(57)【要約】      （修正有）【課題】対象における移植された治療用細胞の生存を制御する方法を提供すること。【解決手段】ａ）治療用細胞を調製するまたは得るステップ、ｂ）該治療用細胞に、多量体化領域と、カスパーゼ−９ポリペプチドまたは改変カスパーゼ−９ポリペプチドとを含むキメラポリペプチドをコードする核酸をトランスフェクトまたは形質導入するステップ、ｃ）該形質導入またはトランスフェクトされた治療用細胞を該対象に移植するステップ、およびｄ）（ｃ）の後に、該対象に、該多量体化領域に結合する多量体リガンドを、該カスパーゼ−９ポリペプチドまたは該改変カスパーゼ−９ポリペプチドを発現する移植された治療用細胞の８０％未満を死滅させるために有効な量で投与するステップを含む、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書または図面に記載の物、使用、方法またはシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
分野
本技術は一部において、誘導性カスパーゼポリペプチドを発現する細胞の部分的なアポ
トーシスを誘導するための方法に関する。本技術は一部において、多量体リガンド誘導因
子に対して改変された用量反応曲線を有する誘導性改変カスパーゼポリペプチドを発現す
る細胞の部分的なアポトーシスを誘導するための方法にさらに関する。本技術は一部にお
いて、誘導性カスパーゼポリペプチドまたは誘導性改変カスパーゼポリペプチドを発現す
る細胞を使用する細胞療法のための方法であって、アポトーシスによって排除されたカス
パーゼポリペプチド発現細胞の割合が、多量体リガンド誘導因子の投与量に関連する方法
にもまた関する。
【０００２】
関連出願
その全体が参考として本明細書に参照され、援用される、２０１３年６月５日出願の米
国仮特許出願第６１／８３１，４２８号、表題「ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＩＮＤＵＣＩ
ＮＧ  ＰＡＲＴＩＡＬ  ＡＰＯＰＴＯＳＩＳ  ＵＳＩＮＧ  ＭＯＤＩＦＩＥＤ  ＣＡＳＰ
ＡＳＥ  ＰＯＬＹＰＥＰＴＩＤＥＳ」および２０１４年３月７日出願の米国特許出願第６
１／９４９，８４７号、表題「ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＩＮＤＵＣＩＮＧ  ＰＡＲＴＩ
ＡＬ  ＡＰＯＰＴＯＳＩＳ  ＵＳＩＮＧ  ＭＯＤＩＦＩＥＤ  ＣＡＳＰＡＳＥ  ＰＯＬＹ
ＰＥＰＴＩＤＥＳ」に対して優先権を主張する。
【０００３】
本出願は、その全体が参考として本明細書に援用される、２０１４年３月７日出願の国
際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０２２００４、表題ＭＯＤＩＦＩＥＤ  ＣＡＳＰＡＳＥ  
ＰＯＬＹＰＥＰＴＩＤＥＳ  ＡＮＤ  ＵＳＥＳ  ＴＨＥＲＥＯＦに関連する。
【背景技術】
【０００４】
キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞（ＣＡＲ）、ドナーリンパ球輸注（ＤＬＩ）、または造血
幹細胞移植後のＴ細胞追加輸注（Ｔ  ｃｅｌｌ  ａｄｄ−ｂａｃｋ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ
ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｓ）（ＨＳ
ＣＴ）を使用する療法などの大多数のＴ細胞療法では、実証された腫瘍に対する有効性の
臨床的妥当性は、オフターゲットまたはオフオーガン（ｏｆｆ−ｏｒｇａｎ）の有害作用
のリスクによっていくらか弱まる。さらに、大きな腫瘍塊を対象とするものなどの過度な
オンターゲット効果により、腫瘍崩壊症候群（ＴＬＳ）、サイトカイン放出症候群（ＣＲ
Ｓ）またはマクロファージ活性化症候群（ＭＡＳ）に関連するサイトカインストームが生
じる恐れがある。結果として、移入されたＴ細胞または幹細胞により重篤な有害事象（Ｓ
ＡＥ）が誘発された、または移入されたＴ細胞または幹細胞が処置後に陳旧になった場合
にそれらを排除することができる、安定な信頼できる「自殺遺伝子」の開発に大きな関心
が寄せられている。
【０００５】
選択的なアポトーシスを誘導することによって治療用細胞を選択的に死滅させるための
方法では有害事象が起こるはずであり、２０１１年５月２０日出願の米国特許出願第１３
／１１２，７３９号、表題「ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＩＮＤＵＣＩＮＧ  ＳＥＬＥＣＴ
ＩＶＥ  ＡＰＯＰＴＯＳＩＳ」、発明者名Ｍａｌｃｏｌｍ  Ｋ．  Ｂｒｅｎｎｅｒにおい
て考察されている。改変カスパーゼ−９ポリペプチドは、２０１３年３月１０日出願の米
国特許出願第１３／７９２，１３５号、表題「ＭＯＤＩＦＩＥＤ  ＣＡＳＰＡＳＥ  ＰＯ
ＬＹＰＥＰＴＩＤＥＳ  ＡＮＤ  ＵＳＥＳ  ＴＨＥＲＥＯＦ」、発明者名Ｄａｖｉｄ  Ｓ
ｐｅｎｃｅｒらにおいて考察されている。各特許出願はその全体がこれによって参照によ
り本明細書に組み込まれる。
【０００６】
細胞療法において使用するドナー細胞の可能性のある負の影響を迅速に取り除きながら
当該療法の有益な影響の一部または全部を保持する能力の釣り合いをとるための方法が必
要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
要約
細胞療法後の有害事象の際、細胞の別個の画分を部分的なアポトーシスによって排除す
ることができ、それにより細胞療法の有益な影響を残すことが可能になる。細胞療法の一
例は、ＣＤ３４＋幹細胞移植後の養子Ｔ細胞移入である。幹細胞移入後にＴ細胞を投与す
ることは、患者レシピエントにおける免疫系の再構成を加速する助けになる。Ｔ細胞は、
例えば、適合血縁ドナーまたは適合非血縁ドナーから得ることができる。適合血縁ドナー
もしくは適合非血縁ドナーが得られない場合、または広範囲にわたるドナー検索を行うに
は疾患が侵攻性でありすぎる場合、ＨＬＡハプロタイプ一致家族ドナーの使用が有効であ
り得る。そのようなドナーは、親、同胞、または第二度近親者であってよい。そのような
注入により、免疫の回復を増強させ、それにより、ウイルス感染を減少させ、再発性白血
病細胞を排除することができる。しかし、ドナー幹細胞移植片にアロ反応性Ｔ細胞が共存
することにより、ドナー細胞がレシピエントに対して反応する移植片対宿主病（ＧｖＨＤ
）が引き起こされる可能性があり、これにより、レシピエントの皮膚、腸、肝臓、および
他の器官が次第に損傷を受ける可能性があり、致死的結果が伴うことも多い。誘導性カス
パーゼ−９系をヒトＴ細胞に適用することができ、次いでこれを幹細胞移植患者に投与す
る。移植片対宿主病の症状が見られたら、多量体リガンドを投与し、その後カスパーゼ−
９が活性化され、これにより、当該タンパク質の二量体化および同種異系活性化Ｔ細胞の
アポトーシスの誘導が引き起こされる。
【０００８】
カスパーゼ−９に基づくアポトーシス安全スイッチは、抗原特異性をＴ細胞に伝達する
ために設計された人工受容体を発現する治療用キメラ抗原受容体発現細胞にも適用するこ
とができる。当該細胞は、Ｔ細胞が活性化され、特異免疫がもたらされるように選択され
た抗原特異的成分、膜貫通成分、および細胞内成分を含む。キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞
は、がん療法を含めた種々の療法に使用することができる。これらの療法は腫瘍に対して
有効であるが、その一方で、一部の場合には、健康な組織に対する非特異的攻撃に一部起
因する副作用が導かれている。これらの治療用細胞を患者に投与する前に誘導性カスパー
ゼ−９系をこれらの細胞にもたらして、患者に、例えば、間違った器官がキメラ抗原受容
体の標的になる、オンターゲットであるがオフオーガンの毒性などの負の副作用が生じた
場合に治療用細胞を選択的に死滅させる能力をもたらすことができる。
【０００９】
他の実施形態では、カスパーゼ−９に基づくアポトーシス安全スイッチを、組織幹細胞
およびそれらの後代を排除するため、ならびに、あまりに完全な死滅により腫瘍溶解作用
が限定される可能性がある、腫瘍溶解性ウイルスに媒介される腫瘍の死滅を増強するため
に使用することができる。
【００１０】
一部の実施形態において特色とされる方法は、カスパーゼ−９発現細胞の別個の画分に
おいてアポトーシスを誘導する方法を含む。例えば、移植片対宿主病が生じた際に、これ
らの方法を使用することにより、患者の免疫系の再構成に役立つ十分な数の治療用細胞を
残しながら、一定の百分率の、移植片対宿主病を引き起こす治療用細胞を排除することが
できる。別の例では、移植後のオフターゲットの毒性に際して、治療用細胞の治療効果を
継続させるために十分な数の細胞を残しながら、一定の百分率の、キメラ抗原受容体を発
現する治療用細胞を排除することができる。さらに別の例では、キメラ抗原受容体発現細
胞および幹細胞移植後の治療用Ｔ細胞などの治療用細胞の両方を患者に輸注する場合、有
害事象が生じた際には、治療用細胞の集団の１つを治療用Ｔ細胞の他の集団の割合に有意
に影響を及ぼすことなく排除することができる。
【００１１】
したがって、一部の実施形態では、対象における移植された治療用細胞の生存を制御す
るための方法であって、治療用細胞を調製するまたは得るステップ；治療用細胞に、多量
体リガンド結合性領域およびカスパーゼ−９ポリペプチドまたは改変カスパーゼ−９ポリ
ペプチドを含むキメラタンパク質をコードする核酸をトランスフェクトまたは形質導入す
るステップであって、カスパーゼ−９ポリペプチドまたは改変カスパーゼ−９ポリペプチ
ドが配列番号９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むステ
ップ；形質導入またはトランスフェクトされた治療用細胞を対象に移植するステップ；お
よび移植後に、多量体リガンド結合性領域に結合する多量体リガンドを対象に有効量で投
与するステップであって、カスパーゼ−９ポリペプチドまたは改変カスパーゼ−９ポリペ
プチドを発現する移植された治療用細胞の８０％未満が多量体リガンドの投与後に死滅す
るステップを含み、改変カスパーゼ−９ポリペプチドが、改変されていないカスパーゼ−
９ポリペプチドと比較して、多量体リガンドに対する応答において低下したＩＣ５０、お
よび／または伸長した用量反応曲線を有する、方法が特色とされる。一部の実施形態では
、治療用細胞は、造血幹細胞、誘導性前駆細胞（ｉＰＳ）、胚性幹（ＥＳ）細胞、間葉系
幹細胞、形質（Ｂ）細胞、筋細胞、腫瘍浸潤リンパ球、およびＴ細胞からなる群から選択
される。一部の実施形態では、対象は幹細胞移植、例えば、ハプロタイプ一致移植、適合
非血縁移植または適合血縁移植を受けた対象である。ある特定の実施形態では、対象は過
剰増殖性疾患と診断されている。他の実施形態では、対象は免疫疾患と診断されている。
【００１２】
一部の実施形態では、改変カスパーゼ−９ポリペプチドは、表３のカスパーゼバリアン
トからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、改変カスパーゼ
−９ポリペプチドは、Ｎ４０５Ｑ、Ｆ４０４Ｙ、Ｆ４０６Ｌ、Ｆ４０６Ｔ、Ｆ４０４Ｗか
らなる群から選択されるアミノ酸置換、およびカスパーゼ−９由来の二量体化ドメインア
ミノ酸残基４０２〜４０６（ＧＣＦＮＦ）の、カスパーゼ１０の等価位置の残基による置
換（ＧＣＦＮＦ４０２ＩＳＡＱＴ）を含有するカスパーゼ−９ポリペプチドを含む。一部
の実施形態では、改変カスパーゼ−９ポリペプチドは、Ｄ３３０ＡおよびＴ３１７Ａから
なる群から選択されるアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、改変カスパーゼ−９ポ
リペプチドは、Ｔ３１７Ｓ、Ｓ１４４Ａ、Ｓ１４４Ｄ、Ｓ１９６Ａ、Ｓ１８３Ａ、および
Ｓ１９５Ａからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む、改変カスパーゼ−９ポリペプ
チドは、Ｄ３３０Ａ−Ｎ４０５Ｑ、Ｄ３３０Ａ−Ｓ１４４Ａ、Ｄ３３０Ａ−Ｓ１４４Ｄ、
Ｄ３３０Ａ−Ｓ１９６Ａ、Ｄ３３０Ａ−Ｔ３１７Ａ、およびＤ３３０Ａ−Ｓ１８３Ａから
なる群から選択されるアミノ酸置換を含む、改変カスパーゼ−９ポリペプチドは、Ｆ４０
４Ｔ、Ｆ４０４Ｗ、Ｎ４０５Ｆ、およびＦ４０６Ｔからなる群から選択されるアミノ酸置
換を含む、改変カスパーゼ−９ポリペプチドは、Ｄ３１５Ａ、Ａ３１６Ｇ、Ｔ３１７Ｓ、
Ｆ３１９Ｗ、およびＳ３０７Ａからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む、改変カス
パーゼ−９ポリペプチドは、Ｙ１５３ＡおよびＹ１５３Ｆからなる群から選択されるアミ
ノ酸置換を含む、改変カスパーゼ−９ポリペプチドは、Ｃ４０３Ｓ、Ｃ４０３Ｔ、Ｃ４０
３、Ｎ４０５Ａ、Ｎ４０６Ａ、Ｎ４０６Ｙ、およびＦ４０６Ｗからなる群から選択される
アミノ酸置換を含む、改変カスパーゼ−９ポリペプチドは、Ｔ３１７Ａ、Ｔ３１７Ｃ、Ｆ
３１８Ａ、Ｆ３１９Ａからなる群から選択されるアミノ酸置換を含み、かつカスパーゼ−
９由来のアミノ酸残基の、カスパーゼ１０の等価位置の残基（４０２ＩＳＡＱＴ）による
置換を含有するカスパーゼ−９ポリペプチド、およびカスパーゼ−９由来のアミノ酸残基
の、等価位置Ｓｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯ（ＡＴＰＦ３１６ＡＶＰＩ）での置換を含有するカ
スパーゼ−９ポリペプチドを含む、改変カスパーゼ−９ポリペプチドは、Ｎ４０５Ｔ、Ｓ
３１７Ｅ、およびＤ３３０Ａ−Ｎ４０５Ｔからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む
、改変カスパーゼ−９ポリペプチドは、Ｆ３１９Ｗ、Ｆ４０４Ｙ、Ａ３１６Ｇ、Ｙ１５３
Ａ、Ｆ４０６Ｌ、Ｃ４０３Ａ、Ｎ４０５Ｑ、Ｆ４０６Ｔからなる群から選択されるアミノ
酸置換、およびカスパーゼ由来の二量体化ドメインアミノ酸残基４０２〜４０６（ＧＣＦ
ＮＦ）の、カスパーゼ１０の等価位置の残基（ＩＳＡＱＴ）での置換を含有するカスパー
ゼ−９ポリペプチドを含む、または、改変カスパーゼ−９ポリペプチドは、Ｎ４０５Ｑ、
Ｆ４０４Ｗ、Ｆ４０４Ｙ、およびＦ４０６Ｔからなる群から選択されるアミノ酸置換を含
む。
【００１３】
対象における移植された治療用細胞の生存を制御するための方法であって、治療用細胞
を調製するまたは得るステップ；治療用細胞の第１のサブセットに、多量体リガンド結合
性領域および第１のカスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラタンパク質をコードする核
酸をトランスフェクトまたは形質導入するステップであって、第１のカスパーゼ−９ポリ
ペプチドが配列番号９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含
むステップ；治療用細胞の第２のサブセットに、多量体リガンド結合性領域および第２の
カスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラタンパク質をコードする核酸をトランスフェク
トまたは形質導入するステップであって、第２のカスパーゼ−９ポリペプチドが配列番号
９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むステップ；形質導
入またはトランスフェクトされた第１の治療用細胞および第２の治療用細胞を対象に移植
するステップ；および、移植後に、多量体リガンド結合性領域に結合する多量体リガンド
を対象に有効量で投与するステップであって、多量体リガンドの投与後に、第１のカスパ
ーゼ−９ポリペプチドを発現する治療用細胞が第２のカスパーゼ−９ポリペプチドを発現
する治療用細胞よりも多く死滅するステップを含む方法も提供される。
【００１４】
一部の実施形態では、第１のカスパーゼ−９ポリペプチドは、第２のカスパーゼ−９ポ
リペプチドと比較して、多量体リガンドに対する応答において低下したＩＣ５０、および
伸長した用量反応曲線を有する。一部の実施形態では、治療用細胞は、造血幹細胞、誘導
性前駆細胞（ｉＰＳ）、胚性幹（ＥＳ）細胞、間葉系幹細胞、形質（Ｂ）細胞、筋細胞お
よびＴ細胞からなる群から選択される。一部の実施形態では、対象は過剰増殖性疾患と診
断されている。一部の実施形態では、対象は免疫疾患と診断されている。一部の実施形態
では、第１のカスパーゼ−９ポリペプチドまたは第２のカスパーゼ−９ポリペプチドは、
Ｆ３１９Ｗ、Ｆ４０４Ｙ、Ａ３１６Ｇ、Ｙ１５３Ａ、Ｆ４０６Ｌ、Ｃ４０３Ａ、Ｎ４０５
Ｑ、Ｃ２８５Ａ、Ｆ４０６Ｔからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む、またはカス
パーゼ−９ポリペプチドは、カスパーゼ１０の二量体化ドメインの対応するアミノ酸配列
であるＩＳＡＱＴを含む、または第１のカスパーゼ−９ポリペプチドもしくは第２のカス
パーゼ−９ポリペプチドは、Ｎ４０５Ｑ、Ｃ２８５Ａ、およびＦ４０６Ｔからなる群から
選択されるアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、第２のカスパーゼ−９ポリペプチ
ドの多量体リガンドに対するＩＣ５０は０．０１ｐＭ超、０．０５ｐＭ超、０．１ｐＭ超
、０．５ｐＭ超、０．０１ｎＭ超、０．０５ｎＭ超、０．１ｎＭ超、０．５ｎＭ超、また
は１ｎＭ超である。
【００１５】
一部の実施形態では、多量体リガンドの投与後に、キメラ抗原受容体を含む第１の治療
用細胞が治療有効レベルで対象において活性なままである。一部の実施形態では、第２の
治療用細胞は、Ｔ細胞、例えば、幹細胞移植後の対象に投与されるＴ細胞である。一部の
実施形態では、対象に投与する前にＴ細胞をアロ枯渇（ａｌｌｏｄｅｐｌｅｔｅ）させる
。一部の実施形態では、対象に投与する前にＴ細胞をアロ枯渇させない。一部の実施形態
では、第２の治療用細胞は、キメラ抗原受容体を含む。一部の実施形態では、第１の治療
用細胞はＴ細胞である。一部の実施形態では、第２の治療用細胞は、幹細胞移植後の対象
に投与されるＴ細胞である。一部の実施形態では、対象に投与する前にＴ細胞をアロ枯渇
させる。他の実施形態では、対象に投与する前にＴ細胞をアロ枯渇させない。
【００１６】
ある特定の実施形態では、カスパーゼ−９ポリペプチドまたは改変カスパーゼ−９ポリ
ペプチドを発現する移植された治療用細胞の８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０
％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、または５％未満が多量体リ
ガンドの投与後に死滅する。一部の実施形態では、改変カスパーゼ−９ポリペプチドの多
量体リガンドに対するＩＣ５０は０．０１ｐＭ超、０．０５ｐＭ超、０．１ｐＭ超、０．
５ｐＭ超、０．０１ｎＭ超、０．０５ｎＭ超、０．１ｎＭ超、０．５ｎＭ超、または１ｎ
Ｍ超である。一部の実施形態では、多量体リガンド結合性領域は、ＦＫＢＰリガンド結合
性領域、シクロフィリン受容体リガンド結合性領域、ステロイド受容体リガンド結合性領
域、シクロフィリン受容体リガンド結合性領域、およびテトラサイクリン受容体リガンド
結合性領域からなる群から選択される。一部の実施形態では、リガンド結合性領域は、Ｆ
ｖ’Ｆｖｌｓアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、リガンドは小分子である。一部
の実施形態では、リガンドは二量体である。一部の実施形態では、リガンドは二量体ＦＫ
５０６または二量体ＦＫ５０６様類似体である。ある特定の実施形態では、多量体リガン
ドはＡＰ１９０３である。一部の実施形態では、多量体リガンドはＡＰ２０１８７である
。一部の実施形態では、細胞はＴ細胞である。一部の実施形態では、キメラタンパク質は
マーカーポリペプチドをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、マーカーを発現する
細胞を対象への投与のために選択する選択ステップをさらに含む。一部の実施形態では、
方法は、対象に多量体リガンドの２回目の用量を投与するステップをさらに含み、２回目
の用量は１回目の用量よりも多くの多量体リガンドを含む。
【００１７】
一部の実施形態では、複数回用量の多量体リガンドを複数回用量の間で投薬量レベルを
漸増させながら対象に対して投与する。一部の実施形態では、投薬量レベルの漸増により
、死滅する治療用細胞の数が増加する。一部の実施形態では、用量を０．０１ｍｇ／ｋｇ
から１ｍｇ／ｋｇまで漸増させる。一部の実施形態では、約１５〜３０分きざみで用量を
投与する。一部の実施形態では、持続注入ポンプを使用して多量体リガンドを投与し、注
入の間に多量体リガンドの濃度を上昇させる。一部の実施形態では、所望の百分率の治療
用細胞が死滅するまで多量体リガンドの濃度を上昇させる。一部の実施形態では、対象は
移植片対宿主病を有し、多量体リガンドの投与により、疾患が緩和される。一部の実施形
態では、対象はヒトである。一部の実施形態では、治療用細胞は、キメラ抗原受容体を含
む。一部の実施形態では、対象は、多量体リガンドの投与前にオフターゲットの毒性の症
状を示している。他の実施形態では、対象は、多量体リガンドの投与前に腫瘍崩壊症候群
（ＴＬＳ）、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）またはマクロファージ活性化症候群（Ｍ
ＡＳ）の症状を示している。一部の実施形態では、多量体リガンドの投与によりオフター
ゲットまたはオフオーガンの毒性が緩和される。オフターゲットの毒性の考察は、例えば
、Ｈｅｓｌｏｐ，  Ｈ．Ｅ、Ｂｌｏｏｄ  １２２巻：８５３〜８５４頁（２０１３年）に
おいて提供される。
【００１８】
他の実施形態では、多量体リガンドの投与により腫瘍崩壊症候群（ＴＬＳ）、サイトカ
イン放出症候群（ＣＲＳ）またはマクロファージ活性化症候群（ＭＡＳ）が緩和される。
一部の実施形態では、治療有効レベルの、キメラ抗原受容体を含む治療用細胞が、多量体
リガンドの投与後に対象において活性なままである。
【００１９】
一部の実施形態では、患者はがんを有する。一部の実施形態では、患者は固形腫瘍を有す
る。一部の実施形態では、がんは患者の血液または骨髄に存在する。一部の実施形態では
、患者は血液疾患または骨髄疾患を有する。一部の実施形態では、患者は幹細胞移植によ
って緩和することができる任意の状態または障害と診断された患者である。一部の実施形
態では、患者は、鎌状赤血球貧血または異染性白質ジストロフィーと診断された患者であ
る。一部の実施形態では、プロモーターが活性化Ｔ細胞において活性化される。ある特定
の実施形態では、カスパーゼ−９ポリペプチドは短縮型カスパーゼ−９ポリペプチドであ
る、またはカスパーゼ−９ポリペプチドはカスパーゼ動員ドメインを欠く。一部の実施形
態では、患者はステージ１、２、３、または４移植片対宿主病の１つまたは複数の症状を
示す。
【００２０】
一部の実施形態では、多量体リガンドの投与後にアロ反応性Ｔ細胞の数が減少する。一
部の実施形態では、アロ反応性Ｔ細胞はマーカーおよびＣＤ３を発現する。一部の実施形
態では、多量体リガンドの投与後にアロ反応性Ｔ細胞の数が約９０％またはそれ超減少す
る。一部の実施形態では、多量体リガンドの投与後に、患者において、増大することがで
き、かつウイルスおよび真菌に対して反応性であるドナーＴ細胞が生存する。一部の実施
形態では、多量体リガンドの投与後に、患者において、増大することができ、かつ患者に
おける腫瘍細胞に対して反応性であるドナーＴ細胞が生存する。一部の実施形態では、患
者は、ハプロ−ＣＤ３４＋幹細胞移植をドナーＴ細胞の投与前に受けている、またはドナ
ーＴ細胞の投与と同時に受ける。
【００２１】
一部の実施形態では、誘導性キメラカスパーゼ−９ポリペプチドは、野生型カスパーゼ
−９ポリペプチド、またはＣＡＲＤドメインが除去されるように短縮された野生型カスパ
ーゼ−９ポリペプチドと比較して、リガンド誘導因子に対する感受性が異なるように、ま
たは形質導入またはトランスフェクトされた細胞における基底の活性が異なるように改変
されている。
【００２２】
したがって、ある特定の実施形態では、本出願の方法では、例えば、ＳＥＡＰレポータ
ーに基づく代理死滅アッセイにおいて、それぞれ、基底の活性が検出不可能までに低く、
それらのＡＰ１９０３  ＩＣ５０に対する悪影響が最小であることが実証されているｉＣ
ａｓｐ９  Ｄ３３０Ａ、ｉＣａｓｐ９  Ｎ４０５Ｑ、およびｉＣａｓｐ９  Ｄ３３０Ａ  
Ｎ４０５Ｑを含めた改変カスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラポリペプチドを使用す
る。
【００２３】
一部の実施形態では、多量体化領域および改変カスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメ
ラタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む細胞であって、改変カスパーゼ−９ポ
リペプチドが、配列番号９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列
を含み、Ｓ１４４Ａ、Ｓ１４４Ｄ、Ｙ１５３Ａ、Ｙ１５３Ｆ、Ｓ１８３Ａ、Ｓ１９５Ａ、
Ｓ１９６Ａ、Ｓ１９６Ｄ、Ｓ３０７Ａ、Ｄ３１５Ａ、Ａ３１６Ｇ、Ｔ３１７Ａ、Ｔ３１７
Ｃ、Ｔ３１７Ｅ、Ｔ３１７Ｓ、Ｐ３１８Ａ、Ｆ３１９Ａ、Ｆ３１９Ｗ、Ｆ３２６Ｋ、Ｄ３
２７Ｇ、Ｄ３２７Ｋ、Ｄ３２７Ｒ、Ｑ３２８Ｋ、Ｑ３２８Ｒ、Ｌ３２９Ｅ、Ｌ３２９Ｇ、
Ｌ３２９Ｋ、Ｄ３３０Ａ、Ｄ３３０Ｅ、Ｄ３３０Ｇ、Ｄ３３０Ｎ、Ｄ３３０Ｓ、Ｄ３３０
Ｖ、Ａ３３１Ｋ、Ｃ４０３Ａ、Ｃ４０３Ｓ、Ｃ４０３Ｔ、Ｆ４０４Ｔ、Ｆ４０４Ｗ、Ｆ４
０４Ｙ、Ｎ４０５Ａ、Ｎ４０５Ｆ、Ｎ４０５Ｑ、Ｎ４０５Ｔ、Ｆ４０６Ａ、Ｆ４０６Ｔ、
Ｆ４０６Ｗ、Ｆ４０６Ｙ、Ｇ４０２Ａ、Ｇ４０２Ｉ、Ｇ４０２Ｑ、Ｇ４０２Ｙ、Ｃ４０３
Ｐ、Ｆ４０４Ａ、Ｆ４０４Ｓ、およびＦ４０６Ｌからなる群から選択されるアミノ酸置換
を少なくとも１つ含む細胞が提供される。一部の実施形態では、少なくとも１つのアミノ
酸置換は、Ｓ１４４Ａ、Ｓ１４４Ｄ、Ｙ１５３Ａ、Ｙ１５３Ｆ、Ｓ１８３Ａ、Ｓ１９５Ａ
、Ｓ１９６Ａ、Ｓ１９６Ｄ、Ｓ３０７Ａ、Ｄ３１５Ａ、Ａ３１６Ｇ、Ｔ３１７Ａ、Ｔ３１
７Ｃ、Ｔ３１７Ｅ、Ｔ３１７Ｓ、Ｐ３１８Ａ、Ｆ３１９Ａ、Ｆ３１９Ｗ、Ｆ３２６Ｋ、Ｄ
３２７Ｇ、Ｄ３２７Ｋ、Ｄ３２７Ｒ、Ｑ３２８Ｋ、Ｑ３２８Ｒ、Ｌ３２９Ｅ、Ｌ３２９Ｇ
、Ｌ３２９Ｋ、Ｄ３３０Ａ、Ｄ３３０Ｅ、Ｄ３３０Ｇ、Ｄ３３０Ｎ、Ｄ３３０Ｓ、Ｄ３３
０Ｖ、Ａ３３１Ｋ、Ｃ４０３Ａ、Ｃ４０３Ｓ、Ｃ４０３Ｔ、Ｆ４０４Ｔ、Ｆ４０４Ｗ、Ｆ
４０４Ｙ、Ｎ４０５Ａ、Ｎ４０５Ｆ、Ｎ４０５Ｑ、Ｎ４０５Ｔ、Ｆ４０６Ａ、Ｆ４０６Ｔ
、Ｆ４０６Ｗ、およびＦ４０６Ｙからなる群から選択される。一部の実施形態では、少な
くとも１つのアミノ酸置換は、Ｓ１４４Ａ、Ｓ１４４Ｄ、Ｙ１５３Ａ、Ｙ１５３Ｆ、Ｓ１
８３Ａ、Ｓ１９５Ａ、Ｓ１９６Ａ、Ｓ１９６Ｄ、Ｓ３０７Ａ、Ｄ３１５Ａ、Ａ３１６Ｇ、
Ｔ３１７Ａ、Ｔ３１７Ｃ、Ｔ３１７Ｓ、Ｐ３１８Ａ、Ｆ３１９Ａ、Ｆ３１９Ｗ、Ｌ３２９
Ｅ、Ｄ３３０Ａ、Ｄ３３０Ｅ、Ｄ３３０Ｇ、Ｄ３３０Ｎ、Ｄ３３０Ｓ、Ｄ３３０Ｖ、Ｃ４
０３Ａ、Ｃ４０３Ｓ、Ｃ４０３Ｔ、Ｆ４０４Ｔ、Ｆ４０４Ｗ、Ｆ４０４Ｙ、Ｎ４０５Ａ、
Ｎ４０５Ｆ、Ｎ４０５Ｑ、Ｆ４０６Ａ、Ｆ４０６Ｔ、Ｆ４０６Ｗ、およびＦ４０６Ｙから
なる群から選択される。一部の実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸置換は、Ｓ１４
４Ａ、Ｓ１４４Ｄ、Ｙ１５３Ａ、Ｙ１５３Ｆ、Ｓ１８３Ａ、Ｓ１９５Ａ、Ｓ１９６Ａ、Ｓ
１９６Ｄ、Ｓ３０７Ａ、Ｄ３１５Ａ、Ａ３１６Ｇ、Ｔ３１７Ａ、Ｔ３１７Ｓ、Ｆ３１９Ｗ
、Ｌ３２９Ｅ、Ｄ３３０Ａ、Ｄ３３０Ｅ、Ｄ３３０Ｇ、Ｄ３３０Ｎ、Ｄ３３０Ｓ、Ｄ３３
０Ｖ、Ｆ４０４Ｔ、Ｆ４０４Ｗ、Ｆ４０４Ｙ、Ｎ４０５Ｆ、Ｎ４０５Ｑ、Ｆ４０６Ａ、Ｆ
４０６Ｔ、Ｆ４０６Ｗ、およびＦ４０６Ｙである。一部の実施形態では、少なくとも１つ
のアミノ酸置換は、Ｓ１４４Ａ、Ｓ１４４Ｄ、Ｓ１８３Ａ、Ｓ１９５Ａ、Ｓ１９６Ａ、Ｓ
１９６Ｄ、Ｔ３１７Ａ、Ｔ３１７Ｓ、Ｌ３２９Ｅ、Ｄ３３０Ａ、Ｄ３３０Ｅ、Ｄ３３０Ｇ
、Ｄ３３０Ｎ、Ｄ３３０Ｓ、Ｄ３３０Ｖ、Ｆ４０４Ｙ、Ｎ４０５Ｑ、Ｆ４０６Ａ、Ｆ４０
６Ｗ、およびＦ４０６Ｙである。一部の実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸置換は
、Ｔ３１７Ｓ、Ｓ１４４Ａ、Ｓ１３３、およびＳ１９６Ｄからなる群から選択される。一
部の実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸置換は、Ｓ１８３Ａ、Ｓ１９５Ａ、Ｓ１９
６Ａ、Ｓ１９６Ｄ、Ｔ３１７Ａ、Ｌ３２９Ｅ、Ｄ３３０Ａ、Ｄ３３０Ｅ、Ｄ３３０Ｇ、Ｄ
３３０Ｎ、Ｄ３３０Ｓ、Ｄ３３０Ｖ、Ｆ４０４Ｙ、Ｎ４０５Ｑ、Ｆ４０６Ａ、Ｆ４０６Ｗ
、およびＦ４０６Ｙからなる群から選択される。一部の実施形態では、少なくとも１つの
アミノ酸置換はＤ３３０Ａである。一部の実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸置換
はＤ３３０Ｅである。一部の実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸置換はＮ４０５Ｑ
である。一部の実施形態では、改変カスパーゼ−９ポリペプチドは、Ｄ３３０Ａ−Ｎ４０
５Ｑ、Ｄ３３０Ａ−Ｓ１４４Ａ、Ｄ３３０Ａ−Ｓ１４４Ｄ、Ｄ３３０Ａ−Ｓ１８３Ａ、Ｄ
３３０Ａ−Ｓ１９６Ａ、Ｎ４０５Ｑ−Ｓ１４４Ａ、Ｎ４０５Ｑ−Ｓ１４４Ｄ、Ｎ４０５Ｑ
−Ｓ１９６Ｄ、Ｎ４０５Ｑ−Ｔ３１７Ｓ、Ｎ４０５Ｑ−Ｓ１４４Ａｃｏ、Ｎ４０５Ｑ−Ｔ
３１７Ｓｃｏ、４０２ＧＣＦＮＦ４０６ＩＳＡＱＴ（ＣＡＳＰ−１０）、３１６ＡＴＰＦ
３１９ＡＶＰＩ（ＳＭＡＣ／Ｄｉａｂｌｏ）、Ｄ３３０Ａ−Ｎ４０５Ｔ、Ｄ３１５Ａ−Ｄ
３３０Ａ、Ｄ３３０Ａ−Ｙ１５３Ａ、Ｄ３３０Ａ−Ｙ１５３Ｆ、Ｄ３３０Ａ−Ｔ３１７Ｅ
、４０２ＧＣＦＮＦ４０６ＣＩＶＳＭ（ＣＡＳＰ−３）、４０２ＧＣＦＮＦ４０６ＡＡＡ
ＡＡ、４０２ＧＣＦＮＦ４０６ＹＣＳＴＬ（ＣＡＳＰ−２）、および４０２ＧＦＮＦ４０
６ＱＰＴＦＴ（ＣＡＳＰ−８）からなる群から選択されるアミノ酸置換を少なくとも２つ
含む。一部の実施形態では、改変カスパーゼ−９ポリペプチドは、Ｄ３３０Ａ−Ｎ４０５
Ｑ、Ｄ３３０Ａ−Ｓ１４４Ａ、Ｄ３３０Ａ−Ｓ１４４Ｄ、Ｄ３３０Ａ−Ｓ１８３Ａ、Ｄ３
３０Ａ−Ｓ１９６Ａ、Ｎ４０５Ｑ−Ｓ１４４Ａ、Ｎ４０５Ｑ−Ｓ１４４Ｄ、Ｎ４０５Ｑ−
Ｓ１９６Ｄ、Ｎ４０５Ｑ−Ｔ３１７Ｓ、Ｎ４０５Ｑ−Ｓ１４４Ａｃｏ、Ｎ４０５Ｑ−Ｔ３
１７Ｓｃｏ、４０２ＧＣＦＮＦ４０６ＩＳＡＱＴ（ＣＡＳＰ−１０）、３１６ＡＴＰＦ３
１９ＡＶＰＩ（ＳＭＡＣ／Ｄｉａｂｌｏ）、およびＤ３３０Ａ−Ｎ４０５Ｔからなる群か
ら選択されるアミノ酸置換を少なくとも２つ含む。一部の実施形態では、改変カスパーゼ
−９ポリペプチドは、Ｄ３３０Ａ−Ｎ４０５Ｑ、Ｄ３３０Ａ−Ｓ１４４Ａ、Ｄ３３０Ａ−
Ｓ１４４Ｄ、Ｄ３３０Ａ−Ｓ１８３Ａ、Ｄ３３０Ａ−Ｓ１９６Ａ、Ｎ４０５Ｑ−Ｓ１４４
Ａ、Ｎ４０５Ｑ−Ｓ１４４Ｄ、Ｎ４０５Ｑ−Ｓ１９６Ｄ、Ｎ４０５Ｑ−Ｔ３１７Ｓ、Ｎ４
０５Ｑ−Ｓ１４４Ａｃｏ、Ｎ４０５Ｑ−Ｔ３１７Ｓｃｏ、４０２ＧＣＦＮＦ４０６ＩＳＡ
ＱＴ（ＣＡＳＰ−１０）、および３１６ＡＴＰＦ３１９ＡＶＰＩ（ＳＭＡＣ／Ｄｉａｂｌ
ｏ）からなる群から選択されるアミノ酸置換を少なくとも２つ含む。一部の実施形態では
、改変カスパーゼ−９ポリペプチドは、Ｄ３３０Ａ−Ｎ４０５Ｑ、Ｄ３３０Ａ−Ｓ１４４
Ａ、Ｄ３３０Ａ−Ｓ１４４Ｄ、Ｄ３３０Ａ−Ｓ１８３Ａ、Ｄ３３０Ａ−Ｓ１９６Ａ、Ｎ４
０５Ｑ−Ｓ１４４Ａ、Ｎ４０５Ｑ−Ｓ１４４Ｄ、Ｎ４０５Ｑ−Ｓ１９６Ｄ、Ｎ４０５Ｑ−
Ｔ３１７Ｓ、Ｎ４０５Ｑ−Ｓ１４４Ａｃｏ、Ｎ４０５Ｑ−Ｔ３１７Ｓｃｏ、および４０２
ＧＣＦＮＦ４０６ＩＳＡＱＴ（ＣＡＳＰ−１０）からなる群から選択されるアミノ酸置換
を少なくとも２つ含む。一部の実施形態では、改変カスパーゼ−９ポリペプチドは、Ｎ４
０５Ｑ−Ｓ１４４ＡｃｏおよびＮ４０５Ｑ−Ｔ３１７Ｓｃｏからなる群から選択されるア
ミノ酸置換を少なくとも２つ含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸置換
は、Ｓ１４４Ａ、Ｓ１４４Ｄ、Ｙ１５３Ａ、Ｙ１５３Ｆ、Ｓ１８３Ａ、Ｓ１９５Ａ、Ｓ１
９６Ａ、Ｓ３０７Ａ、Ｄ３１５Ａ、Ａ３１６Ｇ、Ｔ３１７Ａ、Ｔ３１７Ｃ、Ｔ３１７Ｅ、
Ｔ３１７Ｓ、Ｐ３１８Ａ、Ｆ３１９Ａ、Ｆ３１９Ｗ、Ｆ３２６Ｋ、Ｄ３２７Ｇ、Ｄ３２７
Ｋ、Ｄ３２７Ｒ、Ｑ３２８Ｋ、Ｑ３２８Ｒ、Ｌ３２９Ｅ、Ｌ３２９Ｇ、Ｌ３２９Ｋ、Ｄ３
３０Ａ、Ｄ３３０Ｅ、Ｄ３３０Ｇ、Ｄ３３０Ｎ、Ｄ３３０Ｓ、Ｄ３３０Ｖ、Ａ３３１Ｋ、
Ｆ４０４Ｔ、Ｆ４０４Ｗ、Ｆ４０４ＹＮ４０５Ｆ、Ｎ４０５Ｑ、およびＦ４０６Ｔからな
る群から選択される。一部の実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸置換は、Ｓ１４４
Ａ、Ｓ１４４Ｄ、Ｙ１５３Ａ、Ｙ１５３Ｆ、Ｓ１８３Ａ、Ｓ１９５Ａ、Ｓ１９６Ａ、Ｓ３
０７Ａ、Ｄ３１５Ａ、Ａ３１６Ｇ、Ｔ３１７Ａ、Ｔ３１７Ｃ、Ｔ３１７Ｅ、Ｔ３１７Ｓ、
Ｐ３１８Ａ、Ｆ３１９Ａ、Ｆ３１９Ｗ、Ｆ３２６Ｋ、Ｄ３２７Ｇ、Ｄ３２７Ｋ、Ｄ３２７
Ｒ、Ｑ３２８Ｋ、Ｑ３２８Ｒ、Ｌ３２９Ｅ、Ｌ３２９Ｇ、Ｌ３２９Ｋ、Ｄ３３０Ａ、Ｄ３
３０Ｅ、Ｄ３３０Ｇ、Ｄ３３０Ｎ、Ｄ３３０Ｓ、Ｄ３３０Ｖ、Ａ３３１Ｋ、Ｆ４０４Ｔ、
Ｆ４０４Ｗ、Ｆ４０４Ｙ、Ｎ４０５Ｆ、Ｎ４０５Ｑ、およびＦ４０６Ｔからなる群から選
択される。一部の実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸置換は、Ｓ１４４Ａ、Ｓ１４
４Ｄ、Ｙ１５３Ａ、Ｙ１５３Ｆ、Ｓ１８３Ａ、Ｓ１９５Ａ、Ｓ１９６Ａ、Ｓ３０７Ａ、Ｄ
３１５Ａ、Ａ３１６Ｇ、Ｔ３１７Ａ、Ｔ３１７Ｃ、Ｔ３１７Ｓ、Ｐ３１８Ａ、Ｆ３１９Ａ
、Ｆ３１９Ｗ、Ｌ３２９Ｅ、Ｄ３３０Ａ、Ｄ３３０Ｅ、Ｄ３３０Ｇ、Ｄ３３０Ｎ、Ｄ３３
０Ｓ、Ｄ３３０Ｖ、Ｆ４０４Ｔ、Ｆ４０４Ｗ、Ｆ４０４Ｙ、Ｎ４０５Ｆ、Ｎ４０５Ｑ、お
よびＦ４０６Ｔからなる群から選択される。一部の実施形態では、少なくとも１つのアミ
ノ酸置換は、Ｓ１４４Ａ、Ｓ１４４Ｄ、Ｙ１５３Ａ、Ｙ１５３Ｆ、Ｓ１８３Ａ、Ｓ１９５
Ａ、Ｓ１９６Ａ、Ｓ３０７Ａ、Ｄ３１５Ａ、Ａ３１６Ｇ、Ｔ３１７Ａ、Ｔ３１７Ｓ、Ｆ３
１９Ｗ、Ｄ３３０Ａ、Ｆ４０４Ｔ、Ｆ４０４Ｗ、Ｆ４０４Ｙ、Ｎ４０５Ｆ、Ｎ４０５Ｑ、
およびＦ４０６Ｔからなる群から選択される。一部の実施形態では、少なくとも１つのア
ミノ酸置換は、Ｓ１４４Ａ、Ｓ１４４Ｄ、Ｓ１８３Ａ、Ｓ１９５Ａ、Ｓ１９６Ａ、Ｔ３１
７Ａ、Ｔ３１７Ｓ、Ｄ３３０Ａ、Ｆ４０４Ｙ、およびＮ４０５Ｑからなる群から選択され
る。一部の実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸置換は、Ｓ１９６Ｄ、Ｔ３１７Ｃ、
Ｔ３１７Ｅ、Ｐ３１８Ａ、Ｆ３１９Ａ、Ｆ３２６Ｋ、Ｄ３２７Ｇ、Ｄ３２７Ｋ、Ｄ３２７
Ｒ、Ｑ３２８Ｋ、Ｑ３２８Ｒ、Ｌ３２９Ｅ、Ｌ３２９Ｇ、Ｌ３２９Ｋ、Ｄ３３０Ｅ、Ｄ３
３０Ｇ、Ｄ３３０Ｎ、Ｄ３３０Ｓ、Ｄ３３０Ｖ、Ａ３３１Ｋ、Ｃ４０３Ａ、Ｃ４０３Ｓ、
Ｃ４０３Ｔ、Ｎ４０５Ａ、Ｎ４０５Ｔ、Ｆ４０６Ａ、Ｆ４０６Ｗ、Ｆ４０６Ｙ、Ｇ４０２
Ａ、Ｇ４０２Ｉ、Ｇ４０２Ｑ、Ｇ４０２Ｙ、Ｃ４０３Ｐ、Ｆ４０４Ａ、Ｆ４０４Ｓ、およ
びＦ４０６Ｌからなる群から選択される。一部の実施形態では、少なくとも１つのアミノ
酸置換は、Ｓ１９６Ｄ、Ｔ３１７Ｃ、Ｔ３１７Ｅ、Ｐ３１８Ａ、Ｆ３１９Ａ、Ｆ３２６Ｋ
、Ｄ３２７Ｇ、Ｄ３２７Ｋ、Ｄ３２７Ｒ、Ｑ３２８Ｋ、Ｑ３２８Ｒ、Ｌ３２９Ｅ、Ｌ３２
９Ｇ、Ｌ３２９Ｋ、Ｄ３３０Ｅ、Ｄ３３０Ｇ、Ｄ３３０Ｎ、Ｄ３３０Ｓ、Ｄ３３０Ｖ、Ａ
３３１Ｋ、Ｃ４０３Ａ、Ｃ４０３Ｓ、Ｃ４０３Ｔ、Ｎ４０５Ａ、Ｎ４０５Ｔ、Ｆ４０６Ａ
、Ｆ４０６Ｗ、およびＦ４０６Ｙからなる群から選択される。一部の実施形態では、少な
くとも１つのアミノ酸置換は、Ｓ１９６Ｄ、Ｔ３１７Ｃ、Ｐ３１８Ａ、Ｆ３１９Ａ、Ｌ３
２９Ｅ、Ｄ３３０Ｅ、Ｄ３３０Ｇ、Ｄ３３０Ｎ、Ｄ３３０Ｓ、Ｄ３３０Ｖ、Ｃ４０３Ａ、
Ｃ４０３Ｓ、Ｃ４０３Ｔ、Ｎ４０５Ａ、Ｆ４０６Ａ、Ｆ４０６Ｔ、Ｆ４０６Ｗ、およびＦ
４０６Ｙからなる群から選択される。一部の実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸置
換は、Ｓ１９６Ｄ、Ｌ３２９Ｅ、Ｄ３３０Ｅ、Ｄ３３０Ｇ、Ｄ３３０Ｎ、Ｄ３３０Ｓ、Ｄ
３３０Ｖ、Ｆ４０６Ａ、Ｆ４０６Ｔ、Ｆ４０６Ｗ、およびＦ４０６Ｙからなる群から選択
される。一部の実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸置換は、Ｓ１９６Ｄ、Ｌ３２９
Ｅ、Ｄ３３０Ｅ、Ｄ３３０Ｇ、Ｄ３３０Ｎ、Ｄ３３０Ｓ、Ｄ３３０Ｖ、Ｆ４０６Ａ、Ｆ４
０６Ｗ、およびＦ４０６Ｙからなる群から選択される。４７．少なくとも１つのアミノ酸
置換が、Ｎ４０５Ｑ、Ｆ４０４Ｙ、Ｆ４０６Ａ、Ｆ４０６Ｗ、Ｆ４０６Ｙ、Ｆ４０４Ｔ、
Ｆ４０４Ｗ、Ｎ４０５Ｆ、Ｆ４０６Ｔ、Ｃ４０３Ａ、Ｃ４０３Ｓ、Ｃ４０３Ｔ、Ｎ４０５
Ａ、およびＮ４０５Ｔからなる群から選択される、請求項１に記載の細胞。一部の実施形
態では、少なくとも１つのアミノ酸置換は、Ｎ４０５Ｑ、Ｆ４０４Ｙ、Ｆ４０６Ａ、Ｆ４
０６Ｗ、およびＦ４０６Ｙからなる群から選択される。一部の実施形態では、少なくとも
１つのアミノ酸置換は、Ｔ３１７Ｓ、Ｄ３３０Ａ、Ｄ３３０Ｅ、Ｄ３３０Ｇ、Ｄ３３０Ｎ
、Ｄ３３０Ｓ、Ｄ３３０Ｖ、Ｌ３２９Ｅ、Ｔ３１７Ａ、Ｄ３１５Ａ、Ａ３１６Ｇ、Ｔ３１
７Ｃ、Ｐ３１８Ａ、Ｆ３１９Ａ、Ｔ３１７Ｅ、Ｆ３２６Ｋ、Ｄ３２７Ｇ、Ｄ３２７Ｋ、Ｄ
３２７Ｒ、Ｑ３２８Ｋ、Ｑ３２８Ｒ、Ｌ３２９Ｇ、Ｌ３２９Ｋ、およびＡ３３１Ｋからな
る群から選択される。一部の実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸置換は、Ｔ３１７
Ｓ、Ｄ３３０Ａ、Ｄ３３０Ｅ、Ｄ３３０Ｇ、Ｄ３３０Ｎ、Ｄ３３０Ｓ、Ｄ３３０Ｖ、Ｌ３
２９Ｅ、およびＴ３１７Ａからなる群から選択される。一部の実施形態では、少なくとも
１つのアミノ酸置換は、Ｓ１４４Ａ、Ｓ１４４Ｄ、Ｓ１９６Ｄ、Ｓ１８３Ａ、Ｓ１９５Ａ
、Ｓ１９６Ａ、Ｙ１５３Ａ、Ｙ１５３Ｆ、およびＳ３０７Ａからなる群から選択される。
【００２４】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、カスパーゼ−９ポリペプチドをコードする
最適化されたコドンを含み、一部の実施形態では、改変カスパーゼ−９ポリペプチドをコ
ードするポリヌクレオチドは、Ｎ４０５Ｑのアミノ酸置換を含み、かつ、最適化されたコ
ドンを含む。一部の実施形態では、改変カスパーゼ−９ポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチドは、配列番号３９の核酸配列を含む。
【００２５】
キメラ改変カスパーゼ−９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む細胞の一
部としての、本明細書で考察されているアミノ酸配列を含む改変カスパーゼポリペプチド
も提供される。改変カスパーゼ−９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよびキ
メラ改変カスパーゼ−９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸も提供さ
れる。改変カスパーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよびキメラ改変カス
パーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターも提供される。
【００２６】
一部の実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。本出願の細胞は、任意の型の真核細胞
、例えば、哺乳動物細胞、例えば、ウマ細胞、イヌ細胞、ネコ細胞、ウシ細胞、またはヒ
ト細胞であってよい。一部の実施形態では、細胞は前駆細胞である。一部の実施形態では
、細胞は造血前駆細胞である。一部の実施形態では、細胞は、間葉系間質細胞、胚性幹細
胞、および誘導性多能性幹細胞からなる群から選択される。一部の実施形態では、細胞は
Ｔ細胞である。一部の実施形態では、細胞を骨髄から得るまたは調製する。一部の実施形
態では、細胞を臍帯血から得るまたは調製する。一部の実施形態では、細胞を末梢血から
得るまたは調製する。一部の実施形態では、細胞を末梢血単核細胞から得るまたは調製す
る。
【００２７】
一部の態様では、キメラポリペプチドまたは改変カスパーゼ−９ポリペプチドをコード
するポリヌクレオチドは、プロモーターに作動可能に連結している。一部の実施形態では
、プロモーターは発生的に調節されるものであり、カスパーゼ−９ポリペプチドは発生的
に分化した細胞において発現する。一部の実施形態では、プロモーターは組織特異的なも
のであり、カスパーゼ−９ポリペプチドは特異的な組織において発現する。一部の実施形
態では、プロモーターは活性化Ｔ細胞において活性化される。一部の実施形態では、プロ
モーターは５’ＬＴＲ配列を含む。一部の実施形態では、キメラタンパク質はマーカーポ
リペプチド、例えば、これだけに限定されないが、ΔＣＤ１９ポリペプチドをさらに含む
。一部の実施形態では、カスパーゼ−９ポリペプチドは短縮型カスパーゼ−９ポリペプチ
ドである。一部の実施形態では、カスパーゼ−９ポリペプチドはカスパーゼ動員ドメイン
を欠く。
【００２８】
一部の実施形態では、多量体化領域は、ＦＫＢＰ、シクロフィリン受容体、ステロイド
受容体、テトラサイクリン受容体、重鎖抗体サブユニット、軽鎖抗体サブユニット、柔軟
なリンカードメインによって分離されたタンデムな重鎖可変領域および軽鎖可変領域で構
成される単鎖抗体、およびその変異配列からなる群から選択される。一部の実施形態では
、多量体化領域はＦＫＢＰ１２領域である。一部の実施形態では、ＦＫＢ１２領域はＦＫ
Ｂ１２ｖ３６領域である。一部の実施形態では、多量体化領域はＦｖ’Ｆｖｌｓである。
一部の実施形態では、多量体化領域は、ＦＫ５０６二量体および二量体ＦＫ５０６類似体
リガンドからなる群から選択されるリガンドと結合する。一部の実施形態では、リガンド
はＡＰ１９０３である、他の実施形態では、リガンドはＡＰ２０１８７である。一部の実
施形態では、多量体化領域は、配列番号２９のアミノ酸配列またはその機能性断片を有す
る。一部の実施形態では、多量体化領域は、配列番号３０のヌクレオチド配列またはその
機能性断片によりコードされる。一部の実施形態では、多量体化領域は、配列番号３２の
アミノ酸配列またはその機能性断片を有するポリペプチドをさらに含む。一部の実施形態
では、多量体化領域は、配列番号３１のヌクレオチド配列またはその機能性断片によりコ
ードされるポリペプチドをさらに含む。一部の実施形態では、多量体化領域は、配列番号
３２のアミノ酸配列またはその機能性断片を有するポリペプチドをさらに含む。一部の実
施形態では、多量体化領域は、配列番号３１のヌクレオチド配列またはその機能性断片に
よりコードされるポリペプチドをさらに含む。一部の実施形態では、多量体化領域は、配
列番号２９または配列番号３２のアミノ酸配列またはその機能性断片を有するポリペプチ
ドをさらに含む。一部の実施形態では、多量体化領域は、配列番号３０または配列番号３
１のヌクレオチド配列またはその機能性断片によりコードされるポリペプチドをさらに含
む。
【００２９】
本出願の一部の態様では、細胞にウイルスベクターを形質導入またはトランスフェクト
する。ウイルスベクターは、例えば、これだけに限定されないが、レトロウイルスベクタ
ー、例えば、これだけに限定されないが、マウス白血病ウイルスベクター；ＳＦＧベクタ
ー；およびアデノウイルスベクター、またはレンチウイルスベクターなどであってよい。
【００３０】
一部の態様では、細胞に、遺伝子発現ベクターをさらにトランスフェクトまたは形質導
入する。一部の実施形態では、細胞は、改変カスパーゼ−９ポリペプチドをコードするポ
リヌクレオチドをさらに含み、異種ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを
さらに含む。一部の実施形態では、異種ポリペプチドは、キメラ抗原受容体である。一部
の実施形態では、細胞は、多量体化領域およびカスパーゼ−９ポリペプチドまたは第２の
改変カスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラタンパク質をコードするポリヌクレオチド
をさらに含み、第１のカスパーゼ−９ポリペプチドと第２のカスパーゼ−９ポリペプチド
は、異なるアミノ酸配列を含み、異なる基底の活性または異なるＩＣ５０を有する。一部
の態様では、改変カスパーゼ−９ポリペプチドとカスパーゼ−９ポリペプチド；または改
変カスパーゼ−９ポリペプチドと第２の改変カスパーゼ−９ポリペプチドが多量体リガン
ドに対して異なるＩＣ５０もしくは異なる伸長した用量反応曲線、または異なるＩＣ５０
および異なる伸長した用量反応曲線を有する細胞が提供される。
【００３１】
一部の実施形態では、細胞は単離されたものである。一部の実施形態では、細胞はヒト
対象内にあるものである。一部の実施形態では、細胞はヒト対象に移植されるものである
。
【００３２】
ドナーＴ細胞をヒト患者に投与する方法であって、本出願の細胞のいずれかをヒト患者
を投与するステップを含み、細胞がヒトドナーＴ細胞である方法も提供される。一部の実
施形態では、細胞をドナー細胞培養物に形質導入またはトランスフェクトする。一部の実
施形態では、方法は、細胞を患者に投与した後に患者における移植片対宿主病の存在を検
出するステップ；および移植片対宿主病の存在が検出された患者に、多量体化領域に結合
する多量体リガンドを投与するステップをさらに含む。一部の実施形態では、多量体リガ
ンドの投与後に移植片対宿主病の影響が低減する。
【００３３】
幹細胞移植をヒト患者に施行するステップ；および本出願の細胞を患者に投与するステ
ップであって、細胞が患者に対するドナーＴ細胞であるステップを含む幹細胞移植の方法
も提供される。一部の実施形態では、幹細胞移植は、適合移植、部分適合移植、ハプロタ
イプ一致移植、およびＣＤ３４＋ハプロタイプ一致幹細胞移植からなる群から選択される
。一部の実施形態では、ヒトドナーＴ細胞は、患者のＴ細胞と適合する、部分適合する、
またはハプロタイプが一致するものである。
【００３４】
ある特定の態様では、患者における移植された治療用細胞の生存を制御するための方法
であって、本出願の細胞をヒト患者に投与するステップ、および多量体リガンドを患者に
投与するステップを含み、多量体リガンドが多量体化領域に結合し、投与された、カスパ
ーゼ−９ポリペプチドを発現する細胞が、多量体リガンドの投与後に死滅する方法も提供
される。一部の実施形態では、方法は、本出願の細胞を移植のために調製するステップ、
および治療用細胞をヒト患者に移植するステップを含む。
【００３５】
一部の実施形態では、患者はがんを有する。一部の実施形態では、患者は固形腫瘍を有
する。一部の実施形態では、がんは患者の血液または骨髄に存在する。一部の実施形態で
は、患者は血液疾患または骨髄疾患を有する。一部の実施形態では、患者は幹細胞移植に
よって緩和することができる任意の状態または障害と診断された患者である。
【００３６】
本出願の方法は、マーカーを発現する細胞を患者への投与のために選択する選択ステッ
プをさらに含んでよい。マーカーは、例えば、これだけに限定されないが、ΔＣＤ１９で
あってよい。一部の実施形態では、骨髄試料から調製したドナー細胞培養物において細胞
をトランスフェクトする。一部の実施形態では、末梢血から調製したドナー細胞培養物に
おいて細胞をトランスフェクトする。一部の実施形態では、ドナー細胞培養物はドナー末
梢血単核細胞から調製したものである。一部の実施形態では、トランスフェクトまたは形
質導入する前にドナー細胞培養物からドナーＴ細胞をアロ枯渇させる。一部の実施形態で
は、トランスフェクトまたは形質導入する前にドナー細胞培養物からドナーＴ細胞をアロ
枯渇させない。一部の実施形態では、形質導入またはトランスフェクトされたＴ細胞を患
者に投与する前にＩＬ−２の存在下で培養する。
【００３７】
ある特定の実施形態では、本出願の方法は、例えばＡＰ１９０３またはＡＰ２０１８７
などの、多量体化領域に結合する多量体リガンドを投与するステップをさらに含む。一部
の実施形態では、移植片対宿主病を治療するために多量体リガンドを投与する。一部の実
施形態では、患者は、多量体リガンドを投与する前に移植片対宿主病の症状を示している
。一部の実施形態では、患者は、ステージ０、ステージ１、ステージ２、ステージ３、ま
たはステージ４移植片対宿主病の１つまたは複数の症状を示している。
【００３８】
方法のある特定の実施形態では、１回より多くの用量の多量体リガンドを投与する。一
部の実施形態では、多量体リガンドの投与後にアロ反応性Ｔ細胞の数が減少する。一部の
実施形態では、アロ反応性Ｔ細胞は、マーカーおよびＣＤ３を発現する。一部の実施形態
では、多量体リガンドの投与後にアロ反応性Ｔ細胞の数が約９０％またはそれ超減少する
。一部の実施形態では、多量体リガンドの投与後に、患者において、増大することができ
、かつウイルスおよび真菌に対して反応性であるドナーＴ細胞が生存する。一部の実施形
態では、多量体リガンドの投与後に、患者において、増大することができ、かつ患者にお
ける腫瘍細胞に対して反応性であるドナーＴ細胞が生存する。
【００３９】
一部の実施形態では、患者は、幹細胞移植をドナーＴ細胞の投与前に受けている、また
は投与と同時に受ける。一部の実施形態では、幹細胞移植はハプロタイプ一致幹細胞移植
である。一部の実施形態では、ドナーＴ細胞はハプロタイプが一致するものであり、患者
に投与する前にアロ枯渇させない。
【００４０】
一部の実施形態では、少なくとも１×１０６個の形質導入またはトランスフェクトされ
たドナーＴ細胞を患者に投与する。一部の実施形態では、少なくとも１×１０７の形質導
入またはトランスフェクトされたドナーＴ細胞を患者に投与する。一部の実施形態では、
少なくとも１×１０８個の形質導入またはトランスフェクトされたドナーＴ細胞を患者に
投与する。
【００４１】
一部の実施形態では、多量体リガンドの投与前、多量体リガンドの追加用量前、または
多量体リガンドの投与に必要な方法および投薬量の決定時に疾患または状態のステージま
たはレベルを決定する、個人向けの処置が提供される。これらの方法は、本出願の疾患ま
たは状態のいずれに対する方法のいずれにおいても使用することができる。リガンドを投
与する前に患者を評価するこれらの方法は、移植片対宿主病に関して考察されているが、
これらの方法を他の状態および疾患の処置に同様に適用できることが理解される。したが
って、例えば、本出願の一部の実施形態では、方法は、治療用細胞を患者に投与するステ
ップを含み、患者における、トランスフェクトまたは形質導入した治療用細胞を患者から
除去することが必要な状態の存在または不在を同定するステップ、および、患者において
同定された状態の存在または不在に基づいて、患者に対して、多量体化領域に結合する多
量体リガンドを投与するか、その後の多量体リガンドの投薬量を維持するか、またはその
後の多量体リガンドの投薬量を調整するステップをさらに含む。また、例えば、本出願の
他の実施形態では、方法は、患者における移植片対宿主病の症状の出現に基づいて、患者
に追加用量（複数可）の多量体リガンドを投与するかどうかを決定するステップをさらに
含む。一部の実施形態では、方法は、患者における移植片対宿主病の存在、不在またはス
テージを同定するステップ、および、患者において同定された移植片対宿主病の存在、不
在またはステージに基づいて、患者に対して、多量体化領域に結合する多量体リガンドを
投与するか、その後の多量体リガンドの投薬量を維持するか、またはその後の多量体リガ
ンドの投薬量を調整するステップをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、患者にお
ける移植片対宿主病の存在、不在またはステージを同定するステップ、および、患者にお
いて同定された移植片対宿主病の存在、不在またはステージに基づいて、多量体化領域に
結合する多量体リガンドを患者に投与すべきかどうか、またはその後患者に投与する多量
体リガンドの投薬量を調整するかどうかを決定するステップをさらに含む。一部の実施形
態では、方法は、患者における移植片対宿主病の存在、不在またはステージを含む情報を
受け取るステップ、および、患者において同定された移植片対宿主病の存在、不在または
ステージに基づいて、患者に対して、多量体化領域に結合する多量体リガンドを投与する
か、その後の多量体リガンドの投薬量を維持するか、またはその後の多量体リガンドの投
薬量を調整するステップをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、患者における移植
片対宿主病の存在、不在またはステージを同定するステップ、および、対象において同定
された移植片対宿主病の存在、不在またはステージに基づいて、多量体化領域に結合する
多量体リガンドを投与するか、患者に投与するその後の多量体リガンドの投薬量を維持す
るか、またはその後の多量体リガンドの投薬量を調整するかの決定者に、移植片対宿主病
の存在、不在またはステージを伝達するステップをさらに含む。一部の実施形態では、方
法は、患者における移植片対宿主病の存在、不在またはステージを同定するステップ、お
よび、対象において同定された移植片対宿主病の存在、不在またはステージに基づいて、
多量体結合性領域に結合する多量体リガンドを投与するか、患者に投与するその後の多量
体リガンドの投薬量を維持するか、またはその後の多量体リガンドの投薬量を調整するか
の指示を伝達するステップをさらに含む。
【００４２】
一部の態様では、細胞療法を受けた患者における移植片対宿主病を処置するための方法
であって、療法のために導入された細胞の１つまたは複数が本出願の細胞であり、多量体
化領域に結合する多量体リガンドを患者に投与するステップを含む方法が提供される。一
部の実施形態では、多量体結合性領域に結合する多量体リガンドの投与後に、アロ反応性
Ｔ細胞の数が減少する。一部の実施形態では、細胞分裂していないアロ反応性Ｔ細胞が除
去される。一部の実施形態では、多量体リガンドを投与してから２時間以内に、ＣＤ３＋
ΔＣＤ１９＋細胞の少なくとも９０％が除去される。一部の実施形態では、多量体リガン
ドを投与してから１時間以内に、ＣＤ３＋ΔＣＤ１９＋細胞の少なくとも９０％が除去さ
れる。一部の実施形態では、多量体リガンドを投与してから３０分以内に、ＣＤ３＋ΔＣ
Ｄ１９＋細胞の少なくとも９０％が除去される。一部の実施形態では、多量体リガンドを
投与してから２４時間以内に、ＣＤ３＋ΔＣＤ１９＋細胞が、多量体リガンドの投与後３
０分の時点のＣＤ３＋ΔＣＤ１９＋細胞の量と比較して対数的に減少する。一部の実施形
態では、方法は、多量体リガンドの投与後２４時間以内の皮膚ＧｖＨＤおよび肝臓ＧｖＨ
Ｄの消散をさらに含む。
【００４３】
一部の実施形態では、細胞は治療用細胞であり、それに第２の異種タンパク質をコード
する第２の核酸を形質導入またはトランスフェクトする。一部の実施形態では、治療用細
胞にキメラ抗原受容体を発現する異種遺伝子を形質導入する。一部の実施形態では、治療
用細胞に改変ＴＧＦ−ベータ受容体を発現する異種遺伝子を形質導入する。一部の実施形
態では、治療用細胞への異種遺伝子の形質導入は、多量体化領域およびカスパーゼ−９ポ
リペプチドを含むキメラタンパク質をコードする核酸を形質導入する前、それと同時に、
またはその後に行う。
【００４４】
ドナーＴ細胞をヒト患者に投与するための方法であって、形質導入またはトランスフェ
クトされた本出願のＴ細胞をヒト患者に投与するステップを含み、細胞がアロ枯渇させて
いないヒトドナーＴ細胞である方法も提供される。
【００４５】
一部の実施形態では、例えば、原発性免疫不全障害（例えば、これだけに限定されない
が、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、複合免疫不全症（ＣＩＤ）、先天性Ｔ細胞欠損／
欠乏症（Ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  Ｔ−ｃｅｌｌ  Ｄｅｆｅｃｔ／Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）
、分類不能型免疫不全症（ＣＶＩＤ）、慢性肉芽腫性疾患、ＩＰＥＸ（免疫不全、多腺性
内分泌障害、腸疾患、Ｘ連鎖）またはＩＰＥＸ様、ウィスコット・アルドリッチ症候群、
ＣＤ４０リガンド欠乏症（ＣＤ４０  Ｌｉｇａｎｄ  Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）、白血球接
着不全症、ＤＯＣＫ８欠乏症（ＤＯＣＫ  ８  Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）、ＩＬ−１０欠乏
／ＩＬ−１０受容体欠乏症（ＩＬ−１０  Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ／ＩＬ−１０  Ｒｅｃｅ
ｐｔｏｒ  Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）、ＧＡＴＡ２欠乏症（ＧＡＴＡ  ２  ｄｅｆｉｃｉｅ
ｎｃｙ）、Ｘ連鎖リンパ増殖性疾患（ＸＬＰ）、軟骨毛髪形成不全症など）、血球貪食リ
ンパ組織球増多症（ＨＬＨ）または他の血球貪食障害、遺伝性骨髄不全障害（例えば、こ
れだけに限定されないが、シュワヒマン・ダイアモンド症候群、ダイアモンド・ブラック
ファン貧血、先天性角化異常症、ファンコニー貧血、先天性好中球減少症など）、異常ヘ
モグロビン症（例えば、これだけに限定されないが、鎌状赤血球症、サラセミアなど）、
代謝障害（例えば、これだけに限定されないが、ムコ多糖症、スフィンゴリピドーシスな
ど）、または破骨細胞障害（例えば、これだけに限定されないが、大理石骨病など）など
の非悪性障害を有する対象に、または対象が非悪性障害と診断されている場合に、治療用
細胞を投与する。
【００４６】
治療用細胞は、例えば、所望の治療結果のために患者に投与される任意の細胞であって
よい。細胞は、例えば、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、末梢
血液細胞、造血前駆細胞、骨髄細胞、または腫瘍細胞であってよい。腫瘍細胞を直接死滅
させるために改変カスパーゼ−９ポリペプチドを使用することもできる。１つの適用では
、誘導性改変カスパーゼ−９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクター
を腫瘍に注射し、１０〜２４時間後に（タンパク質を発現させるため）、例えばＡＰ１９
０３などのリガンド誘導因子を投与してアポトーシスを誘発し、それにより、微小環境へ
の腫瘍抗原の放出を引き起こす。腫瘍微小環境を免疫原性が増すようにさらに改善するた
めに、処置を、１つまたは複数のアジュバント（例えば、ＩＬ−１２、ＴＬＲ、ＩＤＯ阻
害剤など）と組み合わせることができる。一部の実施形態では、固形腫瘍を処置するため
に細胞を送達すること、例えば、細胞を腫瘍床に送達することができる。一部の実施形態
では、キメラカスパーゼ−９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをワクチンの一
部として、または腫瘍床に直接送達することによって投与し、それにより、腫瘍細胞にお
けるキメラカスパーゼ−９ポリペプチドの発現をもたらし、その後、リガンド誘導因子を
投与した後に腫瘍細胞のアポトーシスをもたらすことができる。ＤＮＡ療法および腫瘍内
ワクチンを使用して腫瘍細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで死滅させる方法は、例えば、Ｘｉｅ  Ｘ
．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６１巻、６７９５〜６８０４頁（２００１年）およびＮｉ
ｋｉｔｉｎａ，  Ｅ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６５巻：４３０９〜４３１９頁（２０
０５年）において考察されている。したがって、一部の実施形態では、本出願の誘導性ま
たは改変誘導性カスパーゼ−９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を
含む核酸ワクチン、例えばＤＮＡワクチンなども提供される。ワクチンを対象に投与し、
それにより、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて標的細胞を形質転換または形質導入することができ
る。次いで、リガンド誘導因子を本出願の方法に従って投与する。
【００４７】
一部の実施形態では、改変カスパーゼ−９ポリペプチドは、短縮型改変カスパーゼ−９
ポリペプチドである。一部の実施形態では、改変カスパーゼ−９ポリペプチドはカスパー
ゼ動員ドメインを欠く。一部の実施形態では、カスパーゼ−９ポリペプチドは、配列番号
９のアミノ酸配列もしくはその断片を含む、または配列番号８のヌクレオチド配列もしく
はその断片によりコードされる。
【００４８】
一部の実施形態では、方法は、多量体リガンド結合性領域に結合する多量体リガンドを
投与するステップをさらに含む。一部の実施形態では、多量体リガンド結合性領域は、Ｆ
ＫＢＰ、シクロフィリン受容体、ステロイド受容体、テトラサイクリン受容体、重鎖抗体
サブユニット、軽鎖抗体サブユニット、柔軟なリンカードメインによって分離されたタン
デムな重鎖可変領域および軽鎖可変領域で構成される単鎖抗体、およびその変異配列から
なる群から選択される。一部の実施形態では、多量体リガンド結合性領域は、ＦＫＢＰ１
２領域である。一部の実施形態では、多量体リガンドは、ＦＫ５０６二量体または二量体
ＦＫ５０６様類似体リガンドである。一部の実施形態では、多量体リガンドはＡＰ１９０
３である。一部の実施形態では、移植片対宿主病を処置するために多量体リガンドを投与
する。一部の実施形態では、患者は、多量体リガンドを投与する前に移植片対宿主病の症
状を示している。一部の実施形態では、患者は、ステージ０移植片対宿主病の１つまたは
複数の症状を示している。一部の実施形態では、患者は、ステージ１移植片対宿主病の１
つまたは複数の症状を示している。一部の実施形態では、患者は、ステージ２移植片対宿
主病の１つまたは複数の症状を示している。一部の実施形態では、患者は、ステージ３移
植片対宿主病の１つまたは複数の症状を示している。一部の実施形態では、患者は、ステ
ージ４移植片対宿主病の１つまたは複数の症状を示している。一部の実施形態では、１回
より多くの用量の多量体リガンドを投与する。一部の実施形態では、多量体リガンドの投
与後にアロ反応性Ｔ細胞の数が減少する。一部の実施形態では、多量体リガンドの投与後
にアロ反応性Ｔ細胞の数が約６０〜９９％、約７０％〜９５％、８０％〜９０％または約
９０％またはそれ超減少する。一部の実施形態では、多量体リガンドの投与後に、患者に
おいて、増大することができ、かつウイルスおよび真菌に対して反応性であるドナーＴ細
胞が生存する。一部の実施形態では、多量体リガンドの投与後に、患者において、増大す
ることができ、かつ患者における腫瘍細胞に対して反応性であるドナーＴ細胞が生存する
。
【００４９】
ある特定の実施形態が以下の説明、実施例、特許請求の範囲および図面にさらに記載さ
れている。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
対象における移植された治療用細胞の生存を制御する方法であって、
ａ）治療用細胞を調製するまたは得るステップ、
ｂ）該治療用細胞に、多量体化領域と、カスパーゼ−９ポリペプチドまたは改変カスパーゼ−９ポリペプチドとを含むキメラポリペプチドをコードする核酸をトランスフェクトまたは形質導入するステップであって、該カスパーゼ−９ポリペプチドまたは該改変カスパーゼ−９ポリペプチドが、配列番号９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むステップ、
ｃ）該形質導入またはトランスフェクトされた治療用細胞を該対象に移植するステップ、および
ｄ）（ｃ）の後に、該対象に、該多量体化領域に結合する多量体リガンドを、該カスパーゼ−９ポリペプチドまたは該改変カスパーゼ−９ポリペプチドを発現する移植された治療用細胞の８０％未満を死滅させるために有効な量で投与するステップ
を含み、
該改変カスパーゼ−９ポリペプチドが、改変されていないカスパーゼ−９ポリペプチドと比較して、該多量体リガンドに対する応答において低下したＩＣ５０および伸長した用量反応曲線を有する、
方法。
（項目２）
前記カスパーゼ−９ポリペプチドまたは前記改変カスパーゼ−９ポリペプチドを発現する移植された治療用細胞の７０％未満が、前記多量体リガンドの投与後に死滅する、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記カスパーゼ−９ポリペプチドまたは前記改変カスパーゼ−９ポリペプチドを発現する移植された治療用細胞の６０％未満が、前記多量体リガンドの投与後に死滅する、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
前記カスパーゼ−９ポリペプチドまたは前記改変カスパーゼ−９ポリペプチドを発現する移植された治療用細胞の５０％未満が、前記多量体リガンドの投与後に死滅する、項目１から３のいずれか一項に記載の方法。
（項目５）
前記カスパーゼ−９ポリペプチドまたは前記改変カスパーゼ−９ポリペプチドを発現する移植された治療用細胞の４０％未満が、前記多量体リガンドの投与後に死滅する、項目１から４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
前記カスパーゼ−９ポリペプチドまたは前記改変カスパーゼ−９ポリペプチドを発現する移植された治療用細胞の３０％未満が、前記多量体リガンドの投与後に死滅する、項目１から５のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
前記治療用細胞が、異種タンパク質をさらに発現する、項目１から６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
前記異種タンパク質がキメラ抗原受容体である、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記改変カスパーゼ−９ポリペプチドの前記多量体リガンドに対するＩＣ５０が０．０１ｐＭ超である、項目１から８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
前記改変カスパーゼ−９ポリペプチドの前記多量体リガンドに対するＩＣ５０が０．１ｐＭ超である、項目１から８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
前記改変カスパーゼ−９ポリペプチドの前記多量体リガンドに対するＩＣ５０が０．０１ｎＭ超である、項目１から８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
前記改変カスパーゼ−９ポリペプチドの前記多量体リガンドに対するＩＣ５０が０．１ｎＭ超である、項目１から８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
対象における移植された治療用細胞の生存を制御する方法であって、
ａ）治療用細胞を調製するまたは得るステップ、
ｂ）該治療用細胞の第１のサブセットに、多量体化領域および第１のカスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラポリペプチドをコードする核酸をトランスフェクトまたは形質導入するステップであって、該第１のカスパーゼ−９ポリペプチドが、配列番号９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むステップ、
ｃ）該治療用細胞の第２のサブセットに、多量体化領域および第２のカスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラポリペプチドをコードする核酸をトランスフェクトまたは形質導入するステップであって、該第２のカスパーゼ−９ポリペプチドが、配列番号９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むステップ、
ｄ）該形質導入またはトランスフェクトされた治療用細胞の第１のサブセットおよび治療用細胞の該第２のサブセットを該対象に移植するステップ、および
ｅ）（ｄ）の後に、該対象に、該多量体化領域に結合する多量体リガンドを、治療用細胞の該第１のサブセットを治療用細胞の該第２のサブセットよりも多く死滅させるために有効な量で投与するステップ
を含む方法。
（項目１４）
前記第１のカスパーゼ−９ポリペプチドが、前記第２のカスパーゼ−９ポリペプチドと比較して、前記多量体リガンドに対する応答において低下したＩＣ５０および伸長した用量反応曲線を有する、項目１２から１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
治療用細胞の前記第１のサブセットまたは前記第２のサブセットがＴ細胞である、項目１３または１４に記載の方法。
（項目１６）
治療用細胞の前記第１のサブセットまたは前記第２のサブセットがキメラ抗原受容体をさらに発現する、項目１３から１５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７）
前記治療用細胞が、造血幹細胞、誘導性前駆細胞（ｉＰＳ）、胚性幹（ＥＳ）細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、形質（Ｂ）細胞、筋細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、およびＴ細胞からなる群から選択される、項目１３から１６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８）
前記対象に投与する前に前記Ｔ細胞をアロ枯渇させない、項目１５に記載の方法。
（項目１９）
対象における移植された治療用細胞の生存を制御する方法であって、
ａ）治療用細胞を該対象に移植するステップであって、該治療用細胞が、多量体化領域と、カスパーゼ−９ポリペプチドまたは改変カスパーゼ−９ポリペプチドとを含むキメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、該カスパーゼ−９ポリペプチドまたは該改変カスパーゼ−９ポリペプチドが、配列番号９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むステップ、および
ｂ）（ａ）の後に、該対象に、該多量体化領域に結合する多量体リガンドを、該カスパーゼ−９ポリペプチドまたは該改変カスパーゼ−９ポリペプチドを発現する移植された治療用細胞の最大７０％を死滅させるために有効な量で投与するステップ
を含み、
該改変カスパーゼ−９ポリペプチドが、改変されていないカスパーゼ−９ポリペプチドと比較して、該多量体リガンドに対する応答において低下したＩＣ５０および伸長した用量反応曲線を有する、
方法。
（項目２０）
前記細胞に、前記キメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが形質導入またはトランスフェクトされている、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記治療用細胞が、造血幹細胞、誘導性前駆細胞（ｉＰＳ）、胚性幹（ＥＳ）細胞、間葉系幹細胞、形質（Ｂ）細胞、筋細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、腫瘍浸潤リンパ球、およびＴ細胞からなる群から選択される、項目１９または２０に記載の方法。
（項目２２）
前記カスパーゼ−９ポリペプチドまたは前記改変カスパーゼ−９ポリペプチドを発現する移植された治療用細胞の７０％未満が、前記多量体リガンドの投与後に死滅する、項目１９から２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目２３）
前記カスパーゼ−９ポリペプチドまたは前記改変カスパーゼ−９ポリペプチドを発現する移植された治療用細胞の６０％未満が、前記多量体リガンドの投与後に死滅する、項目１９から２２のいずれか一項に記載の方法。
（項目２４）
前記カスパーゼ−９ポリペプチドまたは前記改変カスパーゼ−９ポリペプチドを発現する移植された治療用細胞の５０％未満が、前記多量体リガンドの投与後に死滅する、項目１９から２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
前記カスパーゼ−９ポリペプチドまたは前記改変カスパーゼ−９ポリペプチドを発現する移植された治療用細胞の４０％未満が、前記多量体リガンドの投与後に死滅する、項目１９から２４のいずれか一項に記載の方法。
（項目２６）
前記カスパーゼ−９ポリペプチドまたは前記改変カスパーゼ−９ポリペプチドを発現する移植された治療用細胞の３０％未満が、前記多量体リガンドの投与後に死滅する、項目１９から２５のいずれか一項に記載の方法。
（項目２７）
前記改変カスパーゼ−９ポリペプチドの前記多量体リガンドに対するＩＣ５０が０．０１ｐＭ超である、項目１９から２６のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８）
前記改変カスパーゼ−９ポリペプチドの前記多量体リガンドに対するＩＣ５０が０．１ｐＭ超である、項目１９から２６のいずれか一項に記載の方法。
（項目２９）
前記改変カスパーゼ−９ポリペプチドの前記多量体リガンドに対するＩＣ５０が０．０１ｎＭ超である、項目１９から２６のいずれか一項に記載の方法。
（項目３０）
前記改変カスパーゼ−９ポリペプチドの前記多量体リガンドに対するＩＣ５０が０．１ｎＭ超である、項目１９から２６のいずれか一項に記載の方法。
（項目３１）
前記治療用細胞がキメラ抗原受容体を含む、項目１９から３０のいずれか一項に記載の方法。
（項目３２）
治療有効レベルの治療用細胞であって、前記キメラ抗原受容体を含む細胞が、前記多量体リガンドの投与後に前記対象において活性なままである、項目１９から３１までのいずれかに記載の方法。
（項目３３）
対象における移植された治療用細胞の生存を制御する方法であって、
ａ）治療用細胞の第１のセットを該対象に移植するステップであって、治療用細胞の該第１のセットが、多量体化領域と、第１のカスパーゼ−９ポリペプチドまたは第１の改変カスパーゼ−９ポリペプチドとを含むキメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、該カスパーゼ−９ポリペプチドまたは該改変カスパーゼ−９ポリペプチドが、配列番号９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むステップ、
ｂ）治療用細胞の第２のセットを該対象に移植するステップであって、治療用細胞の該第２のセットが、多量体化領域と、第２のカスパーゼ−９ポリペプチドまたは第２の改変カスパーゼ−９ポリペプチドとを含むキメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、該カスパーゼ−９ポリペプチドまたは該改変カスパーゼ−９ポリペプチドが、配列番号９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むステップ、および
ｃ）該対象に、該多量体化領域に結合する多量体リガンドを、該治療用細胞の該第１のサブセットを治療用細胞の該第２のサブセットよりも多く死滅させるために有効な量で投与するステップ
を含む方法。
（項目３４）
前記第１のカスパーゼ−９ポリペプチドおよび前記第２のカスパーゼ−９ポリペプチドが、異なるアミノ酸配列を含み、異なる基底の活性または異なるＩＣ５０を有する、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
前記第１のカスパーゼ−９ポリペプチドが、前記第２のカスパーゼ−９ポリペプチドと比較して、前記多量体リガンドに対する応答において低下したＩＣ５０および伸長した用量反応曲線を有する、項目３３から３４のいずれか一項に記載の方法。
（項目３６）
治療用細胞の前記第１のサブセットと治療用細胞の前記第２のサブセットとが異なる型の細胞である、項目３３から３５のいずれか一項に記載の方法。
（項目３７）
前記治療用細胞が、造血幹細胞、誘導性前駆細胞（ｉＰＳ）、胚性幹（ＥＳ）細胞、間葉系幹細胞、形質（Ｂ）細胞、筋細胞、腫瘍浸潤リンパ球、およびＴ細胞からなる群から選択される、項目３３から３６のいずれか一項に記載の方法。
（項目３８）
前記第２のカスパーゼ−９ポリペプチドの前記多量体リガンドに対するＩＣ５０が０．０１ｐＭ超である、項目３３から３７のいずれか一項に記載の方法。
（項目３９）
前記第２のカスパーゼ−９ポリペプチドの前記多量体リガンドに対するＩＣ５０が０．１ｐＭ超である、項目３３から３７のいずれか一項に記載の方法。
（項目４０）
前記第２のカスパーゼ−９ポリペプチドの前記多量体リガンドに対するＩＣ５０が０．０１ｎＭ超である、項目３３から３７のいずれか一項に記載の方法。
（項目４１）
前記第２のカスパーゼ−９ポリペプチドの前記多量体リガンドに対するＩＣ５０が０．１ｎＭ超である、項目３３から３７のいずれか一項に記載の方法。
（項目４２）
追加用量の前記多量体リガンドを前記対象に投与するステップをさらに含み、該追加用量の該多量体リガンドを投与した後に、前記第１のカスパーゼ−９ポリペプチドまたは前記第２のカスパーゼ−９ポリペプチドを発現する前記移植された治療用細胞の少なくとも１０％が、該追加用量前の該移植された細胞の数と比較して死滅する、項目３３から４１のいずれか一項に記載の方法。
（項目４３）
追加用量の前記多量体リガンドを前記対象に投与するステップをさらに含み、該追加用量の該多量体リガンドを投与した後に、前記第１のカスパーゼ−９ポリペプチドまたは前記第２のカスパーゼ−９ポリペプチドを発現する前記移植された治療用細胞の少なくとも１０％が、該追加用量前の該移植された細胞の数と比較して死滅する、項目３３から４１のいずれか一項に記載の方法。
（項目４４）
２回用量の前記多量体リガンドを前記対象に投与し、該多量体リガンドの２回目の用量を該多量体リガンドの１回目の用量の２４時間より後に投与する、項目３３から４３のいずれか一項に記載の方法。
（項目４５）
前記多量体リガンドの２回目の用量を該多量体リガンドの１回目の用量の少なくとも１週間後に前記対象に投与する、項目４３または４４に記載の方法。
（項目４６）
前記患者における前記移植された治療用細胞によって生じる状態の存在、不在またはステージを含む情報を受け取るステップ、および
該患者において同定された該状態の存在、不在またはステージに基づいて、該患者に対して前記多量体化領域に結合する多量体リガンドを投与するか、その後の該多量体リガンドの投薬量を維持するか、またはその後の該多量体リガンドの投薬量を調整するステップをさらに含む、項目３３から４５のいずれか一項に記載の方法。
（項目４７）
前記状態が移植片対宿主病である、項目３３から４５のいずれか一項に記載の方法。
（項目４８）
前記第１の治療用細胞または前記第２の治療用細胞がＴ細胞である、項目３３から４７のいずれか一項に記載の方法。
（項目４９）
所望の百分率の第１の治療用細胞が死滅するまで多量体リガンドの濃度を上昇させる、項目３３から４８のいずれか一項に記載の方法。
（項目５０）
前記第１の治療用細胞がキメラ抗原受容体を含む、項目３３から４９のいずれか一項に記載の方法。
（項目５１）
治療有効レベルの前記第１の治療用細胞であって、前記キメラ抗原受容体を含む細胞が、前記多量体リガンドの投与後に前記対象において活性なままである、項目３３から５０のいずれか一項に記載の方法。
（項目５２）
前記第２の治療用細胞がキメラ抗原受容体を含む、項目３３から５１のいずれか一項に記載の方法。
（項目５３）
前記第１の治療用細胞がＴ細胞である、項目５２に記載の方法。
（項目５４）
前記第２の治療用細胞が、幹細胞移植後の対象に投与されるＴ細胞である、項目５３に記載の方法。
（項目５５）
前記対象ががんを有する、項目１から５４のいずれか一項に記載の方法。
（項目５６）
前記対象が固形腫瘍を有する、項目１から５４のいずれか一項に記載の方法。
（項目５７）
前記がんが、前記対象の血液または骨髄に存在する、項目５５に記載の方法。
（項目５８）
前記対象が血液疾患または骨髄疾患を有する、項目１から５４のいずれか一項に記載の方法。
（項目５９）
前記対象が、幹細胞移植によって緩和することができるいずれかの状態または障害と診断されている、項目１から５４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６０）
前記対象が、鎌状赤血球貧血または異染性白質ジストロフィーと診断されている、項目１から５４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６１）
患者が、原発性免疫不全障害、血球貪食リンパ組織球増多症（ＨＬＨ）または他の血球貪食障害、遺伝性骨髄不全障害、異常ヘモグロビン症、代謝障害、および破骨細胞障害からなる群から選択される状態と診断されている、項目１から５４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６２）
前記状態が、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、複合免疫不全症（ＣＩＤ）、先天性Ｔ細胞欠損／欠乏症、分類不能型免疫不全症（ＣＶＩＤ）、慢性肉芽腫性疾患、ＩＰＥＸ（免疫不全、多腺性内分泌障害、腸疾患、Ｘ連鎖）またはＩＰＥＸ様、ウィスコット・アルドリッチ症候群、ＣＤ４０リガンド欠乏症、白血球接着不全症、ＤＯＣＫ８欠乏症、ＩＬ−１０欠乏／ＩＬ−１０受容体欠乏症、ＧＡＴＡ２欠乏症、Ｘ連鎖リンパ増殖性疾患（ＸＬＰ）、軟骨毛髪形成不全症、シュワヒマン・ダイアモンド症候群、ダイアモンド・ブラックファン貧血、先天性角化異常症、ファンコニー貧血、先天性好中球減少症、鎌状赤血球症、サラセミア、ムコ多糖症、スフィンゴリピドーシス、および大理石骨病からなる群から選択される、項目１から５４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６３）
前記対象が、１つまたは複数のステージ１移植片対宿主病の症状を示している、項目１から５４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６４）
