(57)【要約】      （修正有）【課題】簡易な構成で高速に二光子励起に基づく光音響信号を検出する観察装置を提供する。【解決手段】観察装置５０は、光Ｌを発生するパルスレーザー１０と、光Ｌを試料Ｔに照射する照射光学系２０と、光Ｌが照射されたことによる試料Ｔの反応に伴う信号を検出する検出部４０とを有し、照射光学系２０は、焦点面において第１の強度分布を有する光ＬＡを照射することにより試料Ｔに一光子励起及び二光子励起を発生させる第１モードと、焦点面において第２の強度分布を有する光ＬＢを照射することにより試料Ｔに少なくとも一光子励起を発生させる第２モードとを切り替える切替部５１を有する。【選択図】図１
2020134655.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
光を発生する光源と、
前記光を試料に照射する照射光学系と、
前記光が照射されたことによる前記試料の反応に伴う信号を検出する検出部と
を有し、
前記照射光学系は、焦点面において第１の強度分布を有する光を照射することにより前記試料に一光子励起及び二光子励起を発生させる第１モードと、前記焦点面において第２の強度分布を有する光を照射することにより前記試料に少なくとも一光子励起を発生させる第２モードとを切り替える切替部を有する
ことを特徴とする観察装置。
【請求項２】
前記切替部は、前記第１モードと前記第２モードとを所定のタイミングで切り替えることを特徴とする請求項１に記載の観察装置。
【請求項３】
前記検出部は、前記第１モードにより検出した前記信号から前記第２モードにより検出した前記信号を減算することで、前記信号の相違を検出することを特徴とする請求項１または２に記載の観察装置。
【請求項４】
前記検出部は、前記第１モードにより検出した前記信号から前記第２モードにより検出した前記信号を減算することで、二光子励起に基づく信号を検出することを特徴とする請求項３に記載の観察装置。
【請求項５】
前記切替部は、前記第１モードでは、所定のパルス幅を有する前記光を前記試料に照射し、前記第２モードでは、前記パルス幅より長いパルス幅を有する光を前記試料に照射することを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の観察装置。
【請求項６】
前記切替部は、前記光源から発生された前記光のパルス幅を広げるパルス幅伸長部を有し、前記パルス幅伸長部は、少なくとも前記第２モードのときに前記光のパルス幅を広げることを特徴とする請求項５に記載の観察装置。
【請求項７】
前記切替部は、前記第１モードのときに前記試料の特定深さの焦点面の焦点位置に前記光を照射し、前記第２モードのときに前記焦点面において前記焦点位置を除く位置に前記光を照射することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の観察装置。
【請求項８】
前記切替部は、前記第１モードのときに前記試料に照射する前記光の前記焦点位置における点像分布関数と、前記第２モードのときに前記試料に照射する前記光の前記焦点位置における点像分布関数とを異ならせることを特徴とする請求項６に記載の観察装置。
【請求項９】
焦点面において第１の強度分布を有する光を照射することにより試料に一光子励起及び二光子励起を発生させる第１モードと、前記焦点面において第２の強度分布を有する光を照射することにより前記試料に少なくとも一光子励起を発生させる第２モードとを切り替える工程と、
前記光が照射されたことによる前記試料の反応に伴う信号を検出する工程と、
を含むことを特徴とする観察方法。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれかに記載の前記観察装置と、
前記試料の複数の位置に対応する前記信号に基づいて画像を生成する画像生成部と
を有することを特徴とする顕微鏡装置。
【請求項１１】
被検体の体腔内に挿入される管部材を有する挿入部と、
前記挿入部の先端部を操作する操作部とを有し、
前記請求項１〜８のいずれかに記載の前記観察装置が前記挿入部の前記先端部に配置されていることを特徴とする内視鏡装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、観察装置、観察方法、顕微鏡装置及び内視鏡装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
