(57)【要約】      （修正有）【課題】ＡＨＬラクトナーゼ活性の測定方法及び該測定方法を用いた水処理方法を提供する。【解決手段】試料と、下記式（１）で表される化合物とを混合して混合液を得る混合工程と、前記混合液に対して、Ｎ−アシル化ホモセリンラクトン（ＡＨＬ）ラクトナーゼが触媒する酵素反応を行う反応工程と、前記酵素反応後の前記混合液における、前記式（１）で表される化合物由来の前記酵素反応生成物量の指標となる指標値を計測する計測工程とを備えるＡＨＬラクトナーゼ活性測定方法。この結果に基づいて水処理剤の添加量を調整する水処理方法。2020129976.tif 000017（式（１）中、Ｒ１及びＲ２は、各々独立に、水素原子、水酸基、ハロゲン基又は有機基を表し、ｎは１以上の整数を表す。）【選択図】図１
2020129976.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料と、下記式（１）で表される化合物とを混合して混合液を得る混合工程と、
前記混合液に対して、Ｎ−アシル化ホモセリンラクトン（ＡＨＬ）ラクトナーゼが触媒する酵素反応を行う反応工程と、
前記酵素反応後の前記混合液における、前記式（１）で表される化合物由来の前記酵素反応生成物量の指標となる指標値を計測する計測工程と、
を備える、ＡＨＬラクトナーゼ活性測定方法。
【化１】
2020129976.tif 000014
（式（１）中、Ｒ１及びＲ２は、各々独立に、水素原子、水酸基、ハロゲン基又は有機基を表し、ｎは１以上の整数を表す。）
【請求項２】
前記式（１）で表される化合物が、下記式（１Ａ）又は（１Ｂ）で表される化合物である、請求項１に記載のＡＨＬラクトナーゼ活性測定方法。
【化２】
2020129976.tif 000015
（式（１Ａ）中、Ｒ３及びＲ４は、各々独立に、水素原子、水酸基、ハロゲン基又は有機基を表す。）
【化３】
2020129976.tif 000016
（式（１Ｂ）中、Ｒ５及びＲ６は、各々独立に、水素原子、水酸基、ハロゲン基又は有機基を表す。）
【請求項３】
前記指標値が、前記酵素反応前後での前記混合液における前記生成物の吸収波長の吸光度の変化量である、請求項１又は２に記載のＡＨＬラクトナーゼ活性測定方法。
【請求項４】
前記吸収波長が２６０〜３００ｎｍである、請求項３に記載のＡＨＬラクトナーゼ活性測定方法。
【請求項５】
前記混合工程において、トリス塩酸緩衝液を更に混合して前記混合液を得る、請求項１〜４のいずれか一項に記載のＡＨＬラクトナーゼ活性測定方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のＡＨＬラクトナーゼ活性測定方法によって、水系のＡＨＬラクトナーゼ活性を測定する活性測定工程と、
前記水系に、ＡＨＬラクトナーゼ及びＡＨＬ分解菌からなる群より選ばれる少なくとも一種を含む水処理剤を添加する添加工程と、
を備え、
前記添加工程における前記水処理剤の添加量を、前記ＡＨＬラクトナーゼ活性の測定結果に基づいて調整する、水処理方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｎ−アシル化ホモセリンラクトン（Ｎ−アシル−Ｌ−ホモセリンラクトン：ＡＨＬ）ラクトナーゼの活性測定方法と、このＡＨＬラクトナーゼ活性測定方法を用いた水処理方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオフィルムは、細菌が物質固相表面に付着及び増殖して、多糖類などの高分子有機物を生産することにより形成される。バイオフィルムは、膜状の構造体であり、生物膜やスライムとも呼ばれる。
バイオフィルムは、冷却水系などの循環水系において、伝熱効率の低下や配管の目詰まりの要因となることが知られている。また、バイオフィルムは、製紙工程において生産性低下や品質の劣化などの障害（スライム障害）の要因となることが知られ、逆浸透膜（ＲＯ膜）を利用した水処理工程においてＲＯ膜のフラックスの低下の要因となることが知られている。
