（Ｃｉｏｃｃａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２；Ｌａｚａｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）内のＨｓｐ／ｈｓｃ７０の過剰発現は、これらのタンパク質の可能な臨床マーカーに関する研究を促した（Ｃｉｏｃｃａ  ａｎｄ  Ｃａｌｄｅｒｗｏｏｄ，２００５）。この分泌されたｈｓｃ７０シャペロンには、細胞増殖における潜在的役割があり、それが、カテプシンＤを過剰発現するがん細胞におけるより高い腫瘍成長を説明するかもしれない（Ｎｉｒｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。さらにＲｕｉｓｉｎ  ｅｔ  ａｌ．は、この遺伝子の多形性と肺がんリスクの間の関連性を報告した（Ｒｕｓｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。
【０１２１】
液胞タンパク質ソーティング１３ホモログＢ（酵母）（ＶＰＳ１３Ｂ）
ＶＰＳ１３Ｂは、ゴルジ装置に局在する末梢膜タンパク質と同定され、それはそこでシスゴルジ体マトリックスタンパク質ＧＭ１３０と重なる。その細胞内局在に一致して、ＲＮＡｉを用いたＶＰＳ１３Ｂの枯渇は、ゴルジ体リボンのミニスタックへの断片化を引き起こす（Ｓｅｉｆｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。Ｋｏｌｅｈｍａｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）は、染色体８ｑ２２上のコーエン症候群危険領域内で、ＶＰＳ１３Ｂとしてもまた知られているＣＯＨ１遺伝子を同定した（Ｋｏｌｅｈｍａｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。ＶＰＳ１３Ｂ遺伝子中の機能喪失型変異は、常染色体性劣性コーエン症候群を引き起こす（Ｓｅｉｆｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。ＶＰＳ１３Ｂおよびその他の遺伝子の変異は、マイクロサテライト不安定性がある胃がんおよび結腸直腸がんで記載された（Ａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。
【０１２２】
ＣＳＥ１染色体分離１様（酵母）（ＣＳＥ１Ｌ）
細胞アポトーシス感受性（ＣＳＥ１Ｌ）遺伝子は、有糸分裂紡錘体チェックポイントならびに増殖およびアポトーシスをはじめとする、複数の細胞機構を調節することが実証されている。ＣＳＥ１Ｌは、細胞質および細胞核内の双方に位置する。核ＣＳＥ１Ｌは、主要な腫瘍サプレッサータンパク質であるｐ５３タンパク質の転写活性を調節する（Ｒａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。細胞質ＣＳＥ１Ｌは微小管と結合し；この結合は、浸潤突起の伸長を刺激して、腫瘍細胞の移動を促進することが示されている（Ｔａｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。ＣＳＥ１Ｌは、良性および悪性皮膚メラニン細胞病変（Ｂｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）、子宮内膜がん（Ｐｅｉｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）、卵巣がん（Ｂｒｕｓｔｍａｎｎ，２００４）、乳がん（Ｂｅｈｒｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）、膀胱尿路上皮がん（Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）などの大部分のがんで高度に発現され、その発現はがん進行と相関することが示されている。ＣＳＥ１Ｌのサイレンシングは、大腸がんのための可能な治療的アプローチであってもよい（Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。
【０１２３】
ジヒドロピリミジナーゼ様４（ＤＰＹＳＬ４）
ジヒドロピリミジナーゼ関連タンパク質４（ＤＰＹＳＬ４）は、海馬の神経細胞発達の制御因子であることが知られている。ＤＰＹＳＬ４は、歯芽形態形成における、歯の上皮細胞の成長調節、極性化、および分化に関与する（Ｙａｓｕｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。いくつかの研究は、微小管重合の阻害を通じた神経突起伸長可能性の低下におけるＤＰＹＳＬ４の役割を示し、神経細胞死に先だつ核凝縮中における、そのビメンチンとの新規関連性もまた明らかにした（Ａｙｌｓｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。多種多様な腫瘍で頻繁に変異するｐ５３腫瘍抑制遺伝子は、ゲノムの完全性の維持において重要な役割を果たす。ＤＰＹＳＬ４のｍＲＮＡおよびタンパク質発現は、どちらもｐ５３熟練細胞内の抗がん因子によって特異的に誘導された。ＤＰＹＳＬ４は、ＤＮＡ障害に応答して、ｐ５３によって制御されるアポトーシス誘導因子である（Ｋｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。
【０１２４】
Ｓｅｃ６１γサブユニット（ＳＥＣ６１Ｇ）
サブユニットＳＥＣ６１α、β、およびγを含んでなるヘテロ三量体のタンパク質チャンネルであるＳＥＣ６１γは、ＳＥＣ６１トランスロコンのメンバーである（Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ  ａｎｄ  Ｈｉｇｈ，１９９９）。ＳＥＣ６１複合体は、新生ポリペプチドのＥＲ管腔内への移行、ならびに膜貫通タンパク質のＥＲ二重層内への組み込みのための、膜貫通孔を形成する（Ｏｓｂｏｒｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。ＳＥＣ６１γは、腫瘍細胞生存に、そして小胞体ストレスへの細胞性応答に、必須である。さらにそれは、悪性細胞で高度に過剰発現され、正常細胞ではほぼ不在である（Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。ＳＥＣ６１γ発現のノックダウンは、アポトーシス、ＥＧＦＲ／ＡＫＴ生存シグナル伝達抑止（Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）、ならびに腫瘍細胞の成長阻害をもたらした（Ｎｅｉｄｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。
【０１２５】
ＯＲＭ１様１（Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））（ＯＲＭＤＬ１）
ヒト遺伝子（ＯＲＭＤＬ１、ＯＲＭＤＬ２、およびＯＲＭＤＬ３）は、成人および胎児組織で広範に発現される。それらは、ＥＲ中のタンパク質折りたたみに関与する可能性が高い小胞体内にアンカーされる、膜貫通タンパク質をコードする。ゲノム配列解析によって、Ｈｊｅｌｍｑｖｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）は、ＯＲＭＤＬ１遺伝子を染色体２ｑ３２．２にマップした（Ｈｊｅｌｍｑｖｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。ＯＲＭＤＬタンパク質は、哺乳類細胞におけるセラミド生合成の主要制御因子である（Ｓｉｏｗ  ａｎｄ  Ｗａｔｔｅｎｂｅｒｇ，２０１２）。ＯＲＭＤＬ１は、プレセニリン１（ＰＳ１）変異に伴って、特異的に下方制御される（Ａｒａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。
【０１２６】
Ｐｅｃａｎｅｘ様３（ショウジョウバエ）（ＰＣＮＸＬ３）
Ｐｅｃａｎｅｘ様タンパク質（ＰＣＮＸＬ３）は、複数回貫通膜タンパク質であり；それはｐｅｃａｎｅｘファミリーに属する。
【０１２７】
ＰＣＮＸＬ３遺伝子は、染色体領域１１ｑ１２．１−ｑ１３にマップされた。３つの新規ヒト腫瘍関連転座切断点が、マーカーＤ１１Ｓ４９３３とＤ１１Ｓ５４６の間の染色体１１ｑ１３領域に位置した。したがってＰＣＮＸＬ３は、１１ｑ１３関連疾患遺伝子であるかもしれない（ｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。
【０１２８】
小型核リボ核タンパク質２００ｋＤａ（Ｕ５）（ＳＮＲＮＰ２００）
ｍＲＮＡ前駆体スプライシングは、転写されたｍＲＮＡ前駆体断片からイントロンを除去する、特化ＲＮＡとタンパク質サブユニットの複合体であるスプライソソームによって触媒される。スプライソソームは、およそ８０の保存されたタンパク質に加えて、低分子核内ＲＮＡタンパク質（ｓｎＲＮＰ）Ｕ１、Ｕ２、Ｕ４、Ｕ５、およびＵ６からなる。ＳＮＲＮＰ２００は、スプライソソームの触媒活性化の必須段階である、Ｕ４／Ｕ６二本鎖の巻き戻しに必要な遺伝子である（Ｍａｅｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。ＳＮＲＮＰ２００の発現は、心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、および膵臓で検出された（Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。ＳＮＲＮＰ２００の変異は、常染色体優性色素性網膜炎（ａｄＲＰ）と関係することが、最近発見されている（Ｂｅｎａｇｌｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。
【０１２９】
ＳＡＭドメイン、ＳＨ３ドメインおよび核局在性シグナル１（ＳＡＭＳＮ１）
ＳＡＭＳＮ１は、ＳＨ３およびＳＡＭ（不稔性αモチーフ）ドメインを含有する、推定上のアダプターおよびスキャフォールドタンパク質の新規遺伝子ファミリーのメンバーである。ＳＡＭＳＮ１は、造血組織、筋肉、心臓、脳、肺、膵臓、内皮細胞、および骨髄腫で発現される。内在性ＳＡＭＳＮ１発現は、分化および増殖誘導刺激に際して、一次Ｂ細胞で上方制御されることが示され、形質導入実験は、Ｂ細胞の血漿細胞への分化におけるＳＡＭＳＮ１の促進的役割を示唆する（Ｂｒａｎｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。急性骨髄性白血病および多発性骨髄腫患者からの細胞系および初代細胞は、ＳＡＭＳＮ１を発現する（Ｃｌａｕｄｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。ＳＡＭＳＮ１は、大細胞肺がん細胞系Ｃａｌｕ−６において下方制御された（Ｙａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。ＳＡＭＳＮ１は、潰瘍性大腸炎関連がんにおいて差次的に発現された（Ｗａｔａｎａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。
【０１３０】
シグナル伝達兼転写活性化因子２、１１３ｋＤａ（ＳＴＡＴ２）
結腸直腸および皮膚発がんに対する新規誘因としてのＳＴＡＴ２は、遺伝子発現および炎症促進性媒介物の分泌を増大させるように作用してもよく、それは次に、発がん性ＳＴＡＴ３シグナル伝達経路を活性化する（Ｇａｍｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。ＳＴＡＴ２は、Ｉ型ＩＦＮ誘導性アポトーシスの活性化における重要な媒介物である。より重要なことには、ＳＴＡＴ２の発現または核局在における欠陥は、Ｉ型ＩＦＮ免疫療法の有効性を低下させ得た（Ｒｏｍｅｒｏ−Ｗｅａｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。高悪性度星細胞腫と比較すると、低悪性度星細胞腫では、ＳＴＡＴ２のより低い発現が検出された。結果は、グリア腫瘍内のＳＴＡＴとＰＰＡＲγシグナル伝達の間に存在する相関を示し、これらの腫瘍の成長および分化の調節における、ＳＴＡＴの予測される重要な役割をさらに支持する（Ｅｈｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。
【０１３１】
ＣＣＲ４−ＮＯＴ転写複合体、サブユニット１（ＣＮＯＴ１）
ヒトＣＣＲ４−ＮＯＴデアデニラーゼ複合体は、少なくとも９つの酵素的および非酵素的サブユニットからなる。ＣＮＯＴ１は、ＣＣＲ４−ＮＯＴ複合体の酵素活性を示す上で重要な役割を有し、したがってｍＲＮＡ脱アデニル化およびｍＲＮＡ分解の制御において重要である。ＣＮＯＴ１枯渇は、ＣＣＲ４−ＮＯＴ複合体を構造的および機能的に劣化させてｍＲＮＡの安定化を誘導し、それは翻訳の増大をもたらして、ＥＲストレス媒介アポトーシスを引き起こす。Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．は、ＣＮＯＴ１が、ＣＣＲ４−ＮＯＴデアデニラーゼの活性を確保することで、細胞生存に寄与すると結論づける（Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。乳がん細胞内の内在性ＣＮＯＴ１またはその他のＣｃｒ４−ＮｏｔサブユニットのｓｉＲＮＡ媒介性枯渇は、ＥＲα標的遺伝子の調節解除をもたらす（ＥＲα標的遺伝子ＴＴＦ１およびｃ−Ｍｙｃの誘導増大）。これらの知見は、がんに関与する分子経路の理解に関連する、核内受容体シグナル伝達の転写抑制因子としてのヒトＣｃｒ４−Ｎｏｔ複合体の機能を定義する（Ｗｉｎｋｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。
【０１３２】
セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ２（ミトコンドリア型）（ＳＨＭＴ２）
ＳＨＭＴ２遺伝子は、セリンおよびテトラヒドロ葉酸からグリシンおよび５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸への可逆反応を触媒する、ミトコンドリア型のピリドキサールリン酸依存性酵素をコードする。コードされた生成物は、主にグリシン合成に関与する。肺がんなどの多遺伝子性疾患では、遺伝子−遺伝子相互作用が、疾患の表現型の変動性の判定において、重要な役割を果たすことが予測される。ＭＴＨＦＲ６７７、ＭＴＨＦＲ１２９８、およびＳＨＭＴ多形性の間の相互作用は、肺がん患者における遺伝子不安定性に対する、顕著な影響を有してもよい。細胞遺伝学的変化に関しては、タバコ特異的発がん性物質４−（メチルニトロソアミノ）−１−（３−ピリジル）−１−ブタノン［ＮＮＫ］に曝露した肺がん患者からのリンパ球が、ＭＴＨＦＲ６７７、ＭＴＨＦＲ１２９８、およびＳＨＭＴ対立遺伝子変異型の存在下における細胞遺伝的損傷の頻度に、大幅な増大を有したことが示された（Ｐｉｓｋａｃ−Ｃｏｌｌｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。結腸直腸がん患者の５−ＦＵおよびＦＯＬＦＩＲＩプロトコルの有効性における、ＳＨＭＴ遺伝子の多形性の役割についての薬理ゲノミクス研究は、全生存期間の変化もまたもたらす、顕著な効果を明らかにした（Ｔｉｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。
【０１３３】
Ｊｕｎ  Ｂプロトオンコジーン（ＪＵＮＢ）
ＪｕｎＢは、二量体転写因子のＡＰ−１（アクチベータータンパク質１）ファミリーのメンバーである。転写因子ＡＰ−１は、細胞増殖、形質転換、および死滅に関与する（Ｓｈａｕｌｉａｎ  ａｎｄ  Ｋａｒｉｎ，２００２）。ＪｕｎＢは、ＮＦ−ｅＢ経路を通じて調節されるかもしれず、ＨＧＦによって誘導されるＪｕｎＢの上方制御は、ＭＭＰ−９発現を通じた細胞増殖および細胞浸潤の調節において、重要な役割を果たすかもしれない（Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ｋｉｍ，２０１２）。ＪｕｎＢは、リンパ腫、特にホジキンリンパ腫において、発がんの役割を果たすようである（Ｓｈａｕｌｉａｎ，２０１０）。ＪｕｎＢは、ｐ１６の必須上流制御因子であり、ＴＡＣの悪性形質転換を阻止する細胞老化の維持に寄与する。したがってＪｕｎＢは前立腺の発がんの制御において、明らかに重要な役割を果たす（Ｋｏｎｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。ＪｕｎＢは、ＶＨＬ欠陥ｃｃＲＣＣにおいて、腫瘍侵襲性を促進し血管新生を促進する（Ｋａｎｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。
【０１３４】
形質転換、酸性コイルドコイル含有タンパク質３（ＴＡＣＣ３）（ＴＡＣＣ３）
ＴＡＣＣ３は、ｃｈ−ＴＯＧ（結腸および肝臓腫瘍過剰発現遺伝子）と、微小管を動原体糸に架橋させるクラスリンとの複合体中に存在する。ＴＡＣＣ３は、精巣、肺、脾臓、骨髄、胸線、および末梢血白血球をはじめとする、特定の増殖性組織で発現される。ＴＡＣＣ３発現は、いくつかのヒト腫瘍型では変化する。細胞内では、ＴＡＣＣ３は、中心小体および紡錘体微小管の双方に局在するが、星状微小管には局在しない（Ｈｏｏｄ  ａｎｄ  Ｒｏｙｌｅ，２０１１）。ＴＡＣＣ３発現はｐ５３発現と相関し、腫瘍がＴＡＣＣ３およびｐ５３を高度に発現した患者は、腫瘍が双方の免疫染色について低レベルの発現を有した患者よりも、予後が有意により不良であった（Ｐ＝０．００６）。ＴＡＣＣ３の増大がＮＳＣＬＣに増殖優位性を与えて、腫瘍の進行に寄与してもよく、ＴＡＣＣ３の発現が、ＮＳＣＬＣにおける臨床転帰の強力な予後指標であることが示唆される（Ｊｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。Ｔａｃｃ３は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の負の制御因子であってもよい（Ｂａｒｇｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。
【０１３５】
ＲＡＤ５４ホモログＢ（Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））（ＲＡＤ５４Ｂ）
ＤＮＡ修復および組換えタンパク質ＲＡＤ５４Ｂは、ヒトではＲＡＤ５４Ｂ遺伝子によってコードされるタンパク質である。ＲＡＤ５４は二本鎖ＤＮＡに結合し、ＤＮＡ存在下でＡＴＰアーゼ活性を示す。ヒトＲＡＤ５４Ｂタンパク質は、相同組換えにおいて重要な役割を果たすＲＡＤ５４タンパク質のパラログである。相同組換え（ＨＲ）は、ＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）の正確な修復に必須である（Ｓａｒａｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。がんにおいて体細胞性に変異することが知られている遺伝子ＲＡＤ５４Ｂのノックダウンは、哺乳類細胞で染色体不安定性（ＣＩＮ）を引き起こす（ＭｃＭａｎｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。ＲＡＤ５４Ｂによる遺伝子発現の上昇は、ＧＢＭ患者におけるより短時間でのがん進行および不良ＯＳに、有意に関連する（Ｇｒｕｎｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。
【０１３６】
真核生物翻訳延長因子２（ＥＥＦ２）
ＥＥＦ２は、ＧＴＰ結合翻訳延長因子ファミリーのメンバーをコードする。このタンパク質は、タンパク質合成の必須要素である。それは、新生タンパク質鎖の、リボソームのＡ部位からＰ部位へのＧＴＰ依存性転座を促進する。ＥＥＦ２は、肺腺がん（ＬＡＤＣ）で高度に発現されたが、隣接する非腫瘍肺組織ではそうでなかった。ｅＥＦ２発現が高い患者は、早期腫瘍再発率が有意により高く、予後が有意により不良であったので、ｅＥＦ２がＬＡＤＣにおける抗アポトーシスマーカーであることが示唆される。ｅＥＦ２発現のサイレンシングは、ミトコンドリア伸長、細胞の自食作用、およびシスプラチン感受性を増大させた。さらに、ｅＥＦ２はＬＡＤＣ細胞内でＳＵＭＯ化されて、ｅＥＦ２のＳＵＭＯ化は薬剤耐性と相関した（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１ａ）。ＥＥＦ２の阻害は、タンパク質合成の迅速な停止を引き起して、アポトーシスを誘導し、究極的に細胞死をもたらすので、ＥＥＦ２はがん治療のための魅力的な標的である。ＥＥＦ２のｓｉＲＮＡ誘導性サイレンシングは、腫瘍細胞の特異的な細胞傷害性をもたらした（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１ｂ；Ｗｕｌｌｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。
【０１３７】
サイクリンＡ２（ＣＣＮＡ２）
ＣＣＮＡ２は、高度に保存されたサイクリンファミリーに属する。サイクリンは、ＣＤＫキナーゼの調節物質として機能する。異なるサイクリンは、明白な発現および分解パターンを示し、それは各有糸分裂事象の時間整合に寄与する（Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。ヒトサイクリンＡ２は、Ｓ期進行および有糸分裂への移行の重要な制御因子である。ＣＣＮＡ２は、ＣＤＣ２またはＣＤＫ２キナーゼに結合して活性化し、したがって細胞周期Ｇ１／ＳおよびＧ２／Ｍ遷移の双方を促進する（Ｈｏｎｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。細胞周期の進行を変化させる、この遺伝子の変異、増幅、および過剰発現は、多様な腫瘍で頻繁に観察されて、腫瘍形成に寄与してもよい（Ｃｏｏｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００９；Ｋａｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｔｏｍｐｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。さらにＣＣＮＡ２の発現が、数種類のがんにおける予後不良と関係し（Ｙａｓｍｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）、サイクリンＡの発現上昇が、より短い生存期間と相関する（Ｄｏｂａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）ことが記載される。
【０１３８】
神経上皮細胞形質転換１（ＮＥＴ１）４１
ＮＥＴ１は、Ｒｈｏグアニンヌクレオチド交換因子ファミリーの一員であるこのファミリーのメンバーは、ＧＤＰによるＧＴＰの交換を触媒することで、Ｒｈｏタンパク質を活性化する。ＮＥＴ１によってコードされるタンパク質は、細胞核内でＲｈｏＡと相互作用し、電離放射線後のＤＮＡ損傷修復における役割を有してもよい。
【０１３９】
乳腺がん細胞では、オピオイド受容体は発現されないが、ＮＥＴ１遺伝子が発現されて、がん細胞の移動を促進してもよい（Ｅｃｉｍｏｖｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。ＮＥＴ１は、胃がん（ＧＣ）組織で上方制御され、この疾患の浸潤性表現型を駆動する（Ｓｒｏｕｇｉ  ａｎｄ  Ｂｕｒｒｉｄｇｅ，２０１１）。ＮＥＴ１は、ＧＣ進行の重要な側面である、ＧＣ細胞の遊走と浸潤において重要な役割を果たす（Ｂｅｎｎｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。短期内分泌療法後のヒト前立腺がんにおけるＲｈｏＣおよびＮＥＴ１のより高い発現は、ＲｈｏＣおよびＮＥＴ１が内分泌療法で、治療標的になってもよいことを示唆する（Ｋａｗａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。
【０１４０】
染色体１１読み取り枠２４（Ｃ１１ｏｒｆ２４）
Ｃ１１ｏｒｆ２４は、Ｔｗｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ（２００１）によって同定された。Ｃ１１ｏｒｆ２４遺伝子は、その他の遺伝子との既知の類似性を有せず、その機能は不明である。ノーザンブロット分析は、心臓、胎盤、肝臓、膵臓、および結腸における、１．９ｋｂ転写物の高度の発現を検出した。より低いレベルが、脳、肺、骨格筋、腎臓、脾臓、前立腺、精巣、卵巣、および小腸で検出され、非常に低いレベルが、胸線および白血球で検出された（Ｔｗｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。４４９個のアミノ酸長のタンパク質Ｃ１１ｏｒｆ２４は、染色体領域１１ｑ１３上に位置する。この領域は、多種がん易罹患性領域とされている（Ｇｕｄｍｕｎｄｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９；Ｐｕｒｄｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。
【０１４１】
染色体凝縮制御因子１（ＲＣＣ１）
染色体凝縮制御因子１（ＲＣＣ１）は、Ｒａｎ  ＧＴＰアーゼのためのグアニンヌクレオチド交換因子である。クロマチン上のＲＣＣ１による、Ｒａｎ−ＧＴＰの局在的生成は、核原形質の輸送、有糸分裂紡錘体集合、および核膜形成に重要である（Ｈｉｔａｋｏｍａｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。いくつかのデータが、有糸分裂進行に必須の、ＲＣＣ１、Ｍａｄ２、およびサバイビンなどの有糸分裂制御因子の染色体結合を示唆した（Ｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。Ｗｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．は、アポトーシスの初期段階で、核ＲａｎＧＴＰレベルが低下することを発見し、それは染色体上のＲＣＣ１の不動化と相関する。そのため、彼らは、ＲＣＣ１が、カスパーゼ活性化Ｍｓｔ１によって生じるヒストンコードを読み取って、核内のＲａｎＧＴＰレベルを低下させることで、アポトーシスを開始すると提案する（Ｗｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。
【０１４２】
メラノーマ抗原ファミリーＦ、１（ＭＡＧＥＦ１）
ＭＡＧＥ（メラノーマ関連抗原）スーパーファミリーの既知のメンバーのほとんどは、腫瘍、精巣、および胎児組織で発現され、それは、がん／精巣発現パターンとされている（ＭＡＧＥサブグループＩ）。ＭＡＧＥサブグループＩのペプチドは、ペプチドおよびＤＣワクチン接種において、成功裏に使用されている（Ｎｅｓｔｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ｍａｒｃｈａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｍａｒｃｈａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｍａｒｃｈａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｔｈｕｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。対照的に、ＭＡＧＥＦ１などのいくつかのＭＡＧＥ遺伝子（ＭＡＧＥサブグループＩＩ）は、試験された全ての成人および胎児組織で、そして卵巣、乳房、子宮頸、黒色腫、および白血病をはじめとする多数の腫瘍型でも、広範に発現される（Ｎｅｓｔｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ｍａｒｃｈａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｍａｒｃｈａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｍａｒｃｈａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｔｈｕｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。それでもなお、ＭＡＧＥＦ１の過剰発現は、ＮＳＣＬＣ中で（Ｔｓａｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）、および台湾の結腸直腸がん患者コホートの７９％で（Ｃｈｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）検出され得た。
【０１４３】
非ＳＭＣコンデンシンＩ複合体、サブユニットＤ２（ＮＣＡＰＤ２）
コンデンシンは、最初は有糸分裂染色体の構成要素として同定された、ヘテロ五量体複合体である。ＮＣＡＰＤ２は、有糸分裂染色体凝縮に必要なヒトコンデンシン複合体の必須成分である。ＮＣＡＰＤ２枯渇は、分裂中期の染色体アライメントに影響を及ぼして、分裂後期への移行を遅延させる（Ｗａｔｒｉｎ  ａｎｄ  Ｌｅｇａｇｎｅｕｘ，２００５）。最近の連鎖解析および関連研究は、染色体１２ｐ１３遺伝子座が、アルツハイマー病（ＡＤ）に罹りやすくする遺伝的変異をおそらく保有することを示唆している。単一マーカー結合は、ＮＣＡＰＤ２中の２つのＳＮＰ（ｒｓ７３１１１７４およびｒｓ２０７２３７４）が、名目上の有意なｐ値（それぞれ、ｐ＝０．０４９１および０．０１１６）を示すことを明らかにした。これらの遺伝解析は、染色体１２ｐ１３遺伝子座が、中国人のＡＤと関係があるという証拠を提供する（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。
【０１４４】
染色体１２読み取り枠４４（Ｃ１２ｏｒｆ４４）
ショウジョウバエＡｔｇ１３結合タンパク質オルソログについてデータベースを検索することで、Ｍｅｒｃｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）は、Ｃ１２ｏｒｆ４４としてもまた知られているヒトＡＴＧ１０１を同定した（Ｍｅｒｃｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。ＡＴＧ１０１遺伝子は、染色体１２ｑ１３．１３にマップされた。推定上の２１８アミノ酸タンパク質は、細胞質親水性タンパク質であることが予測された（Ｈｏｓｏｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。マクロオートファジーは、細胞質タンパク質、細胞小器官、および巨大分子のリソソーム媒介分解の異化作用過程である。ＡＴＧ１０１などのＡＴＧタンパク質は、リソソームとの融合前に細胞質内カーゴを取り囲んで隔離する二重膜小胞である、オートファゴソーム形成に必要である。ＡＴＧ１０１（Ｃ１２ｏｒｆ４４）は、自食作用に必須である（Ｍｅｒｃｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。
