(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒトＴリンパ球からｉＰＳ細胞を樹立することに加え、さらに、樹立したｉＰＳ細胞を、元のヒトＴリンパ球が有していたＴＣＲ遺伝子の組み換え構造を保ったまま、機能的なＴリンパ球へ分化誘導する方法の提供。【解決手段】ヒトＴ細胞からｉＰＳ細胞を誘導する工程と、該ｉＰＳ細胞をＴ細胞に分化させる工程とを含む、ヒトＴ細胞を製造する方法、該方法によって製造されたＴ細胞を含有する医薬組成物、並びに該方法を利用する免疫細胞治療の方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＴ細胞を製造する方法であって、
ヒトＴ細胞からｉＰＳ細胞を誘導する工程と、
該ｉＰＳ細胞をＴ細胞に分化させる工程と
を含む、方法。
【請求項２】
前記ヒトＴ細胞は、ＣＤ４及びＣＤ８からなる群から選択される少なくとも一の分子が発現しているＴ細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ｉＰＳ細胞へ誘導されるＴ細胞が抗原特異性を有する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ｉＰＳ細胞へ誘導されるＴ細胞とｉＰＳ細胞から分化させるＴ細胞の抗原特異性が同一である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
請求項１から４のいずれかに記載の方法により製造されたヒトＴ細胞。
【請求項６】
請求項５に記載のヒトＴ細胞を含有する、医薬組成物。
【請求項７】
ヒトより所望の抗原特異性を有するＴ細胞を単離する工程と、
該所望の抗原特異性を有するＴ細胞からｉＰＳ細胞を誘導する工程と、
該ｉＰＳ細胞をＴ細胞に分化させる工程と、
得られたｉＰＳ細胞由来Ｔ細胞をヒトの体内に投与する工程と
を含む、免疫細胞治療の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多能性幹細胞を用いた免疫機能再建法に関し、より詳しくは、ヒトＴ細胞を製造する方法、該方法によって製造されたＴ細胞を含有する医薬組成物、該方法を利用する免疫細胞治療の方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
様々な原因により生じる免疫機能低下において、免疫細胞等の補充や再生をすることができれば、疾患の病態改善や治療効果の向上などに極めて有効な手段となる。特に細胞性免疫を担うＴリンパ球の機能補充や再生が強く求められているが、現在有効な治療方法は確立されていない。免疫作用は特異性を特徴とするが、この特異性をうまく利用することが困難なところに大きな原因がある。
【０００３】
近年の遺伝子操作技術の飛躍的な進歩により、抗原特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子を各種リンパ球系細胞に遺伝子導入し、特異的免疫反応を補充や再生する試みがなされている（非特許文献１〜２）。これらの試みでは遺伝子導入細胞として骨髄前駆細胞であるＣＤ３４陽性細胞や、ナイーブＴリンパ球などが用いられているが、これらは、Ｅｘ−ｖｉｖｏでの自己再生能が低い、遺伝子導入の効率が低い、遺伝子導入による分化の調節が困難である、など多くの課題を有している。
【０００４】
また、近年、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）及び人工多能性幹細胞（誘導性多能性幹細胞、ｉＰＳ細胞）が、ヒトを含む多くの動物種より樹立されている。これらの多能性幹細胞は、多能性を維持したまま旺盛な分裂能力を保持するとともに、適切に分化誘導することにより、ほぼ全ての臓器に分化し得ることから、再生医療に最も有用な細胞供給源であると考えられている。特にｉＰＳ細胞は自己由来の体細胞から樹立することが可能であることから、胚を破壊して作るＥＳ細胞に比べ、倫理的や社会的な問題が生じにくく、さらに自己由来であることから、再生医療や移植医療にとって最も大きな壁となる拒絶反応の回避も可能となる。
【０００５】
ｉＰＳ細胞は体細胞を様々な方法で初期化することにより樹立できる。初期化されたｉＰＳ細胞は初期化に用いた遺伝子情報をそのまま引き継ぐことから、免疫系の細胞、特にＢリンパ球やＴリンパ球のように遺伝子を再構成し、終末分化したものにおいても初期化が可能であるかどうかは大きな興味の対象であった。そのような中、マウスＢリンパ球からのｉＰＳ細胞の樹立は、Ｊａｅｎｉｓｃｈ等により２００８年に報告され（非特許文献３）、マウスＴリンパ球からのｉＰＳ細胞の樹立はＹａｍａｎａｋａ等により２００９年に報告された（非特許文献４）。しかしながら、ヒトのＴリンパ球からｉＰＳ細胞を樹立したという報告はない。
【０００６】
Ｔリンパ球を利用した免疫療法を実現するためには、ヒトのＴリンパ球からｉＰＳ細胞を樹立することに加え、さらに、樹立したｉＰＳ細胞を、元のヒトＴリンパ球が有していたＴＣＲ遺伝子の組み換え構造を保ったまま、機能的なＴリンパ球への分化を誘導することが必要であるが、このような技術は、いまだ確立されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｇａｔｔｉｎｏｎｉ  Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２００６年、６巻、３８３〜３９３ページ
【非特許文献２】Ｍｏｒｇａｎ  Ｒ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００６年、３１４巻、１２６〜１２９ページ
【非特許文献３】Ｈａｎｎａ  Ｊ．ら、Ｃｅｌｌ、２００８年、１３３巻、２号、２５０〜２６４ページ
【非特許文献４】Ｈｏｎｇ  Ｈ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、２００９年、４６０巻、１１３２〜１１３５ページ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、上記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、ヒトＴリンパ球からｉＰＳ細胞を樹立し、さらに、樹立したｉＰＳ細胞を、元のヒトＴリンパ球が有していたＴＣＲ遺伝子の組み換え構造を保ったまま、機能的なＴリンパ球へ分化誘導しうる方法を提供することにある。さらなる本発明の目的は、こうして製造されたＴ細胞を含有する医薬組成物、並びにこうして製造されたＴ細胞を利用した免疫細胞治療の方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、元となったヒトＴリンパ球と同じＴＣＲ再構成状態を維持したまま、ヒトＴ細胞からｉＰＳ細胞を樹立することに成功した。さらに、本発明者らは、こうして樹立したヒトＴ細胞由来のｉＰＳ細胞（ＴｉＰＳ細胞）から、元となったヒトＴリンパ球と同じＴＣＲ再構成状態を維持したまま、サイトカイン産生能等を有する機能的なＴ細胞を分化誘導することに成功した。そして、このようにして得られたヒトＴ細胞を患者体内に移植することにより、理想的な免疫細胞治療を行うことが可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
本発明は、より詳しくは、以下の発明を提供するものである。
（１）ヒトＴ細胞を製造する方法であって、ヒトＴ細胞からｉＰＳ細胞を誘導する工程と、該ｉＰＳ細胞をＴ細胞に分化させる工程とを含む、方法。
（２）前記ヒトＴ細胞は、ＣＤ４及びＣＤ８からなる群から選択される少なくとも一の分子が発現しているＴ細胞である、（１）に記載の方法。
（３）ｉＰＳ細胞へ誘導されるＴ細胞が抗原特異性を有する、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）ｉＰＳ細胞へ誘導されるＴ細胞とｉＰＳ細胞から分化させるＴ細胞の抗原特異性が同一である、（３）に記載の方法。
（５）（１）から（４）のいずれかに記載の方法により製造されたヒトＴ細胞。
（６）（５）に記載のヒトＴ細胞を含有する、医薬組成物。
（７）ヒトより所望の抗原特異性を有するＴ細胞を単離する工程と、
該所望の抗原特異性を有するＴ細胞からｉＰＳ細胞を誘導する工程と、
該ｉＰＳ細胞をＴ細胞に分化させる工程と、
得られたｉＰＳ細胞由来Ｔ細胞をヒトの体内に投与する工程と
を含む、免疫細胞治療の方法。
【発明の効果】
【００１１】
発生過程でＴＣＲやＢＣＲ遺伝子塩基配列の構造的な変化を獲得するリンパ球は、ｉＰＳ細胞樹立のソースとしては極めて特異な細胞である。マウスＴ細胞やＢ細胞から再構成されたＴＣＲを持ったｉＰＳ細胞が樹立可能であることが近年相次いで報告され、ＴＣＲ再構成様式が核移植やリプログラミングによっても失われることが無いことが示唆されていた。しかしながら、これらは全てマウスでの事例である。本発明によって、ヒト末梢血Ｔリンパ球からｉＰＳ細胞が得られることが初めて示され、さらに、少なくとも一つのインフレーム（ｉｎ  ｆｒａｍｅ）ＴＣＲ再構成を持つｉＰＳ細胞からＴ系譜細胞を誘導すると、そのＴＣＲを持つヒトＴ系譜細胞がモノクローナル（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ）に出
現することが初めて明らかになった。特にＴＣＲα鎖β鎖とも一つのインフレーム（ｉｎ
ｆｒａｍｅ）再構成しか持たないｉＰＳＣ（ｉＰＳ細胞）からのＴ系譜細胞への誘導においては、出現したＴＣＲはｉＰＳ細胞に保存された塩基配列と同一（ｉｄｅｎｔｉｃａｌ）であり、完全にモノクローナル（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ）であった。このことは、常に内在性ＴＣＲα鎖β鎖（特に対立形質排除（ａｌｌｅｌｉｃ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ）による制御が不完全なα鎖）の発現による阻害効果（ｉｎｔｅｒｆｅｒｅ）を考慮しなければならないＥＳ細胞、ＣＤ３４陽性造血幹細胞、あるいはナイーブＴ細胞へのＴＣＲ遺伝子導入法とは比較にならないほど効率よく、目的の抗原に対するモノクローナルＴＣＲαβを持つＴ細胞を誘導できる事が示された。
【００１２】
従って、本発明によれば、目的とする抗原に特異的なヒトＴリンパ球を効率的に製造することが可能となる。そして、こうして製造されたヒトＴリンパ球を利用することにより、再生医療や移植医療にとって最も大きな壁となる拒絶反応の問題の少ない、免疫細胞治療の方法を提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】末梢血Ｔリンパ球からのヒトｉＰＳ細胞の作製の概略を示す図である。なお、図中「Ｔａｐｅｒｉｎｇ」はヒトｉＰＳ細胞培地（ｈｉＰＳ  ｍｅｄｉｕｍ  等）に徐々に置き換えていった期間を示す。
【図２】図１に示した方法によって形成されたＴ細胞由来のＥＳ細胞様コロニーを示す顕微鏡写真である。なお図中、上部はＣＤ３  Ｔ細胞に山中３／４因子を導入することによって得られたコロニーを示し、下部は、左側から、Ｄａｙ６：ＭＥＦ細胞に播き直した細胞、Ｄａｙ１５：ＥＳ細胞様コロニーを形成している細胞、Ｄａｙ２４：コロニー形成を完了した細胞を各々示す（Ｄａｙについては図１  参照）。また、スケールバーは２００μｍを示す。
【図３】ｉＰＳ細胞コロニーを免疫染色にて観察した結果を示す顕微鏡写真である。
【図４】Ｔ−ｉＰＳ細胞、ヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ３）、末梢血由来ＣＤ３＋細胞（ＰＢ  ＣＤ３＋）における多能性マーカーの発現をＲＴ−ＰＣＲによって分析した結果を示す電気泳動写真である。なお、ＡＣＴＢ（β−アクチン）及びＧＡＰＤＨはローディングコントロールとして用いた。
【図５】末梢血ＣＤ３+Ｔ細胞における、３因子（３Ｆａｃｔｏｒｓ、ｃ−Ｍｙｃを除く）又は４因子（４Ｆａｃｔｏｒｓ、ｃ−Ｍｙｃを含む）による多能性状態への再プログラミング効率を示すグラフである。なお図中、縦軸は２２日目（ｄａｙ２２）の３×１０5個のＴリンパ球に由来するＡＬＰ陽性コロニー数を示す（３因子による結果は、ｍｅａｎ±Ｓ．Ｅ．Ｍ＝５．１±２．４［ｎ＝７］であり、４因子による結果は、ｍｅａｎ±Ｓ．Ｅ．Ｍ＝７７．０±２５．０［ｎ＝１２］であった）。
【図６】オリゴヌクレオチドＤＮＡマイクロアレイを用いた、網羅的遺伝子発現パターンにおけるヒトＴ−ｉＰＳ細胞（ＴｋＴ３Ｖ１−７）と活性ＣＤ４Ｔリンパ球（ＰＢ  ＣＤ４  Ｔ−ｃｅｌｌ）との比較結果（左側）、及び網羅的遺伝子発現パターンにおけるＴｋＴ３Ｖ１−７とヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ３）との比較結果（右側）を示す散布図である。なお、図中の平行な２本の線は対応のあるサンプル間で５倍の差があったことを示す。
【図７】Ｔ−ｉＰＳ細胞の代表的な２例（ＴｋＴ３Ｖ１−７及びＴｋＴ４Ｖ１−３）の核型（Ｋａｒｙｏｔｙｐｅ）を示す顕微鏡写真である。なお、調べたＴ−ｉＰＳ細胞の継代数は１０であり、いずれにおいても染色体異常は認められなかった。
【図８】Ｔ−ｉＰＳ細胞を注入してから８週間後のＮＯＤ−Ｓｃｉｄマウスにおいて形成されたテラトーマの代表的なＨＥ染色切片を示す顕微鏡写真である。三胚葉由来の組織（外胚葉としては神経組織（ｎｅｕｒａｌ  ｔｉｓｓｕｅ、神経板（ｎｅｕｒａｌ  ｐｌａｔｅ））及び網膜細胞（ｒｅｔｉｎｏｃｙｔｅｓ）、中胚葉としては軟骨（ｃａｒｔｉｌａｇｅ）及び筋細胞（ｍｙｏｃｙｔｅｓ）、内胚葉としては胃様粘膜（ｇｕｔ−ｌｉｋｅ  ｍｕｃｏｓａ）、及び分泌腺／管（ｇｌａｎｄｓ／ｄｕｃｔｓ））が存在していることを示す。
【図９】ＴＣＲγ鎖の遺伝子再構成を検出するためのＰＣＲ分析の結果を示す電気泳動写真である。
【図１０】ＴＣＲＧ再構成を検出するためのＰＣＲ分析の代表的な結果を示す電気泳動写真である。なお、再構成したＴＣＲＧは有効なサイズ範囲（約２００ｂｐ）にあるＰＣＲバンドによって同定した。
