(57)【要約】      （修正有）【課題】改変されたＣ型肝炎ウイルスポリペプチドを提供する。【解決手段】Ｃ型肝炎ウイルスＮＳ４ａドメイン及び改変されたＮＳ３ドメインを含む生体サンプル内のＣ型肝炎ウイルスに対する抗体を検出する方法であって（ａ）イムノアッセイ試薬を提供する工程と、（ｂ）ＨＣＶ抗体が生体サンプル内に存在する場合にＨＣＶ抗体をポリペプチドに結合させて第１の免疫複合体を形成する工程と、（ｃ）標識ディテクターを工程（ｂ）から得た第１の免疫複合体に追加する工程であって、標識ディテクターが第１の免疫複合体に反応性である工程と、（ｄ）生体サンプル内のＣ型肝炎ウイルスに対する抗体の存在の指標として、標識ディテクターと第１の免疫複合体との間に形成された第２の免疫複合体を、存在する場合に検出する工程と、を含む。【選択図】図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチドであって、配列番号３を有するＣ型肝炎ウイルスＮＳ４ａドメインと、配列番号４を有する改変されたＣ型肝炎ウイルスＮＳ３ドメインであって、前記改変のない配列番号４を有するＣ型肝炎ウイルスＮＳ３ドメインのプロテアーゼ活性と比較して、前記改変されたＣ型肝炎ウイルスＮＳ３ドメインのプロテアーゼ活性を阻害するように、配列番号４の１つ又は２つ以上のアミノ酸残基が改変されている、ドメインと、前記改変されたＮＳ３ドメインのアミノ末端に前記ＮＳ４ａドメインのカルボキシ末端を接続する介在領域と、を含む、ポリペプチド、又は前記ポリペプチドに対して少なくとも９０％のアミノ酸相同性を有するポリペプチド、又は前記ポリペプチドに対して少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド、を含む、イムノアッセイ試薬。
【請求項２】
前記改変が、配列番号４のアミノ酸残基５５、７９、及び１３７のうち１つ又は２つ以上の置換を含む、請求項１に記載のイムノアッセイ試薬。
【請求項３】
前記改変が、アラニン又はグリシンの置換を含む、請求項２に記載のイムノアッセイ試薬。
【請求項４】
前記改変が、アラニンによるアミノ酸残基１３７の置換を含む、請求項３に記載のイムノアッセイ試薬。
【請求項５】
前記ポリペプチドの前記介在領域が、アミノ酸配列ＳＧＳを有する、請求項１に記載のイムノアッセイ試薬。
【請求項６】
前記ポリペプチドが、配列番号２に示されるようなアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のイムノアッセイ試薬。
【請求項７】
固体担体に結合される、請求項１に記載のイムノアッセイ試薬。
【請求項８】
生体サンプル内のＣ型肝炎ウイルスに対する抗体を検出する方法であって、（ａ）請求項１に記載のイムノアッセイ試薬を提供する工程と、（ｂ）ＨＣＶ抗体が前記生体サンプル内に存在する場合にＨＣＶ抗体を前記ポリペプチドに結合させて第１の免疫複合体を形成することを可能にする条件下で生体サンプルを前記イムノアッセイ試薬と混合する工程と、（ｃ）標識ディテクターを工程（ｂ）から得た前記第１の免疫複合体に追加する工程であって、前記標識ディテクターが前記第１の免疫複合体に反応性である工程と、（ｄ）前記生体サンプル内のＣ型肝炎ウイルスに対する前記抗体の存在の指標として、前記標識ディテクターと前記第１の免疫複合体との間に形成された第２の免疫複合体を、存在する場合に検出する工程と、を含む方法。
【請求項９】
前記標識ディテクターが、標識抗体又は標識抗原である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記イムノアッセイ試薬が、固体担体に結合している、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
生体サンプル内のＣ型肝炎ウイルスに対する抗体及び／又はＣ型肝炎ウイルス抗原を検出する方法であって、（ａ）請求項１に記載のイムノアッセイ試薬を提供する工程と、（ｂ）生体サンプルと、前記イムノアッセイ試薬及び１つ又は２つ以上の抗ＨＣＶ抗体とを、ＨＣＶ抗体が前記生体サンプル内に存在する場合にＨＣＶ抗体を前記ポリペプチドに結合させて第１の免疫複合体を形成することを可能にする条件下、及びＨＣＶ抗原が前記生体サンプル内に存在する場合にＨＣＶ抗原を前記抗ＨＣＶ抗体に更に結合させて第２の免疫複合体を形成することを可能にする条件下で混合する工程と、（ｃ）第１の標識ディテクターを工程（ｂ）から得た前記第１の免疫複合体に追加する工程であって、前記第１の標識ディテクターが前記第１の免疫複合体に反応性である工程と、第２の標識ディテクターを工程（ｂ）から得た前記第２の免疫複合体に追加する工程であって、前記第２の標識ディテクターが前記第２の免疫複合体に反応性である工程と、（ｄ）前記生体サンプル内のＨＣＶに対する抗体及び／又はＨＣＶ抗原の存在の指標として、前記第１の標識ディテクターと前記第１の免疫複合体との間に形成された第３の免疫複合体を、存在する場合に検出する工程と、前記第２の標識ディテクターと前記第２の免疫複合体との間に形成された第４の免疫複合体を、存在する場合に検出する工程と、を含む方法。
【請求項１２】
前記第１の標識ディテクター及び前記第２の標識ディテクターが、それぞれ標識抗体又は標識抗原である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記イムノアッセイ試薬の１つ又は２つ以上及び１つ又は２つ以上の抗ＨＣＶ抗体が、同じ又は異なる固体担体に結合している、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１に記載のイムノアッセイ試薬と、免疫診断テストを実施する手順と、を含む、免疫診断テストキット。
【請求項１５】
１つ又は２つ以上の抗ＨＣＶ抗体を更に含む、請求項１４に記載の免疫診断テストキット。
【請求項１６】
前記１つ又は２つ以上の抗ＨＣＶ抗体が、抗ＨＣＶコア抗体である、請求項１５に記載の免疫診断テストキット。
【請求項１７】
配列番号２のアミノ酸配列を含む、単離ポリペプチド。
【請求項１８】
配列番号２のアミノ酸配列からなる、単離ポリペプチド。
【請求項１９】
ヒト生体サンプルの供給から、請求項１に記載のイムノアッセイ試薬を用いて抗原抗体複合体を形成する抗体を含むサンプルを選択することを含む、ヒト生体サンプルの供給から生体サンプルを選択する方法。
【請求項２０】
前記選択することが、前記供給から除去するためのＨＣＶ陽性サンプルを同定することである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記生体サンプルが血液である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
血液関連製品の調製に選択されない生体サンプルを使用することを更に含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
ヒト生体サンプルの供給から、請求項１に記載の前記イムノアッセイ試薬を用いて抗原抗体複合体を形成する抗体を含まないサンプルを選択することを含む、ヒト生体サンプルの供給から生体サンプルを選択する方法。
【請求項２４】
前記選択することが、血液関連製品の調製に有用な生体サンプルを同定することである、請求項２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は、２０１５年３月２７日出願の米国特許仮出願第６２／１３９，１８３号の利益を主張するものである。
（合衆国政府の助成による研究又は開発に関する陳述）
該当なし。
【０００２】
本発明は、概ね、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）構築物及びこれを使用するための方法に関する。より具体的には、本発明は、ＮＳ４ａ及び改変されたＮＳ３ドメインを有する免疫原性かつ免疫反応性のＨＣＶポリペプチドに関する。改変されたポリペプチドは、立体構造エピトープを保持するので、ＨＣＶ感染を診断するためのイムノアッセイで有用である。
【背景技術】
【０００３】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は、主に身体輸血及び体液交換によって感染する非経口的な非Ａ非Ｂ型肝炎（ＮＡＮＢＨ）の主原因である。このウイルスは、米国内で一般集団の０．４〜２．０％に存在する。慢性肝炎は、感染の約５０％において発症し、これらのうち、感染した個人の約２０％は、時として肝細胞癌につながる肝硬変を発症する。したがって、この病気の研究及び抑制は、医学的重要性がある。
【０００４】
ＨＣＶは、ＨｏｕｇｈｔｅｎらによってＮＡＮＢＨの原因であると初めて同定され、特性化された。ＨＣＶのウイルスゲノム配列は、周知であり、その配列を得るための方法も周知である。例えば、国際公開第８９／０４６６９号、同第９０／１１０８９号、及び同第９０／１４４３６号を参照されたい。ＨＣＶは、９．５ｋｂのプラスセンスの一本鎖ＲＮＡゲノムを有し、Ｆｌａｖｉｒｉｄａｅ科のウイルスのメンバーである。少なくとも６つの異なる、ただし、系統発生解析に基づいて関連した遺伝子型のＨＣＶが同定されている（Ｓｉｍｍｏｎｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９３）７４：２３９１〜２３９９）。ウイルスは、３０００超のアミノ酸残基を有する単一のポリタンパク質をコードする（Ｃｈｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）２４４：３５９〜３６２；Ｃｈｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９１）８８：２４５１〜２４５５；Ｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９１）８８：１７１１〜１７１５）。ポリタンパク質は、共翻訳的に及び翻訳後に、構造タンパク質及び非構造（ＮＳ）タンパク質の両方にプロセシングされる。
【０００５】
特に、いくつかのタンパク質は、ＨＣＶゲノムによってコードされる。ＨＣＶポリタンパク質の開裂産物の順序及び命名法は次の通りである：ＮＨ２−Ｃ−Ｅ１−Ｅ２−Ｐ７−ＮＳ２−ＮＳ３−ＮＳ４ａ−ＮＳ４ｂ−ＮＳ５ａ−ＮＳ５ｂ−ＣＯＯＨ。ポリタンパク質の初期開裂は、３つの構造タンパク質、つまりＮ末端ヌクレオカプシドタンパク質（いわゆる「コア」）並びに２つのエンベロープ糖タンパク質「Ｅ１」（Ｅとしても知られる）及び「Ｅ２」（Ｅ２／ＮＳ１としても知られる）、並びにウイルス酵素を含む非構造（ＮＳ）タンパク質を遊離させる、宿主プロテアーゼによって触媒される。ＮＳ領域は、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、ＮＳ５ａ、及びＮＳ５ｂと呼ばれる。ＮＳ２は、タンパク質分解活性を有する内在性膜タンパク質である。ＮＳ２は、単独又はＮＳ３との組み合わせのいずれかで、ＮＳ２−ＮＳ３の切断しやすい結合を開裂し、次にＮＳ３のＮ末端を生成し、セリンプロテアーゼ活性及びＲＮＡヘリカーゼ活性の両方を含む大きなポリタンパク質を放出する。ＮＳ３プロテアーゼは、残りのポリタンパク質をプロセシングするために役立つ。具体的には、ＨＣＶ  ＮＳ３タンパク質は、３つの機能ドメインを含む６３０アミノ酸タンパク質である。セリン様プロテアーゼドメインが、アミノ末端に位置する一方で、ヘリカーゼ及びＮＴＰａｓｅ活性は、カルボキシ末端にある。ＮＳ３のセリンプロテアーゼは、ＮＳ３／４ａ、ＮＳ４ａ／ｂ、ＮＳ４ｂ／５ａ、及びＮＳ５ａ／ｂの接合部における開裂に関与している。
【０００６】
ＨＣＶポリタンパク質由来の、ＨＣＶ用の免疫学的試薬及び診断的試薬として有用な、多数の一般的及び特異的ポリペプチドが説明されてきた。例えば、Ｈｏｕｇｈｔｏｎら、欧州特許第３１８，２１６号及び同第３８８，２３２号；Ｃｈｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）２４４：３５９〜３６２；Ｋｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）２４４：３６２〜３６４；Ｈｏｕｇｈｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ（１９９１）１４：３８１〜３８８；Ｃｈｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）８９：１００１１〜１００１５；Ｃｈｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔ．Ｈｅｐａｔｏｌ．（１９９３）８：Ｓ３３〜３９；Ｃｈｉｅｎら、国際公開第９３／００３６５号；Ｃｈｉｅｎ，Ｄ．Ｙ．、国際公開第９４／０１７７８号を参照されたい。これらの刊行物は、通常ＨＣＶ並びにＨＣＶポリペプチドの免疫学的試薬の製造及び使用について幅広い知識を提供する。したがって簡潔にするために、これらの刊行物の開示は、参照により本明細書に援用される。
【０００７】
ＨＣＶのキャリア及びＨＣＶ汚染血液又は血液製剤をスクリーングし、同定するための高感度の特異的な方法は、医薬品に重要な進歩をもたらす。輸血後肝炎（ＰＴＨ）は、輸血された患者の約１０％で発生し、ＨＣＶは、これらの症例の最大９０％を占めている。患者の治療、並びに血液及び血液製剤による、又は緊密な個人的接触によるＨＣＶの予防及び伝染は、信頼できる診断ツール及び予後ツールを必要とする。したがって、いくつかのアッセイが、ＨＣＶ感染の血清診断のために開発された。例えば、Ｃｈｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）２４４：３５９〜３６２；Ｋｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）２４４：３６２〜３６４；Ｃｈｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｍｅｄ．Ｂｕｌｌ．（１９９０）４６：４２３〜４４１；Ｅｂｅｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ（１９９０）３３５：９８２〜９８３；ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｏｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ（１９９０）３３５：５５８〜５６０；ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｏｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ（１９９１）３３７：３１７〜３１９；Ｃｈｉｅｎ，Ｄ．Ｙ．、国際公開第９４／０１７７８号；Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら、同第９７／４４４６９号；及びＫａｓｈｉｗａｋｕｍａら、米国特許第５，８７１，９０４号を参照されたい。
【０００８】
参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６，６３０，２９８号は、ＨＣＶ抗体を検出するためにＨＣＶコア抗体を使用してＨＣＶ抗原及びＮＳ３／４ａエピトープを検出するＨＣＶ抗原／抗体組み合わせアッセイについて説明する。ＮＳ３／４ａエピトープは、アミノ末端上にＮＳ３、及びカルボキシ末端上にＮＳ４ａを有する。ＮＳ３ドメインのプロテアーゼ活性は、このエピトープ内に保持され、安定性は、プロテアーゼ活性の存在によってマイナスの影響を受ける。
【０００９】
参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６，６３２，６０１号は、複数エピトープ融合抗原（ＭＥＦＡ）との組み合わせでＮＳ３／４ａ立体構造エピトープを使用するイムノアッセイについて説明する。アッセイは、早期のＨＣＶセロコンバージョンを検出するための方法を提供する。米国特許第６，６３２，６０１号に記載されるように酵母で発現させ、非変性条件下で精製されたＮｓ３／４ａは、プロテアーゼ及びヘリカーゼの両方の機能を含む。なぜなら、この様式で精製されたＮＳ３／４ａは、天然の立体構造を保持するからであり、早期セロコンバージョン抗体検出においてｃ２００又はｃ３３ｃ抗原より高感度であることがわかっている。抗原としてＮＳ３／４ａ及びＭＥＦＡ  ７．１を使用する抗体アッセイにおいて、セロコンバージョン抗体は、当時存在した市販のＨＣＶアッセイより２〜１４日早く検出された。しかしながら、ＮＳ３／４ａタンパク質は、自己加水分解を受け、ＮＳ３プロテアーゼ活性によりＭＥＦＡ７．１を開裂する。
【００１０】
参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第７，４９１，８０８号は、ＭＥＦＡとの併用でタンパク質分解活性の減少を伴って変異したＮＳ３プロテアーゼドメインを含むＮＳ３／４ａ立体構造エピトープについて説明する。
【００１１】
参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６，２１１，３３８号は、天然のＨＣＶ  ＮＳ４ａペプチドの中央疎水性ドメイン、リンカー、及びＨＣＶ  ＮＳ３セリンプロテアーゼドメインを含む共有結合性のＨＣＶのＮＳ４ａ／ＮＳ３複合体について説明する。ＮＳ４ａ／ＮＳ３複合体は、ＮＭＲ分光法によるＨＣＶ阻害物質の構造決定、及び結合方式の決定に有用である。
【００１２】
適切な患者の治療を提供するため、並びに血液及び血液製剤による又は緊密な個人的接触によるＨＣＶの伝染を予防するために、高感度で正確な診断ツール及び予後ツールの必要が残り続ける。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、ＮＳ４ａ／改変されたＮＳ３のＨＣＶポリペプチドの使用が、ＨＣＶ感染を検出するための優れた試薬を提供するという研究結果に一部基づいている。ＮＳ４ａ／改変されたＮＳ３ポリペプチドは、立体構造エピトープ、したがって免疫反応性を保持するので、ＨＣＶ感染の存在を正確かつ効率的に検出するため、特にＨＣＶ特異抗体の早期検出のために、単独又は他のＨＣＶ試薬との組み合わせで使用することができる。本明細書に記載されたアッセイを使用して、ＨＣＶの６個の既知の遺伝子型のいずれかによって生じたＨＣＶ感染を検出することができる。
