(57)【要約】【課題】ｉＰＳ細胞等の幹細胞の培地を有効活用した医薬品組成物を提供する。【解決手段】  幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清を含む、医薬品組成物が提供される。医薬品組成物において、幹細胞が、多能性幹細胞であってもよい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清を含む、医薬品組成物又は医薬品組成物原料。
【請求項２】
前記幹細胞が、多能性幹細胞である、請求項１に記載の医薬品組成物又は医薬品組成物原料。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の医薬品組成物又は医薬品組成物原料を含む、皮膚のシミ、しわ及びたるみのいずれかの形成防止及び改善剤。
【請求項４】
幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清を含む、化粧品組成物又は化粧品組成物原料。
【請求項５】
前記幹細胞が、多能性幹細胞である、請求項４に記載の化粧品組成物又は化粧品組成物原料。
【請求項６】
請求項４又は５に記載の化粧品組成物又は化粧品組成物原料を含む、皮膚のシミ、しわ及びたるみのいずれかの形成防止及び改善剤。
【請求項７】
幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清を含む、コラーゲン産生促進剤又はコラーゲン産生促進剤原料。
【請求項８】
前記幹細胞が、多能性幹細胞である、請求項７に記載のコラーゲン産生促進剤又はコラーゲン産生促進剤原料。
【請求項９】
幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清を含む、ヒアルロン酸産生促進剤又はヒアルロン酸産生促進剤原料。
【請求項１０】
前記幹細胞が、多能性幹細胞である、請求項９に記載のヒアルロン酸産生促進剤又はヒアルロン酸産生促進剤原料。
【請求項１１】
幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清を含む、創傷治療剤又は創傷治療剤原料。
【請求項１２】
前記幹細胞が、多能性幹細胞である、請求項１１に記載の創傷治療剤又は創傷治療剤原料。
【請求項１３】
幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清を含む、表皮細胞増殖促進剤又は表皮細胞増殖促進剤原料。
【請求項１４】
前記幹細胞が、多能性幹細胞である、請求項１３に記載の表皮細胞増殖促進剤又は表皮細胞増殖促進剤原料。
【請求項１５】
幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清を含む、発毛剤又は発毛剤原料。
【請求項１６】
前記幹細胞が、多能性幹細胞である、請求項１５に記載の発毛剤又は発毛剤原料。
【請求項１７】
幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清を含む、育毛剤又は育毛剤原料。
【請求項１８】
前記幹細胞が、多能性幹細胞である、請求項１７に記載の育毛剤又は育毛剤原料。
【請求項１９】
幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清を含む、毛乳頭細胞の活性化剤又は毛乳頭細胞の活性化剤原料。
【請求項２０】
前記幹細胞が、多能性幹細胞である、請求項１９に記載の毛乳頭細胞の活性化剤又は毛乳頭細胞の活性化剤原料。
【請求項２１】
幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清を含む、線維芽細胞成長因子ファミリー産生促進剤又は線維芽細胞成長因子ファミリー産生促進剤原料。
【請求項２２】
前記幹細胞が、多能性幹細胞である、請求項２１に記載の線維芽細胞成長因子ファミリー産生促進剤又は線維芽細胞成長因子ファミリー産生促進剤原料。
【請求項２３】
幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清を含む、血管内皮細胞増殖因子産生促進剤又は血管内皮細胞増殖因子産生促進剤原料。
【請求項２４】
前記幹細胞が、多能性幹細胞である、請求項２３に記載の血管内皮細胞増殖因子産生促進剤又は血管内皮細胞増殖因子産生促進剤原料。
【請求項２５】
幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清を含む、細胞をストレスから保護する細胞保護剤又は細胞保護剤原料。
【請求項２６】
前記幹細胞が、多能性幹細胞である、請求項２５に記載の細胞保護剤又は細胞保護剤原料。
【請求項２７】
幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清を含む、ストレスを受けた細胞の生存率を向上させるにする細胞生存率向上剤又は細胞生存率向上剤原料。
【請求項２８】
前記幹細胞が、多能性幹細胞である、請求項２７に記載の細胞生存率向上剤又は細胞生存率向上剤原料。
【請求項２９】
幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清を含む、核酸、タンパク質、タンパク質複合体、リポタンパク質、リボソーム、及び生体膜からなる群から選択される少なくとも１つの生体物質をストレスから保護する生体物質保護剤又は生体物質保護剤原料。
【請求項３０】
前記幹細胞が、多能性幹細胞である、請求項２９に記載の生体物質保護剤又は生体物質保護剤原料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬品組成物及び化粧品組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
胚性幹細胞（ＥＳ細胞）は、ヒトやマウスの初期胚から樹立された幹細胞である。ＥＳ細胞は、生体に存在する全ての細胞へと分化できる多能性を有する。現在、ヒトＥＳ細胞は、パーキンソン病、若年性糖尿病、及び白血病等、多くの疾患に対する細胞移植療法に利用可能である。しかし、ＥＳ細胞の移植には障害もある。特に、ＥＳ細胞の移植は、不成功な臓器移植に続いて起こる拒絶反応と同様の免疫拒絶反応を惹起しうる。また、ヒト胚を破壊して樹立されるＥＳ細胞の利用に対しては、倫理的見地から批判や反対意見が多い。
【０００３】
このような背景の状況の下、京都大学の山中伸弥教授は、４種の遺伝子：Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、及びＳｏｘ２を体細胞に導入することにより、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を樹立することに成功した。これにより、山中教授は、２０１２年のノーベル生理学・医学賞を受賞した（例えば、特許文献１参照。）。ｉＰＳ細胞は、拒絶反応や倫理的問題のない理想的な多能性細胞である。したがって、ｉＰＳ細胞は、細胞移植療法への利用が期待されている。一方、ｉＰＳ細胞の培養に用いた培地を、医薬品組成物に再利用したとの報告がある（例えば、特許文献２参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第４１８３７４２号公報
【特許文献２】特開２０１６−１２８３９６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、本発明者らが検証したところ、特許文献２に記載の培養方法では、ｉＰＳ細胞は分化してしまうため、実際にはｉＰＳ細胞ではなく分化した細胞を培養した培地が再利用されているものと考えられる。本発明は、ｉＰＳ細胞等の幹細胞の培地を有効活用した医薬品組成物及び化粧品組成物を提供することを目的の一つとする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、鋭意研究の末、幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清が、医薬品あるいは化粧品の有効成分になることを見出した。
【０００７】
本発明の態様によれば、幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清を含む、医薬品組成物又は医薬品組成物原料が提供される。換言すれば、医薬品組成物又は医薬品組成物原料に用いられるための、幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清が提供される。医薬品組成物又は医薬品組成物原料において、幹細胞が、多能性幹細胞であってもよい。多能性幹細胞は、ｉＰＳ細胞であってもよい。多能性幹細胞は、ＥＳ細胞であってもよい。培地がゲル培地であってもよい。培地がジェランガムを含んでいてもよい。
