(57)【要約】【課題】ヘルパーウイルスの非存在下での高力価インフルエンザウイルスの調製に有用な組成物の提供。【解決手段】本発明は、ＭＤＣＫ細胞などの培養中の細胞内又は卵内で成長促進をもたらし、例えば、ヒトにおいて安全である、例えば、重篤な疾患を生じない、インフルエンザウイルスワクチン株又は単離株由来の内部遺伝子を含む、例えばヘルパーウイルスの非存在下での高力価インフルエンザウイルスの調製に有用な組成物を提供する。【選択図】図１７
2020010711.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一のインフルエンザワクチンウイルス単離株由来のＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＮＰ、ＮＳ、及びＭ遺伝子セグメント、異種又はキメラインフルエンザウイルスＮＡ遺伝子セグメント、並びに異種又はキメラＨＡ遺伝子セグメントを有する単離組換えインフルエンザウイルスであって、ここで、該ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＮＰ、ＮＳ、及びＭ遺伝子セグメントの２以上は、選択されたアミノ酸残基をＰＡの３０、３１、１０５、１４２、１４９、２２５、３５６、３５７、４０１、及び／又は５５０位；ＰＢ１の４０、５４、５９、６２、６３、７５、７６、７８、７９、８０、１１２、１８０、２４７、３２７、５０７、６２４、６４４、６６７、６９４、６９５、６９７、６９９、７００、７０１、７０２、７０５、７１３、及び／又は７１４位；ＰＢ２の５７、５８、５９、６１、６６、２０２、３２３、３６８、３９１、５０４、５９１、６７７、６７８、及び／又は６７９位；ＮＰの７４、１１２、１１６、２２４、２９３、３７１、３７７、４１７、４２２又は４４２位；Ｍ１の９０、９７、及び／又は１００位；或いはＮＳ１の３０、４９、５５、１１８、１４０、１６１、及び／又は２２３位
に有する単離組換えインフルエンザウイルス。
【請求項２】
ＰＡに１４２Ｎ、２２５Ｃ、３５６Ｒ、又は５５０Ｌを有し；ＰＢ１に１若しくは複数の１１２Ｇ、２４７Ｈ、５０７Ｖ、又は６４４Ａを有し；ＰＢ２に１若しくは複数の２０２Ｌ、３２３Ｌ又は５０４Ｖを有し；ＮＰに１若しくは複数の７４Ｋ、１１２Ｌ、１１６Ｌ、４１７Ｄ、又は４４２Ａを有し；Ｍ１に９７Ａ及び／又は１００Ｈを有し；並びに／或いはＮＳ１に５５Ｅ及び／又は１４０Ｑを有するか、或いはその組み合わせを有する、請求項１に記載の単離ウイルス。
【請求項３】
ＰＢ２の２０２Ｌ及び／又は３２３Ｌ、ＰＢ１の２４７Ｈ、或いはＮＰの７４Ｋの少なくとも１つを有し、任意にはＰＡ１の１４２Ｎ、ＮＳ１の５５Ｋ或いはＭ１の９７Ａ及び／又は１００Ｈの少なくとも１つを有する、請求項１又は２に記載の単離ウイルス。
【請求項４】
ＰＢ２の２０２Ｌ及び／又は３２３Ｌ、ＰＢ１の２４７Ｈ或いはＮＰの７４Ｋの少なくとも１つを有し、且つ、ＰＡ１の１４２Ｎ、ＮＳ１の５５Ｋ或いはＭ１の９７Ａ及び／又は１００Ｈの少なくとも１つを有する、請求項１又は２に記載の単離ウイルス。
【請求項５】
ＰＢ２に２０２Ｌ及び／又は３２３Ｌを有する、請求項１に記載の単離ウイルス。
【請求項６】
ＰＢ１に２４７Ｈを有する、請求項１又は５に記載の単離ウイルス。
【請求項７】
ＮＰに７４Ｋを有する、請求項１、５又は６に記載の単離ウイルス。
【請求項８】
ＰＢ１、ＰＢ２又はＰＡのいずれかの遺伝子セグメントの４位にＵを有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の単離ウイルス。
【請求項９】
ＰＢ１に４０Ｉ、４０Ｌ、１１２Ｇ、１８０Ｗ、２４７Ｈ、５０７Ｖ、又は６４４Ａを有する、請求項１又は２に記載の単離ウイルス。
【請求項１０】
ＰＢ２に２０２Ｌ及び／又は３２３Ｌを有する、請求項１〜２又は９のいずれか１項に記載の単離ウイルス。
【請求項１１】
ＮＰに７４Ｋ、１１２Ｌ、１１６Ｌ、３７７Ｎ、４１７Ｄ、又は４２２Ｌを有する、請求項１〜２又は９〜１０のいずれか１項に記載の単離ウイルス。
【請求項１２】
ＮＳ１に３０Ｐ、１１８Ｋ、１６１Ｔ又は１４０Ｑを有する、請求項１〜２又は９〜１１のいずれか１項に記載の単離ウイルス。
【請求項１３】
ＰＡに１４２Ｎ、２２５Ｃ、３５６Ｒ、４０１Ｋ、又は５５０Ｌを有する、請求項１〜２又は９〜１２のいずれか１項に記載の単離ウイルス。
【請求項１４】
前記ＰＡの特定の位置の選択されたアミノ酸残基が、９７、１０５、１４２、１４９、２２５、３５６、３５７、４０１、４０４、及び／又は４２１位（の単数若しくは複数）に存在する、請求項１に記載の単離ウイルス。
【請求項１５】
前記ＰＢ１の特定の位置の選択されたアミノ酸残基が、１２、４０、５４、５９、６２、６３、６６、７５、７６、７８、７９、８０、１８０、２４７、５０７、６２４、６４４、６９４、６９５、６９７、６９９、７００、７０１、７０５、７１３、７１４、及び／又は７６２位（の単数若しくは複数）に存在する、請求項１又は１４に記載の単離ウイルス。
【請求項１６】
前記ＰＢ２の特定の位置の選択されたアミノ酸残基が、５７、５８、５９、６１、６６、２０２、２４３、３２３、５０４、６７７、６７８、及び／又は６７９位（の単数若しくは複数）に存在する、請求項１又は１４〜１５のいずれか１項に記載の単離ウイルス。
【請求項１７】
前記ＮＰの特定の位置の選択されたアミノ酸残基が、７４、１１２、１１６、２２４、２９３、４１７、及び／又は４４２位（の単数若しくは複数）に存在する、請求項１又は１４〜１６のいずれか１項に記載の単離ウイルス。
【請求項１８】
前記Ｍ１の特定の位置の選択されたアミノ酸残基が、９０、９７、及び／又は１００位（の単数若しくは複数）に存在する、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の単離ウイルス。
【請求項１９】
前記ＮＳ１の特定の位置の選択されたアミノ酸残基が、４９、３０、５５、１６１、及び／又は２２３位（の単数若しくは複数）に存在する、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の単離ウイルス。
【請求項２０】
前記ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＮＰ、ＮＳ、及びＭ遺伝子セグメントの少なくとも１つが、ＣからＵへのプロモーター変異を有する、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の単離ウイルス。
【請求項２１】
前記ＮＡ遺伝子セグメント及びＨＡ遺伝子セグメントが、同一のインフルエンザウイルス単離株に由来する、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の単離ウイルス。
【請求項２２】
前記ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＮＰ、ＮＳ、及びＭ遺伝子セグメントが、次の：配列番号２によってコードされるアミノ酸配列を有するＰＢ１又は配列番号２によってコードされるＰＢ１に対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するＰＢ１；配列番号３によってコードされるアミノ酸配列を有するＰＢ２又は配列番号３によってコードされるＰＢ２に対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するＰＢ２；配列番号１によってコードされるアミノ酸配列を有するＰＡ又は配列番号１によってコードされるＰＡに対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するＰＡ；配列番号４によってコードされるアミノ酸配列を有するＮＰ又は配列番号４によってコードされるＮＰに対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するＮＰ；配列番号５によってコードされるアミノ酸配列を有するＭ又は配列番号５によってコードされるＭに対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するＭ；又は、配列番号６によってコードされるアミノ酸配列を有するＮＳ又は配列番号６によってコードされるＮＳに対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するＮＳ、の少なくとも１つの配列を含むか；或いは、前記ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＮＰ、ＮＳ、及びＭ遺伝子セグメントが、次の：配列番号１０によってコードされるアミノ酸配列を有するＰＢ１又は配列番号１０によってコードされるＰＢ１に対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するＰＢ１；配列番号１１によってコードされるアミノ酸配列を有するＰＢ２又は配列番号１１によってコードされるＰＢ２に対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するＰＢ２；配列番号１２によってコードされるアミノ酸配列を有するＰＡ又は配列番号１２によってコードされるＰＡに対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するＰＡ；配列番号１３によってコードされるアミノ酸配列を有するＮＰ又は配列番号１３によってコードされるＮＰに対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するＮＰ；配列番号１４によってコードされるアミノ酸配列を有するＭ又は配列番号１４によってコードされるＭに対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するＭ；又は、配列番号１５によってコードされるアミノ酸配列を有するＮＳ又は配列番号１５によってコードされるＮＳに対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するＮＳ、の少なくとも１つの配列を含む、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の単離ウイルス。
【請求項２３】
異種ＨＡ遺伝子セグメント、異種ＮＡ遺伝子セグメント、キメラＨＡ遺伝子セグメント、キメラＮＡ遺伝子セグメント、又はそれらの任意の組み合わせを有する、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の単離ウイルス。
【請求項２４】
請求項１〜２３のいずれか１項に記載の単離された組換えウイルスを有するワクチン。
【請求項２５】
再集合体を調製するための複数のインフルエンザウイルスベクターであって、
ａ）転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＰＡ  ＤＮＡに作動可能に連結されたプロモーターを含むｖＲＮＡ産生のためのベクター、転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスＰＢ１  ＤＮＡに作動可能に連結されたプロモーターを含むｖＲＮＡ産生のためのベクター、転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスＰＢ２  ＤＮＡに作動可能に連結されたプロモーターを含むｖＲＮＡ産生のためのベクター、転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＨＡ  ＤＮＡに作動可能に連結されたプロモーターを含むｖＲＮＡ産生のためのベクター、転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスＮＰ  ＤＮＡに作動可能に連結されたプロモーターを含むｖＲＮＡ産生のためのベクター、転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＮＡ  ＤＮＡに作動可能に連結されたプロモーターを含むｖＲＮＡ産生のためのベクター、転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＭ  ＤＮＡに作動可能に連結されたプロモーターを含むｖＲＮＡ産生のためのベクター、及び転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスＮＳ  ｃＤＮＡに作動可能に連結されたプロモーターを含むｖＲＮＡ産生のためのベクターであって、ｖＲＮＡ産生のためのベクター内のＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、ＮＳ、及びＭ  ＤＮＡが、１若しくは複数のインフルエンザワクチンウイルス単離株に由来すると共に、ＮＡのｖＲＮＡ産生のためのベクター内のＮＡ  ＤＮＡが、異種ＮＡに関する配列を有し、ＨＡのｖＲＮＡ産生のためのベクター内のＨＡ  ＤＮＡが、ＰＡの３０、３１、１０５、１４２、１４９、２２５、３５６、３５７、４０１、及び／又は５５０；ＰＢ１の４０、５４、５９、６２、６３、７５、７６、７８、７９、８０、１１２、１８０、２４７、３２７、５０７、６２４、６４４、６６７、６９４、６９５、６９７、６９９、７００、７０１、７０２、７０５、７１３、若しくは７１４、及び／又は２４７；ＰＢ２の５７、５８、５９、６１、６６、２０２、３２３、３６８、３９１、５０４、５９１、６７７、６７８、６７９、２０２、及び／又は３２３；ＮＰの７４、１１２、１１６、２２４、２９３、３７１、３７７、４１７、４２２、及び／又は４４２；Ｍ１の９０、９７、及び／又は１００；或いはＮＳの３０、４９、５５、１１８、１４０、１６１、及び／又は２２３の異種ＨＡの配列を有するベクター；及び
ｂ）インフルエンザウイルスＰＡをコードするＤＮＡセグメントに作動可能に連結されたプロモーターを含むｍＲＮＡ産生のためのベクター、インフルエンザウイルスＰＢ１をコードするＤＮＡセグメントに作動可能に連結されたプロモーターを含むｍＲＮＡ産生のためのベクター、インフルエンザウイルスＰＢ２をコードするＤＮＡセグメントに作動可能に連結されたプロモーターを含むｍＲＮＡ産生のためのベクター、インフルエンザウイルスＮＰをコードするＤＮＡセグメントに作動可能に連結されたプロモーターを含むｍＲＮＡ産生のためのベクター、及び任意には、インフルエンザウイルスＨＡをコードするＤＮＡセグメントに作動可能に連結されたプロモーターを含むｍＲＮＡ産生のためのベクター、インフルエンザウイルスＮＡをコードするＤＮＡセグメントに作動可能に連結されたプロモーターを含むｍＲＮＡ産生のためのベクター、インフルエンザウイルスＭ１をコードするＤＮＡセグメントに作動可能に連結されたプロモーターを含むｍＲＮＡ産生のためのベクター、インフルエンザウイルスＭ２をコードするＤＮＡセグメントに作動可能に連結されたプロモーターを含むｍＲＮＡ産生のためのベクター、又はインフルエンザウイルスＮＳ２をコードするＤＮＡセグメントに作動可能に連結されたプロモーターを含むｍＲＮＡ産生のためのベクター、
を含むベクター。
【請求項２６】
ｖＲＮＡ産生のためのベクター内のＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、ＮＳ、及びＭ  ＤＮＡが、配列番号１〜６又は１０〜１５によってコードされる対応するポリペプチドと少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡに相当する配列を有する、請求項２５に記載のベクター。
【請求項２７】
ｖＲＮＡベクターに関するプロモーターが、ＲＮＡポリメラーゼＩプロモーター、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター、Ｔ３プロモーター又はＴ７プロモーターである、請求項２５又は２６に記載のベクター。
【請求項２８】
前記ＮＡがＮ９である、請求項２５〜２７のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項２９】
前記ＨＡがＨ７である、請求項２５〜２８のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項３０】
前記ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＮＰ、ＮＳ、及びＭ遺伝子セグメントが、プロモーターのＣに対する変異を有する、請求項２５〜２９のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項３１】
インフルエンザウイルスの調製方法であって、
感染性インフルエンザウイルスを得るのに有効な量の、
転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＰＡ  ＤＮＡに作動可能に連結されたプロモーターを含むｖＲＮＡ産生のためのベクター、転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスＰＢ１  ＤＮＡに作動可能に連結されたプロモーターを含むｖＲＮＡ産生のためのベクター、転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスＰＢ２  ＤＮＡに作動可能に連結されたプロモーターを含むｖＲＮＡ産生のためのベクター、転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＨＡ  ＤＮＡに作動可能に連結されたプロモーターを含むｖＲＮＡ産生のためのベクター、転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスＮＰ  ＤＮＡに作動可能に連結されたプロモーターを含むｖＲＮＡ産生のためのベクター、転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＮＡ  ＤＮＡに作動可能に連結されたプロモーターを含むｖＲＮＡ産生のためのベクター、転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＭ  ＤＮＡに作動可能に連結されたプロモーターを含むｖＲＮＡ産生のためのベクター、及び転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＮＳ  ＤＮＡに作動可能に連結されたプロモーターを含むｖＲＮＡ産生のためのベクターであって、
ｖＲＮＡ産生のためのベクター内のＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、ＮＳ、及びＭ  ＤＮＡが、１若しくは複数のインフルエンザワクチンウイルス単離株に由来すると共に、ＮＡのｖＲＮＡ産生のためのベクター内のＮＡ  ＤＮＡが、異種ＮＡに関する配列を有し、ＨＡのｖＲＮＡ産生のためのベクター内のＨＡ  ＤＮＡが、ＰＡの３０、３１、１０５、１４２、１４９、２２５、３５６、３５７、４０１、及び／又は５５０；ＰＢ１の４０、５４、５９、６２、６３、７５、７６、７８、７９、８０、１１２、１８０、２４７、３２７、５０７、６２４、６４４、６６７、６９４、６９５、６９７、６９９、７００、７０１、７０２、７０５、７１３、７１４、及び／又は２４７；ＰＢ２の５７、５８、５９、６１、６６、２０２、３２３、３６８、３９１、５０４、５９１、６７７、６７８、６７９、２０２、及び／又は３２３；ＮＰの７４、１１２、１１６、２２４、２９３、３７１、３７７、４１７、４２２、及び／又は４４２；Ｍ１の９０、９７、及び／又は１００；或いはＮＳの３０、４９、５５、１１８、１４０、１６１又は２２３の異種ＨＡの配列を有するベクター、及び
インフルエンザウイルスＰＡをコードするＤＮＡセグメントに作動可能に連結されたプロモーターを含むｍＲＮＡ産生のためのベクター、インフルエンザウイルスＰＢ１をコードするＤＮＡセグメントに作動可能に連結されたプロモーターを含むｍＲＮＡ産生のためのベクター、インフルエンザウイルスＰＢ２をコードするＤＮＡセグメントに作動可能に連結されたプロモーターを含むｍＲＮＡ産生のためのベクター、インフルエンザウイルスＮＰをコードするＤＮＡセグメントに作動可能に連結されたプロモーターを含むｍＲＮＡ産生のためのベクター、任意にはインフルエンザウイルスＨＡをコードするＤＮＡセグメントに作動可能に連結されたプロモーターを含むｍＲＮＡ産生のためのベクター、インフルエンザウイルスＮＡをコードするＤＮＡセグメントに作動可能に連結されたプロモーターを含むｍＲＮＡ産生のためのベクター、インフルエンザウイルスＭ１をコードするＤＮＡセグメントに作動可能に連結されたプロモーターを含むｍＲＮＡ産生のためのベクター、インフルエンザウイルスＭ２をコードするＤＮＡセグメントに作動可能に連結されたプロモーターを含むｍＲＮＡ産生のためのベクター、又はインフルエンザウイルスＮＳ２をコードするＤＮＡセグメントに作動可能に連結されたプロモーターを含むｍＲＮＡ産生のためのベクター、
と細胞を接触させることを含む、インフルエンザウイルスの調製方法。
【請求項３２】
前記細胞がニワトリの細胞である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記細胞が哺乳類の細胞である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記細胞が、ベロ細胞、ヒト細胞又はＭＤＣＫ細胞である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
ｖＲＮＡ産生のためのベクター内のＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、ＮＳ、及びＭ  ＤＮＡが、配列番号１〜６又は１０〜１５によってコードされる対応するポリペプチドと少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡに相当する配列を有する、請求項３１〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
ウイルスを単離する方法を更に含む、請求項３１〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
ＰＡ、ＰＢ１、又はＰＢ２遺伝子セグメントの少なくとも１つが、ＣからＵへのプロモーター変異を有する、請求項３１〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
請求項３１〜３７のいずれか１項に記載の方法によって得られたウイルス。
【請求項３９】
配列番号１によってコードされるポリペプチドに対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有し、且つ、３０位にトレオニン、３１位にリジン、１０５位にシステイン又は４０１位にリジンを有する、インフルエンザウイルスＰＡのｖＲＮＡ又はｍＲＮＡ発現のためのベクター。
【請求項４０】
配列番号２によってコードされるポリペプチドに対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有し、且つ、４０位にロイシン、５４位にアラニン又はイソロイシン、１１２位にグリシン、２４７位にヒスチジン、５０７位にバリン、６４４位にアラニン、又は７１３位にシステインを有する、インフルエンザウイルスＰＢ１のｖＲＮＡ又はｍＲＮＡ発現のためのベクター。
【請求項４１】
配列番号３によってコードされるポリペプチドに対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有し、且つ、２０２位及び／又は３２３位にロイシンを有する、ＰＢ２のｖＲＮＡ又はｍＲＮＡ発現のためのベクター。
