(57)【要約】【課題】  従来技術より、さらに簡便、高感度なクロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＢ遺伝子（ｔｃｄＢ）検出法を提供すること。【解決手段】  以下の特徴（Ａ）、及び（Ｂ）を有するオリゴヌクレオチドプローブ：（Ａ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、若しくは配列番号１９のいずれかで示される塩基配列またはそれらに相補的な塩基配列において連続する少なくとも１５塩基以上の塩基配列を含む。（Ｂ）少なくとも一方の末端塩基がグアニンとの相互作用により消光する蛍光消光色素で標識されている。【選択図】  図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中に含まれるクロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＢ遺伝子（ｔｃｄＢ）を検出するために用いられる、以下の特徴（Ａ）及び（Ｂ）を有するオリゴヌクレオチドプローブ。
（Ａ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、若しくは配列番号１９のいずれかで示される塩基配列またはそれらに相補的な塩基配列において連続する少なくとも１５塩基以上の塩基配列を含む。
（Ｂ）少なくとも一方の末端塩基がグアニンとの相互作用により消光する蛍光消光色素で標識されている。
【請求項２】
前記（Ａ）において、配列番号５、配列番号６、配列番号９、配列番号１０、若しくは配列番号１１のいずれかで示される塩基配列またはそれらに相補的な塩基配列を含む、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項３】
前記（Ｂ）の蛍光消光色素が、フルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ＢＯＤＩＰＹ及びその誘導体からなる群より選択される少なくとも１つの蛍光消光色素である請求項１または２に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項４】
前記（Ｂ）の蛍光消光色素が、４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸（ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ）、カルボキシローダミン６Ｇ、ＴＡＭＲＡ、ローダミン６Ｇ、テトラブロモスルホンフルオレセイン（ＴＢＳＦ）、及び２−オキソ−６，８−ジフルオロ−７−ジヒドロキシ−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボン酸（Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ）からなる群より選択される少なくとも１つの蛍光消光色素である請求項１〜３のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項５】
前記（Ｂ）において、蛍光消光色素で標識されている少なくとも一つの末端塩基がシトシンである請求項１〜４のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項６】
試料中に含まれるクロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＢ遺伝子（ｔｃｄＢ）を検出する方法であって、請求項１〜５のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブを少なくとも含む反応液を用いて、以下の工程（１）〜（３）を行うことを特徴とする、ｔｃｄＢ検出方法。
（１）ｔｃｄＢを含みうる試料を提供する工程。
（２）前記反応液を用いて核酸増幅反応を行う工程。
（３）工程（２）で得られうる増幅産物に、該オリゴヌクレオチドプローブをハイブリダイズさせ、該反応液の蛍光強度を測定する工程。
【請求項７】
前記工程（３）が以下の工程（３ａ）〜（３ｃ）の少なくともひとつを含む請求項６に記載の方法。
（３ａ）得られうる増幅産物に該オリゴヌクレオチドプローブをハイブリダイズさせ、該反応液の蛍光強度を測定することで、前記核酸増幅反応の進行をリアルタイムでモニターする工程。
（３ｂ）前記工程（２）の終了後に、得られうる増幅産物に該オリゴヌクレオチドプローブをハイブリダイズさせ、該反応液の蛍光強度を測定することで、前記核酸増幅反応の進行をエンドポイントでモニターする工程。
（３ｃ）前記工程（２）の終了後に、得られうる増幅産物に該オリゴヌクレオチドプローブをハイブリダイズさせ、該反応液の蛍光強度の温度依存性を測定することで、ｔｃｄＢを検出する工程。
【請求項８】
前記工程（２）の核酸増幅反応が、ＰＣＲである請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
前記工程（２）の核酸増幅反応で用いる核酸増幅酵素が、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼである請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼが、古細菌由来のＤＮＡポリメラーゼあるいはその変異体である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
古細菌由来のＤＮＡポリメラーゼが、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼあるいはその変異体である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項６〜１１のいずれかに記載の検出方法を実施するための試薬。
【請求項１３】
請求項６〜１１のいずれかに記載の検出方法を実施するための試薬を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中に含まれるクロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＢ遺伝子（ｔｃｄＢ）を検出するためのオリゴヌクレオチドプローブに関する。更に、本発明は、該オリゴヌクレオチドプローブを用いて、試料中に含まれるｔｃｄＢを検出する方法及びその方法に用いるための試薬・キット等に関する。
【背景技術】
【０００２】
クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、別名：Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）（以下、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅとも称する）は、院内感染の原因微生物のひとつであり、簡便、迅速、高感度に検出することが臨床診断上重要である。
【０００３】
具体的には、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅは抗菌薬の投与に関連した下痢症・腸炎の主要な原因菌であることが知られている。例えば、抗菌薬治療により正常な腸内細菌叢が乱れると、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのうち有毒株である毒素産生菌が、トキシンＡ、トキシンＢ、バイナリートキシン等の毒素を産生し、その毒素によって下痢・腸炎等を引き起こす。したがって、本菌が産生する毒素の検出を行うことがＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症の検査、診断に重要である。従来、毒素検出はイムノクロマト法を用いて行われていたが、該方法は感度が低いという問題があった。そこで、高感度な核酸増幅法を用いることで、これらの毒素産生に関与する遺伝子を検出する方法が開発されてきた（特許文献１）。
【０００４】
しかしながら、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素産生に関与する遺伝子、特にトキシンＡよりも一般に強い毒性を示すとされているトキシンＢ遺伝子（ｔｃｄＢ）を、さらに簡便、高感度に検出する方法の開発が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２０１５−５２９０９０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、かかる従来技術の課題を背景になされたものである。すなわち、本発明の目的は、より簡便、高感度に試料中に含まれるＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのｔｃｄＢを検出することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は鋭意研究の結果、特定のオリゴヌクレオチドプローブを用いることで、より簡便、高感度に試料中に含まれるｔｃｄＢを検出できることを見出し、本発明に到達した。即ち、本発明の概要は以下の通りである。
【０００８】
［項１］  試料中に含まれるクロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＢ遺伝子（ｔｃｄＢ）を検出するために用いられる、以下の特徴（Ａ）及び（Ｂ）を有するオリゴヌクレオチドプローブ。
（Ａ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、若しくは配列番号１９のいずれかで示される塩基配列またはそれらに相補的な塩基配列において連続する少なくとも１５塩基以上の塩基配列を含む。
（Ｂ）少なくとも一方の末端塩基がグアニンとの相互作用により消光する蛍光消光色素で標識されている。
［項２]
前記（Ａ）において、配列番号５、配列番号６、配列番号９、配列番号１０、若しくは配列番号１１のいずれかで示される塩基配列またはそれらに相補的な塩基配列を含む、項１に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
［項３］  前記（Ｂ）の蛍光消光色素が、フルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ＢＯＤＩＰＹ及びその誘導体からなる群より選択される少なくとも１つの蛍光消光色素である項１または２に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
［項４］  前記（Ｂ）の蛍光消光色素が、４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸（ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ）、カルボキシローダミン６Ｇ、ＴＡＭＲＡ、ローダミン６Ｇ、テトラブロモスルホンフルオレセイン（ＴＢＳＦ）、及び２−オキソ−６，８−ジフルオロ−７−ジヒドロキシ−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボン酸（Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ）からなる群より選択される少なくとも１つの蛍光消光色素である項１〜３のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
［項５］  前記（Ｂ）において、蛍光消光色素で標識されている少なくとも一つの末端塩基がシトシンである項１〜４のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
［項６］  試料中に含まれるクロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＢ遺伝子（ｔｃｄＢ）を検出する方法であって、項１〜５のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブを少なくとも含む反応液を用いて、以下の工程（１）〜（３）を行うことを特徴とする、ｔｃｄＢ検出方法。
（１）ｔｃｄＢを含みうる試料を提供する工程。
（２）前記反応液を用いて核酸増幅反応を行う工程。
（３）工程（２）で得られうる増幅産物に、該オリゴヌクレオチドプローブをハイブリダイズさせ、該反応液の蛍光強度を測定する工程。
［項７］  前記工程（３）が以下の工程（３ａ）〜（３ｃ）の少なくともひとつを含む項６に記載の方法。
（３ａ）得られうる増幅産物に該オリゴヌクレオチドプローブをハイブリダイズさせ、該反応液の蛍光強度を測定することで、前記核酸増幅反応の進行をリアルタイムでモニターする工程。
（３ｂ）前記工程（２）の終了後に、得られうる増幅産物に該オリゴヌクレオチドプローブをハイブリダイズさせ、該反応液の蛍光強度を測定することで、前記核酸増幅反応の進行をエンドポイントでモニターする工程。
（３ｃ）前記工程（２）の終了後に、得られうる増幅産物に該オリゴヌクレオチドプローブをハイブリダイズさせ、該反応液の蛍光強度の温度依存性を測定することで、ｔｃｄＢを検出する工程。
