(57)【要約】【課題】試料中に含まれる希少な粒子を標的粒子とした場合であっても、試料の測定が正しく行われたか否かを判定可能な測定成否判定方法および試料測定装置を提供する。【解決手段】測定試料に含まれる標的粒子の測定における測定成否判定方法は、検出工程Ｓ１と、測定の成否の判定工程Ｓ２と、を含む。測定成否判定方法は、検出工程Ｓ１において、測定試料中の標的粒子および標的粒子以外の他の粒子を検出する。また、測定成否判定方法は、測定の成否の判定工程Ｓ２において、少なくとも他の粒子の検出結果に基づいて、標的粒子の測定の成否を判定する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
測定試料に含まれる標的粒子の測定における測定成否判定方法であって、
前記測定試料中の前記標的粒子および前記標的粒子以外の他の粒子を検出し、
少なくとも前記他の粒子の検出結果に基づいて、前記標的粒子の測定の成否を判定する、測定成否判定方法。
【請求項２】
前記測定の成否の判定において、
前記粒子の検出において検出した前記標的粒子および前記他の粒子の検出結果に基づいて、前記標的粒子の測定の成否を判定する、請求項１に記載の測定成否判定方法。
【請求項３】
少なくとも前記他の粒子の検出結果に基づいて、前記測定において検出された前記標的粒子の検出率に関する値を算出し、
前記測定の成否の判定において、
前記検出率に関する値に基づいて、前記標的粒子の測定の成否を判定する、請求項１または２に記載の測定成否判定方法。
【請求項４】
前記検出率に関する値の算出において、
単位時間ごとに検出した少なくとも前記他の粒子の数に基づいて、前記測定において検出が期待される少なくとも前記他の粒子の数に関する推定値を算出し、
前記推定値と、前記測定において実際に検出された少なくとも前記他の粒子の数と、に基づいて、前記検出率に関する値を算出する、請求項３に記載の測定成否判定方法。
【請求項５】
前記検出率に関する値の算出において、
前記推定値と、前記測定において実際に検出された少なくとも前記他の粒子の数と、の比に基づいて、前記検出率に関する値を算出する、請求項４に記載の測定成否判定方法。
【請求項６】
前記検出率に関する値の算出において、
前記推定値に対する前記測定において実際に検出された少なくとも前記他の粒子の数の割合に基づいて、前記検出率に関する値を算出する、請求項４に記載の測定成否判定方法。
【請求項７】
前記検出率に関する値の算出において、
前記単位時間ごとに検出した少なくとも前記他の粒子の数に基づいて、前記測定において検出される少なくとも前記他の粒子の数の時間的変化を近似する近似式を算出し、
前記近似式に基づいて、前記測定において検出が期待される少なくとも前記他の粒子の数に関する推定値を算出する、請求項４ないし６の何れか一項に記載の測定成否判定方法。
【請求項８】
前記近似式の算出において、検出された少なくとも前記他の粒子が所定数以下の時間帯を除外し、前記近似式を算出する、請求項７に記載の測定成否判定方法。
【請求項９】
前記測定試料を測定した全時間帯のうち所定タイミング以前の時間帯を除外し、前記近似式を算出する、請求項７または８に記載の測定成否判定方法。
【請求項１０】
前記測定試料を測定した全時間帯のうち所定タイミング以降の時間帯を除外し、前記近似式を算出する、請求項７ないし９の何れか一項に記載の測定成否判定方法。
【請求項１１】
前記測定の成否の判定において、
前記検出率に関する値を所定の閾値と比較し、前記標的粒子の測定の成否を判定する、請求項３ないし１０の何れか一項に記載の測定成否判定方法。
【請求項１２】
使用者の入力に応じて前記所定の閾値を変更する、請求項１１に記載の測定成否判定方法。
【請求項１３】
前記測定の成否の判定結果を表示部に表示する、請求項１ないし１２の何れか一項に記載の測定成否判定方法。
【請求項１４】
前記測定において実際に検出された少なくとも前記他の粒子の数の時間的変化を示すグラフを前記表示部に表示する、請求項１３に記載の測定成否判定方法。
【請求項１５】
前記検出率に関する値の算出において、
単位時間ごとに検出した少なくとも前記他の粒子から得られる検出信号の値に基づいて、前記測定において検出が期待される検出信号の値に関する推定値を算出し、
前記推定値と、前記測定において実際に検出された検出信号の値と、に基づいて、前記検出率に関する値を算出する、請求項３に記載の測定成否判定方法。
【請求項１６】
前記検出率に関する値の算出において、
単位時間ごとに検出した少なくとも前記他の粒子の数が所定数以上の時間および／または前記単位時間ごとに検出した少なくとも前記他の粒子の数が所定数以下の時間の情報に基づいて、前記検出率に関する値を算出する、請求項３に記載の測定成否判定方法。
【請求項１７】
前記標的粒子および前記他の粒子の検出において、
前記測定試料を流路に流し、前記流路を流れる前記測定試料中の前記標的粒子および前記他の粒子を検出する、請求項１ないし１６の何れか一項に記載の測定成否判定方法。
【請求項１８】
前記標的粒子および前記他の粒子の検出において、
フローセルに形成された流路に前記測定試料を流し、
前記流路を流れる前記測定試料に光を照射し、前記測定試料から生じた光を検出する、請求項１ないし１７の何れか一項に記載の測定成否判定方法。
【請求項１９】
前記標的粒子および前記他の粒子の検出において、複数の画像に基づいて前記測定試料に含まれる前記標的粒子および前記他の粒子を検出し、
前記検出率に関する値の算出において、前記画像ごとに検出した少なくとも前記他の粒子の数に基づいて、前記測定において検出が期待される少なくとも前記他の粒子の数に関する推定値を算出し、
前記推定値と、前記測定において実際に検出された少なくとも前記他の粒子の数と、に基づいて、前記検出率に関する値を算出する、請求項３に記載の測定成否判定方法。
【請求項２０】
前記標的粒子および前記他の粒子は、細胞である、請求項１ないし１９の何れか一項に記載の測定成否判定方法。
【請求項２１】
前記測定試料中の前記標的粒子の数は、前記測定試料中の他の粒子の数より少ない、請求項１ないし２０の何れか一項に記載の測定成否判定方法。
【請求項２２】
前記標的粒子は血中循環腫瘍細胞であり、前記他の粒子は白血球である、請求項１ないし２１の何れか一項に記載の測定成否判定方法。
【請求項２３】
前記血中循環腫瘍細胞および前記白血球を大きさの違いに基づいて、血液中に含まれる前記白血球の一部を除外することで前記測定試料を調製し、
前記測定の成否の判定において、前記測定試料の調製において除去されなかった白血球の検出結果に基づいて、前記標的粒子の測定の成否を判定する、請求項２２に記載の測定成否判定方法。
【請求項２４】
前記標的粒子の数に関する値を表示部に表示する、請求項１ないし２３の何れか一項に記載の測定成否判定方法。
【請求項２５】
測定試料に含まれる標的粒子を測定する試料測定装置であって、
前記測定試料中の前記標的粒子および前記標的粒子以外の他の粒子を検出する検出部と、
少なくとも前記他の粒子の検出結果に基づいて、前記標的粒子の測定の成否を判定する制御部と、を備える、試料測定装置。
【請求項２６】
測定試料中の粒子を検出し、
単位時間ごとに検出した前記粒子の数に基づいて、測定において検出が期待される前記粒子の数に関する推定値を算出し、
前記推定値と、前記測定において実際に検出された前記粒子の数と、に基づいて、検出率に関する値を算出し、
前記検出率に関する値に基づいて、前記粒子の測定の成否を判定する、測定成否判定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、測定成否判定方法および試料測定装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、様々な目的で、試料に含まれる粒子の測定が行われている。たとえば、血液試料等に含まれる細胞は生体の様々な状態を反映しているため、被検者の疾患の状態などを把握することを目的として被検者から採取した検体中の細胞の測定が行われている。特許文献１には、末梢血中に含まれる血中循環腫瘍細胞（Circulating Tumor Cell：ＣＴＣ）を撮像するための粒子撮像装置４００が記載されている（図２２参照）。ＣＴＣは、腫瘍の原発巣等から血液中に遊離した腫瘍細胞であり、がん患者の体内では微量の腫瘍細胞が血流に乗って循環していることが知られている。
【０００３】
特許文献１に記載の粒子撮像装置４００では、粒子検出部４１０における粒子の検出結果に基づいて試料に含まれる粒子のうちＣＴＣの可能性が低い粒子は、粒子選別部４２０により外側に設けられた流路４３０に流される。粒子検出部４１０における粒子の検出結果に基づいてＣＴＣの可能性が高い粒子は中心に設けられた流路４４０に流され、粒子撮像部４５０により粒子の画像が撮像される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１７−１１６５５８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ここで、試料中に含まれる標的粒子の数を正確に測定したい場合に、粒子の検出中に種々の不具合が生じて一定期間の間粒子の検出ができない状況となると、検出結果から試料中に含まれる標的粒子の数を正確に評価することができなくなる。たとえば、ＣＴＣのように、試料中の希少な粒子を標的粒子として検出する場合、標的粒子をもれなく検出できるように、試料を全量測定することが重要となる。しかしながら、もし検出に不具合が生じ粒子の検出漏れが生じた場合であっても、試料に含まれる標的粒子が実際に少ないために検出された標的粒子の数が少ないのか、検出の不具合により試料の全量が測定できておらず検出された標的粒子の数が少ないのかを測定結果から判別できない。このため、粒子の検出結果に基づいて被検者の状態を適正に評価するためには、まずは粒子の検出自体が正しく行われたか否かということを把握することが必要となる。
【０００６】
そこで、本発明は、試料中に含まれる希少な粒子を標的粒子とした場合であっても、試料の測定が正しく行われたか否かを判定可能な測定成否判定方法および試料測定装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の第１の態様は、測定試料に含まれる標的粒子の測定における測定成否判定方法に関する。本態様に係る測定成否判定方法は、測定試料中の標的粒子および標的粒子以外の他の粒子を検出し、少なくとも他の粒子の検出結果に基づいて、標的粒子の測定の成否を判定する。
【０００８】
発明者らは、測定試料に含まれる希少粒子を標的粒子とする場合に、標的粒子以外の他の粒子の検出結果が、標的粒子に対する測定の成否の状態を反映することを見いだした。したがって、本態様に係る測定成否判定方法によれば、少なくとも他の粒子の検出結果に基づいて標的粒子の成否を判定できる。
【０００９】