光吸収によって生じる光音響（ＰＡ、photoacoustic）波を検出することで、試薬等を用いずに試料の吸収分布を画像化できる光音響顕微鏡（ＰＡＭ、photoacoustic microscopy）は、例えば医療分野等において広く利用されている。
【０００３】
このような光音響顕微鏡の一例として、二光子励起光音響顕微鏡が提案されている（例えば非特許文献１参照）。非特許文献1に提案されている光音響顕微鏡では、パルス幅が可変なレーザーを用いている。この光音響顕微鏡では、フェムト秒程度のパルス幅の光により光音響信号を取得し、また、ピコ秒程度のパルス幅の光により光音響信号を取得する。ピコ秒程度のパルス幅の光による光音響信号は一光子励起による光音響信号が支配的であり、フェムト秒程度のパルス幅の光におる光音響信号は一光子励起と二光子励起とによる光音響信号が支配的である。そこで、フェムト秒程度のパルス幅の光による光音響信号からピコ秒程度のパルス幅の光による光音響信号を減算することで、二光子励起による光音響信号のみを取り出すことができる。
【０００４】
しかしながら、上述した非特許文献１に開示された光音響顕微鏡では、パルス幅が可変な特殊なレーザーを用いており、また、パルス幅を変更する作業に時間を要していた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Yoshihisa Yamaoka et. al., “Photoacoustic microscopy using ultrashort pulses with two different pulse durations”, OPTICS EXPRESS（米）, 2014, Vol.22, No.14, p.17063-17072
【発明の概要】
【０００６】
本発明の観察装置は、光を発生する光源と、光を試料に照射する照射光学系と、光が照射されたことによる試料の反応に伴う信号を検出する検出部とを有し、照射光学系は、焦点面において第１の強度分布を有する光を照射することにより試料に一光子励起及び二光子励起を発生させる第１モードと、焦点面において第２の強度分布を有する光を照射することにより試料に少なくとも一光子励起を発生させる第２モードとを切り替える切替部を有する。
【０００７】
本発明の観察方法は、焦点面において第１の強度分布を有する光を照射することにより試料に一光子励起及び二光子励起を発生させる第１モードと、焦点面において第２の強度分布を有する光を照射することにより試料に少なくとも一光子励起を発生させる第２モードとを切り替える工程と、光が照射されたことによる試料の反応に伴う信号を検出する工程と、を含む。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】第一の実施の形態である観察装置が適用される光音響顕微鏡の概略構成を示すブロック図である。
【図２】第一の実施の形態に係る光音響顕微鏡のうち試料付近を拡大して示した概略図である。
【図３】第一の実施の形態に係る光音響顕微鏡の動作の一例を説明するための波形図である。
【図４】第二の実施の形態である観察装置が適用される光音響顕微鏡の概略構成を示すブロック図である。
【図５】第二の実施の形態である観察装置に用いられる原理を説明するための図である。
【図６】第二の実施の形態である観察装置により試料に照射される光のプロファイルの一例を示す図である。
【図７】第二の実施の形態に係る光音響顕微鏡における対物レンズの瞳関数の位相の一例を示す図である。
【図８】第二の実施の形態である観察装置により試料に照射される光の焦点面における光のプロファイルの一例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、実施の形態を図面に基づいて説明する。
【００１０】
（第一の実施の形態）
図１及び図２を参照して、第一の実施の形態である観察装置が適用される光音響顕微鏡について説明する。
【００１１】
図１は第一の実施の形態である観察装置が適用される光音響顕微鏡の概略構成を示すブロック図、図２は第一の実施の形態に係る光音響顕微鏡のうち試料付近を拡大して示した概略図である。
【００１２】
これらの図において、本実施の形態に係る光音響顕微鏡１は、光源であるパルスレーザー１０、照射光学系２０及び検出部４０を有する。
【００１３】