【０００８】
本発明の態様によれば、幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清を含む医薬品組成物を対象に投与又は塗布することを含む、治療方法が提供される。対象が、ヒト又は非ヒト動物あるいは植物であってもよい。
【０００９】
本発明の態様によれば、上記の医薬品組成物を含む、皮膚のシミ、しわ及びたるみのいずれかの形成防止及び改善剤が提供される。また、本発明の態様によれば、上記の医薬品組成物を含む、皮膚のシミ、しわ及びたるみのいずれかの形成防止及び改善剤を対象に投与又は塗布することを含む、治療方法が提供される。対象が、ヒト又は非ヒト動物であってもよい。
【００１０】
本発明の態様によれば、幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清を含む、化粧品組成物又は化粧品組成物原料が提供される。換言すれば、化粧品又は化粧品組成物原料に用いるための、幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清が提供される。化粧品組成物又は化粧品組成物原料において、幹細胞が、多能性幹細胞であってもよい。多能性幹細胞は、ｉＰＳ細胞であってもよい。多能性幹細胞は、ＥＳ細胞であってもよい。培地がゲル培地であってもよい。培地がジェランガムを含んでいてもよい。
【００１１】
本発明の態様によれば、上記の化粧品組成物を含む、皮膚のシミ、しわ及びたるみのいずれかの形成防止及び改善剤が提供される。また、本発明の態様によれば、上記の化粧品組成物を含む、皮膚のシミ、しわ及びたるみのいずれかの形成防止及び改善剤を対象に投与又は塗布することを含む、治療方法が提供される。対象が、ヒト又は非ヒト動物であってもよい。
【００１２】
本発明の態様によれば、幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清を含む、コラーゲン産生促進剤又はコラーゲン産生促進剤原料が提供される。換言すれば、コラーゲン産生の促進に用いるための、幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清が提供される。コラーゲン産生促進剤又はコラーゲン産生促進剤原料において、幹細胞が、多能性幹細胞であってもよい。多能性幹細胞は、ｉＰＳ細胞であってもよい。多能性幹細胞は、ＥＳ細胞であってもよい。培地がゲル培地であってもよい。培地がジェランガムを含んでいてもよい。
【００１３】
本発明の態様によれば、幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清を含むコラーゲン産生促進剤を対象に投与又は塗布することを含む、治療方法が提供される。対象が、ヒト又は非ヒト動物であってもよい。
【００１４】
本発明の態様によれば、幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清を含む、ヒアルロン酸産生促進剤又はヒアルロン酸産生促進剤原料が提供される。換言すれば、ヒアルロン酸産生の促進に用いるための、幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清が提供される。ヒアルロン酸産生促進剤又はヒアルロン酸産生促進剤原料において、幹細胞が、多能性幹細胞であってもよい。多能性幹細胞は、ｉＰＳ細胞であってもよい。多能性幹細胞は、ＥＳ細胞であってもよい。培地がゲル培地であってもよい。培地がジェランガムを含んでいてもよい。
【００１５】
本発明の態様によれば、幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清を含むヒアルロン酸産生促進剤を対象に投与又は塗布することを含む、治療方法が提供される。対象が、ヒト又は非ヒト動物であってもよい。
【００１６】
本発明の態様によれば、幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清を含む、創傷治療剤又は創傷治療剤原料が提供される。換言すれば、創傷の治療に用いるための、幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清が提供される。創傷治療剤又は創傷治療剤原料において、幹細胞が、多能性幹細胞であってもよい。多能性幹細胞は、ｉＰＳ細胞であってもよい。多能性幹細胞は、ＥＳ細胞であってもよい。培地がゲル培地であってもよい。培地がジェランガムを含んでいてもよい。
【００１７】
本発明の態様によれば、幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清を含む創傷治療剤を対象に投与又は塗布することを含む、治療方法が提供される。対象が、ヒト又は非ヒト動物であってもよい。
【００１８】
本発明の態様によれば、幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清を含む、表皮細胞増殖促進剤又は表皮細胞増殖促進剤原料が提供される。換言すれば、表皮細胞の増殖の促進に用いるための、幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清が提供される。表皮細胞増殖促進剤又は表皮細胞増殖促進剤原料において、幹細胞が、多能性幹細胞であってもよい。多能性幹細胞は、ｉＰＳ細胞であってもよい。多能性幹細胞は、ＥＳ細胞であってもよい。培地がゲル培地であってもよい。培地がジェランガムを含んでいてもよい。
【００１９】
本発明の態様によれば、幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清を含む表皮細胞増殖促進剤を対象に投与又は塗布することを含む、治療方法が提供される。対象が、ヒト又は非ヒト動物であってもよい。
【００２０】
本発明の態様によれば、幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清を含む、発毛剤又は発毛剤原料が提供される。換言すれば、発毛に用いるための、幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清が提供される。発毛剤又は発毛剤原料において、幹細胞が、多能性幹細胞であってもよい。多能性幹細胞は、ｉＰＳ細胞であってもよい。多能性幹細胞は、ＥＳ細胞であってもよい。培地がゲル培地であってもよい。培地がジェランガムを含んでいてもよい。
【００２１】
本発明の態様によれば、幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清を含む発毛剤を対象に投与又は塗布することを含む、治療方法が提供される。対象が、ヒト又は非ヒト動物であってもよい。
【００２２】
本発明の態様によれば、幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清を含む、毛乳頭細胞の活性化剤又は毛乳頭細胞の活性化剤原料が提供される。換言すれば、毛乳頭細胞の活性化剤又は毛乳頭細胞の活性化剤原料として用いるための、幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清が提供される。毛乳頭細胞の活性化剤又は毛乳頭細胞の活性化剤原料において、幹細胞が、多能性幹細胞であってもよい。多能性幹細胞は、ｉＰＳ細胞であってもよい。多能性幹細胞は、ＥＳ細胞であってもよい。培地がゲル培地であってもよい。培地がジェランガムを含んでいてもよい。
【００２３】
本発明の態様によれば、幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清を含む毛乳頭細胞を対象に投与又は塗布することを含む、治療方法が提供される。対象が、ヒト又は非ヒト動物であってもよい。
【００２４】
本発明の態様によれば、幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清を含む、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）ファミリー産生促進剤又はＦＧＦファミリー産生促進剤原料が提供される。換言すれば、ＦＧＦファミリーの産生の促進に用いるための、幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清が提供される。ＦＧＦファミリーの例としては、ＦＧＦ−２及びＦＧＦ−７である。ＦＧＦファミリー産生促進剤又はＦＧＦファミリー産生促進剤原料において、幹細胞が、多能性幹細胞であってもよい。多能性幹細胞は、ｉＰＳ細胞であってもよい。多能性幹細胞は、ＥＳ細胞であってもよい。培地がゲル培地であってもよい。培地がジェランガムを含んでいてもよい。
