(57)【要約】【課題】被検物質であるポリペプチドの量又は構造に関する情報を精度よく取得できる手段を提供することを課題とする。【解決手段】被検物質であるポリペプチドと結合する捕捉物質、第１の固相及び第２の固相を用いる免疫複合体転移法において、第１の固相及び第２の固相の少なくとも一方と結合する捕捉物質として、ポリペプチドのＣ末端領域と結合する捕捉物質を用いることにより、上記の課題を解決する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検物質であるポリペプチドと、前記ポリペプチドと結合する捕捉物質とを接触させ、前記ポリペプチド及び前記捕捉物質を含む複合体を形成する工程と、
前記複合体中の捕捉物質と、第１の固相とを結合することにより、前記複合体を第１の固相に固定する工程と、
前記複合体が固定された前記第１の固相を回収する工程と、
回収した前記第１の固相から複合体を遊離して、遊離した前記複合体中の捕捉物質と、第２の固相とを結合することにより、前記複合体を第２の固相に固定する工程と、
前記第２の固相に固定された複合体から前記ポリペプチドに関する情報を取得する工程と
を含み、
前記第１の固相及び前記第２の固相の少なくとも一方と結合する捕捉物質が、前記ポリペプチドのＣ末端領域と結合する、
被検物質の情報の取得方法。
【請求項２】
前記第１の固相と結合する捕捉物質が、前記ポリペプチドのＣ末端領域と結合する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１の固相が、磁性粒子である請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記第２の固相と結合する捕捉物質が、前記ポリペプチドのＣ末端領域と結合する請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記第２の固相が、基板である請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記ポリペプチドが、アミロイドβである請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
標識物質を有し、前記ポリペプチドと結合する検出用物質をさらに前記ポリペプチドと接触させ、前記ポリペプチド、前記捕捉物質及び前記検出用物質を含む複合体を形成する請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記検出用物質が、前記ポリペプチドのＮ末端領域と結合する請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記捕捉物質が、第１の結合物質を有する第１捕捉物質と、第２の結合物質を有する第２捕捉物質とを含み、且つ前記第１捕捉物質及び前記第２捕捉物質の少なくとも一方が、前記ポリペプチドのＣ末端領域と結合し、
前記第１の固相が、前記第１の結合物質と特異的に結合する第１の結合パートナーを有し、前記第２の固相が、前記第２の結合物質と特異的に結合する第２の結合パートナーを有し、
前記複合体を第１の固相に固定する工程において、前記第１の結合物質と前記第１の結合パートナーとの特異的結合により、前記複合体が前記第１の固相に固定され、
前記複合体を第２の固相に固定する工程において、前記第２の結合物質と前記第２の結合パートナーとの特異的結合により、前記複合体が前記第２の固相に固定される、
請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１捕捉物質が、第１の結合物質を有し且つ前記ポリペプチドのＣ末端領域と結合する請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記捕捉物質が、第１の結合物質及び第２の結合物質の両方を有し、且つ前記ポリペプチドのＣ末端領域と結合し、
前記第１の固相が、前記第１の結合物質と特異的に結合する第１の結合パートナーを有し、前記第２の固相が、前記第２の結合物質と特異的に結合する第２の結合パートナーを有し、
前記複合体を第１の固相に固定する工程において、前記第１の結合物質と前記第１の結合パートナーとの特異的結合により、前記複合体が前記第１の固相に固定され、
前記複合体を第２の固相に固定する工程において、前記第２の結合物質と前記第２の結合パートナーとの特異的結合により、前記複合体が前記第２の固相に固定される、
請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記第１の結合物質がハプテンであり、前記第１の結合パートナーが抗ハプテン抗体である請求項９〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記第２の結合物質がビオチン類であり、前記第２の結合パートナーがアビジン類である請求項９〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ポリペプチドに関する情報が、前記ポリペプチドの構造に関する情報である請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ポリペプチドに関する情報が、前記ポリペプチドの大きさ、形態及び凝集度の少なくとも１つに関する情報である請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記情報取得工程において、前記第１の固相上の前記ポリペプチドを顕微鏡により撮像して、前記ポリペプチドの画像を取得する請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記顕微鏡が、蛍光顕微鏡、超解像顕微鏡、ラマン顕微鏡、プローブ顕微鏡又は電子顕微鏡である請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ポリペプチドに関する情報が、前記ポリペプチドの量に関する情報である請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記検出用物質の標識物質が、酵素、蛍光物質又は放射性同位体である請求項７及び請求項７を直接又は間接的に引用する請求項８〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記検出用物質の標識物質が、酵素であり、
前記情報取得工程において、前記複合体中の酵素と前記酵素の基質とを反応させ、酵素反応により生じた反応産物から発生するシグナルを測定する、
請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記検出用物質の標識物質が、蛍光物質であり、
前記情報取得工程において、前記複合体に励起光を照射し、前記複合体中の蛍光物質から発生する蛍光を測定する、
請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
被検物質であるポリペプチドと、前記ポリペプチドと結合する捕捉物質とを接触させ、前記ポリペプチド及び前記捕捉物質を含む複合体を形成する工程と、
前記複合体中の捕捉物質と、第１の固相とを結合することにより、前記複合体を第１の固相に固定する工程と、
前記複合体が固定された前記第１の固相を回収する工程と、
回収した前記第１の固相から複合体を遊離して、遊離した前記複合体中の捕捉物質と、第２の固相とを結合することにより、前記複合体を第２の固相に固定する工程と
を含み、
前記第１の固相及び前記第２の固相の少なくとも一方と結合する捕捉物質が、前記ポリペプチドのＣ末端領域と結合する、
被検物質の捕捉方法。
【請求項２３】
被検物質の情報の取得方法であって、
前記被検物質であるポリペプチド及び前記ポリペプチドと結合する捕捉物質を含む複合体から前記ポリペプチドに関する情報を取得する工程を含み、
前記複合体が、
前記ポリペプチドと、前記捕捉物質とを接触させ、前記ポリペプチド及び前記捕捉物質を含む複合体を形成すること、
前記複合体中の捕捉物質と、第１の固相とを結合することにより、前記複合体を第１の固相に固定すること、
前記複合体が固定された前記第１の固相を回収すること、及び
回収した前記第１の固相から複合体を遊離して、遊離した前記複合体中の捕捉物質と、第２の固相とを結合すること
により得られ、
前記第１の固相及び前記第２の固相の少なくとも一方と結合する捕捉物質が、前記ポリペプチドのＣ末端領域と結合する、
被検物質の情報の取得方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被検物質であるポリペプチドの情報の取得方法、及び被検物質であるポリペプチドの捕捉方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
被検者から採取した臨床検体中の被検物質の量又は構造に関する情報を取得することは、病理診断及び治療方針の決定において有用である。例えば、アルツハイマー病では、病状の進行に伴ってアミロイドβ(Aβ)などの被検物質の量及び構造が変化するので、被検物質の量及び構造に関する情報を取得することにより、病状を的確に把握できる。タンパク質の変性を要因とする疾患としては、例えば、アルツハイマー病の他、ハンチントン病、パーキンソン病、プリオン病、筋萎縮性側索硬化症(ALS)などが挙げられる。
【０００３】
臨床検体中の被検物質の量又は構造に関する情報を取得する方法の一例として、非特許文献１には、脳脊髄液(CSF)に含まれるAβをカバーガラス上に固定して、間接蛍光抗体法で免疫染色し、超解像顕微鏡で撮像することによりAβを検出することが開示されている。取得された画像において、Aβは、凝集の程度に応じた大きさ及び強度のスポットとして検出される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Zhang W.I.ら, Super-Resolution Microscopy of Cerebrospinal Fluid Biomarkers as a Tool for Alzheimer's Disease Diagnostics, J Alzheimers Dis, 2015, vol.46, p.1007-1020
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
非特許文献１の方法では、カバーガラスにCSFを滴下しているので、該カバーガラス上にはAβだけでなく、CSF中の夾雑物も固定される。そのため、免疫染色に用いた一次抗体及び蛍光標識二次抗体が、カバーガラスに固定された夾雑物に非特異的に結合する場合がある。また、蛍光標識二次抗体が、カバーガラス自体に非特異的に結合する場合もある。このように、Aβだけでなく、夾雑物及びカバーガラスも標識抗体で標識されると、被検物質であるAβの量又は構造に関する情報を精度よく取得できない。
【０００６】
