(57)【要約】      （修正有）【課題】高齢に一般的に伴う疾病及び不快感を伴わずに「良く老いる」ことを可能とするツールとして、老化の機序を停止させ、それに伴う有害な作用と闘うために使用できる分子の提供。【解決手段】薬物としての特定のＲＮＡ配列を有する核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）。該ＲＮＡ配列は、老化の機序に関与しており、特に、患者のストレスに対する抵抗性を高めるために、老化の有害な作用を制御するために、典型的には変性疾患、ラミノパチー、糖尿病、肥満、又は癌を予防又は治療するために、並びに、一般的には、患者の寿命を延ばすために使用され得る。該ｓｎｏＲＮＡはまた受精能の処置にも使用され得る。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬品としての使用のための、配列番号１の配列、オルソロガス配列、又は機能的に類似した配列を含む、単離された又は合成のＲＮＡ配列。
【請求項２】
前記のオルソロガス配列が、ヒト起源でありかつ配列番号２の配列からなるか、又はマウス起源でありかつ配列番号３及び配列番号４の中から選択された配列からなることを特徴とする、請求項１記載のＲＮＡ配列。
【請求項３】
前記配列が、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）であることを特徴とする、請求項１又は２記載のＲＮＡ配列。
【請求項４】
前記の機能的に類似した配列が、Ｉｒ５６ｄ、buttonhead、klarsicht、ＣＧ３２６２、ＣＧ３０５０２（ｆａ２ｈ）、ＣＧ１１１２５、ＣＧ９３３９及びＣＧ４０００６の中から選択されたキイロショウジョウバエ遺伝子のスプライシングを可能とすることを特徴とする、請求項１記載のＲＮＡ配列。
【請求項５】
対象の寿命を延ばすこと、ストレスに対する抵抗性を高めること、又は対象における老化の有害な効果と闘うことにおける使用のための、請求項１〜４のいずれか一項記載のＲＮＡ配列。
【請求項６】
対象の変性疾患、特に神経変性疾患、ラミノパチー、糖尿病、肥満、又は癌の予防又は治療に使用するための、請求項１〜５の一項記載のＲＮＡ配列。
【請求項７】
癌が、フリーラジカルによって誘発される癌である、請求項６記載のＲＮＡ配列。
【請求項８】
対象の不妊症の処置又は受精能の刺激のための、請求項１〜３の一項記載のＲＮＡ配列。
【請求項９】
対象が動物若しくは昆虫、典型的には哺乳動物、好ましくはヒト、さらにより好ましくは、請求項１〜３の一項記載のＲＮＡ配列を発現していないか若しくは異常な形の該ＲＮＡ配列を発現している対象、飢餓、熱ショック、若しくは酸化ストレスなどのストレス条件を受けている対象、及び／又は、変性疾患、ラミノパチー、糖尿病、肥満、癌、若しくは受精能問題を患う対象であることを特徴とする、請求項５〜８の一項記載のＲＮＡ配列。
【請求項１０】
請求項１〜３の一項記載のＲＮＡを発現していないか又は異常な形の該ＲＮＡ配列を発現している対象のゲノムが、突然変異を含むＤＮＡ配列を含有し；該配列は、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８の中から選択された野生型状態であり；該突然変異は、好ましくは１つ以上の塩基対の欠失、置換、又は付加の中から選択されることを特徴とする、請求項９記載のＲＮＡ配列。
【請求項１１】
請求項１〜１０の一項記載のＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ配列。
【請求項１２】
好ましくは、腸細胞若しくは卵巣細胞において請求項１〜４の一項記載のＲＮＡ配列の発現を促進するプロモーター及び／又は調節エレメントを含む、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルスベクター、及びファージの中から選択された、該ＲＮＡ配列の発現を可能とするベクター。
【請求項１３】
請求項１〜４の一項記載のＲＮＡ配列を含むか、又は請求項１２記載のベクターを使用して形質転換された、細胞。
【請求項１４】
請求項１〜４の一項記載のＲＮＡ配列、請求項１２記載のベクター、又は請求項１３記載の細胞と、食物的に又は薬学的に許容される担体とを含む、組成物。
【請求項１５】
インビトロ又はエクスビボで請求項１〜１０の一項記載のＲＮＡ配列の発現を回復又は調節するための、連続的な又は順次の、請求項１〜１０の一項記載のＲＮＡ配列、請求項１２記載のベクター、請求項１３記載の細胞、又は請求項１４記載の組成物の使用。
【請求項１６】
ゲノム内の配列番号３及び配列番号４の一方及び／又は他方が、該配列の一方及び／又は他方の発現を妨げるか又は改変させるために改変されている、トランスジェニックマウス。
【請求項１７】
ｉ）請求項１〜３の一項記載のＲＮＡ配列を発現していないか又は異常な形の該ＲＮＡ配列を発現している細胞又は細胞集団の、又は請求項１６記載のトランスジェニックマウスの、試験化合物への曝露、ｉｉ）もしあれば、該細胞（群）又は該トランスジェニックマウスの表現型に対する試験化合物の効果の評価、及びｉｉｉ）該試験化合物の美容効力、すなわち該試験化合物の効力と相関している該ＲＮＡ配列の活性及び／又は発現の回復の決定、を含む、試験化合物の美容効力を評価するための方法。
【請求項１８】
ｉ）請求項１〜３の一項記載のＲＮＡ配列を発現していないか又は異常な形の該ＲＮＡ配列を発現している細胞又は細胞集団の試験化合物への曝露；（ｉｉ）もしあれば、該細胞（群）の表現型に対する試験化合物の効果の評価、及びｉｉｉ）該試験化合物の治療効力、すなわち該試験化合物の効力と相関している該ＲＮＡ配列の活性及び／又は発現の回復の決定、を含む、老化の有害な作用、若しくはストレス、ラミノパチー、糖尿病、肥満と闘うための、又は不妊症と戦うための試験化合物の治療効力を評価するための方法。
【請求項１９】
ｉ）請求項１〜３の一項記載のＲＮＡ配列を含む請求項１３記載の細胞、又は請求項１３記載の細胞を含む細胞集団の試験化合物への曝露、ｉｉ）もしあれば、該細胞又は該細胞集団の表現型に対する試験化合物の効果の評価、及びｉｉｉ）該試験化合物の美容効力、すなわち該試験化合物の効力と相関している該ＲＮＡ配列の活性及び／又は発現の増加の決定、を含む、試験化合物の美容効力を評価するための方法。
【請求項２０】
請求項１〜３の一項記載のＲＮＡ配列を含む請求項１３記載の細胞、又は請求項１３記載の細胞を含む細胞集団の試験化合物への曝露、ｉｉ）もしあれば、該細胞又は該細胞集団の表現型に対する試験化合物の効果の評価、及びｉｉｉ）該試験化合物の治療効力、すなわち該試験化合物の効力と相関している該ＲＮＡ配列の活性及び／又は発現の増加の決定、を含む、老化の有害な作用、若しくはストレス、ラミノパチー、糖尿病、肥満と闘うための、又は不妊症と闘うための試験化合物の美容効力を評価するための方法。
【請求項２１】
曝される細胞又は細胞集団が、腸又は卵巣を起源とする、請求項１７〜２０の一項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬品としての特定のＲＮＡ配列の使用に関する。より正確には、本発明は本発明者らが老化の機序に関与していることを示した核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）の使用に関する。本発明のｓｎｏＲＮＡは、特に対象のストレスに対する抵抗性を高めるためか、老化の有害な作用と闘うために、典型的には、変性疾患、特に神経変性疾患、ラミノパチー、特にハッチンソン・ギルフォード症候群（ＨＧＰＳ）（早老症としても知られる）、糖尿病、肥満、又は癌を予防又は治療するために、より一般的には対象の寿命を延ばすために使用され得る。本発明のｓｎｏＲＮＡは、不妊症の処置にも使用され得る。
【０００２】
本発明はさらに、本発明のｓｎｏＲＮＡを発現することのできるベクター、細胞、トランスジェニック動物、及び組成物、並びに、老化の機序に関連した病態、異常、疾患、又は見た目の若しくは機能的な劣化の予防又は治療において有効である分子を同定するためのツールとして本発明の上記の産物のいずれかを使用した方法に関する。
【０００３】
技術的背景
老化（すなわち、加齢による生存能及び繁殖能の進行的な衰え）の機序は、社会及び科学界を何世紀にもわたり困惑させてきた。現在、２つの一般に広まっている理論があり、一方は老化が遺伝子的に予めプログラム化された進化経路から生じるというもの、他方は老化が存在の正常な結果であり、その間に細胞性及び分子性傷害が蓄積するというものである。この傷害は、フリーラジカルによって誘発される酸化的傷害、ミトコンドリア異常、体細胞突然変異、進行的なテロメアの短小化、プログラム化細胞死、及び傷害された細胞の増殖などを含む（Semsei I. (2000) On the nature of aging. Mech Aging Dev 117:93-108）。
【０００４】
酵母及びマウスのような生物では、カロリーの低減が、寿命の延長に対して決定的なプラスの影響を発揮することが示された（Sohal, R S, Weindruch, R (1998) Oxidative stress, caloric restriction, and aging. Science 273:59-63; Finch, C E, Revkun, G. (2001) The genetics of aging. Annu. Rev. Genom. Hum. Genet. 2:435-462）。近年の研究により、カロリー制限は、ヒトをはじめとする霊長類においても効果的であることが示された（Roth, G S, Lasnikov, V, Lesnikov, M, Ingram, D K, Land, M A (2001) Dietary caloric restriction prevents the age-related decline in plasma melatonin levels of rhesus monkeys. J Clin Endocrinol Metab. 86: 3292-5; Roth G S, Lane M A, Ingramn D K, Mattison J A, Elahi D, Tobin J D, Muller D, Metter E J (2002) Biomarkers of caloric restriction may predict longevity in humans. Science. 297: 811-813; Walford R L, Mock D, Verdery R, MacCallum T. (2002) Calorie restriction in biosphere 2: alterations in physiologic, hematologic, hormonal, and biochemical parameters in humane restricted for a 2-year period. J Gerontol A Biol Sci Med Sci 57: 211-24）。残念なことに、大半のヒトは、この発見から恩恵を受けるに必要とされる厳密なダイエットを続けることができない可能性が高い。
【０００５】
数年間にわたり、多くの研究グループが、老化過程に関与する遺伝子及びシグナル伝達経路の同定に従事してきた。ここで報告された研究は、酵母のサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、線虫のカエノラブディティス・エレガンス（Caenorhabditis elegans）、及びハエのキイロショウジョウバエをはじめとする数多くの生物において行なわれ（Fontana et al., 2010）、増え続けている遺伝子のリストを同定することを可能とした。それらの多くはホルモンシグナル伝達に関与し、多種多様な真核生物において保存されている。少なくとも下等な種において、生命の始まりにおける発生及び成長に関与する経路が、生涯にわたり影響を保持し、さらには部分的にはその持続を調整することが明らかとなった。これらの研究はまた、対象の寿命を評価する上での代謝能及びストレスに対する抵抗性の重要性を間接的に示した。
【０００６】
例えば、カエノラブディティス・エレガンスのｃｌｋ−１遺伝子の突然変異体は、ミトコンドリア外での活性酸素種の発生を低減させることに関与していた（Hekimi, S, Guarente, L. (2003) Genetics and the specificity of the aging process. Science 299:1351-1354）。国際公開公報第９８／１７８２３号の特許は、発生過程及び生涯期間におけるｃｌｋ−１遺伝子の機能を記載する。該特許は特に、ｃｌｋ−１遺伝子の発現の調節によって個々の寿命を延ばすための方法を特許請求する。
【０００７】
Methuselah遺伝子（Ｇタンパク質共役受容体をコードしている）の突然変異はまた、ショウジョウバエの寿命を約３５％延ばすことができるとして記載されている（米国特許第６，３０３，７６８号）。
【０００８】
