(57)【要約】【課題】グルコースからドーパミンを製造可能なドーパミン産生大腸菌を提供する。【解決手段】ｔｙｒＲ遺伝子座が、ｔｙｒＡｆｂｒ遺伝子、ａｒｏＧｆｂｒ遺伝子、ｔｋｔＡ遺伝子及びｐｐｓＡ遺伝子を含む第１発現カセットで置換され、ｔｙｒＲ遺伝子座以外の遺伝子座が、ＤＤＣ遺伝子、ｈｐａＢ遺伝子及びｈｐａＣ遺伝子を含む第２発現カセット、又はＤＤＣ遺伝子、ＰＣＤ遺伝子、ＤＨＰＲ遺伝子及びＴＨ遺伝子を含む第３発現カセットで置換されたドーパミン産生大腸菌である。【選択図】図１
2020129973.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｔｙｒＲ遺伝子座が、ｔｙｒＡｆｂｒ遺伝子、ａｒｏＧｆｂｒ遺伝子、ｔｋｔＡ遺伝子及びｐｐｓＡ遺伝子を含む第１発現カセットで置換され、
ｔｙｒＲ遺伝子座以外の遺伝子座が、ＤＤＣ遺伝子、ｈｐａＢ遺伝子及びｈｐａＣ遺伝子を含む第２発現カセット、又はＤＤＣ遺伝子、ＰＣＤ遺伝子、ＤＨＰＲ遺伝子及びＴＨ遺伝子を含む第３発現カセットで置換されたドーパミン産生大腸菌。
【請求項２】
前記ｔｙｒＲ遺伝子座以外の遺伝子座が前記第３発現カセットで置換され、前記第１発現カセットがｍｔｒＡ遺伝子、ＰＴＰＳ遺伝子、ＳＰＲ遺伝子及びＴＨ遺伝子を更に含む請求項１に記載のドーパミン産生大腸菌。
【請求項３】
前記ｔｙｒＲ遺伝子座以外の遺伝子座が、ｍａｎＸ遺伝子座及びａｓｃＦ遺伝子座の少なくとも一方である請求項１又は２に記載のドーパミン産生大腸菌。
【請求項４】
前記ＤＤＣ遺伝子が、シュードモナス・プチダ由来である請求項１から３のいずれか１項に記載のドーパミン産生大腸菌。
【請求項５】
前記ＴＨ遺伝子がドロソフィラ・メラノガスター由来である請求項１から４のいずれか１項に記載のドーパミン産生大腸菌。
【請求項６】
前記ｈｐａＢ遺伝子及びｈｐａＣ遺伝子がエシェリヒア・コリ由来である請求項１から４のいずれか１項に記載のドーパミン産生大腸菌。
【請求項７】
請求項１から６のいずれか１項に記載のドーパミン産生大腸菌を、グルコース及びグリセロールの少なくとも一方を含む培地中で培養することを含むドーパミンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ドーパミン産生大腸菌及びドーパミンの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ドーパミンは、中枢神経系に存在する神経伝達物質で、アドレナリン、ノルアドレナリン等の前駆体でもある。生体内でドーパミンはチロシンの水酸化で生合成されるＬ−ドーパを脱炭酸することにより産生される。ドーパミンの製造方法としては化学合成法が一般的であるが、微生物由来の芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼを用いてＬ−ドーパからドーパミンを製造する方法が知られている（例えば、特許文献１参照）。また、チロシンを過剰産生する組み替え大腸菌にチロシナーゼと芳香族アミノ酸デカルボシキラーゼを発現させることでドーパミンが産生できるとされている（例えば、非特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１１−１３０７４４号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２：３２６，２０１１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、グルコースからドーパミンを製造可能なドーパミン産生大腸菌を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
第一態様は、ｔｙｒＲ遺伝子座が、ｔｙｒＡｆｂｒ遺伝子、ａｒｏＧｆｂｒ遺伝子、ｔｋｔＡ遺伝子及びｐｐｓＡ遺伝子を含む第１発現カセットで置換され、ｔｙｒＲ遺伝子座以外の遺伝子座が、ＤＤＣ遺伝子、ｈｐａＢ遺伝子及びｈｐａＣ遺伝子を含む第２発現カセット、又はＤＤＣ遺伝子、ＰＣＤ遺伝子、ＤＨＰＲ遺伝子及びＴＨ遺伝子を含む第３発現カセットで置換されたドーパミン産生大腸菌である。
【０００７】
第二態様は、前記ドーパミン産生大腸菌を、グルコース及びグリセロールの少なくとも一方（以下、グルコース等ともいう）を含む培地中で培養することを含むドーパミンの製造方法である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、グルコースからドーパミンを製造可能なドーパミン産生大腸菌を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ドーパミン合成経路の概略を示す図である。
【図２】チロシン生産系遺伝子を含むプラスミドの構成を示す概略図である。
【図３】ドーパミン生産系遺伝子を含むプラスミドの構成を示す概略図である。
【図４】大腸菌変異体によるチロシン生産能を示すグラフである。
【図５】大腸菌変異体によるドーパミン生産能を示すグラフである。
【図６】大腸菌変異体によるドーパミン生産能を示すグラフである。
