(57)【要約】【課題】コストを増大させずに細胞情報を高効率に解析する。【解決手段】細胞解析方法は、解析用チップと解析用チップに積層された膜フィルタとを備える単一細胞解析装置１１を用いる細胞解析方法であって、解析用チップに細胞を含む第１の液体を導入するステップと、解析用チップに第１の液体よりも表面張力が小さい第２の液体を導入するステップと、第１の液体と第２の液体とを膜フィルタ側の流路と接続された送液用ポンプによって吸引するステップと、解析用チップに細胞と反応する反応試薬を導入し、細胞から抽出される分子を固相に反応させるステップと、反応試薬を送液用ポンプによって吸引するステップと、解析用チップの中から固相を取り出して解析するステップと、を含む。【選択図】図４
2020010608.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
解析用チップと前記解析用チップに積層された膜フィルタとを備える単一細胞解析装置を用いる細胞解析方法であって、
前記解析用チップに細胞を含む第１の液体を導入するステップと、
前記解析用チップに前記第１の液体よりも表面張力が小さい第２の液体を導入するステップと、
前記第１の液体と前記第２の液体とを前記膜フィルタ側の流路と接続された送液用ポンプによって吸引するステップと、
前記解析用チップに前記細胞と反応する反応試薬を導入し、前記細胞から抽出される分子を固相に反応させるステップと、
前記反応試薬を前記送液用ポンプによって吸引するステップと、
前記解析用チップの中から前記固相を取り出して解析するステップと、
を含む細胞解析方法。
【請求項２】
請求項１に記載の細胞解析方法であって、
前記第２の液体を導入するステップにおいて、前記第１の液体からなる第１の液層と前記第２の液体からなる第２の液層とが形成されるように前記第２の液体を導入する、
細胞解析方法。
【請求項３】
請求項１に記載の細胞解析方法であって、
前記第２の液体を導入するステップにおいて、前記第２の液体として界面活性剤を導入する、
細胞解析方法。
【請求項４】
請求項１に記載の細胞解析方法であって、
前記膜フィルタは多孔質膜または網目状のフィルタである、
細胞解析方法。
【請求項５】
請求項１に記載の細胞解析方法であって、
前記第２の液体を導入するステップにおいて、前記第１の液体を吸引しながら前記第２の液体を導入する、
細胞解析方法。
【請求項６】
請求項１に記載の細胞解析方法であって、
前記第２の液体を導入するステップにおいて、前記第２の液体の表面張力は純水の表面張力よりも小さい、
細胞解析方法。
【請求項７】
請求項１に記載の細胞解析方法であって、
前記膜フィルタは多孔質膜であり、
前記第２の液体、前記多孔質膜および前記送液用ポンプは、以下の数式を満たすパラメータで特徴づけられる、
細胞解析方法。
【数１】
2020010608.tif 000008
Ｐ：前記送液用ポンプが前記解析用チップ側の液体と前記多孔質膜側の液体との間に生じさせる圧力差
ｋ：前記多孔質膜の形状に関する固有係数
γ1：前記第２の液体の表面張力
θ：前記第２の液体と前記多孔質膜との接触角
Ｄ：前記多孔質膜に設けられた孔の孔径
【請求項８】
請求項１に記載の細胞解析方法であって、
前記第２の液体を導入するステップにおいて、前記解析用チップの映像をモニタに表示しながら前記第２の液体を導入する、
細胞解析方法。
【請求項９】
請求項１に記載の細胞解析方法であって、
前記膜フィルタは０．５〜３．０マイクロメートルの孔径が設けられた多孔質膜である、
細胞解析方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の細胞解析方法であって、
前記第２の液体を導入するステップにおいて、前記第１の液体に分注ピペットの先端が付着した状態で前記第２の液体を導入する、
細胞解析方法。
【請求項１１】
請求項１に記載の細胞解析方法であって、
前記解析用チップは大気圧下に置かれる、
細胞解析方法。
【請求項１２】
請求項７に記載の細胞解析方法であって、
前記細胞から抽出される分子を固相に反応させるステップにおいて、前記反応試薬に前記反応試薬よりも表面張力が小さい第３の液体を導入し、
前記第３の液体、前記多孔質膜および前記送液用ポンプは、以下の数式を満たすパラメータで特徴づけられる、
細胞解析方法。
【数２】
2020010608.tif 000009
