(57)【要約】      （修正有）【課題】少ない工程で、糖タンパク又は糖ペプチドが有する多数の単糖が結合した糖鎖を多数の単糖が結合した他の糖鎖と挿げ替え、所望の特性を有する糖タンパク又は糖ペプチドを製造することができる糖タンパク又は糖ペプチドの製造方法を提供する。【解決手段】２以上の単糖が結合してなるＮ結合型糖鎖Ａを有する化合物と、２以上の単糖が結合してなりコアフコースがないＮ結合型糖鎖Ｂを有する糖タンパク又は糖ペプチドと、エンドグリコシダーゼの１８０番目のアスパラギンをヒスチジンに変換したＥｎｄｏ−ＣＣ  Ｎ１８０Ｈとを混合して反応させることにより、糖鎖Ａを有する糖タンパク又は糖ペプチドを合成する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
２以上の単糖が結合してなるＮ結合型糖鎖Ａを有する化合物と、２以上の単糖が結合してなりコアフコースがないＮ結合型糖鎖Ｂを有する糖タンパク又は糖ペプチドと、エンドグリコシダーゼの１８０番目のアスパラギンをヒスチジンに変換したＥｎｄｏ−ＣＣ  Ｎ１８０Ｈとを混合して反応させることにより、糖鎖Ａを有する糖タンパク又は糖ペプチドを合成することを特徴とする糖タンパク又は糖ペプチドの製造方法。
【請求項２】
前記糖鎖Ａ及び前記糖鎖Ｂが、３〜１１個の単糖が結合してなる糖鎖である請求項１に記載の糖タンパク又は糖ペプチドの製造方法。
【請求項３】
前記Ｎ結合型糖鎖Ｂを有する糖タンパク又は糖ペプチドが、３〜９個の単糖が結合し分岐している糖鎖を有する糖タンパクである請求項２に記載の糖タンパク又は糖ペプチドの製造方法。
【請求項４】
前記糖タンパクを構成するタンパクが、α−Ｌ−イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）、カテプシンＡ（ＣＴＳＡ）又はモガムリズマブである請求項３に記載の糖タンパク又は糖ペプチドの製造方法。
【請求項５】
前記糖鎖Ａを有する化合物が、下記構造式（Ｉ）で表されることを特徴とする請求項１ないし請求項４のいずれか１項に記載の糖タンパク又は糖ペプチドの製造方法。
【化１】
2020010662.tif 000008
【請求項６】
前記糖鎖Ａを有する化合物が、下記構造式（II）で表されることを特徴とする請求項１ないし請求項４のいずれか１項に記載の糖タンパク又は糖ペプチドの製造方法。
【化２】
2020010662.tif 000009
【請求項７】
前記Ｅｎｄｏ−ＣＣ  Ｎ１８０Ｈが、磁性体樹脂ビーズに固定化されて、前記糖鎖Ａを有する化合物及び前記糖鎖Ｂを有する糖タンパク又は糖ペプチドと混合されることを特徴とする請求項１ないし請求項６のいずれか１項に記載の糖タンパク又は糖ペプチドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖転移酵素を使用して、糖タンパク質や糖ペプチドを構成する糖を他の糖に挿げ替える糖タンパク質や糖ペプチドを製造する方法に関する。より詳しくは、糖転移酵素であるエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（エンドグリコシダーゼ）の変異体による酵素反応により、複数の単糖からなる糖鎖が結合したタンパク質やペプチドの当該糖鎖を、複数の単糖からなる他の糖鎖と挿げ替えて、所望の特性を有する糖タンパク質や糖ペプチドを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖鎖がタンパク質やペプチドに結合した糖タンパク質や糖ペプチドには、種々の生命現象に関与するものがあり、医薬品原料、細胞培養用基材、検査薬等への適用が期待されている。例えば、バイオ医薬品の約６割が糖タンパク製剤である。そこで、前記のような用途に望まれる特性を有する糖タンパク質や糖ペプチドの開発が望まれ、それらの調製方法の開発も望まれている。
【０００３】
糖タンパク質や糖ペプチドの調製方法としては、既存の糖タンパク質や糖ペプチドの糖鎖を他の糖鎖で挿げ替える糖転移による方法が知られている。例えば、糖転移酵素を使用した糖転移反応により、動物、微生物等の細胞由来の糖タンパク質の糖鎖を、前記糖鎖とは異なる糖鎖に挿げ替えて所望の特性を有する糖タンパク質とする方法が知られている。
【０００４】
エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（エンドグリコシダーゼ）は、Ｎ結合型糖鎖のキトビオース結合を加水分解して遊離させる活性、糖鎖を転移させる活性を有する糖転移酵素からなる。特許文献１には、コプリナス・シネレウス由来のエンドグリコシダーゼが開示されており、この酵素により、シアリルグリコペプチド（シアロ糖ペプチド：ＳＧＰ）のキトビオース結合が加水分解されて生じたシアリル化糖鎖（ＳＧ）又は前記ＳＧを非特許文献１に記載の方法によりオキサゾリン化したオキサゾリン化シアリル糖鎖（ＳＧ−Ｏｘａｚｏｌｉｎｅ）と、Ｎ−アセチルグルコースアミン（ＧｌｃＮＡｃ）とを反応させて、ＳＧをＧｌｃＮＡｃの４位水酸基に結合する方法が開示されている。
【０００５】
そしてこの方法により、糖タンパク質又は糖ペプチドの糖鎖のキトビオース結合をエンドグリコシダーゼにより加水分解し遊離させて、ＧｌｃＮＡｃタンパク又はＧｌｃＮＡｃペプチドを作製し、ＳＧ等の糖鎖やオキサゾリン化シアリル糖鎖と反応させることにより、この糖鎖をＧｌｃＮＡｃの４位水酸基に結合させて、所望の糖鎖を有する糖タンパク又は糖ペプチドを製造できることが示されている。この方法を利用すれば、例えば、細胞由来の糖タンパク質に、その糖鎖に起因して、拒絶反応を誘発する等の問題がある場合、糖鎖を挿げ替えることによりこの問題を解決し有効性が高い医薬とすることができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１７−１５８５９６号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ，  ２０１２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかし、前記の方法では、ＳＧ（糖鎖）を有する糖タンパク又は糖ペプチドを製造するためには、加水分解活性を有するエンドグリコシダーゼにより糖タンパク質又は糖ペプチドの糖鎖部分を加水分解して糖鎖の切りそろえを行い糖受容体のＧｌｃＮＡｃタンパク又はＧｌｃＮＡｃペプチドを作製する工程、加水分解活性を有するエンドグリコシダーゼによりＳＧＰを加水分解して糖供与体のＳＧを作製する工程を行い、その後、糖転移活性を有するエンドグリコシダーゼにより、前記糖受容体に糖供与体のＳＧを結合する工程が必要である。さらに、反応の活性を向上させるためにオキサゾリン化シアリル糖鎖を用いる場合には、オキサゾリン化の工程も必要である。
