(57)【要約】【課題】  クローニングやシークエンス解析のためのライブラリー調製時のＰＣＲ増幅などにおいて、ＰＣＲの正確性は重要である。そのため、高正確と言われているファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼにおいても、さらなる正確性向上が望まれている。特に、リピート配列のエラーは、高正確性と言われているファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼにおいても発生しやすく、リピート配列のエラー低減が望まれている。そこで、本発明の目的は、核酸増幅の正確性を向上させる方法を提供すること、リピート配列のエラーを低減させることで核酸増幅の正確性を向上させる方法を提供することである。【解決手段】  ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼに加え、ＰＣＮＡを添加することで核酸増幅の正確性を向上させることができた。また、ＰＣＮＡを添加することでリピート配列のエラーを低減させ、核酸増幅の正確性を向上させることができた。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ及びＰｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ａｎｔｉｇｅｎ（ＰＣＮＡ）を反応液中で共存させることにより、核酸増幅におけるスリッページエラーを低減させる方法。
【請求項２】
ＰＣＮＡが単独でＤＮＡにロードする変異体である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＰＣＮＡが、（ａ）８２、８４、１０９番目に相当するアミノ酸からなるＮ末端領域、および（ｂ）１３９、１４３、１４７番目に相当するアミノ酸からなるＣ末端領域のうち、少なくともひとつの改変を有する変異体である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ＰＣＮＡが配列番号１または２に記載のアミノ酸配列において、１４３番目に相当するアミノ酸を塩基性アミノ酸あるいは中性アミノ酸に改変したもの、または、８２番目と１４３番目を共に中性アミノ酸に改変したもの、１４７番目を中性アミノ酸に改変したもの、１０９番目と１４３番目を共に中性アミノ酸に改変したもののいずれかの変異体である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
ＰＣＮＡが配列番号２１に記載のアミノ酸配列において、１４２番目のアミノ酸を塩基性アミノ酸に改変した変異体である請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼが、古細菌（Ａｒｃｈｅａ）由来のＤＮＡポリメラーゼである請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼが、パイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属またはサーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）属の細菌から単離されるＤＮＡポリメラーゼである請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼが減少した塩基類似体検出活性を有する古細菌ＤＮＡポリメラーゼ変異体である請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
更に、核酸増幅におけるミスマッチエラーを低減することを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
リピート配列を含む核酸を鋳型として用いる場合のスリッページエラーを低減することを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかに記載の方法を行うための試薬であって、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ及びＰｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ａｎｔｉｇｅｎ（ＰＣＮＡ）を含む試薬。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれかに記載の方法を行うための試薬を含むキットであって、少なくとも以下の（ａ）及び（ｂ）を含むように構成されているキット：
（ａ）ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ、
（ｂ）Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ａｎｔｉｇｅｎ（ＰＣＮＡ）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸増幅の分野に関する。さらに詳しくは、ＰＣＲ反応における正確性を向上させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）法とは、（１）熱処理によるＤＮＡ変性（２本鎖ＤＮＡから１本鎖ＤＮＡへの解離）、（２）鋳型１本鎖ＤＮＡへのプライマーのアニーリング、（３）ＤＮＡポリメラーゼを用いた前記プライマーの伸長、という３ステップを１サイクルとし、このサイクルを繰り返すことによって、試料中の標的核酸を増幅する方法である。この方法により、数コピーといった極微量サンプルから標的核酸を何十万倍に増幅することができるため、研究用途のみならず、遺伝子診断、臨床診断といった法医学分野、あるいは、食品や環境中の微生物検査等においても、広く用いられている。
【０００３】
ＰＣＲを行う上で重要となる点として、増幅効率と高正確性などが挙げられる。特に、ＰＣＲの正確性は、目的遺伝子のクローニング、シークエンス解析のためのライブラリー調製時のＰＣＲ増幅などにおいて重要となる。
【０００４】
ＰＣＲの正確性の評価の物差しには種々の異なる観点がある。その物差しとしては、例えば、塩基の取り込み間違い（ミスマッチエラー）の頻度が挙げられる。ミスマッチエラーの頻度は、使用するＤＮＡポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性（修復活性）の強さに大きく依存する。一方、別の物差しとして、酵素のスリッピングによるリピート配列の複製エラー（スリッページエラー）の頻度が挙げられる。スリッページエラーは３’−５’エキソヌクレアーゼ活性では修復できない。このように、前記２種類の物差しは全く異なる原因で発生するものである。
【０００５】
ＰＣＲの正確性を向上させるために、超好熱始原菌由来のファミリーＢ（α型）に属するＤＮＡポリメラーゼが開発されてきた。ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼは、例えばパイロコッカス・フリオサス(Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ)由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ(Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ；特許文献１)、サーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｉ(Ｖｅｎｔ)ポリメラーゼ、特許文献２）、パイロコッカス・コダカラエンシス (Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ) ＫＯＤ１（旧名：Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ. ＫＯＤ１）由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ(ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ、特許文献３)などが知られている。これらファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼは３’−５’エキソヌクレアーゼ活性(Ｐｒｏｏｆ ｒｅａｄｉｎｇ活性・校正活性)を有するため、正確性は、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼなどのファミリーＡ（ｐｏｌ  Ｉ型）に属するＤＮＡポリメラーゼに比べて優れている。
【０００６】
しかしながら、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼを使用した場合でも、これらのエラーを完全に消失できるわけではない。例えばミスマッチエラーの観点では、特にクローニングやシークエンス解析において、より正確性の高いＰＣＲ方法が求められている。また、スリッページエラーの観点では、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼを使用した場合でもリピート配列における挿入や欠損に関するエラーは、ほとんど改善が認められていないことが報告されている（非特許文献１）。これは、リピート配列におけるエラーは、ＤＮＡのポリメラーゼのスリッピングによるものであるため、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性(Ｐｒｏｏｆ ｒｅａｄｉｎｇ活性・校正活性)では、修復できないからである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許３４５３３９７
【特許文献２】特開平０６−００７１６０
【特許文献３】特許３１３２６２４
【特許文献４】ＷＯ２００７／００４６５４
【特許文献５】英国特許６３３３１５８
【特許文献６】特許４３９５３７７
【特許文献７】特表２００６−５０７０１２
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐａｔｈｏｌ: Ｍｏｌ Ｐａｔｈｏｌ ２００１;５４:３５１−３５３
【非特許文献２】ＮＵＣＬＥＩＣ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ. ２００３ Ｆｅｂ １;３１(３):９７４−８０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
そこで、本発明はミスマッチエラーやリピート配列を増幅する際のスリッページエラーなどを低減させることで、核酸増幅の正確性を向上させる方法を提供することを目的とする。
さらに本発明の他の目的は、上記の目的に適した試薬キットを提供することにある。要約すれば本発明の目的は、ＰＣＲの正確性が向上し、クローニングやシークエンス解析のためのライブラリー調製時のＰＣＲ増幅などに適したＰＣＲ改良法およびＰＣＲ反応試薬を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、上記事情を鑑み、鋭意研究の結果、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼに加え、Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ａｎｔｉｇｅｎ（ＰＣＮＡ）を添加することで核酸増幅におけるミスマッチエラーの低減や、リピート配列を増幅する際のスリッページエラーの低減に繋がることを見出し、本発明の完成に至った。
【００１１】
Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ａｎｔｉｇｅｎ（ＰＣＮＡ）は、ＤＮＡ複製に関与する因子のひとつである増殖核抗原である。ＰＣＮＡをファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼに添加すると核酸増幅の時間が短縮できること（特許文献４）や、プライマーエクステンション試験で伸長性が向上し、核酸増幅でも比較的長めのターゲットを増幅できること（特許文献５）が知られている。しかし、核酸増幅におけるミスマッチエラーの低減に効果があることや、リピート配列を増幅する際のスリッページエラーの低減に効果があることを示した例は知られていない。
【００１２】
本発明は以下の構成からなる。
［１］核酸増幅の正確性を向上させる方法であって、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼとＰｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ａｎｔｉｇｅｎ（ＰＣＮＡ）を反応液中に含んでいることを特徴とする核酸増幅法。
（ここで、核酸増幅の正確性向上が、ミスマッチエラーの低減、および／または、リピート配列を増幅する際のスリッページエラーの低減であってもよい。）
［２］ＰＣＮＡが単独でＤＮＡにロードする変異体である［１］に記載の方法。
［３］ＰＣＮＡが、（ａ）８２、８４、１０９番目に相当するアミノ酸からなるＮ末端領域、および（ｂ）１３９、１４３、１４７番目に相当するアミノ酸からなるＣ末端領域のうち、少なくともひとつの改変を有する変異体である、［１］または［２］に記載の核酸増幅法。
