(57)【要約】      （修正有）【課題】肥満、脂肪肝症候群、糖尿病、１つ以上の代謝症候群の症状若しくは合併症及び／又は癌を処置、予防及び緩和する方法の提供。【解決手段】有効量のオストレオリシン、その機能的に関連した変異体、又はそれを含む抽出物若しくはキノコ抽出物をそれを必要とする対象に投与するステップを含む方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
必要とする対象における代謝症候群に関連する１つ以上の症状又は合併症を処置する、予防する、又はその重症度を軽減する方法であって、有効量のｏｌｙ、ｏｌｙの機能的に関連した変異体又はそれらの組合せを含む組成物を必要とする対象に投与するステップを含む方法。
【請求項２】
代謝症候群に関連する前記１つ以上の症状又は合併症が、過体重、肥満、リポジストロフィー、脂肪肝、ＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨ、慢性肝疾患、硬変又は肝細胞癌である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
代謝症候群に関連する前記１つ以上の症状又は合併症が、高血中／血漿グルコースレベル、糖不耐性ＩＩ型糖尿病、高コレステロールレベル、高脂質レベル又は高トリグリセリドレベルである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
必要とする対象における癌を処置する、予防する、減少させる、又は軽減する方法であって、有効量のｏｌｙ、ｏｌｙの機能的に関連した変異体又はそれらの組合せを含む組成物をそれを必要とする前記対象に投与するステップを含む方法。
【請求項５】
前記癌が結腸癌である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ｏｌｙが組換えタンパク質である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ｏｌｙが原核細胞中で産生される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記原核細胞が細菌細胞である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記細菌細胞が大腸菌である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
代謝症候群に関連する１つ以上の症状又は合併症を処置する、予防する、又はその重症度を軽減するためのｏｌｙ、ｏｌｙの機能的に関連した変異体又はそれらの組合せを含む製剤。
【請求項１１】
癌を処置する、予防する、減少させる、又は軽減するための有効量のｏｌｙ、ｏｌｙの機能的に関連した変異体又はそれらの組合せを含む製剤。
【請求項１２】
前記癌が結腸癌である、請求項１１に記載の製剤。
【請求項１３】
代謝症候群に関連する前記１つ以上の症状又は合併症が、過体重、肥満、脂肪肝、ＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨ、慢性肝疾患、硬変又は肝細胞癌である、請求項１０に記載の製剤。
【請求項１４】
代謝症候群に関連する前記１つ以上の症状又は合併症が、高血中／血漿グルコースレベル、糖不耐性ＩＩ型糖尿病、高コレステロールレベル、高脂質レベル又は高トリグリセリドレベルである、請求項１０に記載の製剤。
【請求項１５】
前記製剤が医薬製剤である、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１６】
肥満又は過体重を処置するステップが、細胞において白色脂肪細胞を褐色脂肪細胞に分化させること、又は細胞において褐色脂肪生成を誘発させることに関連する、請求項２に記載の方法。
【請求項１７】
褐色脂肪生成マーカーの遺伝子発現が増加する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
必要とする対象における代謝症候群に関連する少なくとも１つ以上の症状又は合併症を処置する、予防する、又はその重症度を軽減する方法であって、ｏｌｙを含む抽出物若しくはｏｌｙを含むキノコ抽出物又はｏｌｙを含む抽出物若しくはｏｌｙを含むキノコ抽出物を含む組成物の有効量を前記必要とする対象に投与するステップを含む方法。
【請求項１９】
代謝症候群に関連する前記１つ以上の症状又は合併症が、過体重、肥満、脂肪肝、ＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨ、慢性肝疾患、硬変又は肝細胞癌である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
代謝症候群に関連する前記１つ以上の症状又は合併症が、高血中／血漿グルコースレベル、糖不耐性ＩＩ型糖尿病、高コレステロールレベル、高脂質レベル又は高トリグリセリドレベルである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
必要とする対象における癌を処置する、予防する、減少させる、又は軽減する方法であって、ｏｌｙを含む抽出物若しくはｏｌｙを含むキノコ抽出物又はｏｌｙを含む抽出物若しくはｏｌｙを含むキノコ抽出物を含む組成物の有効量を前記必要とする対象に投与するステップを含む方法。
【請求項２２】
前記癌が結腸癌である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
代謝症候群に関連する１つ以上の症状又は合併症を処置する、予防する、又はその重症度を軽減するための、ｏｌｙを含む抽出物若しくはキノコ抽出物、又はｏｌｙを含む有効量の抽出物若しくはキノコ抽出物を含む製剤。
【請求項２４】
癌を処置する、予防する、減少させる、又は軽減するための、ｏｌｙを含む抽出物若しくはキノコ抽出物、又はｏｌｙを含む有効量の抽出物若しくはキノコ抽出物を含む製剤。
【請求項２５】
前記癌が結腸癌である、請求項２４に記載の抽出物又は製剤。
【請求項２６】
代謝症候群に関連する前記１つ以上の症状又は合併症が、過体重、肥満、脂肪肝、ＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨ、慢性肝疾患、硬変又は肝細胞癌である、請求項２３に記載の抽出物又は製剤。
【請求項２７】
代謝症候群に関連する前記１つ以上の症状又は合併症が、高血中／血漿グルコースレベル、糖不耐性ＩＩ型糖尿病、高コレステロールレベル、高脂質レベル又は高トリグリセリドレベルである、請求項２３に記載の抽出物又は製剤。
【請求項２８】
前記製剤が機能性食品製剤、食品添加物又は栄養補助食品である、請求項２３〜２７のいずれか一項に記載の抽出物又は製剤。
【請求項２９】
肥満又は過体重を処置することが、細胞において白色脂肪細胞を褐色脂肪細胞に分化させること、又は細胞において褐色脂肪生成を誘発させることに関連する、請求項１９に記載の方法。
【請求項３０】
褐色脂肪生成マーカーの遺伝子発現が増加する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記キノコ抽出物がヒラタケ属キノコに由来する、請求項２３〜２８のいずれか一項に記載の製剤、又は請求項１８〜２２、２９及び３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記ヒラタケ属キノコがヒラタケ又はウスヒラタケである、請求項３１に記載の製剤。
【請求項３３】
前記抽出物又は製剤が、粉体、溶液、腸溶錠、懸濁液、乳濁液、錠剤、又はカプセル、ゲル、クリーム、軟膏、泡、ペースト又は注射の形態である、請求項２３〜２８、３１及び３２のいずれか一項に記載の製剤、又は請求項２３〜２８のいずれか一項に記載の抽出物。
【請求項３４】
前記製剤が、機能性食品組成物又は栄養補助食品であり、摂食に適切な担体を含む、請求項３４に記載の製剤。
【請求項３５】
前記製剤が、粉体、溶液、懸濁液、乳濁液、錠剤、腸溶錠、又はカプセル、ゲル、クリーム、軟膏、泡、ペースト又は注射の形態である、請求項１０〜１５のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項３６】
前記製剤が、医薬組成物であり、薬学的に許容される担体を含む、請求項３５に記載の製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、代謝症候群に関連する１つ以上の症状若しくは合併症を処置、予防、緩和及び／又は軽減するための、又は肥満、脂肪肝、糖尿病及び／又は癌を処置若しくは予防するための、オストレオリシン（ｏｓｔｒｅｏｌｙｓｉｎ）（ｏｌｙ）、機能的に関連したその変異体、又はｏｌｙを含む抽出物若しくはキノコ抽出物の使用を対象とする。
【背景技術】
【０００２】
肥満は、流行しており、世界中で３億人を超える人が肥満であり、絶えず増加している。肥満は、美容の問題だけでなく、生命にかかわる疾患であり、生活の質及びその寿命を低下させる。肥満は、２型糖尿病、循環器疾患及び癌を含めて、多数の恐ろしい疾患のリスクを増加させ、インスリン抵抗性、糖不耐性及び脂質異常症に関連する。したがって、肥満に関連した機序を理解し、致死的疾患及びその合併症と戦う方法を見つける重要な必要性がある。
【０００３】
処置の展望として、肥満及び関連した合併症の適切な治療法を見つけることは、疾患の生理学的及び生化学的複雑さのために、極めて困難である。しかし、エネルギー恒常性をエネルギー摂取に対してエネルギー消費に有利なように変えると、肥満と戦うのに役立つことは明らかである。したがって、全身エネルギー消費を増加させること（「負のエネルギー収支」）ができる細胞機構の特定は、肥満治療の目標として有利である。
【０００４】
エネルギー消費を増加させる１つの選択肢は、褐色脂肪組織（ＢＡＴ：ｂｒｏｗｎ  ａｄｉｐｏｓｅ  ｔｉｓｓｕｅ）におけるミトコンドリア呼吸の脱共役である。このプロセスにおいては、ミトコンドリア内膜における脱共役タンパク質１（ＵＣＰ１：ｕｎｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １）を介した制限的プロトン漏洩（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｏｎ  ｌｅａｋ）が存在し、エネルギーが熱として放散され、燃料酸化が増加する。これは、多量の活性なＢＡＴが肥満との戦いにおいて有益であることを示唆する。しかし、残念ながら、成人は、小型哺乳動物及び新生児とは対照的に、ＢＡＴの量が不十分であると考えられる。したがって、成人期におけるＢＡＴの活性を高める方法を見つけることは、体内の栄養素の酸化を増加させることによって肥満と戦うのに有益であろう。
【０００５】
成人におけるＢＡＴの最近の発見、及びＢＡＴの発生の更なる理解は、肥満を処置する新しい代替法の探索を促進した。というのは、肥満者は、その痩せた相手よりも褐色脂肪組織量／活性が劣るように見えるからである。ＢＡＴの活性が過体重／肥満のグループよりも痩せたグループの方が約４倍高いことは注目すべきである。
【０００６】
解剖学的観点から、褐色脂肪細胞は、２つのタイプの貯蔵所（ｄｅｐｏｔ）、すなわち分離した貯蔵所と拡散した貯蔵所に局在する。ヒトにおいては、分離した場所のＢＡＴは、主要血管周りの頚部−鎖骨上、腎周囲／副腎、及び脊椎傍領域に見られ、恐らくは、熱を生成し、分配して核心温度を維持するために存在する。それに対して、拡散褐色脂肪細胞は、白色脂肪中に存在し、寒冷暴露又は慢性カテコールアミン刺激に応じて出現する。
【０００７】
高脂血症、真性糖尿病、高血圧症などの代謝異常の集団を含む代謝症候群は、西洋先進国において広範にますます流行している疾患である。
【０００８】
非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ：Ｎｏｎ−ａｌｃｏｈｏｌｉｃ  ｆａｔｔｙ  ｌｉｖｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ）は、現在、代謝症候群の肝臓症状として認識され、慢性肝疾患の最も一般的な原因の１つとして世界中で出現している。ＮＡＦＬＤは、単純な肝臓脂肪症から脂肪性肝炎、進行線維症及び硬変まで広い疾患範囲を包含する。ＮＡＦＬＤに起因する肝臓に関連した病的状態及び死亡は、進行線維症及び硬変の患者に認められる。ＮＡＦＬＤの悪化及び進展期に向かう単純な脂肪変性の進行を加速する機序は十分理解されていないが、それは、ツーヒット説を意味すると一般に考えられる。肝脂肪蓄積は、疾患の「第１ヒット」である。肝細胞における脂肪蓄積は、ＮＡＦＬＤの特徴であり、それらを「第２ヒット」、例えば、ＴＮＦ−α、単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１：ｍｏｎｏｃｙｔｅ  ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１）、別のサイトカインなどの酸化的ストレス及び炎症性サイトカインによる損傷に対して極めて脆弱にすることが示唆された。
【０００９】
現在、脂肪性肝炎を完全に逆転又は予防することができる薬物療法は得られていない。したがって、ＮＡＦＬＤの処置に有効な療法を開発することが必要であり、ＮＡＦＬＤのリスクを低下させ得る分子又は組成物の発見が有用であろう。
【００１０】
結腸直腸癌（ＣＲＣ：Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ）は、米国及びイスラエルにおいて成人の癌による死因の第２位である。死亡率は、常に上昇しており、そのため、罹患率を減少させる要因を見つけることはそれだけ重要である。処置の展望として、癌及び関連した合併症の適切な治療法を見つけることは、この疾患進行に関与する機序の複雑さのために、極めて困難である。したがって、関係した細胞機構、並びに結腸癌細胞増殖及び進行を抑制することができる分子の確認は、癌処置に有利であり得る。
【００１１】
カベオリン１（Ｃａｖ−１）は、電子顕微鏡写真において原形質膜の５０〜１００ｎｍ陥入部として認識される分化した脂質ラフトであるカベオラの主要なタンパク質成分である。カベオラは、主に、脂肪細胞、内皮細胞及び線維芽細胞を含めた高分化型間葉細胞に見られ、細胞増殖の負の調節因子としてのＣａｖ−１の果たし得る役割を示唆する。興味深いことに、Ｃａｖ−１は、発癌性細胞形質転換、腫瘍化及び転移の原因に関係する。腫瘍細胞を含めた細胞は、生存し、増殖するか、又はプログラム細胞死（アポトーシス）を起こすかどうかの判断に常に直面している。したがって、アポトーシス促進性又は抗アポトーシス性の経路を特定することは、腫瘍細胞増殖を抑制するために重要な意味がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の一部の実施形態においては、必要とする対象における代謝症候群に関連する１つ以上の症状又は合併症を処置する、予防する、又はその重症度を軽減する方法であって、有効量のｏｌｙ、ｏｌｙの機能的に関連した変異体又はそれらの組合せを含む組成物を必要とする対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【００１３】
本発明の一部の実施形態によれば、代謝症候群に関連する１つ以上の症状又は合併症は、過体重、肥満、リポジストロフィー、脂肪肝、ＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨ、慢性肝疾患、硬変又は肝細胞癌である。
【００１４】
本発明の一部の実施形態によれば、代謝症候群に関連する１つ以上の症状又は合併症は、高血中／血漿グルコースレベル、糖不耐性ＩＩ型糖尿病、高コレステロールレベル、高脂質レベル又は高トリグリセリドレベルである。
【００１５】