【図７】大腸菌変異体によるドーパミン生産能を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけではなく、他の工程と明確に区別できない場合であってもその工程の所期の目的が達成されれば、本用語に含まれる。以下、本発明の実施形態を詳細に説明する。ただし、以下に示す実施形態は、本発明の技術思想を具体化するための、ドーパミン産生大腸菌及びドーパミンの製造方法等を例示するものであって、本発明は、以下に示すドーパミン産生大腸菌及びドーパミンの製造方法等に限定されない。なお、本明細書に記載される各遺伝子は、それらがコードするタンパク質の酵素活性が維持される限り、それらと例えば７０％以上、好ましくは８０％以上、９０％以上又は９５％以上の相同性を有する塩基配列のＤＮＡであってもよい。また、各遺伝子は、それらの塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、各遺伝子がコードするタンパク質の酵素活性が維持されるタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。ここで相同性とは、２つのポリヌクレオチド間の配列の類似の程度を意味し、例えばＢＬＡＳＴＰ、ＦＡＳＴＡ等の配列解析ソフトウェアを用いて決定される。また、ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリダイゼーションのみが起こり、非特異的なハイブリダイゼーションが起きないような条件をいう。
【００１１】
本実施形態のドーパミン産生大腸菌は、そのゲノム中のｔｙｒＲ遺伝子座が、ｔｙｒＡｆｂｒ遺伝子、ａｒｏＧｆｂｒ遺伝子、ｔｋｔＡ遺伝子及びｐｐｓＡ遺伝子を含む第１発現カセットで置換されている。また、ゲノム中のｔｙｒＲ遺伝子座以外の遺伝子座が、ＤＤＣ遺伝子、ｈｐａＢ遺伝子及びｈｐａＣ遺伝子を含む第２発現カセット、又はＤＤＣ遺伝子、ＰＣＤ遺伝子、ＤＨＰＲ遺伝子及びＴＨ遺伝子を含む第３発現カセットで置換されている。
【００１２】
大腸菌ゲノムにおけるｔｙｒＲ遺伝子座が、チロシン生産を促進する酵素群をコードする第１発現カセットで置換され、更にｔｙｒＲ遺伝子とは別のゲノム中の遺伝子座がチロシンをドーパミンに変換する酵素群をコードする第２発現カセット又は第３発現カセットで置換されて、グルコース等を原料としてドーパミンを安定的に生産可能な大腸菌変異体が構成される。ドーパミンを生産するのに必要な酵素群をコードする遺伝子群をゲノム上に有することで、これらの遺伝子をプラスミド上に有する大腸菌に比べてドーパミンの生産効率が向上する。また、プラスミドによる大腸菌に対する負荷が軽減されて生産効率がより向上する。
【００１３】
第１発現カセットは、ｔｙｒＲ遺伝子の少なくとも一部を置換してｔｙｒＲ遺伝子座に挿入され、ｔｙｒＲ遺伝子はノックアウトされる。ｔｙｒＲ遺伝子は、大腸菌における芳香族アミノ酸の生合成及び輸送に関連するいくつかの転写単位を制御する調節タンパク質であるＴｙｒＲタンパク質をコードする非必須遺伝子である。例えば、ＴｙｒＲタンパク質は、シキミ酸経路関連遺伝子群のリプレッサーとして機能する。ｔｙｒＲ遺伝子がノックアウトされることで、例えば、フェニルアラニン生合成経路における重要な酵素の活性が向上して、効率的にチロシンが生産される。
【００１４】
第１発現カセットは、チロシン生産を促進する酵素群をコードする遺伝子群を少なくとも含み、必要に応じてその他の遺伝子群を更に含んでいてもよい。第１発現カセットに含まれるチロシン生産を促進する遺伝子群としては、ｔｙｒＡｆｂｒ遺伝子、ａｒｏＧｆｂｒ遺伝子、ｔｋｔＡ遺伝子及びｐｐｓＡ遺伝子が挙げられる。これらの遺伝子群がコードする酵素群によって、グルコース等を原料としてチロシンが過剰産生される。なお、これらの遺伝子群については、例えば、Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２：３２６，２０１１の記載を参照することができる。
【００１５】
ｔｙｒＡｆｂｒ遺伝子は、フィードバック阻害が抑制されたコリスメートムターゼ／プレフェネートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子である。ｔｙｒＡｆｂｒ遺伝子は、例えば、大腸菌Ｋ−１２ＭＧ１６５５株のｔｙｒＡ遺伝子において１５９番目のグアニンがチミンに置換され、更に１０６０番目のシトシンがチミンに、１０６１番目のチミンがグアニンに置換された変異遺伝子である。ｔｙｒＡｆｂｒ遺伝子によってコードされる酵素ＴｙｒＡｆｂｒにおいては５３番目のメチオニンがイソロイシンに、３５４番目のアラニンがバリンに変異して、フィードバック阻害が抑制されている。ＴｙｒＡｆｂｒ遺伝子は、例えば、配列番号１の塩基配列を有する。
【００１６】
ａｒｏＧｆｂｒ遺伝子は、フィードバック阻害が抑制された７−ホスホ−３−デオキシ−Ｄ−アラビノヘプツロソン酸（ＤＡＨＰ）合成酵素をコードする遺伝子である。ａｒｏＧｆｂｒ遺伝子は、例えば、大腸菌Ｋ−１２ＭＧ１６５５株のａｒｏＧ遺伝子において４３６番目のグアニンがアデニンに置換された変異遺伝子である。ａｒｏＧｆｂｒ遺伝子によってコードされる酵素ＡｒｏＧｆｂｒにおいては１４６番目のアスパラギン酸がアスパラギンに変異して、フィードバック阻害が抑制されている。ａｒｏＧｆｂｒ遺伝子は、例えば、配列番号２の塩基配列を有する。