［４］ＰＣＮＡが配列番号１または２に記載のアミノ酸配列において、１４３番目に相当するアミノ酸を塩基性アミノ酸あるいは中性アミノ酸に改変したもの、または、８２番目と１４３番目を共に中性アミノ酸に改変したもの、１４７番目を中性アミノ酸に改変したもの、１０９番目と１４３番目を共に中性アミノ酸に改変したもののいずれかの変異体である、［１］−［３］のいずれかに記載の核酸増幅法。
［５］ＰＣＮＡが配列番号２１に記載のアミノ酸配列において、１４２番目（配列番号１または２に記載のアミノ酸配列において、１４３番目に相当）のアミノ酸を塩基性アミノ酸に改変した変異体である［１］−［３］のいずれかに記載の核酸増幅方法。
［６］ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼが、古細菌（Ａｒｃｈｅａ）由来のＤＮＡポリメラーゼである［１］−［５］のいずれかに記載の核酸増幅法。
［７］ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼが、パイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属またはサーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）属の細菌から単離されるＤＮＡポリメラーゼである［１］−［５］のいずれかに記載の核酸増幅法。
［８］ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼが減少した塩基類似体検出活性を有する古細菌ＤＮＡポリメラーゼ変異体である［１］−［５］のいずれかに記載の核酸増幅法。
［９］［１］−［８］のいずれかに記載の核酸増幅法を行うための試薬。
［１０］［１］−［８］のいずれかに記載の核酸増幅法を行うための試薬を含むキット。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、核酸増幅（ＰＣＲ）のエラー（例えば、ミスマッチエラー、および／または、リピート配列を増幅する際のスリッページエラー）を低減させることができる。これにより、増幅エラーのない配列を見つけ出すことに時間を要していたクローニングの時間・コストの削減につなげることができる。さらに、シークエンスにおいては、核酸増幅エラー（例えば、ミスマッチエラー、および／または、リピート配列を増幅する際のスリッページエラー）を低減させ核酸増幅（ＰＣＲ）を行えることで正確なデータ、配列情報が得られることが期待できる。この手法は研究分野だけでなく、遺伝子診断などの臨床分野もしくは法医学分野、あるいは食品や環境中の微生物検査等においても広く利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ＰＣＮＡ変異体の評価として増幅増強活性を調べた結果である。
【図２】ＫＯＤ−ＰＣＮＡが、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼに与える正確性への影響を評価した結果である。
【図３】Ｐｆｕ−ＰＣＮＡが、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＤＮＡポリメラーゼに与える正確性への影響を評価した結果である。
【図４】ＫＯＤ−ＰＣＮＡが、減少した塩基類似体検出活性を有する古細菌ＤＮＡポリメラーゼ変異体に与える正確性への影響を評価した結果である。
【図５】Ｍｊａ−ＰＣＮＡが、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼに与える正確性への影響を評価した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明を詳細に説明する。
本明細書においては、塩基配列、アミノ酸配列およびその個々の構成因子については、アルファベット表記による簡略化した記号を用いる場合があるが、いずれも分子生物学・遺伝子工学分野における慣行に従う。また、本明細書においては、アミノ酸配列の変異を簡潔に示すため、例えば「Ｄ１４３Ａ」などの表記を用いる。「Ｄ１４３Ａ」は、第１４３番目のアスパラギン酸をアラニンに置換したことを示しており、すなわち、置換前のアミノ酸残基の種類、その場所、置換後のアミノ酸残基の種類を示している。また、配列番号は、特に断らない限り、配列表に記載された配列番号に対応する。また、多重変異体の場合は、上記の表記を「／」でつなげて表す。たとえば「Ｄ１４３Ａ／Ｄ１４７Ａ」は、第１４３番目のアスパラギン酸をアラニンに置換し、かつ、第１４７番目のアスパラギン酸をアラニンに置換したことを示す。
また、本明細書において「変異型ＰＣＮＡ」、「ＰＣＮＡ変異体」という場合の「変異型」、「変異体」とは、従来知られたＰＣＮＡとは異なるアミノ酸配列を備えることを意味するものであり、人為的変異によるか自然界における変異によるかを区別するものではない。さらに、ＤＮＡポリメラーゼの変異体についても同様である。
【００１６】
本発明におけるＰＣＲの正確性を向上した核酸増幅法は、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼとＰｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ａｎｔｉｇｅｎ（ＰＣＮＡ）を反応液中に含んでいることを特徴とする。
【００１７】
ＰＣＲの正確性とは、ＤＮＡ合成時における塩基の取り込みの正確性を意味する。ＰＣＲの正確性の評価を行う方法として、ストレプトマイシン耐性に関与するリボゾーマルタンパク質Ｓ１２（ｒｐｓＬ）遺伝子を用いた方法や、増幅産物をクローニングし、シークエンスする方法などが挙げられる。
【００１８】
［ＤＮＡポリメラーゼの正確性の評価方法］
本発明におけるＤＮＡポリメラーゼの正確性の評価には、増幅産物をクローニングし、シークエンスする方法を用いている。方法は、まず、ゲノムＤＮＡを鋳型として、任意に選択した領域を増幅できるプライマーにてＰＣＲ増幅を実施する。その後、増幅産物をベクターにクローニングし、複数クローンをピックアップ、シークエンスにより塩基配列を確認し、増幅塩基数に対するエラーの割合を求めることにより算出する。一方、鋳型がリピート配列を含むゲノムＤＮＡである場合は、リピート配列に生じた欠失や挿入のエラーの割合を求めることにより算出する。
【００１９】
具体的な正確性の評価方法を記載する。
（１）ミスマッチエラーの観点から
まず、ＰＣＲをＰＣＮＡ添加の有り、無しそれぞれについて実施する。ＰＣＲの反応組成については、プライマー対として、１５ｐｍｏｌのプライマー対（配列番号１８及び１９）、鋳型として５０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ（ロッシュ・アプライド・サイエンス）を使用する以外は、増幅が可能な組成であれば限定されない。また、ＰＣＲサイクルについても各ＤＮＡ  ポリメラーゼに適した条件で実施すればよい。ＰＣＮＡ添加の有無で増幅量を揃えるために、ＰＣＮＡ添加あり、無しのそれぞれについてサイクル数を設定する。増幅量が揃っているかの確認は、ＰＣＲ反応終了後、５μｌの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色後、紫外線照射下約２．４ｋｂの増幅ＤＮＡ断片の強度を確認することで評価できる。
次にＰＣＮＡ添加有り、無しのそれぞれの増幅産物についてクローニングを実施する。本ＰＣＲ産物は、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼにより増幅しているため３’末端が平滑化されている。そのため、ＰＣＲ産物の平滑末端へのアデニン付加後、ＴＡクローニングを実施する必要性がある。具体的には、アデニン付加、ＴＡクローニングには、ＴＡｒｇｅｔ  Ｃｌｏｎｅ  −Ｐｌｕｓ−（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて、方法は取扱説明書に準じて行えばよい。クローニング方法については、上記方法に限定されず、公知の方法を使用することが可能である。
【００２０】
クローニングにより得られたプラスミドによりエシェリシア・コリＤＨ５αを形質転換し、アンピシリンを含むＬＢ寒天培地に播種後、３７度で一晩培養する。得られたコロニーを複数ピックアップし、アンピシリンを含むＬＢ培地にて培養し、プラスミドを抽出後、シークエンスを実施する。シークエンス反応は、配列番号２０に示すプライマーを用いる。シークエンス解析は、例えば、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ）を用い、製品の取扱説明書に準じてシークエンス反応を行う。解析には、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３７３０ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステムズ）を使用し、解析を実施する。
シークエンス後、複数ピックアップしたコロニーそれぞれについて、シークエンスが完了した塩基数と、間違えて取り込まれた塩基数（エラー塩基数）のカウントを実施する。その後、複数ピックアップしたコロニーについて算出した値を合計し、シークエンスが完了した塩基数の合計値に対する間違えて取り込まれた塩基数（エラー塩基数）の合計値の割合を算出し、この値をエラー率とする。このエラー率について、ＰＣＮＡ添加有り、無しで比較することによりＰＣＮＡ添加効果を確認することができる。この際、シークエンスを実施するプラスミド数は、最低３０クローン、好ましくは５０クローン以上で実施する。また、計算値の分母となるシークエンスが完了した塩基数は１００００塩基以上が望ましく、より好ましくは２００００塩基以上である。
さらに、間違えて取り込まれた塩基数を評価するにあたり、リピート配列に対するエラー（スリッページエラー）は除外する。これは、塩基の取り込み間違い（エラー）とリピート配列に対するエラー（スリッページエラー）は異なる原因で発生するからである。
【００２１】
（２）リピート配列を増幅する際のスリッページエラーの観点から
一方、鋳型がリピート配列を含むゲノムＤＮＡである場合は、リピート配列を含む領域の解析（シークエンス解析）までの工程を前記（１）と同様に実施した後、（Ａ）１２のリピート配列領域のＡの数を各コロニーから抽出したプラスミドごとに集計する。シークエンスを実施したプラスミド数に対するＡの数が１２個であるプラスミドの割合をエラーのない割合とし、シークエンスを実施したプラスミド数に対するＡの数が１２個ではないプラスミドの割合をエラー率とし、ＰＣＮＡ添加有り・無しで比較する。この際、シークエンスを実施するプラスミド数は、最低３０クローン、好ましくは５０クローン以上で実施する。
【００２２】
本発明におけるＰＣＲの正確性の向上とは、ミスマッチエラーの観点からは、ＰＣＮＡ添加によりエラー率（核酸増幅のエラー率）が低下することを意味している。このエラーは、鋳型ＤＮＡ配列と核酸増幅後の塩基配列が異なる割合を求めたものである。一方、リピート配列を増幅する際のスリッページエラーの観点からは、ＰＣＲの正確性の向上とは、リピート配列の増幅エラーが低減することを意味している。このエラーは、リピート配列に生じた欠失や挿入のエラー率で表される。
【００２３】
なお、本発明におけるリピート配列とは、同じ塩基の繰り返し、例えば−（Ａ）ｎ−、−（Ｔ）ｎ−、−（Ｇ）ｎ−、−（Ｃ）ｎ−などを指す。また、２塩基の繰り返し、例えば、−（ＴＡ）ｎ−、−（ＣＡ）ｎ−、−（ＧＡ）ｎ−、−（ＧＴ）ｎ−なども含まれる。さらに繰り返しの対象となる塩基数が３塩基以上でもよい。エラーが生じやすいリピート配列については、すでに複数報告されており、リピート数や配列は限定されるものではない（非特許文献１、非特許文献２）。
【００２４】
本発明におけるファミリーＢ（α型）に属するＤＮＡポリメラーゼは、特に限定されない。たとえば、古細菌から単離されるＤＮＡポリメラーゼ（古細菌ＤＮＡポリメラーゼ）が挙げられる。古細菌としては、パイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属およびサーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）属の細菌が例示される。
パイロコッカス属由来のＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＧＢ−Ｄ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  Ｗｏｅｓｅｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉから単離されたＤＮＡポリメラーゼを含むが、これらに限定されない。
サーモコッカス属に由来するＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ（ＫＯＤと略称することもある）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＪＤＦ−３、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．９ｄｅｇｒｅｅｓ  Ｎｏｒｔｈ−７（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．９°Ｎ−７）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＫＳ−１、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｅｌｅｒ、  またはＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｉｃｕｌｉから単離されたＤＮＡポリメラーゼを含むが、これらに限定されない。
