(57)【要約】      （修正有）【課題】プシコースの甘美度及び甘美質を改善した、プシコース含有混合糖組成物の提供。【解決手段】プシコース、葡萄糖及び果糖を含有する混合糖組成物に含まれている糖類全体の固形分含有量１００重量部を基準にして、葡萄糖含有量が２４重量部以下である、甘美質改善及び無結晶化混合糖組成物。混合糖組成物に含まれている葡萄糖、プシコース及び果糖の合計固形分含有量１００重量部を基準にして、果糖の含有量が３０重量部未満である、前記混合糖組成物。更に、混合糖組成物に含まれている葡萄糖、プシコース及び果糖の合計固形分含有量１００重量部を基準にして、果糖の含有量が２５重量部以下であり、果糖とプシコースの合計含有量が７０重量部を超えるものである、前記混合糖組成物。【効果】前記のプシコースを含む混合糖組成物は、−２０〜３８℃の温度で１年間保管する条件で糖結晶が析出されない。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
プシコース、葡萄糖および果糖を含有する混合糖組成物に含まれている糖類全体の固形分含有量１００重量部を基準にして、葡萄糖含有量が２４重量部以下である、甘美質改善および無結晶化混合糖組成物。
【請求項２】
前記混合糖組成物は、−２０℃乃至３８℃温度で１年間保管する条件で糖結晶が析出されないものである、請求項１に記載の混合糖組成物。
【請求項３】
前記混合糖組成物に含まれている葡萄糖、プシコースおよび果糖の合計固形分含有量１００重量部を基準にして、前記果糖の含有量が３０重量部未満である、請求項１に記載の混合糖組成物。
【請求項４】
前記混合糖組成物に含まれている葡萄糖、プシコースおよび果糖の合計固形分含有量１００重量部を基準にして、前記果糖の含有量が２５重量部以下であり、前記果糖とプシコースの合計含有量が７０重量部を超えるものである、請求項３に記載の混合糖組成物。
【請求項５】
前記混合糖組成物に含まれている葡萄糖、プシコースおよび果糖の合計固形分含有量１００重量部を基準にして、前記葡萄糖含有量が２４重量部以下であり、果糖の含有量が１５重量部以下であり、プシコース含有量が６０重量部以上である、請求項１に記載の混合糖組成物。
【請求項６】
前記混合糖組成物は、プシコースエピマー化酵素、前記酵素を生産する菌株の菌体、前記菌株の培養物、前記菌株の破砕物、および前記破砕物または培養物の抽出物からなる群より選択された１種以上を含むプシコース生産用組成物を果糖−含有原料と反応して製造されたものである、請求項１に記載の混合糖組成物。
【請求項７】
前記混合糖組成物は、プシコース含有量が８０重量％以上であるプシコース結晶化母液と、葡萄糖含有量が８０重量％以上である葡萄糖結晶化母液を混合して製造されるものである、請求項１に記載の混合糖組成物。
【請求項８】
前記プシコース結晶化母液は、糖類全体の固形分含有量中のプシコースを８０乃至９９．９重量％で含有し、追加的に果糖、葡萄糖、オリゴ糖およびプシコース以外の希少糖からなる群より選択された１種以上を含むものである、請求項７に記載の混合糖組成物。
【請求項９】
前記プシコース結晶化母液は、糖類全体の固形分含有量を基準にして果糖２０重量％以下、および葡萄糖１．０重量％以下で含むものである、請求項８に記載の混合糖組成物。
【請求項１０】
前記プシコース、葡萄糖または果糖は、それぞれ、Ｄ−プシコース、Ｄ−葡萄糖、またはＤ−果糖である、請求項１に記載の混合糖組成物。
【請求項１１】
請求項１乃至１０のいずれか一項に記載の混合糖組成物を含有する食品組成物。
【請求項１２】
プシコース、葡萄糖および果糖を含む混合糖組成物において、混合糖組成物に含まれている糖類全体の固形分含有量１００重量部を基準にして、葡萄糖含有量を２４重量部以下に調節して、混合糖組成物の糖結晶の生成を防止する方法。
【請求項１３】
前記混合糖組成物に含まれている葡萄糖、プシコースおよび果糖の合計固形分含有量１００重量部を基準にして、前記果糖の含有量が３０重量部未満である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記混合糖組成物に含まれている葡萄糖、プシコースおよび果糖の合計固形分含有量１００重量部を基準にして、前記果糖の含有量が２５重量部以下であり、前記果糖とプシコースの合計含有量が７０重量部を超えるものである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
プシコース含有量が８０重量％以上であるプシコース結晶化母液と、葡萄糖含有量が８０重量％以上である葡萄糖結晶化母液を混合して葡萄糖含有量を２４重量部以下に調節するものである、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プシコースを含有し、甘美質および結晶化が改善された混合糖組成物、およびプシコースを含む混合糖組成物の結晶化防止方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
