(57)【要約】【課題】正確で簡易なプロテオグリカンの分析方法を提供する。【解決手段】１）強塩基性陰イオン交換樹脂にプロテオグリカンを含有する溶液を通液させる工程、２）次に、強塩基性陰イオン交換樹脂の容積の２倍量以上の０．８Ｍ未満の塩素イオンを含む中性の塩イオン溶液を通液させる工程、３）次に、強塩基性陰イオン交換樹脂の容積の２倍量以上の０．８Ｍ以上の塩素イオンを含む中性の塩イオン溶液を通液させ、強塩基性陰イオン交換樹脂の出口からの通液を約２５０ｎｍ〜約２９０ｎｍの波長の吸光度を検出する工程。【選択図】図１
2020134435.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程によりプロテオグリカンを分析する方法。
１）強塩基性陰イオン交換樹脂にプロテオグリカンを含有する溶液を通液させる工程
２）次に、強塩基性陰イオン交換樹脂の容積の２倍量以上の０．８Ｍ未満の塩素イオンを含む中性の塩イオン溶液を通液させる工程
３）次に、強塩基性陰イオン交換樹脂の容積の２倍量以上の０．８Ｍ以上の塩素イオンを含む中性の塩イオン溶液を通液させ、強塩基性陰イオン交換樹脂の出口からの通液を約２５０ｎｍ〜約２９０ｎｍの波長の吸光度を検出する工程
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロテオグリカンの分析方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
プロテオグリカンは、保水性、細胞増殖因子様作用、ヒアルロン酸産生作用、抗アレルギー作用など様々な機能を有することが明らかになってきている。そのため、いろいろな製品にプロテオグリカンが使われてきており、プロテオグリカンについて、純度や量、夾雑タンパク質の混入を把握しておく必要がある。また、プロテオグリカンを含む食品や化粧品などのプロテオグリカンの量を分析する方法を用意しておくことも重要である。
【０００３】
プロテオグリカンの分析法として、サイズ排除クロマトグラフィーを用いたＨＰＬＣを用いる方法があるが（特許文献１）、分子量が数万〜数十万のプロテオグリカンに多糖やタンパク質が混入したとき、プロテオグリカンのみを明確に分離することは困難であり、定量性に欠ける問題があった。また、プロテオグリカンの抗体で定量する方法もあるが（特許文献２）、費用が高く、プロテオグリカンに混入している不純物のタンパク質の問題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１８−１５１２０７号  公報
【特許文献２】特表２０１６−５１５８２５号  公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記課題に鑑み、本発明は、プロテオグリカンの新規の分析法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を達成するために、以下の方法がプロテオグリカンの分析に優れた方法であることを見出した。それは、最初に、強塩基性陰イオン交換樹脂にプロテオグリカンを含有する溶液を通液させ、次に、強塩基性陰イオン交換樹脂の容積の２倍量以上の０．８Ｍ未満濃度の食塩溶液を通液させ、次に、強塩基性陰イオン交換樹脂の容積の２倍量以上の０．８Ｍ未満濃度の食塩溶液を通液させ、強塩基性陰イオン交換樹脂の出口からの通液を約２５０ｎｍ〜約２９０ｎｍの波長の吸光度を検出する、方法である。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、プロテオグリカンの純度や量を正確かつ簡易に分析することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】実施例１のプロテオグリカンの分析に係り、強塩基性陰イオン交換樹脂を０．５Ｍの塩化ナトリウムで通液させたときの高速液体クロマトグラフである。