テロメアの短小化も、細胞の老化に関与する機序として知られている。脊椎動物では、テロメラーゼはリボ核タンパク質（ＲＮＰ）逆転写酵素であり、その役割は分裂中の真核細胞の染色体の末端へテロメアＤＮＡを付加することによってテロメアの長さを維持することである（Kiss, 2002）。ヒトでは、テロメラーゼｓｎｏＲＮＡのＨ／ＡＣＡボックスにおける突然変異は、多面的遺伝子疾患である先天性角化異常症を引き起こし、その患者はより短いテロメアを呈する（Mitchell et al., 1999; Vulliamy et al., 2001）。老化の機序を解読し、この過程を遅延させる及び／又はその有害な作用に対抗するための新規な治療標的を同定する科学界の努力にもかかわらず、利用可能なツールは依然として不十分である。高齢に一般的に伴う疾病及び不快感を伴わずに「良く老いる」ことを可能とするツールの必要性は、生活状態の全般的な改善と併せた医学的進歩によりすでに、ヒト集団がわずか数十年間の間にその平均余命を非常に有意に延ばすことが可能となったのでなお一層、感じられる。
【０００９】
発明の概要
本発明は、本発明者らが老化の機序に特に関与することを実証した、関心対象のＲＮＡ配列の予防使用又は治療使用に関する。本発明者らは、特に、これらの配列が、老化の機序を停止させ、それに伴う有害な作用と闘うことによって、対象の寿命を飛躍的に延ばすことができることを示した。本発明の配列はまた、老化に関連した疾病、例えば変性疾患、ラミノパチー、及び癌、並びに、糖尿病及び肥満と闘う。それらは特に、不妊症又は生殖不能（すなわち、妊娠困難又は妊娠不能）の処置、並びに対象、特に性的に成熟した対象、好ましくは高齢対象のストレスに対する抵抗性を高めるのに効果的であることが証明された。
【００１０】
本発明の第一の主題は、医薬品としての使用のための、配列番号１の配列、相同配列、好ましくはオルソロガス配列、又は機能的に類似した配列を含む、単離された又は合成のＲＮＡ配列に関する。
【００１１】
本発明者らは、ショウジョウバエで発見された配列番号１のＲＮＡ配列は、霊長類及びヒトなどの哺乳動物、並びにマウス及びラットなどのげっ歯類におけるオルソロガス配列に相当することを実証した。本発明はまた、ヒト起源の配列番号２の配列並びにマウス起源の配列番号３及び配列番号４の配列の中から好ましくは選択された単離された又は合成のＲＮＡ配列の、本文書に記載された一方の又は他方の適用における使用も網羅する。本文書の表１に同定された配列番号２、３、４、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２２、２４、２６及び２８の配列は、配列番号１に対してオルソロガスな配列の例である。
【００１２】
本発明の別の主題は、本発明に記載の関心対象のＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ配列である。
【００１３】
本発明はまた、本発明に記載のＲＮＡ配列のインビトロ、エクスビボ、又はインビボでの発現を可能とするベクターにも関する。
【００１４】
本発明はまた、本発明に記載のＲＮＡ配列を含むか又は本発明に記載のベクターによって形質転換された細胞、並びに、本発明に記載の産物と食物的に又は薬学的に許容される担体とを含む組成物に関する。
【００１５】
本発明はまた、該ＲＮＡ配列のインビボ、インビトロ、又はエクスビボでの発現を回復又は調節するために、継続的に又は順次、本発明に記載のＲＮＡ配列、ベクター、細胞、又は組成物を使用することに関する。
【００１６】
本発明の別の主題は、本発明に記載の関心対象のＲＮＡ配列、典型的には配列番号３及び配列番号４の一方及び／又は他方の配列の発現を妨げるか又は改変させる、好ましくは変化させるために、そのゲノムが遺伝子的に改変されているトランスジェニックマウスである。
【００１７】
本発明はまた、老化の有害な作用若しくはストレスと闘うための、又は不妊症と闘うための、試験化合物の美容効力又は治療効力を評価するための方法を網羅し、該方法は、ｉ）本発明のＲＮＡ配列を発現していないか又は異常な形の該ＲＮＡ配列を発現している細胞又は細胞集団；又は本発明に記載のトランスジェニックマウスの曝露、ｉｉ）該細胞（群）又は該トランスジェニックマウスの表現型に対する試験化合物の効果（ある場合）の評価、及びｉｉｉ）該試験化合物の美容効力又は治療効力、すなわち該試験化合物の効力と相関している該ＲＮＡ配列の活性及び／又は発現の回復の決定を含む。
【００１８】
本発明はまた、老化の有害な作用若しくはストレスと闘うための、又は不妊症と闘うための、試験化合物の美容効力又は治療効力を評価するための方法を網羅し、該方法は、ｉ）本発明に記載のＲＮＡ配列を含む本発明に記載の細胞、又は本発明に記載の細胞を含む細胞集団の曝露、ｉｉ）該細胞又は細胞集団の表現型に対する試験化合物の効果（ある場合）の評価、及びｉｉｉ）該試験化合物の美容効力又は治療効力、すなわち該試験化合物の効力と相関している該ＲＮＡ配列の活性及び／又は発現の増加の決定を含む。
【００１９】
本発明はまた、以前に記載されているような核酸、ベクター、カセット及び／又は細胞を含むキットにも関する。
【００２０】
詳細な説明
本発明は、ショウジョウバエの寿命に対する、核小体低分子ＤＮＡ配列（本文書で配列番号１として同定された、「youth」と呼ばれる、ｓｎｏＲＮＡ：Ψ２８Ｓ−１１５３）の影響の本発明者らによる実証からもたらされる。このｓｎｏＲＮＡは、ショウジョウバエゲノムに関連したｓｎｏＲＮＡの系統的なスクリーニングの一部として同定され（Huang et al., 2005）、これまでどのような機能もそれに帰せられていない。
【００２１】
本発明者らはこの配列を特徴付け、注目すべきことに、ｓｎｏＲＮＡ：Ψ２８Ｓ−１１５３を含有するショウジョウバエゲノムのＦ４領域の６３２塩基対のゲノム欠失が、ショウジョウバエの寿命を約３０％縮めることを示した。その後、本発明者らは、例えばこのｓｎｏＲＮＡをコードするゲノムＤＮＡを含有する導入遺伝子を使用したこのＲＮＡ配列の過剰発現が、ショウジョウバエの寿命を約１００％飛躍的に延ばすことを実証した。本発明のＲＮＡ配列を過剰発現しているハエは、最長で２倍の期間まで生きる。さらに、本発明者らは、マウス及びヒトにおいてオルソロガスな「youth」配列の発現を同定及び検出した。
【００２２】
本発明のＲＮＡ配列及び他の産物の特徴
以前に説明されているように、本発明は、それによって恩恵を得ることのできる対象、典型的には動物又は昆虫、例えば哺乳動物又はげっ歯類、好ましくはヒトにおいて医薬品として使用するための、ショウジョウバエ（キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster））において初めて同定された配列番号１の配列の機能的特徴を有する単離された又は合成のリボヌクレオチド配列（ＲＮＡ配列）に関する。
【００２３】
「医薬品」は、予防特性又は治癒特性を有する物質を意味する。本発明の文脈において、医薬品は、以前に定義されているような対象における異常な老化過程又は単に望ましくない老化過程に関連した病態、異常、又は障害を、治癒、治癒促進、寛解、又は予防することを意味する。
【００２４】
ショウジョウバエでは、関心対象のＲＮＡ配列は、それ自体、染色体２Ｒ上に位置する、領域Ｆ４として同定されたゲノム領域内に含まれる。このヌクレオチド配列は、本発明者らによって研究された初めての種のショウジョウバエ（キイロショウジョウバエ）では、１４８塩基対から構成される。それは、本文書において配列番号１として同定される。
【００２５】
配列番号１の配列の相同体／オルソログ並びに機能的類似体及び変異体も、同様に、本発明の目的である関心対象の配列である。
【００２６】
「相同体」という用語は、本発明の文脈において、そのヌクレオチド配列がショウジョウバエの最初の種において同定された配列番号１の配列と同一又は十分に近く、別の種（ショウジョウバエ、昆虫、又は任意の他の動物）におけるその等価体であると考えられる構造を示すために使用される。配列が、配列番号１に対して、又は少なくとも５０個連続したヌクレオチドのその断片に対して、少なくとも７０％、８０％又は８５％、好ましくは少なくとも９０又は９５％、より好ましくは少なくとも９６、９７、９８又は９９％の配列同一率が、ＲＮＡ構造からＤＮＡ配列を同定し及びその配列類似率を同定する例えばｂｌａｓｔＮ配列アラインメントプログラムによって（Altschul et al., 1990）又は「INFERence of RNA Alignment」用のＩＮＦＥＲＮＡＬプログラムによって得られる場合に、該配列は、配列番号１の配列の相同体であると判断される。２つの異なる種の２つの相同的な遺伝子配列は、それらが、２つの種の最終共通祖先に存在する独特な配列から派生している場合にオルソログであると判断される。
【００２７】
同一率は、最適なアラインメントが行なわれた２つの配列を比較することによって決定される。同一率は、両方の配列全体において同じ位置に同一な残基が出現する位置の数を決定し、これを位置の総数で割り、１００を乗じることによって計算される。２つの配列の最適なアラインメントは、例えば、局所相同探索アルゴリズム（Smith & Watherman, 1981）又は当業者には公知の等価なシステムを用いて得ることができる。
【００２８】
「類似体」という用語は、自然に存在しかつ自然から単離された、又は人工的に製造された化合物であり、それが模倣するヌクレオチド配列の内因的機能の少なくとも１つを有する（機能的に等価なＲＮＡ配列）、例えば、それが模倣するヌクレオチド配列の全ての内因的な機能を有する、任意の模倣体を示す。類似化合物の一例は、例えば、同じ遺伝子のスプライシングを可能とする配列からなる。それ故、本発明の特定の目的は、キイロショウジョウバエのＩｒ５６ｄ、buttonhead、klarsicht、ＣＧ３２６２、ＣＧ３０５０２（脂肪酸２−ヒドロキシラーゼ−ｆａ２ｈ）、ＣＧ１１１２５、ＣＧ９３３９及びＣＧ４０００６の中から選択された１つ以上の遺伝子のスプライシングを可能とする配列番号１に対して類似した配列に関する。本発明者らによって行なわれた実験は、例えば、ＣＧ９３３９遺伝子（skywalkerと呼ばれる）（Uytterhoeven et al., 2011）がＦ４突然変異体では正しくスプライシングされないことを実証し、このことは、youth ｓｎｏＲＮＡがこの遺伝子の選択的スプライシングに関与していることを示す（図１７参照）。類似の結果が、klarsicht遺伝子の転写物（Ｆ４突然変異体ではＣａｎｔｏｎ−Ｓ野生型対照のハエよりもより少ないスプライシングを受けたＲＮＡが観察されている）（図１８Ａ）、並びに、ｆａ２ｈ遺伝子をコードするＣＧ３０５０２遺伝子（図１８Ｂ）においても観察され、後者は、ヒトの様々な形態の脱髄、例えば鉄の蓄積に関連した神経変性、白質ジストロフィー（典型的にはｆａ２ｈ遺伝子の突然変異に関連したもの）及び遺伝性痙性対麻痺（典型的にはＳＰＧ３５遺伝性痙性対麻痺）に関与している（Dick et al., 2008; 2010; Pierson et al., 2012）。
【００２９】
「機能的変異体」という用語は、本出願に記載の親配列と比較して１つ以上の改変又は突然変異（すなわち、例えば、１つ以上の塩基の欠失、置換、又は付加）を有し、かつ本発明の文脈において記載された適用を可能とする任意の核酸を意味する。
【００３０】
本発明の意味において基準配列の相同体、好ましくはオルソログであると判断される配列は、該基準配列の本発明の意味での機能的変異体の一例である。このような配列は、天然配列、組換え配列、又は合成配列であり得る。
【００３１】
配列番号１の配列は、進化の間ずっと高度に保存されてきた配列であり、多くの動物種に存在する。それ故、本発明者らは注目すべきことに、この配列が、ゲノムが公知である１２個の他の種のショウジョウバエにおいても存在することを示した。それ故、配列番号１のＲＮＡ配列に対して相同／オルソロガスな配列の例は、この文書の表１に同定された配列番号９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２２、２４、２６及び２８のＲＮＡ配列も含む（図９参照）。
【００３２】
本発明者らはまた、第１１染色体の１２８２２７２２位〜１２８２２８１１位に位置するヒトのオルソロガスなＲＮＡ配列を同定した。それは、本文書で配列番号２として同定された配列である。本発明者らはまた、第１５染色体の３０３３６８８９位〜３０３３７０１７位（配列番号７）及び第１８染色体の６４９５０１２位〜６４９５０９１位（配列番号８）に位置する、マウスの２つのオルソロガスなＲＮＡ配列（これらはそれぞれ本文書において配列番号３及び４として同定された配列である）を同定した。
【００３３】
ショウジョウバエ、ヒト及びマウスにおいて同定された関心対象のヌクレオチド配列を以下の表１に列挙する。
【００３４】
【表１】
2020010707.tif 000002
2020010707.tif 000003
2020010707.tif 000004
2020010707.tif 000005
【００３５】
本発明の１つの特定の主題は、標的遺伝子を同定するための配列番号１のＲＮＡ配列の使用に関し、配列番号１の該配列は、好ましくはＩｒ５６ｄ、buttonhead、klarsicht、ＣＧ３２６２、ＣＧ３０５０２（脂肪酸２−ヒドロキシラーゼ：ｆａ２ｈ）及びＣＧ１１１２５、ＣＧ９３３９、ＣＧ４０００６の中から選択されたキイロショウジョウバエ遺伝子内の標的遺伝子を認識することができ、該標的配列は、好ましくは、配列番号３１（TGGTTGAATTCACAAAA）、配列番号３２（TTGAATTCACAAAATA）、配列番号３３（AATTCACAAAATAGGC）、配列番号３４（AAGCGTTAGATATTAA）、配列番号３５（ACATCTGCGGATAAGA）、配列番号３６（AAGCTTTGCGTTTTGA）、及び配列番号３７（AGAAGCTTTGCGTTTT）、又はその類似配列の中から選択される。