【００２５】
本発明の態様によれば、幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清を含むＦＧＦ産生促進剤を対象に投与又は塗布することを含む、治療方法が提供される。対象が、ヒト又は非ヒト動物であってもよい。
【００２６】
本発明の態様によれば、幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清を含む、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）産生促進剤又はＶＥＧＦ産生促進剤原料が提供される。換言すれば、ＶＥＧＦの産生の促進に用いるための、幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清が提供される。ＶＥＧＦ産生促進剤又はＶＥＧＦ産生促進剤原料において、幹細胞が、多能性幹細胞であってもよい。多能性幹細胞は、ｉＰＳ細胞であってもよい。多能性幹細胞は、ＥＳ細胞であってもよい。培地がゲル培地であってもよい。培地がジェランガムを含んでいてもよい。
【００２７】
本発明の態様によれば、幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清を含むＶＥＧＦ産生促進剤を対象に投与又は塗布することを含む、治療方法が提供される。対象が、ヒト又は非ヒト動物であってもよい。
【００２８】
本発明の態様によれば、幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清を含む、細胞をストレスから保護する細胞保護剤又は細胞保護剤原料が提供される。換言すれば、細胞をストレスから保護するための、幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清が提供される。細胞保護剤又は細胞保護剤原料において、幹細胞が、多能性幹細胞であってもよい。多能性幹細胞は、ｉＰＳ細胞であってもよい。多能性幹細胞は、ＥＳ細胞であってもよい。培地がゲル培地であってもよい。培地がジェランガムを含んでいてもよい。
【００２９】
本発明の態様によれば、幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清を含む、ストレスを受けた細胞の生存率を向上させる細胞生存率向上剤又は細胞生存率向上剤原料が提供される。換言すれば、ストレスを受けた細胞の生存率を向上させるための、幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清が提供される。細胞生存率向上剤又は細胞生存率向上剤原料において、幹細胞が、多能性幹細胞であってもよい。多能性幹細胞は、ｉＰＳ細胞であってもよい。多能性幹細胞は、ＥＳ細胞であってもよい。培地がゲル培地であってもよい。培地がジェランガムを含んでいてもよい。
【００３０】
本発明の態様によれば、幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清を含む、核酸、タンパク質、タンパク質複合体、リポタンパク質、リボソーム、及び生体膜からなる群から選択される少なくとも１つの生体物質をストレスから保護する生体物質保護剤又は生体物質保護剤原料が提供される。換言すれば、核酸、タンパク質、タンパク質複合体、リポタンパク質、リボソーム、及び生体膜からなる群から選択される少なくとも１つの生体物質をストレスから保護するための、幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清が提供される。生体物質保護剤又は生体物質保護剤原料において、幹細胞が、多能性幹細胞であってもよい。多能性幹細胞は、ｉＰＳ細胞であってもよい。多能性幹細胞は、ＥＳ細胞であってもよい。培地がゲル培地であってもよい。培地がジェランガムを含んでいてもよい。
【発明の効果】
【００３１】
本発明によれば、幹細胞の培地を有効活用した医薬品組成物及び化粧品組成物を提供可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】実施例４に係る線維芽細胞の増殖性試験の結果を示すグラフである。
【図２】実施例４に係る線維芽細胞の増殖性試験の結果を示すグラフである。
【図３】実施例５に係る線維芽細胞によるコラーゲン産生試験の結果を示すグラフである。
【図４】実施例５に係る線維芽細胞によるコラーゲン産生試験の結果を示すグラフである。
【図５】実施例５に係る線維芽細胞によるヒアルロン酸産生試験の結果を示すグラフである。
【図６】実施例６に係る表皮細胞の遊走能試験の結果を示す写真である。
【図７】実施例６に係る表皮細胞の遊走能試験の結果を示すグラフである。
【図８】実施例７に係る毛乳頭細胞の増殖性試験の結果を示すグラフである。
【図９】実施例８に係る毛乳頭細胞によるＦＧＦ−７産生試験の結果を示すグラフである。
【図１０】実施例８に係る毛乳頭細胞によるＶＥＧＦ産生試験の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。なお以下の示す実施の形態は、この発明の技術的思想を具体化するための装置や方法を例示するものであって、この発明の技術的思想は構成部材の組み合わせ等を下記のものに特定するものではない。この発明の技術的思想は、特許請求の範囲において種々の変更を加えることができる。
【００３４】
実施形態に係る医薬品組成物、医薬品組成物原料、化粧品組成物、及び化粧品組成物原料のそれぞれは、幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清を含む。幹細胞は、例えば、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、及び胚性幹細胞（ＥＳ細胞）等の多能性幹細胞である。幹細胞は、接着培養されてもよいし、浮遊培養されてもよい。
【００３５】
幹細胞用培地としては、例えば、ＴｅＳＲ２（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）等のヒトＥＳ／ｉＰＳ培地を使用可能である。ただし、幹細胞用培地は、これに限定されず、種々の幹細胞培地が使用可能である。例えばＰｒｉｍａｔｅ  ＥＳ  Ｃｅｌｌ  Ｍｅｄｉｕｍ、Ｒｅｐｒｏｓｔｅｍ、ＲｅｐｒｏＦＦ、ＲｅｐｒｏＦＦ２、ＲｅｐｒｏＸＦ（Ｒｅｐｒｏｃｅｌｌ）、ｍＴｅＳＲ１、ＴｅＳＲＥ８、ＲｅｐｒｏＴｅＳＲ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＰｌｕｒｉＳＴＥＭ（登録商標）Ｈｕｍａｎ  ＥＳ／ｉＰＳ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｍｅｒｃｋ）、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ  （登録商標）ＸＦ／ＦＦ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｕｍ  ｆｏｒ  Ｈｕｍａｎ  ｉＰＳ  ａｎｄ  ＥＳ  Ｃｅｌｌｓ、Ｐｌｕｒｉｔｏｎ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）、ＰｌｕｒｉＳＴＥＭ（登録商標）、Ｓｔｅｍｆｉｔ  ＡＫ０２Ｎ、Ｓｔｅｍｆｉｔ  ＡＫ０３（Ａｊｉｎｏｍｏｔｏ）、ＥＳＣ−Ｓｕｒｅ（登録商標）ｓｅｒｕｍ  ａｎｄ  ｆｅｅｄｅｒ  ｆｒｅｅ  ｍｅｄｉｕｍ  ｆｏｒ  ｈＥＳＣ／ｉＰＳ（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＳｔｅｍＣｅｌｌ）、Ｌ７（登録商標）ｈＰＳＣ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  （ＬＯＮＺＡ）、及びＰｒｉｍａｔｅ  ＥＳ  Ｃｅｌｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  （ＲｅｐｒｏＣＥＬＬ）等を利用してもよい。
【００３６】
あるいは、幹細胞用培地としては、代替血清、Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸溶液、２−メルカプトエタノール、及びペニシリン／ストレプトマイシンを添加されたダルベッコ改変イーグル培地／ハムＦ−１２（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）であってもよい。幹細胞用培地は、ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ｂＦＧＦ）等の成長因子を含んでいてもよい。
