(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒトＡＡＶ中和抗体への耐性が向上した、異種核酸を含む、感染性組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンの提供。異種核酸を含むｒＡＡＶビリオンを用いた標的細胞に送達する方法の提供。【解決手段】（ａ）特定のアミノ酸配列の少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、変異体アデノ随伴ウイルスカプシドタンパク質、並びに（ｂ）異種核酸を含む、感染性組換えアデノ随伴ウイルスビリオン。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号１１〜１３及び２６〜３３のうちの１つに記載されるアミノ酸配列のアミノ酸２０３〜７３６と少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、変異体アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質、ならびに
（ｂ）異種核酸
を含む、感染性組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオン。
【請求項２】
前記変異体ＡＡＶカプシドタンパク質が、配列番号１１〜１３及び２６〜３３のうちの１つに記載されるアミノ酸配列のアミノ酸２０３〜７３６と少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の前記感染性ｒＡＡＶ。
【請求項３】
前記変異体ＡＡＶカプシドタンパク質が、配列番号１１〜１３及び２６〜３３のうちの１つに記載されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の前記感染性ｒＡＡＶ。
【請求項４】
（ａ）配列番号１０に記載されるアミノ酸配列のアミノ酸２０３〜７３６と少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ配列番号２と比べてアミノ酸置換Ｎ３１２Ｋ、Ｎ４４９Ｄ、Ｄ４７２Ｎ、Ｎ５５１Ｓ、Ｉ６９８Ｖ、及びＬ７３５Ｑを含む、変異体アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質、ならびに
（ｂ）異種核酸
を含む、感染性組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオン。
【請求項５】
前記変異体ＡＡＶカプシドタンパク質が配列番号１０に記載されるアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の前記感染性ｒＡＡＶ。
【請求項６】
ＡＡＶ２（野生型ＡＡＶ血清型２）によって示される耐性と比較して、ヒトＡＡＶ中和抗体への上昇した耐性を示す、請求項１または請求項４に記載の前記感染性ｒＡＡＶ。
【請求項７】
前記ｒＡＡＶビリオンが、ＡＡＶ２によって示される耐性よりも少なくとも約１．５倍高いヒトＡＡＶ中和抗体への耐性を示す、請求項６に記載の前記感染性ｒＡＡＶ。
【請求項８】
前記ｒＡＡＶビリオンが、ＡＡＶ２によって示される耐性よりも少なくとも約３倍高いヒトＡＡＶ中和抗体への耐性を示す、請求項６に記載の前記感染性ｒＡＡＶ。
【請求項９】
前記ｒＡＡＶビリオンが、ＡＡＶ２によって示される耐性よりも少なくとも約５倍高いヒトＡＡＶ中和抗体への耐性を示す、請求項６に記載の前記感染性ｒＡＡＶ。
【請求項１０】
前記ｒＡＡＶビリオンが、ＡＡＶ２によって示される耐性よりも少なくとも約１０倍高いヒトＡＡＶ中和抗体への耐性を示す、請求項６に記載の前記感染性ｒＡＡＶ。
【請求項１１】
前記ｒＡＡＶビリオンが、ＡＡＶ２によって示される耐性よりも少なくとも約３０倍高いヒトＡＡＶ中和抗体への耐性を示す、請求項６に記載の前記感染性ｒＡＡＶ。
【請求項１２】
野生型ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）によって示される哺乳類細胞への形質導入と比較して、ヒトＡＡＶ中和抗体の存在下における哺乳類細胞への増加した形質導入を示す、請求項１または４に記載の前記感染性ｒＡＡＶ。
【請求項１３】
前記哺乳類細胞が、肝臓細胞、膵臓細胞、骨格筋細胞、心筋細胞、線維芽細胞、網膜細胞、滑膜関節細胞、肺細胞、Ｔ細胞、ニューロン、グリア細胞、幹細胞、内皮細胞、または癌細胞である、請求項１２に記載の前記感染性ｒＡＡＶ。
【請求項１４】
前記幹細胞が、造血幹細胞、造血前駆細胞、神経幹細胞、神経前駆細胞、神経堤幹細胞、胚幹細胞、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、間葉幹細胞、中胚葉幹細胞、肝臓幹細胞、膵臓幹細胞、膵臓前駆細胞、筋幹細胞、または網膜幹細胞である、請求項１３に記載の前記感染性ｒＡＡＶ。
【請求項１５】
前記異種核酸がＲＮＡ干渉剤を含む、請求項１または請求項４に記載の前記感染性ｒＡＡＶ。
【請求項１６】
前記異種核酸が、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１または請求項４に記載の前記感染性ｒＡＡＶ。
【請求項１７】
配列番号１１〜１３及び２６〜３３のうちの１つに記載されるアミノ酸配列のアミノ酸２０３〜７３６と少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む変異体アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、単離核酸。
【請求項１８】
前記コードされた変異体ＡＡＶカプシドタンパク質が、配列番号１１〜１３及び２６〜３３のうちの１つに記載されるアミノ酸配列のアミノ酸２０３〜７３６と少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載の前記単離核酸。
【請求項１９】
前記コードされた変異体ＡＡＶカプシドタンパク質が、配列番号１１〜１３及び２６〜３３のうちの１つに記載されるアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載の前記単離核酸。
【請求項２０】
配列番号１０に記載されるアミノ酸配列のアミノ酸２０３〜７３６と少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ配列番号２と比べてアミノ酸置換Ｎ３１２Ｋ、Ｎ４４９Ｄ、Ｄ４７２Ｎ、Ｎ５５１Ｓ、Ｉ６９８Ｖ、及びＬ７３５Ｑを含む、変異体アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質
をコードするヌクレオチド配列を含む、単離核酸。
【請求項２１】
前記コードされた変異体ＡＡＶカプシドタンパク質が、ＡＡＶ２（野生型ＡＡＶ血清型２）によって示される耐性と比較して、ヒトＡＡＶ中和抗体への上昇した耐性を、感染性組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンに与える、請求項１７または請求項２０に記載の前記単離核酸。
【請求項２２】
前記上昇した耐性が、ＡＡＶ２によって示される耐性よりも少なくとも約１．５倍高い、請求項２１に記載の前記単離核酸。
【請求項２３】
前記上昇した耐性が、ＡＡＶ２によって示される耐性よりも少なくとも約３倍高い、請求項２１に記載の前記単離核酸。
【請求項２４】
前記上昇した耐性が、ＡＡＶ２によって示される耐性よりも少なくとも約５倍高い、請求項２１に記載の前記単離核酸。
【請求項２５】
前記上昇した耐性が、ＡＡＶ２によって示される耐性よりも少なくとも約１０倍高い、請求項２１に記載の前記単離核酸。
【請求項２６】
前記上昇した耐性が、ＡＡＶ２によって示される耐性よりも少なくとも約３０倍高い、請求項２１に記載の前記単離核酸。
【請求項２７】
前記変異体ＡＡＶカプシドタンパク質が、ＡＡＶ２（野生型ＡＡＶ血清型２）によって示される形質導入と比較して、ヒトＡＡＶ中和抗体の存在下における哺乳類細胞への増加した形質導入を、感染性組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンに与える、請求項１７または２０に記載の前記単離核酸。
【請求項２８】
請求項１７に記載の前記核酸を含む、単離宿主細胞。
【請求項２９】
請求項２０に記載の前記核酸を含む、単離宿主細胞。
【請求項３０】
前記核酸で安定的にトランスフェクトされる、請求項２８または請求項２９に記載の前記単離宿主細胞。
【請求項３１】
ＡＡＶｒｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸をさらに含む、請求項２８または請求項２９に記載の前記単離宿主細胞。
【請求項３２】
組換えＡＡＶベクターをさらに含む、請求項２８または請求項２９に記載の前記単離宿主細胞。
【請求項３３】
標的細胞を請求項１または請求項４に記載のビリオンに接触させることを含む、異種核酸を前記標的細胞に送達する方法。
【請求項３４】
前記標的細胞が、肝臓細胞、膵臓細胞、骨格筋細胞、心筋細胞、線維芽細胞、網膜細胞、滑膜関節細胞、肺細胞、Ｔ細胞、ニューロン、グリア細胞、幹細胞、内皮細胞、または癌細胞である、請求項３３に記載の前記方法。
【請求項３５】
前記幹細胞が、造血幹細胞、造血前駆細胞、神経幹細胞、神経前駆細胞、神経堤幹細胞、胚幹細胞、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、間葉幹細胞、中胚葉幹細胞、肝臓幹細胞、膵臓幹細胞、膵臓前駆細胞、筋幹細胞、または網膜幹細胞である、請求項３４に記載の前記方法。
【請求項３６】
前記標的細胞がインビトロである、請求項３３に記載の前記方法。
【請求項３７】
前記標的細胞がインビボである、請求項３３に記載の前記方法。
【請求項３８】
個体に、有効量の請求項１または請求項４に記載の感染性組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンを投与するステップを含む、遺伝子産物を、それを必要とする前記個体に送達する方法。
【請求項３９】
前記異種核酸がＲＮＡ干渉剤を含む、請求項３８に記載の前記方法。
【請求項４０】
前記異種核酸がポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項３８に記載の前記方法。
【請求項４１】
前記投与ステップが前記感染性ｒＡＡＶビリオンの間接的送達を含む、請求項３８に記載の前記方法。
【請求項４２】
前記投与ステップが前記感染性ｒＡＡＶビリオンの直接的送達を含む、請求項３８に記載の前記方法。
【請求項４３】
配列番号１１〜１３及び２６〜３３のうちの１つに記載されるアミノ酸配列のアミノ酸２０３〜７３６と少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、変異体アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質。
【請求項４４】
配列番号１１〜１３及び２６〜３３のうちの１つに記載されるアミノ酸配列のアミノ酸２０３〜７３６と少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項４３に記載の前記変異体ＡＡＶカプシドタンパク質。
【請求項４５】
配列番号１１〜１３及び２６〜３３のうちの１つに記載されるアミノ酸配列を含む、請求項４３に記載の前記変異体ＡＡＶカプシドタンパク質。
【請求項４６】
配列番号１０に記載されるアミノ酸配列のアミノ酸２０３〜７３６と少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ配列番号２と比べてアミノ酸置換Ｎ３１２Ｋ、Ｎ４４９Ｄ、Ｄ４７２Ｎ、Ｎ５５１Ｓ、Ｉ６９８Ｖ、及びＬ７３５Ｑを含む、変異体アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質。
【請求項４７】
配列番号１０に記載される前記アミノ酸配列を含む、請求項４６に記載の前記変異体ＡＡＶカプシドタンパク質。
【請求項４８】
前記変異体ＡＡＶカプシドタンパク質が、ＡＡＶ２（野生型ＡＡＶ血清型２）によって示される耐性と比較して、ヒトＡＡＶ中和抗体への上昇した耐性を、感染性組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンに与える、請求項４３または請求項４６に記載の前記変異体ＡＡＶカプシドタンパク質。
【請求項４９】
前記上昇した耐性が、ＡＡＶ２によって示される耐性よりも少なくとも約１．５倍高い、請求項４８に記載の前記変異体ＡＡＶカプシドタンパク質。
【請求項５０】
前記上昇した耐性が、ＡＡＶ２によって示される耐性よりも少なくとも約３倍高い、請求項４８に記載の前記変異体ＡＡＶカプシドタンパク質。
【請求項５１】
前記上昇した耐性が、ＡＡＶ２によって示される耐性よりも少なくとも約５倍高い、請求項４８に記載の前記変異体ＡＡＶカプシドタンパク質。
【請求項５２】
前記上昇した耐性が、ＡＡＶ２によって示される耐性よりも少なくとも約１０倍高い、請求項４８に記載の前記変異体ＡＡＶカプシドタンパク質。
【請求項５３】
前記上昇した耐性が、ＡＡＶ２によって示される耐性よりも少なくとも約３０倍高い、請求項４８に記載の前記変異体ＡＡＶカプシドタンパク質。
【請求項５４】
ＡＡＶ２（野生型ＡＡＶ血清型２）によって示される形質導入と比較して、ヒトＡＡＶ中和抗体の存在下における哺乳類細胞への増加した形質導入を、感染性組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンに与える、請求項４３または請求項４６に記載の前記変異体ＡＡＶカプシドタンパク質。
【請求項５５】
（ｉ）それぞれが変異体アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質及び異種核酸を含む、２つ以上の感染性ｒＡＡＶビリオン、
（ｉｉ）それぞれが変異体ＡＡＶカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、２つ以上の単離核酸、
（ｉｉｉ）それぞれが変異体ＡＡＶカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む、２つ以上の宿主細胞、ならびに
（ｉｖ）２つ以上の変異体ＡＡＶカプシドタンパク質
のうちの少なくとも１つを含むライブラリであって、
前記ライブラリの少なくとも１つのメンバーの前記変異体ＡＡＶカプシドタンパク質が、配列番号１０〜１３及び２６〜３３のうちの１つに記載されるアミノ酸配列と比べて少なくとも１つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む、前記ライブラリ。
【請求項５６】
スターターカプシドタンパク質を含むスタータービリオンと比べて変化した感染特性を示す、改変感染性組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンを生成及び特定する方法であって、
（ａ）前記スターターカプシドタンパク質から変異体アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質を生成するステップであって、前記スターターカプシドタンパク質が配列番号１０〜１３及び２６〜３３のうちの１つに記載されるアミノ酸配列を含み、かつそれぞれの変異体ＡＡＶカプシドタンパク質が前記スターターカプシドタンパク質と比べて少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、ステップと、
（ｂ）それぞれがステップ（ａ）で生成された変異体カプシドＡＡＶタンパク質を含む、変異体ＡＡＶビリオンを生成するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）で生成された変異体ＡＡＶビリオンを変化した感染特性についてアッセイして、前記改変感染性ｒＡＡＶビリオンを特定するステップと
を含む、前記方法。
【請求項５７】
変異体ＡＡＶカプシドタンパク質の前記ライブラリの生成が、ポリメラーゼ連鎖反応突然変異誘発、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発、飽和突然変異誘発、ループスワップ突然変異誘発、断片シャフリング突然変異誘発、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される突然変異誘発方法を含む、請求項５６に記載の前記方法。
【請求項５８】
前記変化した感染特性が、前記スタータービリオンによって示される耐性と比較して、ヒト中和ＡＡＶ抗体への上昇した耐性である、請求項５６に記載の前記方法。
【請求項５９】
前記変化した感染特性が、前記スタータービリオンによって示される形質導入と比較して、ヒトＡＡＶ中和抗体の存在下における哺乳類細胞への増加した形質導入である、請求項５６に記載の前記方法。
【請求項６０】
改変感染性ｒＡＡＶビリオンが、前記スターターカプシドタンパク質と少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変ＡＡＶカプシドタンパク質を含む、請求項５６に記載の前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、２０１３年５月３１日に出願された米国特許仮出願第６１／８２９，７３５号の利益を主張し、この出願は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
連邦政府委託研究に関する声明
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与された助成金番号ＨＬ０８１５２７の下で、政府の支持を伴ってなされた。政府は本発明においてある特定の権利を有する。
【０００３】
テキストファイルとして提供される配列表の参照による組み込み
配列表は、２０１４年５月２８日に作成され、１６９ＫＢのサイズを有する「ＢＥＲＫ−２１６ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」というテキストファイルとして、本明細書とともに提供される。本テキストファイルの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００４】
導入
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に基づく遺伝子送達ベクターは、前臨床疾患モデル、及び最近ではいくつかの疾患標的についてのヒト臨床試験の両方において、有望性を実証している。野生型ＡＡＶは非病原性であり、かついずれの既知の疾患とも病因的関連性を有しないため、ＡＡＶに基づくベクターは最高に安全である。さらに、ＡＡＶは、肝臓、筋肉、肺、網膜、及び脳を含む多くの組織における、高度に効率的な遺伝子送達及び持続的な導入遺伝子発現の能力を提供する。
【０００５】
ＡＡＶは、２つのオープンリーディングフレーム、ｒｅｐ及びｃａｐを含有する、１本鎖ＤＮＡウイルスである。第１の遺伝子は、ゲノム複製に必要な４つのタンパク質（Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、及びＲｅｐ４０）をコードし、第２の遺伝子は、集合してウイルス性カプシドを形成する３つの構造タンパク質（ＶＰ１〜３）を発現する。その名が暗示するように、ＡＡＶは、活発な複製のために、アデノウイルスまたはヘルペスウイルス等のヘルパーウイルスの存在に依存する。ヘルパーの不在下では、ＡＡＶは、そのゲノムがエピソームとして維持されるまたは宿主染色体に統合される、潜伏状態を確立する。複数の同種霊長類ＡＡＶ血清型及び多数の非ヒト霊長類型が特定されている。ＡＡＶ２は、遺伝子送達ビヒクルとして最もよく特徴がわかっている。
【０００６】
２０１０年時点で、ＡＡＶを遺伝子送達ビヒクルとして使用した、７５件の進行中臨床試験があった。しかしながら、ヒト母集団内での多数のＡＡＶ変異体及び血清型への広範囲にわたる曝露に起因する、抗カプシド中和抗体の高い保有率が、ＡＡＶ遺伝子療法の効能を低減させる。この既存の免疫、ならびにベクター投与に起因する後続の免疫発達は、ＡＡＶ遺伝子療法のより広い実施を妨げ得る。例えば、現在までで、ＡＡＶは免疫特権領域への送達を含む臨床研究において最も成功してきている。
【０００７】
近年の分析は、ヒトにおける抗ＡＡＶ  ＩｇＧ抗体の保有率は、ＡＡＶ２（７２％）及びＡＡＶ１（６７％）について最も高いが、ＡＡＶ９（４７％）、ＡＡＶ６（４６％）、ＡＡＶ５（４０％）、及びＡＡＶ８（３８％）抗体もまた研究された母集団の大部分において存在したことを示した。いくつかの研究は、遺伝子療法中のＡＡＶカプシドへの液性免疫が、送達されるｒＡＡＶ粒子の量を低下させることによって防止され得ることを見出した。残念ながら、低いベクター用量の投与は、低い形質導入、ひいては低い治療的遺伝子発現をもたらす。
【０００８】
当該技術分野において、抗ＡＡＶ抗体による中和に耐性である新規ＡＡＶ変異体の開発の必要性がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ａｓｕｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２０１２  Ｆｅｂ；２０（２）：３２９−３８
【非特許文献２】Ｂａｉｎｂｒｉｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．２００８  Ｍａｙ  ２２；３５８（２１）：２２３１−９
【非特許文献３】Ｅｘｃｏｆｆｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２００９Ｍａｒ１０；１０６（１０）：３８６５−７０
【非特許文献４】Ｇｒｉｍｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．２００８  Ｊｕｎ；８２（１２）：５８８７−９１１
【非特許文献５】Ｊａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２０１１  Ａｐｒ；１９（４）：６６７−７５
【非特許文献６】Ｋｌｉｍｃｚａｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２００９  Ｏｃｔ１４；４（１０）：ｅ７４６７
【非特許文献７】Ｋｏｅｒｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．；Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２００８  Ｏｃｔ；１６（１０）：１７０３−９
【非特許文献８】Ｋｏｅｒｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．；Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２００９  Ｄｅｃ；１７（１２）：２０８８−９５
【非特許文献９】Ｍａｇｕｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．２００８  Ｍａｙ２２；３５８（２１）：２２４０−８
【非特許文献１０】Ｍａｇｕｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ．２００９  Ｎｏｖ  ７；３７４（９７０１）：１５９７−６０５
【非特許文献１１】Ｍａｈｅｓｈｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００６  Ｆｅｂ；２４（２）：１９８−２０４
【非特許文献１２】Ｐｅｒａｂｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ．２００６  Ｆｅｂ；８（２）：１５５−６２
【非特許文献１３】Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２００９  Ｍａｒ  １０；１０６（１０）：３９４６−５１
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】ＷＯ２０１２１４５６０１号
【特許文献２】米国特許公開第ＵＳ２００５００５３９２２号
【発明の概要】
【００１１】
概要
本開示は、変異体カプシドタンパク質及び異種核酸を含む、感染性組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンを提供する。本開示は、感染性ｒＡＡＶビリオンに、ヒトＡＡＶ中和抗体への上昇した耐性を与える、変異体アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質（及び／または変異体ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする核酸）をさらに提供する。本開示は、感染性ｒＡＡＶビリオン及び／または主題の変異体ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする核酸を含む、宿主細胞をさらに提供する。本開示は、上記のビリオン、カプシドタンパク質、核酸、及び／または宿主細胞のライブラリをさらに提供し、このライブラリの少なくとも１つのメンバーの変異体ＡＡＶカプシドタンパク質は、配列番号１０〜１３及び２６〜３３のうちの１つに記載されるアミノ酸配列と比べて、少なくとも１つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。
【００１２】
本開示は、異種核酸を標的細胞に送達する方法をさらに提供し、この標的細胞は主題の感染性ｒＡＡＶビリオンに接触させられる。本開示は、遺伝子産物を個体に送達する方法をさらに提供し、該方法は概して、有効量の主題のｒＡＡＶビリオンを、それを必要とする個体に投与することを含む。本明細書には、主題の方法を実践するための組成物及びキットもまた提供される。
【００１３】
特徴
本開示の特徴は、（ａ）配列番号１１〜１３及び２６〜３３のうちの１つに記載されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、変異体アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質、ならびに（ｂ）異種核酸を含む、感染性組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンを含む。いくつかの場合では、変異体ＡＡＶカプシドタンパク質は、配列番号１１〜１３及び２６〜３３のうちの１つに記載されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合では、変異体ＡＡＶカプシドタンパク質は、配列番号１１〜１３及び２６〜３３のうちの１つに記載されるアミノ酸配列を含む。
【００１４】
本開示の特徴は、（ａ）配列番号１０に記載されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、配列番号２と比べてアミノ酸置換Ｎ３１２Ｋ、Ｎ４４９Ｄ、Ｄ４７２Ｎ、Ｎ５５１Ｓ、Ｉ６９８Ｖ、及びＬ７３５Ｑを含む、変異体アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質、ならびに（ｂ）異種核酸を含む、感染性組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンを含む。いくつかの場合では、変異体ＡＡＶカプシドタンパク質は、配列番号１０に記載されるアミノ酸配列を含む。いくつかの場合では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ２（野生型ＡＡＶ血清型２）によって示される耐性と比較して、ヒトＡＡＶ中和抗体への上昇した耐性を示す。いくつかの場合では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ２によって示される耐性よりも、ヒトＡＡＶ中和抗体への少なくとも約１．５倍（例えば、少なくとも約３倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約３０倍等）高い耐性を示す。いくつかの場合では、ｒＡＡＶは、野生型ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）によって示される哺乳類細胞への形質導入と比較して、ヒトＡＡＶ中和抗体の存在下で、哺乳類細胞への増加した形質導入を示す。いくつかの場合では、哺乳類細胞は、肝臓細胞、膵臓細胞、骨格筋細胞、心筋細胞、線維芽細胞、網膜細胞、滑膜関節細胞、肺細胞、Ｔ細胞、ニューロン、グリア細胞、幹細胞（例えば、造血幹細胞、造血前駆細胞、神経幹細胞、神経前駆細胞、神経堤幹細胞、胚幹細胞、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、間葉幹細胞、中胚葉幹細胞、肝臓幹細胞、膵臓幹細胞、膵臓前駆細胞、筋幹細胞、網膜幹細胞等）、内皮細胞、または癌細胞である。いくつかの場合では、異種核酸は、ＲＮＡ干渉剤を含む。いくつかの場合では、異種核酸はポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
【００１５】
本開示の特徴は、配列番号１１〜１３及び２６〜３３のうちの１つに記載されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む変異体アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、単離核酸を含む。いくつかの場合では、コードされた変異体ＡＡＶカプシドタンパク質は、配列番号１１〜１３及び２６〜３３のうちの１つに記載されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合では、コードされた変異体ＡＡＶカプシドタンパク質は、配列番号１１〜１３及び２６〜３３のうちの１つに記載されるアミノ酸配列を含む。
【００１６】
本開示の特徴は、配列番号１０に記載されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ配列番号２と比べてアミノ酸置換Ｎ３１２Ｋ、Ｎ４４９Ｄ、Ｄ４７２Ｎ、Ｎ５５１Ｓ、Ｉ６９８Ｖ、及びＬ７３５Ｑを含む、変異体アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、単離核酸を含む。
【００１７】
いくつかの場合では、コードされた変異体ＡＡＶカプシドタンパク質（単離核酸によってコードされた）は、ＡＡＶ２（野生型ＡＡＶ血清型２）によって示される耐性と比較して、ヒトＡＡＶ中和抗体への上昇した耐性を、感染性組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンに与える。いくつかの場合では、上昇した耐性は、ＡＡＶ２によって示される耐性よりも、少なくとも約１．５倍（例えば、少なくとも約３倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約３０倍等）高い。いくつかの場合では、コードされた変異体ＡＡＶカプシドタンパク質（単離核酸によってコードされた）は、ＡＡＶ２によって示される形質導入と比較して、ヒトＡＡＶ中和抗体の存在下における哺乳類細胞への増加した形質導入を、感染性組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンに与える。
【００１８】
