(57)【要約】      （修正有）【課題】ＴＡＬＥＮを使用した、高等動物、たとえばブタ（ｓｗｉｎｅ）または雌ウシの遺伝子改変方法を提供する。【解決手段】第１の家畜動物の品種または系統から第２の家畜動物の品種または系統へのアレルの移入方法であって、第１の家畜動物の品種または系統のアレルをコードし、相同性依存型修復の鋳型となる核酸の存在下で、第２の家畜動物の品種または系統の細胞または胚にＴＡＬＥＮを導入すること、ここでアレルは細胞または胚にコピーされ、ＴＡＬＥＮは、遺伝子改変された第２の家畜動物の品種または系統のアレルの部位に特異的に結合する；および、細胞または胚から、第２の品種または系統の動物を作成すること、を含む方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビトロ培養物中の初代細胞または胚を、ＴＡＬＥＮをコードする核酸に接触させることを含み、前記細胞は家畜の細胞であり、前記胚は家畜の胚である、遺伝子改変を行う方法。
【請求項２】
前記初代細胞は前記インビトロ培養物中で前記核酸に接触する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＴＡＬＥＮをコードする前記核酸はｍＲＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＴＡＬＥＮは、ｌｅｆｔ  ＴＡＬＥＮであり、前記ｌｅｆｔ  ＴＡＬＥＮと協同してＤＮＡの二重鎖切断を行うｒｉｇｈｔ  ＴＡＬＥＮをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
第２のベクターが、前記ＴＡＬＥＮをコードする前記核酸を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞または前記胚を、レポーターをコードするベクターに接触させることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
選択マーカーをコードするベクターをさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記レポーターは選択マーカーを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
その後の処理のため前記レポーターを発現する細胞または胚を選択することをさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞は、前記レポーターを発現しない細胞を前記培養物から除去することに基づき選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記レポーターは蛍光生体分子を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記胚は前記レポーターの発現に基づき選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞は前記レポーターの発現に基づき選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記ベクターはプラスミドを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１５】
前記ベクターは前記レポーターをコードするトランスポゾンを含み、前記トランスポゾンを認識するトランスポザーゼをコードするベクターをさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１６】
前記トランスポザーゼは、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ、Ｆｒｏｇ  Ｐｒｉｎｃｅ、Ｔｏｌ２、Ｍｉｎｏｓ、Ｈｓｍａｒ、ＰｌａｉｃｅおよびＰａｓｓｐｏｒｔからなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記レポーターを発現する細胞または胚を選択すること、および前記細胞または胚を使用して遺伝子改変動物を作製することをさらに含み、前記遺伝子改変は前記ＴＡＬＥＮにより特異的に結合されるＤＮＡ部位にある、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記動物を繁殖させること、および前記遺伝子改変を発現し、かつ外来性レポーターを含まない子孫を選択することをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記動物は前記改変のホモ接合性両アレルである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記培養物の前記細胞から遺伝子改変動物をクローニングすることをさらに含み、前記細胞は、前記ＴＡＬＥＮにより特異的に結合されるＤＮＡ部位に遺伝子改変を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞は、体細胞核移植またはクロマチン移植により前記動物をクローニングするために使用される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記遺伝子改変は、挿入、欠失、外来性核酸フラグメントの挿入、逆位、天然のアレルへの遺伝子変換、合成アレルへの遺伝子変換、および新規なアレルへの遺伝子変換からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記細胞または胚にリコンビナーゼを送達することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記リコンビナーゼはタンパク質、ｍＲＮＡとして、または前記リコンビナーゼをコードするベクターにより、送達される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記リコンビナーゼは核酸と組み合わさってフィラメントを形成し、前記核酸は相同性依存型修復の鋳型となる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記リコンビナーゼは、ＲｅｃＡ、ｒｅｃＡ８０３、ｕｖｓＸ、ｒｅｃＡミュータント、ｒｅｃＡ様リコンビナーゼ、Ｃｒｅリコンビナーゼ、Ｈｉｎリコンビナーゼ、ＲＡＤ５１、Ｔｒｅ、ＦＬＰ、ＲｕｖＣ、ＤＳＴ２、ＫＥＭ１  ＸＲＮ１、ＳＴＰａ／ＤＳＴ１およびＨＰＰ−１からなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記細胞は、家畜の細胞、偶蹄目動物の細胞、培養細胞、初代細胞、初代体細胞、接合体、始原生殖細胞または幹細胞および接合体からなる群から選択され、あるいは、前記胚は胚盤胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
ＴＡＬＥＮをコードする核酸フラグメント、および前記ＴＡＬＥＮにより特異的に結合されるＤＮＡ部位の遺伝子改変を含む細胞または胚であって、前記細胞は動物組織から単離された初代細胞を含み、前記細胞および前記胚は、偶蹄目の動物、ブタ（ｓｗｉｎｅ）、ウシ、魚、ウサギおよび家畜類からなる群から選択される、細胞または胚。
【請求項２９】
前記細胞を含み、前記初代細胞はインビトロ培養物中で前記核酸に接触する、請求項２８に記載の細胞または胚。
【請求項３０】
ＴＡＬＥＮをコードする前記核酸はｍＲＮＡを含む、請求項２８に記載の細胞または胚。
【請求項３１】
レポーターをコードするベクターをさらに含む、請求項２８に記載の細胞または胚。
【請求項３２】
選択マーカーをコードするベクターをさらに含む、請求項２８に記載の細胞または胚。
【請求項３３】
前記レポーターは選択マーカーを含む、請求項３１に記載の細胞または胚。
【請求項３４】
レポーターをコードするベクター、および前記ＴＡＬＥＮをコードするベクターをさらに含む、請求項２８に記載の細胞または胚。
【請求項３５】
トランスポザーゼをコードするベクターをさらに含み、前記レポーターおよび前記ＴＡＬＥＮはそれらのそれぞれのベクターによりコードされるトランスポゾンである、請求項３４に記載の細胞または胚。
【請求項３６】
前記胚を含み、前記胚は前記遺伝子改変のホモ接合性両アレルである、請求項２８に記載の細胞または胚。
【請求項３７】
外来性リコンビナーゼをさらに含む、請求項２８に記載の細胞または胚。
【請求項３８】
遺伝子改変家畜動物であって、挿入、欠失、外来性核酸フラグメントの挿入、逆位、天然のアレルへの遺伝子変換、合成アレルへの遺伝子変換、および新規なアレルへの遺伝子変換からなる群から選択される遺伝子改変を含み、前記動物は外来性レポーター遺伝子を含まない、遺伝子改変家畜動物。
【請求項３９】
雌ウシ、ブタ（ｓｗｉｎｅ）、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、家禽および魚からなる群から選択される、請求項３８に記載の家畜動物。
【請求項４０】
前記遺伝子改変は５００塩基対の欠失を含む欠失を含む、請求項３８に記載の家畜動物。
【請求項４１】
前記遺伝子改変は１メガ塩基対の欠失を含む欠失を含む、請求項３８に記載の家畜動物。
【請求項４２】
前記遺伝子改変は１メガベースの染色体ＤＮＡを含む逆位を含む、請求項３８に記載の家畜動物。
【請求項４３】
前記遺伝子改変は５００塩基対を含む逆位を含む、請求項３８に記載の家畜動物。
【請求項４４】
前記遺伝子改変は逆位を含み、前記逆位は遺伝形質をコードする、請求項３８に記載の家畜動物。
【請求項４５】
ベルジアンブルー（Ｂｅｌｇｉａｎ  Ｂｌｕｅ）ウシ（ｃａｔｔｌｅ）でないウシ系統の動物を含み、前記遺伝子改変はベルジアンブルー（Ｂｅｌｇｉａｎ  Ｂｌｕｅ）ウシ（ｃａｔｔｌｅ）に多く見られるミオスタチン欠失を含む、請求項３８に記載の家畜動物。
【請求項４６】
形質を選択すること、および家畜動物の創始体として使用される細胞または胚において前記形質をコードするＤＮＡの領域を反転させることを含む、家畜動物を遺伝子改変する方法。
【請求項４７】
前記逆位は１０００塩基対を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記逆位は１メガベースの染色体ＤＮＡを含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
前駆細胞または胚を第１のＤＮＡ部位で特異的に結合する第１のＴＡＬＥＮ、および第２のＤＮＡ部位で特異的に結合する第２のＴＡＬＥＮに接触させることを含み、前記部位の間の領域が欠失される、動物を遺伝子改変する方法。
【請求項５０】
前記第１のＴＡＬＥＮは第１のＴＡＬＥＮペアを含み、前記第２のＴＡＬＥＮは第２のＴＡＬＥＮペアを含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記前駆細胞を含み、前記前駆細胞の体細胞核移植またはクロマチン移植が前記動物を作製するために使用される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記ＴＡＬＥＮを前記前駆細胞に導入すること、およびレポーターを含むベクターをさらに導入すること、および前記レポーターが発現する場合に限り、前記動物の作製のため前記前駆細胞または胚を選択することを含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５３】
アレルを第１の家畜品種から第２の家畜品種に移す方法であって、
前記第１の家畜品種の前記アレルをコードする核酸の存在下でＴＡＬＥＮを前記第２の家畜品種の細胞または胚に導入することを含み、前記アレルは前記細胞または前記胚にコピーされ、さらに前記細胞または前記胚から前記第２の品種の動物を作製すること
を含む方法。
【請求項５４】
前記アレルはベルジアンブルー（Ｂｅｌｇｉａｎ  Ｂｌｕｅ）ウシ（ｃａｔｔｌｅ）に存在するミオスタチンアレルを含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記ＴＡＬＥＮはｍＲＮＡまたはベクターによりコードされる、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
前記ＴＡＬＥＮはｒｉｇｈｔ  ＴＡＬＥＮであり、ｌｅｆｔ  ＴＡＬＥＮをさらに含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５７】
前記ＴＡＬＥＮと独立にレポーターベクターを導入することをさらに含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５８】
前記アレルは前記第１の家畜品種の形質に連鎖する、請求項５３に記載の方法。
【請求項５９】
前記細胞または胚にリコンビナーゼを送達することをさらに含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項６０】
前記リコンビナーゼはタンパク質、ｍＲＮＡとして、または前記リコンビナーゼをコードするベクターにより、送達される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記リコンビナーゼは前記核酸と組み合わさってフィラメントを形成する、請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
第２の品種の家畜動物のアレルを含む第１の品種の家畜動物
を含み、
前記第１の品種の家畜動物は前記第２の品種の動物との減数分裂組換えを含まない遺伝子改変家畜動物。
【請求項６３】
前記動物は、ブタ（ｓｗｉｎｅ）、雌ウシ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ウサギおよび魚からなる群から選択される、請求項６２に記載の動物。
【請求項６４】
前記第１の品種は和牛（Ｗａｇｙｕ  ｃａｔｔｌｅ）であり、前記第２の品種はベルジアンブルー（Ｂｅｌｇｉａｎ  Ｂｌｕｅ）ウシ（ｃａｔｔｌｅ）である、請求項６２に記載の動物。
【請求項６５】
前記アレルは挿入、欠失、多型および一塩基多型からなる群から選択される、請求項６２に記載の動物。
【請求項６６】
前記動物は外来性マーカー遺伝子を含まない、請求項６２に記載の動物。
【請求項６７】
複数の前記アレルを含む、請求項６２に記載の動物。
【請求項６８】
前記アレルは前記第２の品種の量的形質または質的形質に連鎖する、請求項６２に記載の動物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本特許は、すべての目的のために本明細書に援用する、２０１１年２月２５日に出願された米国特許出願第６１／４４６，６５１号明細書に対する優先権を主張する。
【０００２】
連邦政府支援による研究または開発に関する陳述
本発明は、米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）が交付する補助金番号１Ｒ４１ＨＬ１０８４４０−０１「アテローム性動脈硬化症の遺伝的モデルブタの開発（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｏｒｃｉｎｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）」よる政府支援を受けてなされた。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
本技術分野は、遺伝子改変動物、たとえば、機能形質を有する家畜動物の作製に関する。
【背景技術】
【０００４】
転写活性化因子様（ＴＡＬ：ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｌｉｋｅ）エフェクター配列は、可変領域２アミノ酸残基（ＲＶＤ：ｒｅｐｅａｔ  ｖａｒｉａｂｌｅ−ｄｉｒｅｓｉｄｕｅ）の配列を構築することにより、ＤＮＡ標的に特異的に結合するように構築することができる。ＴＡＬエフェクターとヌクレアーゼとの融合タンパク質（ＴＡＬＥＮ）は、細胞ＤＮＡの標的二重鎖切断を行うことが可能であり、これを用いて細胞に特異的遺伝子改変を行うことができる。ＴＡＬＥＮについては、安定に改変されたヒト胚性幹細胞および誘導多能性幹細胞クローンを作製し、ノックアウトＣ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）およびノックアウトゼブラフィッシュを作製するのに有用であると報告されている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクター（ＴＡＬＥ）とヌクレアーゼとの融合体（ＴＡＬＥＮ）は、細胞の遺伝子改変に使用できると報告されている。こうした報告は一般に、植物細胞、形質転換（不死化）動物細胞系、またはマウス胚性幹細胞に着目してきた。図１は、ＴＡＬＥＮに基づく遺伝子工学系の特徴の一部を図示する。
【０００６】
本明細書に記載した一実施形態は、遺伝子改変を行う方法であって、インビトロ培養物中の初代細胞または胚を、ＴＡＬＥＮをコードする核酸に接触させることを含み、細胞は家畜の細胞であり、胚は家畜の胚である方法である。本方法は、初代細胞を核酸にインビトロ培養物において接触させることを含んでもよい。ＴＡＬＥＮをコードする核酸は、ｍＲＮＡを含んでもよい。ＴＡＬＥＮはｌｅｆｔ  ＴＡＬＥＮであってもよく、本方法は、ｌｅｆｔ  ＴＡＬＥＮと協同してＤＮＡの二重鎖切断を行うｒｉｇｈｔ  ＴＡＬＥＮをさらに含んでもよい。第２のベクターは、ＴＡＬＥＮをコードする核酸を含んでもよい。本方法は、細胞または胚を、レポーターをコードするベクターに接触させることをさらに含んでもよい。本方法は、選択マーカーをコードするベクターを含んでもよい。レポーターは、選択マーカーを含んでもよい。レポーターは、発現されるトランスポザーゼにより行われる転位現象を要求してもよい。本方法は、その後の処理のためレポーターを発現する細胞または胚を選択することを含んでもよい。本方法では、細胞は、レポーターを発現しない細胞を培養物から除去することに基づき選択されてもよい。本方法では、レポーターは、蛍光生体分子を含んでもよい。本方法では、胚は、レポーターの発現に基づき選択されてもよい。本方法では、細胞は、レポーターの発現に基づき選択されてもよい。本方法では、ベクターはプラスミドを含んでもよい。本方法では、ベクターは、レポーターをコードするトランスポゾンを含み、トランスポゾンを認識するトランスポザーゼをコードするベクターをさらに含んでもよい。本方法では、トランスポザーゼは、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ、Ｆｒｏｇ  Ｐｒｉｎｃｅ、Ｔｏｌ２、Ｍｉｎｏｓ、Ｈｓｍａｒ、ＰｌａｉｃｅおよびＰａｓｓｐｏｒｔからなる群から選択される。本方法は、レポーターを発現する細胞または胚を選択すること、および細胞または胚を使用して遺伝子改変動物を作製することを含んでもよく、遺伝子改変はＴＡＬＥＮにより特異的に結合されるＤＮＡ部位にある。本方法は、動物を繁殖させること、および遺伝子改変を発現し、かつ外来性レポーターを含まない子孫を選択することを含んでもよい。本方法では、動物は改変のホモ接合性両アレルでも、または改変のヘテロ接合性でも、または改変のヘテロ接合性両アレルでもよい。本方法は、培養物の細胞から遺伝子改変動物をクローニングすることを含んでもよく、細胞は、ＴＡＬＥＮにより特異的に結合されるＤＮＡ部位に遺伝子改変を含む。本方法では、細胞は、体細胞核移植またはクロマチン移植により動物をクローニングするために使用され得る。本方法では、遺伝子改変は、挿入、欠失、外来性核酸フラグメントの挿入、逆位、天然のアレルへの遺伝子変換、合成アレルへの遺伝子変換、および新規なアレルへの遺伝子変換からなる群から選択され得る。本方法は、細胞または胚にリコンビナーゼを送達することを含んでもよい。本方法では、リコンビナーゼは、直接インジェクションにより、またはリコンビナーゼをタンパク質、ｍＲＮＡとしてコードするベクターにより、またはリコンビナーゼをコードするベクターにより送達してもよい。本方法では、リコンビナー��は核酸と一緒になってフィラメントを形成してもよく、核酸は相同性依存型修復の鋳型となる。本方法では、リコンビナーゼは、ＲｅｃＡ、ｒｅｃＡ８０３、ｕｖｓＸ、ｒｅｃＡミュータント、ｒｅｃＡ様リコンビナーゼ、Ｃｒｅリコンビナーゼ、Ｈｉｎリコンビナーゼ、ＲＡＤ５１、Ｔｒｅ、ＦＬＰ、ＲｕｖＣ、ＤＳＴ２、ＫＥＭ１  ＸＲＮ１、ＳＴＰａ／ＤＳＴ１およびＨＰＰ−１からなる群から選択され得る。本方法では、細胞は接合体であってもよいし、または胚は胚盤胞であってもよい。
【０００７】
本明細書に記載した別の実施形態は、ＴＡＬＥＮをコードする核酸フラグメントと、ＴＡＬＥＮにより特異的に結合されるＤＮＡ部位の遺伝子改変とを含む細胞または胚であり、細胞は、動物組織から単離された初代細胞を含み、細胞および胚は、偶蹄目の動物、ブタ（ｓｗｉｎｅ）、ウシ、魚、ウサギおよび家畜類からなる群から選択される。初代細胞は、たとえば、インビトロ培養物において核酸に接触させてもよい。ＴＡＬＥＮをコードする核酸は、ｍＲＮＡを含んでもよい。細胞または胚は、レポーターをコードするベクターを含んでもよい。細胞または胚は、選択マーカーをコードするベクターを含んでもよい。細胞または胚は、レポーターが選択マーカーを含んでもよい。細胞または胚は、レポーターをコードするベクター、およびＴＡＬＥＮをコードするベクターを含んでもよい。細胞または胚は、トランスポザーゼをコードするベクターを含んでもよく、レポーターおよびＴＡＬＥＮはそれらのそれぞれのベクターによりコードされるトランスポゾンである。細胞または胚は、遺伝子改変のホモ接合性両アレルであってもよい。細胞または胚は、外来性リコンビナーゼを含んでもよい。
【０００８】
本発明の実施形態は、挿入、欠失、外来性核酸フラグメントの挿入、逆位、天然のアレルへの遺伝子変換、合成アレルへの遺伝子変換、および新規なアレルへの遺伝子変換からなる群から選択される遺伝子改変を含む遺伝子改変家畜動物であり、動物は外来性レポーター遺伝子を含まない。家畜動物は、偶蹄目の動物、雌ウシ、ブタ（ｓｗｉｎｅ）、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、家禽および魚からなる群から選択され得る。遺伝子改変は、５００塩基対、または１メガ塩基対、または約１０％〜約９０％の範囲の染色体の量の欠失を含む欠失を含んでもよい。当業者であれば、明記された範囲内の範囲および値をすべて意図していることをすぐに理解するであろう。遺伝子改変は、１メガベースの染色体ＤＮＡを含む欠失を含んでもよい。遺伝子改変は、５００塩基対を含む逆位を含んでもよい。遺伝子改変は逆位を含み、逆位は遺伝形質をコードしてもよい。家畜動物は、ベルジアンブルー（Ｂｅｌｇｉａｎ  Ｂｌｕｅ）ウシ（ｃａｔｔｌｅ）でないウシ系統の動物を含んでもよく、遺伝子改変は、ベルジアンブルー（Ｂｅｌｇｉａｎ  Ｂｌｕｅ）ウシ（ｃａｔｔｌｅ）に多く見られるミオスタチン突然変異欠失を含む。