前記対象が、１つまたは複数のステージ２移植片対宿主病の症状を示している、項目１から５４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６５）
前記対象が、１つまたは複数のステージ３移植片対宿主病の症状を示している、項目１から５４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６６）
前記対象が、１つまたは複数のステージ４移植片対宿主病の症状を示している、項目１から５４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６７）
前記多量体リガンドの投与後にアロ反応性Ｔ細胞の数が減少する、項目１から６６のいずれか一項に記載の方法。
（項目６８）
前記アロ反応性Ｔ細胞がマーカーおよびＣＤ３を発現する、項目１から６７のいずれか一項に記載の方法。
（項目６９）
アロ反応性Ｔ細胞の数が前記多量体リガンドの投与後に約９０％またはそれより多く減少する、項目１から６８のいずれか一項に記載の方法。
（項目７０）
前記多量体リガンドの投与後に、前記対象において、増大することができ、かつウイルスおよび真菌に対して反応性であるドナーＴ細胞が生存する、項目１から６９のいずれか一項に記載の方法。
（項目７１）
前記多量体リガンドの投与後に、前記対象において、増大することができ、かつ該対象における腫瘍細胞に対して反応性であるドナーＴ細胞が生存する、項目１から６９のいずれか一項に記載の方法。
（項目７２）
少なくとも１つのアミノ酸置換が、Ｓ１４４Ａ、Ｓ１４４Ｄ、Ｙ１５３Ａ、Ｙ１５３Ｆ、Ｓ１８３Ａ、Ｓ１９５Ａ、Ｓ１９６Ａ、Ｓ１９６Ｄ、Ｓ３０７Ａ、Ｄ３１５Ａ、Ａ３１６Ｇ、Ｔ３１７Ａ、Ｔ３１７Ｃ、Ｔ３１７Ｅ、Ｔ３１７Ｓ、Ｐ３１８Ａ、Ｆ３１９Ａ、Ｆ３１９Ｗ、Ｆ３２６Ｋ、Ｄ３２７Ｇ、Ｄ３２７Ｋ、Ｄ３２７Ｒ、Ｑ３２８Ｋ、Ｑ３２８Ｒ、Ｌ３２９Ｅ、Ｌ３２９Ｇ、Ｌ３２９Ｋ、Ｄ３３０Ａ、Ｄ３３０Ｅ、Ｄ３３０Ｇ、Ｄ３３０Ｎ、Ｄ３３０Ｓ、Ｄ３３０Ｖ、Ａ３３１Ｋ、Ｃ４０３Ａ、Ｃ４０３Ｓ、Ｃ４０３Ｔ、Ｆ４０４Ｔ、Ｆ４０４Ｗ、Ｆ４０４Ｙ、Ｎ４０５Ａ、Ｎ４０５Ｆ、Ｎ４０５Ｑ、Ｎ４０５Ｔ、Ｆ４０６Ａ、Ｆ４０６Ｔ、Ｆ４０６Ｗ、Ｆ４０６Ｙ、Ｇ４０２Ａ、Ｇ４０２Ｉ、Ｇ４０２Ｑ、Ｇ４０２Ｙ、Ｃ４０３Ｐ、Ｆ４０４Ａ、Ｆ４０４Ｓ、およびＦ４０６Ｌからなる群から選択される、項目１から７１のいずれか一項に記載の方法。
（項目７３）
少なくとも１つのアミノ酸置換がＤ３３０Ａである、項目１から７１のいずれか一項に記載の方法。
（項目７４）
少なくとも１つのアミノ酸置換がＤ３３０Ｅである、項目１から７１のいずれか一項に記載の方法。
（項目７５）
少なくとも１つのアミノ酸置換がＮ４０５Ｑである、項目１から７１のいずれか一項に記載の方法。
（項目７６）
前記改変カスパーゼ−９ポリペプチドが、Ｄ３３０Ａ−Ｎ４０５Ｑ、Ｄ３３０Ａ−Ｓ１４４Ａ、Ｄ３３０Ａ−Ｓ１４４Ｄ、Ｄ３３０Ａ−Ｓ１８３Ａ、Ｄ３３０Ａ−Ｓ１９６Ａ、Ｎ４０５Ｑ−Ｓ１４４Ａ、Ｎ４０５Ｑ−Ｓ１４４Ｄ、Ｎ４０５Ｑ−Ｓ１９６Ｄ、Ｎ４０５Ｑ−Ｔ３１７Ｓ、Ｎ４０５Ｑ−Ｓ１４４Ａｃｏ、Ｎ４０５Ｑ−Ｔ３１７Ｓｃｏ、４０２ＧＣＦＮＦ４０６ＩＳＡＱＴ（ＣＡＳＰ−１０）、３１６ＡＴＰＦ３１９ＡＶＰＩ（ＳＭＡＣ／Ｄｉａｂｌｏ）、Ｄ３３０Ａ−Ｎ４０５Ｔ、Ｄ３１５Ａ−Ｄ３３０Ａ、Ｄ３３０Ａ−Ｙ１５３Ａ、Ｄ３３０Ａ−Ｙ１５３Ｆ、Ｄ３３０Ａ−Ｔ３１７Ｅ、４０２ＧＣＦＮＦ４０６ＣＩＶＳＭ（ＣＡＳＰ−３）、４０２ＧＣＦＮＦ４０６ＡＡＡＡＡ、４０２ＧＣＦＮＦ４０６ＹＣＳＴＬ（ＣＡＳＰ−２）、および４０２ＧＦＮＦ４０６ＱＰＴＦＴ（ＣＡＳＰ−８）からなる群から選択されるアミノ酸置換を少なくとも２つ含む、項目１から７１のいずれか一項に記載の方法。
（項目７７）
前記ポリヌクレオチドが、前記カスパーゼ−９ポリペプチドをコードする最適化されたコドンを含む、項目１から７６のいずれか一項に記載の方法。
（項目７８）
前記改変カスパーゼ−９ポリペプチドが、配列番号３９の核酸配列によりコードされる、または配列番号８８の改変カスパーゼ−９ポリペプチドＤ３３０Ｅの核酸配列によりコードされる、項目１から７７のいずれか一項に記載の方法。
（項目７９）
前記改変カスパーゼ−９ポリペプチドが、表５または表６のカスパーゼバリアントからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む、項目１から７８のいずれか一項に記載の方法。
（項目８０）
前記細胞がヒト細胞である、項目１から７９のいずれか一項に記載の方法。
（項目８１）
前記細胞が、間葉系間質細胞、胚性幹細胞、腫瘍浸潤リンパ球、および誘導性多能性幹細胞、前駆細胞、または造血前駆細胞からなる群から選択される、項目１から８０のいずれか一項に記載の方法。
（項目８２）
前記細胞がＴ細胞である、項目１から８０のいずれか一項に記載の方法。
（項目８３）
前記細胞を骨髄、臍帯血、末梢血、または末梢血単核細胞から得るまたは調製する、項目１から８２のいずれか一項に記載の方法。
（項目８４）
前記ポリヌクレオチドがプロモーターに作動可能に連結している、項目１から８３のいずれか一項に記載の方法。
（項目８５）
前記キメラタンパク質がマーカーポリペプチドをさらに含む、項目８４に記載の方法。（項目８６）
前記マーカーポリペプチドがΔＣＤ１９ポリペプチドである、項目８５に記載の方法。（項目８７）
前記マーカーを発現する細胞を前記対象への投与のために選択する選択ステップをさらに含む、項目８５または８６に記載の方法。
（項目８８）
前記カスパーゼ−９ポリペプチドがカスパーゼ動員ドメイン（ＣＡＲＤ）を欠く、項目１から８７のいずれか一項に記載の方法。
（項目８９）
前記多量体化領域が、ＦＫＢＰ、シクロフィリン受容体、ステロイド受容体、テトラサイクリン受容体、重鎖抗体サブユニット、軽鎖抗体サブユニット、柔軟なリンカードメインによって分離されたタンデムな重鎖可変領域および軽鎖可変領域で構成される単鎖抗体、ならびにその変異配列からなる群から選択される、項目１から８８のいずれか一項に記載の方法。
（項目９０）
前記多量体化領域がＦＫＢＰ１２領域である、項目１から８８のいずれか一項に記載の方法。
（項目９１）
前記ＦＫＢ１２領域がＦＫＢ１２ｖ３６領域である、項目９０に記載の方法。
（項目９２）
前記多量体化領域がＦｖ’Ｆｖｌｓである、項目１から９１のいずれか一項に記載の方法。
（項目９３）
前記多量体化領域が、ＦＫ５０６二量体および二量体ＦＫ５０６類似体リガンドからなる群から選択されるリガンドと結合する、項目１から９２のいずれか一項に記載の方法。（項目９４）
前記リガンドがＡＰ１９０３またはＡＰ２０１８７である、項目１から９３のいずれか一項に記載の方法。
（項目９５）
前記多量体化領域が配列番号２９のアミノ酸配列またはその機能性断片を有する、項目１から９４のいずれか一項に記載の方法。
（項目９６）
前記多量体化領域が配列番号３０のヌクレオチド配列またはその機能性断片によりコードされる、項目１から９４のいずれか一項に記載の方法。
（項目９７）
前記多量体化領域が配列番号３２のアミノ酸配列またはその機能性断片を有するポリペプチドをさらに含む、項目９５に記載の方法。
（項目９８）
前記多量体化領域が配列番号３１のヌクレオチド配列またはその機能性断片によりコードされるポリペプチドをさらに含む、項目９６に記載の方法。
（項目９９）
前記多量体化領域が配列番号３２のアミノ酸配列またはその機能性断片を有するポリペプチドをさらに含む、項目９５または９７に記載の方法。
（項目１００）
前記多量体化領域が配列番号３１のヌクレオチド配列またはその機能性断片によりコードされるポリペプチドをさらに含む、項目９６または９８に記載の方法。
（項目１０１）
前記多量体化領域が配列番号２９または配列番号３２のアミノ酸配列あるいはその機能性断片を有するポリペプチドをさらに含む、項目９５、９７または９９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０２）
前記多量体化領域が配列番号３０または配列番号３１のヌクレオチド配列あるいはその機能性断片によりコードされるポリペプチドをさらに含む、項目９６、９８または１００のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０３）
前記細胞に、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、または遺伝子発現ベクターを形質導入またはトランスフェクトする、項目１から１０２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０４）
前記細胞が、前記改変カスパーゼ−９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、異種ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドをさらに含む、項目１から１０３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０５）
前記異種ポリペプチドがキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、項目１０４に記載の方法。
（項目１０６）
前記細胞が、前記改変カスパーゼ−９ポリペプチドをコードし、異種ポリペプチドをさらにコードするポリヌクレオチド、および該改変カスパーゼ−９ポリペプチドと該異種ポリペプチドとを連結する切断可能なリンカーポリペプチドを含む、項目１から１０３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０７）
前記異種ポリペプチドがキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、項目１０６に記載の方法。
（項目１０８）
前記切断可能なリンカーポリペプチドが２Ａまたは２Ａ様ポリペプチドである、項目１０６または１０７に記載の方法。
（項目１０９）
前記対象がヒトである、項目１から１０８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１０）
複数回用量の多量体リガンドを、該複数回用量の間で投薬量レベルを漸増させながら前記対象に対して投与する、項目１から１０９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１１）
投薬量レベルの前記漸増により、死滅する治療用細胞の数が増加する、項目１１０に記載の方法。
（項目１１２）
前記対象が移植片対宿主病を有し、前記多量体リガンドの投与により該移植片対宿主病が緩和される、項目１から１１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１３）
前記対象がヒトである、項目１から１１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１４）
前記治療用細胞がキメラ抗原受容体を含む、項目１から１１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１５）
前記対象が、前記多量体リガンドの投与前にオフターゲットまたはオフオーガンの毒性の症状を示している、項目１から１１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１６）
前記対象が、前記多量体リガンドの投与前に腫瘍崩壊症候群（ＴＬＳ）、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）またはマクロファージ活性化症候群（ＭＡＳ）の症状を示している、項目１から１１５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１７）
前記多量体リガンドの投与により前記オフターゲットまたはオフオーガンの毒性が緩和される、項目１１６に記載の方法。
（項目１１８）
前記多量体リガンドの投与により前記腫瘍崩壊症候群（ＴＬＳ）、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）またはマクロファージ活性化症候群（ＭＡＳ）が緩和される、項目１１６に記載の方法。
（項目１１９）
治療有効レベルの治療用細胞であって、前記キメラ抗原受容体を含む細胞が、前記多量体リガンドの投与後に前記対象において活性なままである、項目１１４から１１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２０）
追加用量の前記多量体リガンドを前記対象に投与すべきかどうかを決定するステップをさらに含む、項目１から１１９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２１）
追加用量の前記多量体リガンドを前記対象に投与するステップをさらに含み、該追加用量の該多量体リガンドを投与後に、前記カスパーゼ−９ポリペプチドまたは前記改変カスパーゼ−９ポリペプチドを発現する前記移植された治療用細胞の少なくとも１０％が、該追加用量前の該移植された細胞の数と比較して死滅する、項目１から１２０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２２）
２回用量の前記多量体リガンドを前記対象に投与し、該多量体リガンドの２回目の用量を前記多量体リガンドの１回目の用量の２４時間より後に投与する、項目１から１２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２３）
前記多量体リガンドの２回目の用量を該多量体リガンドの１回目の用量の少なくとも１週間後に前記対象に投与する、項目１から１２２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２４）
前記患者における前記移植された治療用細胞によって生じる状態の存在、不在またはステージを含む情報を受け取るステップ、および
該患者において同定された該状態の存在、不在またはステージに基づいて、該患者に対して前記多量体化領域に結合する多量体リガンドを投与するか、その後の該多量体リガンドの投薬量を維持するか、またはその後の該多量体リガンドの投薬量を調整するステップをさらに含む、項目１から１２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２５）
前記キメラ抗原受容体がキメラＴ細胞受容体である、項目１から１２４までのいずれかに記載の方法。
（項目１２６）
前記キメラ抗原受容体がｓｃＦｖドメインを含む、項目１から１２４までのいずれかに記載の方法。
【００５０】
図面は、技術の実施形態を例示するものであり、限定するものではない。例示を明白か
つ容易にするために、図面は一定の縮尺で作成されておらず、一部の場合には、種々の態
様は、特定の実施形態の理解を容易にするために誇張または拡大して示されていることが
ある。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１Ａ】図１Ａは、本明細書で考察されている種々のｉＣａｓｐ９発現ベクターを例示する図である。図１Ｂは、図１Ａに示されている発現ベクターによって産生される全長カスパーゼ−９タンパク質および短縮型カスパーゼ−９タンパク質の代表的なウエスタンブロットを例示する図である。
【図１Ｂ】図１Ａは、本明細書で考察されている種々のｉＣａｓｐ９発現ベクターを例示する図である。図１Ｂは、図１Ａに示されている発現ベクターによって産生される全長カスパーゼ−９タンパク質および短縮型カスパーゼ−９タンパク質の代表的なウエスタンブロットを例示する図である。
【００５２】
【図２ＡＢ】図２Ａ〜２Ｄは、種々のｉＣａｓｐ９発現ベクターを形質導入した細胞の表現型に対するｉＣａｓｐ９発現構築物の発現の影響を評価するために実施した実験の結果を示すグラフである。図２Ａは、形質導入された細胞および形質導入されていない細胞における細胞表面マーカーのレベルを例示するグラフである。図２Ｂは、形質導入された細胞および形質導入されていない細胞における、抗原刺激時のＴｈ１型サイトカインおよびＴｈ２型サイトカインの分泌のレベルを例示するグラフである。図２Ｃは、形質導入された細胞および形質導入されていない細胞における、自己由来ＥＶＢで形質転換したリンパ芽球様Ｂ細胞株（ＬＣＬ）、ＨＬＡ不適合ＬＣＬ、およびＨＳＢ−２に対する細胞溶解活性のレベルを例示するグラフである  。図２Ｄは、ｉＣａｓｐ９を形質導入した細胞株への抗原依存の持続を例示するグラフである。抗原刺激を中止した後のＴ細胞の一定の減退に注目されたい。実験条件および結果に関するさらなる考察は実施例において示されている。
【図２ＣＤ】図２Ａ〜２Ｄは、種々のｉＣａｓｐ９発現ベクターを形質導入した細胞の表現型に対するｉＣａｓｐ９発現構築物の発現の影響を評価するために実施した実験の結果を示すグラフである。図２Ａは、形質導入された細胞および形質導入されていない細胞における細胞表面マーカーのレベルを例示するグラフである。図２Ｂは、形質導入された細胞および形質導入されていない細胞における、抗原刺激時のＴｈ１型サイトカインおよびＴｈ２型サイトカインの分泌のレベルを例示するグラフである。図２Ｃは、形質導入された細胞および形質導入されていない細胞における、自己由来ＥＶＢで形質転換したリンパ芽球様Ｂ細胞株（ＬＣＬ）、ＨＬＡ不適合ＬＣＬ、およびＨＳＢ−２に対する細胞溶解活性のレベルを例示するグラフである  。図２Ｄは、ｉＣａｓｐ９を形質導入した細胞株への抗原依存の持続を例示するグラフである。抗原刺激を中止した後のＴ細胞の一定の減退に注目されたい。実験条件および結果に関するさらなる考察は実施例において示されている。
【００５３】
【図３Ａ】図３Ａ〜３Ｄは、ｉＣａｓｐ９発現構築物を発現する細胞における、二量体化の化学的誘導因子（ＣＩＤ）の有効性を決定するために実施した種々の実験の結果を例示する図である。図３Ａは、ＣＩＤまたは担体を用いて処理した後の細胞のＦＡＣＳプロットを例示するグラフである。選択していない細胞（図３Ａの上の段）および高ＧＦＰ発現について選択した細胞（図３Ａの下の段）についてのＦＡＣＳプロットが示されている。図３Ｂは、ｉＣａｓｐ９を形質導入した細胞をＣＩＤで一晩処理した結果を例示する図である。処理パネルは、アポトーシスの特性を示す細胞を示す。図３Ｃは、ＣＩＤ処理した細胞および無処理の細胞をアネキシン−Ｖおよび７−ＡＡＤについて染色した結果を例示するグラフである。図３Ｄは、ＣＩＤ  ＡＰ２０１８７についての用量反応曲線を示すグラフである。実験条件および結果に関するさらなる考察は実施例において示されている。
【図３Ｂ】同上。
【図３Ｃ】同上。
【図３Ｄ】同上。
【００５４】
【図４】図４Ａ〜４Ｃは、導入遺伝子の発現レベルとｉＣａｓｐ９の機能の間の相関を測定するために実施した種々の実験の結果を例示するグラフである。図４Ａは、ＧＦＰ発現に基づく細胞集団の選択の結果を示すグラフである。図４Ｂは、ＣＩＤで一晩処理し、アネキシン−Ｖおよび７−ＡＡＤについて染色した細胞の結果を例示するグラフである。図４Ｃは、選択されたＴ細胞を形質導入されていないＴ細胞と１：１で混合し、抗原による刺激後に１０ｎＭのＣＩＤと一緒にインキュベートした結果を示すグラフである。７日目に残留ＧＦＰ陽性Ｔ細胞の百分率が示されている。実験条件および結果に関するさらなる考察は実施例において示されている。
【００５５】
【図５Ａ】図５Ａ〜５Ｃは、Ｔ細胞におけるｉＦａｓとｉＣａｓｐ９の機能性を比較する種々の実験の結果を例示するグラフである。図５Ａは、ｉＦａｓ発現構築物またはｉＣａｓｐ９発現構築物を形質導入し、ＧＦＰ発現に応じて選別した細胞の結果を例示するグラフである。図５Ｂは、ＣＩＤを用いた処理後のＧＦＰ発現測定の結果を例示するグラフである。図５Ｃは、ヒト由来細胞株であるＪｕｒｋａｔおよびＭＴ−２において実施した発現試験の結果を示すグラフである。細胞株をアネキシン−Ｖおよび７−ＡＡＤで染色した。実験条件および結果に関するさらなる考察は実施例において示されている。
【図５Ｂ】同上。
【図５Ｃ】同上。
【００５６】
【図６】図６は、Ｉｌ−２と同時発現させた際のｉＣａｓｐ９の機能を例示するグラフである。
【００５７】
【図７】図７は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるｉＣａｓｐ９の機能を例示するグラフである。実験条件および結果に関するさらなる考察は実施例において示されている。
【００５８】
【図８】図８Ａは、ｉＣａｓｐ９発現構築物ＳＦＧ．ｉＣａｓｐ９．２Ａ．ΔＣＤ１９の構造を例示する図である。図８Ｂは、アロ枯渇細胞において細胞産物発現ｉＣａｓｐ９を作製するために使用するプロトコールを例示する図である。実験条件および結果に関するさらなる考察は実施例において示されている。
【００５９】
【図９】図９は、アロ枯渇細胞が形質導入後に首尾よく増大することができたことを例示するグラフである。
【００６０】
【図１０】図１０は、自殺遺伝子構築物を形質導入した細胞を、ＣＤ１９免疫磁気選択によって富化して高純度にできることを示すグラフである。実験条件および結果に関するさらなる考察は実施例において示されている。
【００６１】
【図１１ＡＢ】図１１Ａ〜１１Ｃは、遺伝子改変アロ枯渇細胞がそれらの抗ウイルスレパートリーおよび機能性を保持することを示すために実施した種々の実験の結果を例示するグラフである。図１１Ａは、ＥＬＩＳｐｏｔによって評価した、ウイルス抗原に応答したインターフェロン−γ分泌を示すグラフである。図１１Ｂは、アロ枯渇細胞をＥＢＶ−ＬＣＬで刺激した後の細胞毒性アッセイの結果を示すグラフである。図１１Ｃは、ＥＢＶ溶解性抗原（ＢＺＬＦ１）由来のエピトープであるＨＬＡ−Ｂ８−ＲＡＫＦＫＱＬＬに特異的なＴ細胞の頻度を例示するグラフである。
【図１１Ｃ】図１１Ａ〜１１Ｃは、遺伝子改変アロ枯渇細胞がそれらの抗ウイルスレパートリーおよび機能性を保持することを示すために実施した種々の実験の結果を例示するグラフである。図１１Ａは、ＥＬＩＳｐｏｔによって評価した、ウイルス抗原に応答したインターフェロン−γ分泌を示すグラフである。図１１Ｂは、アロ枯渇細胞をＥＢＶ−ＬＣＬで刺激した後の細胞毒性アッセイの結果を示すグラフである。図１１Ｃは、ＥＢＶ溶解性抗原（ＢＺＬＦ１）由来のエピトープであるＨＬＡ−Ｂ８−ＲＡＫＦＫＱＬＬに特異的なＴ細胞の頻度を例示するグラフである。
【００６２】
【図１２】図１２Ａおよび１２Ｂは、ＣＤ２５免疫毒素を使用した最初のアロ枯渇（ａｌｌｏｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）にもかかわらず、遺伝子改変した最終産物細胞から調節性Ｔ細胞を単離できることを示すために実施した種々の実験の結果を例示するグラフである。図１２ＡはＦｏｘｐ３発現のレベルを示すグラフである。図１２Ｂは、ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋遺伝子改変枯渇細胞を添加することにより細胞増殖が有意に低下することを示すために実施した機能アッセイの結果を例示する。実験条件および結果に関するさらなる考察は実施例において示されている。
【００６３】
【図１３Ａ】図１３Ａ〜１３ＣＡおよび１３ＣＢは、遺伝子改変アロ枯渇細胞がＡＰ２０１８７によって急速かつ効率的に排除されること、ならびに導入遺伝子の発現および死滅の効率は培養が延長されるにつれ低下し、Ｔ細胞を再活性化すると回復し得ることを示すために実施した種々の実験の結果を例示するグラフである。図１３Ａは、アネキシン−Ｖおよび７−ＡＡＤを用いて染色した細胞の代表的なＦＡＣＳ分析を示すグラフである。図１３Ｂは、ＡＰ２０１８７を投与した際の死滅に対するＴ細胞の再活性化の結果を例示するグラフである。図１３ＣＡおよび１３ＣＢは、自殺遺伝子の機能に対する培養の延長およびＴ細胞活性化の影響を示す代表的なＦＡＣＳプロットを示す。実験条件および結果に関するさらなる考察は実施例において示されている。
【図１３Ｂ】同上。
【図１３ＣＡ】同上。
【図１３ＣＢ】同上。
【００６４】
【図１４】図１４Ａおよび１４Ｂは、アロ刺激（ａｌｌｏｓｔｉｍｕｌａｔｅ）した細胞を二量体化剤で処理した後にウイルス特異的Ｔ細胞が部分的に保持されることを示すために実施した種々の実験の結果を例示するグラフである。図１４Ａは、ＥＢＶ特異的Ｔ細胞についての結果を示すグラフである。図１４Ｂは、ＣＭＶ特異的Ｔ細胞についての結果を示すグラフである。アロ刺激（ａｌｌｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）前、アロ刺激後、およびアロ刺激した細胞を二量体化剤で処理した後に、五量体分析によって細胞を数量化した。実験条件および結果に関するさらなる考察は実施例において示されている。
【００６５】
【図１５】図１５Ａおよび１５Ｂは、健康な個体由来の間葉系間質細胞（ＭＳＣ）の分析を例示する図である。図１５Ａは、骨髄から単離した単核接着性画分がＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５については均一に陽性であり、造血マーカーについては陰性であったこと示すグラフである。図１５Ｂは、細胞が他の細胞系列に分化することができたことを示す分析を例示する図である。実験条件および結果に関するさらなる考察は実施例において示されている。
【００６６】
【図１６】図１６Ａおよび１６Ｂは、ヒトＭＳＣをｉＣａｓｐ９−ΔＣＤ１９で容易に形質転換し、それらの表現型を維持できることを示すために実施した実験の結果を例示するグラフである。図１６Ａは、ＣＤ１９陽性細胞の百分率（例えば、ｉＣａｓｐ９の上首尾の形質導入の指標）が２週間超にわたって実質的に一定のままであることを例示するグラフである。図１６Ｂは、首尾よく形質導入された細胞および形質導入されていない細胞が特徴的なＭＳＣ表面表現型を保持することを示すグラフである。実験条件および結果に関するさらなる考察は実施例において示されている。
【００６７】
【図１７】図１７Ａおよび１７Ｂは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、ｉＣａｓｐ９を発現するヒトＭＳＣがＣＩＤに曝露した後にアポトーシスに選択的に駆動されることを示すために実施した実験の結果を例示するグラフである。図１７Ａは、ＣＩＤを用いて２４時間処理した細胞のＦＡＣＳ分析の結果を示すグラフである。図１７Ｂは、ｉＣａｓｐ９＋／ＣＤ１９＋細胞の磁気精製の結果を示すグラフである。実験条件および結果に関するさらなる考察は実施例において示されている。
【００６８】
【図１８】図１８は、アポトーシスの有効性を決定し、およびアポトーシス抵抗性集団を同定するために実施した実験の結果を例示するグラフである。
【００６９】
【図１９】図１９のパネルＡ〜Ｑは、特定の細胞系列が強調されるように染色したｉＣａｓｐ９を発現するヒトＭＳＣを例示する図である。形質導入された細胞が改変されていないＭＳＣの分化潜在性を保持することが示されている。実験条件および結果に関するさらなる考察は実施例において示されている。
【００７０】
【図２０】図２０は、ｉＣａｓｐ９を発現するヒトＭＳＣの分化した後代がｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＣＩＤに曝露することによって死滅することを例示するグラフである。
【図２１】図２１Ａ〜２１Ｃは、ｉＣａｓｐ９を発現するヒトＭＳＣが、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＣＩＤに曝露した後に選択的に死滅することを示すために実施した実験の結果を例示する図である。図２１Ａは、動物全身イメージングの結果を示す図である。図２１Ｂは、ＣＩＤに曝露した後のｉＣａｓｐ９＋細胞の死滅の時間経過を示すグラフである。図２１Ｃは、ＭＳＣを皮下接種した後の動物の段階的な調査の結果を示す。実験条件および結果に関するさらなる考察は実施例において示されている。
【００７１】
【図２２】図２２は、自殺遺伝子産物とＣＩＤがどのように相互作用してアポトーシスを引き起こすかを示す図である。
【００７２】
【図２３】図２３は、自殺遺伝子改変アロ枯渇細胞を作製するために使用するプロトコールの概要を例示する図である。
【００７３】
【図２４】図２４は、ｉＣａｓｐ９を発現するアロ枯渇Ｔ細胞の免疫磁気による富化の使用を示す図である。
【００７４】
【図２５】図２５は、ｉＣａｓｐ９−ΔＣＤ１９発現構築物および細胞が発現構築物を有するように形質導入する方法を例示する図である。実験条件および結果に関するさらなる考察は実施例において示されている。
【００７５】
【図２６】図２６は、遺伝子改変Ｔ細胞（例えば、ｉＣａｓｐ９発現細胞）に対するＣＩＤ処理の影響を示す図である。
【図２７】図２７Ａおよび２７Ｂは、患者の末梢血中のｉＣａｓｐ９を形質導入したＴ細胞の検出を示すグラフである。再発した白血病に対するＨＬＡ−ハプロタイプ一致幹細胞移植後の細胞療法を受けている患者４名由来のｉＣａｓｐ９を形質導入したＴ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ１９＋、ＣＤ４＋ＣＤ１９＋、またはＣＤ８＋ＣＤ１９＋）についての、図２７Ａ：ＦＡＣＳ分析および図：２７Ｂ：ＤＮＡ分析。患者１、２、および４では皮膚／肝臓ＧｖＨＤが発生し、単回用量の二量体化薬ＡＰ１９０３を投与した。
【００７６】
【図２８】図２８は、細胞表面マーカーによって示される、形質導入したｉＣａｓｐ９  Ｔ細胞の細胞系列増大を例示するグラフである。
【図２９】図２９は、細胞表面マーカーによって示される、形質導入したｉＣａｓｐ９  Ｔ細胞の細胞系列増大を例示するグラフである。
【００７７】
【図３０】図３０は、二量体化薬ＡＰ１９０３を用いた処置後のＧｖＨＤの急速な逆転のグラフおよび写真である。（Ａ）は、患者１における処置後２４時間以内のビリルビン濃度の正規化を示すグラフである。（Ｂ）は、患者２における処置後２４時間以内の皮膚発疹消失を示す写真である。
【００７８】
【図３１】図３１は、ｉＣａｓｐ９  Ｔ細胞増大後の急性肝臓ＧｖＨＤ（グレード２）の発症を例示するグラフである。
【図３２】図３２は、ｉＣａｓｐ９  Ｔ細胞増大後の急性肝臓ＧｖＨＤ（グレード２）の発症を例示するグラフである。ＧｖＨＤの症状を示す患者の写真も示す。
【００７９】
【図３３】図３３は、ＡＰ１９０３（例えばＣＩＤ）を患者に投与した後のｉＣａｓｐ９  Ｔ細胞の急速かつ効率的な排除を示す図である。
【図３４】図３４は、ＡＰ１９０３（例えばＣＩＤ）を患者に投与した後のｉＣａｓｐ９  Ｔ細胞の急速かつ効率的な排除を示す図である。
【００８０】
【図３５】図３５Ａ〜３５Ｃは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＡＰ１９０３を用いて処置した後のＣＤ３＋／ＣＤ１９＋前駆体の薬物感受性および抗ウイルス機能の持続を示すグラフである。（Ａ）ＣＤ３＋ＣＤ１９＋Ｔ細胞はＡＰ１９０３を用いて処置した５カ月後の末梢血中のＣＤ３＋集団内に残る（患者２）。これらのＣＤ３＋ＣＤ１９＋細胞は、ＦＡＣＳ分析におけるＣＤ３＋ＣＤ１９＋細胞数の減少によって、および（Ｂ）二量体化薬への曝露の前後のｉｃａｓｐ９遺伝子の定量的ＰＣＲ分析によっての両方で評価される通り、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＡＰ１９０３に対する感受性を保持する。（Ｃ）患者２から採取したＣＤ３＋ＣＤ１９＋遺伝子改変Ｔ細胞は、ＣＭＶで刺激した培養物中のＩＦＮ−ガンマ陽性ＣＤ３＋ＣＤ１９＋Ｔ細胞の存在によって示される通り、ＡＰ１９０３の６日前にＣＭＶペプチド混合物に反応したが、ペプチド混合物中に生存している陰性対照には反応しなかった。ＧｖＨＤを処置するためのＡＰ１９０３注入の６日後および１４日後の回復しているＣＤ３＋ＣＤ１９＋集団の評価により、再発性ＧｖＨＤの不在下でのウイルス特異的細胞の持続が示された。
【００８１】
【図３６】図３６は、ｉＣａｓｐ９アロ枯渇細胞がＡＰ１９０３処置後にＧｖＨＤの徴候を伴わずに増大できることを例示するグラフである。
【００８２】
【図３７】図３７は、ｉＣａｓｐ９アロ枯渇細胞がＡＰ１９０３処置後にＧｖＨＤの徴候を伴わずに増大できることを例示するグラフである。ＡＰ１９０３処置後のナイーブ記憶Ｔ細胞、中心記憶Ｔ細胞およびエフェクター記憶Ｔ細胞の再構成を示すグラフである。
【図３８】図３８は、ｉＣａｓｐ９アロ枯渇細胞がＡＰ１９０３処置後にＧｖＨＤの徴候を伴わずに増大できることを例示するグラフである。
【００８３】
【図３９】図３９は、ｉＣａｓｐ９アロ枯渇Ｔ細胞増大およびドナーキメラ現象の回復を例示するグラフである。実験条件および結果に関するさらなる考察は実施例において示されている。
【００８４】
【図４０】図４０は、Ｔ細胞注入前後のウイルス特異的Ｔ細胞を例示するグラフである。
【００８５】
【図４１】図４１は、ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ抗原に応答した患者ＰＢＭＣによる細胞内ＩＦＮ−γ産生のレベルを例示するグラフである。
【００８６】
【図４２】図４２は、ｉＣａｓｐ９  Ｔ細胞増大を例示するグラフである。実験条件および結果に関するさらなる考察は実施例において示されている。
【００８７】
【図４３】図４３は、キメラｉカスパーゼ９およびＣＤ１９ポリペプチドをコードする発現構築物の一部を例示するグラフである。
【００８８】
【図４４】図４４は、カスパーゼ−９ポリペプチドのタンパク質構造を例示する図である。基底のシグナル伝達を改変するために、ホモ二量体化（Ｇ４０２−Ｃ−Ｆ−Ｎ−Ｆ４０６）、タンパク質分解およびＸＩＡＰ−ＢＩＲ３ドメインとの相互作用（淡紅色）において極めて重要であることが以前に報告されている残基、カスパーゼ−９の阻害因子（灰色）（Ｄ３１５−Ａ−Ｐ−Ｆ３１９、Ｄ３３０−Ａ−Ｉ−Ｓ−Ｓ３３４）、およびカスパーゼ−９上のリン酸化部位に対して部位特異的変異誘発を行った。結晶学的構造は１ｎｗ９（ＲＣＳＢ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ）に基づく。６５種のｉＣａｓｐ９変異体を試験し、基底の活性が低い有望な候補にはＳ１８３Ａ、Ｓ１９６Ｄ、Ｄ３３０Ａ、およびＮ４０５Ｑが含まれた。
【００８９】
【図４５】図４５は、ＳＥＡＰアッセイの分析について提示する図である。基底のシグナル伝達とＡＰ１９０３に誘導された活性の両方を検討するために、初期継代ＨＥＫ２９３Ｔ／１６細胞１０６個に種々の量の野生型カスパーゼおよび細胞の生存能力についてのマーカーであるＳＥＡＰを駆動するためにＳＲαプロモーターを使用する発現プラスミド５００ｎｇを同時トランスフェクトした。製造者の提案に従って、各混合物に抗生物質を伴わないＩＭＤＭ＋１０％ＦＢＳを１ｍＬ添加した。混合物１０００μｌを９６ウェルプレートの各ウェルに播種した。トランスフェクションの少なくとも３時間後にＡＰ１９０３を１００μｌ添加した。ＡＰ１９０３を少なくとも２４時間にわたって添加した後、上清１００μｌを９６ウェルプレートに移し、６８℃で３０分熱変性させて内在性アルカリホスファターゼを不活化した。アッセイのために、４−メチルウンベリフェリルホスフェート基質をＳＥＡＰによって加水分解して、３６４ｎｍで励起させ、４４８ｎｍの放出フィルターで検出することができる代謝産物である４−メチルウンベリフェロンにした。ＳＥＡＰを細胞の生存能力についてのマーカーとして使用するので、ＳＥＡＰ読み取りの減少がｉカスパーゼ−９活性の増加に対応する。したがって、ＡＰ１９０３の不在下で、ＳＥＡＰ読み取りがより高いことにより、基底の活性がより低いことが示される。所望のカスパーゼ変異体は、基底のシグナル伝達が減弱しており、ＡＰ１９０３に対する感受性が高い（すなわち、ＩＣ５０が低い）ものである。この試験の目的は、ＩＣ５０を有意に損なうことなく基底のシグナル伝達を低下させることである。
【００９０】
【図４６】図４６Ａ〜４６Ｃは、種々のキメラ改変カスパーゼ−９ポリペプチドの基底のシグナル伝達およびＡＰ１９０３に誘導されたシグナル伝達に関するデータを例示するグラフである。（４６Ａ）ＨＥＫ２９３細胞百万個当たり１μｇのキメラ改変カスパーゼ−９ポリペプチドをコードするＤＮＡおよび０．５μｇのｐＳＨ１−ｋＳＥＡＰを一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３／１６細胞のＳＥＡＰアッセイ、トランスフェクションの７２時間後。ｉＣａｓｐ９  Ｄ３３０Ａ、Ｎ４０５Ｑ、およびＤ３３０Ａ−Ｎ４０５Ｑ二重変異体の全てで低い基底のシグナル伝達が示された。（４６Ｂ）ＨＥＫ２９３細胞百万個当たり０．５μｇのｐＳＨ１−ｋＳＥＡＰと２μｇのキメラ改変カスパーゼ−９ポリペプチドをコードするＤＮＡを一緒にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３／１６細胞。（４６Ｃ）キメラ改変カスパーゼ−９ポリペプチドの推定ＡＰ１９０３  ＩＣ５０の要約。全ての変異でＡＰ１９０３に対するＩＣ５０が反対に増加した。データ点は２つのウェルの平均であり、示されているデータは２つの独立した実験を代表するものである。
【００９１】
【図４７】図４７Ａ〜４７Ｂは、キメラ野生型（修飾されていない）カスパーゼ−９ポリペプチドおよびキメラ改変カスパーゼ−９ポリペプチドのタンパク質の発現およびタンパク質分解を分析したウエスタンブロットの写真を含む。（４７Ａ）ｐＳＨ１−ｉＣａｓｐ９ＷＴ、Ｄ３３０Ａ、Ｎ４０５Ｑ、またはＤ３３０Ａ−Ｎ４０５Ｑ二重変異体１μｇまたは２μｇを一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ／１６細胞の、トランスフェクションの７２時間後のウエスタンブロット。どちらのブロットもレーン当たり３３μｇのタンパク質溶解物をローディングした。ブロットを、１：１０００で希釈し、ヒトカスパーゼ−９の残基２９９〜３１８を標的とするウサギ抗ヒトカスパーゼ−９ポリクローナル抗体で標識し、プロセシングされていない産物とｐ３０切断産物の両方を検出した。ｉＣａｓｐ９  Ｄ３３０Ａ、Ｎ４０５Ｑ、およびＤ３３０Ａ−Ｎ４０５Ｑは野生型ｉＣａｓｐ９と同様のレベルまたはそれよりも高いレベルで発現した。（４７Ｂ）ストリッピングしたブロットを抗アクチンポリクローナル抗体で標識することにより、４Ａへの等量のタンパク質のローディングが示された。
【００９２】
【図４８】図４８は、弱毒化した力価測定可能な改変カスパーゼポリペプチドの理論的な用量反応曲線のグラフを提供する。左側は、改変されていないカスパーゼ−９ポリペプチドの典型的な用量反応曲線に近いものであり、ＩＣ５０は約１０ｐＭである。右側は、仮定上の改変カスパーゼ−９ポリペプチドを示し、ＩＣ５０が低下し、かつ用量反応曲線が伸長する。仮定上の次世代誘導性ＣａｓｐａＣＩＤｅの用量反応曲線が伸長するにもかかわらず、どちらのポリペプチドによっても調節された力価測定可能な細胞の排除が可能になり得、それにより、医師が、投薬量範囲が異なるにもかかわらず細胞死を定方向に調整することが可能になる。
【００９３】
【図４９】図４９（Ａ〜Ｂ）は、健康な男性志願者における用量漸増試験の結果を提供する図である。健康な志願者に示されている用量のＡＰ１９０３を注入し、様々な時点でＨＰＬＣ分析を使用してＡＰ１９０３の血清中レベルを測定した。データにより、ＡＰ１９０３のピークレベルが約２ｌｏｇにわたって確実に力価測定を行うことができるものであり、各用量のほぼＣｍａｘレベルに３０分以内に到達することが示されている。
【００９４】
【図５０Ａ】図５０Ａ〜５０Ｂは、カスパーゼ９二量体境界面の改変により用量反応曲線がシフトすることを例示する用量反応曲線のグラフを提供する。（５０Ａ）基底のシグナル伝達とＡＰ１９０３に誘導されたＣａｓｐａＣＩＤｅ活性の両方を調査するために、初期継代ＨＥＫ２９３Ｔ／１７細胞１０６個に、細胞の生存能力についての代理マーカーであるＳＥＡＰの転写を調節するためにＳＲαプロモーターを使用して、誘導性カスパーゼバリアント２μｇと発現プラスミド５００ｎｇを同時トランスフェクトした。ＩＭＤＭ＋１０％ＦＢＳ（抗生物質を伴わない）中プラスミド、ＧｅｎｅＪａｍｍｅｒおよびＨＥＫ２９３Ｔ／１７細胞を含有するトランスフェクション混合物２００μｌを９６ウェルプレートの各ウェルに播種した。カスパーゼ活性を誘導するために、トランスフェクションの２４時間後に、段階希釈したＡＰ１９０３を２２μｌ添加した。（５０Ｂ）基底のシグナル伝達およびＡＰ１９０３に誘導されたシグナル伝達を調査するために、処理の４８時間後に上清１００μｌを回収し、６８℃で１時間熱変性させて内在性アルカリホスファターゼを不活化した。アッセイのために、４−メチルウンベリフェリルホスフェート（４−ＭＵＰ）基質をＳＥＡＰによって加水分解して、ピーク励起が３６４ｎｍでありピーク放出が４４８ｎｍである代謝産物である４−メチルウンベリフェロンにした。ＳＥＡＰを細胞の生存能力についての代理マーカーとして使用するので、ＳＥＡＰ読み取りの減少がカスパーゼ−９活性の増加に対応する。示されているカスパーゼ変異体の全てで、基底のシグナル伝達の減弱およびＡＰ１９０３に対するより高いＩＣ５０が明らかになった。カスパーゼＦ４０６Ｔで最も高いＩＣ５０が示され、その後、Ｆ４０４Ｙ、Ｆ４０４Ｗ、およびカスパーゼ１０（ＩＳＡＱＴ）、そしてＮ４０５Ｑが続いた。
【図５０Ｂ】同上。
【００９５】
【図５０Ｃ】（５０Ｃ）ＣａｓｐａＣＩＤｅ−２．０候補のＡＰ１９０３に対する推定ＩＣ５０の要約である。全ての変異体でＳＥＡＰ活性およびＡＰ１９０３に対するＩＣ５０の増加が示された。データ点は、２つのウェルの平均を示す。ＩＣ５０値はＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ６で４パラメータ非線形回帰曲線当てはめによって決定した。
【００９６】
【図５１】図５１は、種々の改変カスパーゼ−９ポリペプチドに対応するＡＰ１９０３投薬量に対するＩＣ５０チャートである。
【００９７】
【図５２】図５２Ａおよび５２Ｂは、上位の改変カスパーゼ変異体の基底のシグナル伝達およびＡＰ１９０３に誘導されたシグナル伝達を示す図である。（５２Ａ）ＨＥＫ２９３百万個当たり２μｇの変異体カスパーゼポリペプチドおよび０．５μｇのｐＳＨ１−ｋＳＥＡＰを一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３／１６の、トランスフェクションの７２時間後のＳＥＡＰアッセイ。ｉＣＡＳＰ−９  Ｆ４０４Ｙ、Ｆ４０４Ｗ、Ｎ４０５Ｑ、およびＦ４０６Ｔの全てで、ＷＴ  ｉカスパーゼ９よりも低い基底のシグナル伝達が示された。（５２Ｂ）カスパーゼ変異体の基底の活性およびＡＰ１９０３に対する推定ＩＣ５０の要約。全ての変異により、ＡＰ１９０３に対するＩＣ５０がシフトした。データ点は２つのウェルの平均を反映し、示されているデータは２回の実験を代表するものである。
【００９８】
【図５３Ａ】図５３Ａ〜５３Ｂは、上位の改変カスパーゼ変異体の基底のシグナル伝達およびＡＰ１９０３に誘導されたシグナル伝達を示す図である。（５３Ａ）ＨＥＫ２９３百万個当たり１μｇまたは２μｇの変異体カスパーゼポリペプチドおよび０．５μｇのｐＳＨ１−ｋＳＥＡＰを一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３／１６の、トランスフェクションの７２時間後のＳＥＡＰアッセイ。ｉＣＡＳＰ−９  Ｄ３３０Ａ、Ｎ４０５Ｑ、およびＤ３３０Ａ−Ｎ４０５Ｑ二重変異体の全てで野生型カスパーゼ−９と比較して低い基底のシグナル伝達が示された（破線）。（５３Ｂ）カスパーゼ変異体ポリペプチドのＡＰ１９０３に対する推定ＩＣ５０の要約。Ｎ４０５Ｑでは、ＡＰ１９０３に対するＩＣ５０が反対に増加した。Ｄ３３０ＡとＮ４０５Ｑを組み合わせることではＩＣ５０を改善することはできなかった。データ点は３連の平均であり、示されているデータは７回の実験を代表するものである。
【図５３Ｂ】同上。
【００９９】
【図５４】図５４は、Ｔ３１７Ａ変異体およびＴ３１７Ｓ変異体で観察された基底の活性の低下を示すＳＥＡＰアッセイのグラフである。Ｔ３１７Ａ変異およびＴ３１７Ｓ変異によりＸＩＡＰ結合が低下する可能性があり、これにより基底のシグナル伝達が増加することが予測され、それと逆のことが観察された。
【０１００】
【図５５】図５５は、Ｔ３１７Ａ変異体およびＴ３１７Ｓ変異体のＳＥＡＰアッセイに関する棒グラフである。Ｔ３１７ＡおよびＴ３１７Ｓは基底の活性が低いがＡＰ１９０３に対する感受性は野生型カスパーゼ−９とほぼ同等であり、それによりこれらが新しい変異体の良い候補になる。
【０１０１】
【図５６】図５６は、Ｄ３３０Ａバリアントの基底の活性化およびＡＰ１９０３に誘導された活性化を示すグラフである。ＨＥＫ２９３細胞百万個当たり１μｇまたは２μｇの変異体カスパーゼポリペプチドおよび０．５μｇのｐＳＨ１−ｋＳＥＡＰを一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３／１６細胞の、トランスフェクションの７２時間後のＳＥＡＰアッセイ。各発現プラスミド（ＷＴを含む）２μｇに基づいて正規化したデータを１μｇに基づくトランスフェクションからの正規化したデータと混合した。ｉＣａｓｐ９−Ｄ３３０Ａ、ｉＣａｓｐ９−Ｄ３３０Ｅ、およびｉＣａｓｐ９−Ｄ３３０Ｓでは野生型カスパーゼ−９よりも統計学的に低い基底のシグナル伝達が示された。
【０１０２】
【図５７】図５７は、２μｇの、ｐＳＨ１−ｉＣａｓｐ９ＷＴ、Ｄ３３０Ａ、Ｄ３３０Ｅ、Ｄ３３０Ｎ、Ｄ３３０Ｖ、Ｄ３３０Ｇ、およびＤ３３０Ｓを一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ／１６細胞の、トランスフェクションの７２時間後のウエスタンブロットを示す図である。ブロットを、いくつかのピコルナウイルスに由来する２Ａ配列を認識するウサギポリクローナル抗「２Ａ」ペプチドの１：１０００希釈物で標識した。ｉＣａｓｐ９−Ｄ３３０Ａ、ｉＣａｓｐ９−Ｄ３３０Ｅ、およびｉＣａｓｐ９−Ｄ３３０Ｇは野生型ｉＣａｓｐ９と同様のレベルまたはそれよりも高いレベルで発現した。ＡＰ１９０３に応答して切断の低下が観察された。＊は、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  ＭＷ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌａｄｄｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の注釈であり、
【化Ａ】
2020040969.tif 000002
はＰｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｌｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｕａｌ  Ｃｏｌｏｒ  Ｓｔａｎｄ
ａｒｄ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）の注釈である。
【０１０３】
【図５８】図５８は、ＶＳＶ−Ｇエンベロープに基づくレトロウイルス上清を用いて交差形質導入したＰＧ１３パッケージング細胞に由来するウイルス力価に対する種々のカスパーゼ変異の影響を示すグラフである。レトロウイルスマスター細胞株産生に対するＣａｓｐａＣＩＤｅ由来の基底のシグナル伝達の影響を調査するために、レトロウイルスパッケージング細胞株であるＰＧ１３に、トランスフェクション−エンハンサーであるポリブレン、４μｇ／ｍｌの存在下、ＶＳＶ−Ｇに基づくレトロウイルス上清を用いて５回交差形質導入した。その後、ＣａｓｐａＣＩＤｅを形質導入したＰＧ１３細胞を、ＰＥとコンジュゲートした抗ヒトＣＤ１９抗体を形質導入の指標として用いて染色した。ＣａｓｐａＣＩＤｅ−Ｄ３３０Ａを形質導入したＰＧ１３細胞、ＣａｓｐａＣＩＤｅ−Ｄ３３０Ｅを形質導入したＰＧ１３細胞、およびＣａｓｐａＣＩＤｅ−Ｎ４０５Ｑを形質導入したＰＧ１３細胞ではＣＤ１９平均蛍光強度（ＭＦＩ）の増強が示され、これにより、レトロウイルスコピー数がより多いことが示され、これは、基底の活性がより低いことを意味する。ＰＧ１３形質導入体のウイルス力価をより直接的に調査するために、ＨＴ１０８０細胞をウイルス上清および８μｇ／ｍｌのポリブレンで処理した。ＰＧ１３細胞におけるｉＣａｓｐ９−Ｄ３３０Ａ形質導入体、ｉＣａｓｐ９−Ｎ４０５Ｑ形質導入体、およびｉＣａｓｐ９−Ｄ３３０Ｅ形質導入体のＷＴ  ｉＣａｓｐ９に対するＣＤ１９のＭＦＩの増強は、ＨＴ１０８０細胞において観察された通り、ウイルス力価がより高いことと正に相関する。最初にウイルス力価が低いこと（およそ１Ｅ５形質導入単位（ＴＵ）／ｍｌ）に起因して、ウイルス収率を上昇させるためのＨＡＴ処理の不在下でウイルス力価に差異は観察されなかった。ＨＡＴ培地処理を行うと、ＣａｓｐａＣＩＤｅ−Ｄ３３０Ａ、ＣａｓｐａＣＩＤｅ−Ｎ４０５Ｑ、またはＣａｓｐａＣＩＤｅ−Ｄ３３０Ｅを形質導入したＰＧ１３細胞では、より高いウイルス力価が実証された。ウイルス力価（形質導入単位）は、下式で算出される：ウイルス力価＝（形質導入日の細胞数）＊（％ＣＤ１９＋）／上清の体積（ｍｌ）。基底の活性が低いＣａｓｐａＣＩＤｅ変異体の影響をさらに調査するために、ＣａｓｐａＣＩＤｅの個々のクローン（コロニー）を形質導入したＰＧ１３細胞を選択し、増大させた。他のコホートよりもＣＤ１９のＭＦＩが高いＣａｓｐａＣＩＤｅ−Ｎ４０５Ｑクローンが観察された。
【０１０４】
【図５９】図５９は、ｉＣａｓｐ９変異体を形質導入したＴ細胞のＡＰ１９０３による用量依存的排除を示すグラフである。健康なドナー（ｎ＝６）由来の初代Ｔ細胞に、変異体または野生型ｉＣａｓｐ９およびΔＣＤ１９細胞表面マーカーをコードするレトロウイルスを形質導入した。形質導入後、ｉＣａｓｐ９を形質導入したＴ細胞を、ＣＤ１９−マイクロビーズおよび磁気カラムを使用して精製した。次いで、Ｔ細胞をＡＰ１９０３（０〜１０ｎＭ）に曝露し、２４時間後に、フローサイトメトリーによってＣＤ３＋ＣＤ１９＋Ｔ細胞について測定した。
【０１０５】
【図６０】図６０は、ｉＣａｓｐ９−Ｄ３３０Ａ変異体により、形質導入されたＴ細胞におけるＡＰ１９０３依存性細胞毒性の改善が実証されることを示すグラフである。健康なドナー（ｎ＝６）由来の初代Ｔ細胞に、変異体または野生型ｉＣａｓｐ９またはｉＣａｓｐ９−Ｄ３３０Ａ、およびΔＣＤ１９細胞表面マーカーをコードするレトロウイルスを形質導入した。形質導入後、ｉＣａｓｐ９を形質導入したＴ細胞を、ＣＤ１９−マイクロビーズおよび磁気カラムを使用して精製した。次いで、Ｔ細胞をＡＰ１９０３（０〜１００ｎＭ）に曝露し、２４時間後に、フローサイトメトリーによってＣＤ３＋ＣＤ１９＋Ｔ細胞について測定した。
【０１０６】
【図６１】図６１は、ｉＣａｓｐ９−Ｄ３３０Ａ変異体により、形質導入されたＴ細胞におけるＡＰ１９０３依存性細胞毒性の改善が実証されることを示すグラフである。健康なドナー（ｎ＝６）由来の初代Ｔ細胞に、変異体または野生型ｉＣａｓｐ９またはｉＣａｓｐ９−Ｄ３３０Ａ、およびΔＣＤ１９細胞表面マーカーをコードするレトロウイルスを形質導入した。形質導入後、ｉＣａｓｐ９を形質導入したＴ細胞を、ＣＤ１９−マイクロビーズおよび磁気カラムを使用して精製した。次いで、Ｔ細胞をＡＰ１９０３（０〜１００ｎＭ）に曝露し、２４時間後に、フローサイトメトリーによってＣＤ３＋ＣＤ１９＋Ｔ細胞について測定した。ｉＣａｓｐ９−Ｄ３３０ＡのＩＣ５０は野生型ｉＣａｓｐ９よりも有意に低かった（ｐ＝０．００２）。
【０１０７】
【図６２】図６２は、Ｄ３３０ファミリーメンバーにより、形質導入されたＴ細胞においてＤ３３０Ａと同様のＡＰ１９０３依存性細胞毒性が実証されることを示すグラフである。健康なドナー（ｎ＝２）由来の初代Ｔ細胞に、Ｄ３３０変異体または野生型ｉＣａｓｐ９およびΔＣＤ１９細胞表面マーカーをコードするレトロウイルスを形質導入した。形質導入後、ｉＣａｓｐ９を形質導入したＴ細胞を、ＣＤ１９−マイクロビーズおよび磁気カラムを使用して精製した。次いで、Ｔ細胞をＡＰ１９０３（０〜１００ｎＭ）に曝露し、２４時間後に、フローサイトメトリーによってＣＤ３＋ＣＤ１９＋Ｔ細胞について測定した。
【０１０８】
【図６３】図６３は、ＡＰ１９０３に対する感受性が低いｉＣａｓｐ９変異体により、それでもｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＴ細胞増殖が制御されることを示すグラフである。活性化Ｔ細胞にｉＣａｓｐ９変異体を含有するレトロウイルスを形質導入し、０日目および４日目、その後１０日目まで列挙されている日にＡＰ１９０３で処理した（矢印）。野生型、Ｄ３３０Ａおよび他のｉＣａｓｐ９変異体のどちらによっても１０日後にＴ細胞増殖が停止し、Ｔ細胞の生存が減少した。
【０１０９】
【図６４】図６４は、Ｎ４０５Ｑ変異体の導入遺伝子の発現の改善により形質導入されたＴ細胞におけるＡＰ１９０３依存性細胞毒性が改善されることを示すグラフである。Ｔ細胞にｉＣａｓｐ９野生型、Ｎ４０５Ｑ、コドン最適化Ｎ４０５ＱおよびＦｖ．Ｆｖ’．Ｎ４０５ＱをコードするＲＤ１１４にシュードタイプされたレトロウイルスを形質導入し、次いで、用量を変動させたＡＰ１９０３（０〜１００ｎＭ）を用いて処理した。２４時間後に、ＣＤ３＋ＣＤ１９＋Ｔ細胞をフローサイトメトリーによって測定した。パーセント残存を、ＡＰ１９０３を用いない場合のＣＤ３＋ＣＤ１９＋Ｔ細胞の頻度に対して正規化した。
【０１１０】
【図６５】図６５は、野生型ｉＣａｓｐ９を形質導入したＴ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＡＰ１９０３による用量依存的排除を示すグラフである。Ｔ細胞にＳＦＧ−ｉＣａｓｐ９−２Ａ−ΔＣＤ１９レトロウイルスを形質導入し、免疫不全マウス（ＮＳＧ）に静脈内注射した。２４時間後に、マウスにＡＰ１９０３（０〜５ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射した。さらに２４時間後、マウスを屠殺し、脾臓（Ａ）および末梢血（Ｂ）からリンパ球を単離し、ヒトＣＤ３＋ＣＤ１９＋Ｔ細胞の頻度についてフローサイトメトリーによって分析した。
【０１１１】
【図６６】図６６は、Ｄ３３０Ｅ  ｉＣａｓｐ９を形質導入したＴ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＡＰ１９０３による用量依存的排除を示すグラフである。Ｔ細胞にＳＦＧ−ｉＣａｓｐ９−Ｄ３３０Ｅ−２Ａ−ΔＣＤ１９レトロウイルスを形質導入し、免疫不全マウス（ＮＳＧ）に静脈内注射した。２４時間後に、マウスにＡＰ１９０３（０〜５ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射した。さらに２４時間後、マウスを屠殺し、脾臓（Ａ）からリンパ球を単離し、ヒトＣＤ３＋ＣＤ１９＋Ｔ細胞の頻度についてフローサイトメトリーによって分析した。これにより、ｉＣａｓｐ９−Ｄ３３０ＥによりＡＰ１９０３に応答して野生型ｉＣａｓｐ９と同様のｉｎ  ｖｉｖｏ細胞毒性プロファイルが実証されることが示される。
【発明を実施するための形態】
【０１１２】
本明細書で使用される場合、「ａ（１つの）」または「ａｎ（１つの）」という単語の
使用は、特許請求の範囲および／または本明細書において「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ
）」という用語と同時に使用される場合、「ｏｎｅ（１つの）」を意味し得るが、「１つ
または複数の（ｏｎｅ  ｏｒ  ｍｏｒｅ）」、「少なくとも１つの（ａｔ  ｌｅａｓｔ  
ｏｎｅ）」、および「１つまたは１つ超の（ｏｎｅ  ｏｒ  ｍｏｒｅ  ｔｈａｎ  ｏｎｅ
）」の意味とも一致する。さらに、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄ
ｉｎｇ）」、含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）
」という用語は互換的であり、これらの用語が制限のない用語であることは当業者には理
解される。
【０１１３】
「同種異系」という用語は、本明細書で使用される場合、抗原性が別個であるＨＬＡま
たはＭＨＣ遺伝子座を指す。
【０１１４】
したがって、同じ種から移入された細胞または組織は抗原性が別個であり得る。同系マ
ウスは１つまたは複数の遺伝子座が異なり得（コンジェニック）、同種異系マウスは同じ
バックグラウンドを有し得る。
【０１１５】
「抗原」という用語は、本明細書で使用される場合、免疫応答を惹起する分子と定義さ
れる。この免疫応答には、抗体産生もしくは特定の免疫学的に適格な細胞の活性化のいず
れか、またはその両方が伴い得る。
【０１１６】
「がん」という用語は、本明細書で使用される場合、正常な制御の喪失という独特の形
質により、調節されていない成長、分化の欠乏、局所的な組織浸潤、および転移が生じる
、細胞の過剰増殖と定義される。例として、これだけに限定されないが、黒色腫、非小細
胞肺がん、小細胞肺がん、肺がん、肝細胞癌、白血病、網膜芽細胞腫、星状細胞腫、神経
膠芽腫、歯肉がん、舌がん、神経芽細胞腫、頭部がん、頸部がん、乳がん、膵臓がん、前
立腺がん、腎臓がん、骨がん、精巣がん、卵巣がん、中皮腫、子宮頸部がん、胃腸がん、
リンパ腫、脳がん、結腸がん、肉腫または膀胱がんが挙げられる。
【０１１７】
ドナー：「ドナー」という用語は、患者レシピエントではない哺乳動物、例えばヒトを
指す。ドナーは、例えば、レシピエントとＨＬＡ同一であってもよく、レシピエントと部
分的またはそれ超のＨＬＡ不一致であってもよい。
【０１１８】
ハプロタイプ一致：「ハプロタイプ一致」という用語は、細胞、細胞型および／または
細胞系列に関して使用される場合、本明細書では、ハプロタイプを共有する細胞または１
つの染色体上で密接に連鎖した遺伝子のセットに実質的に同じ対立遺伝子を有する細胞を
指す。ハプロタイプ一致ドナーは、レシピエントと完全にＨＬＡ同一ではなく、部分的な
ＨＬＡ不一致がある。
【０１１９】
血液疾患：  「血液疾患（ｂｌｏｏｄ  ｄｉｓｅａｓｅ）」、「血液疾患（ｂｌｏｏｄ
ｄｉｓｅａｓｅ）」および／または「血液の疾患（ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  
ｂｌｏｏｄ）」という用語は、本明細書で使用される場合、これだけに限定されないが、
血液細胞、ヘモグロビン、血液タンパク質、凝固の機構、血液の産生、血液タンパク質の
産生など、およびこれらの組合せを含めた、血液およびその成分の産生に影響を及ぼす状
態を指す。血液疾患の非限定的な例としては、貧血、白血病、リンパ腫、血液腫瘍、アル
ブミン血症、血友病などが挙げられる。
【０１２０】
骨髄疾患：「骨髄疾患」という用語は、本明細書で使用される場合、血液細胞および血
小板の産生の減少が導かれる状態を指す。いくつかの骨髄疾患では、正常な骨髄構造が感
染症（例えば、結核）または悪性腫瘍によって失われる可能性があり、今度はそれにより
血液細胞および血小板の産生の減少が導かれる可能性がある。骨髄疾患の非限定的な例と
しては、白血病、細菌感染症（例えば、結核）、放射能宿酔または中毒、汎血球減少症（
ａｐｎｏｃｙｔｏｐｅｎｉａ）、貧血、多発性骨髄腫などが挙げられる。
【０１２１】
Ｔ細胞および活性化Ｔ細胞（ＣＤ３＋細胞を意味することも含む）：Ｔ細胞（Ｔリンパ
球とも称される）は、リンパ球と称される白血球のグループに属する。リンパ球は、一般
に、細胞媒介性免疫に関与する。「Ｔ細胞」の「Ｔ」は、胸腺に由来するまたはその成熟
化が胸腺の影響を受ける細胞であることを指す。Ｔ細胞は、Ｂ細胞およびナチュラルキラ
ー（ＮＫ）細胞などの他のリンパ球の型とは、Ｔ細胞受容体として公知の細胞表面タンパ
ク質が存在することによって区別することができる。「活性化Ｔ細胞」という用語は、本
明細書で使用される場合、クラスＩＩ主要組織適合性（ＭＨＣ）マーカーに関して存在す
る抗原性決定因子を認識することによって免疫応答（例えば、活性化Ｔ細胞のクローン増
大）を生じるように刺激されたＴ細胞を指す。Ｔ細胞は、抗原性決定因子、サイトカイン
および／またはリンフォカインおよび表面抗原分類細胞表面タンパク質（例えば、ＣＤ３
、ＣＤ４、ＣＤ８など、およびこれらの組合せ）の存在によって活性化される。示差的な
タンパク質のクラスターを発現する細胞は、多くの場合、Ｔ細胞の表面でのそのタンパク
質の発現に関して「陽性」であると言える（例えば、ＣＤ３またはＣＤ４の発現に関して
陽性である細胞はＣＤ３＋またはＣＤ４＋と称される）。ＣＤ３タンパク質およびＣＤ４
タンパク質は、Ｔ細胞におけるシグナル伝達に直接かつ／または間接的に関与し得る細胞
表面受容体または補助受容体である。
【０１２２】
末梢血：「末梢血」という用語は、本明細書で使用される場合、血液の循環プールから
得られまたは調製され、リンパ系、脾臓、肝臓または骨髄内には隔離されない血液の細胞
性成分（例えば、赤血球、白血球および血小板）を指す。
【０１２３】
臍帯血（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｃｏｒｄ  ｂｌｏｏｄ）：臍帯血（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ
ｃｏｒｄ  ｂｌｏｏｄ）は、末梢血とは別個のものであり、リンパ系、脾臓、肝臓また
は骨髄内に隔離される血液である。「臍帯血（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｃｏｒｄ  ｂｌｏｏ
ｄ）」、「臍帯血（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｂｌｏｏｄ）」または「臍帯血（ｃｏｒｄ  ｂ
ｌｏｏｄ）」という用語は互換的に使用することができ、胎盤内および出産後の付着した
臍帯内に残っている血液を指す。臍帯血（ｃｏｒｄ  ｂｌｏｏｄ）は多くの場合、造血細
胞を含めた幹細胞を含有する。
【０１２４】
「得るまたは調製する」とは、例えば、細胞の場合では、細胞または細胞培養物を供給
源から単離、精製、または部分的に精製することを意味し、供給源は、例えば、臍帯血、
骨髄、または末梢血であってよい。この用語は、供給源または細胞培養物を培養し、細胞
を複製した場合、および後代細胞を供給源から目下得ようとしている場合にも当てはめる
ことができる。
【０１２５】
死滅した細胞のパーセント単位での「死滅させる」または「死滅」とは、アポトーシス
を測定するための任意の公知の方法を使用して、例えば、本明細書で考察されているアッ
セイ、例えば本明細書で考察されているＳＥＡＰアッセイまたはＴ細胞アッセイを使用し
て測定される、アポトーシスによる細胞の死を意味する。この用語は、細胞の除去も指し
得る。
【０１２６】
アロ枯渇：「アロ枯渇」という用語は、本明細書で使用される場合、アロ反応性Ｔ細胞
の選択的な枯渇を指す。「アロ反応性Ｔ細胞」という用語は、本明細書で使用される場合
、例えば、移植された同種異系移植片などの外来細胞への曝露に反応して免疫応答を生じ
るように活性化されたＴ細胞を指す。選択的な枯渇は、一般に、免疫磁気ビーズ、免疫毒
素、フローソーティング、アポトーシスの誘導、光枯渇（ｐｈｏｔｏｄｅｐｌｅｔｉｏｎ
）技法など、またはこれらの組合せを使用して除去するための種々の細胞表面に発現する
マーカーまたはタンパク質（例えば、時には表面抗原分類タンパク質（ＣＤタンパク質）
、ＣＤ１９などをターゲティングすることを伴う。本方法では、アロ枯渇の前またはその
後に、細胞にキメラタンパク質をコードするベクターを形質導入またはトランスフェクト
することができる。また、アロ枯渇ステップを伴わずに、細胞にキメラタンパク質をコー
ドするベクターを形質導入またはトランスフェクトし、アロ枯渇させていない細胞を患者
に投与することができることができる。「安全スイッチ」の付加により、多量体リガンド
を投与した際に例えば移植片対宿主病などの有害事象が緩和され得るので、例えば、アロ
枯渇させていないＴ細胞を投与することが可能である。
【０１２７】
移植片対宿主病：「移植片対宿主病」または「ＧｖＨＤ」という用語は、多くの場合に
同種異系骨髄移植に付随し、時には免疫無防備の患者への非放射線照射血液の輸注に付随
する合併症を指す。移植片対宿主病は、時には、移植された骨髄中の機能的な免疫細胞に
よりレシピエントが「外来」と認識され、免疫学的応答が開始された場合に起こり得る。
ＧｖＨＤは、急性型と慢性型に分けることができる。急性ＧＶＨＤ（ａＧＶＨＤ）は、多
くの場合、移植または輸注後の最初の１００日以内に観察され、肝臓、皮膚、粘膜、免疫
系（例えば、造血系、骨髄、胸腺など）、肺および胃腸管に影響を及ぼし得る。慢性ＧＶ
ＨＤ（ｃＧＶＨＤ）は多くの場合、移植または輸注後１００日またはそれ以降に始まり、
急性ＧｖＨＤと同じ器官を攻撃し得るが、結合組織および外分泌腺にも影響を及ぼし得る
。皮膚の急性ＧｖＨＤは、時にはレース状のびまん性斑状丘疹状皮疹を生じ得る。移植片
対宿主病は、特定のステージを有すると診断することができる。疾患の緩和は、例えば、
疾患のステージを低下させることを含み得る。例えば、処置後には、ステージ４の症状を
示していた患者がステージ３、ステージ２、もしくはステージ１の症状を示す、またはＧ
ｖＨＤの症状を示さない可能性がある。
【０１２８】
ドナーＴ細胞：「ドナーＴ細胞」という用語は、本明細書で使用される場合、多くの場
合、同種異系幹細胞移植後に抗ウイルス免疫および／または抗腫瘍免疫を付与するために
レシピエントに投与されるＴ細胞を指す。ドナーＴ細胞は、多くの場合、骨髄移植片拒絶
を阻害し、アロ生着（ａｌｌｏｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ）の成功を増加させるために利用
されるが、同じドナーＴ細胞により、宿主抗原に対するアロ攻撃性（ａｌｌｏａｇｇｒｅ
ｓｓｉｖｅ）応答が引き起こされ、今度はそれにより移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）が生じ
る恐れがある。ある特定の活性化されたドナーＴ細胞により、他の活性化Ｔ細胞よりも高
いまたは低いＧｖＨＤ応答が引き起こされ得る。ドナーＴ細胞は、レシピエント腫瘍細胞
に対しても反応性であり得、それにより、有益な移植片対腫瘍効果が引き起こされる。
【０１２９】
間葉系間質細胞：「間葉系間質細胞」または「骨髄由来間葉系間質細胞」という用語は
、本明細書で使用される場合、ｅｘ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ
において脂肪細胞、骨芽細胞および軟骨芽細胞に分化し得る多分化能幹細胞を指し、さら
に、標準の培養条件でプラスチック培養皿に接着し、造血系列マーカーについて陰性であ
り、ＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５について陽性である単核骨髄細胞の画分として
定義することもできる。
【０１３０】
胚性幹細胞：「胚性幹細胞」という用語は、本明細書で使用される場合、細胞５０〜１
５０個の初期段階の胚である胚盤胞の内部細胞塊に由来する多能性幹細胞を指す。胚性幹
細胞は、無制限に再生できること、および３つの一次胚葉、外胚葉、内胚葉および中胚葉
の全ての誘導体に分化できることを特徴とする。多能性と多分化能は、多能性細胞からは
全ての細胞型が生成し得るが、多分化能細胞（例えば、成体幹細胞）からは限られた数の
細胞型のみが産生され得るという点で区別される。
【０１３１】
誘導性多能性幹細胞：「誘導性多能性幹細胞」または「人工多能性幹細胞」という用語
は、本明細書で使用される場合、「再プログラミング」された、または、胚性幹細胞のよ
うな、全てではないにしろ多くの細胞型に分化することが可能な細胞を生成するための遺
伝学的操作（例えば、順に多能性を活性化する遺伝子の発現）、生物学的操作（例えば、
処置ウイルスまたはレトロウイルス）および／もしくは化学的操作（例えば、小分子、ペ
プチドなど）によって誘導される成体細胞、または分化細胞を指す。誘導性多能性幹細胞
は、中間または最終分化した状態（例えば、皮膚細胞、骨細胞、線維芽細胞など）を実現
し、次いで、脱分化するように誘導し、それにより、多分化能または多能性細胞を生成す
る能力の一部または全部を再度獲得することができるという点で胚性幹細胞と区別される
。
【０１３２】
ＣＤ３４＋細胞：「ＣＤ３４＋細胞」という用語は、本明細書で使用される場合、細胞
表面にＣＤ３４タンパク質を発現する細胞を指す。「ＣＤ３４」とは、本明細書で使用さ
れる場合、多くの場合に細胞間接着因子として作用し、リンパ節へのＴ細胞の進入に関与
する、「表面抗原分類」遺伝子ファミリーのメンバーである細胞表面糖タンパク質（例え
ば、シアロムチンタンパク質）を指す。ＣＤ３４はまた、幹細胞の骨髄、細胞外マトリッ
クスまたは直接間質細胞への付着を媒介し得る。ＣＤ３４＋細胞は、多くの場合、臍帯お
よび骨髄において、造血細胞、間葉系幹細胞のサブセット、内皮前駆細胞、血管の内皮細
胞（しかしリンパ管の内皮細胞ではない（胸膜リンパ管以外））、肥満細胞、間質および
皮膚の真皮の付属器周辺の樹状細胞の亜集団（第ＸＩＩＩａ因子陰性である）、ならびに
ある特定の軟部組織腫瘍（例えば、胞巣状軟部肉腫、プレＢ急性リンパ芽球性白血病（Ｐ
ｒｅ−Ｂ−ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、ＡＭＬ−Ｍ７、隆起性皮膚線維肉腫
、消化管間質腫瘍、巨細胞線維芽細胞腫、顆粒球性肉腫、カポジ肉腫、脂肪肉腫、悪性線
維性組織球腫、悪性末梢神経鞘腫瘍、髄膜血管外皮腫（ｍｅｎｇｉｎｇｅａｌ  ｈｅｍａ
ｎｇｉｏｐｅｒｉｃｙｔｏｍａ）、髄膜腫、神経線維腫、神経鞘腫、および甲状腺乳頭癌
）内の細胞として見出される。
【０１３３】
腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）とは、標的化様式で腫瘍に浸潤し、腫瘍細胞を死滅させる
種々の受容体を有するＴ細胞を指す。本出願の方法を使用してＴＩＬの活性を調節するこ
とにより、腫瘍細胞の排除をより直接的に制御することが可能になる。
【０１３４】
遺伝子発現ベクター：「遺伝子発現ベクター」、「核酸発現ベクター」、または「発現
ベクター」という用語は、本明細書で使用される場合、文書全体を通して互換的に使用す
ることができ、一般に、宿主細胞において複製させることができ、遺伝子（複数可）を宿
主細胞に導入するために利用することができる核酸分子（例えば、プラスミド、ファージ
、自己複製配列（ＡＲＳ）、人工染色体、酵母人工染色体（例えば、ＹＡＣ））を指す。
発現ベクターに導入される遺伝子は、内在性遺伝子（例えば、宿主細胞または生物体にお
いて通常見出される遺伝子）であっても異種遺伝子（例えば、宿主細胞または生物体のゲ
ノムまたは染色体外核酸において通常は見出されない遺伝子）であってもよい。発現ベク
ターによって細胞に導入される遺伝子は、ネイティブな遺伝子（複数可）であっても改変
または工学的に操作された遺伝子であってもよい。遺伝子発現ベクターを、時には発現ベ
クターに保有される遺伝子（複数可）の効率的な転写を容易にするまたは増強することが
できるエンハンサー配列、プロモーター領域および／またはターミネーター配列として機
能し得る５’  非翻訳調節配列および３’非翻訳調節配列を含有するように工学的に操作
することもできる。時には、遺伝子発現ベクターを特定の細胞型、細胞の場所、または組
織型における複製および／または発現機能（例えば、転写および翻訳）について工学的に
操作することもできる。発現ベクターは、時には、ベクターを宿主またはレシピエント細
胞内に維持するための選択マーカーを含む。
【０１３５】
発生的に調節されるプロモーター：「発生的に調節されるプロモーター」という用語は
、本明細書で使用される場合、発生のプログラムまたは経路によって制御、開始または影
響されるある特定の条件下で発現される遺伝子を転写するためのＲＮＡポリメラーゼに対
する最初の結合部位として作用するプロモーターを指す。発生的に調節されるプロモータ
ーは、多くの場合、プロモーター領域またはその近くに、発生のプログラムまたは経路の
一部である遺伝子の転写に影響を及ぼし得る転写の活性化因子またはリプレッサーとの結
合のための追加的な制御領域を有する。発生的に調節されるプロモーターは、時には、遺
伝子産物が細胞の発生的分化に影響を及ぼす遺伝子の転写に関与する。
【０１３６】
発生的に分化した細胞：「発生的に分化した細胞」という用語は、本明細書で使用され
る場合、特定の機能を果たすために細胞が特殊化の程度が低い形態から特殊化の程度が高
い形態に進化する、特定の発生的に調節される遺伝子の発現を伴うことも多いプロセスを
受けた細胞を指す。発生的に分化した細胞の非限定的な例は、肝臓細胞、肺細胞、皮膚細
胞、神経細胞、血液細胞などである。発生的分化の変化は、一般に、遺伝子発現の変化（
例えば、遺伝子発現のパターンの変化）、遺伝子再組織化（例えば、それぞれサイレンシ
ングする遺伝子または発現させる遺伝子を隠すまたは露出させるためのリモデリングまた
はクロマチン）を含み、ＤＮＡ配列（例えば、免疫多様性分化）の変化を含む時もある。
発生の間の細胞の分化は、遺伝子調節ネットワークの結果と理解することができる。調節
性遺伝子およびそのシス調節性モジュールは、インプット（例えば、発生の経路またはプ
ログラムの上流で発現するタンパク質）を受け、ネットワークの他の箇所にアウトプット
（例えば、発生の経路またはプログラムの下流の他の遺伝子に作用する発現した遺伝子産
物）を生じる遺伝子調節ネットワークにおけるノードである。
【０１３７】
「細胞」、「細胞株」および「細胞培養物」という用語は、本明細書で使用される場合
、互換的に使用することができる。これらの用語は全て、任意のかつ全てのその後の世代
である、それらの後代も含む。意図的なまたは偶発的な変異に起因して、全ての後代が同
一なのではない可能性があることが理解される。
【０１３８】
本明細書で使用される場合、「ｉカスパーゼ−９分子」、ポリペプチド、またはタンパ
ク質という用語は、誘導性カスパーゼ−９と定義される。「ｉカスパーゼ−９」という用
語は、ｉカスパーゼ−９核酸、ｉカスパーゼ−９ポリペプチドおよび／またはｉカスパー
ゼ−９発現ベクターを包含する。この用語は、天然のｉカスパーゼ−９のヌクレオチド配
列もしくはアミノ酸配列のいずれか、またはＣＡＲＤドメインを欠く短縮型配列も包含す
る。ポリペプチドが「改変された」ものであることが、この用語を使用することまたは他
の手段によって示されていない場合、「カスパーゼ−９ポリペプチド」は、「野生型」で
あるとみなされる。「野生型」カスパーゼ−９ポリペプチドとは、本明細書において提供
される実験の詳細に関しては、ＣＡＲＤドメインを欠くカスパーゼ−９ポリペプチドを意
味する。
【０１３９】
本明細書で使用される場合、「ｉカスパーゼ１分子」、「ｉカスパーゼ３分子」、また
は「ｉカスパーゼ８分子」という用語は、それぞれ誘導性カスパーゼ１、誘導性カスパー
ゼ３、または誘導性カスパーゼ８と定義される。ｉカスパーゼ１、ｉカスパーゼ３、また
はｉカスパーゼ８という用語は、それぞれ、ｉカスパーゼ１、ｉカスパーゼ３、もしくは
ｉカスパーゼ８の核酸、ｉカスパーゼ１、ｉカスパーゼ３、もしくはｉカスパーゼ８のポ
リペプチドおよび／またはｉカスパーゼ１、ｉカスパーゼ３、もしくはｉカスパーゼ８の
発現ベクターを包含する。この用語は、それぞれ天然のｉカスパーゼ−１、ｉカスパーゼ
−３、もしくはｉカスパーゼ−８のヌクレオチド配列もしくはアミノ酸配列、またはＣＡ
ＲＤドメインを欠く短縮型配列のいずれかも包含する。
【０１４０】
改変カスパーゼ−９ポリペプチドは、改変カスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラポ
リペプチドでの基底の活性またはＩＣ５０に影響を及ぼす少なくとも１つのアミノ酸置換
を含む。基底の活性およびＩＣ５０を試験するための方法は本明細書で考察されている。
改変されていないカスパーゼ−９ポリペプチドは、この種のアミノ酸置換を含まない。改
変カスパーゼ−９ポリペプチドと改変されていないカスパーゼ−９ポリペプチドはどちら
も、例えばＣＡＲＤドメインを除去するために短縮されたものであってよい。
【０１４１】
「機能保存的バリアント」とは、これだけに限定されないが、アミノ酸の、極性または
非極性、サイズ、形状および電荷を含めた性質が類似したアミノ酸での置き換えを含め、
タンパク質または酵素の全体的なコンフォメーションおよび機能を変更することなく所与
のアミノ酸残基を変化させたタンパク質または酵素である。一般に公知の遺伝子によって
コードされていないアミノ酸の多くに対する保存的アミノ酸置換は当技術分野で周知であ
る。他のコードされていないアミノ酸に対する保存的置換は、それらの物理特性に基づい
て、遺伝子によってコードされているアミノ酸の性質と比較して決定することができる。
【０１４２】
保存的であることが示されているアミノ酸以外のアミノ酸がタンパク質または酵素にお
いて異なる可能性があり、したがって、機能が類似した任意の２つのタンパク質間のパー
セントタンパク質配列類似性またはパーセントアミノ酸配列類似性は変動し得、例えば、
アラインメントスキームに従って決定して、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８
０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％であり得る。
本明細書で言及される場合、「配列類似性」とは、ヌクレオチド配列またはタンパク質配
列が関連する程度を意味する。２つの配列間の類似性の程度は、パーセント配列同一性お
よび／または保存に基づくものであってよい。「配列同一性」とは、本明細書では、２つ
のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列が不変である程度を意味する。「配列アラインメ
ント」とは、類似性の程度を評価する目的で２つまたはそれ超の配列を整列させて最大レ
ベルの同一性（および、アミノ酸配列の場合では、保存）を実現するプロセスを意味する
。例えば、類似性がＭＥＧＡＬＩＧＮアルゴリズムに基づくものであるＣｌｕｓｔｅｒ  
Ｍｅｔｈｏｄ、ならびにＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、およびＦＡＳＴＡなどの、配列を
アラインメントし、類似性／同一性を評価するための多数の方法が当技術分野で公知であ
る。これらのプログラムのいずれかを使用する場合にも、最も高い配列類似性がもたらさ
れる設定が好ましい。
【０１４３】
本明細書で言及されるアミノ酸残基数は、短縮されておらず改変されていないカスパー
ゼ−９ポリペプチドにおけるアミノ酸位、例えば、配列番号９のアミノ酸位を反映する。
配列番号９には、ＣＡＲＤドメインを含まない短縮型カスパーゼ−９ポリペプチドのアミ
ノ酸配列が提示されている。したがって、配列番号９は、全長カスパーゼ−９アミノ酸配
列に関してアミノ酸残基番号１３５で始まり、アミノ酸残基番号４１６で終わる。当業者
は、所望であれば、例えば、本明細書で考察されている配列アラインメント方法を使用し
てアミノ酸残基数を相関させるために、配列をカスパーゼ−９ポリペプチドの他の配列と
アラインメントすることができる。
【０１４４】
本明細書で使用される場合、「ｃＤＮＡ」という用語は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲ
ＮＡ）を鋳型として使用して調製されたＤＮＡを指すものとする。ゲノムＤＮＡまたはゲ
ノムのプロセシングされていないまたは部分的にプロセシングされたＲＮＡ鋳型から重合
させたＤＮＡとは対照的にｃＤＮＡを使用することの利点は、ｃＤＮＡが対応するタンパ
ク質のコード配列を主に含有することである。最適な発現のために非コード領域が必要で
ある場合、またはイントロンなどの非コード領域をアンチセンス戦略の標的とする場合な
ど、完全なまたは部分的なゲノム配列を使用する時がある。
【０１４５】
本明細書で使用される場合、「発現構築物」または「導入遺伝子」という用語は、遺伝
子産物をコードする核酸を含有し、転写することができる配列をコードする核酸の一部ま
たは全部をベクターに挿入することができる、任意の型の遺伝子構築物と定義される。転
写物はタンパク質に翻訳されるが、これは必要ない。ある特定の実施形態では、発現は、
遺伝子の転写とｍＲＮＡの遺伝子産物への翻訳の両方を含む。他の実施形態では、発現は
、目的の遺伝子をコードする核酸の転写のみを含む。「治療用構築物」という用語は、発
現構築物または導入遺伝子を指すためにも使用され得る。発現構築物または導入遺伝子は
、例えば、がんなどの過剰増殖性疾患または障害を処置するための療法として使用するこ
とができ、したがって、発現構築物または導入遺伝子は、治療用構築物または予防用構築
物である。
【０１４６】
本明細書で使用される場合、「発現ベクター」という用語は、転写することができる遺
伝子産物の少なくとも一部をコードする核酸配列を含有するベクターを指す。いくつかの
場合には、次いで、ＲＮＡ分子をタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドに翻訳する
。他の場合、例えばアンチセンス分子またはリボザイムの作製においては、これらの配列
を翻訳しない。発現ベクターは、種々の制御配列を含有してよく、制御配列とは、特定の
宿主生物体における作動可能に連結したコード配列の転写および場合によって翻訳に必要
な核酸配列を指す。転写および翻訳を支配する制御配列に加えて、ベクターおよび発現ベ
クターは、他の機能も果たす、下で考察されている核酸配列も含有してよい。
【０１４７】
本明細書で使用される場合、「ｅｘ  ｖｉｖｏ」という用語は、体の「外」を指す。「
ｅｘ  ｖｉｖｏ」および「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」という用語は、本明細書では互換的に使用
することができる。
【０１４８】
本明細書で使用される場合、「機能的に同等」という用語は、カスパーゼ−９、または
短縮型カスパーゼ−９に関しては、例えば、アポトーシス性の応答を刺激する、カスパー
ゼ−９の核酸断片、バリアント、もしくは類似体を指し、カスパーゼ−９ポリペプチドを
コードする核酸、またはカスパーゼ−９ポリペプチドを指す。「機能的に同等」とは、例
えば、ＣＡＲＤドメインを欠くが、アポトーシス性細胞応答を誘導することができるカス
パーゼ−９ポリペプチドを指す。「機能的に同等」という用語は、例えば、ＣＤ１９、５
’ＬＴＲ、多量体リガンド結合性領域、またはＣＤ３などの他の核酸またはポリペプチド
に適用する場合、本発明の方法の参照ポリペプチドを同じまたは同様の活性を有する断片
、バリアントなどを指す。
【０１４９】
本明細書で使用される場合、「遺伝子」という用語は、機能的なタンパク質、ポリペプ
チド、またはペプチドをコードする単位と定義される。理解される通り、この機能用語は
、タンパク質、ポリペプチド、ドメイン、ペプチド、融合タンパク質、および変異体を発
現する、または発現するように適合させたゲノム配列、ｃＤＮＡ配列、およびより小さな
工学的に操作された遺伝子セグメントを含む。
【０１５０】
「過剰増殖性疾患」という用語は、細胞の過剰増殖から生じる疾患と定義される。例示
的な過剰増殖性疾患としては、これだけに限定されないが、がんまたは自己免疫疾患が挙
げられる。他の過剰増殖性疾患として、血管閉塞、再狭窄、アテローム性動脈硬化症、ま
たは炎症性腸疾患を挙げることができる。
【０１５１】
「免疫原性組成物」または「免疫原」という用語は、免疫応答を惹起することが可能な
物質を指す。免疫原の例としては、例えば、抗原、自己免疫疾患の誘導において役割を果
たす自己抗原、およびがん細胞で発現する腫瘍関連抗原が挙げられる。