本開示の特徴は、上記の主題の核酸を含む単離宿主細胞を含む。いくつかの場合では、宿主細胞が該核酸で安定的にトランスフェクトされる。いくつかの場合では、宿主細胞は、ＡＡＶｒｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸をさらに含む。いくつかの場合では、宿主細胞は組換えＡＡＶベクターをさらに含む。
【００１９】
本開示の特徴は、標的細胞を主題のビリオン（上記）に接触させることを含む、異種核酸を標的細胞に送達する方法を含む。いくつかの場合では、標的細胞は、肝臓細胞、膵臓細胞、骨格筋細胞、心筋細胞、線維芽細胞、網膜細胞、滑膜関節細胞、肺細胞、Ｔ細胞、ニューロン、グリア細胞、幹細胞（例えば、造血幹細胞、造血前駆細胞、神経幹細胞、神経前駆細胞、神経堤幹細胞、胚幹細胞、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、間葉幹細胞、中胚葉幹細胞、肝臓幹細胞、膵臓幹細胞、膵臓前駆細胞、筋幹細胞、もしくは網膜幹細胞等）、内皮細胞、または癌細胞である。いくつかの場合では、標的細胞はインビトロである。いくつかの場合では、標的細胞はインビボである。
【００２０】
本開示の特徴は、遺伝子産物を、それを必要とする個体に送達する方法を含み、該方法は、個体に有効量の主題の感染性組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオン（上記）を投与することを含む。いくつかの場合では、ｒＡＡＶビリオンの異種核酸はＲＮＡ干渉剤を含む。いくつかの場合では、ｒＡＡＶビリオンの異種核酸は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの場合では、投与ステップは感染性ｒＡＡＶビリオンの間接的送達を含む。いくつかの場合では、投与ステップは感染性ｒＡＡＶビリオンの直接的送達を含む。
【００２１】
本開示の特徴は、配列番号１１〜１３及び２６〜３３のうちの１つに記載されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、変異体アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質を含む。いくつかの場合では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、配列番号１１〜１３及び２６〜３３のうちの１つに記載されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、配列番号１１〜１３及び２６〜３３のうちの１つに記載されるアミノ酸配列を含む。
【００２２】
本開示の特徴は、配列番号１０に記載されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ配列番号２と比べてアミノ酸置換Ｎ３１２Ｋ、Ｎ４４９Ｄ、Ｄ４７２Ｎ、Ｎ５５１Ｓ、Ｉ６９８Ｖ、及びＬ７３５Ｑを含む、変異体アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質を含む。いくつかの場合では、変異体ＡＡＶカプシドタンパク質は、配列番号１０に記載されるアミノ酸配列を含む。いくつかの場合では、変異体ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶ２によって示される耐性と比較して、ヒトＡＡＶ中和抗体への上昇した耐性を、感染性組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンに与える。いくつかの場合では、上昇した耐性は、ＡＡＶ２によって示される耐性よりも、少なくとも約１．５倍（例えば少なくとも約３倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約３０倍等）高い。いくつかの場合では、変異体ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶ２によって示される形質導入と比較して、ヒトＡＡＶ中和抗体の存在下における哺乳類細胞への増加した形質導入を、感染性組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンに与える。
【００２３】
本開示の特徴は、（ｉ）それぞれが変異体アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質及び異種核酸を含む、２つ以上の感染性ｒＡＡＶビリオン、（ｉｉ）それぞれが変異体ＡＡＶカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、２つ以上の単離核酸、（ｉｉｉ）それぞれが変異体ＡＡＶカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む、２つ以上の宿主細胞、及び（ｉｖ）２つ以上の変異体ＡＡＶカプシドタンパク質、のうちの少なくとも１つを含むライブラリを含み、このライブラリの少なくとも１つのメンバーの変異体ＡＡＶカプシドタンパク質は、配列番号１０〜１３及び２６〜３３のうちの１つに記載されるアミノ酸配列と比べて少なくとも１つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。
【００２４】
本開示の特徴は、スターターカプシドタンパク質を含むスターター（親）ビリオンと比べて変化した感染特性を示す、改変感染性ｒＡＡＶビリオンを生成及び特定する方法を含み、該方法は、（ａ）スターターカプシドタンパク質から変異体アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質を生成するステップであって、このスターターカプシドタンパク質が配列番号１０〜１３及び２６〜３３のうちの１つに記載されるアミノ酸配列を含み、かつそれぞれの変異体ＡＡＶカプシドタンパク質がスターターカプシドタンパク質と比べて少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、ステップと、（ｂ）それぞれがステップ（ａ）で生成された変異体カプシドＡＡＶタンパク質を含む、変異体ＡＡＶビリオンを生成するステップと、（ｃ）ステップ（ｂ）で生成された変異体ＡＡＶビリオンを変化した感染特性についてアッセイして、改変感染性ｒＡＡＶビリオンを特定するステップと、を含む。いくつかの場合では、変異体ＡＡＶカプシドタンパク質のライブラリの生成は、ポリメラーゼ連鎖反応突然変異誘発、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発、飽和突然変異誘発、ループスワップ突然変異誘発、断片シャフリング突然変異誘発、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される、突然変異誘発方法を含む。いくつかの場合では、変化した感染特性は、ヒト中和ＡＡＶ抗体への、スタータービリオンによって示される耐性と比較して上昇した耐性である。いくつかの場合では、変化した感染特性は、ヒトＡＡＶ中和抗体の存在下での哺乳類細胞の、スタータービリオンによって示される形質導入と比較して増加した形質導入である。いくつかの場合では、改変感染性ｒＡＡＶビリオンは、スターターカプシドタンパク質と少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変ＡＡＶカプシドタンパク質を含む。
【００２５】
本開示の特徴は、スターターカプシドタンパク質から変異体ＡＡＶカプシドタンパク質を生成する方法を含み、該方法は、スターターカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を、ポリメラーゼ連鎖反応突然変異誘発、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発、飽和突然変異誘発、ループスワップ突然変異誘発、断片シャフリング突然変異誘発、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される種類の突然変異誘発に供することを含み、このスターターカプシドタンパク質は、配列番号１０〜１３及び２６〜３３のうちの１つに記載されるアミノ酸配列を含む。
[本発明1001]
（ａ）配列番号11〜13及び26〜33のうちの1つに記載されるアミノ酸配列のアミノ酸203〜736と少なくとも約90％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、変異体アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質、ならびに
（ｂ）異種核酸
を含む、感染性組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオン。
[本発明1002]
前記変異体ＡＡＶカプシドタンパク質が、配列番号11〜13及び26〜33のうちの1つに記載されるアミノ酸配列のアミノ酸203〜736と少なくとも約95％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、本発明1001の前記感染性ｒＡＡＶ。
[本発明1003]
前記変異体ＡＡＶカプシドタンパク質が、配列番号11〜13及び26〜33のうちの1つに記載されるアミノ酸配列を含む、本発明1001の前記感染性ｒＡＡＶ。
[本発明1004]
（ａ）配列番号10に記載されるアミノ酸配列のアミノ酸203〜736と少なくとも約95％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ配列番号2と比べてアミノ酸置換Ｎ312Ｋ、Ｎ449Ｄ、Ｄ472Ｎ、Ｎ551Ｓ、Ｉ698Ｖ、及びＬ735Ｑを含む、変異体アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質、ならびに
（ｂ）異種核酸
を含む、感染性組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオン。
[本発明1005]
前記変異体ＡＡＶカプシドタンパク質が配列番号10に記載されるアミノ酸配列を含む、本発明1004の前記感染性ｒＡＡＶ。
[本発明1006]
ＡＡＶ2（野生型ＡＡＶ血清型2）によって示される耐性と比較して、ヒトＡＡＶ中和抗体への上昇した耐性を示す、本発明1001または本発明1004の前記感染性ｒＡＡＶ。
[本発明1007]
前記ｒＡＡＶビリオンが、ＡＡＶ2によって示される耐性よりも少なくとも約1．5倍高いヒトＡＡＶ中和抗体への耐性を示す、本発明1006の前記感染性ｒＡＡＶ。
[本発明1008]
前記ｒＡＡＶビリオンが、ＡＡＶ2によって示される耐性よりも少なくとも約3倍高いヒトＡＡＶ中和抗体への耐性を示す、本発明1006の前記感染性ｒＡＡＶ。
[本発明1009]
前記ｒＡＡＶビリオンが、ＡＡＶ2によって示される耐性よりも少なくとも約5倍高いヒトＡＡＶ中和抗体への耐性を示す、本発明1006の前記感染性ｒＡＡＶ。
[本発明1010]
前記ｒＡＡＶビリオンが、ＡＡＶ2によって示される耐性よりも少なくとも約10倍高いヒトＡＡＶ中和抗体への耐性を示す、本発明1006の前記感染性ｒＡＡＶ。
[本発明1011]
前記ｒＡＡＶビリオンが、ＡＡＶ2によって示される耐性よりも少なくとも約30倍高いヒトＡＡＶ中和抗体への耐性を示す、本発明1006の前記感染性ｒＡＡＶ。
[本発明1012]
野生型ＡＡＶ血清型2（ＡＡＶ2）によって示される哺乳類細胞への形質導入と比較して、ヒトＡＡＶ中和抗体の存在下における哺乳類細胞への増加した形質導入を示す、本発明1001または1004の前記感染性ｒＡＡＶ。
[本発明1013]
前記哺乳類細胞が、肝臓細胞、膵臓細胞、骨格筋細胞、心筋細胞、線維芽細胞、網膜細胞、滑膜関節細胞、肺細胞、Ｔ細胞、ニューロン、グリア細胞、幹細胞、内皮細胞、または癌細胞である、本発明1012の前記感染性ｒＡＡＶ。
[本発明1014]
前記幹細胞が、造血幹細胞、造血前駆細胞、神経幹細胞、神経前駆細胞、神経堤幹細胞、胚幹細胞、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、間葉幹細胞、中胚葉幹細胞、肝臓幹細胞、膵臓幹細胞、膵臓前駆細胞、筋幹細胞、または網膜幹細胞である、本発明1013の前記感染性ｒＡＡＶ。
[本発明1015]
前記異種核酸がＲＮＡ干渉剤を含む、本発明1001または本発明1004の前記感染性ｒＡＡＶ。
[本発明1016]
前記異種核酸が、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、本発明1001または本発明1004の前記感染性ｒＡＡＶ。
[本発明1017]
配列番号11〜13及び26〜33のうちの1つに記載されるアミノ酸配列のアミノ酸203〜736と少なくとも約90％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む変異体アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、単離核酸。
[本発明1018]
前記コードされた変異体ＡＡＶカプシドタンパク質が、配列番号11〜13及び26〜33のうちの1つに記載されるアミノ酸配列のアミノ酸203〜736と少なくとも約95％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、本発明1017の前記単離核酸。
[本発明1019]
前記コードされた変異体ＡＡＶカプシドタンパク質が、配列番号11〜13及び26〜33のうちの1つに記載されるアミノ酸配列を含む、本発明1017の前記単離核酸。
[本発明1020]
配列番号10に記載されるアミノ酸配列のアミノ酸203〜736と少なくとも約95％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ配列番号2と比べてアミノ酸置換Ｎ312Ｋ、Ｎ449Ｄ、Ｄ472Ｎ、Ｎ551Ｓ、Ｉ698Ｖ、及びＬ735Ｑを含む、変異体アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質
をコードするヌクレオチド配列を含む、単離核酸。
[本発明1021]
前記コードされた変異体ＡＡＶカプシドタンパク質が、ＡＡＶ2（野生型ＡＡＶ血清型2）によって示される耐性と比較して、ヒトＡＡＶ中和抗体への上昇した耐性を、感染性組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンに与える、本発明1017または本発明1020の前記単離核酸。
[本発明1022]
前記上昇した耐性が、ＡＡＶ2によって示される耐性よりも少なくとも約1．5倍高い、本発明1021の前記単離核酸。
[本発明1023]
前記上昇した耐性が、ＡＡＶ2によって示される耐性よりも少なくとも約3倍高い、本発明1021の前記単離核酸。
[本発明1024]
前記上昇した耐性が、ＡＡＶ2によって示される耐性よりも少なくとも約5倍高い、本発明1021の前記単離核酸。
[本発明1025]
前記上昇した耐性が、ＡＡＶ2によって示される耐性よりも少なくとも約10倍高い、本発明1021の前記単離核酸。
[本発明1026]
前記上昇した耐性が、ＡＡＶ2によって示される耐性よりも少なくとも約30倍高い、本発明1021の前記単離核酸。
[本発明1027]
前記変異体ＡＡＶカプシドタンパク質が、ＡＡＶ2（野生型ＡＡＶ血清型2）によって示される形質導入と比較して、ヒトＡＡＶ中和抗体の存在下における哺乳類細胞への増加した形質導入を、感染性組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンに与える、本発明1017または1020の前記単離核酸。
[本発明1028]
本発明1017の前記核酸を含む、単離宿主細胞。
[本発明1029]
本発明1020の前記核酸を含む、単離宿主細胞。
[本発明1030]
前記核酸で安定的にトランスフェクトされる、本発明1028または本発明1029の前記単離宿主細胞。
[本発明1031]
ＡＡＶｒｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸をさらに含む、本発明1028または本発明1029の前記単離宿主細胞。
[本発明1032]
組換えＡＡＶベクターをさらに含む、本発明1028または本発明1029の前記単離宿主細胞。
[本発明1033]
標的細胞を本発明1001または本発明1004のビリオンに接触させることを含む、異種核酸を前記標的細胞に送達する方法。
[本発明1034]
前記標的細胞が、肝臓細胞、膵臓細胞、骨格筋細胞、心筋細胞、線維芽細胞、網膜細胞、滑膜関節細胞、肺細胞、Ｔ細胞、ニューロン、グリア細胞、幹細胞、内皮細胞、または癌細胞である、本発明1033の前記方法。
[本発明1035]
前記幹細胞が、造血幹細胞、造血前駆細胞、神経幹細胞、神経前駆細胞、神経堤幹細胞、胚幹細胞、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、間葉幹細胞、中胚葉幹細胞、肝臓幹細胞、膵臓幹細胞、膵臓前駆細胞、筋幹細胞、または網膜幹細胞である、本発明1034の前記方法。
[本発明1036]
前記標的細胞がインビトロである、本発明1033の前記方法。
[本発明1037]
前記標的細胞がインビボである、本発明1033の前記方法。
[本発明1038]
個体に、有効量の本発明1001または本発明1004の感染性組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンを投与するステップを含む、遺伝子産物を、それを必要とする前記個体に送達する方法。
[本発明1039]
前記異種核酸がＲＮＡ干渉剤を含む、本発明1038の前記方法。
[本発明1040]
前記異種核酸がポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、本発明1038の前記方法。
[本発明1041]
前記投与ステップが前記感染性ｒＡＡＶビリオンの間接的送達を含む、本発明1038の前記方法。
[本発明1042]
前記投与ステップが前記感染性ｒＡＡＶビリオンの直接的送達を含む、本発明1038の前記方法。
[本発明1043]
配列番号11〜13及び26〜33のうちの1つに記載されるアミノ酸配列のアミノ酸203〜736と少なくとも約90％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、変異体アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質。
[本発明1044]
配列番号11〜13及び26〜33のうちの1つに記載されるアミノ酸配列のアミノ酸203〜736と少なくとも約95％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、本発明1043の前記変異体ＡＡＶカプシドタンパク質。
[本発明1045]
配列番号11〜13及び26〜33のうちの1つに記載されるアミノ酸配列を含む、本発明1043の前記変異体ＡＡＶカプシドタンパク質。
[本発明1046]
配列番号10に記載されるアミノ酸配列のアミノ酸203〜736と少なくとも約95％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ配列番号2と比べてアミノ酸置換Ｎ312Ｋ、Ｎ449Ｄ、Ｄ472Ｎ、Ｎ551Ｓ、Ｉ698Ｖ、及びＬ735Ｑを含む、変異体アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質。
[本発明1047]
配列番号10に記載される前記アミノ酸配列を含む、本発明1046の前記変異体ＡＡＶカプシドタンパク質。
[本発明1048]
前記変異体ＡＡＶカプシドタンパク質が、ＡＡＶ2（野生型ＡＡＶ血清型2）によって示される耐性と比較して、ヒトＡＡＶ中和抗体への上昇した耐性を、感染性組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンに与える、本発明1043または本発明1046の前記変異体ＡＡＶカプシドタンパク質。
[本発明1049]
前記上昇した耐性が、ＡＡＶ2によって示される耐性よりも少なくとも約1．5倍高い、本発明1048の前記変異体ＡＡＶカプシドタンパク質。
[本発明1050]
前記上昇した耐性が、ＡＡＶ2によって示される耐性よりも少なくとも約3倍高い、本発明1048の前記変異体ＡＡＶカプシドタンパク質。
[本発明1051]
前記上昇した耐性が、ＡＡＶ2によって示される耐性よりも少なくとも約5倍高い、本発明1048の前記変異体ＡＡＶカプシドタンパク質。
[本発明1052]
前記上昇した耐性が、ＡＡＶ2によって示される耐性よりも少なくとも約10倍高い、本発明1048の前記変異体ＡＡＶカプシドタンパク質。
[本発明1053]
前記上昇した耐性が、ＡＡＶ2によって示される耐性よりも少なくとも約30倍高い、本発明1048の前記変異体ＡＡＶカプシドタンパク質。
[本発明1054]
ＡＡＶ2（野生型ＡＡＶ血清型2）によって示される形質導入と比較して、ヒトＡＡＶ中和抗体の存在下における哺乳類細胞への増加した形質導入を、感染性組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンに与える、本発明1043または本発明1046の前記変異体ＡＡＶカプシドタンパク質。
[本発明1055]
（ｉ）それぞれが変異体アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質及び異種核酸を含む、2つ以上の感染性ｒＡＡＶビリオン、
（ｉｉ）それぞれが変異体ＡＡＶカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、2つ以上の単離核酸、
（ｉｉｉ）それぞれが変異体ＡＡＶカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む、2つ以上の宿主細胞、ならびに
（ｉｖ）2つ以上の変異体ＡＡＶカプシドタンパク質
のうちの少なくとも1つを含むライブラリであって、
前記ライブラリの少なくとも1つのメンバーの前記変異体ＡＡＶカプシドタンパク質が、配列番号10〜13及び26〜33のうちの1つに記載されるアミノ酸配列と比べて少なくとも1つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む、前記ライブラリ。
[本発明1056]
スターターカプシドタンパク質を含むスタータービリオンと比べて変化した感染特性を示す、改変感染性組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンを生成及び特定する方法であって、
（ａ）前記スターターカプシドタンパク質から変異体アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質を生成するステップであって、前記スターターカプシドタンパク質が配列番号10〜13及び26〜33のうちの1つに記載されるアミノ酸配列を含み、かつそれぞれの変異体ＡＡＶカプシドタンパク質が前記スターターカプシドタンパク質と比べて少なくとも1つのアミノ酸置換を含む、ステップと、
（ｂ）それぞれがステップ（ａ）で生成された変異体カプシドＡＡＶタンパク質を含む、変異体ＡＡＶビリオンを生成するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）で生成された変異体ＡＡＶビリオンを変化した感染特性についてアッセイして、前記改変感染性ｒＡＡＶビリオンを特定するステップと
を含む、前記方法。
[本発明1057]
変異体ＡＡＶカプシドタンパク質の前記ライブラリの生成が、ポリメラーゼ連鎖反応突然変異誘発、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発、飽和突然変異誘発、ループスワップ突然変異誘発、断片シャフリング突然変異誘発、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される突然変異誘発方法を含む、本発明1056の前記方法。
[本発明1058]
前記変化した感染特性が、前記スタータービリオンによって示される耐性と比較して、ヒト中和ＡＡＶ抗体への上昇した耐性である、本発明1056の前記方法。
[本発明1059]
前記変化した感染特性が、前記スタータービリオンによって示される形質導入と比較して、ヒトＡＡＶ中和抗体の存在下における哺乳類細胞への増加した形質導入である、本発明1056の前記方法。
[本発明1060]
改変感染性ｒＡＡＶビリオンが、前記スターターカプシドタンパク質と少なくとも約90％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変ＡＡＶカプシドタンパク質を含む、本発明1056の前記方法。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１Ａ〜Ｂは、増強された抗体回避のためのＡＡＶの定向進化を示す。
【図２Ａ】ヒトＩＶＩＧを使用した抗体回避変異体の中和プロファイルを示す。
【図２Ｂ】ヒトＩＶＩＧを使用した抗体回避変異体の中和プロファイルを示す。
【図３Ａ】ＡＡＶに対する高い中和抗体価の存在に起因して血友病Ｂ臨床試験から除外された個人から得られたヒト血清を使用した、抗体回避変異体の中和プロファイルを示す。
【図３Ｂ】ＡＡＶに対する高い中和抗体価の存在に起因して血友病Ｂ臨床試験から除外された個人から得られたヒト血清を使用した、抗体回避変異体の中和プロファイルを示す。
【図３Ｃ】ＡＡＶに対する高い中和抗体価の存在に起因して血友病Ｂ臨床試験から除外された個人から得られたヒト血清を使用した、抗体回避変異体の中和プロファイルを示す。
【図４】図４Ａ〜Ｂは、ループスワップ／シャッフル及び飽和突然変異誘発クローンのアミノ酸配列を示す。
【図５】ＡＡＶ変異体のインビトロ向性を実証する。
【図６】図６Ａ〜Ｂは、新規ＡＡＶ変異体のインビボの局在化及び中和を示す。
【図７】図７Ａ〜Ｄは、ヒト抗体回避体の生成を実証する。
【図８Ａ】ＡＡＶ１〜９の野生型カプシドタンパク質配列（配列番号１〜９）と整列させたシャッフル１００−１のカプシドタンパク質配列（配列番号１１）を示す。
【図８Ｂ】ＡＡＶ１〜９の野生型カプシドタンパク質配列（配列番号１〜９）と整列させたシャッフル１００−１のカプシドタンパク質配列（配列番号１１）を示す。
【図８Ｃ】ＡＡＶ１〜９の野生型カプシドタンパク質配列（配列番号１〜９）と整列させたシャッフル１００−１のカプシドタンパク質配列（配列番号１１）を示す。
【図８Ｄ】ＡＡＶ１〜９の野生型カプシドタンパク質配列（配列番号１〜９）と整列させたシャッフル１００−１のカプシドタンパク質配列（配列番号１１）を示す。
【図８Ｅ】ＡＡＶ１〜９の野生型カプシドタンパク質配列（配列番号１〜９）と整列させたシャッフル１００−１のカプシドタンパク質配列（配列番号１１）を示す。
【図８Ｆ】ＡＡＶ１〜９の野生型カプシドタンパク質配列（配列番号１〜９）と整列させたシャッフル１００−１のカプシドタンパク質配列（配列番号１１）を示す。
【図８Ｇ】ＡＡＶ１〜９の野生型カプシドタンパク質配列（配列番号１〜９）と整列させたシャッフル１００−１のカプシドタンパク質配列（配列番号１１）を示す。
【図８Ｈ】ＡＡＶ１〜９の野生型カプシドタンパク質配列（配列番号１〜９）と整列させたシャッフル１００−１のカプシドタンパク質配列（配列番号１１）を示す。
【図８Ｉ】ＡＡＶ１〜９の野生型カプシドタンパク質配列（配列番号１〜９）と整列させたシャッフル１００−１のカプシドタンパク質配列（配列番号１１）を示す。
【図９Ａ】ＡＡＶ１〜９の野生型カプシドタンパク質配列（配列番号１〜９）と整列させたシャッフル１００−３のカプシドタンパク質配列（配列番号１２）を示す。
【図９Ｂ】ＡＡＶ１〜９の野生型カプシドタンパク質配列（配列番号１〜９）と整列させたシャッフル１００−３のカプシドタンパク質配列（配列番号１２）を示す。
【図９Ｃ】ＡＡＶ１〜９の野生型カプシドタンパク質配列（配列番号１〜９）と整列させたシャッフル１００−３のカプシドタンパク質配列（配列番号１２）を示す。
【図９Ｄ】ＡＡＶ１〜９の野生型カプシドタンパク質配列（配列番号１〜９）と整列させたシャッフル１００−３のカプシドタンパク質配列（配列番号１２）を示す。
【図９Ｅ】ＡＡＶ１〜９の野生型カプシドタンパク質配列（配列番号１〜９）と整列させたシャッフル１００−３のカプシドタンパク質配列（配列番号１２）を示す。
【図９Ｆ】ＡＡＶ１〜９の野生型カプシドタンパク質配列（配列番号１〜９）と整列させたシャッフル１００−３のカプシドタンパク質配列（配列番号１２）を示す。
【図９Ｇ】ＡＡＶ１〜９の野生型カプシドタンパク質配列（配列番号１〜９）と整列させたシャッフル１００−３のカプシドタンパク質配列（配列番号１２）を示す。
【図９Ｈ】ＡＡＶ１〜９の野生型カプシドタンパク質配列（配列番号１〜９）と整列させたシャッフル１００−３のカプシドタンパク質配列（配列番号１２）を示す。
【図９Ｉ】ＡＡＶ１〜９の野生型カプシドタンパク質配列（配列番号１〜９）と整列させたシャッフル１００−３のカプシドタンパク質配列（配列番号１２）を示す。
【図１０Ａ】ＡＡＶ１〜９の野生型カプシドタンパク質配列（配列番号１〜９）と整列させたシャッフル１００−７のカプシドタンパク質配列（配列番号１３）を示す。
【図１０Ｂ】ＡＡＶ１〜９の野生型カプシドタンパク質配列（配列番号１〜９）と整列させたシャッフル１００−７のカプシドタンパク質配列（配列番号１３）を示す。
【図１０Ｃ】ＡＡＶ１〜９の野生型カプシドタンパク質配列（配列番号１〜９）と整列させたシャッフル１００−７のカプシドタンパク質配列（配列番号１３）を示す。
【図１０Ｄ】ＡＡＶ１〜９の野生型カプシドタンパク質配列（配列番号１〜９）と整列させたシャッフル１００−７のカプシドタンパク質配列（配列番号１３）を示す。
【図１０Ｅ】ＡＡＶ１〜９の野生型カプシドタンパク質配列（配列番号１〜９）と整列させたシャッフル１００−７のカプシドタンパク質配列（配列番号１３）を示す。
【図１０Ｆ】ＡＡＶ１〜９の野生型カプシドタンパク質配列（配列番号１〜９）と整列させたシャッフル１００−７のカプシドタンパク質配列（配列番号１３）を示す。
【図１０Ｇ】ＡＡＶ１〜９の野生型カプシドタンパク質配列（配列番号１〜９）と整列させたシャッフル１００−７のカプシドタンパク質配列（配列番号１３）を示す。
【図１０Ｈ】ＡＡＶ１〜９の野生型カプシドタンパク質配列（配列番号１〜９）と整列させたシャッフル１００−７のカプシドタンパク質配列（配列番号１３）を示す。
【図１０Ｉ】ＡＡＶ１〜９の野生型カプシドタンパク質配列（配列番号１〜９）と整列させたシャッフル１００−７のカプシドタンパク質配列（配列番号１３）を示す。
【図１１】免疫マウス血清中のライブラリクローン及び親血清型の中和抗体価を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
定義
アデノ随伴ウイルスは、無エンベロープ正二十面体カプシド内の、４．７ｋｂの１本鎖ＤＮＡゲノムで構成される、非病原性パルボウイルスである。「ＡＡＶ」はアデノ随伴ウイルスの短縮形であり、ウイルス自体またはその誘導体を指すために使用され得る。該ゲノムは、複製及びパッケージングシグナルのウイルス起源として機能する逆位末端配列（ＩＴＲ）が隣接する３つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含有する。ｒｅｐ  ＯＲＦは、ウイルス複製、転写制御、部位特異的統合、及びビリオン集合において役割を果たす、４つの非構造タンパク質をコードする。ｃａｐ  ＯＲＦは、集合して６０量体ウイルス性カプシドを形成する３つの構造タンパク質（ＶＰ１〜３）をコードする。最後に、ｃａｐ遺伝子内の代替リーディングフレームとして存在するＯＲＦは、ＡＡＶカプシドタンパク質を核小体に局在化させ、かつカプシド集合プロセスにおいて機能するウイルス性タンパク質である、集合活性化タンパク質（ＡＡＰ）を生成する。