【０００９】
一実施形態は、家畜動物を遺伝子改変する方法であって、形質を選択すること、および家畜動物の創始体として使用される細胞または胚において形質をコードするＤＮＡの領域を反転させることを含む方法である。遺伝子改変は、逆位を含んでもまたは欠失を含んでもよく、逆位または欠失は、５００塩基対、または１メガ塩基対、または約１０％〜約９０％の範囲の染色体の量を含む。当業者であれば、明記された範囲内の範囲および値をすべて意図していることをすぐに理解するであろう。
【００１０】
一実施形態は、動物を遺伝子改変する方法であって、前駆細胞または胚を第１の部位で第１のＴＡＬＥＮに、さらに第２の部位で第２のＴＡＬＥＮに接触させることを含み、部位の間の領域が欠失される方法である。第１のＴＡＬＥＮは第１のＴＡＬＥＮペアを含んでもよく、第２のＴＡＬＥＮは第２のＴＡＬＥＮペアを含んでもよい。前駆細胞を使用する場合には、たとえば、前駆細胞からの体細胞核移植またはクロマチン移植を用いて、動物を作製してもよい。本方法は、ＴＡＬＥＮを前駆細胞に導入すること、さらにレポーターを含むベクター導入すること、およびレポーターが発現する場合に限り、動物の作製のため前駆細胞または胚を選択することを含む方法であってもよい。
【００１１】
一実施形態は、アレルの突然変異を第１の家畜品種から第２の家畜品種に移す方法であって、第１の家畜品種のアレルの突然変異をコードする核酸の存在下で第２の家畜品種の細胞または胚にＴＡＬＥＮを導入することを含み、アレルの突然変異は細胞または胚にコピーされ、さらに細胞または胚から第２の品種の動物をすることを含む方法である。コピープロセスは、ＨＤＲ鋳型を含んでもよい。アレルの突然変異は、たとえば、ベルジアンブルー（Ｂｅｌｇｉａｎ  Ｂｌｕｅ）ウシ（ｃａｔｔｌｅ）に存在するミオスタチン突然変異アレルを含んでもよい。ＴＡＬＥＮは、タンパク質として導入しても、またはｍＲＮＡもしくはベクターによりコードされていてもよい。本方法は、ＴＡＬＥＮと独立にレポーターベクターを導入することを含んでいてもよい。アレルは、第１の家畜品種の形質に連鎖してもよい。本方法は、細胞または胚にリコンビナーゼを送達することをさらに含んでいてもよい。リコンビナーゼは、タンパク質、ｍＲＮＡとして送達されても、またはリコンビナーゼをコードするベクターにより送達されてもよい。リコンビナーゼは、核酸と一緒になってフィラメントを形成するために使用してもよい。
【００１２】
一実施形態は、第２の品種の家畜動物のアレルを含む第１の品種の家畜動物を含み、第１の品種の家畜動物は第２の品種の動物との減数分裂組換えを含まない、遺伝子改変家畜動物である。動物は、たとえば、ブタ（ｓｗｉｎｅ）、雌ウシ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ウサギおよび魚からなる群から選択され得る。一例を挙げると、第１の品種は和牛（Ｗａｇｙｕ  ｃａｔｔｌｅ）であり、第２の品種はベルジアンブルー（Ｂｅｌｇｉａｎ  Ｂｌｕｅ）ウシ（ｃａｔｔｌｅ）である。アレルは、挿入、欠失、多型および一塩基多型からなる群から選択され得る。動物は、外来性マーカー遺伝子を含まなくてもよい。動物は、複数のアレルを含んでもよい。単数または複数のアレルは、第２の品種の量的形質に連鎖してもまたは質的形質に連鎖してもよい。
【００１３】
以下の特許出願をあらゆる目的において本明細書に援用する。矛盾が生じた場合、本明細書を優先する：米国特許出願公開第２０１０／０１４６６５５号明細書、米国特許出願公開第２０１０／０１０５１４０号明細書、米国特許出願公開第２０１１／００５９１６０号明細書および米国特許出願公開第２０１１／０１９７２９０号明細書。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ＴＡＬＥＮおよびＴＡＬＥＮによる遺伝子改変の図である。
【図２】複数のＤＮＡ遺伝子座で作用するＴＡＬＥＮの図である。
【図３】ウシ胚におけるＴＡＬＥＮ活性である。図（ａ）に実験の概要を示す。ＴＡＬＥＮは、ＦｏｋＩヌクレアーゼホモ２量体の単量体が２量体を形成し、２つの単量体の間のＤＮＡを切断できるように、ＤＮＡ標的の対向する鎖に合わせて設計する。１日目（Ｄ１）に、インビトロで作製されたウシ接合体にＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡをインジェクトし、胚盤胞になるまでインビトロ培養する。８日目に各胚盤胞（ｂｌａｓｔ：胚盤胞）を集め、全ゲノム増幅（ＷＧＡ）に供し、ＰＣＲ増幅およびＣｅｌ−Ｉ（ＳＵＲＶＥＹＯＲヌクレアーゼ、Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃｓ）処理によりインデルについて解析する。図ｂ）ＳＵＲＶＥＹＯＲヌクレアーゼ処理して、ＡＣＡＮ１２  ＴＡＬＥＮにより誘発されたウシ胚のインデルを解析したものである。単位複製配列の長さ、およびインデルを示唆すると予想されたＳＵＲＶＥＹＯＲ切断産物を上に示す。図ｃ）ＳＵＲＶＥＹＯＲヌクレアーゼ処理して、ｐ６５  ＴＡＬＥＮにより誘発されたブタ接合体のインデルを解析したものである。
【図４Ａ】ＡＣＡＮ１２  ＴＡＬＥＮで処理したウシ胚から配列決定された欠失および挿入である。野生型配列を示し、ＴＡＬＥＮ結合部位を下線で示す  欠失現象および挿入現象の両方が同定された。
【図４Ｂ】ＡＣＡＮ１２  ＴＡＬＥＮで処理したブタ胚から配列決定された欠失および挿入である。野生型配列を示し、ＴＡＬＥＮ結合部位を下線で示す  欠失現象および挿入現象の両方が同定された。
【図５】家畜線維芽細胞の遺伝子編集を行うためのＴＡＬＥＮスキャフォールドを比較する  図ａ）この実験で試験したＴＡＬＥＮスキャフォールドの図である。各スキャフォールド（＋２３１、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ  ｅｔ．ａｌ．２０１０｛Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ，２０１０｝および＋６３、Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ．ａｌ．２０１１｛Ｍｉｌｌｅｒ，２０１１｝）は、ＳＶ４０核移行シグナル（ＮＬＳ）を含み、ＦｏｋＩホモ２量体ドメインのＣ末端融合体を有する。番号はＤＮＡ結合ドメインとの関係で付した。第１の可変領域２アミノ酸残基リピート（ＲＶＤ）の前のアミノ酸を「−１」と表記し、最後のＲＶＤリピートの後のアミノ酸を「＋１」と表記した。図ｂ）ＤＭＤＥ７．１  ＴＡＬＥＮペアまたはＡＣＡＮ１２  ＴＡＬＥＮペアのどちらかをトランスフェクトした線維芽細胞について、ＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイを行った。スキャフォールドおよび処理温度をゲルの上に示し、ＮＨＥＪの割合を下に示す。略語ＮＴ＝未処理。図ｃ）＋２３１または＋６３スキャフォールドのどちらかを有する４つの別のＴＡＬＥＮペアの活性を示す。
【図６】ＡＣＡＮ１２  ＴＡＬＥＮで処理した細胞から配列決定された欠失および挿入である。野生型ＡＣＡＮ１２配列をイタリック体で示し、ｌｅｆｔおよびｒｉｇｈｔ（相補）ＴＡＬＥＮ認識配列を下線で示す。挿入されたヌクレオチドを灰色でハイライトし、ミスマッチヌクレオチドを小文字で表示する。
【図７】インデル濃縮のためのトランスポゾン共選択である。実験スケジュールをパネル（ａ）に示す。０日目（Ｄ０）に、各ＴＡＬＥＮの発現カセット、選択マーカーをコードするトランスポゾン、およびトランスポザーゼ発現カセットを含むプラスミドの混合物を細胞にトランスフェクトする。ＴＡＬＥＮのプラスミドが各トランスフェクションの主要な成分である（４倍過剰量）。トランスフェクト細胞を継代前に３０℃あるいは３７℃で３日間培養し、ＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイのためのサンプルを集め、拡大培養によりトランスポゾン組み込みを＋／−選択するためリプレートする。３日目以降、全細胞を３７℃で培養する。ＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイのため１４日間以上培養した細胞を集め、下流用途、すなわち、単一細胞核移植のため凍結保存する。図ｂ）カチオン性脂質を使用して線維芽細胞にトランスフェクトした。３日目では活性が観察されなかったため（低トランスフェクション効率のため）、１４日目以降の集団のデータのみを示す。処理温度、選択およびＴＡＬＥＮ  ｉｄ（図（ｃ）に示したＡ〜Ｃの文字により識別）をゲルの上に示す。図ｃ）線維芽細胞にヌクレオフェクションによりトランスフェクトし、３日目、および１４日目以降の非選択（ＮＳ）および選択（Ｓ）集団におけるＮＨＥＪの割合を測定した。処理温度を各マトリックスの上に示す。略語：ｎｄ＝検出されず；ｗｔ＝野生型単位複製配列、ＳＵＲＶＥＹＯＲ処理済み。
【図８Ａ】インデルを同定するための直接ＰＣＲシーケンシングである。各線維芽細胞コロニー由来のＰＣＲ単位複製配列を精製し、配列決定し、野生型配列と比較した。１つのアレルの突然変異、または、両方のアレルの非重複突然変異が起こると、ＴＡＬＥＮ認識部位近傍が２つの配列になる（上部）。突然変異部位の両側にある２つのピークにより各アレル間の相違を同定できる場合、重複両アレル突然変異を同定することができる。ホモ接合性突然変異を有するコロニーは、インデル部位近傍に二重ピークを示さない。
【図８Ｂ】野生型クローンおよび図８Ａに示したようなホモ接合性インデルを有する両アレルクローンの配列比較である。
【図９Ａ】ＤＭＤによる両アレル性改変アレルである。ホモ接合性改変アレル（すなわち、両方のアレルが同じ突然変異を持つ）あるいは各アレルに異なる突然変異を持つ両アレル突然変異を有するコロニーを示す。２つのインデルを持つコロニーでは、各アレルが配列決定された回数を右側に示す。場合によっては、第３の突然変異または単一の野生型アレルが配列決定されたことから、すべてのコロニーが１００％クローンであるとは限らないことが示される。フレームシフトアレルを示し、ミスマッチヌクレオチドを小文字で表示する。
【図９Ｂ】ＬＤＬＲによる両アレル性改変アレルであり、図９Ａと同様の表記法を用いる。
【図１０】ＴＡＬＥＮによる欠失および逆位である。ＤＭＤ遺伝子座の模式図を図（ａ）に示す。ＤＮＡの方向性を黒い山形模様で示す。雄ブタ線維芽細胞にコトランスフェクトされた、エクソン６および７（黒の矢頭）を標的とするＴＡＬＥＮにより、エクソン６とエクソン７との間でＮＨＥＪによる融合現象が起こり得る。これは、プライマー（黒い矢印）を用いて約５００ｂｐの単位複製配列を得ることにより確認することができる。図ｂ）エクソン６および７を標的とするＴＡＬＥＮを同時にトランスフェクトした細胞のＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイから、両部位でのＮＨＥＪによるインデルが明らかにされる。ＮＨＥＪの割合を下に示す。図ｃ）エクソン６  ＴＡＬＥＮおよびエクソン７  ＴＡＬＥＮを同時に導入すると、推定される欠失部位を挟むプライマーを用いたＰＣＲにより、約５００塩基対の産物が得られるのに対し、単独でトランスフェクトすると、得られない。図ｄ）ＴＡＬＥＮ標的部位間の配列の逆位現象の予想される結果を示す。ＤＮＡの方向性を黒い山形模様で示す。逆位遺伝子座の５’および３’末端の推定されるフランキング部位の外側のプライマー（黒い矢印）を、予想された産物の大きさと共に示す。ＰＣＲ産物は、エクソン６  ＴＡＬＥＮおよびエクソン７  ＴＡＬＥＮの両方を同時に導入したときのみ、５’および３’接合部の両方で観察された。
【図１１】ＤＭＤによる欠失配列である。複製トランスフェクションで得られたＤＭＤ欠失接合部を示す。上方のエクソン６および７配列をそれぞれ緑色および黄色でハイライトし、ＴＡＬＥＮ認識部位を下線で示す。挿入されたヌクレオチドを赤でハイライトする。
【図１２】ＤＭＤによる逆位配列である。ＤＭＤによる逆位アレルの模式図を、シーケンシングによる解析した５’および３’接合部（枠で囲む）と共に示す。下方に、各融合の予想された配列を示し、それぞれの融合は、ＴＡＬＥＮペアの各スペーサーの中央にある。ＴＡＬＥＮ認識部位を下線で示す。トランスフェクトされた集団から配列決定された逆位アレルを示す。各アレルが配列決定された回数を右側に示し、挿入されたヌクレオチドを下線で示す。ミスマッチヌクレオチドを小文字で示す。
【図１３】ウシ線維芽細胞におけるＨＤＲの誘導を示す。図ａ）二重鎖切断誘導性相同組換えにより、ウシＧＤＦ８のエクソン３に１１塩基対欠失（ベルギーブルー（Ｂｅｌｇｉｕｍ  Ｂｌｕｅ）突然変異）を導入するように、ＴＡＬＥＮ（ｂｔＧＤＦ８３．１、矢印）およびｄｓＤＮＡ鋳型（ＢＢ−ＨＤＲ）を設計した。ＢＢ−ＨＤＲ鋳型ではｌｅｆｔ  ＴＡＬＥＮの結合部位の半分が欠損しているため、ＴＡＬＥＮ切断に対して抵抗性を示すはずである。図ｂ）ＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイから、３７℃および３０℃の両方でｂｔＧＤＦ８３．１  ＴＡＬＥＮの活性が立証される。本アッセイで使用したＰＣＲ産物は、プライマーｂおよびｂ’を使用して作製した（図ａに示す）。ＢＢ−ＨＤＲ鋳型は、ｂｔＧＤＦ８３．１活性の推定を難しくすると考えられるため、これらの複製物に含めなかった。図ｃ）アレル特異的ＰＣＲにより、ＨＤＲの誘導は、ＴＡＬＥＮとＢＢ−ＨＤＲ鋳型とのコトランスフェクションに依存することが立証される。ＰＣＲアッセイは、ＨＤＲにより改変されたＧＤＦ８アレルを、プライマーｃおよびｃ’を使用して特異的に検出するように開発した（図ａに示す）。プライマーｃ’の３’末端は１１塩基対欠失をまたぎ、野生型アレル（ｗｔ）を増幅できない。陽性対照「Ｃ」を含む各ＰＣＲ反応に５００細胞相当量を加えた。ＨＤＲ率は、実験反応と対照反応との比較デンシトメトリーにより判定した。
【図１４】シーケンシングによるベルジアンブルー（Ｂｅｌｇｉａｎ  Ｂｌｕｅ）遺伝子移入の確認である。和牛（Ｗａｇｙｕ）野生型ＧＤＦ８およびベルジアンブルー（Ｂｅｌｇｉａｎ  Ｂｌｕｅ）鋳型（ＢＢ−ＨＤＲ）の模式図を示す。５つのＰＣＲ陽性コロニーについて、ホモロジーアーム（ｃおよびｄ）の外側に位置するプライマーを使用してＰＣＲを行ってから、プライマーｂ’を用いてクローニングおよびシーケンシングを行った。野生型配列との比較から、５つのコロニーのうち４つのコロニーでベルジアンブルー（Ｂｅｌｇｉａｎ  Ｂｌｕｅ）アレル（ヘテロ接合性）に特徴的な予想された１１塩基対欠失が明らかにされる。
【図１５】ＴＡＬＥＮを介したＨＤＲの模式図およびゲルである。ブタ（ｓｗｉｎｅ）低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）遺伝子の第４エクソンを標的とするＴＡＬＥＮペア（ＬＤＬＲ２．１）をスーパーコイルプラスミドＬｄｌｒ−Ｅ４Ｎ−ｓｔｏｐとコトランスフェクトした。Ｌｄｌｒ−Ｅ４Ｎ−ｓｔｏｐは、ブタ（ｓｗｉｎｅ）ＬＤＬＲ遺伝子に対応するホモロジーアーム、およびＨＤＲ時にネオマイシンホスホトランスフェラーゼの発現を可能にする遺伝子トラップを含む。
【図１６】図１５のＴＡＬＥＮを介したＨＤＲの模式図およびゲルである。
【図１７】図１５および１６のプロセスにより作製されたトランスジェニックブタ（ｓｗｉｎｅ）である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
ＴＡＬＥＮを使用して高等動物、たとえばブタ（ｓｗｉｎｅ）または雌ウシの遺伝子改変をうまく行うことは、大きな課題である。本明細書では、こうした動物を作製する組成物および方法について記載する。これらの方法の一部には、やはり大きな課題となっている、偶蹄目動物の細胞からのクローニングを含む。さらに、ＴＡＬＥＮで改変された細胞または胚を同定する方法のほか、ＴＡＬＥＮ処理された細胞または胚の割合を高めるプロセスも提供する。意外にも、一方の染色体をＴＡＬＥＮにより遺伝子改変すると、多くの場合、細胞機構により他方の染色体の同じ遺伝子座も改変されることが観察された。
【００１６】
さらに、ＴＡＬＥＮを使用して複数の部位で大きな染色体欠失（ＧＣＤ）を引き起こすことができることも発見された。図２はこのアプローチを図示したもので、本アプローチは、第１の遺伝子座に対する第１のＴＡＬＥＮペア、および第２の遺伝子座に対する第２のＴＡＬＥＮペアを含む。さらに驚くべきことに、ＴＡＬＥＮのペアを用いて大きな染色体配列の逆位を引き起こすこともできることも発見された。逆位の１つの使用は、一定の遺伝形質を有する偶蹄目の動物または他のファウンダー動物の作製、または欠失の作製である。
【００１７】
ＴＡＬＥＮ技術による遺伝子改変家畜類の作製；ＴＡＬＥＮによる改変の検証；コトランスフェクトし、共選択して、改変された細胞を選択する；遺伝子改変家畜類からのレポーター遺伝子の除去
ＴＡＬＥＮにより改変された家畜類を作製する際の障壁の１つは、従来のベストプラクティスを用いても動物細胞の改変効率が数パーセントであることにある。意図した部位で欠失または挿入を達成しても、実際には外来性タンパク質の発現または内在性タンパク質の発現の停止など意図した作用を発揮しないこともあるため、必ずしも成功を意味するとは限らない。低効率でも、ミバエまたはマウスなどの下等動物の遺伝子改変動物の作製には有用な場合もある。こうした下等動物は生殖周期が短いうえ多く繁殖することから、数百の動物の作製、試験およびスクリーニングを行い、改変に成功した少数の動物が存在するかどうかを判定できるためである。しかしながら、これらの従来法で達成される効率のレベルは、妊娠期間が非常に長く、妊娠当たりの子孫が比較的少数である家畜類の偶蹄目動物には適さない。
【００１８】
ＴＡＬＥＮを使用して家畜類を改変する際のもう１つの障壁は、初代細胞においてＴＡＬＥＮを介してＤＮＡを改変することが難しいことである。初代細胞が不安定であるためである。実際、ＴＡＬＥＮにより改変される細胞の頻度は、濃縮法または選択法を行わない場合、経時的に著しく低下することが本明細書に示される。特定の理論に拘泥するものではないが、意図していない部位でのＤＮＡの切断は、アポトーシスの誘導または非標的遺伝子の機能破壊により細胞の安定性を低下し得ると推定される。初代細胞という用語は、生きている動物から単離された細胞であって、組織から単離されて以来０〜２回の複製が行われた細胞を意味する。
【００１９】
このため、形質転換細胞を作製し、遺伝子改変に成功したかを調べるのに通常使用される技術は、その老化しやすさから初代細胞に使用することができない。ＴＡＬＥＮにより改変された細胞は通常、その遺伝子改変をアッセイするために破壊されたり、または単一の親由来の多くの同一細胞を持つクローン系を増殖させるために単離されたりする。しかしながら、初代細胞は本質的に不安定であり、それらを遺伝子改変し、クローン増殖しようとすると、典型的には遺伝子変化、老化および／または細胞死が起こる。本明細書で初めて立証されるように、ＴＡＬＥＮにより改変された細胞はさらに安定性に乏しい。このため、体細胞核移植または他の動物クローニング技術のため初代細胞を改変することを含む従来のアプローチを使用する際に、高率の成功を期待することは合理的でない。一方、本明細書に報告したように、ＴＡＬＥＮは、偶蹄目の動物の遺伝子改変初代細胞を作製するために使用されてきた。これらの改変は、クローニングによる遺伝子改変動物系のファウンダーの作製に適している。さらに本明細書には、接合体の改変に使用した、胚への直接インジェクションも記載されており、改変された接合体は、ファウンダー動物系の妊娠および出産を目的とした代理雌への移植に適している。
【００２０】
ＴＡＬＥＮを介した実際の挿入／欠失現象について調べる典型的なアプローチは、改変された細胞または接合体の配列を決定するものであり、これは、破壊プロセスである。したがって接合体または胚を改変してから代理母に移植する場合、その改変は、利便性の程度に関係なく、動物が生まれるまで検証することができない。クローニングにより遺伝子改変動物を作製する実際の作製プロセスが、遺伝子改変の存在について調べるプロセスから恩恵を受けることは、従来認識されていない。本明細書に提示される本発明は、単一の細胞、接合体または卵母細胞の段階で遺伝子改変の指標を提供する。本明細書に示したように、ＴＡＬＥＮによる改変に連結しないレポーター遺伝子の発現からは、レポーター遺伝子発現カセットの一部ではないものの、それでも所望の遺伝子改変が予測されるのが一般的である。さらに詳しくは、レポーター遺伝子の発現からは、核酸が効率的に送達され、細胞または胚で発現したことが示され、レポーターを発現する細胞または胚がＴＡＬＥＮに基づく改変を受ける可能性が高い。
【００２１】
改変された生物を作製するもう１つの技術は、コトランスフェクション共選択技術である。遺伝子改変動物を作製するためにレポーターを発現する細胞を選択し、これを遺伝子改変動物を作製するために使用することができる。レポーターは、トランスポザーゼ活性を必要とするように選択してもよい。特定の理論に拘泥するものではないが、転位を起こした細胞は、１）トランスフェクトされており、２）二重鎖ＤＮＡ修復の能力があるため、選択されたクローンにおいてＴＡＬＥＮに基づく改変の可能性が高まると推定される。これはさらに、転位を起こした細胞（さらにひいては、ＴＡＬＥＮにより改変された細胞）を濃縮／選択しやすくする。トランスポゾンが、ＴＡＬＥＮによる改変に作動可能に連結しているが、物理的に連結していないことにより、それらは繁殖させることにより相互に離して分離することができる。コトランスフェクション戦略の利点は、ＴＡＬＥＮにより改変される染色体と同じでない染色体上に単数または複数のレポーターを組み込めることである。このプロセスにより、レポーター遺伝子を有さないファウンダー動物の作製が可能になる。たとえば、一部の動物は、細胞に独立して組み込まれた、遺伝子改変と無関係であるレポーター遺伝子を有するプラスミドを用いて作製した。このスキームは、新しいレポーター遺伝子を取り込んだ細胞は、遺伝子改変も取り込むという作用論によった。たとえば、本明細書に提供したデータは、細胞に独立した４つのプラスミドをトランスフェクトし、１つのプラスミドの遺伝子産物の組み込みに成功すると、他のプラスミド遺伝子産物の組み込みにも成功すること、さらにＴＡＬＥＮを介した変化にも成功することが予測されることを示す。
【００２２】
