(57)【要約】      （修正有）【課題】ＣＤ１２３上の異なるエピトープを標的化するための、ＣＤ１２３特異的ｓｃＦｖを含有するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）のファミリーを提供する。【解決手段】ＣＤ１２３特異的ｓｃＦｖを含有する、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）のファミリーであって、いくつかの実施形態では、このようなＣＤ１２３キメラ抗原受容体（ＣＤ１２３ＣＡＲ）遺伝子は、Ｆｃ受容体への結合を消失させる、ＩｇＧ４スペーサー領域の変化を含む修飾ＩｇＧ４ヒンジ領域にインフレームで融合した抗ＣＤ１２３ｓｃＦｖ領域を含む。一実施形態では、修飾ＩｇＧ４ヒンジ領域は、Ｓ２２８Ｐ置換、Ｌ２３５Ｅ置換を含み、任意選択で、Ｎ２９７Ｑ置換を含む。ＣＤ１２３ＣＡＲ遺伝子はまた、少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメイン、およびＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ゼータ鎖のシグナル伝達ドメインも含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ１２３キメラ抗原受容体（ＣＤ１２３ＣＡＲ）遺伝子であって、
Ｓ２２８Ｐアミノ酸置換およびＬ２３５Ｅアミノ酸置換をコードするヌクレオチド配列を含む修飾ＩｇＧ４ヒンジ領域と、
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ゼータ鎖のシグナル伝達ドメインと
にインフレームで融合した抗ＣＤ１２３ｓｃＦｖ領域を含む、前記遺伝子。
【請求項２】
修飾ＩｇＧ４ヒンジ領域が、Ｎ２９７Ｑ置換をコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１に記載のＣＤ１２３ＣＡＲ遺伝子。
【請求項３】
抗ＣＤ１２３ｓｃＦｖ領域が、組換え免疫毒素２６２９２または３２７１６のＶＨドメインおよびＶＬドメインをコードする、請求項１に記載のＣＤ１２３ＣＡＲ遺伝子。
【請求項４】
抗ＣＤ１２３ｓｃＦｖ領域が、ヒト化されている、請求項１に記載のＣＤ１２３ＣＡＲ遺伝子。
【請求項５】
ＣＤ２７共刺激シグナル伝達ドメイン、ＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメイン、４−１ＢＢ共刺激シグナル伝達ドメイン、ＯＸ４０共刺激シグナル伝達ドメイン、またはこれらの任意の組合せから選択される少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメインをさらに含む、請求項１に記載のＣＤ１２３ＣＡＲ遺伝子。
【請求項６】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、または配列番号４から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載のＣＤ１２３ＣＡＲ遺伝子。
【請求項７】
遺伝子が、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、または配列番号１２を含むアミノ酸配列をコードする、請求項１に記載のＣＤ１２３ＣＡＲ遺伝子。
【請求項８】
遺伝子が、ウイルスベクター内に挿入された発現カセットの一部である、請求項１に記載のＣＤ１２３ＣＡＲ遺伝子。
【請求項９】
発現カセットが、切断型上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲｔ）、切断型ＣＤ１９（ＣＤ１９ｔ）遺伝子、または誘導性カスパーゼ９遺伝子から選択されるアクセサリー遺伝子をさらに含む、請求項７に記載のＣＤ１２３ＣＡＲ遺伝子。
【請求項１０】
ＣＤ１２３ＣＡＲ遺伝子を含む発現カセットを含むウイルスベクターにより形質導入されたヒトＴ細胞集団であって、該遺伝子は、
Ｓ２２８Ｐアミノ酸置換およびＬ２３５Ｅアミノ酸置換をコードするヌクレオチド配列を含む修飾ＩｇＧ４ヒンジ領域と、
少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメインと、
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ゼータ鎖のシグナル伝達ドメインと
にインフレームで融合した抗ＣＤ１２３ｓｃＦｖ領域を含み、
ＣＤ１２３ＣＡＲ遺伝子を発現する、前記ヒトＴ細胞集団。
【請求項１１】
修飾ＩｇＧ４ヒンジ領域が、Ｎ２９７Ｑアミノ酸置換をコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１０に記載のヒトＴ細胞集団。
【請求項１２】
ＣＤ１２３ＣＡＲ遺伝子が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、または配列番号４から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１０に記載のヒトＴ細胞集団。
【請求項１３】
遺伝子が、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、または配列番号１２を含むアミノ酸配列をコードする、請求項９に記載のヒトＴ細胞集団。
【請求項１６】
対象におけるＡＭＬを処置する方法であって、第１のＣＤ１２３ＣＡＲ遺伝子が形質導入された第１のＴ細胞集団を対象に投与するステップを含み、第１のＣＤ１２３ＣＡＲ遺伝子が、
Ｓ２２８Ｐ置換、Ｌ２３５Ｅ置換、およびＮ２９７Ｑ置換をコードするヌクレオチド配列を含む修飾ＩｇＧ４ヒンジ領域と、
少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメインと、
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ゼータ鎖のシグナル伝達ドメインと
にインフレームで融合した抗ＣＤ１２３ｓｃＦｖ領域を含む、前記方法。
【請求項１７】
第１のＣＤ１２３ＣＡＲ遺伝子が、配列番号３または配列番号４から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
第１のＣＤ１２３ＣＡＲ遺伝子が形質導入された第１のＴ細胞集団を、第２のＣＤ１２３ＣＡＲ遺伝子が形質導入された第２のＴ細胞集団と組み合わせて、対象に投与するステップをさらに含み、第２のＣＤ１２３ＣＡＲ遺伝子が、
Ｓ２２８Ｐ置換、Ｌ２３５Ｅ置換、およびＮ２９７Ｑ置換を含む修飾ＩｇＧ４ヒンジ領域と、
少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメインと、
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ゼータ鎖のシグナル伝達ドメインと
にインフレームで融合した抗ＣＤ１２３ｓｃＦｖ領域を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
第２のＣＤ１２３ＣＡＲ遺伝子が、配列番号３または配列番号４から選択されるヌクレオチド配列を含み、第２のＣＤ１２３ＣＡＲ遺伝子のヌクレオチド配列が、請求項１７で選択されたヌクレオチド配列と同じではない、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
第１のＣＤ１２３ＣＡＲ遺伝子が形質導入された第１のＴ細胞集団を、幹細胞移植、放射線療法、手術による切除、化学療法剤、免疫療法剤、標的化治療剤、またはこれらの組合せから選択される１種または複数の抗がん治療と組み合わせて投与するステップをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権の主張
[0001]本出願は、参照により図面を含めてその全体が本明細書に組み込まれる、２０１３年３月１５日に出願された米国特許第１３／８４４，０４８号に基づく優先権を主張する。
政府の利益
[0002]本発明は、ＮＩＨによる助成金番号Ｐ５０  ＣＡ１０７３９９号、Ｐ０１  ＣＡ０３０２０６号、およびＭ０１  ＲＲ０００４における政府支援によりなされた。政府は、本発明において、一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
[0003]急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）とは、骨髄中の未成熟の骨髄系細胞の急速な増殖を特徴とし、結果として造血機能不全に至る疾患である［１］。急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）のための第一選択処置は、５０年近くにわたりほとんど変わらないままであり、ＡＭＬは、依然として予後の悪い疾患である。標準的な誘導化学療法は、完全寛解を誘導することもあるが、多くの患者は、最終的には再発して疾患に負ける［２］。したがって、ＡＭＬのための新規の治療剤の開発は、極めて重要である。
【０００３】
[0004]同種造血細胞移植は、選択された患者における疾患の治癒を達成することが可能であり、ＡＭＬのドナー由来の免疫療法に対する感受性を強調する。加えて、インターロイキン３受容体アルファ鎖（ＣＤ１２３）も、正常な造血幹細胞と比較して、ＡＭＬ上で過剰発現するので、潜在的な免疫療法の標的として同定されている。
【０００４】
[0005]ＡＭＬ細胞についての免疫表現型検査における近年の進歩は、将来の治療のための標的として作用する可能性がある複数のＡＭＬ関連細胞表面抗原を明らかにしている［３］。実際、ＡＭＬを処置するための、ＣＤ４４、ＣＤ４７、Ｔ細胞免疫グロブリンムチン３（ＴＩＭ−３）、およびインターロイキン３受容体アルファ鎖（ＩＬ−３Ｒα；ＣＤ１２３）を標的化する抗体を使用する前臨床試験が記載されており、マウスモデルにおける有望な抗白血病活性を裏付けている［３、４］。ＣＤ１２３は、急性骨髄性白血病および慢性骨髄性白血病、有毛細胞白血病、Ｂ細胞系統急性リンパ芽球性白血病、および芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍を含む、多様な悪性腫瘍上で発現する。加えて、ＣＤ１２３は、正常な造血幹細胞上では発現しないことが典型的であり、このため、ＣＤ１２３は、理想的な免疫療法の標的となっている。加えて、ＣＤ１２３特異的治療剤についての２つの第Ｉ相試験も終了しており、いずれの薬物も、良好な安全性プロファイルを表している（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ  ＩＤ：ＮＣＴ００４０１７３９およびＮＣＴ００３９７５７９）。残念ながら、これらのＣＤ１２３標的化薬の有効性が限定されていることから、抗白血病活性を観察するには、ＣＤ１２３を標的化する、代替的、かつ、より強力な治療が要請されうることが示唆される。
【０００５】
[0006]ＡＭＬを処置するための、より強力な可能性がある、代替的な治療は、ＭＨＣ非依存的な形で、細胞表面腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）へと、Ｔ細胞の特異性をリダイレクトするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現させるＴ細胞の使用である［５］。大半の場合において、ＣＡＲは、ＣＤ３ζのシグナル伝達ドメインに融合させたモノクローナル抗体に由来する一本鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）を含み、共刺激エンドドメインを含有しうる［５］。複数の研究グループが、Ｂ細胞悪性腫瘍を処置するための、多様な抗原を標的化するＣＡＲを開発しており［６〜１０］、多くの研究グループが、第Ｉ相臨床試験において、ＣＡＲを発現させるＴ細胞の査定へと進んでいる［１１〜１５］。これに対し、ＡＭＬを処置するための、ＣＡＲを操作されたＴ細胞は、依然として希少である［１６、１７］。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
[0007]ＡＭＬのための現行の処置レジメン（ｒｅｇｉｍｅｓ）は、選択された患者では完全寛解を達成することもあるが、多くの患者は、最終的に再発することから、より永続的な寛解をもたらしうる新規の治療剤に対する必要が強調される。抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球ワクチン、アロ反応性ナチュラルキラー細胞ワクチン、および樹状細胞ワクチンを含む、多様なＡＭＬ標的化免疫療法が現在開発されつつある。例えば、Ｏｋａらは、ウィルムス腫瘍１ペプチドによるワクチン接種は、ＡＭＬ患者における臨床的応答および免疫学的応答をもたらしうることを裏付けた［３３］。しかし、これらの標的化治療は、ＨＬＡ依存性である。この目的では、Ｔ細胞の特異性をリダイレクトして、ＡＭＬ細胞を、ＨＬＡ非依存的な形で、選択的に標的化しうるＣＡＲなどの、標的化治療剤をデザインすることが望ましいと予想される。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
[0008]ＣＤ１２３特異的ｓｃＦｖを含有する、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）のファミリーであって、ＣＤ１２３上の異なるエピトープを標的化するＣＡＲのファミリーを開発した。いくつかの実施形態では、このようなＣＤ１２３キメラ抗原受容体（ＣＤ１２３ＣＡＲ）遺伝子は、Ｆｃ受容体への結合を消失させる、ＩｇＧ４スペーサー領域の変化を含む修飾ＩｇＧ４ヒンジ領域にインフレームで融合した抗ＣＤ１２３ｓｃＦｖ領域を含む。一実施形態では、修飾ＩｇＧ４ヒンジ領域は、Ｓ２２８Ｐ置換、Ｌ２３５Ｅ置換を含み、任意選択で、Ｎ２９７Ｑ置換を含む。ＣＤ１２３ＣＡＲ遺伝子はまた、少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメイン、およびＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ゼータ鎖のシグナル伝達ドメインも含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ１２３ＣＡＲ遺伝子は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、または配列番号４から選択されるヌクレオチド配列を含む。他の実施形態では、ＣＤ１２３ＣＡＲ遺伝子は、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、または配列番号１２を含むアミノ酸配列をコードする。
【０００８】
