(57)【要約】      （修正有）【課題】既知の組換え産物と比較して薬物動態学的特性が向上した組換えＦＳＨの提供。【解決手段】α２，３−およびα２，６−シアリル化を含む組換えＦＳＨであって、全シアリル化の８０％以上がα２，３−シアリル化であり、かつ、全シアリル化の５％〜２０％がα２，６−シアリル化である、組換えＦＳＨ。【選択図】図１
2020040956.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
α２，３−およびα２，６−シアリル化を含む組換えＦＳＨ（ｒＦＳＨ）。
【請求項２】
６ｍｏｌ／ｍｏｌ以上のシアル酸含有量［シアル酸モル数対タンパク質モル数の比率として表される］を有する、請求項１に記載の組換えＦＳＨ。
【請求項３】
６ｍｏｌ／ｍｏｌ〜１５ｍｏｌ／ｍｏｌのシアル酸含有量を有する、請求項１または請求項２に記載の組換えＦＳＨ。
【請求項４】
総シアリル化の１０％以上がα２，３−シアリル化である、請求項１から３のいずれかに記載の組換えＦＳＨ。
【請求項５】
総シアリル化の６５〜８５％の量のα２，３−シアリル化を含む、請求項１から４のいずれかに記載の組換えＦＳＨ。
【請求項６】
総シアリル化の７０〜８０％の量のα２，３−シアリル化を含む、請求項１から５のいずれかに記載の組換えＦＳＨ。
【請求項７】
総シアリル化の５０％以下がα２，６−シアリル化である、請求項１から６のいずれかに記載の組換えＦＳＨ。
【請求項８】
総シアリル化の１５〜３５％の量のα２，６−シアリル化を含む、請求項１から７のいずれかに記載の組換えＦＳＨ。
【請求項９】
総シアリル化の２０〜３０％の量のα２，６−シアリル化を含む、請求項１から８のいずれかに記載の組換えＦＳＨ。
【請求項１０】
α２，８−シアリル化をさらに含む、請求項１から９のいずれかに記載の組換えＦＳＨ。
【請求項１１】
シアル酸含有量が６質量％以上である、請求項１から１０のいずれかに記載の組換えＦＳＨ。
【請求項１２】
ヒト細胞系で産生または発現される、請求項１から１１のいずれかに記載の組換えＦＳＨ。
【請求項１３】
Ｐｅｒ．Ｃ６細胞系、Ｐｅｒ．Ｃ６由来細胞系、または改変Ｐｅｒ．Ｃ６細胞系で産生または発現される、請求項１から１２のいずれかに記載の組換えＦＳＨ。
【請求項１４】
前記細胞系が、α２，３−シアリルトランスフェラーゼを使用して改変されている、請求項１２または１３に記載の組換えＦＳＨ。
【請求項１５】
内因性シアリルトランスフェラーゼ活性によりもたらされるα２，６結合シアル酸（α２，６−シアリル化）を含む、請求項１２から１４のいずれかに記載の組換えＦＳＨ。
【請求項１６】
ヒト細胞系で発現される組換えＦＳＨ。
【請求項１７】
総シアリル化の１０％以上がα２，３−シアリル化である、請求項１６に記載の組換えＦＳＨ。
【請求項１８】
総シアリル化の６５〜８５％の量のα２，３−シアリル化を含む、請求項１６または１７に記載の組換えＦＳＨ。
【請求項１９】
総シアリル化の５０％以下がα２，６−シアリル化である、請求項１６から１８のいずれかに記載の組換えＦＳＨ。
【請求項２０】
総シアリル化の１５〜３５％の量のα２，６−シアリル化を含む、請求項１６から１９のいずれかに記載の組換えＦＳＨ。
【請求項２１】
６ｍｏｌ／ｍｏｌ以上のシアル酸含有量［シアル酸モル数対タンパク質モル数の比率として表される］を含む、請求項１６から２０のいずれかに記載の組換えＦＳＨ。
【請求項２２】
α２，３−シアリル化およびα２，６−シアリル化を含む、請求項１６または２１のいずれかに記載の組換えＦＳＨ。
【請求項２３】
α２，３−およびα２，６−シアリル化を含む組換えＦＳＨ調製物。
【請求項２４】
医薬品用調製物である、請求項２３に記載の調製物。
【請求項２５】
６ｍｏｌ／ｍｏｌ以上のシアル酸含有量［シアル酸モル数対タンパク質モル数の比率として表される］を有する、請求項２３または２４に記載の調製物。
【請求項２６】
総シアリル化の１０％以上がα２，３−シアリル化である、請求項２３から２５のいずれかに記載の調製物。
【請求項２７】
総シアリル化の６５〜８５％の量のα２，３−シアリル化を含む、請求項２３から２６のいずれかに記載の調製物。
【請求項２８】
総シアリル化の５０％以下がα２，６−シアリル化である、請求項２３から２７のいずれかに記載の調製物。
【請求項２９】
総シアリル化の１５〜３５％の量のα２，６−シアリル化を含む、請求項２３から２８のいずれかに記載の調製物。
【請求項３０】
ヒト細胞系で産生または発現される、請求項２３から２９のいずれかに記載の調製物。
【請求項３１】
α２，３−シアリル化およびα２，６−シアリル化を含むｒＦＳＨを含む医薬組成物。
【請求項３２】
総シアリル化の１０％以上がα２，３−シアリル化である、請求項３１に記載の医薬組成物。
【請求項３３】
総シアリル化の６５〜８５％の量のα２，３−シアリル化を含む、請求項３１または３２のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項３４】
総シアリル化の５０％以下がα２，６−シアリル化である、請求項３１から３３のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項３５】
総シアリル化の１５〜３５％の量のα２，６−シアリル化を含む、請求項３１から３３のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項３６】
請求項１から２２のいずれかに記載のｒＦＳＨおよび／または請求項２３から３０のいずれかに記載の調製物を含む医薬組成物。
【請求項３７】
ｈＣＧおよび／またはＬＨをさらに含む、請求項３１から３６のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項３８】
不妊症治療に使用するための、請求項３１から３７のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項３９】
不妊症を治療する方法であって、請求項１から２２のいずれかに記載のｒＦＳＨ、および／または請求項２３から３０のいずれかに記載の調製物、および／または請求項３１から３７のいずれかに記載の医薬組成物を含む組成物を、対象に投与するステップを含む方法。
【請求項４０】
不妊症治療用の薬剤の製造における、請求項１から２２のいずれかに記載のｒＦＳＨおよび／または請求項２３から３０のいずれかに記載のｒＦＳＨ調製物の使用。
【請求項４１】
ヒト細胞系でｒＦＳＨを産生または発現させるステップを含む、請求項１から２２のいずれかに記載のｒＦＳＨおよび／または請求項２３から３０のいずれかに記載のｒＦＳＨ調製物の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、不妊症治療に使用するためのゴナドトロピンに関する。特に、本発明は、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）に関する。
【背景技術】
【０００２】
ゴナドトロピンは、雄および雌の生殖腺機能を制御する一群のヘテロ二量体糖タンパク質ホルモンである。ゴナドトロピンには、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、および絨毛性ゴナドトロピン（ＣＧ）が含まれる。
【０００３】
ＦＳＨは、天然では脳下垂体前葉により分泌され、卵胞発達および排卵を支援する機能を果たす。ＦＳＨは、他の糖タンパク質ホルモンＬＨおよびＣＧにも共通している９２個アミノ酸アルファサブユニットと、ＦＳＨに生物学的特異性を付与するＦＳＨに固有の１１１個アミノ酸ベータサブユニットを含む（Ｐｉｅｒｃｅ  ａｎｄ  Ｐａｒｓｏｎｓ、１９８１）。各サブユニットは、複合糖質残基の付加により翻訳後修飾される。両方サブユニットは、アルファサブユニットではアミノ酸５２および７８、ならびにベータサブユニットではアミノ酸残基７および２４の、２つのＮ結合グリカン付加部位を保持している（Ｒａｔｈｎａｍ  ａｎｄ  Ｓａｘｅｎａ、１９７５、Ｓａｘｅｎａ  ａｎｄ  Ｒａｔｈｎａｍ、１９７６）。したがって、ＦＳＨは、約３０質量％までグリコシル化される（Ｄｉａｓ  ａｎｄ  Ｖａｎ  Ｒｏｅｙ．２００１．Ｆｏｘ  ｅｔ  ａｌ．２００１）。
【０００４】
閉経後のヒト尿から精製されたＦＳＨは、不妊治療において、自然生殖では排卵を促進するため、および補助生殖技術では卵母細胞を供給するための両方のために長年使用されている。２つの組換え型ＦＳＨ、Ｇｏｎａｌ−Ｆ（Ｓｅｒｏｎｏ社製）およびＰｕｒｅｇｏｎ（Ｏｒｇａｎｏｎ社製）が、１９９０年代中頃に利用可能になった。これらは両方ともチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で発現される（Ｈｏｗｌｅｓ、１９９６）。
【０００５】
ＦＳＨ調製物には、存在する種々のアイソフォーム量が異なることに関する相当の不均質性が伴っている。個々のＦＳＨアイソフォームは同一のアミノ酸配列を示すが、それらが翻訳後修飾される程度は異なっており、特定のアイソフォームが、糖鎖分岐構造の不均質性および異なる量のシアル酸（末端の糖）組み込みによって特徴づけられ、不均一性および組み込みの両方は、その特定のアイソフォームの生物活性に影響を及ぼすと考えられている。
【０００６】
天然ＦＳＨのグリコシル化は高度に複雑である。天然由来の下垂体ＦＳＨのグリカンは、ビ−、トリ−、およびテトラ−アンテナグリカン（antennary glycan）の組合せを含むことができる広範囲の構造を含むことができる（Ｐｉｅｒｃｅ  ａｎｄ  Ｐａｒｓｏｎｓ、１９８１．Ｒｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９８７．Ｂａｅｎｚｉｇｅｒ  ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎ、１９８８）。グリカンは、以下のさらなる修飾を保持している場合がある：コアフコシル化（core fucosylation）、バイセクティンググルコサミン（bisecting glucosamine）、アセチルラクトサミンによる鎖伸長、部分的または完全なシアリル化、α２，３およびα２，６結合によるシアリル化、およびガラクトースを置換する硫酸化ガラクトサミン（Ｄａｌｐａｔｈａｄｏ  ｅｔ  ａｌ．、２００６）。さらに、個々のグリコシル化部位におけるグリカン構造の分布に相異がある。同じようなレベルのグリカン複雑性は、個体の血清および閉経後の女性の尿に由来するＦＳＨに見出されている（Ｗｉｄｅ  ｅｔ  ａｌ．、２００７）。
【０００７】
組換えＦＳＨ産物のグリコシル化は、宿主細胞株に存在するグリコシルトランスフェラーゼの範囲を反映する。既存のｒＦＳＨ産物は、遺伝子操作されたチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）に由来する。ＣＨＯに由来するｒＦＳＨのグリカン修飾の範囲は、下垂体抽出物または尿のいずれかに由来する天然産物に見出される範囲よりも限定されている。ＣＨＯ由来のｒＦＳＨに見出されるグリカン不均質性低減の例には、バイセクティンググルコサミンの欠如、ならびにコアフコシル化およびアセチルラクトサミン伸長の含有量低減が含まれる（Ｈａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．、１９９０）。加えて、ＣＨＯ細胞は、α２，３結合を使用してシアル酸を付加することができるに過ぎない（Ｋａｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ、１９８８、Ｔａｋｅｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ、１９８８、Ｓｖｅｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９９０）。これは、α２，３およびα２，６結合シアル酸が混在するグリカンを含有する天然産生ＦＳＨとは異なる。