Ｐ：前記送液用ポンプが前記解析用チップ側の液体と前記多孔質膜側の液体との間に生じさせる圧力差
ｋ：前記多孔質膜の形状に関する固有係数
γ2：前記反応試薬と前記第３の液体との混合液体の表面張力
θ：前記混合液体と前記多孔質膜との接触角
Ｄ：前記多孔質膜に設けられた孔の孔径
【請求項１３】
解析用チップと前記解析用チップに積層された膜フィルタとを備える単一細胞解析装置を用いる細胞解析方法であって、
細胞を含む第１の液体と表面張力が前記第１の液体の表面張力よりも小さく前記細胞を破壊しない目安となる所定の値よりも大きい第２の液体とを混合して混合液体を調製するステップと、
前記解析用チップに前記混合液体を導入するステップと、
前記混合液体を前記膜フィルタ側の流路と接続された送液用ポンプによって吸引するステップと、
前記解析用チップに前記細胞と反応する反応試薬を導入するステップと、
前記反応試薬を前記送液用ポンプによって吸引するステップと、
前記解析用チップの中から前記固相を取り出して解析するステップと、
を含む細胞解析方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の細胞解析方法であって、
前記第２の液体は界面活性剤である、
細胞解析方法。
【請求項１５】
請求項１３に記載の細胞解析方法であって、
前記膜フィルタは多孔質膜であり、
前記混合液体、前記膜フィルタおよび前記送液用ポンプは、以下の数式を満たすパラメータで特徴づけられる、
細胞解析方法。
【数３】
2020010608.tif 000010
Ｐ：前記送液用ポンプが前記解析用チップ側の液体と前記多孔質膜側の液体との間に生じさせる圧力差
ｋ：前記多孔質膜の形状に関する固有係数
γ3：前記混合液体の表面張力
θ：前記混合液体と前記多孔質膜との接触角
Ｄ：前記多孔質膜に設けられた孔の孔径
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、細胞解析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、多数の細胞から構成される生体組織のゲノム解析、遺伝子発現解析または蛋白解析を行うときに、個々の細胞のゲノム、遺伝子発現または蛋白質の違いに注目して解析する単一細胞解析の重要性が認識され始めている。従来の解析では生体組織から採取した多数の細胞を１種類のサンプルとし、それら細胞からＤＮＡおよび／またはＲＮＡを抽出して解析を行う。しかし、この方法では全細胞の平均データしか得ることができず、個々の細胞に含まれるＤＮＡおよび／またはＲＮＡの存在量が平均値から乖離していたとしても評価することができない。
【０００３】
そこで特許文献１で用いられているようなアレイデバイスを用いることで、細胞一つずつの遺伝子解析を行うことが近年すすめられている。特許文献１では細胞を一つずつ捕捉可能な孔を複数持つアレイデバイスを用いて、細胞一つずつの遺伝子解析（単一細胞解析）を可能にしている。また当該アレイデバイスでは、遺伝子解析を行うにあたって、アレイデバイス中に複数の試薬を連続的に投与することによって遺伝子解析を行うための反応をデバイス中で行うことが可能である。細胞情報を持つ生体分子は反応槽内に充填されている生体分子捕捉用ビーズによって捕捉され、複数の試薬を投与することで、解析に必要な反応が生じる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２０１６／０３８６７０号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上述のとおり、特許文献１では、単一細胞解析を行う際に、細胞内の生体分子を反応槽内の生体分子捕捉用ビーズに捕捉させて反応を生じさせている。ここで、高効率な反応を行うためには、生体分子捕捉用ビーズの粒径が小さいことが望ましく、そのためには生体捕捉用ビーズを保持するために設置されている多孔質膜の孔径を小さくしなければいけない。
【０００６】
しかしながら、多孔質膜の孔径が小さくなればなるほど、複数の試薬を順番に投与および送液する際に、気体が多孔質膜に詰まり、送液が困難になる。これは親水性である多孔質膜が液体を保持した状態になると、濡れた多孔質膜を気体が通過するために必要な圧力が高くなるためである。単一細胞解析では複数の試薬を混ぜずに順番に投与および送液する。そのため、一つの試薬を送液し終えてから次の試薬を投与するまでの間に存在する気体は除去することが難しい。したがって、必然的に、液体の送液時に気体も併せて多孔質膜を通過させる必要がある。その場合、液体を吸引する能力が高い送液ポンプが必要となりコストが増大する。
