(57)【要約】      （修正有）【課題】クエンチャーを使用することなく、アプタマーを用いてターゲットを分析するための新たな方法を提供する。【解決手段】容器１２内の液相１５において、サンプルと、ターゲットに対する蛍光標識化アプタマーと、アプタマーに結合する相補鎖とを接触させる工程と、外部から、容器の光導入部１２３に蛍光標識に対する励起光を照射し、外部から、容器の光導出部１２４から導出される蛍光標識の蛍光を検出する工程と、検出した蛍光に基づいて、サンプル中のターゲットを分析する工程とを含み、容器は、固定部１２５と、光導入部と、光導出部とを有し、光導入部と光導出部とは、対向する位置関係であり、固定部は、相補鎖が固定されており、光導入部から導入された励起光が到達しない位置、または固定部において生じる得る蛍光が光導出部に到達しない位置にある工程を含む。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
容器内の液相において、サンプルと、ターゲットに対する蛍光標識化アプタマーと、前記アプタマーに結合する相補鎖とを接触させる工程と、
外部から、前記容器の光導入部に前記蛍光標識に対する励起光を照射し、外部から、前記容器の光導出部から導出される前記蛍光標識の蛍光を検出する工程と、
前記検出した蛍光に基づいて、前記サンプル中のターゲットを分析する工程とを含み、
前記容器は、
固定部と、前記光導入部と、前記光導出部とを有し、
前記光導入部と前記光導出部とは、対向する位置関係であり、
前記固定部は、前記相補鎖が固定されており、前記光導入部から導入された励起光が到達しない位置、または前記固定部において生じ得る蛍光が前記光導出部に到達しない位置にあることを特徴とするターゲット分析方法。
【請求項２】
前記容器は、
有底筒状体であり、
その底部の内壁に前記相補鎖が固定されており、
その側壁の一部が、前記光導入部であり、
前記光導入部に対向する側壁の一部が、前記光導出部である、請求項１記載の分析方法。
【請求項３】
前記容器において、前記光導入部および前記光導出部は、光透過性であり、それ以外は、光非透過性である、請求項１または２に記載の分析方法。
【請求項４】
前記相補鎖には、第１結合体が結合されており、
前記固定部には、第２結合体が結合されており、
前記第１結合体と前記第２結合体との結合により、前記固定部に前記相補鎖が固定化されており、
前記第１結合体と前記第２結合体は、一方が、アビジンまたはアビジン類縁体であり、他方が、ビオチンまたはビオチン類縁体である、請求項１から３のいずれか一項に記載の分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ターゲットの分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ターゲットの分析において、前記ターゲットに結合する核酸分子（以下、アプタマーという）を使用する方法が、報告されている。核酸配列は、一般的に、相補性のある配列に対して、配列依存的に結合するが、これとは異なり、前記アプタマーは、前記ターゲットの立体形状を認識して結合することが知られている。
【０００３】
前記アプタマーと前記ターゲットとの結合による前記ターゲットの分析には、例えば、蛍光物質とクエンチャー物質とを利用する方法がある（非特許文献１、２）。この方法では、予め、前記蛍光物質で標識化した蛍光標識アプタマーと、前記クエンチャー物質で標識化したクエンチャー標識相補鎖とを、配列依存的に結合させ、ハイブリッド形成させておく。この際、前記ハイブリットにおいては、前記蛍光標識化アプタマーの蛍光物質が、前記クエンチャー標識相補鎖のクエンチャーにより、消光状態となる。そして、前記ハイブリッドを含む反応系に対して前記ターゲットを添加すると、前記アプタマーは、前記クエンチャー標識相補鎖から解離して前記ターゲットと結合し、蛍光を発する。この蛍光の有無または強度を検出すれば、前記ターゲットの有無または量を分析することができる。
【０００４】
しかしながら、この方法では、消光状態においても、励起光の照射時における蛍光強度がゼロになるわけではなく、例えば、バックグラウンドの上昇、シグナルノイズ（S／N）比の低下等が問題となる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Li et al., “Analytical and Bioanalytical Chemistry” Vol.410, 2018, p.6269-6277
【非特許文献２】Song et al., “Aptamers and Their Biological Applications.” Sensors (Basel) 12, 2012, p.612-631