【０１４５】
ＨＥＣＴおよびＲＬＤドメイン含有Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼ４（ＨＥＲＣ４）
ＨＥＲＣ４は、ユビキチンリガーゼのＨＥＲＣファミリーに属し、それらは全てＨＥＣＴ領域と、少なくとも１つのＲＣＣ１（ＭＩＭ１７９７１０）様ドメイン（ＲＬＤ）とを含有する。３５０アミノ酸ＨＥＣＴドメインは、ユビキチンとのチオエステル形成を触媒して、それを基質に転移することが予測され、ＲＬＤは、小型Ｇタンパク質のためのグアニンヌクレオチド交換因子として作用することが予測される（Ｈｏｃｈｒａｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。Ｅ３ユビキチンリガーゼＨｅｒｃ４は、全ての組織で広範に発現されるが、特に精子変態中に精巣で最も高度に発現される。Ｈｅｒｃ４リガーゼは、精子が完全に機能性になるための適切な成熟と、細胞質小滴除去に必要である（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  ａｎｄ  Ｓｔｅｗａｒｔ，２００７）。
【０１４６】
インスリン様成長因子２  ｍＲＮＡ結合タンパク質３（ＩＧＦ２ＢＰ３）
ＩＧＦ２ＢＰ３は、ｍＲＮＡ局在化、交代、および翻訳制御に関与するとされるインスリン様成長因子ＩＩ  ｍＲＮＡ結合タンパク質ファミリーのメンバーである。タンパク質は、いくつかのＫＨ（Ｋ相同的）ドメインを含有し、これらはＲＮＡ結合において重要であり、ＲＮＡ合成および代謝に関与することが知られている。発現は、主に胚発生中に起こり、いくつかの腫瘍で記載されている。したがってＩＧＦ２ＢＰ３は、がん胎児性タンパク質であると見なされる（Ｌｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。ＩＧＦ２ＢＰ３は、ＩＧＦ−ＩＩタンパク質合成を増強することによって、およびＣＤ４４  ｍＲＮＡの安定化を通じて細胞接着と浸潤を誘導することによって、腫瘍細胞の増殖を促進してもよい（Ｆｉｎｄｅｉｓ−Ｈｏｓｅｙ  ａｎｄ  Ｘｕ，２０１２）。さらにＩＧＦ２ＢＰ３発現は多数のヒト新生物中で試験されており、それが、移動、浸潤、細胞生存、および腫瘍転移を媒介するという証拠が上がってきており（Ｊｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００９；Ｋａｂｂａｒａｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０；Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｌｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｈｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２；Ｓａｍａｎｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）、それは、血管新生にもまた関与しているかもしれない（Ｓｕｖａｓｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。肺腺がんにおいては、中等度分化型または低分化型腺がんで、より高頻度のＩＧＦ２ＢＰ３発現が検出され得て、それは侵襲性の生物学的挙動と関係してもよい（Ｆｉｎｄｅｉｓ−Ｈｏｓｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０；Ｂｅｌｊａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２；Ｆｉｎｄｅｉｓ−Ｈｏｓｅｙ  ａｎｄ  Ｘｕ，２０１２）。
【０１４７】
細胞分裂周期６ホモログ（Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））（ＣＤＣ６）
ＣＤＣ６タンパク質は、ＤＮＡ複製の初期段階における制御因子として機能する。それは、細胞周期Ｇ１には細胞核内に局在するが、Ｓ期開始時には細胞質に移行する。さらにＣＤＣ６は、高等真核生物細胞内で、ＡＴＲとの相互作用を通じて、複製チェックポイント活性化を制御することが想定されている（Ｙｏｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。ＣＤＣ６はＤＮＡ複製に必須であり、その調節解除は発がんに関与する。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によるＣＤＣ６下方制御は、細胞増殖を妨げ、アポトーシスを促進することが分かった（Ｌａｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。ＣＤＣ６の過剰発現は、数種のがんに見られた。ＣＤＣ６を過剰発現するがん型の例は、胃がん（Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）、脳腫瘍（Ｏｈｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）、経口扁平上皮がん（Ｆｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）、子宮頸がん（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００９ｂ）、および悪性中皮腫（Ｒｏｍａｇｎｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）である。
【０１４８】
線維芽細胞活性化タンパク質、α（ＦＡＰ）
線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）は、セリンプロテアーゼファミリーに属するＩＩ型膜内在性糖タンパク質である。ＦＡＰαの推定上のセリンプロテアーゼの活性およびその生体内誘導パターンは、発達、組織修復、および上皮発がん中の線維芽細胞成長または上皮−間葉相互作用の制御における、この分子の役割を示唆してもよい（Ｓｃａｎｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）。ほとんどの正常な成人組織および良性上皮性腫瘍は、わずかまたは皆無の検出可能ＦＡＰ発現を示す。しかしＦＡＰ発現は、悪性乳腺、結腸直腸、肺、皮膚、および膵臓腫瘍、治癒創傷の線維芽細胞、軟部組織肉腫のストロマの９０％以上、そしていくらかの胎児間葉細胞で検出される。ＦＡＰは、細胞の接着および移動過程、ならびにＥＣＭ構成要素の迅速な分解を通じて、がん増殖および転移における潜在的役割を有する。したがってそれは、ＥＣＭに侵入する腫瘍細胞上、および血管新生に関与する内皮細胞上に存在するが、同一型の不活性細胞では発現されない（Ｄｏｌｚｎｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｋｅｎｎｅｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００９；Ｒｅｔｔｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３；Ｒｅｔｔｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ｓｃａｎｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０ａ）。
【０１４９】
無翅型ＭＭＴＶ組込み部位ファミリー、メンバー５Ａ（ＷＮＴ５Ａ）
一般に、Ｗｎｔ５ａは、増殖、分化、移動、癒着、および極性などの多様な細胞機能を制御する（Ｋｉｋｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。それは、未分化ヒト胚性幹細胞で発現される（Ｋａｔｏｈ，２００８）。ＷＮＴ５Ａは、発がんにおけるその役割が依然としてあいまいな、非形質転換ＷＮＴファミリーメンバーに分類される。それは、数種のがん（甲状腺、脳、乳房、および結腸直腸）では腫瘍抑制活性を示すが、肺、胃、および前立腺がんでは異常に上方制御される（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。発がん性ＷＮＴ５Ａは、自己複製のためのがん幹細胞内のカノニカルＷＮＴシグナル伝達、および浸潤と転移のための腫瘍−間質境界面における非カノニカルＷＮＴシグナル伝達を活性化する（Ｋａｔｏｈ  ａｎｄ  Ｋａｔｏｈ，２００７）。ＷＮＴ５Ａの発現は、多様な腫瘍実体について記述されている。例えば、Ｗｎｔ５ａの異常なタンパク質の発現が、前立腺がんの２８％で観察され、それはそこで攻撃性を促進した（Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。さらに、ＷＮＴ５Ａの過剰発現は、卵巣がん（Ｂａｄｉｇｌｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）、黒色腫（Ｄａ  Ｆｏｒｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００８；Ｗｅｅｒａｒａｔｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）、ＧＢＭ（Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）、肺がん（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）、および膵臓がん（Ｒｉｐｋａ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）における、予後不良および／または腫瘍悪性度増大に関連することが記載される。ＨＣＣでは、カノニカルＷｎｔシグナル伝達経路が腫瘍開始に寄与して、非カノニカルシグナル伝達は腫瘍進行に寄与するようである（Ｙｕｚｕｇｕｌｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。
【０１５０】
ＴＰＸ２、微小管関連、ホモログ（アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）））（ＴＰＸ２）
ＴＰＸ２は、紡錘体集合因子である。それは、アポトーシスにおける、有糸分裂紡錘体および微小管の正常な集合に必要である。ＴＰＸ２は、クロマチンおよび／または動原体依存微小管核形成に必要である（Ｂｉｒｄ  ａｎｄ  Ｈｙｍａｎ，２００８；Ｍｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。新規合成されたＴＰＸ２は、ほぼ全てのオーロラＡ活性化のために、そして卵母細胞成熟中の完全ｐ５３合成と生体内リン酸化のために必要である（Ｐａｓｃｒｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。ＴＰＸ２は、髄膜腫（Ｓｔｕａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）、喉頭の扁平上皮がん（ＳＣＣＬ）（Ｃｏｒｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）、経口扁平上皮がん（ＳＣＣ）（Ｓｈｉｇｅｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）、肝細胞がん（ＨＣＣ）（Ｓａｔｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）、膵臓腫瘍（Ｗａｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）、卵巣がん（Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）、肺の扁平上皮がん（Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）などの多数の腫瘍型で過剰発現される、細胞周期関連タンパク質である。それは、頻繁にオーロラＡと共に同時過剰発現されて、発がん特性がある新規機能単位を生じる（Ａｓｔｅｒｉｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。ＴＰＸ２発現は、肺がんにおける予後指標である（Ｋａｄａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。
【０１５１】
ヒアルロン酸媒介運動性受容体（ＲＨＡＭＭ）（ＨＭＭＲ）
ヒアルロン酸媒介運動性ＲＨＡＭＭ（ＨＭＭＲ）のための受容体は、細胞内で、ならびに細胞膜上で、異なる機能を発揮する。ＲＨＡＭＭは、細胞表面に輸送され得て、そこでヒアルロン酸（ＨＡ）に結合し、ＨＡ受容体ＣＤ４４と相互作用する。細胞運動性、創傷治癒、および浸潤のような過程は、ＲＨＡＭＭによって調節される（Ｓｏｈｒ  ａｎｄ  Ｅｎｇｅｌａｎｄ，２００８）。ＲＨＡＭＭ（ＨＹＡ媒介運動性受容体）は、ヒアルロナン（ＨＹＡ）受容体の１つである（Ｇａｒｅｓ  ａｎｄ  Ｐｉｌａｒｓｋｉ，２０００）。またがん細胞は、ＨＹＡへの結合部位（ＣＤ４４、ＲＨＡＭＭなど）を示して、ＨＹＡはがん細胞を免疫細胞の攻撃から保護する。血清ＨＹＡは、転移性患者において上昇することが多い（Ｄｅｌｐｅｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。さらにＨＹＡと、がん細胞上のＲＨＡＭＭ（ＨＭＭＲ）およびＣＤ４４との相互作用は、腫瘍の進行および内転移の促進に重要であることが提案されている（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０００ｂ）。さらにＲＨＡＭＭは、いくつかのがん組織で過剰発現される（Ｔｚａｎｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）；（Ｋｒａｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）；（Ｔｗａｒｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）；（Ｓｈｉｇｅｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）；（Ｚｌｏｂｅｃ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）；（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０００ａ））。
【０１５２】
ＡＤＡＭメタロペプチダーゼドメイン８（ＡＤＡＭ８）
ＡＤＡＭ８は、ＡＤＡＭ  （ディスインテグリンおよびメタロプロテアーゼドメイン）ファミリーのメンバーである。ＡＤＡＭ８をはじめとする多数のＡＤＡＭ種がヒト悪性腫瘍で発現され、そこで成長因子機能およびインテグリン機能の制御に関与して、細胞増殖および浸潤の促進をもたらす（Ｍｏｃｈｉｚｕｋｉ  ａｎｄ  Ｏｋａｄａ，２００７）。ＡＤＡＭ８の発現は、ＥＧＦＲと正の相関性があった。どちらも、主に細胞質内と細胞膜上で発現された（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。ＡＤＡＭ８は、検査された肺がんのほとんどで大量に発現された。ＡＤＡＭ８の外来性発現は、哺乳類細胞の移動活性を増大させ、ＡＤＡＭ８が肺がんの進行に重要な役割を果たしてもよいことが示唆された（Ｉｓｈｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。ＡＤＡＭ８は、肺がんの予後不良と関連付けられている（Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。ＡＤＡＭ８の過剰発現はより短い患者生存期間と関係があり、それはＲＣＣにおける遠隔転移の良好な予測因子であった（Ｒｏｅｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００４ｂ；Ｒｏｅｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００４ａ）。さらに、ＡＤＡＭ８の発現レベルおよびプロテアーゼ機能は、神経膠腫細胞の侵入性の活性と相関し、脳腫瘍内の腫瘍浸潤で、ＡＤＡＭ８が重要な役割を役割を果たしてもよいことが示唆された（Ｗｉｌｄｅｂｏｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。
【０１５３】
コラーゲンα−３（ＶＩ）鎖タンパク質（ＣＯＬ６Ａ３）
ＣＯＬ６Ａ３は、ＶＩ型コラーゲンの３本のα鎖の１つである、α−３鎖をコードする。タンパク質ドメインは、細胞外基質タンパク質に結合することが示されており、これは基質要素の組織化におけるこのコラーゲンの重要性を説明する相互作用である。
【０１５４】
コラーゲンＶＩの過剰発現を通じた細胞外基質の再構築は、卵巣がん細胞内のシスプラチン抵抗性に寄与する。コラーゲンＶＩの存在は、卵巣がん予後因子である腫瘍悪性度と相関した（Ｓｈｅｒｍａｎ−Ｂａｕｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。ＣＯＬ６Ａ３は、結腸直腸腫瘍（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００９ａ）、唾液腺がん（Ｌｅｉｖｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）において過剰発現され、胃がん（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）において差次的に発現される。ＣＯＬ６Ａ３は、腫瘍特異的スプライス変異がある７つの遺伝子の１つとして同定された。検証された腫瘍特異的スプライシング変化は高度に一貫しており、正常サンプルとがんサンプルを明確に分けられるようにして、場合によっては異なる腫瘍病期でさえも明確に分けられるようにした（Ｔｈｏｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。
【０１５５】
Ｔｈｙ−１細胞表面抗原（ＴＨＹ１）
Ｔｈｙ−１（ＣＤ９０）は、Ｔ細胞、胸腺細胞、神経細胞、内皮細胞、および線維芽細胞をはじめとする多数の細胞型の上で発現される、２５〜３７ｋＤａのグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー型グリコールタンパク質である。Ｔｈｙ−１の活性化は、Ｔ細胞活性化を促進し得る。Ｔｈｙ−１はまた、細胞接着、神経突起伸長、腫瘍成長、腫瘍抑制、移動、創傷治癒、および細胞死をはじめとする多数の非免疫性生物学的過程にも影響を及ぼす。Ｔｈｙ−１は、細胞−細胞および細胞−マトリックス相互作用の重要な制御因子であり、神経再生、転移、炎症、および線維症において重要な役割がある（Ｒｅｇｅ  ａｎｄ  Ｈａｇｏｏｄ，２００６ｂ；Ｒｅｇｅ  ａｎｄ  Ｈａｇｏｏｄ，２００６ａ）。さらに、Ｔｈｙ−１は、胚性でなく成人の血管新生マーカーのようである。サイトカインは、Ｔｈｙ−１を上方制御するが、成長因子は上方制御せず、成人血管新生の病因における炎症の重要性が示唆される（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。肺の正常組織または良性腫瘍細胞と比較して、肺がん細胞核内に位置するＴｈｙ−１の顕著な過剰発現があり、それはＮＳＣＬＣ患者の予後に関連する要素の１つである。したがってＴｈｙ−１は、肺がん病理学における新規潜在型悪性マーカーであってもよい（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００５ｂ）。Ｔｈｙ−１は、様々な種類の幹細胞（間葉系幹細胞、肝臓幹細胞（「卵形細胞」）)（Ｍａｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）、角化細胞幹細胞（Ｎａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）、および造血幹細胞（Ｙａｍａｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）のための代理マーカーと見なし得る。
【０１５６】
脱ヨウ素酵素、ヨードチロニン、ＩＩ型（ＤＩＯ２）
ＤＩＯ２遺伝子によってコードされるタンパク質は、ヨードチロニン脱ヨウ素酵素ファミリーに属する。それは甲状腺で高度に発現され、グレーブス病および甲状腺腫がある患者における、甲状腺Ｔ３産生の相対的増大に顕著に寄与してもよい（Ｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）；（ｄｅ  Ｓｏｕｚａ  Ｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００５））。遺伝子発現パターンは、上方および下方進行型の鼻咽頭がん腫（ＮＰＣ）の間で有意差がある。ＤＩＯ２遺伝子の発現は、上方進行型（局所的増殖および頭蓋底浸潤）よりも、下方進行型（下方＝遠隔転移）でより高く、それはＮＰＣの転移可能性と密接に関係していてもよい（Ｌｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。ＤＩＯ２  ｍＲＮＡならびにＤＩＯ２活性は、脳腫瘍で発現される（Ｍｕｒａｋａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。肺におけるＤ２活性は、肺末梢部と肺がん組織に存在して類似している（Ｗａｗｒｚｙｎｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。
【０１５７】
ペリオスチン、骨芽細胞特異的因子（ＰＯＳＴＮ）
ＰＯＳＴＮは、ファシクリンファミリーと類似し細胞生存および血管新生に関与するタンパク質をエンコードする遺伝子であり、様々なタイプのヒトがんにおける腫瘍進行の有望なマーカーとして登場した（Ｒｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。
【０１５８】
ペリオスチンタンパク質またはｍＲＮＡの高度発現は、乳房（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０ｂ）、結腸（Ｋｉｋｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）、頭頸部（Ｋｕｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）、膵臓（Ｋａｎｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）、乳頭甲状腺（Ｐｕｐｐｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）、前立腺（Ｔｉｓｃｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）、卵巣（Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）、肺（Ｔａｋａｎａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）、および肝臓（Ｕｔｉｓｐａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）がん、ならびに食道扁平上皮がん（Ｋｗｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）をはじめとする固形腫瘍のほとんどで検出された。ペリオスチンは、肺がんにおいて異常に高度に発現され、血管新生、浸潤、および転移と相関する（Ｔａｋａｎａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。Ａ５４９非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）細胞内のペリオスチンのサイレンシングは、腫瘍細胞成長を阻害して細胞浸潤を低下させる（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。
【０１５９】
ＳＬＩＴ１（スリットホモログ１（ショウジョウバエ））、ＳＬＩＴ２（スリットホモログ２（ショウジョウバエ））
ＳＬＩＴ（ＳＬＩＴ１、ＳＬＩＴ２、およびＳＬＩＴ３）は、ＲＯＢＯ受容体を通じたシグナル伝達によって、発達中に、細胞とそれらの環境の間の位置的相互作用を媒介する分泌タンパク質のファミリーである（Ｈｉｎｃｋ，２００４）。しかしＳＬＩＴ／ＲＯＢＯシグナル伝達は、発達に限定されず、これらのシグナルの喪失は、腫瘍進行中に重要な役割を果たす可能性が高い。ＳｌｉｔおよびＲｏｂｏは、それらのプロモーターが上皮がんにおいて頻繁に過剰メチル化されるので、腫瘍抑制遺伝子候補と見なされる（Ｎａｒａｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｓｃｈｍｉｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｌａｔｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。採取されたヒト乳腺腫の約５０％で、ＳＬＩＴ２またはＳＬＩＴ３遺伝子発現が発現停止されている（Ｓｈａｒｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。ＳＬＩＴ２過剰メチル化は、ＮＳＣＬＣで頻繁に検出されて、様々な臨床的特徴と関係がある（Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。
【０１６０】
ＴＬＸ３（Ｔ細胞白血病ホメオボックス３）
ＴＬＸ３（ＲＮＸまたはＨＯＸ１１Ｌ２としてもまた知られている）は、ＤＮＡ結合核転写因子をコードするオーファンホメオボックス遺伝子のファミリーに属する。ＨＯＸ１１遺伝子ファミリーのメンバーは、高度に保存されたホメオドメイン内でシトシンを置き換えるスレオニン４７によって特徴付けられる（Ｄｅａｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）。ＴＬＸ３は、発達中の延髄中でユニークに発現され、一次中継内臓感覚神経と、脳幹内のほとんどの（ノル）アドレナリン作動性中心の適切な形成に必要であり、特に、心臓血管および呼吸器系の生理学的制御に関与する（Ｑｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。ＴＬＸ３の発現はまた、Ｔ細胞急性リンパ球性白血病に罹患した小児の２０％および成人の１３％からの白血病サンプル中でも、検出されているが（Ｃａｖｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）、この遺伝子は正常なＴ細胞分化には関与しない（Ｆｅｒｒａｎｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。
【０１６１】
ＣＥＰ１９２（中心体タンパク質１９２ｋＤａ）
中心体は、紡錘体形成および染色体分離をはじめとする様々な細胞過程において重要な役割を果たす。ＣＥＰ１９２は、哺乳類、ショウジョウバエ、およびＣ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）中で、中心体バイオジェネシスおよび機能において重要な役割を果たす中心体タンパク質である（Ｇｏｍｅｚ−Ｆｅｒｒｅｒｉａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。それは、その上でγチューブリン環複合体と、微小管核形成および紡錘体集合に関与するその他のタンパク質とが、有糸分裂中に機能性になる、足場の形成を刺激する（Ｇｏｍｅｚ−Ｆｅｒｒｅｒｉａ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。
【０１６２】
ＡＮＫＳ１Ａ（アンキリンリピートおよび不稔性αモチーフドメイン含有１Ａ）
アンキリンリピートおよびＳＡＭドメイン含有タンパク質１Ａは、ヒトではＡＮＫＳ１Ａ遺伝子によってコードされるタンパク質である（Ｎａｇａｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。ＡＮＫＳ１Ａは、受容体チロシンキナーゼ様ＥＧＦＲおよびＰＤＧＦＲの標的およびシグナル伝達物質として最初に記載されており（Ｐａｎｄｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）、より最近では受容体チロシンキナーゼＥｐｈＡ８の相互作用パートナーとして記載されている（Ｓｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。最近の研究では、単一ヌクレオチド多形性（ＳＮＰ）が、３４８人の進行型ＮＳＣＬＣ患者において遺伝子型同定された。研究者らは、予後に関連がある１７個の上位候補ＳＮＰを同定した。ＳＮＰは、ＡＮＫＳ１Ａ遺伝子のゲノム領域内に位置した（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。
【０１６３】
ＣＥＰ２５０（中心体タンパク質２５０ｋＤａ）
ＣＥＰ２５０遺伝子は、細胞周期の間期における中心粒−中心粒接着に必要なコア中心体タンパク質をコードする（Ｍａｙｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。照射混合解析によって、Ｆｒｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）は、ＣＥＰ２５０遺伝子をおよそ２０ｑ１１．２で染色体２０の動原体領域にマップした（Ｆｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。Ｍａｙｏｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）は、ヒト骨肉腫細胞系内のＣＥＰ２５０の過剰発現が、大型中心体関連構造体の形成をもたらしたことを発見した。ＣＥＰ２５０の過剰発現は、中心体分離または細胞分裂を妨げなかったが、細胞周期調節性活性が、中心体からＣＥＰ２５０を解離させたことを示唆した（Ｍａｙｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。