【請求項４２】
配列番号４によってコードされるポリペプチドに対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有し、且つ、７４位にリジン、１１６位にロイシン、２２４位にイソロイシン、２９３位にリジン、３７７位にアスパラギン、又は４１７位にアスパラギン酸を有する、インフルエンザウイルスＮＰのｖＲＮＡ又はｍＲＮＡ発現のためのベクター。
【請求項４３】
配列番号６によってコードされるＮＳ１ポリペプチドに対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有し、且つ、３０位にプロリン、４９位にアラニン、１１８位にリジン、１４０位にグルタミン、１６１位にトレオニン、又は２２３位にグルタミン酸を有する、インフルエンザウイルスＮＳ１のｖＲＮＡ又はｍＲＮＡ発現のためのベクター。
【請求項４４】
配列番号５によってコードされるＭ１ポリペプチドに対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有し、且つ、９０位にセリンを有する、インフルエンザウイルスＭ１のｖＲＮＡ又はｍＲＮＡ発現のためのベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１３年７月１５日に出願された米国特許出願第６１／８４６，４６０号に係る優先権を主張し、斯かる出願の開示を参照により本明細書中に援用する。
【０００２】
政府の権利に関する記載事項
本発明は、米国立保健研究所からＡＩ０７００１０及びＨＨＳＮ２６６２００７０００１０Ｃとして受けた政府の支援で完成した。米国政府は、本発明の一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
インフルエンザは、ウマを含む一部の哺乳類において主要な呼吸器疾患であり、例年、かなりの死亡率及び経済損失の原因となっている。さらに、インフルエンザウイルスの感染は、一部の種のトリで重度の全身性疾患を生じ、死につながり得る。インフルエンザウイルスゲノムの分割特性は、２つ以上のインフルエンザウイルスに感染した細胞においてウイルス複製中にセグメントの再集合を可能にする。遺伝子変異及びドリフトと結合したセグメントの再集合（ｒｅａｓｓｏｒｔｍｅｎｔ）は、時間とともに無数のインフルエンザウイルス株を生じ得る。斯かる株は、その赤血球凝集素（ＨＡ）及び／又はノイラミニダーゼ（ＮＡ）タンパク質において抗原変異を示し、特にＨＡタンパク質をコードする遺伝子は高い変異率を有する。インフルエンザの予防のための現在の主要な慣習は、ワクチン接種である。インフルエンザＨＡタンパク質は宿主のウイルスへの防御免疫応答のための主要な標的抗原であり、非常に可変性があるので、インフルエンザウイルスの単離及び最近の大流行と関係するウイルス中のＨＡ抗原の同定及び性質決定は、ワクチン製造に重要である。ワクチンは、蔓延及び予想に基づいて、主要であり且つ予想されたインフルエンザウイルス株に対する防御免疫応答を刺激するようデザインされる（Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４）。
【０００４】
インフルエンザウイルスは３つの一般型、Ａ型、Ｂ型及びＣ型が存在し、それらの内部タンパク質間の血清交差反応性の欠如によって定義される。インフルエンザＡ型ウイルスは、さらにそれらの糖タンパク質、ＨＡ及びＮＡタンパク質の抗原性及び遺伝的差異に基づきサブタイプに分類される。周知の全てのＨＡ及びＮＡサブタイプ（Ｈ１〜Ｈ１５及びＮ１〜Ｎ９）は水鳥から単離されており、インフルエンザの天然の貯蔵所として機能すると考えられている。Ｈ１Ｎ１汎発性ウイルスは２００９年に世界的蔓延を引き起こした。２００９年に試験された最初のワクチン候補株は高力価で成長しなかったので、ワクチンウイルス候補に効率的な複製をもたらすワクチンウイルスバックボーンを開発する必要性をはっきりと示した。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
細胞培養及び／又は孵化鶏卵内でウイルスの複製能力を増強する変異は、インフルエンザウイルスを増幅するために、及び強固なインフルエンザワクチンプラットフォームを樹立するために有用である。現在、ほとんどのインフルエンザワクチンが孵化鶏卵で産生される。ＭＤＣＫ細胞で産生されたインフルエンザワクチンは、現在、米国及び欧米でヒトでの使用が承認され、そして、ベロ細胞に由来するインフルエンザワクチンは、欧米でヒトでの使用が承認されている。ワクチンウイルス単離株（例えば、ＵＷ−ＰＲ８）の「内部」ウイルス遺伝子（すなわち、ウイルス表面糖タンパク質ＨＡ及びＮＡをコードするもの以外のすべてのウイルス遺伝子）のランダム変異を有するウイルスライブラリが、ＭＤＣＫ細胞において作製され、そして、継代された。同定された変異は、ＭＤＣＫ細胞内でより高いウイルス力価をもたらし（そしてまた、ベロ細胞及び／又は孵化鶏卵においてもウイルス力価を増強する可能性があり）、より効果的なインフルエンザウイルス増殖、及びより経済的なワクチン生産を可能にした。そのうえ、先に記載した変異は、ＵＷ−ＰＲ８ワクチンバックボーンウイルスの複製能力を増強した。６つの内部遺伝子セグメントのコード領域の変異に加えて、プロモーター変異、例えばＰＢ２、ＰＢ１、及び／又はＰＡ  ｖＲＮＡセグメントの３末端から４位におけるＣからＵへの変異を含めた、非コード領域における変異は、ウイルスの力価を増強することが観察された。また、得られた配列は、コドン利用が最適化され得、例えば、イヌ細胞、霊長類細胞、又はニワトリ細胞、例えば、鶏胚などの哺乳動物細胞内での発現のために最適化され得る。変異は、使用中の細胞株（又は卵）によって影響される結果、並びにウイルスの複製における所望の改善レベルを有する様々な組み合わせで使用できる。
【０００６】
本発明は、選択されたアミノ酸残基を、ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＮＰ、Ｍ（Ｍ１及びＭ２タンパク質をコードする）、及び／又はＮＳ（ＮＳ１及びＮＳ２タンパク質をコードする）の１若しくは複数の遺伝子セグメントの１若しくは複数の特定の位置に有する、例えば、選択されたアミノ酸残基をＰＢ１、ＰＢ２、及びＮＳ１；ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＮＰ、及びＮＳ１；ＰＢ１、ＰＢ２、ＮＰ、Ｍ、及びＮＳ１；及びＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＮＰ、及びＮＳ１；又はＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＮＰ、Ｍ、及びＮＳ１の特定の位置に有し、且つ、例えば、毎年の及び世界的流行株由来の着目のＨＡ及びＮＡ遺伝子／タンパク質を含む、単離された組換え、例えば、再集合体インフルエンザウイルスを提供し、該ウイルスは、細胞培養によって（ＭＤＣＫ又はベロ細胞内で）又は孵化鶏卵内でより効率的に、且つ、コスト効率よく産生される。一実施形態において、組換え再集合体インフルエンザウイルスは、例えば、ＰＡの１４２位にリジンを有する対応するウイルスと比較して、ＭＤＣＫ細胞、ベロ細胞又は卵を含めた細胞内で成長促進をもたらす、アミノ酸残基をＰＡの１４２位に有する、すなわち、組換えインフルエンザウイルスのＰＡ遺伝子セグメントのＰＡの１４２位の残基は、リジンでないが、ＭＤＣＫ細胞、ベロ細胞又は卵内での複製促進と相関がある残基、且つ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＮＰ、Ｍ１、及び／又はＮＳ１の１若しくは複数の特定の位置において任意に選択されるアミノ酸残基である。一実施形態において、組換え再集合体インフルエンザウイルスは、例えば、ＰＡの１４２位にリジンを有する対応するウイルスと比較して、ＭＤＣＫ細胞、ベロ細胞又は卵内で１若しくは複数の宿主タンパク質との相互作用の強化をもたらすアミノ酸残基をＰＡの１４２位に有する。一実施形態において、組換え再集合体インフルエンザウイルスは、ＰＡの１４２位にアスパラギン又はグルタミンを有し、且つ、任意に選択されたアミノ酸残基をＰＢ１、ＰＢ２、ＮＰ、Ｍ１、及び／又はＮＳ１の１若しくは複数の特定の位置に有する。一実施形態において、組換え再集合体インフルエンザウイルスは、例えば、ＰＢ１の２４７位にグルタミンを有する対応するウイルスと比較して、ＭＤＣＫ細胞、ベロ細胞又は卵を含めた細胞内で成長促進をもたらすアミノ酸残基をＰＢ１の２４７位に有する、すなわち、組換えインフルエンザウイルスのＰＢ１遺伝子セグメントのＰＢ１の２４７位の残基は、グルタミンでないが、ＭＤＣＫ細胞、ベロ細胞又は卵内での複製促進と相関がある残基、且つ、本明細書中に記載したＰＡ、ＰＢ２、ＮＰ、Ｍ１、及び／又はＮＳ１の１若しくは複数の特定の位置で任意に選択されたアミノ酸残基である。一実施形態において、組換え再集合体インフルエンザウイルスは、例えば、ＰＢ１の２４７位にグルタミンを有する対応するウイルスと比較して、ＭＤＣＫ細胞、ベロ細胞又は卵内で１若しくは複数の宿主タンパク質との相互作用の強化をもたらすアミノ酸残基をＰＢ１の２４７位に有する。一実施形態において、組換え再集合体インフルエンザウイルスは、ＰＢ１の２４７位にヒスチジン、アルギニン又はリジンを有し、且つ、任意に選択されたアミノ酸残基を本明細書中に記載したＰＡ、ＰＢ２、ＮＰ、Ｍ１、及び／又はＮＳ１の１若しくは複数の特定の位置に有する。一実施形態において、例えば、組換え再集合体インフルエンザウイルスは、ＰＢ２の２０２位にメチオニン又は３２３位にフェニルアラニンを有する対応するウイルスと比較して、ＭＤＣＫ細胞、ベロ細胞又は卵を含めた細胞内で成長促進をもたらすアミノ酸残基をＰＢ２の２０２位及び／又は３２３位に有する、すなわち、組換えインフルエンザウイルスのＰＢ２遺伝子セグメントのＰＢ２の２０２及び／又は３２３位の残基は、メチオニンでない又はフェニルアラニンでないが、ＭＤＣＫ細胞、ベロ細胞又は卵内での複製促進と相関がある残基、且つ、本明細書中に記載したＰＡ、ＰＢ１、ＮＰ、Ｍ１、及び／又はＮＳの１若しくは複数の特定の位置で任意に選択されたアミノ酸残基である。一実施形態において、組換え再集合体インフルエンザウイルスは、例えば、ＰＢ２の３２３位にフェニルアラニンを有する対応するウイルスと比較して、変更されたキャップ結合相互作用をもたらすアミノ酸残基をＰＢ２の３２３位に有する。一実施形態において、組換え再集合体インフルエンザウイルスは、ＰＢ２の２０２位及び／又は３２３位にロイシン、アラニン、トレオニン、バリン、イソロイシン、又はグリシンを有し、且つ、任意に選択されたアミノ酸残基を本明細書中に記載したＰＡ、ＰＢ１、ＮＰ、Ｍ１、及び／又はＮＳの１若しくは複数の特定の位置に有する。一実施形態において、組換え再集合体インフルエンザウイルスは、例えば、ＮＰの７４位にアルギニンを有する対応するウイルスと比較して、ＭＤＣＫ細胞、ベロ細胞又は卵を含めた細胞内で成長促進をもたらすアミノ酸残基をＮＰの７４位に有する、すなわち、組換えインフルエンザウイルスのＮＰ遺伝子セグメントのＮＰの７４位の残基は、アルギニンでないが、ＭＤＣＫ細胞、ベロ細胞又は卵内での複製促進と相関がある残基、且つ、本明細書中に記載したＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、Ｍ１、及び／又はＮＳの１若しくは複数の特定の位置で任意に選択されたアミノ酸残基である。一実施形態において、組換え再集合体インフルエンザウイルスは、例えば、ＮＰの７４位にアルギニンを有する対応するウイルスと比較して、折り重なり、安定性、及び／又は他のウイルス又は宿主タンパク質との相互作用を変更し得るアミノ酸残基をＮＰの７４位に有する。一実施形態において、組換え再集合体インフルエンザウイルスは、ＮＰの７４位にリジン又はヒスチジンを有し、且つ、任意に選択されたアミノ酸残基を本明細書中に記載したＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、Ｍ１、及び／又はＮＳの１若しくは複数の特定の位置に有する。一実施形態において、組換え再集合体インフルエンザウイルスは、例えば、Ｍ１の９７位にバリン又は１００位にチロシンを有する対応するウイルスと比較して、ＭＤＣＫ細胞、ベロ細胞又は卵を含めた細胞内での成長促進をもたらすアミノ酸残基をＭ１の９７位、及び／又は１００位に有する、すなわち、組換えインフルエンザウイルスのＭ遺伝子セグメントのＭ１の９７及び／又は１００位の残基は、それぞれバリンでない又はチロシンでないが、ＭＤＣＫ細胞、ベロ細胞又は卵内での複製促進と相関がある残基であり、且つ、本明細書中に記載したＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＮＰ、及び／又はＮＳ１の１若しくは複数の特定の位置で選択されたアミノ酸残基である。一実施形態において、組換え再集合体インフルエンザウイルスは、例えば、Ｍ１の９７位にバリンを有する対応するウイルスと比較して、二量体化を変更し得るアミノ酸残基をＭ１の９７位に有する。一実施形態において、組換え再集合体インフルエンザウイルスは、例えば、Ｍ１の１００位にチロシンを有する対応するウイルスと比較して、ウイルス集合を変更し得るアミノ酸残基をＭ１の１００位に有する。一実施形態において、組換え再集合体インフルエンザウイルスは、Ｍ１の９７位にロイシン、トレオニン、イソロイシン、アラニン、又はグリシン、及び／又は１００位にリジン、アルギニン、又はヒスチジンを有し、且つ、選択されたアミノ酸残基を本明細書中に記載したＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＮＰ、及び／又はＮＳ１の１若しくは複数の特定の位置に有する。一実施形態において、組換え再集合体インフルエンザウイルスは、例えば、ＮＳ１の５５位にリジンを有する対応するウイルスと比較して、ＭＤＣＫ細胞、ベロ細胞又は卵を含めた細胞内での成長促進をもたらすアミノ酸残基をＮＳ１の５５位に有し、且つ、選択されたアミノ酸残基を本明細書中に記載したＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＮＰ、及び／又はＭ１の１若しくは複数の特定の位置に有する。一実施形態において、組換え再集合体インフルエンザウイルスは、ＮＳ１の５５位にアスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸又はグルタミンを有し、且つ、選択されたアミノ酸残基を本明細書中に記載したＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＮＰ、及び／又はＭ１の１若しくは複数の特定の位置に有する。一実施形態において、本発明は、２以上の選択されたアミノ酸残基を本明細書中に記載した特定の位置に有するワクチンインフルエンザウイルス由来の６つの「内部」の遺伝子セグメント、第一のインフルエンザウイルス単離株から選択されたＮＡ遺伝子セグメント、及び同じ単離株又は異なった単離株由来のＨＡ遺伝子セグメントを有する、単離された組換え再集合体インフルエンザウイルスを提供する。
【０００７】
一実施形態において、本発明のインフルエンザウイルスは、着目のＨＡ及びＮＡ遺伝子と共に利用され得る、２以上の選択されたアミノ酸残基をＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＮＰ、Ｍ１、及び／又はＮＳ１の１若しくは複数の遺伝子セグメントの特定の位置に有する組換えインフルエンザウイルスである。一実施形態において、組換え再集合体インフルエンザウイルスは、例えば、ＰＡの１４２位にリジンを有する対応するウイルスと比較して、ＭＤＣＫ細胞、ベロ細胞又は卵内での成長促進をもたらすアミノ酸残基をＰＡの１４２位に有するか；例えば、ＰＢ１の２４７位にグルタミンを有する対応するウイルスと比較して、ＭＤＣＫ細胞、ベロ細胞又は卵内での成長促進をもたらすアミノ酸残基をＰＢ１の２４７位に有するか；例えば、ＰＢ２の２０２位にメチオニン又は３２３位にフェニルアラニンを有する対応するウイルスと比較して、ＭＤＣＫ細胞、ベロ細胞又は卵内での成長促進をもたらすアミノ酸残基をＰＢ２の２０２位及び／又は３２３位に有するか；例えば、ＮＰの７４位にアルギニンを有する対応するウイルスと比較して、ＭＤＣＫ細胞、ベロ細胞又は卵内での成長促進をもたらすアミノ酸残基をＮＰの７４位に有するか；例えば、Ｍ１の９７位にバリン又は１００位にチロシンを有する対応するウイルスと比較して、ＭＤＣＫ細胞、ベロ細胞又は卵内での成長促進をもたらすアミノ酸残基をＭ１の９７位及び／又は１００位に有するか；又はＮＳ１の５５位にリジンを有する対応するウイルスと比較して、ＭＤＣＫ細胞、ベロ細胞又は卵内での成長促進をもたらすアミノ酸残基をＮＳ１の５５位に有するか；或いはその組み合わせを有する。
【０００８】
一実施形態において、本発明のインフルエンザウイルスは、着目のＨＡ及びＮＡ遺伝子と共に利用され得る、２以上の選択されたアミノ酸残基をＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＮＰ、Ｍ１、及び／又はＮＳ１の１若しくは複数の遺伝子セグメントの特定の位置に有する組換えインフルエンザウイルスである。一実施形態において、組換え再集合体インフルエンザウイルスは、ＰＡの１４２位のリジン；ＰＢ１の２４７位のグルタミン；  ＰＢ２の２０２位及び／又は３２３位のロイシン；ＮＰの７４位のリジン；  Ｍ１の９７位のアラニン及び１００位のヒスチジン；又はＮＳ１の５５位のグルタミン酸のうちの２以上を有する。
【０００９】
本発明は、本明細書中に記載した１若しくは複数の特徴的な残基を含む、選択されたアミノ酸残基をＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＮＰ、Ｍ１、及び／又はＮＳ１の１若しくは複数の遺伝子セグメントの１若しくは複数の特定の位置、例えば、選択されたアミノ酸残基をＰＢ１、ＰＢ２、及びＮＳ；ＰＢ１、ＰＢ２、ＮＰ、及びＮＳ；ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＮＰ、及びＮＳ；ＰＢ１、ＰＢ２、ＮＰ、Ｍ、及びＮＳ；又はＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＮＰ、Ｍ、及びＮＳの特定の位置に有する、単離された組換え、例えば、再集合体インフルエンザウイルスを提供する。一実施形態において、組換え再集合体インフルエンザウイルスは、例えば、ＰＡの１０５又は４０１位それぞれにフェニルアラニン又はアルギニンを有する対応するウイルスと比較して、細胞、例えば、ＭＤＣＫ細胞内での成長促進をもたらすアミノ酸残基をＰＡの１０５及び／又は４０１位に有する。一実施形態において、組換え再集合体インフルエンザウイルスは、例えば、ＰＢ１の４０、５４、５９、６２、６３、６６（Ｆ２）、７３（Ｆ２）、７５、７６、７８、７９、８０、１１２、１８０、５０４、５０７、６２４、６４４、６６７、６９４、６９５、６９７、６９９、７００、７０１、７０２、７０５、７１３、又は７１４位それぞれにメチオニン、アルギニン、トレオニン、グリシン、アラニン、アスパラギン、リジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、プロリン、セリン、グルタミン酸、グリシン、イソロイシン、メチオニン、ロイシン、バリン、イソロイシン、アスパラギン、ロイシン、グルタミン酸、フェニルアラニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、チロシン、セリン又はメチオニンを有する対応するウイルスと比較して、細胞、例えば、ＭＤＣＫ細胞内での成長促進をもたらすアミノ酸残基をＰＢ１の４０、５４、５９、６２、６３、６６（Ｆ２）、７３（Ｆ２）、７５、７６、７８、７９、８０、１１２、１８０、３２７、５０７、６２４、６４４、６６７、６９４、６９５、６９７、６９９、７００、７０１、７０２、７０５、７１３、及び／又は７１４位に有する。一実施形態において、組換え再集合体インフルエンザウイルスは、例えば、ＰＢ２の５７、５８、５９、６１、６６、２０２、３２３、３６８、３９１、５０４、５９１、６７７、６７８又は６７９位それぞれにイソロイシン、トレオニン、アラニン、リジン、メチオニン、メチオニン、フェニルアラニン、アルギニン、グルタミン酸、イソロイシン、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン酸、又はフェニルアラニンを有する対応するウイルスと比較して、細胞、例えばＭＤＣＫ細胞内での成長促進をもたらすアミノ酸残基をＰＢ２の５７、５８、５９、６１、６６、２０２、３２３、３６８、３９１、５０４、５９１、６７７、６７８、又は６７９位に有する。一実施形態において、組換え再集合体インフルエンザウイルスは、例えば、ＮＰの１１６、２２４、２９３、３７１、４１７、４２２、又は４４２位それぞれにロイシン、アスパラギン、アルギニン、メチオニン、アスパラギン酸、アルギニン又はトレオニンを有する対応するウイルスと比較して、細胞、例えば、ＭＤＣＫ細胞内での成長促進をもたらすアミノ酸残基をＮＰの１１６、２２４、２９３、３７１、４１７、４２２又は４４２位に有する。一実施形態において、組換え再集合体インフルエンザウイルスは、例えば、Ｍ１の９０位にセリンを有する対応するウイルスと比較して、細胞内での成長促進をもたらすアミノ酸残基をＭ１の９０位に有する。一実施形態において、組換え再集合体インフルエンザウイルスは、例えば、ＮＳ１の３０、４９、１４０、１６１又は２２３位それぞれにプロリン、アラニン、グルタミン、トレオニン又はグルタミン酸を有する対応するウイルスと比較して、ＭＤＣＫ細胞内での成長促進をもたらすアミノ酸残基をＮＳ１の３０、４９、１４０、１６１又は２２３位に有する。一実施形態において、組換え再集合体インフルエンザウイルスは、ＰＢ２の５０４位にバリン残基を有さず、且つ、ＰＡの５５０位にロイシン残基を有しない。
【００１０】
一実施形態において、本発明のインフルエンザウイルスは、ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＮＰ、Ｍ１、及び／又はＮＳ１の１、２、３又はそれ以上の特定の位置に特定のアミノ酸残基を有し、且つ、ＰＡのＫ１４２、Ｓ２２５、Ｋ３５６又はＩ５５０以外；ＰＢ１のＥ１１２、Ｑ２４７、Ｍ５０７又はＶ６４４以外；ＰＢ２のＭ２０２、Ｆ３２３又はＩ５０４以外；ＮＰのＲ７４、Ｉ１１２、Ｉ１１６、Ｔ４４２、又はＮ４１７以外；Ｍ１のＶ９７、及び／又はＹ１００以外；及び／又はＮＳのＲ１４０又はＫ５５以外の残基を有するポリペプチドなどの配列番号１〜６又は１０〜１５の１つによってコードされる対応するポリペプチドに対して少なくとも８０％、例えば、８０〜９９のいずれかの整数を含めた、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、又は９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する組換えインフルエンザウイルスである。指定された残基以外の残基は保存的置換であってもよい。保存的なアミノ酸置換とは、類似側鎖を有する残基間の互換性を意味する。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の基は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンであり、脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の基は、セリン及びスレオニンであり、アミド含有側鎖を有するアミノ酸の基は、アスパラギン及びグルタミンであり、芳香族側鎖を有するアミノ酸の基は、フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファンであり、塩基性側鎖を有するアミノ酸の基は、リジン、アルギニン及びヒスチジンであり、硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の基は、システイン及びメチオニンである。一実施形態において、保存的アミノ酸置換基は、バリン−ロイシン−イソロイシン；フェニルアラニン−チロシン；リジン−アルギニン；アラニン−バリン；グルタミン酸−アスパラギン酸；及びアスパラギン−グルタミンである。一実施形態において、インフルエンザウイルスポリペプチドは、配列番号１〜６又は１０〜１５の１つによってコードされるポリペプチドと比較して、１又は２以上の、例えば、２、３又は４個の、非保存的アミノ酸置換を有する。
