(57)【要約】【課題】ｂＦＧＦ等の添加量を抑え、低価格で多能性幹細胞を培養しうる、培養方法を提供する。【解決手段】式（Ｉ）［式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、各々独立して、水素、ハロゲン、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ又はＮＨ２であり；Ｒ４は、水素又はＣ１−６アルキルであり；Ｒ５及びＲ６は、各々独立して、水素、又は−ＮＲ７Ｒ８で置換されていてもよいＣ１−６アルキルであり；Ｒ７及びＲ８は、各々独立して、水素又はＣ１−６アルキルであり；Ｘは、Ｃ１−６アルキレンであり；Ｙは、−ＮＲ９−又は−Ｏ−であり；Ｒ９は、水素又はＣ１−６アルキルであり；ｎは、０又は１である］の構造を有する化合物、その塩又はそのエナンチオマーを含む、多能性幹細胞を培養するための組成物。【選択図】図１
2020129970.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性幹細胞を培養するための組成物であって、
式（Ｉ）：
【化１】
2020129970.tif 000011
［式中、
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、各々独立して、水素、ハロゲン、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ又はＮＨ２であり、
Ｒ４は、水素又はＣ１−６アルキルであり、
Ｒ５及びＲ６は、各々独立して、水素、又は−ＮＲ７Ｒ８で置換されていてもよいＣ１−６アルキルであり、
Ｒ７及びＲ８は、各々独立して、水素又はＣ１−６アルキルであり、
Ｘは、Ｃ１−６アルキレンであり、
Ｙは、−ＮＲ９−又は−Ｏ−であり、
Ｒ９は、水素又はＣ１−６アルキルであり、
ｎは、０又は１である］
の構造を有する化合物、その塩又はそのエナンチオマーを含む、組成物。
【請求項２】
Ｒ１が、水素である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
Ｒ２が、Ｃ１−６アルキル又はＮＨ２である、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
Ｒ５が、Ｃ１−６アルキルである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
ｎが、０である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
Ｙが、−Ｏ−である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
式（Ｉ）の構造を有する化合物が、以下：
【化２】
2020129970.tif 000012
である、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
多能性幹細胞が、ヒト由来の多能性幹細胞である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
多能性幹細胞の未分化状態を維持させるための、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物を用いる、多能性幹細胞を培養するための方法。
【請求項１１】
多能性幹細胞の未分化状態を維持させるための、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物を用いて培養してなる、多能性幹細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多能性幹細胞を培養するための組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、外傷や病気、加齢等により損傷を受けた組織を人工的に再生させる再生医療が注目されている。再生医療は、ある細胞や組織を人工的に製造・構築し、患者へ移植する点において、従来の移植治療が抱える、ドナー不足やドナー摘出時の組織欠損といった課題を解決できる新たな治療方法として期待されている。また、人工的に構築された組織は、新しい薬物・薬剤の有効性を確認するための創薬支援や、その薬物・薬剤の安全性、薬物動態等を評価するツールとしても期待されている。
【０００３】
それら組織の原料となるのが、幹細胞である。幹細胞は、細胞分裂して同じ細胞を作る能力（自己複製能力）と別の細胞へと分化する能力（分化能）を有しており、際限なく増殖する細胞と定義されている。
【０００４】
幹細胞には、受精卵から作られた胚性幹細胞（以下、「ＥＳ細胞」と称することもある。）、皮膚や血液から採取した体細胞から作られる人工多能性幹細胞（以下、「ｉＰＳ細胞」と称することもある。）等の多能性（pluripotency）幹細胞；骨髄から採取される造血幹細胞、肝臓の前駆細胞である肝幹細胞、間葉系幹細胞、皮膚幹細胞、生殖幹細胞等の複能性（multipotency）幹細胞；等が知られている。特に、多能性幹細胞は、幅広い分野で応用可能なため、その注目度は高い。
【０００５】
再生医療の研究においては、これら幹細胞を増殖させ、直接患部に注入する方法、幹細胞を分化誘導させ、分化した細胞を移植（注入）する方法、又は足場材料と併用して分化誘導した細胞を移植する方法等の治療方法が提案されている。
【０００６】
多能性幹細胞の医療応用を視野に入れた場合、提案されているいずれの治療方法においても、多能性幹細胞を増殖させるプロセスは、重要な工程の一つである。
【０００７】
多能性幹細胞は、適切な培地種、足場材料、成長因子、血清等を適宜選択すれば、通常、際限なく未分化状態を維持したまま増殖することができる。なかでも、塩基性線維芽細胞増殖因子（以下、「ｂＦＧＦ」と称することもある。）等の成長因子は、多能性幹細胞を培養する際によく使用される。しかし、成長因子は、一般的に非常に高価であり、かつ、未分化状態を維持するために必要とされる添加量が多いことが知られている。そのため、多能性幹細胞の医療応用は、多能性幹細胞の培養時の高価格化に起因して、コスト面で大きな課題が生じる。それ故に、多能性幹細胞をいかに安価に培養するかが、多能性幹細胞の医療応用をより拡大するうえで重要となる。
【０００８】
そのような背景の下、特許文献１では、ＧＳＫ３β阻害剤及びＤＹＲＫ阻害剤を多能性幹細胞培養用の培地に添加することで、ｂＦＧＦ等の成長因子の添加量を抑え、低価格で調製可能な培地を提供できることを報告している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第２０１５／１４７０４７号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、多能性幹細胞の培養方法は、使用する多能性幹細胞の種類や、培養の目的に応じて多岐にわたるものであり、上記で報告されているＧＳＫ３β阻害剤及びＤＹＲＫ阻害剤の使用が好ましくない場合もある。そのため、ｂＦＧＦ等の添加量を抑え、低価格で多能性幹細胞を培養しうる、更なる培養方法の開発が望まれている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題に鑑み、鋭意検討を重ねたところ、本発明者は、意外にも、式（Ｉ）の構造を有する化合物を含む多能性幹細胞を培養するための組成物を使用することで、ｂＦＧＦの添加量を抑えつつも、多能性幹細胞を培養することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
したがって、本発明は、要旨、以下のものを提供する。
〔１〕  多能性幹細胞を培養するための組成物であって、
式（Ｉ）：
【化１】
2020129970.tif 000003
［式中、
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、各々独立して、水素、ハロゲン、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ又はＮＨ２であり、
Ｒ４は、水素又はＣ１−６アルキルであり、
Ｒ５及びＲ６は、各々独立して、水素、又は−ＮＲ７Ｒ８で置換されていてもよいＣ１−６アルキルであり、