【０００９】
そこで、より少ない工程で、多数の単糖が結合した糖鎖を有する糖タンパク又は糖ペプチドの糖鎖と（ＳＧＰが有するような）多数の単糖が結合した他の糖鎖との糖転移反応を完結させ、所望の特性を有する糖タンパク又は糖ペプチドを製造する方法が望まれていた。本発明は、少ない工程で、糖タンパク又は糖ペプチドが有する多数の単糖が結合した糖鎖を多数の単糖が結合した他の糖鎖と挿げ替え、所望の特性を有する糖タンパク又は糖ペプチドを製造することができる糖タンパク又は糖ペプチドの製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は前記課題を達成するため鋭意検討した結果、糖転移酵素として、エンドグリコシダーゼの特定の変異体、具体的にはエンドグリコシダーゼの１８０番目のアスパラギン残基をヒスチジン残基に変異させたＥｎｄｏ−ＣＣ  Ｎ１８０Ｈを糖転移酵素として用いることにより、Ｅｎｄｏ−ＣＣ  Ｎ１８０Ｈと、多数の単糖が結合した糖鎖を有する化合物と、多数の単糖が結合した糖鎖を有する糖タンパク又は糖ペプチドの糖鎖とを、混合し反応させるのみで、すなわち１工程のみで（ワンポット反応で）、前記化合物が有する多数の単糖が結合した糖鎖を、糖タンパク又は糖ペプチドの糖鎖と挿げ替えることができ、所望の特性を有する糖タンパク又は糖ペプチドを得ることができることを見出し、本発明を完成した。
【００１１】
すなわち、本発明の第１は、
２以上の単糖が結合してなるＮ結合型糖鎖Ａを有する化合物と、２以上の単糖が結合してなりコアフコースがないＮ結合型糖鎖Ｂを有する糖タンパク又は糖ペプチドと、エンドグリコシダーゼの１８０番目のアスパラギンをヒスチジンに変換したＥｎｄｏ−ＣＣ  Ｎ１８０Ｈとを混合して反応させることにより、糖鎖Ａを有する糖タンパク又は糖ペプチドを合成することを特徴とする糖タンパク又は糖ペプチドの製造方法を提供する。
【００１２】
本発明の第２は、前記糖鎖Ａ及び前記糖鎖Ｂが、３〜１１個の単糖が結合してなる糖鎖である本発明の第１の糖タンパク又は糖ペプチドの製造方法である。
【００１３】
本発明の第３は、前記Ｎ結合型糖鎖Ｂを有する糖タンパク又は糖ペプチドが、３〜９個の単糖が結合し分岐している糖鎖を有する糖タンパクである本発明の第２の糖タンパク又は糖ペプチドの製造方法である。
【００１４】
本発明の第４は、前記糖タンパクを構成するタンパクが、α−Ｌ−イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）、カテプシンＡ（ＣＴＳＡ）又はモガムリズマブである本発明の第３の糖タンパク又は糖ペプチドの製造方法である。
【００１５】
本発明の第５は、前記糖鎖Ａを有する化合物が、下記構造式（Ｉ）で表されることを特徴とする本発明の第１〜４の糖タンパク又は糖ペプチドの製造方法である。
【００１６】
【化１】
2020010662.tif 000002
【００１７】
［式（Ｉ）中、Ａｃはアセチル基を表す。以後に示す他の構造式中のＡｃも同じである。］
【００１８】
本発明の第６は、前記糖鎖Ａを有する化合物が、下記構造式（II）で表されることを特徴とする本発明の第１〜４の糖タンパク又は糖ペプチドの製造方法である。
【００１９】
【化２】
2020010662.tif 000003
【００２０】
本発明の第７は、前記Ｅｎｄｏ−ＣＣ  Ｎ１８０Ｈが、磁性体樹脂ビーズに固定化されて、前記糖鎖Ａを有する化合物及び前記糖鎖Ｂを有する糖タンパク又は糖ペプチドと混合されることを特徴とする本発明の第１〜６の製造方法である。
【発明の効果】
【００２１】
本発明の製造方法によれば、糖鎖の切りそろえ等の工程が不要であり、より少ない工程で、多数の単糖が結合した糖鎖を有する化合物の当該糖鎖を多数の単糖が結合した糖鎖を有する糖タンパク又は糖ペプチドの糖鎖と挿げ替え、所望の特性を有する糖タンパク又は糖ペプチドを製造することができる。又、この方法によれば、使用するエンドグリコシターゼの種類を削減することができる。そして、この製造方法により製造され、所望の特性を有する糖タンパク又は糖ペプチドは、医薬品原料、細胞培養用基材、検査薬等への適用が期待される。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、本発明を実施するための形態についてより具体的に説明するが、本発明の範囲は、以下に述べる具体的形態や実施例により限定されず、課題を解決するための手段として述べた前記の範囲及びその均等の範囲が含まれると解されるべきである。
【００２３】
本発明の第１は、２以上の単糖が結合してなるＮ結合型糖鎖Ａを有する化合物と、２以上の単糖が結合してなりコアフコースがないＮ結合型糖鎖Ｂを有する糖タンパク又は糖ペプチドと、エンドグリコシダーゼの１８０番目のアスパラギンをヒスチジンに変換したＥｎｄｏ−ＣＣ  Ｎ１８０Ｈとを混合して反応させることにより、糖鎖Ａを有する糖タンパク又は糖ペプチドを合成することを特徴とする糖タンパク又は糖ペプチドの製造方法である。
【００２４】
２以上の単糖が結合してなるＮ結合型糖鎖Ａを有する化合物とは、糖鎖Ａの末端側に、Ｅｎｄｏ−ＣＣ  Ｎ１８０Ｈにより加水分解される結合を有する化合物であり、糖供与体として本発明の反応に供せられる。糖鎖Ａの末端と結合する官能基は、糖鎖末端との間に、Ｅｎｄｏ−ＣＣ  Ｎ１８０Ｈにより加水分解されない結合を形成する官能基であれば特に限定されない。例えば、アルコキシフェニル基等のフェノール系化合物から水酸基の水素を除いた残基、脂肪族アルコールの水酸基の水素を除いた残基等の低分子の官能基、ＧｌｃＮＡｃが結合したタンパク質やペプチドの当該ＧｌｃＮＡｃの４位水酸基から水素を除いた残基等を挙げることができる。