砂糖はスクロースを主成分とするもので、食べ物に添加して甘味を出す代表的な甘味料の一つである。砂糖は優れた甘美度を有しており、過去から多様な食べ物、加工食品などに添加されて食べ物の味を良くし、食欲をかきたてる最も好まれる甘味料となってきている。
【０００３】
しかし、最近、砂糖の有害性が継続して明らかになることによって問題が提起されている。具体的に、砂糖の過剰摂取が虫歯はもちろん、肥満、糖尿病など各種生活習慣病の大きな原因として指摘されているため、これを代替する甘味料の開発の必要性が全世界的に台頭されている実情である。
【０００４】
これによって、砂糖を代替する甘美度を有しながらも低カロリーであり、ひいては、単に糖類の吸収を阻害するだけで糖の過剰摂取を遮断する甘味料ではない、より改善された代替甘味料の開発が持続的に要求されている。
【０００５】
プシコース（Ｐｓｃｉｃｏｓｅ）は、果糖（Ｄ−ｆｒｕｃｔｏｓｅ）のエピマーであって、希少糖として知られた機能性糖類の一種であり、砂糖の７０％に達する甘美度を示しながらも熱量はほとんどゼロカロリーに近いため、糖尿病の予防および改善に効能があると知られている。またプシコースは、溶解性にも優れていると知られており、食品への活用が注目されている素材の一つである。
【０００６】
しかし、プシコースを単独で用いて食品添加用甘味料として活用することは、プシコースが砂糖に比べて相対的に低い甘美度を有するだけでなく、甘美質も砂糖とは異なり、既存の砂糖の甘味に慣れている消費者の食欲を満足させにくいため、消費者の好みに悪影響を与えるという問題が発生するようになる。
【０００７】
したがって、プシコースに多様な種類の単糖類、二糖類または高甘美度の甘味料などを追加して甘美度および／または甘美質を改善しようとする試みがあった。ただし、混合糖の場合、糖組成により白濁、結晶化、または甘美質退化などの問題点があるため、これを解決する必要があり、特に他の糖類の添加量を増加させるほど、物性がより悪くなり得る。したがって、プシコースを含む混合糖の甘美質および物性などを改善した混合糖組成物を提供する必要がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、プシコースの甘美度および甘美質を改善した、プシコース含有混合糖組成物を提供することにある。
【０００９】
本発明の他の目的は、プシコース含有混合糖組成物の結晶析出または白濁発生を防止または遅延させるプシコース含有混合糖組成物と、室温だけでなく、低温、結晶誘導物質の存在または長期間の保存など、苛酷な条件でも結晶析出または白濁現象が発生しない安定化したプシコース含有混合糖組成物を提供することにある。
【００１０】
本発明のまた他の目的は、前記プシコース含有混合糖組成物を含む飲食物、医薬品または医薬部外品を提供することにある。
【００１１】
本発明の追加目的は、プシコース、果糖および葡萄糖を含む混合糖組成物中の葡萄糖含有量を特定の組成範囲に調節することによって、混合糖組成物の糖結晶の生成を防止する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、プシコースを含む混合糖の甘美質および物性などを改善した混合糖組成物およびプシコースを含む混合糖組成物の糖結晶の生成を防止する方法に関する。
【００１３】
具体的に、本発明は、プシコース、葡萄糖および果糖を含有する混合糖組成物に含まれている糖類全体の固形分含有量１００重量部を基準にして、葡萄糖含有量が２４重量部以下である無結晶化混合糖組成物に関する。前記混合糖組成物のプシコースの甘美質をより改善すると同時に、混合糖の白濁および結晶化を防止することができる。
【００１４】
本発明による混合糖組成物は、混合糖組成物に含まれている糖類全体の固形分含有量１００重量部を基準にして、葡萄糖含有量が２４重量部以下、２３．５重量部以下、２３．２８重量部以下、２０重量部以下、１８重量部以下、１５重量部以下、１０重量部以下、または５重量部以下であってもよい。
【００１５】
また、混合糖組成物に含まれている糖類全体の固形分含有量１００重量部を基準にして、葡萄糖含有量が２４重量部、２３．５重量部以下、２３．２８重量部以下、２０重量部以下、１８重量部以下、１５重量部以下、１０重量部以下、または５重量部以下であり、下限値は０．１重量部以上、または１重量部以上であってもよく、例えば０．１乃至２４重量部、０．１乃至２３．２８重量部、０．１乃至２０重量部、０．１乃至１８重量部、０．１乃至１５重量部、０．１乃至１０重量部、０．１乃至５重量部、１乃至２４重量部、１乃至２３．２８重量部、１乃至２３．５重量部以下、１乃至２０重量部、１乃至１８重量部、１乃至１５重量部、１乃至１０重量部、１乃至５重量部であってもよい。前記混合糖中の葡萄糖含有量を調節することによって、前記葡萄糖、プシコースおよび果糖を含有する混合糖組成物の結晶化または白濁現象を防止することができる。