【０１５２】
「免疫無防備」という用語は、本明細書で使用される場合、免疫系が低下しているまた
は弱まっている対象と定義される。免疫無防備の状態は、免疫系の欠損もしくは機能不全
、または感染症および／または疾患に対する易罹患性を高める他の因子に起因し得る。そ
のようなカテゴリー化により、評価するための概念的な基礎がもたらされるが、免疫無防
備の個体は、多くの場合、１つの群または他の群に完全には当てはまらない。体内の防御
機構における２つ以上の欠損が影響を受け得る。例えば、ＨＩＶによって引き起こされる
特定のＴリンパ球欠損を有する個体は、抗ウイルス療法のために使用される薬物によって
引き起こされる好中球減少も有し得る、または皮膚および粘膜の完全性が破られることが
原因で免疫無防備であり得る。免疫無防備の状態は、静脈内薬物乱用に起因する留置中心
線もしくは他の型の機能障害によって生じ得る、または、二次性悪性腫瘍、栄養不良、ま
たは結核もしくは性感染する疾患、例えば、梅毒もしくは肝炎などの他の感染因子に感染
していることによって引き起こされる。
【０１５３】
本明細書で使用される場合、「薬学的にまたは薬理学的に許容される」という用語は、
動物またはヒトに投与した際に有害な反応、アレルギー性反応、または他の不都合な反応
を生じさせない分子実体および組成物を指す。
【０１５４】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」とは、任意のかつ全ての溶媒
、分散媒、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤などを含
む。そのような媒体および薬剤の薬学的に活性な物質への使用は当技術分野において周知
である。本明細書で提示されているベクターまたは細胞と適合しない場合を除き、任意の
従来の培地または薬剤の治療用組成物への使用が意図されている。補足的な活性成分も組
成物中に組み入れることができる。
【０１５５】
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチドの鎖と
定義される。さらに、核酸はヌクレオチドのポリマーである。したがって、核酸とポリヌ
クレオチドは、本明細書で使用される場合、互換的である。核酸はポリヌクレオチドであ
り、単量体「ヌクレオチド」に加水分解することができる。単量体ヌクレオチドはヌクレ
オシドに加水分解するすることができる。本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチド
は、これだけに限定することなく、組換え手段、すなわち、通常のクローニング技術およ
びＰＣＲ（商標）などを使用した組換えライブラリーまたは細胞ゲノム由来の核酸配列の
クローニングを含めた、当技術分野において利用可能な任意の手段によって、および合成
手段によって得られる全ての核酸配列を含むが、これだけに限定されない。さらに、ポリ
ヌクレオチドは、これだけに限定されないが、当技術分野で周知の方法によるヌクレオチ
ド、またはヌクレオシドの変異を含むポリヌクレオチドの変異を含む。核酸は、１つまた
は複数のポリヌクレオチドを含み得る。
【０１５６】
本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」という用語は、通常は定義済みの配列を
有するアミノ酸残基の鎖と定義される。本明細書で使用される場合、ポリペプチドという
用語は、「ペプチド」および「タンパク質」という用語と交換することができる。
【０１５７】
本明細書で使用される場合、「プロモーター」という用語は、遺伝子の特異的な転写を
開始するために必要な、細胞の合成機構、または導入された合成機構によって認識される
ＤＮＡ配列と定義される。
【０１５８】
「トランスフェクション」および「形質導入」という用語は互換的であり、外因性ＤＮ
Ａ配列を真核宿主細胞に導入するプロセスを指す。トランスフェクション（または形質導
入）は、電気穿孔、微量注射、遺伝子銃送達、レトロウイルス感染、リポフェクション、
スーパーフェクションなどを含めたいくつもの手段の任意の１つによって実現することが
できる。
【０１５９】
本明細書で使用される場合、「同系（ｓｙｎｇｅｎｅｉｃ）」という用語は、同一であ
るまたは組織移植を可能にするのに十分に密接に関連する、または免疫学的に適合性であ
る遺伝子型を有する細胞、組織または動物を指す。例えば、一卵性双生児または同じ近交
系の動物。同系（ｓｙｎｇｅｎｅｉｃ）と同系（ｉｓｏｇｅｎｅｉｃ）は互換的に使用す
ることができる。
【０１６０】
「患者」または「対象」という用語は互換的であり、本明細書で使用される場合、これ
だけに限定されないが、生物体または動物；例えば、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、サル
）、マウス、ブタ、ウシ、ヤギ、ウサギ、ラット、モルモット、ハムスター、ウマ、サル
、ヒツジ、または他の非ヒト哺乳動物を含めた哺乳動物；例えば、鳥類（例えば、ニワト
リまたはアヒル）または魚などの哺乳動物ではない脊椎動物、および哺乳動物ではない無
脊椎動物を含めた非哺乳動物を含む。
【０１６１】
本明細書で使用される場合、「転写制御下で」または「作動可能に連結した」という用
語は、プロモーターが、ＲＮＡポリメラーゼによる開始および遺伝子の発現を制御するた
めに核酸との関連で正しい位置および方向にあると定義される。
【０１６２】
本明細書で使用される場合、「処置」、「処置する）」、「処置された」、または「処
置すること」という用語は、予防法および／または療法を指す。
【０１６３】
本明細書で使用される場合、「ワクチン」という用語は、動物に投与することができる
形態にある、本明細書で提示されている組成物を含有する製剤を指す。一般には、ワクチ
ンは、組成物が懸濁または溶解している従来の生理食塩水または緩衝水溶液媒体を含む。
この形態では、組成物を、状態を予防する、好転させる、または他の点で処置するために
都合よく使用することができる。対象に導入されたら、ワクチンは、これだけに限定され
ないが、抗体の産生、サイトカインおよび／または他の細胞応答を含めた免疫応答を惹起
することができる。
【０１６４】
一部の実施形態では、核酸はウイルスベクター中に含有される。ある特定の実施形態で
は、ウイルスベクターはレトロウイルスベクターである。ある特定の実施形態では、ウイ
ルスベクターはアデノウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターである。一部の実
施形態では、抗原提示細胞をウイルスベクターとｅｘ  ｖｉｖｏで接触させ、一部の実施
形態では、抗原提示細胞をウイルスベクターとｉｎ  ｖｉｖｏで接触させることが理解さ
れる。
造血幹細胞および細胞療法
【０１６５】
造血幹細胞は、成熟血液細胞型に分化することができる造血前駆細胞、未成熟、多分化
能細胞を含む。これらの幹細胞および前駆細胞は、骨髄および臍帯血から単離することが
でき、一部の場合には末梢血から単離することができる。他の幹細胞および前駆細胞とし
ては、例えば、間葉系間質細胞、胚性幹細胞、および誘導性多能性幹細胞が挙げられる。
【０１６６】
標準の培養条件でプラスチック培養皿に接着する単核骨髄細胞の画分と定義されている
骨髄由来間葉系間質細胞（ＭＳＣ）は、造血系列マーカーについて陰性であり、ＣＤ７３
、ＣＤ９０およびＣＤ１０５について陽性であり、また、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて脂肪
細胞、骨芽細胞、および軟骨芽細胞に分化することができる。生理的役割の１つは造血の
支持であると推定されるが、いくつかの報告により、ＭＳＣが瘢痕組織および新生物組織
などの活動的に成長している領域に組み入れられ、場合によって増殖することができるこ
と、およびそれらのネイティブな微小環境に向かい、疾患細胞の機能に取って代わること
ができることも確立されている。ＭＳＣは、それらの分化潜在性およびホーミング能力に
より、再生適用のためにそれらのネイティブな形態で、または活性な生物学的薬剤を疾患
のある骨髄または転移性沈着などの特定の微小環境に送達するためにそれらの遺伝子改変
によってのいずれかで、細胞療法のための魅力的なビヒクルになっている。さらに、ＭＳ
Ｃは、強力な内因性免疫抑制性活性を有し、現在まで、移植片対宿主病および自己免疫障
害の実験的処置においてそれらの最も頻度の高い適用が見出されている（Ｐｉｔｔｅｎｇ
ｅｒ，  Ｍ．  Ｆ．ら（１９９９年）。Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８４巻：１４３〜１４７頁；
Ｄｏｍｉｎｉｃｉ，  Ｍ．ら（２００６年）。Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ  ８巻：３１５〜
３１７頁；Ｐｒｏｃｋｏｐ，  Ｄ．  Ｊ．（１９９７年）。Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７６巻：
７１〜７４頁；Ｌｅｅ，  Ｒ．  Ｈ．ら（２００６年）。Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ
Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０３巻：１７４３８〜１７４４３頁；Ｓｔｕｄｅｎｙ，  Ｍ．
ら、（２００２年）。Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６２巻：３６０３〜３６０８頁；Ｓｔｕｄ
ｅｎｙ，  Ｍ．ら（２００４年）。Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ  ９６巻：１
５９３〜１６０３頁；Ｈｏｒｗｉｔｚ，  Ｅ．  Ｍ．ら（１９９９年）。Ｎａｔ  Ｍｅｄ
５巻：３０９〜３１３頁；Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ，  Ｇ．ら、（２００７年）。Ｓｔ
ｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２５巻：２７３９〜２７４９頁；Ｐｈｉｎｎｅｙ，  Ｄ．  Ｇ、およ
びＰｒｏｃｋｏｐ，  Ｄ．  Ｊ．（２００７年）。Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２５巻：２８
９６〜２９０２頁；Ｈｏｒｗｉｔｚ，  Ｅ．  Ｍ．ら（２００２年）。Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ
ｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９９巻：８９３２〜８９３７頁；Ｈａｌｌ，  Ｂ．
ら、（２００７年）。Ｉｎｔ  Ｊ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ８６巻：８〜１６頁；Ｎａｕｔａ，
Ａ．  Ｊ、およびＦｉｂｂｅ，  Ｗ．  Ｅ．（２００７年）。Ｂｌｏｏｄ  １１０巻：
３４９９〜３５０６頁；Ｌｅ  Ｂｌａｎｃ，  Ｋ．ら（２００８年）。Ｌａｎｃｅｔ  ３
７１巻：１５７９〜１５８６頁；Ｔｙｎｄａｌｌ，  Ａ、およびＵｃｃｅｌｌｉ，  Ａ．
（２００９年）。Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ）。
【０１６７】
ＭＳＣは数百名の患者に注入されており、報告された副作用は最小限である。しかし、
経過観察は限定されており、長期の副作用は未知であり、それらのｉｎ  ｖｉｖｏにおけ
る、例えば軟骨もしくは骨への分化を誘導するため、またはそれらを遺伝子改変してそれ
らの機能性を増強するための今後の試みを伴うような結果はわずかしか分かっていない。
いくつかの動物モデルには安全性の懸念が生じている。例えば、マウス由来ＭＳＣでは培
養物における自然骨肉腫形成が観察された。さらに、心筋梗塞のマウスモデルおよびラッ
トモデルにおいてＭＳＣの局所注射後の異所性骨化および石灰化病巣が記載されており、
また、それらの催不整脈の潜在性も新生児ラット心室筋細胞との共培養実験において明ら
かになっている。さらに、イヌにおける骨髄移植後に、おそらく移植された間質成分に起
因する両側性びまん性肺骨化症が観察された（Ｈｏｒｗｉｔｚ，  Ｅ．  Ｍ．ら、（２０
０７年）。Ｂｉｏｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  １３巻：５３
〜５７頁；Ｔｏｌａｒ，  Ｊ．ら（２００７年）。Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２５巻：３７
１〜３７９頁；Ｙｏｏｎ，  Ｙ．−Ｓ．ら、（２００４年）。Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  
１０９巻：３１５４〜３１５７頁；Ｂｒｅｉｔｂａｃｈ，  Ｍ．ら（２００７年）。Ｂｌ
ｏｏｄ  １１０巻：１３６２〜１３６９頁；Ｃｈａｎｇ，  Ｍ．  Ｇ．ら（２００６年）
。Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １１３巻：１８３２〜１８４１頁；Ｓａｌｅ，  Ｇ．  Ｅ、
およびＳｔｏｒｂ，  Ｒ．（１９８３年）。Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ  １１巻：９６１〜
９６６頁）。
【０１６８】
細胞療法の別の例では、がんを処置するために、キメラ抗原受容体をコードする核酸で
形質導入されたＴ細胞が患者に投与されている（Ｚｈｏｎｇ，  Ｘ．−Ｓ、（２０１０年
）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １８巻：４１３〜４２０頁）。例えば、ヒト化
モノクローナル抗体であるトラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）に基づくキメラ抗原受
容体を発現するＴ細胞ががん患者を処置するために使用されている。しかし、有害事象の
可能性があり、少なくとも１つの報告された症例では、当該療法には患者に対する致死的
な結果があった（Ｍｏｒｇａｎ，  Ｒ．Ａ．ら、（２０１０年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔ
ｈｅｒａｐｙ  １８巻：８４３〜８５１頁）。本明細書で提示されているキメラカスパー
ゼ−９に基づく安全スイッチを有する細胞を形質導入することにより、有害事象が進行す
るのを止めることができる安全スイッチがもたらされる。「キメラ抗原受容体」または「
ＣＡＲ」とは、例えば、膜貫通ポリペプチドと連結した標的抗原を認識するポリペプチド
配列（抗原認識ドメイン）と、Ｔ細胞が活性化され、特異免疫がもたらされるように選択
された細胞内ドメインポリペプチドとを含むキメラポリペプチドを意味する。抗原認識ド
メインは、単鎖可変断片（ＳｃＦｖ）であってもよく、例えば、Ｔ細胞受容体またはパタ
ーン認識受容体などの他の分子に由来するものであってもよい。細胞内ドメインは、Ｔ細
胞の活性化を引き起こすポリペプチド、例えば、これだけに限定されないが、ＣＤ３ゼー
タなど、および、例えば、同時刺激分子、例えば、これだけに限定されないが、ＣＤ２８
、ＯＸ４０および４−１ＢＢを少なくとも１つ含む。「キメラ抗原受容体」という用語は
、抗体に由来するものではないが、キメラＴ細胞受容体であるキメラ受容体も指し得る。
これらのキメラＴ細胞受容体は、標的抗原を認識するポリペプチド配列を含んでよく、認
識配列は、例えば、これだけに限定されないが、Ｔ細胞受容体またはｓｃＦｖに由来する
認識配列であってよい。細胞内ドメインポリペプチドは、Ｔ細胞が活性化されるように作
用するものである。キメラＴ細胞受容体は、例えば、Ｇｒｏｓｓ，  Ｇ、およびＥｓｈａ
ｒ，  Ｚ、ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ６巻：３３７０〜３３７８頁（１９９２年）、
ならびにＺｈａｎｇ，  Ｙ．ら、ＰＬＯＳ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ  ６巻：１〜１３頁（２
０１０年）において考察されている。
【０１６９】
「由来」とは、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列が、分子の配列に由来し得ること
を意味することが理解される。細胞内ドメインは、Ｔ細胞の活性化を引き起こすポリペプ
チド、例えば、これだけに限定されないが、ＣＤ３ゼータなど、および、例えば、同時刺
激分子、例えば、これだけに限定されないが、ＣＤ２８、ＯＸ４０および４−１ＢＢなど
の少なくとも１つを含む。
【０１７０】
細胞療法の別の例では、Ｔ細胞を、非機能性ＴＧＦ−ベータ受容体を発現し、それによ
り、それらがＴＧＦ−ベータに対して抵抗性になるように改変する。これにより、改変さ
れたＴ細胞がＴＧＦ−ベータによって引き起こされる細胞毒性を回避することが可能にな
り、細胞を細胞療法において使用することが可能になる（Ｂｏｌｌａｒｄ，  Ｃ．Ｊ．ら
、（２００２年）Ｂｌｏｏｄ  ９９巻：３１７９〜３１８７頁；Ｂｏｌｌａｒｄ，  Ｃ．
Ｍ．ら、（２００４年）Ｊ．  Ｅｘｐｔｌ．  Ｍｅｄ．  ２００巻：１６２３〜１６３３
頁）。しかし、改変されたＴ細胞はいまや正常な細胞制御の一部を欠き、これらの治療用
Ｔ細胞自体が悪性になる可能性があるので、Ｔ細胞リンパ腫、または他の有害作用も生じ
る可能性がある。本明細書で提示されているキメラカスパーゼ−９に基づく安全スイッチ
を有するこれらの改変されたＴ細胞を形質導入することにより、この結果を回避すること
ができる安全スイッチがもたらされる。
【０１７１】
細胞療法において使用される、改変された受容体、またはキメラ受容体などの異種遺伝
子を発現する細胞に、細胞に異種遺伝子を形質導入する前、その後、またはそれと同時に
キメラカスパーゼ−９に基づく安全スイッチをコードする核酸を形質導入することができ
る。
ハプロタイプ一致幹細胞移植
【０１７２】
幹細胞移植は、造血幹細胞およびそれらの後代を伴う多種多様な疾患を処置する有効な
手段であることが証明されているが、組織適合ドナーの不足が、当該手法の最も広い適用
に対する主要な妨害であることが証明されている。非血縁の幹細胞ドナーの大きなパネル
および／または臍帯血バンクを導入することが問題の緩和に役立っているが、多くの患者
がいずれの供給源にも適さないままになっている。適合ドナーが見つかった場合でさえ、
検索の開始から幹細胞の採取までの経過時間は通常３カ月を超え、これは、貧困患者の多
くを運命付け得る遅延である。したがって、ＨＬＡハプロタイプ一致家族ドナーを使用す
ることにかなりの関心が寄せられている。そのようなドナーは親、同胞または第二度近親
者であり得る。移植片拒絶の問題は、適切な条件付けと大きな用量の幹細胞を組み合わせ
ることによって克服することができ、同時に、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を、広範囲に
わたるドナー移植片のＴ細胞枯渇によって予防することができる。そのような手順の即時
の転帰は、移植後免疫抑制の不在下でさえ、成体および小児のどちらにおいても生着率は
９０％超であり、重症ＧｖＨＤ率は１０％未満であるという満足のいくものになっている
。残念ながら、広範囲にわたるＴ細胞枯渇およびドナーとレシピエントの間のＨＬＡ不一
致と併せて移植手順のきわめて大きな免疫抑制により、非常に高率の移植後感染性合併症
が生じ、疾患再発の発生率が高くなった。
【０１７３】
ドナーＴ細胞注入は、同種異系幹細胞移植後に抗ウイルス免疫および抗腫瘍免疫を付与
するための有効な戦略である。しかし、ハプロタイプ一致移植後の患者へのＴ細胞の単純
な追加輸注ではうまくいかない可能性があり、アロ反応性Ｔ細胞の頻度が、例えばウイル
ス特異的Ｔリンパ球の頻度よりも何桁も多い。まずアロ反応性細胞を枯渇させたドナーＴ
細胞を投与することによって免疫再構成を加速する方法が開発中である。これを実現する
１つの方法は、ドナーＴ細胞を、レシピエントＥＢＶで形質転換したＢリンパ芽球様細胞
株（ＬＣＬ）を用いて刺激することである。アロ反応性Ｔ細胞は、ＣＤ２５発現を上方制
御するものであり、ＣＤ２５  Ｍａｂ免疫毒素コンジュゲート、ＲＦＴ５−ＳＭＰＴ−ｄ
ｇＡによって排除される。この化合物は、ヘテロ二官能性架橋剤［Ｎ−スクシンイミジル
オキシカルボニル−アルファ−メチル−ｄ−（２−ピリジルチオ）トルエン］を介して化
学的に脱グリコシル化したリシンＡ鎖（ｄｇＡ）とコンジュゲートしたマウスＩｇＧ１抗
ＣＤ２５（ＩＬ−２受容体アルファ鎖）からなる。
【０１７４】
ＬＣＬ刺激後にＣＤ２５免疫毒素を用いて処理することにより、アロ反応性細胞の９０
％超が枯渇する。第Ｉ相臨床試験では、アロ枯渇させたドナーＴ細胞をＴ細胞枯渇ハプロ
タイプ一致ＳＣＴのレシピエントを２つの用量レベルで注入した後に、ＣＤ２５免疫毒素
を使用してアロ反応性リンパ球の免疫再構成を枯渇させた。８名の患者を用量当たり１ｋ
ｇ当たり細胞１０４個で処置し、８名の患者は用量当たり１ｋｇ当たり細胞１０５個を受
けた。用量当たり１ｋｇ当たり細胞１０５個を受けた患者では、ＳＣＴの３カ月後、４カ
月後、および５カ月後に、用量当たり１ｋｇ当たり細胞１０４個を受けた患者と比較して
Ｔ細胞の回復の有意な改善が示された（Ｐ＜０．０５）。エフェクター記憶（ＣＤ４５Ｒ
Ａ（−）ＣＣＲ−７（−））集団が増大した結果としてＴ細胞の回復の加速が起こり（Ｐ
＜０．０５）、これにより、防御的なＴ細胞応答の寿命が長くなる可能性がある。Ｔ細胞
受容体シグナル接合部切除サークル（Ｔ−ｃｅｌｌ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｉｇｎａｌ  
ｊｏｉｎｔ  ｅｘｃｉｓｉｏｎ  ｃｉｒｃｌｅｓ）（ＴＲＥＣ）は用量レベル２の患者に
おける再構成しているＴ細胞では検出されず、これにより、これらのＴ細胞が注入された
アロ枯渇細胞に由来する可能性があることが示される。４カ月の時点でのＴ細胞のスペク
トルタイピングにより、ポリクローナルＶベータレパートリーが実証された。四量体およ
び酵素連結ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ（ＥＬＩＳｐｏｔ）アッセイを使用して、用量レベル２
の評価可能な患者６名のうち４名では早ければ移植の２〜４カ月後にサイトメガロウイル
ス（ＣＭＶ）特異的応答およびエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）特異的応答が見ら
れたが、用量レベル１の患者ではそのような応答は６〜１２カ月まで認められなかった。
著しい急性移植片対宿主病（２／１６）および慢性移植片対宿主病（ＧｖＨＤ；２／１５
）の発生率は低かった。これらのデータにより、ハプロタイプ一致ＳＣＴ後のＴ細胞の回
復を改善するために、アロ枯渇させたドナーＴ細胞を安全に使用できることが実証される
。その後、注入する細胞の量を１ｋｇ当たり細胞１０６個まで漸増させ、ＧｖＨＤの証拠
は伴わなかった。
【０１７５】
この手法により抗ウイルス免疫が再構成されたが、再発が主要な問題として残っており
、移植を受けた患者の６名が白血病再発のリスクが高く、疾患により死亡した。したがっ
て、腫瘍反応性前駆体の推定頻度はウイルス反応性前駆体の頻度よりも１〜２ｌｏｇ低い
ので、抗腫瘍免疫を再構成するため、および期待される抗腫瘍効果をもたらすためには、
より高用量のＴ細胞が有用である。しかし、一部の患者では、これらの細胞の用量はアロ
枯渇後でさえもＧｖＨＤを誘発するのに十分なものになる（Ｈｕｒｌｅｙ  ＣＫら、Ｂｉ
ｏｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ２００３年；９巻：６１０〜
６１５頁；Ｄｅｙ  ＢＲら、Ｂｒ．Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ．  ２００６年；１３５巻：４
２３〜４３７頁；Ａｖｅｒｓａ  Ｆら、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  １９９８年；３３９
巻：１１８６〜１１９３頁；Ａｖｅｒｓａ  Ｆら、Ｊ  Ｃ  ｌｉｎ．Ｏｎ  ｃｏｌ．  ２
００５年；２３巻：３４４７〜３４５４頁；Ｌａｎｇ  Ｐ、Ｍｏｌ．Ｄｉｓ．  ２００４
年；３３巻：２８１〜２８７頁；Ｋｏｌｂ  ＨＪら、Ｂｌｏｏｄ  ２００４年；１０３巻
：７６７〜７７６頁；Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ  Ｓら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ  ２００
５年；５６巻：２９〜４４頁；Ｂｌｅａｋｌｅｙ  Ｍら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ
２００４年；４巻：３７１〜３８０頁；Ａｎｄｒｅ−Ｓｃｈｍｕｔｚ  Ｉら、Ｌａｎｃ
ｅｔ  ２００２年；３６０巻：１３０〜１３７頁；Ｓｏｌｏｍｏｎ  ＳＲら、Ｂｌｏｏｄ
２００５年；１０６巻：１１２３〜１１２９頁；Ａｍｒｏｌｉａ  ＰＪら、Ｂｌｏｏｄ
２００６年；１０８巻：１７９７〜１８０８頁；Ａｍｒｏｌｉａ  ＰＪら、Ｂｌｏｏｄ
２００３年；Ｇｈｅｔｉｅ  Ｖら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９９１年
；１４２巻：２２３〜２３０頁；Ｍｏｌｌｄｒｅｍ  ＪＪら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １
９９９年；５９巻：２６７５〜２６８１頁；Ｒｅｚｖａｎｉ  Ｋら、ＣＩｉｎ．Ｃａｎｃ
ｅｒ  Ｒｅｓ．  ２００５年；１  １巻：８７９９〜８８０７頁；Ｒｅｚｖａｎｉ  Ｋら
、Ｂｌｏｏｄ  ２００３年；１０２巻：２８９２〜２９００頁）。
移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）
【０１７６】
移植片対宿主病は、ドナー免疫適格性の細胞、例えばＴ細胞をレシピエントに移植した
後に時々起こる状態である。移植された細胞はレシピエントの細胞を外来と認識し、それ
らを攻撃し破壊する。この状態は、Ｔ細胞移植、特にハプロタイプ一致幹細胞移植に関連
する場合に危険な影響になり得る。例えば、免疫系の再構成および移植片抗腫瘍効果など
の有益な影響をもたらすために十分なＴ細胞を注入すべきである。しかし、移植すること
ができるＴ細胞の数は、移植により重症の移植片対宿主病が生じるという懸念により限定
される。
移植片対宿主病は、以下の表に示されている通りステージ分類することができる：
【表１Ａ】
2020040969.tif 000003
【０１７７】
急性ＧｖＨＤ悪性度分類は、コンセンサスカンファレンス基準によって実施することが
できる（Ｐｒｚｅｐｉｏｒｋａ  Ｄら、１９９４年、Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  Ｃｏｎｆｅｒ
ｅｎｃｅ  ｏｎ  Ａｃｕｔｅ  ＧＶＨＤ  Ｇｒａｄｉｎｇ．  Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  
Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  １９９５年；１５巻：８２５〜８２８頁）。
【表Ａ】
2020040969.tif 000004
【０１７８】
細胞療法に対する「安全スイッチ」および遺伝子操作された細胞移植に対する「安全ス
イッチ」としての誘導性カスパーゼ−９
【０１７９】
移植片対宿主病の影響を低減させることとは、例えば、患者をより低レベルのステージ
に割り当てることができるようにＧｖＨＤの症状を減少させること、例えば、移植片対宿
主病の症状を少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９
０％、９５％、または９９％低減させることを意味する。移植片対宿主病の影響の低減は
、例えば、マーカータンパク質、例えばＣＤ１９を発現し、かつＣＤ３を発現する細胞（
例えばＣＤ３＋ＣＤ１９＋細胞）の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％
、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の減少などの、ＧｖＨＤ反応
に関与する活性化Ｔ細胞の減少を検出することによって測定することができる。
【０１８０】
本発明では、化学的二量体化誘導物質（ＣＩＤ）（Ｃｌａｃｋｓｏｎ  Ｔら、Ｐｒｏｃ
Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  １９９８年、９５巻：１０４３７〜１０
４４２頁）であり、健康な志願者において安全であることが証明されている合成薬物であ
るｍＡＰ１９０３（Ｉｕｌｉｕｃｃｉ  ＪＤら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  
２００１年、４１巻：８７０〜８７９頁）と結合するように最適化されたＦＫＢＰバリア
ントと融合したヒトアポトーシス促進分子に基づく代替自殺遺伝子戦略が提供される。こ
の小分子を投与することにより、アポトーシス促進性標的分子の架橋および活性化がもた
らされる。この誘導性系のヒトＴリンパ球への適用が、Ｆａｓ関連デスドメイン含有タン
パク質（ＦＡＤＤ）のＦａｓまたはデスエフェクタードメイン（ＤＥＤ）をアポトーシス
促進分子として使用して探究されてきた。これらの誘導性死亡分子で形質導入されたＴ細
胞の９０％に至るまでが、ＣＩＤの投与後にアポトーシスを受けた（Ｔｈｏｍｉｓ  ＤＣ
ら、Ｂｌｏｏｄ．  ２００１年、９７巻：１２４９〜１２５７頁；Ｓｐｅｎｃｅｒ  ＤＭ
ら、Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ．  １９９６年、６巻：８３９〜８４７頁；Ｆａｎ  Ｌら、Ｈｕ
ｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  １９９９年、１０巻：２２７３〜２２８５頁；Ｂｅｒｇｅｒ
Ｃら、Ｂｌｏｏｄ．  ２００４年、１０３巻：１２６１〜１２６９頁；Ｊｕｎｋｅｒ  
Ｋら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ２００３年、１０巻：１１８９〜１９７頁）。この自殺遺
伝子戦略は、例えば、造血幹細胞、ならびに、例えば間葉系間質細胞、胚性幹細胞、およ
び誘導性多能性幹細胞を含めた他の前駆細胞を含めた、細胞療法のために使用される任意
の適切な細胞に使用することができる。
【０１８１】
したがって、カスパーゼ−９によって触媒されるこの安全スイッチは、細胞療法の患者
において、トランスフェクトまたは形質導入した治療用細胞の除去が必要な状態が存在す
る場合に使用することができる。治療用細胞は、例えば、疾患または状態の治療的処置の
ために使用される任意の細胞を含み、また、例えば、造血幹細胞、誘導性前駆細胞（ｉＰ
Ｓ）、胚性幹（ＥＳ）細胞、間葉系幹細胞、形質（Ｂ）細胞、筋細胞およびＴ細胞からな
る群から選択される治療用細胞を含む。細胞を除去する必要があり得る状態としては、例
えば、ＧｖＨＤ、細胞が間違った組織型または細胞型のより成熟した細胞へ不適切に分化
すること、および他の毒性が挙げられる。カスパーゼ−９スイッチを活性化するために、
不適切な分化の場合では、組織特異的プロモーターを使用することが可能である。例えば
、前駆細胞が骨および脂肪細胞に分化し、脂肪細胞が所望ではない場合、前駆細胞へのト
ランスフェクトまたは形質導入に使用するベクターにカスパーゼ−９ヌクレオチド配列に
作動可能に連結した脂肪細胞特異的プロモーターを持たせることができる。このように、
細胞が脂肪細胞に分化するのであれば、多量体リガンドを投与すると、不適切に分化した
脂肪細胞のアポトーシスが生じるはずである。
【０１８２】
方法は、例えば、がん、血液または骨髄におけるがん、他の血液または骨髄由来疾患、
例えば鎌状赤血球貧血および異染性白質ジストロフィー（ｍｅｔａｃｈｒｏｍｉｃ  ｌｅ
ｕｋｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）などを含めた、細胞療法によって緩和することができる任意
の障害、ならびに、幹細胞移植によって緩和することができる任意の障害、例えば、鎌状
赤血球貧血または異染性白質ジストロフィー（ｍｅｔａｃｈｒｏｍａｌ  ｌｅｕｋｏｄｙ
ｓｔｒｏｐｈｙ）などの血液または骨髄障害に対して使用することができる。
【０１８３】
治療用Ｔ細胞を腫瘍細胞が使用する免疫回避戦略に対して抵抗性にすることにより、養
子免疫療法の有効性を増強することができる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験により、優性陰性受
容体または免疫調節性サイトカインを用いた形質導入によってこれを実現できることが示
されている（Ｂｏｌｌａｒｄ  ＣＭら、Ｂｌｏｏｄ．  ２００２年、９９巻：３１７９〜
３１８７頁：Ｗａｇｎｅｒ  ＨＪら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ２００４年
、１１巻：８１〜９１頁）。さらに、抗原特異的Ｔ細胞受容体を移入することにより、よ
り広範囲の腫瘍に対してＴ細胞療法を適用することが可能になる（Ｐｕｌｅ  Ｍら、Ｃｙ
ｔｏｔｈｅｒａｐｙ．  ２００３年、５巻：２１１〜２２６頁；Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ  
ＴＮ、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２００２年、２巻：５１２〜５１９頁）。工
学的に操作したヒトＴ細胞に対する自殺系が開発され、それらのその後の臨床試験におけ
る使用を可能にするために試験された。カスパーゼ−９は改変されており、ヒトＴリンパ
球においてそれらの機能特性および表現型特性を損なうことなく安定に発現することが示
されており、一方、抗アポトーシス分子が上方制御されているＴ細胞においてさえもＣＩ
Ｄに対する感受性が実証されている（Ｓｔｒａａｔｈｏｆ，  Ｋ．Ｃ．ら、２００５年、
Ｂｌｏｏｄ  １０５巻：４２４８〜５４頁）。
【０１８４】
遺伝子療法のために使用する遺伝子改変細胞において、遺伝子は、遺伝子を発現させる
ために使用している細胞以外の供給源に由来する異種ポリヌクレオチド配列であってよい
。遺伝子は、細菌、ウイルス、酵母、寄生生物、植物、または、さらには動物などの原核
生物または真核生物である供給源に由来する。異種ＤＮＡはまた、２つ以上の供給源に由
来するもの、すなわち、多重遺伝子構築物または融合タンパク質である。異種ＤＮＡは、
１つの供給源に由来する調節配列と異なる供給源由来の遺伝子を含んでもよい。または、
異種ＤＮＡは、細胞の内在性遺伝子の正常な発現を変化させるために使用する調節配列を
含んでよい。
他のカスパーゼ分子
【０１８５】
現行の技術のキメラポリペプチドによりコードされ得るカスパーゼ−９以外のカスパー
ゼポリペプチドとしては、例えば、カスパーゼ−１、カスパーゼ−３、およびカスパーゼ
−８が挙げられる。これらのカスパーゼポリペプチドに関する考察は、例えば、ＭａｃＣ
ｏｒｋｌｅ，  Ｒ．Ａ．ら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．
Ａ．（１９９８年）９５巻：３６５５〜３６６０頁；およびＦａｎ，  Ｌ．ら（１９９９
年）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １０巻：２２７３〜２２８５頁）において
見出すことができる。
発現構築物の工学的作製
【０１８６】
発現構築物は、全て作動可能に連結した、多量体リガンド結合性領域およびカスパーゼ
−９ポリペプチド、または、ある特定の実施形態では、多量体リガンド結合性領域および
マーカーポリペプチドに連結したカスパーゼ−９ポリペプチドをコードする。この考察、
およびカスパーゼ−９ポリペプチドへの一般参照に関して、「カスパーゼ−９ポリペプチ
ド」という用語は、改変カスパーゼ−９ポリペプチドに対する一般参照を含むものとする
。
【０１８７】
一般に、「作動可能に連結した」という用語は、プロモーター配列が第２の配列に機能
的に連結しており、例えば、プロモーター配列により、第２の配列に対応するＤＮＡの転
写が開始および媒介されることを示すものとする。カスパーゼ−９ポリペプチドは全長で
あっても短縮型であってもよい。ある特定の実施形態では、マーカーポリペプチドがカス
パーゼ−９ポリペプチドに連結している。例えば、マーカーポリペプチドは、例えば、切
断可能な２Ａ様配列などのポリペプチド配列を介してカスパーゼ−９ポリペプチドに連結
することができる。マーカーポリペプチドは、例えば、ＣＤ１９、ΔＣＤ１９であっても
よく、例えば、キメラカスパーゼポリペプチドの活性に影響を及ぼさないように選択され
た異種タンパク質であってもよい。
【０１８８】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、カスパーゼ−９ポリペプチド、および、例
えばマーカーポリペプチドであってよく、例えばキメラ抗原受容体であってよい異種タン
パク質をコードする。異種ポリペプチド、例えばキメラ抗原受容体は、例えば、切断可能
な２Ａ様配列などのポリペプチド配列を介してカスパーゼ−９ポリペプチドに連結するこ
とができる。
【０１８９】
２Ａ様配列、または「切断可能な」２Ａ配列は、例えば、例えばＴｈｏｓｅａ  ａｓｉ
ｇｎａに由来するものを含めた、多くの異なるウイルスに由来するものである。これらの
配列は、時には、「ペプチドスキッピング配列（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｋｉｐｐｉｎｇ  ｓ
ｅｑｕｅｎｃｅ）」としても公知である。この型の配列をシストロン内の分離することが
意図されている２つのペプチド間に置くと、リボソームはペプチド結合をスキップすると
思われ、Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａ配列の場合では、Ｇｌｙアミノ酸とＰｒｏアミノ酸
の間の結合が省かれる。これにより２つのポリペプチド、この場合はカスパーゼ−９ポリ
ペプチドとマーカーポリペプチドが残される。この配列を使用する場合、２Ａ配列に対し
て５’側にコードされるペプチドはＧｌｙ残基および２Ａ配列の上流のすべてを含めてカ
ルボキシ末端の付加的なアミノ酸で終了し得る。２Ａ配列に対して３’側にコードされる
ペプチドは、Ｐｒｏ残基および２Ａ配列の下流のすべてを含めてアミノ末端の付加的なア
ミノ酸で終了し得る。「２Ａ」または「２Ａ様」配列は、ペプチド結合スキッピングを引
き起こし得るペプチドの大きなファミリーの一部である。種々の２Ａ配列が特徴付けられ
ており（例えば、Ｆ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ）、これらは本出願のポリペプチドに使用する
ことができる２Ａ様配列の例である。
【０１９０】
発現構築物をベクター、例えばウイルスベクターまたはプラスミドに挿入することがで
きる。提供される方法のステップは、任意の適切な方法を使用して実施することができ、
これらの方法としては、限定することなく、本明細書で提示されている抗原提示細胞に核
酸を形質導入する、形質転換する、または他のやり方でもたらす方法が挙げられる。一部
の実施形態では、短縮型カスパーゼ−９ポリペプチドは、配列番号８、配列番号２３、配
列番号２５、配列番号２７のヌクレオチド配列、またはＤＮＡリンカーを伴うまたは伴わ
ない機能的に同等なその断片によりコードされる、または配列番号９、配列番号２４、配
列番号２６、または配列番号２８のアミノ酸配列または機能的に同等なその断片を有する
。一部の実施形態では、ＣＤ１９ポリペプチドは、配列番号１４のヌクレオチド配列、ま
たはＤＮＡリンカーを伴うまたは伴わない機能的に同等なその断片によりコードされる、
または配列番号１５のアミノ酸配列、または機能的に同等なその断片を有する。カスパー
ゼ−９ポリペプチドの機能的に同等な断片は、配列番号９のポリペプチドと実質的に同じ
アポトーシスを誘導する能力を有し、配列番号９のポリペプチドの活性の少なくとも５０
％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％を有する。ＣＤ１９ポリペプチドの
機能的に同等な断片は、配列番号１５のポリペプチドと実質的に同じ、形質導入またはト
ランスフェクトされた細胞を同定し、選択するために使用するマーカーとしての機能を果
たす能力を有し、標準の検出技法を使用して、配列番号１５のポリペプチドと比較して、
少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％のマーカーポリペプ
チドが検出される。
【０１９１】
より具体的には、２つ以上のリガンド結合性ドメインまたは多量体化領域を発現構築物
に使用することができる。さらに、発現構築物は、膜ターゲティング配列を含有する。適
切な発現構築物は、上記のＦＫＢＰリガンド結合性エレメントのどちら側に共刺激ポリペ
プチドエレメントを含んでもよい。
リガンド結合性領域
【０１９２】
発現構築物のリガンド結合性（「二量体化」）ドメイン、または多量体化領域は、天然
または天然でないリガンド、例えば、天然でない合成リガンドを使用した誘導が可能にな
る任意の都合のよいドメインであってよい。多量体化領域は、構築物の性質およびリガン
ドの選択に応じて細胞膜の内側にあっても外側にあってもよい。上記の細胞質内領域に付
随するリガンド結合性タンパク質を含めた、受容体を含めた多種多様なリガンド結合性タ
ンパク質が公知である。本明細書で使用される場合、「リガンド結合性ドメイン」は、「
受容体」という用語と交換することができる。リガンド（例えば、小有機リガンド）が公
知であるまたは容易に作製することができるリガンド結合性タンパク質が特に興味深い。
これらのリガンド結合性ドメインまたは受容体としては、ＦＫＢＰおよびシクロフィリン
受容体、ステロイド受容体、テトラサイクリン受容体、上記の他の受容体など、ならびに
抗体、特に重鎖または軽鎖サブユニットから得ることができる「天然でない」受容体、そ
の変異配列、確率論的手順、コンビナトリアル合成などによって得られるランダムなアミ
ノ酸配列が挙げられる。ある特定の実施形態では、リガンド結合性領域は、ＦＫＢＰリガ
ンド結合性領域、シクロフィリン受容体リガンド結合性領域、ステロイド受容体リガンド
結合性領域、シクロフィリン受容体リガンド結合性領域、およびテトラサイクリン受容体
リガンド結合性領域からなる群から選択される。多くの場合、リガンド結合性領域は、Ｆ
ｖ’Ｆｖｌｓ配列を含む。時には、Ｆｖ’Ｆｖｌｓ配列は、追加的なＦｖ配列をさらに含
む。例としては、例えば、Ｋｏｐｙｔｅｋ，  Ｓ．Ｊ．ら、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ  ７巻：３１３〜３２１頁（２０００年）において考察されているもの、お
よびＧｅｓｔｗｉｃｋｉ，  Ｊ．Ｅ．ら、Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｃｈｅｍ．  ＆
Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  １０巻：６６７〜６７５頁（
２００７年）；Ｃｌａｃｋｓｏｎ  Ｔ（２００６年）Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  Ｄｒｕｇ  Ｄ
ｅｓ  ６７巻：４４０〜２頁；Ｃｌａｃｋｓｏｎ，  Ｔ．、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ：  Ｆｒｏｍ  Ｓｍａｌｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｔｏ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏ
ｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ（Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，  ｓ．ら編、Ｗｉｌ
ｅｙ、２００７年））において考察されているものが挙げられる。
【０１９３】
ほとんどの場合、リガンド結合性ドメインまたは受容体ドメインは、天然ドメインまた
はその短縮型活性部分のいずれかとして、少なくとも約５０アミノ酸、かつ約３５０アミ
ノ酸未満であり、通常は２００アミノ酸未満である。結合性ドメインは、例えば、小さく
てよく（＜２５ｋＤａ、ウイルスベクターでの効率的なトランスフェクションを可能にす
るため）、単量体であってよく、非免疫原性であってよく、合成的に入手可能であってよ
く、細胞浸透性であってよく、二量体を形成することができる非毒性リガンドであってよ
い。
【０１９４】
受容体ドメインは、発現構築物の設計および適切なリガンドの利用可能性に応じて細胞
内であっても細胞外であってもよい。疎水性リガンドに対しては、結合性ドメインは膜の
どちら側にあってもよいが、親水性リガンド、特にタンパク質リガンドに対しては、リガ
ンドを結合に利用可能な形態で内部移行させるための輸送系がある場合を除いて、結合性
ドメインは通常は細胞膜の外側にする。細胞内受容体に対しては、構築物は、受容体ドメ
イン配列の５’または３’側のシグナルペプチドおよび膜貫通ドメインをコードしてもよ
く、受容体ドメイン配列の５’側の脂質付着シグナル配列を有してもよい。受容体ドメイ
ンがシグナルペプチドと膜貫通ドメインの間にある場合には、受容体ドメインは細胞外に
なる。
【０１９５】
受容体をコードする発現構築物の一部を種々の理由で変異誘発に供すことができる。変
異誘発されたタンパク質により、より高い結合親和性をもたらすことができる、天然に存
在する受容体および変異誘発された受容体のリガンドによる識別が可能になる、受容体−
リガンド対を設計する機会がもたらされる、などである。受容体の変化は、結合部位にあ
ることが公知のアミノ酸の変化、結合部位に関連するアミノ酸またはコンフォメーション
の変化に関連する他のアミノ酸のコドンを、特定のアミノ酸のコドン（複数可）を既知の
変化を用いてまたはランダムに変化させることによって変異誘発に供することができるコ
ンビナトリアル技法を使用したランダム変異誘発、生じたタンパク質を適切な原核生物宿
主で発現させ、次いで、生じたタンパク質を結合についてスクリーニングすることを伴う
。
【０１９６】
抗体および抗体サブユニット、例えば、重鎖または軽鎖、具体的には断片、より具体的
には可変領域の全部もしくは一部、または高親和性の結合を創出するための重鎖と軽鎖の
融合物を結合性ドメインとして使用することができる。意図されている抗体としては、免
疫応答を誘発せず、一般に末梢（すなわち、ＣＮＳ／脳領域の外）では発現しない細胞外
ドメインなどの、異所発現させたヒト産物である抗体が挙げられる。そのような例として
は、これだけに限定されないが、低親和性神経増殖因子受容体（ＬＮＧＦＲ）、および胚
表面タンパク質（すなわち、癌胎児性抗原）が挙げられる。
【０１９７】
さらに、抗体を生理的に許容されるハプテン分子に対して調製し、個々の抗体サブユニ
ットを結合親和性についてスクリーニングすることができる。サブユニットをコードする
ｃＤＮＡを単離し、定常領域、可変領域の一部の欠失、可変領域の変異誘発などによって
改変して、リガンドに対する適切な親和性を有する結合性タンパク質ドメインを得ること
ができる。このように、生理的に許容されるハプテン化合物のほぼすべてをリガンドとし
て、またはリガンドに対するエピトープをもたらすために使用することができる。抗体ユ
ニットの代わりに、結合性ドメインが公知であり、結合させるために有用なリガンドが存
在する天然の受容体を使用することができる。
オリゴマー形成
【０１９８】
形質導入したシグナルは、通常、キメラタンパク質分子のリガンド媒介性オリゴマー形
成により生じる、すなわち、リガンド結合後のオリゴマー形成の結果として生じるが、他
の結合事象、例えばアロステリック活性化を使用してシグナル伝達を開始することができ
る。キメラタンパク質の構築物は、種々のドメインの順序および個々のドメインの反復の
数に関して変動する。
【０１９９】
受容体の多量体化に関しては、キメラ表面膜タンパク質のリガンド結合性ドメイン／受
容体ドメインのリガンドは、通常、少なくとも２つの結合部位を有し、結合部位のそれぞ
れがリガンド受容体ドメインに結合することができるという意味で多量体である。「多量
体リガンド結合性領域」とは、多量体リガンドに結合するリガンド結合性領域を意味する
。「多量体リガンド」という用語は二量体リガンドを含む。二量体リガンドは、リガンド
受容体ドメインに結合することができる２つの結合部位を有する。対象のリガンドは、小
さな合成有機分子の二量体または通常は約四量体未満の高次オリゴマーであることが望ま
しく、個々の分子は、一般には少なくとも約１５０Ｄａであり、かつ約５ｋＤａ未満、通
常約３ｋＤａ未満である。合成リガンドと受容体の種々の対を使用することができる。例
えば、天然の受容体が関与する複数の実施形態では、二量体ＦＫ５０６をＦＫＢＰ１２受
容体と一緒に使用することができ、二量体化シクロスポリンＡをシクロフィリン受容体と
一緒に使用することができ、二量体化エストロゲンをエストロゲン受容体と一緒に使用す
ることができ、二量体化グルココルチコイドをグルココルチコイド受容体と一緒に使用す
ることができ、二量体化テトラサイクリンをテトラサイクリン受容体と一緒に使用するこ
とができ、二量体化ビタミンＤをビタミンＤ受容体と一緒に使用することができる、など
である。あるいは、高次のリガンド、例えば、三量体リガンドを使用することができる。
天然でない受容体、例えば、抗体サブユニット、改変抗体サブユニット、重鎖可変領域お
よび軽鎖可変領域で構成されるタンデムな単鎖抗体、柔軟なリンカードメインによって分
離されたまたは改変された受容体、およびその変異配列などが関与する実施形態では、多
種多様な化合物のいずれも使用することができる。これらのリガンド単位の重要な特性は
、各結合部位が受容体と高親和性で結合することができること、および、これらを化学的
に二量体化することができることである。また、大多数の適用のためにリガンドの疎水性
／親水性を平衡化し、したがって、これらを血清中に機能的なレベルで溶解させることが
でき、それでも原形質膜にわたって拡散する方法が利用可能である。
【０２００】
ある特定の実施形態では、本方法では、条件的に制御されたタンパク質またはポリペプ
チドを作製するために、化学的誘導二量体化（ＣＩＤ）技法を利用する。この技法は、誘
導性であることに加えて、不安定な二量体化剤の分解または単量体競合阻害剤の投与に起
因して可逆的でもある。
【０２０１】
ＣＩＤ系では、合成二価リガンドを使用して、リガンド結合性ドメインに融合したシグ
ナル伝達分子を急速に架橋結合させる。この系は、オリゴマー形成および細胞表面の活性
化を誘発するため（Ｓｐｅｎｃｅｒ，  Ｄ．  Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９３年、２
６２巻：１０１９〜１０２４頁；Ｓｐｅｎｃｅｒ  Ｄ．  Ｍ．ら、Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ  
１９９６年、６巻：８３９〜８４７頁；Ｂｌａｕ，  Ｃ．  Ａ．ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １９９７年、９４巻：３０７６〜３０８１頁）、または
細胞質タンパク質（Ｌｕｏ，  Ｚ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  １９９６年、３８３巻：１８１〜
１８５頁；ＭａｃＣｏｒｋｌｅ，  Ｒ．  Ａ．ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃ
ｉ  ＵＳＡ  １９９８年、９５巻：３６５５〜３６６０頁）、転写因子をＤＮＡエレメン
トに動員して転写を調節するため（Ｈｏ，  Ｓ．  Ｎ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  １９９６年、
３８２巻：８２２〜８２６頁；Ｒｉｖｅｒａ，  Ｖ．  Ｍ．ら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．  １９
９６年、２巻：１０２８〜１０３２頁）、またはシグナル伝達分子を原形質膜に動員して
シグナル伝達を刺激すること（Ｓｐｅｎｃｅｒ  Ｄ．  Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １９９５年、９２巻：９８０５〜９８０９頁；Ｈｏｌｓｉｎ
ｇｅｒ，  Ｌ．  Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １９９５
年、９５巻：９８１０〜９８１４頁）に使用されている。
【０２０２】
ＣＩＤ系は、表面受容体の凝集により、下流のシグナル伝達カスケードが有効に活性化
されるという概念に基づく。最も単純な実施形態では、ＣＩＤ系では、脂質浸透性免疫抑
制薬の二量体類似体、ＦＫ５０６を使用し、これは、正常な生物活性が失われているが、
ＦＫ５０６結合性タンパク質、ＦＫＢＰ１２と遺伝子融合した分子を架橋させる能力を獲
得させたものである。１つまたは複数のＦＫＢＰをカスパーゼ−９と融合することにより
、二量体化薬依存的であるが、リガンドおよび外部ドメイン非依存的にカスパーゼ−９活
性を刺激することができる。これにより、時間的に制御され、単量体薬物類似体を使用し
て可逆性であり、特異性が増強された系がもたらされる。第３世代ＡＰ２０１８７／ＡＰ
１９０３  ＣＩＤのそれらの結合性ドメイン、ＦＫＢＰ１２に対する高親和性により、内
在性ＦＫＢＰ１２による非特異的な副作用の誘導を伴うことなく組換え受容体をｉｎ  ｖ
ｉｖｏで特異的に活性化することが可能になる。二量体化薬に結合する、アミノ酸置換お
よび欠失を有するＦＫＢＰ１２バリアント、例えばＦＫＢＰ１２ｖ３６なども使用するこ
とができる。さらに、合成リガンドはプロテアーゼ分解に対して抵抗性であり、それによ
り、受容体をｉｎ  ｖｉｖｏで活性化する際に合成リガンドが大多数の送達されたタンパ
ク質薬剤よりも効率的なものになる。
【０２０３】
使用するリガンドは、２つまたはそれ超のリガンド結合性ドメインに結合することがで
きる。キメラタンパク質は、２つ以上のリガンド結合性ドメインを含有する場合に２つ以
上のリガンドに結合することができ得る。リガンドは、一般には、非タンパク質または化
学物質である。例示的なリガンドとしては、これだけに限定されないが、ＦＫ５０６（例
えば、ＦＫ１０１２）が挙げられる。
【０２０４】
他のリガンド結合性領域は、例えば、二量体領域、または、例えば、ＦＫＢＰ１２（Ｖ
３６）などのゆらぎ置換を伴う改変リガンド結合性領域であってよい。Ｆ３６からＶへの
置換を伴うヒト１２ｋＤａ  ＦＫ５０６結合性タンパク質は、完全な成熟コード配列（ア
ミノ酸１〜１０７）であり、合成二量体化薬ＡＰ１９０３の結合部位をもたらす（Ｊｅｍ
ａｌ，  Ａ．ら、ＣＡ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ．  Ｃｌｉｎｉｃ．  ５８巻、７１〜９６頁（
２００８年）；Ｓｃｈｅｒ，  Ｈ．Ｉ．およびＫｅｌｌｙ，  Ｗ．Ｋ、Ｊｏｕｒｎａｌ  
ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  １１巻、１５６６〜７２頁（１９９３年）
）。当該タンパク質の２つのタンデムなコピーも構築物に使用することができ、したがっ
て、ＡＰ１９０３により架橋すると高次オリゴマーが誘導される。
Ｆ３６Ｖ’−ＦＫＢＰ：Ｆ３６Ｖ’−ＦＫＢＰは、Ｆ３６Ｖ−ＦＫＢＰのコドンゆらぎ
型である。
【０２０５】
これは、Ｆ３６Ｖ−ＦＫＰＢと同一のポリペプチド配列をコードするが、ヌクレオチドレ
ベルでの相同性はたった６２％である。Ｆ３６Ｖ’−ＦＫＢＰは、レトロウイルスベクタ
ーにおける組換えを低下させるために設計した（Ｓｃｈｅｌｌｈａｍｍｅｒ，  Ｐ．Ｆ．
ら、Ｊ．  Ｕｒｏｌ．  １５７巻、１７３１〜５頁（１９９７年））。Ｆ３６Ｖ’−ＦＫ
ＢＰをＰＣＲ集合手順によって構築した。導入遺伝子は、１コピーのＦ３６Ｖ−ＦＫＢＰ
と直接連結した１コピーのＦ３６Ｖ’−ＦＫＢＰを含有する。
一部の実施形態では、リガンドは小分子である。選択されたリガンド結合性領域に対し
て適切なリガンドを選択することができる。多くの場合、リガンドは二量体であり、時に
はリガンドは二量体ＦＫ５０６または二量体ＦＫ５０６様類似体である。ある特定の実施
形態では、リガンドはＡＰ１９０３である（ＣＡＳ索引名：２−ピペリジンカルボン酸、
１−［（２Ｓ）−１−オキソ−２−（３，４，５−トリメトキシフェニル）ブチル］−、
１，２−エタンジイルビス［イミノ（２−オキソ−２，１−エタンジイル）オキシ−３，
１−フェニレン［（１Ｒ）−３−（３，４−ジメトキシフェニル）プロピリデン］］エス
テル、［２Ｓ−［１（Ｒ＊），２Ｒ＊［Ｓ＊［Ｓ＊［１（Ｒ＊），２Ｒ＊］］］］］−（
９ＣＩ）ＣＡＳ登録番号：１９５５１４−６３−７；分子式：Ｃ７８Ｈ９８Ｎ４Ｏ２０
【０２０６】
分子量：１４１１．６５）。ある特定の実施形態では、リガンドはＡＰ２０１８７である
。ある特定の実施形態では、リガンドは、例えば、ＡＰ１５１０などのＡＰ２０１８７類
似体である。一部の実施形態では、ある特定の類似体がＦＫＢＰ１２に適し、ある特定の
類似体がゆらぎ型のＦＫＢＰ１２に適する。ある特定の実施形態では、１つのリガンド結
合性領域がキメラタンパク質内に含まれる。他の実施形態では、２つまたはそれ超のリガ
ンド結合性領域が含まれる。例えば、リガンド結合性領域がＦＫＢＰ１２である場合、こ
れらの領域の２つが含まれる場合、その１つは、例えば、ゆらぎ型であってよい。
【０２０７】
意図されている他の二量体化系としては、クーママイシン／ＤＮＡジャイレースＢ系が
挙げられる。クーママイシンに誘導される二量体化により、改変Ｒａｆタンパク質が活性
化され、ＭＡＰキナーゼカスケードが刺激される。Ｆａｒｒａｒら、１９９６年を参照さ
れたい。
注射用のＡＰ１９０３
【０２０８】
ＡＰ１９０３はＡｌｐｈｏｒａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．により製造されており、
注射用のＡＰ１９０３薬品はＦｏｒｍａｔｅｃｈ  Ｉｎｃにより製造されている。これは
、非イオン性可溶化剤Ｓｏｌｕｔｏｌ  ＨＳ  １５の２５％溶液（２５０ｍｇ／ｍＬ、Ｂ
ＡＳＦ）中ＡＰ１９０３の５ｍｇ／ｍＬ溶液として製剤化されている。室温で、この製剤
は、透明な、わずかに黄色の溶液である。冷蔵すると、この製剤は可逆的な相転移を受け
、乳状溶液が生じる。この相転移は室温まで再加温すると逆転する。１容量は３ｍＬのガ
ラスバイアル中２．３３ｍＬ（バイアル当たり注射全体で約１０ｍｇのＡＰ１９０３）で
ある。
【０２０９】
ＡＰ１９０３を患者に投薬する前夜に冷蔵庫から取り出し、およそ２１℃の温度で一晩
保管し、したがって、溶液は希釈前に透明になる。溶液を注入の開始の３０分以内にガラ
スまたはポリエチレンビンまたは非ＤＥＨＰバッグ中に調製し、およそ２１℃で投薬前ま
で保管する。
【０２１０】
全ての試験薬を２℃から８℃の間の温度で維持し、過剰な光および熱から保護し、立ち
入りが制限された鍵のかかった区域で保管する。
【０２１１】
ＡＰ１９０３を投与し、誘導性カスパーゼ−９ポリペプチドを誘導する必要性が決定さ
れたら、患者に、例えば、単一の固定用量の注射用ＡＰ１９０３（０．４ｍｇ／ｋｇ）を
、非ＤＥＨＰ、非エチレンオキシド滅菌済注入セットを使用して、２時間かけてＩＶ注入
によって投与する。ＡＰ１９０３の用量は、全患者について個別に算出し、体重が１０％
以上増減しない限り再算出は行わない。算出された用量を、注入前に通常生理食塩水１０
０ｍＬ中０．９％中に希釈する。
【０２１２】
以前のＡＰ１９０３の第Ｉ相試験では、健康な志願者２４名に、単回用量の注射用ＡＰ
１９０３を０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／
ｋｇおよび１．０ｍｇ／ｋｇの用量レベルで、２時間かけてＩＶ注入により処置した。Ａ
Ｐ１９０３の血漿中レベルは用量に正比例し、平均Ｃｍａｘ値は、０．０１〜１．０ｍｇ
／ｋｇの用量範囲にわたって、およそ１０〜１２７５ｎｇ／ｍＬの範囲であった。最初の
注入期間の後、血中濃度は急速な分布相が実証され、血漿中レベルが投薬の０．５時間後
、２時間後および１０時間後に、それぞれ最大濃度のおよそ１８％、７％、および１％ま
で低下した。注射用ＡＰ１９０３は全用量レベルで安全であり、耐容性がよいことが示さ
れ、好都合な薬物動態プロファイルが実証された。Ｉｕｌｉｕｃｃｉ  ＪＤら、Ｊ  Ｃｌ
ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ４１巻：８７０〜９頁、２００１年。
【０２１３】
使用する固定用量の注射用ＡＰ１９０３は、例えば、０．４ｍｇ／ｋｇを２時間かけて
静脈内注入するものであってよい。ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける細胞の有効なシグナル伝達
に必要なＡＰ１９０３の量は１０〜１００ｎＭ（１６００Ｄａ  ＭＷ）である。これは、
１６〜１６０μｇ／Ｌまたは約０．０１６〜１．６ｍｇ／ｋｇ（１．６〜１６０μｇ／ｋ
ｇ）と等しい。上記のＡＰ１９０３の第Ｉ相試験では最大１ｍｇ／ｋｇの用量の忍容性が
良好であった。
選択マーカー
【０２１４】
ある特定の実施形態では、発現構築物は核酸構築物を含有し、その発現は、マーカーを
発現構築物に含めることによってｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて同定さ
れる。そのようなマーカーにより、発現構築物を含有する細胞を容易に同定することを可
能にする同定可能な変化が細胞に付与される。通常、薬物選択マーカーを含めることがク
ローニングおよび形質転換体の選択に役立つ。有用な選択マーカーは、例えば、ネオマイ
シン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ＤＨＦＲ、ＧＰＴ、ゼオシンおよびヒスチ
ジノールに対する耐性を付与する遺伝子である。あるいは、単純ヘルペスウイルス−Ｉチ
ミジンキナーゼ（ｔｋ）などの酵素を使用する。細胞外非シグナル伝達ドメインを含有す
る免疫学的表面マーカーまたは種々のタンパク質（例えば、ＣＤ３４、ＣＤ１９、ＬＮＧ
ＦＲ）も使用することができ、それにより、磁気または蛍光抗体に媒介される選別の簡単
な方法が可能になる。使用する選択マーカーは、それが遺伝子産物をコードする核酸と同
時に発現させることができるものである限りは、重要であるとは見られない。選択マーカ
ーのさらなる例としては、例えば、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ベータ−ｇａｌまたはクロラムフ
ェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）などのレポーターが挙げられる。ある
特定の実施形態では、輸注用の細胞を選択するために、例えば、免疫磁気選択においてな
どで、例えば、ＣＤ１９などのマーカータンパク質を使用する。
制御領域
プロモーター
【０２１５】
目的のポリヌクレオチド配列の発現を制御するために使用する特定のプロモーターは、
それが標的細胞におけるポリヌクレオチドの発現を導くことができるものである限りは、
重要であるとは見られない。したがって、ヒト細胞を標的とする場合、ポリヌクレオチド
配列コード領域を、例えば、ヒト細胞において発現させることが可能なプロモーターに隣
接させ、その制御下に置くことができる。一般的に言うと、そのようなプロモーターは、
ヒトプロモーターまたはウイルスプロモーターのいずれかを含み得る。
【０２１６】
種々の実施形態では、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期遺伝子プロモーター
、ＳＶ４０初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスの長い末端反復、β−アクチン、ラッ
トインスリンプロモーターおよびグリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼを使用し
て、目的のコード配列の高レベルの発現を得ることができる。目的のコード配列の発現を
実現するための、当技術分野で周知の他のウイルスプロモーターまたは哺乳動物細胞プロ
モーターまたは細菌ファージプロモーターの使用も、発現のレベルが所与の目的に十分で
あれば意図される。周知の性質を有するプロモーターを使用することにより、トランスフ
ェクションまたは形質転換後の目的のタンパク質のレベルおよび発現パターンを最適化す
ることができる。
【０２１７】
特定の生理的シグナルまたは合成シグナルに応答して調節されるプロモーターを選択す
ることにより、遺伝子産物の誘導性発現が可能になる。例えば、導入遺伝子または多シス
トロン性ベクターを利用する場合の導入遺伝子の発現が、ベクターが産生される細胞に対
して毒性である場合、導入遺伝子のうちの１つまたは複数の発現を妨げるまたは低下させ
ることが望ましい。産生細胞株に対して毒性である導入遺伝子の例は、アポトーシス促進
性遺伝子およびサイトカイン遺伝子である。導入遺伝子産物が毒性である場合にウイルス
ベクターを作製するために、いくつかの誘導性プロモーター系が利用可能である（より多
くの誘導性プロモーターを追加する）。
【０２１８】
エクジソン系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）がそのような系の１
つである。この系は、哺乳動物細胞における、調節される目的の遺伝子の発現が可能にな
るように設計されたものである。この系は、事実上、導入遺伝子の基礎レベルの発現がな
いが２００倍を超える誘導能を可能にするしっかりと調節された発現機構からなる。この
系は、ショウジョウバエのヘテロ二量体エクジソン受容体に基づき、エクジソンまたはム
リステロンＡなどの類似体が受容体に結合すると、受容体によりプロモーターが活性化さ
れて、高レベルのｍＲＮＡ転写物が達成される下流の導入遺伝子の発現がオンになる。こ
の系では、ヘテロ二量体受容体の単量体がどちらも１つのベクターから構成的に発現され
るが、目的の遺伝子の発現を駆動するエクジソン応答性プロモーターは別のプラスミド上
にある。したがって、この型の系を目的の遺伝子移入ベクター内に工学的操作によって含
めることが有用である。次いで、目的の遺伝子を含有するプラスミドおよび受容体単量体
を含有するプラスミドを産生細胞株に同時トランスフェクションすることにより、潜在的
に毒性の導入遺伝子を発現させることなく遺伝子移入ベクターを産生することが可能にな
る。適切な時間に、エクジソンまたはムリステロンＡを用いて導入遺伝子の発現を活性化
することができる。
【０２１９】
有用であり得る別の誘導性系は、ＧｏｓｓｅｎおよびＢｕｊａｒｄ（Ｇｏｓｓｅｎおよ
びＢｕｊａｒｄ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８９巻：５
５４７〜５５５１頁、１９９２年；Ｇｏｓｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６８巻：１７６
６〜１７６９頁、１９９５年）により最初に開発されたＴｅｔ−Ｏｆｆ（商標）またはＴ
ｅｔ−Ｏｎ（商標）系（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）である。この系
により、テトラサイクリンまたはドキシサイクリンなどのテトラサイクリン誘導体に応答
して調節される遺伝子の高レベルの発現も可能になる。Ｔｅｔ−Ｏｎ（商標）系では、ド
キシサイクリンの存在下で遺伝子発現がオンになるが、Ｔｅｔ−Ｏｆｆ（商標）系では、
ドキシサイクリンの不在下で遺伝子発現がオンになる。これらの系は、Ｅ．ｃｏｌｉのテ
トラサイクリン耐性オペロンに由来する２つの調節エレメント、テトラサイクリンリプレ
ッサーが結合するテトラサイクリンオペレーター配列、およびテトラサイクリンリプレッ
サータンパク質に基づく。目的の遺伝子をプラスミドのテトラサイクリン応答性エレメン
トを有するプロモーターの後ろにクローニングする。第２のプラスミドは、Ｔｅｔ−Ｏｆ
ｆ（商標）系では、単純ヘルペスウイルス由来のＶＰ１６ドメインおよび野生型テトラサ
イクリンリプレッサーで構成されるテトラサイクリンにより制御されるトランス活性化因
子と称される調節エレメントを含有する。したがって、ドキシサイクリンの不在下で、転
写は構成的にオンになる。Ｔｅｔ−Ｏｎ（商標）系では、テトラサイクリンリプレッサー
は野生型ではなく、ドキシサイクリンの存在下で  転写を活性化する。遺伝子療法ベクタ
ーを作製するために、Ｔｅｔ−Ｏｆｆ（商標）系を使用することができ、したがって、産
生細胞をテトラサイクリンまたはドキシサイクリンの存在下で成長させ、潜在的に毒性の
導入遺伝子の発現を防止することができるが、ベクターを患者に導入する際に、遺伝子発
現が構成的にオンになる。
【０２２０】
一部の場合では、遺伝子療法ベクターにおいて導入遺伝子の発現を調節することが望ま
しい。例えば、所望の発現レベルに応じて、活性の強度が変動する異なるウイルスプロモ
ーターを利用する。哺乳動物細胞では、多くの場合、強力な転写活性化をもたらすために
ＣＭＶ最初期プロモーターが使用される。ＣＭＶプロモーターは、Ｄｏｎｎｅｌｌｙ，  
Ｊ．Ｊ．ら、１９９７年。Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５巻：６１７〜４
８頁に概説されている。導入遺伝子の発現を低下させることが望まれる場合には、効力の
弱い改変型のＣＭＶプロモーターが使用されている。造血細胞における導入遺伝子の発現
が望まれる場合には、ＭＬＶまたはＭＭＴＶ由来のＬＴＲなどのレトロウイルスプロモー
ターが使用されることも多い。所望の効果に応じて使用される他のウイルスプロモーター
としては、ＳＶ４０、ＲＳＶ  ＬＴＲ、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２  ＬＴＲ、Ｅ１Ａ、
Ｅ２Ａ、またはＭＬＰ領域に由来するものなどのアデノウイルスプロモーター、ＡＡＶ  
ＬＴＲ、ＨＳＶ−ＴＫ、およびトリ肉腫ウイルスが挙げられる。
【０２２１】
他の例では、発生的に調節され、特定の分化細胞において活性なプロモーターを選択す
ることができる。したがって、例えば、プロモーターは、多能性幹細胞においては活性で
ない可能性があるが、例えば、多能性幹細胞がより成熟した細胞に分化すると、そのプロ
モーターが活性化され得る。
【０２２２】
同様に、非標的組織に対する潜在的な毒性または望ましくない影響が低下するように、
組織特異的プロモーターを使用して特異的な組織または細胞における転写をもたらす。こ
れらのプロモーターにより、ＣＭＶプロモーターなどのより強力なプロモーターと比較し
て発現の低下がもたらされるが、より限定された発現、および免疫原性ももたらされる（
Ｂｏｊａｋ，  Ａ．ら、２００２年。Ｖａｃｃｉｎｅ．  ２０巻：１９７５〜７９頁；Ｃ
ａｚｅａｕｘ．，  Ｎ．ら、２００２年、Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０巻：３３２２〜３１頁）
。例えば、適切な場合には、ＰＳＡ関連プロモーターもしくは前立腺特異的腺性カリクレ
インなどの組織特異的プロモーター、または筋肉クレアチンキナーゼ遺伝子を使用するこ
とができる。
【０２２３】
組織特異的または分化特異的プロモーターの例としては、これだけに限定されないが、
以下が挙げられる：Ｂ２９（Ｂ細胞）；ＣＤ１４（単核球細胞）；ＣＤ４３（白血球およ
び血小板）；ＣＤ４５（造血細胞）；ＣＤ６８（マクロファージ）；デスミン（筋肉）；
エラスターゼ−１（膵腺房細胞）；エンドグリン（内皮細胞）；フィブロネクチン（分化
細胞、治癒組織）；およびＦｌｔ−１（内皮細胞）；ＧＦＡＰ（星状膠細胞）。
【０２２４】
ある特定の適用では、遺伝子療法ベクターを投与した後の特定の時間に転写を活性化す
ることが望ましい。これは、ホルモンまたはサイトカインにより調節可能なプロモーター
などのプロモーターを用いて行う。使用することができるサイトカインおよび炎症性タン
パク質応答性のプロモーターとしては、ＫキニノーゲンおよびＴキニノーゲン（Ｋａｇｅ
ｙａｍａら、（１９８７年）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ、２６２巻、２３４５〜２３５
１頁）、ｃ−ｆｏｓ、ＴＮＦ−アルファ、Ｃ反応性タンパク質（Ａｒｃｏｎｅら、（１９
８８年）Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、１６巻（８号）、３１９５〜３２０７頁）、
ハプトグロビン（Ｏｌｉｖｉｅｒｏら、（１９８７年）ＥＭＢＯ  Ｊ、６巻、１９０５〜
１９１２頁）、血清アミロイドＡ２、Ｃ／ＥＢＰアルファ、ＩＬ−１、ＩＬ−６（Ｐｏｌ
ｉおよびＣｏｒｔｅｓｅ、（１９８９年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ
．  ＵＳＡ、８６巻、８２０２〜８２０６頁）、補体Ｃ３（Ｗｉｌｓｏｎら、（１９９０
年）Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ、６１８１〜６１９１頁）、ＩＬ−８、アルファ−
１酸性糖タンパク質（ＰｒｏｗｓｅおよびＢａｕｍａｎｎ、（１９８８年）Ｍｏｌ  Ｃｅ
ｌｌ  Ｂｉｏｌ、８巻、４２〜５１頁）、アルファ−１抗トリプシン、リポタンパク質リ
パーゼ（Ｚｅｃｈｎｅｒら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ、２３９４〜２４０１頁、
１９８８年）、アンジオテンシノーゲン（Ｒｏｎら、（１９９１年）Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ
．  Ｂｉｏｌ、２８８７〜２８９５頁）、フィブリノーゲン、ｃ−ｊｕｎ（ホルボールエ
ステル、ＴＮＦ−アルファ、ＵＶ放射、レチノイン酸、および過酸化水素により誘導可能
）、コラゲナーゼ（ホルボールエステルおよびレチノイン酸によって誘導される）、メタ
ロチオネイン（重金属およびグルココルチコイド誘導性）、ストロメライシン（ホルボー
ルエステル、インターロイキン−１およびＥＧＦにより誘導可能）、アルファ−２マクロ
グロブリンおよびアルファ−１抗キモトリプシンが挙げられる。他のプロモーターとして
は、例えば、ＳＶ４０、ＭＭＴＶ、ヒト免疫不全ウイルス（ＭＶ）、Ｍｏｌｏｎｅｙウイ
ルス、ＡＬＶ、エプスタイン・バーウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ヒトアクチン、ミオ
シン、ヘモグロビン、およびクレアチンが挙げられる。
【０２２５】
上記のプロモーターはいずれも、単独で、または別のプロモーターと組み合わせて、所
望の作用に応じて有用であり得ることが構想される。プロモーター、および他の調節エレ
メントは、所望の細胞または組織において機能的であるように選択する。さらに、このプ
ロモーターの一覧は、網羅的または限定的なものであると解釈されるべきではなく、他の
プロモーターが本明細書に開示されているプロモーターおよび方法と併せて使用される。
エンハンサー
【０２２６】
エンハンサーは、同じＤＮＡの分子上の遠位に位置するプロモーターからの転写を増加
させる遺伝エレメントである。初期の例としては、どちらもコード配列に隣接し、いくつ
かのイントロン内に存在する免疫グロブリンおよびＴ細胞受容体に関連するエンハンサー
が挙げられる。ＣＭＶ、ＳＶ４０、およびレトロウイルスＬＴＲなどの多くのウイルスプ
ロモーターがエンハンサー活性と密接に関連し、多くの場合、単一のエレメントのように
扱われる。エンハンサーは、プロモーターに酷似して組織化される。すなわち、エンハン
サーは多くの個体エレメントで構成され、そのそれぞれが１つまたは複数の転写タンパク
質と結合する。エンハンサーとプロモーターの基本的な違いは操作上のものである。エン
ハンサー領域は全体として、離れて、および多くの場合方向は関係なく転写を刺激する。
これはプロモーター領域またはその成分エレメントに当てはまる必要はない。他方では、
プロモーターは、特定の部位において、かつ特定の方向にＲＮＡ合成を直接開始させる１
つまたは複数のエレメントを有するが、エンハンサーはこれらの特異性を欠く。プロモー
ターおよびエンハンサーは多くの場合、重複しており、連続しており、多くの場合、非常
に類似したモジュラー組織化を有すると思われる。エンハンサーのサブセットは、転写活
性を増大させることができるだけでなく、（インスレーターエレメントと一緒に）ゲノム
に組み込む際の転写エレメントの近接配列からの隔離を補助することもできる遺伝子座制
御領域（ＬＣＲ）である。
【０２２７】
任意のプロモーター／エンハンサーの組合せ（Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｐｒｏｍｏｔｅ
ｒ  Ｄａｔａ  Ｂａｓｅ  ＥＰＤＢの通り）を使用して遺伝子の発現を駆動することがで
きるが、多くが、特定の組織型または組織のサブセットに対して発現を制限するものであ
る（例えば、Ｋｕｔｚｌｅｒ，  Ｍ．Ａ、およびＷｅｉｎｅｒ，  Ｄ．Ｂ、２００８年。
Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ９巻：７７６〜８８頁に概説されて
いる）。例としては、これだけに限定されないが、ヒトアクチン、ミオシン、ヘモグロビ
ン、筋肉クレアチンキナーゼ、配列由来のエンハンサー、およびウイルスＣＭＶ、ＲＳＶ
、およびＥＢＶ由来のエンハンサーが挙げられる。特定の適用のために適切なエンハンサ
ーを選択することができる。真核細胞では、送達複合体の一部として、または追加的な遺
伝子発現構築物として適切な細菌ポリメラーゼがもたらされる場合、ある特定の細菌のプ
ロモーターからの細胞質での転写が支持され得る。
ポリアデニル化シグナル
【０２２８】
ｃＤＮＡ挿入断片を使用する場合、一般には、遺伝子転写物の適切なポリアデニル化を
もたらすためにポリアデニル化シグナルを含めることが望ましい。ポリアデニル化シグナ
ルの性質は、本方法の上首尾の実施に対して重大なものではないと考えられ、ヒトまたは
ウシ成長ホルモンおよびＳＶ４０ポリアデニル化シグナルおよびＬＴＲポリアデニル化シ
グナルなどの、そのような配列のいずれも使用される。１つの非限定的な例は、ｐＣＥＰ
３プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）に存
在するＳＶ４０ポリアデニル化シグナルである。また、ターミネーターも発現カセットの
エレメントとして意図されている。これらのエレメントは、メッセージレベルを増強すた
め、およびカセットから他の配列へのリードスルーを最小限にするために役立ち得る。終
結またはポリ（Ａ）シグナル配列を、例えば、ｍＲＮＡの３’末端にある保存された配列
（ＡＡＵＡＡＡ）から約１１〜３０ヌクレオチド下流に位置づけることができる（Ｍｏｎ
ｔｇｏｍｅｒｙ，  Ｄ．Ｌ．ら、１９９３年。ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １２巻：
７７７〜８３頁；Ｋｕｔｚｌｅｒ，  Ｍ．Ａ、およびＷｅｉｎｅｒ，  Ｄ．Ｂ、２００８
年  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．  Ｇｅｎ．  ９巻：７７６〜８８頁）。
シグナルの開始および内部リボソーム結合部位
【０２２９】
コード配列の効率的な翻訳のために、特定のシグナルの開始も必要になり得る。これら
のシグナルは、ＡＴＧ開始コドンまたは近接配列を含む。ＡＴＧ開始コドンを含む外因性
翻訳制御シグナルをもたらす必要があり得る。開始コドンを所望のコード配列の読み枠と
インフレームで位置づけて、挿入断片全体が翻訳されることを確実にする。外因性翻訳制
御シグナルおよび開始コドンは天然のものであっても合成のものであってもよい。適切な
転写エンハンサーエレメントを含めることによって発現の効率を増強することができる。
【０２３０】
ある特定の実施形態では、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）エレメントの使用を
用いて、多重遺伝子、またはポリシストロニックメッセージを創出する。ＩＲＥＳエレメ
ントは、５’メチル化ｃａｐ依存性翻訳のリボソームスキャンモデルを迂回し、内部で翻
訳を開始させることができる（ＰｅｌｌｅｔｉｅｒおよびＳｏｎｅｎｂｅｒｇ、Ｎａｔｕ
ｒｅ、３３４巻：３２０〜３２５頁、１９８８年）。ピコルナウイルスファミリーの２つ
のメンバー（ポリオおよび脳心筋炎）由来のＩＲＥＳエレメント（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒお
よびＳｏｎｅｎｂｅｒｇ、１９８８年）、ならびに哺乳動物メッセージ由来のＩＲＥＳが
考察されている（ＭａｃｅｊａｋおよびＳａｒｎｏｗ、Ｎａｔｕｒｅ、３５３巻：９０〜
９４頁、１９９１年）。ＩＲＥＳエレメントを異種性オープンリーディングフレームに連
結することができる。それぞれがＩＲＥＳによって分離された多数のオープンリーディン
グフレームを一緒に転写し、ポリシストロニックメッセージを創出することができる。Ｉ
ＲＥＳエレメントによって、各オープンリーディングフレームが効率的な翻訳のためにリ
ボソームに到達することができる。単一のメッセージを転写するために単一のプロモータ
ー／エンハンサーを使用して、多数の遺伝子を効率的に発現させることができる（米国特
許第５，９２５，５６５号および同第５，９３５，８１９号を参照されたい、それぞれが
参照により本明細書に組み込まれる）。
配列最適化
【０２３１】
タンパク質産生は、導入遺伝子内のコドンを最適化することによっても増加させること
ができる。種特異的コドン変化を使用して、タンパク質産生を増加させることができる。
また、コドンを最適化して、最適化ＲＮＡを作製することもでき、これにより、より効率
的な翻訳がもたらされ得る。ＲＮＡに組み入れられるコドンを最適化することにより、不
安定性引き起こす二次構造を生じるものなどのエレメント、例えばリボソームの結合を阻
害し得る二次ｍＲＮＡ構造、またはｍＲＮＡの核外移行を阻害し得る潜在的な配列を除去
することができる（Ｋｕｔｚｌｅｒ，  Ｍ．Ａ、およびＷｅｉｎｅｒ，  Ｄ．Ｂ、２００
８年  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．  Ｇｅｎ．  ９巻：７７６〜８８頁；Ｙａｎ，  Ｊ．ら、
