(57)【要約】【課題】抗原結合性ペプチドの抗原との反応性を向上させる技術を提供する。【解決手段】Ｎ末端及びＣ末端に架橋基を有する抗原結合性ペプチド。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ末端及びＣ末端に架橋基を有する抗原結合性ペプチド。
【請求項２】
前記架橋基がチオール基である、請求項１に記載の抗原結合性ペプチド。
【請求項３】
前記抗原の分子量が１００〜１０００である、請求項１又は２に記載の抗原結合性ペプチド。
【請求項４】
前記抗原がトリニトロトルエン（ＴＮＴ）である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗原結合性ペプチド。
【請求項５】
配列番号７若しくは８のアミノ酸配列、又は配列番号７若しくは８のアミノ酸配列のＮ末端又はＣ末端を除く位置において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる、請求項４に記載の抗原結合性ペプチド。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗原結合性ペプチドの架橋物。
【請求項７】
基板と、前記基板上に配置された請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗原結合性ペプチドと、を備える、抗原検出用センサー。
【請求項８】
解離定数（Ｋｄ）が低下した抗原結合性ペプチドの製造方法であって、
Ｎ末端又はＣ末端に架橋基を有しない抗原結合性ペプチドのＮ末端及びＣ末端に架橋基を付加させて、Ｎ末端及びＣ末端に架橋基を有する抗原結合性ペプチドを得る工程を有し、
前記Ｎ末端及びＣ末端に架橋基を有する抗原結合性ペプチドが、Ｋｄが低下した抗原結合性ペプチドである、製造方法。
【請求項９】
前記架橋基がチオール基である、請求項８に記載の製造方法。
【請求項１０】
前記抗原の分子量が１００〜１０００である、請求項８又は９に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗原結合性ペプチド及びその使用に関する。より具体的には、本発明は、抗原結合性ペプチド、抗原検出用センサー及び抗原結合性ペプチドの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
無差別的に人を殺傷する地雷や爆弾テロは、国際社会の保安上大きな問題となっている。爆発物による被害を未然に防止するために、迅速かつ正確な爆発物の探知技術が求められている。現在使用されている主な爆発物探知法としては、爆発物探知犬に爆薬のにおいを探知させる方法、イオン移動度分光分析器を用いる方法等がある。しかしながら、より簡便で高感度に爆発物を検出する技術が求められている。
【０００３】
これまでに発明者らは、簡便で信頼性の高い爆発物探知技術として、トリニトロトルエン（ＴＮＴ）、シクロトリメチレントリニトラミン（ＲＤＸ）、ジニトロトルエン（ＤＮＴ）等の爆発物に結合性を有するペプチドを基板上に配置した爆発物検出用センサーを開発してきた（例えば、特許文献１を参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１７−５２７１５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、上述のペプチドと爆発物との解離定数（Ｋｄ）は数μＭ程度であり、検出感度の更なる向上が求められている。そこで、本発明は、抗原結合性ペプチドの抗原との反応性を向上させる技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、以下の態様を含む。
［１］Ｎ末端及びＣ末端に架橋基を有する抗原結合性ペプチド。
［２］前記架橋基がチオール基である、［１］に記載の抗原結合性ペプチド。
［３］前記抗原の分子量が１００〜１０００である、［１］又は［２］に記載の抗原結合性ペプチド。
［４］前記抗原がトリニトロトルエン（ＴＮＴ）である、［１］〜［３］のいずれか一項に記載の抗原結合性ペプチド。