[0009]下記で記載される実施形態に従い、ＣＤ１２３ＣＡＲ遺伝子は、ベクター（例えば、ウイルスベクター）内に挿入された発現カセットの一部でありうる。ヒトＴ細胞集団自体に、ベクターを介して形質導入する結果として、Ｔ細胞に、ＣＤ１２３ＣＡＲ遺伝子を発現させることができる。健常ドナーのＴ細胞（ＣＤ４／ＣＤ８）内で発現させたところ、ＣＤ１２３ＣＡＲは、Ｔ細胞の特異性をリダイレクトして、ＣＤ１２３＋細胞株に対する強力なエフェクター活性のほか、初代ＡＭＬ患者試料に対する強力なエフェクター活性も媒介した。ＣＤ１２３ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける顆粒球／マクロファージおよび赤血球系のコロニー形成を、それほど変化させなかったことから、ＡＭＬ細胞に対する、免疫細胞と対比した示差的な効果が示唆される。
【０００９】
[0010]さらに、活動性ＡＭＬを有する患者から得られたＴ細胞は、ＣＤ１２３ＣＡＲ遺伝子が発現されるように改変することができ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、自己ＡＭＬ芽球を溶解させることが可能である。これらの結果は、ＣＤ１２３ＣＡＲが形質導入されたＴ細胞が、高リスクのＡＭＬを処置するための免疫療法として使用しうることを示唆する。こうして、いくつかの実施形態によれば、対象におけるＡＭＬを処置する方法であって、第１のＣＤ１２３ＣＡＲ遺伝子が形質導入された第１のＴ細胞集団を対象に投与するステップを含む方法が提供される。方法はさらに、第１のＣＤ１２３ＣＡＲ遺伝子をトランスフェクトされた第１のＴ細胞集団を、第２のＣＤ１２３ＣＡＲ遺伝子が形質導入された第２のＴ細胞集団と組み合わせて、対象に投与するさらなるステップも含みうる。いくつかの実施形態では、第１のＣＤ１２３ＣＡＲ遺伝子は、配列番号３または配列番号４から選択されるヌクレオチド配列を含む。第２のＣＤ１２３ＣＡＲ遺伝子はまた、配列番号３または配列番号４から選択されるヌクレオチド配列も含みうるが、第２のＣＤ１２３ＣＡＲ遺伝子のヌクレオチド配列は、第１のＣＤ１２３ＣＡＲ遺伝子について選択されたヌクレオチド配列と同じではない場合がある。この結果として、２つ以上の異なるＣＤ１２３ＣＡＲが形質導入されたＴ細胞集団を使用する、ＡＭＬの組合せ処置であって、単一のＣＤ１２３ＣＡＲが形質導入されたＴ細胞集団の使用と比較した場合に相乗的効果をもたらしうる、組合せ処置がもたらされる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】[0011]図１は、ＣＤ１２３特異的ＣＡＲを、健常ドナーのヒトＴ細胞内で発現させうることを示す図である。（Ａ）修飾ＩｇＧ４ヒンジドメイン、ＣＤ２８の修飾膜貫通細胞内シグナル伝達ドメイン、およびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含有するＣＡＲについての概略図である。また、Ｔ２Ａリボソームスキップ配列および切断型ＥＧＦＲ（ＥＧＦＲｔ）形質導入マーカーも、指し示される。（Ｂ）単一の健常ドナーに由来する、ｍｏｃｋ形質導入Ｔ細胞およびレンチウイルスで形質導入されたＴ細胞の代表的な表現型を示す図である。免疫磁気選択および１サイクルの増殖の後、ＣＡＲで改変されたＴ細胞を、ビオチニル化抗Ｆｃまたはビオチニル化抗ＥＧＦＲ、続いてＰＥコンジュゲートストレプトアビジンおよび抗ＴＣＲα／β、抗ＣＤ４、または抗ＣＤ８で染色し、フローサイトメトリーで解析した。象限配置は、アイソタイプ対照による染色に基づき、各象限に収まる細胞の百分率が指し示される。（Ｃ）免疫磁気選択および１サイクルの増殖の後における、３つの異なる健常ドナーＴ細胞株からの、表示の細胞表面マーカーの発現を示す図である。データは、平均値±ＳＥＭを表す。
【図２】[0012]図２は、ＣＤ１２３特異的ＣＡＲを発現させるＴ細胞が、ＣＤ１２３を発現させる腫瘍細胞株を溶解させることを示す図である。（Ａ）ＣＤ１２３（上、黒線）またはＣＤ１９（下、黒線）を発現させるように一過性にトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞についてのフローサイトメトリー解析を示す図である。ｍｏｃｋ形質導入親２９３Ｔ細胞を、抗ＣＤ１２３抗体または抗ＣＤ１９抗体（グレーの塗りつぶし、上および下）で染色して、バックグラウンドの発現レベルを決定した。（Ｂ）クロム放出アッセイによる、ＣＤ１２３−ＣＡＲを発現させるＴ細胞（２６２９２および３２７１６）の、ＣＤ１２３（２９３Ｔ−ＣＤ１２３）またはＣＤ１９（２９３Ｔ−ＣＤ１９）を発現させる２９３Ｔ細胞に対する特異的細胞傷害作用を示す図である。データは、３連のウェルの平均値＋Ｓ．Ｄ．を表す。（Ｃ）ＡＭＬ細胞株であるＫＧ１ａ上、ＥＢＶで形質転換されたＬＣＬ細胞株上、およびＣＭＬ細胞株であるＫ５６２上のＣＤ１２３についてのフローサイトメトリー解析を示す図である。各ヒストグラムには、アイソタイプ対照（グレーの塗りつぶし）に照らした、ＣＤ１２３染色について陽性の細胞の百分率（黒線）が指し示される。（Ｄ）クロム放出アッセイによる、ＣＤ１２３−ＣＡＲ  Ｔ細胞（２６２９２および３２７１６）の、ＣＤ１９＋ＣＤ１２３＋ＬＣＬ細胞株およびＣＤ１９−ＣＤ１２３＋細胞株であるＫＧ１ａに対する特異的細胞傷害作用を示す図である。ＯＫＴ３を発現させるＬＣＬ（ＬＣＬ−ＯＫＴ３）細胞株およびＣＤ１９−ＣＤ１２３−Ｋ５６２細胞株を、それぞれ、陽性対照細胞株および陰性対照細胞株として使用した。データは、３連のウェルの平均値＋Ｓ．Ｄ．を表す。
【図３−１】[0013]図３は、ＣＤ１２３特異的Ｔ細胞が、ＩＮＦ−γおよびＴＮＦ−αを放出し、ＣＤ１２３を発現させる標的細胞に応答して増殖することを示す図である。ＣＤ１２３ＣＡＲ  Ｔ細胞、または３例の健常ドナーに由来する、対応する（pairmatched）対照のＴ細胞を、表示の細胞株と共に、Ｅ：Ｔを１０：１として、２４時間にわたり共培養し、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの放出を、Ｌｕｍｉｎｅｘマルチプレックスビーズ技術により定量化したことを示す図である。
【図３−２】図３は、ＣＤ１２３特異的Ｔ細胞が、ＩＮＦ−γおよびＴＮＦ−αを放出し、ＣＤ１２３を発現させる標的細胞に応答して増殖することを示す図である。（Ｂ）対応する、ＣＦＳＥで標識されたＣＤ１９特異的Ｔ細胞またはＣＤ１２３特異的Ｔ細胞を、表示の刺激細胞株と共に、Ｅ：Ｔを２：１として、９６時間にわたり共培養し、ＣＦＳＥの希釈について、フローサイトメトリーで解析したことを示す図である。非刺激Ｔ細胞（塗りつぶされたヒストグラム）を、ベースラインのＴ細胞増殖対照として使用した。
【図４】[0014]図４は、初代ＡＭＬ試料との共培養後における、ＣＤ１２３特異的ＣＡＲによる、複数のＣＤ４エフェクター機能およびＣＤ８エフェクター機能の活性化を示す図である。対応する、ＣＡＲを操作されたＴ細胞を、６時間にわたり、３つの異なる初代ＡＭＬ患者試料（ＡＭＬ１７９、３７３、および６０５）と共に共培養し、表面ＣＤ１０７ａの発現および細胞内ＩＦＮ−γまたは細胞内ＴＮＦ−αの産生について解析した。（Ａ、棒グラフ）ＣＤ１０７ａを発現させる、ＤＡＰＩ−ＣＤ３＋ＣＤ８＋ＥＧＦＲｔ＋細胞の百分率を示す図である。データは、平均値＋Ｓ．Ｄ．を表す（Ａ、円グラフ）。脱顆粒を経、ＩＦＮ−γおよび／またはＴＮＦ−αを産生する、ＣＤ３＋ＣＤ８＋ＥＧＦＲｔ＋細胞の画分を、円グラフにプロットする。（Ｂ）ＡおよびＢにおいて記載される同じ実験に由来する、ＤＡＰＩ−ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＥＧＦＲｔ＋集団についてのデータを示す図である。（Ｃ）対応する、ＣＦＳＥで標識されたＣＤ１９特異的Ｔ細胞またはＣＤ１２３特異的Ｔ細胞を、表示の刺激細胞と共に、Ｅ：Ｔを２：１として、７２時間にわたり共培養し、ＤＡＰＩ  ＣＤ３＋ＥＧＦＲｔ＋集団内のＣＦＳＥの希釈について、フローサイトメトリーで解析した。ＬＣＬ細胞株およびＫ５６２細胞株、それぞれ、２７種類の陽性対照および陰性対照として用いられる。プレＢ−ＡＬＬ８０２は、ＣＤ１９およびＣＤ１２３について二重に陽性の原発性患者試料である。象限配置は、非刺激Ｔ細胞に基づく。
【図５】[0015]図５は、初代ＡＭＬ細胞が、ＣＤ１２３特異的Ｔ細胞により特異的に標的化されることを示す図である。（Ａ）対応するＣＤ１９特異的Ｔ細胞またはＣＤ１２３特異的Ｔ細胞を、５１Ｃｒで標識されたＣＤ３４＋初代ＡＭＬ試料と共に、Ｅ：Ｔを２５：１として、４時間にわたり共培養した。ＬＣＬ細胞株およびＫ５６２細胞株は、それぞれ、陽性対照および陰性対照として用いられる。プレＢ−ＡＬＬ８０２は、ＣＤ１９およびＣＤ１２３について二重に陽性の原発性患者試料である。データは、３連のウェルの平均値＋Ｓ．Ｄ．を表す。（Ｂ）（Ａ）における３例の初代ＡＭＬ患者試料に由来するＡＭＬ芽球の特異的溶解を示す図である。データは、平均値±ＳＥＭを表す。２６２９２および３２７１６をＣＤ１９Ｒと比較する、対応のないスチューデントのｔ検定を使用して、＊：ｐ＜０．０５および＊＊：ｐ＜０．０００５とする。
【図６】[0016]図６は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける、ＣＤ１２３ＣＡＲを発現させるＴ細胞の、正常前駆細胞および白血病性前駆細胞に対する効果を示す図である。（ＡおよびＢ）ＣＤ３４＋臍帯血（ＣＢ）細胞（ｎ＝３）を、ＣＤ３４で免疫磁気選択し、対応するＣＤ１９特異的Ｔ細胞もしくはＣＤ１２３特異的Ｔ細胞または培地単独（未処置）と共に、Ｅ：Ｔを２５：１として、４時間にわたり共培養した。次いで、細胞を、半固体のメチルセルロースによる前駆細胞培養物中に、１４〜１８日間にわたり播種し、顆粒球マクロファージコロニー形成単位（ＣＦＵ−ＧＭ、Ａ）コロニーおよび赤芽球バースト形成単位（ＢＦＵ−Ｅ、Ｂ）コロニーの存在について評定した。百分率は、ＣＤ１９特異的Ｔ細胞対照に対して正規化する。データは、３つの異なるＣＢ試料についての平均値±ＳＥＭを表す。（Ｃ）ＣＤ３４＋初代ＡＭＬ患者試料（ＡＭＬ４９３、ＡＭＬ５１９、またはＡＭＬ５４５）を免疫磁気選択し、対応するＣＤ１９特異的Ｔ細胞もしくはＣＤ１２３特異的Ｔ細胞または培地単独（未処置）と共に、Ｅ：Ｔを２５：１として、４時間にわたり共培養した。次いで、細胞を、半固体のメチルセルロースによる前駆細胞培養物中に、１４〜１８日間にわたり播種し、白血病コロニー形成単位（ＣＦＵ−Ｌ）の存在について評定した。百分率は、ＣＤ１９特異的Ｔ細胞対照に対して正規化する。データは、３つの異なる初代ＡＭＬ患者試料についての平均値±ＳＥＭを表す。２６２９２および３２７１６をＣＤ１９Ｒと比較する、対応のないスチューデントのｔ検定を使用して、＊：ｐ＜０．０５とする。（Ｄ）ＣＤ１９Ｒに対して正規化された、ＣＤ１２３標的化ＣＡＲ構築物（２６２９２または３２７１６）で処置された、（Ａ）に由来するＣＢまたは（Ｃ）に由来するＡＭＬ細胞の組合せによるコロニー形成を示す図である。対応のないスチューデントのｔ検定を使用して、＊：ｐ＜０．０５とする。
【図７】[0017]図７は、ＣＤ１２３ＣＡＲでリダイレクトした、ＡＭＬ患者に由来するＴ細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、自己芽球を特異的に溶解させることを示す図である。（Ａ）３例のＡＭＬ患者に由来するＴ細胞に、レンチウイルスで形質導入して、ＣＤ１９Ｒ、２６２９２  ＣＡＲ、または３２７１６  ＣＡＲを発現させたことを示す図である。形質導入の１９日後における、ＡＭＬ７２２に由来するＴ細胞株が示される。（Ｂ）５１Ｃｒ放出アッセイにおいて使用される標的細胞上のＣＤ１２３の発現を示す図である。ＣＤ１２３＋細胞の百分率および各試料の相対蛍光指数（ＲＦＩ）を指し示す。（Ｃ）３例のＡＭＬ患者試料から操作されたＴ細胞をエフェクターとして使用し、５１Ｃｒで標識された、自己ＣＤ３４に富む芽球を標的細胞として使用する、４時間にわたる自己殺滅アッセイについての結果を示す図である。データは、３連のウェルの平均値＋Ｓ．Ｄ．を表す。
【図８】[0018]図８は、ホタルルシフェラーゼを発現させるように改変された、ＡＭＬ細胞株であるＫＧ１ａを注射した５日後（５日目）において、Ｓ２２８Ｐ＋Ｌ２３５Ｅ突然変異またはＳ２２８Ｐ＋Ｌ２３５Ｅ＋Ｎ２９７Ｑ突然変異を含有する、ＣＤ１２３ＣＡＲが形質導入されたＴ細胞（２６２９２）で処置されたＮＳＧマウスについての生物発光イメージングにより示される、腫瘍サイズの変化を示す図である。
【図９】[0019]図９は、いくつかの実施形態に係る、抗原特異的一本鎖Ｆｖ、ヒンジ領域、共刺激シグナル伝達ドメイン、およびＴ細胞受容体ゼータ鎖シグナル伝達ドメインを有するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の概略図（Ｕｒｂａ  ＷＪおよびＬｏｎｇｏ  ＤＬ、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ、２０１１、３６５：７５４〜７５７による画像）である。
【図１０−１】[0020]図１０は、いくつかの実施形態に係る、３２７１６ＣＡＲ（Ｓ２２８Ｐ＋Ｌ２３５Ｅ）構築物（配列番号１：アンチセンス鎖（上：番号付けされた鎖）、配列番号５：センス鎖（下：番号付けされていない鎖））のヌクレオチド配列、および３２７１６ＣＡＲ（Ｓ２２８Ｐ＋Ｌ２３５Ｅ）構築物（配列番号９）のアミノ酸配列を含む、Ｌ２３５Ｅ突然変異およびＳ２２８Ｐ突然変異（「３２７１６ＣＡＲ（Ｓ２２８Ｐ＋Ｌ２３５Ｅ）」）を有する３２７１６ＣＡＲ構築物についての概略図である。突然変異は、太字で示す。
【図１０−２】[0020]図１０は、いくつかの実施形態に係る、３２７１６ＣＡＲ（Ｓ２２８Ｐ＋Ｌ２３５Ｅ）構築物（配列番号１：アンチセンス鎖（上：番号付けされた鎖）、配列番号５：センス鎖（下：番号付けされていない鎖））のヌクレオチド配列、および３２７１６ＣＡＲ（Ｓ２２８Ｐ＋Ｌ２３５Ｅ）構築物（配列番号９）のアミノ酸配列を含む、Ｌ２３５Ｅ突然変異およびＳ２２８Ｐ突然変異（「３２７１６ＣＡＲ（Ｓ２２８Ｐ＋Ｌ２３５Ｅ）」）を有する３２７１６ＣＡＲ構築物についての概略図である。
【図１０−３】[0020]図１０は、いくつかの実施形態に係る、３２７１６ＣＡＲ（Ｓ２２８Ｐ＋Ｌ２３５Ｅ）構築物（配列番号１：アンチセンス鎖（上：番号付けされた鎖）、配列番号５：センス鎖（下：番号付けされていない鎖））のヌクレオチド配列、および３２７１６ＣＡＲ（Ｓ２２８Ｐ＋Ｌ２３５Ｅ）構築物（配列番号９）のアミノ酸配列を含む、Ｌ２３５Ｅ突然変異およびＳ２２８Ｐ突然変異（「３２７１６ＣＡＲ（Ｓ２２８Ｐ＋Ｌ２３５Ｅ）」）を有する３２７１６ＣＡＲ構築物についての概略図である。
【図１１−１】[0021]図１１は、いくつかの実施形態に係る、２６２９２ＣＡＲ（Ｓ２２８Ｐ＋Ｌ２３５Ｅ）構築物（配列番号２：アンチセンス鎖（上：番号付けされた鎖）、配列番号６：センス鎖（下：番号付けされていない鎖））のヌクレオチド配列、および２６２９２ＣＡＲ（Ｓ２２８Ｐ＋Ｌ２３５Ｅ）構築物（配列番号１０）のアミノ酸配列を含む、Ｌ２３５Ｅ突然変異およびＳ２２８Ｐ突然変異（「２６２９２ＣＡＲ（Ｓ２２８Ｐ＋Ｌ２３５Ｅ）」）を有する２６２９２ＣＡＲ構築物についての概略図である。突然変異は、太字で示す。