【００１４】
したがって、一実施形態では、本発明は、配列番号３を有するＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＮＳ４ａドメインと、配列番号４を有する改変されたＨＣＶ  ＮＳ３ドメインであって、改変のない配列番号４を有するＣ型肝炎ウイルスＮＳ３ドメインのプロテアーゼ活性と比較して、改変されたＣ型肝炎ウイルスＮＳ３ドメインのプロテアーゼ活性を阻害するように、１つ又は２つ以上の配列番号４のアミノ酸残基が改変されているドメインと、改変されたＮＳ３ドメインのアミノ末端にＮＳ４ａドメインのカルボキシ末端を接続する介在領域と、を含むポリペプチド、又はかかるポリペプチドに対して少なくとも９０％のアミノ酸相同性を有するポリペプチド、又はかかるポリペプチドに対して少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド、を含むイムノアッセイ試薬を目的とする。ＮＳ３ドメインは、配列番号４においてアミノ酸残基１５及び１６がイソロイシン（Ｉ）の代わりにリシン（Ｋ）であるという点において、天然のＨＣＶ  ＮＳ３ドメインに対して改変されている。好ましくは、プロテアーゼ活性を阻害するための改変は、配列番号４のアミノ酸残基５５、７９、及び１３７のうち１つ又は２つ以上の置換、好ましくはアラニン又はグリシンの置換を含む。好ましい実施形態では、プロテアーゼ活性を阻害するための改変は、アラニンによる配列番号４のアミノ酸残基１３７の置換を含む。
【００１５】
本発明のポリペプチドの好ましい実施形態では、介在領域は、アミノ酸トリプレットＳＧＳであり、配列番号２を含む又はより具体的には配列番号２からなるポリペプチドをもたらす。介在領域、好ましくはトリペプチドの可撓性リンカーは、「ターン」配列と呼ばれる。ターン配列は、ＮＳ４ａドメインをＮＳ３ドメインのプロテアーゼ領域内のポケットの中への折り畳みを可能にする。
【００１６】
更なる実施形態では、本発明のイムノアッセイ試薬は、固体担体に結合している。
【００１７】
更なる実施形態では、発明は、生体サンプル内のＨＣＶに対する抗体を検出する方法を目的とする。方法は以下を含む：（ａ）上述のようなイムノアッセイ試薬を提供すること；（ｂ）ＨＣＶ抗体が生体サンプル内に存在する場合にＨＣＶ抗体をポリペプチドに結合させて第１の免疫複合体を形成することを可能にする条件下で生体サンプルをイムノアッセイ試薬と混合すること；
（ｃ）標識ディテクターを工程（ｂ）から得た第１の免疫複合体に追加することであって、この標識ディテクター免疫複合体に反応性であること；及び（ｄ）生体サンプル内のＨＣＶ抗体の存在の指標として標識ディテクターと第１の免疫複合体との間に形成された第２の免疫複合体を検出すること（存在する場合）。好ましくは、標識ディテクターは、抗体又は抗原である。好ましくは、イムノアッセイ試薬は、固体担体に結合している。
【００１８】
更なる実施形態では、発明は、生体サンプル内のＣ型肝炎ウイルスに対する抗体及び／又はＣ型肝炎ウイルス抗原を検出する方法（「組み合わせ」又は「コンボ」アッセイ）を目的とする。方法は以下を含む：（ａ）上述のようなイムノアッセイ試薬を提供すること；（ｂ）ＨＣＶ抗体が生体サンプル内に存在する場合にＨＣＶ抗体をポリペプチドに結合させて第１の免疫複合体を形成することを可能にする条件下、及びＨＣＶ抗原が生体サンプル内に存在する場合にＨＣＶ抗原を抗ＨＣＶ抗体に更に結合させて第２の免疫複合体を形成することを可能にする条件下で、生体サンプルをイムノアッセイ試薬及び１つ又は２つ以上の抗ＨＣＶ抗体と混合すること；（ｃ）第１の標識ディテクターを工程（ｂ）から得た第１の免疫複合体に追加することであって、第１の標識ディテクターが前記第１の免疫複合体に反応性であること、及び第２の標識ディテクターを工程（ｂ）から得た第２の免疫複合体に追加することであって、第２の標識ディテクターが第２の免疫複合体に反応性であること；（ｄ）生体サンプル内のＨＣＶに対する抗体の存在及び／又はＨＣＶ抗原の存在の指標として、第１の標識ディテクターと第１の免疫複合体との間に形成された第３の免疫複合体を検出すること（存在する場合）、及び第２の標識ディテクターと第２の免疫複合体との間に形成された第４の免疫複合体を検出すること（存在する場合）。好ましくは、第１の標識ディテクター及び第２の標識ディテクターは、それぞれ標識抗体又は標識抗原である（その任意の組み合わせにおいて；すなわち両方が標識抗体であり得る；両方が標識抗原であり得る；１つが標識抗体であり得る一方、他方が標識抗原である）。好ましくは、イムノアッセイ試薬の１つ又は２つ以上及び１つ又は２つ以上の抗ＨＣＶ抗体が、同じ又は異なる固体担体に結合している。
【００１９】
更なる実施形態では、発明は、上述のようなイムノアッセイ試薬を含む免疫診断テストキット及び免疫診断テストを実施する手順を目的とする。
【００２０】
追加の実施形態では、発明は、１つ又は２つ以上の抗ＨＣＶ抗体、好ましくは抗ＨＣＶコア抗体を更に含む免疫診断テストキットを目的とする。
【００２１】
追加の実施形態では、発明は、配列番号２のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドを目的とする。特定の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列からなる。
【００２２】
更なる実施形態では、発明は、本発明によるイムノアッセイ試薬を用いて抗原抗体複合体を形成する抗体を含むサンプルを、ヒト生体サンプルの供給から選択することを含む、ヒト生体サンプルの供給から生体サンプルを選択する方法を提供する。これは、供給が血液供給であるとき特に関連のある、供給から除去するＨＣＶ陽性サンプルを同定するのに有用である。それらの選択されないサンプルを、血液関連製品の調製に使用することができる。ＨＣＶ陽性サンプルを同定することによって、本方法は、陽性サンプルの付加においても有用であり得る。
【００２３】
発明は、本発明によるイムノアッセイ試薬を用いて抗原抗体複合体を形成する抗体を含まないサンプルを、ヒト生体サンプルの供給から選択することを含む、ヒト生体サンプルの供給から生体サンプルを選択する方法を更に提供する。これは、血液関連製品の調製に有用な生体サンプルを同定するのに有用である。
【００２４】
本発明のこれらの態様及び他の態様は、以下の詳細な説明及び添付の図面を参照すると顕著となるであろう。加えて、より詳細に特定の手順又は組成物を説明する様々な参考文献が本明細書で示されており、したがって参照によりそれら全体が組み込まれる。
【００２５】
本発明の追加的な特徴及び利点は、添付図面と共に考慮される際に伴う説明から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】本アッセイ試薬（タンパク質及び抗体）が由来するポリタンパク質の様々な領域を示しているＨＣＶゲノムの図表示である。
【図２】酵母発現ベクターｐＢＳ２４．１の環状マップである。
【図３】本発明によるターン変異体ＨＣＶ発現カセットの図表示である。
【図４】本発明によるターン変異体発現プラスミドｐｄ．４ａ．ｔ．ｎｓ３．１１６５．ＫＫの環状マップである。
【図５】ターン変異体発現プラスミドｐｄ．４ａ．ｔ．ｎｓ３．１１６５．ＫＫのクローニング法を図示している。
【図６】イムノアッセイ試薬が固体担体に固定化される、本発明によるイムノアッセイ試薬を使用した代表的なイムノアッセイの概略図である。
【図７】イムノアッセイ試薬及び抗ＨＣＶ抗体が固体担体に固定される、本発明によるイムノアッセイ試薬及び抗ＨＣＶ抗体を使用した代表的なイムノアッセイの概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明の実施は、別途記載のない限り、当業者の技能の範囲内の化学、生化学、ＤＮＡ組み換え技術、及び免疫学の従来の方法を利用するだろう。そのような技術は、文献内で完全に説明されている。例えば、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｖｏｌ．Ｉ  ＆  ＩＩ（Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ  ａｎｄ  Ｄ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ，ｅｄｓ．）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．Ｉ−ＩＶ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  ｅｄｓ．，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）；Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９３）；Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，ｃｕｒｒｅｎｔ  ａｄｄｉｔｉｏｎ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．Ｃｏｌｏｗｉｃｋ  ａｎｄ  Ｎ．Ｋａｐｌａｎ  ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）を参照されたい。
【００２８】
本明細書に引用される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、上記であろうと下記であろうと、本明細書の全体にわたり参照により組み込まれる。
【００２９】
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈上別途明らかに示されない限り、複数の指示対象を含むことに留意される必要がある。したがって、例えば、「抗原」への言及は、２つ又はそれ以上の抗原の混合物などを含む。
【００３０】
以下のアミノ酸の略語を、本文全体を通して使用する：
【表１】
2020129001.tif 000003
【００３１】
Ｉ．定義
本発明の記述において、以下の用語を利用し、それらは以下のように定義されることを意図している。
【００３２】
用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを指し、生産物の最小長に制限されない。したがって、ペプチド、オリゴペプチド、二量体、多量体などがこの定義内に含まれる。全長タンパク質及びそのフラグメントの両方は、この定義により包含されている。用語はまた、ポリペプチドの発現後の改変、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化なども含む。更に、本発明の目的に関して、「ポリペプチド」は、タンパク質が所望の活性を維持する限り、天然配列に対する欠失、付加、及び置換などの改変を含むタンパク質を指す（通常は本質的に保存的）。これらの改変は、部位特異的突然変異誘発を通じて意図的であってもよいか、又はタンパク質を産生する宿主の突然変異若しくはＰＣＲ増幅による誤差などを通じて偶発的であってもよい。
【００３３】
ＨＣＶポリペプチドは、上記で定義されたようなＨＣＶポリタンパク質由来のポリペプチドである。ポリペプチドは、物理的にＨＣＶ由来である必要はないが、合成的に又は組み換え的に産生されてもよい。更に、ポリペプチドは、例えばＨＣＶの１、２、３、４、５又は６の株からの単離株のいずれかであるがこれらに限定されない、様々なＨＣＶの株及び単離株のいずれかに由来してもよい。多数の保存領域及び可変領域は、これらの株間で既知であり、一般的には、これらの領域由来のエピトープのアミノ酸配列は、高い配列相同性、例えば、２つの配列を整列させたとき３０％超、好ましくは４０％超のアミノ酸配列相同性を有するだろう。したがって、例えば、用語「ＮＳ４ａ／３」ポリペプチドは、様々なＨＣＶ株、並びに更に以下に定義されるようにＮＳ４ａ／３類似体、突然変異タンパク質、及び免疫原性フラグメントのいずれかから得たＮＳ３と組み合わせたＮＳ４を指す。これらの株の多くの完全な遺伝子型は既知である。例えば、米国特許第６，１５０，０８７号並びにＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＪ２３８８００及びＡＪ２３８７９９を参照されたい。
【００３４】
ＨＣＶポリタンパク質「由来の」ポリペプチドは、参照ＨＣＶポリタンパク質の１つ又は２つ以上の領域若しくは領域の部分の配列を含むポリペプチドを意味する。典型的には、ポリペプチドは、エピトープを含む領域又は領域の部分からなり、通常以下に定義されるような、参照ポリペプチドに実質的に相同のアミノ酸配列を有する。したがって、用語「由来の」は、分子の本来の供給源を同定するために使用されるが、例えば、化学合成手段又は組み換え手段であってもよい分子を作製する方法を制限することを意味するものではない。
【００３５】
用語「類似体」及び「突然変異タンパク質」は、本明細書に記載のアッセイにおいて免疫反応性など所望の活性を保持する参照分子の、生物学的に活性の誘導体又はそのような誘導体のフラグメントを指す。一般的に、用語「類似体」は、改変が免疫原性活性を破壊しない限り、天然の分子に対して１つ又は２つ以上のアミノ酸の付加、置換（通常は本質的に保存的であるか、又は改変されたＮＳ３の様々な実施形態の場合、活性なタンパク質分解部位において本質的に非保存的である）及び／又は欠失のある天然のポリペプチド配列及び構造を有する化合物を指す。用語「突然変異タンパク質」は、アミノ及び／又はイミノ分子だけを含む化合物、アミノ酸（例えば、非天然アミノ酸などを含む）の１つ又は２つ以上の類似体を含むポリペプチド、置換された結合を有するポリペプチド、並びに当該技術分野において周知の他の改変、つまり天然型及び非天然型（例えば、合成）両方の、環化された、分枝状分子などが挙げられるがこれらに限定されない、１つ又は２つ以上のアミノ酸様分子を有するポリペプチドを指す。この用語はまた、１つ又は２つ以上のＮ置換グリシン残基（「ペプトイド」）及び他の合成アミノ酸若しくはペプチドを含有する分子も含む。（ペプトイドの説明については、例えば、米国特許第５，８３１，００５号、同第５，８７７，２７８号、及び同第５，９７７，３０１号；Ｎｇｕｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．（２０００）７：４６３〜４７３；並びにＳｉｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）８９：９３６７〜９３７１を参照されたい）。好ましくは、類似体又は突然変異タンパク質は、少なくとも天然の分子と同じ免疫反応性を有する。ポリペプチド類似体及びポリペプチド突然変異タンパク質を作製する方法は、当該技術分野において周知であり、更に後述される。
【００３６】
上述のように、類似体は、通常、本質的に保存的である置換、すなわち、アミノ酸のファミリー内で生じる、それらの側鎖に関連する置換を含む。具体的には、アミノ酸は、一般に４つのファミリーに分類される：（１）酸性−−アスパルテート及びグルタメート；（２）塩基性−−リシン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性−−アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；並びに（４）非電荷極性−−グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリンスレオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシンは、時として芳香族アミノ酸に分類される。例えば、ロイシンからイソロイシン若しくはバリン、アスパルテートからグルタメート、スレオニンからセリンへの孤立置換、又はアミノ酸から構造的に関連するアミノ酸への類似の保存的置換は、生物活性に大きな影響を与えないであろうことは、合理的に予想可能である。例えば、目的のポリペプチドは、分子の所望の機能がそのまま残される限り、最大約５〜１０個の保存的若しくは非保存的なアミノ酸置換、又は更には最大約１５〜２５個の保存的若しくは非保存的なアミノ酸置換、又は５〜２５の任意の整数の保存的若しくは非保存的なアミノ酸置換を含み得る。当業者は、当該技術分野において周知であるＨｏｐｐ／Ｗｏｏｄｓプロット及びＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅプロットを参考として、目的の分子の変化を許容できる領域を容易に決定することができる。
【００３７】
「改変されたＮＳ３」によって、配列番号４においてアミノ酸残基１５及び１６がイソロイシン（Ｉ）の代わりにリシン（Ｋ）であるという点において天然のＨＣＶ  ＮＳ３ドメインに対して改変されたＮＳ３ポリペプチドを意味し、配列番号４の１つ又は２つ以上のアミノ酸残基は、改変のない配列番号４を有するＣ型肝炎ウイルスＮＳ３ドメインのプロテアーゼ活性と比較して、改変されたＣ型肝炎ウイルスＮＳ３ドメインのプロテアーゼ活性を阻害するように、改変されている。好ましくは、プロテアーゼ活性を阻害するための改変は、配列番号４のアミノ酸残基５５、７９、及び１３７のうち１つ又は２つ以上の置換、好ましくはアラニン又はグリシンの置換を含む。好ましい実施形態では、プロテアーゼ活性を阻害するための改変は、アラニンによる配列番号４のアミノ酸残基１３７の置換を含む。
【００３８】
「フラグメント」によって、無傷の全長ポリペプチド配列及び構造の一部だけからなるポリペプチドを意図する。フラグメントは、天然のポリペプチドのＣ末端欠失及び／又はＮ末端欠失を含み得る。特定のＨＣＶタンパク質の「免疫原性フラグメント」は、一般的に、エピトープを定義する全長分子の少なくとも約５〜１０個の隣接するアミノ酸残基、好ましくは、全長分子の少なくとも約１５〜２５個の隣接するアミノ酸残基、及び最も好ましくは、全長分子の少なくとも約２０〜５０個以上の隣接するアミノ酸残基、又は５個のアミノ酸と全長配列との間の任意の整数の隣接するアミノ酸残基を含むが、ただし問題のフラグメントが本明細書に記載のアッセイにおいて免疫反応性を保持することを条件とする。
【００３９】