【０００３】
上記の循環水系、製紙工程、水処理工程など（以下、まとめて「水処理系」という）においてバイオフィルムに起因する上記の各問題を防止するために、様々な処置方法が考案されている。
【０００４】
それら様々な処置方法のうち、最も一般的なものは、殺菌剤や増殖抑制剤を用いて細菌の繁殖を防止する方法である。これら殺菌剤や増殖抑制剤を用いる方法では、従来、塩素、臭素ならびにその派生物、Ｃｌ−ＭＩＴ（５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン）やＤＢＮＰＡ（２，２−ジブロモ−３−ニトリロプロピオンアミド）といった有機抗菌剤、オゾンや過酸化水素などの酸化性の殺菌剤が利用されている。その他、界面活性剤を利用した分散処理や剥離処理も行われており、これらの方法では、アルキルベンゼンスルホン酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテル類、ポリエチレンイミンなどが利用されている。
【０００５】
また近年、細胞間情報伝達物質がバイオフィルム形成のシグナルとして重要な役割を担っていることが明らかになり、細胞間情報伝達物質を分解してバイオフィルムの形成を抑制する技術開発も進んでいる。
細胞間情報伝達物質を分解してバイオフィルムの形成を抑制する技術として、グラム陰性細菌の中で幅広く使われている細胞間情報伝達物質であるＮ−アシル化ホモセリンラクトン（ＡＨＬ）に着目した技術が開示されている。
【０００６】
具体的には、例えば、水処理プロセスにおいて、磁気微粒子に固定化したＡＨＬ分解酵素を用いてバイオフィルムの形成を抑制する方法（Environmental  Science  &  Technology，43巻、7403-7409頁、2009年）が開示されている。また、系内に導入したＡＨＬ分解菌が産生するＡＨＬ分解酵素によりバイオフィルムの形成を低減する技術はすでに実験室レベルで実証されている（特許第５８５０４４１号公報、Environmental  Science  &  Technology，47巻、836‐842頁、2013年）。
【０００７】
ＡＨＬのラクトン環を開裂するＡＨＬラクトナーゼは、ＡＨＬアシラーゼと並ぶ、ＡＨＬ分解酵素のひとつであり、酵素や生産菌の産業利用が期待されている。例えば、本出願人は、先に、ＡＨＬ分解菌を用いた水処理システム（特開２０１８−１４３１０７号公報）や、ＡＨＬラクトナーゼを用いた水処理剤及び水処理方法（特願２０１８−５６７３９）を提案している。
【０００８】
ＡＨＬラクトナーゼを産業用途で利用する上で、ラクトナーゼの量や濃度を定量する必要がある。特にバイオフィルム抑制剤として利用する場合、適切な添加量を決め、正しく添加するために定量方法は必須である。また系内に添加した薬剤の残留を測定することも、効果確認や管理において重要である。あるいは、酵素製剤や、酵素を産生する微生物製剤を製造・販売する際の品質管理においても、酵素量を測定することは必要である。
【０００９】
酵素量の測定には、一般的に酵素活性測定が用いられる。こうした方法としては、ＡＨＬそのものを酵素で直接分解し、残存するＡＨＬ量をＨＰＬＣで測定する方法が報告されている（Infect.Immun.,74巻、1673‐1681、2006年）。しかし、この方法は、残存ＡＨＬの抽出操作やＨＰＬＣ分析に多大な時間と手間を要することから一般的ではない。
【００１０】
より簡易な測定方法として、ＡＨＬ存在下で色素を産生するChromobacterium  violaceum等のレポーター細菌を用いた定量法が報告されている（FEMS  Microbiol.Let.,279巻、124‐130頁、2008年）。ＡＨＬラクトナーゼによりＡＨＬが分解されると色素の生産が低下するので、色素濃度の違いから酵素量を推測することができる。しかし、酵素量と色素濃度には正確な比例関係がなく、レポーター細菌の培養状態によっても色素産生量は異なるので、この方法では正しい定量は難しい。