【図１１−２】[0021]図１１は、いくつかの実施形態に係る、２６２９２ＣＡＲ（Ｓ２２８Ｐ＋Ｌ２３５Ｅ）構築物（配列番号２：アンチセンス鎖（上：番号付けされた鎖）、配列番号６：センス鎖（下：番号付けされていない鎖））のヌクレオチド配列、および２６２９２ＣＡＲ（Ｓ２２８Ｐ＋Ｌ２３５Ｅ）構築物（配列番号１０）のアミノ酸配列を含む、Ｌ２３５Ｅ突然変異およびＳ２２８Ｐ突然変異（「２６２９２ＣＡＲ（Ｓ２２８Ｐ＋Ｌ２３５Ｅ）」）を有する２６２９２ＣＡＲ構築物についての概略図である。
【図１１−３】[0021]図１１は、いくつかの実施形態に係る、２６２９２ＣＡＲ（Ｓ２２８Ｐ＋Ｌ２３５Ｅ）構築物（配列番号２：アンチセンス鎖（上：番号付けされた鎖）、配列番号６：センス鎖（下：番号付けされていない鎖））のヌクレオチド配列、および２６２９２ＣＡＲ（Ｓ２２８Ｐ＋Ｌ２３５Ｅ）構築物（配列番号１０）のアミノ酸配列を含む、Ｌ２３５Ｅ突然変異およびＳ２２８Ｐ突然変異（「２６２９２ＣＡＲ（Ｓ２２８Ｐ＋Ｌ２３５Ｅ）」）を有する２６２９２ＣＡＲ構築物についての概略図である。
【図１２−１】[0022]図１２は、いくつかの実施形態に係る、３２７１６ＣＡＲ（Ｓ２２８Ｐ＋Ｌ２３５Ｅ＋Ｎ２９７Ｑ）構築物（配列番号３：アンチセンス鎖（上：番号付けされた鎖）のヌクレオチド配列、配列番号７：センス鎖（下：番号付けされていない鎖））、および３２７１６ＣＡＲ（Ｓ２２８Ｐ＋Ｌ２３５Ｅ＋Ｎ２９７Ｑ）構築物（配列番号１１）のアミノ酸配列を含む、Ｌ２３５Ｅ突然変異、Ｓ２２８Ｐ突然変異、およびＮ２９７Ｑ突然変異（「３２７１６ＣＡＲ（Ｓ２２８Ｐ＋Ｌ２３５Ｅ＋Ｎ２９７Ｑ）」）を有する３２７１６ＣＡＲ構築物についての概略図である。突然変異は、太字と下線で強調して示す。ＩＵＰＡＣによる塩基 コードのＲは、ＡまたはＧに対応し、ＩＵＰＡＣによる塩基 コードのＹは、ＴまたはＣに対応する。
【図１２−２】[0022]図１２は、いくつかの実施形態に係る、３２７１６ＣＡＲ（Ｓ２２８Ｐ＋Ｌ２３５Ｅ＋Ｎ２９７Ｑ）構築物（配列番号３：アンチセンス鎖（上：番号付けされた鎖）のヌクレオチド配列、配列番号７：センス鎖（下：番号付けされていない鎖））、および３２７１６ＣＡＲ（Ｓ２２８Ｐ＋Ｌ２３５Ｅ＋Ｎ２９７Ｑ）構築物（配列番号１１）のアミノ酸配列を含む、Ｌ２３５Ｅ突然変異、Ｓ２２８Ｐ突然変異、およびＮ２９７Ｑ突然変異（「３２７１６ＣＡＲ（Ｓ２２８Ｐ＋Ｌ２３５Ｅ＋Ｎ２９７Ｑ）」）を有する３２７１６ＣＡＲ構築物についての概略図である。
【図１２−３】[0022]図１２は、いくつかの実施形態に係る、３２７１６ＣＡＲ（Ｓ２２８Ｐ＋Ｌ２３５Ｅ＋Ｎ２９７Ｑ）構築物（配列番号３：アンチセンス鎖（上：番号付けされた鎖）のヌクレオチド配列、配列番号７：センス鎖（下：番号付けされていない鎖））、および３２７１６ＣＡＲ（Ｓ２２８Ｐ＋Ｌ２３５Ｅ＋Ｎ２９７Ｑ）構築物（配列番号１１）のアミノ酸配列を含む、Ｌ２３５Ｅ突然変異、Ｓ２２８Ｐ突然変異、およびＮ２９７Ｑ突然変異（「３２７１６ＣＡＲ（Ｓ２２８Ｐ＋Ｌ２３５Ｅ＋Ｎ２９７Ｑ）」）を有する３２７１６ＣＡＲ構築物についての概略図である。
【図１３−１】[0023]図１３は、いくつかの実施形態に係る、２６２９２ＣＡＲ（Ｓ２２８Ｐ＋Ｌ２３５Ｅ＋Ｎ２９７Ｑ）構築物（配列番号４：アンチセンス鎖（上：番号付けされた鎖）のヌクレオチド配列、配列番号８：センス鎖（下：番号付けされていない鎖））、および２６２９２ＣＡＲ（Ｓ２２８Ｐ＋Ｌ２３５Ｅ＋Ｎ２９７Ｑ）構築物（配列番号１２）のアミノ酸配列を含む、Ｌ２３５Ｅ突然変異、Ｓ２２８Ｐ突然変異、およびＮ２９７Ｑ突然変異（「２６２９２ＣＡＲ（Ｓ２２８Ｐ＋Ｌ２３５Ｅ＋Ｎ２９７Ｑ）」）を有する２６２９２ＣＡＲ構築物についての概略図である。突然変異は、太字で示す。ＩＵＰＡＣによる塩基 コードのＲは、ＡまたはＧに対応し、ＩＵＰＡＣによる塩基 コードのＹは、ＴまたはＣに対応する。
【図１３−２】[0023]図１３は、いくつかの実施形態に係る、２６２９２ＣＡＲ（Ｓ２２８Ｐ＋Ｌ２３５Ｅ＋Ｎ２９７Ｑ）構築物（配列番号４：アンチセンス鎖（上：番号付けされた鎖）のヌクレオチド配列、配列番号８：センス鎖（下：番号付けされていない鎖））、および２６２９２ＣＡＲ（Ｓ２２８Ｐ＋Ｌ２３５Ｅ＋Ｎ２９７Ｑ）構築物（配列番号１２）のアミノ酸配列を含む、Ｌ２３５Ｅ突然変異、Ｓ２２８Ｐ突然変異、およびＮ２９７Ｑ突然変異（「２６２９２ＣＡＲ（Ｓ２２８Ｐ＋Ｌ２３５Ｅ＋Ｎ２９７Ｑ）」）を有する２６２９２ＣＡＲ構築物についての概略図である。
【図１３−３】[0023]図１３は、いくつかの実施形態に係る、２６２９２ＣＡＲ（Ｓ２２８Ｐ＋Ｌ２３５Ｅ＋Ｎ２９７Ｑ）構築物（配列番号４：アンチセンス鎖（上：番号付けされた鎖）のヌクレオチド配列、配列番号８：センス鎖（下：番号付けされていない鎖））、および２６２９２ＣＡＲ（Ｓ２２８Ｐ＋Ｌ２３５Ｅ＋Ｎ２９７Ｑ）構築物（配列番号１２）のアミノ酸配列を含む、Ｌ２３５Ｅ突然変異、Ｓ２２８Ｐ突然変異、およびＮ２９７Ｑ突然変異（「２６２９２ＣＡＲ（Ｓ２２８Ｐ＋Ｌ２３５Ｅ＋Ｎ２９７Ｑ）」）を有する２６２９２ＣＡＲ構築物についての概略図である。
【図１４】[0024]図１４は、初代ＡＭＬ試料および臍帯血におけるＣＤ１２３の発現を示す図である。（Ａ）初代ＡＭＬ細胞上のＣＤ１２３の発現についての代表例を示す図である。細胞に、ＤＡＰＩ−系統−ＣＤ３４＋集団についてゲートをかけ、ＣＤ１２３の発現（黒色：アイソタイプ対照、赤色：抗ＣＤ１２３）について評価した。（Ｂ）ＤＡＰＩ−系統−ＣＤ３４＋集団内で発現させたＣＤ１２３陽性細胞の百分率を示す図である。各点は、個々の試料を表す。（Ｃ）ＤＡＰＩ−系統−ＣＤ３４＋集団内の、ＣＤ１２３についての相対蛍光指数（ＲＦＩ）を示す図である。ＲＦＩは、抗ＣＤ１２３細胞の中央値を、アイソタイプ対照で染色された細胞の中央値で除することにより計算する。（Ｄ）ＡＭＬ６０５試料上（赤色）、ＡＭＬ７２２試料上（青色）、および臍帯血試料上（グレー）のＣＤ１２３の発現についてのヒストグラムの重合せを示す図である。アイソタイプ対照は、黒色で示す。
【図１５】[0025]図１５は、初代ＡＭＬ患者試料とのインキュベーションに応答する、ＣＤ１２３特異的Ｔ細胞による複数のエフェクター機能の活性化を探索するのに使用される、ゲーティング戦略について例示する図である。Ｔ細胞のエフェクター機能を同定する多色フローサイトメトリーのためのゲーティング戦略を、ＡＭＬ３７３との共培養後におけるＣＤ１２３ＣＡＲ（２６２９２ベースの）Ｔ細胞について示す。（Ａ）初期ゲートを、ＣＤ３＋細胞にかけることを示す図である。（Ｂ）蛍光陰性のものである（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｍｉｎｕｓ  ｏｎｅ）対照を使用して確立される二次ゲートを、ＥＧＦＲｔ＋細胞にかけることを示す図である。（Ｃ）三次ゲートを、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋集団にかけることを示す図である。（Ｄ）最終ゲートを、ＣＤ１０７ａ＋細胞にかけることを示す図である。（Ｅ）ＣＤ１０７ａ＋集団内のＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの産生を示す図である。象限は、アイソタイプ対照で染色された試料を使用して確立した。各象限内に百分率を注記する。
【図１６−１】[0026]図１６は、ＣＦＳＥが、ＣＡＲを発現させるＴ細胞のＣＤ４集団内およびＣＤ８集団内のいずれにおいても希釈されたことを示す図である。この図には、図５Ｃで示した細胞のＣＤ４亜集団（Ａ）を示す。ＤＡＰＩ−ＣＤ３＋ＥＧＦＲｔ＋細胞についての初期ゲートの後で、ＣＤ４細胞およびＣＤ８細胞を、初代ＡＭＬ患者試料との共培養後における、ＣＦＳＥの希釈について解析した。象限配置は、非刺激Ｔ細胞に基づく。
【図１６−２】図１６は、ＣＦＳＥが、ＣＡＲを発現させるＴ細胞のＣＤ４集団内およびＣＤ８集団内のいずれにおいても希釈されたことを示す図である。この図には、図５Ｃで示した細胞のＣＤ８亜集団（Ｂ）を示す。ＤＡＰＩ−ＣＤ３＋ＥＧＦＲｔ＋細胞についての初期ゲートの後で、ＣＤ４細胞およびＣＤ８細胞を、初代ＡＭＬ患者試料との共培養後における、ＣＦＳＥの希釈について解析した。象限配置は、非刺激Ｔ細胞に基づく。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
[0027]本発明のある特定の実施形態について、具体例、配列、および図面を使用して詳細に記載する。本発明は、特許請求の範囲により規定される、本発明の範囲内に含まれうる、全ての代替物、改変、および同等物にわたることを意図するので、列挙される実施形態は、本発明を、それらの実施形態を限定することを意図するものではない。当業者は、本明細書で記載される方法および材料と類似するかまたは同等な、多くの方法および材料を、本発明を実施するのに使用しうることを認識すると予想される。
【００１２】
[0028]いくつかの実施形態では、腫瘍を標的化するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする遺伝子が提供される。ある特定の実施形態に従い、遺伝子は、ＣＤ１２３特異的ＣＡＲ（ＣＤ１２３ＣＡＲ）をコードする。ＣＤ１２３ＣＡＲ遺伝子は、抗ＣＤ１２３一本
鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）領域、および以下のドメイン：ヒンジ領域、共刺激シグナル伝達ドメイン、細胞内シグナル伝達ドメイン、またはこれらの組合せのうちの１または複数を含む。
【００１３】
[0029]いくつかの実施形態では、ＣＤ１２３ＣＡＲ遺伝子は、抗ＣＤ１２３一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）領域、ヒンジ領域を含むことが可能であり、任意選択で、少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメインを含むことが可能であり、任意選択で、細胞内シグナル伝達ドメインを含みうるがこれらに限定されない。
【００１４】
[0030]ある特定の実施形態では、ＣＤ１２３ＣＡＲ遺伝子は、抗ＣＤ１２３一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）領域、ヒンジ領域、少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメイン（図９）を含みうるがこれらに限定されない。
【００１５】
[0031]抗ＣＤ１２３ｓｃＦｖ領域は、発現すると、ＣＤ１２３のエピトープに結合しうるヌクレオチド配列を含みうる。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖ抗ＣＤ１２３ｓｃＦｖ領域は、組換え免疫毒素（ＲＩＴ）である２６２９２および３２７１６［１８］のＶＨドメインおよびＶＬドメインをコードするヌクレオチドを含む。本明細書ではまた、２６２９２を標的化するＣＤ１２３ＣＡＲ遺伝子および３２７１６を標的化するＣＤ１２３ＣＡＲ遺伝子を、それぞれ、２６２９２ＣＡＲおよび３２７１６ＣＡＲとも称する。ある特定の実施形態では、抗ＣＤ１２３ｓｃＦｖ領域は、以下：
３２７１６ＣＡＲのための、配列番号１または配列番号３のヌクレオチド８２〜８１４、または
２６２９２ＣＡＲのための、配列番号２または配列番号４のヌクレオチド８２〜７９２から選択されるヌクレオチド配列を含みうる。
【００１６】
[0032]前記ヌクレオチド配列は、以下：
３２７１６ＣＡＲ内で使用される場合の、配列番号９または配列番号１１の残基２３〜２６６、または
２６２９２ＣＡＲ内で使用される場合の、配列番号１０または配列番号１２の残基２３〜２５９
から選択されるアミノ酸配列をコードする。
【００１７】
[0033]ある特定の実施形態では、抗ＣＤ１２３ｓｃＦｖ領域を改変して、結合を増強することもでき、免疫原性を低減することもできる。例えば、一態様では、抗ＣＤ１２３ｓｃＦｖ領域は、ヒト化抗ＣＤ１２３ｓｃＦｖ領域でありうる。
【００１８】
[0034]ヒンジ領域は、ＣＨ２ドメイン−ＣＨ３ドメイン間に収まる、免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）の少なくとも一部を含みうる。いくつかの実施形態では、ヒンジ領域は、修飾ヒンジである。修飾ヒンジは、ＣＤ１２３ＣＡＲのオフターゲット効果の低減に寄与し、これにより、その特異性および有効性を増大させる、１カ所または複数カ所のアミノ酸置換またはアミノ酸修飾を有しうる。本明細書で使用される「アミノ酸修飾」または「アミノ酸置換」または「置換」とは、タンパク質配列内またはペプチド配列内のアミノ酸の置換、挿入、および／または欠失を意味する。本明細書で使用される「アミノ酸置換」または「置換」とは、親ペプチド配列内または親タンパク質配列内の特定の位置におけるアミノ酸の、別のアミノ酸による置きかえを意味する。例えば、置換Ｓ２２８Ｐとは、２２８位におけるセリンが、プロリンで置きかえられた、変異体タンパク質または変異体ペプチドを指す。
【００１９】
[0035]アミノ酸置換は、タンパク質またはペプチドをコードする、核酸配列内の特定のコドンを、異なるアミノ酸をコードするコドンに変化させるように、突然変異により施す
ことができる。このような突然変異は一般に、可能な最小のヌクレオチド変化を施すことにより施す。この種の置換突然変異を施して、結果として得られるタンパク質内のアミノ酸を、非保存的な形で（すなわち、コドンを、特定のサイズまたは特徴を有するアミノ酸の分類に属するアミノ酸から、別の分類に属するアミノ酸に変化させることにより）変化させることもでき、保存的な形で（すなわち、コドンを、特定のサイズまたは特徴を有するアミノ酸の分類に属するアミノ酸から、同じ分類に属するアミノ酸に変化させることにより）変化させることもできる。このような保存的変化は一般に、結果として得られるタンパク質の構造および機能のより小さな変化をもたらす。
【００２０】
[0036]以下は、アミノ酸の多様な分類の例である：
・非極性Ｒ基を有するアミノ酸：アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン
・非帯電極性Ｒ基を有するアミノ酸：グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン
・帯電極性Ｒ基を有するアミノ酸：（ｐＨ６．０で負に帯電）：アスパラギン酸、グルタミン酸
・塩基性アミノ酸（ｐＨ６．０で正に帯電）：リシン、アルギニン、ヒスチジン（ｐＨ６．０で）。
【００２１】
[0037]別の分類は、フェニル基を有するアミノ酸：フェニルアラニン、トリプトファン、チロシンでありうる。
[0038]下記に示す分子量（すなわち、Ｒ基のサイズ）に従って別の分類も可能である：
グリシン  ７５
アラニン  ８９
セリン  １０５
プロリン  １１５
バリン  １１７
トレオニン  １１９
システイン  １２１
ロイシン  １３１
イソロイシン  １３１
アスパラギン  １３２
アスパラギン酸  １３３
グルタミン  １４６
リシン  １４６
グルタミン酸  １４７
メチオニン  １４９
ヒスチジン（ｐＨ６．０で）  １５５
フェニルアラニン  １６５
アルギニン  １７４
チロシン  １８１
トリプトファン  ２０４。
【００２２】