【０００８】
組換えＦＳＨ調製物（オルガノン社製）は、下垂体、血清、または閉経後の尿のＦＳＨと比較した際に、４未満の等電点（ｐＩ）を有するＦＳＨ（酸性のアイソフォームと考えられている）の量が異なっていることが示されている（Ｕｌｌｏａ−Ａｇｕｉｒｒｅ  ｅｔ  ａｌ．１９９５）。尿調製物の酸性アイソフォームの量は、組換え産物であるＧｏｎａｌ−Ｆ（Ｓｅｒｏｎｏ社製）およびＰｕｒｅｇｏｎ（Ｏｒｇａｎｏｎ社製）と比較して、はるかに高かった（Ａｎｄｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．２００４）。硫酸化修飾された負荷電グリカンのＦＳＨにおける含有量は低いため、これは、ｒＦＳＨのシアル酸モル含有量が低いことを反映しているはずである。天然ＦＳＨと比較してシアル酸含有量がより低いことは、市販の両ＦＳＨ製品の特徴であり、したがって製造工程における制限を反映しているはずである（Ｂａｓｓｅｔｔ  ａｎｄ  Ｄｒｉｅｂｅｒｇｅｎ、２００５）。
【０００９】
ＦＳＨグリコシル化の個体間相異および排卵周期中の変動を分析し、説明しようと試みる科学的研究が大量に存在する。主な考察のうちの１つは、ＦＳＨ濃度およびシアル酸含有量が両方とも、排卵周期の排卵前期中に減少するという観察に関する。シアル酸含有量の減少は、より迅速に除去され、かつ少なくともｉｎ  ｖｉｔｒｏで標的受容体に対してより強力である、より塩基性のＦＳＨをその結果としてもたらす（Ｚａｍｂｒａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．１９９６）。これらの変動の生物学的関連性およびこれらの変動が優性卵胞の選択にどのように関与しているかに関する問題は、未解明のままである（Ｕｌｌｏａ−Ａｇｕｉｒｒｅ、２００３による総説）。
【００１０】
ＦＳＨの循環寿命（ｃｉｒｃｕｌａｔｏｒｙ  ｌｉｆｅ−ｔｉｍｅ）は、様々な供給源に由来する物質で実証されている。これらの物質の幾つかは、それらのｐＩにより特徴づけられるような全体的な分子電荷に基づいて分画されており、そこではより強い酸性はより高い負電荷と等しい。以前に記述されているように、全体的な分子電荷の主な寄与要因は、各ＦＳＨ分子の総シアル酸含有量である。例えば、ｒＦＳＨ（Ｏｒｇａｎｏｎ社製）は、約８ｍｏｌ／ｍｏｌのシアル酸含有量を有しているが、尿由来のＦＳＨはより高いシアル酸含有量を有している（ｄｅ  Ｌｅｅｕｗ  ｅｔ  ａｌ．１９９６）。ラットにおける対応する血漿クリアランス速度は、０．３４および０．１４ｍｌ／分である（Ｕｌｌｏａ−Ａｇｕｉｒｒｅ  ｅｔ  ａｌ．２００３）。組換えＦＳＨの試料が、高ｐＩ画分および低ｐＩ画分に分割された別の例では、高ｐＩ（シアル酸含有量がより低い）画分のｉｎ
ｖｉｖｏ効力は減少しており、より短期間の血漿半減期を示した（Ｄ’Ａｎｔｏｎｉｏ
ｅｔ  ａｌ．１９９９）。排卵周期の後期中に循環するより塩基性のＦＳＨが、エストラジオールレベルの増加により引き起こされる下垂体前葉でのα２，３シアリル−トランスフェラーゼの下方制御に起因することも報告されている（Ｄａｍｉａｎ−Ｍａｔｓｕｍａｒａ  ｅｔ  ａｌ．１９９９．Ｕｌｌｏａ−Ａｇｕｉｒｒｅ  ｅｔ  ａｌ．２００１）。α２，６シアリル−トランスフェラーゼに関する結果は報告されていない。
【００１１】
ＦＳＨおよびｒＦＳＨの総シアル酸含有量は、シアル酸が一般的に２つの様式で結合さ
れているため、直接的に比較することができない。下垂体／血清／尿のＦＳＨは、α２，３およびα２，６結合のシアル酸を両方とも含有しており、前者が圧倒的に多い。しかしながら、ＣＨＯ細胞に由来する組換え体は、α２，３のみを含有する（Ｋａｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ、１９８８、Ｔａｋｅｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ、１９８８、Ｓｖｅｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９９０）。これは、後者のシアル酸含有量が全体的に低いことに加えて、天然産物と現行の組換え産物との間にある別の相異である。
【００１２】
ＣＨＯ細胞は、医薬品ヒト組換えタンパク質の生産に一般的に使用されている。構造解析により、シアル酸はα２，３結合によってのみ結合していることが特定されている。（Ｋａｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ、１９８８、Ｔａｋｅｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ、１９８８、Ｓｖｅｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９９０）。多くのヒト糖タンパク質では、α２，３結合およびα２，６結合の両方が混在する。したがって、ＣＨＯ系を使用して発現させた組換えタンパク質は、末端シアル酸結合のタイプが天然対応物と異なるだろう。このことは、糖鎖がこの分子の薬理学的属性に寄与している可能性があるため、医薬品に使用するための生物学的調製物の生産において考慮すべき重要な点である。
【発明の概要】
【００１３】
ヒト尿からもたらされる産物の生理化学的および薬物動態学的特性をより厳密に再現または模倣するｒＦＳＨ産物を有することが望まれている。既知の組換え産物と比較して薬物動態学的特性（複数可）が向上したｒＦＳＨ産物を有することが望まれている。
【００１４】
本発明によると、α２，３シアリル化とα２，６シアリル化とを含む、および任意選択的にα２，８シアリル化を含んでもよい、組換えＦＳＨ（「ｒＦＳＨ」または「ｒｅｃＦＳＨ」）が提供される。本発明によるｒＦＳＨ（またはｒＦＳＨ調製物）は、総シアリル化の１０％以上が、α２，３シアリル化であってもよく、例えば総シアリル化の６５〜８５％が、α２，３シアリル化であってもよい。本発明のｒＦＳＨ（またはｒＦＳＨ調製物）は、総シアリル化の５０％以下が、α２，６シアリル化であってもよく、例えば総シアリル化の１５〜３５％が、α２，６シアリル化であってもよい。本発明のｒＦＳＨ（またはｒＦＳＨ調製物）は、総シアリル化の５％以下が、α２，８シアリル化であってもよく、例えば総シアリル化の０．１〜４％がα２，８シアリル化であってもよい。本発明によるｒＦＳＨ（またはｒＦＳＨ調製物）は、６ｍｏｌ／ｍｏｌ以上の、例えば６ｍｏｌ／ｍｏｌ〜１５ｍｏｌ／ｍｏｌのシアル酸含有量［シアル酸モル数対タンパク質モル数の比率として表されている］を有してもよい。
【００１５】
本出願者らは、シアル酸結合のタイプ、α２，３−またはα２，６−が、ＦＳＨの生物学的クリアランスに劇的な影響を及ぼすことができることを見出した。ＣＨＯ細胞株とは異なり、ヒト細胞株は、シアル酸がα２，３結合およびα２，６結合の両方により結合されている組換えＦＳＨを発現することができる。実施例４では、α２，３結合シアル酸およびα２，６結合シアル酸のレベルが両方とも低いグリカンを含有するＦＳＨを発現した組換えＦＳＨ細胞株が作製された（図６）。シアル酸含有量が限定されているこの塩基性物質（図４）は、予測どおり、ラットの循環から非常に迅速に除去された（図７）。その後、この細胞株を、α２，６−シアリル−トランスフェラーゼをコードする遺伝子を付加する第２の操作（ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）ステップに供した（実施例５）。その結果生じたｒＦＳＨは、高度にシアリル化されており、尿のＦＳＨと同様のシアル酸含有量およびｐＩ分布を示した（図５）。しかしながら、この物質は、シアル酸含有量が低かった元の物質と同様の速度でラットの循環から非常に迅速に除去された（図８）。天然の生物学的に活性なＦＳＨのシアル酸の一部は、α２，６結合であることが知られているため、これは予期しない観察だった。α２，６−シアリル化ｒＦＳＨのクリアランスは、肝臓に見出されるアシアロ糖タンパク質（ＡＳＧＰ）受容体により媒介されることが見出された（実施例９）。これは、この受容体の別の基質を過剰量で使用して、ＡＳＧＰ受容体を一時
的にブロックすることにより実証された。受容体をアシアロフェツインでブロックすると、この高度にシアリル化された物質の予測通りのクリアランスが回復した（図９）。これは、ブロックが克服されて、α２，６結合の高度にシアリル化されたｒＦＳＨの速やかなクリアランスが再開されるまで、数時間維持された。
【００１６】
α２，３およびα２，６結合シアル酸の両方が混在する組換えＦＳＨは、ｒＦＳＨおよびα２，３シアリルトランスフェラーゼの両方を発現するようにヒト細胞株を操作する（ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）ことにより作製した（実施例４および実施例５）。発現された産物は高度に酸性であり、α２，３結合シアル酸およびα２，６結合シアル酸の両方が混在しており、後者は内因性シアリルトランスフェラーゼ活性によりもたらされる（図６）。これは、従来のＣＨＯ細胞で発現されるｒＦＳＨに対して以下の２つの利点を有する：第１には、この物質が、２つのシアリルトランスフェラーゼの合わさった活性によってより高度にシアリル化されており、第２には、この物質が、天然ＦＳＨにより類似している。これは、α２，３結合シアル酸のみを産生し（Ｋａｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ、１９８８、Ｔａｋｅｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ、１９８８、Ｓｖｅｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９９０）、シアル酸含有量が低い（Ｕｌｌｏａ−Ａｇｕｉｒｒｅ  ｅｔ  ａｌ．１９９５．、Ａｎｄｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．２００４）、ＣＨＯ細胞由来の組換え産物と比較して、より生物学的に適切である可能性が高い。
【００１７】
驚くべきことに、本出願者らは、本発明のｒＦＳＨが、他の組換え産物より、天然ヒト尿産物の生理化学的および薬物動態学的特性をより厳密に再現または模倣することができることを見出した。言いかえれば、本発明のｒＦＳＨは「天然」ＦＳＨにより類似している可能性がある。これは、投薬などに関して顕著な利点を有している可能性がある。さらに、より「天然の」またはより「ヒトに類似した」産物は、ある意味では可能な限り「天然」に類似した人工物ではあるが、治療を望む可能性がある患者により望ましい場合がある。他の組換え産物より天然（例えば、ヒト尿）ＦＳＨに類似した糖鎖（例えばグリカン）構造を有する組換え産物には、他の利点（例えば、薬物動態学的利点）が存在する可能性がある。