［項８］  前記工程（２）の核酸増幅反応が、ＰＣＲである項６または７に記載の方法。
［項９］  前記工程（２）の核酸増幅反応で用いる核酸増幅酵素が、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼである項８に記載の方法。
［項１０］  ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼが、古細菌由来のＤＮＡポリメラーゼあるいはその変異体である、項９に記載の方法。
［項１１］  古細菌由来のＤＮＡポリメラーゼが、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼあるいはその変異体である、項１０に記載の方法。
［項１２］  項６〜１１のいずれかに記載の検出方法を実施するための試薬。
［項１３］  項６〜１１のいずれかに記載の検出方法を実施するための試薬を含むキット。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、簡便、高感度に試料中に含まれるｔｃｄＢを検出できるようになった。本発明のオリゴヌクレオチドプローブ、並びに該プローブを用いた検出方法、試薬、及びキットを使用することで、ｔｃｄＢの簡便、高感度な検出が可能になり、臨床診断の分野に大きく貢献できる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】実施例２の結果を示す図である。実線、点線、破線は、それぞれ異なるオリゴヌクレオチドプローブの蛍光変化を示す。
【図２】実施例３の結果を示す図である。
【図３】実施例４の結果を示す図である。実線、点線、破線は、それぞれ異なるテンプレート濃度のコロニー懸濁液を測定したときの融解曲線分析結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明の実施形態を示しつつ、本発明についてさらに詳説する。
【００１２】
［Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅトキシンＢ遺伝子（ｔｃｄＢ）を検出するためのオリゴヌクレオチド］
本発明の実施態様の一つは、試料中に含まれるＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのｔｃｄＢを検出するために用いられる、以下の特徴（Ａ）及び（Ｂ）を有するオリゴヌクレオチドプローブである。
（Ａ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、若しくは配列番号１９のいずれかで示される塩基配列またはそれらに相補的な塩基配列において連続する少なくとも１５塩基以上の塩基配列を含む。
（Ｂ）少なくとも一方の末端塩基がグアニンとの相互作用により消光する蛍光消光色素で標識されている。
【００１３】
［Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅトキシンＢ遺伝子（ｔｃｄＢ）］
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ（別名Ｃｌｏｓｔｉｒｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）は、院内感染の原因微生物のひとつであり、毒素産生菌はその毒素によって抗菌薬に関連した下痢症・腸炎を引き起こす。主要な毒素は、トキシンＡおよびトキシンＢであるが、ほかにもバイナリートキシン等を毒素として産生することもある。
【００１４】
従来、これらの毒素検出法として、イムノクロマト法等が用いられてきたが、感度が低いという問題があった。そこで、高感度な核酸増幅法を用いることで、これら毒素産生に関与する遺伝子を検出するための方法が開発されてきた（特許文献１）。
【００１５】
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素産生に関与する遺伝子は、ｔｃｄＡ、ｔｃｄＢ、ｔｃｄＣ変異、ｃｄｔＡ、ｃｄｔＢ等があるが、特にトキシンＢをコードする遺伝子であるｔｃｄＢの検出が重要である。
【００１６】
本発明者は、従来技術よりも簡便にｔｃｄＢを検出するため、鋭意研究の結果、本発明のオリゴヌクレオチドプローブを開発した。
【００１７】
［オリゴヌクレオチドプローブ］
本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、以下の特徴（Ａ）及び（Ｂ）を有する。
（Ａ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、若しくは配列番号１９のいずれかで示される塩基配列またはそれらに相補的な塩基配列において連続する少なくとも１５塩基以上の塩基配列を含む。
（Ｂ）少なくとも一方の末端塩基がグアニンとの相互作用により消光する蛍光消光色素で標識されている。
【００１８】
上記の特徴（Ａ）を有するものとしては、（Ａ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、若しくは配列番号１９のいずれかで示される塩基配列またはそれらに相補的な塩基配列において連続する少なくとも１５塩基以上の塩基配列からなるものが好ましく、前記塩基配列において連続する少なくとも１７塩基以上の塩基配列からなるものがより好ましく、前記塩基配列において連続する少なくとも１８塩基以上の塩基配列からなるものが更に好ましく、前記塩基配列において連続する少なくとも１９塩基以上の塩基配列からなるものが更に好ましく、前記塩基配列の全長配列からなるものが更により好ましい。
【００１９】
オリゴヌクレオチドプローブを使用した核酸検査法は、従来から周知であり、既に当該技術分野において確立されている（例えば、特表２０１５−５２９０９０号公報、特許第５３５４２１６号公報）。このような核酸検査法に用いるオリゴヌクレオチドプローブとしては、ＴａｑＭａｎ加水分解プローブ、モレキュラービーコン、ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブ、ＱＰｒｏｂｅなどが知られている。本発明では、（Ｂ）少なくとも一方の末端塩基がグアニンとの相互作用により消光する蛍光消光色素で標識されているという特徴を備えている限り、当該分野で公知の任意の標識プローブを使用することができるが、より確実に良好な結果が得られ易いという観点から、ＱＰｒｏｂｅを使用することが好ましい。
【００２０】