【００２５】
Ｎ結合型糖鎖Ａとは、その還元末端が、糖鎖Ｂを有する糖タンパク又は糖ペプチドを構成するタンパク又はペプチドが有するアスパラギンのアミノ基の窒素と結合する糖鎖であり、その結合により前記タンパク又はペプチドに所望の特性を付与できる糖鎖である。糖鎖Ａは、単糖が２以上結合した糖鎖から選ばれ、所望の特性や、糖鎖Ｂを有する糖タンパク又は糖ペプチドの種類を考慮して、糖鎖Ａを有する化合物が選択される。
糖鎖Ａが、単糖が３以上１１以下結合している糖鎖の場合、本発明の効果はより大きく奏される。中でも、単糖が３以上９以下結合している分岐している糖鎖の場合、本発明の効果はさらに大きく奏される。
【００２６】
Ｎ結合型糖鎖Ａを有し、糖供与体として本発明の反応に供せられる化合物としては、前記構造式（Ｉ）で表されるＭａｎ５（６Ｐ２）ＧＮ２ＭＰ（ＭＷ：１５８９．１２：前記式中、ＭＰとはｐ−メトキシフェニル基である：以下、「Ｍ６Ｐ」と示す）、前記構造式（II）で表されるＳＧＰ、ＳＧＰの糖鎖の還元末端側に結合しているペプチド鎖（Ａｓｎ；アスパラギン残基）がｐ−ニトロフェニル基で置換された化合物、ＳＧＰの糖鎖を下記の構造式（III）又は（IV）で表される糖鎖に置換した化合物、構造式（III）又は（IV）で表される糖鎖の還元末端側にｐ−ニトロフェニル基が結合している化合物等を挙げることができる。
【００２７】
【化３】
2020010662.tif 000004
【００２８】
［式中、Ｒ５及びＲ６は、水素又は下記式（IIIａ）、（IIIｂ）もしくは（IIIｃ）で表される１価基である。］
【００２９】
【化４】
2020010662.tif 000005
【００３０】
【化５】
2020010662.tif 000006
【００３１】
［式中、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１及びＲ１２は、水素又は下記式（IＶａ）で表される１価基であるが、Ｒ７、Ｒ８及びＲ９の中の１つ又は２つは水素であり、Ｒ１０、Ｒ１１及びＲ１２の中の少なくとも１つは水素であり、かつＲ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１及びＲ１２の中の３〜５は水素である。］
【００３２】
【化６】
2020010662.tif 000007
【００３３】
前記の２以上の単糖が結合してなるＮ結合型糖鎖Ａを有する化合物の多くは公知の化合物であり、公知の方法により製造することができる。化合物自体が公知でない場合も公知の方法に準じて製造することができる。
【００３４】
本発明の製造方法において、糖受容体となり得るのは、２以上の単糖が結合してなりコアフコースがないＮ結合型糖鎖Ｂを有する糖タンパク又は糖ペプチドである。コアフコースが付いた糖鎖は加水分解活性や糖転移活性を示さないので、コアフコースを有する糖鎖が結合している糖タンパク又は糖ペプチドは、本発明における糖受容体となり得ない。
Ｎ結合型であるので、前記糖鎖の還元末端は、糖タンパク又は糖ペプチドの窒素原子、アスパラギンのアミノ基の窒素原子と結合している。
前記糖鎖Ｂは、２以上の単糖が結合してなるものであるが、単糖が３以上１１以下結合している糖鎖の場合、本発明の効果はより大きく奏される。中でも、単糖が３以上９以下結合し分岐している糖鎖の場合、本発明の効果はさらに大きく奏される。
【００３５】
本発明の製造方法において糖受容体となる糖鎖Ｂを有する糖タンパク又は糖ペプチドとしては、単糖が３以上９以下結合し分岐しているＮ結合型糖鎖を有する糖タンパクが好ましい。すなわち、糖鎖Ｂを有する糖タンパク又は糖ペプチドが、３〜９個の単糖が結合し分岐しているＮ結合型糖鎖を有する糖タンパクである場合、本発明の効果は特に大きく奏される。
【００３６】
中でも、前記糖タンパクを構成するタンパクが、α−Ｌ−イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）、カテプシンＡ（ＣＴＳＡ）又はモガムリズマブ（ポテリジオ）の場合、本発明は特に好ましく適用される。
ＩＤＵＡは、例えば、特開２０１７−１８４７３６号公報の段落０１０８に記載の方法によりヒトαイズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）遺伝子を導入したトランスジェニックカイコ（ＴＧカイコ）を作製し、このＴＧカイコより同公報の段落０１１２〜０１１４に記載の方法により製造することができる（ＴＧカイコ由来のＩＤＵＡ）。
カテプシンＡ（ＣＴＳＡ）は、ＴＧカイコから、ＹＡＫＵＧＡＫＵ  ＺＡＳＳＨＩ  Ｖｏｌ．１３８，ｐｐ８８５−８９３（２０１８）、ＡＧＲＩＣＵＬＴＵＲＡＬ  ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ  Ｖｏｌ．１（６），ｐｐ６３１−６３５（２０１７）、Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．  Ｔｈｅｒ．  Ｖｏｌ．１０（１），ｐｐ３４−３９（２０１６）等の記載を参考にして製造することができる。
モガムリズマブ（ポテリジオ）は、協和発酵キリン社等から市販されており、市販品を用いることができる。
【００３７】