【００３７】
幹細胞が浮遊培養される場合、ゲル培地が用いられる。ゲル培地は、例えば、幹細胞用培地に脱アシル化ジェランガム等のジェランガムを終濃度が０．５重量％から０．００１重量％、０．１重量％から０．００５重量％、あるいは０．０５重量％から０．０１重量％となるよう添加することにより調製される。なお、本開示においては、ジェランガムとは、脱アシル化ジェランガムを含むものとする。
【００３８】
ゲル培地は、ヒアルロン酸、ラムザンガム、ダイユータンガム、キサンタンガム、カラギーナン、フコイダン、ペクチン、ペクチン酸、ペクチニン酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ヘパリチン硫酸、ケラト硫酸、コンドロイチン硫酸、デルタマン硫酸、ラムナン硫酸、及びそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１種の高分子化合物を含んでいてもよい。また、ゲル培地は、メチルセルロース、並びにリゾホスファチジン酸及びスフィンゴシン−１−リン酸等の脂質を含んでいてもよい。これらの物質を含むことにより、細胞同士の凝集がより抑制される。
【００３９】
あるいは、ゲル培地は、poly(glycerol monomethacrylate) (PGMA)、poly(2-hydroxypropyl methacrylate) (PHPMA）、Poly (N-isopropylacrylamide) (PNIPAM)、amine terminated、carboxylic acid terminated、maleimide terminated、N-hydroxysuccinimide (NHS) ester terminated、triethoxysilane terminated、Poly (N-isopropylacrylamide-co-acrylamide)、Poly (N-isopropylacrylamide-co-acrylic acid)、Poly (N-isopropylacrylamide-co-butylacrylate)、Poly (N-isopropylacrylamide-co-methacrylic acid)、Poly (N-isopropylacrylamide-co-methacrylic acid-co-octadecyl acrylate)、及びN-Isopropylacrylamideから選択される少なくの温度感受性ゲルを含んでいてもよい。
【００４０】
ゲル培地には、例えば、ＲＯＣＫ阻害剤を終濃度が１０００μｍｏｌ／Ｌ以上０．１μｍｏｌ／Ｌ以下、１００μｍｏｌ／Ｌ以上１μｍｏｌ／Ｌ以下、あるいは５μｍｏｌ／Ｌ以上２０μｍｏｌ／Ｌ以下となるよう、添加してもよい。ＲＯＣＫ阻害剤をゲル培地に添加することにより、幹細胞によるコロニー形成が促進される。
【００４１】
ゲル培地は、例えば、ｂＦＧＦ等の成長因子を含まなくともよい。あるいは、ゲル培地は、ｂＦＧＦ等の成長因子を、４００μｇ／Ｌ以下、１００μｇ／Ｌ以下、４０μｇ／Ｌ以下、あるいは１０μｇ／Ｌ以下の低濃度で含んでいてもよい。
【００４２】
また、ゲル培地は、ＴＧＦ−βを含まないか、ＴＧＦ−βを６００ｎｇ／Ｌ以下、３００ｎｇ／Ｌ以下、あるいは１００ｎｇ／Ｌ以下の低濃度で含んでいてもよい。
【００４３】
例えば、幹細胞は、浮遊培養される前に、シングルセルに分解され、シングルセルに分解された幹細胞が、ゲル培地に入れられる。ゲル培地は、撹拌されない。シングルセルは、クローナリティ及び未分化の状態を保ったまま増殖し、ゲル培地中でコロニーを形成する。幹細胞が未分化の状態を保っているか否かは、細胞が未分化マーカーを発現しているか否かを検査することにより、確認することが可能である。
【００４４】
幹細胞を維持培養する際の温度は、例えば３７℃である。幹細胞を維持培養する際の二酸化炭素の濃度は、例えば５％である。幹細胞を維持培養する期間は、例えば、１日以上９０日以下、２日以上６０日以下、５日以上３０日以下、あるいは７日以上２１日以下である。幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清は、ろ過及び遠心等により、幹細胞を除去されていてもよい。
【００４５】
実施形態に係る医薬品組成物は、皮膚塗布組成物であってもよい。実施形態に係る医薬品組成物は、皮膚疾患治療剤であってもよい。実施形態に係る皮膚疾患治療剤で治療可能な疾患の例としては、尋常性ざ瘡、尋常性乾癬、ケロイド、脂漏性皮膚炎、接触皮膚炎、アトピー性皮膚炎、アトピー性乾燥皮膚炎、皮膚粗鬆症（ｄｅｒｍａｔｏｐｏｒｏｓｉｓ）、光線性弾性線維症、日光性角化症、眼瞼下垂症、円形脱毛症、頭髪脱毛症、睫毛貧毛症、肝斑、老人性色素班、汗疹、そばかす、遅発性両側性太田母班、脂漏性角化症、早老症による皮膚疾患、及び単純疱疹等が挙げられる。
【００４６】
実施形態に係る化粧品組成物で改善又は解消可能な状態の例としては、しみ、そばかす、しわ、たるみ、きしみ、肌のはりの低下、くすみ、敏感肌、乾燥肌、及び薄毛等が挙げられる。が挙げられる。実施形態に係る化粧品組成物の効果としては、肌を整える、肌のキメを整える、皮膚をすこやかに保つ、肌荒れを防ぐ、肌をひきしめる、皮膚にうるおいを与える、皮膚の水分及び油分を補い保つ、皮膚の柔軟性を保つ、皮膚を保護する、皮膚の乾燥を防ぐ、肌を柔らげる、肌にはりを与える、肌にツヤを与える、肌を滑らかにする、しみを目立たなくさせる、しわを抑制する及び肌を明るくする等が挙げられる。さらに、実施形態に係る化粧品組成物の頭皮あるいは毛髪に関する効果としては、頭皮を健やかに保つ、育毛、薄毛の予防、かゆみの予防、脱毛の予防、毛生促進、発毛促進、病後又は産後の脱毛の予防、及び養毛等が挙げられる。
【００４７】
実施形態に係る医薬品組成物は、創傷治療剤、表皮細胞増殖促進剤、表皮ターンオーバー促進剤、発毛剤、育毛剤、及び睫毛貧毛症治療薬であってもよい。実施形態に係る医薬品組成物及び化粧品組成物は、コラーゲン産生促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤、発毛剤、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）ファミリー産生促進剤、及び血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）産生促進剤であってもよい。
【００４８】
毛髪の成長においては毛根の毛母細胞が分裂し、そこから生じた細胞が毛髪を構成していく。一方、毛髪の成長には毛周期と呼ばれる周期があり、成長期、退行期、及び休止期を繰り返す。毛乳頭細胞は増殖因子の産生と放出を通じて、毛包上皮幹細胞の増殖及び分化に影響を及ぼし、毛周期を制御している。毛乳頭細胞や毛母細胞の活性化が毛成長のメカニズムに寄与するといわれている。また、毛周期に応じて毛包では活発に血管のリモデリングが行われるが、このときの血管新生に問題があると、毛髪形成のための栄養や酸素の供給が不十分になる。毛包血管網からの血流の不足は男性型脱毛症（ＡＧＡ）の病態に関与するといわれている。
【００４９】
毛乳頭細胞の遺伝子と発毛及び毛成長については、以下のようなことが知られている。すなわち、乳頭細胞が毛母細胞に対して分泌する増殖因子としては、ＦＧＦ−７及びＩＧＦ−１等が知られている。これら遺伝子には毛包成長を維持する作用がある。血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）は毛乳頭細胞より分泌されて毛包血管の増生に関わり、またオートクラインに毛乳頭細胞を増殖させる効果があるが、成長期から退行期へ移行するにしたがい、発現量は減少する。ＶＥＧＦ遺伝子はＡＧＡ（男性型脱毛症）の毛組織で発現が低下している。ＶＥＧＦＢはＶＥＧＦが作用する受容体であるＶＥＧＦＲ−１に競合して結合する。ＶＥＧＦＢは血管内皮細胞の増殖や透過性亢進活性を持つが、毛包での効果は不明である。
【００５０】
実施形態に係る医薬品組成物及び化粧品組成物は、毛乳頭に直接作用し、発毛促進因子であるＦＧＦ−７の産生量を高めて発毛を促進することで毛周期の成長期を長くさせ、細く弱い毛から太くて強い毛に育てる効果、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）を高め、毛乳頭細胞より分泌されて毛包血管の増生に関わり、またオートクラインに毛乳頭細胞を増殖させる効果がある。