[0039]ある特定の実施形態では、修飾ヒンジは、非修飾ヒンジ内に存在するアミノ酸残基と異なるアミノ酸残基で置換された１つまたは複数のアミノ酸残基を含む、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４に由来する。１つまたは複数の置換アミノ酸残基は、２２０、２２６、２２８、２２９、２３０、２３３、２３４、２３５、２３４、２３７、２３８、２３９、２４３、２４７、２６７、２６８、２８０、２９０、２９２、２９７、２９８、２９９、３００、３０５、３０９、２１８、３２６、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３６、３３９、位における１もしくは複数のアミノ酸残基またはこれらの組合せから選択されるがこれらに限定されない。
【００２３】
[0040]いくつかの実施形態では、修飾ヒンジは、以下のアミノ酸残基置換：Ｃ２２０Ｓ、Ｃ２２６Ｓ、Ｓ２２８Ｐ、Ｃ２２９Ｓ、Ｐ２３０Ｓ、Ｅ２３３Ｐ、Ｖ２３４Ａ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３６Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｓ２３９Ｄ、Ｆ２４３Ｌ、Ｐ２４７Ｉ、Ｓ２６７Ｅ、Ｈ２６８Ｑ、Ｓ２８０Ｈ、Ｋ２９０Ｓ、Ｋ２９０Ｅ、Ｋ２９０Ｎ、Ｒ２９２Ｐ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｑ、Ｓ２９８Ａ、Ｓ２９８Ｇ、Ｓ２９８Ｄ、Ｓ２９８Ｖ、Ｔ２９９Ａ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ、Ｖ３０９Ｌ、Ｅ３１８Ａ、Ｋ３２６Ａ、Ｋ３２６Ｗ、Ｋ３２６Ｅ、Ｌ３２８Ｆ、Ａ３３０Ｌ、Ａ３３０Ｓ、Ａ３３１Ｓ、Ｐ３３１Ｓ、Ｉ３３２Ｅ、Ｅ３３３Ａ、Ｅ３３３Ｓ、Ｅ３３３Ｓ、Ｋ３３４Ａ、Ａ３３９Ｄ、Ａ３３９Ｑ、Ｐ３９６Ｌ、のうちの１もしくは複数またはこれらの組合せを含むがこれらに限定されない、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４に由来する（５０）。
【００２４】
[0041]いくつかの実施形態では、修飾ヒンジは、以下のアミノ酸配列：
２１９位  ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＳ  ＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰ  ＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫ  ＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥ  ＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱ  ＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹ
２７９位  ＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫ  ＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳ  ＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶ  ＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥ  ＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬ  ＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫ
３３９位  ＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶ  ＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭ  ＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬ  ＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡ  ＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥ  ＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬ
３９９位  ＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳ  ＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱ  ＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭ  ＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱ  ＫＳＬＳＬＳＬＧＫ（配列番号１３）
を有するＩｇＧ４ヒンジに由来する。
【００２５】
[0042]ある特定の実施形態では、修飾ヒンジは、非修飾ヒンジ内に存在するアミノ酸残基と異なるアミノ酸残基で置換された１つまたは複数のアミノ酸残基を含むＩｇＧ４に由来する。１つまたは複数の置換アミノ酸残基は、２２０、２２６、２２８、２２９、２３０、２３３、２３４、２３５、２３４、２３７、２３８、２３９、２４３、２４７、２６７、２６８、２８０、２９０、２９２、２９７、２９８、２９９、３００、３０５、３０９、２１８、３２６、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３６、３３９、位における１もしくは複数のアミノ酸残基またはこれらの組合せから選択されるがこれらに限定されない。
【００２６】
[0043]いくつかの実施形態では、修飾ヒンジは、以下のアミノ酸残基置換であって、非修飾ヒンジ内のアミノ酸が、表示の位置において、上記で同定されたアミノ酸で置換される、アミノ酸残基置換：２２０Ｓ、２２６Ｓ、２２８Ｐ、２２９Ｓ、２３０Ｓ、２３３Ｐ、２３４Ａ、２３４Ｖ、２３４Ｆ、２３４Ａ、２３５Ａ、２３５Ｅ、２３６Ａ、２３７Ａ、２３８Ｓ、２３９Ｄ、２４３Ｌ、２４７Ｉ、２６７Ｅ、２６８Ｑ、２８０Ｈ、２９０Ｓ、２９０Ｅ、２９０Ｎ、２９２Ｐ、２９７Ａ、２９７Ｑ、２９８Ａ、２９８Ｇ、２９８Ｄ、２９８Ｖ、２９９Ａ、３００Ｌ、３０５Ｉ、３０９Ｌ、３１８Ａ、３２６Ａ、３２６Ｗ、３２６Ｅ、３２８Ｆ、３３０Ｌ、３３０Ｓ、３３１Ｓ、３３１Ｓ、３３２Ｅ、３３３Ａ、３３３Ｓ、３３３Ｓ、３３４Ａ、３３９Ｄ、３３９Ｑ、３９６Ｌ、のうちの１もしくは複数またはこれらの組合せを含むがこれらに限定されない、ＩｇＧ４に由来する。
【００２７】
[0044]いくつかの実施形態では、修飾ＩｇＧ４ヒンジは、２２８位における、プロリン（Ｐ）によるセリン（Ｓ）の置換（Ｓ２２８Ｐ）、２３５位における、ロイシン（Ｌ）によるグルタミン酸（Ｅ）の置換（Ｌ２３５Ｅ）、２９７位における、アスパラギン（Ｎ）によるグルタミン（Ｑ）の置換（Ｎ２９７Ｑ）を含むがこれらに限定されない。ある特定の実施形態では、修飾ＩｇＧ４ヒンジ領域は、以下：
３２７１６ＣＡＲのための、配列番号１または配列番号３のヌクレオチド８１４〜１５００、または
２６２９２ＣＡＲのための、配列番号２または配列番号４のヌクレオチド７９３〜１４７９
から選択されるヌクレオチド配列を含みうる。
【００２８】
[0045]前記ヌクレオチド配列は、以下：
３２７１６ＣＡＲ内で使用される場合の、配列番号１または配列番号３の残基２６７〜４９５、または
２６２９２ＣＡＲ内で使用される場合の、配列番号２または配列番号４の残基２６０〜４８８
から選択されるアミノ酸配列をコードする。
【００２９】
[0046]一実施形態では、修飾ＩｇＧ４ヒンジ領域は、Ｓ２２８Ｐ置換およびＬ２３５Ｅ置換（「Ｓ２２８Ｐ＋Ｌ２３５Ｅ」）を含む（図１０および１１を参照されたい）。別の実施形態では、修飾ＩｇＧ４ヒンジ領域は、Ｓ２２８Ｐ置換、Ｌ２３５Ｅ置換、およびＮ２９７Ｑ置換（「Ｓ２２８Ｐ＋Ｌ２３５Ｅ＋Ｎ２９７Ｑ」）を含む（図１２および１３を参照されたい）。
【００３０】
[0047]いくつかの実施形態では、ヒンジを改変して、Ｃ１２３ＣＡＲ内のＦｃスペーサー領域で、ＣＤ８ａのヒンジ領域など、Ｆｃに結合しないスペーサーを置換することができる。代替的に、ヒンジのＦｃスペーサー領域を、欠失させることもできる。このような置換は、Ｆｃへの結合を低減するかまたは消失させると予想される。
【００３１】
[0048]本明細書で使用される「位置」という用語は、タンパク質の配列内の配置である。位置は、順次番号付けすることもでき、確立されたフォーマット、例えば、ＫａｂａｔによるＫａｂａｔ位置またはＥＵ位置またはＥＵインデックスに従い番号付けすることもできる。本明細書で論じられる全ての位置について、番号付けは、ＥＵインデックスまたはＥＵ番号付けスキーム（参照により全体として本明細書に組み込まれる、Ｋａｂａｔら、１９９１、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、５版、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ）に従う。ＫａｂａｔによるＥＵインデックスまたはＥＵインデックスまたはＥＵ番号付けスキームとは、ＥＵによる抗体の番号付け（参照により全体として本明細書に組み込まれる、Ｅｄｅｌｍａｎら、１９６９、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、６３：７８〜８５）を指す。Ｋａｂａｔ位置は、当技術分野でもまた周知であるが、所与の位置について、ＥＵ位置から変化しうる。例えば、上記で記載したＳ２２８Ｐ置換およびＬ２３５Ｅ置換とは、ＥＵ位置を指す。しかし、これらの置換はまた、Ｋａｂａｔ位置２４１（Ｓ２４１Ｐ）および２４８（Ｌ２４８Ｅ）にも対応しうる［２１］。
【００３２】
[0049]共刺激シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢ共刺激ドメイン、ＯＸ−４０共刺激ドメイン、ＣＤ２７共刺激ドメイン、またはＣＤ２８共刺激ドメインを含むがこれらに限定されない、任意の適切な共刺激ドメインを含みうる。本明細書で記載される実施形態に従い、ＣＤ１２３ＣＡＲは、少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメインを含みうる。一態様では、ＣＤ１２３ＣＡＲは、単一の共刺激シグナル伝達ドメインを有するか、または上記で記載した共刺激シグナル伝達ドメインなど、２つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含みうる。別の態様では、共刺激ドメインは、上記で記載した共刺激ドメインなど、単一の共刺激ドメインからなる場合もあり、代替的に、２つ以上の共刺激ドメインの２つ以上の部分からなる場合もある。代替的に、いくつかの実施形態では、ＣＤ１２３ＣＡＲは、共刺激シグナル伝達ドメインを含まない。
【００３３】
[0050]一実施形態では、ＣＤ１２３ＣＡＲは、ＣＤ２８共刺激ドメインである、共刺激シグナル伝達ドメインを含む。ＣＤ２８シグナル伝達ドメインは、修飾ＣＤ２８膜貫通ドメインを含みうる。一実施形態では、このような修飾ＣＤ２８膜貫通ドメインは、配列番号１０または配列番号１２のアミノ酸残基５３０〜５３１、または配列番号１１または配列番号１３の残基５２３〜５２４における、ロイシン−ロイシン（ＬＬ）からグリシン−グリシン（ＧＧ）への置換（例えば、ＲＬＬＨ→ＲＧＧＨ［２２］）を含むがこれらに限定されない、１カ所または複数カ所のアミノ酸置換またはアミノ酸修飾を有する。ある特定の実施形態では、修飾共刺激シグナル伝達ドメイン領域は、以下：
３２７１６ＣＡＲのための、配列番号１または配列番号３のヌクレオチド１５０１〜１７０７、または
２６２９２ＣＡＲのための、配列番号２または配列番号４のヌクレオチド１４８０〜１６８６
から選択されるヌクレオチド配列を含みうる。
【００３４】
[0051]前記ヌクレオチド配列は、以下：
３２７１６ＣＡＲ内で使用される場合の、配列番号１または配列番号３の残基４９８〜５６４、または
２６２９２ＣＡＲ内で使用される場合の、配列番号２または配列番号４の残基４８９〜５５７
から選択されるアミノ酸配列をコードする。
【００３５】
[0052]細胞内シグナル伝達ドメインは、そのシグナル伝達ドメイン部分である、任意の適切なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体を含みうる。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＴＣＲゼータ鎖（ζ鎖）シグナル伝達ドメインである。ある特定の実施形態では、ζ鎖シグナル伝達ドメインは、以下：
３２７１６ＣＡＲのための、配列番号１または配列番号３のヌクレオチド１７１７〜２０５２、または
２６２９２ＣＡＲのための、配列番号２または配列番号４のヌクレオチド１６９６〜２０３１
から選択されるヌクレオチド配列を含みうる。
【００３６】
[0053]前記ヌクレオチド配列は、以下：
３２７１６ＣＡＲ内で使用される場合の、配列番号１または配列番号３の残基５６８〜６７９、
２６２９２ＣＡＲ内で使用される場合の、配列番号２または配列番号４の残基５６１〜６７２
から選択されるアミノ酸配列をコードする。
【００３７】
[0054]したがって、上記で記載した実施形態に係る実施形態では、ＣＤ１２３ＣＡＲ遺伝子は、配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４から選択されるヌクレオチド配列を含みうる。他の実施形態では、ＣＤ１２３ＣＡＲ遺伝子は、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２から選択されるアミノ酸配列をコードしうる（図１０、１１、１２、１３）。
【００３８】
ＣＤ１２３ＣＡＲ遺伝子の発現およびＴ細胞の形質導入
[0055]いくつかの実施形態では、ＣＤ１２３ＣＡＲ遺伝子は、発現カセットの一部である。いくつかの実施形態では、発現カセットはまた（ＣＤ１２３ＣＡＲ遺伝子に加えて）、アクセサリー遺伝子も含みうる。Ｔ細胞を介して発現すると、アクセサリー遺伝子は、形質導入されたＴ細胞の選択マーカー、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるトラッキングマーカー、または形質導入されたＴ細胞のための自殺遺伝子として用いられうる。
【００３９】