【００２８】
いくつかの自然発生の血清型及び１００を超えるＡＡＶの変異体があり、これらのそれぞれは、特にカプシドタンパク質の超可変領域内で、アミノ酸配列が異なり、ひいてはその遺伝子送達特性も異なる。どのＡＡＶもヒト疾患と関連付けられておらず、組換えＡＡＶを臨床応用に魅力的にしている。
【００２９】
本明細書で使用される場合、用語「ＡＡＶ」は、別途必要とされる場合を除き、全ての亜型ならびに自然発生及び組換え形態の両方を網羅する。用語「ＡＡＶ」は、ＡＡＶ型１（ＡＡＶ−１またはＡＡＶ１）、ＡＡＶ型２（ＡＡＶ−２またはＡＡＶ２）、ＡＡＶ型３（ＡＡＶ−３またはＡＡＶ３）、ＡＡＶ型４（ＡＡＶ−４またはＡＡＶ４）、ＡＡＶ型５（ＡＡＶ−５またはＡＡＶ５）、ＡＡＶ型６（ＡＡＶ−６またはＡＡＶ６）、ＡＡＶ型７（ＡＡＶ−７またはＡＡＶ７）、ＡＡＶ型８（ＡＡＶ−８またはＡＡＶ８）、ＡＡＶ型９（ＡＡＶ−９またはＡＡＶ９）、鳥類ＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、非霊長類ＡＡＶ、及びヒツジＡＡＶを含む。「霊長類ＡＡＶ」は、霊長類に感染するＡＡＶを指し、「非霊長類ＡＡＶ」は非霊長類哺乳類に感染するＡＡＶを指し、「ウシＡＡＶ」はウシ科哺乳類に感染するＡＡＶを指し、以下同様である。
【００３０】
ＡＡＶの様々な血清型のゲノム配列、ならびにネイティブ末端配列（ＴＲ）の配列、Ｒｅｐタンパク質、及びカプシドサブユニットは、当業者に既知である。かかる配列は、文献またはＧｅｎＢａｎｋ等の公共データベースにおいて見出され得る。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００２０７７．１（ＡＡＶ−１）、ＡＦ０６３４９７．１（ＡＡＶ−１）、ＮＣ＿００１４０１．２（ＡＡＶ−２）、ＡＦ０４３３０３．１（ＡＡＶ−２）、Ｊ０１９０１．１（ＡＡＶ−２）、Ｕ４８７０４．１（ＡＡＶ−３）、ＮＣ＿００１７２９．１（ＡＡＶ−３）、ＮＣ＿００１８２９．１（ＡＡＶ−４）、Ｕ８９７９０．１（ＡＡＶ−４）、ＮＣ＿００６１５２．１（ＡＡＶ−５）、ＡＦ０８５７１６．１（ＡＡＶ−５）、ＡＦ０２８７０４．１（ＡＡＶ−６）、ＮＣ＿００６２６０．１（ＡＡＶ−７）、ＡＦ５１３８５１．１（ＡＡＶ−７）、ＡＦ５１３８５２．１（ＡＡＶ−８）ＮＣ＿００６２６１．１（ＡＡＶ−８）、及びＡＹ５３０５７９．１（ＡＡＶ−９）を参照されたく、これらの開示は、ＡＡＶ核酸及びアミノ酸配列を教示するために、参照により本明細書に組み込まれる。例えば、Ｓｒｉｖｉｓｔａｖａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ４５：５５５、Ｃｈｉｏｒｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ７１：６８２３、Ｃｈｉｏｒｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ７３：１３０９、Ｂａｎｔｅｌ−Ｓｃｈａａｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ７３：９３９、Ｘｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ７３：３９９４、Ｍｕｒａｍａｔｓｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ２２１：２０８、Ｓｈａｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５８：９２１、Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９９：１１８５４、Ｍｏｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ３３：３７５−３８３、国際特許公開第ＷＯ００／２８０６１号、ＷＯ９９／６１６０１号、ＷＯ９８／１１２４４号、及び米国特許第６，１５６，３０３号もまた参照されたい。
【００３１】
ＡＡＶ血清型と関連付けられる、自然に存在するｃａｐ（カプシド）タンパク質の配列は当業者に既知であり、ＡＡＶ１（配列番号１）、ＡＡＶ２（配列番号２）、ＡＡＶ３（配列番号３）、ＡＡＶ４（配列番号４）、ＡＡＶ５（配列番号５）、ＡＡＶ６（配列番号６）、ＡＡＶ７（配列番号７）、ＡＡＶ８（配列番号８）、及びＡＡＶ９（配列番号９）を含む。「変異体ＡＡＶカプシドタンパク質」という用語は、配列番号１〜９に記載される自然に存在するＡＡＶカプシドタンパク質配列のうちの１つと比べて少なくとも１つの置換（欠失、挿入等を含む）を含むアミノ酸配列を含む、ＡＡＶカプシドタンパク質である。
【００３２】
「ＡＡＶビリオン」または「ＡＡＶウイルス粒子」は、少なくとも１つのＡＡＶカプシドタンパク質及びカプシド形成したＡＡＶポリヌクレオチドで構成されるウイルス粒子を指す。
【００３３】
ポリヌクレオチドに適用される場合「組換え」は、そのポリヌクレオチドが、クローニング、制限、またはライゲーションステップ、及び自然界で見出されるポリヌクレオチドとは異なる構築物をもたらす他の手順の、様々な組み合わせの産物であることを意味する。組換えウイルスは、組換えポリヌクレオチドを含むウイルス粒子である。これらの用語は、それぞれ、元来のポリヌクレオチド構築物の複製物及び元来のウイルス構築物の子孫を含む。
【００３４】
ＡＡＶビリオンが異種ポリヌクレオチド（すなわち、野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド、例えば標的細胞に送達される導入遺伝子、標的細胞に送達されるＲＮＡｉ剤またはＣＲＩＳＰＲ剤等）を含む場合、これは典型的に「組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ビリオン」または「ｒＡＡＶウイルス粒子」と称される。概して、異種ポリヌクレオチドは、少なくとも１つ、及び概して２つのＡＡＶ逆位末端配列（ＩＴＲ）に隣接する。
【００３５】
「ｒＡＡＶベクター」という用語は、定義によりｒＡＡＶポリヌクレオチドを含むｒＡＡＶビリオン（すなわちｒＡＡＶウイルス粒子）（例えば感染性ｒＡＡＶビリオン）を包含し、かつ、ｒＡＡＶをコードするポリヌクレオチド（例えばｒＡＡＶをコードする１本鎖ポリヌクレオチド（ｓｓ−ｒＡＡＶ）、ｒＡＡＶをコードする２本鎖ポリヌクレオチド（ｄｓ−ｒＡＡＶ）、例えばｒＡＡＶをコードするプラスミド等）もまた包含する。
【００３６】
「パッケージング」は、ＡＡＶ粒子の集合及びカプシド形成をもたらす、一連の細胞内事象を指す。
【００３７】
ＡＡＶ「ｒｅｐ」及び「ｃａｐ」遺伝子は、アデノ随伴ウイルスの複製及びカプシド形成タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を指す。ＡＡＶ  ｒｅｐ及びｃａｐは、本明細書でＡＡＶ「パッケージング遺伝子」と称される。
【００３８】
ＡＡＶの「ヘルパーウイルス」は、ＡＡＶ（例えば野生型ＡＡＶ）が哺乳類細胞によって複製及びパッケージングされることを可能にするウイルスを指す。ＡＡＶの様々なかかるヘルパーウイルスは当業者に既知であり、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、及びワクシニア等のポックスウイルスを含む。サブグループＣのアデノウイルス型５が最も一般的に使用されるものの、アデノウイルスは多数の異なるサブグループを包含する。ヒト、非ヒト哺乳類、及び鳥類由来の多数のアデノウイルスが既知であり、ＡＴＣＣ等の保管所から入手可能である。ヘルペスファミリーのウイルスは、例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）及びエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、ならびにサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）及び仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）を含み、これらもまたＡＴＣＣ等の保管所から入手可能である。
【００３９】
「ヘルパーウイルス機能（複数可）」は、ＡＡＶ複製及びパッケージを可能にする（本明細書に記載される、複製及びパッケージングのための他の要件と合わせて）、ヘルパーウイルスゲノム内にコードされる機能（複数可）を指す。本明細書で記載されるように、「ヘルパーウイルス機能」は、トランスで生成細胞にヘルパーウイルスを提供すること、または、例えば必要な機能（複数可）をコードするポリヌクレオチド配列を提供することを含む、多数の方法で提供され得る。例えば、１つ以上のアデノウイルス性タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むプラスミドまたは他の発現ベクターは、ｒＡＡＶベクターと共に生成細胞中にトランスフェクトされる。
【００４０】
「感染性」ウイルスまたはウイルス粒子は、有能に集合したウイルス性カプシドを含むものであり、ポリヌクレオチド成分を、そのウイルス性種が向性である細胞に送達することができる。この用語は必ずしもウイルスの任意の複製能力を暗示しない。感染性ウイルス粒子を計数するためのアッセイは、本開示他の箇所及び当該技術分野において記載される。ウイルス性感染力は、感染性ウイルス粒子の、合計ウイルス粒子に対する比率として表すことができる。感染性ウイルス粒子の合計ウイルス粒子に対する比率を決定する方法は、当業者に既知である。例えばＧｒａｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１１：Ｓ３３７（ＴＣＩＤ５０感染性力価アッセイを記載）、及びＺｏｌｏｔｕｋｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．６：９７３を参照されたい。実施例もまた参照されたい。
【００４１】
「向性」という用語は、本明細書で使用される場合、ウイルス（例えばＡＡＶ）による宿主種内の特異的宿主種または特異的細胞種の優先的標的化を指す。例えば、心臓、肺、肝臓、及び筋肉の細胞を感染させることができるウイルスは、肺及び筋細胞のみを感染させることができるウイルスに比べて、より広い（すなわち増加した）向性を有する。向性は、宿主の特定の種類の細胞表面分子への、ウイルスの依存性もまた含むことができる。例えば、いくつかのウイルスは、表面グリコサミノグリカンを有する細胞のみを感染させることができ、一方で他のウイルスはシアル酸を有する細胞のみを感染させることができる（かかる依存性は、ウイルス性感染の潜在的宿主細胞として特定のクラスの分子が欠損した様々な細胞株を使用して試験することができる）。いくつかの場合では、ウイルスの向性はウイルスの相対的優先度を説明する。例えば、第１のウイルスは全ての細胞型を感染させることができ得るが、表面グリコサミノグリカンを有する細胞を感染させることにおいてはるかにより成功する。第２のウイルスもまた同じ特徴をより好む（例えば第２のウイルスもまた表面グリコサミノグリカンを有する細胞を感染させることにおいてより成功する）場合、絶対形質導入効率性が同様でない場合でさえ、第２のウイルスは、第１のウイルスと同様（または同一）の向性を有すると考えられ得る。例えば、第２のウイルスは、第１のウイルスよりも、試験される全ての所与の細胞を感染させることにおいて効率的であり得るが、相対的優先度が同様（または同一）である場合、第２のウイルスはなお第１のウイルスと同様（または同一）の向性を有すると考えられ得る。いくつかの実施形態では、主題の変異体ＡＡＶカプシドタンパク質を含むビリオンの向性は、自然発生ビリオンと比べて変化させられない。いくつかの実施形態では、主題の変異体ＡＡＶカプシドタンパク質を含むビリオンの向性は、自然発生ビリオンと比べて拡大（すなわち拡張）される。いくつかの実施形態では、主題の変異体ＡＡＶカプシドタンパク質を含むビリオンの向性は、自然発生ビリオンと比べて低減される。
【００４２】
「複製可能」なウイルス（例えば複製可能ＡＡＶ）は、感染性であり、また感染した細胞内で（すなわちヘルパーウイルスまたはヘルパーウイルス機能の存在下で）複製されることも可能である、表現型が野生型のウイルスを指す。ＡＡＶの場合、複製能力は、概して機能的ＡＡＶパッケージング遺伝子の存在を必要とする。概して、本明細書に記載されるｒＡＡＶベクターは、１つ以上のＡＡＶパッケージング遺伝子の欠如がゆえに、哺乳類細胞内（特にヒト細胞内）で複製不能である。典型的に、かかるｒＡＡＶベクターは、複製可能ＡＡＶがＡＡＶパッケージング遺伝子と入来ｒＡＡＶベクターとの間の組換えによって生成される可能性を最小化するために、任意のＡＡＶパッケージング遺伝子配列を欠如する。多くの実施形態では、本明細書に記載されるｒＡＡＶベクター調製物は、ある場合はわずかな複製可能ＡＡＶ（ｒｃＡＡＶ、ＲＣＡとも称される）を含有する（例えば、１０２ｒＡＡＶ粒子当たり約１ｒｃＡＡＶ未満、１０４ｒＡＡＶ粒子当たり約１ｒｃＡＡＶ未満、１０８ｒＡＡＶ粒子当たり約１ｒｃＡＡＶ未満、１０１２ｒＡＡＶ粒子当たり約１ｒｃＡＡＶ未満、または無ｒｃＡＡＶ）ものである。
【００４３】
「ポリヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド、またはそれらの類似体を含む、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド及びヌクレオチド類似体等の改変ヌクレオチドを含み得、非ヌクレオチド成分によって分断され得る。存在する場合、ヌクレオチド構造への改変は、ポリマーの集合の前または後に与えられ得る。ポリヌクレオチドという用語は、本明細書で使用される場合、２本鎖及び１本鎖分子を交換可能に指す。別途指定または必要とされない限り、ポリヌクレオチドを含む本明細書の任意の実施形態は、２本鎖形態、及び、２本鎖を構成することが知られるまたは予測される２つの相補的１本鎖形態のそれぞれの、両方を包含する。
【００４４】
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、別のポリヌクレオチドまたはポリペプチドとある特定のパーセントの「配列同一性」を有し、これは、整列される場合、２つの配列を比較するときにそのパーセンテージの塩基またはアミノ酸が同じであることを意味する。配列類似性は、いくつかの異なる様式で決定され得る。配列同一性を決定するために、配列は、ワールドワイドウェブを介してｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／にて入手可能な、ＢＬＡＳＴを含む方法及びコンピュータプログラムを使用して、整列させることができる。別の整列アルゴリズムは、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．の完全所有子会社である、米国ウィスコンシン州マディソンの、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）パッケージにおいて入手可能な、ＦＡＳＴＡである。整列の他の技術は、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２６６：Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（１９９６），ｅｄ．Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，ａ  ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｈａｒｃｏｕｒｔ  Ｂｒａｃｅ＆Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡに記載される。特に興味深いのは、配列における隙間を許容する整列プログラムである。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎは、配列整列における隙間を許容するアルゴリズムの一種である。Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７０：１７３−１８７（１９９７）を参照されたい。Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ整列方法を使用するＧＡＰプログラムもまた、配列を整列させるのに利用され得る。Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３（１９７０）を参照されたい。
【００４５】
「遺伝子」は、細胞内で何らかの種類の機能を行うポリヌクレオチドを指す。例えば、遺伝子は、転写及び翻訳された後で特定のタンパク質をコードすることができる、オープンリーディングフレームを含み得る。一方で、遺伝子は、翻訳されない機能的ＲＮＡ産物（例えば、アプタマー、干渉ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）等）をコードすることができる。
【００４６】
「遺伝子発現産物」または「遺伝子産物」は、上記で定義される、特定の遺伝子の発現から生じる分子である。遺伝子発現産物は、例えばポリペプチド、アプタマー、干渉ＲＮＡ，メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）等を含む。
【００４７】
「ＲＮＡ干渉剤」または「ＲＮＡｉ剤」は、遺伝子（上記に定義の通り）の発現を変化させるために使用され得る任意の剤（またはかかる剤をコードするポリヌクレオチド）を包含する。当業者に既知であるＲＮＡｉ剤の例としては、（ｉ）ｓｉＲＮＡ剤、（ｉｉ）アンチセンスＲＮＡ、（ｉｉｉ）ＣＲＩＳＰＲ剤、（ｉｖ）ジンクフィンガーヌクレアーゼ剤、及び（ｖ）転写活性化剤様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）剤が挙げられるがこれらに限定されない。
【００４８】
（ｉ）ｓｉＲＮＡ剤（「低分子干渉」または「短干渉ＲＮＡ」（またはｓｉＲＮＡ））は、遺伝子対象（「標的遺伝子」）に標的化されるヌクレオチドのＲＮＡ２本鎖である。「ＲＮＡ２本鎖」は、ＲＮＡ分子の２つの領域の間の相補的対形成によって形成され、２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の領域を形成する構造を指す。ｓｉＲＮＡは、その２本鎖部分のヌクレオチド配列が標的遺伝子のヌクレオチド配列に相補的であるという点で、その遺伝子に、「標的化」される。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡの２本鎖の長さは、３０ヌクレオチド未満である。いくつかの実施形態では、２本鎖は、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、または１０ヌクレオチドの長さであり得る。いくつかの実施形態では、２本鎖の長さは１９〜２５ヌクレオチドの長さである。ｓｉＲＮＡのＲＮＡ２本鎖部分は、ヘアピン構造の一部であり得る。ヘアピンを含有するｓｉＲＮＡ剤は、「ｓｈＲＮＡ（短ヘアピンＲＮＡ）剤」とも称され得る。２本鎖部分に加え、ヘアピン構造は、２本鎖を形成する２つの配列の間に位置付けられるループ部分を含有し得る。ループは長さが変化し得る。いくつかの実施形態では、ループは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３ヌクレオチドの長さである。ヘアピン構造は、３′または５′オーバーハング部分もまた含有し得る。いくつかの実施形態では、オーバーハングは０、１、２、３、４、または５ヌクレオチドの長さの３′または５′オーバーハングである。概して、標的遺伝子の発現産物（例えば、ｍＲＮＡ、ポリペプチド等）のレベルは、５′未翻訳（ＵＴ）領域、ＯＲＦ、または３′ＵＴ領域を含む、標的遺伝子転写物の少なくとも１９〜２５ヌクレオチド長セグメント（例えば２０〜２１ヌクレオチド配列）に相補的である特異的２本鎖ヌクレオチド配列を含有する、ｓｉＲＮＡ剤（例えばｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ等）によって低減される。いくつかの実施形態では、短干渉ＲＮＡは、約１９〜２５ｎｔの長さである。例えば、ｓｉＲＮＡ技術の説明について、ＰＣＴ出願ＷＯ０／４４８９５号、ＷＯ９９／３２６１９号、ＷＯ０１／７５１６４号、ＷＯ０１／９２５１３号、ＷＯ０１／２９０５８号、ＷＯ０１／８９３０４号、ＷＯ０２／１６６２０号、及びＷＯ０２／２９８５８号、ならびに米国特許公開第２００４００２３３９０号を参照されたい。ｓｉＲＮＡ及び／またはｓｈＲＮＡは、核酸配列によってコードされ得、核酸配列はプロモーターもまた含み得る。核酸配列は、ポリアデニル化シグナルもまた含み得る。いくつかの実施形態では、ポリアデニル化シグナルは、合成最小ポリアデニル化シグナルである。
【００４９】
（ｉｉ）アンチセンスＲＮＡは、遺伝子発現産物に相補的であるＲＮＡである。例えば、特異的ｍＲＮＡに標的化されるアンチセンスＲＮＡは、ｍＲＮＡに相補的であるＲＮＡ系剤（または改変ＲＮＡであり得る）であり、アンチセンスＲＮＡのｍＲＮＡへのハイブリダイゼーションは、ｍＲＮＡの発現を変化させる（例えばＲＮＡの安定性を変化させること、ＲＮＡの翻訳を変化させること等によって）。「アンチセンスＲＮＡ」内にさらに含まれるのは、アンチセンスＲＮＡをコードする核酸である。
【００５０】
（ｉｉｉ）ＣＲＩＳＰＲ剤。ＣＲＩＳＰＲ（規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔｓ））／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）システムは、侵入核酸の発現停止を誘導するためにＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を使用することによって、ウイルス及びプラスミドに対する適応免疫を有する、細菌及び古細菌を提供する。Ｃａｓ９タンパク質（またはその機能的等価物及び／もしくは変異体、すなわちＣａｓ９様タンパク質）は、２つの自然発生ＲＮＡ分子またはｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡと呼ばれる（誘導ＲＮＡとも呼ばれる）合成ＲＮＡ分子を有するタンパク質の会合に依存する、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を自然に含有する。いくつかの場合では、２つの分子は、共有結合され、単一の分子（単一誘導ＲＮＡ（「ｓｇＲＮＡ」）とも呼ばれる）を形成する。したがって、Ｃａｓ９またはＣａｓ９様タンパク質は、ＤＮＡ標的ＲＮＡ（この用語は、２分子誘導ＲＮＡ構成及び単一分子誘導ＲＮＡ構成の両方を包含する）と会合し、これは、Ｃａｓ９またはＣａｓ９様タンパク質を活性化し、このタンパク質を標的核酸配列へと誘導する。Ｃａｓ９またはＣａｓ９様タンパク質がその天然酵素機能を保持する場合、それは標的ＤＮＡを切断して２本鎖切断を作製し、これは、ゲノム変更（すなわち、以下のような編集：欠失、挿入（ドナーポリヌクレオチドが存在する場合）、交換等）をもたらし、それにより遺伝子発現を変化させ得る。Ｃａｓ９のいくつかの変異体（この変異体は、Ｃａｓ９様という用語によって包含される）は、低減したＤＮＡ切断活性を有するように変化させられている（いくつかの場合では、これらは標的ＤＮＡの両方の鎖の代わりに１本鎖を切断するが、一方で他の場合では、これらはＤＮＡ切断活性が無くなるまで重度に低減されている）。低減したＤＮＡ切断活性（さらには無ＤＮＡ切断活性）を有するＣａｓ９様タンパク質は、なお標的ＤＮＡに誘導されることができ、ＲＮＡポリメラーゼ活性を阻害することができる。したがって、酵素不活性Ｃａｓ９様タンパク質は、標的ＤＮＡの転写を阻害するために、ＤＮＡ標的ＲＮＡによって標的ＤＮＡ内の特異的位置に標的化され得る。ＣＲＩＳＰＲ剤に関する詳細な情報は、例えば、（ａ）Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ．ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１２  Ａｕｇ  １７；３３７（６０９６）：８１６−２１："Ａ  ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  ｄｕａｌ−ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ＤＮＡ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｉｎ  ａｄａｐｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ"、（ｂ）Ｑｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ．２０１３  Ｆｅｂ  ２８；１５２（５）：１１７３−８３："Ｒｅｐｕｒｐｏｓｉｎｇ  ＣＲＩＳＰＲ  ａｓ  ａｎ  ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ"、及び（ｃ）米国特許出願第１３／８４２，８５９号及びＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ１３／３２５８９号、において見出され得、該文献の全てはここで参照によりその全体が組み込まれる。したがって、「ＣＲＩＳＰＲ剤」という���語は、本明細書で使用される場合、Ｃａｓ９系システム内で使用され得る自然発生及び／または合成配列（例えば、Ｃａｓ９またはＣａｓ９様タンパク質；ＤＮＡ標的ＲＮＡ、例えば、ｃｒＲＮＡ様ＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ様ＲＮＡ、単一誘導ＲＮＡ等の、任意の成分；ドナーポリヌクレオチド等）を含む、任意の剤（かかる剤をコードする核酸）を包含する。
【００５１】
（ｉｖ）ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）剤。ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメインに融合することによって生成される、人工ＤＮＡエンドヌクレアーゼである。ＺＦＮは、所望のＤＮＡ配列を標的化するように操作され得、これは、ジンクフィンガーヌクレアーゼが固有の標的配列を切断することを可能にする。細胞内に導入される場合、ＺＦＮは、２本鎖切断を引き起こすことによって細胞内の標的ＤＮＡ（例えば細胞のゲノム）を編集するために使用され得る。ＺＦＮの使用に関するより多くの情報については、例えば、Ａｓｕｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２０１２  Ｆｅｂ；２０（２）：３２９−３８、Ｂｉｂｉｋｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００３  Ｍａｙ  ２；３００（５６２０）：７６４、Ｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１１  Ｊｕｌ  １５；３３３（６０４０）：３０７、Ｏｃｈｉａｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ．２０１０  Ａｕｇ；１５（８）：８７５−８５、Ｔａｋａｓｕ  ｅｔ．ａｌ．，Ｉｎｓｅｃｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２０１０  Ｏｃｔ；４０（１０）：７５９−６５；Ｅｋｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｚｅｂｒａｆｉｓｈ  ２００８  Ｓｕｍｍｅｒ；５（２）：１２１−３、Ｙｏｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２０１１  Ａｐｒ  ２６；１０８（１７）：７０５２−７、Ｇｏｌｄｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ．２０１０  Ｍａｒ  ５；１４０（５）：６７８−９１、Ｇｅｕｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００９  Ｊｕｌ  ２４；３２５（５９３９）：４３３、Ｆｌｉｓｉｋｏｗｓｋａ  ｅｔ  ａｌ，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１１；６（６）：ｅ２１０４５．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００２１０４５．Ｅｐｕｂ２０１１  Ｊｕｎ  １３、Ｈａｕｓｃｈｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２０１１  Ｊｕｌ  １９；１０８（２９）：１２０１３−７、及びＹｕ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２０１１  Ｎｏｖ；２１（１１）：１６３８−４０を参照されたく、該文献の全ては、ＺＦＮに関連するそれらの教示について、参照により本明細書に組み込まれる。「ＺＦＮ剤」という用語は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ及び／またはジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを包含する。
【００５２】
（ｖ）転写活性化剤様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）剤。転写活性化剤様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）は、ＴＡＬ（転写活性化剤様）エフェクターＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメインに融合することによって生成される人工ＤＮＡエンドヌクレアーゼである。ＴＡＬＥＮＳは、実質的に任意の所望のＤＮＡ配列に結合するように素早く操作されることができ、かつ、細胞内に導入される場合、ＴＡＬＥＮは、２本鎖切断を引き起こすことによって細胞内の標的ＤＮＡ（例えば細胞のゲノム）を編集するために使用され得る。ＴＡＬＥＮの使用に関するより多くの情報については、例えば、Ｈｏｃｋｅｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１１  Ｊｕｌ  ７；２９（８）：７３１−４、Ｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１１  Ｊｕｌ  １５；３３３（６０４０）：３０７、Ｔｅｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１１  Ａｕｇ  ５；２９（８）：６９５−６、及びＨｕａｎｇ  ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１１  Ａｕｇ  ５；２９（８）：６９９−７００を参照されたく、該文献の全ては、ＴＡＬＥＮに関連するそれらの教示について、参照により本明細書に組み込まれる。「ＴＡＬＥＮ剤」という用語は、ＴＡＬＥＮ及び／またはＴＡＬＥＮをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを包含する。
【００５３】