また、このように測定の成否を判定できると、測定試料に含まれる標的粒子が実際に少ないために検出された標的粒子の数が少なかったのか、検出の不具合により検出された標的粒子の数が少なかったのかを判別できる。したがって、測定の成否に基づいて、測定試料に含まれる標的粒子を適正に評価できる。これにより、たとえば疾患の状態の判断において、不適正な測定によって標的粒子の数が誤って少なくなるために生じる偽陰性を抑制できる。
【００１０】
また、検出の不具合は測定ごとに都度発生することがあるが、本態様に係る測定成否判定方法によれば、実際に行う測定における検出結果に基づいて測定の成否が判定される。したがって、測定試料の測定ごとに測定が正しく行われたかを判定できる。
【００１１】
本態様に係る測定成否判定方法は、測定の成否の判定において、粒子の検出において検出した標的粒子および他の粒子の検出結果に基づいて、標的粒子の測定の成否を判定してもよい。測定試料には、標的粒子以外の他の粒子だけでなく、標的粒子も含まれる。したがって、標的粒子および他の粒子の両方の検出結果に基づいて、標的粒子の測定の成否を判定してもよい。
【００１２】
本態様に係る測定成否判定方法は、少なくとも他の粒子の検出結果に基づいて、測定において検出された標的粒子の検出率に関する値を算出し、測定の成否の判定において、検出率に関する値に基づいて、標的粒子の測定の成否を判定してもよい。標的粒子の検出率に関する値は、測定試料の測定において測定試料に含まれる標的粒子がどの程度の割合で検出できたかを反映した数値であればよく、たとえば、測定試料に含まれる粒子全体の検出率や、標的粒子ではない他の粒子のみの検出率でもよい。
【００１３】
この場合に、本態様に係る測定成否判定方法は、検出率に関する値の算出において、単位時間ごとに検出した少なくとも他の粒子の数に基づいて、測定において検出が期待される少なくとも他の粒子の数に関する推定値を算出し、推定値と、測定において実際に検出された少なくとも他の粒子の数と、に基づいて、検出率に関する値を算出してもよい。この場合の推定値は、少なくとも測定において検出が期待される他の粒子の数を含んでいればよく、測定において検出が期待される標的粒子の数を含んでいてもよい。
【００１４】
この場合に、本態様に係る測定成否判定方法は、検出率に関する値の算出において、推定値と、測定において実際に検出された少なくとも他の粒子の数と、の比に基づいて、検出率に関する値を算出してもよい。
【００１５】
あるいは、本態様に係る測定成否判定方法は、検出率に関する値の算出において、推定値に対する測定において実際に検出された少なくとも他の粒子の数の割合に基づいて、検出率に関する値を算出してもよい。
【００１６】
本態様に係る測定成否判定方法は、検出率に関する値の算出において、単位時間ごとに検出した少なくとも他の粒子の数に基づいて、測定において検出される少なくとも他の粒子の数の時間的変化を近似する近似式を算出し、近似式に基づいて、測定において検出が期待される少なくとも他の粒子の数に関する推定値を算出してもよい。
【００１７】
この場合に、本態様に係る測定成否判定方法は、近似式の算出において、検出された少なくとも他の粒子が所定数以下の時間帯を除外し、近似式を算出してもよい。
【００１８】
本態様に係る測定成否判定方法は、測定試料を測定した全時間帯のうち所定タイミング以前の時間帯を除外し、近似式を算出してもよい。こうすると、測定開始直後に意図せず不具合が生じたような場合でも検出の不具合を判定できる。
【００１９】
本態様に係る測定成否判定方法は、測定試料を測定した全時間帯のうち所定タイミング以降の時間帯を除外し、近似式を算出してもよい。こうすると、意図せず粒子沈降が生じたような場合でも検出の不具合を判定できる。
【００２０】
本態様に係る測定成否判定方法は、測定の成否の判定において、検出率に関する値を所定の閾値と比較し、標的粒子の測定の成否を判定してもよい。
【００２１】
この場合に、本態様に係る測定成否判定方法は、使用者の入力に応じて所定の閾値を変更してもよい。こうすると、病院の要望や検査施設の運用等に合わせて閾値を設定できる。
【００２２】
図２を参照し、本態様に係る測定成否判定方法は、測定の成否の判定結果を表示部（１３）に表示してもよい。こうすると、オペレータは、表示部に表示された判定結果を参照して、測定の成否を円滑に把握できる。
【００２３】
この場合に、本態様に係る測定成否判定方法は、測定において実際に検出された少なくとも他の粒子の数の時間的変化を示すグラフを表示部（１３）に表示してもよい。こうすると、オペレータは、表示部に表示されたグラフを参照して、測定の状況を把握できる。
【００２４】
本態様に係る測定成否判定方法は、検出率に関する値の算出において、単位時間ごとに検出した少なくとも他の粒子から得られる検出信号の値に基づいて、測定において検出が期待される検出信号の値に関する推定値を算出し、推定値と、測定において実際に検出された検出信号の値と、に基づいて、検出率に関する値を算出してもよい。
【００２５】
本態様に係る測定成否判定方法は、検出率に関する値の算出において、単位時間ごとに検出した少なくとも他の粒子の数が所定数以上の時間および／または単位時間ごとに検出した少なくとも他の粒子の数が所定数以下の時間の情報に基づいて、検出率に関する値を算出してもよい。
【００２６】
本態様に係る測定成否判定方法は、標的粒子および他の粒子の検出において、測定試料を流路（１１１）に流し、流路（１１１）を流れる測定試料中の標的粒子および他の粒子を検出してもよい。
【００２７】
図５を参照し、本態様に係る測定成否判定方法は、標的粒子および他の粒子の検出において、フローセル（１１０）に形成された流路（１１１）に測定試料を流し、流路（１１１）を流れる測定試料に光を照射し、測定試料から生じた光を検出してもよい。
【００２８】
本態様に係る測定成否判定方法は、標的粒子および他の粒子の検出において、複数の画像に基づいて測定試料に含まれる標的粒子および他の粒子を検出し、検出率に関する値の算出において、画像ごとに検出した少なくとも他の粒子の数に基づいて、測定において検出が期待される少なくとも他の粒子の数に関する推定値を算出し、推定値と、測定において実際に検出された少なくとも他の粒子の数と、に基づいて、検出率に関する値を算出してもよい。こうすると、たとえば、蛍光顕微鏡を用いて検出を行う場合に、測定成否判定方法により測定の成否を判定できる。
【００２９】
本態様に係る測定成否判定方法において、標的粒子および他の粒子は、たとえば細胞である。
【００３０】
本態様に係る測定成否判定方法において、測定試料中の標的粒子の数は、測定試料中の他の粒子の数より少なくてもよい。
【００３１】
本態様に係る測定成否判定方法において、たとえば、標的粒子は血中循環腫瘍細胞であり、他の粒子は白血球である。
【００３２】
本態様に係る測定成否判定方法において、血中循環腫瘍細胞および白血球を大きさの違いに基づいて、血液中に含まれる白血球の一部を除外することで測定試料を調製し、測定の成否の判定において、測定試料の調製において除去されなかった白血球の検出結果に基づいて、標的粒子の測定の成否を判定してもよい。
【００３３】
図２を参照し、本態様に係る測定成否判定方法は、標的粒子の数に関する値を表示部（１３）に表示してもよい。こうすると、医師等は、標的粒子の数に関する値を参照することにより、被検者に対する診断を行うことができる。
【００３４】
本発明の第２の態様は、測定試料に含まれる標的粒子を測定する試料測定装置に関する。本態様に係る試料測定装置（１０）は、測定試料中の標的粒子および標的粒子以外の他の粒子を検出する検出部（１００）と、少なくとも他の粒子の検出結果に基づいて、標的粒子の測定の成否を判定する制御部（１１）と、を備える。
【００３５】
検出部は、たとえば、フローセルに設けられた流路を流れる測定試料に対して光を照射し、測定試料から生じた光を撮像または測定する光学式の検出部や、流路を流れる測定試料に対して電流を流し、電気抵抗の変化に基づいて粒子を測定する電気抵抗方式の検出部などを含む。
【００３６】
本態様に係る試料測定装置によれば、第１の態様と同様の効果が奏される。
【００３７】
本発明の第３の態様は、測定成否判定方法に関する。本態様に係る測定成否判定方法は、測定試料中の粒子を検出し、単位時間ごとに検出した粒子の数に基づいて、測定において検出が期待される粒子の数に関する推定値を算出し、推定値と、測定において実際に検出された粒子の数と、に基づいて、検出率に関する値を算出し、検出率に関する値に基づいて、粒子の測定の成否を判定する。
【００３８】
本態様に係る測定成否判定方法によれば、検出率は、測定試料の測定において測定試料に含まれる粒子がどの程度の割合で検出できたかを反映した数値となる。したがって、本態様に係る測定成否判定方法によれば、検出率に関する値に基づいて粒子の測定の成否を判定できる。
【発明の効果】
【００３９】
本発明によれば、試料に含まれる希少な標的粒子の測定において、試料の測定が正しく行われたか否かを判定できる。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】図１は、実施形態１〜４に係る測定成否判定方法の概要を示すフローチャートである。
【図２】図２は、実施形態１に係る試料測定装置の構成を示すブロック図である。
【図３】図３は、実施形態１に係る前処理の手順を示すフローチャートである。
【図４】図４（ａ）は、実施形態１に係るチップの構成を示す模式図である。図４（ｂ）は、実施形態１に係るマイクロ流路の断面を示す模式図である。図４（ｃ）は、実施形態１に係るマイクロ流路の出力端部側の端部を示す模式図である。
【図５】図５は、実施形態１に係る検出部の構成を示す模式図である。
【図６】図６は、実施形態１に係るフローセルに測定試料、参照液およびシース液を流すための検出部の構成を示す模式図である。
【図７】図７は、実施形態１に係る試料測定装置の動作を示すフローチャートである。
【図８】図８（ａ）〜（ｃ）は、実施形態１に係る推定値の取得および検出率の取得を説明するための、計測粒子数を模式的に示すグラフである。
【図９】図９は、実施形態１に係る推定値の取得工程の詳細を示すフローチャートである。
【図１０】図１０は、実施形態１に係る検出率の取得工程の詳細を示すフローチャートである。
【図１１】図１１（ａ）〜（ｃ）は、実施形態１の測定成否判定方法の第２の検証で取得された計測粒子数のグラフである。
【図１２】図１２（ａ）〜（ｃ）は、実施形態１の測定成否判定方法の第２の検証で取得された計測粒子数のグラフである。
【図１３】図１３は、実施形態１に係る測定の成否の判定工程の詳細を示すフローチャートである。
【図１４】図１４は、実施形態１に係る表示工程において表示部に表示される画面の構成を示す模式図である。
【図１５】図１５は、実施形態１に係る表示工程において表示部に表示される画面の構成を示す模式図である。
【図１６】図１６は、実施形態１に係る測定成否判定方法の第１の検証において作成された散布図である。