【０１６４】
ＭＤＮ１（ＭＤＮ１、ｍｉｄａｓｉｎホモログ（酵母））
ＭＤＮ１、ｍｉｄａｓｉｎホモログ（酵母）は、ヒトではＭＤＮ１遺伝子によってコードされるタンパク質である。Ｍｉｄａｓｉｎは、それに対してデータが入手できる全ての真核生物中に、良好に保存されたおよそ６００ｋＤａのタンパク質をエンコードする単一コピー遺伝子として存在する。ヒトでは、遺伝子は６ｑ１５に位置して、予測された５５９６残基（６３２ｋＤａ）のタンパク質をコードする（Ｇａｒｂａｒｉｎｏ  ａｎｄ  Ｇｉｂｂｏｎｓ，２００２）。最近、ＭＤＮ１は、乳がん管腔型Ｂサブタイプにおいて変異することが分かった。ＭＤＮ１は、この侵襲性サブタイプの発生およびホルモン抵抗性において、役割を有してもよい（Ｃｏｒｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。
【０１６５】
ＯＬＦＭ１（オルファクトメジン１）
Ｎｏｅｌｉｎ−１とも称されるＯＬＦＭ１は、オルファクトメジンドメインを含有するタンパク質のファミリーに属する分泌糖タンパク質であり、神経管による神経冠細胞の産生の調節において重要な役割を果たす（Ｂａｒｅｍｂａｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。オルファクトメジンは、元来、嗅覚神経の化学感覚樹状突起を取り囲む粘液層の主要構成要素として同定された（Ｋｕｌｋａｒｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。オルファクトメジン１タンパク質の発現は、その他の組織型の肺がんおよび正常な肺組織よりも、肺腺がんで有意により高かった（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。さらにＯＬＦＭ１は、子宮内膜がん、ユーイング肉腫、および神経芽細胞腫において、調節解除される（Ｗｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ａｌｌａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｋｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。
【０１６６】
ＢＵＢ１Ｂ（（ベンゾイミダゾール非阻害性出芽１ホモログβ（酵母））
ＢｕｂＲ１とも称されるＢＵＢ１Ｂは、コア有糸分裂チェックポイント構成要素であり、それは姉妹染色分体を結合する接着環のセパラーゼ媒介切断を統合することによって分裂後期を開始するユビキチンＥ３リガーゼであるＣｄｃ２０活性化後期促進複合体（ＡＰＣ／ＣＣｄｃ２０）に結合して、それを阻害する（Ｂａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。ＢｕｂＲ１は、有糸分裂チェックポイント活性化によってだけでなく、染色体−紡錘体付着の制御によってもまた、適切な染色体分離に寄与する（Ｍａｌｕｒｅａｎｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００９；Ｌａｍｐｓｏｎ  および  Ｋａｐｏｏｒ，２００５）。損なわれた紡錘体チェックポイント機能が、がんの多数の形態で発見されている。ＢｕｂＲ１の変異は、異数性発現と、腫瘍疾病素質と、短寿命、成長および精神遅滞、白内障、および顔面異形症をはじめとするいくつかの早老性形質とによって特徴付けられる稀なヒト症候群である、多彩異数性モザイク（ＭＶＡ）と関連付けられている（Ｍａｔｓｕｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。
【０１６７】
ＰＩ４ＫＡ（ホスファチジルイノシトール４−キナーゼ、触媒性、α）
４種の異なるホスファチジルイノシトール４−キナーゼ（ＰＩ４Ｋ）が、ヒト細胞で発現される。これらのイソ酵素（ＰＩ４ＫＡ、ＰＩ４ＫＢ、ＰＩ４Ｋ２Ａ、およびＰＩ４Ｋ２Ｂ）は、細胞膜の細胞質面におけるホスファチジルイノシトール（ＰｔｄＩｎｓ）のリン酸化を触媒してホスファチジルイノシトール４−リン酸（ＰｔｄＩｎｓ４Ｐ）の生成をもたらす（Ｍｉｎｏｇｕｅ  ａｎｄ  Ｗａｕｇｈ，２０１２）。ＰＩ４ＫＡは、小胞体（ＥＲ）に主に見られる。その活性は、ＥＲ出口部位の形成（Ｂｌｕｍｅｎｔａｌ−Ｐｅｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）、および原形質膜内のＰｔｄＩｎｓ４Ｐ濃度（Ｂａｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）の双方を制御するようである。研究グループは、ＰＩ４ＫＡ  ｍＲＮＡが、健常組織よりもＨＣＣでより豊富なことを発見した。この上方制御は、ＨＣＣにおける分化不良および能動的増殖速度の双方と、有意に相関した。そのためＰＩ４ＫＡは、ＨＣＣの確立された予後モデルを改善するための新規分子マーカーとして使用し得る（Ｉｌｂｏｕｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。
【０１６８】
ＡＵＲＫＢ（オーロラキナーゼＢ）
オーロラＢキナーゼは、有糸分裂紡錘体のセントロメアへの付着において機能するタンパク質である（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。ＡＵＲＫＢは、動原体近くの微小管に局在する（Ｋｕｎｉｔｏｋｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。オーロラキナーゼは多様な腫瘍細胞系で過剰発現され、これらのキナーゼは、腫瘍形成において役割を有するかもしれないことが示唆され、既にがん診断および治療法のための潜在的標的になっている（Ｆｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。最近、ＮＳＣＬＣがある患者の予後と密接に結び付いている、５つの遺伝子（ＴＯＰ２Ａ、ＡＵＲＫＢ、ＢＲＲＮ１、ＣＤＫ１、およびＦＵＳ）の遺伝子シグネチャーが同定された。この結果は、ＡＵＲＫＢのような染色体凝縮に関与する遺伝子が、幹様特性とおそらく関連すること、そして肺腺がんにおける生存期間を予測するかもしれないことを示唆した（Ｐｅｒｕｍａｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。
【０１６９】
ＳＬＣ３Ａ２（溶質輸送体ファミリー３（二塩基性および中性アミノ酸輸送活性化因子）、メンバー２）
ＳＬＣ３Ａ２は、ＣＤ９８（分化抗原群９８）としてもまた知られている、大型中性アミノ酸輸送体（ＬＡＴ１）の軽サブユニットを含んでなる（Ｌｅｍａｉｔｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。ＣＤ９８ヘテロ二量体は、約４０ｋＤａの複数回貫通軽鎖とジスルフィド結合する、約８０〜８５ｋＤａのＩＩ型一回膜貫通型重鎖（ＣＤ９８ｈｃ、４Ｆ２抗原重鎖またはＦＲＰ−１としてもまた知られている；ヒトおよびマウスでそれぞれ遺伝子ＳＬＣ３Ａ２およびＳｌｃ３ａ２によってコードされる）からなる（Ｄｅｖｅｓ  ａｎｄ  Ｂｏｙｄ，２０００）。ＣＤ９８ｈｃはインテグリンシグナル伝達増幅およびアミノ酸輸送において機能し；これらのどちらの機能も細胞の生存と増殖に寄与し得る（Ｃａｎｔｏｒ  ａｎｄ  Ｇｉｎｓｂｅｒｇ，２０１２）。多数の腫瘍がＣＤ９８ｈｃ（ＳＬＣ３Ａ２）を発現し、その発現は、Ｂ細胞リンパ腫における予後不良と相関する。さらに、固形腫瘍内のＣＤ９８ｈｃまたはＣＤ９８軽鎖発現を調べたほぼ全ての研究で、それらの発現が進行性または転移性腫瘍に相関することが示される（Ｋａｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。
【０１７０】
ＩＦＴ８１（鞭毛内輸送８１ホモログ（クラミドモナス））
チューブリンなどの毛様体前駆体の、細胞質から毛様体先端への鞭毛内輸送（ＩＦＴ）は、ほとんどの真核生物細胞上に見られる毛髪様細胞小器官である、繊毛の構築に関与する。点変異体によるＩＦＴ８１のノックダウンおよびレスキュー実験は、ＩＦＴ８１によるチューブリン結合が、ヒト細胞内の毛様体形成に必要であることを示した（Ｂｈｏｇａｒａｊｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。ＩＦＴ７４／７２と共に、ＩＦＴ８１は、繊毛形成に必要なＩＦＴ粒子を構築するためのコア複合体を形成する（Ｌｕｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。
【０１７１】
ＣＯＧ４（オリゴマーゴルジ装置４構成要素）
ＣＯＧ複合体は、ＣＯＧ１〜８と命名された８つのサブユニットからなり（Ｕｎｇａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｗｈｙｔｅ  ａｎｄ  Ｍｕｎｒｏ，２００１）、ＣＯＧ１−４（ＬｏｂｅＡ）とＣＯＧ５−８（ＬｏｂｅＢ）の２つのサブ複合体に分類される（Ｕｎｇａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。ＣＯＧ複合体は、常在性ゴルジ体タンパク質（グリコシル化酵素など）を再利用する小胞の係留において機能する（Ｐｏｋｒｏｖｓｋａｙａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。ＣＯＧ４遺伝子は、染色体１６ｑ２２．１に位置する（Ｒｅｙｎｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。Ｕｎｇａｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）は、ＣＯＧ４が、ゴルジ体の構造と機能に重要であり、細胞内膜輸送に影響を及ぼし得ると結論付けた（Ｕｎｇａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。
【０１７２】
ＮＣＢＰ１（核冠結合タンパク質サブユニット１、８０ｋＤａ）
核冠結合タンパク質複合体は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの５’キャップに結合するＲＮＡ結合タンパク質である。Ｋａｔａｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）は、ｍＲＮＡスプライシングおよびＲＮＡ輸送に関与してもよい、ＨｅＬａ細胞核抽出物に見られる８０ｋＤ核冠結合タンパク質（ＮＣＢＰ１）をコードする遺伝子のクローニングを記載した（Ｋａｔａｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）。体細胞ハイブリッドパネルからのゲノムＤＮＡにハイブリダイズさせることで、Ｃｈａｄｗｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）は、ＮＣＢＰ１遺伝子を９ｑ３４．１にマップした（Ｃｈａｄｗｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。
【０１７３】
ＮＥＦＨ（ニューロフィラメント、重鎖ポリペプチド）
ＮＥＦＨがエンコードするニューロフィラメント重鎖は、神経細胞骨格ニューロフィラメントの主要構成要素の１つである。ニューロフィラメント重鎖ポリペプチド（ＮＥＦＨ、２００ｋＤ）遺伝子は、染色体バンド２２ｑ１２．２に存在し、神経線維腫症２型（ＮＦ２）ファミリーの発症前診断のためのＤＮＡマーカーとして提案された。ＮＥＦＨの喪失または下方制御は、ほとんどがヒト自律神経腫瘍または中枢神経細胞腫において報告されている（Ｍｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｓｅｇａｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）。さらに、ヒト前立腺がん（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）、明細胞類上皮腫瘍（Ｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）、および小細胞肺がん（Ｂｏｂｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）における、ＮＥＦＨ発現の不在または低下が観察されている。興味深いことに、ＮＥＦＨの過剰発現は、正常な細胞構造と機能を妨害して、細胞死を誘導した（Ｓｚｅｂｅｎｙｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。
【発明を実施するための形態】
【０１７４】
本明細書の用法では、別段の記載がない限り、全ての用語は下述のとおり定義される。
【０１７５】
「ペプチド」という用語は、典型的に、隣接するアミノ酸のα−アミノおよびカルボニル基の間のペプチド結合によって互いに連結する、一連のアミノ酸残基を命名するために、本明細書で使用される。ペプチドは、好ましくは９アミノ酸長であるが、８アミノ酸長程度に短く、１０、１１、１２、１３または１４アミノ酸長であり得て、ＭＨＣクラスＩＩペプチドの場合、それらは１５、１６、１７、１８、１９または２０アミノ酸長であり得る。
【０１７６】
さらに「ペプチド」という用語は、典型的に、隣接するアミノ酸のα−アミノおよびカルボニル基の間のペプチド結合によって互いに連結する、一連のアミノ酸残基の塩を含むものとする。好ましくは、塩は、薬学的に許容可能な塩である。
【０１７７】
「ペプチド」という用語は、「オリゴペプチド」を含むものとする。「オリゴペプチドペプチド」という用語は、典型的に、隣接するアミノ酸のα−アミノおよびカルボニル基の間のペプチド結合によって互いに連結する、一連のアミノ酸残基を命名するために、本明細書で使用される。オリゴペプチドの長さは、その中で正しいエピトープ（単数）またはエピトープ（複数）が保持されれば、本発明には重要でない。オリゴペプチドは、典型的に、約３０アミノ酸残基長未満であり、約１５アミノ酸長を超える。
【０１７８】
「本発明のペプチド」という用語は、上で定義される、配列番号１〜配列番号９２に記載のペプチドからなる、またはそれを含んでなる、ペプチドを含むものとする。
【０１７９】
「ポリペプチド」という用語は、典型的に、隣接するアミノ酸のα−アミノおよびカルボニル基の間のペプチド結合によって互いに連結する、一連のアミノ酸残基を指す。正しいエピトープが保持されれば、ポリペプチドの長さは、本発明には重要でない。ペプチドまたはオリゴペプチドという用語とは対照的に、ポリペプチドという用語は、約３０を超えるアミノ酸残基を含有する分子を指すことが意図される。
【０１８０】
ペプチド、オリゴペプチド、タンパク質、またはこのような分子をコードするポリヌクレオチドは、免疫応答を誘導する能力があれば「免疫原性」である(したがって本発明内における「免疫原」である)。。本発明では、免疫原性は、より具体的には、Ｔ細胞応答を誘導する能力と定義される。したがって「免疫原」は、免疫応答を誘導する能力がある分子であり、本発明では、Ｔ細胞応答を誘導する能力がある分子である。別の態様では、免疫原は、それに対する特異的抗体またはＴＣＲを生じさせるのに使用される、ペプチド、ペプチドとＭＨＣの複合体、オリゴペプチド、および／またはタンパク質であり得る。
【０１８１】
クラスＩ  Ｔ細胞「エピトープ」は、クラスＩ  ＭＨＣ受容体に結合する短いペプチドを要して、三成分複合体（ＭＨＣクラスＩα鎖、β−２−ミクログロブリン、およびペプチド）を形成し、それは、適切な親和性でＭＨＣ／ペプチド複合体に結合する適合Ｔ細胞受容体を保有するＴ細胞によって、認識され得る。ＭＨＣクラスＩ分子へのペプチド結合は、典型的に８〜１４アミノ酸長であり、最も典型的には９アミノ酸長である。
【０１８２】
ヒトには、ＭＨＣクラスＩ分子（ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）ともまた称されるヒトのＭＨＣ分子）をコードする、３つの異なる遺伝子座、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、およびＨＬＡ−Ｃがある。ＨＬＡ−Ａ＊０１、ＨＬＡ−Ａ＊０２、およびＨＬＡ−Ｂ＊０７は、これらの遺伝子座から発現され得る、異なるＭＨＣクラスＩ対立遺伝子の例である。
【０１８３】
【表７】
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【０１８４】
したがって治療および診断目的では、いくつかの異なるＨＬＡクラスＩＩ受容体と適切な親和性で結合するペプチドが、非常に望ましい。いくつかの異なるＨＬＡクラスＩＩ分子に対するペプチド結合は、乱交雑バインダーと称される。
【０１８５】
本明細書の用法では、ＤＮＡ配列への言及は、一本鎖および二本鎖ＤＮＡの双方を含む。したがって、特異的配列は、文脈上明らかに別の意味が示唆されない限り、このような配列の一本鎖ＤＮＡ、このような配列とその補体との二本鎖（二本鎖ＤＮＡ）、およびこのような配列の補体を指す。「コード領域」という用語は、その天然ゲノム環境内で、遺伝子の発現産物を天然にまたは正常にコードする遺伝子の部分、すなわち、遺伝子の天然発現産物を生体内でコードする領域を指す。
【０１８６】
コード領域は、非変異型（「正常」）、変異型または改変遺伝子に由来し得て、または当業者に周知のＤＮＡ合成法を使用して実験室で完全に合成された、ＤＮＡ配列または遺伝子にさえ由来する。
【０１８７】
「ヌクレオチド配列」という用語は、デオキシリボヌクレオチドのヘテロ重合体を指す。
【０１８８】
特定のペプチド、オリゴペプチド、またはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、天然起源であってもよく、またはそれらは合成的に構築されてもよい。一般に、本発明のペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質をエンコードするＤＮＡ断片は、ｃＤＮＡフラグメントと短いオリゴヌクレオチドリンカーから構築され、またはひと続きのオリゴヌクレオチドから構築されて、微生物またはウイルスオペロンに由来する調節因子を含んでなる、組換え転写単位で発現できる合成遺伝子を提供する。
【０１８９】
本明細書の用法では、「ペプチドをコードする（またはエンコードする）ヌクレオチド」という用語は、それによって配列が発現される生体系と適合性の人工（人造）開始および停止コドンを含むペプチドをコードする、ヌクレオチド配列を指す。
【０１９０】
「発現産物」という用語は、遺伝子の、そして遺伝コード縮重に起因する同等物をコードし、したがって同一アミノ酸をコードする任意の核酸配列の、天然翻訳産物である、ポリペプチドまたはタンパク質を意味する。
【０１９１】
コード配列に言及する場合、「フラグメント」という用語は、その発現産物が、完全コード領域の発現産物と本質的に同一の生物学的機能または活性を保つ、完全未満のコード領域を含んでなるＤＮＡの部分を意味する。
【０１９２】
「ＤＮＡ断片」という用語は、別々のフラグメントの形態の、またはより大型のＤＮＡコンストラクトの構成要素としての、ＤＮＡポリマーを指し、それは、実質的に純粋な、すなわち、混入内在性物質を含まない形態で、例えばクローニングベクターを使用する標準生化学的方法によって、断片およびその構成ヌクレオチド配列を同定、操作、および回収できるようにする量または濃度で、少なくとも１回単離されたＤＮＡに由来する。このような断片は、読み取り枠の形態で提供され、それは、典型的に真核生物遺伝子内に存在する内部非翻訳配列またはイントロンによって、中断されていない。非翻訳ＤＮＡ配列は、読み取り枠下流に存在してもよく、それはそこでコード領域の操作または発現を妨げない。
【０１９３】
「プライマー」という用語は、短い核酸配列を意味し、それはＤＮＡの１本鎖と対合し得て、ＤＮＡポリメラーゼがそこでデオキシリボヌクレオチド鎖合成を開始する、遊離３’−ＯＨ末端を提供する。
【０１９４】
「プロモーター」という用語は、転写を開始するためのＲＮＡポリメラーゼ結合に関与する、ＤＮＡの領域を意味する。
【０１９５】
「単離」という用語は、物質が、その元の環境（例えばそれが天然起源であれば、天然環境）から取り出されることを意味する。例えば、生きている動物中に存在する天然ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離されていないが、天然システムで共存する物質の一部または全部から分離された同一ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離されている。このようなポリヌクレオチドは、ベクターの一部であり得ておよび／またはこのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、組成物の一部であり得て、このようなベクターまたは組成物がその天然環境の一部でないと言う意味で、なおも単離されている。
【０１９６】
本発明によって開示されるポリヌクレオチド、および組換えまたは免疫原性ポリペプチドは、「精製」形態であってもよい。「精製」という用語は、完全に純粋であることを要求せず；むしろ、それは相対的定義であることが意図されて、これらの用語が当業者によって理解されるように、高度に精製された調製物、または部分的にのみ精製された調製物を含み得る。例えば、ｃＤＮＡライブラリーから単離された個々のクローンは、電気泳動的に均一に、従来法で精製されている。少なくとも１桁、好ましくは２または３桁、より好ましくは４または５桁への、出発原料または天然物質の精製が、明示的に検討される。さらに、重量基準で、好ましくは９９．９９９％、または少なくとも９９．９９％または９９．９％；さらに望ましくは９９％以上の純度を有する、特許請求されるポリペプチドが、明示的に検討される。
【０１９７】
本発明によって開示される核酸およびポリペプチド発現産物、ならびにこのような核酸および／またはこのようなポリペプチドを含有する発現ベクターは、「富化形態」であってもよい。本明細書の用法では、「富化」という用語は、（例えば）その天然濃度の少なくとも約２、５、１０、１００、または１０００倍の物質濃度を意味し、有利には重量基準で０．０１％、好ましくは重量基準で少なくとも約０．１％である。重量基準で約０．５％、１％、５％、１０％、および２０％の富化調製物もまた、検討される。本発明を構成する、配列、コンストラクト、ベクター、クローン、およびその他の物質は、有利には、富化または単離形態であり得る。
【０１９８】
「活性フラグメント」という用語は、単独で、または任意選択的に適切なアジュバントと共に、例えば、ウサギまたはマウスなどのそしてまたヒトを含む哺乳類などの動物に投与されると、免疫応答を生じるフラグメント（すなわち免疫原性を有する）を意味し、このような免疫応答は、ヒトなどのレシピエント動物におけるＴ細胞応答を刺激する形態を取る。代案としては、「活性フラグメント」はまた、生体外でＴ細胞応答を誘導するのに使用してもよい。
【０１９９】
本明細書の用法では、ポリペプチドとの関連で使用される場合、「部分」、「断片」、および「フラグメント」という用語は、アミノ酸残基などの連続する残基の配列を指し、その配列は、より大型の配列の部分集合を形成する。例えば、トリプシンまたはキモトリプシンなどの一般的エンドペプチダーゼのいずれかによってポリペプチドを処理した場合、このような処理から得られるオリゴペプチドは、出発ポリペプチドの部分、断片またはフラグメントに相当する。ポリヌクレオチドに関して使用される場合、これらの用語は、エンドヌクレアーゼのいずれかによる前記ポリヌクレオチドの処理によって生じる生成物を指す。
【０２００】
本発明によると、配列に言及する場合、「同一性百分率」または「パーセント同一」という用語は、比較される配列（「比較配列」）と、記載されまたは特許請求される配列（「参照配列」）とのアライメント後に、配列が、特許請求されまたは記載される配列と比較されることを意味する。次に同一性百分率は、次式に従って判定される：
同一性百分率＝１００［１−（Ｃ／Ｒ）］
式中、Ｃは、参照配列と比較される配列との間のアライメント長にわたる、参照配列と比較配列の間の差異の数であり、
（ｉ）比較配列中に対応する整列塩基またはアミノ酸を有しない参照配列中の各塩基またはアミノ酸、および
（ｉｉ）参照配列中の各ギャップ、および
（ｉｉｉ）比較配列中の整列塩基またはアミノ酸と異なる参照配列中の各整列塩基またはアミノ酸が、差異を構成して、
（ｉｉｉｉ）アライメントは、整合配列の１位から開始しなくてはならず；
Ｒは、比較配列とのアライメント長にわたる参照配列中の塩基またはアミノ酸の数であり、参照配列中に作成される任意のギャップもまた塩基またはアミノ酸として数えられる。
【０２０１】
比較配列とそれに対して同一性百分率が上のように計算される参照配列との間に、特定の最小同一性百分率とほぼ同一のまたはそれ以上のアライメントが存在すれば、その中に上記のように計算された同一性百分率が特定の同一性百分率未満であるアライメントが存在したとしても、比較配列は、参照配列との特定の最小同一性百分率を有する。
【０２０２】
本明細書で開示される元の（未修飾）ペプチドは、特に明記しない場合は、ペプチド鎖内の異なる、おそらくは選択的な部位における、１つまたは複数の残基の置換によって修飾され得る。
【０２０３】
好ましくはこれらの置換は、アミノ酸鎖の末端に位置する。このような置換は、保存的性質であってもよく、例えば、疎水性アミノ酸が別の疎水性アミノ酸によって置換されるなど、構造および特徴の類似したアミノ酸によってアミノ酸が置換される。さらにより保存的な置換は、ロイシンのイソロイシンによる置換などの、同一または類似サイズおよび化学的性質のアミノ酸の置換である。天然起源相同タンパク質ファミリーの配列多様性の研究では、特定のアミノ酸置換は、他よりも耐容されることが多く、これらは、元のアミノ酸とその置換物の間のサイズ、電荷、極性、および疎水性の類似性との相関を示すことが多く、これが「保存的置換」の定義の基礎である。
【０２０４】
保存的置換は、本明細書では、以下の５つのグループの１つの中の交換として定義される：グループ１−小型脂肪族、非極性またはわずかに極性の残基（Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ）；グループ２−極性の負に帯電した残基およびそれらのアミド（Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ）；グループ３−極性の正に帯電した残基（Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ）；グループ４−大型脂肪族の非極性残基（Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ）；およびグループ５−大型芳香族残基（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）。
【０２０５】
より保存的でない置換は、アラニンのイソロイシン残基による置換などの、類似した特徴を有するがサイズがいくらか異なる別のアミノ酸による置換を伴うかもしれない。高度に非保存的な置換は、極性アミノ酸の、または塩基性アミノ酸の酸性アミノ酸による置換を伴うかもしれない。しかし化学効果は完全に予測可能でなく、遊離基置換は単純な化学的原理からは予測できない偶然の効果を生じる可能性があるので、このような「遊離基」置換は、潜在的に無効であるとして却下し得ない。
【０２０６】
もちろんこのような置換には、通常のＬ−アミノ酸以外の構造体が関与してもよい。したがってＤ−アミノ酸が、本発明の抗原性ペプチドに通常見られるＬ−アミノ酸を置換するかもしれず、依然として本明細書の開示に包含される。さらに置換目的で非標準Ｒ基（すなわち、天然タンパク質の通常の２０個のアミノ酸に見られる以外のＲ基）を保持するアミノ酸もまた使用して、本発明による免疫原および免疫原性ポリペプチドを生成してもよい。
【０２０７】
２つ以上の位置における置換が、以下に定義されるように実質的に同等またはそれ以上の抗原活性のあるペプチドをもたらすことが発見された場合、これらの置換の組み合わせを試験して、置換の組み合わせが、ペプチドの抗原性に相加または相乗効果をもたらすかどうかを判定する。最大で、ペプチド内の４つ以下の位置が同時に置換される。
【０２０８】
本発明のペプチドは、最大４個のアミノ酸で伸長し得て、すなわち４：０〜０：４の間のあらゆる組み合わせで、どちらかの末端に１、２、３または４個のアミノ酸を付加し得る。
【０２０９】
本発明による伸長の組み合わせは、表３から表し得る：
【０２１０】
【表８】
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【０２１１】
伸長のためのアミノ酸は、元のタンパク質配列のペプチドまたは任意のその他のアミノ酸であり得る。伸長を利用して、ペプチドの安定性または溶解度を高め得る。
【０２１２】
「Ｔ細胞応答」という用語は、生体外または生体内でペプチドによって誘導される、エフェクター機能の特異的増殖および活性化を意味する。ＭＨＣクラスＩ限定ＣＴＬでは、エフェクター機能は、ペプチドパルスまたはペプチド前駆体パルスまたは天然ペプチド提示標的細胞の溶解；好ましくはペプチドによって誘導されるインターフェロン−γ、ＴＮＦ−α、またはＩＬ−２であるサイトカインの分泌；好ましくはペプチドによって誘導されるグランザイムまたはパーフォリンであるエフェクター分子の分泌；または脱顆粒であってもよい。
【０２１３】
好ましくは、配列番号１〜配列番号９２のペプチドに特異的なＣＴＬを置換ペプチドについて試験する場合、置換ペプチドが背景に対して最大溶解増大の半分を達成するペプチド濃度は、約１ｍＭ以下、好ましくは約１μＭ以下、より好ましくは約１ｎＭ以下、さらにより好適には約１００ｐＭ以下、最も好ましくは約１０ｐＭ以下である。置換ペプチドが、２人以上、少なくとも２人、より好ましくは３人の個人からのＣＴＬによって認識されることもまた好ましい。
【０２１４】
したがって本発明のエピトープは、天然起源腫瘍関連または腫瘍特異的エピトープと同一であってもよく、またはそれらが実質的に同一の抗原活性を有しさえすれば、４つ以下の残基が参照ペプチドと異なるエピトープを含んでもよい。
【０２１５】
免疫応答の刺激は、宿主免疫系によって外来性として認識された抗原の存在に依存する。腫瘍関連抗原の存在の発見は、今や、宿主の免疫系を用いて、腫瘍成長に介入する可能性を高めた。免疫系の体液性および細胞性アームの双方を活用する様々な機構が、がん免疫療法のために目下探求されている。