用語「エピトープ」は、本明細書で使用するとき、少なくとも約３〜５、好ましくは、約５〜１０又は１５、及び約１，０００以下（又はその間の任意の整数）のアミノ酸であって、それ自体で又はより大きな配列の一部として、そのような配列に対応して生成された抗体に結合する配列を定義するアミノ酸の配列を指す。フラグメントの長さに対する重要な上限はなく、フラグメントは、タンパク質配列のほぼ全長、又は更にはＨＣＶポリタンパク質から２つ以上のエピトープを含む融合タンパク質を含んでもよい。本発明で用いるエピトープは、由来する親タンパク質の部分の正確な配列を有するポリペプチドに限定されない。実際には、ウイルスゲノムは、常に変化している状態であり、単離株間で比較的高い可変性を呈するいくつかの可変ドメインを含む。したがって、用語「エピトープ」は、天然配列と同一である配列、並びに欠失、付加、及び置換など（通常、本質的に保存的である）の天然配列に対する改変を包含する。
【００４０】
エピトープを含む所与のポリペプチドの領域は、当該技術分野において周知である任意の数のエピトープマッピング技術を用いて同定することができる。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６６（Ｇｌｅｎｎ  Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ，Ｅｄ．，１９９６）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．を参照されたい。例えば、線形エピトープは、例えば、タンパク質分子の部分に対応している多数のペプチドを固体担体上に同時に合成すること、及びペプチドが担体に結合されているうちにペプチドと抗体を反応させることによって、決定され得る。そのような技術は、当該技術分野において周知であり、例えば、米国特許第４，７０８，８７１号；Ｇｅｙｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：３９９８〜４００２；Ｇｅｙｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：１７８〜１８２；Ｇｅｙｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：７０９〜７１５に記載されており、それら全てを本明細書に全体にわたり参照により組み込む。そのような技術を使用して、多数のＨＣＶのエピトープが同定されている。例えば、Ｃｈｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒａｌ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ（１９９４）ｐｐ．３２０〜３２４、及び更に以下を参照されたい。同様に、立体構造エピトープは、例えば、Ｘ線結晶学及び２次元核磁気共鳴によってなど、アミノ酸の空間立体構造を決定することによって容易に同定される。例えば、上記Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓを参照されたい。タンパク質の抗原性領域はまた、例えば、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒｏｕｐから入手可能なＯｍｉｇａ  ｖｅｒｓｉｏｎ  １．０ソフトウェアプログラムを使用して計算されるものなど標準の抗原性プロット及び疎水性プロットを用いて同定され得る。このコンピュータプログラムは、抗原性プロファイルを決定するためにＨｏｐｐ／Ｗｏｏｄｓ法（Ｈｏｐｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９８１）７８：３８２４〜３８２８）、及び疎水性プロット用にＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ技術（Ｋｙｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８２）１５７：１０５〜１３２）を使用する。
【００４１】
本明細書において使用するとき、用語「立体構造エピトープ」は、全長天然タンパク質内のエピトープをコードするアミノ酸配列特有の構造的特徴を有する、全長タンパク質、又はその類似体若しくは突然変異タンパク質の一部を指す。天然の構造的特徴としては、グリコシル化及び三次元構造が挙げられるが、これらに限定されない。これらのエピトープが抗原の三次元形状（例えば、折り畳み）によって形成されると考えられるので、エピトープ定義配列の長さには、大きなばらつきが生じやすい場合がある。したがって、エピトープを定義するアミノ酸は、比較的少ない数であり得るが、分子の長さに沿って広く分散され、折り畳みを介して正しいエピトープの立体構造がもたらされる。エピトープを定義する残基の間の抗原の部分は、エピトープの立体構造に対して重要でない場合がある。例えば、これらの介在配列の欠失又は置換は、エピトープの立体構造に重要な配列が維持されている場合（例えば、ジスルフィド結合に関するシステイン、グリコシル化部位など）、立体構造エピトープに影響を及ぼさない場合がある。
【００４２】
ＮＳ４ａ／３領域内に存在する立体構造エピトープは、上述の方法を使用して容易に同定される。更に、所与のポリペプチドにおける立体構造エピトープの有無は、抗体（立体構造エピトープに対するポリクローナル血清又はモノクローナル抗体）を用いて目的の抗原をスクリーニングすること、及びその反応性を、線形エピトープ（該当する場合）だけを保持する抗原の変性した変形例のものと比較することによって容易に判定することができる。ポリクローナル抗体を使用したそのようなスクリーニングにおいて、ポリクローナル血清をまず変性した抗原で吸収し、目的の抗原に対する抗体を保持するかどうかを調べることが有利な場合がある。
【００４３】
好ましくは、立体構造エピトープは、組み換えによって産生され、所望の構造的特徴、（例えば、エピトープの変性がないなど）を保存する条件下で抽出可能である細胞内で発現する。そのような細胞は、細菌、酵母、昆虫、及び哺乳類の細胞を含む。ＨＣＶポリタンパク質からの組み換え立体構造エピトープの発現及び単離は、例えば、国際公開第９６／０４３０１号、同第９４／０１７７８号、同第９５／３３０５３号、同第９２／０８７３４号に記載され、その出願は、本明細書に全体にわたり参照により組み込まれる。あるいは、抗原を発現し、回収後タンパク質を更に復元することが可能である。化学合成はまた、天然の抗原の立体構造エピトープと交差反応する、立体構造抗原のミモトープを提供し得ることも理解される。
【００４４】
「抗体」（「Ａｂ」）は、抗原内に存在する目的のエピトープに特異的に結合する分子を意図する。「特異的に結合する」ことによって、抗体と、例えば試験基質との間に生じ得る非特異的な結合ではなく、抗体がエピトープを認識し、相互作用の「鍵と鍵穴」型でエピトープと相互作用して、抗原と抗体との間に複合体を形成することが意味される。したがって、例えば、ＨＣＶコア抗体は、ＨＣＶコアタンパク質に特異的に結合する分子である。用語「抗体」は、本明細書で使用するとき、ポリクローナル及びモノクローナル調製物の両方、並びに以下から得られた抗体を含む。ハイブリッド（キメラ）抗体分子（例えば、Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３４９：２９３〜２９９；及び米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）；Ｆ（ａｂ’）２及びＦ（ａｂ）フラグメント；Ｆｖ分子（共有結合性のヘテロ二量体、例えば、Ｉｎｂａｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９７２）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ６９：２６５９〜２６６２；及びＥｈｒｌｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９８０）Ｂｉｏｃｈｅｍ  １９：４０９１〜４０９６を参照されたい）；単鎖Ｆｖ分子（ｓＦｖ）（例えば、Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８５：５８７９〜５８８３を参照されたい）；二量体及び三量体の抗体フラグメント構築物；ミニボディ（例えば、Ｐａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍ  ３１：１５７９〜１５８４；Ｃｕｍｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １４９Ｂ：１２０〜１２６を参照されたい）；ヒト化抗体分子（例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３〜３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４〜１５３６；及び１９９４年９月２１日に公開された英国特許出願公開第２，２７６，１６９号を参照されたい）；並びに、そのような分子から得られた任意の機能性フラグメントであって、親抗体分子の免疫学的結合特性を保持するフラグメント。
【００４５】
本明細書において使用するとき、用語「モノクローナル抗体」は、均質の抗体集団を有する抗体組成物を指す。この用語は、抗体の種又は起源に関して限定されず、それが作製される方法によって限定されることも意図しない。したがって、この用語は、マウスハイブリドーマから得られた抗体、並びにマウスではなくヒトのハイブリドーマを使用して得られたヒトモノクローナル抗体を包含する。例えば、Ｃｏｔｅ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｎｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，１９８５，ｐ．７７を参照されたい。
【００４６】
ポリペプチドを指す場合、「単離された」ことによって、指示された分子が、その分子が自然界で見出される生物全体とは分離した別個のものである又は同じタイプの他の生体高分子の実質的非存在下で存在することが、意味される。
【００４７】
「等価の抗原決定基」によって、ＨＣＶの株１、２、又は３からのようなＨＣＶの異なる亜種又は株からの抗原決定基が意味される。より具体的には、エピトープは、例えば、ＨＣＶ−１ポリタンパク質配列（配列番号１を参照）に対して番号が付された、大体１６９４〜１７３５位で生じる、「５−１−１」のように周知であり、そのようなエピトープは株１と、２と、３との間で変化する。したがって、３つの異なる株からのエピトープ５−１−１は、等価の抗原決定基であり、したがってそれらの配列が同一でなくても「コピー」である。一般的には、等価の抗原決定基のアミノ酸配列は、高い配列相同性、例えば、２つの配列を整列させたとき３０％超、好ましくは４０％超のアミノ酸配列相同性を有するだろう。
【００４８】
「相同性」は、２つのポリヌクレオチド部分又は２つのポリペプチド部分の間の類似性パーセントを指す。２つのＤＮＡ又は２つのポリペプチド配列は、その配列が、分子の所定の長さにわたり少なくとも約５０％、好ましくは、少なくとも約７５％、より好ましくは、少なくとも約８０％〜８５％、好ましくは、少なくとも約９０％、及び最も好ましくは、少なくとも約９５％〜９８％の配列類似性を呈するとき、互いに「実質的に相同」である。本明細書において使用するとき、実質的に相同はまた、指定のＤＮＡ又はポリペプチド配列に対する完全同一性を示す配列も指す。
【００４９】
一般に「同一性」は、２つのポリヌクレオチド配列又はポリペプチド配列の、それぞれ正確なヌクレオチド対ヌクレオチド、又はアミノ酸対アミノ酸対応を指す。同一性パーセントは、配列の位置を合わせることによって２つの分子（参照配列と、その参照配列に対する未知の％同一性を有する配列と）の間の配列情報を直接比較すること、２つの整列した配列の間の一致の正確な数を集計すること、参照配列の長さで割ること、及びその結果に１００を掛けることによって、決定することができる。
【００５０】
ペプチド解析用の、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２〜４８９，１９８１の局所的相同性アルゴリズムに適合する、例えば、ＡＬＩＧＮ，Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．ｉｎ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ  ｅｄ．，５  Ｓｕｐｐｌ．３：３５３〜３５８，Ｎａｔｉｏｎａｌ  ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）などの直ぐに利用できるコンピュータプログラムを使用して、相同性及び同一性の解析の助けとすることができる。ヌクレオチド配列の相同性を決定するためのプログラムは、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）より入手可能）において利用可能であり（例えば、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＧＡＰプログラムなど）、これらもまた、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを利用している。これらのプログラムは、メーカーによって推奨され、上で参照されたＷｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅに記載されるデフォルトのパラメーターで容易に利用される。例えば、参照配列に対する特定のヌクレオチド配列の相同性パーセントは、６個のヌクレオチド位置のデフォルトのスコアリングテーブル及びギャップペナルティを用いて、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎの相同性アルゴリズムを使用して決定することができる。
【００５１】
本発明の文脈において相同性パーセントを確率する別の方法は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈに著作権があり、Ｊｏｈｎ  Ｆ．Ｃｏｌｌｉｎｓ及びＳｈａｎｅ  Ｓ．Ｓｔｕｒｒｏｋが開発し、ＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆ．）により流通されているＭＰＳＲＣＨプログラムパッケージを使用することである。このパッケージ一式から、デフォルトパラメーターをスコアリングテーブルに使用すると、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用することができる（例えば、ギャップオープンペナルティが１２、ギャップ伸長ペナルティが１、及びギャップが６）。生成されたデータから、「一致」値は、「配列相同性」を示す。配列間の同一性パーセント又は類似性パーセントを計算するための他の好適なプログラムは、当該技術分野において概ね周知である。例えば、別の整合プログラムは、デフォルトパラメーターと共に使用されるＢＬＡＳＴである。例えば、ＢＬＡＳＴＮ及びＢＬＡＳＴＰは、次のデフォルトパラメーターを用いて使用され得る：ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ＝ｓｔａｎｄａｒｄ；ｆｉｌｔｅｒ＝ｎｏｎｅ；ｓｔｒａｎｄ＝ｂｏｔｈ；ｃｕｔｏｆｆ＝６０；ｅｘｐｅｃｔ＝１０；Ｍａｔｒｉｘ＝ＢＬＯＳＵＭ６２；Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ＝５０  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ；ｓｏｒｔ  ｂｙ＝ＨＩＧＨ  ＳＣＯＲＥ；Ｄａｔａｂａｓｅｓ＝ｎｏｎ−ｒｅｄｕｎｄａｎｔ，ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＤＳ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ＋Ｓｗｉｓｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、容易に入手可能である。
【００５２】
あるいは、相同性は、相同領域間に安定した二本鎖を形成する条件下でのポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション、続いて一本鎖特異的ヌクレアーゼ（複数可）消化、及び消化されたフラグメントのサイズ決定によって、決定することができる。実質的に相同であるＤＮＡ配列は、例えば、その特定のシステムについて規定されるストリンジェントな条件下でのサザンハイブリダイゼーション試験で同定することができる。適切なハイブリダイゼーション条件を規定することは、当業者の技能の範囲内である。例えば、上記Ｓａｍｂｒｏｏｋら；上記ＤＮＡクローニング；上記核酸ハイブリダイゼーションを参照されたい。
【００５３】
「コード配列」又は選択されたポリペプチドを「コードする」配列は、適切な調節配列の制御下に置かれたときインビトロ又はインビボで転写され（ＤＮＡの場合）、ポリペプチドに翻訳される（ｍＲＮＡの場合）、核酸分子である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドン及び３’（カルボキシ）末端の翻訳終止コドンによって決定される。転写終結配列は、コード配列に対して３’に位置され得る。
【００５４】
「操作可能に連結された」ことは、そのように記載される構成要素が、所望の機能を実行するように構成されるエレメントの配置を指す。したがって、コード配列に操作可能に連結された所与のプロモーターは、適切な転写因子などが存在するときコード配列の発現をもたらすことができる。プロモーターは、その発現を導くように機能する限り、コード配列に隣接している必要はない。したがって、例えば、介在する、翻訳されないが転写される配列は、転写されるイントロンが存在し得るようにプロモーター配列とコード配列との間に存在し得、プロモーター配列は、なおコード配列に対し「操作可能に連結される」と考えられる。
【００５５】