CSFのような被検者から採取した臨床検体には、被検物質が検出に十分な量で存在するとは限らない。よって、臨床検体中の被検物質を測定するためには、検出感度の向上が求められる。実際、本発明者らは、被検物質としての合成ポリペプチドを良好に検出できた測定系であっても、臨床検体に含まれる被検物質を測定した場合は、検出感度の点で改善の余地があることを見出している。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、免疫複合体転移(ICT)法において、被検物質であるポリペプチドのＣ末端領域と結合する捕捉物質を用いることにより、臨床検体中のポリペプチドをより高い感度で検出できることを見出して、本発明を完成した。
【０００８】
本発明は、被検物質であるポリペプチドと、ポリペプチドと結合する捕捉物質とを接触させ、ポリペプチド及び捕捉物質を含む複合体を形成する工程と、複合体中の捕捉物質と、第１の固相とを結合することにより、複合体を第１の固相に固定する工程と、複合体が固定された第１の固相を回収する工程と、回収した第１の固相から複合体を遊離して、遊離した複合体中の捕捉物質と、第２の固相とを結合することにより、複合体を第２の固相に固定する工程と、第２の固相に固定された複合体からポリペプチドに関する情報を取得する工程とを含み、第１の固相及び第２の固相の少なくとも一方と結合する捕捉物質が、ポリペプチドのＣ末端領域と結合する、被検物質の情報の取得方法を提供する。
【０００９】
また、本発明は、被検物質であるポリペプチドと、ポリペプチドと結合する捕捉物質とを接触させ、ポリペプチド及び捕捉物質を含む複合体を形成する工程と、複合体中の捕捉物質と、第１の固相とを結合することにより、複合体を第１の固相に固定する工程と、複合体が固定された第１の固相を回収する工程と、回収した第１の固相から複合体を遊離して、遊離した複合体中の捕捉物質と、第２の固相とを結合することにより、複合体を第２の固相に固定する工程とを含み、第１の固相及び第２の固相の少なくとも一方と結合する捕捉物質が、ポリペプチドのＣ末端領域と結合する、被検物質の捕捉方法を提供する。
【００１０】
さらに、本発明は、被検物質であるポリペプチド及びポリペプチドと結合する捕捉物質を含む複合体からポリペプチドに関する情報を取得する工程を含む、被検物質の情報の取得方法を提供する。この方法において、複合体は、ポリペプチドと、捕捉物質とを接触させ、ポリペプチド及び捕捉物質を含む複合体を形成すること、複合体中の捕捉物質と、第１の固相とを結合することにより、複合体を第１の固相に固定すること、複合体が固定された第１の固相を回収すること、及び、回収した第１の固相から複合体を遊離して、遊離した複合体中の捕捉物質と、第２の固相とを結合することにより得られる。また、この方法において、第１の固相及び第２の固相の少なくとも一方と結合する捕捉物質は、ポリペプチドのＣ末端領域と結合する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、被検物質であるポリペプチドの量又は構造に関する情報を精度よく取得できる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本実施形態の被検物質の情報の取得方法における処理手順を示すフローチャートである。
【図２】複合体の形成工程及び複合体の第１の固相への固定工程を示す模式図である。
【図３】複合体の回収工程及び遊離工程を示す模式図である。
【図４Ａ】複合体の第２の固相への固定工程を示す模式図である。
【図４Ｂ】複合体の第２の固相への固定工程を示す模式図である。
【図５】複合体の形成工程及び複合体の第１の固相への固定工程を示す模式図である。
【図６Ａ】複合体の第２の固相への固定工程を示す模式図である。
【図６Ｂ】複合体の第２の固相への固定工程を示す模式図である。
【図７】複合体の形成工程及び複合体の第１の固相への固定工程を示す模式図である。
【図８】複合体の回収工程及び遊離工程を示す模式図である。
【図９Ａ】複合体の第２の固相への固定工程を示す模式図である。
【図９Ｂ】複合体の第２の固相への固定工程を示す模式図である。
【図１０】第２の固相に固定された複合体における、発光状態の蛍光色素の分布を示す模式図である。
【図１１】情報取得工程を示すフローチャートである。
【図１２】情報取得工程において、超解像画像を取得して輝点をグループに分類する手順を説明する図である。
【図１３】情報取得工程において、検出装置の表示部に表示される画面の例を示す図である。
【図１４】情報取得工程を自動で行うための検出装置の構成を示す模式図である。
【図１５】実施例１で取得した、脳脊髄液中のAβの蛍光画像である。
【図１６】実施例２で取得した、脳脊髄液中のAβの蛍光画像である。
【図１７Ａ】実施例２で取得した、脳脊髄液中のAβの超解像画像である。
【図１７Ｂ】実施例２で取得した、脳脊髄液中のAβの超解像画像である。
【図１８】実施例３における、脳脊髄液中のAβの測定結果を示すグラフである。
【図１９】実施例３における、合成Aβペプチドの測定結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
(複合体の形成工程)
図１を参照して、本実施形態の被検物質の情報の取得方法(以下、単に「方法」ともいう)における処理手順について説明する。ステップＳ１に示すように、本実施形態の方法では、被検物質であるポリペプチドと、該ポリペプチドと結合する捕捉物質とを接触して、該ポリペプチド及び該捕捉物質を含む複合体を形成する。
【００１４】
本実施形態の方法では、被検物質はポリペプチドである。本明細書において「ポリペプチド」との語は、タンパク質も含む。ポリペプチドは、人工的に合成されたポリペプチドであってもよいし、生体試料などに含まれる生物由来のポリペプチドであってもよい。好ましい被検物質は、生物由来のポリペプチドである。生体試料としては、生体から採取した臨床検体、培養細胞などが挙げられる。臨床検体としては、例えば脳脊髄液、血液(全血、血漿、血清）、組織液、尿などの体液、脳組織などの組織検体が挙げられる。
【００１５】
複合体の形成は通常、液体中で行われるので、ポリペプチドを含む試料は、液状であることが好ましい。液状の試料は、溶液に限られず、懸濁液、ゾルなども含む。組織検体などのように固形の試料を用いる場合は、本実施形態の方法を行う前に、試料を液状にする処理を行うことが好ましい。そのような処理は、試料の種類に応じて、公知の方法から適宜選択できる。例えば、試料が固形組織である場合、界面活性剤を含む溶液中で固形組織をホモジナイズし、遠心分離などにより破砕物などの固形成分を分離することで、ポリペプチドを含む上清を得ることができる。
【００１６】
ポリペプチドの種類は特に限定されず、例えば疾患又は障害の原因となるポリペプチドから任意に選択してもよい。そのようなポリペプチドとしては、例えばAβ、タウタンパク質、ハンチンチン、プリオン、α-シヌクレインなどが挙げられる。それらの中でもAβが特に好ましい。Aβは、通常39〜43のアミノ酸からなるポリペプチドである。本明細書において「アミロイドβ」又は「Aβ」の語は、特に言及しない限り、いずれの長さのAβポリペプチドも含む。
【００１７】
本実施形態では、ポリペプチドは、多量体の形態にあってもよい。多量体は、重合体とも呼ばれ、複数の単量体のポリペプチドが物理的又は化学的に重合あるいは凝集して形成される。多量体は、単量体のポリペプチドが複数含まれていればよく、その他の分子が含まれていてもよい。多量体において、単量体のポリペプチド同士は共有結合などによって強固に結合している必要はない。より緩やかな結合によって複数の単量体のポリペプチドが集合した凝集体も、多量体に含まれる。例えば、Aβは、凝集して不溶性のアミロイド線維を形成する性質を有する。ポリペプチドの多量体としては、Aβ単量体が重合したAβオリゴマー、タウタンパク質が重合したタウオリゴマーなどが挙げられる。
【００１８】
本明細書において「捕捉物質」とは、被検物質であるポリペプチドと特異的に結合し、且つ自身が固相に固定されることにより、該ポリペプチドを固相上に捕捉するための物質をいう。捕捉物質としては、例えば抗体、アプタマーなどが挙げられる。以下、捕捉物質として用いられる抗体を「捕捉抗体」とも呼ぶ。本明細書において「抗体」は、Fab、F(ab')2、Fab'などの抗原結合性抗体フラグメント及びその誘導体を含む。捕捉抗体は、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のいずれでもよいが、好ましくはモノクローナル抗体である。
【００１９】
本明細書において「固相」とは、捕捉物質を固定するための不溶性の担体をいう。「捕捉物質が固相に固定される」とは、捕捉物質と固相とが直接的又は間接的に結合することにより、捕捉物質が固相上に捕捉されることをいう。ポリペプチドと特異的に結合した捕捉物質が固相に固定されることにより、該ポリペプチドは、捕捉物質を介して固相上に捕捉される。
【００２０】
本実施形態の方法はICT法に基づいており、後述のように、捕捉物質とポリペプチドとの複合体を第１の固相から第２の固相へ転移する。このような複合体の転移により、夾雑物などの影響が低減されるので、ポリペプチドをより高い感度で測定できる。捕捉物質は、１種でもよいし、２種でもよい。１種の捕捉物質を用いる実施形態では、該捕捉物質は、第１の固相及び第２の固相の両方に結合する捕捉物質である。２種の捕捉物質を用いる実施形態では、該捕捉物質は、第１の固相に結合する捕捉物質(以下、「第１捕捉物質」ともいう)と、第２の固相に結合する捕捉物質(以下、「第２捕捉物質」ともいう)との組み合わせである。あるいは、第１捕捉物質又は第２捕捉物質と、第１の固相及び第２の固相の両方に結合する捕捉物質とを組み合わせてもよい。
【００２１】
本実施形態では、第１の固相及び第２の固相の少なくとも一方と結合する捕捉物質が、ポリペプチドのＣ末端領域と結合する。好ましくは、第１の固相と結合する捕捉物質が、ポリペプチドのＣ末端領域と結合する。ポリペプチドのＣ末端領域とは、厳密な境界を有するわけではないが、例えば、単量体のポリペプチドのアミノ酸配列における中央付近のアミノ酸残基からＣ末端のアミノ酸残基までの領域であってもよい。単量体のポリペプチドの全長が2n又は2n+1残基(nは１以上の整数)であるとき、中央付近のアミノ酸残基は、例えばn+1位のアミノ酸残基であってもよい。例えば、ポリペプチドが50アミノ酸からなる場合、Ｃ末端領域は、26位のアミノ酸残基から50位のアミノ酸残基までの領域としてもよい。あるいは、当該技術分野において、所定のポリペプチドのＣ末端領域が、構造、物性、機能などにより定義されている場合は、その定義に従ってもよい。例えば、Aβ1-40及びAβ1-42では、Ｎ末端のアミノ酸残基から28位のアミノ酸残基までの領域が親水性であり、29位のアミノ酸残基からＣ末端のアミノ酸残基までの領域が疎水性であることが公知である。そこで、ポリペプチドがAβ1-40又はAβ1-42あるとき、29位のアミノ酸残基からＣ末端のアミノ酸残基までの領域をＣ末端領域として決定してもよい。
【００２２】
