(57)【要約】【課題】  本発明が解決しようとする課題は、高い効率でコラーゲンを標識物質で標識することである。【解決手段】  チオール基が導入されたコラーゲンとチオール反応性官能基を有する標識物質とを反応させて標識する。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
チオール基が導入されたコラーゲンと、チオール反応性官能基を有する標識物質とを反応させることを特徴とするコラーゲンの標識方法。
【請求項２】
前記コラーゲンがクラゲに由来するものであることを特徴とする請求項１に記載の標識方法。
【請求項３】
前記標識物質が抗体であることを特徴とする請求項１又は２に記載の標識方法。
【請求項４】
前記抗体が脳性ナトリウム利尿ペプチドとの親和性を有することを特徴とする請求項３に記載の標識方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コラーゲンを標識する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞外マトリックスの主要な構成分子として、コラーゲンがある。コラーゲンは多くの多細胞生物に共通してあるタンパク質であり、様々な結合組織に力学的強度を与える役割がある。コラーゲンは生体内で最も多く含まれるタンパク質の一種であるが、その多くは中性領域のｐＨでは水に溶解しない。ウシやブタなどに由来する一般的なコラーゲンを水に溶かすためには、溶液のｐＨを酸性にすることが必要である。しかし、酸性条件下では、コラーゲンを標識するための化学修飾を行うことが難しい。また中性領域のｐＨで水に溶けない状態では、その利用方法も限られる。そのため豊富な天然資源ではあるものの、コラーゲンの産業利用はあまり進んでいない。
【０００３】
多くのコラーゲン分子は中性領域のｐＨでは水に溶けないが、例外もある。クラゲに由来するコラーゲンは、中性領域のｐＨで水に可溶である。しかしクラゲ由来のコラーゲンを用いても、標識用の官能基を導入するとコラーゲン分子同士が架橋されてしまい、反応点が潰れる問題がある。そのためコラーゲンに高い効率で標識物質を標識することができず、産業利用上の大きな課題となっていた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明が解決しようとする課題は、高い効率でコラーゲンを標識物質で標識することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は上記課題に関し鋭意検討した結果、チオール基が導入されたコラーゲンとチオール反応性の官能基を有する標識物質とを反応させれば、高い効率でコラーゲンを標識物質で標識できることを見出し、本発明に到達した。
【０００６】
即ち本発明は以下のとおりである。
（１）チオール基が導入されたコラーゲンと、チオール反応性官基を有する標識物質とを反応させることを特徴とするコラーゲンの標識方法。
（２）前記コラーゲンがクラゲに由来するものであることを特徴とする（１）に記載の標識方法。
（３）前記標識物質が抗体であることを特徴とする（１）又は（２）に記載の標識方法。
（４）前記抗体が脳性ナトリウム利尿ペプチドとの親和性を有することを特徴とする（３）に記載の標識方法。
【０００７】
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００８】
本発明はコラーゲンを標識する方法に関するものであり、チオール基が導入されたコラーゲンとチオール反応性官能基を有する標識物質とを反応させて標識することを特徴とする。
【０００９】
使用するコラーゲンは、中性領域のｐＨで水溶性であれば特にその種類が限定されるものではなく、クラゲに由来するコラーゲンなどを用いることができる。また中性領域で不溶性であるヒトやブタ、ウシなどの哺乳動物や、サメなどの魚類に由来するコラーゲンであっても、サクシニル化・ミリスチル化などの化学修飾やアルカリ処理によって水溶性となるものであれば特にその種類が限定されるものではない。更に、使用するコラーゲンは天然物に由来するものに限定されるわけではなく、遺伝的な改変により中性領域のｐＨで水溶性となる組み替え体コラーゲンなどを利用することもできる。
【００１０】