Ｒ７及びＲ８は、各々独立して、水素又はＣ１−６アルキルであり、
Ｘは、Ｃ１−６アルキレンであり、
Ｙは、−ＮＲ９−又は−Ｏ−であり、
Ｒ９は、水素又はＣ１−６アルキルであり、
ｎは、０又は１である］
の構造を有する化合物、その塩又はそのエナンチオマーを含む、組成物。
〔２〕  Ｒ１が、水素である、〔１〕に記載の組成物。
〔３〕  Ｒ２が、Ｃ１−６アルキル又はＮＨ２である、〔１〕又は〔２〕に記載の組成物。
〔４〕  Ｒ５が、Ｃ１−６アルキルである、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の組成物。
〔５〕  ｎが、０である、〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の組成物。
〔６〕  Ｙが、−Ｏ−である、〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の組成物。
〔７〕  式（Ｉ）の構造を有する化合物が、以下：
【化２】
2020129970.tif 000004
である、〔１〕に記載の組成物。
〔８〕  多能性幹細胞が、ヒト由来の多能性幹細胞である、〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載の組成物。
〔９〕  多能性幹細胞の未分化状態を維持させるための、〔１〕〜〔８〕のいずれかに記載の組成物。
〔１０〕  〔１〕〜〔９〕のいずれかに記載の組成物を用いる、多能性幹細胞を培養するための方法。
〔１１〕  多能性幹細胞の未分化状態を維持させるための、〔１０〕に記載の方法。
〔１２〕  〔１〕〜〔９〕のいずれかに記載の組成物を用いて培養してなる、多能性幹細胞。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、多能性幹細胞を培養するための組成物を提供することができる。また、本発明によれば、多能性幹細胞を培養するための方法を提供することができる。更に、本発明によれば、本明細書中に記載の組成物を用いて培養してなる多能性幹細胞を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、実施例１の化合物を含む培地中でＫｈＥＳ−１を培養した際の細胞増殖の結果を画像で示したものである（試験例１）。なお、０μｇ／ｍＬは、培地（−）（０．１％ ＤＭＳＯのみ）に、０．１％ ＤＭＳＯ＋１００ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦは、培地（＋）に対応する。
【図２Ａ】図２Ａは、０〜１００ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを含む培地中でＫｈＥＳ−１を５回継代し、３〜４日間培養した後のコロニーの形態を示す（図中の数値は、ｂＦＧＦの濃度（ｎｇ／ｍＬ）を示す）（試験例２）。なお、ｂＦＧＦ ０ｎｇ／ｍＬにおいては、１回継代し、６日間培養した後（ｐ１＋６ｄ）のコロニーの形態を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、実施例１の化合物及び０〜１００ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを含む培地中でＫｈＥＳ−１を５回継代し、３〜４日間培養した後のコロニーの形態を示す（図中の数値は、ｂＦＧＦの濃度（ｎｇ／ｍＬ）を示す）（試験例２）。なお、ｂＦＧＦ ０ｎｇ／ｍＬにおいては、１回継代し、６日間培養した後（ｐ１＋６ｄ）のコロニーの形態を示す。
【図３】図３は、実施例１の化合物を含む培地中で培養したＫｈＥＳ−１を用いて、多能性幹細胞のマーカーをフローサイトメトリーにより評価した結果を示す（試験例３）。
【図４】図４は、ｂＦＧＦ、実施例１又は２の化合物を含む培地中で培養したＫｈＥＳ−１を用いて、多能性幹細胞のマーカーを定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）により評価した結果を示す（試験例４）。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、多能性幹細胞を培養するための組成物であって、
式（Ｉ）：
【化３】
2020129970.tif 000005
［式中、
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、各々独立して、水素、ハロゲン、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ又はＮＨ２であり、
Ｒ４は、水素又はＣ１−６アルキルであり、
Ｒ５及びＲ６は、各々独立して、水素、又は−ＮＲ７Ｒ８で置換されていてもよいＣ１−６アルキルであり、
Ｒ７及びＲ８は、各々独立して、水素又はＣ１−６アルキルであり、
Ｘは、Ｃ１−６アルキレンであり、
Ｙは、−ＮＲ９−又は−Ｏ−であり、
Ｒ９は、水素又はＣ１−６アルキルであり、
ｎは、０又は１である］
の構造を有する化合物、その塩又はそのエナンチオマーを含む、組成物を提供する。
【００１６】
本発明はまた、多能性幹細胞を培養するための方法であって、有効量の式（Ｉ）の構造を有する化合物、その塩又はそのエナンチオマーを添加することを含む、方法を提供する。
【００１７】
本発明はまた、多能性幹細胞の培養において使用するための式（Ｉ）の構造を有する化合物、その塩又はそのエナンチオマーを提供する。
【００１８】
本発明はまた、多能性幹細胞を培養するための組成物を製造するための、式（Ｉ）の構造を有する化合物、その塩又はエナンチオマーの使用を提供する。
【００１９】
本明細書中で用いられる「Ｃ１−６アルキル」とは、１〜６個の炭素原子を含む飽和の直鎖又は分岐鎖の炭化水素基（これらに限定されるものではないが、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、へキシル等を含む）を意味する。好ましいＣ１−６アルキルは、Ｃ１−４アルキル（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、イソプロピル等を含む）であり、より好ましくは、メチル、エチルである。
【００２０】
本明細書中で用いられる「Ｃ１−６アルコキシ」とは、式「−Ｏ−Ｃ１−６アルキル」の構造を有する基（これらに限定されるものではないが、例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ等を含む）を意味する。好ましいＣ１−６アルコキシは、メトキシ、エトキシ又はプロポキシであり、より好ましくは、メトキシである。
【００２１】
本明細書中で用いられる「ハロゲン」とは、これらに限定されるものではないが、例えば、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素を意味する。好ましいハロゲンは、塩素である。
【００２２】
本明細書中で用いられる「塩」とは、これらに限定されるものではないが、例えば、無機酸（これらに限定されるものではないが、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、炭酸、リン酸等）又は有機酸（これらに限定されるものではないが、例えば、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、グルコン酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、リンゴ酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、アスパラギン酸、アスコルビン酸、グルタミン酸、アントラニル酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、エンボン酸、フェニル酢酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸等）との酸付加塩；有機塩基（これらに限定されるものではないが、例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、２−ジエチルアミノエタノール、トリメタミン、ジシクロへキシルアミン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、カフェイン、プロカイン、ヒドラバミン、コリン、ベタイン、エチレンジアミン、グルコサミン、メチルグルカミン、テオブロミン、プリン類、ピペラジン、ピペリジン、Ｎ−エチルピペリジン等）との塩等が挙げられる。