照射光学系２０は、ハーフミラー２１、第１の音響光学素子（Acousto-Optic Modulator、以下、第１のＡＯＭと称する）２２、鏡２３、光ファイバ２４、第２の音響光学素子（以下、第２のＡＯＭと称する）２５、鏡２６、ハーフミラー２７、ダイクロイックミラー２８、ガルバノスキャナ（走査部）２９、対物レンズ３０及びファンクションジェネレータ３１を有する。
【００１４】
なお、ハーフミラー２１、２７を偏光ビームスプリッターに置き換えても良い。この場合、後述するパルス光ＬＡとパルス光ＬＢの光量を等しくするために、パルスレーザー１０の射出後に、半波長板を設置し、偏光を45°の直線偏光とすることが望ましい。また、パルス光ＬＡとパルス光ＬＢの偏光を等しくするために、二つの光を合波した後の光路に、偏光子を設置し、偏光軸を45°とすることが望ましい。
【００１５】
パルスレーザー１０は、所定のパルス幅を有するレーザー光Ｌを出射する。パルスレーザー１０が発生する光Ｌのパルス幅は、このパルス光Ｌにより試料Ｔに一光子励起及び二光子励起の双方を生じさせることができるかどうかという観点から決定される。本実施の形態に係る光音響顕微鏡１では、一例としてパルスレーザー１０から出射される光Ｌのパルス幅は２００ｆｓとされる。
【００１６】
パルスレーザー１０から出射したパルス光Ｌはハーフミラー２１により光路が２方向に分岐される。ハーフミラー２１により分岐されたパルス光の一方ＬＡは第１のＡＯＭ２２に入射される。
【００１７】
第１のＡＯＭ２２は音響光学媒体の側面に超音波素子を接着したものである。ファンクションジェネレータ３１から出力された所定周波数ｆの電気信号が不図示のＡＯＭドライバに入力され、ＡＯＭドライバからの駆動信号により超音波素子が駆動されると、超音波素子から出力される超音波が音響光学媒体内を伝播する。この超音波は音響光学媒体内において屈折率の変化をもたらし、音響光学媒体がいわば回折格子として作用する。従って、第１のＡＯＭ２２に入射したパルス光ＬＡは第１のＡＯＭ２２により回折される。本実施の形態である照射光学系２０では、第１のＡＯＭ２２からの１次回折光を出力として用いる。
【００１８】
第１のＡＯＭ２２から出射される１次回折光ＬＡは、ハーフミラー２７及びダイクロイックミラー２８を通過してガルバノスキャナ２９に入射される。
【００１９】
ダイクロイックミラー２８はパルス光ＬＡを通過させる。また、後述するように、ダイクロイックミラー２８は、試料Ｔが蛍光試薬によりラベリングされることで試料Ｔが発する蛍光の波長の光を反射させる。ダイクロイックミラー２８の一面には、このような波長依存性を有する誘電体コーティングが施されている。
【００２０】
ダイクロイックミラー２８により反射された蛍光は光学フィルタ３２を通じて光電子増倍管３３に入力される。光電子増倍管３３の出力は、検出部４０の情報処理装置４１に入力される。情報処理装置４１の動作の詳細については後述する。
【００２１】
ガルバノスキャナ２９は、２枚の反射鏡（ガルバノミラー）２９ａ、２９ｂとこれら反射鏡２９ａ、２９ｂを独立して駆動する図略の駆動部とを有する。駆動部により反射鏡２９ａ、２９ｂを駆動することで、パルス光ＬＡをその光軸に直交する平面上の任意の位置にスキャンすることができる。
【００２２】
所定の位置にスキャンされた光ＬＡは、対物レンズ３０により試料Ｔの所定位置（例えば図１に示すスポットＳＰ１）に集光されて入射される。
【００２３】
一方、ハーフミラー２１により分岐されたパルス光の他方ＬＢは、鏡２３によりその光路を所定方向に導かれてパルス幅伸長部である光ファイバ２４に入射される。光ファイバ２４内を伝播した光は第２のＡＯＭ２５に入射される。パルス光ＬＢが光ファイバ２４内を伝播する際に、波長分散の影響を受けてそのパルス幅が伸長される。なお、光ファイバ２４に入射する前にガラスロッドを設置し、パルス幅をある程度伸長させる構成としても良い。
【００２４】
光ファイバ２４により伸長される光ＬＢのパルス幅は、伸長されたパルス幅のパルス光ＬＢにより試料Ｔに少なくとも一光子励起を生じさせることができるかどうかという観点から決定される。本実施の形態に係る光音響顕微鏡１では、一例として光ファイバ２４から出射される光ＬＢのパルス幅は２００ｐｓとされる。従って、光ファイバ２４の構造、材質及び全長は、２００ｆｓのパルス幅の光が入射され、２００ｐｓのパルス幅の光ＬＢが出射されるように定められる。なお、光ファイバ２４の全長を可変に構成することで、伸長された光ＬＢのパルス幅を可変にしてもよい。