家畜類胚におけるＴＡＬＥＮの機能については、インビトロで調製した（ＩＶＰ）ウシおよびブタの胚を使用して調査した。実施例１は、ＴＡＬＥＮ（ｌｅｆｔ  ＴＡＬＥＮおよびｒｉｇｈｔ  ＴＡＬＥＮ）をウシ胚に直接インジェクトして、ＴＡＬＥＮが特異的に結合した部位に改変を含む遺伝子改変動物を作製したことについて記載する。改変は、ホモ接合性−両アレル改変およびヘテロ接合性−両アレル改変を含んでいた。ＴＡＬＥＮのｍＲＮＡを胚にインジェクトしたところ、遺伝子改変の成功が観察された。実施例２は、レポーターｍＲＮＡをＴＡＬＥＮのｍＲＮＡとコインジェクトした追加実験について記載する。胚の約３５％がレポーターを発現し、これらの動物の約３０％がＴＡＬＥＮに基づくインデルを有したため、レポーターの発現から遺伝子改変の成功が予測された。インデルを含む動物うち、約３５％がホモ接合性またはヘテロ接合性のどちらかの両アレルのミュータントであった（図４）。このため、ＴＡＬＥＮを使用した直接的な胚改変は、家畜類ゲノム改変の実行可能なアプローチであることが示された。以上のように、よく知られたプロセスを使用して、動物ファウンダー系の妊娠および出産のための胚を調製し、代理雌に移植することができる。さらに、その後クローニングまたは他のプロセスに使用するため、レポーターを用いて細胞（たとえば、初代細胞、接合体、卵母細胞、胚盤胞）を選択することも可能である。
【００２３】
また、クローニングによるＴＡＬＥＮを介した家畜類の遺伝子改変の方法も開発した。実施例３は、ブタ（ｓｗｉｎｅ）および雌ウシの初代体細胞に好適なＴＡＬＥＮおよびＴＡＬＥＮによる改変の開発について記載する。成功を収めた改変の効率はやや低く、改変の成功を測るためのレポーターは使用しなかった。外来核酸を高効率で細胞に導入する手段としてヌクレオフェクションがあるが、ヌクレオフェクションは費用がかかるうえ細胞毒性が高レベルで、多くの研究者には入手できない。したがって、一般的なカチオン性脂質のトランスフェクション試薬を遺伝子改変のビヒクルとして使用した。実施例４に示すように、カチオン性脂質によるトランスフェクション効率は５％未満であったものの、改変レベルはトランスポゾン共選択により大きく改善した。３日目の集団（データ示さず）、およびトランスポゾンによる選択を用いない１４日目の集団では遺伝子改変は検出未満であったのに対し、ＤＭＤ７．１、ＤＭＤ６およびＬＤＬＲ２．１の選択集団の改変レベルは、それぞれ３１パーセント、１３パーセントおよび２０パーセントに達した（図７）。次いで、＞９０％のトランスフェクション効率が通例であるヌクレオフェクションによりトランスフェクトした細胞にトランスポゾン共選択を適用した。トランスポゾン共選択は、ＡＣＡＮ１２を除いて、ヌクレオフェクションによりトランスフェクトされた改変細胞の維持には効果的であった一方、ヌクレオフェクションは、３日目のレベルと比較して改変細胞を大きく改善しなかった（図７）。このため、トランスポゾン共選択は、トランスフェクション効率が低い場合には効果的な改善方法であり、トランスフェクション効率が高い場合には効果的な維持方法である。共選択プロセスはまた、実施例５に示すようにフィーダー細胞を使用したときも効果的であった。意外にも高い両アレル改変率（ＴＡＬＥＮペアによって約１７％〜約３５％）が観察された。
【００２４】
本発明の一実施形態は、ＴＡＬＥＮを用いて偶蹄目動物などの家畜類を遺伝子改変するための組成物および方法である。従来のプロセスを使用してこうした動物を作製する際の問題の多くは、上記で論じた。遺伝子改変は、たとえば、挿入、欠失、外来性核酸フラグメントの挿入、逆位、および天然または新規なアレルへの遺伝子変換からなるリストから選択され得る。たとえば、染色体または染色体対の望ましくない突然変異は、正常な配列と置換することができる。一般に、標的ＤＮＡ部位を同定し、その部位に特異的に結合するＴＡＬＥＮペアを作製する。ＴＡＬＥＮは、たとえば、タンパク質、ｍＲＮＡとしてまたはＴＡＬＥＮをコードするベクターにより細胞または胚に送達する。ＴＡＬＥＮは、ＤＮＡを切断して二重鎖切断を起こし、その後これが修復され、多くの場合、インデルが作製されるか、あるいは、改変された配列と共に、切断修復の鋳型として挿入されるもしくは鋳型として働く、付随する外来性核酸に含まれる配列または多型が組み込まれる。外来性核酸という用語は、核酸が細胞に自然にある核酸配列と同一かまたは異なるかどうかにかかわらず、細胞または胚に導入される核酸を意味する。核酸フラグメントという用語は広義であり、染色体、発現カセット、遺伝子、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡまたはこれらの一部を含む。細胞または胚は、たとえば、家畜類、偶蹄目の動物、雌ウシ、ブタ（ｓｗｉｎｅ）、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ウサギおよび魚からなる群から選択され得る。家畜類という用語は、食物または生物材料のため商品として飼育される飼い慣らされた動物を意味する。偶蹄目の動物という用語は、偶蹄目（ｏｒｄｅｒ  Ａｒｔｉｏｄａｃｔｙｌａ）の有蹄哺乳動物を意味し、各肢に偶数の指、通常２本または場合によっては４本の指があるウシ（ｃａｔｔｌｅ）、シカ、ラクダ、カバ、ヒツジおよびヤギが挙げられる。
【００２５】
一実施形態は、遺伝子改変家畜類および／または偶蹄目の動物を作製する組成物または方法であって、ＴＡＬＥＮペアにより特異的に結合される部位で細胞または胚のＤＮＡの遺伝子改変を行うＴＡＬＥＮペアを家畜類および／または偶蹄目の動物の細胞または胚に導入すること、および細胞から家畜動物／偶蹄目の動物を作製することを含む組成物または方法を対象とする。細胞または胚には、たとえば、接合体、胚盤胞または胚への直接インジェクションを使用してもよい。あるいは、タンパク質、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＤＮＡまたはベクターを導入する多くの公知の技術のいずれかを使用して、ＴＡＬＥＮおよび／または他の因子を細胞に導入してもよい。遺伝子改変動物は、公知のプロセス、たとえば、胚の妊娠宿主への移植または様々なクローニング方法によって胚または細胞から作製することができる。「ＴＡＬＥＮにより特異的に結合される部位での細胞のＤＮＡの遺伝子改変」という語句または同種のものは、ＴＡＬＥＮがその標的部位に特異的に結合したときに、ＴＡＬＥＮのヌクレアーゼにより切断された部位で遺伝子改変が行われることを意味する。ヌクレアーゼは、ＴＡＬＥＮペアが結合した部位で正確に切断するものではなく、むしろ２つの結合部位の間の決められた部位で切断する。
【００２６】
別のこうした実施形態は、動物のクローニングに使用される組成物または細胞の処理に関する。細胞は、家畜類および／または偶蹄目動物の細胞、培養細胞、初代細胞、初代体細胞、接合体、生殖細胞、始原生殖細胞または幹細胞であってもよい。たとえば、一実施形態は、遺伝子改変を行うための組成物または方法であって、複数の初代培養細胞をＴＡＬＥＮタンパク質または単数または複数のＴＡＬＥＮをコードする核酸に接触させることを含む組成物または方法である。ＴＡＬＥＮは、タンパク質として導入しても、あるいは、たとえば、ベクター中のｍＲＮＡまたはＤＮＡ配列によりコードされる核酸フラグメントとして導入してもよい。
【００２７】
動物の遺伝子改変は、レポーターを含むトランスフェクションをさらに含んでもよい。上記で論じたように、初代細胞は、ＴＡＬＥＮおよび／またはＴＡＬＥＮ導入により誘発される細胞の改変に伴い不安定になることが観察された。このため当然ながら、従来の手段を用いて初代細胞（いくつかの細胞型の中で特に）の改変、および／または、こうした細胞から新しい系統の家畜類を作製することに成功するとは、予想できない。特定の理論に拘泥するものではないが、第１のベクターの遺伝子カセットを発現する細胞は、ｍＲＮＡまたは別のベクターにより独立に送達されるＴＡＬＥＮによる改変にも成功する可能性も高いと推定される。レポーターの発現により、レポーターを発現しない細胞の排除が可能になる。あるいは、レポーターの発現により、レポーターを発現する細胞を、クローニングまたは他のトランスジェニック動物技術により動物に使用できるように培養物から移動するか、あるいは、さらに培養および／もしくは増殖するため、ならびに／または別のベクターおよび／もしくは核酸および／もしくはＴＡＬＥＮを添加するため、ならびに／または他の遺伝子改変のため、第２の培養物に移動することが可能になる。レポーターという用語は、本明細書で使用する場合、レポーターおよび選択マーカーを含む。
【００２８】
選択マーカーという用語は、本明細書で使用する場合、陽性または陰性どちらかの生存選択の基準により単離することを可能にする形質を付与する遺伝子発現生体分子をいう。レポーターは、たとえば、蛍光マーカー、たとえば、緑色蛍光タンパク質および黄色蛍光タンパク質であってもよい。レポーターは、選択マーカー、たとえば、ピューロマイシン、ガンシクロビル、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ、Ｇ４１８、ＡＰＨ）、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、ハイグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ、チミジンキナーゼ（ＴＫ）またはキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ）であってもよい。
【００２９】
本発明の実施形態は、レポーター（たとえばベクターの使用により）およびＴＡＬＥＮ（たとえば、独立のベクターまたはｍＲＮＡにより）を細胞または胚に導入することを含む。細胞は、家畜類および／または偶蹄目動物の細胞であってもよい。ＴＡＬＥＮおよび／またはレポーターは、たとえば、インジェクション、または、たとえば、細胞培養を含む他の手段により直接導入してもよい。培養細胞（初代細胞、接合体、卵母細胞、不死化細胞）、ＴＡＬＥＮをコードする第１の核酸、たとえば、ｍＲＮＡ、またはＴＡＬＥＮをコードするＤＮＡを含むベクター、およびレポーターをコードするＤＮＡ配列を有する独立のベクターを含む細胞培養物を作製してもよい。ｍＲＮＡまたは第１のベクターは任意のレポーターをコードせず、第２のベクターは任意のＴＡＬをコードせず、かつ任意のＴＡＬＥＮもコードしない
【００３０】
レポーターのベクター、選択マーカーのベクター、および／または１つもしくは複数のＴＡＬＥＮのベクターは、たとえば、本明細書に詳述するように、プラスミド、トランスポゾン、トランスポザーゼ、ウイルスベクターまたは他のベクターであってもよい。トランスポザーゼを使用してもよい。トランスポザーゼを含む一実施形態は、トランスポザーゼをコードするベクターを提供する。他のベクターは、トランスポザーゼにより認識され、かつ目的の核酸フラグメント、たとえば、レポーター、選択マーカー、挿入のためのもしくは改変の鋳型としての外来性核酸、または１つもしくは複数のＴＡＬＥＮを有するトランスポゾンをコードする。したがって、細胞または胚には、いくつかの、たとえば、１〜約６個のベクターをトランスフェクトしてもよい。当業者であれば、明記された範囲内の範囲および値をすべて、たとえば、２、３、４、５、および６を意図していることをすぐに理解するであろう。より多くのベクターを使用してもよい。レポーターは、ＴＡＬＥＮにより改変がなされた細胞を同定するために使用してもよい。あるいは、選択マーカーは、選択マーカーを発現しない細胞または胚を破壊することによって、ＴＡＬＥＮにより改変された細胞の比率を改善するために使用してもよい。
【００３１】
本発明の一実施形態は、複数のベクターに接触させたまたはインジェクトされた細胞または胚の培養物である。第１のベクターは、ＴＡＬＥＮまたはＴＡＬＥＮペアを含む。あるいは、ｌｅｆｔ  ＴＡＬＥＮおよびｒｉｇｈｔ  ＴＡＬＥＮを独立に供給する２つのＴＡＬＥＮベクターが存在する。第２のベクターはレポーターを含む。レポーターは、非破壊的同定を可能にしてもよいし、または選択マーカーであってもよい。選択マーカーをコードするベクターは、レポーターベクターの代替手段として使用してもよいし、またはレポーターベクターと共に使用してもよい。別のベクターは外来性核酸をコードしてもよい。
【００３２】
ＴＡＬＥＮにより改変された細胞、胚または動物を作製するプロセスは、ＴＡＬＥＮに接触した細胞または胚についてレポーターの発現をアッセイすること、および遺伝子改変家畜類および／または偶蹄目の動物を作製するための方法または組成物において、その細胞または胚を使用することを含む。たとえば、初代細胞は細胞培養物から採取し、クローニングに使用してもよい。あるいは、初代細胞は培養物から採取し、クローン系統を作るためまたはその後のプロセスのため第２の培養物に加えてもよい。あるいは、レポーターを発現する胚または接合体は代理母動物に移植してもよいし、またはクローニングに使用してもよいのに対し、レポーターを発現しない他の胚または接合体はクローニングに使用しなくてもよい。いくつかの実施形態では、レポーターは、マーカーを発現する細胞または胚の選択に使用する選択マーカーである。
【００３３】
大きな染色体欠失および逆位；遺伝子改変動物
複数のＤＮＡ部位に対するＴＡＬＥＮを用いて実験を行った。各部位は、数千の塩基対離れていた。ＤＮＡは、部位間の全領域の欠失と再結合することができることが観察された。実施形態は、たとえば、１〜５メガベース、または染色体の５０％〜８０％、または約１００〜約１，０００，０００塩基対の距離離れた部位を含む。当業者であれば、明記された範囲内の範囲および値、たとえば、約１，０００〜約１０，０００塩基対、または約５００〜約５００，０００塩基対をすべて意図していることをすぐに理解するであろう。あるいは、外来性ＤＮＡは、外来性ＤＮＡの挿入、または鋳型による部位間のＤＮＡ修復のため細胞または胚に加えてもよい。複数の部位での改変を使用して、遺伝子改変された細胞、胚、偶蹄目の動物および家畜類を作製してもよい。実施例６は、数千塩基対のＤＮＡの欠失について記載し、末端の再結合が生化学的に確認される。
【００３４】
意外にも、離れた部位でＴＡＬＥＮ切断が起こると、ＴＡＬＥＮ標的間の全領域において高頻度の逆位も起きた。さらに驚いたことに、実施例６に詳述するように、これらの逆位は大きな忠実度で生じた。試験した逆位の４３のうち４１が５’接合部および３’接合部の両方で陽性であった。さらに、ＰＣＲ産物のシーケンシングから、欠失現象および逆位現象はどちらも、その接合部で付加または欠失されるヌクレオチドがごくわずかであることが確認された（図１１、１２）。これらの欠失または逆位を含む細胞または胚には、遺伝学のアッセイツールとして多くの用途がある。
【００３５】
これらの細胞は、動物、家畜類および動物モデルの作製にも有用である。大きな欠失は、遺伝子不活性化を引き起こす。さらに、たとえば、細胞、家畜類または動物モデルから欠失株を作製してもよい。突然変異を持つ生物と欠失株を交雑して野生型と比較すると、突然変異の遺伝子座の位置を迅速かつ手軽に特定し同定しやすくなる。欠失株は、こうした技術分野では周知であり、遺伝子のいくつかの欠失から作られた生物のセットを含む。欠失マッピングでは、遺伝子に点突然変異がある株と欠失株との交雑が行われる。２つの株間で組換えが起こり、野生型（＋）遺伝子が生じる場合、突然変異は欠失の領域内にあり得ない。組換えにより任意の野生型遺伝子が生じない場合、点突然変異および欠失が同じ一続きのＤＮＡ内に認められると結論するのが妥当である。これを用いて、たとえば、原因突然変異を同定したり、または量的形質遺伝子座の中にある多型を同定したりすることができる。
【００３６】
逆位を含む細胞、胚、家畜類、偶蹄目の動物および動物モデルは、生体または動物系統または動物品種の子孫の遺伝形質を固定するのにも有用である。組換えは典型的には減数分裂において対応する染色体の相同領域間で起こる。染色体領域の逆位は相同性を破壊し、減数分裂組換えを抑制する。本明細書に記載の方法および組成物を用いれば、こうした生物または動物を作製することができる。たとえば、ウシまたはブタの体細胞のＤＮＡをＴＡＬＥＮにより複数の遺伝子座で切断して逆位を含む細胞を単離してもよいし、またはレポーターを発現する細胞を、成功した逆位の有力な候補として使用してもよい。この細胞を使用して、減数分裂組換えが起きえない染色体領域を持つ動物をクローンしてもよい。あるいは、逆位は、複数のＴＡＬＥＮペアで複数の部位を処理した胚においても合理的頻度で起こると予想される。
【００３７】
本方法の一実施形態は、遺伝形質をコードするＤＮＡ領域を同定し、複数のＴＡＬＥＮを使用して各部位にコードされた形質の両側で細胞または胚のＤＮＡを切断することである。改変された細胞または胚は、遺伝子改変動物の作製に使用してもよい。本方法は、逆位を持つ遺伝子改変動物を単離することを含んでもよい。
【００３８】
アレルの移動
いくつかの家畜類の形質は、アレル、たとえば多型（大または小）、一塩基多型、欠失、挿入または他の変化に関係している。たとえば、ベルジアンブルー（Ｂｅｌｇｉａｎ  Ｂｌｕｅ）ウシ（ｃａｔｔｌｅ）由来のミオスタチンアレル（１１ｂｐ欠失）は、ウシ筋肉肥大表現型を引き起こすことでよく知られている。実施例７は、ベルジアンブルー（Ｂｅｌｇｉａｎ  Ｂｌｕｅ）アレルを用いて、相同性依存型修復（ＨＤＲ）により特定のアレルをある家畜品種から別の家畜品種に正確に移す方法を示す。ウシ線維芽細胞にアレルを導入したら、トランスジェニックウシ（ｃａｔｔｌｅ）の作製に直ちに使用してもよい。このアレルは、正常な発生を妨害するものではなく、本明細書に教示された方法により、他の遺伝子を破壊したり、または外来性遺伝子を組み込んだりすることなくアレルが正確に導入される。既に考察したように、本明細書に示した結果により、姉妹染色分体をＨＤＲ鋳型に使用した場合、家畜線維芽細胞のアレル変換の頻度は高く、したがってアレルが一方の姉妹染色分体に移入されると、多くの場合、ホモ接合になると予測され得ることが示される。
【００３９】
本発明の一実施形態は、アレルを第１の家畜類系統または品種から第２の家畜類系統または品種に移す方法であって、第１の家畜類系統／品種のアレルをコードする核酸の存在下で一対のＴＡＬＥＮにより第２の家畜類系統／品種の細胞または胚のＤＮＡを切断することを含む方法である。胚または細胞は、第１の系統／品種のアレルを持つ第２の系統／品種の動物の作製に使用してもよい。アレルをコードするＤＮＡは、相同性依存型修復の鋳型となる。それは、鋳型として、切片の両側のＤＮＡ部分と相同性があり、さらに所望のアレルを含む。本発明の実施形態は、複数のアレルをある品種から別の品種に移動することを含む。本明細書の他の箇所に記載したように、ＴＡＬＥＮは、タンパク質として送達しても、あるいは、核酸、たとえば、ｍＲＮＡまたはベクターによりコードされていてもよい。レポーターをさらに細胞または胚にトランスフェクトし、ＴＡＬＥＮにより改変された細胞を選択する根拠としてもよい。レポーターは非破壊的にアッセイしてもよく、および／または、選択マーカーを含んでもよい。品種という用語は、同種の外観、行動、および同じ種の他の動物または植物と区別する他の特徴を持つ家畜または植物のグループを意味する。特定の品種に属する動物は、当業者に公知である。
【００４０】
生物の集団または種は典型的には、様々な個体の中の各遺伝子座に複数のアレルを含む。遺伝子座のアレルの変化は、存在するアレル（多型）の数、または集団におけるヘテロ接合体の比率として測定可能である。たとえば、古典的遺伝学では、ヒトのＡＢＯ式血液型糖鎖抗原の遺伝子座で輸血の適合性を決定する３つのアレルＩＡ、ＩＢおよびＩＯが知られている。アレルとは、２つ以上の遺伝子の形態のうちの１つを意味する用語である。
【００４１】
家畜類の場合、多くのアレルが様々な形質、たとえば生産形質、体型形質、ワーカビリティー（ｗｏｒｋａｂｉｌｉｔｙ）形質および他の機能形質に連鎖することが知られている。当業者は、これらの形質のモニタリングおよび定量に慣れている。たとえば、Ｖｉｓｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｉｖｅｓｔｏｃｋ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，４０（１９９４）１２３−１３７、米国特許第７，７０９，２０６号明細書、米国特許出願公開第２００１／００１６３１５号明細書、米国特許出願公開第２０１１／００２３１４０号明細書、および米国特許出願公開第２００５／０１５３３１７号明細書を参照されたい。したがって、移されるアレルは、ある形質に連鎖してもよいし、または生産形質、体型形質、ワーカビリティー（ｗｏｒｋａｂｉｌｉｔｙ）形質、繁殖形質、マザリング（ｍｏｔｈｅｒｉｎｇ）形質および耐病形質からなる群の形質から選択してもよい。
【００４２】
遺伝子改変の文脈における天然のアレルという用語は、改変される生物と同じ種の、自然界に見出されるアレルを意味する。新規なアレルという用語は、非天然のアレルを意味する。ヤギに導入されたヒトアレルは新規なアレルである。合成アレルという用語は、自然界に見出されないアレルを意味する。このため天然のアレルは、交配できる種内に既に存在する変異である。さらに新規なアレルとは、交配できる種内に存在しないアレルである。
【００４３】
従来の繁殖プロセスによりアレルを１つの品種から別の品種に移動させるには、品種間で多くのアレルを交換する必要がある。減数分裂における組換えでは、必然的に品種間で遺伝子座が交換される。これに対し、ＴＡＬＥＮにより改変された家畜類および他の動物には減数分裂組換え現象がない。このため、ＴＡＬＥＮにより改変された動物は、有性生殖により誕生した動物と容易に区別することができる。
【００４４】
組成物およびキット
本発明はまた、たとえば、ＴＡＬＥＮをコードする核酸分子、ＴＡＬＥＮポリペプチド、こうした核酸分子もしくはポリペプチドを含む組成物、またはＴＡＬＥＮにより操作された細胞株を含む組成物およびキットを提供する。こうした品目は、たとえば、リサーチツールとして使用しても、または治療に使用してもよい。
【００４５】
リコンビナーゼ