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで、本発明は、クエンチャーを使用することなく、アプタマーを用いてターゲットを分析するための新たな方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明のターゲット分析方法は、
容器内の液相において、サンプルと、ターゲットに対する蛍光標識化アプタマーと、前記アプタマーに結合する相補鎖とを接触させる工程と
外部から、前記容器の光導入部に前記蛍光標識に対する励起光を照射し、外部から、前記容器の光導出部から導出される前記蛍光標識の蛍光を検出する工程と、
前記検出した蛍光に基づいて、前記サンプル中のターゲットを分析する工程とを含み、
前記容器は、
固定部と、前記光導入部と、前記光導出部とを有し、
前記光導入部と前記光導出部とは、対向する位置関係であり、
前記固定部は、前記相補鎖が固定されており、前記光導入部から導入された励起光が到達しない位置、または前記固定部において生じる得る蛍光が前記光導出部に到達しない位置にあることを特徴とする。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、前記固定部の相補鎖に前記蛍光標識化アプタマーが結合した場合であっても、前記固定部に前記光導入部からの励起光が到達しないため、前記固定部において蛍光が生じることがなく、または、仮に到達しても、前記固定部で生じる蛍光が前記光導出部に到達しないため、前記固定部での蛍光を、外部の検出部が検出することも防止できる。このため、前述のように、例えば、クエンチャーで標識化した相補鎖を使用することなく、前記ターゲットに結合した前記蛍光標識化アプタマーからの蛍光を選択的に検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、本発明で使用する検出系の一例を示す模式図である。
【図２】図２（Ａ）は、実施例１のアプタマーの配列であり、図２（Ｂ）は、実施例１における蛍光強度を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明の分析方法は、例えば、前記容器が、有底筒状体であり、その底部の内壁に前記相補鎖が固定されており、その側壁の一部が、前記光導入部であり、前記光導入部に対向する側壁の一部が、前記光導出部である。
【００１１】
本発明の分析方法は、例えば、前記容器において、前記光導入部および前記光導出部は、光透過性であり、それ以外は、光非透過性である。
【００１２】
本発明の分析方法は、例えば、前記相補鎖には、第１結合体が結合されており、前記固定部には、第２結合体が結合されており、前記第１結合体と前記第２結合体との結合により、前記固定部に前記相補鎖が固定化されており、前記第１結合体と前記第２結合体は、一方が、アビジンまたはアビジン類縁体であり、他方が、ビオチンまたはビオチン類縁体である。
【００１３】
本発明において、「分析」は、例えば、定量分析、半定量分析、定性分析を含む。前記サンプルは、特に制限されない。前記ターゲットは、特に制限されず、目的の物質を設定できる。前記物質は、例えば、タンパク質、ペプチド、低分子化合物等の非核酸物質等があげられる。
【００１４】
前記アプタマーは、特に制限されず、設定したターゲットに結合する核酸分子であればよく、例えば、ＳＥＬＥＸ法等によって調製できる。前記アプタマーは、例えば、一本鎖であり、その長さは、特に制限されず、例えば、１０〜１２０塩基長である。
【００１５】
前記アプタマーを標識化する蛍光標識物質の種類は、特に制限されず、励起光の照射により蛍光を発する物質が使用できる。前記蛍光標識物質は、例えば、Ｃｙ（登録商標）３色素、Ｃｙ（登録商標）５色素、ＦＡＭ色素、ＴＹＥ６６５等があげられる。
【００１６】
前記相補鎖は、クエンチャーで標識されていないクエンチャー非標識相補鎖である。前記相補鎖は、前記アプタマーに配列依存的に結合する核酸配列であればよい。前記相補鎖は、例えば、前記アプタマーの一部または全部に相補的な相補配列を含む。前記相補鎖は、例えば、前記相補配列からなる配列でもよいし、前記相補配列を含む配列でもよい。前記相補配列は、例えば、前記アプタマーの配列情報に基づいて設計できる。前記アプタマーと前記相補配列とをアライメントした際の相補性は、例えば、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、好ましくは１００％である。前記相補鎖は、例えば、一本鎖であり、その長さは、特に制限されず、例えば、１０〜１２０塩基長である。
【００１７】