【図２】実施例１のプロテオグリカンの分析に係り、強塩基性陰イオン交換樹脂を０．６Ｍの塩化ナトリウムで通液させたときの高速液体クロマトグラムである。
【図３】実施例１のプロテオグリカンの分析に係り、強塩基性陰イオン交換樹脂を０．７Ｍの塩化ナトリウムで通液させたときの高速液体クロマトグラムである。
【図４】実施例１のプロテオグリカンの分析に係り、強塩基性陰イオン交換樹脂を０．８Ｍの塩化ナトリウムで通液させたときの高速液体クロマトグラムである。
【図５】実施例２のプロテオグリカンの分析に係り、検出波長２５０ｎｍでの高速液体クロマトグラムである。
【図６】実施例２のプロテオグリカンの分析に係り、検出波長２６０ｎｍでの高速液体クロマトグラムである。
【図７】実施例２のプロテオグリカンの分析に係り、検出波長２７０ｎｍでの高速液体クロマトグラムである。
【図８】実施例２のプロテオグリカンの分析に係り、検出波長２８０ｎｍでの高速液体クロマトグラムである。
【図９】実施例２のプロテオグリカンの分析に係り、検出波長２９０ｎｍでの高速液体クロマトグラムである。
【図１０】実施例２のプロテオグリカンの分析に係り、検出波長３００ｎｍでの高速液体クロマトグラフである。
【図１１】実施例３のプロテオグリカンの分析に係り、高速液体クロマトグラフィーのプロテオグリカンのピーク面積とプロテオグリカンの量の相関を示した図である。
【図１２】実施例４のしじみエキス中のプロテオグリカンの分析に係る高速液体クロマトグラムである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、実施の形態をより具体的に説明する。
【００１０】
本発明はプロテオグリカンを水に溶解させ、分析するものである。プロテオグリカンは糖タンパク質の一種であるが、本発明でいうプロテオグリカンは、動物や魚類に存在し、タンパク質にコンドロイチン硫酸やケラタン硫酸などのグルコサミノグルカンが共有結合したものであり、分子量数万から数百万の天然高分子化合物である。起源となる生物や抽出・製造条件により、分子量や含まれる糖（ウロン酸、アミノ糖、中性糖など）、アミノ酸の種類や量、比率も異なっているが、本発明でいうプロテオグリカンは、起源となる生物や抽出・製造条件を問わない。本発明でいう強塩基性イオン交換樹脂は、担体に四級アンモニウム基のイオン交換基が導入された水不溶性の高分子樹脂である。担体としてはスチレン系やフェノール系、ビニル系、アクリルアミド系などの合成樹脂やセルロース系、アガロース系、デキストラン系などがある。樹脂の粒径は数十μｍ〜数百μｍで、粒径は均一な方がよい。また、プロテオグリカンの吸着量は数ｍｇで十分であり、樹脂の容量が多いほど分析時間が長くなる。イオン型は塩素イオン型とし、樹脂を使用する前には、常法により酸やアルカリなどで予備洗浄し、塩素イオン型に活性化する必要がある。本発明でいう塩素イオンを含む中性の塩イオンは、水に溶解したときｐＨが７前後の中性である塩で、具体的には塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化リチウム、塩化セシウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、塩化バリウムなどがある。
【００１１】