【００２５】
これらのＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲ酵素は市販されており、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（アジレント・テクノロジー、プロメガなど）、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ）、Ｐｆｘ  ＤＮＡ  ポリメラーゼ（ライフテクノロジーズ）、Ｕｌｔｉｍａ  ＤＮＡポリメラーゼ（ライフテクノロジーズ）Ｐｗｏ  ＤＮＡポリメラーゼ（ロッシュ・アプライド・サイエンス）、Ｔｇｏ  ＤＮＡポリメラーゼ（ロッシュ・アプライド・サイエンス）、Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（ニュー・イングランド・バイオラボ）、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（ニュー・イングランド・バイオラボ）、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ）、ＭｉｇｈｔｙＡｍｐ  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ）などが挙げられる。本発明において使用する酵素は、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼであればよく、上記のＤＮＡポリメラーゼに特に限定されるものではないが、なかでもＰＣＲ効率の観点から、伸長性や熱安定性に優れたＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼが特に好ましい。
【００２６】
本発明で使用するファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼは、アミノ酸配列に１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠損、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有する変異体であってもよく、特に限定されない。
【００２７】
本発明で使用するファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼは、「減少した塩基類似体検出活性」を有する変異体でもよい。塩基類似体とはアデニンやシトシン、グアニン、チミン以外の塩基を示し、ウラシルやイノシンなどが挙げられる。通常、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼは、塩基類似体であるウラシルやイノシンを検出すると強く結合し、ポリメラーゼ機能を阻害する。塩基類似体検出活性とは、塩基類似体と強く結合し、ポリメラーゼ機能を阻害する活性を示す。減少した塩基類似体検出活性を有するファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ変異体とは、ウラシルやイノシンへの結合能力が低いことを特徴とするファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ変異体である。
【００２８】
このようなファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼの減少した塩基類似体検出活性を有する変異体としては、古細菌ＤＮＡポリメラーゼ変異体が例示できる。
具体的には、アミノ酸１〜４０、およびアミノ酸７８〜１３０によって形成されるウラシルの結合に関するアミノ酸配列（ウラシル結合ポケット）に改変を加え、野生型のＤＮＡポリメラーゼと比較して、ウラシルやイノシンへの結合能力が低いことを特徴とする古細菌ＤＮＡポリメラーゼ変異体である。ウラシルやイノシンへの結合能力が低い古細菌ＤＮＡポリメラーゼ変異体は、ｄＵＴＰの存在下のＰＣＲでもファミリーＢに属する古細菌由来のＤＮＡポリメラーゼの機能低下があまり見られず、ｄＵＴＰによるＤＮＡポリメラーゼの伸長反応への影響が低減されている。
【００２９】
ウラシルの結合に関するアミノ酸配列はパイロコッカス属に由来するＤＮＡポリメラーゼ及びサーモコッカス属に由来するＤＮＡポリメラーゼにおいて高度に保存されている。サーモコッカス・コダカラエンシスに由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号３）においては、アミノ酸１〜４０、およびアミノ酸７８〜１３０によって形成される。パイロコッカス・フリオサス（配列番号４）においては、アミノ酸１〜４０、およびアミノ酸７８〜１３０によって形成される。サーモコッカス・ゴルゴナリウス（配列番号５）においては、アミノ酸１〜４０、およびアミノ酸７８〜１３０によって形成される。サーモコッカス・リトラリス（配列番号６）においては、アミノ酸１〜４０、およびアミノ酸７８〜１３０によって形成される。パイロコッカス・エスピーＧＢ−Ｄ（配列番号７）においては、アミノ酸１〜４０、およびアミノ酸７８〜１３０によって形成される。サーモコッカス・エスピーＪＤＦ−３（配列番号８）のおいては、アミノ酸１〜４０、およびアミノ酸７８〜１３０によって形成される。サーモコッカス・エスピー９°Ｎ−７（配列番号９）においては、アミノ酸１〜４０、およびアミノ酸７８〜１３０によって形成される。サーモコッカス・エスピーＫＳ−１（配列番号１０）においては、アミノ酸１〜４０、およびアミノ酸７８〜１３０によって形成される。サーモコッカス・セラー（配列番号１１）においては、アミノ酸１〜４０、およびアミノ酸７８〜１３０によって形成される。サーモコッカス・シクリ（配列番号１２）においては、アミノ酸１〜４０、およびアミノ酸７８〜１３０によって形成される。
【００３０】
本発明の核酸増幅法に用いるＤＮＡポリメラーゼ変異体として、より好ましいのは、ウラシルとの相互作用に直接関連していると想定されている７、３６、３７、９０〜９７、および１１２〜１１９番目のアミノ酸のうち少なくとも１つに改変を加えた古細菌ＤＮＡポリメラーゼ変異体である。そのような変異体として、例えば、下記の（ａ）で示されるアミノ酸配列を有するものが挙げられる。
（ａ）配列番号３または配列番号４で示されるアミノ酸配列の７、３６、３７、９０〜９７および１１２〜１１９番目に相当するアミノ酸のうち、少なくとも１つのアミノ酸の改変を有するアミノ酸配列。
【００３１】
上記の古細菌ＤＮＡポリメラーゼ変異体は、以下の（ｂ）のアミノ酸配列で示されるものであってもよい。
（ｂ）（ａ）で示されるアミノ酸配列においてさらに少なくとも１つのアミノ酸が改変されており、そのアミノ酸配列が（ａ）で示されるアミノ酸配列と８０％以上同一（好ましくは８５％以上同一であり、さらに好ましくは９０％以上同一であり、さらに好ましくは９５％以上同一であり、さらに好ましくは９８％以上同一であり、さらに好ましくは９９％以上同一である）であり、かつ、減少した塩基類似体検出活性を有するＤＮＡポリメラーゼをコードするアミノ酸配列。
【００３２】
アミノ酸配列の同一性を算出する方法としては、種々の方法が知られている。例えば、市販のまたは電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができる。
本明細書では、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の相同性アルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ）ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／においてデフォルト（初期設定）のパラメーターを用いることにより、アミノ酸配列の同一性を算出する。
【００３３】
上記の古細菌ＤＮＡポリメラーゼ変異体は、以下の（ｃ）のアミノ酸配列で示されるものであってもよい。
（ｃ）（ａ）で示されるアミノ酸配列においてさらに少なくとも１つのアミノ酸が改変されており、そのアミノ酸配列が（ａ）で示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列であり、かつ、減少した塩基類似体検出活性を有するＤＮＡポリメラーゼをコードするアミノ酸配列。
【００３４】
ここで「数個」とは、「減少した塩基類似体検出活性」が維持される限り制限されないが、例えば、全アミノ酸の約２０％未満に相当する数であり、好ましくは約１５％未満に相当する数であり、さらに好ましくは約１０％未満に相当する数であり、より一層好ましくは約５％未満に相当する数であり、最も好ましくは約１％未満に相当する数である。より具体的には、変異されるアミノ酸残基の個数は、例えば、２〜１６０個、好ましくは２〜１２０個、より好ましくは２〜８０個、更に好ましくは２〜４０個であり、更に好ましくは２〜２０個であり、更に好ましくは２〜１０個であり、より更に好ましくは２〜５個である。
【００３５】
なお、本明細書において、「配列番号３または配列番号４に示されるアミノ酸配列における７、３６、３７、９０〜９７、および１１２〜１１９番目に相当するアミノ酸」とは、配列番号３または配列番号４に示されるアミノ酸配列と完全同一ではないアミノ酸配列を有するＤＮＡポリメラーゼにおいて、配列番号３または配列番号４の７、３６、３７、９０〜９７、および１１２〜１１９番目に対応するウラシルの結合に関するアミノ酸配列を含む表現である。
例えば、上記の（ａ）から（ｃ）に示される古細菌ＤＮＡポリメラーゼ変異体において、改変前のアミノ酸配列は、配列番号３または配列番号４に示されるアミノ酸配列と完全同一ではないアミノ酸配列であってもよい。
【００３６】
本願明細書において、配列番号３または配列番号４に示されるアミノ酸配列と完全同一ではないアミノ酸配列における、配列番号３または配列番号４上のある位置（順番）と対応する位置とは、配列の一次構造を比較（アラインメント）したとき、配列番号３または配列番号４の当該位置と対応する位置とする。配列の一次構造を比較する方法としては、種々の方法が知られている。例えば、市販のまたは電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができる。
本明細書では、ＤＮＡ  Ｄａｔａｂａｎｋ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）のＣｌｕｓｔａｌＷ（ｈｔｔｐ：／／ｃｌｕｓｔａｌｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ／ｌａｎｇ＝ｊａ）においてデフォルト（初期設定）のパラメーターを用いることにより、配列の一次構造を比較する。
【００３７】
本発明の核酸増幅法に用いる減少した塩基類似体検出活性を有する古細菌ＤＮＡポリメラーゼ変異体は、より好ましくは、配列番号３または配列番号４におけるアミノ酸Ｙ７、Ｐ３６、またはＶ９３に相当するアミノ酸から選択される少なくとも１つのアミノ酸の改変を有する。
ここで、例えばＹ７とは、７番目のアミノ酸であるチロシン（Ｙ）残基を意味しており、アルファベット１文字は通用されているアミノ酸の略号を表している。好ましい例において、Ｙ７アミノ酸はチロシン（Ｙ）が非極性アミノ酸に置換されており、具体的にはＹ７Ａ、Ｙ７Ｇ、Ｙ７Ｖ、Ｙ７Ｌ、Ｙ７Ｉ、Ｙ７Ｐ、Ｙ７Ｆ、Ｙ７Ｍ、Ｙ７Ｗ、及びＹ７Ｃからなる群より選ばれるアミノ酸置換である。別の好ましい例において、Ｐ３６アミノ酸はプロリン（Ｐ）が正電荷をもつ極性アミノ酸に置換されており、具体的にはＰ３６Ｈ、Ｐ３６Ｋ、またはＰ３６Ｒのアミノ酸置換である。別の好ましい例において、Ｖ９３アミノ酸はバリン（Ｖ）が正電荷をもち極性アミン酸に置換されており、具体的にはＶ９３Ｈ、Ｖ９３Ｋ、またはＶ９３Ｒのアミノ酸置換である。
【００３８】
より好ましくは、改変がＹ７Ａ、Ｐ３６Ｈ、Ｐ３６Ｋ、Ｐ３６Ｒ、Ｖ９３Ｑ、Ｖ９３Ｋ、及びＶ９３Ｒからなる群より選ばれる、少なくとも１つのアミノ酸の改変である。さらに好ましくはＰ３６Ｋ、Ｐ３６ＲまたはＰ３６Ｈである。さらに好ましくはＰ３６Ｈである。
【００３９】
本発明における減少した塩基類似体検出活性を有する古細菌ＤＮＡポリメラーゼ変異体は、配列番号３または配列番号４におけるアミノ酸Ｙ７、Ｐ３６、またはＶ９３に相当するアミノ酸から選択される２つ以上のアミノ酸を改変したものでも良い。具体的には、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３ＱまたはＰ３６Ｈ／Ｖ９３Ｋなどが挙げられ、好ましくは、Ｙ７Ａ／Ｐ３６ＨまたはＹ７Ａ／Ｖ９３Ｋなどがあげられるが、これらに限定されるものではない。
【００４０】
なお、特許文献６または７には、ウラシルと相互作用に直接関連していると想定されている７、３６、３７、９０〜９７、および１１２〜１１９番目のアミノ酸のいずれかに改変を加えた古細菌ＤＮＡポリメラーゼ変異体がいくつか例示されているが、その全ての改変体が本願の課題にかなう良好な特性を有しているわけではなく、中には活性を失っているものも見られる。
【００４１】