本実施形態において、ポリペプチドのＣ末端領域と結合する捕捉物質は、ポリペプチドのＣ末端領域に存在するエピトープ又はＣ末端領域の立体構造を認識して、該ポリペプチドと特異的に結合してもよい。以下、捕捉物質が認識するエピトープ及び立体構造を「捕捉物質の認識部位」とも呼ぶ。例えば、ポリペプチドがAβ(特にAβ1-42)である場合、ポリペプチドのＣ末端領域と結合する捕捉物質として、Aβの22位、好ましくは29位、より好ましくは33位のアミノ酸残基からＣ末端のアミノ酸残基までの領域に存在するエピトープを認識する抗体を用いることができる。AβのＣ末端領域と結合する抗Aβモノクローナル抗体は一般に入手可能であり、例えばH31L21(エピトープ：36〜42)、G2-11(エピトープ：33〜42)、16C11(エピトープ：33〜42)、21F12(エピトープ：34〜42)などのクローンの抗体が市販されている。それらの中でもH31L21が特に好ましい。
【００２３】
本実施形態では、標識物質を有し、ポリペプチドと結合する検出用物質をさらにポリペプチドと接触させて、ポリペプチド、捕捉物質及び検出用物質を含む複合体を形成することが好ましい。本明細書において「検出用物質」とは、被検物質であるポリペプチドと特異的に結合して、標識物質を介して検出可能なシグナルを提供する物質をいう。検出用物質は、固相に固定されないことが好ましい。検出用物質としては、例えば抗体、アプタマーなどが挙げられる。以下、検出用物質として用いられる抗体を「検出抗体」とも呼ぶ。検出抗体は、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のいずれでもよいが、好ましくはモノクローナル抗体である。
【００２４】
本実施形態では、検出用物質は、ポリペプチドのＣ末端領域と結合してもよいし、Ｎ末端領域と結合してもよい。好ましくは、検出用物質は、標識物質を有し、ポリペプチドのＮ末端領域と結合する。ポリペプチドのＮ末端領域とは、厳密な境界を有するわけではないが、例えば、単量体のポリペプチドのＮ末端のアミノ酸残基から、アミノ酸配列における中央付近のアミノ酸残基までの領域であってもよい。例えば、ポリペプチドが50アミノ酸からなる場合、Ｎ末端領域は、１位のアミノ酸残基から25位のアミノ酸残基までの領域としてもよい。あるいは、当該技術分野において、所定のポリペプチドのＮ末端領域が、構造、物性、機能などにより定義されている場合は、その定義に従ってもよい。
【００２５】
本実施形態において、検出用物質は、ポリペプチド(好ましくはそのＮ末端領域)に存在するエピトープ、又はポリペプチド(好ましくはそのＮ末端領域)の立体構造を認識して、該ポリペプチドと特異的に結合する物質を、免疫学的手法で慣用される公知の標識物質で標識することにより得ることができる。以下、検出用物質が認識するエピトープ及び立体構造を「検出用物質の認識部位」とも呼ぶ。例えば、ポリペプチドがAβ(特にAβ1-42)である場合、検出用物質として、AβのＮ末端のアミノ酸残基から28位、好ましくは21位、より好ましくは16位のアミノ酸残基までの領域に存在するエピトープを認識する抗体を用いることができる。AβのＮ末端領域と結合する抗Aβモノクローナル抗体は一般に入手可能であり、例えば82E1(エピトープ：1〜16)、6E10(エピトープ：3〜8)、WO-2(エピトープ：4〜10)、2H4(エピトープ：1〜8)などのクローンの抗体が市販されている。それらの中でも82E1が特に好ましい。
【００２６】
抗体及びアプタマーを標識物質で標識する方法自体は、当該技術分野において公知であり、標識物質の種類に応じて適宜選択できる。例えば、適当な架橋剤、市販のラベリングキットなどを用いて、抗体又はアプタマーと、標識物質とを結合又は連結できる。
【００２７】
標識物質は、検出可能なシグナルを直接又は間接的に発生することができる物質であれば特に限定されず、例えば酵素、蛍光物質、放射性同位体などが挙げられる。酵素としては、アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、チロシナーゼ、酸性ホスファターゼ、ルシフェラーゼなどが挙げられる。蛍光物質としては、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、ローダミン、Alexa Fluor(登録商標)などの蛍光色素、緑色蛍光タンパク質(GFP)などの蛍光タンパク質などが挙げられる。放射性同位体としては、125Ｉ、14Ｃ、32Ｐなどが挙げられる。
【００２８】
検出用物質を添加するタイミングは、例えば、検出用物質の認識部位と捕捉物質の認識部位とが重複するか否かに応じて決定できる。本明細書において「認識部位が重複する」とは、ポリペプチドと特異的に結合する各物質の認識部位が、同一であるか又は部分的に一致することをいう。検出用物質の認識部位と捕捉物質の認識部位とが重複しない場合、すなわち、単量体のポリペプチドに対して、検出用物質及び捕捉物質の両方が結合できる場合は、検出用物質は、複合体の形成工程において添加してもよいし、後述の第１(又は第２)の固相への固定工程又は第１の固相の回収工程において添加してもよい。検出用物質の認識部位と捕捉用物質の認識部位とが重複する場合、すなわち、単量体のポリペプチドに対して、検出用物質及び捕捉物質のいずれか１の物質しか結合できない場合は、検出用物質は、複合体の形成工程において添加することが好ましい。この場合、最終的に、二量体以上の多量体のポリペプチドの情報を取得できる。好ましい実施形態では、検出用物質は、複合体の形成工程において添加する。
【００２９】
複合体の形成工程は、例えば、ポリペプチドを含む試料と、捕捉物質を含む溶液とを混合することにより行うことができる。混合により、ポリペプチドと捕捉物質とが接触して結合する。これにより、「ポリペプチド−捕捉物質」を含む複合体が形成される。検出用物質を複合体の形成工程において添加する場合は、ポリペプチドを含む試料と、捕捉物質を含む溶液と、検出用物質を含む溶液とを混合する。混合により、検出用物質とポリペプチドと捕捉物質とが接触して結合する。これにより、「検出用物質−ポリペプチド−捕捉物質」を含むサンドイッチ複合体が形成される。ポリペプチド、捕捉物質及び検出用物質の混合順序は、特に限定されないが、好ましくは実質的に同時に混合する。複合体の形成工程における反応温度及び反応時間は特に限定されないが、通常20〜45℃の温度で15分〜１時間静置するか又は穏やかに撹拌すればよい。
【００３０】
２種の捕捉物質を用いる実施形態では、第１捕捉物質の認識部位と第２捕捉物質の認識部位は重複してもよいし、重複していなくてもよい。第１捕捉物質の認識部位と第２捕捉物質の認識部位が重複する場合、単量体のポリペプチドに対して、第１捕捉物質又は第２捕捉抗物質のいずれか１の捕捉物質しか結合できない。この場合、最終的に、二量体以上の多量体のポリペプチドの情報を取得できる。
【００３１】
(第１の固相への固定工程)
図１を参照して、ステップＳ２に示すように、複合体の形成後、該複合体中の捕捉物質と、第１の固相とを結合することにより、複合体を第１の固相に固定する。複合体の第１の固相への固定は通常、液体中で行われる。
【００３２】
第１の固相は、免疫学的手法で慣用される公知の固相から選択できる。固相の素材としては、例えば有機高分子化合物、無機化合物、生体高分子などから選択できる。有機高分子化合物としては、例えばラテックス、ゴム、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、スチレン−ブタジエン共重合体、ポリ塩化ビニル、ポリ酢酸ビニル、ポリアクリルアミド、ポリメタクリレート、スチレン−メタクリレート共重合体、ポリグリシジルメタクリレート、アクロレイン−エチレングリコールジメタクリレート共重合体、ポリビニリデンジフルオライド(PVDF)、シリコーンなどが挙げられる。無機化合物としては、例えば磁性体(酸化鉄、酸化クロム、コバルト、ニッケル、フェライト、マグネタイトなど)、ガラス、シリカ、アルミナなどが挙げられる。生体高分子としては、例えば不溶性アガロース、不溶性デキストラン、ゼラチン、セルロースなどが挙げられる。２種以上の素材を組み合わせてもよい。本実施形態では、第１の固相は、磁性粒子、ラテックス粒子などの不溶性粒子が好ましく、磁性粒子が特に好ましい。
【００３３】
複合体中の捕捉物質と第１の固相との結合は、解離可能な結合であればよい。好ましい実施形態では、複合体中の捕捉物質と第１の固相とを別の物質を介して間接的に結合させる。そのような物質としては、互いに特異的に結合し、且つ解離可能な２つの物質の組み合わせが好ましい。以下、２つの物質をそれぞれ「結合物質」及び「結合パートナー」という。結合物質と結合パートナーの組み合わせは、当該技術において公知であり、例えば抗原(被検物質を除く)とその抗体、リガンドとその受容体、オリゴヌクレオチドとその相補鎖、ビオチン類(ビオチン、デスチオビオチンなどのビオチン類縁体を含む)とアビジン類(アビジン、ストレプトアビジンなどのアビジン類縁体を含む)、ニッケルとヒスチジンタグ、グルタチオンとグルタチオン-S-トランスフェラーゼといった組み合わせが挙げられる。抗原とその抗体の組み合わせとしては、ハプテンと抗ハプテン抗体、及び、ビオチン(又はデスチオビオチン)と抗ビオチン抗体(又は抗デスチオビオチン抗体)が好ましい。ハプテンと抗ハプテン抗体の組み合わせとしては、2, 4-ジニトロフェニル(DNP)基と抗DNP抗体が特に好ましい。
【００３４】
１種の捕捉物質を用いる実施形態では、該捕捉物質は、第１の結合物質及び第２の結合物質の両方を有し、且つポリペプチドのＣ末端領域と結合することが好ましい。２種の捕捉物質を用いる実施形態では、該捕捉物質は、第１の結合物質を有する第１捕捉物質と、第２の結合物質を有する第２捕捉物質とを含み、且つ第１捕捉物質及び第２捕捉物質の少なくとも一方が、ポリペプチドのＣ末端領域と結合することが好ましい。いずれの実施形態においても、第１の固相は、第１の結合物質と特異的に結合する第１の結合パートナーを有し、後述の第２の固相は、第２の結合物質と特異的に結合する第２の結合パートナーを有することが好ましい。
【００３５】
本実施形態では、第１の結合物質と第１の結合パートナーとの特異的結合により、複合体中の捕捉物質と第１の固相とを結合することができる。これにより、複合体が第１の固相に固定される。好ましい実施形態では、第１の結合物質はDNP基であり、第１の結合パートナーは抗DNP抗体である。上記の物質を捕捉物質及び固相に結合させる方法は、当該技術において公知である。例えば、ビオチン又はDNPを抗体に結合する場合、該抗体中のアミノ基又はチオール基と反応する架橋剤(例えば、マレイミド、N-ヒドロキシスクシンイミドなど)を用いる方法が知られている。また、市販のラベリングキットを用いてもよい。結合物質又は結合パートナーを固相に結合する方法としては、物理的吸着法、共有結合法、イオン結合法などが知られている。
【００３６】