【図１１】ＴＣＲＢ再構成を検出するためのＰＣＲ分析の代表的な結果を示す電気泳動写真である。なお図中「Ｔｕｂｅ  Ａ」及び「Ｔｕｂｅ  Ｂ」のカラムにおけるＰＣＲ産物はＶ（Ｄ）Ｊ再構成していることを示す（有効なサイズ範囲：２４０〜２８５ｂｐ）。一方、「Ｔｕｂｅ  Ｃ」のカラムにおけるＰＣＲ産物はＤＪ再構成していることを示す（有効なサイズ範囲：１７０〜２１０ｂｐ、及び２８５〜３２５ｂｐ）。
【図１２】ＴｋＴ３Ｖ１−７における、ＴＣＲＡ再構成を検出するためのＰＣＲ分析の代表的な結果を示す電気泳動写真である。
【図１３】図１１及び１２に示したＴｋＴ３Ｖ１−７由来のＰＣＲ産物のシークエンス結果を示す図である。なお図中、ＴＣＲＡ遺伝子の片方のアレルにおける機能的な（Ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ）再構成を上部に示す。またＴＣＲＢ遺伝子の片方のアレルにおける機能的な再構成（Ｖ（Ｄ）Ｊβ再構成）を中部に示す。ＴＣＲＢ遺伝子のもう片方のアレルにおける非機能的な（Ｕｎｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ）再構成（ＤＪβ再構成）を下部に示す。
【図１４】ＣＤ３+ＣＤ５６-末梢血Ｔ細胞を先ずＣＤ４発現サブセット及びＣＤ８発現サブセットに分け、更にナイーブＴ細胞（Ｎａｉｖｅ、ＣＤ４５ＲＡ+ＣＤ６２Ｌ+）、セントラルメモリーＴ細胞（Ｃｅｍｔｒａｌ  Ｍｅｍｏｒｙ、ＣＤ４５ＲＡ-ＣＤ６２Ｌ+）、エフェクターメモリーＴ細胞（Ｅｆｆｅｃｔｏｒ  Ｍｅｍｏｒｙ、ＣＤ４５ＲＡ-ＣＤ６２Ｌ-）、またはターミナルエフェクターＴ細胞（Ｅｆｆｅｃｔｏｒ、ＣＤ４５ＲＡ+ＣＤ６２Ｌ-）に分類した結果を示す、散布図である。
【図１５】ＭＥＦ上に播き直した１×１０5個のＴ細胞サブセットから得られたＡＬＰ+コロニー数に基づき、各々のＴ細胞サブセットにおける再プログラミング効率を評価した結果を示す、グラフである。なお図中、縦軸は独立した３回の実験におけるＡＬＰ+コロニーのＡｖｅｒａｇｅ  ｎｕｍｂｅｒ±Ｓ．Ｄ．を示す。
【図１６】（ａ）は、ＯＰ９及びＯＰ９−ＤＬ１ストローマ細胞層上での培養による、多能性細胞からＴ系譜細胞作製の概略を示す図、並びに各時点における細胞の様子を示す顕微鏡写真である。なお図中「Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｃｏｃｋｔａｉｌ（サイトカイン  カクテル）」は、ｈＩＬ−７、ｈＦｌｔ−３Ｌ、及びｈＳＣＦを添加したことを示す。（ｂ）は、各多能性細胞から作製されたＴ系譜細胞について、フローサイトメトリーを用いて、ＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、及びＴＣＲαβの発現を調べた結果を示す散布図である。なお図中「ＥＳ」はＥＳ細胞由来のＴ系譜細胞を示し、「ｓｋｉｎ  ｉＰＳ」は皮膚ｉＰＳ細胞由来のＴ系譜細胞を示し、「Ｔ−ｉＰＳ」はＴ−ｉＰＳ細胞由来のＴ系譜細胞を示し、「ＰＢ」は末梢血（対照データ）を示す。
【図１７】（ａ）は、ＯＰ９及びＯＰ９−ＤＬ１ストローマ細胞層上での培養による、Ｔ−ｉＰＳ細胞等の多能性細胞からＴ系譜細胞作製の概略を示す図である。すなわち、サイトカインを含有せずα−ＭＥＭをベースとする必須培地にて、１０〜１４日間、照射ＯＰ９細胞層上にて多能性細胞を培養し、次いで、誘導した造血細胞をＯＰ９−ＤＬ１細胞と共に３又は４週間、ｈＩＬ−７、ｈＦｌｔ−３Ｌ、及びｈＳＣＦ等を添加したαＭＥＭをベースとする必須培地にて培養したことを示す図である。（ｂ）は、各培養時点にて、培地中の浮遊細胞を回収し、フローサイトメトリーを用いて、Ｔ系譜マーカー  ＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＴＣＲαβの発現を調べ、独立した少なくとも３回の実験における代表的な結果を示す散布図である。なお、各散布図に示した数値は、各区分における細胞の割合（％）を示す。また、Ｂの最下部は、新鮮なＰＢＭＣを分析した結果（対照データ）を示す。
【図１８】Ｔ系譜細胞マーカーの発現をフローサイトメトリーによって分析し、独立した少なくとも３回の実験における代表的な結果を示す散布図である。なお図中、各散布図に示した数値は各区分における細胞の割合（％）を示し、「Ｈｕｍａｎ  ＥＳＣ」はヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ３）における結果を示し、「ＣＢ−ｉＰＳ」は臍帯血ＣＤ３４陽性細胞由来ｉＰＳ細胞（ＴｋＣＢ７−４）における結果を示し、「ＨＤＦ−ｉＰＳ」はヒト皮膚繊維芽細胞由来ｉＰＳ細胞（ＴｋＤＡ４Ｍ）における結果を示し、「Ｔ−ｉＰＳＣ」はＴ−ｉＰＳ細胞（ＴｋＴ３Ｖ１‐７）における結果を示し、「ＰＢＭＮＣ」は末梢血単核球細胞における結果を示す。
【図１９】フローサイトメトリーによって評価した、ＣＤ３+Ｔ系譜細胞におけるＣＤ４及びＣＤ８の発現を示すグラフである。なお図中、縦軸は各多能性細胞由来のＴ系譜細胞におけるＲｅｌａｔｉｖｅ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ±Ｓ．Ｄ．を示す。また「Ｈｕｍａｎ  ＥＳＣ」はヒトＥＳ細胞における結果を示し、「ＣＢ−ｉＰＳＣ」は臍帯血ＣＤ３４陽性細胞由来ｉＰＳ細胞における結果を示し、「ＨＤＦ−ｉＰＳＣ」はヒト皮膚繊維芽細胞由来ｉＰＳ細胞における結果を示し、「Ｔ−ｉＰＳＣ」はＴ−ｉＰＳ細胞における結果を示す。また、各細胞のカラムは左から順に「ＤＮ」、「ＣＤ８」、「ＣＤ４」、「ＤＰ」を示す。さらに「ＤＮ」はＣＤ４-ＣＤ８-であることを示し、「ＣＤ４」はＣＤ４+ＣＤ８-であることを示し、「ＣＤ８」はＣＤ４-ＣＤ８+であることを示し、「ＤＰ」はＣＤ４+ＣＤ８+であることを示す。
【図２０】ＯＫＴ−３及びｈＩＬ−２によるＴＣＲ刺激後の再分化Ｔ系譜細胞、及び無刺激の再分化Ｔ系譜細胞における、比例変化（Ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｌ  ｃｈａｎｇｅ）及び形態変化（ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈａｎｇｅ）を示す、グラフ及び顕微鏡写真である。
【図２１】再分化Ｔ系譜細胞のサイトカイン産生プロファイルをフローサイトメトリーによって分析した結果を示す、散布図である。なお、分析した、再分化Ｔ系譜細胞（ＣＤ３+ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ＴｋＴ３Ｖ１−７）又はＰＢＭＮＣ（ＰＢ  ＣＤ３、対照）は、ｈＩＬ−１αとともにＰＭＡ／イオノマイシンによって一晩刺激し、抗体を用いて染色した。プロット図に示した数値は、サイトカイン産生細胞の割合（％）を示す。
【図２２】再分化Ｔ系譜細胞（ＴｉＰＳ細胞由来のＴ系譜細胞）における、ＴＣＲβｍＲＮＡの配列とアミノ酸配列とを示す図である。
【図２３】再分化Ｔ系譜細胞（ＴｉＰＳ細胞由来のＴ系譜細胞）における、ＴＣＲαｍＲＮＡの配列とアミノ酸配列とを示す図である。
【図２４】ＳＭＡＲＴによるｃＤＮＡライブラリー構築を介し、ＰＣＲによってＴｋＴ３Ｖ１−７のＴＣＲを増幅し、得られたＰＣＲ産物を分析した結果を示す電気泳動の写真である。
【図２５】図２４に示した有効なサイズ範囲（約７５０ｂｐ）にあるＰＣＲ産物についてのシークエンシング解析の結果を示す図であり、全ての転写ｍＲＮＡの配列はＴ−ｉＰＳ細胞のゲノムの配列（図１３  参照）と完全に一致し、ＤＪβ再構成アレルからの子孫は確認されなかったことを示す図である。なお、他のサンプルの詳細及び結果は表８及び９に示す。
【図２６】フローサイトメトリーによってＣＤ３の発現を評価した結果を示すグラフである。なお図中、縦軸はＣＤ４５+血球中のＣＤ３+Ｔ系譜細胞の割合（各群３以上の独立した実験のＡｖｅｒａｇｅｓ±Ｓ．Ｄ）を示す。また、「Ｈｕｍａｎ  ＥＳＣ」はヒトＥＳ細胞における結果を示し、「ＣＢ−ｉＰＳＣ」は臍帯血ＣＤ３４陽性細胞由来ｉＰＳ細胞における結果を示し、「ＨＤＦ−ｉＰＳＣ」はヒト皮膚繊維芽細胞由来ｉＰＳ細胞における結果を示し、「Ｔ−ｉＰＳＣ」はＴ−ｉＰＳ細胞における結果を示す。さらに、＊＊は他の全てのサンプルに対して、ｐ＜０．０１であることを示す。
【図２７】フローサイトメトリーによって評価したＣＤ３の平均蛍光強度（ＭＦＩ、Ｍｅａｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）を示すグラフである。なお、縦軸は、ＣＤ−ｉＰＳ及びＨＤＦ−ｉＰＳは各群２の、その他は各群３以上の独立した実験のＡｖｅｒａｇｅｓ±Ｓ．Ｄを示し、「Ｈｕｍａｎ  ＥＳＣ」はヒトＥＳ細胞における結果を示し、「ＣＢ−ｉＰＳＣ」は臍帯血ＣＤ３４陽性細胞由来ｉＰＳ細胞における結果を示し、「ＨＤＦ−ｉＰＳＣ」はヒト皮膚繊維芽細胞由来ｉＰＳ細胞における結果を示し、「Ｔ−ｉＰＳＣ」はＴ−ｉＰＳ細胞における結果を示し、「ＰＢ」は末梢血単核球細胞における結果を示す。
【図２８】ＴＣＲＧ遺伝子の再構成、並びに該再構成状態を検出するためのプライマーの配列及び位置を示す概略図である。なお、ヒトＴＣＲＧ遺伝子座は染色体７ｑ１４上の１３５ｋｂにわたっている。また、フォワードプライマー及びリバースプライマーは、Ｖγセグメント又はＪγセグメントにおいて高い相同性を有する領域に各々を設計され、約２００ｂｐのＰＣＲバンドを検出することによって、ＴＣＲＧ遺伝子の再構成を検出することができる。
【図２９】ＴＣＲＢ遺伝子の再構成、並びに該再構成状態を検出するためのプライマーの配列及び位置を示す概略図である。なお、ヒトＴＣＲＢ遺伝子座は染色体７ｑ３４上の６８５ｋｂにわたっている。また、Ｖβ遺伝子セグメント及びＪβ遺伝子セグメントにおいて、同じ保存領域にアニールすることができる、全てのＶβプライマー及びＪβプライマーとして、２３個のＶβプライマー、２個のＤβプライマー、及び１３個のＪβプライマーが各々設計された。さらに、プライマーは３つのチューブ（ｔｕｂｅ）に分けられ、各々混合して分析に用いられた。すなわち、図中の「Ｔｕｂｅ  Ａ」、「Ｔｕｂｅ  Ｂ」、及び「Ｔｕｂｅ  Ｃ」はそのことを示している。また、Ｔｕｂｅ  Ａ及びＴｕｂｅ  Ｂに示したプライマーセットを用いて約２７０ｂｐのＰＣＲバンドを検出することによって、Ｖ（Ｄ）Ｊβ再構成を検出することができ、Ｔｕｂｅ  Ｃに示したプライマーセットを用いて１７０〜２１０ｂｐ又は２８５〜３２５ｂｐのＰＣＲバンドを検出することによって、ＤＪβ再構成を検出することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
＜ヒトＴ細胞を製造する方法＞
本発明は、ヒトＴ細胞からｉＰＳ細胞を誘導する工程と、該ｉＰＳ細胞をＴ細胞に分化させる工程とを含む、ヒトＴ細胞を製造する方法を提供する。
【００１５】
−ヒトＴ細胞からｉＰＳ細胞を誘導する工程−
本発明においてＴ細胞を単離される「ヒト」としては、特に制限はない。健常人であっても、免疫機能が低下している人や、悪性腫瘍、感染症、自己免疫疾患などを患っている人であってもよい。本発明によって得られたＴ細胞を免疫細胞治療に用いる場合は、拒絶反応が起こらないという観点から、Ｔ細胞を単離されるヒトは、本発明によって得られたＴ細胞が投与されるヒトとＨＬＡの型が一致していることが好ましく、本発明によって得られたＴ細胞が投与されるヒトと同一人であることがより好ましい。
【００１６】
本発明において「Ｔ細胞」とは、表面にＴ細胞受容体（Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＴＣＲ）と称される抗原受容体を発現している細胞を意味する。
本発明において「ｉＰＳ細胞へ誘導されるヒトＴ細胞」及び「ｉＰＳ細胞から分化させるヒトＴ細胞」としては特に制限はないが、好ましくはＣＤ３を発現しており、且つＣＤ４及びＣＤ８からなる群から選択される少なくとも一の分子が発現しているＴ細胞である。このようなヒトＴ細胞としては、例えば、ＣＤ４陽性細胞であるヘルパー／制御性Ｔ細胞、ＣＤ８陽性細胞である細胞傷害性Ｔ細胞、ナイーブＴ細胞（ＣＤ４５ＲＡ+ＣＤ６２
Ｌ+細胞）、セントラルメモリーＴ細胞（ＣＤ４５ＲＡ-ＣＤ６２Ｌ+細胞）、エフェクタ
ーメモリーＴ細胞（ＣＤ４５ＲＡ-ＣＤ６２Ｌ-細胞）、及びターミナルエフェクターＴ細胞（ＣＤ４５ＲＡ+ＣＤ６２Ｌ-細胞）が挙げられる。後述する免疫療法を実施する場合、ｉＰＳ細胞から分化させるヒトＴ細胞は、ｉＰＳ細胞へ誘導されるヒトＴ細胞と抗原特異性が同一であることが好ましい。なお、Ｔ細胞における抗原特異性は、抗原特異的な、再構成されたＴＣＲ遺伝子によりもたらされる。
【００１７】
本発明において「ｉＰＳ細胞へ誘導されるヒトＴ細胞」は、ヒトの組織から公知の手法により単離することができる。ヒトの組織としては、前記Ｔ細胞を含む組織であれば特に制限はないが、例えば、末梢血、リンパ節、骨髄、胸腺、脾臓、臍帯血、病変部組織が挙げられる。これらの中では、ヒトに対する侵襲性が低く、調製が容易であるという観点から、末梢血、臍帯血が好ましい。ヒトＴ細胞を単離するための公知の手法としては、例えば、後述の実施例に示すようなＣＤ４等の細胞表面マーカーに対する抗体と、セルソーターとを用いたフローサイトメトリーが挙げられる。また、サイトカインの分泌や機能性分子の発現を指標に、所望のＴ細胞を単離することも出来る。かかる場合、例えば、Ｔ細胞は、Ｔｈ１タイプかＴｈ２タイプかで分泌されるサイトカインが異なるので、そのようなサイトカインを指標に選別して、所望のＴｈタイプを有するＴ細胞を単離することができる。また、グランザイムやパーフォリンなどの分泌又は産生を指標として、細胞傷害性（キラー）Ｔ細胞を単離することが出来る。
【００１８】