最初の強塩基性陰イオン交換樹脂に試料としてのプロテオグリカンを含有する溶液を通液させる工程で、試料のイオン性化合物を除去もしくは、イオン強度を低くする必要がある。除去の方法としては、限外ろ過や透析、プロテオグリカンの有機溶剤沈殿処理などがある。また、試料の量が多いときは、ｐＨを中性に調整する必要がある。試料によっては除タンパク質処理が必要である。除タンパク質の方法としては、硫酸アンモニウムなどの塩析処理、トリクロロ酢酸などの酸性沈殿処理、限外ろ過膜処理などがある。限外ろ過膜処理にあたっては、プロテオグリカンが通過しない分子量の膜を使用する必要がある。強塩基性陰イオン交換樹脂にプロテオグリカンを含有する溶液を通液させる工程で、プロテオグリカンを強塩基性陰イオン交換樹脂に吸着させた後、強塩基性陰イオン交換樹脂の容積の２倍量以上の０．８Ｍ未満の塩素イオンを含む中性の塩イオン溶液を通液させ、強塩基性陰イオン交換樹脂に残った化合物や樹脂に吸着しているプロテオグリカン以外の化合物を強塩基性陰イオン交換樹脂から溶離させる。最後に、強塩基性陰イオン交換樹脂の容積の２倍量以上の０．８Ｍ以上の塩素イオンを含む中性の塩イオン溶液を通液させ、溶離されたプロテオグリカンを約２５０ｎｍ〜約２９０ｎｍの波長の吸光度で検出する。このとき０．８Ｍ以上の濃度になるように、０．８Ｍ以下の濃度から１．５Ｍや２Ｍまでの濃度勾配溶出法で通液させてもよい。
【００１２】
定量は常法により、予めプロテオグリカンの標品を量が異なる数個を上記方法で実施し、約２５０ｎｍ〜約２９０ｎｍの波長の吸光度で得られたピークの面積や高さとプロテオグリカン量の相関式を作成し、その相関式から試料中のプロテオグリカン量を求める。
【００１３】
本方法は、塩素イオンを含む中性の塩イオン溶液を流すのに定量送液を必要とする。更にいうと、強塩基性陰イオン交換樹脂の製造元が勧める流速を流せるポンプが好ましい。約２５０ｎｍ〜約２９０ｎｍの波長のＵＶ吸光度で検出するためには、フローセルなどが用いられる。検出部の容量が少ないほど、検出感度は高い。本方法は、一般的に高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に代表される中高圧クロマトグラフィーで用いることができる。
【００１４】
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、これは単に例示の目的で述べるものであり、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００１５】
（プロテオグリカンの調製）
プロテオグリカンは、特開２００２−６９０９７号に記載の方法により調製した。鮭１匹の頭の皮を剥ぎ、鼻軟骨を取り出し、４．５％酢酸溶液１Ｌに３日間浸漬した。酢酸溶液を珪藻土ろ過し、このろ液を分子量１０万の限外ろ過膜を装着したかく拌式セル（アミコン社）に入れ、１０ｍＬまで濃縮した。次に水を４０ｍＬ加え、約１０ｍＬまで濃縮した。この操作を２回繰り返した。溶液量の５倍量の含塩化ナトリウムエタノールを加え、遠心し、プロテオグリカンを含む沈殿を得た。この沈殿をアセトンとエタノールで洗浄し、プロテオグリカンを調製した。このプロテオグリカンをガラス製デシケータに入れ、真空ポンプを用いて減圧乾燥した。
【００１６】
（塩素イオン濃度の検討）
上記で調製したプロテオグリカンを０．１重量％になるように水で溶解し、０．４５μｍのメンブレンフィルターでろ過した。ろ過溶液５０μＬを下記の高速液体クロマトグラフに注入した。強塩基性陰イオン交換樹脂はガラスカラムに充填したＳｕｐｅｒＱ−ＴＯＹＯＰＥＲＬＰＡＫ６５０Ｓ（商品名、内径８．０ｍｍ×高さ７５ｍｍ、東ソー株式会社）を用いて、ポンプはＬ-７１００Ｓ（日立製作所株式会社）、吸光度検出器はＬ-４２００（日立製作所株式会社）、フローセルは２ｍｍ、データ処理装置はＤ-２５００（日立製作所株式会社）で、流速１ｍＬ／分、検出波長２７０ｎｍ、温度は室温。塩素イオンを含む中性の塩イオン溶液として塩化ナトリウムを用い、濃度０．５Ｍ、０．６Ｍ、０．７Ｍ、０．８Ｍで８分間流し、次に２０分後に１．５Ｍになるように濃度勾配で１２分間流した。
【００１７】