【０００７】
本開示は、上記の点に鑑みてなされたものであり、コストを増大させずに細胞情報を高効率に解析できる技術を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するために、解析用チップと前記解析用チップに積層された膜フィルタとを備える単一細胞解析装置を用いる細胞解析方法であって、前記解析用チップに細胞を含む第１の液体を導入するステップと、前記解析用チップに前記第１の液体よりも表面張力が小さい第２の液体を導入するステップと、前記第１の液体と前記第２の液体とを前記膜フィルタ側の流路と接続された送液用ポンプによって吸引するステップと、前記解析用チップに前記細胞と反応する反応試薬を導入し、前記細胞から抽出される分子を固相に反応させるステップと、前記反応試薬を前記送液用ポンプによって吸引するステップと、前記解析用チップの中から前記固相を取り出して解析するステップと、を含む細胞解析方法を提供する。
【０００９】
また、解析用チップと前記解析用チップに積層された膜フィルタとを備える単一細胞解析装置を用いる細胞解析方法であって、細胞を含む第１の液体と表面張力が前記第１の液体の表面張力よりも小さく前記細胞を破壊しない目安となる所定の値よりも大きい第２の液体とを混合して混合液体を調製するステップと、前記解析用チップに前記混合液体を導入するステップと、前記混合液体を前記膜フィルタ側の流路と接続された送液用ポンプによって吸引するステップと、前記解析用チップに前記細胞と反応する反応試薬を導入するステップと、前記反応試薬を前記送液用ポンプによって吸引するステップと、前記解析用チップの中から前記固相を取り出して解析するステップと、を含む細胞解析方法を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本開示によれば、コストを増大させずに細胞情報を高効率に解析できる。上記以外の課題、構成および効果は、以下の実施の形態の説明により明らかにされる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本開示の単一細胞解析システムを表す模式図である。
【図２】細胞捕捉孔と核酸捕捉ビーズの拡大図およびＤＮＡプローブの拡大図である。
【図３】単一細胞解析システムの全体外略図である。
【図４】分注装置を用いた単一細胞解析システムの操作フローを示すフローチャートである。
【図５−（ａ）】図４のフローチャートと対応する単一細胞解析システムの各状態を表した概略図である。
【図５−（ｂ）】図４のフローチャートと対応する単一細胞解析システムの各状態を表した概略図である。
【図５−（ｃ）】図４のフローチャートと対応する単一細胞解析システムの各状態を表した概略図である。
【図５−（ｄ）】図４のフローチャートと対応する単一細胞解析システムの各状態を表した概略図である。
【図５−（ｅ）】図４のフローチャートと対応する単一細胞解析システムの各状態を表した概略図である。
【図６】解析用チップのＰＣＲ増幅反応を実施する例を示す概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、図面に基づいて、本開示の実施例を説明する。なお、本開示の実施例は、後述する実施例に限定されるものではなく、その技術思想の範囲において、種々の変形が可能である。また、後述する各実施例の説明に使用する各図の対応部分には同一の符号を付して示し、重複する説明を省略する。まず、本明細書において使用されるいくつかの用語について説明し、続いて実施例に係る単一細胞解析システムについて説明する。
【００１３】
本明細書において「細胞解析」とは、細胞の情報を持った生体分子（例えば、核酸や蛋白質など）を解析することを意味する。ここでいう「細胞」とは一般的な真核細胞由来の細胞のみに限らず、原核細胞に含まれるような真菌、細菌およびウイルスなども含まれる。また、ここでいう「解析」とは、生体分子を細胞内から反応用の固相へと抽出し、任意の反応を行い、細胞の情報、例えば種類や機能といったものを得ることを指す。細胞解析の例として、遺伝子発現解析、ゲノム解析および蛋白質解析などが挙げられる。
【００１４】