ｉＰＳ細胞へ誘導されるヒトＴ細胞として「抗原特異性を有するヒトＴ細胞」を用いる場合、その単離においては、「所望の抗原特異性を有するＴ細胞」を含むヒトの組織より、所望の抗原を固定化したアフィニティカラム等を用いて精製する方法を採用することができる。また、所望の抗原を結合させたＭＨＣ（主要組織適合遺伝子複合体）を４量体化させたもの（いわゆる「ＭＨＣテトラマー」）を用いて、ヒトの組織より「所望の抗原特異性を有するＴ細胞」を精製する方法も採用することができる。
【００１９】
本発明における「ｉＰＳ細胞」とは、人工多能性幹細胞（Ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）又は誘導性多能性幹細胞とも称される細胞であり、前記Ｔ細胞に細胞初期化因子を導入することにより誘導することができる。「細胞初期化因子」は、前記Ｔ細胞に導入されることにより、単独で、又は他の分化多能性因子と協働して該体細胞に分化多能性を付与できる因子であれば特に制限されることはないが、Ｏｃｔ３／４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ５、ＬＩＮ２８、Ｎａｎｏｇ、ＥＣＡＴ１、ＥＳＧ１、Ｆｂｘ１５、ＥＲａｓ、ＥＣＡＴ７、ＥＣＡＴ８、Ｇｄｆ３、Ｓｏｘ１５、ＥＣＡＴ１５−１、ＥＣＡＴ１５−２、Ｆｔｈｌ１７、Ｓａｌ１４、Ｒｅｘ１、Ｕｔｆ１、Ｔｃｌ１、Ｓｔｅｌｌａ、β−ｃａｔｅｎｉｎ、Ｓｔａｔ３及びＧｒｂ２からなる群から選択される少なくとも一種のタンパク質であるであることが好ましい。さらにこれらのタンパク質の中では、少ない因子で効率良くｉＰＳ細胞を樹立できるという観点から、Ｏｃｔ３／４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４（４因子）を前記体細胞に導入することがより好ましい。また、得られる多能性幹細胞の癌化のリスクを低くするという観点から、ｃ−Ｍｙｃを除く、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４（３因子）を前記体細胞に導入することがより好ましい。
【００２０】
ヒトＣＤ８陽性Ｔ細胞をｉＰＳ細胞に誘導する場合においては、ｉＰＳ細胞への誘導効率をより高めるという観点から、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、Ｃ−ＭＹＣ、及びＮＡＮＯＧをヒトＣＤ８陽性Ｔ細胞に導入することが好ましく、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、Ｃ−ＭＹＣ、ＮＡＮＯＧ、及びＬＩＮ２８をヒトＣＤ８陽性Ｔ細胞に導入することがより好ましい。
【００２１】
また、本発明において「Ｔ細胞に細胞初期化因子を導入する」方法としては特に制限はなく、公知の手法を適宜選択して用いることができる。例えば、前記細胞初期化因子をタンパク質の形態にて前記Ｔ細胞に導入する場合においては、タンパク質導入試薬を用いる方法、タンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ）融合タンパク質を用いる方法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法が挙げられる。また、前記細胞初期化因子をコードする核酸の形態にて前記Ｔ細胞に導入する場合においては、前記細胞初期化因子をコードする核酸（例えば、ｃＤＮＡ）を、Ｔ細胞で機能するプロモーターを含む適当な発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを感染、リポフェクション法、リポソーム法、エレク
トロポレーション法、リン酸カルシウム共沈殿法、ＤＥＡＥデキストラン法、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法にて細胞に導入することができる。
【００２２】
本発明にかかる「発現ベクター」としては、例えば、レンチウィルス、レトロウィルス、アデノウィルス、アデノ随伴ウィルス、ヘルペスウィルスなどのウィルスベクター、動物細胞発現プラスミドが挙げられる。
【００２３】
かかる発現ベクターにおいて使用されるプロモーターとしては、例えばＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーターなどが挙げられる。また、かかるプロモータ−は薬剤（例えば、テトラサイクリン）の有無等によって、該プロモータ−の下流に挿入された遺伝子の発現を制御できるものであってもよい。発現ベクターは、さらに、プロモーターの他に、エンハンサー、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー遺伝子（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子）、ＳＶ４０複製起点等を含有していてもよい。
【００２４】
また、「ヒトＴ細胞からｉＰＳ細胞を誘導する工程」においては、後述の実施例において示す通り、前記Ｔ細胞は、前記細胞初期化因子の導入前に、インターロイキン−２（ＩＬ−２）の存在下にて抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体によって刺激して活性化することが好ましい。かかる刺激は、例えば、後述の実施例において示すように、培地中に、ＩＬ−２、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体を添加して前記Ｔ細胞を一定期間培養することによって行うことができる。また、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体は磁性ビーズ等が結合されているものであってもよく、さらにこれらの抗体を培地中に添加する代わりに、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体を表面に結合させた培養ディッシュ上で前記Ｔ細胞を一定期間培養することによって刺激を与えてもよい。さらにまた、ヒトＴ細胞が認識する抗原ペプチドをフィーダー細胞とともに培地中に添加することによって刺激を与えても良い。
【００２５】
かかる刺激を行うために、培地中に添加するＩＬ−２の濃度としては特に制限はないが、１〜２００ｎｇ／ｍｌであることが好ましい。さらに、かかる刺激において培地中に添加する抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体の濃度としては特に制限はないが、前記Ｔ細胞の培養量の１〜１０倍量であることがであることが好ましい。また、かかる刺激において培養ディッシュの表面上に結合させた抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体の濃度としては特に制限はないが、コーティングの際の濃度は抗ＣＤ３抗体では１〜１００μｇ／ｍｌ、抗ＣＤ２８抗体では０．１〜１０μｇ／ｍｌであることが好ましい。
【００２６】
また、かかる刺激を行うための培養期間は、前記Ｔ細胞に対してかかる刺激を与えるのに十分な期間であって、前記細胞初期化因子の導入に必要な細胞数までＴ細胞を増殖しうる期間であれば特に制限はないが、通常２〜１４日間であり、遺伝子導入効率の観点から、好ましくは２〜７日間である。さらに、遺伝子導入効率を上げるという観点から、レトロネクチンがコートしてある培養ディッシュ上にて培養することが好ましい。
【００２７】
前記Ｔ細胞を培養し、ＩＬ−２や抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体等を添加する培地としては、例えば、前記Ｔ細胞の培養に適した公知の培地（より具体的には、ＩＬ−２等のサイトカイン類、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含む、ロズウェルパーク記念研究所（ＲＰＭＩ）１６４０培地、最小必須培地（α−ＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、Ｆ１２培地等）を用いることができる。培地には、ＩＬ−２、及び抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体以外にも、培養に必要なアミノ酸（例えば、Ｌ−グルタミン）、抗生物質（例えば、ストレプトマイシン、ペニシリン）が添加してあっても良い。また、ＣＤ８陽性Ｔ細胞をｉＰＳ細胞に誘導する場合においては、アポトーシスを抑制するという  観点から、培地にＩＬ−７、ＩＬ−１５を添加することが好ましい。ＩＬ−７、ＩＬ−１５の添加濃度としては特に制限はないが、１〜１００ｎｇ／ｍｌであることが好ましい。
【００２８】
また、本発明における「Ｔ細胞に細胞初期化因子を導入する」際、又はその後の条件としては特に制限はないが、前記細胞初期化因子を導入した前記Ｔ細胞は、フィーダー細胞層上で培養するのが好ましい。かかるフィーダー細胞としては特に制限はないが、例えば、放射線の照射や抗生物質処理により細胞分裂を停止させたマウス胎児繊維芽細胞（ＭＥＦ）、ＳＴＯ細胞、ＳＮＬ細胞が挙げられる。
【００２９】
さらに、前記Ｔ細胞からｉＰＳ細胞に誘導する過程において、細胞の分化を抑制するという観点から、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を前記Ｔ細胞に前記細胞初期化因子を導入する際、又はその後において、培地に添加しておくことが好ましい。
【００３０】
また、ｉＰＳ細胞の樹立効率をより高めるために、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤（バルプロ酸（ＶＰＡ）、トリコスタチンＡ、酪酸ナトリウム、ＭＣ  １２９３、Ｍ３４４等の低分子阻害剤、ＨＤＡＣに対するｓｉＲＮＡ等）、Ｇ９ａヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤（ＢＩＸ−０１２９４等の低分子阻害剤、Ｇ９ａに対するｓｉＲＮＡ等）、ｐ５３阻害剤（Ｐｉｆｉｔｈｒｉｎ−α（ＰＦＴ−α）等の低分子阻害剤、ｐ５３に対するｓｉＲＮＡ等）を、前記Ｔ細胞に前記細胞初期化因子を導入する際、又はその後において、培地に添加しておくことが好ましい。
【００３１】
さらに、「Ｔ細胞に細胞初期化因子を導入する」際に、ウィルスベクターを用いる場合には、該ベクターが前記Ｔ細胞に結合し易くなるという観点から、硫酸プロタミンを培地に添加しておくことが好ましい。
【００３２】
また、後述の実施例に示す通り、前記Ｔ細胞からｉＰＳ細胞への移行に合わせて、前記Ｔ細胞の培養に適した公知の培地から、ｉＰＳ細胞の培養に適した培地に徐々に置換していきながら培養することが好ましい。かかるｉＰＳ細胞の培養に適した培地としては、公知の培地を適宜選択して用いることができ、例えば、ノックアウト血清代替物、Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸、２−メルカプトエタノール、ｂ−ＦＧＦ等を含有する、ダルベッコ変法イーグル培地／Ｆ１２培地（ヒトｉＰＳ細胞培地）が挙げられる。
【００３３】
ヒトＣＤ８陽性Ｔ細胞をｉＰＳ細胞に誘導する場合においては、後述の実施例に示すように、ｉＰＳ細胞への誘導効率をより高めるという観点から、前記フィーダー細胞上に移し換えた後に、１〜１０００μＭ  ＲＯＣＫ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒを更に添加した培地中、低酸素濃度条件（酸素濃度：例えば、５％）下にて培養することが好ましく、また１〜１０００μＭ  ＭＥＫ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（例えば、ＰＤ０３２５９０１）及び１〜１０００μＭ  ＧＳＫ３  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（例えば、ＣＨＩＲ９９０２１）を後述のコロニー形成まで培地に添加しておくことが好ましい。
【００３４】
このようにして前記Ｔ細胞から誘導したｉＰＳ細胞（以下、「ＴｉＰＳ細胞」とも称する）の選択は、公知の手法を適宜選択することによって行うことができる。かかる公知の手法としては、例えば、後述の実施例において示すようなＥＳ細胞／ｉＰＳ細胞様コロニーの形態を顕微鏡下にて観察して選択する方法や、ｉＰＳ細胞において特異的に発現することの知られている遺伝子（例えば、前記細胞初期化因子）の遺伝子座に薬剤耐性遺伝子やレポーター遺伝子（ＧＦＰ遺伝子等）をターゲッティングした組換え型のＴ細胞を用い、薬剤耐性やレポーター活性を指標として選択する方法が挙げられる。
【００３５】
このようにして選択された細胞がｉＰＳ細胞であるということの確認は、例えば、後述の実施例において示すような、選択された細胞における未分化細胞特異的マーカー（ＡＬＰ、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、Ｔｒａ−１−８１等）の発現を免疫染色やＲＴ−ＰＣＲ等によって検出する方法や、選択された細胞をマウスに移植して、そのテラトーマ
形成を観察する方法により行うことができる。
【００３６】
また、このようにして選択された細胞が前記Ｔ細胞由来であることの確認は、例えば、後述の実施例に示すように、ＴＣＲ遺伝子再構成の状態をゲノムＰＣＲによって検出することにより行うことができる。
【００３７】
これらの細胞を選択して回収する時期は、コロニーの生育状態を観察しながら適宜決定することができ、概ね、前記細胞初期化因子を前記Ｔ細胞に導入してから１４日〜２８日である。
【００３８】
−ＴｉＰＳ細胞をＴ細胞に分化させる工程−