図１は、塩化ナトリウム０．５Ｍのときのプロテオグリカンの高速液体クロマトグラムである。横軸は時間（分）、縦軸は吸光度を示す。プロテオグリカンのピークは１６．８分である。図２は、塩化ナトリウム０．６Ｍのときのプロテオグリカンの高速液体クロマトグラムである。横軸は時間（分）、縦軸は吸光度を示す。プロテオグリカンのピークは１５．８分である。図３は、塩化ナトリウム０．７Ｍのときのプロテオグリカンの高速液体クロマトグラムである。横軸は時間（分）、縦軸は吸光度を示す。プロテオグリカンのピークは１４．５分である。図４は、塩化ナトリウム０．８Ｍのときのプロテオグリカンの高速液体クロマトグラムである。横軸は時間（分）、縦軸は吸光度を示す。プロテオグリカンはイオン交換樹脂に吸着することなくほぼ素通りであり、プロテオグリカンの分析のための食塩濃度の条件としては不適である。
【実施例２】
【００１８】
（検出波長の検討）
実施例１で調製したプロテオグリカンを０．１重量％になるように水で溶解し、０．４５μｍのメンブレンフィルターでろ過した。ろ過溶液５０μＬを下記の高速液体クロマトグラフに注入した。強塩基性陰イオン交換樹脂はガラスカラムに充填したＳｕｐｅｒＱ−ＴＯＹＯＰＥＲＬＰＡＫ６５０Ｓ（商品名、内径８．０ｍｍ×高さ７５ｍｍ、東ソー株式会社）を用いて、ポンプはＬ-７１００Ｓ（日立製作所株式会社）、吸光度検出器はＬ-４２００（日立製作所株式会社）、フローセルは２ｍｍ、データ処理装置はＤ-２５００（日立製作所株式会社）で、流速１ｍＬ／分、温度は室温。塩素イオンを含む中性の塩イオン溶液として塩化ナトリウムを用い、０．５Ｍで最初８分間流し、次に２０分後に１．５Ｍになるように濃度勾配で１２分間流した。検出波長は、２５０ｎｍ、２６０ｎｍ、２７０ｎｍ、２８０ｎｍ、２９０ｎｍ、３００ｎｍで行った。
【００１９】
図５は、検出波長が２５０ｎｍのときのプロテオグリカンの高速液体クロマトグラムである。横軸は時間（分）、縦軸は吸光度を示す。プロテオグリカンのピークは１６．８分である。このときのピーク面積は２，８０８であった。図６は、検出波長が２６０ｎｍのときのプロテオグリカンの高速液体クロマトグラムである。横軸は時間（分）、縦軸は吸光度を示す。プロテオグリカンのピークは１６．８分で、このときのピーク面積は２，０９４であった。図７は、検出波長が２７０ｎｍのときのプロテオグリカンの高速液体クロマトグラムである。横軸は時間（分）、縦軸は吸光度を示す。プロテオグリカンのピークは１６．８分で、このときのピーク面積は２，７０６であった。図８は、検出波長が２８０ｎｍのときのプロテオグリカンの高速液体クロマトグラムである。横軸は時間（分）、縦軸は吸光度を示す。プロテオグリカンのピークは１６．８分で、このときのピーク面積は２，４２２であった。図９は、検出波長が２９０ｎｍのときのプロテオグリカンの高速液体クロマトグラムである。横軸は時間（分）、縦軸は吸光度を示す。プロテオグリカンのピークは１６．８分で、このときのピーク面積は４１２であった。図１０は、検出波長が３００ｎｍのときのプロテオグリカンの高速液体クロマトグラムである。横軸は時間（分）、縦軸は吸光度を示す。プロテオグリカンのピークは小さく、プロテオグリカンの分析のための測定波長条件としては不適である。
【実施例３】
【００２０】
（プロテオグリカンの定量のための相関式）
市販のプロテオグリカン（株式会社角弘プロテオグリカン研究所）を０．１重量％になるように水で溶解し、０．４５μｍのメンブレンフィルターでろ過した。ろ過溶液１０μＬ（＝プロテオグリカン量１０μｇ）、２０μＬ（＝プロテオグリカン量２０μｇ）、４０μＬ（＝プロテオグリカン量４０μｇ）、６０μＬ（＝プロテオグリカン量６０μｇ）、８０μＬ（＝プロテオグリカン量８０μｇ）、１００μＬ（＝プロテオグリカン量１００μｇ）を下記の高速液体クロマトグラフに注入した。強塩基性陰イオン交換樹脂はガラスカラムに充填したＳｕｐｅｒＱ−ＴＯＹＯＰＥＲＬＰＡＫ６５０Ｓ（商品名、内径８．０ｍｍ×高さ７５ｍｍ、東ソー株式会社）を用いて、ポンプはＬ-７１００Ｓ（日立製作所株式会社）、吸光度検出器はＬ-４２００（日立製作所株式会社）、フローセルは２ｍｍ、データ処理装置はＤ-２５００（日立製作所株式会社）で、流速１ｍＬ／分、検出波長２７０ｎｍ、温度は室温。塩素イオンを含む中性の塩イオン溶液として、塩化ナトリウムを用い、０．５Ｍで最初８分間流し、次に２０分後に１．５Ｍになるように濃度勾配で１２分間流し、１８分のピーク面積と注入量の関係を求めた。