【００１１】
一実施形態において、本発明のインフルエンザウイルスは、特定のアミノ酸残基をＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＮＰ、Ｍ１、及び／又はＮＳ１の１若しくは複数の特定の位置に有し、且つ、ＰＢ２のＭ２０２、ＮＰのＲ７４、及び／又はＭ１のＶ９７に対する保存的置換である残基を有するポリペプチドなどの配列番号１〜６又は１０〜１５の１つによってコードされる対応するポリペプチドに対して少なくとも８０％、例えば、８０〜９９のいずれかの整数を含めた、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、又は９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する組換えインフルエンザウイルスである。
【００１２】
一実施形態において、本発明のインフルエンザウイルスは、特定のアミノ酸残基をＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＮＰ、Ｍ１、及び／又はＮＳ１の特定の位置に有し、且つ、例えば、ＰＡのＫ１４２、ＰＢ１のＱ２４７、ＰＢ２のＭ２０２、Ｆ３２３又はＩ５０４、ＮＰのＲ７４、Ｉ１１２、Ｉ１１６、Ｊ４４２又はＮ４１７、Ｍ１のＶ９７及び／又はＹ１００、及び／又はＮＳ１のＫ５５又はＲ１４０に対する非保存的置換である残基を有するポリペプチドなどの配列番号１〜６又は１０〜１５の１つによってコードされた対応するポリペプチドに対して少なくとも８０％、例えば、８０〜９９のいずれかの整数、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、又は９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する組換えインフルエンザウイルスである。
【００１３】
一実施形態において、本発明のインフルエンザウイルスは、特定のアミノ酸残基をＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＮＰ、Ｍ１、及び／又はＮＳ１の特定の位置に有し、且つ、配列番号１〜６又は１０〜１５の１つによってコードされた対応するポリペプチドに対して少なくとも８０％、例えば、８０〜９９のいずれかの整数を含めた、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、又は９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列、例えば、残基５０４にイソロイシン以外のイソロイシンの保存的置換である残基を有するＰＢ２遺伝子セグメント；Ｅ１１２の非保存的置換を有するＰＢ１遺伝子セグメント；Ｓ２２５の置換を有するＰＡ遺伝子セグメント；Ｒ７４及びＮ４１７の保存的置換を有するＮＰ遺伝子セグメント；Ｖ９７の保存的置換及びＹ１００の非保存的置換を有するＭ遺伝子セグメント；並びにＫ５５の非保存的置換を有するＮＳ遺伝子セグメントを有する組換えインフルエンザウイルスである。
【００１４】
一実施形態において、本発明のインフルエンザウイルスは、特定のアミノ酸残基をＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＮＰ、Ｍ１、及び／又はＮＳ１の特定の位置に有し、且つ、配列番号１〜６又は１０〜１５の１つによってコードされた対応するポリペプチドに対して少なくとも８０％、例えば、８０〜９９のいずれかの整数を含めた、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、又は９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列、例えば、Ｍ２０２及びＦ３２３の非保存的置換を有するＰＢ２遺伝子セグメント；Ｑ２４７の非保存的置換を有するＰＢ１遺伝子セグメント；Ｋ１４２の非保存的置換を有するＰＡ遺伝子セグメント；Ｒ７４の保存的置換を有するＮＰ遺伝子セグメント；Ｖ９７の保存的置換及びＹ１００の非保存的置換を有するＭ遺伝子セグメント；並びにＫ５５Ｅの保存的置換を有するＮＳ遺伝子セグメントを有する組換えインフルエンザウイルスである。
【００１５】
一実施形態において、本発明のインフルエンザウイルスは、特定のアミノ酸残基をＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＮＰ、Ｍ１、及び／又はＮＳ１の特定の位置に有し、且つ、配列番号１〜６又は１０〜１５の１つによってコードされた対応するポリペプチドに対して少なくとも８０％、例えば、８０〜９９のいずれかの整数、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、又は９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列、例えば、Ｉ５０４の保存的置換を有するＰＢ２セグメント；Ｍ４０Ｌの保存的置換及びＧ１８０の非保存的置換を有するＰＢ１セグメント；Ｒ４０１の保存的置換を有するＰＡセグメント；Ｉ１１６の保存的置換を有するＮＰセグメント；並びにＡ３０又はＲ１１８の保存的置換を有するＮＳ遺伝子セグメントを有する組換えインフルエンザウイルスである。
【００１６】
一実施形態において、本発明のインフルエンザウイルスは、特定のアミノ酸残基をＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＮＰ、Ｍ１、及び／又はＮＳ１の１若しくは複数の特定の位置に有し、且つ、ＰＡのＫ１４２、ＰＢ１のＱ２４７、ＰＢ２のＦ３２３、Ｍ１のＹ１００、及び／又はＮＳ１のＫ５５に対する非保存的置換である残基を有するポリペプチドなどの配列番号１〜６又は１０〜１５の１つによってコードされる対応するポリペプチドに対して少なくとも８０％、例えば、８０〜９９のいずれかの整数を含めた、９０％、９２％、９５％、９７％、又は９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する組換えインフルエンザウイルスである。一実施形態において、置換されるアミノ酸残基は、脂肪族側鎖、アミド含有側鎖、塩基性側鎖、硫黄含有側鎖を有するので、芳香族側鎖又は酸性側鎖の置換（非保存的置換）である。一実施形態において、組換えインフルエンザウイルスは、極性又は陰性荷電残基で置換される中性又は陽性荷電残基である残基を有する。
任意の組み合わせの選択されたアミノ酸残基もまた、本明細書中に記載した特定の位置に含まれる。
【００１７】
残基を特定の位置に有するＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＮＰ、Ｍ、及び／又はＮＳの遺伝子セグメントは、本発明の再集合体ワクチンウイルスを提供するために、ＨＡの遺伝子セグメント、例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、又はＨ１７と、ＮＡの遺伝子セグメント、例えば、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８、Ｎ９、又はＮ１０とを組み合わせても、及びＨＡとＮＡとの任意の組み合わせであってもよい。一実施形態において、ＨＡは、Ｈ１、Ｈ５又はＨ７である。一実施形態において、ＮＡは、Ｎ１又はＮ９である。一実施形態において、再集合体ウイルスのＨＡ遺伝子セグメントは、ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＮＰ、Ｍ、及びＮＳの遺伝子セグメントにとって異種である。一実施形態において、再集合体ウイルスのＮＡ遺伝子セグメントは、ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＮＰ、Ｍ、及びＮＳの遺伝子セグメントにとって異種である。一実施形態において、再集合体ウイルスのＨＡ遺伝子セグメントは、１つのインフルエンザウイルス単離株若しくは菌株（「親」）、又はその変異株、例えば、親インフルエンザウイルス単離株又は菌株の配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％のアミノ酸配列同一性を有するか、又は１、２、５、１０、又は２０の置換を有するインフルエンザウイルスタンパク質をコードする遺伝子セグメントを有するもの、に由来するＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＮＰ、Ｍ、及びＮＳの遺伝子セグメントを有する。
【００１８】
一実施形態において、親株は、配列番号１〜６又は１０〜１５に対応する配列を有する遺伝子セグメントを有する。一実施形態において、再集合体ウイルスのＨＡ遺伝子セグメントは、キメラのＨＡ遺伝子セグメント、例えば、親単離株若しくは菌株、又はその変異株のＨＡ遺伝子セグメント由来のＨＡシグナルペプチド配列及び／又はＨＡ膜貫通ドメイン配列に連結した異種ＨＡエクトドメイン配列のキメラである。一実施形態において、単離された組換えウイルスのＮＡ遺伝子セグメントは、キメラＮＡ遺伝子セグメント、例えば、親単離株若しくは菌株、又はその変異株のＮＡ遺伝子セグメント由来のＮＡ膜貫通ドメイン配列、及び／又は親単離株若しくは菌株、又はその変異株由来のストーク（ｓｔａｌｋ）配列に連結した異種ＮＡエクトドメイン配列のキメラである。一実施形態において、単離された組換えウイルスのＮＡ遺伝子セグメントは、キメラＮＡ遺伝子、例えば親単離株若しくは菌株、又はその変異株のＮＡ遺伝子セグメント由来のＮＡ膜貫通ドメイン配列に連結された異種ＮＡエクトドメイン配列、及び／又は第２の単離株若しくは菌株、又はその変異株由来のストーク配列のキメラである。一実施形態において、単離された組換えウイルスは、異種ＨＡ遺伝子セグメント、異種ＮＡ遺伝子セグメント、キメラＨＡ遺伝子セグメント、キメラＮＡ遺伝子セグメント、又はそれらの任意の組み合わせを有する。ｖＲＮＡを調製するために利用される核酸配列は、組換え法によって特定の位置に残基を導入するものであっても、又は特定の位置に残基を有するとして選択されてもよい。
【００１９】
Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）、「ＰＲ８」は、不活化インフルエンザワクチンの作出のための遺伝子バックボーンとしての役割を担う。時折、ＰＲ８バックボーンベースのワクチン株は、卵及び細胞培養内で比較的低力価で複製し、遅いワクチン生産及びワクチン不足につながる。ＭＤＣＫ細胞、鶏卵、及びベロ細胞内での繁殖に関して高収率ワクチン株バックボーンが季節性流行性感冒及び高病原性世界的流行ウイルスの要求を満たすように調製され得るかどうか判断するために、様々な変異誘発ストラテジーが用いられた。例えば、ＰＲ８バックボーンランダム変異ライブラリは、例えば、エラー傾向があるＰＣＲによって内部ＰＲ８遺伝子にランダム変異を導入し、高い複製及び高いポリメラーゼ活性を付与する変異を導入し、そして、コドンバイアスによってＰＲ８内部遺伝子を最適化することによって、高複製変異株をスクリーニングされた。別のアプローチでは、例えば、強いプロモーターを作り出すためにＨＡプロモーターを最適化し、ＨＡ非コード領域を最適化し、及び／又はＨＡシグナルペプチドを最適化することによって、ＨＡ遺伝子がウイルス複製及びＨＡ含有量を増強するように最適化された。
【００２０】
本明細書中に記載のように、ＮＡ及び／又はＨＡの異種遺伝子セグメントを運ぶワクチンウイルスとして有用なインフルエンザウイルス単離株（例えば、ＵＷ−ＰＲ８などの特定の単離株を含めたＡ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４、「ＰＲ８」）は、ＭＤＣＫ細胞で、例えば、１０〜１２回、連続的に継代されても、或いは、それらの細胞で複製促進があるウイルスを得るためにより少ない継代が利用されてもよい。一実施形態において、複製促進がある、連続継代後に得られたウイルスは、連続継代しなかったウイルスに比べて、少なくとも１又は２ログ高い力価を有する。一実施形態において、連続継代後に得られたウイルスは、親ウイルスと比較して２以上の内部遺伝子セグメントに置換を有した。
【００２１】
よって、培養状態の細胞、例えば、ＭＤＣＫ若しくはベロ細胞又は卵内での増殖させる又は継代するためのワクチンウイルスのために、着目のＨＡ及びＮＡ配列と共に利用した場合に、培養細胞内でウイルスの成長促進を付与する、ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＮＰ、Ｍ１、及び／又はＮＳ１の１若しくは複数の特定の位置に開示した残基を有する配列の選択又は該開示した残基の置換は、顕著に高いウイルスの力価をもたらし得る。これにより、本発明は、細胞培養において複製促進があるインフルエンザウイルスを選択する方法を提供する。前記方法は、インフルエンザワクチン生産に好適な細胞を提供し；細胞内で１若しくは複数のインフルエンザウイルス単離株を連続的に培養し；そして、連続培養前の１若しくは複数の単離株と比較して、成長促進がある連続的に培養したウイルスを単離することを含む。一実施形態において、前記細胞は、イヌ又は霊長類、例えば、ヒト又は猿の細胞である。
【００２２】
一実施形態において、本発明のインフルエンザウイルスは、着目のＨＡ及びＮＡ遺伝子と共に利用され得る、２以上の選択されたアミノ酸残基をＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＮＰ、Ｍ１、及び／又はＮＳ１の１若しくは複数の特定の位置に有する組換えインフルエンザウイルスである。一実施形態において、組換え再集合体インフルエンザウイルスは、ＰＡの１４２位にアスパラギン又はグルタミン、２２５位にシステイン、ＰＡの３５６位にアルギニン又はヒスチジン、又はＰＡの５５０位にロイシン、バリン、トレオニン、又はグリシンを有するか；ＰＢ１の２４７位にヒスチジン、アルギニン、又はリジン、ＰＢ１の５０７位にバリン、ロイシン、イソロイシン、トレオニン、アラニン又はグリシン及び／又はＰＢ１の６４４位にアラニン、グリシン、ロイシン又はイソロイシンを有するか；ＰＢ２の２０２位及び／又は３２３位にロイシン、アラニン、バリン、イソロイシン、グリシン、又はトレオニン、又はＰＢ２の５０４位にバリン、ロイシン、グリシン、トレオニン、又はアラニンを有するか；ＮＰの７４位にリジン又はヒスチジン、ＮＰの位１１２、１１６又は４４２位にロイシン、バリン、グリシン又はアラニンを有するか；Ｍ１の９７位にロイシン、イソロイシン、アラニン、グリシン、又はトレオニン、及び／又は１００位にリジン、アルギニン又はヒスチジンを有するか；或いは、ＮＳ１の５５位にアスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸又はグルタミン、又は１４０位にグルタミン又はアスパラギンを有する。
【００２３】
本発明は、例えば、６：１：１  再集合体、６：２  再集合体及び７：１再集合体を含む再集合体ウイルスの調製に有用な、本発明の複数のインフルエンザウイルスベクターを供する。本発明の範囲内の６：１：１  再集合体は、ワクチンウイルス由来の６個の内部遺伝子セグメント、異なる（第二の）ウイルス単離株由来のＮＡ遺伝子セグメント、及び第三の単離株由来のＨＡ遺伝子セグメントを有するインフルエンザウイルスである。本発明の範囲内の６：２再集合体は、ワクチンウイルス由来の６個の内部遺伝子セグメント、及び異なる（第二の）ウイルス単離株由来のＮＡ遺伝子セグメント及びＨＡ遺伝子セグメントを有するインフルエンザウイルスであり；そして、本発明の範囲内の７：１再集合体は、６個の内部遺伝子セグメント、及びワクチンウイルス由来のＮＡ遺伝子セグメント、及び前記ワクチンウイルスと異なったウイルス起源由来のＨＡ遺伝子セグメントを有するインフルエンザウイルスであるか、或いは、６個の内部遺伝子セグメント及びワクチンウイルス由来のＨＡ遺伝子セグメントを有し、ＮＡ遺伝子セグメントが前記ワクチンウイルスと異なるウイルス起源由来であるインフルエンザウイルスである。
【００２４】
本発明の一実施形態において、その多数は、転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＰＡ  ＤＮＡに作動可能に連結されたプロモーターを含むベクター、転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＰＢ１  ＤＮＡに作動可能に連結されたプロモーターを含むベクター、転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＰＢ２  ＤＮＡに作動可能に連結されたプロモーターを含むベクター、転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルス  ＨＡ  ＤＮＡに作動可能に連結されたプロモーターを含むベクター、転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＮＰ  ＤＮＡに作動可能に連結されたプロモーターを含むベクター、転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＮＡ  ＤＮＡに作動可能に連結されたプロモーターを含むベクター、転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＭ  ＤＮＡに作動可能に連結されたプロモーターを含むベクター、及び転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＮＳ  ＤＮＡに作動可能に連結されたプロモーターを含むベクター、から選択されたｖＲＮＡ産生のためのベクターを含む。一実施形態において、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ、及びＮＳのｖＲＮＡ産生のためのＤＮＡは、例えばＭＤＣＫ細胞、ベロ細胞又はＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞などの培養された哺乳類細胞、又は任意には孵化卵内で高い力価で複製するインフルエンザウイルス、及び／又は例えば、ヒトにおいて重症疾患を生じないワクチンウイルス由来の配列を有する。ＮＡのｖＲＮＡ産生のためのＤＮＡは、任意のＮＡ、例えば、Ｎ１〜Ｎ１０のいずれかの由来とすることができ、ＨＡのｖＲＮＡ産生のためのＤＮＡは、任意のＨＡ、例えば、Ｈ１〜Ｈ１７いずれか由来とすることができる。一実施形態において、ｖＲＮＡ産生のためのＤＮＡは、インフルエンザＢ又はＣウイルス用とすることができる。ＮＡ及びＨＡのｖＲＮＡ産生のためのＤＮＡは、異なる株又は異なる単離株（６：１：１再集合体）又は同一の株又は同一の単離株（６：２  再集合体）に由来する、或いはＮＡは内部遺伝子と同一の株又は同一の単離株由来（７：１  再集合体）とすることができる。その多数に、インフルエンザウイルスＰＡをコードするベクター、インフルエンザウイルスＰＢ１をコードするベクター、インフルエンザウイルスＰＢ２をコードするベクター、インフルエンザウイルスＮＰをコードするベクター、任意にはＮＰ、ＮＳ、Ｍ、例えば、Ｍ１及びＭ２、ＨＡ又はＮＡをコードする１又は２以上のベクター、から選択されるｍＲＮＡ産生のためのベクターもまた含まれる。ウイルスタンパク質をコードするベクターは、転写終結配列をさらに含むことができる。
【００２５】
本発明の範囲内の再集合体のための内部遺伝子を供し得るウイルスは、ＭＤＣＫ細胞内で高い力価、例えば、少なくとも約１０５  ＰＦＵ／ｍＬ、例えば、少なくとも１０６  ＰＦＵ／ｍＬ、１０７  ＰＦＵ／ｍＬ又は１０８  ＰＦＵ／ｍＬの力価；孵化卵内で高い力価、例えば、少なくとも約１０７  ＥＩＤ５０／ｍＬ、例えば、少なくとも１０８  ＥＩＤ５０／ｍＬ、１０９  ＥＩＤ５０／ｍＬ又は１０１０  ＥＩＤ５０／ｍＬの力価；ＭＤＣＫ細胞などの細胞内で高い力価、例えば、少なくとも約１０７  ＰＦＵ／ｍＬ、例えば、少なくとも１０８  ＰＦＵ／ｍＬの力価、又はそれらの２以上の宿主細胞内で高い力価を有するウイルスを含む。
【００２６】
一実施形態において、例えばＭＤＣＫ細胞又はベロ細胞などの細胞における本発明の再集合体ウイルスの力価は、特定の位置の特定の残基を欠く対応のウイルスの力価の１ログ、２ログ、３ログ、又はそれ以上とすることができる。
【００２７】
他のＰＲ８単離株又はワクチンウイルス由来の内部遺伝子を有する他の再集合体は、本発明の組換え再集合体ウイルスにおいて利用可能である。特に、ＵＷ−ＰＲ８  ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、及びＭ（「５」）及びＰＲ８（Ｃａｍ）ＮＳ（「１」）を有する５：１：２  再集合体；ＵＷ−ＰＲ８  ＮＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、及びＭ（「６」）及びＰＲ８（Ｃａｍ）ＮＳ（「１」）を有する６：１：１再集合体；及びＵＷ−ＰＲ８  ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ、ＮＡ、及びＮＳ（「７」）を有する７：１再集合体が利用可能である。
【００２８】