ＱＰｒｏｂｅは、ＫＵＲＡＴＡらにより開発された蛍光プローブ（蛍光消光プローブ）である（特許第５３５４２１６号公報）。このプローブは、少なくとも一方の末端塩基がグアニンとの相互作用により消光する蛍光消光色素で標識されているハイブリダイゼーションプローブである。
【００２１】
例えば、Ｑｐｒｏｂｅで用いられる蛍光消光色素としては特に限定されないが、フルオレセインまたはその誘導体（例えば、フルオレセインイソチオシアネート）、ローダミンまたはその誘導体（例えば、テトラメチルローダミン、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、カルボキシローダミン、ｘ−ローダミン、スルホローダミン１０１酸クロリド）、ＢＯＤＩＰＹまたはその誘導体（例えば、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ／Ｃ３、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ／Ｃ６、ＢＯＤＩＰＹ−５−ＦＡＭ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＲ、ＢＯＤＩＰＹ−Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ−５６４、ＢＯＤＩＰＹ−５８１、ＢＯＤＩＰＹ−５９１、ＢＯＤＩＰＹ−６３０、ＢＯＤＩＰＹ−６５０、ＢＯＤＩＰＹ−６６５）等が挙げられる。蛍光消光色素の詳細は、特許第５８１３２６３号公報等に記載があり、本発明も該技術を参照できる。
【００２２】
なかでも、本発明では蛍光消光色素として、４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸（ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ）、カルボキシローダミン６Ｇ、ＴＡＭＲＡ、ローダミン６Ｇ、テトラブロモスルホンフルオレセイン（ＴＢＳＦ）、及び２−オキソ−６，８−ジフルオロ−７−ジヒドロキシ−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボン酸（Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ）からなる群より選択される少なくとも１つを用いることが好ましい。
【００２３】
さらに、蛍光消光色素で標識されている少なくとも一つの末端塩基（即ち、両端が標識されている場合は、少なくとも一方の末端塩基）がシトシンであるオリゴヌクレオチドプローブがより好ましい。
このようなオリゴヌクレオチドプローブは、増幅産物にハイブリダイズした際に、増幅産物中のグアニン塩基と塩基対を形成して相互作用することで消光できるため、非常に簡便に反応液の蛍光強度の変化を測定することができる。
【００２４】
なお、該プローブがハイブリダイズした際に、該プローブのシトシン塩基と増幅産物中のグアニン塩基が塩基対を形成しなくとも、それらの塩基同士の距離が近ければ蛍光は消光できる。例えば、詳細は特許第５３５４２１６号公報に記載があり、本発明も該技術を参照できる。即ち、該プローブがハイブリダイズした際に、該プローブのシトシン塩基に対して、増幅産物中のグアニン塩基が例えば１〜３塩基の範囲内に存在すれば消光できる（シトシン塩基と塩基対を形成する塩基を１とする）。
【００２５】
更に特定の実施態様では、蛍光消光色素で標識されている少なくとも一つの末端塩基（即ち、両端が標識されている場合は、少なくとも一方の末端塩基）がシトシンでないオリゴヌクレオチドプローブであっても、反応液の蛍光強度の変化を測定できる。例えば、詳細は特許第５３５４２１６号公報に記載があり、本発明も該技術を参照できる。例えば、該プローブがハイブリダイズした際に、蛍光消光色素が標識されている少なくとも一つの末端塩基に対して、増幅産物中のグアニン塩基が例えば１〜３塩基の範囲内に存在すれば消光できる（末端塩基と塩基対を形成する塩基を１とする）。
【００２６】
オリゴヌクレオチドプローブは、その目的に応じて、上記特徴（Ｂ）で規定したグアニンで消光する蛍光消光色素に加えて、更に一つ以上の標識物質を付加することができる。このような更なる標識物質には、蛍光物質、化学発光物質、放射性物質、ビオチン、アルカリホスファターゼ、ジゴキシゲニン、ペルオキシダーゼなどがあり、本発明では上記特徴（Ｂ）で規定したグアニンで消光する蛍光消光色素以外の標識物質をさらに付加してもよい。標識物質は、上記特徴（Ｂ）で規定したグアニンで消光する蛍光消光色素を備える以外は特に限定されず、検査法に応じて公知の標識物質が標識されたオリゴヌクレオチドプローブを使用することができる。また、オリゴヌクレオチドプローブの標識化のためにリンカーやスペーサーなどを付加してもよい。
【００２７】
更に特定の実施態様では、オリゴヌクレオチドプローブを構成する塩基には、イノシン、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ＬＮＡといったヌクレオチドアナログを含めてもよい。ヌクレオチドアナログを使用することで、特異性の向上などが期待できる。
【００２８】
本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、若しくは配列番号１９のいずれかで示される塩基配列またはそれらに相補的な塩基配列において連続する少なくとも１５塩基以上の塩基配列を含むことを特徴とする。このような塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって、従来技術よりも簡便、高感度にｔｃｄＢを検出できることが、本発明から明らかとなっている。
【００２９】
なかでも、配列番号５、配列番号６、配列番号９、配列番号１０、若しくは配列番号１１のいずれかで示される塩基配列またはそれらに相補的な塩基配列において連続する少なくとも１５塩基以上の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプローブが好ましく、配列番号５、配列番号６、配列番号９、配列番号１０、若しくは配列番号１１のいずれかで示される塩基配列またはそれらに相補的な塩基配列において連続する少なくとも１７塩基以上の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプローブがより好ましく、配列番号５、配列番号６、配列番号９、配列番号１０、若しくは配列番号１１のいずれかで示される塩基配列またはそれらに相補的な塩基配列において連続する少なくとも１９塩基以上の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプローブがさらに好ましく、配列番号５、配列番号６、配列番号９、配列番号１０、若しくは配列番号１１のいずれかで示される塩基配列またはそれらに相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプローブがさらにより好ましく、配列番号５、配列番号６、配列番号９、配列番号１０、若しくは配列番号１１のいずれかで示される塩基配列またはそれらに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブが特に好ましい。