[0056]いくつかの実施形態では、アクセサリー遺伝子は、切断型ＥＧＦＲ遺伝子（ＥＧＦＲｔ）である。ＥＧＦＲｔは、非免疫原性選択ツール（例えば、ＥＧＦＲｔ含有構築物をレンチウイルスで形質導入したＴ細胞を濃縮するために、ビオチニル化セツキシマブを、抗ビオチンマイクロビーズと組み合わせて使用する免疫磁気選択）、トラッキングマーカー（例えば、Ｔ細胞の生着を追跡するためのフローサイトメトリー解析）、および自殺遺伝子（例えば、セツキシマブ／Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）に媒介される抗体依存性細胞介在性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）経路を介する）として使用することができる。本明細書で記載される実施形態に従い使用されうる、切断型ＥＧＦＲ（ＥＧＦＲｔ）遺伝子の例は、その対象が、全体が本明細書で提示された場合と同様に、参照により本明細書に組み込まれる、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０５５３２９号において記載されている。他の実施形態では、アクセサリー遺伝子は、切断型ＣＤ１９遺伝子（ＣＤ１９ｔ）である。
【００４０】
[0057]別の実施形態では、アクセサリー遺伝子は、誘導性自殺遺伝子である。自殺遺伝子とは、その遺伝子を発現させる細胞に、所望の時点において、プログラム細胞死または抗体に媒介されるクリアランスを受けさせる、組換え遺伝子である。一実施形態では、アクセサリー遺伝子として使用されうる誘導性自殺遺伝子は、誘導性カスパーゼ９遺伝子（その対象が、全体が本明細書で提示された場合と同様に、参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｔｒａａｔｈｏｆら（２００５）、「Ａｎ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｃａｓｐａｓｅ  ９  ｓａｆｅｔｙ  ｓｗｉｔｃｈ  ｆｏｒ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｂｌｏｏｄ、６月１日、１０５（１１）：４２４７〜４２５４を参照されたい）である。
【００４１】
[0058]いくつかの実施形態では、上記で記載したＣＤ１２３ＣＡＲ遺伝子を含む発現カセットは、標的細胞を送達する（形質導入またはトランスフェクションを介して）ためのベクターに挿入することができる。任意の適切なベクター、例えば、細菌ベクター、ウイルスベクター、またはプラスミドを使用することができる。いくつかの実施形態では、ベクターは、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、アデノウイルスベクター、またはアデノ随伴ウイルスベクターから選択されるウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターにより、健常Ｔ細胞集団に形質導入することができる。形質導入またはトランスフェクトすることに成功した標的細胞は、発現カセットの一部である１つまたは複数の遺伝子を発現させる。
【００４２】
[0059]Ｔ細胞の１つまたは複数の集団自体に、ＣＤ１２３ＣＡＲ遺伝子を形質導入することもできる。いくつかの実施形態では、ＣＤ１２３ＣＡＲ遺伝子は、配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４から選択されるヌクレオチド配列を含む。したがって、いくつかの実施形態では、形質導入されたＴ細胞は、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２（図１０、１１、１２、１３）から選択されるアミノ酸配列をコードする、ＣＤ１２３ＣＡＲ遺伝子を発現させる。形質導入されたＴ細胞は、ドナーに由来する場合もあり、ＡＭＬを有し、ＡＭＬのための処置を必要とする対象に由来する場合もある。いくつかの実施形態では、形質導入されたＴ細胞を、ＡＭＬを処置するための、養子免疫療法による処置において使用する。
【００４３】
[0060]さらに、Ｔ細胞の１つまたは複数の集団は、対象に投与するための送達のための、薬学的に許容される組成物の一部でもありうる。ＣＤ１２３ＣＡＲが形質導入されたＴ細胞に加えて、薬学的に有効な組成物は、１種または複数の薬学的に有効な担体を含みうる。本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」とは、目的の処置を、１つの組織、臓器、または体内の一部から、別の組織、臓器、または体内の一部に運ぶかまたは輸送することに関与する、薬学的に許容される材料、組成物、または媒体を指す。このような担体は、例えば、液体、固体、もしくは半固体の充填剤、溶媒、界面活性剤、希釈剤、賦形剤、アジュバント、結合剤、緩衝剤、溶解補助剤、溶媒、封入材料、封鎖剤、分散剤、保存剤、滑沢剤、崩壊剤、増粘剤、乳化剤、抗微生物剤、抗酸化剤、安定化剤、着色剤、またはこれらのいくつかの組合せを含みうる。
【００４４】
[0061]担体の各構成要素は、組成物の他の成分と適合性でなければならず、それが遭遇しうる任意の組織、臓器、または体内の一部との接触に適さなければならないという点で「薬学的に許容され」、これは、その治療的有益性を過度に凌駕する、毒性、刺激、アレルギー反応、免疫原性、または任意の他の合併症のリスクを保有してはならないことを意味する。
【００４５】
[0062]薬学的に許容される担体として用いられうる材料のいくつかの例は、（１）ラクトース、グルコース、およびスクロースなどの糖、（２）トウモロコシデンプンおよびバレイショデンプンなどのデンプン、（３）セルロースおよびカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、および酢酸セルロースなどのその誘導体、（４）トラガント末、（５）麦芽、（６）ゼラチン、コラーゲン、フィブリン、フィブリノーゲン、ラミニン、デコリン、ヒアルロナン、アルギネート、およびキトサンなどの天然ポリマー、（７）滑石、（８）ココアバターおよび坐剤用ワックスなどの賦形剤、（９）ラッカセイ油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油、およびダイズ油などの油、（１０）プロピレングリコールなどのグリコール、（１１）グリセリン、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコールなどのポリオール、（１２）トリメチレンカーボネート、オレイン酸エチル、およびラウリン酸エチルなどのエステル、（１３）寒天、（１４）水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤、（１５）アルギン酸（またはアルギネート）、（１６）発熱物質非含有水、（１７）等張性生理食塩液、（１８）リンゲル液、（１９）エチルアルコールおよびプロパンアルコールなどのアルコール、（２０）リン酸緩衝液、（２１）ポリ乳酸、ポリグリコール酸などの熱可塑性物質、（２２）ポリカプロラクトンなどのポリエステル、（２３）自己集合性ペプチド、ならびに（２４）アセトンなど、医薬処方物中で援用される、他の非毒性の適合性物質を含む。
【００４６】
[0063]医薬組成物は、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどのｐＨ調整剤およびｐＨ緩衝剤、毒性調整剤など、生理学的条件に近づけるのに必要な薬学的に許容される補助物質を含有しうる。
【００４７】
[0064]一実施形態では、薬学的に許容される担体は、水性担体、例えば、緩衝生理食塩液などである。ある特定の実施形態では、薬学的に許容される担体は、極性溶媒、例えば、アセトンおよびアルコールである。
【００４８】
[0065]これらの処方物中の、ＣＤ１２３ＣＡＲが形質導入されたＴ細胞の濃度は、広範に変化する可能性があり、選択される特定の投与方式および生体系の必要に従い、主に、流体容量、粘度、臓器サイズ、体重などに基づき、選択されると予想される。
【００４９】
[0066]ある特定の実施形態では、ＡＭＬ細胞を標的化し、殺滅させるための方法において使用される、本明細書で記載される細胞など、ＣＤ１２４ＣＡＲ遺伝子が形質導入されたＴ細胞（すなわち、ＣＤ１２４ＣＡＲが形質導入されたＴ細胞）の集団は、細胞培養物中で成長させることができる。この実施形態のある種の態様では、方法を、ＡＭＬの病因におけるＣＤ１２３の役割について探索する、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ状況または研究状況において使用することもでき、新たなＣＤ１２３ＣＡＲ構築物の標的化能を査定する、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ状況または研究状況において使用することもできる。
【００５０】
ＣＤ１２３ＣＡＲが形質導入されたＴ細胞によるＡＭＬの処置
[0067]いくつかの実施形態に従い、上記で記載したＣＤ１２３ＣＡＲ遺伝子およびＣＤ１２３ＣＡＲ遺伝子が形質導入されたＴ細胞集団など、ＣＤ１２３ＣＡＲ遺伝子およびＣＤ１２３ＣＡＲ遺伝子が形質導入されたＴ細胞集団を対象におけるＡＭＬを処置するための方法において使用することができる。このような方法は、治療有効量の、少なくとも１つのＣＤ１２３ＣＡＲ遺伝子が形質導入された、少なくとも１つのＴ細胞集団を対象に投与するステップを含みうる。これらの実施形態では、ＣＤ１２３ＣＡＲが形質導入されたＴ細胞集団は、上記で記載したＣＤ１２３ＣＡＲ遺伝子など、１つまたは複数のＣＤ１２３ＣＡＲ遺伝子を発現させる。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞に、３２７１６ＣＡＲ（Ｓ２２８Ｐ＋Ｌ２３５Ｅ＋Ｎ２９７Ｑ）遺伝子構築物（図１２）または２６２９２ＣＡＲ（Ｓ２２８Ｐ＋Ｌ２３５Ｅ＋Ｎ２９７Ｑ）遺伝子構築物（図１３）を形質導入し、これらを発現させる。このような細胞を、養子免疫療法による処置を介して投与すると、形質導入されたＴ細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、ＣＤ１２３を発現させる細胞（すなわち、ＡＭＬ細胞）を特異的に標的化し、これらを溶解させ、これにより、がん細胞を消失させるそれらの治療効果を送達する。下記の実施例で記載する通り、ヒンジ領域内にＳ２２８ＰおよびＬ２３５Ｅ突然変異を有するＣＤ１２３ＣＡＲ遺伝子構築物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養された細胞内で十分な応答を発生させるのに十分な、オフターゲット効果からの保護をもたらす。しかしこのデータから、ｉｎ  ｖｉｖｏでのこれらの構築物の効果を推測すべきではない。研究者らは、処置の効果についてのｉｎ  ｖｉｖｏデータへの移行可能性に関して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのデータを重んじることが多い。場合によっては、ｉｎ  ｖｉｔｒｏデータはｉｎ  ｖｉｖｏデータとよく一致する。しかし、図８により示される通り、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて高度に有効な抗腫瘍細胞効果示したＣＤ１２３ＣＡＲ（Ｓ２２８Ｐ＋Ｌ２３５Ｅ）遺伝子構築物（図１０〜１１）が、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて同じ効果を示さなかったため、この相関は予測不可能である。結果として、ヒンジ領域内に、さらなる突然変異（Ｎ２９７Ｑ）を施して、ＣＤ１２３ＣＡＲ（Ｓ２２８Ｐ＋Ｌ２３５Ｅ＋Ｎ２９７Ｑ）構築物を作製した。ＣＤ１２３ＣＡＲ（Ｓ２２８Ｐ＋Ｌ２３５Ｅ）遺伝子構築物とは対照的に、これらの構築物の投与は、白血病負荷の顕著な低減を結果としてもたらした。
【００５１】
[0068]本明細書で記載される方法に従い使用されうる、１つまたは複数のＣＤ１２３ＣＡＲ遺伝子が形質導入されたＴ細胞の１つまたは複数の集団は、任意の適切な投与経路により、単独で、または医薬組成物の一部として投与することができる。投与経路は、頭蓋内経路、非経口経路、または経皮経路を含むがこれらに限定されない、当技術分野で公知の任意の投与経路を指す場合がある。「非経口」経路とは、一般に注射を随伴する投与経路であって、眼窩下経路、注入、動脈内経路、関節包内経路、心内経路、皮内経路、筋内経路、腹腔内経路、肺内経路、脊髄内経路、胸骨下経路、髄腔内経路、腫瘍内経路、子宮内経路、静脈内経路、くも膜下経路、被膜下経路、皮下経路、経粘膜経路、または経気管経路を含む投与経路を指す。ある特定の実施形態では、形質導入されたＴ細胞を、静脈内投与または髄腔内投与する。
【００５２】
[0069]本明細書で使用される「有効量」という用語は、所望の効果をもたらす薬剤、化合物、処置、または治療の量を指す。例えば、細胞集団を、有効量の薬剤、化合物、処置、または治療と接触させて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける（例えば、細胞培養物中の）その効果について研究するか、またはｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、所望の治療効果をもたらすことができる。有効量の薬剤、化合物、処置、または治療を使用して、標的の状態を防止または処置すること、状態と関連する症状を緩和すること、または所望の生理学的効果をもたらすことなど、対象における治療効果をもたらすことができる。このような場合、有効量の化合物は、「治療有効量」、「治療有効濃度」、または「治療有効用量」である。正確な有効量または治療有効量とは、所与の対象または細胞集団における処置の有効性との関係で、最も有効な結果をもたらす組成物の量である。この量は、化合物の特徴（活性、薬物動態、薬力学、およびバイオアベイラビリティーを含む）、対象または細胞の生理学的状態（年齢、性別、疾患の種類および病期、全身状態、施された投与量に対する応答性、および投薬の種類を含む）、処方物中の１種または複数の薬学的に許容される担体の性質、および投与経路を含むがこれらに限定されない、様々な因子に応じて変化すると予想される。さらに、有効量または治療有効量は、化合物が、単独で投与されるのか、別の化合物、薬物、治療、または他の治療法もしくは治療様式と組み合わせて投与されるのかに応じても変化しうる。臨床技術分野および薬理学技術分野の当業者は、日常的な実験により、すなわち、化合物の投与に対する細胞または対象の応答をモニタリングし、これに応じて投与量を調整することにより、有効量または治療有効量決定することが可能であると予想される。さらなる指針については、参照により、本明細書で全体が提示された場合と同様に、本明細書に組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、「Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ」、２１版、Ｕｎｉｖ．ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（ＵＳＩＰ）、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ、２００５を参照されたい。本明細書で記載される実施形態に係る、所望の効果をもたらす有効量または治療有効量で使用されうる薬剤、化合物、処置、または治療は、ＣＤ１２３ＣＡＲ遺伝子、ＣＤ１２３ＣＡＲ遺伝子を含む発現カセット、ＣＤ１２３ＣＡＲ遺伝子を含む発現カセットを、ＣＤ１２３ＣＡＲ遺伝子が形質導入された、Ｔ細胞およびＴ細胞集団などの標的細胞に送達するベクターを含みうるがこれらに限定されない。