２００７年、Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒ．  １５巻：４１１〜２１頁；Ｃｈｅｕｎｇ，  Ｙ．Ｋ
．ら、２００４年、Ｖａｃｃｉｎｅ  ２３巻：６２９〜３８頁；Ｎａｒｕｍ，  Ｄ．Ｌ．
ら、２００１年、６９巻：７２５０〜５５頁；Ｙａｄａｖａ，  Ａ、およびＯｃｋｅｎｈ
ｏｕｓｅ，  Ｃ．Ｆ、２００３年、Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．  ７１巻：４９６２〜
６９頁；Ｓｍｉｔｈ，  Ｊ．Ｍ．ら、２００４年、ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．  Ｈｕｍ．  Ｒｅ
ｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ２０巻：１３３５〜４７頁；Ｚｈｏｕ，  Ｗ．ら、２００２年、
Ｖｅｔ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ８８巻：１２７〜５１頁；Ｗｕ，  Ｘ．ら、２００４
年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ３１３巻：８９
〜９６頁；Ｚｈａｎｇ，  Ｗ．ら、２００６年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  
Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ３４９巻：６９〜７８頁；Ｄｅｍｌ，  Ｌ．Ａ．ら、２００
１年、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７５巻：１０９９〜１１００１頁；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，  
Ｒ．  Ｍ．ら、１９９７年、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７１巻：４８９２〜４９０３頁；Ｗａ
ｎｇ，  Ｓ．Ｄ．ら、２００６年、Ｖａｃｃｉｎｅ  ２４巻：４５３１〜４０頁；ｚｕｒ
Ｍｅｇｅｄｅ，  Ｊ．ら、２０００年、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７４巻：２６２８〜２６
３５頁）。例えば、ＦＢＰ１２、カスパーゼポリペプチド、およびＣＤ１９配列をコドン
の変化によって最適化することができる。
リーダー配列
【０２３２】
ｍＲＮＡの安定性を増強し、より効率的な翻訳をもたらすためにリーダー配列を加える
ことができる。リーダー配列は、通常、ｍＲＮＡの小胞体へのターゲティングに関与する
。例としては、それ自体の切断を遅延させるＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質（Ｅｎ
ｖ）に対するシグナル配列、およびＩｇＥ遺伝子リーダー配列が挙げられる（Ｋｕｔｚｌ
ｅｒ，  Ｍ．Ａ、およびＷｅｉｎｅｒ，  Ｄ．Ｂ、２００８年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．
Ｇｅｎ．  ９巻：７７６〜８８頁；Ｌｉ，  Ｖ．ら、２０００年、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  
２７２巻：４１７〜２８頁；Ｘｕ，  Ｚ．Ｌ．ら、２００１年、Ｇｅｎｅ  ２７２巻：１
４９〜５６頁；Ｍａｌｉｎ，  Ａ．Ｓ．ら、２０００年、Ｍｉｃｒｏｂｅｓ  Ｉｎｆｅｃ
ｔ．  ２巻：１６７７〜８５頁；Ｋｕｔｚｌｅｒ，  Ｍ．Ａ．ら、２００５年、Ｊ．  Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．  １７５巻：１１２〜１２５頁；Ｙａｎｇ，  Ｊ．Ｓ．ら、２００２年、
Ｅｍｅｒｇ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．  ８巻：１３７９〜８４頁；Ｋｕｍａｒ，  Ｓ
．ら、２００６年、ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ２５巻：３８３〜９２頁；Ｗａｎｇ
，  Ｓ．ら、２００６年、Ｖａｃｃｉｎｅ  ２４巻：４５３１〜４０頁）。ＩｇＥリーダ
ーを使用して、小胞体への挿入を増強することができる（Ｔｅｐｌｅｒ、Ｉら（１９８９
年）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６４巻：５９１２頁）。
【０２３３】
発現を最適化するための適切な方法を選択することによって、導入遺伝子の発現を最適
化および／または制御することができる。これらの方法としては、例えば、プロモーター
、送達方法、および遺伝子配列の最適化が挙げられる（例えば、Ｌａｄｄｙ，  Ｄ．Ｊ．
ら、２００８年、ＰＬｏＳ．ＯＮＥ  ３巻、ｅ２５１７頁；Ｋｕｔｚｌｅｒ，  Ｍ．Ａ、
およびＷｅｉｎｅｒ，  Ｄ．Ｂ、２００８年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．  Ｇｅｎ．  ９巻
：７７６〜８８頁に示されている通り）。
核酸
【０２３４】
「核酸」とは、本明細書で使用される場合、一般に、ＤＮＡ、ＲＮＡもしくは誘導体、
または核酸塩基を含むその類似体の分子（１つ、２つまたはそれ超の鎖）を指す。核酸塩
基としては、例えば、ＤＮＡに見出される、天然に存在するプリン塩基またはピリミジン
塩基（例えば、アデニン「Ａ」、グアニン「Ｇ」、チミン「Ｔ」またはシトシン「Ｃ」）
またはＲＮＡに見出される、天然に存在するプリン塩基またはピリミジン塩基（例えば、
Ａ、Ｇ、ウラシル「Ｕ」またはＣ）が挙げられる。「核酸」という用語は、「オリゴヌク
レオチド」および「ポリヌクレオチド」という用語を包含し、これらはそれぞれ「核酸」
という用語の亜属である。核酸は、少なくとも、最大で、または約３、４、５、６、７、
８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、
２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３
５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８
、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、
６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７
５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８
、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０
１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１２
０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２
０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２
０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２
０、４３０、４４０、４４１、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１
０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１
０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１
０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１
０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１
０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０、または１００
０ヌクレオチドまたはその中で導き出せる任意の範囲の長さであってよい。
【０２３５】
本発明で提供される核酸は、別の核酸と同一または相補的な領域を有し得る。相補的ま
たは同一な領域は少なくとも５個の連続した残基であってよいことが意図されているが、
具体的には、この領域は、少なくとも、最大で、または約６、７、８、９、１０、１１、
１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２
５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８
、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、
５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６
５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８
、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、
９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１１０、１２０、１３０、
１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、
２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、
３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、
４４０、４４１、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、
５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、
６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、
７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、
８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、
９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０、または１０００個の連続し
たヌクレオチドであることが意図されている。
本明細書で使用される場合、「ハイブリダイゼーション」、「ハイブリダイズする」ま
たは「ハイブリダイズすることができる」とは、二重鎖または三重鎖を成した分子または
部分的な二重鎖または三重鎖を成した性質を有する分子を形成することを意味するものと
理解される。「アニーリングする」という用語は、本明細書で使用される場合、「ハイブ
リダイズする」と同義である。「ハイブリダイゼーション」、「ハイブリダイズする）」
または「ハイブリダイズすることができる」という用語は、「ストリンジェントな条件」
または「高ストリンジェンシー」という用語、および「低ストリンジェンシー」または「
低ストリンジェンシー条件」という用語を包含する。
【０２３６】
本明細書で使用される場合、「ストリンジェントな条件」または「高ストリンジェンシ
ー」とは、相補配列（複数可）を含有する１つまたは複数の核酸鎖の間またはその内部で
のハイブリダイゼーションを可能にするが、ランダムな配列のハイブリダイゼーションは
妨げる条件である。ストリンジェントな条件では、もしあれば、核酸と標的鎖の間の不一
致が少わずかに容認される。そのような条件は公知であり、多くの場合、高い選択性を必
要とする適用に使用される。非限定的な適用として、遺伝子またはその核酸セグメントな
どの核酸の単離、または少なくとも１つの特異的なｍＲＮＡ転写物またはその核酸セグメ
ントの検出などが挙げられる。
【０２３７】
ストリンジェントな条件は、約４２℃〜約７０℃の温度で約０．０２Ｍ〜約０．５Ｍの
ＮａＣｌによってもたらされるものなどの低塩および／または高温条件を含み得る。所望
のストリンジェンシーの温度およびイオン強度は、一部において、特定の核酸（複数可）
の長さ、標的配列（複数可）の長さおよび核酸塩基含量、核酸（複数可）の電荷組成、お
よびハイブリダイゼーション混合物中のホルムアミド、塩化テトラメチルアンモニウムま
たは他の溶媒（複数可）の存在または濃度によって決定されることが理解される。
【０２３８】
ハイブリダイゼーションのためのこれらの範囲、組成および条件は単に非限定的な例と
して記載されていること、および特定のハイブリダイゼーション反応に対する所望のスト
リンジェンシーは多くの場合、１つまたは複数の陽性対照または陰性対照と比較すること
によって経験的に決定されることが理解される。ハイブリダイゼーションの様々な条件を
構想される適用に応じて使用して、標的配列に対する核酸の選択性の様々な程度を実現す
ることができる。非限定的な例では、ストリンジェントな条件下では核酸とハイブリダイ
ズしない関連する標的核酸の同定または単離を、低温かつ／または高イオン強度でのハイ
ブリダイゼーションによって実現することができる。そのような条件は、「低ストリンジ
ェンシー」または「低ストリンジェンシー条件」と称され、低ストリンジェンシーの非限
定的な例としては、約２０℃〜約５０℃の範囲の温度において約０．１５Ｍ〜約０．９Ｍ
のＮａＣｌで実施されるハイブリダイゼーションが挙げられる。低ストリンジェンシー条
件または高ストリンジェンシー条件をさらに改変して特定の適用に合わせることができる
。
核酸の改変
【０２３９】
以下で考察する任意の改変を核酸に適用することができる。改変の例としては、ＲＮＡ
骨格またはＤＮＡ骨格、糖または塩基、および、それらの様々な組み合わせに対する変更
が挙げられる。核酸内の任意の適切な数の骨格連結、糖および／または塩基を改変するこ
とができる（例えば、それぞれ独立に、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０
％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０
％、８５％、９０％、９５％、最大１００％）。修飾されていないヌクレオシドは、ベー
タ−Ｄ−リボ−フラノースの１’炭素とつながった塩基アデニン、シトシン、グアニン、
チミン、またはウラシルのうちの任意の１種である。
【０２４０】
改変された塩基は、１’位にあるアデニン、グアニン、シトシンおよびウラシル以外の
ヌクレオチド塩基である。修飾塩基の非限定的な例としては、イノシン、プリン、ピリジ
ン−４−オン、ピリジン−２−オン、フェニル、シュードウラシル、２，４，６−トリメ
トキシベンゼン、３−メチルウラシル、ジヒドロウリジン、ナフチル、アミノフェニル、
５−アルキルシチジン（例えば、５−メチルシチジン）、５−アルキルウリジン（例えば
、リボチミジン）、５−ハロウリジン（例えば、５−ブロモウリジン）または６−アザピ
リミジンまたは６−アルキルピリミジン（例えば、６−メチルウリジン）、プロピンなど
が挙げられる。他の修飾塩基の非限定的な例としては、ニトロピロリル（（例えば、３−
ニトロピロリル、ニトロインドリル（例えば、４−、５−、６−ニトロインドリル）、ヒ
ポキサンチニル、イソイノシニル、２−アザ−イノシニル、７−デアザ−イノシニル、ニ
トロイミダゾリル、ニトロピラゾリル、ニトロベンゾイミダゾリル、ニトロインダゾリル
、アミノインドリル、ピロロピリミジニル、ジフルオロトリル、４−フルオロ−６−メチ
ルベンゾイミダゾール、４−メチルベンゾイミダゾール、３−メチルイソカルボスチリリ
ル、５−メチルイソカルボスチリリル、３−メチル−７−プロピニルイソカルボスチリリ
ル、７−アザインドリル、６−メチル−７−アザインドリル、イミジゾピリジニル、９−
メチル−イミジゾピリジニル、ピロロピリジニル、イソカルボスチリリル、７−プロピニ
ルイソカルボスチリリル、プロピニル−７−アザインドリル、２，４，５−トリメチルフ
ェニル、４−メチルインドリル、４，６−ジメチルインドリル、フェニル、ナプタレニル
、アントラセニル、フェナントラセニル、ピレニル、スチルベニル、テトラセニル、ペン
タセニルなどが挙げられる。
【０２４１】
一部の実施形態では、例えば、核酸は、リン酸骨格が改変された改変核酸分子を含んで
よい。骨格改変の非限定的な例としては、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、
メチルホスホネート、ホスホトリエステル、モルホリノ、アミド化カルバミン酸、カルボ
キシメチル、アセトアミデート、ポリアミド、スルホネート、スルホンアミド、スルファ
ミン酸、ホルムアセタール、チオホルムアセタール、および／またはアルキルシリルの改
変が挙げられる。ある特定の例では、ヌクレオシドに天然に存在するリボース糖部分がヘ
キソース糖、多環ヘテロアルキル環、またはシクロヘキセニル基で置き換えられている。
ある特定の例では、ヘキソース糖は、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース
、グロース、イドース、ガラクトース、タロースまたはその誘導体である。ヘキソースは
、Ｄ−ヘキソース、グルコース、またはマンノースであってよい。ある特定の例では、多
環ヘテロアルキル基は、環内に酸素原子を１つ含有する二環であってよい。ある特定の例
では、多環ヘテロアルキル基は、ビシクロ［２．２．１］ヘプタン、ビシクロ［３．２．
１］オクタン、またはビシクロ［３．３．１］ノナンである。
【０２４２】
ニトロピロリルおよびニトロインドリル核酸塩基は、普遍的な塩基として公知の化合物
のクラスのメンバーである。普遍的な塩基とは、４種の天然に存在する塩基のいずれかと
、オリゴヌクレオチド二重鎖の挙動または活性の融解に実質的に影響を及ぼすことなく置
き換えることができる化合物である。天然に存在する核酸塩基に付随する水素結合相互作
用の安定化とは対照的に、３−ニトロピロリル核酸塩基を含有するオリゴヌクレオチド二
重鎖は、単にスタッキング相互作用によって安定化することができる。ニトロピロリル核
酸塩基との著しい水素結合相互作用がなければ、特異的な相補塩基に対する特異性が必要
なくなる。さらに、４−、５−および６−ニトロインドリルは４種の天然の塩基に対して
非常にわずかな特異性を示す。１−（２’−Ｏ−メチル−．ベータ．−Ｄ−リボフラノシ
ル）−５−ニトロインドールを調製するための手順は、Ｇａｕｂｅｒｔ，  Ｇ．；Ｗｅｎ
ｇｅｌ，  Ｊ．  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２００４年、４５巻、５６
２９頁において考察されている。他の普遍的な塩基としては、ヒポキサンチニル、イソイ
ノシニル、２−アザ−イノシニル、７−デアザ−イノシニル、ニトロイミダゾリル、ニト
ロピラゾリル、ニトロベンズイミダゾリル、ニトロインダゾリル、アミノインドリル、ピ
ロロピリミジニル、およびそれらの構造誘導体が挙げられる。
ジフルオロトリルは、普遍的な塩基として機能する非天然核酸塩基である。ジフルオロ
トリルは、天然の核酸塩基であるチミンのアイソスターである。しかし、チミンとは異な
り、ジフルオロトリルは、天然の塩基のいずれに対しても明らかな選択性を示さない。普
遍的な塩基として機能する他の芳香族化合物は、４−フルオロ−６−メチルベンズイミダ
ゾールおよび４−メチルベンズイミダゾールである。さらに、比較的疎水性のイソカルボ
スチリリル誘導体である３−メチルイソカルボスチリリル、５−メチルイソカルボスチリ
リル、および３−メチル−７−プロピニルイソカルボスチリリルは、天然の塩基のみを含
有するオリゴヌクレオチド配列と比較してわずかな不安定化しか引き起こさない普遍的な
塩基である。他の非天然核酸塩基としては、７−アザインドリル、６−メチル−７−アザ
インドリル、イミジゾピリジニル、９−メチル−イミジゾピリジニル、ピロロピリジニル
、イソカルボスチリリル、７−プロピニルイソカルボスチリリル、プロピニル−７−アザ
インドリル、２，４，５−トリメチルフェニル、４−メチルインドリル、４，６−ジメチ
ルインドリル、フェニル、ナフタレニル、アントラセニル、フェナントラセニル、ピレニ
ル、スチルベニル、テトラセニル、ペンタセニル、およびその構造誘導体が挙げられる。
ジフルオロトリル、４−フルオロ−６−メチルベンズイミダゾール、４−メチルベンズイ
ミダゾール、および上記の他の非天然塩基の合成手順を含めたより詳細な考察については
、Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒら、Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ、５９巻：７２３８〜７２４２頁
（１９９４年）を参照されたい。
さらに、化学的置換基、例えば架橋剤を使用して反応にさらなる安定性または不可逆性
を付加することができる。架橋剤としての非限定的な例は、例えば、１，１−ビス（ジア
ゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ
ドエステル、例えば、４−アジドサリチル酸とのエステル、３，３’−ジチオビス（スク
シンイミジルプロピオン酸）などのジスクシンイミジルエステルを含めた同種二官能性イ
ミドエステル、ビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンなどの二官能性マレイミドおよ
びメチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミデートなどの薬剤が挙げ
られる。
【０２４３】
ヌクレオチド類似体は、「ロックド」核酸も含み得る。ある特定の組成物を使用して、
内在性核酸を特定の構造に基本的に「アンカー」または「ロック」することができる。ア
ンカー配列は核酸複合体の解離を予防する機能を果たし、したがって、コピーを予防する
ことができるだけでなく、内在性の配列を標識、修飾、および／またはクローニングする
こともできる。ロックされた構造により、遺伝子発現を調節する（すなわち、転写または
複製を阻害または増強する）こともでき、内在性核酸配列を標識または他のやり方で修飾
するために使用することができる安定な構造としてこれを使用することもでき、内在性の
配列を単離するため、すなわち、クローニングのためにこれを使用することもできる。
【０２４４】
核酸分子は、ＲＮＡまたはＤＮＡのみを含有する分子に限定する必要はなく、化学修飾
されたヌクレオチドおよび非ヌクレオチドをさらに包含する。非ヌクレオチドまたは修飾
されたヌクレオチドのパーセントは、１％から１００％まで（例えば、約５％、１０％、
１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、
６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％）であってよい。
核酸調製物
【０２４５】
一部の実施形態では、例えば、アッセイ、または治療において対照または標準のとして
使用するための核酸が提供される。核酸は、例えば、化学合成、酵素による産生または生
物学的産生などの当技術分野で公知の任意の技法によって作出することができる。核酸は
、生体試料から回収または単離することができる。核酸は組換え型であってもよく、細胞
に対して天然または内在性（細胞のゲノムから産生されるもの）であってもよい。小さな
核酸分子の回収が増強されるように生体試料を処理できることが意図されている。一般に
、方法は、グアニジニウムおよび界面活性剤を伴う溶液を用いて細胞を溶解することを含
む。
【０２４６】
核酸合成を標準の方法に従って実施することもできる。合成核酸（例えば、合成オリゴ
ヌクレオチド）の非限定的な例としては、ホスホトリエステル、ホスファイト、または、
ホスホラミダイト化学および固相技法を使用して、もしくはデオキシヌクレオシドＨ−ホ
スホン酸中間体を経由するｉｎ  ｖｉｔｒｏ化学合成によって作出された核酸が挙げられ
る。オリゴヌクレオチド合成の種々の異なる機構が他の箇所に開示されている。
【０２４７】
核酸は、公知の技法を使用して単離することができる。特定の実施形態では、小さな核
酸分子を単離するため、および／またはＲＮＡ分子を単離するための方法を使用すること
ができる。クロマトグラフィーは、核酸をタンパク質から、または他の核酸から分離また
は単離するために使用するプロセスである。そのような方法は、ゲルマトリックスを用い
た電気泳動、フィルターカラム、アルコール沈殿、および／または他のクロマトグラフィ
ーを伴い得る。細胞由来の核酸を使用または評価する場合、方法は、一般に、ＲＮＡの特
定の集団を単離するプロセスを行う前に、細胞をカオトロピック（例えば、グアニジニウ
ムイソチオシアネート）および／または界面活性剤（例えば、Ｎ−ラウロイルサルコシン
）で溶解させることを伴う。
【０２４８】
方法は、核酸を単離するために有機溶媒および／またはアルコールの使用を伴い得る。
一部の実施形態では、細胞溶解物に添加するアルコールの量により、約５５％〜６０％の
アルコール濃度が実現される。異なるアルコールを使用することができるが、エタノール
がうまく機能する。固体支持体は任意の構造であってよく、固体支持体としては、電気陰
性基を伴う無機物またはポリマー支持体を含み得るビーズ、フィルター、およびカラムが
挙げられる。そのような単離手順にはガラス繊維フィルターまたはカラムが有効である。
【０２４９】
核酸単離プロセスは、時には、ａ）グアニジニウムを含む溶解溶液を用いて試料中の細
胞を溶解するステップであって、少なくとも約１Ｍのグアニジニウムの濃度の溶解物が生
じるステップ；ｂ）フェノールを含む抽出溶液を用いて溶解物から核酸分子を抽出するス
テップ；ｃ）溶解物にアルコール溶液を添加して溶解物／アルコール混合物を形成するス
テップであって、混合物中のアルコールの濃度が約３５％〜約７０％であるステップ；ｄ
）溶解物／アルコール混合物を固体支持体に塗布するステップ；ｅ）イオン溶液を用いて
固体支持体から核酸分子を溶出させるステップ；および、ｆ）核酸分子を捕捉するステッ
プを含み得る。試料を乾燥させ、その後の操作に適した液体および体積に再懸濁させるこ
とができる。
遺伝子移入の方法
【０２５０】
細胞における導入遺伝子の発現の達成を媒介するために、発現構築物を細胞に移入する
ことが必要になる。そのような移入には、ウイルスによるまたはウイルスによらない遺伝
子移入の方法を使用することができる。この節では、遺伝子移入の方法および組成物に関
する考察が提供される。
【０２５１】
細胞に発現ベクターを導入することによって、発現ベクターを含む形質転換された細胞
を生成する。現行の方法で使用するための細胞小器官、細胞、組織または生物体を形質転
換するためのポリヌクレオチド送達の適切な方法は、事実上、ポリヌクレオチド（例えば
、ＤＮＡ）を細胞小器官、細胞、組織または生物体に導入することができるあらゆる方法
を含む。
【０２５２】
宿主細胞はベクターのレシピエントとして使用することができ、そのように使用されて
いる。宿主細胞は、所望の結果がベクターの複製であるかベクターにコードされるポリヌ
クレオチド配列の一部または全部の発現であるかに応じて、原核生物由来であっても真核
生物由来であってもよい。多数の細胞株および培養物が宿主細胞として使用するために入
手可能であり、これらは、生きている培養物および遺伝物質のアーカイブとしての機能を
果たす組織であり、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏ
ｎ（ＡＴＣＣ）を通じて得ることができる。
【０２５３】
適切な宿主を決定することができる。一般に、これは、ベクターの骨格および所望の結
果に基づく。例えば、多くのベクターを複製するために、プラスミドまたはコスミドを原
核宿主細胞に導入することができる。ベクターの複製および／または発現のための宿主細
胞として使用される細菌細胞としては、ＤＨ５アルファ、ＪＭ１０９、およびＫＣ８、な
らびにいくつもの市販の細菌宿主、例えば、ＳＵＲＥ（登録商標）Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  
ＣｅｌｌｓおよびＳＯＬＯＰＡＣＫ  Ｇｏｌｄ  Ｃｅｌｌｓ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ（登
録商標）、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）などが挙げられる。あるいは、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＬＥ
３９２などの細菌細胞をファージウイルスの宿主細胞として使用することができる。宿主
細胞として使用することができる真核細胞としては、これだけに限定されないが、酵母、
昆虫および哺乳動物が挙げられる。ベクターの複製および／または発現のための哺乳動物
真核宿主細胞の例としては、これだけに限定されないが、ＨｅＬａ、ＮＩＨ３Ｔ３、Ｊｕ
ｒｋａｔ、２９３、ＣＯＳ、ＣＨＯ、Ｓａｏｓ、およびＰＣ１２が挙げられる。酵母株の
例としては、これだけに限定されないが、ＹＰＨ４９９、ＹＰＨ５００およびＹＰＨ５０
１が挙げられる。
【０２５４】
核酸ワクチンは、例えば、非ウイルスＤＮＡベクター、「裸の」ＤＮＡおよびＲＮＡ、
およびウイルスベクターを含み得る。これらのワクチンを用いて細胞を形質転換する方法
、およびこれらのワクチンに含まれる遺伝子の発現を最適化するための方法は公知であり
、本明細書においても考察されている。
核酸またはウイルスベクターを移入する方法の例
【０２５５】
任意の適切な方法を使用して細胞にトランスフェクトまたは形質転換すること、または
本方法のヌクレオチド配列または組成物を投与することができる。ある特定の例は本明細
書で提示されており、これは、陽イオン性ポリマー、脂質様分子、および、例えば、ＩＮ
−ＶＩＶＯ−ＪＥＴ  ＰＥＩなどのある特定の市販品を使用した送達などの方法をさらに
含む。
ｅｘ  ｖｉｖｏにおける形質転換
【０２５６】
ｅｘ  ｖｉｖｏの状況において生物体から取り出された血管細胞および組織をトランス
フェクトするために種々の方法が利用可能である。例えば、イヌ内皮細胞がレトロウイル
スによる遺伝子移入によってｉｎ  ｖｉｔｒｏで遺伝的に変更され、イヌに移植されてい
る（Ｗｉｌｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４巻：１３４４〜１３４６頁、１９８９年）
。別の例では、Ｙｕｃａｔａｎミニブタ内皮細胞がレトロウイルスによってｉｎ  ｖｉｔ
ｒｏでトランスフェクトされ、ダブルバルーンカテーテルを使用して動脈内に移植された
（Ｎａｂｅｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４巻（４９１０号）：１３４２〜１３４４頁、１
９８９年）。したがって、細胞または組織を取り出し、本明細書で提示されているポリヌ
クレオチドを使用してｅｘ  ｖｉｖｏでトランスフェクトすることができることが意図さ
れている。特定の態様では、移植された細胞または組織を生物体に入れることができる。
注射
【０２５７】
ある特定の実施形態では、抗原提示細胞または核酸またはウイルスベクターを細胞小器
官、細胞、組織または生物体に、例えば、皮下、皮内、筋肉内、静脈内、前立腺内、腫瘍
内、腹腔内などの１回または複数回の注射（すなわち、針による注射）によって送達する
ことができる。注射の方法としては、例えば、生理食塩水溶液を含む組成物の注射が挙げ
られる。別の実施形態は、ポリヌクレオチドを直接マイクロインジェクションによって導
入することを含む。使用する発現ベクターの量は、抗原の性質ならびに使用する細胞小器
官、細胞、組織または生物体に応じて変動し得る。
【０２５８】
皮内注射、結節内（ｉｎｔｒａｎｏｄａｌ）注射、またはリンパ内注射は、より一般に
使用されるＤＣ投与の方法のいくつかである。皮内注射は、血流中への吸収率が低いが、
リンパ系に急速に取り込まれることを特徴とする。真皮内に多数のランゲンルハンス樹状
細胞が存在することにより、インタクトな抗原ならびにプロセシングされた抗原が流入領
域リンパ節に輸送される。これを正確に実施するには適切な部位調製が必要である（すな
わち、適切な針の配置を観察するために毛髪を刈る）。結節内注射により、抗原をリンパ
組織に直接送達することが可能になる。リンパ内注射により、ＤＣの直接投与が可能にな
る。
電気穿孔
【０２５９】
ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドを電気穿孔によって細胞小器官、細胞、組
織または生物体に導入する。電気穿孔には、細胞およびＤＮＡの懸濁液を高電圧の放電に
曝露することが伴う。この方法のいくつかの変形では、ペクチン分解酵素などのある特定
の細胞壁分解酵素を使用して、標的レシピエント細胞を無処理の細胞よりも電気穿孔によ
って形質転換されやすいものにする（米国特許第５，３８４，２５３号、参照により本明
細書に組み込まれる）。
【０２６０】
電気穿孔を使用した真核細胞のトランスフェクションはかなり成功している。このよう
にして、マウスプレＢリンパ球にヒトカッパ−免疫グロブリン遺伝子がトランスフェクト
されており（Ｐｏｔｔｅｒら、（１９８４年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．  Ｓ
ｃｉ．  ＵＳＡ、８１巻、７１６１〜７１６５頁）、ラット肝細胞にクロラムフェニコー
ルアセチルトランスフェラーゼ遺伝子がトランスフェクトされている（Ｔｕｒ−Ｋａｓｐ
ａら、（１９８６年）Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、６巻、７１６〜７１８頁）。
ワクチン、またはｅＶａｃに対するｉｎ  ｖｉｖｏにおける電気穿孔が単純な注射技法
によって臨床的に実行されている。ポリペプチドをコードするＤＮＡベクターを患者の皮
内に注射する。次いで、電極から電気パルスが皮内空間に印加され、それにより、そこに
局在している細胞、特に常在皮膚樹状細胞によるＤＮＡベクターの取り込み、およびコー
ドされるポリペプチドの発現が引き起こされる。次いで、局所的な炎症によって活性化さ
れたこれらのポリペプチド発現細胞は、例えば、リンパ節に移動し、抗原を提示し得る。
例えば、これだけに限定されないが、核酸の注射または任意の他の核酸を電気穿孔によっ
て細胞に送達することができる投与の手段に従って電気穿孔を使用して核酸を投与する場
合、核酸は電気穿孔により投与される。
【０２６１】
電気穿孔の方法は、例えば、それらの全体がこれによって参照により本明細書に組み込
まれる、Ｓａｒｄｅｓａｉ，  Ｎ．Ｙ、およびＷｅｉｎｅｒ，  Ｄ．Ｂ、Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ２３巻：４２１〜９頁（２０１
１年）およびＦｅｒｒａｒｏ，  Ｂ．ら、Ｈｕｍａｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ７巻：１２０
〜１２７頁（２０１１年）において考察されている。
リン酸カルシウム
【０２６２】
他の実施形態では、リン酸カルシウム沈殿を使用してポリヌクレオチドを細胞に導入す
る。この技法を使用して、ヒトＫＢ細胞にアデノウイルス５  ＤＮＡがトランスフェクト
されている（Ｇｒａｈａｍおよびｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｂ、（１９７３年）Ｖｉｒｏｌｏｇ
ｙ、５２巻、４５６〜４６７頁）。同様に、このようにして、マウスＬ（Ａ９）細胞、マ
ウスＣ１２７細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＶ−１細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞およびＨ
ｅＬａ細胞に、ネオマイシンマーカー遺伝子がトランスフェクトされ（ＣｈｅｎおよびＯ
ｋａｙａｍａ、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、７巻（８号）：２７４５〜２７５２頁、
１９８７年）、ラット肝細胞に種々のマーカー遺伝子がトランスフェクトされた（Ｒｉｐ
ｐｅら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、１０巻：６８９〜６９５頁、１９９０年）。
ＤＥＡＥ−デキストラン
【０２６３】
別の実施形態では、ＤＥＡＥ−デキストラン、その後にポリエチレングリコールを使用
してポリヌクレオチドを細胞に送達する。このように、レポータープラスミドがマウス骨
髄腫および赤白血病細胞に導入された（Ｇｏｐａｌ，  Ｔ．Ｖ、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉ
ｏｌ．  １９８５年５月；５巻（５号）：１１８８〜９０頁）。
超音波ローディング（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ  ｌｏａｄｉｎｇ）
【０２６４】
さらなる実施形態は、直接音波ローディングによってポリヌクレオチドを導入すること
を含む。超音波ローディングにより、ＬＴＫ−線維芽細胞にチミジンキナーゼ遺伝子がト
ランスフェクトされている（Ｆｅｃｈｈｅｉｍｅｒら、（１９８７年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａ
ｔ’ｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８４巻、８４６３〜８４６７頁）。
リポソーム媒介トランスフェクション
【０２６５】
さらなる実施形態では、例えばリポソームなどの脂質複合体にポリヌクレオチドを封入
することができる。リポソームは、リン脂質二分子膜と内部の水性媒体を特徴とする小胞
構造である。多重膜リポソームは水性媒体によって分離された多数の脂質層を有する。リ
ポソームは、リン脂質を過剰な水溶液に懸濁させると自然に形成される。脂質成分は、閉
じた構造が形成される前に自己再編成を受け、脂質二重層の間に水を封入し、溶質を溶解
させる（ＧｈｏｓｈおよびＢａｃｈｈａｗａｔ、（１９９１年）、Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓｅ
ａｓｅｓ、Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｕｓｉｎ
ｇ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ．  ８７〜１０４
頁）。リポフェクタミン（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）またはＳｕｐｅｒｆｅｃｔ（Ｑｉａｇｅ
ｎ）と複合体を形成したポリヌクレオチドも意図されている。
受容体媒介トランスフェクション
【０２６６】
さらに、受容体媒介性送達ビヒクルによってポリヌクレオチドを標的細胞に送達するこ
とができる。これらは、標的細胞において起こる、受容体媒介性エンドサイトーシスによ
る巨大分子の選択的な取り込みを活用するものである。種々の受容体の細胞型特異的分布
を考慮すると、この送達方法により、また別の程度の特異性が付加される。
【０２６７】
ある特定の受容体媒介性遺伝子ターゲティングビヒクルは、細胞受容体特異的リガンド
およびポリヌクレオチド結合物質を含む。他の受容体媒介性遺伝子ターゲティングビヒク
ルは、送達されるポリヌクレオチドが作動可能に付着した細胞受容体特異的リガンドを含
む。いくつかのリガンドが受容体媒介性遺伝子移入のために使用されており（Ｗｕおよび
Ｗｕ、（１９８７年）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ、２６２巻、４４２９〜４４３２頁；
Ｗａｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８７巻（９
号）：３４１０〜３４１４頁、１９９０年；Ｐｅｒａｌｅｓら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、９１巻：４０８６〜４０９０頁、１９９４年；Ｍｙｅ
ｒｓ、ＥＰＯ０２７３０８５）、これにより、この技法の作動性が確立されている。別の
哺乳動物細胞型に関する特異的な送達が考察されている（ＷｕおよびＷｕ、Ａｄｖ．  Ｄ
ｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ、１２巻：１５９〜１６７頁、１９９３年；参照によ
り本明細書に組み込まれる）。ある特定の態様では、リガンドを、標的細胞集団で特異的
に発現する受容体に対応するように選択する。
【０２６８】
他の実施形態では、細胞特異的ポリヌクレオチドターゲティングビヒクルのポリヌクレ
オチド送達ビヒクル成分は、特異的な結合性リガンドをリポソームと組み合わせて含んで
よい。送達するポリヌクレオチド（複数可）をリポソーム中に収め、特異的な結合性リガ
ンドをリポソーム膜に機能的に組み入れる。したがって、リポソームが標的細胞の受容体
（複数可）に特異的に結合し、内容物が細胞に送達される。そのような系は、例えば、Ｅ
ＧＦ受容体の上方制御を示す細胞にポリヌクレオチドを受容体媒介性送達するために上皮
増殖因子（ＥＧＦ）を使用する系を使用すると機能的であることが示されている。
【０２６９】
さらに別の実施形態では、標的化送達ビヒクルのポリヌクレオチド送達ビヒクル成分は
、リポソーム自体であってよく、それは、例えば、細胞特異的結合を導く１つまたは複数
の脂質または糖タンパク質を含んでよい。例えば、ラクトシルセラミド、ガラクトース−
末端アシアロガングリオシドがリポソームに組み入れられ、肝細胞によるインスリン遺伝
子の取り込みの増加が観察されている（Ｎｉｃｏｌａｕら、（１９８７年）Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ、１４９巻、１５７〜１７６頁）。同様に組織特異的な形質転換用構
築物を標的細胞に特異的に送達することができることが意図されている。
微粒子銃
【０２７０】
微粒子銃技法を使用して、ポリヌクレオチドを少なくとも１つの細胞小器官、細胞、組
織または生物体に導入することができる（米国特許第５，５５０，３１８号；米国特許第
５，５３８，８８０号；米国特許第５，６１０，０４２号；およびＰＣＴ出願ＷＯ９４／
０９６９９；そのそれぞれが参照により本明細書に組み込まれる）。この方法は、ＤＮＡ
をコーティングした微粒子銃を高速度に加速し、それにより、細胞膜に穴を開け細胞を死
滅させることなく細胞に進入させることを可能にできることによる（Ｋｌｅｉｎら、（１
９８７年）Ｎａｔｕｒｅ、３２７巻、７０〜７３頁）。多種多様な微粒子銃技法が当技術
分野で公知であり、その多くが本方法に適用可能である。
【０２７１】
この微粒子銃では、１つまたは複数の粒子に少なくとも１つのポリヌクレオチドをコー
ティングし、推進力によって細胞内に送達することができる。小粒子を加速させるための
いくつかのデバイスが開発されてきた。そのようなデバイスの１つは、高圧放電に依拠し
て電流を生じさせ、今度はそれにより原動力をもたらすものである（Ｙａｎｇら、（１９
９０年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８７巻、９５６８〜
９５７２頁）。使用する微粒子銃は、タングステンまたは金の粒子またはビーズなどの生
物学的に不活性な物質からならなければならない。例示的な粒子としては、タングステン
、プラチナで構成される粒子、および、特定の例では、例えばナノ粒子を含めた金で構成
される粒子が挙げられる。一部の場合には、微粒子銃を使用してＤＮＡをレシピエント細
胞に送達するために金属粒子上にＤＮＡを沈殿させる必要がないことが意図されている。
しかし、粒子は、ＤＮＡをコーティングしたものではなく、ＤＮＡを含有するものであっ
てよいことが意図されている。ＤＮＡをコーティングした粒子により、粒子衝撃によるＤ
ＮＡ送達のレベルが上昇し得るが、それ自体は必要ない。
ウイルスベクター媒介性移入の方法の例
【０２７２】
ヌクレオチド配列、またはヌクレオチド配列を含む組成物を細胞または対象に投与し、
したがって、対象の細胞（複数可）によってヌクレオチド配列によりコードされる遺伝子
が発現され得るようにするために適した任意のウイルスベクターを本方法において使用す
ることができる。ある特定の実施形態では、導入遺伝子をウイルス粒子に組み入れて、細
胞への遺伝子移入を媒介させる。一般には、ウイルスを単に生理的条件下で適切な宿主細
胞に曝露し、それにより、ウイルスの取り込みを可能にする。本方法は、以下に考察する
種々のウイルスベクターを使用して有利に利用される。
アデノウイルス
【０２７３】
アデノウイルスは、ＤＮＡゲノムのサイズが中程度であること、操作が容易であること
、力価が高いこと、標的細胞の範囲が広いこと、および感染性が高いことから、遺伝子移
入ベクターとして使用するために特に適している。およそ３６ｋｂのウイルスゲノムに、
ウイルスＤＮＡの複製およびパッケージングに必要なシス作用性エレメントを含有する１
００〜２００塩基対（ｂｐ）の末端逆位配列（ＩＴＲ）を結合させる。異なる転写ユニッ
トを含有するゲノムの初期（Ｅ）領域および後期（Ｌ）領域がウイルスＤＮＡ複製の開始
によって分割される。
【０２７４】
Ｅ１領域（Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ）は、ウイルスゲノムの転写の調節に関与するタンパク
質および数種の細胞遺伝子をコードする。Ｅ２領域（Ｅ２ＡおよびＥ２Ｂ）の発現により
、ウイルスＤＮＡ複製のためのタンパク質の合成がもたらされる。これらのタンパク質は
ＤＮＡ複製、後期遺伝子発現、および宿主細胞の遮断に関与する（Ｒｅｎａｎ，  Ｍ．  
Ｊ．（１９９０年）Ｒａｄｉｏｔｈｅｒ  Ｏｎｃｏｌ、１９巻、１９７〜２１８頁）。大
多数のウイルスカプシドタンパク質を含めた後期遺伝子（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４および
Ｌ５）の産物は、主要な後期プロモーター（ＭＬＰ）によって発せられる単一の一次転写
物の重要なプロセシングの後にのみ発現する。ＭＬＰ（１６．８マップ単位に位置する）
は、感染の後期に特に効率的であり、このプロモーターから発せられるｍＲＮＡの全てが
５’三部分リーダー（ＴＬ）配列を有し、これにより、それらのｍＲＮＡが翻訳に有用な
ものになる。
【０２７５】
アデノウイルスを遺伝子療法に対して最適化するために、ＤＮＡの大きなセグメントを
含めることができるように保有能力を最大にすることが必要である。ある特定のアデノウ
イルスによる産物に付随する毒性および免疫学的反応を低下させることも非常に望ましい
。２つの目標は、アデノウイルスの遺伝子の排除によりどちらの目的も果たされるという
点で、ある程度境界を共にする。本方法を実施することにより、治療用構築物を相対的に
容易に操作することができるままにしながら、これらの目標の両方を実現することが可能
である。
【０２７６】
ウイルスＤＮＡ複製に必要なシスエレメントは全て直鎖状ウイルスゲノムの両末端にあ
る末端逆位配列（ＩＴＲ）（１００〜２００ｂｐ）内に局在するので、ＤＮＡを大幅に置
き換えることが可能である。ＩＴＲを含有するプラスミドは欠陥のないアデノウイルスの
存在下で複製し得る（Ｈａｙ，  Ｒ．Ｔ．ら、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  １９８４年６月
５日；１７５巻（４号）：４９３〜５１０頁）。したがって、これらのエレメントをアデ
ノウイルスベクターに含めることにより、複製が可能になる。
【０２７７】
さらに、ウイルス封入のためのパッケージングシグナルはウイルスゲノムの左側の末端
にある１９４〜３８５ｂｐ（０．５〜１．１マップ単位）の間に局在する（Ｈｅａｒｉｎ
ｇら、Ｊ．（１９８７年）Ｖｉｒｏｌ、６７巻、２５５５〜２５５８頁）。このシグナル
は、特異的な配列が左側の末端の近くであるが、頭部構造へのＤＮＡの挿入のために必要
なタンパク質への結合を媒介する付着末端配列の外側にあるバクテリオファージラムダＤ
ＮＡのタンパク質認識部位を模倣する。ＡｄのＥ１置換ベクターにより、ウイルスゲノム
の左側の末端にある４５０ｂｐ（０〜１．２５マップ単位）の断片を２９３細胞に直接パ
ッケージングできることが実証された（Ｌｅｖｒｅｒｏら、Ｇｅｎｅ、１０１巻：１９５
〜２０２頁、１９９１年）。
【０２７８】
アデノウイルスゲノムのある特定の領域を哺乳動物細胞のゲノムに組み入れ、それによ
り、コードされる遺伝子を発現させることができることが以前に示されている。これらの
細胞株は、その細胞株によりコードされる、アデノウイルスの機能が欠損したアデノウイ
ルスベクターの複製を支持することができるものである。「ヘルプ」ベクター、例えば、
野生型ウイルスまたは条件的に欠陥のある変異体による複製欠損性アデノウイルスベクタ
ーの補完の報告もなされている。
【０２７９】
複製欠損性アデノウイルスベクターはヘルパーウイルスによってトランスに補完され得
る。しかし、複製に関わる機能をもたらすために必要なヘルパーウイルスの存在があらゆ
る調製物を汚染するので、この知見単独では複製欠損性ベクターの単離は可能にならない
。したがって、複製欠損性ベクターの複製および／またはパッケージングに特異性を付加
する追加的なエレメントが必要であった。そのエレメントはアデノウイルスのパッケージ
ング機能に由来するものである。
【０２８０】
アデノウイルスに対するパッケージングシグナルは従来のアデノウイルスマップの左側
の末端に存在することが示されている（Ｔｉｂｂｅｔｔｓら（１９７７年）Ｃｅｌｌ、１
２巻、２４３〜２４９頁）。後の試験により、ゲノムのＥ１Ａ（１９４〜３５８ｂｐ）領
域が欠失した変異体は、初期（Ｅ１Ａ）機能が補完された細胞株においてさえ成長が不十
分であることが示された（ＨｅａｒｉｎｇおよびＳｈｅｎｋ、（１９８３年）Ｊ．  Ｍｏ
ｌ．  Ｂｉｏｌ．  １６７巻、８０９〜８２２頁）。補償性アデノウイルスＤＮＡ（０〜
３５３ｂｐ）を変異体の右側の末端に再結合させると、ウイルスは正常にパッケージング
された。さらなる変異性分析により、Ａｄ５ゲノムの左側の末端に、短い、繰り返される
位置依存性エレメントが同定された。ゲノムのいずれかの末端に存在する場合、１コピー
の反復が効率的なパッケージングのために十分であるが、Ａｄ５  ＤＮＡ分子の内部に移
動する場合にはそうではないことが見いだされた（Ｈｅａｒｉｎｇら、Ｊ．（１９８７年
）Ｖｉｒｏｌ、６７巻、２５５５〜２５５８頁）。
【０２８１】
変異型のパッケージングシグナルを使用することによって、変動する効率でパッケージ
ングされるヘルパーウイルスを創出することが可能である。一般には、変異は点変異また
は欠失である。パッケージングの効率が低いヘルパーウイルスをヘルパー細胞において成
長させる場合、たとえ野生型ウイルスと比較して速度が低下しても、ウイルスをパッケー
ジングし、それにより、ヘルパーの繁殖を可能にする。しかし、これらのヘルパーウイル
スを細胞において野生型パッケージングシグナルを含有するウイルスと一緒に成長させる
と、野生型パッケージングシグナルが変異型よりも優先的に認識される。パッケージング
因子の量が限定されていることを考慮すると、野生型シグナルを含有するウイルスがヘル
パーと比較して選択的にパッケージングされる。この嗜好が十分に大きければ、ストック
手法の均一性を実現することができる。
【０２８２】
特定の組織または種に対するＡＤＶ構築物のトロピズムを改善するために、多くの場合
、受容体結合性線維配列をアデノウイルス分離株間で置換することができる。例えば、ア
デノウイルス５に見出されるコクサッキーウイルス・アデノウイルス受容体（ＣＡＲ）リ
ガンドでアデノウイルス３５由来のＣＤ４６結合性線維配列を置換し、それによりウイル
スのヒト造血細胞に対する結合親和性を著しく改善することができる。生じた「シュード
タイプされた」ウイルス、Ａｄ５ｆ３５は、いくつかの臨床的に開発されたウイルス分離
株の基礎となっている。さらに、ウイルスの標的細胞への再ターゲティングが可能になる
ように線維を改変するための種々の生化学的方法が存在する。方法は、二機能性抗体（一
方の末端がＣＡＲリガンドに結合し、一方の末端が標的配列に結合する）の使用、および
カスタマイズされたアビジンに基づくキメラリガンドとの会合を可能にするための線維の
代謝的ビオチン化を含む。あるいは、リガンド（例えば、抗ＣＤ２０５、異種二官能性リ
ンカー（例えば、ＰＥＧを含有する）によって）、アデノウイルス粒子に付着させること
ができる。
レトロウイルス
【０２８３】
レトロウイルスは、感染細胞において、逆転写のプロセスによってそれらのＲＮＡを二
本鎖ＤＮＡに変換できることを特徴とする一本鎖ＲＮＡウイルスのグループである（Ｃｏ
ｆｆｉｎ、（１９９０年）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  ｅｄ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｒａｖｅ
ｎ  Ｐｒｅｓｓ、１４３７〜１５００頁）。次いで、生じたＤＮＡを細胞の染色体にプロ
ウイルスとして安定に組み込み、ウイルスタンパク質の合成を導く。組み込みにより、ウ
イルス遺伝子配列がレシピエント細胞およびその後裔に保持される。レトロウイルスゲノ
ムは、それぞれカプシドタンパク質、ポリメラーゼ酵素、およびエンベロープ成分をコー
ドするｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖの３つの遺伝子を含有する。ｇａｇ遺伝子から上流に
見出される、ｐｓｉと称される配列は、ゲノムのビリオンへのパッケージングのシグナル
として機能する。２つの長い末端反復（ＬＴＲ）配列がウイルスゲノムの５’末端および
３’末端に存在する。これらは強力なプロモーターおよびエンハンサー配列を含有し、同
様に、宿主細胞のゲノムへの組み込みのために必要である（Ｃｏｆｆｉｎ、１９９０年）
。したがって、例えば、本技術は、例えば、細胞に形質導入するために使用するポリヌク
レオチドを細胞のゲノムに組み込むための細胞を含む。
【０２８４】
レトロウイルスベクターを構築するために、プロモーターをコードする核酸を、ある特
定のウイルス配列の代わりにウイルスゲノムに挿入して、複製欠損性のウイルスを作製す
る。ビリオンを作製するために、ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子およびｅｎｖ遺伝子を含有
するがＬＴＲおよびｐｓｉ成分を伴わないパッケージング細胞株を構築する（Ｍａｎｎら
、（１９８３年）Ｃｅｌｌ、３３巻、１５３〜１５９頁）。ヒトｃＤＮＡをレトロウイル
スＬＴＲおよびｐｓｉ配列と一緒に含有する組換えプラスミドをこの細胞株に導入すると
（例えばリン酸カルシウム沈殿によって）、ｐｓｉ配列により、組換えプラスミドのＲＮ
Ａ転写物がウイルス粒子にパッケージングされ、次いで、これが培養培地中に分泌される
（Ｎｉｃｏｌａｓ，  Ｊ．Ｆ、およびＲｕｂｅｎｓｔｅｉｎ，  Ｊ．Ｌ．Ｒ、（１９８８
年）、Ｖｅｃｔｏｒｓ：  ａ  Ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅｓ、ＲｏｄｒｉｑｕｅｚおよびＤｅｎ
ｈａｒｄｔ編）。ＮｉｃｏｌａｓおよびＲｕｂｅｎｓｔｅｉｎ；Ｔｅｍｉｎら、（１９８
６年）、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ（編）、Ｎｅｗ  Ｙｏ
ｒｋ：  Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、１４９〜１８８頁；Ｍａｎｎら、１９８３年）。組
換えレトロウイルスを含有する培地を採取し、場合によって濃縮し、遺伝子移入のために
使用する。レトロウイルスベクターは広範な細胞型に感染することができる。しかし、多
くの型のトロウイルスの組み込みおよび安定発現には、宿主細胞の分裂が必要である（Ｐ
ａｓｋｉｎｄら、（１９７５年）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、６７巻、２４２〜２４８頁）。
【０２８５】
最近開発された、レトロウイルスベクターの特異的なターゲティングが可能になるよう
に設計された手法は、ガラクトース残基をウイルスエンベロープに化学的に付加すること
によるレトロウイルスの化学修飾に基づく。この修飾により、所望であり得る、肝細胞な
どの細胞へのアシアロ糖タンパク質受容体を介した特異的な感染が可能になり得る。
【０２８６】
組換えレトロウイルスをターゲティングするための異なる手法が設計されており、これ
は、レトロウイルスのエンベロープタンパクを質に対するビオチン化抗体および特異的な
細胞受容体に対するビオチン化抗体を使用するものである。ストレプトアビジンを使用す
ることによって、ビオチン成分を介して抗体がカップリングされた（Ｒｏｕｘら、（１９
８９年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８６巻、９０７９〜
９０８３頁）。主要組織適合性遺伝子複合体クラスＩおよびクラスＩＩ抗原に対する抗体
を使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて狭宿主性ウイルスを用いて、これらの表面抗原を
有する種々のヒト細胞の感染が実証された（Ｒｏｕｘら、１９８９年）。
アデノ随伴ウイルス
【０２８７】
ＡＡＶは、約４７００塩基対の直鎖状の一本鎖ＤＮＡを利用する。末端逆位配列がゲノ
ムに隣接する。２つの遺伝子がゲノム内に存在し、いくつもの別個の遺伝子産物を生じさ
せる。第１のｃａｐ遺伝子は、ＶＰ−１、ＶＰ−２およびＶＰ−３と名付けられた３つの
異なるビリオンタンパク質（ＶＰ）を産生する。第２のｒｅｐ遺伝子は、４つの非構造タ
ンパク質（ＮＳ）をコードする。これらのｒｅｐ遺伝子産物のうちの１つまたは複数は、
ＡＡＶ転写におけるトランス活性化に関与する。
【０２８８】
ＡＡＶの３つのプロモーターは、マップ単位でのそれらのゲノム内の位置によって名付
けられている。これらは、左から右に、ｐ５、ｐ１９およびｐ４０である。転写により、
６つの転写物が生じ、３つのプロモーターのそれぞれで２つが開始され、各対のうちの１
つがスプライスされる。マップ単位４２〜４６に由来するスプライス部位は各転写物につ
いて同じである。４つの非構造タンパク質は、見たところではより長い転写物に由来し、
３つのビリオンタンパク質は全て最小の転写物から生じる。
【０２８９】
ＡＡＶはヒトにおいていかなる病理的状態にも関連しない。興味深いことに、効率的な
複製のために、ＡＡＶは、単純ヘルペスウイルスＩおよびＩＩ、サイトメガロウイルス、
仮性狂犬病ウイルス、および、当然アデノウイルスなどのウイルスからの「ヘルプ」機能
を必要とする。最もよく特徴付けられているヘルパーはアデノウイルスであり、このウイ
ルスの多くの「初期」機能によりＡＡＶ複製が補助されることが示されている。ＡＡＶ  
ｒｅｐタンパク質の低レベル発現によりＡＡＶの構造的な発現が抑えられると考えられて
おり、ヘルパーウイルス感染によりこの妨害が取り除かれると考えられている。
【０２９０】
ＡＡＶベクターの末端反復は、ＡＡＶまたは改変ＡＡＶゲノムを含有するｐ２０１など
のプラスミド制限エンドヌクレアーゼ消化によって（Ｓａｍｕｌｓｋｉら、Ｊ．  Ｖｉｒ
ｏｌ、６１巻：３０９６〜３１０１頁（１９８７年））、または、これだけに限定されな
いが、公開されたＡＡＶの配列に基づいて末端反復を化学的または酵素的に合成すること
を含めた他の方法によって得ることができる。例えば、欠失分析により、機能すること、
すなわち、安定かつ部位特異的に組み込まれることを可能にするために必要なＡＡＶ  Ｉ
ＴＲの最小の配列またはその一部を決定することができる。どの配列の軽微な改変が、末
端反復の安定かつ部位特異的な組み込みを導く能力を維持しながら許容され得るかも決定
することができる。
【０２９１】
ＡＡＶに基づくベクターは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける遺伝子送達のための安全かつ有
効なビヒクルであることが証明されており、これらのベクターは、前臨床段階および臨床
段階で、ｅｘ  ｖｉｖｏとｉｎ  ｖｉｖｏの両方で潜在的な遺伝子療法において広範囲に
適用するために開発され、試験されている（ＣａｒｔｅｒおよびＦｌｏｔｔｅ、（１９９
５年）Ａｎｎ．  Ｎ．Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ、７７０巻；７９〜９０頁；Ｃｈａｔｔ
ｅｉｊｅｅら、（１９９５年）Ａｎｎ．  Ｎ．Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ、７７０巻、７
９〜９０頁；Ｆｅｒｒａｒｉら、（１９９６年）Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ、７０巻、３２２７〜
３２３４頁；Ｆｉｓｈｅｒら、（１９９６年）Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ、７０巻、５２０〜５３
２頁；Ｆｌｏｔｔｅら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、９０
巻、１０６１３〜１０６１７頁、（１９９３年）；Ｇｏｏｄｍａｎら．（１９９４年）、
Ｂｌｏｏｄ、８４巻、１４９２〜１５００頁；Ｋａｐｌｉｔｔら、（１９９４年）Ｎａｔ
’ｌ  Ｇｅｎｅｔ、８巻、１４８〜１５３頁；Ｋａｐｌｉｔｔ，  Ｍ．Ｇ．ら、Ａｎｎ  
Ｔｈｏｒａｃ  Ｓｕｒｇ．  １９９６年１２月；６２巻（６号）：１６６９〜７６頁；Ｋ
ｅｓｓｌｅｒら、（１９９６年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳ
Ａ、９３巻、１４０８２〜１４０８７頁；Ｋｏｅｂｅｒｌら、（１９９７年）Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、９４巻、１４２６〜１４３１頁；Ｍｉｚ
ｕｋａｍｉら、（１９９６年）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２１７巻、１２４〜１３０頁）。
【０２９２】
肺におけるＡＡＶ媒介性の効率的な遺伝子移入および発現が、嚢胞性線維症を処置する
ための臨床試験に至っている（ＣａｒｔｅｒおよびＦｌｏｔｔｅ、１９９５年；Ｆｌｏｔ
ｔｅら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、９０巻、１０６１３
〜１０６１７頁、（１９９３年））。同様に、ジストロフィン遺伝子の骨格筋へのＡＡＶ
媒介性遺伝子送達による筋ジストロフィーの治療の見込み、脳へのチロシンヒドロキシラ
ーゼ遺伝子送達によるパーキンソン病の処置の見込み、肝臓の第ＩＸ因子遺伝子送達によ
る血友病Ｂの処置の見込み、および潜在的に、心臓への血管内皮増殖因子遺伝子による心
筋梗塞の処置の見込みが、これらの器官におけるＡＡＶ媒介性導入遺伝子発現が非常に効
率的であることが最近示されているので、有望であると思われる（Ｆｉｓｈｅｒら、（１
９９６年）Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ、７０巻、５２０〜５３２頁；Ｆｌｏｔｔｅら、１９９３年
；Ｋａｐｌｉｔｔら、１９９４年；１９９６年；Ｋｏｅｂｅｒｌら、１９９７年；ＭｃＣ
ｏｗｎら、（１９９６年）Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ、７１３巻、９９〜１０７頁；Ｐｉｎｇら
、（１９９６年）Ｍｉｃｒｏｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、３巻、２２５〜２２８頁；Ｘｉａ
ｏら、（１９９６年）Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ、７０巻、８０９８〜８１０８頁）。
他のウイルスベクター
【０２９３】
他のウイルスベクターも本方法および組成物において発現構築物として使用される。ワ
クシニアウイルス（Ｒｉｄｇｅｗａｙ、（１９８８年）Ｖｅｃｔｏｒｓ：  Ａ  ｓｕｒｖ
ｅｙ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉ
ｒ  ｕｓｅｓ、４６７〜４９２頁；ＢａｉｃｈｗａｌおよびＳｕｇｄｅｎ、（１９８６年
）Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ、１１７〜１４８頁；Ｃｏｕｐａｒら、Ｇｅｎｅ、６８巻
：１〜１０頁、１９８８年）カナリアポックスウイルス、およびヘルペスウイルスなどの
ウイルスに由来するベクターが使用される。これらのウイルスにより、種々の哺乳動物細
胞への遺伝子移入において使用するためのいくつかの特徴がもたらされる。
【０２９４】
構築物を細胞内に送達したら、導入遺伝子をコードする核酸が異なる部位に位置づけ、
そこで発現させる。ある特定の実施形態では、導入遺伝子をコードする核酸を安定に細胞
のゲノムに組み込む。この組み込みは相同組換え（遺伝子置換）によるコグネイトな位置
および方向のものである、またはランダムな、非特異的な位置に組み込む（遺伝子増大）
。さらに別の実施形態では、核酸を細胞内で別々のエピソームＤＮＡセグメントとして安
定に維持する。そのような核酸セグメントまたは「エピソーム」は、宿主細胞周期とは独
立したまたはそれと同期した維持および複製を可能にするために十分な配列をコードする
。発現構築物をどのように細胞に送達するか、および細胞内のどこに核酸が留まるかは使
用する発現構築物の種類に左右される。
疾患を治療するための方法
【０２９５】
本方法は、細胞を例えば注入によって投与することが有益であり得る疾患を治療または
予防する方法も包含する。
【０２９６】
細胞、例えば、前駆細胞など、例えば、造血幹細胞、間葉系間質細胞、幹細胞、多能性
幹細胞、および胚性幹細胞などを細胞療法に使用することができる。細胞はドナーに由来
するものであってもよく、患者から得た細胞であってもよい。細胞は、例えば、再生、例
えば、疾患細胞の機能を置き換えるために使用され得る。異種遺伝子を発現するように細
胞を改変することができ、したがって、生物学的薬剤を特定の微小環境、例えば、疾患の
ある骨髄または転移性沈着などに送達することができる。また、例えば、間葉系間質細胞
が免疫抑制性活性をもたらすために使用されており、移植片対宿主病および自己免疫障害
の治療において使用することができる。本出願で提供される細胞は、細胞療法後に、細胞
を除去する必要がある状況で有益であり得る安全スイッチを含有する。例えば、いくつか
の状況において、前駆細胞を患者にもたらす場合には、細胞がより成熟した細胞型に不適
切に分化すること、または、例えば治療用細胞を除去することが必要である別の組織への
望ましくない誘引などの有害事象が生じ得る。「治療用細胞」とは、細胞療法のために使
用される細胞、すなわち、状態または疾患を治療または予防するために対象に投与される
細胞を意味する。細胞が負の影響を有する場合には、本方法を使用して、部分的なアポト
ーシスによって治療用細胞を除去することができる。
【０２９７】
他の例では、種々の疾患および状態を処置するため、および幹細胞移植の一部として、
Ｔ細胞を使用する。ハプロタイプ一致Ｔ細胞移植後に起こり得る有害事象は移植片対宿主
病である（ＧｖＨＤ）。ＧｖＨＤが生じる可能性は移植されるＴ細胞の数が増加するほど
高まる。これにより、注入することができるＴ細胞の数が限定される。患者におけるＧｖ
ＨＤの事象に際して、注入されたＴ細胞を選択的に除去選択的に除去できることにより、
より多数のＴ細胞を注入することができ、細胞１０６個超、１０７個超、１０８個超、ま
たは１０９個超まで数を増加させることができる。投与することができる体重１ｋｇ当た
りのＴ細胞の数は、例えば、体重１ｋｇ当たりＴ細胞約１×１０４個〜体重１ｋｇ当たり
Ｔ細胞約９×１０７個、例えば、体重１ｋｇ当たりＴ細胞約１、２、３、４、５、６、７
、８、または９×１０４個；約１、２、３、４、５、６、７、８、または９×１０５；約
１、２、３、４、５、６、７、８、または９×１０６個；または約１、２、３、４、５、
６、７、８、または９×１０７個であり得る。他の例では、Ｔ細胞以外の治療用細胞を使
用することができる。投与することができる体重１ｋｇ当たりの治療用細胞の数は、例え
ば、体重１ｋｇ当たりＴ細胞約１×１０４個〜体重１ｋｇ当たりＴ細胞約９×１０７個、
例えば、体重１ｋｇ当たり治療用細胞約１、２、３、４、５、６、７、８、または９×１
０４；約１、２、３、４、５、６、７、８、または９×１０５；約１、２、３、４、５、
６、７、８、または９×１０６；または約１、２、３、４、５、６、７、８、または９×
１０７個である。
【０２９８】
「単位用量」という用語は、種菌に関しては、哺乳動物に対する単位投薬量として適切
な物理的に別個の単位を指し、各単位が、所望の免疫原性効果が生じるように算出された
所定の数量の医薬組成物を必要な希釈剤と共に含有する。種菌の単位用量の仕様は医薬組
成物の独特の特性および実現される特定の免疫学的効果によって規定され、それに左右さ
れる。
本明細書で提示されている多量体リガンドなどの医薬組成物の有効量は、カスパーゼ−
９発現細胞の６０％超、７０％超、８０％超、８５％超、９０％超、９５％超、または９
７％超、または８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％
未満、２０％未満、または１０％未満が死滅するような、所望の数または濃度の、カスパ
ーゼ−９ベクターを含む細胞の選択的除去のこの選択された結果が実現される量になる。
この用語は、「十分な量」とも同義である。
【０２９９】
任意の特定の適用に対する有効量は、処置される疾患または状態、投与される特定の組
成物、対象のサイズ、および／または疾患の重症度または状態などの因子に応じて変動し
得る。特定の本明細書で提示されている組成物有効量は、過度な実験を必要とせずに経験
的に決定することができる。
【０３００】
「接触させる」および「曝露する」という用語は、細胞、組織または生物体に適用する
場合、本明細書では、例えば化学療法剤もしくは放射線療剤などの医薬組成物および／も
しくは別の薬剤を標的細胞、組織もしくは生物体に送達する、または標的細胞、組織もし
くは生物体の近くに直接置くプロセスを記載するために使用される。細胞の死滅または静
止を実現するために、医薬組成物および／または追加的な薬剤（複数可）を１つまたは複
数の細胞に細胞（複数可）を死滅させるまたは細胞が分裂するのを妨げるために有効な総
量で送達する。
【０３０１】
医薬組成物の投与は、数分から数週間までにわたる間隔で、他の薬剤（複数可）よりも
先に、それと並行して、かつ／またはそれに続いて行うことができる。医薬組成物および
他の薬剤（複数可）を別々に細胞、組織または生物体に適用する実施形態では、一般に、
医薬組成物および薬剤（複数可）が細胞、組織または生物体に対して有利に組み合わさっ
た効果をなお発揮することができるように、各送達の時間の間に著しい期間が過ぎないこ
とを確実にする。例えば、そのような例では、細胞、組織または生物体を２つ、３つ、４
つまたはそれ超のモダリティを用いて実質的に同時に（すなわち、約１分未満以内に）医
薬組成物と接触させることができることが意図されている。他の態様では、１つまたは複
数の薬剤を、発現ベクターを投与する前および／またはその後、実質的に同時に、約１分
から、約２４時間まで、約７日まで、約１〜約８週間またはそれ超まで、およびその中で
導き出せる任意の範囲までの範囲内で投与することができる。さらに、本明細書で提示さ
れている医薬組成物および１つまたは複数の薬剤の種々の併用レジメンを使用することが
できる。
最適化された個人向けの治療的処置
【０３０２】
移植片対宿主病のステージ、または患者に残っている望ましくない治療用細胞の数を決
定することによって、二量体を投与した後のアポトーシスの誘導を最適化することができ
る。
【０３０３】
例えば、患者がＧｖＨＤを有することおよびＧｖＨＤのステージが決定されることによ
り、多量体リガンドを投与することによりカスパーゼ−９関連アポトーシスを誘導する必
要があり得るという指標が臨床医にもたらされる。別の例では、多量体リガンドを用いた
処置後に患者のＧｖＨＤのレベルが低下したことが決定されることにより、追加用量の多
量体リガンドが必要ないことが臨床医に示され得る。同様に、多量体リガンドを用いた処
置後に、患者がＧｖＨＤの症状をし続けていること、またはＧｖＨＤの再発が生じたこと
が決定されることにより、少なくとも１回の追加用量の多量体リガンドを投与する必要が
あり得ることが臨床医に示され得る。「投薬量」という用語は、投薬の量と、例えば次の
用量のタイミングなどの投与の頻度の両方を包含するものとする。「投薬量レベル」とい
う用語は、対象の体重との関連で投与される多量体リガンドの量を指す。したがって、投
薬量レベルを上昇させることは、対象の体重に対して投与するリガンドの量を増加させる
ことを意味する。さらに、例えば、持続注入ポンプを使用して多量体リガンドを投与する
場合などに投与する用量の濃度を上昇させることは、１分ごとまたは１秒ごとに投与する
濃度（したがって、投与する量）を上昇させることを意味する。
【０３０４】
例えば続きの用量の多量体リガンドなどのその後の薬物用量、および／またはその後の
薬物の投薬量の調整または維持の指標は、任意の都合のよい様式で提供することができる
。一部の実施形態では、指標は、表の形態で（例えば、物理的な媒体または電子媒体で）
提供することができる。例えば、移植片対宿主病で観察される症状を表で提供することが
でき、臨床医が症状を疾患のステージの一覧または表と比較することができる。次いで、
臨床医は、表からその後の薬物用量についての指標を同定することができる。ある特定の
実施形態では、症状またはＧｖＨＤのステージがコンピュータにもたらされた後に（例え
ば、コンピュータのメモリに入力された後に）指標をコンピュータによって提示する（例
えば、表示する）ことができる。例えば、この情報をコンピュータにもたらすこと（例え
ば、使用者がコンピュータメモリに入力することまたはコンピュータネットワーク内の遠
隔デバイスによってコンピュータに送ること）ができ、コンピュータ内のソフトウェアに
より、その後の薬物用量の調整または維持についての指標を生成し、かつ／またはその後
の薬物用量の量をもたらすことができる。
【０３０５】
指標に基づいてその後の用量が決定されたら、臨床医は、その後の用量を投与すること
または別の人または実体に用量を調整するよう指示することができる。「臨床医」という
用語は、本明細書で使用される場合、意思決定者を指し、ある特定の実施形態では、臨床
医は医療専門家である。一部の実施形態では、意思決定者はコンピュータまたは表示され
たコンピュータプログラム出力であってよく、健康サービス提供者はコンピュータに表示
された指標またはその後の薬物用量に従って行動することができる。意思決定者は、その
後の用を直接投与する（例えば、その後の用量を対象に注入する）こともでき、遠隔操作
で投与する（例えば、意思決定者がポンプのパラメータを遠隔操作で変化させる）ことも
できる。
【０３０６】
本明細書で提示されている方法は、これだけに限定することなく、活性化された細胞、
核酸、またはそれをコードする発現構築物を有効量で送達することを含む。医薬組成物の
「有効量」は、一般には、規定された所望の結果を検出可能に、かつ繰り返し実現する、
例えば、疾患またはその症状の程度を好転させる、低下させる、最小限にするまたは限定
するために十分な量と定義される。疾患の排除、根絶または治癒を含めた、他のより厳し
い定義が適用され得る。一部の実施形態では、処置の効果を評価するためおよび毒性を制
御するためにバイオマーカーをモニタリングするステップが存在してよい。
製剤および患者への投与経路
【０３０７】
臨床的適用が意図されている場合、医薬組成物−発現構築物、発現ベクター、融合タン
パク質、トランスフェクトまたは形質導入された細胞を意図された適用に適した形態で調
製することが必要になる。一般に、これには、発熱物質、ならびにヒトまたは動物に対し
て有害であり得る他の不純物を基本的に含まない組成物を調製することが伴う。
【０３０８】
例えばＡＰ１９０３などの多量体リガンドを、例えば、対象の体重１ｋｇ当たり約０．
１〜１０ｍｇ、対象の体重１ｋｇ当たり約０．１〜５ｍｇ、対象の体重１ｋｇ当たり約０
．２〜４ｍｇ、対象の体重１ｋｇ当たり約０．３〜３ｍｇ、対象の体重１ｋｇ当たり約０
．３〜２ｍｇ、または対象の体重１ｋｇ当たり約０．３〜１ｍｇ、例えば、対象の体重１
ｋｇ当たり約０．１ｍｇ、０．２ｍｇ、０．３ｍｇ、０．４ｍｇ、０．５ｍｇ、０．６ｍ
ｇ、０．７ｍｇ、０．８ｍｇ、０．９ｍｇ、１．０ｍｇ、１．５ｍｇ、２ｍｇ、２．５ｍ
ｇ、３ｍｇ、３．５ｍｇ、４ｍｇ、４．５ｍｇ、５ｍｇ、６ｍｇ、７ｍｇ、８ｍｇ、９ｍ
ｇ、または１０ｍｇの用量で送達することができる。一部の実施形態では、リガンドを用
量当たり０．４ｍｇ／ｋｇ、例えば、５ｍｇ／ｍＬの濃度で提供する。例えば、リガンド
をバイアル当たり約０．２５ｍｌ〜約１０ｍｌ、例えば、約０．２５ｍｌ、０．５ｍｌ、
１ｍｌ、１．５ｍｌ、２ｍｌ、２．５ｍｌ、３ｍｌ、３．５ｍｌ、４ｍｌ、４．５ｍｌ、
５ｍｌ、５．５ｍｌ、６ｍｌ、６．５ｍｌ、７ｍｌ、７．５ｍｌ、８ｍｌ、８．５ｍｌ、
９ｍｌ、９．５ｍｌ、または１０ｍｌ、例えば、約２ｍｌの体積で含有するバイアルまた
は他の容器を提供することができる。
【０３０９】
一般に、送達ベクターを安定なものにし、標的細胞による取り込みを可能にするために
、適切な塩および緩衝液を使用することが望まれ得る。組換え細胞を患者に導入する際に
も緩衝液を使用することができる。水性組成物は、薬学的に許容される担体または水性媒
体に溶解または分散させた有効量の細胞に対するベクターを含む。そのような組成物は接
種材料とも称される。薬学的に許容される担体としては、任意のかつ全ての溶媒、分散媒
、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤などが挙げられる
。薬学的に活性な物質に対するそのような媒体および薬剤の使用は公知である。任意の従
来の培地または薬剤がベクターまたは細胞と適合しない場合を除く限りでは、治療用組成
物へのその使用が意図されている。補足的な活性成分も組成物中に組み入れることができ
る。
【０３１０】
活性な組成物は、典型的な医薬調製物を含み得る。これらの組成物の投与は、その経路
によって標的組織に到達可能な限りは、任意の一般的な経路を経由する。これらの経路と
しては、例えば、経口、経鼻、頬側、直腸内、口腔内または局部が挙げられる。あるいは
、投与は、同所注射、皮内注射、皮下注射、筋肉内注射、腹腔内注射または静脈内注射に
よるものであってよい。そのような組成物は通常、本明細書で考察されている薬学的に許
容される組成物として投与される。
【０３１１】
注射による使用に適した医薬形態としては、滅菌水溶液または分散液および滅菌注射用
溶液または分散を即時調製するための滅菌粉末が挙げられる。全ての場合において、容易
に注射可能である限りでは、当該形態は滅菌されたものであり、流体である。当該形態は
製造および保管の条件下では安定であり、細菌および真菌などの微生物の混入作用に対し
て保護されている。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロー
ル、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、適切なそれらの
混合物、ならびに植物油を含有する溶媒または分散媒であってよい。妥当な流動性は、例
えば、レシチンなどのコーティングを使用することによって、分散の場合では必要な粒子
サイズを維持することによって、および界面活性物質を使用することによって維持するこ
とができる。微生物の作用の予防は、種々の抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン
、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらすこと
ができる。特定の例では、等張化剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含めることがで
きる。注射用組成物の持続的吸収は、組成物に吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステ
アリン酸アルミニウムおよびゼラチンを使用することによってもたらすことができる。
【０３１２】
経口投与のためには、組成物に賦形剤を組み入れ、非摂取用洗口剤および歯磨剤の形態
で使用することができる。洗口剤は、ホウ酸ナトリウム溶液（ドーベル液）などの適切な
溶媒中に必要量の活性成分を組み入れて調製することができる。あるいは、ホウ酸ナトリ
ウム、グリセリンおよび炭酸水素カリウムを含有する消毒洗浄剤に活性成分を組み入れる
ことができる。例えば、ゲル剤、ペースト剤、散剤およびスラリー剤を含めた歯磨剤中に
活性成分を分散させることもできる。例えば水、結合物質、研磨剤、香味剤、発泡剤、お
よび保湿剤を含み得るペースト歯磨剤に活性成分を治療有効量で添加することができる。
【０３１３】
組成物は、中性または塩の形態に製剤化することができる。薬学的に許容される塩とし
ては、例えば、酸付加塩（タンパク質の遊離のアミノ基と形成される）および、例えば塩
酸もしくはリン酸などの無機酸、または例えば酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸など
の有機酸と形成される塩が挙げられる。遊離のカルボキシル基と形成される塩は、例えば
ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または水酸化第二鉄などの無機塩基
、および例えばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの
有機塩基に由来するものであってもよい。
【０３１４】
製剤化されたら、溶液を投薬製剤と適合する様式で、治療的に有効な量で投与する。製
剤は、例えば注射用溶液、薬物放出カプセル剤などの種々の剤形で容易に投与される。水
溶液中で非経口投与するためには、例えば、必要であれば溶液を適切に緩衝させ、液体希
釈剤をまず十分な生理食塩水またはグルコースを用いて等張性にする。これらの特定の水
溶液は静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与および腹腔内投与に特に適している。これに関
連して、滅菌水性媒体を使用することができる。例えば、１投薬量を等張性ＮａＣｌ溶液
１ｍｌに溶解させ、皮下注入用液１０００ｍｌに添加するか、または提案された注入部位
に注射する（例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃ
ｉｅｎｃｅｓ」、第１５版、１０３５〜１０３８頁および１５７０〜１５８０頁を参照さ
れたい）。投薬量には、処置される対象の状態に応じていくらかの変動必ず生じる。いず
れにしても、投与に関与する人が個々の対象に対して適切な用量を決定する。さらに、ヒ
トへの投与に関しては、調製物を、必要に応じてＦＤＡ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌ
ｏｇｉｃｓ  ｓｔａｎｄａｒｄｓによる滅菌、発熱性、および一般的な安全性および純度
の基準に適合させることができる。
【実施例】
【０３１５】
下記の実施例は、ある特定の実施形態を例示し、当該技術を限定しない。
【０３１６】
ドナー細胞を選択的に除去するための機構が細胞療法に対する安全スイッチとして試験
されてきたが、合併症が生じている。現在までの安全スイッチ遺伝子を用いたいくつかの
実施はＴリンパ球において成されており、これは、これらの細胞を用いた免疫療法がウイ
ルス感染および悪性腫瘍に対して処置として効果的であることが証明されているからであ
る（Ｗａｌｔｅｒ，  Ｅ．Ａ．ら、Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  １９９５年、３
３３巻：１０３８〜４４頁；Ｒｏｏｎｅｙ，  Ｃ．Ｍ．ら、Ｂｌｏｏｄ．  １９９８年、
９２巻：１５４９〜５５頁；Ｄｕｄｌｅｙ，  Ｍ．Ｅ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００２年
、２９８巻：８５０〜５４頁；Ｍａｒｊｉｔ，  Ｗ．Ａ．ら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  
Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ２００３年、１００巻：２７４２〜４７頁）。再発性悪
性腫瘍および造血幹細胞移植後のエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）リンパ球増殖を
処置するためのドナーＴ細胞注入におけるｉｎ  ｖｉｖｏ自殺スイッチとして単純ヘルペ
スウイルスＩ由来のチミジンキナーゼ（ＨＳＶＴＫ）遺伝子が使用されてきた（Ｂｏｎｉ
ｎｉ  Ｃら、Ｓｃｉｅｎｃｅ．  １９９７年、２７６巻：１７１９〜１７２４頁；Ｔｉｂ
ｅｒｇｈｉｅｎ  Ｐら、Ｂｌｏｏｄ．  ２００１年、９７巻：６３〜７２頁）。しかし、
移植片対宿主病を引き起こすＴ細胞の破壊が不完全であり、ＨＳＶ−ＴＫを活性化するた
めにガンシクロビル（または類似体）をプロドラッグとして使用することにより、サイト
メガロウイルス感染に対する抗ウイルス薬としてガンシクロビルを投与することが妨げら
れる。この作用機構には細胞分裂に依拠するＤＮＡ合成の干渉も必要であり、したがって
、細胞死滅が数日に長引き、不完全になり、これにより臨床的利益に非常に長い遅延が生
じる可能性がある（Ｃｉｃｅｒｉ，  Ｆ．ら、Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌ．  ２００９年
、２６２巻：１０１９〜２４頁）。さらに、免疫抑制されたヒト免疫不全ウイルスおよび
骨髄移植患者においてさえＨＳＶ−ＴＫにより導かれる免疫応答によりＨＳＶ−ＴＫを形
質導入した細胞が排除され、これにより、注入されたＴ細胞の持続性、したがって有効性
が損なわれる。ＨＳＶ−ＴＫはまたウイルス由来であり、したがって、潜在的に免疫原性
である（Ｂｏｎｉｎｉ  Ｃら、Ｓｃｉｅｎｃｅ．  １９９７年、２７６巻：１７１９〜１
７２４頁；Ｒｉｄｄｅｌｌ  ＳＲら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ．  １９９６年、２巻：２１６〜２
３頁）。Ｅ  ｃｏｌｉ由来のシトシンデアミナーゼ遺伝子も臨床的に使用されているが（
Ｆｒｅｙｔａｇ  ＳＯら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２００２年、６２巻：４９６８〜４
９７６頁）、異種抗原として免疫原性であり得、したがって、長期間の持続が必要なＴ細
胞に基づく療法と適合しない。モノクローナルキメラ抗ＣＤ２０抗体によって活性化する
ことができるトランスジェニックヒトＣＤ２０が非免疫原性安全性系として提案されてい
る（Ｉｎｔｒｏｎａ  Ｍら、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ２０００年、１１巻：６１
１〜６２０頁）。
【０３１７】
以下の節では、カスパーゼ−９キメラタンパク質を使用して、細胞療法のために使用さ
れる細胞内に安全スイッチをもたらす方法の例が提供される。
（実施例１）
カスパーゼ−９自殺スイッチ発現ベクターの構築および評価
ベクターの構築および発現の確認
【０３１８】
ヒトＴ細胞において安定にかつ効率的に発現させることができる安全スイッチが本明細
書に示されている。当該系は、改変遺伝子を発現する形質導入されたＴ細胞の選択的な排
除を引き起こすことができる小分子二量体化薬と相互作用するように改変された、免疫原
性の潜在性が低いヒト遺伝子産物を含む。さらに、誘導性カスパーゼ−９は、Ｔ細胞にお
いて抗アポトーシス分子を過剰発現する機能を維持する。
【０３１９】
例えばＦＫＢＰ１２ｖ３６などのヒトＦＫ５０６結合性タンパク質（ＦＫＢＰ）と融合
した改変ヒトカスパーゼ−９活性を含む治療剤として使用するために適した発現ベクター
を構築した。カスパーゼ−９／ＦＫ５０６ハイブリッド活性は小分子医薬品を使用して二
量体化することができる。全長型、短縮型、および改変型のカスパーゼ−９活性をリガン
ド結合性ドメイン、または多量体化領域と融合し、蛍光マーカーであるＧＦＰの発現も可
能にするレトロウイルスベクターＭＳＣＶ．ＩＲＥＳ．ＧＲＰに挿入した。図１Ａには、
アポトーシスを誘導するための自殺スイッチとして構築し、評価した全長カスパーゼ−９
発現ベクター、短縮型カスパーゼ−９発現ベクターおよび改変カスパーゼ−９発現ベクタ
ーが例示されている。
【０３２０】
全長誘導性カスパーゼ−９分子（Ｆ’−Ｆ−Ｃ−Ｃａｓｐ９）は、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇ
ｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカーでカスパーゼ分子の小さなサブユニットおよび大
きなサブユニットと連結した２つ、３つ、またはそれ超のＦＫ５０６結合性タンパク質（
ＦＫＢＰ−例えば、ＦＫＢＰ１２ｖ３６バリアント）を含む（図１Ａを参照されたい）。
全長誘導性カスパーゼ−９（Ｆ’Ｆ−Ｃ−Ｃａｓｐ９．Ｉ．ＧＦＰ）は全長カスパーゼ−
９を有し、Ｆ３６Ｖ変異を含有する２つの１２ｋＤａのヒトＦＫ５０６結合性タンパク質
（ＦＫＢＰ１２；ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＨ００２  ８１８）と連結したカスパーゼ動員ドメ
イン（ＣＡＲＤ；ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ００１  ２２９）も含む（図１Ａ）。レトロウイ
ルスにおいて発現させた際の相同組換えを予防するために、ＦＫＢＰ（Ｆ’）のうちの１
つまたは複数のアミノ酸配列はコドンゆらぎ型（例えば、各アミノ酸コドンの３番目のヌ
クレオチドが、最初にコードされたアミノ酸が維持されるサイレント変異によって変更さ
れたもの）であった。Ｆ’Ｆ−Ｃ−Ｃａｓｐ９Ｃ３Ｓは、その活性化部位を乱す、２８７
位におけるシステインからセリンへの変異を含む。構築物Ｆ’Ｆ−Ｃａｓｐ９、Ｆ−Ｃ−
Ｃａｓｐ９、およびＦ’−Ｃａｓｐ９は、それぞれカスパーゼ活性化ドメイン（ＣＡＲＤ
）、１つのＦＫＢＰ、または両方のＦＫＢＰのいずれかが欠失したものであった。全ての
構築物をＭＳＣＶ．ＩＲＥＳ．ＧＦＰにＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ断片としてクローニングし
た。
【０３２１】
これらの構築物のそれぞれを２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、形質導入の４８時間
後に、マーカー遺伝子ＧＦＰの発現をフローサイトメトリーによって分析した。さらに、
トランスフェクションの２４時間後に、２９３Ｔ細胞を１００ｎＭのＣＩＤと一緒に一晩
インキュベートし、その後、アポトーシスのマーカーであるアネキシンＶを用いて染色し
た。４回の別々の実験からの、導入遺伝子の発現レベルの平均および標準偏差（平均ＧＦ
Ｐ）ならびに化学的二量体化誘導物質（ＣＩＤ）に曝露した前後のアポトーシス細胞の数
（ＧＦＰ〜細胞内の％アネキシンＶ）が図１Ａの表の２段目から５段目までに示されてい
る。ＧＦＰ発現のレベルおよびアネキシンＶでの染色に加えて、全長カスパーゼ−９、短
縮型カスパーゼ−９および改変カスパーゼ−９の発現遺伝子産物もウエスタンブロットに
よって分析して、カスパーゼ−９遺伝子が発現しており、発現産物のサイズが予測された
ものであることを確認した。ウエスタンブロットの結果が図１Ｂに示されている。
【０３２２】
トランスフェクトした２９３Ｔ細胞における、予測されたサイズの誘導性カスパーゼ−
９構築物とマーカー遺伝子ＧＦＰの同時発現が、全長カスパーゼ分子および短縮型カスパ
ーゼ分子の両方に存在するアミノ酸残基２９９〜３１８に特異的なカスパーゼ−９抗体な
らびにＧＦＰ特異的抗体を使用したウエスタンブロットによって実証された。ウエスタン
ブロットは、本明細書で提示されている通り実施した。
【０３２３】
トランスフェクトした２９３Ｔ細胞を、アプロチニン、ロイペプチン、およびフッ化フ
ェニルメチルスルホニル（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ、Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ
）を含有する溶解緩衝液（５０％Ｔｒｉｓ／Ｇｌｙ、１０％ドデシル硫酸ナトリウム［Ｓ
ＤＳ］、４％ベータ−メルカプトエタノール、１０％グリセロール、１２％水、４％ブロ
モフェノールブルー、０．５％）に再懸濁させ、氷上で３０分インキュベートした。３０
分遠心分離した後、上清を回収し、Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕ
ｌｅｓ、ＣＡ）と１：２で混合し、煮沸し、１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにロ
ーディングした。ウサギ抗カスパーゼ−９（アミノ酸残基２９９〜３１８）免疫グロブリ
ンＧ（ＩｇＧ；Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ＢｉｏＲｅａｇｅｎｔｓ、Ｇｏｌｄｅｎ、ＣＯ；１：
５００希釈）を用いて、およびマウス抗ＧＦＰ  ＩｇＧ（Ｃｏｖａｎｃｅ、Ｂｅｒｋｅｌ
ｅｙ、ＣＡ；１：２５，０００希釈）を用いて膜をプローブした。次いで、ブロットを適
切なペルオキシダーゼとカップリングした二次抗体に曝露し、増強化学発光（ＥＣＬ；Ａ
ｍｅｒｓｈａｍ、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＩＬ）を用いてタンパク質の発
現を検出した。次いで、膜をはがし、ヤギポリクローナル抗アクチン（Ｓａｎｔａ  Ｃｒ
ｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；１：５００希釈）を用いて再プローブしてローディ
ングの均等性を確認した。
【０３２４】
図１Ｂにおいて見られるサイズがより小さい追加的なバンドは、分解生成物を示す可能
性が高い。Ｆ’Ｆ−Ｃ−Ｃａｓｐ９構築物およびＦ’Ｆ−Ｃａｓｐ９構築物の分解生成物
は、これらの構築物の発現レベルがそれらの基底の活性の結果として低いことに起因して
、検出されない可能性がある。各試料の均等なローディングを、ウエスタンブロットの各
レーンの下に示されている実質的に等量のアクチンによって確認し、これにより、各レー
ンに実質的に同様の量のタンパク質がローディングされたことが示された。
【０３２５】
カスパーゼ−９自殺スイッチ発現構築物の評価
細胞株
【０３２６】
Ｂ  ９５−８  ＥＢＶで形質転換したＢ細胞株（ＬＣＬ）、Ｊｕｒｋａｔ細胞、および
ＭＴ−２細胞（Ｄｒ  Ｓ．  Ｍａｒｒｉｏｔｔ、Ｂａｙｌｏｒ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  
Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸより善意で提供された）を、１０％ウシ胎仔血
清（ＦＢＳ；Ｈｙｃｌｏｎｅ）を含有するＲＰＭＩ１６４０（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａ
ｎ、ＵＴ）中で培養した。ポリクローナルＥＢＶ特異的Ｔ細胞株を４５％ＲＰＭＩ／４５
％Ｃｌｉｃｋｓ（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓａｎｔａ  Ａｎａ、ＣＡ）／
１０％ＦＢＳ中で培養し、以前報告された通り生成した。簡単に述べると、末梢血単核細
胞（２４ウェルプレートのウェル当たり２×１０６個）を、４０００ｒａｄで放射線を照
射した自己由来ＬＣＬを用いて、応答物質対刺激物質（Ｒ／Ｓ）比４０：１で刺激した。
９〜１２日後に、生存細胞を、放射線を照射したＬＣＬを用いてＲ／Ｓ比４：１で再刺激
した。その後、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を、４０Ｕ／ｍＬ〜１００Ｕ／ｍＬの組換え
ヒトインターロイキン２（ｒｈＩＬ−２；Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ；Ｃｈｉｒｏｎ、Ｅｍｅｒ
ｙｖｉｌｌｅ、ＣＡ）の存在下でＬＣＬを用いて週に１回再刺激することによって増大さ
せた。
レトロウイルスによる形質導入
【０３２７】
レトロウイルスの一過性産生のために、ＧｅｎｅＪｕｉｃｅトランスフェクション試薬
（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用して２９３Ｔ細胞にｉＣａｓｐ９／ｉ
Ｆａｓ構築物をｇａｇ−ｐｏｌおよびＲＤ１１４エンベロープをコードするプラスミドと
一緒にトランスフェクトした。トランスフェクションの４８〜７２時間後にウイルスを回
収し、スナップ凍結させ、使用するまで約８０℃で保管した。安定なＦＬＹＲＤ１８由来
のレトロウイルス産生株を、ＶＳＶ−Ｇにシュードタイプされた一過性のレトロウイルス
上清を用いた多数の形質導入によって生成した。導入遺伝子の発現が最も高いＦＬＹＲＤ
１８細胞を単一細胞選別し、最も高いウイルス力価を生じるクローンを増大させ、それを
使用して、リンパ球への形質導入に使用するためのウイルスを産生させた。８週間超にわ
たる継続的な培養の間、このクローンの導入遺伝子の発現、機能、およびレトロウイルス
力価を維持した。ヒトリンパ球への形質導入のために、組織培養物で処理していない２４
ウェルプレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）に組換
えフィブロネクチン断片をコーティングし（ＦＮ  ＣＨ−２９６；Ｒｅｔｒｏｎｅｃｔｉ
ｎ；Ｔａｋａｒａ  Ｓｈｕｚｏ、Ｏｔｓｕ、Ｊａｐａｎ；ＰＢＳ中４μｇ／ｍＬ、４℃で
一晩）、ウェル当たり０．５ｍＬのレトロウイルスと一緒に３７℃で３０分、２回インキ
ュベートした。その後、ウェル当たりＴ細胞３×１０５〜５×１０５個に、１００Ｕ／ｍ
ＬのＩＬ−２の存在下、ウェル当たり１ｍＬのウイルスを使用して４８〜７２時間にわた
って形質導入した。同時発現させたマーカー遺伝子である緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）
の発現をＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で
分析することによって形質導入効率を決定した。機能的研究のために、形質導入したＣＴ
Ｌを、選択しないか、または、示されている通りＭｏＦｌｏ血球計算器（Ｄａｋｏ  Ｃｙ
ｔｏｍａｔｉｏｎ、Ｆｔ  Ｃｏｌｌｉｎｓ、ＣＯ）を使用して、ＧＦＰ発現が低い集団、
ＧＦＰ発現が中程度の集団、もしくはＧＦＰ発現が高い集団に分離した。
アポトーシスの誘導および分析
【０３２８】
示されている濃度のＣＩＤ（ＡＰ２０１８７；ＡＲＩＡＤ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃ
ａｌｓ）をトランスフェクトした２９３Ｔ細胞または形質導入したＣＴＬに添加した。接
着性細胞および非接着性細胞を回収し、アネキシン結合性緩衝液（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎ
ｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）で洗浄した。細胞を、アネキシン−Ｖおよび７−アミ
ノ−アクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）を製造者（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）の説明
書に従って用いて１５分染色した。染色後１時間以内に、細胞をＣｅｌｌＱｕｅｓｔ  ｓ
ｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用したフローサイトメトリー
によって分析した。
細胞毒性アッセイ
【０３２９】
各ＣＴＬ株の細胞傷害活性を以前に示されている通り標準の４時間５１Ｃｒ放出アッセ
イにおいて評価した。標的細胞には、自己由来ＬＣＬ、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラス
Ｉ−不適合ＬＣＬおよびリンフォカインにより活性化されたキラー細胞感受性Ｔ細胞リン
パ腫株ＨＳＢ−２が含まれた。完全培地または１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００（Ｓｉｇｍａ
、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）中でインキュベートした標的細胞を使用して、それぞれ自然
５１Ｃｒ放出および最大５１Ｃｒ放出を決定した。３連のウェルの特異的な溶解の平均百
分率を１００×（実験的放出−自然放出）／（最大放出−自然放出）として算出した。
表現型決定
【０３３０】
以下のモノクローナル抗体を使用して細胞表面表現型を調査した：ＣＤ３、ＣＤ４、Ｃ
Ｄ８（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）およびＣＤ５６およびＴＣＲ−α／β（Ｉｍ
ｍｕｎｏｔｅｃｈ、Ｍｉａｍｉ、ＦＬ）。抗ＮＧＦＲ抗体（Ｃｈｒｏｍａｐｒｏｂｅ、Ａ
ｐｔｏｓ、ＣＡ）を使用してΔＮＧＦＲ−ｉＦａｓを検出した。適切な適合アイソタイプ
対照（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を各実験に使用した。ＦＡＣＳｓｃａｎフロ
ーサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて細胞を分析した。
サイトカイン産生の分析
【０３３１】
ＣＴＬ培養上清中のインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ
−５、ＩＬ−１０、および腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦα）の濃度を、Ｈｕｍａｎ  Ｔｈ１
／Ｔｈ２  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ｂｅａｄ  Ａｒｒａｙ（ＢＤ  Ｐ
ｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を使用して測定し、培養上清中のＩＬ−１２の濃度を酵素結合免疫
吸着検定法（ＥＬＩＳＡ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）に
より、製造者の説明書に従って測定した。
ｉｎ  ｖｉｖｏでの実験
【０３３２】
６〜８週齢の非肥満糖尿病重症複合免疫不全（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）マウスに、放射線を
照射し（２５０ｒａｄ）、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に再懸濁さ
せたＬＣＬ１０×１０６〜１５×１０６個を右側腹部に皮下注射した。２週間後、直径お
よそ０．５ｃｍの腫瘍を有するマウスの尾静脈に、形質導入していないＥＢＶ  ＣＴＬお
よびｉＣａｓｐ９．Ｉ．ＧＦＰ高を形質導入したＥＢＶ  ＣＴＬ（全部で１５×１０６個
）の１：１混合物を注射した。ＣＴＬ注入の４〜６時間前および３日後に、マウスに組換
えｈＩＬ−２（２０００Ｕ；Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ；Ｃｈｉｒｏｎ）を腹腔内注射した。４
日目に、マウスを２群にランダムに分離し、１群にはＣＩＤを与え（５０μｇのＡＰ２０
１８７、腹腔内）および１群には担体のみを与えた（１６．７％プロパンジオール、２２
．５％ＰＥＧ４００、および１．２５％Ｔｗｅｅｎ８０、腹腔内）。７日目に全てのマウ
スを屠殺した。腫瘍をホモジナイズし、抗ヒトＣＤ３（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を
用いて染色した。ＦＡＣＳ分析により、ゲーティングしたＣＤ３＋集団内のＧＦＰ＋細胞
の数を評価した。形質導入していないＣＴＬのみ（全部で１５×１０６個）を受けた対照
群のマウス由来の腫瘍をＣＤ３＋／ＧＦＰ＋細胞の分析において陰性対照として使用した
。
誘導性カスパーゼ−９の発現および機能の最適化
【０３３３】
カスパーゼ３、７、および９をそれらの誘導性安全スイッチ分子としての適合性につい
て、トランスフェクトした２９３Ｔ細胞と形質導入したヒトＴ細胞の両方においてスクリ
ーニングした。誘導性カスパーゼ−９（ｉＣａｓｐ９）のみが、選択されたＣＩＤ（例え
ば、化学的二量体化誘導物質）に対する感受性が付与されるのに十分なレベルで発現した
。最初のスクリーニングにより、おそらく形質導入された細胞が導入遺伝子の基底の活性
により排除されることに起因して、全長ｉＣａｓｐ９をＴ細胞において高レベルで安定に
維持することができないことが示された。ＣＡＲＤドメインは、チトクロムＣおよびアデ
ノシン三リン酸（ＡＴＰ）により駆動されるアポトーシス性プロテアーゼ活性化因子１（
Ａｐａｆ−１）との相互作用によるカスパーゼ−９分子の生理的な二量体化に関与する。
ＣＩＤは自殺スイッチの二量体化および活性化を誘導するために使用するものなので、こ
の場合にはＣＡＲＤドメインの機能は不必要であり、基底の活性を低下させる方法として
ＣＡＲＤドメインの除去を調査した。カスパーゼ−９の活性化には多量体化ではなく二量
体化のみが必要であることを考慮して、活性化をもたらす方法として単一のＦＫＢＰ１２
ｖ３６ドメインも調査した。
【０３３４】
得られた短縮形態および／または改変形態のカスパーゼ−９（例えば、ＣＡＲＤドメイ
ン、または２つのＦＫＢＰドメインのうちの１つまたはその両方が除去されている）の活
性を比較した。活性化部位が乱された構築物であるＦ’Ｆ−Ｃ−Ｃａｓｐ９Ｃ−＞Ｓによ
り、非機能性対照がもたらされる（図１Ａを参照されたい）。全ての構築物を、レトロウ
イルスの長い末端反復（ＬＴＲ）により導入遺伝子の発現を導き、配列内リボソーム進入
部位（ＩＲＥＳ）を使用することによって同じｍＲＮＡから増強されたＧＦＰを同時発現
させるレトロウイルスベクターＭＳＣＶ２６にクローニングした。トランスフェクトした
２９３Ｔ細胞では、全ての誘導性カスパーゼ−９構築物の予測されたサイズでの発現なら
びにＧＦＰの同時発現がウエスタンブロットによって実証された（図１Ｂを参照されたい
）。タンパク質の発現（ＧＦＰの平均蛍光によって推定され、ウエスタンブロットで可視
化される）は、非機能性構築物Ｆ’Ｆ−Ｃ−Ｃａｓｐ９Ｃ−＞Ｓにおいて最も高く、全長
構築物Ｆ’Ｆ−Ｃ−Ｃａｓｐ９では著しく減弱した。ＣＡＲＤ（Ｆ’Ｆ−Ｃａｓｐ９）、
１つのＦＫＢＰ（Ｆ−Ｃ−Ｃａｓｐ９）、またはその両方（Ｆ−Ｃａｓｐ９）を除去する
ことにより、誘導性カスパーゼ−９とＧＦＰの両方の発現が次第に高くなり、対応して、
ＣＩＤに対する感受性が増強された（図１Ａを参照されたい）。これらの結果に基づいて
、Ｆ−Ｃａｓｐ９構築物（以降ｉＣａｓｐ９Ｍと称される）をヒトＴリンパ球におけるさ
らなる試験に使用した。
ヒトＴリンパ球におけるｉＣａｓｐ９Ｍの安定発現
【０３３５】
遺伝子操作された細胞が持続する限りは自殺遺伝子の発現が必要であるので、自殺遺伝
子発現の長期間安定性が最も重要である。Ｔ細胞への形質導入に関しては、高力価のＲＤ
１１４にシュードタイプされたウイルスを産生するＦＬＹＲＤ１８由来のレトロウイルス
生産クローンを生成して、Ｔ細胞への形質導入を容易にした。ＥＢＶ特異的ＣＴＬ株は機
能および特異性がよく特徴付けられており、ＥＢＶ関連悪性腫瘍を予防および処置するた
めのｉｎ  ｖｉｖｏ療法としてすでに使用されているので、ＥＢＶ特異的ＣＴＬ株（ＥＢ
Ｖ−ＣＴＬ）におけるｉＣａｓｐ９Ｍ発現を評価した。レトロウイルスを用いた単回の形
質導入後に、７０％超（５つの異なるドナーにおいて、平均７５．３％；７１．４％〜８
３．０％の範囲）の一貫したＥＢＶ−ＣＴＬの形質導入効率が得られた。ＥＢＶ−ＣＴＬ
におけるｉＣａｓｐ９Ｍの発現は、選択または導入遺伝子機能の喪失を伴わずに形質導入
後少なくとも４週間にわたって安定であった。
ｉＣａｓｐ９Ｍにより、形質導入されたＴ細胞の特性は変更されない
【０３３６】
ｉＣａｓｐ９Ｍの発現によりＴ細胞の特性が変更されないことを確実にするために、形
質導入していないＥＢＶ−ＣＴＬまたは非機能性のｉＣａｓｐ９Ｃ−＞Ｓを形質導入した
ＥＢＶ−ＣＴＬの表現型、抗原特異性、増殖潜在性、および機能を、ｉＣａｓｐ９Ｍを形
質導入したＥＢＶ−ＣＴＬのものと比較した。４つの別々のドナーにおいて、形質導入し
たＣＴＬおよび形質導入していないＣＴＬは、同数のＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ５６＋、
およびＴＣＲα／β＋細胞からなった（図２Ａを参照されたい）。同様に、ＩＦＮ−γ、
ＴＮＦα、ＩＬ−１０、ＩＬ−４、ＩＬ−５、およびＩＬ−２を含めたサイトカインの産
生はｉＣａｓｐ９Ｍ発現によって変更されなかった（図２Ｂを参照されたい）。ｉＣａｓ
ｐ９Ｍを形質導入したＥＢＶ−ＣＴＬにより、形質導入していないＣＴＬおよび対照形質
導入ＣＴＬと同等の自己由来ＬＣＬが特異的に溶解された（図２Ｃを参照されたい）。ｉ
Ｃａｓｐ９Ｍの発現は、指数関数的に成長しているＣＴＬの成長特性に影響を及ぼさず、
重要なことに、抗原およびＩＬ−２への増殖の依存は保護された（図２Ｄを参照されたい
）。図２Ａおよび２Ｂは、抗原刺激時のＴＨ１型サイトカインおよびＴＨ２型サイトカイ
ンの表現型データおよび分泌データのグラフである。図２Ｃは、形質導入後１５日目〜１
８日目の、自己由来ＥＢＶで形質転換したリンパ芽球様Ｂ細胞株（ＬＣＬ）、ＨＬＡ不適
合ＬＣＬ、およびＨＳＢ−２（ＬＡＫ細胞標的）に対する細胞傷害活性のレベルを、形質
導入していないＥＢＶ特異的ＣＴＬ（ＥＢＶ−ＣＴＬ）（白棒）、Ｆ−Ｃａｓｐ９Ｍを形
質導入したＥＢＶ特異的ＣＴＬ（ＥＢＶ−ＣＴＬ）（黒棒）、およびＦ’Ｆ−Ｃ−Ｃａｓ
ｐ９Ｃ−＞Ｓを形質導入したＥＢＶ特異的ＣＴＬ（ＥＢＶ−ＣＴＬ）（点模様の棒）と比
較して例示するグラフである（形質導入後の２回の抗原による刺激）。３連のウェルの平
均および標準偏差が示されている。４つの異なるドナー由来ＥＢＶ−ＣＴＬを使用した実
験の例が示されている。図２Ｄは、ｉＣａｓｐ９Ｍ形質導入ＣＴＬの抗原依存を例示する
グラフである。形質導入後の２１日目に、自己由来ＬＣＬおよびＩＬ−２を用いた通常の
週に１回の抗原による刺激を継続した（黒色のひし形）または中止した（黒色の四角）。
抗原刺激の中止により、Ｔ細胞の一定の減退がもたらされた。
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける導入遺伝子の高発現に関して選択されたＴリンパ球の９９％
超の排除
【０３３７】
ＣＴＬにおける誘導性ｉＣａｓｐ９Ｍの効力を、ＣＩＤの投与後のＧＦＰ発現細胞の喪
失をモニタリングすることによって試験した；単一の１０ｎＭ用量のＣＩＤの後にＧＦＰ
＋細胞の９１．３％（５つの異なるドナーにおいて８９．５％〜９２．６％の範囲）が排
除された（図３Ａを参照されたい）。ＣＩＤへの曝露時間にかかわらず同様の結果が得ら
れた（範囲、１時間〜継続的）。全ての実験において、ＣＩＤ処理後に残存したＣＴＬの
導入遺伝子の発現は低く、ＣＩＤ後のＧＦＰの平均蛍光強度は７０％（範囲、５５％〜８
２％）低下した。抗原による刺激、その後の２回目の１０ｎＭ用量のＣＩＤにより、生存
しているＧＦＰ＋Ｔ細胞のさらなる排除を得ることはできなかった。したがって、非応答
性ＣＴＬはＣＩＤによる機能活性化のためには不十分なｉＣａｓｐ９Ｍを発現する可能性
が最も高かった。低発現レベルとＣＩＤに対するＣＴＬ非応答の間の相関を調査するため
に、ＣＴＬを、連結したマーカー遺伝子ＧＦＰの低発現、中発現および高発現に関して選
別し、ＣＩＤに誘導されるアポトーシスに応答する形質導入されたＴ細胞の数の正確な定
量化を可能にするために同じドナー由来の形質導入していないＣＴＬと１：１で混合した
。
【０３３８】
排除される形質導入されたＴ細胞の数は、ＧＦＰ導入遺伝子発現のレベルが上昇するに
つれて増加した（図４Ａ、図４Ｂおよび図４Ｃを参照されたい）。導入遺伝子の発現とｉ
Ｃａｓｐ９Ｍの機能の間の相関を決定するために、ｉＣａｓｐ９Ｍ  ＩＲＥＳ．ＧＦＰを
形質導入したＥＢＶ−ＣＴＬをＧＦＰの低発現（平均２１）、ＧＦＰの中発現（平均８０
）およびＧＦＰの高発現（平均１８９）に関して選択した（図４Ａを参照されたい）。選
択されたＴ細胞を１０ｎＭのＣＩＤと一緒に一晩インキュベートし、その後、アネキシン
Ｖおよび７−ＡＡＤを用いて染色した。アネキシンＶ＋＋／７−ＡＡＤ−Ｔ細胞およびア
ネキシンＶ＋／７−ＡＡＤ＋Ｔ細胞の百分率が示されている（図４Ｂを参照されたい）。
選択されたＴ細胞を、形質導入されていないＴ細胞と１：１で混合し、抗原による刺激後
に１０ｎＭのＣＩＤと一緒にインキュベートした。７日目の残留ＧＦＰ陽性Ｔ細胞の百分
率が示されている（図４Ｃを参照されたい）。
【０３３９】
ＧＦＰ高選択された細胞に関しては、１０ｎＭのＣＩＤにより、形質導入された細胞の
９９．１％（９８．７％〜９９．４％の範囲）が消失した（図３Ａを参照されたい）。抗
原刺激の当日に、Ｆ−Ｃａｓｐ９Ｍ．Ｉ．ＧＦＰを形質導入したＣＴＬを無処理のままに
したか、または１０ｎＭのＣＩＤを用いて処理した。７日後に、ＣＩＤに対する応答をＧ
ＦＰについてのフローサイトメトリーによって測定した。ＣＩＤ処理後の残留ＧＦＰ＋細
胞の正確な測定を可能にするために、形質導入されたＴ細胞の百分率を５０％に調整した
。選択されていないＣＴＬにおけるＣＩＤに対する応答（図３Ａの上の段）とＧＦＰ高選
択されたＣＴＬにおけるＣＩＤに対する応答（図３Ａの下の段）を比較した。残留ＧＦＰ
＋細胞の百分率が示されている（図３Ａを参照されたい）。
【０３４０】
ＧＦＰ高選択された細胞における急速なアポトーシスの誘導は、ＣＩＤを投与してから
１４時間以内の細胞の縮小および断片化などのアポトーシス特性によって実証される（図
３Ｂを参照されたい）。１０ｎＭのＣＩＤと一緒に一晩インキュベートした後、Ｆ−Ｃａ
ｓｐ９Ｍ．Ｉ．ＧＦＰ高を形質導入したＴ細胞は、顕微鏡レベルの評価により、細胞の縮
小および断片化などのアポトーシス特性を有した。高発現に関して選択されたＴ細胞のう
ち６４％（５９％〜６９％の範囲）がアポトーシス性表現型を有し（アネキシン−Ｖ＋＋
／７−ＡＡＤ−）、３０％（２６％〜３２％の範囲）が壊死性表現型を有した（アネキシ
ンＶ＋／７−ＡＡＤ＋）（図３Ｃを参照されたい）。アポトーシスのマーカーを用いた染
色により、Ｔ細胞の６４％がアポトーシス性表現型を有し（アネキシンＶ＋、７−ＡＡＤ
−、右下の四半分）および３２％が壊死性表現型（アネキシンＶ＋、７−ＡＡＤ＋、右上
の  四半分）ことが示された。３回の別々の実験の代表例が示されている。
【０３４１】
対照的に、アポトーシスの誘導は、ＧＦＰの中発現またはＧＦＰの低発現に関して選択
されたＴ細胞では有意に低かった（図４Ａ、図４Ｂおよび図４Ｃを参照されたい）。した
がって、臨床的適用のためには、高コピー数、高発現レベル、または高コピー数と高発現
レベルの両方に関する選択を可能にする選択マーカーを伴う型の発現構築物が望ましい可
能性がある。ＣＩＤに誘導されるアポトーシスは汎カスパーゼ阻害物質ｚＶＡＤ−ｆｍｋ
（１００μＭ、ＣＩＤを添加する前に１時間）によって阻害された。ＣＩＤの力価測定に
より、１ｎＭのＣＩＤが最大の消失効果を得るために十分であることが示された（図３Ｄ
）。示されている量のＣＩＤ（ＡＰ２０１８７）を使用した用量反応曲線により、Ｆ−Ｃ
ａｓｐ９Ｍ．Ｉ．ＧＦＰ高のＣＩＤに対する感受性が示されている。示されている量のＣ
ＩＤの投与後７日目にＧＦＰ＋細胞の生存を測定する。各時点についての平均および標準
偏差が示されている。健康な志願者に投与した際に有害作用が実質的にないことが臨床的
に示されている別の化学的二量体化誘導物質（ＣＩＤ）、ＡＰ１９０３を使用して同様の
結果が得られた。用量反応は形質導入後少なくとも４週間にわたって変化しないままであ
った。
ｉＣａｓｐ９Ｍは抗アポトーシス分子を発現する悪性細胞において機能的である
【０３４２】
臨床使用するための誘導性アポトーシス促進分子として、以前に提示されたｉＦａｓお
よびｉＦＡＤＤではなくカスパーゼ−９を選択した。これは、カスパーゼ−９がアポトー
シスシグナル伝達の比較的後期で作用し、したがって、アポトーシス阻害物質による阻害
を受けにくいことが予想されるからである。したがって、抗アポトーシス分子を発現する
悪性の形質転換されたＴ細胞株においてだけでなく、記憶細胞の長期間の保護を確実にす
るプロセスの一部として抗アポトーシス分子の発現が上昇している正常なＴ細胞の亜集団
においても自殺機能が保護されるはずである。この仮説をさらに調査するために、ｉＣａ
ｓｐ９ＭおよびｉＦａｓの機能をまずＥＢＶ−ＣＴＬにおいて比較した。ベクターに基づ
く差異のあらゆる潜在性を排除するために、誘導性ＦａｓもｉＣａｓｐ９と同じくＭＳＣ
Ｖ．ＩＲＥＳ．ＧＦＰベクターで発現させた。これらの実験のために、ΔＮＧＦＲ．ｉＦ
ａｓ．Ｉ．ＧＦＰおよびｉＣａｓｐ９Ｍ．Ｉ．ＧＦＰを形質導入したＣＴＬをＧＦＰ高発
現に関して選別し、形質導入していないＣＴＬと１：１比で混合して、ｉＦａｓまたはｉ
Ｃａｓｐ９Ｍのいずれかを同等の割合かつ同様のレベルで発現する細胞集団を得た（図５
Ａを参照されたい）。ΔＮＧＦＲ−ｉＦａｓ．Ｉ．ＧＦＰを形質導入したＥＢＶ−ＣＴＬ
が図５Ａの左側のパネルに示されている。ｉＣａｓｐ９Ｍ．Ｉ．ＧＦＰを形質導入したＥ
ＢＶ−ＣＴＬが図５Ａの右側のパネルに示されている。ＥＢＶ−ＣＴＬを高ＧＦＰ発現に
関して選別し、示されている通り形質導入していないＣＴＬと１：１で混合した。ΔＮＧ
ＦＲ＋／ＧＦＰ＋およびＧＦＰ＋Ｔ細胞の百分率が示されている。
【０３４３】
１０ｎＭのＣＩＤを投与した後のＧＦＰ＋細胞の排除は、ｉＣａｓｐ９Ｍにおいて、ｉ
Ｆａｓを形質導入したＣＴＬよりも急速かつ効率的であった（ＣＩＤの７日後、ｉＦａｓ
を形質導入した細胞の８９．３％＋／−４．９％と比較して、ｉＣａｓｐ９Ｍを形質導入
した細胞の９９．２％＋／−０．１４％；Ｐ＜．０５；図５Ｂを参照されたい）。ＬＣＬ
刺激の当日に、１０ｎＭのＣＩＤを投与し、示されている時点でＧＦＰを測定してＣＩＤ
に対する応答を決定した。黒色のひし形はΔＮＧＦＲ−ｉＦａｓ．Ｉ．ＧＦＰについての
データを示し、黒色の四角はｉＣａｓｐ９Ｍ．Ｉ．ＧＦＰについてのデータを示す。３回
の実験の平均および標準偏差が示されている。
【０３４４】
ｉＣａｓｐ９ＭおよびｉＦａｓの機能を、ｃ−ＦＬＩＰ発現およびｂｃｌ−ｘＬ発現に
起因して、２種の悪性Ｔ細胞株：Ｊｕｒｋａｔ、アポトーシス感受性Ｔ細胞白血病株、お
よびＭＴ−２、アポトーシス−抵抗性Ｔ細胞株においても比較した。Ｊｕｒｋａｔ細胞お
よびＭＴ−２細胞にｉＦａｓおよびｉＣａｓｐ９Ｍを同様の効率で形質導入し（Ｊｕｒｋ
ａｔでは９２％対８４％、ＭＴ−２では７６％対７０％）、１０ｎＭのＣＩＤの存在下で
８時間培養した。アネキシン−Ｖ染色により、ｉＦａｓおよびｉＣａｓｐ９Ｍにより同数
のＪｕｒｋａｔ細胞でアポトーシスが誘導されたが（それぞれ５６．４％＋／−１５．６
％および５７．２％＋／−１８．９％）、ＭＴ−２細胞ではｉＣａｓｐ９Ｍの活性化によ
ってのみアポトーシスがもたらされた（ｉＦａｓおよびｉＣａｓｐ９Ｍについて、それぞ
れ１９．３％＋／−８．４％および５７．９％＋／−１１．９％；図５Ｃを参照されたい
）ことが示された。
【０３４５】
ヒトＴ細胞株Ｊｕｒｋａｔ（左側）およびＭＴ−２（右側）にΔＮＧＦＲ−ｉＦａｓ．
Ｉ．ＧＦＰ（図５Ｃの上の段）またはｉＣａｓｐ９Ｍ．Ｉ．ＧＦＰ（図５Ｃの下の段）を
形質導入した。同等の百分率のＴ細胞に自殺遺伝子のそれぞれが形質導入された：Ｊｕｒ
ｋａｔではΔＮＧＦＲ−ｉＦａｓ．Ｉ．ＧＦＰが９２％、対してｉＣａｓｐ９Ｍ．Ｉ．Ｇ
ＦＰが８４％、ＭＴ−２ではΔＮＧＦＲ−ｉＦａｓ．Ｉ．ＧＦＰが７６％、対してｉＣａ
ｓｐ９Ｍ．Ｉ．ＧＦＰが７０％。Ｔ細胞を無処理のままにしたか、または１０ｎＭのＣＩ
Ｄと一緒にインキュベートした。ＣＩＤに曝露した８時間後に、アポトーシスをアネキシ
ンＶおよび７−ＡＡＤでの染色によって測定した。３回の実験の代表例が示されている。
ＰＥはフィコエリトリンを示す。これらの結果から、アポトーシス阻害分子を過剰発現す
るＴ細胞では、ｉＦａｓの機能が遮断される可能性があるが、それでもｉＣａｓｐ９Ｍに
より有効にアポトーシスが誘導されることが実証される。
免疫調節性導入遺伝子を発現するＴ細胞のｉＣａｓｐ９Ｍ媒介性排除
【０３４６】
ｉＣａｓｐ９Ｍにより、活性な導入遺伝子産物を発現するように遺伝子改変された細胞
を有効に破壊することができるかどうかを決定するために、ＩＬ−１２を安定に発現する
ＥＢＶ−ＣＴＬを排除するｉＣａｓｐ９Ｍの能力を測定した。ＩＬ−１２は形質導入して
いないＣＴＬおよびｉＣａｓｐ９Ｍ．ＩＲＥＳ．ＧＦＰを形質導入したＣＴＬの上清では
検出不可能であったが、ｉＣａｓｐ９Ｍ．ＩＲＥＳ．ＩＬ−１２を形質導入した細胞の上
清は３２４ｐｇ／ｍＬ  〜７６２ｐｇ／ｍＬのＩＬ−１２を含有した。しかし、１０ｎＭ
のＣＩＤを投与した後には、上清中のＩＬ−１２は検出不可能なレベル（＜８ｐｇ／ｍＬ
）にまで低下した。したがって、導入遺伝子高発現細胞の事前選別を行わなくても、ｉＣ
ａｓｐ９Ｍの活性化は、生物学的に意味のあるレベルのＩＬ−１２を産生する全てのＴ細
胞を完全に排除するために十分なものである（図６）。ＩＬ−１２と同時発現させた際の
ｉＣａｓｐ９Ｍの機能が図６において棒グラフで表されている。ｉＣａｓｐ９Ｍ．Ｉ．Ｇ
ＦＰ構築物におけるマーカー遺伝子ＧＦＰを、ヒトＩＬ−１２のｐ４０サブユニットおよ
びｐ３５サブユニットをコードするｆｌｅｘｉ  ＩＬ−１２で置き換えた。ｉＣａｓｐ９
Ｍ．Ｉ．ＧＦＰを形質導入したＥＢＶ−ＣＴＬおよびｉＣａｓｐ９Ｍ．Ｉ．ＩＬ−１２を
形質導入したＥＢＶ−ＣＴＬをＬＣＬで刺激し、次いで、無処理のままにした、または１
０ｎＭのＣＩＤに曝露した。第２の抗原による刺激の３日後に、培養上清中のＩＬ−１２
のレベルをＩＬ−１２  ＥＬＩＳＡによって測定した（このアッセイの検出限界は８ｐｇ
／ｍＬである）。３連のウェルの平均および標準偏差が示されている。２つの異なるドナ
ー由来のＣＴＬを用いた２回の実験のうちの１回の結果が示されている。
ｉｎ  ｖｉｖｏにおける、導入遺伝子の高発現に関して選択されたＴ細胞の９９％超の
排除
【０３４７】
ｉＣａｓｐ９Ｍの機能をｉｎ  ｖｉｖｏにおいても形質導入したＥＢＶ−ＣＴＬで評価
した。養子免疫療法のためにＳＣＩＤマウス−ヒト異種移植片モデルを使用した。形質導
入していないＣＴＬとｉＣａｓｐ９Ｍ．ＩＲＥＳ．ＧＦＰ高を形質導入したＣＴＬの１：
１混合物を、自己由来ＬＣＬ異種移植片を有するＳＣＩＤマウスに静脈内注入した後、マ
ウスをＣＩＤまたは担体のみの単回用量で処置した。ＣＩＤ／担体投与の３日後に、腫瘍
をヒトＣＤ３＋／ＧＦＰ＋細胞について分析した。ヒト抗ＣＤ３抗体を使用して注入産物
の非形質導入成分が検出されたことにより、ＣＩＤを受けたマウスへの尾部静脈注入の成
功が確認された。ＣＩＤを用いて処置したマウスでは、担体単独を用いて注入処置したマ
ウスと比較して、ヒトＣＤ３＋／ＧＦＰ＋Ｔ細胞の数が９９％超減少し、これにより、ｉ
Ｃａｓｐ９Ｍを形質導入したＴ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける同
等に高い感受性が実証される（図７を参照されたい）。
【０３４８】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるｉＣａｓｐ９Ｍの機能が図７にグラフで例示されている。ＮＯ
Ｄ／ＳＣＩＤマウスに放射線を照射し、１０×１０６〜１５×１０６のＬＣＬを皮下注射
した。１４日後に、直径０．５ｃｍの腫瘍を有するマウスに合計１５×１０６個のＥＢＶ
−ＣＴＬを与えた（これらの細胞の５０％は形質導入していないものであり、５０％がｉ
Ｃａｓｐ９Ｍ．Ｉ．ＧＦＰを形質導入し、高ＧＦＰ発現について選別したものであった）
。ＣＴＬ投与後３日目に、マウスにＣＩＤ（５０μｇのＡＰ２０１８７；（黒色のひし形
、ｎ＝６）または担体のみ（黒色の四角、ｎ＝５）のいずれかを与え、６日目に、腫瘍内
のヒトＣＤ３＋／ＧＦＰ＋Ｔ細胞の存在を分析した。形質導入していないＣＴＬのみを与
えた対照群のマウス（１５×１０６個のＣＴＬ；ｎ＝４）の腫瘍から単離したヒトＣＤ３
＋Ｔ細胞を腫瘍内のＣＤ３＋／ＧＦＰ＋Ｔ細胞の分析の陰性対照として使用した。
考察
【０３４９】
本明細書では、一部の実施形態において、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて遺伝子改変Ｔ細胞を
排除するために適した自殺遺伝子を発現する発現ベクターが提示される。本明細書で提示
されている自殺遺伝子発現ベクターは、改変性遺伝子を有する全ての細胞における安定な
同時発現、細胞死を引き出すために十分に高いレベルでの発現、基底の活性が低いこと、
特異的活性が高いこと、および内在性抗アポトーシス分子の影響の受けやすさが最小限で
あることを含めた、ある特定の非限定的な有利な特徴を有する。本明細書では、ある特定
の実施形態において、基底の活性が低く、それによりヒトＴ細胞において４週間超にわた
って安定発現が可能になる誘導性カスパーゼ−９、ｉＣａｓｐ９Ｍが提示される。１０ｎ
Ｍ用量の小分子化学的二量体化誘導物質（ＣＩＤ）が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖ
ｉｖｏのどちらにおいても、ｉＣａｓｐ９Ｍを形質導入し、導入遺伝子の高発現に関して
選択された細胞の９９％超を死滅させるために十分である。さらに、Ｔｈ１サイトカイン
ＩＬ−１２と同時発現させると、導入遺伝子の高発現に関する選択を行わなくても、ｉＣ
ａｓｐ９Ｍの活性化により、検出可能なＩＬ−１２産生細胞の全てが排除される。カスパ
ーゼ−９は、大多数の抗アポトーシス分子の下流で作用し、したがって、レベルが上昇し
たｂｃｌ−２ファミリーの抗アポトーシス分子の存在にかかわらず、ＣＩＤに対する高感
受性が保護される。したがって、ｉＣａｓｐ９Ｍは、アポトーシスに対して比較的抵抗性
である形質転換されたＴ細胞および記憶Ｔ細胞に対してさえも、その破壊を誘導するため
に有用であることも証明され得る。
【０３５０】
他のカスパーゼ分子とは異なり、タンパク質分解はカスパーゼ−９の活性化のために十
分でないと思われる。結晶学的データおよび機能的データから、不活性カスパーゼ−９単
量体の二量体化により、コンフォメーションの変化に誘導される活性化が導かれることが
示されている。生理的環境におけるプロカスパーゼ−９の濃度は、約２０ｎＭの範囲内で
あり、二量体化に必要な閾値を十分に下回る。
【０３５１】
理論に限定されることなく、二量体化に対するエネルギー障壁は、チトクロムＣおよび
ＡＴＰによって駆動されるＡｐａｆ−１のＣＡＲＤドメインとカスパーゼ−９の間の同種
親和性相互作用により克服することができると考えられる。２つのＦＫＢＰとつながった
カスパーゼ−９の過剰発現により、自然二量体化の発生が可能になり得、最初の全長カス
パーゼ−９構築物で観察された毒性が説明され得る。１つのＦＫＢＰを除去した後に毒性
の低下および遺伝子発現の増加が観察され、これは、自然二量体化に関連する毒性の低下
に起因する可能性が最も高い。多くの場合、多量体化が表面細胞死受容体の活性化に関与
するが、カスパーゼ−９の二量体化は、活性化を媒介するために十分であるはずである。
本明細書で提示されているデータから、単一のＦＫＢＰを有するｉＣａｓｐ９構築物が２
つのＦＫＢＰを有するものと同様に有効に機能することが示される。ＣＡＲＤドメインを
除去することによってＣＩＤに対する感受性を増大させることは、ＣＩＤ結合の際の二量
体化のエネルギー閾値の低下を示し得る。
【０３５２】
ＨＳＶ−ＴＫおよびシトシンデアミナーゼなどのウイルス由来または細菌由来の致死遺
伝子の持続および機能は、ウイルスまたは細菌に由来する致死遺伝子を発現している細胞
に対する望ましくない免疫応答によって損なわれる。ＦＫＢＰおよびｉＣａｓｐ９Ｍの成
分を形成するアポトーシス促進分子はヒト由来の分子であり、したがって、免疫応答が誘
導される可能性が低い。ＦＫＢＰとカスパーゼ−９の間のリンカーおよびＦＫＢＰドメイ
ンにおける単一の点変異により新規のアミノ酸配列が導入されるが、配列はｉＦａｓを形
質導入したＴ細胞のマカクレシピエントによって免疫学的に認識されなかった。さらに、
ｉＣａｓｐ９Ｍの成分はヒト由来の分子であるので、ＨＳＶ−ＴＫなどのウイルス由来の
タンパク質とは異なり、接合部の配列に特異的な記憶Ｔ細胞はレシピエントに存在しない
はずであり、それにより、ｉＣａｓｐ９Ｍを形質導入されたＴ細胞が免疫応答媒介性排除
されるリスクが低下する。
【０３５３】
誘導性ＦａｓまたはＦａｓ関連デスドメインタンパク質（ＦＡＤＤ）のデスエフェクタ
ードメイン（ＤＥＤ）を使用した以前の試験により、形質導入された細胞のおよそ１０％
が破壊性遺伝子の活性化に対して無反応性であることが示された。本明細書で提示されて
いる実験において観察された通り、ＣＩＤに対する不応答性についての可能性のある説明
は、導入遺伝子の低発現である。ＣＩＤ投与後に残存した、我々の試験でｉＣａｓｐ９Ｍ
を形質導入したＴ細胞および他者による試験でｉＦａｓを形質導入したＴ細胞は導入遺伝
子の発現のレベルが低かった。認められているレトロウイルスの「位置効果」を克服する
ための試みにおいて、レトロウイルス組み込み体にニワトリベータ−グロビンクロマチン
インスレーターを隣接させることにより均一な導入遺伝子の発現レベルの上昇が実現され
た。クロマチンインスレーターを付加することにより、形質導入した２９３Ｔ細胞の発現
の均一性が劇的に増大したが、形質導入した初代Ｔ細胞における有意な効果はなかった。
発現レベルが高いＴ細胞を選択することにより、二量体化剤に対する応答の変動性が最小
化された。高ＧＦＰ発現について選別された形質導入されたＴ細胞の９９％超が、１０ｎ
ＭのＣＩＤの単回投与後に排除された。これにより、高レベルの自殺遺伝子を発現してい
る細胞を、選択マーカーを使用して単離することができるという仮説の裏付けが実証され
る。
【０３５４】
非常に少数の抵抗性残留細胞により毒性の復活が引き起こされる可能性があり、最大２
ｌｏｇの消失効率により、この可能性が有意に低下する。臨床使用のためには、短縮型ヒ
トＮＧＦＲ、ＣＤ２０、またはＣＤ３４などの非免疫原性選択マーカー（例えば、ＧＦＰ
の代わりに）と同時発現させることにより、導入遺伝子を高発現しているＴ細胞の選択が
可能になる。自殺スイッチ（例えば、ｉＣＡＳＰ９Ｍ）と適切な選択マーカー（例えば、
短縮型ヒトＮＧＦＲ、ＣＤ２０、ＣＤ３４など、およびこれらの組合せ）の同時発現は、
配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）または自己切断性配列（例えば２Ａ）を含有する
融合タンパク質の翻訳後修飾のいずれかを使用して得ることができる。対照的に、唯一の
安全性の懸念が導入遺伝子に媒介される毒性（例えば、人工Ｔ細胞受容体、サイトカイン
など、またはこれらの組合せ）である状況では、ｉＣａｓｐ９Ｍと導入遺伝子の発現の密
接な関連により、生物学的に意味のあるレベルの治療用導入遺伝子を発現している細胞の
実質的に全てを排除することが可能になるので、この選択ステップは不必要になり得る。
これは、ｉＣａｓｐ９ＭとＩＬ−１２を同時発現させることにより実証された。ｉＣａｓ
ｐ９Ｍの活性化により、あらゆる測定可能なＩＬ−１２産生が実質的に排除された。導入
遺伝子の発現およびその後の「自殺スイッチ」の活性化の成功は、導入遺伝子の機能およ
び活性に左右され得る。
【０３５５】
ＣＩＤに対する不応答性についての別の可能性のある説明は、高レベルのアポトーシス
阻害物質によりＣＩＤ媒介性アポトーシスが弱められる可能性があることである。阻害物
質の例としては、通常アポトーシスと生存の間の平衡を調節するｃ−ＦＬＩＰ、ｂｃｌ−
２ファミリーメンバーおよびアポトーシスタンパク質の阻害物質（ＩＡＰ）が挙げられる
。例えば、ｃ−ＦＬＩＰおよびｂｃｌ−２の上方制御により、記憶プールが確立されるよ
うに運命づけられたＴ細胞の亜集団が、コグネイトな標的または抗原提示細胞に応答した
活性化誘導性細胞死に対して抵抗性になる。いくつかのＴ−リンパ系腫瘍では、細胞生存
が有利になり、アポトーシスと生存の間の生理的平衡が乱される。自殺遺伝子により、記
憶細胞および悪性に形質転換した細胞を含めた実質的に全ての形質導入されたＴ細胞が消
失するべきである。したがって、選択された誘導性自殺遺伝子は、抗アポトーシス分子の
レベルが上昇している中で、その活性の実質的に全てではないにしろ、かなりの部分を保
持するべきである。
【０３５６】
ｉＦａｓ（またはｉＦＡＤＤ）の位置がアポトーシスシグナル伝達経路の頂点であるこ
とにより、ｉＦａｓ（またはｉＦＡＤＤ）はアポトーシスの阻害物質の攻撃を特に受けや
すいままになり、したがって、これらの分子はアポトーシス性安全スイッチの重要な成分
としてあまり適さないものになる。カスパーゼ３またはカスパーゼ７は、末端エフェクタ
ー分子としてよく適すると思われるが、いずれも初代ヒトＴ細胞において機能的なレベル
で発現させることができない。したがって、ｃ−ＦＬＩＰおよび抗アポトーシス性ｂｃｌ
−２ファミリーメンバーの阻害効果を迂回するという点でアポトーシス経路の十分に後期
で機能し、また、機能的なレベルで安定に発現させることもできるカスパーゼ−９を自殺
遺伝子として選択した。アポトーシスのＸ連鎖阻害物質（ＸＩＡＰ）は理論的には自然カ
スパーゼ−９活性化を低下させ得るが、ＡＰ２０１８７（またはＡＰ１９０３）のＦＫＢ
ＰＶ３６に対する親和性が高いことにより、この非共有結合により会合するＸＩＡＰが取
って代わられ得る。ｉＦａｓとは対照的に、ｉＣａｓｐ９Ｍは、ｂｃｌ−ｘＬを含めた抗
アポトーシス分子を過剰発現する形質転換されたＴ細胞株において機能的なままである。
【０３５７】
ヒトＴ細胞によりオンコレトロウイルスベクターから発現させるために特に設計された
誘導性安全スイッチが本明細書で提示される。ｉＣａｓｐ９Ｍは、最適な消失効果のため
に必要な用量で安全であることが証明されている小さな化学的二量体化誘導物質であるＡ
Ｐ１９０３（または類似体）によって活性化することができ、また、ガンシクロビルまた
はリツキシマブとは異なり、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける他の生物学的影響を有さない。した
がって、養子移入のためにこの自殺遺伝子をＴ細胞において発現させることにより、安全
性を増大させることができ、臨床的適用の範囲を広げることもでき得る。
（実施例２）
ハプロタイプ一致幹細胞移植後のアロ枯渇Ｔ細胞の安全性を改善するための、ｉＣａｓ
ｐ９自殺遺伝子の使用
【０３５８】
本実施例では、ハプロタイプ一致幹細胞移植後のアロ枯渇Ｔ細胞の安全性を改善するた
めの発現構築物および発現構築物の使用方法が提示される。ｉＣａｓｐ９および選択マー
カー（短縮型ＣＤ１９）をコードするレトロウイルスベクターをドナーＴ細胞に対する安
全スイッチとして生成した。アロ枯渇（抗ＣＤ２５免疫毒素を使用する）の後でさえ、ド
ナーＴ細胞を効率的に形質導入し、増大させ、その後、ＣＤ１９免疫磁気選択によって９
０％超の純度まで富化させることができる。工学的に操作された細胞は抗ウイルス特異性
および機能性を保持し、調節性の表現型および機能を有するサブセットを含有した。小分
子二量体化剤を用いてｉＣａｓｐ９を活性化することにより、９０％超のアポトーシスが
急速に生じた。休止Ｔ細胞では導入遺伝子の発現が下方制御されたが、ｉＣａｓｐ９は、
活性化された（アロ反応性の）Ｔ細胞における発現が急速に上方制御されたので効率的な
自殺遺伝子のままであった。
材料および方法
アロ枯渇Ｔ細胞の生成
【０３５９】
アロ枯渇細胞を以前に示されている通り健康な志願者から生成した。簡単に述べると、
健康なドナー由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、放射線を照射したレシピエントエプ
スタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）で形質転換したリンパ芽球様細胞株（ＬＣＬ）と、応
答物質対刺激物質比４０：１、無血清培地（ＡＩＭ  Ｖ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒ
ｌｓｂａｄ、ＣＡ）中で共培養した。７２時間後に、ＣＤ２５を発現した活性化Ｔ細胞を
、ＲＦＴ５−ＳＭＰＴ−ｄｇＡ免疫毒素の下で一晩インキュベートすることによって共培
養物から枯渇させた。残留ＣＤ３＋ＣＤ２５＋集団が１％未満であり、３Ｈ−チミジンの
組み入れによる残留増殖が１０％未満であった場合にアロ枯渇が適切であるとみなした。
プラスミドおよびレトロウイルス
【０３６０】
ＳＦＧ．ｉＣａｓｐ９．２Ａ．ＣＤ１９は、切断可能な２Ａ様配列を介して短縮型ヒト
ＣＤ１９（ＣＤ１９；図８Ａを参照されたい）と連結した誘導性カスパーゼ−９（ｉＣａ
ｓｐ９）からなる。ｉＣａｓｐ９は、Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカー
を介してヒトカスパーゼ−９（ＣＡＳＰ９；ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ００１２２９）と接続
した、Ｆ３６Ｖ変異を有するヒトＦＫ５  ０６結合性タンパク質（ＦＫＢＰ１２；Ｇｅｎ
Ｂａｎｋ  ＡＨ００２  ８１８）からなる。Ｆ３６Ｖ変異により、ＦＫＢＰ１２の合成ホ
モ二量体化剤ＡＰ２０１８７またはＡＰ１９０３に対する結合親和性が増大する。カスパ
ーゼ動員ドメイン（ＣＡＲＤ）は、その生理機能がＦＫＢＰ１２で置き換えられており、
当該ドメインを除去することにより導入遺伝子の発現および機能が増大するので、ヒトカ
スパーゼ−９配列から欠失させてある。２Ａ様配列は、グリシンと末端プロリン残基の間
の９９％超の切断を媒介し、それにより、ｉＣａｓｐ９のＣ末端に１９個の付加的なアミ
ノ酸、およびＣＤ１９のＮ末端に１つの付加的なプロリン残基をもたらすＴｈｏｓｅａ  
ａｓｉｇｎａ昆虫ウイルス由来の２０アミノ酸のペプチドをコードする。ＣＤ１９は、細
胞質内のドメインが２４２アミノ酸から１９アミノ酸まで短くなり、リン酸化の潜在的な
部位である保存されたチロシン残基が全て除去される、全長ＣＤ１９（ＧｅｎＢａｎｋ  
ＮＭ００１７７０）がアミノ酸３３３（ＴＤＰＴＲＲＦ）において短縮されたものからな
る。
【０３６１】
テナガザル白血病ウイルス（Ｇａｌ−Ｖ）にシュードタイプされたレトロウイルスを産
生する安定なＰＧ１３クローンを、Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ｅｃｏ細胞株（ＡＴＣＣ  ｐｒｏｄ
ｕｃｔ  ＃ＳＤ３４４４；ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）にＳＦＧ．ｉＣａｓｐ９
．２Ａ．ＣＤ１９を一過性にトランスフェクトすることによって作出した。これにより、
Ｅｃｏにシュードタイプされたレトロウイルスが生じた。ＰＧ１３パッケージング細胞株
（ＡＴＣＣ）に、Ｅｃｏにシュードタイプされたレトロウイルスを用いて３回形質導入し
て、細胞当たり多数のＳＦＧ．ｉＣａｓｐ９．２Ａ．ＣＤ１９プロウイルス組み込み体を
含有する産生株を生成した。単一細胞クローニングを実施し、最も高い力価を生じたＰＧ
１３クローンを増大させ、ベクターを作製するために使用した。
レトロウイルスによる形質導入
【０３６２】
Ｔ細胞を活性化し、増大させるための培養培地は、４５％ＲＰＭＩ１６４０（Ｈｙｃｌ
ｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）、４５％Ｃｌｉｃｋｓ（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉ
ｃ、Ｓａｎｔａ  Ａｎａ、ＣＡ）および１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；Ｈｙｃｌｏｎｅ）
からなった。レトロウイルスベクターを形質導入する前に４８時間にわたって、固定化し
た抗ＣＤ３（ＯＫＴ３；Ｏｒｔｈｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ、ＮＪ）
によってアロ枯渇細胞を活性化した（図８Ｂを参照されたい）。図８Ｂには、形質導入さ
れた導入遺伝子を発現する「最終的な細胞産物」を産生するためのプロセスの概要が示さ
れている。ドナーＰＢＭＣをレシピエントＥＢＶ−ＬＣＬと共培養することによって選択
的なアロ枯渇を実施して、アロ反応性細胞を活性化した。活性化された細胞はＣＤ２５を
発現し、その後、抗ＣＤ２５免疫毒素によって排除された。アロ枯渇細胞をＯＫＴ３によ
って活性化し、４８時間後にレトロウイルスベクターを形質導入した。形質導入の４日目
に免疫磁気選択を実施し、陽性画分をさらに４日間増大させ、凍結保存した。
【０３６３】
小規模実験において、組織培養物で処理していない２４ウェルプレート（Ｂｅｃｔｏｎ
Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を、１ｇ／ｍｌのＯＫＴ３を用いて３
７℃で２〜４時間コーティングした。アロ枯渇細胞をウェル当たり細胞１×１０６個で添
加した。２４時間の時点で、１００Ｕ／ｍｌの組換えヒトインターロイキン２（ＩＬ−２
）（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ；Ｃｈｉｒｏｎ、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＣＡ）を添加した。活
性化の４８時間後にレトロウイルスによる形質導入を実施した。組織培養物で処理してい
ない２４ウェルプレートに３．５μｇ／ｃｍ２の組換えフィブロネクチン断片（ＣＨ−２
９６；Ｒｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎ；Ｔａｋａｒａ  Ｍｉｒｕｓ  Ｂｉｏ、Ｍａｄｉｓｏｎ、
ＷＩ）をコーティングし、そのウェルにレトロウイルスベクターを含有する上清をウェル
当たり０．５ｍｌで２回、３７℃で３０分にわたってローディングし、その後、ＯＫＴ３
により活性化された細胞を新鮮なレトロウイルスベクターを含有する上清、および１００
Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を補充したＴ細胞培養培地に３：１の比でウェル当たり細胞５×１０
５個でプレーティングした。細胞を２〜３日後に回収し、５０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２の存在
下で増大させた。
遺伝子改変アロ枯渇細胞のスケールアップ産生
【０３６４】
臨床的な適用のための形質導入プロセスのスケールアップに、１μｇ／ｍｌのＯＫＴ３
１０ｍｌまたは７μｇ／ｍｌのフィブロネクチン１０ｍｌを４℃で一晩コーティングし
た、組織培養物で処理していないＴ７５フラスコ（Ｎｕｎｃ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ
）を使用した。細胞接着を増加させるためにコロナ処理したフッ素化エチレンプロピレン
バッグ（２ＰＦ−００７２ＡＣ、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｆｌｕｏｒｏｓｅａｌ  Ｃｏｒｐｏ
ｒａｔｉｏｎ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）も使用した。アロ枯渇細胞を、ＯＫＴ
３をコーティングしたフラスコに１ｍｌ当たり細胞１×１０６個で播種した。次の日に１
００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を添加した。レトロウイルスによる形質導入のために、レトロネ
クチンをコーティングしたフラスコまたはバッグにレトロウイルスを含有する上清１０ｍ
ｌを２〜３時間にわたってローディングした。ＯＫＴ３−活性化Ｔ細胞を、１００Ｕ／ｍ
ｌのＩＬ−２を補充した、新鮮なレトロウイルスベクターを含有する培地およびＴ細胞培
養培地に３：１の比で１ｍｌ当たり細胞１×１０６個で播種した。翌朝細胞を回収し、組
織培養物で処理したＴ７５またはＴ１７５フラスコ中、約５０Ｕ／ｍｌから１００Ｕ／ｍ
ｌまでの間のＩＬ−２を補充した培養培地に１ｍｌ当たり細胞約５×１０５個から１ｍｌ
細胞８×１０５個の間の播種密度で増大させた。
ＣＤ１９免疫磁気選択
【０３６５】
ＣＤ１９についての免疫磁気選択を形質導入の４日後に実施した。細胞をモノクローナ
ルマウス抗ヒトＣＤ１９抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ
）とコンジュゲートした常磁性マイクロビーズで標識し、小規模実験ではＭＳまたはＬＳ
カラムで、および大規模実験ではＣｌｉｎｉＭａｃｓ  Ｐｌｕｓ  ａｕｔｏｍａｔｅｄ  
ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｄｅｖｉｃｅで選択した。ＣＤ１９により選択された細胞をさらに
４日間増大させ、形質導入の８日後に凍結保存した。これらの細胞を「遺伝子改変アロ枯
渇細胞」と名付けた。
免疫表現型調査および五量体分析
【０３６６】
フローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒおよびＣｅｌｌＱｕｅｓｔ  ｓｏ
ｆｔｗａｒｅ；Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を、以下の抗体を使用して実施した
：ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４５ＲＡ、
ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ５６およびＣＤ６２Ｌ。ＣＤ１９−ＰＥ（Ｃｌｏｎｅ４Ｇ７；Ｂｅｃ
ｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）により最適な染色がもたらされることが見出され、これを
その後の全ての分析に使用した。形質導入していない対照を使用してＣＤ１９についての
陰性ゲーティングを設定した。ＨＬＡ五量体であるＨＬＡ−Ｂ８−ＲＡＫＦＫＱＬＬ（Ｐ
ｒｏｉｍｍｕｎｅ、Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ、ＶＡ）を使用してＥＢＶ溶解性抗原（ＢＺ
ＬＦ１）由来のエピトープを認識するＴ細胞を検出した。ＨＬＡ−Ａ２−ＮＬＶＰＭＶＡ
ＴＶ五量体を使用してＣＭＶ−ｐｐ６５抗原由来のエピトープを認識するＴ細胞を検出し
た。
抗ウイルス応答についてのインターフェロン−ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ
【０３６７】
ＥＢＶ、ＣＭＶおよびアデノウイルス抗原に対する応答を評価するためのインターフェ
ロン−ＥＬＩＳｐｏｔを、公知の方法を使用して実施した。形質導入の８日後に凍結保存
した遺伝子改変アロ枯渇細胞を解凍し、応答物質細胞として使用する前にＩＬ−２を伴わ
ない完全培地中で一晩静置した。同じドナー由来の凍結保存ＰＢＭＣを比較器として使用
した。応答物質細胞をウェル当たり細胞２×１０５個、１×１０５個、５×１０４個およ
び２．５×１０４個の段階希釈物中で、連または３連でプレーティングした。刺激物質細
胞をウェル当たり１×１０５個でプレーティングした。ＥＢＶに対する応答に関しては、
４０Ｇｙでの放射線を照射したドナー由来のＥＢＶ−ＬＣＬを刺激物質として使用した。
アデノウイルスに対する応答に関しては、Ａｄ５ｆ３５アデノウイルスを感染させたドナ
ー由来の活性化された単球を使用した。
【０３６８】
簡単に述べると、ドナーＰＢＭＣを、２４ウェルプレート中、Ｘ−Ｖｉｖｏ  １５（Ｃ
ａｍｂｒｅｘ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）中で一晩プレーティングし、翌朝回収
し、Ａｄ５ｆ３５を感染多重度（ＭＯＩ）２００で２時間にわたって感染させ、洗浄し、
３０Ｇｙの放射線を照射し、刺激物質として使用した。抗ＣＭＶ応答に関しては、ＣＭＶ
ｐｐ６５導入遺伝子をコードするＡｄ５ｆ３５アデノウイルス（Ａｄ５ｆ３５−ｐｐ６
５）をＭＯＩ５０００で使用する同様のプロセスを使用した。特異的なスポット形成単位
（ｓｐｏｔ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ）（ＳＦＵ）を、応答物質単独のウェルからのＳ
ＦＵおよび刺激物質単独のウェルからのＳＦＵを試験ウェルから引き算することによって
算出した。ＣＭＶに対する応答はＡｄ５ｆ３５−ｐｐ６５ウェルとＡｄ５ｆ３５ウェルの
間のＳＦＵの差異であった。
ＥＢＶ特異的細胞傷害性
【０３６９】
遺伝子改変アロ枯渇細胞を、４０Ｇｙの放射線を照射したドナー由来のＥＢＶＬＣＬを
用いて応答物質：刺激物質比４０：１で刺激した。９日後に、培養物を応答物質：刺激物
質比４：１で再刺激した。再刺激を示されている通り週に１回実施した。２ラウンドまた
は３ラウンドの刺激後、ドナーＥＢＶ−ＬＣＬを標的細として使用し、ドナーＯＫＴ３芽
球を自己由来対照として使用した４時間５１Ｃｒ放出アッセイで細胞傷害性を測定した。
３０倍過剰の低温Ｋ５６２細胞を加えることによってＮＫ活性を阻害した。
化学的二量体化誘導物質、ＡＰ２０１８７を用いたアポトーシスの誘導
【０３７０】
ＣＤ１９免疫磁気選択の翌日に小分子合成ホモ二量体化剤、ＡＰ２０１８７（Ａｒｉａ
ｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ；Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）を最終濃度１０ｎＭ
で添加することによって自殺遺伝子の機能性を評価した。２４時間の時点で細胞をアネキ
シンＶおよび７−アミノアクチノマイシン（７−ＡＡＤ）（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ
）で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。アネキシンＶと７−ＡＡＤの両方
について陰性の細胞を生存可能とみなし、アネキシンＶ陽性の細胞をアポトーシス性とみ
なし、アネキシンＶと７−ＡＡＤの両方について陽性の細胞を壊死性とみなした。二量体
化によって誘導される死滅の百分率を以下の通りベースライン生存能力に対して補正した
：死滅の百分率＝１００％−（ＡＰ２０１８７で処理した細胞の％生存能力÷無処理の細
胞の％生存能力）。
培養の延長および再活性化後の導入遺伝子の発現の評価
【０３７１】
細胞を、５０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を含有するＴ細胞培地中で形質導入後２２日目まで維
持した。１ｇ／ｍｌのＯＫＴ３および１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８（Ｃｌｏｎｅ  ＣＤ２８
．２、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）をコーティングした２４
ウェルプレート上で細胞の一部を４８〜７２時間にわたって再活性化した。形質導入後２
４日目または２５日目に、再活性化した細胞と再活性化していない細胞の両方におけるＣ
Ｄ１９発現および自殺遺伝子の機能を測定した。
【０３７２】
いくつかの実験では、同様に、細胞を形質導入後３週間にわたって培養し、３０Ｇの放
射線を照射した同種異系ＰＢＭＣを応答物質：刺激物質比１：１で用いて刺激した。４日
間共培養した後、細胞の一部を１０ｎＭのＡＰ２０１８７で処理した。２４時間の時点で
アネキシンＶ／７−ＡＡＤ染色によって死滅を測定し、バイスタンダーウイルス特異的Ｔ
細胞に対する二量体化剤の効果をＡＰ２０１８７処理した細胞および無処理の細胞に対す
る五量体分析によって評価した。
調節性Ｔ細胞
【０３７３】
遺伝子改変アロ枯渇細胞におけるＣＤ４、ＣＤ２５およびＦｏｘｐ３発現を、フローサ
イトメトリーを使用して解析した。ヒトＦｏｘｐ３染色に関しては、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎ
ｃｅ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）染色セットを適切なラットＩｇＧ２ａアイソタイプ対
照と共に使用した。これらの細胞を表面ＣＤ２５−ＦＩＴＣおよびＣＤ４−ＰＥと共染色
した。アロ枯渇および遺伝子改変後に選択されたＣＤ４＋２５＋細胞をカルボキシフルオ
レセイン二酢酸Ｎ−スクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識した自己由来ＰＢＭＣ
と共培養することによって機能分析を実施した。まず抗ＣＤ８マイクロビーズ（Ｍｉｌｔ
ｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）を使用してＣＤ８＋細胞を枯渇させ、そ
の後、抗ＣＤ２５マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ａｕｂｕｒｎ、Ｃ
Ａ）を使用して正の選択を行うことによってＣＤ４＋２５＋選択を実施した。自己由来Ｐ
ＢＭＣを、１．５μＭのＣＦＳＥを含有するリン酸緩衝生理食塩水中１ｍｌ当たり２×１
０７個で１０分インキュベートすることによってＣＦＳＥ標識を実施した。同体積のＦＢ
Ｓを添加し、３７℃で１０分インキュベートすることによって反応を停止させた。細胞を
使用する前に２回洗浄した。ＣＦＳＥで標識したＰＢＭＣを、５００ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ
３および４０Ｇで放射線を照射した同種異系ＰＢＭＣフィーダーをＰＢＭＣ：同種異系フ
ィーダー比５：１で用いて刺激した。次いで、細胞を、同数の自己由来ＣＤ４＋２５＋遺
伝子改変アロ枯渇細胞を伴ってまたは伴わずに培養した。５日間培養した後に、細胞分裂
をフローサイトメトリーによって分析した。ＣＤ１９を使用して、ＣＦＳＥで標識されな
かったＣＤ４＋ＣＤ２５＋遺伝子改変Ｔ細胞をゲーティングアウトした。
統計解析
【０３７４】
対応のある両側スチューデントｔ検定を使用して試料間の差異の統計的有意性を決定し
た。全てのデータは、平均±１標準偏差として示されている。
結果
選択的にアロ枯渇させたＴ細胞はｉＣａｓｐ９を効率的に形質導入し、増大させること
ができる
【０３７５】
臨床プロトコールの手順に従って選択的なアロ枯渇を実施した。簡単に述べると、３／
６〜５／６のＨＬＡ不適合ＰＢＭＣおよびリンパ芽球様細胞株（ＬＣＬ）を共培養した。
７２時間共培養した後にＲＦＴ５−ＳＭＰＴ−ｄｇＡ免疫毒素を適用し、残留する増殖が
１０％未満であり（平均４．５±２．８％；範囲０．７４〜９．１％；１０回の実験）、
含有される残留ＣＤ３＋ＣＤ２５＋細胞が１％未満である（平均０．２３±０．２０％；
範囲０．０６〜０．７３％；１０回の実験）アロ枯渇細胞を確実に作製し、それにより、
選択的なアロ枯渇に関する放出基準を満たし、その後の操作の出発材料としての機能を果
たした。
【０３７６】
固定化ＯＫＴ３上で４８時間にわたって活性化したアロ枯渇細胞には、ＳＦＧ．ｉＣａ
ｓｐ９．２Ａ．ＣＤ１９をコードする、Ｇａｌ−Ｖにシュードタイプされたレトロウイル
スベクターを効率的に形質導入することができた。形質導入の２〜４日後にＣＤ１９発現
についてのＦＡＣＳ分析によって評価された形質導入効率は約５３％±８％であり、小規
模（２４ウェルプレート）形質導入の結果と大規模（Ｔ７５フラスコ）形質導入の結果は
同等であった（それぞれ６回の実験および４回の実験で約５５±８％対約５０％±１０％
）。細胞数はＯＫＴ３活性化後の最初の２日間で縮小し、したがって、形質導入の当日に
はアロ枯渇細胞の約６１％±１２％（約４５％〜８０％の範囲）しか回収されなかった（
図９を参照されたい）。図９には、形質導入後にアロ枯渇細胞を首尾よく増大させること
ができるかを決定するために実施した実験の結果がグラフにより例示されている。黒色の
ひし形はフラスコおよびバッグで実施した大規模実験を指す。白抜きの丸は２４ウェルプ
レートで実施した小規模実験を指す。その後、細胞は有意な増大を示し、その後の８日間
にわたる平均増大は約９４±４６倍の範囲（約４０〜約１５３の範囲）であり、正味５８
±３３倍の増大がもたらされた。小規模実験および大規模実験のどちらにおいても細胞増
大は同様であり、正味の増大は、５回の小規模実験では約４５±２９倍（約２５〜約９０
の範囲）であり、３回の大規模実験では約７９±３４倍（約５０〜約１１６の範囲）であ
った。
ΔＣＤ１９により、免疫磁気カラムにおける形質導入された細胞の効率的かつ選択的な
富化が可能になる
【０３７７】
自殺遺伝子活性化の効率は、時には自殺遺伝子自体の機能性に左右され、時には遺伝子
改変細胞を富化するために使用する選択系に左右される。ＣＤ１９による選択により純度
および収率が十分な遺伝子改変細胞の選択が可能になるか、および選択によりその後の細
胞の成長に何らかの悪影響があるかどうかを決定するために、選択マーカーとしてのＣＤ
１９の使用を調査した。製造者の説明書に従って小規模選択を実施したが、細胞１．３×
１０７個当たりＣＤ１９マイクロビーズ１０ｌを使用する場合には大規模選択が最適であ
ることが決定された。抗ＣＤ１９マイクロビーズによる干渉を最小限にするために、免疫
磁気選択の２４時間後にＦＡＣＳ分析を実施した。免疫磁気選択後の細胞の純度は一貫し
て９０％超であり、ＣＤ１９＋細胞の平均百分率は小規模選択では約９８．３％±０．５
％の範囲内（ｎ＝５）であり、大規模ＣｌｉｎｉＭａｃｓによる選択では約９７．４％±
０．９％の範囲内（ｎ＝３）であった（図１０を参照されたい）。図１０には、形質導入
の２日後に実施した免疫磁気選択の代表的なＦＡＣＳ分析トレースが示されている。
【０３７８】
小規模選択および大規模選択の絶対的な収率は、形質導入効率に対して補正後、それぞ
れ約３１％±１１％および約２８％±６％であった。形質導入された細胞の平均回収率は
小規模選択では約５４％±１４％であり、大規模選択では約７２％±１８％であった。選
択プロセスは、その後の細胞増大に対していかなる識別可能な悪影響も及ぼさなかった。
４回の実験において、ＣＤ１９免疫磁気選択後３日間にわたる平均細胞増大は、ＣＤ１９
陽性画分について約３．５倍であり、それに対して選択していない形質導入された細胞で
は約４．１倍であり（ｐ＝０．３４）、形質導入されていない細胞では約３．７倍であっ
た（ｐ＝０．７５）。
遺伝子改変アロ枯渇細胞の免疫表現型
【０３７９】
最終的な細胞産物（形質導入の８日後に凍結保存した遺伝子改変アロ枯渇細胞）の免疫
表現型検査を行い、下記の表に示されている通り、ＣＤ４細胞とＣＤ８細胞の両方を含有
し、ＣＤ８細胞が優勢で６２％±１１％ＣＤ８＋であり、それに対してＣＤ４＋が２３％
±８％であることが見出された。ＮＳ＝有意でない、ＳＤ＝標準偏差。
【表１Ｂ】
2020040969.tif 000005
【０３８０】
大多数の細胞がＣＤ４５ＲＯ＋であり、エフェクター記憶Ｔ細胞の表面免疫表現型を有
した。ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ２７およびＣＤ２８を含めた記憶マーカーの発現は異種性であっ
た。細胞のおよそ２４％が、中心的な記憶細胞上に主に発現するリンパ節ホーミング分子
であるＣＤ６２Ｌを発現した。
遺伝子改変アロ枯渇細胞は抗ウイルス性のレパートリーおよび機能性を保持した
【０３８１】
最終産物細胞の抗ウイルス免疫を媒介する能力を、インターフェロン−ＥＬＩＳｐｏｔ
、細胞毒性アッセイ、および五量体分析によって評価した。凍結保存した遺伝子改変アロ
枯渇細胞は臨床研究における使用について現在評価されている製品を代表するものである
ので、これを全ての分析において使用した。ドナー細胞によって提示されるアデノウイル
ス抗原、ＣＭＶ抗原またはＥＢＶ抗原に応答したインターフェロン−γ分泌は保護された
が、操作していないＰＢＭＣに対して、遺伝子改変アロ枯渇細胞における抗ＥＢＶ応答が
低下する傾向があった（図１１Ａを参照されたい）。図１１Ａにインターフェロン分泌試
験の結果が例示されている。４対の操作していないＰＢＭＣと遺伝子改変アロ枯渇細胞（
ＧＭＡＣ）においてウイルス抗原に対する応答をＥＬＩＳｐｏｔによって評価した。アデ
ノウイルス抗原およびＣＭＶ抗原を、それぞれＡｄ５ｆ３５ヌルベクターおよびＡｄ５ｆ
３５−ｐｐ６５ベクターを感染させることにより、ドナー由来の活性化された単球によっ
て提示させた。ＥＢＶ抗原をドナーＥＢＶ−ＬＣＬによって提示させた。スポット形成単
位（ＳＦＵ）の数を刺激物質単独のウェルおよび応答物質単独のウェルに対して補正した
。４つのドナーのうち３つがＣＭＶ応答について評価可能であり、１つの血清反応陰性ド
ナーは排除した。図１１Ａにおいて、横棒は中央値を示す。
【０３８２】
細胞傷害性を、ドナー由来のＥＢＶ−ＬＣＬを標的として使用して評価した。ドナー由
来のＥＢＶ−ＬＣＬを用いて２ラウンドまたは３ラウンドの刺激を与えた遺伝子改変アロ
枯渇細胞により、ウイルスに感染している自己由来標的細胞を効率的に溶解することがで
きた（図１１Ｂを参照されたい）。図１１Ｂには、細胞毒性アッセイの結果が示されてい
る。遺伝子改変アロ枯渇細胞を、ドナーＥＢＶ−ＬＣＬを用いて２サイクルまたは３サイ
クル刺激した。５１Ｃｒ放出アッセイを、ドナー由来のＥＢＶ−ＬＣＬおよびドナーＯＫ
Ｔ３芽球を標的として使用して実施した。３０倍過剰の低温Ｋ５６２を用いてＮＫ活性を
遮断した。左側のパネルは、完全にまたは部分的に適合しないドナー−レシピエント対を
使用した５回の独立した実験からの結果を示す。右側のパネルは、非血縁ＨＬＡハプロタ
イプ一致ドナー−レシピエント対を使用した３回の実験からの結果を示す。エラーバーは
標準偏差を示す。
【０３８３】
ＥＢＶ−ＬＣＬを選択的なアロ枯渇の間の抗原提示細胞として使用し、したがって、ド
ナーとレシピエントがハプロタイプ一致である場合にＥＢＶ特異的Ｔ細胞を有意に枯渇さ
せることができる可能性があった。この仮説を調査するために、非血縁ＨＬＡ−ハプロタ
イプ一致ドナー−レシピエント対を使用した３回の実験を含め、その結果から、ドナー由
来のＥＢＶ−ＬＣＬに対する細胞傷害性が保持されることが示された。結果から、ＥＢＶ
溶解性抗原（ＢＺＬＦ１）エピトープであるＨＬＡ−Ｂ８−ＲＡＫＦＫＱＬＬを認識する
Ｔ細胞についての五量体分析により、ＨＬＡ−Ｂ８陰性ハプロタイプ一致レシピエントに
対する２つの情報価値のあるアロ枯渇後のドナーが確証された（図１１Ｃを参照されたい
）。図１１Ｃには、ＢＺＬＦ１エピトープに特異的なＴ細胞の頻度が例示されている。操
作していないＰＢＭＣを比較器として使用した。ＲＡＫ−五量体陽性集団は遺伝子改変ア
ロ枯渇細胞において保持され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてドナー由来のＥＢＶ−ＬＣＬを
用いて何回か刺激した後に増大することができた。図１１Ｃに提示されているグラフに示
されている百分率は、ＣＤ８集団内の五量体陽性細胞の百分率を示す。まとめると、これ
らの結果から、遺伝子改変アロ枯渇細胞が著しい抗ウイルス機能性を保持することが示さ
れる。
遺伝子改変アロ枯渇細胞集団における調節性Ｔ細胞
【０３８４】
フローサイトメトリーおよび機能分析を使用して、調節性Ｔ細胞が我々のアロ枯渇遺伝
子改変Ｔ細胞産物に保持されるかどうかを決定した。図１２Ａに示されている通り、Ｆｏ
ｘｐ３＋ＣＤ４＋２５＋集団が見出された。免疫磁気分離後、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋富化画
分では、ＣＦＳＥで標識した自己由来ＰＢＭＣとＯＫＴ３および同種異系フィーダーの存
在下で共培養した場合に抑制因子機能が実証された（図１２Ｂを参照されたい）。図１２
Ｂには、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋機能アッセイの結果が例示されている。ドナー由来のＰＢＭ
ＣをＣＦＳＥで標識し、ＯＫＴ３および同種異系フィーダーを用いて刺激した。ＣＤ４＋
ＣＤ２５＋細胞を遺伝子改変細胞集団から免疫磁気により選択し、１：１比で試験ウェル
に添加した。５日後にフローサイトメトリーを実施した。遺伝子改変Ｔ細胞をＣＤ１９発
現によってゲーティングアウトした。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋遺伝子改変細胞を添加すること
により（下のパネル）、細胞増殖が有意に低下した。したがって、アロ枯渇Ｔ細胞はＣＤ
２５を枯渇させる免疫毒素に曝露した後でさえ調節性表現型を再獲得することができる。
化学的二量体化誘導物質を添加することにより遺伝子改変アロ枯渇細胞が効率的かつ急
速に排除された
【０３８５】
免疫磁気選択の翌日、アポトーシスを誘導するために１０ｎＭの化学的二量体化誘導物
質ＡＰ２０１８７を添加し、アポトーシスは２４時間以内に発生した。２４時間の時点で
のアネキシンＶおよび７−ＡＡＤ染色を用いたＦＡＣＳ分析により、ＡＰ２０１８７で処
理した細胞は約５．５％±２．５％のみが生存可能なままであったが、無処理の細胞は約
８１．０％±９．０％が生存可能であったことが示された（図１３Ａを参照されたい）。
ベースライン生存能力に対して補正した後の死滅の効率は約９２．９％±３．８％であっ