［５］配列番号７若しくは８のアミノ酸配列、又は配列番号７若しくは８のアミノ酸配列のＮ末端又はＣ末端を除く位置において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる、［４］に記載の抗原結合性ペプチド。
［６］［１］〜［５］のいずれか一項に記載の抗原結合性ペプチドの架橋物。
［７］基板と、前記基板上に配置された［１］〜［５］のいずれか一項に記載の抗原結合性ペプチドと、を備える、抗原検出用センサー。
［８］解離定数（Ｋｄ）が低下した抗原結合性ペプチドの製造方法であって、Ｎ末端又はＣ末端に架橋基を有しない抗原結合性ペプチドのＮ末端及びＣ末端に架橋基を付加させて、Ｎ末端及びＣ末端に架橋基を有する抗原結合性ペプチドを得る工程を有し、前記Ｎ末端及びＣ末端に架橋基を有する抗原結合性ペプチドが、Ｋｄが低下した抗原結合性ペプチドである、製造方法。
［９］前記架橋基がチオール基である、［８］に記載の製造方法。
［１０］前記抗原の分子量が１００〜１０００である、［８］又は［９］に記載の製造方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、抗原結合性ペプチドの抗原との反応性を向上させる技術を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】（ａ）は、配列番号５のペプチドとＴＮＴとの結合力を解析した結果を示すグラフである。（ｂ）は、配列番号６のペプチドとＴＮＴとの結合力を解析した結果を示すグラフである。
【図２】、架橋剤である、ＮＨＳ、ＥＤＣ、ＰＤＥＡを基板上に流し、抗原結合性ペプチドを固定して、ペプチドマトリックスを作製した過程を示す図である。
【図３】カルボキシメチルデキストランと抗原結合性ペプチドが架橋されたペプチドマトリックスを模式的に示す図である。
【図４】（ａ）は、配列番号７のペプチドのマトリックスとＴＮＴとの結合力を解析した結果を示す図である。（ｂ）は、配列番号８のペプチドのマトリックスとＴＮＴとの結合力を解析した結果を示す図である。
【図５】（ａ）は、配列番号７のペプチドとＴＮＰ−ＫＬＨとの結合力を解析した結果を示す図である。（ｂ）は、配列番号８のペプチドとＴＮＰ−ＫＬＨとの結合力を解析した結果を示す図である。
【図６】ＴＮＴ検出用センサーと、ＴＮＴ、ＲＤＸ、トルエン、亜硝酸アミルとの結合性を解析した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
［抗原結合性ペプチド］
１実施形態において、本発明は、Ｎ末端及びＣ末端に架橋基を有する抗原結合性ペプチドを提供する。
【００１０】
実施例において後述するように、発明者らは、Ｎ末端及びＣ末端に架橋基を有する抗原結合性ペプチドは、Ｎ末端又はＣ末端に架橋基を有しない点以外はアミノ酸配列が同一である抗原結合性ペプチドと比較して、抗原との反応性が飛躍的に向上することを明らかにした。
【００１１】
［架橋基］
本実施形態の抗原結合性ペプチドは、Ｎ末端及びＣ末端に架橋基を有する。架橋基としては、抗原結合性ペプチドのＮ末端及びＣ末端の間、抗原結合性ペプチドのＮ末端同士、及び、抗原結合性ペプチドのＣ末端同士のいずれかを架橋することができる基の組み合わせであれば特に限定されない。このような組み合わせとしては、例えば、チオール基とチオール基との組み合わせ；チオール基とマレイミド基との組み合わせ；アミノ基と、イソチオシアネート基、イソシアネート基、アシルアジド基、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル基、スルホニルクロリド基、アルデヒド基、グリオキサール基、エポキシド基、オキシラン基、カーボネート基、ハロゲン化アリール基、イミドエステル基、カルボジイミド基及びフルオロエステル基からなる群より選択されるいずれかの基との組み合わせ；アジド基とアルキン基との組み合わせ等が挙げられるがこれらに限定されない。これらの組み合わせは、いずれが抗原結合性ペプチドのＮ末端に存在していてもよく、いずれが抗原結合性ペプチドのＣ末端に存在していてもよい。
【００１２】