【００１１】
こうした問題点をふまえて、ＡＨＬラクトナーゼの加水分解で得られたＮ−ａｃｙｌ−Ｌ−ホモセリンをアミノアシラーゼ反応によりＬ−ホモセリンに変換し、さらに銅−カルセイン複合体との反応により形成されるカルセインの蛍光量を測定する方法が、より簡便な手法として報告されている（Appl．Environ．Microbiol.,82巻、4145‐4154頁、2016年）。しかし、ＡＨＬ試薬や酵素は高価であるばかりでなく、市販のアミノアシラーゼには蛍光に影響を与える夾雑物が含まれており、その除去が必要となるため操作が煩雑であり、一般的ではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特許第５８５０４４１号公報
【特許文献２】特開２０１８−１４３１０７号公報
【特許文献３】特願２０１８−５６７３９
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Environmental  Science  &  Technology，43巻、7403-7409頁、2009年
【非特許文献２】Environmental  Science  &  Technology，47巻、836-842頁、2013年
【非特許文献３】Infect.Immun.,74巻、1673‐1681、2006年
【非特許文献４】FEMS  Microbiol.Let.,279巻、124‐130頁、2008年
【非特許文献５】Appl．Environ.,Microbiol.,82巻、4145‐4154頁、2016年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明はこのような事情に鑑みてなされたものであり、上記した従来技術の問題を解決し、より簡便で定量性に優れたＡＨＬラクトナーゼ活性の測定方法と、この測定結果に基づいて、効率的かつ的確な処理を行う水処理方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討を重ね、特定のラクトン系化合物を基質として用い、この基質からＡＨＬラクトナーゼ分解によって生成される分解生成物量を吸光度計等で定量することにより、簡便かつ定量的にＡＨＬラクトナーゼ活性を測定することができることを見出した。
本発明はこのような知見に基づいて達成されたものであり、以下を要旨とする。
【００１６】
［１］  試料と、下記式（１）で表される化合物とを混合して混合液を得る混合工程と、前記混合液に対して、Ｎ−アシル化ホモセリンラクトン（ＡＨＬ）ラクトナーゼが触媒する酵素反応を行う反応工程と、前記酵素反応後の前記混合液における、前記式（１）で表される化合物由来の前記酵素反応生成物量の指標となる指標値を計測する計測工程と、を備える、ＡＨＬラクトナーゼ活性測定方法。
【００１７】
【化１】
2020129976.tif 000003
【００１８】
（式（１）中、Ｒ１及びＲ２は、各々独立に、水素原子、水酸基、ハロゲン基又は有機基を表し、ｎは１以上の整数を表す。）
【００１９】
［２］  前記式（１）で表される化合物が、下記式（１Ａ）又は（１Ｂ）で表される化合物である、［１］に記載のＡＨＬラクトナーゼ活性測定方法。
【００２０】
【化２】
2020129976.tif 000004
【００２１】
（式（１Ａ）中、Ｒ３及びＲ４は、各々独立に、水素原子、水酸基、ハロゲン基又は有機基を表す。）
【００２２】
【化３】
2020129976.tif 000005
【００２３】
（式（１Ｂ）中、Ｒ５及びＲ６は、各々独立に、水素原子、水酸基、ハロゲン基又は有機基を表す。）