本発明の一部の実施形態によれば、必要とする対象における癌を処置する、予防する、減少させる、又は軽減する方法であって、有効量のｏｌｙ、ｏｌｙの機能的に関連した変異体又はそれらの組合せを含む組成物をそれを必要とする対象に投与するステップを含む方法が提供される。
【００１６】
本発明の一部の実施形態によれば、癌は結腸癌である。
【００１７】
本発明の一部の実施形態によれば、ｏｌｙは組換えタンパク質である。
【００１８】
本発明の一部の実施形態によれば、ｏｌｙは原核細胞中で産生される。
【００１９】
本発明の一部の実施形態によれば、原核細胞は細菌細胞である。
【００２０】
本発明の一部の実施形態によれば、癌を処置する、予防する、減少させる、又は軽減するための有効量のｏｌｙ、ｏｌｙの機能的に関連した変異体又はそれらの組合せを含む製剤が提供される。
【００２１】
本発明の一部の実施形態によれば、癌は結腸癌である。
【００２２】
本発明の一部の実施形態によれば、代謝症候群に関連する１つ以上の症状又は合併症を処置する、予防する、又はその重症度を軽減するためのｏｌｙ、ｏｌｙの機能的に関連した変異体又はそれらの組合せを含む製剤が提供される。
【００２３】
本発明の一部の実施形態によれば、代謝症候群に関連する１つ以上の症状又は合併症は、過体重、肥満、脂肪肝、ＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨ、慢性肝疾患、硬変又は肝細胞癌である。
【００２４】
本発明の一部の実施形態によれば、１つ以上の症状又は合併症は、代謝症候群に関連し、高血中／血漿グルコースレベル、糖不耐性ＩＩ型糖尿病、高コレステロールレベル、高脂質レベル又は高トリグリセリドレベルである。
【００２５】
本発明の一部の実施形態によれば、製剤は医薬製剤である。
【００２６】
本発明の一部の実施形態によれば、肥満又は過体重を処置するステップは、細胞において白色脂肪細胞を褐色脂肪細胞に分化させること、又は細胞において褐色脂肪生成を誘発させることに関連する。
【００２７】
本発明の一部の実施形態によれば、本明細書に記載の処置後に褐色脂肪生成マーカーの遺伝子発現が増加する。
【００２８】
本発明の一部の実施形態によれば、必要とする対象における代謝症候群に関連する少なくとも１つ以上の症状又は合併症を処置する、予防する、又はその重症度を軽減する方法であって、ｏｌｙを含む抽出物若しくはｏｌｙを含むキノコ抽出物又はｏｌｙを含む抽出物若しくはｏｌｙを含むキノコ抽出物を含む組成物の有効量を必要とする対象に投与するステップを含む方法が提供される。
【００２９】
本発明の一部の実施形態によれば、代謝症候群に関連する１つ以上の症状又は合併症は、過体重、肥満、リポジストロフィー、脂肪肝、ＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨ、慢性肝疾患、硬変又は肝細胞癌である。
【００３０】
本発明の一部の実施形態によれば、代謝症候群に関連する１つ以上の症状又は合併症は、高血中／血漿グルコースレベル、糖不耐性ＩＩ型糖尿病、高コレステロールレベル、高脂質レベル又は高トリグリセリドレベルである。
【００３１】
本発明の一部の実施形態によれば、必要とする対象における癌を処置する、予防する、減少させる、又は軽減する方法であって、ｏｌｙを含む抽出物若しくはｏｌｙを含むキノコ抽出物又はｏｌｙを含む抽出物若しくはｏｌｙを含むキノコ抽出物を含む組成物の有効量を必要とする対象に投与するステップを含む方法が提供される。
【００３２】
本発明の一部の実施形態によれば、癌は結腸癌である。
【００３３】
本発明の一部の実施形態によれば、代謝症候群に関連する１つ以上の症状又は合併症を処置する、予防する、又はその重症度を軽減するための、ｏｌｙを含む抽出物若しくはキノコ抽出物、又はｏｌｙを含む有効量の抽出物若しくはキノコ抽出物を含む製剤が提供される。
【００３４】
本発明の一部の実施形態によれば、癌を処置する、予防する、減少させる、又は軽減するための、ｏｌｙを含む抽出物若しくはキノコ抽出物、又はｏｌｙを含む有効量の抽出物若しくはキノコ抽出物を含む製剤が提供される。
【００３５】
本発明の一部の実施形態によれば、製剤は、機能性食品製剤、食品添加物又は栄養補助食品である。
【００３６】
本発明の一部の実施形態によれば、キノコ抽出物はヒラタケ属キノコ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ  ｍｕｓｈｒｏｏｍ）に由来する。
【００３７】
本発明の一部の実施形態によれば、ヒラタケ属キノコは、ヒラタケ又はウスヒラタケ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ  Ｐｕｌｍｏｎａｒｉｏｕｓ  ｍｕｓｈｒｏｏｍ）である。
【００３８】
本発明の一部の実施形態によれば、本明細書に記載の抽出物又は製剤は、粉体、溶液、腸溶錠、懸濁液、乳濁液、錠剤、又はカプセル、ゲル、クリーム、軟膏、泡、ペースト又は注射の形態である。
【００３９】
本発明の一部の実施形態によれば、製剤は、機能性食品組成物又は栄養補助食品であり、摂食に適切な担体を含む。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ画像である。凍結乾燥ｏｌｙ純度を還元剤の存在下でＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１５％）によって測定した。それぞれの４０から５μｌは、１０、５、３．７５、２．５及び１．２５μｇ／レーンに対応する。
【図２】モノマーの予想分子サイズに対応する２５ｍＭトリス−ＨＣｌ＋３００を用いて非変性（ｎｏｎ−ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｖｅ）条件下で展開された分析用Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５カラム上のｏｌｙのゲル濾過クロマトグラフィである。
【図３】ＨＣＴ１１６及びＦＨＳ７４Ｉｎｔ細胞系の細胞生存率を示すグラフである。Ｏｌｙ（６２．５μｇ／ｍｌ）を２４時間添加し、ＭＴＴアッセイを行った。
【図４】新規に設計されたポリクローナル抗体を用いたｏｌｙのウエスタンブロット分析を示す図である。ヒラタケ子実体から抽出したタンパク質（５０μｇ、子実体（ＦＢ：Ｆｒｕｉｔｉｎｇ  Ｂｏｄｉｅｓ））及び組換えｏｌｙタンパク質（２〜４μｇ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥに載せ、ニトロセルロース膜に転写した。ｏｌｙに対して新規に設計されたポリクローナル抗体を使用した（１：２，５００希釈）。
【図５Ａ】ＨＩＢ−１Ｂにおける脂肪滴蓄積を示す顕微鏡画像である。特に、図５Ａは、ＨＩＢ−１Ｂ細胞（１０μｇ／ｍｌ、４８時間）においてｏｌｙによって誘導された脂質蓄積の代表的な光学顕微鏡画像であり、上の画像は対照細胞であり、下の画像はｏｌｙ処理細胞である。さらに、左側の画像はＸ２０倍率であり、右側の画像はＸ４０倍率である。
【図５Ｂ】ＨＩＢ−１Ｂ及び３Ｔ３−Ｌ１細胞における脂肪滴蓄積を示す顕微鏡画像である。図５Ｂは、脂質検出色素ナイルレッドで染色された処理（ｏｌｙ−１０μｇ／ｍｌ、４８時間）又は非処理（対照）のＨＩＢ−１Ｂ及び３Ｔ３−Ｌ１細胞の代表的な共焦点顕微鏡画像である。
【図６Ａ】脂肪生成マーカーの遺伝子発現に対するｏｌｙ（ｏｌｙ、１０μｇ／ｍｌ、４８時間）の効果を示すグラフである。遺伝子発現を実時間ＰＣＲによって測定し、ベータアクチンを基準にした。
【図６Ｂ】特異的褐色脂肪生成マーカーの遺伝子発現に対するｏｌｙ（ｏｌｙ、１０μｇ／ｍｌ、４８時間）の効果を示すグラフである。遺伝子発現を実時間ＰＣＲによって測定し、ベータアクチンを基準にした。
【図７】カベオリン１の遺伝子発現においてｏｌｙによって誘導される増加を示すグラフである。遺伝子発現を実時間ＰＣＲによって測定し、ベータアクチンを基準にした。Ｏｌｙ処理は１０μｇ／ｍｌ、４８時間であった。
【図８】異なる食餌条件（高脂肪食（ＨＦＤ：Ｈｉｇｈ  Ｆａｔ  Ｄｉｅｔ）及び低脂肪食（ＬＦＤ：Ｌｏｗ  Ｆａｔ  Ｄｉｅｔ））及び異なるｏｌｙ処理に供されたマウスの体重増加を示すグラフである。ＩＰＧＴＴを１６週目に実施した。
【図９】異なる食餌条件及びｏｌｙ処理にさらされたマウスの屠殺日における体重を示すグラフである。＊ＨＦＤ  Ｐ＜０．０５。
【図１０Ａ】腹腔内グルコース負荷試験（ＩＰＧＴＴ：ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｔｅｓｔ）の結果を示すグラフである。４実験群の血糖値変化。
【図１０Ｂ】腹腔内グルコース負荷試験（ＩＰＧＴＴ）の結果を示すグラフである。曲線下面積（ＡＵＣ：Ａｒｅａｓ  ｕｎｄｅｒ  ｔｈｅ  ｃｕｒｖｅ）。
【図１１】マウス摂食量を示すグラフである。
【図１２】屠殺日における精巣上体脂肪組織の重量を示すグラフである。＊ＨＦＤ  Ｐ＜０．００１。
【図１３Ａ】Ｂアクチンに対するＵＣＰ−１の発現を示すグラフである。
【図１３Ｂ】Ｂアクチンに対するＣｉｄｅａの発現を示すグラフである。
【図１３Ｃ】Ｂアクチンに対するＰＲＤＭ１６の発現を示すグラフである。
【図１３Ｄ】Ｂアクチンに対するペリリピンＡの発現を示すグラフである。
【図１３Ｅ】内臓脂肪組織におけるβアクチン発現に対するＴＮＦαの発現を示すグラフである。
【図１４】屠殺日における肝臓重量を示すグラフである（ＨＦＤ群Ｐ＜０．０５）。
【図１５】屠殺日におけるＧＯＴレベルを示すグラフである（ＨＦＤ群Ｐ＜０．０５）。
【図１６】屠殺日におけるＧＰＴレベルを示すグラフである（ＨＦＤ群Ｐ＜０．０５）。
【図１７】屠殺日におけるトリグリセリドレベルを示すグラフである（ＨＦＤ群Ｐ＜０．０５）。
【図１８】屠殺日におけるコレステロールレベルを示すグラフである（ＨＦＤ群Ｐ＜０．０５）。
【図１９Ａ】図１９Ａ〜Ｄは、屠殺日におけるマウスの肝臓の組織学的結果を示す画像である。対照ＬＦ（図１９Ａ）、対照ＬＦ＋ｏｌｙ（図１９Ｂ）、ＨＦ（図１９Ｃ）、ＨＦ＋ｏｌｙ（図１９Ｄ）。
【図１９Ｂ】図１９Ａ〜Ｄは、屠殺日におけるマウスの肝臓の組織学的結果を示す画像である。対照ＬＦ（図１９Ａ）、対照ＬＦ＋ｏｌｙ（図１９Ｂ）、ＨＦ（図１９Ｃ）、ＨＦ＋ｏｌｙ（図１９Ｄ）。
【図１９Ｃ】図１９Ａ〜Ｄは、屠殺日におけるマウスの肝臓の組織学的結果を示す画像である。対照ＬＦ（図１９Ａ）、対照ＬＦ＋ｏｌｙ（図１９Ｂ）、ＨＦ（図１９Ｃ）、ＨＦ＋ｏｌｙ（図１９Ｄ）。
【図１９Ｄ】図１９Ａ〜Ｄは、屠殺日におけるマウスの肝臓の組織学的結果を示す画像である。対照ＬＦ（図１９Ａ）、対照ＬＦ＋ｏｌｙ（図１９Ｂ）、ＨＦ（図１９Ｃ）、ＨＦ＋ｏｌｙ（図１９Ｄ）。
【図２０】屠殺日におけるマウスの肝臓におけるアポトーシス評価（ＢＡＸ／ＢＣＬ２）を示すグラフである（Ｐ＜０．０５）。
【図２１】図２１Ａ〜Ｆは、ＨＣＴ１１６細胞（図２１Ａ、Ｃ及びＥ）と、ＨＭ７クローン＃１及びクローン＃１５細胞（図２１Ｂ、Ｄ及びＦ）に対するオストレオリシン（ｏｌｙ）の細胞障害活性を示す。細胞をダルベッコ変法イーグル培地中で終夜増殖させ、実施例の項に示したように様々な濃度のオストレオリシンで４時間（図２１Ａ及びＢ）、８時間（図２１Ｃ及びＤ）、２４時間（図２１Ｅ及びＦ）処理した。細胞生存率をＭＴＴアッセイによって推定した。生存率（％）を、異なる時間間隔における処理細胞と実験の最初における対照細胞の５５０ｎｍにおけるホルマザン吸光度の比として表した。各ポイントは、ｎ＝４反復実験で行った４回の独立した実験の平均±ＳＥである。エラーバーは、シンボルサイズよりも小さいので、識別できない。
【図２２Ａ】ＨＣＴ１１６細胞系の蛍光活性化細胞選別分析を示す。特に、図２２Ａは、Ｏｌｙ１２５μｇ／ｍｌ若しくはＦＢＥ０．０１％（ｗ／ｖ）で処理した細胞、又は対照として８時間未処理の細胞を示す。インキュベーション後、細胞を収集し、透過処理し、ヨウ化プロピジウムで染色し、分析した。結果は、各々３つ組で行った２つの独立した実験のうち１つの代表である。データを１５，０００個のＨＣＴ１１６細胞から得た。
【図２２Ｂ】ＨＣＴ１１６細胞系の蛍光活性化細胞選別分析を示す。図２２Ｂに示したように、Ｏｌｙ１２５μｇ／ｍｌ、ＦＢＥ０．０１％（ｗ／ｖ）で処理し、又は対照として未処理のままで、最後に上述したように透過処理及び染色したＨＣＴ１１６細胞系のＷｉｎＭＤＩ２．９ソフトウェアを用いて細胞周期を分析した。すべての細胞相を百分率として表す。示したデータは、各々３つ組で行った２つの独立した実験の平均±ＳＥである。データを１５，０００個のＨＣＴ１１６細胞から得た。
【図２３Ａ】ＨＣＴ１１６細胞におけるＰＡＲＰ−１の切断及びＢＡＸ発現レベルに対する組換えＯｌｙの効果を示す図である。細胞をＯｌｙ又はＦＢＥ（子実体抽出物：Ｆｒｕｉｔｉｎｇ  Ｂｏｄｉｅｓ  Ｅｘｔｒａｃｔ）の存在又は非存在下で８時間インキュベートした。（ＰＡＲＰ−１及びＢＡＸタンパク質の）全細胞溶解物を、方法に記載のようにウエスタンブロット分析のために処理した。示したデータは、各々二つ組で行った３つの独立した実験のうち１つの代表である。添加量が同じであることは、各ブロットをβアクチンについて探索することによって確認した。
【図２３Ｂ】ＨＣＴ１１６細胞におけるＰＡＲＰ−１の切断及びＢＡＸ発現レベルに対する組換えＯｌｙの効果を示す図である。細胞をＯｌｙ又はＦＢＥ（子実体抽出物：Ｆｒｕｉｔｉｎｇ  Ｂｏｄｉｅｓ  Ｅｘｔｒａｃｔ）の存在又は非存在下で８時間インキュベートした。（ＰＡＲＰ−１及びＢＡＸタンパク質の）全細胞溶解物を、方法に記載のようにウエスタンブロット分析のために処理した。示したデータは、各々二つ組で行った４つの独立した実験のうち１つの代表である。添加量が同じであることは、各ブロットをβアクチンについて探索することによって確認した。
【図２３Ｃ】ＨＣＴ１１６細胞におけるＰＡＲＰ−１の切断及びＢＡＸ発現レベルに対する組換えＯｌｙの効果を示す図である。細胞をＯｌｙ又はＦＢＥ（子実体抽出物：Ｆｒｕｉｔｉｎｇ  Ｂｏｄｉｅｓ  Ｅｘｔｒａｃｔ）の存在又は非存在下で８時間インキュベートした。（ＰＡＲＰ−１及びＢＡＸタンパク質の）全細胞溶解物を、方法に記載のようにウエスタンブロット分析のために処理した。添加量が同じであることは、各ブロットをβアクチンについて探索することによって確認した。濃度測定分析による定量化をＧｅｌｐｒｏ３２分析計ソフトウェアを用いて行った。結果を平均±ＳＥ（ｎ＝４）として表す。統計解析によれば、Ｏｌｙで処理したＨＣＴ１１６細胞におけるＢＡＸの発現は未処理細胞よりも高い。Ｐ値＜０．０５（スチューデントのｔ検定）。
【図２４】オストレオリシンが細胞膜を通り、サイトゾルに入ることを示す図である。抗Ｏｌｙ抗体によって認識される細胞内部のオストレオリシンの存在を示す、非処理条件で８時間処理したＨＣＴ１１６細胞（対照）、濃度１２５μｇ／ｍｌのＯｌｙで処理した細胞、濃度０．０１％（ｗ／ｖ）のＦＢＥで処理した細胞の代表的な免疫蛍光。スケールバー２０μｍ。
【図２５】オストレオリシンが脂質ラフトにおいてカベオリン１の再構築を誘発することを示す図である。抗Ｃａｖ−１抗体によって認識される膜上のＣａｖ−１のクラスター形成を示す、非処理条件で８時間処理したＨＣＴ１１６細胞（対照）、濃度１２５μｇ／ｍｌのＯｌｙで処理した細胞、濃度０．０１％（ｗ／ｖ）のＦＢＥで処理した細胞の代表的な免疫蛍光。スケールバー２０μｍ。図から分かるように、組換えＯｌｙは、ＨＣＴ１１６細胞において脂質ラフトマーカーＦｌｏｔ−１の発現を高める。
【図２６】オストレオリシンが脂質ラフトにおけるフロチリン１の発現を高めないことを示す図である。したがって、Ｏｌｙは、ラフトタンパク質Ｃａｖ−１に特異的である。抗Ｆｌｏｔ−１抗体によって認識される膜上のＦｌｏｔ−１の発現増加を示す、非処理条件で４時間処理したＨＣＴ１１６細胞、濃度１２５μｇ／ｍｌのＯｌｙで処理した細胞、及び濃度０．０１％（ｗ／ｖ）のＦＢＥで処理した細胞の代表的な免疫蛍光。スケールバー２０μｍ。