本明細書において、抗原結合性ペプチドのＮ末端に架橋基を有するとは、抗原結合性ペプチドのＮ末端側から１〜３番目のいずれかのアミノ酸残基に架橋基が存在することを意味し、抗原結合性ペプチドのＮ末端側から１又は２番目のアミノ酸残基に架橋基が存在することが好ましく、抗原結合性ペプチドのＮ末端のアミノ酸残基に架橋基が存在することが更に好ましい。
【００１３】
同様に、本明細書において、抗原結合性ペプチドのＣ末端に架橋基を有するとは、抗原結合性ペプチドのＣ末端側から１〜３番目のいずれかのアミノ酸残基に架橋基が存在することを意味し、抗原結合性ペプチドのＣ末端側から１又は２番目のアミノ酸残基に架橋基が存在することが好ましく、抗原結合性ペプチドのＣ末端のアミノ酸残基に架橋基が存在することが更に好ましい。
【００１４】
抗原結合性ペプチドのＮ末端又はＣ末端に上述の架橋基を付加させるために、架橋試薬を用いてもよい。カルボキシル基とアミノ基の架橋には、例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（１−ｅｔｈｙｌ−３−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）  ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、ＥＤＣ−ＨＣｌ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（Ｎ，Ｎ’−Ｄｉｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ、ＤＣＣ）等のカルボジイミド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｎ−Ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ、ＮＨＳ）等を用いることができるが、これに限定されない。
【００１５】
アミノ基同士の架橋には、例えば、スベリン酸Ｎ，Ｎ’−スクシンイミジル（ｄｉｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｓｕｂｅｒａｔｅ、ＤＳＳ）、グルタル酸Ｎ，Ｎ’−スクシンイミジル（ｄｉｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｇｌｕｔａｒａｔｅ、ＤＳＧ）、スベリン酸ビス（３‐スルホスクシンイミジル）（ｂｉｓ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ）ｓｕｂｅｒａｔｅ、ＢＳ３）等のＮＨＳを用いることができるが、これに限定されない。
【００１６】
アミノ基とチオール基の間の架橋には、例えば、ＮＨＳエステルとマレイミドの構造を有するヘテロ二機能性架橋剤を用いることができる。チオール基同士の間の架橋には、例えば、マレイミドの構造を有する架橋剤を用いることができる。
【００１７】
抗原結合性ペプチドは、Ｎ末端及びＣ末端の双方にチオール基を有していてもよい。チオール基は、例えばシステイン残基の側鎖に存在するチオール基であってもよいし、架橋試薬により導入したチオール基であってもよい。実施例において後述するように、ペプチドのＮ末端のアミノ酸残基とＣ末端のアミノ酸残基が共にシステインである場合、ペプチド同士はジスルフィド結合により架橋することができる。
【００１８】
本実施形態の抗原結合性ペプチドは、Ｎ末端及びＣ末端に存在する架橋基で架橋した架橋物の形態であることが好ましい。実施例において後述するように、本実施形態の抗原結合性ペプチドの架橋物は、抗原に対する反応性が向上している。
【００１９】
本実施形態の抗原結合性ペプチドが認識する抗原は、爆発物に限られず、あらゆる物質であり得る。抗原の分子量は、例えば１００〜１０００であってもよく、１００〜８００であってもよく、１００〜６００であってもよく、１００〜４００であってもよい。抗原の分子量が上記の範囲であると、本実施形態の抗原結合性ペプチドと抗原との反応性の向上効果が顕著に表れ、Ｋｄが低下する傾向にある。
【００２０】
ここで、Ｎ末端又はＣ末端に架橋基を有しない点以外は本実施形態の抗原結合性ペプチドとアミノ酸配列が同一である抗原結合性ペプチドのＫｄは、例えば１〜１０μＭであってもよい。つまり、本実施形態の抗原結合性ペプチドは、Ｎ末端及びＣ末端に架橋基を有することにより、飛躍的に反応性が向上し、Ｋｄが低下する。