【００１７】
ｔｙｒＲ遺伝子座に、ｔｙｒＡｆｂｒ遺伝子及びａｒｏＧｆｂｒ遺伝子が置換されることで、芳香族アミノ酸合成経路に含まれるシキミ酸経路が活性化される。
【００１８】
ｔｋｔＡ遺伝子は、トランスケトラーゼをコードする遺伝子である。ｔｋｔＡ遺伝子は、例えば、大腸菌Ｋ−１２ＭＧ１６５５株に由来し、例えば、配列番号３の塩基配列を有する。また、ｐｐｓＡ遺伝子は、ホスホエノールピルビン酸合成酵素をコードする遺伝子である。ｐｐｓＡ遺伝子は、例えば、大腸菌Ｋ−１２ＭＧ１６５５株に由来し、例えば、配列番号４の塩基配列を有する。これらの遺伝子がｔｙｒＲ遺伝子座に置換されることで、シキミ酸経路への原料供給が活性化される。
【００１９】
第１発現カセットは、Ｔ７プロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター等のプロモーター配列、Ｔ７ターミネーター等のターミネーター配列を更に含んでいてもよい。プロモーター配列は、例えば、各遺伝子の上流にそれぞれ含まれていてもよい。ターミネーター配列は所望のタンパク質をコードする遺伝子群の最下流に含まれていてよい。また、後述するチロシン水酸化酵素をコードする遺伝子としてＴＨ遺伝子が含まれる場合、ＴＨ酵素が要求する補酵素であるテトラヒドロビオプテリン（ＢＨ４）を供給するための遺伝子を、第１発現カセットが含んでいてもよい。補酵素ＢＨ４を供給するための遺伝子としては、例えば、ｍｔｒＡ遺伝子、ＰＴＰＳ遺伝子、ＳＰＲ遺伝子等が挙げられる。ｍｔｒＡ遺伝子は、ＧＴＰサイクロハイドラーゼをコードする遺伝子であり、例えば、バチルスサブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に由来する。ｍｔｒＡ遺伝子は、例えば、配列番号５の塩基配列を有する。ＰＴＰＳ遺伝子は、６−ピルボイルテトラハイドロビオプテリン合成酵素をコードする遺伝子であり、例えば、ラットに由来する。ＰＴＰＳ遺伝子は、例えば、配列番号６の塩基配列を有する。ＳＰＲ遺伝子は、セピアプテリン還元酵素をコードする遺伝子であり、例えば、ラットに由来する。ＳＰＲ遺伝子は、例えば、配列番号７の塩基配列を有する。更に、第１発現カセットはＴＨ遺伝子等のチロシン水酸化酵素をコードする遺伝子を含んでいてもよい。
【００２０】
第１発現カセットに含まれる遺伝子群の連結順は特に制限されないが、例えば、上流からｔｙｒＡｆｂｒ遺伝子、ａｒｏＧｆｂｒ遺伝子、ｔｋｔＡ遺伝子及びｐｐｓＡ遺伝子の順に連結される。また、第１発現カセットがｍｔｒＡ遺伝子、ＰＴＰＳ遺伝子、ＳＰＲ遺伝子及びＴＨ遺伝子を更に含む場合、例えば、上流からｔｙｒＡｆｂｒ遺伝子、ａｒｏＧｆｂｒ遺伝子、ｔｋｔＡ遺伝子、ｐｐｓＡ遺伝子、ｍｔｒＡ遺伝子、ＰＴＰＳ遺伝子、ＳＰＲ遺伝子及びＴＨ遺伝子の順に連結される。なお、各遺伝子間には、プロモーター配列等の機能性配列以外の任意配列を含んでいてもよい。
【００２１】
ドーパミン産生大腸菌のゲノムにおいては、ｔｙｒＲ遺伝子座以外の遺伝子座にチロシンからドーパミンを合成する酵素群をコードするＤＤＣ遺伝子、ｈｐａＢ遺伝子及びｈｐａＣ遺伝子を含む第２発現カセット、又はＤＤＣ遺伝子、ＰＣＤ遺伝子、ＤＨＰＲ遺伝子及びＴＨ遺伝子を含む第３発現カセットが置換される。ｔｙｒＲ遺伝子座以外のゲノム領域にドーパミン合成系遺伝子群が導入されることで効率的にチロシンからドーパミンを合成することができる。
【００２２】
第２発現カセット及び第３発現カセットに含まれるＤＤＣ遺伝子は、ドーパ脱炭酸酵素をコードする遺伝子である。チロシンから合成されるＬ−ドーパが脱炭酸されることでドーパミンが生産される。ＤＤＣ遺伝子は、例えば、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０由来である。ＤＤＣ遺伝子としてシュードモナス・プチダ由来の遺伝子を適用することで、ドーパを選択的に脱炭酸することができ、ドーパミンの生産効率がより向上する。ＤＤＣ遺伝子は、例えば、配列番号８の塩基配列を有する。
【００２３】
第２発現カセットに含まれるｈｐａＢ遺伝子は、４−ヒドロキシフェニル酢酸３−モノオキシゲナーゼのオキシゲナーゼ部分をコードする遺伝子である。ｈｐａＢ遺伝子がコードするオキシゲナーゼは、例えば、ｈｐａＣ遺伝子がコードする酵素から供給されるＦＡＤＨ２を使ってチロシンの３位を水酸化して３，４−ジヒドロキシチロシン（Ｌ−ドーパ）を生成する。ｈｐａＢ遺伝子及びｈｐａＣ遺伝子は、例えば、大腸菌ＢＬ２１ＤＥ３に由来する。ｈｐａＢ遺伝子は、例えば、配列番号９の塩基配列を有し、ｈｐａＣ遺伝子は、例えば、配列番号１０の塩基配列を有する。
【００２４】
第２発現カセットは、ＤＤＣ遺伝子、ｈｐａＢ遺伝子及びｈｐａＣ遺伝子に加えて、Ｔ７プロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター等のプロモーター配列、Ｔ７ターミネーター等のターミネーター配列を更に含んでいてもよい。プロモーター配列は、例えば、各遺伝子の上流にそれぞれ含まれていてもよい。ターミネーター配列は所望のタンパク質をコードする遺伝子群の最下流に含まれていてよい。第２発現カセットに含まれる遺伝子群の連結順は特に制限されないが、例えば、上流からＤＤＣ遺伝子、ｈｐａＢ遺伝子及びｈｐａＣ遺伝子の順に連結される。また、各遺伝子間には、プロモーター配列等の機能性配列以外の任意配列を含んでいてもよい。