前記のようにして得られたＴｉＰＳ細胞をＴ細胞に分化させるためには、中胚葉系への分化を誘導し易くするという観点から、先ずはＴｉＰＳ細胞をストローマ細胞上にて、サイトカインを含有せず、ＦＣＳ等を含有するα−ＭＥＭ培地中にて培養することが好ましい。用いるストローマ細胞としては、造血系への分化を誘導し易くするという観点から、放射線照射等の処理を施したＯＰ９細胞、１０Ｔ１／２細胞であることが好ましい。但し、ＴｉＰＳ細胞を効率良くＣＤ３４陽性造血幹細胞に誘導させる場合には、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＳＣＦ、及びＦＬＴ３Ｌ群から選択される少なくとも１のサイトカインを含有する培地中にて培養することが好ましく、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、及びＴＰＯを含有する培地中、又はＶＥＧＦ、ＳＣＦ、及びＦＬＴ３Ｌを含有する培地中にて培養することがより好ましい。培養期間としては、血球細胞等を含有する袋状の構造物（ＥＳ−ｓａｃ（サック）とも称する）を形成するまでの期間であることが好ましく、ＴｉＰＳ細胞の培養を開始してから１０〜１４日間であることが好ましい。
【００３９】
前記のようにして得られたサックに含有されている細胞（造血前駆細胞、ＣＤ３４陽性細胞、血球細胞等）は、サイトカインやＦＣＳ等を含有するα−ＭＥＭ培地中におけるストローマ細胞上で培養することが好ましい。なお、かかるサック状構造物の内部に存在する細胞は、物理的な手段、例えば、滅菌済みの篩状器具（例えば、セルストレイナーなど）に通すことにより、分離することができる。この培養に用いるストローマ細胞としては、ｎｏｔｃｈシグナルを介して、Ｔリンパ球への分化誘導を行うという観点から、放射線照射等の処理を施したＯＰ９−ＤＬ１細胞、ＯＰ９−ＤＬ４細胞、１０Ｔ１／２／ＤＬ４細胞であることが好ましい。培地に添加するサイトカインとしては、例えば、ＩＬ−７、ＦＬＴ３Ｌ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＩＬ−２、ＩＬ−１５，が挙げられる。これらの中では、初期Ｔ細胞の分化を助けるという観点から、ＩＬ−７及びＦＬＴ３Ｌが好ましい。ＴｉＰＳ細胞のＮＫＴ細胞への分化を抑制するという観点から、ＳＣＦは培地に含まれていないことが好ましい。ＩＬ−７の培地への添加濃度としては、ＣＤ３陽性ＣＤ５６陰性のＴ系譜細胞が得られやすく、またＣＤ４シングルポジティブ（ＳＰ）Ｔ細胞、又はＣＤ８ＳＰＴ細胞への分化が誘導され易いという観点から、０．１〜４ｎｇ／ｍｌであることが好ましい。
【００４０】
このように分化誘導された細胞が、ＴｉＰＳ細胞由来であり、また該ＴｉＰＳ細胞の元となったＴ細胞由来であることの確認は、例えば、後述の実施例に示すように、ＴＣＲ遺伝子再構成の状態を、ゲノムＰＣＲによって検出することにより行うことができる。
【００４１】
このようにして得られたＴ細胞は、公知の手法を適宜選択して単離することができる。かかる公知の手法としては、例えば、後述の実施例に示すようなＣＤ４等の細胞表面マーカーに対する抗体と、セルソーターとを用いたフローサイトメトリーが挙げられる。「所望の抗原特異性を有するＴ細胞」をヒトより単離する場合においては、所望の抗原を固定化したアフィニティカラム等を用いて精製する方法を採用することができる。また、所望の抗原を結合させたＭＨＣテトラマーを用いて、「所望の抗原特異性を有するＴ細胞」を
精製する方法を採用することもできる。
【００４２】
＜ヒトＴ細胞、医薬組成物、免疫細胞治療の方法＞
本発明の方法によって製造したヒトＴ細胞は、抗原特異的な免疫機能を有するため、例えば、腫瘍、感染症、自己免疫不全等の疾患の治療または予防のために用いることができる。
【００４３】
従って、本発明は、本発明の方法によって製造したヒトＴ細胞、該ヒトＴ細胞を含む医薬組成物、並びに該ヒトＴ細胞を用いた免疫細胞治療の方法を提供する。
【００４４】
本発明の医薬組成物は、本発明の方法によって製造したヒトＴ細胞を、公知の製剤学的方法により製剤化することにより調製することができる。例えば、カプセル剤、液剤、フィルムコーティング剤、懸濁剤、乳剤、注射剤（静脈注射剤、点滴注射剤等）、などとして、主に非経口的に使用することができる。
【００４５】
これら製剤化においては、薬理学上許容される担体または媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、溶剤、基剤、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤、希釈剤、等張化剤、無痛化剤、増量剤、崩壊剤、緩衝剤、コーティング剤、滑沢剤、着色剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤等と適宜組み合わせることができる。また、前記疾患の治療または予防に用いられる公知の医薬組成物や免疫賦活剤等と併用してもよい。
【００４６】
本発明の医薬組成物を投与する場合、その投与量は、対象の年齢、体重、症状、健康状態、組成物の種類（医薬品、飲食品など）などに応じて、適宜選択される。
【００４７】
本発明の組成物の製品（医薬品）またはその説明書は、免疫機能の低下を治療または予防するために用いられる旨の表示を付したものであり得る。ここで「製品または説明書に表示を付した」とは、製品の本体、容器、包装などに表示を付したこと、あるいは製品の情報を開示する説明書、添付文書、宣伝物、その他の印刷物などに表示を付したことを意味する。
【００４８】
本発明の免疫細胞治療の方法は、ヒトより所望の抗原特異性を有するＴ細胞を単離する工程と、該所望の抗原特異性を有するＴ細胞からｉＰＳ細胞を誘導する工程と、該ｉＰＳ細胞をＴ細胞に分化させる工程と、得られたｉＰＳ細胞由来Ｔ細胞をヒトの体内に投与する工程とを含む方法である。本発明の免疫細胞治療の方法を実施する場合、拒絶反応が起こらないという観点から、Ｔ細胞を単離されるヒトは、本発明によって得られたＴ細胞が投与されるヒトとＨＬＡの型が一致していることが好ましく、本発明によって得られたＴ細胞が投与されるヒトと同一人であることがより好ましい。投与されるヒトＴ細胞は、本発明の方法により製造されたヒトＴ細胞をそのまま投与してもよく、また、上記の通り、製剤化された医薬組成物の形態で投与してもよい。
【実施例】
【００４９】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。なお、本実施例においては、下記材料を用いて、下記方法等に沿って行った。
【００５０】
＜フローサイトメトリー＞
フローサイトリー分析は、ＭｏＦｌｏ（Ｄａｋｏ  Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ社製）、ＦＡＣＳＡｒｉａ（登録商標、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、又はＦＡＣＳＣａｎｔｏII（登録商標、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製)を用いて行った。得られたデータの分
析はＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅｓｔａｒ社製）を用いて行った。また、フローサイトリー分析に用いた抗体は下記の通りである。
抗ヒトＣＤ３−ＡＰＣ抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、抗ヒトＣＤ４−ＦＩＴＣ抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、抗ヒトＣＤ８−ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、抗ヒトＣＤ５６−ＰＥ抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、抗ヒトＣＤ４５ＲＡ−Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ抗体（Ｃａｌｔａｇ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）、抗ヒトＣＤ６２Ｌ−ＰＥ−Ｃｙ７抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、抗ヒトＣＤ４５−Ａｌｅｘａ  ４０５抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）、抗ヒトＣＤ３４−ＰＥ抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、抗ヒトＣＤ３８−ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、抗ヒトＣＤ１ａ−ＡＰＣ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、抗ヒトＣＤ５−ＰＥ／Ｃｙ７，  −ＣＤ７−ＦＩＴＣ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、抗ヒトＣＤ５−ＰＥ／Ｃｙ７抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、抗ヒトＣＤ７−ＦＩＴＣ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、抗ヒトＴＣＲαβ−ＦＩＴＣ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）。さらに、フローサイトリー分析において、細胞は適切な濃度に調整した抗体カクテルと共に４℃にて３０分間インキュベーションした後、リン酸緩衝生理食塩水にて洗浄した。また、死細胞を排除するため、ヨウ化プロピジウムを添加した。
【００５１】
＜レトロウィルスの調製＞
ヒトＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃ−ＭＹＣ、及びＮＡＮＯＧ（山中因子、ＹＦｓ）をコードするｐＭＸｓレトロウィルスベクターは、山中伸弥教授（京都大学ｉＰＳ細胞研究所  所属）より供与された。Ｇａｇ−Ｐｏｌ遺伝子、及びＴｅｔ−ＯＦＦ制御のＶＳＶ−Ｇ偽型エンベロープ遺伝子を有する２９３ＧＰＧパッケージング細胞に、これらＹＦｓを導入した。テトラサイクリンを除いた培地にてウィルスを誘導してから３日後に、これら細胞の培養上清を毎日、全４回回収した。回収した培養上清は、０．４５μｍ酢酸セルロースフィルターに通し、６０００ｇにて１６時間かけ遠心分離を行った。そして、得られた上清の濃度が０．５％になるようにα−ＭＥＭ（α−最小必須培地）に懸濁し、使用するまで−８０℃にて保存した。
【００５２】
＜Ｔ細胞の調製、レトロウィルス感染、及びｉＰＳ細胞の作製＞
実験プロトコールは、東京大学医科学研究所  ヒト倫理審査委員会の承認を受けたものである（承認番号：２０−６−０８２６）。また、全ての研究はヘルシンキ宣言に従って行った。
【００５３】
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）は、健康な被験者由来の血液から、Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配遠心（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ＰＬＵＳ（登録商標）、１７−１４４０−０２、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）にて単離し、ＭｏＦｌｏ（ＤＡＫＯ  Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ社製）にて精製した。Ｔ細胞はナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞のコンタミを避けるため、ＣＤ３+ＣＤ５６-細胞集団をゲートとし、単離した。Ｔ細胞のサブセットは、更なるゲートを設定し、ＣＤ４（ＣＤ４+ＣＤ８-）、及びＣＤ８（ＣＤ４-ＣＤ８+）コホートに分離した。ＣＤ４及び／又はＣＤ８細胞は更に、ナイーブ（ＣＤ４５ＲＡ+ＣＤ６２
Ｌ+）、セントラルメモリー（ＣＤ４５ＲＡ-ＣＤ６２Ｌ+）、エフェクターメモリー（Ｃ
Ｄ４５ＲＡ-ＣＤ６２Ｌ-）、またはターミナルエフェクター（ＣＤ４５ＲＡ+ＣＤ６２Ｌ-）に分類した。
【００５４】
このようにしてソートした細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、１００Ｕ／ｍｌ  ペニシリン、１００ｎｇ／ｍｌ  ストレプトマイシン、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、及び２０ｎｇ／ｍｌ  ヒトインターロイキン２（ｈＩＬ−２、Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ＆Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を添加した、ロズ
ウェルパーク記念研究所培地（Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ＲＰＭＩ）１６４０培地（ＧＩＢＣＯ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にて最初培養した。そして、かかるＴ細胞の３倍量の抗ＣＤ３／ＣＤ２８結合磁性ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）、ＣｌｉｎＥｘＶｉｖｏ（登録商標）ＣＤ３／ＣＤ２８、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を添加することによって、これら細胞を活性化させた。なお、Ｔ細胞から誘導したｉＰＳ細胞（Ｔ−ｉＰＳ細胞）の作製において、この活性化した日をｄａｙ０と規定する（以下、図１  参照）。いくつかの実験において、抗ＣＤ３／ＣＤ２８結合磁性ビーズによって、ＰＢＭＣｓから磁気的に捕捉したＣＤ３+細胞を単離すると