【００２５】
光ファイバ２４から出射したパルス光ＬＢは第２のＡＯＭ２５に入射される。ファンクションジェネレータ３１から所定周波数ｆの電気信号が不図示のＡＯＭドライバに入力され、ＡＯＭドライバからの駆動信号が第２のＡＯＭ２５に印加されると、第２のＡＯＭ２５が回折格子として作用する。本実施の形態である照射光学系２０でも、第２のＡＯＭ２５からの１次回折光を出力として用いる。
【００２６】
第２のＡＯＭ２５から出射される１次回折光ＬＢは、鏡２６によりその光路が所定方向に導かれ、ハーフミラー２７に入射する。光ＬＢは、このハーフミラー２７により反射されて出射される際に、第１のＡＯＭ２２から出射される光ＬＡとその光軸を共通にするような位置に入射される。
【００２７】
ハーフミラー２７で反射されて出射された光ＬＢは、このハーフミラー２７を通過して出射された光ＬＡと同様にダイクロイックミラー２８に入射する。
【００２８】
ダイクロイックミラー２８を通過した光ＬＢはガルバノスキャナ２９に入射される。ガルバノスキャナ２９により所定の位置にスキャンされた光ＬＢは、対物レンズ３０により、光ＬＡと略同一箇所である試料Ｔの所定位置に集光されて入射される。
【００２９】
検出部４０は、トランスデューサ４２及び情報処理装置４１の光音響検出部４３を有する。
【００３０】
図２に示すように、本実施の形態に係る光音響顕微鏡１では、試料Ｔは光及び光音響波が伝播可能な媒体Ｍ内に浸漬されている。媒体Ｍは光及び光音響波が伝播可能なものであれば特段の限定はないが、本実施の形態に係る光音響顕微鏡１では、取扱の容易性を考慮して水を媒体Ｍとして用いている。
【００３１】
対物レンズ３０により集光されて試料Ｔの所定位置（例えば図１に示すスポットＳＰ１）に入射された光ＬＡ、ＬＢは、光音響効果によりこの所定位置において光音響波Ｗを生じさせる。トランスデューサ４２は、試料Ｔから発生して媒体Ｍを伝播する光音響波Ｗを受信し、受信した光音響波Ｗの強度に応じた電気信号を出力する。試料Ｔの物性に依存するものの、通常、光音響波Ｗは超音波帯の音波である。従って、トランスデューサ４２は超音波トランスデューサであることが望ましい。超音波トランスデューサを構成する材質等は周知であるので、ここでの説明は省略する。
【００３２】
ここで、既に説明したように、第１のＡＯＭ２２から出射された光ＬＡは、パルスレーザー１０から出射された光Ｌとそのパルス幅が同一である。つまり、光ＬＡはフェムト秒程度のパルス幅を有する。このような極短パルス幅の光ＬＡのピーク強度は十分大きいので、この光ＬＡが照射された試料Ｔには一光子励起に加えて二光子励起に伴う光音響波Ｗが生じる。これが第１モードである。また、極短パルス幅の光ＬＡは、焦点面において第１の強度分布を有する光である。
【００３３】
一方、第２のＡＯＭ２５から出射された光ＬＢは光ファイバ２４によりパルス幅が伸長されている。光ファイバ２４によるパルス幅の伸長に伴い、この光ＬＢのピーク強度は光ＬＡより低くなる。従って、光ＬＢが照射された試料Ｔには一光子励起に伴う光音響波Ｗが生じる。これが第２モードである。また、光ＬＢは、焦点面において第２の強度分布を有する光である。
【００３４】
トランスデューサ４２の出力信号は情報処理装置４１に入力される。情報処理装置４１は演算能力を有する、例えばパーソナルコンピュータ等である。情報処理装置４１は、光音響検出部４３、画像処理部（画像生成部）４４及び制御部４５を有する。
【００３５】
検出部４０の一部を為す光音響検出部４３は、トランスデューサ４２からの出力信号に基づいて試料Ｔの光音響信号を検出する。また、光音響検出部４３は、光ＬＡに基づく光音響信号と光ＬＢに基づく光音響信号から、二光子励起により発生する光音響信号のみを取り出す。二光子励起により発生する光音響信号のみを取り出す手法については後述する。
【００３６】
画像処理部４４は、試料Ｔの所定位置から得られた光音響信号を光音響検出部４３から受信する。そして、画像処理部４４は、ガルバノスキャナ２９により試料Ｔの所定位置が走査されることで試料Ｔの広範囲から得られた光音響信号に基づいて、この光音響信号を画像化した画像信号を生成する。画像信号は図略の表示装置に送出され、また、必要に応じて図略の記憶装置に格納される。
【００３７】