【００２５】
第３発現カセットに含まれるＴＨ遺伝子は、チロシン水酸化酵素をコードする遺伝子である。チロシン水酸化酵素によって、チロシンがＬ−ドーパに変換される。ＴＨ遺伝子は、例えば、ドロソフィラ・メラノガスター（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｒａｎｏｇａｓｔｅｒ）に由来する。ＴＨ遺伝子がドロソフィラ・メラノガスターに由来することでより効率的にＬ−ドーパが生産される。ＴＨ遺伝子は、例えば、配列番号１１の塩基配列を有する。第３発現カセットは、ＤＤＣ遺伝子及びＴＨ遺伝子に加えて、ＴＨ酵素が要求する補酵素ＢＨ４を供給するための遺伝子群、補酵素ＢＨ４を再生するための遺伝子群を更に含んでいてもよい。補酵素ＢＨ４を供給するための遺伝子群としては、既述のｍｔｒＡ遺伝子、ＰＴＰＳ遺伝子、ＳＰＲ遺伝子等が挙げられる。また、補酵素ＢＨ４を再生するための遺伝子群としては、ＰＣＤ遺伝子、ＤＨＰＲ遺伝子等が挙げられる。ＰＣＤ遺伝子は、プテリン４αカルビノラミンデハイドラターゼをコードする遺伝子であり、例えば、ヒトに由来する。ＰＣＤ遺伝子は、例えば、配列番号１２の塩基配列を有する。ＤＨＰＲ遺伝子は、ジヒドロプテリジン還元酵素をコードする遺伝子であり、例えば、ヒトに由来する。ＤＨＰＲ遺伝子は、例えば、配列番号１３の塩基配列を有する。
【００２６】
第３発現カセットは、Ｔ７プロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター等のプロモーター配列、Ｔ７ターミネーター等のターミネーター配列を更に含んでいてもよい。プロモーター配列は、例えば、各遺伝子の上流にそれぞれ含まれていてもよい。ターミネーター配列は所望のタンパク質をコードする遺伝子群の最下流に含まれていてよい。第３発現カセットに含まれる遺伝子群の連結順は特に制限されないが、例えば、上流からＤＤＣ遺伝子、ＰＣＤ遺伝子、ＤＨＰＲ遺伝子及びＴＨ遺伝子の順に連結される。また、各遺伝子間には、プロモーター配列等の機能性配列以外の任意配列を含んでいてもよい。
【００２７】
第２発現カセット及び第３発現カセットが置換される遺伝子座は、ｔｙｒＲ遺伝子座以外であればよく、例えば、ｍａｎＸ遺伝子座、ａｓｃＦ遺伝子座、ｌａｃＺ遺伝子座等が挙げられる。中でもｍａｎＸ遺伝子座及びａｓｃＦ遺伝子座の少なくとも一方が好ましく、第２発現カセットがａｓｃＦ遺伝子座に置換していることがより好ましい。ｍａｎＸ遺伝子は、マンノース特異的リン酸転移酵素のＩＩＡコンポーネントをコードする遺伝子であり、非必須遺伝子である。ａｓｃＦ遺伝子は、セロビオース／アルブチン／サリシン特異的リン酸転移酵素のＩＩＢＣコンポーネントをコードする遺伝子であり、非必須遺伝子である。
【００２８】
ドーパミン産生大腸菌に適用される大腸菌の株としては、例えば、Ｋ１２株、ＢＬ２１、Ｗ株等が挙げられる。
【００２９】
ドーパミン産生大腸菌の好ましい態様としては、ｔｙｒＲ遺伝子座が、ｔｙｒＡｆｂｒ−ａｒｏＧｆｂｒ−ｔｋｔＡ−ｐｐｓＡで置換され、ａｓｃＦ遺伝子座が、ＤＤＣ−ｈｐａＢ−ｈｐａＣで置換される第１の大腸菌変異体［ＢＬ２１（ＤＥ３）  ｔｙｒＲ：：ｔｙｒＡｆｂｒ−ａｒｏＧｆｂｒ−ｔｋｔＡ−ｐｐｓＡ  ａｓｃＦ：：ＤＤＣ−ｈｐａＢ−ｈｐａＣ］、ｔｙｒＲ遺伝子座が、ｔｙｒＡｆｂｒ−ａｒｏＧｆｂｒ−ｔｋｔＡ−ｐｐｓＡで置換され、ｍａｎＸ遺伝子座が、ＤＤＣ−ｈｐａＢ−ｈｐａＣで置換される第２の大腸菌変異体［ＢＬ２１（ＤＥ３）  ｔｙｒＲ：：ｔｙｒＡｆｂｒ−ａｒｏＧｆｂｒ−ｔｋｔＡ−ｐｐｓＡ  ｍａｎＸ：：ＤＤＣ−ｈｐａＢ−ｈｐａＣ］、ｔｙｒＲ遺伝子座が、ｔｙｒＡｆｂｒ−ａｒｏＧｆｂｒ−ｔｋｔＡ−ｐｐｓＡ−ｍｔｒＡ−ＰＴＰＳ−ＳＰＲ−ＴＨで置換され、ｍａｎＸ遺伝子座が、ＤＤＣ−ＰＣＤ−ＤＨＰＲ−ＴＨで置換される第３の大腸菌変異体［ＢＬ２１（ＤＥ３）  ｔｙｒＲ：：ｔｙｒＡｆｂｒ−ａｒｏＧｆｂｒ−ｔｋｔＡ−ｐｐｓＡ−ｍｔｒＡ−ＰＴＰＳ−ＳＰＲ−ＴＨ  ｍａｎＸ：：ＤＤＣ−ＰＣＤ−ＤＨＰＲ−ＴＨ］等が挙げられる。
【００３０】
図１にグルコースからＬ−チロシンを介してドーパミンが生産される合成経路の概略を示す。グルコースを原料としてＴｋｔＡにより、エリトロース−４−リン酸（Ｅ４Ｐ）が合成される。また、グルコースを原料としてＰｐｓＡにより、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）が合成される。Ｅ４ＰとＰＥＰから、ＡｒｏＧｆｂｒにより７−ホスホ−３−デオキシ−Ｄ−アラビノヘプツロソン酸（ＤＡＨＰ）が合成され、コリスメート（Ｃｈｏｒｉｓｍａｔｅ）に変換される。コリスメートからＴｙｒＡｆｂｒ等により４−ヒドロキシフェニルピルビン酸（ＨＰＰ）が合成され、ＨＰＰからＬ−チロシンが合成される。Ｌ−チロシンは、チロシン水酸化酵素（ＨｐａＢ／ＨｐａＣ又はＴＨ）により、Ｌ−ドーパ（Ｌ−ＤＯＰＡ）に変換される。Ｌ−ＤＯＰＡが、ドーパ脱炭酸酵素（ＤＤＣ）により脱炭酸されてドーパミンが生産される。