本明細書において「遺伝子発現解析」とは、細胞における遺伝子、すなわちターゲットになる被検核酸の発現を定量的に分析すること、サンプルにおける遺伝子（被検核酸）の発現分布を分析すること、サンプルにおける特定の細胞と遺伝子（被検核酸）発現量との相関データを得ることを意味する。
【００１５】
サンプルは、遺伝子発現を解析しようとする生体由来サンプルであれば特に限定されるものではなく、細胞サンプル、組織サンプルおよび液体サンプルなどの任意のサンプルを用いることができる。
【００１６】
また、サンプルの由来となる生体も特に限定されるものではなく、脊椎動物（例えば、哺乳類、鳥類、爬虫類、魚類、両生類）、無脊椎動物（例えば、昆虫、線虫、甲殻類）、原生生物、植物、真菌、細菌およびウイルスなどの任意の生体に由来するサンプルを用いることができる。
【００１７】
本明細書においてターゲットとなる被検核酸としてはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、ｍｉｃｒｏＲＮＡおよびＤＮＡならびにそれらの断片を用いることができる。
【００１８】
本明細書において「界面活性剤」とは、以下に示す式１において、γ（解析用チップに導入する液体の表面張力）およびθ（解析用チップに導入された液体と膜フィルタとの接触角）の二つを変更するための化学物質の総称であり、一般的な界面活性剤の総称である、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤など以外にも、水に混合することで上記二つのパラメータを変更することが可能な物質（例えばアルコールおよび有機溶媒）も含む。なお、上記界面活性剤の表面張力は、例えば、純水の表面張力よりも小さい。
【数１】
2020010608.tif 000003
ここで、
Ｐ：送液用ポンプが解析用チップ側の液体と膜フィルタ側の液体との間に生じさせる圧力差
ｋ：膜フィルタの形状に関する固有係数
γ：解析用チップに導入する液体の表面張力
θ：解析用チップに導入する液体と膜フィルタとの接触角
Ｄ：膜フィルタに設けられた孔の孔径
【００１９】
＜実施例１＞
図１は、本開示の単一細胞解析システムを表す模式図である。単一細胞解析システムは、単一細胞解析装置１１、分注装置９および送液用ポンプ１０を備える。
【００２０】
単一細胞解析装置１１は、解析用チップ７と、解析用チップ７と密着して設置する膜フィルタ８と、それら二部品を上下から挟み込んで固定する流路壁６で構成される。解析用チップ７には、細胞１を個別に捕捉するための細胞捕捉孔２が設けられ、細胞捕捉孔２の下部には細胞内の核酸２２を捕捉するための核酸捕捉ビーズ３が充填されている。また、解析用チップ７の上部は、大気圧開放されている。膜フィルタ８は、図２に示されるような円筒上の孔が設けられた多孔質膜を例にとって説明するが、網目状のフィルタを用いてもよい。
【００２１】
分注装置９には、細胞懸濁液５、界面活性剤４入り反応試薬および界面活性剤４が設置されている。送液用ポンプ１０は、単一細胞解析装置１１の流路を通して、解析用チップ７の下部に引圧を印加し、大気圧開放されている上部の溶液を解析用チップ７の下部へと送液する。図１には、細胞１を含む細胞懸濁液５および界面活性剤４が二層をなすように分注された様子が示されている。
【００２２】
図２は、細胞捕捉孔２と核酸捕捉ビーズ３の拡大図およびＤＮＡプローブ２１の拡大図である。核酸捕捉ビーズ３の表面には細胞１から放出された被検核酸２２を捕捉するためのＤＮＡプローブ２１が固定されている。核酸捕捉ビーズ３の表面にＤＮＡプローブ２１を固定させる方法は、例えば、ＤＮＡプローブ２１の５’末端にビオチン修飾を行い、予め核酸捕捉ビーズ３の表面に固定させたストレプトアビジンと結合させることにより行うことができる。
【００２３】
ＤＮＡプローブ２１は、３’末端にポリＴ配列を有し、被検核酸２２（例えば、ｍＲＮＡなど）の３’末端のポリＡ配列とハイブリダイズすることにより被検核酸２２を捕捉する。なお、ｍＲＮＡに代えてｍｉｃｒｏＲＮＡなどを解析したい場合には、ＤＮＡプローブ２１内のポリＴ配列を解析対象とハイブリダイズする既知配列に変更しても良い。
【００２４】
ＤＮＡプローブ２１は、核酸捕捉ビーズ３に固定されている５’末端にＰＣＲ増幅用プライマー配列を有する。ＰＣＲ増幅用プライマー配列は、核酸増幅を行うために適切な長さの既知配列であれば特に限定されるものではなく、当業者であればそのような配列を適宜設計することが可能である。ＰＣＲ増幅用プライマー配列は、例えば、１０〜５０塩基、１５〜４０塩基、１５〜３０塩基または１５〜２０塩基とすることができる。共通のプライマー配列をプローブに含めることによって、後の核酸増幅工程における増幅反応を簡便に実施することが可能になる。