【０２１６】
細胞性免疫応答の特定の要素は、腫瘍細胞を特異的に認識して破壊する能力がある。腫瘍浸潤性細胞集団からの、または末梢血からの細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の単離は、がんに対する自然免疫防御において、このような細胞が重要な役割を果たすことを示唆する。特に、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）を保有して、細胞質ゾル内に位置するタンパク質または欠陥リボソーム産物（ＤＲＩＰＳ）に由来する、通常は８〜１２残基のペプチドのクラスＩ分子を認識するＣＤ８陽性Ｔ細胞が、この応答において重要な役割を果たす。ヒトのＭＨＣ分子はまた、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）とも称される。
【０２１７】
ＭＨＣクラスＩ分子は、主に内在性の細胞質または核タンパク質、ＤＲＩＰＳ、およびより大型のペプチドのタンパク質分解的切断から得られる、ペプチドを提示する、核を有する大多数の細胞上にある。しかし、エンドソームコンパートメントまたは外来性起源に由来するペプチドもまた、ＭＨＣクラスＩ分子上に頻繁に見られる。この非古典的様式のクラスＩ提示は、文献中で交差提示と称される。
【０２１８】
ＣＤ８およびＣＤ４依存性のどちらのタイプの応答も、共に相乗的に抗腫瘍効果に寄与するので、ＣＤ８陽性ＣＴＬ（ＭＨＣクラスＩ分子）またはＣＤ４陽性ＣＴＬ（ＭＨＣクラスＩＩ分子）のどちらかによって認識される腫瘍関連抗原の同定および特性解析は、腫瘍ワクチンの開発において重要である。したがってどちらかのクラスのＭＨＣ複合体へのペプチド結合を含有するペプチド組成物を提供することが、本発明の目的である。
【０２１９】
がん治療に関連する重篤な副作用および費用を考慮すると、より良い予後診断法および診断法がぜひとも必要である。したがって一般的がん、特に肺がんのための生物マーカーに相当するその他の要素を同定する必要性がある。さらに一般的がん、特に肺がんの治療法で使用し得る要素を同定する必要性がある。
【０２２０】
本発明は、本発明のペプチドを過剰または排他的に提示する、がん／腫瘍、好ましくは肺がん、なおもより好ましくは非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）の治療において有用なペプチドを提供する。これらのペプチドは、質量分析法によって、原発性ヒト肺がんサンプル上でＨＬＡ分子によって天然に提示されることが示された（実施例１、および図１を参照されたい）。
【０２２１】
それからペプチドが誘導される、起源遺伝子／タンパク質（「完全長タンパク質」または「基礎タンパク質」とも称される）は、非小細胞肺がんで、配列番号６６〜７５は、胃がんおよび神経膠芽腫で、正常組織と比較して高度に過剰発現されることが示され（ＮＳＣＬＣについては実施例２、および図２を参照されたい）、起源遺伝子の腫瘍との高度な関連性が実証された。さらに、ペプチドそれ自体も腫瘍組織上では強力に過剰提示されるが、正常組織では過剰提示されない（実施例３および図３を参照されたい）。
【０２２２】
ＨＬＡ結合ペプチドは、免疫系、具体的にはＴリンパ球／Ｔ細胞によって、認識され得る。Ｔ細胞は、例えば誘導ペプチドを提示する肺がん細胞などの、認識されたＨＬＡ／ペプチド複合体を提示する細胞を破壊し得る。
【０２２３】
本発明のペプチドは、Ｔ細胞応答を刺激する能力があり、および／または過剰提示されることが示されており、したがって抗体および／またはＴＣＲ、特に本発明によるＴＣＲ生成のために利用し得る（実施例４および図４を参照されたい）。さらに、ペプチドは、それぞれのＭＨＣと複合体化した場合、同様に、抗体および／またはＴＣＲ、特に本発明によるＴＣＲ生成のために利用し得る。それぞれの方法は、当業者に良く知られており、同様にそれぞれの文献に見られる。したがって本発明のペプチドは、それによって腫瘍細胞を破壊し得る、患者における免疫応答を生じさせるのに有用である。患者における免疫応答は、理想的には免疫原性を増強する薬剤（すなわちアジュバント）との組み合わせで、記載されるペプチド、または適切な前駆体（例えば伸長ペプチド、タンパク質、またはこれらのペプチドをコードする核酸）を患者に直接投与することで、誘導し得る。本発明の標的ペプチドは、正常組織上では同等のコピー数で提示されないので、このような治療的ワクチン接種から生じる免疫応答は、腫瘍細胞に対して高度に特異的であることが予測され得て、患者の正常細胞に対する望まれない自己免疫反応のリスクを防止する。
【０２２４】
医薬組成物は、遊離形態または薬学的に許容可能な塩の形態のどちらかのペプチドを含んでなる。本明細書の用法では、「薬学的に許容可能な塩」は、開示されたペプチドの誘導体を指し、ペプチドは、薬剤の酸性または塩基性塩を生成することで修飾される。例えば、酸性塩は、適切な酸との反応を伴って、遊離塩基（典型的に中性形態の薬剤が中性−ＮＨ２基を有する）から調製される。酸性塩を調製するための適切な酸としては、例えば、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、リンゴ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸などの有機酸、ならびに例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などの無機酸の双方が挙げられる。逆に、ペプチド上に存在してもよい酸部分の塩基性塩の調製物は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、トリメチルアミンなどの薬学的に許容可能な塩基を用いて調製される。
【０２２５】
特に好ましい一実施形態では、医薬組成物は、酢酸（酢酸塩）、トリフルオロ酢酸または塩酸（塩化物）の塩として、ペプチドを含んでなる。
【０２２６】
がんを治療するために有用であるのに加えて、本発明のペプチドは、診断法としてもまた有用である。ペプチドは肺がん細胞から生じたので、そしてこれらのペプチドは正常組織には存在せずまたはより低レベルで存在すると判定されたので、これらのペプチドを利用してがんの存在を診断し得る。
【０２２７】
特許請求されるペプチドの組織生検上の存在は、がん診断において病理学者を補佐し得る。抗体、質量分析法または当該技術分野で既知のその他の方法による特定のペプチドの検出は、組織が悪性であるまたは炎症を起こしているまたは一般的に病的であることを病理学者に伝え得る。ペプチド基の存在は、病的組織の分類または下位分類を可能にし得る。
【０２２８】
患部組織検体上のペプチドの検出は、特にＴリンパ球が作用機序に関与することが知られておりまたは予測される場合に、免疫系が関与する治療法の利点を判定できるようにする。ＭＨＣ発現の喪失は、それによって感染悪性細胞が免疫監視を逃れる、十分に説明された機序である。したがってペプチドの存在は、この機序が、分析した細胞によって活用されていないことを示す。
【０２２９】
本発明のペプチドは、ペプチドまたはＭＨＣ分子と複合体化したペプチドに対するＴ細胞応答または抗体応答などの、これらのペプチドに対するリンパ球応答を分析するのに使用されるかもしれない。これらのリンパ球応答は、さらなる治療段階を決定するための予後マーカーとして使用し得る。これらの応答はまた、例えば、タンパク質、核酸、自系物質のワクチン接種や、リンパ球の養子免疫伝達などの異なる手段によるリンパ球応答の誘導を目指す、免疫療法アプローチにおける代理マーカーとして使用し得る。遺伝子治療の設定では、副作用の評価において、ペプチドに対するリンパ球応答を考慮し得る。リンパ球応答のモニタリングはまた、例えば移植片対宿主病および宿主対移植片病の検出など、移植治療の経過観察検査のための有益な手段かもしれない。
【０２３０】
本発明のペプチドを使用して、ＭＨＣ／ペプチド複合体に対する特異的抗体を作成して開発し得る。これらは、毒素または放射性物質を患部組織に標的化する治療法のために、使用し得る。これらの抗体の別の用途は、ＰＥＴなどのイメージング目的の放射性核種の患部組織への標的化であり得る。この用途は、小規模な転移の検出、または病的組織のサイズと正確な位置確認の判定を助け得る。
【０２３１】
したがってＨＬＡ限定抗原と複合体化したヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩまたはＩＩと特異的に結合する、組換え抗体を生成する方法を提供することが、本発明のさらなる態様であり、方法は、前記ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩまたはＩＩを発現する細胞を含んでなる、遺伝子操作された非ヒト哺乳類を、前記ＨＬＡ限定抗原と複合体化した可溶性形態のＭＨＣクラスＩまたはＩＩ分子によって免疫化するステップと；前記非ヒト哺乳類の抗体産生細胞から、ｍＲＮＡ分子を単離するステップと；前記ｍＲＮＡ分子によってコードされるタンパク質分子を提示する、ファージディスプレイライブラリーを作成するステップと；前記ファージディスプレイライブラリーから、少なくとも１つのファージを単離するステップとを含んでなり、前記少なくとも１つのファージは、前記ＨＬＡ限定抗原と複合体化した前記ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩまたはＩＩと特異的に結合する、前記抗体を提示する。
【０２３２】
ＨＬＡ限定抗原と複合体化したヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩまたはＩＩと特異的に結合する抗体を提供することも、本発明のさらなる態様であり、抗体は、好ましくは、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、二重特異性抗体および／またはキメラ抗体である。
【０２３３】
本発明のさらに別の態様は、ＨＬＡ限定抗原と複合体化したヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩまたはＩＩと特異的に結合する、前記抗体を生成する方法に関し、方法は、前記ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩまたはＩＩを発現する細胞を含んでなる、遺伝子操作された非ヒト哺乳類を、前記ＨＬＡ限定抗原と複合体化した可溶性形態のＭＨＣクラスＩまたはＩＩ分子によって免疫化するステップと；前記非ヒト哺乳類の抗体産生細胞から、ｍＲＮＡ分子を単離するステップと；前記ｍＲＮＡ分子によってコードされるタンパク質分子を提示する、ファージディスプレイライブラリーを作成するステップと；前記ファージディスプレイライブラリーから、少なくとも１つのファージを単離するステップとを含んでなり、前記少なくとも１つのファージは、前記ＨＬＡ限定抗原と複合体化した前記ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩまたはＩＩと特異的に結合可能な前記抗体を提示する。このような抗体および一本鎖クラスＩ主要組織適合性複合体を生成するそれぞれの方法、ならびにこれらの抗体を生成するためのその他のツールは、本発明の目的で、全てその内容全体を参照によって明示的に援用する、国際公開第０３／０６８２０１号パンフレット、国際公開第２００４／０８４７９８号パンフレット、国際公開第０１／７２７６８号パンフレット、国際公開第０３／０７０７５２号パンフレット、およびＣｏｈｅｎ  ＣＪ，Ｄｅｎｋｂｅｒｇ  Ｇ，Ｌｅｖ  Ａ，Ｅｐｅｌ  Ｍ，Ｒｅｉｔｅｒ  Ｙ．Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｗｉｔｈ  ＭＨＣ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ，ｐｅｐｔｉｄｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ，Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｌｉｋｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ：ｎｅｗ  ｔｏｏｌｓ  ｔｏ  ｓｔｕｄｙ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ＴＣＲ−ｐｅｐｔｉｄｅ−ＭＨＣ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．２００３  Ｓｅｐ−Ｏｃｔ；１６（５）：３２４−３２．；Ｄｅｎｋｂｅｒｇ  Ｇ，Ｌｅｖ  Ａ，Ｅｉｓｅｎｂａｃｈ  Ｌ，Ｂｅｎｈａｒ  Ｉ，Ｒｅｉｔｅｒ  Ｙ．Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ａｎｄ  ＡＰＣｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｗｉｔｈ  ＴＣＲ−ｌｉｋｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｔｏｗａｒｄ  ａ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ａｎｔｉｇｅｎ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００３  Ｓｅｐ  １；１７１（５）：２１９７−２０７；およびＣｏｈｅｎ  ＣＪ，Ｓａｒｉｇ  Ｏ，Ｙａｍａｎｏ  Ｙ，Ｔｏｍａｒｕ  Ｕ，Ｊａｃｏｂｓｏｎ  Ｓ，Ｒｅｉｔｅｒ  Ｙ．Ｄｉｒｅｃｔ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  Ｉ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ：ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ，ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｖｉｒａｌ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ，ＭＨＣ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００３  Ａｐｒ  １５；１７０（８）：４３４９−６１で��示される。
【０２３４】
好ましくは、抗体は、２０ナノモル濃度未満、好ましくは１０ナノモル濃度未満の結合親和性で複合体に結合し、それは本発明の文脈で「特異的」と見なされる。
【０２３５】
特異的ペプチド−ＭＨＣ複合体を認識する可溶性Ｔ細胞受容体を生成する方法を提供することもまた、本発明のさらなる態様である。このような可溶性Ｔ細胞受容体は、特異的Ｔ細胞クローンから生じ得て、それらの親和性は、相補性決定領域を標的とする変異誘発によって増大させ得る。Ｔ細胞受容体の選択目的で、ファージディスプレイを利用し得る（米国特許第２０１０／０１１３３００号明細書、Ｌｉｄｄｙ  Ｎ，Ｂｏｓｓｉ  Ｇ，Ａｄａｍｓ  ＫＪ，Ｌｉｓｓｉｎａ  Ａ，Ｍａｈｏｎ  ＴＭ，Ｈａｓｓａｎ  ＮＪ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ＴＣＲ−ｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ  ｋｉｌｌｉｎｇ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ２０１２  Ｊｕｎ；１８（６）：９８０−９８７）。ファージディスプレイにおいて、および薬剤としての実用において、Ｔ細胞受容体を安定化する目的で、例えば非天然ジスルフィド結合、その他の共有結合（一本鎖Ｔ細胞受容体）、または二量体化ドメインによって、αおよびβ鎖を連結させ得る（Ｂｏｕｌｔｅｒ  ＪＭ，Ｇｌｉｃｋ  Ｍ，Ｔｏｄｏｒｏｖ  ＰＴ，Ｂａｓｔｏｎ  Ｅ，Ｓａｍｉ  Ｍ，Ｒｉｚｋａｌｌａｈ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｔａｂｌｅ，ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｆｏｒ  ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  ２００３  Ｓｅｐ；１６（９）：７０７−７１１．；Ｃａｒｄ  ＫＦ，Ｐｒｉｃｅ−Ｓｃｈｉａｖｉ  ＳＡ，Ｌｉｕ  Ｂ，Ｔｈｏｍｓｏｎ  Ｅ，Ｎｉｅｖｅｓ  Ｅ，Ｂｅｌｍｏｎｔ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＩＬ−２  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｔａｉｎｓ  ＭＨＣ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ＩＬ−２  ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ２００４  Ａｐｒ；５３（４）：３４５−３５７；およびＷｉｌｌｃｏｘ  ＢＥ，Ｇａｏ  ＧＦ，Ｗｙｅｒ  ＪＲ，Ｏ’Ｃａｌｌａｇｈａｎ  ＣＡ，Ｂｏｕｌｔｅｒ  ＪＭ，Ｊｏｎｅｓ  ＥＹ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ａｌｐｈａｂｅｔａ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｓ  ｓｕｉｔａｂｌｅ  ｆｏｒ  ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  １９９９  Ｎｏｖ；８（１１）：２４１８−２４２３を参照されたい）。Ｔ細胞受容体は、標的細胞上で特定機能を発揮させるために、毒素、薬剤、サイトカイン（米国特許第２０１３／０１１５１９１号明細書を参照されたい）、抗ＣＤ３ドメインのようなエフェクター細胞漸増ドメインなどに、連結させ得る。さらにそれは、養子免疫伝達のために使用されるＴ細胞内で発現させ得る。
【０２３６】
さらなる情報は、国際公開第２００４／０３３６８５Ａ１号パンフレットおよび国際公開第２００４／０７４３２２Ａ１号パンフレットにある。ＴＣＲの組み合わせは、国際公開第２０１２／０５６４０７Ａ１号パンフレットに記載される。さらなる生成方法は、国際公開第２０１３／０５７５８６Ａ１号パンフレットで開示される。
【０２３７】
さらに、それらを使用して、生検サンプルに基づく病理学者のがん診断を確認し得る。
【０２３８】
過剰提示ペプチドを選択するために、中央値サンプル提示ならびに反復試験変動を示す、提示プロファイルが計算される。プロファイルは、関心のある腫瘍実体のサンプルを正常なサンプルのベースラインに並置させる。次に、線形混合効果モデルのｐ値を計算し（Ｊ．Ｐｉｎｈｅｉｒｏ，Ｄ．Ｂａｔｅｓ，Ｓ．ＤｅｂＲｏｙ，Ｓａｒｋａｒ  Ｄ．，Ｒ  Ｃｏｒｅ  ｔｅａｍ．ｎｌｍｅ：Ｌｉｎｅａｒ  ａｎｄ  Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ  Ｍｉｘｅｄ  Ｅｆｆｅｃｔｓ  Ｍｏｄｅｌｓ．２００８）、誤検出率によって複数試験について補正する（Ｙ．Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ  ａｎｄ  Ｙ．Ｈｏｃｈｂｅｒｇ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｆａｌｓｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｒａｔｅ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｐｏｗｅｒｆｕｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｔｅｓｔｉｎｇ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒｏｙａｌ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ．Ｓｅｒｉｅｓ  Ｂ（Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｃａｌ），Ｖｏｌ．５７（Ｎｏ．１）：２８９−３００，１９９５）ことで、これらの各プロファイルを過剰提示スコアに統合し得る。
【０２３９】
質量分析法によるＨＬＡリガンドの同定と相対的定量化のために、衝撃凍結サンプルからＨＬＡ分子を精製し、ＨＬＡ関連ペプチドを単離した。単離ペプチドを分離して、オンラインナノエレクトロスプレーイオン化（ｎａｎｏＥＳＩ）液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ−ＭＳ）実験によって、配列を同定した。得られたペプチド配列は、ＮＳＣＬＣサンプルから記録された天然ＴＵＭＡＰの断片化パターンを、同一配列の対応する合成参照ペプチドの断片化パターンと比較することで、確認された。ペプチドは、原発性腫瘍のＨＬＡ分子のリガンドとして直接同定されたので、これらの結果は、ＮＳＣＬＣ患者から入手された原発性腫瘍組織上における、同定されたペプチドの天然プロセッシングおよび提示の直接的証拠を提供する。
【０２４０】
独自仕様の発見パイプラインＸＰＲＥＳＩＤＥＮＴ（登録商標）ｖ２．１（例えば、その内容全体を本明細書に援用する米国特許第２０１３−００９６０１６号明細書を参照されたい）は、いくつかの異なる非がん性組織および臓器と比較した、がん組織上のＨＬＡ限定ペプチドレベルの直接的相対定量化に基づく、妥当な過剰提示ペプチドワクチン候補の同定と選択を可能にする。これは、独自仕様のデータ解析パイプラインによる獲得ＬＣ−ＭＳデータ処理、配列同定のためのアルゴリズム組み合わせ、スペクトルクラスタリング、イオン計数、滞留時間アライメント、電荷状態のデコンボリューション、および正規化を使用した、無標識示差定量化の開発によって、達成された。
【０２４１】
各ペプチドおよびサンプルの誤差推定値を含む、提示レベルが確立された。腫瘍組織上で排他的に提示されるペプチド、および腫瘍内で過剰提示されるペプチドが、非がん性の組織および臓器との比較で同定された。
【０２４２】
５０個の衝撃凍結ＮＳＣＬＣ腫瘍サンプルからＨＬＡ−ペプチド複合体を精製して、ＨＬＡ関連ペプチドをＬＣ−ＭＳによって単離し分析した。
【０２４３】
本出願に含まれる全てのＴＵＭＡＰは、この原発性ＮＳＣＬＣ腫瘍サンプル上のアプローチによって同定され、原発性ＮＳＣＬＣ上のそれらの提示が確認された。
【０２４４】
複数のＮＳＣＬＣ腫瘍および正常組織上で同定されたＴＵＭＡＰは、無標識ＬＣ−ＭＳデータのイオン計数を使用して定量化された。方法は、ペプチドのＬＣ−ＭＳシグナル面積が、サンプル中のその豊富さに相関すると仮定する。様々なＬＣ−ＭＳ実験におけるペプチドの全ての定量的シグナルは、中心傾向に基づいて正規化し、サンプルあたりで平均化して、提示プロファイルと称される棒グラフにマージさせた。提示プロファイルは、タンパク質データベース検索、スペクトルクラスタリング、電荷状態デコンボリューション（除電）、および滞留時間アライメント、および正規化のような、異なる解析法を統合する。
【０２４５】
したがって本発明は、配列番号１〜配列番号６５、および配列番号７６〜配列番号８４、および配列番号９２からなる群から選択される配列を含んでなるペプチド、または配列番号１〜配列番号６５、および配列番号７６〜配列番号８４、および配列番号９２と、少なくとも９０％相同的な（好ましくは同一の）それらの変異型、または前記ペプチドと交差反応するＴ細胞を誘導するそれらの変異型に関し、前記ペプチドは完全長ポリペプチドでない。
【０２４６】
本発明は、配列番号１〜配列番号６５、および配列番号７６〜配列番号８４、および配列番号９２からなる群から選択される配列を含んでなるペプチド、または配列番号１〜配列番号６５、および配列番号７６〜配列番号８４と、少なくとも９０％相同的な（好ましくは同一の）それらの変異型にさらに関し、前記ペプチドまたは変異型は、８〜１００、好ましくは８〜３０、最も好ましくは８〜１４アミノ酸の全長を有する。
【０２４７】
本発明は、ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩまたはＩＩの分子に結合する能力を有する、本発明によるペプチドにさらに関する。
【０２４８】
本発明は、本発明によるペプチドにさらに関し、ペプチドは、配列番号１〜配列番号６５、および配列番号７６〜配列番号８４、および配列番号９２に記載のアミノ酸配列からなり、またはそれから本質的になる。
【０２４９】
本発明は、本発明によるペプチドにさらに関し、ペプチドは、修飾されおよび／または非ペプチド結合を含む。
【０２５０】
本発明は、本発明によるペプチドにさらに関し、ペプチドは、融合タンパク質であり、特にＨＬＡ−ＤＲ抗原関連不変鎖（Ｉｉ）のＮ末端アミノ酸を含んでなり、またはペプチドは、例えば樹状細胞特異的抗体などの抗体に（またその中に）融合する。
【０２５１】
本発明は、本発明によるペプチドをエンコードする核酸にさらに関するが、ただしペプチドは完全ヒトタンパク質でない。
【０２５２】
本発明は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの組み合わせである、本発明による核酸にさらに関する。
【０２５３】
本発明は、本発明による核酸を発現する能力がある発現ベクターにさらに関する。
【０２５４】
本発明は、医療で使用するための、本発明によるペプチド、本発明による核酸、または本発明による発現ベクターにさらに関する。
【０２５５】
本発明は、本発明による核酸または本発明による発現ベクターを含んでなる宿主細胞にさらに関する。
【０２５６】
本発明は、抗原提示細胞である、本発明による宿主細胞にさらに関する。
【０２５７】
本発明は、抗原提示細胞が樹状細胞である、本発明による宿主細胞にさらに関する。
【０２５８】
本発明は、本発明によるペプチドを生成する方法にさらに関し、方法は、記載される宿主細胞を培養するステップと、宿主細胞またはその培養液からペプチドを単離するステップとを含んでなる。
【０２５９】
本発明は、活性化細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を生成するインビトロ法にさらに関し、方法は、生体外ＣＴＬを、適切な抗原提示細胞の表面に発現される抗原負荷ヒトクラスＩまたはＩＩＭＨＣ分子に、前記ＣＴＬを抗原特異的様式で活性化するのに十分な時間にわたり接触させるステップを含んでなり、前記抗原は本発明による任意のペプチドである。
【０２６０】
本発明は、十分な量の抗原を抗原提示細胞に接触させることで、前記抗原が、適切な抗原提示細胞の表面に発現されるクラスＩまたはＩＩＭＨＣ分子上に負荷される、記載される方法にさらに関する。
【０２６１】
本発明は、抗原提示細胞が、配列番号１〜配列番号６５、および配列番号７６〜配列番号８４、および配列番号９２を含有する前記ペプチド、または前記変異型アミノ酸配列を、発現する能力がある発現ベクターを含んでなる、本発明による方法にさらに関する。
【０２６２】
本発明は、記載されるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを異常に発現する細胞を選択的に認識する、本発明による方法によって生成される、活性化細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）にさらに関する。
【０２６３】
本発明は、患者において標的細胞を死滅させる方法にさらに関し、その標的細胞は、本発明による任意のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを異常に発現し、方法は、本発明による有効数の細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を患者に投与するステップを含んでなる。
【０２６４】
本発明は、薬剤としての、または薬剤の製造における、本発明による任意のペプチド、本発明による核酸、本発明による発現ベクター、本発明による細胞、または本発明による活性化細胞傷害性Ｔリンパ球の使用にさらに関する。
【０２６５】
本発明は、薬剤がワクチンである、本発明による使用にさらに関する。
【０２６６】
本発明は、薬剤ががんに対して有効である、本発明による使用にさらに関する。
【０２６７】
本発明は、前記がん細胞が、肺がん細胞、胃、胃腸、結腸直腸、膵臓または腎臓である、本発明による使用にさらに関する。
【０２６８】
本発明は、肺がんの予後診断で使用し得る、特定のマーカータンパク質および生物マーカーにさらに関する。
【０２６９】
さらに、本発明は、がん治療のための、本発明によって記載されるような新規標的の使用に関する。
【０２７０】
「抗体（単数）」または「抗体（複数）」という用語は、本明細書では広義に使用され、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の双方を含む。本発明によれば、「抗体」という用語には、所望の特性（例えば、肺がんマーカーポリペプチドの特異的結合、増大したレベルで肺がんマーカー遺伝子を発現する肺がん細胞への毒素送達、および／または肺がんマーカーポリペプチドの活性阻害）のいずれかを示しさえすれば、未変性または「完全」免疫グロブリン分子に加えて、これらの免疫グロブリン分子のフラグメントまたはポリマー、および免疫グロブリン分子のヒト化バージョンもまた含まれる。
【０２７１】
可能な場合は常に、本発明の抗体は、商業的供給元から購入されてもよい。また本発明の抗体は、周知の方法を使用して作成してもよい。当業者は、本発明の抗体を生成するために、完全長肺がんマーカーポリペプチドまたはその断片のどちらを使用してもよいことを理解するであろう。本発明の抗体を作成するために使用されるポリペプチドは、天然原料から部分的にまたは完全に精製されてもよく、または組換えＤＮＡ技術を使用して生成されてもよい。
【０２７２】
例えば、ＡＢＣＡ１３、ＭＭＰ１２、ＤＳＴ、ＭＸＲＡ５、ＣＤＫ４、ＨＮＲＮＰＨ、ＴＡＮＣ２、１ＲＮＦ２１３、ＳＭＹＤ３、およびＳＬＣ３４Ａ２、または配列番号１〜配列番号６５、および配列番号７６〜配列番号８４、および配列番号９２のポリペプチドの任意のその他のポリペプチド、またはその断片をエンコードするｃＤＮＡを、原核細胞（例えば細菌）または真核生物細胞（例えば、酵母、昆虫、または哺乳類細胞）で発現させ得て、その後、組換え体タンパク質を精製し、本発明による抗体を作成するのに使用される肺がんマーカーポリペプチドと特異的に結合する、モノクローナルまたはポリクローナル抗体調製物を作成するのに使用し得る。