Ｅｎｄｏ−ＣＣ  Ｎ１８０Ｈとは、エンドグリコシダーゼの１８０番目のアスパラギンをヒスチジンに変換した酵素であり、伏見製薬所社等から市販されており、この市販品を用いることができる。なお、Ｅｎｄｏ−ＣＣ  Ｎ１８０Ａ、Ｎ１８０Ｑ、Ｎ１８０Ｄ等の酵素も、同様に加水分解活性、糖転移活性も有する変異体であるので、Ｅｎｄｏ−ＣＣ  Ｎ１８０Ｈと同様に使用することができ、前記本発明の効果と同様な効果を奏すると考えられる。Ｅｎｄｏ−ＣＣ  Ｎ１８０Ａ、Ｎ１８０Ｑ、Ｎ１８０Ｄの製造方法は、https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27714557に「Ｈｉｇｈｌｙ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｔｒａｎｓｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉａｌｏ−ｃｏｍｐｌｅｘ−ｔｙｐｅ  ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｕｓｉｎｇ  Ｃｏｐｒｉｎｏｐｓｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ  ｅｎｄｏｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ  ａｎｄ  ｓｕｇａｒ  ｏｘａｚｏｌｉｎｅ．」として記載されている。
さらに、ＧＨ８５ファミリーとＧＨ１８ファミリーの２つファミリーに属する変異体については、Ｅｎｄｏ−ＣＣ  Ｎ１８０Ｈと同様に使用することができ、前記本発明の効果と同様な効果を奏する可能性も考えられる。
【００３８】
本発明の製造方法においては、Ｅｎｄｏ−ＣＣ  Ｎ１８０Ｈは、磁性体樹脂ビーズに固定化されて、前記糖鎖Ａを有する化合物及び前記糖鎖Ｂを有する糖タンパク又は糖ペプチドと混合されることが好ましい。
Ｅｎｄｏ−ＣＣ  Ｎ１８０Ｈを、磁性体樹脂ビーズに固定化することにより、酵素が反応系に均一に分散されるので、反応を効率よく行うことができるとともに、反応後、磁石の作用により磁性体樹脂ビーズを反応系内の一部に集めて他の反応系との分離を容易に行うことができるので、反応系の分離、取り出しが容易になり好ましい。
磁性体樹脂ビーズに固定化されたＥｎｄｏ−ＣＣ  Ｎ１８０Ｈは、緩衝液中に、磁性体樹脂ビーズとＥｎｄｏ−ＣＣ  Ｎ１８０Ｈを加え、両者を接触させることにより製造することができる。磁性体樹脂ビーズとしては、ＧＥ社や多摩川精機社等から市販されている市販品を用いることができる。
【００３９】
糖鎖Ａを有する化合物と、糖鎖Ｂを有する糖タンパク又は糖ペプチドと、Ｅｎｄｏ−ＣＣ  Ｎ１８０Ｈとの混合及び反応は、例えば、これらを容器内に入れて、当該容器を振盪することにより行うことができる。
糖鎖Ａを有する化合物と、糖鎖Ｂを有する糖タンパク又は糖ペプチドとの反応モル比は、１：１〜１００００：１程度の範囲から選択される場合が多い。Ｅｎｄｏ−ＣＣ  Ｎ１８０Ｈの使用量は、糖鎖Ｂを有する糖タンパク又は糖ペプチドの１ナノモルに対して、１〜３００ｍｕｎｉｔｓの範囲から選択される場合が多い。反応温度は１０〜５０℃程度の範囲から、反応時間は数分から数十時間の範囲、具体的には５分から３０時間程度の範囲から選ばれる場合が多い。前記の反応条件の好ましい範囲は、前記化合物や前記糖タンパク又は糖ペプチドの種類やモル比、Ｅｎｄｏ−ＣＣ  Ｎ１８０Ｈの配合量等により変動するので、予め簡易な予備実験等により最適な条件を選択することが好ましい。
Ｅｎｄｏ−ＣＣ  Ｎ１８０Ｈを磁性体樹脂ビーズに固定化して用いる場合は、当該磁性体樹脂ビーズを磁石により反応容器の１部分に集めることにより、他の反応系と分離することができる。そして、分離された他の反応系をクロマトグラフィー等により精製することにより、反応生成物である、糖鎖Ａを有する糖タンパク又は糖ペプチドを得ることができる。
【００４０】
本発明の製造方法は、医薬品原料、細胞培養用基材、検査薬等の製造への適用が期待できる。例えば、動物、微生物等の細胞由来の糖タンパク質及び前記糖タンパク質とは異なる糖鎖を有する化合物とを、本発明の製造方法により反応させて、糖タンパク質の糖鎖を挿げ替えて、医薬品原料等として望まれる特性を有する糖タンパク質を製造できる。
【実施例】
【００４１】
（実験に使用した材料の製造）
製造例１  ＴＧカイコ絹糸腺由来ＩＤＵＡ（以下、「ＭＳＧ−ＩＤＵＡ」と示す）溶液の製造
特開２０１７−１８４７３６号公報の段落０１０８に記載の方法によりヒトαイズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）遺伝子を導入したＴＧカイコを作製した。
【００４２】
作製されたＴＧカイコから同公報の段落０１１２に記載の方法により採取した中部絹糸腺を解凍後、細断し、０．５ＭのＮａＣｌを含有した２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）中で超音波破砕し、抽出液を調製した。得られた抽出液を、遠心分離機［２００００ｘｇ、４℃、２０分（ベックマンコールター社製：ＡｖａｎｔｉＪ−Ｅ、ロータ：ＪＲＡ１６．２５０）］によって遠心後、上清を回収した。得られた上清を、４℃で静置した（Ｏ／Ｎ）後、遠心分離機［２７０００ｘｇ、４℃、２０分（ベックマンコールター社製：ＡｖａｎｔｉＪ−Ｅ、ロータ：ＪＲＡ１６．２５０）］によって遠心後、上清を回収した。得られた上清に、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を加えて、ＮａＣｌ濃度を１５０ｍＭまで下げた。
【００４３】
得られた上清と、予め結合用緩衝液［１５０ｍＭＮａＣｌを含有した２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）］で平衡化した陽イオン交換担体（ＳＰセファロース  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ、ＧＥ社製）とを遠心管内で混合し、蓋で密閉後、ローテータ（Ｔａｉｔｅｃ社製、ＲＴ−５０）で緩やかに撹拌し、ＩＤＵＡの陽イオン交換担体への結合を行った（４℃、３時間）。その後、遠心分離機［３００ｘｇ、４℃、５分（クボタ社製、ＫＵＢＯＴＡ−６２００、ロータ：ＳＦ  ７２２）］により遠心後、上清を除去し、陽イオン交換クロマトグラフィー洗浄用緩衝液［１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含有した２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）］を用いて陽イオン交換担体の洗浄を行った。その後、陽イオン交換クロマトグラフィー溶出用緩衝液［３００ｍＭ  ＮａＣｌを含有した２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）］により溶出を行った（４℃、Ｏ／Ｎ）。