「制御要素」または「制御配列」は、ポリヌクレオチドの複製、重複、転写、スプライシング、翻訳、または分解を含む、ポリヌクレオチドの機能的制御に寄与する分子の相互作用に関与するヌクレオチド配列である。制御は、プロセスの頻度、速度、または特異性に影響を与え得、本質が増強的または抑制的であり得る。当業者に既知の制御要素は、例えば、プロモーター及びエンハンサー等の、転写制御配列を含む。プロモーターは、ある特定の条件下で、ＲＮＡポリメラーゼに結合することと、たいていプロモーターから下流（３′方向）に位置付けられるコード領域の翻訳を開始させることが可能である、ＤＮＡ領域である。
【００５４】
「作動的に連結される」または「作動可能に連結される」は、遺伝要素の並立を指し、これらの要素は、予測される様式でそれらが作動することを許容する関係にある。例えば、プロモーターは、プロモーターがコード配列の転写を開始させるのを助ける場合、コード領域に作動的に連結されている。この機能的関係が維持される限り、プロモーターとコード領域との間に、介在する残基があってよい。
【００５５】
「発現ベクター」は、目的とするポリペプチドをコードする領域を含むベクターであり、意図される標的細胞内のタンパク質の発現をもたらすために使用される。発現ベクターは、標的内のタンパク質の発現を容易にするために、コード領域に作動的に連結される制御要素もまた含む。制御要素と、発現のためにそれらが作動可能に連結される遺伝子または遺伝子（複数）との組み合わせは、「発現カセット」と称されることがあり、この多くは当業者において既知かつ入手可能であり、または当業者に入手可能である成分から容易に構築することができる。
【００５６】
「異種」は、それが比較されている残りの実体とは遺伝子型が別個の実体に由来することを意味する。例えば、遺伝子操作技術によって、異なる種に由来するプラスミドまたはベクターへと導入されるポリヌクレオチドは、異種ポリヌクレオチドである。そのネイティブコード配列から除去され、かつそれが結合されているのが自然に見出されないコード配列に作動的に連結されるプロモーターは、異種プロモーターである。したがって、例えば、異種遺伝子産物をコードする異種核酸を含むｒＡＡＶは、自然発生の野生型ＡＡＶ内に通常含まれない核酸を含むｒＡＡＶであり、コードされた異種遺伝子産物は、自然発生の野生型ＡＡＶによって通常コードされない遺伝子産物である。
【００５７】
「遺伝子変更」及び「遺伝子改変」という用語（及びそれらの文法的変形）は、本明細書で交換可能に使用され、遺伝子要素（例えばポリヌクレオチド）が有糸分裂または減数分裂以外によって細胞に導入されるプロセスを指す。要素は細胞に対して異種であり得、または細胞内に既に存在する要素の追加の複製または改良版であり得る。遺伝子変更は、例えば、電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿、またはポリヌクレオチドリポソーム複合体に接触させること等の、当業者に既知の任意のプロセスを通して、細胞を組換えプラスミドまたは他のポリヌクレオチドでトランスフェクトすることによってもたらされ得る。遺伝子変更は、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡウイルスまたはウイルス性ベクターでの形質導入または感染によってもまたもたらされ得る。概して、遺伝子要素は細胞内の染色体または微小染色体へと導入されるが、該細胞及びその子孫の表現型及び／または遺伝子型を変化させる任意の変更がこの用語に含まれる。
【００５８】
細胞は、外来性ＤＮＡが細胞内部に導入されている場合、外来性ＤＮＡによって（例えば組換えウイルスを通して）「遺伝子改変」または「形質転換」または「トランスフェクト」されている。外来性ＤＮＡの存在は、永久的または一時的遺伝子変化をもたらす。形質転換させるＤＮＡは、細胞のゲノムへ統合（共有結合）されることもされないこともある。「クローン」は、有糸分裂によって単一の細胞または共通の祖先から誘導される細胞の集合である。「細胞株」は、多くの世代にわたって安定的なインビトロ増殖が可能である一次細胞のクローンである。
【００５９】
遺伝子配列が、インビトロでの細胞の長期培養（ｅｘｔｅｎｄｅｄ  ｃｕｌｔｕｒｅ）中及び／またはインビボでの長期間にわたって、その機能を行うために利用可能である場合、細胞は、その遺伝子配列で「安定的に」変化させられる、形質導入される、遺伝子改変される、または形質転換される、と言われる。概して、かかる細胞は、変化した細胞の子孫によって遺伝可能でもある遺伝子変化が導入されるという点で、「遺伝的に」変化させられている（遺伝子改変されている）。
【００６０】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、本明細書で交換可能に使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。この用語は、改変されたアミノ酸ポリマー、例えばジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、リン酸化、または標識成分との複合体化も包含する。遺伝子産物を哺乳類対象に送達する文脈で考察される場合、抗血管形成ポリペプチド、神経保護ポリペプチド等のようなポリペプチド、及びそれらの組成物は、それぞれの無傷のポリペプチド、または、無傷のタンパク質の所望の生化学機能を保持するその任意の断片もしくは遺伝子操作された誘導体を指す。同様に、抗血管形成ポリペプチドをコードする核酸、神経保護ポリペプチドをコードする核酸、及び遺伝子産物の哺乳類対象への送達における使用のための他のかかる核酸（受容体細胞に送達される「導入遺伝子」と称され得る）への参照は、無傷のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは所望の生化学機能を所有する任意の断片もしくは遺伝子操作された誘導体を含む。
【００６１】
「単離」プラスミド、核酸、ベクター、ウイルス、ビリオン、宿主細胞、タンパク質、または他の物質は、その物質が自然発生するまたはそれから初めに調製される場合に存在し得る、他の成分のうちの少なくともいくつかが欠ける物質の調製物を指す。したがって、例えば単離物質は、原料混合物からそれを濃縮するために、精製技術を使用することによって調製され得る。濃縮は、溶液の体積当たりの重量等の絶対基準で測定され得るか、または、原料混合物内に存在する、第２の潜在的干渉物質との相対性で測定され得る。本開示の実施形態の濃縮を増加することは、より単離を高めることである。単離プラスミド、核酸、ベクター、ウイルス、宿主細胞、または他の物質は、いくつかの実施形態では、例えば、純度約８０％〜約９０％、少なくとも純度約９０％、少なくとも純度約９５％、少なくとも純度約９８％、もしくは少なくとも純度約９９％、またはそれよりも高い純度に精製される。
【００６２】
本明細書で使用される場合、「治療」、「治療する」等の用語は、所望の薬理及び／または生理効果を得ることを指す。効果は、疾患もしくはその症状を完全にもしくは部分的に予防するという点で予防的であり得、かつ／または、疾患及び／もしくは該疾患に帰属する有害作用の部分的または完全治療の点で治療的であり得る。「治療」は本明細書で使用される場合、哺乳類における、特にヒトにおける疾患の任意の治療を網羅し、（ａ）疾患にかかりやすくなった可能性があるまたは疾患にかかる危険性があり得るが、それを有するとまだ診断されていない対象において、疾患（及び／または疾患によって引き起こされる症状）を予防すること、（ｂ）疾患（及び／または疾患によって引き起こされる症状）を抑制すること、すなわちその進行を阻止すること、ならびに（ｃ）疾患（及び／または疾患によって引き起こされる症状）を軽減すること、すなわち疾患（及び／または疾患によって引き起こされる症状）の後退を引き起こすことを含む。
【００６３】
「個体」、「宿主」、「対象」、及び「患者」という用語は、本明細書で交換可能に使用され、哺乳類を指し、ヒト、サルを含む非ヒト霊長類、哺乳類競技動物（例えば、ウマ）、哺乳類家畜動物（例えば、ヒツジ、ヤギ等）、哺乳類ペット（イヌ、ネコ等）、及びげっ歯類（例えば、ネズミ、ラット等）が挙げられるがこれらに限定されない。
【００６４】
いくつかの実施形態では、個体は、以前にＡＡＶに自然に曝露されたことがあり、結果として抗ＡＡＶ抗体（すなわちＡＡＶ中和抗体）を内部に有するヒトである。いくつかの実施形態では、個体は、ＡＡＶベクターを投与されたことがあり（かつ結果として抗ＡＡＶ抗体を内部に有し得る）、異なる症状の治療のためまたは同じ症状のさらなる治療のためにベクターの再投与を必要とするヒトである。例えば肝臓、筋肉、及び網膜（このビヒクルに対する中和抗体によって影響を受けた全ての組織）へのＡＡＶ遺伝子送達を伴う臨床試験における陽性結果に基づき、多くのかかる治療用途／疾患標的がある。
【００６５】
「有効量」という用語は本明細書で使用される場合、有益なまたは所望の臨床結果をもたらすのに十分な量である。有効量は、１回以上の投与で投与され得る。本開示の目的のために、化合物（例えば感染性ｒＡＡＶビリオン）の有効量は、特定の疾患状態（例えば癌）の進行（及び／または疾患状態に関連する症状）を緩和、改良、安定化、逆行、予防、減速、または遅延させるのに十分な量である。したがって、感染性ｒＡＡＶビリオンの有効量は、個人の抗ＡＡＶ抗体の中和活性を逃れる、よって異種核酸を個人の標的細胞（または標的細胞（複数））に有効に送達することができる、感染性ｒＡＡＶビリオンの量である。
【００６６】
本発明をさらに記載する前に、具体的な実施形態は当然のことながら変化し得るため、本発明は記載される具体的な実施形態に限定されないということが理解されるべきである。本明細書で使用される用語は、具体的な実施形態を記載する目的のみのためであり、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲のみによって限定されるため、限定的であるということを意図されないこともまた理解されるべきである。
【００６７】
値の範囲が提供される場合、その範囲の上限と下限との間の、文脈が別様を明確に述べない限り、下限の単位の１０分の１までのそれぞれの介在値、及びその述べられる範囲の任意の他の述べられるまたは介在する値は、本発明内に包含される。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、より小さい範囲に独立して含まれ得、本発明内に包含されるが、述べられる範囲の任意の具体的に排除される限度の対象である。述べられる範囲が限度の一方または両方を含む場合、これらの含まれる限度の一方または両方を排除する範囲もまた本発明に含まれる。
【００６８】
別様が定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術及び科学用語は、本発明が属する技術の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様または等価の任意の方法及び物質もまた、本発明の実践及び試験において使用され得るものの、好ましい方法及び物質がこれから記載される。本明細書で言及される全ての刊行物は、刊行物が記載されるものとの関連で方法及び／または物質を開示及び記載するために、参照により本明細書に組み込まれる。
【００６９】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「この（ｔｈｅ）」は、文脈が別様を明確に述べない限り、複数形の指示物を含むということもまた理解されるべきである。したがって、例えば、「（ａｎ）感染性組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオン」への言及は、複数のかかるビリオンを含み、「（ｔｈｅ）感染性組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオン」への言及は、１つ以上のかかるビリオン及び当業者に既知のその均等物等を含む、等である。請求項は、任意の追加の要素を排除するように起草され得るということにさらに留意されたい。したがって、本声明は、請求要素の記載と関連する「単に」「のみ」等の排除的用語の使用、または「否定的」限定の使用の先の記載の役割を果たすことが意図される。
【００７０】
明確にするために別個の実施形態の文脈において記載される、本発明のある特定の特徴は、単一の実施形態において組み合わせで提供されてもよいということが理解される。逆に、簡潔にするために単一の実施形態の文脈で記載される本発明の様々な特徴は、別個にまたは任意の好適な下位組み合わせでもまた提供されてよい。本発明に関連する実施形態の全ての組み合わせは、本発明によって具体的に包含され、それぞれの全ての組み合わせが個々に明確に開示されるかのように本明細書で開示される。さらに、様々な実施形態及びその要素の全ての下位組み合わせもまた、本発明により具体的に包含され、それぞれの全てのかかる下位組み合わせが個々に明確に本明細書で開示されるかのように本明細書で開示される。
【００７１】
本明細書で考察される刊行物は、本特許出願の出願日の前のその開示についてのみ提供される。本明細書中の全てのものは、本発明が先行発明のためにかかる刊行物に先行する権利が無いという了解として解釈されるべきでない。さらに、提供される刊行物の日付は、独立して確認する必要があり得る実際の公開日とは異なり得る。
【００７２】
詳細な説明
本開示は、変異体カプシドタンパク質及び異種核酸を含む感染性組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンを提供する。本開示は変異体アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質（及び／または変異体ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする核酸）をさらに提供し、これは感染性ｒＡＡＶビリオンに、ヒトＡＡＶ中和抗体への上昇した耐性を与える。本開示は、感染性ｒＡＡＶビリオン及び／または主題の変異体ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする核酸を含む宿主細胞をさらに提供する。本開示は上記のビリオン、カプシドタンパク質、核酸、及び／または宿主細胞のライブラリをさらに提供し、このライブラリの少なくとも１つのメンバーの変異体ＡＡＶカプシドタンパク質は、配列番号１０〜１３及び２６〜３３のうちの１つに記載されるアミノ酸配列と比べて少なくとも１つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。
【００７３】
本開示は、異種核酸を標的細胞に送達する方法をさらに提供し、この標的細胞は主題の感染性ｒＡＡＶビリオンに接触させられる。本開示は、遺伝子産物を個体に送達する方法をさらに提供し、該方法は有効量の主題のｒＡＡＶビリオンを、それを必要とする個体に投与することを概して含む。本明細書には主題の方法を実践するための組成物及びキットもまた提供される。多くの実施形態では、主題の感染性ｒＡＡＶビリオン、主題の核酸、主題の変異体ＡＡＶカプシドタンパク質、主題の宿主細胞等が単離される。
【００７４】
変異体ＡＡＶカプシドポリペプチド
主題の変異体ＡＡＶカプシドポリペプチド（または主題の核酸によってコードされる変異体ＡＡＶカプシドタンパク質）は、変異体ＡＡＶカプシドポリペプチドを含む感染性ｒＡＡＶビリオンに、野生型ＡＡＶ（例えばＡＡＶ２（野生型ＡＡＶ血清型２））または野生型カプシドタンパク質を含むＡＡＶによって示される耐性と比較して、ヒトＡＡＶ中和抗体への上昇した耐性を与える。いくつかの実施形態では、上昇した耐性は、野生型ＡＡＶ（例えばＡＡＶ２（野生型ＡＡＶ血清型２））または野生型カプシドタンパク質を含むＡＡＶによって示される耐性よりも、少なくとも約１．５倍（例えば、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約７．５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約１７倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１５０倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約２５０倍、少なくとも約３００倍等）高い。
【００７５】
主題の変異体ＡＡＶカプシドタンパク質（または主題の核酸によってコードされる変異体ＡＡＶカプシドタンパク質）は、感染性ｒＡＡＶビリオンに、野生型ＡＡＶ（例えばＡＡＶ２（野生型ＡＡＶ血清型２））または野生型カプシドタンパク質を含むＡＡＶによって示される形質導入と比較して、ヒトＡＡＶ中和抗体の存在下で、哺乳類細胞への増加した形質導入を与えると言うことができる。いくつかの実施形態では、増加した形質導入は、野生型ＡＡＶ（例えばＡＡＶ２（野生型ＡＡＶ血清型２））または野生型カプシドタンパク質を含むＡＡＶによって示される形質導入よりも、少なくとも約１．５倍（例えば少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約７．５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約１７倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１５０倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約２５０倍、少なくとも約３００倍等）多い。
【００７６】
いくつかの実施形態では、主題の変異体ＡＡＶカプシドタンパク質（または主題の核酸によってコードされる変異体ＡＡＶカプシドタンパク質）は、野生型ＡＡＶカプシドタンパク質に結合する中和抗体への低下した結合を示す。例えば、主題の変異体ＡＡＶカプシドタンパク質は、野生型カプシドＡＡＶタンパク質に結合する中和抗体への少なくとも約１．５倍（例えば、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約７．５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約１７倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１５０倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約２５０倍、少なくとも約３００倍等）低下した結合（例えば低下した親和性）を、この抗体の野生型ＡＡＶカプシドタンパク質への結合親和性と比較して、示し得る。
【００７７】
いくつかの実施形態では、抗ＡＡＶ中和抗体は、約１０−７Ｍ未満、約５×１０−６Ｍ未満、約１０−６Ｍ未満、約５×１０−５Ｍ未満、約１０−５Ｍ未満、約１０−４Ｍ未満、またはより低い親和性で、主題の変異体ＡＡＶカプシドタンパク質（または主題の核酸によってコードされる変異体ＡＡＶカプシドタンパク質）に結合する。
【００７８】
「変異体カプシドタンパク質」という用語は、野生型ＡＡＶカプシドタンパク質を包含しない。「変異体ＡＡＶカプシドタンパク質」は自然発生ＡＡＶカプシドタンパク質内に存在するアミノ酸配列を含まない。例えば、主題の変異体カプシドタンパク質は、配列番号１〜９に記載される配列のうちのいずれとの１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含まない。換言すると、主題の変異体カプシドタンパク質は、配列番号１〜９のうちのいずれかに記載されるアミノ酸配列を含まない。変異体カプシドタンパク質は、「スターター」または「親」ＡＡＶカプシドタンパク質とはアミノ酸配列が異なり得、この親ＡＡＶカプシドタンパク質は、野生型ＡＡＶカプシドタンパク質または非野生型ＡＡＶカプシドタンパク質であり得る。
【００７９】
いくつかの実施形態では、主題の変異体ＡＡＶカプシドタンパク質（または主題の核酸によってコードされる変異体ＡＡＶカプシドタンパク質）は、配列番号１０〜１３及び２６〜３３のうちの１つに記載されるアミノ酸配列のアミノ酸２０３〜７３６と、少なくとも約９０％（例えば少なくとも約９２％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、または１００％）のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００８０】
いくつかの実施形態では、主題の変異体ＡＡＶカプシドタンパク質（または主題の核酸によってコードされる変異体ＡＡＶカプシドタンパク質）は、配列番号１０〜１３及び２６〜３３のうちの１つに記載されるアミノ酸配列と、少なくとも約９０％（例えば少なくとも約９２％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、または１００％）のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００８１】
いくつかの実施形態では、主題の変異体ＡＡＶカプシドタンパク質（または主題の核酸によってコードされる変異体ＡＡＶカプシドタンパク質）は、配列番号１０に記載されるアミノ酸配列のアミノ酸２０３〜７３６と少なくとも約９５％（例えば少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、または１００％）のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、ＡＡＶ２（例えば配列番号２）のＡＡＶカプシドタンパク質と比べて、アミノ酸置換Ｎ３１２Ｋ、Ｎ４４９Ｄ、Ｄ４７２Ｎ、Ｎ５５１Ｓ、Ｉ６９８Ｖ、及びＬ７３５Ｑ、または別のＡＡＶ親血清型における対応する位置を含む。
【００８２】
いくつかの実施形態では、主題の変異体ＡＡＶカプシドタンパク質（または主題の核酸によってコードされる変異体ＡＡＶカプシドタンパク質）は、配列番号１０に記載されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％（例えば、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、または１００％）のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、ＡＡＶ２（例えば配列番号２）のＡＡＶカプシドタンパク質と比べてアミノ酸置換Ｎ３１２Ｋ、Ｎ４４９Ｄ、Ｄ４７２Ｎ、Ｎ５５１Ｓ、Ｉ６９８Ｖ、及びＬ７３５Ｑ、または別のＡＡＶ親血清型における対応する位置を含む。
【００８３】
いくつかの実施形態では、主題の変異体ＡＡＶカプシドタンパク質（または主題の核酸によってコードされる変異体ＡＡＶカプシドタンパク質）は、配列番号３１に記載されるアミノ酸配列のアミノ酸２０３〜７３６と少なくとも約９５％（例えば、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、または１００％）のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、ＡＡＶ２（例えば配列番号２）のＡＡＶカプシドタンパク質と比べてアミノ酸置換Ｎ３１２Ｋ、Ｎ４４９Ｄ、Ｎ５５１Ｓ、及びＩ６９８Ｖ、または別のＡＡＶ親血清型における対応する位置を含む。
【００８４】
いくつかの実施形態では、主題の変異体ＡＡＶカプシドタンパク質（または主題の核酸によってコードされる変異体ＡＡＶカプシドタンパク質）は、配列番号３１に記載されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％（例えば少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、または１００％）のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、ＡＡＶ２（例えば配列番号２）のＡＡＶカプシドタンパク質と比べてアミノ酸置換Ｎ３１２Ｋ、Ｎ４４９Ｄ、Ｎ５５１Ｓ、及びＩ６９８Ｖ、または別のＡＡＶ親血清型における対応する位置を含む。
【００８５】
いくつかの実施形態では、主題の変異体ＡＡＶカプシドタンパク質（主題の核酸によってコードされる変異体ＡＡＶカプシドタンパク質）は、配列番号３２に記載されるアミノ酸配列のアミノ酸２０３〜７３６と少なくとも約９５％（例えば、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、または１００％）のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、ＡＡＶ２（例えば配列番号２）のＡＡＶカプシドタンパク質と比べてアミノ酸置換Ｄ１８０Ｎ、Ｎ３１２Ｋ、Ｑ３８５Ｒ、Ｎ４４９Ｄ、Ｎ５５１Ｓ、Ｉ６９８Ｖ、及びＳ７２１Ｔ、または別のＡＡＶ親血清型における対応する位置を含む。
【００８６】
いくつかの実施形態では、主題の変異体ＡＡＶカプシドタンパク質（または主題の核酸によってコードされる変異体ＡＡＶカプシドタンパク質）は、配列番号３２に記載されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％（例えば、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、または１００％）のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、ＡＡＶ２（例えば配列番号２）のＡＡＶカプシドタンパク質と比べてアミノ酸置換Ｄ１８０Ｎ、Ｎ３１２Ｋ、Ｑ３８５Ｒ、Ｎ４４９Ｄ、Ｎ５５１Ｓ、Ｉ６９８Ｖ、及びＳ７２１Ｔ、または別のＡＡＶ親血清型における対応する位置を含む。
【００８７】
いくつかの実施形態では、主題の変異体ＡＡＶカプシドタンパク質（または主題の核酸によってコードされる変異体ＡＡＶカプシドタンパク質）は、配列番号３３に記載されるアミノ酸配列のアミノ酸２０３〜７３６と少なくとも約９５％（例えば、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、または１００％）のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、ＡＡＶ２（例えば配列番号：２）のＡＡＶカプシドタンパク質と比べてアミノ酸置換Ｎ３１２Ｋ、Ｎ４４９Ｄ、Ｔ４５０Ａ、Ｎ５５１Ｓ、及びＩ６９８Ｖ、または別のＡＡＶ親血清型における対応する位置を含む。
【００８８】
いくつかの実施形態では、主題の変異体ＡＡＶカプシドタンパク質（または主題の核酸によってコードされる変異体ＡＡＶカプシドタンパク質）は、配列番号３３に記載されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％（例えば、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、または１００％）のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＡＡＶ２（例えば配列番号２）のＡＡＶカプシドタンパク質と比べてアミノ酸置換Ｎ３１２Ｋ、Ｎ４４９Ｄ、Ｔ４５０Ａ、Ｎ５５１Ｓ、及びＩ６９８Ｖ、または別のＡＡＶ親血清型における対応する位置を含む。
【００８９】
例示的な変異体ＡＡＶカプシドタンパク質には以下が挙げられるがこれらに限定されない（選択される例示的な配列アライメントについて図８〜１０を参照されたい）。
【００９０】
ＳＭ１０−２（アミノ酸配列）
2020010684.tif 000002
【００９１】
ＳＭ１０−２（ヌクレオチド配列）
2020010684.tif 000003
【００９２】
シャッフル１００−１（アミノ酸配列）
2020010684.tif 000004
【００９３】
シャッフル１００−１（ヌクレオチド配列）
2020010684.tif 000005
【００９４】
シャッフル１００−３（アミノ酸配列）
2020010684.tif 000006
【００９５】
シャッフル１００−３（ヌクレオチド配列）
2020010684.tif 000007
【００９６】
シャッフル１００−７（アミノ酸配列）
2020010684.tif 000008
【００９７】
シャッフル１００−７（ヌクレオチド配列）
2020010684.tif 000009
【００９８】
シャッフル１０−２（アミノ酸配列）
2020010684.tif 000010
【００９９】
シャッフル１０−２（ヌクレオチド配列）
2020010684.tif 000011
【０１００】
シャッフル１０−６（アミノ酸配列）
2020010684.tif 000012
【０１０１】
シャッフル１０−６（ヌクレオチド配列）
2020010684.tif 000013
【０１０２】
シャッフル１０−８（アミノ酸配列）
2020010684.tif 000014
【０１０３】
シャッフル１０−８（ヌクレオチド配列）
2020010684.tif 000015
【０１０４】
シャッフル１００−２（アミノ酸配列）
2020010684.tif 000016
【０１０５】
シャッフル１００−２（ヌクレオチド配列）
2020010684.tif 000017
【０１０６】
ＳＭ１０−１（アミノ酸配列）
2020010684.tif 000018
【０１０７】
ＳＭ１０−１（ヌクレオチド配列）
2020010684.tif 000019
【０１０８】
ＳＭ１０−８（アミノ酸配列）
2020010684.tif 000020
【０１０９】
ＳＭ１０−８（ヌクレオチド配列）
2020010684.tif 000021
【０１１０】
ＳＭ１００−３（アミノ酸配列）
2020010684.tif 000022
【０１１１】
ＳＭ１００−３（ヌクレオチド配列）
2020010684.tif 000023
【０１１２】
ＳＭ１００−１０（アミノ酸配列）
2020010684.tif 000024
【０１１３】
ＳＭ１００−１０（ヌクレオチド配列）
2020010684.tif 000025
【０１１４】
核酸及び宿主細胞
本開示は、変異体ＡＡＶカプシドタンパク質（上記の通り）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、ならびに主題の核酸を含む宿主細胞を提供する。核酸及び宿主細胞は、ｒＡＡＶビリオンの生成（下記の通り）に有用である。
【０１１５】
本開示は、主題の核酸を含む宿主細胞例えば単離宿主細胞を提供する。主題の宿主細胞は「遺伝子改変宿主細胞」と称され得、典型的に単離細胞例えばインビトロ培養内の細胞である。主題の宿主細胞は、下記のように主題のｒＡＡＶビリオンの生成に有用である。主題の宿主細胞が主題のｒＡＡＶビリオンを生成するために使用される場合、それは「パッケージング細胞」と称される。いくつかの実施形態では、主題の宿主細胞は主題の核酸で安定的に遺伝子改変される（すなわち安定的にトランスフェクトされる）。他の実施形態では、主題の宿主細胞は主題の核酸で一時的に遺伝子改変される（すなわち一時的にトランスフェクトされる）。
【０１１６】
主題の核酸は、電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿、リポソーム媒介トランスフェクト等を含むがこれらに限定されない確立された技術を使用して、宿主細胞に安定的にまたは一時的に導入される。安定的形質転換のために、主題の核酸は、概して、選択マーカー、例えばネオマイシン耐性等のいくつかの公知の選択マーカーのいずれかをさらに含むだろう。
【０１１７】