上記に例示したＤＮＡポリメラーゼの改変をもとに、本発明の核酸増幅法に用いる改変されたＤＮＡポリメラーゼとして、種々の変異体が考えられる。そのような変異体として、以下の（１）−（４）のいずれかの改変を有する古細菌ＤＮＡポリメラーゼの変異体が例示されるが、これに限定されるわけではない。
（１）（Ａ）Ｈ１４７Ｅと、（Ｂ）Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｑ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ、Ｐ３６Ｈ／Ｖ９３Ｋ、Ｐ３６Ｋ、Ｐ３６Ｒ、Ｐ３６Ｈ、Ｖ９３ＲまたはＶ９３Ｑのいずれか
（２）（Ａ）Ｎ２１０Ｄと、（Ｂ）Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ、Ｐ３６Ｋ、Ｐ３６Ｒ、Ｐ３６Ｈ、Ｖ９３Ｑ、Ｖ９３ＫまたはＶ９３Ｒのいずれか
（３）（Ａ）Ｉ１４２Ｒと、（Ｂ）Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｑ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ、Ｐ３６Ｒ、Ｐ３６Ｈ、Ｖ９３Ｋ、Ｖ９３ＲまたはＶ９３Ｑのいずれか
（４）（Ａ）Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａと、（Ｂ）Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ、Ｐ３６Ｒ、Ｐ３６ＨまたはＶ９３Ｋのいずれか
【００４２】
本発明における塩基類似体検出活性はＰＣＲによって評価できる。塩基類似体は典型的にはウラシルである。例えば、鋳型となるＤＮＡ、緩衝材、マグネシウム、ｄＮＴＰｓ、プライマー、および評価対象のＤＮＡポリメラーゼを含む通常のＰＣＲ反応液に、ｄＵＴＰ溶液を、終濃度０．５μＭ〜２００μＭで添加し、熱サイクルを行う。反応後にエチジウムブロマイド染色アガロース電気泳動でＰＣＲ産物の有無を確認し、許容できたｄＵＴＰ濃度によって、ウラシルの検出活性を評価することが出来る。ウラシル検出活性の高いＤＮＡポリメラーゼは少しのｄＵＴＰの添加で伸長反応が阻害され、ＰＣＲ産物が確認できない。またウラシルの検出活性の低いＤＮＡポリメラーゼは高濃度のｄＵＴＰを添加しても問題なくＰＣＲによる遺伝子増幅が確認できる。
【００４３】
減少した塩基類似体検出活性を有する古細菌ＤＮＡポリメラーゼ変異体とは、酵素至適の反応Ｂｕｆｆｅｒ中で、任意のプライマー、および鋳型となるＤＮＡを用い、至適の熱サイクルを行った結果、変異がない野生型と比較し、高濃度のｄＵＴＰを添加しても伸長反応が阻害されず、ＰＣＲ産物が確認できるＤＮＡポリメラーゼのことをいう。ただし、野生型との比較が困難な場合は、ｄＵＴＰを０．５μＭの濃度で添加してもＰＣＲの増幅ができる古細菌ＤＮＡポリメラーゼ変異体については、当該変異体が野生型と比較して減少した塩基類似体検出活性を有すると推定する。
【００４４】
本発明における塩基類似体検出活性の評価は、以下の方法に従う。
ＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）添付の１０×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ、またはＰｆｕ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（アジレント・テクノロジー）添付の１０×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒを用い、１×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ、および１．５ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ，ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）、約１．３ｋｂを増幅する１５ｐｍｏｌの配列番号１３及び１４に記載のプライマー（対）、１０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ（ロッシュ・アプライド・サイエンス）、１Ｕの各酵素を含む５０μｌの反応液中に、ｄＵＴＰ(ロッシュ・アプライド・サイエンス)を終濃度０．５、５、５０、１００、２００μＭになるように添加した反応液を調製する。９４℃、３０秒の前反応の後、９８℃、１０秒→６５℃、３０秒→６８℃、１分３０秒を３０サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ  ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（アプライドバイオシステムズ）にてＰＣＲを行う。反応終了後、５μｌの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下約１．３ｋｂの増幅ＤＮＡ断片を確認することで塩基類似体検出活性が減少しているかどうかが評価できる。
【００４５】
本発明の核酸増幅法に用いるＤＮＡポリメラーゼを、改変する方法は、既に当該技術分野において確立されている。よって、公知の方法に従い改変を行うことが出来、その態様は特に制限されない。
【００４６】
アミノ酸の改変を導入する方法の一態様として、Ｉｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ法に基づく部位特異的変異導入法を用いることができる。例えば、ＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＴＯＹＯＢＯ）は、（１）目的とする遺伝子を挿入したプラスミドを変性させ、該プラスミドに変異プライマーをアニーリングさせ、続いてＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長反応を行う、（２）（１）のサイクルを１５回繰り返す、（３）制限酵素ＤｐｎＩを用いて鋳型としたプラスミドのみを選択的に切断する、（４）新たに合成された遺伝子をリン酸化、Ｌｉｇａｔｉｏｎを実施し環化させる、（５）環化した遺伝子を大腸菌に形質転換し、目的とする変異の導入されたプラスミドを保有する形質転換体を取得することのできるキットである。
【００４７】
上記改変ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を必要に応じて発現ベクターに移し替え、宿主として例えば大腸菌を、該発現ベクターを用いて形質転換した後、アンピシリン等の薬剤を含む寒天培地に塗布し、コロニーを形成させる。コロニーを栄養培地、例えばＬＢ培地や２×ＹＴ培地に接種し、３７℃で１２〜２０時間培養した後、菌体を破砕して粗酵素液を抽出する。ベクターとしては、限定されるものではないがｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ由来のものが好ましい。菌体を破砕する方法としては公知のいかなる手法を用いても良いが、例えば超音波処理、フレンチプレスやガラスビーズ破砕のような物理的破砕法やリゾチームのような溶菌酵素を用いることができる。この粗酵素液を８０℃、３０分間熱処理し、宿主由来のポリメラーゼを失活させ、ＤＮＡポリメラーゼ活性を測定する。
【００４８】
［ＤＮＡポリメラーゼ活性測定法］
本明細書において、ＤＮＡポリメラーゼ活性は、以下の方法で測定することにより定義される。なお酵素活性が強い場合には、保存緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），５０ｍＭ  ＫＣｌ，１ｍＭ  ジチオスレイトール，０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０，０．１％  Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ４０，５０％  グリセリン）でサンプルを希釈して測定を行う。
（１）下記のＡ液２５μｌ、Ｂ液５μｌ、Ｃ液５μｌ、滅菌水１０μｌ、及び酵素溶液５μｌをマイクロチューブに加えて７５℃にて１０分間反応する。（２）その後氷冷し、Ｅ液５０μｌ、Ｄ液１００μｌを加えて、攪拌後更に１０分間氷冷する。（３）この液をガラスフィルター（ワットマン製ＧＦ／Ｃフィルター）で濾過し、０．１Ｎ  塩酸およびエタノールで十分洗浄する。（４）フィルターの放射活性を液体シンチレーションカウンター（パッカード製）で計測し、鋳型ＤＮＡのヌクレオチドの取り込みを測定する。酵素活性の１単位はこの条件で３０分当りの１０ｎｍｏｌのヌクレオチドを酸不溶性画分（即ち、Ｄ液を添加したときに不溶化する画分）に取り込む酵素量とする。
Ａ：４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）１６ｍＭ  塩化マグネシウム１５ｍＭ  ジチオスレイトール１００μｇ／ｍＬ  ＢＳＡ（牛血清アルブミン）
Ｂ：１．５μｇ／μｌ  活性化仔牛胸腺ＤＮＡ
Ｃ：１．５ｍＭ  ｄＮＴＰ（２５０ｃｐｍ／ｐｍｏｌ  ［３Ｈ］ｄＴＴＰ）
Ｄ：２０％  トリクロロ酢酸（２ｍＭピロリン酸ナトリウム）
Ｅ：１ｍｇ／ｍＬ仔牛胸腺ＤＮＡ
【００４９】
上記方法により選抜された菌株から精製ＤＮＡポリメラーゼを取得する方法は、いかなる手法を用いても良いが、例えば下記のような方法がある。栄養培地に培養して得られた菌体を回収した後、酵素的または物理的破砕法により破砕抽出して粗酵素液を得る。得られた粗酵素抽出液から熱処理、例えば８０℃、３０分間処理し、その後硫安沈殿によりＤＮＡポリメラーゼ画分を回収する。この粗酵素液をセファデックスＧ−２５（アマシャムファルマシア・バイオテク）を用いたゲル濾過等の方法により脱塩を行うことができる。
この操作の後、ヘパリンセファロースカラムクロマトグラフィーにより分離、精製し、精製酵素標品を得ることができる。該精製酵素標品はＳＤＳ−ＰＡＧＥによってほぼ単一バンドを示す程度に純化される。
【００５０】
本発明の核酸増幅法に用いるＰＣＮＡ（本明細書では、Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ａｎｔｉｇｅｎとも言う）は、ＰＣＲ増強因子の一種である。前記ＰＣＮＡとしては、ＰＣＲの熱サイクルに耐えられる耐熱性のものが望ましく、好ましくはＰＣＲ後も活性が残るものが望まれる。さらに好ましくは８０℃で３０分の熱処理を行っても可溶性であり、活性が５０％以上、さらに好ましくは７０％以上、さらに好ましくは９０％以上残っているものが望まれる。
【００５１】
本発明の核酸増幅法に用いるＰＣＮＡとしては、さらに好ましくはパイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、サーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）属、メタノカルドコックス（Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ）属の細菌から単離されたＰＣＮＡが挙げられる。パイロコッカス属由来のＰＣＮＡとしては、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ（配列番号２）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＧＢ−Ｄ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｗｏｅｓｅｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉから単離されたＰＣＮＡを含むが、これらに限定されない。サーモコッカス属に由来するＰＣＮＡとしては、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ（配列番号１）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＪＤＦ−３、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．９ｄｅｇｒｅｅｓ  Ｎｏｒｔｈ−７（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．９°Ｎ−７）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＫＳ−１、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｅｌｅｒ、またはＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｉｃｕｌｉから単離されたＰＣＮＡを含むが、これらに限定されない。さらにメタノカルドコックス属由来のＰＣＮＡとしては、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ＿ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ（配列番号２１）から単離されたＰＣＮＡを含むが、これに限定されない。
【００５２】
また、本発明の核酸増幅法に用いるＰＣＮＡは発現量を増やすため、配列番号１または配列番号２の７３番目に相当するメチオニンを改変したものでもよい。より好ましくはＭ７３Ｌに改変したものがあげられるが、これに限定されない。
【００５３】