【００４４】
得られた溶出画分をアミコンウルトラフィルターユニット（分画分子量３０ｋＤａ）（ミリポア社製）を用いて濃縮後、硫酸アンモニウムが終濃度１Ｍとなるように、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）及び２Ｍ硫酸アンモニウムを等量加えた。４℃で３０分静置後、遠心分離［２０００ｘｇ、４℃、１５分（クボタ社製、ＫＵＢＯＴＡ−６２００、ロータ：ＳＦ  ７２２）］を行った後、上清を回収した。その後、０．２２μｍのフィルター（ミリポア社製）を用いて上清中の不溶物を除去した後、ＡＫＴＡ  ｐｕｒｉｆｉｅｒ  ＵＰＣ−１０（ＧＥ社製）に装備されている疎水性相互作用クロマトグラフィー用のカラム（ＨｉＴｒａｐ  Ｂｕｔｙｌ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ、ＧＥ社製）にアプライし、硫酸アンモニウム濃度を１Ｍから０Ｍまで連続的に低下させる条件によって精製操作を行い、ＩＤＵＡを含む画分を得た。
【００４５】
得られた画分をアミコンウルトラフィルターユニット（分画分子量３０ｋＤａ）（ミリポア社製）を用いて濃縮後、０．５Ｍ  ＮａＣｌを含有する１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を用いて緩衝液交換を行った。その後、０．２２μｍフィルターで濾過を行い、ＡＫＴＡ  ｐｕｒｉｆｉｅｒ  ＵＰＣ−１０に装備されているヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー用のカラム（Ｂｉｏ−Ｓｃａｌｅ  ＣＨＴ５−Ｉ、バイオラッド社製）にアプライし、リン酸ナトリウム緩衝液濃度を１０ｍＭから２００ｍＭまで連続的に増大させる条件によって精製操作を行った。ＭＳＧ−ＩＤＵＡは０．５Ｍ  ＮａＣｌを含有する１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で洗い出された画分に含まれた。
【００４６】
得られたＭＳＧ−ＩＤＵＡをアミコンウルトラフィルターユニット（分画分子量３０ｋＤａ）（ミリポア社製）を用いて濃縮し、０．５Ｍ  ＮａＣｌを含有する１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解されたＭＳＧ−ＩＤＵＡを得た。タンパク質濃度はＤＣ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（バイオラッド社製）によって測定し、溶液中のＩＤＵＡ濃度（前記の方法により測定したタンパク質濃度。以下同じである。）は２．４ｍｇ／ｍＬであった。
【００４７】
製造例２  ＧｌｃＮＡｃ−ＩＤＵＡ溶液の製造
前記の方法により得られたＭＳＧ−ＩＤＵＡ溶液を４１６μＬ（含有されているＭＳＧ−ＩＤＵＡは１ｍｇ）、５００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液 (ｐＨ５．０）を１００μＬ、５００ｍＭ  Ｎａｃｌ水溶液を８４μＬ及び純水４００μＬを加えて混合し、全量１０００μＬの溶液を作製した。
この溶液を、２５０ｍＭ  ＮａＣｌを含有した５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液 (ｐＨ５．０）を３ｍＬ加えて平衡化した伏見製薬所社製のＥｎｄｏ−ＣＣ  ＷＴ固定化カラム（１ｍＬカラム：３００ｍＵｎｉｔ／ｍＬ）に、約０．５ｍＬ／ｍｉｎでアプライした後、室温で５分間静置して、ＭＳＧ−ＩＤＵＡの糖鎖切断処理を行った。その後、２５０ｍＭのＮａＣｌを含有した５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液 (ｐＨ５．０）で溶出を行い、溶出画分を得た。前記ＭＳＧ−ＩＤＵＡの糖鎖切断処理によりＮ−アセチルグルコースアミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基がＩＤＵＡにＮ結合したＧｌｃＮＡｃ−ＩＤＵＡが生成するが、前記溶出画分中（ＧｌｃＮＡｃ−ＩＤＵＡ溶液）のＩＤＵＡ濃度は０．５９ｍｇ／ｍＬであった。
【００４８】
製造例３  Ｅｎｄｏ−ＣＣ  Ｎ１８０Ｈ固定化磁気ビーズの製造
伏見製薬所社製のエンドグリコシダーゼ変異体Ｅｎｄｏ−ＣＣ  Ｎ１８０Ｈ（エンドグリコシダーゼの１８０番目のアスパラギンをヒスチジンに置き換えたもの）３００ｍｕｎｉｔｓを、アミコン１０Ｋ（メルク・ミリポア社製）を用いて、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）にバッファー交換をおこない３００ｍｕｎｉｔｓ／１ｍｌの溶液にする。
ＮＨＳ  ｂｅａｄｓ（磁性体樹脂ビーズ：多摩川精機社製）１ｍｇを１５ｍｌ遠沈管（Ｗａｔｓｏｎ社製）に秤量し、１ｍＭ  ＨＣｌを６ｍｌ入れ、磁石でＮＨＳ  ｂｅａｄｓを側面部に集める。上清を捨て、バッファー交換をおこなった前記のＥｎｄｏ−ＣＣ  Ｎ１８０Ｈ溶液を入れ、ＥＹＥＬＡ社製高速振盪機ＣＭ−１０００により、室温、２時間、５００ｒｐｍで振盪撹拌して、Ｅｎｄｏ−ＣＣ  Ｎ１８０Ｈが磁性体樹脂ビーズに固定化されたＥｎｄｏ−ＣＣ  Ｎ１８０Ｈ固定化ビーズが得られる。
【００４９】
その後、磁石でＥｎｄｏ−ＣＣ  Ｎ１８０Ｈ固定化ビーズを側面によせ、上清をすてた後、０．５Ｍエタノールアミンと０．５Ｍ  ＮａＣｌの混合液（ｐＨ  ８．３）を６ｍｌ入れて２時間振盪撹拌する操作、及び、磁石でＥｎｄｏ−ＣＣ  Ｎ１８０Ｈ固定化ビーズを側面によせ上清をすてた後、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を６ｍｌ加え撹拌する操作を３回繰り返すことにより、下記の実験に供するＥｎｄｏ−ＣＣ  Ｎ１８０Ｈ固定化磁気ビーズ（３００ｍＵｎｉｔ／ｍｇビーズ／ｍＬ）の１ｍｇが得られた。