【００１６】
本発明による混合糖組成物は、葡萄糖、プシコースおよび果糖だけを含有するか、プシコース、葡萄糖および果糖成分以外に追加的に他の種類の単糖類、二糖類およびオリゴ糖類からなる群より選択された１種以上の糖類を追加的に含むことができる。
【００１７】
また、前記混合糖組成物に含まれている葡萄糖、プシコースおよび果糖の合計固形分含有量１００重量部を基準にして、前記果糖の含有量が３０重量部未満、２５重量部未満、２０重量部未満、１５重量部未満、１０重量部未満、または５重量部未満であってもよい。果糖の含量を適切に調節することによってまたプシコースを含む混合糖組成物の甘美質を改善することができる。
【００１８】
本発明による混合糖組成物は、前記混合糖組成物に含まれている葡萄糖、プシコースおよび果糖の合計固形分含有量１００重量部を基準にして、前記果糖の含有量が２５重量部以下であり、前記果糖とプシコースの合計含有量が７０重量部を超えるものであってもよい。また、前記混合糖組成物に含まれている葡萄糖、プシコースおよび果糖の合計固形分含有量１００重量部を基準にして、前記葡萄糖含有量が２４重量部以下であり、果糖の含有量が１５重量部以下であり、プシコース含有量が６０重量部以上である混合糖組成物が提供されてもよい。
【００１９】
本発明による混合糖組成物に前記プシコース、葡萄糖または果糖は、それぞれ、Ｄ−プシコース、Ｄ−葡萄糖、またはＤ−果糖であることが好ましい。
【００２０】
本発明による混合糖組成物をプシコースを含有してカロリーが低く、葡萄糖および果糖を含んで甘美質が改善され、結晶形成および白濁が防止された混合糖組成物が提供される。本発明による混合糖組成物は、無結晶化混合糖であって、例えば、−２０℃乃至３８℃の温度条件で１年間保管時に糖結晶が析出されないものであってもよい。
【００２１】
また、本発明による前記混合糖組成物は、プシコースエピマー化酵素、前記酵素を生産する菌株の菌体、前記菌株の培養物、前記菌株の破砕物、および前記破砕物または培養物の抽出物からなる群より選択された１種以上を含むプシコース生産用組成物を果糖−含有原料と反応して製造された混合糖シロップまたはこれを用いて製造されたものであってもよい。また前記混合糖組成物は、プシコース、葡萄糖および果糖をそれぞれ混合して前記混合糖組成として製造することもでき、プシコース結晶化母液と葡萄糖結晶化母液を混合して製造することができる。
【００２２】
前記混合糖組成物の製造に結晶化母液を用いて製造する場合、例えば、プシコース含有量が８０重量％以上であるプシコース結晶化母液と、葡萄糖含有量が８０重量％以上である葡萄糖結晶化母液を混合して製造されてもよい。
【００２３】
前記プシコース結晶化母液は、主成分がプシコースであるものであって、糖類全体の固形分含有量中にプシコースが５０重量％以上、例えば、６０重量％以上、７０重量％以上、または８０重量％以上であってもよく、具体的に、糖類全体の固形分含有量を基準に６０乃至９９．９重量％、７０乃至９９．９重量％、または８０乃至９９．９重量％のプシコースを含有するものであってもよい。
【００２４】
また、前記プシコース結晶化母液は、追加的に多様な単糖類、二糖類、オリゴ糖類および希少糖類からなる群より選択された１種以上を含有することができる。前記単糖類としては、葡萄糖および果糖などを含み、前記希少糖類は、アルロース、タガトース、アルトロースなどであってもよい。
【００２５】
前記葡萄糖結晶化母液は、主成分が葡萄糖であるものであって、糖類全体の固形分含有量中の葡萄糖が５０重量％以上、例えば、６０重量％以上、７０重量％以上、または８０重量％以上であってもよく、具体的に、糖類全体の固形分含有量を基準にして６０乃至９９．９重量％、７０乃至９９．９重量％、８０乃至９９．９重量％の葡萄糖を含有するものであってもよい。
【００２６】
また、前記葡萄糖結晶化母液は、追加的に多様な単糖類、二糖類およびオリゴ糖類からなる群より選択された１種以上を含むことができる。
【００２７】
本明細書で、糖類の結晶化母液とは、目的糖類を含有する製造原液で目的糖類を結晶化または粉末化処理して結晶または粉末を形成し、その結晶または粉末を分離した後に残った母液を意味し、前記目的糖類がプシコースである場合、プシコース結晶化母液であり、前記目的糖類が葡萄糖である場合、葡萄糖結晶化母液という。通常、葡萄糖結晶化母液をハイドロール（ｈｙｄｒｏｌ）ともいう。
【００２８】
プシコース結晶化母液の例としては、Ｄ−プシコースエピマー化酵素を有するエンサイファ菌株を固定化させた担体を用いて果糖をＤ−プシコースに転換することを含む、果糖からＤ−プシコースを連続生産する方法によりＤ−プシコースを製造することができる。
【００２９】
前記方法により製造されたＤ−プシコース溶液をＣａ＋  ｔｙｐｅ分離樹脂を用いて高純度に分離して８０重量％まで濃縮して結晶化を行う。結晶化工程を経て脱水工程で結晶にならずに脱水されて出た脱水液をプシコース結晶化母液として得ることができる。