前記アプタマーおよび前記相補鎖を構成する構成単位は、特に制限されず、天然でもよく、非天然でもよく、例えば、いずれか一方のみで構成されてもよいし、両方を含んで構成されてもよい。前記構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基であり、ヌクレオチドは、例えば、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドおよびそれらの誘導体である。
【００１８】
本発明において使用する容器は、反応系となる液相が収容できる容器であり、前述のように、固定部と、光導入部と、光導出部とを有する。
【００１９】
前記容器において、前記光導入部は、外部から前記容器の内部に光を導入する部位であり、前記光導出部とは、前記容器の内部から外部に光を導出する部位である。前記容器において、前記光導入部と前記光導出部とは、対向する位置関係である。
【００２０】
前記容器における固定部には、前記相補鎖が固定されている。前記容器において、前記固定部は、前記光導入部から導入された励起光が到達しない位置、または前記固定部において生じる得る蛍光が前記光導出部に到達しない位置にある。前記固定部には前記相補鎖が固定されているため、例えば、仮に、前記固定化された相補鎖（固定化相補鎖）に前記蛍光標識化アプタマーが結合し、前記固定部に励起光が到達したとすると、前記固定化相補鎖に結合した前記蛍光標識化アプタマーから蛍光が生じる。しかし、本発明において、前記固定部は、前記容器において、前記光導入部から導入された励起光が到達しない位置にある。したがって、本発明においては、前記固定部の前記固定化相補鎖に結合した前記蛍光標識化アプタマーからの蛍光の発生を防止できる。また、仮に、前記光導入部から導入された励起光が前記固定部に到達したとしても、本発明において、前記固定部は、前記固定部において生じ得る蛍光が前記光導出部に到達しない位置にあるため、前記固定部において前記蛍光標識化アプタマーから発生した蛍光は、前記光導出部には到達しない。このため、本発明においては、前記固定部の前記固定化相補鎖に結合した前記蛍光標識化アプタマーから蛍光が発生しても、その蛍光を、外部の検出部から検出することを防止できる。
【００２１】
前記固定部は、例えば、後述するように、前記容器の内壁であり、前記相補鎖の固定化方法は、特に制限されない。前記相補鎖は、例えば、３’末端において固定化してもよいし、５’末端において固定化してもよい。
【００２２】
前記相補鎖は、例えば、前記容器に対して、直接的に固定化してもよいし、間接的に固定化してもよい。前者の場合、例えば、前記相補鎖との官能基を介したカップリング反応により、前記容器に前記相補鎖を固定化できる。前記官能基は、例えば、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、アルデヒド基等があげられる。また、後者の場合、例えば、非共有結合等が利用でき、具体例としては、例えば、互いに結合する結合体セット（第１結合体と第２結合体との組み合わせ）を使用し、前記第１結合体を、前記容器に結合し、前記第２結合体を、前記相補鎖に結合させる方法があげられる。この場合、前記容器に結合した前記第１結合体が、前記相補鎖に結合した前記第２結合体と結合することにより、前記容器に、前記第１結合体および前記第２結合体を介して、前記相補鎖を固定化できる。前記第１結合体と前記第２結合体との組合せは、特に制限されず、例えば、一方が、ビオチンまたはビオチン類縁体であり、他方が、アビジンまたはアビジン類縁体である。前記ビオチン類縁体は、例えば、デスチオビオチン等であり、前記アビジン類縁体は、例えば、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン等である。
【００２３】
つぎに、本発明の各工程について説明する。本発明の分析工程は、前述のように、接触工程と検出工程と分析工程とを含む。
【００２４】
前記接触工程は、前記容器内の液相において、サンプルと、前記蛍光標識化アプタマーと、前記相補鎖とを接触させる工程である。前記液相は、いわゆる反応系であり、前記溶液中で、前記サンプル中のターゲットと、前記蛍光標識化アプタマーと、前記相補鎖とを接触させ、前記ターゲットと前記蛍光標識化アプタマーとの結合、前記相補鎖と前記蛍光標識化アプタマーとの結合を行える液体溶媒であればよい。前記液相は、例えば、水、緩衝液等が使用でき、前記緩衝液の種類およびｐＨ等は、何ら制限されず、例えば、サンプルおよびターゲットの種類、前記蛍光標識の種類等に応じて、適宜設定できる。
【００２５】