た。大規模ＣＤ１９による選択により、小規模選択と同様の効率で死滅する細胞が生じた
：大規模選択および小規模選択におけるＡＰ２０１８７を用いた場合および用いていない
場合の平均生存能力、ならびに死滅の百分率は、それぞれ約３．９％、約８４．０％、約
９５．４％（ｎ＝３）および約６．６％、約７９．３％、約９１．４％（ｎ＝５）であっ
た。ＡＰ２０１８７は形質導入されていない細胞に対して無毒性であった：ＡＰ２０１８
７を用いた場合および用いていない場合の生存能力はそれぞれ約８６％±９％および８７
％±８％であった（ｎ＝６）。
培養が延長されるにつれ導入遺伝子の発現および機能が低下したが、細胞再活性化に際
して回復した
【０３８６】
導入遺伝子の発現および機能の安定性を評価するために、細胞をＴ細胞培養培地および
低用量のＩＬ−２（５０Ｕ／ｍｌ）中で形質導入の２４日後まで維持した。次いで、ＯＫ
Ｔ３／抗ＣＤ２８を用いて細胞の一部を再活性化した。４８〜７２時間後にＣＤ１９発現
をフローサイトメトリーによって分析し、自殺遺伝子の機能を１０ｎＭのＡＰ２０１８７
を用いた処理によって評価した。図１３Ｂに示されている結果は、形質導入後５日目（す
なわち、ＣＤ１９による選択の１日後）および形質導入後２４日目の、４８〜７２時間の
再活性化を伴うまたは伴わない細胞についての結果である（５回の実験）。２回の実験で
は、ＯＫＴ３／ａＣＤ２８活性化の後にＣＤ２５による選択を実施して、活性化された細
胞をさらに富化した。エラーバーは標準偏差を示す。＊は、形質導入の５日後の細胞と比
較したｐ＜０．０５を示す。２４日目までに、表面ＣＤ１９発現は約９８％±１％から約
８８％±４％まで低下し（ｐ＜０．０５）、それと並行して平均蛍光強度（ＭＦＩ）が７
９３±１２８から４７８±１０７まで低下した（ｐ＜０．０５）（図１３Ｂを参照された
い）。同様に、自殺遺伝子の機能が有意に低下し、残留生存能力はＡＰ２０１８７を用い
て処理した後には１９．６±５．６％であり、ベースライン生存能力に対して補正した後
には  ５４．８±２０．９％であり、これは、死滅の効率がたった６３．１±６．２％で
あるのと等しい。
【０３８７】
経時的な導入遺伝子の発現の減少がＴ細胞の静止後の転写の低下に起因するものである
か形質導入された細胞の排除に起因するものであるかを決定するために、形質導入後２２
日目にＯＫＴ３および抗ＣＤ２８抗体を用いて細胞の一部を再活性化した。４８〜７２時
間の時点で（形質導入後２４日目または２５日目）、ＯＫＴ３／ａＣＤ２８により再活性
化された細胞では、再活性化されていない細胞よりも導入遺伝子の発現が有意に高かった
。ＣＤ１９発現は約８８％±４％から約９３％±４％まで増加し（ｐ＜０．０１）、ＣＤ
１９のＭＦＩは４７８±１０７から６４３±１７４まで増加した（ｐ＜０．０１）。さら
に、自殺遺伝子の機能も、約６３．１％±６．２％の死滅の効率から約８４．６％±８．
０％（ｐ＜０．０１）の死滅の効率まで有意に増加した。さらに、細胞を活性化マーカー
ＣＤ２５について免疫磁気によって選別した場合には死滅の効率が完全に回復し、ＣＤ２
５陽性細胞の死滅の効率は約９３．２％±１．２％であり、これは形質導入の５日後の死
滅の効率（９３．１±３．５％）と同じであった（図１３Ｃを参照されたい）。ＣＤ２５
陰性画分の死滅は７８．６±９．１％であった。図１３Ｃには、自殺遺伝子の機能に対す
る培養の延長およびＴ細胞活性化の影響を示す代表的なＦＡＣＳプロットが例示されてい
る。
【０３８８】
非特異的なマイトジェン刺激によってではなく、同種異系ＰＢＭＣによって再活性化さ
れた遺伝子改変細胞を枯渇させるために二量体化剤を使用した場合に、多くのウイルス特
異的Ｔ細胞が残されることが注目すべき知見であった。図１４Ａおよび図１４Ｂに示され
ている通り、ＥＢＶおよびＣＭＶに由来するペプチドに特異的なＨＬＡ五量体と反応性の
Ｔ細胞の割合によって測定される通り、同種異系細胞を用いて４日間再活性化した後、Ａ
Ｐ２０１８７を用いた処理によりウイルス反応性亜集団が残される（そしてそれにより富
化される）遺伝子改変アロ枯渇細胞を、形質導入後３週間にわたって培養物中で維持して
、導入遺伝子を下方調節させた。細胞を同種異系ＰＢＭＣで４日間刺激し、その後  、一
部を１０ｎＭのＡＰ２０１８７で処理した。ＥＢＶ特異的Ｔ細胞の頻度（図１４Ａを参照
されたい）およびＣＭＶ特異的Ｔ細胞の頻度（図１４Ｂを参照されたい）をアロ刺激前、
アロ刺激後、およびアロ刺激した細胞を二量体化剤で処理した後に五量体分析によって数
量化した。ウイルス特異的Ｔ細胞の百分率はアロ刺激後に低下した。二量体化剤で処理し
た後、ウイルス特異的Ｔ細胞は部分的に、優先的に保持された。
考察
【０３８９】
２つの別個の安全性機構、選択的なアロ枯渇および自殺遺伝子改変を用いて同種異系Ｔ
細胞を工学的に操作することの実現性が本明細書において実証されている。これらの改変
を組み合わせて、ハプロタイプ一致移植後でさえも、実質的な数の、抗ウイルス性活性お
よび抗腫瘍活性を有するＴ細胞を増強しかつ／またはその追加輸注を可能にすることがで
きる。本明細書で提示されているデータから、自殺遺伝子ｉＣａｓｐ９が効率的に機能す
ること（二量体化剤を用いた処理後、９０％超のアポトーシス）、および経時的に起こっ
た導入遺伝子の発現の下方調節がＴ細胞活性化に際してアロ反応性Ｔ細胞がそれらの標的
に遭遇すると生じるのと同様に急速に逆転したことが示されている。本明細書で提示され
ているデータから、ＣＤ１９が、形質導入された細胞の９０％超の純度までの効率的かつ
選択的な富化を可能にする適切な選択マーカーであることも示される。さらに、本明細書
で提示されているデータから、これらの操作には、抗ウイルス活性の保持、およびＴｒｅ
ｇ活性を有するＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋集団の再生を伴う工学的に操作されたＴ
細胞の免疫適格性に対する識別可能な影響はないことが示される。
【０３９０】
自殺遺伝子の全体的な機能性が自殺遺伝子自体と形質導入された細胞を選択するために
使用するマーカーの両方に左右されることを考慮すると、臨床使用への変換には、２つの
遺伝子の発現を併せるために使用する成分と方法の両方を最適化する必要がある。現在診
療において最も広く使用されている選択マーカーの２つにはそれぞれ欠点がある。ネオマ
イシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）は、潜在的に免疫原性の外来タンパク質をコ
ードし、選択培地中で７日間培養することが必要であり、これにより、系の複雑さが増す
だけでなく、ウイルス特異的Ｔ細胞に損傷を与える潜在性もある。広く使用されている表
面選択マーカー、ＬＮＧＦＲには、最近、その明らかな臨床的な安全性にもかかわらず、
マウスモデルにおける発がんの潜在性および白血病との潜在的相関に関する懸念が生じて
いる。さらに、ＬＮＧＦＲ選択は、ほぼ排他的に遺伝子療法において使用されているので
、広範に利用可能なものではない。いくつもの代替選択マーカーが提案されている。ＣＤ
３４もｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてよく試験されているが、主に稀な造血前駆細胞を選択す
るために構成された系を最適化するために必要なステップ、およびより決定的に、ｉｎ  
ｖｉｖｏにおけるＴ細胞ホーミングの変更の潜在性により、ＣＤ３４が自殺スイッチ発現
構築物に対する選択マーカーとして使用するために最適以下のものになる。幹細胞自家移
植片のＢ細胞枯渇のための方法として  臨床グレードのＣＤ１９による選択が容易に利用
可能であるので、ＣＤ１９を代替選択マーカーとして選択した。本明細書で提示されてい
る結果から、ＣＤ１９による富化を高純度および高収率で実施することができ、さらに、
選択プロセスには、その後の細胞の成長および機能性に対する識別可能な影響がないこと
が実証された。
【０３９１】
ＣＤ１９により選択されたｉＣａｓｐ９細胞における自殺遺伝子活性化の効果は、ＨＳ
Ｖｔｋ遺伝子を発現するように形質導入された、ｎｅｏにより選択された細胞またはＬＮ
ＧＦＲにより選択された細胞における自殺遺伝子活性化の効果と非常に好都合に比較され
た。以前の世代のＨＳＶｔｋ構築物では３Ｈ−チミジン取り込みの８０〜９０％の抑制が
もたらされ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける培養が延長されると死滅の効率の同様の低下が示
されたが、それにもかかわらず、臨床的に効果的であった。わずか８０％のｉｎ  ｖｉｖ
ｏにおける循環遺伝子改変細胞の減少を伴う急性ＧＶＨＤと慢性ＧＶＨＤの両方の完全な
消散が報告されている。これらのデータから、ＧＶＨＤに関与する活性化Ｔ細胞では自殺
遺伝子発現が上方制御され、したがって当該細胞はｉｎ  ｖｉｖｏにおいて選択的に排除
されるので、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて見られた導入遺伝子の下方調節が問題になる可能
性は低いという仮説が裏付けられる。この効果がｉｎ  ｖｉｖｏにおいてウイルス特異的
Ｔ細胞および白血病特異的Ｔ細胞の保持を可能にするために十分であるかどうかは、臨床
的な状況でこれから試験される。自殺遺伝子改変前のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける選択的な
アロ枯渇を組み合わせることにより、自殺遺伝子機構を活性化する必要性を著しく低下さ
せ、それにより、追加輸注Ｔ細胞に基づく療法の利益を最大にすることができる。
【０３９２】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて見られるｉＣａｓｐ９媒介性自殺の高効率は、ｉｎ  ｖｉｖ
ｏにおいて再現されている。ＳＣＩＤマウス−ヒト異種移植片モデルでは、ｉＣａｓｐ９
により改変されたＴ細胞の９９％超が単回用量の二量体化剤後に排除された。ＡＰ２０１
８７と非常に近い機能的および化学的同等性を有し、現在臨床的な適用における使用が提
案されているＡＰ１９０３の安全性試験が健康なヒト志願者に対して行われており、安全
であることが示されている。２時間の静脈内注入として投与した０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１
．０ｍｇ／ｋｇ用量範囲に対して、ＡＰ１９０３約１０ｎｇ／ｍｌから約１２７５ｎｇ／
ｍｌまでの間の最大血漿中レベル（約７ｎＭから約８９２ｎＭまでの間と同等である）が
達成された。有意な有害作用は実質的になかった。急速に血漿中再分布させた後、ｉｎ  
ｖｉｔｒｏにおいて使用した二量体化剤の濃度がｉｎ  ｖｉｖｏにおいて容易に実現可能
であった。
【０３９３】
表現型、レパートリーおよび機能性は全て、ポリクローナルＴ細胞活性化のために使用
される刺激、形質導入された細胞を選択するための方法、および培養の持続時間の影響を
受ける可能性があるので、安全スイッチ、選択マーカーおよび細胞型の各組合せについて
、自殺遺伝子改変Ｔ細胞の免疫適格性を維持するために最適な培養条件を決定し、定義し
なければならない。ＣＤ４：ＣＤ８比に関して、操作していないＰＢＭＣとよく似ている
遺伝子改変細胞を生成するための、ＣＤ２８による同時刺激の添加および細胞サイズ常磁
性ビーズの使用、およびリンパ節ホーミング分子ＣＤ６２ＬおよびＣＣＲ７を含めた記憶
サブセットマーカーの発現により、遺伝子改変Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏにおける機能性を
改善することができる。ＣＤ２８による同時刺激により、レトロウイルスによる形質導入
および増大の効率を上昇させることもできる。しかし、興味深いことに、ＣＤ２８による
同時刺激の添加にはアロ枯渇細胞の形質導入に対する影響がなく、また、実証された細胞
増大の程度が、他の試験における抗ＣＤ３単独群と比較して高いことが見出された。さら
に、ｉＣａｓｐ９により改変されたアロ枯渇細胞は有意な抗ウイルス機能性を保持し、お
よそ４分の１がＣＤ６２Ｌ発現を保持した。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋調節性Ｔ細
胞の再生も見られた。Ｔ細胞活性化および形質導入の出発材料として使用したアロ枯渇細
胞は、同時刺激としての抗ＣＤ２８抗体の添加に対する感受性が低いものであった可能性
がある。ＣＤ２５による枯渇を行ったＰＢＭＣ／ＥＢＶ−ＬＣＬ共培養物は、すでにＣＤ
８６を操作していないＰＢＭＣよりも有意に高いレベルで発現しているＴ細胞およびＢ細
胞を含有し、それら自体により同時刺激がもたらされ得る。抗ＣＤ３を用いてポリクロー
ナルＴ細胞活性化を行う前のＣＤ２５＋調節性Ｔ細胞の枯渇により、最終的なＴ細胞産物
の免疫適格性が増強されることが報告されている。ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける培養および
増大の機能的な適格性に対する影響を最小限にするために、本明細書で提示されているい
くつかの実験では、細胞を形質導入後合計８日間にわたって増大させ、ＣＤ１９による選
択を４日目に実施する、比較的短い培養期間を使用した。
【０３９４】
最後に、成人患者を１ｋｇ当たり細胞最大１０７個の用量で処置するために十分な細胞
産物を産生することができるような産生のスケールアップが実証された。アロ枯渇細胞を
活性化し、フラスコ当たり細胞４×１０７個で形質導入し、形質導入後８日目に、最低８
倍になった、ＣＤ１９により選択された最終的な細胞産物を得て、元のフラスコ当たり少
なくとも３×１０８個のアロ枯渇遺伝子改変細胞を産生させることができる。増加した培
養物の体積は追加的なフラスコまたはバッグに容易に適応する。
【０３９５】
本明細書で提示されているアロ枯渇およびｉＣａｓｐ９による改変により、特にハプロ
タイプ一致幹細胞同種異系移植後のＴ細胞の追加輸注の安全性が有意に改善され得る。今
度はこれにより、より大きな用量漸増が可能になり、抗白血病効果を生じる見込みが高ま
る。
（実施例３）
ＣＡＳＰＡＬＬＯ−ハプロタイプ一致幹細胞移植後のアロ枯渇させた誘導性カスパーゼ
−９自殺遺伝子を形質導入したＴ細胞の第Ｉ相臨床試験
【０３９６】
この実施例では、図２２に例示されている代替自殺遺伝子戦略を使用した第Ｉ相臨床試
験の結果を提示する。簡単に述べると、ドナー末梢血単核細胞を、放射線を照射したレシ
ピエントＥＢＶで形質転換したリンパ芽球様細胞と一緒に７２時間共培養し（４０：１）
、ＣＤ２５免疫毒素を用いてアロ枯渇させ、次いで、ｉＣａｓｐ９自殺遺伝子および選択
マーカー（ΔＣＤ１９）を有するレトロウイルス上清を形質導入した。図２３において例
示されている通り、ΔＣＤ１９により、免疫磁気選択によって９０％超の純度まで富化す
ることが可能になった。
【０３９７】
細胞療法製品を生成するためのプロトコールの例が本明細書において提供される。
原料
【０３９８】
末梢血最大２４０ｍｌ（２つの集合）を、確立されたプロトコールに従って移植ドナー
から得た。いくつかの場合には、ドナーおよびレシピエントのサイズに応じて、白血球フ
ェレーシスを実施して十分なＴ細胞を単離した。レシピエントから血液１０ｃｃ〜３０ｃ
ｃも採血し、それを使用して、刺激物質細胞として使用する、エプスタイン・バーウイル
ス（ＥＢＶ）で形質転換したリンパ芽球様細胞株を生成した。いくつかの場合には、低Ｂ
細胞数の病歴および／または指標に応じて、適切な第一度近親者（例えば、親、同胞、ま
たは子孫）を使用して末梢血単核細胞を使用してＬＣＬを生成した。
アロ枯渇細胞の生成
【０３９９】
本明細書で提示されている通り、移植ドナーからアロ枯渇細胞を生成した。健康なドナ
ー由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、放射線を照射したレシピエントエプスタイン・
バーウイルス（ＥＢＶ）で形質転換したリンパ芽球様細胞株（ＬＣＬ）と、応答物質対刺
激物質比４０：１、無血清培地（ＡＩＭ  Ｖ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ
、ＣＡ）中で共培養した。７２時間後に、ＣＤ２５を発現している活性化Ｔ細胞を、ＲＦ
Ｔ５−ＳＭＰＴ−ｄｇＡ免疫毒素の下で一晩インキュベートすることによって共培養物か
ら枯渇させた。残留ＣＤ３＋ＣＤ２５＋集団が１％未満であり、残留３Ｈ−チミジンの組
み入れによる増殖が１０％未満であった場合にアロ枯渇が適切であるとみなした。
レトロウイルスの産生
【０４００】
ｉＣａｓｐ９−ＣＤ１９を構築するためにレトロウイルス産生株クローンを生成した。
産生株のマスター細胞バンクも生成した。マスター細胞バンクの試験を実施して、複製適
格レトロウイルスの生成およびＭｙｃｏｐｌａｓｍａ、ＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶなどによ
る感染を排除した。産生株を集密まで増殖させ、上清を回収し、濾過し、分注し、急速凍
結し、−８０℃で保管した。レトロウイルス上清の全てのバッチに対して追加試験を実施
して、複製適格レトロウイルス（ＲＣＲ）を排除し、プロトコールに従って分析証明書を
発行した。
アロ枯渇細胞の形質導入
【０４０１】
アロ枯渇させたＴ−リンパ球にフィブロネクチンを形質導入した。プレートまたはバッ
グを組換えフィブロネクチン断片ＣＨ−２９６（ＲｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎＴＭ、Ｔａｋａ
ｒａ  Ｓｈｕｚｏ、Ｏｔｓｕ、Ｊａｐａｎ）でコーティングした。コーティングしたプレ
ートまたはバッグ中で産生株の上清をインキュベートすることによってウイルスをレトロ
ネクチンに付着させた。次いで、細胞をウイルスがコーティングされたプレートまたはバ
ッグに移した。形質導入後、プロトコールに従ってアロ枯渇Ｔ細胞にＩＬ−２を週２回供
給して十分な数の細胞に到達するまでアロ枯渇Ｔ細胞を増大させた。
ＣＤ１９免疫磁気選択
【０４０２】
ＣＤ１９についての免疫磁気選択を形質導入の４日後に実施した。細胞をモノクローナ
ル  マウス抗ヒトＣＤ１９抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ａｕｂｕｒｎ、Ｃ
Ａ）とコンジュゲートした常磁性マイクロビーズで標識し、ＣｌｉｎｉＭａｃｓ  Ｐｌｕ
ｓ  ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｄｅｖｉｃｅで選択する（図２４を参照
されたい）。臨床的な注入のために必要な細胞の数に応じて、細胞を、ＣｌｉｎｉＭａｃ
ｓによる選択後に凍結保存したか、またはＩＬ−２を用いてさらに増大させ、形質導入後
６日目または８日目に凍結保存した。
凍結
【０４０３】
ＦＤＡによる最終的な放出試験に必要な形質導入効率、同一性、表現型および微生物学
的培養を試験するために、一定分量の細胞を取り出した。プロトコールに従って、投与す
る前に細胞を凍結保存した。
試験薬
ＲＦＴ５−ＳＭＰＴ−ｄｇＡ
【０４０４】
ＲＦＴ５−ＳＭＰＴ−ｄｇＡは、ヘテロ二官能性架橋剤［Ｎ−スクシンイミジルオキシ
カルボニル−アルファ−メチル−ｄ−（２−ピリジルチオ）トルエン］（ＳＭＰＴ）を介
して化学的に脱グリコシル化したリシンＡ鎖（ｄｇＡ）とコンジュゲートしたマウスＩｇ
Ｇ１抗ＣＤ２５（ＩＬ−２受容体アルファ鎖）である。ＲＦＴ５−ＳＭＰＴ−ｄｇＡを０
．５ｍｇ／ｍｌの滅菌溶液として製剤化した。
合成ホモ二量体化剤、ＡＰ１９０３
【０４０５】
作用機構：ＡＰ１９０３誘導性細胞死は、アポトーシス細胞死のシグナルを伝達するヒ
ト（カスパーゼ−９タンパク質）受容体の細胞内部分とヒトＦＫ５０６結合性タンパク質
（ＦＫＢＰ）に由来する薬物結合性ドメインが融合したキメラタンパク質を発現させるこ
とによって実現される。このキメラタンパク質は、ＦＫＢＰドメインを架橋結合させ、カ
スパーゼシグナル伝達およびアポトーシスを開始させるＡＰ１９０３を投与するまで、内
側細胞において休止したままである。
【０４０６】
毒性学：ＡＰ１９０３は、ＦＤＡにより治験薬（ＩＮＤ）として評価され、第Ｉ相臨床
安全性試験が首尾よく完了している。ＡＰ１９０３を０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１．０ｍｇ／
ｋｇの用量範囲にわたって投与した場合に有意な有害作用は認められなかった。
【０４０７】
薬理学／薬物動態学：患者に０．４ｍｇ／ｋｇのＡＰ１９０３を２時間かけて注入した
。これは、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１．０ｍｇ／ｋｇの用量範囲にわたる血漿中濃度が１０
ｎｇ／ｍＬ〜１２７５ｎｇ／ｍＬであり、血漿中レベルが投薬の０．５時間後および２時
間後に最大レベルの１８％および７％まで低下したことが示されている公開されたＰｋデ
ータに基づくものであった。
【０４０８】
ヒトにおける副作用プロファイル：志願者における第Ｉ相試験の間に重篤な有害事象は
起こらなかった。各処置後の有害事象の発生率は非常に低く、全ての有害事象の重症度が
軽度であった。有害事象の１つのみがおそらくＡＰ１９０３に関連するものと考えられた
。これは血管拡張のエピソードであり、投薬量が１．０ｍｇ／ｋｇのＡＰ１９０３であっ
た志願者１名の「顔面紅潮」として見られた。この事象は、注入開始後３分の時点で起こ
り、３２分持続した後に消散した。試験の間に報告された他の有害事象は全て、研究者に
より、試験薬とは無関係であるまたは関係する可能性が低いとみなされた。これらの事象
には、胸痛、インフルエンザ症候群（ｆｌｕ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、口臭、頭痛、注射部
位  疼痛、血管拡張、咳の増加、鼻炎、発疹、歯肉出血、および斑状出血が含まれた。
【０４０９】
グレード１のＧＶＨＤが発生している患者に、０．４ｍｇ／ｋｇのＡＰ１９０３を２時
間かけて注入した。グレード１のＧＶＨＤの患者にＡＰ１９０３を投与するためのプロト
コールを以下の通り確立した。アロ枯渇Ｔ細胞の注入後にＧｖＨＤが発生している患者の
生検を行って診断を確認し、０．４ｍｇ／ｋｇのＡＰ１９０３を２時間かけて注入する。
グレード１のＧＶＨＤを有する患者は最初に他の療法を受けなかったが、ＧｖＨＤの進行
を示した場合には、従来のＧｖＨＤ療法を施設のガイドラインに従って施した。グレード
２〜４のＧＶＨＤが発生している患者には、ＡＰ１９０３二量体化薬に加えて、標準の全
身免疫抑制療法を施設のガイドラインに従って施した。
【０４１０】
調製および注入の説明：注射用ＡＰ１９０３を、５ｍｇ／ｍｌの濃度で、３ｍｌのバイ
アル中２．３３ｍｌの濃縮溶液として得る（すなわち、バイアル当たり１０．６６ｍｇ）
。投与する前に、注入のために、算出された用量を通常生理食塩水１００ｍＬ中０．９％
まで希釈した。体積１００ｍｌ中注射用ＡＰ１９０３（０．４ｍｇ／ｋｇ）を、非ＤＥＨ
Ｐ、非エチレンオキシド滅菌済注入セットおよび注入ポンプを使用し、２時間にわたるＩ
Ｖ注入によって投与した。
【０４１１】
図２５に示されているｉＣａｓｐ９自殺遺伝子発現構築物（例えば、ＳＦＧ．ｉＣａｓ
ｐ９．２Ａ．ＡＣＤ１９）は、切断可能な２Ａ様配列を介して短縮型ヒトＣＤ１９（ＡＣ
Ｄ１９）と連結した誘導性カスパーゼ−９（ｉＣａｓｐ９）からなる。ｉＣａｓｐ９は、
Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙリンカーを介してヒトカスパーゼ−９
（ＣＡＳＰ９；ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ００１２２９）と接続したＦ３６Ｖ変異を有するヒ
トＦＫ５０６結合性タンパク質（ＦＫＢＰ１２；ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＨ００２  ８１８）
を含む。Ｆ３６Ｖ変異により、ＦＫＢＰ１２の合成ホモ二量体化剤、ＡＰ２０１８７また
はＡＰ１９０３に対する結合親和性が増大し得る。ヒトカスパーゼ−９配列からカスパー
ゼ動員ドメイン（ＣＡＲＤ）を欠失させ、その生理機能をＦＫＢＰ１２で置き換えた。Ｃ
ＡＲＤをＦＫＢＰ１２で置き換えることにより、導入遺伝子の発現および機能が増大する
。２Ａ様配列は、Ｔｈｏｓｅａ  Ａｓｉｇｎａ昆虫ウイルス由来の１８アミノ酸のペプチ
ドをコードし、グリシンと末端プロリン残基の間の９９％超の切断を媒介し、それにより
、ｉＣａｓｐ９のＣ末端に１７個の付加的なアミノ酸、およびＣＤ１９のＮ末端に１つの
付加的なプロリン残基をもたらすものである。ΔＣＤ１９は、細胞質内のドメインが２４
２アミノ酸から１９アミノ酸まで短縮され、リン酸化の潜在的な部位である保存されたチ
ロシン残基が全て除去される、全長ＣＤ１９（ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ００１７７０）がア
ミノ酸３３３（ＴＤＰＴＲＲＦ）において短縮されたものからなる。図２６には、ｉＣａ
ｓｐ９自殺スイッチを有する遺伝子改変Ｔ細胞の排除におけるｉＣａｓｐ９およびＡＰ１
９０３の結果が例示されている。
ｉｎ  ｖｉｖｏ試験
【０４１２】
３名の患者が、ハプロ−ＣＤ３４＋幹細胞移植（ＳＣＴ）後にｉＣａｓｐ９＋Ｔ細胞を
１ｋｇ当たり細胞約１×１０６から約３×１０６個の間の用量レベルで受けた。
【０４１３】
【表２】
2020040969.tif 000006
【０４１４】
図２７、図２８、および図２９において例示されている通り、注入されたＴ細胞は早け
れば注入の７日後にフローサイトメトリー（ＣＤ３＋ΔＣＤ１９＋）またはｑＰＣＲによ
ってｉｎ  ｖｉｖｏで検出され、最大の増大倍率は１７０±５（注入２９±９日後）であ
った。注入から３０分以内に、２名の患者でグレードＩ／ＩＩのａＧＶＨＤが発生し（図
３１〜３２を参照されたい）、ＡＰ１９０３投与によりＣＤ３＋ΔＣＤ１９＋細胞の９０
％超の消失が引き起こされ（図３０、図３３および図３４を参照されたい）、２４時間以
内にさらなる対数関数的低下、ならびに２４時間以内に皮膚および肝臓  ａＧｖＨＤの消
散が伴い（図３５を参照されたい）、これにより、ｉＣａｓｐ９  導入遺伝子がｉｎ  ｖ
ｉｖｏにおいて機能的であったことが示される。
【表３】
2020040969.tif 000007
【０４１５】
ｅｘ  ｖｉｖｏ実験からこのデータが確認された。さらに、図３６〜４２に示されてい
る通り、残留アロ枯渇Ｔ細胞は増大可能であり、また、ウイルス（ＣＭＶ）および真菌（
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）に対して反応性であった（ＩＦＮ−γの
産生）。これらのｉｎ  ｖｉｖｏ試験により、単回用量の二量体化薬により、ＧｖＨＤを
引き起こすＴ細胞の亜集団を低下させるまたは排除することができるが、ウイルス特異的
ＣＴＬは残し、次いでそれを再増大させることができることが見出された。
免疫再構成
【０４１６】
患者細胞および試薬の利用可能性に応じて、移植後に段階的な間隔で免疫再構成試験（
免疫表現型調査、Ｔ細胞機能およびＢ細胞機能）を得ることができる。ｉカスパーゼ形質
導入アロ枯渇Ｔ細胞によって生じる免疫再構成が測定されるいくつかのパラメータを分析
する。分析には、総リンパ球数、Ｔ細胞数およびＣＤ１９  Ｂ細胞数を繰り返し測定する
こと、ならびにＴ細胞サブセット（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ
２７、ＣＤ２８、ＣＤ４４、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ５６、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５
ＲＯ、アルファ／ベータおよびガンマ／デルタＴ細胞受容体）のＦＡＣＳ分析が含まれた
。ＣＤ４１ＣＤ２５１ＦｏｘＰ３などの患者Ｔ細胞Ｔ調節性細胞マーカーも分析する。患
者血液を、可能であれば、注入の４時間後、１カ月にわたって週に１回、月に１回×９カ
月、次いで、１年および２年の時点で、およそ１０〜６０ｍｌ取得する。取得する血液の
量はレシピエントのサイズに左右され、いずれの１回の採血においても全部で１〜２ｃｃ
／ｋｇを超えない（臨床ケアおよび試験評価用の血液取得が可能になる）。
形質導入アロ枯渇Ｔ細胞の持続および安全性
【０４１７】
形質導入されたＴ細胞の機能、持続および安全性を試験カレンダーに示されている時点
でモニタリングするために、末梢血試料に対して以下の分析も実施した。
トランスジェニック細胞の存在を検出するための表現型
【０４１８】
ＰＣＲによるＲＣＲ試験
【０４１９】
レトロウイルス組み込み体を検出するための定量的リアルタイムＰＣＲ
【０４２０】
ＰＣＲによるＲＣＲ試験を試験前、３カ月時点、６カ月時点、および１２カ月時点、次
いで、合計１５年にわたって年に１回実施する。ＦＤＡにより義務付けられている通り、
今後のＲＣＲの試験において使用するための組織、細胞、および血清試料を保管する。
【０４２１】
統計解析および停止規則。
【０４２２】
ＭＴＤを、適格症例の最大２５％においてグレードＩＩＩ／ＩＶの急性ＧＶＨＤを引き
起こす用量と定義する。決定は、サイズ２のコホートを用いたロジスティックモデルを使
用した改変連続再評価法（ＣＲＭ）に基づく。３つの用量群、すなわち、それぞれ毒性の
事前確率を１０％、１５％、および３０％と見積もった、１×１０６、３×１０６、１×
１０７の用量群を評価した。提案されたＣＲＭデザインでは、各コホートの対象を２名以
上にすること、１用量レベルを超えないように用量漸増を限定すること、および、形質導
入されていない細胞に関して安全であることが示されている最低用量レベルで患者登録を
開始することにより元のＣＲＭを改変したものを使用する。最低用量コホートにおける毒
性転帰を使用して用量−毒性曲線を更新する。次の患者コホートを、標的確率２５％に最
も近い関連する毒性の確率を有する用量レベルに割り当てる。この用量漸増試験の患者が
少なくとも１０名になるまでこのプロセスを続ける。患者の入手可能性に応じて、最大で
１８名の患者を第Ｉ相試験に登録することもでき、６名の患者を現行のＭＴＤで処置する
こともできる。最終的なＭＴＤは、これらの終結点において標的毒性率に最も近い確率を
有する用量になる。
【０４２３】
シミュレーションを実施して提案されたデザインの動作特性を決定し、これを標準の３
＋３用量漸増デザインと比較した。提案されたデザインにより、適切な用量レベルがＭＴ
Ｄとして示される確率がより高かったこと、低く効力のない可能性のある用量レベルの患
者がより少数であったこと、および試験に必要な患者の平均総数がより少なく維持された
ことに基づいて、より良好なＭＴＤの推定値がもたらされた。本発明で提案された用量の
範囲にわたって緩やかな用量−毒性曲線が予測され、したがって、患者の安全性を損なう
ことなく急速な用量漸増を行うことができる。実施したシミュレーションにより、改変さ
れたＣＲＭデザインにより、標準のデザインと比較して総毒性の平均数は大きくならなか
った（それぞれ１．９および２．１と等しい総毒性）。
【０４２４】
アロ枯渇Ｔ細胞の最初の注入後４５日以内に起こるグレードＩＩＩ／ＩＶのＧＶＨＤを
ＣＲＭ算出の考慮に入れる。用量−毒性曲線の推定を実行し、予め指定した用量レベルの
うちの１つを使用して次の患者コホートに対する用量レベルを決定するために、試験中に
患者毒性転帰のリアルタイムモニタリングを実施する。
処置制限毒性は、
注入に関連するグレード４の反応、
ＴＣ−Ｔの注入後３０日以内に起こる移植片不全（その後の異なる日数での３回の連続し
た測定におけるＡＮＣの５００１ｍｍ３未満までの減退、少なくとも１４日間持続する増
殖因子療法に対する無反応性として定義される）、
注入後３０日以内に起こるグレード４の非造血系の非感染性有害事象、
ＴＣ−Ｔの注入の４５日後までのグレード３〜４の急性ＧＶＨＤ、
注入後３０日以内に起こる処置に関連する死亡
を含む。
【０４２５】
ＧＶＨＤ率は、安全性および毒性の他の測定基準と一緒に記述統計値を使用して要約す
る。同様に、記述統計値を算出して、グレード１を超えるＧＶＨＤに起因してＡＰ１９０
３を受けた患者における臨床的応答および生物学的応答を要約する。
【０４２６】
ｉカスパーゼ形質導入アロ枯渇Ｔ細胞によって生じる免疫再構成を測定するいくつかの
パラメータを分析する。これらとしては、総リンパ球数、Ｔ細胞数およびＣＤ１９  Ｂ細
胞数を繰り返し測定すること、ならびにＴ細胞サブセット（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤＳ、Ｃ
Ｄ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２７、ＣＤ４４、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ５６、ＣＤ４５Ｒ
Ａ、ＣＤ４５ＲＯ、アルファ／ベータおよびガンマ／デルタＴ細胞受容体）のＦＡＣＳ分
析が挙げられる。分析のために十分なＴ細胞が残っている場合、ＣＤ４／ＣＤ２５／Ｆｏ
ｘＰ３などのＴ調節性細胞マーカーも分析する。各対象を注入前および上記の注入後の多
数の時点で測定する。
【０４２７】
全患者群および用量群ごとならびに測定した時間ごとの、これらのパラメータの記述的
要約を提示する。患者内の経時的な測定を示す成長曲線を生成して一般的な免疫再構成の
パターンを可視化する。ｉＣａｓｐ９陽性細胞の割合も各時点で要約する。これらのエン
ドポイントの注入前と比較した経時的な変化のペアワイズ比較を、対応のあるｔ検定また
はウィルコクソン符号順位検定を使用して実行する。
【０４２８】
繰り返し測定された免疫再構成パラメータのそれぞれの、ランダム係数モデルを使用し
た縦断的解析を実施する。縦断的解析により、患者ごとの免疫再構成モデルパターンの構
築が可能になると同時に、患者内で切片および傾きを変動させることが可能になる。患者
が受けた異なる用量レベルを説明するためのこのモデルにおける独立変数として用量レベ
ルも使用する。本明細書で提示されているモデルを使用して、免疫機能が経時的に有意に
改善されたかどうか、ならびにこれらの改善の大きさの推定値を傾きおよびその標準誤差
の推定値に基づいて試験することが可能である。ＣＴＬの異なる用量レベルにわたる免疫
再構成の速度の差異のあらゆる指標の評価も実施する。恒等リンクを用いた正規分布をこ
れらのモデルにおいて利用し、ＳＡＳ  ＭＩＸＥＤ手順を使用して実行する。免疫再構成
パラメータの正規性の仮定を評価し、必要であれば変換（例えば、対数、平方根）を実施
して正規性を実現することができる。
【０４２９】
上記のものと同様の戦略を使用してＴ細胞の生存、増大および持続のカイネティクスを
評価することができる。絶対的なＴ細胞数とマーカー遺伝子陽性細胞の数の比を決定し、
経時的に縦方向にモデリングする。傾きの推定値が正であることにより、免疫の回復に対
するＴ細胞の寄与の増加が示される。ｉＣａｓｐ９  Ｔ細胞のウイルス特異的免疫を、縦
断的モデルを使用して、ｅｘ−ｖｉｖｏにおける刺激ウイルス特異的ＣＴＬに基づいてＩ
ＦＮガンマを放出するＴ細胞の数を分析することによって評価する。ＥＢＶ、ＣＭＶおよ
びアデノウイルスの免疫の評価を解析するために別々のモデルを生成する。
【０４３０】
最後に、患者コホート全体の全生存率および無病生存率を、カプラン・マイヤー積極限
法を使用して要約する。移植の１００日後および１年後に生存しており、疾患を有さない
患者の割合をカプラン・マイヤー曲線から推定することができる。
【０４３１】
結論として、ハプロＣＤ３４＋ＳＣＴ後のｉＣａｓｐ９＋アロ枯渇Ｔ細胞の追加輸注に
より、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける機能的なドナーリンパ球の有意な増大およびａＧｖＨＤの
消散を伴うアロ反応性Ｔ細胞の急速なクリアランスが可能になる。
（実施例４）
ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＴ細胞のアロ枯渇
【０４３２】
実施例１〜３で提供されるプロトコールを改変して、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＴ細胞の
アロ枯渇を提供することができる。当該手法を、急性ＧｖＨＤを伴わない免疫再構成が有
効であり得るより大きな対象群に拡張するために、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＴ細胞枯渇の
方法をもたらすことによってプロトコールを簡易化することができる。本明細書で考察さ
れている処置前アロ枯渇方法では、まずＥＢＶで形質転換されたリンパ芽球様細胞株をレ
シピエントから調製し、次いでそれを、アロ抗原提示細胞として機能させる。この手順に
は最大８週間かかり、また、以前に処置を受けた悪性腫瘍の対象、特にそれらの最初の療
法の成分としてリツキシマブを受けた対象では広範囲にわたって失敗する可能性がある。
その後、ドナーＴ細胞をレシピエントＥＢＶ−ＬＣＬと共培養し、次いで、アロ反応性Ｔ
細胞（活性化抗原ＣＤ２５を発現する）をＣＤ２５−リシンとコンジュゲートしたモノク
ローナル抗体で処理する。この手順には各対象について実験室での試験にさらに多くの日
数がかかる。
【０４３３】
観察された二量体化薬による急速なｉｎ  ｖｉｖｏにおけるアロ反応性Ｔ細胞の枯渇に
基づき、刺激されていないがウイルス／真菌反応性Ｔ細胞を残すｉｎ  ｖｉｖｏにおける
アロ枯渇の方法を使用することによってプロセスを簡易化することができる。
【０４３４】
グレードＩまたはそれ超の急性ＧｖＨＤが発生している場合、単回用量の二量体化薬を
投与する、例えば、０．４ｍｇ／ｋｇのＡＰ１９０３の用量を２時間かけて静脈内注入す
る。急性ＧｖＨＤが持続する場合には、３回までの追加用量の二量体化薬を４８時間間隔
で投与することができる。グレードＩＩまたはそれ超の急性ＧｖＨＤを有する対象では、
これらの追加用量の二量体化薬をステロイドと組み合わせることができる。持続性のＧＶ
ＨＤを有し、二量体化剤に対するグレードＩＩＩまたはＩＶの反応に起因して追加用量の
二量体化剤を受けることができない患者に対しては、二量体化剤の０回または１回の用量
の後にステロイドを単独で用いて患者を処置することができる。
治療用Ｔ細胞の生成
【０４３５】
末梢血最大２４０ｍｌ（２つの集合）を、獲得の同意にしたがって移植ドナーから得る
。必要であれば、白血球除去を使用して十分なＴ細胞を得る；（幹細胞動員前またはＧ−
ＣＳＦの最終用量の７日後）。肝炎およびＨＩＶなどの感染症について試験するために血
液をさらに１０〜３０ｍｌ採取することもできる。
【０４３６】
末梢血単核細胞を、０日目に抗ヒトＣＤ３抗体（例えば、ＯｒｔｈｏｔｅｃｈまたはＭ
ｉｌｔｅｎｙｉからのもの）を使用して活性化し、２日目に、組換えヒトインターロイキ
ン２（ｒｈＩＬ−２）の存在下で増大させた。ＣＤ３抗体により活性化されたＴ細胞に、
組換えフィブロネクチン断片ＣＨ−２９６（ＲｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎＴＭ、Ｔａｋａｒａ
Ｓｈｕｚｏ、Ｏｔｓｕ、Ｊａｐａｎ）をコーティングしたフラスコまたはプレートにお
いてｉカスパーゼ−９レトロウイルスベクターによって形質導入する。レトロネクチンを
コーティングしたプレートまたはフラスコで産生株の上清をインキュベートすることによ
ってウイルスをレトロネクチンに付着させる。次いで、細胞を、ウイルスをコーティング
した組織培養デバイスに移す。形質導入後、プロトコールに従ってＴ細胞にｒｈＩＬ−２
を週２回供給することによって十分な数の細胞に到達するまでＴ細胞を増大させる。
【０４３７】
注入されたＴ細胞の大多数が自殺遺伝子を有することを確実にするために、選択マーカ
ーである短縮型ヒトＣＤ１９（ΔＣＤ１９）および商業的な選択デバイスを使用して、形
質導入された細胞を選択して９０％超の純度にすることができる。ＣＤ１９についての免
疫磁気選択を形質導入の４日後に実施することができる。細胞をモノクローナル  マウス
抗ヒトＣＤ１９抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）とコン
ジュゲートした常磁性マイクロビーズで標識し、ＣｌｉｎｉＭａｃｓ  Ｐｌｕｓ自動選択
デバイスで選択する。臨床的な注入のために必要な細胞の数に応じて、細胞をＣｌｉｎｉ
Ｍａｃｓによる選択後に凍結保存することもでき、ＩＬ−２を用いてさらに増大させ、十
分な細胞が増大したらすぐに凍結保存することもできる（産生開始から最大１４日）。
【０４３８】
ＦＤＡによる最終的な放出試験に必要な形質導入効率、同一性、表現型、自律的成長お
よび微生物学的調査を試験するために一定分量の細胞を取り出すことができる。細胞投与
する前に凍結保存する。
Ｔ細胞の投与
【０４３９】
例えば幹細胞移植後３０日から１２０日までの間から、形質導入されたＴ細胞を患者に
投与する。凍結保存Ｔ細胞を解凍し、通常生理食塩水を用いてカテーテルラインにより注
入する。小児に対しては、体重ごとに前投薬を行う。細胞の用量は、例えば、１ｋｇ当た
り細胞約１×１０４個から１ｋｇ当たり細胞１×１０８個まで、例えば、１ｋｇ当たり細
胞約１×１０５個から１ｋｇ当たり細胞１×１０７個まで、１ｋｇ当たり細胞約１×１０
６個から１ｋｇ当たり細胞５×１０６個まで、１ｋｇ当たり細胞約１×１０４個から１ｋ
ｇ当たり細胞５×１０６個まで、例えば、１ｋｇ当たり細胞約１×１０４個、約１×１０
５個、約２×１０５個、約３×１０５個、約５×１０５個、６×１０５個、約７×１０５
個、約８×１０５個、約９×１０５個、約１×１０６個、約２×１０６個、約３×１０６
個、約４×１０６個、または約５×１０６個の範囲であってよい。
ＧｖＨＤの処置
【０４４０】
グレード１以上の急性ＧＶＨＤが発生している患者に０．４ｍｇ／ｋｇのＡＰ１９０３
を２時間かけて注入する。注射用ＡＰ１９０３は、例えば、５ｍｇ／ｍｌの濃度で３ｍｌ
のバイアル中２．３３ｍｌの濃縮溶液（すなわち、バイアル当たり１０．６６ｍｇ）とし
て提供され得る。投与する前に、注入のために、算出された用量を通常生理食塩水１００
ｍＬ中０．９％に希釈する。体積１００ｍｌ中注射用ＡＰ１９０３（０．４ｍｇ／ｋｇ）
は、２時間にわたるＩＶ注入によって、非ＤＥＨＰ、非エチレンオキシド滅菌済注入セッ
トおよび注入ポンプを使用して投与することができる。
【表４】
2020040969.tif 000008
【０４４１】
他の方法は、例えば、本明細書の実施例１〜３で提供される臨床療法および評価に従っ
てよい。
（実施例５）
間葉系間質細胞療法の安全性を改善するためのｉＣａｓｐ９自殺遺伝子の使用
【０４４２】
間葉系間質細胞（ＭＳＣ）は、現在まで数百名の患者に注入されており、報告された有
害な副作用は最小限である。経過観察が限定されており、また、ＭＳＣが疾患の処置に使
用されている時間が比較的短いので、長期の副作用は未知である。いくつかの動物モデル
により副作用の潜在性が存在することが示されており、したがって、治療的に使用される
ＭＳＣの成長および生存の制御を可能にする系が望ましい。本明細書で提示されている誘
導性カスパーゼ−９自殺スイッチ発現ベクター構築物を、ＭＳＣを排除する方法としてｉ
ｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて調査した。
材料および方法
ＭＳＣの単離
【０４４３】
ＭＳＣを健康なドナーから単離した。簡単に述べると、注入後廃棄された健康なドナー
骨髄採取バッグおよびフィルターをＲＰＭＩ１６４０（ＨｙＣｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、Ｕ
Ｔ）で洗浄し、組織培養フラスコ中、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、２ｍＭのアラニル
−グルタミン（Ｇｌｕｔａｍａｘ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１００単位／ｍＬのペニシ
リンおよび１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を伴うＤＭ
ＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中にプレーティングした。４８
時間後に、上清を廃棄し、細胞を完全培養培地（ＣＣＭ）：１６．５％ＦＢＳ、２ｍＭの
アラニル−グルタミン、１００単位／ｍＬのペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬのストレ
プトマイシンを伴うα−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養した。細胞を８０％未
満の集密度まで成長させ、必要に応じて、より低い密度で再プレーティングした。
免疫表現型調査
【０４４４】
フィコエリトリン（ＰＥ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ペリジ
ニンクロロフィルタンパク質（ＰｅｒＣＰ）またはアロフィコシアニン（ＡＰＣ）とコン
ジュゲートしたＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５および
ＣＤ１３３モノクローナル抗体を使用してＭＳＣを染色した。抗体は、示されている場合
を除き、全てＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ−Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉ
ｅｇｏ、ＣＡ）からのものであった。適切なアイソタイプを適合させた抗体で標識した対
照試料を各実験に含めた。細胞を、４種の蛍光シグナルに対するフィルターセットを備え
た蛍光活性化細胞選別ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）によって分
析した。
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける分化試験
【０４４５】
脂肪細胞への分化。ＭＳＣ（細胞７．５×１０４個）を、６ウェルプレートのウェル中
、ＮＨ  ＡｄｉｐｏＤｉｆｆ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ａｕ
ｂｕｒｎ、ＣＡ）にプレーティングした。２１日間にわたり、培地を３日ごとに交換した
。細胞を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中４％ホルムアルデヒドを用いて固定した後
、オイルレッドＯ溶液（イソプロパノール中０．５％ｗ／ｖのオイルレッドＯを水３：２
比に希釈することによって得られる）で染色した。
【０４４６】
骨形成分化。ＭＳＣ（細胞４．５×１０４個）を、６ウェルプレート中、ＮＨ  Ｏｓｔ
ｅｏＤｉｆｆ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）にプレーティングし
た。１０日間にわたり、培地を３日ごとに交換した。細胞を、低温メタノールを用いて固
定した後、Ｓｉｇｍａ  Ｆａｓｔ  ＢＣＩＰ／ＮＢＴ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｓｉｇｍａ
−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を製造者の説明書に従って使用してアル
カリホスファターゼ活性について染色した。
【０４４７】
軟骨芽細胞への分化。１５ｍＬまたは１．５ｍＬのポリプロピレン円錐管中で遠心分離
することによって細胞２．５×１０５個〜５×１０５個を含有するＭＳＣペレットを得、
それをＮＨ  ＣｈｏｎｄｒｏＤｉｆｆ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ
ｈ）中で培養した。合計２４日間にわたり、培地を３日ごとに交換した。細胞ペレットを
ＰＢＳ中４％ホルマリン中に固定し、常套的なパラフィン切片作製のために処理した。切
片を、ペプシン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ）を用い
た抗原回復後、アルシアンブルーを用いて、または間接免疫蛍光法を使用してＩＩ型コラ
ーゲンについて染色した（マウス抗ＩＩ型コラーゲンモノクローナル抗体ＭＡＢ８８８７
、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）。
ｉＣａｓｐ９−ΔＣＤ１９レトロウイルスの産生およびＭＳＣの形質導入
【０４４８】
ＳＦＧ．ｉＣａｓｐ９．２Ａ．ΔＣＤ１９（ｉＣａｓｐ−ΔＣＤ１９）レトロウイルス
は、切断可能な２Ａ様配列を介して短縮型ヒトＣＤ１９（ΔＣＤ１９）と連結したｉＣａ
ｓｐ９からなる。上記の通り、ｉＣａｓｐ９は、Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅ
ｒ−Ｇｌｙリンカーを介して、動員ドメイン（ＣＡＲＤ）が欠失されており、その機能が
ＦＫＢＰ１２により置き換えられたヒトカスパーゼ−９と接続した、当該タンパク質の合
成ホモ二量体化剤（ＡＰ２０１８７またはＡＰ１９０３）に対する結合親和性を増大させ
るＦ３６Ｖ変異を有するヒトＦＫ５０６結合性タンパク質（ＦＫＢＰ１２）である。
【０４４９】
２Ａ様配列は、Ｔｈｏｓｅａ  Ａｓｉｇｎａ昆虫ウイルス由来の２０アミノ酸のペプチ
ドをコードし、これは、グリシンと末端プロリン残基の間の９９％超の切断を媒介して、
翻訳された際にｉＣａｓｐ９とΔＣＤ１９が確実に分離されるようにするものである。Δ
ＣＤ１９は、リン酸化の潜在的な部位である細胞質内の保存されたチロシン残基が全て除
去される、アミノ酸３３３において短縮されたヒトＣＤ１９からなる。Ｐｈｏｅｎｉｘ  
Ｅｃｏ細胞株（ＡＴＣＣ製品番号ＳＤ３４４４；ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）に
、ＥｃｏにシュードタイプされたレトロウイルスをもたらすＳＦＧ．ｉＣａｓｐ９．２Ａ
．ΔＣＤ１９を一過性にトランスフェクトすることによって、テナガザル白血病ウイルス
（Ｇａｌ−Ｖ）にシュードタイプされたレトロウイルスを産生する安定なＰＧ１３クロー
ンを作出した。ＰＧ１３パッケージング細胞株（ＡＴＣＣ）にＥｃｏにシュードタイプさ
れたレトロウイルスを３回形質導入して、細胞当たり多数のＳＦＧ．ｉＣａｓｐ９．２Ａ
．ΔＣＤ１９プロウイルス組み込み体を含有する産生株を生成した。単一細胞クローニン
グを実施し、最も高い力価を生じたＰＧ１３クローンを増大させ、ベクターを作製するた
めに使用した。産生細胞株を、１０％ＦＢＳ、２ｍＭのアラニル−グルタミン、１００単
位／ｍＬのペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを伴うＩＭＤＭ（Ｉ
ｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養することによってレトロウイルス上清を得た。最初の培養
の４８時間後および７２時間後に、レトロウイルスを含有する上清を採取した。形質導入
のために、１ｃｍ２当たりＭＳＣおよそ２×１０４個を６ウェルプレート、Ｔ７５または
Ｔ１７５フラスコ中ＣＭにプレーティングした。２４時間後に、培地を、ポリブレンを用
いて１０倍希釈したウイルス上清（最終濃度５μｇ／ｍＬ）と取り換え、細胞を３７℃、
５％ＣＯ２で４８時間インキュベートし、その後、細胞を完全培地中で維持した。
細胞の富化
【０４５０】
誘導性ｉＣａｓｐ９−ΔＣＤ１９陽性ＭＳＣを選択するために、レトロウイルスにより
形質導入したＭＳＣを、抗ＣＤ１９（クローン４Ｇ７）とコンジュゲートした磁気ビーズ
（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を製造者の説明書に従って使用して、ＣＤ１９陽性
細胞について富化した。細胞試料をＰＥとコンジュゲートしたＣＤ１９（クローンＳＪ２
５Ｃ１）抗体またはＡＰＣとコンジュゲートしたＣＤ１９（クローンＳＪ２５Ｃ１）抗体
で染色して細胞画分の純度を評価した。
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるアポトーシス試験
【０４５１】
未分化のＭＳＣ。５０ｎＭの化学的二量体化誘導物質（ＣＩＤ）（ＡＰ２０１８７；Ａ
ＲＩＡＤ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）を、ｉＣａｓ
ｐ９を形質導入したＭＳＣの完全培地中培養物に添加した。２４時間後に、細胞を回収し
、アネキシンＶ結合性緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃ
Ａ）中でアネキシンＶ−ＰＥおよび７−ＡＡＤを用いて染色した後、ＦＡＣＳ分析によっ
てアポトーシスを評価した。対照ｉＣａｓｐ９を形質導入したＭＳＣを、ＣＩＤに曝露せ
ずに培養物中で維持した。
【０４５２】
分化したＭＳＣ。形質導入したＭＳＣを上記の通り分化させた。分化期間の最後に、５
０ｎＭのＣＩＤを分化培地に添加した。上記の通り細胞を試験する組織について適切に染
色し、対比染色（メチレンアズールまたはメチレンブルー）を使用して核および細胞質の
形態を評価した。並行して、組織を末端デオキシヌクレオチジル−トランスフェラーゼｄ
ＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）アッセイ（Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｍａｎｎｈｅｉ
ｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）のために製造者の説明書に従って処理した。各時点について、４つ
の確率場を最終的な拡大率４０×で撮影し、ＩｍａｇｅＪソフトウェア型  １．４３ｏ（
ＮＩＨ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）を用いて画像を解析した。細胞密度を表面積の単位（
ｍｍ２）当たりの核（ＤＡＰＩ陽性）の数として算出した。アポトーシス細胞の百分率を
、核の総数に対する陽性ＴＵＮＥＬシグナルを有する（ＦＩＴＣ陽性）核の数の比として
決定した。対照はＣＩＤを用いずに培養物中で維持した。
マウスモデルにおけるｉｎ  ｖｉｖｏ死滅試験
【０４５３】
マウス実験は全てＢａｙｌｏｒ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｉｍ
ａｌ  ｈｕｓｂａｎｄｒｙ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅに従って実施した。改変ＭＳＣのｉｎ  
ｖｉｖｏにおける持続を評価するために、ＳＣＩＤマウスモデルをｉｎ  ｖｉｖｏ画像診
断系と併せて使用した。ＭＳＣに、高感受性緑色蛍光タンパク質−ホタルルシフェラーゼ
（ｅＧＦＰ−ＦＦＬｕｃ）遺伝子を単独でまたはｉＣａｓｐ９−ΔＣＤ１９遺伝子と一緒
にコードするレトロウイルスを形質導入した。ＭｏＦｌｏフローサイトメーター（Ｂｅｃ
ｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ）を使用した蛍光活性化細胞選別
によって細胞をｅＧＦＰ陽性について選別した。二重形質導入した細胞もＰＥとコンジュ
ゲートした抗ＣＤ１９を用いて染色し、ＰＥ陽性について選別した。ＳＣＩＤマウス（８
〜１０週齢）に、５×１０５個の、ｉＣａｓｐ９−ΔＣＤ１９を伴うＭＳＣとｉＣａｓｐ
９−ΔＣＤ１９を伴わないＭＳＣを反対側の側腹部に皮下注射した。マウスに、５０μｇ
のＣＩＤを、１週間後に開始し、２４時間あけて２回、腹腔内注射した。ｅＧＦＰ−ＦＦ
Ｌｕｃを発現するＭＳＣのｉｎ  ｖｉｖｏ画像診断のために、マウスにＤ−ルシフェリン
（１５０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射し、Ｘｅｎｏｇｅｎ−ＩＶＩＳ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓ
ｙｓｔｅｍを使用して解析した。各時点で総発光（蓄積した総標識ＭＳＣに比例する測定
）をＭＳＣ埋め込み部位にわたって自動的に定義される関心領域（ＲＯＩ）によって算出
した。これらのＲＯＩには、発光シグナルがバックグラウンドを少なくとも５％超える全
ての領域が含まれた。総光子数を各ＲＯＩに対して組み込み、平均値を算出した。ゼロ時
間が１００％シグナルに対応するように結果を正規化した。
【０４５４】
実験の第２のセットにおいて、ｅＧＦＰ−ＦＦＬｕｃで標識したＭＳＣ、２．５×１０
６個とｅＧＦＰ−ＦＦＬｕｃで標識した、ｉＣａｓｐ９−ΔＣＤ１９を形質導入したＭＳ
Ｃ、２．５×１０６個の混合物を右側腹部に皮下注射し、マウスに５０μｇのＣＩＤを、
７日後に開始し、２４時間あけて２回、腹腔内注射した。ＣＩＤ注射後のいくつかの時点
において、ヒト検体全体を同定し、採取するため、およびマウス組織コンタミネーション
を最小限にするために、組織発光を使用してＭＳＣの皮下ペレットを回収した。次いで、
ＱＩＡｍｐ（登録商標）ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を
使用してゲノムＤＮＡを単離した。各導入遺伝子のコピー数を決定するために、特異的な
プライマーおよびプローブ（ｅＧＦＰ−ＦＦＬｕｃ構築物に対して：フォワードプライマ
ー５’−ＴＣＣＧＣＣＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧＡＣ−３’、リバース５’−ＡＣＧＡＡＣＴ
ＣＣＡＧＣＡＧＧＡＣＣＡＴ−３’、プローブ５’ＦＡＭ、６−カルボキシフルオレセイ
ン−ＡＣＧＡＧＡＡＧＣＧＣＧＡＴＣ−３’ＭＧＢＮＦＱ、副溝結合性非蛍光クエンチャ
ー；ｉＣａｓｐ９−ΔＣＤ１９：フォワード５’−ＣＴＧＧＡＡＴＣＴＧＧＣＧＧＴＧＧ
ＡＴ−３’、リバース５’−ＣＡＡＡＣＴＣＴＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＧＡＣＡＴ−３’、
プローブ５’ＦＡＭ−ＣＧＧＡＧＴＣＧＡＣＧＧＡＴＴ−３’ＭＧＢＮＦＱ）を使用した
定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）において１００ｎｇの一定分量のＤＮＡを使用した。既知数の
、各導入遺伝子の単一のコピーを含有するプラスミドを使用して標準曲線を確立した。ｅ
ＧＦＰ−ＦＦＬｕｃを単独で形質導入したＭＳＣまたはｅＧＦＰ−ＦＦＬｕｃ−およびｉ
Ｃａｓｐ９を二重形質導入したＭＳＣの「純粋な」集団から単離したおよそ１００ｎｇの
ＤＮＡは同様の数のｅＧＦＰ−ＦＦＬｕｃ遺伝子コピー（およそ３．０×１０４）、なら
びに、それぞれゼロおよび１．７×１０３個のｉＣａｓｐ９−ΔＣＤ１９遺伝子コピーを
有することが決定された。
【０４５５】
形質導入していないヒト細胞およびマウス組織は、１００ｎｇのゲノムＤＮＡにおいて
、いずれの遺伝のコピー数もゼロであった。ｅＧＦＰ遺伝子のコピー数はＭＳＣのいずれ
かの集団（ｉＣａｓｐ９陰性または陽性）から単離した同一量のＤＮＡと同じであるので
、細胞の任意の混合物から単離したＤＮＡにおけるこの遺伝子のコピー数はｅＧＦＰ−Ｆ
ＦＬｕｃ陽性細胞の総数（ｉＣａｓｐ９陽性ＭＳＣプラスｉＣａｓｐ９陰性ＭＳＣ）に比
例する。さらに、ｉＣａｓｐ９陰性組織はｉＣａｓｐ９コピー数に寄与しないので、任意
のＤＮＡ試料におけるｉＣａｓｐ９遺伝子のコピー数はｉＣａｓｐ９陽性細胞の総数に比
例する。したがって、ＧがＧＦＰ陽性およびｉＣａｓｐ９陰性細胞の総数であり、ＣがＧ
ＦＰ陽性およびｉＣａｓｐ９陽性細胞の総数である場合、任意のＤＮＡ試料について、Ｎ
ｅＧＦＰ＝ｇ・（Ｃ＋Ｇ）およびＮｉＣａｓｐ９＝ｋ・Ｃであり、式中、Ｎは遺伝子コピ
ー数を指し、ｇおよびｋはそれぞれｅＧＦＰおよびｉＣａｓｐ９遺伝子のコピー数および
細胞数に関連する定数である。したがって、ＮｉＣａｓｐ９／ＮｅＧＦＰ＝（ｋ／ｇ）・
［Ｃ／（Ｃ＋Ｇ）］、すなわち、ｉＣａｓｐ９コピー数とｅＧＦＰコピー数の比は、ｅＧ
ＦＰ陽性細胞全ての中の二重形質導入された（ｉＣａｓｐ９陽性）細胞の画分に比例する
。ＮｉＣａｓｐ９およびＮｅＧＦＰの絶対値は各ＭＳＣ外植片におけるマウスの細胞によ
るコンタミネーションが増加するにつれて減少するが、各時点について、ヒト細胞の両方
の型が物理的に混合しているので、含まれるマウス組織の量にかかわらず比は一定になる
。両方の集団の自然アポトーシスの率が同様であると仮定すると（ｉｎ  ｖｉｔｒｏにお
ける培養により実証された通り）、任意の時点におけるＮｉＣａｓｐ９／ＮｅＧＦＰの商
およびゼロ時間におけるＮｉＣａｓｐ９／ＮｅＧＦＰの商は、ＣＩＤに曝露した後に生存
しているｉＣａｓｐ９陽性細胞の百分率を表す。コピー数の決定は全て３連で行った。
統計解析
【０４５６】
対応のある両側スチューデントｔ検定を使用して試料間の差異の統計的有意性を決定し
た。数値データは全て平均±１標準偏差として示されている。
結果
ＭＳＣはｉＣａｓｐ９−ΔＣＤ１９を容易に形質導入され、それらの基本的な表現型を
維持する
【０４５７】
３名の健康なドナー由来のＭＳＣのフローサイトメトリー分析により、これらがＣＤ７
３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５について均一に陽性であり、造血マーカーＣＤ４５、ＣＤ
１４、ＣＤ１３３（図１５Ａ）およびＣＤ３４について陰性であることが示された。骨髄
から単離した単核接着性画分はＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５について均一に陽性
であり、造血マーカーについては陰性であった。単離されたＭＳＣの脂肪細胞、骨芽細胞
および軟骨芽細胞への分化潜在性が特異的アッセイで確認され（図１５Ｂを参照されたい
）、これにより、これらの細胞が真正ＭＳＣであることが実証される。図１５Ｂには、分
化試験の結果が例示されており、単離されたＭＳＣは、適切な培地中で培養した場合、脂
肪細胞（左、オイルレッドおよびメチレンブルー）、骨芽細胞（中央、アルカリホスファ
ターゼ−ブロモクロロインドリルホスフェート／ニトロブルーテトラゾリウムおよびメチ
レンブルー）および軟骨芽細胞（右、抗ＩＩ型コラーゲン抗体−テキサスレッドおよびＤ
ＡＰＩ）に分化することができた。
【０４５８】
初期継代ＭＳＣに誘導型のカスパーゼ−９をコードするｉＣａｓｐ９−ΔＣＤ１９レト
ロウイルスベクターを形質導入した。最適な単回の形質導入条件の下で、細胞の４７±６
％が、ｉＣａｓｐ９とシスで転写され、上首尾の形質導入の代理としての機能を果たし、
形質導入された細胞の選択を可能にする短縮型のＣＤ１９を発現した。図１６Ａに示され
ている通り、ＣＤ１９について陽性の細胞の百分率は培養物中で２週間超にわたって安定
であり、これにより、構築物によるＭＳＣに有害なまたは成長に有利な影響はないことが
実証された。図９Ａには、ｉＣａｓｐ９−ΔＣＤ１９レトロウイルスを用いた単一ラウン
ドの形質導入を行ったＭＳＣの結果が例示されている。ｉＣａｓｐ９の上首尾の形質導入
の代理であるＣＤ１９陽性細胞の百分率は２週間超にわたって一定のままである。構築物
の安定性にさらに対処するために、蛍光活性化された細胞選別機（ＦＡＣＳ）によって精
製したｉＣａｓｐ９陽性細胞の集団を培養物中で維持した。６週間にわたってＣＤ１９陽
性細胞の百分率に有意差は認められなかった（ベースラインにおいて９６．５±１．１％
、それに対して４３日後は９７．４±０．８％、Ｐ＝０．４６）。図１６Ｂ）において例
示されている通り、ｉＣａｓｐ９−ＣＤ１９陽性細胞の表現型は、他の点では形質導入さ
れていない細胞の表現型と実質的に同一であり、事実上全ての細胞がＣＤ７３、ＣＤ９０
およびＣＤ１０５について陽性であり、造血マーカーについて陰性であり、これにより、
ＭＳＣの遺伝子操作によりそれらの基本特性は改変されないことが確認された。
ｉＣａｓｐ９−ΔＣＤ１９を形質導入したＭＳＣはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＣＩＤに
曝露した後に選択的なアポトーシスを受ける
【０４５９】
アポトーシス促進性遺伝子産物であるｉＣａｓｐ９は、ｉＣａｓｐ９製品に存在するＦ
Ｋ５０６結合性ドメインに結合するタクロリムスの類似体である、小さな化学的二量体化
誘導物質（ＣＩＤ）、ＡＰ２０１８７によって活性化することができる。形質導入してい
ないＭＳＣの培養物における自然のアポトーシスの率はおよそ１８％（±７％）であり、
ベースラインにおけるｉＣａｓｐ９陽性細胞と同様である（１５±６％、Ｐ＝０．４７）
。ｉＣａｓｐ９−ΔＣＤ１９を形質導入した後にＭＳＣ培養物にＣＩＤ（５０ｎＭ）を添
加することにより、２４時間以内にｉＣａｓｐ９陽性細胞の９０％超のアポトーシスによ
る死滅がもたらされるが（９３±１％、Ｐ＜０．０００１）、ｉＣａｓｐ９陰性細胞では
形質導入していない対照と同様のアポトーシス指数が保持される（２０±７％、ＣＩＤを
用いた、または用いていない形質導入していない対照に対してそれぞれＰ＝０．９９およ
びＰ＝０．６９）（図１７Ａおよび図７０Ｂを参照されたい）。ＭＳＣにｉＣａｓｐ９を
形質導入した後、完全培地中の培養物に５０ｎＭの化学的二量体化誘導物質（ＣＩＤ）を
添加した。２４時間後に、細胞を回収し、アネキシンＶ−ＰＥおよび７−ＡＡＤを用いて
染色した後、ＦＡＣＳ分析によってアポトーシスを評価した。ｉＣａｓｐ９−ＣＤ１９陽
性細胞（ｉＣａｓｐ  ｐｏｓ／ＣＩＤ）の９３パーセントがアネキシン陽性になり、それ
に対して陰性集団（ｉＣａｓｐ  ｎｅｇ／ＣＩＤ）では１９％のみであり、この割合は同
じ化合物に曝露した形質導入していない対照ＭＳＣ（対照／ＣＩＤ、１５％）およびＣＩ
Ｄに曝露していないｉＣａｓｐ９−ＣＤ１９陽性細胞（ｉＣａｓｐ  ｐｏｓ／ＣＩＤなし
、１３％）と同等であり、また、形質導入していないＭＳＣのベースラインのアポトーシ
ス率（対照／ＣＩＤなし、１６％）と類似するものであった。ｉＣａｐ９−ＣＤ１９陽性
細胞の磁気免疫選択により、高い程度の純度を実現することができる。ＣＩＤに曝露した
後、選択された細胞の９５％超がアポトーシス性になる。
【０４６０】
ＣＩＤに単回曝露した後の後期の時点における、高度に精製されたｉＣａｓｐ９陽性集
団の分析により、わずかなｉＣａｓｐ９陰性細胞が増大すること、およびｉＣａｓｐ９陽
性細胞の集団は残ること、しかしＣＩＤに再曝露することにより後者が死滅し得ることが
示される。したがって、ＣＩＤによるさらなる死滅に対して抵抗性のｉＣａｓｐ９陽性集
団は検出されなかった（図１８を参照されたい）。ｉＣａｓｐ９−ＣＤ１９陰性ＭＳＣの
集団は早ければＣＩＤを導入した２４時間後に出現する。純度が１００％の集団を実現す
ることは非現実的であるので、また、ＭＳＣをｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてそれらの急速な
増大に有利な条件で培養するので、ｉＣａｓｐ９−ＣＤ１９陰性ＭＳＣの集団が予測され
る。死滅は１００％効率的ではないという事実（例えば、９９％純粋な集団において９９
％が死滅すると仮定すると、生じた集団は、４９．７％のｉＣａｓｐ９陽性細胞および５
０．３％のｉＣａｓｐ９陰性細胞を有する）により予測される通り、ごく一部のｉＣａｓ
ｐ９−ＣＤ１９陽性集団が持続する。しかし、後期の時点においてＣＩＤに再曝露するこ
とにより、生存している細胞を死滅させることができる。
ｉＣａｓｐ９−ΔＣＤ１９を形質導入したＭＳＣは改変されていないＭＳＣの分化潜在
性を維持し、それらの後代はＣＩＤへの曝露により死滅する
【０４６１】
ｉＣａｓｐ９陽性ＭＳＣの分化した後代をＣＩＤにより選択的に死滅させることができ
るかを決定するために、ＣＤ１９についての免疫磁気選択を使用して改変集団の純度を上
昇させた（１ラウンドの選択後に９０％超の、図１６Ｂを参照されたい）。したがって選
択されたｉＣａｓｐ９陽性細胞はｉｎ  ｖｉｖｏにおいて試験した結合組織系列の全てに
分化することができた（図１９Ａ〜１９Ｑを参照されたい）。ヒトＭＳＣをＣＤ１９（し
たがって、ｉＣａｓｐ９）発現について免疫磁気により選択し、純度は９１％を超えた。
特異的な分化培地中で培養した後、ｉＣａｓｐ９陽性細胞は脂肪細胞系列（Ａ、オイルレ
ッドおよびメチレンアズール）、骨芽細胞系列（Ｂ、アルカリホスファターゼ−ＢＣＩＰ
／ＮＢＴおよびメチレンブルー）および軟骨芽細胞系列（Ｃ、アルシアンブルーおよびｎ
ｕｃｌｅａｒ  ｒｅｄ）を生じさせることができた。これらの分化した組織は、５０ｎＭ
のＣＩＤ（Ｄ−Ｎ）に曝露することによってアポトーシスに駆動された。無処理の、ｉＣ
ａｓｐ９を形質導入した対照とは対照的に（示されている脂肪生成条件、Ｏ〜Ｑ）（Ｆ、
Ｉ、Ｌ、Ｏ、ＤＡＰＩ；Ｇ、Ｊ、Ｍ、Ｐ、ＴＵＮＥＬ−ＦＩＴＣ；Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、オー
バーレイ）、多数のアポトーシス小体（矢印）、細胞質膜小疱形成（挿入図）および細胞
構造の喪失（ＤおよびＥ）；軟骨細胞小結節における広範にわたるＴＵＮＥＬ陽性（Ｆ〜
Ｈ）、および脂肪生成性培養物（Ｉ〜Ｋ）および骨形成性培養物（Ｌ〜Ｎ）を確認された
い。
【０４６２】
５０ｎＭのＣＩＤに曝露した２４時間後に、脂肪生成性培養物および骨形成性培養物全
体を通して、膜小疱形成、細胞の縮小および脱離、ならびにアポトーシス小体の存在を伴
うアポトーシスの顕微鏡レベルの証拠が観察された。ＴＵＮＥＬアッセイにより、脂肪生
成性培養物および骨形成性培養物、ならびに軟骨細胞小結節における広範にわたる陽性が
示された（図１９Ａ〜１９Ｑを参照されたい）、これは経時的に増加した（図２０を参照
されたい）。脂肪細胞の分化培地中で培養した後、ｉＣａｓｐ９陽性細胞は脂肪細胞を生
じる。５０ｎＭのＣＩＤに曝露した後、ＴＵＮＥＬ陽性細胞の割合の増加によって証明さ
れる通り、進行性アポトーシスが観察された。２４時間後に、細胞密度が有意に減少し（
１ｍｍ２当たり細胞５８４個からｍｍ２当たり細胞１４個未満まで）、ほとんど全てのア
ポトーシス細胞がスライドから剥離し、アポトーシス細胞の割合のさらなる信頼できる算
出が妨げられた。したがって、ｉＣａｓｐ９はＭＳＣ分化の後でさえ機能的なままであり
、その活性化により、分化した後代の死滅がもたらされる。
ｉＣａｓｐ９−ΔＣＤ１９を形質導入したＭＳＣは、ｉｎ  ｖｉｖｏにけるＣＩＤへの
曝露後に選択的なアポトーシスを受ける
【０４６３】
静脈内注射したＭＳＣはｉｎ  ｖｉｖｏにおける生存時間が短いことがすでに明らかで
あるが、局所的に注射した細胞はより長く生存し得、対応してきわめて大きな有害作用を
生じ得る。そのような状況におけるｉＣａｓｐ９自殺系のｉｎ  ｖｉｖｏにおける機能性
を評価するために、ＳＣＩＤマウスにＭＳＣを皮下注射した。ＭＳＣにｅＧＦＰ−ＦＦＬ
ｕｃ（上記）およびｉＣａｓｐ９−ΔＣＤ１９遺伝子を二重形質導入した。ＭＳＣに、ｅ
ＧＦＰ−ＦＦＬｕｃを単独でも形質導入した。ｅＧＦＰ陽性（および、適用可能な場合に
はＣＤ１９陽性）画分を蛍光活性化細胞選別によって９５％超の純度で単離した。各動物
にｉＣａｓｐ９陽性ＭＳＣと対照ＭＳＣ（どちらもｅＧＦＰ−ＦＦＬｕｃ陽性）を反対側
の側腹部に皮下注射した。Ｘｅｎｏｇｅｎ−ＩＶＩＳ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍを
使用してＭＳＣの局在化を評価した。実験の別のセットでは、単独形質導入したＭＳＣお
よび二重形質導入したＭＳＣの１：１混合物を右側腹部に皮下注射し、マウスに上記の通
りＣＩＤを与えた。異なる時点においてＭＳＣの皮下ペレットを回収し、ゲノムＤＮＡを
単離し、ｑＰＣＲを使用してｅＧＦＰ−ＦＦＬｕｃおよびｉＣａｓｐ９−ΔＣＤ１９遺伝
子のコピー数を決定した。これらの条件下で、ｉＣａｓｐ９とｅＧＦＰ遺伝子コピー数の
比は、全ヒト細胞の中のｉＣａｓｐ９陽性細胞の画分に比例する（詳細に関しては上記の
方法を参照されたい）。比を、ゼロ時間がｉＣａｓｐ９陽性細胞の１００％に対応するよ
うに正規化した。ＭＳＣを皮下接種した後（ＣＩＤ注射前）の動物の段階的な調査により
、両方の細胞集団における自然アポトーシスの証拠が示される（全体的な発光シグナルが
ベースラインの約２０％に低下したことによって実証された通り）。これは、以前に異種
モデルにおけるＭＳＣの全身送達および局所送達後に観察されている。
【０４６４】
発光データから、ＭＳＣを局所送達した後、ＣＩＤを投与する前でさえ、最初の９６時
間にわたるヒトＭＳＣの実質的な喪失が示され（図２１Ｃを参照されたい）、１週間後に
生存していた細胞はおよそ２０％であった。しかし、その時点以降は、二量体化薬を用い
た場合と用いていない場合のｉｃａｓｐ９陽性ＭＳＣの生存の間に有意差があった。ＭＳ
Ｃ埋め込みの７日後に、動物に５０μｇのＣＩＤを２４時間あけて２回注射した。図２１
Ａにおいて例示されている通り、ｉＣａｓｐ９を形質導入したＭＳＣは、それらの発光シ
グナルの消失によって実証された通り、当該薬物により直ちに死滅した。ｉＣａｓｐ９に
ついて陰性の細胞は当該薬物の影響を受けなかった。当該薬物を注射しなかった動物では
、両方の集団において、ＭＳＣ埋め込み後最大１カ月のシグナルの持続が示された。細胞
死滅をさらに数量化するために、ｅＧＦＰ−ＦＦＬｕｃおよびｉＣａｓｐ９−ΔＣＤ１９
遺伝子のコピー数を測定するためのｑＰＣＲアッセイを展開した。マウスに二重形質導入
したＭＳＣおよび単独形質導入したＭＳＣの１：１混合物を皮下注射し、ＭＳＣ埋め込み
の１週間後に上記の通りＣＩＤを投与した。ＭＳＣ外植片をいくつかの時点で採取し、ゲ
ノムＤＮＡを試料から単離し、実質的に同一の量のＤＮＡに対してｑＰＣＲアッセイを実
施した。これらの条件下（方法を参照されたい）、任意の時点で、ｉＣａｓｐ９−ΔＣＤ
１９コピー数とｅＧＦＰ−ＦＦＬｕｃコピー数の比は、生存可能なｉＣａｓｐ９陽性細胞
の画分に比例する。ｉＣａｓｐ９陽性細胞の進行性の死滅が観察され（＞９９％）、した
がって、生存しているｉＣａｓｐ９陽性細胞の割合は１週間後には元の集団の０．７％ま
で低下した（図２１Ｂを参照されたい）。したがって、ｉＣａｓｐ９を形質導入したＭＳ
Ｃをｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＣＩＤに曝露した後に選択的に死滅させるが、そうでなけれ
ば持続させることができる。
考察
【０４６５】
誘導性自殺タンパク質を使用して安全性機構を発現するようにヒトＭＳＣを工学的に操
作することの実現性が本明細書において実証されている。本明細書で提示されている日付
は、ＭＳＣに選択可能な表面マーカーＣＤ１９とカップリングした自殺遺伝子ｉＣａｓｐ
９を容易に形質導入することができることを示す。同時形質導入された遺伝子の発現はＭ
ＳＣおよびそれらの分化した後代のどちらにおいても安定であり、それらの表現型または
分化の潜在性は明らかには変更されない。これらの形質導入された細胞は、ｉＣａｓｐ９
に結合する適切な小分子化学的二量体化誘導物質に曝露されるとｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび
ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて死滅し得る。
【０４６６】
細胞に基づく療法を成功させるためには、移植された細胞を回収してから最終的にｉｎ
ｖｉｖにおいて臨床的に適用するまでの期間、それらの細胞が生存しなければならない
。さらに、安全な細胞に基づく療法には、首尾よく移植された細胞の望ましくない成長お
よび活性を制御する能力も含まれるべきである。ＭＳＣは顕著な副作用を伴わずに多くの
患者に投与されているが、最近の報告では、移植されたＭＳＣを遺伝的かつ後成的に改変
してそれらの機能性を増強し、骨および軟骨を含めた系列に分化させる潜在性がさらに調
査され、活用されているので、本明細書で提示されている安全スイッチなどの付加的な防
御により細胞に基づく療法を制御する付加的な方法がもたらされ得る。生物活性のあるタ
ンパク質を放出するように遺伝子改変されたＭＳＣを受けている対象に対して、自殺遺伝
子によって付加される安全性が特に有効である。
【０４６７】
本明細書で提示されている自殺系により、他の公知の自殺系にまさる潜在的な利点がい
くつかもたらされる。単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）とガンシ
クロビル（ＧＣＶ）を組み合わせるもの、および細菌または酵母シトシンデアミナーゼ（
ＣＤ）と５−フルオロ−シトシン（５−ＦＣ）を組み合わせるものなどの、ヌクレオシド
類似体を伴う戦略は細胞周期依存性であり、ＭＳＣを再生医療に適用している間に形成さ
れ得る有糸分裂後の組織においては有効である見込みがない。さらに、増殖中の組織にお
いてさえも、有糸分裂画分が全ての細胞を構成するのではなく、かなりの部分の移植片が
生存し、機能不全のままの可能性がある。いくつかの例では、自殺に必要なプロドラッグ
は、それら自体に治療的使用があり得、したがって、それらが非標的器官（例えば、多く
のチトクロムＰ４５０基質）により代謝された結果として、または標的細胞（例えば、細
菌ニトロレダクターゼの基質であるＣＢ１９５４）により活性化された後に近隣組織に拡
散することに起因して排除される（例えば、ＧＣＶ）、または毒性であり得る（例えば、
５−ＦＣ）。
【０４６８】
対照的に、本明細書で提示されている小分子化学的二量体化誘導物質は、ｉＣａｓｐ９
を活性化するために必要な用量の１０倍の用量においてさえ毒性の証拠は示されなかった
。さらに、ＨＳＶ−ｔｋおよびＤＣなどの非ヒト酵素系は、形質導入された細胞に対する
破壊性免疫応答のリスクが高い。ｉＣａｓｐ９自殺遺伝子と選択マーカーＣＤ１９はどち
らもヒト起源のものであり、したがって、望ましくない免疫応答が誘導される可能性が低
いはずである。選択マーカーの発現と自殺遺伝子を非ヒト起源の２Ａ様切断可能ペプチド
によって連結することにより問題が生じ得るが、２Ａ様リンカーは２０アミノ酸長であり
、非ヒトタンパク質よりも免疫原性が低い可能性がある。最後に、ｉＣａｓｐ９陽性細胞
における自殺遺伝子活性化の効果は他の自殺系を発現している細胞の死滅に勝るとも劣ら
ず、ｉＣａｓｐ９により改変されたＴ細胞の９０％またはそれより多くが単回用量の二量
体化剤後に排除され、これは臨床的に効果的な可能性があるレベルである。
【０４６９】
本明細書で提示されているｉＣａｓｐ９系により、他の細胞に基づき、かつ／または自
殺スイッチに基づく療法において見られるさらなる限定も回避され得る。哺乳動物細胞へ
のレトロウイルスによる形質導入後に、形質導入された構築物のサイレンシングに起因す
る発現の喪失が頻繁に観察された。本明細書で提示されている発現構築物ではそのような
影響の証拠は示されなかった。１カ月培養した後でさえも発現の減少または死滅の誘導は
明らかにならなかった。
他の細胞に基づき、かつ／または自殺スイッチに基づく療法において時々観察された別
の潜在的な問題は、抗アポトーシス遺伝子が上方制御された細胞における抵抗性の発生で
ある。この影響は、Ｆａｓなどのプログラム細胞死経路の種々の要素を伴う他の自殺系に
おいて観察された。ｉＣａｓｐ９はこの限定を有する可能性が低かったので、本明細書で
提示されている発現構築物に対する自殺遺伝子としてこれを選択した。アポトーシスカス
ケードの他のメンバーと比較して、カスパーゼ−９の活性化はアポトーシス性経路の後期
で起こり、したがって、ｃ−ＦＬＩＰおよびｂｃｌ−２ファミリーメンバーなどの、全て
ではないが多くの抗アポトーシス調節因子の影響を迂回するはずである。
【０４７０】
本明細書で提示されている系に特異的な潜在的限定は、ｉＣａｓｐ９の自然二量体化で
あり得、今度はこれにより望ましくない細胞死および不十分な持続が引き起こされる可能
性がある。この影響は、Ｆａｓを利用するある特定の他の誘導性系において観察された。
形質導入された細胞における自然死率が低いことおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおいてトランス
ジェニック細胞が長期にわたって持続されるという知見により、この可能性は、ｉＣａｓ
ｐ９に基づく発現構築物を使用する場合には重要な考察ではないことが示される。
【０４７１】
レトロウイルスによるＭＳＣの形質導入に由来する組み込み事象により有害な変異誘発
が駆動される潜在性があり得、特にレトロウイルスベクターの多数の挿入がある場合、望
ましくないコピー数の影響および／または他の望ましくない影響が引き起こされる。これ
らの望ましくない影響は、レトロウイルスにより形質導入した自殺系の利益により相殺さ
れ得る。これらの影響は、多くの場合、安定な産生細胞株および同様の培養条件から得た
臨床グレードのレトロウイルス上清をＴリンパ球に形質導入するために使用することによ
って最小化することができる。本発明で形質導入し、評価したＴ細胞は、約１〜３個の範
囲の組み込み体を含有する（上清は１ｍＬ当たり約１×１０６個の範囲のウイルス粒子を
含有する）。レンチウイルスベクターでレトロウイルスベクターを置換することにより、
特に自己再生性および分化潜在性が高い細胞における遺伝毒性のリスクがさらに低下し得
る。
【０４７２】
ＣＩＤに単回曝露した後に小さな割合のｉＣａｓｐ９陽性ＭＳＣが持続するが、これら
の生存している細胞は、その後、ＣＩＤへの再曝露後に死滅し得る。ｉｎ  ｖｉｖｏでは
、２回用量で９９％超が枯渇するが、臨床的な状況における最大限の枯渇のために反復用
量のＣＩＤが必要になり得る。誘導性自殺スイッチ系を使用した場合に付加的な安全性を
もたらすためのさらなる非限定的な方法としては、投与した細胞集団の純度をさらに上昇
させるための追加的なラウンドの細胞選別および死滅の効率を増強するための２つ以上の
自殺遺伝子系の使用が挙げられる。
【０４７３】
Ｂリンパ球により生理的に発現されるＣＤ１９分子にはネオマイシンホスホトランスフ
ェラーゼ（ｎｅｏ）および短縮型低親和性神経増殖因子受容体（ΔＬＮＧＦＲ）などの他
の入手可能な選択系にまさる潜在的な利点があるので、形質導入された細胞に対する選択
マーカーとしてこれを選択した。「ｎｅｏ」は、潜在的に免疫原性の外来タンパク質をコ
ードし、選択培地中で７日間培養することが必要であり、これにより、系の複雑さが増し
、また、選択された細胞に損傷を与える潜在性がある。ΔＬＮＧＦＲ発現により、他の表
面マーカーと同様の単離戦略が可能になるはずであるが、これらは臨床使用のために広範
に利用可能なものではなく、また、ΔＬＮＧＦＲの発がんの潜在性に関する懸念が長く残
っている。対照的に、臨床グレードのデバイスを使用したＣＤ１９発現によるｉＣａｓｐ
９陽性細胞の磁気選択は容易に利用可能であり、その後の細胞の成長または分化に対する
顕著な影響は示されていない。
【０４７４】
カスパーゼ−９安全スイッチを含む間葉系間質細胞の調製および投与のために使用する
手順を、胚性幹細胞および誘導性多能性幹細胞を調製するためにも使用することができる
。したがって、本実施例で概説されている手順に関して、本実施例で提供される間葉系間
質細胞を胚性幹細胞または誘導性多能性幹細胞で置換することができる。これらの細胞で
は、レトロウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターを、例えば、ＣＭＶプロモー