【００３０】
葡萄糖結晶化母液の例としては、葡萄糖結晶を収得して残った結晶母液であって、通常、母液に含有されている糖類は、総糖類固形分に対して８０乃至９９重量％の葡萄糖および１乃至２０重量％の二糖類および／またはオリゴ糖（例えば、三糖類、四糖類など）を含有する。
【００３１】
本発明のプシコースは、化学的合成方法またはプシコースエピマー化酵素を用いた生物学的方法を行って製造することができ、好ましくは生物学的方法を行って製造することができる。
【００３２】
そこで、前記プシコースは、プシコースエピマー化酵素、前記酵素を生産する菌株の菌体、前記菌株の培養物、前記菌株の破砕物、および前記破砕物または培養物の抽出物からなる群より選択された１種以上を含むプシコース生産用組成物を、果糖−含有原料と反応して製造されたものであってもよい。
【００３３】
本発明の一例において、生物学的方法によりプシコースを製造する方法としては、プシコースエピマー化酵素を生産する菌株またはプシコースエピマー化酵素を暗号化する遺伝子が導入された組換え菌株を培養し、これから得られたプシコースエピマー化酵素を果糖−含有原料と反応して生産することができる。前記プシコースエピマー化酵素は、液状または固定化酵素を用いた固状で提供されるものであってもよい。
【００３４】
または、プシコースエピマー化酵素を生産する菌株またはプシコースエピマー化酵素を暗号化する遺伝子が導入された組換え菌株を得て、菌株の菌体、前記菌株の培養物、前記菌株の破砕物、および前記破砕物または培養物の抽出物からなる群より選択された１種以上を含むプシコース生産用組成物を、果糖−含有原料と反応して製造されてもよい。プシコースエピマー化酵素を生産する菌株の菌体を用いてプシコースを製造する場合、液状反応または固定化菌体を用いた固状反応で行われてもよい。
【００３５】
本発明の具体的一例において、プシコースエピマー化酵素を生産する菌株としては、高い安定性を有しながらも高収率でプシコースエピマー化酵素を生産することができる菌株であってもよく、前記組換え菌株は、多様な宿主細胞、例えば大腸菌、バシラス属菌株、サルモネラ属菌株およびコリネバクテリウム属菌株などを用いることができるが、好ましくはＧＲＡＳ菌株であるコリネバクテリウム属菌株であってもよく、コリネバクテリウムグルタミクムであってもよい。
【００３６】
組換え菌株を用いた場合、プシコースエピマー化酵素は、多様な菌株に由来する酵素の暗号化遺伝子を用いることができ、例えば韓国特許公開２０１４−００２１９７４に記載されたトレポネマプリミティア由来酵素、韓国特許公開２０１４−００８０２８２に記載されたルミノコッカストロクエス由来酵素および韓国登録特許１０−１３１８４２２号に記載されたクロストリジウムシンデンス由来酵素であってもよく、またエンシファーアドヘレンス由来酵素であってもよい。
【００３７】
具体的な一例において、本発明によるプシコースエピマー化酵素は、クロストリジウムシンデンス由来酵素であってもよく、例えば、配列番号７のアミノ酸配列を含むものであってもよく、配列番号８または配列番号９の核酸配列を含んでいる塩基配列により暗号化されるものであってもよい。配列番号８の核酸配列は、大腸菌最適化核酸配列であり、配列番号９はコリネバクテリウムに適するように変形された核酸配列である。
【００３８】
本発明の一例による組換え菌株の製造において、前記プシコースエピマー化酵素を暗号化する核酸配列の上部に位置する調節配列を用いて酵素の発現を調節することができ、調節配列は、転写プロモーターを必須的に含み、追加的にリボソーム結合領域および／またはスペーサ配列などを含むことができる。前記調節配列を構成する要素は、直接連結されたり、１個乃至１００個の塩基、例えば５個乃至８０個の塩基を有する核酸配列のリンカーを一つ以上含んで連結されてもよい。
【００３９】
具体的な一例において、前記転写プロモーターは、コリネバクテリウム属菌株でプシコースエピマー化酵素を暗号化する核酸配列を発現する核酸分子であってもよいが、ｔａｃ１、ｔａｃ２、ｔｒｃ、ｓｏｄプロモーターであってもよい。ｓｏｄプロモーターは、コリネバクテリウムグルタミクムに由来するものであり、好ましくは配列番号１の核酸配列をコア領域として含む。Ｔｒｃプロモーターは、大腸菌由来プロモーターであり、ｔｒｐプロモーターとｌａｃＵＶ５プロモーターの組み合わせで製造されたものである。Ｔａｃ１プロモーターは、大腸菌由来プロモーターであり、ｔｒｐプロモーターとｌａｃＵＶ５プロモーターの組み合わせで製造されたものである。Ｔａｃ２プロモーターは、大腸菌由来プロモーターであり、ｔｒｐプロモーターとｌａｃＵＶ５プロモーターの組み合わせで製造されたものであって、前記Ｔａｃ１プロモーターの配列を変形して最適化した形態である。
【００４０】