前記検出工程は、外部から、前記容器の光導入部に前記蛍光標識に対する励起光を照射し、外部から、前記容器の光導出部から導出される前記蛍光標識の蛍光を検出する工程である。前記外部からの励起光の照射は、例えば、ＬＥＤ等の光源を用いることができる。具体的には、例えば、前記光源と前記容器との間に励起フィルターを配置し、前記光源（例えば、３５０−７５０ｎｍ）からの光を、前記励起フィルターを通すことによって、目的の波長の光を励起光として取り出し、前記容器の前記光導入部に照射することができる。また、前記光導出部から導出される蛍光の検出は、例えば、受光素子等の検出デバイスを使用できる。具体的には、例えば、前記容器と前記検出デバイスとの間に蛍光フィルターを配置し、前記容器から導出される光を、前記蛍光フィルターを通すことによって取り出し、前記検出デバイスで検出できる。
【００２６】
前記分析工程は、前記検出した蛍光に基づいて、前記サンプル中のターゲットを分析する工程である。前記サンプル中にターゲットが存在しない場合、前記液相中、前記固定部において前記蛍光標識化アプタマーは前記固定化相補鎖と結合し、一方、前記容器内で前記励起光が照射される領域において、フリーの蛍光標識化アプタマーが浮遊することになる。また、前記サンプル中にターゲットが存在する場合、前記液相中、前記蛍光標識化アプタマーは、前記ターゲットの量に応じて前記ターゲットと結合し、その結合体は、前記容器内で前記励起光が照射される領域において、浮遊することとなり、一方、余剰の前記蛍光標識化アプタマーは、前記固定部において前記固定化相補鎖に結合する。このため、前記検出工程において検出した蛍光の有無および蛍光強度は、前記サンプルにおけるターゲットの有無および量に対応することとなる。このため、例えば、検出した蛍光の有無および蛍光強度から、前記サンプルのターゲットを分析できる。
【００２７】
（実施形態１）
本発明の分析方法の一例について、図面を用いて説明する。図１（Ａ）は、前記分析方法に使用する前記容器と分析系の位置関係の一例を示す概略図であり、図１（Ｂ）は、前記容器での反応の一例を示す概略図である。
【００２８】
図１（Ａ）に示すように、容器１２と光源１０との間に励起フィルター１１が配置され、容器１２と検出デバイス１４との間に蛍光フィルター１３が配置されている。そして、図１（Ｂ）に示すように、容器１２は、容器本体１２１と光遮蔽部１２２とを有する。容器本体１２１は、底部の内壁が固定部１２５であり、ストレプトアビジンを介して、ビオチン化相補鎖が固定化されている。容器本体１２１の側壁には、対向する光導入部１２３と光導出部１２４を除き、光遮蔽部１２２が配置されている。光導入部１２３および光導出部１２４は、容器本体１２１の底部から一定距離を置いた位置であり、前記一定距離は、固定部１２５の前記固定化相補鎖に前記蛍光標識化アプタマーが結合した場合でも、光導入部１２３から励起光が到達しない位置、または、前記固定化相補鎖に結合した前記蛍光標識化アプタマーからの蛍光が光導出部１２４に到達しない位置である。
【００２９】
まず、前記相補鎖が予め固定化された容器１２に、前記蛍光標識化アプタマーを注入し、前記相補鎖と前記蛍光標識化アプタマーとを結合させる。そして、前記相補鎖と結合しなかった余剰の前記蛍光標識化アプタマーを、洗浄操作により、容器１２から除去する。つぎに、容器１２に前記サンプルを加え、液相１５中で、前記蛍光標識化アプタマーと前記サンプル中のターゲットとを結合させる。液相１５は、例えば、液体の前記サンプルでもよいし、緩衝液等でもよい。前記サンプル中にターゲットが存在する場合、前記ターゲット量に応じて、容器１２の前記相補鎖に結合した前記蛍光標識化アプタマーが遊離して、前記ターゲットと結合し、ハイブリッド（結合体）を形成する。前記結合体は、液相１５に浮遊した状態となる。そして、前記蛍光標識に対する励起光を、容器１２の光導入部１２３から照射し、前記ハイブリッドが浮遊する液相１５における光導入部１２３と光導出部１２４との間の領域（図１においてドット領域）について、前記蛍光標識の蛍光を生じさせ、光導出部１２４から導出される蛍光を、蛍光フィルター１３を通過させて蛍光デバイス１４で検出する。そして、蛍光デバイスで検出した蛍光強度から、前記サンプル中のターゲットを分析する。
【実施例】
【００３０】
（実施例１）
図２（Ａ）に示すように、アミラーゼアプタマーと、それに対する２種類の相補鎖を調製した。前記アプタマーは、５’を蛍光標識Ｃｙ５で標識化し、下線部のＴは、修飾塩基を使用した。相補鎖１は、前記アプタマーの５’側の１２塩基に相補的な配列とし、その３’をビオチン化し、相補鎖２は、前記１２塩基に相補的な配列の３’に、さらに３塩基を追加し、前記３塩基の３’をビオチン化した。
【００３１】