固定工程は、複合体と第１の固相とを接触させることにより行うことができる。例えば、第１の固相が粒子の形状である場合、複合体を含む液体と、第１の固相とを混合することにより、複合体と第１の固相とが接触する。固定工程で検出用物質を添加する場合、複合体と検出用物質と第１の固相とを接触させる。反応温度及び反応時間は特に限定されないが、通常20〜45℃の温度で15分〜３時間静置するか又は穏やかに撹拌すればよい。
【００３７】
(第１固相の回収工程)
図１を参照して、ステップＳ３に示すように、本実施形態の方法では、複合体が固定された第１の固相を回収する。「固相を回収する」とは、複合体が固定された固相のみを回収することに限らず、他の物質もわずかに含んだ状態で複合体が固定された固相を回収することも含む。反応系には、上記の複合体が固定された第１の固相の他に、試料に含まれていた夾雑物、余剰の抗体などの未反応の成分が存在する。ここで、「未反応の成分」は、固相に固定された複合体以外の成分であって、固相と結合していない遊離の成分のことをいう。この回収工程では、複合体が固定された第１の固相が、未反応の成分から分離して回収される。したがって、この回収工程により、後述の情報取得工程に悪影響を及ぼす未反応成分を除くことができる。このような回収工程は、一般にB/F分離と呼ばれる。回収工程においては、未反応成分を完全に除去する必要はない。測定に悪影響を及ぼさない程度であれば、未反応成分は残留していてもよい。
【００３８】
複合体が固定された第１の固相を回収する方法自体は、当該技術分野において公知であり、第１の固相の種類に応じて適宜決定できる。例えば、磁性粒子を用いた場合、磁気分離により磁性粒子を回収できる。具体的には、複合体が固定された磁性粒子を含む容器の壁面に磁石を近づけて、磁性粒子を容器の壁面に固定させ、液体を吸引除去することにより、複合体が固定された磁性粒子を回収できる。また、ラテックス粒子などの不溶性粒子を用いた場合、遠心分離によって該粒子を沈殿させた後、液体を吸引除去することにより、複合体が固定された不溶性粒子を回収できる。
【００３９】
本実施形態では、回収した第１の固相を洗浄する工程をさらに含むことができる。第１の固相の洗浄は、例えば、回収した第１の固相に洗浄液を添加した後、該第１の固相から洗浄液を除去することにより行うことができる。洗浄液としては、第１の固相に固定された複合体を損なわない緩衝液が好ましい。そのような洗浄液としては、界面活性剤を含む緩衝液が特に好ましく、例えばTBST(0.05% Tween20含有Tris緩衝生理食塩水)、PBST(0.05% Tween20含有リン酸緩衝生理食塩水)などが挙げられる。また、HISCL洗浄液(シスメックス株式会社)などの市販の洗浄液を用いることもできる。洗浄により、第１の固相又は複合体に非特異的に吸着した成分を除去できる。
【００４０】
(第２の固相への固定工程)
図１を参照して、ステップＳ４に示すように、本実施形態の方法では、回収した第１の固相から複合体を遊離する。そして、遊離した複合体中の捕捉物質と、第２の固相とを結合することにより、複合体を第２の固相に固定する。第２の固相に固定された複合体は、後述の情報取得工程において所定の測定系に供されて、ポリペプチドに関する情報が取得されることとなる。
【００４１】
固相上の複合体を遊離させる方法自体は、当該技術分野において公知である。例えば、複合体中の捕捉物質と、第１の固相との結合を解離できる物質(以下、「遊離剤」という)を用いる方法が挙げられる。遊離剤は、当該技術分野において公知であり、捕捉物質と第１の固相との結合様式に応じて適宜選択できる。例えば、複合体中の捕捉物質と、第１の固相とが物理的吸着により結合している場合は、遊離剤として、界面活性剤を含む溶液を用いることで、複合体を第１の固相から遊離することができる。また、イオン結合の場合は、イオンを含む溶液を用いることで、複合体を第１の固相から遊離することができる。
【００４２】
捕捉物質と第１の固相とが、第１の結合物質と第１の結合パートナーとの特異的結合により間接的に結合している場合にも、第１の結合物質と第１の結合パートナーとの結合を解離させる遊離剤を用いることにより、複合体を遊離することができる。そのような遊離剤も当該技術において公知であり、結合物質と結合パートナーの組み合わせに応じて適宜選択できる。例えば、ハプテンと抗ハプテン抗体の結合の場合は、遊離剤として、該ハプテン又はその誘導体を用いることができる。例えば、DNP基と抗DNP抗体との結合の場合は、遊離剤として、ジニトロフェニルアミノ酸を用いることができる。また、ビオチン(又はデスチオビオチン)とアビジン(又はストレプトアビジン)との結合の場合は、遊離剤として、ビオチンを用いることができる。
【００４３】
遊離剤を用いて複合体を遊離させる場合、処理温度及び処理時間は、遊離剤の種類に応じて適宜設定できる。通常は、遊離剤の添加後、20〜45℃の温度下で３〜15分間静置するか又は穏やかに撹拌すればよい。
【００４４】
遊離剤の添加後、第１の固相から遊離した複合体と、第１の固相とを分離して、遊離した複合体を含む液体を回収することが好ましい。例えば、第１の固相として粒子を用いた場合、第１の固相から複合体を遊離させた後、上記の回収工程と同様にして磁力や遠心分離などにより該第１の固相を容器の壁面又は底部に集める。そして、複合体を含む液体を回収する。
【００４５】
複合体の第２の固相への固定は、複合体と第２の固相とを接触させることにより行うことができる。例えば、第２の固相が粒子の形状である場合、複合体を含む液体と、第２の固相とを混合することにより、複合体と第２の固相とが接触する。第２の固相が薄板の形状である場合、複合体を含む液体を第２の固相上に滴下することにより、複合体と第２の固相とが接触する。反応温度及び反応時間は特に限定されないが、通常20〜45℃の温度で15分〜３時間静置するか又は穏やかに撹拌すればよい。
【００４６】
このように、第１の固相から遊離した複合体と、第１の固相とは異なる第２の固相とを接触させることにより、該複合体中の捕捉物質と該第２の固相とが結合して、該複合体が該第２の固相へ転移する。ここで、本明細書において、「第１の固相とは異なる第２の固相」とは、複合体を第１の固相へ固定する工程で添加されたときから存在する第１の固相とは異なる、新たな固相を意味する。すなわち、複合体を第２の固相へ固定する工程では、第１の固相から遊離した複合体が、第１の固相に再び結合することを意図していない。好ましい実施形態では、第１の固相から遊離した複合体を含む液体を回収し、回収した液体と、新たに用意した第２の固相とを接触させる。
【００４７】
第２の固相の素材及び形状は、第１の固相について述べたことと同様である。第２の固相の素材は、第１の固相と同じであってもよいし、異なっていてもよい。第２の固相の形状としては、例えば粒子、薄板、膜、マイクロタイタープレート、マイクロチューブ、試験管などが挙げられる。固相の素材及び形状は、測定手段に応じて適宜決定すればよい。例えば、ポリペプチドを顕微鏡で観察する場合は、光を透過する素材でできた薄板の形状をした固相(例えばスライドガラスなど)が好ましい。
【００４８】
複合体中の捕捉物質と第２の固相との結合様式は、特に限定されない。例えば、物理的吸着、イオン結合などにより、捕捉物質と第２の固相とを直接結合させてもよい。あるいは、捕捉物質と第２の固相とを別の物質を介して間接的に結合させてもよい。そのような物質としては、上記の結合物質及び結合パートナーの組み合わせが挙げられる。第２の結合物質及び第２の結合パートナーの組み合わせは、第１の結合物質及び第１の結合パートナーの組み合わせとは異なっていることが好ましい。１種の捕捉物質を用いる場合、例えば、ビオチン類及びDNP基を有する捕捉物質と、抗DNP抗体を表面に固定した第１の固相と、アビジン類を表面に固定した第２の固相とを用いることができる。２種の捕捉物質を用いる場合、例えば、DNP基を有する第１捕捉物質と、ビオチン類を有する第２捕捉物質と、抗DNP抗体を表面に固定した第１の固相と、アビジン類を表面に固定した第２の固相とを用いることができる。
【００４９】
好ましい実施形態では、複合体が固定された第１の固相を洗浄する工程をさらに含む。第１の固相の洗浄は、第２の固相の洗浄と同様にして行うことができる。
【００５０】
上記の複合体の形成工程から複合体の第２の固相への固定工程までを、図面を参照して説明する。これらの図面は、本実施形態の一例を示すものであって、本発明を限定するものではない。図２に示すように、試料１０は、被検物質であるポリペプチド１１及び夾雑物１２を含む。夾雑物１２は、ポリペプチド１１以外の不要な物質であり、例えばポリペプチド１１以外のタンパク質である。図２では、ポリペプチド１１及び夾雑物１２を含む試料１０と、第１の固相２０と、第１の結合物質３１を有する捕捉物質３０と、第２の結合物質４１を有する捕捉物質４０と、蛍光物質５１を有する検出用物質５０とを混合することにより、複合体６０が形成される。図２において、捕捉物質及び検出用物質は抗体である。抗体３２及び抗体４２は、ポリペプチド１１のＣ末端領域と結合する抗体であり、抗体５２は、ポリペプチド１１のＮ末端領域と結合する抗体である。第１の固相２０は、第１の結合パートナー２２を表面に固定した磁性粒子２１である。図２では、第１の結合物質３１はDNP基であり、第２の結合物質４１はビオチンであり、第１の結合パートナー２２は抗DNP抗体である。複合体６０中の第１捕捉抗体３０と、第１の固相２０とが、第１の結合物質３１と第１の結合パートナー２２との特異的結合を介して結合する。これにより、複合体６０は第１の固相２０に固定される。
【００５１】
図３の(Ａ)を参照して、第１の固相２０に固定された複合体６０は、未反応の成分１３から分離される。図３の(Ａ)では、未反応の成分１３は、夾雑物１２、並びに複合体を形成しなかった捕捉物質３０、捕捉物質４０及び検出用物質５０である。磁石７０を容器に近づけると、容器の内壁に磁性粒子２１が引き寄せられる。このとき、複合体６０は第１の固相２０に固定されているので、磁性粒子２１とともに複合体６０も容器の内壁に引き寄せられる。この状態で、容器内の液体を除去すると、複合体６０が、未反応の成分１３から分離される。
【００５２】
図３の(Ｂ)を参照して、遊離剤としてジニトロフェニルリジンを添加することにより、第１の結合物質３１と第１の結合パートナー２２との結合が解離する。これにより、第１の固相が、複合体６０から解離する。図３の(Ｃ)を参照して、第１の固相２０から遊離した複合体６０と、第１の固相２０とを分離する。磁石７０を容器に近づけると、容器の内壁に磁性粒子２１が引き寄せられる。この状態で、容器内の液体を回収することにより、複合体６０が選択的に回収される。
【００５３】
図４Ａでは、第２の固相として、不溶性粒子を用いた例を示す。図４Ａを参照して、複合体６０を含む液体と、第２の結合パートナー８１を有する第２の固相８０とを混合することにより、複合体６０は第２の固相８０に固定される。第２の結合パートナー８１は、アビジン類である。複合体６０中の第２捕捉抗体４０と、第２の固相８０とが、第２の結合物質４１と第２の結合パートナー８１との特異的結合を介して結合する。これにより、複合体６０は第２の固相８０に固定される。あるいは、図４Ｂに示すように、第２の固相として、薄板状の固相を用いてもよい。図４Ｂを参照して、複合体６０を含む液体を、第２の結合パートナー８１を含む第１の固相８０上に滴下することにより、複合体６０は第２の固相８０に固定される。
