(57)【要約】      （修正有）【課題】新規の、酸化ストレス条件下での安定性に優れた、アスパラギナーゼの提供。【解決手段】ラクトバチルス・サケイ由来のアスパラギナーゼ、もしくは、アスパラギナーゼのアミノ酸配列において、１個若しくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つアスパラギナーゼ活性を有するポリペプチド。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（Ａ）又は（Ｂ）のポリペプチド：
（Ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（Ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において、１個若しくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつアスパラギナーゼ活性を有するポリペプチド。
【請求項２】
以下の（Ｂ１ａ）又は（Ｂ１ｂ）の、請求項１に記載のポリペプチド：
（Ｂ１ａ）  配列番号１のアミノ酸配列において、１９６番目のシステイン、２６４番目のシステイン、及び２９０番目のシステインからなる群より選択される少なくとも１個のシステインがシステイン以外のアミノ酸へ置換されたアミノ酸配列からなり、かつアスパラギナーゼ活性を有するポリペプチド
（Ｂ１ｂ）  （Ｂ１ａ）のポリペプチドのアミノ酸配列において、置換されたアミノ酸は維持された状態で、１個若しくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつアスパラギナーゼ活性を有するポリペプチド。
【請求項３】
前記システイン以外のアミノ酸がセリンである、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
配列番号１のアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアスパラギナーゼ活性を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
Ｌ−グルタミンに対する酵素活性が、Ｌ−アスパラギンに対する酵素活性の４％以下である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項６に記載のポリヌクレオチドを組み込んだ発現ベクター。
【請求項８】
請求項７に記載のベクターで形質転換された形質転換体。
【請求項９】
請求項８に記載の形質転換体を培養する工程を含む、請求項１〜５に記載のポリペプチドの製造方法。
【請求項１０】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項６に記載のポリヌクレオチド、又は請求項７に記載のベクターを含む抗腫瘍剤。
【請求項１１】
大腸菌由来のアスパラギナーゼを含む抗腫瘍剤にアレルギー症状を示す人用の、請求項１０に記載の抗腫瘍剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なアスパラギナーゼ及びその応用技術等に関する。
【背景技術】
【０００２】
アスパラギナーゼはＬ−アスパラギンのＬ−アスパラギン酸とアンモニアへの加水分解反応を触媒する酵素である。白血病細胞などの腫瘍細胞の中には、Ｌ−アスパラギン酸とアンモニアからＬ−アスパラギンを生合成する酵素であるＬ−アスパラギンシンテターゼの活性が低下しているため、Ｌ−アスパラギン要求性を示す細胞がある。このため、急性リンパ性白血病患者にアスパラギナーゼを動脈または静脈に注射によって投与すると血中のＬ−アスパラギンが分解され、Ｌ−アスパラギン要求性の腫瘍細胞がＬ−アスパラギン欠乏状態となり増殖が抑制されるため抗腫瘍効果が発揮されるとして、大腸菌由来のアスパラギナーゼ（ロイナーゼ（登録商標））を用いた治療が行われている。しかし、大腸菌由来のアスパラギナーゼを使用するとアレルギー症状を発症することがあり、継続投与が困難になる場合もあるため、代替品の開発が望まれている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Acta Crystallogr D Biol Crystallogr., 61(Pt 3), 294-301, 2005
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、新規なアスパラギナーゼを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、ラクトバチルス・サケイがアスパラギナーゼを有することを見出し、さらに改良を重ねて本発明を完成させるに至った。
【０００６】
本発明は例えば以下の項に記載の主題を包含する。
項１．
以下の（Ａ）又は（Ｂ）のポリペプチド：
（Ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（Ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において、１個若しくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつアスパラギナーゼ活性を有するポリペプチド。
項２．
以下の（Ｂ１ａ）又は（Ｂ１ｂ）の、項１に記載のポリペプチド：
（Ｂ１ａ）  配列番号１のアミノ酸配列において、１９６番目のシステイン、２６４番目のシステイン、及び２９０番目のシステインからなる群より選択される少なくとも１個のシステインがシステイン以外のアミノ酸へ置換されたアミノ酸配列からなり、かつアスパラギナーゼ活性を有するポリペプチド
（Ｂ１ｂ）  （Ｂ１ａ）のポリペプチドのアミノ酸配列において、置換されたアミノ酸は維持された状態で、１個若しくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつアスパラギナーゼ活性を有するポリペプチド。
項３．
前記システイン以外のアミノ酸がセリンである、項２に記載のポリペプチド。
項４．
配列番号１のアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアスパラギナーゼ活性を有する、項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
項５．
Ｌ−グルタミンに対する酵素活性が、Ｌ−アスパラギンに対する酵素活性の４％以下である、項１〜４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
項６．
項１〜５のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
項７．
項６に記載のポリヌクレオチドを組み込んだ発現ベクター。
項８．
項７に記載のベクターで形質転換された形質転換体。
項９．
項８に記載の形質転換体を培養する工程を含む、項１〜５に記載のポリペプチドの製造方法。
項１０．
項１〜５のいずれか１項に記載のポリペプチド、項６に記載のポリヌクレオチド、又は項７に記載のベクターを含む抗腫瘍剤。
項１１．
大腸菌由来のアスパラギナーゼを含む抗腫瘍剤にアレルギー症状を示す人用の、項１０に記載の抗腫瘍剤。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、新規なアスパラギナーゼを提供することができる。好適な一実施形態において、酸化ストレス条件下での安定性に優れたアスパラギナーゼを提供することができる。また、好適な一実施形態において、アレルギー症状を惹起しないアスパラギナーゼを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】ラクトバチルス・サケイ由来アスパラギナーゼを各ｐＨにおいて、４℃で２４時間保存した後の比活性（Ｕ／ｍｇ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、本発明に包含される各実施形態について、さらに詳細に説明する。
１．ポリペプチド
本発明に包含されるポリペプチドは、（Ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は（Ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において、１個若しくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつアスパラギナーゼ活性を有するポリペプチドである。以下、当該ポリペプチドを「本発明のポリペプチド」と表記することがある。
【００１０】
配列番号１に示されるアミノ酸配列は、乳酸菌ラクトバチルス・サケイＬＫ−１４５由来のアスパラギナーゼを構成するアミノ酸配列である。
【００１１】
１個若しくは２個以上のアミノ酸の欠失、置換、若しくは付加といった変異を特定のアミノ酸配列に加える技術は当該技術分野において公知であり、任意の手法を用いて行うことができる。例えば、制限酵素処理、エキソヌクレアーゼやＤＮＡリガーゼ等による処理、位置指定突然変異導入法、ランダム突然変異導入法等を利用して行なうことができる。
【００１２】
「（Ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において、１個若しくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列」において、欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸の個数の上限は、当該ポリペプチドがアスパラギナーゼ活性を有する限り特に制限されず、例えば、５０個、４５個、４０個、３５個、３０個、２５個、２０個、１９個、１８個、１７個、１６個、１５個、１４個、１３個、１２個、１１個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、又は２個である。
【００１３】
アスパラギナーゼ活性は、本明細書においては、ネスラー法で測定される。具体的には、後述の実施例に記載するように、２５０μｌの０．０４Ｍ  Ｌ−アスパラギンと、２５０μｌの０．５Ｍ  ＧＴＡ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．５）、及び４９５μｌの脱イオン水を３５℃で２分間プレインキュベートし、適当量の精製酵素液を添加して、３５℃で０〜３０分間反応させる。１２５μｌの５０％（ｗ／ｖ）ＴＣＡで反応を停止し、１３，５００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、得られた上清を一次反応液として、２５μｌの一次反応液、９２５μｌの脱イオン水、及び５０μｌのネスラー試薬を混合し、２０℃で２０分間反応させ、４５０ｎｍにおける吸光度を測定する。１分間あたり１μｍｏｌの基質（Ｌ−アスパラギン）を変化させる酵素量（１μｍｏｌ／ｍｉｎ）を１Ｕと定義して、単位重量当たりのアスパラギナーゼ活性（比活性：Ｕ／ｍｇ）を測定することができる。
【００１４】
また本発明のポリペプチドは、（Ｂ１ａ）配列番号１のアミノ酸配列において、１９６番目のシステイン、２６４番目のシステイン、及び２９０番目のシステインからなる群より選択される少なくとも１個のシステインがシステイン以外のアミノ酸へ置換されたアミノ酸配列からなり、かつアスパラギナーゼ活性を有するポリペプチド、又は（Ｂ１ｂ）（Ｂ１ａ）のポリペプチドのアミノ酸配列において、置換されたアミノ酸は維持された状態で、１個若しくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつアスパラギナーゼ活性を有するポリペプチドを好ましく包含する。
【００１５】
システイン以外のアミノ酸としては、ヒドロキシアルキル基を有するアミノ酸であることが好ましく、例えばセリンやトレオニンなどが例示され、特にセリンであることがより好ましい。
【００１６】
（Ｂ１ａ）に示す１９６番目のシステイン、２６４番目のシステイン、又は２９０番目のシステインにおけるアミノ酸置換は、１種だけが配列番号１のアミノ酸配列に加えられていてもよく、２種以上の組み合わせで配列番号１のアミノ酸配列に加えられていてもよい。アミノ酸置換が１種のみ加えられる場合は、１９６番目又は２６４番目のシステインが置換されることが好ましく、１９６番目のシステインが置換されることがより好ましい。２種以上のアミノ酸置換が組み合わせて配列番号１のアミノ酸配列に加えられる場合、その組み合わせは任意であり、１９６番目及び２６４番目、１９６番目及び２９０番目、２６４番目及び２９０番目、並びに１９６番目、２６４番目及び２９０番目のシステインが置換されることができ、１９６番目及び２６４番目のシステインが置換されることがより好ましい。
【００１７】
「（Ｂ１ｂ）（Ｂ１ａ）のポリペプチドのアミノ酸配列において、置換されたアミノ酸は維持された状態で、１個若しくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列」において、欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸の個数の上限は、当該ポリペプチドがアスパラギナーゼ活性を有する限り特に制限されず、例えば、５０個、４５個、４０個、３５個、３０個、２５個、２０個、１９個、１８個、１７個、１６個、１５個、１４個、１３個、１２個、１１個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、又は２個である。
【００１８】
（Ｂ１ａ）に示す１９６番目のシステイン、２６４番目のシステイン、及び２９０番目のシステインからなる群より選択される少なくとも１個のシステインにおいてアミノ酸置換を有することにより、本発明のポリペプチドは、酸化ストレス条件下において高い安定性を有する。
【００１９】
また、本発明のポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列と８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであることが好ましい。より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらにより好ましくは９９％以上である。
【００２０】
アミノ酸配列の同一性は、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の相同性アルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ）http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/においてデフォルトのパラメータを用いることにより、算出することができる。
【００２１】
また、本発明のポリペプチドは、大腸菌由来のアスパラギナーゼ（DDBJアクセッション番号AP009048 Genomic DNA Translation: BAE77020.1）との同一性が５０％以下、４５％以下、４０％以下、３５％以下、又は３０％以下であることが好ましく、４０％以下であることがより好ましく、３５％以下であることがさらに好ましく、３０％以下であることが特に好ましい。大腸菌由来のアスパラギナーゼとの同一性が低い本発明のポリペプチドは、大腸菌由来のアスパラギナーゼを投与した際に発症するアレルギー症状を惹起しないことが期待される。
【００２２】
本発明のポリペプチドは、後述するポリヌクレオチドを利用して、遺伝子工学的な手法で製造することができる。本発明のポリペプチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列の情報に基づいて、一般的なタンパク質の化学合成法（例えば、液相法及び固相法）を用いて製造することも可能である。
【００２３】
また、本発明のポリペプチドは、幅広いｐＨにおいて高い安定性を有する。例えば、本発明のポリペプチドは各種ｐＨにおいて、４℃で２４時間保存した後にも、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、又は９０％以上のアスパラギナーゼ活性を維持する。当該ｐＨの範囲としては、ｐＨ５．５〜１１であり、当該範囲の上限若しくは下限は、例えば６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０、又は１０．５であってもよい。
【００２４】
本発明のポリペプチドは、Ｌ−グルタミンに対する酵素活性が、Ｌ−アスパラギンに対する酵素活性の４％以下であることが好ましい。本明細書において「酵素活性」とは、基質であるアミノ酸に対する加水分解活性を意味する。アスパラギナーゼ活性の測定において基質であるＬ−アスパラギンを、他のアミノ酸に代えることで、各種アミノ酸を基質とした場合の酵素活性を測定することができる。酵素活性の測定において、基質としてＬ−グルタミンを用いた場合の比活性が、基質としてＬ−アスパラギンを用いた場合の比活性の４％以下、３％以下、２％以下、１％以下、又は１％未満であることが好ましく、１％以下であることがより好ましく、１％未満であることがさらに好ましい。また、本発明のポリペプチドは、Ｄ−アスパラギンに対する酵素活性が、Ｌ−アスパラギンに対する酵素活性の５％以下であることが好ましい。酵素活性の測定において、基質としてＤ−アスパラギンを用いた場合の比活性が、基質としてＬ−アスパラギンを用いた場合の比活性の５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、１％以下、又は１％未満であることが好ましく、１％以下であることがより好ましく、１％未満であることがさらに好ましい。また、本発明のポリペプチドは、Ｄ−グルタミンに対する酵素活性が、Ｌ−アスパラギンに対する酵素活性の５％以下であることが好ましい。酵素活性の測定において、基質としてＤ−グルタミンを用いた場合の比活性が、基質としてＬ−アスパラギンを用いた場合の比活性の５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、１％以下、又は１％未満であることが好ましく、１％以下であることがより好ましく、１％未満であることがさらに好ましい。Ｌ−アスパラギンに対する特異性が高い本発明のポリペプチドは、Ｌ−アスパラギン以外のアミノ酸を分解する可能性が低いため、副作用が少ないことが期待される。
【００２５】
２．ポリヌクレオチド
本発明は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを好ましく包含する。以下、当該ポリヌクレオチドを「本発明のポリヌクレオチド」と表記することがある。配列番号２は配列番号１のアミノ酸配列をコードする塩基配列である。
【００２６】
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列は特に制限されない。また本発明のポリヌクレオチドは、配列番号２の塩基配列と一定以上の同一性を有する塩基配列を有することが好ましい。一定以上の同一性とは、例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上である。
【００２７】
塩基配列の同一性は、市販の又は電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができ、例えば、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ、ＳＳＥＡＲＣＨ等のソフトウェアを用いて計算される。具体的には、ＢＬＡＳＴ検索に一般的に用いられる主な初期条件は、以下の通りである。即ち、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ２．１において、プログラムにｂｌａｓｔｎを用い、各種パラメータはデフォルト値に設定して検索を行うことにより、ヌクレオチド配列の同一性の値（％）を算出することができる。
【００２８】
本発明のポリヌクレオチドは、ヒトのコドン使用頻度に適合したポリヌクレオチドであることが好ましい。「ヒトのコドン使用頻度に適合した」とは、１つのアミノ酸に対応するコドンが複数ある場合に、ヒトにおいて最も使用頻度の高いコドンが用いられることを意味する。本発明のポリヌクレオチドのオープンリーディングフレームの５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上がヒトのコドン使用頻度に適合したポリヌクレオチドであることが好ましい。
【００２９】
本発明のポリヌクレオチドは、単離された状態で存在するポリヌクレオチドであることが好ましい。ここで「単離されたポリヌクレオチド」とは、天然状態において共存するその他の核酸やタンパク質等の成分から分離された状態であることをいう。但し、天然状態において隣接する核酸配列（例えばプロモーター領域の配列やターミネーター配列など）など一部の他の核酸成分を含んでいてもよい。ｃＤＮＡ分子など遺伝子工学的手法によって調製されるポリヌクレオチドの場合の「単離された」状態では、好ましくは、細胞成分や培養液などを実質的に含まないことを意味する。同様に、化学合成によって調製されるポリヌクレオチドの場合の「単離されたポリヌクレオチド」は、好ましくは、ｄＮＴＰなどの前駆体（原材料）や合成過程で使用される化学物質等を実質的に含まないことを意味する。
【００３０】
本発明のポリヌクレオチドは、配列番号２の塩基配列に基づいて、化学的なポリヌクレオチドの合成法（例えば、フォスフォアミダイト法）や遺伝子工学的手法を用いて容易に取得することができる。
【００３１】
３．ベクター
本発明は、本発明のポリヌクレオチドを組み込んだベクターを好ましく包含する。当該ベクターは、本発明のポリヌクレオチドを発現可能な様式で含むことが好ましい。本発明に用いるベクターの種類は、宿主細胞の種類を考慮して適宜選択することができる。例えば、プラスミドベクター、コスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター（アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター等）等を挙げることができる。
【００３２】
大腸菌で発現可能なベクターとしては、例えば、pUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、RSF1010、pMW119、pMW118、pMW219、pMW218、pQE、及びpET等を挙げることができる。酵母で発現可能なベクターとしては、例えば、pBR322、pJDB207、pSH15、pSH19、pYepSec1、pMFa、pYES2、pHIL、pPIC、pAO815、及びpPink等を挙げることが出来る。昆虫で発現可能なベクターとしては、例えば、pAc、pVL、及びpFastbac等を挙げることが出来る。
【００３３】
宿主細胞として真核細胞を使用する場合は、発現ベクターとして、発現しようとするポリヌクレオチドの上流にプロモーター、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部位及び転写終了配列等を保有するものを使用することができ、更に必要により複製起点、分泌シグナル、エンハンサー、及び／又は選択マーカーを有していてもよい。
【００３４】
４．形質転換体
本発明は、本発明のポリヌクレオチドを組み込んだベクターで形質転換された形質転換体を好ましく包含する。当該形質転換体中において、ベクターは、宿主細胞中において自律的に存在してもゲノム中に相同組換え的または非相同組換え的に組み込まれて存在してもよい。形質転換に使用する宿主細胞は、本発明のポリペプチドを産生できる限り特に制限されず、原核細胞及び真核細胞のいずれでもよい。具体的には、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌（例えば、BL21（DE3）、Rosetta（DE3）、HB101、MC1061、JM109、CJ236、MV1184等）、コリネバクテリウム・グルタミカム等のコリネ型細菌、ストレプトミセス属細菌等の放線菌、バチルス・サブチリス等のバチルス属細菌、ストレプトコッカス属細菌、スタフィロコッカス属細菌等の原核細胞；サッカロミセス属、ピシア属及びクルイベロマイセス属等の酵母、アスペルギルス属、ペニシリウム属、タラロマイセス属、トリコデルマ属、ハイポクレア属及びアクレモニウム属等の真菌細胞；ドロソフィラS2、スポドプテラSf9、カイコ培養細胞等の昆虫細胞；並びに植物細胞等を挙げることができる。枯草菌、酵母、真菌、放線菌等のタンパク質分泌能を利用して、本発明のポリペプチドを培地中に生産させることもできる。
【００３５】
発現ベクターの宿主細胞内への導入方法は、従来の慣用的に用いられている方法により行うことができる。例えば、コンピテントセル法、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、リポソーム融合法等の種々の方法が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３６】
当該形質転換体は、本発明のポリペプチドを産生可能であるため、本発明のポリペプチドを製造するために用いることができる。
【００３７】
５．抗腫瘍剤
本発明は、本発明のポリペプチド、本発明のポリヌクレオチド、又は本発明のポリヌクレオチドを組み込んだベクターを含む抗腫瘍剤を好ましく包含する。以下、当該抗腫瘍剤を「本発明の抗腫瘍剤」と表記することがある。本発明のポリペプチドはアスパラギナーゼ活性を有するため、アスパラギン要求性の腫瘍細胞に対して抗腫瘍効果を発揮することから、腫瘍の治療又は予防に用いることができる。本発明における「抗腫瘍剤」は、抗癌剤、抗腫瘍薬剤、抗腫瘍医薬組成物等と表現される場合もある。
【００３８】
本発明の抗腫瘍剤は、本発明の効果を損なわない範囲で、他の成分を含んでいてもよい。このような他成分としては、例えば薬学的に許容される担体や、他の抗腫瘍剤等が例示される。
【００３９】
本発明の抗腫瘍剤により予防又は治療できる疾病としては、特に制限されず、例えば癌などが挙げられ、胃癌、直腸癌、結腸癌、小腸癌、食道癌、肝臓癌、膵臓癌、肺癌、咽頭癌、腎癌、胆のう及び胆管癌、頭頸部癌、前立腺癌、膀胱癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、皮膚癌、悪性黒色腫、脳腫瘍、白血病、悪性リンパ腫等が例示される。特に、白血病又は悪性リンパ腫の予防又は治療に用いることが好ましい。また、本発明のポリペプチドは大腸菌由来のアスパラギナーゼとの同一性が低いため、本発明の抗腫瘍剤は大腸菌由来のアスパラギナーゼによりアレルギー症状を示す人用の抗腫瘍剤として使用することができる。
【００４０】
なお、本明細書において「含む」とは、「本質的にからなる」と、「からなる」をも包含する（The term "comprising" includes "consisting essentially of” and "consisting of."）。また、本発明は、本明細書に説明した構成要件を任意の組み合わせを全て包含する。
【００４１】
また、上述した本発明の各実施形態について説明した各種特性（性質、構造、機能等）は、本発明に包含される主題を特定するにあたり、どのように組み合わせられてもよい。すなわち、本発明には、本明細書に記載される組み合わせ可能な各特性のあらゆる組み合わせからなる主題が全て包含される。
【実施例】
【００４２】
本発明の内容を以下の実施例を用いて具体的に説明する。しかし、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。下記において、特に言及する場合を除いて、実験は大気圧及び常温条件下で行っている。また特に言及する場合を除いて、「％」は「質量％」を意味する。
【００４３】
１．アスパラギナーゼの調製
配列番号２に示すアスパラギナーゼ遺伝子をクローニングし、ｐＥＴ２１ｂに導入して、発現ベクターを構築した。この発現ベクターで大腸菌（Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３））を形質転換した。形質転換体をＬＢ培地で培養し、得られた菌体を１０ｍＭのイミダゾールを含む２０ｍＭ  ＫＰＢ  緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、超音波破砕を行った。得られた菌体破砕液を遠心分離して上清を回収し、得られた上清をＮｉ−ＮＴＡアガロースを充填したカラムにアプライし、２００ｍＭのイミダゾールを含む２０ｍＭ  ＫＰＢ  緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて溶出し、精製酵素液Ａを得た。なお、配列番号１のアミノ酸配列と、大腸菌由来のアスパラギナーゼ（DDBJアクセッション番号AP009048 Genomic DNA Translation: BAE77020.1）を構成するアミノ酸配列の同一性は３０％であった。
【００４４】
２．酵素活性の測定（基質特異性の評価）
表１に０．５Ｍ  ＧＴＡ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．５）の組成を示す。
【００４５】
【表１】
2020129969.tif 000002
【００４６】
２５０μｌの０．０４Ｍ  Ｌ−アスパラギン、Ｄ−アスパラギン、Ｌ−グルタミン又はＤ−グルタミン、２５０μｌの０．５Ｍ  ＧＴＡ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．５）、及び４９５μｌの脱イオン水を３５℃で２分間プレインキュベートし、上述の１で得た精製酵素液Ａを５μｌ添加して、３５℃で０〜３０分間反応させた。１２５μｌの５０％（ｗ／ｖ）ＴＣＡで反応を停止し、１３，５００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、得られた上清を一次反応液とした。２５μｌの一次反応液、９２５μｌの脱イオン水、及び５０μｌのネスラー試薬を混合し、２０℃で２０分間反応させ、４５０ｎｍにおける吸光度を測定し、硫酸アンモニウムを用いた検量線により活性（Ｕ）を算出した。また、ブラッドフォード法によりタンパク質量（ｍｇ）を測定し、比活性（Ｕ／ｍｇ）を算出した。さらに、Ｌ−アスパラギンを基質とした場合の比活性に対する、各アミノ酸を基質とした場合の比活性を相対活性（％）として算出した。結果を表２に示す。
【００４７】
【表２】
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【００４８】
表２に示される通り、ラクトバチルス・サケイ由来のアスパラギナーゼの、Ｄ−アスパラギン、Ｌ−グルタミン、又はＤ−グルタミンを基質とした場合の相対活性は、いずれも１％未満であり、ラクトバチルス・サケイ由来のアスパラギナーゼはＬ−アスパラギンに対して高い特異性を示すことが分かった。なお、ＢＲＥＮＤＡデータベース（http://www.brenda-enzymes.info/）または非特許文献１には、大腸菌由来のアスパラギナーゼの基質特異性に関する測定結果が示されている。当該測定結果をもとに、大腸菌由来のアスパラギナーゼの相対活性を算出すると、Ｄ−アスパラギンを基質とした場合の相対活性は、５．６〜１０％、Ｌ−グルタミンを基質とした場合の相対活性は４．５〜５．６％であり、ラクトバチルス・サケイ由来のアスパラギナーゼは、大腸菌由来のアスパラギナーゼと比較して、Ｌ−アスパラギンに対する特異性が高いことが分かった。
【００４９】
３．酵素活性の測定（ｐＨ安定性の評価）
０．５Ｍ  ＭＥＳ  緩衝液（ｐＨ５．５〜７．０）、０．５Ｍ  ＨＥＰＥＳ  緩衝液（ｐＨ７．０〜８．０）、０．５Ｍ  ＴＡＰＳ  緩衝液（ｐＨ８．０〜９．０）、０．５Ｍ  ＣＨＥＳ  緩衝液（ｐＨ９．０〜１０．０）、０．５Ｍ  ＣＡＰＳ  緩衝液（ｐＨ１０．０〜１１．０）を用いて、４℃でのｐＨが目的のｐＨになるように、ｐＨ５．５〜１１．０の範囲において、ｐＨ０．５ごとに２０ｍＭ  緩衝液を調製した。４５０μｌの２０ｍＭ  緩衝液（ｐＨ５．５〜１１．０）と上述の１で得た５０μｌの精製酵素液Ａを４℃で２４時間インキュベートし、前処理液を得た。２５０μｌの０．０４Ｍ  Ｌ−アスパラギン、２５０μｌの０．５Ｍ  ＧＴＡ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．５）、及び４５０μｌの脱イオン水を３５℃で２分間プレインキュベートし、５０μｌの前処理液を添加して、３５℃で０〜３０分間反応させた。１２５μｌの５０％（ｗ／ｖ）ＴＣＡで反応を停止し、１３，５００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、得られた上清を一次反応液とした。２５μｌの一次反応液、９２５μｌの脱イオン水、及び５０μｌのネスラー試薬を混合し、２０℃で２０分間反応させ、４５０ｎｍにおける吸光度を測定し、硫酸アンモニウムを用いた検量線により活性（Ｕ）を算出した。また、ブラッドフォード法によりタンパク質量（ｍｇ）を測定し、比活性（Ｕ／ｍｇ）を算出した。なお、前処理をせずに、２５０μｌの０．０４Ｍ  Ｌ−アスパラギン、２５０μｌの０．５Ｍ  ＧＴＡ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．５）、及び４９５μｌの脱イオン水を３５℃で２分間プレインキュベートし、５μｌの精製酵素液Ａを添加して、３５℃で０〜３０分間反応させたものをコントロールとして用いた。結果を図１に示す。
【００５０】
コントロールの比活性は８８Ｕ／ｍｇであった。図１に示される通り、ラクトバチルス・サケイ由来のアスパラギナーゼは、４℃で２４時間保存した後にも、幅広いｐＨにおいて、５０％以上の活性を維持しており、特に、ｐＨ６．０〜１０．５の条件下においては、７０％以上の活性を維持することが分かった。
【００５１】
４．酵素活性の測定（酸化ストレス条件下における残存活性の比較）
上述の１において作製した大腸菌の形質転換体から、プラスミドを抽出し、これをテンプレートとしてクイックチェンジ法により遺伝子に変異導入を行った。変異の導入には、配列番号３及び４（変異体１）、５及び６（変異体２）、又は７及び８（変異体３）に示すプライマーを用い、当該プライマーセットを用いることにより、配列番号１のアミノ酸配列において、変異体１においては第１９６位、変異体２においては第２６４位、変異体３においては第２９０位のシステイン残基がセリン残基に置換された変異体を作製した。複数箇所に変異を有する変異体については、変異体からプラスミドを抽出し、これをテンプレートとして、上述の操作を繰り返すことで、目的の変異体を作製した。変異を導入した遺伝子配列のシーケンス解析を行い、目的の変異が導入されていることを確認し、各遺伝子が組み込まれたプラスミドで大腸菌（ＢＬ２１（ＤＥ３)）を形質転換した。野生型酵素、または各変異型酵素を発現する形質転換体をＬＢ培地で培養し、得られた菌体を１０ｍＭのイミダゾールを含む２０ｍＭ  ＫＰＢ  緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、超音波破砕を行った。得られた菌体破砕液を遠心分離して上清を回収し、粗酵素液Ｂ１を得た。得られた粗酵素液Ｂ１をＮｉ−ＮＴＡアガロースを充填したカラムにアプライし、２５０ｍＭのイミダゾールを含む２０ｍＭ  ＫＰＢ  緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて溶出し、粗酵素液Ｂ２を得た。粗酵素液Ｂ２を透析膜に入れ、１Ｍ  ＫＰＢ（ｐＨ７．０）を外液として、４℃で透析し、精製酵素液Ｂを得た。
【００５２】
得られた精製酵素液Ｂを、ＲＰＭＩ１６４０培地において処理することで、酸化ストレス条件下での酵素の安定性を評価した。表３にＲＰＭＩ１６４０培地の組成を示す。
【００５３】
【表３】
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【００５４】
９００μｌのＲＰＭＩ１６４０培地に１００μｌの精製酵素液Ｂを添加し、３７℃で１時間インキュベートし、前処理液を得た。２５０μｌの０．０４Ｍ  Ｌ−アスパラギン、２５０μｌの０．５Ｍ  ＧＴＡ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．５）、及び４５０μｌの脱イオン水を３５℃で２分間プレインキュベートし、５０μｌの前処理液を添加して、３５℃で０〜３０分間反応させた。１２５μｌの５０％（ｗ／ｖ）ＴＣＡで反応を停止し、１３，５００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、得られた上清を一次反応液とした。２５μｌの一次反応液、９２５μｌの脱イオン水、及び５０μｌのネスラー試薬を混合し、２０℃で２０分間反応させ、４５０ｎｍにおける吸光度を測定し、硫酸アンモニウムを用いた検量線により活性（Ｕ）を算出した。また、ブラッドフォード法によりタンパク質量（ｍｇ）を測定し、比活性（Ｕ／ｍｇ）を算出し、ＲＰＭＩ１６４０培地での前処理をしない場合の比活性に対する、ＲＰＭＩ１６４０培地での前処理をした場合の比活性を、前処理後の残存活性（％）として算出した。また野生型酵素の前処理後の残存活性に対する、各変異型酵素の前処理後の残存活性を安定化の割合として算出した。結果を表４に示す。ここで、表４中の各置換を表す記号に関して、数字は、配列番号１のアミノ酸配列におけるアミノ酸の位置を意味する。また、数字の前のアルファベットは、その位置に本来存在するアミノ酸の種類を意味する。数字の後のアルファベットは、本来存在するアミノ酸を置換するアミノ酸の種類を意味する。よって、例えば、「Ｃ１９６Ｓ」とは、配列番号１のアミノ酸配列における第１９６番目のシステイン（Ｃ）がセリン（Ｓ）に置換されることを意味する。他の置換を表す記号についても同様である。
【００５５】
【表４】
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【００５６】
表４に示される通り、変異型酵素は、野生型酵素と比較して、前処理後の残存活性が高く、酸化ストレス条件下においても安定であることが分かった。特に、変異型酵素Ｃ１９６Ｓ、変異型酵素Ｃ２６４Ｓは酸化ストレス条件下において、特に優れた安定性を有していることが分かった。
【図１】
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【配列表】
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