コラーゲンに対してチオール基を導入する方法としては、２−イミノチオレーン塩酸塩（トラウト試薬）と反応させる、Ｎ−スクシニミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピネート（ＳＰＤＰ）やスルフォスクシニミジル６−［３’（２−ピリジルジチオ）−プロピオナミド］ヘキサノエート（Ｓｕｌｆｏ−ＬＣ−ＳＰＤＰ）やスクシニミジル６−［３’（２−ピリジルジチオ）−プロピオナミド］ヘキサノエート（ＬＣ−ＳＰＤＰ）などの架橋剤によってチオール反応性官能基を導入した後に、還元するといった方法が挙げられる。
【００１１】
また本発明で使用される標識物質はチオール反応性の官能基を有していれば特にその種類が限定されるわけではなく、抗体、ペプチド、核酸、蛋白質、糖鎖、脂質、ホルモン、薬剤、ウイルス、色素などを用いることができ、その中でも抗体が好ましく、特に脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）との親和性を有する抗体であることが好ましい。また本発明で使用される標識物質は初めからチオール反応性の官能基を有していなくてもよく、前述したＳＰＤＰ、Ｓｕｌｆｏ−ＬＣ−ＳＰＤＰ、ＬＣ−ＳＰＤＰなどの架橋剤によってチオール反応性官能基が導入された物を用いることもできる。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、高い効率でコラーゲンを標識物質で標識できるようになった。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】トラウト試薬で処理したコラーゲンやＳＰＤＰで処理したＦａｂ化抗体などを電気泳動した図である。
【図２】クロスリンカー溶液で処理したコラーゲンなどを電気泳動した図である。
【図３】トラウト試薬で処理したＦａｂ化抗体などを電気泳動した図である。
【図４】クロスリンカー溶液で処理したコラーゲンとトラウト試薬で処理したＦａｂ化抗体とを反応させたサンプルなどを電気泳動した図である。
【図５】トラウト試薬で処理したコラーゲンとクロスリンカー溶液で処理したＦａｂ化抗体とを反応させたサンプルなどを電気泳動した図である。
【実施例】
【００１４】
以下、抗ＢＮＰ抗体をコラーゲンへ標識する実施例によって本発明を具体的に示すが、本発明はこの実施例に限定されるものではない。
なお、使用した薬品の組成及びｐＨは以下に示す通りである。
リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液（ｐＨ７．５）
８．１ｍＭ    りん酸水素二ナトリウム・１２水和物
１．５ｍＭ    りん酸水素カリウム
１３７ｍＭ    塩化ナトリウム
２．７ｍＭ    塩化カリウム
【００１５】
（１）トラウト試薬で処理したクラゲ由来コラーゲン
クラゲ由来コラーゲンの濃度が３ｍｇ／ｍｌとなるよう１ｍｌのＰＢＳ溶液に溶解させて、コラーゲン溶液とした。次に２５ｍＭとなるようにトラウト試薬をＰＢＳ溶液に溶解させて、トラウト溶液とした。コラーゲン溶液１ｍｌに対してトラウト溶液４０μｌを加え、室温で１時間反応させた。そしてこの溶液をＰＢＳ溶液で平衡化したＰＤ−１０カラム（ＧＥ社）に通して脱塩し、コラーゲン濃度が１ｍｇ／ｍｌとなるように調整した。その後トラウト試薬で処理したコラーゲンと、トラウト試薬で処理していないコラーゲンとをそれぞれＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元）にかけた。その結果、コラーゲンをトラウト試薬で処理してもコラーゲン分子同士で架橋されないことを確認した（図１）。
【００１６】
（２）クロスリンカー溶液で処理したクラゲ由来コラーゲン
（１）と同様にコラーゲン溶液を調製した。次にスルフォスクシニミヂル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサンー１−カルボキシレート（Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ）、スクシニミジル−［（Ｎ−マレイミドプロピオナミド）−ヘキサエチレングリコール］エステル（ＳＭ（ＰＥＧ）６）、スクシニミジル−［（Ｎ−マレイミドプロピオナミド）−ドデカエチレングリコール］エステル（ＳＭ（ＰＥＧ）１２）、スクシニミジル−［（Ｎ−マレイミドプロピオナミド）−テトラコサエチレングリコール］エステル（ＳＭ（ＰＥＧ）２４）、Ｎ−スクシニミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）をそれぞれ２５０ｍＭとなるようＤＭＳＯに溶かして、クロスリンカー溶液とした。コラーゲン溶液１ｍｌに対してクロスリンカー溶液をそれぞれ４μｌ加え、室温で１時間反応させた。（１）と同様の条件で脱塩し、コラーゲン濃度が１ｍｇ／ｍｌとなるように調整した。その後、クロスリンカーと反応させたコラーゲンと、何も反応させていないコラーゲンとをそれぞれＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元）にかけた。その結果、コラーゲンにクロスリンカーを反応させるとコラーゲン分子同士で架橋されてしまうことを確認した（図２）。
【００１７】
（３）トラウト試薬で処理したＦａｂ化抗体
ＢＮＰとの親和性を有するマウス由来抗体（ＢＣ２３−１１、特許第５８１０５１４号公報に記載の抗体）を用意してＦａｂ化し、ＰＢＳ溶液中で１ｍｇ／ｍｌ、５００μｌとなるよう調整し、Ｆａｂ化抗体溶液とした。次に２５ｍＭとなるようにトラウト試薬をＰＢＳ溶液に溶解させて、トラウト溶液とした。Ｆａｂ化抗体溶液０．５ｍｌに対してトラウト溶液２０μｌを加え、室温で１時間反応させた。そしてこの溶液をＰＢＳ溶液で平衡化したＰＤ−１０カラム（ＧＥ社製）へ通して脱塩し、Ｆａｂ化抗体濃度が１ｍｇ／ｍｌとなるように調整した。その後トラウト試薬と反応させたＦａｂ化抗体と、何も反応させていないＦａｂ化学抗体とをそれぞれＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元）にかけた。その結果、Ｆａｂ化抗体をトラウト試薬で処理してもＦａｂ化抗体同士で架橋されないことを確認した（図３）。
【００１８】
（４）クロスリンカー溶液で処理したＦａｂ化抗体
（３）と同様にＦａｂ化抗体溶液を調製した。次に１００ｍＭとなるようにＳＰＤＰをＤＭＳＯへ溶解させて、クロスリンカー溶液とした。Ｆａｂ化抗体溶液１ｍｌに対してクロスリンカー溶液１０μｌを加え、室温で１時間反応させた。（３）と同様の条件で脱塩し、Ｆａｂ化抗体濃度が１ｍｇ／ｍｌとなるように調整した。その後クロスリンカー溶液と反応させたＦａｂ化抗体と、何も反応させていないＦａｂ化学抗体とをそれぞれＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元）にかけた。その結果、Ｆａｂ化抗体をクロスリンカー溶液で処理してもＦａｂ化抗体同士で架橋されないことを確認した（図１）。
【００１９】
（５）クラゲ由来コラーゲンへのＦａｂ化抗体の標識
まず、（２）で作製したクロスリンカー溶液で処理したクラゲ由来コラーゲンと（３）で作製したトラウト試薬で処理したＦａｂ化抗体などを図４の通りに混ぜて、２５℃で一昼夜反応させた。その後この各サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元）にかけた。その結果、（２）で作製したクロスリンカー溶液で処理したクラゲ由来コラーゲンと（３）で作製したトラウト試薬で処理したＦａｂ化抗体とを反応させても、Ｆａｂ化抗体に由来するバンドがほぼ減少しないことを確認でき（図４）、Ｆａｂ化抗体でコラーゲンが効率よく標識されないことが分かった。
次に、（１）で作製したトラウト試薬で処理したクラゲ由来コラーゲンと（４）で作製したクロスリンカー溶液で処理したＦａｂ化抗体などを図５の通りに混ぜて、２５℃で一昼夜反応させた。その後この各サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元）にかけた。その結果、（１）で作製したトラウト試薬で処理したクラゲ由来コラーゲンと（４）で作製したクロスリンカー溶液で処理したＦａｂ化抗体とを反応させた時（レーン４、６）のみ、Ｆａｂ化抗体に由来するバンドの減少し、Ｆａｂ化抗体で標識されたコラーゲンに由来すると考えられるバンドが高分子量の位置に確認でき（図５）、Ｆａｂ化抗体でコラーゲンが効率よく標識されていることが分かった。
また、この反応において、コラーゲン１分子に対して３．５等量のＦａｂ化抗体を反応させた時にＦａｂ化抗体に由来するバンドがほぼ消失することを確認でき、コラーゲン１分子あたり３−４分子のＦａｂ化抗体が標識されていると考えられた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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