【図２７】Ｃ５７Ｂｌマウスに移植されたＭＣ３８由来の結腸癌細胞に対するＯｌｙの効果を示す図である。細胞を左腰に皮下注射した（２ｘ１０５細胞／マウス）。注射の１０日後、一部のマウスに腫瘍の徴候が出現した後、マウスを１ｍｇ／ｋｇ  Ｏｌｙで処理した（腹腔内に週３回）。対照マウスにＰＢＳを週３回腹腔内投与した。各バーは、平均値の標準誤差である。Ｎ＝８マウス。マウスを３９日目に屠殺した。＊＝Ｐ＜０．００１。
【図２８】Ｃ５７Ｂｌマウスに移植されたＭＣ３８由来の結腸癌細胞に対するＯｌｙの効果を示す図である。腫瘍を屠殺後に切除し、秤量した。Ｎ＝８。＊＝Ｐ＜０．００１。
【図２９】液体窒素凍結後のヒラタケ（方法１、レーン１及び３）及び−２０℃凍結後の粉末ヒラタケ（方法２、レーン２及び４）の抽出調製物中のｏｌｙの濃度を示すウエスタンブロット画像である。
【図３０Ａ】図３０Ａ〜Ｄは、対照（図３０Ａ）、ｏｌｙ１０μｇ／ｍｌ（図３０Ｂ）、液体窒素凍結後のヒラタケの抽出調製物（図３０Ｃ）、及び−２０℃凍結後の粉末ヒラタケの抽出調製物（図３０Ｄ）を示す。
【図３０Ｂ】図３０Ａ〜Ｄは、対照（図３０Ａ）、ｏｌｙ１０μｇ／ｍｌ（図３０Ｂ）、液体窒素凍結後のヒラタケの抽出調製物（図３０Ｃ）、及び−２０℃凍結後の粉末ヒラタケの抽出調製物（図３０Ｄ）を示す。
【図３０Ｃ】図３０Ａ〜Ｄは、対照（図３０Ａ）、ｏｌｙ１０μｇ／ｍｌ（図３０Ｂ）、液体窒素凍結後のヒラタケの抽出調製物（図３０Ｃ）、及び−２０℃凍結後の粉末ヒラタケの抽出調製物（図３０Ｄ）を示す。
【図３０Ｄ】図３０Ａ〜Ｄは、対照（図３０Ａ）、ｏｌｙ１０μｇ／ｍｌ（図３０Ｂ）、液体窒素凍結後のヒラタケの抽出調製物（図３０Ｃ）、及び−２０℃凍結後の粉末ヒラタケの抽出調製物（図３０Ｄ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
本発明の実施形態は、代謝症候群に関連する１つ以上の症状若しくは合併症を予防、緩和及び／又は軽減する方法、又は肥満、リポジストロフィー、脂肪肝、糖尿病及び／又は癌を処置若しくは予防する方法であって、治療有効量のｏｌｙ、ｏｌｙの機能的に関連した変異体、又はｏｌｙ若しくはｏｌｙの機能的に関連した変異体を含む組成物を対象に投与するステップを含む方法を対象とする。一部の実施形態においては、ｏｌｙを含む抽出物若しくはキノコ抽出物、又はｏｌｙを含む抽出物若しくはキノコ抽出物を含む組成物を対象に投与する。本発明の一部の実施形態においては、キノコ抽出物は、ヒラタケ属キノコからの抽出物である。本発明の一部の実施形態においては、ヒラタケ属キノコはヒラタケに由来する。本発明の一部の実施形態においては、ヒラタケ属キノコはウスヒラタケに由来する。本願を通して、別段の記載がない限り、「処置すること」という用語は、「予防すること」、「症状の作用／重症度を軽減すること」、「症状の進行を遅らせること」、症状の少なくとも１つの望ましくない副作用を軽減／除去すること」などを含むことを意味することに留意されたい。「予防すること」という用語は、投与時に罹患している可能性がないと診断されたが、発症することが予想され得る、又は疾患のリスクが高い可能性がある患者に投与したときに、本発明の化合物が有用であることを意味する。本発明のｏｌｙ若しくはその機能的に関連した変異体、又はｏｌｙを含む抽出物、又はｏｌｙ、その機能的に関連した変異体、若しくはｏｌｙを含む抽出物を含む組成物は、疾患症候の発生を遅らせ、疾患の発生を遅らせ、又は個体が発症するのを完全に予防する。予防することは、年齢、家族歴、遺伝子若しくは染色体の異常のために、及び／又は公知の遺伝子変異などの疾患の１種以上の生物学的マーカーの存在のために、罹患しやすいと考えられる個体に本発明の化合物を投与することも含む。
【００４２】
ｏｌｙ若しくはその機能的に関連した変異体又はｏｌｙを含む抽出物の使用は、様々な代謝病又は障害（例えば、肥満、代謝症候群、インスリン抵抗性、（２型糖尿病を含めた）糖尿病、及び脂質異常症）、並びに急性心筋梗塞（「心臓発作」）及び大動脈弁狭窄及びアテローム性動脈硬化症などのそれだけに限定されない別の心血管合併症；慢性腎疾患（特に、腎血管系に対する糖尿病の影響を考慮して）；動脈石灰化；大動脈弁石灰化又は僧帽弁石灰化を含めて、ただしそれだけに限定されない弁石灰化；大動脈弁狭窄症又は僧帽弁狭窄症を含めて、ただしそれだけに限定されない弁狭窄症；急性心筋梗塞；冠動脈インターベンション後の再狭窄；（生体弁移植を含めた）弁移植を含めて、ただしそれだけに限定されない冠動脈インターベンション後の組織損傷の加速、又は治癒の遅延；ステント留置；人工組織の移植、同種移植片（ａｌｌｏｇｒａｆｔ）、（ロス手術を含めて、ただしそれだけに限定されない）同種移植片（ｈｏｍｏｇｒａｆｔ）、バイオプロテーゼ組織、ダクロン移植片又は任意の合成若しくは生体導管；心臓移植；（伏在静脈バイパス移植片及び血液透析ＡＶシャントを含めて、ただしそれだけに限定されない）動脈又は静脈移植片移植；発作；及び心不全；冠動脈バイパス術のための静脈移植の失敗；糖尿病性腎症；血管炎；網膜症；勃起不全；及びすい炎など、ただしそれだけに限定されない非心血管合併症；非アルコール性脂肪性肝疾患；神経炎症；認知障害；癌などのそれらの臨床的合併症を予防する、遅延させる、又は改善することができる。本願に記載の疾患又は症状の処置又は予防においては、本発明の化合物又は抽出物を治療有効量で投与する。治療有効量は、当業者に知られているように、使用する個々の化合物及び投与経路に応じて変わる。
【００４３】
さらに、投与する組成物の量は、言うまでもなく、処置対象、病気の重症度、投与方式、処方する医師の判断、及びすべての他の関連する要因に依存する。投与する正確な用量の決定は、当業者に既知の方法によって行われる。
【００４４】
本発明の一部の実施形態においては、単一の処置におけるｏｌｙ又はその機能的変異体の量は、約０．１０〜１０ｍｇ／ｋｇ体重（ＢＷ：ｂｏｄｙ  ｗｅｉｇｈｔ）／日であると計算される。本発明の一部の実施形態においては、約０．３〜１．０ｍｇ／ｋｇのｏｌｙ量を１日当たり使用する。一部の実施形態においては、約０．５〜０．８ｍｇ／ｋｇの量を１日当たり使用する。
【００４５】
ｏｌｙを含む抽出物又はキノコ抽出物の場合、投与する乾燥抽出物の量は、その中のｏｌｙの量に応じて計算することができる。一部の実施形態においては、凍結乾燥粉末ヒラタケ属又はヒラタケ約２０〜２００ｍｇ／Ｋｇ体重（ＢＷ）を１日当たり使用する。一部の実施形態においては、凍結乾燥粉末ヒラタケ約２０〜６０ｍｇ／Ｋｇ  ＢＷを１日当たり使用する。一部の実施形態においては、凍結乾燥粉末ヒラタケ約４０〜５０ｍｇ／Ｋｇ  ＢＷを１日当たり使用する。
【００４６】
一般に、ｏｌｙ、その機能的に関連した変異体、又はｏｌｙを含む抽出物、又はｏｌｙを含むキノコ抽出物を用いた処置は、少なくとも１日１回、一般には１日１回、２回、３回又は４回施され、十分な効果を誘導するために薬物の一定した存在を維持するために昼夜を通して等間隔で投与されることが考えられる。しかし、当業者は、処置スケジュールを所与の患者に対して最適化することができ、化合物の投与を１日１回よりも少なくできることを承知しているはずである。
【００４７】
処置は、必要なだけ長期間実施することができる。一般に、処置は、病態が持続する間は無期限に継続されるが、化合物がもはや有益な効果をもたらさない場合は中断も必要になり得ると考えられる。処置する医師は、患者の反応に基づいて処置を増やす、減らす、又は中断する仕方を知っているはずである。
【００４８】
本発明の一部の実施形態においては、抽出物又はキノコ抽出物は、少なくとも０．００１ｍｇ／ｇ抽出物粉体の濃度でｏｌｙを含む。本発明の一部の実施形態においては、抽出物又はキノコ抽出物は、少なくとも０．００５ｍｇ／ｇ粉体の濃度でｏｌｙを含む。本発明の一部の実施形態においては、抽出物又はキノコ抽出物は、少なくとも０．０１ｍｇ／ｇ粉体の濃度でｏｌｙを含む。本発明の一部の実施形態においては、抽出物又はキノコ抽出物は、少なくとも０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１ｍｇ／ｇ抽出物粉体以上の濃度でｏｌｙを含む。
【００４９】
さらに、利用されるｏｌｙ又はその機能的に関連した変異体は、患者の症状を処置するために必要に応じて追加の活性成分と一緒に処方又は投与できると理解される。
【００５０】
オストレオリシン（Ｏｌｙ）は、ヒラタケ（ヒラタケ（ｏｙｓｔｅｒ  ｍｕｓｈｒｏｏｍ）及びヤルデンキノコ（Ｙａｒｄｅｎ  ｍｕｓｈｒｏｏｍｓ）としても知られる）及びウスヒラタケ中に存在するタンパク質である。Ｏｌｙはコレステロール濃縮領域と相互作用し得る子実体形成中に発現される１５ｋＤａ細胞溶解性タンパク質である。
【００５１】
本発明は、ｉｎ−ｖｉｖｏ及びｉｎ−ｖｉｔｒｏモデル並びに様々なパラメータに関連した代謝症候群に対する、及び／又は脂肪肝、肥満、過体重、癌及び糖尿病、並びにＧＯＴ、ＧＰＴ、トリグリセリド及びコレステロールのレベルに対するｏｌｙ及びｏｌｙを含む抽出物の驚くべき効果に基づく。
【００５２】
実施例の項で明らかなように、少量の組換えｏｌｙ、及びｏｌｙを含む抽出物は、細胞における脂肪滴蓄積（図５）、脂肪生成マーカーの遺伝子発現（図６）、体重増加（図８）、ＩＰＧＴＴ（図１０）、精巣上体（ｅｐｉｄｉｄｉｍａｌ）脂肪組織の重量（図１２）、肝臓重量及び遺伝子の発現（それぞれ図１４及び１３）、並びにＧＯＴ、ＧＰＴ、トリグリセリド及びコレステロールのような他のパラメータに対して有意な効果を示した。
【００５３】
本明細書では、「代謝症候群」又は「Ｘ症候群」は、ＮＣＥＰ  ＡＴＰＩＩＩ基準に基づいて定義される。この基準では、以下の要因のうち３つ以上が存在する：１）腹囲の増加（男性＞１０２ｃｍ［＞４０インチ］、女性＞８８ｃｍ［＞３５インチ］）、２）トリグリセリドの上昇（＞１５０ｍｇ／ｄｌ）、３）低ＨＤＬコレステロール（男性＜４０ｍｇ／ｄｌ、女性＜５０ｍｇ／ｄｌ）、４）不適当な血圧（＞１３０ｍｍＨｇ収縮期又はｍｍＨｇ拡張期）、及び５）空腹時血糖異常（＞１１０ｍｇ／ｄｌ）。本発明の方法は、本明細書中に定義した代謝症候群、及び代謝症候群の症状のいずれか１つ以上を、別々に、若しくは本明細書中に定義した組み合わせで、又は上記合併症を処置するためのものであることを理解されたい。
【００５４】
本明細書では、「脂肪肝」という用語は、脂肪が脂質代謝の障害のために肝細胞に過剰に蓄積した状態を指す。それは、アンギナ、心筋梗塞、発作、動脈硬化症、膵炎などの様々な疾患を引き起こすことがある。
【００５５】
「耐糖能障害」を本明細書では米国糖尿病学会の基準に基づいて定義する。耐糖能障害は、２時間７５ｇ経口ブドウ糖負荷試験値１４０から１９９ｍｇ／ｄＬ（７．８から１１．０ｍｍｏｌ／ｌ）である。
【００５６】
「空腹時血糖異常」を本明細書では米国糖尿病学会の基準に基づいて定義する。空腹時血糖異常を空腹時血糖値１００から１２５ｍｇ／ｄＬ（５．６から６．９ｍｍｏｌ／ｌ）として定義する。
【００５７】
「真性糖尿病」とは、一般に、空腹時血糖値１２６ｍｇ／ｄＬ（７．０ｍｍｏｌ／ｌ）以上を指す。
【００５８】
「インスリン抵抗性」を本明細書では２０ｍｃＵ／ｍＬを超える空腹時血中インスリンレベルとして定義する。
【００５９】
個体における「初発糖尿病」（通常、空腹時血中グルコース濃度７．０ｍｍｏｌ／ｌ以上に基づいて定義される）。
【００６０】
「高血糖」は、空腹時血中グルコース濃度７．０ｍｍｏｌ／ｌ以上である。
【００６１】
脂肪肝疾患（ＦＬＤ：ｆａｔｔｙ  ｌｉｖｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ）としても知られる脂肪肝は、可逆的な症状である。トリグリセリド脂肪の大きい液胞は、脂肪変性（細胞内の脂質の異常な保持）プロセスによって肝細胞中に蓄積する。脂肪肝は、過剰なアルコール摂取及び（インスリン抵抗性の作用があってもなくても）肥満の人において世界中で発生する単一の疾患と考えることができる。症状は、脂肪代謝に影響する別の疾患にも関連する。この脂肪代謝プロセスが混乱すると、脂肪が肝臓に過剰に蓄積し、したがって脂肪肝になることがある。アルコール性ＦＬＤと非アルコール性ＦＬＤは、症候が類似しており、異なる段階における小滴性及び大滴性脂肪変化を特徴とする。脂肪の蓄積は、脂肪性肝炎と呼ばれる肝臓の進行性炎症（肝炎）を伴うこともある。「肝臓脂肪症」とは、肝細胞内の脂質の異常な保持を表すプロセスを指す。脂肪肝は、対象のアルコール消費に応じてアルコール性脂肪変性又は非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）と呼ばれ、より重篤な形はアルコール性脂肪性肝炎（アルコール性肝疾患の一部）及び非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ：Ｎｏｎ−ａｌｃｏｈｏｌｉｃ  ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ）と呼ばれることもある。
【００６２】
成人の場合、「過体重」及び「肥満」の範囲は、体重及び身長を用いて「体格指数」（ＢＭＩ：ｂｏｄｙ  ｍａｓｓ  ｉｎｄｅｘ）と呼ばれる数値を計算することによって決定される。ＢＭＩは、ほとんどの人でその体脂肪量と相関するので使用される。ＢＭＩ２５から２９．９の成人は、過体重と考えられる。ＢＭＩ３０以上は肥満と考えられる。これらの症状又は障害のすべてが、ｏｌｙ、ｏｌｙに関連した変異体、又はｏｌｙを含む抽出物を含む組成物によって改善又は処置される。抽出物は、キノコ抽出物とすることができ、一部の実施形態においてはヒラタケ属抽出物とすることができる。
【００６３】
本明細書では、「ｏｌｙ」又は「オストレオリシン」という用語は、下記アミノ酸配列を含む天然オストレオリシンタンパク質又は組換えオストレオリシンタンパク質を指す。
ＡＹＡＱＷＶＩＩＩＩＨＮＶＧＳＱＤＶＫＩＫＮＬＫＡＳＷＧＫＬＨＡＤＧＤＫＤＡＥＶＳＡＳＮＹＥＧＫＩＩＫＰＤＥＫＬＱＩＮＡＣＧＲＳＤＡＡＥＧＴＴＧＴＦＤＬＶＤＰＡＤＧＤＫＱＶＲＨＦＹＷＤＣＰＷＧＳＫＴＮＴＷＴＶＳＧＳＮＴＫＷＭＩＥＹＳＧＱＮＬＤＳＧＡＬＧＴＩＴＶＤＴＬＫＫＧＮ（配列番号１）。
【００６４】
本明細書では、「断片」又は「ｏｌｙ断片」という用語は、ｏｌｙの任意のアミノ酸配列部分を指す。
【００６５】
本明細書では、「ｏｌｙ誘導体」又は「ｏｌｙ類似体」という用語は、ｏｌｙ又はｏｌｙ断片の配列に比べてアミノ酸置換、付加、欠失又は化学修飾によって少なくとも１個の変化したアミノ酸残基を含むｏｌｙ又はｏｌｙ断片を指す。Ｏｌｙ誘導体は、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、任意の化学修飾アミノ酸、及び任意の利用可能な分子構造を有するアミノ酸を含む、アミノ酸置換及び／又は付加を含む。
【００６６】
本明細書では、「ｏｌｙの機能的に関連した変異体」という句は、本明細書に記載のｏｌｙの同じ又は増大した機能活性を有する、ｏｌｙの任意の断片、誘導体若しくは類似体、又はそれらの任意の組合せを指す。
【００６７】
本発明の一部の実施形態においては、ｏｌｙの機能的に関連した変異体は、配列番号１のアミノ酸配列又はｏｌｙタンパク質のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％配列同一性である。
【００６８】
本発明の一部の実施形態においては、ｏｌｙ、ｏｌｙ断片、ｏｌｙ誘導体、ｏｌｙ類似体、又はｏｌｙの機能的に関連した変異体は、単離されたタンパク質である。本発明の一部の実施形態においては、ｏｌｙ、ｏｌｙ断片、ｏｌｙ誘導体、ｏｌｙ類似体、又はｏｌｙの機能的に関連した変異体は、任意のタイプ、サイズ及び原子組成の担体又は分子構造に埋め込まれる、又はそれに接続される。
【００６９】