【図１７】図１７は、実施形態１に係る測定成否判定方法の第２の検証において作成された検出率の分布図である。
【図１８】図１８（ａ）、（ｂ）は、実施形態１に係る測定成否判定方法の第２の検証で取得された計測粒子数のグラフである。
【図１９】図１９（ａ）〜（ｃ）は、実施形態２に係る推定値の取得および検出率の取得を説明するための、計測粒子数を模式的に示すグラフである。
【図２０】図２０（ａ）〜（ｃ）は、実施形態３に係る近似式の取得を説明するための、計測粒子数を模式的に示すグラフである。
【図２１】図２１（ａ）、（ｂ）は、実施形態４に係る検出率の取得を説明するための、計測粒子数を模式的に示すグラフである。
【図２２】図２２は、関連技術に係る構成を説明するための模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
図１を参照して、本発明の測定成否判定方法の概要について説明する。以下、末梢血から調製された測定試料に含まれるＣＴＣを標的粒子として測定する例を用いて説明している。また、この測定において、測定試料に含まれる白血球を標的粒子以外の他の粒子とし、少なくとも白血球の検出結果に基づいて標的粒子の測定の成否を判定している。
【００４２】
検出工程Ｓ１において、測定試料中の標的粒子および標的粒子以外の他の粒子が検出される。これにより、粒子の画像の撮像または粒子から生じた光等に基づく検出信号のデータの取得が行われる。
【００４３】
続いて、測定の成否の判定工程Ｓ２において、検出工程Ｓ１で取得されたデータに基づいて、標的粒子の測定の成否が判定される。測定の成否の判定工程Ｓ２では、たとえば、以下のような工程が行われる。
【００４４】
まず、検出工程Ｓ１で得られた検出信号のデータから取得が期待される推定値が算出され、たとえば、測定において実際に検出された粒子の数や検出信号の値などの実測値と、実測値として本来取得が期待される推定値との比に基づいて、標的粒子の検出率に関する値が算出される。標的粒子の検出率に関する値の算出の詳細については、追って後述する。そして、標的粒子の検出率に関する値が所定の閾値と比較され、標的粒子の測定の成否が判定される。たとえば、標的粒子の検出率に関する値が推定値に対する実測値の割合である場合、標的粒子の検出率に関する値が閾値よりも大きいと、測定試料中の粒子が十分に検出できたものとして、標的粒子の測定が適正であったと判断できる。
【００４５】
ここで、血液等から調製された測定試料には、ＣＴＣ等の分析対象となる標的粒子だけでなく、白血球等の標的粒子以外の他の粒子も含まれる。たとえば標的粒子が希少細胞であり測定試料に含まれる標的粒子が少ない場合でも、測定試料に含まれる粒子の数は、他の粒子を含めることによりある程度の数量となる。これにより、測定が適正であった場合と、測定が不適正であった場合とで、標的粒子の数によらず測定の成否に応じて標的粒子の検出率に関する値が増減するため、標的粒子の検出率に関する値を用いて標的粒子の測定の成否を適正に判断できる。
【００４６】
なお、測定成否判定方法は試料測定装置を用いて行われることが想定されるが、各工程の一部または全部が手技によりオペレータにより行われてもよい。
【００４７】
＜実施形態１＞
（試料測定装置１０の構成）
図２は、試料測定装置１０の構成を示すブロック図である。
【００４８】
試料測定装置１０は、制御部１１と、記憶部１２と、表示部１３と、入力部１４と、検出部１００と、を備える。
【００４９】
制御部１１は、ＣＰＵにより構成される。制御部１１は、記憶部１２に記憶されたプログラムに基づいて各種の処理を行う。制御部１１は、試料測定装置１０内の各部に接続されており、各部からの信号を受信すると共に、各部の動作を制御する。記憶部１２は、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ハードディスク等により構成される。表示部１３は、液晶ディスプレイ、プラズマディスプレイ、ＣＲＴ（Cathode Ray Tube）ディスプレイ等により構成される。入力部１４は、マウスやキーボード等により構成される。なお、表示部１３と入力部１４は、タッチパネル式のディスプレイにより一体的に構成されてもよい。検出部１００は、前処理により調製された測定試料中の粒子を検出するための光学ユニットである。検出部１００の詳細は後述する。
【００５０】
図３は、試料測定装置１０に供される測定試料を調製するための前処理の手順を示すフローチャートである。
【００５１】
なお、検体が全血試料であり、標的粒子が全血試料中のＣＴＣである場合について説明しているが、測定試料の前処理は検体の種類や標的粒子等により適宜設定されるものであり、以下の方法に限られるものではない。被検者から採取される検体は、全血に限らず、分析に対応する標的粒子を含む検体であればよく、たとえば尿や骨髄液などでもよい。標的粒子は、被検者由来の希少細胞であり、ＣＴＣに限らず、血管内皮細胞（Circulating Endothelial Cell：ＣＥＣ）、造血幹細胞（Hematopoietic Stem Cell：ＨＳＣ）、胎児赤芽球などの細胞でもよいし、エキソソームやマイクロパーティクル等の粒子であってもよい。
【００５２】
検体の採取工程Ｓ１１において、被検者から検体として全血が、たとえば５ｍＬ採取される。被検者から採取された全血は、赤血球、血小板、白血球、およびＣＴＣを含む。赤血球の溶血工程Ｓ１２において、被検者から採取された全血対して、界面活性剤等を含む所定の試薬を用いて赤血球が溶血される。続いて、第１遠心分離工程Ｓ１３において、赤血球が溶血された試料が遠心分離器により遠心分離され、上清が除去される。これにより、赤血球がほぼなくなった試料が取得される。
【００５３】
続いて、他の粒子の除去工程Ｓ１４において、赤血球がほぼなくなった試料を渦巻き状の流路に流すことにより、粒子の大きさの違いに基づいて、標的粒子であるＣＴＣと、ＣＴＣ以外の粒子が分離される。すなわち、第１遠心分離工程Ｓ１３で取得された試料から、白血球および血小板等の他の粒子が除去され、ＣＴＣの濃度が増した試料が取得される。
【００５４】
他の粒子の除去工程Ｓ１４においてＣＴＣの濃度が増した試料を取得する際には、たとえば、図４（ａ）に示すチップ５００が用いられる。
【００５５】
図４（ａ）は、チップ５００の構成を示す模式図である。
【００５６】
チップ５００に設けられたマイクロ流路５１０に、第１遠心分離工程Ｓ１３で取得された試料が流されることにより、チップ５００は、第１遠心分離工程Ｓ１３で取得された試料を、第１試料と第２試料とに分離する。
【００５７】
チップ５００は、マイクロ流路５１０と、入力端部５２０と、出力端部５３０と、を備える。マイクロ流路とは、一般的に、深さおよび幅が１０μｍ〜１０００μｍの範囲の流路のことである。チップ５００は、たとえば、マイクロ流路５１０、入力端部５２０、および出力端部５３０に対応する溝が形成された薄い板状部材に、他の板状部材を重ね合わせることにより構成される。他の粒子の除去工程Ｓ１４は、Dean Flow Fractionationと呼ばれる分離原理に基づくものである。
【００５８】
マイクロ流路５１０は、渦巻き形状の曲線部５１１と、２つの直線部５１２、５１３と、を有する。曲線部５１１の形状は、チップ５００に垂直な方向に見た場合に円弧状になっている。２つの直線部５１２、５１３の形状は、チップ５００に垂直な方向に見た場合に直線状になっている。入力端部５２０は、マイクロ流路５１０の渦巻き形状の中心側の端部に設けられており、出力端部５３０は、マイクロ流路５１０の入力端部５２０とは反対側の端部に設けられている。入力端部５２０は、直線部５１２を介して曲線部５１１と繋がっており、出力端部５３０は、直線部５１３を介して曲線部５１１と繋がっている。
【００５９】
入力端部５２０は、２つの入口５２１、５２２を備える。２つの入口５２１、５２２は、チップ５００を構成する部材に設けられた孔により構成される。入口５２１は、マイクロ流路５１０の渦巻き形状の外周側において、直線部５１２を介して曲線部５１１に接続されている。入口５２２は、マイクロ流路５１０の渦巻き形状の内周側において、直線部５１２を介して曲線部５１１に接続されている。出力端部５３０は、２つの出口５３１、５３２を備える。２つの出口５３１、５３２は、チップ５００を構成する部材に設けられた孔により構成される。出口５３１は、マイクロ流路５１０の渦巻き形状の内周側において、直線部５１３を介して曲線部５１１に接続されている。出口５３２は、マイクロ流路５１０の渦巻き形状の外周側において、直線部５１３を介して曲線部５１１に接続されている。
【００６０】
入口５２１に、第１遠心分離工程Ｓ１３で取得された試料が注入され、入口５２２に、試料を流すためのシース液が注入される。入口５２１に注入される試料の量は、たとえば４ｍＬであり、入口５２２に注入されるシース液の量は、たとえば４５ｍＬである。そして、２つの入口５２１、５２２にチューブを介して接続されたポンプ５４０により、２つの入口５２１、５２２に陽圧が加えられる。これにより、入口５２１に注入された試料と、入口５２２に注入されたシース液とが、マイクロ流路５１０内を出力端部５３０に向かって流れる。出口５３１から取得される第１試料の量は、たとえば１０ｍＬであり、出口５３２から取得される第２試料の量は、たとえば３９ｍＬである。
【００６１】
図４（ｂ）は、図４（ａ）に示すマイクロ流路５１０のＡ−Ａ’断面図である。図４（ｂ）において、右側が渦巻き形状の外周側であり、左側が渦巻き形状の内周側である。
【００６２】
第１遠心分離工程Ｓ１３で取得された試料がマイクロ流路５１０に流されると、マイクロ流路５１０内において、図４（ｂ）に示すように、流路の向きに直交する方向に粒子の流れる位置を変化させる力が生じる。具体的には、粒子の径に応じて異なる大きさの揚力ＦＬとディーン抗力ＦＤとが生じる。一般的に、マイクロ流路においては、流路の断面中心の速度が大きく壁近傍の速度が小さくなるように流速が分布する。渦巻き状のマイクロ流路５１０においては、さらに上記の流速分布に起因して、図４（ｂ）において楕円状の矢印に示すように、ディーン渦と呼ばれる二次流が発生する。ディーン抗力ＦＤと揚力ＦＬは、以下の式（１）、（２）により表すことができる。
【００６３】
【数１】
2020134341.tif 000003
【００６４】
試料内の粒子は、マイクロ流路５１０に沿って押し流されながら、揚力ＦＬとディーン抗力ＦＤにより、マイクロ流路５１０内において径の値に応じて分布するようになる。
【００６５】
図４（ｃ）は、マイクロ流路５１０の出力端部５３０側の端部を示す模式図である。
【００６６】
マイクロ流路５１０においてディーン渦が発生すると、図４（ｃ）に示すように、マイクロ流路５１０の出力端部５３０側の端部において、径の値に応じて粒子が分布する。こうして、出口５３１から、所定の径以上の粒子を含む第１試料が取得され、出口５３２から、所定の径未満の粒子を含む第２試料が取得される。
【００６７】