同時に刺激した。ｄａｙ２及びｄａｙ３において、１０μｇ／ｍｌ硫酸プロタミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を添加した、レトロネクチン（登録商標）コ―ティングプレート（Ｔａｋａｒａ社製）上にて、スピノキュレーション（ｓｐｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ）によってレトロウィルスを細胞に感染させた（Ｋａｎｅｋｏ，Ｓ．ら、Ｂｌｏｏｄ、２００９年、１１３巻、１００６〜１０１５ページ  参照）。Ｔ細胞培養用の完全合成培地は毎日交換した。ｄａｙ６において、感染細胞を回収し、６ｃｍディッシュ上の３×１０5個の照射ＭＥＦ細胞層上に移した。その後４日間（ｄａｙ６〜ｄａｙ１０）、培地の
半分量を毎日ヒトｉＰＳ細胞培地に交換した。なお、ヒトｉＰＳ細胞培地の組成は下記の通りである（Ｔａｋａｙａｍａ，Ｎ．ら、Ｂｌｏｏｄ、２００８年、１１１巻、５２９８〜５３０６ページ  参照）。
【００５５】
２０％  ノックアウト血清代替物（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（登録商標）、ＧＩＢＣＯ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、２００μＭ  Ｌ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、１％  非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、１０μＭ  ２−メルカプトエタノール（ＧＩＢＣＯ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、及び５ｎｇ／ｍｌ  ｂ−ＦＧＦ（Ｗａｋｏ社製）を添加したダルベッコ変法イーグル培地／Ｆ１２培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）。
【００５６】
またｉＰＳ細胞コロニーをピックアップする前に、前記ヒトｉＰＳ細胞培地に０．５ｍＭ  ＶＰＡ（ＨＤＡＣ阻害剤  バルプロ酸）を添加した。ｄａｙ１０において、ＶＰＡ含有ヒトｉＰＳ細胞培地に全培地を交換した。ヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞様コロニーと同一視できるようになった際、およそｄａｙ２４において、それらコロニーを機械的に単離し、ピペッティングによって小塊に解離し、新鮮なＭＥＦ細胞層上に播いた。ヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞様コロニーは、トリプシン溶液（０．２５％トリプシン、１ｍＭ  ＣａＣｌ2、及び
２０％  ノックアウト血清代替物添加リン酸緩衝生理食塩水）を用いて、新鮮なＭＥＦ細胞層上に３〜４日毎に移した。
【００５７】
＜染色体分析＞
染色体Ｇバンド分析は、日本遺伝子研究所に外注し、所定の方法に従って行った。
【００５８】
＜アルカリフォスファタ―ゼ（ＡＬＰ）染色、及び免疫細胞化学的染色＞
ＡＬＰ染色のため、ヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞様コロニーを氷冷固定液（９０％メタノール、１０％ホルムアルデヒド）にて固定し、ＡＬＰ染色キット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を用い、その製造会社の説明書に従って染色した。また、免疫細胞化学的染色のため、ヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞様コロニーを５％パラホルムアルデヒドにて固定し、０．１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００にて透過処理を行った。
【００５９】
そして、このように前処理したコロニーを一次抗体とともにインキュベートした。なお、用いた一次抗体、並びに希釈率は下記の通りである。
ＰＥ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉ−ＳＳＥＡ−４（ＦＡＢ１４３５Ｐ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製、希釈率：１／５０）、ａｎｔｉ−Ｔｒａ−１−６０（ＭＡＢ４３６０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、希釈率：１／１００）、ａｎｔｉ−Ｔｒａ−１−８１（ＭＡ
Ｂ４３８１、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、希釈率：１／１００）。また、Ｔｒａ−１−６０及びＴｒａ−１−８１の検出には、二次抗体としてＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  （希釈率：１／５００、Ａ１１０２９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いた。さらに、核の対比染色は４’，６−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌ（希釈率：１／１０００、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を用いて行った。また、顕微鏡写真は、蛍光顕微鏡Ａｘｉｏ  Ｏｂｓｅｒｖｅｒ．Ｚ１（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  Ｊａｐａｎ社製）を用いて撮影した。
【００６０】
＜テラトーマ形成＞
ヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞様コロニーを凝集させ、ＮＯＤ−Ｓｃｉｄマウスの左側の精巣の髄質にＭａｓａｋｉ，Ｈ．ら、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ、２００７年、１巻、１０５〜１１５ページの記載に従って注入した。なお、注入細胞数はマウス１匹あたり、１．０×１０6個である。注入してから８週間後、精巣内に形成された腫瘍を切除し、５％パラ
ホルムアルデヒドにて固定し、パラフィンに包埋した後、切片にした。そして、得られた切片をヘマトキシリン／エオシン法にて染色し、光学顕微鏡にて、前記ｉＰＳ細胞が三胚葉への分化能を有しているかどうかを調べた。
【００６１】
＜多能性遺伝子、及びＴ細胞関連遺伝子についての発現分析＞
ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞（クローニングしてから約５０日目の細胞）、これらの子孫細胞、及び新鮮分離した末梢血ＣＤ３+Ｔ細胞から、ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｃｒｏ  キット（Ｑ
ｉａｇｅｎ社製）を用いて、トータルＲＮＡを抽出した。そして、得られたトータルＲＮＡを鋳型とし、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＩＩ  １ｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  キット（Ｔａｋａｒａ社製）を用いて、逆転写反応を行った。
また、ハウスキーピング遺伝子（ＧＡＰＤＨ又はＡＣＴＢ）については３０サイクル、全ての多能性遺伝子又はＴ細胞関連遺伝子については３５サイクルにて、ＥｘＴａｑ  ＨＳ  （Ｔａｋａｒａ社製）を用いてＰＣＲ反応を行った。
なお、標的遺伝子、及び分析に用いたＰＣＲプライマーの配列は表１及び表２に示す。
【００６２】
【表１】
2020010704.tif 000002
【００６３】
【表２】
2020010704.tif 000003
【００６４】
＜マイクロアレイ分析＞
ヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ３）、Ｔ細胞由来ｉＰＳ細胞（ＴｋＴ３Ｖ１−７）、及びＣＤ３／ＣＤ２８刺激ＣＤ３+ＣＤ４+ＣＤ８-細胞について、全ゲノム遺伝子の発現解析を行
った。先ず、各細胞からトータルＲＮＡ（２μｇ）を抽出し、プローブ調製に供した。そして、蛍光標識した相補的ＲＮＡとＷｈｏｌｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ４ｘ４４Ｋ（Ｇ４１１２Ｆ、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）とを、一色法にてハイブリダイズした（委託先：Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ  Ｉｎｃ）。次いで、アレイをスキャンし、スポットイメージをＡｇｉｌｅｎｔ  Ｆｅａｔｕｒｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  装置（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）にて検出した。そして、得られたシグナルデータは、ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇソフトウェア（Ａｇｉ
ｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて分析した。また得られたデータの正規化には、Ｔｗｏ  ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓを適用した。すなわち、シグナル強度  ０．０１未満は０．０１とした。また、チップから得られた測定値の５０thｐｅｒｃｅｎｔｉｌｅに各チップを正規化した。そして、全３サンプルにおいて、ｐｒｅｓｅｎｔのフラグが付いた遺伝子（３６２７５遺伝子）について分析を行った。
【００６５】
＜Ｔ−ｉＰＳ細胞のゲノムＤＮＡにおけるＴＣＲ再構成の検出＞
約５×１０6個のＴ−ｉＰＳ細胞から、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡキット（Ｑｉａｇｅｎ社
製）を用いて、ゲノムＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡ（４０ｎｇ）は、ＴＣＲＧ、ＴＣＲＢ、及びＴＣＲＡ遺伝子再構成の各々ＰＣＲにて検出するために用いた。
【００６６】
ＴＣＲＧの再構成を検出するためのＰＣＲ（Ｂｅｎｈａｔｔａｒ，Ｊ．ら、Ｄｉａｇｎ
Ｍｏｌ  Ｐａｔｈｏｌ、１９９５年、４巻、１０８〜１１２ページ  参照）はＥｘＴａｑ  ＨＳ  （Ｔａｋａｒａ社製）を用いて行った。ＰＣＲの反応条件は、９５℃にて５分間、次いでアニーリング温度の比較的高い反応、すなわち９５℃にて４５秒間、６５℃にて４５秒間、７２℃にて４５秒間という反応を５サイクル、そしてアニーリング温度の比較的低い反応、すなわち９５℃にて４５秒間、５５℃にて４５秒間、７２℃にて３０秒間の反応を３０サイクルとした。
ＴＣＲＢの再構成を検出するため、ＰＣＲ及びヘテロ二本鎖分析は、若干の改変を加えたＢＩＯＭＥＤ−２プロトコール（ｖａｎ  Ｄｏｎｇｅｎ，Ｊ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ、２００３年、１７巻、２２５７〜２３１７ページ  参照）に沿って行った。
【００６７】
ＴＣＲＡの再構成を検出するためのプライマーのコンストラクトはＨａｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｈａｎ，Ｍ．ら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９９年、１６３巻、３０１〜３１１ページ  参照）に基づく。ＰＣＲの反応条件は、９５℃にて３０秒間、６８℃にて４５秒間、７２℃にて６分間という増幅反応を３サイクル、９５℃にて３０秒間、６２℃にて４５秒間、７２℃にて６分間という増幅反応を１５サイクル、９５℃にて１５秒間、６２℃にて３０秒間、７２℃にて６分間という増幅反応を１２サイクルとした。
【００６８】
また、ＰＣＲはＬＡＴａｑ  ＨＳ（Ｔａｋａｒａ社製）により行った。そして、得られたＰＣＲ産物は、サイズに基づきゲルによって分画した。次いで、予想されたサイズ範囲内の主なバンドは切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ｇｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  キット（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて精製し、シークエンスを行った。シークエンス反応においては、ＢｉｇＤｙｅ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  キットｖ３．１（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）をＶα、Ｊα、Ｖβ、Ｄβ、又はＪβ  プライマー一式と共に用いて、多面的アプローチにて、ＰＣＲの増幅及び蛍光色素付加を行った。そして、得られた反応生成物はＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１００自動シークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）にて分析した。
【００６９】
なお、得られた結果は、ＴＣＲＡ又はＴＣＲＢの構築に関与する、Ｖ、Ｄ、及びＪセグメントは、公開されている配列及びＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ／）と比較し、ｖ−ｑｕｅｓｔといったウェブツールを用いることによって同定した（Ｌｅｆｒａｎｃ，  Ｍ．Ｐ．「ＩＭＧＴ  ｄａｔａｂａｓｅｓ，  ｗｅｂ  ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  ａｎｄ  ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ａｎｄ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ，  ｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ．」、Ｌｅｕｋｅｍｉａ、２００３年、１７巻、２６０〜２６６ページ  参照）。また、遺伝子断片（セグメント）の命名はＩＭＧＴ命名法に従った。またＴＣＲ再構成の検出に用いたプライマー配列は表３〜４に示す。