【００３０】
［ｔｃｄＢ検出方法］
本発明の実施態様の一つは、試料中に含まれるクロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＢ遺伝子（ｔｃｄＢ）を検出する方法であって、前記のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブを少なくとも含む反応液を用いて、以下の工程（１）〜（３）を行うことを特徴とする、ｔｃｄＢ検出方法である。
（１）ｔｃｄＢを含みうる試料を提供する工程。
（２）前記反応液を用いて核酸増幅反応を行う工程。
（３）工程（２）で得られうる増幅産物に、該オリゴヌクレオチドプローブをハイブリダイズさせ、該反応液の蛍光強度を測定する工程。
【００３１】
［試料］
本発明において使用できる試料はｔｃｄＢを含む可能性のあるものであれば特に限定されない。例えば、生体試料や食品、環境試料だけでなく、精製核酸等が挙げられる。また、試料は核酸抽出やいくつかの前処理を行ってもよい。試料の核酸抽出や前処理は、当該技術分野で一般的に行われている。前処理としては、ろ過、遠心分離、希釈処理、加熱処理、酸処理、アルカリ処理、有機溶媒処理、懸濁処理、破砕処理、磨砕処理等が挙げられるが、本発明ではこれらに限定されない。
【００３２】
生体試料の例として、特に制限されないが、動植物組織、体液、排泄物、細胞、細菌、ウイルス等が挙げられる。さらに挙げると、血液、血液培養液、尿、膿、髄液、胸水、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、喀痰、組織切片、皮膚、吐瀉物、糞便、分離培養コロニー、カテーテル洗浄液等が挙げられる。
【００３３】
食品の例として、水、アルコール飲料、清涼飲料水、加工食品、野菜、畜産物、海産物、卵、乳製品、生肉、生魚、惣菜等が挙げられる。また、食品を測定試料とする場合、その食品の一部あるいは全部を使用できるだけでなく、食品表面を拭き取ったものも使用できる。さらに、調理器具やドアノブを拭き取った材料あるいはそれらを洗浄した洗浄液も試料として用いることができる。
【００３４】
環境試料の例として、水、氷、土壌、空気やエアゾール等が挙げられる。ここでいう水とは、例として、水道水、海水あるいは川や滝、湖、池等から採取した水等が挙げられる。また、施設の壁面、床面、設備や備品、便器等を拭き取ったものあるいはそれらを洗浄した洗浄液も試料として用いることができる。
【００３５】
本発明には上記のようないずれの試料も用いることができるが、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅが下痢症・腸炎の主要な原因菌という観点から、生体試料（例えば、動植物組織、体液、排泄物、組織切片、皮膚、吐瀉物、糞便、分離培養コロニー）を用いるのが好ましく、排泄物、吐瀉物、糞便、分理培養コロニーを用いるのがより好ましく、糞便、分離培養コロニーを用いるのが更に好ましい。本発明によれば、このような試料を用いる場合であっても高感度にｔｃｄＢを検出することが可能である。
【００３６】
試料の採取方法、調製方法等は、特に制限されず、試料の種類、目的に応じて公知の方法を用いることができる。
【００３７】
［核酸増幅反応］
核酸増幅法は数コピーの標的核酸を可視化可能なレベル、すなわち数億コピー以上に増幅する技術であり、生命科学研究分野のみならず、臨床診断、食品衛生検査、環境検査等の分野においても広く用いられている。そのような核酸増幅法としては、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＬＣＲ法、ＴＭＡ法、ＳＤＡ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＲＴ−ＬＡＭＰ法、ＮＡＳＢＡ法、ＴＲＣ法、ＴＭＡ法等が挙げられる。これらの技術は既に当該技術分野において確立されており、目的に合わせて方法を選択することができる。本発明のｔｃｄＢ検出方法に用いる核酸増幅法はＰＣＲ法が好ましいが、これに限定されない。
【００３８】
［ＰＣＲ］
ＰＣＲ反応は、主にＤＮＡポリメラーゼによって触媒される反応であり、（１）熱処理によるＤＮＡ変性（２本鎖ＤＮＡから１本鎖ＤＮＡへの乖離）、（２）鋳型１本鎖ＤＮＡへのプライマーのアニーリング、（３）ＤＮＡポリメラーゼを用いた前記プライマーの伸長、という３ステップを１サイクルとし、このサイクルを繰り返すことによって標的核酸を増幅する。ＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｔａｑ、Ｔｔｈ、Ｂｓｔ、ＫＯＤ、Ｐｆｕ、Ｐｗｏ、Ｔｂｒ、Ｔｆｉ、Ｔｆｌ、Ｔｍａ、Ｔｎｅ、Ｖｅｎｔ、ＤＥＥＰＶＥＮＴやその変異体が挙げられる。より簡便、高感度なｔｃｄＢ検出を可能にできるという観点から、本発明では、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼを用いることが好ましい。
【００３９】
［ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ］
本発明で用いるＤＮＡポリメラーゼは、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼが好ましいが、これに限定されない。前記ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼは、特に制限されないが、好ましくは古細菌（Ａｒｃｈｅａ）由来のＤＮＡポリメラーゼである。
【００４０】
［古細菌由来のＤＮＡポリメラーゼ］
ファミリーＢに属する古細菌由来のＤＮＡポリメラーゼとしては、パイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属およびサーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）属の細菌から単離されるＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。また、本発明には、ファミリーＢに属する古細菌由来のＤＮＡポリメラーゼ活性を失っていないその変異体も含まれる。ＤＮＡポリメラーゼの変異体には、ポリメラーゼ活性の増強、エキソヌクレアーゼ活性の欠損、基質特異性の調整等を目的とした変異体が挙げられるが、これらに限定されない。
