(57)【要約】      （修正有）【課題】界面活性剤を用いず、製剤の濃度変化に関係なく、薬物の溶解度を持続的に増加させる方法の提供。【解決手段】生理活性タンパク質又はペプチドを免疫グロブリンＦｃフラグメントに結合させるステップを含む、免疫グロブリンＦｃフラグメントが結合されていない生理活性タンパク質又はペプチドに比べて生理活性タンパク質又はペプチドの溶解度を改善する方法、及び免疫グロブリンＦｃフラグメントを含む、免疫グロブリンＦｃフラグメントを含まない組成物に比べて改善された溶解度を示すことを特徴とする、生理活性タンパク質又はペプチドの溶解度改善用組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生理活性タンパク質又はペプチドを免疫グロブリンＦｃフラグメントに結合させるステップを含む、免疫グロブリンＦｃフラグメントが結合されていない生理活性タンパク質又はペプチドに比べて生理活性タンパク質又はペプチドの溶解度を改善する方法。
【請求項２】
前記免疫グロブリンＦｃフラグメントは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ又はＩｇＭに由来するＦｃフラグメントである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記免疫グロブリンＦｃフラグメントは、それぞれのドメインがＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ及びＩｇＭからなる群から選択される免疫グロブリンに由来する異なる起源を有するドメインのハイブリッドである請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記免疫グロブリンＦｃフラグメントは、同一起源のドメインからなる単鎖免疫グロブリンで構成された二量体又は多量体である請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記免疫グロブリンＦｃフラグメントは、ヒト非グリコシル化ＩｇＧ４ Ｆｃフラグメントである請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記結合させるステップは、生理活性タンパク質又はペプチドと免疫グロブリンＦｃフラグメントを非ペプチド性重合体を介して結合させるものである請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記方法により製造した、生理活性タンパク質又はペプチドと免疫グロブリンＦｃフラグメントが結合された物質は、融合タンパク質の形態である請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記非ペプチド性重合体は、ポリエチレングリコールである請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記非ペプチド性重合体は、ポリプロピレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールの共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、ＰＬＡ（ポリ乳酸，polylactic acid）やＰＬＧＡ（ポリ乳酸−グリコール酸，polylactic-glycolic acid）などの生分解性高分子、脂質重合体、キチン、ヒアルロン酸及びそれらの組み合わせからなる群から選択される請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記方法は、水溶液において生理活性タンパク質又はペプチドの溶解度を改善する請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記水溶液は、クエン酸又は酢酸緩衝液、非イオン性界面活性剤としてのポリソルベート、糖アルコールとしてのマンニトール、及び等張化剤としての塩化ナトリウム又はメチオニンを含む請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記水溶液は、ｐＨ５．０〜７．０である請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記生理活性タンパク質又はペプチドは、エキセンジン−４、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、グルカゴン様ペプチド−２（ＧＬＰ−２）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、カルシトニン、インスリン又はオキシントモジュリンである請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
免疫グロブリンＦｃフラグメントを含む、免疫グロブリンＦｃフラグメントを含まない組成物に比べて改善された溶解度を示すことを特徴とする、生理活性タンパク質又はペプチドの溶解度改善用組成物。
【請求項１５】
前記組成物は、生理活性タンパク質又はペプチドが免疫グロブリンＦｃフラグメントにペプチド性リンカー又は非ペプチド性リンカーを介して連結された、生理活性タンパク質又はペプチドと免疫グロブリンＦｃフラグメントの結合体を有効成分として含む請求項１４に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生理活性タンパク質又はペプチドを免疫グロブリンＦｃフラグメントに結合させるステップを含む、免疫グロブリンＦｃフラグメントが結合されていない生理活性タンパク質又はペプチドに比べて生理活性タンパク質又はペプチドの溶解度を改善する方法、及び免疫グロブリンＦｃフラグメントを含む、免疫グロブリンＦｃフラグメントを含まない組成物に比べて改善された溶解度を示すことを特徴とする、生理活性タンパク質又はペプチドの溶解度改善用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
薬物は溶解している状態でのみ薬理作用を示すことができるので、薬物の溶解度は薬効と密接な関係を有する。水に溶解しやすい薬物の場合、注射剤としても容易に製造でき、精製して服用すると胃腸で溶解するが、難溶性薬物の場合、それを可溶化していない状態で服用すると胃腸でペレットなどの集合体の状態で存在し、単分子として溶解されないので吸収されないことがある。また、難溶性薬物を可溶化していない状態で注射剤として用いると血管が塞がって血栓が生じるため、注射剤として用いることができないので、薬物の溶解度は薬物の剤形化において重要な問題である。
【０００３】
薬物の溶解における周知の方法の１つとして、可溶化剤として界面活性剤を用いる方法が挙げられる。界面活性剤は分子内に親油性基と親水性基の両方を有するため、水中で疎水性炭化水素鎖が中心に集まり、親水性基が水と接するように球状のミセル（micelle）を形成するので、ミセル内に薬物を封入することにより薬物を溶解することができる。ただし、界面活性剤を用いるこのような方法は、界面活性剤を高濃度で用いる場合、静脈内の投与に適さないことがある。また、ミセル形成に対する臨界濃度以下にマイクロエマルジョン（microemulsion）の濃度が希釈されると、ミセル内に含まれる薬物の凝集が誘導されることがある（非特許文献１）。よって、界面活性剤を用いず、製剤の濃度変化に関係なく、薬物の溶解度を持続的に増加させる方法の開発が求められてきた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第９７／０３４６３１号
【特許文献２】国際公開第９６／０３２４７８号
【特許文献３】韓国登録特許第０７５５３１５号公報
【特許文献４】韓国登録特許第０７７５３４３号公報
【特許文献５】韓国登録特許第０８２４５０５号公報
【特許文献６】韓国公開特許第１０−２０１２−０１３７２７１号公報
【特許文献７】国際公開第２０１２／１６９７９８号
【特許文献８】韓国公開特許第１０−２００９−０００８１５１号公報
【特許文献９】国際公開第２００９／０１１５４４号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Journal of Advanced Pharmacy Education & Research 2 (1) 32-67 (2012) ISSN 2249-3379
【非特許文献２】H. Neurath, R.L. Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
こうした背景の下、本発明者らは、生理活性タンパク質又はペプチドなどの薬物の溶解度を向上させる方法を開発すべく鋭意努力した結果、生理活性タンパク質又はペプチドに免疫グロブリンＦｃフラグメントを結合（conjugation）させると、生理活性タンパク質又はペプチドの溶解度を効果的に増加させることにより、生理活性タンパク質又はペプチドを含む、薬理学的に有効な濃度の製剤を容易に製造できることを確認し、本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、生理活性タンパク質又はペプチドを免疫グロブリンＦｃフラグメントに結合させるステップを含む、免疫グロブリンＦｃフラグメントが結合されていない生理活性タンパク質又はペプチドに比べて生理活性タンパク質又はペプチドの溶解度を改善する方法を提供することを目的とする。
【０００８】
また、本発明は、免疫グロブリンＦｃフラグメントを含む、免疫グロブリンＦｃフラグメントを含まない組成物に比べて改善された溶解度を示すことを特徴とする、生理活性タンパク質又はペプチドの溶解度改善用組成物を提供することを目的とする。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により生理活性タンパク質及びペプチドに免疫グロブリンＦｃフラグメントを結合させると、生理活性タンパク質及びペプチドの溶解度を効果的に改善することができるので、様々な薬物の剤形化に効果的である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】インスリン及び持続型インスリン結合体の標準検量曲線を示す図である。
【図２】表１の組成を有するインスリン及び持続型インスリン結合体の溶解度を確認した結果を示す図であり、インスリンは０．６２８ｍｇ／ｍＬの溶解度を示し、持続型インスリン結合体はインスリンに換算すると１５ｍｇ／ｍＬを示す。
【図３】配列番号２７のオキシントモジュリン誘導体及び前記誘導体−ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃフラグメント結合体の標準検量曲線を示す図である。
【図４】表４の組成を有する配列番号２７のオキシントモジュリン誘導体及び前記誘導体−ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃフラグメント結合体の溶解度を確認した結果を示す図であり、オキシントモジュリン誘導体は０．１８８ｍｇ／ｍＬの溶解度を示し、前記結合体はオキシントモジュリンに換算すると１１ｍｇ／ｍＬを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の一態様は、生理活性タンパク質又はペプチドを免疫グロブリンＦｃフラグメントに結合させるステップを含む、免疫グロブリンＦｃフラグメントが結合されていない生理活性タンパク質又はペプチドに比べて生理活性タンパク質又はペプチドの溶解度を改善する方法を提供する。
【００１２】
一具体例として、本発明による方法に用いられる免疫グロブリンＦｃフラグメントは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ又はＩｇＭに由来するＦｃフラグメントであることを特徴とする。
【００１３】
他の具体例として、本発明による方法に用いられる免疫グロブリンＦｃフラグメントは、それぞれのドメインがＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ及びＩｇＭからなる群から選択される免疫グロブリンに由来する異なる起源を有するドメインのハイブリッドであることを特徴とする。