【００３６】
本発明の文脈において、関心対象のＲＮＡ配列は好ましくは、ｓｎｏＲＮＡの形態である。本発明の文脈において、「ｓｎｏＲＮＡ」という用語は、全ての真核細胞に存在するノンコーディングＲＮＡの一群を包含する。それらは、核内に位置し、より特定すると核小体に位置し、そこでそれらはタンパク質と会合してそれと共に核小体低分子リボ核タンパク質すなわちｓｎｏＲＮＰを形成している。それらは一般的にプレ−ｍＲＮＡイントロンから産生される。進化スケールでは、これらのノンコーディングＲＮＡは古細菌から哺乳動物まで存在している。ｓｎｏＲＮＡは、例えばリボソームＲＮＡの修飾、例えば２’−Ｏ−リボースのメチル化、又は様々なクラスのＲＮＡのシュードウリジン化などのいくつかの機能を有し得る。それらはリボソームＲＮＡの核酸分解過程又はさらにはテロメアＤＮＡの合成にさえ関与している（Kiss, 2002; Kiss et al., 2010; Ye, 2007）。ｓｎｏＲＮＡには２つの主なクラスが存在する：１つはＣ／Ｄボックスを含み、１つはＨ／ＡＣＡボックスを含む（図２Ａ）。Ｃ／Ｄボックスは、特定の部位での２’−Ｏ−リボースのメチル化のためのガイド配列として働き、Ｈ／ＡＣＡボックスはウリジンからシュードウリジンへの変換を指令する（Kiss, 2002; Gardner et al., 2010; Huang et al., 2005）（図２Ｂ）。
【００３７】
最初の種のショウジョウバエにおいて同定された、関心対象のｓｎｏＲＮＡ：Ψ２８Ｓ−１１５３（youth）はＨ／ＡＣＡクラスに属し、すなわち、その構造はＨ／ＡＣＡボックスを含む。それ故、それは、リボソームＲＮＡの成熟中のシュードウリジン化（すなわち、ウリジンからシュードウリジンへの変換）に関与し、特定の遺伝子のタンパク質合成を調節するだろう。
【００３８】
本発明に記載のｓｎｏＲＮＡは、典型的には、ヌクレアーゼに対するｓｎｏＲＮＡの抵抗性を高めるために、より良好な親和性／選択性を付与して、よってより良好なｓｎｏＲＮＡの機能を付与するために化学的に改変され得る。改変は典型的には、ヌクレオシド又はヌクレオシド間結合に関する。それらは、糖、例えば（典型的には糖の２’位）、ヌクレオシドの窒素含有塩基（これは典型的には２位、４位又は６位に置換基を含む）、又は１つ（又はそれ以上）のリン酸基に関し得る。
【００３９】
改変は、例えば、アミノ化、ハロゲン化、例えばフッ素化、又はアルキル化、例えばメチル化からなり得る。それ故、改変された糖基は、例えば、２’−Ｏ−メチル基及び２’−Ｏ−メトキシエチル基の中から選択され得る。
【００４０】
改変されたヌクレオチドは、複素環ＤＮＡ塩基又はＲＮＡ塩基と水素結合を作ることのできる複素環塩基を含むヌクレオチドであり得る。
【００４１】
ヌクレオシド間結合の改変は、例えば、ホスホロチオエート結合、メチルホスホネート結合、ホスホトリエステル結合、ホスホロジチオエート結合、及びホスホセレナート結合の中から選択される。
【００４２】
本発明はまた、本発明の関心対象のＲＮＡ配列の発現に関与するデオキシリボヌクレオチド配列（ＤＮＡ）に関する。配列番号１のＲＮＡ配列の発現を可能とするＤＮＡ配列は、配列番号５として本発明において同定された配列であり、配列番号２の配列の発現を可能とするＤＮＡ配列は、配列番号６として本発明において同定された配列であり、配列番号３の配列の発現を可能とするＤＮＡ配列は、配列番号７として本発明において同定された配列であり、配列番号４の配列の発現を可能とするＤＮＡ配列は、配列番号８として本発明において同定された配列である。
【００４３】
それ故、本発明の１つの目的は、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、及び配列番号３０を含む群から選択された単離された又は合成のＤＮＡ配列に関し、それは本発明に記載の関心対象のＲＮＡ配列の発現を可能とすることを特徴とする。
【００４４】
ｓｎｏＲＮＡと同様に、本発明に記載のＤＮＡは、化学的に改変され得る（上記の可能な化学的改変を参照されたい）。
【００４５】
本発明はまた、任意の組換え発現カセットにも関し、これは、それが、本文書において定義されているような本発明に記載の関心対象の核酸配列を含むことを特徴とする。発現カセットという用語は、作動可能に連結された、本発明に記載の関心対象のＲＮＡ配列の発現を可能とする核酸配列と調節領域とを含む、核酸構築物／構築を示す。「作動可能に連結」という表現は、核酸配列の発現（関心対象のＲＮＡ配列の発現に関与する）及び／又は関心対象のＲＮＡ配列の標的化が、転写プロモーターの制御下にあるように成分が組み合わせられていることを示す。典型的には、プロモーター配列は核酸配列の上流に、発現制御に適合性である核酸配列からの距離に配置されている。スペーサー配列は、調節配列とコード配列の間に、それらが関心対象のＲＮＡ配列の発現及び／又は標的化を妨害しない限りにおいて存在し得る。
【００４６】
本発明の別の目的は、宿主細胞又は宿主生物において本発明に記載の関心対象のＲＮＡ配列の発現を可能とする以前に定義されているような核酸又はカセットを含む、任意の（発現）ベクターに関する。ベクターは、環状又は環状ではない、一本鎖又は二本鎖のＤＮＡ又はＲＮＡであり得る。それは典型的には、プラスミド、ファージ、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルス関連ベクター、レンチウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ヘルペスベクターなどの中から選択される）、コスミド又は人工染色体である。有利には、それは、真核細胞、好ましくは動物細胞、典型的にはヒト細胞、好ましくは腸又は卵巣起源の細胞を形質転換することのできるベクターである。このようなベクターは当業者には周知であり、特に特許出願の国際公開公報第０６／０８５０１６号、又は、Barton及びMedzhitov, 2002; Tiscornia et al., 2004; Xia et al., 2002 et Shen et al., 2003による論文に記載されている。
【００４７】
本発明に記載の関心対象のＲＮＡ配列の発現を可能とする１つの好ましいベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルスベクター、又はファージの中から選択され得る。特にショウジョウバエにおいて使用することのできる１つの好ましいベクターは、ｐＣｈｓ−Ｇａｌ４ベクターであり、このベクターにはＧａｌ４転写因子の上流に、所与の組織内の所与の遺伝子の発現を調節することが知られている特定のＤＮＡ配列、例えばＭｙｏ１Ａ−Ｇａｌ４、ｓｎａｉｌ−Ｇａｌ４、Ｓｕ（Ｈ）−ＧＢＥ−Ｇａｌ４、Ｄｅｌｔａ−Ｇａｌ４が挿入されている。同時に、関心対象のエフェクター遺伝子、ここではｓｎｏＲＮＡを含む第二のベクター（ｐＵＡｓ−ｓｎｏＲＮＡ）は好ましくは、ＵＡＳ（上流活性化配列）調節配列の下流に位置し、これらのＵＡＳ調節配列はＰ［ＧＡＬ４］転写因子によって認識される。これらの各々の２つのベクターは、次いで、遺伝子組換えによって動物に導入される。次いでこれらの２つの動物系統を交配させる。この系はＰ［ＧＡＬ４］バイナリー発現系と呼ばれる（Brand and Perrimon, 1993; Elliott and Brand, 2008）。それ故、より具体的には、Ｍｙｏ１Ａ−Ｇａｌ４、ｓｎａｉｌ−Ｇａｌ４、Ｓｕ（Ｈ）−ＧＢＥ−Ｇａｌ４及びＤｅｌｔａ−Ｇａｌ４ベクターは、腸細胞において該ＲＮＡ配列の発現を促進するプロモーター及び調節配列を含むが、ｎａｎｏｓ−Ｇａｌ４又はＭＴＤ−（母親由来チューブリン）−Ｇａｌ４ベクターは、卵巣において該ＲＮＡ配列の発現を促進するプロモーター及び調節配列を含む。
【００４８】
本発明のベクターはまた、複製起点、選択遺伝子、レポーター遺伝子、及び／又は組換え配列などを含むことができる。ベクターは、当業者には周知である標準的な分子生物学的技術によって、例えば、制限酵素、ライゲーション酵素、クローニング用酵素、複製用酵素などを使用して構築され得る。本発明の意味におけるベクターの具体例は、実験部において提供される。これらのベクターは、例えば、Ｐ［ＧＡＬ４］バイナリー系（上記）（Brand and Perrimon, 1993; Elliott and Brand, 2008）を含み得る。
【００４９】
本発明はまた、本発明に記載のＲＮＡ配列を含むか、又は本発明に記載の構築物若しくはベクターを用いて形質転換された細胞に関する。該細胞は好ましくは、腸細胞又は卵巣細胞である。さらにより好ましくは、それは腸幹細胞、腸芽細胞、腸細胞、腸内分泌細胞、ナース細胞、又は卵母細胞である。
【００５０】
本発明はまた、本発明に記載の関心対象のＲＮＡ配列の発現をインビトロ、エクスビボ又はインビボで回復又は調節、典型的には増幅させるために、継続的に又は順次、本発明に記載の産物、典型的には本発明に記載のＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列、ベクター又は細胞を使用することを含む。
【００５１】
本発明はまた、当業者に周知の技術を使用してゲノム（典型的には配列番号７又は配列番号８）が遺伝子的に改変されて、例えば、配列番号３及び配列番号４の一方又は他方の発現が妨げられるか又は改変、例えば増加又は低減され、好ましくはその発現が変化した、トランスジェニックマウスに関する。
【００５２】
マウスは、有利には、例えばＣＲＥ／ＬＯＸ系の使用を含む、当業者には公知である相同的組換え（ノックイン、ノックアウト、ノックダウン）技術によって遺伝子的に改変されている。
【００５３】
本発明はまた、本発明に記載のＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列、構築物、ベクター、又は細胞を含む組成物に関する。
【００５４】
本発明のＲＮＡ配列は、インビトロにおいて非常に安定かつ非常に抵抗性である。しかし、処置しようとする対象への投与の場合、本発明に記載の組成物はまた、有利には、食物的に又は薬学的に許容される担体を含み得る。
【００５５】
「食物的に許容される担体」という表現は、対象がリスクを伴うことなく、このような配列を含む本発明に記載のＲＮＡ配列、構築物、ベクター、又は細胞を含む組成物を摂取及び消化することを可能とし、かつ、該組成物が治療作用を生じる前にそれを変化させる可能性がある、特に食物消化に関連したあらゆる攻撃から該配列を保護することのできる、担体を示す。
【００５６】
「薬学的に許容される担体」という表現は、下記された可能な投与経路の１つによる、このような配列を含む本発明に記載のＲＮＡ配列、構築物、ベクター、又は細胞を含む組成物のリスクを伴わない投与を可能とする担体を示す。
【００５７】
有利には、本発明の組成物の担体は、本発明に記載の関心対象のＲＮＡ、構築物、若しくは発現ベクターの、細胞への、理想的には本文書で同定されたような特定の細胞への浸透を促進し、及び／又は、該ＲＮＡ、該構築物、若しくは該発現ベクターを、その効力を損なう可能性のあるあらゆる傷害から保護する。
【００５８】
担体の選択並びに担体中の活性物質の含量は、一般的には、活性物質の溶解度及び化学的特性、投与形態、及び処置しようとする対象の特徴に関して決定される。
【００５９】
薬学的に許容される使用可能な担体又は担体としては、本発明の核酸と複合体を形成する、キトサン若しくはアテロコラーゲンなどの天然の陽イオン性ポリマー、又は、ポリ（Ｌ−リジン）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）若しくはデンドリマーなどの合成ポリマー；リポソーム；陽イオン性リポソーム；ガラクトシル化リポソーム；細胞型へと標的化させることを可能とするリガンドでコーティングされたリポソーム、例えば標的細胞に特異的な抗体でコーティングされたイムノリポソーム（Zheng et al., 2009）；ポリマーによって形成されたナノ粒子内に配置されたリポソーム（Carmona et al., 2009）又はさらにはポリカチオン及びポリアニオンの多層フィルムが挙げられる。
【００６０】
賦形剤、例えば乳糖、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸二カルシウム、及び崩壊剤、例えばデンプン、アルギン酸、及び潤滑剤（例えばステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム及びタルク）と配合した特定の複合ケイ酸塩を使用して、錠剤を調製することができる。ロゼンジ剤を調製するために、乳糖及び高分子量のポリエチレングリコールを使用することが有利である。水性懸濁液は、乳化剤又は懸濁を促進する物質を含有する。ショ糖、エタノール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、グリセロール、及びクロロホルム、又はこれらの混合物などの希釈剤も使用可能である。
【００６１】