前記リボソーム結合領域とスペーサは、化学的に直接連結されたりその中間にリンカー核酸配列を介して間接的に連結されてもよい。本発明の一例においてリボソーム結合領域（ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）およびスペーサ配列は５’から３’の順に順次連結された一つのオリゴヌクレオチドを含むことができる。本発明の一例によるプロモーター配列、リボソーム結合領域（ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）およびスペーサ配列の核酸配列を下記表１に示す。表１で濃く下線表示された部分は、調節配列のうち、リボソーム結合領域、スペーサ配列、リンカー配列などを示す。
【００４１】
【表１】
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本発明によるプシコースエピマー化酵素は、酵素活性および熱安定性に優れたものが好ましく、そこで、本発明の具体的な例において、転写プロモーターまたは調節配列はプシコースエピマー化酵素をコーディングする遺伝子との組み合わせが重要であり、本発明に使用されたプシコースエピマー化酵素とはｔａｃ１、ｔａｃ２、ｔｒｃ、ｔｒｉｐ、ｓｏｄプロモーターの全てが適正以上の蛋白質発現を提供することができ、ｓｏｄプロモーターを用いた場合には、蛋白質のフォルディング（ｆｏｌｄｉｎｇ）が堅固で熱安定性が高く現れる結果を得ることができるため、より好ましい。
【００４２】
組換え菌株を用いたプシコース生産方法などは、韓国特許公開２０１４−００２１９７４、韓国特許公開２０１４−００８０２８２および韓国登録特許１０−１３１８４２２号に記載された方法により行われ得るが、特に限定されない。
【００４３】
前記プシコース生産方法において、効率的なプシコース生産のために、基質として使用される果糖の濃度は、反応物全体を基準にして４０乃至１００％（ｗ／ｖ）、４０乃至７５％（ｗ／ｖ）、例えば、５０乃至７５％（ｗ／ｖ）であってもよい。果糖の濃度が前記範囲より低ければ経済性が低くなり、前記範囲より高ければ果糖がよく溶解されないため、果糖の濃度は前記範囲にすることが良い。前記果糖は、緩衝溶液または水（例えば蒸溜水）に溶解された溶液状態で用いることができる。
【００４４】
本発明による混合糖組成物は、結晶化が防止され、甘美質が改善されたものであって、多様な食品、医薬品または医薬部外品などに甘味料として用いることができる。
【発明の効果】
【００４５】
本発明によるプシコースを含む混合糖組成物およびその結晶化防止方法は、プシコースを含む混合糖の甘美質および物性などを改善して、具体的には室温だけでなく、低温、結晶誘導物質の存在、または長期間の保存など、苛酷な条件でも結晶析出または白濁現象が発生しない安定化したプシコース含有混合糖組成物を提供して飲食物、医薬品、医薬部外品または化粧品など多様な製品に適用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】本発明の実施例２による高純度プシコースシロップ組成物の葡萄糖濃度別結晶加速テスト結果を示す写真である。
【図２】本発明の実施例３による高純度プシコースシロップ組成物の葡萄糖濃度別結晶加速テスト結果を示す写真である。
【図３】本発明の実施例４による長期間保管時、高純度プシコースシロップ組成物の葡萄糖濃度別結晶加速テスト結果を示す写真である。
【図４】本発明によりプシコースシロップ製造のための組換え発現ベクター（ｐＣＥＳ＿ｓｏｄＣＤＰＥ）の一例を示した図面である。
【図５】本発明の実施例１による液状果糖シロップで結晶を分離および乾燥し、ＨＰＬＣで分析した結果グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
本発明を下記の実施例に基づいてより詳細に説明する。ただし、下記の実施例は、本発明の好ましい実施例に過ぎず、本発明はこれに限定されない。
【００４８】
（製造例１：プシコース結晶化母液の製造）
１−１：プシコース生産菌株の製造
クロストリジウムシンデンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｉｍ  ｓｃｉｎｄｅｎｓ  ＡＴＣＣ  ３５７０４）に由来するプシコースエピマー化酵素の暗号化遺伝子（ＤＰＥ  ｇｅｎｅ；Ｇｅｎｅ  ｂａｎｋ：ＥＤＳ０６４１１．１）を、大腸菌に最適化して変形した形態のポリヌクレオチドで合成してＣＤＰＥと命名した。大腸菌に最適化されたポリヌクレオチド（配列番号２）とｐＥＴ２１ａベクターから確保したｓｏｄプロモーターとＴ７ターミネーターをＰＣＲを通じてそれぞれの鋳型で確保し、これをオーバーラップＰＣＲ法で一つの鋳型で連結してＴ−ベクタークローニング（Ｔ−ｖｅｃｔｏｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ）を通じてｐＧＥＭ  Ｔ−イージー ベクター（ｐＧＥＭ  Ｔ−ｅａｓｙ  ｖｅｃｔｏｒ）にクローニングして、ｓｏｄプロモーター（配列番号１）、配列番号８の最適化ＣＤＰＥ配列およびＴ７−ターミネーターを含むポリヌクレオチドの配列を確認した。