【００２５】
核酸捕捉ビーズ３には、細胞捕捉孔２ごとに異なる細胞認識配列を有するＤＮＡプローブ２１が固定されており、それ故、後に分析した配列がいずれの細胞由来であるかを判別することが可能となる。例えば、細胞認識配列を５塩基のランダム配列にした場合には４の５乗、すなわち１０２４の細胞を識別することが可能となる。したがって細胞認識配列は細胞捕捉孔２の数に応じて任意に設定でき、具体的には５〜３０塩基、５〜２０塩基、５〜１５塩基または５〜１０塩基の範囲とすることができる。
【００２６】
図３は、単一細胞解析システムの全体外略図である。単一細胞解析システムには、図１に示された単一細胞解析装置１１の他に、単一細胞解析装置１１に導入された液体の様子や残量をリアルタイムでモニタリングするカメラ３１および制御用ＰＣ３２が付属している。
【００２７】
解析用チップ７は２．０ミリメートル四方のポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を成型して厚さ１００マイクロメートルで作製した。ただし解析用チップ７の素材はポリプロピレン、ポリスチレンなどの樹脂でもよい。また、解析用チップ７は、シリコンウェハ等の微細加工によって作製することが可能である。
【００２８】
細胞捕捉孔２は、直径３マイクロメートル、１２５マイクロメートル間隔のピッチで、解析用チップ７の上面側に百個設置した。細胞捕捉孔２の下部に存在する空間に核酸捕捉ビーズ３をインクジェットプリンタで分注した。核酸捕捉ビーズ３のサイズは直径１マイクロメートルである。膜フィルタ８は、直径約８００ナノメートルの細孔を有し、親水性処理がなされている。膜フィルタ８に設ける細孔の径は、例えば、０．５〜３．０マイクロメートルとする。膜フィルタ８の素材は、ポリカーボネート、ポリフッ化ビニリデン、ナイロンおよびポリエチレン等が使用可能である。流路壁６はアクリルによって作製し、上下のアクリル製流路壁６によって解析用チップ７と膜フィルタ８とを挟み込んでネジで固定した。流路壁６の素材はアクリルの他にも、ポリプロピレン、ポリスチレンまたはポリテトラフルオロエチレン等でも作製可能である。また、核酸捕捉ビーズ３には予めストレプトアビジンが固定化されており、そこに５’末端がビオチン修飾されたＤＮＡプローブ２１を固定した。ＤＮＡプローブ２１は５’末端から３０塩基のＰＣＲ増幅用共通配列、５塩基の細胞認識配列、７塩基のランダム配列からなる分子認識配列、１８塩基のオリゴ配列および２塩基のＶＮ配列を有するようにした。
【００２９】
図４は、分注装置９を用いた単一細胞解析システムの操作フローを示すフローチャートである。図５は、図４のフローチャートと対応する単一細胞解析システムの各状態を表した概略図である。例えば、図４の操作フローの（ａ）の状態は、図５−（ａ）図と一致している。以下に、図４に示された単一細胞解析システムの操作フローの各ステップについて説明する。
【００３０】
（ａ）細胞懸濁液分注（Ｓ４０１）
被検対象である細胞１を含んだ細胞懸濁液５を分注装置９にセットし、制御用ＰＣ３２によって制御しながら単一細胞解析装置１１の解析用チップ７の上部に分注する。細胞懸濁液５の分注量は５マイクロリットルほどとし、細胞懸濁液５の内部に存在する細胞数は八十個ほどを目安にする。また、解析用チップ７の上部の様子はカメラ３１でモニタリングし、細胞捕捉孔２に細胞が捕捉される様子および解析チップ７の上部の溶液の残量を確認する。必要な量の細胞懸濁液５が分注された後、フロー（ａ）を終了する。
【００３１】
（ｂ）界面活性剤分注（Ｓ４０２）
フロー（ａ）終了後、以下の式２を満たすような界面活性剤４を準備し、分注装置９にセットする。
【数２】
2020010608.tif 000004
ここで、
Ｐ：送液用ポンプ１０が解析用チップ７側の液体と膜フィルタ８側の液体との間に生じさせる圧力差
ｋ：膜フィルタ８の形状に関する固有係数
γ1：界面活性剤４の表面張力
θ：界面活性剤４と膜フィルタ８との接触角
Ｄ：膜フィルタ８に設けられた孔の孔径
【００３２】