核酸分子を説明するために本明細書で使用される場合、「組み換え」は、その由来又は処置のせいで、天然で結び付けられるポリヌクレオチドの全部又は一部と結び付けられないゲノム由来、ｃＤＮＡ由来、ウイルス由来、半合成由来、又は合成由来のポリヌクレオチドを意味する。用語「組み換え」は、タンパク質又はポリペプチドに関して使用される場合、組み換えポリヌクレオチドの発現によって産生されたポリペプチドを意味する。一般に、目的の遺伝子は、更に後述されるように、クローン化され、次に形質転換された生物内で発現する。宿主生物は、発現条件下で外来遺伝子を発現してタンパク質を産生する。
【００５６】
「制御エレメント」は、それが結合されるコード配列の発現を助けるポリヌクレオチド配列を指す。この用語は、プロモーター、転写終結配列、上流制御ドメイン、ポリアデニル化シグナル、非翻訳領域（５’−ＵＴＲ及び３’−ＵＴＲ、並びに適切な場合、リーダー配列及びエンハンサーを含む）を含み、宿主細胞内のコード配列の転写及び翻訳を共同して提供する。
【００５７】
本明細書で使用するとき、「プロモーター」は、宿主細胞内でＲＮＡポリメラーゼを結合すること、及びそこに操作可能に連結された下流（３’方向）コード配列の転写を開始することが可能なＤＮＡ制御領域である。本発明の目的のために、プロモーター配列は、バックグラウンドより上の検出可能なレベルで目的の遺伝子の転写を開始するのに必要な最小数の塩基又はエレメントを含む。プロモーター配列内にあるのは、転写開始部位、並びに、ＲＮＡポリメラーゼの結合に関与するタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）である。真核細胞プロモーターは、多くの場合、ただし常にではないが、「ＴＡＴＡ」ボックス及び「ＣＡＴ」ボックスを含む。
【００５８】
ＲＮＡポリメラーゼがプロモーター配列に結合し、コード配列をｍＲＮＡに転写するとき、コントロール配列は、細胞内のコード配列の「転写を指向し」、次にこのｍＲＮＡは、コード配列によってコードされたポリペプチドに翻訳される。
【００５９】
「発現カセット」又は「発現構築物」は、目的の配列（複数可）又は遺伝子（複数可）の発現を指向することができる集団を指す。発現カセットは、上述のような、目的の配列（複数可）又は遺伝子（複数可）に（それらの転写を指向するように）操作可能に連結されたプロモーターなどの制御エレメントを含み、多くの場合、同様にポリアデニル化配列を含む。本発明の特定の実施形態において、本明細書に記載された発現カセットは、プラスミド構築物内に含まれ得る。発現カセットの構成要素に加えて、プラスミド構築物はまた、１つ又は２つ以上の選択可能なマーカー、プラスミド構築物を一本鎖ＤＮＡとして存在させるシグナル（例えば、Ｍ１３複製起点）、少なくとも１つの多重クローニング部位、及び「哺乳類」複製起点（例えば、ＳＶ４０又はアデノウイルス複製起点）も含み得る。
【００６０】
本明細書で使用するとき、「形質転換」は、挿入に使用される方法に関係なく宿主細胞への外因性ポリヌクレオチドの挿入を指す：例えば、直接取り込み、トランスフェクション、感染などによる形質転換。トランスフェクションの特定の方法については、以下を更に参照されたい。外因性ポリヌクレオチドは、非組込型ベクター（例えば、エピソーム）として維持され得るか、又はあるいは宿主ゲノムの中へ組み込まれ得る。
【００６１】
「宿主細胞」は、外因性ＤＮＡ配列によって、変換された細胞、又は形質転換できる細胞である。
【００６２】
本明細書で使用するとき、「生体サンプル」は、被験体から単離された組織又は流体のサンプルを指し、一般的に被験体又は被験体内に存在する抗原によって産生された抗体を含む。このような抗体及び／又は抗原を含む典型的なサンプルは、当該技術分野において周知であり、血液、血漿、血清、排泄物、尿、骨髄、胆汁、脊髄液、リンパ液、皮膚のサンプル、皮膚、呼吸器、腸、及び尿生殖路の分泌物、涙、唾液、母乳、血液細胞、臓器、生検、並びにまたインビトロ細胞培養構成成分（培地内の細胞及び組織の増殖から得られる条件培地が挙げられるがこれに限定されない）のサンプル（例えば、組み換え細胞及び細胞構成要素）が挙げられるがこれらに限定されない。
【００６３】
「固体担体」は、目的のイムノアッセイで用いられるＨＣＶポリペプチド（及び／又は本発明の組み合わせアッセイにおけるＨＣＶ抗原）が共有結合される、又は疎水性吸着などの非共有結合的手段により結合される固体マトリックスを意図する。
【００６４】
「免疫学的に反応性である」又は「免疫反応性」は、問題の抗原が、ＨＣＶ感染した固体からの生体サンプル内に存在する抗ＨＣＶ抗体に特異的に反応すること、及び／又は問題の抗ＨＣＶ抗体が、ＨＣＶ感染した固体からの生体サンプル内に存在するＨＣＶ抗原に特異的に反応することを意味する。
【００６５】
「免疫原性」は、問題の抗原が固体に投与されたとき、免疫反応を誘発することを意図する。
【００６６】
「免疫複合体」は、抗体が抗原上のエピトープに結合するときに形成される結合体を意図する。
【００６７】
本明細書で使用するとき、用語「標識」及び「検出可能な標識」は、検出することができる分子を指し、放射性同位元素、蛍光剤、化学発光剤、発色団、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素阻害剤、発色団、染料、金属イオン、金属ゾル、リガンド（例えば、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、又はハプテン）などが挙げられるが、これらに限定されない。用語「蛍光剤」は、検出可能な範囲の蛍光を呈することができる物質又はその一部を指す。本発明のもとで使用され得る標識の特定の実施例は、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、フルオレセイン、ＦＩＴＣ、ローダミン、ダンシル、ウンベリフェロン、ジメチルアクリジニウムエステル（ＤＭＡＥ）、Ｔｅｘａｓ  ｒｅｄ、ルミノール、ＮＡＤＰＨ及びα−、β−ガラクトシダーゼが挙げられるがこれらに限定されない。
【００６８】
ＩＩ．発明を実施する形態
本発明を詳細に説明する前に、本発明が特定の処方又は処理パラメーターに限定されないこと、したがって当然ながら変化し得ることが理解されるべきである。本明細書で用いられる専門用語が、本発明の特定の実施形態を説明することのみを目的とし、限定することを意図するものではないことも理解されるべきである。
【００６９】
本明細書で説明されたものと同様又は同等の多数の組成物及び方法が本発明の実施に使用され得るが、好ましい材料及び方法が本明細書に記載される。
【００７０】
上述したように、本発明は、ＮＳ４ａ／改変されたＮＳ３のＨＣＶポリペプチドの使用が、ＨＣＶ感染を検出するための優れた試薬を提供するという発見に基づいている。ＮＳ４ａ／改変されたＮＳ３ポリペプチドは、立体構造エピトープ、したがって免疫反応性を保持するので、ＨＣＶ感染の存在を正確かつ効率的に検出するため、単独又は他のＨＣＶ試薬との組み合わせで使用することができる。本明細書に記載されたアッセイを使用して、ＨＣＶの６個の既知の遺伝子型のいずれかによって生じたＨＣＶ感染を検出することができる。ＮＳ４ａ／改変されたＮＳ３ポリペプチドは、早期ＨＣＶ感染を正確に検出するための診断方法で特に有用である。この方法を使用して、ＨＣＶセロコンバージョンの初期の間にＨＣＶ感染を検出することができ、これにより検出精度を向上させ、誤った結果の発生率を低減する。
【００７１】
ＮＳ４ａ／改変されたＮＳ３ポリペプチドを、イムノアッセイにおいて単独で、又は同じ若しくは異なるＨＣＶ遺伝子型及び単離株（例えば、ＨＣＶコア、Ｅ１、Ｅ２、ＮＳ３、５−１−１、ｃ１００−３、及びＮＳ５配列の主要エピトープ）からの他のＨＣＶ抗原と組み合わせて使用することができる。この方法は、限定するものではないが、例えば、ＨＣＶ抗原（及び／又は抗ＨＣＶ抗体）が結合される固体担体を利用するアッセイ形式など後述のいくつかのアッセイ形式のいずれかを用いる単一のアッセイで簡便に実施され得る。
【００７２】
発明の更なる理解のために、より詳細な議論が、ＮＳ４ａ／改変されたＮＳ３ポリペプチド、並びにタンパク質の産生、及びタンパク質を使用する方法に関して以下に提供される。
【００７３】
ＨＣＶタンパク質
ＨＣＶ株のゲノムは、約９，０００〜１２，０００ヌクレオチドの単一のオープンリーディングフレームを含み、これは、ポリタンパク質に転写される。図１及び表１に示されるように、ＨＣＶポリタンパク質は、開裂時、次の順序で少なくとも１０個の異なる生成物を産生する：ＮＨ２−コア−Ｅ１−Ｅ２−ｐ７−ＮＳ２−ＮＳ３−ＮＳ４ａ−ＮＳ４ｂ−ＮＳ５ａ−ＮＳ５ｂ−ＣＯＯＨ。コアポリペプチドは、ＨＣＶ−１に対して番号が付された、配列番号１の１〜１９１位で生じる（ＨＣＶ−１ゲノムについては、Ｃｈｏｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：２４５１〜２４５５を参照されたい）。このポリペプチドは、更にプロセシングされて、ほぼ配列番号１のアミノ酸１〜１７３を有するＨＣＶポリペプチドを産生する。エンベロープポリペプチド、Ｅ１及びＥ２は、大体、配列番号１の１９２〜３８３位及び配列番号１の３８４〜７４６位でそれぞれ発生する。Ｐ７ドメインは、大体、配列番号１の７４７〜８０９位で見出される。ＮＳ２は、タンパク質分解活性を有する内在性膜タンパク質であり、大体、ポリタンパク質の配列番号１の８１０〜１０２６位で見出される。ＮＳ２は、ＮＳ３（大体、配列番号１の１０２７〜１６５７位で見出される）との組み合わせで、ＮＳ２−ＮＳ３の切断しやすい結合を開裂し、次にＮＳ３のＮ末端を生成し、セリンプロテアーゼ活性及びＲＮＡヘリカーゼ活性の両方を含む大きなポリタンパク質を放出する。ＮＳ３プロテアーゼ（大体、配列番号１の１０２７〜１２０７位で見出される）は、残りのポリタンパク質をプロセシングするために役立つ。ヘリカーゼ活性は、大体、配列番号１の１１９３〜１６５７位で見出される。ＮＳ３は、ＮＳ３補因子（大体、配列番号１の１６５８〜１７１１位で見出されるＮＳ４ａ）、２つのタンパク質（大体、配列番号１の１７１２〜１９７２位で見出されるＮＳ４ｂ、及び大体、配列番号１の１９７３〜２４２０位で見出されるＮＳ５ａ）、及びＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（大体、配列番号１の２４２１〜３０１１位で見出されるＮＳ５ｂ）を遊離させる。ポリタンパク質成熟の完了は、ＮＳ３セリンプロテアーゼによって触媒されたＮＳ３−ＮＳ４ａ接合部での自己触媒的開裂によって開始される。
【００７４】
本発明の改変されたＮＳ３ポリペプチドは、配列番号４においてアミノ酸残基１５及び１６がイソロイシン（Ｉ）の代わりにリシン（Ｋ）であるという点において、天然のＨＣＶ  ＮＳ３ドメインに対して変異されている。この親水性アミノ酸残基による疎水性アミノ酸残基の置換は、本発明に従い、より可溶性かつ安定した形態のイムノアッセイ試薬を生成する。
【００７５】
本発明の改変されたＮＳ３ポリペプチドはまた、プロテアーゼ活性を阻害するように変異されていて、その結果、改変されたＮＳ３ドメインを含むポリペプチド（例えば、ＮＳ４ａ／３ポリペプチド）の更なる開裂、並びに改変されたＮＳ３ポリペプチドとの組み合わせで使用される追加のＨＣＶタンパク質の触媒的開裂が阻害される。ＮＳ３ポリペプチドは、ＮＳ３プロテアーゼドメインの全て又は一部の欠失によって改変され得る。あるいは、タンパク質分解活性は、プロテアーゼドメインの活性領域内でのアミノ酸の置換によって阻害され得る。最終的に、触媒部位が改変されるようなドメインの活性領域へのアミノ酸の付加も、タンパク質分解活性の阻害を助けるだろう。好ましくは、プロテアーゼ活性を低減又は除去するようになされた改変は、天然のＮＳ３又はＮＳ４ａ／３タンパク質において立体構造エピトープを破壊しない。
【００７６】
上述のように、プロテアーゼ活性は、全長のＨＣＶ−１ポリタンパク質に対して番号が付された、大体、配列番号１のアミノ酸１０２７〜１２０７位で見出される（Ｃｈｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９１）８８：２４５１〜２４５５を参照されたい）。ＮＳ３プロテアーゼ及び活性部位の構造は、周知である。例えば、Ｌｉｎ，「Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  Ｖｉｒｕｓｅｓ：Ｇｅｎｏｍｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」，Ｅｄ．Ｓ．Ｌ．Ｔａｎ，Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（２００６）の「ＨＣＶ  ＮＳ３−４Ａ  Ｓｅｒｉｎｅ  Ｐｒｏｔｅａｓｅｓ」；Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９９６）８７：３４３〜３５５；Ｔｏｍｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９３）６７（７）：４０１７〜４０２６；Ｄｅ  Ｆｒａｎｃｅｓｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｖｉｒ．Ｔｈｅｒ．（１９９８）３：９９〜１０９；Ｋｏｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００１）４０：６３１〜６４０を参照されたい。したがって、天然配列に対する欠失又は改変は、典型的にはその分子の活性部位で、又はその近くで生じるだろう。好ましい改変は、プロテアーゼの活性部位での触媒トライアド、すなわちＨ、Ｄ及び／又はＳ残基に対するプロテアーゼ不活性化のためのものである。これらの残基は、全長のＨＣＶポリタンパク質に対して番号が付された、配列番号１の触媒トライアドのＨｉｓ１０８３、Ａｓｐ１１０７、及びＳｅｒ１１６５位でそれぞれ生じる（配列番号４のそれぞれ５５、７９、及び１３７位）。そのような改変は、免疫反応性を維持しながら、ＮＳ３プロテアーゼのタンパク質分解性の開裂活性を抑制する。特に好ましい置換は、本質的に保存的でなく、かつ中性であり、例えば、Ａｌａ又はグリシンによる、プロテアーゼドメインの配列番号１の１０８３、１１０７、及び１１６５位（配列番号４のそれぞれ５５、７９、及び１３７位）で通常見出されるアミノ酸残基の１つ又は２つ以上の置換などである。当業者は、ＮＳ３プロテアーゼの部分を容易に判定して、活性を妨害するために除去することができる。
【００７７】
更に、これらの部位における他の適切なアミノ酸改変は、当業者によって、例えば、Ｄｅ  Ｆｒａｎｃｅｓｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｖｉｒ．Ｔｈｅｒ．（１９９８）３（Ｓｕｐｐｌ  ３）：９９〜１０９；及びＳｃｈｅｃｈｔｅｒ  ａｎｄ  Ｂｅｒｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９６７）２７：１５７〜１６２に記載されるように、周知のＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼの構造及び機能に基づき容易に判定することができる。特に、ＮＳ３プロテアーゼがセリンプロテアーゼであり、タンパク質分解機構が、セリンにより標的されたペプチド結合の求核攻撃に基づいていることは、周知である。多くの場合において、基の求核的性質は、アスパルテートによって「プロトンアクセプター状態」に保持されたヒスチジンの存在によって改善される。整列したセリン、ヒスチジン及びアスパルテートの側鎖は、ほとんどのセリンプロテアーゼに共通の触媒トライアドを構築する。セリンプロテアーゼの活性部位は、ポリペプチド基質が結合する裂溝として形成される。Ｓｃｈｅｃｈｔｅｒ  ａｎｄ  Ｂｅｒｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９６７）２７：１５７〜１６２では、ポリペプチド基質（Ｐｉ，．．．，Ｐ３，Ｐ２，Ｐ１，Ｐ１’，Ｐ２’，Ｐ３’，．．．，Ｐｊ）及びそれらの対応する結合サブ部位（Ｓｉ，．．．，Ｓ３，Ｓ２，Ｓ１，Ｓ１’，Ｓ２’，Ｓ３’，．．．，Ｓｊ）のＮ末端からＣ末端までアミノ酸残基に標識が付けられ、開裂がＰ１とＰ１’との間で触媒されることが見出された。ＮＳ３プロテアーゼは、キモトリプシン様の折り目を示し、非常に長いペプチド基質（Ｐ６〜Ｐ４’）の必要条件と一致する非常に長い溶媒曝露の基質結合部位を含む。ＮＳ３プロテアーゼは、基質Ｐ１位におけるシステイン残基の優先傾向を有する。したがって、上述のような、及び当該技術分野において既知の構造及び機能に基づいて、当業者は、ＮＳ３プロテアーゼのタンパク質分解活性を妨害する働きをする他のアミノ酸の置換、付加、及び欠失を容易に決定することができる。
【００７８】
ＮＳ３タンパク質分解活性の有無は、当業者らに周知の方法を用いて判定することができる。例えば、プロテアーゼ活性又はその欠如は、実施例に後述された手順を使用して、並びに当該技術分野において周知のアッセイを使用して、決定され得る。例えば、Ｔａｋｅｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９７）２４７：２４２〜２４６；Ｋａｋｉｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９７）１２２：７４９〜７５５；Ｓａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９８）３７：３３９２〜３４０１；Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈ．（１９９８）７２：１０９〜１１５；Ｃｅｒｒｅｔａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９９）２６６：１９２〜１９７；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９９）２７０：２６８〜２７５；Ｋａｋｉｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈ．（１９９９）８０：７７〜８４；Ｆｏｗｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｃｒｅｅｎ．（２０００）５：１５３〜１５８；及びＫｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２０００）２８４：４２〜４８を参照されたい。