本発明の実施形態は、単数または複数のＴＡＬＥＮをリコンビナーゼと共に投与することを含む。リコンビナーゼは、核酸フラグメントとフィラメントを形成し、実際に、細胞ＤＮＡを検索してその配列と実質的に相同なＤＮＡ配列を見つける。ＴＡＬＥＮ−リコンビナーゼ実施形態の一実施形態は、ＨＤＲの鋳型として働く核酸配列とリコンビナーゼを組み合わせることを含む。ＨＤＲ鋳型配列は、ＴＡＬＥＮ／ＴＡＬＥＮペアによる切断の標的となる部位と実質的な相同性がある。本明細書に記載するように、ＨＤＲ鋳型は、アレルの導入、インデルの作製、外来性ＤＮＡの挿入、または他の変化によりネイティブＤＮＡを変化させる。ＴＡＬＥＮは、タンパク質、ｍＲＮＡとしてまたはベクターを使用して、本明細書に記載の方法により細胞または胚に導入される。リコンビナーゼは、ＨＤＲと一緒になってフィラメントを形成し、細胞に導入される。リコンビナーゼおよび／またはリコンビナーゼと一緒になったＨＤＲ鋳型は、タンパク質、ｍＲＮＡとしてまたはリコンビナーゼをコードするベクターを用いて、細胞または胚に導入してもよい。米国特許出願公開第２０１１／００５９１６０号明細書（米国特許出願第１２／８６９，２３２号明細書）の開示内容は、あらゆる目的において本明細書に援用する。矛盾が生じた場合、本明細書を優先する。リコンビナーゼという用語は、細胞において比較的長いＤＮＡ二重鎖の間で比較的短いＤＮＡ断片の連結を酵素的に触媒する遺伝子組換え酵素をいう。リコンビナーゼとして、Ｃｒｅリコンビナーゼ、Ｈｉｎリコンビナーゼ、ＲｅｃＡ、ＲＡＤ５１、ＣｒｅおよびＦＬＰを挙げることができる。Ｃｒｅリコンビナーゼは、ｌｏｘＰ部位間でＤＮＡの部位特異的組換えを触媒するＰ１バクテリオファージ由来のＩ型トポイソメラーゼである。Ｈｉｎリコンビナーゼは、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）細菌に見られる１９８個のアミノ酸からなる２１ｋＤのタンパク質である。Ｈｉｎは、活性部位セリンに依存してＤＮＡの切断および組換えを惹起するＤＮＡインベルターゼのセリンリコンビナーゼファミリーに属する。ＲＡＤ５１はヒト遺伝子である。この遺伝子がコードするタンパク質は、ＤＮＡ二重鎖切断の修復を支援するＲＡＤ５１タンパク質ファミリーのメンバーである。ＲＡＤ５１ファミリーメンバーは、細菌のＲｅｃＡおよび酵母のＲａｄ５１と相同的である。Ｃｒｅリコンビナーゼは、実験室試験でＨＩＶにより挿入されたＤＮＡを感染細胞から除去することに成功した実験酵素である。この酵素は、ＨＩＶマーカーを同定するため選択的突然変異によりＣｒｅリコンビナーゼから得られた。ＨＩＶマーカーは、ｌｏｘＰ部位と接していないため、Ｃｒｅ−Ｌｏｘ組換えの試みは行われない。ＦＬＰは、パン酵母サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の２μのプラスミドに由来するフリッパーゼ組換え酵素（ＦＬＰまたはＦｌｐ）をいう。
【００４６】
ＲｅｃＡは、相同組換えによる二重鎖切断の修復において鎖交換を触媒するそのリコンビナーゼ活性で知られている（ＭｃＧｒｅｗ  ａｎｄ  Ｋｎｉｇｈｔ，２００３）Ｒａｄｄｉｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，１９８１；Ｓｅｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。ＲｅｃＡはまた、たとえば、ＬｅｘＡおよびλリプレッサータンパク質のタンパク質分解を触媒し、ＤＮＡ依存性ＡＴＰアーゼ活性を有することも示されている。電離放射線または他の何らかの損傷から二重鎖切断が起きた後、エキソヌクレアーゼがＤＮＡを５’末端から３’末端方向に分解し、それによりＤＮＡの一方の鎖を接触させる（Ｃｏｘ，１９９９；ＭｃＧｒｅｗ  ａｎｄ  Ｋｎｉｇｈｔ，２００３）。一本鎖ＤＮＡは、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）により安定化する。ＳＳＢの結合後、ＲｅｃＡは、一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡに結合し、螺旋状ヌクレオプロテインフィラメント（フィラメントまたはシナプス前フィラメントという）を形成する。ＤＮＡ修復において、ＲｅｃＡの相同性検索機能によりフィラメントは相同ＤＮＡに誘導され、相同塩基対合および鎖交換を触媒する。この結果、ＤＮＡヘテロ二本鎖が形成される。ストランドインベージョンの後、ＤＮＡポリメラーゼは、相同的ＤＮＡ鋳型に基づきｓｓＤＮＡを伸長させてＤＮＡ切断を修復し、クロスオーバー構造、すなわちホリデイジャンクションが形成される。ＲｅｃＡは、クロスオーバー構造の移動に関与する運動機能も示す（Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｓ，１９９９）。
【００４７】
リコンビナーゼ活性は、いくつかの異なる機能を有する。たとえば、リコンビナーゼ活性を持つポリペプチド配列は、一本鎖ＤＮＡに配列非特異的に結合してヌクレオプロテインフィラメントを形成することができる。こうしたリコンビナーゼ結合ヌクレオプロテインフィラメンは、二重鎖ＤＮＡ分子と配列非特異的に相互作用し、フィラメントの配列と相同な二重鎖分子の鎖を検索し、こうした配列を見つけると、二重鎖分子の鎖の一方を置き換えてフィラメントの配列と二重鎖分子の鎖の一方の相補配列と間で塩基対合を作ることができる。こうしたステップは、「シナプシス」と総称される。
【００４８】
ＲｅｃＡおよびＲｅｃＡ様タンパク質（多くの真核生物種ではＲａｄ５１という）は、種々の真核生物系で遺伝子ターゲティングおよび相同組換えについて調べられてきた。タバコ細胞では核移行シグナル（ＮＬＳ）を含む細菌ＲｅｃＡの発現が、相同組換えおよび体細胞染色体内組換え（相同染色体間の組換え）によるマイトマイシンＣ誘導性ＤＮＡ損傷の修復を３〜１０倍促進した（Ｒｅｉｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。タバコにＮＬＳＲｅｃＡが発現すると、姉妹染色分体交換を野生型レベルより２．４倍刺激することもできる（Ｒｅｉｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。哺乳動物体細胞では、ＮＬＳＲｅｃＡの過剰発現が、相同組換えによる遺伝子ターゲティングを１０倍刺激する（Ｓｈｃｈｅｒｂａｋｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。しかしながら、ヒト細胞では、ＲｅｃＡのヒトホモログ、ｈＲＡＤ５１の過剰発現は、抗生物質選択下、組換えを野生型レベルより２〜３倍刺激するにとどまる（Ｙａｎｅｚ  ａｎｄ  Ｐｏｒｔｅｒ，１９９９）。ゼブラフィッシュの場合、高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）のミュータント形態が、ｓｓＤＮＡ−ＲｅｃＡフィラメントを直接インジェクトすることにより低頻度で修正された（Ｃｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。また、Ｒａｄ５１エピスタシスグループのメンバーＲａｄ５２は、変異オリゴヌクレオチドを用いて、ゼブラフィッシュの一本鎖アニーリングおよび低レベル遺伝子破壊を促進する（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ａｎｄ  Ｄａｗｉｄ，２００５）。総合すると、これらの研究から、ＲｅｃＡまたはＲａｄ５１の異所性発現は、相同組換えを適度に刺激するものの、遺伝子ターゲティングに十分に有用であるようにはレベルを上昇させないことが示される。
【００４９】
以上のように、リコンビナーゼ活性は、以下に限定されるものではないが、一本鎖ＤＮＡ結合、シナプシス、相同性検索、一本鎖ＤＮＡによる二重鎖侵入、ヘテロ二本鎖形成、ＡＴＰ加水分解およびタンパク質分解を含む。原型リコンビナーゼは、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のＲｅｃＡタンパク質である。たとえば、米国特許第４，８８８，２７４号明細書を参照されたい。サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種およびプロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）種の原核生物ＲｅｃＡ様タンパク質も記載されている。サーマス・アクアティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）由来の耐熱性ＲｅｃＡタンパク質は、米国特許第５，５１０，４７３号明細書に記載されている。ＲｅｃＡのバクテリオファージＴ４ホモログ、ＵｖｓＸタンパク質も記載されている。リコンビナーゼ活性の変化したＲｅｃＡミュータントは、たとえば、米国特許第６，７７４，２１３号明細書；同第７，１７６，００７号明細書および同第７，２９４，４９４号明細書に記載されている。植物ＲｅｃＡホモログは、たとえば、米国特許第５，６７４，９９２号明細書；同第６，３８８，１６９号明細書および同第６，８０９，１８３号明細書に記載されている。リコンビナーゼ活性を含むＲｅｃＡフラグメントは、たとえば、米国特許第５，７３１，４１１号明細書に記載されている。リコンビナーゼ活性の増強されたミュータントＲｅｃＡタンパク質、たとえば、ＲｅｃＡ８０３も記載されている。たとえば、Ｍａｄｉｒａｊｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：６５９２−６５９６を参照されたい。
【００５０】
やはりリコンビナーゼ活性を有する真核生物ＲｅｃＡのホモログは、酵母サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）で最初に同定されたＲａｄ５１タンパク質である。Ｂｉｓｈｏｐ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｃｅｌｌ  ６９：４３９−５６  ａｎｄ  Ｓｈｉｎｏｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ，（１９９２）Ｃｅｌｌ：４５７−７０  Ａｂｏｕｓｓｅｋｈｒａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７２，３２２４−３２３４．Ｂａｓｉｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２，３２３５−３２４６。植物Ｒａｄ５１の配列は、米国特許第６，５４１，６８４号明細書；同第６，７２０，４７８号明細書；同第６，９０５，８５７号明細書および同第７，０３４，１１７号明細書に記載される。ＲｅｃＡと相同な別の酵母タンパク質にＤｍｃ１タンパク質がある。Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）以外の生物のＲｅｃＡ／Ｒａｄ５１ホモログも記載されている。Ｍｏｒｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６５７７−６５８０；Ｓｈｉｎｏｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．４：２３９−２４３；Ｈｅｙｅｒ（１９９４）Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ  ５０：２２３−２３３；Ｍａｅｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｇｅｎｅ  １６０：１９５−２００；米国特許第６，５４１，６８４号明細書および同第６，９０５，８５７号明細書。
【００５１】
本明細書では、「ＲｅｃＡ」または「ＲｅｃＡタンパク質」は、同じ機能、特に：（ｉ）その後ＤＮＡポリメラーゼによる伸長のため適切なオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをそれらと相同な標的に配置する能力；（ｉｉ）ＤＮＡ合成のため二本鎖核酸を形態的に調製する能力；および（ｉｉｉ）ＲｅｃＡ／オリゴヌクレオチドまたはＲｅｃＡ／ポリヌクレオチド複合体が効率的に相補配列を見つけて結合する能力、の全部または大部分を本質的に有するＲｅｃＡ様組換えタンパク質のファミリーをいう。最も研究の進んでいるＲｅｃＡタンパク質は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のものである。このタンパク質の最初のアレル型だけでなく、いくつかのミュータントＲｅｃＡ様タンパク質、たとえば、ＲｅｃＡ８０３が同定されている。さらに、多くの生物、たとえば、酵母、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、ヒトを含む哺乳動物、および植物もＲｅｃＡ様鎖転移タンパク質を有する。これらのタンパク質として、たとえば、Ｒｅｃ１、Ｒｅｃ２、Ｒａｄ５１、Ｒａｄ５１Ｂ、Ｒａｄ５１Ｃ、Ｒａｄ５１Ｄ、Ｒａｄ５１Ｅ、ＸＲＣＣ２およびＤＭＣ１が挙げられる。組換えタンパク質の一実施形態は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＲｅｃＡタンパク質である。あるいは、ＲｅｃＡタンパク質は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）のミュータントＲｅｃＡ−８０３タンパク質、別の細菌源のＲｅｃＡタンパク質または別の生物の相同組換えタンパク質であってもよい。
【００５２】
リコンビナーゼ活性を有するタンパク質に関する他の記載は、たとえば、本明細書に援用するＦｕｇｉｓａｗａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：７４７３；Ｈｓｉｅｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｃｅｌｌ  ４４：８８５；Ｈｓｉｅｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：５０８９；Ｆｉｓｈｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：３６８３；Ｃａｓｓｕｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０８：１０；Ｇａｎｅａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．７：３１２４；Ｍｏｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．：１１１０８；Ｋｅｅｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：３０５７；Ｋｉｍｉｅｃ（１９８４）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．４８：６７５；Ｋｉｍｅｉｃ（１９８６）Ｃｅｌｌ  ４４：５４５；Ｋｏｌｏｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：５５６０；Ｓｕｇｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：３６８３；Ｈａｌｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：２１４０３；Ｅｉｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：７４８１；ＭｃＣａｒｔｈｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８５４；ａｎｄ  Ｌｏｗｅｎｈａｕｐｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：２０５６８に掲載されている。さらにＢｒｅｎｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．４４：５２８も参照されたい。
【００５３】
リコンビナーゼ活性を有するタンパク質の例として、ｒｅｃＡ、ｒｅｃＡ８０３、ｕｖｓＸ、および他のｒｅｃＡミュータントおよびｒｅｃＡ様リコンビナーゼ（Ｒｏｃａ（１９９０）Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２５：４１５），（Ｋｏｌｏｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：５５６０；Ｔｉｓｈｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１：２５９３）、ＲｕｖＣ（Ｄｕｎｄｅｒｄａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：５０６）、ＤＳＴ２、ＫＥＭ１およびＸＲＮ１（Ｄｙｋｓｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１：２５８３）、ＳＴＰａ／ＤＳＴ１（Ｃｌａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１：２５７６）、ＨＰＰ−１（Ｍｏｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８８：９０６７）、他の真核生物のリコンビナーゼ（Ｂｉｓｈｏｐ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｃｅｌｌ  ６９：４３９；ａｎｄ  Ｓｈｉｎｏｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｃｅｌｌ  ６９：４５７）が挙げられる。参考文献については本明細書に援用する。
【００５４】
リコンビナーゼ活性を有するインビトロ進化したタンパク質は、米国特許第６，６８６，５１５号明細書に記載されている。さらにリコンビナーゼに関する公報には、たとえば、米国特許第７，７３２，５８５号明細書；同第７，３６１，６４１号明細書および同第７，１４４，７３４号明細書がある。リコンビナーゼの概説については、Ｃｏｘ（２００１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：８１７３−８１８０を参照されたい。
【００５５】
ヌクレオプロテインフィラメントまたは「フィラメント」が形成されてもよい。リコンビナーゼと構造体を形成する文脈におけるフィラメントという用語は、こうした分野の当業者に公知の用語である。そのように形成されたヌクレオプロテインフィラメントはその後、たとえば、別の核酸と接触させても、または細胞に導入してもよい。フィラメントが、リコンビナーゼ活性を有するポリペプチド配列および核酸を含むヌクレオプロテインフィラメントを形成する方法は、当該技術分野においてよく知られている。たとえば、Ｃｕｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｍａｒｉｎｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５：１７４−１８４、および米国特許第４，８８８，２７４号明細書；同第５，７６３，２４０号明細書；同第５，９４８，６５３号明細書および同第７，１９９，２８１号明細書を参照されたい。これらの開示内容は、リコンビナーゼを核酸に結合してヌクレオプロテインフィラメントを形成する例示的な技術を開示することを目的として援用する。
【００５６】
一般に、リコンビナーゼ活性を有する分子は、線状一本鎖核酸と接触させる。線状一本鎖核酸はプローブであってもよい。こうした一本鎖核酸の調製方法は知られている。反応混合物は典型的には、マグネシウムイオンを含む。任意に、反応混合物は緩衝化し、さらに任意にＡＴＰ、ｄＡＴＰまたは非加水分解性ＡＴＰアナログ、たとえば、γ−チオ−ＡＴＰ（ＡＴＰ−γ−Ｓ）またはγ−チオ−ＧＴＰ（ＧＴＰ−γ−Ｓ）をさらに含んでもよい。反応混合物は任意に、ＡＴＰ産生系をさらに含んでもよい。二重鎖ＤＮＡ分子は、フィラメント形成の前、あるいは、フィラメント形成中に変性させることができる（たとえば、熱またはアルカリにより）。リコンビナーゼと核酸とのモル比の最適化は、当該技術分野の技術の範囲内である。たとえば、一定量の核酸に一連の異なる濃度のリコンビナーゼを加え、アガロースゲルまたはアクリルアミドゲルにおける移動度によりフィラメントの形成をアッセイしてもよい。結合タンパク質は、ポリヌクレオチドの電気泳動移動度を遅延させるため、核酸の移動度の遅延によりフィラメントの形成が証明される。最大の遅延度合い、または移動度の遅延した状態で移動した最大量の核酸を使用すれば、最適なリコンビナーゼ：核酸比を示すことができる。タンパク質−ＤＮＡ結合も、ポリヌクレオチドがニトロセルロースに結合する能力を測定することにより定量することができる。
【００５７】
ＴＡＬＥＮ
ＴＡＬＥＮという用語は、本明細書で使用する場合、広義であり、別のＴＡＬＥＮの援助なしに二重鎖ＤＮＡを切断できる単量体ＴＡＬＥＮを含む。ＴＡＬＥＮという用語は、協力して同じ部位でＤＮＡを切断するように操作されたＴＡＬＥＮのペアの一方または両方をいうのにも使用される。協力する各ＴＡＬＥＮは、ＤＮＡの左右方向を参照してｌｅｆｔ−ＴＡＬＥＮおよびｒｉｇｈｔ−ＴＡＬＥＮということがある。
【００５８】
Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２９：１４３）は、ＴＡＬ切断変異体をＦｏｋＩヌクレアーゼの触媒ドメインに連結することにより部位特異的ヌクレアーゼ構築物のＴＡＬＥＮを作製したことを報告した。得られたＴＡＬＥＮは、不死化ヒト細胞において真核生物の２つの主要なＤＮＡ修復経路、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）および相同組換え修復により遺伝子改変を誘導することが示された。ＴＡＬＥＮは、特異的に結合するように操作してもよい。特異的結合とは、生物学の技術分野で一般に用いられているように、非標的組織と比較して相対的に高い親和性で分子が標的に結合することをいい、一般に複数の非共有結合性相互作用、たとえば静電的相互作用、ファンデルワールス相互作用、水素結合および同種のものを必要とする。特異的結合相互作用は、抗体−抗原結合、酵素−基質結合および特異的に結合したタンパク質−受容体相互作用を特徴付ける。
【００５９】
ＴＡＬのコードが報告されており（国際公開第２０１１／０７２２４６号パンフレット）、そこでは各ＤＮＡ結合リピートが標的ＤＮＡ配列において１つの塩基対の認識に関わっている。残基は、ＤＮＡ配列を標的とするように構築することができ、（ａ）Ｃ／Ｇの認識にはＨＤ；（ｂ）Ａ／Ｔの認識にはＮＩ；（ｃ）Ｔ／Ａの認識にはＮＧ；（ｄ）Ｃ／ＧまたはＡ／ＴまたはＴ／ＡまたはＧ／Ｃの認識にはＮＳ；（ｅ）Ｇ／ＣまたはＡ／Ｔの３０認識にはＮＮ；（ｆ）Ｔ／Ａの認識にはＩＧ；（ｇ）Ｃ／Ｇの認識にはＮ；（ｈ）Ｃ／ＧまたはＴ／Ａの認識にはＨＧ；（ｉ）Ｔ／Ａの認識にはＨ；および（ｊ）Ｇ／Ｃの認識にはＮＫとなる。手短に言えば、ＴＡＬＥＮが結合する標的部位を決定し、ヌクレアーゼと標的部位を認識する一連のＲＶＤとを含む融合分子を作製する。結合すると、ヌクレアーゼはＤＮＡを切断するため、細胞修復機構が作動して切断末端で遺伝子改変を行う。ＴＡＬＥＮという用語は、転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクター結合ドメインおよびヌクレアーゼドメインを含むタンパク質を意味し、それ自体で機能する単量体ＴＡＬＥＮのほか、別の単量体ＴＡＬＥＮとの２量体化を必要とする他のＴＡＬＥＮも含む。２量体化により、２つの単量体ＴＡＬＥＮが同一である場合、ホモ２量体ＴＡＬＥＮが生じ得、あるいは、単量体ＴＡＬＥＮが異なる場合、ヘテロ２量体ＴＡＬＥＮが生じ得る。