【００２１】
図１１は、プロテオグリカンの注入量と面積の関係をグラフで示したものであり、横軸は注入量、縦軸は面積を示す。相関係数は最小二乗法で計算し、一次相関式として、面積＝注入量（μｇ）×１００．１４−３２７．３３、相関係数Ｒ２＝０．９８９４が得られた。
【実施例４】
【００２２】
（食品中のプロテオグリカンの分析）
市販のしじみエキスドリンク（商品名：肝助、株式会社しじみちゃん本舗）１００ｍＬに市販のプロテオグリカン（株式会社角弘プロテオグリカン研究所）１０ｍｇを加え、溶解した。この溶液５０ｍＬをろ紙を用いてろ過し、ろ液を分子量１０万の限外ろ過膜を装着した５０ｍＬ容量のかく拌式セル（アミコン社）に入れ、約１０ｍＬまで濃縮した。次に水を４０ｍＬ加え、５ｍＬ以下に濃縮し、水で５ｍＬにメスフラスコで定容した。
【００２３】
上記定容した溶液を０．４５μｍのメンブレンフィルターでろ過した。ろ過溶液５０μＬを下記の高速液体クロマトグラフィーに注入し、プロテオグリカンの分析を行った。強塩基性陰イオン交換樹脂はガラスカラムに充填したＳｕｐｅｒＱ−ＴＯＹＯＰＥＲＬＰＡＫ６５０Ｓ（商品名、内径８．０ｍｍ×高さ７５ｍｍ、東ソー株式会社）を用いて、ポンプはＬ-７１００Ｓ（日立製作所株式会社）、吸光度検出器はＬ-４２００（日立製作所株式会社）、フローセルは２ｍｍ、データ処理装置はＤ-２５００（日立製作所株式会社）で、流速１ｍＬ／分、検出波長２７０ｎｍ、温度は室温。塩素イオンを含む中性の塩イオン溶液として、塩化ナトリウムを用い、０．５Ｍで最初８分間流し、次に２０分後に１．５Ｍになるように濃度勾配で１２分間流し、その後８分間１．５Ｍで流した。分析は３回行い、ピーク面積の平均値を求め、実施例４の一次相関式からプロテオグリカンの量を算出した。
【００２４】
図１２は、プロテオグリカンを添加したしじみエキスの高速液体クロマトグラムであり、横軸は時間（分）、縦軸は吸光度を示す。プロテオグリカンのピーク面積からプロテオグリカンの量を求めたところ、プロテオグリカンの注入量は４９．７μｇと計算された。しじみエキスドリンク１００ｍＬに加えたプロテオグリカンの量は１０ｍｇで、ドリンク５０ｍＬ（プロテオグリカン５ｍｇ含有）を１０倍に濃縮し、そのうち５０μＬ（プロテオグリカン５０μｇ含有）を分析に供したことから、回収率は９９．４％であった。
【産業上の利用可能性】
【００２５】
本発明によりプロテオグリカンの正確かつ簡易な分析方法が提供されることにより、化学分野や食品産業、化粧品産業に広く利用されることが可能となる。
【図１】
2020134435.tif 000003
【図２】
2020134435.tif 000004
【図３】
2020134435.tif 000005
【図４】
2020134435.tif 000006
【図５】
2020134435.tif 000007
【図６】
2020134435.tif 000008
【図７】
2020134435.tif 000009
【図８】
2020134435.tif 000010
【図９】
2020134435.tif 000011
【図１０】
2020134435.tif 000012
【図１１】
2020134435.tif 000013
【図１２】
2020134435.tif 000014