【００１４】
さらに他の具体例として、本発明による方法に用いられる免疫グロブリンＦｃフラグメントは、同一起源のドメインからなる単鎖免疫グロブリンで構成された二量体又は多量体であることを特徴とする。
【００１５】
さらに他の具体例として、本発明による方法に用いられる免疫グロブリンＦｃフラグメントは、ヒト非グリコシル化ＩｇＧ４ Ｆｃフラグメントであることを特徴とする。
【００１６】
さらに他の具体例として、本発明による方法は、生理活性タンパク質又はペプチドに連結された非ペプチド性重合体に免疫グロブリンＦｃフラグメントを結合させるステップを含むことを特徴とする。
【００１７】
さらに他の具体例として、本発明による方法で製造した、生理活性タンパク質又はペプチドと免疫グロブリンＦｃフラグメントが結合された物質は、融合タンパク質の形態であることを特徴とする。
【００１８】
さらに他の具体例として、本発明による方法に用いられる非ペプチド性重合体は、ポリエチレングリコールであることを特徴とする。
【００１９】
さらに他の具体例として、本発明による方法に用いられる非ペプチド性重合体は、ポリプロピレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールの共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、ＰＬＡ（ポリ乳酸，polylactic acid）やＰＬＧＡ（ポリ乳酸−グリコール酸，polylactic-glycolic acid）などの生分解性高分子、脂質重合体、キチン、ヒアルロン酸及びそれらの組み合わせからなる群から選択されることを特徴とする。
【００２０】
さらに他の具体例として、本発明による方法は、水溶液において生理活性タンパク質又はペプチドの溶解度を改善することを特徴とする。
【００２１】
さらに他の具体例として、本発明による方法に用いられる水溶液は、クエン酸又は酢酸緩衝液、非イオン性界面活性剤としてのポリソルベート、糖アルコールとしてのマンニトール、等張化剤としての塩化ナトリウム又はメチオニンを含むことを特徴とする。
【００２２】
さらに他の具体例として、本発明による方法に用いられる水溶液は、ｐＨ５．０〜７．０であることを特徴とする。
【００２３】
さらに他の具体例として、本発明による方法における前記生理活性タンパク質又はペプチドは、エキセンジン−４、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、グルカゴン様ペプチド−２（ＧＬＰ−２）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、カルシトニン、インスリン又はオキシントモジュリンであることを特徴とする。
【００２４】
さらに他の具体例として、本発明による方法に用いられる水溶液は、界面活性剤をさらに含むことを特徴とする。
【００２５】
本発明の他の態様は、免疫グロブリンＦｃフラグメントを含む、免疫グロブリンＦｃフラグメントを含まない組成物に比べて改善された溶解度を示すことを特徴とする、生理活性タンパク質又はペプチドの溶解度改善用組成物を提供する。
【００２６】
一具体例として、前記組成物は、生理活性タンパク質又はペプチドが免疫グロブリンＦｃフラグメントにペプチド性リンカー又は非ペプチド性リンカーを介して連結された、生理活性タンパク質又はペプチドと免疫グロブリンＦｃフラグメントの結合体を有効成分として含むことを特徴とする。
【００２７】
本発明は、生理活性タンパク質又はペプチドを免疫グロブリンＦｃフラグメントに結合させるステップを含む、免疫グロブリンＦｃフラグメントが結合されていない生理活性タンパク質又はペプチドに比べて生理活性タンパク質又はペプチドの溶解度を改善する方法に関する。本発明の方法は、溶媒に界面活性剤を追加しない場合も生理活性タンパク質又はペプチドの溶解度を効果的に改善する効果を有する。従来のタンパク質医薬品の構成成分である生理活性タンパク質又はペプチド、具体的にはインスリン、オキシントモジュリンなどの場合、体内投与用製剤の一般的なｐＨの範囲であるｐＨ５〜７において低い溶解度を示すので所望の濃度の製剤への製造に困難があり、また注射用製剤においては生体内で沈殿を誘発するので意図しない副作用を引き起こすことがあるという問題があった。しかし、驚くべきことに、前記生理活性タンパク質又はペプチドに免疫グロブリンＦｃフラグメントを結合させると、前記ｐＨの範囲内で溶解度が増加することが本発明において確認された。すなわち、本発明の方法は、ｐＨ５〜７の弱酸性領域で低い溶解度を示すインスリン、オキシントモジュリンなどのペプチド又はタンパク質の溶解度を向上させることができるという効果を有する。
【００２８】
本発明における「溶解度」とは、生理活性タンパク質又はペプチドが人体への投与に適した溶媒に溶解する程度を意味する。具体的には、特定の温度で与えられた溶媒に対して溶質が飽和した程度を示すものである。溶解度は溶質の飽和濃度を決定することにより測定することができ、例えば溶媒に溶質を過剰量で添加してそれを攪拌して濾過すると、濃度をＵＶ分光器やＨＰＬＣなどで測定することができるが、これらに限定されるものではない。生理活性タンパク質又はペプチドが治療用に用いられるためには薬理学的に有効な量で溶媒に溶解することが重要であり、これは凍結乾燥製剤の再構成の際の濃度や、液状製剤の活性物質の濃度などを決定する上で重要な考慮事項となる。
【００２９】
本発明は、生理活性タンパク質又はペプチドに免疫グロブリンＦｃフラグメントを結合させると、前記フラグメントが結合されていない生理活性タンパク質又はペプチドに比べて溶解度が大幅に増加することが確認されたことに基づくものであり、よって水溶液において生理活性タンパク質又はペプチドの溶解度を改善したことを１つの特徴とする。
【００３０】
本発明の一実施例によれば、代表的な生理活性ペプチドとしてインスリン及びオキシントモジュリンを用いて、それに免疫グロブリンＦｃをそれぞれ結合させると、インスリン及びオキシントモジュリンの溶解度が大幅に増加する結果を示した（図２及び図４）。
【００３１】
本発明における「水溶液」とは、生理活性タンパク質又はペプチドを溶解する溶液を意味する。前記水溶液は、生理活性タンパク質又はペプチドを人体に投与するのに適した溶液である。本発明の具体的な一実施形態において、水溶液のｐＨは中性又は弱酸性、例えばｐＨ５．０〜７．０であってもよい。本発明の方法が用いられる水溶液は、その種類が特に限定されるものではないが、クエン酸又は酢酸緩衝液、非イオン性界面活性剤としてのポリソルベート、糖アルコールとしてのマンニトール、等張化剤としての塩化ナトリウム又はメチオニンを含む組成を有してもよい。
【００３２】
本発明による方法における前記免疫グロブリンＦｃフラグメントとは、生理活性タンパク質又はペプチドに非ペプチド性重合体結合されたものであってもよい。具体的には、前記免疫グロブリンＦｃフラグメントは、生理活性タンパク質又はペプチドに連結された非ペプチド性重合体を介して結合されてもよく、免疫グロブリンＦｃフラグメント−非ペプチド性重合体が生理活性タンパク質又はペプチドに連結されてもよい。
【００３３】
本発明における「非ペプチド性重合体」とは、繰り返し単位が少なくとも１つ結合された生体適合性重合体を意味し、前記繰り返し単位はペプチド結合を除く任意の共有結合により互いに連結される。
【００３４】
本発明に使用可能な非ペプチド性重合体は、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールの共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、ＰＬＡ（ポリ乳酸，polylactic acid）やＰＬＧＡ（ポリ乳酸−グリコール酸，polylactic-glycolic acid）などの生分解性高分子、脂質重合体、キチン類、ヒアルロン酸及びそれらの組み合わせからなる群から選択されてもよく、ポリエチレングリコールであることが好ましいが、これらに限定されるものではない。当該分野で公知のこれらの誘導体や当該分野の技術水準で容易に作製できる誘導体も本発明に含まれる。
【００３５】
前記非ペプチド性重合体は、免疫グロブリンＦｃフラグメントがキャリアとしての役割を十分に果たせるように、生体内タンパク質分解酵素により切断されにくい、生体内タンパク質分解酵素に抵抗性のある重合体を用いることが好ましく、このような重合体であれば制限なく用いられる。このような非ペプチド性重合体の分子量は、１〜１００ｋＤａの範囲、より具体的には１〜２０ｋＤａの範囲である。また、前記免疫グロブリンＦｃフラグメントに結合される本発明の非ペプチド性重合体は、１種類の重合体だけでなく、異なる種類の重合体の組み合わせが用いられてもよい。
【００３６】
非ペプチド性重合体は、免疫グロブリンＦｃフラグメント、及びタンパク質又はペプチド薬物に結合される反応基を有し、免疫グロブリンＦｃフラグメントとタンパク質又はペプチド薬物を互いに連結させるリンカーの役割を果たすことができる。
【００３７】
非ペプチド性重合体をリンカーとして用いて生理活性タンパク質又はペプチドを免疫グロブリンＦｃフラグメントに結合させることは、（１）非ペプチド性重合体を生理活性タンパク質もしくはペプチド、又は免疫グロブリンＦｃフラグメントのいずれかと反応させるステップと、（２）ステップ（１）の反応混合物を生理活性タンパク質もしくはペプチド、又は免疫グロブリンＦｃフラグメントの他のいずれかと反応させるステップとを順次行うことにより達成することができる。
【００３８】
ただし、ステップ（１）で両末端に反応基を有する非ペプチド性重合体に免疫グロブリンＦｃフラグメントを反応させると、具体的な反応条件によってはステップ（１）の生成物の一部において、免疫グロブリンＦｃフラグメントの２つのＮ末端が非ペプチド性重合体の両末端に全て結合する橋（bridge）の形態になることがある。このような橋の形態のステップ（１）の生成物は、生理活性タンパク質又はペプチドを連結させる２次カップリング反応を不可能にするか、カップリング収率を大幅に低下させる。よって、一実施形態においては、免疫グロブリンＦｃフラグメントと非ペプチド性重合体間に橋の形態の反応が起こることを防止するために、非ペプチド性重合体と生理活性タンパク質又はペプチドを先に反応させ、その後非ペプチド性重合体が連結された生理活性タンパク質又はペプチドを免疫グロブリンＦｃフラグメントと反応させる順序で行ってもよい。しかし、本発明の溶解度改善方法を必ずこのような順序で行わなければならないわけではない。
【００３９】
ステップ（１）において、非ペプチド性重合体を生理活性タンパク質もしくはペプチド、又は免疫グロブリンＦｃフラグメントに結合させるために用いる化学反応には公知の方法を用いることができ、例えば両末端に反応基を有する非ペプチド性重合体と生理活性タンパク質もしくはペプチド、又は免疫グロブリンＦｃフラグメントを０〜２５℃で１〜１６時間反応させてもよい。このような反応により、生理活性タンパク質もしくはペプチド、又は免疫グロブリンＦｃフラグメントに１つの非ペプチド性重合体が反応基を介して共有結合される。
【００４０】
ステップ（１）において、生理活性タンパク質又はペプチドと非ペプチド性重合体を互いに連結させる反応は、有機溶媒を含む反応溶液で行われてもよい。ここで、前記有機溶媒としては当業界で通常用いられる有機溶媒を全て用いることができ、これらに限定されるものではないが、好ましくは第一級、第二級、第三級アルコールを全て用いることができ、また炭素数１〜１０のアルコールを用いることができ、前記アルコールはイソプロパノール、エタノール又はメタノールであることがより好ましい。前記有機溶媒は、生理活性タンパク質又はペプチドの種類に応じて好ましい有機溶媒を適宜選択することができる。また、前記有機溶媒は、生理活性タンパク質又はペプチドと非ペプチド性重合体間の連結のために用いられるものであり、これらに限定されるものではないが、反応溶液総量に対して、好ましくは１０〜６０％含まれ、より好ましくは３０〜５５％含まれ、さらに好ましくは４５〜５５％含まれる。さらに、前記反応溶液のｐＨは、これらに限定されるものではないが、好ましくは４．５〜７．０、より好ましくは５．０〜６．５である。