【００１８】
したがって、本発明は、α２，３シアル酸およびα２，６シアル酸の混在する、したがってより厳密に天然ＦＳＨに類似している組換え型ＦＳＨである。ＩＶＦ技術における卵巣刺激および排卵誘発の制御に本化合物を使用すると、その結果として既存の組換え産物と比較してより自然な卵巣刺激がもたらされることになることが予想される。
【００１９】
本発明によると、α２，３シアリル化、およびα２，６シアリル化を含む組換えＦＳＨ（「ｒＦＳＨ」または「ｒｅｃＦＳＨ」）（および／または組換えＦＳＨ調製物）が提供される。ｒＦＳＨまたはｒＦＳＨ調製物は、任意選択的にα２，８シアリル化をさらに含んでいてもよい。
【００２０】
本明細書中では、「組換えＦＳＨ調製物」という用語は、例えば、組換えＦＳＨを含む医薬品に使用するための調製物を含む。本発明の実施形態では、ｒＦＳＨは、単一のアイソフォームとして存在してもよく、またはアイソフォームの混合物として存在してもよい。
【００２１】
本発明によるｒＦＳＨ（またはｒＦＳＨ調製物）は、シアル酸含有量［シアル酸モル数対タンパク質モル数の比率として表されている］が、６ｍｏｌ／ｍｏｌ以上（実施例８）、例えば６ｍｏｌ／ｍｏｌ〜１５ｍｏｌ／ｍｏｌ、例えば８ｍｏｌ／ｍｏｌ〜１４ｍｏｌ／ｍｏｌ、例えば１０ｍｏｌ／ｍｏｌ〜１４ｍｏｌ／ｍｏｌ、例えば１１ｍｏｌ／ｍｏｌ〜１４ｍｏｌ／ｍｏｌ、例えば１２ｍｏｌ／ｍｏｌ〜１４ｍｏｌ／ｍｏｌ、例えば１２ｍｏｌ／ｍｏｌ〜１３ｍｏｌ／ｍｏｌであってもよい。本発明のｒＦＳＨは、ヒト細胞株で
産生または発現させてもよい。
【００２２】
本発明によるｒＦＳＨ（またはｒＦＳＨ調製物）は、総シアリル化の１０％以上が、α２，３シアリル化であってもよい。例えば、総シアリル化の２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、または９０％以上が、α２，３シアリル化であってもよい。ｒＦＳＨ（またはｒＦＳＨ調製物）は、総シアリル化の６５〜８５％、例えば総シアリル化の７０〜８０％、例えば総シアリル化の７１〜７９％の量のα２，３シアリル化を含んでいてもよい。本発明のｒＦＳＨ（またはｒＦＳＨ調製物）は、総シアリル化の５０％以下が、α２，６シアリル化であってもよい。例えば、総シアリル化の４０、３０、２０、１０、または５％以下が、α２，６シアリル化であってもよい。ｒＦＳＨ（またはｒＦＳＨ調製物）は、総シアリル化の１５〜３５％、例えば総シアリル化の２０〜３０％、例えば総シアリル化の２１〜２９％の量のα２，６シアリル化を含んでいてもよい。本発明のｒＦＳＨ（またはｒＦＳＨ調製物）は、総シアリル化の５％以下が、α２，８シアリル化であってもよい。例えば、総シアリル化の２．５％以下がα２，８シアリル化であってもよい。ｒＦＳＨ（またはｒＦＳＨ調製物）は、総シアリル化の０．１〜４％、例えば総シアリル化の０．５〜３％、例えば総シアリル化の０．５〜２．５％の量のα２，８シアリル化を含んでいてもよい。シアリル化とは、ＦＳＨ糖鎖構造に存在するシアル酸残基の量を意味する。α２，３シアリル化とは、２，３位（当技術分野で周知であるような）におけるシアリル化を意味しており、α２，６シアリル化とは、２，６位（これも当技術分野で周知）におけるシアリル化を意味する。したがって、「総シアリル化の％はα２，３シアリル化であってもよい」とは、２，３位でシアリル化されているＦＳＨに存在するシアル酸残基の総数の％を指す。「総シアリル化の％はα２，６シアリル化であってもよい」という用語は、２，６位でシアリル化されているＦＳＨに存在するシアル酸残基の総数の％を指す。
【００２３】
本発明によるｒＦＳＨ（またはｒＦＳＨ調製物）は、シアル酸含有量（１ＦＳＨ分子当たりのシアリル化量）が、質量（糖鎖およびタンパク質の質量ではなく、タンパク質の質量に基づく）で、６％以上（例えば６％〜１５％、例えば７％〜１３％、例えば８％〜１２％、例えば１１％〜１５％、例えば１２％〜１４％）であってもよい。
【００２４】
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で発現された組換えＦＳＨは、α２，３シアリル化のにを含んでいる（Ｋａｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ、１９８８、Ｔａｋｅｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．１９８８、Ｓｖｅｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９０）。
【００２５】
本発明のｒＦＳＨは、ヒト細胞株で産生または発現させてもよい。例えばシアリル化を保持する細胞増殖培地の取扱いおよびコントロールは公知の工程ほど重要ではないと考えられるため、これにより、生産方法を単純化する（かつより効率的にする）ことができる。本方法はより効率的でもあり得る。なぜなら、公知のｒＦＳＨ産物を生産する際よりも塩基性ｒＦＳＨがほとんど産生されず、より多くの酸性ｒＦＳＨが産生され、塩基性ＦＳＨの分離／除去はそれほど問題ではないためである。ｒＦＳＨは、Ｐｅｒ．Ｃ６細胞株、Ｐｅｒ．Ｃ６由来細胞株、または改変Ｐｅｒ．Ｃ６細胞株で産生または発現させることができる。細胞株は、α２，３−シアリルトランスフェラーゼを使用して改変されていてもよい。細胞株は、α２，６−シアリルトランスフェラーゼを使用して改変されていてもよい。あるいはまたはそれに加えて、ｒＦＳＨは、［細胞株］の内因性シアリルトランスフェラーゼ活性によりもたらされるα２，６結合シアル酸（α２，６シアリル化）を含んでいてもよい。
【００２６】
ｒＦＳＨは、α２，３および／またはα２，６シアリルトランスフェラーゼを使用して産生させてもよい。ｒＦＳＨは、α２，３シアリルトランスフェラーゼを使用して産生させてもよい。ｒＦＳＨは、内因性シアリルトランスフェラーゼ活性によりもたらされるα２，６結合シアル酸（α２，６シアリル化）を含んでいてもよい。
【００２７】
さらなる態様の本発明によると、本明細書中に記載のような（本発明の態様による）ｒＦＳＨおよび／またはｒＦＳＨ調製物の生産方法であって、ヒト細胞株、例えばＰｅｒ．Ｃ６細胞株、Ｐｅｒ．Ｃ６由来細胞株、または改変Ｐｅｒ．Ｃ６細胞株、例えばα２，３シアリルトランスフェラーゼを使用して改変された細胞株でｒＦＳＨを産生または発現させるステップを含む方法が提供される。
【００２８】
ｒＦＳＨ構造はグリカン部分を含有している。分岐が生じる場合があり、その結果グリカンは、当技術分野で周知であるように、１、２、３、または４つ以上の末端糖残基または「アンテナ（antennae）」を有する場合がある。本発明のｒＦＳＨは、モノ−アンテナおよび／またはジ−アンテナおよび／またはトリ−アンテナおよび／またはテトラ−アンテナ構造上にシアリル化が存在するグリカンを有していてもよい。ｒＦＳＨは、好ましくは、モノ−シアリル化、ジ−シアリル化、トリ−シアリル化、およびテトラ−シアリル化グリカン構造を以下のような相対量で含んでいてもよい：９〜１５％のモノシアリル化、２７〜３０％のジ−シアリル化、３０〜３６％のトリ−シアリル化、および２５〜２９％のテトラ−シアリル化（例えば、実施例８ｃで示されている荷電グリカンのＷＡＸ分析により示されたような）。
【００２９】
さらなる態様の本発明によると、ヒト細胞株で産生された（例えば、発現された）ｒＦＳＨが提供される。ｒＦＳＨは、α２，３およびα２，６シアリル化を含んでいてもよい。ｒＦＳＨは、Ｐｅｒ．Ｃ６細胞株、Ｐｅｒ．Ｃ６由来細胞株、または改変Ｐｅｒ．Ｃ６細胞株で産生または発現させることができる。細胞株は、α２，３−シアリルトランスフェラーゼを使用して改変されていてもよい。細胞株は、α２，６−シアリルトランスフェラーゼを使用して改変されていてもよい。あるいはまたはそれに加えて、ｒＦＳＨは、［細胞株］の内因性シアリルトランスフェラーゼ活性によりもたらされるα２，６結合シアル酸（α２，６シアリル化）を含んでいてもよい。ｒＦＳＨ（またはｒＦＳＨ調製物）は、総シアリル化の１０％以上が、α２，３シアリル化であってもよく、例えば総シアリル化の６５〜８５％がα２，３シアリル化であってもよい。本発明のｒＦＳＨ（またはｒＦＳＨ調製物）は、総シアリル化の５０％以下が、α２，６シアリル化であってもよく、例えば総シアリル化の１５〜３５％がα２，６シアリル化であってもよい。本発明のｒＦＳＨ（またはｒＦＳＨ調製物）は、総シアリル化の５％以下が、α２，８シアリル化であってもよく、例えば総シアリル化の０．５〜４％がα２，８シアリル化であってもよい。ｒＦＳＨは、６ｍｏｌ／ｍｏｌ以上の、例えば６ｍｏｌ／ｍｏｌ〜１５ｍｏｌ／ｍｏｌのシアル酸含有量［シアル酸モル数対タンパク質モル数の比率として表されている］を有してもよい。
【００３０】
さらなる態様の本発明によると、α２，３シアリル化およびα２，６シアリル化（例えば、上記のような）を含むｒＦＳＨを含む医薬組成物が提供される。医薬組成物は、ｈＣＧおよび／またはＬＨをさらに含んでいてもよい。
【００３１】
ｈＣＧは、当技術分野で公知の任意の手段により取得することができる。ｈＣＧは、本明細書中で使用される場合、ヒト由来の組換えｈＣＧを含む。ヒト由来のｈＣＧは、当技術分野で公知の任意の方法により任意の適切な供給源（例えば、尿および胎盤）から精製することができる。組換えｈＣＧを発現および精製する方法は、当技術分野で周知である。
【００３２】
ＬＨは、当技術分野で公知の任意の手段により取得することができる。ＬＨは、本明細書中で使用される場合、ヒト由来の組換えＬＨを含む。ヒト由来のＬＨは、当技術分野で公知の任意の方法により任意の適切な供給源（例えば、尿）から精製することができる。組換えＬＨを発現および精製する方法は、当技術分野で周知である。
【００３３】
医薬組成物は、例えば不妊症の治療用、例えば補助生殖技術（ＡＲＴ）、排卵誘発、または子宮腔内授精（ＩＵＩ）用であってもよい。医薬組成物は、例えば、公知のＦＳＨ調製物が使用される医学的適応に使用することができる。本発明は、本明細書に記載の（本発明の態様による）ｒＦＳＨおよび／またはｒＦＳＨ調製物の、不妊症治療または不妊症治療用の薬剤の製造における使用も提供する。本発明の医薬組成物は、任意の薬物投与経路、例えば経口、直腸、非経口、経皮的（例えば、パッチ技術）、静脈内、筋肉内、皮下、槽内（intrasusternal）、膣内、腹腔内、局所的（散剤、軟膏剤、または滴下剤）、またはバッカルもしくは鼻内噴霧用の周知の組成物に製剤化することができる。典型的な組成物は、なかでもＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｆｉｆｔｅｅｎｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｍａｔｔ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、１９７５）の１４０５〜１４１２ページおよび１４６１〜８７ページ、ならびにｔｈｅ  ｎａｔｉｏｎａｌ  ｆｏｒｍｕｌａｒｙ  ＸＩＶ  ｆｏｕｒｔｅｅｎｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ、１９７５）に記載の、水溶液、塩および保存剤を含む非毒性賦形剤、ならびに緩衝剤などの薬学的に許容される担体を含む。