主題の宿主細胞は、主題の核酸を、様々な細胞、例えば、例えばマウス細胞及び霊長類細胞（例えばヒト細胞）を含む、哺乳類細胞のいずれかに導入することによって生成される。好適な哺乳類細胞は、霊長類細胞及び細胞株を含むがこれらに限定されず、好適な細胞株は、２９３細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、３Ｔ３マウス線維芽細胞、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２線維芽細胞、ＣＨＯ細胞等を含むがこれらに限定されない。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、主題の宿主細胞は、突然変異カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸に加え、１つ以上のＡＡＶ  ｒｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む。他の実施形態では、主題の宿主細胞は、下記に記載のようにｒＡＡＶベクターをさらに含む。下記により詳細に記載されるように、ｒＡＡＶビリオンは主題の宿主細胞を使用して生成される。
【０１１９】
感染性ｒＡＡＶビリオン
主題の感染性ｒＡＡＶビリオンは、変異体ＡＡＶカプシドタンパク質及び異種核酸（下記により詳細に記載される）を含み、野生型ＡＡＶ（例えばＡＡＶ２（野生型ＡＡＶ血清型２））または野生型カプシドタンパク質を含むＡＡＶによって示される耐性と比較して、ヒトＡＡＶ中和抗体への上昇した耐性を示す。「上昇した耐性」とは、主題の感染性ｒＡＡＶビリオンがヒト抗ＡＡＶ抗体の存在下で上昇した感染性を示すことを意味する。上記のように、ウイルス感染性は、感染性ウイルス粒子の合計ウイルス粒子に対する比率として表現され得る。したがって、上昇した感染性は、感染性ウイルス粒子の合計ウイルス粒子に対する上昇した比率を意味する。ヒト抗ＡＡＶ抗体へのＡＡＶの耐性を決定するために、ＡＡＶの感染性は、遺伝子送達効率性（すなわち感染性）をヒト抗ＡＡＶ抗体の不在下の５０％に低減するために必要とされる抗体濃度（例えば、血清濃度、ＩＶＩＧ濃度等）（ｍｇ／ｍＬ）を得るために様々な濃度のヒト抗ＡＡＶ抗体の存在下で測定される。遺伝子送達効率性をヒト抗ＡＡＶ抗体の不在下におけるそれの５０％に低減するために、より高い抗体濃度を必要とするウイルスは、抗体中和への上昇した耐性を有するとされる。したがって、耐性における２倍の上昇は、遺伝子送達効率性をヒト抗ＡＡＶ抗体の不在下におけるそれの５０％に低減するために必要とされる抗体濃度における２倍の上昇を意味する。いくつかの実施形態では、主題の感染性ｒＡＡＶビリオンは、野生型ＡＡＶ（例えばＡＡＶ２（野生型ＡＡＶ血清型２））または野生型カプシドタンパク質を含むＡＡＶによって示される耐性よりも、ヒトＡＡＶ中和抗体への少なくとも約１．５倍（例えば少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約７．５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約１７倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１５０倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約２５０倍、少なくとも約３００倍等）高い耐性を示す。
【０１２０】
主題の感染性ｒＡＡＶビリオンは、ヒトＡＡＶ中和抗体の存在下で、哺乳類細胞への増加した形質導入を示すと言われ得る。いくつかの実施形態では、主題の感染性ｒＡＡＶビリオンは、野生型ＡＡＶ（例えばＡＡＶ２（野生型ＡＡＶ血清型２））または野生型カプシドタンパク質を含むＡＡＶによって示される形質導入よりも、ヒトＡＡＶ中和抗体の存在下で、哺乳類細胞の少なくとも約１．５倍（例えば少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約７．５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約１７倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１５０倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約２５０倍、少なくとも約３００倍等）多い形質導入を示す。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、主題の感染性ｒＡＡＶビリオンは、野生型ＡＡＶカプシドタンパク質に結合する中和抗体への低下した結合を示す。例えば、主題の感染性ｒＡＡＶビリオンは、抗体の野生型ＡＡＶカプシドタンパク質への結合親和性と比較して、野生型カプシドＡＡＶタンパク質に結合する中和抗体への、少なくとも約１．５倍（例えば少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約７．５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約１７倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１５０倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約２５０倍、少なくとも約３００倍等）低減した結合（例えば低減した親和性）を示し得る。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、抗ＡＡＶ中和抗体は、約１０−７Ｍ未満、約５×１０−６Ｍ未満、約１０−６Ｍ未満、約５×１０−５Ｍ未満、約１０−５Ｍ未満、約１０−４Ｍ未満、またはより低い親和性で主題の感染性ｒＡＡＶビリオンに結合する。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、主題の感染性ｒＡＡＶビリオンは、野生型ＡＡＶと比較して増加したインビボ滞留時間を示す。例えば、主題の感染性ｒＡＡＶビリオンは、野生型ＡＡＶの滞留時間よりも少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約１００％、少なくとも約３倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍以上長い滞留時間を示す。
【０１２４】
所与の主題の感染性ｒＡＡＶビリオンが、中和抗体への低減した結合及び／または中和抗体への上昇した耐性を示すかどうかは、当業者に既知の任意の便利なアッセイを使用して決定することができる。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、主題の感染性ｒＡＡＶビリオンは、野生型Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、及びＲｅｐ４０タンパク質を含む。他の実施形態では、主題の感染性ｒＡＡＶビリオンは、１つ以上の変異体カプシドタンパク質に加えて、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、及びＲｅｐ４０タンパク質のうちの１つ以上における１つ以上の突然変異体を含む。
【０１２６】
異種核酸
主題のｒＡＡＶベクター（例えば主題の感染性ｒＡＡＶビリオン）における使用に好適な異種ＤＮＡ分子（本明細書で「異種核酸」とも称される）は、任意の異種核酸であり得る。いくつかの実施形態では、異種核酸は、ポリペプチド（例えば、いくつかの所望の特徴を標的細胞に与えるタンパク質、例えば細胞追跡を可能にする蛍光タンパク質、標的細胞内で欠けているまたは変化した活性を提供する酵素等）をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、異種核酸はＲＮＡ干渉剤（上記に定義の通り）を含む。
【０１２７】
主題の異種核酸は、概して約５キロベース（ｋｂ）未満の大きさであり、例えば、受容体個体または標的細胞から不足しているまたは欠けているタンパク質をコードする遺伝子（ヌクレオチド配列）、所望の生物効果または治療効果（例えば、抗細菌、抗ウイルス、または抗腫瘍／抗癌機能）を有するタンパク質をコードする遺伝子、有害あるいは望ましくないタンパク質の生成を抑制または低減するＲＮＡをコードするヌクレオチド配列（例えば上記に定義されるＲＮＡ干渉剤をコードするヌクレオチド配列）、及び／または抗原タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むだろう。
【０１２８】
好適な異種核酸は、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、癌、ハイパーコレステミア（ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｍｉａ）；活性化剤欠損症／ＧＭ２ガングリオシドーシス、αマンノシドーシス、アスパルチルグルコサミン尿症、コレステロールエステル蓄積症、慢性ヘキソサミニダーゼＡ欠損症、シスチン症、ダノン病、ファブリー病、ファーバー病、フコシドーシス、ガラクトシアリドーシス、ゴーシェ病、ＧＭ１ガングリオシドーシス、Ｉ細胞病／ムコリピドーシスＩＩ、乳児遊離シアル酸蓄積症／ＩＳＳＤ、若年性ヘキソサミニダーゼＡ欠損症、クラッベ病、リゾソーマル酸リパーゼ欠損症、異染性白質ジストロフィー、ムコ多糖症疾患（偽性ハーラーポリジストロフィー／ムコリピドーシスＩＩＩＡ、ＭＰＳＩハーラー症候群、ＭＰＳＩシャイエ症候群、ＭＰＳ  Ｉハーラーシャイエ症候群、ＭＰＳ  ＩＩハンター症候群、サンフィリポ症候群Ａ型／ＭＰＳ  ＩＩＩ  Ａ、サンフィリポ症候群Ｂ型／ＭＰＳ  ＩＩＩ  Ｂ、サンフィリポ症候群Ｃ型／ＭＰＳ  ＩＩＩ  Ｃ、サンフィリポ症候群Ｄ型／ＭＰＳ  ＩＩＩ  Ｄ、モルキオＡ型／ＭＰＳ  ＩＶＡ、モルキオＢ型／ＭＰＳ  ＩＶＢ、ＭＰＳ  ＩＸヒアルロニダーゼ欠損症、ＭＰＳ  ＶＩ  マロトーラミー、ＭＰＳ  ＶＩＩ  スライ症候群、ムコリピドーシスＩ／シアリドーシス、ムコリピドーシスＩＩＩＣ、及びムコリピドーシスＩＶ型を含む）、多種スルファターゼ欠損症、ニーマンピック病、神経セロイドリポフスチン症、ポンペ病／糖原病ＩＩ型、濃化異骨症、サンドホフ病／成人発症／ＧＭ２ガングリオシドーシス、サンドホフ病／ＧＭ２ガングリオシドーシス−乳児性、サンドホフ病／ＧＭ２ガングリオシドーシス−若年性、シンドラー病、サラ病／シアル酸蓄積症、テイサックス／ＧＭ２ガングリオシドーシス、及びウォルマン病等のリソソーム蓄積症、糖尿病等のインスリン障害、成長障害、様々な貧血症、地中海貧血症、及び血友病を含む様々な血液障害；嚢胞性線維症、ゴーシェ病、ハーラー病、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）欠損症、肺気腫等の遺伝的欠損等の、炎症性疾患、自己免疫、慢性、及び感染性疾患等の障害を含む、内分泌、代謝、血液、心循環、神経、筋骨格、泌尿器、肺、及び免疫障害の治療のために使用されるタンパク質をコードするものを含むがこれらに限定されない。
【０１２９】
好適な異種核酸は、インターフェロン（例えばＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−ω；ＩＦＮ−τ）；インスリン（例えばＮｏｖｏｌｉｎ、Ｈｕｍｕｌｉｎ、Ｈｕｍａｌｏｇ、Ｌａｎｔｕｓ、Ｕｌｔｒａｌｅｎｔｅ等）；エリスロポエチン（「ＥＰＯ」；例えばＰｒｏｃｒｉｔ（登録商標）、Ｅｐｒｅｘ（登録商標）、またはＥｐｏｇｅｎ（登録商標）（エポエチン−α）；Ａｒａｎｅｓｐ（登録商標）（ダルベポエチン−α）；ＮｅｏＲｅｃｏｒｍｏｎ（登録商標）、Ｅｐｏｇｉｎ（登録商標）（エポエチン−β）等）；モノクローナル抗体の抗原結合断片（例えばＬｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標）（ラニビズマブ））を含む、抗体（例えばモノクローナル抗体）（例えばＲｉｔｕｘａｎ（登録商標）（リツキシマブ）、Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標）（インフリキシマブ）、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）（トラスツズマブ）、Ｈｕｍｉｒａ（商標）（アダリムマブ）、Ｘｏｌａｉｒ（登録商標）（オマリズマブ）、Ｂｅｘｘａｒ（登録商標）（トシツモマブ）、Ｒａｐｔｉｖａ（商標）（エファリズマブ）、Ｅｒｂｉｔｕｘ（商標）（セツキシマブ）、Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）（ベバシズマブ）等）；血液因子（例えばＡｃｔｉｖａｓｅ（登録商標）（アルテプラーゼ）組織プラスミノーゲン活性化因子、ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）（組換えヒト因子ＶＩＩａ）、因子ＶＩＩａ、因子ＶＩＩＩ（例えばＫｏｇｅｎａｔｅ（登録商標））、因子ＩＸ、β−グロビン、ヘモグロビン等）；コロニー刺激因子（例えばＮｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標）（フィルグラスチム；Ｇ−ＣＳＦ）、Ｎｅｕｌａｓｔａ（ペグフィルグラスチム）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球−単球コロニー刺激因子、マクロファージコロニー刺激因子、巨核球コロニー刺激因子等）；成長ホルモン（例えばソマトロピン、例えばＧｅｎｏｔｒｏｐｉｎ（登録商標）、Ｎｕｔｒｏｐｉｎ（登録商標）、Ｎｏｒｄｉｔｒｏｐｉｎ（登録商標）、Ｓａｉｚｅｎ（登録商標）、Ｓｅｒｏｓｔｉｍ（登録商標）、Ｈｕｍａｔｒｏｐｅ（登録商標）等、ヒト成長ホルモン等）；インターロイキン（例えばＩＬ−１、例えばＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）を含むＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９等）；成長因子（例えばＲｅｇｒａｎｅｘ（登録商標）（ベクラペルミン（ｂｅｃｌａｐｅｒｍｉｎ）；ＰＤＧＦ）、Ｆｉｂｌａｓｔ（登録商標）（トラフェルミン；ｂＦＧＦ）、Ｓｔｅｍｇｅｎ（登録商標）（アンセスチム；幹細胞因子）、ケラチノサイト成長因子、酸性線維芽細胞成長因子、幹細胞因子、塩基性線維芽細胞成長因子、肝細胞成長因子等）；可溶性受容体（例えば、Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標）（エタネルセプト）等のＴＮＦ−α結合可溶性受容体、可溶性ＶＥＧＦ受容体、可溶性インターロイキン受容体、可溶性γ／δ  Ｔ細胞受容体等）；酵素（例えばα−グルコシダーゼ；Ｃｅｒａｚｙｍｅ（登録商標）（イミグルカラーゼ；β−グルコセレブロシダーゼ、Ｃｅｒｅｄａｓｅ（登録商標）（アルグルセラーゼ；）；酵素活性化剤（例えば組織プラスミノーゲン活性化因子）；ケモカイン（例えばＩＰ−１０；Ｍｉｇ；Ｇｒｏα／ＩＬ−８、ＲＡＮＴＥＳ；ＭＩＰ−１α；Ｍ��Ｐ−１β；ＭＣＰ−１；ＰＦ−４等）；血管形成剤（例えば血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）；抗血管形成剤（例えば可溶性ＶＥＧＦ受容体）；タンパク質ワクチン；ブラジキニン、コレシストキニン、ガスチン（ｇａｓｔｉｎ）、セクレチン、オキシトシン、性腺刺激ホルモン放出ホルモン、ベータエンドルフィン、エンケファリン、Ｐ物質、ソマトスタチン、プロラクチン、ガラニン、成長ホルモン放出ホルモン、ボンベシン、ダイノルフィン、ニューロテンシン、モチリン、甲状腺刺激ホルモン、ニューロペプチドＹ、黄体ホルモン、カルシトニン、インスリン、グルカゴン、バソプレシン、アンジオテンシンＩＩ、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、血管作用性小腸ペプチド、睡眠ペプチド等の神経活性ペプチド；血栓溶解剤、心房性ナトリウム利尿ペプチド、骨形態形成蛋白質、トロンボポエチン、リラキシン、グリア線維酸性タンパク質、卵胞刺激ホルモン、ヒトα−１抗トリプシン、白血病抑制因子，形質転換成長因子、インスリン様成長因子、黄体形成ホルモン、マクロファージ活性化因子、腫瘍壊死因子、好中球走化性因子、神経成長因子メタロプロテイナーゼの組織抑制因子等の他のタンパク質；血管作用性小腸ペプチド、アンジオゲニン、アンジオトロピン、フィブリン；ヒルジン；白血病抑制因子；ＩＬ−１受容体拮抗薬（例えばＫｉｎｅｒｅｔ（登録商標）（アナキンラ））；イオンチャネル、例えば嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）；ジストロフィン；ウトロフィン、腫瘍抑制因子；リソソーム酵素酸性α−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）；等を含むがこれらに限定されない、様々なタンパク質のうちのいずれかをコードするものを含むがこれらに限定されない。好適な核酸は、前述のタンパク質のいずれかの機能的断片をコードするもの、及び前述のタンパク質のいずれかの機能的変異体をコードする核酸もまた含む。
【０１３０】
好適な異種核酸は抗原タンパク質をコードするものもまた含む。抗原タンパク質をコードする異種核酸を含む主題のｒＡＡＶベクターは、哺乳類宿主における抗原タンパク質への免疫応答を刺激するのに好適である。抗原タンパク質は、自己抗原、アレルゲン、腫瘍／癌関連抗原、病原ウイルス、病原細菌、病原原虫、病原蠕虫、または哺乳類宿主に感染する任意の他の病原微生物に由来する。本明細書で使用される場合、「に由来する抗原タンパク質をコードする核酸」という用語は、野生型抗原タンパク質をコードする核酸、例えばウイルス性タンパク質をコードする病原ウイルスから単離された核酸；自然発生抗原タンパク質とアミノ酸配列が同一である抗原タンパク質をコードする、実験室で生成された合成核酸；自然発生抗原タンパク質とはアミノ酸配列が異なる（例えば１アミノ酸〜約１５アミノ酸）抗原タンパク質をコードするが、それでもなお対応する自然発生抗原タンパク質への免疫応答を引き起こす、実験室で生成された合成核酸；抗原タンパク質の断片（例えば約５アミノ酸〜約５０アミノ酸の断片であり、この断片は１つ以上の抗原エピトープを含む）をコードし、この断片が対応する自然発生抗原タンパク質への免疫応答を引き起こす、実験室で生成された合成核酸等を含む。
【０１３１】
同様に、自己抗原、アレルゲン、腫瘍／癌関連抗原、病原ウイルス、病原細菌、病原原虫、病原蠕虫、または哺乳類宿主に感染する任意の他の病原微生物に「由来する」抗原タンパク質は、自然発生抗原タンパク質とアミノ酸配列が同一であるタンパク質、及び自然抗原タンパク質とはアミノ酸配列が異なる（例えば１アミノ酸〜約１５アミノ酸）が、それでもなお対応する自然発生抗原タンパク質への免疫応答を引き起こすタンパク質、ならびに、対応する自然発生抗原タンパク質への免疫応答を引き起こす、抗原タンパク質の断片（例えば約５アミノ酸〜約１００アミノ酸、例えば約５〜約５０アミノ酸の断片であり、この断片は１つ以上の抗原エピトープを含む）を含む。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、主題のｒＡＡＶベクターによってコードされる抗原タンパク質への免疫応答は、哺乳類宿主において抗原タンパク質または抗原エピトープ（またはｒＡＡＶコード抗原タンパク質または抗原エピトープと交差反応性のタンパク質またはエピトープ）を呈する病原微生物への保護免疫応答を刺激するだろう。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶコード抗原タンパク質への細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答は、哺乳類宿主において引き起こされるだろう。他の実施形態では、抗原タンパク質に特異的な抗体が生成されるように、ｒＡＡＶコード抗原タンパク質への体液性応答は哺乳類宿主細胞において引き起こされるだろう。多くの実施形態では、ｒＡＡＶコード抗原タンパク質へのＴＨ１免疫応答は哺乳類宿主において引き起こされるだろう。好適な抗原タンパク質は、腫瘍／癌関連抗原、ウイルス性抗原、細菌性抗原、及び原虫性抗原、ならびにその抗原断片を含む。いくつかの実施形態では、抗原タンパク質は細胞内病原体に由来する。他の実施形態では、抗原タンパク質は自己抗原である。さらに他の実施形態では、抗原タンパク質はアレルゲンである。
【０１３３】
腫瘍／癌特異性抗原は、ＭＡＧＥ１（例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ７７４８１）、ＭＡＧＥ２（例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ０３７３５）、ＭＡＧＥ３、ＭＡＧＥ４等を含む様々なＭＡＧＥ（メラノーマ関連抗原Ｅ）のいずれか；様々なチロシナーゼのいずれか；突然変異ｒａｓ；突然変異ｐ５３（例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ５４１５６及びＡＡ４９４３１１）；及びｐ９７メラノーマ抗原（例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ１２１５４）を含むがこれらに限定されない。他の腫瘍／癌特異性抗原は、進行癌に関連するＲａｓペプチド及びｐ５３ペプチド、子宮頸癌に関連するＨＰＶ１６／１８及びＥ６／Ｅ７抗原、乳癌に関連するＭＵＣＩ１−ＫＬＨ（例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｊ０３６５１）、結腸直腸癌に関連するＣＥＡ（癌胎児性抗原）（例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ９８３１１）、ｇｐ１００（例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｓ７３００３）またはメラノーマに関連するＭＡＲＴ１抗原、及び前立腺癌に関連するＰＳＡ抗原（例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ１４８１０）を含む。ｐ５３遺伝子配列は既知であり（例えばＨａｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，６：４６５０−４６５６を参照）受託番号Ｍ１４６９４の下でＧｅｎＢａｎｋに寄託される。したがって、主題のタンパク質、核酸、及び／またはビリオンは、子宮頸癌、乳癌、結腸直腸癌、前立腺癌、肺癌を含むがこれらに限定されない癌、及びメラノーマの免疫療法として使用され得る。
【０１３４】
ウイルス性抗原は、麻疹、流行性耳下腺炎、風疹、灰白髄炎、肝炎Ａ、Ｂ（例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｅ０２７０７）、及びＣ（例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｅ０６８９０）、ならびに他の肝炎ウイルス、インフルエンザ、アデノウイルス（例えば４型及び７型）、狂犬病（例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ３４６７８）、黄熱病、日本脳炎（例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｅ０７８８３）、デング熱（例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ２４４４４）、ハンタウイルス、及びヒト免疫不全ウイルス（例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ１８５５２）を含むがこれらに限定されない疾患の原因となる既知の病原体に由来する。
【０１３５】
好適な細菌性及び寄生虫抗原は、ジフテリア、百日咳（例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ３５２７４）、破傷風（例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ６４３５３）、結核、細菌性及び真菌性肺炎（例えばインフルエンザ菌、ニューモシスチスカリニ等）、コレラ、腸チフス、ペスト、細菌性赤痢，サルモネラ症（例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｌ０３８３３）、在郷軍人病、ライム病（例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ５９４８７）、マラリア（例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ５３８３２）、鉤虫、オンコセルカ症（例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ２７８０７）、住血吸虫症（例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｌ０８１９８）、トリパノソーマ症、レシュマニアシス（ｌｅｓｈｍａｎｉａｓｉｓ）、ジアルジア症（例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ３３６４１）、アメーバ症、フィラリア症（例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｊ０３２６６）、ボレリア症、及び旋毛虫症を含むがこれらに限定されない疾患の原因となる既知の病原体に由来するものを含む。
【０１３６】
異種遺伝子産物をコードする好適な異種核酸は、ＲＮＡｉ剤（上記により詳細に記載される通り）（例えばアンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ＣＲＩＳＰＲ剤、例えばＣａｓ９またはＣａｓ９様タンパク質、ｃｒＲＮＡ様ＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ様ＲＮＡ、単一誘導ＲＮＡ、及び／またはドナーポリヌクレオチド等）等の未翻訳ＲＮＡ、リボザイム等を含む。ＲＮＡｉ剤は、遺伝子発現を抑制するために使用され得る。いくつかのＲＮＡｉ剤は、遺伝子発現を抑制するために後に使用することができるツールを提供する（例えば、ｃａｓ９またはｃａｓ９様タンパク質等のＣＲＩＳＰＲ剤）。
【０１３７】
標的遺伝子は有害（例えば病理的）である標的遺伝子産物（ＲＮＡまたはタンパク質）、例えば、機能不全の標的遺伝子産物（例えば、コードタンパク質配列における突然変異に起因する、遺伝子産物の定常状態レベルを制御する非コード配列における突然変異に起因する等）をコードする任意の遺伝子を含む。標的遺伝子産物は、ハンチンチン、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、アミロイド前駆体タンパク質、タウ、ポリグルタミン反復配列を含むタンパク質、ヘルペスウイルス（例えば水痘帯状疱疹）、任意の病理的ウイルス等を含むがこれらに限定されない。
【０１３８】
したがって、ＲＮＡｉ剤をコードする異種核酸を含む主題のｒＡＡＶは、神経変性疾患、例えば、ポリグルタミン反復配列に関連する疾患であって、例えばハンティントン病、脊髄小脳失調症、球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ）、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）等の、ポリグルタミン反復配列に関連する疾患等の、トリヌクレオチド反復配列疾患；ウイルス性感染等の後天性病理（例えば異常な生理、生化学、細胞、構造、または分子生物状態によって明らかになる疾患または症候群）例えばＨＣＶ感染の結果として生じるまたは生じ得る肝炎、ＨＩＶ感染の結果として生じる後天性免疫不全症候群；癌等を含むがこれらに限定されない、様々な障害及び病態の治療に有用である。
【０１３９】
多くの実施形態では、ＲＮＡｉ剤をコードする異種核酸はプロモーターに作動可能に連結される。好適なプロモーターは、当業者に既知であり、任意のタンパク質コード遺伝子、例えば内因的に制御された遺伝子または構成的に発現された遺伝子のプロモーターを含む。例えば、細胞生理事象、例えば低酸素状態において、例えば熱ショック、酸素レベル、及び／または一酸化炭素レベルによって制御される遺伝子のプロモーターはｓｉＲＮＡコード核酸に作動可能に連結され得る。
【０１４０】
ＥＰＯコードまたは目的とする核酸等の選択された異種ヌクレオチド配列は、インビボのヌクレオチド配列におけるその転写または発現を管理する制御要素に作動可能に連結される。かかる制御要素は、通常選択された遺伝子と関連する制御配列（例えば内因性細胞制御要素）を含み得る。あるいは、異種制御配列が用いられ得る。有用な異種制御配列は概して哺乳類またはウイルス性遺伝子をコードする配列に由来するものを含む。例としては、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳癌ウイルス末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ  ＭＬＰ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）プロモーター、目的とする遺伝子に対して異種である内因性細胞プロモーター、ＣＭＶ最初期プロモーター領域（ＣＭＶＩＥ）等のサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、合成プロモーター、ハイブリッドプロモーター等が挙げられるがこれらに限定されない。さらに、マウスメタロチオネイン遺伝子等の非ウイルス性遺伝子由来の配列もまた本明細書において役立ち得る。かかるプロモーター配列は、例えばＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（カリフォルニア州サンディエゴ）から商業的に入手可能である。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、細胞型特異性または組織特異性プロモーターは、遺伝子産物が具体的な細胞型（複数可）または組織（複数可）内で選択的にまたは優先的に生成されるように、異種遺伝子産物をコードする異種核酸に作動可能に連結され得る。いくつかの実施形態では、誘導プロモーターは、異種核酸に作動可能に連結され得る。
【０１４２】
例えば、筋肉特異性かつ誘導プロモーター、エンハンサー等は、遺伝子産物の筋細胞への送達に有用である。かかる制御要素は、ｍｙｏＤ遺伝子ファミリーから等のアクチン及びミオシン遺伝子ファミリー由来のもの、ミオサイト特異性エンハンサー結合因子ＭＥＦ−２、ヒト骨格アクチン遺伝子及び心臓アクチン遺伝子由来の制御要素、筋クレアチンキナーゼ配列要素及びマウスクレアチンキナーゼエンハンサー（ｍＣＫ）要素、骨格速収縮トロポニンＣ遺伝子、緩徐収縮心臓トロポニンＣ遺伝子、及び緩徐収縮トロポニンＩ遺伝子由来の制御要素、低酸素誘導核因子、グルココルチコイド応答要素（ＧＲＥ）等のステロイド誘導要素及びプロモーター、ＲＵ４８６誘導のための融合コンセンサス要素、テトラサイクリン制御遺伝子発現を提供する要素を含むがこれらに限定されない。
【０１４３】