【００５３】
[0070]状態「を処置すること」または状態の「処置」という用語は、状態を防止すること、状態の発症もしくは進行速度を緩徐化させること、状態を進行させるリスクを低減すること、状態と関連する症状の進行を防止するかもしくは遅延させること、状態と関連する症状を軽減するかもしくは終息させること、状態の完全退縮もしくは部分退縮をもたらすこと、またはこれらのいくつかの組合せを指す場合がある。処置はまた、状態の予防的処置または防止的処置を意味する場合もある。
【００５４】
[0071]本明細書で使用される「対象」という用語は、ヒトまたは霊長動物（特に、高等霊長動物）、ヒツジ、イヌ、齧歯動物（例えば、マウスまたはラット）、モルモット、ヤギ、ブタ、ネコ、ウサギ、およびウシなど、全ての哺乳動物を含む動物を指す。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトである。
【００５５】
[0072]ある特定の実施形態では、ＡＭＬを処置するための方法は、治療有効量の、第１のＣＤ１２３ＣＡＲ遺伝子が形質導入された第１のＴ細胞集団を、治療有効量の、第２のＣＤ１２３ＣＡＲ遺伝子が形質導入された第２のＴ細胞集団と組み合わせて投与するステップを含みうる。
【００５６】
[0073]他の実施形態では、ＣＤ１２３ＣＡＲが形質導入されたＴ細胞は、１種または複数のさらなる抗がん治療と組み合わせて投与することができる。本明細書で使用される「組み合わせて」または「〜と組み合わせて」とは、同じ対象において同じがんを処置する過程で、２つ以上の薬剤、薬物、治療剤、手順、処置レジメン、処置様式、またはこれらの組合せを、任意の順序で使用することを意味する。これは、同時的投与のほか、時間的に最大数日の間隔をあけた順序での投与も含む。このような組合せ処置はまた、薬剤、薬物、治療剤、手順、処置レジメン、および処置様式のうちの任意の１または複数の複数回投与も含みうる。さらに、２つ以上の薬剤、薬物、治療剤、手順、処置レジメン、処置様式、またはこれらの組合せの投与は、同じ投与経路を介する場合もあり、異なる投与経路を介する場合もある。
【００５７】
[0074]本明細書で記載される方法に従い使用されうる、さらなる抗がん治療は、１種ま
たは複数の抗がん手順、抗がん処置様式、抗がん治療剤、またはこれらの組合せを含みうる。いくつかの実施形態では、ＣＤ１２３ＣＡＲが形質導入されたＴ細胞は、幹細胞移植（例えば、同種幹細胞、自己幹細胞、または骨髄非破壊的移植を使用する、骨髄移植または末梢血幹細胞移植）、放射線療法、または手術による切除を含むがこれらに限定されない、１種または複数の抗がん手順または抗がん処置様式と組み合わせて投与することができる。他の実施形態では、ＣＤ１２３ＣＡＲが形質導入されたＴ細胞は、ＡＭＬを処置するのに使用されうる、１もしくは複数の抗がん治療剤または抗がん薬であって、化学療法剤、および他の抗がん薬、免疫療法剤、標的化治療剤、またはこれらの組合せを含むがこれらに限定されない、抗がん治療剤または抗がん薬と組み合わせて投与することができる。
【００５８】
[0075]本明細書で記載される実施形態に係る、ＣＤ１２３ＣＡＲが形質導入されたＴ細胞と組み合わせて投与されうる、化学療法剤および他の抗がん薬は、オールトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）、三酸化ヒ素、アントラサイクリン系抗生剤およびそれらの薬学的に許容される塩（例えば、ドキソルビシン塩酸塩、ダウノルビシン塩酸塩、イダルビシン、ミトキサントロン）、アルキル化剤（例えば、シクロホスファミド、ラロムスチン）、代謝拮抗剤の類似体（シタラビン、６−チオグアニン、６−メルカプトプリン、メトトレキサート）、脱メチル化剤（例えば、デシタビン、５−アザシチジン）、核酸合成阻害剤（例えば、ヒドロキシ尿素）、トポイソメラーゼ阻害剤（例えば、エトポシド）、ビンカアルカロイド（例えば、ビンクリスチン硫酸塩）、またはこれらの組合せ（例えば、シタラビン（Ａｒａ−Ｃ）、ダウノルビシン塩酸塩、およびエトポシドの組合せを含む組合せ処置である「ＡＤＥ」）を含むがこれらに限定されない。
【００５９】
[0076]本明細書で記載される実施形態に係る、ＣＤ１２３ＣＡＲが形質導入されたＴ細胞と組み合わせて投与されうる、免疫療法剤は、免疫調節性試薬（例えば、ＳＴＡＴ３阻害剤であるレナリドマイド）および治療用モノクローナル抗体を含むがこれらに限定されない。治療用モノクローナル抗体は、（ｉ）ＣＤ３３（例えば、ゲムツズマブ、リンツズマブ）、ＭＵＣ１（例えば、カンツズマブ・ラブタンシン、クリバツズマブ・テトラキセタン、ペムツモマブ）を含むがこれらに限定されない、１種または複数のＡＭＬ抗原；（ｉ）Ｂ細胞抗原（例えば、リツキシマブ、オファツムマブ）；またはＶＥＧＦもしくはＶＥＧＦＲなどの血管系モジュレーター（例えば、アラシズマブ・ペゴール、ベバシズマブ、イクルクマブ、ラムシルマブ、ラニビズマブ）を標的化するようにデザインすることができる。
【００６０】
[0077]本明細書で記載される実施形態に係る、ＣＤ１２３ＣＡＲが形質導入されたＴ細胞と組み合わせて投与されうる、標的化治療剤は、チロシンキナーゼ阻害剤（イマチニブ、ダサチニブ、ニロチニブ、スニチニブ）、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、チピファルニブ）、ＦＬＴ阻害剤、およびｃ−Ｋｉｔ（またはＣＤ１１７）阻害剤（イマチニブ、ダサチニブ、ニロチニブ）を含むがこれらに限定されない。
【実施例】
【００６１】
実施例１：ＣＤ１２３ＣＡＲが形質導入されたＴ細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、ＡＭＬに対する強力な細胞傷害活性および複数のエフェクター機能を示す
材料と方法
[0078]細胞株：そうでないことが弁明されない限りにおいて、全ての細胞株を、以下では完全培地（ＣＭ）と称する、２ｍＭのＬ−グルタミン、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、および１０％の熱不活化ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を補充したＲＰＭＩ  １６４０（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で維持した。既に記載されている［１９］通りに、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、エプスタイン−バーウイルスで形質転換して、リンパ芽球様細胞株（ＬＣＬ）を作製した。ＬＣＬ−ＯＫＴ３細胞は、膜に結合したＯＫＴ３を発現させ
るが、これを、０．４ｍｇ／ｍｌのハイグロマイシンを補充したＣＭ中で成長させた［２０］。Ｋ５６２細胞は、ＡＴＣＣから得、推奨される通りに培養した。ＫＧ１ａ細胞（Ｒａｖｉ  Ｂｈａｔｉａ博士による恵与）は、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、４ｍＭのＬ−グルタミン（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、および２０％のＦＣＳを含むＩＭＤＭ（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で維持した。２９３Ｔ細胞（Ｔｈｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｔ  Ｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｈｏｐｅからの恵与）は、ＤＭＥＭ＋１０％の熱不活化ＦＣＳ中で維持した。
【００６２】
[0079]初代ＡＭＬ試料：初代ＡＭＬ試料は、患者の末梢血から得た（本明細書では、ＡＭＬ試料ＩＤ番号：１７９、３７３、４９３、５１９、５４５、５５９、６０５、７２２、および８１３と称する）。試料の特徴を、下記の表１にまとめる。
［表１は次頁に記載］。
【００６３】
【表１】
2020010699.tif 000002
【００６４】
[0080]フローサイトメトリー：蛍光色素をコンジュゲートさせたアイソタイプ対照である、抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、抗Ｔ細胞受容体αβ（ＴＣＲαβ）、抗ＣＤ１２３（９Ｆ５）
、抗ＣＤ３４（８Ｇ１２）、および抗ＣＤ３８（ＨＩＴ２）は、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。ビオチニル化抗Ｆｃ抗体は、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。ビオチニル化セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ）は、ＣＯＨ  ｐｈａｒｍａｃｙから購入したが、これについては既に記載されている［２０］。ビオチニル化抗ＣＤ２、抗ＣＤ３、抗ＣＤ７、抗ＣＤ１０、抗ＣＤ１１ｂ、抗ＣＤ１９、抗ＣＤ３３、および抗ＣＤ２３５Ａは、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入した。データ収集は、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、ＬＳＲＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、またはＭＡＣＳＱｕａｎｔ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）上で実施し、ＦＣＳ  Ｅｘｐｒｅｓｓ、Ｖｅｒｓｉｏｎ  ３（Ｄｅ  Ｎｏｖｏ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して解析した。
【００６５】
[0081]２９３Ｔ細胞へのＣＤ１２３のトランスフェクション：ＣＤ１２３  ｃＤＮＡは、ＣＤ１２３−ｐＭＤ１８−Ｔ（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ．）から、ポリメラーゼ連鎖反応およびプライマー（ＣＤ１２３−Ｆ：５’−ＡＴＡＡＧＧＣＣＴＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＴＣＣＴＣＣＴＴＴＧＧＣＴＣＡＣＧ−３’およびＣＤ１２３−Ｒ５’−ＡＴＡＧＣＴＡＧＣＴＣＡＡＧＴＴＴＴＣＴＧＣＡＣＧＡＣＣＴＧＴＡＣＴＴＣ−３’）を使用して増幅した。ＰＣＲ産物は、ＳｔｕＩ制限部位およびＮｈｅＩ制限部位を使用して、ｐＭＧＰａｃにクローニングした。２９３Ｔ細胞には、製造元の指示書に従い、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、フローサイトメトリーにより、ＣＤ１２３の発現を確認した。
【００６６】
[0082]レンチウイルスベクターの作製：本研究において使用されるＣＡＲ構築物を作製するため、ＶＨ鎖およびＶＬ鎖、修飾ＩｇＧ４ヒンジドメインおよび修飾ＣＤ２８膜貫通ドメイン（ＲＬＬＨ→ＲＧＧＨ［２２］）をコードする、コドンを最適化したＤＮＡ配列を合成し（ＧＥＮＥＡＲＴ）、ＮｈｅＩ部位およびＲｓｒＩＩ部位を使用して、ＣＤ１９ＲＣＡＲ−Ｔ２ＡＥＧＦＲｔ＿ｅｐＨＩＶ７［２０］にクローニングして、ＣＤ１９ＲＣＡＲを置きかえた。レンチウイルスは、ＣａｌＰｈｏｓ（商標）哺乳動物細胞トランスフェクションキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して、２９３Ｔ細胞に、レンチウイルスベクター、ならびにパッケージングベクターであるｐＣＭＶ−Ｒｅｖ２、ｐＣＨＧＰ−２、およびｐＣＭＶ−Ｇをトランスフェクトすることにより製造した。これらの２６２９２  ＣＡＲ構築物および３２７１６  ＣＡＲ構築物を、本明細書ではまた、２６２９２ＣＡＲ（Ｓ２２８Ｐ＋Ｌ２３５Ｅ）または２６２９２ＣＡＲ（Ｓ２２８Ｐ＋Ｌ２３５Ｅ＋Ｎ２９７Ｑ）（図１１および１３）および３２７１６ＣＡＲ（Ｓ２２８Ｐ＋Ｌ２３５Ｅ）または３２７１６ＣＡＲ（Ｓ２２８Ｐ＋Ｌ２３５Ｅ＋Ｎ２９７Ｑ）（図１０および１２）とも称する。レンチウイルスの上清は、トランスフェクションの２４、４８、および７２時間後において回収し、超遠心分離により濃縮した。
【００６７】
[0083]健常ドナーのＰＢＭＣおよびＡＭＬ患者のＰＢＭＣへの形質導入：匿名化されたＰＢＭＣは、施設内倫理委員会で承認されたプロトコール下で、説明同意文書に署名した健常ドナーおよび患者から得た。健常ドナーでは、毎週３回ずつ、２５Ｕ／ｍｌのＩＬ−２および０．５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１５を補充されるＣＭ（本明細書では、Ｔ細胞培地と称する）中のＯＫＴ３（３０ｎｇ／ｍｌ）を使用して、Ｔ細胞を活性化させた。活性化の７２時間後、８００ｇおよび３２℃で３０分間にわたり遠心分離することにより、Ｔ細胞に、レンチウイルスを、ＭＯＩ＝３でスピノキュレートした。ＣＡＲの発現については、レンチウイルスを形質導入した１２〜１４日後に、フローサイトメトリーで解析した。ＥＧＦＲｔを発現させるＴ細胞は、既に記載されている［２０］通りに濃縮した。Ｔ細胞は、急速増殖法［２３］により、Ｔ細胞培地中で増殖させた。
【００６８】
[0084]ＡＭＬ患者に由来するＴ細胞を遺伝子改変するため、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録
商標）Ｈｕｍａｎ  Ｔ−Ｅｘｐａｎｄｅｒ  ＣＤ３／ＣＤ２８（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、Ｔ細胞培地中に３：１のビーズ：ＣＤ３＋細胞比で、融解させた末梢血またはアフェレーシス生成物を刺激した。ビーズによる刺激の７２時間後、細胞に、レンチウイルスを、ＭＯＩ＝３でスピノキュレートした。初期刺激の９〜１４日間後、ＤｙｎａＭａｇ（商標）−５０磁石（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してビーズを除去し、Ｔ細胞を、Ｔ細胞培地中で維持した。ＡＭＬ患者に由来する、ＣＡＲを発現させるＴ細胞株は、殺滅アッセイにおける使用の前に免疫磁気選択しなかった。
【００６９】
[0085]ＣＦＳＥ増殖アッセイ：Ｔ細胞を、製造元の指示書に従い、０．５μＭのカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で標識した。標識されたＴ細胞を、１０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を補充したＣＭ中に２：１のＥ：Ｔ比で、刺激細胞を伴い、またはこれを伴わずに共培養した。７２〜９６時間後、細胞を採取し、ビオチニル化セツキシマブのほか、ヨウ化プロピジウムまたはＤＡＰＩで染色して、死細胞を解析から除外した。試料を、フローサイトメトリーで解析して、ＣＦＳＥの希釈により、ＥＧＦＲｔ陽性生細胞の増殖を査定した。