まず、５ｐｍｏｌのＣｙ５標識化アプタマーと、１００ｐｍｏｌのビオチン化相補鎖１またはビオチン化相補鎖２とに対して、１０ｘバッファー（４００ｍｍｏｌ／Ｌ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１２５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＫＣｌ、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＣｌ２、０．５％  Ｔｗｅｅｎ−２０）５μＬ、および５ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ  １２．５μＬを添加し、蒸留水で５０μＬにメスアップした。この混合液を、９５℃で５分間加熱後、２５℃で３０分間静置して、前記混合液中で前記アプタマーと相補鎖とのハイブリッドを形成した。１ウェルあたり２００μｇのストレプトアビジン固相化磁気ビーズ（商品名Dynabeads（商標）MyOne（商標）Streptavidin C1、65001、Thermo Fisher Scientific社）を含むウェルプレート（商品名MICROPLATE 96WELL U-BOTTOM CRYSTAL CLEAR、650101、greiner社）に対して、前記ハイブリッドを含む前記混合液を、１ウェルあたり５０μＬとなるように加えて、前記ウェルプレートを、室温で、３０分間振盪させた。これにより、前記磁気ビーズにストレプトアビジンを介して前記ビオチン化相補鎖を結合させた。このように調製したビオチン化相補鎖を有する前記磁気ビーズを、前記各ウェル内で、１ｘバッファー（４０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１２５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＫＣｌ、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＣｌ２、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０）で洗浄した。そして、各ウェルに、サンプル１または２を、５０μＬ混合した。サンプル１は、アミラーゼ未添加の１ｘバッファーを使用し、サンプル２は、１００ｎｍｏｌ／Ｌのアミラーゼを含む１ｘバッファーを使用した。これらを混合した後、磁石を前記ウェルプレートに近づけ、前記ウェルの底部に前記磁気ビーズを集積させた。その状態のまま、前記ウェルから液体画分を回収した。
【００３２】
前記液体画分に励起光を照射し、蛍光を、蛍光検出器（商品名ＴＥＣＡＮ、Infinite（登録商標）Ｍ１０００）で検出した。検出条件は、Ｅｘｃｉｔａｒｉｏｎ（６４８ｎｍ、バンド幅５ｎｍ)、Ｅｍｉｓｓｉｏｎ（６６８ｎｍ、バンド幅５ｎｍ)、Ｇａｉｎ（２００)とした。
【００３３】
これらの結果を図２（Ｂ）に示す。図２（Ｂ）は、蛍光強度を示すグラフである。図２（Ｂ）に示すように、アミラーゼ未添加のサンプル１と比較して、アミラーゼ添加のサンプル２は、極めて高い蛍光強度を示した。前述のように、本発明は、前記固定部への励起光の照射を抑制し、且つ、前記固定部で蛍光が発生しても前記光導出部に到達しないような条件下で、前記液相において浮遊している前記蛍光標識化アプタマーの蛍光を測定している。本実施例における前記液体画分は、前記光導入部と前記光導出部との間の領域における液相と同様の状態であることから、前記液体画分の分析結果は、本発明における分析結果に相当すると解される。このため、本発明によれば、前記容器の固定部における影響を受けることなく、目的の蛍光の検出を行えるといえる。
【００３４】
以上、実施形態および実施例を参照して本願発明を説明したが、本願発明は、上記実施形態及び実施例に限定されるものではない。本願発明の構成や詳細には、本願発明のスコープ内で当業者が理解しうる様々な変更をすることができる。
【産業上の利用可能性】
【００３５】
本発明の分析方法によれば、前記固定部の相補鎖に前記蛍光標識化アプタマーが結合した場合であっても、前記固定部に前記光導入部からの励起光が到達しないため、前記固定部において蛍光が生じることがなく、または、仮に到達しても、前記固定部で生じる蛍光が前記光導出部に到達しないため、前記固定部での蛍光を、外部の検出部が検出することも防止できる。このため、前述のように、例えば、クエンチャーで標識化した相補鎖を使用することなく、前記ターゲットに結合した前記蛍光標識化アプタマーからの蛍光を選択的に検出することができる。
【符号の説明】
【００３６】
１０    光源
１１    励起フィルター
１２    容器
１２１  容器本体
１２２  光遮蔽部
１２３  光導入部
１２４  光導出部
１２５  固定部
１３    蛍光フィルター
１４    蛍光デバイス
１５    液相
【図１】
2020134357.tif 000003
【図２】
2020134357.tif 000004
【配列表】
2020134357000001.app