【００２４】
［３］  前記指標値が、前記酵素反応前後での前記混合液における前記生成物の吸収波長の吸光度の変化量である、［１］又は［２］に記載のＡＨＬラクトナーゼ活性測定方法。
【００２５】
［４］  前記吸収波長が２６０〜３００ｎｍである、［３］に記載のＡＨＬラクトナーゼ活性測定方法。
【００２６】
［５］  前記混合工程において、トリス塩酸緩衝液を更に混合して前記混合液を得る、［１］〜［４］のいずれかに記載のＡＨＬラクトナーゼ活性測定方法。
【００２７】
［６］  ［１］〜［５］のいずれかに記載のＡＨＬラクトナーゼ活性測定方法によって、水系のＡＨＬラクトナーゼ活性を測定する活性測定工程と、前記水系に、ＡＨＬラクトナーゼ及びＡＨＬ分解菌からなる群より選ばれる少なくとも一種を含む水処理剤を添加する添加工程と、を備え、前記添加工程における前記水処理剤の添加量を、前記ＡＨＬラクトナーゼ活性の測定結果に基づいて調整する、水処理方法。
【発明の効果】
【００２８】
本発明のＡＨＬラクトナーゼ活性測定方法によれば、ＡＨＬラクトナーゼ活性を、ＡＨＬの代替基質を用いて簡便かつ精度よく定量的に測定することができる。また、ＡＨＬよりも安価な代替基質を用いる場合には、ＡＨＬラクトナーゼ活性をより安価に測定することもできる。
さらに、本発明の水処理方法によれば、この測定結果に基づいて、水系へのＡＨＬラクトナーゼ及び／又はＡＨＬ分解菌よりなる水処理剤の添加量を的確に調整して効率的な水処理を行える。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】実施例１で求めたＡＨＬラクトナーゼ濃度と吸光度差（Δ２７０ｎｍ）との関係を示すグラフである。
【図２】実施例２で求めたＡＨＬラクトナーゼ濃度と吸光度差（Δ２７０ｎｍ）との関係を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
以下に本発明の実施の形態を詳細に説明する。
【００３１】
［ＡＨＬラクトナーゼ活性測定方法］
本発明のＡＨＬラクトナーゼ活性測定方法は、試料と、下記式（１）で表される化合物（以下、「化合物（１）」と称す。）とを混合して混合液を得る混合工程と、前記混合液に対して、Ｎ−アシル化ホモセリンラクトン（ＡＨＬ）ラクトナーゼが触媒する酵素反応を行う反応工程と、前記酵素反応後の前記混合液における、前記化合物（１）由来の前記酵素反応生成物量の指標となる指標値を計測する計測工程とを備える。
【００３２】
【化４】
2020129976.tif 000006
【００３３】
式（１）中、Ｒ１及びＲ２は、各々独立に、水素原子、水酸基、ハロゲン基又は有機基を表し、ｎは１以上の整数を表す。
【００３４】
ここで、試料とは、ＡＨＬラクトナーゼ活性を測定すべき、酵素液、水処理すべき水系の水、ＡＨＬ分解菌を含有する微生物製剤等である。
【００３５】
＜メカニズム＞
本発明において、基質として用いる上記化合物（１）は、ＡＨＬラクトナーゼの触媒作用による加水分解反応でラクトン環が開環し、酵素反応生成物として有機物を生成する。
例えば、３，４−ジヒドロクマリンは、ＡＨＬラクトナーゼの触媒作用による加水分解反応で、下記反応式に示すようにラクトン環が開環し、酵素反応生成物として３−（２−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸を生じる。この酵素分解で生成する有機酸の量から試料のＡＨＬラクトナーゼ活性を求めることができる。
【００３６】
【化５】
2020129976.tif 000007
【００３７】
本発明における指標値は、酵素反応生成物の生成量に基づく指標であってもよく、基質の減少量に基づく指標であってもよい。
【００３８】
＜基質＞
本発明において、基質として用いる化合物（１）は、前記式（１）で表されるラクトン系化合物である。