【００４９】
前記確認されたポリヌクレオチド全体を制限酵素ＮｏｔＩとＸｂａＩ（ＮＥＢ）を用いて発現ベクターであるｐＣＥＳ２０８（Ｊ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  １８：６３９−６４７，  ２００８）の同一の制限酵素部位に挿入して組換えベクターｐＣＥＳ２０８／プシコースエピマー化酵素（ｐＣＥＳ＿ｓｏｄＣＤＰＥ）を製造した。前記製造された組換えベクター（ｐＣＥＳ＿ｓｏｄＣＤＰＥ）の切断地図を図４に開示した。
【００５０】
前記製造された組換えベクター（ｐＣＥＳ＿ｓｏｄＣＤＰＥ）プラスミドを電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いてコリネバクテリウムグルタミクムを形質転換させた。コロニーをピッキング（ｐｉｃｋｉｎｇ）してカナマイシン（Ｋａｎａｍｙｃｉｎ）を最終濃度１５ｕｇ／ｍｌに添加したＬＢ培地（トリプトーン１０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  １０ｇ／Ｌ、酵母抽出物５ｇ／Ｌ）４ｍｌに接種した後、培養条件３０℃および２５０ｒｐｍで約１６時間培養した。その後、前記培養液中の１ｍｌを収得して１５ｕｇ／ｍｌのカナマイシンを含んでいる１００ｍｌのＬＢ培地に接種して本培養を１６時間以上行った。ビードビーター（Ｂｅａｄｂｅａｔｅｒ）を用いて培養した細胞を溶解（ｌｙｓｉｓ）させた後、上澄液だけを取得してサンプルバッファーと１：１に混合後、１００℃で５分間加熱する。準備したサンプルは、１２％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（組成：分離ゲル（ｒｕｎｎｉｎｇ  ｇｅｌ）  −３．３ｍｌ  Ｈ２Ｏ、４．０ｍｌ  ３０％  アクリルアミド（ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）、２．５ｍｌ  １．５Ｍ  トリスバッファー（Ｔｒｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ）（ｐＨ８．８）、１００μｌ  １０％  ＳＤＳ、１００μｌ  １０％  ＡＰＳ、４μｌ  ＴＥＭＥＤ／濃縮ゲル（ｓｔａｃｋｉｎｇ  ｇｅｌ）  −１．４ｍｌ  Ｈ２Ｏ、０．３３ｍｌ  ３０％  アクリルアミド、０．２５ｍｌ  １．０Ｍ  トリスバッファー（ｐＨ６．８）、２０μｌ  １０％  ＳＤＳ、２０μｌ  １０％  ＡＰＳ、２μｌ  ＴＥＭＥＤ）に１８０Ｖで約５０分間電気泳動して蛋白質発現を確認した。ＣＤＰＥの発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で確認後、正確な発現量の測定のためにＮｉ−ＮＴＡ樹脂（ｒｅｓｉｎ）を用いたＨｉｓ−ｔａｇ精製を行い、計算式（発現率（％）＝（Ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ｍｇ）／Ｔｏｔａｌ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ｍｇ））Ｘ１００）を用いて発現率を計算した。前記製造された形質転換コリネバクテリウムグルタミクムは全体水溶性蛋白質を１６．６２ｍｇおよび精製された酵素蛋白質１．７４ｍｇを生産した。
【００５１】
１−２：プシコースシロップの製造
製造例１−１で得られたプシコースエピマー化酵素を生産する組換え菌株を用いて果糖からプシコースを製造するために、菌株培養で遠心分離により細胞を回収した。
【００５２】
その後、前記細胞懸濁液に最終体積に乳化剤（Ｍ−１６９５）を０．０５％（ｗ／ｖ）処理して３５℃（±５℃）で６０分間処理した。反応が完了した菌体は、再び遠心分離機を用いて乳化剤が含まれている上澄液は除去した後、菌体を回収した。
【００５３】
固定化ビードの製造のために、前記回収された菌体はＤ．Ｗ．と混合して最終菌体濃度５％（ｗ／ｖ）に合わせ、水に溶解された４％（ｗ／ｖ）アルギン酸と回収された菌体５％（ｗ／ｖ）を１：１に混合し、混合時に生成された気泡を除去するために４℃で冷蔵保管した。前記冷蔵保管された混合液はニードル（内径０．２０乃至０．３０ｍｍ）を通じて混合液が射出されて滴形態に形成され、重量により落下するようになり、落下された混合液は予め製造された１００ｍＭ塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）溶液で落として硬化して球形または楕円形のビード（直径２．０乃至２．２ｍｍ）を形成した。前記形成されたビードは１００ｍＭ塩化カルシウム溶液に浸して攪拌機により均一に混合されながらより硬化するようにした。
【００５４】