【００４１】
また、反応に関与する反応基の種類によっては、還元剤をさらに含んで前記ステップを行ってもよい。
【００４２】
具体的には、本発明における還元剤とは、非ペプチド性重合体の反応基であるアルデヒドとポリペプチド（生理活性タンパク質又はペプチド，免疫グロブリンＦｃフラグメント）のアミノ基が結合して生成される可逆的なイミン二重結合を還元することにより共有結合を生成することのできる当該分野で公知の全ての還元剤を意味し、本発明の目的上、非ペプチド性重合体が生理活性タンパク質もしくはペプチド、又は免疫グロブリンＦｃフラグメントと共有結合できるようにするために反応溶液に含まれる。前記還元剤は、当業界で通常用いられる還元剤を全て用いることができ、これらに限定されるものではないが、シアノ水素化ホウ素酸ナトリウム（Sodium cyanoborohydride）、ボラン−ピリジン錯体（Borane pyridine complex）、水素化ホウ素ナトリウム（Sodium borohydride）、ボラン−ジメチルアミン錯体（Borane dimethylamine complex）、ボラン−トリメチルアミン錯体（Borane trimethylamine complex）又はトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（Sodium triacetoxyborohydride）であることが好ましい。前記還元剤は、生理活性タンパク質もしくはペプチド、又は免疫グロブリンＦｃフラグメントの種類と反応溶媒に応じて好ましい還元剤を適宜選択することができる。
【００４３】
また、前記還元剤は、生理活性タンパク質もしくはペプチドと非ペプチド性重合体、又は免疫グロブリンＦｃフラグメントと非ペプチド性重合体間の連結反応（ステップ(１)の反応）時に最終濃度１〜２０ｍＭ、カップリング反応（ステップ(２)の反応）時に最終濃度１〜１００ｍＭで含まれてもよい。
【００４４】
一方、前記非ペプチド性重合体は、両末端にそれぞれ免疫グロブリンＦｃフラグメント及び生理活性タンパク質又はペプチド薬物に結合される反応基、具体的には生理活性タンパク質もしくはペプチド、又は免疫グロブリンＦｃフラグメントのＮ末端、あるいはリシンに位置するアミノ基に結合されるか、システインのチオール基に結合される反応基を含む。このような両末端の反応基は、反応アルデヒド基、プロピオンアルデヒド基、ブチルアルデヒド基、マレイミド（maleimide）基及びスクシンイミド（succinimide）誘導体からなる群から選択されることが好ましい。前記、スクシンイミド誘導体としては、スクシンイミジルカルボキシメチル、スクシンイミジルバレレート、スクシンイミジルメチルブタノエート、スクシンイミジルメチルプロピオネート、スクシンイミジルブタノエート、スクシンイミジルプロピオネート、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド又はスクシンイミジルカーボネートが用いられてもよいが、これらに限定されるものではなく、免疫グロブリンＦｃフラグメントと生理活性タンパク質又はペプチドのアミノ酸残基のアミノ基又はチオール基に連結される反応基であれば制限なく含まれる。
【００４５】
特に、前記非ペプチド性重合体が両末端に反応アルデヒド基の反応基を有する場合、非特異的反応を最小限に抑え、非ペプチド性重合体の両末端に生理活性タンパク質又はペプチド及び免疫グロブリンがそれぞれ結合するのに効果的である。アルデヒド結合による還元性アルキル化で生成された最終産物は、アミド結合により連結されたものよりはるかに安定している。アルデヒド反応基は、低いｐＨではＮ末端に選択的に反応し、高いｐＨ、例えばｐＨ９．０の条件ではリシン（lysine, Lys）残基と共有結合を形成することができる。
【００４６】
前記非ペプチド性重合体のリンカーの両末端の反応基は、同じものであってもよく、異なるものであってもよい。例えば、一末端にはマレイミド基、他の末端にはアルデヒド基、プロピオンアルデヒド基又はブチルアルデヒド基を有してもよい。両末端にヒドロキシ反応基を有するポリエチレングリコールを非ペプチド性重合体として用いる場合、公知の化学反応により前記ヒドロキシ基を前述した様々な反応基として活性化するか、商業的に入手可能な修飾された反応基を有するポリエチレングリコールを用いることにより、本発明の持続型タンパク質結合体を製造することができる。
【００４７】
また、特にこれらに限定されるものではないが、前記非ペプチド性重合体の反応基は、各生理活性タンパク質又はペプチド及び免疫グロブリンＦｃフラグメントのＮ末端のアミノ基又はリシン残基の側鎖のアミノ基に結合することができる。ここで、生理活性タンパク質又はペプチド及び免疫グロブリンＦｃフラグメントにおけるリシン残基の位置は、特定の位置に限定されるものでなく、また前記リシン残基も、天然リシンだけでなく、非ペプチド性重合体の反応基に連結されるアミノ基を有するものであれば、非天然アミノ酸及びＬｙｓ誘導体が制限なく含まれる。
【００４８】
一方、ステップ（１）で生理活性タンパク質又はペプチドを非ペプチド性重合体と先に反応させる場合、生理活性タンパク質又はペプチドと非ペプチド性重合体を１：１〜１：２０のモル比で反応させ、ステップ（２）ではステップ（１）の生成物である生理活性タンパク質又はペプチドと非ペプチド性重合体の連結体と免疫グロブリンＦｃフラグメントを１：０．５〜１：１０のモル比で反応させることが好ましいが、これに限定されるものではない。
【００４９】
また、ステップ（１）を行ってステップ（２）を行う前に、ステップ（１）の生成物から生理活性ポリペプチド−非ペプチド性重合体の連結体又は免疫グロブリンＦｃフラグメント−非ペプチド性重合体の連結体を分離精製する過程を含んでもよい。本過程は、当業界で公知のクロマトグラフィーなどの様々な物質分離方法を用いて行うことができる。
【００５０】
ステップ（２）で生理活性ポリペプチド−非ペプチド性連結体を免疫グロブリンＦｃフラグメントに連結させる場合、ｐＨ条件は、特にこれに限定されるものではないが、ｐＨ４．０〜９．０とすることができる。
【００５１】
一方、前記生理活性タンパク質又はペプチドと免疫グロブリンＦｃフラグメントは、融合タンパク質の形態で結合された形態であってもよい。
【００５２】
本発明における「融合タンパク質」とは、別個にコードされた少なくとも２つの遺伝子を結合（joining）させて作製したタンパク質を意味する。前記融合タンパク質は、組換えＤＮＡ技術により人工的に作製することができる。また、前記融合タンパク質は、生理活性タンパク質又はペプチドと免疫グロブリンＦｃフラグメントがリンカーを介さずに連結された形態であってもよく、ペプチド性リンカーを介して連結された形態であってもよい。
【００５３】
ここで、ペプチド性リンカーとは、融合タンパク質を構成する２種類のタンパク質を互いに連結するペプチドを意味する。前記ペプチド性リンカーは、融合タンパク質の構成要素である２つのタンパク質が融合タンパク質の形態でも独立して折りたたまれる（folding）ものであってもよく、それぞれの機能を維持できるように含まれるものであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【００５４】
本発明における「免疫グロブリンＦｃフラグメント」とは、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖の可変領域、重鎖定常領域１（ＣＨ１）及び軽鎖定常領域１（ＣＬ１）を除いたものであり、重鎖定常領域２（ＣＨ２）及び重鎖定常領域３（ＣＨ３）部分を意味し、重鎖定常領域にヒンジ（hinge）部分を含むこともある。また、本発明の免疫グロブリンＦｃフラグメントは、天然のものと実質的に同等又は向上した効果を有するものであれば、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖の可変領域を除き、一部又は全部の重鎖定常領域１（ＣＨ１）及び／又は軽鎖定常領域１（ＣＬ１）を含む拡張されたＦｃフラグメントであってもよい。さらに、ＣＨ２及び／又はＣＨ３に相当する非常に長い一部のアミノ酸配列が除去された領域であってもよい。すなわち、本発明の免疫グロブリンＦｃフラグメントは、１）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びＣＨ４ドメイン、２）ＣＨ１ドメイン及びＣＨ２ドメイン、３）ＣＨ１ドメイン及びＣＨ３ドメイン、４）ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン、５）１つ又は２つ以上のドメインと免疫グロブリンヒンジ領域（又はヒンジ領域の一部）との組み合わせ、６）重鎖定常領域の各ドメインと軽鎖定常領域の二量体であってもよい。
【００５５】
本発明の目的上、前記免疫グロブリンＦｃフラグメントは、これに結合する薬物、すなわち生理活性タンパク質又はペプチドの溶解度を増加させる効果をもたらす物質としての意味を有し、さらに薬物のキャリアとしての意味をも有する。
【００５６】
本発明における「キャリア」とは、薬物と共に結合される物質を意味し、一般に薬物に結合されることにより薬物の生理活性を増減させるか、除去する。しかし、本発明の目的上、本発明における前記キャリアとは、結合する薬物の生理活性の減少を最小限に抑え、薬物の生体内安定性及び皮下投与時に投与部位から血中への移動を遅延させることによる効力の持続性を増加させると共に、タンパク質とペプチドの溶解度を改善するためのものを意味する。このような薬物のキャリアとして、従来から脂質（lipid）、重合体（polymer）など様々な物質が研究されてきたが、本発明は、結合される薬物の生体内持続性を増加させ、生体内活性の減少を最小限に抑え、さらに溶解度を最大限に増加させるためのキャリアとして免疫グロブリンＦｃフラグメントを提供することを特徴とする。また、前記免疫グロブリンＦｃフラグメントは、生体内で代謝される生分解性のポリペプチドであるので、薬物のキャリアとして安全に用いられるという利点も有する。これらの特性から、生理活性タンパク質又はペプチドに免疫グロブリンＦｃフラグメントが結合された結合体は、本発明において持続型結合体と命名される。
【００５７】
また、本発明において生理活性タンパク質又はペプチドの溶解度の改善のために用いられる免疫グロブリンＦｃフラグメントは、リンカーを介して、又は生理活性タンパク質又はペプチドに直接結合させることができる。ここで、免疫グロブリンＦｃフラグメントが結合される生理活性タンパク質又はペプチドの位置は、特に限定されるものではなく、タンパク質又はペプチド内、又はＮ末端もしくはＣ末端のいずれの部位であってもよい。もっとも、本発明の方法により製造された生理活性タンパク質又はペプチドと免疫グロブリンＦｃフラグメントの結合体が人体に投与されたときに薬理活性を示すように、用いる生理活性タンパク質又はペプチドの種類に応じてその生理活性を阻害しない部位を選択することが好ましいが、特にこれに限定されるものではない。
【００５８】
また、免疫グロブリンＦｃフラグメントは、免疫グロブリン分子全体に比べて相対的に分子量が小さいので、結合体の作製、精製及び収率の面で有利であるだけでなく、アミノ酸配列は抗体毎に異なるため、高い非均質性を示すＦａｂ部分を除去することにより、物質の同質性が非常に高くなり、血中抗原性を誘発する可能性が低くなるという効果も期待することができる。
【００５９】