一実施形態において、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ、及びＮＳの内部遺伝子に関するＤＮＡは、配列番号１〜６又は１０〜１５の１つによってコードされる対応のポリペプチドとして実質的に同一の活性を有するタンパク質をコードする。本明細書において、「実質的に同一の活性」とは、活性又はタンパク質レベルそれぞれについて、対応する全長ポリペプチドの約０．１％、１％、１０％、３０％、５０％、９０％、例えば、１００％又はそれ以上の活性、又は約８０％、９０％又はそれ以上の検出可能なタンパク質レベルを含む。一実施形態において、核酸配列は、配列番号１〜６又は１０〜１５の１つによってコードされたポリペプチドと、例えば、８０〜９９のいずれかの整数％、少なくとも８０％、例えば、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％又は９９％の、連続したアミノ酸配列同一性を有することと実質的に同一であるポリペプチドをコードする配列である。一実施形態において、単離及び／又は精製された核酸分子は、例えば、配列番号１〜６又は３３−３８の１つと５０〜１００のいずれかの整数％、少なくとも５０％、例えば、６０％、７０％、８０％又は９０％、又はそれ以上の連続した核酸配列同一性を有することと実質的に同一であるヌクレオチド配列を含む。一実施形態において、インフルエンザウイルスポリペプチドは、１若しくは複数の、例えば２、５、１０、１５、２０若しくはそれ以上の保存的アミノ酸置換、例えば、保存的アミノ置換と非保存的アミノ酸置換の組み合わせ２、５、１０、１５、２０若しくはそれ以上の最大１０％又は２０％の保存的置換、例えば、配列番号１〜６又は１０〜１５の１つによってコードされたポリペプチドと比較して残基の最大１０％又は２０％の保存的置換を有し、配列番号１〜６又は１０〜１５の１つによってコードされるポリペプチドと比較して、ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＮＰ、Ｍ１、及び／又はＮＳ１の２以上に特徴的な残基を有し、並びにＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＮＰ、Ｍ１、及び／又はＮＳ１の遺伝子セグメントの２以上に特徴的な残基を有する、例えば、ＰＡの１４２位にアスパラギン又はグルタミン；ＰＢ１の２４７位にヒスチジン、アルギニン又はリジン；ＰＢ２の２０２位及び／又は３２３位にロイシン、アラニン、バリン、イソロイシン、グリシン、又はセリン；ＮＰの７４位にリジン又はヒスチジン；Ｍ１の２０２位にロイシン、イソロイシン、アラニン、グリシン、又はセリン及び／又は１００位にリジン、アルギニン、又はヒスチジン；或いは、ＮＳ１の４４位にアスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸又はグルタミンが存在する。一実施形態において、インフルエンザウイルスポリペプチドは、配列番号１〜６又は１０〜１５の１つによってコードされるポリペプチド、例えば、表４の１、４、３６、３８、Ｐ１７、Ｐ２５又はＰ６１のウイルス単離株のものに対して、１若しくは複数の、例えば、２、３、４、５、６、７又は８個の保存的アミノ酸置換及び／又は非保存的アミノ酸置換を有する。
【００２９】
従って、本発明は、インフルエンザウイルスのタンパク質を発現する又はコードする、或いはインフルエンザｖＲＮＡ、未変性及び組換えｖＲＮＡ双方を発現又はコードする、単離及び精製ベクター又はプラスミドの使用を含む。ベクターは、インフルエンザｃＤＮＡ、例えば、インフルエンザＡ（例えば、１６  ＨＡ又は９  ＮＡサブタイプのいずれかを含む任意のインフルエンザＡ遺伝子）、Ｂ又はＣ  ＤＮＡを含む（Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（Ｆｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｃｋｅｎｓ（２００６）を参照されたい。それらは特に参照により本明細書に組み込まれる）。任意の適したプロモーター又は転写終結配列は、タンパク質又はペプチド、例えば、ウイルスタンパク質又はペプチド、非ウイルス性病原体のタンパク質又はペプチド、又は治療タンパク質又はペプチドを発現するために利用可能である。
【００３０】
本発明のベクターの組成物又は多数のベクターには、例えば、ワクチンとして又は遺伝子置換において有用な免疫原性ペプチド又はタンパク質をコードする外来遺伝子などの、例えば癌治療若しくはワクチンにおいて有用なエピトープ、又は遺伝子治療において有用なペプチド若しくはポリペプチドをコードすることができる異種遺伝子又は翻訳領域もまた含むことができる。ウイルスを調製する場合、目的の遺伝子又はｃＤＮＡを含むベクター又はプラスミドは、インフルエンザウイルス遺伝子に関するベクター又はプラスミドと置換する、又は、全てのインフルエンザウイルス遺伝子に関するベクター又はプラスミドに加えることができる。従って、本発明の他の実施形態は、ベクターの１つが置換された上記ベクターの組成物又は斯かるベクターを複数含み、さらに５’  インフルエンザウイルス配列をさらに含む。任意には、５’  インフルエンザウイルス配列は、目的の核酸配列、例えば、目的のｃＤＮＡに結合された、任意には３’  インフルエンザウイルスコード配列又はその部分を含む３’  インフルエンザウイルス配列に結合された、５’インフルエンザウイルスコード配列又はその部分を含む。一実施形態において、例えばｃＤＮＡなどの目的の核酸配列は、アンチセンス（アンチゲノム）方向にある。上記の他のベクターと組み合わせたこれらのベクターの、インフルエンザウイルス複製に許容される宿主細胞への導入は、斯かるベクターの異種配列に対応したｖＲＮＡを含む組換えウイルスを生じる。
【００３１】
ｖＲＮＡ産生のためのベクター中のプロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩプロモーター、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター、Ｔ７  プロモーター、又はＴ３  プロモーターとすることができ、任意にはベクターは、例えばＲＮＡポリメラーゼＩ転写終結配列、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ転写終結配列、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写終結配列、又はリボザイムなどの転写終結配列を含む。本発明の範囲内のリボザイムは、テトラヒメナリボザイム、リボヌクレアーゼＰ、ハンマーヘッド型リボザイム、ヘアピンリボザイム、肝炎リボザイム、及び合成リボザイムを含むがこれらに限定されない。一実施形態において、ＲＮＡポリメラーゼＩプロモーターは、ヒトＲＮＡポリメラーゼＩプロモーターである。
【００３２】
ｖＲＮＡ又はウイルスタンパク質発現ベクター中のプロモーター又は転写終結配列は、プロモーター又は任意の他のベクターと同一又は異なるものとすることができる。一実施形態において、インフルエンザｖＲＮＡを発現するベクター又はプラスミドは、少なくとも１つの特定の宿主細胞、例えば、トリ、又は、例えばイヌ、ネコ、ウマ、ウシ、又はヒト細胞を含む霊長類細胞などの哺乳類宿主細胞における発現、又は１以上の宿主における発現に適したプロモーターを含む。
【００３３】
一実施形態において、ｖＲＮＡに関する少なくとも１つのベクターは、他のリボザイム配列に結合されたウイルスコード配列に結合されたリボザイム配列に結合された、任意にはＲＮＡポリメラーゼＩＩ転写終結配列に結合された、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターを含む。一実施形態において、ｖＲＮＡ産生のための少なくとも２、例えば、３、４、５、６、７又は８個のベクターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター、第一のリボザイム配列を含み、それはウイルスコード配列を含むウイルス配列に相当する配列に対して５’に、第二のリボザイム配列に対して５’に、転写終結配列に対して５’に存在する。各ｖＲＮＡベクター中の各ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターは、任意の他のｖＲＮＡベクターにおけるＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターと同一又は異なるものとすることができる。同様に、各ｖＲＮＡベクター中の各リボザイム配列は、任意の他のｖＲＮＡベクター中のリボザイム配列と同一又は異なるものとするこができる。一実施形態において、単一ベクター中のリボザイム配列は同一でない。
【００３４】
一実施形態において、本発明は、再集合体のための多数のインフルエンザウイルスベクターを供し、斯かるベクターは、転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルス  ＰＡ  ＤＮＡに作動可能に連結されたプロモーターを含むｖＲＮＡ産生のためのベクター、転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＰＢ１  ＤＮＡに作動可能に連結されたプロモーターを含むｖＲＮＡ産生のためのベクター、転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＰＢ２  ＤＮＡに作動可能に連結されたプロモーターを含むｖＲＮＡ産生のためのベクター、転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＨＡ  ＤＮＡに作動可能に連結されたプロモーターを含むｖＲＮＡ産生のためのベクター、転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＮＰ  ＤＮＡに作動可能に連結されたプロモーターを含むｖＲＮＡ産生のためのベクター、転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＮＡ  ＤＮＡに作動可能に連結されたプロモーターを含むｖＲＮＡ産生のためのベクター、転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＭ  ＤＮＡに作動可能に連結されたプロモーターを含むｖＲＮＡ産生のためのベクター、及び転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルス  ＮＳ  ｃＤＮＡに作動可能に連結されたプロモーターを含むｖＲＮＡ産生のためのベクターであると共に、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、ＮＳ、及びＭのＤＮＡが１又は２以上のインフルエンザワクチンシードウイルス由来であり、そして、２以上の特徴的な残基を（単数若しくは複数の）特定の位置に含み；インフルエンザウイルスＰＡをコードするＤＮＡセグメントに作動可能に連結されたプロモーターを含むｍＲＮＡ産生のためのベクター、インフルエンザウイルスＰＢ１をコードするＤＮＡセグメントに作動可能に連結されたプロモーターを含むｍＲＮＡ産生のためのベクター、インフルエンザウイルスＰＢ２をコードするＤＮＡセグメントに作動可能に連結されたプロモーターを含むｍＲＮＡ産生のためのベクター、及びインフルエンザウイルスＮＰをコードするＤＮＡセグメントに作動可能に連結されたプロモーターを含むｍＲＮＡ産生のためのベクター、任意にはインフルエンザウイルスＨＡをコードするＤＮＡセグメントに作動可能に連結されたプロモーターを含むｍＲＮＡ産生のためのベクター、インフルエンザウイルスＮＡをコードするＤＮＡセグメントに作動可能に連結されたプロモーターを含むｍＲＮＡ産生のためのベクター、インフルエンザウイルスＭ１をコードするＤＮＡセグメントに作動可能に連結されたプロモーターを含むｍＲＮＡ産生のためのベクター、インフルエンザウイルスＭ２をコードするＤＮＡセグメントに作動可能に連結されたプロモーターを含むｍＲＮＡ産生のためのベクター、又はインフルエンザウイルスＮＳ２をコードするＤＮＡセグメントに作動可能に連結されたプロモーターを含むｍＲＮＡ産生のためのベクター、を含む。一実施形態において、少なくとも１つのベクターは、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ、又はＮＳ、又はそれらの部分をコードする配列に対応する配列を含み、配列番号１〜６又は１０〜１５の１つによってコードされる対応するポリペプチドと実質的に同一の活性を有し、例えば���配列番号１〜６又は１０〜１５の１つによってコードされるポリペプチドと、８０〜１００のいずれかの整数％、少なくとも８０％、例えば、８５％、９０％、９２％、９５％、９８％、９９％又は１００％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドをコードする配列を含む。任意には、転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＭ  ｃＤＮＡに作動可能に連結されたプロモーターを含むベクターの代わりに、例えば、転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＭ１  ｃＤＮＡに作動可能に連結されたプロモーターを含むベクター、及び転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＭ２  ｃＤＮＡに作動可能に連結されたプロモーターを含むベクターなどの２つのベクターが利用可能である。
【００３５】
本発明の多数のベクターは物理的に結合する、又は各ベクターは個々のプラスミド又は他の、例えば、線状の、核酸送達ビヒクル上に存在することができる。一実施形態において、各ｖＲＮＡ産生ベクターは、別々のプラスミド上である。一実施形態において、各ｍＲＮＡ産生ベクターは、別々のプラスミド上である。
【００３６】
本発明はまた、インフルエンザウイルスの調製方法を供する。斯かる方法は、例えば、連続して又は同時に、感染性インフルエンザウイルスを得るのに有効な量の多数の本発明のベクターと細胞を接触させる工程を含む。本発明はまた、多数のベクターと結合した細胞からウイルスを単離する工程を含む。従って、本発明は、単離ウイルス、及び本発明の多数のベクター又はウイルスと結合した宿主細胞をさらに供する。他の実施形態において、本発明は、他のベクター、ｖＲＮＡ又はタンパク質産生ベクターに先立ち、１又は２以上のベクター、ｖＲＮＡ又はタンパク質産生ベクターと細胞を接触させる工程を含む。一実施形態において、方法で利用されるｖＲＮＡベクターに関するプロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩプロモーター、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター、Ｔ３プロモーター又はＴ７プロモーターである。一実施形態において、ＲＮＡポリメラーゼＩプロモーターは、ヒトＲＮＡポリメラーゼＩプロモーターである。一実施形態において、方法で利用される各ｖＲＮＡベクターは、別々のプラスミド上に存在する。一実施形態において、前記方法で利用されるｖＲＮＡベクターは、１つのプラスミド又は２つ又は３つの異なるプラスミド上に存在する。一実施形態において、方法で利用される各ｍＲＮＡベクターは、別々のプラスミド上に存在する。一実施形態において、前記方法で利用されるＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２及びＮＰに関するｍＲＮＡベクターは、１つのプラスミド又は２つ若しくは３つの異なるプラスミド上に存在する。
【００３７】
一実施形態において、本発明は、細胞培養において増強された複製を有するインフルエンザウイルスの選択方法を供する。斯かる方法は、インフルエンザワクチン製造に適した細胞を供する工程；前記細胞中で、１又は２以上のインフルエンザウイルス単離株を連続的に培養する工程；及び連続培養前の１又は２以上の単離株と比較して増強された成長を有する、連続的に培養されたウイルスを単離する工程を含む。一実施形態において、細胞は齧歯類又は霊長類細胞である。
【００３８】
本明細書に記載される、ヘルパーウイルス感染が必要ないウイルスの製造方法は、ウイルス変異原性試験、ワクチン（例えば、ＡＩＤＳ、インフルエンザ、肝炎Ｂ、肝炎Ｃ、ライノウイルス、フィロウイルス、マラリア、ヘルペス、及び足部及び口腔疾患用）の製造、及び遺伝子治療ベクター（例えば、癌、ＡＩＤＳ、アデノシンデアミナーゼ、筋ジストロフィー、オルニチントランスカルバミラーゼ欠乏症及び中枢神経腫瘍用）の製造において有用である。従って、医学療法における使用（例えば、ワクチン又は遺伝子治療）用ウイルスを供する。
【００３９】
本発明はまた、単離ウイルスポリペプチド、及び本発明の組換えウイルスの調製及び使用方法を供する。斯かる方法は、本発明のインフルエンザウイルス、例えば、不活化ウイルス調製物の有効量を、任意にはアジュバント及び／又は担体と併用して、宿主生物、例えば、哺乳類に、そのウイルス又は抗原性に密接に関係したウイルスによる例えば哺乳類などの動物の感染を予防又は寛解するのに有効な量で投与する工程を含む。一実施形態においてウイルスは、筋肉内に投与され、一方他の実施形態において、ウイルスは鼻腔内に投与される。一部の投与プロトコールにおいて、用量は全て筋肉内又は鼻腔内に投与することができ、他のプロトコールにおいては、筋肉内と鼻腔内投与との組み合わせを利用することができる。ワクチンは、例えば、多価ワクチンを形成するために、組換えインフルエンザウイルスを含むインフルエンザウイルスの他の単離株、他の病原体、さらなる生物由来物質又は微生物成分をさらに含むことができる。一実施形態において、例えば、不活化インフルエンザウイルス、及び粘膜アジュバントを含む鼻腔内ワクチン接種は、鼻咽頭におけるウイルス特異的ＩｇＡ及び中和抗体、並びに血清ＩｇＧを誘発することができる。
【００４０】
本発明のインフルエンザウイルスは、他の抗ウイルス剤の、例えば、アマンタジン、リマンタジン、及び／又はノイラミニダーゼ阻害剤と共に利用することができ、例えば、それらの抗ウイルス剤と組み合わせて、例えば、投与前、中、及び／又は後に別々に投与することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１Ａ】ＰＲ８（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１０〜１５）。
【図１Ｂ】ＰＲ８（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１０〜１５）。
【図１Ｃ】ＰＲ８（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１０〜１５）。
【図２】ライブラリ継代の概略と高収率候補の識別。
【図３】特定のＨＡ力価を有するランダム変異を伴うクローン数。
【図４】選択的変異を有するクローンの力価。
【図５Ａ】ＰＢ２（Ａ）ＰＢ１（Ｂ）、ＰＡ（Ｃ）、ＮＰ、Ｍ又はＮＳ１（Ｄ）において以前に同定された変異を有するＵＷ−ＰＲ８ウイルスの成長曲線。
【図５Ｂ】ＰＢ２（Ａ）ＰＢ１（Ｂ）、ＰＡ（Ｃ）、ＮＰ、Ｍ又はＮＳ１（Ｄ）において以前に同定された変異を有するＵＷ−ＰＲ８ウイルスの成長曲線。
【図５Ｃ】ＰＢ２（Ａ）ＰＢ１（Ｂ）、ＰＡ（Ｃ）、ＮＰ、Ｍ又はＮＳ１（Ｄ）において以前に同定された変異を有するＵＷ−ＰＲ８ウイルスの成長曲線。
【図５Ｄ】ＰＢ２（Ａ）ＰＢ１（Ｂ）、ＰＡ（Ｃ）、ＮＰ、Ｍ又はＮＳ１（Ｄ）において以前に同定された変異を有するＵＷ−ＰＲ８ウイルスの成長曲線。
【図６】ＭＤＣＫ細胞内で高い複製特性を付与する変異の概要。
【図７Ａ】Ａ）ＨＡ力価（２ｎ単位）及びウイルス力価（ＰＦＵ／ｍＬ単位）に関してウイルス株を試験した。Ｂ）ＭＤＣＫ細胞における成長曲線。
【図７Ｂ】Ａ）ＨＡ力価（２ｎ単位）及びウイルス力価（ＰＦＵ／ｍＬ単位）に関してウイルス株を試験した。Ｂ）ＭＤＣＫ細胞における成長曲線。
【図８Ａ−Ｂ】Ａ）野性型（ＵＷ−ＰＲ８）とクローン＃４のＨＡ力価。Ｂ）野性型（ＵＷ−ＰＲ８）と＃４のウイルスタンパク質。Ｃ）野性型及び＃４のウイルスタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。
【図８Ｃ】Ａ）野性型（ＵＷ−ＰＲ８）とクローン＃４のＨＡ力価。Ｂ）野性型（ＵＷ−ＰＲ８）と＃４のウイルスタンパク質。Ｃ）野性型及び＃４のウイルスタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。
【図９Ａ】Ａ）野生型ウイルス（ＵＷ−ＰＲ８）とＭ１に変異を有する高複製ウイルスとの力価の比較。Ｂ）野生型ウイルス（ＵＷ−ＰＲ８）及びＭ１に変異を有する高複製ウイルスの成長速度。
【図９Ｂ】Ａ）野生型ウイルス（ＵＷ−ＰＲ８）とＭ１に変異を有する高複製ウイルスとの力価の比較。Ｂ）野生型ウイルス（ＵＷ−ＰＲ８）及びＭ１に変異を有する高複製ウイルスの成長速度。
【図１０Ａ】Ａ）イヌのコドン利用表。Ｂ）野性型（ＵＷ−ＰＲ８）と「希少（ｒａｒｅ）」コドン最適化ＰＢ２ウイルスとの相対適応性。Ｃ）野性型（ＵＷ−ＰＲ８）と「全」コドン最適化ＰＢ２ウイルスとの相対適応性。Ｄ）ＰＢ２コドン最適化ウイルスの成長速度。Ｅ）コドン最適化ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ又はＮＰ遺伝子セグメント又はセグメントの組み合わせを有するウイルスの成長速度。Ｆ）ＵＷ−ＰＲ８のＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ及びＮＰ遺伝子セグメントの配列とＵＷ−ＰＲ８のイヌコドン利用最適化ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、及びＮＰ遺伝子セグメントの配列。
【図１０Ｂ】Ａ）イヌのコドン利用表。Ｂ）野性型（ＵＷ−ＰＲ８）と「希少（ｒａｒｅ）」コドン最適化ＰＢ２ウイルスとの相対適応性。Ｃ）野性型（ＵＷ−ＰＲ８）と「全」コドン最適化ＰＢ２ウイルスとの相対適応性。Ｄ）ＰＢ２コドン最適化ウイルスの成長速度。Ｅ）コドン最適化ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ又はＮＰ遺伝子セグメント又はセグメントの組み合わせを有するウイルスの成長速度。Ｆ）ＵＷ−ＰＲ８のＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ及びＮＰ遺伝子セグメントの配列とＵＷ−ＰＲ８のイヌコドン利用最適化ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、及びＮＰ遺伝子セグメントの配列。
【図１０Ｃ】Ａ）イヌのコドン利用表。Ｂ）野性型（ＵＷ−ＰＲ８）と「希少（ｒａｒｅ）」コドン最適化ＰＢ２ウイルスとの相対適応性。Ｃ）野性型（ＵＷ−ＰＲ８）と「全」コドン最適化ＰＢ２ウイルスとの相対適応性。Ｄ）ＰＢ２コドン最適化ウイルスの成長速度。Ｅ）コドン最適化ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ又はＮＰ遺伝子セグメント又はセグメントの組み合わせを有するウイルスの成長速度。Ｆ）ＵＷ−ＰＲ８のＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ及びＮＰ遺伝子セグメントの配列とＵＷ−ＰＲ８のイヌコドン利用最適化ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、及びＮＰ遺伝子セグメントの配列。
【図１０Ｄ】Ａ）イヌのコドン利用表。Ｂ）野性型（ＵＷ−ＰＲ８）と「希少（ｒａｒｅ）」コドン最適化ＰＢ２ウイルスとの相対適応性。Ｃ）野性型（ＵＷ−ＰＲ８）と「全」コドン最適化ＰＢ２ウイルスとの相対適応性。Ｄ）ＰＢ２コドン最適化ウイルスの成長速度。Ｅ）コドン最適化ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ又はＮＰ遺伝子セグメント又はセグメントの組み合わせを有するウイルスの成長速度。Ｆ）ＵＷ−ＰＲ８のＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ及びＮＰ遺伝子セグメントの配列とＵＷ−ＰＲ８のイヌコドン利用最適化ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、及びＮＰ遺伝子セグメントの配列。