前記混合液が全部射出された後、４乃至６時間冷蔵保管しながらビードをより硬化させた後に新たな１００ｍＭ塩化カルシウム溶液と交換して冷蔵状態で約６時間程度硬化させた。硬化が完了したビードは取りはらって水気を完全に除去した後、ビード体積に対して３倍体積の水を投入した後、１０分間攪拌し、このような過程を３回処理して塩化カルシウム溶液を除去した。洗浄されたビードはマンガンソーキングのために水気を完全除去した後、１０ｍＭマンガンが含まれている４０ｂｒｉｘ（％）反応基質をビード体積に対して３倍体積で投入した後、１０分間攪拌し、このような処理を３回以上処理して１０ｍＭマンガンが含まれている反応基質に交換した。反応基質はｐＨ６．８乃至７．２で３Ｎ  ＮａＯＨにより調節され、生産物の種類により液状果糖または結晶果糖が反応基質になることができる。１０ｍＭマンガンが含まれている反応基質に交換されたビードは反応槽に移された後、反応温度５０℃で約３０乃至６０分間反応してマンガンおよび果糖でビードのソーキング作業を完了した。ソーキングが完了したビードは直径が約１．６乃至１．８ｍｍに減りながら強度も増加するようになる。ソーキングが完了したビードの基質を除去後、固定化反応カラムに充填後、プシコースシロップの生産に用いた。
【００５５】
＜固定化カラムの反応条件＞
反応温度：カラムジャケット内部温度５０℃
基質流速：０．５ＳＶ（ｓｐａｃｅ  ｖｅｌｏｃｉｔｙ  Ｌ．ｈ−１）
反応基質：結晶果糖４０ｂｒｉｘ、ｐＨ６．８乃至７．２、
ビード製造：２．５％（ｗ／ｗ）菌体、２％（ｗ／ｗ）アルギン酸混合および１０ｍＭＭｎ２＋ｓｏａｋｉｎｇ
前記固定化反応カラムに、原料溶液が７５％の固形分を含み、固形分含有量全体が１００重量部である時、果糖の含有量を９２重量部で含む原料を提供して２種類の組成の混合糖であるプシコースシロップを製造した。つまり、前記反応液から葡萄糖：果糖：プシコース：オリゴ糖の重量比で葡萄糖：果糖：プシコース：オリゴ糖＝６：６７：２５：２である２５（ｗ／ｗ）％プシコースシロップを収得して下記の実施例に用いた。
【００５６】
１−３：プシコース結晶化母液の製造
製造例１−２で得られたプシコースシロップを有色およびイオン成分などの不純物を除去するために陽イオン交換樹脂、陰イオン交換樹脂および陽イオンと陰イオン交換樹脂が混合された樹脂で充填された常温のカラムに時間当りイオン交換樹脂２倍体積の速度で通液させて脱塩させた後、カルシウム（Ｃａ２＋）タイプのイオン交換樹脂で充填されたクロマトグラフィーを用いて高純度プシコース溶液で分離してプシコース含有量が８０重量％になるまで濃縮して結晶化を行った。結晶化工程を経て脱水工程で結晶にならずに脱水されて出た脱水液をプシコース結晶化母液として収得し、前記母液は６５．１Ｂｘであり、固形分組成で果糖８．４重量％およびプシコース９１．６重量％を含んでいる。
【００５７】
（実施例１：果糖−含有シロップの結晶化物質）
市販される液状果糖４２（果糖３９．５重量％および葡萄糖５３．２重量％）および液状果糖５５（果糖５４．０重量％および葡萄糖３７．０重量％）シロップの中で結晶が生成されたものを採取して５，０００ＲＰＭで３０分間遠心分離を行った後、上澄液を捨てて結晶部分を取った。完璧にシロップ成分を除去するために、エタノールで洗浄しながら５μｍメンブレインフィルターを用いて真空ろ過した。フィルターに通過された水溶液を捨て、フィルターに残った結晶を６０℃オーブンに一日間乾燥した。
【００５８】
乾燥された結晶をＨＰＬＣ分析した結果、葡萄糖８０重量％で結晶の主成分で表２と図５に示した。ＨＰＬＣ糖組成分析はＢｉｏｒａｄ社のＡｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｃカラム（８０℃）を用いて水溶媒を０．６ｍｌ／ｍｉｎ流速でサンプル１０μｌを注入してＲＩで検出した。したがって、果糖シロップで生成された結晶はシロップ内の葡萄糖によるものであることが分かった。
【００５９】
【表２】
2020010710.tif 000004
【００６０】
（実施例２：結晶化シロップ組成物の製造）
製造例１で高純度分離を通じて９５重量％以上のプシコース含有量を含むシロップを結晶化の後に出る結晶母液と葡萄糖結晶の後に出る結晶母液を一定の混合比で混合して高純度プシコースシロップを製造した。
【００６１】
具体的に、製造例１で得られたプシコース結晶母液（三養ゼネックス、６５．１Ｂｘ、固形分組成：果糖８．４重量％、プシコース９１．６重量％）と製造例２で得られた葡萄糖結晶母液（ハイドロール）（三養ゼネックス、６５．３Ｂｘ、固形分組成：二糖類以上８．７重量％、葡萄糖９１．３重量％）を用いて、表３に記載された多様な混合比で混合して製造したシロップ組成物を製造した。前記シロップ組成物は、それぞれ葡萄糖含有量１０重量％、２０重量％、３０重量％、４０重量％、または５０重量％になるように製造し、７５Ｂｘで濃縮して濃縮シロップ液を製造した。
【００６２】
前記葡萄糖結晶母液製品は、葡萄糖の製造時に葡萄糖原液を結晶化処理して葡萄糖結晶（無水結晶または含水結晶）を形成した後、その結果物をろ過して葡萄糖結晶を収得して残った結晶母液を得た。前記得られたハイドロールは６５．３Ｂｘであり、固形分組成として二糖類以上８．７重量％および葡萄糖９１．３重量％を含んでいる。