また、本発明の免疫グロブリンＦｃフラグメントには、天然アミノ酸配列だけでなく、その配列誘導体（derivatives）も含まれる。アミノ酸配列誘導体とは、天然アミノ酸配列と少なくとも１つのアミノ酸残基が異なる配列を有するものを意味し、自然に発生したものであってもよく、人為的に発生させたものであってもよい。免疫グロブリンのＦｃフラグメントには、欠失、挿入、非相補もしくは相補置換又はそれらの組み合わせによる誘導体が含まれる。挿入は、通常約１個〜２０個のアミノ酸の連続配列で行われるが、それより大きな挿入も可能である。欠失は、通常約１個〜３０個の残基で行われる。これらの免疫グロブリンＦｃフラグメントの配列誘導体を作製する技術は、本発明に参照として取り込まれる特許文献１、２などに開示されている。分子の活性を全体的に変化させないタンパク質及びペプチドにおけるアミノ酸交換は当該分野において公知である（非特許文献２）。最も一般的な交換は、アミノ酸残基Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｈｙ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ間の交換である。場合によっては、リン酸化、硫酸化（sulfation）、アクリル化（acrylation）、グリコシル化（glycosylation）、メチル化、ファルネシル化（farnesylation）、アセチル化、アミド化（amidation）などにより修飾（modification）されてもよい。
【００６０】
前述した免疫グロブリンＦｃ誘導体は、本発明のＦｃフラグメントと同じ生物学的活性を示すが、Ｆｃフラグメントの熱、ｐＨなどに対する構造的安定性を向上させた誘導体である。
【００６１】
また、このような免疫グロブリンＦｃフラグメントは、ヒト、及びウシ、ヤギ、ブタ、マウス、ウサギ、ハムスター、ラット、モルモットなどの動物の生体内から分離した天然のものから得てもよく、形質転換された動物細胞もしくは微生物から得られた組換えたもの又はその誘導体であってもよい。ここで、天然のものから得る方法においては、全免疫グロブリンをヒト又は動物の生体から分離し、その後タンパク質分解酵素で処理することにより得ることができる。パパイン（papain）で処理するとＦａｂ及びＦｃに切断され、ペプシン（pepsin）で処理するとｐＦ’ｃ及びＦ（ａｂ’）2に切断される。これらは、サイズ排除クロマトグラフィー（size-exclusion chromatography）などを用いてＦｃ又はｐＦ’ｃを分離することができる。本発明による免疫グロブリンＦｃフラグメントは、ヒト由来の免疫グロブリンＦｃフラグメントが微生物から得られた組換え免疫グロブリンＦｃフラグメントであることが好ましい。
【００６２】
また、免疫グロブリンＦｃフラグメントは、天然糖鎖、天然のものに比べて増加した糖鎖、天然のものに比べて減少した糖鎖、又は糖鎖が除去された形態であってもよい。このような免疫グロブリンＦｃ糖鎖の増減又は除去には、化学的方法、酵素学的方法、微生物を用いた遺伝工学的手法などの通常の方法が用いられる。ここで、Ｆｃから糖鎖が除去された免疫グロブリンＦｃフラグメントは、補体（ｃ１ｑ）の結合力が著しく低下し、抗体依存性細胞傷害又は補体依存性細胞傷害が低減又は除去されるので、生体内で不要な免疫反応を誘発しない。このようなことから、糖鎖が除去されるか、非グリコシル化された免疫グロブリンＦｃフラグメントは、薬物のキャリアとしての本発明の目的に適する。
【００６３】
本発明における「糖鎖の除去（deglycosylation）」とは、酵素で糖を除去した免疫グロブリンＦｃフラグメントを意味し、「非グリコシル化（aglycosylation）」とは、原核細胞、好ましくは大腸菌で産生されてグリコシル化されていない免疫グロブリンＦｃフラグメントを意味する。
【００６４】
一方、免疫グロブリンＦｃフラグメントはヒト起源、又はウシ、ヤギ、ブタ、マウス、ウサギ、ハムスター、ラット、モルモットなどの動物起源であり、ヒト起源であることが好ましい。また、免疫グロブリンＦｃフラグメントは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ由来であるか、又はそれらの組み合わせ（combination）もしくはそれらのハイブリッド（hybrid）によるＦｃフラグメントであってもよい。ヒト血液に最も豊富なＩｇＧ又はＩｇＭ由来であることが好ましく、リガンド結合タンパク質の半減期を延長させることが知られているＩｇＧ由来であることが最も好ましい。
【００６５】
一方、本発明における「組み合わせ（combination）」とは、二量体又は多量体を形成する際に、同一起源の単鎖免疫グロブリンＦｃフラグメントをコードするポリペプチドが異なる起源の単鎖ポリペプチドに結合することを意味する。すなわち、ＩｇＧ Ｆｃ、ＩｇＡ Ｆｃ、ＩｇＭ Ｆｃ、ＩｇＤ Ｆｃ及びＩｇＥ Ｆｃフラグメントからなる群から選択される少なくとも２つのフラグメントから二量体又は多量体を作製することができる。
【００６６】
本発明における「ハイブリッド（hybrid）」とは、単鎖の免疫グロブリンＦｃフラグメント内に、少なくとも２つの異なる起源の免疫グロブリンＦｃフラグメントに相当する配列が存在することを意味する。本発明においては、様々な形態のハイブリッドが可能である。すなわち、ＩｇＧ Ｆｃ、ＩｇＭ Ｆｃ、ＩｇＡ Ｆｃ、ＩｇＥ Ｆｃ及びＩｇＤ ＦｃのＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４からなる群から選択される１つ〜４つのドメインのハイブリッドが可能であり、ヒンジ領域を含んでもよい。
【００６７】
一方、ＩｇＧもＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４のサブクラスに分けられ、本発明にはそれらの組み合わせ及びそれらのハイブリッドも含まれる。ＩｇＧ２及びＩｇＧ４サブクラスであることが好ましく、補体依存性細胞傷害（complement-dependent cytotoxicity, CDC）などのエフェクター機能のほとんどないＩｇＧ４のＦｃフラグメントであることが最も好ましい。
【００６８】
一方、本発明の免疫グロブリンＦｃフラグメントは、そのＮ末端にヒンジ領域が連結された組換え形態であってもよいが、その場合、凝集体の形態で発現した免疫グロブリンＦｃフラグメントは、活性の損失をもたらすことなく、開始コドンによりコードされる開始メチオニン残基が除去された活性型の二量体又は単量体の形態のＦｃフラグメントに可溶化（solublization）及びリフォールディング（refolding）されるという利点がある。
【００６９】
前述したように、本発明に適した免疫グロブリンＦｃフラグメントについての説明は、本発明に参照として取り込まれる特許文献３、４及び５に詳細に記述されている。
【００７０】
すなわち、薬物のキャリアとして本発明によるインスリン及びオキシントモジュリンとの融合タンパク質に用いる上で最も好ましい免疫グロブリンＦｃフラグメントは、ヒトＩｇＧ４由来の非グリコシル化されたＦｃフラグメントである。ヒト由来のＦｃフラグメントは、ヒト生体において抗原として作用し、それに対する新規な抗体を生成するなどの好ましくない免疫反応を起こす非ヒト由来のＦｃフラグメントに比べて好ましい。
【００７１】
本発明における「生理活性タンパク質又はペプチド」とは、遺伝子発現又は生理機能を調節するタンパク質又はペプチドを意味する。本発明の目的上、前記生理活性タンパク質又はペプチドは、溶解度を増加させるタンパク質又はペプチドであれば制限なく含まれる。
【００７２】
一方、本発明におけるアミノ酸は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ命名法に従って次のように略語で記載した。
アラニン  Ａｌａ又はＡ
アルギニン  Ａｒｇ又はＲ
アスパラギン  Ａｓｎ又はＮ
アスパラギン酸  Ａｓｐ又はＤ
システイン  Ｃｙｓ又はＣ
グルタミン酸  Ｇｌｕ又はＥ
グルタミン  Ｇｌｎ又はＱ
グリシン  Ｇｌｙ又はＧ
ヒスチジン  Ｈｉｓ又はＨ
イソロイシン  Ｉｌｅ又はＩ
ロイシン  Ｌｅｕ又はＬ
リシン  Ｌｙｓ又はＫ
メチオニン  Ｍｅｔ又はＭ
フェニルアラニン  Ｐｈｅ又はＦ
プロリン  Ｐｒｏ又はＰ
セリン  Ｓｅｒ又はＳ
トレオニン  Ｔｈｒ又はＴ
トリプトファン  Ｔｒｐ又はＷ
チロシン  Ｔｙｒ又はＹ
バリン  Ｖａｌ又はＶ
【００７３】
また、本明細書全体を通して、アミノ酸を示す通常の１文字及び３文字のコードが全て用いられる。
【００７４】
さらに、前記生理活性タンパク質又はペプチドは、天然生理活性タンパク質又はペプチド以外にも、その誘導体、変異体、フラグメントなどが全て含まれる概念である。
【００７５】
本発明における「誘導体」とは、天然生理活性タンパク質又はペプチドのアミノ酸配列において、アミノ酸残基の一部の基が化学的に置換（例；alpha-methylation, alpha-hydroxylation）、除去（例；deamination）、又は修飾（例；N-methylation）された形態を意味する。前記誘導体には、天然生理活性ペプチドと配列相同性がないにもかかわらず前記天然生理活性ペプチドの活性を有するペプチド模倣体の形態も含まれる。
【００７６】
本発明における「ペプチド模倣体」とは、ペプチドを模倣したタンパク質様鎖を意味する。前記ペプチド模倣体の例としては、Ｄ−アミノ酸を含むＤ−ペプチド模倣体などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。前記ペプチド模倣体は、ペプチド模倣体の作製に関する当業界で公知の技術を用いて容易に作製することができる。
【００７７】
本発明における「変異体」とは、天然タンパク質又はペプチドとアミノ酸配列が少なくとも１つ異なるタンパク質又はペプチドであり、天然タンパク質の活性を示すものを意味する。前記変異体は、天然タンパク質又はペプチドから一部のアミノ酸の置換（substitution）、追加（addition）、除去（deleteion）及び修飾（modification）のいずれかの方法又はそれらの方法の組み合わせにより作製することができる。ここで、追加されるアミノ酸は天然に存在しないアミノ酸（例えば、Ｄ型アミノ酸）であってもよい。
【００７８】
本発明における「フラグメント」とは、天然タンパク質又はペプチドのＮ末端又はＣ末端の１つ又はそれ以上のアミノ酸が除去された形態を意味し、天然タンパク質の活性を有するものであることが好ましい。
【００７９】
このような生理活性タンパク質又はペプチドは、天然又は組換え起源のいかなる方法で作製されたものであってもよく、例えば大腸菌などの原核細胞を宿主細胞として用いて作製した組換えタンパク質が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００８０】
一方、前記生理活性タンパク質又はペプチドは、オキシントモジュリン、エキセンジン−４（exendin-4）、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、ＧＬＰ−２、グルコース依存性インスリン分泌ペプチド（glucose-dependent insulinotropic peptide, GIP）などのインスリン分泌ペプチド、インスリン、グルカゴン、副甲状腺ホルモン（parathyroid hormone, PTH）、又はカルシトニン（Calcitonin）であってもよいが、これらに限定されるものではない。また、前述したように、前記生理活性タンパク質又はペプチドは、天然生理活性タンパク質又はペプチド以外にも、その誘導体、変異体、フラグメントなどが全て含まれる概念である。
【００８１】
本発明における「インスリン」とは、体内の血糖が高いときに膵臓から分泌され、肝臓、筋肉、脂肪組織で糖を吸収してグリコーゲンとして貯蔵し、脂肪を分解してエネルギー源として用いることを抑制して血糖調節機能を有するペプチドを意味する。前記ペプチドには、天然インスリン、基礎インスリン（basal insulin）、インスリンアゴニスト（agonist）、前駆体（precursor）、誘導体（derivatives）、フラグメント（fragments）、変異体（variants）などが含まれる。
【００８２】
本発明における「天然インスリン」とは、膵臓から分泌されるホルモンであり、一般に細胞内へのグルコース取り込みを促進し、脂肪の分解を抑制し、体内の血糖を調節する役割を果たす。インスリンは、血糖調節機能のないプロインスリン（proinsulin）前駆体の形態からプロセシングを経て血糖調節機能を有するインスリンとなる。インスリンアミノ酸配列は次の通りである。
Ａ鎖：Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ（配列番号１）
Ｂ鎖：Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ（配列番号２）