【００５４】
図２に示す複合体の形成工程では、ポリペプチド１１のＣ末端領域と結合する２種の捕捉物質として、第１の結合物質３１を有する捕捉物質３０と、第２の結合物質４１を有する捕捉物質４０との２種を用いた。これらの２種の捕捉物質に代えて、図５に示すように、第１の結合物質３１及び第２の結合物質４１を有する捕捉物質３０を用いてもよい。図５では、ポリペプチド１１及び夾雑物１２を含む試料１０と、第１の固相２０と、第１の結合物質３１及び第２の結合物質４１を有する捕捉物質３０と、蛍光物質５１を有する検出用物質５０とを混合することにより、複合体６０が形成される。複合体６０中の捕捉物質３０と、第１の固相２０とが、第１の結合物質３１と第１の結合パートナー２２との特異的結合を介して結合する。これにより、複合体６０は第１の固相２０に固定される。複合体６０の形成後は、図３と同様に磁気分離により、複合体６０を選択的に回収する。
【００５５】
図６Ａを参照して、複合体６０を含む液体と、第２の結合パートナー８１を含む第２の固相８０とを混合することにより、第２の結合物質４１と第２の結合パートナー８１との特異的結合を介して、複合体６０が第２の固相８０に固定される。図６Ｂを参照して、複合体６０を含む液体を、第２の結合パートナー８１を含む第２の固相８０上に滴下することにより、複合体６０は第２の固相８０に固定される。
【００５６】
図７を参照して、ポリペプチドのＣ末端領域と結合する捕捉物質と、ポリペプチドのＮ末端領域と結合する捕捉物質とを用いる例について説明する。図７に示すように、試料１０は、被検物質であるポリペプチド１１及び夾雑物１２を含む。図７では、ポリペプチド１１及び夾雑物１２を含む試料１０と、第１の固相２０と、第１の結合物質３１を有する捕捉物質３０と、第２の結合物質４１を有する捕捉物質４０と、蛍光物質５１を有する検出用物質５０とを混合することにより、複合体６０が形成される。図７では、捕捉物質３０(抗体３２)は、ポリペプチド１１のＣ末端領域と結合する抗体であり、捕捉物質４０(抗体４２)及び検出用物質５０(抗体５２)は、ポリペプチド１１のＮ末端領域と結合する抗体である。第１の固相２０は、第１の結合パートナー２２を表面に固定した磁性粒子２１である。図７では、第１の結合物質３１はDNP基であり、第２の結合物質４１はビオチンであり、第１の結合パートナー２２は抗DNP抗体である。複合体６０中の捕捉物質３０と、第１の固相２０とが、第１の結合物質３１と第１の結合パートナー２２との特異的結合を介して結合する。これにより、複合体６０は第１の固相２０に固定される。
【００５７】
図８の(Ａ)では、磁気分離により、第１の固相２０に固定された複合体６０が回収される。図８の(Ｂ)では、遊離剤としてジニトロフェニルリジンを添加することにより、第１の結合物質３１と第１の結合パートナー２２との結合が解離する。これにより、第１の固相が、複合体６０から解離する。図８の(Ｃ)では、第１の固相２０から遊離した複合体６０と、第１の固相２０とを磁気分離し、複合体６０を選択的に回収する。図８に示される工程の詳細については、図３について述べたことと同様である。
【００５８】
図９Ａでは、複合体６０を含む液体と、第２の結合パートナー８１を含む第２の固相８０とを混合することにより、第２の結合物質４１と第２の結合パートナー８１との特異的結合を介して、複合体６０が第２の固相８０に固定される。図９Ｂでは、複合体６０を含む液体を、第２の結合パートナー８１を含む第２の固相８０上に滴下することにより、複合体６０は第２の固相８０に固定される。
【００５９】
本実施形態では、上記の複合体の形成から、第１の固相からの複合体の遊離及び回収までの各工程又は一連の工程を用手法で行ってもよいし、装置により行ってもよい。あるいは、複合体の形成から、複合体の第２の固相への固定までの各工程又は一連の工程を用手法で行ってもよいし、装置により行ってもよい。そのような装置としては、例えば自動検体処理装置、自動免疫測定装置、顕微鏡観察用スライド作製装置などが挙げられる。
【００６０】
(情報取得工程)
図１を参照して、ステップＳ５に示すように、本実施形態の方法では、第２の固相に固定された複合体からポリペプチドに関する情報を取得する。ポリペプチドに関する情報は、ポリペプチドの量に関する情報であってもよいし、ポリペプチドの構造に関する情報であってもよい。
【００６１】
ポリペプチドの量に関する情報は、定性的情報であってもよいし、定量的情報であってもよい。定性的情報としては、ポリペプチドの存否などが挙げられる。定量的情報としては、例えばポリペプチドの濃度、含有量(重量)、それらを示す測定値自体などが挙げられる。定量的情報には、「少量」、「中程度」、「多量」などのようにポリペプチドの量を段階的に示す半定量的情報も含まれる。
【００６２】
ポリペプチドの構造に関する情報としては、例えばポリペプチドの大きさ、形態、凝集度などの情報が挙げられる。好ましい実施形態では、第２の固相上のポリペプチドを顕微鏡により撮像して、該ポリペプチドの画像を取得することにより、ポリペプチドの構造に関する情報を得る。顕微鏡の種類は、ペプチドの画像を取得可能であれば特に限定されないが、例えば蛍光顕微鏡、超解像顕微鏡、ラマン顕微鏡、プローブ顕微鏡、電子顕微鏡などが挙げられる。
【００６３】
本実施形態では、ポリペプチドに関する情報は、第２の固相に固定された複合体中の検出用物質の標識物質に基づくシグナルを測定することにより取得される。ポリペプチドの量に関する情報を取得する場合は、シグナルの強度などを数値で測定することが好ましい。例えば、得られた測定値を、濃度既知のポリペプチドの測定値から作成した検量線に当てはめることにより、ポリペプチドの濃度又は含有量に関する情報を取得できる。ポリペプチドの構造に関する情報を取得する場合は、シグナルに基づいて画像を取得することが好ましい。
【００６４】
標識物質に基づくシグナルを測定する方法自体は、当該技術分野において公知である。本実施形態では、上記の標識物質に由来するシグナルの種類に応じた適切な測定方法を選択できる。例えば、標識物質が酵素である場合、複合体中の酵素と、該酵素の基質とを反応させ、酵素反応により生じた反応産物から発生する光、色などのシグナルを、公知の装置を用いて測定できる。そのような測定装置としては、分光光度計、ルミノメータなどが挙げられる。
【００６５】
酵素の基質は、酵素の種類に応じて公知の基質から適宜選択できる。例えば、酵素としてアルカリホスファターゼを用いる場合、基質としては、CDP-Star(登録商標)(4-クロロ-3-(メトキシスピロ[1, 2-ジオキセタン-3, 2'-(5'-クロロ)トリクシロ[3. 3. 1. 13, 7]デカン]-4-イル)フェニルリン酸２ナトリウム)、CSPD(登録商標)(3-(4-メトキシスピロ[1, 2-ジオキセタン-3, 2-(5'-クロロ)トリシクロ[3. 3. 1. 13, 7]デカン]-4-イル)フェニルリン酸２ナトリウム)などの化学発光基質；p-ニトロフェニルホスフェート、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルリン酸(BCIP)、4-ニトロブルーテトラゾリウムクロリド(NBT)、ヨードニトロテトラゾリウム(INT)などの発光基質；4-メチルウムベリフェニル・ホスフェート(4MUP)などの蛍光基質；5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルリン酸(BCIP)、5-ブロモ-6-クロロ-インドリルリン酸２ナトリウム、p-ニトロフェニルリンなどの発色基質が挙げられる。酵素としてβ−ガラクドシダーゼを用いる場合、基質の例としては、4-メチルウンベリフェリル-β-D-ガラクトピラノシドが挙げられる。
【００６６】
標識物質が蛍光物質である場合は、複合体に励起光を照射し、該複合体中の蛍光物質から発生する蛍光を、蛍光マイクロプレートリーダなどの公知の装置を用いて測定できる。標識物質が放射性同位体である場合、複合体中の放射性同位体から生じる放射線を、シンチレーションカウンターなどの公知の装置を用いて測定できる。
【００６７】
以下に、超解像顕微鏡の一種である超解像蛍光顕微鏡により、ポリペプチドの構造に関する情報を取得する場合について、図面を参照して以下に説明する。なお、超解像顕微鏡とは、光の回折限界を超えた分解能を有する顕微鏡である。
【００６８】
図10では、薄板状の第２の固相８０(以下、「基板８０」ともいう)に固定された複合体を示す。複合体において、蛍光物質５１で標識された検出抗体がポリペプチド１１に結合している。蛍光色素５１は、励起光が照射され続けると、蛍光を生じる発光状態と蛍光を生じない消光状態とに切り替わるよう構成されている。このような光スイッチ型蛍光色素は、例えばMolecular Probes社などにより市販されている。図10において、発光状態の蛍光色素５１は黒丸で示され、消光状態の蛍光色素５１は白丸で示されている。
【００６９】
図11を参照して、ステップＳ１０１において、励起光が基板８０上の蛍光色素５１に照射される。図10の(Ａ)に示すように、初期状態では、全ての蛍光色素５１が発光状態にある。この状態で、励起光の照射が開始されると、全ての蛍光色素５１から蛍光が励起される。その後、励起光が蛍光色素５１に照射され続けると、時間の経過とともに、例えば図10の(Ｂ)及び(Ｃ)に示すように、発光状態の蛍光色素５１の分布が変化する。
【００７０】
ステップＳ１０２において、蛍光色素５１に励起光が照射されている間に、生じた蛍光が撮像され、蛍光色素５１の画像が取得される。ステップＳ１０２では、蛍光色素５１に励起光が照射されている間に撮像が繰り返され、例えば3000枚の画像が取得される。上記のように時間の経過に応じて発光状態の蛍光色素５１の分布が変化するので、取得される画像上の蛍光の分布も、撮像タイミングごとに異なる。
【００７１】
ステップＳ１０３において、所定時間が経過し、必要な画像の取得が終了したか否かが判定される。所定時間が経過するまでは、ステップＳ１０２において撮像が繰り返される。所定時間が経過して必要な画像の取得が完了すると、処理がステップＳ１０４に進められる。このように画像を取得すると、後段のステップにおいてポリペプチド１１の構造に関する情報を取得できるようになる。
【００７２】
ステップＳ１０１〜Ｓ１０３の工程に代えて、STORM (Stochastic optical reconstruction microscopy)、PALM (Photoactivated localization microscopy)、STED (Stimulated emission depletion)又はSIM (Structured illumination microscopy)の手法に基づく工程によって、画像を取得してもよい。STORMに基づく工程によって画像が取得される場合、蛍光色素５１は、蛍光を生じる活性状態と蛍光を生じない不活性状態とに切り替わるよう構成される。そして、蛍光色素５１が２種類の光により活性状態と不活性状態に切り替えられることにより、上記と同様に、蛍光の分布が異なる複数の画像が取得される。