【００７９】
ＨＣＶポリタンパク質の様々な領域の核酸及びアミノ酸配列を含み、コア、ＮＳ２、ｐ７、Ｅ１、Ｅ２、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、ＮＳ５ａ、ＮＳ５ｂ遺伝子及びポリペプチドを含む、多数のＨＣＶ株及び単離株の核酸並びにアミノ酸配列が判定されている。例えば、単離株ＨＣＶ  Ｊ１．１は、Ｋｕｂｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｊａｐａｎ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：１０３６７〜１０３７２；Ｔａｋｅｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｇｅｎｅ  ９１：２８７〜２９１；Ｔａｋｅｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７１：３０２７〜３０３３；及びＴａｋｅｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：４６２６に記載される。２つの独立した単離株、ＨＣＶ−Ｊ及びＢＫの完全なコード配列は、Ｋａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：９５２４〜９５２８及びＴａｋａｍｉｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：１１０５〜１１１３によってそれぞれ記載される。
【００８０】
ＨＣＶ−１単離株を記載する刊行物としては、Ｃｈｏｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｂｒｉｔ．Ｍｅｄ．Ｂｕｌｌ．４６：４２３〜４４１；Ｃｈｏｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：２４５１〜２４５５、及びＨａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１７１１〜１７１５が挙げられる。ＨＣＶ単離株ＨＣ−Ｊ１及びＨＣ−Ｊ４は、Ｏｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊａｐａｎ  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．６０：１６７〜１７７に記載される。ＨＣＶ単離株ＨＣＴ  １８（およそ）、ＨＣＴ  ２３、Ｔｈ、ＨＣＴ  ２７、ＥＣ１及びＥＣ１０は、Ｗｅｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｖｉｒｏｌ．１８０：８４２〜８４８に記載される。ＨＣＶ単離株Ｐｔ−１、ＨＣＶ−Ｋ１、及びＨＣＶ−Ｋ２は、Ｅｎｏｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７０：１０２１〜１０２５に記載される。ＨＣＶ単離株Ａ、Ｃ、Ｄ、及びＥは、Ｔｓｕｋｉｙａｍａ−Ｋｏｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｖｉｒｕｓ  Ｇｅｎｅｓ  ５：２４３〜２５４に記載される。
【００８１】
本発明に従いＮＳ４ａ／改変されたＮＳ３ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号２に示される。配列は、Ｎ末端からＣ末端の方向で、Ｎ末端Ｍｅｔを含み、アミノ酸２〜１４は、ＮＳ４ａであり、介在するアミノ酸ＳＧＳが続き、改変されたＮＳ３であるアミノ酸１８〜６４６が続く（アミノ酸３２及び３３はリシンであり、アミノ酸１５４はアラニンである）。
【００８２】
抗ＨＣＶ抗体
抗ＨＣＶ抗体（同じ又は異なるＨＣＶドメインエピトープに対して指向される）は、例えば、ＨＣＶ抗コア抗体を含み得る。本発明において有用な特定の抗コア抗体の実施例は、抗体分子、例えば、配列番号１のアミノ酸１０〜５３、配列番号１のアミノ酸１０〜４５、配列番号１のアミノ酸６７〜８８、配列番号１のアミノ酸１２０〜１３０の間で見出されるコア領域内のエピトープに対して指向されるモノクローナル抗体、又は、例えば、米国特許第６，６３０，２９８号；米国特許第６，１５０，０８７号；米国特許第６，３４６，３７５号；Ｈｏｕｇｈｔｏｎら、米国特許第５，３５０，６７１号；Ｃｈｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）８９：１００１１〜１００１５；Ｃｈｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔ．Ｈｅｐａｔｏｌ．（１９９３）８：Ｓ３３〜３９；Ｃｈｉｅｎら、国際公開第９３／００３６５号；及びＣｈｉｅｎ，Ｄ．Ｙ．、国際公開第９４／０１７７８号（これらの開示は、本明細書に全体にわたり参照により組み込まれる）で同定されるコアエピトープのいずれかに対して指向される抗体などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８３】
図６に示される本発明の一実施形態では、迅速な捕捉リガンドイムノアッセイが、ＮＳ４ａ／改変されたＮＳ３ポリペプチドを使用して実行される。サンプルは、抗原と混ぜ合わされ、この抗原は、更に後述されるように固体担体上に存在し得る。サンプルがＨＣＶに感染している場合、固体担体上に存在するそれらのエピトープに対するＨＣＶ抗体は、固体担体成分に結合する。検出は、検出可能なマーカー（図６に示されるように西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）など）の抗原／抗体複合体のメンバーへの接着による。接着は、共有結合的手段によってもよく、若しくはその後の標準サンドイッチアッセイにおけるような検出可能に標識された抗体の結合によってもよく、又は酵素反応によってもよく、この反応の生産物は検出可能である。検出可能なマーカーとして、発色団、抗体、抗原、酵素、その開裂生成物が検出可能である酵素反応性化合物、ローダミン若しくはローダミン誘導体、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、蛍光剤化合物、化学発光化合物（ジメチルアクリジニウムエステル（ＤＭＡＥ）など）、これらのマーカーの誘導体及び／又は組み合わせを挙げることができるがこれらに限定されない。ヒトＩｇＧ分子の存在を検出することができる、検出可能に標識された抗ヒト抗体は、都合よく使用することができる。
【００８４】
図７に示される本発明の更なる実施形態では、迅速な捕捉リガンドイムノアッセイが、ＮＳ４ａ／改変されたＮＳ３ポリペプチド及び抗ＨＣＶ抗体を使用して実行される。サンプルは、ポリペプチド及び抗ＨＣＶ抗体と混ぜ合わされ、これらは、更に後述されるように固体担体上に存在し得る。サンプルがＨＣＶに感染している場合、固体担体上に存在するそれらのエピトープに対するＨＣＶ抗体は、固体担体成分に結合し、固体担体上の抗体エピトープに免疫学的に反応性であるＨＣＶ抗原もまた固体担体成分に結合する。検出は、検出可能なマーカー（図７に示されるように西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）など）の抗原／抗体複合体のメンバーへの接着による。接着は、共有結合的手段によってもよく、若しくはその後の標準サンドイッチアッセイにおけるような検出可能に標識された抗体の結合によってもよく、又は酵素反応によってもよく、この反応の生産物は検出可能である。検出可能なマーカーとして、発色団、抗体、抗原、酵素、その開裂生成物が検出可能である酵素反応性化合物、ローダミン若しくはローダミン誘導体、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、蛍光剤化合物、化学発光化合物（ジメチルクリジニウムエステル（ＤＭＡＥ）など）、これらのマーカーの誘導体及び／又は組み合わせを挙げることができるがこれらに限定されない。ヒトＩｇＧ分子の存在を検出することができる、検出可能に標識された抗ヒト抗体は、都合よく使用することができる。
【００８５】
そのようなアッセイは、ＨＣＶに感染した個体の生体サンプルに存在し得る、ＨＣＶ抗原及びＨＣＶ抗体の両方を検出することができるＨＣＶ組み合わせアッセイである。
【００８６】
ＨＣＶ抗原の産生
上述のように、本発明の分子は、一般に、組み換え的に産生される。したがって、本発明で使用するＨＣＶ抗原をコードするポリヌクレオチドは、分子生物学の標準技術を使用して作製され得る。例えば、上述の分子をコードするポリヌクレオチド配列は、例えば、その遺伝子を発現する細胞からｃＤＮＡライブラリー及びゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって、又はその遺伝子を含むことが知られているベクターからその遺伝子を誘導することによってなど、組み換え法を使用して得ることができる。更に、所望の遺伝子は、Ｈｏｕｇｈｔｏｎら、米国特許第５，３５０，６７１号などで、当該技術分野において記載される技術を使用してウイルス核酸分子から直接単離することができる。目的の遺伝子はまた、クローン化されるのではなく合成的にも産生され得る。この分子を、特定の配列用に適切なコドンで設計することができる。次に完全な配列は、標準手法によって調製された重複オリゴヌクレオチドからアセンブリされ、完全なコード配列にアセンブリされる。例えば、Ｅｄｇｅ（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ  ２９２：７５６；Ｎａｍｂａｉｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２３：１２９９；及びＪａｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：６３１１を参照されたい。
【００８７】
したがって、特定のヌクレオチド配列は、所望の配列を有するベクターから得ることができる、又は適切な場合、例えば、部位特異的突然変異誘発及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術などの当該技術分野において周知の様々なオリゴヌクレオチド合成技術を使用して完全に若しくは部分的に合成することができる。例えば、上記Ｓａｍｂｒｏｏｋを参照されたい。特に、所望の配列をコードするヌクレオチド配列を得る１つの方法は、従来の核酸自動合成装置で産生された重複合成オリゴヌクレオチドの補集合をアニールし、続けて適切なＤＮＡリガーゼによるライゲーション、及びＰＶＲを介してライゲーションされたヌクレオチド配列の増幅を行うことによるものである。例えば、Ｊａｙａｒａｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：４０８４〜４０８８を参照されたい。加えて、オリゴヌクレオチド指向性合成（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ５４：７５〜８２）、既存のヌクレオチド領域のオリゴヌクレオチド指向性突然変異誘発（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３〜３２７及びＶｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４〜１５３６）、及びＴ．ｓｕｂ．４  ＤＮＡポリメラーゼを用いるギャップの付いたオリゴヌクレオチドの酵素的充填（Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１００２９〜１００３３）を本発明の下で使用して、変化した若しくは強化された抗原結合能力及び／又は低減した免疫原性を有する分子を提供することができる。
【００８８】
ＮＳ３、又は他のＨＣＶ抗原などの所望のヌクレオチド配列の突然変異体又は類似体を産生する方法は、周知である。例えば、Ｄａｓｍａｈａｐａｔｒａら、米国特許番号第５，８４３，７５２号、及びＺｈａｎｇら、同第５，９９０，２７６号を参照されたい。イムノアッセイで用いる改変されたＮＳ３及び他のＨＣＶタンパク質は、目的のポリペプチドをコードする配列の一部の欠失により、配列の挿入により、及び／又は配列内の１つ又は２つ以上のヌクレオチドの置換により、調製され得る。ヌクレオチド配列を改変するための技術（例えば、部位特異的突然変異誘発など）は、当業者に周知である。例えば、上記Ｓａｍｂｒｏｏｋら；Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８５）８２：４４８；Ｇｅｉｓｓｅｌｓｏｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ５：７８６；Ｚｏｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ（１９８３）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００：４６８；Ｄａｌｂｉｅ−ＭｃＦａｒｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７９：６４０９を参照されたい。
【００８９】
ひとたびコード配列が調製されるか又は単離されると、そのような配列を、任意の好適なベクター又はレプリコンの中にクローン化することができる。多くのクローニングベクターは、当業者らに周知であり、適切なクローニングベクターの選択は、選択できる問題である。好適なベクターとしては、適切な制御エレメントと関連付けられたときに複製することができるプラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、又はウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９０】
次にコード配列を、発現に使用される系に依存して好適な制御エレメントの制御下に置く。したがって、目的のＤＮＡ配列が好適な形質転換体によってＲＮＡに転写されるように、コード配列を、プロモーター、リボソーム結合部位（細菌発現のため）、及び所望により作動因子、の制御下に置くことができる。コード配列は、翻訳後プロセシングにおいて、後で宿主によって除去することができるシグナルペプチド又はリーダー配列を含んでも含まなくてもよい。例えば、米国特許第４，４３１，７３９号；同第４，４２５，４３７号；同第４，３３８，３９７号を参照されたい。
【００９１】
コントロール配列に加えて、宿主細胞の増殖に対して配列の発現の調整を可能にする調節配列を追加することが望ましい場合がある。調節配列は、当業者らに周知であり、例として、制御化合物の存在を含む化学的又は物理的刺激に応答して遺伝子の発現をオンオフさせる調節配列が挙げられる。他のタイプの制御エレメントもまたベクター内に存在してもよい。例えば、エンハンサーエレメントは、構築物の発現レベルを向上させるために本明細書で使用され得る。例として、ＳＶ４０初期遺伝子エンハンサー（Ｄｉｊｋｅｍａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）ＥＭＢＯ  Ｊ．４：７６１）、Ｒｏｕｓ  Ｓａｒｃｏｍａ  Ｖｉｒｕｓの長端末反復（ＬＴＲ）由来のエンハンサー／プロモーター（Ｇｏｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７９：６７７７）及びヒトＣＭＶ由来のエレメント（Ｂｏｓｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｃｅｌｌ  ４１：５２１）（例えば、ＣＭＶイントロンＡ配列に含まれるエレメントなど（米国特許第５，６８８，６８８号））が挙げられる。発現カセットは、好適な宿主細胞における自律複製のための複製起点、１つ又は２つ以上の選択可能マーカー、１つ又は２つ以上の制限部位、高いコピー数の潜在能力、及び強力なプロモーターを更に含み得る。
【００９２】
発現ベクターは、特定のコード配列が適切な調節配列と共にベクター内に位置するように構築され、コード配列の位置及び向きは、コード配列がコントロール配列の「制御」下で転写されるようなものである（すなわち、コントロール配列でＤＮＡ分子に結合するＲＮＡポリメラーゼは、コード配列を転写する）。目的の分子をコードする配列の改変が、この結果を得るために望ましい場合がある。例えば、場合によっては、適切な向きでコントロール配列に接着することができるように（すなわち、読み枠を維持するために）、配列を改変することが必要な場合がある。コントロール配列及び他の調節配列は、ベクターへの挿入の前にコード配列にライゲーションされてもよい。あるいは、コード配列は、コントロール配列及び適切な制限部位を既に含む発現ベクター内に直接クローン化することができる。
【００９３】
分子は、昆虫、哺乳類、細菌、ウイルス、及び酵母の発現系を含む、広範な種類の系で発現することができ、これらは全て当該技術分野において周知である。例えば、バキュロウイルス系などの昆虫細胞発現系は、当業者らに周知であり、例えば、Ｓｕｍｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｔｅｘａｓ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ  Ｓｔａｔｉｏｎ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  Ｎｏ．１５５５（１９８７）に記載されている。バキュロウイルス／昆虫細胞発現系の材料及び方法は、キット形式で、とりわけ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）から市販されている（「ＭａｘＢａｃ」キット）。同様に、細菌及び哺乳類の細胞発現系は、当該技術分野において周知であり、例えば、上記Ｓａｍｂｒｏｏｋらに記載されている。酵母発現系もまた、当該技術分野において周知であり、例えば、Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｂａｒｒ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９８９）Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ，Ｌｏｎｄｏｎに記載されている。