【００６０】
いくつかの実施形態では、単量体ＴＡＬＥＮを使用してもよい。ＴＡＬＥＮは典型的には、スペーサーを含む２つの部分からなる認識部位において２量体として機能するため、２つのＴＡＬエフェクタードメインをそれぞれＦｏｋＩ制限酵素の触媒ドメインに融合し、得られた各ＴＡＬＥＮのＤＮＡ認識部位はスペーサー配列により隔てられている。そして各ＴＡＬＥＮ単量体が認識部位に結合すると、ＦｏｋＩが２量体化し、スペーサー内で二重鎖切断を行うことができる。しかしながら、単量体ＴＡＬＥＮはまた、機能するのに２量体化を必要としないヌクレアーゼに１つのＴＡＬエフェクターを融合するように構築してもよい。こうしたヌクレアーゼの１つは、たとえば、２つの単量体が単一のポリペプチドとして発現するＦｏｋＩの単鎖変異体である。他の天然または操作された単量体ヌクレアーゼもこの役割を果たすことができる。単量体ＴＡＬＥＮに使用されるＤＮＡ認識ドメインは、天然ＴＡＬエフェクターから得ることができる。あるいは、ＤＮＡ認識ドメインは、特定のＤＮＡ標的を認識するように操作してもよい。操作された単鎖ＴＡＬＥＮは、操作されたＤＮＡ認識ドメインを１つしか必要としないので、より構築および配置しやすい場合がある。２量体のＤＮＡ配列特異的ヌクレアーゼは、２つの異なるＤＮＡ結合ドメイン（たとえば、ＴＡＬエフェクター結合ドメイン１つと、別の種類の分子由来の結合ドメイン１つ）を使用して作製してもよい。ＴＡＬＥＮは、スペーサーを含む２つの部分からなる認識部位において２量体として機能し得る。また、このヌクレアーゼ構築物は、たとえば、１つのＴＡＬＥＮ単量体および１つのジンクフィンガーヌクレアーゼ単量体から作製される標的特異的ヌクレアーゼに使用してもよい。こうした場合には、ＴＡＬＥＮ単量体およびジンクフィンガーヌクレアーゼ単量体のＤＮＡ認識部位は、適切な長さのスペーサーにより隔ててもよい。２つの単量体の結合により、ＦｏｋＩが２量体化してスペーサー配列内に二重鎖切断を行うことができる。また、ジンクフィンガー以外のＤＮＡ結合ドメイン、たとえばホメオドメイン、ｍｙｂリピートまたはロイシンジッパーをＦｏｋＩに融合し、機能的ヌクレアーゼを作製するためＴＡＬＥＮ単量体のパートナーとしてもよい。
【００６１】
いくつかの実施形態では、ＴＡＬエフェクターを使用して他のタンパク質ドメイン（たとえば、非ヌクレアーゼタンパク質ドメイン）を特定のヌクレオチド配列にターゲティングしてもよい。たとえば、ＴＡＬエフェクターは、以下に限定されるものではないが、ＤＮＡ２０相互作用酵素（たとえば、メチラーゼ、トポイソメラーゼ、インテグラーゼ、トランスポザーゼまたはリガーゼ）、転写アクチベーターもしくはリプレッサー、またはヒストンなど他のタンパク質と相互作用したり、改変したりするタンパク質由来のタンパク質ドメインに連鎖してもよい。こうしたＴＡＬエフェクター融合体の用途には、たとえば、エピジェネティックな調節エレメントの作製または改変、ＤＮＡにおける部位特異的挿入、欠失または修復の作製、遺伝子発現の制御およびクロマチン構造の改変がある。
【００６２】
標的配列のスペーサーは、ＴＡＬＥＮの特異性および活性を調節するように選択しても、または変化させてもよい。スペーサー長の柔軟性から、高い特異性で特定の配列を標的とするようにスペーサー長を選択することができることが示される。さらに、様々なスペーサー長で活性の差異が観察されてきたことから、スペーサー長は、ＴＡＬＥＮ活性の所望のレベルを達成するように選択することもできることが示される。
【００６３】
ヌクレアーゼという用語は、エキソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼを含む。エンドヌクレアーゼという用語は、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子内、好ましくはＤＮＡ分子内の核酸間の結合の加水分解（切断）を触媒できる任意の野生型または変異体酵素をいう。エンドヌクレアーゼの非限定的な例として、ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼ、たとえばＦｏｋＩ、ＨｈａＩ、ＨｉｎｄｌＩＩ、ＮｏｔＩ、ＢｂｖＣｌ、ＥｃｏＲＩ、ＢｇｌＩＩおよびＡｌｗＩが挙げられる。エンドヌクレアーゼは、典型的には約１２〜４５塩基対（ｂｐ）長、一層好ましくは１４〜４５ｂｐのポリヌクレオチド認識部位を有する場合のレアカットエンドヌクレアーゼをさらに含む。レアカットエンドヌクレアーゼは、規定の遺伝子座でＤＮＡ二重鎖切断（ＤＳＢ）を誘導する。レアカットエンドヌクレアーゼは、たとえばホーミングエンドヌクレアーゼ、操作されたジンクフィンガードメインとＦｏｋＩなどの制限酵素の触媒ドメインとの融合により生じるキメラジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、または化学エンドヌクレアーゼであってもよい。化学エンドヌクレアーゼでは、化学切断体またはペプチド性切断体を核酸のポリマーまたは特異的標的配列を認識する別のＤＮＡにコンジュゲートすることにより、切断活性を特異的配列にターゲティングする。化学エンドヌクレアーゼは、特異的ＤＮＡ配列に結合することが知られている、オルトフェナントロリンのコンジュゲートのような合成ヌクレアーゼ、ＤＮＡ切断分子、および三重鎖形成オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）をさらに包含する。こうした化学エンドヌクレアーゼは、本発明による「エンドヌクレアーゼ」という用語に包含される。こうしたエンドヌクレアーゼの例として、Ｉ−Ｓｅｅ  Ｉ、Ｉ−Ｃｈｕ  Ｌ  Ｉ−Ｃｒｅ  Ｉ、Ｉ−Ｃｓｍ  Ｉ、ＰＩ−Ｓｅｅ  Ｌ  ＰＩ−Ｔｔｉ  Ｌ  ＰＩ−Ｍｔｕ  Ｉ、Ｉ−Ｃｅｕ  Ｉ、Ｉ−Ｓｅｅ  ＩＬ  １−  Ｓｅｅ  ＩＩＩ、ＨＯ、ＰＩ−Ｃｉｖ  Ｉ、ＰＩ−Ｃｔｒ  Ｌ  ＰＩ−Ａａｅ  Ｉ、ＰＩ−Ｂｓｕ  Ｉ、ＰＩ−Ｄｈａ  Ｉ、ＰＩ−Ｄｒａ  Ｌ  ＰＩ−Ｍａｖ  Ｌ  ＰＩ−Ｍｅｈ  Ｉ、ＰＩ−Ｍｆｕ  Ｌ  ＰＩ−Ｍｆｌ  Ｉ、ＰＩ−Ｍｇａ  Ｌ  ＰＩ−Ｍｇｏ  Ｉ、ＰＩ−Ｍｉｎ  Ｌ  ＰＩ−Ｍｋａ  Ｌ  ＰＩ−Ｍｌｅ  Ｉ、ＰＩ−Ｍｍａ  Ｉ、ＰＩ−  ３０  Ｍｓｈ  Ｌ  ＰＩ−Ｍｓｍ  Ｉ、ＰＩ−Ｍｔｈ  Ｉ、ＰＩ−Ｍｔｕ  Ｉ、ＰＩ−Ｍｘｅ  Ｉ、ＰＩ−Ｎｐｕ  Ｉ、ＰＩ−Ｐｆｕ  Ｌ  ＰＩ−Ｒｍａ  Ｉ、ＰＩ−Ｓｐｂ  Ｉ、ＰＩ−Ｓｓｐ  Ｌ  ＰＩ−Ｆａｅ  Ｌ  ＰＩ−Ｍｊａ  Ｉ、ＰＩ−Ｐｈｏ  Ｌ  ＰＩ−Ｔａｇ  Ｌ  ＰＩ−Ｔｈｙ  Ｉ、ＰＩ−Ｔｋｏ  Ｉ、ＰＩ−Ｔｓｐ  Ｉ、Ｉ−ＭｓｏＩが挙げられる。
【００６４】
遺伝子改変動物
核酸コンストラクトを非ヒト動物に導入して、核酸コンストラクトがゲノムに組み込まれたファウンダー系統を作製するには、当該技術分野において公知の様々な技術を使用することができる。こうした技術には、以下に限定されるものではないが、前核へのマイクロインジェクション（米国特許第４，８７３，１９１号明細書）、レトロウイルスによる生殖系列への遺伝子導入（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｕｔｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２，６１４８−１６５２）、胚性幹細胞への遺伝子ターゲティング（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｃｅｌｌ  ５６，３１３−３２１）、胚のエレクトロポレーション（Ｌｏ（１９８３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３，１８０３−１８１４）、経精巣遺伝子導入（Ｌａｖｉｔｒａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９，１４２３０−１４２３５；Ｌａｖｉｔｒａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．１８，１９−２３）、および体細胞、たとえば卵丘もしくは乳腺細胞または成体、胎生もしくは胚性幹細胞のインビトロ形質転換後の核移植（Ｗｉｌｍｕｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  ３８５，８１０−８１３；ａｎｄ  Ｗａｋａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  ３９４，３６９−３７４）がある。前核へのマイクロインジェクション、経精巣遺伝子導入および体細胞核移植は、特に有用な技術である。
【００６５】
典型的には、前核へのマイクロインジェクションの場合、核酸コンストラクトを受精卵に導入する。精子頭部および卵由来の遺伝子材料を含む前核は原形質内で見えるため、１または２細胞期の受精卵を使用する。前核期の受精卵は、インビトロまたはインビボ（すなわち、ドナー動物の卵管から回収する）で採取することができる。インビトロ受精卵は、以下の通り作製することができる。たとえば、ブタ（ｓｗｉｎｅ）卵巣を屠殺場で採取し、輸送中２２〜２８℃に維持する。卵巣は、卵胞吸引のため洗浄し、単離してもよく、１８ゲージ針を用いて真空下で４〜８ｍｍの範囲の卵胞を５０ｍＬのコニカル遠心管に吸引すればよい。卵胞液および吸引した卵母細胞は、市販のＴＬ−ＨＥＰＥＳ（Ｍｉｎｉｔｕｂｅ，Ｖｅｒｏｎａ，ＷＩ）でプレフィルターに通してリンスしてもよい。緻密な卵丘細胞塊に囲まれた卵母細胞を選択し、０．１ｍｇ／ｍＬのシステイン、１０ｎｇ／ｍＬの上皮増殖因子、１０％ブタ卵胞液、５０μＭの２−メルカプトエタノール、０．５ｍｇ／ｍｌのｃＡＭＰ、各々１０ＩＵ／ｍＬの妊馬血清ゴナドトロピン（ＰＭＳＧ）およびヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）を補充したＴＣＭ−１９９  ＯＯＣＹＴＥ  ＭＡＴＵＲＡＴＩＯＮ  ＭＥＤＩＵＭ（Ｍｉｎｉｔｕｂｅ，Ｖｅｒｏｎａ，ＷＩ）に３８．７℃、５％ＣＯ２で加湿空気中、約２２時間置けばよい。その後、卵母細胞は、ｃＡＭＰ、ＰＭＳＧまたはｈＣＧを含まない新鮮なＴＣＭ−１９９  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｍｅｄｉｕｍに移し、さらに２２時間インキュベートする。０．１％ヒアルロニダーゼ中、１分間ボルテックスすれば、成熟した卵母細胞からその卵丘細胞を取り除くことができる。
【００６６】
ブタ（ｓｗｉｎｅ）の場合、成熟卵母細胞は、Ｍｉｎｉｔｕｂｅ製５ウェル受精用ディッシュを用いて５００μｌのＭｉｎｉｔｕｂｅ  ＰＯＲＣＰＲＯ  ＩＶＦ  ＭＥＤＩＵＭ  ＳＹＳＴＥＭ（Ｍｉｎｉｔｕｂｅ，Ｖｅｒｏｎａ，ＷＩ）で受精させればよい。インビトロ受精（ＩＶＦ）を行うには、採取したばかりのまたは凍結雄ブタ精液を洗浄し、ＰＯＲＣＰＲＯ  ＩＶＦ  Ｍｅｄｉｕｍに４×１０５精子になるように再懸濁してもよい。精子濃度は、コンピューター支援精液解析（ＳＰＥＲＭＶＩＳＩＯＮ，Ｍｉｎｉｔｕｂｅ，Ｖｅｒｏｎａ，ＷＩ）により解析することができる。最終的なインビトロ授精は、雄ブタに応じて約４０運動精子／卵母細胞の最終濃度、１０μｌの量で行えばよい。授精卵母細胞をすべて３８．７℃、５．０％ＣＯ２雰囲気で６時間インキュベートする。授精から６時間後、推定される接合体をＮＣＳＵ−２３で２回洗浄し、０．５ｍＬの同じ培地に移してもよい。この系は通常、大部分の雄ブタにおいて２０〜３０％胚盤胞を作製することができ、多精受精率は１０〜３０％である。
【００６７】
直線化した核酸コンストラクトを前核の１つにインジェクトしてもよい。次いでインジェクトされた卵をレシピエント雌に（たとえば、レシピエント雌の卵管に）移し、レシピエント雌で発育させ、トランスジェニック動物を作製することができる。特に、インビトロ受精胚は、１５，０００×ｇで５分間遠心して脂質を沈降させ、前核を可視化してもよい。胚は、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ＦＥＭＴＯＪＥＴ注射器を用いてインジェクトしてもよく、胚盤胞になるにまで培養すればよい。胚の卵割および胚盤胞形成の割合ならびに品質を記録してもよい。
【００６８】
胚は、非同調性レシピエントの子宮に外科的に移植してもよい。典型的には、５．５インチＴＯＭＣＡＴ（登録商標）カテーテルを使用して１００〜２００（たとえば、１５０〜２００）個の胚を卵管の膨大部−峡部接合部に注入する。手術後、妊娠のリアルタイム超音波検査を行ってもよい。
【００６９】
体細胞核移植では、上述の核酸コンストラクトを含むトランスジェニック偶蹄目の動物細胞（たとえば、トランスジェニックブタ細胞またはウシ細胞）、たとえば胚割球、胎仔線維芽細胞、成体耳部線維芽細胞または顆粒膜細胞腫を除核卵母細胞に導入して融合細胞を樹立してもよい。卵母細胞は、極体近傍の透明帯部分切開後、切開部から細胞質を押し出すことにより除核することができる。典型的には、面取り加工を施した先端の鋭いインジェクションピペットを使用して、トランスジェニック細胞を第２減数分裂時で停止した除核卵母細胞にインジェクトする。慣習として、第２減数分裂時で停止した卵母細胞を「卵」ということがある。ブタまたはウシ胚の作製後（たとえば、卵母細胞を融合および活性化することにより）、活性化から約２０〜２４時間後、胚をレシピエント雌の卵管に移植する。たとえば、Ｃｉｂｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８０，１２５６−１２５８および米国特許第６，５４８，７４１号明細書を参照されたい。ブタの場合、胚の移植から約２０〜２１日後にレシピエント雌の妊娠を確認してもよい。
【００７０】
標準的な繁殖技術を用いて、最初のヘテロ接合性ファウンダー動物から標的核酸のホモ接合体である動物を作製することができる。しかしながら、ホモ接合性を必要としない場合がある。本明細書に記載のトランスジェニックブタは、関心を持つ他のブタと交配してもよい。
【００７１】
いくつかの実施形態では、目的の核酸および選択可能なマーカーは、別々のトランスポゾン上にあり、選択可能なマーカーを含むトランスポゾンの量が目的の核酸を含むトランスポゾンを大きく上回る（５〜１０倍過剰）同等でない量で胚あるいは細胞のいずれかに供給されてもよい。目的の核酸を発現するトランスジェニック細胞または動物は、選択可能なマーカーの存在および発現に基づき単離することができる。トランスポゾンは正確かつ非連鎖的（独立した転位現象）にゲノムに組み込まれるため、目的の核酸および選択可能なマーカーは遺伝的に連鎖しておらず、標準的な繁殖を介した遺伝的分離により容易に分離することができる。このため、その後の世代において選択可能なマーカーを保持すること（公共の安全の立場からある程度懸念される問題）を強いられないトランスジェニック動物を作製することができる。
【００７２】
トランスジェニック動物が作製されたら、標準的な技術を用いて標的核酸の発現をアッセイしてもよい。最初のスクリーニングは、サザンブロット解析によりコンストラクトが組み込まれたか否かを判定することにより達成することができる。サザン解析の説明については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ；ＮＹのセクション９．３７〜９．５２を参照されたい。さらに最初のスクリーニングには、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を使用してもよい。ＰＣＲとは、標的核酸を増幅する手順または技術をいう。一般に、目的の領域または目的の領域を超える領域の末端の配列情報を利用して、増幅する鋳型の逆鎖と配列が同一または類似しているオリゴヌクレオチドプライマーを設計する。ＰＣＲを使用すれば、全ゲノムＤＮＡまたは全細胞ＲＮＡの配列を含むＤＮＡおよびＲＮＡの特定の配列を増幅することができる。プライマーは典型的には１４〜４０ヌクレオチド長であるが、１０ヌクレオチド長から数百ヌクレオチド長の範囲であってもよい。ＰＣＲについては、たとえばＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｅｄ．Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ  ａｎｄ  Ｄｖｅｋｓｌｅｒ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９５に記載されている。また、核酸は、リガーゼ連鎖反応法、鎖置換増幅法、自己保持配列複製法またはｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｅｄによっても増幅することができる。たとえば、Ｌｅｗｉｓ（１９９２）Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｎｅｗｓ  １２，１；Ｇｕａｔｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：１８７４；ａｎｄ  Ｗｅｉｓｓ（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１２９２を参照されたい。胚は胚盤胞期に、ＰＣＲ、サザンハイブリダイゼーションおよびｓｐｌｉｎｋｅｒｅｔｔｅ  ＰＣＲによる解析用に個々に処理してもよい（たとえば、Ｄｕｐｕｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（２００２）９９：４４９５を参照されたい）。
【００７３】
トランスジェニックブタの組織のポリペプチドをコードする核酸配列の発現は、たとえば、動物から採取した組織サンプルのノーザンブロット解析、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション解析、ウエスタン解析、酵素免疫測定法などのイムノアッセイ、および逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を含む技術を用いて評価することができる。
【００７４】
ベクターおよび核酸
ノックアウトのために、または他の目的で遺伝子の発現を得るために、種々の核酸を偶蹄目の動物細胞または他の細胞に導入してもよい。トランスジェニック動物の作製に使用することができる核酸コンストラクトは、標的核酸配列を含む。本明細書で使用する場合、核酸という用語は、ＤＮＡ、ＲＮＡおよび核酸アナログ、ならびに二重鎖または一本鎖（すなわち、センスまたはアンチセンス一本鎖）の核酸を含む。核酸アナログは、たとえば、核酸の安定性、ハイブリダイゼーションまたは溶解性を向上させるため塩基部分、糖部分またはリン酸骨格を修飾してもよい。塩基部分の修飾には、デオキシチミジンのデオキシウリジンと、デオキシシチジンの５−メチル−２’−デオキシシチジンおよび５−ブロモ−２’−デオキシシチジンとがある。糖部分の修飾には、２’−Ｏ−メチルまたは２’−Ｏ−アリル糖を形成するためのリボース糖の２’ヒドロキシルの修飾がある。デオキシリボースリン酸骨格は、塩基部分がそれぞれ６員のモルホリノ環に連結されたモルホリノ核酸、またはデオキシリン酸骨格が偽ペプチド骨格で置換され、４つの塩基が保持されたペプチド核酸が得られるように修飾してもよい。Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｅｒ（１９９７）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．７（３）：１８７；ａｎｄ  Ｈｙｒｕｐ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｂｉｏｏｒｇａｎ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４：５を参照されたい。さらに、デオキシリン酸骨格は、たとえば、ホスホロチオアートまたはホスホロジチオアート骨格、ホスホロアミダイトまたはアルキルホスホトリエステル骨格で置換してもよい。
【００７５】
標的核酸配列は、プロモーターなどの調節領域に作動可能に連結してもよい。調節領域は、ブタの調節領域であってもよいし、または他の種由来であってもよい。本明細書で使用する場合、作動可能に連結されたとは、核酸配列に対して調節領域が、標的核酸の転写を可能にするまたは促進するように配置されていることをいう。
【００７６】
どのような種類のプロモーターを標的核酸配列に作動可能に連結してもよい。プロモーターの例として、以下に限定されるものではないが、組織特異的プロモーター、構成的プロモーター、および特定の刺激に応答するまたは応答しないプロモーターが挙げられる。好適な組織特異的プロモーターは、β細胞で核酸転写物を優先的に発現することができ、たとえば、ヒトインスリンプロモーターが挙げられる。他の組織特異的プロモーターは、たとえば、肝実質細胞または心臓組織で優先的に発現することができ、それぞれアルブミンプロモーターまたはα−ミオシン重鎖プロモーターを挙げることができる。他の実施形態では、組織または時期特異性をあまり持たずに核酸分子の発現を促進するプロモーター（すなわち、構成的プロモーター）を使用してもよい。たとえば、β−アクチンプロモーター、たとえばニワトリβ−アクチン遺伝子プロモーター、ユビキチンプロモーター、ｍｉｎｉＣＡＧｓプロモーター、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモーターまたは３−ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターのほか、ウイルスプロモーター、たとえば単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーターまたはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを使用してもよい。いくつかの実施形態では、ニワトリβアクチン遺伝子プロモーターとＣＭＶエンハンサーとの融合体をプロモーターとして使用する。たとえば、Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１２：５６３；ａｎｄ  Ｋｉｗａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．７：８２１を参照されたい。
【００７７】
誘導性プロモーターの例には、核酸の転写の制御に使用することができるテトラサイクリン（ｔｅｔ）−ｏｎプロモーター系がある。この系では、変異型Ｔｅｔリプレッサー（ＴｅｔＲ）を単純ヘルペスウイルスのＶＰ１６トランス活性化因子タンパク質の活性化ドメインに融合して、ｔｅｔまたはドキシサイクリン（ｄｏｘ）により調節されるテトラサイクリン制御転写活性化因子（ｔＴＡ）を作製する。抗生物質の非存在下では転写がほとんど見られないのに対し、ｔｅｔまたはｄｏｘの存在下では転写が誘導される。別の誘導系には、エクジソンまたはラパマイシン系がある。エクジソンは、エクジソン受容体のヘテロ２量体およびｕｌｔｒａｓｐｉｒａｃｌｅ遺伝子（ＵＳＰ）の産生によりその産生が制御される昆虫の脱皮ホルモンである。発現は、エクジソンまたはエクジソンのアナログ、たとえばムリステロンＡにより処理することで誘導される。動物に投与して誘導系を誘発する作用物質は、誘導剤という。