アルミニウム塩（例えば水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなど）などのアジュバント、界面活性剤（例えばリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、及びエマルション）、完全及び不完全フロイントアジュバント、ＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（モノホスホリルリピドＡ、合成トレハロースジコリノミコラート）、チロシン、アルミニウム、サポニン、例えばスティミュロン（商標）、並びにサイトカインも、組成物の効力を向上させるために添加することができる。
【００６２】
本発明のＲＮＡ配列は、産物の制御放出又は持続放出をもたらし得る物質、例えば注射可能なミクロスフィア、生体浸食性粒子、ポリマー化合物（例えばポリ乳酸又はポリグリコール酸）、ビーズ又はリポソームと共に調製され得る。
【００６３】
食物的に許容される担体の例としては、例えば、糖、サポニンなどが挙げられる。
【００６４】
該組成物はまた、ラミノパチーの処置に、特にハッチンソン−ギルフォード症候群すなわちＨＧＰＳ（早老症としても知られ、ヒトにおける早老及び促進老化からなる）、肥満、糖尿病、癌、変性疾患、特に神経変性疾患（例えば白質ジストロフィー又は依然としてＳＰＧ３５として同定されている遺伝性痙性対麻痺）、ストレス、又は不妊症を処置するのに使用可能な薬剤の中から好ましくは選択された１つ以上の他の活性成分を含んでいてもよい。
【００６５】
肥満の処置における活性成分は、例えば、レプチン又はその誘導体の１つであり得る。
【００６６】
糖尿病の処置における活性成分は、例えば、インスリン又はその誘導体の１つであり得る。
【００６７】
癌の処置における活性成分は、例えば、ＤＮＡ複製阻害剤（例えばＤＮＡ結合剤、特に挿入化合物又はアルキル化化合物）、代謝拮抗剤（例えばＤＮＡポリメラーゼ阻害剤又はトポイソメラーゼＩ阻害剤若しくはトポイソメラーゼＩＩ阻害剤）、有糸分裂阻害剤（例えばアルカロイド）、癌腫瘍の増殖を遮断する薬剤（例えばチロシナーゼ阻害剤又はモノクローナル抗体）から選択された、従来の細胞障害性化学療法剤であり得る。
【００６８】
本発明に記載のＲＮＡ（おそらく、本文書に記載された本発明に記載の別の産物を含むか又はそれを使用して発現された）及び他の活性化合物又は化合物群は、同じ組成物中で適用可能である場合には同時に投与しても、又は順次投与してもよい。
【００６９】
本発明の産物（核酸配列、ベクター、細胞、組成物）は、当業者には周知の標準的なプロトコールに従って、静脈内投与、経口投与、舌下投与、非経口投与、直腸投与、局所投与、経皮投与、皮下投与、粘膜投与、筋肉内投与、肺内投与、鼻腔内投与、膣内投与などのために適応させ得る。
【００７０】
好ましくは、産物は、経口投与のために適応させ、固形剤形又は液体剤形で提示される。産物は、食物、錠剤、カプセル剤、丸剤、糖衣錠、ロゼンジ剤、顆粒剤、又は経口用液剤の剤形であり得る。非経口投与の場合、それは好ましくは液体溶液、エマルション、又は懸濁液の剤形である。静脈内、皮内、又は皮下投与の場合、それは典型的には注射溶液の剤形である。
【００７１】
関心対象のヌクレオチド配列はまた、電気穿孔によって、対象の筋肉に又は皮膚を通して投与され得る。
【００７２】
投与量（又は治療有効量）は、所望の効果（すなわち、寿命を延ばし、老化の有害な作用、ストレス、及び／又は不妊症と闘う）が得られるように当業者によって容易に決定される。産物の具体的な用量は、関与する対象及び所望の適用に対して調整されるべきである。それは、対象の体重、健康状態、性別、及び食事、投与経路、吸収速度、排泄速度、及び１つ以上の他の活性分子との可能な組合せなどを含む、いくつかの因子に依存する。
【００７３】
１回量又は数回の投与でヒト対象に投与される産物の１日総量は、例えば、１kgあたり１μg〜２０mg、好ましくは１００μg〜５mgを含み得る。投与は、週１回又は１日１回、又はさらには１日数回反復投与され得る。それらを含む本発明に記載のＲＮＡ又は組成物は、０．０５〜２０mgのＲＮＡ、優先的には０．１〜５mgを含む単位投与形で投与され得る。
【００７４】
１つの特定の実施態様では、本発明の関心対象のＲＮＡ配列は、治療用組成物に、例えばワクチンに使用される。
【００７５】
別の特定の実施態様では、本発明の関心対象のＲＮＡ配列は、美容組成物に使用される。
【００７６】
本発明の産物の適用
本発明は特に、医薬品として使用するための、本発明に記載の関心対象のＲＮＡ配列若しくはＤＮＡ配列からなるか又はこれを含む、本文書に記載されているような産物に関する。
【００７７】
本発明はまた、ｉ）老化の機序に関連した病態、異常、疾患、又は見た目の若しくは機能的な劣化を予防又は治療するために、ｉｉ）対象の寿命を延ばすために、又はｉｉｉ）ストレスに対する対象の抵抗性を高めるために、使用するための、本発明に記載の産物又は組成物にも関する。
【００７８】
１つの特定の態様では、本発明は、ｉ）老化の機序に関連した病態、異常、疾患、又は見た目の若しくは機能的な劣化を予防又は治療する、ｉｉ））対象の寿命を延ばす、又はｉｉｉ）ストレスに対する対象の抵抗性を高めることを目的とした医薬組成物の調製のための、治療有効量のこのような産物の使用に関する。
【００７９】
さらに別の特定の態様では、本発明は、美容組成物の調製のためのこのような産物の使用に関する。
【００８０】
本文書において使用される「処置」という用語は、症状の改善若しくは寛解、疾病若しくは老化過程の進行の緩徐化、疾病の進行の停止、又は疾病の寛解を指す。
【００８１】
本発明者らは、老化過程（群）を遅延させ、これらの過程（群）に関連した病態及び有害な作用と闘う上での、本発明に記載のＲＮＡ配列の驚くべき効力を実証した。
【００８２】
本発明者らは注目すべきことに、ショウジョウバエにおける配列番号１の配列のｓｎｏＲＮＡ：Ψ２８Ｓ−１１５３の過剰発現が、該ショウジョウバエの寿命を飛躍的に倍加させることを実証した。特に、本発明者らは、ｓｎｏＲＮＡ：Ψ２８Ｓ−１１５３についての突然変異ハエは、４０日令の野生型ハエよりも多くの神経変性病変を有することを実証した（図１２）。一般的に、ｓｎｏＲＮＡ：Ψ２８Ｓ−１１５３を過剰発現しているハエは、より少ない脳病変を有するか又はさらには全く脳病変を有さず、このことは神経変性病態に関する本発明に記載のｓｎｏＲＮＡの保護性質を示す。さらに、本発明者らは、ｓｎｏＲＮＡ：Ψ２８Ｓ−１１５３を過剰発現している４０日令のハエが、野生型のハエよりも良好な感覚運動成績を示し（ここでは、自発運動活性を定量する試験中に移動した距離によって示される）、それ故、老化の機序に関連した有害な作用から保護されていることを示した。
【００８３】
本発明者らは、本発明に記載の関心対象のＲＮＡ配列の過剰発現が、対象の寿命を延ばし、老化の機序を遅延させ、これらの機序に関連した有害な作用と闘うことを可能とすることを実証した。特に、本発明者らは、この過剰発現が神経保護的であり、特に、変性疾患、特に神経変性疾患、典型的には脳の脱髄をもたらす鉄の蓄積に関連した神経変性疾患、例えば、ｆａ２ｈ遺伝子の１つ以上の突然変異によって引き起こされる神経変性疾患を予防又は治療するように働くことを示した。本発明はまた、特に、白質ジストロフィー（典型的にはｆａ２ｈ遺伝子の突然変異に関連したもの）又は遺伝性痙性対麻痺（典型的にはＳＰＧ３５遺伝性痙性対麻痺）の処置も可能とする。本発明はまた、糖尿病、癌、又は不妊症若しくは生殖不能問題の予防又は治療を可能とし（図１４）、また、処置された対象の自発運動活性の維持も支援する。
【００８４】
「対象」は、その性別又は年齢に関わらず、このような処置から恩恵を受けることのできるあらゆる生物を意味する。好ましくは対象は成体対象である。対象は、昆虫、例えばショウジョウバエ、又は動物、例えば哺乳動物（好ましくは霊長類又はヒト）、又はげっ歯類（好ましくはマウス又はラット）であり得る。
【００８５】
好ましくは、対象は、ｉ）関心対象のＲＮＡ配列を発現していないか、又は、異常な形の該ＲＮＡ配列を発現し、ｉｉ）飢餓、熱ショック、酸化ストレス（例えばパラコートへの曝露）、又は検出可能な細胞増殖若しくはＤｅｌｔａ／Ｎｏｔｃｈ経路の調節不全に原因がある（腸内の）ストレスなどの、ストレス条件を経験している対象（特に、性的に成熟した対象、好ましくは高齢対象）であり、及び／又はｉｉｉ）老化に関連した又は老化によって促進される疾病、典型的には変性疾患、特に神経変性疾患、ラミノパチー、例えば早老症、肥満、糖尿病、癌、又は不妊症問題（特に不妊症又は生殖不能を含む）を患う対象である。
【００８６】
特定の実施態様では、本発明から恩恵を受ける可能性が高い対象のゲノムは、ｉ）本文書に記載されているような関心対象のＲＮＡ配列を発現していないか、ｉｉ）異常な形の関心対象の該ＲＮＡ配列を発現しているか、又はｉｉｉ）関心対象の該ＲＮＡ配列の無発現又は異常な（すなわち機能的ではない）発現の原因となる突然変異を含むＤＮＡ配列を含有している。
【００８７】
正常な形（野生型）のＤＮＡ配列は、例えば、以前に同定された、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８及び配列番号３０の配列の中から選択され得る。正常な形のＤＮＡ配列に影響を及ぼす可能性の高い、すなわち本発明に記載の関心対象のＲＮＡ配列の発現を妨害する可能性の高い突然変異は、典型的には、１つ以上のヌクレオチドの欠失、付加、及び／又は置換の中から選択される。
【００８８】
「生涯期間」又は「寿命」という用語は、理想的な条件下で疾病又は事故のない中で生きる、対象が生物学的種としてプログラム化されている寿命を指す。「最大生涯期間」又は「最大寿命」は、所与の種の個体が到達することのできる最大の寿命である。実践的な目的のために、対象の最大生涯期間は、集団のメンバーの一員が到達した最高年齢によって推定される。「平均生涯期間」又は「平均寿命」は、所与の集団の５０％が生存している年令である。
【００８９】
「寿命の延長」に対する処置の効果を測定する広く認識されている方法は、最大生涯期間又は平均生涯期間を参照することによる。処置が、対照対象群と比較して、対象群の最大生涯期間又は平均生涯期間を有意に延長させる場合、寿命の延長及び老化の遅延があると判断される。
【００９０】
ショウジョウバエでは、性的な成熟は、平均して、１日令で到達する。平均寿命は約３０日間である。最大寿命は、ショウジョウバエの種及び系列、並びに、生存条件又は飼育条件に依存して、約６０〜８０日間である。マウスでは、性的な成熟は、平均して生誕から４２日後に到達する。平均寿命は約８３２日間である。ヒトでは、性的な成熟は９歳から１４歳の間に到達する。平均寿命は男性では７３歳、女性では７９歳である。最大寿命は現在、１２２年５カ月１４日間である。
【００９１】
本発明の文脈における「老化」という用語は、対象の小児期及び思春期を通じての成熟から機能的な衰えまでの徐々かつ自然発生的な変化の過程である。それ故、老化は、発達及び成熟という正の構成要素と、衰えという負の構成要素とを含む。
【００９２】
本発明の関心対象のＲＮＡ配列は、対象の最大生涯期間又は平均生涯期間（又は寿命）を延長させる。好ましくは、これらの配列は寿命を延ばし、対象、又は例えば性別及び／若しくは年齢によって（すなわち、最少年齢若しくは最高年齢によって、又は年齢窓によって）規定された成体対象の亜集団の老化を遅延させる。
【００９３】
本発明を使用して、老化の容態を改善しつつ、ショウジョウバエ並びに哺乳動物（マウス、特にヒトを含む）の寿命を約５０％又はさらには１００％延長することが典型的には考えられる。
【００９４】
本発明のＲＮＡ配列を使用して、「老化の有害な作用」と闘うことも可能である。本発明の文脈において、この表現は、老化の負の構成要素、すなわち、対象の衰えを意味する。加齢による生理学的能力の進行的な衰えは、臓器毎に、対象毎に異なる。対象の生理学的な衰えにより、環境刺激に対して応答する能力は低下し、疾病及び障害への易感染性及び脆弱性は高まる。老化の有害な作用は、所与の対象の衰弱に対して影響を及ぼしかつその死を誘発する可能性のある、望ましくない変化の蓄積を包含する。これらの変化の原因は、発達、生まれつきの老化過程、遺伝子異常の可能性、環境、及び対象に影響を及ぼす又は実際に影響を及ぼした疾病であり得る。
【００９５】
さらに、本発明を使用して、変性疾患、特に神経変性疾患、典型的には中枢神経系及び／又は末梢神経系に影響を及ぼす変性疾患を予防又は治療することが可能である。
【００９６】
好ましい実施態様では、本発明は、脳の脱髄をもたらす鉄の蓄積に関連した神経変性疾患、特に、ｆａ２ｈ遺伝子の１つ以上の突然変異によって誘発される神経変性疾患の予防又は治療を可能とする。それ故、本発明は、白質ジストロフィー（典型的にはｆａ２ｈ遺伝子の突然変異に関連したもの）又は遺伝性痙性対麻痺（典型的にはＳＰＧ３５遺伝性痙性対麻痺）の処置を可能とする。
【００９７】
他の実施態様では、本発明は、ミオパチー、ハンター症候群、先天性角化異常症、プラダー・ウィリー症候群、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、多発性硬化症、及び筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の中から選択された病態を予防又は治療するだろう。
【００９８】