大半の白血球の直径は、１０μｍ〜１５μｍ付近の値以下であり、大半のＣＴＣの直径は、１０μｍ〜１５μｍ付近の値以上である。したがって、第１遠心分離工程Ｓ１３で取得された試料から、ＣＴＣ以外の他の粒子として白血球、血小板、および溶血されずに残った赤血球を除去する際には、１０μｍ〜１５μｍ付近の値をカットオフ値として、カットオフ値より小さい直径の粒子が除去され、カットオフ値以上の直径の粒子が取り出されるように、チップ５００におけるマイクロ流路の形状を設定する。
【００６８】
ここで、血液中に循環しているＣＴＣは極微量であり、がん患者であっても、一般的に血液１０ｍＬ中に数個から千個程度しか存在しないといわれている。したがって、第１試料に含まれるＣＴＣも極微量となる。上記のチップ５００を用いることにより、ＣＴＣ以外の他の粒子を含む第２試料が除去されるが、白血球は、ＣＴＣと同程度の大きさを有するものも多数存在するため、第１試料には依然としてある程度の白血球が残っている。
【００６９】
なお、上述の例では、溶血剤を用いて赤血球の除去を行ったがこれに限らず、渦巻き状の流路により、ＣＴＣと赤血球との直径の違いに基づいてＣＴＣと赤血球とを分離してもよい。
【００７０】
図３に戻り、ＣＴＣの蛍光標識工程Ｓ１５において、他の粒子の除去工程Ｓ１４で取得された第１試料において、ＣＴＣの標的部位が蛍光標識される。たとえば、蛍光標識の対象となる標的部位は、核、Ｈｅｒ２遺伝子、および１７番染色体のセントロメア領域（ＣＥＰ１７）である。なお、蛍光標識される標的部位は、細胞の部位であればよい。標的部位は、遺伝子や核に限らず、たとえば、細胞のタンパク質、細胞質、細胞膜、細胞膜上の表面抗原でもよい。標的部位の蛍光標識は、インサイチュハイブリダイゼーションや特異的な染色に基づいて行われることに限らず、抗原抗体反応に基づく免疫染色によって行われてもよい。標的部位が遺伝子の場合、Ｈｅｒ２遺伝子やＣＥＰ１７に限らず、他の遺伝子領域であってもよい。このように標的部位が蛍光標識されると、後述する図７に記載の試料測定装置１０における分析工程Ｓ２６において、測定試料に含まれる標的粒子を識別して分析できる。
【００７１】
続いて、第２遠心分離工程Ｓ１６において、標的部位が蛍光標識されたＣＴＣを含む試料に対して、遠心分離等の処理が行われ、遠心分離後の上清が除去される。これにより、試料に含まれるＣＴＣが残存した状態で液量が低下し、ＣＴＣの濃度が増加する。こうして、試料測定装置１０に供するための測定試料が得られる。
【００７２】
上述したように、赤血球は、赤血球の溶血工程Ｓ１２および第１遠心分離工程Ｓ１３によりほぼ除去され、血小板および溶血されずに残った赤血球は、他の粒子の除去工程Ｓ１４においてほぼ除去される。一方、白血球は、他の粒子の除去工程Ｓ１４を経ても試料中に残存することとなる。具体的には、ＣＴＣは、測定試料中に数個〜数百個程度含まれることに対し、白血球は、測定試料中に１万弱〜２０万個程度含まれる。このように、前処理によって得られる測定試料には、他の粒子として多数の白血球が含まれる。
【００７３】
ここで、以降の分析において、ＣＴＣは分析の対象となる標的粒子であることに対し、白血球は分析対象ではない他の粒子である。したがって、白血球は、分析の観点からすれば本来は不要な粒子である。しかしながら、図７を参照して説明する測定の成否の判定工程Ｓ２５においては、本来は分析に不要である白血球の計数値を用いて、試料測定装置１０による標的粒子の測定が適正に行われたか否かが判定される。測定の成否の判定については、追って図７を参照して説明する。
【００７４】
図５は、検出部１００の構成を示す模式図である。
【００７５】
検出部１００は、フローセル１１０と、４つの光源１２１〜１２４と、７つの集光レンズ１３１〜１３７と、３つのダイクロイックミラー１４１〜１４３と、光学格子１５１と、光検出器１５２と、反射ユニット１６０と、撮像部１７０と、を備える。図５には、互いに直交するＸＹＺ軸が示されている。
【００７６】
フローセル１１０の流路１１１には、測定試料がＺ軸正方向に流される。４つの光源１２１〜１２４は、フローセル１１０を流れる測定試料に光を照射する。４つの光源１２１〜１２４は、半導体レーザ光源により構成される。４つの光源１２１〜１２４から出射される光は、それぞれ、波長λ１１、λ１２、λ１３、λ１４の互いに異なる波長のレーザ光である。４つの集光レンズ１３１〜１３４は、それぞれ、４つの光源１２１〜１２４から出射された光を集光する。ダイクロイックミラー１４１は、波長λ１１の光を透過させ、波長λ１２の光を反射する。ダイクロイックミラー１４２は、２つの波長λ１１、λ１２の光を透過させ、波長λ１３の光を反射する。こうして、３つの波長λ１１、λ１２、λ１３の光は、流路１１１を流れる測定試料に対してＸ軸正方向に照射される。波長λ１４の光は、流路１１１を流れる測定試料に対してＹ軸正方向に照射される。
【００７７】
ここで、核と２つの遺伝子をそれぞれ標識する蛍光色素は、波長λ１１の励起光が照射されることにより波長λ２１の蛍光を生じる蛍光色素、波長λ１２の励起光が照射されることにより波長λ２２の蛍光を生じる蛍光色素、波長λ１３の励起光が照射されることにより波長λ２３の蛍光を生じる蛍光色素、の中から選択される。３つの波長λ２１、λ２２、λ２３の蛍光がそれぞれ撮像されることにより、標的部位である核と２つの遺伝子に関する蛍光画像を取得できる。
【００７８】
フローセル１１０を流れる測定試料に３つの波長λ１１、λ１２、λ１３の光が照射されると、ＣＴＣの標的部位を標識している蛍光色素から蛍光が生じる。また、フローセル１１０を流れる測定試料に波長λ１４の光が照射されると、この光は細胞を透過する。細胞を透過した波長λ１４の光は、明視野画像の生成に用いられる。集光レンズ１３５は、測定試料から生じた４つの波長λ２１、λ２２、λ２３、λ１４の光を集光する。
【００７９】
ここで、フローセル１１０には測定試料とともに、参照粒子を含む参照液が流される。参照粒子は、測定試料に含まれる粒子とは異なり、流路１１１内の流速を監視するために用いられる非生物粒子である。参照粒子は、たとえば、ラテックス等の重合体や、無機物などである。参照粒子は、光が照射された場合に、測定試料に含まれる細胞等の他の粒子よりも強い散乱光を生じる光学特性を有する。
【００８０】
測定試料とともに流路１１１を流れる参照粒子に、波長λ１１の光が照射されると、参照粒子から散乱光が生じる。ダイクロイックミラー１４３は、参照粒子から生じた波長λ１１の散乱光を反射し、波長λ１１以外の波長帯の光を透過する。光学格子１５１は、Ｚ軸方向に透明部分と不透明部分とが交互に配置された格子構造を備える。波長λ１１の散乱光が光学格子１５１に入射すると、散乱光の強度は、光学格子１５１により変調される。集光レンズ１３６は、光学格子１５１で生じた変調光を集光する。光検出器１５２は、集光レンズ１３６により集光された変調光を受光する。光検出器１５２は、たとえば、光電子増倍管やフォトダイオードにより構成される。制御部１１（図２参照）は、光検出器１５２の検出信号に基づいて、フローセル１１０をＺ軸方向に流れる測定試料の流速を算出する。
【００８１】
反射ユニット１６０は、４枚のダイクロイックミラーが組み合わせられた構成を有する。反射ユニット１６０の４枚のダイクロイックミラーは、４つの波長λ２１、λ２２、λ２３、λ１４の光を互いに僅かに異なる角度で反射し、撮像部１７０の受光面上において分離させる。集光レンズ１３７は、反射ユニット１６０で反射された光を集光する。
【００８２】
撮像部１７０は、ＴＤＩ（Time Delay Integration）カメラにより構成される。撮像部１７０は、３つの波長λ２１、λ２２、λ２３の蛍光と波長λ１４の光とを、参照粒子に基づいて得られる流速に基づいて撮像し、測定試料中の粒子の画像として、３つの波長λ２１、λ２２、λ２３の蛍光にそれぞれ対応した蛍光画像と、波長λ１４の光に対応した明視野画像とを生成する。制御部１１は、撮像部１７０により生成された蛍光画像および明視野画像を記憶部１２に記憶させる。
【００８３】
ここで、撮像部１７０は、ＴＤＩカメラにより構成される。撮像部１７０の受光面で受光した光を、光検出器１５２を用いて算出した流速に基づいて積算して蛍光画像および明視野画像を生成する。これにより、蛍光画像および明視野画像の品質を高めることができる。また、撮像部１７０により撮像画像が取得されると、後段の分析工程Ｓ２６（図７参照）において、撮像画像を用いて測定試料に含まれる粒子を精度よく分析できる。
【００８４】
図６は、フローセル１１０に測定試料、参照液およびシース液を流すための検出部１００の構成を示す模式図である。
【００８５】
検出部１００は、図５で示した構成に加えて、第１の送液ユニット２１０と、第２の送液ユニット２２０と、第３の送液ユニット２３０と、チャンバ２４０と、５つの流路２５１〜２５５と、を備える。
【００８６】
第１の送液ユニット２１０は、測定試料をフローセル１１０に送液するための構成である。第１の送液ユニット２１０は、シリンジ２１１と、作動子２１２と、駆動機構２１３と、を備える。作動子２１２は、シリンジ２１１に挿入され、プランジャーやピストンなどにより構成される。駆動機構２１３は、作動子２１２を移動させ、モーターなどにより構成される。
【００８７】
第２の送液ユニット２２０は、参照粒子を含む参照液をフローセル１１０に送液する。第２の送液ユニット２２０も、第１の送液ユニット２１０と同様に構成され、シリンジ２２１と、作動子２２２と、駆動機構２２３と、を備える。第３の送液ユニット２３０は、フローセル１１０に対して２つ設けられており、シース液をフローセル１１０に送液する。第３の送液ユニット２３０も、第１の送液ユニット２１０と同様に構成され、シリンジ２３１と、作動子２３２と、駆動機構２３３と、を備える。シース液の送液の際、２つの第３の送液ユニット２３０は交互にシース液を送液し、一方の第３の送液ユニット２３０がシース液を送液している間、他方の第３の送液ユニット２３０はシリンジ２３１にシース液を充填する。これにより、シース液が途切れることなくフローセル１１０に送液される。
【００８８】
なお、第１の送液ユニット２１０、第２の送液ユニット２２０、および第３の送液ユニット２３０は、ダイヤフラムポンプであってもよく、コンプレッサーなどの圧力源に接続された電空変換器で発せられる気圧を用いて液体を移送してもよい。
【００８９】
チャンバ２４０には、前処理工程において調製された測定試料が収容される。流路２５１は、第１の送液ユニット２１０と接続点２５６とを接続する。流路２５２は、第２の送液ユニット２２０と接続点２５６とを接続する。流路２５３は、第３の送液ユニット２３０とフローセル１１０とを接続する。流路２５４は、チャンバ２４０と接続点２５６とを接続する。流路２５５は、接続点２５６とフローセル１１０とを接続する。
【００９０】