【００７３】
続いて、ステップＳ１０４において、超解像画像が作成される。図12に示すように、超解像画像は、図11のステップＳ１０２の工程で取得された複数の蛍光画像に基づいて作成される。各蛍光画像について、撮像系の点像分布関数又はPSF(Point Spread Function)によるフィッティングを行い、蛍光の輝点が抽出される。具体的には、ガウスフィッティングにより蛍光の輝点が抽出される。これにより、２次元平面において、各輝点の座標とフィッティングの誤差が取得される。ここで、ガウスフィッティングにより、所定範囲で基準波形とマッチングする蛍光領域の輝点については、この範囲に応じた広さの輝点領域が割り当てられる。基準波形と１点でマッチングする蛍光領域の輝点については、最低レベルの広さの輝点領域が割り当てられる。こうして、各蛍光画像から得られた輝点領域が重ね合わせられることにより、超解像画像が作成される。
【００７４】
したがって、ステップＳ１０２において3000枚の蛍光画像が取得された場合、蛍光画像の超解像画像は、3000枚の蛍光画像から輝点が抽出され、抽出された輝点の輝点領域が重ね合わせられることにより作成される。
【００７５】
図11に戻り、ステップＳ１０５において、ポリペプチド１１の構造に関する情報が取得される。ステップＳ１０５では、ポリペプチド１１の構造に関する情報として、ポリペプチド１１についての、大きさ、形態、構造、凝集度などが取得される。
【００７６】
ステップＳ１０５では、以下のような手順でポリペプチド１１の構造に関する情報が取得される。図12に示すように、図11のステップＳ１０４の工程で取得された超解像画像の作成時に抽出した輝点が、凝集したポリペプチド１１に対応するグループに分類される。すなわち、まず、複数の蛍光画像から抽出された全ての輝点が、座標平面にマッピングされる。続いて、所定の広さの参照領域で座標平面が走査され、参照領域に含まれる輝点の数が取得される。そして、参照領域に含まれる輝点の数が閾値よりも多く、かつ、周囲よりも多い参照領域の位置が抽出され、抽出された位置において参照領域に含まれる輝点が、１つのグループに分類される。こうして得られた１つのグループは、ポリペプチド１１の１つの凝集塊とみなされる。
【００７７】
なお、１つのグループに輝点を分類する方法は、これに限らず、他のクラスタリングの手法でもよい。例えば、全ての蛍光画像を足し合わせて生成した蛍光画像上で所定の閾値以上の画素値を有する領域を１つの凝集塊とみなしてもよい。また、情報取得工程のステップＳ１０１の開始直後に全ての蛍光色素５１から励起された蛍光を撮像した蛍光画像上で、所定の閾値以上の画素値を有する領域を１つの凝集塊とみなしてもよい。
【００７８】
続いて、ポリペプチド１１の凝集塊ごとに、超解像画像に基づいて、以下の情報が取得される。すなわち、ポリペプチド１１の大きさとして、長手方向の長さ、短手方向の長さ、周囲長、面積などが取得される。また、ポリペプチド１１の形態として、縦横比、真円率、分岐数、分岐角度などが取得される。縦横比は、例えば、長手方向の長さを短手方向の長さで除算することにより得られる。また、ポリペプチド１１の構造として、ポリペプチド１１の凝集塊が、タンパク質の一次構造、二次構造、三次構造、四次構造のいずれであるかが取得される。また、ポリペプチド１１の凝集度として、凝集塊を形成するモノマーの個数が取得される。モノマーの個数は、モノマーの標準の大きさと凝集塊の大きさとを比較することにより取得される。
【００７９】
ステップＳ１０５では、ポリペプチド１１の構造に関する情報が、超解像画像に基づいて取得されたが、これに限らず、蛍光色素５１から生じた蛍光を撮像して得られる蛍光画像に基づいて取得されてもよい。例えば、ステップＳ１０１の開始直後に全ての蛍光色素５１から生じた蛍光を撮像して得られる蛍光画像に基づいて、ポリペプチド１１の構造に関する情報が取得されてもよい。ただし、この場合は、光の回折限界を超えた分解能で分析を行うことができない。したがって、上記のように超解像画像に基づいてポリペプチド１１の構造に関する情報が取得されるのが好ましい。
【００８０】
図11に戻り、ステップＳ１０６において、ステップＳ１０５で取得された情報が出力される。具体的には、取得された情報が、ディスプレイからなる表示部に表示される。この他、取得された情報が、スピーカから音声として出力されてもよく、デジタルデータとして他の装置に送信されてもよい。
【００８１】
図13を参照して、ステップＳ１０６において表示部に表示される画面９０について説明する。画面９０は、画像９１、９２と領域９３を備える。画像９１は、図11のステップＳ１０５で取得された超解像画像である。画像９２は、画像９１の一部を拡大した画像である。領域９３は、図11のステップＳ１０６で取得されたポリペプチド１１の構造に関する情報を表示する領域である。情報取得工程において図13に示すような画面９０が表示されると、例えば医師等は、視覚的に超解像画像及びポリペプチド１１の構造に関する情報を把握できるので、円滑に病状を診断し治療方針を決定できる。
【００８２】
本実施形態では、情報取得工程は、図14に示す検出装置１００により自動で行われてもよい。検出装置１００は、情報取得部１０１と情報処理部１０２を備える。検出装置１００は、図11の情報取得工程の各工程を自動で行うための装置である。
【００８３】
情報取得部１０１は、光源部１１０と、シャッター１２１と、1/4波長板１２２と、ビームエキスパンダ１２３と、集光レンズ１２４と、ダイクロイックミラー１２５と、対物レンズ１２６と、集光レンズ１２７と、ステージ１３０と、撮像部１４０と、シャッター駆動機構１５１と、ステージ駆動機構１５２とを備える。ステージ１３０には、ポリペプチド１１が固定された基板８０が設置される。
【００８４】
光源部１１０は、光源１１１とミラー１１２を備える。光源１１１は、励起光を出射する。光源１１１としては、レーザー光源を用いるのが好ましいが、水銀ランプ、キセノンランプ、LEDなどを用いてもよい。光源１１１から出射される励起光は、ポリペプチド１１に結合した蛍光色素５１を発光状態と消光状態とに変化させるとともに、発光状態の蛍光色素５１を励起させて蛍光を生じさせる。ミラー１１２は、光源１１１からの励起光を反射して、シャッター１２１へと導く。
【００８５】
なお、蛍光色素５１が蛍光を生じる活性状態と蛍光を生じない不活性状態とに切り替わるよう構成される場合、光源部１１０は、２つの光源と、ミラーと、ダイクロイックミラーとを備えるよう構成される。この場合、一方の光源は、蛍光色素５１を活性状態にする光を出射し、他方の光源は、蛍光色素５１を不活性状態にする光を出射する。２つの光源からの光の光軸は、ミラーとダイクロイックミラーによって、互いに一致させられる。
【００８６】
シャッター１２１は、シャッター駆動機構１５１により駆動され、光源部１１０から出射された励起光を通過させる状態と、光源部１１０から出射された励起光を遮断する状態とに切り替える。これにより、被検物質１１に対する励起光の照射時間が調整される。シャッター駆動機構１５１は、例えばモーター、バネなどから構成される。1/4波長板１２２は、光源部１１０から出射された直線偏光の励起光を円偏光に変換する。蛍光色素５１は、所定の偏光方向の励起光に反応する。よって、光源部１１０から出射された励起光を円偏光に変換することにより、励起光の偏光方向が、蛍光色素５１が反応する偏光方向に一致し易くなる。これにより、蛍光色素５１に効率良く蛍光を励起させることができる。ビームエキスパンダ１２３は、基板８０上における励起光の照射領域を広げる。集光レンズ１２４は、対物レンズ１２６から基板８０に平行光が照射されるよう励起光を集光する。
【００８７】
ダイクロイックミラー１２５は、光源部１１０から出射された励起光を反射し、蛍光色素５１から生じた蛍光を透過する。対物レンズ１２６は、ダイクロイックミラー１２５で反射された励起光を、基板８０に導く。ステージ１３０は、ステージ駆動機構１５２により駆動され、ステージ１３０を面方向に移動させる。ステージ駆動機構は、例えばモーター、シャフト、ナットなどから構成される。基板８０上の蛍光色素５１から生じた蛍光は、対物レンズ１２６を通り、ダイクロイックミラー１２５を透過する。集光レンズ１２７は、ダイクロイックミラー１２５を透過した蛍光を集光して、撮像部１４０の受光面１４１に導く。撮像部１４０は、受光面１４１に照射された蛍光を撮像し、蛍光画像を生成する。撮像部１４０は、例えばCCDなどにより構成される。
【００８８】
情報処理部１０２は、処理部１６１と、記憶部１６２と、表示部１６３と、入力部１６４と、インターフェース１６５とを備える。
【００８９】
処理部１６１は、たとえばＣＰＵである。記憶部１６２は、ROM、RAM、ハードディスクなどである。処理部１６１は、記憶部１６２に記憶されたプログラムに基づいて、インターフェース１６５を介して、情報処理部１０２の各部と、光源部１２０の光源１１１と、撮像部１４０と、シャッター駆動機構１５１と、ステージ駆動機構１５２とを制御する。
【００９０】
また、処理部１６１は、記憶部１６２に記憶されたプログラムに基づいて、図11に示した情報取得工程を実行する。すなわち、処理部１６１は、情報取得工程において、光源１１１を駆動して、蛍光色素５１から生じた蛍光を撮像部１４０により受光し、撮像部１４０を駆動して蛍光画像を取得する。処理部１６１は、撮像部１４０により取得した蛍光画像に基づいて、超解像画像を生成する。処理部１６１は、生成した超解像画像に基づいて、ポリペプチド１１の構造に関する情報を取得し、取得した情報を含む画面を表示部１６３に表示する。
【００９１】
表示部１６３は、処理部１６１による処理結果等を表示するためのものであり、液晶ディスプレイ、プラズマディスプレイ、CRT(Cathode Ray Tube)ディスプレイ等である。表示部１６３は、図13に示す画面９０を表示する。入力部１６４は、オペレータによる指示の入力を受け付けるためのキーボードとマウスである。
【００９２】
図11に示す情報取得工程では、光の回折限界を超えた空間分解能を有する超解像蛍光顕微鏡によって基板８０上のポリペプチド１１が測定されたが、これに限らず、ラマン顕微鏡、プローブ顕微鏡、電子顕微鏡によって、基板８０上のポリペプチド１１が測定されてもよい。プローブ顕微鏡と電子顕微鏡によれば、光の回折限界を超えた空間分解能でポリペプチド１１を測定できる。情報取得工程において蛍光を用いた測定が行われない場合、例えばラマン顕微鏡やプローブ顕微鏡を用いる場合、上記の検出抗体の添加によるポリペプチドの標識は省略される。検出抗体の添加が省略されると、ポリペプチド１１の結合サイトに捕捉抗体を結合させやすくなるので、ポリペプチド１１をより円滑に基板８０に固定できる。
【００９３】
ポリペプチドの構造に関する情報のうち、ポリペプチドの大きさ、形態、凝集度については、超解像蛍光顕微鏡、ラマン顕微鏡、プローブ顕微鏡又は電子顕微鏡を用いてポリペプチド１１を測定した場合に取得可能である。ポリペプチドの構造に関する情報のうち、ポリペプチドの構造については、超解像蛍光顕微鏡、ラマン顕微鏡又はプローブ顕微鏡を用いてポリペプチド１１を測定した場合に取得可能である。