制御部４５は光音響顕微鏡１全体の制御を行う。具体的には、パルスレーザー１０から出射される光パルスの出射タイミングの制御、ファンクションジェネレータ３１に駆動信号を出力させるトリガとなる信号の送出制御、ガルバノスキャナ２９の駆動部の制御などを行う。また、制御部４５は光音響検出部４３及び画像処理部４４の制御も行う。
【００３８】
以上の構成において、本実施の形態である観察装置５０は、パルスレーザー１０、照射光学系２０及び検出部４０を有する。但し、ガルバノスキャナ２９を有する走査部及び対物レンズ３０は観察装置５０に必須の構成ではない。また、照射光学系２０は、第１モードと第２モードとを切り替える切替部５１を備え、切替部５１は、本実施の形態では、第１のＡＯＭ２２、第２のＡＯＭ２５、光ファイバ２４及びファンクションジェネレータ３１を備える。
【００３９】
次に、図３を参照して、本実施の形態に係る光音響顕微鏡１の動作及び検出原理について説明する。
【００４０】
図３（ａ）は、パルスレーザー１０から出射されるパルス光Ｌを示す波形図である。情報処理装置４１の制御部４５は、パルスレーザー１０から所定の繰り返し周波数でパルスＬが出射されるようにこのパルスレーザー１０を駆動する。一例として、パルスレーザー１０から出射されるパルス光Ｌの繰り返し周波数は８０ＭＨｚとされる。
【００４１】
図３（ｂ）、（ｃ）は、それぞれファンクションジェネレータ３１から第１のＡＯＭ２２及び第２のＡＯＭ２５に供給される駆動電圧信号を示す波形図である。ファンクションジェネレータ３１から供給される駆動電圧信号は周波数ｆの矩形波であり、そして、第１のＡＯＭ２２と第２のＡＯＭ２５とでその位相が反転している。従って、第１のＡＯＭ２２と第２のＡＯＭ２５とは、図に示すように周波数ｆの周期で交互にＯＮ／ＯＦＦされる。情報処理装置４１の制御部４５は、図に示すような駆動電圧信号をファンクションジェネレータ３１から出力させるようなトリガ信号を送出する。
【００４２】
図３（ｄ）は第１のＡＯＭ２２から出力される光ＬＡを示す波形図、図３（ｅ）は第２のＡＯＭ２５から出力される光ＬＢを示す波形図である。これら図３（ｄ）、（ｅ）に示すように、第１のＡＯＭ２２と第２のＡＯＭ２５とからは、交互に光ＬＡ及び光ＬＢが出射される。
【００４３】
光音響検出部４３は、光ＬＡまたは光ＬＢが試料Ｔに照射されることにより生じる光音響信号を検出する。そして、光音響検出部４３は、光ＬＡに基づく光音響信号の強度から光ＬＢに基づく光音響信号の強度を減算することで、二光子励起にのみ基づく光音響信号の強度を算出する。このため、光音響検出部４３または制御部４５は、光ＬＡ、ＬＢに基づく光音響信号を一時的に格納する図略の記憶部を有する。
【００４４】
二光子励起にのみ基づく光音響信号の強度を算出するタイミングは任意である。但し、リアルタイム性を考慮すると、ファンクションジェネレータ３１から供給される駆動電圧信号の周波数ｆと等しい間隔で算出することが好ましい。
【００４５】
次いで、制御部４５は、ガルバノスキャナ２９を制御することで、試料Ｔに入射する光ＬＡ及び光ＬＢの照射位置を変更する。一例として、図１に示すスポットＳＰ１からスポットＳＰ２に照射位置を変更する。そして、光音響検出部４３は、スポットＳＰ２においても上述の計算を行う。
【００４６】
制御部４５は、ガルバノスキャナ２９を制御することで、光ＬＡ及び光ＬＢの入射方向において所定深さに位置する試料Ｔの所定平面上にこれら光ＬＡ及び光ＬＢを走査する。光音響検出部４３は、各走査スポットにおいて、光ＬＡ及び光ＬＢに基づく光音響信号、及び、光ＬＡに基づく光音響信号の強度から光ＬＢに基づく光音響信号の強度を減算することで求められる二光子励起にのみ基づく光音響信号を算出する。画像処理部４４は、各走査スポットにおいて光音響検出部４３が計算した光音響信号に基づいて、光ＬＡ及び光ＬＢに基づく光音響信号、及び、二光子励起にのみ基づく光音響信号の分布画像を生成する。
【００４７】
なお、光ＬＡ及び光ＬＢが照射される試料Ｔの深さ方向（Ｚ方向）の位置は、対物レンズ３０と試料Ｔとの相対距離を調整することにより決定され、画像生成中は固定される。Ｚ方向の距離は、対物レンズ３０を移動させてもよいし、試料Ｔを移動させてもよい。
【００４８】
本実施の形態に係る光音響顕微鏡１では、切替部５１により、試料Ｔに一光子励起及び二光子励起を発生させる第１モードと、試料Ｔに少なくとも一光子励起を発生させる第２モードとを切り替えている。従って、光源としてパルス幅が固定されたパルスレーザー１０を用いて二光子励起にのみ基づく光音響信号を取得することができる。これにより、本実施の形態に係る光音響顕微鏡１によれば、簡易な構成により光音響信号の測定及び画像取得が可能となる。加えて、パルスレーザー１０においてパルス幅を変更する作業が不要となる。これにより、光音響信号の測定及び画像取得を高速に行うことができる。