検出部１００による検出の際には、第１の送液ユニット２１０が、２つの流路２５１、２５４を介して、チャンバ２４０内の測定試料を、接続点２５６と第１の送液ユニット２１０の間まで引き込む。続いて、２つの第３の送液ユニット２３０のいずれか一方が、流路２５３を介してフローセル１１０にシース液を送液し、第２の送液ユニット２２０が、２つの流路２５２、２５５を介してフローセル１１０に参照粒子を含む参照液を送液する。制御部１１（図２参照）が、光検出器１５２（図５参照）の検出信号に基づいて、フローセル１１０の流路１１１内の流速が所定の値になったと判定すると、第１の送液ユニット２１０は、流路２５１に引き込んだ測定試料を、２つの流路２５１、２５５を介してフローセル１１０に送液する。そして、上述したように、フローセル１１０の流路１１１を流れる測定試料に、４つの波長λ１１、λ１２、λ１３、λ１４の光が照射される。
【００９１】
（試料測定装置１０の動作）
図７は、実施形態１の試料測定装置１０の動作を示すフローチャートである。図７に示す各工程は、オペレータが試料測定装置１０に指示を入力し、試料測定装置１０が入力された指示に応じて各工程を実行することにより行われる。図７に示す各工程は、試料測定装置１０により自動的に行ってもよいし、図７に示す工程の一部または全部をオペレータが手動で行ってもよい。
【００９２】
検出工程Ｓ２１において、図２に記載の試料測定装置１０の制御部１１は、図５に記載の検出部１００を駆動して、前処理で調製された所定量の測定試料をフローセル１１０の流路１１１に流し、流路１１１を流れる測定試料に含まれる粒子を検出する。具体的には、図５に記載の撮像部１７０は、一定の検出期間の間に、流路１１１を流れる測定試料に含まれる各粒子から蛍光画像および明視野画像を撮像する。図２に記載の制御部１１は、撮像された蛍光画像および明視野画像を、撮像された時間に関連する情報とともに記憶部１２に記憶する。
【００９３】
ここで、上述したように、測定試料に含まれる白血球は、１万弱〜２０万個程度であり、測定試料に含まれるＣＴＣは、数個〜数百個程度である。このように、測定試料中の粒子のうち白血球が大部分を占めているため、検出工程Ｓ２１で検出される粒子の大半は白血球である。
【００９４】
計測工程Ｓ２２において、制御部１１は、時間に関連する情報とともに記憶部１２に記憶された明視野画像に基づいて、フレーム毎に粒子の数を計測し、フレーム毎の粒子数を取得する。１フレームは、単位時間に相当し、たとえば２０秒である。明視野画像を用いることにより、精度よく粒子数を計測できる。また、実施形態１では、検出工程Ｓ２１で検出される粒子の大半は白血球であるため、計測工程Ｓ２２で取得される計数値は、ほぼ白血球に基づくものである。
【００９５】
なお、所定量の測定試料とは、前処理で調製された測定試料の一部または全部を示す。実施形態１では、希少細胞であるＣＴＣが分析の対象であるため、測定試料の全量をフローセル１１０に流し、検出部１００により検出することが好ましい。また、実施形態１の検出部１００は、フローセル１１０に設けられた流路１１１を流れる測定試料に対して光を照射し、測定試料から生じた光を測定する光学式の検出部であったが、これに限らず、流路を流れる測定試料に対して電流を流し、電気抵抗の変化に基づいて粒子を検出する電気抵抗方式の検出部でもよい。
【００９６】
図８（ａ）は、計測工程Ｓ２２において単位時間ごとに検出された粒子の数を模式的に示す計測粒子数のグラフである。各グラフにおいて、横軸は測定時間における経過時間を示し、縦軸は、各単位時間において計測された粒子数を示す。
【００９７】
計測工程Ｓ２２において、制御部１１は、撮像部１７０により取得された明視野画像に基づいて、単位時間ごとに粒子数を計測する。グラフ上の１つのプロットは、単位時間である２０秒の間に計測された粒子数を示している。また、図８（ａ）に示すように、測定試料の送液は、グラフの左端に位置するＴｍｉｎにおいて開始され、グラフの右端に位置するＴｍａｘで終了している。言い換えれば、Ｔｍｉｎ〜Ｔｍａｘの期間で測定試料の全量の検出が完了している。図８（ａ）に示す例では、安定的に粒子が検出されている時間帯があるものの、一部の時間帯Ｔａ３１、Ｔａ３２において粒子の検出が行われておらず、検出に不具合が生じている可能性がある。
【００９８】
このような検出の不具合は、たとえば、図６に記載のシース液を送液する２つの第３の送液ユニット２３０が切り替えられたことによりシース液に送液の乱れが生じた場合に生じることがある。また、検出の不具合は、図５に記載の撮像部１７０のフォーカスずれにより粒子が識別されなかった場合、参照粒子に基づいて得られる流速とＴＤＩカメラの積算速度が適正に同期できなかった場合、光源１２４から適正に光が出射されなかった場合、撮像部１７０において適正に明視野画像が生成されなかった場合、などに起こり得る。
【００９９】
なお、図８（ｂ）、（ｃ）は、図８（ａ）のグラフに基づくグラフである。図８（ｂ）、（ｃ）のグラフについては、追って推定値の取得工程Ｓ２３および検出率の取得工程Ｓ２４において説明する。
【０１００】
図７に戻り、推定値の取得工程Ｓ２３において、制御部１１は、計測工程Ｓ２２において単位時間ごとに取得した粒子数に基づいて、検出工程Ｓ２１において検出が期待される粒子の数に関する推定値を取得する。
【０１０１】
推定値の取得工程Ｓ２３において、制御部１１は、計測粒子数のグラフに対応する測定データから近似式を算出し取得する。図８（ａ）に示す計測粒子数のグラフの場合、制御部１１は、検出に不具合が生じている可能性のある時間帯を除外し、図８（ｂ）に示すように、除外後のその他の時間帯における計測粒子数に基づいて、計測粒子数の近似式を取得する。近似式は、検出された粒子の数の時間的変化を近似する直線である。そして、制御部１１は、近似式に基づいて推定値を取得する。
【０１０２】
図９は、推定値の取得工程Ｓ２３の詳細を示すフローチャートである。
【０１０３】
平均値の算出工程Ｓ１０１において、制御部１１は、図８（ａ）のグラフに対応する測定データに基づいて、単位時間における計測粒子数が１以上である期間の計測粒子数の平均Ｖ１を算出する。続いて、１ＳＤの値の算出工程Ｓ１０２において、制御部１１は、単位時間における計測粒子数が１以上である期間における計測粒子数の１ＳＤの値Ｖ２を算出する。続いて、閾値の算出工程Ｓ１０３において、制御部１１は、平均値の算出工程Ｓ１０１で算出した平均Ｖ１から１ＳＤの値の算出工程Ｓ１０２で算出した値Ｖ２を減算して、閾値Ｎｔｈを算出する。図８（ｂ）に示す破線の細い直線は、閾値Ｎｔｈを示している。
【０１０４】
ここで、平均Ｖ１は、検出に不具合が生じていないと判断される時間帯において、単位時間にどれだけの計測粒子数が取得されるかを示す値である。また、値Ｖ２は、検出に不具合が生じていないと判断される時間帯において、計測粒子数が平均Ｖ１に対してどの程度ばらついているかを示す値である。したがって、平均Ｖ１−値Ｖ２により算出される閾値Ｎｔｈは、検出に不具合が生じていないと判断される時間帯における、計測粒子数の値の範囲の１ＳＤの下限を示していることになる。計測粒子数が閾値Ｎｔｈ以上であれば、対象となる時間帯において粒子が検出されたと判断し、計測粒子数が閾値Ｎｔｈ未満であれば、対象となる時間帯において粒子が検出されなかったと判断する。
【０１０５】
続いて、近似式の取得工程Ｓ１０４において、制御部１１は、図８（ａ）のグラフから閾値Ｎｔｈ以上の計測粒子数のみを図８（ｂ）のグラフに示すように抽出し、図８（ｂ）に示すグラフに対応するデータに基づいて、計測粒子数の一次線形回帰式を近似式として取得する。破線の太い直線は、一次線形回帰式を示している。このように、一次線形回帰式は、測定において粒子が検出されなかったと判断された時間帯を除外して求められる。具体的には、この近似式は、Ｔ秒〜Ｔ＋２０秒の２０秒間で検出が期待される粒子の数を表している。
【０１０６】
なお、ここで、近似式の算定に一次線形回帰式を用いたが、これに限られず、たとえば、多項式近似を行ってもよい。また、検出に不具合が生じている可能性のある時間帯を除外するための閾値Ｎｔｈは、上記のような算出手順により算出されることに限らない。
【０１０７】
続いて、推定値の算出工程Ｓ１０５において、制御部１１は、図８（ｂ）に示すような近似式で規定される粒子の総数を推定値として取得する。この推定値は、今回の測定において、検出が期待される粒子の数の推定値、すなわち検出の不具合がなければ取得されたであろう総粒子数の推定値を意味している。
【０１０８】
具体的には、制御部１１は、近似式の取得工程Ｓ１０４で取得した近似式を、ＴｍｉｎからＴｍａｘまで積分して推定値を算出する。ここで、図８（ｂ）のグラフ上の１つのプロットは、２０秒間に検出された粒子の数を示している。したがって、近似式を積分する場合には、あらかじめ近似式を縦軸方向に１／２０に縮小する必要がある。たとえば、横軸方向の時間をＴ、縦軸方向の計測粒子数をＮとすると、近似式はＮ＝−ａＴ＋ｂとして表される。この場合、近似式を縦軸方向に１／２０に縮小すると、新たに設定される近似式はＮ＝（−ａＴ＋ｂ）／２０となる。制御部１１は、このように１／２０に縮小した近似式をＴｍｉｎからＴｍａｘにわたって積分して推定値を算出する。
【０１０９】
なお、グラフ上にプロットされる計測粒子数は、標的粒子の計測粒子数と他の粒子の計測粒子数とを含んでいる。したがって、推定値の算出工程Ｓ１０５において算出される推定値は、測定において検出が期待される標的粒子の数と、測定において検出が期待される他の粒子の数との和である。このように、推定値は、少なくとも測定において検出が期待される他の粒子の数を含んでいればよく、測定において検出が期待される標的粒子の数を含んでいてもよい。
【０１１０】
また、この推定値は、近似式と、時間Ｔｍｉｎに対応する縦方向の直線と、時間Ｔｍａｘに対応する縦方向の直線と、計測粒子数＝０に対応する横方向の直線とに囲まれた四角形の面積Ａに対応する。面積Ａは、検出に不具合がない場合に、測定において検出されることが予想される粒子の数であり、測定試料中の総粒子数を反映する推定値である。こうして、推定値の取得工程Ｓ２３における推定値の取得が終了する。
【０１１１】
図７に戻り、検出率の取得工程Ｓ２４において、制御部１１は、推定値の取得工程Ｓ２３で取得した推定値と、検出工程Ｓ２１において実際に検出された粒子の数と、に基づいて検出率を取得する。
【０１１２】
図１０は、検出率の取得工程Ｓ２４の詳細を示すフローチャートである。
【０１１３】
実測値の算出工程Ｓ１１１において、制御部１１は、測定において実際に検出された粒子の数（実測値）を算出する。測定において実際に検出された粒子の数は、単位時間ごとの計測粒子数の合計である。図８（ｃ）に示す例では、単位時間ごとの計測粒子数の合計は、面積Ａ１＋Ａ２＋Ａ３＋Ａ４に対応する。
【０１１４】