パイロコッカス属由来のＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＧＢ−Ｄ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｗｏｅｓｅｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉから単離されたＤＮＡポリメラーゼ、及びこれらに由来するＤＮＡポリメラーゼ活性を失っていないその変異体を含むが、これらに限定されない。
サーモコッカス属に由来するＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＪＤＦ−３、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．９ｄｅｇｒｅｅｓ  Ｎｏｒｔｈ−７（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．９°Ｎ−７）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｉｃｕｌｉから単離されたＤＮＡポリメラーゼ、及びこれらに由来するＤＮＡポリメラーゼ活性を失っていないその変異体を含むが、これらに限定されない。
これらのＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲ酵素は市販されており、Ｐｆｕ（Ｓｔａｒａｇｅｎｅ社）、ＫＯＤ（Ｔｏｙｏｂｏ社）、Ｐｆｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、Ｖｅｎｔ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）、Ｔｇｏ（Ｒｏｃｈｅ社）、Ｐｗｏ（Ｒｏｃｈｅ社）などが挙げられ、そのいずれもが本発明に用いられ得る。
【００４１】
なかでも、伸長性や熱安定性の優れたＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ及びその変異体（例えば、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠失させたＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ等）が好ましい。
【００４２】
ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼは、ファミリーＡに属するＤＮＡポリメラーゼであるＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼに比べて、正確性、増幅効率、伸長性、クルードサンプル耐性に優れている。本発明では、このようなＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼを使用することで、後述の実施例に示すように、簡便でありながら高感度でｔｃｄＢを検出することが可能となる。
【００４３】
本発明のｔｃｄＢ検出方法においては、前記のいずれかの方法で得られる増幅産物に、前記のいずれかのオリゴヌクレオチドプローブをハイブリダイズさせ、該反応液の蛍光強度を測定し、ｔｃｄＢを検出する。
【００４４】
ハイブリダイズの条件は、温度、ｐＨ、陽イオン濃度、溶液中の有機溶媒の存在等によって影響を受けるため、実施する核酸増幅反応等に合わせて至適化すればよい。
【００４５】
前記のｔｃｄＢ検出方法における工程（３）の核酸検出の態様としては、特に限定されないが、例えば、以下の工程（３ａ）〜（３ｃ）の少なくともひとつを包含する方法を用いることが好ましい。
（３ａ）得られうる増幅産物に該オリゴヌクレオチドプローブをハイブリダイズさせ、該反応液の蛍光強度を測定することで、前記核酸増幅反応の進行をリアルタイムでモニターする工程。
（３ｂ）前記工程（２）の終了後に、得られうる増幅産物に該オリゴヌクレオチドプローブをハイブリダイズさせ、該反応液の蛍光強度を測定することで、前記核酸増幅反応の進行をエンドポイントでモニターする工程。
（３ｃ）前記工程（２）の終了後に、得られうる増幅産物に該オリゴヌクレオチドプローブをハイブリダイズさせ、該反応液の蛍光強度の温度依存性を測定することで、ノロウイルスＧ１型核酸を検出あるいは該核酸の塩基配列多型を分析する工程。
【００４６】
［（３ａ）核酸増幅反応の進行をリアルタイムでモニター］
核酸増幅反応の進行をリアルタイムでモニターすることで、試料中に含まれる標的核酸を迅速に検出することができる。さらに、増幅率に基づいて試料中に含まれる標的核酸の定量も可能である。
例えば、蛍光消光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブを含む反応液の蛍光強度を測定することで、核酸増幅反応の進行をリアルタイムでモニターする。核酸増幅反応の任意の時点で、反応液の蛍光強度を測定する。試料中にｔｃｄＢのＤＮＡが含まれている場合、増幅した核酸量に依存してオリゴヌクレオチドプローブが増幅核酸にハイブリダイズして蛍光強度が増加（あるいは減少）する。取得した蛍光強度を時間（ＰＣＲ反応ではサイクル数）に対してプロットすることで、核酸増幅反応の進行をリアルタイムでモニターできる（例えば、実施例２）。
【００４７】
［（３ｂ）核酸増幅反応の進行をエンドポイントでモニター］
核酸増幅反応の進行をエンドポイントでモニターすることで、試料中に含まれる標的核酸を迅速に検出することができる。さらに、エンドポイントでの蛍光強度等を比較することで標的核酸の定量も可能である。
例えば、蛍光消光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブを含む反応液の蛍光強度を測定することで、核酸増幅反応の進行をエンドポイントでモニターする（例えば、実施例３）。核酸増幅反応終了後に、反応液の蛍光強度を測定する。反応後の反応液の蛍光強度を反応前の反応液の蛍光強度と比較することで、標的核酸の増幅の有無を確認できる。あるいは、反応後の反応液の反応強度をコントロール反応液の反応強度と比較することでも試料中に含まれる標的核酸の有無を確認することができる。コントロール反応液とは、測定したい試料の代わりに陰性と判明している試料あるいは陽性と判明している試料を加えた反応液である。