さらに、本発明の核酸増幅法に用いるＰＣＮＡは単独でＤＮＡにロードする変異体であってもよい。ＰＣＮＡは通常、多量体を形成し輪のような構造をとる。ＤＮＡにロードするとは、ＰＣＮＡ多量体の輪の構造内部にＤＮＡを通すことを示し、通常はＲＦＣと呼ばれる因子と共同して初めてＰＣＮＡはＤＮＡにロードすることができる。単独でＤＮＡにロードする変異体とは、ＰＣＮＡの多量体形成に関わる部位を改変し、多量体形成を不安定化することで、ＲＦＣなしでもＤＮＡをＰＣＮＡ多量体内部に通しやすくした変異体を示す。
【００５４】
ＰＣＮＡが多量体形成に関する部位は、サーモコッカス・コダカラエンシスに由来するＰＣＮＡ（配列番号１）、パイロコッカス・フリオサスのＰＣＮＡ（配列番号２）においては、８２、８４、１０９番目のアミノ酸からなるＮ末端領域と１３９、１４３、１４７番目のアミノ酸からなるＣ末端領域があげられる。Ｎ末端領域はプラスに帯電し、Ｃ末端領域はマイナスに帯電し、相互作用することで多量体形成を行う。
【００５５】
なお、本明細書において、「（ａ）８２、８４、１０９番目に相当するアミノ酸からなるＮ末端領域、および（ｂ）１３９、１４３、１４７番目に相当するアミノ酸からなるＣ末端領域」とは、配列番号１または２を基準とした場合の位置（順番）である。そのため、本明細書において、「配列番号１または配列番号２に示されるアミノ酸配列における８２、８４、１０９、１３９、１４３、１４７番目に相当するアミノ酸」とは、配列番号１または配列番号２に示されるアミノ酸配列と完全同一ではないアミノ酸配列を有するＰＣＮＡにおいて、配列番号１または配列番号２の８２、８４、１０９、１３９、１４３、１４７番目に対応する多量体形成に関するアミノ酸配列を含む表現である。
例えば、下記のＰＣＮＡ変異体において、改変前のアミノ酸配列は、配列番号１または配列番号２に示されるアミノ酸配列と完全同一ではないアミノ酸配列であってもよい。
【００５６】
本願明細書において、配列番号１または配列番号２に示されるアミノ酸配列と完全同一ではないアミノ酸配列における、配列番号１または配列番号２上のある位置（順番）と対応する位置とは、配列の一次構造を比較（アラインメント）したとき、配列番号１または配列番号２の当該位置と対応する位置とする。
本明細書では、ＤＮＡ  Ｄａｔａｂａｎｋ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）のＣｌｕｓｔａｌＷ（ｈｔｔｐ：／／ｃｌｕｓｔａｌｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ／ｌａｎｇ＝ｊａ）においてデフォルト（初期設定）のパラメーターを用いることにより、配列の一次構造を比較する。
【００５７】
上記例として、配列番号２１に記載のＭｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ＿ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ（以下、Ｍｊａ）由来のＰＣＮＡが挙げられる。Ｍｊａ由来のＰＣＮＡでは、配列番号１または２に示されるアミノ酸配列における８２、８４、１０９、１３９、１４３、１４７番目に対応する位置は、それぞれ８１、８３、１０８、１３８、１４２、１４６番目となる。
【００５８】
単独でＤＮＡにロードするＰＣＮＡ変異体は、より好ましくは、ＰＣＮＡの多量体形成に関わる
（ａ）８２、８４、１０９番目に相当するアミノ酸からなるＮ末端領域、または
（ｂ）１３９、１４３、１４７番目に相当するアミノ酸からなるＣ末端領域に少なくともひとつの改変を有し、ＲＦＣがなくともＤＮＡにロードし、ＤＮＡポリメラーゼの伸長反応を促進する変異体があげられる。
【００５９】
たとえば、配列番号１または配列番号２の１４３番目に相当するアミノ酸を塩基性アミノ酸あるいは中性アミノ酸に改変したもの、８２番目と１４３番目を共に中性アミノ酸に改変したもの、１４７番目を中性アミノ酸に改変したもの、または、１０９番目と１４３番目を共に中性アミノ酸に改変したものなどが挙げられる。
本明細書において、置換する塩基性アミノ酸、中性アミノ酸の種類は特に限定されない。塩基性アミノ酸としては、天然のものであれば、アルギニン、ヒスチジン、リシン、中性アミノ酸としては、天然のものであれば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、プロリン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミンが挙げられる。
【００６０】
より好ましくは、ＷＯ２００７／００４６５４に記載のＰＣＮＡ変異体が例示されるほか、第１４７番目のアミノ酸残基をアラニンに換えた配列（Ｄ１４７Ａ）、第８２番目、および第１４３番目のアミノ酸残基をアラニンに変えた配列（Ｒ８２Ａ／Ｄ１４３Ａ、もしくはＲ８２Ａ／Ｅ１４３Ａ）、第１０９番目、および第１４３番目のアミノ酸残基をアラニンに変えた配列（Ｒ１０９Ａ／Ｄ１４３Ａ、もしくはＲ１０９Ａ／Ｅ１４３Ａ）、第１４３番目のアミノ酸残基をアルギニンあるいはリシンに変えた配列（Ｄ１４３Ｒ、Ｄ１４３Ｋ、Ｅ１４３Ｒ、Ｅ１４３Ｋ）などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００６１】
本発明の核酸増幅法に用いるＰＣＮＡを、改変する方法は、既に当該技術分野において確立されている。よって、公知の方法に従い改変を行うことが出来、その態様は特に制限されない。
【００６２】
ＰＣＮＡ変異体が単独でＤＮＡにロードできるかどうかは、ＰＣＲによって評価できる。例えば、鋳型となるＤＮＡ、緩衝材、マグネシウム、ｄＮＴＰｓ、プライマー、およびファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼを含む通常のＰＣＲ反応液に、ＰＣＮＡ変異体を添加し、ＰＣＮＡ添加なしのもの、また野生型ＰＣＮＡ添加のものと増幅量を比較することで、単独でＤＮＡにロードできるかを確認することができる。野生型のＰＣＮＡをはじめ、単独でＤＮＡにロードできないＰＣＮＡは添加しても、ＰＣＲの増幅量は変化せず、むしろ増幅量を減らす傾向がある。一方、単独でＤＮＡにロードできる変異体は、ＰＣＮＡ添加なしのもの、また野生型ＰＣＮＡ添加のものと比べて優れた増幅量を得ることができる。
【００６３】
本発明において「ＰＣＮＡ変異体が単独でＤＮＡにロードできるかどうか」の評価（増幅増強活性の評価）は、以下の方法に従う。ＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）添付の１０×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒを用い、１×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ、および１．５ｍＭ  ＭｇＳＯ４、ｄＴＴＰの代わりにｄＵＴＰ（ロッシュ・アプライド・サイエンス）を含んだ０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ，ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）、約１．３ｋｂを増幅する１５ｐｍｏｌの配列番号１３及び１４に記載のプライマー、１０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ（ロッシュ・アプライド・サイエンス）、１Ｕ  ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼＶ９３Ｋ変異体を含む５０μｌの反応液中に、評価するＰＣＮＡを２５０ｎｇ添加し、９４℃、３０秒の前反応の後、９８℃、１０秒→６５℃、３０秒→６８℃、１分３０秒を３５サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲを行う。反応終了後、５μｌの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下約１．３ｋｂの増幅ＤＮＡ断片を野生型ＰＣＮＡを添加したもの、あるいはＰＣＮＡを添加していないものと比較することで単独でＤＮＡにロードできるＰＣＮＡかどうかを評価することができる。単独でＤＮＡにロードできるＰＣＮＡは添加によって増幅量が増加する。
【００６４】
本発明の核酸増幅法は、標的核酸を増幅する方法であって、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼとＰＣＮＡを反応液中に含んでいることを除いて、特に限定されない。
【００６５】
ＤＮＡポリメラーゼで増幅可能な方法としては、典型的にはＰＣＲが挙げられるが、本発明はＰＣＲのみならず、ＤＮＡを鋳型とし、１種のプライマー、ｄＮＴＰ（デオキシリボヌクレオチド３リン酸）を反応させることによりプライマーを伸長して、ＤＮＡプライマー伸長物を合成する方法にも使用される。具体的には、プライマーエクステンション法、シークエンス法、従来の温度サイクルを行わない方法およびサイクルシーケンス法を含む。
【００６６】
本発明の方法において、ＰＣＲの場合の代表的な条件を以下に示すが、これに限定されるものではない。
増幅対象ＤＮＡに、
（ａ）ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ
（ｂ）一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に互いに相補的である一対のプライマー
（ｃ）ＤＮＡ合成基質（デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ））
（ｄ）マグネシウムイオン、及び／またはアンモニウムイオン及び／または、カリウムイオンを含むバッファー溶液、および、
（ｅ）ＰＣＮＡ
を、混合し、サーマルサイクラー等を用いて反応液の温度を上下させることにより、（１）ＤＮＡ変性、（２）プライマーのアニーリング、（３）プライマーの伸長の熱サイクルを繰り返し、特定のＤＮＡ断片を増幅させる。
上記ＰＣＲ法においては、必要に応じて、さらに、ＰＣＲ増強因子、ＢＳＡ、非イオン界面活性剤などを用いてもよい。また、ＤＮＡポリメラーゼに、減少した塩基類似体検出活性を有するような改変を施した変異体を用いる場合は、ｄＵＴＰなどの塩基類似体をＤＮＡ合成基質として用いることが可能である。
【００６７】
上記ＰＣＲ法においては、必要に応じて、さらに、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼ活性及び／または３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を抑制する活性を有する抗体を用いても良い。前記抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体などが挙げられる。本反応組成は、ＰＣＲの感度上昇、非特異増幅の軽減に特に有効である。
【００６８】
上記の本発明の核酸増幅法を実行するための試薬または前記試薬を含むキットは、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ、および、ＰＣＮＡを反応液中に含み、それ以外の構成は特に限定されない。また、適用する核酸増幅法も特に限定されない。
【００６９】
核酸増幅法としてＰＣＲを行う場合、本発明の試薬または前記試薬を含むキットとして、以下の（ａ）〜（ｅ）を含む構成が例示できるが、これに限定されない。
（ａ）ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ
（ｂ）一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に互いに相補的である一対のプライマー
（ｃ）ＤＮＡ合成基質（デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ））
（ｄ）マグネシウムイオン、及び／またはアンモニウムイオン、及び／またはカリウムイオンを含むバッファー溶液、および、
（ｅ）ＰＣＮＡ
【００７０】
前記試薬、キットは、必要に応じてさらに、その他の試薬類、たとえばＢＳＡ、非イオン界面活性剤などを用いてもよい。
【実施例】
【００７１】
以下、実施例に基づき本発明をより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００７２】
実施例１：ＫＯＤ−ＰＣＮＡ変異体の作製
サーモコッカス・コダカラエンシス  ＫＯＤ１株由来の改変型耐熱性ＰＣＮＡ遺伝子を含有するプラスミドを作製した。変異導入に使用されるＤＮＡ鋳型は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローニングされたサーモコッカス・コダカラエンシス  ＫＯＤ１株由来のＰＣＮＡ（配列番号１５）（ｐＫＯＤ  ＰＣＮＡ）を用いた。変異導入にはＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて、方法は取扱説明書に準じて行った。なお、変異体の確認は塩基配列の解読で行った。得られたプラスミドによりエシェリシア・コリＤＨ５αを形質転換し、酵素調製に用いた。
【００７３】
実施例２：Ｐｆｕ−ＰＣＮＡ変異体の作製