別の実施態様では、本発明は、ラミノパチー、例えばハッチンソン・ギルフォード症候群（又は早老症）、下顎骨異形成（ＭＡＤ）、エメリー・ドレイフス型筋ジストロフィー、非定型ウェルナー症候群、拘束性皮膚障害、致命的な胎児アキネジア、及びＬＩＲＬＬＣ（全身性脂肪萎縮症、インスリン抵抗性糖尿病、白斑黒皮症の丘疹、脂肪肝、及び肥大性心筋症）、好ましくはハッチンソン・ギルフォード症候群を予防又は治療するであろう。
【００９９】
さらに別の実施態様では、本発明は、糖尿病又は肥満を予防又は治療するであろう。
【０１００】
本発明はまた、癌又は新生物の過程の予防又は治療にも関与し得る。癌は、典型的には、細胞癌、肉腫、リンパ腫、黒色腫、小児腫瘍、又は白血病の中から選択された癌である。癌は、例えば、乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、前立腺癌、食道癌、大腸癌、直腸癌、腎臓癌、肺癌、甲状腺癌、骨肉腫、黒色腫、白血病、神経芽細胞腫などであり得る。
【０１０１】
１つの特定の実施態様では、本発明は、大腸癌及び胃癌などのフリーラジカルによって誘発された癌と闘うのに特に有用である。
【０１０２】
また、本発明に記載の産物を使用して不妊症又は生殖不能の問題と闘うことも可能である。「不妊症」又は「生殖不能」は、妊娠困難又は妊娠不能を意味する。この使用の文脈において、対象は典型的には、性的に成熟し、例えば、早産などの生殖に困難を有する雌である。典型的には、対象は、生殖不能であるか、不妊症であるか、又は、受精能の早期若しくは成熟前の低下を有している。本発明に記載の関心対象のＲＮＡ配列は、不妊症を処置するか、又は、処置された対象の受精能を回復するか、高めるか、増強するか、若しくは刺激することを可能とする。
【０１０３】
本発明はまた、老化の機序に関連した、又は本文書に記載のようなストレスに関連した病態、異常、疾患、有害な作用、又は見た目の若しくは機能的な劣化を処置するための方法に関する。
【０１０４】
試験化合物の予防効力又は治療効力の評価を可能とする方法
本発明はまた、老化の有害な作用若しくはストレス、並びに、このようなストレス若しくはこのような老化機序に関連した病態と闘うための、又は不妊症と闘うための、試験化合物の美容効力又は治療効力を評価するための方法を提供する。
【０１０５】
「試験化合物」は、老化の有害な作用に対する、ストレスに対する、又は不妊症に対する闘いに関与する可能性のあるあらゆる化合物を意味する。例えば、それは、天然分子又は化学的分子、金属、放射線照射剤などであり得る。
【０１０６】
化合物を、その可能性ある治療効力について、すなわち、疾病及び老化の有害な作用又はストレス、例えばラミノパチー、変性疾患、又は前記されているような癌を予防、治療、又はその処置を増強するその能力について、糖尿病又は肥満を予防、治療、又はその処置を増強するその能力について、あるいは、不妊症を予防、治療、又はその処置を増強するその能力について試験することができる。
【０１０７】
また、化合物を、その可能性ある美容効力について、すなわち、対象の身体上の外見を改善し、老化の機序に関連した対象の見た目の劣化に対してより良好に闘うためのその能力について試験することができる。試験化合物は、例えば、表皮、体毛及び／又は毛細血管系、爪、唇、外陰部、歯、又は粘膜の美容処置に有効であることを証明することができる。
【０１０８】
第一の実施態様では、本発明に記載の方法は、以下の工程を含む：
ｉ）本発明に記載のＲＮＡ配列を発現していないか、又は異常な形の該ＲＮＡ配列を発現している、細胞、細胞集団、又は組織；又は、本発明に記載のトランスジェニックマウスの曝露、
ｉｉ）該細胞（群）又は該組織又は該トランスジェニックマウスの表現型に対する試験化合物の効果（ある場合）の評価、及び
ｉｉｉ）該試験化合物の美容効力又は治療効力、すなわち該試験化合物の効力と相関している該ＲＮＡ配列の活性及び／又は発現の回復の決定。
【０１０９】
該試験化合物の美容効力又は治療効力を、対照値を参照して評価又は決定することができる。この対照値は、該ＲＮＡ配列を発現していないか若しくは異常な形の該ＲＮＡ配列を発現している細胞、細胞集団、若しくは組織における、又は、本発明に記載のトランスジェニックマウスにおける該ＲＮＡ配列の活性及び／又は発現のレベルから確立され得る。
【０１１０】
試験化合物に曝された細胞、細胞集団、組織、又はトランスジェニックマウス内に存在する該ＲＮＡ配列の活性及び／又は発現が、該ＲＮＡ配列を発現していないか若しくは異常な形の該ＲＮＡ配列を発現している細胞、細胞集団、若しくは組織における、あるいは、本発明の該トランスジェニックマウスにおける該ＲＮＡ配列の活性及び／又は発現よりも大きい場合、試験化合物は美容効力又は治療効力を有する。
【０１１１】
第二の実施態様では、本発明に記載の方法は、以下の工程を含む：
ｉ）本発明に記載のＲＮＡ配列を含む本発明に記載の細胞、細胞集団、又は本発明に記載の細胞を含む組織の曝露、
ｉｉ）該細胞又は細胞集団又は該組織の表現型に対する試験化合物の効果（ある場合）の評価、及び
ｉｉｉ）該試験化合物の美容効力又は治療効力、すなわち該試験化合物の効力に相関している該ＲＮＡ配列の活性及び／又は発現の増加の決定。
【０１１２】
本発明のこの態様によると、対照値は、該ＲＮＡ配列を発現している細胞又は細胞集団における該ＲＮＡ配列の活性及び／又は発現のレベルから確立され得る。
【０１１３】
この場合、試験化合物に曝された細胞又は細胞集団に存在する該ＲＮＡ配列の活性及び／又は発現が、該ＲＮＡ配列を発現している細胞又は細胞集団のＲＮＡ配列の活性及び／又は発現よりも大きい場合、試験化合物は美容効力又は治療効力を有する。
【０１１４】
ＲＮＡ配列の活性及び／又は発現のレベルは、当業者に公知の技術を使用して、典型的には定量ＰＣＲ又は免疫組織化学法（関心対象のｓｎｏＲＮＡによって調節される遺伝子／タンパク質に対して指向される抗体による染色）によって定量され得る。
【０１１５】
治療効果はまた、例えば、細胞分裂の回数を測定することなどによって、細胞の寿命を決定することによって評価され得る。
【０１１６】
好ましくは、試験化合物に曝された細胞又は細胞集団は、腸又は卵巣を起源とする。好ましい細胞は、本文書に記載された細胞の中から、典型的には腸芽細胞、腸細胞、腸内分泌細胞、腸幹細胞、ナース細胞、典型的には卵巣チャンバーのナース細胞、卵母細胞、卵原細胞（ooblast）などから選択され得る。
【０１１７】
本発明の他の態様及び利点は、以下に続く図面及び実施例を読めば明らかとなるだろう。この図面及び実施例は、例示的なものであり限定的なものであると考えるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【０１１８】
【図１】Ｐ［Ｇａｌ４］４Ｃ遺伝子座のゲノム領域の地図、youthｓｎｏＲＮＡ及びＦ４欠失の位置。
【図２】Ａ）Ｈ／ＡＣＡボックスモチーフ、Ｂ）シュードウリジン化の図（Kiss et al., (2010) Molecular Cell, 37, 597-606から抜粋）。
【図３】雌のハエの生涯期間。日数の関数としての生存中のハエの数の累積減少率（％）。Ｃｏｎｔ−ＣＳ＝野生型の対照のハエ。Ｆ４＝Ｆ４突然変異体、Ｇ５＝Ｇ５ゲノムｓｎｏＲＮＡ導入遺伝子を有するハエ、Ｆ４；Ｇ５＝野生型の表現型を回復させるために、Ｆ４突然変異体遺伝子バックグランドにおいてＧ５ｓｎｏＲＮＡ導入遺伝子を有するハエ（括弧内：ハエの数）。
【図４−１】３日令のマウスに対して実施されたストレス抵抗性試験（熱ショック、飢餓、パラコート）。Ａ）熱ショック：Ｆ４突然変異体は、対照よりも抵抗性である（雌のみ）。ｓｎｏＲＮＡを過剰発現しているハエ（Ｇ５）並びに導入遺伝子を与えられたＦ４突然変異体（Ｆ４；Ｇ５）は、対照よりも抵抗性である（雌及び雄）。Ｂ）飢餓：Ｆ４突然変異体は対照よりも抵抗性である（雄及び雌）。ｓｎｏＲＮＡを過剰発現しているハエ（Ｇ５）はより抵抗性である（雌のみ）。導入遺伝子を与えられたＦ４突然変異体の雌のハエ（Ｆ４；Ｇ５）は、対照のハエと類似し；それ故、野生型は導入遺伝子によって回復している。Ｃ）パラコート：Ｆ４突然変異体は、対照よりも抵抗性である（雄及び雌）。ｓｎｏＲＮＡを過剰発現しているハエ（Ｇ５）は、より抵抗性である（雌のみ）。導入遺伝子を与えられたＦ４突然変異体のハエ（Ｆ４；Ｇ５）は、対照のハエと類似し、それ故、野生型は導入遺伝子によって回復している。
【図４−２】３日令のマウスに対して実施されたストレス抵抗性試験（熱ショック、飢餓、パラコート）。Ａ）熱ショック：Ｆ４突然変異体は、対照よりも抵抗性である（雌のみ）。ｓｎｏＲＮＡを過剰発現しているハエ（Ｇ５）並びに導入遺伝子を与えられたＦ４突然変異体（Ｆ４；Ｇ５）は、対照よりも抵抗性である（雌及び雄）。Ｂ）飢餓：Ｆ４突然変異体は対照よりも抵抗性である（雄及び雌）。ｓｎｏＲＮＡを過剰発現しているハエ（Ｇ５）はより抵抗性である（雌のみ）。導入遺伝子を与えられたＦ４突然変異体の雌のハエ（Ｆ４；Ｇ５）は、対照のハエと類似し；それ故、野生型は導入遺伝子によって回復している。Ｃ）パラコート：Ｆ４突然変異体は、対照よりも抵抗性である（雄及び雌）。ｓｎｏＲＮＡを過剰発現しているハエ（Ｇ５）は、より抵抗性である（雌のみ）。導入遺伝子を与えられたＦ４突然変異体のハエ（Ｆ４；Ｇ５）は、対照のハエと類似し、それ故、野生型は導入遺伝子によって回復している。
【図５−１】腸及び卵巣におけるインサイツハイブリダイゼーション。Ａ）野生型対照マウス（Ｃａｎｔｏｎ−Ｓ）では、ｓｎｏＲＮＡは腸の上皮細胞に発現している。青色：ＤＡＰＩによる核内のＤＮＡの染色。赤色：ｓｎｏＲＮＡの染色。ｓｎｏＲＮＡの染色（赤色の点）が核の染色（青色）とは明確に異なりかつ補完的であり、このことは、ｓｎｏＲＮＡが核小体に局在していることを実証することを注記する。Ｂ）Ｆ４突然変異体（ｓｎｏＲＮＡの欠失）では、青色の染色が見られるが（ＤＡＰＩ）、赤色の染色は見られない。なぜなら、ｓｎｏＲＮＡは欠失し、それ故、発現されていないからである。Ｃ）対照のハエ、野生型（Ｃａｎｔｏｎ−Ｓ）。ｓｎｏＲＮＡは卵巣ナース細胞において発現されている。Ｄ）Ｆ４突然変異体のハエ。ｓｎｏＲＮＡは卵巣において発現されていない。
【図５−２】腸及び卵巣におけるインサイツハイブリダイゼーション。Ａ）野生型対照マウス（Ｃａｎｔｏｎ−Ｓ）では、ｓｎｏＲＮＡは腸の上皮細胞に発現している。青色：ＤＡＰＩによる核内のＤＮＡの染色。赤色：ｓｎｏＲＮＡの染色。ｓｎｏＲＮＡの染色（赤色の点）が核の染色（青色）とは明確に異なりかつ補完的であり、このことは、ｓｎｏＲＮＡが核小体に局在していることを実証することを注記する。Ｂ）Ｆ４突然変異体（ｓｎｏＲＮＡの欠失）では、青色の染色が見られるが（ＤＡＰＩ）、赤色の染色は見られない。なぜなら、ｓｎｏＲＮＡは欠失し、それ故、発現されていないからである。Ｃ）対照のハエ、野生型（Ｃａｎｔｏｎ−Ｓ）。ｓｎｏＲＮＡは卵巣ナース細胞において発現されている。Ｄ）Ｆ４突然変異体のハエ。ｓｎｏＲＮＡは卵巣において発現されていない。
【図５−３】腸及び卵巣におけるインサイツハイブリダイゼーション。Ａ）野生型対照マウス（Ｃａｎｔｏｎ−Ｓ）では、ｓｎｏＲＮＡは腸の上皮細胞に発現している。青色：ＤＡＰＩによる核内のＤＮＡの染色。赤色：ｓｎｏＲＮＡの染色。ｓｎｏＲＮＡの染色（赤色の点）が核の染色（青色）とは明確に異なりかつ補完的であり、このことは、ｓｎｏＲＮＡが核小体に局在していることを実証することを注記する。Ｂ）Ｆ４突然変異体（ｓｎｏＲＮＡの欠失）では、青色の染色が見られるが（ＤＡＰＩ）、赤色の染色は見られない。なぜなら、ｓｎｏＲＮＡは欠失し、それ故、発現されていないからである。Ｃ）対照のハエ、野生型（Ｃａｎｔｏｎ−Ｓ）。ｓｎｏＲＮＡは卵巣ナース細胞において発現されている。Ｄ）Ｆ４突然変異体のハエ。ｓｎｏＲＮＡは卵巣において発現されていない。
【図６−１】レポーター遺伝子ＧＦＰの発現を駆動する４つの別々のＧａｌ４ドライバー系統（ＵＡＳ−ＧＦＰ）を介した、腸の上皮細胞におけるｓｎｏＲＮＡの標的化発現。インサイツハイブリダイゼーションによるｓｎｏＲＮＡの発現の検出（赤色／橙色）（左の列：ａ１、ｂ１、ｃ１、ｄ１、ｅ１）、ＤＡＰＩを用いての核の染色（青色）（２番目の列：ａ２、ｂ２、ｃ２、ｄ２、ｅ２）、免疫染色によるＧＦＰの発現（ＦＩＴＣ（緑色）により顕現する抗ＧＦＰ抗体）（３番目の列：ａ３、ｂ３、ｃ３、ｄ３、ｅ３）。右の列（ａ４、ｂ４、ｃ４、ｄ４、ｅ４）は、共局在を示す前の３つの画像の重ね合わせ。（Ａ）（Ｍｙｏ１Ａ−Ｇａｌ４）にのみ二重染色が存在し、このことはｓｎｏＲＮＡが腸細胞にのみ発現されることを示すことを注記する。Ａ）Ｍｙｏ１Ａ−Ｇａｌ４（Ｍｙｏ１Ａ−Ｇａｌ４；ＵＡＳ−ｍＣＤ８−ＧＦＰ）の制御下における、腸細胞内でのｓｎｏＲＮＡの標的化発現。Ｂ）Ｆ４突然変異体の遺伝子バックグラウンドにおけるＭｙｏ１Ａ−Ｇａｌ４（Ｍｙｏ１Ａ−Ｇａｌ４、Ｆ４／Ｆ４；ＵＡＳ−ｓｎｏＲＮＡ−８Ｍ／＋）による腸細胞における標的化発現。Ｃ）腸幹細胞（ＩＳＣ）を染色するｅｓｇ−Ｇａｌ４（ｅｓｇ−Ｇａｌ４、ＵＡＳ−ＧＦＰ）の制御下での腸内における標的化発現。Ｄ）腸芽細胞を染色するＳｕ（Ｈ）−Ｇａｌ４（Ｓｕ（Ｈ）−ＧＢＥ−Ｇａｌ４；ＵＡＳ−ｍＣＤＢ−ＧＦＰ）の制御下における腸内における標的化発現。Ｅ）腸幹細胞（ＩＳＣ）を染色するＤｅｌｔａ−Ｇａｌ４（Ｄｌ−Ｇａｌ４、ＵＡＳ−ＧＦＰ）の制御下における腸内における標的化発現。