【００７０】
[0086]クロム放出アッセイおよびサイトカイン分泌アッセイ：標的細胞を、１時間にわたり、５１Ｃｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で標識し、５回にわたり洗浄し、多様なエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比でエフェクター細胞を含むウェル１つ当たり５×１０３個の細胞で、３連でアリコートに分けた。４時間にわたる共培養の後で、上清を採取し、ガンマカウンターまたはＴｏｐｃｏｕｎｔ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して放射線を測定した。特異的溶解パーセントは、既に記載されている［２４］通りに計算した。Ｅ：Ｔ比を１０：１とする共培養の２４時間後におけるサイトカイン産生は、既に記載されている通りに計算した［２５］。
【００７１】
[0087]ＣＤ１０７ａの脱顆粒および細胞内のサイトカイン産生：Ｔ細胞を、Ｅ：Ｔを２：１とする標的細胞と共に、ＧｏｌｇｉＳｔｏｐ（商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）および抗ＣＤ１０７ａクローンであるＨ４Ａ３またはアイソタイプの対応する対照抗体の存在下、３７℃で６時間にわたり共培養した。６時間にわたるインキュベーションの終了時において、細胞を採取し、洗浄し、抗ＣＤ３、抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、およびビオチニル化セツキシマブで染色した後、ＰＥコンジュゲートストレプトアビジンを使用して二次染色を施した。次いで、細胞を固定し、製造元の指示書に従い、透過処理し（Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ（商標）；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗ＩＦＮ− （ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；クローンＢ２７）および抗ＴＮＦ−α（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；クローンＭＡｂ１１）で染色した。データ収集は、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ  ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して実施し、解析は、ＦＣＳ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ３（Ｄｅ  Ｎｏｖｏ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して行った。
【００７２】
[0088]コロニー形成細胞アッセイ：免疫磁気カラムによる分離（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して、臍帯血（ＣＢ）単核細胞または初代ＡＭＬ試料に由来するＣＤ３４＋細胞を選択した。１０３個のＣＤ３４＋ＣＢ細胞を、２５×１０３個のエフェクター細胞と共に、４時間にわたり共培養してから、２連のウェル内の半固体のメチルセルロースによる前駆細胞培養物［２６］中に播種した。１４〜１８日後、顆粒球マクロファージコロニー形成単位（ＣＦＵ−ＧＭ）コロニーおよび赤芽球バースト形成単位（ＢＦＵＥ）コロニーを計数した。ＡＭＬ試料では、５×１０３個のＣＤ３４＋ＡＭＬ細胞を、１２５×１０３個のエフェクター細胞と共に、４時間にわたり共培養してから、２連のウェル内の半固体のメチルセルロースによる前駆細胞培養物中に播種した。
【００７３】
[0089]統計学的解析：統計学的解析は、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｖ５．０４を
使用して実施した。対応のないスチューデントのｔ検定を使用して、処置群間の有意差を確認した。
【００７４】
結果
ＣＤ１２３ＣＡＲ発現Ｔ細胞の作製
[0090]Ｔ細胞の特異性をリダイレクトするため、ＣＤ１２３ＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターを開発した。ＣＡＲの各々は、それぞれ、２つのＣＤ１２３特異的ｓｃＦｖである２６２９２および３２７１６［１８］のうちの１つをコードする、コドンを最適化した配列を含む。ｓｃＦｖは、ヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域と、ＣＤ２８共刺激ドメインと、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインとにインフレームで融合されている。ＣＡＲ配列のすぐ下流には、Ｔ２Ａリボソームスキップ配列および切断型ヒトＥＧＦＲ（ＥＧＦＲｔ）形質導入マーカー（図１Ａ）を置く。健常ドナーに由来する、ＯＫＴ３で刺激されたＰＢＭＣに、レンチウイルスで形質導入し、ビオチニル化Ｅｒｂｉｔｕｘ抗体を使用する免疫磁気選択により、ＣＡＲを発現させるＴ細胞を単離した後、抗ビオチン抗体磁気ビーズによる二次染色を施した。１ＲＥＭサイクルの後、単離された細胞を、フローサイトメトリーで、ＣＡＲの表面発現およびＴ細胞の表現型について解析した。ＦｃおよびＥＧＦＲｔのいずれの発現も、３例の健常ドナーから作製されたＴ細胞株中の９０％を超え、最終のＴ細胞産物は、ＣＤ４陽性Ｔ細胞とＣＤ８陽性Ｔ細胞との混合物からなった（図１Ｂ、１Ｃ）。
【００７５】
ＣＤ１２３ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＣＤ１２３を発現させる腫瘍細胞株を特異的に標的化する
[0091]ＣＤ１２３ＣＡＲ  Ｔ細胞の特異性を確認するため、遺伝子改変されたＴ細胞の、ＣＤ１２３を発現させるように一過性にトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞を溶解させる能力を検討した（２９３Ｔ−ＣＤ１２３；図２Ａ）。いずれのＣＤ１２３ＣＡＲ  Ｔ細胞も、２９３Ｔ−ＣＤ１２３の溶解を効率的にもたらしたが、ＣＤ１９を発現させるように一過性にトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞の溶解はもたらさなかったことから、ＣＤ１２３の特異的認識が裏付けられる（図２Ｂ）。次に、ＣＤ１２３特異的Ｔ細胞の、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける、ＣＤ１２３を内因的に発現させる腫瘍細胞株に対する細胞溶解能について探索した。ＬＣＬ細胞株上およびＫＧ１ａ細胞株上のＣＤ１２３の発現は、フローサイトメトリーにより確認した（図２Ｃ）。いずれのＣＤ１２３特異的Ｔ細胞株も、ＬＣＬ標的細胞株およびＫＧ１ａ標的細胞株を効率的に溶解させたが、ＣＤ１２３−Ｋ５６２細胞株は溶解させなかった（図２Ｃ）。対応するＣＤ１９特異的Ｔ細胞は、ＣＤ１９＋ＬＣＬ標的を有効に溶解させたが、ＣＤ１９−ＫＧ１ａまたはＫ５６２標的は溶解させなかった（図２Ｄ）。ｍｏｃｋ形質導入親細胞は、陽性対照のＬＣＬ−ＯＫＴ３細胞株だけを溶解させた（図２Ｄ）。
【００７６】
ＣＤ１２３ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＣＤ１２３陽性標的細胞と共に共培養されると、複数のエフェクター機能を活性化させる
[0092]ＣＤ１２３特異的Ｔ細胞のエフェクター機能について検討するため、多様な腫瘍細胞株との共培養後における、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの分泌を測定した。いずれのＣＤ１２３ＣＡＲを発現させるＴ細胞も、ＣＤ１２３＋標的細胞と共に共培養されると、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの両方を産生したのに対し、対応するＣＤ１９特異的Ｔ細胞は、ＣＤ１９＋ＬＣＬまたはＬＣＬ−ＯＫＴ３細胞株と共に共培養された場合に限り、これらのサイトカインを分泌した（図３Ａ）。加えて、いずれのＣＤ１２３特異的Ｔ細胞株も、ＣＤ１２３＋細胞株であるＬＣＬ、ＬＣＬ−ＯＫＴ３、またはＫＧ１ａのうちのいずれかと共に共培養されると増殖したが、ＣＤ１２３−Ｋ５６２細胞株と共に共培養されると増殖しなかった（図３Ｂ）。これに対し、対応するＣＤ１９  ＣＡＲを発現させるＴ細胞は、ＬＣＬまたはＬＣＬ−ＯＫＴ３と共に共培養された場合に限り増殖した（図３Ｂ）。
【００７７】
ＣＤ１２３ＣＡＲ  Ｔ細胞は、初代ＡＭＬ試料と共に共培養されると、複数のエフェクター機能を活性化させる
[0093]初代ＡＭＬ試料におけるＣＤ１２３の過剰発現は、十分に記載されており［２７〜２９］、本研究でも確認される（図１４）。多面的なＴ細胞応答は、感染およびワクチンに対する頑健な免疫応答に極めて重要であり、また、ＣＡＲでリダイレクトしたＴ細胞の抗腫瘍活性においても役割を果たしうる［３０］。初代ＡＭＬ試料に対する複数のエフェクター経路を活性化させる、ＣＤ１２３ＣＡＲ  Ｔ細胞の能力について探索するため、操作されたＴ細胞を、３つの異なるＡＭＬ患者試料（１７９、３７３、および６０５）と共に、６時間にわたり共培養し、多色フローサイトメトリー（図１５に示されるゲーティング戦略）を使用して、ＣＤ１０７ａの上方調節およびＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの産生について査定した。ＣＤ１２３特異的Ｔ細胞のＣＤ４区画およびＣＤ８区画のいずれにおいても、ＣＤ１０７ａの細胞表面における移動が観察されたのに対し、対応するＣＤ１９Ｒ  Ｔ細胞では、初代ＡＭＬ試料に対する感知できるほどの脱顆粒はなかった（図４Ａ、棒グラフ）。さらにまた、ＣＤ１０７ａ＋ＣＤ１２３ＣＡＲ  Ｔ細胞の亜集団も、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、または両方のサイトカインを産生した（図４Ａ、円グラフ）。この多機能性応答は、ＣＤ４集団およびＣＤ８集団のいずれについても観察された（図４Ａおよび４Ｂ）。加えて、ＣＡＲを操作されたＴ細胞の、初代ＡＭＬ試料との共培養に応答して増殖する能力も検討した。いずれのＣＤ１２３特異的Ｔ細胞株も、ＡＭＬ８１３試料またはプレＢ−ＡＬＬ８０２試料との共培養後において、増殖することが可能であった（図４Ｃ）。増殖は、ＣＤ４集団およびＣＤ８集団のいずれについても観察された（図１６）。対応するＣＤ１９特異的Ｔ細胞は、ＣＤ１９＋プレＢ−ＡＬＬ８０２と共に共培養されると増殖したが、ＡＭＬ８１３と共に共培養されると増殖しなかった。
【００７８】
ＣＤ１２３ＣＡＲを発現させるＴ細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、初代ＡＭＬ細胞を標的化する
ＣＤ１２３特異的Ｔ細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、臍帯血細胞によるコロニー形成を消失させない
[0094]ＣＤ１２３は、骨髄系共通前駆細胞（ＣＭＰ）上で発現する［３１］ことを踏まえると、操作されたＴ細胞の、ＣＤ３４に富む正常な臍帯血（ＣＢ）試料のコロニー形成能力に対する効果について探索した。ＣＢ試料による骨髄系および赤血球系のコロニー形成は、Ｅ：Ｔを２５：１とする共培養の４時間後において、ＣＤ１２３−ＣＡＲを発現させるＴ細胞により、対応するＣＤ１９Ｒ  ＣＡＲ  Ｔ細胞と比較してそれほど低減されなかった（図６ＡおよびＢ）。次に、ＣＤ１２３特異的Ｔ細胞の、初代クローン原性ＡＭＬ細胞の成長を阻害する能力を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて検討した。いずれのＣＤ１２３ＣＡＲ  Ｔ細胞株も、白血病コロニーの形成を、対応するＣＤ１９Ｒ  Ｔ細胞と比較して著明に減殺した（図６Ｃ）。ＣＤ１２３特異的Ｔ細胞が、白血病コロニー形成に対して、正常な骨髄系コロニー形成と比較して大きな影響を及ぼしたことは注目に値する（図６Ｄ、それぞれ、６９％の低減対３１％の低減）。
【００７９】
ＡＭＬ患者に由来するＴ細胞を遺伝子改変して、ＣＤ１２３ＣＡＲを発現させ、自己腫瘍細胞を特異的に標的化することができる
[0095]ＡＭＬ患者に由来するＴ細胞は、アクチンを再極性化せず、自己芽球と共に欠損した免疫シナプスを形成することが公知である［３２］。加えて、本発明者らが知る限りにおいて、ＡＭＬ患者に由来する、ＣＡＲを発現させるＴ細胞はいまだ記載されていない。したがって、ＡＭＬ患者に由来するＴ細胞を遺伝子改変して、ＣＤ１２３ＣＡＲを発現させうるのかどうかについて決定した。低温保存されたＰＢＭＣ（ＡＭＬ６０５およびＡＭＬ７２２）またはアフェレーシス産物（ＡＭＬ５５９）を、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで刺激し、レンチウイルスで形質導入して、ＣＤ１２３ＣＡＲまたはＣＤ１９Ｒ対照ＣＡＲのうちのいずれかを発現させた。３例の患者試料に由来するＴ細胞は全て、２６２９２
ＣＡＲ（４０〜６５％の形質導入効率）、３２７１６  ＣＡＲ（４６〜７０％の形質導入効率）、およびＣＤ１９Ｒ  ＣＡＲを発現させた（ＣＤ１２３特異的Ｔ細胞の、初代ＡＭＬ細胞を死滅させる能力を査定するため、対応するＣＤ１９Ｒ  ＣＡＲまたはＣＤ１２３ＣＡＲを発現させるＴ細胞を、４時間にわたる５１Ｃｒ放出アッセイにおいて、ＣＤ３４に富む初代ＡＭＬ患者試料と共に共培養した。対応するＣＤ１９Ｒ  Ｔ細胞とは対照的に、いずれのＣＤ１２３ＣＡＲ  Ｔ細胞株も、全ての被験初代ＡＭＬ患者試料を頑健に溶解させた（図５Ａ）。加えて、ＣＤ１２３ＣＡＲを発現させるＴ細胞の細胞溶解能力の間で統計学的差違が認められなかったのに対し、いずれのＣＤ１２３特異的Ｔ細胞も、細胞傷害作用の、対応するＣＤ１９Ｒ−ＣＡＲ  Ｔ細胞と比較した顕著な増強を裏付けた（図５Ｂ）。
【００８０】
[0096]２３〜３７％の形質導入効率）。ＡＭＬ患者に由来するＣＡＲ  Ｔ細胞の表現型の代表例を、図７Ａに示す。次に、４時間にわたる５１Ｃｒ放出アッセイにおいて、ＣＤ３４に富む自己標的細胞に対する、ＡＭＬ患者に由来するＣＡＲ  Ｔ細胞の細胞溶解の潜在能力を検討した。ＣＤ３４に富む自己細胞の全ては、百分率および強度を変化させたが、ＣＤ１２３を発現させた（図７Ｂ）。ＡＭＬ６０５およびＡＭＬ７２２に由来するＴ細胞が、自己芽球を効率的に溶解させるのに対し、ＡＭＬ５５９に由来するＴ細胞は、おそらくＡＭＬ５５９芽球上の低度で不均質なＣＤ１２３の発現に起因して、低レベルの自己芽球溶解を表した（図７Ｃ）。
【００８１】
考察