代謝的に関連したパラメータ、代謝関連疾患、及び／又は代謝に関連した病的症状の改善とは、（単独で、又は１つ以上の組み合わせで）以下の１つ以上を指す：体重減少、（場合によっては褐色脂肪の脂肪細胞（ｂｒｏｗｎ  ｆａｔ  ａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ）産生の増加による）エネルギー消費の増加、肝臓重量、（例えば、ＧＯＴ、ＧＰＴなどの肝酵素の活性の改善による）肝機能及び幾つかの脂肪滴を含めた肝臓関連パラメータの改善、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）に関連する臨床パラメータの改善、血中／血漿グルコースレベルなどのグルコース関連パラメータの改善、糖不耐性の改善、並びにコレステロール、脂質、ペプチド、レプチン及びトリグリセリドレベルに関連した１個以上のパラメータの改善。
【００７０】
ＮＡＦＬＤは、慢性肝疾患の主要原因であることが知られており、ＮＡＦＬＤ患者の２０〜３０％は、進行して非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）を発症し、それは、硬変、肝細胞癌及び死亡率上昇、ＩＩ型糖尿病、高脂血症（ｈｙｐｅｒｌｉｐｉｍｅｄｉｍｉａ）、高コレステロール血症、並びに臨床的に有益な効果が肝機能又は少なくとも１個の関連した肝臓パラメータの改善によって現れる疾患を引き起こし得る。したがって、これらの症状は、本発明の方法及び調製物によっても処置することができる。
【００７１】
一部の実施形態によれば、ｏｌｙ、その機能的に関連した変異体、又はｏｌｙ、その機能的に関連した変異体を含む抽出物若しくはキノコ抽出物、又はｏｌｙ若しくはｏｌｙの機能的に関連した変異体又はｏｌｙを含む抽出物若しくはキノコ抽出物を含む組成物、又はｏｌｙを含む組成物抽出物若しくはキノコ抽出物は、場合によっては褐色脂肪細胞分化を促進し、エネルギー消費を増加させることによって、肥満、糖尿病及び／又はそれらの合併症の処置に使用することができる。更なる実施形態によれば、ｏｌｙ、その機能的に関連した変異体、又はｏｌｙを含む抽出物若しくはキノコ抽出物、又はｏｌｙ、その機能的に関連した変異体又はｏｌｙを含む抽出物若しくはキノコ抽出物を含む組成物を使用して、肝機能を改善する、肝臓重量を減少させることができる。本発明の一部の実施形態によれば、ｏｌｙ、その機能的に関連した変異体、又はｏｌｙを含む抽出物若しくはキノコ抽出物、又はｏｌｙ、その機能的に関連した変異体又はｏｌｙを含む抽出物若しくはキノコ抽出物を含む組成物を使用して、高脂肪食で育てた動物における糖不耐性を改善することができる。更なる実施形態によれば、ｏｌｙ、その機能的に関連した変異体、又はｏｌｙを含む抽出物若しくはキノコ抽出物、又はｏｌｙ、その機能的に関連した変異体又はｏｌｙを含む抽出物若しくはキノコ抽出物を含む組成物を使用して、既に完全に分化した脂肪細胞の代謝を増加させる。
【００７２】
本発明の一部の実施形態によれば、細胞において白色脂肪細胞を褐色脂肪細胞に分化させる、又は褐色脂肪生成を誘発させる方法であって、ｏｌｙ、ｏｌｙの機能的に関連した変異体、又はそれらの任意の組合せ、又はｏｌｙを含む抽出物と細胞を接触させるステップを含む方法を提供する。この方法は、インビトロ試験、例えば、それだけに限定されないが、ｏｌｙと他の活性材料の相乗効果の評価に使用することができる。
【００７３】
本発明の更なる実施形態は、有効量のｏｌｙ、その機能的に関連した変異体、又はｏｌｙを含む抽出物若しくはキノコ抽出物、又はｏｌｙ、その機能的に関連した変異体又はｏｌｙを含む抽出物若しくはキノコ抽出物を含む組成物と脂肪細胞を接触させることによって代謝率を高くする方法を対象とする。一部の実施形態によれば、脂肪細胞は、褐色、白色又はその両方である。一部の実施形態によれば、より高い代謝率は、呼吸及び／又は栄養素酸化の増加に起因し得る。
【００７４】
本発明の更なる実施形態は、褐色脂肪の脂肪細胞の産生を高める方法であって、有効量のｏｌｙ、その機能的に関連した変異体、又はｏｌｙを含む抽出物若しくはキノコ抽出物、又はｏｌｙ、その機能的に関連した変異体又はｏｌｙを含む抽出物若しくはキノコ抽出物を含む組成物と褐色脂肪の脂肪細胞の前駆体を接触させるステップを含む方法を対象とする。
【００７５】
本発明の更なる実施形態は、有効量のｏｌｙ、その機能的に関連した変異体、又はｏｌｙを含む抽出物若しくはキノコ抽出物、又はｏｌｙ、その機能的に関連した変異体又はｏｌｙを含む抽出物若しくはキノコ抽出物を含む組成物の投与を含む、癌を処置する方法を対象とする。一部の実施形態によれば、処置される癌は結腸癌である。本発明の別の実施形態によれば、癌は、脳腫瘍、中咽頭癌、上咽頭癌、腎臓癌、胆道癌、前立腺癌、クロム親和細胞腫、膵島細胞癌、リ・フラウメニ腫瘍、甲状腺癌、副甲状腺癌、下垂体腫瘍、副腎腫瘍、骨原性肉腫腫瘍、複数の神経内分泌Ｉ型及びＩＩ型腫瘍、乳癌、肺癌、頭部＆頚部癌、前立腺癌、食道癌、気管癌、皮膚癌  脳腫瘍、肝臓癌、膀胱癌、胃癌、膵癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頚癌、精巣癌、結腸癌、直腸癌又は皮膚癌である。本明細書では「癌」という用語は、発癌細胞に典型的な特性、例えば、抑制されない増殖、分化機能の喪失、不死、著しい転移能、抗アポトーシス活性の著しい増加、急速な成長及び増殖速度、並びにある特徴的な形態及び細胞マーカーを有する細胞の存在を指す。一般に、癌細胞は、腫瘍の形態であり、動物内に局在し、又は独立細胞、例えば、白血病細胞として血流中を循環する。癌の処置としては、癌細胞の増殖の減少、癌の発生、再発の予防、増殖速度の減少、増殖の停止、腫瘍縮小、進行の遅延、転移の減少、生存率の上昇、癌患者の生活の質の向上などが挙げられる。癌細胞の増殖の減少は、増殖速度の減少、細胞分裂停止効果、細胞傷害効果、アポトーシス効果、又はそれらの任意の組合せによって達成することができる。
【００７６】
一部の実施形態においては、ｏｌｙ、その機能的に関連した変異体、又はｏｌｙを含む抽出物若しくはキノコ抽出物は、細胞停止及び／又はアポトーシスを誘発する。一部の実施形態においては、ｏｌｙ、その機能的に関連した変異体、又はｏｌｙを含む抽出物若しくはキノコ抽出物は、癌細胞における細胞停止又はアポトーシスを誘発する。一部の実施形態においては、ｏｌｙ、その機能的に関連した変異体、又はｏｌｙを含む抽出物若しくはキノコ抽出物は、転移を阻止する。一部の実施形態においては、ｏｌｙ、その機能的に関連した変異体、又はｏｌｙを含む抽出物若しくはキノコ抽出物は、腫瘍増殖を阻止する。一部の実施形態においては、ｏｌｙ、その機能的に関連した変異体、又はｏｌｙを含む抽出物若しくはキノコ抽出物は、血管新生を阻止する。一部の実施形態においては、ｏｌｙ、その機能的に関連した変異体、又はｏｌｙを含む抽出物若しくはキノコ抽出物は、細胞周期を阻害する。一部の実施形態においては、ｏｌｙ、その機能的に関連した変異体、又はｏｌｙを含む抽出物若しくはキノコ抽出物は、異常細胞周期を阻害する。
【００７７】
一部の実施形態によれば、本発明によって利用されるｏｌｙは、キノコによって産生される天然ｏｌｙである。一部の実施形態によれば、本発明によって利用されるｏｌｙは、組換えタンパク質である。更なる実施形態によれば、ｏｌｙは原核細胞中で産生される。一部の実施形態によれば、ｏｌｙは細菌細胞中で産生される。一部の実施形態によれば、産生されるｏｌｙは、溶血性でない。一部の実施形態によれば、細菌細胞は大腸菌である。
【００７８】
一部の実施形態は、活性成分として治療有効量のｏｌｙ、その機能的に関連した変異体、又はｏｌｙを含む抽出物若しくはキノコ抽出物と、薬学的又は機能性食品的に許容される担体とを含む医薬組成物又は機能性食品組成物を対象とする。本発明は、さらに、ｏｌｙ、又はｏｌｙの機能的に関連した変異体、又はｏｌｙを含む抽出物若しくはキノコ抽出物を含む栄養補助食品を提供する。活性成分（ｏｌｙ又は機能的に関連したその変異体）の薬学的に許容される塩を一部の実施形態によれば使用することもできる。薬学的に許容される塩としては、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などの無毒の無機又は有機酸から誘導される塩などの遊離アミノ基と形成される塩、及びナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどの無毒の無機又は有機塩基から誘導される塩などの遊離カルボキシル基と形成される塩が挙げられる。
【００７９】
ｏｌｙ、その機能的に関連した変異体、又はｏｌｙを含む抽出物若しくはキノコ抽出物を含む薬学的又は機能性食品的組成物は、代謝症候群、又は本明細書に記載の代謝症候群症状若しくは合併症の１つ以上、並びに肥満、脂肪肝、糖尿病、癌及び高レベルのコレステロール及び／又はトリグリセリドの１つ以上を処置するのに必要な１種以上の追加の活性成分を含むことができる。追加の活性成分は、ｏｌｙ、ｏｌｙ、その機能的に関連した変異体、又はｏｌｙを含む抽出物若しくはキノコ抽出物と相乗効果を有し得ることに留意されたい。
【００８０】
本発明のｏｌｙ、その機能的に関連した変異体、又はｏｌｙを含む抽出物若しくはキノコ抽出物は、肥満、リポジストロフィー、肥満における食欲抑制、（本明細書で定義した）代謝症候群、並びに（本明細書で定義した）その症状及び／又は合併症、及びリポジストロフィー関連不妊症又は肥満、脂肪肝、糖尿病、癌並びに高レベルのコレステロール及び又はトリグリセリドの１つ以上の処置に使用される他の薬物と組み合わせて摂取するように処方することもできる。かかる組合せで使用するときには、ｏｌｙ若しくはその機能的に関連した変異体、又はｏｌｙを含む抽出物、及び従来の薬物は、同じ若しくは異なる経路で、同時に投与することができ、又は処置中の異なる時間に投与することができる。選択した従来の薬物の用量は、使用する個々の化合物、並びに投与の経路及び回数に依存する。
【００８１】
本発明は、本発明の医薬品又は機能性食品組成物の成分の１つ以上を充填した１個以上の容器を含む医薬品又は機能性食品のパック又はキットも提供する。医薬品又は生物学的製剤の製造、使用又は販売を規制する政府機関によって指定された形の通知をかかる容器（単数又は複数）に場合によっては添付する。通知は、ヒト投与のための製造、使用又は販売の機関による承認を示すものである。
【００８２】
「薬学的に許容される」という用語は、対象、例えば、ヒトへの投与に適切であることを意味する。例えば、「薬学的に許容される」という用語は、連邦若しくは州政府の規制行政機関によって認可された、又は米国薬局方、若しくは動物用、より具体的にはヒト用の他の一般に認知された薬局方に記載されていることを意味し得る。「担体」という用語は、治療化合物が一緒に投与される、希釈剤、アジュバント、賦形剤又はビヒクルを指す。かかる医薬担体は、落花生油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油など、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、他の合成溶媒などの石油、動物、野菜又は合成起源のものを含めて、水、油などの無菌液体とすることができる。水は、医薬組成物を静脈内投与するときに好ましい担体である。食塩水並びにデキストロース及びグリセロール水溶液を、特に注射液用の、液状担体として使用することもできる。適切な医薬品賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、白亜、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノールなどが挙げられる。組成物は、必要に応じて、少量の湿潤剤若しくは乳化剤、又は酢酸塩、クエン酸塩、リン酸塩などのｐＨ緩衝剤を含むこともできる。ベンジルアルコール、メチルパラベンなどの抗菌剤、アスコルビン酸、亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤、及び塩化ナトリウム、デキストロースなどの浸透圧調節剤も予見される。
【００８３】
医薬組成物、機能性食品組成物又は栄養補助食品は、溶液、懸濁液、乳濁液、錠剤又はカプセルの形態を取ることができる。医薬組成物は、粉体、ゲル、クリーム、軟膏、泡、ペースト、徐放性製剤などの形態を取ることもできる。組成物は、トリグリセリド、微結晶セルロース、トラガカントゴム、ゼラチンなどの伝統的な結合剤及び担体と一緒に坐剤として処方することができる。経口製剤は、医薬品等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準担体を含むことができる。適切な医薬担体の例は、その内容を参照により本明細書に援用するＥ．Ｗ．マーチン（Ｍａｒｔｉｎ）「レミントンの薬学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」に記載されている。かかる組成物は、対象への適切な投与のための剤形を与えるように適切な量の担体と一緒に、例えば、十分精製された形態の、治療有効量のｏｌｙ、その機能的に関連した変異体を含む。本発明の一部の実施形態においては、機能性食品又は栄養補助食品をチューインガム、乳製品などの食品に添加することができる。本発明の一部の実施形態においては、機能性食品又は栄養補助食品を水、乳、ジュースなどの液体に添加することができる。
【００８４】
個々の障害又は症状の処置に有効であるｏｌｙ、その機能的に関連した変異体、又はそれを含む抽出物若しくはキノコ抽出物の量は、障害又は症状の性質に依存し、当業者に既知の標準臨床技術によって決定することができる。さらに、ｉｎ−ｖｉｔｒｏアッセイを場合によっては用いて、最適な投与量範囲の確認を助けることができる。製剤に使用される正確な用量は、投与経路及び疾患又は障害の性質にも依存するが、開業医の判断及び各患者の状況に応じて決定すべきである。有効量は、ｉｎ−ｖｉｔｒｏ又はｉｎ−ｖｉｖｏ動物モデル試験バイオアッセイ又はシステムから得られる用量反応曲線から推定することができる。
【００８５】
医薬組成物の投与経路は、患者及び／又は処置する疾患若しくは症状に依存する。適切な投与経路としては、非経口投与、例えば、皮内、静脈内、筋肉内、病巣内、皮下、髄腔内、腹腔内、及び当該技術分野で公知の任意の他の投与方法が挙げられるが、それだけに限定されない。一部の実施形態によれば、組成物を経口、経皮、直腸、膣、局所、経鼻、吸入及び眼球処置様式で投与する。例えば、吸入器又は噴霧器を使用して、肺投与することもできる。
【００８６】
経口適用の場合、医薬組成物は、以下の成分又は性質の類似した化合物のいずれかを含むことができる錠剤又はカプセルの形態とすることができる：微結晶セルロース、トラガカントゴム、ゼラチンなどの結合剤、デンプン、ラクトースなどの賦形剤、アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、コーンスターチなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、又はコロイド状二酸化ケイ素などの流動化剤。投与単位剤形がカプセルであるときには、それは、上記タイプの成分に加えて、脂肪油などの液状担体を含むことができる。さらに、投与単位剤形は、投与単位の物理的形態を変える種々の別の材料、例えば、糖、シェラック又は別の腸溶剤の被覆物を含むことができる。本発明の錠剤は、さらに、フィルム被覆することができる。
【００８７】
「褐色脂肪の脂肪細胞の前駆体」という用語は、例えば、幹細胞、間葉幹細胞、筋原性前駆体、褐色前駆脂肪細胞及び白色前駆脂肪細胞を含めて、褐色脂肪の脂肪細胞に直接、又は中間細胞型を経て、分化することができる任意の細胞を指す。
【００８８】
「類似体」及び「誘導体」という用語は、天然ペプチドに比べてアミノ酸置換、付加、欠失又は化学修飾によって少なくとも１個の変化したアミノ酸残基を含むペプチドを指す。ペプチド誘導体は、特に、天然アミノ酸残基によるアミノ酸置換及び／又は付加、及び、例えば、一般に天然に存在する酵素修飾などの化学修飾を含む。ペプチド類似体は、特に、非天然アミノ酸残基によるアミノ酸置換及び／又は付加、及び天然に存在しない化学修飾を含む。