【００４９】
また、試料Ｔを蛍光試薬によりラベリングして試料Ｔが発する蛍光の強度を光電子増倍管３３により検出することで、蛍光画像を得ることもできる。
【００５０】
（第二の実施の形態）
次に、図４を参照して、第二の実施の形態である観察装置が適用される光音響顕微鏡について説明する。図４は第二の実施の形態である観察装置が適用される光音響顕微鏡の概略構成を示すブロック図である。なお、以下の説明において、第一の実施の形態に係る光音響顕微鏡１と同一の構成要素については同一の符号を付し、その説明を簡略化する。
【００５１】
本実施の形態に係る光音響顕微鏡１００も、第一の実施の形態に係る光音響顕微鏡１と同様に、光源であるパルスレーザー１０、照射光学系１１０及び検出部４０を有する。
【００５２】
照射光学系１１０は、空間光変調器（Spatial Light Modulator、以下ＳＬＭと称する）１１１、鏡１１２、ガルバノスキャナ２９及び対物レンズ３０を有する。
【００５３】
パルスレーザー１０からのパルス光ＬはＳＬＭ１１１に入射される。ＳＬＭ１１１は、空間的・時間的に振幅変調、位相変調、または偏光を変調する装置である。ＳＬＭそのものは公知の装置であるので、その詳細な構成の説明は省略する。本実施の形態に係るＳＬＭ１１１は、一例として屈折率を画素単位で制御可能な液晶素子を有する。入射光Ｌがこの液晶素子に入射して反射されることで、入射光Ｌに対して画素単位で位相変調を与えることができる。情報処理装置４１の制御部４５は、ＳＬＭ１１１の駆動を制御する信号を送出する。ＳＬＭ１１１は、図略のレンズにより対物レンズ３０の瞳面と共役な位置に設置されている。
【００５４】
ＳＬＭ１１１からの反射光Ｌは鏡１１２によりその光路を所定方向に導かれ、ガルバノスキャナ２９に入射する。そして、光Ｌはガルバノスキャナ２９を経由して対物レンズ３０により集光され、試料Ｔの所定位置に入射される。
【００５５】
以上の構成において、本実施の形態である観察装置１２０は、パルスレーザー１０、照射光学系１１０及び検出部４０を有する。但し、ガルバノスキャナ２９を有する走査部及び対物レンズ３０は観察装置１２０に必須の構成ではない。また、ＳＬＭ１１１は、照射光学系１１０が備える切替部を構成する。
【００５６】
次に、図５〜図７を参照して、本実施の形態に係る光音響顕微鏡１００の動作及び検出原理について説明する。
【００５７】
情報処理装置４１の制御部４５は、図６（ａ）、（ｂ）及び図８（ａ）、（ｂ）に示すような光プロファイルのいずれかを反射光Ｌに与えるようにＳＬＭ１１１を駆動制御する。ここに、図６（ａ）、（ｂ）の上段は、試料Ｔに入射される光Ｌのうち、図５に示す試料Ｔの表面に近い焦点外れ面Ｚ１の光プロファイルである。また、図６（ａ）、（ｂ）の下段は、試料Ｔに入射される光Ｌのうち、図５に示す試料Ｔの表面からＺ方向の所定深さ、つまり焦点距離にある焦点面Ｚ２の光プロファイルである。また、図８（ａ）、（ｂ）は、図５に示す焦点面Ｚ２における図６（ａ）、（ｂ）に示す光プロファイル、つまり点像分布関数（Point Spread Function、以下ＰＳＦと称する）の強度を示す図である。
【００５８】
焦点外れ面Ｚ１において光Ｌは一点（正確には微小領域）に収束されておらず、所定の広さを持つ領域に照射されている。従って、光ＬによりＰＳＦは形成されない。このため、図６（ａ）、（ｂ）の上段に示すように、光プロファイルは一様な分布を有する。
【００５９】
一方、焦点面Ｚ２において光Ｌは集光されている。従って、光ＬによりＰＳＦが形成される。図６（ａ）の下段及び図８（ａ）に示す光プロファイル、つまりＰＳＦは焦点位置（図６において中央位置、図８の上段における点線部）にピークを有する。一方、図６（ｂ）の下段及び図８（ｂ）に示すＰＳＦは焦点位置を除く位置にピークを有する。より具体的には、焦点位置を中心とする所定距離の円の周上にピークを有するドーナツ状のＰＳＦである。従って、図６（ａ）及び図８（ａ）に示す光プロファイルを有する光Ｌは、焦点面Ｚ２において第１の強度分布を有する光であり、図６（ｂ）及び図８（ｂ）に示す光プロファイルを有する光Ｌは、焦点面Ｚ２において第２の強度分布を有する光である。