式（１）において、Ｒ１，Ｒ２は、各々独立に、水素原子、水酸基、ハロゲン基又は有機基を表す。本発明で言う有機基とは炭酸原子を含む基を言い、具体的には、置換基を有していてもよいアルキル基、カルボキシ基、置換基を有していてもよいアルコキシカルボニル基等が挙げられる。
【００３９】
入手の容易性の観点からＲ１，Ｒ２は各々独立に水素原子、水酸基、炭素数１〜３のアルキル基であることが好ましい。
【００４０】
また、式（１）において、ｎは１以上の整数であるが、入手の容易性の観点から、１又は２であることが好ましい。
【００４１】
本発明において、基質として用いる化合物（１）としては、特に、下記式（１Ａ）で表されるジヒドロクマリン系化合物又は（１Ｂ）で表されるクマラノン系化合物が好ましい。
【００４２】
【化６】
2020129976.tif 000008
【００４３】
式（１Ａ）中、Ｒ３及びＲ４は、各々独立に、水素原子、水酸基、ハロゲン基又は有機基を表す。
ここで、有機基は、例えば、置換基を有していてもよいアルキル基、カルボキシ基、置換基を有していてもよいアルコキシカルボニル基等であってよい。
入手の容易性の観点からＲ３，Ｒ４は各々独立に水素原子、水酸基、炭素数１〜３のアルキル基であることが好ましい。
【００４４】
【化７】
2020129976.tif 000009
【００４５】
式（１Ｂ）中、Ｒ５及びＲ６は、各々独立に、水素原子、水酸基、ハロゲン基又は有機基を表す。
ここで、有機基は、例えば、置換基を有していてもよいアルキル基、カルボキシ基、置換基を有していてもよいアルコキシカルボニル基等であってよい。
入手の容易性の観点からＲ５，Ｒ６は各々独立に水素原子、水酸基、炭素数１〜３のアルキル基であることが好ましい。
【００４６】
これらの化合物のうち、特に３，４−ジヒドロクマリン、２−クマラノン、５−ヒドロキシ−２−クマラノン等は市販品を用いることができる。
【００４７】
酵素反応時の基質濃度は特に制限されるものではないが、０．５ｍＭ〜５ｍＭの終濃度で行うことが望ましい。
【００４８】
＜反応ｐＨ＞
本発明における反応ｐＨ（酵素反応を行う混合液のｐＨ）は、ＡＨＬラクトナーゼの作用最適ｐＨで試験することが望ましく、一概には限定されないが、アルカリ域のｐＨでは、基質である化合物（１）の自己分解が進むため、反応ｐＨはおおむね４〜８、特に６〜７．５の範囲とすることが好ましい。
【００４９】
また、上記の反応ｐＨを一定とするために緩衝液を添加することが好ましい。緩衝液としては、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、ピペス緩衝液などを利用することができるが、トリス緩衝液（具体的にはトリス塩酸緩衝液）を用いると感度を高め、微量のＡＨＬ分解活性を評価することができることから、好ましい。
【００５０】
＜酵素反応条件＞
本発明における酵素反応温度は、ＡＨＬラクトナーゼの作用最適温度付近で試験することが望ましく、一概には限定されないが、一般には３０℃〜４０℃の範囲で実施する。
反応時間も特に制限されるものではないが、通常５分〜３０分程度が適切である。
【００５１】
＜ＡＨＬラクトナーゼ活性の指標値＞
本発明において、ＡＨＬラクトナーゼ活性は、基質として用いる化合物（１）由来のＡＨＬラクトナーゼに触媒された酵素反応の生成物の量を定量することで求められる。
ここで、酵素反応生成物は、前述の通り、化合物（１）の加水分解で生成する有機酸であり、この有機酸の生成量は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等による分析、或いは、酸生成によるｐＨの低下を指標として定量することも可能であるが、ベンゼン環構造を有する有機酸の吸収極大波長（最大吸収波長）である波長２６０〜３００ｎｍ、特に２７０〜３００ｎｍの吸光度を測定することがより簡便かつ的確であり、好ましい。
【００５２】