【図１０Ｅ】Ａ）イヌのコドン利用表。Ｂ）野性型（ＵＷ−ＰＲ８）と「希少（ｒａｒｅ）」コドン最適化ＰＢ２ウイルスとの相対適応性。Ｃ）野性型（ＵＷ−ＰＲ８）と「全」コドン最適化ＰＢ２ウイルスとの相対適応性。Ｄ）ＰＢ２コドン最適化ウイルスの成長速度。Ｅ）コドン最適化ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ又はＮＰ遺伝子セグメント又はセグメントの組み合わせを有するウイルスの成長速度。Ｆ）ＵＷ−ＰＲ８のＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ及びＮＰ遺伝子セグメントの配列とＵＷ−ＰＲ８のイヌコドン利用最適化ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、及びＮＰ遺伝子セグメントの配列。
【図１０Ｆ】Ａ）イヌのコドン利用表。Ｂ）野性型（ＵＷ−ＰＲ８）と「希少（ｒａｒｅ）」コドン最適化ＰＢ２ウイルスとの相対適応性。Ｃ）野性型（ＵＷ−ＰＲ８）と「全」コドン最適化ＰＢ２ウイルスとの相対適応性。Ｄ）ＰＢ２コドン最適化ウイルスの成長速度。Ｅ）コドン最適化ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ又はＮＰ遺伝子セグメント又はセグメントの組み合わせを有するウイルスの成長速度。Ｆ）ＵＷ−ＰＲ８のＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ及びＮＰ遺伝子セグメントの配列とＵＷ−ＰＲ８のイヌコドン利用最適化ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、及びＮＰ遺伝子セグメントの配列。
【図１０Ｇ】Ａ）イヌのコドン利用表。Ｂ）野性型（ＵＷ−ＰＲ８）と「希少（ｒａｒｅ）」コドン最適化ＰＢ２ウイルスとの相対適応性。Ｃ）野性型（ＵＷ−ＰＲ８）と「全」コドン最適化ＰＢ２ウイルスとの相対適応性。Ｄ）ＰＢ２コドン最適化ウイルスの成長速度。Ｅ）コドン最適化ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ又はＮＰ遺伝子セグメント又はセグメントの組み合わせを有するウイルスの成長速度。Ｆ）ＵＷ−ＰＲ８のＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ及びＮＰ遺伝子セグメントの配列とＵＷ−ＰＲ８のイヌコドン利用最適化ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、及びＮＰ遺伝子セグメントの配列。
【図１０Ｈ】Ａ）イヌのコドン利用表。Ｂ）野性型（ＵＷ−ＰＲ８）と「希少（ｒａｒｅ）」コドン最適化ＰＢ２ウイルスとの相対適応性。Ｃ）野性型（ＵＷ−ＰＲ８）と「全」コドン最適化ＰＢ２ウイルスとの相対適応性。Ｄ）ＰＢ２コドン最適化ウイルスの成長速度。Ｅ）コドン最適化ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ又はＮＰ遺伝子セグメント又はセグメントの組み合わせを有するウイルスの成長速度。Ｆ）ＵＷ−ＰＲ８のＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ及びＮＰ遺伝子セグメントの配列とＵＷ−ＰＲ８のイヌコドン利用最適化ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、及びＮＰ遺伝子セグメントの配列。
【図１０Ｉ】Ａ）イヌのコドン利用表。Ｂ）野性型（ＵＷ−ＰＲ８）と「希少（ｒａｒｅ）」コドン最適化ＰＢ２ウイルスとの相対適応性。Ｃ）野性型（ＵＷ−ＰＲ８）と「全」コドン最適化ＰＢ２ウイルスとの相対適応性。Ｄ）ＰＢ２コドン最適化ウイルスの成長速度。Ｅ）コドン最適化ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ又はＮＰ遺伝子セグメント又はセグメントの組み合わせを有するウイルスの成長速度。Ｆ）ＵＷ−ＰＲ８のＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ及びＮＰ遺伝子セグメントの配列とＵＷ−ＰＲ８のイヌコドン利用最適化ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、及びＮＰ遺伝子セグメントの配列。
【図１０Ｊ】Ａ）イヌのコドン利用表。Ｂ）野性型（ＵＷ−ＰＲ８）と「希少（ｒａｒｅ）」コドン最適化ＰＢ２ウイルスとの相対適応性。Ｃ）野性型（ＵＷ−ＰＲ８）と「全」コドン最適化ＰＢ２ウイルスとの相対適応性。Ｄ）ＰＢ２コドン最適化ウイルスの成長速度。Ｅ）コドン最適化ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ又はＮＰ遺伝子セグメント又はセグメントの組み合わせを有するウイルスの成長速度。Ｆ）ＵＷ−ＰＲ８のＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ及びＮＰ遺伝子セグメントの配列とＵＷ−ＰＲ８のイヌコドン利用最適化ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、及びＮＰ遺伝子セグメントの配列。
【図１０Ｋ】Ａ）イヌのコドン利用表。Ｂ）野性型（ＵＷ−ＰＲ８）と「希少（ｒａｒｅ）」コドン最適化ＰＢ２ウイルスとの相対適応性。Ｃ）野性型（ＵＷ−ＰＲ８）と「全」コドン最適化ＰＢ２ウイルスとの相対適応性。Ｄ）ＰＢ２コドン最適化ウイルスの成長速度。Ｅ）コドン最適化ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ又はＮＰ遺伝子セグメント又はセグメントの組み合わせを有するウイルスの成長速度。Ｆ）ＵＷ−ＰＲ８のＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ及びＮＰ遺伝子セグメントの配列とＵＷ−ＰＲ８のイヌコドン利用最適化ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、及びＮＰ遺伝子セグメントの配列。
【図１０Ｌ】Ａ）イヌのコドン利用表。Ｂ）野性型（ＵＷ−ＰＲ８）と「希少（ｒａｒｅ）」コドン最適化ＰＢ２ウイルスとの相対適応性。Ｃ）野性型（ＵＷ−ＰＲ８）と「全」コドン最適化ＰＢ２ウイルスとの相対適応性。Ｄ）ＰＢ２コドン最適化ウイルスの成長速度。Ｅ）コドン最適化ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ又はＮＰ遺伝子セグメント又はセグメントの組み合わせを有するウイルスの成長速度。Ｆ）ＵＷ−ＰＲ８のＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ及びＮＰ遺伝子セグメントの配列とＵＷ−ＰＲ８のイヌコドン利用最適化ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、及びＮＰ遺伝子セグメントの配列。
【図１０Ｍ】Ａ）イヌのコドン利用表。Ｂ）野性型（ＵＷ−ＰＲ８）と「希少（ｒａｒｅ）」コドン最適化ＰＢ２ウイルスとの相対適応性。Ｃ）野性型（ＵＷ−ＰＲ８）と「全」コドン最適化ＰＢ２ウイルスとの相対適応性。Ｄ）ＰＢ２コドン最適化ウイルスの成長速度。Ｅ）コドン最適化ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ又はＮＰ遺伝子セグメント又はセグメントの組み合わせを有するウイルスの成長速度。Ｆ）ＵＷ−ＰＲ８のＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ及びＮＰ遺伝子セグメントの配列とＵＷ−ＰＲ８のイヌコドン利用最適化ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、及びＮＰ遺伝子セグメントの配列。
【図１１Ａ】Ａ）ＰＲ８及びＩｎｄｏ／ＮＣ／０９の各遺伝子のヌクレオチド４位。Ｂ）すべての３’Ｃ４Ｕ変異株。Ｃ）ＰＢ２、ＰＢ１、及びＰＡ遺伝子の４位に「Ｃ」をコードする組換えＵＷ−ＰＲ８ウイルス（黒色）及び８つのセグメントすべての４位に「Ｕ」をコードする変異株（赤）の成長速度。
【図１１Ｂ】Ａ）ＰＲ８及びＩｎｄｏ／ＮＣ／０９の各遺伝子のヌクレオチド４位。Ｂ）すべての３’Ｃ４Ｕ変異株。Ｃ）ＰＢ２、ＰＢ１、及びＰＡ遺伝子の４位に「Ｃ」をコードする組換えＵＷ−ＰＲ８ウイルス（黒色）及び８つのセグメントすべての４位に「Ｕ」をコードする変異株（赤）の成長速度。
【図１１Ｃ】Ａ）ＰＲ８及びＩｎｄｏ／ＮＣ／０９の各遺伝子のヌクレオチド４位。Ｂ）すべての３’Ｃ４Ｕ変異株。Ｃ）ＰＢ２、ＰＢ１、及びＰＡ遺伝子の４位に「Ｃ」をコードする組換えＵＷ−ＰＲ８ウイルス（黒色）及び８つのセグメントすべての４位に「Ｕ」をコードする変異株（赤）の成長速度。
【図１２Ａ】ワクチン向けの高力価インフルエンザウイルスを提供するのに有効な、本明細書中に開示した内部遺伝子セグメント配列と共に使用するための代表的な配列であるＨ７及びＮ９のヌクレオチド及びアミノ酸配列。
【図１２Ｂ】ワクチン向けの高力価インフルエンザウイルスを提供するのに有効な、本明細書中に開示した内部遺伝子セグメント配列と共に使用するための代表的な配列であるＨ７及びＮ９のヌクレオチド及びアミノ酸配列。
【図１２Ｃ】ワクチン向けの高力価インフルエンザウイルスを提供するのに有効な、本明細書中に開示した内部遺伝子セグメント配列と共に使用するための代表的な配列であるＨ７及びＮ９のヌクレオチド及びアミノ酸配列。
【図１３Ａ】Ａ）ウイルス力価を増強するキメラＨＡ及びＮＡ遺伝子の図解。Ｂ）キメラウイルスの成長速度。
【図１３Ｂ】Ａ）ウイルス力価を増強するキメラＨＡ及びＮＡ遺伝子の図解。Ｂ）キメラウイルスの成長速度。
【図１４Ａ】Ａ）変異の組み合わせを有するウイルスの成長速度。Ｂ）変異の組み合わせを有するウイルスのＰＦＵ及びＨＡ力価。
【図１４Ｂ】Ａ）変異の組み合わせを有するウイルスの成長速度。Ｂ）変異の組み合わせを有するウイルスのＰＦＵ及びＨＡ力価。
【図１５】卵におけるスクリーニング。
【図１６】ベロ細胞から単離された２１６個のクローンのＨＡ力価。
【図１７】異なるＰＲ８バックボーン変異を用いて作出した組換えウイルス。
【図１８Ａ】ＭＤＣＫ細胞及びベロ細胞内で成長促進があるウイルス作出の概略。
【図１８Ｂ】ＭＤＣＫ細胞及びベロ細胞内で成長促進があるウイルス作出の概略。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
本発明の詳細な説明
定義
本明細書において、用語「単離」とは、本発明の核酸分子、例えば、ベクター又はプラスミド、ペプチド又はポリペプチド（タンパク質）、又はウイルスのインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）での調製及び／又は単離を意味し、よってインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）の物質と関係がない、又は実質的にインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）の物質から精製される。単離ウイルスの調製は、通常インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）での培養及び増殖によって、且つ／又は卵内の継代を介して得られ、実質的に他の感染病原体を含まない。
【００４３】
本明細書において、「実質的に精製」とは、組成物において対象の種が優勢種である、例えば、モル基準で、任意の他の個々の種より豊富、好ましくは、組成物中に存在する種の少なくとも約８０％、任意には９０％以上、例えば、存在する種の９５％、９８％、９９％又はそれ以上であることを意味する。
【００４４】
本明細書において、「実質的に含まない」とは、特定の感染病原体に対する標準検出方法を使用して、その病原体に関して検出レベル以下を意味する。
【００４５】
「組換え」ウイルスとは、ウイルスゲノムに変更を導入するために、例えば、組換えＤＮＡ技術を使用してインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で操作されたウイルスである。再集合体ウイルスは、組換え又は非組換え技術によって調製することができる。
【００４６】
本明細書において、用語「組換え核酸」又は「組換えＤＮＡ配列又はセグメント」とは、ある起源に由来する又は起源から単離されたもので、その後にインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で化学的に変化し得る核酸、例えば、ＤＮＡであって、その配列が自然起源でない、又は未変性ゲノムに存在しない自然起源の配列に相当するものを意味する。ある起源に「由来する」ＤＮＡの例は、有用な断片として認識され、続いて本質的に純粋な形態で化学的に合成されるＤＮＡ配列とすることができる。そのようなある起源から「単離」されたＤＮＡの例は、化学的手段、例えば、制限酵素の使用によって斯かる起源から切除又は除去された有用なＤＮＡ配列となり得るものであり、本発明の使用のために、遺伝工学方法によってさらに操作、例えば、増幅することができる。
【００４７】
本明細書において、「異種」インフルエンザウイルス遺伝子又は遺伝子セグメントとは、組換え、例えば、再集合体、インフルエンザウイルス中の、大部分の他のインフルエンザウイルスの遺伝子又は遺伝子セグメントとは異なるインフルエンザウイルス源に由来するものである。
【００４８】
用語「単離ポリペプチド」、「単離ペプチド」又は「単離タンパク質」とは、合成起源の１つを含むｃＤＮＡ又は組換えＲＮＡによってコードされたポリペプチド、ペプチド又はタンパク質、又はそれらの組み合わせを含む。
【００４９】
本明細書で用いられる用語「組換えタンパク質」又は「組換えポリペプチド」とは、組換えＤＮＡ分子から発現されたタンパク質分子を意味する。対照的に、本明細書では用語「未変性タンパク質」とは、自然起源（すなわち、非組換え起源）から単離されたタンパク質を示すために用いられる。分子生物学的技術は、タンパク質の未変性形態と比較して同一特性を有するタンパク質の組換え形態を産生するために使用することができる。
【００５０】
配列比較の方法は当技術分野で周知である。従って、任意の２つの配列間のパーセント同一性の測定は、数学アルゴリズムを使用して達成することができる。
【００５１】
これらの数学アルゴリズムのコンピューターによる実行は、配列同一性を測定する配列比較のために利用することができる。これらのプログラムを使用する配列比較は、デフォルトパラメータを使用して行うことができる。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センターを通じて公的に利用できる（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）。アルゴリズムは、問い合わせの配列中の長さＷの短いワードを同定することによる、高スコア配列ペア（ＨＳＰ）の最初の同定を含み、斯かる同定は、データベース配列においてワードが同長のワードと整列された場合に、正の値の閾値Ｔに一致するか又はこれを満たすかを同定する。Ｔは、近接ワードスコア閾値（ｎｅｉｇｈｂｏｒｈｏｏｄ  ｗｏｒｄ  ｓｃｏｒｅ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）と呼ばれる。これらの最初の近隣ワードヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを見つける検索を開始するためのシード（ｓｅｅｄ）として機能する。続いてワードヒットは、累積配列比較スコアが増加され得る限り、各配列に沿って両方向に伸長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列に関して、パラメータＭ（マッチする残基のペアのリウォードスコア；常に＞  ０）及びＮ（ミスマッチの残基のペナルティスコア；常に＜０）を使用して計算される。アミノ酸配列に関して、スコアマトリックスは累積スコアを計算するために使用される。各方向のワードヒットの伸長は、累積配列比較スコアがその最大達成値から量Ｘまで減少する、１又は２以上の不のスコアの残基配列比較の累積によって累積スコアがゼロ又はそれ以下となる、又は一方の配列末端に到達した場合に停止される。
【００５２】
さらに、パーセント配列同一性の算定のために、ＢＬＡＳＴアルゴリズムもまた、２つの配列間の類似性の統計分析を実施することができる。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって供される類似性の１つの測定値は、２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列間の一致が偶然に生じうる可能性を示す、最小の合計確率（Ｐ（Ｎ））とすることができる。例えば、試験核酸配列の参照核酸配列との比較の最小の合計確率が約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、及び最も好ましくは約０．００１未満である場合に、試験核酸配列は参照配列と類似と考えられる。
【００５３】
ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列に関する）は、１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、１００のカットオフ値、Ｍ＝５、Ｎ＝４、及び両鎖の比較をデフォルトとして使用することができる。アミノ酸配列に関して、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、３のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、及びＢＬＯＳＵＭ６２スコアマトリックスをデフォルトとして使用することができる。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎ１ｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照されたい。配列比較はまた、観察によって手動で実施できる。
【００５４】
配列比較に関して、典型的には１つの配列が、試験配列が比較される参照配列として機能する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験及び参照配列は、コンピューターに入力され、必要な場合サブシーケンス座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。続いて、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメータに基づき、参照配列と比較して試験配列に関してパーセント配列同一性を計算する。
【００５５】
インフルエンザウイルスの構造及び増殖
インフルエンザＡウイルスは、少なくとも１０個のタンパク質をコードする８つの単一鎖ネガティブセンスのウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）のゲノムを有する。インフルエンザウイルスの生活環は、宿主細胞の表面上のシアル酸含有受容体への赤血球凝集素（ＨＡ）の結合から始まり、受容体媒介エンドサイトーシスが続く。後期エンドソームにおける低ｐＨは、ＨＡにおいて立体構造変化を引き起こし、その結果ＨＡ２サブユニット（いわゆる融合ペプチド）のＮ末端を露呈する。融合ペプチドは、ウイルス及びエンドソーム膜の融合を惹起し、マトリックスタンパク質（Ｍ１）及びＲＮＰ複合体を細胞質中に遊離する。ＲＮＰは、ｖＲＮＡをキャプシド形成するヌクレオプロテイン（ＮＰ）、及びＰＡ、ＰＢ１、及びＰＢ２タンパク質によって形成されるウイルスポリメラーゼ複合体から成る。ＲＮＰは核中に輸送され、転写及び複製が行われる。ＲＮＡポリメラーゼ複合体は、３つの異なる反応：５’キャップ及び３’  ポリＡ構造を有するｍＲＮＡの合成、全長相補ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）の合成、及び鋳型としてｃＲＮＡを使用したゲノムｖＲＮＡの合成を触媒する。新たに合成されたｖＲＮＡ、ＮＰ、及びポリメラーゼタンパク質は、続いてＲＮＰ中に構築され、核から排出され、細胞膜に輸送され、そこで後代ウイルス粒子の出芽が生じる。ノイラミニダーゼ（ＮＡ）タンパク質は、シアル酸をシアリルオリゴ糖から除去することによって感染の終盤において重要な役割を担い、これにより、細胞表面から新たに構築されたウイルス粒子を放出し、ウイルス粒子の自己凝集を防止する。ウイルス集合はタンパク質−タンパク質及びタンパク質−ｖＲＮＡ相互作用を含むが、これらの相互作用の性質はほとんど知られていない。
【００５６】
インフルエンザＢ及びＣウイルスは、インフルエンザＡウイルスと構造的及び機能的に類似するが、一部の差異が存在する。例えば、インフルエンザＢウイルスは、イオンチャネル活性を有するＭ２タンパク質を有しないが、ＢＭ２を有し、ＮＡ及びＮＢ配列双方を有する遺伝子セグメントを有する。インフルエンザＣウイルスは、７つの遺伝子セグメントのみ有する。
【００５７】
本発明において使用することができる細胞株
例えば、任意のトリ細胞、又は、例えばヒトなどの、例えば、２９３Ｔ又はＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞、又はイヌ、例えば、ＭＤＣＫ、ウシ、ウマ、ネコ、ブタ、ヒツジ、齧歯類の細胞、例えば、ミンクの細胞、例えば、ＭｖＬｕ１細胞、又はハムスターの細胞、例えば、ＣＨＯ細胞、又は非ヒト霊長類の細胞、例えば、ベロ細胞などの哺乳類細胞などの、変異体細胞を含む任意の細胞であって、インフルエンザウイルスの効率複製を補助する細胞は、インフルエンザウイルスを単離及び／又は増殖するために使用することができる。単離ウイルスは、再集合体ウイルスを調製するために使用することができる。一実施形態において、ワクチン製造のための宿主細胞は、維持された哺乳類又はトリ株化細胞又は細胞株である。使用される細胞の完全な性質決定は、最終産物の純度に関する適切な試験を含むことが可能となるように行うことができる。細胞の性質決定に使用することができるデータは、（ａ）その起源、由来、及び継代歴に関する情報；（ｂ）その成長及び形態的特徴に関する情報；（ｃ）外来病原体（ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ  ａｇｅｎｔ）の試験結果；（ｄ）他の株化細胞の中で明確に認識することができる、例えば生化学、免疫学、及び細胞遺伝的パターンなどの際立った特徴；及び（ｅ）腫瘍形成能に関する試験結果を含む。一実施形態において、使用される宿主細胞の継代レベル、又は集団倍加は、可能な限り低いものとする。
【００５８】
一実施形態において、細胞はＷＨＯ認可の、又は認可され得る、連続株化細胞である。このような株化細胞の認定に必要な条件は、系統、成長特性、免疫マーカー、ウイルス感受性腫瘍形成能及び保存条件の少なくとも１つに関する性質決定、及び動物、卵、及び細胞培養における試験を含む。このような性質決定は、細胞が検出可能な外来病原体を含まないことを確認するために使用される。一部の国においては、核学もまた必要とすることができる。さらに、腫瘍形成能は、ワクチン製造に使用されるものと同一継代レベルである細胞内で試験することができる。ウイルスは、ワクチン製造前に、一貫した結果を生じることが示されている工程によって精製することができる（例えば、世界保健機関、１９８２を参照されたい）。
【００５９】
宿主細胞によって生成されたウイルスは、ワクチン又は遺伝子治療の製剤化前に高度に精製することができる。一般的に、精製方法は、細胞ＤＮＡ及び他の細胞成分、及び外来病原体の広範な除去を生じる。ＤＮＡを広範に分解又は変性する方法もまた使用することができる。