【００９４】
ラマン顕微鏡を用いてポリペプチド１１を測定した場合、ポリペプチド１１を構成する分子又は原子を反映したラマンスペクトル、及び、ポリペプチド１１の形状を反映した画像が取得される。したがって、ラマン顕微鏡によれば、ポリペプチドの構造に関する情報として、大きさ、形態、構造、凝集度に加えて、化学結合も取得可能である。具体的には、ポリペプチド１１の化学結合として、ポリペプチド１１を構成する分子又は原子の種類、数、濃度、割合などが取得される。この場合、図13の画面９０内の領域９３に、大きさ、形態、構造、凝集度に加えて、取得されたポリペプチド１１の化学結合が表示される。例えば、領域９３には、取得されたポリペプチド１１の化学結合として、「Ｃ＝Ｏは…濃度、Ｃ−Ｈは…濃度」などが表示される。
【００９５】
本発明の範囲には、被検物質の捕捉方法も含まれる。この方法では、図１に示されるステップＳ１からステップＳ４までの工程を行うことにより、試料中の被検物質であるポリペプチドを捕捉できる。各工程の詳細については、本実施形態の被検物質の情報の取得方法について述べたことと同様である。本実施形態の被検物質の捕捉方法では、試料中の被検物質であるポリペプチドは、捕捉物質に捕捉されて複合体となり、第２の固相に固定される。第２の固相に固定された複合体は、被検物質であるポリペプチドの情報を取得するための測定試料である。よって、本実施形態の被検物質の捕捉方法は、被検物質の情報の取得のための測定試料の調製方法と言い換えることができる。あるいは、本実施形態の被検物質の捕捉方法は、被検物質の情報の取得のための、被検物質を含む試料の前処理方法と言い換えてもよい。
【００９６】
また、本発明の範囲には、被検物質であるポリペプチド及び該ポリペプチドと結合する捕捉物質を含む複合体からポリペプチドに関する情報を取得する工程を含む、被検物質の情報の取得方法も含まれる。情報取得工程の詳細については、上記の本実施形態の被検物質の情報の取得方法について述べたことと同様である。この方法において、情報取得のための測定に付される複合体は、図１に示されるステップＳ１からステップＳ４までの工程により得ることができる。各工程の詳細については、上記の本実施形態の被検物質の情報の取得方法について述べたことと同様である。
【００９７】
以下に、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００９８】
実施例１
免疫複合体転移法(ICT)及び蛍光顕微鏡を利用する本実施形態の方法により、被検者から採取した臨床検体に含まれるAβを感度よく測定できるかを検討した。
【００９９】
１．試料の調製
Aβを含む試料として、検体の提供に同意したアルツハイマー病患者から採取した脳脊髄液(CSF)を用いた。実施例１では、複数の患者由来のCSFを混合して調製したプールCSF(以下、「臨床検体１」と呼ぶ)を使用した。
【０１００】
２．試薬の調製
(2.1) 第１の固相の作製
第１の固相として、表面に抗DNP抗体が固定された磁性粒子(以下、単に「磁性粒子」とも呼ぶ)を、次のようにして作製した。粒径2.2μmの磁性粒子(商品名：MAG2201、JSR社)に、慣用の手法により抗DNP抗体(シスメックス株式会社)を固定した。これにより、表面に抗DNP抗体が固定された磁性粒子の懸濁液(粒子濃度2.5%)を得た。
【０１０１】
(2.2) 第２の固相の作製
第２の固相として、ストレプトアビジンを表面に固定したガラス基板(以下、単に「基板」とも呼ぶ)を、次のようにして作製した。シリコンゴムシート(SR-50、タイガースポリマー株式会社)に直径６mmの貫通孔を設け、MASコートガラス(松浪硝子工業株式会社)に貼り付けた。0.5μLの30μg/mLビオチン結合ウシ血清アルブミン(BSA)をシリコンゴムシート内側のガラス上に滴下し、室温で１時間静置した。ガラスを40μLのHISCL洗浄液(シスメックス株式会社)でピペッティングにより洗浄した。洗浄は計２回実施した。さらに40μLのPBSでピペッティングにより洗浄した。洗浄は計２回実施した。40μLの1% BSA/PBS溶液をガラス上に滴下し、４℃で一晩静置した。ガラスを40μLのHISCL洗浄液(シスメックス株式会社)でピペッティングにより洗浄した。洗浄は計２回実施した。さらに40μLのPBSでピペッティングにより洗浄した。PBSによる洗浄は計２回実施した。40μLの10μg/mLストレプトアビジン/1% BSA/PBS溶液をガラス上に滴下し、室温で１時間撹拌した。ガラスを40μLのHISCL洗浄液(シスメックス株式会社)でピペッティングにより洗浄した。洗浄は計２回実施した。さらに40μLのPBSでピペッティングにより洗浄した。PBSによる洗浄は計２回実施した。
【０１０２】
(2.3) 捕捉物質
実施例１では、Aβペプチドと結合する捕捉物質として、ウサギ抗アミロイドβ42モノクローナル抗体(Life Technologies社、クローン名：H31L21)(以下、「H31L21抗体」とも呼ぶ)及びマウス抗ヒトアミロイドβモノクローナル抗体(IBL社、クローン名：82E1)(以下、「82E1抗体」とも呼ぶ)を用いた。H31L21抗体は、AβペプチドのＣ末端領域と結合する抗体であり、Aβの36〜42位の領域を認識する。82E1抗体は、AβペプチドのＮ末端領域と結合する抗体であり、Aβの1〜16位の領域を認識する。実施例１では、第１の結合物質としてDNPを用い、第２の結合物質としてビオチンを用いた。具体的には、以下のようにして、各抗体をDNP又はビオチンで標識して第１及び第２捕捉物質を得た。
【０１０３】
(2.3.1) 第１の結合物質を有する第１捕捉物質 (DNP標識捕捉抗体)
Ｎ-スクシンイミドＳ-アセチルチオアセテート(SATA)(Thermo Fischer Scientific社)を用いて、H31L21抗体及び82E1抗体のそれぞれにチオール基を導入した。Ｎ-(6-マレイミドカプロイルオキシ)スクシンイミド(EMCS)を用いて、N-(2, 4-ジニトロフェニル)-L-リジン(DNP-Lys)(東京化成工業株式会社)をマレイミド化した。チオール基を導入した各抗体と、マレイミド化したDNP-Lysとを混合して反応させた。これにより、Aβを第１の固相(上記の磁性粒子)に固定するための第１捕捉物質として、DNP標識H31L21抗体及びDNP標識82E1抗体を得た。
【０１０４】
(2.3.2) 第２の結合物質を有する第２捕捉物質 (ビオチン標識捕捉抗体)
SATA(Thermo Fischer Scientific社)を用いて、H31L21抗体及び82E1抗体のそれぞれにチオール基を導入した。チオール基を導入した各抗体と、Biotin-PEAC5-マレイミド(6-[N'-[2-(N-マレイミド)エチル]-N-ピペラジニルアミド]ヘキシルD-ビオチンアミド塩酸塩)とを混合して反応させた。これにより、Aβを第２の固相(上記の基板)に固定するための第２捕捉物質として、ビオチン標識H31L21抗体及びビオチン標識82E1抗体を得た。
【０１０５】
(2.4) 検出用物質
82E1抗体をシリルローダミン系蛍光色素で標識して、Aβを検出するための蛍光標識抗体を得た。該蛍光色素は、Grimm J.B.ら, "A general method to improve fluorophores for live-cell and single-molecule microscopy", Nature Methods, vol.12, (2015) p.244-250の記載に従って合成した。
【０１０６】
(2.5) 遊離剤
第１捕捉物質が有するDNPと、第１の固相(磁性粒子)上の抗DNP抗体との結合を解離するための遊離剤として、2.5mM DNP-Lys溶液を用いた。DNP-Lys溶液は、N-(2, 4-ジニトロフェニル)-L-リジン(東京化成工業株式会社)を、濃度が2.5mMとなるようにバッファー(0.1 Tris-HCl(pH 7.5)、2%カゼインナトリウム、0.1% NaN3及びDMSO)で希釈して調製した。
【０１０７】
(2.6) 抗体溶液の調製
上記の２種の捕捉物質及び検出用物質を、表１に示されるＡ〜Ｄの抗体の組み合わせでHISCL R3希釈液(シスメックス株式会社)中に混合して、抗体溶液を得た。該抗体溶液における各抗体の含有量は、いずれの抗体も300 fmol/assayとなるよう調整した。以下、表中の(N)は、82E1抗体がAβのＮ末端領域と結合する抗体であることを示し、(C)は、H31L21抗体がAβのＣ末端領域と結合する抗体であることを示す。なお、表１中、Ａの抗体の組み合わせは図２に対応し、Ｂの抗体の組み合わせは図７に対応する。
【０１０８】
【表１】
2020134329.tif 000003
【０１０９】
３．測定
全自動検体処理装置であるMagtration System 6GC (プレシジョン・システム・サイエンス株式会社)に上記の抗体溶液、第１の固相(磁性粒子)の懸濁液、HISCL洗浄液及び遊離剤(DNP-Lys溶液)を設置した。当該装置により試料を処理して、Aβ及び上記の抗体を含む複合体を回収した。具体的な処理は次のとおりであった。80μLの試料と80μLの抗体溶液とを混合して、37℃で30分間インキュベートした。ここに、20μLの磁性粒子の懸濁液をさらに混合して、37℃で15分間インキュベートした。磁性粒子を集磁して上清を除き、600μLのHISCL洗浄液を加えて磁性粒子を洗浄した。洗浄は計２回実施した。さらに150μLのHISCL洗浄液を加えて磁性粒子を洗浄した。洗浄は計１回実施した。洗浄後、磁性粒子に30μLのDNP-Lys溶液を添加し、37℃で10分間撹拌した。磁性粒子を集磁し、上清を回収した。
【０１１０】
回収した上清を基板上に滴下して、室温で３時間撹拌した。基板を40μLのHISCL洗浄液(シスメックス株式会社)でピペッティングにより洗浄した。洗浄は計２回実施した。さらに40μLのPBSでピペッティングにより洗浄した。PBSによる洗浄は計２回実施した。レーザーを組み込んだ倒立顕微鏡を用いて基板上のAβの蛍光画像を撮像した。64視野の蛍光画像をMax intensityで重ねて、結果を取得した。
【０１１１】
４．結果
取得した蛍光画像を図15に示す。図中の「Ａ」、「Ｂ」、「Ｃ」及び「Ｄ」はそれぞれ、表１のＡ、Ｂ、Ｃ及びＤの抗体の組み合わせを用いて得た画像である。図中のスケールバーは10μmを示す。実施例１では、蛍光標識抗体、DNP標識抗体及びビオチン標識抗体のうちの２種又は３種が同一クローンの抗体であるので、蛍光画像上の輝点は、二量体以上のAβの凝集体を示す。臨床検体１の蛍光画像の輝点の数を、表２に示す。輝点のカウントは、蛍光画像において所定の閾値を超える画素値を有する領域を輝点領域とし、特定した輝点領域の数をカウントすることにより行われた。
【０１１２】
【表２】
2020134329.tif 000004
【０１１３】