【００２３】
式（Ｉ）の構造を有する化合物には、その溶媒和物、その結晶多形等も包含される。
【００２４】
本明細書中で用いられる「溶媒和物」とは、１つ以上の溶媒分子と式（Ｉ）の構造を有する化合物との会合体、複合体等を意味する。溶媒としては、これらに限定されるものではないが、例えば、水、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ＤＭＳＯ、酢酸、酢酸エチル等が挙げられる。
【００２５】
本発明の一実施態様では、Ｒ１が、水素である、本明細書中に記載の組成物である。
【００２６】
本発明の一実施態様では、Ｒ２が、Ｃ１−６アルキル又はＮＨ２である、本明細書中に記載の組成物である。
【００２７】
本発明の好ましい実施態様では、Ｒ２が、メチル又はＮＨ２である、本明細書中に記載の組成物である。
【００２８】
本発明のより好ましい実施態様では、Ｒ２が、ＮＨ２である、本明細書中に記載の組成物である。
【００２９】
本発明の一実施態様では、Ｒ５が、Ｃ１−６アルキルである、本明細書中に記載の組成物である。
【００３０】
本発明の好ましい実施態様では、Ｒ５が、エチルである、本明細書中に記載の組成物である。
【００３１】
本発明の一実施態様では、Ｒ６が、Ｃ１−６アルキルである、本明細書中に記載の組成物である。
【００３２】
本発明の好ましい実施態様では、Ｒ６が、エチルである、本明細書中に記載の組成物である。
【００３３】
本発明のより好ましい実施態様では、Ｒ５が、Ｃ１−６アルキルであり、Ｒ６が、Ｃ１−６アルキルである、本明細書中に記載の組成物である。
【００３４】
本発明の更に好ましい実施態様では、Ｒ５が、エチルであり、Ｒ６が、エチルである、本明細書中に記載の組成物である。
【００３５】
本発明の好ましい実施態様では、ｎが、０である、本明細書中に記載の組成物である。
【００３６】
本発明の好ましい実施態様では、Ｙが、−Ｏ−である、本明細書中に記載の組成物である。
【００３７】
本発明の一実施態様では、式（Ｉ）の構造を有する化合物が、以下：
【化４】
2020129970.tif 000006
である、本明細書中に記載の組成物である。
【００３８】
式（Ｉ）の構造を有する化合物は、市販されているか、或いは本明細書中に後述される方法により、公知若しくは周知の方法により、又はこれらに類似する方法により製造することができる。例えば、式（Ｉ）の構造を有する化合物は、Ｓｅｌｅｎａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社から購入することができる。
【００３９】
本明細書中で用いられる「多能性幹細胞」とは、生体を構成する全ての組織や細胞へ分化し得る能力を有する細胞を意味する。多能性幹細胞としては、これらに限定されるものではないが、例えば、ＥＳ細胞；核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹細胞（ｎｔＥＳ細胞）；精子幹細胞（ＧＳ細胞）；多能性生殖幹細胞（ｍＧＳ細胞）；胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）；ｉＰＳ細胞；培養線維芽細胞又は骨髄幹細胞由来の多能性細胞（Ｍｕｓｅ細胞）；ヒトＥＳ細胞と体細胞との融合細胞；ストレスや細胞刺激によって誘導・選抜される多能性幹細胞；体細胞の核を核移植することによって作成された初期胚を培養することによって樹立した多能性幹細胞（Ｎａｔｕｒｅ，３８５，８１０（１９９７）；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８０，１２５６（１９９８）；Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１７，４５６（１９９９）；Ｎａｔｕｒｅ，３９４，３６９（１９９８）；Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２２，１２７（１９９９）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６，１４９８４（１９９９）；Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２４，１０９（２０００））；等が挙げられ、これらは単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよいが、好ましくはＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞であり、より好ましくはｉＰＳ細胞である。したがって、本発明の一実施多様では、多能性幹細胞が、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞である、本明細書中に記載の組成物を提供する。更に、本発明の好ましい実施態様では、多能性幹細胞が、ｉＰＳ細胞である、本明細書中に記載の組成物を提供する。
【００４０】
ｉＰＳ細胞の場合には、その作製に使用される体細胞としては、これらに限定されるものではないが、例えば、神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）；組織前駆細胞；リンパ球、上皮細胞、内皮細胞、筋肉細胞、線維芽細胞（皮膚細胞等）、毛細胞、肝細胞、胃粘膜細胞、腸細胞、脾細胞、膵細胞(膵外分泌細胞等)、脳細胞、肺細胞、腎細胞及び脂肪細胞等の分化した細胞；等が挙げられ、これらは、初代培養細胞であっても、継代細胞であっても、株化細胞であってもよい。
【００４１】
多能性幹細胞は、これらに限定されるものではないが、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類；ウサギ等のウサギ目；ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の有蹄目；イヌ、ネコ等のネコ目；ヒト、サル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジー等の霊長類；等の由来の多能性幹細胞であり、好ましくは、多能性幹細胞は、霊長類由来の多能性幹細胞であり、より好ましくは、多能性幹細胞は、ヒト由来の多能性幹細胞である。したがって、本発明の一実施態様では、多能性幹細胞が、ヒト由来の多能性幹細胞である、本明細書中に記載の組成物を提供する。
【００４２】
本明細書中で互換可能に用いられる「多能性幹細胞を培養する」及び「多能性幹細胞の培養」は、例えば、多能性幹細胞の初代培養であっても、継代培養であってもよいし、多能性幹細胞の細胞株の培養（継代培養を含む）であってもよいし、或いは、多能性幹細胞を樹立するための培養であってもよい。
【００４３】
本発明の一実施態様では、多能性幹細胞の未分化状態を維持させるための、本明細書中に記載の組成物を提供する。
【００４４】
本明細書中で用いられる「未分化状態」とは、多能性幹細胞が、多能性及び／又は増殖能を有している状態であることを意味する。
【００４５】
本明細書中で用いられる「多能性」とは、多能性幹細胞が、分化能を有していることを意味する。
【００４６】
多能性幹細胞が未分化状態を維持していることは、これらに限定されるものではないが、例えば、ＯＣＴ−３／４（ＯＣＴ−３又はＯＣＴ−４）、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１等のタンパク質の発現を指標として確認してもよいし、或いは、これらの遺伝子の発現を指標として確認してもよい。タンパク質の測定は、例えば、免疫染色法、フローサイトメトリー等により実施してもよい。また、遺伝子の測定は、例えば、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）等を用いて実施してもよい。