【００５１】
実施形態に係る医薬品組成物及び化粧品組成物が育毛剤又は発毛剤として用いられる場合、ミノキシジル、センブリ、パントテニルエチルエーテル、トコフェロール酢酸エステル、グリチルリチン酸二カリウム、及びアデノシン等の他の有効成分を含んでいてもよい。
【００５２】
実施形態に係る創傷治療剤で治療可能な創傷の例としては、熱傷、擦過創、裂傷、挫傷、縫合創、褥瘡、及び皮膚欠損創等が挙げられる。
【００５３】
実施形態に係る医薬品組成物又は化粧品組成物は、幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清を含む、細胞をストレスから保護する細胞保護剤であってもよい。また、実施形態に係る医薬品組成物又は化粧品組成物は、幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清を含む、ストレスを受けた細胞を安定化し、例えば生存率を向上させる細胞生存率向上剤であってもよい。ストレスを受けた細胞は、例えば線維芽細胞、表皮細胞、及び毛乳頭細胞であるが、これらの細胞に限定されず、いかなる細胞でもよい。あるいは、実施形態に係る医薬品組成物又は化粧品組成物は、幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清を含む、核酸、タンパク質、タンパク質複合体、リポタンパク質、リボソーム、及び生体膜からなる群から選択される少なくとも１つの生体物質をストレスから保護する生体物質保護剤であってもよい。ここで、生体膜は、細胞膜を含む。
【００５４】
実施形態に係る医薬品組成物及び化粧品組成物は、幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清を有効量含む。ここで、有効量とは、医薬品組成物あるいは化粧品組成物として効用を発揮可能な量をいう。有効量は、患者の年齢、対象疾患、他の成功成分の有無、及び他の配合物の量に応じて、適宜設定される。
【００５５】
実施形態に係る医薬品組成物及び化粧品組成物は、製剤上許容される担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、防腐剤、及び生理食塩水等を含んでいてもよい。賦形剤の例としては、乳糖、デンプン、ソルビトール、Ｄ−マンニトール、及び白糖が挙げられる。崩壊剤の例としては、カルボキシメチルセルロース、及び炭酸カルシウムが挙げられる。緩衝剤の例としては、リン酸塩、クエン酸塩、及び酢酸塩が挙げられる。乳化剤の例としては、アラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、及びトラガントが挙げられる。
【００５６】
懸濁剤の例としては、モノステアリン酸グリセリン、モノステアリン酸アルミニウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、及びラウリル硫酸ナトリウムが挙げられる。無痛化剤の例としては、ベンジルアルコール、クロロブタノール、及びソルビトールが挙げられる。安定剤の例としては、プロピレングリコール、及びアスコルビン酸が挙げられる。保存剤の例としては、フェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、及びメチルパラベンが挙げられる。防腐剤の例としては、塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、及びクロロブタノールが挙げられる。
【００５７】
また、実施形態に係る医薬品組成物及び化粧品組成物には、水、アルコール、界面活性剤（カチオン、アニオン、ノニオン、及び両性界面活性剤等）、保湿剤（グリセリン、１，３-ブチレングリコール、プロピレングリコール、プロパンジオール、ペンタンジオール、ポリクオタニウム、アミノ酸、尿素、ピロリドンカルボン酸塩、核酸類、単糖類、及び少糖等、並びにそれらの誘導体等）、増粘剤（多糖類、ポリアクリル酸塩、カルボキシビニルポリマー、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、キチン、キトサン、アルギン酸、カラギーナン、キサンタンガム、及びメチルセルロース等、並びにそれらの誘導体等）、ワックス、ワセリン、炭化水素飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、及びシリコン油等、並びにそれらの誘導体、トリ（カプリル・カプリン酸）グリセリル、及びトリオクタン酸グリセリル等のトリグリセライド類、ステアリン酸イソプロピル等のエステル油類、天然油脂類（オリブ油、椿油、アボガド油、アーモンド油、カカオ脂、月見草油、ブドウ種子油、マカデミアンナッツ油、ユーカリ油、ローズヒップ油、スクワラン、オレンジラフィー油、ラノリン、及びセラミド等）、防腐剤（オキシ安息香酸誘導体、デヒドロ酢酸塩、感光素、ソルビン酸、及びフェノキシエタノール等、並びにそれらの誘導体等）、殺菌剤（イオウ、トリクロカルバアニリド、サリチル酸、ジンクピリチオン、及びヒノキチオール等、並びにそれらの誘導体等）、紫外線吸収剤（パラアミノ安息香酸、及びメトキシケイ皮酸等、並びにそれらの誘導体等）、抗炎症剤（アラントイン、ビサボロール、ε−アミノカプロン酸、アセチルファネシルシスティン、及びグリチルリチン酸等、並びにそれらの誘導体等）、抗酸化剤（トコフェロール、ＢＨＡ、ＢＨＴ、及びアスタキサンチン等、並びにそれらの誘導体等）、キレート剤（エデト酸、及びヒドロキシエタンジホスホン酸等、並びにそれらの誘導体等）、動植物エキス（アシタバ、アロエ、エイジツ、オウゴン、オウバク、海藻、カリン、カミツレ、甘草、キウイ、キュウリ、クワ、シラカバ、トウキ、ニンニク、ボタン、ホップ、マロニエ、ラベンダー、ローズマリー、ユーカリ、ミルク、各種ペプタイド、プラセンタ、ローヤルゼリー、ユーグレナエキス、加水分解ユーグレナエキス、及びユーグレナ油等、並びにこれらの含有成分精製物又は発酵物等）、ｐＨ調整剤（無機酸、無機酸塩、有機酸、及び有機酸塩等、並びにそれらの誘導体等）、ビタミン類（ビタミンＡ類、ビタミンＢ類、ビタミンＣ、ビタミンＤ類、ユビキノン、及びニコチン酸アミド等、並びにそれらの誘導体等）、酵母、麹菌及び乳酸菌の発酵液、ガラクトミセス培養液、美白剤（トラネキサム酸、トラネキサム酸セチル塩酸塩、４−ｎ−ブチルレゾルシノール、アルブチン、コウジ酸、エラグ酸、カンゾウフラボノイド、ナイアシンアミド、及びビタミンＣ誘導体等）、セラミド・セラミド誘導体、抗シワ剤（レチノール、及びレチナール、並びにそれらの誘導体、ニコチン酸アミド、及びオリゴぺプチド等、並びにそれらの誘導体等、好中球エラスターゼ阻害、並びにＭＭＰ−１及びＭＭＰ−２阻害作用のある天然及び合成成分等）、酸化チタン、タルク、マイカ、シリカ、酸化亜鉛、酸化鉄、シリコン、及びこれらを加工処理した粉体類等を、実施形態に係る医薬品組成物及び化粧品組成物の目的を達成する範囲内で配合することができる。
【００５８】
なお、実施形態に係る医薬品組成物及び化粧品組成物に添加可能な成分は、上記に限られるものではなく、医薬品組成物及び化粧品組成物に用い得る成分であれば自由に選択が可能である。実施形態に係る医薬品組成物及び化粧品組成物をハップ剤として用いる場合、上記成分に加えて、基剤（カオリン、及びベントナイト等）、ゲル化剤（ポリアクリル酸塩、及びポリビニルアルコール等）を目的を達成する範囲内で配合することができる。実施形態に係る医薬品組成物及び化粧品組成物を入浴剤として用いる場合、硫酸塩、炭酸水素塩、ホウ酸塩、色素、及び保湿剤を目的を達成する範囲内で適宜配合し、パウダータイプ、液剤タイプに調製してもよい。
【００５９】
実施形態に係る医薬品組成物及び化粧品組成物は、当該技術分野において周知慣用されている方法によって製造可能である。
【実施例１】
【００６０】
（実施例１：幹細胞を維持培養した培地の上清の調製）