【００８９】
本発明は、少なくとも１個のアミノ酸が化学修飾されたペプチド／タンパク質の使用を包含する。アミノ酸残基の化学修飾としては、アミド化、メチル化、アセチル化、グリコシル化、酸化、還元、ミリスチル化、硫酸化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、環化、ヒドロキシル化、ヨウ素化、保護／ブロック基による誘導体化、又は当該技術分野で公知の任意の他の誘導体化方法が挙げられるが、それだけに限定されない。かかる変化は、ｏｌｙの生物活性を破壊しないが、改善し得る。
【００９０】
一実施形態においては、本明細書では「断片」と「ペプチド」という用語は、区別なく使用することができ、全く同じ意味及び性質を有する。
【００９１】
一実施形態においては、本明細書では「ペプチド」と「タンパク質」という用語は、区別なく使用することができ、全く同じ意味及び性質を有する。
【００９２】
本発明の原理による誘導体、類似体、前駆体及び断片は、−ＣＨ２−ＮＨ−、−ＣＨ２−Ｓ−、−ＣＨ２−Ｓ＝Ｏ、Ｏ＝Ｃ−ＮＨ−、−ＣＨ２−Ｏ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、Ｓ＝Ｃ−ＮＨ−及び−ＣＨ＝ＣＨ−を含めて、ただしそれだけに限定されない側鎖結合修飾、並びに修飾ペプチド結合などの骨格修飾を含むこともできる。ペプチド内のペプチド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）は、例えば、Ｎ−メチル化結合（−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＯ−）、エステル結合（−Ｃ（Ｒ）Ｈ−Ｃ−Ｏ−Ｏ−Ｃ（Ｒ）Ｈ−Ｎ）、ケトメチレン結合（−ＣＯ−ＣＨ２−）、α−アザ結合（−ＮＨ−Ｎ（Ｒ）−ＣＯ−）（式中、Ｒは任意のアルキル基、例えば、メチルである）、カルバ結合（−ＣＨ２−ＮＨ−）、ヒドロキシエチレン結合（−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−）、チオアミド結合（−ＣＳ−ＮＨ）、オレフィン二重結合（−ＣＨ＝ＣＨ−）及びペプチド誘導体（−Ｎ（Ｒ）−ＣＨ２−ＣＯ−）（式中、Ｒは、炭素原子上に天然に存在する「通常の」側鎖である）で置換することができる。これらの修飾は、ペプチド鎖に沿った１個以上の結合において、更には同時に幾つか（例えば、２〜３）においても起こり得る。
【００９３】
本発明は、遊離アミノ基を誘導体化して、アミン塩酸塩、ｐ−トルエンスルホニルアミノ基、カルボベンゾキシアミノ基、ｔ−ブチルオキシカルボニルアミノ基、クロロアセチルアミノ基又はホルミルアミノ基を形成するペプチド／タンパク質誘導体及び類似体も包含する。遊離カルボキシル基を誘導体化して、例えば、塩、メチル及びエチルエステル、又は別のタイプのエステル、又はヒドラジド、及びアミドを形成することができる。ヒスチジンのイミダゾール窒素を誘導体化して、Ｎ−ｉｍ−ベンジルヒスチジンを形成することができる。
【００９４】
２０種の標準アミノ酸残基の１種以上の天然アミノ酸誘導体を含むペプチド／タンパク質誘導体も含まれる。例えば、４−ヒドロキシプロリンでプロリンを置換することができ、５−ヒドロキシリジンでリジンを置換することができ、３−メチルヒスチジンでヒスチジンを置換することができ、ホモセリンでセリンを置換することができ、オルニチンでリジンを置換することができる。ペプチド類似体は、非天然アミノ酸を含むこともできる。非天然アミノ酸の例としては、サルコシン（Ｓａｒ）、ノルロイシン、オルニチン、シトルリン、ジアミノ酪酸、ホモセリン、イソプロピルＬｙｓ、３−（２’−ナフチル（ｎａｐｈｔｙｌ））−Ａｌａ、ニコチニルＬｙｓ、アミノイソ酪酸及び３−（３’−ピリジル−Ａｌａ）が挙げられるが、それだけに限定されない。
【００９５】
さらに、ペプチド／タンパク質類似体は、メチル化アミノ酸、Ｎ−ベンジル化アミノ酸、Ｏ−ベンジル化アミノ酸、Ｎ−アセチル化アミノ酸、Ｏ−アセチル化アミノ酸、カルボベンゾキシ置換アミノ酸などを含めて、ただしそれだけに限定されない別の誘導体化アミノ酸残基を含むことができる。具体例としては、メチル−Ａｌａ（ＭｅＡｌａ）、ＭｅＴｙｒ、ＭｅＡｒｇ、ＭｅＧｌｕ、ＭｅＶａｌ、ＭｅＨｉｓ、Ｎ−アセチル−Ｌｙｓ、Ｏ−アセチル−Ｌｙｓ、カルボベンゾキシ−Ｌｙｓ、Ｔｙｒ−Ｏ−ベンジル、Ｇｌｕ−Ｏ−ベンジル、ベンジル−Ｈｉｓ、Ａｒｇ−トシル、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニンなどが挙げられるが、それだけに限定されない。
【００９６】
アミノ酸配列に関して、当業者は、コード化配列中の単一のアミノ酸又は少数のアミノ酸を変える、付加する、又は欠失させる核酸、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質配列に対する個々の置換、欠失又は付加は、変更が化学的に類似したアミノ酸によるアミノ酸の置換という結果になる場合を含めて、「保存的に改変された変異体」であることを認識するはずである。機能上類似したアミノ酸を与える保存的置換の表は当該技術分野で周知である。表現型として無変化である可能性があるアミノ酸変化に関するガイダンスは、ボウイ（Ｂｏｗｉｅ）ら、１９９０、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２４７：１３０６  １３１０にも記載されている。かかる保存的に改変された変異体は、多形変異体、種間ホモログ及び対立遺伝子を補うものであり、これらを排除するものではない。典型的な保存的置換としては、１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）、５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）、６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、及び８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）が挙げられるが、それだけに限定されない（例えば、クライトン（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ）、プロテインズ（Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）（１９８４）を参照されたい）。アミノ酸は、側鎖に関連する性質に基づいて置換することができ、例えば、極性側鎖を有するアミノ酸は、例えば、セリン（Ｓ）及びスレオニン（Ｔ）で置換することができ、側鎖の電荷に基づくアミノ酸は、例えば、アルギニン（Ｒ）及びヒスチジン（Ｈ）で置換することができ、疎水性側鎖を有するアミノ酸は、例えば、バリン（Ｖ）及びロイシン（Ｌ）で置換することができる。示したように、変化は、一般に、折りたたみやタンパク質の活性に大きな影響を及ぼさない保存的アミノ酸置換などの重要でない性質のものである。
【００９７】
本明細書では、一実施形態においては、「アミノ酸誘導体」という用語は、本明細書で記述及び例示したように、天然又は非天然アミノ酸から誘導可能な基を指す。アミノ酸誘導体は、当業者に明らかであり、エステル、アミノアルコール、アミノアルデヒド、アミノラクトン、並びに天然及び非天然アミノ酸のＮ−メチル誘導体が挙げられるが、それだけに限定されない。一実施形態においては、アミノ酸誘導体は、本明細書に記載の化合物の置換基として与えられ、置換基は、−ＮＨ−Ｇ（Ｓｃ）−Ｃ（Ｏ）−Ｑ又は−ＯＣ（Ｏ）Ｇ（Ｓｃ）−Ｑである。式中、Ｑは−ＳＲ、−ＮＲＲ又はアルコキシルであり、Ｒは水素又はアルキルであり、Ｓｃは天然又は非天然アミノ酸の側鎖であり、ＧはＣ１〜Ｃ２アルキルである。ある実施形態においては、ＧはＣｉアルキルであり、Ｓｃは水素、アルキル、ヘテロアルキル、アリールアルキル及びヘテロアリールアルキルからなる群から選択される。
【００９８】
本発明の一部の実施形態においては、タンパク質／ペプチドのアミノ酸は、Ｌ若しくはＤ立体異性体又はそれらの組合せである。
【００９９】
本明細書では、一実施形態においては、「ペプチド」又は「タンパク質」又は「断片」という用語は、天然生物源から誘導することができ、合成することができ、又は組換え技術によって産生することができる。それは、化学合成を含めてどんな方法でも生成させることができる。１個以上のアミノ酸を、例えば、炭水化物基、リン酸基、ファルネシル基、イソファメシト（ｉｓｏｆａｍｅｓｙｔ）基、脂肪酸基、アシル基（例えば、アセチル基）、結合リンカー、官能基化（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）、別の公知の保護／ブロック基などの化学物質の添加によって修飾することができる。
【０１００】
一実施形態においては、本発明のペプチド／タンパク質を、アフィニティクロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、濾過、電気泳動、疎水性相互作用クロマトグラフィ、ゲル濾過クロマトグラフィ、逆相クロマトグラフィ、コンカナバリンＡクロマトグラフィ、クロマトフォーカシング、分別可溶化（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｏｌｕｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）など、ただしそれだけに限定されない種々の標準タンパク質精製技術によって精製する。
【０１０１】
一実施形態においては、回収を容易にするために、発現されるコード配列を操作して、本発明のペプチド／タンパク質及び融合した切断可能部分をコードすることができる。一実施形態においては、ペプチド／タンパク質がアフィニティクロマトグラフィによって、例えば、切断可能部分に特異的なカラム上の固定化によって、容易に単離できるように、融合タンパク質を設計することができる。一実施形態においては、切断部位は、ペプチドと切断可能部分の間で操作され、ペプチドは、融合タンパク質をこの部位において特異的に切断する適切な酵素又は薬剤で処理することによってクロマトグラフィカラムから遊離させることができる［例えば、ブース（Ｂｏｏｔｈ）ら、イムノロジー・レターズ（Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．）１９：６５〜７０（１９８８）、及びガーデラ（Ｇａｒｄｅｌｌａ）ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）２６５：１５８５４〜１５８５９（１９９０）］。
【０１０２】
一実施形態においては、本発明のタンパク質／ペプチドは、ｉｎ−ｖｉｔｒｏ発現系を用いて合成することもできる。一実施形態においては、ｉｎ−ｖｉｔｒｏ合成法は、当該技術分野で周知であり、系の成分は市販されている。
【０１０３】
一実施形態においては、本発明のタンパク質／ペプチドの製造は、組換えＤＮＡ技術を使用している。「組換え」ペプチド又はタンパク質とは、組換えＤＮＡ技術によって製造される、すなわち、所望のペプチド又はタンパク質をコードする外来ＤＮＡ構築物によって形質転換された細胞から産生される、ペプチド又はタンパク質を指す。
【０１０４】
一実施形態においては、本発明のペプチドは、少なくとも５個のアミノ酸を含む。別の一実施形態においては、ペプチドは、少なくとも１０個のアミノ酸を含む。別の一実施形態においては、ペプチドは、少なくとも２０個のアミノ酸を含む。別の一実施形態においては、ペプチドは、少なくとも２５個のアミノ酸を含む。別の実施形態においては、ペプチドは、少なくとも３０個のアミノ酸、少なくとも５０個のアミノ酸、７５個のアミノ酸、１００個のアミノ酸、１２５個のアミノ酸、１５０個のアミノ酸、２００個のアミノ酸、２５０個のアミノ酸、３００個のアミノ酸、３５０個のアミノ酸、又は４００個のアミノ酸を含む。一実施形態においては、本発明のペプチドは、少なくとも５個のアミノ酸から本質的になる。別の一実施形態においては、ペプチドは、少なくとも１０個のアミノ酸から本質的になる。別の実施形態においては、ペプチドは、少なくとも３０個のアミノ酸、少なくとも５０個のアミノ酸、７５個のアミノ酸、１００個のアミノ酸、１２５個のアミノ酸、１５０個のアミノ酸、２００個のアミノ酸、２５０個のアミノ酸、３００個のアミノ酸、３５０個のアミノ酸、又は４００個のアミノ酸から本質的になる。一実施形態においては、本発明のペプチドは、少なくとも５個のアミノ酸からなる。別の一実施形態においては、ペプチドは、少なくとも１０個のアミノ酸からなる。別の実施形態においては、ペプチドは、少なくとも３０個のアミノ酸、少なくとも５０個のアミノ酸、７５個のアミノ酸、１００個のアミノ酸、１２５個のアミノ酸、１５０個のアミノ酸、２００個のアミノ酸、２５０個のアミノ酸、３００個のアミノ酸、３５０個のアミノ酸、又は４００個のアミノ酸からなる。
【０１０５】
天然芳香族アミノ酸Ｔｒｐ、Ｔｙｒ及びＰｈｅは、ＴＩＣ、ナフチルエラニン（ｎａｐｈｔｈｙｌｅｌａｎｉｎｅ）（Ｎｏｌ）、Ｐｈｅの環メチル化誘導体、Ｐｈｅのハロゲン化誘導体、ｏ−メチル−Ｔｙｒなどの合成非天然酸を置換することができる。
【０１０６】
本明細書では、一実施形態においては「アミノ酸」という用語は、天然及び合成α、β  γ又はδアミノ酸を指し、タンパク質中に存在するアミノ酸、すなわちグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、プロリン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン及びヒスチジンを含むが、それだけに限定されない。ある実施形態においては、アミノ酸は、Ｌ配置である。あるいは、アミノ酸は、アラニル、バリニル、ロイシニル、イソロイシニル、プロリニル、フェニルアラニニル、トリプトファニル、メチオニニル、グリシニル、セリニル、スレオニニル、システイニル、チロシニル、アスパラギニル、グルタミニル、アスパルトイル、グルタロイル、リジニル、アルギニニル、ヒスチジニル、β−アラニル、β−バリニル、β−ロイシニル、β−イソロイシニル、β−プロリニル、β−フェニルアラニニル、β−トリプトファニル、β−メチオニニル、β−グリシニル、β−セリニル、β−スレオニニル、β−システイニル、β−チロシニル、β−アスパラギニル、β−グルタミニル、β−アスパルトイル、β−グルタロイル、β−リジニル、β−アルギニニル又はβ−ヒスチジニルの誘導体とすることができる。本明細書では、一実施形態においては、「保存的に改変された変異体」という句は、アミノ酸配列と核酸配列の両方に適用される。「アミノ酸変異体」とは、アミノ酸配列を指す。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された変異体とは、同一若しくは本質的に同一なアミノ酸配列をコードする核酸を指し、又は核酸がアミノ酸配列をコードしない場合、本質的に同一な若しくは関連する（例えば、天然に隣接する）配列を指す。遺伝コードの縮重のため、多数の機能的に同一な核酸が大部分のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ及びＧＣＵは全てアミノ酸のアラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンによって指定される全ての位置において、コドンは、コードされたポリペプチドを変えずに、記述された対応するコドンのうち別のコドンに変更することができる。かかる核酸変異は、保存的に改変された変異の一種である「サイレントな変異」である。ポリペプチドをコードする本明細書の全ての核酸配列は、核酸のサイレントな変異も記述する。ある状況においては、核酸中の各コドン（通常はメチオニンの唯一のコドンであるＡＵＧ及び通常はトリプトファンの唯一のコドンであるＴＧＧを除く）は、機能的に同一な分子を得るために改変できることを当業者は理解するはずである。したがって、ポリペプチドをコードする核酸のサイレントな変異は、発現生成物に関して記述された配列に暗黙的に含まれる。