[0097]本明細書で記載される実施形態は、組換え免疫毒素（ＲＩＴ）に由来するｓｃＦｖを使用する、２つの新規のＣＤ１２３標的化ＣＡＲであって、異なるエピトープに結合し、ＣＤ１２３に対して同様の結合親和性を有する［１８］ＣＤ１２３標的化ＣＡＲである、２６２９２および３２７１６の作製を含む。Ｔ細胞集団により発現させると、これらのＣＤ１２３標的化ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＣＤ１２３を発現させる細胞に対する特異性をリダイレクトする。標準的な４時間にわたるクロム５１（５１Ｃｒ）放出アッセイを使用したところ、ＣＤ１２３ＣＡＲを発現させるように操作された健常ドナーのＴ細胞は、ＣＤ１２３＋細胞株および初代ＡＭＬ患者試料を効率的に溶解させた。加えて、ＣＤ１２３ＣＡＲ  Ｔ細胞のいずれも、ＣＤ１２３＋細胞株および初代ＡＭＬ患者試料との共培養後において、複数のエフェクター機能を活性化させた。さらに、ＣＤ１２３標的化Ｔ細胞は、臍帯血（ＣＢ）に由来する顆粒球マクロファージコロニー形成単位（ＣＦＵ−ＧＭ）コロニーまたは赤芽球バースト形成単位（ＢＦＵ−Ｅ）コロニーの数を、ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞と比較してそれほど低減しなかった。ＣＤ１９特異的Ｔ細胞が、初代ＡＭＬ試料の白血病コロニー形成に対して影響をほとんど及ぼさなかったのに対し、ＣＤ１２３標的化Ｔ細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける白血病コロニー形成を著明に低減したことは注目に値する。また、ＡＭＬ患者に由来するＴ細胞が、ＣＤ１２３ＣＡＲを発現させ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて自己芽球を溶解させうることも示された。
【００８２】
[0098]２つのＣＤ１２３特異的ＣＡＲのうちのいずれかを発現させるＴ細胞も、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、ＣＤ１２３を発現させる細胞株および初代ＡＭＬ患者試料を特異的に溶解させることが可能であり、複数のエフェクター機能を、抗原特異的な形で活性化させうることから、いずれのエピトープも、処置のための潜在的な標的であることが裏付けられる。ＣＤ１２３＋細胞と共に共培養したところ、ＣＤ１２３ＣＡＲを操作されたＴ細胞株の間で、標的細胞の殺滅、サイトカインの分泌、または増殖に関して大きな差異は観察されなかった。これについての１つの可能な説明は、ＣＤ１２３−ＣＡＲにおいて使用される、ＣＤ１２３特異的ｓｃＦｖの結合親和性が、ナノモル範囲にあり、３倍未満の差違であり、このため、いずれのｓｃＦｖも、抗原への結合の標的化において顕著な利点を付与しないということである［１８］。
【００８３】
[0099]ＡＭＬ細胞上の複数の細胞表面抗原の発現については、十分に記載されている［４、２７、３４］。これらの抗原のうちのいくつかに対する、ＣＡＲを発現させるＴ細胞を介する標的化は、実現可能でない場合がある。例えば、ＡＭＬ関連抗原であるＴＩＭ−３は、消耗したＴ細胞のサブセット上で発現し［３５、３６］ＣＡＲで操作されたＴ細胞を使用して、ＴＩＭ−３を標的化する結果として、遺伝子改変細胞の自己溶解がもたらされる可能性がある。加えて、ＣＤ４７も、遍在的に発現する［３７］ため、ＣＡＲで操作されたＴ細胞により標的化可能となる可能性が低い。ＣＤ３３分化抗原は、主に骨髄系細胞上で発現し、現在、ＣＤ３３／ＣＤ３二特異的なＴ細胞係合抗体であるゲムツズマブオゾガマイシン、およびＣＤ３３  ＣＡＲなど、ＣＤ３３を標的化する免疫療法が、臨床状況および前臨床状況において使用されている［１７、３８、３９］。ＴＩＭ−３と同様に、ＣＤ３３も、Ｔ細胞のサブセット上で発現することから、ＣＡＲベースの治療のための理想的な標的とはならない［４０］。加えて、ＣＤ３３標的化療法の抗白血病活性は、正常な造血幹細胞（ＨＳＣ）の長期にわたる自己再生時における、ＣＤ３３発現の結果である可能性が高い、造血および血球減少の回復の緩徐化［４１］を伴うことが多かった。さらに、肝毒性も、ＣＤ３３標的化処置の一般的な副作用であり、ＣＤ３３＋クッパー細胞の意図されない標的化に起因する可能性がある［４２］。
【００８４】
[00100]ＣＤ１２３の発現は、Ｔ細胞上では見られず、主に骨髄系統の細胞に限定され
［４３］、大部分のＨＳＣ上でも見られない［２７］。まとめると、これらの観察は、ＣＤ１２３を、ＣＡＲに媒介されるＴ細胞療法のための魅力的な標的とした。ＣＤ１２３に特異的な治療剤は、第Ｉ相試験（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ  ＩＤ：ＮＣＴ００４０１７３９およびＮＣＴ００３９７５７９）において好適な安全性プロファイルを表した。残念ながら、これらの治療は、処置された患者の大半において寛解を誘導できなかった。本発明で作製された、ＣＤ１２３−ＣＡＲを発現させるＴ細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、ＣＤ１２３＋細胞株および初代ＡＭＬ試料に対する強力な細胞溶解能を表した。下記で記載される研究は、プアリスクのＡＭＬを有する患者に由来する初代試料が、ＣＤ１２３ＣＡＲ  Ｔ細胞に媒介された細胞傷害作用を受けやすいことを示す。まとめると、短期間の細胞傷害作用アッセイのために使用された初代試料の小規模のコホートでは、診断時において高リスクの特徴を示し、かつ／または化学療法耐性を示したＡＭＬ患者試料は、ＣＤ１２３＋細胞株を使用する実験において観察されたのと同様に、ＣＤ１２３ＣＡＲによる殺滅に対して感受性であった。さらに、これらの結果が大規模な試料コホートについても当てはまることを確認する解析も必要となろう。
【００８５】
[00101]多機能性Ｔ細胞応答は、ウイルス感染の制御と相関し、抗腫瘍ＣＡＲ  Ｔ細胞
応答においても重要でありうる［４４］。実際、ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞療法に対して応答性の患者は、ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて、ＣＤ１９＋標的に応答して、治療後における、検出可能なＴ細胞応答（すなわち、脱顆粒、サイトカインの分泌、または増殖）を示す［１１、１２、１４］。下記の実施例では、ＣＤ１２３＋細胞株および初代ＡＭＬ試料の両方に応答した、ＣＤ１０７ａの上方調節、炎症性サイトカインの産生、およびＣＤ１２３特異的Ｔ細胞の増殖を解析することにより、ＣＤ１２３−ＣＡＲを発現させるＴ細胞の機能性が裏付けられた。さらに、多機能性は、ＣＤ４＋区画およびＣＤ８＋区画のいずれにおいても観察されたが、これは、腫瘍の微小環境内で、持続的な抗白血病活性を促進し、抗白血病活性をブーストする可能性がある［４５、４６］。４−１ＢＢなど、他の共刺激ドメインの組入れ、および分化の程度が小さな「若い」Ｔ細胞の使用はさらに、ＣＤ１２３ＣＡＲ応答を増進する可能性があり、活発な研究領域である［９、４７］。
【００８６】
[00102]さらに、ＣＤ１２３特異的Ｔ細胞は、正常な前駆細胞によるコロニー形成を阻
害しない（Ｅ：Ｔを２５：１としてもなお）。系統−ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞上のＣＤ１２３の発現は、骨髄系共通前駆細胞の顕徴であり、このため、ＣＤ１２３ＣＡＲ  Ｔ細胞の標的である可能性が高い［３１］。ＣＢ細胞を、ＣＤ１２３特異的Ｔ細胞とインキュ
ベートしたところ、骨髄系由来コロニーの相対百分率の減少が観察されたが、対応するＣＤ１９Ｒ  ＣＡＲ  Ｔ細胞より顕著な減少ではなかった。限定された試料サイズは、この結果に起因する可能性があり、さらなる実験により、ＣＤ１２３ＣＡＲ  Ｔ細胞で処置された臍帯血試料中のＣＦＵ−ＧＭ形成の顕著な減少を明らかになる可能性もある。加えて、播種する前の４時間にわたる、Ｔ細胞とＣＢ細胞との共培養は、正常な骨髄系前駆細胞のコロニー形成に対する効果を観察するのに十分に長い時間ではない可能性もあり、インキュベーション時間を長くすると、観察される骨髄系由来コロニーの数が減少する可能性もある。しかし、ＣＢ細胞に使用されたのと同じ方法を使用して、ＣＤ３４に富む初代ＡＭＬ患者試料を、ＣＤ１２３ＣＡＲ  Ｔ細胞とインキュベートしたところ、形成される白血病コロニー数の実質的な減少が観察されたことから、４時間にわたるインキュベーション時間は、白血病コロニー形成と正常コロニー形成との間で効果を観察するのに十分であることが示唆される。代替的に、ＣＢ細胞上のＣＤ１２３の相対発現が、ＡＭＬ細胞と比較して小さいことの部分的な結果として、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、ＣＤ１２３ＣＡＲ  Ｔ細胞に、骨髄系由来コロニーの形成を変化させる能力がない可能性がある。他の研究者らは、ＣＤ１２３が、系統−ＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＨＳＣの小さな画分内だけで発現することを裏付けており、ＣＤ１２３を標的化する薬剤を使用する２つの第Ｉ相試験は、長期の骨髄抑制は見られないことを明らかにしたが、ＣＤ１２３ＣＡＲ  Ｔ細胞療法の、造血に対する効果を査定する、さらなる研究が必要とされている。望ましくないオフターゲット毒性を制御するために、ＥＧＦＲｔをレンチウイルス構築物内に組み入れて、ＣＡＲを発現させるＴ細胞の除去を可能とした。また、ＣＤ１２３を発現させる正常な細胞を死滅させる潜在的可能性を踏まえ、誘導性カスパーゼ９によるアポトーシススイッチ［４８］またはＣＡＲ  ｍＲＮＡの電気穿孔［４９］など、ＣＡＲ  Ｔ細胞活性をモジュレートする他の戦略も、大きな関心の的となっている。
【００８７】
[00103]さらに、活動性疾患を有するＡＭＬ患者に由来する、低温保存されたＰＢＭＣ
を遺伝子改変して、ＣＤ１２３ＣＡＲを発現させ、試料３例中の２例において、自己白血病性芽球に対する強力な細胞溶解活性を示しうることも裏付けられた。ＡＭＬ５５９に由来する、ＣＤ１２３ＣＡＲを発現させるＴ細胞は、低レベルのＣＤ１２３を発現させる自己芽球を溶解させなかったが、これらのＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＣＤ１２３＋ＬＣＬ細胞株およびＣＤ１２３＋ＫＧ１ａ細胞株を溶解させた（データは示さない）ことから、作製されたＴ細胞は、ＣＤ１２３を発現させる標的細胞を標的化する潜在的な可能性を有することが示唆される。本発明者らが知る限りにおいて、これは、ＡＭＬ患者に由来するＴ細胞を、ＣＡＲを発現させ、自己芽球に対する抗原特異的細胞傷害作用のリダイレクトを示すように操作しうることの初めての実証である。
【００８８】
[00104]まとめると、下記の実施例において記載される研究の結果により、ＣＤ１２３
ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＣＤ１２３＋細胞とＣＤ１２３−細胞とを識別することが可能であり、プアリスクの初代ＡＭＬ患者試料のパネルに対して、Ｔ細胞の複数のエフェクター機能を活性化させうることが裏付けられる。ＣＤ１２３特異的Ｔ細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、正常な前駆細胞コロニーの形成をそれほど変化させず、クローン原性骨髄性白血病性前駆細胞の成長を大幅に低減したことは注目に値する。また、ＡＭＬ患者に由来するＴ細胞を遺伝子改変して、ＣＤ１２３特異的ＣＡＲを発現させることが可能であり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、自己芽球を溶解させうることも裏付けられた。したがって、ＣＤ１２３ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＡＭＬの免疫療法のための有望な候補細胞である。
【００８９】
実施例２：ＣＤ１２３ＣＡＲが形質導入されたＴ細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、白血病の進行を遅延させる
[00105]ＣＤ１２３ＣＡＲ構築物：２６２９２ＣＡＲ（Ｓ２２８Ｐ＋Ｌ２３５Ｅ）およ
び３２７１６ＣＡＲ（Ｓ２２８Ｐ＋Ｌ２３５Ｅ）構築物は、上記の実施例１で記載した通りに作製した。また、さらに２つのＣＤ１２３ＣＡＲ構築物であって、各ｓｃＦｖのＩｇ
Ｇ４ヒンジ内の２９７位にさらなる突然変異（Ｎ２９７Ｑ）を組み入れた構築物（「２６２９２ＣＡＲ（Ｓ２２８Ｐ＋Ｌ２３５Ｅ＋Ｎ２９７Ｑ）」および「３２７１６ＣＡＲ（Ｓ２２８Ｐ＋Ｌ２３５Ｅ＋Ｎ２９７Ｑ）」）も作製した（図１２および１３、突然変異を太字とし、下線を付した）。
【００９０】
[00106]ＮＳＧマウスに、ＡＭＬ腫瘍細胞を移植し（０日目）、５日目に、２６２９２
ＣＡＲ（Ｓ２２８Ｐ＋Ｌ２３５Ｅ）または２６２９２ＣＡＲ（Ｓ２２８Ｐ＋Ｌ２３５Ｅ＋Ｎ２９７Ｑ）を発現させる、５．０×１０６個のＣＡＲ＋Ｔ細胞で処置し、生物発光イメージングにより、白血病の進行をモニタリングした。図８において示される通り、８日目において、白血病負荷は、２６２９２ＣＡＲ（Ｓ２２８Ｐ＋Ｌ２３５Ｅ）が形質導入されたＴ細胞で処置する、マウスの処置日と比較して進行したことから、ヒンジ領域の位置Ｓ２２８ＰおよびＬ２３５Ｅにおける突然変異を有する、ＣＤ１２３ＣＡＲ構築物が形質導入された細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、効果を及ぼさなかったことが指し示される。これに対し、２６２９２ＣＡＲ（Ｓ２２８Ｐ＋Ｌ２３５Ｅ＋Ｎ２９７Ｑ）が形質導入されたＴ細胞で処置されたマウスは、処置日と比較した腫瘍サイズの低減を示したことから、ヒンジ領域の２９７位における突然変異（Ｎ２９７Ｑ）の付加は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、白血病の進行を遅延させることが可能なＣＤ１２３ＣＡＲ構築物を結果としてもたらすことが指し示される。
【００９１】
参考文献
以下に列挙する参考文献、特許および公開された特許出願、ならびに上記明細書中に引用された全ての参考文献は、本明細書中に完全に記載されているかのように、それらの全体が参照により本明細書中に組込まれる。
【００９２】
【化１】
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【００９３】
【化２】
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【００９４】
【化３】
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【００９５】
【化４】
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【００９６】
【化５】
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【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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