【０２７３】
当業者は、モノクローナルまたはポリクローナル抗体の２つ以上の異なるセットの作成が、その目的の用途（例えば、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学的検査、生体内イメージング、免疫毒素療法）に必要な特異性および親和性がある抗体を得る可能性を最大化することを理解するであろう。抗体は、それに対して抗体が使用される目的に従って、既知の方法によってそれらの所望の活性について試験された（例えば、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学的検査、免疫療法など；抗体の作成および試験のさらなるガイダンスについては、例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｎｅｗ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ  ２０１３を参照されたい）。例えば、抗体は、ＥＬＩＳＡアッセイ、ウエスタンブロット、ホルマリン固定肺がんまたは冷凍組織切片の免疫組織化学染色中で試験してもよい。それらを最初に生体外特性解析した後、治療または生体内診断用途を意図した抗体が、公知の臨床試験法によって試験される。
【０２７４】
「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書の用法では、実質的に均質な抗体集団から入手される抗体を指し；すなわち、母集団を構成する個々の抗体は、微量で存在してもよい可能な自然発生的変異以外は同一である。本明細書では、「モノクローナル抗体」は、それらが所望の拮抗活性を示しさえすれば、その中で重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種に由来しまたは特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する、抗体中の対応する配列と同一または相同的である一方、鎖の残部が、別の種に由来しまたは別の抗体クラスまたはサブクラスに属する、抗体中の対応する配列と同一または相同的である、「キメラ」抗体、ならびにこのような抗体の断片を特に含む（その内容全体を参照によって援用する、米国特許第４，８１６，５６７号明細書）。
【０２７５】
本発明のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法を使用して調製されてもよい。ハイブリドーマ法では、マウスまたはその他の適切な宿主動物が免疫剤によって典型的に免疫化されて、免疫剤と特異的に結合する抗体を産生するまたは産生できるリンパ球を生じさせる。代案としては、リンパ球は、生体外で免疫化されてもよい。
【０２７６】
モノクローナル抗体は、また、米国特許第４，８１６，５６７号明細書に記載されるものなどの組換えＤＮＡ法によって生成されてもよい。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して、容易に単離および配列決定し得る（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子と特異的に結合できる、オリゴヌクレオチドプローブを使用して）。
【０２７７】
インビトロ法もまた、一価の抗体を調製するのに適する。そのフラグメント、特にＦａｂフラグメントを作成するための抗体の消化は、当該技術分野で公知の通例の技術を使用して達成し得る。例えば、消化は、パパインを使用して実施し得る。パパイン消化の例は、１９９４年１２月２２日に公開された国際公開第９４／２９３４８号パンフレット、および米国特許第４，３４２，５６６号明細書に記載される。抗体のパパイン消化は、それぞれ単一抗原結合部位があるＦａｂフラグメントと称される、２つの同一の抗原結合フラグメントと、残留Ｆｅフラグメントとを典型的に生成する。ペプシン処理は、２つの抗原結合位置を有し依然として抗原を架橋する能力がある、フラグメントをもたらす。
【０２７８】
抗体フラグメントは、その他の配列に付着するかどうかに関わりなく、フラグメントの活性が非修飾抗体または抗体フラグメントと比較して顕著に変化せずまたは損なわれないという条件で、特定領域または特定アミノ酸残基の挿入、欠失、置換、またはその他の選択された修飾もまた含み得る。これらの修飾は、ジスルフィド結合能力のあるアミノ酸の除去／付加、そのバイオ寿命増大、その分泌特性改変などのいくつかの追加的な特性を提供し得る。いずれにしても、抗体フラグメントは、結合活性、結合領域における結合調節などの生理活性特性を有しなくてはならない。抗体の機能性または活性領域は、タンパク質の特定領域の変異誘発と、それに続く発現と、発現したポリペプチドの試験によって同定されてもよい。このような方法は、当該技術分野の熟練した実務家には容易に分かり、抗体フラグメントをエンコードする核酸の部位特異的変異誘発を含み得る。
【０２７９】
本発明の抗体は、ヒト化抗体またはヒト抗体をさらに含んでなってもよい。非ヒト（例えばマウス）抗体などのヒト化形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有する、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはその断片（抗体のＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはその他の抗原結合部分配列など）である。ヒト化抗体としては、その中でレシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有する、マウス、ラットまたはウサギなどの非ヒト生物種（ドナー抗体）のＣＤＲからの残基によって置換される、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）が挙げられる。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体または移入ＣＤＲまたはフレームワーク配列のどちらにも見られない、残基を含んでなってもよい。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つおよび典型的に２つの可変領域の実質的に全てを含んでなり、その中では、ＣＤＲ領域の全てまたは実質的に全てが、非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲ領域の全てまたは実質的に全てが、ヒト免疫グロブリン共通配列のものである。ヒト化抗体は、至適には、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にヒト免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部もまた含んでなる。
【０２８０】
非ヒト抗体をヒト化する方法は、当該技術分野で周知である。通常、ヒト化抗体は、非ヒト起源から導入された1つまたは複数のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、「移入」残基と称されることが多く、それは典型的に「移入」可変領域から得られる。ヒト化は、齧歯類ＣＤＲ（複数）またはＣＤＲ（単数）配列を対応するヒト抗体配列によって置換することで、基本的に実施し得る。したがって、このような「ヒト化」抗体は、キメラ抗体（米国特許第４，８１６，５６７号明細書）であり、その中では、実質的に非損傷ヒト可変領域未満が、非ヒト生物種からの対応する配列によって置換されている。実際には、ヒト化抗体は典型的にヒト抗体であり、その中では、いくつかのＣＤＲ残基と、おそらくはいくつかのＦＲ残基とが、齧歯類抗体中の類似部位からの残基によって置換される。
【０２８１】
免疫化に際して、内在性免疫グロブリン生成不在下で、ヒト抗体の完全レパートリーを生成できる遺伝子組換え動物（例えばマウス）を用い得る。例えば、キメラおよび生殖細胞系変異マウスにおける、抗体重鎖連結領域遺伝子のホモ接合型欠失が、内在性抗体生成の完全阻害をもたらすことが記載される。このような生殖細胞系変異マウスにおけるヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子アレイの転写は、抗原チャレンジに際してヒト抗体の生成をもたらす。ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリー中でも生成し得る。
【０２８２】
本発明の抗体は、好ましくは薬学的に許容できる担体中で、対象に投与される。典型的に、製剤中で適当量の薬理的に許容可能な塩が使用されて製剤を等張にする。薬理的に許容可能な担体の例としては、生理食塩水、リンゲル液、およびデキストロース溶液が挙げられる。溶液のｐＨは、好ましくは約５〜約８、より好ましくは約７〜約７．５である。さらなる担体としては、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックス徐放性製剤が挙げられ、そのマトリックスは、例えば、フィルム、リポソームまたは微粒子などの造形品の形態である。例えば、投与される抗体の投与経路および濃度次第で、特定の担体がより好ましくあってもよいことが、当業者には明らかであろう。
【０２８３】
抗体は、注射（例えば、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内）によって、またはその有効形態での血流への送達を確実にする輸液などのその他の方法によって、対象、患者、または細胞に投与し得る。抗体はまた、腫瘍内または腫瘍周囲経路によって投与されて、局所性ならびに全身性の治療効果を発揮してもよい。局所注射または静脈注射が好ましい。
【０２８４】
抗体を投与するための有効投与量およびスケジュールは、経験的に判定してもよく、このような測定の実施は当該技術分野の技術範囲内である。当業者は、投与しなくてはならない抗体用量が、例えば、抗体を投与される対象、投与経路、使用される特定の抗体型、および投与されるその他の薬剤次第で変動することを理解するであろう。単独使用される抗体の典型的な１日量は、上述の要素次第で、１日あたり約１（μｇ／ｋｇ〜最大１００ｍｇ／ｋｇ体重またはそれ以上の範囲であるかもしれない。肺がんを治療するための抗体投与に続いて、治療用抗体の効力は、熟練した実務家に良く知られている様々な方法で評価され得る。例えば、標準腫瘍イメージング技術を使用して、治療を受ける対象中の肺がんのサイズ、数、および／または分布をモニターしてもよい。抗体投与不在下で起こるであろう疾患経過と比較して、腫瘍成長を停止させ、腫瘍収縮をもたらし、および／または新規腫瘍の発症を予防する、治療的に投与された抗体は、肺がん治療のための有効な抗体である。
【０２８５】
本発明の肺腫瘍マーカーＡＢＣＡ１３、ＭＭＰ１２は、肺がん細胞で高度に発現され、正常細胞で極めて低レベルで発現されるので、ＡＢＣＡ１３およびＭＭＰ１２発現またはポリペプチド活性の阻害が、ＮＳＣＬＣを治療または予防するための任意の治療ストラテジーに組み込まれてもよい。
【０２８６】
アンチセンス療法の原理は、（転写または翻訳を介した）遺伝子発現の配列特異的抑制が、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡと相補的アンチセンス種の間の細胞内部ハイブリダイゼーションによって達成されてもよいという仮説に基づく。このようなハイブリッド核酸二本鎖の形成は、標的腫瘍抗原エンコードゲノムＤＮＡの転写、または標的腫瘍抗原ｍＲＮＡのプロセッシング／輸送／翻訳および／または安定性を妨害する。
【０２８７】
アンチセンス核酸は、多様なアプローチによって送達され得る。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスＲＮＡは、腫瘍細胞への取り込みを可能にする形態で、（例えば静脈注射によって）対象に直接投与し得る。代案としては、アンチセンスＲＮＡ（またはＲＮＡフラグメント）をコードするウイルスまたはプラスミドベクターを、生体内の細胞に導入し得る。アンチセンス効果はまた、センス配列によって誘導し得る；しかし表現型変化の程度は、極めて変わりやすい。効果的なアンチセンス療法によって誘導される表現型変化は、例えば、標的ｍＲＮＡレベル、標的タンパク質レベル、および／または標的タンパク質活性レベルの変化によって評価される。
【０２８８】
具体例では、アンチセンス遺伝子治療による肺腫瘍マーカー機能の阻害は、アンチセンス肺腫瘍マーカーＲＮＡの対象への直接投与によって達成されてもよい。アンチセンス腫瘍マーカーＲＮＡは、任意の標準的な技術によって生成および単離されてもよいが、高効率プロモーター（例えばＴ７プロモーター）の制御下にあるアンチセンス腫瘍マーカーｃＤＮＡを使用して、生体外転写によって最も容易に生成される。アンチセンス腫瘍マーカーＲＮＡの細胞への投与は、下に記載される直接的な核酸投与法のいずれかによって実施し得る。
【０２８９】
遺伝子治療を使用してＡＢＣＡ１３、およびＭＭＰ１２機能を阻害するための代案のストラテジーは、抗ＡＢＣＡ１３、ＭＭＰ１２抗体の、または抗ＡＢＣＡ１３、ＭＭＰ１２抗体の一部の、細胞内発現を伴う。例えば、ＡＢＣＡ１３、ＭＭＰ１２ポリペプチドと特異的に結合して、その生物学的活性を阻害するモノクローナル抗体をエンコードする遺伝子（または遺伝子フラグメント）は、核酸発現ベクター内で、特定の（例えば組織または腫瘍特異的）遺伝子制御配列の転写制御下に置かれる。次にベクターは、肺がん細胞またはその他の細胞に取り込まれるように対象に投与され、次に細胞は、抗ＡＢＣＡ１３、ＭＭＰ１２抗体を分泌し、それによってＡＢＣＡ１３、ＭＭＰ１２ポリペプチドの生物学的活性を妨げる。好ましくは、ＡＢＣＡ１３、ＭＭＰ１２ポリペプチドは、胃がん細胞の細胞外表面に存在する。
【０２９０】
外来性ＤＮＡの対象細胞への投与と取り込み（すなわち、遺伝子導入または形質移入）を含む上述の方法では、本発明の核酸は裸のＤＮＡの形態であり得て、または核酸は胃腫瘍マーカータンパク質発現を阻害するために、核酸を細胞に送達するベクター内にあり得る。ベクターは、アデノウイルスベクター（Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｌａｖａｌ，Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａ）などの市販の調製物であり得る。核酸またはベクターの細胞への送達は、多様な機構を介し得る。一実施例として、送達は、リポフェクチン、リポフェクタミン（ＧＩＢＣＯ−２５  ＢＲＬ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍｄ．），ＳＵＰＥＲＦＥＣＴ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、およびＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）などの市販のリポソーム調製物、ならびに当該技術分野で標準的な手順に従って開発されたその他のリポソームを使用して、リポソームを介し得る。さらに、本発明の核酸またはベクターは、その技術がＧｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）から入手できる電気穿孔によって、ならびにＳＯＮＯＰＯＲＡＴＩＯＮ装置（ＩｍａＲｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．，Ｔｕｃｓｏｎ，Ａｒｉｚｏｎａ）の手段によって、生体内に送達し得る。
【０２９１】
一実施例として、ベクター送達は、組換えレトロウイルスゲノムをパッケージし得るレトロウイルスベクター系などのウイルス系を介し得る。次に組換えレトロウイルスを使用して感染させ、それによって感染細胞に、ＡＢＣＡ１３、ＭＭＰ１２の発現を阻害するアンチセンス核酸を送達し得る。改変核酸を哺乳類細胞に導入する正確な方法は、もちろん、レトロウイルスベクターの使用に限定されない。アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス性（ＡＡＶ）ベクター、レンチウイルスベクター、偽型レトロウイルスベクターの使用をはじめとするその他の技術が、この手順のために一般的に利用可能である。リポソーム送達および受容体媒介およびその他のエンドサイトーシス機構などの物理的形質導入技術もまた、使用し得る。本発明は、これらのまたはその他の一般に使用される遺伝子導入方法のいずれかと併用し得る。
【０２９２】
抗体はまた、生体内診断アッセイのために使用してもよい。通常、抗体は、免疫シンチグラフィーを使用して腫瘍を位置確認し得るように、放射性ヌクレオチド（１１１Ｉｎ、９９Ｔｃ、１４Ｃ、１３１Ｉ、３Ｈ、３２Ｐまたは３５Ｓなど）で標識される。一実施形態では、抗体またはその断片は、２つ以上のＡＢＣＡ１３、ＭＭＰ１２標的の細胞外ドメインに結合して、親和性値（Ｋｄ）は１×１０μＭ未満である。
【０２９３】
診断用の抗体は、様々なイメージング法による検出に適する、プローブで標識されてもよい。プローブの検出方法としては、蛍光、光学、共焦点、および電子顕微鏡検査；磁気共鳴画像法および分光法；蛍光透視法、コンピュータ断層撮影および陽電子放射型断層撮影法が挙げられるが、これに限定されるものではない。適切なプローブとしては、フルオレセイン、ローダミン、エオジンおよびその他のフルオロフォア、放射性同位体、金、ガドリニウムおよびその他のランタニド、常磁性鉄、フッ素１８およびその他の陽電子放出放射性核種が挙げられるが、これに限定されるものではない。さらに、プローブは二官能価または多官能価であってもよく、列挙される方法の１つ以上によって検出可能である。これらの抗体は、前記プローブで直接または間接的に標識されてもよい。特に十分に技術分野で承認されている、プローブの抗体への付着としては、プローブの共有結合、プローブの抗体への組み込み、およびプローブ結合のためのキレート化合物の共有結合が挙げられる。免疫組織化学的検査では、疾患組織サンプルは、新鮮または冷凍であってもよく、またはパラフィン包埋されホルマリンなどの保存料で固定されてもよい。サンプルを含有する固定または包埋切片を標識一次抗体および二次抗体と接触させ、抗体を使用して、原位置発現するＡＢＣＡ１３、ＭＭＰ１２タンパク質を検出する。
【０２９４】
したがって本発明は、配列番号１〜配列番号６５、および配列番号７６〜配列番号８４、および配列番号９２からなる群から選択される配列を含んでなるペプチド、または配列番号１〜配列番号６５、および配列番号７６〜配列番号８４、および配列番号９２と、９０％相同的なそれらの変異型、または前記ペプチドと交差反応するＴ細胞を誘導するそれらの変異型を提供する。
【０２９５】
本発明のペプチドは、ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩおよび／またはクラスＩＩの分子に結合する能力を有する。
【０２９６】
本発明では、「相同的」という用語は、２つのアミノ酸配列、すなわちペプチドまたはポリペプチド配列の配列間の同一性の程度（上の同一性百分率を参照されたい）を指す。前述の「相同性」は、比較される配列にわたり、最適条件下でアライメントされた２つの配列を比較することで判定される。このような配列相同性は、例えばＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムを使用してアライメントを作成することで、計算し得る。一般に利用できる配列解析ソフトウェア、より具体的には、ベクターＮＴＩ、ＧＥＮＥＴＹＸまたはその他の分析ツールが、公共データベースによって提供される。
【０２９７】
当業者は、特定のペプチドの変異型によって誘導されるＴ細胞が、ペプチドそれ自体と交差反応できるかどうかを評価できるであろう（Ｆｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）；（Ｚａｒｅｍｂａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｃｏｌｏｍｂｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ａｐｐａｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。
【０２９８】
所与のアミノ酸配列の「変異型」によって、本発明者らは、ペプチドが、配列番号１〜配列番号６５、および配列番号７６〜配列番号８４、および配列番号９２中の所与のアミノ酸配列からなるペプチドと実質的に同様に、ＨＬＡ分子となおも結合できるように、（例えば、それらを別の天然アミノ酸残基の側鎖で、またはその他の側鎖で、置換することにより）例えば、アミノ酸の１つまたは２つの残基の側鎖が変化することを意味する。例えばペプチドは、それがＨＬＡ−Ａ＊０２または−ＤＲなどの適切なＭＨＣ分子の結合溝と相互作用して結合する能力を改善せずとも、少なくとも維持するように修飾されてもよく、そのようにしてそれは、活性化ＣＴＬのＴＣＲに結合する能力を改善せずとも、少なくとも維持する。
【０２９９】
これらのＣＴＬは、引き続いて細胞と交差反応して、本発明の態様で定義される同族ペプチドの天然アミノ酸配列を含有するポリペプチドを発現する細胞を殺滅し得る。学術文献（Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）およびデータベース（Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）から演繹し得るように、ＨＬＡ結合ペプチドの特定の位置は、典型的に残基に固着して、結合溝を構成するポリペプチド鎖の極性、電気物理的特性、疎水性、および空間特性によって定義されるＨＬＡ受容体の結合モチーフに適合するコア配列を形成する。したがって当業者は、既知のアンカー残基を維持することによって、配列番号１〜配列番号６５、および配列番号７６〜配列番号８４、および配列番号９２に記載されるアミノ酸配列を修飾でき、このような変異型が、ＭＨＣクラスＩまたはＩＩ分子に結合する能力を維持するかどうかを判定できる。本発明の変異型は、活性化ＣＴＬのＴＣＲに結合する能力を維持して、それは引き続いて細胞と交差反応して、本発明の態様で定義されるような同族ペプチドの天然アミノ酸配列を含有するポリペプチドを発現する細胞を殺滅し得る。
【０３００】
Ｔ細胞受容体との相互作用に実質的に寄与しないアミノ酸残基は、その組み込みが、Ｔ細胞反応性に実質的に影響を及ぼさず、関連ＭＨＣとの結合を排除しない、別のアミノ酸での置換によって修飾され得る。したがって所与の条件以外は、本発明のペプチドは、所与のアミノ酸配列を含む任意のペプチド（本発明者らは、その用語にオリゴペプチドまたはポリペプチドを含める）、またはそれらの所与の部分または変異型であってもよい。
【０３０１】
【表９−１】
2020010686.tif 000010
【表９−２】
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【表９−３】
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【０３０２】
より長いペプチドもまた、適切であってもよい。通常は８〜１１アミノ酸長であるが、ＭＨＣクラスＩエピトープが、ペプチドプロセッシングによって、実際のエピトープを含むより長いペプチドまたはタンパク質から生成されることも可能である。実際のエピトープ側面に位置する残基は、プロセッシング中に実際のエピトープを曝露させるのに必要である、タンパク質分解切断に、実質的に影響を及ぼさない残基であることが好ましい。
【０３０３】
したがって、本発明は、ＭＨＣクラスＩエピトープのペプチドおよび変異型もまた提供し、ペプチドまたは変異型は、８〜１００、好ましくは８〜３０、最も好ましくは８〜１４、すなわち８、９、１０、１１、１２、１３、１４アミノ酸の全長を有し、クラスＩＩ結合ペプチドの場合は、長さはまた、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または３３アミノ酸であり得る。
【０３０４】
もちろん本発明によるペプチドまたは変異型は、ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩの分子に結合する能力を有する。ペプチドまたは変異型のＭＨＣ複合体への結合は、当該技術分野で公知の方法によって試験されてもよい。
【０３０５】
本発明の特に好ましい実施形態では、ペプチドは、配列番号１〜配列番号６５、および配列番号７６〜配列番号８４、および配列番号９２に記載のアミノ酸配列からなり、またはそれから本質的になる。
【０３０６】
「から本質的になる」は、配列番号１〜配列番号６５、および配列番号７６〜配列番号８４、および配列番号９２のいずれかに記載の配列に加えて、本発明によるペプチドまたはそれらの変異型が、ＭＨＣ分子エピトープのエピトープとして機能するペプチドの部分を形成するのに必須でない、追加的なＮおよび／またはＣ末端に位置する一続きのアミノ酸を含有することを意味するものとする。
【０３０７】
それでもなお、これらのストレッチは、本発明によるペプチドの細胞への効率的な導入を提供する上で重要であり得る。本発明の一実施形態では、ペプチドは、例えば、ＮＣＢＩ、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｘ００４９７に由来する、ＨＬＡ−ＤＲ抗原関連不変鎖の８０個のＮ末端アミノ酸を含んでなる、融合タンパク質である（ｐ３３、以下の「Ｉｉ」）。その他の融合物中では、本発明のペプチドは、本明細書に記載されるような抗体、またはその機能的部分に、特に抗体の配列中に、前記抗体によって特異的に標的化されるように融合し得て、または例えば樹状細胞に対して特異的な抗体に、またはその中に融合し得る。
【０３０８】
さらにペプチドまたは変異型は、より強力な免疫応答を引き起こすために、安定性および／またはＭＨＣ分子への結合を改善するようにさらに修飾してもよい。ペプチド配列のこのような最適化方法は当該技術分野で周知であり、例えば、逆ペプチド結合または非ペプチド結合の導入が挙げられる。
【０３０９】
逆ペプチド結合中では、アミノ酸残基はペプチド（−ＣＯ−ＮＨ−）結合によって連結せず、ペプチド結合が逆転する。このようなレトロ−インベルソペプチド模倣剤は、例えば、参照によって本明細書に援用するＭｅｚｉｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９，３２３０−３２３７に記載されるものなどの、当該技術分野で公知の方法を使用して生成されてもよい。このアプローチは、側鎖の方向でなく主鎖に関与する変化を含有する、擬ペプチド生成に関与する。Ｍｅｚｉｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ（１９９７）は、ＭＨＣ結合およびＴヘルパー細胞応答に関して、これらの擬ペプチドが有用であることを示す。ＣＯ−ＮＨペプチド結合の代わりにＮＨ−ＣＯ結合を含有するレトロ−インベルソペプチドは、タンパク質分解に対してはるかにより高い耐性がある。
【０３１０】
非ペプチド結合は、例えば、−ＣＨ２−ＮＨ、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＯＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−、および−ＣＨ２ＳＯ−である。米国特許第４，８９７，４４５号明細書は、標準手順によって合成されるポリペプチド、およびＮａＣＮＢＨ３の存在下でアミノアルデヒドとアミノ酸を反応させることで合成される非ペプチド結合が関与する、ポリペプチド鎖中で、非ペプチド結合（−ＣＨ２−ＮＨ）を固相合成する方法を提供する。
【０３１１】
上述の配列を含んでなるペプチドは、それらのアミノおよび／またはカルボキシ末端に存在する追加的な化学基と共に合成して、ペプチドの安定性、生物学的利用能、および／または親和性を高めてもよい。例えば、カルボベンゾキシル、ダンシル、またはｔ−ブチルオキシカルボニル基などの疎水性基をペプチドのアミノ末端に付加してもよい。同様に、アセチル基または９−フルオレニルメトキシ−カルボニル基が、ペプチドのアミノ末端に配置されてもよい。さらに、疎水性基、ｔ−ブチルオキシカルボニル、またはアミド基が、ペプチドのカルボキシ末端に付加されてもよい。
【０３１２】
さらに、本発明のペプチドは、それらの立体配置を改変するように合成されてもよい。例えば、通常のＬ異性体でなく、ペプチドのアミノ酸残基の１つまたは複数のＤ異性体を使用してもよい。なおもさらに、本発明のペプチドのアミノ酸残基の少なくとも１つは、良く知られている非天然起源アミノ酸残基の１つで置換されてもよい。これらのような変化は、本発明のペプチドの安定性、生物学的利用能および／または結合作用の増大に役立ってもよい。
【０３１３】
同様に、本発明のペプチドまたは変異型は、ペプチド合成の前または後のどちらかに、特定のアミノ酸を反応させることで、化学的に修飾してもよい。このような修飾の例は、当該技術分野で周知であり、例えば、参照によって本明細書に援用する、Ｒ．Ｌｕｎｄｂｌａｄ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ，３ｒｄ  ｅｄ．ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，２００５に要約される。アミノ酸の化学修飾としては、これに限定されるものではないが、アシル化、アミジン化、リジンのピリドキシル化、還元アルキル化、２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）によるアミノ基のトリニトロベンジル化、システインのシステイン酸への過ギ酸酸化によるカルボキシル基のアミド修飾とスルフヒドリル修飾、水銀誘導体の形成、その他のチオール化合物との混合ジスルフィド形成、マレイミドとの反応、ヨード酢酸またはヨードアセトアミドによるカルボキシメチル化、およびアルカリ性ｐＨでのシアネートによるカルバモイル化による修飾が挙げられるが、これに限定されるものではない。この点において、当業者は、タンパク質の化学修飾に関するより詳細な手順について、Ｃｈａｐｔｅｒ  １５  ｏｆ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｅｄｓ．Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ  ＮＹ  １９９５−２０００）を参照されたい。
【０３１４】