核酸増幅反応の進行は、一般的にリアルタイムでモニターすることが好ましいが、検出工程をより簡便にする等の目的では、エンドポイントでモニターすることが好ましい。
【００４８】
［（３ｃ）蛍光強度の温度依存性を測定］
蛍光強度の温度依存性を測定するとは、具体的には、反応液の温度を低温から高温に変化させながら、各温度における蛍光強度を測定することである（例えば、実施例４）。得られた蛍光強度について温度で一次微分することにより、使用するオリゴヌクレオチドプローブに固有の融解温度（Ｔｍ値）を求めることができる。また、蛍光強度は目的に合わせて蛍光消光率等に変換してもよい。
Ｔｍ値を用いた標的核酸の検出、分析等を融解曲線分析という。一般的に、Ｔｍ値は、オリゴヌクレオチドがその相補鎖と二本鎖を形成している割合と二本鎖を形成せず一本鎖である割合が等しいときの温度をいう。Ｔｍ値は、塩基配列に固有の値であるため、融解曲線分析は標的核酸の塩基配列多型を分析する手法として使用できる。ここでいう塩基配列多型とは、一塩基多型、塩基置換、塩基欠損、塩基挿入等を含む。
【００４９】
一例として、融解曲線分析はＳＮＰ解析などにも応用されている。
オリゴヌクレオチドプローブに対して標的核酸の塩基配列に変異がある場合、プローブがハイブリダイズした際に塩基がミスマッチしているため、一般的にＴｍ値は低くなる。したがって、Ｔｍ値の大きさを比較することで一塩基多型の解析（ＳＮＰ解析）を行うことができる。
【００５０】
［ｔｃｄＢを検出するための試薬］
本発明の別の実施態様として、試料中に含まれるｔｃｄＢを検出するための試薬が挙げられる。試薬には、前述の特徴（Ａ）及び（Ｂ）を備えたオリゴヌクレオチドプローブに加えて、核酸増幅に必要な成分が少なくとも含まれる。必要な成分は、実施する核酸増幅反応によって異なっており、それぞれ公知の方法を用いることができる。例えば、ＰＣＲ反応を用いて試料中に含まれるｔｃｄＢを検出する場合、オリゴヌクレオチドプローブ、ＤＮＡポリメラーゼ、オリゴヌクレオチドプライマー、デオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）、マグネシウム塩を少なくとも含むことが好ましい。目的の実験に応じて各成分の濃度は適宜調整できるが、例えば、オリゴヌクレオチドプローブは０．１〜１μＭが好ましく、０．２〜０．５μＭがより好ましい。ＤＮＡポリメラーゼは０．０１〜１Ｕ／ｕＬが好ましく、０．１〜０．５Ｕ／ｕＬがより好ましい。オリゴヌクレオチドプライマーはそれぞれ異なるが、０．１〜１０μＭが好ましい。デオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）は０．０２〜１ｍＭが好ましく、０．１〜０．５ｍＭがより好ましい。マグネシウム塩は０．１〜６ｍＭが好ましく、１〜５ｍＭがより好ましい。
【００５１】
さらに、非特異増幅の抑制や反応促進を目的として、当該技術分野で知られる添加物等を加えてもよい。非特異増幅の抑制を目的とする添加物として、抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体やリン酸等が挙げられる（特許文献４）。反応促進を目的とする添加物として、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、プロテアーゼインヒビター、シングルストランド結合タンパク質（ＳＳＢ）、Ｔ４遺伝子３２タンパク質、ｔＲＮＡ、硫黄または酢酸含有化合物類、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、エチレングリコール、プロピレングリコール、トリメチレングリコール、ホルムアミド、アセトアミド、ベタイン、エクトイン、トレハロース、デキストラン、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ゼラチン、塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ）、水酸化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＨ）、酢酸テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＡ）、ポリエチレングリコール、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）、ツイーン（Ｔｗｅｅｎ２０）、ノニデットＰ４０などが挙げられる。本発明では、これらの添加物を１種類以上組み合わせて使用してもよいが、これらに限定されない。
【００５２】
オリゴヌクレオチドプライマーは、核酸増幅反応において核酸増幅の起点として使用されるオリゴヌクレオチドであり、当該技術分野において一般的に使用されている（例えば、特許文献１）。また、実施する核酸増幅反応によって複数種類のオリゴヌクレオチドプライマーが使用されてもよい。実験の目的によって異なるが、好ましくは、本発明のオリゴヌクレオチドプローブがハイブリダイズする標的配列を含む５０〜５００ｂｐ程度、好ましくは５０〜２００ｂｐ程度を増幅できるようなフォワードプライマーとリバースプライマーとをセットで用いるのがよい。特異性の高いオリゴヌクレオチドプライマーは、３’末端がターゲット配列に対して相補的であることが重要であり、言い換えれば、３’末端が相補的であれば５’末端が相補的でなくとも有効なプライマーとなり得る。このことから、本発明で使用するオリゴヌクレオチドプライマーも３’末端がゲノム配列に対して相補的な配列を有するように設計することが好ましい。さらに、標的核酸が菌株によって塩基配列多型である場合、縮重プライマーを使用してもよい。
【００５３】
［ｔｃｄＢを検出するためのキット］
さらに、本発明の別の実施態様として、試料中に含まれるｔｃｄＢを検出するための試薬を含むキットが挙げられる。キットの構成は、前記オリゴヌクレオチドプローブを含む前記ｔｃｄＢ検出試薬を含み、ｔｃｄＢを検出できるよう構成されていれば特に限定されない。
【実施例】
【００５４】
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００５５】
実施例１：ｔｃｄＢのアライメントとオリゴヌクレオチドプローブの設計
（１−１）方法
従来技術よりも簡便、高感度にｔｃｄＢを検出できるオリゴヌクレオチドプローブを設計するために、ｔｃｄＢのアライメントを行った。ｔｃｄＢの塩基配列をＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のデータベースから取得し、それらのアライメントを行った（全４０配列）。
（１−２）結果