【００６０】
インフルエンザワクチン
本発明のワクチンは、本発明の単離組換えインフルエンザウイルス、及び任意には他の単離インフルエンザウイルスを含む１又は２以上の他の単離ウイルス、１又は２以上の単離インフルエンザウイルス又は１又は２以上の他の病原体、例えば、１又は２以上の細菌、非インフルエンザウイルス、酵母又は真菌由来の免疫原性タンパク質の１又は２以上の免疫原性タンパク質又は糖タンパク質、或いは本発明の単離インフルエンザウイルスの１又は２以上の免疫原性タンパク質を含む１又は２以上のウイルスタンパク質をコードする単離核酸をコードする単離核酸（例えば、ＤＮＡワクチン）を含む。一実施形態において、本発明のインフルエンザウイルスは、インフルエンザウイルス又は他の病原体のためのワクチンベクターとすることができる。
【００６１】
完全なウイルス粒子ワクチンは、限外濾過によって濃縮し、続いてゾーン遠心分離又はクロマトグラフィーによって精製することができる。本発明のウイルス以外、例えば多価ワクチンに含まれるウイルスは、例えば、ホルマリン又はベータプロピオラクトンを使用して、精製前又は後に不活化することができる。
【００６２】
サブユニットワクチンは、精製糖タンパク質を含む。このようなワクチンは、次の通り調製することができる：界面活性剤での処理によって断片化されたウイルス懸濁液を使用して、例えば、超遠心分離法によって表面抗原が精製される。従って、サブユニットワクチンは、主にＨＡタンパク質、及びＮＡもまた含有する。使用される界面活性剤は、例えば、ヘキサデシルトリメチル臭化アンモニウム（Ｂａｃｈｍｅｙｅｒ，  １９７５）などの陽イオン界面活性剤、例えばデオキシコール酸アンモニウム（Ｌａｖｅｒ  ＆  Ｗｅｂｓｔｅｒ，  １９７６）などの陰イオン界面活性剤、又は例えば市販の名称トリトンＸ１００などの非イオン界面活性剤、とすることができる。赤血球凝集素は、ウイルス粒子の処理後に、例えばブロメリンなどのプロテアーゼで単離し、続いて精製することもまたできる。サブユニットワクチンは、多価ワクチン中で本発明の弱毒化ウイルスと組み合わせることもまたできる。
【００６３】
スプリットワクチンは、脂質を溶解する薬剤での処理に供されたウイルス粒子を含む。スプリットワクチンは、次の通り調製することができる：上記の不活化された又は不活化されていない、得られた精製ウイルスの水性懸濁液を、界面活性剤と組み合わせて、例えばエチルエーテル又はクロロホルムなどの脂質溶媒によって撹拌下で処理する。ウイルス外被脂質の溶解は、ウイルス粒子の断片化を生じる。取り出された水相には、除去されたウイルス起源の脂質環境、及びコア又はその分解生成物と共に、主に赤血球凝集素及びノイラミニダーゼから成るスプリットワクチンが含まれる。続いて、残渣感染性粒子は、まだ不活化されていない場合は、不活化される。スプリットワクチンは、多価ワクチン中で本発明の弱毒化ウイルスと組み合わせることができる。
【００６４】
不活化ワクチン
不活化インフルエンザウイルスワクチンは、例えば、ホルマリン又はβ−プロピオラクトン処理などのこれらに限定されない周知の方法を使用して、複製されたウイルスの不活化によって供される。本発明において使用することができる不活化ワクチン型は、全ウイルス（ＷＶ）ワクチン又はサブビリオン粒子（ＳＶ）（スプリット）ワクチンを含むことができる。ＷＶワクチンは、未処理の不活化ウイルスを含有し、一方ＳＶワクチンは、脂質含有ウイルス外被を可溶化する界面活性剤で、続いて残渣ウイルスの化学的不活化によって破壊された精製ウイルスを含有する。
【００６５】
さらに、使用することができるワクチンは、単離ＨＡ及びＮＡ表面タンパク質含有ワクチンを含み、表面抗原又はサブユニットワクチンと呼ばれる。
【００６６】
弱毒化生ウイルスワクチン
例えば、本発明の組換えウイルスを含むワクチンなどの弱毒化生インフルエンザウイルスワクチンは、インフルエンザウイルス感染を予防又は治療するために使用することができる。弱毒化は、周知の方法に従って一段階で、複製単離株又は再集合（ｒｅａｓｓｏｒｔｅｄ）ウイルスへの弱毒化ドナーウイルス由来の弱毒化遺伝子の転移によって達成することができる。インフルエンザＡウイルスへの抵抗性は、ＨＡ及び／又はＮＡ糖タンパク質への免疫応答の発生によってまず媒介されるので、これらの表面抗体をコードする遺伝子は、再集合ウイルス又は臨床単離株に由来する。弱毒化遺伝子は、弱毒化された親に由来する。このアプローチにおいて、弱毒化を与える遺伝子は通常、ＨＡ及びＮＡ糖タンパク質をコードしない。
【００６７】
再現性よくインフルエンザウイルスの弱毒化が可能なウイルス（ドナーインフルエンザウイルス）を利用でき、例えば、低温に順化した（ｃａ）ドナーウイルスを弱毒化ワクチン製造に使用することができる。生きた、弱毒化再集合体ウイルスワクチンは、ｃａドナーウイルスを病原性複製ウイルスと接合することによって産生することができる。再集合体の後代は、続いて２５°Ｃにおいて（病原性ウイルスの複製に制限される）、適した抗血清の存在下で選択され、それは弱毒化ｃａドナーウイルスの表面抗体を有するウイルスの複製を阻害する。有用な再集合体は、（ａ）感染性があり、（ｂ）血清陰性の非成体哺乳類及び免疫学的に初回刺激を受けた成体哺乳類用に弱毒化され、（ｃ）免疫原性があり、そして（ｄ）遺伝的に安定である。ｃａ再集合体の免疫原性は、それらの複製レベルに匹敵する。従って、新規な野生型ウイルスによるｃａドナーウイルスの６つの伝達性遺伝子の獲得は、成体及び非成体両方の感受性哺乳類のワクチン接種における使用のためのこれらのウイルスを再現性よく弱毒化している。
【００６８】
他の弱毒化変異は、部位特異的な変異誘発によって、インフルエンザウイルス遺伝子中に導入し、これらの変異体遺伝子を有する感染性ウイルスを取り出す（ｒｅｓｃｕｅ）ことができる。弱毒化変異は、ゲノムの非翻訳領域、及び翻訳領域中に導入することができる。これらの弱毒化変異は、ＨＡ又はＮＡ以外の遺伝子、例えば、ＰＢ２ポリメラーゼ遺伝子中に導入することもまたできる。従って、部位特異的変異誘発によって導入された弱毒化変異を有する新たなドナーウイルスもまた産生することができ、ｃａドナーウイルスに関する上記方法に類似の方法で、このような可能性のある新たなドナーウイルスを弱毒化生再集合体ワクチンの製造において使用することができる。同様に、他の周知且つ適した弱毒化ドナー株をインフルエンザウイルスと再集合させて、哺乳類のワクチン接種における使用に適した弱毒化ワクチンを得ることができる。
【００６９】
一実施形態において、このような弱毒化ウイルスは、本来の臨床単離株と実質的に同様の抗原決定基をコードするウイルス由来の遺伝子を維持する。これは、弱毒化ワクチンが、ウイルスの本来の臨床単離株と実質的に同一の抗原性を供する一方で同時に、ワクチン接種を受けた哺乳類におけるワクチンの重篤な疾患状態を誘発する可能性が最小となる程度まで病原性を欠失していることを目的とするからである。
【００７０】
従って、多価ワクチン中のウイルスは、動物、例えば、哺乳類に免疫応答を導入するために、弱毒化又は不活化し、ワクチンとして周知の方法に従って製剤し且つ投与することができる。このような弱毒化又は不活化ワクチンが、臨床単離株又はそれに由来する高成長の株と類似の抗原性を保持するかを測定する方法は、当技術分野で周知である。このような周知の方法は、ドナーウイルスの抗原決定基を発現するウイルスを除去するための抗血清又は抗体の使用；化学的選択（例えば、アマンタジン又はリマンタジン  ）；ＨＡ及びＮＡ活性及び抑制；及び抗原決定基をコードするドナー遺伝子（例えば、ＨＡ又はＮＡ遺伝子）が弱毒化ウイルス中に存在しないことを確認する核酸スクリーニング（例えば、プローブハイブリダイゼーション又はＰＣＲなど）を含む。
【００７１】
医薬組成物
接種、例えば、経鼻、非経口又は経口投与に適した本発明の医薬組成物は、１又は２以上のインフルエンザウイルス単離株、例えば、１又は２以上の弱毒化又は不活化インフルエンザウイルス、それらのサブユニット、それらの単離タンパク質、及び／又は１又は２以上のそのタンパク質をコードする単離核酸を含み、それらは任意にはさらに無菌水性又は非水性溶液、懸濁液、及び乳濁液を含む。斯かる組成物は、さらに当技術分野で周知の補助剤又は賦形剤を含むことができる。本発明の斯かる組成物は、一般的に、個々の用量形態（単位用量）で表される。
【００７２】
通常のワクチンは、一般的に、それらの組成物に加えられる各株由来のＨＡを、約０．１〜２００  μｇ、例えば、３０〜１００  μｇ含有する。本発明のワクチン組成物の主成分を形成するワクチンは、１つのインフルエンザウイルス、又は１又は２以上の再集合体を含む、例えば、少なくとも２又は３つのインフルエンザウイルスなどの、インフルエンザウイルスの組み合わせを含むことができる。
【００７３】
非経口投与のための調製物は、無菌水性又は非水性溶液、懸濁液、及び／又は乳濁液を含み、当技術分野で周知の補助剤又は賦形剤を含有することができる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、例えばオリーブ油などの植物油、及び注射可能な例えばオレイン酸エチルなどの有機エステルである。皮膚浸透性を増大し抗原吸収を増強するために、担体又は密封包帯を使用することができる。経口投与用液体剤形は、一般的に、液体剤形を含むリポソーム溶液を含むことができる。リポソームの懸濁に適した形態は、乳濁液、懸濁液、溶液、シロップ、及び例えば精製水などの当技術分野で一般に使用される不活性希釈剤を含有するエリキシル剤を含む。斯かる不活性希釈剤に加え、このような組成物は、アジュバント、湿潤剤、乳化及び懸濁化剤、又は甘味剤、香味料、又は芳香剤を含むこともまたできる。
【００７４】
個体への投与に本発明の組成物が使用される場合、塩、緩衝剤、アジュバント、又は組成物の有効性の改良に望ましい他の物質をさらに含むことができる。ワクチンに関して、アジュバント、特異的免疫応答を増強することができる物質を使用することができる。通常、アジュバント及び組成物は、免疫系への提示の前に混合されるか、免疫化を受けている生物の同一部位中に別々に提示される。
【００７５】
ワクチンの異種性は、少なくとも２つのインフルエンザウイルス株、例えば２〜２０株などの又はそれらの任意の範囲又は値の複製されたインフルエンザウイルスを混合することによって供することができる。ワクチンは、当技術分野で周知の技術を使用して、インフルエンザウイルスの単一株中のバリエーションに供することができる。
【００７６】
本発明の医薬組成物は、少なくとも１つの、例えば、遺伝子治療のための化学療法化合物、免疫抑制剤、抗炎症剤又は免疫増強剤、及びワクチン用の、化学療法剤をさらに含む又は追加で含むことができ、それらには、ガンマグロブリン、アマンタジン、グアニジン、ヒドロキシベンズイミダゾール、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、腫瘍壊死因子アルファ、チオセミカルバゾン、メチサゾン、リファンピン、リバビリン、ピリミジン類似体、プリン類似体、フォスカーネット、ホスホノ酢酸、アシクロビル、ジデオキシヌクレオシド、プロテアーゼ阻害剤、又はガンシクロビルを含むがこれらに限定されない。
【００７７】
斯かる組成物は、組成物が投与された生物において安全であり且つ望ましくない効果に寄与しないことが分かっている、エンドトキシンを含まないホルムアルデヒド、及び保存剤を可変量であるが少量含有することもできる。
【００７８】
医薬目的
斯かる組成物（又はそれが誘発する抗血清）の投与は、「予防」又は「治療」目的とすることができる。予防に供する場合、ワクチンである本発明の斯かる組成物は、病原体感染のいずれかの症状又は臨床徴候が顕在化する前に提供する。斯かる組成物の予防投与は、続いて生じる感染の予防又は減弱することに役立つ。予防用に供する場合、本発明の遺伝子治療組成物は、疾患のいずれかの症状又は臨床徴候が顕在化する前に提供する。斯かる組成物の予防投与は、疾患と関係がある１又は２以上の症状又は臨床徴候の予防又は減弱に役立つ。
【００７９】
治療上提供する場合、ウイルスワクチンは実際の感染の症状又は臨床徴候の検出に供する。化合物の治療投与は、実際の感染を減弱するのに役立つ。治療上提供する場合、遺伝子治療組成物は、疾患の症状又は臨床徴候の検出に供する。化合物の治療投与は、その疾患の症状又は臨床徴候を減弱するのに役立つ。
【００８０】
従って、本発明のワクチン組成物は、感染の発生の前（予測された感染を予防又は減弱するために）又は実際の感染の惹起後に供することができる。同様に、疾病又は疾患のいずれかの症状又は臨床徴候が顕在化する前又は１又は２以上の症状が検出された後に、遺伝子治療のために、斯かる組成物を供することができる。
【００８１】
組成物は、レシピエント哺乳類がその投与に耐容性を示し得る場合、「医薬的に許容される」とすることができる。このような薬剤は、投与される量が生理的に有意である場合、「治療上有効量」で投与されるという。本発明の組成物は、その存在によりレシピエント患者の生理機能において検出可能な変化を生じる、例えば、感染性インフルエンザウイルスの少なくとも１つの株に対する少なくとも１つの一次又は二次体液性又は細胞性免疫応答を増強する場合、生理的に有効である。
【００８２】
提供される「予防」は、絶対である必要はなく、すなわち、哺乳類の対照群又は集団と比較して統計上有意な改善が存在すればよく、インフルエンザ感染が完全に予防又は根絶される必要はない。予防は、インフルエンザウイルス感染の症状又は臨床徴候の発生の重症度又は速度を軽減することに限定することができる。
【００８３】
医薬投与
本発明の組成物は、受動免疫又は能動免疫によって、１又は２以上の病原体、例えば、１又は２以上のインフルエンザウイルス株に対して抵抗性を与えることができる。能動免疫において、弱毒化生ワクチン組成物は予防上宿主（例えば、哺乳類）に投与され、投与への宿主の免疫応答は感染及び／又は疾患を防ぐ。受動免疫に関して、誘発された抗血清を回収し、少なくとも１つのインフルエンザウイルス株によって生じる感染に罹患する疑いのあるレシピエントに投与することができる。本発明の遺伝子治療組成物は、能動免疫によって予防又は治療レベルの目的の遺伝子生成物を得ることができる。
【００８４】
一実施形態において、ワクチンは、免疫応答を生じるのに十分な時間及び量の条件下で、メス哺乳類（妊娠又は出産時に又は前）に供し、これにより（胎盤を通した又は母乳中の抗体の受動的な取り込みを介して）メス及び胎仔又は新生仔の双方の保護に役立つ。
【００８５】
従って、本発明は、障害又は疾患、例えば、少なくとも病原体の１つの株による感染を予防又は軽減するための方法を含む。本明細書において、ワクチンは、その投与が、疾患の臨床徴候又は状態の全体又は部分的な軽減（すなわち、抑制）、又は疾患への個体の全体又は部分的な免疫を生じる場合、疾患を予防又は軽減するという。本明細書において、遺伝子治療組成物は、その投与が疾患の臨床徴候又は状態の全体又は部分的な軽減（すなわち、抑制）、又は疾患に対する個体の全体又は部分的な免疫を生じる場合、疾患を予防又は軽減するという。
【００８６】
弱毒化されたウイルス及び１又は２以上の他の単離ウイルス、１又は２以上のその単離ウイルスタンパク質、１又は２以上のそのウイルスタンパク質をコードする１又は２以上の単離核酸分子、又はそれらの組み合わせを含む、本発明の少なくとも１つのインフルエンザウイルスを有する組成物は、目的を達成する任意の手段によって投与することができる。
【００８７】
例えば、これらの組成物の投与は、例えば皮下、静脈内、皮内、筋肉内、腹腔内、鼻腔内、経口又は経皮経路などの様々な非経口経路によって行うことができる。非経口投与は、急速静注又は時間をかけた灌流によって達成することができる。
【００８８】
インフルエンザウイルスの関連症状を予防、抑制、又は治療するための典型的な投与計画は、１週〜約２４月、又はそれら中の任意の範囲又は値まで及びその期間中、単回治療として投与される、又は増強又は追加投与として反復される、本明細書のワクチン組成物の有効量の投与を含む。
【００８９】
本発明によれば、組成物の「有効量」は、目的の効果を達成するのに十分な量である。効果的な用量は、レシピエントの種、年齢、性別、健康、及び体重、併用する場合は併用治療の種類、処理頻度、及び所望の効果の性質次第とすることができると理解される。以下に供する有効量の範囲は、本発明の用量範囲を限定的に表すことを目的とするものではない。
【００９０】
例えば哺乳類の成体生物などの動物のための弱毒生又は死滅ウイルスワクチンの用量は、約１０２〜１０１５、例えば、１０３〜１０１２のプラーク形成単位（ＰＦＵ）／ｋｇ、又はその中のいずれかの範囲とすることができる。不活化ワクチンの用量は、約０．１〜１０００、例えば、３０〜１００  μｇのＨＡタンパク質とすることができる。しかしながら、用量は、現存のワクチンをスタートとし使用して、通常の方法によって決定される安全且つ有効な量とすべきである。
【００９１】
複製されたウイルスワクチンの各用量中の免疫反応性ＨＡの用量は、適した用量、例えば、３０〜１００  μｇ又はこの中の任意の範囲又は値を含有するよう、又は政府機関又は認可された専門機関によって推奨される量に標準化することができる。ＮＡの量もまた、標準化することができるが、この糖タンパク質は精製及び保存中不安定となり得る。
【００９２】
複製されたウイルスワクチンの各用量中の免疫反応ＨＡの用量は、適量、例えば、１〜５０  μｇ又はこの中の任意の範囲又は値、Ｕ．Ｓ．  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ（ＰＨＳ）に推奨される量を含有するよう標準化することができ、通常、年長児（３歳以上）に対して成分あたり１５  μｇ、及び３歳未満の小児に対して７．５  μｇである。ＮＡの量もまた、標準化することができるが、プロセッサ精製及び保存中はこの糖タンパク質は不安定となり得る（Ｋｅｎｄａｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８０；Ｋｅｒｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９７５）。ワクチンの０．５−ｍｌの用量は各々、約１０〜５００億のウイルス粒子、好ましくは１００億個の粒子を含み得る。
【００９３】
本発明を、以下の非限定的実施例によって説明する。
【実施例】
【００９４】
実施例１
方法
細胞及びウイルス
２９３Ｔヒト胚腎臓細胞を、ダルベッコ変法イーグル最小基本培地（ＤＭＥＭ）中で、１０％胎仔の仔ウシ血清及び抗生物質で維持する。５％新生仔の仔ウシ血清及び抗生物質のＭＥＭ中で、メイディンダービーイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞を成長させる。ヒトのワクチン製造における使用のためのバイオセイフティー試験後に確立されたアフリカミドリザルベロＷＣＢ細胞（Ｓｕｇａｗａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２）を、抗生物質を含む血清非含有ＶＰ−ＳＦＭ培地（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）で維持する。細胞を５％  ＣＯ２中、３７℃で維持する。ＷＨＯ推奨のワクチンシードウイルスはＮＩＢＲＧ−１４である。
【００９５】
プラスミドの作成及びリバースジェネティクス
インフルエンザＡウイルスの再集合体を生成するために、プラスミドに基づいてリバースジェネティクス（Ｎｅｕｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９）を使用する。ヒトポリメラーゼＩプロモーター及びマウスＲＮＡポリメラーゼＩターミネーター（ＰｏｌＩプラスミド）の制御下で、全長ｃＤＮＡをプラスミド中にクローン化した。
【００９６】
Ａ／ＷＳＮ／３３（Ｈ５Ｎ１；ＷＳＮ）又はＰＲ８  株に由来する予め生成された一連のＰｏｌＩコンストラクトを、リバースジェネティクスに使用する（Ｈｏｒｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６；Ｎｅｕｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９）。世界保健機関（ＷＨＯ）はＡ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４（Ｈ１Ｎ１；ＰＲ８）を、ヒトにおけるその安全性のためドナーウイルスとして推奨する（Ｗｏｏｄ  ＆  Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，  ２００４；Ｗｅｂｂｙ  ＆  Ｗｅｂｓｔｅｒ，  ２００３）。
【００９７】
ニワトリアクチン、例えば、ベータアクチン、プロモーターの制御下でＷＳＮ又はＰＲ８  ＮＰ、ＰＡ、ＰＢ１、又はＰＢ２を発現するプラスミドを、全リバースジェネティクス実験のために使用する（Ｈｏｒｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６；Ｎｅｕｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９）。つまり、ＰｏｌＩプラスミド及びタンパク質発現プラスミドを、形質移入試薬、Ｔｒａｎｓ−ＩＴ  ２９３Ｔ（Ｐａｎｖｅｒａ）と混合し、室温で１５分間インキュベートし、続いて２９３Ｔ細胞に添加する。形質移入細胞をＯｐｔｉ−ＭＥＭＩ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）において４８時間インキュベートする。ベロＷＣＢ細胞におけるリバースジェネティクスのために、エレクトロポレーター（Ａｍａｘａ）を使用して、製造者の指示に従ってプラスミド混合物を形質移入する。形質移入の１６時間後、フレッシュに調製したベロＷＣＢ細胞を形質移入細胞に添加し、６時間後にＴＰＣＫ−トリプシン（１ｇ／ｍＬ）を培養物に添加する。形質移入細胞を血清非含有ＶＰ−ＳＦＭ中で合計４日間インキュベートする。感染性ウイルス含有の上清を回収し、限界希釈によって生物学的に（ｂｅｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ）クローン化することができる。
【００９８】
Ａ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／２１３／２００３（Ｈ５Ｎ１）由来のＨＡ及びＮＡ遺伝子及びその他の残部はＵＷ−ＰＲ８  由来のＡ型インフルエンザウイルスの遺伝子を有する組換えウイルスを調製した。組換えウイルスの力価は、１０１０．６７  ＥＩＤ５０／ｍＬであり、ＨＡの力価は１：１６００であった。
【００９９】
【表１】
2020010711.tif 000003
【０１００】
ＰＲ８（ＵＷ）遺伝子の配列は、次の通りである：
【化１】
2020010711.tif 000004
【０１０１】
【化２】
2020010711.tif 000005
【０１０２】
【化３】
2020010711.tif 000006
【０１０３】
【化４】
2020010711.tif 000007
【０１０４】
【化５】
2020010711.tif 000008
【０１０５】
【化６】
2020010711.tif 000009
【０１０６】
【化７】
2020010711.tif 000010
【０１０７】
【化８】
2020010711.tif 000011
【０１０８】