【００４７】
本明細書中に記載の多能性幹細胞を培養するための組成物には、式（Ｉ）の構造を有する化合物の他に、基礎培地を加えることができる。
【００４８】
基礎培地としては、本発明の目的を達成できる限り特段限定されるものではないが、例えば、ＤＭＥＭ、ＥＭＥＭ、ＩＭＤＭ（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＧＭＥＭ（Ｇｌａｓｇｏｗ’ｓ ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ−１６４０、α−ＭＥＭ、Ｈａｍ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ Ｆ−１０、Ｈａｍ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ Ｆ−１２、Ｈａｍ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ Ｆ１２Ｋ、Ｍｅｄｉｕｍ １９９、ＡＴＣＣ−ＣＲＣＭ３０、ＤＭ−１６０、ＤＭ−２０１、ＢＭＥ、Ｆｉｓｃｈｅｒ、ＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ、Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓ Ｌ−１５、ＲＩＴＣ８０−７、ＭＣＤＢ１０５、ＭＣＤＢ１０７、ＭＣＤＢ１３１、ＭＣＤＢ１５３、ＭＣＤＢ２０１、ＮＣＴＣ１０９、ＮＣＴＣ１３５、Ｗａｙｍｏｕｔｈ’ｓ ＭＢ７５２／１、ＣＭＲＬ−１０６６、Ｗｉｌｌｉａｍｓ’ ｍｅｄｉｕｍ Ｅ、Ｂｒｉｎｓｔｅｒ’ｓ ＢＭＯＣ−３ ｍｅｄｉｕｍ、Ｅ８ ｍｅｄｉｕｍ（Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１１，８，４２４−４２９）、ＲｅｐｒｏＦＦ、ＲｅｐｒｏＦＦ２等が挙げられ、これらは単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００４９】
また、本明細書中に記載の多能性幹細胞を培養するための組成物には、式（Ｉ）の構造を有する化合物の他に、必要に応じて、例えば、血清、成長因子、鉄源、ポリアミン、微量金属、糖類、有機酸、アミノ酸及びその誘導体、還元剤、ビタミン、ステロイド、抗生物質、緩衝剤、無機塩、ｐＨ調整剤、タンパク質（酵素等を含む）、各種の活性化剤・阻害剤等の添加剤を加えることができる。添加剤の添加量は、本発明の目的を達成できる限り特段限定されるものではなく、当業者が適宜選択することができる。
【００５０】
血清としては、本発明の目的を達成できる限り特段限定されるものではないが、例えば、ウシ胎仔血清、仔ウシ血清、ウマ血清、ヒト血清等の哺乳類動物由来の血清が挙げられ、これらは単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
なお、多能性幹細胞を医療目的で使用する場合等には、異種由来成分が血液媒介病原菌の感染源や異種膠原となる可能性があることから、本明細書中に記載の多能性幹細胞を培養するための組成物に血清を加えないことが好ましいこともある。本明細書中に記載の多能性幹細胞を培養するための組成物に血清を加えない場合には、例えば、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ−ｄｅｆｉｎｅｄ Ｌｉｐｉｄ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ（Ｇｉｂｃｏ社）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ社）等の血清を代替する添加剤を加えてもよい。
【００５１】
成長因子としては、これらに限定されるものではないが、例えば、インスリン、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）等が挙げられ、これらは単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００５２】
鉄源としては、これらに限定されるものではないが、例えば、トランスフェリン、フェリチン、硫酸鉄（ＩＩ）等が挙げられ、これらは単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００５３】
ポリアミンとしては、これらに限定されるものではないが、例えば、スペルミン、スペルミジン、ノルスペルミン、ノルスペルミジン、ホモスペルミン、ホモスペルミジン、カダベリン、プトレシン、アグマチン、オルニチン等が挙げられ、これらは単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００５４】
微量金属としては、これらに限定されるものではないが、例えば、マグネシウム、亜鉛、コバルト、スズ、モリブデン、ニッケル、セレン、亜セレン酸ナトリウム等が挙げられ、これらは単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００５５】
糖類としては、これらに限定されるものではないが、例えば、グルコース、ガラクトース、フルクトース、スクロース等が挙げられ、これらは単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００５６】
有機酸としては、これらに限定されるものではないが、例えば、ピルビン酸、乳酸、リノレイン酸、リノール酸等が挙げられ、これらは単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００５７】
アミノ酸及びその誘導体としては、これらに限定されるものではないが、例えば、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−リシン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−メチオニン、Ｌ−システイン、Ｌ−プロリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−カルニチン、Ｌ−オルニチン、グルタチオン（還元型を含む）等が挙げられ、これらは単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００５８】
還元剤としては、これらに限定されるものではないが、例えば、２−メルカプトエタノール、ジチオトレイトール等が挙げられ、これらは単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００５９】
ビタミンとしては、これらに限定されるものではないが、例えば、ビタミンＡ及びその誘導体（ビタミンＡ酢酸エステル等を含む）、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ５、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ及びその誘導体（酢酸ＤＬ−α−トコフェロール等を含む）、ビタミンＫ、ビオチン、葉酸等が挙げられ、これらは単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００６０】
ステロイドとしては、これらに限定されるものではないが、例えば、β−エストラジオール、プロゲステロン、コルチコステロン等が挙げられ、これらは単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００６１】
抗生物質としては、これらに限定されるものではないが、例えば、ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン等が挙げられ、これらは単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００６２】