【００７０】
【表３】
2020010704.tif 000004
【００７１】
【表４】
2020010704.tif 000005
【００７２】
＜Ｔ−ｉＰＳ細胞からＴ系譜細胞（Ｔ−ｌｉｎｅａｇｅ  Ｃｅｌｌｓ）への誘導＞
Ｔ−ｉＰＳ細胞又はその他の多能性幹細胞を、胚性幹細胞由来サック（ＥＳ−ｓａｃ）様の構造をとるように、若干の変更を施したＴａｋａｙａｍａ，Ｎ．ら、Ｂｌｏｏｄ、２００８年、１１１巻、５２９８〜５３０６ページの記載に沿って、誘導した。
【００７３】
多能性細胞は照射ＯＰ９細胞層上で、サイトカインは含有せずα−ＭＥＭをベースとする培地（２０％  ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍｌ  ペニシリン、１００ｎｇ／ｍｌ  ストレプトマイシン、及び２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを添加したαＭＥＭ）にて１０〜１４日間（約Ｄａｙ１２）共培養した。
【００７４】
サックに詰まっている浮遊細胞はＯＰ９−ＤＬ１細胞層上に移し、αＭＥＭをベースとし、１０ｎｇ／ｍｌ  ｈＩＬ−７及びｈＦｌｔ−３Ｌが添加された培地にて、Ｄａｙ４０まで共培養した。なお多能性細胞をＯＰ９細胞層上に移した日をＤａｙ０とする。培養培地は３日毎に交換した。ＯＰ９−ＤＬ１細胞層上に浮遊しており、ＣＤ４５、ＣＤ３、及
びＴＣＲαβを発現しているＴ系譜細胞は、毎週フローサイトメトリーにてソーティングし、遺伝子発現解析を行った。なお、ＯＰ９細胞及びＯＰ９−ＤＬ１細胞は、ナショナルバイオリソースプロジェクト（日本）を通して、理研バイオリソースセンターから入手した。
【００７５】
＜ＴＣＲ刺激に対する反応性、及びＴ−ｉＰＳ細胞から再分化したＴ系譜細胞のサイトカイン発現プロファイル＞
Ｔ細胞への誘導の終わり（ＯＰ９−ＤＬ１細胞層上にて約４週間培養した後、Ｄａｙ４０）に、浮遊細胞を回収し、３０ｎｇ／ｍｌ  ＯＫＴ−３（Ｊａｎｓｓｅｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ社製）及び６００ＩＵ／ｍｌ  ｈＩＬ−２（Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ＆  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）にて刺激した。その５日後に細胞数を数え、ＣＤ３の発現を評価した。そして、顕微鏡写真を撮り、形態学的画像を得た。
【００７６】
また、Ｔ系譜細胞のサイトカイン産生（発現）プロファイルは若干の変更を施したＵｃｋｅｒｔ，Ｗ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ、２００８年、５８巻、８０９〜８２２ページに記載の方法に沿って調べた。すなわち、１×１０5個
の浮遊細胞を、１０ｎｇ／ｍｌ  ホルボール  １２−ミリスタート  １３−アセテ―ト（ＰＭＡ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）、０．４μＭ  Ａ２３１８７  カルシウムイオノホア（イオノマイシン、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）、及び２０ＩＵ／ｍｌ  ｈＩＬ−１α（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）によって、１２時間刺激した。さらに最後の３時間においては、タンパク質分泌阻害剤  ブレフェルジンＡ（１ｍＭ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を添加して培養した。
【００７７】
かかる刺激後の細胞を、抗ＣＤ３結合磁性マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社製）にて標識し、そして磁気カラム中に保持した。一方、細胞内染色キット（Ｉｎｓｉｄｅ  ｓｔａｉｎ  ｋｉｔ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社製）を用い、製造会社の説明書に従って、固相細胞内染色（ｓｏｌｉｄ−ｓｔａｔｅ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｓｔａｉｎｉｎｇ）をこれら細胞に施した。ｈＩＦＮ−γ及びｈＩＬ−２の細胞内レベルを測定した。
【００７８】
＜Ｔ−ｉＰＳ細胞から誘導したＴ系譜細胞のｍＲＮＡにおけるＴＣＲ再構成の検出＞
ＯＰ９−ＤＬ１細胞層上での培養を開始してから、１４日目（ｄａｙ２６）、２１日目（ｄａｙ３３）、及び２８日目（ｄａｙ４０）に、Ｔ−ｉＰＳ細胞から誘導したＣＤ３+
ＴＣＲαβ+Ｔ系譜細胞から、トータルＲＮＡを抽出した。
そして、逆転写産物５’末端における乗り換え機構（ｓｗｉｔｃｈ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ａｔ  ｔｈｅ  ５’−ｅｎｄ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）に基づく方法（ＳＭＡＲＴ法、Ｄｕ，Ｇ．ら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２００６年、３０８巻、１９〜３５ページ  参照）にて、Ｓｕｐｅｒ  ＳＭＡＲＴ（登録商標）ｃＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を用いて、製造会社の説明書に従って、ｃＤＮＡを合成した。すなわち、３’ＳＭＡＲＴ（登録商標）ＣＤＳ  ｐｒｉｍｅｒ及びＳＭＡＲＴ  II  Ａ  ｏｌｉｇｏ（Ｓｕｐｅｒ  ＳＭＡＲＴ（登録商標）  ｃＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｋｉｔ）、並びにＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  （Ｔａｋａｒａ社製）を用いて、４２℃にて９０分間、逆転写反応を行った。また、二本鎖ｃＤＮＡの合成及び増幅は、５’ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ  ＩＩ  Ａ（Ｓｕｐｅｒ  ＳＭＡＲＴ（登録商標）  ｃＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｋｉｔ）及びＡｄｖａｎｔａｇｅ２  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（ＢＤ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）に含まれている試薬類を用いて行った。なお、ＰＣＲの反応条件は、９５℃にて５秒間、６５℃にて５秒間、６８℃にて３分間を２０サイクルとした。
【００７９】
そして、増幅したｃＤＮＡは、ＴＣＲＡ特異的増幅反応又はＴＣＲＢ特異的増幅反応における鋳型として用いた。すなわち、フォワードプライマー（２ｎｄ  ５’−ＳＭＡＲＴ）及びリバースプライマーを用いて、９４℃にて３０秒間、５５℃にて３０秒間、７２℃にて３分間という反応を２５サイクル行い増幅した。なお、リバースプライマーとしては、ＴＣＲＡ増幅においては３’−ＴＲＡＣを、ＴＣＲＢ増幅においては３’−ＴＲＢＣを用いた。そして得られたＰＣＲ産物はｐＧＥＭ−Ｔ−Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，  Ｍａｄｉｓｏｎ社製）に挿入し、シークエンシングを行った。
【００８０】
＜統計解析＞
本実施例における全ての統計解析は、エクセル（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ社製）、Ｐｒｉｓｍ（Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ社製）、及びＳｔａｔｃｅｌ２（ＯＭＳ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ社製）を用い、ＡＮＯＶＡ又はスチューデントｔ検定にて行った。そして、Ｐ＜０．０５を有意とした。
【００８１】
（実施例１）
＜ヒト末梢血Ｔ細胞からのｉＰＳ細胞の樹立＞
先ず、ヒト末梢血中のＴ細胞を用いて、図１に示すようにｉＰＳ細胞の樹立を行った。すなわち、健常人（年齢（２４〜５６歳）及び性別の異なる複数の健常人）の末梢血より、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）又はＣＤ３陽性細胞を単離し、ＣＤ３／ＣＤ２８  ＣｌｉｎＥｘＶｉｖｏ  ビーズにて刺激した。そして、ｈＩＬ−２  ２０ｎｇ／ｍｌを含有するＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳ＋ＰＳＧ（ペニシリン、ストレプトマイシン、及びＬ−グルタミン）で２日間培養し、ＶＳＶ−Ｇシュードタイプのレトロウイルスウイルスベクター  ｐＭＸ  ＯＣＴ４、ｐＭＸ  ＳＯＸ２、ｐＭＸ  ＫＬＦ４、及びｐＭＸ  ｃ−ＭＹＣｍ、又はｐＭＸ  ＯＣＴ４、ｐＭＸ  ＳＯＸ２、ｐＭＸ  ＫＬＦ４を用いて遺伝子導入した。連続２日間の遺伝子導入操作後、分離日から６日目に６ｃｍｄｉｓｈの照射ＭＥＦ（マウス胎児繊維芽細胞）上に１×１０5個を撒き、連日半量ずつｉＰＳメディウム（ヒト
ｉＰＳ細胞培地）に置換していき、播種後４日間にＴ細胞メディウムから完全にｉＰＳメディウムに置換した。分離１１日後（播種５日後）ころより敷石様の細胞集ゾクを認め、数日の後（培養開始してから１８〜２４日後）にヒトＥＳ細胞様の外観を呈するようになった（図２：コロニー（ヒトＥＳ細胞様コロニー）の写真  参照、）。それらの細胞はＡＬＰ染色陽性、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１などの未分化マーカー陽性（図３：コロニーの染色写真  参照）であり、外来遺伝子のサイレンシングとＥＳ細胞様遺伝子発現パターンを認めた（図４：電気泳動の写真  参照）。なお、ｃ−ＭＹＣを導入した、及び導入しなかった３×１０5個の細胞から、各々アルカリフォスファター
ゼ（ＡＬＰ）陽性ヒトＥＳ細胞様コロニーを、７７±２５（０．０３％）及び５．１±２．４（０．００１％）の割合にて得た(図５  参照)。
【００８２】
また、マイクロアレイ解析によって、ＣＤ３由来多能性細胞と、ヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ３）及び末梢血Ｔ細胞との発現遺伝子プロファイルを比較した。ＣＤ３由来ｉＰＳ細胞における遺伝子発現の全体的なパターンは、ヒトＥＳ細胞におけるそれと類似しているが、Ｔ細胞におけるそれとは異なるものだった(図６  参照)。
【００８３】
さらに、細胞のカリオタイプ（核型）は正常で（図７：カリオタイプ解析写真  参照）、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス精巣への移植によって３胚葉への分化を示す奇形腫（テラトーマ）を形成した（図８：テラトーマ形成病理所見  参照）。
従って、ヒト末梢血Ｔ細胞から樹立したｉＰＳ細胞は多能性を有していることが明らかになった。
【００８４】
（実施例２）
樹立されたｉＰＳ細胞がＴ細胞由来であることを確認するために、ＴＣＲ遺伝子の再構
成を確認した。ＴＣＲ遺伝子はＴＣＲδ、ＴＣＲγ、ＴＣＲβの３群が（ほぼこの順番で）早期から再構成を始める。４因子由来の４クローン中２クローン、３因子由来の９クローン中６クローンでＴＣＲγ遺伝子の再構成を認めた（図９：電気泳動  参照）。それらのクローンのＴＣＲβ遺伝子とＴＣＲα遺伝子の再構成を解析したところ、全てのクローンでインフレーム（ｉｎ  ｆｒａｍｅ）のＴＣＲβ遺伝子とＴＣＲα遺伝子の再構成を認めた（表５：ＴＣＲα鎖領域のインフレーム（ｉｎ  ｆｒａｍｅ）遺伝子再構成、表６：ＴＣＲβ鎖領域のインフレーム（ｉｎ  ｆｒａｍｅ）遺伝子再構成  参照）。それらの全ての再構成でＴＲＡＶ２４とＴＲＢＶ１１が特異的に用いられるＮＫＴ細胞タイプの組合わせは無く、末梢血Ｔ細胞由来のｉＰＳ細胞であることが確認された。なお、表５及び６において、「ｉＰＳ  Ｃｌｏｎｅ」は樹立したＴ細胞由来のｉＰＳ細胞株を示し、「Ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ」は再構成に用いられるセグメントの組み合わせを示し、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｊｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｉｏｎ」は結合領域の塩基配列を示す。
【００８５】
【表５】
2020010704.tif 000006
【００８６】
【表６】
2020010704.tif 000007
【００８７】
（実施例３）
また、実施例２同様に、樹立されたｉＰＳ細胞がＴ細胞由来であることを確認するために、ＴＣＲ遺伝子の再構成を確認した。すなわち、ヒトは４つのＴＣＲ遺伝子（ＴＣＲＡ、ＴＣＲＢ、ＴＣＲＧ、及びＴＣＲＤ）を有しており、これらのＤＮＡ再構成は、胸腺における正常なＴリンパ球の発達に関与していることが知られている。また、ＴＣＲ遺伝子の再構成は、Ｔ系譜細胞に特異的な、不可逆的な遺伝的現象であり、この遺伝的現象によってＴ細胞は遺伝的な痕跡を与えられ、特徴付けられる。従って、これらの痕跡を調べる