【図６−２】レポーター遺伝子ＧＦＰの発現を駆動する４つの別々のＧａｌ４ドライバー系統（ＵＡＳ−ＧＦＰ）を介した、腸の上皮細胞におけるｓｎｏＲＮＡの標的化発現。インサイツハイブリダイゼーションによるｓｎｏＲＮＡの発現の検出（赤色／橙色）（左の列：ａ１、ｂ１、ｃ１、ｄ１、ｅ１）、ＤＡＰＩを用いての核の染色（青色）（２番目の列：ａ２、ｂ２、ｃ２、ｄ２、ｅ２）、免疫染色によるＧＦＰの発現（ＦＩＴＣ（緑色）により顕現する抗ＧＦＰ抗体）（３番目の列：ａ３、ｂ３、ｃ３、ｄ３、ｅ３）。右の列（ａ４、ｂ４、ｃ４、ｄ４、ｅ４）は、共局在を示す前の３つの画像の重ね合わせ。（Ａ）（Ｍｙｏ１Ａ−Ｇａｌ４）にのみ二重染色が存在し、このことはｓｎｏＲＮＡが腸細胞にのみ発現されることを示すことを注記する。Ａ）Ｍｙｏ１Ａ−Ｇａｌ４（Ｍｙｏ１Ａ−Ｇａｌ４；ＵＡＳ−ｍＣＤ８−ＧＦＰ）の制御下における、腸細胞内でのｓｎｏＲＮＡの標的化発現。Ｂ）Ｆ４突然変異体の遺伝子バックグラウンドにおけるＭｙｏ１Ａ−Ｇａｌ４（Ｍｙｏ１Ａ−Ｇａｌ４、Ｆ４／Ｆ４；ＵＡＳ−ｓｎｏＲＮＡ−８Ｍ／＋）による腸細胞における標的化発現。Ｃ）腸幹細胞（ＩＳＣ）を染色するｅｓｇ−Ｇａｌ４（ｅｓｇ−Ｇａｌ４、ＵＡＳ−ＧＦＰ）の制御下での腸内における標的化発現。Ｄ）腸芽細胞を染色するＳｕ（Ｈ）−Ｇａｌ４（Ｓｕ（Ｈ）−ＧＢＥ−Ｇａｌ４；ＵＡＳ−ｍＣＤＢ−ＧＦＰ）の制御下における腸内における標的化発現。Ｅ）腸幹細胞（ＩＳＣ）を染色するＤｅｌｔａ−Ｇａｌ４（Ｄｌ−Ｇａｌ４、ＵＡＳ−ＧＦＰ）の制御下における腸内における標的化発現。
【図７−１】ｓｎｏＲＮＡ（ＵＡＳ−８Ｍ）の発現を駆動する３つの他の別々のＧａｌ４ドライバー系統を介した、他の腸上皮細胞型におけるｓｎｏＲＮＡの標的化発現であって、これは、ｓｎｏＲＮＡが、他の細胞型においても異所的に発現され得ることを実証する。Ａ）ｅｓｇ−Ｇａｌ４（ｅｓｇ−Ｇａｌ４、Ｆ４／Ｆ４；ＵＡＳ−８Ｍ／＋）の制御下における標的化発現。Ｂ）Ｓｕ（Ｈ）−Ｇａｌ４（Ｓｕ（Ｈ）−ＧＢＥ−Ｇａｌ４、Ｆ４／Ｆ４；ＵＡＳ−８Ｍ／＋）の制御下における標的化発現。Ｃ）Ｄｅｌｔａ−Ｇａｌ４（Ｄｅｌｔａ−Ｇａｌ４、Ｆ４／Ｆ４；ＵＡＳ−８Ｍ／＋）の制御下における標的化発現。
【図７−２】ｓｎｏＲＮＡ（ＵＡＳ−８Ｍ）の発現を駆動する３つの他の別々のＧａｌ４ドライバー系統を介した、他の腸上皮細胞型におけるｓｎｏＲＮＡの標的化発現であって、これは、ｓｎｏＲＮＡが、他の細胞型においても異所的に発現され得ることを実証する。Ａ）ｅｓｇ−Ｇａｌ４（ｅｓｇ−Ｇａｌ４、Ｆ４／Ｆ４；ＵＡＳ−８Ｍ／＋）の制御下における標的化発現。Ｂ）Ｓｕ（Ｈ）−Ｇａｌ４（Ｓｕ（Ｈ）−ＧＢＥ−Ｇａｌ４、Ｆ４／Ｆ４；ＵＡＳ−８Ｍ／＋）の制御下における標的化発現。Ｃ）Ｄｅｌｔａ−Ｇａｌ４（Ｄｅｌｔａ−Ｇａｌ４、Ｆ４／Ｆ４；ＵＡＳ−８Ｍ／＋）の制御下における標的化発現。
【図８−１】３日令のハエの腸におけるｓｎｏＲＮＡの標的化発現（Ｆ４突然変異体の遺伝子バックグラウンドにおけるｓｎｏＲＮＡの再発現）後の様々なストレスに対する抵抗性。Ａ）飢餓：Ｍｙｏ１Ａ−Ｇａｌ４の制御下におけるｓｎｏＲＮＡ（ＵＡＳ−８Ｍ）の標的化発現。２つの対照の系統と比較して、ｓｎｏＲＮＡ（Ｍｙｏ、Ｆ４／Ｆ４；８Ｍ／＋）を発現しているハエにおける抵抗性は明らかに増加している。Ｂ）飢餓：ｅｓｇ−Ｇａｌ４の制御下におけるｓｎｏＲＮＡ（ＵＡＳ−８Ｍ）の標的化発現。２つの対照の系統と比較して、ｓｎｏＲＮＡ（ｅｓｇ、Ｆ４／Ｆ４；８Ｍ）を発現しているハエにおける抵抗性は明らかに増加している。Ｃ）飢餓：Ｓｕ（Ｈ）−Ｇａｌ４の制御下におけるｓｎｏＲＮＡ（ＵＡＳ−８Ｍ）の標的化発現。２つの対照の系統と比較して、ｓｎｏＲＮＡ（Ｓｕ（Ｈ）、Ｆ４／Ｆ４；８Ｍ）を発現しているハエにおける抵抗性は明らかに増加している。Ｄ）３６℃での熱ショック：Ｓｕ（Ｈ）−Ｇａｌ４の制御下でのｓｎｏＲＮＡ（ＵＡＳ−８Ｍ）の標的化発現。２つの対照の系統と比較して、ｓｎｏＲＮＡ（Ｓｕ（Ｈ）、Ｆ４／Ｆ４；８Ｍ）を発現しているハエにおける抵抗性は明らかに増加している。
【図８−２】３日令のハエの腸におけるｓｎｏＲＮＡの標的化発現（Ｆ４突然変異体の遺伝子バックグラウンドにおけるｓｎｏＲＮＡの再発現）後の様々なストレスに対する抵抗性。Ａ）飢餓：Ｍｙｏ１Ａ−Ｇａｌ４の制御下におけるｓｎｏＲＮＡ（ＵＡＳ−８Ｍ）の標的化発現。２つの対照の系統と比較して、ｓｎｏＲＮＡ（Ｍｙｏ、Ｆ４／Ｆ４；８Ｍ／＋）を発現しているハエにおける抵抗性は明らかに増加している。Ｂ）飢餓：ｅｓｇ−Ｇａｌ４の制御下におけるｓｎｏＲＮＡ（ＵＡＳ−８Ｍ）の標的化発現。２つの対照の系統と比較して、ｓｎｏＲＮＡ（ｅｓｇ、Ｆ４／Ｆ４；８Ｍ）を発現しているハエにおける抵抗性は明らかに増加している。Ｃ）飢餓：Ｓｕ（Ｈ）−Ｇａｌ４の制御下におけるｓｎｏＲＮＡ（ＵＡＳ−８Ｍ）の標的化発現。２つの対照の系統と比較して、ｓｎｏＲＮＡ（Ｓｕ（Ｈ）、Ｆ４／Ｆ４；８Ｍ）を発現しているハエにおける抵抗性は明らかに増加している。Ｄ）３６℃での熱ショック：Ｓｕ（Ｈ）−Ｇａｌ４の制御下でのｓｎｏＲＮＡ（ＵＡＳ−８Ｍ）の標的化発現。２つの対照の系統と比較して、ｓｎｏＲＮＡ（Ｓｕ（Ｈ）、Ｆ４／Ｆ４；８Ｍ）を発現しているハエにおける抵抗性は明らかに増加している。
【図９−１】Ａ）ゲノムが公知である１２種のショウジョウバエにおける相同性；Ｂ）１２種のショウジョウバエの共通構造。
【図９−２】Ａ）ゲノムが公知である１２種のショウジョウバエにおける相同性；Ｂ）１２種のショウジョウバエの共通構造。
【図１０】第１１染色体上のヒト相同体。
【図１１−１】ハツカネズミ（Mus musculus）における２つの相同遺伝子（マウス−１及びマウス−２）。
【図１１−２】ハツカネズミ（Mus musculus）における２つの相同遺伝子（マウス−１及びマウス−２）。
【図１２−１】脳組織学的検査：４０日令のハエの脳における可視的な神経変性。対照のハエ（Ｃａｎｔｏｎ−Ｓ野生型）（ａ１）は神経変性病変を呈するが（空胞／細胞間隙）、Ｆ４突然変異体ハエ（ａ２）は、より多くの病変を呈する。突然変異体の遺伝子バックグラウンドにおいてｓｎｏＲＮＡを発現しているハエ（レスキュー：Ｆ４；Ｇ５）（ｂ１）はＣＳ及びＦ４よりも少ない病変を呈し、これはｓｎｏＲＮＡを過剰発現しているハエ（Ｇ５）（ｂ２）も同様である。腸細胞において特異的にｓｎｏＲＮＡを再発現しているＦ４突然変異体ハエ（Ｍｙｏ、Ｆ４／Ｆ４；ＵＡＳ−ｓｎｏＲＮＡ）（ｃ２）もまた、それを発現していないハエ（Ｍｙｏ、Ｆ４／Ｆ４）（ｃ１）よりも少ない病変を有する。（ｄ）では、これらの様々な遺伝子型についての幼若なハエ（４日令）及び老齢なハエ（４０日令）における病変の定量。これらすべての結果は、ｓｎｏＲＮＡの発現が、老齢なハエにおける神経変性病変から保護することを示す（０、＋、＋＋、＋＋＋＝その数及び面積に基づいた病変の重度）。
【図１２−２】脳組織学的検査：４０日令のハエの脳における可視的な神経変性。対照のハエ（Ｃａｎｔｏｎ−Ｓ野生型）（ａ１）は神経変性病変を呈するが（空胞／細胞間隙）、Ｆ４突然変異体ハエ（ａ２）は、より多くの病変を呈する。突然変異体の遺伝子バックグラウンドにおいてｓｎｏＲＮＡを発現しているハエ（レスキュー：Ｆ４；Ｇ５）（ｂ１）はＣＳ及びＦ４よりも少ない病変を呈し、これはｓｎｏＲＮＡを過剰発現しているハエ（Ｇ５）（ｂ２）も同様である。腸細胞において特異的にｓｎｏＲＮＡを再発現しているＦ４突然変異体ハエ（Ｍｙｏ、Ｆ４／Ｆ４；ＵＡＳ−ｓｎｏＲＮＡ）（ｃ２）もまた、それを発現していないハエ（Ｍｙｏ、Ｆ４／Ｆ４）（ｃ１）よりも少ない病変を有する。（ｄ）では、これらの様々な遺伝子型についての幼若なハエ（４日令）及び老齢なハエ（４０日令）における病変の定量。これらすべての結果は、ｓｎｏＲＮＡの発現が、老齢なハエにおける神経変性病変から保護することを示す（０、＋、＋＋、＋＋＋＝その数及び面積に基づいた病変の重度）。
【図１３】７時間の記録の最中に移動した距離によってここに示された、ビデオ追跡によって定量された感覚運動パラメーター（自発運動活性）。４０日令のハエを、幼若な４日令のハエと比較する。Ａ）雌が移動した距離、Ｂ）雄が移動した距離。
【図１４】ハエの受精能（Ａ）１７日間におよぶ、１日あたり１匹の雌あたりの産卵数、及びＢ）１７日間の１匹の雌あたりの産卵数）。全てにおいて、Ｆ４突然変異体は、対照（ＣＳ）よりも僅かにより多くの卵を産んだが、僅かに遅かった。Ｆ４突然変異体における導入遺伝子（ｓｎｏＲＮＡ）の発現（Ｆ４；Ｇ４、Ｆ４；４Ｍとも呼ばれる）は、受精能を低下させる。導入遺伝子の過剰発現（Ｇ４、４Ｍとも呼ばれる）は、受精能（産卵数）を高める。
【図１５】腸上皮の図（Jiang and Edgar, Exp. Cell. Res., 2011から抜粋）。Ａ）成体ショウジョウバエにおける腸上皮再生モデル。Ｂ）ショウジョウバエ（胚、幼虫、蛹、成体）及び哺乳動物における腸内分泌細胞におけるＮｏｔｃｈ機能のモデル。Ｄｌ＝Ｄｅｌｔａ、Ｎ＝Ｎｏｔｃｈ、ＮＯ＝Ｎｏｔｃｈシグナルなし。この図は、ショウジョウバエの腸上皮とヒトの腸上皮との間の完全な類似性を明瞭に示す。
【図１６】ショウジョウバエにおける腸の恒常性及び再生（中腸）を調節する逆制御機序（Jiang and Edgar, Exp. Cell. Res., 2011から抜粋）（図１５と同じ略称）。
【図１７】youthｓｎｏＲＮＡは、ＣＧ９３３９遺伝子（skywalker）の選択的スプライシングに関与している。比較ＲＴ−ＰＣＲを、いくつかの可能性ある標的遺伝子に行ない、Ｆ４突然変異体においてこれらの中のいくつかの遺伝子が野生型のハエ（対照−ＣＳ）と比較して正しくスプライシングされなかったかどうかを調べた。とりわけ、ＣＧ９３３９遺伝子（skywalker）の３４５−４００−４３２−４６２ｂｐの４つの転写物を分析した。ｒｐ４９遺伝子（３００ｂｐの断片）を内部対照、並びに、ＲＮＡを含む対照（事前の逆転写は全くない）として使用し、使用されるＲＮＡには痕跡量のＤＮＡも混入していないことを実証する。Ｆ４突然変異体にはＣＧ９３３９遺伝子（skywalker）の小さな３４５ｂｐの転写が存在しないことを注記する（矢印）。
【図１８】youthｓｎｏＲＮＡは、２つの他の遺伝子：klarsicht及びＣＧ３０５０２遺伝子（ｆａ２ｈ）のＲＮＡレベルの調節に関与している。Ａ）klarsichtでは、４６４ｂｐの断片（エキソンに含まれる）の増幅により、野生型の対照のハエ（Ｃａｎｔｏｎ−Ｓ）よりもＦ４突然変異体において転写された産物がより少ないことが示される。ｆａ２ｈでは、４２９ｂｐの断片（エキソンに含まれる）の増幅により、野生型の対照のハエ（Ｃａｎｔｏｎ−Ｓ）よりもＦ４突然変異体においてより転写が少ないことが示される。
【図１９】klarsichtの役割を記載したモデル。Ａ）klarsichtは、そのＫＡＳＨドメインを介して、核膜の内表面上に位置するラミナと相互作用する（Patterson et al., 2004による）。Ｂ）核ラミンの構造及び機能を示した図。ラミンは、核膜の内表面上に位置し、核の安定性を維持し、クロマチンを構成し、核膜孔（ＮＰＣ）に結合するように働く。ラミンと相互作用しているいくつかのタンパク質もまた図示されている（Coutinho et al., Immunity & Ageing, 2009による）。
【図２０】youthｓｎｏＲＮＡのオルソロガスな哺乳動物の配列が、マウス及びヒトにおいて発現されている（ＲＴ−ＰＣＲによるマウス及びヒトの相同体の検出）。これらのｓｎｏＲＮＡの発現は、それらが機能的である可能性が非常に高いことを示す。ヒトでは、１５９ｂｐのｓｎｏＲＮＡ（配列番号２）が腸及び脳において発現され、僅かに卵巣及び腎臓において発現されている（より正確には赤色のアステリスクで示されている）。マウスでは、１２９ｂｐのｓｎｏＲＮＡ−１（配列番号３）が脳にのみ発現されている。これに対し、１２２ｂｐのｓｎｏＲＮＡ−２（配列番号４）は腸、脳及び卵巣において発現され、腎臓には発現されていない。
【図２１】youthｓｎｏＲＮＡについて突然変異させたハエ（Ｆ４突然変異体）は、脂肪体の肥大を示す。４０日令の高齢のハエにおいて、そのそれぞれの対照（これも４０日令）と比較してその有意な変化が観察される。これらの病変は、アポトーシスを受けた細胞を標識する、活性化抗カスパーゼ−３抗体の標識によって示される。Ａ）「ＣＳ」対照のハエ。白い点線によって囲まれた脂肪体は僅かに均一かつ平らである。Ｂ）Ｆ４突然変異体のハエ：大きな細胞凝集物を認める（白い矢印）。Ｃ）ｓｎｏＲＮＡ導入遺伝子を有するハエ（Ｇ５）における：凝集物を含まない脂肪体は、「ＣＳ」対照の脂肪体と似ている。Ｄ）Ｆ４突然変異体の遺伝子バックグラウンドにＧ５導入遺伝子を含むハエでは（Ｆ４；Ｇ５）、これらのハエはいくつかの凝集物を示すのみであり、これらの凝集物はより小さく、このことは、導入遺伝子が突然変異に起因する脂肪体の病変を部分的にレスキューすることを示す。これらの結果は、炭水化物及び脂肪の代謝における崩壊を強く示唆する。
【０１１９】
実験部
１）Ｐ［ＧＡＬ４］４Ｃ遺伝子座に位置するｓｎｏＲＮＡ：Ψ２８Ｓ−１１５３（youth）の遺伝子的及び分子的特徴付け