【００９４】
上記の系で使用するための多数の適切な宿主細胞もまた周知である。例えば、哺乳類細胞株は、当該技術分野において周知であり、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な不死化細胞株を含む（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎培養細胞（ＣＯＳ）、ヒト胎児由来腎臓細胞、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ  Ｇ２）、メイディンダービーウシ腎臓（「ＭＤＢＫ」）細胞、並びにその他であるが、これらに限定されない）。同様に、細菌宿主（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、及びＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ）は、本発現構築物との使用を見出すだろう。本発明における有用な酵母宿主としては、とりわけ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｉｌｌｅｒｉｍｏｎｄｉｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、及びＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａが挙げられる。バキュロウイルス発現ベクターと共に使用する昆虫細胞としては、とりわけ、Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ、Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、及びＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉが挙げられる。
【００９５】
目的のヌクレオチド配列を含む核酸分子は、当該技術分野において周知の様々な遺伝子送達技術を用いて、宿主細胞ゲノムの中に安定的に組み込むことができ、又は好適な宿主細胞内で安定したエピソームエレメント上に維持することができる。例えば、米国特許第５，３９９，３４６号を参照されたい。
【００９６】
選択された発現系及び宿主に応じて、分子は、上述の発現ベクターによって形質転換された宿主細胞を成長させることによってタンパク質が発現する条件下で産生される。発現したタンパク質を次に宿主細胞から単離し、精製する。発現系が、増殖培地中にタンパク質を分泌する場合、生産物を培地から直接精製することができる。分泌しない場合、これを細胞可溶化物から単離することができる。適切な増殖条件及び回収方法の選択は、当業者の技能の範囲内である。
【００９７】
様々なＨＣＶ抗原の組み換え産生が、説明されている。例えば、国際公開第９４／０１７７８号、同第９３／００３６５号、同第０４／００５４７号、及び同第０１／３８３６０号；米国特許第５，３５０，６７１号、同第５，６８３，８６４号、同第６，３４６，３７５号、同第６，１５０，０８７号、同第６，５１４，７３１号、同第６，４２８，７９２号、及び同第６，６３２，６０１号；Ｃｈｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔ．Ｈｅｐａｔｏｌ．（１９９３）８：Ｓ３３〜３９；Ｃｈｉｅｎ，Ｄ．Ｙ．，国際公開第９４／０１７７８号；Ｃｈｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）８９：１００１１〜１００１５；（それらの全ての開示を全体にわたり参考として引用し、本明細書に組み込む）を参照されたい。ＮＳ４ａ／改変されたＮＳ３ポリペプチドを産生する好ましい方法を以下に説明する。
【００９８】
免疫診断アッセイ
ひとたび産生されると、そのＨＣＶ抗原を、周知の抗原を使用する実質的に任意のアッセイ形式で使用して、抗体を検出することができる。これらのアッセイ全ての共通の特徴は、サンプル中に存在する任意のそのような抗体に、抗原が結合することを可能にする条件下で、抗原を、ＨＣＶ抗体を含むと疑われる生体サンプルと接触させることである。そのような条件は、典型的には、過剰の抗原を使用した、生理的な温度、ｐＨ、及びイオン強度であろう。抗原の検体によるインキュベーションの後に、抗原からなる免疫複合体の検出が続く。
【００９９】
イムノアッセイの設計は、大きな変動の対象であり、多くの形式が当該技術分野において周知である。プロトコルは、例えば、固体担体、又は免疫沈降を使用してもよい。ほとんどのアッセイは、標識された抗体又はポリペプチドの使用を伴う；この標識は、詳細に上述されたように例えば、酵素分子、蛍光分子、化学発光分子、放射能分子、又は色素分子であってもよい。免疫複合体からのシグナルを増幅するアッセイも周知である；その例は、ビオチン及びアビジンを利用するアッセイ、並びに酵素標識及び酵素媒介イムノアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイなど）である。
【０１００】
イムノアッセイは、制限なしに、不均一形式若しくは均一形式で、かつ標準型又は競合型のものであってもよい。不均一形式では、ポリペプチドは、典型的に固体マトリックス又は固体担体に結合されて、インキュベーション後のポリペプチドからのサンプルの分離を促進する。固体担体は、この発明の目的のために、不溶性マトリックスである任意の材料であり得、剛体面又は半剛体面を有し得る。代表的な固体担体として、ニトロセルロースのような基質（例えば、膜又はマイクロタイターウェル形態で）；ポリ塩化ビニル（例えば、シート又はマイクロタイターウェル）；ポリスチレンラテックス（例えば、ビーズ又はマイクロタイタープレート）；ポリビニリデンフルオリド；ジアゾ化紙；ナイロン膜；活性化ビーズ、磁気応答性ビーズなどが挙げられるが、これらに限定されない。特定の担体としては、プレート、ペレット、ディスク、毛管、中空繊維、針、ピン、中実繊維、セルロースビーズ、細孔ガラスビーズ、シリカゲル、必要に応じてジビニルベンゼンで架橋されたポリスチレンビーズ、グラフトコポリビーズ、ポリアクリルアミドビーズ、ラテックスビーズ、必要に応じてＮ−Ｎ’−ビス−アクリロイルエチレンジアミンで架橋されたジメチルアクリルアミドビーズ、及び疎水性ポリマーでコーティングされたガラス粒子が挙げられる。
【０１０１】
必要に応じて、固体担体に追加されるべき分子を、容易に官能化して、スチレン部分又はアクリレート部分を作製することができ、このようにしてポリスチレン、ポリアクリレート若しくは他のポリマー、例えばポリイミド、ポリアクリルアミド、ポリエチレン、ポリビニル、ポリジアセチレン、ポリフェニレン−ビニレン、ポリペプチド、多糖類、ポリスルホン、ポリピロール、ポリイミダゾール、ポリチオフェン、ポリエーテル、エポキシ、シリカガラスシリカゲル、シロキサン、ポリホスフェート、ハイドロゲル、アガロース、セルロースなどへのこの分子の取り込みを可能にする。
【０１０２】
アッセイにおいて、例えば、ＮＳ４ａ／改変されたＮＳ３ポリペプチド及び別のＨＣＶ抗原など１種より多いＨＣＶ抗原が使用される場合、抗原を、同じ固体基質又はアッセイで組み合わされる異なる固体基質上に提供することができる。したがって、例えば、抗原は、別個の実体として、例えばプレート上に存在し得、又は、例えば目的のアッセイで使用するために共に追加される個々のマイクロビーズ上に存在し得る。
【０１０３】
１つの状況では、図６に示されるように、固体担体は、分子が担体に十分に固定されるような好適な結合条件下で最初にＮＳ４ａ／改変されたＮＳ３ポリペプチド（本明細書では集合的に「固相成分」と呼ばれる）などのＨＣＶ抗原と反応する。時として、担体への固定は、抗原のより良好な固相結合特性を有するタンパク質への最初のカップリングによって強化することができる。好適なカップリングタンパク質として、マクロ分子、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシニアン、免疫グロブリン分子、サイログロブリン、オボアルブミン、及び当業者に周知である他のタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。分子を担体に結合するために使用され得る他の試薬は、ポリサッカライド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合アミノ酸、アミノ酸コポリマーなどが挙げられる。そのような分子及びこれらの分子を抗原にカップリングする方法は、当業者に周知である。例えば、Ｂｒｉｎｋｌｅｙ，Ｍ．Ａ．（１９９２）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．３：２〜１３；Ｈａｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６：５６〜６３；及びＡｎｊａｎｅｙｕｌｕ  ａｎｄ  Ｓｔａｒｏｓ（１９８７）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊ．ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．３０：１１７〜１２４を参照されたい。
【０１０４】
固体担体を固相成分と反応させた後、任意の非固定化固相成分は、洗浄によって担体から除去され、担体に結合した成分を、次に好適な結合条件下で、ＨＣＶ抗体を含むと疑われる生体サンプル（本明細書では集合的に「リガンド分子」と呼ばれる）と接触させる。ＨＣＶ抗体がサンプル中に存在する場合、これらは、ＨＣＶ抗原と共に複合体を形成するだろう。任意の非結合リガンド分子を除去するために洗浄した後、抗ＨＣＶ抗体上のエピトープを認識する抗異種（例えば、抗ヒト）抗体など、検出可能に標識された抗体を追加する。これらの抗体は、複合体形成によって結合する。
【０１０５】
当該技術分野において周知である、更なるアッセイ形式では、ストレプトアビジンでコーティングされた固体担体は、改変されたＮＳ３に結合するビオチン標識抗体と反応する。生体サンプルを、好適な結合条件下で追加する。ＨＣＶ抗体がサンプル中に存在する場合、これらは、ＨＣＶ抗原と共に複合体を形成するだろう。任意の非結合リガンド分子を除去するために洗浄した後、検出可能に標識された抗体を上述のように添加する。
【０１０６】
均一形式では、テストサンプルを、溶液中の抗原の組み合わせと共にインキュベートする。例えば、形成される任意の抗原抗体複合体を沈降させる条件下にあってもよい。均一アッセイに関する標準形式及び競合形式の両方が、当該技術分野において周知である。
【０１０７】
標準形式では、抗体抗原複合体を形成するＨＣＶ抗体の量を直接監視する。これは、抗ＨＣＶ抗体上のエピトープを認識する標識された抗異種（例えば、抗ヒト）抗体が、複合体形成が原因で結合するかどうかを決定することによって達成され得る。競合形式では、サンプル内のＨＣＶ抗体の量が、複合体における既知の量の標識抗体（又は他の競合するリガンド）の結合で競合効果を監視することによって推定される。
【０１０８】
より具体的には、抗ＨＣＶ抗体（又は、競合アッセイの場合、競合する抗体の量）を含んで形成される複合体は、形式に依存して、多数の周知の技術のいずれかによって検出される。例えば、複合体における未標識ＨＣＶ抗体は、標識（例えば、酵素標識）と複合された抗異種Ｉｇの抱合体を使用して検出することができる。免疫沈降又は凝集アッセイの形式において、ＨＣＶ抗原と抗体との間の反応は、溶液又は懸濁液から沈降するネットワークを形成し、沈降物の可視層又は薄膜を形成する。生体サンプル中に抗ＨＣＶ抗体が存在しない場合は、可視の沈降物は形成されない。結合された抗体及び抗原を有するイムノアッセイ固体担体、並びに捕捉したサンプルと反応することになる抗体及び抗原を含む上述のアッセイ試薬は、上述のようにイムノアッセイを行うために好適な指示書及び他の必要な試薬と共にキットで提供され得る。そのキットは、通常、抗原及び／又は抗体の組み合わせ（固体担体に結合されていても、固体担体に結合するための試薬と別でもよい）、コントロール抗体及び／又は抗原の処方物（陽性及び／又は陰性）、アッセイ形式が標識抗体及び／又は抗原を要求する場合の標識抗体及び／又は抗原、並びに標識がシグナルを直接生成しない場合のシグナル生成試薬（例えば、酵素基質）を別個の容器で含む。アッセイを実行するための指示書（例えば、文書、テープ、ＶＣＲ、ＣＤ−ＲＯＭなど）は、通常キットの中に含まれるであろう。キットは、使用される特定のイムノアッセイに応じて、他のパッケージ試薬及び材料（すなわち洗浄緩衝液など）も含む場合がある。上述されたような標準イムノアッセイは、これらのキットを使用して実行することができる。
【０１０９】
同様に、抗ＨＣＶ抗体はまた、抗体を検出するための周知の抗原と組み合わせて、抗原を検出するための周知の抗体を使用する実質上任意のアッセイ形式で使用され得る。図７に示されるように、固体担体は、ＨＣＶ抗原（ＮＳ４ａ／改変されたＮＳ３ポリペプチドとして示される）と反応し、また抗ＨＣＶコア抗体とも反応する。
【０１１０】
ＩＩＩ．実験
以下は、本発明を実施するための特定の実施形態の実施例である。実施例は、例示の目的のみで提供され、いかなるようにも本発明の範囲を限定することを意図しない。
【０１１１】
使用された数字（例えば、量、温度など）に対する精度を確保する努力がなされたが、ある程度の実験誤差及び偏差は、当然ながら許容されるべきである。
【０１１２】
Ｃ型肝炎ウイルス特異抗体の早期発見のためにイムノアッセイの感度を向上させるためのＮＳ４ａ／改変されたＮＳ３ポリペプチド立体構造抗原のクローニング、発現、及び精製。
【０１１３】
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（ＡＤ３株）における直接発現のためにＨＣＶ  ＮＳ４ａ／ＮＳ３．ＫＫ変異体セリンプロテアーゼの遺伝子組み換えを行った。発現カセットを、ｐＢＳ２４．１酵母発現ベクター内にクローン化した（図２）。ｐＢＳ２４．１酵母シャトルベクターは、酵母における自律複製のための２μ配列、並びに選択可能マーカーとして酵母遺伝子ｌｅｕ２−ｄ及びＵＲＡ−３を含む。βラクタマーゼ遺伝子及びＣｏｌＥ１複製起点は、細菌におけるプラスミド複製に必要である。抗原／タンパク質は、ハイブリッドＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターの制御下で発現する。ＮＳ４ａ／ＮＳ３．ＫＫ変異体抗原（図３参照）は、可撓性ＳＧＳ（Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）配列を通してＮＳ３のＮ末端に接着されるＮＳ４ａタンパク質の１３ａａセグメント（最小ドメインと呼ばれる）を利用する。この配列は、ＮＳ４ａを、プロテアーゼ内部のポケットの中に折り畳み、酵素的に活性な分子を作製することができるようにする。ＮＳ３プロテアーゼ活性による自己加水分解を回避するために、プロテアーゼの触媒トライアドの（配列番号１の）Ｓｅｒ１１６５を、米国特許第７，４９１，８０８Ｂ２で以前に説明されたように、Ａｌａに変異させた。加えて、１組の帯電したＬｙｓ残基を、プロテアーゼのＮ末端上に導入し（配列番号１のＨＣＶ  ａａ１０４３及び１０４４）、Ｉｌｅ残基を置換して、精製されたＮＳ４ａ／ＮＳ３分子の可溶性を向上させた。米国特許第７，４９１，８０８Ｂ２号に記載されるＮＳ３ドメインは、Ｔｙｒ１４２８Ｐｒｏ及びＳｅｒ１４２９Ｉｌｅ（配列番号１を基準として）に突然変異を有する（ＰＩ突然変異と省略され、プロテアーゼ開裂部位を除去するために導入された）。これらのＰＩ突然変異は、セリンプロテアーゼの活性が除去されているので、本明細書では、ＮＳ４ａ／ＮＳ３．ＫＫ変異体内で除去され、天然のＨＣＶ１ａ配列、Ｔｙｒ１４２８及びＳｅｒ１４２９に戻される。配列番号１の１４２８位でのＰｒｏ置換は、ＮＳ４ａ／ＮＳ３分子の立体構造の不安定化効果を及ぼした恐れがある。
【０１１４】
図４は、発現プラスミドｐｄ．４ａ．ｔ．ｎｓ３．１１６５．ＫＫ（配列番号２）の環状マップを示す。
【０１１５】
クローニング。
３つの突然変異（Ｉｌｅ１０４３Ｌｙｓ、Ｉｌｅ１０４４Ｌｙｓ、Ｓｅｒ１１６５Ａｌａ）を有するＮＳ４ａ−ターン−ＮＳ３をコードするプラスミドｐｄ．４ａ．ｔ．ｎｓ３．１１６５．ＫＫを以下のように４工程の手順で生成した。
【０１１６】
最初に、次のＤＮＡ断片を共にライゲーションした：（ａ）米国特許第７，４９１，８０８号に記載されるように、ｐＳＰ７２．ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｃｌａ．４ａ．ｔ．ｎｓ３．１１６５＃１４から調製されたＡｖｒ２−ＣｌａＩ脱リン酸化ベクター、（８０３ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＣｌａＩ挿入は、配列番号５：ＡＣＡＡＡＡＣＡＡＡの配列、イニシエーターＡＴＧ、引き続きＮＳ４のａａ  １６７８〜１６９０のためのコドン、Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒターン配列及びＮＳ３  ａａ  １０２９〜１２７４（配列番号１を基準として）を提供する。アミノ酸１１６５を、ＳｅｒからＡｌａに変異させた。ｐＳＰ７２は、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ），ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬアクセッション番号Ｘ６５３３２から入手される市販のベクターである）；（ｂ）Ａｖｒ２−ＢｇｌＩ制限末端を有し、ＨＣＶ  ａａ  １０４０〜１０４６をコードする、かつ所望のＩｌｅ１０４３Ｌｙｓ及びＩｌｅ１０４４Ｌｙｓ突然変異を導入する合成オリゴヌクレオチド、ＡＢ−１及びＡＢ−２；（ｃ）ｐＳＰ７２．ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｃｌａ．４ａ．ｔ．ｎｓ３．１１６５＃１４からゲル精製した６８３ｂｐのＢｇｌＩ−ＣｌａＩ  ＤＮＡフラグメント；ＢｇｌＩ−ＣｌａＩフラグメントは、ＨＣＶ  ＮＳ３  ａａ  １０４６〜１２７４をコードする。