ＡＡＶ  ＩＴＲによって結合される目的とするＤＮＡ分子（異種ＤＮＡ）を内部に有するＡＡＶ発現ベクターは、選択された配列（複数可）を、主要なＡＡＶオープンリーディングフレーム（「ＯＲＦ」）が切除されたＡＡＶゲノムに直接的に挿入することによって構築され得る。ＩＴＲの十分な部分が複製及びパッケージング機能を可能にし続ける限り、ＡＡＶゲノムの他の部分もまた削除され得る。かかる構築物は、当業者に公知の技術を使用して設計され得る。例えば米国特許第５，１７３，４１４号及び同第５，１３９，９４１号、国際公開ＷＯ９２／０１０７０号（１９９２年１月２３日公開）及びＷＯ９３／０３７６９号（１９９３年３月４日公開）、Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：３９８８−３９９６、Ｖｉｎｃｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ９０（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、Ｃａｒｔｅｒ，Ｂ．Ｊ．（１９９２）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ３：５３３−５３９、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．（１９９２）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７−１２９、Ｋｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．（１９９４）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ５：７９３−８０１、Ｓｈｅｌｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ（１９９４）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ１：１６５−１６９、ならびにＺｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９：１８６７−１８７５を参照されたい。
【０１４４】
あるいは、ＡＡＶ  ＩＴＲは、ウイルス性ゲノムから、または別のベクター内に存在する選択された核酸構築物の同じかつ融合した５′及び３′を含有するＡＡＶベクターから、当業者に既知の任意の便利な方法を使用して切除され得る。例えば１つの好適なアプローチは、上記のＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．に記載されるもの等の、標準ライゲーション技術を使用する。例えばライゲーションは、２０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ７．５、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＤＴＴ、３３μｇ／ｍｌのＢＳＡ、１０ｍＭ〜５０ｍＭのＮａＣｌ、及び４０μＭのＡＴＰ、０℃〜１６℃の０．０１〜０．０２（Ｗｅｉｓｓ）ユニットＴ４  ＤＮＡリガーゼ（「付着末端」ライゲーション）、または１ｍＭのＡＴＰ、１４℃の０．３〜０．６（Ｗｅｉｓｓ）ユニットＴ４  ＤＮＡリガーゼ（「平滑末端」ライゲーション）のいずれかにおいて、達成され得る。分子内「付着末端」ライゲーションは、たいてい３０〜１００μｇ／ｍｌの合計ＤＮＡ濃度（５〜１００ｎＭの合計最終濃度）で行われる。ＩＴＲを含有するＡＡＶベクターは、例えば米国特許第５，１３９，９４１号に記載されている。特に、該文献において、受託番号５３２２２、５３２２３、５３２２４、５３２２５、及び５３２２６下で米国培養細胞系統保存機関（「ＡＴＣＣ」）から入手可能であるいくつかのＡＡＶベクターが記載される。
【０１４５】
さらに、キメラ遺伝子は、１つ以上の選択された核酸配列の５′及び３′を配置したＡＡＶ  ＩＴＲ配列を含むために、合成的に生成され得る。哺乳類筋細胞におけるキメラ遺伝子配列の発現に好ましいコドンが使用され得る。完全キメラ配列は、標準方法によって調製される重複オリゴヌクレオチドから構築される。例えば、Ｅｄｇｅ，Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）２９２：７５６、Ｎａｍｂａｉｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８４）２２３：１２９９、Ｊａｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８４）２５９：６３１１を参照されたい。
【０１４６】
主題の感染性ｒＡＡＶビリオンの生成
導入として、ｒＡＡＶベクター複製及びパッケージングのために、宿主または「生成体」細胞を用いるのが典型的である。かかる生成体細胞（たいてい哺乳類宿主細胞）は、概してｒＡＡＶ生成のためにいくつかの異なる種類の成分を含むか、または含むように改変される。第１の成分は、宿主パッケージング細胞によってベクター粒子に複製及びパッケージングされ得る、組換えアデノ随伴ウイルス性（ｒＡＡＶ）ベクターゲノム（または「ｒＡＡＶプロベクター」）である。ｒＡＡＶプロベクターは、通常異種ポリヌクレオチド（または「導入遺伝子」）を含み得、これを用いて、遺伝子療法に関連して別の細胞を遺伝子変化させることが望ましい（かかる導入遺伝子のｒＡＡＶベクターへのパッケージングは、導入遺伝子を様々な哺乳類細胞に送達するために有効に使用することができるため）。導入遺伝子は概して、ＡＡＶベクターの切除、複製、及びパッケージングの間、ならびにベクターの宿主細胞ゲノムへの統合の間に認識される配列を含む、２つのＡＡＶ逆位末端配列（ＩＴＲ）によって隣接される。
【０１４７】
第２の成分は、ＡＡＶ複製のためのヘルパー機能を提供するヘルパーウイルスである。アデノウイルスが一般的に用いられるものの、当業者に既知のように他のヘルパーウイルスもまた使用され得る。あるいは、必要なヘルパーウイルス機能がヘルパーウイルスから遺伝子単離され得、コード遺伝子がトランスにヘルパーウイルス機能を提供するために使用され得る。ＡＡＶベクター要素及びヘルパーウイルス（またはヘルパーウイルス機能）は、同時にまたは任意の順で連続的に、のいずれかで宿主細胞に導入され得る。
【０１４８】
ＡＡＶ生成が提供されるための生成体細胞内の最後の成分は、複製タンパク質及びカプシド形成タンパク質をそれぞれ提供する、ＡＡＶ  ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子等の「ＡＡＶパッケージング遺伝子」である。ＡＡＶパッケージング遺伝子のいくつかの異なるバージョンが提供され得る（ｒｅｐ及び／またはｃａｐ遺伝子がネイティブプロモーターの制御下に残され得るかまたは異種プロモーターに作動可能に連結され得る、ｒｅｐ−ｃａｐカセット及び別個のｒｅｐ及び／またはｃａｐカセットを含む）。かかるＡＡＶパッケージング遺伝子は、当業者に既知でありかつ下記により詳細に記載されるように、宿主パッケージング細胞に一時的にまたは安定的に導入され得る。
【０１４９】
１．ｒＡＡＶベクター
目的とする異種ＤＮＡ（「目的とする異種ＤＮＡ」は本明細書で「異種核酸」とも称される）を含む主題のｒＡＡＶビリオンは、当業者に既知の標準方法を使用して生成することができる。方法は、（１）主題のｒＡＡＶベクターを宿主細胞に導入するステップ、（２）ＡＡＶヘルパー構築物を宿主細胞に導入するステップであって、該ヘルパー構築物が、ＡＡＶベクターから欠けているＡＡＶヘルパー機能を補償するために、宿主細胞内で発現されることが可能なＡＡＶコード領域を含む、導入するステップ、（３）１つ以上のヘルパーウイルス及び／または付属機能ベクターを宿主細胞に導入するステップであって、該ヘルパーウイルス及び／または付属機能ベクターが、宿主細胞における効率的な組換えＡＡＶ（「ｒＡＡＶ」）ビリオン生成を支持することが可能である付属機能を提供する、導入するステップ、ならびに（４）ｒＡＡＶビリオンを生成するために宿主細胞を培養するステップを概して含む。ＡＡＶ発現ベクター、ＡＡＶヘルパー構築物、及びヘルパーウイルスまたは付属機能ベクター（複数可）は、標準トランスフェクト技術を使用して、同時にまたは連続的に、のいずれかで宿主細胞に導入され得る。
【０１５０】
ＡＡＶ発現ベクターは、少なくとも転写の方向で作動的に連結される成分、転写開始領域を含む制御要素、目的とするＤＮＡ、及び転写終端領域を提供するために、既知の技術を使用して構築される。制御要素は、哺乳類筋細胞において機能的になるように選択される。作動的に連結される成分を含有する生じた構築物は、機能的ＡＡＶ  ＩＴＲ配列で結合される（５′及び３′）。
【０１５１】
ＡＡＶ  ＩＴＲ領域のヌクレオチド配列は既知である。例えば、ＡＡＶ−２配列について、Ｋｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．（１９９４）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ５：７９３−８０１；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ  ａｎｄ  Ｄ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ，ｅｄｓ．）内のＢｅｒｎｓ，Ｋ．Ｉ．"Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ"を参照されたい。本発明のベクターにおいて使用されるＡＡＶ  ＩＴＲは、野生型ヌクレオチド配列を有する必要がなく、例えばヌクレオチドの挿入、欠失、または置換によって変化させられ得る。さらに、ＡＡＶ  ＩＴＲは、ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−７等を含むがこれらに限定されないいくつかのＡＡＶ血清型のうちのいずれかに由来し得る。さらに、ＡＡＶ発現ベクターにおいて選択されたヌクレオチド配列に隣接する５′及び３′ＩＴＲは、それらが意図されるように機能する、すなわち宿主細胞ゲノムまたはベクターからの目的とする配列の切除及び救出を可能にする、及びＡＡＶ  Ｒｅｐ遺伝子産物が細胞内に存在する場合ＤＮＡ分子の受容体細胞ゲノムへの統合を可能にする限り、同一である必要または同じＡＡＶ血清型または単離物に由来する必要がない。ＩＴＲは、Ｒｅｐタンパク質の適切な混合物の存在下で、ベクター配列の複製を可能にする。ＩＴＲは、ＡＡＶ粒子を生成するための、ベクター配列のカプシドへの組み込みもまた可能にする。
【０１５２】
ｒＡＡＶビリオンを生成するために、ＡＡＶ発現ベクターは、トランスフェクト等の既知の技術を使用して好適な宿主細胞に導入される。多数のトランスフェクト技術は概して当業者に既知である。例えばＧｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、及びＣｈｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｇｅｎｅ１３：１９７を参照されたい。特に好適なトランスフェクト方法は、リン酸カルシウム共沈殿（Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９７３）Ｖｉｒｏｌ．５２：４５６−４６７）、培養細胞への直接的微量注入（Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｍ．Ｒ．（１９８０）Ｃｅｌｌ２２：４７９−４８８）、電気穿孔（Ｓｈｉｇｅｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｇｕｅｓ６：７４２−７５１）、リポソーム媒介遺伝子移入（Ｍａｎｎｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ６：６８２−６９０）、脂質媒介形質導入（Ｆｅｌｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：７４１３−７４１７）、及び高速微小投射物を使用する核酸送達（Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ３２７：７０−７３）を含む。
【０１５３】
本開示の目的のために、ｒＡＡＶビリオンの生成に好適な宿主細胞は、異種ＤＮＡ分子の受容体として使用され得るまたは使用されている、微細物、酵母細胞、昆虫細胞、及び哺乳類細胞を含む。この用語は、トランスフェクトされた元来細胞の子孫を含む。したがって、ｒＡＡＶビリオンを生成するための「宿主細胞」は、概して外来性ＤＮＡ配列でトランスフェクトされた細胞を指す。安定的ヒト細胞株である２９３（例えば受託番号ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５７３下で米国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）を通して容易に入手可能）からの細胞は多くの実施形態で使用される。特に、ヒト細胞株２９３は、アデノウイルス５型ＤＮＡ断片で形質転換されたヒト胎児性腎細胞株であり（Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９７７）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：５９）、アデノウイルス性Ｅ１ａ及びＥ１ｂ遺伝子（Ａｉｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９７９）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ９４：４６０）を発現する。２９３細胞株は、容易にトランスフェクトされ、ｒＡＡＶビリオンを生成するための特に便利なプラットフォームを提供する。
【０１５４】
２．ＡＡＶヘルパー機能
ＡＡＶ  ＩＴＲによって隣接されるヌクレオチド配列を複製及びカプシド形成してｒＡＡＶビリオンを生成するために、上記のＡＡＶ発現ベクターを含有する宿主細胞は、ＡＡＶヘルパー機能を提供することができるようにされなければならない。ＡＡＶヘルパー機能は、概して、順に、生産的ＡＡＶ複製のためにトランスにおいて機能するＡＡＶ遺伝子産物を提供するために発現され得る、ＡＡＶ由来コード配列である。ＡＡＶヘルパー機能は、本明細書において、ＡＡＶ発現ベクターから欠けている必須ＡＡＶ機能を補償するために使用される。したがって、ＡＡＶヘルパー機能は、主要なＡＡＶ  ＯＲＦ、すなわちｒｅｐ及びｃａｐコード領域、またはその機能的相同体のうちの１つまたは両方を含む。本開示の文脈では、ｃａｐ機能は１つ以上の突然変異カプシドタンパク質を含み、少なくとも１つのカプシドタンパク質は上記のように少なくとも１つの突然変異を含む。
【０１５５】
「ＡＡＶ  ｒｅｐコード領域」とは、複製タンパク質Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、及びＲｅｐ４０をコードするＡＡＶゲノムの当業者に認識される領域を意味する。これらのＲｅｐ発現産物は、ＤＮＡ複製のＡＡＶ起源の認識、結合、及びニッキング、ＤＮＡヘリカーゼ活性、ならびにＡＡＶ（または他の異種）プロモーターからの転写の調節を含む、多くの機能を所有することが示されている。Ｒｅｐ発現産物は、ＡＡＶゲノムの複製のために集合的に必要とされる。ＡＡＶ  ｒｅｐコード領域の説明について、例えばＭｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．（１９９２）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７−１２９、及びＫｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．（１９９４）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ５：７９３−８０１を参照されたい。ＡＡＶ  ｒｅｐコード領域の好適な相同体は、ＡＡＶ−２ＤＮＡ複製を媒介するとも既知である（Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ２０４：３０４−３１１）、ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ−６）ｒｅｐ遺伝子を含む。
【０１５６】
ＡＡＶ  ｃａｐタンパク質はＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３を含み、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３のうちの少なくとも１つは、上記のように少なくとも１つの突然変異を含む。
【０１５７】
ＡＡＶヘルパー機能は、ＡＡＶ発現ベクターのトランスフェクトの前またはそれと同時のいずれかで、宿主細胞をＡＡＶヘルパー構築物でトランスフェクトすることによって、宿主細胞に導入される。ＡＡＶヘルパー構築物は、したがって、生産的ＡＡＶ感染に必須である、欠けているＡＡＶ機能を補償するために、ＡＡＶ  ｒｅｐ及び／またはｃａｐ遺伝子の少なくとも一時的な発現を提供するために使用される。ＡＡＶヘルパー構築物はＡＡＶ  ＩＴＲを欠如し、自身を複製することもパッケージングすることもできない。これらの構築物は、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、ウイルス、またはビリオンの形態であり得る。Ｒｅｐ及びＣａｐ発現産物の両方をコードする、一般的に使用されるプラスミドｐＡＡＶ／Ａｄ及びｐＩＭ２９＋４５等の、多数のＡＡＶヘルパー構築物が説明されている。例えばＳａｍｕｌｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２−３８２８、及びＭｃＣａｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：２９３６−２９４５を参照されたい。Ｒｅｐ及び／またはＣａｐ発現産物をコードする多数の他のベクターが説明されている。例えば米国特許第５，１３９，９４１号を参照されたい。
【０１５８】
ＡＡＶ発現ベクター及びＡＡＶヘルパー構築物の両方は、１つ以上の任意の選択マーカーを含有するように構築され得る。好適なマーカーは、細胞が適切な選択的媒体において増殖されるとき、選択マーカーを含有する核酸構築物でトランスフェクトされた細胞への抗生物質耐性または感受性を与える、該細胞に色を与える、または該細胞の抗原特徴を変更する、遺伝子を含む。本開示の方法の実践において有用であるいくつかの選択マーカーには、ハイグロマイシンに耐性を与えることによって、哺乳類細胞における選択を可能にするハイグロマイシンＢ耐性遺伝子（アミノグリコシドホスホトランフェラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｆｅｒａｓｅ）（ＡＰＨ）をコードする）、Ｇ４１８に耐性を与えることによって、哺乳類細胞における選択を可能にするネオマイシンホスホトランフェラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｆｅｒａｓｅ）遺伝子（ネオマイシンホスホトランスフェラーゼをコードする）等が挙げられる。他の好適なマーカーは当業者に既知である。
【０１５９】
３．ＡＡＶ付属機能
ｒＡＡＶビリオンを生成するために、宿主細胞（またはパッケージング細胞）は、非ＡＡＶ由来機能または「付属機能」を提供することもできるようにされなければならない。付属機能は、ＡＡＶがその複製について依存性である、非ＡＡＶ由来ウイルス及び／または細胞機能である。したがって、付属機能は、ＡＡＶ遺伝子転写の活性化、段階特異的ＡＡＶ  ｍＲＮＡスプライシング、ＡＡＶ  ＤＮＡ複製、Ｃａｐ発現産物の合成、及びＡＡＶカプシド構築に関与するものを含む、ＡＡＶ複製において必要とされる少なくともこれらの非ＡＡＶタンパク質及びＲＮＡを含む。ウイルス系の付属機能は、既知のヘルパーウイルスのうちの任意のものに由来し得る。
【０１６０】
特に、付属機能は、当業者に既知の方法を使用して、宿主細胞内に導入されてそこにおいて発現され得る。一般的に、付属機能は、宿主細胞の無関係のヘルパーウイルスでの感染により提供される。アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス１型及び２型等のヘルペスウイルス、及びワクシニアウイルスを含む、多数の好適なヘルパーウイルスが既知である。任意の様々な既知の剤を使用して細胞同期化によって提供されるもの等の非ウイルス性付属機能もまた本明細書で役立ち得る。例えばＢｕｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４０：２４１−２４７、ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１４７：２１７−２２２、Ｓｃｈｌｅｈｏｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１５２：１１０−１１７を参照されたい。
【０１６１】
あるいは、付属機能は付属機能ベクターを使用して提供され得る。付属機能ベクターは、１つ以上の付属機能を提供するヌクレオチド配列を含む。付属機能ベクターは、宿主細胞における効率的なＡＡＶビリオン生成を支持するために、好適な宿主細胞に導入され得る。付属機能ベクターは、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、または別のウイルスの形態であり得る。付属ベクターは、適切な制御要素及び酵素と関連付けられると、付属機能を提供するために宿主細胞において転写または発現され得る、１つ以上の直線化ＤＮＡまたはＲＮＡ断片の形態でもまたあり得る。
【０１６２】
付属機能を提供する核酸配列は、アデノウイルス粒子のゲノムからのように、自然源から得られ得、または、当業者に既知の組換えまたは合成方法を使用して構築され得る。この点に関して、アデノウイルス由来の付属機能は、広範に研究されており、付属機能に関与する多数のアデノウイルス遺伝子が特定及び部分的に特徴付けられている。例えばＣＲＣ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ，ｖｏｌ．Ｉ（Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ，ｅｄ．）内のＣａｒｔｅｒ，Ｂ．Ｊ．（１９９０）"Ａｄｅｎｏ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｖｉｒｕｓ  Ｈｅｌｐｅｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ"、及びＭｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎ．１５８：９７−１２９を参照されたい。得に、早期アデノウイルス遺伝子領域Ｅ１ａ、Ｅ２ａ、Ｅ４、ＶＡＩ  ＲＮＡ、及びおそらくＥ１ｂは、付属プロセスに関わると考えられる。Ｊａｎｉｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７８：１９２５−１９２９。ヘルペスウイルス由来の付属機能は説明されている。例えばＹｏｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９７９）Ｐｒｏｇ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．２５：１１３を参照されたい。ワクシニアウイルス由来の付属機能もまた説明されている。例えば上記のＣａｒｔｅｒ，Ｂ．Ｊ．（１９９０）、Ｓｃｈｌｅｈｏｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１５２：１１０−１１７を参照されたい。
【０１６３】
宿主細胞のヘルパーウイルスでの感染または宿主細胞の付属機能ベクターでのトランスフェクトの結果として、ＡＡＶ  Ｒｅｐ及び／またはＣａｐタンパク質を生成するために、ＡＡＶヘルパー構築物を転写活性化する、付属機能が発現される。Ｒｅｐ発現産物は、ＡＡＶ発現ベクターから組換えＤＮＡ（目的とするＤＮＡ、例えば異種核酸を含む）を切除する。Ｒｅｐタンパク質はＡＡＶゲノムを複製する役割もまた果たす。発現されたＣａｐタンパク質はカプシドへと構築し、組換えＡＡＶゲノムはカプシドにパッケージングされる。したがって、生産的ＡＡＶ複製が結果として生じ、ＤＮＡはｒＡＡＶビリオンにパッケージングされる。
【０１６４】
組換えＡＡＶ複製の後、ｒＡＡＶビリオンは、ＣｓＣｌ勾配等の様々な従来の精製方法を使用して、宿主細胞から精製され得る。さらに、付属機能を発現するために感染が用いられる場合、既知の方法を使用して残留ヘルパーウイルスが不活性化され得る。例えば、アデノウイルスは、およそ６０℃の温度まで例えば２０分間以上加熱することによって不活性化され得る。ＡＡＶは極めて加熱安定性であり、一方でヘルパーアデノウイルスは熱不安定性であるため、この処置はヘルパーウイルスのみを有効に不活性化する。
【０１６５】
結果として生じるｒＡＡＶビリオンは、遺伝子療法用途等におけるＤＮＡ送達、または遺伝子産物の哺乳類宿主への送達のための使用に準備が整う。
【０１６６】
異種核酸の送達
本開示は、異種核酸を、標的細胞及び／または異種核酸を必要とする個体に送達する方法をさらに提供する。いくつかの実施形態では、異種核酸を必要とする個体は、以前にＡＡＶに自然に曝露されたことがあり、結果として抗ＡＡＶ抗体（すなわちＡＡＶ中和抗体）を内部に有するヒトである。例えば、肝臓、筋肉、及び網膜へのＡＡＶ遺伝子送達を含む臨床試験における陽性結果（全ての組織がこのビヒクルに対する中和抗体によって影響を受けた）に基づき、多くのかかる治療用途／疾患標的がある。
【０１６７】
主題の方法は概して（ｉ）有効量の主題のｒＡＡＶビリオンを個体に投与すること、及び／または（ｉｉ）標的細胞を主題のビリオンに接触させることを含む。概して、ｒＡＡＶビリオンは、インビボ（「直接的」）またはインビトロ（「間接的」）形質導入技術のいずれかを使用して対象に投与される。インビトロで（「間接的に」）形質導入される場合、所望の受容体細胞（すなわち「標的細胞」）は、個体から除去され得、ｒＡＡＶビリオンで形質導入され得、個体に再導入され得る。あるいは、同系細胞または異種細胞が個体において不適切な免疫応答を生成し得ない場合、同系細胞または異種細胞を使用することができる。
【０１６８】
形質導入された標的細胞の個体への送達及び導入の好適な方法は説明されている。例えば、細胞は、例えば適切な培地内で組換えＡＡＶビリオンを細胞と組み合わせること、及び目的とするＤＮＡを内部に有する細胞について、サザンブロット及び／もしくはＰＣＲ等の従来の技術を使用して、または選択マーカーを使用することによりスクリーニングすることによって、インビトロで形質導入され得る。形質導入された細胞は、その後、下記により完全に記載される医薬組成物へと製剤され得、該組成物は、筋肉内、静脈内、皮下、及び腹腔内注射によって等の、様々な技術によって対象へと導入され得る。
【０１６９】
インビボ（すなわち「直接的」）送達については、ｒＡＡＶビリオンは医薬組成物へと製剤され得、非経口投与され得る（例えば、筋肉内、皮下、腫瘍内、経皮、髄腔内、静脈内投与経路等を介して投与される）。
【０１７０】
医薬組成物は、治療的に有効な量の目的とする遺伝子発現産物を生成するために十分な遺伝子物質、すなわち、問題になっている疾患状態の症状を低減または改良するために十分な量、または所望の便益を与えるのに十分な量を含み得る。医薬組成物は薬学的に許容される賦形剤もまた含有し得る。かかる賦形剤は、それ自身では組成物を受容する個体に有害な抗体の生成を引き起こさない任意の医薬剤を含み、これは過度の毒性を伴わずに投与され得る。薬学的に許容される賦形剤は、水、生理食塩水、グリセロール、及びエタノール等の液体を含むがこれらに限定されない。薬学的に許容される塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩等のような鉱酸塩、及び酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩等のような有機酸の塩がそこに含まれ得る。さらに、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質等のような補助物質がかかるビヒクル内に存在し得る。幅広い種類の薬学的に許容される賦形剤が当業者に既知であり、本明細書で詳細に取り上げる必要はない。薬学的に許容される賦形剤は、例えば、Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００）"Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，"２０ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，＆Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（１９９９）Ｈ．Ｃ．Ａｎｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，７ｔｈｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，＆Ｗｉｌｋｉｎｓ、及びＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ（２０００）Ａ．Ｈ．Ｋｉｂｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，３ｒｄｅｄ．Ａｍｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃ．を含む様々な刊行物において詳細に説明されている。
【０１７１】
適切な投与量は、他の要因の中でもとりわけ、治療されている哺乳類（例えばヒトもしくは非ヒト霊長類、または他の哺乳類）、治療される個体の年齢及び全身状態、治療されている状態の重症度、問題になっている具体的な治療タンパク質、その投与の様態に依存し得る。適切な有効量は、当業者によって容易に決定され得る。
【０１７２】
したがって「治療的に有効な量」は、臨床試験によって決定され得る相対的に広い範囲に収まるだろう。例えば、インビボ注射、すなわち骨格筋または心筋への直接的な注射については、治療的に有効な用量は、約１０６〜約１０１５のｒＡＡＶビリオン、例えば約１０８〜１０１２のｒＡＡＶビリオンに類似するだろう。インビトロ形質導入については、細胞に送達されるｒＡＡＶビリオンの有効量は、約１０８〜約１０１３のｒＡＡＶビリオンに類似するだろう。他の有効な用量は、用量応答曲線を確立するルーチン試験を通して、当業者によって容易に確立され得る。
【０１７３】
用量治療は、単回用量スケジュールまたは複数回用量スケジュールであり得る。さらに、対象は、適切な限り多くの用量を投与され得る。当業者は、用量の適切な回数を容易に決定し得る。
【０１７４】
目的とする細胞（すなわち「標的細胞」）は、典型的に哺乳類であり、この用語は、ヒト、飼育及び家畜動物、ならびに動物園、実験室、競技、またはペット動物を含む、イヌ、ウマ、ネコ、ウシ、マウス、ラット、ウサギ等の、哺乳類として分類される任意の動物を指す。いくつかの実施形態では、標的細胞はヒト細胞である。
【０１７５】
目的とする標的細胞は、主題のｒＡＡＶビリオンによる感染を受けやすい任意の細胞を含む。いくつかの場合では、例えば方法が異種核酸を標的細胞に送達する方法である場合、標的細胞は個体から除去された細胞（例えば「一次」細胞）であり得、または標的細胞は組織培養細胞（例えば確立された細胞株から）であり得る。
【０１７６】
例示的な標的細胞は、肝臓細胞、膵臓細胞（例えば島細胞：アルファ細胞、ベータ細胞、デルタ細胞、ガンマ細胞、及び／またはエプシロン細胞）、骨格筋細胞、心筋細胞、線維芽細胞、網膜細胞、滑膜関節細胞、肺細胞、Ｔ細胞、ニューロン、グリア細胞、幹細胞、造血前駆細胞、神経前駆細胞、内皮細胞、及び癌細胞を含むがこれらに限定されない。例示的な幹細胞の標的細胞は、造血幹細胞、神経幹細胞、神経堤幹細胞、胚幹細胞、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、間葉幹細胞、中胚葉幹細胞、肝臓幹細胞、膵臓幹細胞、筋幹細胞、及び網膜幹細胞を含むがこれらに限定されない。