ことにより、実施例１において得られたｉＰＳ細胞は、健常人ドナーの成熟末梢Ｔリンパ球由来であるかどうか遡及的に確認することができる。
【００８８】
先ず、Ｂｅｎｈａｔｔｅｒ達やＢＩＯＭＥＤ−２コンソーシアムによって設計されたＴＣＲプライマーセットを用いたＰＣＲ解析によって、ＴＣＲＧ又はＴＣＲＢ再構成を検出した（図２８及び２９  参照、Ｂｅｎｈａｔｔａｒ，Ｊ．ら、Ｄｉａｇｎ  Ｍｏｌ  Ｐａｔｈｏｌ、１９９５年、４巻、１０８〜１１２ページ、ｖａｎ  Ｄｏｎｇｅｎ，  Ｊ．Ｊ．、Ｌｅｕｋｅｍｉａ、２００３年、１７巻、２２５７〜２３１７ページ  参照）。その結果、調べた全てのｉＰＳ細胞株において、ＴＣＲＧ又はＴＣＲＢ再構成は同定され、調べた全てのｉＰＳ細胞株は末梢血Ｔリンパ球由来のものであることが確認された（図１０及び１１）。
また、ＴＣＲβ鎖はＴＣＲα鎖と共にヘテロ二量体を形成しており、殆どの末梢血Ｔ細胞はＴＣＲαβを発現している（Ｄａｖｉｓ，Ｍ．Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９８年、３３４巻、３９５〜４０２ページ  参照）。ＴＣＲＧ及びＴＣＲＢに対して、ＴＣＲＡ遺伝子座は複雑である。ＴＣＲＡ遺伝子座はＴＣＲＤ遺伝子座を含んでいるだけでなく、１０３のＶαセグメント、６１のＪαセグメント、及びＣαセグメントを含む、１０００ｋｂ以上にわたる領域である。そこで、ゲノムＤＮＡにおけるＴＣＲＡ遺伝子再構成を検出するために、Ｖαセグメントに対する３４のフォワードプライマーと、Ｊαセグメントに対する１２のリバースプライマーとのセットを設計した。なお、多重構造の解析にこれらを用いる際に、膨大なプライマーの組み合わせを実用できる程度にその数を絞った。そして、全てのＪαプライマーは一つのチューブにて混合し、このＪαプライマーミックスと、各Ｖαプライマーとを用いて、１つのサンプルに対して３４のＰＣＲ反応を行った。その結果、この方法によって、ＴＣＲＢ再構成ｉＰＳ細胞において、ＴＣＲＡ再構成を同定することができた（図１２  参照）。
【００８９】
さらに、ＨＬＡ−ペプチド複合体に対するＴＣＲの結合性は、３タイプの相補性決定領域（ＣＤＲ１、２、及び３）からなる抗原認識部位の三次元構造によって必然的に決定される。これら３領域においては、様々なランダムヌクレオチド（Ｎ−ヌクレオチド又はＰ−ヌクレオチド）が挿入されているＶ（Ｄ）Ｊ結合領域に渡っているため、ＣＤＲ３は最も分散可能（ｄｉｖｅｒｓｉｆｉａｂｌｅ）なものである。そこで、樹立したｉＰＳ細胞のゲノムのＣＤＲ３領域における、個々のＴＣＲ鎖をコードする配列を同定した。その結果、元のＴ細胞における機能的な再構成（Ｒｅａｒｒａｎｇｅｄ（Ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ）、インフレームで結合しておりストップコドンがない構成）が保存されていることが明らかになり、全てのＴ−ｉＰＳ細胞において、１アレル上に機能的なＴＣＲＡ及びＴＣＲＢ再構成を一つのみ有していることが明らかになった。もう片方のアレルにおいては、ＤＪβ再構成を含む、完全な又は非機能的な再構成（ｉｎｔａｃｔ又はＲｅａｒｒａｎｇｅｄ（Ｕｎｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ)）を有していることが明らかになった(表７、及び図１３参照）。なお、表７において、「ｉＰＳ  Ｃｌｏｎｅ」は樹立したＴ細胞由来のｉＰＳ細胞株を示し、「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ」は、再構成したＴ細胞受容体が機能を有するか否か、すなわちβ受容体と複合体を作り抗原を認識するか（機能的：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ）、否か（非機能的：Ｕｎｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ）を示し、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｊｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｉｏｎ」は結合領域の塩基配列を示す。また、ＴＲＡＶ２４及びＴＲＢＶ１１セグメントが特異的に確認されるヒトＮＫＴリンパ球はなかった（Ｇｏｄｆｒｅｙ，Ｄ．Ｉ．ら、Ｓｅｍｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、２２巻、６１〜６７ページ  参照）。したがって、ＣＤＲ３配列に刻まれていたＴＣＲ産生能は変化することなく、一つの末梢血Ｔ細胞からｉＰＳ細胞が作製されたことが明らかになった。
【００９０】
【表７】
2020010704.tif 000008
【００９１】
（実施例４）
＜ＣＤ４+リンパ球又はＣＤ８+リンパ球からｉＰＳ細胞への再プログラミング＞
末梢Ｔリンパ球は主に２つの機能的なサブセット、すなわちＣＤ４+ヘルパー／制御性
細胞、及びＣＤ８+細胞傷害性細胞に由来する。また、ウィルスによる遺伝子導入効率に
おいて、ＣＤ４+リンパ球とＣＤ８+リンパ球との間に有意な差はないことが知られている（Ｂｅｒｇｅｒ，Ｃ．ら、Ｂｌｏｏｄ、２００３年、１０１巻、４７６〜４８４ページ、Ｋａｎｅｋｏ，Ｓ．ら、Ｂｌｏｏｄ、２００９年、１１３巻、１００６〜１０１５ページ
参照）。そこで、末梢Ｔリンパ球をＣＤ４+Ｔ細胞とＣＤ８+Ｔ細胞とに分け、ｉＰＳ細
胞への再プログラミングを行い、由来するＴ細胞の違いによって、ｉＰＳ細胞への再プログラミングの効率に差異があるのかどうかを調べた。なお、各細胞における誘導条件を下記に示す。
【００９２】
＜ＣＤ４+Ｔ細胞に対する誘導条件＞
採血により得た末梢血単核球のＣＤ３陽性ＣＤ５６陰性ＣＤ４陽性Ｔ細胞分画（以下、ＣＤ４陽性Ｔ細胞）をフローサイトで分取し、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体（ビーズ結合、固層化、培地への添加の別を問わない）で活性化させた。培地にはヒトＩＬ−２を２０ｎｇ／ｍｌ程度添加し、刺激から４８〜９６時間後にかけてレトロネクチンをコートした２４穴プレート上で複数回の山中因子遺伝子導入を行った。その際に用いた山中因子はＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、及びＣ−ＭＹＣ、又はＯＣＴ４、ＳＯＸ２、及びＫＬＦ４である。最後の遺伝子導入から２日後以降を目安に、６ｃｍディッシュ上の照射ＭＥＦ上に１〜５ｘ１０5の遺伝子導入Ｔ細胞を乗せた。なお、初日にフローサイトでＣＤ４陽
性Ｔ細胞を分取して用いなかった場合は、このタイミングでフローサイトによりＣＤ４陽性Ｔ細胞を分取してＭＥＦに乗せた。乗せ換え翌日より４日間、半量ずつの培地を０．５μＭバルプロ酸入りＥＳ細胞用培地に置換し、その後は連日又は一日おきに０．５μＭバルプロ酸入りＥＳ細胞用培地を交換して培養を続けた。乗せ換え後１０日前後より敷石様の細胞集簇を認め、数日のうちに完成したｉＰＳ細胞コロニーが観察された。
【００９３】
＜ＣＤ８+Ｔ細胞に対する誘導条件＞
採血により得た末梢血単核球のＣＤ３陽性ＣＤ５６陰性ＣＤ８陽性Ｔ細胞分画（以下、ＣＤ８陽性Ｔ細胞）をフローサイトで分取し、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体（ビーズ結合、固層化、培地への添加の別を問わない）で活性化させた。培地にはヒトＩＬ−２を２０ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ−７を１０ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ−１５を１０ｎｇ／ｍｌ程度添加し、刺激から４８〜９６時間後にかけてレトロネクチンをコートした２４穴プレート上で複数回の山中因子遺伝子導入を行う。その際に用いた山中因子はＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、Ｃ−ＭＹＣ、ＮＡＮＯＧ、及びＬＩＮ２８、又はＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、Ｃ−ＭＹＣ、及びＮＡＮＯＧである。最後の遺伝子導入から２日後以降を目安に、６ｃｍディッシュ上の照射ＭＥＦ上に１〜５ｘ１０5の遺伝子導入Ｔ細胞を乗せた。なお、初日にフ
ローサイトでＣＤ８陽性Ｔ細胞を分取して用いなかった場合は、このタイミングでフローサイトによりＣＤ８陽性Ｔ細胞を分取してＭＥＦに乗せた。乗せ換え翌日より４日間、半量ずつの培地を０．５μＭバルプロ酸入りＥＳ細胞用培地に置換し、その後は連日又は一日おきに０．５μＭバルプロ酸入りＥＳ細胞用培地を交換して培養を続けた。乗せ換え後２週前後より敷石様の細胞集簇を認め、１〜２週のうちに完成したｉＰＳ細胞コロニーが観察された。
【００９４】
上記誘導条件にて調べた結果、本実施例においては、ＮＡＮＯＧを導入しない条件下におけるＣＤ４+Ｔリンパ球からＴ−ｉＰＳ細胞への誘導の成功率は、リプログラミング因
子  ＮＡＮＯＧを更に導入する条件下におけるＣＤ８+Ｔリンパ球からＴ−ｉＰＳ細胞へ
の誘導の成功率の２倍であった。なお、本実施例において、ＣＤ４+Ｔリンパ球からはＮ
ＡＮＯＧを導入せずに、７、８回の試行によってＴ−ｉＰＳ細胞が得られる。
【００９５】
また、図には示さないが、ＣＤ８+Ｔリンパ球からＴ−ｉＰＳ細胞への誘導の際に、Ｍ
ＥＦ上への乗せ換え後に１０μＭのＲＯＣＫ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ存在下に５％Ｏ2下の
低酸素培養、又は１μＭ  ＭＥＫ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＰＤ０３２５９０１）及び３μＭ  ＧＳＫ３  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  （ＣＨＩＲ９９０２１）をコロニー形成まで培地に添加することによって、Ｔ−ｉＰＳ細胞への誘導効率が若干上昇する傾向にあることが確認された。
【００９６】
前記結果を受け、さらに、ＣＤ４+Ｔリンパ球を更に、ＣＤ４５ＲＡ及びＣＤ６２Ｌ／
ＣＣＲ７の発現に基づき、ナイーブ（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋）、セントラルメモリー（ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ６２Ｌ＋）、エフェクターメモリー（ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ６２Ｌ−）、及びターミナルエフェクターＴ細胞（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ−）のサブセットに分け、ｉＰＳ細胞への誘導（再プログラミング）を行った（Ｓａｌｌｕｓｔｏ，Ｆ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９９年、４０１巻、７０８〜７１２ページ  参照、図１４  参照）。その結果、健常人ドナー３人における平均  再プログラミングの効率は、ナイーブＴ細胞においては０．００４１％、セントラルメモリーＴ細胞においては０．０１７％、エフェクターメモリーＴ細胞においては０．００３６％、ターミナルエフェクターＴ細胞においては０．０００８％であり、特にセントラルメモリーＴ細胞より比較的良好にＴ−ｉＰＳ細胞は樹立されることが明らかになった（図１５  参照）。なお、ＣＤ４+セントラル
メモリーＴ細胞の再プログラミング効率の高さは、抗ＣＤ３／ＣＤ２８刺激に対する感受性を反映しているのかもしれない。
【００９７】
（実施例５）
＜ＴｉＰＳ細胞から分化したＴ系譜細胞の機能解析＞
ヒトＥＳ細胞から得たＣＤ３４陽性細胞をＳＣＩＤ−ｈｕマウスに移植することで移植されたヒト胎児胸腺内にＴ細胞系譜が分化誘導される（Ｇａｌｉｃ，Ｚら、ＰＮＡＳ、２００６年、１０３巻、３１号、１１７４２〜７ページ  参照）。またｉｎ  ｖｉｖｏではＥＳ細胞はＯＰ９−ＤＬ１細胞によって、ＣＤ４／ＣＤ８  ｄｏｕｂｌｅ  ｐｏｓｉｔｉｖｅを主としたＣＤ３陽性、ＴＣＲ陽性細胞へと誘導される（Ｔｉｍｍｅｒｍａｎｓら、ＪＩ、２００９年、１８２巻、６８７９〜６８８８ページ  参照）。
【００９８】
そこで、得られたＴ細胞由来ｉＰＳ細胞（Ｔ−ｉＰＳ細胞）を用いて、Ｔ細胞への分化誘導を試みた。Ｔ細胞は発生過程でＴＣＲ遺伝子の組み換えを経た後には高頻度体細胞突然変異をおこさないので、Ｔ−ｉＰＳ細胞から誘導したＴ細胞系譜は元のＴ−ｉＰＳ細胞のＴＣＲ情報を保持し、対立アレル排除状態によってはモノクローナルなＴＣＲをもつと予想した。しかしながら、Ｔ−ｉＰＳ細胞からＴ細胞が誘導できるかどうか、また誘導したＴ細胞は機能的であるかどうか、ＴＣＲの再構成状態は、Ｔ−ｉＰＳ細胞の元になったＴ細胞と同一であるかどうかについては不明であるため、これらの点について以下の通り調べた。
【００９９】
先ず、樹立したＴ−ｉＰＳ細胞よりＴＣＲα鎖、ＴＣＲβ鎖とも片方のアレルがインフレーム（ｉｎ  ｆｒａｍｅ）再構成を起こし、対側のアレルがα鎖においてはアウトフレーム（ｏｕｔ  ｆｒａｍｅ）再構成、β鎖においてはＤＪ再構成で停止したクローンを選択し（ＴｋＴ３Ｖ１−７）、Ｔ細胞系譜をｉｎ  ｖｉｔｒｏで誘導した。ＩＬ−７、Ｆｌｔ３Ｌ（ヒトＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド）またはＳＣＦ（ヒト幹細胞因子、ｈＳＣＦ）存在下にＯＰ９上で培養されたＴ−ｉＰＳ細胞はＥＳ−ｓａｃ（サック）（Ｔａｋａｙａｍａら、Ｂｌｏｏｄ、２００８年、１１１巻、１１号、５２９８〜５３０６ページ  参照）様の構造物を形成して１４日目までに内部にＣＤ４５陽性血液細胞を誘導した（図１６の（ａ）  参照）。１２〜１４日目に血液細胞をＯＰ９−ＤＬ１に乗せ換えて培地交換を３日おきに繰り返して培養を継続し、２１日目および４０日目にＦＡＣＳでＣＤ３陽性細胞を採取しＴ細胞関連遺伝子の発現を評価した。４０日目のＣＤ３陽性細胞はＣＤ４／８陰性細胞が中心であるものの、一部にＣＤ８の単独陽性細胞を認めた（図１６の（ｂ）  参照）。