パイロコッカス・フリオサス由来の改変型耐熱性ＰＣＮＡ遺伝子を含有するプラスミドを作製した。変異導入に使用されるＤＮＡ鋳型は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローニングされたパイロコッカス・フリオサス株由来のＰＣＮＡ（配列番号１６）（ｐＰｆｕ  ＰＣＮＡ）を用いた。変異導入にはＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて、方法は取扱説明書に準じて行った。なお、変異体の確認は塩基配列の解読で行った。得られたプラスミドによりエシェリシア・コリＤＨ５αを形質転換し、酵素調製に用いた。
【００７４】
実施例１および実施例２で作製したプラスミドを表１に示す。
【００７５】
【表１】
2020010702.tif 000002
【００７６】
実施例３：ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ変異体の作製
後述の実施例におけるＰＣＮＡの評価に用いるために、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼの種々の変異体を以下の方法で作製した。
サーモコッカス・コダカラエンシス  ＫＯＤ１株由来の改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含有するプラスミドを作製した。変異導入に使用されるＤＮＡ鋳型は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローニングされたサーモコッカス・コダカラエンシス  ＫＯＤ１株由来の改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子（配列番号１７）（ｐＫＯＤ）を用いた。変異導入にはＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて、方法は取扱説明書に準じて行った。なお、変異体の確認は塩基配列の解読で行った。得られたプラスミドによりエシェリシア・コリＪＭ１０９を形質転換し、酵素調製に用いた。作製したプラスミドは表２に示す。
【００７７】
【表２】
2020010702.tif 000003
【００７８】
実施例４：ＫＯＤ−ＰＣＮＡ、Ｐｆｕ−ＰＣＮＡの作製
実施例１または２で得られた菌体の培養は以下のようにして実施した。まず、滅菌処理した１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＴＢ培地（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ、ｐ．Ａ．２）８０ｍＬを５００ｍＬ坂口フラスコに分注した。この培地に予め１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する３ｍＬのＬＢ培地（１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム；ギブコ）で３７℃、１６時間培養したエシェリシア・コリＤＨ５α（プラスミド形質転換株）（試験管使用）を接種し、３７℃にて１６時間通気培養した。培養液より菌体を遠心分離により回収し、５０ｍＬの破砕緩衝液（３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、３０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に懸濁後、ソニケーション処理により菌体を破砕し、細胞破砕液を得た。次に細胞破砕液を８０℃にて１５分間処理した後、遠心分離にて不溶性画分を除去した。更に、ポリエチレンイミンを用いた除核酸処理、硫安塩析、Ｑセファロースクロマトグラフィーを行い、最後に保存緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ  塩化カリウム、１ｍＭ  ジチオスレイトール、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０、０．１％ノニデットＰ４０、５０％グリセリン）に置換し、改変型耐熱性ＰＣＮＡを得た。
【００７９】
実施例５：改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの作製
実施例３で得られた菌体の培養は以下のようにして実施した。まず、滅菌処理した１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＴＢ培地（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ、ｐ．Ａ．２）８０ｍＬを５００ｍＬ坂口フラスコに分注した。この培地に予め１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する３ｍＬのＬＢ培地（１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム；ギブコ）で３７℃、１６時間培養したエシェリシア・コリＪＭ１０９（プラスミド形質転換株）（試験管使用）を接種し、３７℃にて１６時間通気培養した。培養液より菌体を遠心分離により回収し、５０ｍＬの破砕緩衝液（３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、３０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に懸濁後、ソニケーション処理により菌体を破砕し、細胞破砕液を得た。次に細胞破砕液を８０℃にて１５分間処理した後、遠心分離にて不溶性画分を除去した。更に、ポリエチレンイミンを用いた除核酸処理、硫安塩析、ヘパリンセファロースクロマトグラフィーを行い、最後に保存緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ  塩化カリウム、１ｍＭ  ジチオスレイトール、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０、０．１％ノニデットＰ４０、５０％グリセリン）に置換し、改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを得た。これら精製工程のＤＮＡポリメラーゼ活性測定は、上述のＤＮＡポリメラーゼ活性測定法にしたがって測定した。
【００８０】
実施例６：ＰＣＮＡの評価
ＰＣＮＡが単独でＤＮＡにロードできるかを確認するため、ＫＯＤ−ＰＣＮＡ変異体（Ｍ７３Ｌ、Ｍ７３Ｌ／Ｅ１４３Ｒ、Ｍ７３Ｌ／Ｒ１０９Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｒ８２Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｅ１４３Ｆ、Ｍ７３Ｌ／Ｅ１４３Ａ）を用いてｄＵＴＰ存在下ＰＣＲでの増幅量の違いを、増幅増強活性の測定方法に従い、Ｈｕｍａｎ  β−グロビンの１．３ｋｂを増幅することで比較した。この際、ＤＮＡポリメラーゼには、実施例３および５で作製したＫＯＤ  Ｖ９３Ｋ変異体を用いた。なお、上述のとおり、Ｍ７３Ｌ変異を野生型に相当するものとみなす。
ＰＣＲにはＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）添付のＢｕｆｆｅｒ、ＭｇＳＯ４を用い、１×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ、および０．２ｍＭ  ｄＴＴＰをｄＵＴＰに置換したｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ，ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）、１．５ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１５ｐｍｏｌのプライマー（対）（配列番号１３及び１４）、１０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ（ロッシュ・アプライド・サイエンス）、抗体と混合した１Ｕの酵素を含む５０μｌの反応液を調製し、９４℃、２分の前反応の後、９８℃、１０秒→６０℃、３０秒→６８℃、１分を３５サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ  ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（アプライドバイオシステムズ）を用いてＰＣＲを行った。反応終了後、５μｌの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下増幅ＤＮＡ断片の増幅量を確認した。
【００８１】
図１は、種々のＰＣＮＡ変異体を２５０ｎｇ添加しＰＣＲ反応を行い、得られた産物を電気泳動した結果を示す。用いたＰＣＮＡ変異体はＭ７３Ｌ、Ｍ７３Ｌ／Ｅ１４３Ｒ、Ｍ７３Ｌ／Ｒ１０９Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｒ８２Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｅ１４３Ｆ、Ｍ７３Ｌ／Ｅ１４３Ａの計７種である。
今回用いたＫＯＤ Ｖ９３Ｋ変異体はｄＵＴＰの阻害を受けて増幅量が少ない。ＰＣＮＡ添加なしやＭ７３Ｌ変異体ではほとんどバンドが確認されなかったが、他のＫＯＤ−ＰＣＮＡ変異体の添加でしっかりとしたバンドが確認された。ＰＣＮＡは多量体を形成し核酸の合成反応を促進するが、通常、ＲＦＣの働きなしではＤＮＡにロードできず反応が進まない。Ｍ７３Ｌ／Ｅ１４３Ｒ、Ｍ７３Ｌ／Ｒ１０９Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｒ８２Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｅ１４３Ｆ、Ｍ７３Ｌ／Ｅ１４３Ａの改変は、多量体形成に関わる部位への改変であり、適度に多量体形成が弱まったため、ＰＣＮＡが単独でＤＮＡにロードでき、ＰＣＲ増幅量を向上させたことが考えられる。
【００８２】
Ｐｆｕ−ＰＣＮＡ変異体（Ｍ７３Ｌ、Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４３Ｒ、Ｍ７３Ｌ／Ｒ１０９Ａ／Ｄ１４３Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｒ８２Ａ／Ｄ１４３Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４３Ａ）でも同様の実験を行い、Ｐｆｕ−ＰＣＮＡ  Ｍ７３Ｌ変異体では、ほとんどバンドが確認できなかったが、他のＰｆｕ−ＰＣＮＡ変異体（Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４３Ｒ、Ｍ７３Ｌ／Ｒ１０９Ａ／Ｄ１４３Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｒ８２Ａ／Ｄ１４３Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４３Ａ）の添加でしっかりとしたバンドが確認された。
【００８３】
実施例７：ＰＣＮＡが与えるファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼの正確性評価
ＰＣＮＡが、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼの正確性に影響を及ぼすか検証した。ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼとして、ＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  ＤＮＡポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ）、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ）を使用した。また、ＰＣＮＡは単独でＤＮＡにロードする変異体の例として、ＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  ＤＮＡポリメラーゼに対しては、ＫＯＤ−ＰＣＮＡ変異体（Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａ）、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＤＮＡポリメラーゼに対しては、Ｐｆｕ−ＰＣＮＡ変異体（Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４３Ｒ）を使用した。
【００８４】
ＫＯＤ−ＰＣＮＡがＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  ＤＮＡポリメラーゼに与える正確性への影響評価は以下の方法にて行った。
（１）ミスマッチエラーの頻度