【０１７７】
「幹細胞」という用語は、本明細書で、自己再生及び分化子孫を生成の両方の能力を有する哺乳類細胞を指すために使用される（例えばＭｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｃｅｌｌ８８：２８７−２９８を参照）。概して幹細胞は、以下の特徴：分裂後の２つの娘細胞が異なる表現型を有し得る場合、非同時性または対称性複製を受ける能力；広範な自己再生能力；有糸分裂的無活動形態における存在の能力；及びそれらが存在する組織全てのクローン再生、例えば造血幹細胞が全ての造血系列を再構成する能力、のうちの１つ以上も有する。当業者によって理解されるように、「前駆細胞」は、それらが典型的に広範な自己再生能力を有せず、それらが由来する組織において系列のより限定されたサブセット、例えばリンパ球のみを、または造血環境では赤血球系統を、生成することができるという点で幹細胞とは異なる。本明細書で使用される場合「幹細胞」という用語は、上記に定義される「幹細胞」及び「前駆細胞」の両方を包含する。
【０１７８】
幹細胞は、抗体によって特定される特異的エピトープに関連するマーカーの存在、及び特異的抗体の結合の欠如によって特定されるある特定のマーカーの不在の両方を特徴とし得る。幹細胞は、インビトロ及びインビボの両方での機能的アッセイ、特に複数の分化子孫を起こす幹細胞の能力に関連するアッセイによっても特定され得る。
【０１７９】
目的とする好適な幹細胞は、造血幹細胞及びそれに由来する前駆細胞（米国特許第５，０６１，６２０号）；神経堤幹細胞（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｃｅｌｌ９６：７３７−７４９を参照）；神経幹細胞及び神経前駆細胞；胚幹細胞；間葉幹細胞；中胚葉幹細胞；肝臓幹細胞、筋幹細胞、網膜幹細胞、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）等を含むがこれらに限定されない。他の目的とする造血「前駆」細胞は、リンパ系統に特化した細胞、例えば未熟Ｔ細胞及びＢ細胞集団を含む。
【０１８０】
幹細胞または前駆細胞の精製集団が使用され得る。例えば、ヒト造血幹細胞は、ＣＤ３４、ｔｈｙ−１に特異的な抗体を使用して陽性選択され得、またはグリコホリンＡ、ＣＤ３、ＣＤ２４、ＣＤ１６、ＣＤ１４、ＣＤ３８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ３６、ＣＤ２、ＣＤ１９、ＣＤ５６、ＣＤ６６ａ、及びＣＤ６６ｂを含み得る系統特異性マーカー、Ｔ細胞特異性マーカー、腫瘍／癌特異性マーカー等を使用して陰性選択され得る。中胚葉幹細胞の分離に有用なマーカーには、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、Ｔｈｙ−１、ＣＤ４４、ＶＬＡ−４α、ＬＦＡ−１β、ＨＳＡ、ＩＣＡＭ−１、ＣＤ４５、Ａａ４．１、Ｓｃａ−１等が挙げられる。神経堤幹細胞は、低親和性神経成長因子受容体（ＬＮＧＦＲ）に特異的な抗体で陽性選択され得、かつマーカースルファチド、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、ミエリンタンパク質Ｐｏ、ペリフェリン、及び神経フィラメントについて陰性選択され得る。ヒト間葉幹細胞は、マーカーＳＨ２、ＳＨ３、及びＳＨ４を使用して正に分離され得る。
【０１８１】
用いられる標的細胞は、新鮮であっても、凍結していても、あるいは事前培養に供されたものであってもよい。これらは胎児、新生児、成体であってもよい。造血細胞は、胎児性肝臓、骨髄、血液、特にＧ−ＣＳＦまたはＧＭ−ＣＳＦ動員末梢血液、または任意の他の従来の源から得られてもよい。幹細胞が造血または他の系統の他の細胞から分離される様式は、本開示には重要ではない。上記のように、幹細胞または前駆細胞の実質的に均一な集団は、幹細胞に関連するエピトープ特徴を示しながら分化細胞と関連するマーカーを有しない細胞の選択性単離によって得られてもよい。
【０１８２】
個体に送達され得る核酸は、上記に定義される異種核酸のいずれかを含む。主題の方法を使用して送達され得るタンパク質は、前述のタンパク質のいずれかの機能的断片及び前述のタンパク質のいずれかの機能的変異体も含む。
【０１８３】
いくつかの実施形態では、治療的に有効な量のタンパク質は、哺乳類宿主内で生成される。治療的に有効な量の特定のタンパク質が、主題の方法を使用して哺乳類宿主内で生成されるかどうかは、特定のタンパク質に適切なアッセイを使用して容易に決定される。例えば、タンパク質がＥＰＯの場合、ヘマトクリットが測定される。
【０１８４】
ｒＡＡＶが抗原タンパク質をコードする場合、主題の方法を使用して個体に送達され得る好適な抗原タンパク質は、腫瘍／癌関連抗原、自己抗原（「自己（ｓｅｌｆ）」抗原）、ウイルス性抗原、細菌性抗原、原虫性抗原、及びアレルゲン、ならびにそれらの抗原断片を含むがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶコード抗原タンパク質への細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答が哺乳類宿主において引き起こされるだろう。他の実施形態では、抗原タンパク質に特異的な抗体が生成されるように、ｒＡＡＶコード抗原タンパク質への体液性応答が哺乳類宿主において引き起こされるだろう。多くの実施形態では、ｒＡＡＶコード抗原タンパク質へのＴＨ１免疫応答が、哺乳類宿主において引き起こされるだろう。抗原タンパク質への免疫応答が生成されたかどうかは、十分に確立された方法を使用して容易に決定される。例えば、酵素結合免疫吸着アッセイは、抗原タンパク質への抗体が生成されたかどうかを決定するために使用され得る。抗原特異性ＣＴＬを検出する方法は当業者に公知である。例えば、細胞の表面に抗原タンパク質を発現する、検出可能に標識された標的細胞は、血液試料内の抗原特異性ＣＴＬの存在についてアッセイするために使用される。
【０１８５】
治療的に有効な量の異種核酸（例えばポリペプチドをコードする核酸、ＲＮＡｉ剤等）が、主題の方法を使用して哺乳類宿主に送達されたかどうかは、任意の適切なアッセイを使用して容易に決定される。例えば、遺伝子産物がＨＩＶを抑制するＲＮＡｉ剤である場合、ウイルス負荷が測定され得る。
【０１８６】
改変ｒＡＡＶビリオンを生成及び特定する方法
本開示は、スターターＡＡＶカプシドタンパク質と比較して少なくとも１つのアミノ酸置換（欠失、挿入等を含む）を有するアミノ酸配列を含む変異体カプシドタンパク質を含む、改変感染性組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンを生成及び特定する方法を提供する。スターターＡＡＶカプシドタンパク質は、配列番号１０〜１３及び２６〜３３のうちの１つに記載されるアミノ酸配列を含む。
【０１８７】
本方法は、概して、突然変異ｒＡＡＶビリオンライブラリを生成すること、及びスターターｒＡＡＶビリオンと比べて変化した特性を有する改変ｒＡＡＶビリオンのためにライブラリを選択することを含む。スターターｒＡＡＶビリオンは、配列番号１０〜１３及び２６〜３３のうちの１つに記載されるアミノ酸配列を含む変異体ＡＡＶカプシドタンパク質を含む。本開示は、ライブラリ及びライブラリを含む組成物をさらに提供する。
【０１８８】
いくつかの実施形態では、所与の選択ステップは、変化したビリオン特性のための主題のＡＡＶライブラリを濃縮するために、２、３、４回以上反復される。いくつかの実施形態では、ＡＡＶライブラリの選択の後、個々のクローンは単離及び配列決定される。
【０１８９】
突然変異体ＡＡＶライブラリの生成
スターターＡＡＶ  ｃａｐ遺伝子と比べて１つ以上の突然変異体を含む突然変異体ＡＡＶライブラリが生成される。スターターｃａｐ遺伝子は、配列番号１０〜１３及び２６〜３３のうちの１つに記載されるアミノ酸配列を含む変異体ＡＡＶカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むｃａｐである。ｒＡＡＶ  ｃａｐ遺伝子における突然変異体は、任意の既知の方法を使用して生成される。スターターＡＡＶ  ｃａｐ遺伝子の突然変異誘発のための好適な方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）系方法、オリゴヌクレオチド特異性突然変異誘発、飽和突然変異誘発、ループスワップ突然変異誘発、断片シャフリング突然変異誘発（すなわちＤＮＡシャッフリング）等を含むがこれらに限定されない。突然変異を生成するための方法は、当業者において十分に説明される。例えばＺｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９８  Ｍａｒ；１６（３）：２３４−５、Ｋｏｅｒｂｅｒ  ｅｔ．ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２００８  Ｏｃｔ、１６（１０）：１７０３−９、Ｋｏｅｒｂｅｒ  ｅｔ．ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２００９  Ｄｅｃ；１７（１２）：２０８８−９５、米国特許第６，５７９，６７８号、米国特許第６，５７３，０９８号、及び米国特許第６，５８２，９１４号を参照されたく、該文献の全ては、突然変異誘発に関するそれらの教示について、ここで参照により組み込まれる。
【０１９０】
いくつかの実施形態では、ｃａｐ遺伝子における突然変異を含む突然変異体ＡＡＶライブラリは、付着伸長プロセスを使用して生成され得る。付着伸長プロセスは、ＰＣＲ系の方法を使用するｃａｐ遺伝子の増幅を含む。鋳型ｃａｐ遺伝子は、特異的なＰＣＲプライマーを使用して予備刺激され、変性と非常に短いアニーリング／ポリメラーゼ触媒伸長との反復される周期が続く。それぞれの周期では、成長する断片が配列相補性に基づき異なる鋳型にアニーリングし、さらに伸長する。変性、アニーリング、及び伸長の周期は、全長配列が形成するまで反復される。結果として生じる全長配列は、野生型ＡＡＶ  ｃａｐ遺伝子と比較して、ｃａｐ遺伝子において少なくとも１つの突然変異を含む。
【０１９１】
１つ以上の突然変異を含むＡＡＶ  ｃａｐ配列を含むＰＣＲ産物は、野生型ＡＡＶゲノムを含有するプラスミドに挿入される。結果として生じるのは、ＡＡＶ  ｃａｐ突然変異体のライブラリである。したがって本開示は、約１０〜約１０１０メンバーを含み、かつＡＡＶ  ｃａｐ遺伝子における突然変異を含む、突然変異体ＡＡＶ  ｃａｐ遺伝子ライブラリを提供する。ライブラリの所与のメンバーは、ＡＡＶ  ｃａｐ遺伝子において約１〜約５０の突然変異を有する。主題のライブラリは、１０〜約１０９の明確に異なるメンバーを含み、それぞれはＡＡＶ  ｃａｐ遺伝子における異なる突然変異（複数可）を有する。
【０１９２】
ｃａｐ突然変異ライブラリが生成されると、その後変化したカプシド特性に基づいて選択され得るウイルス粒子が生成される。ライブラリプラスミドＤＮＡは、好適な宿主細胞（例えば２９３細胞）中にトランスフェクトされ、その後ヘルパーウイルスの細胞への導入が続く。トランスフェクトされた宿主細胞によって生成されるウイルス粒子（ｒＡＡＶライブラリ粒子）が採取される。
【０１９３】
ライブラリ選択
ライブラリが生成されると、それは、具体的なビリオン特性（すなわち変化した感染特性）について選択される。ウイルス粒子は上記のように生成され（よって改変ｒＡＡＶビリオンのライブラリを生成する）、変化した感染特性（配列番号１０〜１３及び２６〜３３のうちの１つに記載されるアミノ酸配列を含む変異体カプシドタンパク質を含む感染性ｒＡＡＶビリオンと比べて）を有する改変ｒＡＡＶビリオンを特定するための１つ以上の選択ステップを経る。そのために選択される感染の特性は、１）ＡＡＶ中和抗体への変化した結合（例えば低減した結合）、２）ＡＡＶ中和抗体の上昇した回避、３）ＡＡＶでの感染に耐性である細胞の上昇した感染性、及び４）変化したヘパリン結合を含み得るがこれらに限定されない。
【０１９４】
１．ＡＡＶ中和抗体への低減した結合についての選択
いくつかの実施形態では、主題のＡＡＶライブラリは、中和抗体の野生型ＡＡＶビリオンへの結合及び野生型ＡＡＶビリオンの中和と比較して（または配列番号１０〜１３及び２６〜３３のうちの１つに記載されるアミノ酸配列を含む変異体カプシドタンパク質を含む感染性ｒＡＡＶビリオンと比べて）、野生型ＡＡＶビリオンに結合してそれを中和する中和抗体への変化した（例えば低減した）結合について選択される。ＡＡＶライブラリ粒子（ＡＡＶライブラリビリオン）を中和抗体に接触させ、ＡＡＶライブラリ粒子が許容状態の宿主細胞を感染させる能力が試験される。典型的に、ＡＡＶライブラリ粒子は様々な濃度の中和抗体に接触させられる。ＡＡＶライブラリ粒子の感染性を低減するために必要とされる中和抗体の濃度がより高いほど、ＡＡＶ粒子は中和に対してより耐性である。ＡＡＶライブラリビリオンの、中和する抗ＡＡＶ抗体への結合を直接的に測定する（例えば結合親和性を測定する）ために当業者に既知の任意の便利なアッセイが使用され得る。
【０１９５】
２．ＡＡＶ中和抗体からの上昇した回避についての選択
いくつかの実施形態では、主題のＡＡＶライブラリは、配列番号１０〜１３及び２６〜３３のうちの１つに記載されるアミノ酸配列を含む変異体カプシドタンパク質を含む感染性ｒＡＡＶビリオンと比べて上昇した、中和抗体からの回避（すなわち、上昇したヒト中和ＡＡＶ抗体への耐性）について選択される。ＡＡＶライブラリ粒子は、中和ＡＡＶ抗体（たいていヒト中和抗ＡＡＶ抗体）の存在下で標的細胞に接触させられる。ＡＡＶライブラリ粒子を有する細胞の感染を可能にするための好適な長さの時間の後、ヘルパーウイルスを加え、細胞（複数可）を感染させることに成功したＡＡＶライブラリ粒子を回収する。いくつかの実施形態では、感染性は感染の成功を示すビリオンについて測定される（例えば上記のように）。いくつかの実施形態では、感染の周期、ヘルパーウイルスの添加、及びＡＡＶ粒子の回収は、１、２、３回以上反復される。選択は、様々な程度の回避について選択するために、様々な量（濃度）の中和ＡＡＶ抗体を用いて生じ得る（例えば、それぞれの反復される回は、その前の回と比べて上昇した濃度の抗体を利用し得る）。
【０１９６】
３．非許容細胞の上昇した感染性についての選択
いくつかの実施形態では、主題のＡＡＶライブラリは、非許容細胞の上昇した感染性（配列番号１０〜１３及び２６〜３３のうちの１つに記載されるアミノ酸配列を含む変異体カプシドタンパク質を含む感染性ｒＡＡＶビリオンと比べて）について選択される。ＡＡＶライブラリ粒子を非許容細胞（例えば非許容細胞の集合）に接触させる。ＡＡＶライブラリ粒子を有する細胞の感染を可能にするための好適な長さの時間の後、ヘルパーウイルスを加え、非許容細胞（複数可）を感染させることに成功したＡＡＶライブラリ粒子を回収する。いくつかの実施形態では、感染の周期、ヘルパーウイルスの添加、及びＡＡＶ粒子の回収は、１、２、３回以上反復される。
【０１９７】
４．変化したヘパリン結合についての選択
いくつかの実施形態では、主題のライブラリは、野生型ＡＡＶビリオンヘパリン結合と比べて（または配列番号１０〜１３及び２６〜３３のうちの１つに記載されるアミノ酸配列を含む変異体カプシドタンパク質を含む感染性ｒＡＡＶビリオンと比べて）上昇したヘパリン結合及び低減したヘパリン結合を含む、変化したヘパリン結合について選択される。ＡＡＶライブラリ粒子をヘパリン親和性マトリックスに接触させる。例えば、ＡＡＶライブラリ粒子は、ＡＡＶライブラリ粒子のヘパリンへの結合を許容する条件下で、ヘパリン親和性カラムに入れられる。例示的な条件は、ｐＨ７．５の０．１５ＭのＮａＣｌ及び５０ｍＭのＴｒｉｓを用いたカラムの平衡化を含む。ＡＡＶライブラリ粒子がヘパリン親和性マトリックスに結合することを可能にした後、ＡＡＶライブラリ粒子／ヘパリン親和性マトリックス複合体は、段階的に上昇する濃度のＮａＣｌを含有するある量の緩衝剤で洗浄し、それぞれのＮａＣｌ濃度で、溶離したＡＡＶライブラリ粒子を採取する。例えば、結合の後、ＡＡＶライブラリ粒子／ヘパリン親和性マトリックス複合体は、２００ｍＭのＮａＣｌを含有する、ｐＨ７．５の、５０ｍＭの量のＴｒｉｓ緩衝剤で洗浄し、溶離したＡＡＶライブラリ粒子を採取する。溶離ステップは、約２５０ｍＭのＮａＣｌ、約３００ｍＭのＮａＣｌ、約３５０ｍＭ、約４００ｍＭのＮａＣｌ、約４５０ｍＭのＮａＣｌ、約５００ｍＭのＮａＣｌ、約５５０ｍＭのＮａＣｌ、約６００ｍＭのＮａＣｌ、約６５０ｍＭのＮａＣｌ、約７００ｍＭのＮａＣｌ、または約７５０ｍＭのＮａＣｌを含有する、ｐＨ７．５の５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝剤を用いて反復される。
【０１９８】
約４５０ｍＭのＮａＣｌよりも低いＮａＣｌ濃度で溶離するＡＡＶライブラリ粒子は、野生型ＡＡＶと比べて低減したヘパリン結合特徴を示す。約５５０ｍＭのＮａＣｌよりも高いＮａＣｌ濃度で溶離するＡＡＶライブラリ粒子は、野生型ＡＡＶと比べて上昇したヘパリン結合特徴を示す。
【０１９９】
いくつかの実施形態では、溶離したＡＡＶライブラリ粒子は、許容細胞のヘルパーウイルスでの同時感染によって増幅され、ヘパリン親和性マトリックス上で再分画される。本ステップは、変化したヘパリン結合特徴を有するＡＡＶライブラリ粒子を濃縮するために何回も反復され得る。
【０２００】
本方法では、１つ以上の選択ステップがＡＡＶライブラリ粒子の生成に後続し得る。例えば、いくつかの実施形態では、方法は、上昇したヘパリン結合について選択すること、その後中和抗体への低減した結合について選択することを含む。他の実施形態では、方法は、中和抗体への低減した結合について選択すること、その後上昇したヘパリン結合について選択することを含む。他の実施形態では、方法は低減したヘパリン結合について選択すること、その後中和抗体への低減した結合について選択することを含む。他の実施形態では、方法は中和抗体への低減した結合について選択すること、その後低減したヘパリン結合について選択することを含む。他の実施形態では、方法は、中和抗体への低減した結合について選択すること、その後幹細胞の上昇した感染性について選択することを含む。他の実施形態では、方法は中和抗体への低減した結合について選択すること、その後中和抗体の上昇した回避について選択することを含む。他の実施形態では、方法は中和抗体の上昇した回避について選択すること、その後中和抗体への低減した結合について選択することを含む。
【０２０１】
したがって、本開示は、それぞれの核酸が変異体ＡＡＶカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む複数の核酸を含む、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ライブラリを提供する。コード変異体ＡＡＶカプシドタンパク質は配列番号１０〜１３及び２６〜３３のうちの１つに記載される配列と比べて少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。本開示は、それぞれが配列番号１０〜１３及び２６〜３３のうちの１つに記載される配列と比べて少なくとも１つのアミノ酸置換を含むＡＡＶカプシドタンパク質を含む複数のＡＡＶ粒子を含む、突然変異アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子のライブラリを提供する。突然変異体ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする核酸は、コード突然変異体ＡＡＶカプシドタンパク質の特徴と同様に上記に記載される。
【０２０２】
本開示は、（ｉ）それぞれが変異体アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質及び異種核酸を含む２つ以上の感染性ｒＡＡＶビリオン、（ｉｉ）それぞれが変異体ＡＡＶカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む２つ以上の単離核酸、（ｉｉｉ）それぞれが変異体ＡＡＶカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む２つ以上の宿主細胞、及び（ｉｖ）２つ以上の変異体ＡＡＶカプシドタンパク質のうちの少なくとも１つを含むライブラリをさらに提供し、ライブラリの少なくとも１つのメンバーの変異体ＡＡＶカプシドタンパク質は、配列番号１０〜１３及び２６〜３３のうちの１つに記載されるアミノ酸配列と比べて少なくとも１つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。
【０２０３】
組成物及びキット
本開示の方法における使用のための組成物及びキットもまた提供される。主題の組成物及びキットは、主題の感染性ｒＡＡＶビリオン、主題のｒＡＡＶベクター、主題の変異体ＡＡＶカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む主題のヌクレオチド酸、主題の核酸（すなわち、主題の変異体ＡＡＶカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む、主題の遺伝子改変宿主細胞）を含む単離宿主細胞、主題のライブラリ（例えば上記のライブラリのいずれか）、及び主題の変異体ＡＡＶカプシドタンパク質のうちの少なくとも１つを含む。組成物またはキットは、上記のものの任意の便利な組み合わせを含み得る。組成物またはキットは、ヘルパーウイルス及び／またはヘルパーウイルスをコードするヌクレオチド配列を含む核酸もまた含み得る。キットは、改変変異体ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする核酸（すなわち「突然変異体」核酸）の生成のための試薬もまた含み得る。
【０２０４】
上記の組成物に加え、主題のキットは（ある特定の実施形態では）、主題の方法を実践するための説明書をさらに含み得る。これらの説明書は、様々な形態で主題のキット内に存在し得、このうちの１つ以上がキット内に存在し得る。これらの説明書が存在し得る１つの形態は、キットの包装内の、包装挿入物内等の、好適な媒体または基材に印刷された情報、例えば情報が印刷された紙である。これらの説明書のさらに別の形態は、情報が記録されたコンピュータ可読媒体、例えば、フロッピーディスク、コンパクトディスク（ＣＤ）、フラッシュドライブ等である。これらの説明書の存在し得るさらに別の形態は、離れたサイトで情報にアクセスするためにインターネットを介して使用され得るウェブサイトアドレスである。
【０２０５】
本発明はここで完全に記載されており、当業者には、本発明の趣旨または範囲から逸脱せずに様々な変更及び修正がなされ得るということが明白となるであろう。
【実施例】
【０２０６】
以下の実施例は、当業者に、本発明を行う及び使用する方法の完全な開示及び説明を提供するために述べられ、発明人が彼らの発明として見なすものの範囲を限定することを意図されず、下記の実験が行われる全てのまたは唯一の実験であることを表すことも意図されない。使用される数（例えば、量、温度等）に関して正確性を確実にするよう努力がなされたが、いくつかの実験誤差及び偏差が把握されるべきである。別途示されない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏度であり、圧力は大気圧またはその付近である。標準短縮語、例えばｂｐ、塩基対（複数可）；ｋｂ、キロベース（複数可）；ｍｌ、ミリリットル（複数可）、μｌ、マイクロリットル（複数可）、ｎｌ、ナノリットル（複数可）、ｐｌ、ピコリットル（複数可）、ｓまたはｓｅｃ、秒（複数可）、ｍｉｎ、分（複数可）、ｈまたはｈｒ、時間（複数可）、ａａ、アミノ酸（複数可）、ｋｂ、キロベース（複数可）、ｂｐ、塩基対（複数可）、ｎｔ、ヌクレオチド（複数可）、ｉ．ｍ．、筋肉内（に）、ｉ．ｐ．、腹腔内（に）、ｓ．ｃ．、皮下（に）、ｉ．ｖ．、静脈内（に）等が使用され得る。
【０２０７】
実施例１：
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）遺伝子療法ベクターは、今日までのいくつかの臨床試験において相当な有望性を実証している。しかしながら、幼少期の曝露またはＡＡＶベクターの以前の投与から生じる、循環する抗ＡＡＶ抗体が、多くの潜在的患者のためのＡＡＶ遺伝子療法の実施を妨げてきた。本発明者らは、インビトロ及びインビボの両方で増強した抗ＡＡＶ抗体回避が可能である新規ＡＡＶ変異体を単離した。低及び高効力ヒト血清プールならびにヒトＩＶＩＧを使用する選択から生じるストリンジェントな圧力は、個々のヒト血清、ヒトＩＶＩＧ、及びマウス血清由来の抗体中和からの回避が可能であるＡＡＶ変異体を進化させ、これは現在までで最も広範に回避的な変異体である。
【０２０８】
材料及び方法
細胞株
細胞株は３７℃で５％のＣＯ２で培養し、別途示されない限り、米国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（バージニア州マナサス）から得た。ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨｅＬａ、及びＨＴ１０８０細胞を、１０％ウシ胎仔血清（カリフォルニア州カールスバッド、Ｇｉｂｃｏ）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（カリフォルニア州カールスバッド、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充した、ダルベッコ改変イーグル培地で培養した。ＣＨＯ  Ｋ１及びＣＨＯ  ｐｇｓＡ細胞を、１０％ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したＦ−１２Ｋ培地（ＡＴＣＣ）で培養した。Ｐｒｏ５及びＬｅｃ１細胞を、１０％ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したＭＥＭ−アルファ培地（Ｇｉｂｃｏ）で培養した。
【０２０９】
選択のためのヒト血清プール
１８の個々のヒト血清試料をＩｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．（ミシガン州サウスフィールド）から得、野生型ＡＡＶ２についての中和抗体価をそれぞれの試料について決定した（表２）。個々の試料は、抗体の親和性及びエピトープ特異性の両方において変動を有する可能性が高いため、個々の血清試料の同等量を混合することによって、３つの有効な血清プール（α＝Ａ＋Ｆ＋Ｇ、β＝Ｂ＋Ｈ＋Ｍ、及びγ＝Ｉ＋Ｊ＋Ｎ）を生成した。抗体のこれらの変動の存在下での選択は、多くの既存のヒト抗体への耐性の一般的増強をもたらすはずである。さらにより広い範囲の抗体への耐性について選択するために、後の選択をＧａｍｉｍｕｎｅ  Ｎ、１０％ヒトＩＶＩＧ（インディアナ州エルクハート、Ｂａｙｅｒ）の存在下で行った。
【０２１０】
表２：個々のヒト血清試料の中和抗体価
それぞれの試料についての中和抗体（ＮＡｂ）力価は、血清の不在下で測定される値の３７％まで感染性を低減するのに必要な血清の体積分率の逆数として報告する。その後、３つの血清プール（α＝Ａ＋Ｆ＋Ｇ、β＝Ｂ＋Ｈ＋Ｍ、及びγ＝Ｉ＋Ｊ＋Ｎ）を３つの個々の血清試料の同等の量を混合することによって生成した。
（表２）
2020010684.tif 000026
【０２１１】
ライブラリ生成及びウイルス産生
飽和突然変異誘発ライブラリを作製するために、エラープローンＰＣＲによって、その後
2020010684.tif 000027
をそれぞれ順方向プライマー及び逆方向プライマーとして使用するＺｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．に記載される付着伸長プロセスによって、ＡＡＶ２  ｃａｐライブラリを生成した。プールした個体のヒト血清を使用する選択は、飽和突然変異誘発ライブラリのための基礎としての役割を果たした４つの点突然変異を含有する変異体（結果欄に記載）を明らかにした。この変異体のためのｃａｐ遺伝子は、特異的な部位のアミノ酸を変更することによって、さらなる突然変異誘発を受けた。プライマー
2020010684.tif 000028
及び対応する逆方向相補体プライマーを、Ｒ４７１アミノ酸部位に突然変異を起こさせるために使用した。プライマー
2020010684.tif 000029
及び対応する逆方向相補体プライマーを、Ｋ５３２及びＥ５４８アミノ酸部位に突然変異を起こさせるために使用した。プライマー
2020010684.tif 000030
及び対応する逆方向相補体プライマーを、Ｎ５８７アミノ酸部位に突然変異を起こさせるために使用した。プライマー
2020010684.tif 000031
及び対応する逆方向相補体プライマーを、Ｖ７０８及びＴ７１６アミノ酸部位に突然変異を起こさせるために使用した。無作為化ｃａｐループ領域を含有するＡＡＶ２から成るライブラリ、及び野生型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９  ｃａｐ遺伝子からのシャッフルＤＮＡを含有するライブラリは、初期選択ステップのためにパッケージングされ、プールされた。（Ｋｏｅｒｂｅｒ  ｅｔ．ａｌ．；Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２００８  Ｏｃｔ；１６（１０）：１７０３−９、及びＫｏｅｒｂｅｒ  ｅｔ．ａｌ．；Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２００９  Ｄｅｃ；１７（１２）：２０８８−９５、該文献の両方はここで参照によりその全体が組み込まれる）。
【０２１２】
進化の第２及び第３の回については、ループスワップ／シャッフルライブラリ及び飽和突然変異誘発ライブラリからのｃａｐ遺伝子を、前述のように、
2020010684.tif 000032
をそれぞれ順方向プライマー及び逆方向プライマーとして使用するエラープローンＰＣＲに供することで、無作為の突然変異誘発ライブラリが生成された。複製可能なＡＡＶライブラリ及びＣＭＶプロモーターの制御下でＧＦＰを発現する組換えＡＡＶベクターは、リン酸カルシウムトランスフェクト方法を使用しＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ）を使用してパッケージングされ、ウイルスはイオジキソナール（ｉｏｄｉｘｏｎａｌ）勾配遠心分離によって精製された。インビボでの使用のための、ＣＭＶプロモーターの制御下でＧＦＰまたはルシフェラーゼを発現する組換えＡＡＶベクターは、Ａｍｉｃｏｎ濾過によってさらに精製された。ＤＮａｓｅ耐性ゲノム力価は、定量ＰＣＲによって決定された（Ｅｘｃｏｆｆｏｎ  ｅｔ．ａｌ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２００９  Ｍａｒ１０；１０６（１０）：３８６５−７０、及びＭａｈｅｓｈｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００６  Ｆｅｂ；２４（２）：１９８−２０４、該文献の両方はここで参照によりその全体が組み込まれる。）
【０２１３】
ライブラリ選択及び進化