【００５０】
（実験に使用した材料）
［ＳＧＰ溶液］
下記の実験では、伏見製薬所社製のα２，６−ＳＧＰ（分子量：２．８７ｋＤａ）を、２５０ｎｍｏｌ／μＬ（０．７２ｍｇ／μＬ）となるように純水で溶解した溶液を使用した。
【００５１】
［Ｍ６Ｐ溶液］
特開２０１７−１８４７３６号公報の段落０１２１に化合物１２として構造式が記載されている化合物の水溶液である。この化合物は、同公報の段落０１２２〜段落０１２７に記載の方法により合成することができる。下記の実験では、東京化成から購入した乾燥品を超純水で１００ｎｍｏｌ／μＬに調製した溶液を、Ｍ６Ｐ溶液として使用した。
【００５２】
実施例１  ＳＧＰとＭＳＧ−ＩＤＵＡの糖鎖挿げ替え反応
前記製造例１で製造されたＭＳＧ−ＩＤＵＡ溶液（３０μＬ：ＩＤＵＡ７２μｇ；１ｎｍｏｌ：Ａｃｃｅｐｔｏｒ）、５００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）（１４μＬ）及びＳＧＰ溶液（４μＬ：ＳＧＰ１０００ｎｍｏｌ：Ｄｏｎｏｒ）に、純水９６μＬを加えて全量１４４μＬとした液（Ｄｏｎｏｒ：Ａｃｃｅｐｔｏｒ＝１０００：１（モル比））の全量を、前記製造例３で得られたＥｎｄｏ−ＣＣ  Ｎ１８０Ｈ固定化磁気ビーズが１００μｇ入ったチューブにアプライした。
チューブを３０℃で震盪し、１ｈ、２ｈ、４ｈ、６ｈ、１８ｈ、２４ｈ経過したときに、磁気ビーズを磁石で集めてサンプルを、それぞれ、２０μＬ（１０μｇ）回収した。
回収したサンプルを、ＩＤＵＡ濃度が１μｇ／１０μｌとなるように純水で希釈後、６ｘＳＤＳサンプルバッファー［３００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ６．８）、３６％グリセロール、２４％ＳＤＳ、０．０１２％ブロモフェノールブルー、１２％メルカプトエタノール］を２μＬ加えてＳＤＳ−ＰＡＧＥ用にサンプル調製（煮沸２分間）した。
【００５３】
調製されたサンプルを１μｇＩＤＵＡ／Ｌａｎｅで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％ｇｅｌ）した。さらに、ＳＳＡ  ｌｅｃｔｉｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇによって末端シアル酸含有糖鎖−ＩＤＵＡの検出を行った。また同様に定法にてＣＢＢ染色により分子量の変化を調べた。以下に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ＣＢＢ染色、ＳＳＡ  ｌｅｃｔｉｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇの方法、条件を示す。
【００５４】
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ＣＢＢ染色）
スラブ電気泳動装置（バイオクラフト社製）を使用した。１０％ポリアクリルアミド均一ゲルを用いた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のゲル内タンパク質の検出は、ＧＥ社製の１０％ＣＢＢ−Ｒ３５０、２７％メタノール、９％酢酸、０．１％ＣｕＳＯ４からなるＣＢＢ染色液中で１時間以上染色を行った後、１０％酢酸を用いて６時間以上脱色して行った。
【００５５】
（ＳＳＡ  ｌｅｃｔｉｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ）
前記ＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動を行った後、定法に従い、４８ｍＭトリス、３９ｍＭグリシン、２０％メタノールの混合溶液を緩衝液として用い、ＰＶＤＦ膜へのタンパク質の転写を、１５Ｖの定電圧で１時間行った。転写したＰＶＤＦ膜を、５０％Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｏｎｅ（ナカライテスク）／ＴＢＳ中で、室温で１．５時間振盪してブロッキングした。
【００５６】
１ｓｔプローブとして、５０％Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｏｎｅ／ＴＢＳで５００倍希釈したＳＳＡ−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｊオイルミルズ社製）中でＰＶＤＦ膜を振盪した（４℃、Ｏ／Ｎ）。その後、ＰＶＤＦ膜について、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０／ＴＢＳ（ＴＢＳＴ）中、室温で５分間の洗浄を５回繰り返した後、さらにＴＢＳ中、室温で５分間洗浄した。
２ｎｄプローブとして、５０％Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｏｎｅ／ＴＢＳで１０００倍希釈したＨＲＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉ−ｂｉｏｔｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）を使用し、ＰＶＤＦ膜を室温で１時間振盪した後、ＰＶＤＦ膜について、ＴＢＳＴ中、室温で５分間の洗浄を５回繰り返した後、さらにＴＢＳ中、室温で５分間洗浄した。
その後、ＰＶＤＦ膜を、Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ  Ｕｌｔｒａ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）により化学発光させ、画像解析装置［ＢＩＯ−ＲＡＤ，ＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＸＲＳ＋（バイオラッド社製）］を用いてシグナル（バンド）検出を行った。
【００５７】