【００８３】
本発明における「基礎インスリン（basal insulin）」とは、１日の血糖値（daily blood glucose level）を正常なレベルに調節するペプチドであり、例えばレベミル（levemir）、ランタス（lantus）、デグルデク（degludec）などが挙げられる。
【００８４】
本発明における「インスリンアゴニスト」とは、インスリンの構造に関係なく、インスリンの生体内の受容体に結合してインスリンと同じ生物学的活性を示す物質を意味する。
【００８５】
前記インスリン変異体は、インスリンとアミノ酸配列が少なくとも１つ異なるペプチドであり、体内で血糖調節機能を有するペプチドである。
【００８６】
また、インスリン誘導体とは、天然インスリンと比較して、少なくとも８０％のアミノ酸配列相同性を有し、アミノ酸残基の一部の基が化学的に置換、除去又は修飾された形態であり、体内で血糖を調節する機能を有するペプチドを意味する。さらに、インスリンフラグメントは、インスリンのＮ末端又はＣ末端に１つ又はそれ以上のアミノ酸が除去された形態であり、体内で血糖調節機能を有する。
【００８７】
インスリンアゴニスト、誘導体、フラグメント及び変異体において用いる各作製方法は、単独で用いてもよく、組み合わせて用いてもよい。例えば、アミノ酸配列が少なくとも１つ異なり、Ｎ末端アミノ酸残基が脱アミノ化（deamination）された体内で血糖調節機能を有するペプチドも含まれる。本発明に用いられるインスリンは、組換え法で生産したものであってもよく、Ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ合成法で合成して生産したものであってもよい。
【００８８】
また、本発明に用いられるインスリンは、非ペプチド性重合体が結合されたものであってもよく、このような非ペプチド性重合体は、本発明においてリンカーとして用いられる。前記非ペプチド性重合体をリンカーとして用いて免疫グロブリンＦｃフラグメントを連結することにより、インスリンの活性を保持すると共に、溶解度を向上させ、さらには安定性までも向上させることができる。遺伝子組換え技術を用いたペプチドリンカーも用いることができる。
【００８９】
また、本発明は、生理活性タンパク質又はペプチドに免疫グロブリンＦｃフラグメントを結合させて前記タンパク質又はペプチドの溶解度を向上させることを特徴とするものであり、特に結合位置に制限はないが、インスリンの場合はＡ鎖を修飾すると活性が減少して安定性が低下することがあるので、Ｂ鎖に免疫グロブリンＦｃフラグメントがリンカーを介して、又は介さずに連結される。特に、インスリンＢ鎖のＮ末端に非ペプチド性リンカーを介して、又は介さずに免疫グロブリンＦｃフラグメントが連結されるが、特にこれらに限定されるものではない。
【００９０】
本発明における「オキシントモジュリン」とは、グルカゴンの前駆体であるプレグルカゴン（pre-glucagon）から作られるペプチドを意味し、天然オキシントモジュリン、前駆体（precursor）、誘導体（derivatives）、フラグメント（fragments）、変異体（variants）などが含まれる。
【００９１】
前記オキシントモジュリンは、ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＳＲＲＡＱＤＦＶＱＷＬＭＮＴＫＲＮＲＮＮＩＡのアミノ酸配列（配列番号３）を有することが好ましい。
【００９２】
前記オキシントモジュリン誘導体には、前記オキシントモジュリンの配列の一部のアミノ酸を付加、欠失又は置換して修飾することにより、ＧＬＰ−１受容体とグルカゴン受容体の両方を活性化させることができ、天然オキシントモジュリンに比べて前記各受容体を高いレベルで活性化できる、ペプチド、ペプチド誘導体、ペプチド模倣体などが含まれる。本発明におけるオキシントモジュリン誘導体は、例えば配列番号４〜３６のいずれかのアミノ酸配列を有する。
【００９３】
また、前記オキシントモジュリンフラグメントは、体内で血糖調節機能を有する。
【００９４】
さらに、前記オキシントモジュリン変異体は、天然オキシントモジュリンとアミノ酸配列が少なくとも１つ異なるペプチドであり、ＧＬＰ−１及びグルカゴン受容体活性化機能を有する。オキシントモジュリン変異体、誘導体及びフラグメントにおいて用いられる各作製方法は、単独で用いてもよく、組み合わせて用いてもよい。例えば、アミノ酸配列が少なくとも１つ異なり、Ｎ末端アミノ酸残基が脱アミノ化（deamination）されたＧＬＰ−１受容体とグルカゴン受容体の両方に対する活性化機能を有するペプチドも含まれる。
【００９５】
本発明におけるオキシントモジュリン誘導体には、配列番号３のアミノ酸配列においてアミノ酸の置換、付加、欠失又は翻訳後修飾（例えば、メチル化、アシル化、ユビキチン化、分子内の共有結合）が生じ、グルカゴン及びＧＬＰ−１受容体を同時に活性化し得る任意のペプチドが含まれる。前記アミノ酸の置換又は付加の際に、ヒトタンパク質において通常観察される２０種のアミノ酸だけでなく、非定型又は非天然アミノ酸を用いることができる。非定型アミノ酸の商業的出所には、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＣｈｅｍＰｅｐ、Ｇｅｎｚｙｍｅ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓが含まれる。これらのアミノ酸が含まれるペプチドと定型的なペプチド配列は、民間のペプチド合成会社、例えば米国のＡｍｅｒｉｃａｎ ｐｅｐｔｉｄｅ ｃｏｍｐａｎｙやＢａｃｈｅｍ、又は韓国のＡｎｙｇｅｎにおいて合成及び購入することができる。
【００９６】
具体的な一態様において、本発明のオキシントモジュリン誘導体は、一般式１のアミノ酸を含む新規なペプチドである。
【００９７】
Ｒ１−Ｘ１−Ｘ２−ＧＴＦＴＳＤ−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｘ１６−Ｘ１７−Ｘ１８−Ｘ１９−Ｘ２０−Ｘ２１−Ｘ２２−Ｘ２３−Ｘ２４−Ｒ２（一般式１）
【００９８】
上記式において、Ｒ１はヒスチジン、デスアミノ−ヒスチジル（desamino-histidyl）、ジメチル−ヒスチジル（N-dimethyl-histidyl）、β−ヒドロキシイミダゾプロピオニル（beta-hydroxyimidazopropionyl）、４−イミダゾアセチル（4-imidazoacetyl）、β−カルボキシイミダゾプロピオニル（beta-carboxy imidazopropionyl）又はチロシンであり、Ｘ１はＡｉｂ（aminoisobutyric acid）、Ｄ−アラニン、グリシン、Ｓａｒ（N-methylglycine）、セリン又はＤ−セリンであり、Ｘ２はグルタミン酸又はグルタミンであり、Ｘ３はロイシン又はチロシンであり、Ｘ４はセリン又はアラニンであり、Ｘ５はリシン又はアルギニンであり、Ｘ６はグルタミン又はチロシンであり、Ｘ７はロイシン又はメチオニンであり、Ｘ８はアスパラギン酸又はグルタミン酸であり、Ｘ９はグルタミン酸、セリン、α−メチルグルタミン酸又は欠失した配列であり、Ｘ１０はグルタミン、グルタミン酸、リシン、アルギニン、セリン又は欠失した配列であり、Ｘ１１はアラニン、アルギニン、バリン又は欠失した配列であり、Ｘ１２はアラニン、アルギニン、セリン、バリン又は欠失した配列であり、Ｘ１３はリシン、グルタミン、アルギニン、α−メチルグルタミン酸又は欠失した配列であり、Ｘ１４はアスパラギン酸、グルタミン酸、ロイシン又は欠失した配列であり、Ｘ１５はフェニルアラニン又は欠失した配列であり、Ｘ１６はイソロイシン、バリン又は欠失した配列であり、Ｘ１７はアラニン、システイン、グルタミン酸、リシン、グルタミン、α−メチルグルタミン酸又は欠失した配列であり、Ｘ１８はトリプトファン又は欠失した配列であり、Ｘ１９はアラニン、イソロイシン、ロイシン、セリン、バリン又は欠失した配列であり、Ｘ２０はアラニン、リシン、メチオニン、グルタミン、アルギニン又は欠失した配列であり、Ｘ２１はアスパラギン又は欠失した配列であり、Ｘ２２はアラニン、グリシン、トレオニン又は欠失した配列であり、Ｘ２３はシステイン、リシン又は欠失した配列であり、Ｘ２４はアラニン、グリシン及びセリンの組み合わせで構成された２〜１０個のアミノ酸を有するペプチド又は欠失した配列であり、Ｒ２はＫＲＮＲＮＮＩＡ（配列番号３７）、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号３８）、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳＫ（配列番号３９）、ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤ（配列番号４０）、ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＲＹＬＤＫ（配列番号４１）、ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＫＱＭＥＥＥＡＶＫ（配列番号４２）又は欠失した配列である（ただし、一般式１のアミノ酸配列が配列番号３と同じ場合は除く）。
【００９９】
本発明のオキシントモジュリン誘導体は、野生型オキシントモジュリンのグルカゴン受容体及びＧＬＰ−１受容体に対する活性を向上させるために、配列番号３で表されるアミノ酸配列の１番目のアミノ酸であるヒスチジンのα炭素を欠失させた４−イミダゾアセチル（4-imidazoacetyl）、Ｎ末端アミノ基を欠失させたデスアミノ−ヒスチジル（desamino-histidyl）、Ｎ末端アミノ基を２つのメチル基で修飾したジメチル−ヒスチジル（N-dimethyl-histidyl）、Ｎ末端アミノ基をヒドロキシ基に置換したβ−ヒドロキシイミダゾプロピオニル（beta-hydroxyimidazopropionyl）、又はＮ末端アミノ基をカルボキシ基に置換したβ−カルボキシイミダゾプロピオニル（beta-carboxy imidazopropionyl）に置換することができる。また、ＧＬＰ−１受容体に結合する部位を、疎水性結合とイオン結合を強化するアミノ酸に置換するか、又はそれらを組み合わせることができる。さらに、オキシントモジュリン配列の一部の配列をＧＬＰ−１のアミノ酸配列又はエキセンジン−４（Exendin-4）のアミノ酸配列に置換してＧＬＰ−１受容体の活性を向上させることができる。
【０１００】
また、オキシントモジュリン配列の一部の配列を、αヘリックスを強化する配列に置換することができる。例えば、一般式１のアミノ酸配列の１０、１４、１６、２０、２４及び２８番目のアミノ酸を、αヘリックスをサポートすることが知られているＴｙｒ（４−Ｍｅ）、Ｐｈｅ、Ｐｈｅ（４−Ｍｅ）、Ｐｈｅ（４−Ｃｌ）、Ｐｈｅ（４−ＣＮ）、Ｐｈｅ（４−ＮＯ2）、Ｐｈｅ（４−ＮＨ2）、Ｐｈｇ、Ｐａｌ、Ｎａｌ、Ａｌａ（２−ｔｈｉｅｎｙｌ）又はＡｌａ（ｂｅｎｚｏｔｈｉｅｎｙｌ）で構成されるアミノ酸又はアミノ酸誘導体に置換することができる。
【０１０１】
ここで、Ｔｙｒ（４−Ｍｅ）は、チロシンの誘導体であり、チロシンのヒドロキシル基の水素がメチル基に置換された形態である。また、Ｐｈｅ（４−Ｍｅ）は、フェニルアラニンの誘導体であり、フェニルアラニンのパラ位がメチル基に置換された形態である。さらに、Ｐｈｅ（４−Ｃｌ）は、フェニルアラニンの誘導体であり、フェニル基のパラ位が塩素に置換された形態である。さらに、Ｐｈｅ（４−ＣＮ）は、フェニルアラニンの誘導体であり、フェニル基のパラ位がシアノ基（cyanide）に置換された形態である。さらに、Ｐｈｅ（４−ＮＯ2）は、フェニルアラニンの誘導体であり、フェニル基のパラ位がニトロ基に置換された形態である。さらに、Ｐｈｅ（４−ＮＨ2）は、フェニルアラニンの誘導体であり、フェニル基のパラ位がアミンに置換された形態である。
【０１０２】
さらに、Ｐｈｇはフェニルグリシンである。さらに、Ｐａｌは、アラニンの誘導体であり、アラニンのβ−メチル基がピリジル基に置換された形態である。さらに、Ｎａｌは、アラニンの誘導体であり、アラニンのβ−メチル基がナフチル基に置換された形態である。さらに、Ａｌａ（２−ｔｈｉｅｎｙｌ）は、アラニンの誘導体であり、アラニンのβ−メチル基が２−チエニル基（2-thienyl group）に置換された形態である。さらに、Ａｌａ（ｂｅｎｚｏｔｈｉｅｎｙｌ）は、アラニンの誘導体であり、アラニンのβ−メチル基がベンゾチエニル基に置換された形態である。