緩衝剤としては、これらに限定されるものではないが、例えば、炭酸水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、ＨＥＰＥＳ等が挙げられ、これらは単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００６３】
無機塩としては、これらに限定されるものではないが、例えば、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化カリウム、硫酸銅、硝酸鉄（ＩＩ）、硫酸鉄、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム等が挙げられ、これらは単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００６４】
ｐＨ調整剤としては、これらに限定されるものではないが、例えば、塩酸、硝酸、リン酸、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸水素ナトリウム等が挙げられ、これらは単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００６５】
タンパク質（酵素等を含む）としては、これらに限定されるものではないが、例えば、ヒトアルブミン、ウシ血清アルブミン、スーパーオキシドジムスターゼ、カタラーゼ等が挙げられ、これらは単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００６６】
各種の活性化剤・阻害剤としては、これらに限定されるものではないが、例えば、Ｗｎｔ−３ａ、Ｗｎｔ−５ａ、塩化リチウム、補体分子Ｃ１ｑ等のＷｎｔシグナル活性化剤；Ｙ−２７６３２、Ｋ−１１５（リパスジル塩酸塩水和物）、ＨＡ１０７７（塩酸ファスジル）等のＲｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤等が挙げられ、これらは単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００６７】
本明細書中に記載の多能性幹細胞を培養するための組成物のｐＨは、本発明の目的を達成できる限り特段限定されるものではないが、例えば、約４〜約１０、好ましくは約５〜約９、より好ましくは約６〜約８、更に好ましくは約６．５〜約７．５であり得る。
【００６８】
本明細書中に記載の多能性幹細胞を培養するための組成物は、コンタミネーション等を防止する目的で、滅菌されたものであってもよい。滅菌する方法は、これらに限定されるものではないが、例えば、紫外線照射、放射線照射、加熱、ろ過等が挙げられる。
【００６９】
本明細書中に記載の多能性幹細胞を培養するための組成物は、多能性幹細胞培養用の培地として使用してもよい。
【００７０】
本明細書中に記載の多能性幹細胞を培養するための組成物は、例えば、溶液の形態であっても、乾燥した固体（例えば、固形状、粉末状等）の形態であってもよい。
溶液の形態である場合には、そのまま多能性幹細胞培養用の培地として用いてもよいし、溶媒で希釈し、必要に応じて上述した添加剤を加えたものを、多能性幹細胞培養用の培地として用いてもよい。希釈する際に用いる溶媒としては、例えば、水、緩衝液、生理食塩水、上述した基礎培地等が挙げられ、これらは単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
乾燥した固体の形態である場合には、例えば、水、緩衝液、生理食塩水、上述した基礎培地等の溶媒に溶解し、必要に応じて上述した添加剤を加えたものを、多能性幹細胞培養用の培地として用いてもよい。
【００７１】
本明細書中に記載の多能性幹細胞を培養するための組成物中、又はこれから得られた多能性幹細胞用の培地中の式（Ｉ）の構造を有する化合物の含有量は、例えば、組成物全量又は培地全量に対して、最終濃度として、約０．００１〜約１０００μｇ／ｍＬ、好ましくは約０．０５〜約５００μｇ／ｍＬ、より好ましくは約０．１〜約２５０μｇ／ｍＬ、更に好ましくは約１〜約１００μｇ／ｍＬ、なお更に好ましくは、約１〜約４０μｇ／ｍＬであり得る。或いは、式（Ｉ）の構造を有する化合物の含有量は、例えば、組成物全量又は培地全量に対して、最終濃度として、約０．１〜約１０００００ｎｍｏｌ／Ｌ、好ましくは約５〜約５００００ｎｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは約１０〜約２５０００ｎｍｏｌ／Ｌ、更に好ましくは約１００〜約１００００ｎｍｏｌ／Ｌ、なお更に好ましくは約１００〜約４０００ｎｍｏｌ／Ｌであり得る。
【００７２】
本発明の別の実施態様では、本明細書中に記載の多能性幹細胞を培養するための組成物を用いる、多能性幹細胞を培養するための方法を提供する。
【００７３】
本発明の更に別の実施態様では、本明細書中に記載の多能性幹細胞を培養するための組成物を用いる、多能性幹細胞の未分化状態を維持するための方法を提供する。
【００７４】
多能性幹細胞の培養に用いられる培養器は、多能性幹細胞の培養が可能なものであれば特段限定されるものではないが、例えば、フラスコ、組織培養用フラスコ、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マルチプレート、マルチウェルプレート、マイクロスライド、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、ローラーボトル等が挙げられる。
【００７５】
多能性幹細胞の培養に用いられる培養器は、細胞接着性であっても、細胞非接着性であってもよく、目的に応じて適宜選ばれる。細胞接着性の培養器は、培養器の表面上での細胞との接着性を向上させる目的で、任意の細胞支持用基質でコーティングされたものであってもよい。細胞支持用基質は、多能性幹細胞の接着又は場合により用いられるフィーダー細胞の接着を目的とする任意の物質であってもよい。
【００７６】
本明細書中で用いられる「フィーダー細胞」とは、多能性幹細胞等がその上にプレートされる幹細胞をいい、プレートされた多能性幹細胞等の増殖等の助けとなる環境を提供するものを意味する。
【００７７】
本明細書中に記載の多能性幹細胞を培養するための組成物を用いる、多能性幹細胞を培養するための方法においては、フィーダー細胞を用いてもよいし、用いなくてもよい。
【００７８】
細胞支持用基質としては、天然由来のものであっても、人工物（例えば、組換え体等）であってもよく、これらに限定されるものではないが、例えば、コラーゲン、プロテオグリカン、フィブロネクチン、ヒアルロン酸、テネイシン、エンタクチン、エラスチン、フィブリリン、ラミニン、又はこれらの断片等が挙げられ、これらは単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００７９】
多能性幹細胞の培養温度は、多能性幹細胞を培養することができる限り特段限定されるものではないが、例えば、約３０〜約４０℃、好ましくは約３７℃であり得る。該方法は、ＣＯ２含有空気の雰囲気下で培養することができ、ＣＯ２濃度は、例えば、約１〜約１０％、好ましくは約２〜約５％であり得る。
【００８０】
本明細書中に記載の多能性幹細胞を培養するための又は多能性幹細胞の未分化状態を維持するための方法において、培養する多能性幹細胞の数は、特段限定されるものではないが、例えば、溶液状態の培地中、約５０〜約１０００００ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、好ましくは約１００〜約５００００ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、より好ましくは約５００〜約３００００ｃｅｌｌｓ／ｍＬであり得る。或いは、該方法において培養する多能性幹細胞の数は、特段限定されるものではないが、例えば、溶液状態の培地中、約５０〜約１０００００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２、好ましくは約１００〜約５００００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２、より好ましくは約５００〜約３００００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２であり得る。