続いて、検出率の算出工程Ｓ１１２において、制御部１１は、測定試料中の総粒子数（推定値）と、実測値の算出工程Ｓ１１１で算出した、測定において実際に検出された粒子の数（実測値）と、の比に基づいて、検出率を算出する。測定試料中の総粒子数として、図７に示した推定値の取得工程Ｓ２３で取得した推定値が用いられる。具体的には、制御部１１は、実際に検出された粒子の数（実測値）を、不具合がない場合に予想される計測粒子数（推定値）で除算して、検出率を取得する。図８（ａ）〜（ｃ）に示す例では、検出率は、（Ａ１＋Ａ２＋Ａ３＋Ａ４）／Ａに対応する。こうして、検出率の取得工程Ｓ２４における検出率の取得が終了する。
【０１１５】
なお、検出率の算出工程Ｓ１１２において、演算に用いられる推定値および実測値は、標的粒子と他の粒子の両方に基づく値であるため、算出される検出率は、測定試料に含まれる粒子全体の検出率である。しかしながら、これに限らず、検出率の算出工程Ｓ１１２で算出される検出率は、標的粒子の検出率に関する値、すなわち測定試料の測定において測定試料に含まれる標的粒子がどの程度の割合で検出できたかを反映した数値であればよい。たとえば、検出率の算出工程Ｓ１１２で算出される検出率は、他の粒子のみの検出率でもよい。
【０１１６】
ここで、図１１（ａ）、（ｂ）および図１２（ａ）、（ｂ）を参照して、実際に発明者らが測定成否判定方法の検証で取得したグラフに基づいて検出率を取得した手順について説明する。
【０１１７】
図１１（ａ）、（ｂ）および図１２（ａ）、（ｂ）は、計測工程Ｓ２２において単位時間ごとに検出された粒子の数を示すグラフである。図１１（ａ）に示すグラフでは、破線で示す閾値Ｎｔｈの直線よりも上側に位置する大部分の時間帯において、安定的に１５０個前後の細胞が計測されている。図１２（ａ）に示す例では、破線で示す閾値Ｎｔｈの直線よりも下側に位置する時間帯が長く、全体として検出に不具合が生じている可能性がある。なお、測定試料の送液は、グラフの左端に位置する０秒において開始され、グラフの右端に位置する４５００秒で終了している。
【０１１８】
図１１（ａ）に示す計測粒子数のグラフの場合、計測粒子数が１以上である計測粒子数の平均Ｖ１は、１４４．２であった。計測粒子数が１以上である計測粒子数の１ＳＤの値Ｖ２は、３０．７であった。閾値Ｎｔｈは、平均Ｖ１−値Ｖ２に基づいて算出し、１１３．４とした。図１１（ｂ）のグラフは、図１１（ａ）のグラフから閾値Ｎｔｈ以上の計測粒子数のみを抽出したものである。図１１（ｂ）のグラフにおいて、太い直線に示すように、計測粒子数の一次線形回帰式を取得した。この場合、一次線形回帰式はｙ＝０．００２４ｘ＋１４６．９２であり、決定係数は０．０２３６であった。
【０１１９】
続いて、図１１（ｂ）に示す近似式で規定される粒子の総数が推定値として取得される。近似式に基づく直線と、時間＝０に対応する縦方向の直線と、時間＝４５００に対応する縦方向の直線と、計測粒子数＝０に対応する横方向の直線とに囲まれた四角形に基づいて面積が算出される。図１１（ｂ）のグラフでは、推定値に相当する面積は３４２６９．２となった。また、図１１（ａ）のグラフにおいて、全時間帯における計測粒子数の合計は３１１４０であった。したがって、検出率は、３１１４０／３４２６９．２＝９０．９％となった。
【０１２０】
図１２（ａ）に示す計測粒子数のグラフの場合、計測粒子数が１以上である計測粒子数の平均Ｖ１は、２５．１であった。計測粒子数が１以上である計測粒子数の１ＳＤの値Ｖ２は、１１．３であった。閾値Ｎｔｈは、平均Ｖ１−値Ｖ２に基づいて算出し、１３．８とした。図１２（ｂ）のグラフは、図１２（ａ）のグラフから、閾値Ｎｔｈ以上の計測粒子数のみを抽出したものである。図１２（ｂ）のグラフにおいて、太い直線に示すように、計測粒子数の一次線形回帰式を取得した。この場合、一次線形回帰式はｙ＝−０．００１５ｘ＋３３．７３２であり、決定係数は０．０７４９であった。
【０１２１】
続いて、図１２（ｂ）に示す近似式で規定される粒子の総数が推定値として取得される。図１２（ｂ）のグラフでは、推定値に相当する面積は６８２７．９２となった。また、図１２（ａ）のグラフにおいて、全時間帯における計測粒子数の合計は３４０９であった。したがって、検出率は、３４０９／６８２７．９２＝４９．９％となった。
【０１２２】
図７に戻り、測定の成否の判定工程Ｓ２５において、制御部１１は、検出率と、判定のための閾値Ｒｔｈとを比較することにより、標的粒子の測定の成否を判定する。
【０１２３】
図１３は、測定の成否の判定工程Ｓ２５の詳細を示すフローチャートである。
【０１２４】
閾値の読み出し工程Ｓ１２１において、制御部１１は、閾値Ｒｔｈを記憶部１２（図２参照）から読み出す。閾値Ｒｔｈは、どの程度の粒子を検出する必要があるかに基づいて決められる。たとえば、検出率の目標値として８０％を設定した場合、検出率が８０％の−２ＳＤ以上、すなわち６４％以上であることが好ましいと考えられため、閾値Ｒｔｈは６４％に設定される。なお、閾値Ｒｔｈは、目標値の−２ＳＤ以上に限らず、目標値の−１ＳＤ以上であってもよい。また、閾値Ｒｔｈは、試料測定装置１０を使用する施設の運用などによって異なるため、制御部１１は、オペレータによる入力部１４（図２参照）を用いた入力に応じて、閾値Ｒｔｈを変更してもよい。これにより、病院の要望や検査施設の運用等に合わせて閾値Ｒｔｈを設定できる。
【０１２５】
判定工程Ｓ１２２において、制御部１１は、図７に示した検出率の取得工程Ｓ２４で取得した検出率が、閾値の読み出し工程Ｓ１２１で読み出した閾値Ｒｔｈ以上であるか否かを判定する。検出率が閾値Ｒｔｈ以上である場合、適正判定工程Ｓ１２３において、制御部１１は、図７に示した検出工程Ｓ２１で行われた検出が適正であったとして、標的粒子の測定が適正であったと判定する。他方、検出率が閾値Ｒｔｈ未満である場合、不適正判定工程Ｓ１２４において、制御部１１は、図７に示した検出工程Ｓ２１で行われた検出が不適正であったとして、標的粒子の測定が不適正であったと判定する。
【０１２６】
閾値Ｒｔｈが６４％に設定された場合、図１１（ａ）、（ｂ）に示す例では、検出率は９０．９％であったため、制御部１１は、標的粒子の測定が適正であったと判定する。一方、図１２（ａ）、（ｂ）に示す例では、検出率は４９．９％であったため、制御部１１は、標的粒子の測定が不適正であったと判定する。
【０１２７】
このように標的粒子の測定の成否を判定できると、測定試料に含まれる標的粒子が実際に少ないために検出された標的粒子の数が少なかったのか、検出の不具合により検出された標的粒子の数が少なかったのかを判別できる。したがって、測定試料に含まれる標的粒子の数が取得される際に、あわせて標的粒子の測定の成否が得られると、測定の成否に基づいて、測定試料に含まれる標的粒子を適正に評価できる。たとえば、標的粒子が希少細胞であり、標的粒子の数に基づいて疾患の状態が判断される場合、測定が適正に行われた場合に標的粒子の数に基づいて疾患の状態を適正に判断できる。これにより、たとえば疾患の状態の判断において、不適正な測定によって標的粒子の数が誤って少なくなるために生じる偽陰性を抑制できる。
【０１２８】
また、検出の不具合は検出ごとに都度発生することがあるが、実施形態１では、実際に行う測定における検出結果に基づいて測定の成否が判定される。したがって、測定試料の測定ごとに測定が正しく行われたかを判定できる。
【０１２９】
また、測定の成否の判定工程Ｓ２５では、測定試料の大半を占める白血球の計数値に基づく検出率を用いて、試料測定装置１０による測定が適正に行われたか否かが判定される。このように、実施形態１では、本来は分析の対象ではない他の粒子を利用して、標的粒子の測定の成否の判定が行われる。
【０１３０】
なお、図１０に示した検出率の算出で算出される検出率は、推定値と、測定試料の測定において実際に検出された粒子の数と、に応じた値であればよく、上記のように、推定値に対する測定試料の測定において実際に検出された粒子の数の割合に限らず、たとえば、測定試料の測定において実際に検出された粒子の数に対する推定値の割合でもよい。この場合、検出率が小さいほど測定が適正と判定できる。したがって、この場合、制御部１１は、検出率が閾値Ｒｔｈ以下であれば、図７に示した検出工程Ｓ２１で行われた検出が適正であったと判定して測定が適正であったと判定し、検出率が閾値Ｒｔｈより大きければ、図７に示した検出工程Ｓ２１で行われた検出が不適正であったと判定して測定が不適正であったと判定する。また、検出率は、割合に限らず、推定値と、測定試料の測定において実際に検出された粒子の数と、の差に応じた値であってもよい。
【０１３１】
図７に戻り、分析工程Ｓ２６において、制御部１１は、検出工程Ｓ２１で取得した検出結果、すなわち記憶部１２に記憶した蛍光画像に基づいて、標的粒子であるＣＴＣの分析を行う。
【０１３２】
具体的には、制御部１１は、Ｈｅｒ２遺伝子を標識する蛍光色素から生じた蛍光画像と、ＣＥＰ１７を標識する蛍光色素から生じた蛍光画像において、輝点を抽出する。制御部１１は、細胞ごとに、Ｈｅｒ２遺伝子に基づく輝点数をＣＥＰ１７に基づく輝点数で除算し、算出した値が１より大きい場合に、この細胞においてＨｅｒ２遺伝子が増幅していると判定する。そして、制御部１１は、Ｈｅｒ２遺伝子が増幅している陽性細胞をＣＴＣとして判定する。そして、制御部１１は、判定したＣＴＣの数や、撮像部１７０により撮像された全細胞に対するＣＴＣの割合などを取得する。
【０１３３】
なお、標的粒子が血管内皮細胞（ＣＥＣ）である場合、分析工程Ｓ２６において、ＣＥＣに含まれるタンパク質であるＮＦκＢの、細胞内における局在が解析される。具体的には、前処理において、ＣＥＣは、ＣＥＣに発現する抗体に特異的に結合するＣＤ１４６の標識抗体を介して蛍光標識され、ＮＦκＢは、ＮＦκＢに特異的に結合する標識抗体を介して蛍光標識される。検出工程Ｓ２１において、ＣＥＣに基づく蛍光が撮像され、ＮＦκＢに基づく蛍光が撮像される。そして、分析工程Ｓ２６において、蛍光画像に基づいてＣＥＣが検出され、シグナル分子であるＮＦκＢが核内に局在しているか否かが判定され、ＣＥＣの活性化の有無が判定される。また、標的粒子が肺がん由来のＣＴＣであり、標的部位がサイトケラチンである場合、分析工程Ｓ２６において、サイトケラチンが細胞質内に存在している量に基づいてＣＴＣの検出が行われ、ＣＴＣの数やＣＴＣの割合が取得される。
【０１３４】
表示工程Ｓ２７において、制御部１１は、検出工程Ｓ２１で取得した画像と、測定の成否の判定工程Ｓ２５で取得した判定結果と、分析工程Ｓ２６で取得した分析結果などを表示部１３に表示する。
【０１３５】
図１４、１５は、表示工程Ｓ２７において表示部１３に表示される画面３００の構成を示す模式図である。
【０１３６】
図１４、１５に示すように、画面３００は、分析結果領域３１０と、細胞画像領域３２０と、グラフ領域３３０と、判定結果領域３４０と、を備える。図１４には、図１１（ａ）、（ｂ）のグラフに示す測定試料について表示される画面３００が例示されている。図１５には、図１２（ａ）、（ｂ）のグラフに示す測定試料について表示される画面３００が例示されている。
【０１３７】
図１４、１５に示す例では、標的粒子の測定の成否の判定結果が異なっている。以下、図１４、１５を参照して画面３００の構成を説明する。