【００３１】
ドーパミン産生大腸菌は、通常の大腸菌に対して、所定の遺伝子座を所望の遺伝子で置換して形質転換することで大腸菌変異体として取得することができる。形質転換の方法として、例えば、ＦＬＰリコンビナーゼでＦＲＴサイトを置換する方法（例えば、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，２０００，９７：６６４０−６６４５参照）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を利用する方法、条件致死遺伝子を有したプラスミドによる方法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９９７，１７９：６２２８−６２３７参照）等を挙げることができる。
【００３２】
ドーパミンの製造方法
本実施形態のドーパミンの製造方法は、上述したドーパミン産生大腸菌を、グルコース及びグリセロールの少なくとも一方を含む培地中で培養する培養工程を含む。ドーパミン産生大腸菌を、グルコース等を含む培地中で培養することでドーパミンが生産されて培地に蓄積される。
【００３３】
ドーパミン産生大腸菌を培養する培地としては、例えば、ＬＢ培地、ＴＢ培地、Ｍ９等が挙げられる。培地にはグルコース及びグリセロールの少なくとも一方が添加される。グルコース等の添加濃度としては、例えば、終濃度として０．４重量％以上６重量％以下とすることができる。培地のｐＨは、例えば、５．５以上８以下とすることができる。また、培養温度としては、例えば、１８℃以上３７℃以下とすることができる。
【００３４】
ドーパミンの製造方法は、培養工程に加えてドーパミン産生大腸菌を準備する準備工程を更に含んでいてもよい。準備工程は、例えば、ドーパミン産生大腸菌を取得する取得工程であってよい。取得工程は、例えば、ｔｙｒＡｆｂｒ遺伝子、ａｒｏＧｆｂｒ遺伝子、ｔｋｔＡ遺伝子及びｐｐｓＡ遺伝子を含む第１発現カセットで、大腸菌ゲノム中のｔｙｒＲ遺伝子座を置換する第１組み替え工程と、ＤＤＣ遺伝子、ｈｐａＢ遺伝子及びｈｐａＣ遺伝子を含む第２発現カセット、又はＤＤＣ遺伝子、ＰＣＤ遺伝子、ＤＨＰＲ遺伝子及びＴＨ遺伝子を含む第３発現カセットで、ｔｙｒＲ遺伝子座以外の遺伝子座を置換する第２組み替え工程とを含む。
【実施例】
【００３５】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、以下において、プライマーｐｒＸＸＸ−ｐｒＹＹＹとの記載は、フォワードプライマーとしてｐｒＸＸＸを、リバースプライマーとしてｐｒＹＹＹを用いたことを意味する。
【００３６】
大腸菌ゲノムへのＤＮＡ断片の挿入は、基本的にはＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，２０００，９７：６６４０−６６４５に記載の方法に準じて実施し、実施に必要なプラスミドベクターｐＣＰ２０、ｐＫＤ１３、ｐＫＤ３、ｐＫＤ４６等を常法により準備した。また、ゲノムに挿入するＤＮＡ断片は、プラスミドベクターにクローニングしてから、ＰＣＲによって得た。具体的には、挿入したいゲノム上の領域（遺伝子座）の上流領域及び下流領域をプラスミドベクターにクローニングし、組み換え用の基本ベクターを構築した。続いて、上流領域と下流領域の間に挿入したいＤＮＡ断片と抗生物質耐性遺伝子をクローニングすることにより、挿入したいＤＮＡ断片が挿入したい領域の部分配列に挟まれた塩基配列を含むプラスミドベクターを作製した。
【００３７】
（実施例１）
チロシン生産系遺伝子の導入
ｔｙｒＲ遺伝子の開始コドン（ＡＴＧ）の上流５３２ｂｐから４９７ｂｐを上流領域（プライマーｐｒ６４０（配列番号１４）−ｐｒ６４１（配列番号１５））とし、ｔｙｒＲの終止コドン直下から５１５ｂｐを下流領域（プライマーｐｒ６４２（配列番号１６）−ｐｒ６４３（配列番号１７））として、ＢＬ２１（ＤＥ３）ゲノムＤＮＡを鋳型にＰＣＲをおこない、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（タカラバイオ社製）により、上流領域及び下流領域を同時にプラスミドベクターｐＥＴ２３ａのＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩ部位にクローニングして、プラスミドベクターｐＡＮ２５６２を得た。なお、上流領域と下流領域の間にはＢａｍＨＩ切断配列（下線部）を挿入した。
【００３８】
【表１】
2020129973.tif 000003
【００３９】
Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２，：３２６，２０１１に記載の方法に準じて、チロシン生産系の４遺伝子であるｔｙｒＡｆｂｒ遺伝子、ａｒｏＧｆｂｒ遺伝子、ｔｋｔＡ遺伝子及びｐｐｓＡ遺伝子を含むプラスミドベクターｔｙｒＡｆｂｒ−ａｒｏＧｆｂｒ−ｔｋｔＡ−ｐｐｓＡ／ｐＣＯＬＡＤｕｅｔ−１（ｐＡＮ００２４；図２）を準備した。チロシン生産系の４遺伝子の内、ｔｙｒＡｆｂｒプロモーター領域からｔｙｒＡｆｂｒとａｒｏＧｆｂｒの２遺伝子とｔｋｔＡの開始コドン下流１２９ｂｐを含む計２６８４ｂｐのＤＮＡ断片を、ｐＡＮ００２４からプライマーｐｒ６４４（配列番号１８）−ｐｒ６９６（配列番号１９）を用いてＰＣＲにより増幅した。