この実験は、ショウジョウバエの自発運動行動に関与する神経基盤についての調査、及び中心複合体、特に楕円体の構造と機能との間の関係の研究の一部である。この文脈では、Ｐ［ＧＡＬ４］エンハンサートラップ系統のライブラリーのスクリーニングは、楕円体において特異的に発現されているＰ［ＧＡＬ４］４Ｃ系統の同定を可能とした（図１）。様々な遺伝子的アプローチ、特に破傷風毒素の標的化発現は、これらのニューロンの遮断が、自発運動活性に異常を発生することを示した（Martin et al., 2002）。第二の工程では、これらのニューロンを詳細にさらに特徴付け、かつ自発運動活性に関与する神経ネットワーク内のその機能をより良く決定するために、Ｐ［ＧＡＬ４］４Ｃ系統の挿入遺伝子座を遺伝子的にかつ分子的に特徴付けた。ＰＣＲによるレスキューが行なわれ、２Ｒ染色体（右：すなわち、右アーム上）の５０Ａ位の２つの遺伝子：ＣＧ１３３３３とＣＧ１３３３４との間にＰ［ＧＡＬ４］４ＣのＰ因子の挿入点を示すことを可能とした（図１）。次いで、これらの２つの遺伝子のそれぞれの表現型及び機能を示すことができるように、Ｐ因子を再度切り出すことによって（ジャンプアウト又は復帰突然変異と呼ばれる遺伝子的アプローチによって）それらの中に突然変異を作成した。このようにして、Ｆ４と命名された６３２塩基対（ｂｐ）の小さな欠失が得られた（図１）。
【０１２０】
Huang et al.（2005）によって行なわれたショウジョウバエゲノムの全ての可能性ある核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）の系統的スクリーニングの一部として、この遺伝子座の６７３３１位にｓｎｏＲＮＡ：Ψ２８Ｓ−１１５３が同定された（図１）。しかし、対応する論文は、特定のｓｎｏＲＮＡを全く区別せず、ｓｎｏＲＮＡ：Ψ２８Ｓ−１１５３と機能とを全く結び付けていない。本発明の文脈では、このｓｎｏＲＮＡは、小さなＦ４の欠失がないので、正確に正しく配置され、構造的かつ機能的に特徴付けられた。したがって、このｓｎｏＲＮＡは１４８塩基対（ｂｐ）からなり、その構造はＨ／ＡＣＡボックスを含む。
【０１２１】
２）Ｆ４欠失の表現型の特徴付け：寿命の縮み
Ｐ［ＧＡＬ４］４Ｃ系統の標識されたリング状のニューロンにおける破傷風毒素の標的化発現を介してハエの自発運動活性を定量するために研究が実施されたのと同時に、本発明者らは、これらのハエが非常に短い寿命を有することを観察し、Ｐ［ＧＡＬ４］４Ｃ／ＵＡＳ−破傷風毒素のハエ並びにＦ４のハエ（４Ｃ遺伝子座において突然変異）の該寿命を正確に定量することを決定した。したがって、Ｆ４のハエは短い寿命を有し（野生型の対照ハエと比較して約３０％）、このことはｓｎｏＲＮＡの欠失が寿命（生涯期間）に影響を及ぼす可能性があることを示唆する（図３）。本発明者らはまた、この効果が、ハエの性別に応じて異なり、効果は、雄よりも雌においてはるかにより顕著であることを観察した。
【０１２２】
３）野生型表現型を回復（「レスキュー」）する目的のためのｓｎｏＲＮＡ（youth）のゲノム領域を含有するトランスジェニック系統の生成
Ｆ４突然変異体の表現型が実際に、ｓｎｏＲＮＡの欠失に起因するかを実証するために、ｓｎｏＲＮＡ（図１）及びその調節配列を含む１７２３ｂｐの領域のゲノムＤＮＡ配列（６６３７７〜６８１００）を有するトランスジェニックショウジョウバエの系統を作製した。より正確には、１７２３ｂｐの領域からのゲノム断片をＰＣＲによって増幅し、Ｘｂａ１制限酵素部位を介してｐＣａＳｐｅｒ−４ベクター（このベクターは全くプロモーター配列／調節配列を含有していない）に挿入した。次いで、トランスジェニックハエを標準的な技術に従って作製し、同導入遺伝子を発現しているがゲノムの別の場所に挿入されたハエの系統を得た（独立した挿入；Ｇ４、Ｇ５）。
【０１２３】
次に、導入遺伝子が機能的であり、Ｆ４突然変異をレスキューできる（すなわち、野生型表現型を回復できる、すなわち、Ｆ４が欠失していないものに観察されたのと等価な寿命を回復できる）かを検証するために、本発明者らは標準的な遺伝子交配（Ｆ４；Ｇ４及びＦ４；Ｇ５）によってこれらのトランスジェニック系統をＦ４遺伝子突然変異体に導入した。このようにして、導入遺伝子は、寿命の縮みの原因である突然変異に起因する表現型をレスキューすることができたことが実証できた（図３）（例えば：Ｆ４対Ｆ４；Ｇ５を参照）。さらに、野生型ゲノム（正常）に配置されたこの導入遺伝子（このｓｎｏＲＮＡの過剰発現に相当する。なぜなら、ｓｎｏＲＮＡの２つの内因性コピーではなく、ここでは４つのコピーが存在するからである）（Ｇ５）は寿命を延ばす（Ｆ４；Ｇ５の場合には寿命を倍加さえさせるか、又はＧ５については約３０％延ばす）（図３）。したがって、この実験は、動物の寿命は、このｓｎｏＲＮＡを過剰発現させることによって（又はその発現レベルを改変することによって）延ばすことができることを明瞭に示す。要約すると、この遺伝子の突然変異に相当する又はこれに等価である、領域内の小規模のゲノムの欠失は（６３２塩基対、Ｆ４と呼ばれる）（図１）は、寿命を縮め、一方、遺伝子療法による（このｓｎｏＲＮＡのゲノムＤＮＡを含有する導入遺伝子を介しての）過剰発現は、同突然変異をレスキューするだけでなく、処置される対象の寿命を劇的に延ばす（倍化させる）（図３）。
【０１２４】
４）ストレス抵抗性試験
生涯期間に対して作用する遺伝子は一般的にストレスに対する抵抗性を高めることが現在一般的に認められている。本発明者らは、このｓｎｏＲＮＡの過剰発現が、飢餓、熱ショック、及び（パラコートによって誘発される）酸化ストレスなどのストレス条件下に関わる対象の寿命を効果的に延ばすことができるかを検証し、その確証を得た（図４）。
【０１２５】
Ａ）熱抵抗性試験（熱ショック試験）
雄及び雌を、食物を含有する標準的なチューブにおいて３日間一緒に飼育する。３日令の時に、雄と雌とを、食物を含有する標準的なチューブに２０匹ずつのグループに別々に分配する。ハエを熱ショックにかけるために、ハエを含有するチューブを３６℃のインキュベーター中に入れる。死滅したハエの数を６時間毎に計数する。図４Ａの熱ショック（３６℃）では、Ｆ４突然変異体のハエ（雌のみ）は対照のハエよりも抵抗性が高いことを注記する。しかし、Ｇ５のハエ（雄及び雌）は対照及びＦ４突然変異体よりも抵抗性が高く、一方、Ｆ４突然変異体におけるＧ５導入遺伝子の発現の結果として（Ｆ４；Ｇ５ハエ）、これらのハエもまた、対照のハエ及びＦ４突然変異体のハエよりもはるかに抵抗性が高い。
【０１２６】
Ｂ）飢餓試験
熱抵抗性試験と同様に、雄及び雌を、食物を含有する標準的なチューブで３日間一緒に飼育する。３日令の時に、雄と雌とを、ろ紙と乾燥を防ぐための水 ４００μLとを含有するチューブに、２０匹ずつのグループに別々に分配する。ハエを２４℃の加湿部屋で飼い、死滅したハエの数を６時間毎に計数する。図４Ｂの飢餓では、Ｆ４突然変異体のハエ（雄及び雌）は対照のハエよりも抵抗性が高いことを注記する。さらに、Ｇ５のハエ（雌）はさらにより抵抗性が高く、一方、Ｆ４突然変異体における導入遺伝子の発現（Ｆ４；Ｇ５）は正常な生存期間を回復する（雌において）。
【０１２７】
Ｃ）酸化ストレス（パラコート）に対する抵抗性
パラコート（１，１’−ジメチル−４，４’−ビピリジニウムジクロリド）はＮＡＤＨを還元し、次いで安定なパラコートラジカルを生成し、次いで酸素と反応してＲＯＳ（活性酸素種）を生成する。結果として、ＲＯＳは細胞傷害を引き起こす（Rzezniczak et al., 2011）。以前の試験と同様に、雄及び雌を、食物を含有する標準的なチューブで３日間一緒に飼育する。３日令の時に、雄及び雌を、空の標準的なチューブに、２０匹ずつのグループに別々に分配し、それらを６時間飢餓状態にする。次に、ハエを、ろ紙と食物摂取を促進するための１％ショ糖に希釈された２０mMパラコート４５０μlとを含有するチューブに移す。ハエを２４℃の加湿部屋で飼い、死滅したハエの数を６時間毎に計数する。
【０１２８】
図４Ｃの酸化ストレスでは、Ｆ４突然変異体のハエ（雌のみであるが、雄についても強い傾向がある）は、対照のハエよりも抵抗性が高いことを注記する。同様に、雌Ｇ５ハエは、対照よりも抵抗性が高く、Ｆ４突然変異体と類似し、一方、Ｆ４突然変異体における導入遺伝子の発現（Ｆ４；Ｇ５）は、ハエの生存期間を回復させる（対照のハエと等価）。
【０１２９】
要約すると、Ｆ４突然変異体のハエは、対照のハエよりも抵抗性が高く、一方、過剰発現（Ｇ５）はさらにこの抵抗性を高める（効果は、雄よりも雌においてより顕著でありかつ一貫している）。さらに、両方の試験（飢餓及び酸化ストレス）において、Ｆ４突然変異体における導入遺伝子の発現（Ｆ４；Ｇ５）は、ハエの生存期間を、特に雌における生存期間を回復させる。したがって、Ｆ４突然変異が寿命を縮めるという生涯期間とは対照的に、Ｆ４突然変異は、幼若な３日令のハエにおいて行われた３回のストレス試験において抵抗性を高め、この効果は、ｓｎｏＲＮＡのゲノム導入遺伝子によって回復させることができる（２回の試験において）。結論すると、「youth」ｓｎｏＲＮＡの発現の調節（抑制、低減、又は増加）は、試験される対象の寿命を変化させる。
【０１３０】
５）ｓｎｏＲＮＡの空間−時間の発現プロファイルの決定（インサイツハイブリダイゼーション）
関心対象のｓｎｏＲＮＡがどのような細胞及び／又は組織において発現され作用するかを決定するために、このｓｎｏＲＮＡの空間−時間の発現プロファイルを本発明の文脈において、成体ハエにおいてインサイツハイブリダイゼーション（ＨＩＳ）によって抗センス鎖ｓｎｏＲＮＡを使用して決定した。チラミドを使用して標識を増幅させた。雄及び雌の両方において、youthｓｎｏＲＮＡは腸壁（上皮）において発現されているが（図５Ａ）、一方、予想された通り、Ｆ４突然変異体には存在しない（図５Ｂ）。より具体的には、腸の様々な細胞型に特異的なＰ［Ｇａｌ４］系統を二重標識と組み合わせて使用することにより、youthｓｎｏＲＮＡは腸細胞（主な細胞及び大半の細胞は腸上皮を形成している）の核小体に特異的に発現され（図６Ａ）、一方、他の細胞型には発現されていないことが実証された（図６Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ）。さらに、雌では、それはまた卵巣にも、より特定するとナース細胞にも発現されている（図５Ｃ及び５Ｄ）。
【０１３１】
６）腸上皮以外の細胞型におけるｓｎｏＲＮＡの標的化発現
３つの他の明確に異なるＧａｌ４ドライバー系統の使用を介した腸上皮以外の細胞型におけるｓｎｏＲＮＡ（ＵＡＳ−８Ｍ）の標的化発現（異所性）が行なわれた：ｅｓｇ−Ｇａｌ４（ｅｓｇ−Ｇａｌ４、Ｆ４／Ｆ４；ＵＡＳ−８Ｍ／＋）及びＤｅｌｔａ−Ｇａｌ４（Ｄｅｌｔａ−Ｇａｌ４、Ｆ４／Ｆ４；ＵＡＳ−８Ｍ／＋）は腸幹細胞（ＩＳＣ）を標的化し、一方、Ｓｕ（Ｈ）−Ｇａｌ４（Ｓｕ（Ｈ）−ＧＢＥ−Ｇａｌ４、Ｆ４／Ｆ４；ＵＡＳ−８Ｍ／＋）は腸芽細胞を標的化する（図７）。これらの結果は、１）ｓｎｏＲＮＡが他の細胞型において異所的に発現され得、２）この異所性発現はまた、特定のストレスに対する抵抗性を高めることを実証する（図８）。要約すると、これらの結果は、ｓｎｏＲＮＡがまた、それが腸上皮以外の細胞型において発現される場合にも保護を付与することができることを示す。
【０１３２】
７）ストレスに対する抵抗性のレスキューをもたらす、ｓｎｏＲＮＡの標的化（選択的）発現
本発明者らは、２つの独立したアプローチによって、腸細胞における標的化発現が、ストレス抵抗性表現型を回復させるのに十分であることを実証した。ゲノムトランスジェニック系統（生涯期間を増加させる系統：Ｇ５、同様に、別の独立した挿入（Ｇ４））から行なわれたインサイツハイブリダイゼーション技術によって、ｓｎｏＲＮＡが腸細胞において発現され、生涯期間の調節のためには腸細胞におけるｓｎｏＲＮＡの発現が十分であることを実証することができた。
【０１３３】
この最初の結果を確認するために、腸細胞内のみのｓｎｏＲＮＡを、Ｐ［Ｇａｌ４］バイナリー発現系を使用することによって標的化させた。関心対象のｓｎｏＲＮＡ（僅か１４８ｂｐ）がＧａｌ４の調節配列（上流活性化配列：ＵＡＳ）の制御下に配置されているプラスミドベクター（ｐ［ＵＡＳ−ｓｎｏＲＮＡ］）を構築した。次いで、トランスジェニックハエ系統（ＵＡＳ−ｓｎｏＲＮＡ：４Ｍ、５Ｍ及び８Ｍ）を作製した。標的化発現のために、特に腸細胞において発現することが知られている、導入遺伝子（ｐＣｈｓ−Ｇａｌ４）を含有しているトランスジェニックハエのいわゆる「ドライバー」系統（プラスミドベクター株Ｍｙｏ１Ａ−Ｇａｌ４、ｅｓｇ−Ｇａｌ４（ｅｓｃａｒｇｏｔ−Ｇａｌ４）、Ｓｕ（Ｈ）ＧＢＥ−Ｇａｌ４、及びＤｌ−Ｇａｌ４（Ｄｅｌｔａ−Ｇａｌ４））を使用した（Jiang and Edgar, 2011; Takashima et al., 2011）。次に、これらの様々な導入遺伝子を、Ｆ４突然変異体の遺伝子バックグラウンドに配置し、インサイツハイブリダイゼーションによって、ｓｎｏＲＮＡが、その標的化発現後にこれらの様々な種類の腸細胞において（図６及び７）実際に発現されることが実証された（ｅｓｇ−Ｇａｌ４、Ｆ４／Ｆ４；ＵＡＳ−ｓｎｏＲＮＡ−８Ｍ）（Ｍｙｏ１Ａ−Ｇａｌ４、Ｆ４／Ｆ４；ＵＡＳ−ｓｎｏＲＮＡ−８Ｍ）（Ｓｕ（Ｈ）−ＧＢＥ−Ｇａｌ４、Ｆ４／Ｆ４；ＵＡＳ−ｓｎｏＲＮＡ−８Ｍ）（Ｆ４／Ｆ４；Ｄｅｌｔａ−Ｇａｌ４／ＵＡＳ−ｓｎｏＲＮＡ−８Ｍ）。結果は、この標的化発現（Ｆ突然変異体における）がストレス抵抗性表現型（飢餓及び熱ショック）を実質的に回復させることを示す（図８）。
【０１３４】
これらの実験は、腸（intestinal）細胞、より特定すると腸細胞（enterocyte）においてこれらのｓｎｏＲＮＡを操作することが、ストレスに対する抵抗性を回復するのに必要とされかつ十分であることを明瞭に示す。これらの実験は、ショウジョウバエで実施されたけれども、腸の上皮細胞におけるｓｎｏＲＮＡの再発現（発現の回復又はレスキュー）又は過剰発現が、哺乳動物、特にヒトにおける寿命の延長をもたらすことができることを示唆することを可能とする。