【０１３８】
分析結果領域３１０は、分析工程Ｓ２６で取得されたＣＴＣ数やＣＴＣの割合などの、ＣＴＣの数に関する値を表示する。細胞画像領域３２０は、図７に示した検出工程Ｓ２１で取得された蛍光画像を表示する。医師等は、分析結果領域３１０に表示されたＣＴＣの数に関する値と、細胞画像領域３２０に表示された細胞の画像とを参照することにより、検体が採取された被検者に対する診断を行うことができる。
【０１３９】
グラフ領域３３０は、計測粒子数のグラフ３３１、３３２を表示する。グラフ３３１、３３２は、検出された粒子の数の時間的変化を示すグラフである。グラフ３３１は、単位時間ごとの計測粒子数のグラフである。グラフ３３１には、近似式の生成において粒子を除外するための閾値Ｎｔｈが破線で示されている。グラフ３３２は、グラフ３３１から閾値Ｎｔｈ以上の計測粒子数のみが残されたグラフである。グラフ３３２には、グラフ３３２上の計測粒子数に基づいて生成された近似式が示されている。このように、グラフ３３１、３３２が表示部１３に表示されると、オペレータは、グラフ３３１、３３２を参照して、検出結果を把握できる。
【０１４０】
判定結果領域３４０は、実際に検出された粒子の数と、推定値と、検出率と、判定で用いられた閾値Ｒｔｈと、標的粒子の測定の成否の判定結果と、を表示する。図１４に示す例では、検出率が閾値Ｒｔｈ以上であるため、制御部１１は、標的粒子の測定が適正であったと判定し、「測定が正しく行われました。」とのメッセージを判定結果領域３４０に表示している。この場合、オペレータは、測定結果の信頼性が高いことを把握できる。一方、図１５に示す例では、検出率が閾値Ｒｔｈ未満であるため、制御部１１は、標的粒子の測定が不適正であったと判定し、「測定が正しく行われませんでした。」とのメッセージを判定結果領域３４０に表示している。この場合、オペレータは、測定結果の信頼性が低いことを把握できる。このように、標的粒子の測定の成否の判定結果が表示部１３に表示されると、オペレータは、判定結果を参照して標的粒子の測定の成否を円滑に把握できる。
【０１４１】
また、医師等は、測定の成否の判定結果を参照することにより、標的粒子の測定が正しく行われた場合に、分析結果領域３１０と細胞画像領域３２０に基づく診断を行うことができ、標的粒子の測定が正しく行われなかった場合に、分析結果領域３１０と細胞画像領域３２０に基づく診断を保留できる。
【０１４２】
なお、標的粒子の測定が不適正であったと判定した場合には、表示工程Ｓ２７において表示部１３に表示される画面３００において、分析結果領域３１０および細胞画像領域３２０に分析結果および細胞の画像を表示しない構成としてもよい。これにより、標的粒子の測定が不適正であった場合に、医師等が不適切な結果に基づいて被検者に対する診断を行うことを防止できる。
【０１４３】
実施形態１の測定試料は、標的粒子であるＣＴＣに加えて、ＣＴＣよりも数の多い白血球を他の粒子として含んでいる。このように、実施形態１では、測定試料がある程度の数の他の粒子を含んでいるため、上記のような測定の成否の判定が可能となる。したがって、たとえば、測定試料が、希少細胞であるＣＴＣのみを含む場合など、全体として僅かな粒子しか含まない場合は、測定試料に例えばビーズ等の他の粒子を混合して、測定試料中の粒子数をある程度増やすのが好ましい。測定試料中の粒子数が増えると、図７に示した検出工程Ｓ２１で検出される粒子の数が増えるため、上記のような測定の成否の判定が可能となる。
【０１４４】
＜測定成否判定方法の第１の検証＞
次に、発明者らが行った測定成否判定方法の第１の検証について説明する。第１の検証では、上記の実施形態１の手順に基づいて取得した検出率を用いて、真の検出率であるデータ取得率と比較して、測定の成否をどの程度適正に判定できるかを検証した。第１の検証は、以下に示す手順１−１、１−２、１−３、１−４、１−５からなる。
【０１４５】
１−１．測定試料の調製
ＣＴＣモデル細胞株から得られたＣＴＣを、所定の試薬により染色した。そして、ＣＴＣが１８０００個含まれるようにＣＴＣをＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）に添加し、測定試料を調製した。ＣＴＣのカウントは、血球計算盤を用いて顕微鏡により行われた。このような測定試料を８種類調製した。なお、この場合の測定試料は、ＣＴＣ以外の白血球などの血球を含まない。
【０１４６】
１−２．粒子数の計測
手順１−１で調製した８種類の測定試料をそれぞれ試料測定装置１０（図２参照）に供給し、試料測定装置１０において測定試料を測定した。ここでは、測定試料の全量を測定し、測定時間は４５００秒とした。測定によって取得された明視野画像に基づいて、２０秒ごとの計測粒子数を取得した。ここで、８種類の測定試料のうちいくつかの測定試料を測定する際に、フローセル１１０を流れる測定試料に対してフォーカスをずらすことにより、意図的に検出に不具合を生じさせた。
【０１４７】
１−３．データ取得率の算出
８種類の測定試料ごとに、手順１−２の測定で得られた計測粒子数の合計を、元の１８０００個で除算することにより、データ取得率を算出した。粒子数の１８０００は、上述したように、測定試料中の粒子を実際にカウントして取得された値であり、試料測定装置１０に実際に供給された粒子数である。このように、あらかじめ試料測定装置１０に供給された粒子の真の個数が分かると、算出されたデータ取得率は、試料測定装置１０により検出された粒子の検出率を真に反映した値となる。したがって、データ取得率は、測定の成否を確実に判定できる真の検出率と言える。
【０１４８】
１−４．検出率の算出
８種類の測定試料ごとに、上述した実施形態１の手順と同様にして、検出率を算出した。
【０１４９】
具体的には、上述したように、計測粒子数が１以上である計測粒子数の平均Ｖ１を算出し、計測粒子数が１以上である計測粒子数の１ＳＤの値Ｖ２を算出した。そして、平均Ｖ１−値Ｖ２を閾値Ｎｔｈとして、閾値Ｎｔｈ以上の計測粒子数のみを残して計測粒子数のグラフを生成した。そして、生成されたグラフの計測粒子数に基づいて、近似式を取得した。そして、実施形態１の手順と同様にして、近似式を、０秒から４５００秒まで積分して推定値を算出した。そして、手順１−２の測定で得られた計測粒子数の合計を推定値で除算することにより、検出率を取得した。
【０１５０】
１−５．散布図の作成
図１６は、手順１−３で取得したデータ取得率と手順１−４で取得した検出率との散布図である。散布図には、８種類の測定試料について、データ取得率と検出率からなる点がプロットされている。図１６の散布図において、上述したようにいくつかの測定試料を測定する際に意図的に検出に不具合を生じさせたため、いくつかの測定試料においてデータ取得率が低くなっている。作成した散布図に基づいて、一次線形回帰式と決定係数を算出した。一次線形回帰式はｙ＝１．０４６９ｘ−０．０２２４であり、決定係数は０．９７２７であった。
【０１５１】
以上の手順を経て作成された散布図において、決定係数が１に近い値であることから、８種類の測定試料についてプロットされた点は概ね一次線形回帰式に沿って並んでおり、データ取得率と検出率との間には高い相関関係があると言える。
【０１５２】
ここで、手順１−４の検出率の算出に用いられる推定値は、近似式に基づく値であり、試料測定装置１０に供給されたと推定される粒子の個数である。本来、試料測定装置１０においてどれだけの粒子が検出されたかを確実に取得するためには、測定前に測定試料に対して目視等を行って、測定試料に含まれる粒子の真の個数を取得する必要がある。しかしながら、図１６に示すように、推定値に基づく検出率は、測定の成否を確実に反映したデータ取得率との間で相関関係があることが示された。このことから、測定の成否を判定する際にデータ取得率に代えて検出率を用いたとしても、測定の成否を適正に判定できることが示された。
【０１５３】
さらに、図１６に示すように、データ取得率と検出率との間に相関関係があることから、検出率に基づいて測定の精度を評価できることが分かった。たとえば、図１６に示す例の場合、所望のデータ取得率を達成するためには、検出率は、少なくとも所望のデータ取得率と同程度の値以上であるのが好ましいことが分かる。よって、図７に示した測定の成否の判定工程Ｓ２５によれば、検出率が所定の閾値Ｒｔｈよりも大きいか否かに基づいて測定の成否を判定できることが示された。
【０１５４】
＜測定成否判定方法の第２の検証＞
次に、発明者らが行った測定成否判定方法の第２の検証について説明する。第２の検証では、検出率による測定の成否の判定が、計測粒子数のグラフを人目で確認することにより判断される測定の成否に対して一致するか否かを検証した。また、第２の検証では、検出率に基づく測定の成否の判定により、ＣＴＣが適正に検出できたか否かを判定できることを検証した。第２の検証は、以下に示す手順２−１、２−２、２−３、２−４、２−５からなる。
【０１５５】
２−１．測定試料の調製
ＣＴＣモデル細胞株から得られたＣＴＣを、所定の試薬により染色した。そして、ＣＴＣの数をカウントした上で、ＣＴＣを健康人の血液に添加し、測定試料を調製した。ＣＴＣのカウントは、顕微鏡を用いて行われた。このような測定試料を５４種類調製した。なお、この場合の測定試料は、ＣＴＣ以外の白血球などの血球を含む。
【０１５６】
２−２．粒子数の計数
手順２−１で調製した５４種類の測定試料をそれぞれ試料測定装置１０（図２参照）に供給し、試料測定装置１０において測定試料を測定した。ここでは、測定試料の全量を測定し、測定時間は４５００秒とした。測定によって取得された明視野画像に基づいて、２０秒ごとの計測粒子数を取得した。なお、上述した図１１（ａ）、（ｂ）および図１２（ａ）、（ｂ）に、５４種類の測定試料を代表して２つの測定試料の結果をグラフに示している。
【０１５７】
２−３．検出率の算出
５４種類の測定試料ごとに、上述した実施形態１の手順、および、第１の検証の手順１−４と同様にして、検出率を算出した。
【０１５８】
２−４．検出率の分布図の作成
図１７は、測定成否判定方法の検証において作成された分布図である。図１７に示すように、５４種類の測定試料に基づいて取得された検出率をプロットすることにより、分布図が作成された。
【０１５９】
ここで、上述したように、検出率と比較する閾値Ｒｔｈは、どの程度の粒子を検出する必要があるかに基づいて決められる。たとえば、検出率の目標値として８０％を設定した場合、検出率が８０％の−２ＳＤ以上、すなわち６４％以上であることが好ましいとして、閾値Ｒｔｈを６４％に設定してもよい。あるいは、検出率が８０％の−１ＳＤ以上、すなわち７２％以上であることが好ましいとして、閾値Ｒｔｈを７２％に設定してもよい。このような閾値Ｒｔｈの設定は、病院の要望や検査施設の運用等によって異なる。
【０１６０】