続いて、分注装置９にセットした界面活性剤４を、カメラ３１で確認しながら制御用ＰＣ３２によって制御し、解析用チップ７の上部の細胞懸濁液５の液面上に追加分注する。この際、できる限り二液（細胞懸濁液５および界面活性剤４）が混ざらないように静かに分注し、撹拌を行わない。
【００３３】
例えば、細胞懸濁液５からなる第１の液層の上方に界面活性剤４からなる第２の液層が形成されるよう静かに分注を行う。界面活性剤４を分注する際は、細胞懸濁液５に分注ピペットの先端が付着した状態で界面活性剤４を導入すると、細胞懸濁液５中の細胞１に界面活性剤４が触れ、細胞１が破壊されるのを防ぐことができる。界面活性剤４を導入する理由は、表面張力が小さい（例えば、純水よりも小さい）液体を流すことにより解析用チップ７内に気泡による目詰まりが生じるのを防ぐためである。必要量の界面活性剤４が分注されればフロー（ｂ）を終了する。
【００３４】
（ｃ）細胞懸濁液および界面活性剤の送液（Ｓ４０３）
フロー（ｂ）の終了後、送液用ポンプ１０を起動する。送液用ポンプ１０によって解析用チップ７の上方に存在する細胞懸濁液５は解析用チップ７の下部の流路を介して排出され始め、それに伴い細胞懸濁液５中の細胞１は細胞捕捉孔２に捕捉される。細胞懸濁液５の送液完了後、細胞懸濁液５の上方に存在していた界面活性剤４が解析用チップ７の上方に存在しなくなるまで完全に送液される。解析チップ７の上方の溶液の残量はカメラ３１で確認することが可能で、界面活性剤４が完全に送液されたことを確認されれば、送液用ポンプ１０を停止してフロー（ｃ）を終了する。
【００３５】
上述のとおり、細胞懸濁液５と界面活性剤４とはできるだけ混合しないように分注されているため、細胞１に界面活性剤４が接触するのは送液ポンプ１０によって細胞懸濁液５の大部分が送液し終わった後である。そして、短い時間で界面活性剤４を送液するため細胞１に界面活性剤４が接触する時間が短い。それ故、細胞１の細胞膜を破壊することなく界面活性剤４を流路に流すことができ、解析用チップ７内に気泡による目詰まりが生じるのを防ぐことができる。また、仮に細胞１の細胞膜が破壊されて中の分子が出てしまったとしても、細胞懸濁液５の送液により個々の細胞１が細胞捕捉孔２に既に捕捉されているため、核酸捕捉ビーズ３に細胞１内の分子を捕捉させることができる。
【００３６】
（ｄ）反応試薬分注（Ｓ４０４）
フロー（ｃ）の終了後、解析用チップ７上には細胞捕捉孔２に捕捉された被検細胞１が残っている状態となる。フロー（ｄ）では遺伝子発現解析を行うための試薬を分注し、解析用チップ中で反応を行う。実施例１では細胞膜を破壊するＬｙｓｉｓバッファを第１試薬として分注した。試薬の種類はこれに限ったものではなくユーザの任意で選択して構わない。単一細胞解析装置１１に導入する全ての反応試薬には、以下の式３を満たすような界面活性剤４を混合し、予め分注装置９にセットしておく。
【数３】
2020010608.tif 000005
ここで、
Ｐ：送液用ポンプ１０が解析用チップ７側の液体と膜フィルタ８側の液体との間に生じさせる圧力差
ｋ：膜フィルタ８の形状に関する固有係数
γ2：界面活性剤４と反応試薬との混合液体の表面張力
θ：混合液体と膜フィルタ８との接触角
Ｄ：膜フィルタ８に設けられた孔の孔径
【００３７】
反応試薬に表面張力が小さい界面活性剤４を混合しておくことにより、送液完了時に解析用チップ７内に気泡による目詰まりが生じることを防ぐことができる。カメラ３１でフロー（ｃ）の終了を確認後、制御用ＰＣ３２を通して、分注装置９からＬｙｓｉｓバッファ（界面活性剤４を含む）を解析用チップ７上に分注する。必要量のＬｙｓｉｓバッファが分注されればフロー（ｄ）を終了する。なお、反応試薬に混合させる界面活性剤４は、フロー（ｂ）において分注した界面活性剤４と同一種類の界面活性剤であってもよく、異なる種類の界面活性剤であってもよい。
【００３８】
（ｅ）反応試薬の送液（Ｓ４０５）
フロー（ｄ）の終了後、送液用ポンプ１０を起動する。フロー（ｄ）で分注したＬｙｓｉｓバッファによって細胞捕捉孔２に捕捉した細胞１の細胞膜を破壊し、細胞１内の被検核酸２２を細胞捕捉孔２の下部へ吸引する。被検核酸２２は、核酸捕捉ビーズ３の表面に固定されているＤＮＡプライマー２１に捕捉される。細胞１の細胞膜が破壊されたかどうかをカメラ３１でモニタリングし、細胞膜の破壊が不十分な場合は、制御用ＰＣ３２が分注装置９を制御してＬｙｓｉｓバッファの追加分注を行う。捕捉された全ての細胞１が破壊されたのを確認し、全てのＬｙｓｉｓバッファの送液が完了したら、送液用ポンプ１０を停止し、フロー（ｅ）を終了する。フロー（ｅ）を終了した後、解析用チップ７の上方には何もない状態となる。