【０１０７】
一部の実施形態においては、本発明は、さらに、ｏｌｙ若しくはその機能的に関連した変異体又はその融合タンパク質が複合体に含まれ、それがタンパク質部分（例えば、非相同アミノ酸配列）又は非タンパク質部分（例えば、ＰＥＧ）に結合していることも想定する。タンパク質部分又は非タンパク質部分の各々は、循環中に組成物の半減期を延長することができる。
【０１０８】
かかる分子は、極めて安定であり（恐らくは非タンパク質部分によって付与される立体障害のために、ｉｎ−ｖｉｖｏタンパク質分解活性に対して耐性があり）、一般的な固相合成によって製造することができる。組換えペプチド生成物をｉｎ−ｖｉｔｒｏ修飾（例えば、以下に更に記述するＰＥＧ化）に供する更なる組換え技術を使用することもできる。
【０１０９】
本明細書では「非タンパク質部分」という句は、上記ＩＬ−３１アミノ酸配列に結合したペプチド結合アミノ酸を含まない分子を指す。一部の実施形態によれば、非タンパク質部分は、ポリマー又はコポリマー（合成又は天然）とすることができる。本発明の非タンパク質部分の非限定的例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ：ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）若しくはその誘導体、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ：Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ  ｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ）、ジビニルエーテルと無水マレイン酸のコポリマー（ＤＩＶＥＭＡ：ｄｉｖｉｎｙｌ  ｅｔｈｅｒ  ａｎｄ  ｍａｌｅｉｃ  ａｎｈｙｄｒｉｄｅ  ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ）、ポリシアル酸（ＰＳＡ：ｐｏｌｙｓｉａｌｉｃ  ａｃｉｄ）及び／又はポリ（スチレンコ無水マレイン酸）（ＳＭＡ：ｐｏｌｙ（ｓｔｙｒｅｎｅ  ｃｏｍａｌｅｉｃ  ａｎｈｙｄｒｉｄｅ））が挙げられる。さらに、ｏｌｙ又はその機能的に関連した変異体を環境から保護し、したがってその安定性を維持することができる複合体を使用することができる。例えば、ｏｌｙ若しくはその機能的に関連した変異体又はそれを含む融合タンパク質を含むリポソーム又はミセルも本発明に含まれる。
【０１１０】
本発明の一部の実施形態によれば、本発明のｏｌｙ若しくはその機能的に関連した変異体、又はｏｌｙ若しくはその機能的に関連した変異体を含む融合タンパク質は、徐放性促進剤として作用し得る非タンパク質部分に結合している。例示的な徐放性促進剤としては、ヒアルロン酸（ＨＡ：ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、アルギン酸（ＡＡ：ａｌｇｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）、ポリメタクリル酸ヒドロキシエチル（ポリＨＥＭＡ：ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ  ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）、グリム及びポリイソプロピルアクリルアミドが挙げられるが、それだけに限定されない。
【０１１１】
本発明のｏｌｙ若しくはその機能的に関連した変異体又はそれを含む融合タンパク質のアミノ酸配列成分を別の非アミノ酸剤に共有結合によって、又は非共有結合形態（ｎｏｎ−ｃｏｖａｌｅｎｔ  ｃｏｍｐｌｅｘｉｏｎ）によって、例えば、分解若しくは切断して徐放可能な化合物を生成することができる疎水性ポリマーとの形態によって、ｏｌｙ若しくはその機能的に関連した変異体又はそれを含む融合タンパク質のアミノ酸部分をリポソーム又はミセル中に捕捉して、ｏｌｙ若しくはその機能的に関連した変異体又はそれを含む融合タンパク質を含む複合体を生成することによって、結合することができる。結合は、他の成分（リポソーム、ミセル）内のアミノ酸配列の捕捉、又は本発明の最終ペプチドを生成するポリマー内のアミノ酸配列の注入によることができる。
【０１１２】
一部の実施形態においては、ＰＥＧ誘導体は、ＰＥＧカルボン酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル、カルボキシメチル化ＰＥＧのスクシンイミジルエステル（ＳＣＭ−ＰＥＧ）、ＰＥＧのベンゾトリアゾールカルボナート誘導体、ＰＥＧのグリシジルエーテル、ＰＥＧｐ−ニトロフェニルカルボナート（メトキシＰＥＧ−ＮＰＣなどのＰＥＧ−ＮＰＣ）、ＰＥＧアルデヒド、ＰＥＧ−オルトピリジル−ジスルフィド、カルボニルジイミダゾル（ｃａｒｂｏｎｙｌｄｉｍｉｄａｚｏｌ）活性化ＰＥＧ、ＰＥＧ−チオール、ＰＥＧ−マレイミドである。ＰＥＧ−マレイミド、ＰＥＧ−ビニルスルホン（ＶＳ）、ＰＥＧ−アクリラート（ＡＣ）又はＰＥＧ−オルトピリジルジスルフィドを使用することもできる。
【０１１３】
非タンパク質部分は、ｏｌｙ又はその機能的に関連した変異体アミノ酸配列に任意の選択位置において結合することができる。ただし、ｏｌｙ又はその機能的に関連した変異体の治療活性は保持される。
【０１１４】
本発明の一部の実施形態においては、ｏｌｙ又はその機能的に関連した変異体を含む融合タンパク質、及びｏｌｙ若しくはその機能的に関連した変異体を安定化する、又は血流若しくは組織においてそれを保護するタンパク質を提供する。本発明の一部の実施形態においては、ｏｌｙ又はその機能的に関連した変異体及びＩｇＧを含む融合タンパク質を提供する。ＩｇＧは、その任意のサブクラス又はアイソタイプ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４とすることができる。
【０１１５】
本発明の一部の実施形態においては、ｏｌｙ又はその機能的に関連した変異体、及びＩｇＧ、及びＩｇＧ、及び／又は血清中のｏｌｙ若しくはその機能的に関連した変異体及びＩｇＧの半減期を延長するために使用することができる任意の他のタンパク質を、リンカーによって連結する。本発明の一部の実施形態においては、リンカーは、２〜２０個のアミノ酸の配列である。
【０１１６】
本発明の一部の実施形態においては、リンカーは、ＭＭＰ９／２、トリプシン、ＰＳＡ、カテプシン、カリクレイン、セリンプロテアーゼ、カスパーゼなどの酵素のための切断部位を形成する４〜１２個のアミノ酸の配列である。追加の可能な切断部位は、チョイ（ＣＨＯＩ）ら、「プロテアーゼ活性化薬剤開発（Ｐｒｏｔｅａｓｅ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）」、セラノスティクス（Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ）、Ｖｏｌ．２（２）、ｐｐ．１５６〜１７８（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｈｎｏ．ｏｒｇ／ｖ０２ｐ０１５６．ｐｄｆ）に記載されている。一部の実施形態においては、リンカーは、６〜８個のアミノ酸であり、一部の実施形態においては、ＭＭＰ９／２、トリプシン、ＰＳＡ、カテプシン、カリクレイン、セリンプロテアーゼ、カスパーゼ及び／又は別の酵素などの酵素のための切断部位を含む。
【０１１７】
一部の実施形態においては、リンカーは、ＭＭＰ−９／２、カテプシン、トリプシン、カリクレイン、セリンプロテアーゼ、カスパーゼ、又はｏｌｙ若しくはその機能的に関連した変異体とＩｇＧの間に付加することができる任意の他の切断酵素の切断部位を含む。一部の実施形態においては、本発明は、ｏｌｙ又はその機能的に関連した変異体及びＩｇＧを含む融合タンパク質を提供する。
【０１１８】
さらに、本発明は、本明細書に記載の融合タンパク質をコードする核酸を包含する。本発明は、さらに、ｏｌｙ又はｏｌｙの機能的に関連した変異体をコードする核酸を包含する。さらに、これらの核酸を含むベクター、及びかかるベクターで形質転換された細胞も本発明に包含される。
【０１１９】
本発明の一部の実施形態においては、ｏｌｙを含む抽出物を、本明細書に記載の様々な症状、例えば、肥満、脂肪肝、糖尿病、癌などの処置に使用することができる。本発明の一部の実施形態においては、抽出物はキノコ抽出物である。キノコ抽出物はヒラタケ抽出物とすることができる。抽出物は、本明細書に詳述するように調製することができる。
【０１２０】
乾燥粉体は、ヒラタケ（ヤルデン（Ｙａｒｄｅｎ））キノコの新しい子実体から、新しい子実体を液体窒素で凍結させ、凍結乾燥し、その後、任意の適切な粉砕機で粉砕して調製することができる。あるいは、キノコを温度−４℃から−４０℃で凍結させ、凍結乾燥し、任意の適切な粉砕機で粉砕する。一部の実施形態においては、粉砕を約２０秒から１０分間行う。一部の実施形態においては、粉砕を約３０秒から２分間行う。一部の実施形態においては、粉砕を約１分間行う。粉末子実体を水で抽出することができ、一部の実施形態においては、終夜又は約２０分間から６時間撹拌することによって冷水を使用する。次いで、抽出物を、例えば、約３，０００ｒｐｍから３０ｒｐｍで約１０分間から２時間以上遠心分離する。上清を濾過する。一定分量をマウスＨＩＢ−１Ｂ細胞におけるＯｌｙ発現又は活性について試験することができる。
【０１２１】
実施例７に示すように、液体窒素による新しい子実体の凍結、続いて凍結乾燥、その後の粉砕によって、温度約−２０℃で凍結させ、凍結乾燥し、粉砕したキノコよりもｏｌｙ濃度が高くなった。しかし、マウスＨＩＢ−１Ｂ細胞における活性は、両方の調製物からの一定分量では類似していた。本発明の一部の実施形態においては、ｏｌｙが豊富な抽出物を提供するために、追加のｏｌｙ（天然でも合成でもよい）を抽出物に添加することができる。
【０１２２】
以下の実施例は、本発明のある実施形態を更に説明するためのものである。しかし、それらは、本発明の広範な範囲を限定するものと決して解釈すべきではない。当業者は、本発明の範囲から逸脱することなく、本明細書に開示した原理の多数の変更及び改変を容易に考案することができる。
【実施例】
【０１２３】
実験法
オストレオリシンの調製
Ｏｌｙを、（５’末端の）ＮｃｏＩ及び（３’末端の）ＢａｍＨＩ＋ＸｂａＩ部位を含むプライマーを用いてＰＣＲ増幅し、ＮｃｏＩ及びＸｂａＩ部位においてｐＴｒｃ９９ａベクターにサブクローニングした。タンパク質の分子量は１５，４００Ｄａであり、（ＤＮＡｍａｎプログラムによって計算される）２８０ｎｍにおける比吸光度はｇ／Ｌに対して２．６２であった。タンパク質は、ＩＰＴＧを可溶性タンパク質として用いた誘導によって発現した。タンパク質をＮａＨＣＯ３の存在下で、近似のタンパク質：塩比１：１で、逐次抽出、硫安塩析、透析、アニオン交換クロマトグラフィ、調製用ゲル濾過、透析及び凍結乾燥によって精製した。その濃度を２８０ｎｍにおける比吸光度によって計算した。タンパク質は、ＤＤＷに易溶である。その純度を、還元剤の存在下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって（図１参照）、また、２５ｍＭトリス−Ｈｃｌ＋３００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８の存在下で展開されたＳｕｐｐｅｒｄｅｘ７５カラム上の分析的ゲル濾過によって（図２参照）測定した。両方の方法によって測定した純度は＞９５％であり、非変性条件下の分子量は、タンパク質がモノマーであることを示している。多量のｏｌｙを得るために、タンパク質を大腸菌中で過剰発現させ、精製した（図１及び２参照）。
【０１２４】
細胞培養
［トランスジェニックマウスの褐色脂肪腫瘍から誘導され、褐色脂肪特異的ミトコンドリア脱共役タンパク質（ＵＣＰ）を発現可能な第１樹立褐色脂肪細胞の細胞系である］ＨＩＢ−１Ｂ褐色前駆脂肪細胞を増殖させ、分化させ、又はロシグリタゾンを使用し、又はそれらをＯｌｙで処理した。マウス３Ｔ３−Ｌ１を増殖させ、ロシグリタゾンを用いて分化させた。
【０１２５】
ＲＮＡ抽出及びＲＴ−ＰＣＲ
全ＲＮＡをＴ−Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｓｉｇｍａ）を用いて単離した。逆転写をＨｉｇｈ−Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行った。ＲＴ−ＰＣＲをＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行った。
【０１２６】
ウエスタンブロット法
一次及び二次抗体をＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ダンバーズ、ＭＡ）又はＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（サンタクルズ、ＣＡ）から入手し、ヤフーダ−シナイドマン（Ｙｅｈｕｄａ−Ｓｈｎａｉｄｍａｎ），Ｅ．ら、「ＰＫＡによって誘導される脂肪分解による白色脂肪細胞呼吸の急性刺激（Ａｃｕｔｅ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｗｈｉｔｅ  ａｄｉｐｏｃｙｔｅ  ｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎ  ｂｙ  ＰＫＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｌｉｐｏｌｙｓｉｓ）」、ダイアビーテス（Ｄｉａｂｅｔｅｓ）、２０１０．５９（１０）：ｐ．２４７４〜８３に記載のようにウエスタンブロット法を実施した。
【０１２７】
免疫蛍光及び共焦点顕微鏡法
細胞を１２ウェルプレートに蒔き、ガラスカバーガラスで覆い、０．１％ゼラチンで被覆した。１日後、ｏｌｙ（１０〜６２．５μｇ／ｍｌ）を８時間添加した。細胞を３．７％（ｖ／ｖ）ＰＦＡで固定し、０．５％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を用いて３分間透過処理した。細胞をＰＦＡ３．７％と一緒に２０分間インキュベートし、ＰＢＳで洗浄した。５％（ｖ／ｖ）ロバ血清を用いて室温で１時間ブロッキング後、カバーガラスをカベオリン１一次抗体（１：１００希釈）又はｏｌｙ一次抗体と一緒に終夜４０℃でインキュベートした。カバーガラスをＴＢＳＴで洗浄し、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８ヤギ抗ウサギＩｇＧ二次抗体及びファロイジン−ＴＲＩＴＣと一緒に２時間室温でインキュベートした。追加の洗浄を行い、最後に、ＤＡＰＩ（３０％（ｖ／ｖ））を含む封入溶液（７０％（ｖ／ｖ））を添加した。細胞を共焦点Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  １００Ｍ顕微鏡（ＬＳＭ  ５１０、ドイツ）で観察した。
【０１２８】
ナイルレッド染色
細胞を０．１％ゼラチン被覆ガラス底部２４ウェル培養皿（ＭａｔＴａｋ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、アシュランド、ＭＡ）の上に蒔いた。３７℃、５％ＣＯ２で終夜インキュベーション後、細胞をＰＢＳで洗浄し、１μｇ／ｍｌナイルレッドと一緒に２０分間３７℃でインキュベートし、共焦点顕微鏡によって分析した。