図１７の分布図において、閾値Ｒｔｈが６４％と７２％のいずれに設定された場合も、４９種類の測定試料において測定が適正であったと判定され、５種類の測定試料において測定が不適正であったと判定された。発明者らは、測定が適正と判定された測定試料について計測粒子数のグラフを確認したところ、図１１（ａ）、（ｂ）と同様に、計測粒子数が極端に少ない時間帯が短いことが分かった。また、発明者らは、測定が不適正と判定された測定試料について計測粒子数のグラフを確認したところ、図１２（ａ）、（ｂ）と同様に、計測粒子数が極端に少ない時間帯が長いことが分かった。
【０１６１】
以上のように、測定成否判定方法によれば、測定の成否を適正に判定できることが示唆された。
【０１６２】
２−５．ＣＴＣ回収率の算出
図１８（ａ）、（ｂ）は、５４種類の測定試料のうち、図１１（ａ）、（ｂ）および図１２（ａ）、（ｂ）に示す２つの測定試料とは別の測定試料について取得された計測粒子数のグラフである。ここで、閾値Ｒｔｈを７２％とした場合、図１８（ａ）の場合は、検出率が８８．２％であるため検出は適正に行われたと判定され、図１８（ｂ）の場合は、検出率が６８．４％であるため検出は適正に行われなかったと判定された。
【０１６３】
ここで、図１８（ａ）、（ｂ）のそれぞれの測定試料に対して、図７に示した分析工程Ｓ２６と同様にして、ＣＴＣの数を取得した。また、図１８（ａ）、（ｂ）のそれぞれの測定試料に対して、手順２−５で取得したＣＴＣの数を、手順２−１でカウントしたＣＴＣの数で除算することにより、ＣＴＣ回収率を算出した。図１８（ａ）の場合は、ＣＴＣ回収率は３６．７％であり、図１８（ｂ）の場合は、ＣＴＣ回収率は２８％であった。
【０１６４】
図１８（ａ）に示すように測定が適正と判定された場合に、ＣＴＣ回収率が高く、図１８（ｂ）に示すように測定が不適正と判定された場合に、ＣＴＣ回収率が低くなった。したがって、上記のような測定の成否の判定が行われた場合に、測定の成否とＣＴＣ回収率との間に相関関係があることが示唆された。
【０１６５】
＜実施形態２＞
実施形態１では、推定値の取得工程Ｓ２３（図７参照）において、撮像部１７０（図５参照）が撮像した撮像画像に基づく計測粒子数により推定値を生成した。これに対し、実施形態２では、推定値の取得工程Ｓ２３において、図５に示すような４つの光検出器１５２が受光した光に基づく検出信号の値に基づいて推定値を算出する。
【０１６６】
実施形態２では、計測工程Ｓ２２（図７参照）において、制御部１１（図２参照）は、明視野光に対応する波長λ１４の光を受光した光検出器の検出信号を単位時間ごとに積分して、検出信号の値を取得する。推定値の取得工程Ｓ２３（図７参照）において、制御部１１は、単位時間ごとに検出された検出信号の値の時間的変化を近似する近似式を求め、近似式で規定される検出信号の値の総和を推定値として取得する。検出率の取得工程Ｓ２４（図７参照）において、推定値に対する、測定において実際に検出された検出信号の値の総和の割合を検出率として取得する。実施形態２のその他の構成は、実施形態１と同様である。
【０１６７】
図１９（ａ）〜（ｃ）を参照して、実施形態２の推定値および検出率の取得について説明する。
【０１６８】
実施形態２では、波長λ１４の光に基づく検出信号が単位時間ごとに積分され、単位時間ごとに検出信号の値が取得される。図１９（ａ）において、横軸は経過時間を示し、縦軸は、各単位時間における検出信号の値を示す。図１９（ａ）上の１つのプロットは、単位時間において積分された光検出器の検出信号、すなわち単位時間における検出信号の値である。
【０１６９】
制御部１１は、図１９（ａ）の各プロットに対応するデータに基づいて、実施形態１と同様にして、推定値および検出率を取得する。
【０１７０】
具体的には、制御部１１は、図１９（ａ）に対応するデータに基づいて閾値Ｎｔｈを生成し、図１９（ｂ）に示すように、閾値Ｎｔｈ以上の検出信号の値に基づいて近似式を取得する。そして、制御部１１は、近似式を、ＴｍｉｎからＴｍａｘまで積分して推定値を算出する。なお、この場合も、単位時間ごとに検出信号の値が取得されているため、制御部１１は、縦軸方向に１／２０に縮小した近似式をＴｍｉｎからＴｍａｘにわたって積分して推定値を算出する。このように算出された推定値は、今回の測定において、期待される検出信号の合計の推定値、すなわち検出の不具合がなければ取得されたであろう検出信号の合計の推定値を意味している。なお、この推定値は、図１９（ｂ）に示す面積Ａに対応する。
【０１７１】
また、制御部１１は、測定において実際に取得された検出信号の値（実測値）を算出する。測定において実際に取得された検出信号の値は、単位時間ごとの検出信号の値の合計である。図１９（ｃ）に示す例では、単位時間ごとの検出信号の値の合計は、面積Ａ１＋Ａ２＋Ａ３＋Ａ４に対応する。そして、制御部１１は、期待される検出信号の合計（推定値）と、測定において実際に取得された検出信号の値の合計（実測値）と、の比に基づいて、検出率を算出する。たとえば、制御部１１は、実測値に対応する面積を推定値に対応する面積で除算して、検出率を取得する。図１９（ａ）〜（ｃ）に示す例では、検出率は（Ａ１＋Ａ２＋Ａ３＋Ａ４）／Ａに対応する。
【０１７２】
実施形態２においても、検出率と閾値Ｒｔｈとを比較することにより、標的粒子の測定の成否を判定できる。これにより、測定試料に含まれる粒子が実際に少ないために検出された粒子の数が少なかったのか、検出の不具合により検出された粒子の数が少なかったのかを判別できる。
【０１７３】
＜実施形態３＞
図６を参照し、実施形態３では、実施形態１と比較して、第１の送液ユニット２１０が、チャンバ２４０の底部から測定試料を引き込むのではなく、チャンバ２４０の上側から測定試料を引き込むよう構成されている。実施形態３では、測定試料内の粒子が沈降することにより、フローセル１１０に送られる測定試料中の粒子の数が減少し、時間の経過とともに計測粒子数が減少する不具合が起こり得る。この場合、実施形態１の測定成否判定方法によれば、推定値が低くなることにより検出率が高くなるため、測定が不適正にもかかわらず、適正と判定されてしまうおそれがある。
【０１７４】
たとえば、図２０（ａ）に示すような計測粒子数のグラフが取得された場合、このグラフに基づいて近似式を生成すると、図２０（ｂ）のような近似式が生成される。この場合、時間帯Ｔａ１１において計測粒子数が低下しているため、近似式で規定される面積すなわち推定値が小さくなる。このため、図２０（ａ）の計測粒子数の合計を推定値で除算することにより得られる検出率が高くなり、測定が不適正にもかかわらず、適正と判定されてしまう。
【０１７５】
そこで、実施形態３では、全時間帯のうち、粒子沈降が進んでいると判断できる所定タイミング以降の時間帯を除外して近似式が求められる。粒子沈降が進んでいると判断できる所定タイミングは、たとえばストークスの式等、粒子沈降に関する理論式に基づいて決められる。なお、実施形態３のその他の構成は、実施形態１と同様である。
【０１７６】
図２０（ｃ）に示すように、実施形態３では、所定タイミング以降の時間帯Ｔａ１１の計測粒子数を除外し、所定のタイミングより前の時間帯Ｔａ１２の計測粒子数に基づいて近似式が生成される。これにより、図２０（ｃ）の近似式は、図２０（ｂ）で生成された近似式よりも平行に近付けられるため、近似式で規定される面積すなわち推定値は、図２０（ｂ）の場合よりも大きくなる。そして、実施形態３では、図２０（ａ）の計測粒子数の合計を、図２０（ｃ）の近似式に基づいて取得された推定値で除算することにより検出率が求められる。この場合の検出率は、図２０（ｂ）の比較例に比べて小さくなる。したがって、実施形態３によれば、実施形態１と同様に検出率と閾値Ｒｔｈを比較することにより、意図せず粒子沈降が生じた場合でも検出の不具合を判定できる。
【０１７７】
なお、実施形態３では、全時間帯のうち所定タイミング以降の時間帯を除外して近似式が求められたが、これに限らず、全時間帯のうち不具合が前半に生じることが予想される場合は、所定タイミング以前の時間帯を除外して近似式が求められてもよい。また、全時間帯のうち不具合が所定の時間帯に生じることが予想される場合は、所定の時間帯を除外して近似式が求められてもよい。
【０１７８】
＜実施形態４＞
実施形態４では、計測粒子数のグラフにおいて、全時間帯に対する、粒子が適正に検出された時間帯の割合が検出率として取得される。実施形態４のその他の構成は、実施形態１と同様である。
【０１７９】
たとえば、図２１（ａ）に示すような計測粒子数のグラフが取得される場合、制御部１１（図２参照）は、実施形態１と同様にして、図２１（ｂ）に示すように、検出に不具合が生じている可能性を判断するための閾値Ｎｔｈを取得する。そして、制御部１１は、計測粒子数が閾値Ｎｔｈ以上の時間帯の合計時間を取得する。図２１（ａ）、（ｂ）に示す例では、計測粒子数が閾値Ｎｔｈ以上の時間帯の合計時間は、Ｔａ２１＋Ｔａ２２＋Ｔａ２３である。そして、制御部１１は、計測粒子数が閾値Ｎｔｈ以上の時間帯の合計時間を、測定試料の測定における全時間帯の合計時間で除算することにより、検出率を取得する。図２１（ａ）、（ｂ）に示す例では、全時間帯の合計時間は、Ｔａ２０である。したがって、この場合の検出率は、（Ｔａ２１＋Ｔａ２２＋Ｔａ２３）／Ｔａ２０となる。
【０１８０】
以上のように、実施形態４においても、全時間帯に対する、検出が適正に行われたと判断される時間帯の割合が検出率として取得されるため、実施形態１と同様に、標的粒子の測定の成否を判定できる。
【０１８１】
なお、制御部１１は、計測粒子数が閾値Ｎｔｈ未満の時間帯の合計時間を、全時間帯の合計時間で除算することにより、検出率を取得してもよい。図２１（ａ）、（ｂ）に示す例では、この場合の検出率は、｛Ｔａ２０−（Ｔａ２１＋Ｔａ２２＋Ｔａ２３）｝／Ｔａ２０となる。この場合、検出率が閾値Ｒｔｈ以下であれば、測定が適正であると判定され、検出率が閾値Ｒｔｈより大きければ、測定が不適正であると判定される。また、検出率は、（Ｔａ２１＋Ｔａ２２＋Ｔａ２３）／｛Ｔａ２０−（Ｔａ２１＋Ｔａ２２＋Ｔａ２３）｝でもよい。また、上記の検出率の算出式において、分母と分子が逆でもよい。
【０１８２】
また、全血から測定試料が調製される場合には、測定試料に含まれる粒子の数は、測定試料ごとに極端に異なることは少ない。このように測定試料に含まれる粒子の数が大きく変化しない場合には、実施形態３のように時間の比率に基づく検出率により、標的粒子の測定の成否を判定してもよい。これに対し、測定試料に含まれる粒子の数が大きく変化する場合、および、標的粒子の測定の成否をより正確に判断したい場合には、実施形態１のように粒子数の比率に基づく検出率により、標的粒子の測定の成否を判定するのが好ましい。
【符号の説明】
【０１８３】
１０  試料測定装置
１１  制御部
１３  表示部
１００  検出部
１１０  フローセル
１１１  流路
３３１、３３２  グラフ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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