即ち、酵素反応前後での上記好適波長における吸光度の変化量（吸光度差）から、酵素反応生成物の生成量を求めることができる。この場合、酵素反応前の吸光度は、酵素反応を行う反応液と同様にして調製した未反応の反応液（混合工程の混合液）を用意して、この未反応の反応液について測定することにより、酵素反応前の吸光度とすることができる。また、酵素反応前の吸光度は、ＡＨＬラクトナーゼを添加して反応液を調製する場合は、ＡＨＬラクトナーゼを添加していないこと以外は同様にして調製した反応液（混合工程の混合液）について測定することにより、酵素反応前の吸光度としてもよい。
【００５３】
ＡＨＬラクトナーゼ活性は、予め作成した検量線に、測定、算出された吸光度差を当てはめて求めることができる。また、吸光度差から、ＡＨＬラクトナーゼ活性の程度を評価することもできる。
【００５４】
なお、前述の通り、本発明における指標値は、酵素反応生成物の生成量に基づく指標であってもよく、基質の減少量に基づく指標であってもよい。
また、上記の吸光度等の測定に当たり、酵素活性阻害剤等を含む反応停止剤を添加して酵素の活性を止めたのちに、上記の測定を行うこともできる。この場合、反応停止剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、塩酸グアニジン、エチルアルコール等を用いることができる。
【００５５】
［水処理方法］
本発明の水処理方法は、上記の本発明のＡＨＬラクトナーゼ活性測定方法により、水系のＡＨＬラクトナーゼ活性を測定する活性測定工程と、ＡＨＬラクトナーゼ活性を測定した水系に、ＡＨＬラクトナーゼ及びＡＨＬ分解菌からなる群より選ばれる少なくとも一種を含む水処理剤を添加する添加工程とを備え、この添加工程における水処理剤の添加量を、ＡＨＬラクトナーゼ活性の測定結果に基づいて調整することを特徴とするものであり、ＡＨＬラクトナーゼ活性の測定結果に基づいて水処理剤の添加量を制御することにより、水処理剤の過不足を防止して効率的かつ的確な水処理を行える。
【００５６】
ここで、ＡＨＬラクトナーゼ及び／又はＡＨＬ分解菌を含む水処理剤としては特に制限はないが、前述の特開２０１８−１４３１０７号公報や特願２０１８−５６７３９で提案されているものを用いることができる。
【００５７】
本発明の水処理方法は、例えば、冷却水系などの循環水系、或いは製紙工程、或いは逆浸透膜（ＲＯ膜）を利用した水処理水系等、各種の水系におけるバイオフィルムの形成を抑制する水処理方法として好適に用いられる。
【実施例】
【００５８】
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はその要旨を超えない限り、以下の実施例に限定されるものではない。
【００５９】
［基質］
以下の実施例及び比較例で基質として用いた化合物の構造式を以下に示す。
【００６０】
【化８】
2020129976.tif 000010
【００６１】
［ＡＨＬ分解酵素の調製］
以下の実施例及び比較例で用いたＡＨＬラクトナーゼは、公知の方法（J  Biosci  Bioeng．2018  Oct31．pii：S1389-1723(18)30610-8．doi：10．1016/j．jbiosc．2018．10．005.）に従い、Ｓｐｈｉｎｇｏｐｙｘｉｓ  ｓｐ．ＥＧ６株由来のＡＨＬラクトナーゼ遺伝子を保持する、大腸菌ＤＨ５α（ｐＱＳＤ−ＥＧ６Ｈ）株のライセートより、ＨｉｓＴＲａｐアフィニティクロマトグラフィー（ＧＥヘルスケア社）を用いて精製することで調製した。
【００６２】
［実施例１］
ＡＨＬラクトナーゼは、２０ｎｇ−protein／ｍｌ〜１０μｇ−protein／ｍｌとなるように純水に溶解したのち適宜希釈した。尚、蛋白質の濃度はＴａＫａＲａ  ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社製）を用いて測定し、牛血清アルブミン換算で表した。