簡単に述べると、例えばタンパク質中のアルギニル残基の修飾は、付加体を形成するためのフェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、および１，２−シクロヘキサンジオンなどの、隣接するジカルボニル化合物の反応に基づくことが多い。別の実施例は、メチルグリオキサールとアルギニン残基の反応である。システインは、リジンおよびヒスチジンなどのその他の求核性部位の同時の修飾なしに修飾され得る。その結果、システイン修飾のために多数の試薬が利用可能である。Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈなどの会社のウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ）が、特定の試薬に関する情報を提供する。
【０３１５】
タンパク質中のジスルフィド結合の選択的還元もまた、一般的である。ジスルフィド結合は、生物医薬品の加熱処理中に形成されて酸化され得る。
【０３１６】
ウッドワード試薬Ｋを使用して、特定のグルタミン酸残基を修飾してもよい。Ｎ−（３−（ジメチルアミノ）プロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミドを利用して、リジン残基とグルタミン酸残基の間に分子内架橋を形成し得る。
【０３１７】
例えばジエチルピロ炭酸は、タンパク質中のヒスチジル残基修飾のための試薬である。ヒスチジンはまた、４−ヒドロキシ−２−ノネナールを使用して修飾し得る。
【０３１８】
リジン残基およびその他のα−アミノ基の反応物は、例えば、ペプチドの表面への結合またはタンパク質／ペプチド架橋で有用である。リジンはポリ（エチレン）グリコールの付着部位であり、タンパク質のグリコシル化の主要な修飾部位である。
【０３１９】
タンパク質中のメチオニン残基は、例えばヨードアセトアミド、ブロモエチルアミン、およびクロラミンＴによって修飾され得る。テトラニトロメタンおよびＮ−アセチルイミダゾールを使用して、チロシル残基を修飾し得る。ジチロシンの形成を通じた架橋は、過酸化水素／銅イオンによって達成し得る。
【０３２０】
トリプトファンの修飾に関する最近の研究では、Ｎ−ブロモサクシニミド、臭化２−ヒドロキシ−５−ニトロベンジルまたは３−ブロモ−３−メチル−２−（２−ニトロフェニルメルカプト）−３Ｈ−インドール（ＢＰＮＳ−スカトール）が使用されている。
【０３２１】
ＰＥＧによる治療用タンパク質およびペプチドの成功裏の修飾が、循環半減期の延長と関係することが多い一方で、タンパク質と、グルタルアルデヒド、ポリエチレングリコールジアクリレート、およびホルムアルデヒドとの架橋は、ハイドロゲル調製のために使用される。免疫療法のためのアレルゲンの化学修飾は、カリウムシアネートでのカルバミル化によって達成されることが多い。
【０３２２】
ペプチドが修飾されまたは非ペプチド結合を含む、ペプチドまたは変異型は、本発明の好ましい実施形態である。概して、ペプチドおよび変異型（少なくともアミノ酸残基間にペプチド結合を含有するもの）は、Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ（１９８１）およびその中の参考文献で開示されるような、固相ペプチド合成によってＦｍｏｃ−ポリアミド様式で合成されてもよい。一時的なＮ−アミノ基保護は、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基によってもたらされる。この高度に塩基不安定性の保護基の反復性切断は、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中の２０％ピペリジンを使用して実施される。側鎖機能性は、それらのブチルエーテル（セリン、スレオニン、およびチロシンの場合）、ブチルエステル（グルタミン酸およびアスパラギン酸の場合）、ブチルオキシカルボニル誘導体（リジンおよびヒスチジンの場合）、トリチル誘導体（システインの場合）、および４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル誘導体（アルギニンの場合）として保護されてもよい。グルタミンまたはアスパラギンが、Ｃ末端残基である場合、側鎖アミド官能基を保護するために、４，４’−ジメトキシベンズヒドリル基が利用される。固相担体は、ジメチルアクリルアミド（主鎖単量体）、ビスアクリロイルエチレンジアミン（架橋剤）、およびアクリロイルサルコシンメチルエステル（官能基化因子）の３つの単量体から構成される、ポリジメチル−アクリルアミドポリマーをベースとする。使用されるペプチド−対−樹脂の切断可能な結合因子は、酸不安定性４−ヒドロキシメチル−フェノキシ酢酸誘導体である。逆転Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシル−カルボジイミド／１ヒドロキシベンゾトリアゾール媒介性共役手順を使用して付加されるアスパラギンおよびグルタミンを除いて、全てのアミノ酸誘導体は、それらのあらかじめ形成された対称的な無水物誘導体として添加される。全ての共役および脱保護反応は、ニンヒドリン、トリニトロベンゼンスルホン酸またはイサチン試験手順を使用してモニターされる。合成完了時に、ペプチドは樹脂担体から切断され、同時に、５０％スカベンジャー混合物を含有する９５％トリフルオロ酢酸での処理によって、側鎖保護基が除去される。一般に使用されるスカベンジャーとしては、エタンジチオール、フェノール、アニソール、および水が挙げられ、正確な選択は、合成されるペプチドの構成アミノ酸に左右される。ペプチドの合成のための固相および溶液相方法論の組み合わせもまた、可能である（例えば（Ｂｒｕｃｋｄｏｒｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）およびその中で引用される参考文献を参照されたい）。
【０３２３】
トリフルオロ酢酸は、真空蒸発によって除去され、引き続くジエチルエーテルとの磨砕は、粗製ペプチドをもたらした。存在する任意のスカベンジャーは、単純な抽出処置によって除去され、それは水相の凍結乾燥時に、スカベンジャーを含まない粗製ペプチドを与える。ペプチド合成のための試薬は、一般に、例えばＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ（ＵＫ）Ｌｔｄ，Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ  ＮＧ７  ２ＱＪ，ＵＫから入手できる。
【０３２４】
精製は、再結晶化、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、および（通常は）例えばアセトニトリル／水勾配分離を使用した逆相高速液体クロマトグラフィーなどの技術の任意の１つまたは組み合わせによって実施してもよい。
【０３２５】
ペプチドの分析は、薄層クロマトグラフィー、電気泳動法、特にキャピラリー電気泳動法、固相抽出（ＣＳＰＥ）、逆相高速液体クロマトグラフィー、酸加水分解後のアミノ酸分析を使用して、高速原子衝撃（ＦＡＢ）質量分光分析によって、ならびにＭＡＬＤＩおよびＥＳＩ−Ｑ−ＴＯＦ質量分光分析によって、実施してもよい。
【０３２６】
本発明のさらなる態様は、本発明のペプチドまたはペプチド変異型をエンコードする核酸（例えばポリヌクレオチド）を提供する。ポリヌクレオチド、例えば、一本鎖および／または二本鎖のどちらかのＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの組み合わせ、または例えばホスホロチオエート主鎖があるポリヌクレオチドなどの未変性または安定化形態のポリヌクレオチドであってもよく、それがペプチドをコードしさえすれば、それはイントロンを含有してもよく、またはしなくてもよい。もちろん、天然起源ペプチド結合によって連結する天然アミノ酸残基を含有するペプチドのみが、ポリヌクレオチドによってエンコードされ得る。本発明のなおもさらなる態様は、本発明によるポリペプチドを発現する能力がある発現ベクターを提供する。
【０３２７】
例えば相補的付着端を通じて、ポリヌクレオチド、特にＤＮＡをベクターに連結する、多様な方法が開発されている。例えば、ベクターＤＮＡに挿入されるＤＮＡ断片に、相補的ホモポリマー配列を付加し得る。次に、相補的ホモポリマー尾部間の水素結合によって、ベクターおよびＤＮＡ断片が連結されて、組換えＤＮＡ分子が形成する。
【０３２８】
１つまたは複数の制限酵素認識部位を含有する合成リンカーは、ＤＮＡ断片をベクターに連結する代替え方法を提供する。多様な制限エンドヌクレアーゼ部位を含有する合成リンカーは、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，ＣＮ，ＵＳＡをはじめとするいくつかの供給元から、商業的に入手できる。
【０３２９】
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを修飾する望ましい方法は、（Ｓａｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８）で開示されるようなポリメラーゼ連鎖反応を用いる。この方法は、例えば適切な制限酵素認識部位を改変することで、ＤＮＡを適切なベクターに導入するために使用してもよく、またはそれは、当該技術分野で既知のその他の有用な様式でＤＮＡを修飾するために使用してもよい。ウイルスベクターを使用するのであれば、ポックスウイルスまたはアデノウイルスベクターが好ましい。
【０３３０】
次にＤＮＡ（またはレトロウイルスベクターの場合はＲＮＡ）を適切な宿主中で発現させて、本発明のペプチドまたは変異型を含んでなるポリペプチドを生成してもよい。このようにして、本明細書に含まれる教示を考慮して適切に修正された周知の技術に従って、本発明のペプチドまたは変異型をコードするＤＮＡを使用して、発現ベクターを構築してもよく、次にそれを使用して、本発明のポリペプチドの発現および生成のために、適切な宿主細胞に形質転換する。このような技術としては、米国特許第４，４４０，８５９号明細書、米国特許第４，５３０，９０１号明細書、米国特許第４，５８２，８００号明細書、米国特許第４，６７７，０６３号明細書、米国特許第４，６７８，７５１号明細書、米国特許第４，７０４，３６２号明細書、米国特許第４，７１０，４６３号明細書、米国特許第４，７５７，００６号明細書、米国特許第４，７６６，０７５号明細書、および米国特許第４，８１０，６４８号明細書で開示されるものが挙げられる。
【０３３１】
本発明の化合物を構成するポリペプチドをエンコードするＤＮＡ（またはレトロウイルスベクターの場合はＲＮＡ）は、適切な宿主への導入のために、多種多様なその他のＤＮＡ配列に連結されてもよい。コンパニオンＤＮＡは、宿主の性質、ＤＮＡの宿主への導入様式、およびエピソームの維持または組み込みが所望されるかどうかに左右される。
【０３３２】
一般に、ＤＮＡは、発現のための適切な方向および正しい読み枠で、プラスミドなどの発現ベクター中に挿入される。必要ならば、ＤＮＡは、所望の宿主によって認識される、適切な転写および翻訳調節制御ヌクレオチド配列に連結されてもよいが、このような制御は、一般に発現ベクター内で利用できる。次に標準的な技術を通じて、ベクターを宿主に導入する。一般に、宿主の全てがベクターによって形質転換されるわけではない。したがって、形質転換された宿主細胞を選択することが必要になる。１つの選択技術は、抗生物質耐性などの形質転換細胞内で選択可能な形質をコードする、任意の必要な制御要素があるＤＮＡ配列を、発現ベクター内に組み込むことを伴う。
【０３３３】
代案としては、このような選択可能な形質の遺伝子は、所望の宿主細胞を同時形質転換するのに使用される、別のベクター上にあり得る。
【０３３４】
次に本明細書で開示される教示を考慮して、当業者に知られている適切な条件下で十分な時間にわたり、本発明の組換えＤＮＡによって形質転換された宿主細胞を培養して、ポリペプチドの発現を可能にし、それを次に回収し得る。
【０３３５】
細菌（例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、酵母（例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、糸状菌（例えばアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ））、植物細胞、動物細胞、および昆虫細胞をはじめとする多数の発現系が知られている。好ましくは、細胞系は、ＡＴＣＣ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手できるＣＨＯ細胞などの哺乳類細胞であり得る。
【０３３６】
構成的発現のための典型的な哺乳類細胞ベクタープラスミドは、適切なポリＡ尾部と、ネオマイシンなどの耐性マーカーとがある、ＣＭＶまたはＳＶ４０プロモーターを含んでなる。一実施例は、Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡから入手できるｐＳＶＬである。誘導性哺乳類発現ベクターの一例、ｐＭＳＧもまた、Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手できる。有用な酵母プラスミドベクターは、ｐＲＳ４０３−４０６およびｐＲＳ４１３−４１６であり、通常、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ  ９２０３７，ＵＳＡから入手できる。プラスミドｐＲＳ４０３、ｐＲＳ４０４、ｐＲＳ４０５、およびｐＲＳ４０６は、酵母組み込みプラスミド（ＹＩｐｓ）であり、酵母の選択可能なマーカーＨＩＳ３、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２、およびＵＲＡ３が組み込まれでいる。プラスミドｐＲＳ４１３−４１６は、酵母セントロメアプラスミド（Ｙｃｐｓ）である。ＣＭＶプロモーターベースのベクター（例えばＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製）は、一過性または安定性発現、細胞質内発現または分泌、およびＦＲＡＧ、３ｘＦＬＡＧ、ｃ−ｍｙｃまたはＭＡＴの様々な組み合わせでのＮ末端またはＣ末端標識付けを提供する。これらの融合タンパク質は、組換えタンパク質を検出、精製、および分析できるようにする。二重標識融合物は、検出において融通性を提供する。
【０３３７】
強力なヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター調節領域は、ＣＯＳ細胞内において、構成タンパク質発現レベルを１ｍｇ／Ｌ程度の高さに駆動する。効力がより低い細胞系では、タンパク質レベルは、典型的に約０．１ｍｇ／Ｌである。ＳＶ４０複製起点の存在は、ＳＶ４０複製許容ＣＯＳ細胞内で、高レベルのＤＮＡ複製をもたらす。例えばＣＭＶベクターは、細菌細胞内のｐＭＢ１（ｐＢＲ３２２の誘導体）複製起点、細菌内のアンピシリン耐性選択のためのｂ−ラクタマーゼ遺伝、ｈＧＨポリＡ、およびｆ１起点を含有し得る。プレプロトリプシンリーダー（ＰＰＴ）配列を含有するベクターは、抗ＦＲＡＧ抗体、樹脂、およびプレートを使用した精製のために、培養液中へのＦＲＡＧ融合タンパク質分泌を誘導し得る。多様な宿主細胞で使用するためのその他のベクターおよび発現系が、当該技術分野で周知である。
【０３３８】
別の実施形態では、本発明の２つ以上のペプチドまたはペプチド変異型がコードされ、したがって順次発現される（「数珠玉構造」コンストラクトに類似する）。その際に、ペプチドまたはペプチド変異型は、例えばＬＬＬＬＬＬなどの一続きのリンカーアミノ酸によって、共に連結または融合してもよく、またはそれらの間の任意の追加的なペプチドなしに連結してもよい。
【０３３９】
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドベクターコンストラクトで形質転換された宿主細胞にも関する。宿主細胞は、原核または真核生物のどちらかであり得る。細菌細胞は、いくつかの状況では、好ましい原核宿主細胞であってもよく、典型的には、例えばＢｅｔｈｅｓｄａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ＵＳＡから入手できる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５株、および米国微生物系統保存機関（ＡＴＣＣ）Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡから入手できるＲＲ１（ＡＴＣＣ番号３１３４３）などの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株である。好ましい真核生物宿主細胞としては、酵母、昆虫、および哺乳類細胞、好ましくはマウス、ラット、サルまたはヒト線維芽および結腸細胞系からのものなどの脊椎動物細胞が挙げられる。酵母宿主細胞としては、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ  ９２０３７，ＵＳＡから一般に入手できる、ＹＰＨ４９９、ＹＰＨ５００、およびＹＰＨ５０１が挙げられる。好ましい哺乳類宿主細胞としては、ＡＴＣＣからＣＣＬ６１として入手できるチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＡＴＣＣからＣＲＬ１６５８として入手できるＮＩＨ  Ｓｗｉｓｓマウス胚細胞ＮＩＨ／３Ｔ３、ＡＴＣＣからＣＲＬ１６５０として入手できるサル腎臓由来ＣＯＳ−１細胞、およびヒト胎児由来腎臓細胞である２９３細胞が挙げられる。好ましい昆虫細胞は、バキュロウイルス発現ベクターで形質移入され得るＳｆ９細胞である。発現のための適切な宿主細胞の選択に関する概説は、例えば、テキストブック、Ｐａｕｌｉｎａ  Ｂａｌｂａｓ  ａｎｄ  Ａｒｇｅｌｉａ  Ｌｏｒｅｎｃｅ”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｒｅｖｉｅｗｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，”Ｐａｒｔ  Ｏｎｅ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＩＳＢＮ  ９７８−１−５８８２９−２６２−９および当業者に知られているその他の文献にある。
【０３４０】
本発明のＤＮＡコンストラクトによる適切な細胞宿主の形質転換は、典型的に使用されるベクターのタイプに左右される、周知の方法によって達成される。原核宿主細胞の形質転換に関しては、例えば、Ｃｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ（１９７２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ６９，２１１０、およびＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹを参照されたい。酵母細胞の形質転換は、Ｓｈｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ（１９８６）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹに記載される。Ｂｅｇｇｓ（１９７８）Ｎａｔｕｒｅ  ２７５，１０４−１０９の方法もまた有用である。脊椎動物細胞に関しては、例えばリン酸カルシウムおよびＤＥＡＥ−デキストランまたはリポソーム製剤など、このような細胞を形質移入するのに有用な試薬は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、またはＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ  ２０８７７，ＵＳＡから入手できる。電気穿孔もまた、細胞を形質転換および／または形質移入するのに有用であり、酵母細胞、細菌細胞、昆虫細胞、および脊椎動物細胞を形質転換するために、当該技術分野で周知である。
【０３４１】
成功裏に形質転換された細胞、すなわち本発明のＤＮＡコンストラクトを含有する細胞は、ＰＣＲなどの周知の技術によって同定し得る。代案としては、上清タンパク質の存在は、抗体を使用して検出し得る。
【０３４２】
例えば、細菌、酵母、および昆虫細胞などの本発明の特定の宿主細胞は、本発明のペプチドの調製において有用であることが理解されるであろう。しかしその他の宿主細胞が、特定の治療法において有用であってもよい。例えば、樹状細胞などの抗原提示細胞は、それらが適切なＭＨＣ分子内に負荷されてもよいように、本発明のペプチドを発現するために有用に使用してもよい。したがって、本発明は、本発明による核酸または発現ベクターを含んでなる宿主細胞を提供する。
【０３４３】
好ましい実施形態では、宿主細胞は、抗原提示細胞、特に樹状細胞または抗原提示細胞である。前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）を含有する組換え融合タンパク質が負荷されたＡＰＣが、前立腺がん（シプロイセル−Ｔ）治療のために目下研究されている（Ｓｍａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｒｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。
【０３４４】
本発明のさらなる態様は、ペプチドまたはその変異型を生成する方法を提供し、方法は、宿主細胞を培養するステップと、宿主細胞またはその培養液からペプチドを単離するステップとを含んでなる。
【０３４５】
別の実施形態では、本発明のペプチド、核酸または発現ベクターは、医療で使用される。例えば、ペプチドまたはその変異型は、静脈内（ｉ．ｖ．）注射、皮下（ｓ．ｃ．）注射、皮内（ｉ．ｄ．）注射、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射、筋肉内（ｉ．ｍ．）注射のために調合されてもよい。ペプチド注射の好ましい方法としては、ｓ．ｃ．、ｉ．ｄ．、ｉ．ｐ．、ｉ．ｍ．、およびｉ．ｖ．が挙げられる。ＤＮＡ注射の好ましい方法としては、ｉ．ｄ．、ｉ．ｍ．、ｓ．ｃ．、ｉ．ｐ．、およびｉ．ｖ．が挙げられる。例えば５０μｇ〜１．５ｍｇ、好ましくは１２５μｇ〜５００μｇのペプチドまたはＤＮＡの用量が投与されてもよく、それぞれのペプチドまたはＤＮＡに左右される。この範囲の用量は、以前の治験で成功裏に使用された（Ｗａｌｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １８，１２５４−１２６１（２０１２））。
【０３４６】
本発明の別の態様は、活性化Ｔ細胞を生成するインビトロ法を含み、方法は、生体外Ｔ細胞を、適切な抗原提示細胞の表面に発現される抗原負荷ヒトＭＨＣ分子に、Ｔ細胞を抗原特異的様式で活性化するのに十分な時間にわたり接触させるステップを含んでなり、抗原は本発明によるペプチドである。好ましくは、抗原提示細胞と共に、十分な量の抗原が使用される。
【０３４７】
好ましくは、哺乳類細胞は、ＴＡＰペプチド輸送体のレベルまたは機能が皆無でありまたは低下している。ＴＡＰペプチド輸送体が欠如している適切な細胞としては、Ｔ２、ＲＭＡ−Ｓ、およびショウジョウバエ細胞が挙げられる。ＴＡＰは、抗原処理に関連する輸送体である。
【０３４８】
ヒトペプチド負荷欠乏細胞系Ｔ２は、カタログ番号ＣＲＬ１９９２の下に、米国微生物系統保存機関、１２３０１  Ｐａｒｋｌａｗｎ  Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ  ２０８５２，ＵＳＡから入手でき；ショウジョウバエ細胞系Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ系統２は、カタログ番号ＣＲＬ１９８６３の下にＡＴＣＣから入手でき；マウスＲＭＡ−Ｓ細胞系はＫａｒｒｅ  ｅｔ  ａｌ  １９８５に記載される。
【０３４９】
好ましくは、宿主細胞は、形質移入前に、ＭＨＣクラスＩ分子を実質的に発現しない。刺激因子細胞が、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＩＣＡＭ−１、およびＬＦＡ３のいずれかなどのＴ細胞のための共刺激シグナルを提供する上で、重要な分子を発現することもまた好ましい。多数のＭＨＣクラスＩ分子および共刺激因子分子の核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋおよびＥＭＢＬデータベースから公的に入手可能である。
【０３５０】
ＭＨＣクラスＩエピトープが抗原として使用される場合、Ｔ細胞はＣＤ８陽性ＣＴＬである。
【０３５１】
抗原提示細胞が形質移入されて、このようなエピトープを発現する場合、好ましくは細胞は、配列番号１〜配列番号６５、および配列番号７６〜配列番号８４、および配列番号９２を含有するペプチド、またはそれらの変異アミノ酸配列を、発現する能力がある発現ベクターを含んでなる。
【０３５２】
生体外でＣＴＬを生成するために、いくつかのその他の方法を使用してもよい。例えば、Ｐｅｏｐｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ  （１９９５）およびＫａｗａｋａｍｉ  ｅｔ  ａｌ  （１９９２）に記載される方法は、ＣＴＬの生成において自己腫瘍浸潤性リンパ球を使用する。Ｐｌｅｂａｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ  （１９９５）は、ＣＴＬの調製に自己末梢血リンパ球（ＰＬＢ）を利用する。Ｊｏｃｈｍｕｓ  ｅｔ  ａｌ  （１９９７）は、ペプチドまたはポリペプチドで樹状細胞をパルスすることにより、または組換えウイルスの感染を通じて、自己ＣＴＬを生成することを記載する。Ｈｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ（１９９５）および  Ｊｅｒｏｍｅ  ｅｔ  ａｌ（１９９３）は、自己ＣＴＬの生成においてＢ細胞を利用する。さらに、ペプチドまたはポリペプチドでのマクロファージパルス、または組換えウイルスによる感染を自己ＣＴＬの調製で使用してもよい。Ｓ．Ｗａｌｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００３は、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を使用したＴ細胞の生体外初回刺激を記載して、それはまた、選択されたペプチドに対するＴ細胞を生成するための適切な方法でもある。この研究では、ａＡＰＣが、ビオチン：ストレプトアビジン生化学によって、あらかじめ形成されたＭＨＣ：ペプチド複合体を表面ポリスチレン粒子（ミクロビーズ）に共役することで生成される。このシステムは、ａＡＰＣ上のＭＨＣ密度の正確な調節を可能にし、それは、血液サンプルから高効率で、高または低結合活性の抗原特異的Ｔ細胞応答を選択的に引き起こすことを可能にする。ＭＨＣ：ペプチド複合体の他に、ａＡＰＣは、それらの表面に共役する抗ＣＤ２８抗体のような共刺激活性があるその他のタンパク質を保有すべきである。さらにこのようなａＡＰＣベースのシステムは、例えばサイトカイン様インターロイキン１２などの適切な可溶性因子の付加を要することが多い。
【０３５３】
Ｔ細胞の調製において同種異系細胞もまた使用してもよく、方法は、参照によって本明細書に援用する、国際公開第９７／２６３２８号パンフレットで詳述される。例えば、ショウジョウバエ細胞およびＴ２細胞に加えて、その他の細胞を使用して、ＣＨＯ細胞、バキュロウイルス感染昆虫細胞、細菌、酵母、ワクシニア感染標的細胞などの抗原を提示してもよい。さらに植物ウイルスを使用してもよい（例えば、外来性ペプチド提示のための高収率システムとしてのササゲモザイクウイルス開発を記載するＰｏｒｔａ  ｅｔ  ａｌ（１９９４）を参照されたい）。
【０３５４】
本発明のペプチドに対する活性化Ｔ細胞は、治療法において有用である。したがって、本発明のさらなる態様は、前述の本発明の方法によって入手可能な活性化Ｔ細胞を提供する。
【０３５５】
上の方法によって生成される活性化Ｔ細胞は、配列番号１〜配列番号９２のアミノ酸配列、好ましくは、配列番号１〜配列番号６５、および配列番号７６〜配列番号８４、および配列番号９２の配列を含んでなるポリペプチドを、異常に発現する細胞を選択的に認識する。
【０３５６】
好ましくは、Ｔ細胞は、そのＴＣＲを通じた、ＨＬＡ／ペプチド複合体（例えば結合）との相互作用によって、細胞を認識する。Ｔ細胞は、その標的細胞が、本発明のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを異常に発現する患者において、標的細胞を死滅させる方法で有用であり、患者には、有効数の活性化Ｔ細胞が投与される。患者に投与されるＴ細胞は、上述のように、患者から誘導され活性化されてもよい（すなわちそれらは自己Ｔ細胞である）。代案としては、Ｔ細胞は、患者でなく別の個人に由来する。もちろん、個人が健常人であれば、それが好ましい。「健常人」によって、本発明者らは、個人が概して健康良好であり、好ましくは有能な免疫系を有して、より好ましくは容易に検査され検出され得る任意の疾患に罹患していないことを意味する。
【０３５７】
生体内で、本発明によるＣＤ８陽性Ｔ細胞の標的細胞は、（時にＭＨＣクラスＩＩを発現する）腫瘍細胞であり得て、および／または腫瘍（腫瘍細胞）周囲の間質細胞であり得る（それは時にＭＨＣクラスＩＩもまた発現する；（Ｄｅｎｇｊｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００６））。
【０３５８】
本発明のＴ細胞は、治療用組成物の活性成分として使用されてもよい。したがって、本発明は、その標的細胞が、本発明のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを異常に発現する患者において、標的細胞を死滅させる方法もまた提供し、方法は、上で定義されるようなＴ細胞の有効数を患者に投与するステップを含んでなる。
【０３５９】
「異常に発現される」によって、本発明者らは、正常な発現レベルと比較して、ポリペプチドが過剰発現されること、または腫瘍がそれに由来する組織では遺伝子がサイレントであるが、腫瘍ではそれが発現されることもまた意味する。「過剰発現」によって、本発明者らは、ポリペプチドが、正常組織に存在するレベルの少なくとも１．２倍のレベルで；好ましくは正常組織に存在するレベルの少なくとも２倍、より好ましくは少なくとも５倍または１０倍のレベルで存在することを意味する。
【０３６０】
Ｔ細胞は、例えば上で記載されるものなどの当該技術分野で公知の方法によって得られてもよい。
【０３６１】
Ｔ細胞のこのいわゆる養子免疫伝達のためのプロトコルは、当該技術分野で周知である。レビューは、（Ｇａｔｔｉｎｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）および（Ｍｏｒｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）にある。