【００３９】
（ｄ’）反応試薬分注（２工程目）
実施例１では、反応手順が全２工程存在する例を説明するため、操作フローにしたがってもう一度、フロー（ｄ）を行う。実施例１では第２試薬として逆転写反応を行うためのＲＴ試薬を分注する。以下に示す式４の条件を満たすように界面活性剤４を混合したＲＴ試薬を分注装置９によって分注する。
【数４】
2020010608.tif 000006
ここで、
Ｐ：送液用ポンプ１０が解析用チップ７側の液体と膜フィルタ８側の液体との間に生じさせる圧力差
ｋ：膜フィルタ８の形状に関する固有係数
γ22：界面活性剤４と第２試薬との混合液体の表面張力
θ：混合液体と膜フィルタ８との接触角
Ｄ：膜フィルタ８に設けられた孔の孔径
【００４０】
任意の分量（例えば、数マイクロリットル）を分注後、フロー（ｄ’）を終了する。なお、第２試薬に混合させる界面活性剤４は、フロー（ｂ）および１回目のフロー（ｄ）において分注した界面活性剤４と同一種類の界面活性剤であってもよく、異なる種類の界面活性剤であってもよい。
【００４１】
（ｅ’）反応試薬の送液（２工程目）
フロー（ｄ’）の終了後、送液用ポンプ１０を起動し、界面活性剤４入りのＲＴ試薬を送液する。解析チップ７の上方のＲＴ試薬の残量をカメラ３１で確認しながら送液を行い、全ての溶液を送液するまでに、一度、送液用ポンプ１０を停止し、逆転写反応が十分行われる時間（例えば５０分）静置する。逆転写反応の終了後、再度、送液用ポンプ１０を起動し、残りのＲＴ試薬を全て送液する。全ての溶液の送液が完了した後、送液用ポンプ１０を停止し、フロー（ｅ’）を終了する。
【００４２】
以上で分注装置９を備える単一細胞解析システムを用いての操作は全て終了する。続いて、単一細胞解析装置１１から解析用チップ７を取り出し、ＰＣＲ増幅に必要な反応をチューブ４１中で行う。
【００４３】
図６は、解析用チップ７のＰＣＲ増幅反応を実施する例を示す概略図である。チューブ４１中にはＰＣＲ反応に必要なＰＣＲ用試薬４２が入っている。ＰＣＲ増幅反応終了後、ＤＮＡ配列シーケンシングを行い、細胞捕捉孔２で捕捉した一細胞ごとの遺伝子発現量を解析することが可能になる。
【００４４】
上記のとおり、本開示の単一細胞解析システムは、表面張力が小さい界面活性剤４を単一細胞解析装置１１に導入することにより、送液用ポンプ１０で解析用チップ７の上方に存在する液体を送液し終えた際に、解析用チップ７内に気泡の目詰まりが生じることを防ぐことができる。
【００４５】
なお、上記の説明では、反応工程が二回必要な例を説明したが、反応工程は一回でもそれ以上でもよい。本開示は、解析用チップ７内に気泡の目詰まりを防ぐ方法として反応試薬に界面活性剤４を導入する方法を説明したが、次の送液を控えてない最後の反応試薬に対しては、必ずしも界面活性剤４を混入する必要はない。例えば、反応工程が一回しかない操作フローの場合は、反応試薬に界面活性剤４を混入しなくともよい。また、反応工程が三回存在する操作フローの場合は、三回目の反応試薬に対して界面活性剤４を混入しなくともよい。
【００４６】
＜実施例２＞
実施例２では、実施例１に示した方法よりも細胞１が界面活性剤４から受けるダメージをさらに減少させることができる方法を説明する。実施例２の細胞解析方法は、上で説明した操作フローのうち、フロー（ｂ）（Ｓ４０２）が実施例１とは異なる。以下に、実施例２のフロー（ｂ）について説明する。
【００４７】
（ｂ）界面活性剤分注（Ｓ４０２）
フロー（ａ）の終了後、上記式２を満たすような界面活性剤４を準備し、分注装置９にセットする。フロー（ａ）の終了後、解析チップ７の上方には細胞懸濁液５のみが分注されている状態である。続いて、界面活性剤４を分注する前に送液用ポンプ１０を起動し、送液を開始する。分注装置９は、細胞懸濁液５の液面のレベルが解析用チップ７の上方にあるうちに、界面活性剤４の分注を開始する。界面活性剤４を分注し終え、且つ分注した界面活性剤４の送液を終えた後、送液用ポンプ１０を停止する。この際、制御用ＰＣ３２には、細胞懸濁液５が送液し終わる前のタイミングで準備した界面活性剤４の分注を開始するようにプログラムが記録されるか、または、ユーザによって設定される。または、カメラ３１によって細胞懸濁液５の残量を観察しながら制御用ＰＣ３２を操作し、界面活性剤４を分注してもよい。界面活性剤４の送液が完了後、実施例１と同様にフロー（ｄ）以降を行う。