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ＣＢＢ染色の結果）
・未処理サンプルでは７５ｋＤａにバンドが見られた。（Ｌａｎｅ１）
・１ｈサンプルでは７６ｋＤａのバンドが見られた。（Ｌａｎｅ２）
・２ｈサンプルでは７６ｋＤａのスメアなバンドが見られた。（Ｌａｎｅ３）  
・４ｈサンプルでは７６〜８０ｋＤａのスメアなバンドが見られた。（Ｌａｎｅ４）
・６ｈサンプルでは７６〜８０ｋＤａのスメアなバンドが見られた。（Ｌａｎｅ５）
・１８ｈサンプルでは７７〜８５ｋＤａのスメアなバンドが見られた。（Ｌａｎｎ６）
・２４ｈサンプルでは７７〜８５ｋＤａのスメアなバンドが見られた。（Ｌａｎｅ７）
【００５８】
（ＳＳＡ  ｌｅｃｔｉｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇの結果）
・未処理サンプルではシグナルは見られなかった。（Ｌａｎｅ１）
・１ｈサンプルでは９０ｋＤａに弱いシグナルが見られた。（Ｌａｎｅ２）
・２ｈサンプルでは８０〜９０ｋＤａのスメアなシグナルが見られた。また７５ｋＤａに弱いシグナルが見られた。（Ｌａｎｅ３）
・４ｈサンプルでは８０〜９０ｋＤａのスメアなシグナルが見られた。また７５ｋＤａに弱いシグナルが見られた。（Ｌａｎｅ４）
・６ｈサンプルでは８０〜１００ｋＤａのスメアなシグナルが見られた。また７５ｋＤａに弱いシグナルが見られた。（Ｌａｎｅ５）
・１８ｈサンプルでは８０〜１００ｋＤａのスメアなシグナルが見られた。また７５ｋＤａに弱いシグナルが見られた。（Ｌａｎｎ６）
・２４ｈサンプルでは８０〜１００ｋＤａの濃いスメアなシグナルが見られた。また７５ｋＤａに弱いシグナルが見られた。（Ｌａｎｅ７）
【００５９】
参考例１  ＳＧＰとＧｌｃＮＡｃ−ＩＤＵＡの糖鎖挿げ替え反応
前記製造例２で製造されたＧｌｃＮＡｃ−ＩＤＵＡ溶液（１２２μＬ：ＩＤＵＡ７２μｇ；１ｎｍｏｌ：Ａｃｃｅｐｔｏｒ）、５００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）（１４μＬ）及びＳＧＰ溶液（４μＬ：ＳＧＰ１０００ｎｍｏｌ：Ｄｏｎｏｒ）に、純水４μＬを加えて全量１４４μＬとした液（Ｄｏｎｏｒ：Ａｃｃｅｐｔｏｒ＝１０００：１（モル比））の全量を、前記製造例３で得られたＥｎｄｏ−ＣＣ  Ｎ１８０Ｈ固定化磁気ビーズが１００μｇ入ったチューブにアプライした。
チューブを３０℃で震盪し、１ｈ、２ｈ、４ｈ、６ｈ、１８ｈ、２４ｈ経過したときに、磁気ビーズを磁石で集めてサンプルを、それぞれ、２０μＬ（１０μｇ）回収した。
回収したサンプルを、ＩＤＵＡ濃度が１μｇ／１０μｌとなるように純水で希釈後、６ｘＳＤＳサンプルバッファーを２μＬ加えてＳＤＳ−ＰＡＧＥ用にサンプル調製（煮沸２分間）した。
【００６０】
調製されたサンプルを、実施例１と同様にしてＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％ｇｅｌ）した。さらに、ＳＳＡ  ｌｅｃｔｉｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇによって末端シアル酸含有糖鎖の検出を行った。また実施例１と同様に定法にてＣＢＢ染色により分子量の変化を調べた。
【００６１】
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ＣＢＢ染色の結果）
・未処理サンプルでは７５ｋＤａにバンドが見られた。（Ｌａｎｅ１）
・ＧｌｃＮＡｃ−ＩＤＵＡサンプルでは７３ｋＤａにバンドが見られた。（Ｌａｎｅ２）
・１ｈサンプルでは７４ｋＤａのバンドが見られた。（Ｌａｎｅ３）
・２ｈサンプルでは７４ｋＤａのスメアなバンドが見られた。（Ｌａｎｅ４）  
・４ｈサンプルでは７５ｋＤａのスメアなバンドが見られた。（Ｌａｎｅ５）
・６ｈサンプルでは７５ｋＤａのスメアなバンドが見られた。（Ｌａｎｅ６）
・１８ｈサンプルでは７５ｋＤａのスメアなバンドが見られた。（Ｌａｎｅ７）
・２４ｈサンプルでは７５ｋＤａのスメアなバンドが見られた。（Ｌａｎｅ８）
【００６２】
（ＳＳＡ  ｌｅｃｔｉｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇの結果）
・未処理サンプルではシグナルは見られなかった。（Ｌａｎｅ１）
・ＧｌｃＮＡｃ−ＩＤＵＡサンプルではシグナルは見られなかった。（Ｌａｎｅ２）
・１ｈサンプルではシグナルは見られなかった。（Ｌａｎｅ３）
・２ｈサンプルでは約８５ｋＤａの極弱いシグナルが見られた。（Ｌａｎｅ４）  
・４ｈサンプルでは８０〜９０ｋＤａの弱いスメアなシグナルが見られた。（Ｌａｎｅ５）
・６ｈサンプルでは８０〜９０ｋＤａの弱いスメアなシグナルが見られた。（Ｌａｎｅ６）
・１８ｈサンプルでは８０〜９０ｋＤａのスメアなシグナルが見られた。（Ｌａｎｅ７）
・２４ｈサンプルでは８０〜９０ｋＤａのスメアなシグナルが見られた。（Ｌａｎｅ８）
【００６３】
実施例２  Ｍ６ＰとＭＳＧ−ＩＤＵＡの糖鎖挿げ替え反応
前記製造例１で製造されたＭＳＧ−ＩＤＵＡ溶液（６μＬ：ＩＤＵＡ１４．４μｇ；０．２ｎｍｏｌ：Ａｃｃｅｐｔｏｒ）、５００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）（０．７２μＬ）及びＭ６Ｐ溶液（２μＬ：Ｍ６Ｐ２００ｎｍｏｌ：Ｄｏｎｏｒ）に、純水５．６８μＬを加えて全量１４．４μＬとした液（Ｄｏｎｏｒ：Ａｃｃｅｐｔｏｒ＝１０００：１（モル比））の全量を、前記製造例３で得られたＥｎｄｏ−ＣＣ  Ｎ１８０Ｈ固定化磁気ビーズが２０μｇ入ったチューブにアプライした。
チューブを、３０℃で、シェーカーインキュベーターを使用し６００ｒｐｍで震盪し、２ｈ、４ｈ、２４ｈ経過したときに、磁気ビーズを磁石で集めてサンプルを、それぞれ、３μＬ（３μｇ）回収した。
回収したサンプルを、ＩＤＵＡ濃度が１μｇ／２０μｌとなるように純水で希釈後、６ｘＳＤＳサンプルバッファーを４μＬ加えてＳＤＳ−ＰＡＧＥ用にサンプル調製（煮沸２分間）した。