【０１０３】
αヘリックス構造を強化するために挿入するアミノ酸又はアミノ酸誘導体の種類や数には制限がない。また、具体的な一実施形態においては、アミノ酸残基間に分子内の環を形成することができる。例えば、１０番目と１４番目、１２番目と１６番目、１６番目と２０番目、２０番目と２４番目、及び２４番目と２８番目の位置に分子内の環を形成することができ、その際に用いる残基としては、例えばグルタミン酸とリシンの対を該当位置に置換して用いることができる。本発明の方法により溶解度を改善できるオキシントモジュリン誘導体において、その中に形成される分子内の環の数は特に限定されるものではない。
【０１０４】
一実施形態において、本発明の方法により溶解度を改善できるオキシントモジュリン又はその誘導体は、一般式２〜６から選択されるアミノ酸配列を有するオキシントモジュリン誘導体であってもよい。具体的な一態様において、本発明のオキシントモジュリン誘導体は、オキシントモジュリンのアミノ酸配列にエキセンジン又はＧＬＰ−１の配列に置換した一般式２のアミノ酸を含むペプチドである。
【０１０５】
Ｒ１−Ａ’−Ｒ３（一般式２）
【０１０６】
他の具体的な態様において、本発明のオキシントモジュリン誘導体は、オキシントモジュリンのアミノ酸配列の一部と、エキセンジン又はＧＬＰ−１の配列の一部とを適当なアミノ酸リンカーで連結した一般式３のアミノ酸を含むペプチドである。
【０１０７】
Ｒ１−Ｂ’−Ｃ’−Ｒ４（一般式３）
【０１０８】
さらに他の具体的な態様において、本発明のオキシントモジュリン誘導体は、オキシントモジュリンのアミノ酸配列の一部をＧＬＰ−１受容体との結合力を向上させるアミノ酸に置換したものを用いることができる。例えば、天然オキシントモジュリンの２６番目のロイシンはＧＬＰ−１受容体と疎水性結合を行うが、疎水性を増加させるアミノ酸であるＩｌｅ又はＶａｌに置換することにより、ＧＬＰ−１受容体に対する結合力を向上させることができる。より具体的には、このように受容体結合力を向上（Ｄ６置換）させたオキシントモジュリンペプチドを含むペプチドを一般式４に示す。
【０１０９】
Ｒ１−ＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤ−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｄ４−Ｄ５−ＬＦＶＱＷ−Ｄ６−Ｄ７−Ｎ−Ｄ８−Ｒ３（一般式４）
【０１１０】
さらに他の具体的な態様において、本発明のオキシントモジュリン誘導体は、固有のオキシントモジュリンのＧＬＰ−１受容体とグルカゴン受容体の活性を向上させるために、アミノ酸配列の一部を欠失させるか、アミノ酸の一部を挿入するか、アミノ酸の一部を他のアミノ酸に置換した一般式５を含むペプチドである。
【０１１１】
Ｒ１−Ｅ１−ＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤ−Ｅ２−Ｅ３−ＲＡ−Ｅ４−Ｅ５−ＦＶ−Ｅ６−ＷＬＭＮＴ−Ｅ７−Ｒ５（一般式５）
【０１１２】
一般式２〜５において、Ｒ１は一般式１における構成と同一であり、Ａ’はＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＳＲＲＡＱＤＦＶＱＷＬＭＮＴ（配列番号４３）、ＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＭＮＴ（配列番号４４）、ＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＥＲＲＡＱＤＦＶＡＷＬＫＮＴ（配列番号４５）、ＧＱＧＴＦＴＳＤＹＳＲＹＬＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＫＮＧ（配列番号４６）、ＧＱＧＴＦＴＳＤＹＳＲＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＫＮＧ（配列番号４７）、ＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＲＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＡＡ（配列番号４８）及びＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＲＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＭＮＧ（配列番号４９）から構成される群から選択され、Ｂ’はＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＳＲＲＡＱＤＦＶＱＷＬＭＮＴ（配列番号４３）、ＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＭＮＴ（配列番号４４）、ＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＥＲＲＡＱＤＦＶＡＷＬＫＮＴ（配列番号４５）、ＧＱＧＴＦＴＳＤＹＳＲＹＬＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＫＮＧ（配列番号４６）、ＧＱＧＴＦＴＳＤＹＳＲＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＫＮＧ（配列番号４７）、ＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＲＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＡＡ（配列番号４８）、ＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＲＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＭＮＧ（配列番号４９）、ＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＲＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷ（配列番号５０）及びＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＲＹＬＤ（配列番号５１）からなる群から選択され、Ｃ’はアラニン、グリシン及びセリンの組み合わせで構成された２〜１０個のアミノ酸を有するペプチドであり、Ｄ１はセリン、グルタミン酸又はアルギニンであり、Ｄ２はアルギニン、グルタミン酸又はセリンであり、Ｄ３はアルギニン、アラニン又はバリンであり、Ｄ４はアルギニン、バリン又はセリンであり、Ｄ５はグルタミン、アルギニン又はリシンであり、Ｄ６はイソロイシン、バリン又はセリンであり、Ｄ７はメチオニン、アルギニン又はグルタミンであり、Ｄ８はトレオニン、グリシン又はアラニンであり、Ｅ１はセリン、Ａｉｂ、Ｓａｒ、Ｄ−アラニン又はＤ−セリンであり、Ｅ２はセリン又はグルタミン酸であり、Ｅ３はアルギニン又はリシンであり、Ｅ４はグルタミン又はリシンであり、Ｅ５はアスパラギン酸又はグルタミン酸であり、Ｅ６はグルタミン、システイン又はリシンであり、Ｅ７はシステイン、リシン又は欠失した配列であり、Ｒ３はＫＲＮＲＮＮＩＡ（配列番号３７）、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号３８）又はＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳＫ（配列番号３９）であり、Ｒ４はＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤ（配列番号４０）、ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＲＹＬＤＫ（配列番号４１）又はＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＫＱＭＥＥＥＡＶＫ（配列番号４２）であり、Ｒ５はＫＲＮＲＮＮＩＡ（配列番号３７）、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号３８）、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳＫ（配列番号３９）又は欠失した配列である（ただし、一般式２〜５のアミノ酸配列が配列番号３と同じ場合は除く）。
【０１１３】
本発明のオキシントモジュリン誘導体は、一般式６のペプチドであることが好ましい。
【０１１４】
Ｒ１−Ｘ１−Ｘ２−ＧＴＦＴＳＤ−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｘ１６−Ｘ１７−Ｘ１８−Ｘ１９−Ｘ２０−Ｘ２１−Ｘ２２−Ｘ２３−Ｘ２４−Ｒ２（一般式６）
【０１１５】
一般式６において、Ｒ１はヒスチジン、デスアミノ−ヒスチジル（desamino-histidyl）、４−イミダゾアセチル（4-imidazoacetyl）又はチロシンであり、Ｘ１はＡｉｂ（aminoisobutyric acid）、グリシン、セリン又はＤ−セリンであり、Ｘ２はグルタミン酸又はグルタミンであり、Ｘ３はロイシン又はチロシンであり、Ｘ４はセリン又はアラニンであり、Ｘ５はリシン又はアルギニンであり、Ｘ６はグルタミン又はチロシンであり、Ｘ７はロイシン又はメチオニンであり、Ｘ８はアスパラギン酸又はグルタミン酸であり、Ｘ９はグルタミン酸、α−メチルグルタミン酸又は欠失した配列であり、Ｘ１０はグルタミン、グルタミン酸、リシン、アルギニン又は欠失した配列であり、Ｘ１１はアラニン、アルギニン又は欠失した配列であり、Ｘ１２はアラニン、バリン又は欠失した配列であり、Ｘ１３はリシン、グルタミン、アルギニン、α−メチルグルタミン酸又は欠失した配列であり、Ｘ１４はアスパラギン酸、グルタミン酸、ロイシン又は欠失した配列であり、Ｘ１５はフェニルアラニン又は欠失した配列であり、Ｘ１６はイソロイシン、バリン又は欠失した配列であり、Ｘ１７はアラニン、システイン、グルタミン酸、グルタミン、α−メチルグルタミン酸又は欠失した配列であり、Ｘ１８はトリプトファン又は欠失した配列であり、Ｘ１９はアラニン、イソロイシン、ロイシン、バリン又は欠失した配列であり、Ｘ２０はアラニン、リシン、メチオニン、アルギニン又は欠失した配列であり、Ｘ２１はアスパラギン又は欠失した配列であり、Ｘ２２はトレオニン又は欠失した配列であり、Ｘ２３はシステイン、リシン又は欠失した配列であり、Ｘ２４はグリシンで構成された２〜１０個のアミノ酸を有するペプチド又は欠失した配列であり、Ｒ２はＫＲＮＲＮＮＩＡ（配列番号３７）、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号３８）、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳＫ（配列番号３９）、ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤ（配列番号４０）、ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＲＹＬＤＫ（配列番号４１）、ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＫＱＭＥＥＥＡＶＫ（配列番号４２）又は欠失した配列である（ただし、一般式６のアミノ酸配列が配列番号３と同じ場合は除く）。
【０１１６】
本発明のオキシントモジュリン誘導体は、配列番号４〜３６のペプチドからなる群から選択されるものであることがより好ましい。
【０１１７】