【０１００】
また、サックをＯＰ９−ＤＬ１細胞層上に移した後、サックから出てきた浮遊細胞を回収し、フローサイトメトリーを用いて毎週分析した（図１７の（ａ）  参照）。その結果、第１週において、大抵の浮遊細胞はＣＤ４５を弱く発現しおり、いくらかの細胞において、ＣＤ３４、ＣＤ７、及びＣＤ１ａは発現しており、一方ＣＤ３−ＴＣＲαβ複合体及びＣＤ５を発現している細胞はなかった。第２週において、大抵の細胞においてＣＤ４５
の発現は亢進しており、いくらかの細胞において、ＣＤ３−ＴＣＲαβ複合体も発現し始めていた。第３週までに、ＣＤ３４細胞は完全に消失しており、ＣＤ３−ＴＣＲαβ強陽性細胞は浮遊細胞の最も多い細胞群となっていた。なお、ＣＤ３＋細胞においてＴＣＲαβ-細胞はなかった（図１７の（ｂ）  参照）。また、第３週の後でさえ、大抵の再分化
ＣＤ３+ＴＣＲαβ+細胞は、共陰性（ＤＮ）ステージのものであったが、いくつかの細胞群においては、ＣＤ４のみ陽性な細胞（８．５±８．２％）及びＣＤ８のみ陽性な細胞（１５．５±１５．９％）も検出された（図１８及び図１９  参照）。
【０１０１】
一般に、胸腺細胞ステージでも、ＴＣＲ発現Ｔ系譜細胞はＴＣＲ刺激に応答することができ、サイトカインを産生することもできることが知られている（Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｍ．ら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９１年、１４６巻、３４５２〜３４５６ページ  参照）。そこで、ＯＫＴ−３及びＩＬ−２にて前記浮遊細胞を刺激して、ＣＤ３発現細胞の活性化並びに数を調べた。すなわち、３０ｎｇ／ｍｌ  ＯＫＴ−３及び６００ＩＵ／ｍｌ  ｈＩＬ−２にて５日間、浮遊細胞を刺激した結果、ＣＤ３+細胞群は増加し、形態学的基準に
よってＣＤ３発現細胞は活性化しているように見受けられた（図２０  参照）。しかし、実際のＣＤ３+細胞は変わっていないことが確認された。
【０１０２】
また、誘導ＣＤ３+ＴＣＲαβ+細胞はＴ系譜細胞への分化誘導に機能的に寄与していることを明らかにするため、サイトカイン産生能を下記の通り評価した。すなわち、ＰＭＡ及びカルシウムイオノフォア（イオノマイシン）によって刺激した結果、１２．５％のＴ系譜細胞はＩＦＮ−γを産生し、１．０％のＴ系譜細胞はＩＬ−２を産生し、６．２％のＴ系譜細胞はその両方を産生していることが明らかになった（図２１  参照）。従って、Ｔ−ｉＰＳ細胞から誘導したＣＤ３+ＴＣＲαβ+細胞は、形態学的にも機能的にもＴ系譜細胞への誘導に寄与していることが明らかになった。
【０１０３】
また、前述の通り、一般にＴＣＲ遺伝子は高頻度体細胞突然変異（ｓｏｍａｔｉｃ  ｈｙｐｅｒ−ｖａｒｉａｂｌｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ）を受けないため、Ｔ−ｉＰＳ細胞由来の再分化Ｔ系譜細胞は高頻度にＴ−ｉＰＳ細胞の元となった細胞のゲノムにコードされているＴＣＲαβが発現していることが予想される。しかしながら、ＴＣＲの再構成状態は、Ｔ−ｉＰＳ細胞の元になったＴ細胞と同一であるかどうかについては不明であるため、この点について以下の通り調べた。
【０１０４】
その結果、誘導されたＣＤ３細胞のＴＣＲ発現を解析するとＴｋＴ３Ｖ１−３、ＴｋＴ３Ｖ１−７においては１種類のＴＣＲβ鎖のみが出現しており、ＣＤＲ３領域を中心とした配列は誘導前のｉＰＳ細胞と同一であった（図２２  参照）。ＴＣＲα鎖は多様性を認めるものの大半は再構成済みのα鎖由来であった（図２３  参照）。リプログラミングを受けたＴ細胞は再度Ｔ細胞へと誘導される際に、クローナルにＴＣＲを発現することが明らかになった。
【０１０５】
また、ドナー２人由来の４  Ｔ−ｉＰＳ細胞から再分化したＣＤ３highＴＣＲαβhighＴ系譜細胞を分析した。すなわち、これらの細胞のｃＤＮＡライブラリーをＳＭＡＲＴ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎによって構築し（Ｄｕ，Ｇ．，ら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２００６年、３０８巻、１９〜３５ページ  参照）、ＴＣＲ遺伝子を増幅した。そして、増幅したＴＣＲ遺伝子をクローニングベクターに挿入し、クローニングして分析した。
【０１０６】
その結果、分析したクローンの配列は、Ｔ−ｉＰＳ細胞の分化前の細胞のゲノムにコードされていたＴＣＲ配列と一致した（図１３、２３、及び２５  参照）。一方、殆どの転写産物は機能的な鎖（ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ｃｈａｉｎ）由来であり、非機能的な鎖（ｕｎｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ｃｈａｉｎ）由来の転写産物も存在していた（表８  参照）
。しかし、機能的又は非機能的再構成由来の配列とは異なる転写産物は確認されなかった（表９  参照）。なお、表８において、「ｉＰＳ  Ｃｌｏｎｅ」は樹立したＴ細胞由来のｉＰＳ細胞株を示し、「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ」は、再構成したＴ細胞受容体が機能を有するか否か、すなわちβ受容体と複合体を作り抗原を認識するか（機能的：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ）、否か（非機能的：Ｕｎｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ）を示し、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｊｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｉｏｎ」は結合領域の塩基配列を示す。また、表９において、「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ」は、再構成したＴ細胞受容体が機能を有するか否か、すなわちβ受容体と複合体を作り抗原を認識するか（機能的：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ）、否か（非機能的：Ｕｎｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ）を示し、「Ｎｏ．ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ  Ｓａｍｐｌｅｓ」は各ＴＣＲ遺伝子において解析したサンプル数を示し、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  Ｔ−ｉＰＳＣ‘ｓ  ｇｅｎｏｍｅ」は、解析したサンプルにおいて、再分化前のＴ−ｉＰＳ細胞のゲノムと一致した数及び割合（Ｉｄｅｎｔｉｃａｌ）、又は該ゲノムと異なった数及び割合（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ）を示す。
【０１０７】
【表８】
2020010704.tif 000009
【０１０８】
【表９】
2020010704.tif 000010
【０１０９】
さらに、他の多能性細胞からＣＤ３４陽性細胞への誘導と、本発明の方法とを比較した。その結果、ＥＳ細胞（ヒトＥＳ細胞、Ｈｕｍａｎ  ＥＳＣ）、皮膚由来ｉＰＳ細胞（ヒト皮膚繊維芽細胞由来ｉＰＳ細胞、ＨＤＦ−ｉＰＳ）、ＣＤ３４陽性細胞由来ｉＰＳ細胞（臍帯血ＣＤ３４陽性細胞由来ｉＰＳ細胞、ＣＢ−ｉＰＳＣ）、Ｔ−ｉＰＳ細胞（Ｔ−ｉ
ＰＳＣ）のいずれにおいてもＣＤ３陽性細胞が誘導されたが、Ｔ−ｉＰＳ細胞は、皮膚細胞やＣＤ３４陽性細胞に由来するｉＰＳ、およびＥＳ細胞に比して明らかにＴ細胞へと誘導されやすいことが判明した（図１６、１７、２６、及び２７  参照）。
【０１１０】
（実施例６）
＜ヒトＴ細胞より樹立したｉＰＳ細胞から機能的Ｔ細胞への誘導２＞
複数ドナーのＣＤ４Ｔ細胞又はＣＤ８Ｔ細胞に由来するＴ−ｉＰＳＣクローン（６クローン）を用いて、モノクローナルＴＣＲを持つＴ細胞集団の誘導を試みた。すなわち、誘導開始日に３×１０5個のＴ−ｉＰＳ細胞を１０ｃｍディッシュに敷き詰めた照射ＯＰ９
細胞又は１０Ｔ１／２細胞に撒き、分化培地を用いて１４日間程度共培養した。１２〜１４日目にかけて共培養中に袋状の構造物に入った血球細胞が出現した。なお、その際にサイトカインを併用しなくても血球細胞は出現したが、ＶＥＧＦを添加するとＣＤ３４陽性造血幹細胞（以下ＣＤ３４細胞）の回収が改善することが明らかになった。またＶＥＧＦ、ＳＣＦ、及びＴＰＯ、又はＶＥＧＦ、ＳＣＦ、及びＦＬＴ３Ｌを加えると、さらにＣＤ３４細胞の回収が改善するも明らかになった。なお、後述の通り、これらの傾向は最終産物であるＴ系譜細胞の回収にも反映された。
【０１１１】
また、１２日〜１４日目のいずれかに、それらのＣＤ３４細胞を含む血球細胞を１０ｃｍディッシュに敷き詰めた照射ＯＰ９／ＤＬ１細胞、ＯＰ９／ＤＬ４細胞、又は１０Ｔ１／２／ＤＬ４細胞に３×１０5個まき、ＩＬ−７及びＦｌｔ３Ｌの存在下に２０％ＦＢＳ
含有α−ＭＥＭ培地にて共培養した。なお、ＳＣＦはＮＫ細胞への分化を強く促すため、使用しなかった。前述の通り、共培養２週目には一部、３週目には大部分の浮遊細胞がＣＤ３陽性ＴＣＲαβ陽性のＴ系譜細胞になるが、それらの細胞はＣＤ４とＣＤ８の発現においてダブルネガティブ（ＤＮ）、ダブルポジティブ（ＤＰ）、シングルポジティブ（ＳＰ）を含み、一様の集団ではなかった（図１７  参照）。そこで、さらに詳細に検討した結果、ＤＮ、ＤＰ、ＣＤ４ＳＰ、ＣＤ８ＳＰの構成はＩＬ−７の濃度に依存することを見出した。具体的には、図には示さないが、ＩＬ−７非添加ではＣＤ３陽性ＣＤ５６陰性Ｔ細胞そのものが少なくて大部分はＤＮであった。ＩＬ−７  ５〜１０ｎｇ／ｍｌではＣＤ３陽性ＣＤ５６陽性ＮＫＴ様の細胞集団が出現し、やはり大部分はＤＮであった。一方、ＩＬ−７  １ｎｇ／ｍｌではＣＤ３陽性ＣＤ５６陰性のＴ系譜細胞が大部分を占め、ＤＮからＤＰ、そしてＣＤ４ＳＰ、ＣＤ８ＳＰへの分化が確認された。また、これらのＳＰ細胞を末梢血Ｔ細胞の分化マーカーで解析すると、ＣＤ８ＳＰの８０％程度はＣＤ４５ＲＡ+ＣＤ６２Ｌ+ナイーブＴ細胞であり、ＣＤ４ＳＰの大部分はＣＤ４５ＲＡ-ＣＤ６２Ｌ+セントラルメモリーＴ細胞であったすなわち、エフェクターメモリー段階に進んでいたＴ細胞が、Ｔ−ｉＰＳ細胞を介してナイーブＴ細胞（ＣＤ８ＳＰの場合）やセントラルメモリーＴ細胞（ＣＤ４の場合）に若返りし得ることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【０１１２】
上記の通り、本発明のヒトＴリンパ球の製造方法は、特に目的とする抗原に特異的であるヒトＴリンパ球の製造、ひいては目的とする抗原に特異的であり、且つ所望のヒト組織適合性抗原（ＨＬＡ）拘束性のＣＤ４単独陽性細胞、またはＣＤ８単独陽性細胞の製造に優れている。従って、本発明は、慢性難治性感染症や悪性腫瘍、又は自己免疫疾患等、種々の難病の治療又は予防等に大きく貢献しうるものである。
【配列表フリーテキスト】
【０１１３】
配列番号１〜１０９
＜２２３＞  人工的に合成されたプライマーの塩基配列
【図１】
2020010704.tif 000011
【図２】
2020010704.tif 000012
【図３】
2020010704.tif 000013
【図４】
2020010704.tif 000014
【図５】
2020010704.tif 000015
【図６】
2020010704.tif 000016
【図７】
2020010704.tif 000017
【図８】
2020010704.tif 000018
【図９】
2020010704.tif 000019
【図１０】
2020010704.tif 000020
【図１１】
2020010704.tif 000021
【図１２】
2020010704.tif 000022
【図１３】
2020010704.tif 000023
【図１４】
2020010704.tif 000024
【図１５】
2020010704.tif 000025
【図１６】
2020010704.tif 000026
【図１７】
2020010704.tif 000027
【図１８】
2020010704.tif 000028
【図１９】
2020010704.tif 000029
【図２０】
2020010704.tif 000030
【図２１】
2020010704.tif 000031
【図２２】
2020010704.tif 000032
【図２３】
2020010704.tif 000033
【図２４】
2020010704.tif 000034
【図２５】
2020010704.tif 000035
【図２６】
2020010704.tif 000036
【図２７】
2020010704.tif 000037
【図２８】
2020010704.tif 000038
【図２９】
2020010704.tif 000039
【配列表】
2020010704000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年10月18日(2019.10.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＴ細胞を製造する方法であって、
ヒトＴ細胞からｉＰＳ細胞を誘導する工程と、
該ｉＰＳ細胞をＴ細胞に分化させる工程と
を含む、方法。