【００７８】
核酸コンストラクトに有用であり得る他の調節領域には、ポリアデニル化配列、翻訳制御配列（たとえば、配列内リボソーム進入部位、ＩＲＥＳ）、エンハンサー、誘導エレメントまたはイントロンがあるが、これに限定されるものではない。こうした調節領域は、必要でない場合もあるが、ｍＲＮＡの転写、安定性、翻訳効率または同種のものに影響を与えることにより発現を増強することがある。こうした調節領域は、単数または複数の細胞内で核酸の最適な発現を得るのに望ましいように核酸コンストラクトに組み込むことができる。しかしながら、こうした追加エレメントを用いずに十分な発現が得られることもある。
【００７９】
シグナルペプチドまたは選択可能なマーカーをコードする核酸コンストラクトを使用してもよい。シグナルペプチドは、コードされたポリペプチドが特定の細胞部位（たとえば、細胞表面）に移行するように使用することができる。選択可能なマーカーの非限定的な例には、ピューロマイシン、ガンシクロビル、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ、Ｇ４１８、ＡＰＨ）、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、ハイグロマイシン−Ｂ−ホスフトランスフェラーゼ、チミジンキナーゼ（ＴＫ）およびキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ）がある。こうしたマーカーは、培養における安定な形質転換体の選択に有用である。他の選択可能なマーカーとして、蛍光ポリペプチド、たとえば緑色蛍光タンパク質または黄色蛍光タンパク質が挙げられる。
【００８０】
いくつかの実施形態では、選択可能なマーカーをコードする配列を、たとえば、ＣｒｅまたはＦｌｐなどのリコンビナーゼの認識配列で挟んでもよい。たとえば、選択可能なマーカーは、選択可能なマーカーがコンストラクトから切り出されるようにｌｏｘＰ認識部位（Ｃｒｅリコンビナーゼにより認識される３４ｂｐの認識部位）、またはＦＲＴ認識部位で挟んでもよい。Ｃｒｅ／ｌｏｘ技術の概説には、Ｏｒｂａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９９２）８９：６８６１、およびＢｒａｎｄ  ａｎｄ  Ｄｙｍｅｃｋｉ，Ｄｅｖ．Ｃｅｌｌ（２００４）６：７を参照されたい。また、選択可能なマーカー遺伝子を間に挟んだＣｒｅまたはＦｌｐ活性化導入遺伝子を含むトランスポゾンを使用して、導入遺伝子の条件発現によりトランスジェニック動物を得てもよい。たとえば、マーカー／導入遺伝子の発現を誘導するプロモーターは、Ｆ０動物（たとえば、ブタ）においてマーカーがユビキタスにまたは組織特異的に発現するのであれば、ユビキタスプロモーターまたは組織特異的プロモーターのどちらでもよい。導入遺伝子の組織特異的活性化は、たとえば、マーカーを間に挟んだ導入遺伝子をユビキタスに発現するブタを、ＣｒｅまたはＦｌｐを組織特異的に発現するブタと交配するか、またはマーカーを間に挟んだ導入遺伝子を組織特異的に発現するブタをＣｒｅまたはＦｌｐリコンビナーゼをユビキタスに発現するブタと交配することにより達成することができる。導入遺伝子の制御された発現またはマーカーの制御された切り出しにより、導入遺伝子の発現が可能になる。
【００８１】
いくつかの実施形態では、標的核酸はポリペプチドをコードする。ポリペプチドをコードする核酸配列は、コードされたポリペプチドのその後の操作を行いやすいように（たとえば、位置決定または検出を行いやすいように）設計された「タグ」をコードするタグ配列を含んでもよい。タグ配列は、コードされるタグがポリペプチドのカルボキシル末端またはアミノ末端のどちらかに位置するようにポリペプチドをコードする核酸配列に挿入してもよい。コードされるタグの非限定的な例には、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）およびＦＬＡＧ（商標）タグ（Ｋｏｄａｋ，Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，ＣＴ）がある。
【００８２】
他の実施形態では、標的核酸配列は、標的核酸の発現を抑制するように標的核酸に対してＲＮＡ干渉を誘導する。たとえば標的核酸配列は、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ：ｃｙｓｔｉｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）ポリペプチドをコードする核酸に対してＲＮＡ干渉を誘導してもよい。たとえば、ＣＦＴＲ  ＤＮＡと相同な二重鎖低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）またはスモールヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を使用して、このＤＮＡの発現を抑制してもよい。ｓｉＲＮＡのコンストラクトは、たとえば、Ｆｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  ３９１：８０６；Ｒｏｍａｎｏ  ａｎｄ  Ｍａｓｉｎｏ（１９９２）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６：３３４３；Ｃｏｇｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）ＥＭＢＯ  Ｊ．１５：３１５３；Ｃｏｇｏｎｉ  ａｎｄ  Ｍａｓｉｎｏ（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  ３９９：１６６；Ｍｉｓｑｕｉｔｔａ  ａｎｄ  Ｐａｔｅｒｓｏｎ（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：１４５１；ａｎｄ  Ｋｅｎｎｅｒｄｅｌｌ  ａｎｄ  Ｃａｒｔｈｅｗ（１９９８）Ｃｅｌｌ  ９５：１０１７に記載されているように作製することができる。ｓｈＲＮＡのコンストラクトは、ＭｃＩｎｔｙｒｅ  ａｎｄ  Ｆａｎｎｉｎｇ（２００６）ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１により記載されているように作製することができる。一般に、ｓｈＲＮＡは、アニールしてスモールヘアピンを形成することができる相補領域を含む一本鎖ＲＮＡ分子として転写される。
【００８３】
核酸コンストラクトは、ＳｓｓＩ  ＣｐＧメチラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を使用してメチル化してもよい。一般に、核酸コンストラクトは、緩衝液中、３７℃でＳ−アデノシルメチオニンおよびＳｓｓＩ  ＣｐＧ−メチラーゼとインキュベートすることができる。過剰メチル化は、コンストラクトを１単位のＨｉｎＰ１Ｉエンドヌクレアーゼと１時間３７℃でインキュベートし、アガロースゲル電気泳動によりアッセイすることにより確認することができる。
【００８４】
核酸コンストラクトは、種々の技術を用いて、たとえば、生殖細胞、たとえば卵母細胞または卵、前駆細胞、成熟または胚性幹細胞、始原生殖細胞、腎細胞、たとえばＰＫ−１５細胞、島細胞、β細胞、肝細胞、または線維芽細胞、たとえば皮膚線維芽細胞など、どのような種類の胚細胞、胎仔細胞または偶蹄目動物の成熟細胞に導入してもよい。技術の非限定的な例には、トランスポゾン系、細胞に感染できる組換えウイルス、もしくはリポソーム、または核酸を細胞に送達することができる他の非ウイルス法、たとえばエレクトロポレーション、マイクロインジェクションもしくはリン酸カルシウム沈殿がある。
【００８５】
トランスポゾン系では、核酸コンストラクトの転写単位、すなわち、標的核酸配列に作動可能に連結された調節領域がトランスポゾンの逆方向反復配列に挟まれる。たとえば、核酸をマウス、ヒトおよびブタの細胞などの細胞に導入するため、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ（米国特許第６，６１３，７５２号明細書および米国特許出願公開第２００５／０００３５４２号明細書を参照されたい）；Ｆｒｏｇ  Ｐｒｉｎｃｅ（Ｍｉｓｋｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：６８７３）；Ｔｏｌ２（Ｋａｗａｋａｍｉ（２００７）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ８（Ｓｕｐｐｌ．１）：Ｓ７；Ｍｉｎｏｓ（Ｐａｖｌｏｐｏｕｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ８（Ｓｕｐｐｌ．１）：Ｓ２）；Ｈｓｍａｒ１（Ｍｉｓｋｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００７））Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２７：４５８９）；およびＰａｓｓｐｏｒｔなど、いくつかのトランスポゾン系が開発されてきた。Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンは、特に有用である。トランスポザーゼは、標的核酸と同じ核酸コンストラクトにコードされたタンパク質として送達しても、別の核酸コンストラクトに導入しても、またはｍＲＮＡ（たとえば、インビトロ転写によるキャップ化ｍＲＮＡ）として供給してもよい。
【００８６】
また、インスレーター配列を核酸コンストラクトに組み入れて標的核酸の発現を維持し、宿主遺伝子の望ましくない転写を阻害してもよい。たとえば、米国特許出願公開第２００４／０２０３１５８号明細書を参照されたい。典型的には、インスレーター配列は、転写単位の両側にあり、かつトランスポゾンの逆方向反復配列内にある。インスレーター配列の非限定的な例には、マトリックス結合領域（ＭＡＲ）型インスレーター配列および境界型インスレーター配列がある。たとえば、米国特許第６，３９５，５４９号明細書；同第５，７３１，１７８号明細書；同第６，１００，４４８号明細書；および同第５，６１０，０５３号明細書、ならびに米国特許出願公開第２００４／０２０３１５８号明細書を参照されたい。
【００８７】
核酸はベクターに組み込んでもよい。ベクターは、キャリアから標的ＤＮＡに移動するように設計された任意の特定のＤＮＡセグメントを含む広義の用語である。ベクターは、ゲノムまたは他の標的化ＤＮＡ配列にＤＮＡの挿入を行うのに必要な一連の要素である発現ベクターまたはベクター系、たとえばエピソーム、プラスミド、またはさらにはウイルス／ファージのＤＮＡセグメントをいうことがある。ベクター系、たとえば動物の遺伝子送達に使用されるウイルスベクター（たとえば、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルスおよび組み込みファージウイルス）および非ウイルスベクター（たとえば、トランスポゾン）は、２つの基本的な成分：１）ＤＮＡ（またはｃＤＮＡに逆転写されるＲＮＡ）からなるベクター、および２）ベクターおよびＤＮＡ標的配列の両方を認識し、ベクターを標的ＤＮＡ配列に挿入するトランスポザーゼ、リコンビナーゼまたは他のインテグラーゼ酵素、を有する。ベクターは、ほとんどの場合、それぞれ１つまたは複数の発現制御配列を含む１つまたは複数の発現カセットを含み、発現制御配列は、別のＤＮＡ配列またはｍＲＮＡの転写および／または翻訳を制御または調節するＤＮＡ配列である。
【００８８】
多様な種類のベクターが知られている。たとえば、プラスミドおよびウイルスベクター、たとえば、レトロウイルスベクターが知られている。哺乳動物の発現プラスミドは典型的には、複製起点、好適なプロモーターおよび任意のエンハンサー、さらには任意に必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライス供与部位およびスプライス受容部位、転写終結配列、ならびに５’隣接非転写配列を有する。ベクターの例として、プラスミド（別の種類のベクターのキャリアであってもよい）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルス（たとえば、改変されたＨＩＶ−１、ＳＩＶまたはＦＩＶ）、レトロウイルス（たとえば、ＡＳＶ、ＡＬＶまたはＭｏＭＬＶ）、およびトランスポゾン（たとえば、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ、Ｐ−エレメント、Ｔｏｌ−２、Ｆｒｏｇ  Ｐｒｉｎｃｅ、ｐｉｇｇｙＢａｃ）が挙げられる。
【００８９】
本明細書で使用する場合、核酸という用語は、たとえば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成（たとえば、化学合成）ＤＮＡのほか、天然および化学修飾核酸、たとえば、合成塩基または別の骨格などのＲＮＡおよびＤＮＡの両方をいう。核酸分子は、二重鎖でもまたは一本鎖（すなわち、センスまたはアンチセンス一本鎖）でもよい。本明細書のトランスジェニックという用語は、広義で使用され、遺伝子工学技術を用いてその遺伝子材料を変化させた遺伝子改変生物または遺伝子操作生物をいう。したがってノックアウト偶蹄目動物は、外来遺伝子または核酸が動物またはその子孫に発現するか否かに関わらずトランスジェニックである。
【００９０】
実施例１
ＴＡＬＥＮの直接インジェクションにより作製された遺伝子改変偶蹄目家畜類（ウシ）
Ｃｅｒｍａｋ  ｅｔ．ａｌ．（２０１１）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３９：ｅ８２に記載されているように３つのＴＡＬＥＮペアを設計および構築し（図３）、授精から約１９時間後にウシ胚の細胞質にｍＲＮＡをインジェクトした。インジェクトされた胚をインビトロで培養し、胚盤胞期で採取した（図３）。個々の胚盤胞のゲノムＤＮＡを全ゲノム増幅（ＷＧＡ）（Ｃａｒｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｔｒａｎｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．２０：２９）により増幅し、ＳＵＲＶＥＹＯＲヌクレアーゼアッセイを用いてインデルについてスクリーニングした（図３、４Ａおよび４Ｂ）。ＴＡＬＥＮ活性が示唆された切断産物は、インジェクトされた胚の１０％で観察された（たとえば、図３、４Ａ、および４Ｂ）。予想された領域の突然変異は、ＡＣＡＮ１１のＴＡＬＥＮペアまたはＡＣＡＮ１２のＴＡＬＥＮペアのどちかをインジェクトされた２つの胚盤胞で確認された（図３）。ＴＡＬＥＮをインジェクトされた胚の発生能の著しい低下は、観察されなかった。次いでＡＣＡＮ１２のＴＡＬＥＮペアを用いて１０〜１００ｎｇ／μｌの範囲のｍＲＮＡ用量で２回目のインジェクションを行った。１回目（３３％）と２回目（５％）（１０ｎｇ／μｌの条件）との胚盤胞形成率の比較から、胚の品質が不十分であることが明らかになった（表Ｓ２）。胚の品質は不十分であるものの、ＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイを用いて１２個の推定ミュータント（インジェクトされたうちの２７％）が同定された。ＳＵＲＶＥＹＯＲ陽性胚の遺伝子型はそれぞれ、クローン化したＰＣＲ産物由来の１４個のシーケンシングリードを用いて解析した。シーケンシングから、遺伝子改変においてモザイク現象が明らかになった。インデルは４個のＳＵＲＶＥＹＯＲ陽性胚で同定され、これらのうち、インデル陽性配列リードは胚ごとに全リードの７〜２９％を占めた。これらの結果から、ＴＡＬＥＮは偶蹄目動物胚で機能することが立証された。ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）およびＴＡＬＥＮを用いた胚の遺伝子改変については、ヌクレアーゼペアをコードするＺＦＮまたはＴＡＬＥＮのｍＲＮＡの直接インジェクションによるモデル生物が報告されているＧｅｕｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２５：４３３；Ｃａｒｂｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１０）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １８６：４５１；Ｍａｓｈｉｍｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ５：ｅ８８７０；Ｔｅｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２９：６９５。
【００９１】
実施例２
ＴＡＬＥＮの直接インジェクションにより作製された遺伝子改変偶蹄目動物家畜類（ブタ（ｓｗｉｎｅ））。
また、アフリカ豚コレラ耐性アレルが提唱された（Ｐａｌｇｒａｖｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８５：６００８）ブタＲＥＬＡ遺伝子（ｐ６５）を標的とするＴＡＬＥＮを使用して、ブタのＩＶＰ胚に一連のインジェクションを行った。ネイティブなＴＡＬＥスキャフォールドの切断型変異体を用いてＴＡＬＥＮ活性が増強されることを２つのグループが報告した（Ｍｕｓｓｏｌｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３９：９２８３；Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２９：１４３｛Ｍｕｓｓｏｌｉｎｏ，２０１１  ＃１５１；Ｍｉｌｌｅｒ，２０１１  ＃４２｝。したがって、＋２３１スキャフォールド（ＢａｍＨＩフラグメント、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ  ｅｔ．ａｌ．（２０１０）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １８６：７５７）を使用した上記の実験とは異なり、ｐ６５ＴＡＬＥＮスキャフォールドを選択し、Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ．ａｌ．２０１１（前掲）に記載された＋６３型を模して切断した（図５も参照）。ｌｅｆｔおよびｒｉｇｈｔ  ＴＡＬＥＮをそれぞれ１０ｎｇ／μｌを含むｍＲＮＡの混合物と共に５ｎｇ／μｌのＥＧＦＰのｍＲＮＡをインジェクションの成功の指標として接合体にインジェクトした。７５個のＥＧＦＰ陽性接合体（インジェクトした２１４個のうち、３５％）が同定され、ＷＧＡによるインデル解析に供した。ＥＧＦＰ陽性胚のうち５６個のＰＣＲ増幅に成功し、これらのうち１６個（２９％）から、ＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイ（図３）または配列解析によりインデルが明らかになった。ウシ（ｃａｔｔｌｅ）と比較してブタの接合体ではモザイク現象が減少するようであり、実際、ホモ接合性またはヘテロ接合性の両アレルのミュータント（図４）は、ミュータントの３分の１（６／１６）であった。これらの結果から、ＴＡＬＥＮが偶蹄目動物胚で機能することが立証された。改変された胚に基づく動物ファウンダー系の作製プロセスは、周知である。
【００９２】
実施例３
ウシおよびブタ（ｓｗｉｎｅ）体細胞の遺伝子改変により作製された遺伝子改変偶蹄目動物家畜類。
生物医学的または農業上のいずれかの重要性に基づき選択したブタおよびウシ（ｃａｔｔｌｅ）の標的に対し、いくつかの追加のＴＡＬＥＮペアを構築した。前述の２つのＴＡＬＥＮスキャフォールド（＋２３１、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ  ｅｔ．ａｌ．２０１０（前掲）および＋６３、Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ．ａｌ．２０１１（前掲））（図５）に照らして、６つのＴＡＬＥＮペアの結合ドメインを導入した。各ＴＡＬＥＮペアを初代家畜類線維芽細胞にトランスフェクトし、３日目にＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイ（Ｇｕｓｃｈｉｎ，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６４９：２４７によりゲノム改変を測定した。最も活性なＴＡＬＥＮペアＤＭＤＥ７．１およびＡＣＡＮ１２からは、それぞれ染色体の３８％および２５％の切断が示され、サンガーシーケンシングから、ＮＨＥＪによるＤＮＡ修復の特徴である様々なインデルが明らかになった（図５および図６）。ＴＡＬＥＮスキャフォールドは、線維芽細胞の活性に大きな影響を与えた。全体で、＋６３アイソフォームの標的となる６つの遺伝子座のうち４つが３．５％以上で切断されたのに対し、＋２３１スキャフォールドでは、１％を超えて切断したのはＤＭＤＥ７．１ＴＡＬＥＮペアのみであった（図５）。これまでの研究Ｄｏｙｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ８：７４；Ｍｉｌｌｅｒ，（２０１１）ｏｐ．ｃｉｔ．）に記載されているように、トランスフェクション後３０℃で７２時間のインキュベーションを行っても、活性にプラスの影響があり、３つのＴＡＬＥＮペアの活性には、こうしたインキュベーションが必要とされた。活性ＴＡＬＥＮペアの作製の成功率は高いものとなっている。出願時までに収集されたデータでは、常染色体とＸ染色体およびＹ染色体とのブタおよび雌ウシのゲノムに散在する１５個の遺伝子において３６ＴＡＬＥＮペアのうち２３（６４％）が検出できる程度に活性（＞１．０％ＮＨＥＪ）であったことが示される（表Ｓ３）。活性ペアの４分の３が高効率（１９〜４０％）で切断し、平均の改変率は２５％であった。改変された線維芽細胞に基づき動物ファウンダー系を作製するクローン法は、周知である。
【００９３】
実施例４
トランスポゾンのコトランスフェクションによる拡大培養およびインデル濃縮。