ター、またはｒｏｎｉｎプロモーターと一緒に使用することができる。
（実施例６）
基底の活性が低く、およびリガンドＩＣ５０の低下が最小限である改変カスパーゼ−９
ポリペプチド
【０４７５】
基底のシグナル伝達、アゴニストまたは活性化剤の不在下でのシグナル伝達は、多数の
生体分子に広くいきわたっている。これは、例えば、多数の亜科由来の６０種超の野生型
Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）［１］、ＥＲＫおよびａｂｌなどのキナーゼ［２］
、表面免疫グロブリン［３］、およびプロテアーゼにおいて観察されている。基底のシグ
ナル伝達は、胚性幹細胞多能性の維持から、Ｂ細胞の発生および分化［４〜６］、Ｔ細胞
分化［２、７］、胸腺細胞発生［８］、エンドサイトーシスおよび薬物耐性［９］、自己
免疫［１０］、植物の成長及び発達［１１］までの非常に多様な生物学的事象に寄与する
という仮説が立てられている。その生物学的な重要性は必ずしも十分に理解されているま
たは明らかになっているとは限らないが、不完全な基底のシグナル伝達は重篤な結果に至
る可能性がある。不完全な基底のＧｓタンパク質シグナル伝達は、網膜色素変性症、色覚
異常、腎性尿崩症、家族性ＡＣＴＨ抵抗性、および家族性低カルシウム尿性高カルシウム
血症などの疾患に至っている［１２、１３］。
【０４７６】
野生型イニシエーターカスパーゼ−９のホモ二量体化はエネルギー的に好ましくなく、
溶液中では大部分が単量体になる［１４−１６］にもかかわらず、未処理のカスパーゼ−
９の低レベルの固有の基底の活性［１５、１７］は、その天然のアロステリック調節因子
であるＡｐａｆ−１に基づく「アポトソーム」の存在下で増強される［６］。さらに、超
生理的発現レベルおよび／または共局在により、近傍により駆動される二量体化が導かれ
得、これにより基底の活性化がさらに増強される。
【０４７７】
キメラ非改変カスパーゼ−９ポリペプチドでは、生得的なカスパーゼ−９の基底の活性
はＣＡｓｐａｓｅ−Ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ  ｐｒｏ−Ｄｏｍａｉｎ（ＣＡＲＤ）［１８
］を除去し、コグネイトな高親和性ＡＰ１９０３結合性ドメイン、ＦＫＢＰ１２−Ｆ３６
Ｖで置き換えることにより有意に低下する。細胞療法に対するアポトーシス促進性「安全
スイッチ」としての有用性は多数の試験において十分に実証されている［１８〜２０］。
Ｇタンパク質共役受容体とは対照的に、特異的が高く基底の活性が低いことにより細胞療
法における強力なツールになっているが、現在のところ、製造のために、およびいくつか
の適用において望ましい場合がある、基底のシグナル伝達を排除するための「インバース
アゴニスト」は存在しない［２１］。マスターセルバンクの調製は、基底の活性のレベル
が低いキメラポリペプチドの高い増幅に起因して困難であることが証明されている。さら
に、いくつかの細胞は、基底の活性のレベルが低いカスパーゼ−９に対して他の細胞より
も感受性であり、それにより、形質導入された細胞の意図されたものではないアポトーシ
スが導かれる［１８］。
【０４７８】
キメラカスパーゼ−９ポリペプチドの基底の活性を改変するために、ランダムに生成し
た変異体に対する選択圧力として多数のスクリーニングのサイクルを使用する「定向進化
」［２２］ではなく、「合理的な設計」に基づく方法を使用して、ホモ二量体化、ＸＩＡ
Ｐ媒介性阻害、またはリン酸化において極めて重要な役割を果たすことが分かっている残
基に基づいて７５種のｉＣａｓｐ９変異体を工学的に作製した（図４４、下の表）。二量
体化により駆動されるカスパーゼ−９の活性化は、イニシエーターカスパーゼ活性化の優
性モデルであると考えられている［１５、２３、２４］。自然二量体化を減少させるため
に、ホモ二量体化、したがって基底のカスパーゼ−９シグナル伝達に極めて重要な残基の
部位特異的変異誘発を行った。カスパーゼ−９の重要な二量体化の境界面であるβ６鎖内
の５つの重要な残基（Ｇ４０２−Ｃ−Ｆ−Ｎ−Ｆ４０６）を、構成的に二量体のエフェク
ターであるカスパーゼ−３のもの（Ｃ２６４−Ｉ−Ｖ−Ｓ−Ｍ２６８）と置き換えること
により、カスパーゼ−９を著しい構造再編成がなければＡｐａｆ−１活性化に対して無反
応性である構成的に二量体のタンパク質に変換した［２５］。自然ホモ二量体化を改変す
るために、アミノ酸化学、および溶液中で単量体として優勢に存在するイニシエーターカ
スパーゼ−２、−８、−９、および−１０の対応する残基に基づいて５つの残基の体系変
異誘発を行った［１４、１５］。２８種のｉＣａｓｐ９変異体を作出し、分泌型アルカリ
ホスファターゼ（ＳＥＡＰ）に基づく代理死滅アッセイによって試験した後（以下の表）
、Ｎ４０５Ｑ変異により、ＡＰ１９０３に対するＩＣ５０が高くなる中程度（＜１０倍）
の犠牲を伴って基底のシグナル伝達が低下することが見出された。
【０４７９】
タンパク質分解は、一般にはカスパーゼ活性化に必要であるが、カスパーゼ−９活性化
のためには絶対必要なものではないので［２６］、自己タンパク質分解を阻害するための
熱力学的「ハードル」があがった。さらに、ＸＩＡＰ媒介性カスパーゼ−９結合により、
カスパーゼ−９が単量体状態に捕捉されてその触媒活性および基底の活性が減弱するので
［１４］、ＸＩＡＰとの相互作用に重大なテトラペプチド（Ａ３１６−Ｔ−Ｐ−Ｆ３１９
、Ｄ３３０−Ａ−Ｉ−Ｓ−Ｓ３３４）に対して変異誘発することによってＸＩＡＰとカス
パーゼ−９の間の相互作用を強化するための取り組みがなされた。これらのｉＣａｓｐ−
９変異体のうちの１７種から、Ｄ３３０Ａ変異により、最小（＜５倍）のＡＰ１９０３  
ＩＣ５０の犠牲で基底のシグナル伝達が低下することが決定された。
【０４８０】
第３の手法は、カスパーゼ−９が、ＰＫＣ−ζによるＳ１４４のリン酸化［２７］、プ
ロテインキナーゼＡによるＳ１８３のリン酸化［２８］、Ａｋｔ１によるＳ１９６のリン
酸化［２９］に際してキナーゼによって阻害され、ｃ−ａｂｌによるＹ１５３のリン酸化
に際して活性化される［３０］という以前報告された所見に基づくものであった。これら
の「ブレーキ」によりＩＣ５０が改善され得る、またはリン酸化模倣（ｐｈｏｓｐｈｏｒ
ｙｌａｔｉｏｎ  ｍｉｍｉｃ）（「リン酸化模倣（ｐｈｏｓｐｈｏｍｉｍｅｔｉｃ）」）
残基での置換により、これらの「ブレーキ」が増強されて基底の活性が低下し得る。しか
し、これらの残基に基づく１５種の単一の残基変異体でＡＰ１９０３に対するＩＣ５０が
首尾よく低下したものはなかった。
【０４８１】
例えば実施例１〜５において、および本出願全体を通して考察されているものなどの方
法を、必要であれば適切な改変を伴ってキメラ改変カスパーゼ−９ポリペプチド、および
種々の治療用細胞に適用することができる。
（実施例７）
材料および方法
カスパーゼ−９のＰＣＲ部位特異的変異誘発：
【０４８２】
カスパーゼ−９の基底のシグナル伝達を改変するために、変異を含有する  オリゴおよ
びＫａｐａ（Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ）を用いてＰＣＲに
基づく部位特異的な変異誘発［３１］を行った。増幅を１８サイクル行った後、ＰＣＲ産
物をインタクトなままにするメチル化依存性ＤｐｎＩ制限酵素を用いて親プラスミドを除
去した。得られた反応物２μｌを使用してＸＬ１−ｂｌｕｅまたはＤＨ５αを化学的に形
質転換した。その後、配列決定（ＳｅｑＷｒｉｇｈｔ、Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ）によって
陽性変異体を同定した。
細胞株の維持およびトランスフェクション：
【０４８３】
初期継代ＨＥＫ２９３Ｔ／１６細胞（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）を、１０％
ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、および１００Ｕ／ｍＬのストレプトマイシンを補
充したＩＭＤＭ、ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃ
ａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中、加湿、３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気雰囲気下でトランス
フェクトするまで維持した。対数期の増殖中の細胞に、１５ｍＬの円錐管中、細胞百万個
当たり、ｉＣａｓｐ９変異体をコードする発現プラスミド８００ｎｇ〜２μｇおよびＳＲ
αプロモーターにより駆動されるＳＥＡＰをコードする発現プラスミド５００ｎｇを一過
性にトランスフェクトした。触媒として不活性カスパーゼ−９（Ｃ２８５Ａ）（ＦＫＢＰ
ドメインを伴わない）または「空の」発現プラスミド（「ｐＳＨ１−ヌル」）を使用して
、トランスフェクション間の総プラスミドレベルを一定に保った。ＧｅｎｅＪａｍｍｅｒ
（登録商標）Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔを１μｇのプラスミドＤＮＡ当
たり３μｌの比で使用して、抗生物質の不在下、ＨＥＫ２９３Ｔ／１６細胞に一過性にト
ランスフェクトした。トランスフェクション混合物１００μｌまたは２ｍＬをそれぞれ９
６ウェルプレートまたは６ウェルプレートの各ウェルに添加した。ＳＥＡＰアッセイのた
めに、トランフェクション後最低３時間インキュベートした後、ＡＰ１９０３の対数希釈
物を添加した。ウエスタンブロットのために、細胞を回収前にＡＰ１９０３（１０ｎＭ）
と一緒に２０分インキュベートした。
分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）アッセイ：
【０４８４】
ＡＰ１９０３処理の２４〜４８時間後に、上清約１００μｌを回収して９６ウェルプレ
ートに入れ、記載されている通りＳＥＡＰ活性についてアッセイした［１９、３２］。簡
単に述べると、６５℃で４５分の熱変性を行って熱に対して感受性の内在性（および血清
由来）アルカリホスファターゼによって引き起こされるバックグラウンドを低下させた後
、上清５μｌを９５μｌのＰＢＳに添加し、２Ｍのジエタノールアミンに再懸濁させた１
００ｍＭの４−メチルウンベリフェリルホスフェート（４−ＭＵＰ；Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．
Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）１μｌを含有する基質緩衝液１００μｌに添加した。ＳＥＡＰによる
４−ＭＵＰの加水分解により、容易に測定することができる励起／放出（３５５／４６０
ｎｍ）を伴う蛍光基質が生じる。ウェル間の蛍光漏出を最小限にするために、アッセイを
黒色の不透明な９６ウェルプレート中で実施した（図４５）。
ウエスタンブロット分析：
【０４８５】
プラスミド２μｇを４８〜７２時間にわたって一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２
９３Ｔ／１６細胞を、ＡＰ１９０３を用いて３７℃で７．５〜２０分（示されている通り
）処理し、その後、Ｈａｌｔ（商標）Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋ
ｔａｉｌを伴うＲＩＰＡ緩衝液（０．０１ＭのＴｒｉｓ・ＨＣｌ、ｐＨ８．０／１４０ｍ
ＭのＮａＣｌ／１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００／１ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニ
ル／１％デオキシコール酸ナトリウム／０．１％ＳＤＳ）５００μｌに溶解させた。溶解
物を採取し、氷上で３０分溶解させた。細胞片をペレット化した後、上を覆っている上清
由来のタンパク質の濃縮物を９６ウェルプレート中でＢＣＡ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ
ｓｓａｙを製造者によって推奨されている通り用いて測定した。タンパク質３０μｇを、
２．５％２−メルカプトエタノールを伴うＬａｅｍｍｌｉ試料緩衝液（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、
Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）中、９５℃で５分煮沸した後、Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ  ＴＧＸ１
０％Ｔｒｉｓ／グリシンタンパク質ゲルによって分離した。１／１０００のウサギ抗ヒト
カスパーゼ−９ポリクローナル抗体、その後１／１０，０００のＨＲＰとコンジュゲート
したヤギ抗ウサギＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２二次抗体（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて膜をプロ
ーブした。タンパク質のバンドを、Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｆｅｍｔｏ化学
発光基質を使用して検出した。同等の試料ローディングを確実にするために、ブロットを
、１／１０，０００のウサギ抗アクチンポリクローナル抗体で標識する前にＲｅｓｔｏｒ
ｅ  ＰＬＵＳ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔ  Ｓｔｒｉｐｐｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒを用いて
６５℃で１時間ストリッピングした。別段の指定のない限り、試料は全てＴｈｅｒｍｏ  
Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。
【０４８６】
実施例１〜５において、および本明細書全体を通して考察されている方法および構築物
を、改変カスパーゼ−９ポリペプチドのアッセイおよび使用にも使用することができる。
（実施例８）
キメラ改変カスパーゼ−９ポリペプチドの評価および活性
基底の活性およびＡＰ１９０３に誘導された活性の比較：
【０４８７】
キメラ改変カスパーゼ−９ポリペプチドの基底の活性およびＡＰ１９０３に誘導された
活性の両方を調査するために、ＳＥＡＰおよび異なる量のｉＣａｓｐ９変異体を同時トラ
ンスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ／１６細胞のＳＥＡＰ活性を調査した。ｉＣａｓｐ９  
Ｄ３３０Ａ、Ｎ４０５Ｑ、およびＤ３３０Ａ−Ｎ４０５Ｑでは、細胞百万個当たり１μｇ
のｉＣａｓｐ９（相対的なＳＥＡＰ活性単位：１４８９２８、１７９０８１、２０５７７
２対１１４５１８）または細胞百万個当たり２μｇのｉＣａｓｐ９（１３６８６３、１７
５５２９、１７４３６６対９８８８９）のいずれかをトランスフェクトした細胞について
、改変されていないｉＣａｓｐ９よりも有意に低い基底の活性が示された（図４６Ａ、４
６Ｂ）。細胞百万個当たり２μｇでトランスフェクトした３種のキメラ改変カスパーゼ−
９ポリペプチド全ての基底のシグナル伝達は有意に高かった（ｐ値＜０．０５）。ｉＣａ
ｓｐ９  Ｄ３３０Ａ、Ｎ４０５Ｑ、およびＤ３３０Ａ−Ｎ４０５Ｑでも、ＡＰ１９０３に
対する推定ＩＣ５０の上昇が示されたが、それでも、ＷＴの１ｐＭと比較して、これらは
全て６ｐＭ未満であり（ＳＥＡＰアッセイに基づいて）（図４６Ｃ）、これにより、潜在
的に有用なアポトーシススイッチになる。
タンパク質発現レベルおよびタンパク質分解の評価：
【０４８８】
観察されたキメラ改変カスパーゼ−９ポリペプチドの基底の活性の低下がタンパク質の
安定性の低下またはトランスフェクション効率の変動に起因する可能性を排除するため、
およびｉＣａｓｐ９の自己タンパク質分解を調査するために、トランスフェクトされたＨ
ＥＫ２９３Ｔ／１６細胞におけるカスパーゼ−９バリアントのタンパク質発現レベルをア
ッセイした。キメラ非改変カスパーゼ−９ポリペプチドのタンパク質レベルは、ｉＣａｓ
ｐ９  Ｄ３３０Ａ、およびｉＣａｓｐ９  Ｄ３３０Ａ−Ｎ４０５Ｑによりこの試験におい
て使用したトランスフェクション条件下で全て同様のタンパク質レベルが示された（図４
７Ａ）。対照的に、ｉＣａｓｐ９  Ｎ４０５Ｑバンドは、特に発現プラスミド２μｇを使
用した場合、他のバンドよりも暗く見えた。使用したトランスフェクション条件では、お
そらく生存細胞のみを採取したことが原因で自己タンパク質分解は容易に検出可能ではな
かった。抗アクチンタンパク質再ブロッティングにより、各レーンに同等の溶解物量がロ
ーディングされたことが確認された（図４７Ｂ）。これらの結果から、ＳＥＡＰアッセイ
によって観察された、ｉＣａｓｐ９  Ｄ３３０Ａ、Ｎ４０５Ｑ、およびＤ３３０Ａ−Ｎ４
０５Ｑ変異体において観察された低い基底のシグナル伝達が裏付けられる。
考察：
【０４８９】
ＳＥＡＰスクリーニングアッセイに基づいて、これらの３種のキメラ改変カスパーゼ−
９ポリペプチドでは、ｉＣａｓｐ９ＷＴトランスフェクタントと比較してＡＰ１９０３に
依存しない高いＳＥＡＰ活性、したがって、低い基底のシグナル伝達が示された。しかし
、二重変異（Ｄ３３０−Ｎ４０５Ｑ）により基底の活性またはＩＣ５０（０．０５ｎＭ）
のいずれかを単一のアミノ酸変異体と比較してさらに低下させることはできなかった（図
４６Ａ、４６Ｂ、４６Ｃ）。観察された差異は、トランスフェクションの間に使用するタ
ンパク質の不安定性にもプラスミドの示差的な量にも起因しないと思われた（図４７Ｂ）
。
（実施例９）
キメラ改変カスパーゼ−９ポリペプチドの評価および活性
【０４９０】
誘導性カスパーゼ−９により、急速な、細胞周期に依存しない、細胞自律的な死滅がＡ
Ｐ１９０３依存的にもたらされる。この誘導性カスパーゼ−９ポリペプチドの特性を改善
することにより、いっそう広範な適用性が可能になる。タンパク質のリガンド非依存性細
胞傷害性を低下させ、低発現レベルでのその死滅を増加させることが望ましい。リガンド
非依存性細胞傷害性は、比較的低発現レベルにおいては懸念がないが、例えばベクター産
生の間など、発現のレベルが主要な標的細胞におけるものよりも１つまたは複数の桁高い
ものに達し得ると重大な影響を及ぼす可能性がある。また、細胞は、細胞が発現するＸＩ
ＡＰおよびＢｃｌ−２のようなアポトーシス阻害物質のレベルに起因して、低レベルのカ
スパーゼ発現に対して示差的に感受性であり得る。したがって、カスパーゼポリペプチド
を、基底の活性が低くなるように、および場合によってＡＰ１９０３リガンドに対する感
受性が高くなるように再度工学的に操作するために、４つの変異誘発戦略を考案した。
【０４９１】
二量体化ドメイン：カスパーゼ−９は生理的なレベルでは溶液中で単量体であるが、例
えば、アポトーシス促進性の、Ａｐａｆにより駆動される「アポトソーム」において起こ
る高発現レベルでは、カスパーゼ−９は二量体を形成する可能性があり、これによりＤ３
１５における自己タンパク質分解および触媒活性の大きな増加がもたらされる。Ｃ２８５
は活性部位の一部であるので、変異Ｃ２８５Ａは触媒として不活性であり、これを陰性対
照構築物として使用する。二量体化には特に５つの残基、すなわち、Ｇ４０２、Ｃ４０３
、Ｆ４０４、Ｎ４０５、およびＦ４０６の非常に密接な相互作用が必要である。各残基に
ついて、異なるクラスのアミノ酸（例えば、疎水性、極性など）を表す種々のアミノ酸置
換を構築した。興味深いことに、Ｇ４０２におけるすべての変異体（すなわち、Ｇ４０２
Ａ、Ｇ４０２Ｉ、Ｇ４０２Ｑ、Ｇ４０２Ｙ）およびＣ４０３Ｐにより、触媒として不活性
なカスパーゼポリペプチドが生じた。追加的なＣ４０３変異（すなわち、Ｃ４０３Ａ、Ｃ
４０３Ｓ、およびＣ４０３Ｔ）は野生型カスパーゼと同様であり、それ以上追求しなかっ
た。Ｆ４０４における変異は全て基底の活性を低下させるものであったが、ＩＣ５０に対
する感受性の、約１ｌｏｇから測定できないところまでの低下も反映された。有効性の順
に、Ｆ４０４Ｙ＞Ｆ４０４Ｔ、Ｆ４０４Ｗ＞＞Ｆ４０４Ａ、Ｆ４０４Ｓであった。Ｎ４０
５における変異は、Ｎ４０５Ａのように影響がなかったか、Ｎ４０５Ｔのように基底の活
性が上昇したか、または、それぞれＮ４０５ＱおよびＮ４０５ＦのようにＩＣ５０に対す
る小さな（約５倍）またはより大きな悪影響と同時に基底の活性が低下した。最後に、Ｆ
４０４と同様に、Ｆ４０６における変異は全て基底の活性を低下させ、ＩＣ５０に対する
感受性の約１ｌｏｇから測定できないところまでの低下を反映するものであった。有効性
の順に、Ｆ４０６Ａ  Ｆ４０６Ｗ、Ｆ４０６Ｙ＞Ｆ４０６Ｔ＞＞Ｆ４０６Ｌである。
【０４９２】
二量体化ドメイン内の化合物変異であるが、溶液中で単量体であることが分かっている
他のカスパーゼ（例えば、カスパーゼ−２、−８、−１０）または二量体であることが分
かっている他のカスパーゼ（例えば、カスパーゼ−３）に由来する類似の５残基で置換さ
れた変異を有するいくつかのポリペプチドを構築し、試験した。ＡＡＡＡＡアラニン置換
と一緒にカスパーゼ−２、−３、および−８由来の５残基の変化を含有するカスパーゼ−
９ポリペプチドは全て触媒として不活性であったが、カスパーゼ−１０由来の同等の残基
（ＩＳＡＱＴ）により、基底の活性の低下が生じたがＩＣ５０は高かった。
【０４９３】
全体的に、ＩＣ５０に対するほんの軽い影響と組み合わせた一貫して低い基底の活性の
組合せに基づいて、Ｎ４０５Ｑをさらなる実験のために選択した。有効性を改善するため
に、Ｎ４０５Ｑｃｏと称される、Ｎ４０５Ｑ置換を有するコドン最適化型の改変カスパー
ゼ−９ポリペプチドを試験した。このポリペプチドは野生型Ｎ４０５Ｑで置換したカスパ
ーゼ−９ポリペプチドよりもＡＰ１９０３に対する感受性がわずかに高いと思われた。
【０４９４】
切断部位変異体：アポトソーム内へのカスパーゼ−９の凝集後またはＡＰ１９０３によ
り強制されるホモ二量体化を介して、Ｄ３１５における自己タンパク質分解が起こる。こ
れにより、少なくとも一過性に、Ａ３１６に新しいアミノ末端が創出される。興味深いこ
とに、新しく現れたテトラ−ペプチド、３１６ＡＴＰＦ３１９は、上記の通り二量体化モ
チーフ、ＧＣＦＮＦにおいてカスパーゼ−９自体と二量体化について競合するカスパーゼ
−９阻害物質であるＸＩＡＰに結合する。したがって、Ｄ３１５切断の最初の転帰はＸＩ
ＡＰ結合であり、これにより、さらなるカスパーゼ−９活性化が減弱する。しかし、下流
のエフェクターカスパーゼ、カスパーゼ−３の標的である第２のカスパーゼ切断部位がＤ
３３０に存在する。アポトーシス促進圧が高まるにつれて、Ｄ３３０がますます切断され
るようになり、それにより残基３１６〜３３０内のＸＩＡＰ結合性小ペプチドが放出され
、したがって、この軽減性カスパーゼ−９阻害物質が除去される。基底の活性が低下して
いるが、Ｎ４０５Ｑによるものほどは低くないＤ３３０Ａ変異体を構築した。高コピー数
でのＳＥＡＰアッセイにより、ＩＣ５０がわずかに上昇することも明らかになったが、初
代Ｔ細胞における低コピー数では、ＩＣ５０が実際にわずかに上昇し、標的細胞の死滅が
改善された。自己タンパク質分解部位であるＤ３１５における変異によっても基底の活性
が低下したが、これにより、おそらくＤ３３０切断が次にカスパーゼ活性化に必要になっ
たのでＩＣ５０が大きく上昇した。Ｄ３１５ＡおよびＤ３３０Ａにおける二重変異により
、適正にプロセシングされない不活性な「ロックド」カスパーゼ−９が生じた。
【０４９５】
Ｄ３３０Ｅ、Ｄ３３０Ｇ、Ｄ３３０Ｎ、Ｄ３３０Ｓ、およびＤ３３０Ｖを含めた他のＤ
３３０変異体を創出した。Ｄ３２７における変異により、コンセンサスカスパーゼ−３切
断部位はＤｘｘＤであるので、Ｄ３３０における切断も妨げられるが、いくつかのＤ３２
７変異（すなわち、Ｄ３２７Ｇ、Ｄ３２７Ｋ、およびＤ３２７Ｒ）はＦ３２６Ｋ、Ｑ３２
８Ｋ、Ｑ３２８Ｒ、Ｌ３２９Ｋ、Ｌ３２９Ｇ、およびＡ３３１Ｋと併せて、Ｄ３３０変異
とは異なり、基底の活性を低下させるものではなく、これ以上追求しなかった。
【０４９６】
ＸＩＡＰ結合性変異体：上記の通り、Ｄ３１５における自己タンパク質分解により、Ｘ
ＩＡＰをカスパーゼ−９複合体内に「誘引」するＸＩＡＰ結合性テトラペプチド、３１６
ＡＴＰＦ３１９が現れる。ＡＴＰＦをミトコンドリア由来の抗ＸＩＡＰ阻害物質であるＳ
ＭＡＣ／ＤＩＡＢＬＯ由来の類似のＸＩＡＰ結合性テトラペプチド、ＡＶＰＩで置換する
ことにより、ＸＩＡＰへの結合がよりしっかりしたものになり、基底の活性が低下する可
能性がある。しかし、この４残基置換に効果はなかった。ＡＴＰＦモチーフ内の他の置換
は、基底の活性を低下させる効果なし（すなわち、Ｔ３１７Ｃ、Ｐ３１８Ａ、Ｆ３１９Ａ
）から、ＩＣ５０の非常に軽度の上昇を伴う基底の活性の低下（すなわち、Ｔ３１７Ｓ）
、ＩＣ５０の軽度の上昇を伴う基底の活性の低下（すなわち、Ｔ３１７Ａ）、ＩＣ５０の
大きな上昇を伴う基底の活性の低下（すなわち、Ａ３１６Ｇ、Ｆ３１９Ｗ）までにわたっ
た。全体的に、ＸＩＡＰ結合性テトラペプチドを変化させることの効果は軽度であったが
、それにもかかわらず、Ｔ３１７Ｓを、ＩＣ５０に対する影響が群の中で最も軽度であっ
たことを理由として、二重変異（下記）において試験するために選択した。
【０４９７】
リン酸化変異体：少数のカスパーゼ−９残基が阻害性リン酸化の標的であるか（例えば
、Ｓ１４４、Ｓ１８３、Ｓ１９５、Ｓ１９６、Ｓ３０７、Ｔ３１７）または活性化リン酸
化の標的である（すなわち、Ｙ１５３）ことが報告された。したがって、酸性の残基（例
えば、Ａｓｐ）で置換することによってリン酸化を模倣する（「リン酸化模倣（ｐｈｏｓ
ｐｈｏｍｉｍｅｔｉｃ）」）変異か、またはリン酸化を排除する変異のいずれかを試験し
た。概して、リン酸化模倣（ｐｈｏｓｐｈｏｍｉｍｅｔｉｃ）であるか試みなかったかに
かかわらず、大多数の変異により基底の活性が低下した。基底の活性が低い変異体の中で
、Ｓ１４４における変異（すなわち、Ｓ１４４ＡおよびＳ１４４Ｄ）およびＳ１４９６Ｄ
には、ＩＣ５０に対する識別可能な影響はなく、変異体Ｓ１８３Ａ、Ｓ１９５Ａ、および
Ｓ１９６Ａにより、ＩＣ５０が穏やかに上昇し、変異体Ｙ１５３Ａ、Ｙ１５３Ａ、および
Ｓ３０７ＡにはＩＣ５０に対する大きな悪影響があった。基底の活性が低いことと、ＩＣ
５０に対する影響があったとしても最小であることの組合せに起因して、Ｓ１４４Ａを二
重変異（下記）のために選択した。
【０４９８】
二重変異体：有効性がわずかに改善されたＤ３３０Ａバリアントと基底の活性をさらに
低下させ得る可能性のある残基を組み合わせるために、多数のＤ３３０Ａ二重変異体を構
築し、試験した。一般には、Ｎ４０５Ｑ、Ｓ１４４Ａ、Ｓ１４４Ｄ、Ｓ１８３Ａ、および
Ｓ１９６Ａにおける第２の変異を含め、これらにより、低い基底の活性が維持され、ＩＣ
５０のほんのわずかな上昇が伴った。二重変異体Ｄ３３０Ａ−Ｎ４０５Ｔは基底の活性が
高く、Ｄ３３０ＡのＹ１５３Ａ、Ｙ１５３Ｆ、およびＴ３１７Ｅとの二重変異体は触媒と
して不活性であった。有効性を改善するまたはＩＣ５０を低下させることを意図した、基
底の活性が低いＮ４０５Ｑを用いた一連の二重変異体を試験した。これらの全てが、Ｃａ
ｓｐａＣＩＤｅ−１．０と比較して基底の活性が低く、ＩＣ５０がわずかに上昇している
ことに関してＮ４０５Ｑと同様であると思われ、Ｎ４０５ＱとＳ１４４Ａ、Ｎ４０５Ｑと
Ｓ１４４Ｄ、Ｎ４０５ＱとＳ１９６Ｄ、およびＮ４０５ＱとＴ３１７Ｓを含めた。
【０４９９】
図５２Ａには、二量体化ドメイン変異体のいくつかの基底の活性およびＣＩＤ感受性を
試験するためのＳＥＡＰアッセイが示されている。これにより、Ｎ４０５Ｑ（黒い丸）が
、ＡＰ１９０３に依存しないシグナル伝達が上向きにシフトしたことによって決定される
通り、ＷＴカスパーゼ−９よりも低い基底の活性で試験した変異体の中で最もＡＰ１９０
３感受性が高いことが示される。Ｆ４０６ＴのＣＩＤ感受性がこの群で最低であった。５
２Ｂには、最大のＳＥＡＰ活性（基底の活性を反映する）およびＩＣ５０の表が示されて
いる。
【０５００】
図５３Ａには、変異体カスパーゼポリペプチドＤ３３０ＡおよびＮ４０５Ｑ、併せて二
重変異体Ｄ３３０Ａ−Ｎ４０５Ｑの二量体非依存性ＳＥＡＰ活性が示されている。多数の
トランスフェクション（Ｎ＝７〜１３）の結果が示されており、これにより、Ｎ４０５Ｑ
の基底の活性がＤ３３０Ａよりも低く、および二重変異体は中間であることが例示される
。
【０５０１】
図５３Ｂには、変異体カスパーゼポリペプチドＤ３３０ＡおよびＮ４０５Ｑ、併せて二
重変異体Ｄ３３０Ａ−Ｎ４０５Ｑの平均（＋ｓｔｄｅｖ、ｎ＝５）ＩＣ５０が示されてい
る。結果から、一過性トランスフェクションアッセイにおいて、Ｄ３３０ＡのＡＰ１９０
３に対する感受性がＮ４０５Ｑ変異体よりもいくらか高いが、ＷＴカスパーゼ−９の感受
性の約２分の１であることが示される。
【０５０２】
図５４には、ＷＴカスパーゼ−９、Ｎ４０５Ｑ、不活性Ｃ２８５Ａ、およびいくつかの
ＸＩＡＰ結合性ドメイン内のＴ３１７変異体を反映するＳＥＡＰアッセイが示されている
。結果から、Ｔ３１７ＳおよびＴ３１７Ａにより、ＡＰｆ１９０３に対するＩＣ５０の大
きなシフトを伴わずに基底の活性が低下し得ることが示される。したがって、Ｎ４０５Ｑ
との二重変異体を作出するためにＴ３１７Ｓを選択した。
【０５０３】
図５５には、実験５０ＢからのＩＣ５０が示されており、Ｔ３１７ＡおよびＴ３１７Ｓ
は、ＩＣ５０が野生型カスパーゼ−９ポリペプチドと同様であるにもかかわらず基底の活
性が低いことが示されている。
【０５０４】
図５６には、いくつかのＤ３３０変異体からの二量体非依存性ＳＥＡＰ活性が示されて
おり、Ｄ３３０Ａ、Ｄ３３０Ｅ、Ｄ３３０Ｎ、Ｄ３３０Ｖ、Ｄ３３０Ｇ、およびＤ３３０
Ｓを含めた試験したこのクラスのメンバーの全てが、野生型カスパーゼ−９よりも基底の
活性が低いことが示されている。
【０５０５】
図５７にはウエスタンブロットの結果が示されており、Ｄ３３０変異によりＤ３３０に
おける切断が遮断され、それにより、わずかに大きな（移動が遅い）小さなバンド（＜２
０ｋＤａのマーカー）が生じることが例示されている。他のブロットには、Ｄ３２７変異
によっても切断が遮断されることが示されている。
【０５０６】
図５８には、示されているカスパーゼ−９ポリペプチドをコードするレトロウイルスを
５回形質導入したＰＧ１３の多数のクローンの平均蛍光強度が示されている。基底の活性
がより低いことは、一般には、遺伝的に連鎖しているレポーター、ＣＤ１９と併せてカス
パーゼ−９遺伝子の発現が高レベルであることに変換される。結果から、平均で、Ｎ４０
５Ｑ変異体を発現するクローンは高レベルのＣＤ１９を発現することが示され、Ｎ４０５
Ｑの基底の活性がＤ３３０変異体またはＷＴカスパーゼ−９よりも低いことを反映する。
【０５０７】
図５９には、初代Ｔ細胞における、大部分が単一コピーである種々のカスパーゼポリペ
プチドの影響が示されている。これは、これらの自殺遺伝子がどのように治療的に使用さ
れるかをより正確に反映し得る。驚いたことに、このデータから、Ｄ３３０Ａ変異体が実
際に、２４時間アッセイにおいて試験した場合、低力価でＡＰ１９０３に対する感受性が
より高く、少なくともＷＴカスパーゼ−９と同じくらいよく死滅させることが示されてい
る。Ｎ４０５Ｑ変異体はＡＰ１９０３に対する感受性がより低く、２４時間以内に標的細
胞を効率的に死滅させることができない。
【０５０８】
図６０は、別々の健康なドナー由来の６つの独立したＴ細胞試料への形質導入の結果を
示す。これらの結果から、Ｄ３３０Ａ変異体（ｍｕｔ）が野生型カスパーゼ−９ポリペプ
チドよりもＡＰ１９０３に対する感受性が高いことが確認される。
【０５０９】
図６１には、図５６に示されている６名の健康なドナーからの平均ＩＣ５０、範囲およ
び標準偏差が示されている。このデータから、改善が統計的に有意であることが示される
。
【０５１０】
図６２には、いくつかのＤ３３０変異体の結果が示されており、試験した６種のＤ３３
０変異体（Ｄ３３０Ａ、Ｅ、Ｎ、Ｖ、Ｇ、およびＳ）が、野生型カスパーゼ−９ポリペプ
チドよりもＡＰ１９０３に対する感受性が高いことが示されている。
【０５１１】
図６３には、Ｎ４０５Ｑ変異体により、Ｎ４０４ＹおよびＮ４０６Ｙを含めた他の二量
体化ドメイン変異体と併せて、野生型カスパーゼ−９ポリペプチドまたはＤ３３０Ａから
区別できない標的Ｔ細胞が１０日以内に死滅し得ることが示されている。０日目にＡＰ１
９０３を受けた細胞は４日目にＡＰ１９０３の２回目の用量を受けた。このデータから、
Ｎ４０５Ｑのような感受性が低下したカスパーゼ−９変異体の、調節された有効性スイッ
チの一部としての使用が裏付けられる。
【０５１２】
図６４には、「Ｎ４０５Ｑｃｏ」と称されるＮ４０５Ｑカスパーゼポリペプチドのコド
ン最適化の結果が示されており、コドン最適化により、誘導性カスパーゼ機能に対しては
非常にわずかな影響のみで発現の増加がもたらされる可能性が高いことが示されている。
これは、元のカスパーゼ−９遺伝子における共通のコドンの使用を反映する可能性が高い
。
【０５１３】
図６５には、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるカスパーゼ−９ポリペプチドの用量反応曲線が、
カスパーゼ−９ポリペプチドを発現するＴ細胞の変動する画分を排除するために使用する
ことができるものであることが示されている。このデータから、０．５ｍｇ／ｋｇ用量の
ＡＰ１９０３が、大多数の改変Ｔ細胞をｉｎ  ｖｉｖｏにおいて排除するために十分であ
ることも示される。
【０５１４】
図６６には、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＤ３３０Ｅ変異体の用量反応曲線が示されている
。この試験により、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける用量設定可能なＴ細胞の排除も示されている
。
【０５１５】
結論：記載されている通り、単一の変異体変異の中からこれまでのこの７８種の変異体
の分析から、Ｄ３３０変異で、いくらか改善された有効性とわずかに低下した基底の活性
が組み合わされる。Ｎ４０５Ｑ変異体も、基底の活性が非常に低く、ＩＣ５０の４〜５倍
の上昇によって反映される有効性の低下がほんのわずかだけであるので、魅力的である。
初代Ｔ細胞における実験から、Ｎ４０５Ｑ変異体は、標的細胞を有効に死滅させることが
できるものであるが、カイネティクスがＤ３３０変異体よりもいくらか遅いことが示され
、これにより、初回用量のＡＰ１９０３後に部分的に死滅させ、２回目の用量のＡＰ１９
０３に際して最大完全な死滅を実現することができる段階的な自殺スイッチとして潜在的
に非常に有用なものになることが示された。
【０５１６】
以下の表には、本明細書で考察されている方法に従って調製し、アッセイした種々のキ
メラ改変カスパーゼ−９ポリペプチドについての基底の活性およびＩＣ５０の要約が提示
されている。結果は、１回試験したサブセット（すなわち、Ａ３１６Ｇ、Ｔ３１７Ｅ、Ｆ
３２６Ｋ、Ｄ３２７Ｇ、Ｄ３２７Ｋ、Ｄ３２７Ｒ、Ｑ３２８Ｋ、Ｑ３２８Ｒ、Ｌ３２９Ｇ
、Ｌ３２９Ｋ、Ａ３３１Ｋ、Ｓ１９６Ａ、Ｓ１９６Ｄ、および以下の二重変異体：Ｄ３３
０ＡとＳ１４４Ａ、Ｄ３３０ＡとＳ１４４Ｄ、またはＤ３３０ＡとＳ１８３Ａ；およびＮ
４０５ＱとＳ１４４Ａ、Ｎ４０５ＱとＳ１４４Ｄ、Ｎ４０５ＱとＳ１９６Ｄ、またはＮ４
０５ＱとＴ３１７Ｓ）以外は最低２回の非依存性ＳＥＡＰアッセイに基づく。試験するキ
メラ改変カスパーゼ−９ポリペプチドを生成するために４つの多面的な手法を取った。「
死」改変カスパーゼ−９ポリペプチドはもはやＡＰ１９０３に応答しないものである。二
重変異体はハイフンで示されており、例えば、Ｄ３３０Ａ−Ｎ４０５Ｑは３３０位におけ
る置換および４０５位における置換を有する改変カスパーゼ−９ポリペプチドを示す。
【表５−１】
2020040969.tif 000009
【表５−２】
2020040969.tif 000010
【０５１７】
実施例６〜９において引用されている参考文献
【０５１８】
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【０５１９】
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【０５２０】
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Ｌｃｋ  ＳＨ３  ｄｏｍａｉｎ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  
Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｉｇｎａｌｓ  ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｙｍｏ
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ｐｌａｎｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙ
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ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅｓ：
ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｉｎｔｏ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  
ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ、２００８年、１
２０巻（２号）：１２９〜４８頁。
【０５３０】
１３．Ｓｐｉｅｇｅｌ，  Ａ．Ｍ、Ｄｅｆｅｃｔｓ  ｉｎ  Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕ
ｐｌｅｄ  ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｄｉｓｅａｓ
ｅ．  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｐｈｙｓｉｏｌ、１９９６年、５８巻：１４３〜７０頁。
【０５３１】
１４．Ｓｈｉｏｚａｋｉ，  Ｅ．Ｎ．ら、Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ＸＩＡＰ−ｍｅｄ
ｉａｔｅｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｓｐａｓｅ−９．  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ、
２００３年、１１巻（２号）：５１９〜２７頁。
【０５３２】
１５．Ｒｅｎａｔｕｓ，  Ｍ．ら、Ｄｉｍｅｒ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｄｒｉｖｅｓ  ｔ
ｈｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  ｐｒｏｔｅａｓｅ
ｃａｓｐａｓｅ−９．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ、２００
１年、９８巻（２５号）：１４２５０〜５頁。
【０５３３】
１６．Ｓｈｉ，  Ｙ、Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  Ｃａｓｐａｓｅ  ａｃｔｉｖａｔｉ
ｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．  Ｍｏｌ  
Ｃｅｌｌ、２００２年、９巻（３号）：４５９〜７０頁。
【０５３４】
１７．Ｓｈｉｏｚａｋｉ，  Ｅ．Ｎ、Ｊ．  Ｃｈａｉ、およびＹ．  Ｓｈｉ、Ｏｌｉｇｏ
ｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｓｐａｓｅ−９，  
ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  Ａｐａｆ−１  ＣＡＲＤ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓ
ｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ、２００２年、９９巻（７号）：４１９７〜２０２頁。
【０５３５】
１８．Ｓｔｒａａｔｈｏｆ，  Ｋ．Ｃ．ら、Ａｎ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｃａｓｐａｓｅ
−９  ｓａｆｅｔｙ  ｓｗｉｔｃｈ  ｆｏｒ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｔｈｅｒａｐｙ．  Ｂｌｏ
ｏｄ、２００５年、１０５巻（１１号）：４２４７〜５４頁。
【０５３６】
１９．ＭａｃＣｏｒｋｌｅ，  Ｒ．Ａ、Ｋ．Ｗ．  Ｆｒｅｅｍａｎ、およびＤ．Ｍ．  Ｓ
ｐｅｎｃｅｒ、Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃａｓｐａｓｅｓ：
ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｄｅａｔｈ  ｓｗｉｔｃｈｅｓ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃ
ａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ、１９９８年、９５巻（７号）：３６５５〜６０頁。
【０５３７】
２０．Ｄｉ  Ｓｔａｓｉ，  Ａ．ら、Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ａｓ  
ａ  ｓａｆｅｔｙ  ｓｗｉｔｃｈ  ｆｏｒ  ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｃｅｌｌ  ｔｈｅｒａｐ
ｙ．  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ、２０１１年、３６５巻（１８号）：１６７３〜８３頁
。
【０５３８】
２１．Ｃｈａｎｇ，  Ｗ．Ｃ．ら、Ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ  ｌｉｇａｎｄ−ｉｎｄｕｃｅｄ
ａｎｄ  ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ
５−ＨＴ４  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ、２００７年、２巻（１２号）：
ｅ１３１７頁。
【０５３９】
２２．Ｂｌｏｏｍ，  Ｊ．Ｄ．およびＦ．Ｈ．  Ａｒｎｏｌｄ、Ｉｎ  ｔｈｅ  ｌｉｇｈ
ｔ  ｏｆ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ：  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｏｆ  ａｄａ
ｐｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  
Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ、２００９年、１０６巻、補遺１：９９９５〜１００００頁。
【０５４０】
２３．Ｂｏａｔｒｉｇｈｔ，  Ｋ．Ｍ．およびＧ．Ｓ．  Ｓａｌｖｅｓｅｎ、Ｍｅｃｈａ
ｎｉｓｍｓ  ｏｆ  Ｃａｓｐａｓｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃ
ｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、２００３年、１５巻（６号）：７２５〜３１頁。
【０５４１】
２４．Ｂｏａｔｒｉｇｈｔ，  Ｋ．Ｍ．ら、Ａ  ｕｎｉｆｉｅｄ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  
ａｐｉｃａｌ  Ｃａｓｐａｓｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ、２００３
年、１１巻（２号）：５２９〜４１頁。
【０５４２】
２５．Ｃｈａｏ，  Ｙ．ら、Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａ  ｄｉｍｅｒｉｃ  ｃａｓｐａ
ｓｅ−９：  ａ  ｒｅ−ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｒｏ
ｘｉｍｉｔｙ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  Ｃａｓｐａｓｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．  ＰＬｏ
Ｓ  Ｂｉｏｌ、２００５年、３巻（６号）：ｅ１８３頁。
【０５４３】
２６．Ｓｔｅｎｎｉｃｋｅ，  Ｈ．Ｒ．ら、ｃａｓｐａｓｅ−９  ｃａｎ  ｂｅ  ａｃｔ
ｉｖａｔｅｄ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ．  Ｊ
Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、１９９９年、２７４巻（１３号）：８３５９〜６２頁。
【０５４４】
２７．Ｂｒａｄｙ，  Ｓ．Ｃ、Ｌ．Ａ．  Ａｌｌａｎ、およびＰ．Ｒ．  Ｃｌａｒｋｅ、
Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｓｐａｓｅ−９  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｐｈｏｓｐｈｏｒ
ｙｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ｃ  ｚｅｔａ  ｉｎ  ｒｅｓｐ
ｏｎｓｅ  ｔｏ  ｈｙｐｅｒｏｓｍｏｔｉｃ  ｓｔｒｅｓｓ．  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉ
ｏｌ、２００５年、２５巻（２３号）：１０５４３〜５５頁。
【０５４５】
２８．Ｍａｒｔｉｎ，  Ｍ．Ｃ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ａ  ｒｅｇｕｌａ
ｔｅｓ  ｃａｓｐａｓｅ−９  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ａｐａｆ−１  ｄｏｗｎｓ
ｔｒｅａｍ  ｏｆ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｃ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２００５年
、２８０巻（１５号）：１５４４９〜５５頁。
【０５４６】
２９．Ｃａｒｄｏｎｅ，  Ｍ．Ｈ．ら、Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｄｅａ
ｔｈ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｃａｓｐａｓｅ−９  ｂｙ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ
．  Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９８年、２８２巻（５３９２号）：１３１８〜２１頁。
【０５４７】
３０．Ｒａｉｎａ，  Ｄ．ら、ｃ−Ａｂｌ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｒｅｇｕ
ｌａｔｅｓ  ｃａｓｐａｓｅ−９  ａｕｔｏｃｌｅａｖａｇｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｐｏｐ
ｔｏｔｉｃ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ＤＮＡ  ｄａｍａｇｅ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅ
ｍ、２００５年、２８０巻（１２号）：１１１４７〜５１頁。
【０５４８】
３１．Ｐａｐｗｏｒｔｈ，  Ｃ、Ｂａｕｅｒ，  Ｊ．  Ｃ、Ｂｒａｍａｎ，  Ｊ．および
Ｗｒｉｇｈｔ，  Ｄ．  Ａ．、Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  
ｉｎ  ｏｎｅ  ｄａｙ  ｗｉｔｈ  ＞８０％  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ．  Ｓｔｒａｔｅｇ
ｉｅｓ、１９９６年、９巻（３号）：３〜４頁。
【０５４９】
３２．Ｓｐｅｎｃｅｒ，  Ｄ．Ｍ．ら、Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ
Ｆａｓ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｕｓｉｎｇ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｉ
ｎｄｕｃｅｒｓ  ｏｆ  ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ．  Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ、１９９６年
、６巻（７号）：８３９〜４７頁。
【０５５０】
３３．Ｈｓｉａｏ，  Ｅ．Ｃ．ら、Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ  Ｇｓ  ａｃｔｉｖａｔｉ
ｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ  ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ
−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉ
ｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｍｉｃｅ．  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  Ｔｈｅ
ｒ、２０１１年、２巻（２号）：１１頁。
【０５５１】
３４．Ｗａｌｄｎｅｒ，  Ｃ．ら、Ｄｏｕｂｌｅ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ  ｈｕｍａｎ
ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｋｉｄｎｅｙ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ＦＬＰ
ａｎｄ  ＰｈｉＣ３１  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉ
ｏｎ．  ＢＭＣ  Ｒｅｓ  Ｎｏｔｅｓ、２０１１年、４巻：４２０頁。
（実施例１０）
リガンド誘導因子の投薬量を変動させて投与することによる制御されたレベルのアポト
ーシスの誘導
いくつかの臨床的なシナリオでは養子移入された細胞（例えば、ＣＡＲ  Ｔ細胞）を急
速かつ完全に排除することが望ましいが、これらの細胞を部分的に排除および低下させる
ことがより望ましい他のシナリオが多く存在する。そのようなシナリオの可能性は、キメ
ラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞標的および付随する有害事象（ＡＥ）の種類に固有の種々
の性質に支配される。これらの性質としては、標的とする分子および器官、毒性の重症度
、および発症の迅速性が挙げられる。より別個の数の治療用細胞においてアポトーシスを
誘導するために多量体リガンドをより制御された量で送達することが有効である臨床的な
シナリオと関連する可能性がある、有効性および安全性を支配するこれらの性質に関して
異なるプロファイルを有する異なる型のＣＡＲ／Ｔ細胞標的は少なくとも５種存在する。
これらは、細胞療法の安全性レオスタットの使用とオン／オフスイッチの使用を区別する
際に考慮することができる：
【０５５２】
カテゴリー１：分化抗原（例えば、ＭＡＲＴ、ｇｐ１００、ＣＥＡ、Ｈｅｒ−２／ｎｅ
ｕ）は成人では低レベルで発現する。これらの抗原を標的とするＣＡＲ  Ｔ細胞には、そ
れらの臨床的な生存能力を限定し、大多数が初期試験を通過して進行しない重篤であり命
にかかわるＡＥの率が高いことが伴っている。正常な器官（例えば、肺）におけるこれら
の抗原の発現のレベルが低いことに起因して、予想外の患者合併症および死亡が生じてい
る。
【０５５３】
カテゴリー２：標的非必須組織（例えば、Ｂ細胞におけるＣＤ１９、甲状腺におけるサ
イログロブリン、前立腺細胞におけるＰＳＭＡ）。これらのＣＡＲ  Ｔ細胞により、患者
における劇的な抗がん活性が示されたが、多くの場合、他の点では処置に応答する患者に
おける腫瘍崩壊症候群およびサイトカインストームに関連する患者の死亡を含めたＳＡＥ
も伴っている。
【０５５４】
カテゴリー３：がん・精巣抗原（ＣＴＡ）（例えば、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＧＥ−Ａ
１、−Ａ３；がんの５０％でこれらの２つのファミリーのいずれかが発現する）。ＣＴＡ
は、生殖細胞および一部の腫瘍において発現する。ファミリーメンバーとの交差反応性に
起因するカテゴリー１と同様の懸念。
【０５５５】
カテゴリー４：独特の抗原（例えば、ＥＧＦＲｖＩＩＩ）が利用可能であればおそらく
最良であるが、それでもほんの少数の腫瘍である。
【０５５６】
カテゴリー５：腫瘍間質（例えば、ＶＥＧＦ−Ｒ２、ＦＡＰ）は腫瘍では高レベルであ
り、正常な組織では低レベルである。多少の完全奏効（ＣＲ）が存在しているが、ＳＡＥ
の潜在的なリスクが高い。
【０５５７】
一般的なＴ細胞療法、例えば、幹細胞移植後のＴ細胞追加輸注により、移植片対宿主病
に関する、本明細書で考察されているものなどの有害事象が生じ得る。別個の数の移植さ
れたＴ細胞における制御されたアポトーシスの誘導などの制御されたレベルのＴ細胞除去
により、ＧｖＨＤの症状を緩和することができ、同時に、なお十分な患者の免疫系の再構
成が可能になる。リガンド誘導因子のレベルを決定するために、段階的に上昇させた用量
の誘導因子を患者、例えば、ＣＤ３４で選択された幹細胞ハプロ移植を受けている患者に
投与することができる。誘導因子の所望の投薬量は、生着を容易にし、免疫再構成を増強
し、移植片対白血病（ＧｖＬ）の影響を潜在的に改善すると同時に、重症の急性ＧｖＨＤ
の重症度および持続時間を低下させることができるレベルになる。一実施例では、重症の
急性ＧｖＨＤ（グレード３および４）を示している対象、ならびにコルチコステロイド療
法が進行しているグレード１および２の対象は、例えば、ＡＰ１９０３、４０ｍｇの単一
のバイアル（５ｍｇ／ｍＬ；８ｍＬ）を２時間の注入で受けることができる。最大１００
ｋｇの患者に対して、これは少なくとも０．４ｍｇ／ｋｇまたはそれより多くの投薬量に
等しい。
【０５５８】
ｉＣａｓｐ９についてのＩＣ５０は、０．００１〜０．０１ｎＭの範囲であり、用量反
応曲線は約１〜２対数濃度にわたって急勾配になる。０．４ｍｇ／ｋｇの２時間注入のＣ
ｍａｘは１５〜３０分以内の１００〜１０００ｎＭに到達するので、体内のＡＰ１９０３
レベルはｉＣａｓｐ９についてのＩＣ５０よりも＞３ｌｏｇ急速に高くなり、これにより
、ｉＣａｓｐ９が「オン／オフスイッチ」として有効に機能することが可能になり、測定
の第１の時点（すなわち、３０分）以内に細胞の９０％超が死滅し、最初の２４時間以内
にさらなるｌｏｇ死滅が伴った。適切な量または濃度のリガンド誘導因子を投与すること
により、「野生型」誘導性カスパーゼ−９を発現する治療用細胞部分的に除去し、一部の
治療用細胞を患者に残すことができる。あるいは、治療用細胞は、異なる量または濃度の
リガンド誘導因子に応答し得る、ＩＣ５０が異なる誘導性カスパーゼ−９バリアントを発
現し得る。
【０５５９】
安全スイッチを含有する治療用細胞、またはこれらの治療用細胞のごく一部を選択的に
死滅させるための方法の他の例は本明細書において提供される。
【０５６０】
肺および肝臓への転移性疾患を有し、多数の標準の処置に不応性の結腸がん患者を、Ｅ
ｒｂＢ２  ＣＡＲにより改変されたＴ細胞を用いて処置する。注入してから１５分以内に
、患者に呼吸窮迫および肺浸潤が発生する。サイトカインストームが結果として起こり、
思い切った手段にもかかわらず、患者は５日以内に死亡する。ＣＡＲ  Ｔ細胞の傷害性は
オフオーガンのターゲティング（肺）に起因するものであり、また急速かつ命にかかわる
ものであった。処置する医師はおそらくＥｒｂＢ２  ＣＡＲにより改変されたＴ細胞をで
きるだけ迅速にかつ完全に終結させることを望む。この種のシナリオでは、安全性「オン
／オフ」スイッチによってできるだけの多くの治療用細胞を死滅させることが最も適切な
選択肢だと思われる。
【０５６１】
化学療法を用いて処置された白血病患者では、潜在的に治癒的なＨＳＣＴに対する適格
性に必要なＣＲが実現できない。ＣＤ１９を標的とするＣＡＲ  Ｔ細胞療法がなされる。
患者は急速に応答するが、疾患の大きな負荷により、腫瘍崩壊症候群が発生し、ＩＣＵ入
院、全身性ステロイド薬、および支持療法が必要な重症になる。患者はこの療法に応答す
るが、後におそらくステロイドによる全体的な免疫抑制に起因して白血病が再発する。Ｃ
ＡＲ  Ｔ細胞の毒性はオフモレキュラー（ｏｆｆ−ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）またはオフオー
ガンの特異性には関連しなかったが、応答の過剰効果に起因して、命にかかわる腫瘍崩壊
症候群およびサイトカインストームが生じた。処置する医師は、アポトーシスを誘導し、
治療用細胞の全てを死滅させることによって、命にかかわる白血病に対する有効な処置を
完全に終結させることには気が進まない可能性がある。医師は抗がん活性をより安全な、
より持続可能なレベルに調節するためにＣＡＲ  Ｔ細胞の数を単に減少させたい可能性が
ある。この臨床的なシナリオでは、治療用細胞のごく一部のみを選択的に死滅させるため
の方法が好ましい可能性がある。
【０５６２】
ステージ４神経芽細胞腫の２歳にＧＤ２を標的とするＣＡＲ  Ｔ細胞の注入を行う。患
者は療法にゆっくりと応答するが、発熱、咳、発疹、疼痛、および運動神経障害を含めた
厄介な副作用が発生し、これらは全て以前に抗ＧＤ２モノクローナル抗体療法で見られた
ものである。患者を抗炎症薬、ステロイドおよび疼痛薬で処置し、わずかに軽減する。Ｃ
ＡＲ  Ｔ細胞の傷害性は、オンモレキュラー（ｏｎ−ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）標的／オフオ
ーガン標的シナリオに関連し、亜急性であり、命にかかわるものではない。処置する医師
は、アポトーシスを誘導し、治療用細胞の全てを死滅させることによって、命にかかわる
神経芽細胞腫に対する有効な処置を完全に終結させることには気が進まない可能性がある
。医師抗がん活性をより安全な、より持続可能なレベルに調節するためにＣＡＲ  Ｔ細胞
の数を単に減少させたい可能性がある。この臨床的なシナリオでは、治療用細胞のごく一
部のみを選択的に死滅させるための方法が好ましい可能性がある。
【０５６３】
ＡＭＬを有し、化学療法後の２回目の寛解状態にある５２歳をＨＳＣＴについて評価す
るが適合ドナーが見つからない。ＣＤ３４で選択されたハプロタイプ一致ＨＳＣＴを実施
し、ＨＳＣＴ時にＢＰＸ−５０１  Ｔ細胞追加輸注を行う。ＨＳＣＴ後５０日目に、患者
においてグレードＩＩからＩＩＩのＧｖＨＤを示す症候性の発疹およびビリルビンのわず
かな上昇が発生したが、白血病の寛解状態のままである。毒性はオンモレキュラー標的／
オフオーガン標的であるが、亜急性であり命にかかわるものではない。ＡＰ１９０３を４
０ｍｇの用量（０．４ｍｇ／ｋｇ）で与え、ＧｖＨＤが消散した場合、付随的なＧｖＬ効
果も消失する可能性があり、これにより、医師が当該技術を使用する気が進まなくなる。
この場合、処置する医師は、ＧｖＨＤの症状を緩和するためにＴ細胞を単に部分的に排除
することを望む可能性がある。
（実施例１１）
制御されたレベルのアポトーシスのための改変カスパーゼポリペプチド
【０５６４】
例えばＡＰ１９０３などの高用量の化学的誘導物質を用いて排除される細胞の割合の増
加に「ダイヤルイン」可能なカスパーゼレオスタットにより、細胞療法の毒性の異なる臨
床的なシナリオに対する測定される応答を可能にすることによってまだ対処されていない
臨床的な必要性がよりよく満たされる可能性がある。レオスタットとしてカスパーゼ技術
を使用することにより、０．５〜１ｍｇ／ｋｇの十分な用量で９０％超の急速な死滅を実
現する能力が維持されると同時に、低用量における臨床的に用量設定可能に低下させた死
滅が可能になる（図４８および図４９）。
【０５６５】
一実施形態では、０．０１ｍｇ／ｋｇから１ｍｇ／ｋｇまでの用量漸増をわずか１５〜
３０分きざみで行いながら、応答に関して患者の有害事象（複数可）をモニタリングする
。
【０５６６】
別の実施形態では、持続注入ポンプを使用してＡＰ１９０３注入を非常に低用量で開始
し、わずか１５〜３０分きざみで徐々に高く用量設定を行い、患者の有害事象をモニタリ
ングする。
【０５６７】
別の実施形態では、ＡＰ１９０３の緩慢放出製剤（経口、ＩＭ、ＳＱ、ＳＬ）を数日ま
たは数週間かけて行って、養子移入された細胞の一部を排除することによって亜急性の命
にかかわるものではない細胞療法の毒性の制御を徐々に実現する。
【０５６８】
一実施形態では、タンパク質−タンパク質二量体化の境界面内（すなわち、小サブユニ
ット内のカスパーゼ−９のβ６鎖内のＧＣＦＮＦ４０２−４０６）に種々の点変異を含む
改変カスパーゼポリペプチド（（１、２））により、基底の活性の低下と併せて、ＩＣ５
０レベルの改変が生じる（図５０）。
【０５６９】
改変カスパーゼ−９の基底のシグナル伝達を改変するために、組み入れられたヌクレオ
チド当たり誤差２．８×１０７の誤差率であることが分かっており、Ｔａｑポリメラーゼ
よりも忠実度が１００倍高いＫａｐａ高忠実度ポリメラーゼ（Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔ
ｅｍｓ、Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ）を用いてＰＣＲに基づく部位特異的な変異誘発（３）を行
った。増幅を１８サイクル行った後、ＰＣＲ産物をインタクトなままにするメチル化依存
性ＤｐｎＩ制限酵素を用いて親プラスミドを除去した。得られた反応物２μｌを使用して
ＸＬ１−ｂｌｕｅまたはＤＨ５αを化学的に形質転換した。その後、配列決定（ＳｅｑＷ
ｒｉｇｈｔ、Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ）によって陽性変異体を同定した。
【０５７０】
基底の活性とＡＰ１９０３媒介性活性の両方を評価するために、トランスフェクション
まで１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、および１００Ｕ／ｍＬのストレプトマ
イシンを補充したＩＭＤＭ、ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中、加湿、３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気雰囲気下
で維持した初期継代ＨＥＫ２９３Ｔ／１６細胞（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）に
おいてトランスフェクションを行った。対数期の成長中の細胞に、１５ｍＬの円錐管中、
細胞百万個当たり、ｉＣａｓｐ９変異体をコードする発現プラスミド８００ｎｇ〜２μｇ
およびＳＲαプロモーターにより駆動されるＳＥＡＰをコードする発現プラスミド５００
ｎｇを一過性にトランスフェクトした。触媒として不活性カスパーゼ−９（Ｃ２８５Ａ）
（ＦＫＢＰドメインを伴わない）または「空の」発現プラスミド（「ｐＳＨ１−ヌル」）
を使用して、トランスフェクション間の総プラスミドレベルを一定に保った。ＧｅｎｅＪ
ａｍｍｅｒ（登録商標）Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔを１μｇのプラスミ
ドＤＮＡ当たり３μｌの比で使用して、抗生物質の不在下、ＨＥＫ２９３Ｔ／１６細胞に
一過性にトランスフェクトした。トランスフェクション混合物１００μｌまたは２ｍＬを
それぞれ９６ウェルプレートまたは６ウェルプレートの各ウェルに添加した。ＳＥＡＰア
ッセイのために、トランフェクション後最低３時間インキュベートした後、ＡＰ１９０３
の対数希釈物を添加した。
【０５７１】
基底の活性とＡＰ１９０３媒介性活性の両方を評価するために、分泌型アルカリホスフ
ァターゼ（ＳＥＡＰ）アッセイを実施した。ＡＰ１９０３処理の２４〜４８時間後に、上
清約１００μｌを回収して９６ウェルプレート中に入れ、記載されている通りＳＥＡＰ活
性についてアッセイした（４、５）。簡単に述べると、６５℃で４５分の熱変性を行って
、熱感受性の内在性（および血清由来）アルカリホスファターゼを不活化した後、上清５
μｌをイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）９５μｌに添加し、２Ｍのジエタノール
アミンに再懸濁させた１００ｍＭの４−メチルウンベリフェリルホスフェート（４−ＭＵ
Ｐ；Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）１μｌを含有する基質緩衝液１００μｌに
添加した。ＳＥＡＰによる４−ＭＵＰの加水分解により、容易に測定することができる励
起／放出（３５５／４６０ｎｍ）を伴う蛍光基質が生じる。ウェル間の蛍光「漏出」を最
小限にするために、アッセイを黒色の不透明な９６ウェルプレート中で実施した。
【０５７２】
一実施形態では、細胞療法は、高感受性改変カスパーゼ、例えばＮ４０５Ｑを発現して
いる細胞を、低感受性カスパーゼ、例えばＦ４０６Ｔを発現している細胞と併せて含み、
それにより、ＣＩＤ制御下で、最もリガンド感受性の高いサブセットを選択的に排除する
と同時に、感受性の低い細胞を保護することが可能になる。
【０５７３】
別の実施形態では、患者に２つの型の細胞、例えば、２つの型のキメラ抗原受容体を用
いた細胞療法を行うこともでき、例えば、幹細胞移植後のＴ細胞追加輸注およびＣＡＲ細
胞療法を行うこともできる。この実施形態では、細胞の１つのセットに高感受性改変カス
パーゼを発現させることができ、細胞の他のセットに低感受性カスパーゼを発現させるこ
とができ、これにより、有害事象に際して細胞の選択的な除去が可能になる。例えば、幹
細胞移植後に追加輸注されるＴ細胞に高感受性改変カスパーゼを発現させることができ、
ＣＡＲにより改変された細胞に低感受性改変カスパーゼを発現させることができる。移植
片対宿主病が出現したら、低用量の多量体リガンドを投与することによってＴ細胞を排除
することができ、その一方でＣＡＲにより改変された治療用細胞は保持される。別の実施
形態では、ＣＡＲにより改変された細胞に高感受性改変カスパーゼを発現させることがで
き、幹細胞移植後に追加輸注されるＴ細胞に低感受性改変カスパーゼを発現させることが
できる。オフターゲットの毒性、腫瘍崩壊症候群（ＴＬＳ）、サイトカイン放出症候群（
ＣＲＳ）またはマクロファージ活性化症候群（ＭＡＳ）、またはＣＡＲにより改変された
治療用細胞に関連する他の有害な転帰が出現したら、低用量の多量体リガンドを投与する
ことによってこれらの細胞を排除することができる。さらに別の実施形態では、細胞のう
ちの１つの集団を排除することが望まれる前に有害事象または移植片対宿主病が患者に存
在しない場合がある。療法の持続時間を限定することが必要になり得る。例えば、幹細胞
移植後に追加輸注されたＴ細胞を維持しながら、ＣＡＲにより改変された治療用細胞療法
を限られた時間にわたって追跡することが有効であり得る。本実施例では、ＣＡＲにより
改変された治療用細胞は高感受性改変カスパーゼを発現する。または、例えば、ＣＡＲに
より改変された治療用細胞療法を追求しながら、幹細胞移植後にＴ細胞を限られた時間に
わたってもたらすことが有効であり得る。本実施例では、Ｔ細胞は高感受性改変カスパー
ゼを発現する。
【０５７４】
１．Ｃｈａｏ，  Ｙ、Ｓｈｉｏｚａｋｉ，  Ｅ．Ｎ、Ｓｒｉｎｉｖａｓｕｌａ，  Ｓ．Ｍ
、Ｒｉｇｏｔｔｉ，  Ｄ．Ｊ、Ｆａｉｒｍａｎ，  Ｒ、およびＳｈｉ，  Ｙ．  ２００５
年、Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａ  ｄｉｍｅｒｉｃ  ｃａｓｐａｓｅ−９：  ａ  ｒｅ−
ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  ｍｏｄｅ
ｌ  ｆｏｒ  ｃａｓｐａｓｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．  ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌ  ３巻：ｅ
１８３頁。
【０５７５】
２．Ｓｈｉｏｚａｋｉ，  Ｅ．Ｎ、Ｃｈａｉ，  Ｊ、Ｒｉｇｏｔｔｉ，  Ｄ．Ｊ、Ｒｉｅ
ｄｌ，  Ｓ．Ｊ、Ｌｉ，  Ｐ、Ｓｒｉｎｉｖａｓｕｌａ，  Ｓ．Ｍ、Ａｌｎｅｍｒｉ，  
Ｅ．Ｓ、Ｆａｉｒｍａｎ，  Ｒ、およびＳｈｉ，  Ｙ．  ２００３年、Ｍｅｃｈａｎｉｓ
ｍ  ｏｆ  ＸＩＡＰ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｓｐａｓｅ
−９．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  １１巻：５１９〜５２７頁。
【０５７６】
３．Ｐａｐｗｏｒｔｈ，  Ｃ、Ｂａｕｅｒ，  Ｊ．  Ｃ、Ｂｒａｍａｎ，  Ｊ．およびＷ
ｒｉｇｈｔ，  Ｄ．  Ａ．  ．  １９９６年、Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇ
ｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｏｎｅ  ｄａｙ  ｗｉｔｈ  ＞  ８０％  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ．
Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ９巻：３〜４頁。
【０５７７】
４．ＭａｃＣｏｒｋｌｅ，  Ｒ．Ａ、Ｆｒｅｅｍａｎ，  Ｋ．Ｗ、およびＳｐｅｎｃｅｒ
，  Ｄ．Ｍ．  １９９８年、Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｓ
ｐａｓｅｓ：  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｄｅａｔｈ  ｓｗｉｔｃｈｅｓ．  Ｐｒｏｃ  Ｎ
ａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９５巻：３６５５〜３６６０頁。
【０５７８】
５．Ｓｐｅｎｃｅｒ，  Ｄ．Ｍ、Ｂｅｌｓｈａｗ，  Ｐ．Ｊ、Ｃｈｅｎ，  Ｌ、Ｈｏ，  
Ｓ．Ｎ、Ｒａｎｄａｚｚｏ，  Ｆ、Ｃｒａｂｔｒｅｅ，  Ｇ．Ｒ、およびＳｃｈｒｅｉｂ
ｅｒ，  Ｓ．Ｌ．  １９９６年、Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｆａ
ｓ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｕｓｉｎｇ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｉｎｄｕ
ｃｅｒｓ  ｏｆ  ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ．  Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ  ６巻：８３９〜８
４７頁。
（実施例１２）
移植片対宿主病を回避するためのリガンド誘導因子の用量設定
【０５７９】
療法後の治療用細胞の部分的な消失を、例えばＧｖＨＤなどの有害事象の出現を回避す
るために予防的に実施することができる。スケジュールならびに治療用細胞およびリガン
ド誘導因子の投薬量を決定するために使用する方法を、有害事象を緩和するためのスケジ
ュールおよび治療用細胞およびリガンド誘導因子の投薬量を決定するためにも使用するこ
とができる。これらの方法を使用することにより、アロ反応性Ｔ細胞が先制して排除され
、ＧｖＨＤが回避されると同時に、ＧｖＬ媒介性Ｔ細胞を含めた有益なＴ細胞が最大数で
維持される、リガンド誘導因子、例えばＡＰ１９０３の最低用量を同定することができる
。さらに、アロ反応性Ｔ細胞を予防的に標的化することにより、高用量のＴ細胞を患者に
投与することができ、したがって、生着が容易になり、感染に対する免疫機能が保護され
ると同時に、ＧｖＨＤの出現が減少する。
【０５８０】
移植片対宿主病が起こり得る１つの例は、血液悪性腫瘍の成人および小児における骨髄
破壊的ハプロ移植後である。治療転帰の測定には、例えば、療法の３カ月後、６カ月後、
１２カ月後、および２４カ月後の生着、免疫機能および再発が含まれる。血液悪性腫瘍を
有する成体または小児対象に、０日目に骨髄破壊的ハプロ移植を行う。０日目〜２日目に
、誘導性カスパーゼ−９、または誘導性カスパーゼ−９バリアントを発現するＴ細胞を固
定用量で患者に投与する。Ｔ細胞追加輸注の濃度の範囲は、例えば、１ｋｇ当たり細胞１
×１０５〜１×１０８個であり得る。
【０５８１】
７日目に、リガンド誘導因子、例えばＡＰ１９０３を予防的に投与する。他の例では、
リガンド誘導因子を３日目〜１５日目に投与することができる。誘導因子の最初の用量を
、例えば、患者３名の各コホートにおいて、１００日目までに、２回目の十分な用量のＡ
Ｐ１９０３によって緩和されるＧｖＨＤが出現するまでハーフログ（ｈａｌｆ−ｌｏｇ）
ずつ減少させる。他の方法では、誘導因子の最初の用量を低用量にし、例えば、各コホー
トにおいてＧｖＨＤの出現がなくなるまでハーフログずつ増加させる。誘導因子の用量範
囲は、例えば、１ｋｇ当たり０．０１〜０．１マイクログラムであり得る。
【０５８２】
表７には、ＧｖＨＤを回避するために適したリガンド誘導因子の投薬量を決定するため
のプロトコールの例の要約が提示されている。
【表７】
2020040969.tif 000011
【０５８３】
（実施例１３）
特定の核酸配列およびアミノ酸配列の例
配列番号１、５’ＬＴＲ配列のヌクレオチド配列
【化１】
2020040969.tif 000012
配列番号２、Ｆｖ（ヒトＦＫＢＰ１２ｖ３６）のヌクレオチド配列
【化２】
2020040969.tif 000013
配列番号３、Ｆｖ（ヒトＦＫＢＰ１２ｖ３６）のアミノ酸配列
【化３】
2020040969.tif 000014
配列番号４、ＧＳリンカーヌクレオチド配列
【化４】
2020040969.tif 000015
配列番号５、ＧＳリンカーアミノ酸配列
【化５】
2020040969.tif 000016
配列番号６、リンカーヌクレオチド配列（ＧＳリンカーとＣａｓｐ９の間）
【化６】
2020040969.tif 000017
配列番号７、リンカーアミノ酸配列（ＧＳリンカーとＣａｓｐ９の間）
【化７】
2020040969.tif 000018
配列番号８、Ｃａｓｐ９（短縮型）ヌクレオチド配列
【化８−１】
2020040969.tif 000019
【化８−２】
2020040969.tif 000020
配列番号９、カスパーゼ−９（短縮型）アミノ酸配列−ＣＡＲＤドメイン欠失
【化９】
2020040969.tif 000021
配列番号１０、リンカーヌクレオチド配列（カスパーゼ−９と２Ａの間）
【化１０】
2020040969.tif 000022
配列番号１１、リンカーアミノ酸配列（カスパーゼ−９と２Ａの間）
【化１１】
2020040969.tif 000023
配列番号１２、カプシドタンパク質前駆体由来のＴｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａウイルス
−２Ａヌクレオチド配列
【化１２】
2020040969.tif 000024
配列番号１３、カプシドタンパク質前駆体由来のＴｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａウイルス
−２Ａアミノ酸配列
【化１３】
2020040969.tif 000025
配列番号１４、ヒトＣＤ１９（Δ細胞質ドメイン）ヌクレオチド配列（膜貫通ドメイン
が太字で示されている）
【化１４】
2020040969.tif 000026
配列番号１５、ヒトＣＤ１９（Δ細胞質ドメイン）アミノ酸配列
【化１５】
2020040969.tif 000027
配列番号１６、３’ＬＴＲヌクレオチド配列
【化１６】
2020040969.tif 000028
【０５８４】
配列番号１７、発現ベクター構築物ヌクレオチド配列−キメラタンパク質および５’Ｌ
ＴＲ配列および３’ＬＴＲ配列、ならびに追加的なベクター配列をコードするヌクレオチ
ド配列。
【化１７−１】
2020040969.tif 000029
【化１７−２】
2020040969.tif 000030
【化１７−３】
2020040969.tif 000031
【化１７−４】
2020040969.tif 000032
【化１７−５】
2020040969.tif 000033
配列番号１８、（ＸｈｏＩ／ＳａｌＩリンカーを伴うＦｖ’Ｆｖｌｓのヌクレオチド配
列、（Ｆｖ’内のゆらぎコドンが小文字で示されている））
【化１８】
2020040969.tif 000034
配列番号１９、（ＦＶ’ＦＶＬＳアミノ酸配列）
【化１９】
2020040969.tif 000035
配列番号２０、ＦＫＢＰ１２ｖ３６（残基２〜１０８）
ＳＧＧＧＳＧリンカー（６アミノ酸）
ΔＣａｓｐ９（残基１３５〜４１６）
【化２０】
2020040969.tif 000036
配列番号２１、ＦＫＢＰ１２ｖ３６（残基２〜１０８）
【化２１】
2020040969.tif 000037
配列番号２２、ΔＣａｓｐ９（残基１３５〜４１６）
【化２２−１】
2020040969.tif 000038
【化２２−２】
2020040969.tif 000039
配列番号２３、ΔＣａｓｐ９（残基１３５〜４１６）Ｄ３３０Ａ、ヌクレオチド配列
【化２３】
2020040969.tif 000040
配列番号２４、ΔＣａｓｐ９（残基１３５〜４１６）Ｄ３３０Ａ、アミノ酸配列
【化２４】
2020040969.tif 000041
配列番号２５、ΔＣａｓｐ９（残基１３５〜４１６）Ｎ４０５Ｑヌクレオチド配列
【化２５−１】
2020040969.tif 000042
【化２５−２】
2020040969.tif 000043
配列番号２６、ΔＣａｓｐ９（残基１３５〜４１６）Ｎ４０５Ｑアミノ酸配列
【化２６】
2020040969.tif 000044
配列番号２７、ΔＣａｓｐ９（残基１３５〜４１６）Ｄ３３０Ａ  Ｎ４０５Ｑヌクレオ
チド配列
【化２７】
2020040969.tif 000045
配列番号２８、ΔＣａｓｐ９（残基１３５〜４１６）Ｄ３３０Ａ  Ｎ４０５Ｑアミノ酸
配列
【化２８】
2020040969.tif 000046
配列番号２９、ＦＫＢＰｖ３６（Ｆｖ１）ヌクレオチド配列
【化２９】
2020040969.tif 000047
配列番号３０、ＦＫＢＰｖ３６（Ｆｖ１）アミノ酸配列
【化３０】
2020040969.tif 000048
配列番号３１、ＦＫＢＰｖ３６（Ｆｖ２）ヌクレオチド配列
【化３１】
2020040969.tif 000049
配列番号３２、ＦＫＢＰｖ３６（Ｆｖ２）アミノ酸配列
【化３２】
2020040969.tif 000050
配列番号３３、ΔＣＤ１９ヌクレオチド配列
【化３３】
2020040969.tif 000051
配列番号３４、ΔＣＤ１９アミノ酸配列
【化３４】
2020040969.tif 000052
【０５８５】
コドン最適化ｉＣａｓｐ９−Ｎ４０５Ｑ−２Ａ−ΔＣＤ１９配列：（ヌクレオチド配列
の名称の後ろの．ｃｏはコドン最適化されたものであること（またはコドン最適化された
ヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列）を示す。
配列番号３５、ＦＫＢＰｖ３６．ｃｏ（Ｆｖ３）ヌクレオチド配列
【化３５】
2020040969.tif 000053
配列番号３６、ＦＫＢＰｖ３６．ｃｏ（Ｆｖ３）アミノ酸配列
【化３６】
2020040969.tif 000054
配列番号３７、リンカー．ｃｏヌクレオチド配列
【化３７】
2020040969.tif 000055
配列番号３８、リンカー．ｃｏアミノ酸配列
【化３８】
2020040969.tif 000056
配列番号３９、カスパーゼ−９．ｃｏヌクレオチド配列
【化３９】
2020040969.tif 000057
配列番号４０、カスパーゼ−９．ｃｏアミノ酸配列
【化４０】
2020040969.tif 000058
配列番号４１、リンカー．ｃｏヌクレオチド配列
【化４１】
2020040969.tif 000059
配列番号４２、リンカー．ｃｏアミノ酸配列
【化４２】
2020040969.tif 000060
配列番号１３６：Ｔ２Ａ．ｃｏヌクレオチド配列
【化４３】
2020040969.tif 000061
配列番号４３：Ｔ２Ａ．ｃｏアミノ酸配列
【化４４】
2020040969.tif 000062
配列番号１３７：ΔＣＤ１９．ｃｏヌクレオチド配列
【化４５】
2020040969.tif 000063
配列番号１３８：ΔＣＤ１９．ｃｏアミノ酸配列
【化４６】
2020040969.tif 000064
【表６−１】
2020040969.tif 000065
【表６−２】
2020040969.tif 000066
【表６−３】
2020040969.tif 000067
【表６−４】
2020040969.tif 000068
【表６−５】
2020040969.tif 000069
【表６−６】
2020040969.tif 000070
【表６−７】
2020040969.tif 000071
【表６−８】
2020040969.tif 000072
【表６−９】
2020040969.tif 000073
【表６−１０】
2020040969.tif 000074
【表６−１１】
2020040969.tif 000075
【表６−１２】
2020040969.tif 000076
【表６−１３】
2020040969.tif 000077
【表６−１４】
2020040969.tif 000078
【表６−１５】
2020040969.tif 000079
【表６−１６】