【００６３】
前記濃縮シロップ液に無水結晶葡萄糖（三養ゼネックス）を固形分０．５重量％ずつ添加して４℃で４日間保管して結晶加速試験を行った。無水葡萄糖粉末を混合して得られたシロップ液の糖組成は表３に示した。表３は、本発明のプシコース結晶母液と葡萄糖結晶母液組成物の固形分組成を示す。
【００６４】
結晶析出（白濁現象）有無を観察して次のような基準に評価してその結果を表４および図１に示した。
【００６５】
【表３】
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【００６６】
下記表４は、プシコース結晶母液と葡萄糖結晶母液組成物の結晶加速テスト結果を示す。
【００６７】
＜評価基準＞
−：結晶がない
±：結晶核はできるが、実用性がある
＋：肉眼で結晶が見えるが、流動性がある
＋＋：結晶が析出し、白濁現象がある
＋＋＋：結晶が析出し、流動性がない
【００６８】
【表４】
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【００６９】
表４および図１から分かるように、葡萄糖加速テスト実験結果でシロップ内の葡萄糖含有量が３０重量％以上で白濁が生成されることが分かり、特に４０重量％以上では白濁で結晶化が行われていることを確認した。葡萄糖含有量が２０重量％以下では白濁が発生しなかったが、葡萄糖含有量範囲をより具体的に確認するために、葡萄糖含有量２０乃至３０重量％範囲を細分化して実施例３を行った。
【００７０】
（実施例３：結晶化シロップ組成物の製造）
シロップ組成物の結晶化を誘導する葡萄糖の濃度を細部的に明らかにするために、葡萄糖濃度をより細分化してシロップ組成物を製造して結晶化実験を行った。
【００７１】
具体的に、実施例１と実質的に同様な方法でプシコース結晶母液と葡萄糖結晶母液を混合して濃縮シロップ液を製造し、結晶加速テストを実施した。ただし、この時、高純度プシコースシロップの組成物は表５のとおりである。結晶析出（白濁現象）有無を観察して実施例２のような基準に評価してその結果を表６、表７、および図２に示した。下記表５は、プシコース結晶母液と葡萄糖結晶母液組成物の固形分組成を示す。
【００７２】
【表５】
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【００７３】
下記表６および表７は、プシコース結晶母液と葡萄糖結晶母液組成物の結晶加速テスト結果を示す。
【００７４】
【表６】
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【００７５】
【表７】
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【００７６】
表６および７と図２から分かるように、葡萄糖加速テスト実験結果において、シロップ内の葡萄糖含有量が２５重量％以上で白濁が生成されることが分かった。葡萄糖含有量が２４重量％以下では白濁が発生しなかった。
【００７７】
実施例３の結果を基に葡萄糖含有量が２４重量％以下では苛酷条件でも白濁現象が発生せず、長時間保存する場合にも製品の品質を維持できると判断される。
【００７８】
（実施例４：結晶化シロップ組成物の製造）
実施例３の結果で示された葡萄糖含有量２４重量％以下では長時間保存する場合にも製品の品質が維持されるのか立証するために、実施例３と同一の葡萄糖濃度を細分化したシロップ組成物を製造して長期保管結晶化実験を行った。
【００７９】
具体的に、実施例３と実質的に同様な方法でプシコース結晶母液と葡萄糖結晶母液を混合して濃縮シロップ液を製造し、結晶加速テストを実施した。この時、高純度プシコースシロップの組成物は実施例３の表５のとおりである。結晶析出（白濁現象）有無を観察するために低温室に９６日間保管後、実施例２のような基準に評価してその結果を表８、表９、および図３に示した。
【００８０】
【表８】
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【００８１】
【表９】
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【００８２】
表８、表９、および図３から分かるように、葡萄糖加速テスト実験結果において、シロップ内の葡萄糖含有量が２５重量％以上で白濁が生成されることが分かった。葡萄糖含有量が２４重量％以下では白濁が発生しなかった。
【００８３】
前記実験結果を総合すると、実施例２、３および４の結果を基に葡萄糖含有量が２４重量％以下では長時間の苛酷条件でも白濁現象が発生せず、長時間製品の品質を維持することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【外国語明細書】
2020010710000001.pdf