【００２１】
本実施形態の抗原結合性ペプチドの抗原は、特に限定されないが、例えば、トリニトロトルエン（ＴＮＴ）、シクロトリメチレントリニトラミン（ＲＤＸ）、ジニトロトルエン（ＤＮＴ）等の爆発物であってもよい。ＴＮＴの分子量は２２７．１であり、ＲＤＸの分子量は２２２．１２であり、ＤＮＴの分子量は１８２．１４である。
【００２２】
例えば抗原がＴＮＴである場合、本実施形態の抗原結合性ペプチドとしては、配列番号７若しくは８のアミノ酸配列からなるペプチドが挙げられる。また、抗原結合性ペプチドは、ＴＮＴに対する結合性を有している限り、配列番号７若しくは８のアミノ酸配列に対して変異を有していてもよい。より具体的には、配列番号７若しくは８のアミノ酸配列のＮ末端又はＣ末端を除く位置において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、且つＴＮＴに対する結合性を有するペプチドが挙げられる。
【００２３】
［抗原検出用センサー］
１実施形態において、本発明は、基板と、基板上に配置された上述の抗原結合性ペプチドと、を備える、抗原検出用センサーを提供する。
【００２４】
本実施形態の抗原検出用センサーに配置する抗原結合性ペプチドは、１種類であってもよいし、２種類以上の混合物であってもよい。本実施形態の抗原検出用センサーにおいて、抗原結合性ペプチドは、Ｎ末端及びＣ末端に存在する架橋基で架橋した架橋物の形態であることが好ましい。
【００２５】
本実施形態の抗原検出用センサーにおいて、基板の材質は特に限定されず、例えば、ガラス基板、樹脂基板、金属基板、ガラス又は樹脂の基板上に金属層が積層された基板等が挙げられる。金属基板としては、アルミ、ステンレス、金、シリコンウエハー等が挙げられる。また金属層としては、金、ニッケル、クロム、アルミ等が挙げられる。
【００２６】
基板の表面は、親水性高分子で修飾されていてもよい。親水性高分子としては、例えば、アガロース、デキストラン、キチン等の多糖類、カルボキシルメチルセルロース等のセルロース化合物、ポリメタクリル酸等の合成高分子等が挙げられる。
【００２７】
実施例において後述するように、カルボキシメチルデキストランで修飾された基板を用いて、架橋剤を添加し、カルボキシメチルデキストランと、Ｎ末端とＣ末端にシステインを有する抗原結合性ペプチドを架橋させて、抗原と強く結合するペプチドマトリックスを作製することができる。
【００２８】
本実施形態の抗原検出用センサーは、例えば、表面プラズモン共鳴（Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ、ＳＰＲ）センサー、水晶振動子マイクロバランス（ｑｕａｒｔｚ  ｃｒｙｓｔａｌ  ｍｉｃｒｏｂａｌａｎｃｅ、ＱＣＭ）センサー、電界効果型トランジスタ、電気化学計測（インピーダンス、電位計測等）や分光電気化学計測を原理とするセンサー等であってもよい。本実施形態の抗原検出用センサーにより、被検試料中の抗原の存在を高感度に検出することができる。
【００２９】
ＳＰＲセンサーとは、金属薄膜上の質量変化を高感度に検出するセンサーである。まず、ＳＰＲ現象について説明する。ガラス板上に蒸着された金属薄膜の裏面等に対して光源からレーザー等で光を照射すると、金属薄膜裏面で光が全反射すると同時に金属薄膜でエバネッセント波が発生する。このとき、金属薄膜表面側では表面プラズモンが発生する。このエバネッセント波と表面プラズモンのそれぞれの波数・周波数が一致した際、共鳴により光子エネルギーが表面プラズモンの電子を励起するために消費される。そのため、ある入射角で光を入射すると反射光が減衰する現象が生じる。これがＳＰＲ現象であり、このときの入射角を共鳴角と呼ぶ。
【００３０】
ＱＣＭセンサーとは、水晶振動子に取り付けた電極表面に物質が吸着するとその質量に応じて水晶振動子の共振周波数が減少する現象を利用して、共振周波数の変化量によって極微量な吸着物を定量的に検出するものである。
【００３１】
基板の材質は、センサーの原理等に応じて適宜選択すればよい。例えば、ＳＰＲセンサーやＱＣＭセンサーの場合、基板は金属薄膜で構成される。金属種は特に限定されないが、化学的に不活性であり、信号の発生効率がよい等の理由から金（Ａｕ）が好ましい。