2020040969.tif 000080
【表６−１７】
2020040969.tif 000081
【表６−１８】
2020040969.tif 000082
【表６−１９】
2020040969.tif 000083
【表６−２０】
2020040969.tif 000084
【表６−２１】
2020040969.tif 000085
【表６−２２】
2020040969.tif 000086
【表６−２３】
2020040969.tif 000087
【表６−２４】
2020040969.tif 000088
【表６−２５】
2020040969.tif 000089
【表６−２６】
2020040969.tif 000090
【表６−２７】
2020040969.tif 000091
【表６−２８】
2020040969.tif 000092
【表６−２９】
2020040969.tif 000093
【表６−３０】
2020040969.tif 000094
【表６−３１】
2020040969.tif 000095
【表６−３２】
2020040969.tif 000096
【表６−３３】
2020040969.tif 000097
【表６−３４】
2020040969.tif 000098
【表６−３５】
2020040969.tif 000099
【表６−３６】
2020040969.tif 000100
【表６−３７】
2020040969.tif 000101
【表６−３８】
2020040969.tif 000102
【表６−３９】
2020040969.tif 000103
【表６−４０】
2020040969.tif 000104
【表６−４１】
2020040969.tif 000105
【表６−４２】
2020040969.tif 000106
【表６−４３】
2020040969.tif 000107
【表６−４４】
2020040969.tif 000108
【０５８６】
配列番号１３０、ΔＣａｓｐ９（残基１３５〜４１６）Ｆ４０６Ｗのヌクレオチド配列
【化４７】
2020040969.tif 000109
配列番号１３１、ΔＣａｓｐ９（残基１３５〜４１６）Ｆ４０６Ｗのアミノ酸配列
【化４８】
2020040969.tif 000110
配列番号１３２、ΔＣａｓｐ９（残基１３５〜４１６）Ｆ４０６Ｙのヌクレオチド配列
【化４９−１】
2020040969.tif 000111
【化４９−２】
2020040969.tif 000112
配列番号１３３、ΔＣａｓｐ９（残基１３５〜４１６）Ｆ４０６Ｙのアミノ酸配列
【化５０】
2020040969.tif 000113
配列番号１３４、ΔＣａｓｐ９（残基１３５〜４１６）Ｃ４０３Ａのヌクレオチド配列
【化５１】
2020040969.tif 000114
配列番号１３５、ΔＣａｓｐ９（残基１３５〜４１６）Ｃ４０３Ａアミノ酸配列
【化５２】
2020040969.tif 000115
（実施例１４）
代表的な実施形態
【０５８７】
当該技術のある特定の実施形態が以下に提示されている。
Ａ１．  対象における移植された治療用細胞の生存を制御する方法であって、
ａ）治療用細胞を調製するまたは得るステップ、
ｂ）治療用細胞に、多量体化領域およびカスパーゼ−９ポリペプチドまたは改変カスパ
ーゼ−９ポリペプチドを含むキメラポリペプチドをコードする核酸をトランスフェクトま
たは形質導入するステップであって、カスパーゼ−９ポリペプチドまたは改変カスパーゼ
−９ポリペプチドが、配列番号９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ
酸配列を含むステップ、
ｃ）形質導入またはトランスフェクトされた治療用細胞を対象に移植するステップ、お
よび
ｄ）（ｃ）の後に、対象に、多量体化領域に結合する多量体リガンドを、カスパーゼ−
９ポリペプチドまたは改変カスパーゼ−９ポリペプチドを発現する移植された治療用細胞
の８０％未満を死滅させるために有効な量で投与するステップ
を含み、
改変カスパーゼ−９ポリペプチドが、改変されていないカスパーゼ−９ポリペプチドと
比較して、多量体リガンドに対する応答において低下したＩＣ５０、および伸長した用量
反応曲線を有する、
方法。
【０５８８】
Ａ２．カスパーゼ−９ポリペプチドまたは改変カスパーゼ−９ポリペプチドを発現する
移植された治療用細胞の７０％未満が、多量体リガンドの投与後に死滅する、実施形態Ａ
１に記載の方法。
【０５８９】
Ａ３．カスパーゼ−９ポリペプチドまたは改変カスパーゼ−９ポリペプチドを発現する
移植された治療用細胞の６０％未満が、多量体リガンドの投与後に死滅する、実施形態Ａ
１またはＡ２に記載の方法。
【０５９０】
Ａ４．カスパーゼ−９ポリペプチドまたは改変カスパーゼ−９ポリペプチドを発現する
移植された治療用細胞の５０％未満が、多量体リガンドの投与後に死滅する、実施形態Ａ
１からＡ３までのいずれか１つに記載の方法。
【０５９１】
Ａ５．カスパーゼ−９ポリペプチドまたは改変カスパーゼ−９ポリペプチドを発現する
移植された治療用細胞の４０％未満が、多量体リガンドの投与後に死滅する、実施形態Ａ
１からＡ４までのいずれか１つに記載の方法。
【０５９２】
Ａ６．カスパーゼ−９ポリペプチドまたは改変カスパーゼ−９ポリペプチドを発現する
移植された治療用細胞の３０％未満が、多量体リガンドの投与後に死滅する、実施形態Ａ
１からＡ５までのいずれか１つに記載の方法。
【０５９３】
Ａ６．１．治療用細胞が、異種タンパク質をさらに発現する、実施形態Ａ１からＡ６ま
でのいずれか１つに記載の方法。
【０５９４】
Ａ６．２．異種タンパク質がキメラ抗原受容体である、実施形態Ａ６．１に記載の方法
。
【０５９５】
Ａ６．３．キメラ抗原受容体がキメラＴ細胞受容体である、実施形態Ａ６．２に記載の
方法。
【０５９６】
Ａ６．４．キメラ抗原受容体がｓｃＦｖドメインを含む、実施形態Ａ６．１に記載の方
法。
【０５９７】
Ａ７．改変カスパーゼ−９ポリペプチドの多量体リガンドに対するＩＣ５０が０．０１
ｐＭ超である、実施形態Ａ１からＡ６．４までのいずれか１つに記載の方法。
【０５９８】
Ａ７．１  改変カスパーゼ−９ポリペプチドの多量体リガンドに対するＩＣ５０が０．
０５ｐＭ超である、実施形態Ａ１からＡ６．４までのいずれか１つに記載の方法。
【０５９９】
Ａ７．２  改変カスパーゼ−９ポリペプチドの多量体リガンドに対するＩＣ５０が０．
１ｐＭ超である、実施形態Ａ１からＡ６．４までのいずれか１つに記載の方法。
【０６００】
Ａ７．３  改変カスパーゼ−９ポリペプチドの多量体リガンドに対するＩＣ５０が０．
５ｐＭ超である、実施形態Ａ１からＡ６．４までのいずれか１つに記載の方法。
【０６０１】
Ａ７．４  改変カスパーゼ−９ポリペプチドの多量体リガンドに対するＩＣ５０が０．
０１ｎＭ超である、実施形態Ａ１からＡ６．４までのいずれか１つに記載の方法。
【０６０２】
Ａ８．改変カスパーゼ−９ポリペプチドの多量体リガンドに対するＩＣ５０が０．０５
ｎＭ超である、実施形態Ａ１からＡ７．４までのいずれか１つに記載の方法。
【０６０３】
Ａ９．改変カスパーゼ−９ポリペプチドの多量体リガンドに対するＩＣ５０が０．１ｎ
Ｍ超である、実施形態Ａ１からＡ８までのいずれか１つに記載の方法。
【０６０４】
Ａ１０．改変カスパーゼ−９ポリペプチドの多量体リガンドに対するＩＣ５０が０．５
ｎＭ超である、実施形態Ａ１からＡ９までのいずれか１つに記載の方法。
【０６０５】
Ａ１１．改変カスパーゼ−９ポリペプチドの多量体リガンドに対するＩＣ５０が１ｎＭ
超である、実施形態Ａ１からＡ１０までのいずれか１つに記載の方法。
Ｂ１．対象における移植された治療用細胞の生存を制御する方法であって、
ａ）治療用細胞を調製するまたは得るステップ、
ｂ）治療用細胞の第１のサブセットに、多量体化領域および第１のカスパーゼ−９ポリ
ペプチドを含むキメラポリペプチドをコードする核酸をトランスフェクトまたは形質導入
するステップであって、第１のカスパーゼ−９ポリペプチドが、配列番号９に対して少な
くとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むステップ、
ｃ）治療用細胞の第２のサブセットに、多量体化領域および第２のカスパーゼ−９ポリ
ペプチドを含むキメラポリペプチドをコードする核酸をトランスフェクトまたは形質導入
するステップであって、第２のカスパーゼ−９ポリペプチドが、配列番号９に対して少な
くとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むステップ、
ｄ）形質導入またはトランスフェクトされた治療用細胞の第１のサブセットおよび治療
用細胞の第２のサブセットを対象に移植するステップ、および
【０６０６】
ｅ）（ｄ）の後に、対象に、多量体化領域に結合する多量体リガンドを、治療用細胞の
第１のサブセットを治療用細胞の第２のサブセットよりも多く死滅させるために有効な量
で投与するステップ
を含む方法。
【０６０７】
Ｂ２．第１のカスパーゼ−９ポリペプチドおよび第２のカスパーゼ−９ポリペプチドが
、異なるアミノ酸配列を含み、異なる基底の活性または異なるＩＣ５０を有する、実施形
態Ｂ１に記載の方法。
【０６０８】
Ｂ３．第１のカスパーゼ−９ポリペプチドのアミノ酸配列と第２のカスパーゼ−９ポリ
ペプチドのアミノ酸配列が異なる、実施形態Ｂ１またはＢ２に記載の方法。
【０６０９】
Ｂ４．第１のカスパーゼ−９ポリペプチドが、第２のカスパーゼ−９ポリペプチドと比
較して、多量体リガンドに対する応答において低下したＩＣ５０、および伸長した用量反
応曲線を有する、実施形態Ｂ１からＢ３までのいずれか１つに記載の方法。
【０６１０】
Ｂ５．治療用細胞の第１のサブセットと治療用細胞の第２のサブセットが異なる型の細
胞である、実施形態Ｂ１からＢ４までのいずれか１つに記載の方法。
【０６１１】
Ｂ６．治療用細胞の第１のサブセットまたは第２のサブセットがＴ細胞である、実施形
態Ｂ５に記載の方法。
【０６１２】
Ｂ７  治療用細胞の第１のサブセットまたは第２のサブセットが異種タンパク質をさら
に発現する、実施形態Ｂ５またはＢ６に記載の方法。
【０６１３】
Ｂ８．異種タンパク質がキメラ抗原受容体である、実施形態Ｂ７に記載の方法。
【０６１４】
Ｂ８．１．キメラ抗原受容体がキメラＴ細胞受容体である、実施形態Ｂ８に記載の方法
。
【０６１５】
Ｂ８．２．キメラ抗原受容体がｓｃＦｖドメインを含む、実施形態Ｂ８に記載の方法。
【０６１６】
Ｂ９．治療用細胞の第１のサブセットおよび治療用細胞の第２のサブセットが異なる時
間に対象から単離した同じ細胞型である、実施形態Ｂ１からＢ８．２までのいずれか１つ
に記載の方法。
【０６１７】
Ｂ１０．治療用細胞が、造血幹細胞、誘導性前駆細胞（ｉＰＳ）、胚性幹（ＥＳ）細胞
、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、形質（Ｂ）細胞、筋細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、
マクロファージ、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、およびＴ細胞からなる群から選択される
、実施形態Ｂ１からＢ９までのいずれか１つに記載の方法。
【０６１８】
Ｂ１１．  予備。
【０６１９】
Ｂ１２．第１のカスパーゼ−９ポリペプチドまたは第２のカスパーゼ−９ポリペプチド
の多量体リガンドに対するＩＣ５０が０．０１ｐＭ超である、実施形態Ｂ１からＢ１０ま
でのいずれか１つに記載の方法。
【０６２０】
Ｂ１２．１．第１のカスパーゼ−９ポリペプチドまたは第２のカスパーゼ−９ポリペプ
チドの多量体リガンドに対するＩＣ５０が０．０５ｐＭ超である、実施形態Ｂ１からＢ１
０までのいずれか１つに記載の方法。
【０６２１】
Ｂ１２．２  第１のカスパーゼ−９ポリペプチドまたは第２のカスパーゼ−９ポリペプ
チドの多量体リガンドに対するＩＣ５０が０．１ｐＭ超である、実施形態Ｂ１からＢ１０
までのいずれか１つに記載の方法。
【０６２２】
Ｂ１２．３  第１のカスパーゼ−９ポリペプチドまたは第２のカスパーゼ−９ポリペプ
チドの多量体リガンドに対するＩＣ５０が０．５ｐＭ超である、実施形態Ｂ１からＢ１０
までのいずれか１つに記載の方法。
【０６２３】
Ｂ１２．４  第１のカスパーゼ−９ポリペプチドまたは第２のカスパーゼ−９ポリペプ
チドの多量体リガンドに対するＩＣ５０が０．０１ｎＭ超である、実施形態Ｂ１からＢ１
０までのいずれか１つに記載の方法。
【０６２４】
Ｂ１３．第１のカスパーゼ−９ポリペプチドまたは第２のカスパーゼ−９ポリペプチド
の多量体リガンドに対するＩＣ５０が０．０５ｎＭ超である、実施形態Ｂ１からＢ１２．
４までのいずれか１つに記載の方法。
【０６２５】
Ｂ１４．第１のカスパーゼ−９ポリペプチドまたは第２のカスパーゼ−９ポリペプチド
の多量体リガンドに対するＩＣ５０が０．１ｎＭ超である、実施形態Ｂ１からＢ１３まで
のいずれか１つに記載の方法。
【０６２６】
Ｂ１５．第１のカスパーゼ−９ポリペプチドまたは第２のカスパーゼ−９ポリペプチド
の多量体リガンドに対するＩＣ５０が０．５ｎＭ超である、実施形態Ｂ１からＢ１４まで
のいずれか１つに記載の方法。
【０６２７】
Ｂ１６．第１のカスパーゼ−９ポリペプチドまたは第２のカスパーゼ−９ポリペプチド
の多量体リガンドに対するＩＣ５０が１ｎＭ超である、実施形態Ｂ１からＢ１５までのい
ずれか１つに記載の方法。
【０６２８】
Ｂ１７．第１の治療用細胞または第２の治療用細胞がＴ細胞である、実施形態Ｂ１から
Ｂ１６までのいずれか１つに記載の方法。
【０６２９】
Ｂ１８．第２の治療用細胞がＴ細胞である、実施形態Ｂ１からＢ１７までのいずれか１
つに記載の方法。
【０６３０】
Ｂ１９．第２の治療用細胞が、幹細胞移植後の対象に投与されるＴ細胞である、実施形
態Ｂ１８に記載の方法。
【０６３１】
Ｂ２０．対象に投与する前にＴ細胞をアロ枯渇させる、実施形態Ｂ１９またはＢ２０に
記載の方法。
【０６３２】
Ｂ２１．対象に投与する前にＴ細胞をアロ枯渇させない、実施形態Ｂ１９またはＢ２０
に記載の方法。
【０６３３】
Ｂ２２．第２の治療用細胞がキメラ抗原受容体を含む、実施形態Ｂ１からＢ２１までの
いずれか１つに記載の方法。
【０６３４】
Ｂ２３．第１の治療用細胞がＴ細胞である、実施形態Ｂ２２に記載の方法。
【０６３５】
Ｂ２４．第２の治療用細胞が幹細胞移植後の対象に投与されるＴ細胞である、実施形態
Ｂ２３に記載の方法。
【０６３６】
Ｂ２５．対象に投与する前にＴ細胞をアロ枯渇させる、実施形態Ｂ２３またはＢ２に記
載の方法。
【０６３７】
Ｂ２６．対象に投与する前にＴ細胞をアロ枯渇させない、実施形態Ｂ２３またはＢ２４
に記載の方法。
Ｃ１．対象における移植された治療用細胞の生存を制御する方法であって、
ａ）治療用細胞を対象に移植するステップであって、治療用細胞が、多量体化領域およ
びカスパーゼ−９ポリペプチドまたは改変カスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、カスパーゼ−９ポリペプチドまたは改変
カスパーゼ−９ポリペプチドが、配列番号９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有
するアミノ酸配列を含むステップ、および
ｂ）（ａ）の後に、対象に、多量体化領域に結合する多量体リガンドを、カスパーゼ−
９ポリペプチドまたは改変カスパーゼ−９ポリペプチドを発現する移植された治療用細胞
の最大７０％を死滅させるために有効な量で投与するステップ、
を含み、
改変カスパーゼ−９ポリペプチドが、改変されていないカスパーゼ−９ポリペプチドと
比較して、多量体リガンドに対する応答において低下したＩＣ５０、および伸長した用量
反応曲線を有するが伸長する、
方法。
【０６３８】
Ｃ２．細胞に、キメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが形質導入またはト
ランスフェクトされている、実施形態Ｃ１に記載の方法。
【０６３９】
Ｃ３．治療用細胞が、造血幹細胞、誘導性前駆細胞（ｉＰＳ）、胚性幹（ＥＳ）細胞、
間葉系幹細胞、形質（Ｂ）細胞、筋細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、腫瘍
浸潤リンパ球、およびＴ細胞からなる群から選択される、実施形態Ｃ１またはＣ２に記載
の方法。
【０６４０】
Ｃ４．カスパーゼ−９ポリペプチドまたは改変カスパーゼ−９ポリペプチドを発現する
移植された治療用細胞の７０％未満が、多量体リガンドの投与後に死滅する、実施形態Ｃ
１からＣ３までのいずれか１つに記載の方法。
【０６４１】
Ｃ５．カスパーゼ−９ポリペプチドまたは改変カスパーゼ−９ポリペプチドを発現する
移植された治療用細胞の６０％未満が、多量体リガンドの投与後に死滅する、実施形態Ｃ
１からＣ４までのいずれか１つに記載の方法。
【０６４２】
Ｃ６．カスパーゼ−９ポリペプチドまたは改変カスパーゼ−９ポリペプチドを発現する
移植された治療用細胞の５０％未満が、多量体リガンドの投与後に死滅する、実施形態Ｃ
１からＣ５までのいずれか１つに記載の方法。
【０６４３】
Ｃ７．カスパーゼ−９ポリペプチドまたは改変カスパーゼ−９ポリペプチドを発現する
移植された治療用細胞の４０％未満が、多量体リガンドの投与後に死滅する、実施形態Ｃ
１からＣ６までのいずれか１つに記載の方法。
【０６４４】
Ｃ８．カスパーゼ−９ポリペプチドまたは改変カスパーゼ−９ポリペプチドを発現する
移植された治療用細胞の３０％未満が、多量体リガンドの投与後に死滅する、実施形態Ｃ
１からＣ７までのいずれか１つに記載の方法。
【０６４５】
Ｃ９．改変カスパーゼ−９ポリペプチドの多量体リガンドに対するＩＣ５０が０．０１
ｐＭ超である、実施形態Ｃ１からＣ８までのいずれか１つに記載の方法。
【０６４６】
Ｃ８．１．改変カスパーゼ−９ポリペプチドの多量体リガンドに対するＩＣ５０が０．
０５ｐＭ超である、実施形態Ｃ１からＣ８までのいずれか１つに記載の方法。
【０６４７】
Ｃ８．２．改変カスパーゼ−９ポリペプチドの多量体リガンドに対するＩＣ５０が０．
１ｐＭ超である、実施形態Ｃ１からＣ８までのいずれか１つに記載の方法。
【０６４８】
Ｃ８．３．改変カスパーゼ−９ポリペプチドの多量体リガンドに対するＩＣ５０が０．
５ｐＭ超である、実施形態Ｃ１からＣ８までのいずれか１つに記載の方法。
【０６４９】
Ｃ８．４．改変カスパーゼ−９ポリペプチドの多量体リガンドに対するＩＣ５０が０．
０１ｎＭ超である、実施形態Ｃ１からＣ８までのいずれか１つに記載の方法。
【０６５０】
Ｃ９．  予備。
【０６５１】
Ｃ１０．改変カスパーゼ−９ポリペプチドの多量体リガンドに対するＩＣ５０が０．０
５ｎＭ超である、実施形態Ｃ１からＣ８．４までのいずれか１つに記載の方法。
【０６５２】
Ｃ１１．改変カスパーゼ−９ポリペプチドの多量体リガンドに対するＩＣ５０が０．１
ｎＭ超である、実施形態Ｃ１からＣ１０までのいずれか１つに記載の方法。
【０６５３】
Ｃ１２．改変カスパーゼ−９ポリペプチドの多量体リガンドに対するＩＣ５０が０．５
ｎＭ超である、実施形態Ｃ１からＣ１１までのいずれか１つに記載の方法。
【０６５４】
Ｃ１３．改変カスパーゼ−９ポリペプチドの多量体リガンドに対するＩＣ５０が１ｎＭ
超である、実施形態Ｃ１からＣ１２までのいずれか１つに記載の方法。
【０６５５】
Ｃ１４．治療用細胞がキメラ抗原受容体を含む、実施形態Ｃ１からＣ１３までのいずれ
か１つに記載の方法。
【０６５６】
Ｃ１４．１．キメラ抗原受容体がキメラＴ細胞受容体である、実施形態Ｃ１４に記載の
方法。
【０６５７】
Ｃ１４．２．キメラ抗原受容体がｓｃＦｖドメインを含む、実施形態Ｃ１４に記載の方
法。
【０６５８】
Ｃ１５．治療有効レベルの、キメラ抗原受容体を含む治療用細胞が、多量体リガンドの
投与後に対象において活性なままである、実施形態Ｃ１４からＣ１４．２までのいずれか
に記載の方法。
Ｄ１．対象における移植された治療用細胞の生存を制御する方法であって、
ａ）治療用細胞の第１のセットを対象に移植するステップであって、治療用細胞の第１
のセットが、多量体化領域および第１のカスパーゼ−９ポリペプチドまたは第１の改変カ
スパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含
み、カスパーゼ−９ポリペプチドまたは改変カスパーゼ−９ポリペプチドが、配列番号９
に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むステップ、
ｂ）治療用細胞の第２のセットを対象に移植するステップであって、治療用細胞の第２
のセットが、多量体化領域および第２のカスパーゼ−９ポリペプチドまたは第２の改変カ
スパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含
み、カスパーゼ−９ポリペプチドまたは改変カスパーゼ−９ポリペプチドが、配列番号９
に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むステップ、および
【０６５９】
ｃ）対象に、多量体化領域に結合する多量体リガンドを、治療用細胞の第１のサブセッ
トを治療用細胞の第２のサブセットよりも多く死滅させるために有効な量で投与するステ
ップ
を含む方法。
【０６６０】
Ｄ２．第１のカスパーゼ−９ポリペプチドおよび第２のカスパーゼ−９ポリペプチドが
、異なるアミノ酸配列を含み、異なる基底の活性または異なるＩＣ５０を有する、実施形
態Ｄ１に記載の方法。
【０６６１】
Ｄ３．第１のカスパーゼ−９ポリペプチドのアミノ酸配列と第２のカスパーゼ−９ポリ
ペプチドのアミノ酸配列が異なる、実施形態Ｄ１またはＤ２に記載の方法。
【０６６２】
Ｄ４．第１のカスパーゼ−９ポリペプチドが、第２のカスパーゼ−９ポリペプチドと比
較して、多量体リガンドに対する応答において低下したＩＣ５０、および伸長した用量反
応曲線を有する、実施形態Ｄ１からＤ３までのいずれか１つに記載の方法。
【０６６３】
Ｄ５．治療用細胞の第１のサブセットと治療用細胞の第２のサブセットが異なる型の細
胞である、実施形態Ｄ１からＤ４までのいずれか１つに記載の方法。
【０６６４】
Ｄ６．治療用細胞の第１のサブセットおよび治療用細胞の第２のサブセットが異なる時
間に対象から単離した同じ細胞型である、実施形態Ｄ１からＤ４までのいずれか１つに記
載の方法。
【０６６５】
Ｄ７．治療用細胞が、造血幹細胞、誘導性前駆細胞（ｉＰＳ）、胚性幹（ＥＳ）細胞、
間葉系幹細胞、形質（Ｂ）細胞、筋細胞、腫瘍浸潤リンパ球、およびＴ細胞からなる群か
ら選択される、実施形態Ｄ１またはＤ２に記載の方法。
【０６６６】
Ｄ８．第２のカスパーゼ−９ポリペプチドの多量体リガンドに対するＩＣ５０が０．０
１ｐＭ超である、実施形態Ｄ１からＤ７までのいずれか１つに記載の方法。
【０６６７】
Ｄ８．１  第２のカスパーゼ−９ポリペプチドの多量体リガンドに対するＩＣ５０が０
．０５ｐＭ超である、実施形態Ｄ１からＤ７までのいずれか１つに記載の方法。
【０６６８】
Ｄ８．２  第２のカスパーゼ−９ポリペプチドの多量体リガンドに対するＩＣ５０が０
．１ｐＭ超である、実施形態Ｄ１からＤ７までのいずれか１つに記載の方法。
【０６６９】
Ｄ８．３  第２のカスパーゼ−９ポリペプチドの多量体リガンドに対するＩＣ５０が０
．５ｐＭ超である、実施形態Ｄ１からＤ７までのいずれか１つに記載の方法。
【０６７０】
Ｄ８．４  第２のカスパーゼ−９ポリペプチドの多量体リガンドに対するＩＣ５０が０
．０１ｎＭ超である、実施形態Ｄ１からＤ７までのいずれか１つに記載の方法。
【０６７１】
Ｄ９．第２のカスパーゼ−９ポリペプチドの多量体リガンドに対するＩＣ５０が０．０
５ｎＭ超である、実施形態Ｄ１からＤ８．４までのいずれか１つに記載の方法。
【０６７２】
Ｄ１０．第２のカスパーゼ−９ポリペプチドの多量体リガンドに対するＩＣ５０が０．
１ｎＭ超である、実施形態Ｄ１からＤ９までのいずれか１つに記載の方法。
【０６７３】
Ｄ１１．第２のカスパーゼ−９ポリペプチドの多量体リガンドに対するＩＣ５０が０．
５ｎＭ超である、実施形態Ｄ１からＤ１０までのいずれか１つに記載の方法。
【０６７４】
Ｄ１２．第２のカスパーゼ−９ポリペプチドの多量体リガンドに対するＩＣ５０が１ｎ
Ｍ超である、実施形態Ｄ１からＤ１１までのいずれか１つに記載の方法。
【０６７５】
Ｄ１３．追加用量の多量体リガンドを対象に投与するステップをさらに含み、追加用量
の多量体リガンドの投与の後に、追加用量の前の移植された細胞の数と比較して、第１の
カスパーゼ−９ポリペプチドまたは第２のカスパーゼ−９ポリペプチドを発現する移植さ
れた治療用細胞の少なくとも１０％が死滅する、実施形態Ｄ１からＤ１２までのいずれか
１つに記載の方法。
【０６７６】
Ｄ１４．追加用量の多量体リガンドを対象に投与するステップをさらに含み、追加用量
の多量体リガンドの投与の後に、追加用量の前の移植された細胞の数と比較して、第１の
カスパーゼ−９ポリペプチドまたは第２のカスパーゼ−９ポリペプチドを発現する移植さ
れた治療用細胞の少なくとも１０％が死滅する、実施形態Ｄ１からＤ１３までのいずれか
１つに記載の方法。
【０６７７】
Ｄ１５．２回用量の多量体リガンドを対象に投与し、多量体リガンドの２回目の用量を
多量体リガンドの１回目の用量の２４時間より後に投与する、実施形態Ｄ１からＤ１４ま
でのいずれか１つに記載の方法。
【０６７８】
Ｄ１６．多量体リガンドの２回目の用量を多量体リガンドの１回目の用量の少なくとも
１週間後に対象に投与する、実施形態Ｄ１４またはＤ１５に記載の方法。
【０６７９】
Ｄ１７．対象への多量体リガンドの３回目の用量を多量体リガンドの２回目の用量の２
４時間より後に投与する、実施形態Ｄ１４またはＤ１６に記載の方法。
【０６８０】
Ｄ１８．対象への多量体リガンドの３回目の用量を多量体リガンドの２回目の用量の少
なくとも１週間後に投与する、実施形態Ｄ１４またはＤ１６に記載の方法。
Ｄ１９．患者における移植された治療用細胞によって生じる状態の存在、不在またはス
テージを含む情報を受け取るステップ、および
患者において同定された状態の存在、不在またはステージに基づいて、患者に対して多
量体化領域に結合する多量体リガンドを投与するか、その後の多量体リガンドの投薬量を
維持するか、またはその後の多量体リガンドの投薬量を調整するステップ
をさらに含む、実施形態Ｄ１からＤ１８までのいずれか１つに記載の方法。
Ｄ２０．
患者における、移植された治療用細胞によって生じる状態の存在、不在またはステージ
を同定するステップ、および
状態の存在、不在またはステージを、対象において同定された状態の存在、不在または
ステージに基づいて、多量体化領域に結合する多量体リガンドを投与するか、患者に投与
するその後の多量体リガンドの投薬量を維持するか、またはその後の多量体リガンドの投
薬量を調整するかの意思決定者に伝達するステップ
をさらに含む、実施形態Ｄ１からＤ１８までのいずれか１つに記載の方法。
Ｄ２１．
患者における、移植された治療用細胞によって生じる状態の存在、不在またはステージ
を同定するステップ、および
対象において同定された状態の存在、不在またはステージに基づいて、多量体結合性領
域に結合する多量体リガンドを投与するか、患者に投与するその後の多量体リガンドの投
薬量を維持するか、またはその後の多量体リガンドの投薬量を調整するかの指示を伝達す
るステップ
をさらに含む、実施形態Ｄ１からＤ１８までのいずれか１つに記載の方法。
【０６８１】
Ｄ２２．状態が移植片対宿主病である、実施形態Ｄ１からＤ２１までのいずれか１つに
記載の方法。
【０６８２】
Ｄ２３．第１の治療用細胞または第２の治療用細胞がＴ細胞である、実施形態Ｄ１から
Ｄ２２までのいずれか１つに記載の方法。
【０６８３】
Ｄ２４．所望の百分率の第１の治療用細胞が死滅するまで多量体リガンドの濃度を上昇
させる、実施形態Ｄ１からＤ２３までのいずれか１つに記載の方法。
【０６８４】
Ｄ２５．対象が移植片対宿主病を有し、多量体リガンドの投与により疾患が緩和される
、実施形態Ｄ１からＤ２４までのいずれか１つに記載の方法。
【０６８５】
Ｄ２６．第１の治療用細胞がキメラ抗原受容体を含む、実施形態Ｄ１からＤ２５までの
いずれか１つに記載の方法。
【０６８６】
Ｄ２６．１．キメラ抗原受容体がキメラＴ細胞受容体である、実施形態Ｄ２６に記載の
方法。
【０６８７】
Ｄ２６．２．キメラ抗原受容体がｓｃＦｖドメインを含む、実施形態Ｄ２６に記載の方
法。
【０６８８】
Ｄ２７．治療有効レベルの、キメラ抗原受容体を含む第１の治療用細胞が、多量体リガ
ンドの投与後に対象において活性なままである、実施形態Ｄ１からＤ２６．２までのいず
れか１つに記載の方法。
【０６８９】
Ｄ２８．第２の治療用細胞がＴ細胞である、実施形態Ｄ１からＤ２７までのいずれか１
つに記載の方法。
【０６９０】
Ｄ２９．第２の治療用細胞が、幹細胞移植後の対象に投与されるＴ細胞である、実施形
態Ｄ２８に記載の方法。
【０６９１】
Ｄ３０．対象に投与する前にＴ細胞をアロ枯渇させる、実施形態Ｄ２８またはＤ２９に
記載の方法。
【０６９２】
Ｄ３１．対象に投与する前にＴ細胞をアロ枯渇させない、Ｄ２８またはＤ２９に記載の
方法。
【０６９３】
Ｄ３２．第２の治療用細胞がキメラ抗原受容体を含む、実施形態Ｄ１からＤ３１までの
いずれか１つに記載の方法。
【０６９４】
Ｄ３３．第１の治療用細胞がＴ細胞である、実施形態Ｄ３２に記載の方法。
【０６９５】
Ｄ３４．第２の治療用細胞が幹細胞移植後の対象に投与されるＴ細胞である、実施形態
Ｄ３３に記載の方法。
【０６９６】
Ｄ３５．対象に投与する前にＴ細胞をアロ枯渇させる、実施形態Ｄ３３またはＤ３４に
記載の方法。
【０６９７】
Ｄ３６．対象に投与する前にＴ細胞をアロ枯渇させない、Ｄ３３またはＤ３４に記載の
方法。
【０６９８】
Ｄ３７．  予備。
【０６９９】
Ｆ１．対象ががんを有する、実施形態Ａ１からＡ１１まで、Ｂ１からＢ２６まで、Ｃ１
からＣ１５まで、またはＤ１からＤ３６までのいずれか１つに記載の方法。
【０７００】
Ｆ２．対象が固形腫瘍を有する、実施形態Ａ１からＡ１１まで、Ｂ１からＢ２６まで、
Ｃ１からＣ１５まで、またはＤ１からＤ３６までのいずれか１つに記載の方法。
【０７０１】
Ｆ３．がんが、対象の血液または骨髄に存在する、実施形態Ｆ１に記載の方法。
【０７０２】
Ｆ４．対象が血液疾患または骨髄疾患を有する、実施形態Ａ１からＡ１１まで、Ｂ１か
らＢ２６まで、Ｃ１からＣ１５まで、またはＤ１からＤ３６までのいずれか１つに記載の
方法。
【０７０３】
Ｆ５．対象が、幹細胞移植によって緩和することができる任意の状態または障害と診断
されている、実施形態Ａ１からＡ１１まで、Ｂ１からＢ２６まで、Ｃ１からＣ１５まで、
またはＤ１からＤ３６までのいずれか１つに記載の方法。
【０７０４】
Ｆ６．対象が、鎌状赤血球貧血または異染性白質ジストロフィーと診断されている、実
施形態Ａ１からＡ１１まで、Ｂ１からＢ２６まで、Ｃ１からＣ１５まで、またはＤ１から
Ｄ３６までのいずれか１つに記載の方法。
【０７０５】
Ｆ７．患者が、原発性免疫不全障害、血球貪食リンパ組織球増多症（ＨＬＨ）または他
の血球貪食障害、遺伝性骨髄不全障害、異常ヘモグロビン症、代謝障害、および破骨細胞
障害からなる群から選択される状態と診断されている、実施形態Ａ１からＡ１１まで、Ｂ
１からＢ２６まで、Ｃ１からＣ１５まで、またはＤ１からＤ３６までのいずれか１つに記
載の方法。
【０７０６】
Ｆ８．状態が、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、複合免疫不全症（ＣＩＤ）、先天性
Ｔ細胞欠損／欠乏症、分類不能型免疫不全症（ＣＶＩＤ）、慢性肉芽腫性疾患、ＩＰＥＸ
（免疫不全、多腺性内分泌障害、腸疾患、Ｘ連鎖）またはＩＰＥＸ様、ウィスコット・ア
ルドリッチ症候群、ＣＤ４０リガンド欠乏症、白血球接着不全症、ＤＯＣＫ８欠乏症、Ｉ
Ｌ−１０欠乏／ＩＬ−１０受容体欠乏症、ＧＡＴＡ２欠乏症、Ｘ連鎖リンパ増殖性疾患（
ＸＬＰ）、軟骨毛髪形成不全症、シュワヒマン・ダイアモンド症候群、ダイアモンド・ブ
ラックファン貧血、先天性角化異常症、ファンコニー貧血、先天性好中球減少症、鎌状赤
血球症、サラセミア、ムコ多糖症、スフィンゴリピドーシス、および大理石骨病からなる
群から選択される、実施形態Ａ１からＡ１１まで、Ｂ１からＢ２６まで、Ｃ１からＣ１５
まで、またはＤ１からＤ３６までのいずれか１つに記載の方法。
【０７０７】
Ｆ９．対象が、１つまたは複数のステージ１移植片対宿主病の症状を示している、実施
形態Ａ１からＡ１１まで、Ｂ１からＢ２６まで、Ｃ１からＣ１５まで、またはＤ１からＤ
３６までのいずれか１つに記載の方法。
【０７０８】
Ｆ１０．対象が、１つまたは複数のステージ２移植片対宿主病の症状を示している、実
施形態Ａ１からＡ１１まで、Ｂ１からＢ２６まで、Ｃ１からＣ１５まで、またはＤ１から
Ｄ３６までのいずれか１つに記載の方法。
【０７０９】
Ｆ１１．対象が、１つまたは複数のステージ３移植片対宿主病の症状を示している、実
施形態Ａ１からＡ１１まで、Ｂ１からＢ２６まで、Ｃ１からＣ１５まで、またはＤ１から
Ｄ３６までのいずれか１つに記載の方法。
【０７１０】
Ｆ１２．対象が、１つまたは複数のステージ４移植片対宿主病の症状を示している、実
施形態Ａ１からＡ１１まで、Ｂ１からＢ２６まで、Ｃ１からＣ１５まで、またはＤ１から
Ｄ３６までのいずれか１つに記載の方法。
【０７１１】
Ｆ１３．多量体リガンドの投与後にアロ反応性Ｔ細胞の数が減少する、実施形態Ａ１か
らＡ１１まで、Ｂ１からＢ２６まで、Ｃ１からＣ１５まで、Ｄ１からＤ３６まで、または
Ｆ１からＦ２までのいずれか１つに記載の方法。
【０７１２】
Ｆ１４．アロ反応性Ｔ細胞がマーカーおよびＣＤ３を発現する、実施形態Ａ１からＡ１
１まで、Ｂ１からＢ２６まで、Ｃ１からＣ１５まで、Ｆ１からＦ２まで、またはＤ１から
Ｄ３６までのいずれか１つに記載の方法。
【０７１３】
Ｆ１５．アロ反応性Ｔ細胞の数が多量体リガンドの投与後に約９０％またはそれより多
く減少する、実施形態Ａ１からＡ１１まで、Ｂ１からＢ２６まで、Ｃ１からＣ１５まで、
Ｆ１からＦ１４まで、またはＤ１からＤ３６までのいずれか１つに記載の方法。
【０７１４】
Ｆ１６．多量体リガンドの投与後に、対象において、増大することができ、かつウイル
スおよび真菌に対して反応性であるドナーＴ細胞が生存する、実施形態Ａ１からＡ１１ま
で、Ｂ１からＢ２６まで、Ｃ１からＣ１５まで、Ｆ１からＦ１５まで、またはＤ１からＤ
３６までのいずれか１つに記載の方法。
【０７１５】
Ｆ１７．多量体リガンドの投与後に、対象において、増大することができ、かつ対象に
おける腫瘍細胞に対して反応性であるドナーＴ細胞が生存する、実施形態Ａ１からＡ１１
まで、Ｂ１からＢ２６まで、Ｃ１からＣ１５まで、Ｆ１からＦ１６まで、またはＤ１から
Ｄ３６までのいずれか１つに記載の方法。
【０７１６】
Ｆ１８．少なくとも１つのアミノ酸置換が、Ｓ１４４Ａ、Ｓ１４４Ｄ、Ｙ１５３Ａ、Ｙ
１５３Ｆ、Ｓ１８３Ａ、Ｓ１９５Ａ、Ｓ１９６Ａ、Ｓ１９６Ｄ、Ｓ３０７Ａ、Ｄ３１５Ａ
、Ａ３１６Ｇ、Ｔ３１７Ａ、Ｔ３１７Ｃ、Ｔ３１７Ｅ、Ｔ３１７Ｓ、Ｐ３１８Ａ、Ｆ３１
９Ａ、Ｆ３１９Ｗ、Ｆ３２６Ｋ、Ｄ３２７Ｇ、Ｄ３２７Ｋ、Ｄ３２７Ｒ、Ｑ３２８Ｋ、Ｑ
３２８Ｒ、Ｌ３２９Ｅ、Ｌ３２９Ｇ、Ｌ３２９Ｋ、Ｄ３３０Ａ、Ｄ３３０Ｅ、Ｄ３３０Ｇ
、Ｄ３３０Ｎ、Ｄ３３０Ｓ、Ｄ３３０Ｖ、Ａ３３１Ｋ、Ｃ４０３Ａ、Ｃ４０３Ｓ、Ｃ４０
３Ｔ、Ｆ４０４Ｔ、Ｆ４０４Ｗ、Ｆ４０４Ｙ、Ｎ４０５Ａ、Ｎ４０５Ｆ、Ｎ４０５Ｑ、Ｎ
４０５Ｔ、Ｆ４０６Ａ、Ｆ４０６Ｔ、Ｆ４０６Ｗ、Ｆ４０６Ｙ、Ｇ４０２Ａ、Ｇ４０２Ｉ
、Ｇ４０２Ｑ、Ｇ４０２Ｙ、Ｃ４０３Ｐ、Ｆ４０４Ａ、Ｆ４０４Ｓ、およびＦ４０６Ｌか
らなる群から選択される、実施形態Ａ１からＡ１１まで、Ｂ１からＢ２６まで、Ｃ１から
Ｃ１５まで、Ｆ１からＦ１７まで、またはＤ１からＤ３６までのいずれか１つに記載の方
法。
【０７１７】
Ｆ１９．少なくとも１つのアミノ酸置換が、Ｓ１４４Ａ、Ｓ１４４Ｄ、Ｙ１５３Ａ、Ｙ
１５３Ｆ、Ｓ１８３Ａ、Ｓ１９５Ａ、Ｓ１９６Ａ、Ｓ１９６Ｄ、Ｓ３０７Ａ、Ｄ３１５Ａ
、Ａ３１６Ｇ、Ｔ３１７Ａ、Ｔ３１７Ｃ、Ｔ３１７Ｅ、Ｔ３１７Ｓ、Ｐ３１８Ａ、Ｆ３１
９Ａ、Ｆ３１９Ｗ、Ｆ３２６Ｋ、Ｄ３２７Ｇ、Ｄ３２７Ｋ、Ｄ３２７Ｒ、Ｑ３２８Ｋ、Ｑ
３２８Ｒ、Ｌ３２９Ｅ、Ｌ３２９Ｇ、Ｌ３２９Ｋ、Ｄ３３０Ａ、Ｄ３３０Ｅ、Ｄ３３０Ｇ
、Ｄ３３０Ｎ、Ｄ３３０Ｓ、Ｄ３３０Ｖ、Ａ３３１Ｋ、Ｃ４０３Ａ、Ｃ４０３Ｓ、Ｃ４０
３Ｔ、Ｆ４０４Ｔ、Ｆ４０４Ｗ、Ｆ４０４Ｙ、Ｎ４０５Ａ、Ｎ４０５Ｆ、Ｎ４０５Ｑ、Ｎ
４０５Ｔ、Ｆ４０６Ａ、Ｆ４０６Ｔ、Ｆ４０６Ｗ、およびＦ４０６Ｙからなる群から選択
される、実施形態Ａ１からＡ１１まで、Ｂ１からＢ２６まで、Ｃ１からＣ１５まで、Ｄ１
からＤ３６まで、またはＦ１からＦ１７までのいずれか１つに記載の方法。
【０７１８】
Ｆ２０．少なくとも１つのアミノ酸置換が、Ｓ１４４Ａ、Ｓ１４４Ｄ、Ｙ１５３Ａ、Ｙ
１５３Ｆ、Ｓ１８３Ａ、Ｓ１９５Ａ、Ｓ１９６Ａ、Ｓ１９６Ｄ、Ｓ３０７Ａ、Ｄ３１５Ａ
、Ａ３１６Ｇ、Ｔ３１７Ａ、Ｔ３１７Ｃ、Ｔ３１７Ｓ、Ｐ３１８Ａ、Ｆ３１９Ａ、Ｆ３１
９Ｗ、Ｌ３２９Ｅ、Ｄ３３０Ａ、Ｄ３３０Ｅ、Ｄ３３０Ｇ、Ｄ３３０Ｎ、Ｄ３３０Ｓ、Ｄ
３３０Ｖ、Ｃ４０３Ａ、Ｃ４０３Ｓ、Ｃ４０３Ｔ、Ｆ４０４Ｔ、Ｆ４０４Ｗ、Ｆ４０４Ｙ
、Ｎ４０５Ａ、Ｎ４０５Ｆ、Ｎ４０５Ｑ、Ｆ４０６Ａ、Ｆ４０６Ｔ、Ｆ４０６Ｗ、および
Ｆ４０６Ｙからなる群から選択される、実施形態Ａ１からＡ１１まで、Ｂ１からＢ２６ま
で、Ｃ１からＣ１５まで、またはＤ１からＤ３６まで、またはＦ１からＦ１７までのいず
れか１つに記載の方法。
【０７１９】
Ｆ２１．少なくとも１つのアミノ酸置換が、Ｓ１４４Ａ、Ｓ１４４Ｄ、Ｙ１５３Ａ、Ｙ
１５３Ｆ、Ｓ１８３Ａ、Ｓ１９５Ａ、Ｓ１９６Ａ、Ｓ１９６Ｄ、Ｓ３０７Ａ、Ｄ３１５Ａ
、Ａ３１６Ｇ、Ｔ３１７Ａ、Ｔ３１７Ｓ、Ｆ３１９Ｗ、Ｌ３２９Ｅ、Ｄ３３０Ａ、Ｄ３３
０Ｅ、Ｄ３３０Ｇ、Ｄ３３０Ｎ、Ｄ３３０Ｓ、Ｄ３３０Ｖ、Ｆ４０４Ｔ、Ｆ４０４Ｗ、Ｆ
４０４Ｙ、Ｎ４０５Ｆ、Ｎ４０５Ｑ、Ｆ４０６Ａ、Ｆ４０６Ｔ、Ｆ４０６Ｗ、およびＦ４
０６Ｙである、実施形態Ａ１からＡ１１まで、Ｂ１からＢ２６まで、Ｃ１からＣ１５まで
、またはＤ１からＤ３６まで、またはＦ１からＦ１７までのいずれか１つに記載の方法。
【０７２０】
Ｆ２２．少なくとも１つのアミノ酸置換が、Ｓ１４４Ａ、Ｓ１４４Ｄ、Ｓ１８３Ａ、Ｓ
１９５Ａ、Ｓ１９６Ａ、Ｓ１９６Ｄ、Ｔ３１７Ａ、Ｔ３１７Ｓ、Ｌ３２９Ｅ、Ｄ３３０Ａ
、Ｄ３３０Ｅ、Ｄ３３０Ｇ、Ｄ３３０Ｎ、Ｄ３３０Ｓ、Ｄ３３０Ｖ、Ｆ４０４Ｙ、Ｎ４０
５Ｑ、Ｆ４０６Ａ、Ｆ４０６Ｗ、およびＦ４０６Ｙである、実施形態Ａ１からＡ１１まで
、Ｂ１からＢ２６まで、Ｃ１からＣ１５まで、またはＤ１からＤ３６まで、またはＦ１か
らＦ１７までのいずれか１つに記載の方法。
【０７２１】
Ｆ２３．少なくとも１つのアミノ酸置換が、Ｔ３１７Ｓ、Ｓ１４４Ａ、Ｓ１３３、およ
びＳ１９６Ｄからなる群から選択される、実施形態Ａ１からＡ１１まで、Ｂ１からＢ２６
まで、Ｃ１からＣ１５まで、またはＤ１からＤ３６まで、またはＦ１からＦ１７までのい
ずれか１つに記載の方法。
【０７２２】
Ｆ２４．少なくとも１つのアミノ酸置換が、Ｓ１８３Ａ、Ｓ１９５Ａ、Ｓ１９６Ａ、Ｓ
１９６Ｄ、Ｔ３１７Ａ、Ｌ３２９Ｅ、Ｄ３３０Ａ、Ｄ３３０Ｅ、Ｄ３３０Ｇ、Ｄ３３０Ｎ
、Ｄ３３０Ｓ、Ｄ３３０Ｖ、Ｆ４０４Ｙ、Ｎ４０５Ｑ、Ｆ４０６Ａ、Ｆ４０６Ｗ、および
Ｆ４０６Ｙからなる群から選択される、実施形態Ａ１からＡ１１まで、Ｂ１からＢ２６ま
で、Ｃ１からＣ１５まで、またはＤ１からＤ３６まで、またはＦ１からＦ１７までのいず
れか１つに記載の方法。
【０７２３】
Ｆ２５．少なくとも１つのアミノ酸置換がＤ３３０Ａである、実施形態Ａ１からＡ１１
まで、Ｂ１からＢ２６まで、Ｃ１からＣ１５まで、またはＤ１からＤ３６まで、またはＦ
１からＦ１７までのいずれか１つに記載の方法。
【０７２４】
Ｆ２６．少なくとも１つのアミノ酸置換がＤ３３０Ｅである、実施形態Ａ１からＡ１１
まで、Ｂ１からＢ２６まで、Ｃ１からＣ１５まで、またはＤ１からＤ３６まで、またはＦ
１からＦ１７までのいずれか１つに記載の方法。
【０７２５】
Ｆ２７．少なくとも１つのアミノ酸置換がＮ４０５Ｑである、実施形態Ａ１からＡ１１
まで、Ｂ１からＢ２６まで、Ｃ１からＣ１５まで、またはＤ１からＤ３６まで、またはＦ
１からＦ１７までのいずれか１つに記載の方法。
【０７２６】
Ｆ２８．改変カスパーゼ−９ポリペプチドが、Ｄ３３０Ａ−Ｎ４０５Ｑ、Ｄ３３０Ａ−
Ｓ１４４Ａ、Ｄ３３０Ａ−Ｓ１４４Ｄ、Ｄ３３０Ａ−Ｓ１８３Ａ、Ｄ３３０Ａ−Ｓ１９６
Ａ、Ｎ４０５Ｑ−Ｓ１４４Ａ、Ｎ４０５Ｑ−Ｓ１４４Ｄ、Ｎ４０５Ｑ−Ｓ１９６Ｄ、Ｎ４
０５Ｑ−Ｔ３１７Ｓ、Ｎ４０５Ｑ−Ｓ１４４Ａｃｏ、Ｎ４０５Ｑ−Ｔ３１７Ｓｃｏ、４０
２ＧＣＦＮＦ４０６ＩＳＡＱＴ（ＣＡＳＰ−１０）、３１６ＡＴＰＦ３１９ＡＶＰＩ（Ｓ
ＭＡＣ／Ｄｉａｂｌｏ）、Ｄ３３０Ａ−Ｎ４０５Ｔ、Ｄ３１５Ａ−Ｄ３３０Ａ、Ｄ３３０
Ａ−Ｙ１５３Ａ、Ｄ３３０Ａ−Ｙ１５３Ｆ、Ｄ３３０Ａ−Ｔ３１７Ｅ、４０２ＧＣＦＮＦ
４０６ＣＩＶＳＭ（ＣＡＳＰ−３）、４０２ＧＣＦＮＦ４０６ＡＡＡＡＡ、４０２ＧＣＦ
ＮＦ４０６ＹＣＳＴＬ（ＣＡＳＰ−２）、および４０２ＧＦＮＦ４０６ＱＰＴＦＴ（ＣＡ
ＳＰ−８）からなる群から選択されるアミノ酸置換を少なくとも２つ含む、実施形態Ａ１
からＡ１１まで、Ｂ１からＢ２６まで、Ｃ１からＣ１５まで、またはＤ１からＤ３６まで
、またはＦ１からＦ１７までのいずれか１つに記載の方法。
【０７２７】
Ｆ２９．改変カスパーゼ−９ポリペプチドが、Ｄ３３０Ａ−Ｎ４０５Ｑ、Ｄ３３０Ａ−
Ｓ１４４Ａ、Ｄ３３０Ａ−Ｓ１４４Ｄ、Ｄ３３０Ａ−Ｓ１８３Ａ、Ｄ３３０Ａ−Ｓ１９６
Ａ、Ｎ４０５Ｑ−Ｓ１４４Ａ、Ｎ４０５Ｑ−Ｓ１４４Ｄ、Ｎ４０５Ｑ−Ｓ１９６Ｄ、Ｎ４
０５Ｑ−Ｔ３１７Ｓ、Ｎ４０５Ｑ−Ｓ１４４Ａｃｏ、Ｎ４０５Ｑ−Ｔ３１７Ｓｃｏ、４０
２ＧＣＦＮＦ４０６ＩＳＡＱＴ（ＣＡＳＰ−１０）、３１６ＡＴＰＦ３１９ＡＶＰＩ（Ｓ
ＭＡＣ／Ｄｉａｂｌｏ）、およびＤ３３０Ａ−Ｎ４０５Ｔからなる群から選択されるアミ
ノ酸置換を少なくとも２つ含む、実施形態Ａ１からＡ１１まで、Ｂ１からＢ２６まで、Ｃ
１からＣ１５まで、またはＤ１からＤ３６まで、またはＦ１からＦ１７までのいずれか１
つに記載の方法。
【０７２８】
Ｆ３０．改変カスパーゼ−９ポリペプチドが、Ｄ３３０Ａ−Ｎ４０５Ｑ、Ｄ３３０Ａ−
Ｓ１４４Ａ、Ｄ３３０Ａ−Ｓ１４４Ｄ、Ｄ３３０Ａ−Ｓ１８３Ａ、Ｄ３３０Ａ−Ｓ１９６
Ａ、Ｎ４０５Ｑ−Ｓ１４４Ａ、Ｎ４０５Ｑ−Ｓ１４４Ｄ、Ｎ４０５Ｑ−Ｓ１９６Ｄ、Ｎ４
０５Ｑ−Ｔ３１７Ｓ、Ｎ４０５Ｑ−Ｓ１４４Ａｃｏ、Ｎ４０５Ｑ−Ｔ３１７Ｓｃｏ、４０
２ＧＣＦＮＦ４０６ＩＳＡＱＴ（ＣＡＳＰ−１０）、および３１６ＡＴＰＦ３１９ＡＶＰ
Ｉ（ＳＭＡＣ／Ｄｉａｂｌｏ）からなる群から選択されるアミノ酸置換を少なくとも２つ
含む、実施形態Ａ１からＡ１１まで、Ｂ１からＢ２６まで、Ｃ１からＣ１５まで、または
Ｄ１からＤ３６まで、またはＦ１からＦ１７までのいずれか１つに記載の方法。
【０７２９】
Ｆ３１．改変カスパーゼ−９ポリペプチドが、Ｄ３３０Ａ−Ｎ４０５Ｑ、Ｄ３３０Ａ−
Ｓ１４４Ａ、Ｄ３３０Ａ−Ｓ１４４Ｄ、Ｄ３３０Ａ−Ｓ１８３Ａ、Ｄ３３０Ａ−Ｓ１９６
Ａ、Ｎ４０５Ｑ−Ｓ１４４Ａ、Ｎ４０５Ｑ−Ｓ１４４Ｄ、Ｎ４０５Ｑ−Ｓ１９６Ｄ、Ｎ４
０５Ｑ−Ｔ３１７Ｓ、Ｎ４０５Ｑ−Ｓ１４４Ａｃｏ、Ｎ４０５Ｑ−Ｔ３１７Ｓｃｏ、およ
び４０２ＧＣＦＮＦ４０６ＩＳＡＱＴ（ＣＡＳＰ−１０）からなる群から選択されるアミ
ノ酸置換を少なくとも２つ含む、実施形態Ａ１からＡ１１まで、Ｂ１からＢ２６まで、Ｃ
１からＣ１５まで、またはＤ１からＤ３６まで、またはＦ１からＦ１７までのいずれか１
つに記載の方法。
【０７３０】
Ｆ３２．改変カスパーゼ−９ポリペプチドが、Ｎ４０５Ｑ−Ｓ１４４ＡｃｏおよびＮ４
０５Ｑ−Ｔ３１７Ｓｃｏからなる群から選択されるアミノ酸置換を少なくとも２つ含む、
実施形態Ａ１からＡ１１まで、Ｂ１からＢ２６まで、Ｃ１からＣ１５まで、またはＤ１か
らＤ３６まで、またはＦ１からＦ１７までのいずれか１つに記載の方法。
【０７３１】
Ｆ３２．１．少なくとも２つのアミノ酸置換がＮ４０５ＱおよびＳ１１４Ａである、実
施形態Ｆ３２に記載の方法。
【０７３２】
Ｆ３２．２．カスパーゼ−９ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列がコドン最適
化されたものである、実施形態Ｆ３２に記載の方法。
【０７３３】
Ｆ３３．少なくとも１つのアミノ酸置換が、Ｓ１４４Ａ、Ｓ１４４Ｄ、Ｙ１５３Ａ、Ｙ
１５３Ｆ、Ｓ１８３Ａ、Ｓ１９５Ａ、Ｓ１９６Ａ、Ｓ３０７Ａ、Ｄ３１５Ａ、Ａ３１６Ｇ
、Ｔ３１７Ａ、Ｔ３１７Ｃ、Ｔ３１７Ｅ、Ｔ３１７Ｓ、Ｐ３１８Ａ、Ｆ３１９Ａ、Ｆ３１
９Ｗ、Ｆ３２６Ｋ、Ｄ３２７Ｇ、Ｄ３２７Ｋ、Ｄ３２７Ｒ、Ｑ３２８Ｋ、Ｑ３２８Ｒ、Ｌ
３２９Ｅ、Ｌ３２９Ｇ、Ｌ３２９Ｋ、Ｄ３３０Ａ、Ｄ３３０Ｅ、Ｄ３３０Ｇ、Ｄ３３０Ｎ
、Ｄ３３０Ｓ、Ｄ３３０Ｖ、Ａ３３１Ｋ、Ｆ４０４Ｔ、Ｆ４０４Ｗ、Ｆ４０４Ｙ、Ｎ４０
５Ｆ、Ｎ４０５Ｑ、およびＦ４０６Ｔからなる群から選択される、実施形態Ａ１からＡ１
１まで、Ｂ１からＢ２６まで、Ｃ１からＣ１５まで、またはＤ１からＤ３６まで、または
Ｆ１からＦ１７までのいずれか１つに記載の方法。
【０７３４】
Ｆ３４．少なくとも１つのアミノ酸置換が、Ｓ１４４Ａ、Ｓ１４４Ｄ、Ｙ１５３Ａ、Ｙ
１５３Ｆ、Ｓ１８３Ａ、Ｓ１９５Ａ、Ｓ１９６Ａ、Ｓ３０７Ａ、Ｄ３１５Ａ、Ａ３１６Ｇ
、Ｔ３１７Ａ、Ｔ３１７Ｃ、Ｔ３１７Ｅ、Ｔ３１７Ｓ、Ｐ３１８Ａ、Ｆ３１９Ａ、Ｆ３１
９Ｗ、Ｆ３２６Ｋ、Ｄ３２７Ｇ、Ｄ３２７Ｋ、Ｄ３２７Ｒ、Ｑ３２８Ｋ、Ｑ３２８Ｒ、Ｌ
３２９Ｅ、Ｌ３２９Ｇ、Ｌ３２９Ｋ、Ｄ３３０Ａ、Ｄ３３０Ｅ、Ｄ３３０Ｇ、Ｄ３３０Ｎ
、Ｄ３３０Ｓ、Ｄ３３０Ｖ、Ａ３３１Ｋ、Ｆ４０４Ｔ、Ｆ４０４Ｗ、Ｆ４０４Ｙ、Ｎ４０
５Ｆ、Ｎ４０５Ｑ、およびＦ４０６Ｔからなる群から選択される、実施形態Ａ１からＡ１
１まで、Ｂ１からＢ２６まで、Ｃ１からＣ１５まで、またはＤ１からＤ３６まで、または
Ｆ１からＦ１７までのいずれか１つに記載の方法。
【０７３５】
Ｆ３５．少なくとも１つのアミノ酸置換が、Ｓ１４４Ａ、Ｓ１４４Ｄ、Ｙ１５３Ａ、Ｙ
１５３Ｆ、Ｓ１８３Ａ、Ｓ１９５Ａ、Ｓ１９６Ａ、Ｓ３０７Ａ、Ｄ３１５Ａ、Ａ３１６Ｇ
、Ｔ３１７Ａ、Ｔ３１７Ｃ、Ｔ３１７Ｓ、Ｐ３１８Ａ、Ｆ３１９Ａ、Ｆ３１９Ｗ、Ｌ３２
９Ｅ、Ｄ３３０Ａ、Ｄ３３０Ｅ、Ｄ３３０Ｇ、Ｄ３３０Ｎ、Ｄ３３０Ｓ、Ｄ３３０Ｖ、Ｆ
４０４Ｔ、Ｆ４０４Ｗ、Ｆ４０４Ｙ、Ｎ４０５Ｆ、Ｎ４０５Ｑ、およびＦ４０６Ｔからな
る群から選択される、実施形態Ａ１からＡ１１まで、Ｂ１からＢ２６まで、Ｃ１からＣ１
５まで、またはＤ１からＤ３６まで、またはＦ１からＦ１７までのいずれか１つに記載の
方法。
【０７３６】
Ｆ３６．少なくとも１つのアミノ酸置換が、Ｓ１４４Ａ、Ｓ１４４Ｄ、Ｙ１５３Ａ、Ｙ
１５３Ｆ、Ｓ１８３Ａ、Ｓ１９５Ａ、Ｓ１９６Ａ、Ｓ３０７Ａ、Ｄ３１５Ａ、Ａ３１６Ｇ
、Ｔ３１７Ａ、Ｔ３１７Ｓ、Ｆ３１９Ｗ、Ｄ３３０Ａ、Ｆ４０４Ｔ、Ｆ４０４Ｗ、Ｆ４０
４Ｙ、Ｎ４０５Ｆ、Ｎ４０５Ｑ、およびＦ４０６Ｔからなる群から選択される、実施形態
Ａ１からＡ１１まで、Ｂ１からＢ２６まで、Ｃ１からＣ１５まで、またはＤ１からＤ３６
まで、またはＦ１からＦ１７までのいずれか１つに記載の方法。
【０７３７】
Ｆ３７．少なくとも１つのアミノ酸置換が、Ｓ１４４Ａ、Ｓ１４４Ｄ、Ｓ１８３Ａ、Ｓ
１９５Ａ、Ｓ１９６Ａ、Ｔ３１７Ａ、Ｔ３１７Ｓ、Ｄ３３０Ａ、Ｆ４０４Ｙ、およびＮ４
０５Ｑからなる群から選択される、実施形態Ａ１からＡ１１まで、Ｂ１からＢ２６まで、
Ｃ１からＣ１５まで、またはＤ１からＤ３６まで、またはＦ１からＦ１７までのいずれか
１つに記載の方法。
【０７３８】
Ｆ３８．少なくとも１つのアミノ酸置換が、Ｓ１９６Ｄ、Ｔ３１７Ｃ、Ｔ３１７Ｅ、Ｐ
３１８Ａ、Ｆ３１９Ａ、Ｆ３２６Ｋ、Ｄ３２７Ｇ、Ｄ３２７Ｋ、Ｄ３２７Ｒ、Ｑ３２８Ｋ
、Ｑ３２８Ｒ、Ｌ３２９Ｅ、Ｌ３２９Ｇ、Ｌ３２９Ｋ、Ｄ３３０Ｅ、Ｄ３３０Ｇ、Ｄ３３
０Ｎ、Ｄ３３０Ｓ、Ｄ３３０Ｖ、Ａ３３１Ｋ、Ｃ４０３Ａ、Ｃ４０３Ｓ、Ｃ４０３Ｔ、Ｎ
４０５Ａ、Ｎ４０５Ｔ、Ｆ４０６Ａ、Ｆ４０６Ｗ、Ｆ４０６Ｙ、Ｇ４０２Ａ、Ｇ４０２Ｉ
、Ｇ４０２Ｑ、Ｇ４０２Ｙ、Ｃ４０３Ｐ、Ｆ４０４Ａ、Ｆ４０４Ｓ、およびＦ４０６Ｌか
らなる群から選択される、実施形態Ａ１からＡ１１まで、Ｂ１からＢ２６まで、Ｃ１から
Ｃ１５まで、またはＤ１からＤ３６まで、またはＦ１からＦ１７までのいずれか１つに記
載の方法。
【０７３９】
Ｆ３９．少なくとも１つのアミノ酸置換が、Ｓ１９６Ｄ、Ｔ３１７Ｃ、Ｔ３１７Ｅ、Ｐ
３１８Ａ、Ｆ３１９Ａ、Ｆ３２６Ｋ、Ｄ３２７Ｇ、Ｄ３２７Ｋ、Ｄ３２７Ｒ、Ｑ３２８Ｋ
、Ｑ３２８Ｒ、Ｌ３２９Ｅ、Ｌ３２９Ｇ、Ｌ３２９Ｋ、Ｄ３３０Ｅ、Ｄ３３０Ｇ、Ｄ３３
０Ｎ、Ｄ３３０Ｓ、Ｄ３３０Ｖ、Ａ３３１Ｋ、Ｃ４０３Ａ、Ｃ４０３Ｓ、Ｃ４０３Ｔ、Ｎ
４０５Ａ、Ｎ４０５Ｔ、Ｆ４０６Ａ、Ｆ４０６Ｗ、およびＦ４０６Ｙからなる群から選択
される、実施形態Ａ１からＡ１１まで、Ｂ１からＢ２６まで、Ｃ１からＣ１５まで、また
はＤ１からＤ３６まで、またはＦ１からＦ１７までのいずれか１つに記載の方法。
【０７４０】
Ｆ４０．少なくとも１つのアミノ酸置換が、Ｓ１９６Ｄ、Ｔ３１７Ｃ、Ｐ３１８Ａ、Ｆ
３１９Ａ、Ｌ３２９Ｅ、Ｄ３３０Ｅ、Ｄ３３０Ｇ、Ｄ３３０Ｎ、Ｄ３３０Ｓ、Ｄ３３０Ｖ
、Ｃ４０３Ａ、Ｃ４０３Ｓ、Ｃ４０３Ｔ、Ｎ４０５Ａ、Ｆ４０６Ａ、Ｆ４０６Ｔ、Ｆ４０
６Ｗ、およびＦ４０６Ｙからなる群から選択される、実施形態Ａ１からＡ１１まで、Ｂ１
からＢ２６まで、Ｃ１からＣ１５まで、またはＤ１からＤ３６まで、またはＦ１からＦ１
７までのいずれか１つに記載の方法。
【０７４１】
Ｆ４１．少なくとも１つのアミノ酸置換が、Ｓ１９６Ｄ、Ｌ３２９Ｅ、Ｄ３３０Ｅ、Ｄ
３３０Ｇ、Ｄ３３０Ｎ、Ｄ３３０Ｓ、Ｄ３３０Ｖ、Ｆ４０６Ａ、Ｆ４０６Ｔ、Ｆ４０６Ｗ
、およびＦ４０６Ｙからなる群から選択される、実施形態Ａ１からＡ１１まで、Ｂ１から
Ｂ２６まで、Ｃ１からＣ１５まで、またはＤ１からＤ３６まで、またはＦ１からＦ１７ま
でのいずれか１つに記載の方法。
【０７４２】
Ｆ４２．少なくとも１つのアミノ酸置換が、Ｓ１９６Ｄ、Ｌ３２９Ｅ、Ｄ３３０Ｅ、Ｄ
３３０Ｇ、Ｄ３３０Ｎ、Ｄ３３０Ｓ、Ｄ３３０Ｖ、Ｆ４０６Ａ、Ｆ４０６Ｗ、およびＦ４
０６Ｙからなる群から選択される、実施形態Ａ１からＡ１１まで、Ｂ１からＢ２６まで、
Ｃ１からＣ１５まで、またはＤ１からＤ３６まで、またはＦ１からＦ１７までのいずれか
１つに記載の方法。
【０７４３】
Ｆ４３．ポリヌクレオチドが、カスパーゼ−９ポリペプチドをコードする最適化された
コドンを含む、実施形態Ａ１からＡ１１まで、Ｂ１からＢ２６まで、Ｃ１からＣ１５まで
、またはＤ１からＤ３６まで、またはＦ１からＦ１７までのいずれか１つに記載の方法。
【０７４４】
Ｆ４４．改変カスパーゼ−９ポリペプチドが、Ｎ４０５Ｑのアミノ酸置換を含む、実施
形態Ａ１からＡ１１まで、Ｂ１からＢ２６まで、Ｃ１からＣ１５まで、またはＤ１からＤ
３６まで、またはＦ１からＦ１７までのいずれか１つに記載の方法。
【０７４５】
Ｆ４５．改変カスパーゼ−９ポリペプチドが配列番号３９の核酸配列によりコードされ
る、または配列番号８８の改変カスパーゼ−９ポリペプチドＤ３３０Ｅの核酸配列により
コードされる、実施形態Ａ１からＡ１１まで、Ｂ１からＢ２６まで、Ｃ１からＣ１５まで
、またはＤ１からＤ３６まで、またはＦ１からＦ１７までのいずれか１つに記載の方法。
【０７４６】
Ｆ４６．少なくとも１つのアミノ酸置換が、Ｎ４０５Ｑ、Ｆ４０４Ｙ、Ｆ４０６Ａ、Ｆ
４０６Ｗ、Ｆ４０６Ｙ、Ｆ４０４Ｔ、Ｆ４０４Ｗ、Ｎ４０５Ｆ、Ｆ４０６Ｔ、Ｃ４０３Ａ
、Ｃ４０３Ｓ、Ｃ４０３Ｔ、Ｎ４０５Ａ、およびＮ４０５Ｔからなる群から選択される、
実施形態Ａ１からＡ１１まで、Ｂ１からＢ２６まで、Ｃ１からＣ１５まで、またはＤ１か
らＤ３６まで、またはＦ１からＦ１７までのいずれか１つに記載の方法。
【０７４７】
Ｆ４７．少なくとも１つのアミノ酸置換が、Ｎ４０５Ｑ、Ｆ４０４Ｙ、Ｆ４０６Ａ、Ｆ
４０６Ｗ、およびＦ４０６Ｙからなる群から選択される、実施形態Ａ１からＡ１１まで、
Ｂ１からＢ２６まで、Ｃ１からＣ１５まで、またはＤ１からＤ３６まで、またはＦ１から
Ｆ１７までのいずれか１つに記載の方法。
【０７４８】
Ｆ４８．少なくとも１つのアミノ酸置換が、Ｔ３１７Ｓ、Ｄ３３０Ａ、Ｄ３３０Ｅ、Ｄ
３３０Ｇ、Ｄ３３０Ｎ、Ｄ３３０Ｓ、Ｄ３３０Ｖ、Ｌ３２９Ｅ、Ｔ３１７Ａ、Ｄ３１５Ａ
、Ａ３１６Ｇ、Ｔ３１７Ｃ、Ｐ３１８Ａ、Ｆ３１９Ａ、Ｔ３１７Ｅ、Ｆ３２６Ｋ、Ｄ３２
７Ｇ、Ｄ３２７Ｋ、Ｄ３２７Ｒ、Ｑ３２８Ｋ、Ｑ３２８Ｒ、Ｌ３２９Ｇ、Ｌ３２９Ｋ、お
よびＡ３３１Ｋからなる群から選択される、実施形態Ａ１からＡ１１まで、Ｂ１からＢ２
６まで、Ｃ１からＣ１５まで、またはＤ１からＤ３６まで、またはＦ１からＦ１７までの
いずれか１つに記載の方法。
【０７４９】
Ｆ４９．少なくとも１つのアミノ酸置換が、Ｔ３１７Ｓ、Ｄ３３０Ａ、Ｄ３３０Ｅ、Ｄ
３３０Ｇ、Ｄ３３０Ｎ、Ｄ３３０Ｓ、Ｄ３３０Ｖ、Ｌ３２９Ｅ、およびＴ３１７Ａからな
る群から選択される、実施形態Ａ１からＡ１１まで、Ｂ１からＢ２６まで、Ｃ１からＣ１
５まで、またはＤ１からＤ３６まで、またはＦ１からＦ１７までのいずれか１つに記載の
方法。
【０７５０】
Ｆ５０．少なくとも１つのアミノ酸置換が、Ｓ１４４Ａ、Ｓ１４４Ｄ、Ｓ１９６Ｄ、Ｓ
１８３Ａ、Ｓ１９５Ａ、Ｓ１９６Ａ、Ｙ１５３Ａ、Ｙ１５３Ｆ、およびＳ３０７Ａからな
る群から選択される、実施形態Ａ１からＡ１１まで、Ｂ１からＢ２６まで、Ｃ１からＣ１
５まで、またはＤ１からＤ３６まで、またはＦ１からＦ１７までのいずれか１つに記載の
方法。
【０７５１】
Ｆ５１．改変カスパーゼ−９ポリペプチドが、表５または表６のカスパーゼバリアント
からなる群から選択されるアミノ酸置換を含む、実施形態Ａ１からＡ１１まで、Ｂ１から
Ｂ２６まで、Ｃ１からＣ１５まで、またはＤ１からＤ３６まで、またはＦ１からＦ１７ま
でのいずれか１つに記載の方法。
【０７５２】
Ｆ５２．細胞がヒト細胞である、実施形態Ａ１からＡ１１まで、Ｂ１からＢ２６まで、
Ｃ１からＣ１５まで、Ｆ１からＦ５１まで、またはＤ１からＤ３６までのいずれか１つに
記載の方法。
【０７５３】
Ｆ５３．細胞が前駆細胞である、実施形態Ａ１からＡ１１まで、Ｂ１からＢ２６まで、
Ｃ１からＣ１５まで、Ｆ１からＦ５１まで、またはＤ１からＤ３６までのいずれか１つに
記載の方法。
【０７５４】
Ｆ５４．細胞が造血前駆細胞である、実施形態Ａ１からＡ１１まで、Ｂ１からＢ２６ま
で、Ｃ１からＣ１５まで、Ｆ１からＦ５１まで、またはＤ１からＤ３６までのいずれか１
つに記載の方法。
【０７５５】
Ｆ５５．細胞が、間葉系間質細胞、胚性幹細胞、腫瘍浸潤リンパ球、および誘導性多能
性幹細胞からなる群から選択される、実施形態Ａ１からＡ１１まで、Ｂ１からＢ２６まで
、Ｃ１からＣ１５まで、Ｆ１からＦ５１まで、またはＤ１からＤ３６までのいずれか１つ
に記載の方法。
【０７５６】
Ｆ５６．細胞がＴ細胞である、実施形態Ａ１からＡ１１まで、Ｂ１からＢ２６まで、Ｃ
１からＣ１５まで、Ｆ１からＦ５１まで、またはＤ１からＤ３６までのいずれか１つに記
載の方法。
【０７５７】
Ｆ５７．細胞を骨髄から得るまたは調製する、実施形態Ａ１からＡ１１まで、Ｂ１から
Ｂ２６まで、Ｃ１からＣ１５まで、Ｆ１からＦ５１まで、またはＤ１からＤ３６までのい
ずれか１つに記載の方法。
【０７５８】
Ｆ５８．細胞を臍帯血から得るまたは調製する、実施形態Ａ１からＡ１１まで、Ｂ１か
らＢ２６まで、Ｃ１からＣ１５まで、Ｆ１からＦ５１まで、またはＤ１からＤ３６までの
いずれか１つに記載の方法。
【０７５９】
Ｆ５９．細胞を末梢血から得るまたは調製する、実施形態Ａ１からＡ１１まで、Ｂ１か
らＢ２６まで、Ｃ１からＣ１５まで、Ｆ１からＦ５１まで、またはＤ１からＤ３６までの
いずれか１つに記載の方法。
【０７６０】
Ｆ６０．細胞を末梢血単核細胞から得るまたは調製する、実施形態Ａ１からＡ１１まで
、Ｂ１からＢ２６まで、Ｃ１からＣ１５まで、Ｆ１からＦ５１まで、またはＤ１からＤ３
６までのいずれか１つに記載の方法。
【０７６１】
Ｆ６１．ポリヌクレオチドがプロモーターに作動可能に連結している、実施形態Ａ１か
らＡ１１まで、Ｂ１からＢ２６まで、Ｃ１からＣ１５まで、Ｆ１からＦ６０まで、または
Ｄ１からＤ３６までのいずれか１つに記載の方法。
【０７６２】
Ｆ６２．第１のカスパーゼ−９ポリペプチドまたは第２のカスパーゼ−９ポリペプチド
をコードするポリヌクレオチドの少なくとも１つがプロモーターに作動可能に連結してい
る、実施形態Ａ１からＡ１１まで、Ｂ１からＢ２６まで、Ｃ１からＣ１５まで、またはＤ
１からＤ３６までのいずれか１つに記載の方法。
【０７６３】
Ｆ６３．プロモーターが発生的に調節されるものであり、カスパーゼ−９ポリペプチド
が発生的に分化した細胞において発現する、実施形態Ｆ６２またはＦ６３に記載の方法。
【０７６４】
Ｆ６４．プロモーターが組織特異的なものであり、カスパーゼ−９ポリペプチドが特異
的な組織において発現する、実施形態Ｆ６２またはＧ６３に記載の方法。
【０７６５】
Ｆ６５．プロモーターが活性化Ｔ細胞において活性化される、実施形態Ｆ６２またはＦ
６３に記載の方法。
【０７６６】
Ｆ６６．プロモーターが５’ＬＴＲ配列を含む、実施形態Ｆ６２またはＦ６３に記載の
方法。
【０７６７】
Ｆ６７．キメラタンパク質がマーカーポリペプチドをさらに含む、実施形態Ｆ６２また
はＦ６３に記載の方法。
【０７６８】
Ｆ６８．マーカーポリペプチドがΔＣＤ１９ポリペプチドである、実施形態Ｆ６７に記
載の方法。
【０７６９】
Ｆ６９．マーカーを発現する細胞を対象への投与のために選択する選択ステップをさら
に含む、実施形態Ｆ６７またはＦ６８に記載の方法。
【０７７０】
Ｆ７０．カスパーゼ−９ポリペプチドが短縮型カスパーゼ−９ポリペプチドである、実
施形態Ａ１からＡ１１まで、Ｂ１からＢ２６まで、Ｃ１からＣ１５まで、Ｆ１からＦ６９
まで、またはＤ１からＤ３６までのいずれか１つに記載の方法。
【０７７１】
Ｆ７１．カスパーゼ−９ポリペプチドがカスパーゼ動員ドメイン（ＣＡＲＤ）を欠く、
実施形態Ａ１からＡ１１まで、Ｂ１からＢ２６まで、Ｃ１からＣ１５まで、Ｆ１からＦ７
０まで、またはＤ１からＤ３６までのいずれか１つに記載の方法。
【０７７２】
Ｆ７２．多量体化領域が、ＦＫＢＰ、シクロフィリン受容体、ステロイド受容体、テト
ラサイクリン受容体、重鎖抗体サブユニット、軽鎖抗体サブユニット、柔軟なリンカード
メインによって分離されたタンデムな重鎖可変領域および軽鎖可変領域で構成される単鎖
抗体、およびその変異配列からなる群から選択される、実施形態Ａ１からＡ１１まで、Ｂ
１からＢ２６まで、Ｃ１からＣ１５まで、Ｆ１からＦ７１まで、またはＤ１からＤ３６ま
でのいずれか１つに記載の方法。
【０７７３】
Ｆ７３．多量体化領域がＦＫＢＰ１２領域である、実施形態Ａ１からＡ１１まで、Ｂ１
からＢ２６まで、Ｃ１からＣ１５まで、Ｆ１からＦ７１まで、またはＤ１からＤ３６まで
のいずれか１つに記載の方法。
【０７７４】
Ｆ７４．ＦＫＢ１２領域がＦＫＢ１２ｖ３６領域である、実施形態Ｆ７３に記載の方法
。
【０７７５】
Ｆ７５．多量体化領域がＦｖ’Ｆｖｌｓである、実施形態Ａ１からＡ１１まで、Ｂ１か
らＢ２６まで、Ｃ１からＣ１５まで、Ｆ１からＦ７４まで、またはＤ１からＤ３６までの
いずれか１つに記載の方法。
【０７７６】
Ｆ７６．多量体化領域が、ＦＫ５０６二量体および二量体ＦＫ５０６類似体リガンドか
らなる群から選択されるリガンドと結合する、実施形態Ａ１からＡ１１まで、Ｂ１からＢ
２６まで、Ｃ１からＣ１５まで、Ｆ１からＦ７５まで、またはＤ１からＤ３６までのいず
れか１つに記載の方法。
【０７７７】
Ｆ７７．リガンドがＡＰ１９０３またはＡＰ２０１８７である、実施形態Ａ１からＡ１
１まで、Ｂ１からＢ２６まで、Ｃ１からＣ１５まで、Ｆ１からＦ７６まで、またはＤ１か
らＤ３６までのいずれか１つに記載の方法。
【０７７８】
Ｆ７８．多量体化領域が配列番号２９のアミノ酸配列またはその機能性断片を有する、
実施形態Ａ１からＡ１１まで、Ｂ１からＢ２６まで、Ｃ１からＣ１５まで、またはＤ１か
らＤ３６までのいずれか１つに記載の方法。
【０７７９】
Ｆ７９．多量体化領域が配列番号３０のヌクレオチド配列またはその機能性断片により
コードされる、実施形態Ａ１からＡ１１まで、Ｂ１からＢ２６まで、Ｃ１からＣ１５まで
、またはＤ１からＤ３６までのいずれか１つに記載の方法。
【０７８０】
Ｆ８０．多量体化領域が配列番号３２のアミノ酸配列またはその機能性断片を有するポ
リペプチドをさらに含む、実施形態Ｆ７８に記載の方法。
【０７８１】
Ｆ８１．多量体化領域が配列番号３１のヌクレオチド配列またはその機能性断片により
コードされるポリペプチドをさらに含む、実施形態Ｆ７９に記載の方法。
【０７８２】
Ｆ８２．多量体化領域が配列番号３２のアミノ酸配列またはその機能性断片を有するポ
リペプチドをさらに含む、実施形態Ｆ７８またはＦ８０に記載の方法。
【０７８３】
Ｆ８３．多量体化領域が配列番号３１のヌクレオチド配列またはその機能性断片により
コードされるポリペプチドをさらに含む、実施形態Ｆ７９またはＦ８１に記載の方法。
【０７８４】
Ｆ８４．多量体化領域が配列番号２９または配列番号３２のアミノ酸配列またはその機
能性断片を有するポリペプチドをさらに含む、実施形態Ｆ７８、Ｆ８０またはＦ８２のい
ずれか一項に記載の方法。
【０７８５】
Ｆ８５．多量体化領域が配列番号３０または配列番号３１のヌクレオチド配列またはそ
の機能性断片によりコードされるポリペプチドをさらに含む、実施形態Ｆ７９、Ｆ８１ま
たはＦ８３のいずれか一項に記載の方法。
【０７８６】
Ｆ８６．細胞に、レトロウイルスベクターを形質導入またはトランスフェクトする、実
施形態Ａ１からＡ１１まで、Ｂ１からＢ２６まで、Ｃ１からＣ１５まで、Ｆ１からＦ８５
まで、またはＤ１からＤ３６までのいずれか１つに記載の方法。
【０７８７】
Ｆ８７．レトロウイルスベクターがマウス白血病ウイルスベクターである、実施形態Ｆ
８６に記載の方法。
【０７８８】
Ｆ８８．レトロウイルスベクターがＳＦＧベクターである、実施形態Ａ１からＡ１１ま
で、Ｂ１からＢ２６まで、Ｃ１からＣ１５まで、Ｆ１からＦ８５まで、またはＤ１からＤ
３６までのいずれか１つに記載の方法。
【０７８９】
Ｆ８９．細胞にアデノウイルスベクターを形質導入またはトランスフェクトする、実施
形態Ａ１からＡ１１まで、Ｂ１からＢ２６まで、Ｃ１からＣ１５まで、Ｆ１からＦ８５ま
で、またはＤ１からＤ３６までのいずれか１つに記載の方法。
【０７９０】
Ｆ９０．細胞にレンチウイルスベクターを形質導入またはトランスフェクトする、実施
形態Ａ１からＡ１１まで、Ｂ１からＢ２６まで、Ｃ１からＣ１５まで、Ｆ１からＦ８５ま
で、またはＤ１からＤ３６までのいずれか１つに記載の方法。
【０７９１】
Ｆ９１．細胞に遺伝子発現ベクターをさらにトランスフェクトまたは形質導入する、実
施形態Ａ１からＡ１１まで、Ｂ１からＢ２６まで、Ｃ１からＣ１５まで、Ｆ１からＦ９０
まで、またはＤ１からＤ３６までのいずれか１つに記載の方法。
【０７９２】
Ｆ９２．細胞が、改変カスパーゼ−９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含
み、異種ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドをさらに含む、実施形態Ａ１
からＡ１１まで、Ｂ１からＢ２６まで、Ｃ１からＣ１５まで、Ｆ１からＦ９１まで、また
はＤ１からＤ３６までのいずれか１つに記載の方法。
【０７９３】
Ｆ９３．異種ポリペプチドがキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、実施形態Ｆ９２に記
載の方法。
【０７９４】
Ｆ９３．１  細胞が、改変カスパーゼ−９ポリペプチドをコードし、異種ポリペプチド
をさらにコードするポリヌクレオチド、および改変カスパーゼ−９ポリペプチドと異種ポ
リペプチドを連結する切断可能なリンカーポリペプチドを含む、実施形態Ａ１からＡ１１
まで、Ｂ１からＢ２６まで、Ｃ１からＣ１５まで、Ｆ１からＦ９１まで、またはＤ１から
Ｄ３６までのいずれか１つに記載の方法。
【０７９５】
Ｆ９３．２  異種ポリペプチドがキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、実施形態Ｆ９３
．１に記載の方法。
【０７９６】
Ｆ９３．３．切断可能なリンカーポリペプチドが２Ａポリペプチドまたは２Ａ様ポリペ
プチドである、実施形態Ｆ９３．１またはＦ９３．２に記載の方法。
【０７９７】
Ｆ９３．４．対象が幹細胞移植を受けた対象である、実施形態Ａ１からＡ１１まで、Ｂ
１からＢ２６まで、Ｃ１からＣ１５まで、Ｆ１からＦ９３．３まで、またはＤ１からＤ３
６までのいずれか１つに記載の方法。
【０７９８】
Ｆ９４．幹細胞移植が、適合移植、部分適合移植、ハプロタイプ一致移植、およびＣＤ
３４＋ハプロタイプ一致幹細胞移植からなる群から選択される、実施形態Ｆ９３．４に記
載の方法。
【０７９９】
Ｆ９５．対象が、ハプロ−ＣＤ３４＋幹細胞移植をドナーＴ細胞の投与前に受けている
、またはドナーＴ細胞の投与と同時に受ける、実施形態Ａ１からＡ１１まで、Ｂ１からＢ
２６まで、Ｃ１からＣ１５まで、Ｄ１からＤ３６まで、またはＦ１からＦ９３．３までの
いずれか１つに記載の方法。
【０８００】
Ｆ９６．ヒトドナーＴ細胞が患者のＴ細胞と適合する、部分適合する、またはハプロタ
イプが一致するものである、実施形態Ａ１からＡ１１まで、Ｂ１からＢ２６まで、Ｃ１か
らＣ１５まで、Ｆ１からＦ９５まで、またはＤ１からＤ３６までのいずれか１つに記載の
方法。
【０８０１】
Ｆ９７．対象がヒトである、実施形態Ａ１からＡ１１まで、Ｂ１からＢ２６まで、Ｃ１
からＣ１５まで、Ｆ１からＦ９６まで、またはＤ１からＤ３６までのいずれか１つに記載
の方法。
【０８０２】
Ｆ９８．移植がハプロタイプ一致移植、適合非血縁移植または適合血縁移植である、実
施形態Ｆ９３．１に記載の方法。
【０８０３】
Ｆ９９．対象が過剰増殖性疾患と診断されている、実施形態Ａ１からＡ１１まで、Ｂ１
からＢ２６まで、Ｃ１からＣ１５まで、Ｆ１からＦ９８まで、またはＤ１からＤ３６まで
のいずれか１つに記載の方法。
【０８０４】
Ｆ１００．対象が免疫疾患と診断されている、実施形態Ａ１からＡ１１まで、Ｂ１から
Ｂ２６まで、Ｃ１からＣ１５まで、Ｆ１からＦ９８まで、またはＤ１からＤ３６までのい
ずれか１つに記載の方法。
【０８０５】
Ｆ１０１．対象に多量体リガンドの２回目の用量を投与するステップをさらに含み、２
回目の用量が１回目の用量よりも多くの多量体リガンドを含む、実施形態Ａ１からＡ１１
まで、Ｂ１からＢ２６まで、Ｃ１からＣ１５まで、Ｆ１からＦ１００まで、またはＤ１か
らＤ３６までのいずれか１つに記載の方法。
【０８０６】
Ｆ１０２．複数回用量の多量体リガンドを複数回用量の間で投薬量レベルを漸増させな
がら対象に対して投与する、実施形態Ａ１からＡ１１まで、Ｂ１からＢ２６まで、Ｃ１か
らＣ１５まで、Ｆ１からＦ１０１まで、またはＤ１からＤ３６までのいずれか１つに記載
の方法。
【０８０７】
Ｆ１０３．投薬量レベルの漸増により、死滅する治療用細胞の数が増加する、実施形態
Ｆ１０２に記載の方法。
【０８０８】
Ｆ１０４．用量を０．０１ｍｇ／ｋｇから１ｍｇ／ｋｇまで漸増させる、実施形態Ｆ１
０２またはＦ１０３に記載の方法。
【０８０９】
Ｆ１０５．約１５〜３０分きざみで用量を投与する、実施形態Ｆ１０１からＦ１０４ま
でのいずれか１つに記載の方法。
【０８１０】
Ｆ１０６．持続注入ポンプを使用して多量体リガンドを投与し、注入の間に多量体リガ
ンドの濃度を上昇させる、実施形態Ａ１からＡ１１まで、Ｂ１からＢ２６まで、Ｃ１から
Ｃ１５まで、Ｆ１からＦ１０５まで、またはＤ１からＤ３６までのいずれか１つに記載の
方法。
【０８１１】
Ｆ１０７．所望の百分率の治療用細胞が死滅するまで多量体リガンドの濃度を上昇させ
る、実施形態Ａ１からＡ１１まで、Ｂ１からＢ２６まで、Ｃ１からＣ１５まで、Ｆ１から
Ｆ１０６まで、またはＤ１からＤ３６までのいずれか１つに記載の方法。
【０８１２】
Ｆ１０８．対象が移植片対宿主病を有し、多量体リガンドの投与により疾患が緩和され
る、実施形態Ａ１からＡ１１まで、Ｂ１からＢ２６まで、Ｃ１からＣ１５まで、Ｆ１から
Ｆ１０７まで、またはＤ１からＤ３６までのいずれか１つに記載の方法。
【０８１３】
Ｆ１０９．対象がヒトである、実施形態Ａ１からＡ１１まで、Ｂ１からＢ２６まで、Ｃ
１からＣ１５まで、Ｆ１からＦ１０８まで、またはＤ１からＤ３６までのいずれか１つに
記載の方法。
【０８１４】
Ｆ１１０．治療用細胞がキメラ抗原受容体を含む、実施形態Ａ１からＡ１１まで、Ｂ１
からＢ２６まで、Ｃ１からＣ１５まで、Ｆ１からＦ１０９まで、またはＤ１からＤ３６ま
でのいずれか１つに記載の方法。
【０８１５】
Ｆ１１０．１  キメラ抗原受容体がキメラＴ細胞受容体である、実施形態Ｆ１１０に記
載の方法。
【０８１６】
Ｆ１１０．２  キメラ抗原受容体がｓｃＦｖドメインを含む、実施形態Ｆ１１０に記載
の方法。
【０８１７】
Ｆ１１１．対象が、多量体リガンドの投与前にオフターゲットまたはオフオーガンの毒
性の症状を示している、実施形態Ａ１からＡ１１まで、Ｂ１からＢ２６まで、Ｃ１からＣ
１５まで、Ｆ１からＦ１１０．２まで、またはＤ１からＤ３６までのいずれか１つに記載
の方法。
【０８１８】
Ｆ１１２．対象が、多量体リガンドの投与前に腫瘍崩壊症候群（ＴＬＳ）、サイトカイ
ン放出症候群（ＣＲＳ）またはマクロファージ活性化症候群（ＭＡＳ）の症状を示してい
る、実施形態Ａ１からＡ１１まで、Ｂ１からＢ２６まで、Ｃ１からＣ１５まで、Ｆ１から
Ｆ１１１まで、またはＤ１からＤ３６までのいずれか１つに記載の方法。
【０８１９】
Ｆ１１３．多量体リガンドの投与によりオフターゲットまたはオフオーガンの毒性が緩
和される、実施形態Ｆ１１１に記載の方法。
【０８２０】
Ｆ１１４．多量体リガンドの投与により腫瘍崩壊症候群（ＴＬＳ）、サイトカイン放出
症候群（ＣＲＳ）またはマクロファージ活性化症候群（ＭＡＳ）が緩和される、実施形態
Ａ１からＡ１１まで、Ｂ１からＢ２６まで、Ｃ１からＣ１５まで、またはＤ１からＤ３６
までのいずれか１つに記載の方法。
【０８２１】
Ｆ１１５．治療有効レベルの、キメラ抗原受容体を含む治療用細胞が、多量体リガンド
の投与後に対象において活性なままである、実施形態Ｆ１１２に記載の方法。
【０８２２】
Ｆ１１６．追加用量の多量体リガンドを対象に投与すべきかどうかを決定するステップ
をさらに含む、実施形態Ａ１からＡ１１まで、Ｂ１からＢ２６まで、Ｃ１からＣ１５まで
、Ｆ１からＦ１１５まで、またはＤ１からＤ３６までのいずれか１つに記載の方法。
【０８２３】
Ｆ１１７．追加用量の多量体リガンドを対象に投与するステップをさらに含み、追加用
量の多量体リガンドの投与の後に、追加用量の前の移植された細胞の数と比較して、カス
パーゼ−９ポリペプチドまたは改変カスパーゼ−９ポリペプチドを発現する移植された治
療用細胞の少なくとも１０％が死滅する、実施形態Ａ１からＡ１１まで、Ｂ１からＢ２６
まで、Ｃ１からＣ１５まで、Ｆ１からＦ１１６まで、またはＤ１からＤ３６までのいずれ
か１つに記載の方法。
【０８２４】
Ｆ１１８．追加用量の多量体リガンドを対象に投与するステップをさらに含み、追加用
量の多量体リガンドの投与の後に、追加用量の前の移植された細胞の数と比較して、カス
パーゼ−９ポリペプチドまたは改変カスパーゼ−９ポリペプチドを発現する移植された治
療用細胞の少なくとも１０％が死滅する、実施形態Ａ１からＡ１１まで、Ｂ１からＢ２６
まで、Ｃ１からＣ１５まで、Ｆ１からＦ１１７まで、またはＤ１からＤ３６までのいずれ
か１つに記載の方法。
【０８２５】
Ｆ１１９．２回用量の多量体リガンドを対象に投与し、多量体リガンドの２回目の用量
を多量体リガンドの１回目の用量の２４時間より後に投与する、実施形態Ａ１からＡ１１
まで、Ｂ１からＢ２６まで、Ｃ１からＣ１５まで、Ｆ１からＦ１１８まで、またはＤ１か
らＤ３６までのいずれか１つに記載の方法。
【０８２６】
Ｆ１２０．多量体リガンドの２回目の用量を多量体リガンドの１回目の用量の少なくと
も１週間後に対象に投与する、実施形態Ａ１からＡ１１まで、Ｂ１からＢ２６まで、Ｃ１
からＣ１５まで、Ｆ１からＦ１１９まで、またはＤ１からＤ３６までのいずれか１つに記
載の方法。
【０８２７】
Ｆ１２１．対象への多量体リガンドの３回目の用量を多量体リガンドの２回目の用量の
２４時間より後に投与する、実施形態Ａ１からＡ１１まで、Ｂ１からＢ２６まで、Ｃ１か
らＣ１５まで、Ｆ１からＦ１２０まで、またはＤ１からＤ３６までのいずれか１つに記載
の方法。
【０８２８】
Ｆ１２２．対象への多量体リガンドの３回目の用量を多量体リガンドの２回目の用量の
少なくとも１週間後に投与する、実施形態Ａ１からＡ１１まで、Ｂ１からＢ２６まで、Ｃ
１からＣ１５まで、Ｆ１からＦ１２１まで、またはＤ１からＤ３６までのいずれか１つに
記載の方法。
Ｆ１２３．患者における移植された治療用細胞によって生じる状態の存在、不在または
ステージを含む情報を受け取るステップ、および
患者において同定された状態の存在、不在またはステージに基づいて、患者に対して多
量体化領域に結合する多量体リガンドを投与するか、その後の多量体リガンドの投薬量を
維持するか、またはその後の多量体リガンドの投薬量を調整するステップ
をさらに含む、実施形態Ａ１からＡ１１まで、Ｂ１からＢ２６まで、Ｃ１からＣ１５まで
、Ｆ１からＦ１２２まで、またはＤ１からＤ３６までのいずれか１つに記載の方法。
Ｆ１２４．患者における、移植された治療用細胞によって生じる状態の存在、不在また
はステージを同定するステップ、および
状態の存在、不在またはステージを、対象において同定された状態の存在、不在または
ステージに基づいて、多量体化領域に結合する多量体リガンドを投与するか、患者に投与
するその後の多量体リガンドの投薬量を維持するか、またはその後の多量体リガンドの投
薬量を調整するかの意思決定者に伝達するステップ
をさらに含む、実施形態Ａ１からＡ１１まで、Ｂ１からＢ２６まで、Ｃ１からＣ１５まで
、Ｆ１からＦ１２３まで、またはＤ１からＤ３６までのいずれか１つに記載の方法。
【０８２９】
Ｆ１２５．
患者における、移植された治療用細胞によって生じる状態の存在、不在またはステージ
を同定するステップ、および
対象において同定された状態の存在、不在またはステージに基づいて、多量体結合性領
域に結合する多量体リガンドを投与するか、患者に投与するその後の多量体リガンドの投
薬量を維持するか、またはその後の多量体リガンドの投薬量を調整するかの指示を伝達す
るステップ
をさらに含む、実施形態Ａ１からＡ１１まで、Ｂ１からＢ２６まで、Ｃ１からＣ１５まで
、Ｆ１からＦ１２４まで、またはＤ１からＤ３６までのいずれか１つに記載の方法。
【０８３０】
Ｆ１２６．状態が移植片対宿主病である、実施形態Ａ１からＡ１１まで、Ｂ１からＢ２
６まで、Ｃ１からＣ１５まで、Ｆ１からＦ１２５まで、またはＤ１からＤ３６までのいず
れか１つに記載の方法。
【０８３１】
Ｆ１２７．状態が移植片対宿主病である、実施形態Ａ１からＡ１１まで、Ｂ１からＢ２
６まで、Ｃ１からＣ１５まで、Ｆ１からＦ１２６まで、またはＤ１からＤ３６までのいず
れか１つに記載の方法。
【０８３２】
本明細書において参照されている特許、特許出願、刊行物および文書のそれぞれの全体
が、これによって参照により組み込まれる。上記の特許、特許出願、刊行物および文書を
引用することは、前述のいずれもが先行技術に関連することを認めるものではなく、また
、これらの刊行物または文書の内容または日付に関していかなる容認も成すものではない
。
【０８３３】
当該技術の基本的な態様から逸脱することなく前述のものに改変を行うことができる。
当該技術は、１つまたは複数の特定の実施形態を参照してかなり詳細に記載されているが
、本出願に詳細に開示されている実施形態に変化を生じさせることができ、それでもこれ
らの改変および改良は当該技術の範囲および主旨の中に入ることが当業者には理解されよ
う。
【０８３４】
本明細書において適切に例示的に記載されている技術は、本明細書に詳細に開示されて
いない要素（複数可）のいずれがなくとも実施することができる。したがって、例えば、
本明細書の各例における「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「から本質的になる（ｃｏ
ｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」および「からなる（ｃｏｎｓｉｓ
ｔｉｎｇ  ｏｆ）」という用語はいずれも、他の２つの用語と置き換えることができる。
使用されている用語および表現は、説明する用語として使用され、限定ではなく、そのよ
うな用語および表現を使用することにより、示され、記載されている特徴の等価物または
その一部は排除されず、特許請求された技術の範囲内で種々の改変が可能である。「ａ（
１つの）」または「ａｎ（１つの）」という用語は、要素のうちの１つ、または要素のう
ちの１つ超のいずれかが記載されていることが文脈上明らかでない限り、それが修飾する
要素の１つまたは複数を指し得る（例えば、「ａ（１つの）試薬」は、１つまたは複数の
試薬を意味し得る）。「約」という用語は、本明細書で使用される場合、基になるパラメ
ータの１０％以内の値（すなわち、プラス１０％またはマイナス１０％）を指し、一連の
値の最初に「約」という用語を使用することにより、値のそれぞれが修飾される（すなわ
ち、「約１、２および３」とは、約１、約２および約３を指す）。例えば、「約１００グ
ラム」の重量は、９０グラムから１１０グラムの間の重量を含み得る。さらに、値の列挙
が本明細書に記載されている場合（例えば、約５０％、６０％、７０％、８０％、８５％
または８６％）、その列挙は、それらの中間の値および小数値の全てを含む（例えば、５
４％、８５．４％）。したがって、本技術は代表的な実施形態および任意選択の特徴によ
って詳細に開示されているが、当業者は本明細書に開示されている概念の改変および変形
を用いることができ、そのような改変および変形は本技術の範囲内であるとみなされるこ
とが理解されるべきである。
【０８３５】
当該技術のある特定の実施形態は、続く請求項（複数可）に記載されている。
【図１Ａ】
2020040969.tif 000116
【図１Ｂ】
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【図２ＡＢ】
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【図２ＣＤ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
2020040969.tif 000121
【図３Ｃ】
2020040969.tif 000122
【図３Ｄ】
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【図４】
2020040969.tif 000124
【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
2020040969.tif 000126
【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
2020040969.tif 000129
【図８】
2020040969.tif 000130
【図９】
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【図１０】
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【図１１ＡＢ】
2020040969.tif 000133
【図１１Ｃ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３ＣＡ】
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【図１３ＣＢ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
2020040969.tif 000146
【図２１】
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【図２２】
2020040969.tif 000148
【図２３】
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【図２４】
2020040969.tif 000150
【図２５】
2020040969.tif 000151
【図２６】
2020040969.tif 000152
【図２７】
2020040969.tif 000153
【図２８】
2020040969.tif 000154
【図２９】
2020040969.tif 000155
【図３０】
2020040969.tif 000156
【図３１】
2020040969.tif 000157
【図３２】
2020040969.tif 000158
【図３３】
2020040969.tif 000159
【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
2020040969.tif 000163
【図３８】
2020040969.tif 000164
【図３９】
2020040969.tif 000165
【図４０】
2020040969.tif 000166
【図４１】
2020040969.tif 000167
【図４２】
2020040969.tif 000168
【図４３】
2020040969.tif 000169
【図４４】
2020040969.tif 000170
【図４５】
2020040969.tif 000171
【図４６】
2020040969.tif 000172
【図４７】
2020040969.tif 000173
【図４８】
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【図４９】
2020040969.tif 000175
【図５０Ａ】
2020040969.tif 000176
【図５０Ｂ】
2020040969.tif 000177
【図５０Ｃ】
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【図５１】
2020040969.tif 000179
【図５２】
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【図５３Ａ】
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【図５３Ｂ】
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【図５４】
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【図５５】
2020040969.tif 000184
【図５６】
2020040969.tif 000185
【図５７】
2020040969.tif 000186
【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
2020040969.tif 000189
【図６１】
2020040969.tif 000190
【図６２】
2020040969.tif 000191
【図６３】
2020040969.tif 000192
【図６４】
2020040969.tif 000193
【図６５】
2020040969.tif 000194
【図６６】
2020040969.tif 000195
【配列表】
2020040969000001.app
【外国語明細書】
2020040969000001.pdf