【０１２９】
実施例１
ＨＣＴ−１１６結腸癌細胞系における組換えｏｌｙの抗増殖活性を評価するｉｎ−ｖｉｔｒｏアッセイ
生死判別試験（ＭＴＴアッセイ）を使用して、ＨＣＴ−１１６結腸癌細胞系における組換えｏｌｙの生物学的抗増殖活性を試験した。天然タンパク質と同様に、組換えｏｌｙは抗増殖活性を有する（図３灰色）。ｏｌｙの抗増殖活性が、多量の脂質ラフト（ｌｉｐｉｄ  ｄｒａｆｔｓ）を有する癌細胞に特異的であるかどうか更に調査するために、非癌細胞系ＦＨＳ７４Ｉｎｔ（胎児の小腸）の生存率に対するｏｌｙの効果を試験した。図３（黒色の柱）に示すように、ｏｌｙの抗増殖活性は、癌細胞（灰色）よりも非癌細胞（黒色）においてはるかに低い。
【０１３０】
実施例２
全組換えｏｌｙに対するポリクローナル特異的抗体の選定
全組換えｏｌｙに対するポリクローナル特異的抗体を設計した。図４は、得られた抗体が極めてｏｌｙ特異的であり、組換えタンパク質と野生型タンパク質の両方を認識することを示す。
【０１３１】
実施例３
脂肪細胞分化におけるｏｌｙの役割を試験するｉｎ−ｖｉｔｒｏアッセイ
細胞に侵入することができる活性なｏｌｙを得た後、ｏｌｙを脂肪細胞分化におけるその推定上の役割について試験した。マウス褐色前駆脂肪細胞の細胞系ＨＩＢ−１Ｂ及びマウス白色前駆脂肪細胞の細胞系３Ｔ３−Ｌ１をこの試験に利用した。ＨＩＢ−１Ｂ細胞をｏｌｙで処理すると、細胞質における脂肪滴の蓄積のために形態学的変化が認められた（図５Ａ）。これは、ナイルレッド染色によっても証明された（図５Ｂ）。それに対して、ｏｌｙで処理した３Ｔ３−Ｌ１は、脂質蓄積を示さないが（図５Ｂ）、幾つかの分化遺伝子（ＨＳＬ、ＰＧＣ−１αなど、図示せず）の遺伝子発現に影響を及ぼした。注意：両方の細胞系において、ｏｌｙの最良の効果を２４〜４８時間後に検出した。処理期間を延長しても、更なる変化は生じなかった。
【０１３２】
ｏｌｙによって誘導される褐色脂肪生成を更に特徴づけるために、幾つかの脂肪生成マーカーの遺伝子発現に対するｏｌｙの効果を測定した。図６Ａは、ｏｌｙがａＰ２、ＰＧＣ−１α及びＣ／ＥＢＰαの遺伝子発現を増加させ、ネクジン（ｎｅｃｄｉｎ）（脂肪生成阻害剤）が減少することを示しており、脂肪細胞分化を示唆している。さらに、ｏｌｙは、ＵＣＰ１、ＣＩＤＥＡ、ｐｒｄｍ１６などの特異的褐色脂肪生成マーカーの遺伝子発現を増加させる（図６Ｂ）。
【０１３３】
したがって、ｏｌｙが褐色脂肪の分化を誘発し、白色脂肪細胞から「褐色様」細胞への転換を起こし得ると仮定される。白血球は褐色細胞に転換し得ることが知られている。
【０１３４】
ｏｌｙによって誘導される褐色脂肪生成における脂質ラフト関連タンパク質の関与についても調査した。この問題は、以下の２つの理由により特に関連する：（１）ｏｌｙは、脂質ラフトと相互作用し、それは、細胞膜を通したその侵入を引き起こし得る、（２）多数の累積した証拠によれば、脂肪細胞代謝におけるカベオリン１に対する役割が提起される。したがって、ｏｌｙによって誘導される脂肪生成におけるカベオリン１の役割を試験した。ｏｌｙは、ＨＩＢ−１Ｂ細胞においてカベオリン１遺伝子発現を増加させることが判明した（図７）。これは、ｏｌｙの効果におけるカベオリン１に対する役割を示唆しており、分化プロセスの一部であり得る。
【０１３５】
実施例４
毒性のｉｎ−ｖｉｖｏ実験
組換えｏｌｙ０．２ｍｇ／ｋｇ体重（ＢＷ）又は０．５ｍｇ／ｋｇＢＷをマウスにＩＰ注射しても死亡を誘発せず、投与後１週間後の適用から、注射したマウスにおける病気や毒性の徴候もなかった。
【０１３６】
実施例５
肥満、糖尿病及び脂肪肝に対するｏｌｙの効果を評価するｉｎ−ｖｉｖｏ試験
動物及び実験の設計
雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウス、５週齢をＨａｒｌａｎ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｅｉｎ  Ｋａｒｅｍ、エルサレムから購入した。すべてのマウスは同腹仔であった。マウスを同じ動物施設において４個のプラスチック製檻中で飼育した。各檻は、異なる実験群であり、２群を通常食で維持し、２群は高脂肪食（６０％脂肪）を摂取した。マウスには水を自由に与えた。マウスを週２回秤量した。マウス群に２種類の食餌を１４週間与えた後、ｏｌｙの注射期間を開始した。処置群（１つの檻の通常食及び１つの檻の高脂肪食（ＨＦＤ）マウスに固定濃度のｏｌｙ（１．０μｇ／ｇＢＷ）を隔日で腹腔注射した。各マウスを注射前に秤量し、ｏｌｙの注射体積をマウスの体重に応じて調節した。対照群に同様の体積の食塩水を注射した。すべての注射において、２６Ｇａ３／８’’針を有する滅菌１ｍｌシリンジを使用した。動物管理及び実験手順は、ヘブライ大学の公認の動物倫理委員会に従った。
【０１３７】
体重に対するｏｌｙの効果
実験中の４群のマウスの体重増加を図８に示す。図９は、屠殺日におけるマウスの体重を示す。結果によれば、肥満マウス、すなわち、高脂肪食を与えたマウスへのｏｌｙ投与は、かなりの体重減少をもたらした。
【０１３８】
腹腔内グルコース負荷試験（ＩＰＧＴＴ：Ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｔｅｓｔ）に対するｏｌｙの効果
空腹時血糖値を１２時間絶食したマウスから得た。実験１日目から１６週間後に試験を行った。各マウスを秤量し、血糖計（Ｏｐｔｉｍｕｍ  Ｘｃｅｅｄ、Ａｂｂｏｔ、ＵＫ）及びそれぞれの血中グルコース試験片（Ｏｐｔｉｍｕｍ、Ａｂｂｏｔ、ＵＫ）を用いて、空腹時血糖値を小さい尾部クリップからの静脈血から得た。その後、グルコース溶液（２０％（ｗ／ｖ）食塩水溶液）を、１ｍｌシリンジ、２６Ｇａ３／８’’針を用いて、マウスの体重に応じて（２ｍｇ／ｇ体重）、注射した。グルコース溶液注射から３０、６０、９０及び１２０分間後に血糖値を測定した（図１０Ａ参照）。体の耐糖能を表すＩＰＧＴＴの曲線下面積（ＡＵＣ）をすべてのマウス群について計算した（図１０Ｂ参照）。図１０Ａ及び１０Ｂに示すように、肥満マウスへのｏｌｙ投与は、グルコース応答性をかなり低下させ、ｏｌｙは、糖不耐性をかなり低下させた。
【０１３９】
摂食量に対するｏｌｙの効果
実験を通したマウスの摂食量をモニターした。図１１に示すように、マウスの摂食量は、ｏｌｙの投与によって影響されない。したがって、証明された体重減少は、食欲不振などによるものではない。
【０１４０】
体組織に対するｏｌｙの効果
２０週間後、異なる群のマウスを屠殺し、異なる組織を血液試料と同様に分析した。精巣上体脂肪組織の重量を図１２に示す。図１３Ａは、ＵＣＰ−１、Ｃｉｄｅａ、ＰＲＤＭ１６、ペリリピンＡ（褐色脂肪生成マーカー）の発現を示す。発現は、その中で示したように、ｏｌｙの投与によって増加する。一方、ＴＮＦ−αの発現は、ｏｌｙの投与によって内臓脂肪組織において減少した。したがって、ｏｌｙの投与は、精巣上体脂肪量をかなり減少させ、内臓嚢（ｖｉｓｃｅｒａｌ  ｍａｓｓ）をより褐色脂肪生成特性に向かって制御すると結論される。
【０１４１】
図１４は、屠殺日におけるマウスの肝臓重量を示し、ｏｌｙの投与が肝臓重量をかなり減少させることを示している。さらに、血液を肝機能について分析した。図１５及び１６に示すように、トランスアミナーゼＧＯＴ及びＧＰＴは、ｏｌｙ処理によってかなり減少した。さらに、図１７及び１８に示すように、トリグリセリド及びコレステロールレベルもｏｌｙ処理によってかなり減少した。
【０１４２】
さらに、肝臓試料を組織学的に試験した。図１９に示すように、高脂肪食を与えたマウスの肝臓は、低脂肪食を与えたマウスにおける脂肪滴数よりも比較的多い脂肪滴数から明らかであるように、極度に脂肪過多であることが判明した（対照ＨＦ群参照）。さらに、ｏｌｙで処理したＨＦＤマウスから得られる正常な組織学的結果から明らかであるように、ｏｌｙ処理は、肝臓の脂肪レベルを低下させたと思われる。肝臓におけるアポトーシスも同様に評価した。図２０に示すように、ｏｌｙは、アポトーシス促進ペプチドＢａｘを減少させ、抗アポトーシスペプチドＢｃｌ２を増加させた。したがって、ＢＡＸ／ＢＣＬ２は、肝臓試料においてｏｌｙの投与によって減少し、したがって肝細胞の死を阻止した。上記結果は、ｏｌｙの投与が脂肪肝の出現及び付随する肝臓活性をかなり低下させたことを示している。
【０１４３】
さらに、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）に対するＯｌｙの効果を評価する様々な試験を行った。試験及び結果を下表１に示す。
【０１４４】
【表１−１】
2020040966.tif 000002
【０１４５】
【表１−２】
2020040966.tif 000003
【０１４６】
実施例６
癌におけるｏｌｙの効果
方法
細胞系及び培養条件
ＨＣＴ１１６結腸直腸癌細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−２４７）を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ：Ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｂｅｉｔ  Ｈａｅｍｅｋ、イスラエル）及び０．２％（ｖ／ｖ）ペニシリン−ストレプトマイシン−ナイスタチンを補充したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ：Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、イスラエル）中で維持した。クローン＃１（カベオリン１を発現しない、ｐｃＤＮＡ３  ｎｅｏプラスミドを移入したＨＭ７細胞）及びクローン＃１５（高レベルのカベオリン１を発現する、カベオリン１タンパク質挿入断片を含むプラスミドであるｐｃＤＮＡ−カベオリン１を移入したＨＭ７細胞）由来のＨＭ７高転移性結腸癌細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ及び０．２７５％（ｖ／ｖ）Ｇ−４１８を補充したＤＭＥＭ（ギブコ、ペイズリー、ＵＫ）中で維持した。すべての細胞を５％ＣＯ２、加湿雰囲気で３７℃で培養した。
【０１４７】
抗癌活性（ＭＴＴアッセイ）
クローン＃１及びクローン＃１５由来のＨＣＴ１１６細胞及びＨＭ７細胞を９６ウェルプレートに蒔いた（２．０ｘ１０４／ウェル）。ＣＯ２恒温器中で終夜３７℃でプレインキュベーション後、大腸菌中の発現によって調製された組換えタンパク質オストレオリシンを細胞培養物に濃度１２５μｇ／ｍｌ及び６２．５μｇ／ｍｌで添加した。新しい培地のみを対照に添加した。子実体抽出物を３つの濃度で添加した：０．０１％（ｗ／ｖ）、０．０２５％（ｗ／ｖ）、０．０５％（ｗ／ｖ）。３７℃で４、８、１２、２４時間インキュベーション後、培地を除去し、３−（４−，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム臭化物（ＭＴＴ）溶液（０．５ｍｇ／ｍｌ）５０μｌを添加した。プレートを１時間３７℃でインキュベートした。ＭＴＴ溶液を除去した後、ＤＭＳＯ１００μｌを各ウェルに添加し、プレートを２０分間振とうした。有色ホルマザンの形成を５５０ｎｍにおいてＥＬｘ８０８Ｕｌｔｒａマイクロプレートリーダー（ＢＩＯ−ＴＥＫ  ＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴＳ  ＩＮＣ）でＫＣ  ｊｕｎｉｏｒソフトウェアを用いて評価した。
【０１４８】
細胞周期分析
ＨＣＴ１１６細胞を６ウェルプレートに蒔き（９．０×１０５細胞／ウェル）、終夜付着させた。新しい培地を濃度１２５μｇ／ｍｌの組換えタンパク質オストレオリシンを含む細胞培養物に添加した。新しい培地のみを対照に添加した。子実体抽出物を濃度０．０１％（ｗ／ｖ）で添加した。８時間インキュベーション後、細胞をＰＢＳで洗浄し、トリプシン処理し、収集し、０．５ｍｌ無菌ＰＢＳに再懸濁した。冷７０％（ｖ／ｖ）エタノール０．５ｍｌをボルテックス撹拌しながら細胞懸濁液に添加し、試料を４℃で貯蔵した。染色のため、細胞を５分間１５００ｒｐｍで遠心分離し（Ｈｅｔｔｉｃｈ  Ｚｅｎｔｒｉｆｕｇｅｎ  Ｒｏｔｏｆｉｘ  ３２）、上層を廃棄し、ＤＮＡ断片化溶液（０．０５ｍｇ／ｍｌヨウ化プロピジウム、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００及び０．１％（ｗ／ｖ）クエン酸ナトリウム）を添加し、氷上で１時間インキュベートした。ヨウ化プロピジウムを４８８ｎｍにおいて励起させ、５７５ｎｍにおける発光（ＦＬ２）をフローサイトメータ（ＢＤ  ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ  ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、サンホゼ、ＣＡ）によって測定することによって、ＤＮＡ含有量を測定した。分析をＷｉｎＭＤＩ２．９ソフトウェアによって行った。
【０１４９】
ウエスタンブロット法及び濃度測定
ＨＣＴ１１６細胞溶解物を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ中で電気泳動させ、ニトロセルロース転写膜（ワットマン、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ、Ｓｃｈｕｅｌｌ、Ｄａｓｓｅｌ、ドイツ）に転写し、５％（ｗ／ｖ）乾燥脱脂乳を含むＴＢＳＴ中でブロックし、ＰＡＲＰ−１（１：１０００希釈）又はＢＡＸ（１：５００）又はβアクチン（１：１０，０００希釈）抗体と一緒に終夜４℃でインキュベートした。続いて、膜を西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩＲ、ボルチモア、ＰＡ、ＵＳＡ、１：１０，０００希釈）に結合した二次抗ウサギ抗体と一緒に１時間室温でインキュベートした。タンパク質をＥＣＬキットを用いて可視化した。ニトロセルロース膜への有効な転写をポンソーＳ染色によって確認した。膜をＭｕｓｔｅｋ１２００ＵＢ  Ｐｌｕｓスキャナー（Ｍｕｓｔｅｋ  ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．、ＣＡ、ＵＳＡ）によって走査した。濃度測定をＧｅｌｐｒｏ３２分析計ソフトウェアを用いて評価し、βアクチンを負荷対照として使用した。
【０１５０】
免疫蛍光及び共焦点顕微鏡法
１２ウェルプレート中に置かれた０．１％ゼラチン被覆ガラスカバーガラス（直径１．８ｃｍ）の上にＨＣＴ１１６細胞を密度３．６ｘ１０５細胞／ウェルで蒔いた。細胞を終夜付着させ、以下のように処理した：新しい培地を濃度１２５μｇ／ｍｌの組換えタンパク質ｏｌｙを含む細胞培養物に添加した。新しい培地のみを対照に添加した。子実体抽出物を濃度０．０１％（ｗ／ｖ）で添加した。４又は８時間インキュベーション後、細胞を３．７％（ｖ／ｖ）ＰＦＡで固定し、０．５％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で３分間透過処理した。その後、細胞をＰＦＡ３．７％と一緒に２０分間インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄した。非特異的染色をブロックするために、細胞を１時間室温で５％（ｖ／ｖ）ロバ血清と一緒にＴＢＳＴ中でインキュベートした。細胞を湿度チャンバ中で終夜４℃でカベオリン１一次抗体（１：１００希釈）又はオストレオリシン一次抗体（１：５００希釈）又はフロチリン１一次抗体（１：１００希釈）で順次染色した。カバーガラスをＴＢＳＴで３回３０分間洗浄し、次いでＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８ヤギ抗ウサギＩｇＧ二次抗体（１：５００希釈）及びファロイジン−ＴＲＩＴＣと一緒に湿度チャンバ中で２時間室温でインキュベートした。カバーガラスをＴＢＳＴで４回洗浄し、次いでＤＡＰＩ（３０％（ｖ／ｖ））を含む封入溶液と混合した封入溶液（７０％（ｖ／ｖ））を用いてスライドガラス上に裏返して載せた。細胞をＬｅｉｃａ  ＣＴＲ４０００共焦点顕微鏡（マンハイム、ドイツ）でｘ６３倍率で液浸油を用いて観察した。