ＴＡＬＥＮペアを線維芽細胞にトランスフェクトし、トランスポゾン共選択を用いてまたは用いずに細胞を１４日間以上培養してから改変レベルを測定した。結果を図７にまとめてある。０日目（Ｄ０）に、各ＴＡＬＥＮの発現カセット（２つのプラスミド）、選択マーカーをコードするトランスポゾン（ピューロマイシンをコードする第３のプラスミド、およびトランスポザーゼ−発現カセット（第４のプラスミド）を含むプラスミドの混合物を細胞にトランスフェクトする。ＴＡＬＥＮのプラスミドが各トランスフェクションの主要な成分である（４倍過剰量）。トランスフェクト細胞を継代前に３０℃あるいは３７℃で３日間培養し、ＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイのためのサンプルを採取し、拡大培養によりトランスポゾン組み込みを＋／−選択するためリプレートする。３日目以降、全細胞を３７℃で培養する。ＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイのため１４日間以上培養した細胞を集め、下流用途、すなわち、ＳＣＮＴのため凍結保存する。比較のため、ヌクレオフェクションにより他の線維芽細胞にもトランスフェクトし、３日目、および１４日目以降の非選択（ＮＳ）および選択（Ｓ）集団におけるＮＨＥＪの割合を測定した。比較のため、カチオン性脂質による線維芽細胞のトランスフェクションも行った。
【００９４】
実施例５
片アレルおよび両アレルのＫＯクローンの単離。
トランスジェニック初代線維芽細胞は、標準的な密度（＞１５０細胞／ｃｍ２）で非トランスジェニック線維芽細胞（フィーダー細胞）と一緒に播種し、上記で使用したトランスポゾン共選択技術を使用して薬剤選択に供すると、効率的に増殖させ、コロニーとして単離することができる（Ｃａｒｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．２０：１１２５）。このアプローチを評価するため、６つのＴＡＬＥＮペアで処理した細胞のピューロマイシン耐性コロニーを単離し、それらの遺伝子型を、標的部位をまたぐＰＣＲ産物のＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイまたは直接シーケンシングにより評価した（図８Ａおよび８Ｂ）。一般に、インデル陽性クローンの比率は、３日目の改変レベルに基づき行った予測と同様であった。両アレルノックアウトクローンは、６つのＴＡＬＥＮペアのうち５つで同定され、インデル陽性細胞の最大３５パーセントで生じた（表１）。過半数の例（２３のうち１５）では、インデルは各アレルに特有のインデルではなく、同型（各アレルで同じインデル）であったことから、姉妹染色分体を鋳型とした修復が一般的であることが示唆された（図９）。目を引くのは、染色体切断を独立した現象として処理する場合、改変されたクローンのうち、過半数のＴＡＬＥＮペアで両アレル改変の頻度（１７〜３５％）が３日目の改変に基づく予測（１０〜１５．６％）を上回ることである。ＺＦＮを用いたこれまでの研究（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１９：１２７９；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．２０：８１；Ｐｅｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６：８０８））は、これらの結果を裏付けるものである。こうしたこれまでの研究から、両アレル改変は、ヌクレアーゼ活性のレベルに関係なく、改変された細胞の３分の１で起こることが示唆される。
【００９５】
実施例６
ＴＡＬＥＮによる染色体欠失および逆位。
同一染色体を標的とする２つのＴＡＬＥＮペアを同時送達すると、大きな染色体欠失または逆位が誘導できるとの仮説を立てた。ＴＡＬＥＮペアＤＭＤＥ６およびＤＭＤＥ７．１の高い活性と、ブタモデルがヒトの状態に合うように高い割合のデュシェンヌ型筋ジストロフィーが大規模欠失によりで引き起こされる（Ｂｌａｋｅ，２００２）という事実とのため、ＤＭＤＥ６およびＤＭＤＥ７．１を試験した。結果を図１０にまとめてある。各ＴＡＬＥＮペアの３日目の遺伝子改変レベルは、ＴＡＬＥＮペアのどちらかを個別にトランスフェクトしたときより若干低いものの、高レベルであった（ＤＭＤＥ６で２４％およびＤＭＤＥ７．１で２３％）（図１０）。２つのＴＡＬＥＮペアの間の配列が欠失されたかどうかを判定するため、ＴＡＬＥＮの標的部位をまたぐプライマーを用いてＰＣＲを試みた。６．５ｋｂの配列が除去された場合、選択したＰＣＲ条件では、約５００ｂｐのバンドが予想される一方、７ｋｂの野生型バンドは増幅されないと考えられた。ＴＡＬＥＮペアの両方を導入した複製物ではほぼ５００ｂｐのバンドが観察されたが、ＴＡＬＥＮペアの一方のみを導入した場合には存在しなかった（図１０）。
【００９６】
次に、推定される新たな５’および３’接合部の両側からのＰＣＲにより細胞集団の逆位現象をアッセイした。産物は、推定される逆位の５’接合部も３’接合部も、両方のＴＡＬＥＮペアを導入したときのみ、予想された大きさで観察された（図１０）。さらに逆位を確認するため、トランスポゾン共選択戦略を用いてコロニーを作製し、欠失および逆位現象をスクリーニングした。欠失および逆位現象は、どちらも高頻度で回復されていた（それぞれ１０．３％および４．１％；ｎ＞１０００）（表Ｓ４）。欠失および逆位現象は、非常に高い忠実度で生じる。４３の逆位陽性コロニーのうち４１のコロニーが５’接合部および３’接合部の両方で陽性であった。最後に、ＰＣＲ産物のシーケンシングから、欠失現象および逆位現象はどちらも、その接合部で付加または欠失されるヌクレオチドがごくわずかであることが確認された（図１１、１２）。
【００９７】
実施例７
ＴＡＬＥＮ誘導性相同組換えは、選択マーカーを連結する必要がない。
ベルジアンブルー（Ｂｅｌｇｉａｎ  Ｂｌｕｅ）ウシ（ｃａｔｔｌｅ）由来のミオスタチンアレルミュータント（１１ｂｐ欠失）を野生型和牛（Ｗａｇｙｕ  ｃａｔｔｌｅ）のゲノムに導入した（Ｇｒｏｂｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．１７：７１）（図１３）。ｂｔＧＤＦ８．１  ＴＡＬＥＮペアを単独でトランスフェクトした場合、標的遺伝子座で染色体の最大１６％を切断した（図１３）。ＴＡＬＥＮ（ｂｔＧＤＦ８３．１）およびｄｓＤＮＡ鋳型（ＢＢ−ＨＤＲ）は、ウシＧＤＦ８のエクソン−３に１１ｂｐの欠失（ベルギーブルー（Ｂｅｌｇｉｕｍ  Ｂｌｕｅ）突然変異）をＤＳＢ誘導性相同組換えにより導入するように設計した。ＢＢ−ＨＤＲ鋳型ではｌｅｆｔ  ＴＡＬＥＮの結合部位の半分が欠損していたため、ＢＢ−ＨＤＲ鋳型はＴＡＬＥＮ切断に対して抵抗性があった。ＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイから、３７℃および３０℃の両方でｂｔＧＤＦ８３．１  ＴＡＬＥＮの活性が立証された。本アッセイで使用したＰＣＲ産物は、プライマーｂおよびｂ’を使用して作製した（図１３の図ａに示す）。ＢＢ−ＨＤＲ鋳型は、ｂｔＧＤＦ８３．１活性の推定を難しくすると考えられるため、これらの複製物に含めなかった。アレル特異的ＰＣＲから、ＨＤＲの誘導は、ＴＡＬＥＮとＢＢ−ＨＤＲ鋳型とのコトランスフェクションに依存することが立証された。ＰＣＲアッセイは、ＨＤＲにより改変されたＧＤＦ８アレルを、プライマーｃおよびｃ’を使用して特異的に検出するように開発した（図１３の図ａに示す）。プライマーｃ’の３’末端は１１ｂｐの欠失をまたぎ、野生型アレル「ｗｔ」を増幅できない。陽性対照「Ｃ」を含む各ＰＣＲ反応に５００細胞相当量を加えた。ＨＤＲ率は、実験反応と対照反応とをデンシトメトリーにより比較して判定した。ベルジアンブルー（Ｂｅｌｇｉａｎ  Ｂｌｕｅ）ウシ（ｃａｔｔｌｅ）由来の１６２３ｂｐのＤＮＡフラグメントを有するスーパーコイルＤＮＡ鋳型とコトランスフェクションを行ったところ、所望の現象に対する選択を行わずに３日目の半定量ＰＣＲにより示唆されたように、遺伝子変換頻度（ＨＤＲ）が最大５％となった（図１３）。これらの結果から、マーカーを用いずにＴＡＬＥＮを使用して、アレルを含む外来性核酸配列を家畜類に効率的に組み込むことができることが立証された。個々のコロニーにおける組み込み頻度を評価するため、トランスポゾン共選択戦略を実施し、個々のコロニーを単離し増殖させてＤＮＡシーケンシングを行った。ＰＣＲにより調べた３６６コロニーのうち５つのコロニーにおいて、ベルジアンブルー（Ｂｅｌｇｉａｎ  Ｂｌｕｅ）ウシ（ｃａｔｔｌｅ）由来の鋳型を使用した遺伝子変換が検出された。ベルジアンブルー（Ｂｅｌｇｉａｎ  Ｂｌｕｅ）ＨＤＲ鋳型の外側のプライマーで増幅し、シーケンシングを行ったところ、予想された１１ｂｐの欠失の存在が４つのコロニーで確認された（図１４）。
【００９８】
実施例８
家畜類細胞におけるＨＤＲの標的としての、ＴＡＬＥＮによるＤＮＡ切断。
ブタ（ｓｗｉｎｅ）低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）遺伝子の第４エクソンを標的とするＴＡＬＥＮペア（ＬＤＬＲ２．１）をスーパーコイルプラスミドＬｄｌｒ−Ｅ４Ｎ−ｓｔｏｐとコトランスフェクトした。Ｌｄｌｒ−Ｅ４Ｎ−ｓｔｏｐは、ブタ（ｓｗｉｎｅ）ＬＤＬＲ遺伝子に対応するホモロジーアーム、およびＨＤＲ時にネオマイシンホスホトランスフェラーゼの発現を可能にする遺伝子トラップを含む（図１５）。培養から３日後、ＰＣＲ解析により、抗生物質選択を行わなくても、３０℃で標的遺伝子座（レーン４）にてＨＤＲ現象に対応するバンドを検出し得ることが明らかになった。ジェネティシン（Ｇ４１８）による１４日間の培養細胞集団の選択の結果、ＨＤＲ細胞が顕著に濃縮された（レーン１１および１３）。こうして改変された細胞を体細胞核移植によりクローニングすると、８頭のブタ（雌ブタ５頭、雄ブタ３頭）が誕生し、各々が、ＴＡＬＥＮを介したＨＤＲ現象を含むことがホモロジーアームの両側のフランキングＰＣＲにより証明された（図１６）。雌ブタを図１７に示す。これらのブタは、下記表に示すように正常ブタと比較して食後脂質異常症の意図した表現型を示す：
【００９９】
【表１】
2020010692.tif 000002
【０１００】
参考文献
本明細書に記載した特許出願、特許、刊行物および学術論文は、あらゆる目的において本明細書に援用する。矛盾が生じた場合、本明細書を優先する。
Ｍ．ＣＨＲＩＳＴＩＡＮ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ＤＮＡ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｂｒｅａｋｓ  ｗｉｔｈ  ＴＡＬ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ，１８６  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（２０１０）．
Ｊ．Ｃ．ＭＩＬＬＥＲ，ｅｔ  ａｌ．，Ａ  ＴＡＬＥ  ｎｕｃｌｅａｓｅ  ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ  ｆｏｒ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ，２９  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．（２０１１）．
Ｄ．Ａ．ＭＣＧＲＥＷ  ＆  Ｋ．Ｌ．ＫＮＩＧＨＴ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＲｅｃＡ  ｐｒｏｔｅｉｎ，３８  Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ（２００３）．
Ｍ．Ｍ．ＣＯＸ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎａｌ  ＤＮＡ  ｒｅｐａｉｒ  ｉｎ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ＲｅｃＡ  ｐｒｏｔｅｉｎ，６３  Ｐｒｏｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ（１９９９）．
Ｂ．ＲＥＩＳＳ，ｅｔ  ａｌ．，ＲｅｃＡ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐｌａｎｔｓ，９３  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ（１９９６）．
Ｂ．ＲＥＩＳＳ，ｅｔ  ａｌ．，ＲｅｃＡ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ  ｓｉｓｔｅｒ  ｃｈｒｏｍａｔｉｄ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ｏｆ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｂｒｅａｋ  ｒｅｐａｉｒ，ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｇｅｎｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，ｉｎ  ｐｌａｎｔｓ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ  ｂｙ  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ，９７  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ（２０００）．
Ｏ．Ｇ．ＳＨＣＨＥＲＢＡＫＯＶＡ，ｅｔ  ａｌ．，Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ＲｅｃＡ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ，４５９  Ｍｕｔａｔ  Ｒｅｓ（２０００）．
Ｒ．Ｊ．ＹＡＮＥＺ  ＆  Ａ．Ｃ．ＰＯＲＴＥＲ，Ｇｅｎｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｉｓ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｈＲＡＤ５１，６  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ（１９９９）．
Ｚ．ＣＵＩ，ｅｔ  ａｌ．，ＲｅｃＡ−ｍｅｄｉａｔｅｄ，ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｚｅｂｒａｆｉｓｈ，５  Ｍａｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（ＮＹ）（２００３）．
Ｎ．ＴＡＫＡＨＡＳＨＩ  ＆  Ｉ．Ｂ．ＤＡＷＩＤ，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｚｅｂｒａｆｉｓｈ  Ｒａｄ５２  ａｎｄ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ｆｏｒ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，３３  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ（２００５）．
Ｔ．ＣＥＲＭＡＫ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ｃｕｓｔｏｍ  ＴＡＬＥＮ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ＴＡＬ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ−ｂａｓｅｄ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，（ｉｎ  ｐｒｅｓｓ）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（２０１１）．
Ｄ．Ｆ．ＣＡＲＬＳＯＮ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｍａｒｋｅｒ−ｆｒｅｅ  ｓｗｉｎｅ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ  ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ，２０  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ（２０１１）．
Ａ．Ｍ．ＧＥＵＲＴＳ，ｅｔ  ａｌ．，Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｒａｔｓ  ｖｉａ  ｅｍｂｒｙｏ  ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ，３２５  Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００９）．
Ｉ．Ｄ．ＣＡＲＢＥＲＹ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｇｅｎｏｍｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｕｓｉｎｇ  ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ，１８６  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（２０１０）．
Ｔ．ＭＡＳＨＩＭＯ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｒａｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｘ−ｌｉｎｋｅｄ  ｓｅｖｅｒｅ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ（Ｘ−ＳＣＩＤ）ｕｓｉｎｇ  ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ，５  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ（２０１０）．
Ｌ．ＴＥＳＳＯＮ，ｅｔ  ａｌ．，Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｒａｔｓ  ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｂｙ  ｅｍｂｒｙｏ  ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＴＡＬＥＮ，２９  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２０１１）．
Ｃ．Ｊ．ＰＡＬＧＲＡＶＥ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｐｅｃｉｅｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ＲＥＬＡ  ｕｎｄｅｒｌｉｅｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ＮＦ−ｋａｐｐａＢ  ａｃｔｉｖｉｔｙ：ａ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  Ａｆｒｉｃａｎ  ｓｗｉｎｅ  ｆｅｖｅｒ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ，８５  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ（２０１１）．
Ｃ．ＭＵＳＳＯＬＩＮＯ，ｅｔ  ａｌ．，Ａ  ｎｏｖｅｌ  ＴＡＬＥ  ｎｕｃｌｅａｓｅ  ｓｃａｆｆｏｌｄ  ｅｎａｂｌｅｓ  ｈｉｇｈ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｌｏｗ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ（２０１１）．
Ｄ．Ｙ．ＧＵＳＣＨＩＮ，ｅｔ  ａｌ．，Ａ  ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｇｅｎｅｒａｌ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｇｅｎｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ，６４９  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ（２０１０）．
Ｙ．ＤＯＹＯＮ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｃｏｌｄ  ｓｈｏｃｋ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ，７  Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（２０１０）．
Ｈ．Ｊ．ＫＩＭ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ  ｖｉａ  ｍｏｄｕｌａｒ  ａｓｓｅｍｂｌｙ，１９  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．（２００９）．
Ｈ．Ｊ．ＬＥＥ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ，２０  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ（２０１０）．
Ｅ．Ｅ．ＰＥＲＥＺ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ  ｏｆ  ＨＩＶ−１  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｉｎ  ＣＤ４＋  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ，２６  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２００８）．
Ｄ．Ｊ．ＢＬＡＫＥ，ｅｔ  ａｌ．，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ  ａｎｄ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｍｕｓｃｌｅ，８２  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｖ（２００２）．