【００３２】
例えば、抗原検出用センサーがＳＰＲセンサー又はＱＣＭセンサーである場合、被検試料を緩衝液中に溶解させてセンサー部に導入するとよい。ここで、ＳＰＲセンサー又はＱＣＭセンサーが、フローシステムを採用したものであると簡便である。ここで、フローシステムとは、固定化した固相の分子に液相の分子を一定の条件（濃度、速度、供給量）で供給し続けるシステムをいう。
【００３３】
これにより、抗原検出用センサーにおける、抗原結合性ペプチドが配置された基板と、被検試料とを接触させることができる。
【００３４】
上述の抗原結合性ペプチドに抗原が結合したか否かを検出する工程は、センサーの原理等に応じて適宜行えばよい。例えば、ＳＰＲセンサーの場合には、共鳴角の質量変化による変化を測定することにより、基板上に配置した抗原結合性ペプチドに、抗原が結合したか否かを検出するとよい。また、ＱＣＭセンサーの場合には、水晶振動子に取り付けた電極表面上に配置した抗原結合性ペプチドに、抗原が結合すると、その質量に応じて水晶振動子の共振周波数が減少する現象を利用して、爆発性化合物が結合したか否かを検出するとよい。
【００３５】
１実施形態において、本発明は、Ｋｄが低下した抗原結合性ペプチドの製造方法であって、Ｎ末端又はＣ末端に架橋基を有しない抗原結合性ペプチドのＮ末端及びＣ末端に架橋基を付加させて、Ｎ末端及びＣ末端に架橋基を有する抗原結合性ペプチドを得ることを有し、前記Ｎ末端及びＣ末端に架橋基を有する抗原結合性ペプチドが、Ｋｄが低下した抗原結合性ペプチドである、製造方法を提供する。
【００３６】
本実施形態の製造方法は、抗原結合性ペプチドの抗原に対するＫｄを低下させる方法であるということもできる。すなわち、Ｎ末端又はＣ末端に架橋基を有しない抗原結合性ペプチドのＮ末端及びＣ末端に架橋基を付加させることにより得られた、Ｎ末端及びＣ末端に架橋基を有する抗原結合性ペプチドは、架橋基を付加する前の抗原結合性ペプチドと比較して、抗原に対するＫｄが低下しており、抗原に対する反応性が向上している。本実施形態の製造方法は、Ｎ末端及びＣ末端に架橋基を有する抗原結合性ペプチドを架橋することを更に含んでいてもよい。
【００３７】
実施例において後述するように、Ｎ末端及びＣ末端に架橋基を有する抗原結合性ペプチドは、抗原との結合力が飛躍的に上昇し、Ｋｄが低下する。
【００３８】
抗原結合性ペプチドが有する架橋基としては、［架橋基］で述べたような架橋構造を形成する架橋基が好ましい。実施例において後述するように、架橋基はチオール基であってもよい。
【００３９】
また、実施例において後述するように、互いに架橋された抗原結合性ペプチドは、低分子量物質である抗原には高い反応性（低いＫｄ）を示すが、高分子量物質である抗原には低い反応性（高いＫｄ）を示す。ここで、低分子量物質である抗原の分子量としては、例えば１００〜１０００であってもよく、１００〜８００であってもよく、１００〜６００であってもよく、１００〜４００であってもよい。
【実施例】
【００４０】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００４１】
［実験例１］
（ＴＮＴ結合性ペプチドの作製）
まず、ペプチドアレイを用いて、ＴＮＴ結合性ペプチドをスクリーニングした。
【００４２】
《ペプチドアレイの作製》
ＴＮＴ結合性ペプチドの候補となる多数のペプチドからなるペプチドアレイを作製した。まず、活性化メンブレンを作製した。３７℃で１日乾燥させたセルロースメンブレン（フィルターペーパー５４２、ＧＥヘルスケア社）を、ジメチルホルムアミド（以下、「ＤＭＦ」という。）に１日浸漬した。続いて、メンブレンをエタノールで２回洗浄した後乾燥させた。続いて、ＤＭＦ  ３００ｍＬ、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（以下、「Ｆｍｏｃ」という。）−β−アラニン２４ｍＬ（１．０Ｍ）、ジイソプロピルカルボジイミド（以下、「ＤＩＰＣＩ」という。）５００μＬ、１−メチルイミダゾール（以下、「ＮＭＩ」という。）４００μＬを混合して調製した活性化試薬に、上記のメンブレンを２日間浸漬した。最後に、メンブレンを、ＤＭＦ及びエタノールでそれぞれ３回ずつ洗浄し、冷風をあてて乾燥させた。完成した活性化メンブレンは−２０℃の冷凍庫中に保存した。