アライメントの結果から、以下の特徴（ａ）〜（ｂ）を満たすと考えられる塩基配列を選択した。
（ａ）株間差なくハイブリダイズできる
（ｂ）ダイマー等の非特異産物を形成しない
（ｃ）Ｔｍ値が４０℃以上である
その結果、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９のいずれかで示される塩基配列またはそれらに相補的な塩基配列で示される塩基配列の一部のうち、連続する少なくとも１５塩基以上の塩基配列を選択できた。
【００５６】
実施例２：リアルタイムでモニターできるｔｃｄＢの検出
（２−１）方法
配列番号９、配列番号１０、配列番号１１に相補的な塩基配列で、３’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬで標識したオリゴヌクレオチドプローブのいずれかを用いて、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ（ｔｃｄＢ陽性）コロニー懸濁液を試料としてＰＣＲ反応を行った。なお、オリゴヌクレオチドプライマーは配列番号２０、配列番号２１に記載の塩基配列を使用した。
（２−２）反応液
ＫＯＤ  ＦＸ  Ｎｅｏ（東洋紡社）を使用して以下に示される成分を含む反応液を調製した。反応液の調製等はＫＯＤ  ＦＸ  Ｎｅｏ（東洋紡社）の取扱説明書に従った。
１．５μＭ  配列番号２０で示されるプライマー
０．５μＭ  配列番号２１で示されるプライマー
０．３μＭ  オリゴヌクレオチドプローブ（配列番号９〜１１のいずれかに相補的な塩基配列）
（２−３）反応
Ｒｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ（ＴＭ）  Ｑを用いて、前記反応液を以下の温度サイクルで反応させ、各サイクルにおける蛍光強度を測定した。
９４℃  ３０秒、
９８℃  １秒−５２℃  １０秒−６３℃  １０秒（サイクル数６０回）
（２−４）結果
図１は、測定で得られた蛍光強度（消光率に変換）をサイクル数にプロットした図である。実線、点線、破線がそれぞれ配列番号９、配列番号１０、配列番号１１に相補的な塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドプローブを使用したときの蛍光強度のプロット図である。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドプローブを使用して、核酸増幅反応の進行をリアルタイムでモニターできることが示された。
【００５７】
実施例３：エンドポイントでモニターできるｔｃｄＢの検出
（３−１）方法
配列番号１１に相補的な塩基配列で、３’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬで標識したオリゴヌクレオチドプローブを用いて、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ（ｔｃｄＢ陽性）コロニー懸濁液を試料としてＰＣＲ反応を行った。なお、オリゴヌクレオチドプライマーは配列番号２０、配列番号２１に記載の塩基配列を使用した。テンプレートの濃度は、０、１００、１０００ＣＦＵ／ｔｅｓｔのコロニー懸濁液をそれぞれ使用した。
（３−２）反応液
ジーンキューブ（登録商標）テストベーシック（東洋紡社）を使用して以下に示される成分を含む反応液を調製した。反応液の調製等はジーンキューブ（登録商標）テストベーシックの取扱説明書に従った。
１．５μＭ  配列番号２０で示されるプライマー
０．５μＭ  配列番号２１で示されるプライマー
０．３μＭ  オリゴヌクレオチドプローブ
（３−３）反応
ＧＥＮＥＣＵＢＥ（登録商標）を用いて、前記反応液を以下の温度サイクルで反応させ、各サイクルにおける蛍光強度を測定した。
９４℃  ３０秒、
９８℃  １秒−５２℃  １０秒−６３℃  １０秒（サイクル数６０回）
（３−４）結果
図２に、蛍光強度及び蛍光変化率を示す。蛍光変化率（本実施例では消光率を表す）は、（増幅前蛍光強度−増幅後蛍光強度）／（増幅前蛍光強度）の式より求めた。図２より、テンプレート量にしたがって、蛍光強度が変化することが明らかになり、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ（ｔｃｄＢ陽性）の半定量も可能であった。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドプローブを使用して、核酸増幅反応の進行をエンドポイントでモニターできることが示された。オリゴヌクレオチドプローブとして配列番号９、配列番号１０に相補的な塩基配列で示される配列を有するものを用いた場合においても、それぞれ同様の結果が得られた。
【００５８】
実施例４：融解曲線分析によるｔｃｄＢの検出
（４−１）方法
実施例３と同様の反応液（配列番号１１に相補的な塩基配列のオリゴヌクレオチドプローブを含む）、反応条件を用いて、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ（ｔｃｄＢ陽性）コロニー懸濁液を試料としてＰＣＲ反応を行った。核酸増幅反応後に以下の条件による融解曲線分析を行った。テンプレートの濃度は、０、１００、１０００ＣＦＵ／ｔｅｓｔのコロニー懸濁液をそれぞれ使用した。
９４℃  ３０秒、
３９℃  ３０秒、
４０−７５℃  ０．０９℃／秒
（４−２）結果
図３に、融解曲線分析の結果を示す。実線、点線、破線がそれぞれ１０００、１００、０ＣＦＵ／ｔｅｓｔのコロニー懸濁液を測定したときの融解曲線分析結果である。図３より、融解曲線分析によって試料中に含まれるｔｃｄＢを検出できることが示された。オリゴヌクレオチドプローブとして配列番号９、配列番号１０に相補的な塩基配列で示される配列を有するものを用いた場合においても、それぞれ同様の結果が得られた。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
本発明に記載のオリゴヌクレオチドプローブ及び該プローブを使用した方法、試薬またはキットを使用することで、簡便、高感度に試料中に含まれるｔｃｄＢを検出できるようになった。したがって、本発明は研究用途のみならず、院内感染等のおそれがある場合に、その原因菌の毒素遺伝子であるｔｃｄＢを迅速、簡便、高感度に検出することを可能とし、臨床診断や環境検査等にも大きく貢献することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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