【０１１７】
ＡＢ−１
配列番号６：ＣＴＡＧＧＧＴＧＣＡＡＧＡＡＧＡＣＣＡＧＣＣＴＡＡＣ
【０１１８】
ＡＢ−２
配列番号７：ＡＧＧＣＴＧＧＴＣＴＴＣＴＴＧＣＡＣＣ
【０１１９】
ライゲーション混合物をＨＢ１０１コンピテントセルに形質転換し、１００ｕｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬｕｒｉａ寒天プレート上に平板培養した。個々のクローンのＭｉｎｉｐｒｅｐ解析は、推定される陽性の同定を導き、それらは増幅され、配列決定された。正しい配列を有するクローンは、ｐＳＰ７２．ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｃｌａ．４ａ．ｔ．ｎｓ３．１１６５．ＫＫ＃１と命名された。プラスミドのアリコートを、続いてＥ．ｃｏｌｉ株ＳＣＳ１１０に形質転換して、後続のクローニング工程で必要とされるＣｌａＩ制限部位をブロックするｄａｍメチル化を回避した。（ｐＴ７ＨＣＶは、ＣｈｏｏらのＨＣＶの配列番号１とは、アミノ酸残基９が、Ｋの代わりにＲであり、アミノ酸残基１１が、Ｎの代わりにＴであるという点だけが異なる。）
【０１２０】
２番目に、天然のＨＣＶ１ａ配列（配列番号１）のＮＳ３  ａａ  １２７４〜１６５７のためのコドンを提供するＣｌａＩ−ＳａｌＩフラグメントをクローニングする目的のために次のＤＮＡ断片を共にライゲーションした：（ａ）ｐＳＰ７２から調製されたＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｌＩ脱リン酸化ベクター；（ｂ）ｐＳＰ７２．ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｃｌａ．４ａ．ｔ．ｎｓ３．１１６５＃１４から調製された８０３ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＣｌａＩ制限フラグメント；（ｃ）米国特許第７，４４９，５６６（Ｂ２）号に記載されるように、ＮＳ３  ａａ  １２７４〜ａａ  １６４７をコードする、ｐＴ７ＨＣＶから調製された、ＨＣＶ１ａゲノム全体（配列番号１を参照）を包含するｐＵＣ１８構築物である、１１２１ｂｐのＣｌａＩ−ＡｖａＩＩＩ制限フラグメント（以下もまた参照されたい：Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｖａｊｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２００６：８７，ｐ．２２５３〜２２６２；（ｄ）ａａ  １６５７までのＮＳ３配列を完成させ、また２つの終止コドンをコードする、２つのＡｖａＩＩＩ−ＳａｌＩオリゴヌクレオチド、ａｖｓａｌ−１及びａｖｓａｌ−２）。
【０１２１】
ａｖｓａｌ−１
配列番号８：ＴＧＴＣＧＧＣＣＧＡＣＣＴＧＧＡＧＧＴＣＧＴＣＡＣＧＴＧＡＴＡＡＧ
【０１２２】
ａｖｓａｌ−２
配列番号９：ＴＣＧＡＣＴＴＡＴＣＡＣＧＴＧＡＣＧＡＣＣＴＣＣＡＧＧＴＣＧＧＣＣＧＡＣＡＴＧＣＡ
【０１２３】
ライゲーション混合物をＨＢ１０１コンピテントセルに形質転換し、１００ｕｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬｕｒｉａ寒天プレート上に平板培養した。個々のクローンのＭｉｎｉｐｒｅｐ解析は、推定される陽性の同定を導き、それらは増幅され、配列決定された。正しい配列を有するクローンは、ｐＳＰ７２．４ａ．ｔ．ｎｓ３．１１６５＃２と命名された。プラスミドのアリコートを、続いてＥ．ｃｏｌｉ株ＳＣＳ１１０に形質転換して、ＣｌａＩ制限部位をブロックするｄａｍメチル化を回避した。
【０１２４】
３番目に、酵母発現ベクターの中に直接クローニングする試みが失敗したので、サブクローニングベクターの中に４ａ．ｔ．ｎｓ３．１１６５．ＫＫコード配列全体をクローニングする目的のために次のＤＮＡ断片を共にライゲーションした：（ａ）ｐＳＰ７２から調製されたＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｌＩ脱リン酸化ベクター；（ｂ）ｐＳＰ７２．ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｃｌａ．４ａ  ｔ．ｎｓ３．１１６５．ＫＫ＃１からの８０３ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＣｌａＩフラグメント；（ｃ）ｐＳＰ７２．４ａ．ｔ．ｎｓ３．１１６５＃２からの１１５８ｂｐのＣｌａＩ−ＳａｌＩフラグメント。ライゲーション混合物をＨＢ１０１コンピテントセルに形質転換し、１００ｕｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬｕｒｉａ寒天プレート上に平板培養した。個々のクローンのＭｉｎｉｐｒｅｐ解析は、ｐＳＰ７２．４ａ．ｔ．ｎｓ３．１１６５．ＫＫ＃３と命名された陽性クローンの同定を導いた。
【０１２５】
最後に、酵母発現プラスミドを作製するために次のＤＮＡ断片を共にライゲーションした：（ａ）ＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ脱リン酸化ｐＢＳ２４．１酵母発現ベクター；（ｂ）酵母ハイブリッドプロモーターＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨのための１３６６ｂｐのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント；（ｃ）ｐＳＰ７２．４ａ．ｔ．ｎｓ３．１１６５．ＫＫ＃３からの１９６１ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｌＩフラグメント。ライゲーション混合物を、ＨＢ１０１コンピテントセルに形質転換した。ミニスクリーン解析後、予想される３３２５ｂｐのＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ制限フラグメントを有するクローンは、ｐｄ．４ａ．ｔ．ｎｓ３．１１６５．ＫＫ＃７として同定された（図４）。
【０１２６】
酵母形質転換。
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＡＤ３（ＭＡＴａ，ｌｅｕ２，ｕｒａ３−５２，ｐｒｂ１−１１２２，ｐｅｐ４−３，ｐｒｃ１−４０７，ｇａｌ２，［ｃｉｒ０］，：ｐＤＭ１５（ｐＧＡＰ／ＡＤＲ１：Ｇ４１８Ｒ），：Ｙｉｐ５ΔｌｅｕＡＤ）を、Ｓ．ｃ．ＥａｓｙＣｏｍｐ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）より入手される）を使用して、ｐｄ．４ａ．ｔ．ｎｓ３．１１６５．ＫＫ  ＃７によって形質転換した。ウラシルを含まない寒天プレートで増殖された形質転換体（８％グルコースを用いたＵｒａ−寒天プレート）を、単一のコロニーについて画線し、Ｌｅｕ−８％グルコース寒天プレート上にパッチして、プラスミドコピー数を増加させた。７．１％グルコースを含有するＬｅｕ−液体スターター培養物を３０℃で２４時間にわたり増殖させ、次に、ＹＥＰＤ（１％酵母抽出物、２％バクトペプトン、２％グルコース）培地に１：２０に希釈した。細胞を３０℃で４８時間及び２５℃で増殖させた。発現をテストするために、細胞のアリコートを、溶解緩衝液中でガラスビーズを用いて溶解した。組み換えタンパク質は、クマシーブルー染色によって検出され、モノクローナル抗体の抗Ｃ３３Ｃ  ４Ｄ−１を使用した免疫ブロット解析によって確認されたように酵母において高レベルで発現した。（この抗体は、Ｓａｎｓａｎ  Ｌｉｎ  ｅｔ．ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｇ．２００５，ｐ．３９１７〜３９２４に記載されている。）
【０１２７】
組み換えＨＣＶ  ４ａ．ｔ．ＮＳ３．１１６５．ＫＫタンパク質の精製（ターン変異体ＫＫを「ＴＭＫＫ」とする）。
【０１２８】
ＴＭＫＫタンパク質（ＮＳ４ａ／改変されたＮＳ３ポリペプチド）を次のように精製した：ＮＳ４ａ．ｔ．ＮＳ３．１１６５ＫＫターン変異体を発現するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞を、回収し、溶解緩衝液中（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ８．０、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、Ｒｏｃｈｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅプロテアーゼ阻害剤錠剤）に懸濁させ、Ｄｙｎｏ−Ｍｉｌｌ（Ｗａｂ  Ｗｉｌｌｙ  Ａ．Ｂａｃｈｏｆｏｎ（Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ））又は同等の装置内で、ガラスビーズを、細胞：緩衝液：０．５ｍｍガラスビーズを１：１：１の比で使用して溶解した。３５分間の溶解後、可溶化物のサンプルを顕微鏡法によって視覚的に検査して、細胞破損が少なくとも９５％完了したことを確認した。可溶化物を採取して、１７，７００×ｇで３０分間４℃にて遠心分離し、可溶性タンパク質を含むペレットを、抽出緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ８．０、１Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ；２ｍＬ／初期細胞ペレットの重量ｇ）に追加し、ビーカー内で３０分間室温にて撹拌した。この懸濁液を、３０，１００×ｇで３０分間４℃にて遠心分離し、可溶化されたＴＭＫＫを含む上澄を、更なる精製のために採取した。
【０１２９】
固体硫酸アンモニウムをこの上澄に３０％の濃度まで追加して、氷上で３時間撹拌した。沈降物を、３０，１００×ｇで３０分間４℃での遠心分離によって採取した。ペレットを１×ＰＢＳ（０．５ｍＬ／ｇｍ開始ペレット重量）に再懸濁し、３０分間室温で撹拌し、次に希釈緩衝液＃１（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ７．５、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＤＴＴ、１０％グリセロール）で４倍に希釈した。希釈された懸濁液を静かに一晩４℃にて撹拌した。
【０１３０】
一晩の撹拌後、この懸濁液を、３０，１００×ｇで４℃にて遠心分離した。上澄を採取し、希釈緩衝液＃２（５０ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ６．０、５ｍＭ  ＤＴＴ、０．０２％  Ｔｗｅｅｎ−２０、１０％グリセロール）で２倍に希釈し、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  ｉｏｎ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｃｏｌｕｍｎ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用した。ローディングが完了すると、カラムをＳＰカラム緩衝液（５０ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ６．０、３７．５ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＤＴＴ、０．０２％  Ｔｗｅｅｎ−２０、１０％グリセロール）で洗浄し、カラム緩衝液中で最大０．７Ｍまで増加するＮａＣｌ勾配を用いてＴＭＫＫをカラムから溶出した。画分を、クマシー染色されたＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルの目視検査に基づきプールした。
【０１３１】
ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ精製したＴＭＫＫを含むプールを、希釈緩衝液＃３（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ８．０、５ｍＭ  ＤＴＴ、１０％グリセロール）で２倍に希釈し、ｐＨを８．０に調節した。サンプルを、カラム緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＤＴＴ、０．０２％  Ｔｗｅｅｎ−２０、１０％グリセロール）中で平衡化されたｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ  ｔｙｐｅ  ＩＩ  ｃｏｌｕｍｎ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に適用した。ローディングが完了すると、カラムを２００ｍＭ  ＮａＣｌを含むカラム緩衝液で洗浄した。２８０ｎｍで測定された吸光度が基準に戻るまでロード及び洗浄の画分を採取した。カラムは、再生緩衝液（５００ｍＭ  ＮａＰＯ４  ｐＨ７．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＤＴＴ、０．０２％  Ｔｗｅｅｎ−２０、１０％グリセロール）で剥離された。画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析し、精製されたＴＭＫＫタンパク質を含む流れる画分及び洗浄の画分をプールした。３０ｋＤのカットオフコンセントレーターを使用してプールを１〜２ｍｇ／ｍＬに濃縮し、−８０℃で保存した。
【０１３２】
試薬の調製（１）
精製水に、リン酸水素二ナトリウムを１．６２７ｇ／Ｌ、リン酸二水素二ナトリウムを１．１６２ｇ／Ｌ、塩化ナトリウムを２９．２２ｇ／Ｌ、エデト酸二ナトリウムを０．３３６ｇ／Ｌ、カゼインナトリウムを１．０ｇ／Ｌ、及びＰｒｏＣｌｉｎを０．５ｍＬ／Ｌ添加して、ｐＨを約７．３に調節することによって、ベース緩衝液を調製した。好適な量の上記ベース緩衝液に、ＴＷＥＥＮ２０（商標）を５ｍＬ／Ｌ、ＳＤＳ溶液（１％）を２０ｍＬ／Ｌ、酵母抽出物を０．５ｇ／Ｌ、及びＢＳＡ溶液（３０％）を１０ｇ／Ｌ添加して、ｐＨを６．４に調節し、結果として得られた溶液を、０．２２μｍのメンブランフィルタを通過させることによって、サンプル希釈剤を調製した。
【０１３３】
同じ方法で、精製水に、リン酸二水素ナトリウムを３．２８ｇ／Ｌ、リン酸カリウムを１３．２８ｇ／Ｌ、塩化ナトリウムを１７．５６ｇ／Ｌ、エデト酸二ナトリウムを０．３７２ｇ／Ｌ、Ｄｅｘｔｒａｎ  Ｔ２０００を１０ｇ／Ｌ、スクロースを１０ｇ／Ｌ、ＰＶＰ（ｋ＝３０）を１０ｇ／Ｌ、ＰｒｏＣｌｉｎを０．５ｍＬ／Ｌ、ＢＳＡを２０ｇ／Ｌ、カゼインナトリウムを３ｇ／Ｌ、不活性化ウマ血清を２０ｍＬ／Ｌ、不活性化マウス血清を１０ｍＬ／Ｌ、ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標）を１０ｍＬ／Ｌ、Ｃ１４ＡＰＳを３ｇ／Ｌ、及びＣ１６ＴＡＢを２ｇ／Ｌ添加して、ｐＨを約７．２に調節し、結果として得られた溶液を、０．２２μｍのメンブランフィルタを通過させることによって、マーカー緩衝液を調製した。
【０１３４】
精製水に、無水クエン酸を４．９３６ｇ／Ｌ、及びリン酸水素二ナトリウムを６．８９５ｇ／Ｌ溶解して、ｐＨを約４．９に調節し、結果として得られた溶液を、０．２２μｍのメンブランフィルタを通過させることによって、基質緩衝液を調製した。１３ｍｇ錠剤のｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩を、６ｍＬの基質緩衝液に溶解することによって、基質試薬を調製した。
【０１３５】
反応停止試薬として、４Ｎ硫酸を使用した。
【０１３６】
精製水に、リン酸二水素ナトリウムを１．０９ｇ／Ｌ、リン酸水素カリウムを０．３１ｇ／Ｌ、塩化ナトリウムを８．２ｇ／Ｌ、Ｔｗｅｅｎ２０を１ｍＬ／Ｌ、及びＰｒｏＣｌｉｎを０．５ｍＬ／Ｌ添加して、結果として得られた溶液を、０．２２μｍのメンブランフィルタを通過させることによって、洗浄緩衝液を調製した。
【０１３７】
精製水に、リン酸二水素ナトリウムを５．４５ｇ／Ｌ、リン酸水素カリウムを１．５５ｇ、及びエデト酸二ナトリウムを０．７４４ｇ／Ｌ添加することによって、抗原の固相化のためのコーティング緩衝液を調製した。このコーティング緩衝液を、ＨＣＶ  ＴＭＫＫ組み換え抗原又はｃ２００組み換え抗原別に添加した（それぞれ２．０μｇ／ｍＬ）。
【０１３８】
精製水に、リン酸緩衝液を好適な量、カゼインナトリウムを１０ｇ／Ｌ、及びスクロースを３０ｇ／Ｌ添加することによって、ブロッキング緩衝液を調製した。
【０１３９】
マーカーとして、「（ＬＫ１１）Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ  ＮＨ２（Ｄｏｊｉｎ  Ｋａｇａｋｕ  Ｋｅｎｋｙｕｓｈｏ）」を使用してＨＲＰでマークされた、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｔｏｋｕｓｈｕ  Ｍｅｎｅｋｉ  Ｋｅｎｋｙｕｓｈｏ）から購入されたマウス抗ヒトＩｇＧモノクローナル抗体（２ＡＨＩＧＧ２）を使用した。
【実施例】
【０１４０】
（実施例１）
ＨＣＶ  ＴＭＫＫ組み換え抗原を含む抗原の固相化のためのコーティング緩衝液を２００μＬ／ウェルの量で分注し、一晩４℃で静置した。ウェル内の液体を除去した後、リン酸緩衝液で１回ウェルを洗浄した。次に、ブロッキング緩衝液を３００μＬ／ウェルの量で分注し、４時間超室温で静置した。ウェル内の液体を除去した後、洗浄緩衝液で１回ウェルを洗浄して、その後固相プレートを作製するために乾燥させた。
【０１４１】