【００４３】
続いて、ペプチドアレイを作製した。ペプチド合成機（型式「ＲｅｓＰｅｐ  ＳＬ、ＫＩＦＵ２０１４００４７−００００」、Ｉｎｔａｖｉｓ社）を用いて、上述した活性化メンブレン上の決められた位置にアミノ酸のスポッティングを繰り返すことにより、Ｆｍｏｃ固相合成反応によるペプチドの伸長反応を行った。スポットするアミノ酸溶液としては、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（以下、「ＮＭＰ」という。）に溶解した０．５Ｍ  Ｆｍｏｃアミノ酸溶液、及び、ＤＩＰＣＩとヒドロキシベンゾトリアゾール（以下、「ＨｏＢｔ」という。）をモル比で１：４に混合して調製した活性化剤を、１７：１００の容量比で混合させたものを使用した。Ｆｍｏｃ基の脱保護には、２０％ピペリジン（渡辺化学社）を用いた。キャッピングには、無水酢酸とＤＭＦとを容量比で２：１００に混合した溶液を使用した。また、メンブレンの洗浄には、ＤＭＦ及びエタノールを使用した。
【００４４】
脱保護、洗浄したペプチドアレイを１％のＢｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ、和光純薬工業)を含む５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ（ブロッキング溶液）に一晩浸漬させ、メンブレンの非特異吸着を防ぐためのブロッキングを行った。その後、ブロッキング溶液で希釈した１００  ｎＭ  ＴＮＰ−ＫＬＨ溶液に３７℃で１時間浸漬させた。ペプチドアレイをＴＢＳ−Ｔにて３回洗浄後、ブロッキング溶液にて１／１０００に希釈したＲａｂｂｉｔ  Ａｎｔｉ−ＫＬＨ 抗体（コスモ・バイオ）溶液に３７℃で１時間浸漬させた。さらに、ＴＢＳ−Ｔにて３回洗浄後、ブロッキング溶液にて１／５０００に希釈したＡｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ−ＦＩＴＣ  （Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）溶液に３７℃で１時間浸漬させた。これによりメンブレン上へのＴＮＰ−ＫＬＨの結合量をＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ（ＦＩＴＣ）の蛍光強度により評価する。最終的にメンブレンをＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、スキャナタイプ画像解析装置Ｔｙｐｈｏｏｎ  ＦＬＡ  ９５００  （ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にてペプチドアレイの蛍光画像を取得し、蛍光画像からの画像解析ソフトＩｍａｇｅ  Ｑｕａｎｔを使用して各ペプチドスポットの蛍光強度を取得した。
【００４５】
スクリーニングにより得られたＴＮＴ結合性ペプチドのアミノ酸配列を配列番号１、２に示す。蛍光強度を解析した結果、配列番号２に示すペプチドが、配列番号１よりもＴＮＴと強く結合することが明らかになった。
【００４６】
《無作為ペプチド配列》
続いて、配列番号２を構成するアミノ酸を無作為に並べた７９２種のペプチドを、上述のようにスポットしてペプチドアレイを作製し、ＴＮＴ結合性ペプチドをスクリーニングした。蛍光強度を解析した結果、配列番号３に示すペプチドが、配列番号２よりもＴＮＴと強く結合することが明らかになった。
【００４７】
《置換ペプチド配列》
続いて、配列番号２に示すペプチドのＮ末端から７残基を置換した１２９６種の配列を、上述のようにスポットしてペプチドアレイを作製し、ＴＮＴ結合性ペプチドをスクリーニングした。蛍光強度を解析した結果、配列番号４に示すペプチドが、配列番号３に示すペプチドよりもＴＮＴと強く結合することが明らかになった。
【００４８】
《架橋基を有するＴＮＴ結合性ペプチド》
続いて、架橋基を有するＴＮＴ結合性ペプチドを合成した。架橋基としてはチオール基を用いた。チオール基は、ペプチドのＮ末端又はＣ末端にシステイン残基を付加することにより付加した。