【００８１】
本明細書中に記載の多能性幹細胞を培養するための又は多能性幹細胞の未分化状態を維持するための方法においては、当業者に公知又は周知の方法により、適宜、培地の交換を行うことができる。培地の交換は、例えば、約１日〜約７日ごとに、好ましくは約１〜約４日ごとに、より好ましくは約１日ごとに行うことができる。
【００８２】
また、本明細書中に記載の多能性幹細胞を培養するための又は多能性幹細胞の未分化状態を維持するための方法においては、当業者に公知又は周知の方法により、適宜、多能性幹細胞を継代することできる。継代は、例えば、約１〜約７日ごとに、好ましくは約２〜約５日ごとに、より好ましくは約３〜約４日ごとに行うことができる。
【００８３】
本明細書中に記載の多能性幹細胞を培養するための又は多能性幹細胞の未分化状態を維持するための方法により培養された多能性幹細胞は、多能性を有する未分化状態の多能性幹細胞であり得る。このような多能性幹細胞は、そのまま、又は所望の細胞に分化させて、研究材料として又は再生医療等製品の製造等に使用することができる。
【００８４】
本発明の別の実施態様では、本明細書中に記載の多能性幹細胞を培養するための組成物を用いて培養してなる、多能性幹細胞を提供する。
【実施例】
【００８５】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、これら実施例は、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【００８６】
［実施例１］
【化５】
2020129970.tif 000007
ナミキ商事株式会社（サプライヤー：Ｓｅｌｅｎａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社）から購入したものを使用した。
【００８７】
［実施例２］
【化６】
2020129970.tif 000008
東京化成工業株式会社製のものを使用した。
【００８８】
［共通事項］
培地の調製
ＤＭＥＭ／Ｆ−１２（Ｓｉｇｍａ Ｄ−６４２１）に、Ｎｏｎ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ （Ｓｉｇｍａ Ｍ−７１４５、最終濃度 １×）、Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（Ｓｉｇｍａ Ｇ−７５１３、最終濃度 １ｍＭ）、Ｎ２（Ｇｉｂｃｏ ＃１７５０２０４８、最終濃度 １×）、Ｂ２７（Ｇｉｂｃｏ ＃１７５０４０４４、最終濃度 １×）、及び２−ＭＥ（Ｇｉｂｃｏ ＃２１９８５−０２３、最終濃度 ０．１ｍＭ）を添加したもの（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，（２００６）ＢＢＲＣ，３４６，１３１−１３９）を、基本培地として用いた。この基本培地に、実施例１又は２の化合物（ＤＭＳＯ中に溶解（ＤＭＳＯの最終濃度 ０．１％）、最終濃度 １μｇ／ｍＬ〜３５μｇ／ｍＬ）を添加したもの（以下、「培地（ｔｅｓｔ）」と称することもある。）、ＤＭＳＯ（最終濃度 ０．１％）を添加したもの（以下、「培地（−）」と称することもある。）、並びにＤＭＳＯ（最終濃度 ０．１％）及びｂＦＧＦ（最終濃度 ２０〜１００ｎｇ／ｍＬ）を添加したもの（以下、「培地（＋）」と称することもある。）を調製した。
ディッシュのコーティング
ディッシュ（＃３５３０４３、Ｆａｌｃｏｎ社製）の表面を覆う程度の量の２５０μｇ／ｍＬ マトリゲル（Ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｄｕｃｅｄ，Ｃｏｒｎｉｎｇ ＃３５４２３０）溶液を該ディッシュに添加し、３７℃で２時間、室温で３時間以上、又は４℃で一晩静置し、ディッシュをコーティングした。多能性幹細胞に対するマトリゲルの影響を最小限度にするため、コーティングしたディッシュをＤＭＥＭ／Ｆ−１２又は上記で調製した培地等で１回洗浄してから使用した。
【００８９】
［試験例１：多能性幹細胞の増殖性の評価］
ヒト多能性幹細胞の準備
培地（２０％ ＫＳＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＃１０８２８−０２８）、Ｎｏｎ−ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｓｉｇｍａ ＃Ｍ７１４５、最終濃度 １×）、２ｍＭ Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（Ｓｉｇｍａ ＃Ｇ７５１３）、０．１ｍＭ ２−ＭＥ（Ｓｉｇｍａ ＃Ｍ−７５２２）、及び５ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ（Ｗａｋｏ＃０６０−０４５４３）を含むＤＭＥＭ／Ｆ−１２（Ｓｉｇｍａ Ｄ６４２１））中、フィーダー細胞（使用したフィーダー細胞：マウス胎仔繊維芽細胞；フィーダー細胞の培養に用いた培地：１０％ ＦＢＳ（Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＃１７１０１２）及びＮｏｎ−ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｓｉｇｍａ ＃Ｍ７１４５、最終濃度 １×）を含むＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ Ｄ５７９６））上で培養し、コンフルエントになったヒト多能性幹細胞（ＫｈＥＳ−１（京都大学再生医科学研究所））を用意した。培地を除去し、剥離液（ＣＴＫ溶液（リプロセル ＲＣＨＥＴＰ００２））を添加し、ディッシュの底面になじませた。コロニーの周辺がある程度剥がれるまで、インキュベータ内（３７℃、５％ ＣＯ２）で３〜７分間処理した。剥離液を除去した後、培地を加え、Ｐ１０００チップ等を使用して、ピペッティングにより遠心管に回収した。培地を加え、コロニーを懸濁し、５〜１０分間静置した。この間、フィーダー細胞は浮遊している一方、ＫｈＥＳ−１のコロニーは早く沈むため、この性質の差を利用してフィーダー細胞とＫｈＥＳ−１を分離した。これを３回程度繰り返すことにより、フィーダー細胞をほぼ除去した。最後にコロニーをピペッティングにより２０〜５０個程度の細胞塊にほぐした後、遠心（１００ｒｐｍ、５分間）することによりＫｈＥＳ−１を回収した。上清を除去し、培地中にＫｈＥＳ−１を懸濁し、上記でコーティングしたディッシュに約１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２となるように播種した。播種した翌日以降、ＫｈＥＳ−１がマトリゲル上に十分に接着していることを確認した後に、培地を、培地（ｔｅｓｔ）、培地（−）又は培地（＋）に交換し、化合物の評価培養をスタートした。以後、後述する増殖性の評価を実施するまで培地交換を毎日行い、５〜６日間培養した。
増殖性の評価
ヒト多能性幹細胞のマーカーとしてよく知られているＯＣＴ４の発現により、ＫｈＥＳ−１を検出した。なお、ＯＣＴ４の発現は核内で検出できるため、培養下の状態にある細胞でも容易に判定できる。