【００３４】
好適な水性および非水性の医薬用担体、希釈剤、溶媒、または媒体の例には、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、およびポリエチレングリコールなどのような）、カルボキシメチルセルロース、およびそれらの好適な混合物、植物油（オリーブオイルなど）、ならびにオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルが含まれる。
【００３５】
本発明の組成物は、これらに限定されないが、保存剤、湿潤剤、乳化剤、および分散剤などの添加剤も含有することができる。抗菌剤および抗真菌剤が、微生物の増殖を予防するために含まれていてもよく、それらには、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、およびソルビン酸などを含む。さらに、糖および塩化ナトリウムなどのような等張剤を含むことが望ましい場合がある。
【００３６】
時には、持続的効果を達成するために、皮下または筋肉内注射からのＦＳＨ（およびもし存在すれば他の活性成分）の吸収を遅延させることが望ましい。これは、水溶性が低い結晶または非結晶性物質の液体懸濁剤を使用することにより達成することができる。したがって、ＦＳＨの吸収速度はその溶解速度に依存するところ、溶解速度は結晶サイズおよび結晶形態に依存し得る。あるいは、非経口的に投与したＦＳＨ配合剤形態の遅延吸収は、ＦＳＨ配合剤を油性媒体に溶解または懸濁させることにより達成される。
【００３７】
注射可能なデポー形態は、ポリ乳酸−ポリグリコリドなどの生分解性ポリマー中でＦＳＨ（およびもし存在すれば他の作用剤）のマイクロカプセルマトリックスを形成することにより作製することができる。ＦＳＨ対ポリマーの比率、および使用する特定のポリマーの性質に依存して、ＦＳＨ放出の速度を制御することができる。他の生分解性ポリマーの例には、ポリビニルピロリドン、ポリ（オルトエステル）、ポリ（無水物）が含まれる。デポー注射製剤は、体内組織と適合するリポソームまたはマイクロエマルジョン中にＦＳＨを捕捉することによっても調製することができる。
【００３８】
注射可能な製剤は、例えば、細菌除去フィルターでろ過することにより、または使用直前に滅菌水または他の無菌注射可能媒体に溶解または分散することができる無菌固形組成物の形態の殺菌剤を組み込むことにより、殺菌することができる。注射可能な製剤は、任意の好適な容器、例えばバイアル、充填済シリンジ、および注射カートリッジなどで供給することができる。
【００３９】
注射可能な製剤は、ＦＳＨ（任意選択的にｈＣＧ、ＬＨなどと共に）を含有する医薬組成物を有する製品として供給することができる。複数の活性成分（つまり、ＦＳＨおよび例えばｈＣＧまたはＬＨ）が存在する場合、これらは、個別投与または同時投与に好適であり得る。個別投与の場合、投与は連続的であってもよい。製品は任意の適切な包装で供給することができる。例えば、製品は、ＦＳＨ、ｈＣＧ、またはＦＳＨとｈＣＧとの両組合せのいずれかを含有する多数の充填済シリンジを含むことができ、シリンジは、ブリスター包装または殺菌を維持する他の手段に包装されている。製品は、任意選択的にＦＳＨおよびｈＣＧ製剤を使用するための説明書を含有することができる。
【００４０】
医薬組成物の種々の成分のｐＨおよび正確な濃度は、当分野での日常的な作業により調整される。ＧＯＯＤＭＡＮ  ａｎｄ  ＧＩＬＭＡＮ’ｓ  ＴＨＥ  ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＢＡＳＩＳ  ＦＯＲ  ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＥＳ、第７版を参照されたい。好ましい実施形態では、本発明の組成物は、非経口投与用組成物として供給される。非経口製剤を調製するための一般的方法は、当技術分野で公知であり、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ；  ＴＨＥ  ＳＣＩＥＮＣＥ  ＡＮＤ  ＰＲＡＣＴＩＣＥ  ＯＦ  ＰＨＡＲＭＡＣＹ、上記、７８０〜８２０ページに記載されている。非経口用組成物は、液体製剤中で、または投与直前に無菌注射剤媒体と混合されることになる固形として供給することができる。特に好ましい実施形態では、非経口用組成物は、投与および均一な用量を容易にするために単位剤形で供給される。
【００４１】
本発明は、これから以下の実施例および添付の図面を参照してより詳細に説明される。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】ｐＦＳＨアルファ／ベータ発現ベクターのプラスミド地図を示す図である。
【図２】α２，３−シアリルトランスフェラーゼ（ＳＴ３ＧＡＬ４）発現ベクターを示す図である。
【図３】α２，６−シアリルトランスフェラーゼ（ＳＴ６ＧＡＬ１）発現ベクターを示す図である。
【図４】安定的にＦＳＨを発現するＰｅｒ．Ｃ６細胞により産生された組換えＦＳＨの等電点電気泳動を示す図である。
【図５】α２，３−またはα２，６−シアリルトランスフェラーゼで操作した後で安定的にＦＳＨを発現するＰｅｒ．Ｃ６細胞により産生された組換えＦＳＨの等電点電気泳動により分析されたクローンの例を示す図である。
【図６Ａ】Ｐｅｒ．Ｃ６  ＦＳＨのシアル酸結合の分析を示す図である。
【図６Ｂ】Ｐｅｒ．Ｃ６  ＦＳＨのシアル酸結合の分析を示す図である。
【図７】Ｐｅｒ．Ｃ６  ＦＳＨ試料の代謝クリアランス率（ＭＣＲ）を示す図である。
【図８】α２，６−シアリトランスフェラーゼ（sialytransferase）で操作したＰｅｒ．Ｃ６  ＦＳＨ試料のＭＣＲを示す図である。
【図９】α２，６−シアリトランスフェラーゼで操作したＰｅｒ．Ｃ６  ＦＳＨ試料のＭＣＲを示す図である。
【図１０】α２，３−シアリトランスフェラーゼで操作したＰｅｒ．Ｃ６  ＦＳＨ試料のＭＣＲを示す図である。
【図１１】ＳｔｅｅｌｍａｎおよびＰｏｈｌｅｙ（１９５３年）の方法に従った、親Ｐｅｒ．Ｃ６  ｒＦＳＨのＰｅｒ．Ｃ６  ｒＦＳＨクローンによる卵巣重量増大を示す図である。
【図１２】操作した（α２，６−シアリルトランスフェラーゼ）Ｐｅｒ．Ｃ６  ｒＦＳＨのＰｅｒ．Ｃ６  ｒＦＳＨクローンによる卵巣重量増大を示す図である。
【図１３】操作した（α２，３−シアリルトランスフェラーゼ）Ｐｅｒ．Ｃ６  ｒＦＳＨのＰｅｒ．Ｃ６  ｒＦＳＨクローンによる卵巣重量増大を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
配列選択
ヒトＦＳＨ
ＦＳＨアルファポリペプチドの遺伝子のコード領域を、ＦｉｄｄｅｓおよびＧｏｏｄｍａｎ（１９８１年）に従って使用した。この配列は、ＡＨ００７３３８として寄託されており、構築時には、このタンパク質配列の他の変異体は存在しなかった。この配列は、本明細書中では配列番号１として参照される。
【００４４】
ＦＳＨベータポリペプチドの遺伝子のコード領域を、Ｋｅｅｎｅら（１９８９年）に従って使用した。この配列は、ＮＭ＿０００５１０として寄託されており、構築時には、このタンパク質配列の他の変異体は存在しなかった。この配列は、本明細書中では配列番号２として参照される。
【００４５】
シアリルトランスフェラーゼ
α２，３−シアリルトランスフェラーゼ：ベータガラクトシドアルファ−２，３−シアリルトランスフェラーゼ４（α２，３−シアリルトランスフェラーゼ、ＳＴ３ＧＡＬ４）の遺伝子のコード領域を、ＫｉｔａｇａｗａおよびＰａｕｌｓｏｎ（１９９４年）に従って使用した。この配列は、Ｌ２３７６７として寄託されており、本明細書中では配列番号３として参照される。
【００４６】
α２，６−シアリルトランスフェラーゼ：ベータガラクトサミドアルファ−２，６−シアリルトランスフェラーゼ１（α２，６−シアリルトランスフェラーゼ、ＳＴ６ＧＡＬ１）の遺伝子のコード領域を、Ｇｒｕｎｄｍａｎｎら（１９９０年）に従って使用した。この配列は、ＮＭ＿００３０３２として寄託されており、本明細書中では配列番号４として参照される。
【実施例】
【００４７】
実施例１
ＦＳＨ発現ベクターの構築
ＦＳＨアルファポリペプチド（ＡＨ００７３３８、配列番号１）のコード配列、およびＦＳＨベータポリペプチド（ＮＭ＿００３０３２、配列番号２）を、プライマーの組合せＦＳＨａ−ｆｗおよびＦＳＨａ−ｒｅｖならびにＦＳＨｂ−ｆｗおよびＦＳＨｂ−ｒｅｃをそれぞれ使用して、ＰＣＲにより増幅した。
FSHa-fw 5'-CCAGGATCCGCCACCATGGATTACTACAGAAAAATATGC-3'
FSHa-rev 5'-GGATGGCTAGCTTAAGATTTGTGATAATAAC-3'
FSHb-fw 5'-CCAGGCGCGCCACCATGAAGACACTCCAGTTTTTC-3'
FSHb-rev 5'-CCGGGTTAACTTATTATTCTTTCATTTCACCAAAGG-3'
【００４８】
その結果生じた増幅ＦＳＨベータＤＮＡを、制限酵素子ＡｓｃＩおよびＨｐａＩで消化し、ネオマイシン選択マーカーを保持するＣＭＶ駆動性（ｄｒｉｖｅｎ）哺乳類発現ベクターのＡｓｃＩおよびＨｐａＩ部位に挿入した。同様に、ＦＳＨアルファＤＮＡを、ＢａｍＨＩおよびＮｈｅＩで消化し、ＦＳＨベータポリペプチドＤＮＡを既に含有していた発現ベクターのＢａｍＨＩおよびＮｈｅＩ部位に挿入した。
【００４９】
ベクターＤＮＡを使用して大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α株を形質転換した。６０個のコロニーを増幅用に選択し、５７個が、ＦＳＨアルファおよびベータの両方を含有するベクターを含有していた。これらのうちの２０個を配列決定用に選択し、すべてが配列番号１および配列番号２の通りの正確な配列を含有していた。プラスミドｐＦＳＨ  Ａ＋Ｂ＃１７をトランスフェクション用に選択した（図１）。
【００５０】
実施例２
ＳＴ３発現ベクターの構築
ベータガラクトシドアルファ−２，３−シアリルトランスフェラーゼ４（ＳＴ３、Ｌ２３７６７、配列番号３）のコード配列を、プライマーの組合せ２，３ＳＴｆｗおよび２，３ＳＴｒｅｖを使用してＰＣＲにより増幅した。
2,3STfw 5'-CCAGGATCCGCCACCATGTGTCCTGCAGGCTGGAAGC-3'
2,3STrev 5'-TTTTTTTCTTAAGTCAGAAGGACGTGAGGTTCTTG-3'
【００５１】
その結果生じた増幅ＳＴ３  ＤＮＡを、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＡｆｌＩＩで消化し、ヒグロマイシン耐性マーカーを保持するＣＭＶ駆動性哺乳類発現ベクターのＢａｍＨＩおよびＡｆｌＩＩ部位に挿入した。以前に記載されているようにベクターを増幅し、配列決定した。クローンｐＳＴ３＃１（図２）は、配列番号３の通りの正確な配列を含有しており、トランスフェクション用に選択された。
【００５２】
実施例３
ＳＴ６発現ベクターの構築
ベータガラクトサミドアルファ−２，６−シアリルトランスフェラーゼ１（ＳＴ６、ＮＭ＿００３０３２、配列番号４）のコード配列を、プライマーの組合せ２，６ＳＴｆｗおよび２，６ＳＴｒｅｖを使用してＰＣＲにより増幅した。