【０１５１】
結果
組換えオストレオリシンは、ＨＣＴ１１６細胞及びＨＭ７クローンに対して抗増殖効果を示す。
ＨＣＴ１１６（結腸直腸癌細胞）をｏｌｙに曝露すると、有効濃度１２５μｇ／ｍｌで細胞傷害性を示し、８時間における細胞生存率が５０％減少した（図２１Ｃ）。ｏｌｙの細胞傷害効果はＨＭ７（高転移性結腸癌）においても認められた。（高Ｃａｖ−１レベルを発現する）ＨＭ７クローン＃１５は、４及び８時間投与すると（それぞれ図２１Ｂ及び２１Ｄ）、クローン＃１（Ｃａｖ−１発現なし）に比べてｏｌｙに対する感受性がかなり増加した。
【０１５２】
細胞形態の直接顕微鏡観察によって、ｏｌｙがＨＣＴ１１６細胞系及びＨＭ７クローンに対して類似の効果を有し、細胞の収縮を生じることが確認された（データ示さず）。ｏｌｙの細胞障害活性は、両方の細胞系において４時間のインキュベーション後に既に最高に達した。
【０１５３】
ｏｌｙの細胞傷害効果が癌細胞に特異的であるかどうか試験するために、非癌細胞系ＦＨＳ７４Ｉｎｔ（胎児の小腸）の生存率に対するｏｌｙの効果も試験した。図３に示すように（実施例１参照）、ｏｌｙの抗増殖活性は、癌細胞（ＨＣＴ１１６、灰色）よりも正常細胞（ＦＨＳ７４Ｉｎｔ、黒色）においてはるかに低く、癌細胞におけるｏｌｙの特異的抗増殖性の役割を意味している。
【０１５４】
ＨＣＴ１１６細胞系の細胞周期分析によれば、組換えｏｌｙはこれらの細胞においてアポトーシスを誘発する。
アポトーシス及び細胞周期における細胞分布を定量化するために、ＨＣＴ１１６細胞系をフローサイトメトリー（図２２Ａ）によって処理なし（対照）又はｏｌｙ１２５μｇ／ｍｌ及びＦＢＥ０．０１％（ｗ／ｖ）に関して分析した。定量的ＤＮＡ結合色素で染色後、アポトーシスによってＤＮＡを失った細胞は、より染色されず、Ｇ１ピークの左にサブＧ１ピークとして出現する。結果は、ＨＣＴ１１６未処理細胞において、細胞周期分布が、アポトーシス、Ｇ０／Ｇ１、Ｓ、Ｇ２／Ｍでそれぞれ１．２３８±０．１２４、４２．４８２±１．７０９、１３．１９８±０．８４５、２７．９９７±０．８５６であったことを示している。ＦＢＥ０．０１％（ｗ／ｖ）で処理したＨＣＴ１１６細胞においては、細胞周期分布は、アポトーシス、Ｇ０／Ｇ１、Ｓ、Ｇ２／Ｍでそれぞれ２．０４５±０．３２６、３３．８０７±１．１０９、１１．４８３±０．７２６、２７．５６０±１．１０２であった。ｏｌｙ１２５μｇ／ｍｌで処理したＨＣＴ１１６細胞においては、細胞周期分布は、アポトーシス、Ｇ０／Ｇ１、Ｓ、Ｇ２／Ｍでそれぞれ７．３８０±０．５８４、４６．０４８±２．３０７、１３．０２２±１．１５８、２５．９８８±０．４８７であった。未処理ＨＣＴ１１６細胞とｏｌｙ１２５μｇ／ｍｌ処理ＨＣＴ−１１６細胞の差は、Ｐ値＜０．０５で有意であった（図２２Ｂ）。
【０１５５】
組換えオストレオリシンは、ＨＣＴ１１６細胞系（結腸癌ヒト細胞系）においてＰＡＲＰ−１の切断、及びＢＡＸアポトーシス促進マーカーの発現を促進する。
アポトーシスの程度を、ウエスタンブロットを用いた活性ＰＡＲＰ−１の検出及びＢＡＸタンパク質の検出によって評価した。１１６ｋＤの核ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼであるＰＡＲＰは、ｉｎ−ｖｉｖｏでカスパーゼ３の主要な切断標的の１つである。切断は、ＰＡＲＰアミノ末端ＤＮＡ結合領域（２４ｋＤ）をカルボキシ末端触媒領域（８９ｋＤ）から分離し（１０）、アポトーシスを起こす細胞のマーカーとして役立つ。ＨＣＴ１１６細胞系においては、ｏｌｙ１２５μｇ／ｍｌ処理がＰＡＲＰの切断を誘発したことが（図２３Ａ）、完全長１１６ｋＤ断片と８９ｋＤ切断断片の両方を認識する抗体によって明らかになった。ＢＡＸは、Ｂｃｌ−２ファミリーの一員である２３ｋＤアポトーシス促進タンパク質である。ＢＡＸの活性化プロセスにおける重要な事象は、ミトコンドリアへのその転位、並びにミトコンドリア膜挿入及びオリゴマー化に密接に関連したそのＮ末端の構造変化である。ミトコンドリア外膜へのＢＡＸの挿入は、アポトーシスプログラムの実行に必須であるチトクロムｃ、プロカスパーゼ３などの幾つかのタンパク質のサイトゾル中への放出に密接に関連する。ＢＡＸ活性化を、ＢＡＸの活性化構造を特異的に認識する抗体を用いたウエスタンブロットによって調べた。ＨＣＴ１１６細胞のＯｌｙ１２５μｇ／ｍｌ処理は、無処理条件に比べて活性化ＢＡＸを増加させた（図２３Ｂ）。ＢＡＸ陽性アポトーシス細胞数の定量化は、ｏｌｙが対照未処理細胞に比べて全アポトーシスにかなり影響することを明らかにした（図２３Ｃ）。
【０１５６】
組換えオストレオリシンは、細胞膜と相互作用し、ＨＣＴ１１６細胞のサイトゾルに入る。
既報のように、軟骨細胞膜上のｏｌｙの選択的結合及びクラスター形成は、人工膜及びチャイニーズハムスター卵巣細胞から得られた結果と合わせて、膜に結合したｏｌｙ分子の分布が細胞表面に均一に分布せず、多数の限局的クラスター中に濃縮されたことを示している。これは、ｏｌｙが、恐らくはアエゲロリジン（ａｅｇｅｒｏｌｙｓｉｎ）様タンパク質に対する付着部位として働く明確な膜領域を認識し、それらの集合及び細孔の形成をもたらすことを示唆している。
【０１５７】
次に、対照条件と比較したＨＣＴ１１６細胞のｏｌｙ及びＦＢＥ処理後の組換えｏｌｙの膜分布（図２４）を検討した。組換えｏｌｙ１２５μｇ／ｍｌで８時間処理した細胞は、対照及びＦＢＥ条件よりも広いｏｌｙリッチ領域の分布を示した（図２４）。さらに、ｏｌｙ処理細胞の断面画像は、組換えｏｌｙが細胞膜を通り、サイトゾルに入ることを示した。
【０１５８】
組換えｏｌｙは、ＨＣＴ１１６細胞においてＣａｖ−１リッチ膜の再構築及びクラスター形成を誘導する。
細胞外刺激によって、原形質膜は、カベオラなどのサイズ及び寿命が増大したより安定化された領域及び分子クラスターの形成に備えていると考えられる。結腸癌細胞のアポトーシスへのカベオリン１の関与を理解するために、ＨＣＴ１１６細胞系に対するｏｌｙ刺激の効果を調べた（図２５）。カベオラは、均一形状の直径５０〜１００ｎｍの円形輪郭としてはっきり見え、カベオリンの重合によって形成され、細胞原形質膜における既存のコレステロールスフィンゴ脂質リッチ領域（脂質ラフト）のクラスター形成及び陥入をもたらす。したがって、対照条件及びｏｌｙ処理後におけるＣａｖ−１の膜分布を検討した。ｏｌｙ１２５μｇ／ｍｌで８時間処理した細胞は、対照条件よりも多数のＣａｖ−１リッチ領域を示した（図２５）。それに対して（図２６）、Ｏｌｙは、脂質ラフト関連タンパク質フロチリン（Ｆｌｏｔｉｌｉｎ）１の発現の著しい上方制御を誘導しなかった。
【０１５９】
ｉｎ−ｖｉｖｏ抗癌実験
Ｃ５７ＢｌマウスにＭＣ３８結腸癌細胞株を皮下接種すると、細胞接種後３週間以内に極めて侵襲性の高い腫瘍が原位置で発生した。図２７は、Ｃ５７Ｂｌマウスに移植されたＭＣ３８由来の結腸癌細胞に対するＯｌｙの効果を示す。細胞を左腰に皮下注射した（２ｘ１０５細胞／マウス）。注射の１０日後、一部のマウスに腫瘍の徴候が出現した後、マウスを１ｍｇ／ｋｇ  Ｏｌｙで処理した（腹腔内に週３回）。対照マウスにＰＢＳを週３回腹腔内投与した。各バーは、平均値の標準誤差である。Ｎ＝８マウス。マウスを３９日目に屠殺した。＊＝Ｐ＜０．００１。図から分かるように、ｏｌｙは、腫瘍サイズをかなり減少させた。図２８は、（対照のサイズの約半分である）腫瘍重量に対するｏｌｙの有益な効果を示す。
【０１６０】
実施例７
ヒラタケ抽出物の調製：
ヒラタケ調製法１：
ヒラタケ（ヤルデン）キノコの新しい子実体から、新しい子実体を液体窒素で凍結させ、凍結乾燥し、その後に１分間粉砕して、乾燥粉体を調製した。粉末子実体各１０グラムを終夜撹拌して冷水（４℃）１００ｍｌで抽出し、混合物を１０，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。上清を濾過し、一定分量のＯｌｙ発現をウエスタンブロットによって試験し（将来的には、Ｏｌｙ濃度を試験するＥＬＩＳＡ法が開発されるであろう）、マウスＨＩＢ−１Ｂ細胞における活性を試験するために１０マイクロリットル一定分量を使用した。
【０１６１】
ヒラタケ調製法２：
ヒラタケ（ヤルデン）キノコの新しい子実体から、試料を−２０℃で凍結させ、凍結乾燥し、Ｍｏｕｌｉｎｅｘ中で１分間粉砕して、乾燥粉体を調製した。粉末子実体各１０グラムを終夜撹拌して冷（４℃）水１００ｍｌで抽出し、１０，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。上清を濾過し、一定分量のＯｌｙ発現をウエスタンブロットによって試験し、マウスＨＩＢ−１Ｂ細胞における活性を試験するために１０マイクロリットル一定分量を使用した。
【０１６２】
２個のヒラタケ調製物におけるｏｌｙ濃度の比較
ウエスタンブロット分析を示した図２９から分かるように、液体窒素凍結後の粉末ヒラタケ（方法１）からの抽出物のＯｌｙ濃度は、−２０℃凍結後の粉末ヒラタケ（方法２）からの抽出物より高い。
【０１６３】
２個のヒラタケ調製物の生物学的試験
試料を生物学的に試験した。
用いた生物学的試験は、ＨＩＢ−１Ｂ細胞内の細胞内脂肪滴に似た球体の外観であり、それはトランスジェニックマウスの褐色脂肪腫瘍から誘導され、褐色脂肪特異的ミトコンドリア脱共役タンパク質（ＵＣＰ）を発現可能な第１樹立褐色脂肪細胞の細胞系である。
【０１６４】
ＨＩＢ−１Ｂ細胞を、ヒラタケ調製法１の１／１０希釈調製物１０μｌ（蒸留滅菌水で希釈）、又はほぼ同量のヒラタケ調製法２にさらした。
【０１６５】
結果
（２４時間インキュベーションでは、４８時間インキュベーションと同様の結果を得たが、データを示していないことに留意されたい。）
【０１６６】
図３０から分かるように、対照ＨＩＢ−１Ｂ細胞においては、脂肪滴は見られなかった（図３１Ａ）。Ｏｌｙ（１０μｇ／ｍｌ）で処理したＨＩＢ−１Ｂ細胞においては、多数の脂肪滴を見ることができる（図３１Ｂ）。ヒラタケ調製法１で処理したＨＩＢ−１Ｂ細胞における。
【０１６７】
方法１に従ったヒラタケからの子実体抽出物で処理したＨＩＢ−１Ｂ細胞。ｏｌｙ処理細胞とほぼ同じ量の脂肪滴が見られた（図３１Ｃ）。同様に、ヒラタケ調製法２で処理したＨＩＢ−１Ｂ細胞を示す図３１Ｄから分かるように、細胞中の脂肪滴の量は、ｏｌｙ処理における液滴量とほぼ同じであった。
【０１６８】
要するに、両方の抽出物調製法は、十分なＯｌｙ様活性をもたらした。より低濃度のｏｌｙでも、調製物は有効である。したがって、これらのヒラタケ単離物のｉｎ−ｖｉｖｏ投与は、組換えｏｌｙで見られたように、抗肥満、抗インスリン抵抗性、抗癌及び抗脂肪肝効果を誘発すると予想される。
【０１６９】
本発明は、上で特に示し、記述したものに限定されないことを当業者は理解されたい。より正確に言えば、本発明の範囲は、以下の特許請求の範囲によって規定される。
【図１】
2020040966.tif 000004
【図２】
2020040966.tif 000005
【図３】
2020040966.tif 000006
【図４】
2020040966.tif 000007
【図５Ａ】
2020040966.tif 000008
【図５Ｂ】
2020040966.tif 000009
【図６Ａ】
2020040966.tif 000010
【図６Ｂ】
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【図７】
2020040966.tif 000012
【図８】
2020040966.tif 000013
【図９】
2020040966.tif 000014
【図１０Ａ】
2020040966.tif 000015
【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
2020040966.tif 000018
【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
2020040966.tif 000020
【図１３Ｃ】
2020040966.tif 000021
【図１３Ｄ】
2020040966.tif 000022
【図１３Ｅ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
2020040966.tif 000026
【図１７】
2020040966.tif 000027
【図１８】
2020040966.tif 000028
【図１９Ａ】
2020040966.tif 000029
【図１９Ｂ】
2020040966.tif 000030
【図１９Ｃ】
2020040966.tif 000031
【図１９Ｄ】
2020040966.tif 000032
【図２０】
2020040966.tif 000033
【図２１】
2020040966.tif 000034
【図２２Ａ】
2020040966.tif 000035
【図２２Ｂ】
2020040966.tif 000036
【図２３Ａ】
2020040966.tif 000037
【図２３Ｂ】
2020040966.tif 000038
【図２３Ｃ】
2020040966.tif 000039
【図２４】
2020040966.tif 000040
【図２５】
2020040966.tif 000041
【図２６】
2020040966.tif 000042
【図２７】
2020040966.tif 000043
【図２８】
2020040966.tif 000044
【図２９】
2020040966.tif 000045
【図３０Ａ】
2020040966.tif 000046
【図３０Ｂ】
2020040966.tif 000047
【図３０Ｃ】
2020040966.tif 000048
【図３０Ｄ】
2020040966.tif 000049
【配列表】
2020040966000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年11月29日(2019.11.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂肪肝、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、及び非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）のうち１以上の処置、予防、又はその重症度の軽減における使用のための、オストレオリシン、又は、配列番号１と少なくとも９５％の配列同一性を有するオストレオリシンの機能的に関連した変異体を含む製剤。
【請求項２】
前記オストレオリシンの機能的に関連した変異体は、配列番号１と少なくとも９９％の配列同一性を有する、請求項１に記載の製剤。
【請求項３】
前記製剤が医薬製剤である、請求項１又は２に記載の製剤。
【請求項４】
前記製剤が、粉体、溶液、腸溶錠、懸濁液、乳濁液、錠剤、カプセル、ゲル、クリーム、軟膏、泡、ペースト又は注射の形態である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項５】
前記オストレオリシンが組換えタンパク質である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項６】
前記オストレオリシンが精製されたタンパク質である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の製剤。
【外国語明細書】
2020040966000001.pdf