まず、ＰＣＲにはＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）添付のＢｕｆｆｅｒ、ＭｇＳＯ４、ｄＮＴＰｓを用い、１×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ、および０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ，ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）、１．５ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１５ｐｍｏｌのプライマー（配列番号１８及び１９）、５０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ（ロッシュ・アプライド・サイエンス）、１Ｕ  ＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−、１００ｎｇ  ＫＯＤ−ＰＣＮＡ変異体（Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａ）と混合し、５０μｌの反応液を調製した。
この反応液を９４℃、２分の前反応の後、９４℃、１５秒→６０℃、３０秒→６８℃、２．５分を２１サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ  ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（アプライドバイオシステムズ）を用いてＰＣＲを行った。本ＰＣＲ産物は、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼを使用しているため３’末端が平滑化されている。そのため、ＰＣＲ産物の平滑末端へのアデニン付加後、ＴＡクローニングを実施した。具体的には、アデニン付加、ＴＡクローニングには、ＴＡｒｇｅｔ  Ｃｌｏｎｅ  −Ｐｌｕｓ−（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて、方法は取扱説明書に準じて行った。得られたプラスミドによりエシェリシア・コリＤＨ５αを形質転換し、アンピシリンを含むＬＢ寒天培地に播種後、３７度で一晩培養した。得られたコロニーを複数ピックアップし、アンピシリンを含むＬＢ培地にて培養し、プラスミドを抽出後、シークエンスを実施した。シークエンス反応は、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ）を用い、製品の取扱説明書に準じてシークエンス反応を行った。解析には、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３７３０ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステムズ）を使用し、配列番号２０のプライマーをシークエンスプライマーとして用いて解析を実施した。
ＫＯＤ−ＰＣＮＡがＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  ＤＮＡポリメラーゼに与える正確性への影響評価は、ＰＣＮＡ添加有り、無しのエラー率を比較することにより実施した。エラー率は、解析が完了した塩基数に対する間違えて取り込まれた塩基数（エラー塩基数）の割合を算出することで求めた。
【００８５】
（２）リピート配列を増幅する際のスリッページエラーの頻度
前記（１）の方法に従って、ＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物のＴＡクローニングを実施した後、得られたプラスミドによりエシェリシア・コリＤＨ５αを形質転換し、アンピシリンを含むＬＢ寒天培地に播種後、３７度で一晩培養した。得られたコロニーを複数ピックアップし、アンピシリンを含むＬＢ培地にて培養し、プラスミドを抽出、（Ａ）１２のリピート配列を含む領域のシークエンスを実施した。シークエンス反応は、配列番号２０のプライマーをシークエンスプライマーとして用いて、前記（１）と同様に実施した。ＫＯＤ−ＰＣＮＡがＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  ＤＮＡポリメラーゼに与える正確性への影響評価は、シークエンス結果より、（Ａ）１２のリピート配列に対して、挿入や欠損に関するエラーの割合を求めることで実施した。
上記解析は、ＰＣＲをＮ＝２で実施し、その後、独立してシークエンス解析まで実施した。
【００８６】
Ｐｆｕ−ＰＣＮＡが  ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＤＮＡポリメラーゼに与える正確性への影響評価は以下の方法にて行った。
（１）ミスマッチエラーの頻度
まず、ＰＣＲにはＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ）添付のＢｕｆｆｅｒである５×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｍｇ２＋  ｐｌｕｓ）、ｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅを用い、１×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｍｇ含有）、および０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）、１５ｐｍｏｌのプライマー対（配列番号１８及び１９）、５０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ（ロッシュ・アプライド・サイエンス）、１，２５Ｕ  ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、１００ｎｇ  Ｐｆｕ−ＰＣＮＡ変異体（Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４３Ｒ）と混合し、５０μｌの反応液を調製した。
この反応液を、９８℃、１０秒→５５℃、５秒→７２℃、２．５分を２３サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ  ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（アプライドバイオシステムズ）を用いてＰＣＲを行った。本ＰＣＲ産物は、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼを使用しているため３’末端が平滑化されている。そのため、ＰＣＲ産物の平滑末端へのアデニン付加後、ＴＡクローニングを実施した。具体的には、アデニン付加、ＴＡクローニングには、ＴＡｒｇｅｔ  Ｃｌｏｎｅ  −Ｐｌｕｓ−（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて、方法は取扱説明書に準じて行った。
得られたプラスミドによりエシェリシア・コリＤＨ５αを形質転換し、アンピシリンを含むＬＢ寒天培地に播種後、３７度で一晩培養した。得られたコロニーを複数ピックアップし、アンピシリンを含むＬＢ培地にて培養し、プラスミドを抽出後、シークエンスを実施した。シークエンス反応は、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ）を用い、製品の取扱説明書に準じてシークエンス反応を行った。解析には、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３７３０ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステムズ）を使用し、配列番号２０のプライマーをシークエンスプライマーとして用い、解析を実施した。
Ｐｆｕ−ＰＣＮＡがＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＤＮＡポリメラーゼに与える正確性への影響評価は、ＰＣＮＡ添加有り、無しのエラー率を比較することにより実施した。
【００８７】
（２）リピート配列を増幅する際のスリッページエラーの頻度
前記（１）の方法に従って、ＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物のＴＡクローニングを実施した後、得られたプラスミドによりエシェリシア・コリＤＨ５αを形質転換し、アンピシリンを含むＬＢ寒天培地に播種後、３７度で一晩培養した。得られたコロニーを複数ピックアップし、アンピシリンを含むＬＢ培地にて培養し、プラスミドを抽出、（Ａ）１２のリピート配列を含む領域のシークエンスを実施した。シークエンス反応は、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ）を用い、製品の取扱説明書に準じてシークエンス反応を行った。解析には、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３７３０ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステムズ）を使用し、リピート配列を含む領域の解析を実施するために、配列番号２０のプライマーをシークエンスプライマーとして用いた。
Ｐｆｕ−ＰＣＮＡがＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＤＮＡポリメラーゼに与える正確性への影響評価は、シークエンス結果より、（Ａ）１２のリピート配列に対して、挿入や欠損に関するエラーの割合を求めることで実施した。
【００８８】
（１）ミスマッチエラーの頻度
ＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  ＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＮＡ添加なしで増幅した場合のエラー率とＰＣＮＡ添加ありで増幅した場合のエラー率を求めた結果を表３に記す。ＰＣＮＡ添加なしでは、エラー塩基数が、３３４５０塩基あたり３個であるのに対し、ＰＣＮＡを添加することで、３３５９８塩基あたり０個に減少することが示された。エラー割合としては、８．９７×１０−５から０に減少しており、ＰＣＮＡ添加により正確性が向上することが示された。
【００８９】
【表３】
2020010702.tif 000004
【００９０】
ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＮＡ添加なしで増幅した場合のエラー率とＰＣＮＡ添加ありで増幅した場合のエラー率を求めた結果を表４に記す。ＰＣＮＡ添加なしでは、エラー塩基数が３１９８６塩基あたり２個であるのに対し、ＰＣＮＡを添加することで、３２３２３塩基あたり０塩基に減少することが示された。エラー割合としては、６．２５×１０−５から０に減少しており、ＰＣＮＡ添加により正確性が向上することが示された。
【００９１】
【表４】
2020010702.tif 000005
【００９２】
これらの結果より、ファミーＢに属するＤＮＡポリメラーゼにＰＣＮＡを添加することで、正確性が向上することが示された。正確性が向上することは有意義なことであり、クローニングやシークエンスにおいて利用が期待される。
【００９３】
（２）リピート配列を増幅する際のスリッページエラーの頻度
ＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  ＤＮＡポリメラーゼをＰＣＮＡ添加なしで増幅した場合のリピート配列部分の塩基数とＰＣＮＡ添加ありで増幅した場合のリピート配列部分の塩基数をカウントした結果を図２に記す。ＰＣＮＡ添加なしでは、エラーのないクローン数が６０％以下であるのに対し、ＰＣＮＡを添加することで、１０％もエラー率が低減し、７０％程度まで正確性が向上することが示された。
【００９４】
ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＤＮＡポリメラーゼをＰＣＮＡ添加なしで増幅した場合のリピート配列部分の塩基数とＰＣＮＡ添加ありで増幅した場合のリピート配列部分の塩基数をカウントした結果を図３に記す。ＰＣＮＡ添加なしでは、エラーのないクローン数が５３．５％であるのに対し、ＰＣＮＡを添加することで、２０％もエラー率が低減し、７５％程度まで正確性が向上することが示された。
【００９５】
これらの結果より、ファミーＢに属するＤＮＡポリメラーゼにＰＣＮＡを添加することで、正確性が１０％以上も向上することが示された。１０％向上することは有意義な差異であり、クローニングやシークエンスにおいて利用が期待される。
【００９６】
実施例８：ＫＯＤ−ＰＣＮＡが与える減少した塩基類似体検出活性を持つファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼの正確性評価
ＫＯＤ−ＰＣＮＡが、減少した塩基類似体検出活性を持つファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼの正確性に影響を及ぼすか検証した。減少した塩基類似体検出活性を持つファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼの例として、実施例３および５で作製したＫＯＤ  Ｈ１４７Ｅ／Ｐ３６Ｈ／Ｙ７Ａ変異体、ＫＯＤ  Ｈ１４７Ｅ／Ｖ９３Ｋ／Ｙ７Ａ変異体を使用し、またＰＣＮＡは、ＫＯＤ−ＰＣＮＡ変異体（Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａ）を使用した。
【００９７】
ＫＯＤ−ＰＣＮＡが  減少した塩基類似体検出活性を持つファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼに与える正確性への影響評価は、前述のＫＯＤ  ＤＮＡ  ポリメラーゼの評価と同様な方法にて行った。