2,6STfw 5'-CCAGGATCCGCCACCATGATTCACACCAACCTGAAG-3'
2,6STrev 5'-TTTTTTTCTTAAGTTAGCAGTGAATGGTCCGG-3'
【００５３】
その結果生じた増幅ＳＴ６  ＤＮＡを、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＡｆｌＩＩで消化し、ヒグロマイシン耐性マーカーを保持するＣＭＶ駆動性哺乳類発現ベクターのＢａｍＨＩおよびＡｆｌＩＩ部位に挿入した。以前に記載されているようにベクターを増幅し、配列決定した。クローンｐＳＴ６＃１１（図３）は、配列番号４の通りの正確な配列を含有しており、トランスフェクション用に選択された。
【００５４】
実施例４
ＰＥＲ．Ｃ６細胞におけるｐＦＳＨ  Ａ＋Ｂの安定的発現。クローンのトランスフェクション単離およびスクリーニング。
ＦＳＨを産生するＰｅｒ．Ｃ６クローンを、単一プラスミドからＦＳＨの両ポリペプチド鎖を発現させることにより産生した（実施例１を参照）。
【００５５】
安定的クローンを取得するために、リポソームに基づくトランスフェクション剤をｐＦＳＨ  Ａ＋Ｂ構築体と共に使用した。安定的クローンを、１０％ＦＣＳが添加され、Ｇ４１８を含有するＶＰＲＯ中で選択した。トランスフェクションの３週間後に、Ｇ４１８耐性クローンが増殖した。計２５０個のクローンを選択して単離した。単離されたクローンを、７０〜８０％コンフルエントまで選択培地で培養した。上清を、ＦＳＨ選択的ＥＬＩＳＡを使用してＦＳＨタンパク質含有量について分析し、およびｃＡＭＰ蓄積アッセイを使用してクローン細胞系のＦＳＨ受容体での薬理活性について分析した。機能的タンパク質を発現するクローン（９８個）を、２４ウエル、６ウエル、およびＴ８０フラスコで培養増殖に進ませた。
【００５６】
７つのクローンに由来する物質の生産性および品質を決定する研究をＴ８０フラスコで開始し、十分な材料を産生させた。細胞を、以前に記載されているように添加培地で７日間培養し、上清を回収した。生産性は、ＦＳＨ選択的ＥＬＩＳＡを使用して測定した。材料の等電点特性を測定した（実施例６）。代表的な試料を図４に示す。ＩＥＦからの情報を使用して、代謝クリアランス率を分析するためのクローンを選択した（実施例９）。十
分な生産性および品質を有するクローン（００５、１０４、１７９、２２３、１４４）を選択して、シアリルトランスフェラーゼで操作した。
【００５７】
実施例５
シアリル化のレベルは、α２，３−またはα２，６−シアリルトランスフェラーゼを過剰発現する細胞で増加する。ＰＥＲ．Ｃ６細胞を発現するＦＳＨにおけるｐＳＴ３またはｐＳＴ６の安定的な発現；クローンのトランスフェクション単離およびスクリーニング。
ＦＳＨの両ポリペプチド鎖を既に発現しているＰｅｒ．Ｃ６細胞においてα２，３シアリルトランスフェラーゼまたはα２，６シアリルトランスフェラーゼを別々のプラスミド（実施例２および３を参照）から発現させることにより、高度にシアリル化されたＦＳＨを産生するＰｅｒ．Ｃ６クローンを生成した（実施例４を参照）。実施例４で示したようなＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞から生成した４つのクローンを、生産性、良好な増殖特性、機能的タンパク質の産生、および産生されたＦＳＨ（幾らかのシアリル化を含む）などの特徴によって選択した。
【００５８】
実施例４で前述したように、安定的なクローンが生成された。α２，３−シアリルトランスフェラーゼプログラムに由来する計２０２個のクローン、およびα２，６−シアリルトランスフェラーゼプログラムに由来する２１０個のクローンを単離、増殖、およびアッセイした。α２，３−研究用の最終クローン数は１２個であり、α２，６−研究用は３０個だった。
【００５９】
α２，３−シアリルトランスフェラーゼクローンを無血清培地および懸濁条件に適応させた。
【００６０】
上記のように、ＦＳＨ選択的ＥＬＩＳＡ、ＦＳＨ受容体細胞系における機能的応答、ＩＥＦ（実施例６）、代謝クリアランス率（実施例９）、およびＳｔｅｅｌｍａｎ  Ｐｏｈｌｅｙ分析（実施例１０）を使用して、クローンをアッセイした。結果を、市販の組換えＦＳＨ（Ｇｏｎａｌ−ｆ、Ｓｅｒｏｎｏ社製）および親ＦＳＨ  Ｐｅｒ．Ｃ６細胞系と比較した。代表的な試料を図５に示す。α２，３−またはα２，６−シアリルトランスフェラーゼ無しで発現されたＦＳＨと比較して、幾つかのクローンはシアリル化の増加を示さなかったが、ほとんどのクローンにより産生されたＦＳＨはシアリル化が著しく向上していた（つまり、平均すると、多数のシアル酸を有するＦＳＨアイソフォームがより多い）ことがわかる。
【００６１】
結論として、Ｐｅｒ．Ｃ６細胞においてシアリルトランスフェラーゼをＦＳＨと一緒に発現させることは、その結果として、ＦＳＨのみを発現する細胞と比較してシアリル化ＦＳＨのレベル増加をもたらす。
【００６２】
実施例６
Ｐｅｒ．Ｃ６が産生したＦＳＨアイソフォームのｐＩの等電点電気泳動による分析。
電気泳動は、電場による荷電された分子の溶媒中の移動と定義される。電場中の生体分子の移動度は、電場の強さ、分子の正味電荷、分子のサイズおよび形状、分子が移動する媒体のイオン強度および特性に依存するだろう。
【００６３】
等電点電気泳動法（ＩＥＦ）は、タンパク質をそのｐＩに基づいて分離するための電気泳動技術である。ｐＩとは、タンパク質が正味電荷を示さず、電場中で移動しないｐＨのことである。ＦＳＨアイソフォームのシアル酸含有量によって、各アイソフォームのｐＩ点が微妙に変わるので、そのことをＩＥＦ技術を使って利用すれば、各クローンに由来するＰｅｒ．Ｃ６  ＦＳＨアイソフォームを視覚化することができる。
【００６４】
Ｐｅｒ．Ｃ６が細胞培養上清中に産生したＦＳＨアイソフォームの等電点を、等電点電気泳動法を使用して分析した。Ｐｅｒ．Ｃ６  ＦＳＨクローンからの細胞培養培地を、実施例４および５に記載されているように作った。
【００６５】
Ｐｅｒ．Ｃ６  ＦＳＨ試料を、両性電解質溶液ｐＨ３．０〜ｐＨ７．０中ｐＨ３．０〜７．０勾配の天然条件下で５％ポリアクリルアミドを含有するＮｏｖｅｘ（登録商標）ＩＥＦゲルで分離した。
【００６６】
タンパク質を、支持されたニトロセルロースに移し、一次抗ＦＳＨαモノクローナル抗体、二次抗マウスＩｇＧアルカリホスファターゼ結合抗体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）、ならびにバンドを視覚化するための５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ホスフェート（ＢＣＩＰ）およびニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）試薬を使用して視覚化した。
【００６７】
図４および５に示されるように、バンドは、異なる数のシアル酸分子を含有するＦＳＨのアイソフォームを表す。
【００６８】
この方法を使用して、多数のシアル酸分子を有するＦＳＨアイソフォームを産生するクローンを特定した。α２，３−またはα２，６−シアリルトランスフェラーゼで操作することにより、結果としてより多くのシアル酸および低ｐＩを有するクローンがもたらされた。
【００６９】
実施例７
Ｐｅｒ．Ｃ６  ＦＳＨのシアル酸結合の分析
レクチンに基づくグリカン識別法を使用して、複合糖質を分析した。この方法では、ニトロセルロースに結合した糖タンパク質および複合糖質を特徴づけることができる。レクチンは、特定の部分、例えばα２，３結合シアル酸を選択的に認識する。添加されたレクチンは、ステロイドハプテンジゴキシゲニンと結合し、これによって結合したレクチンの免疫学的検出が可能になる。
【００７０】
親クローン由来の精製Ｐｅｒ．Ｃ６  ＦＳＨ（シアリルトランスフェラーゼの追加なし）、α２，３−シアリルトランスフェラーゼ操作クローンおよびα２，６−シアリルトランスフェラーゼ操作クローンを、標準的ＳＤＳ−ＰＡＧＥ技術を使用して分離した。市販の組換えＦＳＨ（Ｇｏｎａｌ−ｆ、Ｓｅｒｏｎｏ社製）を標準物質として使用した。
【００７１】
製造業者説明書に従ってＤＩＧグリカン識別キット（カタログ番号１１  ２１０  ２３８  ００１、Ｒｏｃｈｅ社製）を使用して、シアル酸を分析した。セイヨウニワトコ（Sambucus nigra）凝集素（ＳＮＡ）との陽性反応は、末端結合（２−６）シアル酸を示した。イヌエンジュ（Maackia amurensis）凝集素ＩＩ（ＭＭＡ）との陽性反応は、末端結合
（α２−３）シアル酸を示した。
【００７２】
要約すると、親クローン００５は、α２，３−およびα２，６−シアル酸を両方とも低レベルで含有していた。α２，３−シアリルトランスフェラーゼで操作したクローンは、高レベルのα２，３−シアル酸結合および低レベルのα２，６−シアル酸結合を含有していた。α２，６−シアリルトランスフェラーゼで操作したクローンは、高レベルのα２，６−シアル酸結合および低レベルのα２，３−シアル酸結合を含有していた。基準対照Ｇｏｎａｌ−ｆは、α２，３−シアル酸結合のみを含有している。これは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で産生された組換えタンパク質について公知であることと一致している（Ｋａｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ、１９８８、Ｔａｋｅｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ、１９８８、Ｓｖｅｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９９０）。
【００７３】
結論として、α２，３−またはα２，６−シアリルトランスフェラーゼで操作したＰｅｒ．Ｃ６  ＦＳＨ細胞は、試料中のＦＳＨ結合シアル酸分子数を増加させることに成功した。
【００７４】
実施例８ａ
総シアル酸の定量
シアル酸は、単糖類と考えられているタンパク質結合炭水化物であり、ガラクトース、マンノース、グルコサミン、ガラクトサミン、およびフコースのような他のモノサッカライドとの組合せで生じる。
【００７５】
精製ｒＦＳＨ（実施例１１）の総シアル酸を、製造業者プロトコールに従って酵素的シアル酸定量キットを使用して測定した（Ｓｉｇｍａ社製、Ｓｉａｌｉｃ−Ｑ）。手短に言えば、Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼは、シアル酸に触媒作用を及ぼしてＮ−アセチルマンノアシン（N-acetylmannoasine）およびピルビン酸にする。ピルビン酸は、β−ＮＡＤＨおよび乳酸デヒドロゲナーゼにより乳酸に還元することができる。Β−ＮＡＤＨ酸化は、分光光度法で正確に測定することができる。
【００７６】
タンパク質濃度は、ローリー法に基づく市販のビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイキット（Ｓｉｇｍａ社製、Ｂ９６４３）を使用して、マイクロタイタープレート中で測定した（Ｌｏｗｒｙ  ｅｔ  ａｌ、１９５１）。
【００７７】
Ｐｅｒ．Ｃ６  ＦＳＨの総シアル酸含有量を測定し、６ｍｏｌ／ｍｏｌを超えることを見出した。
【００７８】
実施例８ｂ