５ｍＬのＬ−グルタミン（２５０３０−０８１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、５ｍＬの非必須アミノ酸溶液（１１１４０−０５０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１ｍＬの２−メルカプトエタノール（２１９８５−０２３、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２．５ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシン（１５１４０−１２２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にＤＭＥＭ／Ｆ１２（１０５６５−０１８、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、及び代替血清（ＫＳＲ：ＫｎｏｃｋＯｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ、登録商標、１０８２８０２８、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えて、全量が５００ｍＬの培地を作製した。当該培地に、０．２ｍＬの１０μｇ／ｍＬ  ｂＦＧＦ（ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、Ｒ  ａｎｄ  Ｄ）を添加し、幹細胞用培地とした。幹細胞用培地におけるｂＦＧＦの濃度は、４ｎｇ／ｍＬであった。
【００６１】
上記のように作製した幹細胞用培地を用いて、接着培養用シャーレ上のフィーダー細胞上で、ヒトｉＰＳ細胞を接着維持培養した。ヒトｉＰＳ細胞は、１週間ごとに継代した。継代の際には、ヒトｉＰＳ細胞を、０．２５％トリプシン、０．１ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼＩＶ、１ｍｍｏｌ／ＬのＣａＣｌ2、及び２０％のＫＳＲを含む剥離溶液で処理した。
【００６２】
上記の通り維持培養されたヒトｉＰＳ細胞を、ＥＳ細胞解離液（ＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ、登録商標、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて、接着培養用シャーレから剥がした。剥がしたヒトｉＰＳ細胞を、ラミニン（ニッピ）でコートしたディッシュ上に播種した。その後、１０μｍｏｌ／ＬのＲＯＣＫ阻害剤を添加したＴｅＳＲ２培地（Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）を用いて、ヒトｉＰＳ細胞を１週間培養した。培地交換は、毎日行った。
【００６３】
その後、培地を幹細胞用培地に置換し、二日後に幹細胞用培地の上清を回収した。回収した幹細胞用培地の上清を１５００回転で５分遠心し、培地の上清を再度回収した後に３０００回転で３分遠心し、遠心後の幹細胞用培地の上清を０．２２μｍのフィルターでろ過した。ろ過後の幹細胞用培地の上清を、実施例１に係る上清溶液とした。
【００６４】
また、維持培養されたｉＰＳ細胞は、未分化マーカーであるＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ３／４、及びＴＲＡ  １−６０が陽性であることを確認した。
【００６５】
（実施例２：幹細胞を維持培養した培地の上清の調製）
実施例１と同様にヒトｉＰＳ細胞を維持培養した。その後、実施例１と同様に、ヒトｉＰＳ細胞を接着培養用シャーレから剥がし、シングルセルまで分割した。次に、ジェランガム及び１０μｍｏｌ／ＬのＲＯＣＫ阻害剤（Ｓｅｌｌｅｃｋ）を添加してゲル化した幹細胞用培地にヒトｉＰＳ細胞を播種し、ヒトｉＰＳ細胞を２１日間浮遊培養した。その間、二日に一度、ゲル化した幹細胞用培地を培養器に補充した。
【００６６】
その後、ヒトｉＰＳ細胞が懸濁しているゲル化幹細胞用培地をメッシュフィルターでろ過し、細胞塊を除去した。さらに、ろ過されたゲル化幹細胞用培地を１５００回転で５分遠心して細胞及びゲルを沈殿させ、遠心後の幹細胞用培地の上清を再度回収した後に３０００回転で３分遠心し、遠心後の幹細胞用培地の上清を０．２２μｍのフィルターでろ過した。ろ過後の幹細胞用培地の上清を、実施例２に係る上清溶液とした。
【００６７】
また、維持培養されたｉＰＳ細胞は、未分化マーカーであるＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ３／４、及びＴＲＡ  １−６０が陽性であることを確認した。
【００６８】
（実施例３：幹細胞を維持培養した培地の上清の調製）
実施例１と同様にヒトｉＰＳ細胞を維持培養した。その後、実施例１と同様に、ヒトｉＰＳ細胞を接着培養用シャーレから剥がし、シングルセルまで分割した。次に、ジェランガム、及び１００μｍｏｌ／ＬのＲＯＣＫ阻害剤（Ｓｅｌｌｅｃｋ）を添加してゲル化した幹細胞用培地にヒトｉＰＳ細胞を播種し、ヒトｉＰＳ細胞を１４日間浮遊培養した。その間、二日に一度、ゲル化した幹細胞用培地を培養器に補充した。
【００６９】
その後、ヒトｉＰＳ細胞が懸濁しているゲル化幹細胞用培地をメッシュフィルターでろ過し、細胞塊を除去した。さらに、ろ過されたゲル化幹細胞用培地を１５００回転で遠心して細胞及びゲルを沈殿させ、遠心後の幹細胞用培地の上清を再度回収した後に３０００回転で３分遠心し、遠心後の幹細胞用培地の上清を０．２２μｍのフィルターでろ過した。ろ過後の幹細胞用培地の上清を、実施例３に係る上清溶液とした。
【００７０】
また、維持培養されたｉＰＳ細胞は、未分化マーカーであるＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ３／４、及びＴＲＡ  １−６０が陽性であることを確認した。
【００７１】
（比較例：分化した細胞を培養した培地の上清の調製）
特開２０１６−１２８３９６号公報に記載の実施例に準じてヒトｉＰＳ細胞を培養した。すなわち、実施例１と同じ幹細胞用培地を用いて、接着培養用シャーレ上のフィーダー細胞上で、ヒトｉＰＳ細胞を接着維持培養した。ヒトｉＰＳ細胞は、１週間ごとに継代した。継代の際には、ヒトｉＰＳ細胞を、０．２５％トリプシン、０．１ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼＩＶ、１ｍｍｏｌ／ＬのＣａＣｌ2、及び２０％のＫＳＲを含む剥離溶液で処理した。
【００７２】
上記の通り培養されたヒトｉＰＳ細胞を、ＥＳ細胞解離液（ＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ、登録商標、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて、接着培養用シャーレから剥がした。剥がしたヒトｉＰＳ細胞を、非接着培養用シャーレに入れたゲル化していないヒトｉＰＳ細胞中で１週間浮遊培養した。この結果、胚様体（ＥＢ）が形成された。形成された胚様体を接着培養用シャーレ上に播種し、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中で１週間成長（ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ）させた。
【００７３】
次に、細胞を０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡ溶液を用いて接着培養用シャーレから剥がし、シングルセルまで分割された細胞を新たな接着培養用シャーレに播種した。その後、培地として１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭを用い、細胞を一週間培養した。
【００７４】
細胞が７０％から８０％以上コンフルエントになったことを確認した後に、培地を無血清培地（ＦＢＳを含まないＤＭＥＭ）に置換し、２日間培養後、培地の上清を回収した。回収した培地の上清を１５００回転で５分遠心し、培地の上清を再度回収した後に３０００回転で３分遠心し、培地の上清を再度回収したものを比較例に係る上清溶液とした。
【００７５】
また、培養された細胞は、未分化マーカーであるＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ３／４、及びＴＲＡ  １−６０が陰性であり、分化した細胞であることが確認された。
【００７６】
（実施例４：線維芽細胞の増殖性試験）
増殖培地Ａとして、１０％ＦＢＳ及び１％ペニシリン−ストレプトマイシン添加ＤＭＥＭ培地を用意した。次に、成人由来正常ヒト線維芽細胞（ＫＦ−４１０９、Ｓｔｒａｉｎ  Ｎｏ．０１０３５、クラボウ）を、濃度が５×１０3細胞／０．１ｍＬ／ウェルとなるよう増殖培地Ａで懸濁し、９６ウェルプレートに播種して、ＣＯ2インキュベーター内（５％ＣＯ2、３７℃）で１日間培養した。
【００７７】
試験培地Ａとして、１％ＦＢＳ及び１％ペニシリン−ストレプトマイシン添加ＤＭＥＭ培地を用意した。次に、実施例１から３及び比較例に係る上清溶液のそれぞれと、試験培地Ａと、を、体積比で、１０．００：９０．００となるよう混合し、濃度が１０．００ｖ／ｖ％の実施例１から３及び比較例に係る上清添加培地Ａを得た。一部のウェル内の増殖培地Ａを、実施例１から３及び比較例に係る上清添加培地Ａのそれぞれに置換した。