【００９８】
（１）ミスマッチエラーの頻度
減少した塩基類似体検出活性を持つファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＮＡ添加なしで増幅した場合のエラー率とＫＯＤ−ＰＣＮＡ添加ありで増幅した場合のエラー率を求めた結果を表５に記す。ＫＯＤ−ＰＣＮＡ添加なしでは、エラー塩基数が、２８７８７塩基あたり５個であるのに対し、ＫＯＤ−ＰＣＮＡを添加することで、２８７８７塩基あたり２個に減少することが示された。エラー割合としては、１．７４×１０−４から５．９７×１０−５に減少しており、ＰＣＮＡ添加により正確性が向上することが示された。この結果より、ＰＣＮＡは、減少した塩基類似体検出活性を持つファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼに対しても効果があり、正確性が必要なＰＣＲにおいて利用が期待される。
【００９９】
【表５】
2020010702.tif 000006
【０１００】
（２）リピート配列を増幅する際のスリッページエラーの頻度
（Ａ）１２のリピート配列に対して、挿入や欠損に関するエラーの割合を図４に示す。２種類の減少した塩基類似体検出活性を持つファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼに対して評価を実施した結果、ＰＣＮＡ添加なしでは、エラーのないクローン数が６０％程度であるのに対し、ＰＣＮＡ添加によりエラー率が、１０〜２０％低減することが示された。この結果より、ＰＣＮＡは、減少した塩基類似体検出活性を持つファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼに対しても効果があり、正確性が必要なＰＣＲにおいて利用が期待される。
【０１０１】
実施例９：Ｍｊａ−ＰＣＮＡ変異体の作製
Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ＿ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ株由来の改変型耐熱性ＰＣＮＡ遺伝子を含有するプラスミドを作製した。変異導入に使用されるＤＮＡ鋳型は、ｐＥＴ２３ｂにクローニングされたＭｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ＿ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ株由来のＰＣＮＡ（配列番号２２）（ｐＭｊａ  ＰＣＮＡ）を用いた。変異導入にはＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて、方法は取扱い説明書に準じて行った。なお、変異体の確認は塩基配列の解読で行った。得られたプラスミドによりエシェリシア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳを形質転換し、酵素調製に用いた。作製したプラスミドは表６に示す。
【０１０２】
【表６】
2020010702.tif 000007
【０１０３】
Ｍｊａ−ＰＣＮＡの変異導入部位は、１４２番目であるが、この位置は、配列番号１および２におけるアミノ酸配列の１４３番目に相当する位置である。
【０１０４】
実施例１０：Ｍｊａ−ＰＣＮＡの作製
実施例９で得られた菌体の培養は以下のようにして実施した。まず、滅菌処理した１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＬＢ培地（１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム；ギブコ製）８０ｍＬを５００ｍＬ坂口フラスコに分注した。この培地に予め１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する３ｍＬのＬＢ培地で３７℃、１６時間培養したエシェリシア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（プラスミド形質転換株）（試験管使用）を接種し、３７℃にてＯＤ６００が０．３〜０．６になるまで通気培養した。その後、ＩＰＴＧを終濃度０．５ｍＭになるように添加し、４時間通気培養した。培養液より菌体を遠心分離により回収し、５０ｍＬの破砕緩衝液（３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、３０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に懸濁後、ソニケーション処理により菌体を破砕し、細胞破砕液を得た。次に細胞破砕液を８０℃にて１５分間処理した後、遠心分離にて不溶性画分を除去した。更に、ポリエチレンイミンを用いた除核酸処理、硫安塩析、Ｑセファロースクロマトグラフィーを行い、最後に保存緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ  塩化カリウム、１ｍＭ  ジチオスレイトール、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０、０．１％ノニデットＰ４０、５０％グリセリン）に置換し、Ｍｊａ−ＰＣＮＡ変異体を得た。
【０１０５】
実施例１１：Ｍｊａ−ＰＣＮＡが与える減少した塩基類似体検出活性を持つファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼの正確性評価
Ｍｊａ−ＰＣＮＡが、減少した塩基類似体検出活性を持つファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼの正確性に影響を及ぼすか検証した。減少した塩基類似体検出活性を持つファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼの例として、実施例３および５で作製したＫＯＤ  Ｈ１４７Ｅ／Ｖ９３Ｋ／Ｙ７Ａ変異体を使用し、またＰＣＮＡは、実施例９および１０で作製したＭｊａ−ＰＣＮＡ変異体（Ｅ１４２Ｒ）を使用した。
【０１０６】
Ｍｊａ−ＰＣＮＡが減少した塩基類似体検出活性を持つファミリーＢに属するポリメラーゼに与える正確性への影響評価は以下の方法にて行った。
（１）ミスマッチエラーの頻度
まず、ＰＣＲにはＫＯＤ  ＦＸ（ＴＯＹＯＢＯ）添付のＢｕｆｆｅｒ、ｄＮＴＰｓを用い、１×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ、および０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ，ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）、１５ｐｍｏｌのプライマー（配列番号１８及び１９）、５０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ（ロッシュ・アプライド・サイエンス）、１.５Ｕ  ＫＯＤ  Ｈ１４７Ｅ／Ｖ９３Ｋ／Ｙ７Ａ変異体、１０００ｎｇ  Ｍｊａ−ＰＣＮＡ変異体（Ｅ１４２Ｒ）と混合し、５０μｌの反応液を調製した。
この反応液を９４℃、２分の前反応の後、９４℃、１５秒→６０℃、３０秒→６８℃、２．５分を２１サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ  ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（アプライドバイオシステムズ）を用いてＰＣＲを行った。本ＰＣＲ産物は、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼを使用しているため３’末端が平滑化されている。そのため、ＰＣＲ産物の平滑末端へのアデニン付加後、ＴＡクローニングを実施した。具体的には、アデニン付加、ＴＡクローニングには、ＴＡｒｇｅｔ  Ｃｌｏｎｅ  −Ｐｌｕｓ−（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて、方法は取扱説明書に準じて行った。得られたプラスミドによりエシェリシア・コリＤＨ５αを形質転換し、アンピシリンを含むＬＢ寒天培地に播種後、３７度で一晩培養した。得られたコロニーを複数ピックアップし、アンピシリンを含むＬＢ培地にて培養し、プラスミドを抽出後、シークエンスを実施した。シークエンス反応は、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ）を用い、製品の取扱説明書に準じてシークエンス反応を行った。解析には、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３７３０ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステムズ）を使用し、配列番号２０のプライマーをシークエンスプライマーとして用いて解析を実施した。
ＫＯＤ−ＰＣＮＡが減少した塩基類似体検出活性を持つファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼに与える正確性への影響評価は、ＰＣＮＡ添加有り、無しのエラー率を比較することにより実施した。エラー率は、解析が完了した塩基数に対する間違えて取り込まれた塩基数（エラー塩基数）の割合を算出することで求めた。
【０１０７】
（２）リピート配列を増幅する際のスリッページエラーの頻度
前記（１）の方法に従って、ＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物のＴＡクローニングを実施した後、得られたプラスミドによりエシェリシア・コリＤＨ５αを形質転換し、アンピシリンを含むＬＢ寒天培地に播種後、３７度で一晩培養した。得られたコロニーを複数ピックアップし、アンピシリンを含むＬＢ培地にて培養し、プラスミドを抽出、（Ａ）１２のリピート配列を含む領域のシークエンスを実施した。シークエンス反応は、配列番号２０のプライマーをシークエンスプライマーとして用いて、前記（１）と同様に実施した。ＫＯＤ−ＰＣＮＡがＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  ＤＮＡポリメラーゼに与える正確性への影響評価は、シークエンス結果より、（Ａ）１２のリピート配列に対して、挿入や欠損に関するエラーの割合を求めることで実施した。
【０１０８】
（１）ミスマッチエラーの頻度
減少した塩基類似体検出活性を持つファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＮＡ添加なしで増幅した場合のエラー率とＭｊａ−ＰＣＮＡ添加ありで増幅した場合のエラー率を求めた結果を表７に記す。Ｍｊａ−ＰＣＮＡ添加なしでは、エラー塩基数が、４４５２９塩基あたり８個であるのに対し、Ｍｊａ−ＰＣＮＡを添加することで、４２１００塩基あたり３個に減少することが示された。エラー割合としては、１．７９×１０−４から７．１３×１０−５に減少しており、ＰＣＮＡ添加により正確性が向上することが示された。
この結果より、ＰＣＮＡは、減少した塩基類似体検出活性を持つファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼに対しても効果があり、正確性が必要なＰＣＲにおいて利用が期待される。
【０１０９】
【表７】
2020010702.tif 000008
【０１１０】
（２）リピート配列を増幅する際のスリッページエラーの頻度
減少した塩基類似体検出活性を持つファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＮＡ添加なしで増幅した場合のリピート配列部分の塩基数とＭｊａ−ＰＣＮＡ添加ありで増幅した場合のリピート配列部分の塩基数をカウントした結果を図５に記す。ＰＣＮＡ添加なしでは６５％以下であるのに対し、Ｍｊａ−ＰＣＮＡを添加することで、６％もエラーが低減し、７０％程度まで正確性が向上することが示された。
この結果より、Ｍｊａ−ＰＣＮＡについても、減少した塩基類似体検出活性を持つファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼに対しても効果があり、正確性が必要なＰＣＲにおいて利用が期待される。
【産業上の利用可能性】
【０１１１】
本発明により、核酸増幅（ＰＣＲ）のエラー（例えば、ミスマッチエラー、および／または、リピート配列を増幅する際のスリッページエラー）を低減させることができる。これにより、増幅エラーのない配列を見つけ出すことに時間を要していたクローニングの時間・コストの削減につなげることができる。さらに、シークエンスにおいては、ミスマッチエラー、および／または、リピート配列を増幅する際のスリッページエラーを低減させることができるため、正確なデータ、配列情報が得られることが期待できる。この手法は研究分野だけでなく、遺伝子診断などの臨床分野もしくは法医学分野、あるいは食品や環境中の微生物検査等においても産業上広く利用することができる。
【図１】
2020010702.tif 000009
【図２】
2020010702.tif 000010
【図３】
2020010702.tif 000011
【図４】
2020010702.tif 000012
【図５】
2020010702.tif 000013
【配列表】
2020010702000001.app