【００４０】
【表２】
2020129973.tif 000004
【００４１】
ｐＫＤ１３を鋳型にフリッパーゼ認識配列に挟まれたカナマイシン耐性遺伝子断片をプライマーｐｒ６９４（配列番号２０）−ｐｒ６９５（配列番号２１）を用いてＰＣＲにより増幅した。上記のプライマーｐｒ６４４−ｐｒ６９６で増幅した断片と、プライマーｐｒ６９４−ｐｒ６９５で増幅した断片とをｔｙｒＲ上流領域及び下流領域をクローニングしてあるｐＡＮ２５６２のＢａｍＨＩ部位にＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（タカラバイオ社製）により同時にクローニングして、プラスミドベクターｐＡＮ２７９６を得た。得られたプラスミドベクターｐＡＮ２７９６を鋳型とし、ｔｙｒＲ上流領域内のプライマー（ｐｒ５９４（配列番号２２））およびｔｙｒＲ下流領域内のプライマー（ｐｒ５９５（配列番号２３））を用いてＰＣＲを行い、挿入断片を得た。
【００４２】
【表３】
2020129973.tif 000005
【００４３】
組み換え促進ベクターｐＫＤ４６を保有したＢＬ２１（ＤＥ３）に上記で得られた挿入断片を挿入して、大腸菌変異体ＡＮ２８０８を得た。なお、カナマイシン耐性遺伝子は、ｐＡＮ２７９６よりＥｃｏＲＶで除去できるように設計した。
【００４４】
ｐＡＮ２７９６からＥｃｏＲＶによりカナマイシン耐性遺伝子を除去し、そこへプラスミドベクターｐＡＮ００２４をプライマーｐｒ７０７（配列番号２４）−ｐｒ７０８（配列番号２５）を用いてＰＣＲにより増幅した断片（ｔｋｔＡ開始コドンより１３０ｂｐ下流からｐｐｓＡ開始コドンより６３０ｂｐ下流のトータル２６５９ｂｐ）と、ｐＫＤ３を鋳型にフリッパーゼ認識配列に挟まれたクロラムフェニコール耐性遺伝子をプライマーｐｒ６９４（配列番号２０）−ｐｒ７０９（配列番号２６）を用いてＰＣＲで増幅した断片とをＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（タカラバイオ社製）によりクローニングして、プラスミドベクターｐＡＮ２８４８を得た。
【００４５】
【表４】
2020129973.tif 000006
【００４６】
プラスミドベクターｐＡＮ２８４８を鋳型として、ａｒｏＧｆｂｒ遺伝子内に結合できるプライマーｐｒ６９７（配列番号２７）とｔｙｒＲ下流領域に結合できるプライマーｐｒ５９５（配列番号２３）を用いてＰＣＲにより増幅し、大腸菌変異体ＡＮ２８０８に対して２段階目のゲノム挿入を行った。なお、プラスミドベクターｐＡＮ２８４８は、プラスミドベクターｐＡＮ２７９６と同様にＥｃｏＲＶでクロラムフェニコール耐性遺伝子を除去できるように設計した。
【００４７】
【表５】
2020129973.tif 000007
【００４８】
プラスミドベクターｐＡＮ２８４８からＥｃｏＲＶを用いた切断によってクロラムフェニコール耐性遺伝子を除去し、そこへプラスミドベクターｐＡＮ００２４をプライマーｐｒ７１１（配列番号２８）−ｐｒ７１２（配列番号２９）を用いてＰＣＲにより増幅した断片（ｐｐｓＡ開始コドンより６３１ｂｐ下流からｐｐｓＡ終始コドンよりＴ７ターミネーターを含む４３２ｂｐ下流のトータル１７４９ｂｐ）と、ｐＫＤ１３を鋳型にフリッパーゼ認識配列に挟まれたカナマイシン耐性遺伝子をプライマーｐｒ６９４（配列番号２０）−ｐｒ６９５（配列番号２１）を用いてＰＣＲで増幅した断片とをＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（タカラバイオ社製）によりクローニングして、プラスミドベクターｐＡＮ２８９０を得た。得られたｐＡＮ２８９０をｐｐｓＡの５’末端プライマーｐｒ７１３（配列番号３０）およびｐｒ５９５（配列番号２３）を用いて挿入断片を増幅し、先の２段階目ゲノム挿入株に対し、３段階目のゲノム挿入を行った。３段階ゲノム挿入株はカナマイシン耐性遺伝子を持っているため、ｐＣＰ２０を導入してフリッパーゼを発現させて、カナマイシン耐性遺伝子を除去して、大腸菌変異体ＡＮ２８９６を得た。
【００４９】
【表６】
2020129973.tif 000008
【００５０】
大腸菌変異体ＡＮ２８９６は、以下のように表される。
ＢＬ２１（ＤＥ３）  ｔｙｒＲ：：ｔｙｒＡｆｂｒ−ａｒｏＧｆｂｒ−ｔｋｔＡ−ｐｐｓＡ
【００５１】
ｍａｎＸ遺伝子座へのドーパミン生産系の導入
ｍａｎＸ遺伝子の開始コドン上流４６９ｂｐから３１３ｂｐを上流領域（プライマーｐｒ７４７（配列番号３１）−ｐｒ７４８（配列番号３２））として、ｍａｎＸ遺伝子の終止コドン下流２６ｂｐから３１３ｂｐを下流領域（プライマーｐｒ７４９（配列番号３３）−ｐｒ７５０（配列番号３４））として、ＢＬ２１（ＤＥ３）ゲノムＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲをおこない、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（タカラバイオ社製）により、上流領域及び下流領域を同時にｐＥＴ２３ａのＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩ部位にクローニングして、プラスミドベクターｐＡＮ２９４０を得た。なお、上流領域と下流領域の間にはＢａｍＨＩ切断配列を挿入した。