オキシントモジュリンは、ＧＬＰ−１とグルカゴンの２つのペプチド活性を有し、ＧＬＰ−１にはインスリン分泌による血糖降下効力があるが、グルカゴンには血糖上昇効力があり、ＧＬＰ−１には食物摂取抑制と胃排出遅延、グルカゴンには脂肪分解及びエネルギー代謝量増加による体重減少効力など異なる生物学的効能がある。よって、１つのペプチドに前述した２つのペプチドが存在する場合、いずれか一方の効力が大きいと望ましくない効力を発揮することがある。例えば、グルカゴンの効力がＧＬＰ−１の効力より大きいと血糖が上昇することがあり、ＧＬＰ−１の効力が大きいと吐気や嘔吐などの副作用が大きくなることがある。また、２つのペプチドの活性比率によって全体の効力が変化し得る。
【０１１８】
本発明における「インスリン分泌ペプチド」とは、インスリン分泌機能を有するペプチドを意味する。前記インスリン分泌ペプチドは、膵臓β細胞のインスリンの合成及び発現を刺激することができる。このようなインスリン分泌ペプチドの例として、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、グルカゴン様ペプチド−２（ＧＬＰ−２）、エキセンジン−３（exendin-3）、エキセンジン−４（exendin-4）、イミダゾ−アセチルエキセンジン−４（Imidazoacetyl(CA)exendin-4）、又はグルコース依存性インスリン分泌ペプチド（glucose-dependent insulinotropic peptide, GIP）が挙げられるが、インスリン分泌機能を有するペプチドであればいかなるものでもよく、これらに限定されるものではない。本発明に用いられるインスリン分泌ペプチドには、天然インスリン分泌ペプチドだけでなく、その誘導体、変異体又はフラグメントの形態が全て含まれ、その一般的な内容については前述した通りである。
【０１１９】
このようなＧＬＰ−１、エキセンジン−３又はエキセンジン−４、及びその誘導体に関しては、オキシントモジュリン誘導体の例について記述した特許文献６（又は特許文献７）、及びインスリン分泌ペプチド誘導体の例について記述した特許文献８（又は特許文献９）に開示されている内容が全て含まれ、上記特許の明細書全体が本発明に参照として取り込まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１２０】
本発明における「グルカゴン」とは、血糖値を引き上げるペプチドホルモンを意味する。前記グルカゴンは、肝臓においてグリコーゲンをブドウ糖に分解して血糖量を増加させる作用を有する。
【０１２１】
一方、天然グルカゴンは下記配列を有する。
Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ（配列番号５２）
【０１２２】
また、本発明に用いられるグルカゴンには、天然グルカゴンだけでなく、その誘導体、変異体又はフラグメントの形態が全て含まれ、その一般的な内容については前述した通りである。
【０１２３】
本発明における「副甲状腺ホルモン（parathyroid hormone, PTH）」とは、副甲状腺が分泌するホルモンであり、血中カルシウム濃度を増加させる活性を有する。前記副甲状腺ホルモンのアミノ酸配列などの情報については、米国国立衛生研究所のＧｅｎＢａｎｋなどの公知のデータベースから得ることができる。また、前記副甲状腺ホルモンには、天然副甲状腺ホルモンだけでなく、その誘導体、変異体又はフラグメントの形態が全て含まれる。
【０１２４】
本発明における「カルシトニン（Calcitonin）」とは、血液中のカルシウム濃度を調節する甲状腺ホルモンであり、血中カルシウム濃度を低下させる活性を有する。前記カルシトニンのアミノ酸配列などの情報については、米国国立衛生研究所のＧｅｎＢａｎｋなどの公知のデータベースから得ることができる。また、前記カルシトニンには、天然カルシトニンだけでなく、その誘導体、変異体、又はフラグメントの形態が全て含まれる。
【０１２５】
一方、本発明による方法は、界面活性剤を含まなくても生理活性タンパク質又はペプチドの溶解度を効果的に増加させることができるが、溶解度をさらに増加させるために界面活性剤を共に用いてもよい。
【０１２６】
すなわち、水溶液に界面活性剤を共に含ませて生理活性タンパク質又はペプチドに免疫グロブリンＦｃフラグメントが結合された持続型結合体を封入したミセル（micelle）を形成させることにより、前記結合体の溶解度をさらに増加させてもよい。
【０１２７】
また、本発明の他の態様は、免疫グロブリンＦｃフラグメントを含む、免疫グロブリンＦｃフラグメントを含まない組成物に比べて改善された溶解度を示すことを特徴とする、生理活性タンパク質又はペプチドの溶解度改善用組成物に関する。
【０１２８】
ここで、前記組成物は、生理活性タンパク質又はペプチドと免疫グロブリンＦｃフラグメントがペプチド性リンカー又は非ペプチド性リンカーで連結された、生理活性タンパク質又はペプチドと免疫グロブリンＦｃフラグメントの結合体を有効成分として含むことを特徴とする。
【０１２９】
本発明の一実施例においては、代表的な生理活性ペプチドであるインスリン及びオキシントモジュリンを用いて、それらに免疫グロブリンＦｃをそれぞれ結合させた場合に、弱酸性のｐＨでインスリン及びオキシントモジュリンの溶解度を増加させることができるか否かを確認した。その結果、免疫グロブリンＦｃフラグメントを結合させると、そうでない場合に比べてインスリン及びオキシントモジュリンの溶解度が大幅に増加した（表２及び３，図２，表５及び６，図４）。これらの結果は、本発明の方法がタンパク質又はペプチドの溶解度を向上させることができること、特に中性や弱酸性の条件で溶解度が非常に低いため薬理学的に有効な濃度に作製することが困難であったタンパク質又はペプチドの溶解度を画期的に向上させることができることを示すものである。
【０１３０】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明する。しかし、これらの実施例は本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【０１３１】
［実施例１］
インスリン及び持続型インスリン結合体の溶解度評価
（１）持続型インスリン結合体の作製
インスリン粉末を１０ｍＭ ＨＣｌに溶解し、その後３．４Ｋ ｐｒｏｐｉｏｎ−ＡＬＤ２ ＰＥＧ（プロピオンアルデヒド基を２つ有するＰＥＧ，ＮＯＦ社，日本）をインスリンＢ鎖のＮ末端にペグ化（PEGylation）させるために、インスリン：ＰＥＧのモル比を１：２とし、インスリン濃度を５ｍｇ／ｍｌとして、４℃で約２時間反応させた。ここで、反応は５０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ５．０）、４５％イソプロパノールにおいて行われ、２〜２０ｍＭの濃度のシアノ水素化ホウ素酸ナトリウム還元剤を添加して反応させた。反応液はクエン酸ナトリウム（ｐＨ３．０）バッファとＫＣｌ濃度勾配を用いたＳＰ−ＨＰ（GE Healthcare）カラムにかけて精製した。インスリン−ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃフラグメント結合体を作製するために、モノペグ化（mono-PEGylated）インスリンと免疫グロブリンＦｃフラグメントのモル比を１：１．２とし、総タンパク質濃度を２０ｍｇ／ｍｌとして、常温で１３時間反応させた。ここで、反応液は１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２２ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ８．２であり、還元剤として２０ｍＭシアノ水素化ホウ素酸ナトリウムを添加した。
【０１３２】
反応終了後に、反応液は第１次としてＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）バッファとＮａＣｌ濃度勾配を用いたＱ ｓｅｐｈａｒｏｄｅ ＨＰ（GE Healthcare）カラムにかけ、第２次としてＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）バッファと硫酸アンモニウムの濃度勾配を用いたＳｏｕｒｃｅ １５ ＩＳＯ（GE Healthcare）にかけてインスリン−ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ結合体を最終精製した。
【０１３３】
（２）インスリン及び持続型インスリン結合体の溶解度評価の実験
インスリン及び持続型インスリン結合体の溶解度を確認するために、表１の組成でそれぞれインスリン及び持続型インスリン結合体の標準品及び試験物質を作製した。
【０１３４】
前記インスリン及び持続型インスリン結合体試験物質は、ｐＨ６．０であり、酢酸緩衝液、非イオン性界面活性剤としてのポリソルベート、糖アルコールとしてのマンニトール、等張化剤としての塩化ナトリウムを含む組成を有する。また、表２及び３の定量値に従って常温で溶解させ、完全に溶解していないインスリン試験物質は遠心分離後にその上清のみ回収して溶解度試験に用いた。
【０１３５】
ここで、インスリン試験物質の理論定量値のうち最大定量値は、持続型インスリン結合体１００ｍｇ／ｍＬをインスリンに換算すると定量値が約１０ｍｇ／ｍＬとなるが、この値を最大定量値に選定し、最大定量値で溶解したインスリン試験物質を希釈し続けて異物やペレットがなくなった完全溶解時点のインスリン量（０．００８ｍｇ／ｍＬ）を最小定量値に選定した。
【０１３６】
逆相クロマトグラフィー法（Reverse Phase-High Performance Liquid Chromatography, RP-HPLC）を用いて、図１に示すインスリン及び持続型インスリン結合体の標準検量曲線（Standard curve）を先に確認した。逆相クロマトグラフィー法で確認されたインスリン及び持続型インスリン結合体試験物質のピーク面積値を標準検量曲線に代入してインスリン及び持続型インスリン結合体の定量値を計算した。その結果を表２及び３並びに図２に示す。
【０１３７】
【表１】
2020040983.tif 000002
【０１３８】
【表２】
2020040983.tif 000003
【０１３９】
【表３】
2020040983.tif 000004
【０１４０】
表２及び３から分かるように、持続型インスリン結合体剤形バッファに溶解した持続型インスリン結合体試験物質の定量値は理論値と実際の測定値が類似しているのに対して、持続型インスリン結合体剤形バッファに溶解したインスリン試験物質の定量値は理論値と実際の測定値に大きな差が確認された（最大で約１６倍の差）。また、持続型インスリン結合体剤形バッファにインスリン試験物質を溶解させた場合、０．００８ｍｇ／ｍＬを除く他の全てにおいて溶解後に遠心分離するとペレットが確認された。
【０１４１】
これらの結果から分かるように、持続型インスリン結合体のキャリアとして用いられた免疫グロブリンＦｃフラグメントにより溶解度が改善された。
【０１４２】
［実施例２］
オキシントモジュリン及び持続型オキシントモジュリン結合体の溶解度評価
（１）持続型オキシントモジュリン誘導体結合体の作製
ＭＡＬ−１０Ｋ−ＡＬＤ ＰＥＧ（ＮＯＦ，日本）を配列番号２７のオキシントモジュリン誘導体のアミノ酸配列の３０番目のシステイン残基にペグ化させるために、前記オキシントモジュリン誘導体とＭＡＬ−１０Ｋ−ＡＬＤ ＰＥＧのモル比を１：１とし、オキシントモジュリン誘導体の濃度を３ｍｇ／ｍＬとして、４℃で１時間反応させた。ここで、反応は５０ｍＭトリス（Tris）（ｐＨ７．５）に６０％イソプロパノールが添加された環境下で行われた。反応終了後に、前記反応液をクエン酸ナトリウム（ｐＨ３．０）バッファとＫＣｌ濃度勾配を用いたＳＰ ＨＰ（GE healthcare, Sweden）にかけてシステインにモノペグ化されたオキシントモジュリン誘導体を精製した。
【０１４３】
次に、前述したように精製されたモノペグ化オキシントモジュリン誘導体と免疫グロブリンＦｃのモル比を１：４とし、タンパク質濃度を２０ｍｇ／ｍＬとして、４℃で１６時間反応させた。ここで、反応は１００ｍＭ Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｐＨ６．０）に還元剤である２０ｍＭ ＳＣＢが添加された環境下で行われた。反応終了後に、前記反応液は第１次としてビストリスバッファとＮａＣｌ濃度勾配を用いたＢｕｔｙｌ ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ精製カラム（GE healthcare, Sweden）にかけ、第２次としてクエン酸ナトリウムバッファと硫酸アンモニウムの濃度勾配を用いたＳｏｕｒｃｅ ＩＳＯ精製カラム（GE healthcare, Sweden）にかけてオキシントモジュリン誘導体−ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃを含む結合体を精製した。