α２，３、α２，６、およびα２，８シアル酸の相対量の定量
精製ｒＦＳＨ（実施例１１）のα２，３、α２，６、およびα２，８シアル酸の相対パーセント量を、公知の技術を使用して測定した。
【００７９】
ｒＦＳＨの各試料を、固定化し（ゲルブロック）、洗浄し、還元し、アルキル化し、ＰＮＧａｓｅ  Ｆで一晩消化した。その後、Ｎ−グリカンを抽出および処理した。ＮＰ−ＨＰＬＣおよびＷＡＸ−ＨＰＬＣ分析用に、Ｎ−グリカンをＲｏｙｌｅらに詳述されているようなフルオロフォア２ＡＢで標識した。Ｎ−グリカンを、ＴＳＫアミドカラム（Ｒｏｙｌｅらに詳述されているような）の順相（ＮＰ）ＨＰＬＣにかけ、保持時間をグルコース単位（ＧＵ）で表した。
【００８０】
抽出し、プールしたグリカン（上記のように抽出した）の試料を、異なるシアリダーゼで消化して結合を決定した。ＮＡＮ１（組換えシアリダーゼ）は、α２，３結合の非還元末端シアル酸（ＮｅｕＮＡｃおよびＮｅｕＮＧｃ）を放出し、ＡＢＳ（アルトロバクター・ウレアファシエンス（Arthrobacter ureafaciens）シアリダーゼ）は、α２，３、α２，６、およびα２，８結合非還元末端シアル酸（ＮｅｕＮＡｃおよびＮｅｕＮＧｃ）を放出する。試料をＮＰ−ＨＰＬＣで分析して、未消化の試料を、ＮＡＮ１で消化した試料およびＡＢＳで消化した試料と比較した。３つのＮＰ−ＨＰＬＣトレース（未消化、ＮＡＮ１消化、ＡＢＳ消化）を比較すると、ＡＢＳおよびＮＡＮ１による消化が異なる結果もたらすことが示された。これは、試料が、α２，３、α２，６、およびα２，８結合を有するシアル酸を有することを示す。相対パーセントを未消化グリカンのプールに存在する構造から計算したところ、α２，３シアリル化は６５％〜８５％の範囲（例えば、７７．７５％）であり、α２，６シアリル化は１５％〜３５％（例えば、２１．４６％）、およびα２，８シアリル化は０．１％〜３％であることが見出された。
【００８１】
実施例８ｃ
モノ、ジ、トリ、およびテトラアンテナシアリル化構造の相対量の定量
精製ｒＦＳＨ（実施例１１）から抽出したグリカンにあるモノ、ジ、トリ、およびテトラシアリル化構造の相対パーセント量を、公知の技術を使用して測定した。
【００８２】
ｒＦＳＨの各試料を、固定化し（ゲルブロック）、洗浄し、還元し、アルキル化し、ＰＮＧａｓｅ  Ｆで一夜消化した。その後、Ｎ−グリカンを抽出および処理した。ＮＰ−ＨＰＬＣおよびＷＡＸ−ＨＰＬＣ分析用に、Ｎ−グリカンをＲｏｙｌｅらに詳述されているようなフルオロフォア２ＡＢで標識した。
【００８３】
電荷によりＮ−グリカンを分離するための弱アニオン交換（ＷＡＸ）ＨＰＬＣ（実施例８ｂ）を、フェチュイン（Ｆｅｔｕｉｎ）Ｎ−グリカン標準物質を基準として、Ｒｏｙｌｅらに示されているように実施した。グリカンを、それらが含有していたシアル酸の数により溶出した。すべての試料には、モノ（１Ｓ）、ジ（２Ｓ）、トリ（３Ｓ）、およびテトラ（４Ｓ）シアリル化構造が含まれていた。シアリル化構造の相対量は、以下の比率であることが見出された（１Ｓ：２Ｓ：４Ｓ：４Ｓ）：９〜１５％：２７〜３０％：３０〜３６％：２５〜２９％（例えば、１０．２４：２８．６５：３５．４９：２５．６２）。
【００８４】
実施例９
ｒＦＳＨの代謝クリアランス率の測定
Ｐｅｒ．Ｃ６  ＦＳＨ試料の代謝クリアランス率（ＭＣＲ）を測定するために、意識のある雌ラット（１クローン当たり３匹の動物）の尾部静脈に、ｒＦＳＨのボーラスを時点ゼロで注射した（１〜１０μｇ／ラット、試料のＥＬＩＳＡ定量に基づいて、ＤＲＧ  ＥＩＡ  １２８８）。血液試料（４００μｌ）を、試験試料注射の１、２、４、８、１２、２４、および３２時間後に尾部先端から採取した。血清を遠心分離により収集し、ＥＬＩＳＡ（ＤＲＧ  ＥＩＡ  １２８８）によりＦＳＨ含有量についてアッセイした。
【００８５】
アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰ−Ｒ）は、アシアロフェツイン（ＡＳＦ）などの脱シアリ化（desialyated）（ガラクトース末端化）糖タンパク質を認識する（Ｐｒｉ
ｃｅｒ  ａｎｄ  Ａｓｈｗｅｌｌ、１９７１．Ｖａｎ  Ｌｅｎｔｅｎ  ａｎｄ  Ａｓｈｗｅｌｌ、１９７２）。ＡＳＧＰ受容体および結合した脱シアリ化糖タンパク質は、細胞内に内部移行し、そこで受容体が再利用され、リガンドが分解される（Ｒｅｇｏｅｃｚｉ  ｅｔ  ａｌ、１９７８、Ｓｔｅｅｒ  ａｎｄ  Ａｓｈｗｅｌｌ、１９８０）。
【００８６】
Ｐｅｒ．Ｃ６  ＦＳＨ物質がこの機序により除去されるかどうかを調査するために、ＡＳＧＰ−Ｒをアシアロフェツインで飽和させた。親物質、α２，６−シアリルトランスフェラーゼ操作物質、またはα２，３−シアリルトランスフェラーゼ操作物質の代謝クリアランス率を、記載したように、最低７５００倍モル過剰のアシアロフェツインを同時投与して、ＡＳＧＰ−Ｒを１〜２時間飽和させて測定した。
【００８７】
親Ｐｅｒ．Ｃ６  ＦＳＨクローンにより産生された物質は、ＭＣＲがより長い物質をある程度含有していたが、高い割合の物質が速やかに除去された（図７）。最もシアリル化した物質を含有していたリード（ｌｅａｄ）クローン００５は、α２，６−またはα２，３−シアリルトランスフェラーゼを使用して操作されていた（実施例５）。α２，６−シアリルトランスフェラーゼで操作したクローンは、シアリル化が増加していたが（図５）、ＭＣＲに改善はなかった（図７）。ＡＳＧＲのブロックは、基準物質のＭＣＲと比べてα２，６物質のＭＣＲを回復させ、α２，６結合が増加しても、この物質が速やかに除去されることが示された（図８）。α２，３−シアリルトランスフェラーゼによる操作は、その結果として、基準物質と同様のＭＣＲを有するクローンをもたらし（図９）、シアル
酸含有量が様々であったことは、ＦＳＨのアイソフォームで知られていることと一致していた（図１０）。
【００８８】
実施例１０
Ｓｔｅｅｌｍａｎ−Ｐｏｈｌｅｙ  ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイ
ＦＳＨのシアル酸含有量の増加が、その結果として生物学的効果の増加をもたらすことを示すために、高度にシアリル化されたＦＳＨ、例えば実施例５で産生されたものなど、によるラット卵巣の重量増加を検査した。
【００８９】
Ｐｅｒ．Ｃ６  ｒＦＳＨクローンによる卵巣重量の増加を、ＳｔｅｅｌｍａｎおよびＰｏｈｌｅｙ（１９５３年）の方法に従って分析した。細胞培地をろ過した試料からのＰｅｒ．Ｃ６  ｒＦＳＨを、ＥＬＩＳＡ（ＤＲＧ、ＥＩＡ−１２８８）で定量した。試料（Ｐｅｒ．Ｃ６  ｒＦＳＨ）および基準物質（Ｇｏｎａｌ−ｆ  ｒＦＳＨ）を、５つの異なる用量で試験した（３匹の動物／用量）。Ｇｏｎａｌ−ｆを、５０、１００、２００、４００、および８００ｎｇ／ラットで投与した。試料用量は、Ｇｏｎａｌ−ｆに対するそれらのＡＵＣ値を用いて計算し、典型的には０．０５〜１０μｇ／ラットであった。
【００９０】
結論としては、親Ｐｅｒ．Ｃ６  ＦＳＨクローンによって産生された低シアリル化（ｕｎｄｅｒｓｉａｌｙｌａｔｅｄ）物質（図１１）は、卵巣の重量増加アッセイにおいて市販のｒＦＳＨほど効力がなかった。追加的なα２，６結合を付加するシアリルトランスフェラーゼ操作は、シアル酸含有量を増加させたが、このｉｎ  ｖｉｖｏアッセイでは効力を向上させなかった（図１２）。しかしながら、追加的なα２，３結合は、効力を著しく向上させ（図１３）、２つの組換えＦＳＨ調製物（Ｐｅｒ．Ｃ６およびＣＨＯ由来）は、このアッセイで非常に類似した特性を示した。
【００９１】
実施例１１
産生および精製の概要
無血清培地に懸濁培養したＰＥＲ．Ｃ６細胞中でＦＳＨを産生するための手順を開発した。その手順は下記に記載されており、数個のＦＳＨ産生ＰＥＲ．Ｃ６細胞系に適用した。
【００９２】
親クローン００５、α２，３クローン００７、およびα２，６クローン０５９に由来するＦＳＨを、Ｌｏｗｒｙら（１９７６年）によって記載されている方法の変法を使用して調製した。
【００９３】
ＰＥＲ．Ｃ６−ＦＳＨを産生する場合、細胞系を無血清培地、つまりＥｘｃｅｌｌ５２５（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）に馴化させた。まず、細胞を培養して、Ｔ８０培養フラスコで、７０％〜９０％コンフルエント単層を形成させた。継代の際に、細胞を無血清培地、Ｅｘｃｅｌｌ５２５＋４ｍＭ  Ｌ−グルタミンに再懸濁して、０．３×１０6細胞／ｍｌの細胞密度にした。２５ｍｌの細胞懸濁液を２５０ｍｌの振とうフラスコ
に入れ、５％ＣＯ2、３７℃、１００ｒｐｍで振とうした。１×１０6細胞／ｍｌを超える細胞密度に達した後、０．２または０．３×１０6細胞／ｍｌの細胞密度で細胞を継代し
、３７℃、５％ＣＯ2、および１００ｒｐｍの振とうフラスコでさらに培養した。
【００９４】
ＦＳＨを産生させる場合、ＰＥＲ．Ｃ６細胞が非常に高い細胞密度（通常バッチ培養で１０7細胞／ｍｌを超える）に増殖するのを支援する無血清産生培地、つまりＶＰＲＯ（
ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）に、細胞を移した。まず細胞を、１×１０6細胞
／ｍｌを超えるまでＥｘｃｅｌｌ５２５で培養し、その後１０００ｒｐｍで５分間遠心沈降し、続いて１×１０6細胞／ｍｌの密度でＶＰＲＯ培地＋６ｍＭ  Ｌ−グルタミンに懸
濁した。その後、細胞を３７℃、５％ＣＯ2、および１００ｒｐｍで７〜１０日間振とう
フラスコで培養した。この期間中に、細胞は１０7細胞／ｍｌを超える密度に増殖した。
細胞生存率が低下し始めた後、培地を回収した。細胞を、１０００ｒｐｍで５分間遠心沈降し、上清をＦＳＨの定量および精製に使用した。ＦＳＨの濃度を、ＥＬＩＳＡ（ＤＲＧ
ＥＩＡ  １２８８）を使用して測定した。
【００９５】
その後、ＦＳＨの精製を、Ｌｏｗｒｙら（１９７６年）により記述されている方法の変法を使用して実施した。これは、ＤＥＡＥ−セルロース上のクロマトグラフィー、セファデックスＧ１００上のゲルろ過、ヒドロキシアパタイト上の吸着クロマトグラフィー、および調製用ポリアクリルアミド電気泳動によって達成された。
【００９６】
すべてのクロマトグラフィーの手順中、免疫反応性ＦＳＨの存在は、ＲＩＡ（ＤＲＧ  ＥＩＡ  １２８８）およびＩＥＦ（実施例６）によって確認された。
【００９７】
（参考文献）
Andersen CY, Westergaard LG, and van Wely M. (2004). FSH isoform composition of commercial gonadotrophin preparations: a neglected aspect? Reprod Biomed Online.9(2), 231-236.
Arey BJ, Stevis PE, Deecher DC, Shen ES, Frail DE, Negro-Vilar A, and Lopez FJ. (1997) Induction of promiscuous G protein coupling of the follicle-stimulating hormone (FSH) receptor: a novel mechanism for transducing pleiotropic actions of FSH isoforms. Mol Endocrinol. 11(5), 517-526.