サンプル希釈剤を１７５μＬ／ウェル、及び各サンプルを２５μＬ（Ｕ．Ｓ．ＰｒｏＭｅｄＤｘの市販のヒト血清）を固相プレート内にそれぞれ分注し、それらをプレートミキサーで撹拌し、３７℃で１時間インキュベートした。ウェル内の液体を除去した後、洗浄緩衝液で５回ウェルを洗浄した。次に、マーカー希釈緩衝液で５，０００倍に希釈されたマーカーを有する液体（すなわち、ＨＲＰ有識マウス抗ヒトＩｇＧモノクローナル抗体）を２００μＬ／ウェルの量で分注し、それを３７℃で３０分間インキュベートした。ウェル内の液体を除去した後、洗浄緩衝液で５回ウェルを洗浄した。次いで、基質緩衝液中に０．１％の量で過酸化水素（３０％）を添加することによって調製された基質液体を、２００μＬ／ウェルの量で分注し、３０分間室温で反応させた。５０μＬ／ウェルの量で反応停止溶液を分注した後、プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＤｅｖｉｃｅｓのＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  ３４０ＰＣ）を用いた主波長４９０ｎｍ及び副波長６５０ｎｍの二波長測光を使用して吸光度を測定した。測定された値を表２に示す。
【０１４２】
比較実施例１
抗原の固相化のためのコーティング緩衝液としてＨＣＶ  ＴＭＫＫ組み換え抗原を使用する代わりにｃ２００組み換え抗原を含む液体を用いることを除き、実施例１と同じ手順で光度計測を実行する。測定された値を表２に示す。
【０１４３】
比較実施例２
指示書に従い、上記サンプルから抗体を検出するためにＲＩＢＡ３（Ｏｒｔｈｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した。結果を表２に示す。表中、丸かっこ内のサンプル番号は、ＰｒｏＭｅｄＤｘによって割り当てられたサンプル番号である。「ＮＨＳ」は、正常なヒト血清であり、陰性対照として使用された。
【０１４４】
表２に示されるように、実施例１におけるＴＭＫＫを使用するＣ型肝炎ウイルスの検出又は定量は、比較実施例１におけるｃ２００の使用よりも高い感度を示した。具体的には、比較実施例２のサンプル４〜２３によってＣ型肝炎ウイルス抗体の検出を確認した。しかしながら、比較実施例１におけるｃ２００を用いた定量は、特にサンプル４、５、及び１４に関して不合理に低い感度を示したが、一方で実施例１におけるＴＭＫＫを用いた定量は、高い検出感度を示した。サンプル１〜３のようなＣ型肝炎ウイルス抗体が存在しないサンプルは、実施例１においてさえもより低い定量値を呈した。検出又は定量の精度に問題はない。サンプル１０に関するＲＩＢＡのｃ３３ｃ陽性結果が、恐らく交差反応のためであったことに留意されたい。
【０１４５】
（実施例２）
Ｃ型肝炎ウイルス感染が遺伝子スクリーニングによって確認されているセロコンバージョンパネル（ＺｅｐｔｏＭｅｔｒｉｘ）のパネル「６２１２」、「６２１５」、及び「９０５８」内のサンプルを使用することを除き、実施例１と同じ手順で光度計測を実行した。測定された値を表３〜５に示す。サンプルの枝番（例えば、「−１」、「−２」）が増加するにつれて、サンプルの血液採取日の遅いことを意味する、すなわちＣ型肝炎ウイルス感染がより進行したことを示す。各サンプルに対するＲＩＢＡ３測定値の周知の結果もまた、表３〜５に示す。
【０１４６】
比較実施例２
セロコンバージョンパネル（ＺｅｐｔｏＭｅｔｒｉｘ）のパネル「６２１２」、「６２１５」、及び「９０５８」内のサンプルを使用することを除き、比較実施例１と同じ手順で光度計測を実行した。測定された値を表３〜５に示す。
【０１４７】
感染の初期におけるサンプルに関して、表３に示されるパネル６２１２−０２及び６２１２−０３の場合、抗体の検出は、実施例２においてＴＭＫＫを使用して成功したが、比較実施例２においてｃ２００を使用して、及びＲＩＢＡ３を用いて失敗した。加えて、パネル６２１２−０４及び６２１２−０５での抗体の検出は、実施例２においてＴＭＫＫを、及び比較実施例２においてｃ２００を使用して成功したが、検出感度は、実施例２においてＴＭＫＫでより高かった。
【０１４８】
表４に示されるように、パネル６２１５−０４での抗体の検出は、実施例２においてＴＭＫＫを使用して成功したが、比較実施例２においてｃ２００を使用して失敗した。本発明の試薬の感度は、比較的高い検出感度を有することが周知であるコア抗原（Ｃ２２）以上であったので、本発明の試薬を使用する場合は、コア抗原と組み合わせた使用が必ずしも必要ではないことが確認された。
【０１４９】
表５に示されるように、パネル９０５８−０４のような感染の初期のサンプルでの抗体の検出は、実施例２においてＴＭＫＫを使用して、及びＲＩＢＡ３を用いて成功したが、比較実施例２においてｃ２００を使用して失敗した。サンプルは、ＲＩＢＡ３結果によって示されるようにコア抗体セロコンバーターであり、比較的高い検出感度を有することが周知であるコア抗原（Ｃ２２）との組み合わせの使用の適切性を示唆している。加えて、パネル９０５８−０５での抗体の検出は、実施例２におけるＴＭＫＫの使用及び比較実施例２におけるｃ２００の使用の両方で成功した。しかしながら、その感度は、実施例２におけるＴＭＫＫの使用でより高かった。
【０１５０】
試薬の調製（２）
上述した「試薬の調製（１）」で調製された試薬を、後述の試薬を除き、使用する。
【０１５１】
適切な量の上述のベース緩衝液に、ＴＷＥＥＮ２０（商標）を５ｍＬ／Ｌ、ＳＤＳ溶液（１％）を２０ｍＬ／Ｌ、酵母抽出物を０．５ｇ／Ｌ、ＢＳＡ溶液（３０％）を１０ｇ／Ｌ、ＬＤＡＯを５ｇ／Ｌ、及びＤＴＴ  １ｍＭを添加して、ｐＨを７．３に調節し、結果として得られた溶液を、０．２２μｍのメンブランフィルタを通過させることによって、サンプル希釈剤を調製した。
【０１５２】
精製水に、塩化ナトリウムを５．８５ｇ／Ｌ、無水酢酸ナトリウムを５．１８ｇ／Ｌ、酢酸を２．２ｍＬ／Ｌ、及び硫酸アンモニウムを１１４ｇ／Ｌ、添加し、ｐＨを約４．８に調節することによって、抗体の固相化のためのコーティング緩衝液を調製した。このコーティング溶液を、ｃ１１−３モノクローナル抗体及びｃ１１−７モノクローナル抗体別に添加した（それぞれ１．８μｇ／ｍＬ）。
【０１５３】
マーカーとして、「ＨＣＶ  ｃｏｒｅ  Ａｇ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（Ｏｒｔｈｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）に含まれる標識抗体を、抗原検出のために使用したが、一方「（ＬＫ１１）Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ  ＮＨ２（Ｄｏｊｉｎ  Ｋａｇａｋｕ  Ｋｅｎｋｙｕｓｈｏ）を使用することによってＨＲＰでマークされたＨＣＶ  ＴＭＫＫ組み換え抗原を、抗体検出のために使用した。
【０１５４】
実施例３
抗原の固相化のための上記コーティング緩衝液を２００μＬ／ウェルの量で、９６ウェルマイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ｈｉｇｈ−ｂｉｎｄ  ｔｙｐｅ）に分注し、６時間室温で静置した。ウェル内の液体を除去した後、リン酸緩衝液で３回ウェルを洗浄した。次に、抗原の固相化のための上記コーティング緩衝液を２００μＬ／ウェルの量で分注し、一晩４℃で置いた。ウェル内の液体を除去した後、リン酸緩衝液で１回ウェルを洗浄した。次に、ブロッキング緩衝液を３００μＬ／ウェルの量で分注し、４時間超室温で静置した。ウェル内の液体を除去した後、洗浄緩衝液で１回ウェルを洗浄して、その後固相プレートを作製するために乾燥させた。
【０１５５】
１５０μＬ／ウェルの量でサンプル希釈剤、並びに５０μＬの量でサンプルとしてセロコンバージョンパネル（ＺｅｐｒｏＭｅｔｒｉｘ）の「６２１２」及び「６２２４」を、固相プレート内にそれぞれ分注し、それらをプレートミキサーで撹拌し、３７℃で１時間インキュベートした。ウェル内の液体を除去した後、洗浄緩衝液で５回ウェルを洗浄した。次に、マーカー（すなわち、ＨＲＰ有識ＨＣＶ  ＴＭＫＫ組み換え抗原）がマーカー希釈緩衝液で４０，０００倍に希釈された液体、及びマーカー（すなわち、ＨＲＰ有識抗ＨＣＶコア抗体）がマーカー希釈緩衝液で１００倍に希釈された液体、を２００μＬ／ウェルの量で分注し、それを３７℃で３０分間インキュベートした。ウェル内の液体を除去した後、洗浄緩衝液で５回ウェルを洗浄した。次いで、基質緩衝液中に０．１％の量で過酸化水素（３０％）を添加することによって調製された基質液体を、２００μＬ／ウェルの量で分注し、３０分間室温で反応させた。５０μＬ／ウェルの量で反応停止溶液を分注した後、プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＤｅｖｉｃｅｓのＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  ３４０ＰＣ）を用いた主波長４９０ｎｍ及び副波長６５０ｎｍの二波長測光を使用して吸光度を測定することによって、光度計測を実行した。結果を表６及び７に示す。各サンプルに対するＲＩＢＡ３測定値の周知の結果もまた、表６及び７に示す。表中のＣＯＩは、ＯＤ平均値が１０ＳＤずつ追加されるカットオフ値を適用して、１０単位のＨＣＶ抗体陰性サンプルを測定することによって計算された値である。
【０１５６】
比較実施例３として、以下の点を除き、実施例３と同じ手順で光度計測を実行した：本発明の定量試薬の代わりに市販のＨＣＶ抗原−抗体検出キットである「Ｍｏｎｏｌｉｓａ  ＨＣＶ  Ａｇ−Ａｂ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）」を使用すること；キットの指示書に従いテストを実施すること；及びＯＤ及びＣＯＩを決定すること。比較実施例４として、各サンプルに対する「ＨＣＶ  Ａｇ／Ａｂ  Ｃｏｍｂｏ（ＡＢＢＯＴＴ）の既知のＣＯＩを、表６及び７に示す。更に、比較実施例５として、指示書に従い「ＬＵＭＩＰＵＬＳＥ（商標）Ｏｒｔｈｏ  ＨＣＶ  ａｎｔｉｇｅｎ（Ｏｒｔｈｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した各サンプルにおける抗体量の測定の結果を、表６及び７に示す。各サンプルに対するＲＩＢＡ３測定値の周知の結果もまた、表６及び７に示す。
【０１５７】
表６に示されるように、パネル６２１２−０１及び６２１２−０２のような感染の初期でのサンプルについて、ＨＣＶの検出は、実施例３において抗ＨＣＶコアＡｂｓ及びＴＭＫＫを使用して成功し、比較実施例４で失敗し、比較実施例３に比べて比較実施例４では成功したが低い感度であった。加えて、パネル６２１２−０５及び６２１２−０６に示されるように、抗原量が減少する段階でのサンプルにおけるＨＣＶ検出は、比較実施例５で失敗であったが、ＨＣＶ検出は、実施例３における抗ＨＣＶコアＡｂｓ及びＴＭＫＫを使用して可能であった。
【０１５８】
表７に示されるように、パネル６２２４−０１〜６２２４−０３のような感染の初期でのサンプルについて、ＨＣＶの検出は、実施例３において抗ＨＣＶコアＡｂｓ及びＴＭＫＫを使用して、比較実施例３におけるより高い感度で成功した。加えて、パネル６２２４−０４に示されるように、抗原量が減少する段階でのサンプルにおけるＨＣＶ検出は、比較実施例４で失敗であったが、ＨＣＶ検出は、実施例３における抗ＨＣＶコアＡｂｓ及びＴＭＫＫを使用して成功であった。
【０１５９】
本発明の特定の実施形態が示されてきたが、当然ながら、特に前述の技術を考慮すれば、当業者により改変がなされ得るため、本発明がそれらに限定されないことは理解されるであろう。合理的な変形及び修正が、本発明の趣旨から逸脱することなく本発明の前述の開示の範囲内で可能である。
【０１６０】
【表２】
2020129001.tif 000004
＊ＨＣＶ−１に対して番号が付されている。Ｃｈｏｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：２４５１〜２４５５参照。
【０１６１】
【表３】
2020129001.tif 000005
【０１６２】
【表４】
2020129001.tif 000006
【０１６３】
【表５】
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【０１６４】
【表６】
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【０１６５】
【表７】
2020129001.tif 000009
【０１６６】
【表８】
2020129001.tif 000010
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2020129001.tif 000016
【図７】
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【配列表】
2020129001000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年6月9日(2020.6.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチドであって、配列番号３を有するＣ型肝炎ウイルスＮＳ４ａドメインと、配列番号４を有する改変されたＣ型肝炎ウイルスＮＳ３ドメインであって、前記改変のない配列番号４を有するＣ型肝炎ウイルスＮＳ３ドメインのプロテアーゼ活性と比較して、前記改変されたＣ型肝炎ウイルスＮＳ３ドメインのプロテアーゼ活性を阻害するように、配列番号４の１つ又は２つ以上のアミノ酸残基が改変されている、ドメインと、前記改変されたＮＳ３ドメインのアミノ末端に前記ＮＳ４ａドメインのカルボキシ末端を接続する介在領域と、を含む、ポリペプチド、又は前記ポリペプチドに対して少なくとも９０％のアミノ酸相同性を有するポリペプチド、又は前記ポリペプチドに対して少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド、を含む、イムノアッセイ試薬。
【請求項２】
前記改変が、配列番号４のアミノ酸残基５５、７９、及び１３７のうち１つ又は２つ以上の置換を含む、請求項１に記載のイムノアッセイ試薬。
【請求項３】
前記改変が、アラニン又はグリシンの置換を含む、請求項２に記載のイムノアッセイ試薬。
【請求項４】
前記改変が、アラニンによるアミノ酸残基１３７の置換を含む、請求項３に記載のイムノアッセイ試薬。
【請求項５】
前記ポリペプチドの前記介在領域が、アミノ酸配列ＳＧＳを有する、請求項１に記載のイムノアッセイ試薬。
【請求項６】
前記ポリペプチドが、配列番号２に示されるようなアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のイムノアッセイ試薬。
【請求項７】
生体サンプル内のＣ型肝炎ウイルスに対する抗体を検出する方法であって、（ａ）請求項１に記載のイムノアッセイ試薬を提供する工程と、（ｂ）ＨＣＶ抗体が前記生体サンプル内に存在する場合にＨＣＶ抗体を前記ポリペプチドに結合させて第１の免疫複合体を形成することを可能にする条件下で生体サンプルを前記イムノアッセイ試薬と混合する工程と、（ｃ）標識ディテクターを工程（ｂ）から得た前記第１の免疫複合体に追加する工程であって、前記標識ディテクターが前記第１の免疫複合体に反応性である工程と、（ｄ）前記生体サンプル内のＣ型肝炎ウイルスに対する前記抗体の存在の指標として、前記標識ディテクターと前記第１の免疫複合体との間に形成された第２の免疫複合体を、存在する場合に検出する工程と、を含む方法。
【請求項８】
前記標識ディテクターが、標識抗体又は標識抗原である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記イムノアッセイ試薬が、固体担体に結合している、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
生体サンプル内のＣ型肝炎ウイルスに対する抗体及び／又はＣ型肝炎ウイルス抗原を検出する方法であって、（ａ）請求項１に記載のイムノアッセイ試薬を提供する工程と、（ｂ）生体サンプルと、前記イムノアッセイ試薬及び１つ又は２つ以上の抗ＨＣＶ抗体とを、ＨＣＶ抗体が前記生体サンプル内に存在する場合にＨＣＶ抗体を前記ポリペプチドに結合させて第１の免疫複合体を形成することを可能にする条件下、及びＨＣＶ抗原が前記生体サンプル内に存在する場合にＨＣＶ抗原を前記抗ＨＣＶ抗体に更に結合させて第２の免疫複合体を形成することを可能にする条件下で混合する工程と、（ｃ）第１の標識ディテクターを工程（ｂ）から得た前記第１の免疫複合体に追加する工程であって、前記第１の標識ディテクターが前記第１の免疫複合体に反応性である工程と、第２の標識ディテクターを工程（ｂ）から得た前記第２の免疫複合体に追加する工程であって、前記第２の標識ディテクターが前記第２の免疫複合体に反応性である工程と、（ｄ）前記生体サンプル内のＨＣＶに対する抗体及び／又はＨＣＶ抗原の存在の指標として、前記第１の標識ディテクターと前記第１の免疫複合体との間に形成された第３の免疫複合体を、存在する場合に検出する工程と、前記第２の標識ディテクターと前記第２の免疫複合体との間に形成された第４の免疫複合体を、存在する場合に検出する工程と、を含む方法。
【請求項１１】
前記第１の標識ディテクター及び前記第２の標識ディテクターが、それぞれ標識抗体又は標識抗原である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記イムノアッセイ試薬の１つ又は２つ以上及び１つ又は２つ以上の抗ＨＣＶ抗体が、同じ又は異なる固体担体に結合している、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１に記載のイムノアッセイ試薬と、免疫診断テストを実施するための指示書と、を含む、免疫診断テストキット。
【請求項１４】
１つ又は２つ以上の抗ＨＣＶ抗体を更に含む、請求項１３に記載の免疫診断テストキット。
【請求項１５】
配列番号２のアミノ酸配列を含む、単離ポリペプチド。
【請求項１６】
請求項１に記載のイムノアッセイ試薬を用いて、サンプルが抗原抗体複合体を形成する抗体を含むか否かを決定することを含む、ヒト生体サンプルの供給から生体サンプルを選択する方法。
【請求項１７】
前記選択することが、前記供給から除去するためのＨＣＶ陽性サンプルを同定することである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記選択することが、血液関連製品の調製に有用な生体サンプルを同定することである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記生体サンプルが血液である、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【外国語明細書】
2020129001000001.pdf