【００５２】
【表７】
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【００５３】
チロシンからドーパミンを生産するのに必要なＤＤＣ遺伝子、ｈｐａＢ遺伝子及びｈｐａＣ遺伝子をクローニングしたプラスミドベクターＤＤＣ−ｈｐａＢ−ｈｐａＣ／ｐＥＴ２３ａ（ｐＡＮ３４５３；図３）を常法により準備した。
【００５４】
プラスミドベクターｐＡＮ３４５３を鋳型として、この３つの遺伝子及びＴ７ターミネーターを含む領域を増幅するプライマーｐｒ９２６（配列番号３５）−ｐｒ８１４（配列番号３６）を用いてＰＣＲを行って得られた断片と、ｐＫＤ１３を鋳型にしてフリッパーゼ認識配列に挟まれたカナマイシン耐性遺伝子断片をプライマーｐｒ６９４（配列番号２０）−ｐｒ７５３（配列番号３７）を用いてＰＣＲにより増幅した断片とをｐＡＮ２９４０のＢａｍＨＩ部位にＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（タカラバイオ社製）にてクローニングしてプラスミドベクターを得た。得られたプラスミドベクターを鋳型にして、ｍａｎＸ上流領域及び下流領域に結合するプライマーｐｒ７５８（配列番号３８）−ｐｒ７５９（配列番号３９）を用いてＰＣＲを行い、得られた断片を、ｐＫＤ４６を保有している大腸菌変異体ＡＮ２８９６に対してゲノム挿入した。得られたゲノム挿入株は、カナマイシン耐性遺伝子を持っているため、ｐＣＰ２０を導入してフリッパーゼを発現させ、カナマイシン耐性遺伝子を除去して、大腸菌変異体ＡＮ３５３３を得た。
【００５５】
【表８】
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【００５６】
大腸菌変異体ＡＮ３５３３は、以下のように表される。
ＢＬ２１（ＤＥ３）  ｔｙｒＲ：：ｔｙｒＡｆｂｒ−ａｒｏＧｆｂｒ−ｔｋｔＡ−ｐｐｓＡ  ｍａｎＸ：：ＤＤＣ−ｈｐａＢ−ｈｐａ
【００５７】
（実施例２）
ａｓｃＦ遺伝子座へのドーパミン生産系の導入
ａｓｃＦ遺伝子の開始コドン上流２１４４ｂｐから１０２４ｂｐを上流領域（プライマーｐｒ８１５（配列番号４０）−ｐｒ８１６（配列番号４１））として、ａｓｃＦ遺伝子の終止コドン下流２４８ｂｐから１０１５ｂｐを下流領域（プライマーｐｒ８１７（配列番号４２）−ｐｒ８１８（配列番号４３））として、ＢＬ２１（ＤＥ３）ゲノムＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲをおこない、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（タカラバイオ社製）により、上流領域及び下流領域を同時にｐＥＴ２３ａのＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩ部位にクローニングして、プラスミドベクターｐＡＮ３２８１を得た。なお、上流領域と下流領域の間にはＢａｍＨＩ切断配列を挿入した。
【００５８】
【表９】
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【００５９】
ｐＡＮ３４５３を鋳型として、実施例１と同様にプライマーｐｒ８２０（配列番号４４）−ｐｒ８１４（配列番号３６）を用いてＰＣＲを行って得られた断片と、ｐＫＤ１３を鋳型にフリッパーゼ認識配列に挟まれたカナマイシン耐性遺伝子断片をプライマーｐｒ６９４（配列番号２０）−ｐｒ８２１（配列番号４５）を用いてＰＣＲにより増幅した断片とをｐＡＮ３２８１のＢａｍＨＩ部位にＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（タカラバイオ社製）にてクローニングしてプラスミドベクターを得た。得られたプラスミドベクターを鋳型にａｓｃＦ上流領域及び下流領域に結合するプライマーｐｒ８３２（配列番号４６）−ｐｒ８３３（配列番号４７）を用いてＰＣＲを行い、得られた断片をｐＫＤ４６を保有している大腸菌変異体ＡＮ２８９６に対してゲノム挿入した。得られたゲノム挿入株はカナマイシン耐性遺伝子を持っているため、ｐＣＰ２０を導入してフリッパーゼを発現させ、カナマイシン耐性遺伝子を除去して、大腸菌変異体ＡＮ３８６８を得た。
【００６０】
【表１０】
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【００６１】
大腸菌変異体ＡＮ３８６８は、以下のように表される。
ＢＬ２１（ＤＥ３）  ｔｙｒＲ：：ｔｙｒＡｆｂｒ−ａｒｏＧｆｂｒ−ｔｋｔＡ−ｐｐｓＡ  ａｓｃＦ：：ＤＤＣ−ｈｐａＢ−ｈｐａ
【００６２】
（実施例３）