【０３６２】
本発明の任意の分子、すなわちペプチド、核酸、抗体、発現ベクター、細胞、活性化ＣＴＬ、Ｔ細胞受容体またはそれをエンコードする核酸は、免疫応答を逃れた細胞によって特徴付けられる障害の治療に有用である。したがって本発明の任意の分子は、薬剤として、または薬剤の製造において使用されてもよい。分子は、単独で、または本発明のその他の分子または既知の分子との組み合わで、使用してもよい。
【０３６３】
好ましくは、本発明の薬剤は、ワクチンである。それは、直接患者に、罹患臓器に、または全身性に、ｉ．ｄ．、ｉ．ｍ．、ｓ．ｃ．、ｉ．ｐ．、およびｉ．ｖ．投与され、または生体外で患者またはヒト細胞系に由来する細胞に適用されて、それが引き続いて患者に投与され、または生体外で使用されて患者に由来する免疫細胞の亜集団が選択され、それが次に患者に再投与されてもよい。核酸が、生体外で細胞に投与される場合、インターロイキン２などの免疫刺激サイトカインを同時発現させるように、細胞を形質移入することが有用であってもよい。ペプチドは、実質的に純粋であり、または免疫刺激アジュバント（下記参照）と組み合わされ、または免疫賦活性サイトカインと組み合わせて使用され、または例えばリポソームなどの適切な送達系によって投与されてもよい。ペプチドはまた、キーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）またはマンナンなどの適切な担体に共役してもよい（国際公開第９５／１８１４５号パンフレット、およびＬｏｎｇｅｎｅｃｋｅｒ，１９９３を参照されたい）。ペプチドはまた、標識されてもよく、融合タンパク質であってもよく、またはハイブリッド分子であってもよい。その配列が本発明に記載されるペプチドは、ＣＤ４またはＣＤ８  Ｔ細胞を刺激することが予測される。しかし、ＣＤ８  ＣＴＬの刺激は、ＣＤ４  Ｔヘルパー細胞によって提供される援助の存在下でより効率的である。したがって、ＣＤ８  ＣＴＬを刺激するＭＨＣクラスＩエピトープでは、ハイブリッド分子の融合パートナーまたはセクションは、適切にはＣＤ４陽性Ｔ細胞を刺激するエピトープを提供する。ＣＤ４およびＣＤ８刺激エピトープは当該技術分野で周知であり、本発明で同定されるものが含まれる。
【０３６４】
一態様では、ワクチンは、配列番号１〜配列番号９２に記載されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つのペプチドと、少なくとも１つの追加的なペプチド、好ましくは２〜５０、より好ましくは２〜２５、なおもより好ましくは２〜２０、最も好ましくは２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７または１８個のペプチドとを含んでなる。ペプチドは、１つまたは複数の特異的ＴＡＡから誘導されてもよく、ＭＨＣクラスＩ分子に結合してもよい。
【０３６５】
別の態様では、ワクチンは、配列番号１〜配列番号６５、および配列番号７６〜配列番号８４、および配列番号９２に記載されるアミノ酸配列を有する、少なくとも１つのペプチドと、少なくとも１つの追加的なペプチド、好ましくは２〜５０、より好ましくは２〜２５、なおもより好ましくは２〜２０、最も好ましくは２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７または１８個のペプチドとを含んでなる。ペプチドは、１つまたは複数の特異的ＴＡＡから誘導されてもよく、ＭＨＣクラスＩ分子に結合してもよい。
【０３６６】
ポリヌクレオチドは、実質的に純粋であり、または適切なベクターまたは送達系に含有されてもよい。核酸は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの組み合わせであってもよい。このような核酸をデザインして導入する方法は、当該技術分野で周知である。概説は、例えば（Ｐａｓｃｏｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）に提供される。ポリヌクレオチドワクチンは調製が容易であるが、免疫応答誘導におけるこれらのベクターの作用機序は、完全には分かっていない。適切なベクターおよび送達系としては、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノ随伴ウイルスまたは２つ以上のウイルスの構成要素を含有するハイブリッドベースのシステムなどのウイルスＤＮＡおよび／またはＲＮＡが挙げられる。非ウイルス送達系としては、カチオン性脂質およびカチオン性ポリマーが挙げられ、ＤＮＡ送達技術分野で周知である。「遺伝子銃」などを介した、物理的送達もまた使用してもよい。核酸によってコードされるペプチド（単数）またはペプチド（複数）は、例えば、上述のように、それぞれの逆ＣＤＲのＴ細胞を刺激する、エピトープとの融合タンパク質であってもよい。
【０３６７】
本発明の薬剤は、１つまたは複数のアジュバントもまた含んでもよい。アジュバントは、抗原に対する免疫応答（例えば、ＣＴＬおよびヘルパーＴ（ＴＨ）細胞によって媒介される免疫応答）を非特異的に促進または増強する物質であり、したがって本発明の薬剤で有用であると考えられる。適切なアジュバントとしては、１０１８ＩＳＳ、アルミニウム塩、ＡＭＰＬＩＶＡＸ（登録商標）、ＡＳ１５、ＢＣＧ、ＣＰ−８７０および８９３、ＣｐＧ７９０９、ＣｙａＡ、ｄＳＬＩＭ、フラジェリンまたはフラジェリンに由来するＴＬＲ５リガンド、ＦＬＴ３リガンド、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＣ３０、ＩＣ３１、イミキモド（ＡＬＤＡＲＡ（登録商標））、レシキモド、ＩｍｕＦａｃｔ  ＩＭＰ３２１、ＩＬ−２やＩＬ−１３やＩＬ−２１などのインターロイキン、インターフェロンαまたはβまたはそのペグ化誘導体、ＩＳパッチ、ＩＳＳ、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ、ＩＳＣＯＭ、ＪｕｖＩｍｍｕｎｅ（登録商標）、ＬｉｐｏＶａｃ、ＭＡＬＰ２、ＭＦ５９、モノホスホリルリピドＡ、モンタニドＩＭＳ  １３１２、モンタニドＩＳＡ  ２０６、モンタニドＩＳＡ  ５０Ｖ、モンタニドＩＳＡ−５１、油中水型および水中油型エマルション、ＯＫ−４３２、ＯＭ−１７４、ＯＭ−１９７−ＭＰ−ＥＣ、ＯＮＴＡＫ、ＯｓｐＡ、ＰｅｐＴｅｌ（登録商標）ベクター系、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）［ＰＬＧ］ベースおよびデキストラン微粒子、ｔａｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ  ＳＲＬ１７２、ビロゾームおよびその他のウイルス様粒子、ＹＦ−１７Ｄ、ＶＥＧＦ  ｔｒａｐ、Ｒ８４８、β−グルカン、Ｐａｍ３Ｃｙｓ、サポニンに由来するＡｑｕｉｌａ’ｓ  ＱＳ２１  ｓｔｉｍｕｌｏｎ、マイコバクテリア抽出物および合成細菌細胞壁模倣物、およびＲｉｂｉ’ｓ  ＤｅｔｏｘまたはＱｕｉｌまたはＳｕｐｅｒｆｏｓなどのその他の独自仕様のアジュバントが挙げられるが、これに限定されるものではない。フロイントまたはＧＭ−ＣＳＦなどのアジュバントが好ましい。樹状細胞およびそれらの調製物に対して特異的な、いくつかの免疫学的アジュバント（例えばＭＦ５９）が、以前記載されている（Ａｌｌｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ｋｒｕｍｍｅｌ，１９９５；Ａｌｌｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ｋｒｕｍｍｅｌ，１９９５）。また、サイトカインも使用してもよい。数種のサイトカインは、樹状細胞のリンパ組織（例えばＴＮＦ−）への移動に影響を与えること、Ｔリンパ球（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１、およびＩＬ−４）のための効率的な抗原提示細胞への樹状細胞の成熟を加速すること（その内容全体を参照によって本明細書に具体的に援用する米国特許第５，８４９，５８９号明細書）、および免疫増強剤（例えば、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２３、ＩＬ−７、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β）として作用することと、直接関連づけられている（Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈ，１９９６）。
【０３６８】
ＣｐＧ免疫賦活性オリゴヌクレオチドもまた、ワクチン環境において、アジュバント効果を促進することが報告されている。理論により拘束されることなく、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）、主にＴＬＲ９を通じた、内在的（非適応性）免疫系の活性化によって作用する。ＣｐＧ誘発性ＴＬＲ９活性化は、ペプチドまたはタンパク質抗原、生きたまたは死滅ウイルス、樹状細胞ワクチン、自己細胞ワクチン、および予防的および治療的ワクチンの双方における多糖コンジュゲートをはじめとする、多種多様な抗原に対する、抗原特異的体液性および細胞性応答を増強する。より重要なことには、それは樹状細胞の成熟と分化を促進し、ＣＤ４  Ｔ細胞援助の不在下であってさえも、ＴＨ１細胞の活性化促進、および強力な細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）生成をもたらす。ＴＬＲ９刺激によって誘導されるＴＨ１バイアスは、常態ではＴＨ２バイアスを促進するミョウバンまたは不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）などのワクチンアジュバント存在下であってさえも維持される。ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、その他のアジュバントと調合されまたは同時投与された際に、または微粒子、ナノ粒子、脂質エマルションなどの配合物、または類似配合物中で、なおもより高いアジュバント活性を示し、それは、抗原が比較的弱い場合、強力な応答を誘導するのに特に必要である。それらは免疫応答もまた加速し、いくつかの実験では、ＣｐＧなしのワクチン総量と同等の抗体応答で、抗原用量のほぼ２桁分の低減を可能にする（Ｋｒｉｅｇ，２００６）。米国特許第６，４０６，７０５Ｂ１号明細書は、抗原特異的免疫応答を誘導するためのＣｐＧオリゴヌクレオチド、非核酸アジュバント、および抗原の併用を説明する。ＣｐＧ  ＴＬＲ９拮抗薬は、Ｍｏｌｏｇｅｎ（Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）製のｄＳＬＩＭ（二重ステムループ免疫修飾物質）であり、それは本発明の医薬組成物の好ましい構成要素である。ＲＮＡ結合ＴＬＲ７、ＴＬＲ８および／またはＴＬＲ９などのその他のＴＬＲ結合分子もまた、使用してもよい。
【０３６９】
有用なアジュバントその他の例としては、化学修飾ＣｐＧ（例えば、ＣｐＲ、Ｉｄｅｒａ）；ポリ（Ｉ：Ｃ）などのｄｓＲＮＡアナログおよびそれらの誘導体（例えばＡｍｐｌｉＧｅｎ（登録商標）、Ｈｉｌｔｏｎｏｌ（登録商標）、ポリ（ＩＣＬＣ）、ポリ（ＩＣ−Ｒ）、ポリ（Ｉ：Ｃ１２Ｕ））、非ＣｐＧ細菌ＤＮＡまたはＲＮＡ；ならびにシクロホスファミド、スニチニブ、ベバシズマブ（登録商標）、セレブレックス、ＮＣＸ−４０１６、シルデナフィル、タダラフィル、バルデナフィル、ソラフェニブ、テモゾロマイド、テムシロリムス、ＸＬ−９９９、ＣＰ−５４７６３２、パゾパニブ、ＶＥＧＦＴｒａｐ、ＺＤ２１７１、ＡＺＤ２１７１、抗ＣＴＬＡ４などの免疫活性小型分子および抗体；免疫系の重要な構造体を標的にするその他の抗体（例えば、抗ＣＤ４０、抗ＴＧＦβ、抗ＴＮＦα受容体）；ＳＣ５８１７５が挙げられるが、これに限定されるものではなく、これらは治療的におよび／またはアジュバントとして作用してもよい。本発明の文脈で有用なアジュバントおよび添加剤の量と濃度は、過度の実験を実施することなく、当業者によって容易に判定され得る。
【０３７０】
好ましいアジュバントは、イミキモド、レシキモド、ＧＭ−ＣＳＦ、シクロホスファミド、スニチニブ、ベバシズマブ、インターフェロンα、ＣｐＧオリゴヌクレオチドおよび誘導体、ポリ（Ｉ：Ｃ）および誘導体、ＲＮＡ、シルデナフィル、およびＰＬＧまたはビロソーム微粒子配合物である。
【０３７１】
本発明による薬剤組成物の好ましい実施形態では、アジュバントは、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ、サルグラモスチム）、シクロホスファミド、イミキモド、レシキモド、およびインターフェロンαなどのコロニー刺激因子からなる群から選択される。
【０３７２】
本発明による薬剤組成物の好ましい実施形態では、アジュバントは、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ、サルグラモスチム）、シクロホスファミド、イミキモド、およびレシキモドなどのコロニー刺激因子からなる群から選択される。
【０３７３】
本発明による薬剤組成物の好ましい実施形態では、アジュバントは、シクロホスファミド、イミキモドまたはレシキモドである。
【０３７４】
なおもより好ましいアジュバントは、モンタニドＩＭＳ  １３１２、モンタニドＩＳＡ  ２０６、モンタニドＩＳＡ  ５０Ｖ、モンタニドＩＳＡ−５１、ポリＩＣＬＣ（Ｈｉｌｔｏｎｏｌ（登録商標））、および抗ＣＤ４０ｍＡＢまたはそれらの組み合わせである。
【０３７５】
この組成物は、皮下、皮内、筋肉内などの非経口投与、または経口投与のために使用される。このためには、ペプチドおよび任意選択的にその他の分子が、薬学的に許容可能な、好ましくは水性担体に溶解され、または懸濁される。さらに組成物は、緩衝液、結合剤、ブラスチング剤、希釈剤、フレーバー、潤滑剤などの賦形剤を含有し得る。ペプチドはまた、サイトカインなどの免疫刺激物質と共に投与され得る。このような組成物で使用し得る賦形剤の詳細な一覧は、例えば、Ａ．Ｋｉｂｂｅ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，３ｒｄ  Ｅｄ．，２０００，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｐｒｅｓｓから採用され得る。組成物は、腺腫様またはがん性疾患の阻止、予防法および／または治療法のために使用し得る。代表的配合物は、例えば欧州特許第２１１３２５３号明細書にある。
【０３７６】
それでもなお、本発明のペプチドの数および物理化学的特性次第で、１２〜１８ヶ月を超えて安定している、ペプチドの特定の組み合わせ、特に２０を超えるペプチドとの組み合わせのための配合を提供するために、さらなる研究が必要である。
【０３７７】
本発明は、がん、特に非小細胞肺がん、胃がん、腎細胞がん、大腸がん、腺がん、前立腺がん、良性新生物、および悪性黒色腫の治療において有用な薬剤を提供する。
【０３７８】
本発明は、
（ａ）溶液中のまたは凍結乾燥形態の上述の医薬組成物を含有する容器；
（ｂ）任意選択的に、凍結乾燥製剤のための希釈剤または再構成溶液を含有する第２の容器；および
（ｃ）任意選択的に、（ｉ）溶液の使用、または（ｉｉ）凍結乾燥製剤の再構成および／または使用、のための使用説明書
を含んでなるキットをさらに目的とする。
【０３７９】
キットは、（ｉｉｉ）緩衝液、（ｉｖ）希釈剤、（Ｖ）濾過、（ｖｉ）針、または（Ｖ）シリンジの１つまたは複数をさらに含んでなってもよい。容器は、好ましくは、ボトル、バイアル、シリンジまたは試験管であり；それは、多回使用容器であってもよい。医薬組成物は、好ましくは凍結乾燥される。
【０３８０】
本発明のキットは、好ましくは、適切な容器内の本発明の凍結乾燥製剤と、その再構成および／または使用のための使用説明書とを含んでなる。適切な容器としては、例えば、ボトル、バイアル（例えば二重チャンバーバイアル）、シリンジ（二重チャンバーシリンジなど）、および試験管が挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの多様な材料から形成されてもよい。好ましくは、キットおよび／または容器は、容器上の、または容器に付随する、使用説明を含み、それは再構成および／または使用上の指示を示す。例えば、ラベルは、凍結乾燥製剤が、上述されるようなペプチド濃度に再構成されることを表示してもよい。ラベルは、製剤が皮下投与に有用であり、または皮下投与用であることをさらに表示してもよい。
【０３８１】
製剤を収容する容器は、多回使用バイアルであってもよく、それは再構成製剤の反復投与（例えば２〜６回の投与）を可能にする。キットは、適切な希釈剤（例えば炭酸水素ナトリウム溶液）を含んでなる、第２の容器をさらに含んでなってもよい。
【０３８２】
希釈剤と凍結乾燥製剤の混合時に、再構成製剤中の最終ペプチド濃度は、好ましくは少なくとも０．１５ｍｇ／ｍＬ／ペプチド（＝７５μｇ）であり、好ましくは３ｍｇ／ｍＬ／ペプチド（＝１５００μｇ）以下である。キットは、その他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、および使用説明が掲載されるパッケージインサートをはじめとする、商業的および使用者観点から望ましい、その他の物質をさらに含んでもよい。
【０３８３】
本発明のキットは、その他の構成要素（例えば、その他の化合物またはこれらのその他の化合物の医薬組成物）が添加されたまたは添加されない、本発明による医薬組成物製剤を含有する単回容器を有してもよく、または各構成要素のための別個の容器を有してもよい。
【０３８４】
好ましくは、本発明のキットは、第２の化合物（アジュバント（例えばＧＭ−ＣＳＦ）、化学療法剤、天然物、ホルモンまたは拮抗薬、抗血管新生因子または阻害剤、アポトーシス誘発剤またはキレート剤など）またはその医薬組成物の同時投与と組み合わせるためにパッケージされた、本発明の製剤を含む。キットの構成要素は、あらかじめ混合されてもよく、または各構成要素は、患者への投与前に別個の異なる容器内にあってもよい。キットの構成要素は、１つまたは複数の液体溶液、好ましくは水溶液、より好ましくは無菌水溶液中で、提供されてもよい。またキットの構成要素は、固体として提供されてもよく、それは、好ましくは別の異なる容器内に提供される、適切な溶媒の添加によって液体に変換されてもよい。
【０３８５】
治療用キットの容器は、バイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジ、または固体または液体を封入するその他のあらゆる手段であってもよい。通常、２つ以上の構成要素がある場合、キットは、第２のバイアルまたはその他の容器を含有して、別々の投薬を可能にする。キットは、薬学的に許容可能な液体のための別の容器もまた、含有してもよい。好ましくは、治療用キットは、装置（例えば、１本または複数の針、シリンジ、点眼器、ピペットなど）を含有して、本キットの構成要素である本発明の作用物質の投与を可能にする。
【０３８６】
本製剤は、経口（腸内）、経鼻、眼、皮下、皮内、筋肉内、静脈内または経皮などの任意の許容できる手段によるペプチド投与に適するものである。好ましくは、投与はｓ．ｃ．であり、最も好ましくはｉ．ｄである。投与は、輸液ポンプによってもよい。
【０３８７】
本発明のペプチドは、ＮＳＣＬＣから単離されたので、本発明の薬剤は、好ましくはＮＳＣＬＣを治療するために使用される。好ましい実施形態では、ＡＢＣＡ１３およびＭＭＰ１２に由来する本発明のペプチドは、ＮＳＣＬＣから単離されたので、本発明の薬剤は、好ましくはＮＳＣＬＣを治療するために使用される。
【０３８８】
配列番号７８〜９２があるペプチドはメルケル細胞がんから単離され、したがってメルケル細胞がんを治療するのに使用し得る。
【０３８９】
ここで好ましい実施形態を記載する以下の実施例において、本発明を説明するが、それでもなお、これらに限定されないのものとする。本発明の目的で、本明細書で引用される全ての参考文献は、その内容全体を参照によって援用する。
【図面の簡単な説明】
【０３９０】
【図１−１】ＡＢＣＡ１３−００１からの代表的質量スペクトルは、原発性腫瘍サンプルＮＳＣＬＣ８９８上のその提示を実証する。ＮａｎｏＥＳＩ−ＬＣＭＳは、ＮＳＣＬＣサンプル８９８から溶出したペプチドプールについて実施された。ｍ／ｚ  ５４３．８３１８±０．００１Ｄａ、ｚ＝２の質量クロマトグラムは、滞留時間８６．３６分におけるペプチドピークを示す。Ｂ）８６．３６分で質量クロマトグラム中に検出されるピークは、ＭＳスペクトル中のｍ／ｚ  ５４３．８３１８のシグナルを明らかにした。Ｃ）所定の滞留時間でｎａｎｏＥＳＩ−ＬＣＭＳ実験において記録された、選択前駆物質からの衝突誘導崩壊質量スペクトルｍ／ｚ  ５４３．８３１８は、ＮＳＣＬＣ８９８腫瘍サンプル中のＡＢＣＡ１３−００１の存在を確認した。Ｄ）合成ＡＢＣＡ１３−００１参照ペプチドの断片化パターンが記録され、配列検証のために、Ｃに示される生じた天然ＴＵＭＡＰ断片化パターンと比較された。
【図１−２】同上
【図１−３】同上
【図１−４】同上
【図２】正常組織および２１個の肺がんサンプル中の選択されたタンパク質のｍＲＮＡの発現プロファイルである。ａ）ＡＢＣＡ１３（Ｐｒｏｂｅｓｅｔ  ＩＤ：１５５３６０５＿ａ＿ａｔ）ｂ）ＭＭＰ１２（Ｐｒｏｂｅｓｅｔ  ＩＤ：２０４５８０＿ａｔ）
【図２ｂ】同上
【図３−１】選択ＨＬＡクラスＩペプチドの提示プロファイルである。提示プロファイルは、平均サンプル提示を示す各ペプチドならびに反復試験変動について計算された。プロファイルは、関心のある腫瘍実体のサンプルを正常サンプルのベースラインに並置させる。ａ）ＡＢＣＡ１３−００１ｂ）ＤＳＴ−００１ｃ）ＭＸＲＡ５−００１
【図３−２】同上
【図３−３】同上
【図４】クラスＩ  ＴＵＭＡＰのペプチド特異的生体外免疫原性の代表的結果である。特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は、２種の異なる蛍光色素に連結するＨＬＡ多量体で染色された。ドットプロットは、刺激ペプチド（左パネル）、および各陰性対照刺激（右パネル）に対するＭＨＣ多量体ダブルポジティブ集団を示す。
【図５】調査されたＨＬＡハプロタイプに対するＰＯＳＴＮ−００２およびＭＭＰ１２−００２の結合特性である。略図は、分析されたＨＬＡ−ＤＲハプロタイプ７つの内５つに対するＰＯＳＴＮ−００２およびＭＭＰ１２−００２の結合スコアを示す。
【図６】ＨＬＡ−ＰＯＳＴＮ−００２およびＭＭＰ１２−００２複合体の３７℃で２４時間後の安定性：略図は、３７℃で２４時間後における、対応するＨＬＡ分子とＨＬＡ−ＰＯＳＴＮ−００２およびＨＬＡ−ＭＭＰ１２−００２との非損傷複合体のの百分率を示す。
【図７−１】クラスＩＩＩＣＳアッセイにおける、ＣＥＡ−００６に対する代表的ワクチン誘導ＣＤ４  Ｔ細胞応答である。生体外感作に続いて、時点プールＶ８／ＥＯＳにおけるＣＥＡ−００６（上部パネル）および模擬（下部パネル）に対するＣＤ４  Ｔ細胞応答について、患者３６−０３１のＰＢＭＣを分析した。細胞を対応するペプチドで刺激して、生存度、抗ＣＤ３、抗ＣＤ８、抗ＣＤ４、およびエフェクターマーカーによって、それぞれ染色した（右から左：ＣＤ１５４、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−２、ＩＬ−１０）。生存能力があるＣＤ４  Ｔ細胞は、１つまたは複数のエフェクター分子について陽性である細胞の比率について分析した。
【図７−２】同上
【図８】様々なクラスＩＩペプチドの免疫原性である。略図は、ＩＭＡ９５０ペプチドについては１６人の患者、ＩＭＡ９１０ペプチドについては７１人の患者で検出された、ＩＣＳを使用した５種の様々なクラスＩＩペプチドの免疫応答評価を示す。
【実施例】
【０３９１】
実施例１
細胞表面に提示される腫瘍関連ペプチドの同定および定量化
組織サンプル
患者の腫瘍組織は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙによって提供された。全ての患者の告知に基づく同意書は、外科手術前に得た。組織は、外科手術直後に液体窒素中で衝撃凍結して、ＴＵＭＡＰの単離まで−８０℃で保存した。
【０３９２】
組織サンプルからのＨＬＡペプチドの単離
衝撃凍結組織試料からのＨＬＡペプチド貯留は、ＨＬＡ−Ａ＊０２−特異的抗体ＢＢ７．２、ＨＬＡ−Ａ、−Ｂ、−Ｃ特異的抗体Ｗ６／３２、ＣＮＢｒ活性化セファロース、酸処理、および限外濾過を用いて、わずかに修正したプロトコル（Ｆａｌｋ，Ｋ．，１９９１；Ｓｅｅｇｅｒ，Ｆ．Ｈ．Ｔ．，１９９９）に従って、固形組織からの免疫沈降によって得た。
【０３９３】
方法
得られたＨＬＡペプチド貯留は、逆相クロマトグラフィー（Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  ｓｙｓｔｅｍ，Ｗａｔｅｒｓ）によって、それらの疎水性に従って分離し、ＥＳＩ源を装着したＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐハイブリッド質量分光計（ＴｈｅｒｍｏＥｌｅｃｔｒｏｎ）内で、溶出ペプチドを分析した。ペプチド貯留は、毎分４００ｎＬの流速を適用して、１．７μｍ  Ｃ１８逆相材料（Ｗａｔｅｒｓ）で充填された、分析用融合シリカマイクロキャピラリーカラム（７５μｍ内径×２５０ｍｍ）上に直接負荷した。引き続いて、毎分３００ｎＬの流速で１０％から３３％へのＢの二段階１８０分間二成分勾配を用いて、ペプチドを分離した。勾配は、溶媒Ａ（水中の０．１％ギ酸）および溶媒Ｂ（アセトニトリル中の０．１％ギ酸）から構成された。ｎａｎｏＥＳＩ源への導入には、金被覆ガラス毛管（ＰｉｃｏＴｉｐ，Ｎｅｗ  Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ）を使用した。ＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分光計は、ＴＯＰ５ストラテジーを使用してデータ依存モードで操作された。手短に述べると、スキャンサイクルは、ｏｒｂｉｔｒａｐ（Ｒ＝３００００）内の高質量精度の完全スキャンで開始され、これもまたｏｒｂｉｔｒａｐ（Ｒ＝７５００）内の５種の最も豊富な前駆イオンのＭＳ／ＭＳスキャンがそれに続き、あらかじめ選択されたイオンは動的に除外された。タンデム質量スペクトルは、ＳＥＱＵＥＳＴおよび追加的な手動調節によって解釈された。同定されたペプチド配列は、生じた天然ペプチド断片化パターンと、配列が同一の合成参照ペプチドの断片化パターンとの比較によって保証された。図１は、ＭＨＣクラスＩ関連ペプチドＡＢＣＡ１３−００１の腫瘍組織から得られた代表的スペクトルと、ＵＰＬＣシステム上のその溶出プロファイルとを示す。
【０３９４】
イオン計数によって、すなわちＬＣ−ＭＳ特性の抽出および解析によって、無標識相対ＬＣ−ＭＳ定量化を実施した（Ｍｕｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００７ａ）。方法は、ペプチドのＬＣ−ＭＳシグナル面積が、サンプル中のその豊富さに相関すると仮定する。抽出された特性は、電荷状態デコンボリューションと滞留時間アライメントによって、さらに処理した（Ｍｕｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００７ｂ；Ｓｔｕｒｍ  ｅｔ  ａｌ．２００８）。最終的に、全てのＬＣ−ＭＳ特性を配列同定結果と相互参照して、異なるサンプルの定量的データと組織からペプチドへの提示プロファイルとを組み合わせた。定量的データは、技術的および生物学的複製内の変動を考慮した中心傾向に従って、二重様式で正規化した。このようにして、それぞれの同定されたペプチドが定量的データと関連付けられ、サンプルと組織の間の相対定量化が可能になる。さらに、ペプチド候補について得られた全ての定量的データを手動で検査し、データ整合性を保証して自動解析の確度を確認した。各ペプチドについて、提示プロファイルを計算し、平均サンプル提示ならびに反復試験変動を示した。プロファイルは、ＮＳＣＬＣサンプルを正常な組織サンプルのベースラインに並置させる。
【０３９５】
代表的過剰提示ペプチドの提示プロファイルは、図３に示される。
【０３９６】
実施例２
本発明のペプチドをコードする遺伝子発現プロファイリング
ＭＨＣ分子によって腫瘍細胞の表面に提示されると同定された全てのペプチドが、免疫療法に適するとは限らないが、それはこれらのペプチドの大多数が、多数の細胞型によって発現される正常な細胞タンパク質に由来するためである。これらのペプチドのごく少数のみが腫瘍関連であり、それらが由来する腫瘍を高特異性で認識するＴ細胞を誘導できると思われる。このようなペプチドを同定し、ワクチン接種によって誘導される自己免疫リスクを最小化するために、本発明者らは、大多数の正常組織と比較して腫瘍細胞上で過剰発現される、タンパク質に由来するペプチドに焦点を合わせた。
【０３９７】
理想的なペプチドは、腫瘍に特有で任意のその他の組織には存在しない、タンパク質に由来する。理想的なものと同様の発現プロファイルがある遺伝子に由来するペプチドを同定するために、同定されたペプチドをそれらが由来するタンパク質と遺伝子にそれぞれ割り当て、これらの遺伝子の発現プロファイルを作成した。
【０３９８】
ＲＮＡ起源および調製
外科的に除去された組織標本は、告知に基づく同意書を各患者から得た後に、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙによって提供された（実施例１を参照されたい）。腫瘍組織標本は、外科手術直後に液体窒素中でスナップ凍結し、その後、液体窒素下で乳鉢と乳棒によって均質化した。全ＲＮＡは、ＴＲＩ試薬（Ａｍｂｉｏｎ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してこれらのサンプルから調製され、ＲＮｅａｓｙ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）による精製がそれに続き；どちらの方法も製造業者のプロトコルに従って実施された。
【０３９９】
健常ヒト組織からの全ＲＮＡは、商業的に入手された（Ａｍｂｉｏｎ，Ｈｕｎｔｉｎｇｄｏｎ，ＵＫ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ；ＢｉｏＣｈａｉｎ，Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）。幾人（２〜１２３人）かの個人からのＲＮＡは、各個人からのＲＮＡが等しく重み付けされるように混合した。
【０４００】