【０１４４】
（２）オキシントモジュリン及び持続型オキシントモジュリン結合体の溶解度評価の実験
配列番号２７のオキシントモジュリン誘導体及び持続型オキシントモジュリン誘導体結合体の溶解度を確認するために、表４の組成でそれぞれオキシントモジュリン誘導体及び持続型オキシントモジュリン誘導体結合体の標準品及び試験物質を作製した。
【０１４５】
前記オキシントモジュリン誘導体及び持続型オキシントモジュリン誘導体結合体試験物質は、ｐＨ５．６であり、クエン酸緩衝液、非イオン性界面活性剤としてのポリソルベート、糖アルコールとしてのマンニトール、メチオニンを含む組成を有する。また、表５及び６の定量値に従って常温で溶解させ、完全に溶解していないオキシントモジュリン誘導体試験物質は遠心分離後にその上清のみ回収して溶解度試験に用いた。
【０１４６】
ここで、オキシントモジュリン誘導体試験物質の理論定量値のうち最大定量値は、持続型オキシントモジュリン誘導体結合体８０ｍｇ／ｍＬをオキシントモジュリン誘導体に換算すると定量値が約５ｍｇ／ｍＬとなるが、この値を最大定量値に選定し、最大定量値で溶解したオキシントモジュリン誘導体試験物質を希釈し続けて異物やペレットがなくなった完全溶解時点のオキシントモジュリン誘導体量（０．００８ｍｇ／ｍＬ）を最小定量値に選定した。
【０１４７】
逆相クロマトグラフィー法を用いて、図３に示すオキシントモジュリン誘導体及び持続型オキシントモジュリン誘導体結合体の標準検量曲線（Standard curve）を先に確認した。逆相クロマトグラフィー法で確認されたオキシントモジュリン誘導体及び持続型オキシントモジュリン誘導体結合体試験物質のピーク面積値を標準検量曲線に代入してオキシントモジュリン誘導体及び持続型オキシントモジュリン誘導体結合体の定量値を計算した。
【０１４８】
【表４】
2020040983.tif 000005
【０１４９】
【表５】
2020040983.tif 000006
【０１５０】
【表６】
2020040983.tif 000007
【０１５１】
表５及び６並びに図４から分かるように、持続型オキシントモジュリン結合体剤形バッファに溶解した持続型オキシントモジュリン誘導体結合体試験物質の定量値は理論値と実際の測定値が類似しているのに対して、持続型オキシントモジュリン結合体剤形バッファに溶解したオキシントモジュリン誘導体試験物質の定量値は理論値と実際の測定値に大きな差が確認された（最大で約２７倍の差）。また、持続型オキシントモジュリン結合体剤形バッファにオキシントモジュリン誘導体試験物質を溶解させた場合、０．００８ｍｇ／ｍＬを除く他の全てにおいて溶解後に遠心分離するとペレットが確認された。これらの結果から分かるように、持続型オキシントモジュリン誘導体結合体のキャリアとして用いられた免疫グロブリンＦｃフラグメントによりオキシントモジュリン誘導体の溶解度が改善された。
【０１５２】
これらの結果は、本発明の生理活性タンパク質及びペプチドのキャリアとして用いられる免疫グロブリンＦｃフラグメントがタンパク質及びペプチドの溶解度を効果的に改善できることを示すものである。
【０１５３】
以上の説明から、本発明の属する技術分野の当業者であれば、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施できることを理解するであろう。なお、上記実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本発明の範囲は、明細書ではなく特許請求の範囲の意味及び範囲とその等価概念から導かれるあらゆる変更や変形された形態を含むものであると解釈すべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年11月25日(2019.11.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫グロブリンＦｃフラグメントを生理活性タンパク質又はペプチドに結合させて、免疫グロブリンＦｃフラグメントが結合されていない生理活性タンパク質又はペプチドに比べて生理活性タンパク質又はペプチドの溶解度を改善するための、免疫グロブリンＦｃフラグメントを含む薬剤。
【請求項２】
前記免疫グロブリンＦｃフラグメントは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ又はＩｇＭに由来するＦｃフラグメントである請求項１に記載の薬剤。
【請求項３】
前記免疫グロブリンＦｃフラグメントは、それぞれのドメインがＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ及びＩｇＭからなる群から選択される免疫グロブリンに由来する異なる起源を有するドメインのハイブリッドである請求項２に記載の薬剤。
【請求項４】
前記免疫グロブリンＦｃフラグメントは、同一起源のドメインからなる単鎖免疫グロブリンで構成された二量体又は多量体である請求項２に記載の薬剤。
【請求項５】
前記免疫グロブリンＦｃフラグメントは、ヒト非グリコシル化ＩｇＧ４ Ｆｃフラグメントである請求項４に記載の薬剤。
【請求項６】
前記結合させることは、生理活性タンパク質又はペプチドと免疫グロブリンＦｃフラグメントを非ペプチド性重合体を介して結合させることである請求項１に記載の薬剤。
【請求項７】
生理活性タンパク質又はペプチドと免疫グロブリンＦｃフラグメントが結合された物質は、融合タンパク質の形態である請求項１に記載の薬剤。
【請求項８】
前記非ペプチド性重合体は、ポリエチレングリコールである請求項６に記載の薬剤。
【請求項９】
前記非ペプチド性重合体は、ポリプロピレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールの共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、ＰＬＡ（ポリ乳酸，polylactic acid）やＰＬＧＡ（ポリ乳酸−グリコール酸，polylactic-glycolic acid）などの生分解性高分子、脂質重合体、キチン、ヒアルロン酸及びそれらの組み合わせからなる群から選択される請求項６に記載の薬剤。
【請求項１０】
水溶液において生理活性タンパク質又はペプチドの溶解度を改善するためのものである請求項１に記載の薬剤。
【請求項１１】
前記水溶液は、クエン酸又は酢酸緩衝液、非イオン性界面活性剤としてのポリソルベート、糖アルコールとしてのマンニトール、及び等張化剤としての塩化ナトリウム又はメチオニンを含む請求項１０に記載の薬剤。
【請求項１２】
前記水溶液は、ｐＨ５．０〜７．０である請求項１０に記載の薬剤。
【請求項１３】
前記生理活性タンパク質又はペプチドは、エキセンジン−４、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、グルカゴン様ペプチド−２（ＧＬＰ−２）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、カルシトニン、インスリン又はオキシントモジュリンである請求項１に記載の薬剤。
【請求項１４】
免疫グロブリンＦｃフラグメントを生理活性タンパク質又はペプチドに結合させて、免疫グロブリンＦｃフラグメントが結合されていない生理活性タンパク質又はペプチドに比べて生理活性タンパク質又はペプチドの溶解度を改善するための、免疫グロブリンＦｃフラグメントの使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５３】
以上の説明から、本発明の属する技術分野の当業者であれば、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施できることを理解するであろう。なお、上記実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本発明の範囲は、明細書ではなく特許請求の範囲の意味及び範囲とその等価概念から導かれるあらゆる変更や変形された形態を含むものであると解釈すべきである。
次に、本発明の好ましい態様を示す。
１．  生理活性タンパク質又はペプチドを免疫グロブリンＦｃフラグメントに結合させるステップを含む、免疫グロブリンＦｃフラグメントが結合されていない生理活性タンパク質又はペプチドに比べて生理活性タンパク質又はペプチドの溶解度を改善する方法。
２．  前記免疫グロブリンＦｃフラグメントは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ又はＩｇＭに由来するＦｃフラグメントである上記１に記載の方法。
３．  前記免疫グロブリンＦｃフラグメントは、それぞれのドメインがＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ及びＩｇＭからなる群から選択される免疫グロブリンに由来する異なる起源を有するドメインのハイブリッドである上記２に記載の方法。
４．  前記免疫グロブリンＦｃフラグメントは、同一起源のドメインからなる単鎖免疫グロブリンで構成された二量体又は多量体である上記２に記載の方法。
５．  前記免疫グロブリンＦｃフラグメントは、ヒト非グリコシル化ＩｇＧ４ Ｆｃフラグメントである上記４に記載の方法。
６．  前記結合させるステップは、生理活性タンパク質又はペプチドと免疫グロブリンＦｃフラグメントを非ペプチド性重合体を介して結合させるものである上記１に記載の方法。
７．  前記方法により製造した、生理活性タンパク質又はペプチドと免疫グロブリンＦｃフラグメントが結合された物質は、融合タンパク質の形態である上記１に記載の方法。
８．  前記非ペプチド性重合体は、ポリエチレングリコールである上記６に記載の方法。
９．  前記非ペプチド性重合体は、ポリプロピレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールの共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、ＰＬＡ（ポリ乳酸，polylactic acid）やＰＬＧＡ（ポリ乳酸−グリコール酸，polylactic-glycolic acid）などの生分解性高分子、脂質重合体、キチン、ヒアルロン酸及びそれらの組み合わせからなる群から選択される上記６に記載の方法。
１０．  前記方法は、水溶液において生理活性タンパク質又はペプチドの溶解度を改善する上記１に記載の方法。
１１．  前記水溶液は、クエン酸又は酢酸緩衝液、非イオン性界面活性剤としてのポリソルベート、糖アルコールとしてのマンニトール、及び等張化剤としての塩化ナトリウム又はメチオニンを含む上記１０に記載の方法。
１２．  前記水溶液は、ｐＨ５．０〜７．０である上記１０に記載の方法。
１３．  前記生理活性タンパク質又はペプチドは、エキセンジン−４、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、グルカゴン様ペプチド−２（ＧＬＰ−２）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、カルシトニン、インスリン又はオキシントモジュリンである上記１に記載の方法。
１４．  免疫グロブリンＦｃフラグメントを含む、免疫グロブリンＦｃフラグメントを含まない組成物に比べて改善された溶解度を示すことを特徴とする、生理活性タンパク質又はペプチドの溶解度改善用組成物。
１５．  前記組成物は、生理活性タンパク質又はペプチドが免疫グロブリンＦｃフラグメントにペプチド性リンカー又は非ペプチド性リンカーを介して連結された、生理活性タンパク質又はペプチドと免疫グロブリンＦｃフラグメントの結合体を有効成分として含む上記１４に記載の組成物。