予め３０℃に保温しておいた１００ｍｌの５０ｍＭ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）に、１ｍｌの１００ｍＭ  ３，４−ジヒドロクマリン／メタノール溶液を加え良く混合したのち（基質濃度１ｍＭ）、その１ｍｌを試験管に分注した。３０℃のウォーターバスで試験管を１分間保温したのち、表１のＡＨＬラクトナーゼ濃度となるように、０．０５ｍｌのＡＨＬラクトナーゼ水溶液を添加し１０分間反応させた。ここへ、１ｍｌの５％ＳＤＳ水溶液を添加して酵素反応を停止したのち、吸光度計で波長２７０ｎｍの吸光度を測定した。
ブランク試験として、ＡＨＬラクトナーゼ水溶液の代わりに水を用いたこと以外は上記と同様に行ったときの波長２７０ｎｍの吸光度も測定し、その差（Δ２７０ｎｍ）を求めた。
表１及び図１にＡＨＬラクトナーゼ濃度とΔ２７０ｎｍの値を示す。
表１及び図１よりＡＨＬラクトナーゼ濃度の増大とともにΔ２７０ｎｍの上昇が観察され、その値も安定しており、ＡＨＬラクトナーゼ活性の定量が可能であることがわかる。
【００６３】
【表１】
2020129976.tif 000011
【００６４】
［実施例２］
実施例１において、ＡＨＬラクトナーゼの濃度を表２の通り変えると共に、緩衝液として５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）又は５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）を用いて同様に試験を行った。
その結果、表２及び図２に示す通り、リン酸ナトリウム緩衝液を用いた場合はΔ２７０ｎｍの値は、トリス塩酸緩衝液を用いた時と比較して１／１０以下であった。
この結果から、緩衝液としては、リン酸ナトリウム緩衝液よりもトリス緩衝液を用いた方が酵素反応を鋭敏に検知することが可能であることが分かる。
【００６５】
【表２】
2020129976.tif 000012
【００６６】
［実施例３，４、比較例１，２］
実施例１において３，４−ジヒドロクマリン（実施例１）の代わりに、２−クマラノン（実施例３）、５−ヒドロキシ−２−クマラノン（実施例４）、１−イソクロマノン（比較例１）又は３−イソクロマノン（比較例２）を用いて同様にＡＨＬラクトナーゼ活性を測定した。ＡＨＬラクトナーゼ濃度を１００ｎｇ／ｍｌとした場合のそれぞれのΔ２７０ｎｍを測定した。
実施例４では、Δ２７０ｎｍと同様にして波長２９０ｎｍにおける吸光度差（Δ２９０ｎｍ）も測定した。
これらの結果を表３に示す。なお、表３において、「｜Δ２７０ｎｍ｜＜０．０１」は、Δ２７０ｎｍの絶対値が０．０１よりも小さいことを表す。
【００６７】
【表３】
2020129976.tif 000013
【００６８】
表３より、５−ヒドロキシ−２−クマラノン以外の化合物（１）である基質を用いた場合、波長２７０ｎｍにおける吸光度の増大が観察され、ＡＨＬラクトナーゼ活性の測定用基質として利用できることがわかった。
５−ヒドロキシ−２−クマラノン（ホモゲンチジン酸ラクトン）については、波長２７０ｎｍにおける吸光度は減少したが、波長２９０ｎｍにおける吸光度の増大が観察された。ホモゲンチジン酸の吸収極大は２９０ｎｍであり、基質の分解によって２７０ｎｍの吸光度が低下し、２９０ｎｍの吸光度が増大したと考えられる。
これに対して、化合物（１）ではない１−イソクロマノン又は３−イソクロマノンを用いた場合は、吸光度の変化は小さく、ＡＨＬラクトナーゼ活性を求めることはできない。これらのイソクロマノンは、ＡＨＬラクトナーゼが触媒する酵素反応で分解され難く、基質として適していないと考えられる。
【図１】
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【図２】
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