１回の選択は、ＡＡＶ開始ライブラリを使用するＨＥＫ２９３Ｔ細胞感染として定義され（プールされた個々のヒト血清については室温で３０分間、または感染の前に加熱不活性化したＩＶＩＧと共に３７℃で１時間インキュベートし）、その後アデノウイルス救出及び成功した変異体の回収が続く。各回の進化は、開始ライブラリを作製するためのｃａｐ遺伝子の突然変異誘発及び３回の選択から成る。３回の進化を各ライブラリで行い、このうちクローン分析を各回の進化の間に行なった。各回の進化のための開始ライブラリは、上記のように生成された。３回目の選択の後、ＡＡＶ  ｃａｐ遺伝子は、成功したＡＡＶ変異体のプールから単離され、ＰＣＲによって増幅された。ｃａｐ遺伝子は、ＮｏｔＩ及びＨｉｎｄＩＩＩを使用してｐＸＸ２組換えＡＡＶパッケージングプラスミドに挿入された。ｃａｐ遺伝子は、その後カリフォルニア大学Ｂｅｒｋｅｌｅｙ校のＤＮＡ配列決定施設で配列決定され、Ｇｅｎｅｉｏｕｓソフトウェア（ニュージーランドオークランド、Ｂｉｏｍａｔｔｅｒｓ）を使用して分析された。ＡＡＶ２カプシド（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａｂａｎｋ受託番号１ＬＰ３）の３次元モデルが、Ｐｙｍｏｌ（カリフォルニア州サンカルロス、ＤｅＬａｎｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）において表された。
【０２１４】
抗体回避変異体のインビトロ形質導入分析
ＨＥＫ２９３Ｔは、感染の２４時間前に３×１０４細胞／ウェルの密度で播種した。変異体は、感染の前に、加熱不活性化したＩＶＩＧ、個々のヒト血清、または個々のマウス血清と共に３７℃で１時間インキュベートし、細胞はその後ゲノムＭＯＩ２０００でｒＡＡＶ−ＧＦＰで感染させた。ＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージは、ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ  Ｍｉｃｒｏ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（カリフォルニア州サニーベール、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）及びＭｅｔａＸｐｒｅｓｓ  Ｉｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，バージョン３．１．０，Ｍｕｌｔｉ  Ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｏｒｉｎｇ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｏｄｕｌｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して、感染の４８時間後に評価した。
【０２１５】
インビトロ形質導入分析
相対的な形質導入効率性を決定するために、親野生型ＡＡＶ血清型、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＣＨＯ  Ｋ１、ＣＨＯ  ｐｇｓＡ（全ての表面グリコサミノグリカンを欠如する）、ＣＨＯ  Ｐｒｏ５（Ｌｅｃ１細胞を含むいくつかのグリコシル化突然変異体のための親系統）、ＣＨＯ  Ｌｅｃ１（グリコシル化欠損）、ＨｅＬａ、及びＨＴ１０８０細胞（ヒト線維肉腫細胞株）と比較した、選択された突然変異体を、感染の２４時間前に、１つのウェルあたり２．５×１０４細胞の密度で播種した。細胞を、１００〜１０００の範囲のＭＯＩで、ｒＡＡＶ１−ＧＦＰ、ｒＡＡＶ２−ＧＦＰ、ｒＡＡＶ６−ＧＦＰ、シャッフル１００．１−ＧＦＰ、シャッフル１００．３−ＧＦＰ、ＳＭ１０．２−ＧＦＰ、またはシャッフル１００．７−ＧＦＰで感染させた。ＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージは、Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｙｔｏｍｉｃｓ  ＦＣ５００フローサイトメーター（カリフォルニア州ブレア、Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して感染の４８時間後に評価した。
【０２１６】
抗体回避変異体のインビボ分析
インビボでの遺伝子発現の分析のために、８週齢の雌のＢａｌｂ／ｃマウスを、組換えシャッフル１００−３（配列番号１２を参照）、ＳＭ１０−２（配列番号１０を参照）、またはＡＡＶ２ベクターの投与の２４時間前に、尾静脈注射を介して、１匹のマウス当たり４ｍｇのＩＶＩＧまたはリン酸緩衝生理食塩水（対照マウス）で予備刺激した。マウスは、尾静脈注射を介して、ＣＭＶプロモーターの制御下でルシフェラーゼをコードする組換えＡＡＶベクターの１０１１ウイルス性ゲノムで感染させた。生物発光撮像のために、マウスを２％のイソフルオラン及び酸素で麻酔した。Ｄ−ルシフェリン基質（ミズーリ州セントルイス、ＧＯＬＤ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を体重の５００μｇ／ｇの投与量で、腹腔内注射した。画像をＶｉｖｏＶｉｓｉｏｎ  ＩＶＩＳ  Ｌｕｍｉｎａ撮像装置（カリフォルニア州アラメダ、Ｘｅｎｏｇｅｎ）を使用して生成した。それぞれのマウスについて、４週間にわたり毎週、基質注射の７〜１０分後に腹側画像を撮った。注射の５週間後、血清を、心臓穿刺を介して採取し、マウスをその後０．９％の生理食塩水溶液で潅流した。心臓、肝臓、肺、腎臓、脾臓、脳、脊髄、及び後肢筋が回収され凍結された。凍結した組織試料は、インビトロルシフェラーゼ分析のために、Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（ドイツマンハイム、Ｐｒｏｍｅｇａ）内で均質化及び再懸濁させた。ルシフェラーゼを含有する可溶化液を、１０，０００ｇで１０分間の遠心分離によって浄化した。試料をアッセイするために、２０μＬの可溶化液を１００μＬのルシフェラーゼアッセイ緩衝剤に加え、混合し、５分間インキュベートし、ルミノメーター内に配置した。シグナルは、２秒の遅延で３０秒間統合され、ＴＤ２０／２０ルミノメーター（カリフォルニア州サニーベール、Ｔｕｒｎｅｒ  Ｄｅｓｉｇｎｓ）によって検出されるＲｅｌａｔｉｖｅ  Ｌｉｇｈｔ  Ｕｎｉｔｓ（ＲＬＵ）で報告された。ルシフェラーゼシグナルは、ビシンコニン酸アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）によって決定される合計タンパク質含量に正規化した。
【０２１７】
結果
本発明者らの結果は、ＡＡＶが、インビトロ及びインビボの両方で抗ＡＡＶ抗体による中和を有意に克服するために進化し得ることを実証した。野生型ＡＡＶインビトロよりも２〜３５倍高い中和抗体価を必要とする（ヒトＩＶＩＧを使用する）新規ＡＡＶ変異体を単離した。抗体中和特性はまた、中和抗体の存在下で増強したインビボでの形質導入にも変換された。抗ＡＡＶ抗体に耐性である、かかる新規クローンの単離は、核酸送達ベクターとしてのＡＡＶに基づく治療のより広い実施（ＡＡＶ遺伝子療法に現在不適格である高い抗体価を有する個体を含む）を可能にする。
【０２１８】
定向進化によるＡＡＶライブラリ生成及び選択
図１ａは、ヒト抗体中和を回避することができる新規ＡＡＶ変異体を単離するために使用される、定向進化アプローチの模式図を示す。ウイルスのライブラリは、以下の段落に記載されるＤＮＡ突然変異誘発技術を使用して作製された（図１ａ、ステップ１及び２）。最初の選択の間、ＡＡＶ２  ｃａｐ遺伝子に対するエラープローンＰＣＲ突然変異により作製したウイルス性ライブラリのプールは、様々な希釈の低効力αヒト血清プールと共に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の感染の前に３０分間室温でインキュベートした（ステップ３）。低効力αヒト血清プールに対する３回の選択（図１ａ、ステップ４及び５）の後、この中和血清プールへの増強した耐性を有するいくつかの変異体が得られた（図１ａ、ステップ６、図７ａ）。変異体１．４５は、２点突然変異（Ｎ３１２Ｋ、Ｎ４４９Ｄ）を含有し、これは、野生型ＡＡＶ２と比較して、αプールによる中和に対する１０倍を超えるより高い耐性をもたらした。
【０２１９】
変異体１．４５からのｃａｐ遺伝子は、追加の無作為突然変異誘発に供され、結果として得られたライブラリは、並行してβ及びγプールに対するさらに３回の選択のために選択された。抗体回避においてわずかな改良のみが観察された（データ表示せず）ため、回収されたｃａｐ遺伝子はプールされＤＮＡシャッフリング及びＥＰ  ＰＣＲによる追加の多様化を受けた。β及びγプールの両方からの血清の増加する量に対するもう３回の選択は、野生型ＡＡＶ２と比較して、ウイルス性ライブラリから回収されたウイルスの量における、実質的な富化をもたらした（図７ｂ、ｃ）。両方のプールからの成功したｃａｐ遺伝子の配列決定は、いくつかの低頻度突然変異体及び単一の優性突然変異体である変異体γ４．３を明らかにし、変異体γ４．３は、両方のライブラリ内に存在する４つの点突然変異（Ｎ３１２Ｋ、Ｎ４４９Ｄ、Ｎ５５１Ｓ、及びＩ６９８Ｖ）を含有した。ヒトＩＶＩＧの存在下で、変異体１．４５は、中和への適度な１．２倍増強された耐性を実証し、一方でγ４．３は中和への３．１倍増強された耐性を実証した（図７ｄ）。この観察は、個々のヒト血清のプールが、一般的ヒト集合において存在する抗体の増強した回避が可能であるＡＡＶ変異体を単離させるために使用され得るという仮説を認める。
【０２２０】
抗ＡＡＶ抗体による中和に抵抗することにおける、変異体γ４．３の適度な成功は、γ４．３ｃａｐ遺伝子に基づくライブラリの発展を引き起こした。事前にＡＡＶ２カプシド上の免疫原性部位であると決定されたアミノ酸部位Ｒ４７１、Ｋ５３２、Ｅ５４８、Ｎ５８７、Ｖ７０８、Ｔ７１６は、γ４．３の抗体耐性に改良を加え得るアミノ酸突然変異を発見する試みで、飽和突然変異誘発を受けた。この「飽和突然変異誘発」ライブラリは、７つの親ＡＡＶ血清型の無作為ｃａｐキメラから成る「シャッフル」ライブラリ及び置換されたループ領域を有するＡＡＶ２ｃａｐから成る「ループスワップ」ライブラリと共に、追加の３回の選択を受け、ここにおいてウイルス性ライブラリのプールを、様々な希釈のヒトＩＶＩＧと共にＨＥＫ２９３Ｔ細胞の感染の前に３７℃で１時間インキュベートした。ＡＡＶライブラリでの感染及びアデノウイルス重感染による感染性ＡＡＶ変異体の増幅の後、選択の成功を決定する方法として、それぞれのライブラリ状態からの、ウイルス性ゲノムの数またはウイルス性力価を定量化し、野生型ＡＡＶ２の力価と比較した（図１ｂ）。飽和突然変異誘発及びループスワップ／シャッフルライブラリを使用する選択のそれぞれの回について、野生型ＡＡＶ２よりも高いウイルス性力価を生成した１：１０及び１：１００ＩＶＩＧ希釈状態からのウイルス性プールが、選択の後続の回のための開始点として使用された。３回の選択の後、成功したウイルス性ｃａｐ遺伝子は単離され、最も効率的な遺伝子送達を有するウイルスを決定するために個々に試験された。さらに、３回目の選択から単離されたｃａｐ遺伝子は、エラープローンＰＣＲ突然変異誘発の追加の回を受け、このプロセスはウイルスの適応度を繰り返し上昇させるために反復された。
【０２２１】
図１は、増強した抗体回避のためのＡＡＶの定向進化を描写する。（ａ）定向進化の概略。１）いくつかの相補的アプローチを使用してｃａｐ遺伝子を遺伝子的に多様化することによって、ウイルス性ライブラリを作製する。２）ウイルスを、プラスミドトランスフェクトを使用してＨＥＫ２９３Ｔ細胞内にパッケージングし、次いで回収及び精製する。３）ウイルス性ライブラリをいくつかの濃度のヒトＩＶＩＧと共にインキュベートし、インビトロでＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入する。４）成功したウイルスを、アデノウイルス重感染を介して増幅して回収する。５）成功したクローンを、より低いＭＯＩでの反復される選択によって濃縮する。６）単離されたウイルス性ＤＮＡは、成功したｃａｐ遺伝子を明らかにする。７）成功したｃａｐ遺伝子を、選択の新規開始点としての役割を果たすために再度突然変異させる。（ｂ）ループスワップ／シャッフル、及び飽和突然変異誘発ライブラリからの抗体回避変異体の選択。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ウイルス性ライブラリで２４時間感染させた。細胞を生産的に感染させたウイルス粒子をアデノウイルス感染により増幅させ、救出されたＡＡＶをｑＰＣＲによって定量化した。ＩＶＩＧの１：１０希釈は、１０ｍｇのＩＶＩＧ／ｍＬの濃度に対応する。エラーバーは標準偏差を示す（ｎ＝３）。
【０２２２】
図７は、ＡＡＶ２に基づくヒト抗体回避体の生成を実証する。（ａ）低ストリンジェンシーのαプールに対する３回の選択の後に選択される４つのウイルス性クローンは、１のＭＯＩのα血清の１μＬへの増強した耐性を実証する。さらなる２回の多様化（すなわち突然変異誘発及びＤＮＡシャッフル）及び選択（血清量増加を３回）は、大量の非常に効力のある（ｂ）β及び（ｃ）γプールの存在下で有意に向上したウイルス回収をもたらした。（ｄ）さらに、２つのウイルス性クローン（１．４５及びγ４．３）は、野生型ＡＡＶ２と比較して、約１００，０００の個体由来のプールされたヒト静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩｇ）と共に存在する既存の抗体の高度に多様なプールに対する１．２３倍及び３．１０倍増強した耐性を実証した。
【０２２３】
インビトロでの新規進化ＡＡＶ変異体の上昇した抗体回避
ヒトＩＶＩＧに対する９回のスクリーニング後の飽和突然変異誘発及びループスワップ／シャッフルライブラリからの、個々の分析のために選択及びパッケージングされた１２のクローンのうち、１２全てが、野生型ＡＡＶ１及びＡＡＶ２の両方よりも高い中和抗体価を必要とした（図２ａ及び表１）。中和のために野生型ＡＡＶ２よりも３５倍高いインビトロＩＶＩＧ濃度を必要とした、変異体シャッフル１００−３（配列番号１２を参照）は、１ｍｇ／ｍＬのＩＶＩＧの存在下で、細胞のおよそ１０％に形質導入することがなお可能であった（図２ｂ）。さらに、ＡＡＶ２飽和突然変異誘発ライブラリからの変異体ＳＭ１０−２は、野生型ＡＡＶ２よりも７．５倍高いインビトロＩＶＩＧ濃度を中和に必要とした。さらに、変異体シャッフル１００−３及びＳＭ１０−２（配列番号１０参照）は、血友病Ｂ臨床試験から排除された個々の患者からの血清試料の存在下で、増強した形質導入を示した（図３）（Ｎａｔｈｗａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．２０１１  Ｄｅｃ  ２２；３６５（２５）：２３５７−６５）。
【０２２４】
図２は、抗体回避変異体の中和プロファイルを示す。３回の進化の後に単離された抗体回避突然変異体のｃａｐ遺伝子を、ＧＦＰをコードする組換えＡＡＶをパッケージングするために使用し、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の感染の前にヒトＩＶＩＧと共にインキュベートした。残っている感染性粒子の割合を、高含量蛍光撮像を使用して決定し、ＩＶＩＧの不在下で感染性力価に正規化した。ＩＶＩＧへの耐性を有するそれぞれのライブラリからの２つのクローンを示す。分析された他のクローンについてのデータは表１に示す。（ａ）中和曲線。エラーバーは、標準偏差を示す（ｎ＝３）。（ｂ）いくつかのＩＶＩＧ希釈からの代表的な蛍光画像は、突然変異体が、高濃度の中和抗体の存在下でＨＥＫ２９３Ｔ形質導入が可能であることを示す。
【０２２５】
図３は、抗体回避変異体の中和プロファイルを示す。ヒト血清は、ＡＡＶに対する高い中和抗体力価の存在により血友病Ｂ臨床試験から除外された個人から得られた。ＧＦＰをコードする組換えＡＡＶは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の感染の前に、個々のヒト血清試料と共にインキュベートした。残っている感染性粒子の割合を、蛍光顕微鏡法を使用して決定し、ヒト血清の不在下で感染性力価に正規化した。エラーバーは標準偏差を示す（ｎ＝３）。
【０２２６】
１２のクローンの配列分析は、最も高い中和抗体耐性を有する２つの変異体である、シャッフル１００−３（配列番号１２参照）及びシャッフル１００−１（配列番号１１参照）が、ＡＡＶ１−４、ＡＡＶ６、及びＡＡＶ９の断片を含有するほぼ同一のシャッフルカプシドであることを示した（図４）。２つの変異体の間の、アミノ酸４６９（ＡＡＶ６残基対ＡＡＶ７残基）及び５９８（ＡＡＶ６残基対ＡＡＶ１残基）における差異は、シャッフル１００−３（配列番号１２参照）についての中和抗体価におけるほぼ３倍の増加に変換される（表１）。４番目に高い中和抗体耐性（表１）を有した変異体シャッフル１００−７（配列番号１３参照）もまた、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、及びＡＡＶ８の断片を含有するシャッフルカプシドであり（図４）、野生型ＡＡＶ１及びＡＡＶ８が抗ＡＡＶ２抗体を回避することに有効であることを示す報告されたデータと良好に合致する。興味深いことに、変異体ＳＭ１０−２（配列番号１０参照）は変異γ４．３によって得られる点突然変異を保持し、飽和突然変異誘発部位にて野生型残基も保持した。変異体ＳＭ１０−２（配列番号１０参照）は、表面残基Ｄ４７２Ｎ及び内部残基Ｌ７３５Ｑにて追加の点突然変異を得た。図４は、ループスワップ／シャッフル及び飽和突然変異誘発クローンのアミノ酸配列を示す。（ａ）カプシドタンパク質の模式図を、最も高い中和ＩＶＩＧ濃度を有するそれぞれのライブラリからの２つのクローンについて示す。それぞれの領域は、それが由来する親血清型に応じて影が付けられる。黒い矢印は、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３カプシドタンパク質の開始コドンを示す（左から右へ）。灰色の矢印は、ＡＡＶ２カプシドに基づく表面ループ領域Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、及びＶを示す（左から右へ）。（ｂ）溶解構造に基づく完全ＡＡＶ２カプシドの分子モデルを、最も高い中和ＩＶＩＧ濃度を有するそれぞれのライブラリからの２つのクローンについて示す。それぞれの領域は、それが由来する親血清型に応じて影が付けられる。変異体シャッフル１００−３（配列番号１２参照）については、黒い矢印は変異体シャッフル１００−１（配列番号１１参照）からの差異を示す。変異体ＳＭ１０−２（配列番号１０参照）については、突然変異Ｎ４４９Ｄ、Ｄ４７２Ｎ、Ｎ５５１Ｓ、及びＩ６９８Ｖは表面突然変異（黒）である。
【０２２７】
表１：ライブラリクローン及び親血清型のＩＶＩＧ中和抗体価
野生型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ８、ならびにループスワップ／シャッフル及び飽和突然変異誘発ライブラリから回収された変異体からのカプシドを有する組換えＡＡＶ−ＧＦＰベクターを中和するために、ヒトＩＶＩＧを使用した。遺伝子送達効率性をＩＶＩＧの不在下のものの５０％に低減するために必要とされるＩＶＩＧ濃度（ｍｇ／ｍＬ）が示され、ＡＡＶ２の送達を低減するために必要とされる濃度と比較される。分析された全ての変異体は、野生型ＡＡＶ１及びＡＡＶ２よりも高い濃度のＩＶＩＧを必要とした。中和抗体価は、図２の曲線を指数関数的曲線に当てはめることによって決定された。配列番号は「アミノ酸、ヌクレオチド」として記載される。
（表１）
2020010684.tif 000033
【０２２８】
変異体シャッフル１００−３（配列番号１２参照）、シャッフル１００−１（配列番号１１参照）、及びシャッフル１００−７（配列番号１３参照）は、親血清型ＡＡＶ１及びＡＡＶ６の形質導入を模倣する形質導入プロファイルを有する（図５）。さらに、ＳＭ１０−２（配列番号１０参照）における突然変異は、ヘパリン依存性を予防せず（親血清型ＡＡＶ２において見出される通り）、ＡＡＶ２と同様のプロファイルをもたらす（図５）。
【０２２９】
図５は、新規ａａｖ変異体のインビトロ向性を実証する。緑色蛍光タンパク質を発現する組換えＡＡＶベクターを使用して、細胞株：ＣＨＯ、ｐｇｓＡ（全ての表面グリコサミノグリカンを欠如する）、Ｐｒｏ５、Ｌｅｃ１（シアル酸を欠如する）、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨｅＬａ、及びＨＴ１０８０（ヒト線維肉腫細胞株）、のパネルを形質導入し、新規ＡＡＶ変異体の形質導入特徴のプロファイルを得た。エラーバーは、標準偏差（ｎ＝３）を示す。
【０２３０】
インビボでの新規進化ＡＡＶ変異体の上昇した抗体回避
変異体シャッフル１００−３及びシャッフル１００−７の局在化パターンを決定するために、ルシフェラーゼ酵素活性が、ＡＡＶ２、シャッフル１００−３、またはシャッフル１００−７を注射したナイーブマウスの様々な組織において試験された（図６ａ）。変異体シャッフル１００−７は、７倍より高い心臓の形質導入、５倍より高い肺の形質導入、及び４．５倍より低い肝臓の形質導入を除き、ＡＡＶ２と同様のインビボ向性を示した。シャッフル１００−３変異体は、ＡＡＶ２よりも、４倍を超えてより高い脳の形質導入、３倍を超えてより高い肺の形質導入、及び２７倍より高い筋肉の形質導入を示した。これらのマウスからの血清の分析は、変異体シャッフル１００−３が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ８、またはシャッフル１００−３遺伝子送達ベクターを与えられたマウスからの血清について、中和のために、ＡＡＶ１及びＡＡＶ８よりも同等以上のインビトロ血清濃度を必要としたことを示した（図１１）。シャッフル１００−７は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ８、シャッフル１００−３、またはＳＭ１０−２遺伝子送達ベクターを与えられたマウスからの血清について、中和のためにＡＡＶ１よりも同等以上のインビトロ血清濃度を必要とした（図１１）。さらに、両方の変異体は、ＡＡＶ２遺伝子送達ベクターを与えられたマウスからの血清によって、試験された全ての野生型ＡＡＶ血清型よりも、中和されなかった。興味深いことに、さらに、変異体シャッフル１００−３は、それに対して免疫化されたマウスの血清によって、試験された他の血清型または変異体のいずれよりも、中和されなかった（図１１）。このデータは、複数のベクター投与を必要とする適用において、これらの変異体が、野生型ＡＡＶ血清型または他の変異体との組み合わせで使用され得る可能性を示す。
【０２３１】
図１１は、免疫化マウス血清中のライブラリクローン及び親血清型の中和抗体価を示す。ライブラリクローンまたは野生型ＡＡＶを投与されたマウスからの血清は、野生型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ８からのカプシド、及びループスワップ／シャッフル及び飽和突然変異誘発ライブラリから回収された変異体を有する、組換えＡＡＶ−ＧＦＰベクターを中和するために使用された。遺伝子送達効率を血清の不在下での効率の５０％に低減するために必要とされる血清希釈を示す。
【０２３２】
インビボで抗体中和を回避する変異体シャッフル１００−７及びシャッフル１００−３の能力を決定するために、マウスは、ＡＡＶ注射の前にヒトＩＶＩＧで受動的に免疫化された。変異体シャッフル１００−７は、ルシフェラーゼ酵素活性によって測定され、ＡＡＶ２よりも有意に高い心臓、肝臓、及び筋肉での形質導入を有した（図６ｂ）。変異体シャッフル１００−３は、ＡＡＶ２と比較して有意により高い心臓及び筋肉での形質導入を有した（図６ｂ）。
【０２３３】
図６は、新規ＡＡＶ変異体のインビボ局在化及び中和を示す。（ａ）ルシフェラーゼをコードする組換えＡＡＶベクターを、雌のＢＡＬＢ／ｃマウスに尾静脈注射を介して投与した。５週間後、ルシフェラーゼ活性のレベルを決定し、分析されたそれぞれの試料について、合計タンパク質に正規化した。（ｂ）ルシフェラーゼを発現する組換えＡＡＶベクターを、４ｍｇのヒトＩＶＩＧの尾静脈注射の２４時間後に、尾静脈注射を介して雌ＢＡＬＢ／ｃマウスに投与した。５週間後、ルシフェラーゼ発現のレベルは、分析されたそれぞれの試料について合計タンパク質に正規化した。エラーバーは標準偏差（ｎ＝３）を示し、＊＝ｐ＜０．０５．ＲＬＵ、相対的ルシフェラーゼ単位。
【０２３４】
個々のヒト血清のプールに対して選択されるＡＡＶ２系のエラープローンライブラリから単離された変異体γ４．３は、４つの点突然変異（Ｎ３１２Ｋ、Ｎ４４９Ｄ、Ｎ５５１Ｓ、及びＩ６９８Ｖ）を含有した。興味深いことに、これらの位置のうちの２つ（Ｎ４４９及びＮ５５１）は、ヒト血清の他のプールを使用して免疫原性残基として事前に特定されており、これらの部位を含む抗原性エピトープは多くの異なる中和抗体によって標的とされることを実証した。したがって、これらの部位は、突然変異のための興味深く価値のある標的である。飽和突然変異誘発ライブラリ内で定向進化及び合理的な設計を合わせることで、変異体ＳＭ１０−２の単離をもたらし、これは、インビトロのＡＡＶ１及びＡＡＶ２の両方よりも高い抗体耐性が可能であった。変異体ＳＭ１０−２は、変異γ４．３上で見られるものに対して２つの追加の点突然変異（Ｄ４７２Ｎ及びＬ７３５Ｑ）を組み込む。Ｄ４７２Ｎ突然変異は、以前に、ＨＥＫ２９３細胞内のカプシド合成のレベルを上昇させることが示された。同様に、アミノ酸位置７３５の正電荷リジン側鎖の、非電荷グルタミン側鎖との交換は、それが集合カプシドの内側内に位置付けられるにもかかわらず変異体シャッフル１００−７内にも存在するため、カプシドを安定化する機能を果たし得る（図４）。
【０２３５】
キメラＡＡＶカプシドの作製は、複数のＡＡＶ血清型からの望ましい特徴を混合させ得るウイルス性変異体の作製を可能にする。ＡＡＶ８及びＡＡＶ９もまた、ＩＶＩＧによる中和に対してＡＡＶ２よりもはるかに耐性があると示されてきたが、これらのカプシドに特異的なアミノ酸は、本発明者らの選択の間に単離されるシャッフル変異体の表面上の小さいスパン内にのみ存在した（図４）。インビトロで抗体中和のより効率的な回避を示す変異体である、シャッフル１００−３は、その親血清型ＡＡＶ１及びＡＡＶ６と同様のインビトロ向性を示したが、どちらの野生型血清型よりも高い率の感染性であった。シャッフル１００−１とシャッフル１００−３との間のアミノ酸４６９及び５９８における差は、シャッフル１００−３についての中和抗体価におけるほぼ３倍の上昇に変換される。Ｌｏｃｈｒｉｅ  ｅｔ  ａｌ．による研究は、ヒト血清及びＩＶＩＧによって認識される免疫原性残基は異なることを報告しており、これは様々なヒトがＡＡＶカプシド上の異なるセットのエピトープへの様々な中和抗体を生成することができ、かつ中和からの完全な逃避は容易でないことを示唆した（Ｌｏｃｈｒｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．２００６  Ｊａｎ；８０（２）：８２１−３４）。本発明者らの研究は、様々な量及び効力の抗ＡＡＶ抗体を含有するいくつかの異なる血清プールを使用する複数の回の定向進化の使用が、複数の抗ＡＡＶ抗体プールの存在下で、インビトロ及びインビボの両方で増強した細胞形質導入が可能である新規ＡＡＶ変異体の単離をもたらすであろうことを実証する。
【０２３６】
動物及びヒトにおけるＡＡＶベクター成分への適応免疫応答は、多くの場合、同じ血清型のＡＡＶベクターの再投与を阻み、複数のベクター投与を必要とする遺伝子送達用途を困難にする。生体内分布研究において使用されるマウスからの血清を使用するインビトロ中和アッセイは、変異体が野生型ＡＡＶよりもこれらの血清によって中和されないことを実証し（図１１）、これはベクター再投与が必要である遺伝子療法戦略に有用であり得る。例えば、シャッフル１００−３は、ＡＡＶ２を注射されたマウスからの血清によって中和されず、ＡＡＶ２は、シャッフル１００−３を注射されたマウスからの血清によって中和されず、この変異体が野生型ＡＡＶ血清型との組み合わせで、または複数のベクター投与を必要とする用途において、使用され得ることを示唆した。結論として、本発明者らは、インビトロ及びインビボの両方で、個々のヒト患者、プールされたヒト血清、及びマウス血清に由来する抗ＡＡＶ抗体による低減した中和が可能である、新規ＡＡＶ変異体を単離するために、定向進化を使用した。
【０２３７】
本発明が、その具体的実施形態への参照を伴って記載されてきた一方で、当業者には、本発明の真の趣旨及び範囲から逸脱することなく、様々な変更がなされ得、均等物が置換され得ることが理解されるはずである。さらに、具体的な状況、材料、組成物、プロセス、プロセスステップ（単数または複数）を、本発明の目的、趣旨、及び範囲に適応させるために、多くの修正がなされ得る。全てのかかる修正は、本明細書に添付される特許請求の範囲内であることが意図される。
【図１】
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【図２Ａ】
2020010684.tif 000035
【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
2020010684.tif 000038
【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
2020010684.tif 000041
【図６】
2020010684.tif 000042
【図７】
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【図８Ａ】
2020010684.tif 000044
【図８Ｂ】
2020010684.tif 000045
【図８Ｃ】
2020010684.tif 000046
【図８Ｄ】
2020010684.tif 000047
【図８Ｅ】
2020010684.tif 000048
【図８Ｆ】
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【図８Ｇ】
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【図８Ｈ】
2020010684.tif 000051
【図８Ｉ】
2020010684.tif 000052
【図９Ａ】
2020010684.tif 000053
【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図９Ｇ】
2020010684.tif 000059
【図９Ｈ】
2020010684.tif 000060
【図９Ｉ】
2020010684.tif 000061
【図１０Ａ】
2020010684.tif 000062
【図１０Ｂ】
2020010684.tif 000063
【図１０Ｃ】
2020010684.tif 000064
【図１０Ｄ】
2020010684.tif 000065
【図１０Ｅ】
2020010684.tif 000066
【図１０Ｆ】
2020010684.tif 000067
【図１０Ｇ】
2020010684.tif 000068
【図１０Ｈ】
2020010684.tif 000069
【図１０Ｉ】
2020010684.tif 000070
【図１１】
2020010684.tif 000071
【配列表】
2020010684000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年8月22日(2019.8.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号１１〜１３及び２６〜３３のうちの１つに記載されるアミノ酸配列のアミノ酸２０３〜７３６と少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、変異体アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質、ならびに
（ｂ）異種核酸
を含む、感染性組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオン。