(57)【要約】  【課題】作製及び病態観察が簡便で、且つ静脈血栓症（特に深部静脈血栓症）の臨床病態をよりよく反映した、モデル動物の提供。  【解決手段】静脈結紮部周辺の静脈に光を照射することを含む、静脈血栓症モデル非ヒト哺乳動物作製方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
静脈結紮部周辺の静脈に光を照射することを含む、静脈血栓モデル非ヒト哺乳動物作製方法。
【請求項２】
静脈結紮部周辺の静脈に光を照射すること、及び、前記静脈結紮を除去すること、を含む、肺塞栓モデル非ヒト哺乳動物作製方法。
【請求項３】
血流速度が０．６ｍｍ／秒以下の静脈に光を照射することを含む、静脈血栓モデル非ヒト哺乳動物作製方法。
【請求項４】
非ヒト哺乳動物の静脈結紮部周辺の静脈に光を照射すること、あるいは、非ヒト哺乳動物の血流速度が０．６ｍｍ／秒以下の静脈に光を照射すること、を含む、
静脈血栓作製方法。
【請求項５】
前記光が、波長２５０〜６５０ｎｍの光である、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記光の光強度が３０ｍＷ以上である、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
（Ａ）請求項１又は３に記載の方法で作製された静脈血栓モデル非ヒト哺乳動物に被験物質を適用すること、及び
（Ｂ）被験物質が適用された静脈血栓モデル非ヒト哺乳動物の血栓の抑制若しくは改善の程度を測定すること
を含む、静脈血栓予防又は治療候補物質をスクリーニングする方法。
【請求項８】
（Ａ’）請求項２に記載の方法で作製された肺塞栓モデル非ヒト哺乳動物に被験物質を適用すること、及び
（Ｂ’）被験物質が適用された肺塞栓モデル非ヒト哺乳動物の血栓の抑制若しくは改善の程度を測定すること
を含む、肺塞栓予防又は治療候補物質をスクリーニングする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、静脈血栓モデル非ヒト哺乳動物、当該動物の製造方法、当該動物を用いた予防又は治療用候補物質のスクリーニング方法等に関する。なお、本明細書に記載される文献は、下記先行技術文献（特許文献及び非特許文献）として挙げた文献を含め、全ての文献につき、記載される全ての内容が、参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
静脈血栓症（特に深部静脈血栓症）は、静脈内に血栓が形成される病気であり、当該血栓が血流により飛散すると肺動脈にまで到達し、肺塞栓症という致死的疾患を誘発する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１１−２５２７５７
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】YAKUGAKU ZASSHI, 132(9) 1019-1024 (2012) : 血栓動物病態モデルによる抗血栓薬の評価
【非特許文献２】J Visualized Experiments, 53 (7), e2737, p1-4 (2011) : Electrolytic Inferior Vena Cava Model (EIM) of Venous Thrombosis.
【非特許文献３】Blood,  117 (4), 1106-1107 (2011) : Clues to DVT pathogenesis.
【非特許文献４】J Visualized Experiments, 52 (6), pii 2738. doi 10.3791-2738 (2011) : Mouse Complete Stasis Model of Inferior Vena Cava Thrombosis.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
静脈血栓症の発生機序については、１８５６年に報告された「血流低下、凝固能亢進、血管内皮異常」というＶｉｒｃｈｏｗの３徴からほとんど解明が進んでいない。その主な原因として、深部静脈血栓に類似した動物モデルが存在しないことが挙げられる。
【０００６】
動脈血栓モデルはこれまでに種々の生体モデルが報告されているが、殆どは血小板を中心とした白色血栓（血小板血栓）である。一方、静脈血栓は、フィブリンを中心とした赤血球を多く含む赤色血栓であり、動脈血栓とは全く病態が異なる。このため、既存の動脈血栓モデルでは静脈血栓の病態解明には有用ではない。また、類似技術として光化学刺激（光感作物質ポルフィリンを静脈投与した後に光照射）による生体血栓モデルがあるが、これもヒトでは（深部）静脈血栓が起らないような微小血管に血小板凝集を誘導するモデルであり、動脈血栓モデルであって、静脈血栓の病態解明には有用ではない。現状として、静脈血栓症に最も近いゴールドスタンダードとされるモデルは、下大静脈結紮モデルであるが、このモデルは、作製に時間がかかる（結紮から数日が必要）うえ、腫瘍圧迫などの特殊な静脈血栓に類似した病態である。日常臨床で経験する一般的な深部静脈血栓症は血流が保たれている部位に起こることが多いことから、この静脈結紮モデルも深部静脈血栓症の臨床病態を反映したものではない。
【０００７】
この様な状況の下、作製及び病態観察が簡便で、且つ静脈血栓症（特に深部静脈血栓症）の臨床病態をよりよく反映した、モデル動物が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、まず、現在のゴールドスタンダードである下大静脈結紮モデルを体表に存在する大腿静脈に応用し、生体イメージングが可能となる可能性を検討したが、結紮部位などの各種条件を最適化しても、大腿静脈は分枝の静脈が多く、血流遮断しても血流が停滞せず、数日以内に側副血行路が形成されるため、静脈血栓は形成されなかった。
【０００９】
しかし、諦めずに更に検討を進めたところ、結紮により血流速度を通常の半分以下程度まで低下させ、さらに光（例えば、通常の蛍光顕微鏡での観察時に用いる励起光）を照射することによって、静脈血栓が形成される可能性を見出し更に検討を重ねた。得られた知見を本明細書に開示する。
【００１０】
本開示は例えば以下の項に記載の主題を包含する。
項１．
（好ましくは蛍光色素化合物が投与された非ヒト哺乳動物の）静脈結紮部周辺の静脈（好ましくは、血流速度が０．６ｍｍ／秒以下の静脈）に光を照射することを含む、静脈血栓症モデル（好ましくは、深部静脈血栓症モデル）非ヒト哺乳動物作製方法。
項２．
（好ましくは蛍光色素化合物が投与された非ヒト哺乳動物の）静脈結紮部周辺の静脈（好ましくは、血流速度が０．６ｍｍ／秒以下の静脈）に光を照射すること、及び、前記静脈結紮を除去すること、を含む、肺塞栓モデル非ヒト哺乳動物作製方法。
項３．
（好ましくは蛍光色素化合物が投与された非ヒト哺乳動物の）血流速度が０．６ｍｍ／秒以下の静脈に光を照射することを含む、静脈血栓症モデル非ヒト哺乳動物作製方法。
項４．
（好ましくは蛍光色素化合物が投与された）非ヒト哺乳動物の静脈結紮部周辺の静脈に光を照射すること、あるいは、非ヒト哺乳動物の血流速度が０．６ｍｍ／秒以下の静脈に光を照射すること、を含む、
静脈血栓作製方法。
項５．
前記光が、波長２５０〜６５０ｎｍの光である、項１〜４のいずれかに記載の方法。
項６．
前記光の光強度が３０ｍＷ以上である、項１〜５のいずれかに記載の方法。
項７．
（Ａ）項１又は３に記載の方法で作製された静脈血栓症モデル非ヒト哺乳動物に被験物質を適用すること、及び
（Ｂ）被験物質が適用された静脈血栓症モデル非ヒト哺乳動物の血栓の抑制若しくは改善の程度を測定すること
を含む、静脈血栓症予防又は治療候補物質をスクリーニングする方法。
項８．
（Ａ’）項２に記載の方法で作製された肺塞栓モデル非ヒト哺乳動物に被験物質を適用すること、及び
（Ｂ’）被験物質が適用された肺塞栓モデル非ヒト哺乳動物の血栓の抑制若しくは改善の程度を測定すること
を含む、肺塞栓予防又は治療候補物質をスクリーニングする方法。
項９．
（ａ）非ヒト哺乳動物の静脈結紮部周辺の静脈に光を照射すること、あるいは、非ヒト哺乳動物の血流速度が０．６ｍｍ／秒以下の静脈に光を照射すること、
（ｂ）非ヒト哺乳動物に被験物質を適用すること、並びに
（ｃ）被験物質が適用された非ヒト哺乳動物の光照射部位における血栓の抑制若しくは改善の程度を測定すること
を、（ｃ）が最後になるように含む
静脈血栓症予防又は治療候補物質をスクリーニングする方法。
項１０．
（ａ’）非ヒト哺乳動物の静脈結紮部周辺の静脈に光を照射すること、及び、前記静脈結紮を除去すること
（ｂ）非ヒト哺乳動物に被験物質を適用すること、並びに
（ｃ’）被験物質が適用された非ヒト哺乳動物の肺血栓の抑制若しくは改善の程度を測定すること
を、（ｃ’）が最後になるように含む
肺塞栓予防又は治療候補物質をスクリーニングする方法。
【発明の効果】
【００１１】
作製及び病態観察が簡便で、且つ静脈血栓症（特に深部静脈血栓症）の臨床病態をよりよく反映した、モデル動物が提供される。当該モデル動物は、生体イメージングにも応用可能であり、好ましい。また、当該血栓は、血小板が少なく赤血球優位という実際の静脈血栓と類似した血栓であることから、既存モデルにおける血小板血栓とは異なり、静脈壁から容易に剥離し遊離して静脈血流にのって肺動脈に達するという、まさに肺血栓症の病態をそのまま再現することが可能である。（既存モデルにおける血小板血栓は、動脈血栓であるうえ、強固に血管壁と癒着しており剥がれ難い。）
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】マウスの大腿静脈を結紮し、蛍光色素化合物を投与して、当該結紮部位を蛍光顕微鏡で観察することにより、血栓が生成されることを確認するための、一連の検討手順の概要を示す。
【図２】大腿静脈結紮部位への励起光照射時間が長くなるにつれ、形成される血栓が大きくなることを示す。
【図３】Ａ）血流速度、Ｂ）照射光の波長（すなわち、励起光波長）、Ｃ）照射光の強度、又はＤ）光照射時間のいずれかの条件を振って、それぞれの条件が静脈血栓生成に与える影響について検討した結果を示す。
【図４】生成された血栓（左側赤色部）が、結紮を除去することで遊離した（右側で赤色部が焼失した）ことを示す。
【図５】遊離した大腿静脈の血栓が肺血栓を引き起こしたことを示す。
【図６】図５において肺血栓が観察された部位を病理解析（ＨＥ染色）した図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本開示は、病態（特に静脈血栓又は肺塞栓）モデル非ヒト哺乳動物、当該動物の製造方法、当該動物を用いた予防又は治療用候補物質のスクリーニング方法等を好ましく包含するが、これらに限定されるわけではなく、本開示は本明細書に開示され当業者が認識できる全てを包含する。
【００１４】
本開示に包含される静脈血栓モデル非ヒト哺乳動物は、例えば、静脈結紮部周辺の静脈に光を照射することを含む作製方法、あるいは血流速度が０．６ｍｍ／秒以下の静脈に光を照射することを含む作製方法によって作成される。また、本開示に包含される肺血栓モデル非ヒト哺乳動物は、例えば、静脈結紮部周辺の静脈に光を照射すること、及び、前記静脈結紮を除去することを含む作製方法によって作成される。当該静脈血栓モデル非ヒト哺乳動物を「本開示の静脈血栓モデル動物」ということがある。また、当該肺血栓モデル非ヒト哺乳動物を「本開示の肺血栓モデル動物」ということがある。
【００１５】
静脈結紮部周辺の静脈に光を照射することにより、短時間（例えば１０秒〜１分程度）で光照射部位に形成される。結紮された部分周辺の静脈の血流が通常より遅くなっており、この通常より遅い血流（例えば正常時の５０％以下の速さ）の状態において、光を照射することにより、好ましく血栓が形成される。具体的な好ましい血流の速さとしては、例えば０．６ｍｍ／秒以下を挙げることができる。また、血流の速さの下限は、特に制限はされないが、例えば０．０１ｍｍ／秒を挙げることができる。当該範囲（０．６ｍｍ／秒以下０．０１ｍｍ／秒以上）においては、上限又は下限が例えば０．５５、０．５、０．４５、０．４、０．３５、０．３、０．２５、０．２、０．１５、０．１、又は０．０５であってもよい。例えば、０．５ｍｍ／秒以下０．１ｍｍ／秒以上がより好ましい。
【００１６】
また、このようにして静脈血栓が形成された後、静脈結紮を除去することにより、静脈壁から剥離し得、遊離して静脈血流にのって肺動脈に達することができる。これにより、本開示の肺血栓モデル動物を作製することができる。すなわち、肺血栓モデル動物作製方法は、例えば、静脈結紮部周辺の静脈に光を照射すること、及び、前記静脈結紮を除去すること、を含む。
【００１７】
またさらに、本開示の肺血栓モデル動物は、光操作により血栓形成を誘導して作製するものであるため、生存下に繰り返し血栓形成をおこすことが可能である。ゆえに、急性肺塞栓モデルのみならず、慢性血栓塞栓性肺高血圧症モデルを作製するためにも有用である。すなわち、微小血栓を繰り返し生存下に作成し、肺塞栓を繰り返すことによって、この慢性血栓塞栓性肺高血圧症の病態を作り出すことが可能となる。このため、例えば、静脈結紮部周辺の静脈に光を照射すること、及び、前記静脈結紮を除去すること、をこの順に繰り返して（例えば２〜２０回程度、好ましくは２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０回程度）含む、慢性血栓塞栓性肺高血圧症モデル作製方法も、本開示の肺血栓モデル作製方法に好ましく包含される。
【００１８】
なお、本開示の静脈血栓モデル動物作製方法は、血流速度が０．６ｍｍ／秒以下の静脈に光を照射することを含む作製方法をも好ましく包含しており、当該方法における血流速度についても上記の内容が当てはまる。さらに、下述する各要件（光の波長、光の強度等）についても、同様に当てはまる。なお、当該方法においては、静脈の血流速度を下げる好ましい方法の例として、静脈結紮が挙げられる。
【００１９】
照射される光の波長は、例えば２５０〜６５０ｎｍ程度が好ましい。当該範囲の上限又は下限は、例えば２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、又は６４０ｎｍ程度であってもよい。より具体的には、当該範囲は例えば３００〜６００ｎｍ程度がより好ましく、３５０〜５００ｎｍ程度がさらに好ましく、３５０〜５７０ｎｍ程度がよりさらに好ましい。
【００２０】
また、照射される光の強度は、例えば３０ｍＷ以上が好ましく、３５、４０、４５、又は５０ｍＷ以上がより好ましい。また当該強度の上限は特に制限はされないが、例えば２００ｍＷ以下が挙げられる。さらに、当該上限は、例えば１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、又は１００ｍＷ以下であってもよい。
【００２１】
また、光照射時間は、静脈血栓が生成する範囲で適宜設定することができる。例えば、５秒以上が好ましく、１０秒、１５秒、２０秒、２５秒、３０秒、３５秒、４０秒、４５秒、５０秒、５５秒、又は６０秒以上がより好ましい。また、光照射時間の上限は特に制限される訳ではない。例えば３００秒程度が例示できる。
【００２２】
上記のステップにより、簡便に、静脈に血栓を生じさせることができる。従って、当該方法は、静脈血栓症（特に深部静脈血栓症）モデル非ヒト哺乳動物作製方法として、好ましい。また、蛍光顕微鏡を用いて蛍光物質を励起して観察する際の励起光を、当該方法に好適な光として用いることができる。この場合には、蛍光顕微鏡において、観察のための励起光が、静脈血栓を生成するための光としても作用することになり、観察と血栓形成誘発とを同一光源で行うことができる。このため、生体イメージングへの応用が簡便であり、好ましい。
【００２３】
またさらに、当該方法により生成される静脈血栓は、血管長軸方向に伸びる形態をしており、また静脈弁にも好発するなど、深部静脈血栓証の臨床病態をよく反映していると考えられ、好ましい。
【００２４】
また、本開示は、同様のステップを含む、静脈血栓を作製する方法をも包含する。作製された血栓そのものは、上記の通り深部静脈血栓証の臨床病態をよく反映していると考えられることから、例えば病理学的な検討に供されるなど、好ましく利用することができる。
【００２５】
なお、本開示において、非ヒト哺乳動物の種としては、例えばペット又は家畜、あるいは実験動物として用いられる非ヒト哺乳動物が好ましく、例えばマウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ、ウマ、サル等が挙げられる。中でも、げっ歯類（マウス、ラット、ウサギなど）が好ましい。
【００２６】
本開示は、また、（Ａ）上記の方法で作製された静脈血栓症モデル非ヒト哺乳動物に被験物質を適用すること、及び（Ｂ）被験物質が適用された静脈血栓症モデル非ヒト哺乳動物の血栓の抑制若しくは改善の程度を測定すること、を含む、静脈血栓症予防又は治療候補物質をスクリーニングする方法をも包含する。またさらに、本開示は、（Ａ’）上記の方法で作製された肺塞栓モデル非ヒト哺乳動物に被験物質を適用すること、及び（Ｂ’）被験物質が適用された肺塞栓モデル非ヒト哺乳動物の血栓の抑制若しくは改善の程度を測定すること、を含む、肺塞栓予防又は治療候補物質をスクリーニングする方法をも包含する。
【００２７】
ここでの被験物質は、特に制限はされない。例えば、化合物及び組成物であり得る。化合物としては、例えば低分子化合物や、核酸（例えばＤＮＡ、ＲＮＡ等）やタンパク質（例えば抗体又はその一部等）、ポリマー等の高分子化合物であってよい。組成物としても、生物（例えば動物、植物、微生物等）から得た抽出物等であってもよく、化合物を２種以上組み合わせたものであってもよい。
【００２８】
被験物質を適用する手法（経路）についても特に制限はされず、検討する被験物質の性質等を考慮して適宜選択することができる。例えば経口投与、経血管投与（静脈投与、動脈投与）、経皮投与等により、被験物質を前記モデル動物に適用することができる。また例えば、経口投与時にはゾンデ、経血管投与時には注射器等、適宜投与のための器具を選択して用いることもできる。また、被験物質に、薬学的又は食品衛生学的に許容される担体や食餌等を混合して、各投与経路に適した組成物として投与することもできる。特に制限されないが、経口投与または経血管投与が好ましい。
【００２９】
また、被験物質が適用された静脈血栓モデル非ヒト哺乳動物又は肺塞栓モデル非ヒト哺乳動物の血栓の抑制若しくは改善の程度を測定するにあたっては、例えば蛍光顕微鏡における観察（好ましくはバイオイメージング）において、血栓の観察を可能とする、蛍光色素化合物を用いることが好ましい。
【００３０】
このような蛍光色素化合物としては、例えば、蛍光色素とデキストランとが結合した構造有する化合物が好ましい。また、用いる蛍光組織としては、例えばＦＩＴＣ（fluorescein isothiocyanate）やＣｙ（例えばＣｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、Ｃｙ７．５等）が好ましい。蛍光色素化合物としては、なかでもＦＩＴＣ又はＣｙとデキストランとが結合した化合物が好ましく、特にコストの観点からＦＩＴＣデキストラン（フルオレセインイソチオシアナートデキストラン：Fluorescein Isothiocyanate Dextran）が好ましい。蛍光色素化合物は、蛍光顕微鏡における観察時（観察直前）に、経血管投与（特に静脈投与）して用いることが好ましい。
【００３１】
蛍光顕微鏡により、蛍光色素化合物を投与したモデル動物の静脈血栓生成部位（静脈結紮周辺の光照射部位）又は肺血栓生成部位を観察することにより、血栓の抑制若しくは改善の程度を測定できる。特に、被験物質の投与の前後において同様の観察を行い、被験物質投与によりどのように血栓が変化したか等を測定することによって、被験物質の評価を行い、特に被験物質の適用により血栓の生成が抑制された若しくは改善（血栓の大きさの減少等）された場合、その被験物質は静脈血栓若しくは肺血栓予防又は治療候補物質としてスクリーニングすることができる。
【００３２】
本開示は、また、（ａ）非ヒト哺乳動物の静脈結紮部周辺の静脈に光を照射すること、あるいは、非ヒト哺乳動物の血流速度が０．６ｍｍ／秒以下の静脈に光を照射すること、（ｂ）非ヒト哺乳動物に被験物質を適用すること、並びに（ｃ）被験物質が適用された非ヒト哺乳動物の光照射部位における血栓の抑制若しくは改善の程度を測定することを、（ｃ）が最後になるように含む、静脈血栓症予防又は治療候補物質をスクリーニングする方法をも包含する。またさらに、本開示は、（ａ’）非ヒト哺乳動物の静脈結紮部周辺の静脈に光を照射すること、及び、前記静脈結紮を除去すること、（ｂ）非ヒト哺乳動物に被験物質を適用すること、並びに、（ｃ’）被験物質が適用された非ヒト哺乳動物の肺血栓の抑制若しくは改善の程度を測定すること、を、（ｃ’）が最後になるように含む、肺塞栓予防又は治療候補物質をスクリーニングする方法をも包含する。
【００３３】
当該スクリーニング方法にも、上述した内容が好ましく当てはまる。例えば、（ａ）又は（ａ’）における、非ヒト哺乳動物の静脈結紮部周辺の静脈への光の照射、あるいは非ヒト哺乳動物の血流速度が０．６ｍｍ／秒以下の静脈への光の照射については、上述した内容が好ましく当てはまる。また例えば、（ｂ）における、非ヒト哺乳動物への被験物質の適用についても、上述した内容が好ましく当てはまる。また例えば、（ｃ）又は（ｃ’）における、被験物質が適用された非ヒト哺乳動物の光照射部位における血栓又は肺血栓の抑制若しくは改善の程度の測定についても、上述した内容が好ましく当てはまる。また、（ｃ）又は（ｃ’）においては、血栓が存在していない場合もありえることから、上記のように被験物質投与によりどのように血栓が変化したかを測定するだけではなく、例えば被験物質投与により血栓の生成しづらさ（生成抑制）の程度がどの程度となったかを測定することも包含される。このような測定は、コントロール（例えば、被験物質の投与の有無以外は同様の操作を施した対照）を用意し、当該コントロールと比較することによって好ましく行うことができる。
【００３４】
なお、（ｃ）における光照射部位とは、より具体的には、（ａ）において、光が照射された静脈結紮部周辺の静脈である。
【００３５】
これら（ａ）（ｂ）（ｃ）の順序は、（ｃ）が最後である限り特に制限されない。（ａ）の後に（ｂ）が行われても、（ｂ）の後に（ａ）が行われても、あるいは（ａ）及び（ｂ）が同時に行われてもよい。また、（ａ’）（ｂ）（ｃ’）の順序は、（ｃ’）が最後である限り特に制限されない。
【００３６】
なお、本明細書において「含む」とは、「本質的にからなる」と、「からなる」をも包含する（The term "comprising" includes "consisting essentially of” and "consisting of."）。
【００３７】
また、上述した各実施形態について説明した各種特性（性質、構造、機能等）は、本開示に包含される主題を特定するにあたり、どのように組み合わせられてもよい。
【実施例】
【００３８】
以下、本開示に包含される主題をより具体的に説明するが、当該主題は下記の例に限定されるものではない。
【００３９】
なお、以下の例で用いたマウスは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（野生型）であり、日本クレア株式会社から購入した。また、蛍光色素化合物  ＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  Ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ  Ｄｅｘｔｒａｎ、Ｍｗ：２０００ｋＤａ）は、シグマアルドリッチから購入して用いた。蛍光顕微鏡は、Ｎｉｋｏｎ  ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｎｉ（株式会社ニコン）を用いた。
【００４０】
まず、麻酔下にマウスの大腿静脈を外科的に大腿動脈から分離し、大腿静脈のみを外科的に結紮した。これにより、静脈血流速度が低下した状態において、蛍光顕微鏡のステージに置いた。さらに、当該マウスに対して、蛍光色素化合物 ＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎ（２５ｍｇ／ｋｇ）を静脈注射により投与した。ＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎは血流を可視化できる蛍光色素化合物であるため、血栓が生成すれば、ＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎで可視化された血流の欠損部分として血栓をも可視化できる。その後、サンプル（ＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎ）を励起する光の波長調整フィルターを用いて、結紮静脈周辺を蛍光顕微鏡で観察した。ＤＡＰＩ−Ｆｉｌｔｅｒ（３７５／２８ｎｍ）、ＦＩＴＣ−Ｆｉｌｔｅｒ（４８０／３０ｎｍ）、ＴＲＩＴＣ−Ｆｉｌｔｅｒ（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ）（５４０／２５ｎｍ）のいずれの波長の光を用いて観察した場合であっても、血栓が観察（すなわち、光照射から１０〜２０秒程度で形成）されることが確認できた。
【００４１】
以上の一連の実験手順概要を図１に示す。また、観察０秒後、３０秒後、及び１２０秒後の観察画像を図２に示す。観察時間が長くなるにつれ（すなわち、励起光照射時間が長くなるにつれ）、形成される血栓が大きくなることが確認できた。
【００４２】
さらに、上記と同様の手順に従いつつ、Ａ）血流速度、Ｂ）照射光の波長（すなわち、励起光波長）、Ｃ）照射光の強度、又はＤ）光照射時間のいずれかの条件を振って、それぞれの条件が静脈血栓生成に与える影響について検討した。
【００４３】
Ａ）大腿静脈流速と血栓形成
マウス大腿静脈を外科的に結紮した後、血流速度を計測した。その後、ＦＩＴＣフィルターでの蛍光観察に伴う励起光照射（４８０ｎｍ，１００ｍＷ，３０秒）後の血栓面積を計測した。その結果、血栓形成は血流速度依存性であり、血流速度が遅いほど血栓面積は増大すること、及び血流速度が０．６ｍｍ／秒を超えると血栓は形成され難いことがわかった。
Ｂ）血栓形成と励起光波長
マウス大腿静脈を外科的に結紮した後、各種フィルターを介した蛍光観察に伴う励起光照射（１００ｍＷ，３０秒）、または７００ｎｍ波長のレーザー照射（１００ｍＷ，３０秒）後の血栓面積を計測した。結果、生体透過性の高い７００ｎｍの近赤外光以外の波長において、照射光の波長に非依存的に血栓が形成されることがわかった。
Ｃ）光照射強度と血栓形成
マウス大腿静脈を外科的に結紮した後、各光強度（１００ｍＷ，５０ｍＷ，２５ｍＷ）におけるＦＩＴＣフィルターでの蛍光観察に伴う励起光照射（４８０ｎｍ，３０秒）後の血栓面積を計測した。結果、血栓形成は光強度依存的に起こることがわかった。この励起光照射条件においては、２５ｍＷ以下の光強度では血栓形成が起こり難いこともわかった。
Ｄ）血栓形成と光照射時間
マウス大腿静脈を外科的に結紮した後、各照射時間（１０，２０，３０，６０秒）におけるＦＩＴＣフィルターでの蛍光観察に伴う励起光照射（４８０ｎｍ，１００ｍＷ）後の血栓面積を計測した。結果、血栓形成は照射時間依存性に起こり、増大することがわかった。
【００４４】
以上のＡ）〜Ｄ）の検討結果を統計処理しグラフ化して図３に示す。図３において、＊はＰ＜０．０５を、＊＊はＰ＜０．０１を、＊＊＊はＰ＜０．００１を、それぞれ示す。また、ｎｓは有意差無しを示す。
【００４５】
またさらに、上記血栓作製検討において、ＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎを静脈投与する際に、あわせて蛍光標識されたフィブリノゲンを５ｍｇ／ｋｇの容量で静脈投与した。蛍光標識されたフィブリノゲンとしては、Fibrinogen From Human Plasma, Alexa FluorTM 647 Conjugate（インビトロジェン）を購入して用いた。
【００４６】
そして、上記と同様に、マウス大腿静脈を結紮後に、蛍光顕微鏡で観察することによって、血栓形成を誘導した。生成された血栓を図４左側に示す。図４左側では、血栓に取り込まれた、蛍光標識されたフィブリノゲンが赤く検出されることで、血栓が生成されていることが確認できる。
【００４７】
血栓作製後、結紮糸を除去して、血流を再開させた。再開された血流に乗って、大腿静脈の血栓が遊離した。蛍光顕微鏡でフィブリノゲンの遊離（消失）を確認した図を図４右側に示す。図４左側で観察された血栓（赤色部）が消失していることから、血栓が遊離したことが確認できる。
【００４８】
その後、マウスを安楽死させ、肺を摘出し、蛍光標識されたフィブリノゲンをIVIS装置によって検出した。結果を図５に示す。図５上側に示すように、蛍光標識されたフィブリノゲンが肺から検出されたことから、遊離した大腿静脈の血栓が肺血栓を引き起こしたことが確認できた。なお、図５下側は、蛍光顕微鏡観察による血栓形成を誘導せずに、蛍光標識されたフィブリノゲンのみを投与し、同様に観察した図を示す。これにより、死後の血栓形成を観察しているのではなく、大腿静脈の血栓が遊離して肺に到達したことが確認できた。
【００４９】
またさらに、図５（ＩＶＩＳ画像）において、蛍光シグナルを検出した部位で病理解析を行った。ＨＥ（ヘマトキシリン・エオジン）染色によって、血管内腔に炎症細胞浸潤を伴う血栓が確認できた（図６：上側の白点線四角枠を拡大して下側に示す。）。これにより、血栓が生前に存在したものであることも示された。（死後の血栓であれば炎症細胞浸潤は伴わないため。） 
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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