【００４９】
より具体的には、配列番号１のペプチドのＣ末端にシステイン残基を付加したペプチド（配列番号５）、配列番号４のペプチドのＣ末端にシステイン残基を付加したペプチド（配列番号６）、配列番号２のペプチドのＮ末端及びＣ末端にシステイン残基を付加したペプチド（配列番号７）、配列番号４のペプチドのＮ末端及びＣ末端にシステイン残基を付加したペプチド（配列番号８）を合成した。
【００５０】
配列番号とアミノ酸配列との対応を表１に示す。
【表１】
2020040891.tif 000002
【００５１】
［実験例２］
（ＴＮＴ結合性ペプチドの反応性の検討１）
Ｎ末端のみに架橋基を有するペプチドとＴＮＴとの結合力を解析した。
【００５２】
結合力の解析には、表面プラズモン共鳴（Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ、ＳＰＲ）センサーを用いた。ＳＰＲ装置としては、ビアコア（ＧＥヘルスケア社）を使用した。
【００５３】
《ＴＮＴ検出用センサーの作製》
次に示すような手順により、ＴＮＴ検出用センサーを作製した。まず、カルボキシル基が導入された金基板に、ＥＤＣ／ＮＨＳ（カタログ番号「Ａｍｉｎｅ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇキット  ＢＲ１０００５０」、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を流し、カルボキシル基を活性化させた。次に、２−（２−ピリジニルジチオ）エタンアミド（ＰＤＥＡ）を流し、チオール基を導入した。−続いて、配列番号５又は６のＴＮＴ結合性ペプチドを含む溶液をそれぞれ流し、ジスルフィド結合を形成させて基板上にそれぞれ固定した。さらに、Ｌ−システインを流してブロッキングを行い、ＴＮＴ検出用センサーを得た。
【００５４】
続いて、配列番号５のペプチドを固定したＴＮＴ検出用センサー及び配列番号６のペプチドを固定したＴＮＴ検出用センサーをそれぞれ用いて、ＴＮＴとの結合力をそれぞれ解析した。その結果を図１に示す。
【００５５】
図１（ａ）は、配列番号５のペプチドとＴＮＴとの結合力を解析した結果を示すグラフである。図１（ｂ）は、配列番号６のペプチドとＴＮＴとの結合力を解析した結果を示すグラフである。
【００５６】
ＳＰＲセンサーの検出値と、ＴＮＴの濃度に基づき、プロットに対してヒルの式に基づく非線形曲線のカーブフィッティングを行い、各ペプチドとＴＮＴのＫｄを算出した。その結果、配列番号５のペプチドとＴＮＴとのＫｄは１．３１μＭであり、配列番号６のペプチドとＴＮＴとのＫｄは１．２１μＭであった。一方、配列番号５のペプチドとＴＮＰ−ＫＬＨとのＫｄは２．０１μＭであり、配列番号６のペプチドとＴＮＴとのＫｄは３６８ｎＭであった。
【００５７】
［実験例３］
（ＴＮＴ結合性ペプチドの反応性の検討２）
Ｎ末端及びＣ末端に架橋基を有するペプチドと、ＴＮＴ又はＴＮＰ−ＫＬＨとの結合力を解析した。
【００５８】
《ＴＮＰ−ＫＬＨの調製》
ＴＮＴの類似化合物である２，４，６−トリニトロフェノール（ＴＮＰ）をハプテン化したＴＮＰ−ＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ  Ｌｉｍｐｅｔ  Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）を、次のようにして調製した。
【００５９】
まず、１ｍｇ／ｍＬピクリルスルホン酸ナトリウム水溶液と、４８０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３水溶液に１０ｍｇ／ｍＬの濃度でＫＬＨを溶解したＫＬＨ溶液とを等容量ずつ混合し、４０℃条件下で２時間反応させた。続いて、反応後の溶液を限外ろ過により精製し、ピクリルスルホン酸がトリニトロフェニル基（ＴＮＰ）としてＫＬＨに結合したＴＮＰ−ＫＬＨを得た。
【００６０】
《ＴＮＴ検出用センサーの作製》