【００６０】
このようなＰＳＦを与えるための、ＳＬＭ１１１により与えられる位相変調について図７を参照して説明する。図７は対物レンズ３０の瞳面における位相分布を示す図である。図７（ａ）は、図６（ａ）の光プロファイルに対応する瞳関数における位相分布であり、一様かつ一定値の位相である。一方、図７（ｂ）は、図６（ｂ）の光プロファイルに対応する瞳関数における位相分布であり、円周方向に変化し、円周方向に一周すると０から２πまで変化する。
【００６１】
図７（ｂ）に示すような位相変調を与える光学器具は螺旋位相板（Vortex Phase Plate：ＶＰＰ）と呼ばれる。ＳＬＭ１１１は、図７（ａ）または図７（ｂ）に示す位相分布を反射光Ｌに与えるように駆動制御される。
【００６２】
焦点面Ｚ２において図６（ａ）及び図８（ａ）に示すＰＳＦを有する光Ｌが試料Ｔに照射されると、焦点位置（図８の上段における点線部）において高強度の光Ｌが照射される。この結果、この焦点位置において一光子励起及び二光子励起に基づく光音響信号が発生する。これが第１モードである。発生した光音響信号に基づく光音響波Ｗはトランスデューサ４２により受信される。
【００６３】
一方、焦点面Ｚ２において図６（ｂ）及び図８（ｂ）に示すＰＳＦを有する光Ｌが試料Ｔに照射されると、焦点位置においてのみ考えると、低強度の光Ｌが照射される（図８の下段における点線部）。この結果、この焦点位置において、二光子励起に基づく光音響信号は発生せず、一光子励起に基づく光音響信号が極僅か発生する。
一方焦点位置を中心とする所定距離の円の周上にピークが生じるので、このドーナツ領域からは一光子励起及び二光子励起に基づく光音響信号が発生する。これが第２モードである。発生した光音響信号に基づく光音響波Ｗはトランスデューサ４２により受信される。
【００６４】
従って、情報処理装置４１の制御部４５は、図６（ａ）及び図６（ｂ）に示すＰＳＦを交互に反射光Ｌに与えるようにＳＬＭ１１１を駆動制御する。すなわち、ＳＬＭ１１１は、第１モードと第２モードとを切り替える切替部である。リアルタイム性を考慮すると、ＳＬＭ１１１によるＰＳＦの切替周波数は高いことが好ましいが、画像処理部４４及び制御部４５の演算速度を考慮して切替周波数が定められる。
【００６５】
あるいは、制御部４５が周波数ｆの矩形波、正弦波をＳＬＭ１１１に印加することで、ＳＬＭ１１１が周波数ｆによりＰＳＦの切替制御をする。また、制御部４５が周波数ｆのロックイン信号を光音響検出部４３及び画像処理部４４に提供し、この周波数ｆの周期で各種信号処理をする。
【００６６】
このとき、二光子励起に基づく光音響信号から得られる画像Ｉは次式で与えられる。
［数１］
Ｉ＝Ｉ１−αＩ２
ここに、
Ｉ1： 図６（ａ）に示すＰＳＦで取得した画像
Ｉ2:：図６（ｂ）に示すＰＳＦで取得した画像
α: 比例係数
【００６７】
第１モード、第２モードのいずれの場合も、焦点外れ面Ｚ１おいて一光子励起による光音響信号が発生し、それぞれの画像に混入する。このため、両者の差分をとることで、焦点外れ面Ｚ１から生じる一光子励起に基づく光音響信号を除去し、焦点面Ｚ２から生じる二光子励起に基づく光音響信号を抽出することができる。焦点外れ面Ｚ１から生じる一光子励起に基づく光音響信号を除去するためには、α＝１が望ましい。一方で、画像Ｉにおける図６（ｂ）のＰＳＦのピークとその付近の強度がマイナスになってしまう。画像Ｉはマイナスの値をとれないので、この部分は情報が欠落してしまう。
【００６８】
従って、この影響を低減するためにαの値を１より小さくすることが望ましい。しかしながら、この場合、減算による一光子励起に基づく光音響信号除去の効果は低減してしまう。このように、αの値によって、トレードオフが生じる。
【００６９】
そこで、画像Ｉの生成時において、画像Ｉ１と画像Ｉ２とを取得した後、αを０．５から１まで変えて画像Ｉを生成する。そして、画像Ｉにおいてコントラストと輝度のマイナス値がバランスするようなαを選択することが望ましい。コントラストの大きさは、画像Ｉのフーリエ変換の直流成分の大きさで評価しても良い。輝度のマイナスは、マイナス値を取る画素の数、あるいは、マイナス値を取る画素の輝度値の総和で評価しても良い。
【００７０】
ＰＳＦの差は焦点面Ｚ２のみにおいて生じるので、画像Ｉ１から画素Ｉ２を減算することで、焦点外れ面Ｚ１から生じる光音響信号を除去することができる。光強度を強くした場合には、焦点外れ面Ｚ１においても、望ましくない二光子励起による光音響信号が生じる場合があるが、この信号も本手法により除去することができる。