全てのＲＮＡサンプルの品質および量は、ＲＮＡ  ６０００  Ｐｉｃｏ  ＬａｂＣｈｉｐキット（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して、Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｗａｌｄｂｒｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）上で評価した。
【０４０１】
マイクロアレイ実験
全ての腫瘍および正常組織ＲＮＡサンプルの遺伝子発現解析は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ（ＨＧ）Ｕ１３３ＡまたはＨＧ−Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ  ２．０オリゴヌクレオチドマイクロアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳＡ）によって実施した。全てのステップは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘマニュアルに従って実施した。簡単に述べると、二本鎖ｃＤＮＡは、マニュアルに記載されるようにして、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＲＴＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびオリゴｄＴ−Ｔ７プライマー（ＭＷＧ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、５〜８μｇの全ＲＮＡから合成された。生体外転写は、Ｕ１３３ＡアレイのためのＢｉｏＡｒｒａｙ  Ｈｉｇｈ  Ｙｉｅｌｄ  ＲＮＡ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＥＮＺＯ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，ＮＹ，ＵＳＡ）、またはＵ１３３  Ｐｌｕｓ  ２．０のためのＧｅｎｅＣｈｉｐ  ＩＶＴ標識キット（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）によって実施され、ｃＲＮＡ断片化、ハイブリダイゼーション、およびストレプトアビジン−フィコエリトリンとビオチン化抗ストレプトアビジン抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｌｅｉｄｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）による染色がそれに続いた。画像をＡｇｉｌｅｎｔ  ２５００Ａ  ＧｅｎｅＡｒｒａｙ  Ｓｃａｎｎｅｒ（Ｕ１３３Ａ）またはＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｇｅｎｅ−Ｃｈｉｐ  Ｓｃａｎｎｅｒ  ３０００（Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ  ２．０）でスキャンして、全てのパラメータについてデフォルト設定を使用して、ＧＣＯＳソフトウェア（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）によってデータを解析した。正規化のためには、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘによって提供される１００個のハウスキーピング遺伝子を使用した。相対的発現値は、ソフトウェアによって与えられるシグナルｌｏｇ比から計算され、正常な腎臓サンプルを自由裁量で１．０に設定した。
【０４０２】
非小細胞肺がんにおいて高度に過剰発現され、または排他的に発現される本発明の起源遺伝子の代表的発現プロファイルは、図２に示される。
【０４０３】
実施例４
ＮＳＣＬＣ  ＭＨＣクラスＩ提示ペプチドの生体外免疫原性
本発明のＴＵＭＡＰの免疫原性に関する情報を得るために、本発明者らは、ペプチド／ＭＨＣ複合体および抗ＣＤ２８抗体を負荷した人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）によるＣＤ８＋Ｔ細胞の反復刺激に基づく、生体外Ｔ細胞初回刺激アッセイを用いて調査を実施した。このようにして、本発明者らは、これまでに本発明の９個のＨＬＡ−Ａ＊０２０１制限ＴＵＭＡＰの免疫原性を示し得て、これらのペプチドが、それに対するＣＤ８＋前駆Ｔ細胞がヒトに存在するＴ細胞エピトープであることを実証した（表４）。
【０４０４】
ＣＤ８＋Ｔ細胞の生体外初回刺激
ペプチドＭＨＣ複合体（ｐＭＨＣ）および抗ＣＤ２８抗体を負荷した、人工抗原提示細胞による生体外刺激を実施するために、本発明者らは、最初に、告知に基づく同意後に、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｔｕｅｂｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙから得られた健常ドナーのＣＤ８ミクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ｂｅｒｇｉｓｃｈ−Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用した、正の選択を通じて、新鮮ＨＬＡ−Ａ＊０２白血球除去生成物からＣＤ８＋Ｔ細胞を単離した。
【０４０５】
単離ＣＤ８＋リンパ球またはＰＢＭＣは、１０％熱不活性化ヒトＡＢ血清（ＰＡＮ−Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ａｉｄｅｎｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン／１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｃａｍｂｒｅｘ，Ｃｏｌｏｇｎｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（ＣＣ  Ｐｒｏ，Ｏｂｅｒｄｏｒｌａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、２０μｇ／ｍｌゲンタマイシン（Ｃａｍｂｒｅｘ）を添加した、ＲＰＭＩ−Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）からなるＴ細胞培地（ＴＣＭ）中で、使用時まで培養した。２．５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）および１０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２（Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｐｈａｒｍａ，Ｎｕｒｎｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）もまた、この段階でＴＣＭに添加した。
【０４０６】
ｐＭＨＣ／抗ＣＤ２８被覆ビーズの作成、Ｔ細胞刺激、および読み取りは、高度に定義された生体外システム内で、刺激条件あたり４種の異なるｐＭＨＣ分子と、読み取り条件あたり８種の異なるｐＭＨＣ分子を使用して実施した。
【０４０７】
ａＡＰＣ負荷およびサイトメトリー読み取りのために使用された全てのｐＭＨＣ複合体は、わずかな修正を加えたＵＶ誘発ＭＨＣリガンド交換（Ｒｏｄｅｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）に由来した。交換によって得られるｐＭＨＣ単量体の量を判定するために、本発明者らは、（Ｒｏｄｅｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）に記載のストレプトアビジンベースのサンドイッチＥＬＩＳＡを実施した。
【０４０８】
製造業者（Ｐｅｒｂｉｏ，Ｂｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）が推奨する通りにスルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドビオチンを使用して、精製共刺激マウスＩｇＧ２ａ抗ヒトＣＤ２８  Ａｂ  ９．３（Ｊｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７）を化学的にビオチン化した。使用されたビーズは、直径５．６μｍのストレプトアビジン被覆ポリスチレン粒子（Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ，ＵＳＡ）であった。
【０４０９】
陽性および陰性対照刺激のために使用されたｐＭＨＣは、それぞれ、Ａ＊０２０１／ＭＬＡ−００１（修飾Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１からのペプチドＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ）、およびＡ＊０２０１／ＤＤＸ５−００１（ＤＤＸ５からのＹＬＬＰＡＩＶＨＩ）であった。
【０４１０】
４×１２．５ｎｇの異なるビオチンｐＭＨＣ存在下で、８００，０００個のビーズ／２００μｌを９６ウェルプレート内で被覆して洗浄し、引き続いて２００μｌの容量中で６００ｎｇのビオチン抗ＣＤ２８を添加した。５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１２（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ）を添加した２００μｌのＴＣＭ中で、１×１０６のＣＤ８＋Ｔ細胞を２×１０５の洗浄した被覆ビーズと、３７℃で３〜４日間にわたり同時インキュベートすることで、９６ウェルプレート内で刺激を開始した。次に８０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を添加した新鮮ＴＣＭで培地の半分を交換し、３７℃で３〜４日間にわたり培養を継続した。この刺激サイクルを合計３回実施した。条件あたり８種の異なるｐＭＨＣ分子を使用するｐＭＨＣ多量体読み取りでは、５種の異なる蛍光色素への共役を含むわずかな修正を加えて、以前記載されたような（Ａｎｄｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）二次元コンビナトリアルコーディングアプローチを使用した。最後に、Ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ近赤外染料（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＣＤ８−ＦＩＴＣ抗体クローンＳＫ１（ＢＤ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、および蛍光性ｐＭＨＣ多量体による細胞の染色によって多量体解析を実施した。解析では、適切なレーザーおよびフィルターを装着したＢＤ  ＬＳＲＩＩ  ＳＯＲＰ血球計数器を使用した。ペプチド特異的細胞は、全ＣＤ８＋細胞の百分率として計算した。多量体解析の評価は、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ，Ｏｒｅｇｏｎ，ＵＳＡ）を使用して実施した。特異的多量体＋ＣＤ８＋リンパ球の生体外初回刺激は、陰性対照刺激と比較することで検出された。所与の抗原の免疫原性は、１人の健常ドナーの少なくとも１つの評価可能生体外刺激ウェルが、生体外刺激後に、特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞系を含有することが認められた場合に、検出された（すなわちこのウェルは、ＣＤ８＋Ｔ細胞内に少なくとも１％の特異的多量体＋を含有し、特異的多量体＋細胞の百分率は、陰性対照刺激の中央値の少なくとも１０倍である）。
【０４１１】
ＮＳＣＬＣペプチドの生体外免疫原性
ＨＬＡクラスＩペプチドを試験するために、ペプチド特異的Ｔ細胞系の作成によって生体外免疫原性を実証し得る。本発明の２種のペプチドの、ＴＵＭＡＰ特異的多量体染色後の代表的フローサイトメトリー結果は、対応する陰性対照と共に図４に示される。本発明からの２５種のペプチドの結果は、表５に要約される。
【０４１２】
【表１０−１】
2020010686.tif 000013
【表１０−２】
2020010686.tif 000014
【０４１３】
実施例５
ペプチドの合成
全てのペプチドは、Ｆｍｏｃ−ストラテジーを使用する、標準的な十分に確立された固相ペプチド合成を使用して合成された。分取ＲＰ−ＨＰＬＣによる精製後、イオン交換法を実施して、生理学的適合性カウンターイオン（例えばトリフルオロ酢酸、酢酸、アンモニウムまたは塩化物）を組み込んだ。
【０４１４】
個々のペプチドのアイデンティティーおよび純度は、質量分析法および分析用ＲＰ−ＨＰＬＣによって判定された。ペプチドは、イオン交換法後に、純度が９０％〜９９．７％の白色から灰白色凍結乾燥物として得られた。
【０４１５】
全てのＴＵＭＡＰは、好ましくはトリフルオロ酢酸塩または酢酸塩として投与され、その他の塩形態もまた可能である。実施例４の測定では、ペプチドのトリフルオロ酢酸塩を使用した。
【０４１６】
実施例６
ＵＶリガンド交換
本発明によるワクチンの候補ペプチドは、生体外初回刺激アッセイによって、免疫原性についてさらに試験された。これらのアッセイに必要な個々のペプチド−ＭＨＣ複合体は、ＵＶリガンド交換によって生成され、ＵＶ感受性ペプチドはＵＶ照射に際して切断されて、分析される関心のあるペプチドで交換された。ペプチド受容性ＭＨＣ分子を効果的に結合して安定化し得るペプチド候補のみが、ＭＨＣ複合体の分離を防止する。交換反応の収率を判定するために、安定化ＭＨＣ複合体の軽鎖（β２ｍ）の検出に基づくＥＬＩＳＡを実施した。アッセイは、概して、Ｒｏｄｅｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ．（Ｒｏｄｅｎｋｏ  Ｂ，Ｔｏｅｂｅｓ  Ｍ，Ｈａｄｒｕｐ  ＳＲ，ｖａｎ  Ｅｓｃｈ  ＷＪ，Ｍｏｌｅｎａａｒ  ＡＭ，Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ  ＴＮ，Ｏｖａａ  Ｈ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅ−ＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  Ｉ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ＵＶ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｌｉｇａｎｄ  ｅｘｃｈａｎｇｅ．Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ．２００６；１（３）：１１２０−３２）に記載されるようにして実施した。
【０４１７】
９６ウェルＭＡＸＩＳｏｒｐプレート（ＮＵＮＣ）をＰＢＳ中の２ｕｇ／ｍｌストレプトアビジンで室温で一晩被覆し、４回洗浄して、ブロック緩衝液を含有する２％ＢＳＡ中で３７℃で３０分間ブロックした。再折りたたみされたＨＬＡ−Ａ＊０２０１／ＭＬＡ−００１単量体が、８〜５００ｎｇ／ｍｌの範囲をカバーする標準物質の役割を果たした。ＵＶ交換反応のペプチド−ＭＨＣ単量体は、ブロック緩衝液中で１００倍に希釈した。サンプルを３７℃で１時間インキュベートして、４時間洗浄し、２ｕｇ／ｍｌＨＲＰ共役結合抗β２ｍと共に３７℃で１時間インキュベートし、再度洗浄して、ＮＨ２ＳＯ４で停止されたＴＭＢ溶液で検出した。吸光を４５０ｎｍで測定した。
【０４１８】
【表１１−１】
2020010686.tif 000015
【表１１−２】
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【表１１−３】
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【０４１９】
抗体またはその断片、および／またはＴ細胞受容体またはその断片の作成および生成のためには、高い交換収率（すなわち４０％よりも高く、好ましくは５０％よりも高く、より好ましくは７０％よりも高く、最も好ましくは８０％よりも高い）を示す候補ペプチドが一般に好ましいが、それは、これらがＭＨＣ分子に対する十分な結合活性を示して、ＭＨＣ複合体の分離を防止するためである。
【０４２０】
実施例７
選択されたＭＨＣクラスＩＩペプチドの結合および免疫原性
ＨＬＡクラスＩＩタンパク質は、多数のハプロタイプによってコードされる、３つの主要なアイソタイプＨＬＡ−ＤＲ、−ＤＰ、ＤＱに分類される。様々なαおよびβ鎖の組み合わせは、任意の母集団に見られるＨＬＡクラスＩＩタンパク質の多様性を増大させる。したがって、選択されたＨＬＡクラスＩＩ  ＴＵＭＡＰは、かなりの割合の患者で、効果的なＴ細胞応答に寄与するために、数種の異なるＨＬＡ−ＤＲ分子に結合しなくてはならない（すなわち乱交雑結合能力を示す）。
【０４２１】
ＰＯＳＴＮ−００２およびＭＭＰ１２−００２の様々なＨＬＡ−ＤＲハプロタイプへの乱交雑結合、および形成した複合体の安定性は、次のように外的サービス提供者によって生体外結合アッセイで評価された。
【０４２２】
材料と方法
【表１２】
2020010686.tif 000018
【０４２３】
調査したＨＬＡ−ＤＲハプロタイプの一覧
７種の調査したＨＬＡ−ＤＲハプロタイプは、ＨＬＡ−Ａ＊０２およびＨＬＡ−Ａ＊２４陽性北米人母集団中における、それらの頻度に従って選択された（表７．１および７．２）。
【０４２４】
データは、米国骨髄バンクに登録した１３５万人のＨＬＡ型ボランティアの分析から導かれた（Ｍｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。分析された母集団は、次の民族に細分化された：白人米国人（Ｎ＝９９７，１９３）、アフリカ系米国人（Ｎ＝１１０，０５７）、アジア系米国人（Ｎ＝８１，１３９）、ラテン系米国人（Ｎ＝１００，１２８）、および北米先住民（Ｎ＝１９，２０３）。
【０４２５】
【表１３】
2020010686.tif 000019
【０４２６】
【表１４】
2020010686.tif 000020
【０４２７】
試験原理
ＰｒｏＩｍｍｕｎｅ  ＲＥＶＥＡＬ（登録商標）ＭＨＣ−ペプチド結合アッセイは、各候補ペプチドが選択されたＨＬＡクラスＩＩハプロタイプに結合して、ＨＬＡ−ペプチド複合体を安定化する能力を判定する。それによって候補ペプチドは、特定のＨＬＡクラスＩＩタンパク質と共に生体外で構築される。ＨＬＡ分子へのペプチド組み込みのレベルは、再折りたたみ手順完了後０時間目における（いわゆるオンレート）、構築されたＨＬＡ−ペプチド複合体の天然立体配座の存在または不在によって測定される。
【０４２８】
特定のＨＬＡ分子に対する候補ペプチドの結合能力は、既知の非常に強力な結合特性があるもの（陽性対照）と比較されて、対応するＲＥＶＥＡＬ（登録商標）ＭＨＣ−ペプチド結合スコアが得られる。陽性対照ペプチドは、ＰｒｏＩｍｍｕｎｅによって、各ＨＬＡハプロタイプに関する個別の経験に基づいて選択され、提供される。
【０４２９】
特定のＨＬＡ分子に対するペプチドの親和性に加えて、形成されるＨＬＡ−ペプチド複合体の永続的安定性は、免疫応答発生に重要である。したがって形成されたＨＬＡ−ペプチド複合体の存在が、３７℃で２４時間にわたるインキュベーション後に測定される。その結果、形成されたＭＨＣ−ペプチド複合体の安定性は、２４時間目の結合スコアと、再折りたたみ直後（したがって０時間目）に得られる結合スコアとのパーセント比として計算される。
【０４３０】
結果
ＲＥＶＥＡＬ（登録商標）ＭＨＣ−ペプチド結合アッセイにおけるＰＯＳＴＮ−００２およびＭＭＰ１２−００２の分析は、双方のペプチドが様々なＨＬＡハプロタイプに結合することを示した。ＰＯＳＴＮ−００２は、７種の調査したＨＬＡハプロタイプの内４種と、ＭＭＰ１２−００２は５種と複合体を形成することが示された（図５）。どちらのペプチドも、ＨＬＡ−ＤＲ３およびＨＬＡ−ＤＲ６には結合しなかった。検出された結合スコアは、陽性対照に対して０．０２〜約２．５％の範囲内であり、非結合ペプチドのスコアを明らかに超えていた。
【０４３１】
形成されたＨＬＡ−ＰＯＳＴＮ−００２およびＨＬＡ−ＭＭＰ１２−００２複合体の安定性分析は、調査した６種のＨＬＡ−ペプチド複合体の内、それぞれ３種および２種が、３７℃で２４時間後に安定していたことを明らかにした（図６）。
【０４３２】
ＨＬＡ分子との結合能力に基づくペプチドの免疫原性の結論は、このペプチドの結合スコアを既知の免疫原性と比較することで得られる。したがって、免疫原性が判定された５種の十分に調査されたペプチドをこの比較のために選択した。これらのペプチドの免疫原性は、細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）ＣＤ４  Ｔ細胞を使用して、ワクチン接種患者の血中サンプル中で、生体外で判定した。
【０４３３】
原則的に、ＩＣＳアッセイは、エフェクター機能の観点から、特異的Ｔ細胞の質を分析する。そのため、末梢単核細胞（ＰＢＭＣ）を生体外で培養し、引き続いて関心のあるペプチド、参照ペプチド、および陰性対照（ここではＭＯＣＫ）で再刺激した。再刺激に続いて、ＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２、およびＩＬ−１０生成、ならびに共刺激分子ＣＤ１５４の発現について細胞を染色した。影響を受けた細胞の計数は、フローサイトメーター上で実施した（図７）。
【０４３４】
免疫原性解析は、１６人の患者におけるＩＭＡ９５０ペプチド（ＢＩＲ−００２およびＭＥＴ−００５）でのワクチン接種による１００％免疫応答、および７１人の患者におけるＭＡ９１０ペプチド（ＣＥＡ−００６、ＴＧＦＢＩ−００４、およびＭＭＰ−００１）でのワクチン接種による４４％〜８６％の免疫応答を明らかにした。
【０４３５】
ＰＯＳＴＮ−００２およびＭＭＰ１２−００２ペプチドの結合スコアをＩＭＡ９１０およびＩＭＡ９５０ペプチドの結合スコアと比較するために、検出された結合スコアに従って、調査した各ＨＬＡ−ＤＲハプロタイプについて、全てのペプチドを表に配列した（表８．１〜８．５）。
【０４３６】
【表１５】
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【０４３７】
【表１６】
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【０４３８】
【表１７】
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【０４３９】
【表１８】
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【０４４０】
【表１９】
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【０４４１】
ＰＯＳＴＮ−００２およびＭＭＰ１２−００２の結合スコアと、既知の免疫原性がある別のクラスＩＩペプチドの結合スコアとの比較は、双方のペプチドの結合能力が、ＨＬＡ−ＤＲ２を除いて、大部分が、表の中央から下半分までに位置したことを示した。双方のペプチドのＨＬＡ−ＤＲ２結合能力は、表の上半分に位置し、ＭＭＰ１２−００２が最上位候補であった。この分析に基づいて、ＰＯＳＴＮ−００２およびＭＭＰ１２−００２の双方のペプチドが、免疫応答を同様に誘導すると予測すべきである。
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図２】
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【図２ｂ】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年9月4日(2019.9.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３９に示されるアミノ酸配列からなるペプチド、または薬学的に許容可能なその塩。
【請求項２】
ペプチドに非ペプチド結合が導入されている、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
ペプチドが、融合タンパク質の一部であり、ＨＬＡ−ＤＲ抗原関連不変鎖（Ｉｉ）のＮ末端アミノ酸に融合し、または抗体に融合しているものである、請求項１に記載のペプチド。
【請求項４】
請求項１に記載のペプチドをコードする核酸。
【請求項５】
ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの組み合わせである、請求項に４に記載の核酸。
【請求項６】
請求項５に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項７】
請求項５に記載の核酸または請求項６に記載の発現ベクターを含んでなり、ヒト胚性幹細胞でない宿主細胞。
【請求項８】
前記細胞が、抗原提示細胞である、請求項７に記載の宿主細胞。
【請求項９】
前記細胞が、樹状細胞である、請求項７に記載の宿主細胞。
【請求項１０】
請求項１に記載のペプチドまたは薬学的に許容可能なその塩と、薬学的に許容可能な担体、賦形剤、緩衝液、結合剤、ブラスチング剤、希釈剤、フレーバー、潤滑剤、免疫刺激または免疫調節物質の群から選択される少なくとも１つのその他の成分とを含んでなる、がんの治療または予防のための医薬組成物。
【請求項１１】
請求項７に記載の宿主細胞を培養するステップと、ペプチドを宿主細胞またはその培養液から単離するステップとを含んでなる、配列番号３９に示されるアミノ酸配列からなるペプチドを生成する方法。
【請求項１２】
ＣＴＬまたはＴｈ細胞を、適切な抗原提示細胞の表面に発現される抗原負荷ヒトクラスＩ  ＭＨＣ分子に、前記ＣＴＬを抗原特異的様式で活性化するのに十分な時間にわたり生体外で接触させるステップを含んでなる、活性化細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）またはＴヘルパー細胞（Ｔｈ細胞）を生成するインビトロ法であって、前記抗原が、請求項１に記載のペプチドである、インビトロ法。
【請求項１３】
前記抗原が、十分な量の前記抗原を前記抗原提示細胞に接触させることで、適切な抗原提示細胞の表面に発現されるクラスＩＭＨＣ分子上に負荷される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗原提示細胞が、請求項１に記載のペプチドを発現する能力がある発現ベクターを含んでなる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１２に記載の方法によって生成される活性化細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）またはＴヘルパー細胞（Ｔｈ細胞）であって、請求項１に記載のペプチドを異常に発現する細胞を選択的に認識する、ＣＴＬまたはＴｈ細胞。
【請求項１６】
請求項１５に記載の活性化細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）またはＴヘルパー細胞（Ｔｈ細胞）由来のＴＣＲまたは可溶性ＴＣＲ（ｓＴＣＲ）またはそのフラグメントの可変領域をクローニングするステップと、前記ＴＣＲまたはｓＴＣＲまたはそのフラグメントを適切な宿主および／または発現系で発現させるステップとを含んでなる、請求項１に記載のペプチドに対して特異的なＴＣＲまたはｓＴＣＲまたはそのフラグメントを生成するためのインビトロ法。
【請求項１７】
配列番号３９に示されるアミノ酸配列からなるペプチドとＭＨＣ分子との複合体に特異的に結合する、抗体もしくはそのフラグメント。
【請求項１８】
配列番号３９に示されるアミノ酸配列からなるペプチドであるＨＬＡリガンドと結合する、単離されたＴＣＲもしくはｓＴＣＲ。
【請求項１９】
活性化細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を含むがんの治療のための薬剤であって、前記活性化細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）は活性化細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を生成するインビトロ方法によって生成されるものであり、前記インビトロ法はＣＴＬまたはＴｈ細胞を、適切な抗原提示細胞または人工抗原提示細胞の表面に発現される抗原負荷ヒトクラスＩ  またはＩＩ  ＭＨＣ分子に、前記ＣＴＬを抗原特異的様式で活性化するのに十分な時間にわたり生体外で接触させるステップを含むものであり、前記抗原は配列番号３９に示されるアミノ酸配列からなるペプチドであって、前記活性化細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）は配列番号３９に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを異常に発現する細胞を選択的に認識するものである、薬剤。
【請求項２０】
請求項１に記載のペプチド、請求項４に記載の核酸、請求項６に記載の発現ベクター、請求項７に記載の細胞、請求項１５に記載の活性化細胞傷害性Ｔリンパ球、請求項１７に記載の抗体、または請求項１８に記載のＴＣＲまたはｓＴＣＲを含む、がんの治療または予防のための薬剤。
【請求項２１】
前記薬剤がワクチンである、請求項２０に記載の薬剤。
【請求項２２】
前記がんが、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、肺がん、胃がん、および／または神経膠芽腫から選択される、請求項２０に記載の薬剤。
【請求項２３】
ヒトにおける養子細胞療法のための、請求項２０に記載の薬剤。
【請求項２４】
請求項１８に記載のＴ細胞受容体を含む、自系または同種異系ヒト細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）またはＴヘルパー細胞（Ｔｈ細胞）。
【請求項２５】
（ａ）以下のａ１〜ａ８からなる群から選択される実体：
（ａ１）請求項１に記載の単離ペプチド、
（ａ２）請求項１７に記載の抗体、
（ａ３）請求項１８に記載のＴ細胞受容体、ｓＴＣＲまたはそのフラグメント、
（ａ４）請求項３に記載の融合タンパク質、
（ａ５）請求項４に記載の核酸、
（ａ６）請求項６に記載の発現ベクター、
（ａ７）請求項７に記載の宿主細胞、および
（ａ８）請求項１５に記載の活性化細胞傷害性Ｔリンパ球またはＴヘルパー細胞、および
（ｂ）薬学的に許容できる担体、
を含んでなる、がんの治療または予防のための薬剤。