【００７８】
陰性コントロールとして、一部のウェルの増殖培地Ａを、１％ＦＢＳ及び１％ペニシリン−ストレプトマイシンを添加していないＤＭＥＭ培地（無添加試験培地Ａ）に置換した。また、陰性コントロールとして、ＤＭＥＭ／Ｆ１２と、試験培地Ａと、を、体積比で、１０．００：９０．００となるよう混合して得られた希釈試験培地Ａに、一部のウェルの増殖培地Ａを置換した。
【００７９】
置換された培地で、１日間及び３日間、線維芽細胞を培養し、生細胞数測定試薬ＳＦ（Ｃａｔ．Ｎｏ．０７５５３−１５、ナカライテスク）及びプレートリーダー（Ｖａｒｉｏｓｋａｎ  ＭｉｃｒｏＰｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、ＷＳＴ−８法で生細胞数測定を行った。結果を図１及び図２に示す。濃度が１０．００ｖ／ｖ％の実施例１から３に係る上清添加培地Ａを用いた場合、無添加試験培地Ａ、希釈試験培地Ａ、及び比較例に係る上清添加培地Ａを用いた場合と比較して、線維芽細胞が優位に増殖したことが確認された。また、幹細胞の培地の上清が、細胞の生存率の上昇に有効であることが示唆された。さらに、継代時のシャーレからの剥離の際、あるいはシングルセルに分割される際には、細胞には、圧力等の物理的ストレスと、剥離剤により化学的なストレスが加えられる。しかし、これらのストレスを受けた細胞が、実施例に係る上清添加培地によって増殖したことから、実施例に係る上清添加培地が、細胞が受けたストレスを緩和し、細胞をストレスから保護し、細胞を安定化し、生存率を向上させることが示唆された。これらの結果から、実施例に係る上清添加培地が、細胞に含まれる核酸、タンパク質、タンパク質複合体、リポタンパク質、リボソーム、及び生体膜を保護することが示唆された。ここで、生体膜は、細胞膜を含む。
【００８０】
（実施例５：線維芽細胞によるＩ型コラーゲン及びヒアルロン酸産生試験）
実施例４と同様に、増殖培地Ａで成人由来正常ヒト線維芽細胞を１日間培養した。その後、濃度が１．００ｖ／ｖ％、１０．００ｖ／ｖ％又は１００．０ｖ／ｖ％である以外は、実施例４と同様に、一部のウェル内の増殖培地Ａを、実施例１から３及び比較例に係る上清添加培地Ａのそれぞれに置換した。
【００８１】
陽性コントロールとして、一部のウェルの増殖培地Ａを置換しなかった。陰性コントロールとして、一部のウェルの増殖培地Ａを、無添加試験培地Ａに置換した。また、陰性コントロールとして、一部のウェルの増殖培地Ａを、実施例４と同様に調整した希釈試験培地Ａに置換した。
【００８２】
培地を交換した後、３日間、線維芽細胞を培養し、培地の上清を回収し、−８０℃で保存した。その後、培地の上清を解凍し、培地の上清のＩ型コラーゲン濃度を、ヒトコラーゲンタイプ１  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＥＣ１−Ｅ１０５）で測定した。また、培地の上清のヒアルロン酸濃度を、ＤｕｅＳｅｔ  Ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＤＹ３６１４、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて測定した。結果を図３、図４及び図５に示す。
【００８３】
図３及び図４において、右側の補正されたバーは、線維芽細胞を培養する前から元々培地に含まれていたコラーゲンの量を除く補正をされたデータを示している。左側の生データのバーは、補正前のデータを示している。図３に示すように、濃度が１．０ｖ／ｖ％の実施例１に係る上清添加培地Ａを用いた場合、無添加試験培地Ａ、増殖培地Ａ、希釈試験培地Ａ、及び比較例に係る上清添加培地Ａを用いた場合と比較して、Ｉ型コラーゲンの産生量が優位に増加していた。図４に示すように、濃度が１．０ｖ／ｖ％及び１００．０ｖ／ｖ％の実施例３に係る上清添加培地Ａを用いた場合、増殖培地Ａを用いた場合と比較して、Ｉ型コラーゲンの産生量が顕著に増加していた。したがって、幹細胞の培地の上清が、コラーゲンの産生を促進し、皮膚のシワ及びたるみ形成防止、及び改善に有効であることが示唆された。
【００８４】
図５において、右側の補正されたバーは、線維芽細胞を培養する前から元々培地に含まれていたヒアルロン酸の量を除く補正をされたデータを示している。左側の生データのバーは、補正前のデータを示している。濃度が１０．０ｖ／ｖ％及び１００．０ｖ／ｖ％の実施例１から３に係る上清添加培地Ａを用いた場合、無添加試験培地Ａ、希釈試験培地Ａ、及び比較例に係る上清添加培地Ａと比較して、ヒアルロン酸の産生量が顕著に増加していた。したがって、幹細胞の培地の上清が、ヒアルロン酸の産生を促進し、ヒアルロン酸の減少によるシワ及びたるみの形成防止、及び改善に有効であることが示唆された。
【００８５】
（実施例６：表皮細胞の遊走性試験）
増殖培地Ｂとして、増殖添加剤（１０μｇ／ｍＬのインスリン、０．１ｎｇ／ｍＬのｈＥＧＦ、０．６７μｇ／ｍＬのハイドロコーチゾン、４μＬ／ｍＬのウシ脳下垂体抽出液ＢＰＥ）及び抗菌剤（５０μｇ／ｍＬのゲンタマイシン、５０ｎｇ／ｍＬのアンフォテリシン）を含む５００ｍＬの表皮細胞培地（ＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２、クラボウ）を用意した。
【００８６】
成人由来正常ヒト表皮細胞を１０μｇ／ｍＬのＭｉｔｏｍｙｃｉｎ  Ｃ（Ｃａｔ．Ｎｏ．２０８９８−２１、Ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ）で２時間処理し、細胞分裂を停止させた。次に、ヒト表皮細胞を、濃度が４×１０4細胞／０．１ｍＬ／ウェルとなるよう増殖培地Ｂで懸濁し、細胞の遊走能を測定するキット（Ｏｒｉｓ  Ｃｅｌｌ  Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ、登録商標）のコラーゲンコート済みプレートに播種して、ＣＯ2インキュベーター内（５％ＣＯ２、３７℃）で１日間培養し、プレート上のストッパーで塞がれていないストッパーの外縁部に表皮細胞を定着させた。その後、ストッパーをプレート上から撤去した。
【００８７】
試験培地Ｂとして、５００ｍＬの表皮細胞培地に抗菌剤（５０μｇ／ｍＬのゲンタマイシン及び５０ｎｍ／ｍＬのアンフォテリシン）を添加した培地を用意した。次に、実施例１から３及び比較例に係る上清溶液のそれぞれと、試験培地Ｂと、を、体積比で、１０．０：９０．０、１．０：９９．０となるよう混合し、実施例１から３及び比較例に係る上清添加培地Ｂを得た。一部のプレート上の増殖培地Ｂを、実施例１から３及び比較例に係る上清添加培地Ｂのそれぞれに置換した。
【００８８】
一部のプレート上の増殖培地Ｂを、陰性コントロールとして、増殖添加剤を添加していない表皮細胞培地（無添加試験培地Ｂ）に置換した。また、陰性コントロールとして、ＤＭＥＭ／Ｆ１２と、試験培地Ｂと、を、体積比で、１０．０：９０．０、１．０：９９．０となるよう混合して得られた希釈試験培地Ｂに、一部のプレート上の増殖培地Ｂを置換した。
【００８９】
創傷治癒の過程では、傷に向かって表皮細胞が遊走して創傷が収縮する。本実施例においては、ストッパーで塞がれていたところに表皮細胞が遊走したか否かを、プレートリーダーを用いて分析した。具体的には、培地を置換してから２３時間後、生細胞染色試薬（Ｃａｌｃｅｉｎ  ＡＭ、Ｃａｔ．ＮＯ．３４１−０７９０１、ＤＯＪＩＮＤＯ）で表皮細胞を染色し、プレートリーダー（Ｖａｒｉｏｓｋａｎ  ＭｉｃｒｏＰｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、波長４８５ｎｍの励起光に対する波長５３８ｎｍの蛍光を測定した。
【００９０】
結果を図６及び図７に示す。濃度が１．０ｖ／ｖ％及び１０．０ｖ／ｖ％の実施例１から３に係る上清添加培地Ｂを用いた場合、無添加試験培地Ｂ、希釈試験培地Ｂ、及び比較例に係る上清添加培地Ｂと比較して、表皮細胞の遊走能の有意な促進効果が認められた。したがって、幹細胞の培地の上清が、創傷治癒に有効であることが示された。また、幹細胞の培地の上清が、例えば、紫外線暴露による皮膚損傷で生じる皮膚表層のしみ及び不均一な肌色の形成の防止及び改善に有効であることが示唆された。また、幹細胞の培地の上清が、細胞を安定化し、生存率の上昇に有効であることが示唆された。さらに、継代時のシャーレからの剥離の際、あるいはシングルセルに分割される際には、細胞には、圧力等の物理的ストレスと、剥離剤により化学的なストレスが加えられる。しかし、これらのストレスを受けた細胞が、実施例に係る上清添加培地によって増殖したことから、実施例に係る上清添加培地が細胞が受けたストレスを緩和し、細胞をストレスから保護し、細胞を安定化し、生存率を向上させることが示唆された。これらの結果から、実施例に係る上清添加培地が、細胞に含まれる核酸、タンパク質、タンパク質複合体、リポタンパク質、リボソーム、及び生体膜を保護することが示唆された。ここで、生体膜は、細胞膜を含む。