高力価Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１，  ＵＷ−ＰＲ８  ）ウイルスは卵中で、他のＡ／ＰＲ／８／３４  ＰＲ８株より１０倍良好に成長する（１０１０  ＥＩＤ５０／ｍＬ；ＨＡ力価：１：８，０００）。従って、ＵＷ−ＰＲ８  のＨＡ及びＮＡ遺伝子の、インフルエンザウイルスの現在流通の株のものとの置換は、安全に生成され得るワクチン株を生じ、マスターワクチン株としてのＵＷ−ＰＲ８  の使用を確証する。
【０１０９】
ＮＩＢＲＧ−１４  ワクチン株の非ＨＡ  及び  非ＮＡ遺伝子（図  １）を供する、ＵＷ−ＰＲ８  とＰＲ８（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）との間の異なる成長特性に寄与する遺伝子を測定した。内部遺伝子の大部分がＵＷ−ＰＲ８  に由来する場合、卵中で高い力価が得られた。最も高い力価は、ＵＷ−ＰＲ８  のＭ遺伝子セグメント及びＰＲ８（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）のＮＳ遺伝子を有するものであった。ＵＷ−ＰＲ８  のＮＳ遺伝子は、Ｋ（リジン）を残基５５に有し、一方ＰＲ８（Ｃａｍ）のＮＳ遺伝子は、Ｅ（グルタミン酸）を有する。ポリメラーゼサブユニット（ＰＡ、ＰＢ１、及びＰＢ２）及びＵＷ−ＰＲ８  のＮＰ遺伝子は、Ｈ５Ｎ１ワクチンシードウイルスの成長をニワトリ孵化卵中で増強し、ＰＲ８（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）のＮＳ遺伝子は、ニワトリ孵化卵中でＨ５Ｎ１ワクチンシードウイルスの成長を増強した。ＵＷ−ＰＲ８  のＰＢ２における３６０位のチロシン（Ｙ）は、おそらくＭＤＣＫ細胞におけるそのウイルスの高成長速度に寄与する。
【０１１０】
実施例２
特定の宿主細胞におけるワクチンウイルスの成長のための高収率Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１；ＰＲ８）ウイルスバックボーンを開発するために、ＰＲ８（ＨＧ）（ＰＲ８ＵＷ）の内部遺伝子のランダム変異導入を実施した。エラープローンＰＣＲによってランダム変異をＵＷ−ＰＲ８（実施例１）の内部遺伝子の中に導入し、その後、ランダム変異を個々のＵＷ−ＰＲ８内部遺伝子の中に有しているプラスミドライブラリを調製した。次に、Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／ＮＣ／０９（Ｈ５Ｎ１）ウイルス（表１）の他の野性型内部遺伝子、ＮＡ、及び「解毒化」ＨＡ遺伝子と共に、個々のＵＷ−ＰＲ８内部遺伝子の中にランダム変異を有するウイルスライブラリ（ＰＲ８／Ｈ５Ｎ１）を作り出して、「６＋２」組換えウイルスを作り出した。ＭＤＣＫ細胞内でのウイルスの連続継代を、高成長特性を有する変異株を選択するために利用した。
【０１１１】
【表２】
2020010711.tif 000012
【０１１２】
ウイルスライブラリを、ＭＤＣＫ細胞内で１２回継代するか、又は２回の継代後に、そのライブラリを混合し、そして、もう１０回の継代を実施した（図２）。
ＭＤＣＫ細胞内での１０〜約１２回の連続継代後に、プラークアッセイを実施し、１４００個を超える個々のプラークを選び出した。図３は、様々なＨＡ力価を有するクローンの数を示す。成長促進変異は：ＰＢ２：Ｍ２０２Ｌ、Ｆ３２３Ｌ、Ｉ５０４Ｖ、ＰＢ１：Ｅ１１２Ｇ、Ｖ６４４Ａ、ＮＰ：Ｒ７４Ｋ、Ｎ４１７Ｄ、Ｉ１１６Ｌ、及びＮＳ：Ｓ１６１Ｔを含んでいた。図４は、選択的変異から作り出された組換えウイルスの力価を示す。ランダム変異導入ライブラリからの最も高いＨＡ力価を有する３６個のウイルスの配列を決定した（表２）。
【０１１３】
【表３】
2020010711.tif 000013
【表４】
2020010711.tif 000014
【０１１４】
第二のアプローチでは、文献に記載されている成長を促進する潜在的変異を、ＵＷ−ＰＲ８ウイルスのバックグラウンド（ウイルスストック力価に関して表３を参照）に導入し、そして、複製能力について試験した。図５Ａ〜Ｄは、様々なウイルスの成長曲線を示す。
【０１１５】
【表５】
2020010711.tif 000015
【０１１６】
第三のアプローチでは、アプローチ１及び２からの候補株を組み合わせ、そして、ＨＡ力価及びＰＦＵ／ｍＬを測定した（表４）。
【０１１７】
【表６】
2020010711.tif 000016
【表７】
2020010711.tif 000017
【０１１８】
表４に示したように、＃１、＃４、＃３６、＃３８、Ｐ１７、Ｐ１６、及びＰ６１などの野性型より良好に複製したいくつかの組換えウイルスを同定した。これらのウイルスの成長特性を同定するために、ＭＤＣＫ細胞内での成長速度を測定した（図７）。１つの候補株について、ショ糖勾配によりウイルスを精製し、そして、ＨＡ含有量及びウイルス総タンパク質を評価した。図８Ａは、野性型（ＵＷ−ＰＲ８）及び＃４に関するＨＡ力価を示し、図８Ｂは、野性型（ＵＷ−ＰＲ８）及び＃４に関するウイルスタンパク質を示し、そして、図８Ｃは、野性型（ＵＷ−ＰＲ８）及び＃４に関するウイルスタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析である。更なる分析により、Ｍ１のＶ９７Ａ／Ｙ１００Ｈ変異を有するウイルスは、親ウイルスより高いＨＡ力価を生じるが、ウイルス力価は低いことが実証された（図９Ａ〜Ｂを参照）。Ｍ１のＶ９７Ａ／Ｙ１００Ｈ変異は、より多くのＨＡタンパク質が組み込まれ得るより大きな表面積の粒子をもたらし得る。不活化インフルエンザウイルスはそれらのＨＡ含有量に基づいて投与されるので、高いＨＡ含有量を有する変異株は魅力的なワクチン候補株である。
【０１１９】
複製促進をもたらすインフルエンザプロモーター領域の変異を同定するために、８つのｖＲＮＡセグメントすべての３’末端の４位に「Ｕ」を有するウイルスを、ＵＷ−ＰＲ８のＰＡ、ＰＢ１、及びＰＢ２の内部遺伝子で調製した（ＵＷ−ＰＲ８のＰＢ２、ＰＢ１、及びＰＡセグメントは４位に「Ｃ」を有する）。得られたウイルスの成長曲線を、図１１Ｃに示す。
プロモーター変異とアミノ酸変化との組み合わせを有するウイルスを調製し、そして、力価を測定した（表５）。
【０１２０】
【表８】
2020010711.tif 000018
【０１２１】
コドン利用最適化もおこなった。コドンの改変は、タンパク質の発現を増強し得るが、ＲＮＡの構造及び安定性も変更する場合がある。例えば、ＰＢ２遺伝子セグメントのコドン利用最適化は、イヌ細胞（ＭＤＣＫ細胞がイヌ起源のものなので）（図１０Ａ）のコドン利用を反映するようにおこなったが、残った（ｖＲＮＡの５’及び３’末端に位置する）パッケージングシグナルは変化がなかった。あるアプローチでは、コドン最適化を、ＰＢ２遺伝子（図１０Ｃ）の「内部」領域のすべてのコドンについておこない、そして、別のアプローチでは、コドン最適化を（所定のアミノ酸に関して最も頻繁に使用されるコドンと比較して、著しく低い頻度でしか使用されない）いわゆる「希少」コドンについておこなった（図１０Ｂ）（図１０Ｆの配列番号２５を参照）。「Ｇｒａｐｈｉｃａｌ  Ｃｏｄｏｎ  Ｕｓａｇｅ  Ａｎａｌｙｓｅｒ」（ｗｗｗ．ｇｃｕａ．ｄｅ）を使用して分析を実施した。それらのウイルスの力価を、表６に示す（図１０Ｂ〜Ｃも参照）。
【０１２２】
【表９】
2020010711.tif 000019
【０１２３】
ＰＢ２の希少コドンの最適化は、野生型ウイルス（ＵＷ−ＰＲ８）と比較して、力価の増強をもたらした（図１０Ｄを参照）。他の遺伝子セグメントをコドン最適化し、そして、それらのセグメント又は最適化セグメントの組み合わせを有するウイルスの力価を測定した（図１０Ｅ）。
ＭＤＣＫ細胞内でのウイルス力価を増強する別のアプローチでは、キメラＨＡ及びＮＡ遺伝子を調製し（図１３Ａ）、そして、それらの遺伝子を有するウイルスの力価を測定した（図１３Ｂ）。
【０１２４】
上記の変異（高成長バックボーン変異、プロモーター変異、キメラＨＡ及びＮＡ遺伝子、及びイヌコドン最適化）の組み合わせを有するウイルスを調製し、そして、それらのウイルスの成長速度、ＰＦＵ、及びＨＡ力価を測定した（図１４を参照）。代表的なバックボーン変異は、イヌコドンｏｐｔｉ−ＰＢ２＋Ｃ４Ｕ＋Ｍ２０２Ｌ、Ｆ３２３Ｌ；ＰＢ１：Ｃ４Ｕ＋Ｑ２４７Ｈ；ＰＡ：Ｃ４Ｕ＋Ｋ１４２Ｎ；ＮＰ：イヌコドンｏｐｔｉ−ＮＰ＋Ｒ７４Ｋ；Ｍ：Ｖ９７Ａ、Ｙ１００Ｈ；及びＮＳ：Ｋ５５Ｅである。
本明細書中に記載した任意の変異又はそれらの任意の組み合わせが、例えば、季節性Ｈ１Ｎ１及びＨ３Ｎ２、Ｈ３Ｎ２変異株、ＰｄｍＨ１Ｎ１、Ｈ５Ｎ１、Ｈ７Ｎ９若しくはＨ９Ｎ２、又は他の分岐群若しくは候補ワクチン株と組み合わせられてもよい。例えば、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９（ｐｄｍ  Ｈ１Ｎ１）由来のＨＡ及びＮＡ遺伝子を、ＵＷ−ＰＲ／８の６つの内部遺伝子と組み合わせて、「６＋２」組換えウイルスを作り出した。１１のウイルスライブラリを作製し、卵内で１０回継代した。３段階の限界希釈をおこなって、高成長変異株をスクリーニングした（図１５）。一実施形態において、ＭＤＣＫ細胞内で高成長特性を有する変異株は、プロモーター変異（Ｃ４Ｕ）と（親ウイルスに対する）Ｉ５０４Ｖをもたらす変異を有するＰＢ２遺伝子セグメント；プロモーター変異（Ｃ４Ｕ）とＥ１１２Ｇをもたらす変異を有するＰＢ１遺伝子セグメント；プロモーター変異（Ｃ４Ｕ）とＳ２２５Ｃをもたらす変異を有するＰＡ遺伝子セグメント；Ｒ７４Ｋ及びＮ４１７Ｄをもたらす変異を有するＮＰ遺伝子セグメント；Ｖ９７Ａ及びＹ１００Ｈをもたらす変異を有するＭ遺伝子セグメント；並びにＫ５５Ｅをもたらす変異を有するＮＳ遺伝子セグメントを有し、ここで、任意には、１若しくは複数の遺伝子セグメントの配列、例えば、ＮＰ遺伝子セグメントは、最適化されたイヌコドンを含むように改変される。一実施形態において、ＭＤＣＫ細胞内で高成長特性を有する変異株は、変異のプロモーター変異（Ｃ４Ｕ）及びＭ２０２Ｌ及びＦ３２３Ｌをもたらす変異を有するイヌコドン最適化ＰＢ２遺伝子セグメント；プロモーター変異（Ｃ４Ｕ）とＱ２４７Ｈをもたらす変異を有するＰＢ１遺伝子セグメント；プロモーター変異（Ｃ４Ｕ）とＫ１４２Ｎをもたらす変異を有するＰＡ遺伝子セグメント；Ｒ７４Ｋをもたらす変異を有するイヌコドン最適化ＮＰ遺伝子セグメント；Ｖ９７Ａ及びＹ１００Ｈをもたらす変異を有するＭ遺伝子セグメント；並びにＫ５５Ｅをもたらす変異を有するＮＳ遺伝子セグメントを有する。
【０１２５】
同様の実験を、ＭＤＣＫ細胞内での高い複製特性を有するクローンを使用して、ベロ細胞において、例えば、ベロ細胞内での約３〜５回の継代後に実施した（図１６を参照）。図１７は、ベロ細胞内で高い複製特性を有する可能性がある５つのウイルスを示す。一実施形態において、ベロ細胞内で高成長特性を有するＰＲ８（ＵＷ）変異株は、ＰＲ８（ＵＷ）ウイルスの複製能力を増強するのに様々な組み合わせで使用し得る、以下の変異：ＰＢ２セグメント：Ｃ４Ｕ（プロモーター変異）、Ｉ５０４Ｖ（アミノ酸変化）；ＰＢ１セグメント：Ｃ４Ｕ（プロモーター変異）；Ｍ４０Ｌ（アミノ酸変化）、Ｇ１８０Ｗ（アミノ酸変化）；ＰＡセグメント：Ｃ４Ｕ（プロモーター変異）、Ｒ４０１Ｋ（アミノ酸変化）；ＮＰセグメント：Ｉ１１６Ｌ（アミノ酸変化）；ＮＳセグメント：Ａ３０Ｐ（ＮＳ１のアミノ酸変化）、又はＲ１１８Ｋ（ＮＳ１のアミノ酸変化）、を有する。
【０１２６】
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【０１２７】
全出版物、特許及び特許出願は、参照により本明細書に組み込まれる。前記明細書中で、本発明は特定の好適な実施形態に関して記載され、多くのことが説明の目的で詳細に説明されるが、発明はさらなる実施形態に適応でき、発明の基本原理を逸脱することなく本明細書に記載の詳細の一部は相当に変更可能であることは当業者に明らかであろう。
【図１Ａ】
2020010711.tif 000020
【図１Ｂ】
2020010711.tif 000021
【図１Ｃ】
2020010711.tif 000022
【図２】
2020010711.tif 000023
【図３】
2020010711.tif 000024
【図４】
2020010711.tif 000025
【図５Ａ】
2020010711.tif 000026
【図５Ｂ】
2020010711.tif 000027
【図５Ｃ】
2020010711.tif 000028
【図５Ｄ】
2020010711.tif 000029
【図６】
2020010711.tif 000030
【図７Ａ】
2020010711.tif 000031
【図７Ｂ】
2020010711.tif 000032
【図８Ａ−Ｂ】
2020010711.tif 000033
【図８Ｃ】
2020010711.tif 000034
【図９Ａ】
2020010711.tif 000035
【図９Ｂ】
2020010711.tif 000036
【図１０Ａ】
2020010711.tif 000037
【図１０Ｂ】
2020010711.tif 000038
【図１０Ｃ】
2020010711.tif 000039
【図１０Ｄ】
2020010711.tif 000040
【図１０Ｅ】
2020010711.tif 000041
【図１０Ｆ】
2020010711.tif 000042
【図１０Ｇ】
2020010711.tif 000043
【図１０Ｈ】
2020010711.tif 000044
【図１０Ｉ】
2020010711.tif 000045
【図１０Ｊ】
2020010711.tif 000046
【図１０Ｋ】
2020010711.tif 000047
【図１０Ｌ】
2020010711.tif 000048
【図１０Ｍ】
2020010711.tif 000049
【図１１Ａ】
2020010711.tif 000050
【図１１Ｂ】
2020010711.tif 000051
【図１１Ｃ】
2020010711.tif 000052
【図１２Ａ】
2020010711.tif 000053
【図１２Ｂ】
2020010711.tif 000054
【図１２Ｃ】
2020010711.tif 000055
【図１３Ａ】
2020010711.tif 000056
【図１３Ｂ】
2020010711.tif 000057
【図１４Ａ】
2020010711.tif 000058
【図１４Ｂ】
2020010711.tif 000059
【図１５】
2020010711.tif 000060
【図１６】
2020010711.tif 000061
【図１７】
2020010711.tif 000062
【図１８Ａ】
2020010711.tif 000063
【図１８Ｂ】
2020010711.tif 000064
【配列表】
2020010711000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年10月21日(2019.10.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４１】
【図１Ａ】ＰＲ８（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１０〜１５）。
【図１Ｂ】ＰＲ８（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１０〜１５）。
【図１Ｃ】ＰＲ８（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１０〜１５）。
【図２】ライブラリ継代の概略と高収率候補の識別。
【図３】特定のＨＡ力価を有するランダム変異を伴うクローン数。
【図４】選択的変異を有するクローンの力価。
【図５Ａ】ＰＢ２（Ａ）ＰＢ１（Ｂ）、ＰＡ（Ｃ）、ＮＰ、Ｍ又はＮＳ１（Ｄ）において以前に同定された変異を有するＵＷ−ＰＲ８ウイルスの成長曲線。
【図５Ｂ】ＰＢ２（Ａ）ＰＢ１（Ｂ）、ＰＡ（Ｃ）、ＮＰ、Ｍ又はＮＳ１（Ｄ）において以前に同定された変異を有するＵＷ−ＰＲ８ウイルスの成長曲線。
【図５Ｃ】ＰＢ２（Ａ）ＰＢ１（Ｂ）、ＰＡ（Ｃ）、ＮＰ、Ｍ又はＮＳ１（Ｄ）において以前に同定された変異を有するＵＷ−ＰＲ８ウイルスの成長曲線。
【図５Ｄ】ＰＢ２（Ａ）ＰＢ１（Ｂ）、ＰＡ（Ｃ）、ＮＰ、Ｍ又はＮＳ１（Ｄ）において以前に同定された変異を有するＵＷ−ＰＲ８ウイルスの成長曲線。
【図６】ＭＤＣＫ細胞内で高い複製特性を付与する変異の概要。
【図７Ａ】Ａ）ＨＡ力価（２ｎ単位）及びウイルス力価（ＰＦＵ／ｍＬ単位）に関してウイルス株を試験した。Ｂ）ＭＤＣＫ細胞における成長曲線。
【図７Ｂ】Ａ）ＨＡ力価（２ｎ単位）及びウイルス力価（ＰＦＵ／ｍＬ単位）に関してウイルス株を試験した。Ｂ）ＭＤＣＫ細胞における成長曲線。
【図８Ａ−Ｂ】Ａ）野性型（ＵＷ−ＰＲ８）とクローン＃４のＨＡ力価。Ｂ）野性型（ＵＷ−ＰＲ８）と＃４のウイルスタンパク質。Ｃ）野性型及び＃４のウイルスタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。
【図８Ｃ】Ａ）野性型（ＵＷ−ＰＲ８）とクローン＃４のＨＡ力価。Ｂ）野性型（ＵＷ−ＰＲ８）と＃４のウイルスタンパク質。Ｃ）野性型及び＃４のウイルスタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。
【図９Ａ】Ａ）野生型ウイルス（ＵＷ−ＰＲ８）とＭ１に変異を有する高複製ウイルスとの力価の比較。Ｂ）野生型ウイルス（ＵＷ−ＰＲ８）及びＭ１に変異を有する高複製ウイルスの成長速度。
【図９Ｂ】Ａ）野生型ウイルス（ＵＷ−ＰＲ８）とＭ１に変異を有する高複製ウイルスとの力価の比較。Ｂ）野生型ウイルス（ＵＷ−ＰＲ８）及びＭ１に変異を有する高複製ウイルスの成長速度。
【図１０Ａ】Ａ）イヌのコドン利用表。Ｂ）野性型（ＵＷ−ＰＲ８）と「希少（ｒａｒｅ）」コドン最適化ＰＢ２ウイルスとの相対適応性。Ｃ）野性型（ＵＷ−ＰＲ８）と「全」コドン最適化ＰＢ２ウイルスとの相対適応性。Ｄ）ＰＢ２コドン最適化ウイルスの成長速度。Ｅ）コドン最適化ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ又はＮＰ遺伝子セグメント又はセグメントの組み合わせを有するウイルスの成長速度。Ｆ）ＵＷ−ＰＲ８のＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ及びＮＰ遺伝子セグメントの配列とＵＷ−ＰＲ８のイヌコドン利用最適化ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、及びＮＰ遺伝子セグメントの配列。
【図１０Ｂ】Ａ）イヌのコドン利用表。Ｂ）野性型（ＵＷ−ＰＲ８）と「希少（ｒａｒｅ）」コドン最適化ＰＢ２ウイルスとの相対適応性。Ｃ）野性型（ＵＷ−ＰＲ８）と「全」コドン最適化ＰＢ２ウイルスとの相対適応性。Ｄ）ＰＢ２コドン最適化ウイルスの成長速度。Ｅ）コドン最適化ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ又はＮＰ遺伝子セグメント又はセグメントの組み合わせを有するウイルスの成長速度。Ｆ）ＵＷ−ＰＲ８のＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ及びＮＰ遺伝子セグメントの配列とＵＷ−ＰＲ８のイヌコドン利用最適化ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、及びＮＰ遺伝子セグメントの配列。
【図１０Ｃ】Ａ）イヌのコドン利用表。Ｂ）野性型（ＵＷ−ＰＲ８）と「希少（ｒａｒｅ）」コドン最適化ＰＢ２ウイルスとの相対適応性。Ｃ）野性型（ＵＷ−ＰＲ８）と「全」コドン最適化ＰＢ２ウイルスとの相対適応性。Ｄ）ＰＢ２コドン最適化ウイルスの成長速度。Ｅ）コドン最適化ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ又はＮＰ遺伝子セグメント又はセグメントの組み合わせを有するウイルスの成長速度。Ｆ）ＵＷ−ＰＲ８のＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ及びＮＰ遺伝子セグメントの配列とＵＷ−ＰＲ８のイヌコドン利用最適化ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、及びＮＰ遺伝子セグメントの配列。
【図１０Ｄ】Ａ）イヌのコドン利用表。Ｂ）野性型（ＵＷ−ＰＲ８）と「希少（ｒａｒｅ）」コドン最適化ＰＢ２ウイルスとの相対適応性。Ｃ）野性型（ＵＷ−ＰＲ８）と「全」コドン最適化ＰＢ２ウイルスとの相対適応性。Ｄ）ＰＢ２コドン最適化ウイルスの成長速度。Ｅ）コドン最適化ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ又はＮＰ遺伝子セグメント又はセグメントの組み合わせを有するウイルスの成長速度。Ｆ）ＵＷ−ＰＲ８のＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ及びＮＰ遺伝子セグメントの配列とＵＷ−ＰＲ８のイヌコドン利用最適化ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、及びＮＰ遺伝子セグメントの配列。
【図１０Ｅ】Ａ）イヌのコドン利用表。Ｂ）野性型（ＵＷ−ＰＲ８）と「希少（ｒａｒｅ）」コドン最適化ＰＢ２ウイルスとの相対適応性。Ｃ）野性型（ＵＷ−ＰＲ８）と「全」コドン最適化ＰＢ２ウイルスとの相対適応性。Ｄ）ＰＢ２コドン最適化ウイルスの成長速度。Ｅ）コドン最適化ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ又はＮＰ遺伝子セグメント又はセグメントの組み合わせを有するウイルスの成長速度。Ｆ）ＵＷ−ＰＲ８のＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ及びＮＰ遺伝子セグメントの配列とＵＷ−ＰＲ８のイヌコドン利用最適化ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、及びＮＰ遺伝子セグメントの配列。
【図１０Ｆ】Ａ）イヌのコドン利用表。Ｂ）野性型（ＵＷ−ＰＲ８）と「希少（ｒａｒｅ）」コドン最適化ＰＢ２ウイルスとの相対適応性。Ｃ）野性型（ＵＷ−ＰＲ８）と「全」コドン最適化ＰＢ２ウイルスとの相対適応性。Ｄ）ＰＢ２コドン最適化ウイルスの成長速度。Ｅ）コドン最適化ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ又はＮＰ遺伝子セグメント又はセグメントの組み合わせを有するウイルスの成長速度。Ｆ）ＵＷ−ＰＲ８のＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ及びＮＰ遺伝子セグメントの配列（それぞれ、配列番号３、２、１、及び４）とＵＷ−ＰＲ８のイヌコドン利用最適化ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、及びＮＰ遺伝子セグメントの配列（それぞれ、配列番号２５、２６、２７及び２８）。
【図１０Ｇ】Ａ）イヌのコドン利用表。Ｂ）野性型（ＵＷ−ＰＲ８）と「希少（ｒａｒｅ）」コドン最適化ＰＢ２ウイルスとの相対適応性。Ｃ）野性型（ＵＷ−ＰＲ８）と「全」コドン最適化ＰＢ２ウイルスとの相対適応性。Ｄ）ＰＢ２コドン最適化ウイルスの成長速度。Ｅ）コドン最適化ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ又はＮＰ遺伝子セグメント又はセグメントの組み合わせを有するウイルスの成長速度。Ｆ）ＵＷ−ＰＲ８のＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ及びＮＰ遺伝子セグメントの配列（それぞれ、配列番号３、２、１、及び４）とＵＷ−ＰＲ８のイヌコドン利用最適化ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、及びＮＰ遺伝子セグメントの配列（それぞれ、配列番号２５、２６、２７及び２８）。