【００４８】
上記のように細胞懸濁液５の送液を界面活性剤４の追加分注よりも先に開始し、細胞懸濁液５の送液が完了する直前に界面活性剤４を追加分注することで、細胞１が界面活性剤４と接触する時間をできる限り短くすることが可能である。
【００４９】
＜実施例３＞
実施例１および２では、細胞懸濁液５を分注し終えてから界面活性剤４を分注した。実施例３では、細胞懸濁液５に界面活性剤４を混合した混合液体を分注することによって、実施例１において説明したフロー（ａ）および（ｂ）を代替する。この際、界面活性剤４は、以下の式５の条件式を満たすように選ばれる。
【数５】
2020010608.tif 000007
ここで、
Ｐ：送液用ポンプ１０が解析用チップ７側の液体と膜フィルタ８側の液体との間に生じさせる圧力差
ｋ：膜フィルタ８の形状に関する固有係数
γ3：界面活性剤４と細胞懸濁液５との混合液体の表面張力
θ：混合液体と膜フィルタ８との接触角
Ｄ：膜フィルタ８に設けられた孔の孔径
【００５０】
実施例３では、界面活性剤４の表面張力は、上記フローにおいて細胞１を壊さない程度の所定の値よりも大きい表面張力であることが要求される。このγ3は、例えば、実験によって決定される。また、界面活性剤４と細胞懸濁液５との混合液体は、分注してからなるべく早急に送液すると細胞１へのダメージを軽減することができる。
【００５１】
上で説明した実施例１〜３では、界面活性剤４を追加分注または細胞懸濁液５もしくは反応試薬に予め混合することによって、単一細胞解析装置１１に導入する溶液の表面張力を小さくすることができた。これにより、解析用チップ７内に気体の目詰まりが生じることを防ぐことができ、高い能力の送液用ポンプ１０を必要とせずに済む。また、膜フィルタ８に設ける孔および細胞捕捉孔２の孔径を小さくすることができるため、小さい核酸捕捉用ビーズ３を使用することができ、高効率な反応が実施できる。また、上述の操作フローを実行することにより、溶液の表面張力を小さくした場合であっても、細胞膜が破壊されることを防ぐことができる。
【００５２】
なお、本開示は上記した実施例に限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。例えば、上記した実施例は本開示を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも説明した全ての構成を備えるものに限定されるものではない。また、ある実施例の構成の一部を他の実施例の構成に置き換えることが可能であり、また、ある実施例の構成に他の実施例の構成を加えることも可能である。また、各実施例の構成の一部について、他の構成の追加・削除・置換をすることが可能である。
【００５３】
例えば、上記の実施例１および２では、分注装置９を使用して細胞懸濁液５、界面活性剤４および反応試薬等の各種液体を単一細胞解析デバイス１１に分注する例を説明したが、液体の分注はピペット等を使用して手技によって実行されてもよい。その場合、実施例２では、例えば、カメラ３１で解析用チップ７上の細胞懸濁液５の残量を確認しながら、送液用ポンプ１０を稼働させ、細胞懸濁液５の残量が少なくなった時点で、界面活性剤４を細胞懸濁液５の液面上に追加分注してもよい。
【符号の説明】
【００５４】
１…細胞、２…細胞捕捉用孔、３…核酸捕捉用ビーズ、４…界面活性剤、５…細胞懸濁液、６…流路壁、７…解析用チップ、８…多孔質膜、９…分注装置、１０…送液用ポンプ、２１…ＤＮＡプローブ、２２…被検核酸、３１…カメラ、３２…制御用ＰＣ、４１…チューブ、４２…ＰＣＲ用試薬
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−（ａ）】
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【図５−（ｂ）】
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【図５−（ｃ）】
2020010608.tif 000017
【図５−（ｄ）】
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【図５−（ｅ）】
2020010608.tif 000019
【図６】
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