表２に示されるように、第１捕捉物質及び第２捕捉物質の一方又は両方が、AβのＣ末端領域と結合する抗体であり、検出用物質が、AβのＮ末端領域と結合する抗体であるとき、臨床検体中のAβを感度よく検出できることが示唆された。特に、第１捕捉物質及び第２捕捉物質が、AβのＣ末端領域と結合する抗体であり、検出用物質が、AβのＮ末端領域と結合する抗体であるとき、臨床検体中のAβの検出感度が顕著に向上した。
【０１１４】
実施例２
実施例１では、ICTにおいて２種類の捕捉物質を用いたが、実施例２では、１種類の捕捉物質抗体を用いるICT及び蛍光顕微鏡を利用する本実施形態の方法により、臨床検体に含まれるAβを感度よく測定できるかを検討した。
【０１１５】
１．試料の調製
Aβを含む試料として、検体の提供に同意したアルツハイマー病患者から採取したCSFを用いた。
【０１１６】
２．試薬の調製
２種の捕捉物質を用いる測定には、実施例１と同様に、第１捕捉物質としてDNP標識H31L21抗体を用い、第２捕捉物質としてビオチン標識H31L21抗体を用いた。１種の捕捉物質を用いる測定には、捕捉物質として、DNP及びビオチンの両方で標識したH31L21抗体を用いた。DNP及びビオチンの両方で標識したH31L21抗体は、WO 2017/138497 A1の記載を参照して、後述のようにして作製した。第１の固相、第２の固相、検出用物質(蛍光標識82E1抗体)及び遊離剤は、実施例１と同じであった。
【０１１７】
(2.1) 第１及び第２の結合物質を有する捕捉物質の作製
H31L21抗体を慣用の手法によりペプシンで消化して、F(ab')2フラグメントを得た。得られたF(ab')2フラグメントを還元して、Fab'を得た。DNP及びビオチンがコンジュゲートされたBSA(商品名：DNP-BSA-Biotin、LGC Biosearch Technologies社)と、ポリエチレングリコール(PEG)クロスリンカー(スクシンイミジル-[(Ｎ-マレイミドプロピオンアミド)-オクタエチレングリコール]エステル、商品名：SM(PEG)8、Thermo Fisher Scientific社)とを反応させて、マレイミド基を有するリンカーをDNP-BSA-Biotinに結合した。該リンカーが結合したDNP-BSA-Biotinと、Fab'とを混合することにより、Fab'のチオール基とDNP-BSA-Biotinのマレイミド基とを反応させて、DNP及びビオチン標識Fab'を得た。実施例２では、H31L21抗体由来のDNP及びビオチン標識Fab'を、DNP及びビオチン標識捕捉物質として用いた。
【０１１８】
(2.2) 抗体溶液の調製
上記の捕捉物質及び検出用物質を、表３に示されるＡ及びＥの抗体の組み合わせでHISCL R3希釈液(シスメックス株式会社)中に混合して、抗体溶液を得た。抗体溶液における各抗体の含有量は、いずれの抗体も300 fmol/assayとなるよう調整した。なお、表３中、Ａの抗体の組み合わせは図２に対応し、Ｅの抗体の組み合わせは図５に対応する。
【０１１９】
【表３】
2020134329.tif 000005
【０１２０】
３．測定
上記の抗体溶液を用いること以外は実施例１と同様にして、試料の測定を行った。なお、測定(n=2)は、独立して２回行った。取得した蛍光画像の代表例を図16に示す。また、倒立顕微鏡により取得した超解像画像を、図17Ａ及びＢに示す。図16、図17Ａ及びＢ中の「Ａ」及び「Ｅ」はそれぞれ、表３のＡ及びＥの抗体の組み合わせを用いて得た画像である。図16中のスケールバーは10μmを示す。図17Ａ及びＢ中の各パネルは、200 nm×200 nmのサイズである。また、蛍光画像の輝点の数の平均値を、表４に示す。
【０１２１】
【表４】
2020134329.tif 000006
【０１２２】
表４に示されるように、捕捉物質として、AβのＣ末端領域と結合する抗体を用いる場合、捕捉物質は１種であっても２種であっても、臨床検体中に存在するAβを感度よく検出できることが示された。図17Ａ及びＢ中の各パネルに示されるように、光の回折限界を超えた分解能により、Aβの凝集塊の大きさ、形態及び凝集度が識別できた。
【０１２３】
実施例３
化学発光酵素免疫測定法(CELIA)を利用する本実施形態の方法でも、臨床検体中のAβを測定可能であるかを検討した。
【０１２４】
１．試料の調製
Aβを含む試料として、検体の提供に同意したアルツハイマー病患者から採取したCSF(以下、「臨床検体２」と呼ぶ)を用いた。ポジティブコントロールとして、Beta Amyloid (1-42)(Anaspec社)の凝集体を化学架橋して得た調製物(以下、「合成Aβ」と呼ぶ)を10 pg/mLの濃度で含む溶液を用いた。化学架橋は、Farid Rahimiら, "Photo-Induced Cross-Linking of Unmodified Proteins (PICUP) Applied to Amyloidogenic Peptides", J Vis Exp, vol.23, (2009), 1071の記載に従って実施した。ネガティブコントロールとして、C0溶液(シスメックス株式会社)を用いた。
【０１２５】
２．試薬の調製
第２の固相として、表面にストレプトアビジンが固定された磁性粒子を含む懸濁液であるHISCL R2試薬(シスメックス株式会社)を用いた。検出用物質として、アルカリホスファターゼ(ALP)で標識した82E1抗体を用いた。ALPで標識した82E1抗体は、WO 2017/138497 A1の記載を参照して、後述のようにして作製した。第１の固相、第１捕捉物質(DNP標識H31L21抗体)、第２捕捉物質(ビオチン標識H31L21抗体及びビオチン標識82E1抗体)及び遊離剤は、実施例１と同じであった。化学発光の測定には、測定用バッファーを含むHISCL R4試薬(シスメックス株式会社)、及びアルカリホスファターゼの化学発光基質CDP-Star(登録商標)を含むHISCL R5試薬(シスメックス株式会社)を用いた。
【０１２６】
(2.1) 検出用物質(ALP標識検出抗体)の作製
82E1抗体を慣用の手法によりペプシンで消化して、F(ab')2フラグメントを得た。得られたF(ab')2フラグメントを還元して、Fab'を得た。ALPとEMCSとを反応させてALPをマレイミド化した。Fab'とマレイミド化したALPとを混合することにより、Fab'のチオール基とALPのマレイミド基とを反応させてALP標識Fab'を得た。実施例３では、82E1抗体由来のALP標識Fab'を、ALP標識検出抗体として用いた。
【０１２７】
(2.2) 抗体溶液の調製
上記の捕捉物質及び検出用物質を、表５に示されるＡ及びＢの抗体の組み合わせでHISCL R3希釈液(シスメックス株式会社)中に混合して、抗体溶液を得た。抗体溶液における各抗体の含有量は、いずれの抗体も300 fmol/assayとなるよう調整した。なお、表５中、Ａの抗体の組み合わせは図２に対応し、Ｂの抗体の組み合わせは図７に対応する。
【０１２８】
【表５】
2020134329.tif 000007
【０１２９】
３．測定
測定は、全自動免疫測定装置HISCL-800(シスメックス株式会社製)を用いて、次のように行った。70μLの試料と80μLの抗体溶液とを混合して、37℃で27分間インキュベートした。ここに、20μLの第１の固相の懸濁液をさらに混合して、37℃で11分間インキュベートした。磁性粒子を集磁して上清を除き、300μLのHISCL洗浄液を加えて磁性粒子を洗浄した。洗浄は計３回実施した。洗浄後、磁性粒子に110μLのDNP-Lys溶液を添加し、42℃で５分間インキュベートした。磁性粒子を集磁して、上清を80μL回収した。回収した上清に30μLの第２の固相(HISCL R2試薬)を混合して、37℃で５分間インキュベートした。混合液中の磁性粒子を集磁して上清を除き、300μLのHISCL洗浄液を加えて磁性粒子を洗浄した。洗浄は計４回実施した。磁性粒子を集磁して上清を除いた。磁性粒子に30μLのHISCL R4試薬及び60μLのHISCL R5試薬を混合して、42℃で５分間インキュベートし、発光強度を測定した。
【０１３０】
４．結果
化学発光強度の測定値は、いずれも検出下限を超えていた。測定値からSN比(S/N)を、下記の式を用いて算出した。結果を図18及び19に示す。図18及び19中の「Ａ」及び「Ｂ」はそれぞれ、表５のＡ及びＢの抗体の組み合わせを用いて得た測定結果である。
(S/N)＝[(試料の発光強度)−(ネガティブコントロールの発光強度)]／(ネガティブコントロールの発光強度)
【０１３１】
図18及び19に示されるように、CELIAを利用する本実施形態の方法でも、試料中のAβを測定することができた。図18より、抗体の組み合わせについては、表５のＢの組み合わせよりも、Ａの組み合わせの方がSN比は高かった。これに対して、図19に示されるように、合成Aβを測定した場合は、表５のＡの組み合わせよりもＢの組み合わせの方がSN比は高かった。これらのことから、試料が臨床検体である場合は、第１捕捉物質及び第２捕捉物質として、AβのＣ末端領域と結合する抗体を用い、検出用物質として、AβのＮ末端領域と結合する抗体を用いることにより、より高い感度でAβを検出できることが示唆された。
【符号の説明】
【０１３２】
１０  試料
１１  ポリペプチド
１２  夾雑物
１３  未反応の成分
２０  第１の固相
２１  磁性粒子
２２  第１の結合パートナー
３０  捕捉物質(第１捕捉物質)
３１  第１の結合物質
３２  抗体
４０  捕捉物質(第２捕捉物質)
４１  第２の結合物質
４２  抗体
５０  検出用物質
５１  蛍光物質
５２  抗体
６０  複合体
７０  磁石
８０  第２の固相
８１  第２の結合パートナー
【図１】
2020134329.tif 000008
【図２】
2020134329.tif 000009
【図３】
2020134329.tif 000010
【図４Ａ】
2020134329.tif 000011
【図４Ｂ】
2020134329.tif 000012
【図５】
2020134329.tif 000013
【図６Ａ】
2020134329.tif 000014
【図６Ｂ】
2020134329.tif 000015
【図７】
2020134329.tif 000016
【図８】
2020134329.tif 000017
【図９Ａ】
2020134329.tif 000018
【図９Ｂ】
2020134329.tif 000019
【図１０】
2020134329.tif 000020
【図１１】
2020134329.tif 000021
【図１２】
2020134329.tif 000022
【図１３】
2020134329.tif 000023
【図１４】
2020134329.tif 000024
【図１５】
2020134329.tif 000025
【図１６】
2020134329.tif 000026
【図１７Ａ】
2020134329.tif 000027
【図１７Ｂ】
2020134329.tif 000028
【図１８】
2020134329.tif 000029
【図１９】
2020134329.tif 000030