Ｌ．ＧＲＯＢＥＴ，ｅｔ  ａｌ．，Ａ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂｏｖｉｎｅ  ｍｙｏｓｔａｔｉｎ  ｇｅｎｅ  ｃａｕｓｅｓ  ｔｈｅ  ｄｏｕｂｌｅ−ｍｕｓｃｌｅｄ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｉｎ  ｃａｔｔｌｅ，１７  Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ（１９９７）．
Ｒ．ＫＡＭＢＡＤＵＲ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｍｙｏｓｔａｔｉｎ（ＧＤＦ８）ｉｎ  ｄｏｕｂｌｅ−ｍｕｓｃｌｅｄ  Ｂｅｌｇｉａｎ  Ｂｌｕｅ  ａｎｄ  Ｐｉｅｄｍｏｎｔｅｓｅ  ｃａｔｔｌｅ，７  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ（１９９７）．
【図１】
2020010692.tif 000003
【図２】
2020010692.tif 000004
【図３】
2020010692.tif 000005
【図４Ａ】
2020010692.tif 000006
【図４Ｂ】
2020010692.tif 000007
【図５】
2020010692.tif 000008
【図６】
2020010692.tif 000009
【図７】
2020010692.tif 000010
【図８Ａ】
2020010692.tif 000011
【図８Ｂ】
2020010692.tif 000012
【図９Ａ】
2020010692.tif 000013
【図９Ｂ】
2020010692.tif 000014
【図１０】
2020010692.tif 000015
【図１１】
2020010692.tif 000016
【図１２】
2020010692.tif 000017
【図１３】
2020010692.tif 000018
【図１４】
2020010692.tif 000019
【図１５】
2020010692.tif 000020
【図１６】
2020010692.tif 000021
【図１７】
2020010692.tif 000022
【配列表】
2020010692000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年9月19日(2019.9.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の家畜動物の品種（ｂｒｅｅｄ）または系統（ｌｉｎｅ）から第２の家畜動物の品種または系統へのアレルの移入方法であって、該方法は、第１の家畜動物の品種または系統のアレルをコードし、相同性依存型修復の鋳型となる核酸の存在下で、第２の家畜動物の品種または系統の細胞または胚にＴＡＬＥＮを導入すること、ここでアレルは細胞または胚にコピーされ、ＴＡＬＥＮは、遺伝子改変された第２の家畜動物の品種または系統のアレルの部位に特異的に結合する；および、細胞または胚から、第２の品種または系統の動物を作成すること、を含む方法。
【請求項２】
アレルが第１の家畜動物の品種または系統に連鎖する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＴＡＬＥＮは、ｌｅｆｔ  ＴＡＬＥＮであり、ｌｅｆｔ  ＴＡＬＥＮと協同してＤＮＡの二重鎖切断を行うｒｉｇｈｔ  ＴＡＬＥＮをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
家畜動物が、ブタ（ｓｗｉｎｅ）、ウシ、ヒツジ、ヤギ、家禽、ウサギおよび魚からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
アレルが、挿入、欠失、多型および一塩基多型からなる群から選択される改変を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
アレルのが、ベルジアンブルー（Ｂｅｌｇｉａｎ  Ｂｌｕｅ）ウシ（ｃａｔｔｌｅ）に存在するミオスタチンアレルを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ＴＡＬＥＮが、ｍＲＮＡまたはベクターによりコードされる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ＴＡＬＥＮと独立にレポーターベクターを導入することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
系統のネイティブアレルから、減数分裂組換えを含まない同種からの天然アレルへの遺伝子変換、または
系統のネイティブアレルから、減数分裂組換えを含まない他の種からの新規アレルへの遺伝子変換、
を含む、ゲノム編集された家畜動物。
【請求項１０】
ゲノム編集された家畜動物が、遺伝子改変のホモ接合性両アレルである、請求項１に記載の家畜動物。
【請求項１１】
新規アレルが合成アレルである、請求項９または１０に記載の家畜動物。
【請求項１２】
家畜動物が和牛（Ｗａｇｙｕ  ｃａｔｔｌｅ）であり、天然アレルが、ベルジアンブルーウシからのアレルを含む、請求項９に記載の家畜動物。
【請求項１３】
天然アレルまたは新規アレルが、ネイティブアレルに対して、挿入、欠失、多型および一塩基多型からなる群から選択される特徴を含む、請求項９または１０に記載の家畜動物。
【請求項１４】
天然アレルまたは新規アレルが、量的形質に連鎖する、請求項９〜１３のいずれか１項に記載の家畜動物。
【請求項１５】
天然アレルまたは新規アレルに対してホモ接合性である、請求項９〜１４のいずれか１項に記載の家畜動物。
【請求項１６】
天然アレルまたは新規アレルに対してホモ接合性である、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の家畜動物。
【請求項１７】
天然アレルが、毛色に連鎖する、請求項９〜１０および１２〜１４のいずれか１項に記載の家畜動物。
【請求項１８】
天然アレルが、ミオスタチンアレルである、請求項９〜１０および１２〜１４のいずれか１項に記載の家畜動物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１６
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１７
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
【図１】ＴＡＬＥＮおよびＴＡＬＥＮによる遺伝子改変の図である。
【図２】複数のＤＮＡ遺伝子座で作用するＴＡＬＥＮの図である。
【図３】ウシ胚におけるＴＡＬＥＮ活性である。図（ａ）に実験の概要を示す。ＴＡＬＥＮは、ＦｏｋＩヌクレアーゼホモ２量体の単量体が２量体を形成し、２つの単量体の間のＤＮＡを切断できるように、ＤＮＡ標的の対向する鎖に合わせて設計する。１日目（Ｄ１）に、インビトロで作製されたウシ接合体にＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡをインジェクトし、胚盤胞になるまでインビトロ培養する。８日目に各胚盤胞（ｂｌａｓｔ：胚盤胞）を集め、全ゲノム増幅（ＷＧＡ）に供し、ＰＣＲ増幅およびＣｅｌ−Ｉ（ＳＵＲＶＥＹＯＲヌクレアーゼ、Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃｓ）処理によりインデルについて解析する。図ｂ）ＳＵＲＶＥＹＯＲヌクレアーゼ処理して、ＡＣＡＮ１２  ＴＡＬＥＮにより誘発されたウシ胚のインデルを解析したものである。単位複製配列の長さ、およびインデルを示唆すると予想されたＳＵＲＶＥＹＯＲ切断産物を上に示す。図ｃ）ＳＵＲＶＥＹＯＲヌクレアーゼ処理して、ｐ６５  ＴＡＬＥＮにより誘発されたブタ接合体のインデルを解析したものである。
【図４Ａ】ＡＣＡＮ１２  ＴＡＬＥＮで処理したウシ胚から配列決定された欠失および挿入である。野生型配列を示し、ＴＡＬＥＮ結合部位を下線で示す  欠失現象および挿入現象の両方が同定された。
【図４Ｂ】ＡＣＡＮ１２  ＴＡＬＥＮで処理したブタ胚から配列決定された欠失および挿入である。野生型配列を示し、ＴＡＬＥＮ結合部位を下線で示す  欠失現象および挿入現象の両方が同定された。
【図５】家畜線維芽細胞の遺伝子編集を行うためのＴＡＬＥＮスキャフォールドを比較する  図ａ）この実験で試験したＴＡＬＥＮスキャフォールドの図である。各スキャフォールド（＋２３１、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ  ｅｔ．ａｌ．２０１０｛Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ，２０１０｝および＋６３、Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ．ａｌ．２０１１｛Ｍｉｌｌｅｒ，２０１１｝）は、ＳＶ４０核移行シグナル（ＮＬＳ）を含み、ＦｏｋＩホモ２量体ドメインのＣ末端融合体を有する。番号はＤＮＡ結合ドメインとの関係で付した。第１の可変領域２アミノ酸残基リピート（ＲＶＤ）の前のアミノ酸を「−１」と表記し、最後のＲＶＤリピートの後のアミノ酸を「＋１」と表記した。図ｂ）ＤＭＤＥ７．１  ＴＡＬＥＮペアまたはＡＣＡＮ１２  ＴＡＬＥＮペアのどちらかをトランスフェクトした線維芽細胞について、ＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイを行った。スキャフォールドおよび処理温度をゲルの上に示し、ＮＨＥＪの割合を下に示す。略語ＮＴ＝未処理。図ｃ）＋２３１または＋６３スキャフォールドのどちらかを有する４つの別のＴＡＬＥＮペアの活性を示す。
【図６】ＡＣＡＮ１２  ＴＡＬＥＮで処理した細胞から配列決定された欠失および挿入である。野生型ＡＣＡＮ１２配列をイタリック体で示し、ｌｅｆｔおよびｒｉｇｈｔ（相補）ＴＡＬＥＮ認識配列を下線で示す。挿入されたヌクレオチドを灰色でハイライトし、ミスマッチヌクレオチドを小文字で表示する。
【図７】インデル濃縮のためのトランスポゾン共選択である。実験スケジュールをパネル（ａ）に示す。０日目（Ｄ０）に、各ＴＡＬＥＮの発現カセット、選択マーカーをコードするトランスポゾン、およびトランスポザーゼ発現カセットを含むプラスミドの混合物を細胞にトランスフェクトする。ＴＡＬＥＮのプラスミドが各トランスフェクションの主要な成分である（４倍過剰量）。トランスフェクト細胞を継代前に３０℃あるいは３７℃で３日間培養し、ＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイのためのサンプルを集め、拡大培養によりトランスポゾン組み込みを＋／−選択するためリプレートする。３日目以降、全細胞を３７℃で培養する。ＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイのため１４日間以上培養した細胞を集め、下流用途、すなわち、単一細胞核移植のため凍結保存する。図ｂ）カチオン性脂質を使用して線維芽細胞にトランスフェクトした。３日目では活性が観察されなかったため（低トランスフェクション効率のため）、１４日目以降の集団のデータのみを示す。処理温度、選択およびＴＡＬＥＮ  ｉｄ（図（ｃ）に示したＡ〜Ｃの文字により識別）をゲルの上に示す。図ｃ）線維芽細胞にヌクレオフェクションによりトランスフェクトし、３日目、および１４日目以降の非選択（ＮＳ）および選択（Ｓ）集団におけるＮＨＥＪの割合を測定した。処理温度を各マトリックスの上に示す。略語：ｎｄ＝検出されず；ｗｔ＝野生型単位複製配列、ＳＵＲＶＥＹＯＲ処理済み。
【図８Ａ】インデルを同定するための直接ＰＣＲシーケンシングである。各線維芽細胞コロニー由来のＰＣＲ単位複製配列を精製し、配列決定し、野生型配列と比較した。１つのアレルの突然変異、または、両方のアレルの非重複突然変異が起こると、ＴＡＬＥＮ認識部位近傍が２つの配列になる（上部）。突然変異部位の両側にある２つのピークにより各アレル間の相違を同定できる場合、重複両アレル突然変異を同定することができる。ホモ接合性突然変異を有するコロニーは、インデル部位近傍に二重ピークを示さない。
【図８Ｂ】野生型クローンおよび図８Ａに示したようなホモ接合性インデルを有する両アレルクローンの配列比較である。
【図９Ａ】ＤＭＤによる両アレル性改変アレルである。ホモ接合性改変アレル（すなわち、両方のアレルが同じ突然変異を持つ）あるいは各アレルに異なる突然変異を持つ両アレル突然変異を有するコロニーを示す。２つのインデルを持つコロニーでは、各アレルが配列決定された回数を右側に示す。場合によっては、第３の突然変異または単一の野生型アレルが配列決定されたことから、すべてのコロニーが１００％クローンであるとは限らないことが示される。フレームシフトアレルを示し、ミスマッチヌクレオチドを小文字で表示する。
【図９Ｂ】ＬＤＬＲによる両アレル性改変アレルであり、図９Ａと同様の表記法を用いる。
【図１０】ＴＡＬＥＮによる欠失および逆位である。ＤＭＤ遺伝子座の模式図を図（ａ）に示す。ＤＮＡの方向性を黒い山形模様で示す。雄ブタ線維芽細胞にコトランスフェクトされた、エクソン６および７（黒の矢頭）を標的とするＴＡＬＥＮにより、エクソン６とエクソン７との間でＮＨＥＪによる融合現象が起こり得る。これは、プライマー（黒い矢印）を用いて約５００ｂｐの単位複製配列を得ることにより確認することができる。図ｂ）エクソン６および７を標的とするＴＡＬＥＮを同時にトランスフェクトした細胞のＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイから、両部位でのＮＨＥＪによるインデルが明らかにされる。ＮＨＥＪの割合を下に示す。図ｃ）エクソン６  ＴＡＬＥＮおよびエクソン７  ＴＡＬＥＮを同時に導入すると、推定される欠失部位を挟むプライマーを用いたＰＣＲにより、約５００塩基対の産物が得られるのに対し、単独でトランスフェクトすると、得られない。図ｄ）ＴＡＬＥＮ標的部位間の配列の逆位現象の予想される結果を示す。ＤＮＡの方向性を黒い山形模様で示す。逆位遺伝子座の５’および３’末端の推定されるフランキング部位の外側のプライマー（黒い矢印）を、予想された産物の大きさと共に示す。ＰＣＲ産物は、エクソン６  ＴＡＬＥＮおよびエクソン７  ＴＡＬＥＮの両方を同時に導入したときのみ、５’および３’接合部の両方で観察された。
【図１１】ＤＭＤによる欠失配列である。複製トランスフェクションで得られたＤＭＤ欠失接合部を示す。上方のエクソン６および７配列をそれぞれ緑色および黄色でハイライトし、ＴＡＬＥＮ認識部位を下線で示す。挿入されたヌクレオチドを赤でハイライトする。
【図１２】ＤＭＤによる逆位配列である。ＤＭＤによる逆位アレルの模式図を、シーケンシングによる解析した５’および３’接合部（枠で囲む）と共に示す。下方に、各融合の予想された配列を示し、それぞれの融合は、ＴＡＬＥＮペアの各スペーサーの中央にある。ＴＡＬＥＮ認識部位を下線で示す。トランスフェクトされた集団から配列決定された逆位アレルを示す。各アレルが配列決定された回数を右側に示し、挿入されたヌクレオチドを下線で示す。ミスマッチヌクレオチドを小文字で示す。
【図１３】ウシ線維芽細胞におけるＨＤＲの誘導を示す。図ａ）二重鎖切断誘導性相同組換えにより、ウシＧＤＦ８のエクソン３に１１塩基対欠失（ベルギーブルー（Ｂｅｌｇｉｕｍ  Ｂｌｕｅ）突然変異）を導入するように、ＴＡＬＥＮ（ｂｔＧＤＦ８３．１、矢印）およびｄｓＤＮＡ鋳型（ＢＢ−ＨＤＲ）を設計した。ＢＢ−ＨＤＲ鋳型ではｌｅｆｔ  ＴＡＬＥＮの結合部位の半分が欠損しているため、ＴＡＬＥＮ切断に対して抵抗性を示すはずである。図ｂ）ＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイから、３７℃および３０℃の両方でｂｔＧＤＦ８３．１  ＴＡＬＥＮの活性が立証される。本アッセイで使用したＰＣＲ産物は、プライマーｂおよびｂ’を使用して作製した（図ａに示す）。ＢＢ−ＨＤＲ鋳型は、ｂｔＧＤＦ８３．１活性の推定を難しくすると考えられるため、これらの複製物に含めなかった。図ｃ）アレル特異的ＰＣＲにより、ＨＤＲの誘導は、ＴＡＬＥＮとＢＢ−ＨＤＲ鋳型とのコトランスフェクションに依存することが立証される。ＰＣＲアッセイは、ＨＤＲにより改変されたＧＤＦ８アレルを、プライマーｃおよびｃ’を使用して特異的に検出するように開発した（図ａに示す）。プライマーｃ’の３’末端は１１塩基対欠失をまたぎ、野生型アレル（ｗｔ）を増幅できない。陽性対照「Ｃ」を含む各ＰＣＲ反応に５００細胞相当量を加えた。ＨＤＲ率は、実験反応と対照反応との比較デンシトメトリーにより判定した。
【図１４】シーケンシングによるベルジアンブルー（Ｂｅｌｇｉａｎ  Ｂｌｕｅ）遺伝子移入の確認である。和牛（Ｗａｇｙｕ）野生型ＧＤＦ８およびベルジアンブルー（Ｂｅｌｇｉａｎ  Ｂｌｕｅ）鋳型（ＢＢ−ＨＤＲ）の模式図を示す。５つのＰＣＲ陽性コロニーについて、ホモロジーアーム（ｃおよびｄ）の外側に位置するプライマーを使用してＰＣＲを行ってから、プライマーｂ’を用いてクローニングおよびシーケンシングを行った。野生型配列との比較から、５つのコロニーのうち４つのコロニーでベルジアンブルー（Ｂｅｌｇｉａｎ  Ｂｌｕｅ）アレル（ヘテロ接合性）に特徴的な予想された１１塩基対欠失が明らかにされる。
【図１５】ＴＡＬＥＮを介したＨＤＲの模式図およびゲルである。ブタ（ｓｗｉｎｅ）低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）遺伝子の第４エクソンを標的とするＴＡＬＥＮペア（ＬＤＬＲ２．１）をスーパーコイルプラスミドＬｄｌｒ−Ｅ４Ｎ−ｓｔｏｐとコトランスフェクトした。Ｌｄｌｒ−Ｅ４Ｎ−ｓｔｏｐは、ブタ（ｓｗｉｎｅ）ＬＤＬＲ遺伝子に対応するホモロジーアーム、およびＨＤＲ時にネオマイシンホスホトランスフェラーゼの発現を可能にする遺伝子トラップを含む。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９８】
実施例８
家畜類細胞におけるＨＤＲの標的としての、ＴＡＬＥＮによるＤＮＡ切断。
ブタ（ｓｗｉｎｅ）低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）遺伝子の第４エクソンを標的とするＴＡＬＥＮペア（ＬＤＬＲ２．１）をスーパーコイルプラスミドＬｄｌｒ−Ｅ４Ｎ−ｓｔｏｐとコトランスフェクトした。Ｌｄｌｒ−Ｅ４Ｎ−ｓｔｏｐは、ブタ（ｓｗｉｎｅ）ＬＤＬＲ遺伝子に対応するホモロジーアーム、およびＨＤＲ時にネオマイシンホスホトランスフェラーゼの発現を可能にする遺伝子トラップを含む（図１５）。培養から３日後、ＰＣＲ解析により、抗生物質選択を行わなくても、３０℃で標的遺伝子座（レーン４）にてＨＤＲ現象に対応するバンドを検出し得ることが明らかになった。ジェネティシン（Ｇ４１８）による１４日間の培養細胞集団の選択の結果、ＨＤＲ細胞が顕著に濃縮された（レーン１１および１３）。体細胞核移植により、こうして改変された細胞のクローニングが実施され、代理雌ブタは現在胚を妊娠している。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９９
【補正方法】削除
【補正の内容】
【外国語明細書】
2020010692.tif 000023
2020010692.tif 000024
2020010692.tif 000025
2020010692.tif 000026
2020010692.tif 000027
2020010692.tif 000028
2020010692.tif 000029
2020010692.tif 000030
2020010692.tif 000031
2020010692.tif 000032
2020010692.tif 000033
2020010692.tif 000034
2020010692.tif 000035
2020010692.tif 000036
2020010692.tif 000037
2020010692.tif 000038
2020010692.tif 000039
2020010692.tif 000040
2020010692.tif 000041
2020010692.tif 000042
2020010692.tif 000043
2020010692.tif 000044
2020010692.tif 000045
2020010692.tif 000046
2020010692.tif 000047
2020010692.tif 000048
2020010692.tif 000049
2020010692.tif 000050
2020010692.tif 000051
2020010692.tif 000052
2020010692.tif 000053
2020010692.tif 000054
2020010692.tif 000055
2020010692.tif 000056
2020010692.tif 000057
2020010692.tif 000058
2020010692.tif 000059
2020010692.tif 000060
2020010692.tif 000061
2020010692.tif 000062
2020010692.tif 000063
2020010692.tif 000064
2020010692.tif 000065
2020010692.tif 000066
2020010692.tif 000067
2020010692.tif 000068
2020010692.tif 000069
2020010692.tif 000070
2020010692.tif 000071
2020010692.tif 000072
2020010692.tif 000073
2020010692.tif 000074
2020010692.tif 000075
2020010692.tif 000076
2020010692.tif 000077
2020010692.tif 000078
2020010692.tif 000079
2020010692.tif 000080
2020010692.tif 000081
2020010692.tif 000082
2020010692.tif 000083
2020010692.tif 000084
2020010692.tif 000085
2020010692.tif 000086
2020010692.tif 000087
2020010692.tif 000088
2020010692.tif 000089
2020010692.tif 000090
2020010692.tif 000091
【配列表】
2020010692000002.app