はじめに、培地を除去し、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２で細胞を１回洗浄した後、４％パラホルムアルデヒド（Ｎａｋａｒａｉ ＃２６１２６−２５）／ＰＢＳにより、室温で１５〜２０分間固定した。その後、ＰＢＳによる洗浄（室温、１０分間）を３回行った。抗体の透過性を高めるため、室温で１０分間、０．２％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（Ｎａｋａｒａｉ ＃３５５０１−１５）／ＰＢＳによる処理を行った。更に、内在性のＨＲＰを不活化するために、室温で１０分間、０．３％ Ｈ２Ｏ２（過酸化水素）／ＰＢＳによる処理を行った。続いて、ＰＢＳによる洗浄（室温、１０分間）を２回行った後、ブロッキング溶液（ＰＢＳ中に３％ Ｎｏｒｍａｌ Ｇｏａｔ Ｓｅｒｕｍ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓ２６−１００ＭＬ）及び２％ ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ ＃Ａ９４１８−５０Ｇ）を含むもの）によるブロッキング処理を室温で１時間行った。次に、一次抗体としてのＯＣＴ４抗体（Ｃ−１０；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ ＳＣ−５２７９）（ブロッキング溶液で１：２００に希釈）と共に、４℃で一晩インキュベートした。翌日、ＰＢＳによる洗浄（室温、１０分間）を３回行った後、Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ ＨＲＰ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）（ブロッキング溶液で１：５００に希釈）と共に、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳによる洗浄（室温、１０分間）を３回行った後、ＤＡＢ発色（Ｓｉｇｍａ ４２９３−５０ＳＥＴ、１５分間発色）を行った。その後、ＰＢＳで３回洗浄し、ディッシュにおける発色画像をスキャナー（エプソン ＥＳ−２０００）にて取り込んだ。得られた画像（４５０×４５０ｐｉｘｅｌｓ）中の細胞の面積（発色部分の面積）を、フリーソフトであるＯｐｅｎＣＶを用いて、得られた画像全体に対する占有率として算出した（ｎ＝２で実施し、その平均値として表した）。結果を表１及び図１に示す。
【表１】
2020129970.tif 000009
【００９０】
表１及び図１の結果より、実施例１の化合物を含む培地では、濃度依存的に発色している部分が増加していることから、ＫｈＥＳ−１のコロニー数及びその大きさが増加したことが分かる。したがって、実施例１の化合物を含む多能性幹細胞を培養するための組成物は、ＫｈＥＳ−１の増殖能を維持するか又は促進するものである。即ち、実施例１の化合物を含む多能性幹細胞を培養するための組成物は、ＫｈＥＳ−１を培養することができるものである。
更に、実施例１の化合物を含む培地は、ＫｈＥＳ−１の増殖能を維持するか又は促進することから、ＫｈＥＳ−１の未分化状態を維持することができるといえる。したがって、実施例１の化合物を含む多能性幹細胞を培養するための組成物は、ＫｈＥＳ−１の未分化状態を維持することができるものである。
また、実施例１の化合物を含む培地では、ｂＦＧＦの非存在下でも、ＫｈＥＳ−１の増殖能を維持するか又は促進することが分かる。したがって、実施例１の化合物を含む多能性幹細胞を培養するための組成物は、ｂＦＧＦの添加量を抑えることができるものである。
【００９１】
［試験例２：多能性幹細胞の継続的な培養］
培地（２０％ ＫＳＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＃１０８２８−０２８）、Ｎｏｎ−ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｓｉｇｍａ ＃Ｍ７１４５、最終濃度 １×）、２ｍＭ Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（Ｓｉｇｍａ ＃Ｇ７５１３）、０．１ｍＭ ２−ＭＥ（Ｓｉｇｍａ ＃Ｍ−７５２２）、及び５ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ（Ｗａｋｏ＃０６０−０４５４３）を含むＤＭＥＭ／Ｆ−１２（Ｓｉｇｍａ Ｄ６４２１））中、フィーダー細胞（使用したフィーダー細胞：マウス胎仔繊維芽細胞；フィーダー細胞の培養に用いた培地：１０％ ＦＢＳ（Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＃１７１０１２）及びＮｏｎ−ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｓｉｇｍａ ＃Ｍ７１４５、最終濃度 １×）を含むＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ Ｄ５７９６））上で培養し、コンフルエントになったヒト多能性幹細胞（ＫｈＥＳ−１（京都大学再生医科学研究所））を用意した。培地を除去し、ＰＢＳで洗浄後、剥離液（Ｇｅｎｔｌｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＃ＳＴ−０７１７４））を添加し、室温で２〜３分間処理した。ここに培地を加え、洗浄した後に、培地を除去した。培地（ｔｅｓｔ）、培地（−）又は培地（＋）を加え、ピペッティングにより、又はセルスクレーパー（スミロン ＭＳ−９３１００）等を用いることにより、細胞をディッシュから剥がし、回収した。回収した細胞を１５ｍＬのコニカルチューブ（Ｆａｌｃｏｎ ＃３５２１９６）に入れ、細胞を均一に懸濁した後、その１／３〜１／１０を、マトリゲルでコーティングしたディッシュに播種した。播種時には、培地にＹ−２７６３２（Ｗａｋｏ、最終濃度 １０μＭ）を添加した。培地交換は、翌日又は翌々日以降から、毎日行った。その際には、Ｙ−２７６３２を添加しない培地を用いた。継代は、４〜５日毎に行い、継代の回数に応じ、ｐ１、ｐ２、ｐ３・・・ｐｎと命名した。なお、試験例２で使用する培地（ｔｅｓｔ）には、実施例１の化合物（最終濃度 ２５μｇ／ｍＬ）に加え、ｂＦＧＦ（最終濃度 ２０ｎｇ／ｍＬ）を添加した。結果を図２Ａ及び２Ｂに示す。
【００９２】
ｂＦＧＦの添加量が１００ｎｇ／ｍＬでは、略円状〜略楕円状のコロニーを形成しているため、細胞が未分化状態を維持しており、分化細胞がほとんど出現していないことが分かる（図２Ａ）。しかしながら、ｂＦＧＦの添加量を下げていくと、それに伴い未分化細胞の周辺から分化細胞が出現してくる（図２Ａ）。特に、ｂＦＧＦを含まない培地（０ｎｇ／ｍＬ、培地（−））では、ｐ１でほぼ全ての細胞が分化し、継代維持はできなかった（図２Ａ）。一方、培地中に実施例１の化合物を添加したものは、ｂＦＧＦの添加量が通常の１／５である２０ｎｇ／ｍＬであっても、分化細胞の出現がほとんど抑えられた。形態的な観察からは、１００ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦを含む培地と２０ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦ及び実施例１の化合物を含む培地との間で差が認められなかった（図２Ｂ）。したがって、実施例１の化合物を含む多能性幹細胞を培養するための組成物は、ｂＦＧＦの添加量が少なくとも通常の１／５以下であっても、ＫｈＥＳ−１の未分化状態を維持することができることが分かる。即ち、実施例１の化合物を含む多能性幹細胞を培養するための組成物は、ｂＦＧＦの添加量を少なくとも通常の１／５以下に抑えることができるものである。
【００９３】
［試験例３：多能性幹細胞の未分化状態の評価１］
試験方法
試験例２において培養した、ｐ５の細胞を用いて評価した。細胞をＰＢＳで１又は２回洗浄した後、ａｃｃｕｔａｓｅ（ＩＣＴ ＃ＡＴ１０４）と共に３７℃で５分間反応させた。細胞をピペッティングにより回収し、遠心（１０００ｒｐｍ、５分）により細胞を沈殿させた。細胞をＰＢＳ（１００ｍＬ）中に再懸濁し、細胞数を測定し、約６×１０６個の細胞を用意した。細胞を遠心（１０００ｒｐｍ、５分）により沈殿させ、以下に記載のキットに同封されているＣｙｔｏｆｉｘ Ｆｉｘａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ ６００μＬを用いて、室温で２０分間固定した。ＰＢＳで２回洗浄し、３ｍＬのＰＢＳ中に再懸濁し、セルストレーナー（ＦＡＬＣＯＮ ＃３５２２３５、３５ミクロン）に通し、１ｍＬずつに分け、以下に記載のそれぞれのキットの取扱説明書に従い、フローサイトメトリー（ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩ）を行った。評価マーカーとしては、多能性幹細胞のマーカーとして一般的によく用いられている、転写因子のＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４及びＳＯＸ２、並びに細胞表面マーカーのＴＲＡ１−１−６０、ＴＲＡ−１−８１及びＳＳＥＡ−３を用いた。なお、試験例３で使用する培地（ｔｅｓｔ）には、実施例１の化合物（最終濃度 ２５μｇ／ｍＬ）に加え、ｂＦＧＦ（最終濃度 ２０又は１００ｎｇ／ｍＬ）を添加した。結果を図３に示す。