【００６４】
調製されたサンプルを、実施例１と同様にしてＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％ｇｅｌ）した。さらに、下記の手順のＭａｎ６ＰＲ  ｌｅｃｔｉｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇにより末端Ｍ６Ｐ含有糖鎖の検出を行った。また同様に定法にてＣＢＢ染色により分子量の変化を調べた。
【００６５】
（Ｍａｎ６ＰＲ  ｌｅｃｔｉｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ）
サンプルを１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動を行った後、Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ  ＳＤ  Ｓｅｍｉ−Ｄｒｙ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｃｅｌｌ（バイオラッド社製）を使用しＰＶＤＦ膜へのタンパク質の転写を、１５Ｖの定電圧で１時間行った。転写用の緩衝液は４８ｍＭトリス、３９ｍＭグリシン、２０％メタノールの混合溶液を用いた。転社したＰＶＤＦ膜を、５０％Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｏｎｅ（ナカライテスク）／ＴＢＳ中で、室温で１．５時間振盪してブロッキングした。
１ｓｔプローブとして特開２０１７−１８４７３６号公報の段落０１２９に記載の方法にて得られたＭａｎ６ＰＲ（ＤＯＭ９−ＨＩＳ）を５μｇ使用し、５０％Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｏｎｅ／ＴＢＳ中でＰＶＤＦ膜を振盪した（室温、３０分の後に４℃、Ｏ／Ｎ）。その後０．１％ＴＷＥＥＮ２０／ＴＢＳ（ＴＢＳＴ）中、ＰＶＤＦ膜について、室温で５分間の洗浄を５回繰り返した後、さらにＴＢＳ中、室温で５分間洗浄した。
２ｎｄプローブとして５０％Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｏｎｅ／ＴＢＳで１０００倍希釈した抗Ｈｉｓ抗体（Ａｎｔｉ−Ｈｉｓ  ｔａｇ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（ＱＩＡＧＥＮ社製））を使用し、ＰＶＤＦ膜を室温で１時間振盪した。その後ＴＢＳＴ中、ＰＶＤＦ膜について、室温で５分間の洗浄を５回繰り返した後、さらにＴＢＳ中、室温で５分間洗浄した。
３ｒｄプローブとして５０％Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｏｎｅ／ＴＢＳで１０００倍希釈したＨＲＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）を使用し、ＰＶＤＦ膜を室温で１時間振盪した。その後ＴＢＳＴ中、ＰＶＤＦ膜について、室温で５分間の洗浄を５回繰り返した後、さらにＴＢＳ中、室温で５分間洗浄した。ＰＶＤＦ膜はＷｅｓｔｅｒｎ  ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｕｌｔｒａ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）により化学発光させ、画像解析装置［ＢＩＯ−ＲＡＤ，ＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＸＲＳ＋（バイオラッド社製）］を用いてシグナル（バンド）検出を行った。
【００６６】
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ＣＢＢ染色の結果）
・未処理ＩＤＵＡサンプルでは７４ｋＤａにバンドが見られた。（Ｌａｎｅ１）
・２ｈサンプルでは７４ｋＤａのバンドが見られた。（Ｌａｎｅ２）
・４ｈサンプルでは７４ｋＤａのバンドが見られた。（Ｌａｎｅ３）  
・２４ｈサンプルでは７４ｋＤａのバンドが見られた。また７６ｋＤａの薄いバンドが見られた。（Ｌａｎｅ４）
【００６７】
（Ｍａｎ6ＰＲ  ｌｅｃｔｉｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇの結果）
・未処理ＩＤＵＡサンプルではシグナルは見られなかった。（Ｌａｎｅ１）
・２ｈサンプルではシグナルは見られなかった。（Ｌａｎｅ２）
・４ｈサンプルではシグナルは見られなかった。（Ｌａｎｅ３）  
・２４ｈサンプルでは８５ｋＤａの弱いシグナルが見られた。（Ｌａｎｅ４）
【００６８】
実施例１のＳＧＰとＭＳＧ−ＩＤＵＡの糖鎖挿げ替え反応では、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＣＢＢ染色）でのバンドが、反応前（未処理）の７５ｋＤａから反応時間が経過すると高分子量側にシフトしており、反応時間４時間、６時間では７６〜８０ｋＤａに、反応時間１８時間、２４時間では７７〜８５ｋＤａにシフトしている。この結果から、反応により、ＭＳＧ−ＩＤＵＡの糖鎖がＳＧＰの糖鎖に挿げ替えられて高分子量化していることが示されている。
又、ＳＳＡ  ｌｅｃｔｉｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇでも、反応前（未処理）では見られないシグナルが、反応開始後では見られるようになり、特に反応時間２４時間では、８０〜１００ｋＤａの濃いスメアなシグナルが見られ、この結果からも、反応により、ＭＳＧ−ＩＤＵＡの糖鎖がＳＧＰの糖鎖に挿げ替えられていることが示されている。
同様な結果は、実施例２のＭ６ＰとＭＳＧ−ＩＤＵＡの糖鎖挿げ替え反応でも得られており、本発明の製造方法により、短い工程（ワンポット反応）で、２以上の単糖が結合してなりコアフコースがないＮ結合型糖鎖を有する糖タンパクの糖鎖を、２以上の単糖が結合してなるＮ結合型糖鎖を有する化合物の糖鎖への挿げ替えが可能であることが示されている。