【００９１】
（実施例７：毛乳頭細胞の増殖性試験）
増殖培地Ｃとして、専用添加剤（牛胎児血清、インスリン・トランスフェリン・トリヨードサイロニン混液、牛下垂体抽出液、サイプロテロンアセテート）添加済みの毛乳頭細胞専用培地（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＴＭＴＰＧＭ−２５０、ＴＯＹＯＢＯ）を用意した。次に、正常ヒト毛乳頭細胞（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＣＡ６０２０５ａ、Ｌｏｔ．Ｎｏ．２８６８、ＴＯＹＯＢＯ）を、濃度が１．２×１０4細胞／０．３ｍＬ／ウェルとなるよう増殖培地Ｃで懸濁し、ｔｙｐｅＩコラーゲンコート４８ウェルプレートに播種して、ＣＯ2インキュベーター内（５％ＣＯ2、３７℃）で１日間培養した。
【００９２】
実施例１から３及び比較例に係る上清溶液のそれぞれと、添加剤を添加していない毛乳頭細胞専用培地（無添加試験培地Ｃ）と、を、体積比で３０．０：７０．０となるよう混合し、実施例１から３及び比較例に係る上清添加培地Ｃを得た。一部のウェル内の増殖培地Ｃを、実施例１から３及び比較例に係る上清添加培地Ｃのそれぞれに置換した。
【００９３】
陰性コントロールとして、一部のウェルの増殖培地Ｃを、添加剤を添加していない毛乳頭細胞専用培地（無添加試験培地Ｃ）に置換した。また、陰性コントロールとして、ＤＭＥＭ／Ｆ１２と、無添加試験培地Ｃと、を、体積比で３０．０：７０．０となるよう混合して得られた希釈試験培地Ｃに、一部のウェルの増殖培地Ｃを置換した。
【００９４】
置換された培地で、３日間、毛乳頭細胞を培養し、ＷＳＴ−８法で生細胞数測定を行った。結果を図８に示す。濃度が３０．０ｖ／ｖ％の実施例１から３に係る上清添加培地Ｃを用いた場合、無添加試験培地Ｃ及び希釈試験培地Ｃを用いた場合と比較して、毛乳頭細胞が優位に増殖したことが確認された。したがって、幹細胞の培地の上清が、薄毛の治療、脱毛の予防、毛生促進、及び発毛促進等の育毛及び発毛効果を有することが示唆された。
【００９５】
（実施例８：毛乳頭細胞によるＦＧＦ−７及びＶＥＧＦ産生試験）
実施例７と同様に、増殖培地Ｃで正常ヒト毛乳頭細胞を１日間培養した。その後、濃度が０．３ｖ／ｖ％、３０．０ｖ／ｖ％、又は１００．０ｖ／ｖ％である以外は、実施例７と同様に、一部のウェル内の増殖培地Ｃを、実施例１から３及び比較例に係る上清添加培地Ｃのそれぞれに置換した。
【００９６】
陰性コントロールとして、一部のウェルの増殖培地Ｃを、無添加試験培地Ｃ及び希釈試験培地Ｃのそれぞれに置換した。また、参考コントロールとして、一部のウェルの増殖培地Ｃを、毛乳頭細胞専用培地に１００μｍｏｌ／Ｌのアデノシンを添加したアデノシン添加培地、及び毛乳頭細胞専用培地に３０μｍｏｌ／Ｌのミノキシジルを添加したアデノシン添加培地のそれぞれに置換した。また、ミノキシジルのビヒクル・コントロールとして、一部のウェルの増殖培地Ｃを、毛乳頭細胞専用培地に０．１％ＤＭＳＯを添加したＤＭＳＯ添加培地に置換した。
【００９７】
培地を交換した後、３日間、毛乳頭細胞を培養し、培地の上清を回収し、−８０℃で保存した。その後、培地の上清を解凍し、培地の上清の線維芽細胞成長因子７（ＦＧＦ−７）濃度を、ＦＧＦ−７  Ｈｕｍａｎ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（Ｃａｔ．Ｎｏ．ａｂ１００５１９、ａｂｃａｍ）で測定した。また、培地の上清の血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）濃度をＨｕｍａｎ  ＶＥＧＦ  Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡ（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＤＶＥ００、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）で測定した。結果を図９及び図１０に示す。
【００９８】
図９において、右側の補正されたバーは、毛乳頭細胞を培養する前から元々培地に含まれていたＦＧＦ−７の量を除く補正をされたデータを示している。左側の生データのバーは、補正前のデータを示している。濃度が０．３ｖ／ｖ％の実施例１から３に係る上清添加培地Ｃを用いた場合、無添加試験培地Ｃ、希釈試験培地Ｃ、及び比較例に係る上清添加培地Ｃを用いた場合と比較して、ＦＧＦ−７の産生量が有意に増加したのが確認された。
【００９９】
図１０において、右側の補正されたバーは、毛乳頭細胞を培養する前から元々培地に含まれていたＶＥＧＦの量を除く補正をされたデータを示している。左側の生データのバーは、補正前のデータを示している。濃度が３０．０ｖ／ｖ％及び１００．０ｖ／ｖ％の実施例１から３に係る上清添加培地Ｃを用いた場合、希釈試験培地Ｃ及び比較例に係る上清添加培地Ｃを用いた場合と比較して、ＶＥＧＦの産生量が有意に増加したのが確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年12月19日(2019.12.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉＰＳ細胞を未分化状態で維持培養した浮遊培地の上清を含む、皮膚のシミ、しわ及びたるみのいずれかの形成防止及び改善剤。
【請求項２】
ｉＰＳ細胞を未分化状態で維持培養した浮遊培地の上清を含む、コラーゲン産生促進剤。
【請求項３】
ｉＰＳ細胞を未分化状態で維持培養した浮遊培地の上清を含む、ヒアルロン酸産生促進剤。
【請求項４】
ｉＰＳ細胞を未分化状態で維持培養した浮遊培地の上清を含む、創傷治療剤。
【請求項５】
ｉＰＳ細胞を未分化状態で維持培養した浮遊培地の上清を含む、表皮細胞増殖促進剤。
【請求項６】
ｉＰＳ細胞を未分化状態で維持培養した浮遊培地の上清を含む、発毛剤。
【請求項７】
ｉＰＳ細胞を未分化状態で維持培養した浮遊培地の上清を含む、育毛剤。
【請求項８】
ｉＰＳ細胞を未分化状態で維持培養した浮遊培地の上清を含む、毛乳頭細胞の活性化剤。
【請求項９】
ｉＰＳ細胞を未分化状態で維持培養した浮遊培地の上清を含む、線維芽細胞成長因子ファミリー産生促進剤。
【請求項１０】
ｉＰＳ細胞を未分化状態で維持培養した浮遊培地の上清を含む、血管内皮細胞増殖因子産生促進剤。
【請求項１１】
ｉＰＳ細胞を未分化状態で維持培養した浮遊培地の上清を含む、線維芽細胞及び表皮細胞をストレスから保護する細胞保護剤。
【請求項１２】
ｉＰＳ細胞を未分化状態で維持培養した浮遊培地の上清を含む、ストレスを受けた線維芽細胞及び表皮細胞の生存率を向上させる細胞生存率向上剤。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７２】
上記の通り培養されたヒトｉＰＳ細胞を、ＥＳ細胞解離液（ＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ、登録商標、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて、接着培養用シャーレから剥がした。剥がしたヒトｉＰＳ細胞を、非接着培養用シャーレに入れたゲル化していない培地中で１週間浮遊培養した。この結果、胚様体（ＥＢ）が形成された。形成された胚様体を接着培養用シャーレ上に播種し、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中で１週間成長（ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ）させた。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９６】
陰性コントロールとして、一部のウェルの増殖培地Ｃを、無添加試験培地Ｃ及び希釈試験培地Ｃのそれぞれに置換した。また、参考コントロールとして、一部のウェルの増殖培地Ｃを、毛乳頭細胞専用培地に１００μｍｏｌ／Ｌのアデノシンを添加したアデノシン添加培地、及び毛乳頭細胞専用培地に３０μｍｏｌ／Ｌのミノキシジルを添加したミノキシジル添加培地のそれぞれに置換した。また、ミノキシジルのビヒクル・コントロールとして、一部のウェルの増殖培地Ｃを、毛乳頭細胞専用培地に０．１％ＤＭＳＯを添加したＤＭＳＯ添加培地に置換した。