【０１３５】
８）他の種のショウジョウバエ、並びに哺乳動物、例えばマウス及びヒトにおける、youth配列の相同体の同定
配列相同性の探索は、これらのｓｎｏＲＮＡがまた、ゲノムが入手可能である１１個の他の種のショウジョウバエにも存在することを示した（図９Ａ）（１２個の種のショウジョウバエの共通構造も参照：図９Ｂ）。
【０１３６】
さらに、相同性の探索、特にＲＮＡ構造を介しての相同性の探索（ＩＮＦＥＲＮＡＬソフトウェアを使用して）は、第１１染色体の１２８２２７２２位〜１２８２２８１１位に位置するヒトの相同体の同定を可能とした（図１０）。マウスでも、２つの相同体が同定されている：第１５染色体の３０３３６８８９位〜３０３３７０１７位；及び第１８染色体の６４９５０１２位〜６４９５０９１位（図１１Ａ及び１１Ｂ）。
【０１３７】
ショウジョウバエと同様に、この遺伝子及び／又は合成類似体の過剰発現（遺伝子的に又は経口投与若しくは注射によって）が、ヒトの寿命を延ばすであろう確率は非常に高い。このような発現はまた、様々な変性疾患の有害な作用から保護することもできる。
【０１３８】
９）神経変性及び神経保護におけるｓｎｏＲＮＡの役割
Ｆ４ハエは非常に短い寿命を有し、一方、ｓｎｏＲＮＡを過剰発現しているハエ（Ｇ５）はより長く生きるので、あらゆる神経変性病変（脳に存在するより大きなサイズ又はより小さなサイズのより多くの又はより少ない穴）の存在について確認するために老齢なハエ（４０日令）を研究した。全体的に、対照ハエ（Ｃａｎｔｏｎ−Ｓ）では、ハエの約６０％が病変を呈する（しかし、ＣＳハエの５０％はすでに４０日目に死滅している）（図１２）［さらなる詳細については、半定量分析についての図１２ｄを参照］。Ｆ４突然変異体では、全てのハエ（１００％）が病変を有し、それらは一般的に対照よりもより重度であるが（穴のサイズ及び数）、Ｆ４；Ｇ５のハエは、有意により少ない穴を有し（ハエの僅か約１０％）、これらの穴はまたより小さなサイズである。最終的にＧ５のハエでは、ＣＳ対照とほぼ同じ比率のハエが病変を呈するが（約４０％）、これらの病変は明らかにより重度が低い（図１２ｄ）。要約すると、ゲノム導入遺伝子（Ｆ４；Ｇ５）は部分的に神経変性表現型をレスキューするが、ｓｎｏＲＮＡの過剰発現（Ｇ５）は神経変性から保護する。
【０１３９】
１０）感覚運動パラメーターの防御におけるｓｎｏＲＮＡの役割
同様に、ｓｎｏＲＮＡによって与えられた神経保護が、感覚運動パラメーターなどの生理学的パラメーターに対して効果を及ぼすかどうかを確認するために、４０日令よりも老齢なハエの自発運動活性を定量し（ビデオでの追跡によって）（Martin, 2004）、４日令の幼若なハエと比較した（図１３）。まず、４日令のハエと４０日令のハエとの間に巨大な差が観察され；４０日令のハエは４日令のハエが移動した距離の３分の１しか移動しない。しかし、老齢な４０日令のハエでは、ｓｎｏＲＮＡを過剰発現するハエ（Ｇ５）は対照のハエ（Ｃａｎｔｏｎ−Ｓ）、Ｆ４突然変異体、及び遺伝子突然変異体バックグラウンドにおいてｓｎｏＲＮＡを発現しているハエ（Ｆ４；Ｇ５）よりも長い距離を歩く。この効果は、雌よりも雄においてより認められる。要約すると、老齢な４０日令のハエでは、本発明者らは、ｓｎｏＲＮＡを過剰発現しているハエは、対照のハエよりも良好な感覚運動成績を有することを認める。これらの結果は、老化の機序に関連した有害な作用に対するｓｎｏＲＮＡの保護性質を実証する。
【０１４０】
１１）卵巣におけるｓｎｏＲＮＡの機能の試験：受精能（生殖）における役割
雌では、ｓｎｏＲＮＡは、卵巣及びより正確にはナース細胞においても発現されている（図５Ｃ、Ｄ）。本発明者らはまた、突然変異体のハエ（Ｆ４）が、受精能の変化も有することを示した（生殖能の表現型）。Ｆ４突然変異体は、対照のハエ（ＣＳ）よりもいくつかより多くの卵を産む（図１４）。突然変異体の遺伝子バックグラウンドにｓｎｏＲＮＡを有するハエ（Ｆ４；Ｇ４）は多くのより少ない卵を産むが（受精能の低下）、ｓｎｏＲＮＡを過剰発現しているハエ（Ｇ４）は対照のハエよりもより多くの卵を産む（図１４）。これらの結果は、卵巣においてｓｎｏＲＮＡによって発揮された重要な効果、及び雌の受精能に対するその影響を紛れもなく実証する。
【０１４１】
１２）ｓｎｏＲＮＡを用いての処置（経口経路又は注射による投与）
ｓｎｏＲＮＡは、経口で（per os）又は注射によって投与され得る。他の投与経路、例えば吸入及び局所／皮膚適用も、使用されるベクターの種類に依存して使用され得る。
【０１４２】
本発明の一部として行なわれた実験が示すように、ｓｎｏＲＮＡの経口投与は、その安定性及びインビトロでの抵抗性、並びに腸壁の細胞（腸芽細胞、腸細胞、ＩＳＣ）に対して局所的に作用するその能力があれば可能である。以前に説明されているように、それ故、関心対象のｓｎｏＲＮＡの投与は、さもなくば存在しないであろう発現を可能とすることができるか（又は換言すれば、既存の突然変異をレスキューできるか）、又は、必要であれば、より良好なホルモン平衡及び代謝平衡を維持しつつ腸壁を傷害から保護するために過剰発現を可能とすることができる。
【０１４３】
１３）癌の処置
哺乳動物及びショウジョウバエの両方において、ｄｅｌｔａ／ｎｏｔｃｈ遺伝子が腸（intestine、gut）前駆細胞の分化を調節し、一方、Ｗｎｔシグナル伝達経路はＩＳＣの維持及び増殖に関与することが示された。同様に、サイトカインシグナル伝達経路（Ｕｐｄ／Ｊａｋ／Ｓｔａｔ）及びＥＧＦＲ（上皮増殖因子受容体）経路は、ＩＳＣの増殖を調節する（図１５〜１６）（Jiang and Edgar, 2011; Takashima et al., 2011）。
【０１４４】
本発明者らの実験は、本発明に記載の関心対象のｓｎｏＲＮＡが、特定の遺伝子、例えばｎｏｔｃｈ、ｄｅｌｔａ、ＪＮＫ、ＥＧＦＲなど（図１５）を調節することができることを示し、該遺伝子の調節不全により、腸上皮の過増殖がもたらされ、それ故、癌がもたらされる可能性がある（Jiang and Edgar, 2011; Takashima et al., 2011）。本発明の関心対象のｓｎｏＲＮＡは特に、ＥＧＦＲの発現を調節できるその能力を通して、癌を予防又は治療することができ、ショウジョウバエ及び哺乳動物の腸におけるＩＳＣの増殖の調節におけるＥＧＦＲシグナル伝達経路は、事実、特によく保存されている（図１６）［２つの抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体（セツキシマブ及びパニツムマブ）をはじめとする、いくつかの治療法が、現在、大腸癌の処置のための臨床試験中である（Amado et al., 2008; Di Nicolantonio et al, 2008）］。
【０１４５】
１４）ヒトにおける早老及び促進老化からなる、早老症としても知られる、ハッチンソン−ギルフォード症候群（ＨＧＰＳ）への関心対象のｓｎｏＲＮＡ（「youth」）の関与
本発明者らは、youthｓｎｏＲＮＡが、klarsicht遺伝子のスプライシング（スプライシングされたＲＮＡの量）を調節することを実証した（図１８Ａ）。この遺伝子は、核の内膜に位置するタンパク質であるラミナ（Patterson et al., 2004）と相互作用し、早老症（ヒトにおいて早老及び促進老化を引き起こす疾病）に関与することが示された（図１８Ｂ）。早老症は、８００万人中１人の個体が患う稀な疾病である（Scaffidi and Misteli, 2006; Broers et al., 2006; Cohen et al., 2001; Cau et al., 2014; Coutinho et al., 2009）。youth ｓｎｏＲＮＡは、その表現型（生涯期間に関与）及びklarsicht遺伝子の調節におけるその関与を通して、ラミノパチー、例えばハッチンソン−ギルフォード症候群又は早老症、下顎骨異形成（ＭＡＤ）、エメリー・ドレイフス型筋ジストロフィー、非定型ウェルナー症候群、拘束性皮膚障害、致命的な胎児アキネジア、ＬＩＲＬＬＣ（全身性脂肪萎縮症、インスリン抵抗性糖尿病、白斑黒皮症の丘疹、脂肪肝、及び肥大性心筋症（Hutchison, 2002; Broers et al, 2006）、特にハッチンソン−ギルフォード症候群（早老症）の処置のための新たな展望を提供する。
【０１４６】
１５）脂肪酸２−ヒドロキシラーゼ（ｆａ２ｈ）遺伝子スプライシングの調節、及び結果として、この遺伝子に関連した様々な形態の神経変性の調節への、関心対象のｓｎｏＲＮＡ（「youth」）の関与
本発明者らは、youth ｓｎｏＲＮＡが、脂肪酸２−ヒドロキシラーゼ（ｆａ２ｈ）をコードするＣＧ３０５０２遺伝子のスプライシング（スプライシングされたＲＮＡの量）を調節することを実証した（図１８Ｂ）。この遺伝子は、脂肪酸の生合成過程、より特定すると、複合脂質、例えばスフィンゴ脂質及びセラミドの代謝過程に関与している（Carvalho et al., 2010）。ヒトでは、このｆａ２ｈは、様々な形態の神経変性（脱髄）、例えば脳内での鉄の蓄積に関連した神経変性、特定の白質ジストロフィー、及び最終的には遺伝性痙性対麻痺（ＳＰＧ３５）などに関連している（Kruer et al., 2010; Pierson et al., 2012; Schneider and Bhatia, 2010）。その表現型（Ｆ４突然変異体に観察された生涯期間及び／又は脂肪体肥大に関与）及びｆａ２ｈ遺伝子の調節におけるその関与に因り、youth ｓｎｏＲＮＡは、上記の神経変性疾患の処置のための新たな展望を与える。
【０１４７】
１６）腸と脳との間の代謝的及び神経内分泌的関係（脳腸軸）
以前に記載されているように、ｓｎｏＲＮＡ突然変異体（Ｆ４）は脂肪体肥大を呈し、腹部及び頭蓋内の脳の周辺の両方で見られる（図２１）。さらに、トリグリセリドの定量により、この肥大症が確認された（したがって、ハエの「肥満」資格認定因子）。この表現型は、腸内でのｓｎｏＲＮＡの発現と、神経変性病変と、延長した寿命との間の代謝的及び／又は神経内分泌的な関係を示唆する。より具体的には、この代謝の破壊は、インスリンシグナル伝達経路の関与を示唆し、この経路は、ショウジョウバエの生涯期間に関与しているとして何回も記載されている（Tatar et al., 2001; Bai et al., 2012; Partridge et al., 2011; Fontana et al., 2010)）。活性化抗カスパーゼ−３抗体に対して指向される免疫組織化学的マーカーにより、成体ショウジョウバエにおいて、Ｆ４突然変異体では脳の境界付近に位置する脂肪が大きく破壊されている（すなわち肥大している）が、これはｓｎｏＲＮＡの過剰発現（導入遺伝子Ｇ５）によって保護され、並びにレスキュー（発現の回復）（Ｆ４；Ｇ５）において保護されていることが示された（図２１）。これらの結果は、ｓｎｏＲＮＡが、該ｓｎｏＲＮＡを発現する生物を脂肪体の変化から保護し、それ故、肥満から伸張によって保護することを実証する。さらに、インスリン受容体（ＩｎＲ）突然変異とＦ４突然変異体とを含む遺伝子相互作用実験（二重突然変異体）は、ｓｎｏＲＮＡの突然変異が、インスリン受容体の突然変異の表現型を少なくとも部分的にレスキューすることができることを示す（図２１及びその見出しを参照）。これらの結果は、インスリンシグナル伝達経路と、ｓｎｏＲＮＡと、生涯期間との間の連鎖（直接的であれ間接的であれ）の存在を示す。前の結果は、ｓｎｏＲＮＡの突然変異及び／又は調節不全が、炭水化物及び脂質の代謝を破壊することを示す。それ故、youth ｓｎｏＲＮＡは、糖尿病及び肥満の両方を処置するための新たな展望を与える。
【０１４８】
１７）ヒト及びマウスにおける関心のｓｎｏＲＮＡ（「youth」）の発現
ＲＴ−ＰＣＲアプローチによって、本発明者らは、哺乳動物において具体的に発現されたyouth ｓｎｏＲＮＡ（ショウジョウバエにおいて初めて同定された）に対する相同的配列、より正確にはオルソロガスな配列の存在を実証した（図２０）。ヒトでは、１５９ｂｐのｓｎｏＲＮＡ（配列番号２）が腸及び脳において発現され、僅かに卵巣及び腎臓において発現されている。マウスでは、１２９ｂｐのｓｎｏＲＮＡ−１（配列番号３）は脳にしか発現されておらず、１２２ｂｐのｓｎｏＲＮＡ−２（配列番号４）は、腸、脳、及び卵巣において発現されているが、腎臓には発現されていない。これらのデータは、これらのｓｎｏＲＮＡの発現がヒト及びマウスの両方において機能的である可能性が非常に高いことを支持する。
【０１４９】
参考文献
【表２】
2020010707.tif 000006
2020010707.tif 000007
2020010707.tif 000008
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
2020010707.tif 000037
【図２１】
2020010707.tif 000038
【配列表】
2020010707000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年10月17日(2019.10.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載の発明。
【外国語明細書】
2020010707000001.pdf