【図１０Ｈ】Ａ）イヌのコドン利用表。Ｂ）野性型（ＵＷ−ＰＲ８）と「希少（ｒａｒｅ）」コドン最適化ＰＢ２ウイルスとの相対適応性。Ｃ）野性型（ＵＷ−ＰＲ８）と「全」コドン最適化ＰＢ２ウイルスとの相対適応性。Ｄ）ＰＢ２コドン最適化ウイルスの成長速度。Ｅ）コドン最適化ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ又はＮＰ遺伝子セグメント又はセグメントの組み合わせを有するウイルスの成長速度。Ｆ）ＵＷ−ＰＲ８のＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ及びＮＰ遺伝子セグメントの配列（それぞれ、配列番号３、２、１、及び４）とＵＷ−ＰＲ８のイヌコドン利用最適化ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、及びＮＰ遺伝子セグメントの配列（それぞれ、配列番号２５、２６、２７及び２８）。
【図１０Ｉ】Ａ）イヌのコドン利用表。Ｂ）野性型（ＵＷ−ＰＲ８）と「希少（ｒａｒｅ）」コドン最適化ＰＢ２ウイルスとの相対適応性。Ｃ）野性型（ＵＷ−ＰＲ８）と「全」コドン最適化ＰＢ２ウイルスとの相対適応性。Ｄ）ＰＢ２コドン最適化ウイルスの成長速度。Ｅ）コドン最適化ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ又はＮＰ遺伝子セグメント又はセグメントの組み合わせを有するウイルスの成長速度。Ｆ）ＵＷ−ＰＲ８のＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ及びＮＰ遺伝子セグメントの配列（それぞれ、配列番号３、２、１、及び４）とＵＷ−ＰＲ８のイヌコドン利用最適化ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、及びＮＰ遺伝子セグメントの配列（それぞれ、配列番号２５、２６、２７及び２８）。
【図１０Ｊ】Ａ）イヌのコドン利用表。Ｂ）野性型（ＵＷ−ＰＲ８）と「希少（ｒａｒｅ）」コドン最適化ＰＢ２ウイルスとの相対適応性。Ｃ）野性型（ＵＷ−ＰＲ８）と「全」コドン最適化ＰＢ２ウイルスとの相対適応性。Ｄ）ＰＢ２コドン最適化ウイルスの成長速度。Ｅ）コドン最適化ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ又はＮＰ遺伝子セグメント又はセグメントの組み合わせを有するウイルスの成長速度。Ｆ）ＵＷ−ＰＲ８のＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ及びＮＰ遺伝子セグメントの配列（それぞれ、配列番号３、２、１、及び４）とＵＷ−ＰＲ８のイヌコドン利用最適化ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、及びＮＰ遺伝子セグメントの配列（それぞれ、配列番号２５、２６、２７及び２８）。
【図１０Ｋ】Ａ）イヌのコドン利用表。Ｂ）野性型（ＵＷ−ＰＲ８）と「希少（ｒａｒｅ）」コドン最適化ＰＢ２ウイルスとの相対適応性。Ｃ）野性型（ＵＷ−ＰＲ８）と「全」コドン最適化ＰＢ２ウイルスとの相対適応性。Ｄ）ＰＢ２コドン最適化ウイルスの成長速度。Ｅ）コドン最適化ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ又はＮＰ遺伝子セグメント又はセグメントの組み合わせを有するウイルスの成長速度。Ｆ）ＵＷ−ＰＲ８のＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ及びＮＰ遺伝子セグメントの配列（それぞれ、配列番号３、２、１、及び４）とＵＷ−ＰＲ８のイヌコドン利用最適化ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、及びＮＰ遺伝子セグメントの配列（それぞれ、配列番号２５、２６、２７及び２８）。
【図１０Ｌ】Ａ）イヌのコドン利用表。Ｂ）野性型（ＵＷ−ＰＲ８）と「希少（ｒａｒｅ）」コドン最適化ＰＢ２ウイルスとの相対適応性。Ｃ）野性型（ＵＷ−ＰＲ８）と「全」コドン最適化ＰＢ２ウイルスとの相対適応性。Ｄ）ＰＢ２コドン最適化ウイルスの成長速度。Ｅ）コドン最適化ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ又はＮＰ遺伝子セグメント又はセグメントの組み合わせを有するウイルスの成長速度。Ｆ）ＵＷ−ＰＲ８のＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ及びＮＰ遺伝子セグメントの配列（それぞれ、配列番号３、２、１、及び４）とＵＷ−ＰＲ８のイヌコドン利用最適化ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、及びＮＰ遺伝子セグメントの配列（それぞれ、配列番号２５、２６、２７及び２８）。
【図１０Ｍ】Ａ）イヌのコドン利用表。Ｂ）野性型（ＵＷ−ＰＲ８）と「希少（ｒａｒｅ）」コドン最適化ＰＢ２ウイルスとの相対適応性。Ｃ）野性型（ＵＷ−ＰＲ８）と「全」コドン最適化ＰＢ２ウイルスとの相対適応性。Ｄ）ＰＢ２コドン最適化ウイルスの成長速度。Ｅ）コドン最適化ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ又はＮＰ遺伝子セグメント又はセグメントの組み合わせを有するウイルスの成長速度。Ｆ）ＵＷ−ＰＲ８のＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ及びＮＰ遺伝子セグメントの配列（それぞれ、配列番号３、２、１、及び４）とＵＷ−ＰＲ８のイヌコドン利用最適化ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、及びＮＰ遺伝子セグメントの配列（それぞれ、配列番号２５、２６、２７及び２８）。
【図１１Ａ】Ａ）ＰＲ８及びＩｎｄｏ／ＮＣ／０９の各遺伝子のヌクレオチド４位。Ｂ）すべての３’Ｃ４Ｕ変異株。Ｃ）ＰＢ２、ＰＢ１、及びＰＡ遺伝子の４位に「Ｃ」をコードする組換えＵＷ−ＰＲ８ウイルス（黒色）及び８つのセグメントすべての４位に「Ｕ」をコードする変異株（赤）の成長速度。
【図１１Ｂ】Ａ）ＰＲ８及びＩｎｄｏ／ＮＣ／０９の各遺伝子のヌクレオチド４位。Ｂ）すべての３’Ｃ４Ｕ変異株。Ｃ）ＰＢ２、ＰＢ１、及びＰＡ遺伝子の４位に「Ｃ」をコードする組換えＵＷ−ＰＲ８ウイルス（黒色）及び８つのセグメントすべての４位に「Ｕ」をコードする変異株（赤）の成長速度。
【図１１Ｃ】Ａ）ＰＲ８及びＩｎｄｏ／ＮＣ／０９の各遺伝子のヌクレオチド４位。Ｂ）すべての３’Ｃ４Ｕ変異株。Ｃ）ＰＢ２、ＰＢ１、及びＰＡ遺伝子の４位に「Ｃ」をコードする組換えＵＷ−ＰＲ８ウイルス（黒色）及び８つのセグメントすべての４位に「Ｕ」をコードする変異株（赤）の成長速度。
【図１２Ａ】ワクチン向けの高力価インフルエンザウイルスを提供するのに有効な、本明細書中に開示した内部遺伝子セグメント配列と共に使用するための代表的な配列であるＨ７及びＮ９のヌクレオチド及びアミノ酸配列。
【図１２Ｂ】ワクチン向けの高力価インフルエンザウイルスを提供するのに有効な、本明細書中に開示した内部遺伝子セグメント配列と共に使用するための代表的な配列であるＨ７及びＮ９のヌクレオチド及びアミノ酸配列。
【図１２Ｃ】ワクチン向けの高力価インフルエンザウイルスを提供するのに有効な、本明細書中に開示した内部遺伝子セグメント配列と共に使用するための代表的な配列であるＨ７及びＮ９のヌクレオチド及びアミノ酸配列。
【図１３Ａ】Ａ）ウイルス力価を増強するキメラＨＡ及びＮＡ遺伝子の図解。Ｂ）キメラウイルスの成長速度。
【図１３Ｂ】Ａ）ウイルス力価を増強するキメラＨＡ及びＮＡ遺伝子の図解。Ｂ）キメラウイルスの成長速度。
【図１４Ａ】Ａ）変異の組み合わせを有するウイルスの成長速度。Ｂ）変異の組み合わせを有するウイルスのＰＦＵ及びＨＡ力価。
【図１４Ｂ】Ａ）変異の組み合わせを有するウイルスの成長速度。Ｂ）変異の組み合わせを有するウイルスのＰＦＵ及びＨＡ力価。
【図１５】卵におけるスクリーニング。
【図１６】ベロ細胞から単離された２１６個のクローンのＨＡ力価。
【図１７】異なるＰＲ８バックボーン変異を用いて作出した組換えウイルス。
【図１８Ａ】ＭＤＣＫ細胞及びベロ細胞内で成長促進があるウイルス作出の概略。
【図１８Ｂ】ＭＤＣＫ細胞及びベロ細胞内で成長促進があるウイルス作出の概略。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一のインフルエンザワクチンウイルス単離株由来のＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＮＰ、ＮＳ、及びＭウイルスセグメント、異種又はキメラインフルエンザウイルスＮＡウイルスセグメント、並びに異種又はキメラＨＡウイルスセグメントを有する単離組換えインフルエンザＡウイルスであって、ここで、該ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、及びＮＳウイルスセグメントのうちの２以上は、ＰＡにおける１０５Ｃ、及び／又は４０１Ｋ；ＰＢ１における４０Ｌ及び１８０Ｗ、及び／又は１１２Ｇ、及び／又は２４７Ｈ、及び／又は６４４Ａ；ＰＢ２における２０２Ｌ及び３２３Ｌ、及び／又は５０４Ｖ；或いはＮＳ１における３０Ｐ、及び／又は１６１Ｔを有し、ここで組換えインフルエンザＡウイルスが、ＵＷ−ＰＲ８に対して増大された複製を有する、前記単離組換えインフルエンザウイルス。
【請求項２】
ＰＢ１に６４４Ａを有し；ＰＢ２に１若しくは複数の２０２Ｌ、３２３Ｌ又は５０４Ｖを有し；ＮＰに１若しくは複数の７４Ｋ及び４１７Ｄ、又は１１７Ｌを有し；又はそれらの組み合わせを有し；或いは
ＰＢ２に２０２Ｌ及び３２３Ｌ、ＮＰに７４Ｋ及び４１７Ｄ、そして場合によりＭ１に少なくとも１の９７Ａ及び／又は１００Ｈを有し；或いは
ＰＢ２に２０２Ｌ及び３２３Ｌ、及びＮＰに７４Ｋ及び４１７Ｄを有し；
或いはＰＢ２に２０２Ｌ及び３２３Ｌを有し、或いは
ＮＰに７４Ｋ及び４１７Ｄを有する、
請求項１に記載の単離ウイルス。
【請求項３】
ＰＢ１、ＰＢ２又はＰＡのいずれか１について、ウイルスセグメントの４位にＵを有する、請求項１又は２に記載の単離ウイルス。
【請求項４】
ＰＢ１に４０Ｉ、４０Ｌ、１１２Ｇ、１８０Ｗ、又は６４４Ａを有し；或いはＰＢ２に２０２Ｌ及び３２３Ｌを有し；或いはＮＰに７４Ｋ、４１７Ｄ、又は１１６Ｌを有し；或いはＮＳ１に３０Ｐ、又は１６１Ｔを有し；或いはＰＡに１０５Ｃ又は４０１Ｋを有する、請求項１又は２に記載の単離ウイルス。
【請求項５】
ＰＡに４０１Ｋ；又はＰＢ１に４０Ｌ及び／又は１８０Ｗ；又はＰＢ２に２０２Ｌ及び３２３Ｌ；又はＮＰに１１６Ｌを有する、請求項１に記載の単離ウイルス。
【請求項６】
ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＮＰ、ＮＳ、及びＭウイルスセグメントの少なくとも１が、C〜Uへのプロモーター変異を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の単離ウイルス。
【請求項７】
ＮＡウイルスセグメント及びＨＡウイルスセグメントが、同じインフルエンザウイルス単離株に由来する、請求項１〜６のいずれか一項に気シアノ単離ウイルス。
【請求項８】
前記組換えウイルスにおけるＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＮＰ、ＮＳ、及びＭウイルスセグメントが、以下の：
配列番号２によりコードされるアミノ酸配列を有するＰＢ１又は配列番号２によりコードされるＰＢ１に少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するＰＢ１；
配列番号３によりコードされるアミノ酸配列を有するＰＢ２又は配列番号３によりコードされるＰＢ２に少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するＰＢ２；
配列番号１によりコードされるアミノ酸配列を有するＰＡ又は配列番号１によりコードされるＰＡに少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するＰＡ；
配列番号４によりコードされるアミノ酸配列を有するＮＰ又は配列番号４によりコードされるＮＰに少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するＮＰ；
配列番号５によりコードされるアミノ酸配列を有するＭ又は配列番号５によりコードされるＭに少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するＭ；
配列番号６によりコードされるアミノ酸配列を有するＮＳ又は配列番号６によりコードされるＮＳに少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するＮＳ；
の少なくとも１についての配列を含むか；或いは
前記ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＮＰ、ＮＳ、及びＭウイルスセグメントが、以下の：
配列番号１０によりコードされるアミノ酸配列を有するＰＢ１又は配列番号１０によりコードされるＰＢ１に少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するＰＢ１；
配列番号１１によりコードされるアミノ酸配列を有するＰＢ２又は配列番号１１によりコードされるＰＢ２に少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するＰＢ２；
配列番号１２によりコードされるアミノ酸配列を有するＰＡ又は配列番号１２によりコードされるＰＡに少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するＰＡ；
配列番号１３によりコードされるアミノ酸配列を有するＮＰ又は配列番号１３によりコードされるＮＰに少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するＮＰ；
配列番号１４によりコードされるアミノ酸配列を有するＭ又は配列番号１４によりコードされるＭに少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するＭ；
配列番号１５によりコードされるアミノ酸配列を有するＮＳ又は配列番号１５によりコードされるＮＳに少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するＮＳ；
の少なくとも１についての配列を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の単離ウイルス。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の単離組換えウイルスを有するワクチン。
【請求項１０】
インフルエンザＡウイルスを製造する方法であって、細胞を、
転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＰＡ  ＤＮＡに作動可能に連結されたプロモーターを含むｖＲＮＡ産生のためのベクター、
転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスＰＢ１  ＤＮＡに作動可能に連結されたプロモーターを含むｖＲＮＡ産生のためのベクター、
転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスＰＢ２  ＤＮＡに作動可能に連結されたプロモーターを含むｖＲＮＡ産生のためのベクター、
転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＨＡ  ＤＮＡに作動可能に連結されたプロモーターを含むｖＲＮＡ産生のためのベクター、
転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスＮＰ  ＤＮＡに作動可能に連結されたプロモーターを含むｖＲＮＡ産生のためのベクター、
転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＮＡ  ＤＮＡに作動可能に連結されたプロモーターを含むｖＲＮＡ産生のためのベクター、
転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＭ  ＤＮＡに作動可能に連結されたプロモーターを含むｖＲＮＡ産生のためのベクター、及び
転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＮＳ  ＤＮＡに作動可能に連結されたプロモーターを含むｖＲＮＡ産生のためのベクターであって、ここでｖＲＮＡ産生のためのベクター内のＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、ＮＳ、及びＭ  ＤＮＡが、１若しくは複数のインフルエンザワクチンウイルス単離株に由来すると共に、ＮＡのｖＲＮＡ産生のためのベクター内のＮＡ  ＤＮＡが、異種ＮＡに関する配列を有し、ＨＡのｖＲＮＡ産生のためのベクター内のＨＡ  ＤＮＡが、異種ＨＡに関する配列を有し、ＰＡの１０５Ｃ、及び／又は４０１Ｋ；ＰＢ１の４０Ｌ及び１８０Ｗ、及び／又は１１２Ｇ、及び／又は２４７Ｈ、及び／又は６４４Ａ；ＰＢ２の２０２Ｌ及び３２３Ｌ、及び／又はＰＢ２の５０４Ｖ；ＮＳの３０Ｐ、及び／又は１６１Ｔ、ここで前記組換えインフルエンザＡウイルスがＵＷ−ＰＲ８に対して増加した複製を有し；そして
インフルエンザウイルスＰＡをコードするＤＮＡセグメントに作動可能に連結されたプロモーターを含むｍＲＮＡ産生用のベクター、
インフルエンザウイルスＰＢ１をコードするＤＮＡセグメントに作動可能に連結されたプロモーターを含むｍＲＮＡ産生用のベクター、
インフルエンザウイルスＰＢ２をコードするＤＮＡセグメントに作動可能に連結されたプロモーターを含むｍＲＮＡ産生用のベクター、及び
インフルエンザウイルスＮＰをコードするＤＮＡセグメントに作動可能に連結されたプロモーターを含むｍＲＮＡ産生用のベクター、並びに場合により
インフルエンザウイルスＨＡをコードするＤＮＡセグメントに作動可能に連結されたプロモーターを含むｍＲＮＡ産生用のベクター、
インフルエンザウイルスＮＡをコードするＤＮＡセグメントに作動可能に連結されたプロモーターを含むｍＲＮＡ産生用のベクター、
インフルエンザウイルスＭ１をコードするＤＮＡセグメントに作動可能に連結されたプロモーターを含むｍＲＮＡ産生用のベクター、
インフルエンザウイルスＭ２をコードするＤＮＡセグメントに作動可能に連結されたプロモーターを含むｍＲＮＡ産生用のベクター、
インフルエンザウイルスＮＳ２をコードするＤＮＡセグメントに作動可能に連結されたプロモーターを含むｍＲＮＡ産生用のベクターと、感染性インフルエンザウイルスを産生するために十分な量で接触させる工程を含む、前記方法。
【請求項１１】
前記細胞が、鳥細胞又は哺乳動物細胞、例えばベロ細胞、ヒト細胞又はＭＤＣＫ細胞である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ｖＲＮＡ産生用のベクターにおいて、前記ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、ＮＳ、及びＭのＤＮＡが、配列番号１〜６及び配列番号１０〜１５にコードされる対応するポリペプチドに少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードする、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
さらにウイルスを単離することを含む、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
少なくとも１のＰＡ、ＰＢ１又はＰＢ２ウイルスセグメントが、ＣからＵへのプロモーター変異を有する、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
ＰＢ２が、Ｃ４Ｕ及び５０４Ｖを含み；ＰＢ１がＣ４Ｕ、４０Ｌ及び１８０Ｗを含み；ＰＡがＣ４Ｕ及び４０１Ｋを含み；ＮＰが１１６Ｌを含み；及び／又はＮＳ１がＡ３０Ｐ又はＲ１１８Ｋを含む、請求項１に記載のウイルス又は請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
ＰＢ２が５０４Ｖを有し、及びＰＢ１が１１２Ｇを有し；或いはＰＢ２が５０４Ｖを有し、ＰＢ１が４０Ｌ及び１８０Ｗを有し；ＰＡが４０１Ｋを有し、及びＮＳが３０Ｐ又はＲ１１８Ｋを有し；或いはＰＢ２が、２０２Ｌ及び３２３Ｌを有し、そしてＰＢ１が２４７Ｈを有する、請求項１に記載の単離ウイルス。
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１０Ｆ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１０Ｆ】
2020010711.tif 000065
【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１０Ｇ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１０Ｇ】
2020010711.tif 000066
【手続補正５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１０Ｈ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１０Ｈ】
2020010711.tif 000067
【手続補正６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１０Ｉ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１０Ｉ】
2020010711.tif 000068
【手続補正７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１０Ｊ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１０Ｊ】
2020010711.tif 000069
【手続補正８】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１０Ｋ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１０Ｋ】
2020010711.tif 000070
【手続補正９】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１０Ｌ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１０Ｌ】
2020010711.tif 000071
【手続補正１０】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１０Ｍ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１０Ｍ】
2020010711.tif 000072
【外国語明細書】
2020010711000001.pdf