ＡＮ２８９６へ導入したｐｐｓＡ遺伝子３’末側５９０ｂｐ及びＴ７ターミネーターを含む計１０４３ｂｐと、ｔｙｒＲの終止コドン直下から５１５ｂｐの下流領域をｐＥＴ２３ａのＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩ部位にクローニングした。なお、ｐｐｓＡ下流部とｔｙｒＲ下流部の間にはＢａｍＨＩ切断部位を挿入した。得られたプラスミドベクターのＢａｍＨＩ部位に、ＢＨ４生成に必要なｍｔｒＡ−ＰＴＰＳ−ＳＰＲ遺伝子をｐｒ７３９−ｐｒ７４０を用いて増幅した断片と、カナマイシン耐性遺伝子をｐｒ６９４−ｐｒ６７５で増幅した断片とをクローニングして、プラスミドベクターｐＡＮ３０５９を得た。
【００６３】
【表１１】
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【００６４】
プラスミドベクターｐＡＮ３０５９に対して、ｐｒ７１３−ｐｒ５９５を用いて挿入断片を増幅し、ｐＫＤ４６を保有しているＡＮ２８９６に対し、ゲノム挿入して、大腸菌変異体ＡＮ３０６８を得た。
【００６５】
【表１２】
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【００６６】
上記で得られたｐｐｓＡ遺伝子下流域とｔｙｒＲ下流域を含むプラスミドベクターのＢａｍＨＩ部位に、ｐｒ７４２−ｐｒ７４３を用いて増幅したＴＨ開始コドンより１７４４ｂｐ下流域及びｐｒ６９４−ｐｒ７０９で増幅したクロラムフェニコール耐性遺伝子をクローニングして得られたプラスミドベクターを鋳型として、ｐｒ７６０−ｐｒ５９５で増幅して得られたＤＮＡ断片を、ｐＫＤ４６を保有しているＡＮ３０６８に対して、ゲノム挿入して、大腸菌変異体を得た。
【００６７】
【表１３】
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【００６８】
続いて、上記で得られたｐｐｓＡ遺伝子下流域とｔｙｒＲ下流域を含むプラスミドベクターのＢａｍＨＩ部位にｐｒ７４５−ｐｒ７１２を用いて増幅したＴＨの１７４５ｂｐ以降の下流部分とｐｒ６９４−ｐｒ６７５で増幅したカナマイシン耐性遺伝子をクローニングして、プラスミドベクターを得た。得られたプラスミドを鋳型として、ｐｒ７６１−ｐｒ５９５を用いたＰＣＲで得られたＤＮＡ断片を、上記で得られた大腸菌変異体のゲノムに挿入することにより、ＴＨ遺伝子を有するドーパミン生産菌（ＡＮ３１７２）を作製した。
【００６９】
【表１４】
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【００７０】
（参考例）
チロシンの製造
上記で得られた大腸菌変異体ＡＮ２８９６と、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）  ｔｙｒＲ：：ｎｕｌｌにプラスミドベクターｐＡＮ００２４を導入した大腸菌変異体について、以下のようにしてチロシンの生産能を評価した。それぞれの大腸菌変異体のグリセロールストックを直接５ｍＬのＬＢ培地に植えて、３７℃で１２時間培養した。その後、培養液の５００μＬを５０ｍＬのＴＢ培地に植えて、２５℃で１２時間培養した後、１Ｍ  イソプロピル-β-チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）溶液を１５μＬ（終濃度３００μＭ）、５０％（ｗ／ｖ）グルコース溶液を３ｍＬ（終濃度３％）添加した。２５℃で４８時間培養を継続したのち、培養液をサンプリングして、チロシン濃度を測定した。結果を図４に示す。
【００７１】
チロシン生産系遺伝子をゲノム挿入した大腸菌変異体は、プラスミドベクターでチロシン生産系遺伝子を導入した大腸菌変異体よりも、チロシンの生産効率が高かった。
【００７２】
（実施例４）
ドーパミンの製造１  ｍａｎＸ遺伝子座
上記で得られた大腸菌変異体ＡＮ３５３３について、以下のようにしてドーパミンの生産能を評価した。大腸菌変異体のグリセロールストックを直接５ｍＬのＬＢ培地に植えて、３７℃で１２時間培養した。その後、培養液の５００μＬを５０ｍＬのＴＢ培地に植えて、２５℃で１２時間培養した後、１Ｍ  ＩＰＴＧ溶液を１５μＬ（終濃度３００μＭ）、５０％（ｗ／ｖ）グルコース溶液を３ｍＬ（終濃度３％）添加した。２５℃で４８時間培養を継続したのち、培養液をサンプリングして、ドーパミン濃度を測定した。横軸に大腸菌のロット、縦軸にドーパミン濃度を示す結果を図５に示す。
【００７３】
（実施例５）
ドーパミンの製造２  ａｓｃＦ遺伝子座
上記で得られた大腸菌変異体ＡＮ３８６８について、実施例４と同様にしてドーパミンの生産能を評価した。横軸に大腸菌のロット、縦軸にドーパミン濃度を示す結果を図６に示す。
【００７４】
（実施例６）
ドーパミンの製造３  ＴＨ遺伝子
上記で得られた大腸菌変異体ＡＮ３１７２について、実施例４と同様にしてドーパミンの生産能を評価した。縦軸にドーパミン濃度を示す結果を、大腸菌変異体ＡＮ３８６８の結果とともに図７に示す。
【００７５】
図５から図７に示すように、チロシン産生遺伝子群とドーパミン産生遺伝子群とを大腸菌のゲノムに挿入することにより、グルコースからドーパミンを効率よく産生することができた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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