使用したキット
・Ｈｕｍａｎ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｉｎｇ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｋｉｔ（ＢＤ ＃５６０４６１）
・Ｈｕｍａｎ Ａｎｄ Ｍｏｕｓｅ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｋｉｔ（ＢＤ ＃５６０４７７）
・Ｈｕｍａｎ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｋｉｔ（ＢＤ ＃５６０５８９）
なお、ＢＤ ＃５６０４７７のキットでは、ＢＤ ＃５６０４７７に同封されているＡｌｅｘａ６４７−ＳＳＥＡ４ ａｎｔｉｂｏｄｙとＢＤ ＃５６０１９３に同封されているＰＥ−ＴＲＡ−１−６０ ａｎｔｉｂｏｄｙを使用した。また、ｉｓｏｔｙｐｅとしては、ＰＥ−ｉｓｏｔｙｐｅとＡｌｅｘａ６４７−ｉｓｏｔｙｐｅを使用した。
【００９４】
１００ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦを含む培地では、ほぼ１００％の細胞が多能性幹細胞マーカーを発現していたが、２０ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦを含む培地では、多能性幹細胞マーカーを発現する細胞が全体の２０〜３０％まで減少した。一方、２０ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦと実施例１の化合物とを含む培地では、ほぼ１００％の細胞が多能性幹細胞のマーカーを発現していた。したがって、試験例３の結果からも、実施例１の化合物を含む多能性幹細胞を培養するための組成物は、ｂＦＧＦの添加量が少なくとも通常の１／５以下であっても、ＫｈＥＳ−１の未分化状態を維持することができることが分かる。
【００９５】
［試験例４：多能性幹細胞の未分化状態の評価２］
ヒト多能性幹細胞の準備
培地（２０％ ＫＳＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＃１０８２８−０２８）、Ｎｏｎ−ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｓｉｇｍａ ＃Ｍ７１４５、最終濃度 １×）、２ｍＭ Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（Ｓｉｇｍａ ＃Ｇ７５１３）、０．１ｍＭ ２−ＭＥ（Ｓｉｇｍａ ＃Ｍ−７５２２）、及び５ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ（Ｗａｋｏ＃０６０−０４５４３）を含むＤＭＥＭ／Ｆ−１２（Ｓｉｇｍａ Ｄ６４２１））中、フィーダー細胞（使用したフィーダー細胞：マウス胎仔繊維芽細胞；フィーダー細胞の培養に用いた培地：１０％ ＦＢＳ（Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＃１７１０１２）及びＮｏｎ−ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｓｉｇｍａ ＃Ｍ７１４５、最終濃度 １×）を含むＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ Ｄ５７９６））上で培養し、コンフルエントになったヒト多能性幹細胞（ＫｈＥＳ−１（京都大学再生医科学研究所））を用意した。培地を除去し、剥離液（ＣＴＫ溶液（リプロセル ＲＣＨＥＴＰ００２））を添加し、ディッシュの底面になじませた。コロニーの周辺がある程度剥がれるまで、インキュベータ内（３７℃、５％ ＣＯ２）で３〜７分間処理した。剥離液を除去した後、培地を加え、Ｐ１０００チップ等を使用して、ピペッティングにより細胞を遠心管に回収した。培地を加え、コロニーを懸濁し、５〜１０分間静置した。この間、フィーダー細胞は浮遊している一方、ＫｈＥＳ−１のコロニーは早く沈むため、この性質の差を利用してフィーダー細胞とＫｈＥＳ−１を分離した。これを３回程度繰り返すことにより、フィーダー細胞をほぼ除去した。最後にコロニーをピペッティングにより２０〜５０個程度の細胞塊にほぐした後、遠心（１００ｒｐｍ、５分間）することによりＫｈＥＳ−１を回収した。上清を除去し、培地中にＫｈＥＳ−１を懸濁し、上記でコーティングしたディッシュに約１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２となるように播種した。播種した翌日以降、ＫｈＥＳ−１がマトリゲル上に十分に接着していることを確認した後に、培地を、培地（ｔｅｓｔ）、培地（−）又は培地（＋）に交換し、化合物の評価培養をスタートした。以後、培地交換を毎日行い、５日間培養した。
なお、実施例１又は２の化合物に加えて、１００ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを添加したものも試験例４で使用した。
ＲＮＡの精製
ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用い、取扱説明書に従って、上記で培養したＫｈＥＳ−１からＲＮＡを精製した。精製したＲＮＡは、ＮａｎｏＶｕｅ（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ）により純度及び濃度を測定した。
ｃＤＮＡの調製
精製したＲＮＡ ２μｇをテンプレートにし、ｒａｎｄｏｍ ｐｒｉｍｅｒ（東洋紡株式会社）を用いて、取扱説明書に従って、Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）によりｃＤＮＡを調製した。
ｑＰＣＲの実施
５ｎｇ ＲＮＡ相当のｃＤＮＡを用い、Ｆａｓｔ ＳＹＢＲ（登録商標） Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて試薬を調整し、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）によりリアルタイムＰＣＲを行った。プログラムは、酵素の活性化（９５℃、２０秒）→ＰＣＲ（９５℃、３秒→６０℃、３０秒のサイクルを、４０サイクル）で行った。内在性のコントロールとして一般的に用いられているＧＡＰＤＨ、β−Ａｃｔｉｎ及び１８ｓ ｒＲＮＡを用い、比較Ｃｔ法により評価を行った。なお、ｑＰＣＲに使用したプライマーの配列を以下の表２に示す。結果を図４に示す。
【００９６】
【表２】
2020129970.tif 000010
【００９７】
実施例１又は２の化合物を含む培地では、ｂＦＧＦを全く含まない培地（０ｎｇ／ｍＬ、培地（−））と比較して、ＮＡＮＯＧ及びＯＣＴ４の発現量が増加した。そして、実施例１又は２の化合物を含む培地によるＮＡＮＯＧ及びＯＣＴ４の発現量の増加は、１００ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦを含む培地における増加と同程度であった。したがって、実施例１又は２の化合物を含む多能性幹細胞を培養するための組成物は、ＫｈＥＳ−１の未分化状態を維持することができるものである。
【００９８】
以上、試験例１〜４の結果より、式Ｉの構造を有する化合物を含む多能性幹細胞を培養するための組成物は、多能性幹細胞を培養することができるものである。また、これらの組成物は、多能性幹細胞の未分化状態を維持することができるものである。更に、これらの組成物は、ｂＦＧＦの添加量を少なくとも通常の１／５以下に抑えることができるものである。
【図１】
2020129970.tif 000013
【図２Ａ】
2020129970.tif 000014
【図２Ｂ】
2020129970.tif 000015
【図３】
2020129970.tif 000016
【図４】
2020129970.tif 000017
【配列表】
2020129970000001.app