次に示すような手順により、ＴＮＴ検出用センサーを作製した。まず、ＥＤＣ／ＮＨＳ（カタログ番号「Ａｍｉｎｅ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇキット  ＢＲ１０００５０」、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を流し、カルボキシル基を活性化させた。次に、２−（２−ピリジニルジチオ）エタンアミド（ＰＤＥＡ）を流し、チオール基を導入した。続いて、配列番号７又は８のＴＮＴ結合性ペプチドを含む溶液をそれぞれ流し、ジスルフィド結合を形成させて基板上にそれぞれ固定した。さらに、Ｌ−システインを流してブロッキングを行い、ＴＮＴ検出用センサーを得た。この過程を図２に示す。図２は、架橋剤である、ＥＤＣ／ＮＨＳ、ＰＤＥＡを基板上に流し、抗原結合性ペプチドを固定して、ペプチドマトリックスを作製した過程を示す図である。
【００６１】
上述の方法により、カルボキシメチルデキストランと抗原結合性ペプチドはジスルフィド結合により架橋される。また、抗原結合性ペプチド同士もジスルフィド結合により架橋される。正確な構造は明らかではないが、カルボキシメチルデキストランと抗原結合性ペプチドが架橋され、網目状の構造が基板上に形成されると推定される。図３は、カルボキシメチルデキストランと抗原結合性ペプチドが架橋されたペプチドマトリックスを模式的に示す図である。
【００６２】
続いて、配列番号７のペプチドを固定したＴＮＴ検出用センサー及び配列番号８のペプチドを固定したＴＮＴ検出用センサーをそれぞれ用いて、ＴＮＴ又はＴＮＰ−ＫＬＨとの結合力をそれぞれ解析した。その結果を図４、５に示す。
【００６３】
図４（ａ）は、配列番号７のペプチドとＴＮＴとの結合力を解析した結果を示す図である。また、図４（ｂ）は、配列番号８のペプチドとＴＮＴとの結合力を解析した結果を示す図である。
【００６４】
また、図５（ａ）は、配列番号７のペプチドとＴＮＰ−ＫＬＨとの結合力を解析した結果を示す図である。また、図５（ｂ）は、配列番号８のペプチドとＴＮＰ−ＫＬＨとの結合力を解析した結果を示す図である。
【００６５】
その結果、配列番号７のペプチドとＴＮＴとのＫｄは１０．１ｎＭであった。また、配列番号８のペプチドとＴＮＴとのＫｄは１５．３ｎＭであった。一方、配列番号７のペプチドとＴＮＰ−ＫＬＨとのＫｄは２．０８μＭであった。また、配列番号８のペプチドとＴＮＰ−ＫＬＨとのＫｄは１．０７μＭであった。
【００６６】
これらの結果から、Ｎ末端及びＣ末端に架橋基を有する抗原結合性ペプチドとＴＮＴとの結合力は強いが、これと比較して、Ｎ末端及びＣ末端に架橋基を有する抗原結合性ペプチドとＴＮＰ−ＫＬＨとの結合力は弱いことが明らかになった。
【００６７】
配列番号５〜８に示されるペプチドをそれぞれ用いて作製したＴＮＴ検出用センサーと、ＴＮＴ又はＴＮＰ−ＫＬＨとの結合力を表２に小括した。
【００６８】
【表２】
2020040891.tif 000003
【００６９】
［実験例３］
（ＴＮＴ検出用センサーと低分子化合物との反応性の検討）
ＴＮＴ検出用センサーと低分子化合物との結合特異性を解析した。低分子化合物としては、トリニトロトルエン（ＴＮＴ）、シクロトリメチレントリニトラミン（ＲＤＸ）、トルエン、亜硝酸アミルを使用した。
【００７０】
まず、配列番号６のペプチドを用いて、実験例２と同様にしてＴＮＴ検出用センサーを作製した。続いて、実験例２と同様にして、各低分子化合物の反応性を検討した。図６は、ＴＮＴ検出用センサーと、ＴＮＴ、ＲＤＸ、トルエン、亜硝酸アミルとの結合性を解析した結果を示す図である。その結果、ＴＮＴ検出用センサーはＴＮＴに特異性を示すことが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００７１】
本発明によれば、抗原結合性ペプチドの抗原との反応性を向上させる技術を提供することができる。
【符号の説明】
【００７２】
１００…ペプチドマトリックス
１１０…カルボキシメチルデキストラン
１２０…抗原性ペプチド
１３０…ＴＮＴ
１４０…ＴＮＰ−ＫＬＨ
１５０…基板
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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