【００７１】
本実施の形態に係る光音響顕微鏡１００においても、切替部であるＳＬＭ１１１により、試料Ｔに一光子励起及び二光子励起を発生させる第１モードと、試料Ｔに少なくとも一光子励起を発生させる第２モードとを切り替えている。従って、光源としてパルス幅が固定されたパルスレーザー１０を用いて二光子励起にのみ基づく光音響信号を取得することができる。これにより、本実施の形態に係る光音響顕微鏡１００によっても、上述した第一の実施の形態に係る光音響顕微鏡１と同様の効果を得ることができる。
【００７２】
（変形例）
以上、図面を参照して、実施の形態を詳述してきたが、具体的な構成は、この実施の形態及び実施例に限らず、その要旨を逸脱しない程度の設計的変更は、本開示に含まれる。
【００７３】
一例として、上述した第一の実施の形態に係る光音響顕微鏡１では、フェムト秒程度のパルス幅を有するパルスレーザー１０を用いていたが、このパルスレーザー１０と、ピコ秒程度のパルス幅を有するパルスレーザーとを併用してもよい。より詳細には、パルスレーザー１０からのパルス光を直接第１のＡＯＭ２２に入射させ、ピコ秒程度のパルス幅を有するパルスレーザーからのパルス光を直接第２のＡＯＭ２５に入射させればよい。この場合、ハーフミラー２１は省略できる。
【００７４】
また、第一の実施の形態では、パルス幅伸長部である光ファイバ２４を第２モードにおける光路のみに配置した例を示したが、これに加えて、第１モードにおける光路にもパルス伸長部を配置してもよい。この場合、第１モードのパルス伸長部による伸長量よりも第２モードのパルス伸長部による伸長量を大きくする。これにより、光源１０からの光のパルス幅が、第１モードで焦点面において二光子励起を発生させるのに適したパルス幅よりも小さい場合でも、第１モードにおいて試料Ｔに照射される光のパルス幅を適切な大きさに設定することができる。
【００７５】
また、第二の実施の形態に係る光音響顕微鏡１００において、第一の実施の形態に係る光音響顕微鏡１と同様に、鏡１１２とガルバノスキャナ２９との間にダイクロイックミラー２８を挿入し、光学フィルタ３２及び光電子増倍管３３を追加してもよい。
【００７６】
これにより、試料Ｔを蛍光試薬によりラベリングして試料Ｔが発する蛍光の強度を光電子増倍管３３により検出することで、蛍光画像を得ることもできる。
【００７７】
そして、上述の第一及び第二の実施の形態では、観察装置を光音響顕微鏡に適用していたが、観察装置は他の装置に適用することもできる。一例として、観察装置は内視鏡装置に適用することもできる。
【００７８】
第一及び第二の実施の形態である観察装置が適用される内視鏡装置は、被検体の体腔内に挿入される管部材を有する挿入部と、挿入部の先端部を操作する操作部とを有する。そして、第一〜第二の実施の形態である観察装置は、挿入部の先端部に配置されている。かかる構成の内視鏡装置によっても、被検体内の粘膜内面等の試料Ｔから発生する、二光子励起にのみ基づく光音響信号を取得することができる。加えて、走査部を設ければ、被検体内の粘膜内面等の二光子励起にのみ基づく光音響信号画像を取得することができる。
【００７９】
光音響画像取得の際のシーケンスとしては、画像の一画素ごと又は所定の画素数ごとに第１モードおよび第２モードを切り替える構成と、第１モードで画像取得(全画素分の信号を取得)し、次いで第２モードで画像取得(全画素分の信号を取得)する構成との二通りがある。前者の方が試料の動きや装置の揺らぎの影響を受けにくいのでより望ましい。
【符号の説明】
【００８０】
Ｌ    光
ＬＡ    光
ＬＢ    光
Ｔ    試料
１、１００    光音響顕微鏡
１０    パルスレーザー（光源）
２０、１１０    照射光学系
２２    第１のＡＯＭ
２４    光ファイバ（パルス幅伸長部）
２５    第２のＡＯＭ
２９    ガルバノスキャナ（走査部）
３１    ファンクションジェネレータ
４０    検出部
４４    画像処理部（画像生成部）
５１    切替部
１１１  ＳＬＭ（切替部）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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