Baenziger JU and Green ED. (1988). Pituitary glycoprotein hormone oligosaccharides: structure, synthesis and function of the asparagine-linked oligosaccharides on lutropin, follitropin and thyrotropin. Biochim Biophys Acta. 947(2), 287-306.
Bassett RM, and Driebergen R. (2005). Continued improvements in the quality and consistency of follitropin alfa, recombinant human FSH. Reprod Biomed Online. 10(2), 169-177. 
Damian-Matsumura P, Zaga V, Maldonado A, Sanchez-Hernandez C, Timossi C, and Ulloa-Aguirre A. (1999). Oestrogens regulate pituitary alpha2,3-sialyltransferase messenger ribonucleic acid levels in the female rat. J Mol Endocrinol. 23(2), 153-165. 
D’Antonio M., Borrelli F. , Datola A., Bucci R. , Mascia M. , Polletta P., Piscitelli D., and Papoian R. (1999) Biological characterization of recombinant human follicle stimulating hormone isoforms. Human Reproduction 14, 1160-1167
Dalpathado DS, Irungu J, Go EP, Butnev VY, Norton K, Bousfield GR, and Desaire H. (2006). Comparative glycomics of the glycoprotein follicle stimulating hormone: glycopeptide analysis of isolates from two mammalian species. Biochemistry. 45(28), 8665-8673. No copy
Dias JA, Van Roey P. (2001). Structural biology of human follitropin and its receptor. Arch Med Res. 32(6),510-519 
Fiddes, J. C. and Goodman, H. M. (1979) Isolation, cloning and sequence analysis
of the cDNA for the alpha-subunit of human chorionic gonadotropin. Nature, 281,
351-356.
Flack, M.R., Bennet, A.P., Froehlich, J. Anasti, JN and Nisula, B. (1994). Increased biological activity due to basic isoforms in recombinant human follicle-stimulating hormone produced in a human cell line. J. Clin. Endocrinol. Metab., 79,756-760
Fox KM, Dias JA, and Van Roey P. (2001). Three-dimensional structure of human follicle-stimulating hormone. Mol Endocrinol. 15(3), 378-89
Grabenhorst E, Hoffmann A, Nimtz M, Zettlmeissl G, and Conradt HS. (1995). Construction of stable BHK-21 cells coexpressing human secretory glycoproteins and human Gal(beta 1-4)GlcNAc-R alpha 2,6-sialyltransferase alpha 2,6-linked NeuAc is preferentially attached to the Gal(beta 1-4)GlcNAc(beta 1-2)Man(alpha 1-3)-branch of diantennary oligosaccharides from secreted recombinant beta-trace protein. Eur J Biochem. 232(3), 718-25. 
Green ED and Baenziger JU. (1988). Asparagine-linked oligosaccharides on lutropin, follitropin, and thyrotropin. II. Distributions of sulfated and sialylated oligosaccharides on bovine, ovine, and human pituitary glycoprotein hormones. J Biol Chem. 263(1), 36-44.
Grundmann,U., Nerlich,C., Rein,T. and Zettlmeissl, G. (1990). Complete cDNA sequence encoding human beta-galactoside alpha-2,6-sialyltransferase. G Nucleic Acids Res. 18 (3), 667
Howles, C.M. (1996). Genetic engineering of human FSH (Gonal-F). Hum Reprod. Update, 2,172-191.
Kagawa Y, Takasaki S, Utsumi J, Hosoi K, Shimizu H, Kochibe N, and Kobata A. (1988). Comparative study of the asparagine-linked sugar chains of natural human interferon-beta 1 and recombinant human interferon-beta 1 produced by three different mammalian cells. J Biol Chem. 263(33), 17508-17515.
Keene, J.L., Matzuk, M.M., Otani, T., Fauser, B,C,J,M., Galway, A.B., Hsueh, A.J.W. and Boime, I. (1989). Expression of Biologically active Human Follitropin inChinese Hamster Ovary Cells. The Journal of Biological Chemistry, 264(9), 4769-4775.
Kitagawa,H. and Paulson,J.C (1994) Cloning of a novel alpha 2,3-sialyltransferase that sialylates glycoprotein and glycolipid carbohydrate groups. J. Biol. Chem. 269(2), 1394-1401.
Lee EU, Roth J, and Paulson JC (1989) Alteration of terminal glycosylation sequences on N-linked oligosaccharides of Chinese hamster ovary cells by expression of beta-galactoside alpha 2,6-sialyltransferase. J Biol Chem. 264(23), 13848-13855.
de Leeuw, R., Mulders, J., Voortman, G. Rombout, F. Damm, J. and Kloosterboer, L
. (1996) Structure-function relationship of recombinant follicle stimulating hormone (Puregon). Mol. Hum. Reprod., 2,361-369.
Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ. (1951) Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem. 193(1), 265-75.
Lowry, PJ, McLean, C, Jones RL and Satgunasingam N. (1976) Purification of anterior pituitary and hypothalamic hormones Clin Pathol Suppl (Assoc Clin Pathol). 7, 16-21.
Pierce JG, and Parsons TF (1981) Glycoprotein hormones: structure and function Annu Rev Biochem. 50, 465-495. 
Pricer WE Jr, and Ashwell G. (1971). The binding of desialylated glycoproteins by plasma membranes of rat liver. J Biol Chem. 246(15), 4825-33. 
Rathnam P, and Saxena BB. (1975). Primary amino acid sequence of follicle-stimulating hormone from human pituitary glands. I. alpha subunit. J Biol Chem.;250(17):6735-6746.
Regoeczi E, Debanne MT, Hatton MC, and Koj A. (1978) Elimination of asialofetuinand asialoorosomucoid by the intact rat. Quantitative aspects of the hepatic clearance mechanism. Biochim Biophys Acta. 541(3),372-84. 
Royle L, Radcliffe CM, Dwek RA and Rudd PM (2006) Methods in Molecular Biology, ed I Brockhausen-Schutzbach (Humana Press), 347: Glycobiology protocols, 125-144. 
Ryan RJ, Keutmann HT, Charlesworth MC, McCormick DJ, Milius RP, Calvo FO and Vutyavanich T. (1987). Structure-function relationships of gonadotropins. Recent Prog Horm Res.;43,:383-429.
Saxena BB and Rathnam P. (1976) Amino acid sequence of the beta subunit of follicle-stimulating hormone from human pituitary glands. J Biol Chem. 251(4), 993-1005
Steelman SL, and Pohley FM. (1953) Assay of the follicle stimulating hormone based on the augmentation with human chorionic gonadotropin. Endocrinology. 53(6), 604-616.
Steer CJ, and Ashwell G. (1980) Studies on a mammalian hepatic binding protein specific for asialoglycoproteins. Evidence for receptor recycling in isolated rathepatocytes. J Biol Chem. 255(7), 3008-13. 
Svensson EC, Soreghan B, and Paulson JC. (1990) Organization of the beta-galactoside alpha 2,6-sialyltransferase gene. Evidence for the transcriptional regulation of terminal glycosylation. J Biol Chem. 265(34):20863-20868.
Takeuchi M, Takasaki S, Miyazaki H, Kato T, Hoshi S, Kochibe N, and Kobata A (1988). Comparative study of the asparagine-linked sugar chains of human erythropoi
etins purified from urine and the culture medium of recombinant Chinese hamster ovary cells. J Biol Chem. 263(8), 3657-3663.
Timossi CM, Barrios de Tomasi J, Zambrano E, Gonzalez R, Ulloa-Aguirre A. (1998). A naturally occurring basically charged human follicle-stimulating hormone (FSH) variant inhibits FSH-induced androgen aromatization and tissue-type plasminogen activator enzyme activity in vitro. Neuroendocrinology. 67(3), 153-163. 
Timossi CM, Barrios-de-Tomasi J, Gonzalez-Suarez R, Arranz MC, Padmanabhan V, Conn PM, and Ulloa-Aguirre A. (2000). Differential effects of the charge variants of human follicle-stimulating hormone. J Endocrinol. 165(2),193-205.
Ulloa-Aguirre, A., Espinoza, R., Damian-Matsumura, P. and Chappel, S.C. (1988) Immunological and biological potencies of the different molecular species of gonadotrophins. Hum. Reprod. 3,491-501.
Ulloa-Aguirre, A., Cravioto, A., Damian-Matsumura, P. Jimenez, M, Zambrano, E and Diaz-Sanchez, V. (1992) Biological characterization of the naturally occurringanalogues of intrapituitary human follicle stimulating hormone. Hum. Reprod. 7,
23-30.
Ulloa-Aguirre A, Midgley AR Jr, Beitins IZ, and Padmanabhan V. (1995). Follicle-stimulating isohormones: characterization and physiological relevance. Endocr Rev.16(6), 765-787.
Ulloa-Aguirre A, Maldonado A, Damian-Matsumura P, and Timossi C (2001). Endocrine regulation of gonadotropin glycosylation. Arch Med Res. 32(6), 520-532.
Ulloa-Aguirre A, Timossi C, Barrios-de-Tomasi J, Maldonado A, and Nayudu P. (2003). Impact of carbohydrate heterogeneity in function of follicle-stimulating hormone: studies derived from in vitro and in vivo models. Biol Reprod. 69(2), 379-389.
Van Lenten L, and Ashwell G. (1972) The binding of desialylated glycoproteins byplasma membranes of rat liver. Development of a quantitative inhibition assay. J
Biol Chem. 247(14),4633-40.
Wide, L. and Albertsson-Wikland, K. (1990) Change in electrophoretic mobility ofhuman follicle-stimulating hormone in serum after administration of gonadotropin-releasing hormone. J. Clin. Endocrinol. Metab.70, 271-276.
Wide, L. and Bakos, O. (1993). More basic forms of both human follicle-stimulating hormone and luteinizing hormone in serum at midcycle compared with the follicular or luteal phase. J. Clin. Endocrinol. Metab., 76, 885-889.
Wide L, Naessen T, Sundstrom-Poromaa I, Eriksson K. (2007) Sulfonation and sialylation of gonadotropins in women during the menstrual cycle, after menopause, and with polycystic ovarian syndrome and in men. J Clin Endocrinol Metab.;92(11),4410-4417.
Zambrano E, Zarinan T, Olivares A, Barrios-de-Tomasi J, and Ulloa-Aguirre A. (19
99). Receptor binding activity and in vitro biological activity of the human FSHcharge isoforms as disclosed by heterologous and homologous assay systems: implications for the structure-function relationship of the FSH variants. Endocrine.
10(2), 113-121.
Zhang X, Lok SH, and Kon OL (1998) Stable expression of human alpha-2,6-sialyltransferase in Chinese hamster ovary cells: functional consequences for human erythropoietin expression and bioactivity. Biochim Biophys Acta. 1425(3), 441-452.
【００９８】
配列番号１
卵胞刺激ホルモンアルファポリペプチド
受託番号ＡＨ００７３３８
ＦＳＨアルファのヌクレオチド配列
1 ATGGATTACT ACAGAAAATA TGCAGCTATC TTTCTGGTCA CATTGTCGGT GTTTCTGCAT
61 GTTCTCCATT CCGCTCCTGA TGTGCAGGAT TGCCCAGAAT GCACGCTACA GGAAAACCCA
121 TTCTTCTCCC AGCCGGGTGC CCCAATACTT CAGTGCATGG GCTGCTGCTT CTCTAGAGCA
181 TATCCCACTC CACTAAGGTC CAAGAAGACG ATGTTGGTCC AAAAGAACGT CACCTCAGAG
241 TCCACTTGCT GTGTAGCTAA ATCATATAAC AGGGTCACAG TAATGGGGGG TTTCAAAGTG
301 GAGAACCACA CGGCGTGCCA CTGCAGTACT TGTTATTATC ACAAATCTTA A
ＦＳＨアルファのタンパク質配列
1 MKTLQFFFLF CCWKAICCNS CELTNITIAI EKEECRFCIS INTTWCAGYC YTRDLVYKDP
61 ARPKIQKTCT FKELVYETVR VPGCAHHADS LYTYPVATQC HCGKCDSDST DCTVRGLGPS
121 YCSFGEMKE
配列番号２
卵胞刺激ホルモンベータポリペプチド
受託番号ＮＭ＿０００５１０
ＦＳＨベータのヌクレオチド配列
1 ATGAAGACAC TCCAGTTTTT CTTCCTTTTC TGTTGCTGGA AAGCAATCTG CTGCAATAGC
61 TGTGAGCTGA CCAACATCAC CATTGCAATA GAGAAAGAAG AATGTCGTTT CTGCATAAGC
121 ATCAACACCA CTTGGTGTGC TGGCTACTGC TACACCAGGG ATCTGGTGTA TAAGGACCCA
181 GCCAGGCCCA AAATCCAGAA AACATGTACC TTCAAGGAAC TGGTATATGA AACAGTGAGA
241 GTGCCCGGCT GTGCTCACCA TGCAGATTCC TTGTATACAT ACCCAGTGGC CACCCAGTGT
301 CACTGTGGCA AGTGTGACAG CGACAGCACT GATTGTACTG TGCGAGGCCT GGGGCCCAGC
361 TACTGCTCCT TTGGTGAAAT GAAAGAATAA
ＦＳＨベータのタンパク質配列
1 MKTLQFFFLF CCWKAICCNS CELTNITIAI EKEECRFCIS INTTWCAGYC YTRDLVYKDP
61 ARPKIQKTCT FKELVYETVR VPGCAHHADS LYTYPVATQC HCGKCDSDST DCTVRGLGPS
121 YCSFGEMKE
配列番号３
ベータガラクトシドアルファ−２，３−シアリルトランスフェラーゼ４
受託番号Ｌ２３７６７
ＳＴ３ＧＡＬ４のヌクレオチド配列
1 ATGTGTCCTG CAGGCTGGAA GCTCCTGGCC ATGTTGGCTC TGGTCCTGGT CGTCATGGTG
61 TGGTATTCCA TCTCCCGGGA AGACAGGTAC ATCGAGCTTT TTTATTTTCC CATCCCAGAG
121 AAGAAGGAGC CGTGCCTCCA GGGTGAGGCA GAGAGCAAGG CCTCTAAGCT CTTTGGCAAC
181 TACTCCCGGG ATCAGCCCAT CTTCCTGCGG CTTGAGGATT ATTTCTGGGT CAAGACGCCA
241 TCTGCTTACG AGCTGCCCTA TGGGACCAAG GGGAGTGAGG ATCTGCTCCT CCGGGTGCTA
301 GCCATCACCA GCTCCTCCAT CCCCAAGAAC ATCCAGAGCC TCAGGTGCCG CCGCTGTGTG
361 GTCGTGGGGA ACGGGCACCG GCTGCGGAAC AGCTCACTGG GAGATGCCAT CAACAAGTAC
421 GATGTGGTCA TCAGATTGAA CAATGCCCCA GTGGCTGGCT ATGAGGGTGA CGTGGGCTCC
481 AAGACCACCA TGCGTCTCTT CTACCCTGAA TCTGCCCACT TCGACCCCAA AGTAGAAAAC
541 AACCCAGACA CACTCCTCGT CCTGGTAGCT TTCAAGGCAA TGGACTTCCA CTGGATTGAG
601 ACCATCCTGA GTGATAAGAA GCGGGTGCGA AAGGGTTTCT GGAAACAGCC TCCCCTCATC
661 TGGGATGTCA ATCCTAAACA GATTCGGATT CTCAACCCCT TCTTCATGGA GATTGCAGCT
721 GACAAACTGC TGAGCCTGCC AATGCAACAG CCACGGAAGA TTAAGCAGAA GCCCACCACG
781 GGCCTGTTGG CCATCACGCT GGCCCTCCAC CTCTGTGACT TGGTGCACAT TGCCGGCTTT
841 GGCTACCCAG ACGCCTACAA CAAGAAGCAG ACCATTCACT ACTATGAGCA GATCACGCTC
901 AAGTCCATGG CGGGGTCAGG CCATAATGTC TCCCAAGAGG CCCTGGCCAT TAAGCGGATG
961 CTGGAGATGG GAGCTATCAA GAACCTCACG TCCTTCTGA
ＳＴ３ＧＡＬ４のタンパク質配列
1 MCPAGWKLLA MLALVLVVMV WYSISREDRY IELFYFPIPE KKEPCLQGEA ESKASKLFGN
61 YSRDQPIFLR LEDYFWVKTP SAYELPYGTK GSEDLLLRVL AITSSSIPKN IQSLRCRRCV
121 VVGNGHRLRN SSLGDAINKY DVVIRLNNAP VAGYEGDVGS KTTMRLFYPE SAHFDPKVEN
181 NPDTLLVLVA FKAMDFHWIE TILSDKKRVR KGFWKQPPLI WDVNPKQIRI LNPFFMEIAA
241 DKLLSLPMQQ PRKIKQKPTT GLLAITLALH LCDLVHIAGF GYPDAYNKKQ TIHYYEQITL
301 KSMAGSGHNV SQEALAIKRM LEMGAIKNLT SF
配列番号４
ベータガラクトサミドアルファ−２，６シアリルトランスフェラーゼ１
受託番号ＮＭ＿００３０３２
ＳＴ６ＧＡＬ１のヌクレオチド配列
1 ATGATTCACA CCAACCTGAA GAAAAAGTTC AGCTGCTGCG TCCTGGTCTT TCTTCTGTTT
61 GCAGTCATCT GTGTGTGGAA GGAAAAGAAG AAAGGGAGTT ACTATGATTC CTTTAAATTG
121 CAAACCAAGG AATTCCAGGT GTTAAAGAGT CTGGGGAAAT TGGCCATGGG GTCTGATTCC
181 CAGTCTGTAT CCTCAAGCAG CACCCAGGAC CCCCACAGGG GCCGCCAGAC CCTCGGCAGT
241 CTCAGAGGCC TAGCCAAGGC CAAACCAGAG GCCTCCTTCC AGGTGTGGAA CAAGGACAGC
301 TCTTCCAAAA ACCTTATCCC TAGGCTGCAA AAGATCTGGA AGAATTACCT AAGCATGAAC
361 AAGTACAAAG TGTCCTACAA GGGGCCAGGA CCAGGCATCA AGTTCAGTGC AGAGGCCCTG
421 CGCTGCCACC TCCGGGACCA TGTGAATGTA TCCATGGTAG AGGTCACAGA TTTTCCCTTC
481 AATACCTCTG AATGGGAGGG TTATCTGCCC AAGGAGAGCA TTAGGACCAA GGCTGGGCCT
541 TGGGGCAGGT GTGCTGTTGT GTCGTCAGCG GGATCTCTGA AGTCCTCCCA ACTAGGCAGA
601 GAAATCGATG ATCATGACGC AGTCCTGAGG TTTAATGGGG CACCCACAGC CAACTTCCAA
661 CAAGATGTGG GCACAAAAAC TACCATTCGC CTGATGAACT CTCAGTTGGT TACCACAGAG
721 AAGCGCTTCC TCAAAGACAG TTTGTACAAT GAAGGAATCC TAATTGTATG GGACCCATCT
781 GTATACCACT CAGATATCCC AAAGTGGTAC CAGAATCCGG ATTATAATTT CTTTAACAAC
841 TACAAGACTT ATCGTAAGCT GCACCCCAAT CAGCCCTTTT ACATCCTCAA GCCCCAGATG
901 CCTTGGGAGC TATGGGACAT TCTTCAAGAA ATCTCCCCAG AAGAGATTCA GCCAAACCCC
961 CCATCCTCTG GGATGCTTGG TATCATCATC ATGATGACGC TGTGTGACCA GGTGGATATT
1021 TATGAGTTCC TCCCATCCAA GCGCAAGACT GACGTGTGCT ACTACTACCA GAAGTTCTTC
1081 GATAGTGCCT GCACGATGGG TGCCTACCAC CCGCTGCTCT ATGAGAAGAA TTTGGTGAAG
1141 CATCTCAACC AGGGCACAGA TGAGGACATC TACCTGCTTG GAAAAGCCAC ACTGCCTGGC
1201 TTCCGGACCA TTCACTGCTA A
０ｐ−ＳＴ６ＧＡＬ１のタンパク質配列
1 MIHTNLKKKF SCCVLVFLLF AVICVWKEKK KGSYYDSFKL QTKEFQVLKS LGKLAMGSDS
61 QSVSSSSTQD PHRGRQTLGS LRGLAKAKPE ASFQVWNKDS SSKNLIPRLQ KIWKNYLSMN
121 KYKVSYKGPG PGIKFSAEAL RCHLRDHVNV SMVEVTDFPF NTSEWEGYLP KESIRTKAGP
181 WGRCAVVSSA GSLKSSQLGR EIDDHDAVLR FNGAPTANFQ QDVGTKTTIR LMNSQLVTTE
241 KRFLKDSLYN EGILIVWDPS VYHSDIPKWY QNPDYNFFNN YKTYRKLHPN QPFYILKPQM
301 PWELWDILQE ISPEEIQPNP PSSGMLGIII MMTLCDQVDI YEFLPSKRKT DVCYYYQKFF
361 DSACTMGAYH PLLYEKNLVK HLNQGTDEDI YLLGKATLPG FRTIHC
【図１】
2020040956.tif 000003
【図２】
2020040956.tif 000004
【図３】
2020040956.tif 000005
【図４】
2020040956.tif 000006
【図５】
2020040956.tif 000007
【図６Ａ】
2020040956.tif 000008
【図６Ｂ】
2020040956.tif 000009
【図７】
2020040956.tif 000010
【図８】
2020040956.tif 000011
【図９】
2020040956.tif 000012
【図１０】
2020040956.tif 000013
【図１１】
2020040956.tif 000014
【図１２】
2020040956.tif 000015
【図１３】
2020040956.tif 000016
【配列表】
2020040956000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年11月22日(2019.11.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
α２，３−およびα２，６−シアリル化を含む組換えＦＳＨ（ｒＦＳＨ）であって、全シアリル化の８０％以上がα２，３−シアリル化であり、かつ、全シアリル化の５％〜２０％がα２，６−シアリル化である、組換えＦＳＨ。
【請求項２】
α２，３−およびα２，６−シアリル化を含む組換えＦＳＨ（ｒＦＳＨ）であって、全シアリル化の７７．７５％以上がα２，３−シアリル化であり、かつ、全シアリル化の１０％〜２１．４６％がα２，６−シアリル化である、組換えＦＳＨ。
【請求項３】
α２，３−およびα２，６−シアリル化を含む組換えＦＳＨ（ｒＦＳＨ）であって、全シアリル化の５％〜２０％がα２，６−シアリル化である、組換えＦＳＨ。
【請求項４】
α２，３−およびα２，６−シアリル化を含む組換えＦＳＨ（ｒＦＳＨ）であって、全シアリル化の１０％〜２１．４６％がα２，６−シアリル化である、組換えＦＳＨ。
【請求項５】
ヒト細胞株において発現された、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組換えＦＳＨ。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の組換えＦＳＨを含む、医薬組成物。
【請求項７】
ｈＣＧおよび／またはＬＨをさらに含む、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
不妊症の治療において用いるための、請求項６または７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のｒＦＳＨを製造する方法であって、ヒト細胞株においてｒＦＳＨを生産させ、または発現させる工程を含み、前記細胞株は、α２，３−シアリルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を前記細胞に導入することによって改変されている、方法。
【外国語明細書】
2020040956000001.pdf